(57)【要約】本発明は、ルシフェリン色素の置換ヒドラジドまたはそれに類似する色素の置換ヒドラジドに関する。これらの化学化合物は、発光部分前駆体としてルシフェリン色素またはそれに類似する色素および脱離基前駆体として置換ヒドラジドを含み、ここで、該ヒドラジド基の窒素原子は該ルシフェリンもしくは該アナログのカルボニル基または該カルボニル基と化学的に等価な基に結合される。本発明はまた、生体分子とこれらの化合物との結合体および化学ルミネセンス手順におけるかかる化合物の使用に関する。
2005500281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェリン類またはそのアナログの色素およびヒドラジド基または置換ヒドラジド基を含んでなり、ここで、該ヒドラジド基の１つの窒素原子がカルボニル基または該ルシフェリンもしくは該アナログのカルボニル基と化学的に等価な基に結合されている、化学化合物。
【請求項２】
ルシフェリン類の前記色素がジメチルルシフェリンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記ヒドラジドが、カルボニル基またはチオニル基に連結されている請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
前記ヒドラジドがアルキル、アルキル−Ｙ、アリール、アリール−Ｙ、アルキル−アリール、アルキル−アリール−Ｙ、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｙ、ここでＹはカップリング基または標識である、で置換されている、請求項１〜３いずれか記載の化合物。
【請求項５】
前記ヒドラジドがＣ６、Ｃ１０またはＣ１４アリール基で置換されている、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
前記ヒドラジドが、それぞれ独立してＨ、Ｙ、アルキル、アルキル−Ｙ、アリール、アリール−Ｙ、アルキル−アリール、アルキル−アリール−Ｙ、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｙ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、Ｏ−アリール、ハロゲンから選択される置換基Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５を含む、および／または炭素環式または複素環式環系の部分としてＺ１〜Ｚ５基の２つ以上を含むフェニル基で置換されており、ここで、Ｙは前記で規定され、Ｙがカップリング基である場合のみ存在する、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
生体分子および請求項１〜６いずれか記載の化合物を含んでなる結合体。
【請求項８】
試料中の分析物の検出用の特異的結合アッセイにおける請求項７記載の結合体の使用。
【請求項９】
過酸化物の存在下で
ａ）脱離基前駆体が酸化されること、
ｂ）信号放射基前駆体が遊離されること、
ｃ）光が放射されること、および
ｃ）における発光が測定されること
を特徴とする、請求項１〜６いずれか記載の化合物または請求項７記載の結合体を使用してルミネセンス測定を実行する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ルシフェリン色素の置換ヒドラジドまたはそれに類似する色素の置換ヒドラジドに関する。これらの化学化合物は、発光部分前駆体としてルシフェリン色素またはそれに類似する色素および脱離基前駆体として置換ヒドラジドを含有し、ここで前記ヒドラジド基の窒素原子は前記ルシフェリンまたは前記アナログのカルボニル基、あるいは前記カルボニル基に化学的に等価な基に結合されている。本発明はまた、生体分子とこれらの化合物の間の結合体、および化学ルミネセンス手順におけるかかる化合物の使用に関する。
【０００２】
生物学的分子の特異的な検出および定量は、例えば、放射性同位元素標識レポーター分子の使用により優れた感度で達成されている。1950年代最後に発達した最初のラジオイムノアッセイは、広く様々な異なる検出またはレポーター系を使用する特に医学におけるインビトロ診断の最も重要なツールに成熟している。レポーター分子の周知の例は、酵素、標識ラテックスビーズ、蛍光色素および特に化学ルミネセンス色素である。
【０００３】
特異的結合アッセイの理論および実践を記載する概説が入手できる。当業者は、Tijssen,「Practice and theory of enzyme immunoassays」(1990), Elsevier, AmsterdamならびにTijssenの違った版,「Methods in Enzymology」,S. P. Colowick, N. O. Caplanand S. P.編, Academic Press（免疫学的検出方法を扱う特に70,73,74,84,92および121巻）のような教科書に特異的結合アッセイを行なうための全ての必要な技術的詳細を見出すであろう。
【０００４】
光測定技術の発達および高い感度装置の市販に平行して、発光団は、多くの適用において同位体標識と置き換わっている。いくつかの新規ルミネセンス標識は、非常に低いレベルの感度で分析物検出を容易にする。したがって、かかる標識は、商業上非常に興味深い。
【０００５】
ルミネセンス標識は、蛍光標識群とルミネセンス標識群とにさらに分けられ得る。蛍光標識が、蛍光標識の存在を検出および測定するために励起光での試料の照射を必要とする一方、化学ルミネセンス系は、特別な光の供給源を必要としない。
【０００６】
周知の化学ルミネセンスベース系は、特に以下のカテゴリー、ルシフェラーゼと対応するルシフェリン、環状アリールヒドラジド、アクリジン誘導体、安定なジオキセタン(dioxetane)、およびシュウ酸誘導体の組み合わせを含む標識を使用する。
【０００７】
化学ルミネセンス標識に使用される好ましいクラスの化合物は、対応するルシフェラーゼと組み合わせたルシフェリンまたはそれに対するアナログである(Mayer A.およびNeuenhofer,S., Luminescent labels - more than just an alternative to radioisotopes? 「AngewandteChemie: International Edition in English」(1994)1044-1072, E.P. Goelitz編, VCH VerlagsgesellschaftmbH, Weinheim)。
【０００８】
化学ルミネセンス原理にしたがって発光をもたらすいくつかの機構が提案されている。短寿命の中間体が、脱カルボキシル化および発光をもたらすプロセスの一部で考えられている。
【０００９】
非常によく知られており、最も研究された天然の光システムの１つは、北アメリカホタル(Photinus Pyralus)において「作動」する。生物ルミネセンスの機構は、30年を超えて研究されており、ルシフェリンのベンゾチアゾール誘導体が合成により得られるようになり、1960年代の初めに構造決定されたが、生物ルミネセンス反応の詳細はまだ全てが解明されているわけではない。
【００１０】
長い間、1970年代の終わりに大部分が証明されるまで、ホタルの特異的なルシフェラーゼがATPおよびマグネシウムイオンの存在下でルシフェリンの酸化を触媒すると考えられてきた。ホタルルシフェリンに対して仮定されたプロセスは、図１に概略的に示される。最初に、ルシフェリンのアシル-AMP種およびルシフェラーゼから複合体が形成される。酸素の存在下で、酸化は、光子を放射することにより基底状態に戻る励起オキシルシフェリンを確実に与える。インビボでジアニオンの黄色〜緑色の放射（λmax＝565nm）が観察され、インビボでモノアニオンのさらなる赤色放射（λmax＝615nm）（pHに依存する）が観察された。酸化は、おそらくジオキセタノン中間体を介して進み、脱カルボキシル化して励起オキシルシフェリンを与える。
【００１１】
しばしば提案されたジオキセタノンを中間体としてまたはむしろ遷移状態としてどの程度まで見ることができるのかは、まだ明瞭でない。しかし、ホタルの光反応は、全体として解明されているようである。補酵素Ａもまた光反応において役割を果たすという1950年代の終わりに最初になされた仮定が、ここ数年で確認されている。補酵素の添加は、通常のホタルルシフェリン／ルシフェラーゼ系の実用性を近い将来さらに改良するであろう。なぜなら、発光の強度および持続が、増加され得るからである。これまでのこの方法の限定因子は、ルシフェリンの限定された加水分解安定性およびルシフェラーゼの感度に加えて、ホタルから抽出された酵素ルフェラーゼの不十分な利用可能性であった。
【００１２】
上記で示したルシフェリンまたはルシフェリン誘導体の有利な使用は、検出手順に使用される色素化合物の安定性／不安定性、ならびに補助酵素（１つまたは複数）（例えば、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、ペプチダーゼ、ガラクトシダーゼ、など(aso.)）の利用可能性および安定性の両方にかなり依存する。
【００１３】
ルシフェリンおよびそれに対するアナログは、非常に魅力的な基礎特徴を有する化学ルミネセンス色素であるので、当該分野で公知の系と比較して利点を提供する化学ルミネセンスアッセイにおける使用のために、ルシフェリンクラスの色素またはそれに類似する色素を含有する新規化合物を見出しかつ同定することが本発明の課題であった。かかる利点は、例えば、独立して、安定な色素もしくは標識、高感度の検出、高い収量および／またはいずれのルシフェラーゼも必要としない化学ルミネセンス検出手順であり得る。多くの適用に対して、生体分子の標識または生体分子への結合に適切なカップリング基をさらに含有する化合物が必要とされる。
【００１４】
驚くべきことに、当該分野で公知の問題を克服するのに役立つ発光部分前駆体としてルシフェリン型色素および脱離基の前駆体として置換ヒドラジド基を含有する化合物が合成され得ることが見出された。これらの新規化合物は、置換ヒドラジド基の窒素原子と、ルシフェリン型色素のカルボニル基またはそれに対して化学的に等価な基の間のカルボニル−ヒドラジド結合により特徴づけられる。当該分野で公知の手順とは非常に異なり、本発明においてルシフェリンのルミネセンスをもたらす手順は、酵素ルシフェラーゼを必要とせず、単に化学的または酵素的酸化に基づいている。酵素的酸化において、好ましくは、強くかつ周知のペルオキシダーゼのうちの１つ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼが使用される。
【００１５】
本発明の化合物は、通常の条件下で安定である。これらの化合物のヒドラジド結合の酸化により、脱離基前駆体が活性化になり、さらなる酸化の際に脱離基は化合物を脱離し、発光基前駆体であるルシフェリン型色素は、エネルギーを化学ルミネセンスの形態で放出する。
【００１６】
要するに、本発明は、ルシフェリンクラスの色素またはそれに対するアナログと、ヒドラジド基または置換ヒドラジド基とを含有する化学化合物に関し、ここで、前記ヒドラジド基の１つの窒素原子は、前記ルシフェリンまたは前記アナログのカルボニル基または前記カルボニル基に化学的に等価な基に結合される。
【００１７】
本発明の化合物は、保存安定性ならびに化学ルミネセンス手順における高感度検出の両方を包含するので、それらはまた生体分子を標識するために使用され、大きな利点を有する得られる結合体は、試料中の分析物の検出のための適切な特異的結合アッセイに適用され得る。
【００１８】
大きな利点と共に、新規化合物は、過酸化物の検出ならびにペルオキシダーゼの検出に使用され得る。
【００１９】
本発明はまた、記載された新規化合物を用いて化学ルミネセンス測定を行なう方法に関し、この方法では、脱離基前駆体が最初に酸化され、その結果脱離基に変形し、発光基前駆体が、さらなる酸化の際に反応性になり、光の形態でエネルギーが生じ、放射光が標準手順により測定される。このルシフェリン型色素に基づく化学ルミネセンス手順は、いずれのルシフェラーゼ活性も必要としない。それは、化学的酸化またはペルオキシダーゼを用いる酵素活性化に完全に基づいている。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ルシフェリンクラスの色素またはそれに対するアナログの色素とヒドラジド基または置換ヒドラジド基とを含有する化学化合物に関し、ここで、前記ヒドラジド基の１つの窒素原子は、前記ルシフェリンまたは前記アナログのカルボニル基、または前記カルボニル基に化学的に等価な基に結合されている。
【００２１】
本発明の化学化合物は、発光部分前駆体としてルシフェリンクラスの色素またはそれに類似する色素と脱離基の前駆体として置換ヒドラジドとを含有する。これらの２つの化学実体は、前記色素のカルボニル基と前記置換ヒドラジドの窒素原子との間のアミド様結合を介して互いに連結される。この結合は、「カルボニル−ヒドラジド結合」と呼ばれる。このカルボニル−ヒドラジド結合は安定であり、したがって、全体の化学構造の安定性を確実にし、例えば、生理学的条件下または通常の保存条件下で加水分解されない。
【００２２】
発光部分前駆体としてルシフェリン様色素を含有する新規色素誘導体は、例えば、生体分子へのコンジュゲーションの間または長期保存条件下で（例えば多くの市販適用に必要とされる場合）、容易に取り扱われ得る。
【００２３】
本発明の意味において「発光部分前駆体」は、かかる化学部分を含有し、化学ルミネセンスの検出に基づく解析系において、適切な活性化に基づいて使用および測定され得る。本発明の化合物中に含有されるルシフェリン型色素は、図２に例示されるように酸化プロセスの際に発光部分に転換される。
【００２４】
本発明の発光部分前駆体は、カルボニル基または化学的に等価な基を保有するべきである。本発明の化合物において、ルシフェリン様発光部分前駆体は、もちろん、遊離の発光基前駆体として存在しないが、むしろ脱離基前駆体である置換ヒドラジドに結合される。換言すれば、記載された化合物における発光部分前駆体は、カルボニルヒドラジド結合のルシフェリンカルボン酸部分として理解されるべきである。
【００２５】
カルボニル基の特徴的でかつ重要な機能は、H2O2のような求核剤が、sp2炭素原子を攻撃し得ることである。チオカルボニルまたはシアニミノ(cyanimino)残基のような基は、カルボニル基と類似の化学特性をもたらすことは周知である。チオカルボニルおよびシアニミノ基は、「カルボニル基と化学的に等価」であるとみなされる基である。これらの基の中で、カルボニル基およびチオカルボニル基が好ましく、カルボニル基が最も好ましい。言語の重複を避けるために、以下のほとんどの場合において単に用語カルボニル基が使用される。しかしながら、適切な機能的等価物が同様に使用され得ることが理解されるべきである。
【００２６】
酸化により、安定なカルボニル−ヒドラジド結合が不安定なカルボニル-N=N結合に転換され、したがって脱離基前駆体は、脱離基に転換される。用語が示すように、脱離基は−過酸化物とカルボニル基の反応および加水分解切断後−「脱離」し、活性化ルシフェリンにもどす（図２を参照）。
【００２７】
安定なカルボニルヒドラジド結合の一部であるカルボニル基は、（脱離基が形成された後）過酸化物による攻撃の際に、光の放射を伴い、ルシフェリンから切断されるのと同じカルボニル官能基である（図２を参照）。
【００２８】
提案された機構にしたがって、H2O2の攻撃により（カルボニルヒドラジド結合の一部であった）カルボニル基は、ジオキセタノン部分の一部になる。ジオキセタノン部分の自発的な分解は、発光を伴い、カルボニル基の場合複素環式ケトンとCO2を生ずるか、またはカルボニル基の機能的等価物の場合、より一般的な化学用語でヘテロクムレン(heterocumulene)が存在していた。
【００２９】
用語「ルシフェリン様」色素は、２つの異なる局面を示すために使用される。すなわち、かかる色素は、ルシフェリンとして要約される色素のクラス（図１を参照）、およびそれに対するアナログ（構造的にかなり異なるが、類似の様式で化学ルミネセンス手順において使用され得る）（式２および３参照）のいずれかにも由来し得る。
【００３０】
用語「脱離基の前駆体」は、本発明の酸化によるさらなる化学修飾なしには、脱離基前駆体が脱離基として機能しないかまたは少なくとも非常に不十分な脱離基であり、発光部分前駆体が、酸化なしに本質的に遊離しないことを示すために使用される。脱離基前駆体のヒドラジド結合の酸化がなければ、発光部分前駆体と脱離基前駆体との間のカルボニルヒドラジド結合は、加水分解に対して安定である。
【００３１】
本発明の化合物において、脱離基の前駆体は脱離基の代わりに使用される。好ましい態様において、化合物は、ヒドラジド基を含有する。さらに好ましい態様において、化合物は、置換ヒドラジド基を含有する。これらの脱離基前駆体は、それらがカルボニルヒドラジド結合の一部として「酸化され得る(oxidizable)」窒素を含むことに特徴づけられる。
【００３２】
「酸化され得る」は、前記カルボニル−ヒドラジド結合中の前記窒素が、電子リッチであり、電子が容易に引き抜かれ得る、すなわちしたがって窒素またはヒドラジド結合が酸化されることを意味する。当業者が認識するように、電子リッチ窒素は少なくとも１つのいわゆる（電子）供与体置換基の付着を必要とする。供与体置換基は当業者に周知であり、ここで詳しく述べる必要はない。供与体置換基は、かかるヒドラジド基の１つの窒素原子に直接にまたは代替的にはビニローグに(vinylogous)もしくはフェニローグ(phenylogous)に付着され得る。両方の場合において、窒素原子は、Huenig(Huenig, S., Pure & Appl. Chem. 62(1990)396-406)に記載されるような可逆的二段階酸化還元系としても知られている、二段階供与体−π−供与体酸化還元系の還元形態の一部である。
【００３３】
好ましい態様において、ルシフェリンクラスの色素は、式１の色素である。それに対するアナログは、式２および３により表される色素から選ばれる。
【００３４】
【化１】
2005500281.tif 000003
【００３５】
R1＝R1＝H、低級アルキル(C1〜C6)、
R2＝R2＝H、CH3
【００３６】
好ましい態様において、R1およびR2の両方は、メチル基である。驚くべきことに、例えば、ジ-メチル-ルシフェリンは化学ルミネセンスのフラッシュ速度論を示す一方、ホタルルシフェリン(R1およびR2が水素である)は長く続く「グロー型」速度論を示すことが見出された。
【００３７】
【化２】
2005500281.tif 000004
【００３８】
X＝O  2-(4ヒドロキシフェニル)4Hベンゾ[エ][1,3]オキサジン-4-カルボン酸
X＝S  2-(4ヒドロキシフェニル)4Hベンゾ[エ][1,3]チアジン-4-カルボン酸
X＝N-アルキル  N-アルキル-2-(4ヒドロキシフェニル)1,4ジヒドロキナゾリン4-カルボン酸
【００３９】
【化３】
2005500281.tif 000005
【００４０】
X＝O  2-(4ヒドロキシフェニル)4,5ジヒドロオキサゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸
X＝S  2-(4ヒドロキシフェニル)4,5ジヒドロチアゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸
X＝N-アルキル  N-アルキル-2-(4-ヒドロキシフェニル)4,5ジヒドロイミダゾール5,5ジメチル-4-カルボン酸；
R1およびR2は、上記で規定されたものである。
【００４１】
好ましい態様において、本発明は、発光部分前駆体として式１のルシフェリン色素と脱離基の前駆体としてヒドラジドまたは置換ヒドラジドとを含有する化合物に関し、ここで前記ルシフェリンのカルボニル基または化学的に等価な基が脱離基前駆体のヒドラジド窒素原子に連結されている。式４は、ルシフェリンクラスの色素の色素に基づくかかる化合物の例を与える。もちろん、式２および３に与えられるルシフェリンに類似する色素もまた使用され得、ルシフェリン（またはそれに対するアナログ）が、そのd-、またはそのl-、またはラセミ形態で使用され得ることを心に留めておくべきである。
【００４２】
【化４】
2005500281.tif 000006
【００４３】
R１＝H、低級アルキル(C1〜C6)、
R２＝H、CH３、
R３＝R１、アルキル、アルキル-Y、アリール、アリール-Y、アルキル-アリール、アルキル-アリール-Y、ヘテロアリール、ヘテロアリール-Y、またはそれらの置換型、式中Y＝カップリング基または標識。
【００４４】
好ましいアルキルは、低級アルキル(C1〜C6)であり、また好ましくはアリールは、C6、C10またはC14アリールである。最も好ましくは、アリール基は、フェニル基である。
【００４５】
Yがカップリング基である場合、Y基は、第２の分子、特にタンパク質、多糖、ポリヌクレオチドまたは別の生物学的物質に結合体化され得る（以下を参照）。
【００４６】
Yが標識である場合、好ましい標識分子は、2000ダルトン未満の分子量を有し、標識ビオチンおよびジオキシゲニンが最も好ましい。
【００４７】
R3は、電子リッチであり、したがって、ヒドラジド結合の酸化を促進する残基であるのが好ましい。R3に対するかかる好ましい基は、上記のようなπ電子系の態様である残基である。
【００４８】
最も好ましくは、R3はフェニル残基であり、式５に規定される置換基を保有する。
【００４９】
【化５】
2005500281.tif 000007
【００５０】
式中、R1およびR2は、上記で規定されたものであり、
Z1、Z2、Z3、Z4およびZ5は、独立して、H、Y、アルキル、アルキル-Y、アリール、アリール-Y、アルキル-アリール、アルキル-アリール-Y、ヘテロアリール、ヘテロアリール-Y、OH、NH2、O-アルキル、NH-アルキル、N(アルキル)2、O-アリール、ハロゲンであり、および／または炭素環式または複素環式の環系の一部としてZ1〜Z5基の２つ以上を含有しており、式中Yは上記で規定されたものであり、Yがカップリング基である場合のみ存在する。
【００５１】
特に好ましくは、Z1〜Z5は、独立して、H、OH、NH2、アルキル(C1〜C6)、O-アルキル(C1〜C6)、NH-アルキル(C1〜C6)、N(アルキル(C1〜C6))2、アルキル(C1〜C6)-Y、O-アルキル(C1〜C6)-Y、NH-アルキル(C1〜C6)-Y、N-アルキル(C1〜C6)-アルキル(C1〜C6))-Yから選ばれる。
【００５２】
発光部分前駆体としてルシフェリン様色素と脱離基の前駆体としてヒドラジドまたは置換ヒドラジドとを含有し、互いにカルボニル−ヒドラジド結合により連結されている本発明の化合物は、例えば生体分子の標識に関して非常に魅力的な標識である。生体分子への標識のカップリングに使用される方法は、ここ数年間でかなり成熟しており、優れた概観が、Aslam, M. およびDent, A., The preparation of protein-protein conjugates 「Bioconjugation」(1998) 216-363, M. AslamおよびA. Dent編、McMillian, London および上記Tijssen 「Practice and theory of enzyme immunoassays」における「Macromolecule conjugation 」の章に与えられている。当業者は、結合体をどのように作製するかを知っており、および／またはこれらの教科書においてかかる結合体の作製に必要な全ての情報を見出すであろう。
【００５３】
適切なカップリング化学が、前記引用文献から公知である(Aslam、上記）。本発明の化学化合物は、好ましくは調査中の生体分子に適切なカップリング化学に適合するカップリング基を含有するように設計され、合成される。
【００５４】
好ましい態様において、本発明の化学化合物のY基は、カップリング基である。このカップリング基は、生体分子への化合物の化学的カップリングに使用される反応基または活性化基である。Y基は、好ましくはカルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物、カルボン酸ヒドラジド、カルボン酸アジドなどの活性化カルボン酸基または活性エステル（例えば、N-ヒドロキシ-スクシニミド、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、イミダゾリルまたはN-ヒドロキシベンゾトリアゾリルエステル）、アミン、マレイミド、チオール、パラ−アミノベンゾイル基または光活性化基（例えば、アジド）である。Yは、カップリングが行われる生体分子の化学官能基に適合するように選択される。
【００５５】
生体分子のアミノ基（末端-NH2基またはリジン側鎖のNH2基、ならびにジアミノカルボン酸のω−アミノ基）は、「アミノ化学」に基づくそれへのマーカー基の化学的カップリングに使用され得る。アミノ化学の周知の例は、中でも、いわゆる活性化基(NHS-エステル、他の活性化エステル、酸塩化物およびアジドなど)とアミノ基との反応を含む。
【００５６】
生体分子上のカルボキシル基（末端-COO−基、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボキシ官能基）は、「カルボキシ化学」に基づく化学的カップリングに使用される。カルボキシ化学の周知の例は、中でも上記活性化基を保有するようなこれらのカルボキシ基の活性化を含む。次に、マーカー上の例えばアミノ基へのカップリングが容易に行なわれ得る。
【００５７】
代替的には、生体分子上のスルフヒドリル基（例えば、システインの遊離の-SH基またはジスルフヒドリル架橋の還元により得られる-SH基）は、「スルフヒドリル化学」に基づく化学的カップリングに使用される。スルフヒドリル化学の周知の例は、中でも、マレイミド基と-SH基との反応、あるいは、α-ハロゲンカルボキシル基とのまたはチオエーテルによるアルキル化を含む。
【００５８】
チロシン残基の水酸基またはヒスチジンのイミダゾール基はまた、例えば、ジアゾニウム基の助けを借りて生体分子に本発明の化合物を共有結合するために使用され得る。
【００５９】
カップリング基は、発光基前駆体の一部または脱離基前駆体の一部のいずれかであり得る。化学ルミネセンス基と生体分子の両方がきわめて接近している場合、大きな生体分子は、化学ルミネセンス基により放射されるルミネセンス光を妨害し得ることが、一般に認められている。したがって、好ましくは、カップリング基が脱離基前駆体の一部であり、好ましくはかかる化合物が生体分子へのカップリングに使用される。この場合、脱離基の前駆体の酸化の際に、発光部分前駆体は生体分子から放出され、両方の分子はもはやきわめて接近はしていない。これが、試料中の分析物の検出のためのアッセイにおいて有利である。
【００６０】
一般に、本発明の化合物は、発光前駆体の活性化型（好ましくは酸塩化物）を還元型の脱離基前駆体と反応させることにより合成される。脱離基前駆体として適切であるヒドラジドを含む化学物質は、市販されているか、または標準手順により合成され得る。好ましい置換ヒドラジドは、置換アリールヒドラジドであり、最も好ましくは置換フェニルヒドラジドである。
【００６１】
用語「生体分子」は、治療または診断分野における目的の分子および物質を含有する。本発明の意味において生体分子は、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、脂質、および／または糖のような生物学的分子からなる任意に天然に生じるかまたは合成により作製される分子であり得る。合成アミノ酸または合成ヌクレオチドまたは核酸アナログのようなその非天然誘導体はまた、生体分子を置換するために使用され得る。
【００６２】
好ましい態様において、生体分子は、ポリペプチド、核酸、および低分子量薬物からなる群より選ばれる。
【００６３】
本発明の特徴を有する発光部分前駆体と脱離基の前駆体を含有する化合物と生体分子との間の結合体は、さらに好ましい態様を表わす。生体分子と本発明に記載される化学化合物との間の結合体が、試料中の分析物の検出のための特異的結合アッセイにおいて大きな利点であることは、当業者により容易に認められるであろう。
【００６４】
一般的に特異的結合アッセイは、バイオアフィン(bioaffine)結合対の２つのメンバーの特異的相互作用に基づいている。かかる結合対における適切な結合パートナーの例は、ハプテンまたは抗原とそれに反応する抗体、ビオチンまたはアミノ,ビオチン、イミノビオチンもしくはデスチオビオチンなどのビオチン−アナログ（ビオチンまたはストレプトアビジンに結合する）、糖とレクチン、核酸または核酸アナログと相補的な核酸、レセプターとリガンド（例えば、ステロイドホルモンレセプターとステロイドホルモン）、および酵素とその基質である。
【００６５】
核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの検出に基づくアッセイにおける核酸（または核酸アナログ）とそれに相補的な核酸との間の特異的相互作用および抗体と広範囲の免疫アッセイに基づくそれぞれの抗原との特異的相互作用は、最も好ましい結合対である。
【００６６】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの理論および実践は、Kessler, C.の「Non-radioactive labeling and detection of biomolecules」（1992）, Springer Verlag, Heidelbergなどの関連教科書に要約される。当業者は、その中で全ての関連項目を見出す。
【００６７】
現今、免疫学的検定法は広く使用され、当業者にとって一般的知識である。関連方法および手順は、「Bioconjugation」Aslam, M.およびDent, A.（1998）216〜363, London, McMillan Referenceおよび「Practice and theory of enzyme immunoassays」Tijssen（1990）, Amsterdam, Elsevierなどの関連教科書に要約される。包括的な概要もまた、Mayer, A.およびNeuenhofer, S.によって書かれた論文「AngewandteChem. intern. Ed. Engl.」（1994）1063〜1068, Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft mbHに見出され得る。
【００６８】
本明細書に記載の化学化合物は、発光部分前駆体と脱離基の前駆体との間のカルボニル−ヒドラジド結合が脱離基前駆体の酸化の際に不安定になるという著しい特性を有する。従って、光発生（すなわち化学ルミネセンス）は、酸化剤および過酸化物の存在に依存する。従って、記載される化学化合物が一方では過酸化物の検出アッセイおよび他方ではペルオキシダーゼの検出アッセイの両方に使用され得ることは明らかである。
【００６９】
好ましい態様において、本発明の化合物は、過酸化物の検出方法に使用される。
【００７０】
ペルオキシダーゼを使用して、酸化後脱離基として機能する脱離基前駆体を酸化し得る。従って、適切なアッセイ条件下で、ペルオキシダーゼの存在は、放射される化学ルミネセンス光の測定の際に検出され得る。好ましい態様において、本発明の化学化合物は、ペルオキシダーゼの活性に基づく検出方法に使用され得る。最も好ましくは、新規化合物は、ペルオキシダーゼの検出に使用される。
【００７１】
脱離基前駆体のヒドラジド基を酸化するために、種々の機構がすぐに使える。一方では脱離基前駆体および他方では適用の様式の酸化性に依存して、適切な酸化剤が選択される。
【００７２】
本発明の方法を実施する好ましい様式において、酸化はペルオキシダーゼを使用して実施される。
【００７３】
適切な化学酸化剤を使用することも好ましい。本発明の測定プロセスについて、発光分子の破壊が起こらないこと（例えば、Ｃ−Ｃ結合の破壊が起こらないこと）を保証する化学酸化の条件が、選択されなければならない。典型的な化学酸化剤としては、過ホウ酸塩、過硫酸塩、DDQ（ジシアノジクロロキノン）、希HNO3、Br04-、H2O2、または硝酸セルアンモニウム（cerammonium）IVが挙げられる。上記のように、この工程における酸化条件は、発光分子の破壊が起こらないように選択されなければならない。かかる条件は、日常の実験によって容易に達成される。
【００７４】
好ましくは、発光基前駆体の酸化に使用される試薬は、脱離基前駆体を脱離基へ変換するために使用されるものと同じである。最も好ましくは、酸化が実施され、光がペルオキシダーゼの存在下でH2O2の使用により発生する。
【００７５】
さらに好ましい様式において、酸化は電気化学手段により実施される。
【００７６】
さらに好ましい態様において、本発明は、本発明の化合物の使用に基づくルミネセンス測定を実施する方法に関する。この方法は、過酸化物の存在下で、脱離基前駆体が酸化され、発光基前駆体が活性化され、エネルギーが放射され、測定されることに特徴を有する。
【００７７】
本発明の化学化合物は、活性な脱離基を含まない。脱離基前駆体は酸化されなければならず、その酸化された形態が脱離基として作用する。これを、脱離基前駆体を脱離基に変換する酸化工程と呼ぶ。ドナー−π−ドナー脱離基の場合、これはWursterまたはWeitz型の酸化還元プロセスが生じることを意味する（Huenig、前出）。
【００７８】
発光部分前駆体は、脱離基前駆体の酸化後、容易に遊離する。過酸化物または反応性酸素種（酸素ラジカルアニオンなど）の作用の際に、図２に示した機構に従って、発光部分の前駆体は、カルボキシル基が除去されて電子的に励起したエミッターを発生するジオキセタン（dioxetane）中間体をおそらく形成する。このエミッターの基底状態への遷移は光子の放出（＝化学ルミネセンス）により起こる。それにより放射されるエネルギー（光）は、標準的手順により日常の器具を用いて測定される。
【００７９】
示されるように、H2O2または酸素ラジカルアニオンなどの反応性酸素種は、中間体ジオキセタノン（dioxetanone）を形成するために存在していなければならない。H2O2は、直接的に付加または例えば酵素反応（グルコースオキシダーゼ／グルコース）により間接的に生成され得る。反応性酸素種は、酸素またはH2O2から化学ルミネセンス反応の間に生成される。あるいは、反応性酸素種は、例えば、酸素開始Ｃ−Ｃカップリングにより計画的に生成され得る（インドキシル−リン酸塩、米国特許第5,589,328号）。
【００８０】
上記の酸化工程（例えば、ペルオキシダーゼなどの酵素により触媒される）はまた、媒介物質またはエンハンサーの使用により加速され得る。
【００８１】
媒介物質は、電子伝達プロセスを加速することによって化合物の酸化を促進する酸化還元活性化合物である。媒介物質は酸化剤により酸化され、次いで本発明の化合物を酸化し、それにより、媒介物質は再度還元される。典型的な媒介物質はヘキソシアノ鉄酸塩（II）およびフェロセンなどの金属複合体である。化学ルミネセンス反応に使用される他のエンハンサーとしては、ヨードフェノールまたはフェニルボロン酸（boronic acid）などの化学物質が挙げられる。
【００８２】
酸化は好ましくは、発光複素環式ケトンの周囲に疎水性微小環境（microenvironment）を作る適切な界面活性剤の存在下で実施される。これにより、化学ルミネセンス定量収量の増加を生じる。なぜならば、水分子との相互作用によるクエンチングが減少するからである。さらに、フルオレセインなどの適切な蛍光物質（fluorophor）が界面活性剤に共有結合され得るか、あるいは、蛍光物質は、励起した複素環式ケトンからこの蛍光物質へエネルギー転移させるために反応混合物に添加され得る。
【００８３】
本発明に記載の化合物のさらなる魅力的な特性は、全く異なる反応動態が生じ得ることであり、必要により選択される化合物である。これは、図３および４に示される放射動態を比較することにより明らかとなる。グロー（glow）型反応動態（緩徐であるが長期持続反応）は、ブロット技術などの適用に非常に好ましい。ブロット技術に関連する染色への本発明のグロー型化合物の使用もまた、好ましい態様である。
【００８４】
最も好ましくは、フラッシュ型化合物（高い強度ピーク型の速い発光）は、液相免疫学的検定法に使用される。
【００８５】
以下の実施例、参考文献、及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。示される手順における改変は本発明の趣旨を逸脱せずになされ得ることが理解される。
【００８６】
実施例
（実施例１および２の合成経路はまた、図３に示される。実施例１および２の下線を付した数は、その中に描かれる化学構造に対応する。）
【００８７】
実施例１：ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジド［4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾ-チアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸ヒドラジド］の合成
ａ）ジメチルルシフェリン（4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イルカルボン酸）（３＝図３における構造３）の調製
704mg（4mmol）の2-シアノ-6-ヒドロキシベンゾチアゾール１（欧州特許第0024525号に従って調製）、596mg（4mmol）のD-ペニシラミン２（Aldrich, no.P40-3）および276mg（2mmol）の炭酸カリウムを、アルゴン雰囲気下で6mlのメタノールおよび3.2mlの蒸留水に溶解する。撹拌しながら混合物を3時間還流して、澄明な黄色液体を得る。
【００８８】
ロータリーエバポレーターを使用して、減圧で溶媒を除去する（水浴40℃）。残った黄茶色がかった懸濁液を100mlの蒸留水に溶解し、pHをconc.塩酸で2に調整する。所望の生成物を沈殿させ、焼結ガラス漏斗を用いて濾過除去する。残渣を小容積のメタノールでフラスコに洗い落とす。続いて、メタノールをロータリーエバポレーターを用いて減圧下で除去（水浴40℃）して、黄色固体を得る。
【００８９】
多くの以下の化合物と同様に薄層クロマトグラフィー＝TLCにより分析を実施する。
【００９０】
TLC（Kieselgel 60 F254、メタノール／クロロホルム  1/1）：Rf＝0.81
【００９１】
ｂ）2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチルチアゾール-4-イルカルボン酸塩化物）（図３における構造５）の調製
385mg（1.25mol）のジメチル-D-ルシフェリン３をアルゴン雰囲気下で50mlの乾燥テトラヒドロフランに溶解する。415mg（2.75mmol）のtert.-ブチルジメチルシリル塩化物（Aldrich, no. 19,050-0）および続いて0.506ml（5.0mol）のトリエチルアミンを周囲温度で添加する。数分後、塩化アンモニウムの白色沈殿が形成される。溶液を一晩アルゴン雰囲気下で撹拌し、次いで、沈殿物を濾過除去し、溶媒をロタベーパー（rotavapor）で除去（水浴40℃）して、2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチル-4,5-ジヒドロチアゾール-4-イルカルボン酸tert.-ブチルジメチルシリルエステル；（図３における構造４）を黄色でわずかに茶色がかった油を得る。
【００９２】
2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸をアルゴン雰囲気下で8mlの乾燥塩化メチレンに溶解し、澄明な溶液を-15℃に冷却し、0.162ml（1.875mmol）の塩化オキサリルと500μlの新鮮な蒸留ジメチルホルムアミドの混合物を、勢い良く撹拌しながら反応液に滴下する。わずかなガス放出をこの工程中に観察することができる。反応混合物を-15℃にてさらに30分間撹拌し、続いて新鮮な蒸留塩化メチレンで最終容積30mlに希釈する。
【００９３】
2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸塩化物５の生じた澄明な茶色がかった赤色溶液を、さらなる精製なしに次工程に直接使用する。
【００９４】
ｃ）N-BOC-ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジド[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾ-チアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸2-(1,1-ジメチルエトキシカルボニル)ヒドラジド７の調製
前記実験から得た1.25mmolの2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸塩化物５の溶液を、室温に移した。333mg（2.5mmol）のtert.-ブチルカルバゼート（carbazate）６（Aldrich, no. B-9,100-5）を含有する5mlの新鮮な蒸留テトラヒドロフランおよび250μmol（2.5mmol）のトリエチルアミンを添加する。アンモニウム塩の沈殿が観察され、懸濁液を4時間油浴で60℃に加熱する。混合物を室温に冷却し、沈殿物を濾過により除去し、溶液をエバポレートする。約1gの赤色油を得る。200mg分を調製用逆相HPLCシステム（VydacC-18カラム、300Å、15〜20μm、50×250m）に適用する。生成物をアセトニトリル／蒸留水勾配（0〜100％アセトニトリル；0.1％トリフルオロ酢酸）で溶出する。6位のほとんどのシリル保護基がこの検査手順中に除去され、脱シリル化した（desilylated）生成物を、極僅かなシリル化生成物と共に得る。
【００９５】
適切な画分を収集してプールする。最後に、溶媒を凍結乾燥により除去して、60mgの僅かに緑色の生成物７を得る。
【００９６】
TLC（Kieselgel 60 F254、酢酸エチル／メタノール  1/1）：Rf＝0.89
【００９７】
ｄ）ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジド[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾ-チアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸ヒドラジド８の調製
54mg（100μmol）BOC保護ヒドラジド７を、2mlの乾燥テトラヒドロフランに溶解し、氷浴で0℃に冷却する。2mlのトリフルオロ酢酸を添加し、次いで氷桶（bat）を取り除く。1時間、澄明な黄色溶液を撹拌した後、溶媒をエバポレートし、残渣をジオキサンから凍結乾燥する。純粋な生成物８をオフホワイトの固体として得る（収量：44mg）。
【００９８】
TLC（Kieselgel 60 F254、酢酸エチル／メタノール  1/1）：Rf＝0.48
【００９９】
分子量をエレクトロスプレーイオン化質量分光学＝ESI-MSにより確認している。MSI-MS：M+＝322
【０１００】
実施例２：ジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジド[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾ-チアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸2-フェニルヒドラジドの合成
ａ）4,5-ジヒドロ-2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸-2-フェニルヒドラジド１０の調製
1.25mmolの2-(6-tert.-ブチルジメチルシリルオキシベンゾチアゾール-2-イル)-4,5-ジヒドロ-5,5-ジメチル-4-チアゾールカルボン酸塩化物５の溶液を、5mlのピリジン、2mlのジメチルホルムアミドおよび395μl（4mmol）のフェニルヒドラジド９（Merck eurolab, no.107251）の混合物（全ての成分は新鮮な蒸留物）と共に粉砕する。橙色への色の変化を元に沈殿の瞬時形成が観察される。混合物を室温に移し、48時間撹拌する。固体を濾過により除去し、澄明な溶液をエバポレート（オイルポンプ減圧、水浴40℃）する。生成物を調製用逆相HPLC（Waters Delta Pak C-18カラム、100Å、15μm、50×300mm）により残存する深橙色油から分離する。生成物をアセトニトリル／蒸留水勾配（0〜70％アセトニトリル；0.1％トリフルオロ酢酸）で溶出する。適切な画分を収集しプールする。最後に、溶媒を凍結乾燥により除去して、121mgの橙色生成物１０を得る。
【０１０１】
TLC（Kieselgel 60 F254、石油（petrol）エーテル／酢酸エチル  1/1）：Rf＝0.87
【０１０２】
ｂ）ジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジド[4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシベンゾ-チアゾール-2-イル)-5,5-ジメチルチアゾール-4-イル-カルボン酸2-フェニルヒドラジド１１の調製
102mg（200μmol）のシリル化ヒドラジン１０を15mlの新鮮な蒸留テトラヒドロフランにアルゴン下で溶解し、105mg（400μmol）のフッ化テトラブチルアンモニウム一水和物（Aldrich, no. 24,151-2）を添加する。反応容器を密閉し、溶液を１時間室温にて撹拌する。20mlのジクロロメタンを添加し、次いで混合物を分液漏斗に移動し2×10mlの5％塩化アンモニウム溶液、続いて2×10mlの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄する。溶媒をエバポレートして、粗生成物を調製用HPLC（Waters Delta Pak C-18カラム、100Å、15μm、50×300mm）で精製する。生成物をアセトニトリル／蒸留水勾配（0〜70％アセトニトリル；0.1％トリフルオロ酢酸）で溶出する。適切な画分をプールし、凍結乾燥後、生成物１１を僅かに緑色の固体として得る（収量：14mg）。
【０１０３】
TLC（Kieselgel 60 F254、石油（petrol）エーテル／酢酸エチル  1/1）：Rf＝0.75
【０１０４】
分子量をエレクトロスプレーイオン化質量分光学＝ESI-MSにより確認している。MSI-MS：M+＝398
【０１０５】
実施例３：化学ルミネセンス
測定をBerthold LumatLB953により行った。化学ルミネセンスを生じるために、２つのトリガーを使用している。トリガー１は、脱離基前駆体の酸化を引き起こし、トリガー２は化学ルミネセンスを促進する。
【０１０６】
トリガー１：300μl、0.5％ H2O2、0.1M HNO3
【０１０７】
トリガー２：300μl、0.25M NaOH
【０１０８】
実施例１および２それぞれのルシフェリンカルボニルヒドラジドを、0.1％Thesitを含有するPBS緩衝液に1×10-8Mol/lに希釈した。100μlの試料を5mlのSarstedtチューブに分配して装置に配置した。トリガー１を-1位置に添加し、トリガー２を装置の測定位置に添加した。測定を10秒間行った。
【０１０９】
実施例１および２で合成した化合物の発光の動態をそれぞれ図４および５に示す。わかるように、フェニル置換は、より鋭いピークの蛍光をもたらす。
【０１１０】
参考文献の表
Aslam, M.およびDent, A., The preparation of protein-protein conjugates 「Bioconjugation」（1998）216〜363, M. AslamおよびA. Dent編, McMillan London
Huening, S., Pure & Appl. Chem. 62（1990）396〜406
Kessler, C.,「Non-radioactive labeling and detection of biomolecules」（1992）, Springer Verlag, Heidelberg
Mayer, A.およびNeuenhofer, S., Luminescent labels - more than just an alterative to radioisotopes?「Angewandte Chemie: international Edition in English」（1994）1044〜1072, E.P. Goelitz編, VCH VerlagsgesellschaftmbH, Weinheim
Tijssen,「Methods in Enzymology」, S.P. Colowick編, N.O. Caplan and S.P., Academic Press
Tijssen, 「Practice and theory of enzyme immunoassays」（1990）, Elsevier, Amsterdam
米国特許第5,589,328号
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、ルシフェリンに基づくルミネセンス反応である。次の略語が使用される：ATP＝アデノシン三リン酸；AMP＝アデノシン一リン酸；HS-CoA＝補酵素（co-enzym）Ａ。
【図２】図２は、ルシフェリンヒドラジドに対するルミネセンス反応の提案機構である。用語「nucl.」は、中間求核性置換を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジドおよびジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジドの合成経路である。次の略語が使用される：TBDMS＝tert.-ブチルジメチルシリル塩化物；（COCl）2＝塩化オキサリル；DMF＝ジメチルホルムアミド；TFA＝トリフルオロ酢酸；TBAF＝テトラブチルフッ化アンモニウム；Z（1-5）は、フェノール環での１つまたは数個の置換基である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジドおよびジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジドの合成経路である。次の略語が使用される：TBDMS＝tert.-ブチルジメチルシリル塩化物；（COCl）2＝塩化オキサリル；DMF＝ジメチルホルムアミド；TFA＝トリフルオロ酢酸；TBAF＝テトラブチルフッ化アンモニウム；Z（1-5）は、フェノール環での１つまたは数個の置換基である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジドおよびジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジドの合成経路である。次の略語が使用される：TBDMS＝tert.-ブチルジメチルシリル塩化物；（COCl）2＝塩化オキサリル；DMF＝ジメチルホルムアミド；TFA＝トリフルオロ酢酸；TBAF＝テトラブチルフッ化アンモニウム；Z（1-5）は、フェノール環での１つまたは数個の置換基である。
【図４】図４は、ジメチル-D-ルシフェリンヒドラジドのルミネセンス反応である。RLU＝相対光吸収度単位
【図５】図５は、ジメチル-D-ルシフェリンフェニルヒドラジドのルミネセンス反応である。RLU＝相対光吸収度単位
【図１】
2005500281.tif 000008
【図２】
2005500281.tif 000009
【図３Ａ】
2005500281.tif 000010
【図３Ｂ】
2005500281.tif 000011
【図３Ｃ】
2005500281.tif 000012
【図４】
2005500281.tif 000013
【図５】
2005500281.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005500281.tif 000015
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月10日(2003.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェリン類またはそのアナログの色素および置換ヒドラジド基を含んでなり、ここで、該ヒドラジド基の１つの窒素原子がカルボニル基または該ルシフェリンもしくは該アナログのカルボニル基と化学的に等価な基に結合されており、該ヒドラジドが、それぞれ独立してＨ、Ｙ、アルキル、アルキル−Ｙ、アリール、アリール−Ｙ、アルキル−アリール、アルキル−アリール−Ｙ、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｙ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−アルキル、ＮＨ−アルキル、Ｎ（アルキル）２、Ｏ−アリール、ハロゲンから選択される置換基Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４およびＺ５を含む、および／または炭素環式または複素環式環系の部分としてＺ１〜Ｚ５基の２つ以上を含むフェニル基で置換されており、ここで、Ｙは前記で規定され、Ｙがカップリング基である場合のみ存在する、化学化合物。
【請求項２】
ルシフェリン類の前記色素がジメチルルシフェリンである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記ヒドラジドがカルボニル基またはチオニル基に連結されている請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
前記ヒドラジドがアルキル、アルキル−Ｙ、アリール、アリール−Ｙ、アルキル−アリール、アルキル−アリール−Ｙ、ヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｙ、ここでＹはカップリング基または標識である、で置換されている、請求項１〜３いずれか記載の化合物。
【請求項５】
前記ヒドラジドがＣ６、Ｃ１０またはＣ１４アリール基で置換されている、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
生体分子および請求項１〜５いずれか記載の化合物を含んでなる結合体。
【請求項７】
試料中の分析物の検出用の特異的結合アッセイにおける請求項６記載の結合体の使用。
【請求項８】
過酸化物の存在下で
ａ）脱離基前駆体が酸化されること、
ｂ）信号放射基前駆体が遊離されること、
ｃ）光が放射されること、および
ｃ）における発光が測定されること
を特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の化合物または請求項６記載の結合体を使用してルミネセンス測定を実行する方法。
【国際調査報告】
2005500281.tif 000045
2005500281.tif 000046
2005500281.tif 000047
2005500281.tif 000048
2005500281.tif 000049