(57)【要約】本発明は、タンパク質解析のシステムおよび方法に関する。例えば、本発明は、表面膜タンパク質を同定し特徴づける方法を提供する。本発明はまた、タンパク質のアレイを作製し解析する方法およびシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) i) 表面タンパク質および細胞内タンパク質を含む1つまたは複数の細胞を含む試料と、
ii) 非膜透過性標識と
を提供する段階；
b) 該標識が該表面タンパク質に結合し標識表面タンパク質を生じる条件下で、該試料を該標識に曝す段階；ならびに
c) 2つまたはそれ以上の該標識タンパク質を同定する段階
を含む、細胞表面タンパク質を同定する方法。
【請求項２】
同定段階が、10個またはそれ以上の標識タンパク質を同定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
2つまたはそれ以上の同定される標識タンパク質が、第1クラスのタンパク質である第1タンパク質および第2クラスのタンパク質である第2タンパク質を含み、タンパク質の該第1クラスと該第2クラスが、プロテインキナーゼ、増殖因子、プロテインホスファターゼ、イオンチャネル、および受容体からなる群より選択される異なるタンパク質クラスである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1タンパク質クラスが増殖因子であり、第2タンパク質クラスが増殖因子ではない、請求項3記載の方法。
【請求項５】
同定段階の前に、標識表面タンパク質を細胞内タンパク質から分離する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
標識がビオチンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ビオチンがNHS-ビオチンを含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
同定段階の前に、標識表面タンパク質を細胞内タンパク質から分離する、請求項6記載の方法。
【請求項９】
分離段階が、アビジンを含む固相支持体への標識表面タンパク質の結合を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
2つまたはそれ以上の標識タンパク質の同定段階が、該標識タンパク質の質量分析法による解析を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
2つまたはそれ以上の同定される標識タンパク質の少なくとも1つの量を定量化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
2つまたはそれ以上の同定される標識タンパク質の少なくとも1つの量を、別の細胞試料の2つまたはそれ以上の同定される標識タンパク質の少なくとも1つの量と比較する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
同定段階の前に、標識表面タンパク質を緩衝液に可溶化する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
同定段階の前および可溶化段階の後に、不溶化標識タンパク質を消化する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
1つまたは複数の細胞が癌細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
a) i) 表面タンパク質および細胞内タンパク質を含む1つまたは複数の細胞を含む試料と、
ii) 非膜透過性標識と
を提供する段階；
b) 該標識が該表面タンパク質に結合し標識表面タンパク質を生じる条件下で、該試料を該標識に曝す段階；
c) 該標識表面タンパク質を該細胞内タンパク質から分離し、分離表面タンパク質を生じる段階；ならびに
d) 該分離表面タンパク質を固相支持体に結合させる段階
を含む、細胞表面タンパク質を特徴づける方法。
【請求項１７】
a) i) 固相支持体と、
ii) 細胞タンパク質を含む試料と、
iii) 第1の物理的性質に基づいてタンパク質を分離する分離装置と
を提供する段階；
b) 該試料を該分離装置で処理し、複数のタンパク質画分を生じる段階；ならびに
c) 該タンパク質画分の1つの画分からのタンパク質を該固相支持体のあらかじめ選択した位置に結合させる段階
を含む、タンパク質アレイを作製する方法。
【請求項１８】
試料が癌細胞の細胞抽出物を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
分離装置がタンパク質の電荷に基づいてタンパク質を分離する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
分離装置がタンパク質の大きさに基づいてタンパク質を分離する、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部、公衆衛生局助成金第CA 84982号により部分的に支援される研究中になされたものである。米国は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、タンパク質解析のシステムおよび方法に関する。例えば、本発明は、表面膜タンパク質を同定し特徴づける方法を提供する。本発明はまた、タンパク質のアレイを作製し解析する方法およびシステムを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
プロテオミクスは、生物のタンパク質成分およびそれらが相互作用する方法を同定する目的で、ならびに健康時、疾患時、および外因性の因子に反応したタンパク質成分の発現および翻訳後修飾のパターンを決定するために、様々な技術を組み合わせることを目指して現れた分野である。この試みは、タンパク質が細胞の最も機能的なコンパートメントを表し、タンパク質レベルで得られる情報は生物のゲノムを解読したりまたはRNAレベルで発現を調べることによって単に予測できないことから、正当化される。プロテオミクスのアプローチは、翻訳後タンパク質修飾の細胞機能への寄与を独自にとらえている。プロテオミクスにおける目下の関心は、複雑なタンパク質混合物を定量的に解析する方法が利用できること、タンパク質およびタンパク質の翻訳後修飾を同定する方法が利用できること、タンパク質とDNA配列を結びつけるバイオインフォマティックス手段の開発、ならびにタンパク質情報を保存および問い合わせをするデータベースを開発する能力から生じている。
【０００４】
プロテオーム発現解析は、典型的に、タンパク質を分離し、マッピングし、特徴づける一連の技術を含む。最新のプロテオミクスで最も広く用いられている技術に、タンパク質を分離してマッピングする2次元（2-D）電気泳動法とタンパク質の特徴づけをする質量分析法（MS）の2つがある。細胞または組織可溶化液中のタンパク質を定量的に解析するために2-Dゲルを使用する上での問題の1つは、分解能と感度の限界から、2-Dゲルが日常的に1,000〜2,000個のタンパク質しか分離できないことである。ある細胞種では、約10,000個の遺伝子に由来するタンパク質を非常に幅広いタンパク質レベルで発現している可能性があり、最も多量にあるタンパク質以外は全部を可視化することは困難である。したがって、現在、同じ細胞または組織試料中の残りのタンパク質を定量的に解析する能力を犠牲にすることなく、少量のタンパク質を定量的に解析するのに十分に高い感度を提供するプロテオミクスの新しい方法を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、タンパク質解析のシステムおよび方法に関する。例えば、本発明は、表面膜タンパク質を同定し特徴づける方法を提供する。本発明はまた、タンパク質のアレイを作製し解析する方法およびシステムを提供する。
【０００６】
例えば、本発明は細胞表面タンパク質を同定する方法を提供するが、これは、表面タンパク質および細胞内タンパク質を含む1つまたは複数の細胞と非膜透過性標識（すなわち、膜非透過性の標識であり、細胞表面に曝した場合、実質的に膜の外側のみに残存し、膜の外側のタンパク質のみを実質的に標識する）を含む試料を提供する段階；標識が表面タンパク質に結合して標識表面タンパク質が生じる条件下で試料を標識に曝す段階；ならびに2つまたはそれ以上（例えば、3つまたはそれ以上、、、、10個またはそれ以上、、、、100個またはそれ以上、、、、）の標識タンパク質を同定する段階を含む。したがって、本発明は、複数の膜タンパク質または任意のタイプもしくはクラスのタンパク質を同時に解析する方法を提供する。いくつかの態様においては、解析するタンパク質は様々なクラスのタンパク質（例えば、互いに異なる酵素活性を有するタンパク質）を含む。例えば、いくつかの態様においては、同定される2つまたはそれ以上の標識タンパク質は、第1クラスのタンパク質である第1タンパク質および第2クラスのタンパク質である第2タンパク質を含み、第1クラスと第2クラスのタンパク質は互いに異なり、これらはプロテインキナーゼ、増殖因子、タンパク質ホスファターゼ、イオンチャネル、および受容体を含むがこれらに限定されないタンパク質クラスのものである。
【０００７】
いくつかの態様においては、同定段階の前に、標識表面タンパク質を細胞内タンパク質から分離する。そのようないくつかの態様において、標識はビオチン（例えば、膜非透過性NHS-ビオチン）を含む。いくつかの態様においては、アビジンを含む固相支持体への標識表面タンパク質の結合により、ビオチン標識タンパク質を分離する。
【０００８】
本発明は、タンパク質の同定または解析の種類に制限されない。いくつかの態様において、同定段階は標識タンパク質の質量分析法による解析を含む。いくつかの態様においては、方法はさらに、2つまたはそれ以上の同定される標識タンパク質の少なくとも1つの量を定量化する段階を含む。ある好ましい態様においては、方法は、同定される標識タンパク質の量を、別の細胞試料の同じタンパク質または類似のタンパク質の量と比較する段階を含む。
【０００９】
いくつかの態様においては、同定段階の前に、標識表面タンパク質を緩衝液に可溶化する。いくつかの態様においては（例えば、1つまたは複数の標識タンパク質が緩衝液に可溶化されない場合）、同定段階の前および可溶化段階の後に、不溶化標識タンパク質を消化する。
【００１０】
タンパク質は、癌細胞、未分化細胞（例えば幹細胞）、分化した細胞、薬剤で処理した細胞、細胞培養細胞、組織（例えば、動物または植物組織）等を含むがこれらに限定されない望ましい細胞試料由来であってよい。
【００１１】
本発明はまた、タンパク質アレイを作製する方法を提供するが、これは、固相支持体、細胞タンパク質を含む試料、および第1の物理的性質に基づいてタンパク質を分離する分離装置を提供する段階；試料を分離装置で処理し複数のタンパク質画分を生じる段階；ならびに1つ（またはそれ以上）のタンパク質画分のタンパク質を固相支持体のあらかじめ選択した位置に結合させる段階を含む。いくつかのそのような態様においては、少なくとも1つの共通した性質を有するタンパク質を共にアレイに配置する。いくつかの態様においては、複数の分離段階を行うが、各段階では1つまたは複数の異なる物理的性質に基づきタンパク質を分離する。このような態様においては、タンパク質（例えば、上記の方法で単離した細胞表面タンパク質）を2つまたはそれ以上の基準により定義される複数のサブグループに分類する。次に、タンパク質のサブグループを固相支持体の所定の位置に共に配置してもよい。
【００１２】
本発明の方法により作製するタンパク質アレイによって、類似の性質を共有しないタンパク質を除く、類似の性質を有するタンパク質の調査と解析が可能になる。例えば、本発明の方法を用いて、創薬の候補標的であるタンパク質を単離してそのアレイを作製することが可能である。次に、アレイに配置したすべてまたは多くのタンパク質が（わずかまたは全くなしというのとは対照的に）薬剤アッセイ法に適した種類のタンパク質であるタンパク質アレイを、薬剤スクリーニングに使用することができる。稀なタンパク質が全細胞タンパク質と共にアレイに配置され、十分な量が存在しないためにその存在または挙動が識別できない場合、稀なタンパク質のアレイを作製して特徴づける際に本発明の方法の特有な利用法が見い出せる。
【００１３】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下で定義する。
【００１４】
天然タンパク質分子のアミノ酸配列を意味するために本明細書においてアミノ酸配列を引用する場合、アミノ酸配列およびポリペプチドまたはタンパク質等の同様の用語は、そのアミノ酸配列を、引用したタンパク質分子に伴う完全な天然のアミノ酸配列に制限する意図はない。
【００１５】
本明細書で用いる用語「断片」とは、天然タンパク質と比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有し、残存するアミノ酸配列が全長cDNA配列から推定されるアミノ酸配列の相当する位置と同一であるポリペプチドを意味する。断片は、典型的には、少なくとも4アミノ酸長、好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長またはそれ以上であり、種々のリガンドおよび／または基質との分子間結合または活性に必要なポリペプチドの部分に及ぶ。
【００１６】
本明細書で用いる膜受容体タンパク質という用語は、リガンド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）に結合する膜貫通タンパク質を意味する。当技術分野で周知のように、タンパク質のリン酸化は、細胞の外側から核への調節シグナルを運ぶタンパク質を選択的に修飾する、細胞が利用する共通の調節機構である。これらの生化学的修飾を行うタンパク質は、プロテインキナーゼとして知られる酵素群である。これらは、リン酸化の標的とする基質残基によって、さらに定義され得る。プロテインキナーゼの1つのグループは、標的タンパク質のチロシン残基を選択的にリン酸化するチロシンキナーゼ（TK）である。いくつかのチロシンキナーゼは膜結合受容体であり（RTK）、リガンドによる活性化により、基質を修飾するばかりでなく自己リン酸化も行い得る。リガンド刺激による連続的なリン酸化の開始は、例えば、上皮増殖因子（EGF）、インスリン、血小板由来増殖因子（PDGF）、および線維芽細胞増殖因子（FGF）等のエフェクターの作用に根拠をなすパラダイムである。これらのリガンドに対する受容体はチロシンキナーゼであり、リガンド（ホルモン、増殖因子）の標的細胞への結合と1つまたは複数の生化学的経路の活性化による細胞内へのシグナルの伝達との接点を提供する。受容体チロシンキナーゼへのリガンド結合は、固有の酵素活性を活性化する。チロシンキナーゼは細胞質の非受容体タイプの酵素であってもよく、シグナル伝達経路の下流成分として働く。
【００１７】
本明細書で用いる「多相タンパク質分離法」という用語は、少なくとも2回の分離段階を含むタンパク質分離法を意味する。いくつかの態様においては、多相タンパク質分離法は、タンパク質の異なる物理的性質に基づいてタンパク質を分離する2回またはそれ以上の分離段階を意味する（例えば、第1段階ではタンパク質の電荷に基づいて分離し、第2段階ではタンパク質の疎水性に基づいて分離する）。
【００１８】
本明細書で用いる「タンパク質特性マップ」という用語は、試料のタンパク質内容の表示を意味する。例えば、「タンパク質特性マップ」は、ある細胞で発現される全タンパク質の1次元表示を含む。いくつかの態様においては、タンパク質特性マップは、細胞内の全タンパク質のサブセットを示してもよい。タンパク質特性マップを利用して、2つまたはそれ以上の試料間の「タンパク質発現パターン」（例えば、試料で発現されるタンパク質の量および同一性）を比較することができる。例えば、一方の試料（例えば癌細胞）には存在し、もう一方の試料（例えば正常組織）には存在しないタンパク質、または一方の試料をもう一方の試料と比較して過剰に発現もしくは低発現しているタンパク質を同定する際に、そのような比較の利用法が見い出せる。
【００１９】
本明細書で用いる「物理的性質に基づいてタンパク質を分離できる分離装置」という用語は、2つまたはそれ以上のタンパク質種を含む試料中に存在するタンパク質間の物理的性質の相違に基づき、タンパク質（少なくとも1つのタンパク質）を互いに分離できる構成またはシステムを意味する。例えば、イオン排除、イオン交換、順相／逆相分配、サイズ排除、リガンド交換、液相／ゲル相等電点電気泳動、および吸着クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない種々のタンパク質分離カラムならびに構成が考えられる。これらおよび他の装置は、「物理的性質」に基づいて、タンパク質を互いに分離することができる。物理的性質の例には、大きさ、電荷、疎水性、およびリガンド結合親和性が含まれるがこれらに限定されない。そのような分離技法により、「物理的性質によって規定される」（すなわち物理的性質の相違に基づき試料中の他のタンパク質から分離される）タンパク質の画分またはサブグループが得られるが、画分またはサブグループ内のタンパク質はすべて物理的性質を共有していることになる。例えば、画分内の全タンパク質は、規定の溶液条件（例えば塩濃度）または狭い範囲の溶液条件でカラムから溶出され、その画分内に存在しない他のタンパク質はカラムに結合し続けているか、または別の溶液条件で溶出される。
【００２０】
「液相」分離装置は、溶液に含まれるタンパク質試料を利用するが、分離中はタンパク質は液相に可溶化されたままで存在し、装置から収集される産物（例えば分画）は液相状態である。これは、分離中にタンパク質がゲル相に入るゲル電気泳動装置とは対照的である。液相のタンパク質は、ゲル相の場合と比較し、タンパク質の回収／抽出にはるかに敏感に反応する。いくつかの態様においては、それぞれ次の段階の処理の前に試料に手を加える必要なしに（例えば、タンパク質の回収／抽出および再可溶化の必要なしに）、液相のタンパク質試料を多段階（例えば、複数の分離および特徴づけ段階）過程で使用することが可能である。
【００２１】
本明細書で用いる「タンパク質の表示」という用語は、タンパク質試料中のタンパク質の存在を解釈するために用いる種々の技法を意味する。表示には、コンピューターのディプレイ、図、オートラジオグラフィーのフィルム、一覧表、表、チャート等にタンパク質を可視化することを含むがこれらに限定されない。「第1および第2の物理的性質を示した条件下でのタンパク質の表示」とは、表示される各タンパク質の少なくとも2つの異なる物理的性質が示されるまたは検出できるタンパク質（例えば、分離装置により得られるタンパク質またはタンパク質のサブセット）の表示を意味する。例えば、このような表示には、各タンパク質の第1および第2の物理的性質を記述してある（定量化してある）欄を含む表、各タンパク質がX、Yの位置で表され、X、Y座標は第1および第2の物理的性質それぞれによって定義されまたはその逆である2次元表示が含まれるが、これらに限定されない。このような表示には、さらなる物理的性質を含む多次元表示（例えば3次元表示）も含まれる。
【００２２】
本明細書で用いるイオンチャネルタンパク質という用語は、細胞膜を越えるイオンの流入または流出を調節するタンパク質を意味する。イオンチャネルタンパク質の例には、Na+-K+ ATPアーゼポンプ、Ca2+ポンプ、およびK+リークチャネルが含まれるがこれらに限定されない。
【００２３】
本明細書で用いる「タンパク質を検出できる検出システム」という用語は、タンパク質分離装置で得られたタンパク質（例えば、分離装置から収集された1つまたは複数の画分中のタンパク質）を検出する任意の検出装置、アッセイ法、またはシステムを意味する。そのような検出システムにより、タンパク質自体の性質（例えばUV分光法）を検出することができ、またはタンパク質に結合した標識（例えば蛍光標識）もしくは検出可能な他のシグナルを検出することが可能である。検出システムは、タンパク質の検出基準（吸光度、蛍光、発光等）を、電子工学的にまたは同様の手段で加工または保存し得るシグナルに変換する（例えば、光電子増倍管または同様のシステムを使用して検出される）。
【００２４】
本明細書で用いる「集中管理システム」または「集中管理ネットワーク」という用語は、複数の機器または装置（例えば、自動化試料取り扱い装置および分離装置）に機能的に結合した情報および設備管理システム（例えば、コンピュータプロセッサおよびコンピュータメモリ）を意味する。好ましい態様においては、集中管理ネットワークは、ネットワークに接続した装置および機器の操作を制御するように設定される。例えば、いくつかの態様においては、集中管理ネットワークは複数のクロマトグラフィー装置の操作、装置間の試料の移動、ならびにデータの解析および表示を制御する。
【００２５】
本明細書で用いる「固相支持体」または「支持体」という用語は、別の物質を結合することが可能な固体また半固体構造を提供する任意の物質を意味する。このような物質には、滑らかな支持体（例えば、金属、ガラス、プラスチック、シリコン、およびセラミック表面）ならびに表面にきめのある物質および多孔性物質が含まれる。このような物質には、ゲル、ゴム、ポリマー、および他の軟質物質も含まれるがこれらに限定されない。固相支持体は平らである必要はない。支持体には、球状（例えばビーズ）を含む任意の形状が含まれる。固相支持体に結合する物質は、固相支持体の任意の部分に結合してよい（例えば、多孔性固相支持体物質の内部に結合してよい）。本発明の好ましい態様では、タンパク質等の生体分子を固相支持体に結合させる。生体物質は、無作為ではない化学的または物理的相互作用により固相支持体に結びつく場合に、固相支持体に「結合」している。いくつかの好ましい態様において、結合は共有結合による。しかし、結合は共有結合である必要も永久的である必要もない。いくつかの態様においては、物質は、「スペーサー分子」または「連結基」を介して固相支持体に結合する。そのようなスペーサー分子は、生体物質に結合する第1の部分と固相支持体に結合する第2の部分を有する分子である。したがって、固相支持体に結合する場合、スペーサー分子によって固相支持体と生体物質は分離されているが、スペーサー分子は両方に結合している。
【００２６】
2つの分子に関して本明細書で用いる「直接結合する」という用語は、親分子の一部ではないいかなる連結基もスペーサー基も介在することなく、2つの分子間で共有結合していることを意味する。
【００２７】
本明細書で用いる「連結基」または「リンカー基」という用語は、2つの実態（例えば、固相支持体、タンパク質、または他の分子）を連結もしくは結合する原子または分子を意味するが、これは連結する個々の実態のどちらの一部でもない。
【００２８】
本明細書で用いる「試験化合物」という用語は、疾患、疾病、病気、もしくは身体機能の障害を治療または予防するのに使用し得る、または試料の生理的状態もしくは細胞状態を変化させ得る、任意の化学物質、医薬品、薬剤等を意味する。試験化合物は、既知の治療化合物と候補治療化合物の両方を含む。本発明のスクリーニング法を使用してスクリーニングすることにより、試験化合物が治療的であることを決定できる。「既知の治療化合物」とは、治療または予防において効果的であることが示されている（例えば、動物実験またはヒトへの投与を伴う事前実験による）治療化合物を意味する。
【００２９】
本明細書で用いる「試料」という用語は、最も広い意味で用いる。1つの意味においては、任意の材料源由来の検体または培養物、ならびに生体試料および環境試料を含むことを意図する。生体試料は植物および動物（ヒトを含む）由来でよく、液体、固体、組織、および気体を含む。生体試料には、血漿、血清等の血液製剤が含まれる。環境試料には、地表物質、土壌、水、および産業試料等の環境物質が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を制限するものと解釈すべきではない。
【００３０】
発明の概要
本発明は、タンパク質解析のシステムおよび方法に関する。例えば、本発明は、表面膜タンパク質を同定し特徴づける方法を提供する。本発明はまた、タンパク質のアレイを作製し解析する方法およびシステムを提供する。
【００３１】
タンパク質タギング技術は長い間役立っており、様々な応用に利用されているが、2-Dゲル解析との組み合わせで感度を増強する戦略の一部としてタンパク質タギングを組み入れる研究はほとんど試みられていない。例えば、様々な種類のタンパク質研究において長年にわたりタンパク質放射ヨウ素標識が利用されているが、複雑な混合液中の放射ヨウ素標識タンパク質の解析に基づいた論文は、銀染色ゲルでのタンパク質解析について存在する膨大な数の文献に比べると、ほとんど発表されていない。回収後にアルキル化し、次に（3H）ヨードアセトアミドまたは125Iのどちらかで放射標識することによりタンパク質の検出を改良する方法が記載されている（Voungら、Electrophoresis 21:2594 [2000]）。また、細胞可溶化液におけるシステインの同位体ビオチン化の手順が、システインを含むペプチドを捕獲し質量分析法により同定し定量化するするために開発された（Gygi, Sら、Nature Biotechnology:17:994 [1999]）。しかしこの方法は、無傷の細胞のビオチン化または表面膜の選択的ビオチン化も、個々のペプチドに対比させたビオチン化タンパク質の定量的解析も対象にしていない。したがって、不足しているものは、無傷の細胞、組織、または細胞小器官を標識し、組織または表面膜のような細胞コンパートメントの何百もの標識タンパク質の複雑な混合液を可溶化、精製、定量的解析、および同定する、組み入れるべき方法論である。本発明では、そのような方法を提供する。
【００３２】
例えば、本発明では、膜タンパク質の分離および／または特徴づけを可能にする膜タンパク質を標識する方法を提供する。いくつかの態様においては、本発明のシステムおよび方法により、細胞の全プロテオームと共に解析した場合には検出不可能であろう稀なタンパク質の特徴づけが可能となる。本発明はまた、プロテオミクス解析を容易にするタンパク質アレイを作製する方法を提供する。
【００３３】
本発明のある態様においては、膜タンパク質（例えば、原形質膜タンパク質）は結合対の第1メンバーと結合する。このような態様においては、結合対の第2メンバー（例えば、固相支持体に結合した第2のメンバー）に曝した場合、膜タンパク質は結合対の結合相互作用を介して第2メンバーに結合する。膜タンパク質が第1メンバーで標識され他の細胞タンパク質が標識されていない場合、膜タンパク質を非膜タンパク質から分離および／または特徴づけることができる。
【００３４】
いくつかの態様においては、結合対はアビジンとビオチンを含む。アビジン-ビオチン相互作用の高い親和性と特異性は、免疫学、組織化学、インサイチューハイブリダイゼーション、アフィニティークロマトグラフィー、および多くの他の領域での多様な応用に利用されている。ビオチン化試薬は、ほとんど検出できない分子を標識検出試薬により認識され得るプローブへと変換する「タグ」を提供する。抗体、レクチン、薬剤、ポリヌクレオチド、多糖、または受容体リガンド等の目的の分子をビオチンで標識すると、これを用いて細胞、組織、またはタンパク質ブロットもしくはアレイ、あるいは複雑な溶液を探索することができる。標識した分子は、フルオロフォア、蛍光微粒子、酵素、発色団、金コロイド、または他の検出可能な成分で標識した適切なアビジンまたは抗ハプテン抗体の結合で検出することが可能である。ビオチン化プローブは、同時にマルチカラーアッセイを行うために他のプローブと組み合わせることが多い。天然のアビジンまたはストレプトアビジンへのビオチンの結合は基本的には基本的には不可逆的であるが、改良したアビジンはビオチン化プローブに可逆的に結合することが可能であり、複雑な混合液からビオチン化分子を単離して精製する有用な試薬となる。いくつかの態様においては、本発明は、タンパク質のビオチン化に基づいて細胞タンパク質を大規模に解析して同定する戦略を利用する。
【００３５】
本発明の局面は、全細胞または組織のタンパク質を用いるプロテオミクスアプローチの感度／分解能に限界があるため、別々にタギングし細胞または組織の細画分を解析することでタンパク質サブセットの収量が増加するという考えに端を発する。表面膜はサブセットに相当する。例えば、癌における表面膜タンパク質の詳細な解析により、診断に有用性のあるタンパク質または治療の標的となり得るタンパク質が明らかになる。表面膜タンパク質のビオチン化で達成され得たように、同じ量／開始材料のタンパク質試料から、高い感度を保持して複数のサブセットを定量的に解析できるとすると、試料の入手を増加させる必要性なしに分解能が実質的に増加することになる。これは、生物医学的な応用のように試料が限られた量しか得られない場合に、重要な問題である。したがって、標識した表面膜タンパク質の定量的解析についての本発明のいくつかの態様において、細胞集団または組織検体であり得るタンパク質試料を2つの画分：標識した（例えばビオチン化）表面膜タンパク質画分と残り（すなわち、残りの細胞タンパク質）に分割する。非標識画分はそのまま解析することもでき、またはタンパク質の特異的性質に基づいて複数のサブセットにさらに分画することもできる（例えば、リンタンパク質、グリコシル化タンパク質の別々の捕獲）。本明細書で記載する多くの実施例においてタギング方法を表面膜タンパク質の解析について実証するが、ミトコンドリア、核等の他の細胞成分画分のさらなる標識化によって、そのようなタンパク質サブセットの定量的解析でも実質的な改良が得られる。
【００３６】
本発明はさらに、タンパク質アレイを作製する方法を提供する。試料中のタンパク質存在量をアッセイできるまたは所与のプローブのタンパク質標的を同定できるタンパク質アレイ（例えばチップ）の開発に、多大な関心が寄せられている（MacBeathおよびSchreiber、Science, 289:1760 [2000]）。これまでのタンパク質チップアプローチでは、抗体等の種々の「ベイト」タンパク質を特別に処理した表面上にアレイ型式で固定化する。次に表面を目的の試料で探索すると、該当する抗体に結合するタンパク質のみがチップに結合した状態になる（Luekingら、Analytical Biochemistry, 270:103 [1999]）。このうようなアプローチは、現在使用されている酵素結合免疫測定法の大規模な適応を表す。タンパク質チップは、2つの異なる材料源の蛍光標識タンパク質で探索してもよい。タンパク質混合液は異なるフルオロフォアで標識して混合し、その比率により2つの材料源における抗体に結合したタンパク質存在量の相違が提供される。このシステムは、抗体の利用可能性とその抗体の特異性に依存する。翻訳後修飾によるようなタンパク質の異なる修飾型を識別しない抗体は、タンパク質の修飾型の定量的解析の有用性がほとんどない。
【００３７】
アレイにペプチド、タンパク質断片、またはタンパク質を固定化し、ファージライブラリーまたは患者の血清等の試料をアレイに供して特定のタンパク質または目的のペプチドへの結合を決定することにも、大きな関心が寄せられている。結合した物質の性質は、質量分析法または他の手段によって決定し得る（Daviesら、Biotechniques, 27:1258 [1999]）。細胞または組織の全タンパク質の実質的な画分を表すタンパク質の固定化に関する主要な問題は、タンパク質の適当な材料源を整備することの必要性である。1つの方法は、細菌での組換えタンパク質の産生であり、次にこれを精製してアレイを作製する。原理的には、アレイを作製するために、組換えタンパク質を産生させる方法を拡大して、多数のタンパク質を産生させることが可能である。この方法の問題点は、組換えタンパク質がこれらのタンパク質を発現する細胞内で起こる翻訳後修飾を欠くかもしれないことであり、そのためアレイに配置した組換えタンパク質は細胞で産生されるタンパク質または生体液に見い出されるタンパク質とは構造上実質的に異なる可能性がある。したがって、マイクロアレイ解析には、細胞および組織由来のタンパク質を得ることが望ましいと考えられる。しかし、マイクロアレイを作製するために、複雑な混合液から多数のタンパク質を単離する手順は記述がない。様々な細胞集団もしくは組織集団、または様々な細胞成分コンパートメントもしくは組織コンパートメントからタンパク質およびタンパク質画分を獲得する能力により、特定の組織もしくは細胞画分（例えば、本発明のシステムおよび方法により単離する膜画分）のタンパク質を含む特殊化マイクロアレイ、または様々な組織もしくは細胞画分から得られるタンパク質を含む包括的なマイクロアレイを作製することが可能となる。
【００３８】
本発明は、細胞もしくは組織またはその画分のタンパク質を分離しアレイを作製する方法を提供する。例えば、ある態様においては、全細胞または全組織のタンパク質抽出物を、1つまたは複数の物理的性質（例えば、細胞での位置、タンパク質pI、大きさ等）に基づいてタンパク質成分に分離する。例えば、下記のように、  A549肺腺癌細胞株の全細胞タンパク質抽出物を液相で20画分に分離し、各画分を逆相クロマトグラフィーによりさらに個々のタンパク質細画分に分離し、数百の別々のタンパク質ピークを取得し、そのピークからタンパク質を単離してアレイを作製した。または、特定のタンパク質コンパートメントをタンパク質単離とアレイ作製の標的にしてもよい。1つのそのようなコンパートメントは、本発明のシステムおよび方法により標識され得る表面膜タンパク質からなる。
【００３９】
発明の詳細な説明
以下の項：I) 膜タンパク質の標識化；II) タンパク質解析；およびIII) タンパク質アレイの作製において、詳細な説明を提供する。
【００４０】
I) 膜タンパク質タギング
上記のように、本発明のいくつかの態様において、膜タンパク質（例えば、原形質膜タンパク質）を、他の細胞タンパク質から膜タンパク質を分離できるようにする分子で標識する。本発明は、標識分子の性質に限定されない。好ましい態様において、標識分子は特異的結合対のメンバーである。特異的結合対とは天然または合成分子であり、分子対の一方がその表面上または空洞に特異的に結合する領域を有し、もう一方の分子の特有の空間的および極性機構と相補的であると定義され、よってこの対は互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合対の例には、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-ホルモン受容体、受容体-リガンド、酵素-基質、IgG-プロテインA等が挙げられる。いずれか特定の結合対に限定はしないが、説明上、ビオチン-アビジン結合対を用いて本発明の方法を以下に記載する。
【００４１】
A. ビオチン化
ビオチン（ストレプト）アビジンシステムは、ビタミンビオチンと卵白タンパク質アビジンまたはその細菌類縁体ストレプトアビジン間に形成される複合体の特徴である並外れた親和性から、何年にもわたって利用されている。このシステムの重要な特徴は、ビオチンという小分子による化学的修飾によって、大部分の標的では酵素触媒作用等の生物学的性質または物理化学的性質がほとんど変化しない点である。このシステムが成功したのは、幅広いアレイ用途のために何百というアビジン-ビオチン製品が何十もの会社から入手できるためである。特定の応用を記載する何千という原著に加え、ビオチン-アビジンシステムについての多くの本、専門誌、および技術マニュアルがある。表面膜のビオチン化の利用は、特異的抗体の特徴づけに広く利用されている（Le Naourら、Science, 287:319 [2000]；Serruら、Biochem J., 340:103 [1999]；Lagaudriere-Gesbertら、Cell Immunol., 182:105 [1997]；Rubinsteinら、Eur J Immunol., 27: [1997]；Le Naourら、Leukemia, 11:1290 [1997]；Rubinsteinら、Eur J Immunol., 26:2657 [1996]）。基本的な技術は、25年間利用されている。しかし、全ビオチン化タンパク質の特徴づけおよびその同定を可能にする統合的な戦略はこれまでに開発されていない。この目的を達成するためには、克服すべきいくつもの障害がある。ビオチン化は、特定の目的の細胞画分（例えば、細胞表面膜タンパク質）だけを容易に標的にすることはできない。他のタンパク質がビオチン化される可能性もあり、これによりデータの解析および解釈に支障が生じることになる。膜タンパク質は、分離および同定の前段階として適切に可溶化する点でかなり困難であると考えられている。したがって、膜タンパク質を標識したとしても、可溶化の問題を解決する必要がある。適切に可溶化したとしても、おそらくその疎水性、大きな分子量、または変わった構造上の特性から、タンパク質は分離および定量的な解析の点で困難である。本発明の開発において開発した方法論によって、表面膜タンパク質を標識し、その後、例えば、他の細胞タンパク質との混合物の一部として、または例えばアビジン等を用いた親和性に基づく技法により部分的な濃縮後もしくは完全に精製した後に、多次元システムで分離することが可能になる。
【００４２】
ビオチン-アビジンに基づく応用においての基本的な成分は、標的とする成分である。タンパク質の場合には、ビオチン化は、通常ビオチン類似体のN-ヒドロキシスクシニミド（NHS）エステルを用いてリジンのε-アミノ基を介して行われる。「NHS-ビオチン」試薬は、数社から入手可能である。ビオチン化の他の種類には、スルフヒドリル基もしくはカルボキシル基、または糖質との反応性が含まれる。本発明の表面膜タンパク質ビオチン化の主要な局面は、細胞への流入を防ぐために非膜透過性のビオチン試薬を用いることである。NHS-ビオチンは水溶性である。本発明のビオチン化方法は、一般に、NHSビオチン試薬の供給業者（例えばピアスケミカル社（Piarce Chemical Company）、イリノイ州ロックフォード）の提供する手順書に従うことができる。NHSビオチンにおける際立った特徴は、スペーサーの長さの範囲である。本発明での使用に適したスペーサーは22 Åのスペーサー長であるが、より短くても長くても使用可能である。
【００４３】
ビオチン化によって、タンパク質の検出および精製に効果的な手段が提供される。しかし、タンパク質の生物活性およびリガンド結合特性を保持するためには、目的のタンパク質を最小限にビオチン化するビオチン化反応を行うことが必要であることが多い。そのような温和なビオチン化反応により、ビオチン化タンパク質と非ビオチン化タンパク質の混合物が生じる。本発明の開発において、ビオチン化タンパク質の移動／分離特性またはその同定を顕著に変えることなく回収率を増すために、ビオチン化を増加できる範囲を調べた。考えるべきことでさらに変更可能なものに、溶液中のビオチン濃度、室温から4℃まで変更する必要があり得るインキュベーション温度、およびインキュベーション時間が含まれる。以下の説明により、適切な条件を提供する。
【００４４】
本発明はまた、細胞とは対照的に、組織において表面膜タンパク質をビオチン化する方法を提供する。水溶性のビオチンは組織の薄切片を通して拡散し、表面膜に結合することが可能であるが、膜を透過することはできない。本方法を以下のように説明する。腫瘍細胞をマウスに注入し、異種移植片を形成する。次に、新鮮な腫瘍組織を異種移植片から採取し、1mmの薄切片にスライスし、ビオチン化に使用する。血清および血液成分をできるだけ除去するため、組織試料をビオチン標識緩衝液で洗浄する。標識には、NHS-LCビオチン（ピアス）を用いる。ビオチン化タンパク質のパターンを作製する。異種移植した（腫瘍）細胞の表面膜タンパク質のパターンを、インビトロで培養した同じ細胞型から得た同様のパターンと比較することができる。
【００４５】
いくつかの態様において、1つまたは複数の試料に1種より多いビオチン標識を用いる。例えば、第1標識で第1ビオチンタグを標識し、第2標識で第2ビオチンタグを標識することができる。いくつかの態様において、第1の細胞または試料を第1タグで標識し、第2の細胞または試料を第2タグで標識する。この配置によって標識の比率を定量的に解析することが可能となり、各細胞または試料中の目的タンパク質の相対的な量が示唆される。アフィニティータグの同位元素標識の方法は周知である（例えば、Gygiら、Nat. Biotechnol., 17:994 [1999]）。
【００４６】
B. 可溶化
膜タンパク質の可溶化とそれに関わる問題に関する多くの文献も存在する。近年、等電点電気泳動に先立って行うタンパク質の可溶化を改善する試薬を報告する数々の出版物がある。これらの試薬により可能となる可溶化の改良により、2-Dゲルで可視化できる膜タンパク質の総数が増加し、いくつかの内在性膜タンパク質の分離が可能となったが、いくつかのタンパク質は依然として解析に精力的に取り組み中である（Herbert, Electrophoresis 20:660 [1999]）。非標識タンパク質方法を用いたモデル生物での最近の研究により、原形質膜は外因性タンパク質に豊富であることが明らかになったが、以下の2つの主要な問題に直面した：(i) 疎水性タンパク質は2次元電気泳動ゲルからほとんど回収されなかった；および(ii) 多くの原形質膜タンパク質は既知の機能をもたず、多数シークエンスしたにもかかわらずデータベース上未知であった。疎水性タンパク質の中で膜試料を濃縮することが期待されるいくつかの方法を比較した。可溶化方法の最適化により、使用すべき界面活性剤が試料の脂質含有量に依存することが明らかになった。溶解度および電気泳動特性に従いタンパク質を再分類する目的で、相当するプロテオームを統計学的モデルと比較した。この解析によって現れた異なる群および各群のタンパク質の同定により、それらに特異的な特性が付与された（Santoniら、Electrophoresis 21:3329 [2000]）。ある1つの研究では、CHAPSによる可溶化とTriton X-114とを併用したタンパク質の分画では、2-DEゲル上で特定の膜タンパク質の検出は不可能であった。タンパク質の可溶化にC8phiを使用しても、この結果は改善されなかった。しかし、アルカリ緩衝液で膜を処理した後、界面活性剤C8phiで原形質膜タンパク質を可溶化したところ、2-Dゲルでこれらのタンパク質の回収が可能となった（Santoniら、Electrophoresis 20:705 [1999]）。新しい双生イオン試薬により、膜タンパク質の可溶化と解析が改善された（Chevalletら、Electrophoresis 19:1901 [1998]）。本発明の開発過程で行った実験により、全細胞可溶化液の可溶化において界面活性剤を含む反応混液を使用することで、他の損失を伴うことが多い特定のタンパク質の分解能が改善されることが示された。ビオチン化タンパク質を解析するために可溶化反応混液を選択する上での特有の制約は、アビジンとの親和性反応の完全性を保持する必要があることである。本発明の開発過程で行った実験により、NP40を使用するような穏和な可溶化条件によってタンパク質捕獲が妨げられないことを見い出した。これらの困難な点から、いくつかの態様において、本発明では膜タンパク質の包括的な解析のために2段階の方法を提供する。第1段階では、可溶化反応混液を用いて、ビオチン化した無傷の細胞、組織、または細胞小器官から無傷のビオチン化タンパク質を抽出する。抽出したビオチン化タンパク質を2-DEゲルにより直接分離し、ブロッティング後に可視化するか、またはアビジン親和性捕獲により捕獲して精製し、続く解析を行う。本方法は、すべての膜タンパク質、特に疎水性の膜貫通タンパク質に有効でない可能性がある。そのような問題のあるタンパク質を同定し定量的に解析するため、第2段階を行ってもよいが、ここでは第1段階で可溶化されず回収されなかったビオチン化タンパク質を、化学的（例えば、臭��シアンによる）または酵素的に（例えば、トリプシンまたは他のタンパク質分解酵素による）部分切断する。このような処理によって、膜貫通タンパク質の膜外のビオチン化成分が切断される。第2段階で得られた切断されたビオチン化ポリペプチドを、第1段階で可視化して精製する。従って、第1段階でいくらかのビオチン化膜タンパク質が無傷のまま回収され、第2段階で残りのビオチン化タンパク質が一部切断されたタンパク質として回収される。または、第1段階を全く行わなくてもよく、その場合第2段階に従ってビオチン化膜タンパク質を直接処理して、その表面膜成分を一部切断されたタンパク質として回収する。
【００４７】
C.ビオチン化タンパク質のアビジンに基づく捕獲
アビジン-ビオチン相互作用は、タンパク質とリガンド間の既知の非共有結合的な生物学的認識の中で最も強力な認識である。ビオチンと四量体アビジン間の結合形成は非常に迅速であり、ひとたび形成されるとpH、有機溶媒、および変性剤に影響を受けない。結合は、低いpHにおける6M〜8Mグアニジン塩酸塩のような極度な条件によってのみ、解離し得る。ビオチン化タンパク質の精製では、さらにより適切な変法は単量体アビジンの使用であり、これは穏和な方法を用いて解離することが可能であるもののビオチン-アビジン相互作用の特異性を保持する。適切な方法を以下の実施例1に提供するが、任意の捕獲分離方法を用いることが可能である。
【００４８】
D. ビオチン化タンパク質のゲルに基づく分離
タンパク質コンパートメント／画分を標識したならば、表面膜等の標識タンパク質を細胞または組織試料の残り等の他のコンパートメントの非標識タンパク質と共に、そのまま分離過程に供することができる。または、アフィニティー捕獲したタンパク質を、非標識のタンパク質とは別に分離過程に供することができる。本発明のいくつかの態様においては、標準の2-Dゲル手順を利用して、精製した標識タンパク質を分離するか、または標識タンパク質を同じ組織源もしくは同じ細胞集団の非標識タンパク質と共に分離する。いくつかの態様において、本発明ではゲルに基づく改良方法を提供するが、この方法では、2次元目のアクリルアミド勾配の濃度をSDS存在下で減じ、高分子量の表面膜タンパク質の侵入を促進する。
【００４９】
図1Aは、腺癌細胞株A549の全細胞可溶化液の典型的な2-Dパターンを示す。1次元目の分離は、両性電解質担体（CA）、pH4〜8を用いて行った。タンパク質は、銀染色により可視化した。図1Bは図1Aと同じ可溶化液の2-Dパターンを示すが、ビオチン化表面膜タンパク質のみを可視化してある点が異なる。全細胞可溶化液の非ビオチン化タンパク質は、可視化されていない。肺腺癌細胞のビオチン化タンパク質は、PVDF膜に転写した後に、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体でハイブリダイズすることにより可視化した。全可溶化液の銀染色した2-Dゲルで可視化されなかった分離タンパク質のパターンが非常に濃く出ており、これにより表面膜タンパク質を可視化して定量的に解析する能力が実質的に増加したことが示唆された。図1Cは図1Bと同じ種類の材料であるが、完全に独立した第2の実験で得られたものを示し、これにより本発明の方法によって得られる表面膜タンパク質のパターンに著しい再現性があることが示された。分離したビオチン化タンパク質の多くは、多様な翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、硫酸化等）を起こした膜タンパク質で予想されるように、一続きのスポットを形成した。
【００５０】
他の実験では、図2に示すように、1次元目の分離に固定化pH勾配（IPG）pH 3〜10を利用した。図2Aに、表面膜タンパク質をビオチン化したA549全細胞可溶化液の典型的なIPG 2-Dゲル分離を示す。分離後、タンパク質をPVDF膜にブロットし、図1と同様にビオチン化タンパク質を可視化した。図2Bは図2Aと同じ材料源のビオチン化タンパク質のIPG分離を示すが、全細胞タンパク質をアビジンカラムに通してビオチン化タンパク質を捕獲し、溶出して2-Dゲルに単独で泳動し、銀染色で可視化した点が異なる。図2Aと図2Bのパターンが、極めて類似していることが認められた。銀染色による表面膜タンパク質の可視化により、質量分析法または他のタンパク質同定手段により同定するためにそれらタンパク質をゲルから切り出すことが可能となる。従って、比較する異なるタンパク質源をビオチン化した後、目的タンパク質の定量的解析および同定のために分析2-Dゲル行い、ビオチン化タンパク質をアビジンに基づくアフィニティー手順を用いて精製してから、ここに示すように同定の前段階としてゲル電気泳動を用いて、または以下に示すような液体に基づく分離法を用いて分離することができる。2-Dゲルから切り出し、質量分析法による同定に供したタンパク質の例を図3に示す。これらのタンパク質には、コネキシン40、アネキシンIおよびII、ならびにプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターが含まれる。
【００５１】
本発明で提供する方法により定量的に解析する表面膜タンパク質のパターンが、単に可溶化しやすく、検出および同定しやすく、遍在性であり細胞および組織間で変わらずにわずかに関心があるのみの特性を有するタンパク質のサブセットを表しているのではないことを実証することが重要である。すなわち、本発明の方法により分離した表面膜タンパク質のパターンにより、この技法の生物医学的な応用への有用性が支持されたことを実証すべきである。従って、実験を行い、異なる系譜の細胞がビオチン化表面膜タンパク質のパターンに検出可能な相違を有するか否かを調べた。図1Bおよび図4は、2つの異なる細胞株（一方は肺腺癌であり、もう一方は神経芽細胞腫）で検出した表面膜タンパク質のパターンにおける相違を表す。図5は、本方法によっていかに目的の生物学的発見が明らかとなるかを示す。この場合、表面膜で検出されるアネキシン1型は細胞内のアネキシン1型とは構造の点で異なる。したがって、本発明の方法は、細胞試料間でのわずかな相違の特徴づけを可能にする高感度な解析を提供する。
【００５２】
E. ビオチン化タンパク質の液相分離
2-Dゲルは、プロテオミクスにおけるタンパク質の定量的解析に現在最も広く用いられているシステムであるが、全タンパク質の解析に関して限界があり、この限界は特に高分子量および低分子量タンパク質の分離の問題に起因する。液体に基づく電気泳動システムおよび高速液体クロマトグラフィーを含む液体に基づく分離法には、いくつかの利点がある。新しい充填材、カラム、および超高圧ポンプシステムにより、小粒子を充填したカラムでの効率が実質的に改善され、解析時間が短縮された（MacNairら、Anal. Chem., 69:983 [1997]）。プロテオームマッピングのための包括的な2-D HPLCに、いくつかの戦略を実行した（Opiteckら、Analytical Biochemistry 258:349 [1998]；Wagnerら、J Chromatogr, 893:293 [2000]；およびOpiteckら、Anal. Chem., 69:1518 [1997]）。例えば、Jorgensonのグループは、サイズ排除液体クロマトグラフィーの後に逆相液体クロマトグラフィーを行う2-D液体クロマトグラフィーシステムを行い、大腸菌可溶化液のタンパク質を分離した。サイズ排除クロマトグラフィーは、変性条件または非変性条件のいずれかで行った。2D HPLCタンパク質精製および同定システムを用いて、大腸菌に挿入した非受容体チロシンキナーゼpp60c-srcのsrcホモロジー（SH2）ドメインおよびβ-ラクタマーゼ、ならびに大腸菌プロテオームのほんの一部を含む多数の天然タンパク質を単離した（Opiteckら、Analytical Biochemistry 258：349 [1998]）。そのようなシステムにおけるサイズ排除クロマトグラフィーの使用は、一般にそのようなカラムの分解能の限界、過度のカラム長の必要性、および優れた分離能を達成するための分離時間による問題がある。より適した別法では、1次元目でイオン交換カラムを用いる（Wangerら、J Chromatogr., 893:293 [2000]）。1つの構成では、陽イオン交換クロマトグラフィーの後に逆相クロマトグラフィーを行う。2つのLCシステムは、保存ループを備えたマルチポートバルブで、コンピューターの制御下で連結する。RPLC流出液をUV検出器と熱スプレー質量分析法の両方でサンプリングする。このように、大きな生体分子の複雑な混合液を、2時間未満で迅速に分離し、脱塩し、および分子量を解析することができる（Opiteckら、Anal. Chem., 69:1518 [1997]）。他の改良法には、タンパク質を分離するキャピラリー電気クロマトグラフィー法の利用が含まれる（DermauxおよびSandra、Electrophoresis 20:3027 [1999]）。ビオチン化タンパク質の液相における捕獲と次の溶出は、それに続く多次元の液体に基づく分離システムでの分離と適合する。多次元の液体に基づく分離システムで分離した試料の例を図11に示す。
【００５３】
多数の細胞タンパク質を分離できる2次元液相分離方法が開発された。1つの方法では、1次元目では等電点電気泳動を用いてpIによって、2次元目では逆相HPLCを用いて疎水性により、タンパク質を分離する。電気泳動による分離の方法には、ロトフォア（Rotofor）と呼ばれる装置を用いて達成され得る等電点電気泳動法が含まれる（Ayalaら、Applied Biochemistry and Biotechnology, 69:11 [1998]）。この装置により、高タンパク質の泳動および実施に4〜6時間を要する迅速な分離が可能になる。2次元目には、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が含まれる。本方法により、疎水性と分子量に基づいた、再現性があり高分解能であるタンパク質の分離が提供される。非多孔性シリカ充填剤の使用により、多孔性および大きなタンパク質の回収率の低さに関する問題が最小限に抑えられ、さらに解析時間が短縮される。
【００５４】
親和性に基づく方法によりビオチン化タンパク質を捕獲した場合に、液体媒体において次の溶出および回収を行うことにより、そのタンパク質は液体に基づくシステムでの分離に都合がよくなる。いくつかの態様においては、本発明は、ビオチン化タンパク質を分離する、液体に基づくモジュール式のシステムを提供する。このモジュール式のシステムでは、1次元目のいくつかの液体分離方法のうちのいずれか1つを、2次元目の液体に基づく分離方法と組み合わせることができる。または、液体分離方法で得られた画分を、2次元目でゲルに基づく分離方法に供すことができる。最終的な分離の次元では、質量分析によりタンパク質を特徴づける現行の戦略に適合する液体に基づく分離方法で行うことが好ましい。
【００５５】
基本的原理は、異なるカラム型または媒体が互いに置換できるモジュール式のシステムを行うことである（例えば、ロトフォア、または陽イオン対陰イオン対アフィニティーカラム）。最終的な分離は、好ましくは逆相カラムを用いて行う。図6〜図9に、ビオチン化タンパク質の分離についてのクロマトグラフィーに基づくスキームを示す。1次元目で溶出した画分またはピークを2次元目の分離（例えば、逆相クロマトグラフィー）に供し、さらにタンパク質を分離する。いくつかの態様においては、1つの種類の分離（例えば、陰イオン交換）では適切に分画されずに通り抜けてしまう（ブレークスルー）タンパク質をアフィニティーカラムで捕獲し、別の方法（例えば、陰イオン交換に代わりに陽イオン交換）を用いてさらに分離し、個々の画分を溶出して次に逆相分離により分離する。1つの試料源からの分離タンパク質から得られる全体的なパターンを、別の試料源からのパターンと比較することができる。興味深い相違または類似性を示す任意のピーク／画分を質量分析により同定したり、または他の手段を用いて同定することができる。または、収集したすべての画分を、ビオチン化タンパク質の系統的な特徴づけのためにタンパク質同定することができる。したがって、分離したタンパク質の一定量をフラクションコレクターにより96ウェルマイクロタイタープレートに乗せ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化方式飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF/MS）および／または熱スプレー質量分析法（ESI/MS）等の質量分析法によって、目的の画分を解析することが可能である。回収したタンパク質の大部分を、タンデム型質量分析法により同定することが可能である。本方法を行うための適切な条件の例を、以下の実施例3に提供する。
【００５６】
II. タンパク質の解析
任意の適切な方法により、分離したタンパク質を解析することができる。タンパク質の同一性を望むのであれば、好ましい態様において、分離したタンパク質（例えば、膜タンパク質）を質量分析技法に供する。
【００５７】
過去10年間に、新しい質量分析法による技術により、ゲル電気泳動法または液体クロマトグラフィー法によって分離したタンパク質の同定はさらに有意義な試みとなった。タンパク質解析の質量分析の可能性を格段に伸ばした2つの質量分析技法は、マトリックス支援脱離イオン化法（MALDI）と熱スプレーイオン化法（ESI）である。処理量、感度、使いやすさ、およびデータの取り扱いを増すこれらの技法を基にする機器整備の改良が続けられている。質量分析法の感度におけるさらなる利点は、試料のイオン化効率、検出技法の緻密化、および生じたイオンの効率的な利用によって達成された。本発明の質量分析法の実例となる利用法を、以下にいくつか提供する。
【００５８】
A) オフライン消化
タンパク質の質量分析同定は、一般に、その消化とそれに続く脱塩段階を必要とする。MALDI-TOF質量分析を用いて、ゲル内でのタンパク質分解消化により生じたペプチドの質量を測定し、同じ酵素を用いたタンパク質の模擬消化データベースから形成されるコンピューター生成リストに対して検索する。比較的新しい高分解能タンデム型質量分析の計測手段系統である四重極飛行時間型（Q-TOF）タンデム質量分析が、MALDIを補足するプロテオミクスの解析に用いられている。タンデム型質量分析法では、解離によりイオンの混合液からペプチドイオンを分離する。第2段階では、断片のm/z値を分離し検出する。タンパク質の複雑な混合液を高分解能の2次元分離し、トリプシン消化したタンパク質をQ-TOF-MS/MSを用いて解析する組み合わせにより、広範囲のタンパク質の同定が可能になる。この機器は、ESIを基にし、最初の四重極分析計により前駆体イオンを選択し、衝突ガスセルへと続き、最初に生じた産物イオンと前駆体の生き残りを直行加速し、最終的にリフレクトロンシステムを用いた高分解能飛行時間型解析により産物イオンを解析する。いくつかのトリプシン消化したペプチドについての、完全なまたは部分的なMS/MSスペクトルが得られる。これによりいくつかのペプチド配列をデータベースと比較することが可能となり、タンパク質の同定の助けとなる。ある好ましい態様においては、オンラインでデータベース検索できるソフトウェアを含む機器を用いる。
【００５９】
B) タンパク質のオンライン解析
ESIは主に濃度に依存したイオン化技法であるため、液体クロマトグラフィーを縮小化することにより適合する。同定の標的とする表面膜タンパク質は、LC/MSにより同定することが可能である。
【００６０】
流速：100 nl/分〜3μl/分、シース構成なし
2005502030.tif 000002
【００６１】
溶液または溶出液の流速がキャピラリーHPLCと適合する0.5μl/分〜3μl/分である場合に、感度の改良が達成される（Markides, J. Microcolumn Separations 11:353 [1999]）。分離したタンパク質をESI-Q-TOF MSにより直接解析し、分子量の情報を得て、複数の試料および実験における同じタンパク質の追跡が可能となる。マイクロHPLCを利用するには、スプリッタを用いてチップ内の流速を0.5μl/分〜3μl/分に保つ。
【００６２】
上記の方法を用いて、1) A549腺癌細胞のビオチン化により、ブロッティング後に可視化したタンパク質が細胞表面膜タンパク質を表すこと、2) このビオチン化手順を用いて、異なる系譜または分化状態の細胞間のパターンにおける相違を観察し、生物医学的応用への方法の有用性を支持できること、および3) ビオチン化方法を組織試料中の表面膜タンパク質のビオチン化に適合させ得ること、が実証された。
【００６３】
III. タンパク質アレイの作製
タンパク質の解析を容易にするため、タンパク質が上記方法により標識した膜タンパク質であろうと、またはその他のタンパク質試料であろうと、本発明の方法を用いてアレイを作製することができる。タンパク質を固相表面に結合する手順は周知である。例えば、MacBeathおよびSchreiber（MacBeathおよびSchreiber、前記）は、マイクロアレイの作製にポリ-L-リジンコーティングしたスライドを用いる。ニトロセルロースコーティングしたスライドも、市販されている。本発明で利用する代表的な結合法およびアレイの作製法を、実施例4に提供する。アレイにした試料中の特異的タンパク質の検出を実施例5に提供する。
【００６４】
これらの方法により作製したA549細胞タンパク質可溶化液のアレイに配置したタンパク質は、550 nmレーザーを用いてGeneTac LS IVスキャナーで取り込んだ。アレイに配置したA549細胞タンパク質可溶化液の多くの異なるタンパク質画分の中から、特異的抗体を用いた各タンパク質を、アレイに配置したスポットの異なるウェルから検出した。アレイに配置したタンパク質は、それぞれさらに逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離されたロトフォア画分を表す。Op18、ビメンチン、PGP9.5、アネキシンI、およびアネキシンIIを、スポットした異なる画分で検出した。A549の膜タンパク質画分に存在するアネキシンIおよびアネキシンIIを、アレイに配置した表面膜タンパク質の特定の画分に検出した。表面膜タンパク質は、A549細胞の表面をビオチン化し、アビジンアフィニティーカラムを用いて表面膜タンパク質を捕獲し、次にイオン交換および逆相高速液体クロマトグラフィーの組み合わせによって分離することにより取得した。
【００６５】
本発明の好ましい態様においては、タンパク質の物理的性質に基づいて、タンパク質を固相支持体の物理的な位置に配置する。例えば、全細胞タンパク質のサブセットを含む分離したタンパク質試料を、アレイの特定した位置に配置することができる。いくつかの態様においては、分離したタンパク質のサブセットは、本発明の標識法によって分離したタンパク質を含む。このような態様においては、タンパク質のサブセットは膜タンパク質または非膜タンパク質を含む。他の態様においては、アレイに配置したタンパク質画分は1つまたは複数の物理的性質によって特徴づけられる。例えば、本発明の2相液体分離法で分離したタンパク質を、大きさとpIで規定する画分に収集することができる。各画分を他の画分と別々にまたは独立してアレイに配置し、類似の物理的性質を共有するタンパク質を解析のために共に配置する。いくつかの好ましい態様においては、アレイの作製は自動化してあり、タンパク質分離手順と連結している。例えば、分離装置から回収した画分をアレイ作製ステーション（例えば、32ピンFlexysアレイヤー；ジェノミックソリューション（Genomic Solution））に導き、固相支持体にスポットすることが可能である。これらのアレイ作成法を用いて、本発明は、既知の位置を有する規定のタンパク質サブセットを含むタンパク質アレイを提供する。1つまたは複数の物理的性質に基づくタンパク質のこの分割により、さらなる解析が容易になる。例えば、細胞表面タンパク質と相互作用すると思われる薬剤候補を、全細胞タンパク質のアレイに供するのではなく、細胞膜タンパク質を含むアレイの対象とすることができる。タンパク質のサブセットのみをアレイにする利点は、アレイの濃度と感度をアレイに配置した特定のタンパク質画分について最適化できることである。例えば、全細胞タンパク質のアレイ中での検出性に問題がある場合、稀なタンパク質を濃縮し、検出を最大限にすることが可能である。組換えタンパク質のアレイを作製する方法と比較した本方法のタンパク質アレイの作製についての利点は、アレイに配置するタンパク質がその起源とする細胞または組織で起こるのと同じ翻訳後修飾による修飾を受けた状態にあることであり、これに対して組換えタンパク質ではそのような修飾を全く反映していない。したがって、タンパク質を分画して個々のタンパク質またはタンパク質画分を生じマイクロアレイを作製する本方法は、薬剤または特定の抗体等の種々の標的と反応する個々のタンパク質またはタンパク質画分を同定する手段を提供する。アレイに配置した反応性のあるタンパク質または断片は、アレイを作製するために使用した1試料分とさらなる調査のために保存しておくもう1試料分を個々に収集しておき、さらに調べ、同定し、またはさらに分離することができる。本発明の方法を用いて検出したアレイのタンパク質の実施例を図12に示す。
【００６６】
実験
以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様および局面を示しさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【００６７】
以下の実験の開示においては、以下の略語を使用する：N（規定濃度）；M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（mマイクロモル）；nmol（ナノモル）；pmol（ピコモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまたはL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；および℃（摂氏温度）。
【００６８】
実施例１
膜タンパク質のビオチン化
本発明のいくつかの態様においては、10％ウシ胎仔血清（ギブコ（GIBCO））、100 U/mlペニシリン、および100 U/mlストレプトマイシン（ギブコ-BRL（GIBCO-BRL）、ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地/F12、ギブコ）に入れて、6％ CO2加湿インキュベーター内で37℃に置く標準条件下で培養する細胞を用いて、細胞集団（例えば、結腸、肺、卵巣癌細胞株）のビオチン化を行う。細胞は、毎週、70％〜80％コンフルエントに達してから継代する。表面ビオチン化の開始手順は以下のとおりである。細胞をハンクス緩衝生理食塩水で3回洗浄し、10 mM hepes pH 7.3、150 mM NaCl、0.2 mM CaCl2、0.2 mM MgCl2、および0.25 mg/ml Sulfo-NHS LCビオチン（ピアス、イリノイ州ロックフォード）中で、穏やかに撹拌しながら4℃でインキュベートする。氷冷PBS-Ca-Mg（pH 7.40、0.1 mM CaCl2、および1 mM MgCl2）で洗浄し、遊離のビオチンを除去し、反応基を阻害して反応を停止する。標識後、細胞を100μlの溶解緩衝液（150 mM NaCl、20 mM N-ヒドロキシエチルピペラジン-N’-2-エタンスルホン酸、1 mM EDTA、1％ Nonidet P-40(NP40)、100μg/mlアプロチニン、100μg/mlロイペプチン、および2 mMフェニルメチルスルホニルフッ化物）に剥がし取る。懸濁液を5分間ボルテックスし、次に超音波ウォーターバス中で5分間超音波処理し、再度ボルテックスしてから0℃で1時間インキュベートする。超音波処理は、膜タンパク質の可溶化に著しく役立つ。
【００６９】
実施例2
ビオチン化タンパク質のアビジン捕獲
ビオチン化タンパク質の捕獲には、ピアスケミカル社（イリノイ州ロックフォード）の単量体アビジンを用いる。固定化単量体アビジンカラムの3 mlカラムを、製造者の使用説明書に従い調製する。カラムをPBSで洗浄し、PBS中の2 mM D-ビオチン溶液を用いてカラムの不可逆性ビオチン結合部位をすべて遮断し、再生緩衝液（0.1 M グリシン、pH 2.8）を用いて可逆性ビオチン結合部位からゆるく結合したビオチンを除去し、2 x 10 ml PBSで洗浄する。ビオチン化可溶化液をカラムに供し、室温で1時間維持してアビジン-ビオチン結合を増加させる。次にカラムをPBSで洗浄し、カラムから非ビオチン化タンパク質を除去する。非結合タンパク質がすべてカラムから洗浄して除去され、画分の吸光度が基準値に戻るまで、画分の吸光度を280 nmでモニターする。ビオチン化タンパク質を溶出するため0.1 M グリシン、pH 2.8を添加し、溶出画分を1 M Tris.HCl (pH=8.6)で緩衝し、収集してプールし、セントリコンY-M3（ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて濃縮する。さらに、吸光度が基準値に戻るまで、画分の吸光度を280 nmでモニターする。次にカラムをPBSで洗浄し、3 ml のPBS中0.05％ NaN3により保存する。2 mM D-ビオチンの代わりに0.1 Mグリシン、pH 2.8で溶出することで、より濃縮された溶出ビオチン化タンパク質の画分が得られる。様々な特性を有しかつ様々な粒子の大きさの固定化支持体を有するいくつもの製品（シグマ（Sigma）、プロメガ（Promega）、ピアス、モレキュラープローブ（Molecular Probes）、パーセプティブ（PerSeptive））、ならびに様々な結合効率、選択性、および回収率を有するいくつもの製品が市販されている。
【００７０】
実施例3
クロマトグラフィーによるタンパク質の分離
本発明の開発において、個々の構成成分から2-D HPLCシステムを含むシステムを構築したが、これは主にポンプの性能により、分取用LC、コンベンショナルHPLC、マイクロHPLC、キャピラリーHPLC、およびナノHPLCに用いることが可能である。LC法の感度は、LCカラム直径の二次関数である。一定の移動相速度において、分析物ピークの容量はピーク幅とカラムの断面積に比例する。コンベンショナル4.6 mm内径（ID）カラムを0.1 mm（ID）カラムで置換することにより、理論上感度が(4.6/0.1)2 = 2116倍増加し、同量の試料を利用してカラムの余分なデッドボリュームを最小限に抑えられると考えられる。
【００７１】
システムのマクロからマイクロLCへの変換は、
1) カラム
2) チューブ
3) UV検出器のフローセル
4) サンプルループ
を交換することにより達成する。ポンプ、検出器、インジェクター、およびマルチポジションバルブは交換の必要はない。
【００７２】
(表) マクロからナノにわたる分離型の条件
2005502030.tif 000003
【００７３】
クロマトグラフィー条件：
陰イオン交換に用いた条件は以下のとおりである：
1. カラム：
1.0 mm内径 x 150 mm長、8μ 1000Å（基材はポリスチレンジビニルベンゼン共重合体であり、官能基として+N(CH3)3を有する四分岐ポリエチレンイミン（PEI）と結合している。カラムは、マイクロムバイオリソース社（カリフォルニア州オーバーン）製である。）
2. 勾配溶出
移動相A：15％ MeOH + 10 mmol/L Tris-HAc, pH 8.05
移動相B：10 mmol/L Tris-HAc + 1.0 mol/L NaAc, pH 8.05
0〜5分：0％ B
5〜65分：0％ B - 90％B
サンプリング：10μl
3. 流速
50μl/分
4. 検出波長、280 nm
逆相の前に脱塩カラムを用いるが、典型的には分析用は150μm内径、2 mm長からなる。
逆相最適化の開始条件は以下のとおりである：
1) 1-Dカラムの大きさ
150μm内径、15 cm長
2) 勾配条件
A：水中0.1％ TFA（または0.5％酢酸）
B：アセトニトリル（ACN）中0.1％ TFA（または0.5％酢酸）
流速：〜5.0μl/分、1,500 〜2,500 psi
B：10分間に0→60％
検出波長、280 nm
【００７４】
実施例4
タンパク質アレイの作製
マルチウェルプレートのウェルにタンパク質を固定化するため、ウェル内のタンパク質濃度を0.01〜0.3 mg/mlの範囲にした。
【００７５】
洗浄段階：PBS／3％ノンファットミルク／0.1％ Tween-20溶液で1分間、その後PBS／3％ノンファットミルク／0.02％アジ化ナトリウムで4℃にて一晩行う。
【００７６】
Cy3/Cy5色素で標識した抗体または抗原によりハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後の洗浄段階は、PBS/0.1％ Tween-20で20分間、次にPBSで2回、ddH2Oで2回、それぞれ5〜10分間行う。スライドを遠心し、乾燥する。
【００７７】
アルデヒド処理したスライドも、マイクロアレイの作製に用いることができる（Haabら、Genome Biology 2:0004.1 [2001]）。
【００７８】
ナノの液滴の蒸発を防ぐために、タンパク質試料を60％ PBS/40％グリセロール中0.1 mg/ml に調製した。加湿チャンバー内で室温にて3時間インキュベートした後、スライドを反転し、PBS + 1％ BSA溶液に1分間浸した。次に、表を上にしてBSA溶液に浸し、1時間室温で撹拌し、次に蛍光色素で標識したタンパク質または小分子でハイブリダイズする。インキュベーション後、スライドをPBSですすぎ、PBS + 0.1％ Tween-20で3分間3回洗浄し、さらにPBSで2回洗浄して、遠心分離した。
【００７９】
アレイを作製するために、分離したタンパク質画分をウェルあたり5μl、0.05〜0.2 mg/mlの濃度で384ウェルプレートに添加し、1,000 x gで2分間遠心した。32ピンFlexysアレイヤー（ジェノミックソリューション）を用いて、アルデヒド処理したスライドにタンパク質をスポットした。スポットの間隔を400μmに設定し、スポットの直径は典型的に175〜225μmの間で異なった。アレイをPBS／3％ノンファットミルク溶液で1分間洗浄し、非結合のタンパク質を除去した。次に、スライドをPBS／3％ノンファットミルク溶液に浸し、室温で1時間撹拌した。最後にアレイをPBSで1分間2回すすぎ、ハイブリダイゼーションの準備を整えた。
【００８０】
実施例5
アレイの検出
分離した多数の細胞タンパク質の中から特異的なタンパク質を検出する能力を、アネキシンI、アネキシンII、OP18、PGP9.5、およびビメンチンに対する抗体を用いて試験した。単官能基反応色素（アマシャムファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））を用いて、製造者の手順書に従い、抗体を蛍光Cy3色素で標識した。色素標識抗体溶液20μlをスライドに添加して24 x 50 mmカバーガラスで覆い、スライドをCoverWellインキュベーションチャンバー（コーニング（Corning））に入れ、光保護箱内で4℃にて2時間インキュベーションした。アレイをPBSですすぎ、次にPBS + 0.1％ Tween-20溶液で室温で10分間撹拌しながら洗浄した。スライドをPBSで3分間2回すすぎ、さらにH2Oで3分間2回すすいだが、洗浄段階はすべて室温で行った。スキャンするために、200 x gで1分間遠心分離して乾燥させた。
【００８１】
上記明細書において言及した出版物および特許はすべて、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神に反することなく、本発明で記載した方法および系に様々な修正と変更が行われ得ることは当業者に明白であろう。本発明を特異的な好ましい態様に関して説明したが、請求する本発明は特異的態様に過度に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際に、本発明を実施するための上記形態の様々な修正は、関連分野の技術者には自明であり、特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図1A、B、およびCは、本発明のいくつかの態様において分離したタンパク質を示す。図1Aは、A549腺癌細胞株の全細胞タンパク質の2-Dゲル分離を示す。ゲルは銀染色してある。1次元目の分離は、両性電解質担体を用いて行った。2次元目の分離は、SDS中の7％〜14％アクリルアミド勾配を用いて行った。図1Bは、表面膜をビオチン化した後に図1A と同じ条件を使用した、A549の全細胞タンパク質の2-Dゲル分離およびブロッティングを示す。ビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンの結合により可視化してある。図1Cは図1Bと同様のデータを示すが独立した実験実験のものであり、このことからビオチン化タンパク質パターンの再現性の程度が高いことが示される。
【図２】図2AおよびBは、本発明のいくつかの態様において分離したタンパク質を示す。図2Aは、表面膜をビオチン化した後のA549全細胞可溶化液の2-Dゲル分離を示す。2-D PAGEの1次元目に固定化pH勾配（pH3〜10）を用いた点以外は、条件は図1Bと同様である。タンパク質はPVDF膜に転写し、ストレプトアビジンの結合を用いたハイブリダイゼーションにより可視化した。図2Bは、アビジンカラムに捕獲して溶出したビオチン化表面膜タンパク質の固定化pH勾配に基づく2-D分離を示す。タンパク質は銀染色により可視化したが、図2Aで表すパターンと類似していることが示される。
【図３】免疫親和性精製（7％〜14％）IPG-ASB14溶解緩衝液後の、A549の細胞表面タンパク質の修飾Agの解析を示す。
【図４】ビオチン化wce SY5Y（7％〜14％）IPGのウェスタンブロットを示す。
【図５】A549細胞のビオチン化表面膜タンパク質画分中（上のパネル）および全細胞可溶化液中（下のパネル）におけるアネキシンIとIIの比較を示す。精製した表面膜タンパク質（上のパネル）および全細胞可溶化液（下のパネル）はIPG 2-D PAGEによって分離し、抗アネキシン抗体を用いてアネキシンを可視化した。
【図６】本発明の1つの態様におけるタンパク質分離システムを示す。
【図７】本発明の1つの態様におけるタンパク質分離システムを示す。
【図８】本発明の1つの態様におけるタンパク質分離システムを示す。
【図９】本発明の1つの態様におけるタンパク質分離システムを示す。
【図１０】イオン交換クロマトグラフィーをし、個々の画分をSDSゲル電気泳動したビオチン化表面膜タンパク質画分の解析を示す。
【図１１】2段階の分離方法を用いたA549肺腺癌細胞の試料分画を示す。1段階目の分離は陰イオン交換であり、30画分を収集した。2段階目の分離は、1段階目の分離後の各画分の逆相クロマトグラフィーである。
【図１２】A549肺腺癌細胞の20画分をスライド当たり複数の区画に配置した、タンパク質マイクロアレイの実験結果を示す。各区画は、対照（ビオチン化アルブミン）（1列に2ドット、図面中では3と表示）を含んだ。一方のスライド（図12B）は抗アネキシン抗体とハイブリダイズし、もう一方は抗ビメンチン抗体とハイブリダイズした（図12A）。図面に示されるように、異なる画分がそれぞれの抗体と反応した。1と表示した画分はビメンチン抗体と反応した。ビメンチンを含む4つの画分を1/5希釈してアレイに配置したが、相応して減少したシグナルが見られた（列4）。アネキシンは2と表示したアレイに配置した画分と反応し、多次元液体分離システムで取得された。本実験は、どの画分がどのタンパク質を含むかに基づいた反応性の異なるパターンを示す。
【図１Ａ】
2005502030.tif 000004
【図１Ｂ】
2005502030.tif 000005
【図１Ｃ】
2005502030.tif 000006
【図２Ａ】
2005502030.tif 000007
【図２Ｂ】
2005502030.tif 000008
【図３】
2005502030.tif 000009
【図４】
2005502030.tif 000010
【図５】
2005502030.tif 000011
【図６】
2005502030.tif 000012
【図７】
2005502030.tif 000013
【図８】
2005502030.tif 000014
【図９】
2005502030.tif 000015
【図１０】
2005502030.tif 000016
【図１１】
2005502030.tif 000017
【図１２】
2005502030.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2005502030.tif 000019
2005502030.tif 000020
2005502030.tif 000021
2005502030.tif 000022
2005502030.tif 000023
2005502030.tif 000024
2005502030.tif 000025
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2005502030.tif 000069
2005502030.tif 000070
2005502030.tif 000071
【国際調査報告】
2005502030.tif 000072