(57)【要約】細胞外基質分解プロテアーゼと上皮細胞機能に関連する増殖因子とを、プロテアーゼによる増殖因子の不活性化または分解を起こすことなく、互いに組合せた組成物。好ましくは、プロテアーゼはプラスミン／プラスミノーゲンまたは関連のものであって、増殖因子は、ＫＧＦまたは関連のものである。組合せによって、再上皮形成過程または治療過程に不可欠な２つのそれぞれ独立しているが相乗的な機能、すなわち、上皮細胞増殖／分化を刺激する機能と細胞外基質成分を排除することによって上皮細胞の移動を促進させる機能が結合される。この組合せは、様々な方法により構築可能で、創傷の治療または上皮起源の細胞または増殖因子が影響を与え得る他のタイプの細胞が関与するその他の疾病状態を治療するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞機能に関連する増殖因子および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物。
【請求項２】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
線維芽細胞増殖因子および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物。
【請求項１４】
前記線維芽細胞増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記線維芽細胞増殖因子が、０．００００１％（ｗ／ｖ）から０．１％（ｗ／ｖ）の濃度を有し、前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、０．０００１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
担体をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記担体が緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
第１容器中の第１担体中の上皮細胞機能に関連する増殖因子を含む第１成分および第２容器中の第２担体中の細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む第２成分を含むキット。
【請求項２７】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３６】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記第１担体が第２担体と同一または異なる、請求項２６に記載のキット。
【請求項３８】
前記第１担体が、水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３９】
前記第２担体が、水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項４０】
第１容器中の上皮細胞機能に関連する増殖因子を含む第１成分、
第２容器中の細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む第２成分、および
第３容器中の担体を含む第３成分を含むキット。
【請求項４１】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記線維芽細胞増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項５０】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記担体が、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項５２】
上皮細胞機能に関連する増殖因子および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物を創傷に適用することを含む、動物またはヒトで創傷を治療する方法。
【請求項５３】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関する酵素を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記創傷が、皮膚の内または上、口腔、消化管、粘膜表面、眼球または肺を含む上皮細胞起源の細胞を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記創傷が、内皮細胞、線維芽細胞または肝細胞を含む、増殖因子が影響を与える他タイプの細胞を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項６６】
創傷に２つの成分：
（ａ）上皮細胞機能に関連する増殖因子、および
（ｂ）細胞外基質分解プロテアーゼ酵素
を適用することを含む動物またはヒトで創傷を治療する方法であって、成分（ｂ）を成分（ａ）に続いて適用するか、または、成分（ａ）を成分（ｂ）に続いて適用する方法。
【請求項６７】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関する酵素を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７７】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの成分、すなわち（１）上皮細胞機能に関する増殖因子と（２）動物またはヒトで傷の治癒を高めるための細胞外基質分解プロテアーゼとを混合して形成される組合せを含む組成物に関する。この２つの成分は、治療すべき対象に与える前に予め混ぜ合わせるか、対象に順次与えることができる。本発明は、より詳細には、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）とプラスミン、プラスミノーゲン、プラスミノーゲン活性化因子、または機能的生物学上同等物との組合せに関し、その組合せを、上皮細胞を起源とする細胞およびＫＧＦが影響を与えるかもしれない他のタイプの細胞が関与する傷の治療に利用するものである。さらに、本発明は、増殖因子を有する容器および、細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を有する容器を保有するキットに関する。各容器の内容物は、担体溶液（例えば、水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏）中にあっても、または凍結乾燥されて第３容器中に入れた担体溶液で使用者がこれらの成分を戻せるようにしてあってもよい。本発明の更なる目的は、創傷治癒向上を目的としたキットの成分を使用する方法を提供することである。例えば、キットの成分を混合し傷上に置くかまたは、キットの個々の成分を創傷の上に縦に重ねるかまたは順次置くことが可能である。また、キット中の成分または生物学上同等な成分は購入または製造可能であり、創傷治癒向上を目的とする上記記載方法で使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞は人体の全細胞の３分の１を占める。皮膚の上皮細胞は、角化細胞と呼ばれる。上皮細胞はまた、口腔、鼻道、胃腸管、膣、およびいくつかの器官または組織（例えば、肺および角膜）などの表面ライニングにも見つけられる。上皮細胞が関与する傷または創傷は種々様々な形で起こり、切傷、火傷、および、（関与する傷または創傷は、種々様々な形で起こり、切傷、火傷、および）潰瘍などがある。創傷は急性でも慢性でもよい。その例には、褥瘡性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、糖尿病性脚潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、口蹄病潰瘍、角膜潰瘍などが含まれる。非治癒性および遅治癒性の創傷は、慢性創傷と呼ばれる。口腔または腸粘膜での慢性創傷は、化学療法を受けている癌患者に頻繁に発生する。これらは人口の高齢化で益々増大しつつある重要な健康問題である。
【０００３】
内皮細胞は人体のもう１つの大きな細胞の集団である。内皮細胞は、すべての血管の表面ライニングを形成している。７０ｋｇの成人の血管系は、約１０００ｍ２の内皮細胞でライニングされている。人口の高齢化に際し、心臓病、卒中、および下肢虚血に関連する血管の損傷は最も重大な健康問題の１つである。大血管が関与する心臓病は、血管形成術またはバイパス手術などのある種の外科的処置で治療することができる。しかし、小血管が関与する疾病状態に利用可能な有効な治療はない。近年、これらの血管系疾病状態の有望な新規治療法である治療的血管形成法が開発されつつある。この方法は、新しい血管の形成を促進する血管形成性増殖因子の送達が関与する。Ｌ−アルギニンおよび血管形成性増殖因子から構成される治療混合物が、米国特許第６，２３９，１７２号に開示されており、これは内皮不全に関係する疾患治療のためのもので、この全内容は参照により本明細書に含まれる。
【０００４】
細胞外基質は、細胞を支え、固着する生体線維性基質であって、組織構造および組織保全性を確立し組織の正常機能維持をもたらす。その構成要素には、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、ヒアルロン酸、およびエラスチンが含まれる。創傷の場合、損傷した組織中または組織上にフィブリン線維によって形成された血塊によって、別の基質成分が構成されている。創傷治癒の間または正常な組織の増殖中に、細胞がこの基質を通って移動するために、移動している細胞の周りの基質を分解する必要がある。理論によって拘束されたくないが、この分解過程に、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼおよびプラスミンをはじめとする多くの酵素が関わっていることが知られている。精緻なシステムがこうした酵素の活性を調節するために存在している。酵素の多くは、不活性のプロ酵素として細胞によって産生され、このプロ酵素は作用可能となる前に、別の酵素などによって活性化されなければならない。こうした酵素の中には、細胞表面に受容体を有するものがあるので、細胞の近くではその活性が限られる。
【０００５】
ＫＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーであって、線維芽細胞増殖因子−７としても知られている（Ｗｅｒｎｅｒ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９：１５３−１６５，１９９８）。このファミリーのメンバーは、増殖因子とその受容体との間の相互作用を仲介する際に重要な役割を果たすヘパリンと結合する能力に特徴がある（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｇｅｒら、Ｃｅｌｌ  ８３：３５７−３６０，１９９５）。ＦＧＦファミリーの代表例であるａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）およびｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）は、広く研究されてきた。ＫＧＦは１９８９年に初めて単離された（Ｒｕｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８０２−８０６（１９８９））。その後、ＫＧＦ遺伝子がクローンされて、ＫＧＦが細菌中で発現された（Ｆｉｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５，７５２−７５５（１９８９）：Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）；Ｒｕｂｉｎら、米国特許第５，７４１，６４２号）。ＫＧＦは間充織起源の細胞によって産生され、主として上皮細胞起源の細胞に作用する点が特有である。ＫＧＦは、上皮細胞の増殖および分化を刺激する（Ａａｒｏｎｓｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６３８，６２−７７，１９９１）。
【０００６】
成熟したＫＧＦは１６３個のアミノ酸のポリペプチドである。構造および突然変異誘発研究で、ヘパリンおよび受容体結合ドメインがこの分子の中心部付近に位置していることがわかっている。残基２３−１４４（Δ２３ＫＧＦ−Ｒ１４４Ｑ）からなるＫＧＦ断片は、より一層の温度安定性と共にオリジナルの生物学的活性を保持している（Ｏｓｓｌｕｎｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７：１６８１−１６９０（１９９８））。米国特許第５，６７７，２７８号（‘２７８特許）は、角化細胞増殖因子の切断断片（Δ２３ＫＧＦ、すなわち、Ｎ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸が欠如しているＫＧＦ）が、成熟した完全長の角化細胞増殖因子と比べて、少なくとも２倍の細胞分裂活性を示すことを開示している。‘２７８特許はさらに、上皮の過増殖疾患の治療に使用する、切断ＫＧＦと毒性分子との複合体にも関与する。‘２７８特許はさらにまた、切断ＫＧＦと製薬上許容可能な担体を含む治療用組成物および創傷治癒のための治療用組成物の使用に関係する。‘２７８特許の全内容は、引用によって本明細書に含まれる。
【０００７】
ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）には４つのタイプ、ＦＧＦＲｌ〜ＦＧＦＲ４がある。ＦＧＦＲの中には数種のイソ型が確認されている。ａＦＧＦは、ＦＧＦＲ４種のすべてと結合するが、ＫＧＦは、ＦＧＦＲ２のＩＩＩｂイソ型と結合することだけが知られている。ＫＧＦは、皮膚の創傷で高度に発現される。ＫＧＦの発現の増加は、傷の後の膀胱および腎臓、ならびに炎症性腸疾患でも観察されている。他の増殖因子と異なり、ＫＧＦは、治癒の進む中、高レベルで持続的に発現される（Ｗｅｒｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，６８９６−６９００，１９９２）。動物の研究では、ＫＧＦを局所的に創傷に適用することで治癒が促進されることがわかっている（Ｓｔａｉａｎｏ−Ｃｏｉｃｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：８６５−８７８（１９９３）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８３１−８４０（１９９４）；Ｗｕら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３１：６６０−６６６（１９９６））。ＫＧＦの全身への投与が、実験的に誘導した大腸炎で創傷を減少させることがわかっている。ＫＧＦはまた、放射線および／または化学療法に供する動物の上皮細胞を保護する。さらに、創傷治癒を遅らせることで知られるグルココルチコイドでの治療では、ＫＧＦ発現が抑制される。ペプチドおよび増殖因子の放出制御送達用の組成物および装置の使用を、米国特許第６，１８７，３３０号（‘３３０特許）が開示している。‘３３０特許発明は、血管形成の基本の線維芽細胞増殖因子または血管内皮増殖因子を局所に送達するために利用できるかもしれない。その全内容は引用によって本明細書中に含まれる。
【０００８】
米国特許第５，９６５，５３０号（‘５３０特許）では、ＫＧＦが別のタイプの細胞に作用することが示されている。その全内容は、引用によって本明細書中に含まれる。動物での大規模なインビボ研究を基に、ＫＧＦが角化細胞の他に様々なタイプの細胞の増殖、成長および分化を刺激することが今のところ判明してきている。インビボでのＫＧＦの生物学的作用をより一層理解することで、皮膚付属組織、肝臓、肺および胃腸管などの組織および器官を苦しめまたは悪影響を与える疾病状態および健康状態を特異的に治療するために、治療剤として、適切に薬剤組成物に配合されたこのポリペプチドを、より広く使用することが可能になる。上皮由来の細胞の他に、ＫＧＦが微小血管の内皮細胞に作用するが、大動脈などの大血管由来のものに作用しないことが近年わかってきた。ＫＧＦは微小血管内皮細胞の化学走化性および増殖を刺激して、ラットの角膜で血管形成を誘導する（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２：２０４９−２０５７（１９９９））。
【０００９】
ＫＧＦと同様の増殖因子が近年同定され、ＦＧＦ−１０またはＫＧＦ−２と名づけられている（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：１５９１８−１９５２１（１９９６）；Ｂｅｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５：２２１１−２２１８（１９９７）；Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７３：１３２３０−１３２３５（１９９８）；Ｊｉｍｅｎｅｚ  ａｎｄ  Ｒａｍｐｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８１：２３８−２４２（１９９９））。この増殖因子は同じＦＧＦファミリーに属し、ＫＧＦと５４％のアミノ酸同一性を有している。この増殖因子もまた、原則として上皮細胞に作用する。しかしＫＧＦと異なり、ＦＧＦ−１０はＦＧＦＲ１とも結合し、ヘパリンとより強く結合する。ＦＧＦ−１０は、皮膚創傷でＫＧＦのように高度に発現されてはいないようだが、ＦＧＦ−１０を局所適用すると治癒過程を早めることがわかっている。
【００１０】
ＫＧＦおよびＦＧＦ−１０の他に、上皮細胞を刺激することが可能な増殖因子が他にもある。これらの増殖因子には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）が含まれる。しかし、これらの増殖因子はまた、線維芽細胞、肝細胞および筋肉細胞など他のタイプの細胞にも作用する。
【００１１】
上皮細胞の移動は、他の多くの細胞の移動と同じように、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびその受容体（ｕＰＡＲ）の発現に密接に関連していると考えられる（Ｍｏｒｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８８：４１８−４２３，１９８７；Ｒｏｍｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０２：５１９−５２２，１９９４）。ｕＰＡＲの役割は、細胞表面でのｕＰＡに仲介されるフィブリン溶解またはタンパク質溶解に絞られる。ｕＰＡＲが、単一鎖の不活性なｕＰＡ、すなわち、ｓｃｕＰＡと結合すると、ｓｃｕＰＡは、活性の二重鎖ｕＰＡに変換される。ＫＧＦは、上皮細胞でｕＰＡの発現を増加させることがわかっている（Ｔｓｕｂｏｉら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０１：４９−５３，１９９３；Ｚｈｅｎｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：１２８−１３４，１９９６）。ｕＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。プラスミノーゲンは、約９０ｋＤａの糖タンパク質であり、５つのクリングル・ドメインおよびプロテアーゼ・ドメインから構成される。活性化は、プラスミノーゲンが、単一のペプチド結合（Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２）で切断されて起こる。活性化の後、ジスルフィド結合によって２つの鎖は共に連結されたまま残る。プラスミノーゲンも、プラスミノーゲン結合部位によって細胞表面に結合すると、ｕＰＡＲ結合ｕＰＡによって容易に活性化される。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）も、プラスミノーゲンを活性化するが、細胞表面受容体を有しておらず、酵素が至適に働くために、フィブリンと結合することが必要である。最初の４つまたは５つ全部のクリングル・ドメインを欠くプラスミノーゲンは、ミニプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミノーゲンと呼ばれる。これらはプラスミノーゲンと同様に活性化することができる（Ｋｏｍｏｒｏｗｉｃｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：９１１２−９１１８（１９９８））。
【００１２】
プラスミン／プラスミノーゲンは、フィブリン溶解の重要な酵素である（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８２：２５９−２７０，１９９９）。プラスミン／プラスミノーゲンは、フィブリン血塊および他の細胞外基質成分を分解する働きを担うが、メタロプロテアーゼおよびＴＧＦ−β等の増殖因子の活性化にも関与する。ｕＰＡおよびｔＰＡの他に、プラスミノーゲンは、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ等の他の酵素および一般的な吸血コウモリプラスミノーゲン活性化因子によって活性化することもできる。近年の研究で、プラスミノーゲンは創傷治癒に重要であることがわかってきた。プラスミノーゲン遺伝子ノックアウトマウスは、過剰のフィブリンが沈着した結果、皮膚創傷治癒の遅れをきたし、角化細胞の移動を妨げる（Ｒｏｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２８７−２９２，１９９６）。もしフィブリノーゲン遺伝子もこれらのマウスで欠損していたとしたら、創傷治癒機能が取り戻される（Ｂｕｇｇｅら、Ｃｅｌｌ  ８７：７０９−１９，１９９６）。また、プラスミンの重要性も、動脈および角膜創傷治癒において観察されている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：３１８０−９１（１９９７）；Ｋａｏら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：５０２−５０８（１９９８））。慢性の静脈脚潰瘍において、プラスミノ−ゲンの異常が観察されている（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１：１１４０−４，１９９８）。さらに、ｕＰＡおよび／またはｔＰＡ遺伝子の欠損も、過剰のフィブリン沈着の結果、創傷治癒の遅延を引きおこす（Ｂｕｇｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５８９９−５９０４（１９９６）；Ｈｅｙｍａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．５：１１３５−１１４２（１９９９））。プラスミンは、創傷治療の局所作用剤として使用されており、血栓症治療用の注入剤として評価されている。
【００１３】
血管形成の初期工程は、内皮細胞の移動を伴い、細胞外基質のタンパク質溶解性分解が関与する。ｕＰＡおよびｕＰＡＲの発現が、内皮細胞の移動の際にアップレギュレートされる（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：２７１−２８１，１９９７）。理論によって拘束されたくないが、プラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲンは、トリガーとなって血管形成に重要な働きをし得るプロテアーゼ・カスケードを作動させる。遺伝子欠損マウスを使用した研究で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、つまり既知の血管増殖因子による治療の後であっても、ｕＰＡ欠損マウスが血管再生不全を示したことがわかっている（Ｈｅｙｍａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．５：１１３５−１１４２，１９９９）。
【００１４】
プラスミン／プラスミノーゲンの他に、フィブリン分解に関与し得る酵素が他にもある。このような酵素の１クラスに、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）があり、２０を超えるメンバーを有する。ＭＭＰ−１２およびＭＭＰ−１４は、フィブリンを分解することで知られている。プラスミノーゲン欠損マウスでは、創傷の治癒は非常に遅れたが、創傷は最終的に治癒した。対照的に、広スペクトルのＭＭＰ阻害因子（例えば、ガラディン（ｇａｌａｒｄｉｎ））をこれらのマウスに適用すると、創傷治癒が完全に停止した（Ｌｕｎｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，４６４５−４６５６，１９９９）。ＭＭＰ−１４によるフィブリンの分解も、内皮細胞の移動に関与している（Ｈｉｒａｏｋａら、Ｃｅｌｌ，９５，３６５−３７７，１９９８）。
【００１５】
トロンビン阻害因子と組換えプラスミノーゲン活性化因子はいずれも、創傷の治癒過程を制御する製品に使用されてきた。例えば、米国特許第６，１７４，８５５号に、体内の創傷治癒過程、特に、フィブリンが関係する癒着および／または創傷組織形成の阻止または防止の制御に使用する製品の製造にトロンビン阻害因子を使用すること、ならびに多糖類（例えば、キトサン）および低分子量のペプチドを基盤とするトロンビン阻害剤を含む、体内の創傷治癒過程の制御に使用する製品が開示されている。この全内容はすべて、引用によって本明細書に含まれる。加えて、米国特許第６，０３３，６６４号（‘６６４特許）は、治癒の遅い創傷または非治癒性の創傷の処置用の局所的医学的製剤を製造にあたって、非細菌性プラスミノーゲン活性化因子を使用することを開示している。加えて、‘６６４特許は、生理学的に許容可能な担体および有効量の非細菌性プラスミノーゲン活性化因子を含む（ｔＰＡを除く）組成物に関係する。この全内容は引用によって本明細書に含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
すべての進展に関わらず、上皮起源の細胞が関与する傷を有効に治療する薬剤には依然として大きな需要がある。前述したように、従来技術では、傷はタンパク質由来の増殖因子またはタンパク質増殖因子の種々様々な混合物によって治療できることが教示されている。さらに、従来技術は、タンパク質分解酵素によって治りの遅い傷が治療できると教示している。創傷治癒を助長するために、タンパク質増殖因子とタンパク質分解酵素とを組合せて使用することは、たとえ、タンパク質増殖因子の作用と酵素の作用とが補完関係にあると見えても、直感的に理解できない。このように推論するその最も明らかな理由は、タンパク質分解酵素はタンパク質を加水分解（消化）するように作用することにある。したがって、タンパク質増殖因子（例えば、ＫＧＦ）とタンパク質を消化する酵素（例えば、プラスミノーゲン）とを組合せることは、当分野の技術者にとって、創傷治癒のための治療法として効果的であると当初は思えなかったであろう。しかし、本発明で、増殖因子とタンパク質分解酵素との組合せによる相乗効果を示唆する洞察がもたらされた。このような組合せ剤が生産され、インビボ状態で精緻な相互作用に基づいて使用されることが特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１つの実施形態は、ヒトを含めた動物など対象物の傷の創傷治療を高めるための、２つの成分：すなわち（１）上皮細胞機能に関連する増殖因子と（２）細胞外基質分解プロテアーゼとを混合して形成される組合せを含む組成物に関する。この２つの成分は、対象物に与える前に「前もって混合」するかまたは順次対象物に与えることができる。より詳しくは、本発明は、酸性線維芽細胞増殖因子（線維芽細胞増殖因子１）、角化細胞増殖因子（線維芽細胞増殖因子７）、角化細胞増殖因子２（線維芽細胞増殖因子１０）、上皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子α、トランスフォーミング増殖因子β、インシュリン様増殖因子、肝細胞増殖因子、またはこれら増殖因子のうちのいずれかの機能的生物学上同等物と、プラスミン／プラスミノーゲン、ミニプラスミン／ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミン／マイクロプラスミノーゲン、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼまたはこれらの活性化因子および／またはプロテアーゼの機能的生物学上同等物とを、ヒトまたは動物において創傷治癒を高める目的で、組合せて利用することに関する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、増殖因子を有する容器と細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を有する容器を保持するキットに関する。各容器の内容物は、それぞれ担体溶液（例えば水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏）中にあっても、凍結乾燥されて第３容器中に入れた担体溶液で使用者がこれらの成分を戻せるようしてあってもよい。キットの成分は、混合されて創傷の治癒を高める目的で動物またはヒトの傷上に置かれる。あるいは、キットの個々の成分を創傷の上に縦に重ねるかまたは順次置くことができる。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、上皮細胞機能に関連する増殖因子と細胞外基質分解プロテアーゼとの組合せを利用することで、動物またはヒトで傷を治療する方法に関する。本方法は、ここに記載されたキットを利用することまたはその個々の成分を利用することを含む。例えば、キットの成分を混合し傷の上におくか、またはキットの個々の成分を縦に重ねてまたは順次傷の上におくことができる。また、キットの成分または生物学的同等物は、購入するかあるいは製造し、創傷治癒を高めるための記載された方法で使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
略号：
次の略号を本明細書では使用する：ａＦＧＦ：酸性線維芽細胞増殖因子、Ａｒｇ：アルギニン、ＢＣＡ：ビシンコニン酸、ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子、ＣＭＣ：カルボキシメチルセルロース、ｄＮ２３ＫＧＦ：Ｎ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸を欠くＫＧＦ分子、ＥＧＦ：上皮増殖因子、ＦＧＦ：線維芽細胞増殖因子、ＨＧＦ：肝細胞増殖因子、ＩＧＦ−Ｉ：インシュリン様増殖因子Ｉ、ＫＧＦ：角化細胞増殖因子、Ｓｅｒ：セリン、ｔＰＡ：組織プラスミノーゲン活性化因子、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、ｕＰＡ：ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子、ｕＰＡＲ：ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体。
【００２１】
用語：
用語「創傷」は、組織または器官の、外部でも内部でもその完全性の破壊すべてを言う。これはまた、用語「傷」と互換的に使用される。創傷には、上皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、肝細胞、内皮細胞、およびマクロファージなどの種々の免疫細胞を含む多くの異なるタイプの細胞が関与している可能性がある。上皮細胞起源の細胞が関与する傷には、皮膚中または上、粘膜表面、口腔、消化管、眼球または肺を含めた上皮起源の細胞の傷が含まれる。
【００２２】
用語「組換えタンパク質」は、原核生物または真核生物系のいずれかで、そのタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を担持する適切な発現ベクターを用いて産生されるタンパク質またはタンパク質の活性部分のことを云う。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、合成することも、当分野で既知の分子生物学的技法を使用して細胞のｍＲＮＡからクローンすることもできる。
【００２３】
用語「核酸発現構築体」は、転写されることが可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子構築体のことを云う。用語「発現ベクター」もこれと互換的に使用することができる。
【００２４】
本明細書で使用されているような増殖因子、細胞外基質分解プロテアーゼ酵素またはプラスミノーゲン活性化因子の「機能的生物学上同等物」という用語は、自然に相異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドか、または相異なるアミノ酸配列を含むように設計されたポリペプチドであるが、同時に、野生型増殖因子、酵素または酵素活性化因子と比べた場合、同等かまたは改良された生物学的活性を有しているポリペプチドである。
【００２５】
用語「ベクター」は、核酸を細胞または器官に送達する任意のベシクルを云う。例としては、プラスミド・ベクター、ウィルス・ベクター、リポソーム、またはカチオン性脂質が含まれる。
【００２６】
用語「切断」は、所与の技法で検出された場合、少なくとも１つの断片が、これ以上切断できない安定した産物であって、分子に関する本来の活性の全てまたはほとんどを留保し得る可能性を持って、分子を２つ以上の断片に切断または分離することを云う。
【００２７】
用語「分解」は、分子を所与の技法では検出できない細かい断片に切断または分離することを云う。
【００２８】
用語「関係する酵素」は、その機能、特異性、構造、または同じ酵素カスケードの一部によって互いに関係する酵素を云う。
【００２９】
用語「関係する増殖因子」は、機能または構造によって互いに関係している増殖因子を云う。
【００３０】
分子生物学的技法には、核酸およびタンパク質分子の単離、精製、産生、分析、修飾、および操作の技法が含まれる。組換えＤＮＡ技法は、ＤＮＡ配列を単離、精製および操作するために使用される技法のことを云う。このような技法はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，ｖｏｌ．１−４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、ｖｏｌ．１−３，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）に十分に記載されている。このような技法の例には、核酸またはタンパク質の単離および精製、逆転写、ＰＣＲ（ポリメーゼ連鎖反応）、インビトロ突然変異、制限酵素切断、種々の（プラスミド）ベクターへのクローニング、トランスフェクション、形質転換、および原核細胞（細菌）または真核細胞（酵母、昆虫、哺乳類）でのタンパク質発現が含まれる。
【００３１】
当分野技術では、創傷および傷は、タンパク質分解酵素またはタンパク質増殖因子によってそれぞれ独立して治療できると教示されているが、両者を同時に使用することは、タンパク質増殖因子の作用と酵素の作用とが補完関係にあると見えても、はじめは直感的に理解できなかったであろう。このように推論するその最も明らかな理由は、タンパク質分解酵素はタンパク質を加水分解（消化）するように作用することにある。タンパク質増殖因子（例えばＫＧＦ）とタンパク質を消化する酵素（例えばプラスミン）とを組合せることは、当分野の技術者にとって、創傷治癒のための治療法として効果的であると当初は思えなかったであろう。しかし、本発明で増殖因子とタンパク質分解酵素との組合せによる相乗効果を示唆する洞察がもたらされた。このような組合せ剤が生産され、インビボ状態で精緻な相互作用に基づいて使用されることが特に望ましい。
【００３２】
ヒトＫＧＦが、プラスミンまたはトリプシンによってＮ末端からＡｒｇ２３−Ｓｅｒ２４結合で切断され、その結果得られた断片、ｄＮ２３ＫＧＦ（Ｎ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸が欠損しているＫＧＦ）が、酵素消化に対して安定であることが発見された。トリプシンでも確認されたように、酵素が高濃度である時のみ、ｄＮ２３ＫＧＦの若干分解がもたらされる。さらに、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するｕＰＡおよびｔＰＡは、ＫＧＦに何の影響も与えない。同じく重要なのは、ｄＮ２３ＫＧＦが、完全な状態のＫＧＦと同様に活性のままであることだ。キモトリプシンによってさらに２つのアミノ酸を除去すると、生物学的活性が減少したｄＮ２５ＫＧＦ（Ｎ末端から最初の２５個のアミノ酸が欠損しているＫＧＦ）となる。これらの結果は、ＫＧＦの機能的ドメインについて組換えＤＮＡ技法によって前に行われた分析と一致している。すなわち、ＫＧＦのＮ末端は、いかなる生物学的活性も失わずに最高２３個のアミノ酸（アルギニン）まで除去できる（Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２９８４−２９８８（１９９３）；Ｏｓｓｌｕｎｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７，１６８１−１６９０（１９９８））。プラスミンは、アルギニンまたはリジン残基でタンパク質を切断する。またその一次配列（１０アルギニンおよび１７リジン残基）に基づくと、ＫＧＦ上には多くのプラスミンによる切断可能部位があるので、Ａｒｇ２３の特定部位での切断により、安定した活性断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）を生じるのは予想外のことであった。
【００３３】
ＫＧＦが、創傷体液中のプラスミンで切断され、また線維芽細胞から単離された天然のＫＧＦもやはりプラスミンで切断されて、組換えＫＧＦで得られるｄＮ２３ＫＧＦと同一サイズのＣ末端断片を生じる。さらに、プラスミノーゲンとＫＧＦとを組合せると相乗して、角化細胞に仲介されるフィブリン溶解および角化細胞の移動および増殖が増加する。したがって、理論によって拘束されたくないが、ＫＧＦおよびプラスミンは、創傷治癒または再上皮形成過程の間、上皮細胞の作用であって、２つの独立してはいるが相乗的に作用する側面に対して働きかけ、つまり、ＫＧＦが上皮細胞の増殖を刺激し、一方プラスミン（間接的プラスミノーゲン活性化因子）が、フィブリン血塊および関係する細胞外基質成分を排除することによって上皮細胞の移動を容易にするようにみえる。
【００３４】
理論によって拘束されたくないが、ｄＮ２３ＫＧＦは、現在のインビトロ分析系では解明され得ない高い生物学的活性をもつのかもしれない。この活性は、細胞受容体に対する高い親和性および／またはタンパク質構造の安定性をはじめ多くの因子に起因する可能性がある。同時に、切断はまた、増殖因子の全分解過程の最初の工程であるのかもしれない。‘２７８特許は、ｄＮ２３ＫＧＦと同一ではないとしても類似しているΔ２３ＫＧＦ（Ｎ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸が欠損しているＫＧＦ）を伴った、有糸分裂活性の増加が、観測されたことを開示していた。
【００３５】
血漿中のプラスミノーゲン濃度は高い（１．５〜２μＭまたは１３５〜１８０μｇ／ｍ１）（ＣｏｌｌｅｎおよびＬｉｊｎｅｎ，フィブリン溶解および血行停止の制御（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｓｔａｓｉｓ）、ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｇ．Ｓ．Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｗ．Ｎｉｅｎｈｕｉｓ，Ｐ．Ｗ．Ｍａｊｅｒｕｓ，およびＨ．Ｖａｒｍｕｓ，ｅｄｓ），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ（１９９４），Ｐａｇｅｓ  ７２５  ｔｏ  ７５２）。創傷または創傷体液中のプラスミンの濃度は、あまり調査されていない。角膜創傷治癒期間中の涙液のプラスミンの濃度は、約３７．９μｇ／ｍｌである（ｖａｎ  Ｓｅｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１２９３−１２９８，１９８９）と報告されている。理論によって拘束されたくないが、特殊な高濃度化のメカニズムが関与しないと仮定すると、起こり得る最も高いプラスミンの濃度は、血漿中の実際のプラスミノーゲンの濃度である。創傷中のプラスミンの濃度は、ｕＰＡおよび／またはｔＰＡの発現レベルおよび創傷の状態に影響されやすい。本発明の実験に使用された最も高いプラスミンの濃度は、２４００ｎＭまたは２１３μｇ／ｍｌで、これはインビボ状態の下で起こり得る最も高い生理的濃度よりも高い。この濃度の５分の１で、プラスミンは完全に１．７４μＭまたは３３μｇ／ｍｌのＫＧＦを切断する。３７℃でインキュベーション期間を長くしてテストしたが、テストした全てのプラスミン濃度で、切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）は、ほんのわずか（＜５％）かまたはまったく分解されなかったことが観察された。
【００３６】
すべての増殖因子のタンパク質が分解状態で安定であるとは限らない。例えば、ＦＧＦ−１０は、同じＦＧＦファミリーの別のメンバーであるが、ＫＧＦとの類似性のためにＫＧＦ−２としても知られる。ＫＧＦもＦＧＦ−１０も、原則的に上皮細胞に作用するが、ヘパリン結合強度、受容体結合特異性、創傷における発現レベルについては互いに異なる。我々の実験では、ＦＧＦ−１０は、プラスミンおよびトリプシンによって分解されて、安定な切断断片を残さないことがわかった。創傷の周囲に存在するプロテアーゼの影響と関連させると、これらの結果によってＫＧＦの特異性はさらに強調される。
【００３７】
したがって、ＫＧＦとプラスミン／プラスミノーゲンとを特異的に組合せて、上皮細胞が関与する創傷の治療に利用することができる。このような組合せは、ＦＧＦ−１０では達成できず、少なくともプラスミン（活性酵素）とでは達成できない。理論によって拘束されたくないが、この組合せは、薬剤組成物に適切に配合された場合、再上皮形成過程に不可欠な２つの独立しているが相乗した作用を連携させることができる（すなわち、上皮細胞増殖／分化を刺激し、フィブリン血塊および関係する細胞外基質成分を排除することでその移動を促進する作用）。実際、インビトロの分析系で、この組合せが、角化細胞の増殖および移動に相乗的に刺激を与えることが実証された。さらに、ＫＧＦが、創傷体液中でプラスミンによって切断されると、ＫＧＦとプラスミン／プラスミノーゲンとの組合せによる生理学的な関与と与えられる恩恵が強化される。この概念は、線維芽細胞から単離される天然のＫＧＦもやはりプラスミンによって切断され、組換えＫＧＦで得られるｄＮ２３ＫＧＦと同じサイズのＣ末端断片を生じるという知見で、さらに強調される。
【００３８】
したがって、この発見の好ましい実施形態は、上皮細胞起源の細胞または増殖因子が影響を与え得る他のタイプの細胞が関与する傷または疾病状態を治療するための、細胞外基質分解プロテアーゼと上皮細胞機能に関連した増殖因子との組合せである。この組合せは、
１）適用前または適用時のいずれかで２つを物理的に共に混ぜ合わせること
２）１つを最初に適用し、続いて他を適用すること、または
３）二者択一方式（すなわち、ある治療期間中、疾病状態を一方で治療し、続いて次の治療期間中、他方で治療する）によって達成される。
【００３９】
増殖因子が、活性型の細胞外基質分解プロテアーゼによって不活性化されないことが好ましい。加えて、増殖因子が、上皮細胞機能に関連していて、ＫＧＦであるか関連のものであることが好ましい。さらに、プロテアーゼが、直接または間接的に細胞外基質分解に関連していて、プラスミン／プラスミノーゲンまたは関連のものであることが好ましい。この組合せを、増殖因子が影響を与え得る上皮細胞および他のタイプの細胞が関与する創傷または傷を治療するのに使用する。増殖因子および酵素は、ヒトまたは動物血、組織または培養細胞から単離によって天然タンパク質として産生できるか、あるいは、原核または真核生物系で組換えＤＮＡ技法によって組換えタンパク質として産生できる。
【００４０】
本発明によるポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質の構造に修飾および／または変更を加えた場合でも、一方で類似かまたは改良された特徴を有する分子である限り、そのような生物学的機能的同等物もやはり本発明の範疇に入る。
【００４１】
Ａ．修飾されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド
生物学的機能的同等物には、相異なる配列を含むように設計されているが、同時に「野生型」または標準タンパク質をコードする能力を保持しているポリヌクレオチドが含まれる。これらは、遺伝子コードの縮重、すなわち、同じアミノ酸をコードする多重コドンの存在によって達成される。１つの例として、当分野の技術者なら、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの能力を阻害することなく、ポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入したいかもしれない。
【００４２】
他の例としては、ポリヌクレオチドが、より大幅な変更を有する生物学的機能的同等物であってもよいし、（それをコードしていてもよい）。例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子、受容体などの結合部位といった構造との相互結合能力をあまり失うことなく、タンパク質構造のある種のアミノ酸が他のアミノ酸と置換していてもよい。タンパク質のいわゆる「保存的」変化は、タンパク質の生物学的活性を阻害しない。というのは、そうした構造的変化は、設計された機能を実行するタンパク質の能力に影響を与えないからである。したがって、本発明者は、本発明の目的を満たしたままで、本明細書に開示された遺伝子およびタンパク質の配列に、様々な変化を加えられるように熟考した。
【００４３】
機能的同等物という点で、「生物学的機能的同等」であるタンパク質および／またはポリヌクレオチドの定義に、本来、許容レべルの生物学的に同等の活性を有する分子であることを維持しながら、分子の規定された部分内でなされ得る変更の数に限りがあるという概念が備わっていることは、当業者には十分理解されている。したがって、本明細書で規定される生物学的機能的同等物というのは、特定のアミノ酸（またはコドン）が置換していてもよいタンパク質（およびポリヌクレオチド）である。
【００４４】
Ｂ．変更アミノ酸
本発明は多くの面で、適切なポリヌクレオチドの転写および翻訳を通して、細胞中でペプチドおよびポリペプチドを合成することを当てにしている。これらのペプチドおよびポリペプチドには、２０の「天然」アミノ酸、その翻訳後の修飾物が含まれる。しかし、修飾されたアミノ酸および／または特殊なアミノ酸も、インビトロのペプチド合成によって本発明の一般的範囲からはずれることなく使用することができる。
【００４５】
Ｃ．模倣物
上記に記述した生物学的機能的同等物に加えて、本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要部分を摸倣した構造的に類似の化合物を形成できるのではないかということも、本発明者は考えた。このような化合物は、ペプチド模倣物と名づけられるが、本発明のペプチドと同様に使用することができるので、これも機能的に同等物といえる。
【００４６】
タンパク質の２次構造および３次構造の要素を模倣している模倣物がいくつか、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）に記載されている。ペプチド模倣物を使用する背景には、タンパク質のペプチド骨格の存在が、主に抗体および／または抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させているという理由があるからである。したがって、ペプチド模倣物は、天然分子と同様の分子間相互作用をするように設計される。
【００４７】
ペプチド模倣物構想を応用したいくつかの成功例では、高度に抗原性であることが知られるタンパク質内のβターンの模倣物が注目されている。ポリペプチド内のβターン構造は、本明細書で記載したように、コンピュータによる計算で予測できるようだ。このターンの構成アミノ酸が決定された場合、アミノ酸側鎖の必要不可欠な因子を同じように空間配置させた模倣物が構築できる。
【００４８】
他のアプローチでは、巨大タンパク質の結合部位を摸倣する生物学的に活性な高次構造を産生するための、構造的に魅力的なテンプレートとして、小さいマルチジスルフィド結合を含むタンパク質を使用することに注目した（Ｖｉｔａら、（１９９８））。ある種のトキシン中で進化の過程で保存されてきたと思われる構造的モチーフは、小さく（３０−４０アミノ酸）、安定で、変異が高度に起こりやすい。このモチーフは、３つのジスルフィドによって内部核を埋めているβシートとαへリックスとからなる。
【００４９】
ベータＩＩターンの摸倣は、環状Ｌ−ペンタペプチドとＤ−アミノ酸を有するペプチドを使用して成功している（Ｗｅｉｓｓｈｏｆｆら、（１９９９））。また、Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｏｎら（１９９９）は、逆ターンを有する２環式トリペプチドによって特徴が誘導されると報告している。
【００５０】
特殊構造を生み出す方法は、従来技術に開示されている。例えば、αへリックス模倣構造は、米国特許第５，４４６，１２８、５，７１０，２４５、５，８４０，８３３、および５，８５９，１８４号に開示されている。これらの構造によって、ペプチドまたはタンパク質はより熱に対して安定となり、また、タンパク質分解に対する抵抗性が増加する。６、７、１１、１２、１３、１４員環構造物も開示されている。
【００５１】
高次構造的に制限のあるβターンおよびβバルジを生成する方法については、例えば、米国特許第５，４４０，０１３、５，６１８，９１４および５，６７０，１５５号が記載している。βターンでは、対応する主鎖の高次構造を変化させることなく側鎖置換基を変化させ、ペプチド内に適切な末端を取り込ませることが、標準の合成手法によってできる。摸倣ターンには他に、逆ターンおよびガンマターンが含まれる。逆ターン摸倣物は、米国特許第５，４７５，０８５および５，９２９，２３７号に開示され、ガンマターン摸倣物は、米国特許第５，６７２，６８１および５，６７４，９７６号に記載されている。
【００５２】
さらに、本発明の発見の好ましい実施形態は、実施例１０に概略を述べたように様々な技法でなされる。このような組合せは、多くの酵素または増殖因子の代替物で作ってもよいと考えられる。細胞外基質分解に直接または間接に関係する酵素の代替物の例には、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、一般的な吸血コウモリプラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよびメタロプロテアーゼなどが含まれる。プラスミンと同等の特異性を共に有する酵素を使用してもよい。上皮細胞機能に関係する増殖因子の代替物の例には、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１０、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−Ｉ、ＨＧＦ、およびａＦＧＦが含まれる。特に、ＦＧＦ−１０はプラスミノーゲン（不活性プロ酵素）または関連の酵素と互いに組合せてもよいと思われる。
【００５３】
最近の知見で、ＫＧＦが、微細血管内皮細胞および肝細胞をはじめとする他のタイプの細胞をも刺激することが示されているが、これに照らすと、上記に記載された組合せを使用して、これらの細胞が関与する疾病状態も治療し得る。プラスミノ−ゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子もまた、内皮細胞の移動を促進することによって血管再生に関わることが知られている。異なるタイプの細胞を処置する際に、ＫＧＦを、基質分解プロテアーゼによって不活性化も分解もされない別の増殖因子に代えて、組合せればよいと思われる。
【実施例１】
【００５４】
ＫＧＦのトリプシン、プラスミンおよびキモトリプシンによる切断
何種かのプロテアーゼを使用して、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））またはペプロテク（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ））から入手した組換えヒトＫＧＦ（１６３個のアミノ酸）を処理した。トリプシン（１３，０００単位／ｍｇタンパク質）、キモトリプシン（６０単位／ｍｇタンパク質）およびブタ由来のプラスミン（３．２単位／ｍｇタンパク質）またはヒト血液（５．７単位／ｍｇタンパク質）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）から入手した。ヒト尿由来２鎖ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）（１００，０００単位／ｍｇタンパク質）およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から入手した。ＫＧＦと酵素とを共にＴＮ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣ１，ｐＨ７．４）に溶解した。これらを表示濃度で混合し、同量のサンプル緩衝液と混合する前に水浴で３７℃で１時間以上インキュベートし、変性条件の下で１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での電気泳動に供した。最前部にあった染料（ブロモフェノール・ブルー）がゲルの最後部近くに移動した時、電気泳動を停止した。クーマシーブルー染色によってタンパク質のバンドを可視化した。被染色ゲルの映像を、完全無彩色スケールで、映像取得可能な状況下でＣＣＤカメラ付きＧＳ−５０００デジタル撮像システム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｆｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．）を使用して取得した。タンパク質のバンドのデンシトメトリー分析をマッキントッシュ・コンピュータで、パブリックドメインＮＩＨイメージ１．６２プログラム（アメリカ国立衛生研究所で開発）を使用して行った。各バンドの非補正の光学密度（ＯＤ）を測定した。同じゲル上のバンド間で比較を行った。
【００５５】
その結果、トリプシン、プラスミン、キモトリプシンがＫＧＦ（１．７４μＭ）を切断して、約１６ｋＤａの断片を生じることがわかった（図１）。トリプシンおよびプラスミンで生成した断片は、同じサイズを示したが、キモトリプシンで生成した断片は、若干小さいようであった。ｔＰＡおよびｕＰＡは、同じ条件の下でＫＧＦに何の影響も及ぼさなかった（図１）。ｕＰＡおよびｔＰＡの濃度をそれぞれ３．０４μＭおよび４．１６μＭと１６倍に増加させてもＫＧＦは完全なままであった。ｕＰＡおよびｔＰＡの自然基質であるプラスミノーゲンを酵素活性に対するコントロールとして使用した。ｕＰＡおよびｔＰＡは、２．４μＭのプラスミノ−ゲンをそれぞれ１．２ｎＭおよび０．１ｎＭで、完全に切断または活性化した。これらの結果は、ｕＰＡおよびｔＰＡがＫＧＦに何の影響も与えないことを示す。
【実施例２】
【００５６】
ＫＧＦの切断部位
トリプシン、プラスミンまたはキモトリプシンで生成した断片をＮ末端配列決定に供した。トリプシン、プラスミンまたはキモトリプシンで消化したＫＧＦ（２μｇ）を、ゲル電気泳動で選別した後、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。タンパク質を４０％メタノール、１０％酢酸中０．１％のクーマシーブルーで〜２０秒間染色してから、４０％メタノールで脱色した。次に膜を脱イオン水で洗浄して空気乾燥した。これらの酵素で生成した〜１６ｋＤ断片を、エドマン（Ｅｄｍａｎ）配列決定法を使用してヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇ１０００Ａ）自動タンパク質シーケンサーで行うＮ末端アミノ酸配列決定を行うために切り出した。配列決定の結果、切断部位の同定ができた。つまり、すべての酵素がＫＧＦをＮ末端で切断し、トリプシンおよびプラスミンはＡｒｇ２３−Ｓｅｒ２４で、およびキモトリプシンはＴｙｒ２５−Ａｓｐ２６で切断した（表１、図２）。すなわち、トリプシンおよびプラスミンは、ｄＮ２３ＫＧＦ（Ｎ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸が欠損したＫＧＦ）を、またキモトリプシンは、ｄＮ２５ＫＧＦ（Ｎ末端からこの末端を先頭に２５個のアミノ酸が欠損したＫＧＦ）を生成した。
【００５７】
ラビット抗ＫＧＦ・Ｃ末端ペプチド（ＣＧＫＫＴＫＫＥＱＫＴＡＨＦＬＰＭＡＩＴ）抗体を、ＫＬＨ（シグマ・ジェノシス社：Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｕｎｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ）と複合した合成ペプチドを使用して生成した。ＫＧＦは、プラスミンで処理または処理しないで、電気泳動で分離し、イモビロン−Ｐ膜上にブロットした。この膜を抗ペプチド抗体およびアルカリホスファターゼ複合抗ラビットＩｇＧをプローブとして探索し、検出用に酵素基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）を使用した。その結果、ＫＧＦと同様に、ｄＮ２３ＫＧＦは、この抗ペプチド抗体と強く反応して、ｄＮ２３ＫＧＦのＣ末端が完全で、Ｃ末端から２０以上のアミノ酸を含む切断は生じていないことがわかった。これはｄＮ２３ＫＧＦのサイズ（約１６ｋＤａ）と一致し、もしさらに２０のアミノ酸がＣ末端から欠損すれば、ｄＮ２３ＫＧＦのサイズが〜１４ｋＤａまで減少することになる。
【００５８】
したがって、ｄＮ２３ＫＧＦは、Δ２３ＫＧＦ−１４４ＱおよびΔ２３ＫＧＦとＮ末端が同一である。また、データが示唆するように、ｄＮ２３ＫＧＦのＣ末端で何の切断も生じていないと仮定すると、後者ともＣ末端が同一である。Δ２３ＫＧＦ−１４４ＱとΔ２３ＫＧＦの両者は、高い有糸分裂作用または熱安定性あるいはその両方を有することがわかっている。
【実施例３】
【００５９】
ｄＮ２３ＫＧＦの安定性に与える酵素濃度の影響
酵素消化は、実施例１と同じように３７℃１時間で、様々な酵素濃度で行った。その結果、ＫＧＦの切断が酵素濃度に依存していることを示した。完全なＫＧＦ（１．７４μＭ）の＞５０％切断は、トリプシン１３．８ｎＭ以上で達成された（図３ｂ）。実際、ほとんどすべてのＫＧＦ分子が、１３．８ｎＭで切断され、相当量の切断が１．３８ｎＭで達成された。一方、プラスミンは、すべてのＫＧＦ分子を４８０ｎＭで切断し、わずかな部分のみを４８ｎＭで切断したが、これはトリプシンの１．３８ｎＭでの切断より少なかった（図３ａおよび３ｂ）。同様の結果が、ヒトまたはブタのプラスミンで得られた。したがって、ＫＧＦを切断する際、プラスミンはトリプシンよりも効果が〜３４倍低かった（図３ａおよび３ｂ）。
【００６０】
ＫＧＦ分子がすべてまたはほとんどすべて切断される一方、高酵素濃度（１３８０ｎＭ）のトリプシンで生成したｄＮ２３ＫＧＦ断片は、その低酵素濃度（１３８ｎＭおよび１３．８ｎＭ）での断片よりもそれぞれ１７％および２０％少なかった（図３ｂ）。これは、ｄＮ２３ＫＧＦが、高トリプシン濃度（１３８０ｎＭ）では、さらにある程度まで分解されることを示す。しかし、この観測ではまた、トリプシン濃度を１３．８から１３８ｎＭと１０倍増やしてもｄＮ２３ＫＧＦ断片の分解が著しくは増加しないことわかった。
【００６１】
ＫＧＦのＮ末端からこの末端を先頭に２３個のアミノ酸を除去すると、質量が１４％削減することとなる。この計算と一致するのが、デンシトメトリー測定による観測で、１００％切断を達成した時、テストしたすべてのプラスミンの酵素濃度（４８０および９６０ｎＭ）で、ｄＮ２３ＫＧＦは、オリジナルのＫＧＦの〜９０％に相当していた（図３ａおよび４）。これは、ｄＮ２３ＫＧＦが、使用したプラスミンの濃度では安定であることを示す。同様に、低酵素濃度のトリプシン（１３８および１３．８ｎＭ）では、ｄＮ２３ＫＧＦは、オリジナルのＫＧＦの約８６％に相当していたが、高濃度（１３８０ｎＭ）では、さらに分解されるため、約７１％に相当していたに過ぎない（図３ｂ）。
【００６２】
理論によって拘束されたくないが、フィブリン溶解の際してのプラスミンの役割は、フィブリンを分解することである。酵素活性用のコントロールとしてプラスミンおよびトリプシンを使用して、ＫＧＦ消化と同じ条件を使用してフィブリノーゲンを処理した。プラスミンは、フィブリノーゲン（４９０ｎＭ）を、４８ｎＭ以上で完全に小さな断片に分解したが、４．８ｎＭではわずかに分解しただけであった。トリプシンもまた、プラスミンのように、フィブリン（フィブリノーゲン）を切断して、同様の切断産物を生成できる（Ｋｏｍｏｒｏｗｉｃｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：９１１２−９１１８（１９９８））。トリプシンは、１３．８ｎＭでフィブリノーゲン（４９０ｎＭ）を４．８から４８ｎＭ濃度のプラスミンと同程度まで切断した。このように、フィブリノーゲン分解に際して、トリプシンはプラスミンよりも最高でも約３倍程度しか効率が高くないが、ＫＧＦに対しては、３４倍効率が高かった。したがってプラスミンは、ＫＧＦよりもフィブリノーゲンを切断する際により効率が高いと思われる。
【実施例４】
【００６３】
ｄＮ２３ＫＧＦの安定性に与える長時間酵素消化の影響
トリプシンまたはプラスミンと接触させたｄＮ２３ＫＧＦの安定性をさらに評価するため、様々な時間に採取したサンプルについて３７℃で消化を行った。酵素を必要以上に高い濃度で使用して、完全に切断した（図３ａおよび３ｂ）。その結果、１時間のインキュベーションを行った後生成したｄＮ２３ＫＧＦの量と比べて、さらに５時間インキュベーションした後では、プラスミンの９６０ｎＭ（８６μｇ／ｍｌ）では、減少がわずか５％あっただけであったことがわかった（図４ａ）。さらに、プラスミンの濃度を２，４００ｎＭ（２１３μｇ／ｍｌ）まであげると、３０分インキュベーションの後生成したｄＮ２３ＫＧＦの量を、さらに２．５時間インキュベーションした後の量と比べると、やはり、わずか５％の減少が観測された（図４ｂ）。
【００６４】
トリプシン１３８０ｎＭ（３３μｇ／ｍｌ）では、さらに５時間インキュベーションした後のｄＮ２３ＫＧＦの量に１８％減少があった（図４ａ）。トリプシンまたはプラスミンについてｄＮ２３ＫＧＦの量に減少が観測されるのは、試験管の表面への付着および／または自己分解といった酵素とは無関係な因子に原因するものもいくつかあるようだ。インキュベーション中のこのような損失は、特に反応中の全タンパク質濃度が低く（例えばＫＧＦコントロール）、インキュベーション期間が長い場合に顕著である。つまり、さらに５時間のインキュベーション後のＫＧＦコントロールで、２７％減少が確認された（図４ａ）。同じ酵素モル濃度の下では、全タンパク質濃度（ｗ／ｖ）は、トリプシン反応の方が、プラスミンよりも〜３倍低くなることになる。
【００６５】
この結果は、実施例３で記載したものと総合して、ｄＮ２３ＫＧＦは、プラスミン消化に対して安定であることを示す。トリプシン消化に対しても、特に低い酵素濃度では、比較的安定であった。
【実施例５】
【００６６】
ｄＮ２３ＫＧＦの生物学的活性
マウスの角化細胞系Ｂａｌｂ／ＭＫを使用した（Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ａａｒｏｎｓｏｎ，Ｃｅｌｌ  ３２：５９９−６０６（１９８３））。細胞を１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を有する低カルシウム培地ＥＭＥＭ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中で培養した。増殖分析では、細胞を９６ウエルのプレートに１〜３×１０３細胞／ウエルで播種し、３７℃で一晩インキュベーションした。各酵素につき、ゲル電気泳動によって確認されるＫＧＦの完全切断を確実にするために酵素濃度を２倍に増加させた以外は図１と同様の条件の下でＫＧＦを酵素処理した。
【００６７】
ＫＧＦまたは酵素で処理されたＫＧＦを、まず同量のＦＢＳと混合し、次に細胞（１００μｌ／ウエル）に添加する前に０．５％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ中に連続希釈した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、ＭＴＴ（テトラゾリウム塩）増殖分析をプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から入手したキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６）で行った。要するに、ＭＴＴ染料をウエル（１５μｌ／ウエル）に添加し、３７℃で４時間後、溶解液（１００μｌ／ウエル）を添加した。５７０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定する前にプレートを湿式容器中で一晩保持した。
【００６８】
その結果、トリプシンまたはプラスミンで生成したｄＮ２３ＫＧＦは、完全なＫＧＦと同じように活性のままであった。キモトリプシンで生成した断片（ｄＮ２５ＫＧＦ）は、完全なＫＧＦより若干活性が劣った（図５）。酵素のみでは細胞増殖に何の影響も与えなかった。
【実施例６】
【００６９】
プラスミノーゲンおよびＫＧＦの組合せが角化細胞の移動および増殖ならびに角化細胞に仲介されるフィブリン溶解に与える影響
フィブリンゲル被覆表面上での角化細胞の移動分析を使用して、プラスミノーゲンおよびＫＧＦの組合せが、角化細胞の移動および増殖に与える影響を評価した。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を上記のように培養した。ＥＭＥＭ（３ｍｇ／ｍｌ）中にあるヒトプラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、０．０２単位／ｍｌのウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合し、２４ウエルのプレートに入れた（０．５ｍｌ／ウエル）。プレートを３７℃で３時間保持することでフィブリンゲルを形成させた。Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞をトリプシンを有するフラスコから取り上げ、１０％ＦＢＳを含むＥＭＥＭで３回洗浄し、１０％ＦＢＳ（無ＥＧＦ）を含むＥＭＥＭで懸濁し、フィブリンゲル（１０００細胞／ウエル）上に播種した。一晩インキュベートし、培養培地を取り除き、プラスミノーゲン（０．１または５μｇ／ｍｌ）、ＫＧＦ（０または５０ｎｇ／ｍｌ）またはプラスミノーゲンとＫＧＦの両方を含むＥＭＥＭと取り替えた。次に細胞を３７℃で培養した。
【００７０】
フィブリンゲル上の個々の細胞周囲には、透明な消化ゾーンがプラスミノーゲンの存在の下で２４時間後に鮮明に見えるようになった。コントロール（培地のみ）およびＫＧＦで処理された細胞でも、弱い消化ゾーンが４８時間後に確認され、ＫＧＦで処理した細胞周囲の透明な消化ゾーンはコントロール細胞のものと比べ、よりはっきり見えた。個々の細胞の周りに透明な消化ゾーンが現れるのは、フィブリン溶解が細胞によって行われる過程であることを示す。すなわち、細胞がプラスミノーゲン結合部位を有し、プラスミノーゲンを活性化するｕＰＡを発現していることを示す。４８時間までに、プラスミノーゲン５μｇ／ｍｌ（ＫＧＦ有無）で処理した細胞は、フィブリンゲルを消化して貫通し、プレート表面に付着した。５日間培養した後、プラスミノーゲン５μｇ／ｍｌで処理した細胞のみが、依然としてゲルを完全に消化し貫通していた。しかし、プラスミノ−ゲン（５μｇ／ｍｌ）とＫＧＦを組合せて処理した細胞のみが増殖した（図６ａ）。これらの結果は、角化細胞がフィブリンゲルを通って移動し増殖するために、ＫＧＦとプラスミノーゲンの両方が必要であって、ＫＧＦがプラスミン／プラスミノーゲンの存在の下で機能することを示した。同じ結果が、プラスミノーゲンおよび／またはＫＧＦが初めてフィブリンゲル中に取り入れられた時にも得られた。
【００７１】
プラスミン／プラスミノーゲンとＫＧＦとの組合せが、フィブリン基質の透明化に与える影響をさらに評価するために、角化細胞によるフィブリン消化分析を行った。この分析は、プラスミンの消化によって生成されたフィブリンの切断断片が溶解性であるという事実をベースとする。角化細胞（Ｂａｌｂ／ＭＫ）を２４ウエルのプレートに播種した（５０００細胞／ウエル）。細胞は、１０％ＦＢＳを有するＥＭＥＭで３７℃で２４時間培養し、次にＦＢＳを含まないＥＭＥＭ中でさらに２４時間培養した。細胞の一部をまずＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で３時間処理した。次に細胞を洗浄し、細胞に、プラスミノーゲン（１０μｇ／ｍｌ）を有するかまたは有しない無血清ＥＭＥＭ（５ｍｇ／ｍｌ）のフィブリノーゲン溶液０．５ｍｌを入れた。（細胞に）適用する直前にトロンビンをこのフィブリノーゲン溶液（０．０２単位／ｍｌ）に添加した。細胞は次にさらに３時間培養された。残りのフィブリンゲルを培地とともに各ウエルから除去し、５分間１０，０００ｇで遠心分離した。上澄み液を除去し、そのタンパク質分をＢＣＡ分析で測定した。無血清ＥＭＥＭを、バックグラウンド・コントロールとして使用した。結果は、プラスミノーゲンのみが、顕著なフィブリン溶解を誘導したことを示す（図６ｂ）。空のウエルのプラスミノーゲンを含むフィブリンゲルでは、フィブリン溶解は見られなかった。細胞をＫＧＦで予め処理すると、プラスミノーゲンに誘導されるフィブリン溶解がさらに増加し、２０％近く増加した（図６ｂ）。同じように大切なのは、ＫＧＦとプラスミノーゲンを組合せて処理すると、より多くの細胞で移動する細胞の表現系が生じることである。すなわち、細胞が細長い細胞質の突起を有する線維芽細胞様となる。これらの結果は、ＫＧＦとプラスミノーゲンが相乗してフィブロン溶解を高め、角化細胞の移動を促進させることを示す。理論によって拘束されたくないが、これらの結果に、ＫＧＦが、角化細胞においてｕＰＡの発現を増加させ、その結果により多くのプラスミノ−ゲンをプラスミンに変換し、そしてフィブリン溶解を高めるという事実が反映されているようだ。
【実施例７】
【００７２】
様々な酵素によるＦＧＦ−１０の分解
ＦＧＦ−１０は、ＫＧＦ−２としても知られるが、ＫＧＦと類似のＦＧＦである。したがって、ＦＧＦ−１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）もやはり、図１と同じ条件の下でＫＧＦを切断する酵素によって処理される。この結果は、トリプシン、プラスミンおよびキモトリプシンのすべてが、ＦＧＦ−１０（１９ｋＤａ）を切断するが、安定な切断断片を生成しないことを示す。プラスミンおよびトリプシンは、さらに分解されることが明らかな一過性の断片〜１６ｋＤａを生成した。
【００７３】
任意の安定なＦＧＦ−１０断片がより低い濃度で生成されるかどうかを判断するために、ＦＧＦ−１０を、図３ａおよび３ｂにおけるＫＧＦに対するものと同じ条件の下で、トリプシンまたはプラスミンの様々な濃度で処理した。その結果、酵素濃度ゼロにおいては、約１６ｋＤａの切断産物が、オリジナルのＦＧＦ−１０の２０％より多かったが、使用した酵素濃度範囲にわたって、ＦＧＦ−１０は完全に切断された（図３ｃおよび３ｄ）。これが、これら２つの酵素によるＫＧＦの切断と際立って対比される点である。つまり、無傷の分子の完全または完全に近い切断が達成される酵素の濃度で、切断された産物（ｄＮ２３ＫＧＦ）は、オリジナルのＫＧＦの少なくとも７０％に相当していた（図３ａおよび３ｂ）ＫＧＦの切断と、はっきりと対照をなす。これは、トリプシンまたはプラスミンによって生成されたＦＧＦ−１０の〜１６ｋＤａ断片が、オリジナルのＦＧＦ−１０のはじめの切断に近い効率でさらに分解されることを示す。
【実施例８】
【００７４】
創傷体液によるＫＧＦの切断およびプラスミン阻害剤ブデリンによる阻害
皮膚の厚み全体にわたる創傷を、外科手術によってメスの子ブタ（４０−４５ポンド）の背中に作成した。創傷はおのおの生理食塩水を含浸させたガーゼスポンジ包帯で覆い、続いて非通気性フィルム包帯で覆った。創傷体液を、手術後２日目および４日目の包帯替えの時に除去された、生理食塩水を含浸させたガーゼスポンジから採集した。全部で８つの創傷体液のサンプルを４つの異なる創傷から得て使用した。ＫＧＦ（０．２５μｇ）を５μｌの創傷体液に対して、ブデリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在または非存在の下で混合し、１０または２５μｌの反応量（体積）で様々な濃度とした。３７℃で１時間インキュベーションした後、混合物をゲル電気泳動で分離し、イモビロン−Ｐ膜にブロットした。この膜をヤギ抗ヒトＫＧＦまたはラビット抗ヒトＫＧＦのＣ末端ペプチド（実施例２参照）をプローブとして探索した。アルカリホスファターゼ複合抗ヤギＩｇＧまたはアルカリホスファターゼ複合抗ラビットＩｇＧおよび酵素基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）を検出用に使用した。デンシトメトリー分析を実施例１のように行った。
【００７５】
その結果、創傷体液はＫＧＦを切断し、プラスミンによる断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）と同じサイズの切断断片を生成した（図７ａ）。切断は主として４日目の創傷体液で生じた（図７ａ）。４日目の創傷は、再上皮形成過程の初期段階にある。切断はプラスミン阻害剤ブデリンで、投与量に依存して阻害され、生成された切断断片の量はブデリンによって、使用最高量（２．５μｇ）で４．６倍減少した（図７ｂ）。これは、創傷体液中でのＫＧＦ切断を担う酵素がプラスミンであり、生成した断片がｄＮ２３ＫＧＦであることを示す。創傷体液によって生成される切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）もまた、抗ＫＧＦのＣ末端ペプチド抗体と強く反応した。
【００７６】
これらの結果をあわせると、ＫＧＦが創傷体液中のプラスミンで切断されてｄＮ２３ＫＧＦを生成することが実証される。
【実施例９】
【００７７】
プラスミンによる天然ＫＧＦの切断
哺乳動物細胞によって産生される天然ＫＧＦは、グリコシル化されて組換えＫＧＦよりも大きなサイズ（２４−２８ｋＤａ）を有する。この実験はプラスミンが、ＫＧＦを発現することが知られるネズミ９２９線維芽細胞から単離される天然ＫＧＦをも切断するかどうかを判定するためのものである。細胞は、５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭで培養した。培養培地を採集して、０．２μｍフィルターを通してろ過した。各５００ｍｌの培養培地に対して、０．５ｍｌヘパリン・アガロースのビーズのスラリー（５０％）を添加した。培地を室温で振盪しながら１時間保持した。ビーズをＴＮ緩衝液で洗浄して、アクセス（ａｃｃｅｓｓ）緩衝液を除去するためスピンカラム中に入れた。ビーズに結合したタンパク質を１ＭのＮａＣｌで抽出した。抽出液をＴＮ緩衝液に対して透析した。次にこれを上記記載のようにヒトプラスミンで処理した。組換えＫＧＦをコントロールとして使用した。タンパク質をゲル電気泳動で分離して、イモビロン−Ｐ膜にブロットした。この膜をラビット抗ヒトＫＧＦのＣ末端ペプチド（実施例２参照）をプローブとして探索した。アルカリホスファターゼ複合抗ラビットＩｇＧおよび酵素基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）を検出用に使用した。デンシトメトリー分析を実施例１のように行った。
【００７８】
天然ＫＧＦは、予想していたように組換えＫＧＦの断片より大きなサイズ（約２６ｋＤａ）を有していた（図８）。酵素の消化実験で、天然ＫＧＦがプラスミンで切断され、同じ酵素で組換えＫＧＦから生じるｄＮ２３ＫＧＦと同一サイズを有するＣ末端切断断片を生じることがわかった。
【実施例１０】
【００７９】
創傷または他の疾病状態を治療するためのＫＧＦとプラスミン／プラスミノーゲンまたは関連するものの組合せ：配合物および方法
上記に記載された知見は明らかに、ＫＧＦとプラスミン／プラスミノーゲンとの組合せまたは関連する酵素との組合せが、上皮細胞が関与する創傷または他の疾患状態を治療するために使用できることを示す。この組合せは、細胞の増殖／分化を促進するばかりでなく、フィブリン血塊および関連する細胞外基質を排除することで細胞の移動を促進する。
【００８０】
この組合せは、ＫＧＦまたはリストＡ掲載物から選択される（これに限定されない）関連の増殖因子（０．００００１％から０．１％（ｗ／ｖ）の濃度で）と、プラスミン／プラスミノーゲンまたはリストＢ掲載物から選択される（これに限定されない）関連の細胞外基質分解プロテアーゼ酵素（０．０００１％から１％（ｗ／ｖ）の濃度で）とを、リストＣ掲載物から選択される（これに限定されない）製薬上許容可能な担体中で物理的に混合することによって達成される。この組合せに、さらにリストＤの掲載物から選択される（これに限定されない）製薬上許容可能な増粘剤も含まれる。
【００８１】
リストＡ：        リストＢ：            リストＣ：        リストＤ：
ＥＧＦ            トリプシン            溶液              ＣＭＣ
ＦＧＦ−１０      ｔＰＡ                懸濁液            ゼラチン
ＨＧＦ            ｕＰＡ                乳濁液            ＨＰＭＣ
ＴＧＦ−α        ストレプトキナーゼ    固体投与形態      ＨＥＣ
ＴＧＦ−β        スタフィロキナーゼ                      デキストラン
ＩＧＦ−Ｉ        メタロプロテアーゼ                      ヒアルロン酸
ａＦＧＦ                                                  ペクチン
アルギン酸
キトサン
【００８２】
リストＡの増殖因子はすべて、ＫＧＦと共に、上皮細胞の増殖を刺激することがわかっている。またＥＧＦ、ａＦＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ−１０およびＴＧＦ−βをはじめとしてそのほとんどが動物およびヒトで創傷治癒を刺激することがわかっている。ヒトの臨床研究では、これらを使用して、圧迫性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍および火傷をはじめとする様々な種類の創傷が治療されてきた。動物での研究（マウス、ラット、ラビットまたはブタ）では、完全厚切開または部分厚切開または切除創傷が最も一般的に使用された。多くの場合、増殖因子は直接創傷表面に局所的に適用された。増殖因子は、０．１から１００μｇ／ｃｍ２汎用範囲内の様々な投与量で使用された。増殖因子は生理食塩水、緩衝食塩水、クリームまたはコラーゲンスポンジ基質の形で適用された。組成物の中には増粘剤を含んでいるものがあってもよい。治療の前に、創傷を清浄し清拭してもよい。治療後、創傷は、創傷のタイプおよび実際の創傷状態によって異なるが、非接着性の通気性または非通気性フィルム包帯をはじめとする種々のタイプの包帯で被覆されてもよい。１日１回または１週間に２回などの様々な治療スケジュールが使用される。全治療期間は続いて数週間にわたってもよい。結果は、再上皮形成、顆粒組織形成、血管形成、コラーゲン配合量、創傷破壊強度、および創傷閉鎖などの様々な基準によって判定された。これらの増殖因子を使用した動物およびヒトの研究の多くで、これらの基準の１つまたは複数に基づいてプラスの効果が得られた（Ｃｌａｒｋ  Ｒ．Ａ．Ｆ．（ｅｄ）、創傷修復の分子および細胞生物学、パートＩＩ、柔組織治癒における増殖因子、ｐｐ１７１−３１０、１９９６、Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，治癒向上のための増殖因子の局所使用、皮膚創傷治癒、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｆ．（ｅｄ．）ｐｐ  ３７９−３９８．２００１．Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ．Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００８３】
リストＣで、固体投与形態には、錠剤、カプセル、粉末、フィルム、テープ、スポンジ、泡、パッド、および他の基質または組成物形態が含まれるがこれに限定されない。
【００８４】
オリジナルの活性をすべてあるいは部分的に保持する増殖因子または酵素の活性部位または断片あるいは修飾型もまた組合せて使用可能である。例えば、ＫＧＦの代わりにｄＮ２３ＫＧＦを使用してもよいし、プラスミン／プラスミノーゲンの代わりに、ミニプラスミン／プラスミノーゲンを使用してもよい。さらに、活性型の酵素でもプロ酵素である不活性型酵素を使用してもよい。もし、プラスミンなどの活性型酵素をＫＧＦと組合せて使用する場合、ｄＮ２３ＫＧＦが、組成中に生成されることになるのは明らかであるといえる。一方、プラスミノーゲンなど不活性型酵素を使用する場合、ｄＮ２３ＫＧＦが生成することはない。
【００８５】
本発明の１つの実施形態は、増殖因子（例えばリストＡ）を有する容器および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素または活性化剤（例えば、リストＢ）を有する容器を保持したキットに関する。いずれの容器の内容物も、担体溶液（例えばリストＣまたはリストＤ）中にあってもよく、凍結乾燥されて第３の容器中の担体溶液（例えばリストＣまたはリストＤ）で使用者が成分を戻せるようしてもよい。キットの使用者は、プロトコルに従って、キットの成分を混合し、創傷治癒を高めるために動物またはヒトの傷の上におけばよい。あるいは、キットの個々の成分を縦に重ねてまたは順次傷の上においてもよい。
【００８６】
増殖因子も酵素も、ヒトまたは動物の血液、組織または培養された細胞から単離して天然タンパク質として産生してもよいし、あるいは、原核生物または真核生物系で組換えＤＮＡ技法によって組換えタンパク質として産生してもよい。本発明で使用する器官、細胞、組織、または生体の形質転換のために核酸を送達するために適切な方法には、本明細書で記載したあるいは当分野の技術者に既知である、核酸（例えばＤＮＡ）の器官、細胞、組織、または生体へ導入できる方法であれば事実上どんな方法も含まれると思われる。このような方法には、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）トランスフェクション、マイクロインジェクション（米国特許第５，７８９，２１５号、引用によって本明細書に含まれる）を含めた注入（米国特許第５，９９４，６２４号、５，９８１，２７４号、５，９４５，１００号、５，７８０，４４８号、５，７３６，５２４号、５，７０２，９３２号、５，６５６，６１０号、５，５８９，４６６号および５，５８０，８５９号、各々引用によって本明細書に含まれる）、電気ポーレーション（米国特許第５，３８４，２５３、引用によって本明細書に含まれる）、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン続いてポリエチレングリコールの使用、直接超音波充填、リポソームに仲介されるトランスフェクションおよび受容体に仲介されるトランスフェクション、微粒子銃（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９および９５／０６１２８；米国特許第５，６１０，０４２号；５，３２２，７８３号、５，５６３，０５５号、５，５５０，３１８号、５，５３８，８７７号および５，５３８，８８０号、各々引用によって本明細書に含まれる）；炭化ケイ素線維による攪拌（米国特許第５，３０２，５２３号および５，４６４，７６５号、各々引用によって本明細書に含まれる）、アグロバクテリアに仲介される形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号および５，５６３，０５５号、各々引用によって本明細書に含まれる）、ＰＥＧに仲介されるプロトプラストの形質転換（米国特許４，６８４，６１１号および４，９５２，５００号、各々引用によって本明細書に含まれる）、乾燥／阻害に仲介されるＤＮＡの取り込み、およびこれらの方法を任意に組合せたものといったＤＮＡの直接送達法が含まれるがこれに限定されない。これらの技法を適用すると、器官、細胞、組織、または生体が安定して一時的に形質転換され得る。
【００８７】
複数のタンパク質または複数のＤＮＡベクターの組合せは、液体または乾燥した形態の配合物とすることができる。この組合せは、疾病状態および配合によって異なるが、皮下、筋肉内、静脈内、経口、局所、鼻腔内、または肺送達によって投与できる。
【００８８】
技術者ならわかるだろうが、この組合せ中のどの成分もその量は、治療すべき疾病状態、臨床上効果的にするための投与経路によって変更してもよい。さらに、混合物または組合せ物として配合する代わりに、酵素および増殖因子を個々に調合し、使用直前に混ぜ合わせてもよいし、または、最初に酵素を（局所的、経口的、非経口的または注入によって）適用して、次に増殖因子を適用するか、あるいはこの逆でもよい。さらに、増殖因子適用期間続いて酵素適用期間またはこの逆といった交互治療方式を使用してもよい。どちらの成分の添加時間間隔も、創傷の状態および治癒の状況に応じて変えられる。
【００８９】
本発明には、プロテアーゼおよび増殖因子を組合せて細胞機能に対して相乗的効果を与えるための原理が含まれる。他の実施形態に概念、方法、増殖因子、プロテアーゼ、上記の記載および実施例の工夫が含まれていることは当分野の技術者に評価されるはずだ。本明細書に含まれている記載および実施例は、本発明の範囲を限定することを意図せず、説明の目的で包含されている。本発明の実施形態が他にも開発でき、それが本発明および請求項の精神および範囲に入ることは当然である。
【００９０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】種々のプロテアーゼによるＫＧＦの処理を示す図である。ＫＧＦ（１．７４μＭ）を種々のプロテアーゼによって表示濃度で３７℃、１時間処理し、ゲル電気泳動に供した。タンパク質はクーマシーブルーで染色した。ゲルの画像は、ＮＩＨイメージ１．６２を使用して分析した。ゲルのレーンのスキャン・プロフィルを示す。ＫＧＦおよびその切断断片（約１６ｋＤａ）をそれぞれ閉鎖矢頭および解放矢頭で示す。分子量範囲内のプロテアーゼのバンドを、星印で示す。標準の分子量（ｋＤａ）は一番上に示される。電気泳動の方向は黒矢で示される。
【図２】ＫＧＦ上のトリプシン、プラスミン、キモトリプシン切断部位を示す図である。約１６ｋＤａ断片（表１参照）のＮ末端シーケンスによって特定された切断部位を矢で示す。成熟ＫＧＦ（１６３のアミノ酸）のアミノ酸をＮ末端から順番に番号を付してある。
【図３】ＫＧＦおよびＦＧＦ−１０のトリプシンまたはプラスミンによる種々の酵素濃度における消化を示す図である。ＫＧＦ（１．７４μＭ）またはＦＧＦ−１０（１．７４μＭ）をトリプシンまたはプラスミンの種々の濃度で消化した。電気泳動およびタンパク質染色は図１と同様である。ＫＧＦおよびその切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）のＯＤ測定を、ＦＧＦ−１０および切断断片（約１６ｋＤａ）の測定と並べて示す。    ３ａ）ＫＧＦのプラスミン処理    ３ｂ）ＫＧＦのトリプシン処理    ３ｃ）ＦＧＦ−１０のプラスミン処理    ３ｄ）ＦＧＦ−１０のトリプシン処理
【図４】ＫＧＦのトリプシンまたはプラスミンによる長期消化を示す図である。電気泳動およびタンパク質染色は図１と同様である。    ４ａ）ＫＧＦ（１．７４μＭ）をトリプシン（１３８０ｎＭ）またはプラスミン（９６０ｎＭ）で消化して、サンプルを３７℃でのインキュベーションから１時間後または６時間後に取り出し、ＫＧＦ（酵素処理をしないコントロール）およびトリプシンまたはプラスミン処理後のその切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）のＯＤ測定を示し、    ４ｂ）ＫＧＦ（１．７４μＭ）をプラスミン（２４００ｎＭ）で消化して、サンプルを３７℃でのインキュベーションから３０分後または３時間後に取り出し、その切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ）のＯＤ測定を示す。
【図５】細胞増殖分析を示す図である。各酵素について濃度を２倍にした以外は図１と同様な条件の下でトリプシン、プラスミンまたはキモトリプシンでＫＧＦを処理した。反応混合物をＦＢＳと混合し、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞に適用する前に、０．５％のＦＢＳを含むＥＭＥＭ中で希釈した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、ＭＴＴ染料を添加した。さらに４時間のインキュベーションの後、細胞溶解溶液を添加した。細胞を湿潤チャンバーに一晩保持してからＯＤを５７０ｎｍで測定した。
【図６】フィブリンゲル上での角化細胞の移動および増殖および角化細胞に仲介されるフィブリン溶解に対するＫＧＦとプラスミノーゲン（Ｐｌｇ）の組合せの効果を示す図である。    ６ａ）細胞を２４ウエル・プレート（１０００細胞／ウエル）中のフィブリンゲル上に播種して、ＫＧＦ、プラスミノーゲン、またはその組合せで処理した。３７℃で５日間インキュベーションした後、プレート表面に達し付着した細胞を、トリプシン消化してから、ヘモサイトメーターで計測した。    ６ｂ）プラスミノーゲン含有または非含有フィブリンゲルをＫＧＦで前処理（３７℃３時間）した２４ウエル・プレートまたは非処理の２４ウエル・プレート中のＢａｌｂ／ＭＫ細胞（５０００細胞／ウエル）上に形成した。３７℃で３時間インキュベーションした後、残ったフィブリンゲルを培地と共に各ウエルから取り除き、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。上澄み液の溶解性のタンパク質の濃度をＢＣＡ分析で測定した。
【図７】創傷体液によるＫＧＦの切断を示す図である。ブデリンの存在または非存在の下で術後２日または４日目に、ＫＧＦをブタ（ピッグ）の皮膚の厚み全体にわたる創傷から採集した創傷体液で処理した。ゲル電気泳動によって分離されイモビロン−Ｐ膜に移されたタンパク質は、抗ＫＧＦ抗体をプローブとして探索した。    ７ａ）１０μｌ反応量中、術後２および４日目に採集された創傷体液（５μｌ）によるＫＧＦの切断、および    ７ｂ）１２．５μｌ反応量中、ブデリンを種々濃度で有する術後４日目の創傷体液（５μｌ）によるＫＧＦ切断阻止。標準分子量（ｋＤａ）を一番上に示す。電気泳動の方向を黒矢で示す。
【図８】天然ＫＧＦのプラスミンによる切断を示す図である。マウスの線維芽細胞系９２９細胞から単離された天然ＫＧＦを、組換えヒトＫＧＦと共にプラスミンで処理した。処理後、タンパク質をゲル電気泳動で分離し、イモビロン−Ｐ膜に移し、ラビット抗ＫＧＦのＣ末端抗体をプローブとして探索した。組換えＫＧＦおよびその切断断片（ｄＮ２３ＫＧＦ；約１６ｋＤａ）をそれぞれ閉鎖矢頭および解放矢頭で示し、一方、天然のＫＧＦおよびその切断断片（約１６ｋＤａ）は、それぞれ閉鎖矢および開放矢で示した。標準の分子量（ｋＤａ）を一番上に示す。電気泳動の方向を黒矢で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月13日(2003.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞機能に関連する増殖因子タンパク質および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物。
【請求項２】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
線維芽細胞増殖因子タンパク質および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物。
【請求項１４】
前記線維芽細胞増殖因子タンパク質が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記線維芽細胞増殖因子が、０．００００１％（ｗ／ｖ）から０．１％（ｗ／ｖ）の濃度を有し、前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、０．０００１％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ）の濃度を有する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
担体をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記担体が緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
第１容器中の第１担体中の上皮細胞機能に関連する増殖因子タンパク質を含む第１成分および第２容器中の第２担体中の細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む第２成分を含むキット。
【請求項２７】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３６】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記第１担体が第２担体と同一または異なる、請求項２６に記載のキット。
【請求項３８】
前記第１担体が、水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３９】
前記第２担体が、水、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項４０】
第１容器中の上皮細胞機能に関連する増殖因子タンパク質を含む第１成分、
第２容器中の細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む第２成分、および
第３容器中の担体を含む第３成分を含むキット。
【請求項４１】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記線維芽細胞増殖因子が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関係する酵素を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項５０】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記担体が、緩衝液、生理食塩水、増粘剤、乳剤、または軟膏を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項５２】
上皮細胞機能に関連する増殖因子タンパク質および細胞外基質分解プロテアーゼ酵素を含む成分を混合することによって形成される混合物を含む組成物を創傷に適用することを含む、動物またはヒトで創傷を治療する方法。
【請求項５３】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関する酵素を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記創傷が、皮膚の内または上、口腔、消化管、粘膜表面、眼球または肺を含む上皮細胞起源の細胞を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記創傷が、内皮細胞、線維芽細胞または肝細胞を含む、増殖因子が影響を与える他タイプの細胞を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項６６】
創傷に２つの成分：
（ａ）上皮細胞機能に関連する増殖因子タンパク質、および
（ｂ）細胞外基質分解プロテアーゼ酵素
を適用することを含む動物またはヒトで創傷を治療する方法であって、成分（ｂ）を成分（ａ）に続いて適用するか、または、成分（ａ）を成分（ｂ）に続いて適用する方法。
【請求項６７】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
上皮細胞機能に関連する前記増殖因子タンパク質が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ｄＮ２３ＫＧＦ、ＫＧＦ−２、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、インシュリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミン、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物に関する酵素を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、ミニプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、マイクロプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、トリプシン、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼまたはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞外基質分解プロテアーゼ酵素が、プラスミノーゲン活性化因子またはその機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７７】
前記プラスミノーゲン活性化因子が、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ、または機能的生物学上同等物を含む、請求項６６に記載の方法。
【国際調査報告】
2005519992.tif 000011