(57)【要約】逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用した、遺伝子発現の数値の遺伝子試料間での直接比較のための方法が記載される。ＣＤＮＡ、競合鋳型混合物、複数の遺伝子に対するプライマー対を、少なくとも１種の適切なバッファーおよび少なくとも１種の適切な酵素と合わせ、混合物を形成する。混合物は予め決められたサイクル数で増幅し、ＰＣＲ産物を形成する。ＰＣＲ産物は、少なくとも１種の適切なバッファー、少なくとも１種の適切な酵素、およびそれぞれの遺伝子に特異的な１種のプライマー対と混合する。得られた混合物は付加的な予め決められたサイクル数で増幅する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のことを含む、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用した遺伝子試料間の数字で表した遺伝子発現値の直接比較のための方法：
ｉ）複数の遺伝子に対するｃＤＮＡ、競合鋳型混合物、およびプライマー対と少なくとも１種の適切なバッファーおよび少なくとも１種の適切な酵素を合わせて第１混合物を形成し、そして第１混合物を予め決めたサイクル数で増幅し、ＰＣＲ産物を形成すること；
ｉｉ）少なくとも１種の適切なバッファー、少なくとも１種の酵素、およびそれぞれの遺伝子に特異的な１種のプライマー対の予め決めた量を混合して第２混合物を形成し、そして第２混合物を予め決めた付加的なサイクル数で増幅すること。
【請求項２】
（ｉ）のＰＣＲ産物が約３〜約４０サイクルの間で増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）のＰＣＲ産物が５、８、１０または３５サイクルで増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）のＰＣＲ産物が約３５サイクルで増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）のＰＣＲ産物が１／１００，０００に希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも約１００，０００の遺伝子発現量が（ｉ）ＰＣＲ産物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
比較される遺伝子数が増加する場合、プライマー対が約０．０５〜約０．００５μｇ／μｌに希釈される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
数字で表した遺伝子発現値と臨床的に関連する表現型との相関を明らかにし、遺伝子発現値の組み合わせを少なくとも１種の具体的な表現型を説明する少なくとも１種の指標にする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
それぞれの遺伝子の内部標準競合鋳型を作製し、クローニングして少なくとも約１０１０アッセイのための競合鋳型を作製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
約１０００遺伝子までに対する競合鋳型が一緒に混合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイが約６分子以下の感度を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
競合鋳型（ＣＴ）混合物が少なくとも１種の競合鋳型（ＣＴ）基準、またはハウスキーピング遺伝子、および少なくとも１種の標的遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＴ混合物が少なくとも１種の基準遺伝子のＣＴおよび少なくとも１種の標的遺伝子のＣＴを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＴ混合物が少なくとも１種の基準遺伝子のＣＴおよび複数の標的遺伝子のＣＴの組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種の基準遺伝子がβ‐アクチンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１種の基準遺伝子がＧＡＰＤＨを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現がｉ）基準遺伝子の固有鋳型（ＮＴ）対競合鋳型（ＣＴ）の比；ｉｉ）それぞれの標的遺伝子のＮＴ／ＣＴの比；およびハウスキーピングＮＴ／ＣＴ比（ｉ）に比較した標的遺伝子ＮＴ／ＣＴ比（ｉｉ）の比を計算することにより定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
定量ＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物を測定するために高密度オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡアレイの使用をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
増幅されているそれぞれのｃＤＮＡのセンス鎖またはリバース鎖にハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡが蛍光標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲ反応物のオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ内の１種以上のｄＮＴＰが蛍光色素により標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
高密度オリゴヌクレオチドアレイが以下の特性を有する、請求項１８に記載の方法：
それぞれの遺伝子に対して、以下の２種のオリゴヌクレオチドアレイが作製される；
ｉ）アレイ上の１遺伝子座はＰＣＲにより増幅された遺伝子の固有鋳型に特有の配列に相同で、結合することになるオリゴヌクレオチドをそれに結びつけている；および
ｉｉ）アレイ上の別の遺伝子座は、競合鋳型の５′末端と、競合鋳型の切断されて不適切に配列された３′末端間の連結部分にまたがる配列に相同で、結合することになるオリゴヌクレオチドをそれに結びつけている。
【請求項２２】
標的遺伝子の発現がハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の固有鋳型およびＣＴのアレイの蛍光強度を比較することにより定量される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのプロセスの組み合わせにおいて、以下の工程を実行するソフトウェアプログラムを含む、請求項１に記載の方法：
ａ）試料の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の形式を標的遺伝子に実施する場合に使用されるＣＴ試薬の所望する濃度を決定する工程；ならびに
ｂ）少なくとも１種の所望する試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲが実施されることになる複数の反応チェンバーに分配する；およびＲＴ−ＰＣＲプロセスの産物を適切に同定する工程。
【請求項２４】
同定されたＲＴ−ＰＣＲ産物に対し、標的遺伝子の発現を定量的に測定するために、得られた産物についての定量データを分析するためのさらなる工程ｃ）を行わせる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子発現を定量的に測定する方法を最適化するために所望する試薬を選択し、分配するための情報を提供する工程（ｄ）をさらに含む、請求項２４に記載の方法であって、
標的遺伝子ＮＴ／ＣＴ比対ハウスキーピング遺伝子ＮＴ／ＣＴ比の所望する比が所望する範囲内にない場合、それによって第２の所望する濃度が決定され、そして工程（ａ）〜（ｃ）が反復される、前記方法。
【請求項２６】
定量ＲＴ−ＰＣＲ法により対象となる標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータプログラム製品であって、
該コンピュータプログラム製品は、
コンピュータ判読可能な媒体；および
遺伝子発現を定量的に測定するための、コンピュータ判読可能な媒体に記憶された指令
を含む前記コンピュータプログラム製品；
を含み、ここで、該指令は以下のことを含む：
ａ）試料の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の形式を標的遺伝子に行う場合に使用されるＣＴ試薬の所望する濃度を自動的に決定すること；
ｂ）所望する試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲを実施するための複数の反応チェンバーに分配すること；そして所望により
ｃ）得られた産物についてのデータを定量的に分析して標的遺伝子の発現を定量的に測定すること。
【請求項２７】
請求項２６に記載のソフトウェアプログラム製品であって、指令が遺伝子発現を定量的に測定する方法を最適化するために所望する試薬を選択し、分配するための情報を提供する工程（ｄ）をさらに含み、標的遺伝子ＮＴ／ＣＴ比対ハウスキーピング遺伝子ＮＴ／ＣＴ比の所望する比が所望する範囲内にない場合、それによって第２の所望する濃度が決定され、そして工程（ａ）〜（ｃ）が反復される、前記ソフトウェアプログラム製品。
【請求項２８】
指令が、ＰＣＲ反応混合物を高密度ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドアレイに分配し、定量ＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物を測定することをさらに含む、請求項２６に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２９】
指令が、増幅されているそれぞれのｃＤＮＡのセンス鎖および／またはアンチ‐センス鎖をハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡを蛍光標識することをさらに含む、請求項２８に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３０】
指令が、ＰＣＲ反応物中のオリゴヌクレオチド内の１以上のｄＮＴＰを蛍光色素で標識することをさらに含む、請求項２６に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の固有鋳型およびＣＴに対するアレイの蛍光強度を比較することにより標的遺伝子の発現が定量される、請求項３０に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３２】
ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータを使用した方法であって、
ａ）試料の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の競合型を標的遺伝子に実施する場合に使用されるＣＴ試薬の所望する濃度を決定すること；
ｂ）所望する試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲを実施するための複数の反応チェンバーに分配すること；そして所望により
ｃ）得られた産物についての定量データを分析して標的遺伝子の発現を定量的に測定すること；
を含む、上記方法。
【請求項３４】
遺伝子発現を定量的に測定する方法を最適化するために所望する試薬を選択し、分配するための情報を提供する工程（ｄ）をさらに含み、標的遺伝子ＮＴ／ＣＴ比対ハウスキーピング遺伝子ＮＴ／ＣＴ比の所望する比が所望する範囲内にない場合、それによって第２の所望する濃度が決定され、そして工程（ａ）〜（ｃ）が反復される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は研究助成Ｎｏ．ＮＩＨ  ＣＡ８５１４７の下に行われ、その研究助成は本発明に対して一定の権利を有してよい。
【０００２】
本発明は少量の生体試料における遺伝子発現の評価のためのマルチプレックス標準化逆転写酵素‐ポリメラーゼ連鎖反応法に関する。該方法は、細針吸引生検試料、およびレーザー捕捉顕微解剖試料のような、少量の生体試料を評価するために有用である。本明細書に記載の方法がなければ、そのような試料からは、ほんの少数の遺伝子だけしか評価することができないだろう。本明細書に記載の方法を使用することにより、これまでわずか１遺伝子しか評価することができなかったのと同じ標本から、たくさんの遺伝子を標準化測定することが可能になる。
【０００３】
発明の背景
ＰＣＲ法は、一般に、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；および第４，９６５，１８８号に記載される。ＰＣＲ法は、一般に、核酸分子内に含まれるいずれかの所望する具体的な核酸配列を増幅するための方法を含む。ＰＣＲプロセスは、個々の核酸の相補的系統を過剰な２種のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することを含む。プライマーは伸長して、相補的プライマー伸長産物を形成し、この伸長産物が、所望する核酸配列を合成するための鋳型となる。ＰＣＲプロセスは同時に段階的に行われ、所望する核酸配列の増幅レベルを増大させるために、所望する回数だけ反復ことができる。ＰＣＲプロセスに従って、それぞれのＤＮＡ系統上のプライマー間のＤＮＡ配列は、ＤＮＡの残りの部分および選択された試料にわたり選択的に増幅される。ＰＣＲプロセスはＤＮＡの所望する領域の特定の増幅を提供する。
【０００４】
ＰＣＲ産物の収率は、限界のないサイクル数の間、指数関数的に増加する。ある時点で、そして不確定な理由のために、反応は限定され、ＰＣＲ産物は未知の割合で増加する。結果として、増幅された産物の収率は、同時に進行した同一の試料間で６倍も変化することが報告されている（Ｇｉｌｌｉａｎｄ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２７２５−２７２９，１９９０）。（これらの刊行物および他の参考試料は、発明の背景、および具体的な例では本発明の実施に対して付加的な詳細を提供するために包含されていて、すべては本明細書に参照として明確に援用される）。したがって、一定数のＰＣＲサイクル後に、標的遺伝子の初期濃度を外挿により正確に決定することはできない。ＰＣＲで定量するために、様々な研究者が、指数的な増幅を提供することが知られているサイクル数だけ増幅された試料を分析している（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１０８−１１６（１９９２）；Ｎｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：７１６０−７１６４（１９９０）；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１０３５１−１０３５６（１９９０）；Ｃａｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１８０２−１８１０（１９９１）；Ｃｈｅｌｌｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８７：６９１−６９８（１９９０）；Ａｂｂｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２９：１９１−１９６（１９９２）；Ｆｅｌｄｍａｍ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８３：１８６６−１８７２（１９９１）。一般に、ＰＣＲ産物の収率が低い場合、これらの分析は、終点より前のＰＣＲプロセスの初期に行われる。結果として、産物が定量可能なレベルに到達するためには、ＰＣＲ反応物中により多くの出発ｃＤＮＡが含有されなければならない。また、指数相は、付加的な時間および材料の使用を必要とするそれぞれの実験条件の組に対して定めなければならない。
【０００５】
別の進歩は競合ＰＣＲであり、ここではＰＣＲは一塩基が変異した競合鋳型の存在下で行われる（Ｇｉｌｌｉａｎｄ，上記；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：９４３７−９４４６（１９８９））。既知量の競合鋳型は、未知量の標的配列と共に共増幅される。競合相手は標的と同じ配列（一塩基変異または配列の一部の欠失を除いて）で、標的ｃＤＮＡと同じ増幅プライマーを使用し、そして標的ｃＤＮＡと同じ効率で増幅する。標的／標準の出発比は、全増幅過程を通して保存され、指数相が完了した後であっても保存される。
【０００６】
競合ＰＣＲは、Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：５５７−５５８（１９９２）；Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２４４−２４９（１９９３）、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ，１９９３，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で、一般的に論じられる。しかし、競合ＰＣＲだけでは、鋳型の出発量の変化を適切に制御できない。試料の分解およびピペット操作の誤りによって、変化してしまう可能性がある。
【０００７】
遺伝子発現を測定するためのノーザン分析を使用する場合、標的遺伝子と（組織試料間または刺激への反応において変化することが予想されない）“ハウスキーピング”または基準遺伝子の両方に対して、同じブロットを調べることによりこれらの問題を克服することができる。基準遺伝子は標的遺伝子の相対的発現を測定する場合の分母となる。この概念を応用するため、別の研究者らは別個のチューブでＰＣＲ‐増幅を行った。しかし、２種の遺伝子が別々のチューブで増幅される場合、増幅条件およびピペット操作の誤りによるチューブ間の変化は避けがたい。また、標的および基準遺伝子が同じチューブで増幅される非競合マルチプレックスＰＣＲが、Ｎｏｏｎａｎ（上記）に記載されているが、この方法は増幅核種の指数範囲を決定するために標準曲線の作製を必要とするため、不便である。
【０００８】
他の方法であるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、増幅の対数直線相を自動的に決定する。しかし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいても、１種の遺伝子と別の遺伝子の発現を比較するために、標準曲線が必要である。
【０００９】
Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，０４３，３９０号；第５，６３９，６０６号；および第５，８７６，９７８号（それらは参照として本明細書に明確に援用される）は遺伝子発現の定量的測定法を記載し、それらは上記の欠点を１つも持たず、標準的な訓練を受けた技術者によって実施可能である。
【００１０】
本発明は上記のＷｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の‘３９０、‘６０６および‘９７８ＰＣＲ増幅法の改良であり、“標的遺伝子”、“ハウスキーピング”または基準遺伝子、およびこれらの遺伝子それぞれの競合鋳型の同時増幅を可能にする。“標的ＤＮＡ配列”および“標的遺伝子”という用語は一般に、その遺伝子またはＤＮＡ配列を選択的に増幅することが望まれる、対象となる遺伝子を表す。“ハウスキーピング”または“基準”遺伝子という用語は、ＰＣＲ反応ごとのＲＮＡの量に対する適切な基準である遺伝子を表す。
【００１１】
一般的かつ全体的な意味において、重要な点は、標的遺伝子のプライマー、ハウスキーピングまたは基準遺伝子のプライマー、および標的遺伝子および基準遺伝子の突然変異体を含む２種の内部標準競合鋳型の同時使用である。これらの突然変異は、点突然変異、挿入、欠失などであってよい。
【００１２】
Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の‘３９０、‘６０６および‘９７８の特許は、異種ｃＤＮＡ分子混合物内に存在する選択されたｃＤＮＡ分子の同定された領域内の標的ＤＮＡ配列の量を定量するための方法に関する。１種以上の標的遺伝子および／または基準遺伝子を使用することができる。そのような付加的な標的および／またはハウスキーピング遺伝子の定量は、その付加的な標的および／またはハウスキーピング遺伝子の突然変異を含む内部標準競合鋳型をさらに含有することを必要とする。変異した競合鋳型は、標的配列の対応するヌクレオチドに関して変異した少なくとも１種のヌクレオチドを含むと理解すべきである。ハウスキーピング遺伝子配列の対応するヌクレオチドに相補的な、少なくとも１つの単一ヌクレオチドの突然変異が必要とされる。しかし、より長い欠失、挿入または改変も有用であると理解すべきである。標的遺伝子プライマー（それらは標的遺伝子の固有および競合鋳型の両方のプライマーとして役立つ）、ハウスキーピング遺伝子プライマー（それらはハウスキーピング遺伝子の固有および競合鋳型の両方のプライマーとして役立つ）、標的遺伝子の競合鋳型、およびハウスキーピング遺伝子の競合鋳型には、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の両方のＤＮＡを含む固有ｃＤＮＡと一緒にＰＣＲプロセスを実施する。
【００１３】
本発明のＰＣＲプロセスは、１）標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の固有ｃＤＮＡのｃＤＮＡ産物と、２）標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の変異した競合鋳型ｃＤＮＡのｃＤＮＡ産物とを提供する。ｃＤＮＡ産物は、ｃＤＮＡ産物の単離に適した方法を使用して単離される。固有ｃＤＮＡ産物と変異したｃＤＮＡ産物の存在比は、標的遺伝子をコードする固有ｃＤＮＡと標的遺伝子の競合鋳型をコードする変異ｃＤＮＡとの量を測定し、ハウスキーピング遺伝子をコードする固有ｃＤＮＡとハウスキーピング遺伝子の競合鋳型をコードする変異したｃＤＮＡとの量を比較することにより検出される。
【００１４】
本発明に従って、本明細書では“試料”は通常、植物、個体または動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成成分から単離された組織または流体の試料を示す。
“プライマー”、“核酸”および“オリゴヌクレオチド”という用語は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドを表すと理解すべきであり、これらの用語によって表される配列の長さに意図的な区別はない。むしろ、これらの用語は分子の一次構造を表す。これらの用語は２本鎖および１本鎖ＲＮＡならびに２本鎖および１本鎖ＤＮＡを包含する。オリゴヌクレオチドは任意の現存または天然の配列に由来し、そして任意の方法で作製してよいと理解すべきである。また、オリゴヌクレオチドは、化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製およびこれらの作製方法の組み合わせにより作製できることも理解すべきである。
【００１５】
“プライマー”という用語は、条件がプライマー伸長産物の合成に適する場合、相補鎖に沿った合成の開始点としての役割を果たすオリゴヌクレオチドを表す。合成条件は、４種の異なるデオキシリボヌクレオチド三燐酸および逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼのような少なくとも１種の重合誘導物質の存在を含む。これらは適切なバッファー中に存在し、そして補助因子や、種々の適切な温度においてｐＨ等の条件に影響を与える構成成分を含んでいてよい。プライマーは、好ましくは増幅効率が最適化されるような１本鎖配列であるが、別の２本鎖配列が本発明で使用されてもよい。
【００１６】
“標的遺伝子”、“配列”または“標的核酸配列”という用語はオリゴヌクレオチドの領域を表し、そしてそれは増幅および／または検出されるかのいずれかである。標的配列は増幅過程で使用されるプライマー配列間に位置すると理解すべきである。
【００１７】
Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の‘４９０、‘６０６および‘９７８の特許はまた、ａ）少なくとも１種の標的遺伝子および少なくとも１種の“ハウスキーピング”遺伝子由来のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅、および、ｂ）対象となる標的遺伝子および人工的に短縮されている“ハウスキーピング”遺伝子の配列を含む競合鋳型のＰＣＲ増幅を記載する。これらの短縮配列はＰＣＲ増幅に使用される標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子プライマーの両方に相同な配列を保持する。試料細胞または組織から抽出されたＲＮＡは逆転写される。ｃＤＮＡの系列希釈物は、標的遺伝子および“ハウスキーピング”遺伝子に相同なオリゴヌクレオチドの存在下でＰＣＲ増幅され、内部の変異した標準競合鋳型の量が定量される。増幅されたＤＮＡは制限消化され、エチジウムブロマイドにより染色されたアガロースゲル上で電気泳動されるか、またはＡｇｉｌｅｎｔもしくはＡＢ１  ３１０のような他の電気泳動法で、変異した産物と固有のものを分離する。デンシトメトリーを行い、バンドを定量する。“ハウスキーピング”遺伝子に対する標的遺伝子の発現比を測定するこの技術は正確で、同じマスター混合物および内部標準希釈物により行われた研究に対して再現性を有する。具体的な試料に対する遺伝子発現の反復評価が行われる場合、標準偏差は一般に平均の約５０％未満である。この技術は遺伝子発現変化の測定に役立つ。この方法は、研究試料の量が限定される場合や、遺伝子発現のレベルが低い場合に、とりわけ有用である。
【００１８】
ヒトゲノムプロジェクトの最近の進歩により我々の知識は増え、公知の表現型と遺伝的基礎とを相関させる機会が増している。正常な発達および多くの疾患過程の理解を向上させる遺伝子発現パターンの測定は、標準化ＲＴ−ＰＣＲ（ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ）逆転写酵素‐ポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより容易に行われ、これは、Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，８７６，９７８号、第５，６３９，６０６号および第５，６４３，７６５号に詳細に記載される。
【００１９】
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの主な利点の１つは、多くの遺伝子に対する標準化した、定量データを同時に速やかに再現可能に得る能力である。それぞれの遺伝子発現量は、値の組み合わせを指標にすること、および実験間の直接比較を考慮して数字で表された値で報告される。データは共通の内部対照に対して標準化されるため、試料間および研究室間で直接比較することも可能である。
【００２０】
しかし、遺伝子発現パターンを臨床的に適切な表現型と相関させるためには、約５０〜１００遺伝子の発現レベルを評価する必要があるかもしれない。さらに、これらの遺伝子発現パターンは、少量の貴重な試料において評価する必要があるかもしれない。
【００２１】
多くの臨床的状況において得られる生検標本のサイズは、細胞学的方法が改良され、そして経費軽減のための経済的圧力の増大により、年々減少している。たとえば、肺、乳房、前立腺、甲状腺、および膵臓における癌の疑いのある病変の生検標本は、一般に、細針吸引（ＦＮＡ）生検により行われる。さらに、レーザー捕捉顕微解剖試料および流動選別細胞集団を含む、解剖学的に小型であるが機能的に重要な脳、成長胚、および動物モデル組織試料の発現パターンを評価する必要性がある。さらに、表現型を十分に性状解析するためには５０〜１００種の遺伝子を測定することが必要かもしれない（Ｈｅｌｄｅｎｆａｌｋ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ  ３４４：５３９，２０００）ので、ｃＤＮＡの消費、およびそれぞれのアッセイの経費をできるだけ減らすことが重要である。
【００２２】
自動化および少量化における最近の進歩によって、ＰＣＲ反応容積を非常に縮小し、それによって試薬および試料の消費を減らすことが可能になった。しかし、それぞれの反応においては、まれな転写物を検出するために十分なｃＤＮＡを使用し、１種の転写物と他のものとの関係が検出方法により変化しないことを確かめることが重要である。
【００２３】
したがって、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスを改善させる必要がある。また、まれな転写物を検出するために、遺伝子発現アッセイごとにかなり少ないｃＤＮＡを使用しつつ、感度は維持する必要性がある。
【００２４】
とりわけ、以下の疾患に関連した遺伝子発現のパターンを同定するためにＳｔａＲＴ−ＰＣＲが使用された最近の研究において、これらの必要性が示される：肺癌（Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．"Normal bronchial epithelial cell expression of glutathione transferase P1, glutathion transferase M3, and glutathione peroxidase is low in subjects with bronchogenic cartinoma." Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：１６０９−１６１８，２０００；ＤｅＭｕｔｈ，ｅｔ  ａｌ．， "The gene expression index c-mycxE2F-1/p21 is highly predictive of malignant phenotype in human bronchial epitherial cells." Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：１８−２４，１９９８）；肺サルコイドーシス（Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．， "Enhanced insulin-like growth factor binding protein-related protein 2 (connective tissue growth factor) expression in patients with idiopathic pulmonary fibrosis and pulmonary sarcoidosis." Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１：６９３−７００，１９９９）；嚢胞性線維症（Ａｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．上記）；および小児白血病における化学療法抵抗性（Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．， "Circumvention of methotrexate resistance in childhood leukemia subtypes by rationally designed antifolates." Ｂｌｏｏｄ，９４（９）：３１２１−３１２８，１９９９；Ｒｏｔｓ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，"mRNA expression levels of methotrexate resistance-related proteins in childhood leukemia as determined by a competitive template-based RT-PCR method." Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１４：２１６６−２１７５（２０００））。
【００２５】
ロボットおよびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置の実現に伴い、遺伝子発現測定のスループット能力が増大するため、ｃＤＮＡおよび必要な他の試薬量を減らす方法を開発することが重要である。
【００２６】
これを成し遂げるための１つの方法は、それぞれのＰＣＲ反応における多くの遺伝子の多重増幅であろう。単一のＰＣＲ反応において２種の遺伝子の固有鋳型（ＮＴ）と競合鋳型（ＣＴ）とをＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより増幅することは可能であるが、本発明に到るまで、単一反応によって２種より多い遺伝子について定量可能なバンドを生成することは達成されていない。
【００２７】
本発明は、ｃＤＮＡが２ラウンドでＰＣＲにより増幅されるＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの改良法を提供する。ラウンド１では、複数の遺伝子のプライマーが、ｃＤＮＡと同じ遺伝子のＣＴを含むＣＴ混合物と一緒に存在する。ラウンド２では、ラウンド１の増幅産物のアリコートがただ１つの遺伝子のプライマーと共にさらに増幅される。
【００２８】
したがって、本発明の目的は、遺伝子発現の定量測定のための改善された方法を提供することである。
本発明の別の目的は、市販のプロセスとして適した、ＰＣＲを基にした遺伝子発現の定量測定のための方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、臨床的に適切な表現型と遺伝子発現パターンとを正確で効率的に相関させるための方法を提供することである。
本発明のこれらの目的および他の目的、態様、ならびにこれに付随する多くの利点は、本明細書に添付された図面と共に考慮する場合、以下の詳細な説明を読むことでよりよく理解されるであろう。
【００３０】
発明の概要
本発明は、数字で表した遺伝子発現値を試料間および実験室間で直接比較するマルチプレックス標準化ＲＴ−ＰＣＲ（ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ）プロセスに関する。１つの側面において、本発明は、ｃＤＮＡ量を増やさず、そしてまれな転写物を検出するための能力を損なわずに、統計的に有意な方法で実質的により多い遺伝子発現値を測定する新規マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスに関する。
【００３１】
本発明のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスは、２ラウンドの増幅を使用して行われる。ラウンド１では、ｃＤＮＡ、競合鋳型（ＣＴ）混合物および所望する遺伝子数（例えば、９または９６遺伝子）に対するプライマー対をバッファーおよび酵素と合わせ、所望するサイクル数（たとえば、約３〜約４０の間、そしてある態様では約５、８、１０または３５サイクル）増幅して、ＰＣＲ産物を形成する。ラウンド２では、ラウンド１のＰＣＲ産物を使用して、ラウンド１のＰＣＲ産物のアリコートをバッファー、酵素およびラウンド１で使用された所望する数の遺伝子の１種に特異的なプライマー対と共に新しい反応チューブに入れ、予め決めた付加的なサイクル数だけ増幅する（たとえば、付加的な３５サイクル）。この第２反応には付加的なｃＤＮＡまたはＣＴ混合物は添加されない。
【００３２】
ラウンド１のＰＣＲ産物を１／１００，０００に希釈して、その後のラウンド２における増幅で定量することができる。対照的に、ラウンド１で使用したｃＤＮＡおよびＣＴ混合物の１／１００，０００の希釈物を、１プライマー対と共に１ラウンド、３５サイクルで増幅しても検出可能な産物は何も生じなかった。したがって、２ラウンドの増幅を使用することにより、ただ１回の増幅ラウンドで１種の遺伝子発現量を得るために一般に使用されるのと同じ量のｃＤＮＡとＣＴ混合物から、まれな転写物を検出するための感度を損なうことなく、１００，０００遺伝子の発現量を得ることができる。この方法により得られた遺伝子発現値と対照反応により得られた値との間には有意な差は検出されなかった。
【００３３】
本発明に従って、数字で表した遺伝子発現値を臨床的に適切な表現型と関連づけ、遺伝子発現値の組み合わせを少なくとも１種の具体的な表現型を説明する少なくとも１種の指標とすることが可能になる。内部標準鋳型はそれぞれの遺伝子に対して作製され、クローニングされて、少なくとも約１０１０アッセイのための競合鋳型を生成する。ある態様では、約１０００までの遺伝子に対する競合鋳型を一緒に混合する。さらに、アッセイは約６分子以下の感度を有することが可能である。
【００３４】
好ましい態様では、ＣＴ混合物は、少なくとも１種の基準、または少なくとも１種の標的遺伝子に対するハウスキーピング遺伝子およびＣＴを含む。あるいは、ＣＴ混合物は、少なくとも１種の基準遺伝子のＣＴおよび複数の標的遺伝子のＣＴの組み合わせを含む。
【００３５】
遺伝子発現は、ｉ）基準遺伝子の固有鋳型対競合鋳型（ＣＴ）の比；ｉｉ）それぞれの標的遺伝子のＮＴ／ＣＴ比；およびｉｉｉ）工程（ｉｉ）の比と工程（ｉ）の比との比を計算することにより定量する。
【００３６】
ある側面において、該方法はさらに定量ＲＴ−ＰＣＲ後にＰＣＲ産物を測定するための高密度オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡアレイの使用を包含する。増幅されるそれぞれのｃＤＮＡのセンス鎖またはリバース鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡは蛍光標識される。また、ＰＣＲ反応におけるオリゴヌクレオチド内の１種以上のｄＮＴＰを蛍光色素で標識してもよい。標的遺伝子の発現は、基準遺伝子およびそれぞれの標的遺伝子のＮＴおよびＣＴのアレイ中におけるスポットの蛍光強度を比較することにより定量する。
【００３７】
高密度オリゴヌクレオチドアレイは以下の特性を有する；それぞれの遺伝子に対し、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドアレイ上に２種の遺伝子座が作製される；ｉ）アレイ上の１遺伝子座は、ＰＣＲにより増幅された遺伝子の固有鋳型に特有の配列に相同で、結合することになるオリゴヌクレオチドをそれに結合させること；およびｉｉ）アレイ上の別の遺伝子座が、競合鋳型の５′末端と、切断されて不適切に配列された競合鋳型の３′末端間の連結部にまたがる配列に相同で、結合することになるオリゴヌクレオチドをそれに結合させること。
【００３８】
別の側面において、本発明は上記の方法を使用して対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定し、以下の工程を実行するためのプロセスに関する：ａ）試料の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の競合型をその標的遺伝子に実施する場合に使用されるＣＴ試薬の望ましい濃度を決定する工程；ｂ）少なくとも１種の望ましい試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲプロセスが実施されることになる複数の反応チェンバーにそれを分配する；そしてたとえばキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置を流すことにより、同定および／または標識するための適切な装置に送り；そして時にはそこでプロセスを終わらせる工程。ある態様では、標的遺伝子の発現を定量的に測定するために、ＣＥ装置からの情報は得られた産物についての定量データを分析するための工程ｃ）に送られ、工程（ｃ）からの情報は“レポート”に提供され、“データベース”に送られ、および／またはデータをさらに分析するためにプロセスを繰り返して行う工程ｄ）に送られる。
【００３９】
さらに別の側面において、本発明はツーステップ定量ＲＴ−ＰＣＲプロセスにより対象となる標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータプログラム製品は、定量的に遺伝子発現を測定するために、コンピュータ可読媒体と、コンピュータ可読媒体上に記憶された指令（instructions）を含む。指令を使用して上記の工程を行う。
【００４０】
ソフトウェアプログラムおよび製品はまた、定量ＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物を測定するための高密度ｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドアレイにＰＣＲ反応混合物を分配するための指令を含んでいてよい。
【００４１】
コンピュータプログラムおよび製品は、増幅されるそれぞれのｃＤＮＡのセンス鎖および／またはアンチ‐センス鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを蛍光標識するための指令を含んでいてよい。
【００４２】
コンピュータプログラムおよび製品は、ＰＣＲ反応物のオリゴヌクレオチド内の１種以上のｄＮＴＰを蛍光色素でさらに標識するための指令を含んでいてよい。
コンピュータプログラムおよび製品は、基準またはハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の固有およびＣＴに対するアレイの蛍光強度を比較することにより、標的遺伝子を定量する指令を含んでいてよい。
【００４３】
本発明はまた、ツーステップＲＴ−ＰＣＲプロセスを使用した、対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータ処理法に関する。該方法は以下の工程を含む：
ａ）試料の競合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を標的遺伝子に実施する場合に使用される、ＣＴ試薬の望ましい濃度を決定する工程；
ｂ）所望する試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲが実施されることになる複数の反応チェンバーに分配すること；そしてキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置を流すか、またはそこに送る工程。
【００４４】
ある態様では、情報は得られた産物についての定量データを分析し、定量的に標的遺伝子の発現を測定するための工程ｃ）に送られ、“レポート”を作製し、“データベース”に記憶され、および／またはさらに分析される。
【００４５】
さらに別の側面では、本発明は以下の別の工程ｄ）を使用して遺伝子の定量的測定を最適化することを含む：
ｄ）計算された比が所望する範囲内（たとえば、１０倍比内）にあるかどうかを確かめるための工程ｃ）から受け取ったデータを分析する工程。
【００４６】
計算された比が所望する範囲内にない場合、ＣＴ試薬の新規な所望する濃度（すなわち、工程（ａ）で選択された初めの濃度と異なる）が選択され、そして工程（ｂ）〜（ｃ）が新規濃度のＣＴ試薬により反復される。
【００４７】
発明の詳細な説明
遺伝子発現のパターンを同定するためのマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの使用は、多くの利点を有する。データが標準化されるため、データを試料間および実験室間で容易に比較することができる。臨床的に関連する表現型と遺伝子発現とを数字で表した相関により、遺伝子発現値の組み合わせが、具体的な表現型をよりよく説明する指標となる。別の遺伝子発現を測定する方法に比べ、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスは、迅速、安価で、感度が高い。また、ｃＤＮＡおよびＣＴが２ラウンドで増幅される定量マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスには、それぞれの反応物における内部標準（ＣＴ）の存在が考慮される。さらに、発現を測定するために必要とする出発試料材料の量は、別の方法で必要な量よりも、かなり少ない。標準化ＲＴ−ＰＣＲプロセス（ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ）は、多くの遺伝子データを、同時に、迅速で、再現可能に、標準化して定量測定する。
【００４８】
本発明の方法に従って、内部標準競合鋳型（ＣＴ）がそれぞれの遺伝子に対して作製され、クローニングされて、少なくとも１０８、そして好ましくは＞１０９アッセイに必要な十分な競合鋳型を生じ、そして少なくとも約１０００遺伝子までに対するＣＴが一緒に混合される。
【００４９】
競合鋳型（ＣＴ）は本質的にＣｅｌｉの方法（Ｃｅｌｉ，Ｆ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，１０４７（１９９３））に基づいて構築された。プライマーは初めにＰｒｉｍｅｒ  ３．１ソフトウェアを使用して設計され、アニーリング温度５８℃（許容範囲＋／−１℃）で標的遺伝子のコード領域の２００〜８００塩基を増幅した。これにより、すべての標準化分析ＰＣＲ反応を同一条件下で進行させることが可能になり、さらに微小流体キャピラリーゲル電気泳動を含む、自動化およびハイスループットな応用が可能となる。それぞれのＣＴが構築される前に、それぞれのプライマー対は、対象となる遺伝子を表すことが知られている多様な組織または個体のｃＤＮＡクローンから逆転写されたＲＮＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して試験された。作動しないプライマー対（１回に約１０％）に対して、新しいものが設計され、プロセスが反復された。次にそれぞれの遺伝子に対してＣＴプライマー（約４０ｂｐの融合オリゴ）が作製された。それぞれの融合プライマーの３′末端は、リバースプライマーに対して３′側の５０〜１００塩基の領域に相同な、約２０塩基の配列から構成された。５′末端は２０ｂｐのリバースプライマーであった。次に、固有フォワードプライマーおよびＣＴプライマーを使用して１０μｌのＰＣＲ反応を５回行うことにより競合鋳型を作製した。これらのＰＣＲ反応物を合わせ、１Ｘ  ＴＡＥ中の３％  ＮｕＳｉｅｖｅゲル上で電気泳動し、正しいサイズのバンドをゲルから切り出し、ＱｉａＱｕｉｃｋ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ）を使用して抽出した。精製されたＰＣＲ産物はＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングされ、ＨＳ９９６（ＤＨ１０ＢのＴ１‐ファージ抵抗性変異体）に形質転換された。
【００５０】
クローニング、形質転換、そしてＸ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、およびカルベニシリンを含むＬＢプレートへの接種後、３種の孤立した白色コロニーを採取した。プラスミドミニプレップを作製し、ＥｃｏＲＩ消化を行い、消化物を３％Ｓｅａｋｅｍアガロース上で電気泳動にかけた。ＥｃｏＲＩ消化による挿入物に陽性のクローンに対して、挿入物の配列は、ベクター特異的プライマーを使用して、同じ未消化プラスミド標本のシークエンシングにより決定した。正しい遺伝子配列に相同性を示し、プラスミド配列に１００％一致したクローンだけに大規模ＣＴ調製を行い、それらを標準混合物に含めた。その後、この品質管理評価に合格したものが、次の工程に進んだ。次に、それぞれの特性のクローン由来のプラスミドを、＞１０億のアッセイ（約２．６ｍｇ）に必要な量（１．５Ｌ）だけ調製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＧｉｇａＰｒｅｐキットを使用して、得られた採取細胞からプラスミドを精製した。プラスミド収率はＨｏｅｆｆｅｒ  ＤｙＮＡＱｕａｎｔ  ２１０蛍光計を使用して評価した。
【００５１】
この工程において、それぞれのプラスミド調製品のアリコートを再びシークエンシングし、品質を確かめた。所定の品質管理工程のすべてに合格したそれぞれのＣＴに対して、系列希釈物にＰＣＲ反応を行い、依然としてＰＣＲ産物を生じる限界濃度を確定することにより、調製品およびプライマーの感度を評価した。６０分子を検出する調製品およびプライマーだけが標準ＣＴ混合物に引き続き含有された。開発されたアッセイの大部分は６分子以下の感度であった。
【００５２】
品質が確かめられた調製品由来のプラスミドは、２４、または９６遺伝子のいずれかを表すＣＴ混合物に混合した。２４遺伝子混合物中の競合鋳型の濃度は、β‐アクチンＣＴに対して４ｘ１０−９Ｍ、ＧＡＰＤＨ（ＣＴ１）に対して４ｘ１０−１０Ｍ、ＧＡＰＤＨ（ＣＴ２）に対して４ｘ１０−１１Ｍ、そして他のＣＴのそれぞれに対して４ｘ１０−８Ｍであった。２４遺伝子ＣＴ混合物は、以下に記載の実際の希釈物の調製前にＮｏｔＩ消化により線形化した。４組の２４遺伝子混合物を等しい量で合わせ、β‐アクチンの１０−９Ｍ、ＧＡＰＤＨ（ＣＴ１）の１０−１０Ｍ、ＧＡＰＤＨ（ＣＴ２）の１０−１１Ｍ、そして他のＣＴの１０−８Ｍの最高レベル濃度において９６遺伝子ＣＴ混合物を作製した。次にこれらの最高レベル混合物を、１０−９Ｍのβ‐アクチン、１０−１０ＭのＧＡＰＤＨ（ＣＴ１）、１０−１１ＭのＧＡＰＤＨ（ＣＴ２）混合物で系列希釈し、１０−１２Ｍのβ‐アクチン、１０−１３ＭのＧＡＰＤＨ  ＣＴ１、１０−１４ＭのＧＡＰＤＨ  ＣＴ２、および１０−１１（Ａ）、１０−１２（Ｂ）１０−１３（Ｃ）１０−１４（Ｄ）１０−１５（Ｅ）１０−１６Ｍ（Ｆ）という他のＣＴ濃度の６種の作業標準化ＣＴ混合物（Ａ〜Ｆ）を作製した。
【００５３】
それぞれの遺伝子、および基準、またはハウスキーピング遺伝子は、それぞれのＣＴに関して測定される。次に、それぞれの標的遺伝子は、基準遺伝子に対して標準化し、反応物に添加されたｃＤＮＡと比較される。それぞれの遺伝子発現量は、共通のデータバンクへの登録、および対話式遺伝子発現指標と値とを組み合わせるために、実験間の比較が直接できる数字で表した値として報告される。同じ内部標準ＣＴ混合物が使用される限り、同じ実験内の試料間、同じ実験室における異なる実験、および異なる実験室の潜在的に異なる実験間で直接比較を行うことができる。本明細書で報告される実験では、多くのＳｔａＲＴ−ＰＣＲ試験において、β‐アクチンおよびＧＡＰＤＨは、任意に選択された基準、またはハウスキーピング遺伝子である。しかし、それぞれのマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスでは、実験データは、共通の内部標準混合物に対して測定されるため、所望するならば、いずれかの測定された遺伝子または遺伝子の組み合わせ（たとえすべての遺伝子でも）を基準遺伝子として使用してよく、データはその基準に関して容易に再計算される。
【００５４】
ｃＤＮＡ試料内で、新規基準に関する再計算は、それぞれの個々の遺伝子の値を変えるが、お互いに関する遺伝子発現値は変化しない。
本発明のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ法は、ｃＤＮＡおよびＣＴを２ラウンドで増幅し、そしてそれは少量のｃＤＮＡ試料から得ることができる遺伝子発現量を非常に増大させる。
【００５５】
マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ法を使用する場合、Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．の‘３９０、‘６０６および‘９７８のＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスを使用して一般に１種の遺伝子の発現量を得るために使用するのと同じ量のｃＤＮＡから、少なくとも約１０，０００から少なくとも約１００，０００遺伝子の発現量が得られる。ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲで使用されるものと同じ量のｃＤＮＡがマルチプレックス法の１ラウンドで使用されるが、まれな転写物は希釈されずに、依然として統計的に有意に検出可能である。
【００５６】
図１に示すように、ＰＣＲ反応に使用されるｃＤＮＡの量は、測定することができる転写物／細胞の数と直接関係を有する。一般に、ＲＮＡ抽出は１００％に近いが、逆転写は１０％の効率であると考えられる。したがって、同種細胞集団が試験され、それぞれの細胞が１種の遺伝子に対して１０コピーのｍＲＮＡを含む場合、逆転写後に細胞ごとに１コピーが残っていることになる。ＰＣＲにおいて１０コピー未満の転写物を測定することの統計的意味は疑わしい。したがって、１０コピーの転写物を検出するためには、１０の細胞を提示するｃＤＮＡがＰＣＲ反応物に存在しなければならない（図１）。１０のうち１つの細胞が特定の転写物を発現する異種細胞集団を調べる場合、１０コピーを検出するためには１，０００の細胞を提示するｃＤＮＡがＰＣＲ反応物に存在しなければならない。
【００５７】
ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲプロセスにおいて、１回のＰＣＲ反応で１遺伝子を測定するために通常１００〜１，０００細胞を提示するｃＤＮＡが使用される。この量を使用して、図１に従い、１細胞につき０．１〜１コピー（または１０細胞につき１〜１０コピー）の割合で発現される転写物を統計的に有意に検出することができる。同じ量のｃＤＮＡがマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの第１ラウンドで使用される。このｃＤＮＡは測定されるそれぞれの遺伝子のＣＴと共増幅され、そして内在性ｃＤＮＡとＣＴとの関係はＰＣＲ後に一定のままであるため、ラウンド１のＰＣＲ産物は、ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲで得られた数字で表した値を有意に変化させずに、希釈して、１種の遺伝子に特異的なプライマーと共に第２ラウンドで再び増幅することができる。この方法によって、付加的なｃＤＮＡを使用せず、かつ、従来のＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスで得られた数値を有意に変化させずに、十分なＰＣＲ産物を作製し、多くの遺伝子の遺伝子発現を検出し、測定することができる。
【００５８】
微小流体ＣＥ法（Ｔ．Ｓ．Ｋａｎｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｐ．Ａ．Ｌｉｍｂａｃｈ，Ｊ．Ｃ．Ｏｗｉｃｋｉ，Ｒ．Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ，Ｗ．Ｔａｎ編、Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ  ３９２６：１７２，２０００）は、非常に少ない容量での遺伝子発現の測定を可能にする。しかし、先に述べたように、使用することが可能で、依然として統計的に有意な測定をすることができる最少量のｃＤＮＡが存在する。２００種以上の異なる遺伝子および１００種以上の細胞株ならびに組織試料を含む５０，０００以上のＳｔａＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現量において、β‐アクチンより対数で平均して約２少ない遺伝子間の統計的発現分布がある。約１，０００の気管支上皮細胞を表す代表的な１μｌのｃＤＮＡ試料は６ｘ１０５のβ‐アクチンＣＴに釣り合う。平均レベル（β‐アクチンの１／１００）で発現された遺伝子は約６，０００のＣＴ分子と釣り合うことになる。しかし、少数の（しかし、しばしば機能的に非常に重要である）遺伝子はβ‐アクチンの１／１０，０００発現され、そしてこの試料ではそのような遺伝子に対して６０分子が提示されることになる。このＰＣＲ反応物の容積を１０μｌから１００ナノリットルまでの１／１００に減らすと、β‐アクチンの１／１０，０００発現される遺伝子は０．６分子以下で提示され、確率論的に考慮すると、許容可能な信頼度で定量することは困難であろう。対照的に、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスでは、ラウンド１ＰＣＲ産物１０μｌ中の１０ナノリットルを１００ナノリットルのラウンド２反応容積で使用することができる。１，０００，０００倍以上の増幅がラウンド１反応で日常的に行われるため、ラウンド１のＰＣＲ産物１０μｌ中の１０ナノリットルはラウンド２反応において、十分な固有および競合鋳型を含み、統計的な信頼度で測定されることになる。
【００５９】
図２の表は、いくつかの遺伝子のプライマー配列および位置を示す。
マルチブロックサーマルサイクラーとわずかに改変したＣＥシステムとを合わせることによるＳｔａＲＴ−ＰＣＲの自動化は、２４時間で４，０００以上の遺伝子発現アッセイを可能にする。さらに、２００〜８００ｂｐ間に分布する固有鋳型（ＮＴ）および競合鋳型（ＣＴ）産物サイズを増幅するプライマーを設計することにより、単一のＣＥチャンネルで１００以上の遺伝子を定量することが可能である。したがって、９６チャンネルＣＥ装置を自動化されたハイスループット（２４時間あたり、＞３００，０００の標準化遺伝子発現アッセイ）装置に容易に変換することができる。
【００６０】
ｃＤＮＡ消費および費用の点から最も効率的なＳｔａＲＴ−ＰＣＲ分析の方法は：１）１μｌがβ‐アクチンＣＴの６００，０００分子に釣り合うように、試験されるｃＤＮＡ試料を希釈する（ＣＴ混合物１μｌ）；２）ツーステップＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスのラウンド１において、６種（Ａ〜Ｆ）のＣＴ混合物のそれぞれと釣り合った１μｌのｃＤＮＡを使用する；３）混合物Ｄ（大部分の遺伝子と釣り合うことになる濃度でＣＴを含む）を使用して、１００ナノリットル容積のラウンド２反応物に対応する１０ナノリットルのラウンド１ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ産物を使用してすべての９６ｓｙｓｔｅｍ１遺伝子の発現を測定する；および４）適切な混合物を使用して、混合物Ｄと釣り合わない遺伝子に対してＳｔａＲＴ−ＰＣＲを反復することである。
【００６１】
それぞれの遺伝子に対するＮＴ／ＣＴ比に基づいて、反復実験で使用する適切なＣＴ混合物を選択するソフトウェアプログラムは有用で、そしてまた本発明の範囲内である。図８は、対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのプロセスにおける方法の組み合わせにおいて、以下の工程を実行するソフトウェアプログラムを示す概略図である：ａ）試料の競合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をその標的遺伝子に実施する場合に使用するＣＴ試薬の所望する濃度を決定する工程；ｂ）少なくとも１種の所望する試薬を選択し、ＲＴ−ＰＣＲが実施されることになる複数の反応チェンバーにそれを分配する；そしてたとえばキャピラリー電気泳動（ＣＥ）装置を流すことにより、同定および／または標識するための適切な装置に送り；そして時にはそこでプロセスを終了する工程。ある態様において、ＣＥ装置からの情報は、標的遺伝子の発現を定量的に測定するために、得られた産物についての定量データを分析するための工程ｃ）に進む。工程（ｃ）からの情報は、“レポート”で提供され、“データベース”に送られ、および／またはデータをさらに分析するために方法を繰り返して行う工程ｄ）に送られる。
【００６２】
ツーステップ定量ＲＴ−ＰＣＲ法により対象となる標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータプログラムおよび製品には、遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータ可読媒体；およびコンピュータ可読媒体上に記憶された指令が挙げられる。指令は好ましくは、先に説明した工程を含む。
【００６３】
コンピュータプログラムおよび製品はさらに、定量ＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物を測定するための高密度ｃＤＮＡおよび／またはオリゴヌクレオチドアレイにＰＣＲ反応混合物を分配するための指令を含んでいてよい。
【００６４】
コンピュータプログラムおよび製品はさらに、増幅されるそれぞれのｃＤＮＡのセンス鎖および／またはアンチ‐センス鎖をハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを蛍光標識するための指令を含んでいてよい。
【００６５】
コンピュータプログラムおよび製品はさらに、ＰＣＲ反物中のオリゴヌクレオチド内の１種以上のｄＮＴＰを蛍光色素で標識するための指令を含んでいてよい。
コンピュータプログラムおよび製品はさらに、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の固有鋳型およびＣＴに対するアレイの蛍光強度を比較することにより標的遺伝子の発現を定量するための指令を含んでいてよい。
【００６６】
本発明はまた、上記の工程を使用したマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲプロセスを使用して、対象となる複数の標的遺伝子の遺伝子発現を定量的に測定するためのコンピュータ処理法を含む。
【００６７】
図８は、計算された比が所望する範囲内（たとえば１０倍以内）であるかどうかを確かめるために受け取ったデータをさらに分析するための別の工程（ｄ）を使用して、遺伝子の定量測定を最適化するための、本発明の図式フローチャートである。計算された比が所望する範囲内でない場合、ＣＴ試薬の新規の所望する濃度（すなわち、工程（ａ）に対して選択された初めの濃度とは異なる）が選択され、そして工程（ｂ）〜（ｃ）が新規濃度のＣＴ試薬により反復される。
【００６８】
遺伝子発現はｍＲＮＡ、蛋白質、または機能的レベルで測定可能であるが、遺伝子発現のための共通の言語の開発にはｍＲＮＡレベルでの測定がとりわけ適する。このことは、ｍＲＮＡ発現が翻訳に利用可能な転写物の数により主に調節されるためである。対照的に、蛋白質レベルでは、コピー数は、りん酸化、二量体化、および／または蛋白質分解開裂を含む改変のため、しばしば重要ではない。ｍＲＮＡ発現は、主にコピー数に関連するため、それぞれの遺伝子に対する内部標準を開発し、そしてさらに遺伝子発現量のための共通単位を確立することができる。逆転写効率は可変であるが、得られたｃＤＮＡにおいて１種の遺伝子の別の遺伝子に対する提示は影響されないため、標的遺伝子のｃＤＮＡコピー数／１０６  β‐アクチンのｃＤＮＡコピー数は、標的遺伝子のｍＲＮＡ／１０６  β‐アクチンのｍＲＮＡと同等である。
【００６９】
本明細書の実験では、遺伝子発現はβ‐アクチンｍＲＮＡに関して測定される。しかし、別の遺伝子（たとえばＧＡＰＤＨ）、もしくは測定された別の遺伝子、または測定されたすべての遺伝子であっても、試料間でより安定であることが確定された場合、試料内の相対的発現値を変化させずにその基準遺伝子に対して再びデータを計算することができる。
【００７０】
基準遺伝子としてＧＡＰＤＨまたはいずれか別の遺伝子を使用して遺伝子発現データを計算し直す場合、遺伝子間の発現比は同じままである。ｍＲＮＡ／１０６  β‐アクチン分子基準からｍＲＮＡ／１０６  ＧＡＰＤＨ分子基準への変換は、単にそれぞれの遺伝子発現値に１０６／（ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ／１０６  β‐アクチン分子）を乗じることにより行われる。これが行われた場合、同じ試料内の遺伝子発現比は変化しない。したがって、ある試料内の２種の遺伝子間の発現値の比は、基準としてのＧＡＰＤＨ、β‐アクチン、または遺伝子の組み合わせに対して同じことになる。この理由は、遺伝子のそれぞれの発現量はＣＴ混合物に関連し、同じＣＴ混合物が使用される限り、１種のＣＴと別のものとの濃度比は依然として同じままであるためである。遺伝子発現指標の場合、１種の基準遺伝子から別のものに変換後に得られた値の差は、いくつの遺伝子が分子にあり、そしていくつの遺伝子が分母にあるかに依存する。遺伝子発現指標におけるそれぞれの遺伝子は指標の計算前に新規の基準に変換されなければならない。分子と分母に等しい数の遺伝子がある場合、新規基準への変換は試料間の相対指標値に対して影響を与えない。しかし、分子と分母の遺伝子数が等しくない場合、試料間の相対指標値は試料間の相対基準遺伝子値のいずれかの差に従って変化することになる。
【００７１】
１種の試料から別のものへの発現において変化する基準遺伝子の効果は、釣り合った（分子と分母における発現値の等しい数）相互作用する（interactive）遺伝子発現指標において中和される。このためと、相互作用する遺伝子発現指標が個々の遺伝子の発現より表現型とよく相関することのため、対象となる表現型と相関する、釣り合った相互作用する遺伝子発現指標を探し出すことが望ましい。
【００７２】
ヒトおよびマウスの約３０％の遺伝子をＰＣＲ増幅するプライマーを同定することが可能であり、そのための試薬は現在入手可能である。プライマーは、いっそう幅広い種の間で適用できるように開発中である。したがって、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ試薬は、種にわたって、遺伝子発現のための共通の言語を提供する。
【００７３】
以下の実施例で提示されるデータは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲプロセスが実験室間の遺伝子発現データの、信頼度の高い比較を可能にすることを確証する。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲプロセスにより、少量の試料で多くの遺伝子の反復測定が可能になる。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲは、ハイスループット自動化および小型化に非常に好都合である。本明細書に提示された感度および再現性のレベルにより、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲプロセスは重要な遺伝子発現データベースの開発を促進し、そして遺伝子発現のための共通言語として役立つ。
【００７４】
実施例１
材料および方法
試薬
Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒのための１０ＸＰＣＲバッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、２．５ｍｇ／μｌ  ＢＳＡ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）は、Ｉｄａｈａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｄａｈｏ  Ｆａｌｌｓ、Ｉｄａｈｏ）から得た。Ｔｈｅｒｍｏ  １０Ｘ  バッファー（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）、オリゴｄＴプライマー、ＲＮａｓｉｎ（２５Ｕ／μｌ）、ｐＧＥＭサイズマーカー、およびｄＮＴＰ混合物は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）および５Ｘ  第１鎖バッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＤＴＴ）は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）から得た。ＮｕＳｉｅｖｅ  ａｎｄ  ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロースは、ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）から得た。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）から得た。ＲＮアーゼ‐フリーの水は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から得た。色素、マトリクス、および標準を含むＤＮＡ  ７５００アッセイキットは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得た。肺腺癌細胞株、Ａ５４９は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）が注文により合成した。Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１およびｓｙｓｔｅｍ１ａ遺伝子発現キットは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から快く供与された。他のすべての化合物および試薬は、分子生物学等級であった。
【００７５】
ＲＮＡ抽出および逆転写
単層培養した細胞の全ＲＮＡは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って抽出した。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡは、指令に従って沈殿させた。約１μｇの全ＲＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマーを使用して逆転写した。
【００７６】
ユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ
ＳｔａＲＴ−ＰＣＲは、以前に公表されたプロトコール（Ｗｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６−１７，１９９８；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ１  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．ｗｗｗ．ｇｅｎｅｘｎａｔ．ｃｏｍ  ２０００）を使用して、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１またはｓｙｓｔｅｍ１ａ遺伝子発現キット（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ，Ｉｎｃ．）により行った。手短に述べると、Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１またはｓｙｓｔｅｍ１ａキットの、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、ｃＤＮＡ、競合鋳型（ＣＴ）混合物およびｔａｑポリメラーゼを含むマスター混合物を作製し、遺伝子特異的プライマーを含むチューブに分取し、そしてＲａｐｉｄｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）またはＰｒｉｍｕｓ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（ＭＷＧ−ＢＩＯＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）のいずれかで３５サイクル循環させた。それぞれのプロトコールにおいて、変性温度は９４℃、アニーリング温度は５８℃、そして伸長温度は７２℃であった。Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒでは、変性時間は５秒、アニーリング時間は１０秒、伸長時間は１５秒、そして勾配は９．９であった。Ｐｒｉｍｕｓ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉｂｌｏｃｋでは、変性、アニーリングおよび伸長時間はそれぞれ１分、リッド（ｌｉｄ）温度は１１０℃およびリッド圧は１５０ニュートンであった。ＰＣＲ産物は以下に記載のように、アガロースゲルまたはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で評価した。
【００７７】
９遺伝子のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲによる増幅
それぞれのマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応物は、２ラウンドで増幅した。マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの第１ラウンドでは、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、予め作製したｃＤＮＡとＣＴ混合物との混合物（１：１のＡ５４９ｐ８５由来のｃＤＮＡとＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１  １ａ由来のＣＴ混合物の１種）、ｔａｑポリメラーゼ、および９遺伝子のプライマー対を含む１つの反応物が用意された。この反応物を、５、８、１０または３５サイクル循環させた。プライマー混合物中のそれぞれのプライマー濃度は、０．０５μｇ／μｌであった。この増幅後、このＰＣＲ産物はラウンド２の鋳型としての使用のために、水で希釈した。
【００７８】
ラウンド２では、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｔａｑポリメラーゼおよび１種の遺伝子に特異的なプライマー対を含むマスター混合物を、第１ラウンドのＰＣＲ産物の以下の希釈物をそれぞれ１μｌずつ含むチューブに分取した：未希釈、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００および１／１，０００，０００。これらの反応物を３５回循環させ、以下に記載のようにアガロースゲルまたはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで検出した。このラウンドで使用されたプライマー対は、ラウンド１で使用されたプライマー対の中から選択された。ラウンド２では、付加的なｃＤＮＡまたはＣＴ混合物はＰＣＲ反応物に添加されなかった。
【００７９】
対照ユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応では、９遺伝子のマルチプレックス反応のラウンド１で使用するために作製されたｃＤＮＡおよびＣＴ混合物の混合物を、増幅前に系列希釈した：未希釈、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００。それぞれの希釈物の１μｌアリコートは、バッファー、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼおよび１種の遺伝子に特異的なプライマー対（それぞれのプライマーの０．０５μｇ／μｌ）を含むマスター混合物のアリコート１μｌと合わせた。これらの反応物は３５サイクルの１ラウンドだけで増幅された。
【００８０】
９６遺伝子のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ増幅
これらの実験では、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡおよびＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１（９６遺伝子のＣＴを含む）のＣＴ混合物の試料を使用した。Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１のＣＴにより提示された９６遺伝子のそれぞれに対するプライマーを含む溶液は第１ラウンド反応物に含有された。この９６遺伝子のプライマー混合物は、それぞれのプライマーの濃度が０．００５μｇ／μｌになるように希釈した。どのラウンド１反応物も皆３５回循環させた。次にラウンド１ＰＣＲ産物を１／１００に希釈した（９９μｌの水に１μｌのラウンド１産物を添加）。それぞれのラウンド２反応では、希釈されたラウンド１ＰＣＲ産物１μｌとラウンド１で増幅されたものの中から選択された単一遺伝子に対するプライマーを一緒に使用し、３５回循環させた。
【００８１】
対照ユニプレックス反応は、先に記載のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡおよびＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１のＣＴ混合物の試料を使用して行った。これらの実験では、増幅前にｃＤＮＡおよびＣＴ混合物の希釈は行わなかった。
【００８２】
電気泳動および定量
アガロースゲル電気泳動：
増幅後、ＰＣＲ産物を、０．５μｇ／μｌ  エチジウムブロマイドを含む４％  アガロースゲル（３：１  ＮｕＳｉｅｖｅ：ＳｅａＫｅｍ）上に直接加えた。ゲルは約１時間、２２５Ｖで電気泳動した。電気泳動バッファーを冷やし、電気泳動中再循環させた。ゲルはＦｏｔｏ／Ｅｃｌｉｐｓｅ画像分析システム（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ，Ｈａｒｔｌａｎｄ，ＷＩ）で可視化した。デジタル画像は、Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃ７１００／６６コンピュータに保存し、Ｃｏｌｌａｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ）をデンシトメトリー分析に使用した（またはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（以下で説明する）を使用して分析した）。
【００８３】
遺伝子発現の定量を行った。初めに、ハウスキーピング遺伝子、β‐アクチンの固有鋳型（ＮＴ）／ＣＴ比、およびそれぞれの標的遺伝子に対するＮＴ／ＣＴ比を計算した。ＰＣＲ反応物に添加された初期ＣＴ濃度が既知のため、初期ＮＴ濃度を確定することができた。それぞれのＮＴ／ＣＴ比はＰＣＲ産物のエチジウムブロミド染色に基づき、この染色は塩基対に存在する分子数および分子長の両方により影響されるため、ＮＴ／ＣＴ比を利用する前にＮＴはＣＴ産物のサイズに対して任意に修正された。測定可能な場合、ヘテロダイマー（ＨＤ）はＣＴのサイズに対して修正され、２つに分けられた。ＨＤ鎖の１つはＮＴに由来し、そして他の１つはＣＴに由来するため、ＮＴ／ＣＴ比を計算する前に、ＨＤ値の半分はＮＴに添加され、他の半分はＣＴに添加された。次に、計算された標的遺伝子ＮＴ分子数は、計算されたβ‐アクチンＮＴ分子数により分割され、添加差に対して修正された。
【００８４】
マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲでは、それぞれの条件下（希釈および／またはラウンド１サイクル数を変える）で検出された標的遺伝子は、同じ条件下で検出されたβ‐アクチンに対して測定された。たとえば、９遺伝子のマルチプレックス反応のラウンド１は、β‐アクチンおよびｃ−ｍｙｃを含む９遺伝子のプライマーを含有した。ラウンド１のＰＣＲ反応物の１／１００，０００希釈物が作製され、ラウンド２で使用された。この希釈物のアリコートはラウンド２で使用され、β‐アクチンおよびｃ−ｍｙｃの両方を増幅させた。これらの条件下で、ラウンド１において３５回、そしてラウンド２において３５回循環させた場合、ｃ−ｍｙｃは３．４０ｘ１０４分子／１０６  β‐アクチン分子として測定された（図３）。
【００８５】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ微小キャピラリー電気泳動：
増幅後、それぞれのＰＣＲ反応物１０μｌのうちの１μｌを、ＤＮＡ７５００アッセイの指令に従って作製したチップのウェルに添加した。手短に述べると、ゲル‐色素マトリクス９μｌを１ウェル中のチップに添加し、チップを３０秒間加圧した。別の２つのウェルをゲル‐色素マトリクスで満たし、残りのウェルのそれぞれは分子量マーカー５μｌを添加した。ＤＮＡラダー１マイクロリットルをラダーウェルに添加し、ＰＣＲ産物１μｌをそれぞれの試料ウェルに添加した。チップはボルテックスし、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに入れた。それぞれの試料に順次電流を適用し、試料を分離するＤＮＡ  ７５００アッセイプログラムを実施した。ＤＮＡはゲル‐色素マトリクス中の介在色素の蛍光により検出された。ＮＴ／ＣＴ比はそれぞれのＰＣＲ産物の曲線下面積から計算し、エチジウムブロミド染色アガロースゲル電気泳動のようにＤＮＡを検出するために介在色素が使用されたため、サイズ修正を行った。
【００８６】
統計解析：
すべての統計解析はＷｉｎｄｏｗｓのＳＰＳＳバージョン９．０を使用して行った。ユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られた遺伝子発現値をマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られたものと比較するために、対数変換したデータに対して両側（two-tailed）ポアソン相関試験を行った。ｐ値が０．０５未満の場合、相関は統計的に有意であるとみなした。
【００８７】
結果
９遺伝子のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ増幅
ラウンド１において９遺伝子のプライマー対と共に３５回の増幅後、ＰＣＲ産物のアリコートを希釈し、９遺伝子の１種のプライマーと共に増幅した。明るく、明瞭なバンドがそれぞれの遺伝子に対して観察された（図１）。したがって、１ラウンドの増幅で１種の遺伝子を測定するための代表的なユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応で使用されるｃＤＮＡおよびＣＴ混合物の同じ量が、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにおいて９遺伝子の発現量を得るために使用された。
【００８８】
さらに、ラウンド１ＰＣＲ産物はカタラーゼまたはｃ−ｍｙｃに対して１／１，０００，０００に希釈され（β‐アクチンでは、１／１００，０００）、ラウンド２における１種の遺伝子のプライマー対を用いた次の増幅を定量することができる（図１および３）。対照的に、ラウンド１において使用されたｃＤＮＡおよびＣＴ混合物が増幅前に１／１，０００以下（β‐アクチンに対しては１／１００以下）に希釈され、その後３５回の単一ラウンドにおいてこれらの遺伝子のいずれか１つに対する単一のプライマー対と共に増幅される場合、産物は全く観察されなかった。
【００８９】
ラウンド１で使用されるサイクル数を増やすと、ラウンド２前に希釈されて、ラウンド２増幅後でも依然として検出可能なＰＣＲ産物の量が増大した。したがって、より少ないサイクル数（５、８および１０サイクル）をラウンド１で使用するか、またはユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用するより、それぞれのラウンドで３５サイクルを使用するマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲを使用して試料を増幅する場合、試料上でより多くの遺伝子発現量を得ることができる。それぞれの遺伝子およびそれぞれの条件に関する詳細は図３に示す。対照ユニプレックス反応およびマルチプレックス反応の代表的なゲルは図１に示す。
【００９０】
９６遺伝子のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ増幅
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ由来のｃＤＮＡのユニプレックスおよび９６遺伝子マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られた遺伝子発現値を、図２に示す。９６プライマー対がマルチプレックス反応物に含有されたが、以下の理由から９３遺伝子だけの遺伝子発現値を報告する：１）それぞれの遺伝子発現値は、β‐アクチンの値が報告されないように標的遺伝子の分子／β‐アクチンの１０６分子として報告される、２）ＧＡＰＤ遺伝子発現を測定するための２組の試薬セット（ＧＡＰＤ  ＣＴ１およびＧＡＰＤ  ＣＴ２）がＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１キットに含有されるが、この試料では、ＧＡＰＤ  ＣＴ１だけが測定された、および３）キットにより提供された、１種の遺伝子、ＢＡＸアルファの試薬が、Ｇ．Ｅ．Ｎ．ＥＩｎｃ．により行われた品質管理試験に合格しなかったため、この遺伝子はこの試験において評価されなかった。ユニプレックスおよびマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現値の２変数解析は、きわめて有意な（ｐ＝０．００１）正の相関を明らかにした（ｒ＝０．９９３）（図３）。
【００９１】
実施例ＩＩ
本発明のマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ法は、研究者が生検標本、微小解剖組織または選別した細胞集団から入手できる少量のｃＤＮＡからより多くの遺伝子を研究し、より多くの複製データを得ることを可能にする。
【００９２】
図６および７は、本発明の方法が首尾よく少量の初代組織細胞に適用されたことを示すデータの表である。図６は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から集めた細針吸引物のデータを示す。測定された遺伝子が記載され、すべてのデータはＧＥＮＥＳｙｓｔｅｍ１のＣＴ混合物を使用して、１８マルチプレックスＰＣＲにより測定した。
【００９３】
図７は肺疾患を持たない肺ドナーから採取したデータを示す。また遺伝子発現は、９６遺伝子マルチプレックスＰＣＲを使用して、ＧＥＮＥＳｙｓｔｅｍ１のＣＴ混合物を用いて集めた。
【００９４】
本発明の上記の詳細な記載は説明のためだけに提示される。本発明の範囲から逸脱することなく、多数の変更および改変ができることは当業者には明らかであろう。したがって、上記の記載のすべては、例証的であって、限定的ではない意味において解釈すべきであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定められる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、統計的に信頼される、異なるレベルで発現された遺伝子を検出するために必要とされる細胞数／ＰＣＲ反応の最少数を示すグラフである。ＰＣＲ反応に提示された細胞数はＸ軸に沿って示される。ＰＣＲ反応にかけられたｍＲＮＡ転写物の初期のコピー数はＹ軸上に示される。統計的に信頼される遺伝子発現を測定するため、および偶発変異の影響を減らすために、少なくとも１０の初期コピーが存在しなければならないと考えられる。代表的なユニプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応物は１００〜１，０００細胞のｃＤＮＡを含む。この量の場合、１００〜１，０００細胞のｃＤＮＡは、０．１〜１転写物／細胞にて発現された遺伝子の１０転写物を含むと予想される。ヒト肺組織において、以前に測定された遺伝子は０．１転写物／細胞（たとえばＧＡＤＤ４５）〜１０，０００転写物／細胞（たとえばＣＣ１０）で発現された。
【図２Ａ】図２は、記載された遺伝子をユニプレックスおよびマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより測定した、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏｓ．１〜２８２）に由来するｃＤＮＡの平均遺伝子発現を示す表である。ｐ２１の“長い”名称は“ＣＤＫＮ１Ａ”である。配列は表２のように、同じ順に記載される。それぞれの遺伝子は３種の配列を有する。初めの配列はフォワードプライマーであり、第２の配列はリバースプライマーであり、そして第３の配列はＣＴプライマーである。それで、たとえば配列１はＨＳＤ１１Ｂ１フォワードプライマーであり、配列２はＨＳＤ１１Ｂ１リバースプライマーである。
【図２Ｂ】図２は、記載された遺伝子をユニプレックスおよびマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより測定した、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏｓ．１〜２８２）に由来するｃＤＮＡの平均遺伝子発現を示す表である。ｐ２１の“長い”名称は“ＣＤＫＮ１Ａ”である。配列は表２のように、同じ順に記載される。それぞれの遺伝子は３種の配列を有する。初めの配列はフォワードプライマーであり、第２の配列はリバースプライマーであり、そして第３の配列はＣＴプライマーである。それで、たとえば配列１はＨＳＤ１１Ｂ１フォワードプライマーであり、配列２はＨＳＤ１１Ｂ１リバースプライマーである。
【図３】図３は、遺伝子発現の程度を変化させずに産物の量を増やすためのマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスの使用を示す。マルチプレックスＰＣＲ反応物は、Ｒａｐｉｄｃｙｃｌｅｒで増幅した。ラウンド１では、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、予め作製されたｃＤＮＡとＣＴ混合物の混合物（１：１のＡ５４９  ｐ８５のｃＤＮＡとＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１混合物Ｄ）、Ｔａｑポリメラーゼおよび９種のプライマー対の１０Ｘストックソルーションの１μｌ（濃度０．０５μｇ／μｌ）を含む１０μｌの反応混合物を作製した。この反応は、５、８、１０または３５サイクル行った。ラウンド１の増幅後、ＰＣＲ産物はラウンド２で鋳型として使用するために希釈した。ラウンド２では、バッファー、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼおよび１種の遺伝子に特有のプライマー対を含むマスター混合物９μｌを、ラウンド１のＰＣＲ産物の以下の希釈物：未希釈、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００、１／１００，０００および１／１，０００，０００、のそれぞれの１μｌを含むチューブに入れることにより、１０μｌの反応混合物を作製した。これらの反応物は３５回循環させた。ラウンド２で使用したプライマー対は、ラウンド１で使用したプライマー対の中から選択した。ラウンド２のＰＣＲ反応物に、付加的なｃＤＮＡまたはＣＴ混合物は添加されなかった。対照ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲ反応のためには、９遺伝子のマルチプレックス反応のラウンド１で使用するために作製されたｃＤＮＡおよびＣＴ混合物の混合物を増幅前に系列希釈した：未希釈、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／１，０００、１／１０，０００。これらの反応物は３５サイクルの１ラウンドだけで増幅された。それぞれの希釈物のアリコート１μｌは、バッファー、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、および１種の遺伝子に特有のプライマー対（０．５μｇ／μｌのそれぞれのプライマー）を含むマスター混合物のアリコートと混合した。遺伝子発現の定量を行った。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ対ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲ反応の代表的な結果を示す。図４Ａ〜Ｄでは、増幅後、ＳｔａＲＴ−ＰＣＲ産物は４％アガロースゲル上で電気泳動を行った。Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅ．ｓｙｓｔｅｍ１ａ  ＣＴ混合物ＤとＡ５４９ｐ８５のｃＤＮＡとを一緒に混合し、ユニプレックスおよびマルチプレックスＰＣＲ反応で増幅した。［図４Ａ］β‐アクチンプライマーによる対照ユニプレックス反応。レーン１，ｐＧＥＭサイズマーカー；レーン２、β‐アクチンＣＴの３００，０００分子と、それと釣り合った（in balance with）β‐アクチンＮＴとである、未希釈ｃＤＮＡを含むＰＣＲ反応物；レーン３、１：５に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物を含むＰＣＲ反応物；レーン４、１：１０に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン５、１：５０に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン６、１：１００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン７、１：１，０００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン８、１：１０，０００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物。［図４Ｂ］第２ラウンドマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応のＰＣＲ産物であって、それらはそれぞれラウンド１ＰＣＲ産物とβ‐アクチンプライマーのアリコートを含む。レーン１，ｐＧＥＭサイズマーカー；レーン２、１／５００のラウンド１ＰＣＲ産物１０μｌ（１：５０の希釈物１μｌ）；レーン３、１／１，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン４、１／１０，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン５、ｐＧＥＭサイズマーカー；レーン６、１／１０，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン７、１／１００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン８、１／１，０００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン９、１／１０，０００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物。［図４Ｃ］カタラーゼプライマーによる対照反応。レーン１，ｐＧＥＭサイズマーカー；レーン２、未希釈ｃＤＮＡおよびカタラーゼＣＴの３，０００分子に等価のＣＴ混合物を含むＰＣＲ反応物；レーン３、１：５に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン４、１：１０に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン５、１：５０に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン６、１：１００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン７、１：１，０００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物；レーン８、１：１０，０００に希釈したｃＤＮＡ／ＣＴ混合物。［図４Ｄ］第２ラウンドマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲ反応のＰＣＲ産物。反応物はラウンド１ＰＣＲ産物およびカタラーゼプライマーのアリコートを含む。レーン１，ｐＧＥＭサイズマーカー；レーン２、１／１００のラウンド１ＰＣＲ産物１０μｌ（１：１０希釈物１μｌ）；レーン３、１／５００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン４、１／１，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン５、１／１０，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン６、１／１００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン７、１／１，０００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物；レーン８、１／１０，０００，０００のラウンド１ＰＣＲ産物。
【図５】図５は、９６遺伝子マルチプレックスまたはユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲのいずれかにより得られた遺伝子発現値の相関を示すグラフである。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの試料は、ＣＴ混合物（Ｇ．Ｅ．Ｎ．Ｅｓｙｓｔｅｍ１のＢ．Ｃ．Ｄ．ＥおよびＦ混合物が使用された）と合わせ、ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲまたはＧ．Ｅ．Ｎ．Ｅｓｙｓｔｅｍ１のすべての遺伝子に対するプライマー対を持つ９６遺伝子マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲのいずれかにより増幅した。評価可能であった９３遺伝子の平均値を、図２（表２）に示す。これらのうち７９は、ユニプレックスおよびマルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲの両方により測定され、比較可能であった。遺伝子発現値は、１０６β‐アクチンｍＲＮＡ分子ごとのｍＲＮＡ分子数として表す。ユニプレックスＳＴＡＲＴ−ＰＣＲにより得られた値はＸ軸にそってプロットし、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲにより得られた値はＹ軸に沿ってプロットする。
【図６】図６は、初代非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるカルボプラチン化学抵抗性遺伝子候補の発現量を示す表である。
【図７】図７は、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲによる肺ドナー気道上皮細胞における遺伝子発現量を示す表である。
【図８】図８は、マルチプレックスＳｔａＲＴ−ＰＣＲプロセスを使用した少量の生体試料の遺伝子発現を定量的に測定するためのプロセスに有用なソフトウェアプログラムを示す概略図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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