(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、高処理能力の巨大分子分析の実行において好適な、ナノ流体コンポーネントとマイクロ流体コンポーネント間のインターフェース用装置に関する。回折勾配リソグラフィ（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、略称ＤＧＬ）を使用し、マイクロ流体領域とナノ流体領域間に勾配インターフェースを形成する。前記勾配インターフェース領域は、前記ナノ流体領域に形成されるナノチャネルへの局所的エントロピー障壁を低減する。１実施形態では、前記勾配インターフェース領域は、マイクロン（μｍ）〜ナノメートル（ｎｍ）のオーダーの値の断面積を狭めるため、横方向の空間的勾配構造から形成される。別の実施形態では、前記勾配インターフェース領域は、垂直方向に傾斜させた勾配構造から形成される。さらに、前記勾配構造は、横勾配および垂直勾配の双方を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体装置を製造する方法であって、
ナノ流体領域を基板上に形成する工程と、
マイクロ流体領域を前記基板上に形成する工程と、
前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間に、勾配インターフェース領域を形成する工程と、
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記勾配インターフェース領域は複数の勾配構造を有し、これら勾配構造間の横方向距離は前記ナノ流体領域へ向かって減少するものである。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記勾配構造間の前記距離は、約５００ｎｍ以下に低減されるものである。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、前記勾配構造間の前記距離は、約１０ｎｍ以下に低減されるものである。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、前記勾配構造間の前記距離は、実質的に生体高分子の直径と同等の距離に低減されるものである。
【請求項６】
請求項２記載の方法において、前記勾配構造は、前記マイクロ流体領域から前記ナノ流体領域へと高さが漸増するものである。
【請求項７】
請求項２記載の方法において、前記勾配構造は分岐チャネルである。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記勾配インターフェースは、前記マイクロ流体領域から前記ナノ流体領域へと高さが漸増するものである。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記勾配インターフェース領域を形成する工程と前記マイクロ流体領域を形成する工程とは次の工程により同時に形成されるものであって、この工程は、
フォトレジストを前記基板上にコーティングする工程と、
前記マイクロ流体領域および前記勾配インターフェース領域をパターニングするフォトマスクを、前記フォトレジスト上に提供する工程と、
前記ナノ流体領域上に施された前記フォトマスクの部分を覆って延長するように、前記フォトマスク上にブロックマスクを提供する工程と、
前記フォトマスクを露光する工程と、
を有するものである。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記ブロックマスクは、前記ブロックマスクの縁部に沿って光の回折を起こすものである。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法であって、さらに、
前記光の回折を制御するために前記ブロックマスクの縁部を選択する工程を有するものである。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、前記ブロックマスクは光に対し不透明な材料から形成されるものである。
【請求項１３】
請求項９記載の方法において、前記ブロックマスクは金属から形成されるものである。
【請求項１４】
請求項９記載の方法において、前記ブロックマスクはアルミ箔から形成されるものである。
【請求項１５】
請求項９記載の方法であって、さらに、
前記フォトマスク上に前記ブロックマスクを提供する工程の後、前記フォトレジストを現像する工程を有し、
前記フォトレジストは前記ブロックマスクの縁部により生じる光回折領域に沿って未現像フォトレジストの勾配を有するものである。
【請求項１６】
請求項９記載の方法において、前記フォトマスクは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の厚さを有するものである。
【請求項１７】
請求項９記載の方法において、前記ブロックマスクは、約１ｍｍ〜約１２ｍｍの範囲の厚さを有するものである。
【請求項１８】
請求項９記載の方法において、前記フォトマスク上に前記ブロックマスクを提供する工程はさらに、
前記ブロックマスクと前記フォトマスク間の距離を制御する工程であって、前記距離は前記ブロックマスク縁部に沿った光の回折量を制御する、距離を制御する工程を有するものである。
【請求項１９】
請求項１記載の方法において、前記ナノ流体領域は、ナノピラー、ナノ細孔、およびナノチャネルからなる群から選択されるナノ流体構造を有するものである。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法において、前記ナノ流体構造はナノチャネルであって、
ナノインプリントリソグラフィ、干渉リソグラフィ、自己組織化共重合体パターン転写、スピンコーティング、電子ビームリソグラフィ、集束イオンビームミリング、フォトリソグラフィ、反応性イオンエッチング、ウェットエッチング、プラズマ化学気相成長法、電子ビーム蒸着、スパッタ蒸着、およびこれらの組み合わせにより形成されるナノチャネルを有するものである。
【請求項２１】
請求項１記載の方法により形成される流体装置。
【請求項２２】
マイクロ流体／ナノ流体装置を形成する方法であって、
ナノ流体領域を基板上に形成する工程と、
フォトレジストを前記基板上にコーティングする工程と、
前記フォトレジストの一部を覆って延長するよう、ブロックマスクを前記フォトレジスト上に提供する工程と、
前記ブロックマスクを露光する工程であって、前記フォトレジストが勾配インターフェース領域を形成する光回折領域に沿って未現像フォトレジストの勾配を有し、前記光回折領域がブロックマスクの縁部により生じる、前記ブロックマスクを露光する工程と
を有するものである。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記フォトレジストを前記基板上にコーティングする工程の後、さらに、
前記マイクロ流体領域および前記勾配インターフェース領域をパターニングするフォトマスクを前記フォトレジスト上に提供する工程を有するものである。
【請求項２４】
請求項２３記載の方法において、前記ブロックマスクを提供する工程中、前記ブロックマスクは前記フォトレジスト上にコーティングされるものである。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、前記フォトマスク上に前記ブロックマスクを提供する工程はさらに、
前記ブロックマスクと前記フォトマスク間の距離を制御する工程であって、前記距離は光の回折量を制御する、距離を制御する工程を有するものである。
【請求項２６】
請求項２２記載の方法により形成される流体装置。
【請求項２７】
流体装置を製造するためのシステムであって、
ナノ流体領域を基板上に形成する手段と、
マイクロ流体領域を前記基板上に形成する手段と、
前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間に勾配インターフェース領域を形成する手段と、
を有するシステム。
【請求項２８】
請求項２７記載のシステムにおいて、前記勾配インターフェース領域は複数の勾配構造を有し、これら勾配構造間の横方向距離は前記ナノ流体領域へ向かって減少するものである。
【請求項２９】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配構造間の前記距離は、５００ｎｍ以下に低減されるものである。
【請求項３０】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配構造間の前記距離は、約１０ｎｍ以下に低減されるものである。
【請求項３１】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配構造間の前記距離は、実質的に生体高分子の直径と同等の距離に低減されるものである。
【請求項３２】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配構造は分岐チャネルである。
【請求項３３】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配構造は前記基板から前記ナノ流体領域へと高さが漸増するものである。
【請求項３４】
請求項２８記載のシステムにおいて、前記勾配インターフェースは前記マイクロ流体領域から前記ナノ流体領域へと高さが漸増するものである。
【請求項３５】
請求項２７記載のシステムにおいて、前記勾配インターフェース領域を形成する手段は、
フォトレジストを前記基板上にコーティングする手段と、
フォトマスクを前記フォトレジスト上にコーティングする手段と、
前記ナノ流体領域の部分を覆って延長するように前記フォトマスク上にブロックマスクを提供する手段と、
前記フォトマスクを露光する手段と、
を有するものである。
【請求項３６】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記ブロックマスクは前記ブロックマスクの縁部に沿って光の回折を起こすものである。
【請求項３７】
請求項３６記載のシステムにおいて、前記ブロックマスクの縁部は前記光の回折を制御するように選択されるものである。
【請求項３８】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記ブロックマスクは光に対し不透明な材料から形成されるものである。
【請求項３９】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記ブロックマスクは金属から形成されるものである。
【請求項４０】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記ブロックマスクはアルミ箔から形成されるものである。
【請求項４１】
請求項３５記載のシステムであって、さらに、
前記フォトレジストを現像する手段を有し、前記フォトレジストは光回折領域に沿って未現像フォトレジストの勾配を有し、前記光回折領域は前記ブロックマスクの縁部により生じるものである。
【請求項４２】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記フォトマスクは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の厚さを有する。
【請求項４３】
請求項３５記載のシステムにおいて、前記ナノ流体領域は、ナノピラー、ナノ細孔、およびナノチャネルからなる群から選択されるナノ流体構造を有するものである。
【請求項４４】
請求項４３記載のシステムにおいて、前記複数のナノチャネルは、ナノインプリントリソグラフィ、干渉リソグラフィ、自己組織化共重合体パターン転写、スピンコーティング、電子ビームリソグラフィ、集束イオンビームミリング、フォトリソグラフィ、反応性イオンエッチング、ウェットエッチング、プラズマ化学気相成長法、電子ビーム蒸着、スパッタ蒸着、およびこれらの組み合わせにより形成されるものである。
【請求項４５】
流体チップであって、
表面であって、前記表面の材料内に形成されるナノ流体領域を有する表面と、
前記表面上のマイクロ流体領域と、
前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間の勾配インターフェース領域と、
前記マイクロ流体領域と流体連通する、流体を受容できる少なくとも１つの試料リザーバと、
少なくとも１つの前記チャネルと流体連通し、流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバと、
を有する流体チップ。
【請求項４６】
請求項４５記載の流体チップにおいて、前記勾配インターフェース領域は、隣接するチャネル間の横方向の距離が前記ナノ流体領域へ向かって減少する分岐流体チャネルを有するものである。
【請求項４７】
少なくとも１つの巨大分子を分析する方法であって、
表面を提供する工程であって、前記表面の材料内に複数のチャネルから形成されるナノ流体領域を有する表面を提供する工程と、
前記表面上にマイクロ流体領域を提供する工程と、
前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間に勾配インターフェース領域を提供する工程と、
前記マイクロ流体領域と流体連通し、流体を受容できる少なくとも１つの試料リザーバを提供する工程と、
前記ナノ流体領域と流体連通し、流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバを提供する工程と、
前記少なくとも１つの試料リザーバに少なくとも１つの流体を提供する工程であって、前記流体は少なくとも１つの巨大分子を有する、流体を提供する工程と、
少なくとも１つの巨大分子を引き伸ばすため、前記マイクロ流体領域と前記ナノ流体領域間で前記少なくとも１つの巨大分子を移送する工程と、
前記少なくとも１つの引き伸ばされた巨大分子から伝達された少なくとも１つの信号を検出する工程と、
検出された信号を、少なくとも１つの巨大分子の少なくとも１つの特性と相関させる工程と、
を有する方法。
【請求項４８】
請求項４７記載の方法において、前記検出された信号は、長さ、立体構造、結合マーカーまたはタギングなどの物理的付加体および化学的付加体、および化学組成の特性のうち少なくとも１つと相関するものである。
【請求項４９】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は合成高分子または生体高分子である。
【請求項５０】
請求項４９記載の方法において、前記生体高分子は、タンパク質、ポリペプチド、および核酸のうち少なくとも１つである。
【請求項５１】
請求項５０記載の方法において、前記核酸はＤＮＡであり、前記検出された信号は前記ＤＮＡの塩基対配列と相関するものである。
【請求項５２】
請求項４９記載の方法において、前記生体高分子は、前記チャネル内では少なくとも実質的にアンフォールドした（開いた）状態である。
【請求項５３】
請求項４７記載の方法において、前記流体中の前記巨大分子の濃度は、少なくとも１アトグラム（ａｔｔｏｇｒａｍ＝１０−１８ｇ）／ｍｌである。
【請求項５４】
請求項４７記載の方法において、前記流体中の前記巨大分子の濃度は、少なくとも１フェムトグラム（ｆｅｍｔｏｇｒａｍ＝１０−１５ｇ）／ｍｌである。
【請求項５５】
請求項４７記載の方法において、前記流体中の前記巨大分子の濃度は、少なくとも１ピコグラム（ｐｉｃｏｇｒａｍ＝１０−１２ｇ）／ｍｌである。
【請求項５６】
請求項４７記載の方法において、前記流体中の前記巨大分子の濃度は、５μｇ／ｍｌ未満である。
【請求項５７】
請求項４７記載の方法において、前記流体中の前記巨大分子の濃度は、０．５μｇ／ｍｌ未満である。
【請求項５８】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は前記チャネル内で１５０ｎｍを超える引き伸ばし長を有するものである。
【請求項５９】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は前記チャネル内で５００ｎｍを超える引き伸ばし長を有するものである。
【請求項６０】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は前記チャネル内で１μｍを超える引き伸ばし長を有するものである。
【請求項６１】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は前記チャネル内で１０μｍを超える引き伸ばし長を有するものである。
【請求項６２】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は１００を超える塩基対を有するＤＮＡである。
【請求項６３】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は１，０００を超える塩基対を有するＤＮＡである。
【請求項６４】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は１０，０００を超える塩基対を有するＤＮＡである。
【請求項６５】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は１００，０００を超える塩基対を有するＤＮＡである。
【請求項６６】
請求項４７記載の方法において、前記巨大分子は１，０００，０００を超える塩基対を有するＤＮＡである。
【請求項６７】
請求項４７記載の方法において、前記少なくとも１つの巨大分子は染色体である。
【請求項６８】
請求項６７記載の方法において、前記少なくとも１つの染色体は、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型の存在を決定するため分析されるものである。
【請求項６９】
少なくとも１つの流体チップを有するカートリッジであって、このカートリッジは巨大分子分析を実行するシステムに対し挿脱可能であり、この少なくとも１つの流体チップは少なくとも１つのナノチャネルアレイを有し、このナノチャネルアレイは、
表面であって、前記表面の材料内に形成されるナノ流体領域を有する表面と、
前記表面上のマイクロ流体領域と、
前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間の勾配インターフェース領域と、
前記マイクロ流体領域と流体連通し、流体を受容できる少なくとも１つの試料リザーバと、
少なくとも１つの前記チャネルと流体連通し、流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバと、
前記少なくとも１つのチャネル内の前記少なくとも１つの流体から伝達された少なくとも１つの信号を検出するための機器と、
を有する少なくとも１つのナノチャネルのアレイを有する、カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオナノテクノロジーに関し、特に、マイクロ流体／ナノ流体ハイブリッド形装置であって、前記装置のマイクロ流体部とナノ流体部間のインターフェースにおいて、修正されたフォトリソグラフィ技術により形成される勾配構造を有するハイブリッドマイクロ流体／ナノ流体装置の製造方法と、その使用方法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新興分野のバイオナノテクノロジーにおいては、ナノテクノロジー、電子工学、および生物学が組み合されている。バイオナノテクノロジーでは、チャネルなど極端に小形の流体構造のナノファブリケーションが、ＤＮＡなどの生体分子やタンパク質を単一分子分解能で直接操作および分析するために利用できる。例えば、このチャネルを使うと、ゲノムＤＮＡを引き伸ばして、医学的に重要な遺伝子マーカーまたはエピジェネティックマーカーをスキャンすることが可能になる。超微小サイズのナノスケール流体での生体高分子の閉じ込めを介した（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）エントロピー作用を理解する新しい考察は、まだ始まったばかりである。
【０００３】
ナノスケールにおいて、ＤＮＡは固い分子である。この分子の剛性は、持続長（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ）と呼ばれるパラメータにより記述される。ＤＮＡは、十分に長い分子に対するその剛比にもかかわらず、自由溶液内では小型でランダムならせん状の無秩序なもつれを形成しがちである。自由溶液中における高分子の立体構造は、高分子ダイナミクス界では球形の「塊（ｂｌｏｂ）」と呼ばれてきた。この塊のサイズは、前記ＤＮＡ分子の長さと前記持続長とに依存する。
【０００４】
鎖状に長いＤＮＡを均一に引き伸ばすには、ナノ流体構造の寸法が、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍの二本鎖ＤＮＡの持続長に近いか、その近傍であるか、それより小さいかでなければならないことが説明されてきた。最高５０万単位のナノチャネルアレイはナノインプリンティングリソグラフィ（ｎａｎｏｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、略称ＮＩＬ）を使って１００ｍｍウエハー上に製造され、高度に平行した状態で長いゲノムＤＮＡを引き伸ばし、整列し、分析するための微小断面積１０ｎｍ×５０ｎｍを有する密閉チャネルを有し、さらにその結果は、Ｃａｏ  Ｈ．、Ｗａｎｇ  Ｊ．、Ｔｅｇｅｎｆｅｌｄｔ  Ｐ．、Ａｕｓｔｉｎ  Ｒ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ  Ｅ．、Ｗｅｉ  Ｗ．、およびＣｈｏｕ  Ｓ．Ｙ．、Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １０  ｎｍ  Ｅｎｃｌｏｓｅｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  （２００２）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．８１、Ｎｏ．１、ｐｐ  １７４に説明されている。図１Ａおよび図１Ｂに例示したように、狭いチャネル内へと塊状の長いＤＮＡを効率的に移動するのは困難である、なぜなら長い生体高分子が自発的に細長くなって前記環境からナノチャネルに直接進入するには、負のエントロピー変化を克服するため大量の自由エネルギーを要し、これはエネルギー的に起こりづらいためである。例えば、長さ１６９キロベースの二本鎖Ｔ４ファージＤＮＡ分子は、回転半径（Ｒｇ＝（Ｌρ／６）１／２、ここで、Ｌは長さ、ρはＤＮＡの持続長）約７００ｎｍのガウシアンコイルを緩衝水溶液中で形成するが、これは前記ナノチャネルの開口部幅の何倍もの長さに相当する。その結果、ナノ環境とマクロ環境との接合部でＤＮＡが目詰まりするなどの問題が生じ、従来のナノ流体装置の性能を落とした。
【０００５】
米国特許出願第２００２／０１６０３６５号では、低エネルギー領域と高エネルギー領域との境界を分子に強制的に越えさせることにより、ＤＮＡの長鎖を長さ別に分離する方法を説明している。前記高エネルギー領域は、多様なピラー（柱状構造体）領域である。前記低エネルギー領域は、前記高エネルギー領域に隣接して形成された、より大きなチャンバーである。
【０００６】
米国特許出願第２００２／００７２２４３号では、流体装置の内部構造を定義する犠牲層および永久層のパターンを使った製造技術について説明している。マイクロチャネルと遅延用障害物のアレイとを有する流体装置のパターンは、レジスト層内に定義される。このパターンはリソグラフィ技術を使って作成される。電子ビームリソグラフィの場合、およびフォトリソグラフィによる深い構造の場合は、パターン転写を補助するための硬質のパターンマスクが必要とされる。インレットチャンバーと、アウトレットチャンバーと、インレットマイクロチャネルと、アウトレットチャンバーと、穴部のアレイとが、犠牲層内に形成される。この犠牲層を覆うため、天井層が蒸着される。この天井層は、前記穴部に進入して密集したピラーを形成する。前記犠牲層は、床層と天井層間にマイクロチャネルを形成するため除去される。前記ピラーは、このシステム内を流通する流体に対し、篩（ふるい）または人工ゲルフィルタとして機能する。２００℃〜４００℃での基板の加熱など、前記犠牲材料の除去に必要な工程により、一定の材料の使用は制限される。電子ビームリソグラフィは、異なるパターンを書き込める柔軟性を有するが、処理能力が低く、製造コストが高い。
【０００７】
ナノチャネルに進入する際の局所的エントロピー障壁を低減するため、装置のマイクロ流体コンポーネントとナノ流体コンポーネント間のインターフェース用に改善された構造を提供し、改善されたその製造方法を提供することが望まれている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高処理能力において好適な、すなわち巨大分子分析に適切な、ナノ流体コンポーネントとマイクロ流体コンポーネント間のインターフェース用装置に関する。本発明では、回折勾配リソグラフィ（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、略称ＤＧＬ）を使用し、マイクロ流体領域とナノ流体領域間に勾配インターフェースを形成する。この勾配インターフェース領域は、前記ナノ流体領域に形成されるナノチャネルへの局所的エントロピー障壁を低減する。
【０００９】
１実施形態では、前記勾配インターフェース領域は、マイクロン（μｍ）〜ナノメートル（ｎｍ）オーダーの値の断面積を狭めるため、横方向の空間的勾配構造から形成される。異なる別の実施形態では、前記勾配インターフェース領域は、垂直方向に傾斜させた勾配構造から形成される。さらに、前記勾配構造は、横勾配および垂直勾配の双方を提供することができる。これらの勾配構造を使うと、生体分子を微小なナノ流体領域へじょうご式に詰め込むことができる。
【００１０】
本発明の１態様では、回折勾配リソグラフィによる流体装置の製造方法は、ナノ流体領域を基板上に形成する工程と、マイクロ流体領域を前記基板上に形成する工程と、前記ナノ流体領域と前記マイクロ流体領域間に勾配インターフェース領域を形成する工程とを有する。前記勾配インターフェース領域は、フォトリソグラフィ中、フォトマスクおよび／またはフォトレジストの上方にブロックマスクを位置付けて使用することにより形成できる。前記ブロックマスクの縁部は、前記フォトレジスト上に強度勾配を伴った光を投影する回折を提供する。別の実施形態では、前記流体装置を製造するためのシステムが提供される。
【００１１】
本発明の１態様では、前記ナノ流体コンポーネントは、ナノスケール流体構造を有する。このナノ流体構造には、ナノピラー（ナノスケールの柱状構造体）と、ナノ細孔と、ナノチャネルアレイとを含めることができる。
【００１２】
本発明の別の態様では、流体装置は、ナノ流体領域とマイクロ流体領域間の勾配インターフェースと、前記マイクロ流体領域と流体連通して流体をリリースできる少なくとも１つの試料リザーバと、前記ナノ流体領域と流体連通して流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバとから形成される。別の態様では、流体装置を含む分析実行システムが提供される。この流体装置は、ナノ流体領域とマイクロ流体領域間の勾配インターフェースと、前記マイクロ流体領域と流体連通して流体をリリースできる少なくとも１つの試料リザーバと、少なくとも１つの前記チャネルと流体連通して流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバと、信号取得と、データプロセッサとから形成される。前記信号としては、光子、電流/インピーダンス測定値、または測定値の変化を利用できる。前記流体装置は、ＭＥＭＳ装置およびＮＥＭＳ装置で使用できる。
【００１３】
別の実施形態では、少なくとも１つの巨大分子を分析する方法が提供され、この方法は例えば、流体装置を提供する工程であって、ナノ流体領域とマイクロ流体領域間の勾配インターフェースと、前記マイクロ流体領域と流体連通して流体をリリースできる少なくとも１つの試料リザーバと、前記ナノ流体領域と流体連通して流体を受容できる少なくとも１つの廃棄物リザーバとから形成される流体装置を提供する工程と、少なくとも１つの巨大分子を引き伸ばすために前記マイクロ流体領域から前記ナノ流体領域へ少なくとも１つの巨大分子を移送する工程と、前記少なくとも１つの巨大分子から伝達された少なくとも１つの信号を検出する工程と、検出された信号を前記巨大分子の少なくとも１つの特性と相関させる工程とを含む。
【００１４】
本発明に基づくナノ流体チップを含むカートリッジも、本明細書で開示される。このようなカートリッジは、本明細書に示したようなシステムに嵌入し、前記システムと併用し、前記システムから取り外すことができる。本発明に係るシステム以外の分析システムに有用なカートリッジも、本発明に包含される。
【００１５】
本発明は、本明細書の図面を参照することで、より完全に説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、添付の図面に例示された本発明の好適な実施形態を詳しく参照する。全図面および全説明にわたり、同一または類似の部品を参照するにあたり、可能であれば同一の参照番号を使用する。
【００１７】
図２は、本発明の説明に基づいた、マイクロ流体コンポーネントとナノ流体コンポーネント間のインターフェース用装置１０の模式図である。勾配インターフェース領域１２は、マイクロ流体領域１４とナノ流体領域１６間に位置付けされる。マイクロ流体領域１４は、基板１９上に形成された複数のマイクロポスト１８を有する。例えば、マイクロポスト１８は、約０．５μｍ〜約５．０μｍの範囲の直径を有することができ、マイクロポスト１８間の距離Ｄ１は、約０．５μｍ〜約５．０μｍの範囲が可能である。１実施形態では、マイクロポスト１８は、約１．２μｍ〜約１．４μｍの範囲の直径を有し、マイクロポスト１８間の距離Ｄ１は、約１．５μｍ〜約２．０μｍの範囲である。
【００１８】
ナノ流体領域１６は、表面を含む、前記表面内の材料内に複数のナノチャネル２１を有する複数のナノチャネルアレイ２０を有することができる。「複数のチャネル」とは、３つ以上のチャネル、典型的には６つ以上のチャネル、さらに典型的には１０個、９６個、１００個、３８４個、１，０００個、１，５３６個、１０，０００個、１００，０００個、および１，０００，０００個を超えるチャネルを意味する。ナノチャネル２１は、基板１９全体にわたり平行した複数の直線的チャネルとして設けることができる。ナノチャネル２１は、約１５０ｎｍ未満の溝幅、より典型的には１００ｎｍ未満の溝幅、そしてさらに典型的には７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、および１５ｎｍより狭い溝幅を有することができる。特定の実施形態では、この溝幅を約１０ｎｍにできる。本発明では、この溝幅を少なくとも２ｎｍにできるが、典型的には少なくとも５ｎｍである。ナノチャネル２１の溝の深さは、約２００ｎｍ未満が可能である。
【００１９】
前記ナノチャネルは、前記チャネルの壁材料に隣接する密閉材料を有することができる。この実施形態では、前記密閉材料により前記溝幅を低減できる。この密閉材料の蒸着パラメータを変化させると、前記チャネルの溝幅を狭めることができ、前記蒸着パラメータを変えると、典型的に１００ｎｍ未満の溝幅を提供できる。より多くの材料を蒸着させていくと、溝幅は７５ｎｍ未満、さらに５０ｎｍ未満、２５ｎｍ未満、および１５ｎｍ未満にまで狭めることができる。約１０ｎｍの溝幅も、本発明の方法で設けることができる。典型的に、蒸着の結果得られる溝幅は２ｎｍを超え、より典型的には５ｎｍを超える。１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、および２５ｎｍの溝幅も、本発明の方法で提供できる。約１５ｎｍの溝深さも提供可能である。溝の深さは、典型的に少なくとも５ｎｍで、より典型的には少なくとも１０ｎｍである。
【００２０】
特定の実施形態では、溝の深さは典型的に１７５ｎｍ未満で、より典型的には１５０ｎｍ未満、１２５ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、および２５ｎｍ未満である。特定の実施形態では、溝の深さを約１５ｎｍにすることができる。特定の実施形態では、溝の深さは少なくとも２ｎｍで、典型的に少なくとも５ｎｍで、より典型的には少なくとも１０ｎｍである。前記ナノチャネル２１の少なくとも一部は、密閉材料を載せて、少なくとも実質的に収納することができる。前記ナノチャネルアレイのチャネル長さは、広い範囲にわたることが可能である。
【００２１】
また、ナノチャネルアレイ２０内のチャネルの長さは、同一でも異なってもよい。以下のようにナノチャネルアレイ２０を使って巨大分子分析を実行する場合、ナノチャネル２１の長さは、少なくとも約１ミリメートル（ｍｍ）、１マイクロメートル（μｍ）、またはそれ以上であることが望ましい。ナノチャネル２１の長さは、約１ミリメートル（ｍｍ）および約１センチメートル（ｃｍ）を超える場合があり、さらに約５ｃｍ、約１５ｃｍ、および約２５ｃｍを超える場合もある。ナノチャネル２１は、Ｚ．Ｎ．Ｙｕ、Ｐ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｗ．Ｗｕ、Ｊ．Ｗａｎｇ、およびＳ．Ｙ．Ｃｈｏｕ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７７（７）、９２７（２０００）；Ｓ．Ｙ．Ｃｈｏｕ、Ｐ．Ｒ．Ｋｒａｕｓｓ、およびＰ．Ｊ．Ｒｅｎｓｔｒｏｍ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６７（２１）、３１１４（１９９５）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｙ．Ｃｈｏｕ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒ．Ｋｒａｕｓｓ、およびＰｒｅｓｔｏｎ  Ｊ．Ｒｅｎｓｔｒｏｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、８５（１９９６）；および米国特許第５，７７２，９０５号で説明されているとおり（この参照により各々その全体を本出願に組み込まれる）、ナノインプリントリソグラフィ（ｎａｎｏｉｍｐｒｉｎｔ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ、略称ＮＩＬ）で製造可能である。ナノチャネル２１は、ナノインプリントリソグラフィと、干渉リソグラフィと、自己組織化共重合体パターン転写と、スピンコーティングと、電子ビームリソグラフィと、集束イオンビームミリングと、フォトリソグラフィと、反応性イオンエッチングと、ウェットエッチングと、プラズマ化学気相成長法と、電子ビーム蒸着と、スパッタ蒸着と、これらの組み合わせとにより形成が可能である。あるいは、他の従来の方法を使用してナノチャネルを形成することもできる。
【００２２】
代替実施形態では、ナノ流体領域１６はナノスケール流体構造を有する場合がある。例えば、このナノスケール流体構造はナノピラーやナノスフェアを有してもよい。
【００２３】
勾配インターフェース領域１２は、生体高分子２２がナノ流体領域１６に近づく前に前記生体高分子２２を効果的に引き伸ばし整列させるために使われる。生体高分子２２は、ナノチャネル２１に進入する前に、隣接するマイクロポスト１８のペア間で事前に引き伸ばすことができる。勾配インターフェース領域１２は、図３に示したように生体高分子２２がナノ流体領域１６に進入する前に、エントロピー障壁の勾配を低減する。
【００２４】
図２において、勾配インターフェース領域１２には、基板１９上に形成された複数の勾配構造２３を有することができる。勾配構造２３間の距離Ｄ２は、ナノ流体領域１６へ向かって徐々に低減される。例えば、勾配構造２３間の距離Ｄ２は、約２μｍから徐々に約５００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約２００ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、および約２ｎｍ以下へ減少させることが可能である。１実施形態では、前記勾配構造２３間の距離Ｄ２は、生体高分子２２の回転半径にほぼ等しい範囲で、実質的に生体高分子２２の直径にまで低減される。例えば、勾配構造２３間の直径Ｄ２は、ＤＮＡモジュールの直径である約２ｎｍの範囲で、Ｔ４ファージＤＮＡ分子の回転半径である約７００ｎｍまで低減できる。
【００２５】
勾配構造２３は、基板１９からの高さＨ１を漸増することが可能である。ナノ流体領域１６は、マイクロ流体領域１４の深さＤＰ２より浅い深さＤＰ１を有することができる。このため、マイクロ流体領域１４からナノ流体領域１６への高さＨ１の漸増により、マイクロ流体領域１４とナノ流体領域１６との相互連結が改善される。
【００２６】
回折勾配リソグラフィを使った、処理工程１〜３を含む本発明の基本製造工程は、図４Ａ〜図４Ｃの概略一部斜視図で概略説明している。この工程では、１若しくはそれ以上のナノチャネル２１を基板１９上に製造した。基板１９は、シリコンウエハー基板であってよい。あるいは、前記フォトリソグラフィと互換性のあるいかなるタイプの材料も基板として使用してよい。基板１９は、ＨＭＤＳ処理とベークとの後、フォトレジスト３２でコーティングした。工程１では、μｍサイズのポストアレイを有するフォトマスク３４を使って、マイクロ流体領域１４と勾配インターフェース領域１２とをパターン化することができる。
【００２７】
工程２では、ブロックマスク３５をフォトマスク３４上に配置またはコーティングした。ブロックマスク３５は、フォトマスク３４の部分３６上に延長する。ブロックマスク３５は、フォトマスク３４の部分３６の下に位置付けられたナノ流体領域１６の部分３８をマスクして、ナノチャネル２１を保護する。工程３では、装置１０を入射ＵＶ光３７に露光した。ブロックマスク３５は、ブロックマスク３５の縁部３９に沿って光回折を起こす。
【００２８】
ブロックマスク３５は、光リソグラフィに使われる露光に対し不透明な任意の材料で形成できる。例えば、ブロックマスク３５はアルミ箔などの金属や不透明なプラスチックで形成できる。
【００２９】
図４Ｂでは、工程４で、従来技術を使って装置１０を現像した。ブロックマスク３５の縁部３９により生じる光回折は、フォトレジスト３２の現像剤への溶出速度に勾配を生み出す。現像中、露光したフォトレジスト３２は、ブロックマスク３５によりブロックされなかった部分４１で完全に除去され、その下の前記基板の表面を露出する。部分４２では、フォトレジスト３２が光回折領域に沿って未現像フォトレジストの勾配を有する。この未現像フォトレジスト勾配の厚さは、回折光への露光に対応する。部分４３では、ブロックマスク３５がフォトレジスト３２の露光を完全にブロックする。
【００３０】
図４Ｃでは、工程５で、反応性イオンエッチング（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｅｔｃｈｉｎｇ、略称ＲＩＥ）工程中、フォトレジスト３２がエッチングマスクとして使われ、フォトレジスト３２の勾配パターンが基板１９に転写される。
【００３１】
フォトマスク３４上の光強度プロファイルを図４Ｄに示す。この光強度プロファイルは、ブロックマスク３５の縁部３９に沿った光強度の減少を示している。この勾配プロファイルは、フォトレジストのタイプと、現像条件と、エッチング条件とにより制御が可能である。例えば、低コントラストのレジストでは緩やかな勾配プロファイルを提供できる。ブロックマスク３５の縁部３９を調整すると、勾配プロファイルを調整できる。例えば、縁部３９の傾斜またはパターン化により、勾配プロファイルが調整できる。
【００３２】
１実施形態では、図５Ａ〜図５Ｂに示すように、勾配インターフェース領域１２が、マイクロ流体領域１４からナノ流体領域１６への緩やかな傾斜部として形成される。この実施形態では、１若しくはそれ以上のナノチャネルが基板１９内に製造される。基板１９は、工程１において、ＨＭＤＳ処理とベークとの後、フォトレジスト３２でコーティングされる。工程２では、ブロックマスク３５がフォトレジスト３２上に位置付けされる。ブロックマスク３５は、フォトマスク３４の部分３６上に延長する。ブロックマスク３５は、ナノチャネル２１を保護するため、ナノ流体領域１６の部分３８をマスクする。工程３では、装置１０を入射ＵＶ光３７に露光させる。ブロックマスク３５は、ブロックマスク３５の縁部３９に沿って光回折を起こす。工程４では、従来技術を使って装置１０を現像した。反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）工程中は、フォトレジスト３２がエッチングマスクとして使われ、フォトレジスト３２の勾配パターンが基板１９に転写された。現像中は、強度が漸減する光をフォトレジスト３２上に投影し、これにより、基板１６へ転写される勾配インターフェース領域１２に垂直方向の勾配を形成する。
【００３３】
図６Ａ〜図６Ｂに示したように、ブロックマスク３５の幅Ｗ２およびフォトマスク３４とブロックマスク３５間の距離を変えると、ブロックマスク３５からフォトレジスト３２までの距離Ｄ３を決定することができる。例えば、ブロックマスク３５は、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲の可変幅Ｗ２とすることができる。Ｗ２は、ブロックマスク３５の幅Ｗ２を増加させるブロックマスク３５に融合させた、１若しくはそれ以上の追加ブロックマスクから形成することが可能である。ブロックマスク３５はフォトマスク３４にコーティングできる。
【００３４】
代替実施形態では、ブロックマスク３５からフォトレジスト３２までの距離Ｄ３は、前記ブロックマスク３５とフォトマスク３４との距離を調整することにより調整できる。ブロックマスク３５は、ブロックマスクホルダー４０を使ってフォトマスク３４上に位置付けすることができる。フォトマスク３４は、アライナ４２を使ってフォトレジスト３２上に配置できる。ブロックマスクホルダー４０は、Ｘ１とＸ２とＹ１とＹ２との方向にブロックマスクを移動できる。アライナ４２は、Ｘ１とＸ２とＹ１とＹ２との方向にフォトマスク３４を移動できる。距離Ｄ３は、ブロックマスク３５をフォトレジスト３２へ向かって、およびフォトレジスト３２から離れるよう移動することにより変更可能である。距離Ｄ３は、フォトレジスト３２に対する回折を決定する。例えば、距離Ｄ３を縮めると、勾配インターフェース領域１２での回折領域は狭まる。
【００３５】
本発明の別の態様では、マイクロ流体コンポーネントとナノ流体コンポーネント間のインターフェース用の前記勾配インターフェース領域を含む、マイクロ流体／ナノ流体チップが提供される。図７では、マイクロ流体／ナノ流体チップ１００は、マイクロ流体領域と、基板１９と、ナノ流体領域１６と、勾配インターフェース領域１２と、試料を扱うためのリザーバ１０２と、試料を受容し試料回収するためのリザーバ１０４とを有する。基板１９内に形成されたトンネル１０３は、リザーバ１０２およびリザーバ１０４をそれぞれマイクロ流体領域１４およびナノ流体領域１６に連結するため使用できる。
【００３６】
ナノ流体領域１６は、上記のようにナノ流体チャネル２１を有してもよい。あるいは、ナノ流体領域１６および勾配インターフェース領域１２は、分岐チャネル１０６を有してもよい。分岐チャネル１０６を約５．０μｍ〜約２ｎｍの範囲のより小さい枝へ段階的に分岐させていくと、チャネル間の勾配距離を横方向に減少させて横方向勾配を提供することができる。分岐チャネル１０６は、上記のとおり回折勾配リソグラフィを使って、高さを漸増させることが可能である。
【００３７】
リザーバは、前記試料リザーバが前記チャネルへ流体をリリースできるよう、また前記廃棄物リザーバが前記チャネルから流体を受容できるよう、少なくとも１つのチャネルと流体連している。典型的に、これらの流体は分析する巨大分子を含む。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、前記マイクロ流体／ナノ流体チップは、前記基板の表面に形成された、少なくとも１つの試料リザーバを含む。リザーバは、フォトリソグラフィの後、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、化学エッチング、またはＦＩＢミリングを直接前記基板へパターン転写して、ナノ流体領域１６またはナノチャネル２１と液体流通自在なリザーバを作成することにより構成することができる。この実施形態では、少なくとも１つの廃棄物リザーバが少なくとも１つの前記チャネルと流体連通している。典型的に、前記マイクロ流体／ナノ流体チップは、少なくとも１つの試料リザーバを含む。あるいは、他の種々の実施形態は、種々の数のリザーバを含む。
【００３９】
巨大分子分析用途の場合、マイクロ流体／ナノ流体チップ１００は、ナノ流体領域１６の少なくとも一部を２次元検出器で画像処理できる。前記ナノ流体領域１６の画像処理は、前記ナノチャネルからの光を回収する光学素子など、発せられた信号を回収するための適切な機器に、前記ナノチャネルおよび任意の密閉材料を提示することにより提供される。この実施形態では、前記マイクロ流体／ナノ流体チップは、試料リザーバから、マクロ流体領域を横切り、前記ナノ流体領域を横切って、複数の引き伸ばされた巨大分子を移送することができる。
【００４０】
本発明の特定の実施形態では、前記マイクロ流体／ナノ流体チップは、前記試料リザーバから、前記マクロ流体領域およびナノ流体領域を通過して、前記廃棄物リザーバへと巨大分子を移送するための機器を含む。適切な機器は、少なくとも一部の前記チャネル両端に少なくとも１方向に電場を印加できる、少なくとも１つの電極対を含む。電極の金属接点は、少なくとも１つの試料および少なくとも１つの回収／廃棄物リザーバと接触して、方向性を有する電場を確立するように、標準的な集積回路製造技術を使って集積可能である。電場としては、交流（ＡＣ）、直流（ＤＣ）、またはその両タイプを印加できる。前記電極はほとんどの金属で作成でき、典型的には、構成済み線軌道に蒸着した薄いＡｌ／Ａｕ金属層である。典型的に、１つの電極の少なくとも一端が、前記リザーバの緩衝溶液に接触する。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、前記マイクロ流体／ナノ流体チップは、それぞれ異なる方向に電場を提供する少なくとも２対の電極を含む。独立した電極が少なくとも２セットあることにより、場の接触を使って前記電場の方向と振幅を独立に調整し、巨大分子を望ましい速度で移動する、または望ましい方向へ移動することが可能になる。
【００４２】
本発明の別の態様では、図８に示したようにシステム２００を使って巨大分子分析を実行する。システム２００は、本明細書で説明したとおりマイクロ流体／ナノ流体チップ１００と、前記マイクロ流体／ナノ流体チップ１００のナノチャネル２１内の１若しくはそれ以上の流体から伝達された少なくとも１つの信号を検出するための機器とを含む。
【００４３】
本発明の種々の実施形態では、前記システムは、少なくともマイクロ流体領域１４とナノチャネル２１とを通過して流体を移送するための移送機器と、マイクロ流体／ナノ流体チップ１００内の試料リザーバへ少なくとも１つの流体をロードするための試料ロード用機器と、画像または信号の検出器と、データプロセッサとのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【００４４】
システム２００に使用するマイクロ流体／ナノ流体チップ１００は、典型的に使い捨て式で、個別包装され、１〜５０，０００流体試料分の試料ロード容量を有する。マイクロ流体／ナノ流体チップ１００は、試料ロード用開口部およびリザーバ、あるいは試料ロード用開口部およびプレートであって、Ｏリングなどの密閉機構に連結したプレートを、典型的に有する。電極２０２は、電位発生器２０４およびマイクロ流体／ナノ流体チップ１００に連結している。電極２０２および電位発生器２０４は、金属接点に連結してよい。適切な金属接点としては、外部走査／画像処理／電場チューナーへ接続できる外部接触パッチが可能である。
【００４５】
本発明の１実施形態では、システム２００は、前記チャネル内部の巨大分子を励起し、その結果生じた信号を検出および回収するための機器を含む。レーザービーム２０６は、集束レンズ２０８を使ってナノ流体領域１６上の点に集光される。前記ナノ流体流体内またはナノチャネル（図示せず）内の巨大分子から生成された光信号は、集束／回収レンズ２０９により回収され、ダイクロイックミラー／帯域通過フィルタ２１０から光経路２１２へ反射され、ＣＣＤ（強化電荷結合素子）カメラ２１３へと供給される。あるいは、励起光源を、ダイクロイックミラー／帯域通過フィルタボックス２１０と、集束／回収スキームとを経由して前記チップの頂部から引き渡すこともできる。前記システムでは、デジタルカメラ、ＰＭＴ（光電子増倍管）、およびＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）など、種々の光コンポーネントおよび装置を使っても光信号の検出が可能である。
【００４６】
システム２００はデータプロセッサ２１４を含んでもよい。データプロセッサ２１４は、ＣＣＤ  ２１３からの信号を処理し、ナノ流体領域１６のデジタル画像をディスプレイ２１５に表示するために使用できる。また、データプロセッサ２１４を使うと、前記デジタル画像を分析して、巨大分子サイズ統計量、ヒストグラム、核型、マッピング、診断情報などの特性情報を提供し、データ読み出し２１６に適切な形式でそれらの情報を表示することもできる。
【００４７】
マイクロ流体／ナノ流体チップ１００をプラスチックなどの適切なハウジングに収納すると、便利で汎用対応のカートリッジまたはカセットを提供できる。典型的に、このナノ流体カートリッジは、前記試料ロード用装置を前記リザーバに対し嵌入、導入、および整列するための適切な機能をハウジング上またはハウジング内に有する。プラスチックケース内には、嵌入用スロット、嵌入用軌道、またはその双方が提供可能である。
【００４８】
前記システムで分析できる巨大分子流体の試料には、哺乳類からの流体（ＤＮＡ、細胞、血液、血清、生検組織など）、高分子などの合成巨大分子、および自然界に見られる物質（植物、動物、および他の生物形態から得られる物質など）が含まれる。このような流体試料は、自動または手動の本発明の試料ロード用機器を使って、管理、ロード、および注入できる。
【００４９】
本発明の別の態様では、少なくとも１つの巨大分子を分析する方法が提供される。本発明において前記分析は、本発明に係るマイクロ流体／ナノ流体チップ１００を提供する工程と、前記少なくとも１つの試料リザーバに、少なくとも１つの流体であって、少なくとも１つの巨大分子を有する流体を提供する工程と、マクロ流体領域から、勾配インターフェース領域を通過して、少なくとも１つのチャネルへと、少なくとも１つの巨大分子を引き伸ばすために前記少なくとも１つの巨大分子を移送する工程と、引き伸ばされた前記少なくとも１つの巨大分子から伝達される少なくとも１つの信号を検出する工程と、検出された信号を前記少なくとも１つの巨大分子の少なくとも１つの特性と相関させる工程とを含む。
【００５０】
本発明の１実施形態では、前記巨大分子を分析する方法は、緩衝溶液か巨大分子を含む緩衝溶液かの毛管現象を使って、前記チャネルを湿潤させる工程を含む。高分子やＤＮＡなどの巨大分子は、電場、毛管現象、温度勾配または化学勾配による表面張力差、あるいは減圧などの差圧により、ナノチャネルアレイに導入することができる。
【００５１】
この方法を使うと、種々の巨大分子を分析することができる。ＤＮＡ分析の場合、典型的な工程条件は、４：１〜１０：１の比の塩基対と適切な色素とで染色したＤＮＡの希釈溶液を提供する工程を含む。適切な染料には、ＴＯＴＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）などがある。染色したＤＮＡの溶液は、さらに希釈し、酸化防止剤および固着防止剤で処理できる。
【００５２】
本発明の１実施形態では、前記巨大分子を分析する方法は、１つのＤＮＡ巨大分子のサイズを測定する工程を含む。１つのＤＮＡ巨大分子は、損傷を避けるため（重合させたゲルプラグ中などで）、炭疽菌などの単一の細胞または胞子から抽出して適切に移送することが可能である。
【００５３】
単一ＤＮＡについては長さが検出、報告でき、強度プロファイルもプロット可能である。本発明の種々の実施形態では、前記巨大分子を分析する方法は、検出された信号を、長さ、立体構造、および化学組成のうち少なくとも１つと相関させる工程を含む。この方法で分析可能な種々の巨大分子には、タンパク質などの生体高分子、ポリペプチド、およびＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡなどの核酸が含まれる。ＤＮＡ核酸の場合、検出された信号は、前記ＤＮＡの塩基対配列と相関させることができる。
【００５４】
流体中の巨大分子の典型的な濃度は、１巨大分子または少なくとも約１アトグラム／ｍｌであり、より典型的には少なくとも１フェムトグラム／ｍｌであり、より典型的には少なくとも１ピコグラム／ｍｌであり、さらに典型的には少なくとも１ナノグラム／ｍｌである。濃度は、典型的に約５μｇ／ｍｌ未満で、より典型的には約０．５μｇ／ｍｌ未満である。
【００５５】
本発明の１実施形態では、前記巨大分子を分析する方法は、１５０ｎｍを超える、典型的には約５００ｎｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、約１ｍｍ、約１ｃｍ、および約１０ｃｍを超える引き伸ばし長さを有する巨大分子の長さを測定する。
【００５６】
１０個を超える塩基対を有するＤＮＡも、前記方法で分析できる。典型的に、１００個を超える塩基対、１，０００個を超える塩基対、１０，０００個を超える塩基対、１００，０００個を超える塩基対、および１，０００，０００個を超える塩基対が測定可能である。前記方法では、１００万個、１０００万個、さらに１億個を超える塩基対を有するＤＮＡが分析できる。
【００５７】
本発明の１実施形態では、前記方法を使って、制限酵素断片長多型と、染色体と、一塩基変異多型のうち１若しくはそれ以上を分析することができる。
【００５８】
本発明は以下の例によりさらに例示できるが、当然のことながら、これらの例は単に例示のために含まれているもので、別段の明記がない限り本発明の範囲を限定するように意図されたものではない。本明細書、本明細書の例、および本明細書の請求項に含まれるパーセント、比、および濃度は、すべて重量に基づいており、別段の明記がない限り近似値である。
【００５９】
例
まず、Ｓ．Ｙ．Ｃｈｏｕ、Ｐ．Ｒ．Ｋｒａｕｓｓ、およびＰ．Ｊ．Ｒｅｎｓｔｒｏｍ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６７（２１）、３１１４（１９９５）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｙ．Ｃｈｏｕ、Ｐｅｔｅｒ  Ｒ．Ｋｒａｕｓｓ、およびＰｒｅｓｔｏｎ  Ｊ．Ｒｅｎｓｔｒｏｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、８５（１９９６）、および米国特許第５，７７２，９０５号に説明されているナノインプリンティングリソグラフィを使って、ナノチャネルの大型アレイをＳｉ基板チップ上の全体にわたり製造した。このチップを、ポジ型フォトレジスト（ＡＺ５２１４−Ｅ）で、標準プロトコルを使って、ＨＭＤＳ処理後に４０００ｒｐｍで１分間スピンコーティングし、１１０℃で２分間ベークした。マイクロ流体領域のパターン化には、Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ−６接触式アライナおよび均一なμｍサイズの六角アレイフォトマスクを使用した。アルミ箔片のブロックマスクを、前記フォトマスク上に配置した。このブロックマスクと前記フォトレジスト表面間の距離は約３ｍｍであった。前記チップを４００ｎｍのＵＶ光にｈａｒｄ  ｃｏｎｔａｃｔ（減圧による接触強化）モードで３５秒間露光し、標準的な手順で現像した（ＡＺ３１２  ＭＩＦ：Ｈ２０  １：１）。次に、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）工程中、フォトレジストをエッチングマスクとして使い、フォトレジストの勾配パターンをその下層にあるＳｉ基板に転写した。
【００６０】
図９Ａは、フォトレジスト現像後、実際の勾配チップを上面から見た光学画像である。次に、０２プラズマおよびＣＨＦ３プラズマの組み合わせを使ってポスト間の間隙を前記チップにエッチングした後、アセトンでレジストを除去した。図９Ｂは、パターン転写およびフォトレジスト除去の後の、マイクロポスト間に勾配の横方向間隔を伴った前記インターフェース用領域の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示したものである。前記ブロックマスク直下のナノチャネル作成済み領域は、フォトレジストをマスキングすることにより、ＲＩＥから保護される。
【００６１】
図１０Ａ〜図１０Ｂは劈開プロファイルのＳＥＭ画像を例示したもので、前記マイクロポスト間の前記間隙が典型的に１．２μｍから徐々に４００ｎｍ未満へと漸減し、前記流体チップの基板が徐々に高さを増して、より浅いナノ流体チャネルと相互連結している様子を呈している。図１０Ａおよび図１０Ｂに示したこの勾配プロファイルは、わずかに異なるフォトレジスト条件と、現像条件と、エッチング条件とで制御されている。
【００６２】
蛍光染色した長いＤＮＡ分子を、図１に示した先行技術ナノ流体チップおよび図２に示した装置１０に入れた。図１１Ａでは、ＤＮＡはこの画像の右側から進入したが、前記先行技術ナノ流体チップの縁部に近づきそこで停止したことにより、このチップに汚れを生じている。図１１Ｂでは、ラムダファージＤＮＡ分子またはゲノムＢＡＣ  ＤＮＡが、勾配領域に進入した際、部分的に伸ばされ、前記ナノチャネルの縁部で「上り坂の」エントロピーにより移動が緩慢になった。より大きなＤＮＡ分子は、引き伸ばされたまま、著しく改善された効率で、引き続きこのナノチャネル内へ移動した。画像積分後のこの画像の左部分には、移動中のＤＮＡ分子が長く白い筋として見られる。
【００６３】
言うまでもなく、上記の実施形態は、本発明の原理の応用方法を表現できると考えられる多数の具体的実施形態のうち、わずか少数を例示したものである。当業者であれば、本発明の要旨を変更しない範囲で、これらの原理に基づき多様な構成が他に多数容易に考案できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図１Ａは、ナノチャネルを含む先行技術装置の模式図。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの装置のナノチャネルのエントロピー変化を示すグラフ。
【図２】図２は、本発明の説明に基づいた、マイクロ流体コンポーネントとナノ流体コンポーネント間のインターフェース用装置の模式図。
【図３】図３は、図２の前記装置の前記ナノチャネルのエントロピー変化を示すグラフ。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、マイクロポストアレイおよびインターフェース勾配構造を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄは、マイクロポストアレイおよびインターフェース勾配構造を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄは、マイクロポストアレイおよびインターフェース勾配構造を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、マイクロポストアレイおよびインターフェース勾配構造を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図５Ａ】図５Ａは、傾斜した勾配インターフェース領域を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図５Ｂ】図５Ｂは、傾斜した勾配インターフェース領域を製造するため、回折勾配リソグラフィ（ＤＧＬ）を組み込んだ工程を例示した図。
【図６Ａ】図６Ａは、厚さを使って回折勾配を調整する方法の模式図。
【図６Ｂ】図６Ｂｈａ，可変距離を使って回折勾配を調整する方法の模式図。
【図７】図７は、マイクロ流体／ナノ流体チップの模式図。
【図８】図８は、マイクロ流体／ナノ流体チップを使った巨大分子分析システムの模式図。
【図９Ａ】図９Ａは、図４Ｂの工程４に基づいたフォトレジスト現像後における、本発明の装置の製造中の光学画像。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図４Ｃの工程５に基づいたパターン転写とフォトレジスト除去との後における、本発明の装置の製造中の走査型電子顕微鏡像。
【図１０Ａ】図１０Ａは、図４Ｃの工程５に基づき第１のエッチング条件を使ったパターン転写とフォトレジスト除去との後における、本発明の装置の製造中の走査型電子顕微鏡像。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図４Ｃの工程５に基づき第２のエッチング条件を使ったパターン転写とフォトレジスト除去との後における、本発明の装置の製造中の走査型電子顕微鏡像。
【図１１Ａ】図１１Ａは、図１の先行技術ナノ流体チップへ蛍光性の長いＤＮＡ分子が進入している様子を示した、強化電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ、略称ＣＣＤ）画像。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図２の装置１０へ蛍光性の長いＤＮＡ分子が進入している様子を示した、強化電荷結合素子（ＣＣＤ）画像。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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