(57)【要約】動物細胞培養物におけるサイトカイン制御因子および１つ以上のサイトカインの発現を増強する方法が記載される。サイトカイン制御因子（例えば、ＰＫＲ）を過剰生産する細胞培養物において、１つ以上のサイトカインの合成が高レベルに誘導され、そして有意な量の個々のサイトカインが回収され得る。本発明は、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ、ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７）を過剰発現する哺乳動物細胞によるサイトカイン生成を増強するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞組成物であって、以下のプロセス：
（ａ）ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る親細胞株を提供する工程；
（ｂ）該親細胞株を、複数のサブクローンを効果的に生成する様式で限界希釈クローニングに供する工程；
（ｃ）ＰＫＲ発現について該複数のサブクローンをアッセイする工程；ならびに
（ｄ）該親細胞株のＰＫＲ発現レベルよりも少なくとも２倍（２×）大きい、ＰＫＲ発現レベルによって同定されたＰＫＲ過剰発現サブクローンを選択し、そしてＰＫＲ過剰発現細胞株を生成するために該サブクローンを増殖する工程、
によって調製されるＰＫＲ過剰発現細胞を含む、ヒト細胞組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞組成物であって、前記調製プロセスが、さらに以下の工程：
（ｅ）前記ＰＫＲ過剰発現細胞をプライミングする工程；および
（ｆ）１つ以上のサイトカインの増大した発現によって特徴づけられる、ＰＫＲ過剰発現細胞株を生成するために効果的な様式で、該プライム化ＰＫＲ過剰発現細胞を増殖する工程、
を包含する、細胞組成物。
【請求項３】
前記調製プロセスが、前記増殖工程（ｆ）の前に前記プライム化ＰＫＲ過剰発現細胞を処置する工程をさらに包含する、請求項２に記載の細胞組成物。
【請求項４】
前記親細胞株が、少なくとも３回限界希釈クローニンングに供される、請求項１に記載の細胞組成物。
【請求項５】
前記プライミング工程が、前記細胞を酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）または酪酸ナトリウムと共に培養する工程を包含する、請求項２に記載の細胞組成物。
【請求項６】
前記処置工程が、ｄｓＲＮＡを用いた非ウイルス性誘導を含む、請求項３に記載の細胞組成物。
【請求項７】
前記処置工程が、センダイウイルスを用いたウイルス性誘導を含む、請求項３に記載の細胞組成物。
【請求項８】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項３に記載の細胞組成物。
【請求項９】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロンまたはβ−インターフェロンを含む、請求項３に記載の細胞組成物。
【請求項１０】
サイトカイン生成における使用のためのヒト細胞組成物であって、以下：
増強されたＰＫＲ生成およびサイトカイン生成を生じるために効果的な様式で、処置および誘導されたＰＫＲ過剰発現細胞であって、該細胞が、対応する親細胞株によって生成されるより少なくとも２倍以上の、１つ以上のサイトカインの発現または生成レベルによって特徴づけられる、ＰＫＲ過剰発現細胞、
を含む、ヒト細胞組成物。
【請求項１１】
ＰＫＲを過剰発現する細胞株を生成する方法であって、該方法が以下：
（ａ）ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る親細胞株を提供する工程；
（ｂ）該親細胞を、複数のサブクローンを生成するために効果的な様式で、限界希釈クローニングに供する工程；
（ｃ）ＰＫＲ発現について該複数のサブクローンをアッセイする工程；および
（ｄ）該親細胞株のＰＫＲ発現レベルよりも少なくとも２倍（２×）以上のＰＫＲ発現レベルによって同定されるＰＫＲ過剰発現サブクローンを選択する工程；および
（ｅ）ＰＫＲ過剰発現細胞株を生成するために該サブクローンを増殖する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記増殖工程の前に、前記ＰＫＲ過剰発現細胞株をプライミングする工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖工程の前に、前記プライム化ＰＫＲ過剰発現細胞株を誘導する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プライミング工程が、前記ＰＫＲ過剰発現細胞を、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）または酪酸ナトリウムと共に培養する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記誘導する工程が、ｄｓＲＮＡを用いた非ウイルス性誘導およびセンダイウイルスを用いたウイルス性誘導を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖工程が、１つ以上のサイトカインの増大した発現により特徴付けられるＰＫＲ過剰発現細胞株を生成するために効果的な様式である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロンまたはβ−インターフェロンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
高められたサイトカイン生成のためのヒト細胞組成物であって、以下を包含するプロセス：
（ａ）ＰＫＲならびに生物学活性形態のヒトＰＫＲのための第１のコード配列および選択マーカーのための第２のコード配列を含む異種核酸構築物を発現し得る親細胞を提供する工程；
（ｂ）ＰＫＲおよび該選択マーカーの発現を生じるために効果的な様式で、該親細胞株に前記異種核酸配列構築物を導入する工程；
（ｃ）該形質転換親細胞を、ＰＫＲの発現を高めるために効果的な条件下で培養する工程；
（ｄ）形質転換ＰＫＲ過剰発現細胞を選択する工程であって、該ＰＫＲ過剰発現細胞が、非形質転換親細胞株のＰＫＲ発現レベルの少なくとも２倍（２×）以上である、ＰＫＲ発現レベルによって同定される、工程；
（ｅ）該選択されたＰＫＲ過剰発現細胞を増殖する工程；ならびに
（ｆ）該選択を繰り返し、そして１つ以上のサイトカインの高められた発現によって特徴づけられるＰＫＲ過剰発現子孫細胞株を生成するために増殖する工程、
によって、調製されるＰＫＲ過剰発現細胞を含む、ヒト細胞組成物。
【請求項２０】
前記調製プロセスが、前記ＰＫＲ過剰発現細胞をプライミングする工程、および前記増殖工程の前に該プライム化ＰＫＲ過剰発現細胞を処置する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の細胞組成物。
【請求項２１】
前記プライミング工程が、前記細胞を、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）または酪酸ナトリウムとともに培養する工程を包含する、請求項２０に記載の細胞組成物。
【請求項２２】
前記処置工程が、ｄｓＲＮＡを用いた非ウイルス性誘導またはセンダイウイルスを用いたウイルス性誘導を含む、請求項２０に記載の細胞組成物。
【請求項２３】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項１９に記載の細胞組成物。
【請求項２４】
前記１つ以上のサイトカインが、α−インターフェロンまたはβ−インターフェロンを含む、請求項１９に記載の細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞によるＰＫＲ過剰生産の条件下で、細胞培養物中のサイトカインの生成を増強するための方法および組成物に関する。
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【数１】
2005500816.tif 000002
2005500816.tif 000003
（発明の背景）
ｄｓＲＮＡ−活性化インヒビターは、ヒト細胞およびマウス細胞中の、それぞれ分子量６８ｋＤａおよび６５ｋＤａのセリン／スレオニンキナーゼである。ｄｓＲＮＡへの結合または１本鎖ＲＮＡへの結合は、ＰＫＲの活性化および自己リン酸化を導く（ＧａｌａｂｒｕおよびＨｏｖａｎｅｓｓｉａｎ、１９８７；Ｍｅｕｒｓら、１９９０）。これは、ＰＫＲが、その天然基質である真核生物のタンパク質合成開始因子２（ｅＩＦ−２）のαサブユニットをリン酸化することを可能にし、タンパク質合成の阻害を導く。
【０００４】
ヒトＰＫＲ遺伝子のヌクレオチド配列が決定され、そして、この遺伝子が１７個のエキソン（これらは５５１アミノ酸のＰＫＲタンパク質をコードする）を含むことを示す（Ｋｕｈｅｎら、１９９６）。
【０００５】
類似の酵素が、ウサギ網状赤血球、異なるマウス組織およびヒト末梢血単核細胞において示された（Ｆａｒｒｅｌら、１９７７；Ｌｅｖｉｎら、１９７８；Ｈｏｖａｎｅｓｓｉａｎ、１９８０；Ｋｒｕｓｔら、１９８２；Ｂｕｆｆｅｔ−Ｊａｎｖｒｅｓｓｅら、１９８６）。
【０００６】
ＰＫＲは、他の基質に加えて、タンパク質合成開始因子ｅＩＦ２およびＩ−κＢ（ＮＦ−κＢのインヒビター；Ｋｕｍａｒ  Ａら、１９９４）をリン酸化するその能力を介して、翻訳、転写およびシグナル伝達経路の調節において種々の重要な役割を果たすことが示された。
【０００７】
ＰＫＲに対して最も良く特徴付けられたインビボ基質は、真核生物の開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ−２α）であり、これは、一旦リン酸化されると、最終的に細胞タンパク質合成およびウイルスタンパク質合成の阻害を導く（Ｈｅｒｓｈｅｙ、１９９１）。ＰＫＲは、２本鎖ＲＮＡによって活性化された場合に開始因子ｅＩＦ−２αをインビトロでリン酸化することが実証された（Ｃｈｏｎｇら、１９９２）。
【０００８】
ＰＫＲに起因する活性としては、（１）ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイスル活性および抗増殖活性を媒介すること、（２）非感染細胞の生理的ストレスに対する応答、および（３）細胞増殖調節における役割が挙げられる（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．およびＥｌｉａ，Ａ．、１９９７；Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ，Ｍ．ら、１９９９）。
【０００９】
ＰＫＲは腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスの誘導因子として機能し得るということもまた示唆されており（例えば、Ｃｌｅｍｅｎｓ  Ｍ．Ｊ．およびＢｏｍｍｅｒ  Ｕ．Ａ．、１９９９；Ｙｅｕｎｇら、１９９６；Ｋｏｒｏｍｉｌａｓら、１９９２を参照のこと）、最近の結果は、ＰＫＲの活性形態の発現が、おそらくＦａｓレセプターのアップレギュレーションを介してアポトーシスを引き起こすということを示す（Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．ら、１９９９）。
【００１０】
インターフェロンを生成し得る細胞株がＰＫＲをコードする発現ベクターを用いてトランスフェクションされる場合、ＰＫＲの過剰発現はインターフェロンのさらなる生成を誘導するということがさらに示された（ＷＯ  ９７／０８３２４）。インターフェロンタンパク質は、サイトカインのプロトタイプファミリーであり、そして、病原体および癌組織に対する免疫防御において重要な役割を果たすことが示された。
【００１１】
サイトカインは、ある範囲の生物学的活性を示し、そして、広範な標的細胞に作用する調節分子である（例えば、Ｂａｌｋｗｉｌｌ，Ｆ．Ｒ．およびＢｕｒｋｅ，Ｆ．、１９８９；Ｗｏｎｇ，Ｇ．およびＣｌａｒｋ，Ｓ．、１９８８；ならびにＣｌａｒｋ，ＳおよびＫａｍｅｎ，Ｒ．、１９８７を参照のこと）。
【００１２】
一般に、サイトカインは、現在のところ、昆虫宿主細胞、細菌宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞における組換えタンパク質の発現によって生成される。
【００１３】
一般に、サイトカインおよび他のタンパク質は、細胞培養物から天然タンパク質を精製することか、または昆虫細胞、微生物細胞もしくはヒト細胞中でタンパク質を組換え的に生成することのいずれかによって、様々な治療的適用のために生成される。ヒト細胞によって生成される天然のサイトカインおよび他のタンパク質は、これらが、所定のサイトカインまたはタンパク質のネイティブ形態の完全なレパートリーを含むことが知られており、そして、ヒト細胞中で生成されたタンパク質に特有であり得る適切なタンパク質構造（グリコシル化および翻訳後修飾を含む）を有するという点で、好まれ得る。しかし、これらは、ヒト細胞を生成するには高価であり、そして時間の無駄である。
【００１４】
組換え的に生成されたサイトカインおよび他のタンパク質は、作製するのはあまり高価ではないが、供給源に依存して、このサイトカインが投与されるヒト被験体による免疫応答が生じるような外来の抗原を含み得るか、または、ネイティブ形態からの構造的バリエーション（すなわちグリコシル化パターン）に起因して活性が弱くあり得る。
【００１５】
本発明の方法は、微生物系（サイトカインタンパク質のグリコシル化およびネイティブの折り畳みを可能にしない）、またはヒト細胞（一般に、非常に低レベルの組換えタンパク質を生成する）におけるサイトカインの発現を利用する。従って、本質的に１つ以上のサイトカインを生成する細胞中で、１つ以上のサイトカインの生成を増強するための方法が有利である。
【００１６】
本発明は、サイトカイン生成が、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ、ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７）を過剰発現する培養された哺乳動物細胞において、増強されるという知見に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、サイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ、ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７）を過剰発現する哺乳動物細胞によるサイトカイン生成を増強するための方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、１つ以上のサイトカインの生成の増強を示すサイトカイン調節因子過剰発現細胞株組成物を提供する。
【００１９】
１つの好ましいアプローチにおいて、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る親細胞株が提供され、そして、複数のサブクローンを生成するために、限界希釈クローニングに供される。親細胞株よりも少なくとも２倍（２×）より大きいＰＫＲ発現レベルを示すサブクローンが選択され、そして、ＰＫＲ過剰発現細胞を生成するために増殖される。
【００２０】
別の好ましいアプローチにおいて、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る親細胞株は、ヒトＰＫＲの生物学的活性形態についてのコーディング配列および選択マーカーについてのコーディング配列を含む異種核酸構築物と共に、提供される。この方法の実施において、異種核酸構築物は、ＰＫＲおよび選択マーカーの発現を生じる親細胞株へ導入される。次いで、この細胞株は、選択因子を含む培養培地中で培養され、そして、形質転換されていない親細胞株のＰＫＲ発現レベルよりも、少なくとも２倍（２×）より大きいＰＫＲ発現レベルを示す細胞をが選択される。
【００２１】
いずれかのアプローチにおいて、この方法はさらに、ＰＫＲ過剰発現細胞をプライムする工程、またはＰＫＲ過剰発現細胞をプライムおよび処理する工程、ならびに、１つ以上のサイトカインの増強された発現によって特徴付けられるＰＫＲ過剰発現細胞株を生成するために効果的な様式で細胞を増殖する工程を包含する。
【００２２】
「プライムする工程」は、細胞をプライミング因子（例えば、酢酸ホルボールミリステート（ＰＭＡ）または落酸ナトリウム）へ曝すことによって達成され得る。「処理する工程」の例としては、ｄｓＲＮＡを用いた非ウイルス誘導およびセンダイウイルスまたは単純ヘルペスを用いたウイルス誘導が挙げられる。
【００２３】
多くのサイトカインのいずれかは、本発明の方法を使用して、このようなＰＫＲ過剰発現細胞によって生成され得、そしてこのような細胞から収集され得る。そして、これらのサイトカインとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：α−インターフェロン、β−インターフェロン、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ならびにＧＭ−ＣＳＦ。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面および実施例と併せて読まれる場合、より完全に明確となる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学用語は、本発明の当業者に対する意味と同一の意味を有する。当業者は、技術の定義および用語のために、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３に特方向付けられる。本発明が、記載された特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことは理解されるべきである。なぜなら、これらは変化し得るからである。
【００２６】
本明細書で引用された全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物および方法論を記載し、そして開示する目的で、参考として本明細書中に明白に援用される。
【００２７】
「異種」核酸構築物または「異種」核酸配列は、これが発現される細胞に対してネイティブでない配列の一部を有する。制御配列に関して、異種とは、この制御配列が現在調節しているものと同一の遺伝子の発現を調節するように天然には機能しない制御配列（すなわちプロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般に、異種核酸配列は、細胞に対して内因性でないか、またはこの異種核酸配列が存在するゲノムの一部でない、そして、感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞へ加えられる。「異種」核酸構築物は、ネイティブ細胞中で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せと同じか、または異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組合せを含み得る。
【００２８】
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、異なる宿主細胞間を移動するように設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」は、外来細胞において異種ＤＮＡフラグメントを組み込み、そして発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核生物および真核生物の発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは２つの複製系を有し得、従って、２つの生物体中（例えば、発現に関してはヒト細胞中およびクローニングおよび増幅に関しては原核生物中）で保持されることを可能にする。クローニングベクターおよび発現ベクターは、典型的に、選択マーカーを含む。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「選択マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、哺乳動物細胞において発現し得るヌクレオチド配列、および選択マーカーの発現が、発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択因子の存在下で増殖する能力を与えるようなヌクレオチド配列をいう。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、下流の遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、一般に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に適している。他の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）とともにプロモーターは、所定の遺伝子を発現するために必要である。一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列。プロモーターは、構成的でも誘導性でもよく、そして、天然に存在するプロモーターでも、操作されたプロモーターでもハイブリッドプロモーターでもよい。
【００３１】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物体における、作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【００３２】
本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関して、用語「作動可能に連結された」は、選択されたコード配列の作動的制御のために互いに直接連結された組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド成分を意味する。一般に、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しかつリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは連続されなくてもよい。連結は、便利な制限部位にてライゲーションすることによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣習的技術に従って使用される。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡセグメントを意味し、これは、コード領域に先行する領域および後ろの領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」は、配列アライメントプログラムを使用して整列された、２つ以上の整列配列における核酸配列同一性またはアミノ酸配列同一性を意味する。
【００３５】
用語「％相同性」は、本明細書の用語「％同一性」と交換可能に、本明細書中で使用され、そして、配列アライメントプログラムを使用して整列された場合の、２つ以上の整列配列間の核酸配列またはアミノ酸配列の同一性のレベルをいう。例えば、本明細書で使用する場合、８０％相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同義であり、従って、所定の配列のホモログは、所定の配列の長さにわたって、８０％よりも大きい配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、本明細書に記載されるように、ＰＫＲ配列に対して８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
２つの配列間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータープログラムとしては、ＢＬＡＳＴプログラム一式（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸならびにＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）（「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／」にて、インターネット上で公に利用可能）が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７もまた参照のこと。
【００３７】
配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公開データベース中の核酸配列と比較して所定の核酸配列を評価する場合、典型的に、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公開データベース中のアミノ酸配列に対して、全てのリーディングフレームで翻訳された核酸配列を検索するために好ましい。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティーおよび１．０の伸長ギャップペナルティーのデフォルトパラメーターを使用して実施され、そして、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを利用する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７を参照のこと）。
【００３８】
２つ以上の配列間の「％同一性」を決定するために、選択された配列の好ましいアラインメントが、例えばＭａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラム（デフォルトパラメーター（１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティーおよびＢＬＯＳＵＭ  ３０類似性マトリクスを含む）を用いて操作される）を使用して、実施される。
【００３９】
核酸配列は、２つの配列が中程度〜高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に対して「選択的にハイブリダイズ可能」であると見なされる。ハイブリダイゼーション条件は、複合体またはプローブに結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大のストリンジェンシー」は、代表的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）の温度で；「高いストリンジェンシー」は、Ｔｍより約５℃〜１０℃低い温度で；「中間のストリンジェンシー」はプローブのＴｍより１０℃〜２０℃低い温度で；そして「低いストリンジェンシー」はＴｍより２０℃〜２５℃低い温度で起きる。機能的に、最大のストリンジェンシーの条件は、ハイブリダイゼーションプローブと完全な同一性または完全に近い同一性を有する配列を同定するために使用され得る；一方、高いストリンジェンシーの条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を同定するために使用される。
【００４０】
中程度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当該分野に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９章および１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３（本明細書中に参考として明白に援用される）を参照のこと）。高いストリンジェンシーの条件の例として、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中において、約４２℃でのハイブリダイゼーション、続く２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ中における室温での２回の洗浄、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ中における４２℃でのさらに２回の洗浄が、挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「組換え体」は、異種核酸配列の導入によって改変された細胞もしくはベクターへの言及、またはこのように改変された細胞由来の細胞を含む。従って、例えば、組換え細胞は、この細胞のネイティブ（非組換え）形態内では、同一の形態で見出されない遺伝子を発現するか、または、意図的な人間の介入の結果として、別に異常に発現されるか、過少発現されるか、または全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、哺乳動物細胞に関して用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」または「トランスジェニック」は、哺乳動物細胞が、２世代以上を通じて維持される、そのゲノムへ組み込まれた非ネイティブの（異種の）核酸配列を有する、ということを意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「発現」はポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００４４】
用語「ＰＫＲ発現」は、ＰＫＲ遺伝子の転写および翻訳のことをいい、その生成物として、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセスを受けたポリペプチド、およびその誘導体が挙げられる（マウスまたはサルの酵素のような他の種由来のＰＫＲ発現を含む）ことが理解される。例として、ＰＫＲのアッセイとしては、自己リン酸化アッセイ、ｅＩＦ２αリン酸化についてのアッセイ、ＰＫＲタンパク質のウェスタンブロット、ならびにＰＫＲ  ｍＲＮＡに関するノーザンブロット分析およびリバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが挙げられる。
【００４５】
「選択的スプライシング」は、単一の遺伝子から複数のポリペプチドアイソフォームを生成するプロセスであり、その遺伝子のいくつか（全てではない）の転写産物のプロセシングの間に非連続的なエキソンをひとつに繋ぎ合わせる工程を包含する。従って、特定のエキソンは、いくつかの選択的エキソンのいずれか１つに接続され得、メッセンジャーＲＮＡを形成する。選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡは、いくつかの部分が共通し、その他の部分が異なるポリペプチド（「スプライス改変体」）を生成する。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「ＰＫＲの生物学的活性」および「生物学的に活性なＰＫＲ」は、ＰＫＲ、またはＰＫＲの任意のフラグメント、誘導体、もしくはアナログに関連する任意の生物学的活性（例えば、酵素活性（特に、自己リン酸化活性）および真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２）リン酸化活性）をいう。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「正常レベルのＰＫＲ活性」および「正常レベルのＰＫＲ発現」は、特定の型（例えば、特定の細胞株）の、選択されていない細胞、刺激を受けていない細胞、または感染していない細胞において存在することが決定された、ＰＫＲ活性またはＰＫＲ発現のレベルをいう。このような「正常な」ＰＫＲ活性またはＰＫＲ発現は、選択されておらず、導入された（異種起源または同種起源の）ＰＫＲコード配列を含まず、刺激を受けておらず（誘導もプライムもされていない）、そして感染していない所定の型の細胞（または細胞株）について一般的に観察されるＰＫＲ活性またはＰＫＲ発現の範囲として報告されることが理解される。
【００４８】
「正常な」ＰＫＲ活性またはＰＫＲ発現の範囲は、培養条件に依存してある程度変化し得る。例えば、Ｕ９３７細胞株は、Ｖｅｒｏ細胞株またはＮａｍａｌｗａ細胞株と異なるＰＫＲ活性の正常な範囲を有し得る。ＰＫＲの過剰発現は、選択されておらず、導入された（異種起源または同種起源の）ＰＫＲコード配列を含まず、刺激を受けておらず（誘導もプライムもされていない）、そして感染していない所定の型の細胞について一般的に観察されるＰＫＲ発現の正常な範囲を超える発現レベルを意味することが理解される。
【００４９】
用語「ＰＫＲ過剰発現」および「増強されたＰＫＲ発現」は、本明細書中で使用する場合、ＰＫＲを過剰発現するのに効果的な様式で選択または処理されていない特定の型の細胞において代表的に存在するＰＫＲ発現またはＰＫＲ産生よりも大きいレベルのＰＫＲの活性、発現、または産生をいい、以下でさらに詳述する。従って、ＰＫＲの「過剰発現」は、選択されておらず、導入された（異種起源または同種起源の）ＰＫＲコード配列を含まず、刺激を受けておらず（誘導もプライムもされていない）、そして感染していない所定の型の細胞について一般的に観察されるよりも大きなＰＫＲの活性、発現、または産生の範囲を意味する。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性な」は、培養された細胞株の特定のタンパク質に起因する活性をいう。このようなタンパク質の「生物学的活性」は、培養条件に依存してある程度変化し得、活性の範囲として一般的に報告されることが理解される。従って、タンパク質の「生物学的に不活性な」形態は、そのタンパク質の天然で見出される活性を妨害する様式で改変されたタンパク質の形態をいう。
【００５１】
１つの好ましい局面において、ＰＫＲの過剰発現は、使用する特定の培養条件下での同一の細胞株について、正常レベルのＰＫＲの活性、発現、産生よりも少なくとも１５０％（１．５倍または１．５×）、好ましくは、少なくとも２００％、３００％、または４００％、あるいは５００％またはそれ以上大きいＰＫＲの活性、発現、産生のレベルを意味する。言い換えると、ＰＫＲを過剰発現する細胞株は、代表的に、ＰＫＲを過剰発現するのに効果的な様式で選択または処理されていない同一型の細胞株により代表的に示されるＰＫＲの発現、または産生のレベルよりも、少なくとも１．５倍、好ましくは、２倍（２×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）、またはそれ以上大きいＰＫＲの産生または発現のレベルを示す。いくつかの場合、ＰＫＲを過剰発現する細胞株は、使用する特定の条件下で、ＰＫＲを過剰発現するのに効果的な様式で選択または処理されていない同一型の細胞によって代表的に示されるＰＫＲの発現または産生のレベルよりも１０倍（１０×）またはそれ以上大きいＰＫＲの発現または産生のレベルを示す。一般的に、用語「ＰＫＲを過剰発現するのに効果的な様式で処理される」は、細胞中への（異種起源または同種起源の）ＰＫＲコード配列の導入、刺激（プライミングまたはプライミングおよび誘導）、および／または感染を意味する。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「正常レベルのサイトカイン」および「正常レベルのタンパク質」は、活性、発現、または産生に関して、ＰＫＲを過剰発現するのに効果的な様式で処理されていない特定の型の細胞において存在することが決定された、サイトカインまたは他のタンパク質の活性、発現、または産生のレベルをいう。例として、ＰＫＲ活性、発現、または産生を増強するような様式で選択または処理されていない野生型細胞株、および導入されたＰＫＲコード発現を含まない細胞株が挙げられる。このような「正常な」サイトカインまたは他のタンパク質の活性、発現、または産生は、所定の細胞について代表的に観察される活性、発現、または産生として報告され、培養条件に依存してある程度変化し得ることが理解される。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、用語「精製された」および「単離された」は、一般的に、発見または生成される環境の他の成分から分離された分子（ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）をいう。例えば、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、代表的に、それらの発見または生成された環境の成分の７５％以上から分離されている。単離または精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、好ましくは、それらの発見された環境の成分の少なくとも８０％〜８５％、より好ましくは、少なくとも９０％またはそれ以上から分離されている。例えば、「精製」または「単離」されたサイトカインは、そのサイトカインの生成された細胞培養培地の成分の少なくとも７５％またはそれ以上、好ましくは少なくとも８０％〜８５％またはそれ以上、より好ましくは、少なくとも９０％またはそれ以上から分離されているサイトカインを意味する。
【００５４】
用語「アポトーシス細胞死」「プログラム細胞死」、および「アポトーシス」は、本明細書中で使用する場合、細胞分化の特定の段階でおよび特定の刺激に応答して生じる細胞現象の複雑なカスケードにより引き起こされるかまたはそのカスケードに関連する任意の細胞死をいう。アポトーシス細胞死は、死滅する細胞の核における、細胞質の凝縮およびクロマチン凝縮により特徴付けられる。このプロセスは、ＤＮＡの複数の２００塩基対への断片化およびＲＮＡの分解、ならびに壊死性の細胞死におけるような急な細胞溶解を伴わない組織化された様式でのタンパク質分解を伴う。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、用語「アポトーシス細胞死を阻害する」は、細胞株がサイトカインまたは他のタンパク質の発現または産生の目的で培養される期間にわたり、細胞死プロセスを部分的または完全に阻害することを意味する。このような阻害は、一般的に、アポトーシス細胞死の量が、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式に改変されていない細胞株において観察されるアポトーシス細胞死の量と比べて、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、８０％までまたはそれ以上減少することを意味する。
【００５６】
ＰＫＲ産生および／またはサイトカイン産生の場合、このような阻害は、一般的に、アポトーシス細胞死の量が、アポトーシスを阻害するのに効果的な様式に改変されていないＰＫＲ過剰発現細胞株において観察されるアポトーシス細胞死の量と比べて、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、８０％までまたはそれ以上減少することを意味する。
【００５７】
（ＩＩ．ＰＫＲ）
ＰＫＲは、キナーゼ活性を有することが知られている唯一の同定されたｄｓＲＮＡ結合タンパク質である。ＰＫＲは、セリン／スレオニンキナーゼであり、その酵素活性はｄｓＲＮＡへの結合およびその結果としての自己リン酸化を必要とする（Ｍｅｕｒｓら、１９９０；Ｆｅｎｇ，Ｃ．Ｓ．ら、１９９２）。
【００５８】
種々の機能がＰＫＲに起因し、これらの機能として、真核生物開始因子２（ｅＩＦ−２α）が挙げられ、ｅＩＦ−２αは、一旦リン酸化されると、タンパク質合成の阻害を引き起こす（Ｈｅｒｓｈｅｙら、１９９１）。ＰＫＲのこの特定の機能は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの抗ウイルス活性および抗増殖活性の媒介を担う機構の１つとして示唆されている。ＰＫＲのさらなる生物学的機能は、例えば、ＩｋＢのリン酸化によるシグナル伝達作用としてのその予想される役割であり、これによって、核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）を放出および活性化する（Ｋｕｍａｒ  Ａ．ら、１９９４）。
【００５９】
ＰＫＲは、ＩＦＮ発現の転写活性を媒介することがこれまでに実証されている（Ｄｅｒ，Ｄ．およびＬａｕ，Ａ．Ｓ．、１９９５）。この観察と併せて、ＰＫＲに対するアンチセンスでＵ９３７をトランスフェクトすることによる内因性ＰＫＲ活性の抑制またはＰＫＲ欠損変異体の発現により、ウイルス感染に対するＩＦＮの誘導が減少した（Ｄｅｒ，Ｄ．およびＬａｕ，Ａ．Ｓ．、１９９５）。
【００６０】
まとめると、ＰＫＲは、ｅＩＦ−２αのリン酸化による、（１）複雑なレセプター系（ＩＦＮ、ＴＮＦ、およびＦａｓを含む）に対するシグナル伝達、（２）サイトカイン遺伝子の転写活性化、（３）アポトーシスの阻害、および（４）タンパク質合成の阻害に関連する。
【００６１】
ＰＫＲは、サイトカインの発現を調節し得るタンパク質の例として、本明細書中で使用されるが、他のサイトカイン調節因子（例えば、ＰＭＡ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）インデューサー、インターフェロンγ、インターフェロンα、インターフェロンβ、ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦ）が、ＰＫＲの代わりに使用され得ることが理解される。
【００６２】
哺乳動物細胞においてサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）の発現／活性を増大することにより、サイトカイン産生が増大し得る。従って、より高い構成性のレベルのサイトカイン調節因子を発現する哺乳動物細胞培養物、またはサイトカイン調節因子の発現がより高いレベルに誘導された哺乳動物細胞培養物は、サイトカインの産生のために有用である。
【００６３】
本発明の方法は、ＰＫＲにより本明細書中で例示されるようなサイトカイン調節因子（サイトカインの発現を調節し得るタンパク質）を過剰発現する使用細胞に基づき、特定のサイトカイン調節因子の過剰発現の方法を必要としない。本発明の方法を実施する上で使用するためのさらなるサイトカイン調節因子として、ＩＲＦ−７、ＩＲＦ−３、およびＮＦ−ｋＢのような転写因子が挙げられるがこれらに限定されない。これらの因子の過剰発現は、サイトカインの発現または産生を増大するのに使用され得る。
【００６４】
ＰＫＲを過剰発現または過剰産生する細胞株を獲得する方法の例として、ＰＫＲを過剰発現する細胞の選択し、その細胞を増殖してＰＫＲ過剰発現細胞を生成する方法および／または（異種起源または同種起源の）内因性ＰＫＲコード配列を発現するのに効果的な様式で細胞中にそのコード配列を導入することによりＰＫＲを産生し得るよう細胞を改変する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
ＰＫＲを過剰発現する細胞の選択は、ＰＫＲ  ｍＲＮＡまたはＰＫＲタンパク質を過剰発現する細胞、または内因性遺伝子の発現に起因してより高いＰＫＲキナーゼ活性を示す細胞の選択またはサブクローニングすることにより達成され得る。このようなサブクローンは、対応する親細胞株よりもより高い機能的ＰＫＲキナーゼ活性、より高いＰＫＲ  ｍＲＮＡレベル、またはより高いＰＫＲタンパク質レベルを有する細胞を選択することにより選択され得る。
【００６６】
この機構は本発明の一部ではないけれども、これらの細胞において増強されたＰＫＲは、（１）増大した転写を導く増強されたプロモーター活性；（２）増強されたキナーゼ活性を有するＰＫＲの改変形態を生じるＰＫＲ遺伝子変異；（３）増強されたキナーゼ活性を生じる多数の遺伝子コピー；または（４）細胞ストレスシグナル（例えば、ポリＩ：Ｃ、エンドトキシン、ＰＭＡ、または熱ショック）を含む刺激に対するプロモーターの増強された応答性の結果であり得る。
【００６７】
ＰＫＲ過剰発現細胞はまた、サイトカインを合成するそれらの機能的能力を試験することによって同定および選択され得る。
【００６８】
一旦ＰＫＲを過剰発現または過剰産生する細胞株が獲得されると、その細胞株はさらに、ＰＫＲおよび／またはサイトカイン産生を増加させるのに効果的な様式でプライムまたはプライムおよび処理され得る。
【００６９】
１つの好ましいアプローチにおいて、この方法は、（ａ）ＰＫＲを過剰発現し得る哺乳動物細胞またはそれらのアナログもしくはホモログを、ＰＫＲを過剰発現するのに十分な条件下で培養する工程；（ｂ）プライミング工程；および（ｃ）サイトカイン遺伝子の発現を誘導するのに適切に細胞培養物を処理する工程、を包含する。
【００７０】
同様に、サイトカイン調節因子（例えば、ＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）または他の転写因子）を過剰発現または過剰産生する細胞株を獲得する方法の例として、この因子（例えば、ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７）を過剰発現する細胞を選択し、その細胞を増殖してＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７の過剰発現細胞株を生成する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
代替のアプローチにおいて、この因子を産生し得る細胞は、（異種起源または同種起源の）この因子（例えば、ＩＲＦ−３またはＩＲＦ−７）の核酸コード配列を含む異種核酸構築物を、このコード配列を発現するのに効果的な様式で細胞中に導入することにより改変され得る。
【００７２】
サイトカイン調節因子（例えば、ＩＲＦまたは他の転写因子）を過剰発現する細胞はまた、サイトカインを合成するそれらの機能的能力を評価することにより同定および選択され得る。
【００７３】
（ＩＩＩ．増強されたサイトカイン調節因子の発現は、増強されたサイトカイン産生に関連する）
本発明は、概して、サイトカイン調節因子の過剰発現と増強されたサイトカイン産生との間の関係に関する。
【００７４】
哺乳動物細胞においてサイトカイン調節因子（例えば、ＰＫＲ）の発現／活性を増大させることにより、サイトカイン産生が増大され得る。従って、より高い構成的レベルのサイトカイン調節因子を発現するか、またはサイトカイン調節因子の発現がより高いレベルに誘導され得る哺乳動物細胞培養物は、サイトカインの産生に有用である。
【００７５】
この方法は、サイトカイン調節因子またはサイトカインの発現を調節し得るタンパク質を過剰発現する細胞の使用に基づき（本明細書中にＰＫＲにより例示される）、サイトカイン調節因子を過剰発現させる特定の方法を必要としない。
【００７６】
一旦ＰＫＲを過剰発現または過剰産生する細胞株が獲得されると、その細胞株はさらに、ＰＫＲおよび／またはサイトカイン産生を増大するのに効果的な様式でプライムおよび処理され得る。
【００７７】
１つの好ましいアプローチにおいて、この方法は、（ａ）サイトカイン調節因子を過剰発現し得る哺乳動物細胞を培養する工程；（ｂ）サイトカイン調節因子のコード配列を含む異種核酸構築物またはそれらのアナログもしくはホモログを、サイトカイン調節因子を過剰発現するのに十分な条件下で導入する工程；（ｃ）プライミング工程；および（ｄ）サイトカイン遺伝子の発現を誘導するのに適切に細胞培養物を処理する工程、を包含する。
【００７８】
１つの好ましい実施形態において、サイトカイン調節因子はＰＫＲであり、細胞はＰＫＲの過剰発現に対して誘導性である。好ましい局面において、ＰＫＲを過剰発現し得る細胞は、より高いレベルのＰＫＲ発現または産生を生じるような様式で処理および／または誘導される。
【００７９】
本発明の１つの好ましい局面において、培養条件、プライミング工程、プライミングおよび処理工程、または誘導工程の組み合わせにより、所定の細胞株によるサイトカイン産生が有意に増強される（例えば、本明細書に記載されるような細胞の処理工程、プライミング工程、誘導工程のうちの１つ以上を含まない同一培養条件下で同一細胞株により示されるレベルに対して、少なくとも２００％（２倍または２×）、２５０％（２．５倍または２．５×）、４００％（３倍または３×）、４００％（４倍または４×）、５００％（５倍または５×）、および好ましくは、１０００％（１０倍または２×）、またはそれ以上のサイトカイン産生もしくは発現を示す増加）。いくつかの場合、本発明の方法は、１００倍（１００×）〜１０００倍（１０００×）またはそれ以上のサイトカイン産生の増大を生じる。
【００８０】
従って、本発明の１つの局面は、ＰＫＲを過剰発現または過剰産生する細胞（すなわち、細胞株）の単離された集団に関する。用語「集団」は、本明細書中で使用する場合、単一の親細胞から誘導された２つ以上の細胞の群をいう。
【００８１】
任意の多くの公知の細胞型が、ＰＫＲ過剰発現細胞株を作製するのに有用であり、特定の例を以下に提供する。
【００８２】
代表的に、細胞培養物におけるサイトカイン産生に付随する問題（例えば、非組み換え哺乳動物系からの低い収率、不適切なグリコシル化、または微生物系において生成されるタンパク質のミスホールディング）は、本発明の方法において排除され、本発明の方法は、治療タンパク質の開発に有用であることを証明するはずである。
【００８３】
（ＩＶ．内因性ＰＫＲの活性、発現、および／または産生の増加）
１つの局面において、本発明は、内因性ＰＫＲコード配列を過剰発現または過剰産生するネイティブな細胞株、および同一物を生成する方法を提供する。
【００８４】
本発明に従って、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る細胞株が、限界希釈クローニング（本明細書中で、「サブクローニング」と称される）に供され得、増強されたＰＫＲキナーゼ活性および／またはｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現についてスクリーニングされ得、増強されたサイトカイン活性および／または発現についてさらにサブクローニングおよび選択され得る（以下でさらに詳述される）ことが発見された。このような増強されたサイトカイン調節因子の過剰発現のマーカーとして使用され得るサイトカインの例として、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＦＮが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
本発明を実施する上で、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカインを発現し得る細胞株（本明細書中で、「親細胞株」と称される）は、同定され、そして当業者により慣用的に使用される標準的な方法を用いる単一細胞の限界希釈クローニングに供される。一般的に、サブクローニング工程は、少なくとも３回、好ましくは、少なくとも５回、そして代表的には、５〜１０回、９６ウェルプレートにて実施される。サブクローンは、代表的に親細胞を培養するのに用いられる培養条件を使用して増殖され、約３００，０００〜５００，０００細胞／ｍｌの集団を獲得するために増殖される。次いで、このサブクローンは、当該分野で公知の方法を使用して、転写（ｍＲＮＡ）および／またはタンパク質レベル（ウェスタンブロット）および／またはキナーゼ活性を評価することにより、ＰＫＲ発現についてアッセイされる（例えば、Ｇｕｎｎｅｒｙ，Ｓ．およびＭａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．、１９９８を参照のこと）。
【００８６】
例として、ＰＫＲ活性についてのアッセイとして、自己リン酸化アッセイ（ＤｅｒおよびＬａｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：８８４１−８８４５、１９９５）、ｅＩＦ２αリン酸化についてのアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈ、Ｄｅｒ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、１８：３１５−３２６、１９９９）、およびキナーゼアッセイ（ＰＫＲの免疫沈降およびキナーゼについてのインビトロアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０：１２７８−１２９０、２０００）により実施される）が挙げられる。
【００８７】
ＰＫＲ発現および／または産生についてのアッセイの例として、ウェスタンブロットのようなタンパク質アッセイ、ならびにＲＴ−ＰＣＲ（リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応）およびノーザンブロット、ドットブロット、またはＰＫＲコード核酸配列に基づく適切な標識プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションのようなＰＫＲ  ｍＲＮＡについてのアッセイが挙げられる。
【００８８】
親細胞株のＰＫＲの発現または産生のレベルよりも少なくとも２倍（２×）、好ましくは、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）またはそれ以上高い、ＰＫＲの発現または産生のレベルを示すサブクローンが選択される。いくつかの場合、このような選択されたサブクローンは、親細胞株のＰＫＲ発現または産生レベルよりも１０倍（１０×）またはそれ以上高いＰＫＲの発現または産生レベルを示す。選択されたサブクローンはまた、より高いレベルのＰＫＲの発現および／または産生を示す。１つの好ましいアプローチにおいて、ＰＫＲの発現または産生のレベルは、ＰＫＲ活性アッセイにより決定される。
【００８９】
次いで、選択されたサブクローンは、増強されたＰＫＲおよびサイトカインの活性、発現、および／または産生を生じるのに効果的な様式で処理される。この処理は、以下にさらに記載されるように、細胞培養物に対する微生物（例えば、ウイルス）または非微生物インデューサーの添加を含み得る。
【００９０】
代表的に、選択されたサブクローンは、増強されたＰＫＲおよびサイトカイン産生を生じるのに効果的な様式で処理される前に、プライミング試薬に暴露することによりプライムされる。プライミング試薬の例もまた、以下にさらに記載される。
【００９１】
（Ｖ．細胞中での異種核酸構築物の発現によるＰＫＲの増加）
本発明はまた、ＰＫＲコード核酸配列を含む発現ベクターで形質導入、形質転換、またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション前に親宿主細胞に対してそれまで使用されていた培養条件であり、これは当業者に明らかである。
【００９２】
１つのアプローチにおいて、哺乳動物細胞株は、ＰＫＲをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、宿主細胞株において機能するプロモーターもしくは生物学的に活性なプロモーターフラグメントまたは１つ以上（例えば、一連の）エンハンサーを有する発現ベクターでトランスフェクトされ、その結果、ＰＫＲがその細胞株において過剰発現される。
【００９３】
（Ａ．ベクター）
ＰＫＲをコードする天然または合成のポリヌクレオチドフラグメント（「ＰＫＲコード核酸配列」）は、哺乳動物細胞中への導入および哺乳動物細胞中での複製が可能な異種核酸構築物またはベクターに組み込まれ得る。本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、ＰＫＲの発現のために宿主細胞中で使用するのに適切である。導入された哺乳動物細胞中で複製可能であり、生存可能である限り、任意のベクターが使用され得る。多くの適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、市販されている。ヒト細胞において使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターもまた、特に本明細書により参考として援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９８９に記載されている。適切なＤＮＡ配列は、種々の手順により、プラスミドまたはベクター（本明細書中で、集合的に「ベクター」と称される）中に挿入され得る。一般的に、ＤＮＡ配列は、標準的な手順により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および関連のサブクローニング手順は、当業者の認識の範囲内であるとみなされる。
【００９４】
このようなベクターは、代表的に、選択マーカー、挿入部位、および適切な制御エレメント（例えば、終結配列）を備えている。ベクターは、コード配列に作動可能に連結された、宿主細胞（および／または改変された可溶性タンパク質抗原コード配列が通常発現されないベクターもしくは宿主細胞環境）におけるコード配列の発現に効果的な調節配列（例えば、非コード配列（例えば、イントロン）および制御エレメント（すなわち、プロモーターおよび終結エレメント）あるいは５’および／または３’非翻訳領域を含む）を含む。多くの適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、市販されており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されている。
【００９５】
プロモーターの例として、構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が挙げられる。これらの例として、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、記載される（ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＢＡＳＦ）ようなｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆ系におけるｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター、βアクチンプロモーター、および特定の金属塩の添加によりアップレギュレートされ得るメタロチエネインプロモーターが挙げられる。
【００９６】
適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、種々の宿主に対して適切なマーカーが当該分野で周知である。代表的なマーカー遺伝子は、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ，Ｊ．、１９８２）、ミコフェノール酸（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、１９８０）、ピューロマイシン、ゼオマイシン、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５））に対する耐性を付与するタンパク質をコードする。
【００９７】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ＰＫＲの過剰発現は、細胞培養物におけるＰＫＲの過剰発現に適切なプロモーター（構成性または誘導性のいずれか）の制御下で、外因的に提供されるＰＫＲコード核酸配列を含む細胞を用いて達成される。
【００９８】
（Ｂ．ＰＫＲコード核酸配列）
ＰＫＲコード核酸配列を含むベクターは、細胞中に導入され得、その細胞によるＰＫＲの過剰発現をもたらす。このようなベクターにおいて使用するためのコード配列の例として、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３５６６３にて見出されるヒトｐ６８ＰＫＲ遺伝子、マウスＰＫＲ遺伝子、および他のｅＩＦ−２αキナーゼ（酵母ＧＣＮ２およびヘミン調節インヒビター（Ｗｅｋ，Ｒ．Ｃ．、１９９４）からのコード配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
さらに、これらのＰＫＲ遺伝子の変異体または改変体が、ＰＫＲの過剰発現において使用するためのベクター構築物に含まれ得る。発現の際に、これらのＰＫＲタンパク質の変異形態または改変形態は、キナーゼ活性を増大または減少させ得る。
【０１００】
１つのアプローチにおいて、ＰＫＲ変異遺伝子は、形質転換部位特異的変異誘発キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いて作製される。ＣａｉおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９８）は、キナーゼ活性（基質のリン酸化）からの基質結合（ｅＩＦ−αの観点で）の分離を示す一連のＰＫＲ変異体を記載した。ＰＫＲ活性の減少したこれらの変異体は、基質結合において効果が少なくとも、またはキナーゼ活性が低くとも、ＰＫＲ発現細胞を作製するための細胞のトランスフェクションに使用され得る。
【０１０１】
選択されたＰＫＲコード配列は、周知の組み換え技術に従って適切なベクター中に挿入され得、そしてＰＫＲを過剰発現し得る細胞株を形質転換するのに使用される（以下にさらに記載される）。
【０１０２】
本発明に従って、ＰＫＲをコードするポリヌクレオチド配列は、スプライス改変体、ＰＫＲのフラグメント、融合タンパク質、それらの改変形態または機能等価物を含み、これらは本明細書中で、集合的に、「ＰＫＲコード核酸配列」と称される（例えば、Ｗｕ，ＳおよびＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、１９９７を参照のこと）。このような「ＰＫＲコード核酸配列」は、適切な宿主細胞においてＰＫＲの発現を指向する組み換えＤＮＡ分子（異種核酸構築物とも称される）において使用され得る。
【０１０３】
遺伝子暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同一であるかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、ＰＫＲのクローニングおよび発現に使用され得る。従って、所定のＰＫＲコード核酸配列について、遺伝子暗号の縮重の結果として、同一のＰＫＲアミノ酸配列をコードする多くのコード配列が生成されることが理解される。例えば、トリプレットＣＧＴは、アミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、代替的に、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧによりコードされる。従って、コード領域におけるこのような置換は、本発明により網羅される配列改変体に含まれることが理解される。これらの配列改変体のいずれかまたは全てが、親のＰＫＲコード核酸配列について本明細書中に記載されるのと同一様式で使用され得る。
【０１０４】
「改変体」ＰＫＲコード核酸配列は、ネイティブなＰＫＲポリペプチドから１つ以上のアミノ酸によって変更された「改変体」ＰＫＲアミノ酸配列をコードし得る。これらは両方とも本発明の範囲内に含まれる。同様に、用語「〜の改変形態」は、ＰＫＲに対して、ネイティブのＰＫＲコード核酸配列またはタンパク質の誘導体または改変形態を意味する。すなわち、ＰＫＲの「改変形態」は、少なくとも１つの核酸またはアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む誘導配列を有する。核酸またはアミノ酸の置換、挿入、または欠失は、コードされるアミノ酸配列が、ネイティブのＰＫＲタンパク質の生物学的活性（例えば、自己リン酸化活性または真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ−２）リン酸化活性）を維持している限り、配列内の任意の残基で生じ得る。
【０１０５】
「改変」ＰＫＲコード核酸配列は、アミノ酸の挿入または欠失、あるいはその両方を含む「改変」ＰＫＲアミノ酸配列をコードし得る。さらに、改変ＰＫＲコード核酸配列は、参照ポリヌクレオチドまたはネイティブ配列と同一のポリペプチドをコードし得るが、遺伝子暗号の縮重に起因して、参照ポリヌクレオチド配列またはネイティブポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基が変化した核酸コード配列を有する。
【０１０６】
改変体核酸コード配列は、「保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得、ここで、置換されたアミノ酸は、それが置換するアミノ酸に類似の構造または化学的性質、ならびに天然に見出される相同的タンパク質中の物理化学的アミノ酸側鎖性質および高置換頻度を有する（例えば、標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスにより測定されたとき)。さらに、またはあるいは、この改変体核酸コード配列は、「非保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得、ここで、この置換されたアミノ酸は、それが置換するアミノ酸には類似しない構造または化学的性質を有する。標準的な置換クラスは、当業者に一般に知られるように、共通の側鎖性質および天然の相同性タンパク質における最高の置換頻度を基に、６つのクラスのアミノ酸を含み、そして改変体ＰＫＲをコードする核酸配列を開発するために採用され得る。
【０１０７】
ＰＫＲをコードするヌクレオチド配列はまた、コードされたポリペプチドの機能を実質的に改変しない、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の代替形態として規定される「対立遺伝子」を含み得る。
【０１０８】
本発明を実施することにおける使用のためのポリヌクレオチドは、ＰＫＲおよびＰＫＲスプライス改変体、タンパク質コード配列に相補的な配列、およびポリヌクレオチドの新規フラグメントをコードする配列を含む。このポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態であるか、またはＤＮＡの形態であり得、そしてメーセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡを含む。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖であれば、コード鎖または非コード（アンチセンス、相補的）鎖であり得る。
【０１０９】
当業者により理解され得るように、いくつかの場合には、天然に存在しないコドンを有するＰＫＲコード化ヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。特定の真核生物宿主により好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ、Ｅ．ら、１９８９）が、例えば、ＰＫＲポリペプチド発現の比率を増大するため、または天然に存在する配列から生成された転写物より長い半減期のような、所望の性質を有する組換えＲＮＡを生成するために選択され得る。
【０１１０】
１つの一般的な実施形態では、ＰＫＲコードヌクレオチド配列は、本明細書に参考として明確に援用されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３５６６３に見出されるヒトｐ６８ＰＫＲコード配列に、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％または９５％またはそれ以上の配列同一性を有する。
【０１１１】
ＰＫＲをコードするヌクレオチド配列は、細胞によるＰＫＲのクローニング、プロセッシングおよび／または発現を修飾する改変を含むがこれに限定されない種々の理由のためにＰＫＲコード配列を改変するために操作され得る。
【０１１２】
異種核酸構築物は、ＰＫＲのコード配列、改変体、フラグメントまたはそのスプライス改変体を：（ｉ）単離物中；（ｉｉ）ＰＫＲコード配列が優勢コード配列である、融合タンパク質またはシグナルペプチドのような；さらなるコード配列と組み合わせて；（ｉｉｉ）適切な宿主中でコード配列の発現に有効な、イントロン、およびプロモーターおよびターミネーターエレメントまたは５’および／または３’非翻訳領域のような制御要素のような、非コード化配列と組み合わせて；および／または（ｉｖ）ＰＫＲコード配列が異種遺伝子であるベクターまたは宿主環境中に含み得る。
【０１１３】
本発明はまた、上記のような、ＰＫＲをコードする核酸配列の１つ以上を含む組換え核酸構築物を含む。この構築物は、その中に本発明の配列が順配向または逆配向で挿入された、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含む。
【０１１４】
（Ｃ．宿主細胞の選択および形質転換）
上記のような適切な核酸コード配列を、適切なプロモーターおよび制御配列とともに含むベクターを採用して哺乳動物細胞を形質転換し得、細胞がＰＫＲを過剰発現するようにし、そしてそれによってサイトカイン発現または産生を増大する。
【０１１５】
本発明の１つの局面では、異種核酸構築物を採用してインビトロで細胞中（確立された細胞株が好ましい）にＰＫＲをコードする核酸配列を移入する。サイトカイン類の長期間の高収率産生のために、安定発現がまた好ましい。次いで、安定な形質転換対体を生成するに有効な任意の方法が本発明を実施するのに用いられ得る。
【０１１６】
他にそうであることが示されなければ、本発明の実施には、当該技術分野内にある、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法が採用され得る。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、２００１）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８８）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９３）；およびＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ、１９９４）を参照のこと。前述および後述両方の、本明細書に述べられる、すべての特許、特許出願、論文および刊行物は、参考として本明細書中に特に援用される。
【０１１７】
本発明は、外因的に提供されるＰＫＲコード化核酸配列を含むように遺伝子的に改変された細胞および細胞組成物を提供する。親細胞または細胞株は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子的に改変され得る（すなわち、形質導入、形質転換またはトランスフェクション）。このベクターは、例えば、上記でさらに記載のような、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。
【０１１８】
ベクターをインビトロで細胞中に送達するために種々の方法が採用され得る。ＰＫＲをコードする核酸配列を含む異種核酸構築物は、インビトロで転写され、そして得られるＲＮＡを、例えば、注入によるような周知の方法により宿主細胞中に導入され得る。異種核酸配列の発現のために、細胞中に核酸を導入する方法はまた、当業者に公知であり、限定されずに、エレクトロポーレーション；核マイクロインジェクションまたは単一細胞中への直接マイクロインジェクション；インタクト細胞との細菌プロトプラスト融合；ポリカチオン（例えば、ポリブレンまたはポリオルニチン）の使用；リポソームを用いた膜融合、リポフェクタミンまたはリポフェクション媒介トランスフェクション；ＤＮＡ被覆マイクロパーティクルを用いた高速度ボンバードメント；リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション；改変ウイルス核酸での感染；などを含む。（例えば、Ｄａｖｉｓ、Ｌ．、Ｄｉｂｎｅｒ、Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ、Ｉ．、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、１９８６を参照のこと）。
【０１１９】
遺伝子改変された細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＰＫＲコード化核酸配列の発現を増幅するため、適切に改変された従来の栄養培地中で培養され得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に先に用いられたような条件であり、そして当業者に明らかである。
【０１２０】
異種核酸構築物が導入された細胞の子孫は、一般に、この異種核酸構築物中に見出されるＰＫＲコード化核酸配列を含むと考えられる。
【０１２１】
（Ｄ．増大されたＰＫＲ発現のための細胞および培養条件）
従って、本発明は、対応する親細胞株に対して、増大したＰＫＲ産生または発現を生じるに有効な様式で、選択、改変、プライムおよび／またはプライムかつ処置された細胞を含む細胞株を提供する。
【０１２２】
増大したＰＫＲ発現のために処置および／または改変され得る親細胞株の例は、制限されずに、Ｂ細胞（Ｎａｍａｌｗａ、２９３、Ｒａｊｉ）、単球細胞（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８細胞、Ｆｌｏｗ１０００細胞、Ｆｌｏｗ４０００細胞、ＦＳ−４およびＦＳ−７細胞、線維芽細胞（ＭＲＣ−５、ＭＧ−６３細胞）、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞、Ｔ細胞（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ）細胞およびＴ９８Ｇ細胞を含む。ＰＫＲ発現のために選択され、改変され、プライムされおよび／またはプライムかつ処置され得る適切な一次細胞型の例は、制限されずに、単球／マクロファージ系統の細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を含むリンパ球系統の細胞、マスト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、骨芽由来細胞、メラノサイト、内皮細胞、血小板、種々の他の免疫系細胞、肺上皮細胞、膵臓実質細胞、そのような細胞型由来の神経膠腫細胞および腫瘍細胞を含む。ＰＫＲ過剰発現細胞は、代表的には、親細胞株を培養するために採用された条件下で培養される。
【０１２３】
一般に、細胞は、生理学的塩および栄養分を含む、代表的には、ウシ胎仔血清のような５−１０％血清で補填した、標準ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭまたはＤＭＥＭのような、標準的な培地で培養される。培養条件もまた標準的であり、例えば、培養物は、３７℃で、所望のレベルのＰＫＲ発現が達成されるまで、静置またはローラー培養でインキュベートされる。
【０１２４】
所定の細胞株のための好適な培養条件は、科学的文献および／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／」）のような細胞株の供給源から見出され得る。線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、樹状細胞、および単球のような一次細胞株のための好適な培養条件は、一般に、科学的文献中で利用可能である。細胞増殖が確立された後、細胞は、ＰＫＲの過剰発現を引き起こすか、または許容するために有効な条件に曝される。
【０１２５】
ＰＫＲ遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、誘導剤、例えば、金属塩または抗生物質が、高レベルＰＫＲ発現を誘導するに有効な濃度で培地に添加される。
【０１２６】
（Ｅ．ＰＫＲ発現をさらに増大するための細胞の処置）
一般に、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカイン類の発現を増大するため、または哺乳動物細胞株からサイトカイン類の回収を容易にするためにさらなる工程がとられる。このような工程は、（１）ＰＫＲの発現を増大するために有効な条件下で細胞を培養すること；（２）ポリペプチド類、化学薬品類、または核酸類を含むがこれらに限定されない試薬でＰＫＲ発現細胞をプライムすること；および（３）ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカイン類の産生を誘導するためにＰＫＲ発現細胞を処置すること（誘導）、の１つ以上を含む。
【０１２７】
１つの例示のアプローチでは、ポリＩ：ＣでのＰＫＲ過剰発現細胞株（４１．０２７．Ａ９および４．０２７．Ｃ１）の処置が、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞について観察されたより大きいＰＫＲ発現を誘導するために有効であった（図２Ｂ）。さらに、本明細書中に提供された結果は、４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１クローンおよびそのサブクローン化子孫細胞株のような、サブクローニングおよび選択により派生するＰＫＲ過剰発現細胞株が、集合的に、対応する野生型細胞株よりＰＫＲ活性および発現の誘導に対し応答性であることを示す（図１、２および３）。このようなＰＫＲ過剰発現細胞株は、従って、ＩＦＮについて図５に、そしてＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８について図６に例示されるように、より高いレベルのサイトカイン類を産生する。
【０１２８】
サイトカイン類の回収を容易にするために有効な条件下で細胞を培養することは、制限されずに、血清中および／または無タンパク質もしくは無血清培地中で培養することを含む。
【０１２９】
プライミングは周知の現象であり、それによって、プライミング剤での細胞の前処理が、次の処置または誘導の後、１つ以上のサイトカイン類の増大した産生を生じる。例示のプライミング剤は、制限されずに、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびその他のホルボールエステル、カルシウムイオノフォア、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンβ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＥＧＦまたはケモカイン類（ＩＬ−８、ＭＣＰまたはＭＩＰ）、酪酸ナトリウム、エンドトキシン、キナーゼアクチベーター（例えば、ＰＫＲ、ＰＡＣＴのタンパク質アクチベーター）、または転写アクチベーター（ＮＦ−ＫＢ、ＩＲＦ−３およびＩＲＦ−７を含むＩＲＦ類）を含む。ＰＫＲインヒビターｐ５３の抑制もまた、増大したＰＫＲ活性を生じることが示されている（Ｔａｎら、１９９８）。あるいは、血清およびＩＬ−３のような増殖因子の枯渇を用いて細胞中のＰＫＲ活性を誘導し得る。適切なプライミング剤濃度は、科学的文献中に見出し得、例えば、ＰＭＡの濃度は５−５０ｎＭの範囲で、好ましくは約１０ｎＭが適切である。
【０１３０】
処置することは、微生物（ウイルス、細菌または真菌）誘導剤、誘導剤として作用し得る微生物の抽出物（例えば、エンドトキシンまたは細菌細胞壁含有抽出物）または非微生物誘導剤を細胞培養に添加することを含み得る。例示の非微生物剤は、制限されずに、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（ポリＩ：Ｃ）のような二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子（例えば、ポリアニオン）、ヘパリン硫酸デキストラン、硫酸コンドロイチンおよびサイトカイン類を含む。
【０１３１】
ウイルス誘導の例示の方法は、制限されずに、（１）生存ウイルス（Ｓｅｎｄａｉウイルス、脳心筋ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなど）に曝すこと；（２）前述の死滅ウイルスに曝すこと；または（３）単離された二本鎖ＲＮＡに曝すことを含む。さらに、サイトカイン誘導は、特定細胞中でサイトカイン産生を刺激することが知られる特定のサイトカイン類を添加することにより生成または増大され得る。
【０１３２】
誘導剤の添加後、代表的には、細胞は、所望のレベルの誘導されかつ分泌されたサイトカイン類が得られるまで、さらにインキュベートされ得る。３７℃で少なくとも１２−４８時間、そして７２−９６時間までが一般に十分である。
【０１３３】
１つの好適なアプローチでは、ＰＫＲおよび１つ以上のサイトカイン類の過剰発現は、ＤＥＡＥデキストランでの細胞のさらなる処置により行われる。
【０１３４】
ヌクレオチドアナログである２−アミノプリン（２−ＡＰ）は、ＰＫＲの公知のインヒビターである。図５は、２−ＡＰを用いた処置による結果のサイトカイン誘導の抑制によるＰＫＲ活性の阻害を示す。代表的には、２ＡＰは、約０．５〜５ｍＭの濃度で用いられる。
【０１３５】
別のアプローチでは、ＰＫＲ発現は、ＰＫＲコード化核酸配列の発現を制御するプロモーターと相互作用する調節因子により増大され得る。内因性ＰＫＲコード化核酸配列の発現の場合には、例示の調節因子は、インターフェロン誘導性ＧＡＳ要素、ＩＬ−６感受性ＮＦ−ＩＬ６およびＡＰＲＦ要素およびＮＦ−κＢ要素を含む（例えば、Ｊａｇｕｓ  Ｒら、１９９９およびＷｉｌｌｉａｍｓ、Ｂ．Ｒ．、１９９９を参照のこと）。
【０１３６】
（ＶＩ．ＰＫＲ発現を評価する方法）
所定のサイトカイン−調節因子の活性、発現および／または産生は、当該技術分野で公知の方法により測定され得る。
【０１３７】
例示すれば、内因的または外因的に提供されたＰＫＲコード化核酸配列の存在、増幅および／または発現は、サンプル中で、例えば、ＰＫＲ活性、発現および／または産生のためのアッセイにより直接測定され得る。このようなアッセイは、自己リン酸化アッセイ、ｅＩＦ２αリン酸化のためのアッセイ、キナーゼアッセイ；ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、またはＰＫＲコード化核酸配列に基づく、適切に標識されたプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーション；および従来のサザンブロッティングを含む。
【０１３８】
あるいは、遺伝子発現は、ＰＫＲの発現を直接評価するための細胞または組織切片の免疫組織化学的染色、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡのような、免疫学的方法により測定され得る。免疫組織化学的染色および／またはサンプル流体のアッセイのために有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして任意の動物中で調製され得る。
【０１３９】
このような方法の詳細は、当業者に公知であり、そしてこのような方法を実施するための多くの試薬が市販されている。
【０１４０】
（ＶＩＩ．サイトカイン産生を増大するために有効なさらなる因子）
アポトーシスまたはプログラム化細胞死は、細胞に本質的な自殺プロセスであり、それによって、所望されない個々の細胞は遺伝子により決定されたプログラムを経て、染色体ＤＮＡフラグメント化、ＲＮＡの分解および最終的な細胞死に至る（Ｏｒｒｅｎｉｕｓ  １９９５；Ｓｔｅｌｌａｒ  １９９５；Ｖａｕｘ  １９９３に総説がある）。一旦、アポトーシスが始まると、細胞は、新たなラウンドのタンパク質合成、ならびに、細胞質凝縮、核クロマチン凝縮、膜小気胞化、および特徴的なオリゴヌクレオチドのラダーとして検出される最終的なＤＮＡ分解を含む、種々の形態学的／生理学的変化を行う。
【０１４１】
プロトタイプ早期炎症性サイトカインとしてのＴＮＦは、病原体排除、抗ウイルス活性、および腫瘍破壊のプロセスの間に活性化した免疫細胞により産生される細胞傷害性タンパク質である。しかし、インビボで高レベルのＴＮＦαは有害である。なぜなら、ＴＮＦαは、代謝障害、消耗、および造血の抑制を誘導するからである。細胞レベルにおいて、ＴＮＦαは、スーパーオキシドラジカルの生成、リソソーム酵素の活性化（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９０；Ｌｉｄｄｉｌら、１９８９）、およびエンドヌクレアーゼ活性の活性化によるＤＮＡのフラグメント化（Ｒｉｂｉｎら、１９８８）を誘導し、アポトーシスに至る。
【０１４２】
ＰＫＲは、ＴＮＦαシグナル伝達経路において、およびアポトーシスの誘導において役割を果たすことが知られている。ＰＫＲを過剰生産するＵ９３７細胞はまた、増大したアポトーシスを示すことが示されている（例えば、Ｙｅｕｎｇ、Ｍ．Ｃ．ら、１９９６および１９９９を参照のこと）。
【０１４３】
従って、本発明の１つの局面では、ＰＫＲを過剰発現する、サイトカイン産生性細胞株を処理してアポトーシスを阻害する。
【０１４４】
例えば、細胞は、適切なプロモーターの制御下で、細胞におけるアポトーシスを阻害し得るタンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトされる。
【０１４５】
代表的には、細胞は最初に、抗アポトーシス遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされ、次いで、成功した形質転換体がさらに、サイトカイン調節遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされる。これは、細胞が抗アポトーシス機能ですでに「安定化」されて、第２のトランスフェクションおよび選択を実施することを可能にする。あるいは、サブクローン化および選択されたＰＫＲ過剰生産細胞を増殖して、抗アポトーシス遺伝子を含むベクターが導入されたＰＫＲ過剰発現細胞株を生成する。
【０１４６】
特にＰＫＲ過剰発現の条件下で、サイトカイン合成をともなうアポトーシスを阻害することによって細胞培養中のサイトカインの産生を増大する方法は、本明細書中に参考として特に援用される同時所有の米国仮出願第０９／６５７，８８１号にさらに記載されている。
【０１４７】
（ＶＩＩＩ．サイトカイン産生）
ＰＫＲを過剰発現する細胞により産生されるサイトカイン類は、培地中に分泌され、そして、例えば、細胞培養培地から所望されない成分を除去することにより、精製または単離され得る。一般に、サイトカイン類は、特定の結合剤（例えば、抗体またはレセプター）に対する結合親和性のような選択された性質を有するサイトカイン類；または選択された分子量範囲、または等電点の範囲のサイトカイン類を分離するために分画される。
【０１４８】
（Ａ．ＰＫＲ過剰発現と組み合わせて過剰生産されるサイトカイン類）
本発明の方法を用いて発現が増大され得る例示のサイトカイン類は、制限されずに、インターフェロン類（α、βおよびγ）、インターロイキン類（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２およびＩＬ−４〜１３）、腫瘍壊死因子αおよびβ（ＴＮＦ−β）およびそれらの個々の可溶性レセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、Ｇ−ＣＳＦ；顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＧＭ−ＣＳＦ；およびＩＬ−３）、造血因子（線維芽細胞成長因子、ＦＧＦ；血管内皮細胞成長因子、ＶＥＧＦ）；および血小板由来成長因子１および２（ＰＤＧＦ−１および−２）および抗造血因子（アンギオスタチンおよびエンドスタチン）を含む。
【０１４９】
サイトカイン調節因子、例えば、ＰＫＲの過剰発現細胞株が、組換えＤＮＡ技術により生成される場合、このサイトカイン調節因子は、誘導性プロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーターまたはテトラサイクリン（ＴＲＥ）プロモーター（ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆ）；構成性プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはＳＶ−４０プロモーターの制御下で発現され得る。
【０１５０】
ＰＫＲをコードするベクターでトランスフェクトされた細胞によるサイトカイン類の生産は、先に、インターフェロンについて同時所有の米国特許出願第０９／４４４，２２４号（特許された）に、そしてその他のサイトカイン類、例えば、ＩＬ−１−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−βについては、単独または組み合わせて、同時所有の米国出願番号第０９／５９５，３３８号および同第０９／６６０，４６８号に記載されており、これらすべては特に参考として本明細書中に援用される。
【０１５１】
（Ｂ．サイトカイン類の組み合わせ）
本明細書中に記載の方法は、本明細書中に特に参考として援用される同時所有の米国仮出願第０９／６６０，４６８号に詳細に記載されるように、治療的使用のための２つ以上のサイトカインの混合物、特に、癌、ウイルス感染、または炎症を治療する使用のためのサイトカイン混合物の生産にさらなる有用性を見出す。
【０１５２】
要約すると、ＰＫＲ過剰生産細胞株を適切な条件下で培養し、２つ以上のサイトカイン類を得るに有効な様式で誘導および／または処理し、そして細胞により産生され、そして培地中に分泌されたサイトカイン類が、例えば、細胞培養培地から所望されない成分を除去して単離される。
【０１５３】
好ましくは、この組成物は、収集されたサイトカイン類を分画することにより生成され、結合剤（例えば、抗体またはレセプター）に対する結合親和性、または選択された分子量範囲、または等電点の範囲のような、選択された性質をもつサイトカイン類を単離する。
【０１５４】
（Ｃ．サイトカイン類の精製および／または単離）
１つのアプローチでは、サイトカイン調節因子、例えば、ＰＫＲを過剰生産する細胞からのサイトカインの単離を単純にするために、細胞を、血清含有培地中で培養するが、代表的には、誘導剤および単離工程を、血清および／またはタンパク質が実質的にない培地中で実施される。
【０１５５】
一旦、所定のサイトカインの増加した発現が達成されると、このサイトカインは、細胞培養から単離および／または精製される。この単離工程は、分泌されたサイトカイン類を含む培養培地を、単離されるべきサイトカイン（単数または複数）に対して特異的である表面に付着した抗体を有する固体支持体と接触されること、この固体支持体を洗浄して非結合物質を取り除くこと、およびこの支持体に特異的に結合したサイトカイン類を溶出することを包含する。
【０１５６】
このような単離および／または精製に適切な例示の手順は以下を包含する：抗体−親和性カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；焦点クロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；および、例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いるゲル濾過。タンパク質精製の種々の方法が採用され得、そしてこのような方法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８２、１９９０；Ｓｃｏｐｅｓ、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４に記載されている。選択された精製工程（単数または複数）は、例えば、用いた生産プロセスおよび産生された特定のサイトカインの性質に依存する。
【０１５７】
サイトカイン類の誘導後の種々の時点で、細胞培地は、１つ以上の選択されたサイトカイン類の存在について試験され得る。選択されたサイトカイン類の存在は、直接検出（例えば、抗体結合アッセイ（以下を参照のこと））を用いるか、または代表的には当該技術分野で採用される生物学的アッセイに従って、種々のサイトカイン応答性細胞の活性に対する培養培地の効果により間接的にアッセイされ得る。
【０１５８】
（Ｄ．サイトカイン発現を評価する方法）
所定のサイトカインの活性、発現および／または産生はまた、当該技術分野で公知の方法により測定され得る。例は、ｍＲＮＡについてノザンブロットおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む。さらに、ＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、間接免疫蛍光アッセイなどのイムノアッセイを用いて発現されたタンパク質を検出し得る。
【０１５９】
一般に、サイトカイン分析のためのキットは市販されており、そして公知のサイトカイン類またはその他のタンパク質の発現レベルの定量的イムノアッセイのために用いられ得る（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なサイトカイン検出キット）。
【０１６０】
本発明の１つの好適な局面では、培養条件、処置、プライミングおよび誘導の組み合わせが、所定の細胞株による顕著に増大したサイトカイン産生をもたらし、例えば、提示される増加は、本明細書に記載のような細胞の処置、プライミングおよび誘導の１つ以上がない同じ培養条件の下で同じ細胞株により示されるレベルに対し、少なくとも２倍（２×）、２．５倍（２．５×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）、および好ましくは１０倍（１０×）またはそれより多いサイトカイン産生または発現である。いくつかの場合には、本発明の方法は、１００倍（１００×）〜１０００倍（１０００×）またはそれより多いサイトカイン産生における増加をもたらす。
【０１６１】
本明細書中に引用されるすべての特許および参考文献は、それらの全体が参考として本明細書中に特に援用される。
【０１６２】
以下の実施例は例示であり、いかなる様式においても本発明を制限する意図はない。
【実施例】
【０１６３】
（実施例１）
ＰＫＲ過剰生産細胞株の調製
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．から得た。これらの細胞を、以下に詳細に記載するように、培養し、サブクローン化し、選択し、プイラムおよび誘導した。
【０１６４】
野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞は、０．５〜１５％濃度範囲のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養した。このＮａｍａｌｗａ細胞を、当業者により慣用的に採用される標準的な方法を用いて９６ウェルプレート中で培養することにより、限界希釈クローニング（本明細書では「サブクローニング」という）した。このサブクローニング工程は、単一細胞の子孫として生じるクローンを生じた。このサブクローニングは、５〜１０回実施し、そしてこれらサブクローンを、代表的には親細胞株を培養するために採用された培養条件を用いて増殖させ、約０．３〜０．５百万細胞／ｍｌの集団を得た。次いで、これらサブクローンを、ＰＫＲ発現および活性について、ノザンブロット、ウェスタンブロット、自己リン酸化アッセイ（ＤｅｒおよびＬａｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９５；９２：８８４１−８８４５）、ｅＩＦ２αリン酸化のためのアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら）、およびキナーゼアッセイ（キナーゼのインビトロアッセイ（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、２０００）と組み合わせたＰＫＲの免疫沈降により実施した）によりアッセイした。
【０１６５】
親細胞株より少なくとも２倍多いキナーゼ活性を示したサブクローンを選択した。選択されたサブクローンをまた、ウェスタンおよびノザンブロットによりＰＫＲ産生および／または発現についてスクリーニングした。次いで、選択されたサブクローンを、誘導前のプライミング有りまたは無しで処置し、増大したＰＫＲおよびサイトカイン活性、産生および／または発現を誘導した。
【０１６６】
プライミングまたは誘導の不在下で、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞と比べ、２倍またはそれより多いレベルのＰＫＲ活性を発現する細胞株を生成した。Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞と命名した例示のＰＫＲ過剰生産性細胞株を、本明細書中で本発明を例示するために用いる。
【０１６７】
（実施例２）
（ＰＫＲ過剰発現細胞株の特徴づけ）
（Ａ．非ウイルス性誘導への応答における増強された内因性ＰＫＲ発現）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞およびＷＴ  Ｎａｍａｌｗａ細胞の個々のサブクローン由来の細胞を、Ｔ１５０フラスコ中で、２４時間、５．０×１０５細胞／ｍｌの密度まで２０ｎＭ  酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を用いて前処理した。続いて、さらに４８時間、２００μｇ／ｍｌポリＩ：Ｃおよび１０μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ  デキストランを用いて処理し、ＰＫＲ発現を誘導した。総ＲＮＡを、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．ら（１９８７）に記載される単一工程の酸グアニジウム  チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法を用いて単離した。
【０１６８】
ノーザンブロットを、上記のように単離された２０μｇの総ＲＮＡを用いて調製し、２．２Ｍのホルミルアミドを含む１％アガロースゲル上で変性条件下で電気泳動し、次いでＰｒｏｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌ）上に移した。ＰＫＲ−Ｅｃｏ  Ｒ１フラグメントを、ハイブリダイゼーションのための特定のプローブとして使用した。フィルターを、４０％のホルムアミドを含む標準のハイブリダイゼーション溶液を用いて５時間プレハイブリダイズし、次いで、３２Ｐ標識化プローブ（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手した、商業用の標識キットを用いてランダムプライミング反応によって標識した）を用いて一晩ハイブリダイズした。次いで、膜を、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７）を用いて６０℃で１５分間２回洗浄し、０．１％ＳＤＳで洗浄し、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて同様の温度で１度洗浄した。
【０１６９】
図１Ａは、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞におけるＰＫＲ発現に関するＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞におけるポリＩ：Ｃ誘導後の増強されたＰＫＲ発現を例示する。上のパネルは、生じた細胞（レーン１および３）ならびに上記のようにポリＩ：Ｃを用いて処置された細胞（レーン２および４）から単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。３２Ｐ標識化ＰＫＲ  Ｅｃｏ  Ｒ１フラグメントを、プローブとして用いた。コントロールとして、下のパネルは、臭化エチジウムを用いて染色されたゲルの写真を示す。ｒＲＮＡバンドの強度の比較は、各レーンにロードされたＲＮＡの総量が同じであることを示す。２８Ｓ  ｒＲＮＡのサイズは、約５ｋｂであり、そして１８Ｓ  ｒＲＮＡのサイズは、約１．９ｋｂである。従って、上のパネルにおけるＰＫＲバンド強度の増加は、ＰＫＲ  ＲＮＡのレベルの増加に起因し、そして各レーンに存在する総ＲＮＡの量における差異に起因しない。
【０１７０】
（Ｂ．ウイルス性誘導への応答における増強された内因性ＰＫＲ発現）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞およびＷＴＮａｍａｌｗａ細胞の個々のサブクローン由来の細胞を、１ｍＭ酪酸ナトリウムを用いて２４時間、Ｔ１５０フラスコ中で５．０×１０５細胞／ｍｌの密度で３７℃で前処理した。これに続いて、５００ＨＡＵ／ｍｌのセンダイウイルス（ＳＶ）を用いてさらに２４時間処理した。ＲＮＡを、記載されるような（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７）単一工程の酸グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法を用いることによって単離した。
【０１７１】
ノザン分析を、２０μｇの総ＲＮＡを用いて実行し、これは２．２Ｍのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で変性条件下で電気泳動し、続いて、Ｐｒｏｔｒａｎ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌ）上に移した。ＰＫＲ−Ｅｃｏ  Ｒ１フラグメントを、市販のＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ非同位体検出キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いるハイブリダイゼーションのための特異的プローブとして使用した。
【０１７２】
図１Ｂは、野生型（ＷＴ）Ｎａｍａｌｗａ細胞（レーン１）におけるＰＫＲ発現と比較した、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞（レーン２）におけるセンダイウイルス誘導後の増強されたＰＫＲ発現を例示する。コントロールとして、下のパネルは、エチジウムブロミドを用いて染色されたゲルの写真を示す。ｒＲＮＡバンドの強度の比較は、各レーンにロードされたＲＮＡの総量が、同様であることを示す。２８ＳｒＲＮＡのサイズは、約５ｋｂであり、そして１８ＳｒＲＮＡのサイズは、約１．９ｋｂである。従って、上のパネルにおけるＰＫＲバンド強度における増加は、ＰＫＲ  ＲＮＡの増加したレベルに起因し、各レーンに存在する総ＲＮＡの量における差異に起因しない。
【０１７３】
図１Ａおよび１Ｂに示される結果から見出され得るように、非ウイルス性誘導またはウイルス性誘導後、Ｎａｍａｌｅａ４１．０２７細胞によって本明細書中で例示されるＰＫＲ過剰発現細胞株は、誘導されて、同じ処理に供された野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも有意に多いＰＫＲを産生し得る。この結果は、レーザーデンシトメトリーによって定量され得る。
【０１７４】
（Ｃ．非誘導対ポリＩ：Ｃ誘導ＷＴおよび４１．０２７細胞株のキナーゼアッセイ）
Ｎａｍａｌｗａ  ＷＴおよびサブクローンした子孫細胞株４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１を、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で培養し、そして５％のＣＯ２存在下で３７℃でインキュベートした。細胞を収集し、そしてトリパンブルー色素排除アッセイを用いて計測し、そして最終の細胞密度５０×１０５細胞／ｍＬで細胞培養処理フラスコ中に接種した。重複フラスコを、各細胞株について調製した。この細胞を、２０ｎＭの酢酸ミスチリン酸ホルボール（ＰＭＡ）を用いて２０分間処理することによってプライムした。ＰＭＡへの曝露後、次いで、各細胞株について１セットのフラスコを、２００μｇ／ｍＬの最終濃度のポリＩ：Ｃと１０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥデキストランを用いて４８時間処理することによって誘導した。
【０１７５】
プライム工程および誘導工程の後に、細胞抽出物を調製し、ＰＫＲを、免疫沈降させ、そしてＰＫＲキナーゼ活性を、インビトロアッセイによって測定した（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、２０００）。この目的のために、細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして細胞ペレットを記載されるように、６０〜９０μｌの免疫沈降（ＩＰ）溶解緩衝液に再懸濁した。細胞溶解物を、氷上で２０分間インキュベートし、続いて２０，８００ｇで、４℃で２０分間遠心分離した。ＰＫＲを、免疫沈降し、そしてインビトロキナーゼアッセに供した（Ｚａｍａｎｉａｎ−Ｄａｒｙｏｕｓｈら、１９９９）。手短には、ＰＫＲを、抗ＰＫＲモノクローナル抗体（パスツール研究所のＡｒａ  Ｈｏｖａｎｓｓｉａｎから入手したＭＡｂ７１／１０）を用いて１００μｇの総溶解タンパク質から免疫沈降した。氷上での３０分間のインキュベーション後、プロテインＧセファロースビーズを、添加し、４℃で２４時間インキュベートし、そしてビーズ結合キナーゼを、溶解緩衝液を用いて２回洗浄し、続いてＤＢＧＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭの酢酸マグネシウム、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、７ｍＭのメルカプトエタノール）を用いて洗浄した。免疫沈降したＰＫＲを、０．８３ｍＭの塩化マグネシウム、０．８μＭのＡＴＰ、１０μの精製したヒストン、および９μＣｉのγ［３２Ｐ］ＡＴＰを含むＤＢＧＡ中で３０℃で２０分間インキュベートした。このキナーゼ反応を、４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加によって終結した。リン酸化ＰＫＲタンパク質を、勾配（４〜１２％ポリアクリルアミド）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。次いで、このリン酸化ＰＫＲタンパク質を、当該分野において周知の標準的なプロトコルを用いてＰＶＤＦ膜に移し、そして固定した。ＰＫＲバンド中に含まれる放射能の量を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｓ  ５．２と組み合わせて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｔｙｐｈｏｎ  ８６００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒのリン酸画像化能（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を用いて定量した。
【０１７６】
図２Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＰＫＲ自動キナーゼ活性アッセイのオートラジオグラフィーの画像を示す。このアッセイを、上記のようにＰＭＡ単独またはＰＭＡおよびポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランに曝露した後に、Ｎａｍａｌｗａ−ＷＴおよびＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ＋＋サブクローン化細胞株を用いて行った。レーン１〜３は、ＰＭＡで２０時間プライムしたが、ポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランを用いて誘導されないサンプルを示す；レーン４〜６は、ＰＭＡで２０時間プライムした後に、ポリＩ：ＣおよびＤＥＡＥデキストランを用いて４８時間誘導したサンプルを示す。
【０１７７】
ＰＫＲキナーゼ活性を、定量し、そしてその結果を、図２Ｂおよび図２Ｃに示す。示されるように、サブクローンされた細胞株（Ｎａｍａｌｗａ−ＰＫＲ＋＋４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１）は、誘導後のＷＴ細胞株よりＰＫＲキナーゼ活性の２倍より大きい増加を伴いポリＩ：Ｃ処理に対してより感受性である。
【０１７８】
（Ｄ．非誘導対ポリＩ：Ｃ誘導ＷＴおよび４１．０２７細胞株のウェスタンブロット分析）
ＰＫＲタンパク質を、ＰＶＤＦ膜に固定化し、そして節Ｃで概要を述べられたようにＰＫＲキナーゼ活性について評価した後、同じ膜を、酵素増幅化学発光ウェスタンブロット分析を用いて総ＰＫＲタンパク質のレベルを評価するためにさらに処理した。この目的のために、１次抗体としてウサギポリクローナル抗ＰＫＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｓ，ＣＡから入手した）を用いてインキュベートし、続いて、２次抗体として、抗ウサギフルオレセイン結合化ポリクローナル抗体を用いて検出し、次いで、抗フルオレセインアルカリホスファターゼ結合化３次抗体を用いて検出した。シグナルを、蛍光基質ＥＣＦ（Ａｅｍｒｓｈａｒｍ）の添加によって増した。ウェスタンブロットを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）の画像分析能を用いて評価した。ＥＣＦ反応を、５３２ｎｍの励起波長でレーザーを用いて検出し、光学マルチパイパーチューブを、１００ピクセルの媒体感度でセットされた装置の解像度で５００ボルトにセットした。データを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ５．２）を用いて分析した。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃに示される結果は、プライムおよび誘導された野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞と比較して、プライムおよび誘導されたＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞（４１．０２７．Ｃ１および４１．０２７．Ａ９）においてＰＫＲタンパク質発現のレベルが２倍増加したことを示す。さらに、タンパク質発現の比較レベルとの活性データの相関は、プライムおよび誘導された野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞と比較した、プライムおよび誘導されたＰＫＲ過剰発現Ｎａｍａｌｗａ細胞におけるＰＫＲ特異的活性の合計３倍〜５倍の増加を明らかにする（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【０１７９】
（実施例３）
（ウイルス性誘導またはポリＩ：Ｃでの処置に応答する、ＰＫＲ過剰発現細胞株における増強されたインターフェロン産生）
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞およびＷＴ  Ｎａｍａｌｗａ細胞の個々のサブクローン由来の細胞を、６ウェルプレート中で２４時間、細胞密度５．０×１０５細胞／ｍｌで２０ｎＭの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を用いて前処理し、続いて、５００ＨＡＵ／ｍｌのセンダイウイルス、または２００μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃと１０μｇ／ｍＬのＤＥＡＥデキストランを用いてさらに７２時間処理して、ＩＦＮ発現を誘導した。センダイウイルス処理細胞由来の培養上清を、誘導後２４時間および４８時間で除去し、そしてポリＩ：Ｃ処理細胞由来の上清を、７２時間で除去した。ＩＦＮ−α産生を、ＥＬＩＳＡ（ＰＢＬから入手したＨｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）を用いてこれらの細胞培養上清中で測定した。
【０１８０】
図５は、図５に示されるような野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞によるＩＦＮ−α産生と比較して、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞においてセンダイウイルスおよびポリＩ：Ｃ誘導の両方の後にＩＦＮ−α産生が高められることを例示する。ＩＦＮ−α産生のレベルは、センダイウイルスでの誘導後、４８時間で最も高く、この点で、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも約４倍（４×）高いＩＦＮ−α産生を示した。同様に、ポリＩ：Ｃは、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞中にＩＦＮを誘導し得るが、親のＮａｍａｌｗａ細胞中でＩＦＮ−α誘導は検出不可能である（図５）。
【０１８１】
対応する実験を、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞およびＷＴＮａｍａｌｗａ細胞の個々のサブクローンの二重培養物において実行した。これらの培養物をまた、６ウェルプレート中で２４時間、５．０×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で２０ｎＭの酢酸ミリスチン酸ホルボールを用いて前処理し、続いて、５００ＨＡＵ／ｍｌのセンダイウイルスまたはポリＩ：Ｃ（２００μｇ／ｍｌ）と１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストランを用いて処理した。さらに、これらの培養物をまた、ＰＫＲインヒビターの５ｍＭ  ２−アミノプリン（２ＡＰ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した）を用いて処理した。センダイウイルス誘導細胞由来の培養上清を、誘導後２４時間で除き、そしてポリＩ：Ｃ誘導細胞由来の培養上清を、７２時間で除き、そしてＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．４１１０５  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｆａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）を用いてＩＦＮα産生について評価した。
【０１８２】
図５は、２−アミノプリンに曝された場合の、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７およびＷＴ細胞におけるセンダイウイルスまたはポリＩ：Ｃ誘導後のＩＦＮ−α産生の減少を示す。この結果は、ＰＫＲキナーゼ活性の公知のインヒビターである２−アミノプリンが、ＩＦＮ−α誘導を阻害し得ることを示す。同様に、２−アミノプリンは、ウイルスまたはポリＩ：Ｃによる他の前炎症サイトカインの誘導を阻害する（結果は示されていない）。
【０１８３】
（実施例４）
（ウイルス性誘導に対する応答におけるＰＫＲ過剰発現細胞株中の増強されたＴＮＦ−β産生）
ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞およびＷＴＮａｍａｌｗａ細胞の個々のサブクローン由来の細胞を、６ウェルプレート中で、５．０×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で２０ｎＭの酢酸ミリスチン酸ホルボールを用いて、２０時間前処理した。これに続いて、２００μｇ／ｍｌポリＩ：Ｃを用いてさらに７２時間処理して、サイトカインの発現を誘導した。処理された細胞由来の培養上清を、誘導後７２時間で除き、そしてＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介して、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８産生について評価した。
【０１８４】
図６は、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞によるＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８産生と比較して、ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞におけるポリＩ：Ｃ誘導後の増強されたＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生を例示する。ＮａｍａｌｗａＰＫＲ＋＋４１．０２７細胞における誘導後７２時間のＴＮＦ−β産生のレベルは、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも約３倍（３×）高いＴＮＦ−β産生を示した。同様に、ポリＩ：Ｃでの感染後７２時間において、親のコントロールと比較して、４１．０２７細胞において１０倍より大きいＩＬ−６およびＩＬ−８が誘導された。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１Ａは、Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋  ４１．０２７細胞および野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）におけるポリＩ：Ｃ誘導に続くＰＫＲ発現のノーザンブロット分析を示す。（上段のパネル、レーン１およびレーン３−休止細胞から単離されたＲＮＡ、レーン２およびレーン４−ポリＩ：Ｃ処理された細胞由来のＲＮＡ；ならびに下段のパネルは臭化エチジウムを用いて染色されたゲルを示す）。
【０１８６】
図１Ｂは、Ｎａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋  ４１．０２７細胞および野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）におけるセンダイウイルス（ＳＶ）誘導に続くＰＫＲ発現のノーザンブロット分析を示す。（上段のパネル、レーン１−ＳＶ感染したＮａｍ−ＷＴ細胞由来のＲＮＡ；レーン２−ＳＶ感染したＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ＋＋  ４１．０２７細胞由来のＲＮＡ；および下段のパネルは臭化エチジウムを用いて染色されたゲルを示す）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランにの前にＰＭＡに２０時間曝露した後のＮａｍａｌｗａ−ＷＴおよびＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７細胞株を用いて実施した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＰＫＲ自己キナーゼ活性アッセイのオートラジオグラフィーの画像を示す。（レーン１〜レーン３−ＰＭＡを用いてプライムされたが、ポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランを用いて誘導されていないサンプルを示す；レーン４〜レーン６は、ポリＩ：ＣおよびＤＥＡＥデキストランを用いた４８時間の誘導にの前にＰＭＡを用いてプライムさせたサンプルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）中、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲキナーゼ活性を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）中、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲキナーゼ活性の増加倍率を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の、野生型（ＷＴ）中、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲ発現の蛍光ウェスタンブロット分析を示す。（レーン１〜レーン３−ＰＭＡを用いてプライムされたがポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランを用いて誘導されていないサンプルを示す．レーン４〜レーン６は、４８時間のポリＩ：ＣおよびＤＥＡＥデキストランを用いた誘導の前にＰＭＡを用いてプライムされたサンプルを示す）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）中、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲタンパク質の相対レベルを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）中、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲタンパク質の増加倍率を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲタンパク質の比活性を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＭＡ単独または４８時間のポリＩ：Ｃ／ＤＥＡＥデキストランの前にＰＭＡに２０時間暴露した後の、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）、ならびにＮａｍａｌｗａ−ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７をサブクローニングした子孫細胞株である４１．０２７．Ａ９および４１．０２７．Ｃ１中におけるＰＫＲ比活性の増加倍率を示す。
【図５】図５は、ＰＭＡプライミングおよび２４時間または４８時間のセンダイウイルス誘導に続く、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７細胞中のＩＮＦ−α産生（データセット１〜３）、ならびにＰＭＡプライミングおよび５ｍＭの２−アミノプリン（２−ＡＰ）の存在下で２４時間のセンダイウイルス誘導に続く、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７細胞中のＩＮＦ−α産生（データセット４）を図示する。この図はさらに、ＰＭＡプライミングおよび７２時間のポリＩ：Ｃ誘導に続く、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７細胞中のＩＮＦ−α産生（データセット５）、ならびにＰＭＡプライミングおよび５ｎＭの２−アミノプリンの存在下で７２時間のポリＩ：Ｃ誘導に続く、野生型Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ  ＋＋  ４１．０２７細胞中のＩＮＦ−α産生（データセット６）を図示する。
【図６】図６は、Ｎａｍａｌｗａ野生型（ＷＴ）およびＮａｍａｌｗａ  ＰＫＲ過剰発現細胞株（４１．０２７）の培養物中のＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ−８サイトカインノンレベルの分析結果の概要を図示する。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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