(57)【要約】  ケトラーゼ遺伝子が、カロテノイド生合成経路のカロテノイド修飾酵素をコードするロドコッカス−エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株から単離された。該遺伝子と遺伝子産物は、初めてロドコッカス株から単離された。６個の保存的アミノ酸モチーフがこのタイプのケトラーゼ酵素に特徴的なものであることが同定された。本発明の該遺伝子と遺伝子産物は、種々の生物におけるケト−カロテノイド化合物生産のために種々の方法で使用できる。
2005511011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：７、８、９、１０、１１および１２に記載の６個の保存的モチーフを全て含有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）アミノ酸配列番号：２をコードする単離された核酸分子；
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする単離された核酸分子；または、
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子、からなる群から選択される、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、前記の単離された核酸分子が配列番号：５または配列番号：３でない単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号：１に記載の、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：２に記載の、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）法のアライメントに基いて、少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも５３２個のアミノ酸のカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列；
または前記第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
単離された核酸分子が配列番号：５または配列番号：３でないという条件で、配列番号：７〜１２に記載のＣｒｔＯの特徴的なモチーフを定めるアミノ酸配列の全てに対して、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）法のアライメントに基づき、少なくとも７０％の同一性を有するカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
ポリペプチドが配列番号：６または配列番号：４でないという条件で、請求項６に記載の単離された核酸分子によりコードされたポリペプチド。
【請求項８】
好適な調節配列に操作可能に結合された、請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の前記単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物からなる群から選択される、請求項９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター・クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびミキソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライ麦、アマ、硬葉樹、軟葉樹、およびまぐさからなる群から選択される、請求項１０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
（ａ）請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の核酸分子により、ゲノムライブラリを探索し；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された前記クローンを含んでなるゲノムフラグメントの配列を決定すること、
を含んでなり、前記配列決定されたゲノムフラグメントがカロテノイドケトラーゼ酵素をコードしている、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ａ）の核酸分子が、配列番号：２および配列番号：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）配列番号：１および配列番号：３からなる群から選択される配列の部分に対応する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し；
（ｂ）前記ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクター中に存在する挿入部を増幅させること、
を含んでなり、前記増幅された挿入部がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードしている、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法の産物。
【請求項１８】
（ａ）配列番号：７〜１２からなる群から選択される特徴的なＣｒｔＯモチーフ配列をコードする核酸プローブを提供し；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）のプローブの全てとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定された前記クローンを含んでなるゲノムフラグメントの配列を決定すること、
を含んでなり、前記配列決定されたゲノムフラグメントがカロテノイドケトラーゼ酵素をコードしている、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１９】
（ａ）単環式または二環式カロテノイド類を産生する宿主細胞を提供し；
（ｂ）カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載の遺伝子により、（ａ）の宿主細胞を形質転換し；
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を、環状ケトカロテノイドが産生される条件下で増殖させることを含んでなる、環状ケトカロテノイド化合物を産生する方法。
【請求項２０】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号：２および配列番号：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記環状ケトカロテノイド化合物が、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−ガンマ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、ミクソバクトンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
単環式または二環式カロテノイド類が、β−カロテン、γ−カロテン、ゼアキサンチン、ルビキサンチン、エキネノンおよびトルレンからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記形質転換宿主が、細菌、酵母、糸状菌類、藻類、および緑色植物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記形質転換宿主細胞が、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピヒア、カンジダ、ハンゼヌラ、またはサルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ザイモモナス、アグロバクテリウム、エリスロバクター・クロロビウム、クロマチウム、フラボバクテリウム、サイトファーガ、ロドバクター、ロドコッカス、ストレプトマイセス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリア、マイコバクテリウム、デイノコッカス、エシェリヒア、エルウィニア、パントエア、シュードモナス、スフィンゴモナス、メチロモナス、メチロバクター、メチロコックス、メチロジーナス、メチロミクロビウム、メチロシスチス、アルカリゲネス、シネコシスチス、シネココックス、アナベナ、チオバシラス、メタノバクテリウム、クレブシエラおよびミキソコッカスからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記形質転換宿主細胞が、スピルリナ、ヘモタコッカスおよびドナリエラからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記形質転換宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ、アブラナ科野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ、サトウダイコン、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライ麦、アマ、硬葉樹、軟葉樹、およびまぐさからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）好適な調節配列の制御下で請求項１、２、５または６のいずれか一項に記載のカロテノイドケトラーゼ遺伝子を宿主細胞に導入し；
（ｂ）前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子を発現し、環状ケトカロテノイドの生合成を調節する条件下で（ａ）の宿主細胞を増殖させることを含んでなる生物において環状ケトカロテノイド生合成を調節する方法。
【請求項２８】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、配列番号：２および配列番号：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、アップレギュレートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、マルチコピープラスミド上で過剰発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、誘導または調節プロモータに操作可能に結合された、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、ダウンレギュレートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記カロテノイドケトラーゼ遺伝子が、アンチセンス配向で発現される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子が、コード領域への外来ＤＮＡの挿入により中断される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ類によりヌクレオチド配列の混合物を消化するステップであって、前記混合物は、
ａ）天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子と；
ｂ）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団と；
ｃ）前記天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしない、ヌクレオチドフラグメントの第２の集団とを含んでなり、
制限フラグメントの混合物を産生するステップと；
（ｉｉ）前記制限フラグメントの混合物を変性するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記変性制限フラグメント混合物をポリメラーゼとともにインキュベートするステップと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復し、変化した生物活性を有する蛋白質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子を産生するステップと、
を含んでなる方法によって産生される、変化した生物活性を有するカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする変異遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年８月２日に出願した米国仮特許出願第６０／３０９，６５３号の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、環状ケトカロテノイド化合物の微生物産生に有用な酵素をコードする核酸フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド類は、自然界に遍在し、あらゆる光合成生物により合成され、また、一部の従属栄養で成長する細菌や真菌類にも遍在する色素である。カロテノイドは、花、野菜、昆虫、魚類および鳥類に色を与える。カロテノイドの色は、黄から赤の範囲にあり、褐色や紫の変種もある。ビタミンＡの前駆体としてのカロテノイド類は、我々の食物の基本的成分であり、人の健康において、重要な補助的役割を演じている。カロテノイド類の工業的利用の中で少数例を挙げると、薬、保健食品、動物飼料の添加物および化粧品の着色剤がある。
【０００４】
動物は、カロテノイドを新規に合成できないため、それらを食物手段で得なければならない。したがって、植物または細菌におけるカロテノイド産生と合成の操作により、カロテノイド類の新規の、または改善された供給源が与えられる。
【０００５】
カロテノイド類は、種々の形態と化学的構造体をとる。最も多く見られる天然物カロテノイド類は、８個のＣ５イソプレン単位（ＩＰＰ）の連続的縮合から誘導されたＣ４０メチル分枝鎖炭化水素骨格を含有する疎水性のテトラテルペノイド類である。他には、非光合成細菌の一部の種に、より長いまたはより短い骨格を有する希少なカロテノイド類が見られる。用語の「カロテノイド」とは、実際上、カロテン類とキサントフィル類の双方を含む。「カロテン」とは、炭化水素カロテノイド類を指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−またはアルデヒド官能基の形態で、またはグリコシド類、グリコシドエステル類または硫酸塩の内部に１個以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、集合的に「キサントフィル類」として知られている。カロテノイド類はさらに、その炭化水素骨格の末端が環化して、脂肪族の、または環状の環構造を作っているかどうかに依って、非環式、単環式、または二環式であると言われる（非特許文献１）。
【０００６】
カロテノイドの生合成は、イソプレノイド経路と、Ｃ５イソプレン単位である、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生成から開始される。ＩＰＰは、その異性体であるジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と縮合して、Ｃ１０のゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を形成し、Ｃ１５のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）へと伸張化される。ＦＰＰ合成は、カロテン産生細菌およびカロテン非産生細菌の双方に見られる。引き続いてカロテノイド経路における酵素類が、ＦＰＰ前駆体からカロテノイド色素類を生成するが、これらの酵素類は、２つに分類できる。すなわち、カロテン骨格合成酵素類およびそれに続く修飾酵素類である。カロテン骨格合成酵素類としては、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、およびリコペンシクラーゼなどが挙げられる。修飾酵素類としては、ケトラーゼ類、ヒドロキラーゼ類、デヒドラターゼ類、グリコシラーゼ類が挙げられる。
【０００７】
カロテノイドケトラーゼ類は、β−カロテンなどの環式カロテノイド類のイオノン環にケト基を導入して、ケトカロテノイド類を産生する酵素の種類である。ケトカロテノイド類としては、アスタキサチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−ガンマ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシサンチン、ミクソバクトンが挙げられる。アスタキサンチンは、ヒトにおいて免疫機能を高め、動物において発癌を減少させると報告された。全ての生物に共通な上流イソプレノイド経路における遺伝子とは違って、下流のカロテノイド修飾酵素は希である。ケトラーゼの２つの種類、ＣｒｔＷとＣｒｔＯが報告されている。ＣｒｔＷは、β−カロテンの双方の環にケト基を付加する対称的挙動の酵素である（非特許文献２）。フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）らはβ−カロテン環の１個だけに不斉的にケト基を付加させるシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ６８０３から、他のケトラーゼ酵素を発見した（非特許文献３）。ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）のｃｒｔＯ遺伝子はタバコ植物に伝達され、その植物中にアスタキサンチンを発現した（非特許文献４）。
【０００８】
カロテノイド生合成経路に関与する遺伝子は、一部の生物において知られているが、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）細菌のカロテノイド生合成に関与する遺伝子は、現存する文献には記載されていない。しかし、カロテノイド色素を産生する能力がこれらの細菌に広くゆきわたっていることを示唆する有色のロドコッカス細菌は多く存在している。ロドコッカスのカロテノイド類は、構造的に（非特許文献５）に記載されたロドコッカスに特徴付けられる。
【０００９】
【非特許文献１】ジー・アームストロング（Ｇ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、（１９９９）ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２巻、３２１〜３５２頁
【非特許文献２】ハンニバル（Ｈａｎｎｉｂａｌ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２０００）１８２：３８５０〜３８５３頁
【非特許文献３】フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２；９７２８〜９７３３頁
【非特許文献４】マン（Ｍａｎｎ）ら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８：８８８〜８９２頁
【非特許文献５】イチヤマ（Ｉｃｈｉｙａｍａ）ら、（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）、３３：５０３〜５０８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、解決すべき課題は、カロテノイド産生におけるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）の最終的利用のために、ロドコッカスにおけるカロテノイド生合成に関与する配列を単離することである。本出願者らは、このタイプのケトラーゼ酵素の特徴である６個の保存特徴的アミノ酸モチーフを含有するケトラーゼ酵素をコードする１つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含有する遺伝子、ｃｒｔＯを、ロドコッカス−エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ−ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２株から単離することによって上記の課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、環状カロテノイド類のイオノン環に、ケト基を付加する酵素をコードするケトカロテノイド遺伝子を提供する。したがって、本発明は、
（ａ）配列番号：７、８、９、１０、１１および１２に記載される６個の保存的モチーフを全て含有するアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）アミノ酸配列番号：２をコードする単離された核酸分子；
（ｃ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズする単離された核酸分子；または、
（ａ）または（ｂ）と相補的な単離された核酸分子、からなる群から選択される、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子であって、前記の単離された核酸分子が配列番号：５または配列番号：３でない単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、該遺伝子によってコードされるポリペプチド類、ならびに該遺伝子の遺伝子キメラおよび該遺伝子を含んでなる組換え宿主を提供する。前記ペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するカロテノイドケトラーゼをコードする遺伝子もまた本発明の範囲内である。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、
（ａ）本発明の核酸分子により、ゲノムライブラリを探索し；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノムフラグメントの配列を決定すること、
を含んでなり、配列決定されたゲノムフラグメントがカロテノイドケトラーゼ酵素をコードしている、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１４】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号：１および配列番号：３からなる群から選択される配列の部分に対応する少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し；
（ｂ）前記ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクター中に存在する挿入部を増幅させること、
を含んでなり、前記増幅された挿入部がカロテノイドケトラーゼ酵素をコードしている、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、
（ａ）単環式または二環式カロテノイド類を産生する宿主細胞を提供し；
（ｂ）カロテノイドケトラーゼ酵素、すなわち配列番号：２および配列番号：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子で、（ａ）の宿主細胞を形質転換し；
（ｃ）（ｂ）の形質転換宿主細胞を環状ケトカロテノイドが産生される条件下で増殖させることを含んでなる、環状ケトカロテノイド化合物を産生する方法を提供する。
【００１６】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号：１および配列番号：３からなる群から選択されカロテノイドケトラーゼ遺伝子を、宿主細胞内に導入し、前記遺伝子が好適な調節配列の制御下にあること；および
（ｂ）カロテノイドケトラーゼ遺伝子が発現し、環状ケトカロテノイドの生合成が調節される条件下で（ａ）の宿主細胞を増殖させることを含んでなる生物における環状ケトカロテノイドの生合成を調節する方法を提供する。
【００１７】
代替実施形態において、本発明は、
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ類によりヌクレオチド配列の混合物を消化するステップであって、前記混合物は、
ａ）天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子と；
ｂ）前記の天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団と；
ｃ）前記の天然カロテノイドケトラーゼ遺伝子とハイブリダイズしない、ヌクレオチドフラグメントの第２の集団とを含んでなり、
制限フラグメントの混合物を産生するステップと；
（ｉｉ）前記制限フラグメントの混合物を変性するステップと；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の前記変性制限フラグメント混合物をポリメラーゼとともにインキュベートするステップと；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復し、変化した生物活性を有する蛋白質をコードする変異カロテノイドケトラーゼ遺伝子を産生するステップと、
を含んでなる方法によって産生する、変化した生物活性を有するカロテノイドケトラーゼ酵素をコードする変異遺伝子を提供する。
【００１８】
本発明は、以下の詳細な説明および本出願の一部を成している添付の配列記載から、より十分に理解することができる。
【００１９】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願要件−配列規定」）に従い、世界知的財産権機構（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯとＰＣＴの配列表作成要件（規定５．２および４９．５（エイ−ビス）および行政指示の２０８節と添付文書）に準拠している。ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列データに用いられる記号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２項に記載の基準に準拠している。
【００２０】
配列番号：１は、ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２株由来のｃｒｔＯ遺伝子をコードするヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号：２は、配列番号：１で用いられたｃｒｔＯ遺伝子の推定アミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号：３は、デイノコッカス・ラジオデュランズ（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）Ｒ１株由来のｃｒｔＯ遺伝子をコードするヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号：４は、配列番号：３で用いられたｃｒｔＯ遺伝子の推定アミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号：５は、種ＰＣＣ６８０３株由来のｃｒｔＯ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号：６は、配列番号：５で用いられたｃｒｔＯ遺伝子の推定アミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号：７〜１２は、配列番号：２、４、６に記載されたＣｒｔＯ酵素のうちの保存的モチーフの特徴的アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号：１３〜２５は、プライマーの配列である。
【００２８】
配列番号：２６〜３１は、それぞれロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２のｃｒｔＯモチーフ１〜６である。
【００２９】
配列番号：３２〜３７は、それぞれデイノコッカスのｃｒｔＯモチーフ１〜６である。
【００３０】
配列番号：３８〜４３は、それぞれシネコシスチスのｃｒｔＯモチーフ１〜６である。
【００３１】
配列番号：４４〜４５は、ピー・スチュワート（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）のｃｒｔ遺伝子を増殖させるために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３２】
配列番号：４６〜４７は、アール・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＮ１２のｃｒｔＯ遺伝子を増殖させるために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００３３】
発明の詳細な記述
該ｃｒｔＯ遺伝子とその発現産物、環状カロテノイドケトラーゼは、環状カロテノイド化合物を産生する能力を有する組換え生物の創製のために有用である。上記酵素をコードする核酸フラグメントは、ロドコッカス−エリスロポリス株から単離され、当業者によく知られたＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ演算法を用いて、ヌクレオチド配列および蛋白質配列を含む公開のデータベースと比較することにより同定された。ＭＥＭＥプログラムを用いた３個のＣｒｔＯ酵素間のモチーフ分析により、ロドコッカス、デイノコッカスおよびシネコシスチス由来のＣｒｔＯ酵素のうち、６個の保存的な特徴的モチーフが同定された。
【００３４】
本発明の遺伝子および遺伝子産物は、環状ケトカロテノイド化合物の産生と調節のため、種々の方法で使用できる。
【００３５】
微生物のイソプレノイド経路は、カロテノイド類、キノン類、スクワレンおよびビタミン類などの化合物を産生する種々の天然物産生の場である。これらの天然物は鎖長において、５炭素単位から５５炭素単位超であり得る。これらの化合物は化学的に製造することが困難であることから、微生物のイソプレノイド産生は一般に実用的に有益である（ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびリーンヒール（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１〜１９１頁（１９９１））。
【００３６】
ロドコッカス−エリスロポリスの場合、カロテノイド類を産生する固有の能力は特に有用である。ロドコッカス細胞は多くの溶媒に抵抗性があり、かつ混合相段階の展開を受けることができるため、ロドコッカス株を産生の場として利用することは有利である。ロドコッカス株はアクリルアミドなど、他の化学物質の商業的生産のための産生宿主として好首尾で利用されてきた。
【００３７】
本明細書に記載した遺伝子と遺伝子配列により、健康によいカロテノイド類産生をロドコッカス−エリスロポリス由来の単一の細胞蛋白産生物の中へ、直接組み込むことが可能となる。この点から、これらの遺伝子を組み込むこの株、またはいずれかの細菌株は、飼料に望ましい着色および健康上の利益を加えることが知られているカロテノイドが存在することから、動物飼料にとって、より望ましい産生宿主となっている。サケやエビの水産養殖は、本発明の特に有用な適用となる。これらの生物の価値にとって、カロテノイド着色は決定的に重要であるからである（エフ・シャヒジ（Ｆ．Ｓｈａｈｉｄｉ）、ジェイ・エイ・ブラウン（Ｊ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ）、「Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｅａｆｏｏｄ  ａｎｄ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３８（１）：１〜６７頁（１９９８））。特にケトカロテノイドのアスタキサンチンは強力な抗酸化剤であり、ヒトにおける免疫機能を高め、また、発癌を減少させることが報告されている（ジョウノウチ（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ）ら、Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）２３：１７１〜１８３頁；タナカ（Ｔａｎａｋａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）５５：４０５９〜４０６４頁）。
【００３８】
本開示において、多くの用語と略語が用いられており、以下の定義が与えられている。
【００３９】
「オープン・リーディング・フレーム」の略語はＯＲＦである。
【００４０】
「ポリメラーゼ連鎖反応」の略語はＰＣＲである。
【００４１】
本明細書で用いられる「単離された核酸フラグメント」とは、一本鎖または二本鎖で、場合によっては、合成、非天然、または変化させたヌクレオチド塩基を含有しているＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態における単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１種以上のセグメントからなり得る。
【００４２】
用語の「イソプレノイド」または「テルペノイド」とは、カロテノイド類やキサントフィル類などの炭素数１０のテルペノイド類やその誘導体を含む、イソプレノイド経路から誘導されたいずれかの分子である化合物を指す。
【００４３】
用語の「ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２」または「ＡＮ１２」は、交換可能に用いられ、ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２株を指す。
【００４４】
用語の「ロドコッカス−エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２」または「ＡＴＣＣ４７０７２」は、交換可能に用いられ、ロドコッカス−エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２株を指す。
【００４５】
用語の「カロテノイド」とは、５個の炭素イソプレン単位から縮合されたポリエン骨格からなる化合物を指す。カロテノイド類は非環式であるか、または、末端に１個（単環式）または２個（二環式）の環状末端基を有し得る。用語の「カロテノイド」は、カロテン類とキサントフィル類の双方を含み得る。「カロテン」とは、炭化水素カロテノイド類を指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−またはアルデヒド官能基の形体で、またはグリコシド類、グリコシドエステル類または硫酸塩の内部に１個以上の酸素原子を含有するカロテン誘導体は、集合的に「キサントフィル類」として知られている。本発明において特に好適なカロテノイド類は単環式または二環式カロテノイド類である。
【００４６】
用語の「カロテノイドケトラーゼ」または「ケトラーゼ」または「環状カロテノイドケトラーゼ」とは、単環式または二環式カロテノイド類のイオノン環にケト基を付加することのできる酵素群を指す。
【００４７】
用語の「モチーフ」とは、蛋白質配列群に見出される短い保存的アミノ酸配列を指す。モチーフ類は、認識配列を形成することが多いか、または、ドメインのうち、保存性の高い部分である。モチーフとはまた、それらのサイズにはよらず、全ての局在化した相同領域を指すことができる。モチーフの用語を多義性や鎖長の挿入を示すアミノ酸の特性や他の特性からなる複数の短い配列モチーフの記述に用いることもあり得る。
【００４８】
用語の「保存的な特徴的モチーフ類」、または「保存的アミノ酸モチーフ類」または「特徴的モチーフ」とは、ＣｒｔＯケトラーゼ酵素間に共通であって、その存在が、環状カロテノイドケトラーゼ機能性の特徴となっているアミノ酸配列を指す。
【００４９】
用語の「ケト基」または「ケトン基」は交換可能に用いられ、カルボニル基が２個の炭素原子に結合している基：Ｒ２Ｃ＝Ｏ（どちらのＲもＨではない）を指す。
【００５０】
本明細書に用いられる「実質的に類似した」とは、１個以上のヌクレオチド塩基の変化により１個以上のアミノ酸置換を生じるが、そのＤＮＡ配列にコードされた蛋白質の機能的性質に影響を与えない核酸ヌクレオシドを指す。「実質的に類似した」とはまた、１個以上のヌクレオチド塩基の変化がアンチセンスまたは共抑制法により遺伝子発現の変化を媒介する核酸フラグメントも指す。「実質的に類似した」とはまた、１個以上のヌクレオチド塩基の欠失または挿入などが、それによって生じる転写産物の機能的性質に実質的に影響を与えない本発明の核酸フラグメントの変更をも指す。したがって、本発明は、特定の例示的配列以外のものも包含していることが解される。
【００５１】
例えば、与えられた部位で化学的に等価なアミノ酸の産生をもたらすが、コードされた蛋白質の機能的性質に影響を与えない遺伝子における変更が、一般的であることは当業界によく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５群中の１群における交換と規定されている。
１．小型の脂肪族で非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性で負に荷電した残基およびそのアミド類：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大型の脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．大型の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００５２】
したがって、疎水性のアミノ酸である、アミノ酸アラニンのコドンは、他のより疎水性の低い残基（グリシンなど）またはより疎水性の高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換できる。同様に負に荷電したある残基を他のものへ置換（アスパラギン酸をグルタミン酸へ、など）、または正に荷電したある残基を他のものへ置換（リシンをアルギニンへ、など）する変更によっても機能的に等価な産物を生じることが予測できる。
【００５３】
また多くの場合、蛋白質分子のＮ末端部分およびＣ末端部分を変更しても、その蛋白質の活性は変化しないと考えられる。
【００５４】
企図された修飾の各々、また、コードされた産物の生物活性保持の測定は、当業界の慣例的技術の内にある。さらに、本発明に包含された実質的に同類の配列はまた、ストリンジェント条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、本明細書に例示された配列とハイブリダイズする能力によっても定義されることは、当業者によって認識される。本発明と実質的に同類の核酸フラグメントの好ましいものは、本明細書に報告されている核酸フラグメントのＤＮＡ配列と、少なくとも８０％同一であるＤＮＡ配列を有する核酸フラグメントである。さらに好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されている核酸フラグメントのＤＮＡ配列と、少なくとも９０％同一であるＤＮＡ配列を有する核酸フラグメントである。本明細書に報告されている核酸フラグメントのＤＮＡ配列と、少なくとも９５％同一であるＤＮＡ配列を有する核酸フラグメントが最も好ましい。
【００５５】
核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、他の核酸分子にアニールできる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの他の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションの条件と洗浄条件はよく知られており、サンブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）、フリッシュ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．）およびマニアチス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー（１９８９）、特にその中の１１章と表１１．１（全体を本明細書に援用する）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、関連性の遠い生物の相同配列などのいくらか類似したフラグメントの選別、密接に関連した生物の機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似したフラグメントの選別のために調整できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件のセットの１つでは、以下の一連の洗浄を用いる：室温で１５分間、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始、その後４５℃で３０分間、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで５０℃で３０分間、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復。より好ましいストリンジェンシー条件のセットでは、より高い温度を用いるが、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの最後の２回の３０分間の洗浄温度を６０℃に上げること以外、洗浄は上記の条件と同じである。他の好ましい高ストリンジェント条件のセットでは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回の最終洗浄を用いる。ハイブリダイゼーションには、二つの核酸が相補的配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依って、塩基間の誤対合が起こる可能性がある。核酸のハイブリッド形成のための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、および相補正の程度に依っており、変数は当業界によく知られている。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高くなるにつれて、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００個のヌクレオチド長を超えるハイブリッドに関しては、Ｔｍを算出する等式が誘導されている（サンブルックら、上記９．５０〜９．５１を参照）。それより短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチド類を用いるハイブリダイゼーションでは、誤対合の位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サンブルックら、上記１１．７〜１１．８を参照）。１つの実施形態では、ハイブリッド形成が可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。ハイブリッド形成が最短の核酸の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは、少なくとも約２０個のヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも３０個のヌクレオチドの長さである。さらに、温度および洗浄溶液の塩濃度は、プローブの長さなどの要因に依って、適宜調整できることは、当業者に認識されるであろう。
【００５６】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含んでなり、当業者による配列のマニュアル評価、またはＢＬＡＳＴ（アルシュール・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．）ら、「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照）などの演算法を用いて、コンピュータ自動配列比較および同定により、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定する。一般に、１０個以上の連続アミノ酸配列または３０個以上のヌクレオチド配列が、ポリペプチド配列または核酸配列を推定的に同定するために知られた蛋白質または遺伝子と相同していることが必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の連続したヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ類を、配列依存的な遺伝子同定法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニまたはバクテリオファージプラークのインサイチュのハイブリダイゼーション）において用いることができる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、プライマーを含んでなる特定の核酸フラグメントを得るために、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用できる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含んでなる核酸フラグメントを具体的に同定し、および／または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、部分的または完全アミノ酸配列、ならびに１種以上の特定の微生物蛋白質をコードするヌクレオチド配列を教示する。当業者は、本明細書に報告された配列の利益を得て、当業者に知られた目的のために開示された配列の全て、または実質的な部分を直ちに利用できる。したがって、本発明は、添付する配列リストに報告された完全配列ならびに上記に定義されたこれらの配列の実質的な部分を含んでなる。
【００５７】
用語の「相補的」は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を述べるために用いられる。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明はまた、添付する配列リストに報告された完全配列ならびに実質的に類似の核酸配列に相補的な単離された核酸フラグメントを含む。
【００５８】
当業界に知られた用語の「パーセント同一性」とは、複数配列を比較することにより決定される２種以上のポリペプチド配列または２種以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当業界において、「同一性」とはまた、場合によっては、このような配列鎖間のマッチによって決定できるポリペプチド配列間、またはポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度を意味する。「同一性」と「類似性」とは、限定はしないが、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（レスク・エイ・エム（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．）編集）、ニューヨーク州オックスフォード大学プレス（１９８８）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（スミス・ディー・ダブリュー（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．）編集）ニューヨーク州のアカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９３）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ」（グリフィン・エイ・エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．）およびグリフィン・エイチ・ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．）編集）ニュージャージー州のヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９４）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（フォン・ヘインジ・ジー（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．）編集）アカデミック・プレス、（１９８７）；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（グリブスコフ・エム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．）およびデベロイクス・ジェイ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．）編集、ニューヨーク州のストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９９１））に記載された方法など、知られた方法によって容易に計算できる。同一性を決定する好ましい方法は、被験配列間の最良のマッチを得るためにデザインされる。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用できるコンピュータ・プログラムにコード化されている。配列アライメントとパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォメーション・コンピューティング一式のメガライン・プログラム（ウィスコンシン州マジソンのＤＮＡスター・インク（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．））を用いて実施できる。配列のマルチプルアライメントを、デフォルト・パラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）でクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法のアライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３頁）を用いて実施した。前記クラスタル法を用いるペアワイズアライメントに関するデフォルト・パラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００５９】
好適な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性をもち、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチド類をコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントである。好適な核酸フラグメントは、上記の類似性を有するのみならず、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドを典型的にコードする。
【００６０】
「コドン縮退」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列を変異させる遺伝子コードの性質を指す。したがって、本発明は、配列番号２および７〜１２に記載の本微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたは実質部分をコードする任意のアミノ酸フラグメントに関する。当業者は、所与のアミノ酸を明示するために、ヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」についてよく認識している。したがって、宿主細胞において発現改善のための遺伝子を合成する場合、そのコドン利用頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用頻度に近づくように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６１】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた方法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドのビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを結合し、遺伝子セグメントを形成するようにアニールされ、次いで酵素的に組み立てられて全体の遺伝子を構築する。ＤＮＡ配列に関連する場合、「化学的に合成された」とは、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動の化学的合成が、十分に確立された方法を用いて達成でき、または自動化化学合成が、多くの商業的に入手できる機械装置の１つを用いて実施できる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映させるヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適遺伝子発現のために適合化させることができる。コドンの利用が宿主により好まれるこれらコドンに対してバイアスされている場合、当業者は、遺伝子発現が好結果となる可能性を認識する。配列情報が入手できる宿主細胞から誘導された遺伝子調査に基づき好ましいコドンが決定できる。
【００６２】
「遺伝子」とは、コード配列の前にあるか（５’非コード配列）、またコード配列の後にある（３’非コード配列）調節配列を含む、特定の蛋白質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然の遺伝子」とは、天然にそれ自体の調節配列と共に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、天然には共に見出されない調節配列およびコード配列を含んでなる天然遺伝子ではない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来の調節配列およびコード配列、または同一の起源由来ではあるが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」とは、微生物のゲノム内の本来の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、通常、宿主生物に見出されないが、遺伝子伝達により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００６３】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連したコード配列の翻訳に影響を与える。調節配列としてはプロモータ類、翻訳リーダー配列、イントロン類、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を挙げることができる。
【００６４】
「プロモータ」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモータ配列の３’に位置する。プロモータ類は、その全体が天然遺伝子から由来するか、または天然に見出される種々のプロモータ類に由来する種々の要素からなるか、または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。種々のプロモータ類は、種々の組織または細胞種、または種々の発達段階、または種々の環境あるいは生理的条件における遺伝子発現を指令できることが当業者により解される。大抵の細胞種においてほとんどの時間、遺伝子を発現させるプロモータは、通常、「構成的プロモータ」と呼ばれる。多くの場合、調節配列の正確な境界は、完全には定義されていないことから、種々の長さのＤＮＡフラグメントが、同一のプロモータ活性を有し得ることがさらに認識される。
【００６５】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置したＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用することができる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することにより特徴付けられる。
【００６６】
「ＲＮＡ転写産物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産生物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的複製である場合、それは主要な転写産物を指し、または主要転写産物の転写プロセシング後に誘導されるＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンなしで、また、細胞により蛋白質に翻訳できるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的で、ｍＲＮＡから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写産物を指し、細胞により蛋白質に翻訳できる。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の主要転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子発現を遮断するＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号；国際公開第９９２８５０８号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の一部、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列のいずれかであってよい。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが、細胞プロセスに作用する他のＲＮＡを指す。
【００６７】
用語の「操作可能に結合した」とは、１個の核酸フラグメント上の核酸配列が対合して、その結果、ある機能が他の機能によって影響を受けていることを指す。例えば、プロモータが、そのコード配列に影響を及ぼすことができる場合、そのプロモータは操作可能にに結合している（すなわち、コード配列は、そのプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、調節配列にセンス方向またはアンチセンス方向で操作可能に結合できる。
【００６８】
本明細書で用いられる用語の「発現」とは、本発明の核酸フラグメントに由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と着実な蓄積を指す。発現とは、また、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
【００６９】
「形質転換」とは、宿主生物のゲノム内へ、核酸フラグメントが転移し、遺伝子的に安定な遺伝が生じることを指す。形質転換した核酸フラグメントを含有している宿主生物は、「遺伝形質転換」または「組換え」または「形質転換」した生物と言われる。
【００７０】
用語の「炭素基質」とは、本発明の宿主生物によって代謝されることのできる炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖、多糖類およびそれら混合物の１炭素基質からなる群から選択される炭素源を指す。
【００７１】
用語の「プラスミド」、「ベクター」または「カセット」とは、細胞の中心的な部分ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常、環状の二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態にある染色体以外の因子を指す。これらの要素は、任意の起源由来の自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線形または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであって、その中では、多くのヌクレオチド配列が独特の構造へと結合または組換えられて、適切な３’未翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモータフラグメントやＤＮＡ配列を細胞内へ導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、ある特定の宿主細胞の形質転換を促進させる因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、異種の宿主においてその遺伝子発現を高めることのできる因子を有する特定のベクターを指す。
【００７２】
用語の「変化した生物活性」とは、微生物核酸配列によってコードされた蛋白質に関連したアッセイ法によって測定できる活性であって、天然の微生物配列に関連した活性より高い、または低い活性を指す。「増強した生物活性」とは、天然の配列に関連した活性よりも増強して変化した活性を指す。「減少した生物活性」とは、天然の配列に関連した活性よりも減少して変化した活性を指す。
【００７３】
用語の「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の分析に有用な何らかのコンピュータ演算法またはソフトウェアプログラムを指す。配列分析ソフトウェアは、商品として入手できるか、または独立して開発できる。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はしないが、ＧＣＧプログラム一式（ウィスコンシン州マジソンのウィスコンシン・パッケージ・バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（米国５３７１５ウィスコンシン州マジソン、パーク通り１２２８ＳのＤＮＡスター・インク（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．））、およびスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）演算を組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（ダブリュー・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年開催、１１１〜２０頁。編集者：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）。出版元：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））が挙げられる。用語の「ＭＥＭＥ」とは、ｃｒｔＯ配列における特徴的な６個の保存的モチーフを同定するために用いられる、隠れマルコフモデルに基づいたソフトウェアプログラムを指す（チモシー・エル・ベイリイ（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｌ．Ｂａｉｌｅｙ）およびチャールズ・エルカン（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅｌｋａｎ）、「Ｆｉｔｔｉｎｇ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８〜３６頁、カリフォルニア州メンロパークのＡＡＡＩプレス（Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年）。「ＭＡＳＴ」（チモシー・エル・ベイリイ（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｌ．Ｂａｉｌｅｙ）およびマイケル・グリブスコフ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）、「Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐ−ｖａｌｕｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈｅｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ、１４巻、４８〜５４頁、１９９８年）とは、ＭＥＭＥプログラムからのアウトプットを取り入れ、ＥＭＢＬやスイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）などの蛋白質データベースに当たって同定モチーフを探索するプログラムである。本出願の明細書中には、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、分析結果は、他に明記しない限り、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書に用いられる「デフォルト値」とは、最初の開始時に、元来ソフトウェアにロードされていた何らかの数値またはパラメータのセットを意���する。
【００７４】
本明細書に用いられる標準的な組換えＤＮＡ法および分子クローニング法は、当業界によく知られており、サンブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）、フリッシュ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．）およびマニアチス・ティー・（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８９）（以後「マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；シルハービイ・ティ・ジェイ（Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．）、ベナン・エム・エル（Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト・エル・ダブリュー（Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８４）；オースベル・エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシ・アンド・ワイリイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）により出版（１９８７））によって記載されている。
【００７５】
本発明は、ロドコッカスから単離され、環状カロテノイドケトラーゼをコードする新規に発見されたｃｒｔＯ遺伝子を提供する。本発明は、以前デイノコッカス−ラジオデュランスのフェイトンデヒドロゲナーゼとして同定された遺伝子が環状カロテノイドケトラーゼの活性を有するという知見を提供する。本発明の配列は、単環式および二環式カロテノイド化合物から環状ケトカロテノイド類を生産するために組換え宿主においてインビトロおよびインビボで使用できる。
【００７６】
ｃｒｔＯヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を、スミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）のアライメントアルゴリズム（ダブリュー・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年開催、１１１〜２０頁。編集者：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）。出版元：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム）を用いて、公的のデータベースと比較すると、最も類似している既知配列は、本明細書に報告されるアミノ酸配列に、５３２個のアミノ酸長にわたり、約３５％一致していることが判る。したがって、好ましいアミノ酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％一致し、より好ましいアミノ酸配列は、本明細書に報告されたアミノ酸フラグメントに少なくとも約８０％〜９０％一致し、最も好ましいものは、本明細書に報告されたアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％一致する核酸フラグメントである。同様に、当該配列に対応する核酸配列をコードする好ましいｃｒｔＯは、活性蛋白質をコードし、かつ本明細書に報告された核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。より好ましいｃｒｔＯ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本明細書に報告されたアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるｃｒｔＯ核酸フラグメントである。
【００７７】
３つのｃｒｔＯ遺伝子についてモチーフ分析を行った。この分析では、ロドコッカスＡＮ１２から単離されたＣｒｔＯ酵素のアミノ酸配列（配列番号：２）、デイノコッカスから単離されたＣｒｔＯ酵素のアミノ酸配列（配列番号：４）、およびシネコシスチスから単離されたＣｒｔＯ酵素のアミノ酸配列（配列番号：６）と比較した。この分析結果は、３種全ての酵素に存在する６個の保存性の高い特徴的モチーフを同定した（図３）。これらのモチーフコンセンサス配列は、配列番号：７〜１２に記載されている。単一ポリペプチドにおけるこれら全てのモチーフの存在は、ＣｒｔＯ、ケトラーゼ機能性に特徴的であると考えられる。したがって、本発明は、カロテノイドケトラーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供し、前記酵素は、配列番号：７〜１２に記載のＣｒｔＯ特徴的モチーフを定義するアミノ酸配列の全てに対して、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて少なくとも７０％一致する。同様に本発明は、カロテノイドケトラーゼ活性を有するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、配列番号：７〜１２に表されているＣｒｔＯの特徴的モチーフを定義するアミノ酸配列の全てに対して、スミス−ウォーターマン法のアライメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する。前述したことにもかかわらず、本発明は、シネコシスチス種ＰＣＣ６８０３ｃｒｔＯ遺伝子、および配列番号：５および６でそれぞれ表されているフェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら（Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２；９７２８〜９７３３頁）により記載された酵素は明白に除外している。
【００７８】
相同体の単離
本発明の核酸フラグメントは、同一種または他の微生物種由来の相同蛋白質をコードする遺伝子を単離するために使用できる。配列依存のプロトコルを用いる相同遺伝子の単離は当業界によく知られている。配列依存のプロトコルの例としては、限定はしないが、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅法の種々の利用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、ら、米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、エス・テイバー（Ｔａｂｏｒ、Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８２、１０７４頁、（１９８５））またはストランド置換増幅（ＳＤＡ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８９、３９２頁（１９９２））が挙げられる。
【００７９】
例えば、本発明の蛋白質またはポリペプチドと同様のものをコードする遺伝子は、当業者によく知られた方法論を用いて、任意の所望の細菌からライブラリをスクリーンするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして前記核酸フラグメントの全てまたは一部を用いることにより直接単離できるであろう。前記核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブ類をデザインし、当業者に知られた方法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））により合成できる。さらに、全体配列は、ランダムプライマーのＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、末端標識法、または利用できるインビトロ転写システムを用いるＲＮＡプローブなど、当業者に知られた方法により、ＤＮＡプローブ類を合成するために直接利用できる。さらに、特定のプライマー類をデザインし、本配列の一部または完全長を増幅させるために使用できる。得られた増幅産物を、増幅反応中に直接標識または増幅反応後に標識でき、適切なストリンジェンシー条件下で完全長のＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして用いることができる。
【００８０】
ＰＣＲ増幅法において典型的には、前記プライマー類は、種々の配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に依って、前記プライマー類の配列は、標的核酸の効率的で忠実な複製に供するようにデザインされる必要がある。ＰＣＲプライマーデザイン法は、当業界によく知られている（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ケイ・イー・デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編集、（１９８６）３３〜５０頁、バージニア州ヘルンドンのＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ））；ダブリュー・リチリク（Ｒｙｃｈｌｉｋ、Ｗ．）、ビー・エイ・ホワイト（Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ａ．）（編集）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９８６）、１５巻、３１〜３９頁、「ＰＣＲプロトコル：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ニュージャージー州トトワのヒューマニア・プレス（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ））。
【００８１】
一般に、前記配列の２つの短いセグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応のプロトコルにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードする、より長い核酸フラグメントを増幅するために用いることができる。前記ポリメラーゼ連鎖反応はまた、１種のプライマー配列が前記核酸フラグメントに由来し、他のプライマー配列が真核性遺伝子のｍＲＮＡ前駆物質の３’末端におけるポリアデニル酸域の存在を利用する場合、クローン化核酸フラグメントのライブラリに対して実施できる。ポリアデニル化ｍＲＮＡを欠く微生物遺伝子の場合、ランダムプライマー類を用いることができる。ランダムプライマー類もまた、ＤＮＡからの増幅にとって有用であると思われる。
【００８２】
他に、第２のプライマー配列は、クローニングベクター由来の配列に基づくことができる。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８））に従い、転写におけるある単一箇所と３’または５’末端間の領域の複製を増幅するためにＰＣＲを用いてｃＤＮＡを生成することができる。本配列から、３’および５’方向に方向付けられたプライマー類をデザインできる。商品として入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ）を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離できる（オーハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７（１９８９））。
【００８３】
他に、本配列は、ホモログの同定のためのハイブリダイゼーション試剤として使用できる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素としては、プローブ、関心対象の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有すると考えられるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。本発明のプローブは、典型的には、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列と「ハイブリッド形成可能」である。プローブ長は５塩基から数万塩基まで変化し、実施される特定の試験に依存する。典型的には、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が好適である。検出すべき核酸配列に相補的であることが必要なのはプローブ分子の一部だけである。また、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全な相補的分子間でも生じ、その結果、ハイブリッドが形成された領域における塩基のある一定の小部分は、正しい相補的塩基と対合していない。
【００８４】
ハイブリダイゼーション法は、十分に規定されている。典型的には、プローブとサンプルを、核酸のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で混合しなければならない。このことは、プローブとサンプルを無機塩または有機塩の存在のもとで、適当な濃度と温度条件下で接触させることを含む。プローブと核酸サンプルとの間に全ての可能なハイブリダイゼーションが生じ得るように、プローブと核酸サンプルを十分長時間接触させなければならない。混合物中のプローブ、または標的濃度により、ハイブリダイゼーションが生じるために必要な時間が決定される。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベート時間は短くなる。場合によっては、カオトロピック試剤を加えてもよい。カオトロピック試剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック試剤は、短いオリゴヌクレオチドプローブのセンシティブかつストリンジェントなハイブリダイゼーションを室温で可能にする［ヴァンネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１頁］。好適なカオトロピック試剤としては、特に塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的にカオトロピック試剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望の場合は、ハイブリダイゼーション混合物に、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを加えることができる。
【００８５】
種々のハイブリダイゼーション溶液が使用できる。典型的には、これらの溶液は、約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５Ｍ〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５Ｍ〜０．１Ｍのクエン酸ナトリム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの緩衝剤、約０．０５％〜０．２％のドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、または０．５ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシア・インク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）および血清アルブミンが用いられる。典型的なハイブリダイゼーション溶液にはまた、例えば子牛胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなどの約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの核断片ＤＮＡ由来の未標識担体核酸、および場合によっては、約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌグリシンが含まれる。ポリエチレングリコール、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー類、および硫酸デキストランなどのアニオン性サッカライドのポリマー類などの種々の極性水溶性試剤または膨潤性試剤を含む体積排除試剤などの他の添加物もまた含み得る。
【００８６】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイ方式に適合性がある。最も好適なものの１つはサンドイッチアッセイ方式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合性がある。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は固体支持体である。前記固体支持体は、未標識で配列の一部に相補的である核酸プローブに固定化されて、それに吸着または共有結合している。
【００８７】
当該ヌクレオチドおよび推測されたアミノ酸配列を利用できることから、ＤＮＡ発現ライブラリの免疫学的スクリーニングが容易になる。当該アミノ酸配列の部分を表す合成ペプチドを合成できる。これらのペプチドは、動物を免疫化して、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたは蛋白質に対する特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するために利用できる。次にこれらの抗体を用いてＤＮＡ発現ライブラリを選抜し、関心対象の完全長ＤＮＡクローン類を単離する（アール・エイ・ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ．Ａ．）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１頁（１９８４）；マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））。
【００８８】
組換え体発現−微生物学
当該配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種性の宿主細胞内、特に微生物宿主の細胞内で産生できる。組換え微生物宿主における発現は、種々の経路の中間体の発現、既に宿主内に存在している経路の調節、または、これまでは宿主を使用して可能でなかった新規産物の合成のために有用であり得る。
【００８９】
当該遺伝子および核酸フラグメントの発現にとって好ましい異種性の宿主細胞は、真菌属または細菌属内に幅広く見つけることができ、また、温度、ｐＨ値および溶媒耐容性の広範囲にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌類、酵母および糸状菌が当該核酸フラグメントの発現に好適な宿主であると考えられる。転写、翻訳および蛋白質生合成の装置は細胞の供給源に係りなく同一であるため、機能的遺伝子は、細胞バイオマスを生成するために用いられる炭素供給源に係りなく発現する。光合成宿主または化学的独立栄養宿主の場合、大規模な微生物の増殖および機能的遺伝子の発現には、広範囲の単純な、または複雑な炭水化物、有機酸やアルコール、メタン、二酸化炭素などの飽和炭水化物を利用できる。しかしながら、機能的遺伝子は、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または無機小イオン類などの任意の微量栄養物の形態と量を含む特定の増殖条件によって調節、抑制または低下され得る。さらに、培養液に添加され、典型的には栄養物またはエネルギー源としては考えられていない特定の調節分子の存在または非存在下で機能的遺伝子の調節が達成できる。遺伝子発現においては増殖速度もまた重要な調節因子となり得る。宿主株の例としては、限定はしないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター・クロロビウム（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎ���ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびミキソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）などの細菌種、真菌種または酵母種が挙げられる。
【００９０】
外来蛋白質の高レベル発現を指令する調節配列を含有する微生物発現システムと発現ベクターは当業者によく知られている。当該ケトラーゼ類の発現にキメラ遺伝子を構築するために、これらのいずれかを使用できると考えられる。次にこれらのキメラ遺伝子を形質転換により適切な微生物内へ導入し、高レベルの酵素発現を提供することができると考えられる。
【００９１】
したがって、例えば、適切なプロモータの制御下で当該細菌酵素をコードするキメラ遺伝子を導入することにより環状カロテノイド産生の増加または変化が示されると予想される。当該遺伝子を天然宿主細胞並びに異種性の宿主、双方内に発現させることは有用であると考えられる。当該ｃｒｔＯ遺伝子の天然宿主内への導入により、現存カロテノイドの産生レベルが変化するであろう。さらに、当該遺伝子は現存カロテノイド経路が操作できる非天然宿主細菌内へも導入できる。
【００９２】
本発明によって産生する特定のケトカロテノイドとしては、限定はしないが、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルビン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、４−ケト−ガンマ−カロテン、４−ケト−ルビキサンチン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、デオキシフレキシキサンチン、ミクソバクトンが挙げられる。アスタキサンチン、４−ケト−ルビキサンチンの産生は、特に興味深く、その合成は図１に示してある。当該ＣｒｔＯ酵素のための特異的基質は単環式または二環式カロテノイドである。環状カロテノイド類は当業界によく知られており、商品として入手できる。本発明においてＣｒｔＯケトラーゼの基質として好ましいものは、環状カロテノイドであり、限定はしないが、β−カロテン、γ−カロテン、ゼアキサンチン、ルビキサンチン、エキネノンおよびトルレンが挙げられる。
【００９３】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクター、またはカセットは当業界によく知られている。典型的にはベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択性マーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。好適なベクターは、転写開始制御を有している遺伝子の５’領域および転写の終結を制御するＤＮＡフラグメントの３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞の相同遺伝子から誘導される場合が最も好ましいいが、このような制御領域は、産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導される必要はないことを理解すべきである。
【００９４】
所望の宿主細胞内に当該ＯＲＦ類の発現を推進するために有用な開始制御領域、すなわちプロモータ類は数多く存在し、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を推進することのできる任意のプロモータが本発明に好適であり、限定はしないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０，ＡＤＨ１，ＰＧＫ、ＰＨＯ５，ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア属における発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）、並びにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモータ類およびバチルス属における発現に有用である種々のファージプロモータ類が挙げられる。クロラムフェニコール耐性遺伝子プロモータなどのプロモータ類は、ロドコッカス属における発現に有用であり得る。
【００９５】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の種々の遺伝子から誘導できる。場合によっては、終結部位は必要ないが、含まれていれば最も好ましい。
【００９６】
当該遺伝子の配列に対する知見は、このような経路を有する任意の生物、特にロドコッカス属におけるカロテノイド生合成経路の操作に有用となる。遺伝子経路の操作法は当業界において一般的であり、よく知られている。特定の経路における選択された遺伝子は種々の方法でアップレギュレートまたはダウンレギュレートできる。また、経路の競合で、遺伝子中断や同様の方法によって生物は、除去または純化できる。
【００９７】
一旦、基本的な遺伝子経路が同定されて配列決定されると、特定の遺伝子がアップレギュレートされて、その経路の産出を増加させることができる。例えば、標的遺伝子の追加複製物をｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミドによって宿主細胞内に導入することができる。他に、標的遺伝子を、非天然プロモータに制御されるように変更できる。細胞周期または発酵操作中にある特定の時点で経路が働くことが望まれる場合、調節または誘導プロモーターを、標的遺伝子の天然プロモーターに置き換えるために使用できる。同様に、幾つかの場合、天然または内因性プロモーターは、遺伝子発現を増加させるために変更できる。例えば、内因性プロモータをインビボで変異、欠失および／または置換によって、変更できる（クミーク（Ｋｍｉｅｃ）、米国特許第５，５６５，３５０号；ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照）。
【００９８】
他に、標的経路において、またはエネルギーまたは炭素のための競合シンクとして働き得る競合経路において、一定の遺伝子の発現を減少する、または除去することが必要な場合もある。この目的のために、遺伝子をダウンレギュレートする方法が開発されている。中断すべき遺伝子配列が知られている場合、遺伝子ダウンレギュレーションの効果的な方法の１つは、転写を中断するために、外来ＤＮＡを構造遺伝子内へ挿入する標的遺伝子中断である。これは、中断すべき遺伝子部分に高い相同性を有する配列が側面に付いた挿入ＤＮＡ（遺伝子マーカーであることが多い）を含んでなる遺伝子カセット類の創製によって実施できる。宿主細胞内へのカセット導入は、細胞固有のＤＮＡ複製機構による外来ＤＮＡの構造遺伝子挿入をもたらす（例えば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７〜４６２２頁、バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら（１９９３）Ｇｅｎｅ１３６：２１１〜２１３頁、ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９〜２５２４頁、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０〜２７７頁を参照）。
【００９９】
アンチセンス法は、標的遺伝子の配列が知られている遺伝子をダウンレギュレートするもう１つの方法である。これを達成するためには、所望の遺伝子の核酸セグメントをクローン化し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、プロモータに操作可能に結合させる。次にこの構築体を宿主細胞に導入すると、ＲＮＡのアンチセンス鎖が産生される。アンチセンスＲＮＡは、関心対象の蛋白質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することによって遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定遺伝子の発現を減少させるためのアンチセンス法には特別な配慮が伴うことを知っている。例えば、アンチセンス遺伝子の適切な発現レベルには、当業界の技術者に知られた種々の調節因子を利用した種々のキメラ遺伝子の使用が必要と思われる。
【０１００】
標的遺伝子中断とアンチセンス法は、配列が知られている遺伝子をダウンレギュレートする効果的な方法を提供するが、配列に基づかない特異性のより低い他の方法論が開発されている。例えば、細胞をＵＶ照射に曝露してから、所望の表現型に関して選別できる。化学的試剤による変異誘発もまた、変異体生成のために効果的であり、一般に用いられている物質としては、ＨＮＯ２やＮＨ２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を与える化学物質、並びにフレームシフト変異を引き起こすことで著明なアクリジン染料などの複製ＤＮＡに影響を及ぼす試剤が挙げられる。照射または化学試剤を用いた変異創製のための特定の方法は当業界で十分に文書化されている。例えば、トーマス・ディー・ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９）、マサチューセッツ州サンダーランドのＳｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、またはデシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ）、ヴィー・ムクンド（Ｍｕｋｕｎｄ、Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７頁（１９９２））を参照されたい。
【０１０１】
遺伝子中断の他の非特異的方法は、転移因子、すなわちトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡ中に無作為に挿入されるが、後で配列に基づいて回収され、挿入に基づいた箇所を決定できる遺伝子因子である。インビボ、インビトロ両方の転移法が知られている。両法とも、トランスポゼースと組合わせた転移因子の使用を含んでいる。転移因子、すなわちトランスポゾンを、トランスポゼース存在下、核酸フラグメントと接触させると、転移因子は核酸フラグメント内へ任意に挿入される。中断された遺伝子は、転移因子の配列に基づいて同定できるため、この方法は任意の変異および遺伝子単離にとって有用である。インビトロ転写用キットは商品として入手できる（例えば、酵母Ｔｙ１因子に基づいたザ・プライマー・アイランド・トランスポジション・キット（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）は、ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手でき；細菌のトランスポゾンＴｎ７に基づいたザ・ゲノム・プライミング・システム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、マサチューセッツ州ビベルリイのニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手でき；細菌の転写因子Ｔｎ５に基づいたＥＺ：：ＴＮのトランスポゾン・インサーション・システムス（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ウィスコンシン州マジソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手できる）。
【０１０２】
工業的生産
当該ＣｒｔＯ遺伝子を用いて環状ケトカロテノイド化合物の商業的生産が望まれる場合、種々の培養方法論が適用できる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現した特定遺伝子産物の大規模生産はバッチ方法論と連続培養方法論の双方により生産できる。
【０１０３】
伝統的なバッチ培養法は、培養液の組成が培養開始時に設定され、培養過程の間、人工的変更に供されない閉鎖系である。したがって、培養過程の開始時に培養液は、所望の単一または複数の生物と共にインキュベートされ、システムに何も添加せずに、増殖または代謝活性が許容される。しかし、典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨや酸素濃度などの因子を制御して試みられることが多い。バッチシステムにおいては、システムの代謝産物およびバイオマス組成は、培養が終る時まで、一定して変化する。バッチ培養内の細胞は、静的な誘導期から対数高増殖期までは緩やかで、最後に増殖率が減少、または停止する定常期に至る。処理を加えなければ細胞はついに死滅する。対数期における細胞が、最終産物または一部のシステムでは、中間体の生産バルクとなることが多い。他のシステムでは、定常期生産または指数関数期後の生産を得ることができる。
【０１０４】
標準的バッチシステムの変法に供給バッチシステムがある。供給バッチシステムもまた、本発明において好適であり、培養の進行に応じて基質の添加を増加させること以外は典型的なバッチシステムからなる。カタボライト抑制は細胞の代謝を阻害しがちであり、培養液中の基質量を制限したい場合に、供給バッチシステムは有用である。供給バッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解酸素、およびＣＯ２などの廃ガス分圧なおどの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ培養法および供給バッチ培養法は当業界で一般的によく知られており、それらの例は、本明細書に援用されている、トーマス・ディー・ブロック、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９）、マサチューセッツ州サンダーランドのＳｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．、またはデシュパンデ、ヴィー・ムクンド、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７頁（１９９２））に見ることができる。
【０１０５】
環状ケトカロテノイド類の商業的生産はまた、連続培養によって達成できる。連続培養は、規定の培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、順化培地のある等しい量を除去して処理する開放システムである。連続培養での細胞は、一定の高密度液相に維持され、細胞は主に対数増殖期にある。他に、連続培養は、固定化した細胞を用いて実施でき、そこでは炭素と栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物または廃棄産物が連続的に細胞集団から取り出される。細胞固定は、天然物質および／または合成物質からなる広範囲の固体支持体を用いて実施できる。
【０１０６】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１つの因子または幾つかの数の因子のモジュレーションができる。例えば、１方法では、炭素源または窒素レベルなどの栄養物を一定の割合に制限することが維持され、他の全てのパラメータは適度にされる。他のシステムでは、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変化させる一方で、培地濁度を測定して細胞濃度を一定に保つことができる。連続システムは安定状態の増殖条件を維持するために努めるもので、培地除去による細胞損失と培養中の細胞増殖率との均衡を保持しなければならない。連続培養処理のために栄養物および増殖因子をモジュレートする方法、並びに産物の形成率を最大化する技術は、工業的微生物学分野でよく知られており、種々の方法が上記ブロックにより詳述されている。
【０１０７】
本発明の発酵培地は、好適な炭素基質を含有しなければならない。好適な基質としては、限定はしないが、グルコースやフルクトースなどの単糖類、ラクトースやスクロースなどのオリゴ糖、デンプンやセルロ−スなどの多糖類、またはそれらの混合物、およびチ−ズ乳清浸透物、コーン浸し液、サトウダイコン液、オオムギモルトなどの再生可能な飼料ストックの未精製混合物が挙げられる。また、炭素基質は、基本的な生合成中間体への代謝的変換が立証されている二酸化炭素、メタン、メタノールなどの１炭素基質であってもよい。１種および２種の炭素基質の他に、代謝活性用にメチルアミン、グルコサミンおよび種々のアミノ酸など、他の多くの炭素含有化合物を利用するための、Ｃ１資化性菌生物もまた知られている。例えば、メチルアミンの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成するためにＣ１資化性酵母が知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７回（１９９３）、４１５〜３２頁。編集者：コリン・ジェイ・ムレル（Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ドン・ピー・ケリイ（Ｋｅｌｌｙ、Ｄｏｎ  Ｐ．）、発行元：英国アンドーバーのインターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ））。同様に、カンジダ属の様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（スルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５〜４８９頁（１９９０））。したがって、本発明において利用される炭素源は、多種多様の炭素含有基質を包含することができ、生物の選択によってのみ制限されることになる。
【０１０８】
組換え発現−植物
植物および藻類もまた、カロテノイド化合物を産生することが知られている。本発明の核酸フラグメントは、微生物の蛋白質を発現する能力を有する組換え植物を創製するために利用できる。好ましい植物宿主は、当該蛋白質の高生産レベルを維持する何れかの種である。好適な緑色植物としては、限定はしないが、ダイズ、ナタネ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ビー・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、コショウ、ヒマワリ（ヘリアンタス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ワタ（ゴッシイピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メディカゴ・サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コムギ（トリチカム種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ））、オオムギ（ホルデューム・バルガーレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（アベナ・サチバ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、Ｌ．）、モロコシ（ソルギウム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、コメ（オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、シロイヌナズナ、アブラナ科野菜（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラス・シード・クロップ（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、サトウダイコン、サトウキビ、豆類、エンドウ豆、ライ麦、アマ、硬葉樹、軟葉樹、およびまぐさが挙げられる。藻類としては、限定はしないが、スピルリナ、ヘモトコッカス、およびドナリエラなどの商業的に重要な宿主が挙げられる。カロテノイド化合物の産生はまた、所望の組織における、所望の発達段階での遺伝子発現を指令する能力のあるプロモータにコード領域が操作可能に結合している、本発明のキメラ遺伝子を先ず構築することによって達成できる。便宜性のため、前記キメラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモータ配列と翻訳リーダー配列を含んでなることができる。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もまた提供される必要がある。当該キメラ遺伝子は、遺伝子発現を促進するために１個以上のイントロンもまた含んでなることができる。
【０１０９】
コード領域の発現を誘導することのできる何らかのプロモータと何らかのターミネータの何らかの組合わせをキメラ遺伝子配列に用いることができる。プロモータ類とターミネータ類の好適な例のいくつかとして、ノパリン合成（ｎｏｓ）、オクトピン合成（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものが挙げられる。使用できる効率的な植物プロモータの１種は高レベル植物プロモータである。本発明の遺伝子配列と操作可能に結合したこのようなプロモータ類は、当該遺伝子産物の発現を促進できるはずである。本発明に使用できる高レベル植物プロモータ類としては、ダイズ由来のリブロース−１，５−ビスホスファートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）プロモータ（ベリイ−ロー（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３〜４９８頁、（１９８２））、およびクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質のプロモータが挙げられる。これら２種のプロモータは、植物細胞内で光誘導されることが知られている（例えば、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」、エイ・キャッシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ニューヨーク州のＰｌｅｎｕｍ（１９８３）、２９〜３８頁；ジー・コルジイ（Ｃｏｒｕｚｚｉ、Ｇ．）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９頁（１９８３）；およびピー・ダンスムア（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ、Ｐ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５頁（１９８３）を参照）。
【０１１０】
次に、当該キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクター類が構築できる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するために用いられる方法に依存する。当業者は、前記キメラ遺伝子含有の宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、および増殖させるためにプラスミド上に存在しなければならない遺伝子因子を十分認識している。当業者はまた、種々の独立した形質転換事象が種々のレベル、種々の発現パターンで生じ（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：２４１１〜２４１８頁；デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６頁）、したがって、所望の発現レベルと所望のパターンを示す株を得るためには、多くの事象をスクリーニングしなければならないこともまた認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３頁、（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロクゼク（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．６１８（１〜２）（１９９３）１３３〜１４５頁）、蛋白質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって達成できる。
【０１１１】
幾つかの適用に関しては、当該蛋白質を種々の細胞区画へと方向づけることは有用である。したがって、上記のキメラ遺伝子は、トランジット配列（ケイ・キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ、Ｋ．）、Ｃｅｌｌ５６：２４７〜２５３頁（１９８９））、小胞体の局在化をコードするシグナル配列または配列（ジェイ・ジェイ・クリスピールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、Ｊ．Ｊ．）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））、および／または既に存在している標的配列を除去した核局在化シグナル（エヌ・ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ、Ｎ．）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２頁（１９９２））などの適切な細胞内標的配列を有する酵素をコードするためのコード配列を変化させることによって、さらに追加できる。引用文献は、これら各々の例を提供しているが、そのリストは完全ではなく、本発明において有用なさらに多くの利用標的シグナルが将来発見されると考えられる。
【０１１２】
蛋白質工学
当該ヌクレオチド類は、増強した活性または変化した活性を有する遺伝子産物を産生するために使用できると考えられる。天然の遺伝子配列を変異させて、変化した活性または増強した活性を有する遺伝子産物を産生する種々の方法が知られており、限定はしないが、エラープローンＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９９年２月１５日）２７巻、４号、１０５６〜１０６２頁）；部位特異的変異誘発（クームズ（Ｃｏｏｍｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１頁、１プレート。編集者：アンゲレッティ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルス・ホーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）。発行元：カリフォルニア州サンディエゴのアカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ））および「遺伝子シャッフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号；米国特許第５，８１１，２３８号；米国特許第５，８３０，７２１号；および米国特許第５，８３７、４５８号、本明細書に援用されている）が挙げられる。
【０１１３】
遺伝子シャッフリング法は、容易に実施でき、変異率が高く、またスクリーニングが容易であることから、特に魅力的である。遺伝子シャッフリング法は、関心対象の遺伝子と類似したＤＮＡ領域、または異なってＤＮＡ領域双方の追加集団の存在下、関心対象の遺伝子を特定サイズのフラグメントへ制限エンドヌクレアーゼで切断することを含む。このフラグメントプールを次に変性し、再アニールして変異遺伝子を創製する。次に変異遺伝子を変化した活性に関してスクリーニングする。
【０１１４】
この方法により、本発明の当該微生物配列は変異し、変化した活性または増強した活性に関してスクリーニングできる。前記配列は、二本鎖であるはずで、５０ｂｐから１０ｋｂ範囲の種々の長さであり得る。前記配列は、当業界でよく知られた制限エンドヌクレアーゼを用いて、約１０ｂｐから１０００ｂｐ範囲のフラグメントへ任意に消化できる（上記マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））。当該微生物配列の他に、この微生物配列の全てまたは一部とハイブリッド形成可能なフラグメントの集団を加えることができる。同様に、当該配列とハイブリッド形成のできないフラグメントの集団も加えることができる。典型的には、これらの追加フラグメント集団は、核酸全体に比して、約１０倍から２０倍過剰の重量で加えられる。一般に、この方法を用いると、混合物中の種々の特異的核酸フラグメントの数は、約１００から約１０００となる。任意の核酸フラグメントの混合集団を変性して、一本鎖核酸フラグメントを形成し、次に再アニールする。他の一本鎖核酸フラグメントとの相同性領域を有する一本鎖核酸フラグメントだけが再アニールすることになる。任意の核酸フラグメントは加熱により変性できる。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性させるために必要な条件を決定できよう。この温度は、８０℃から１００℃までが好ましい。前記核酸フラグメントは、冷却によって再アニールできる。この温度は２０℃から７５℃までが好ましい。復元は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の追加によって加速される。好適な塩濃度は、０ｍＭから２００ｍＭの範囲であり得る。アニールした核酸フラグメントを次に、核酸ポリメラーゼとｄＮＴＰ類（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下、インキュベートする。前記核酸ポリメラーゼは、クレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼまたは当業界で知られた他のいずれのＤＮＡポリメラーゼであってよい。前記ポリメラーゼは、任意の核酸フラグメントへ、アニーリングの前にアニーリングと同時に、またはアニーリング後にに加えることができる。変性、復元およびポリメラーゼ存在下、インキュベートのサイクルは、所望の回数で反復される。このサイクルは、２回から５０回反復することが好ましく、この配列は、１０回から４０回反復することが好ましい。生じた核酸は約５０ｂｐから約１００ｋｂの範囲のより大型の二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングプロトコルおよび発現プロトコルによって発現および変化した活性に関してスクリーニングできる（上記マナティス（Ｍａｎａｔｉｓ）。
【０１１５】
さらに、ハイブリッド蛋白質は、遺伝子シャッフリング（エクソンシャッフリング）法を用いて、機能的ドメインの融合によって組み立てることができる（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、９４：１０６９〜１０７３頁（１９９７））。当該遺伝子の機能的ドメインは、他の遺伝子の機能的ドメインと組合わせて、所望の触媒機能を有する新規の酵素を創製することができる。ハイブリッド酵素は、ＰＣＲ重複伸張法を用いて構築し、当業者によく知られた方法を用いて種々の発現ベクター類内へクローン化できる。
【０１１６】
好ましい実施形態の記述
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株を含有する、源になる環境サンプルを廃水処理施設から得た。１ｍｌの活性スラッジを直接１０ｍｌのＳ１２培地に接種した。炭素とエネルギーの単一源としてアニリンを用いた。培養液は、２〜３日毎に、１００ｐｐｍのアニリンを追加して維持した。培養液を１４日毎に希釈した（１：１００希釈）。炭素とエネルギーの単一源としてアニリンを利用する細菌を、さらに単離してＳ１２寒天上で精製した。アニリン（５μｌ）を各培養皿のふたの内側に入れた。
【０１１７】
ＡＮ１２の１６  ｓｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、遺伝子バンクの配列データベースにおける他の１６  ｓｒＲＮＡ配列と比較すると、ＡＮ１２株由来の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と少なくとも９８％の類似性を有している。
【０１１８】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株のゲノムヌクレオチド配列を単離し、現存するデータベースの遺伝子と比較した。２種の異なった推定フィトエンデヒドロゲナーゼと相同であるＯＲＦは２種あった。ＯＲＦ１の遺伝子をＣｒｔＯと称し、他の遺伝子をｃｒｔｌと称した。２種の遺伝子は互いにわずかな相同性しかなかった（２４％の同一性）。ＯＲＦ１の配列（配列番号：１）は、デイノコッカス・ラジオデュランスのフィトエンデヒドロゲナーゼと考えられる遺伝子と３５％の同一性を有している。元のままのｃｒｔＯによるｃｒｔｌ変異体がフィトエンデヒドロゲナーゼノックアウト表現型を示したことから、ＣｒｔＯではなくＣｒｔｌがデヒドロゲナーゼであると決定された。本発明は、環状カロテノイド類のβ−イオノン環にケトン基を付加し、ケトカロテノイド類を産生するケトラーゼを、ｃｒｔＯ（ＯＲＦ１）がコードすることを示している。
【０１１９】
２つのタイプのカロテノイドケトラーゼ類（ＣｒｔＷタイプとＣｒｔＯタイプ）が報告されている（カジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：３４３〜３５２頁；フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２；９７２８〜９７３３頁）。ＣｒｔＷ酵素は全て、対称的な二環性ケトラーゼ類である。本明細書中、ＡＮ１２およびデイノコッカス属から単離されたＣｒｔＯはＣｒｔＷと同様に対称的な二環性ケトラーゼ類である。
【０１２０】
図２は、文献に報告さた全てのケトラーゼ類の２つの系統樹分析を示している。ケトラーゼ類のＣｒｔＷタイプとＣｒｔＯタイプとは、明らかに系統樹の異なった分枝に属している。ＣｒｔＷタイプケトラーゼは、β−カロテンの両方のβ−イオノン環に対称的にケトン基を付加してカンタキサンチンを生成する。ＣｒｔＯタイプケトラーゼ類は、１種だけ、以前文献に報告されている（フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２；９７２８〜９７３３頁）。このＣｒｔＯは、シネコシスチス種ＰＣＣ６８０３から単離され、β−カロテンの１つのβ−イオノン環にのみケト基を導入し、エキネノンを生成する非対称的に作用するβ−カロテンケトラーゼの新型であることが示された。興味深いことにシネコシスチスＣｒｔＯ（ｓｉｒ００８８）は、細菌のフィトエンデヒドロゲナーゼ類との相同性を有しているが、生化学的にこのような活性を示さなかった。本発明のＣｒｔＯ遺伝子は、ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２から単離され、アミノ酸５３２個の長さである。ＢＬＡＳＴプログラム（「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」；エス・エフ・アルトシュルら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁）によって決定されたように、ロドコッカスｃｒｔＯに最も類似した配列は、フィトエンデヒドロゲナーゼの機能を有すると推定されるデイノコッカス属から単離されたアミノ酸５１１個の蛋白質ＤＲ００９３であった。本出願者は、デイノコッカス属のＤＲ００９３の機能性もまたカロテノイドケトラーゼであって、以前報告されたようなフィトエンデヒドロゲナーゼではないことを証明した。
【０１２１】
ＢＬＡＳＴ探索から得られたロドコッカスＣｒｔＯに２番目に近い配列は、５４２個のアミノ酸を有するシネコシスチス属の仮定上の蛋白質（ｓｌｒ００８８）であり、これは後にＣｒｔＯケトラーゼであることが確認された（フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２；９７２８〜９７３３頁）。ロドコッカスのＣｒｔＯは、シネコシスチスのＣｒｔＯと３５％のアミノ酸同一性および６４％の類似性を有している。これは、ＣｒｔＷタイプの酵素とはわずかの配列相同性しか持っていない。系統発生分析によると、ロドコッカスＣｒｔＯ、デイノコッカスＣｒｔＯおよびシネコシスチスＣｒｔＯは、共に別の分枝に分類され、全てのＣｒｔＷ酵素と別である（図２）。ロドコッカスＯＲＦのＣｒｔＯの指定は、シネコシスチスＣｒｔＯとの配列相同性に基づいた。
【０１２２】
ロドコッカス、デイノコッカス、シネコシスチスの３種のＣｒｔＯ酵素によるモチーフ分析を、ＭＥＭＥプログラム（チモシー・エル・ベイリイ（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｌ．Ｂａｉｌｅｙ）およびチャールズ・エルカン（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅｌｋａｎ）、「Ｆｉｔｔｉｎｇ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２８〜３６頁、カリフォルニア州メンロパークのＡＡＡＩプレス、１９９４年）を用いて実施した（図３）。３種のＣｒｔＯ酵素の各々において、６種の保存モチーフが同定された。比較されたＣｒｔＯ酵素において、モチーフの位置もまた保存されている。モチーフのコンセンサス配列を用い、ＭＡＳＴプログラム（上記ベイリイとグリブスコフ）を使用して、ＥＭＢＬデータベースとスイスプロットデータベースを探索した。公共のデータベースにおける他の蛋白質で６種のモチーフ全てを有しているものは見出されいないため、これら３種のモチーフが共に存在することがＣｒｔＯケトラーゼ機能に特徴的となる。モチーフ探索に基づいて最も密な関連性を有する蛋白質は数種のフィトエンデヒドロゲナーゼＣｒｔｌ酵素類であったが、これらは２種または３種のモチーフだけを有していた。６種のモチーフの存在と位置が、カロテノイドケトラーゼ類のＣｒｔＯタイプに対する指標であると考えられる。
【０１２３】
ｃｒｔＯ遺伝子が変異により中断されると元のままのｃｒｔＯ遺伝子を有する株におけるピンク色に比してＣｒｔＯ変異体のコロニーは黄色であった。カロテノイド類を変異体コロニーから抽出し、ＨＰＬＣで分析した（図４）。ＣｒｔＯ変異体コロニーの色素は、元のままのｃｒｔＯ遺伝子を有するコロニーに存在する主要なピークを欠いていることから、ＣｒｔＯ酵素は、黄色形態のカロテノイドからピンク形態のカロテノイドへの変換に関与していることが示唆される。この発見はさらに、野生型株由来の主要カロテノイドのケト基が化学的に減少すると、色がピンクから黄色に変化したことが示された際に確証された。
【０１２４】
ＣｒｔＯ変異体における主要なカロテノイドを精製し、さらに検討した。変異体のＣｒｔＯ株における主要なカロテノイドの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて、５３６ダルトンと決定された。野生型ＡＴＣＣ４７０７２における主および副カロテノイド（副ピークは、ＣｒｔＯ変異体の主ピークと同一）の分子量は、それぞれ５５０ダルトンおよび５３６ダルトンであり、１４ダルトンの差は、本来のＣｒｔＯによる１個のケト基の付加によることが示唆される。
【０１２５】
大腸菌のゲノムは、ｃｒｔ遺伝子を含有せず、したがって、大腸菌細胞抽出物は、βカロテンを基質として利用できるカロテノイドケトラーゼを含有しない。ロドコッカスＡＮ１２から単離された完全長のｃｒｔＯ遺伝子が大腸菌内へクローン化された（実施例７）。大腸菌宿主が、クローン化されたピー・スチュワート（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ｃｒｔＥＸＹＩＢクラスタからインビボでβ−カロテンを合成した際、ＣｒｔＯの発現によりβ−カロテンは、カンタキサンチン（９２％）とエキネノン（６％）に変換された。また、インビトロでβ−カロテン化合物を、ＣｒｔＯを発現した大腸菌の粗細胞抽出物に添加した（実施例８）。２時間と１６時間の反応混合物のＨＰＬＣ分析を実施して、ＣｒｔＯ酵素活性の結果生じた反応中間体ならびに反応産物を同定した。２時間の反応混合物は、ただ１本の追加ピークを含んでいた。この時点では、生成した唯一の中間体はエキネノンであって、カンタキサンチンは検出されなかった。インキュベート時間を長くするとエキネノンの濃度が増加し、次にこれがカンタキサンチンへと変換されたが、これは２個のケトン基の付加を表す最終産物である（表２）。このインビトロアッセイのデータによって、ｃｒｔＯは、ケトラーゼをコードし、これが中間体としてのエキネノン（１個のケトン基を含有）を経由してβ−カロテンをカンタキサンチン（２個のケトン基を含有）へと変換することが立証された。ロドコッカスＡＮ１２ＣｒｔＯの対称的ケトラーゼ活性は、シネコシスチスＣｒｔＯの非対称的機能に関し報告されている活性とは異なっている。
【０１２６】
デイノコッカス遺伝子ＤＲ００９３は現在、データベースにおいて恐らくフィトエンデヒドロゲナーゼであるとして、注釈がつけられているが、これはロドコッカスｃｒｔＯ遺伝子との間に密な相同性を共有している。ＤＲ００９３が、カロテノイドケトラーゼまたはフィトエンデヒドロゲナーゼをコードするかどうかを決定するために、ＤＲ００９３の機能を調べた。実施例７に記載されたように、ＤＲ００９３遺伝子を、本質的に大腸菌において発現させた。大腸菌における異種発現およびインビトロ酵素アッセイ、双方によりデイノコッカスのＣｒｔＯは、ロドコッカスのＣｒｔＯと同様な様式、すなわち、２個のケトン基がβ−カロテンに付加され、エキネノンを経由して、カンタキサンチンを形成するという様式で作用することが確認され、したがってそのカロテノイドケトラーゼ活性が確証された。
【実施例】
【０１２７】
本発明を、以下の実施例においてさらに明確にする。本発明の好ましい実施形態を示すこれらの実施例は、例証によってのみ供されることを理解する必要がある。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認でき、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の使用法および条件に適合させるために種々の変更と修飾ができる。
【０１２８】
一般法
実施例で用いられる標準的な組換えＤＮＡ法および分子クロ−ニング法は当業界によく知られており、ジェイ・サンブルック、イー・エフ・フリッシュおよびティー・マニアチス、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（１９８９）マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；ティ・ジェイ・シルハービイ（Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．）、エム・エル・ベナン（Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．）およびエル・ダブリュー・エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、（１９８４）；およびエフ・エム・オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシ・アンド・ワイリイ・インターサイエンスにより出版（１９８７））によって記載されている。
【０１２９】
細菌培養の維持と増殖に好適な材料と方法は、当業界によく知られている。以下の実施例に使用するために好適な方法は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・ムレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン・ダブリュー・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリアム・エイ・ウッド（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびジー・ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、アメリカ微生物学会、ワシントンＤＣ（１９９４））において、またはトーマス・ディー・ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、マサチューセッツ州サンダーランドのＳｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．（１９８９）により提示されているものを見ることができる。細菌細胞の増殖と維持のために用いられる全試薬、制限酵素および材料は、他に指定しない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ディフコ・ラボラトリーズ／ＢＤダイアグノスティックス（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（メリーランド州スパークス）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウィスコンシン州マジソン）、ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ビベルリイ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬライフ・テクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州カールスバッド）、またはミズーリ州セント・ルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手された。
【０１３０】
遺伝子配列の操作は、ジェネティックス・コンピュータ・グループ・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０、ウィスコンシン州マジソンのジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））から入手できるプログラム一式を用いて達成した。ＧＣＧプログラムの「Ｐｉｌｅｕｐ」では、ｇａｐ・クリエーション・デフォルト値は１２を用いたが、ｇａｐ伸張デフォルト値は４を用いた。ＣＧＣの「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムではデフォルト・ｇａｐ・クリエーション・ペナルティは５０を用いていたが、デフォルト・ｇａｐ・伸張ペナルティは３を用いた。マルチプルアライメントは、スミス・ウォーターマンのアルゴリズム（ダブリュー・アール・ピアソン、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、１９９２年開催、１１１〜２０頁。編集者：スハイ、サンダー。出版元：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム）を組み入れたＦＡＳＴＡプログラムを用いて創製された。これらにおいて、または任意の他のプログラムにおいてプログラムパラメータが、プロンプトされていない何れの場合もデフォルト値を用いた。
【０１３１】
略語の意味は以下のとおりである：「ｈ」は、ｈｏｕｒ（ｓ）（時間）を意味し；「ｍｉｎ」は、ｍｉｎｕｔｅ（ｓ）（分）を意味し；「ｓｅｃ」は、ｓｅｃｏｎｄ（ｓ）（秒）を意味し；「ｄ」は、ｄａｙ（ｓ）（日）を意味し；「ｍｌ」はｍｉｌｉｌｌｉｔｅｒｓ（ミリリットル）を意味し；「Ｌ」は、ｌｉｔｅｒｓ（リットル）を意味する。
【０１３２】
実施例１：ＡＮ１２株の単離と特性評価
実施例１は、炭素とエネルギーの単一源としてのアニリンで増殖できることを基準にしてロドコッカス−エリスロポリスのＡＮ１２株の単離を記載する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の分析により、ＡＮ１２株はロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌に関連することを示した。
【０１３３】
アニリンで増殖した細菌を増菌培養から単離した。増菌培養は、１２５ｍｌのねじ口付きエレンマイヤーフラスコ中、１ｍｌの活性スラッジを、１０ｍｌのＳ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭＭｇＣｌ２、０．７ｍＭＣａＣｌ２、５０μＭＭｎＣｌ２、１μＭＦｅＣｌ３，１μＭＺｎＣｌ３、１．７２μＭＣｕＳＯ４、２．５３μＭＣｏＣｌ２、２．４２μＭＮａ２ＭｏＯ２、および０．０００１％ＦｅＳＯ４）中に接種することにより設定した。前記活性スラッジは、廃水処理施設から入手した。増菌培養は、培養培地に直接１００ｐｐｍのアニリンを加えることにより補足し、往復振盪しながら２５℃でインキュベートした。増菌培養は２〜３日毎に１００ｐｐｍのアニリンを加えて維持された。１４日毎に９．９ｍｌの培養液を同量のＳ１２培地で置換することにより、培養液を希釈した。炭素とエネルギーの単一源としてアニリンを利用した細菌を、Ｓ１２寒天上に増菌培養のサンプルを散布することにより単離した。アニリン（５μｌ）を各ペトリ皿のふたの内側に入れた。前記ペトリ皿をパラフィンで密封し、上下逆さにして室温（約２５℃）でインキュベートした。次に、炭素とエネルギーの単一源としてアニリンを利用する能力について代表的な細菌コロニーを試験した。コロニーを、最初の単離に用いられた元のＳ１２寒天プレートから新たなＳ１２寒天プレートに移し、各ペトリ皿のふたの内側にアニリンを供給した。ペトリ皿をパラフィンで密封し、上下逆さにして室温（約２５℃）でインキュベートした。
【０１３４】
各単離体の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、以下のように分析した。各単離体を、Ｒ２Ａ寒天（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））上で増殖させた。培養プレートから数個のコロニーを、１００μｌの水に懸濁した。この混合物を凍結してから一度解凍した。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を、製造元の取扱い説明書（パーキン・エルマー（コネチカット州ノーウォークのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））に従って、プライマーＨＫ１２（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号：２３）およびＨＫ１３（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列番号：２４）を有する商品キットを用いてＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲはパーキン・エルマー・ジーン・アンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ）９６００（コネチカット州ノーウォーク）において実施した。このサンプルを９４℃で５分間インキュベートし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３５回行った。増幅した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、製造元の取扱い説明書（キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））に従ってキット商品を用いて精製し、自動化ＡＢＩシーケンサ上で配列決定した。配列決定反応は、プライマーＨＫ１２、ＨＫ１３、およびＨＫ１４（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＹＭＧＣＧＧＴ−３’）（配列番号：２５、式中Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ）により開始した。各単離体の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を、同様の配列に関する遺伝子バンクのＢＬＡＳＴサーチ［アルトシュルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７）］に対するクエリー配列として用いた。
【０１３５】
ＡＮ１２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、遺伝子バンクの配列決定データベースにおける他の１６ＳｒＲＮＡ配列と比較した。ＡＮ１２株由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、ロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と少なくとも９８％類似していた。
【０１３６】
実施例２
配列決定用ゲノムＤＮＡの調製および配列生成ゲノムＤＮＡの調製
ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２を、２５ｍｌＮＢＹＥ培地（０．８％栄養ブイヨン、０．５％酵母エキス、０．０５％トゥイーン８０）中、通気しながら３７℃でｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅまで増殖させた。細菌細胞を４℃で３０分間４，０００ｇで遠心分離した。細胞ペレット１Ｍ  ＫＣｌ（ｐＨ１０）を含有する２０ｍｌの５０ｍＭＮａ２ＣＯ３で、次に２０ｍｌの５０ｍＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５）で１回洗浄した。前記細胞ペレットを５ｍｌの５０ｍＭトリス１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に静かに再懸濁し、リゾチームを２ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。この懸濁液を３７℃で２時間インキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを１％の最終濃度まで加え、プロティナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。この懸濁液を５５℃で５時間インキュベートした。懸濁液は透明となり、透明溶解産物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の同容量で抽出した。１７，０００ｇで２０分間の遠心分離後、水相を注意深く除去し、新しい管に移した。２倍容量のエタノールを加えると、ＤＮＡは封をしたガラスパスツールピペットにより緩やかに巻きついた。このＤＮＡを７０％エタノールを含む管に浸してから風乾した。風乾後、ＤＮＡをＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍＬ）と共に４００μｌのＴＥ（１０ｍＭトリス１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸濁し、４℃で保存した。
【０１３７】
ライブラリ構築
２００μｇから５００μｇの染色体ＤＮＡを、３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡおよび３０％グリセロールの溶液に再懸濁し、エアロミスト・ダウンドラフト、ネビュライザ・チャンバ（Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）（イリノイ州シカゴのＩＢＩメディカル・プロダクツ（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ））中、１２ｐｓｉで６０秒間剪断した。ＤＮＡが沈殿し、再懸濁してＢａｌ３１ヌクレアーゼ（マサチューセッツ州ビベルリイのニューイングランド・バイオラブス）で処理した。０．８％アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画後、フラクション（２．０ｋｂまたは５．０ｋｂ）を切除し、清浄し、２ステップ連結法を用いて９９％単一挿入体を超える高力価ライブラリを生産した。
【０１３８】
配列決定
微生物ゲノム全体の配列決定のためにショットガン配列決定戦略法を採用した（ロバート・フライシュマン（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）ら、「Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１９９５年）。
【０１３９】
配列は、ベクターおよび挿入特異的プライマーの組合わせを用いてダイターミネータ法（米国特許第５３６６８６０号；ＥＰ２７２００７号）を用いてＡＢＩ自動シーケンサで生成した。配列編集は、ＤＮＡスター（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ）（ウィスコンシン州マジソンのＤＮＡスター・インク（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）またはウィスコンシンＧＣＧプログラム（ウィスコンシン州マジソンのウィスコンシン・パッケージ・バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピュータ・グループＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））、およびコンセド・パッケージ（ＣＯＮＳＥＤ  ｐａｃｋａｇｅ）（バージョン７．０）のいずれかで実施した。すべての配列は、双方向において少なくとも２回のカバー率を表す。
【０１４０】
実施例３：ロドコッカスＡＮ１２ＣｒｔＯの配列分析
２種の異なるフィトエンデヒドロゲナーゼに対し相同性を有する２種のＯＲＦが、ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２のゲノム配列中に同定された。１種のＯＲＦはＣｒｔｌと称され、ストレプトマイセス・コエリコロール（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３（２）由来の推定フィトエンデヒドロゲナーゼに対し最も高い相同性（４５％同一性、５６％類似性）を有した。他のＯＲＦ（元来Ｃｒｔｌ２と称されたが、現在ではＣｒｔＯと称される）は、フィトエンデヒドロゲナーゼであると思われるデイノコッカス−ラジオデュランス由来のＤＲ００９３に対し最も高い相同性（３５％同一性、５０％類似性；オー・ホワイト（Ｗｈｉｔｅ、Ｏ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６（５４４４）、１５７１〜１５７７（１９９９））を有した。
【０１４１】
ＡＮ１２のＣｒｔｌとＣｒｔＯとは、互いにほとんど相同性を共有しなかった（ＦＡＤドメインに含有する分子の２５７個のアミノ酸長Ｎ末端半部において２４％の同一性と３６％の類似性；膜貫通基質結合ドメインを含有する分子のＣ末端半部には相同性が無い）。無傷のＣｒｔＯによるＣｒｔｌ変異体がフィトエンデヒドロゲナーゼのノックアウト表現型を示したことから、ＣｒｔＯは、重複性のフィトエンデヒドロゲナーゼではなかった。
【０１４２】
下記に示したデータは、ＣｒｔＯ遺伝子が、ケトン基を環状カロテノイド類のβ−イオノン環に付加するケトラーゼをコードしてケトカロテノイドを産生することを確証している。
【０１４３】
２つのタイプのカロテノイドケトラーゼ（ＣｒｔＷタイプとＣｒｔＯタイプ）が報告されている。図２は、文献に報告された全てのケトラーゼ類の系統樹分析を示す。ケトラーゼ類のＣｒｔＷタイプとＣｒｔＯタイプは、明らかに前記系統樹の２つの異なる分枝に属する。ケトラーゼ類のＣｒｔＷタイプは、β−カロテンの２つのβ−イオノン環に対称的にケトン基を付加してカンタキサンチンを生成する。これらは、細菌源由来の４種の酵素を含む１群と、藻類から単離された２種の酵素を含む１群との２つの亜群クラスターである。細菌のＣｒｔＷは、２４２個または２５８個のアミノ酸を有する。藻類のＣｒｔＷは３２０個または３２９個のアミノ酸を有する。ＣｒｔＷ酵素の細菌群と藻類群は、互いに相同的である。他の１種のケトラーゼのみが、文献に報告されている（フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２；９７２８頁）。このＣｒｔＯは、シネコシスチス種ＰＣＣ６８０３から単離され、β−カロテンのβ−イオノン環に１つだけのケトン基を導入してエキネノンを生成する、非対称的に作用するβ−カロテンケトラーゼであることが示されている。それは、ＣｒｔＷ酵素よりもかなり大きく５４２個のアミノ酸を有しており、ＣｒｔＷ酵素のいずれにも相同性を有しない。シネコシスチスＣｒｔＯ（ｓｌｒ００８８）はまた、細菌のフィトエンデヒドロゲナーゼとも類似しているが、実験的にこのような活性を示さないことは興味深い。ロドコッカス−エリスロポリスＡＮ１２から同定されたＣｒｔＯは、長さが５３２個のアミノ酸である。ＢＬＡＳＴ演算サーチまたは公共のデータベースを用いて同定されたこの配列に最も近い相同性は、フィトエンデヒドロゲナーゼとして推定して同定された、５１１個のアミノ酸のデイノコッカス遺伝子（ＤＲ００９３）に対してであった。デイノコッカスのＤＲ００９３の機能はまた、本出願書においてカロテノイドケトラーゼであることが証明された。
【０１４４】
ＢＬＡＳＴサーチの結果から２番目に高い相同性は、ＣｒｔＯケトラーゼとして確証されたシネコシスチスの仮定的蛋白質に対してであった（フェルナンデス−ゴンザレス（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２；９７２８頁）。ロドコッカス由来のＣｒｔＯは、シネコシスチス由来のＣｒｔＯと３３％のアミノ酸同一性と６４％の類似性を有する。シネコシスチスＣｒｔＯと同様に、それはまた、ＣｒｔＷタイプの酵素に対して配列類似性をわずかしか共有していない。系統的分析（図２）により、ロドコッカスＣｒｔＯ、デイノコッカスＣｒｔＯ、およびシネコシスチスＣｒｔＯはともに全てのＣｒｔＷ酵素とは別の分枝に分類された。ロドコッカスＯＲＦのＣｒｔＯの指定は、シネコシスチスＣｒｔＯと共有する配列相同性に基づいた。
【０１４５】
モチーフ分析は、ロドコッカス、デイノコッカスまたはシネコシスチス由来の３種のＣｒｔＯ酵素によるＭＥＭＥプログラムを用いてなされた（図３）。６種の保存モチーフが、各々３種のＣｒｔＯ酵素の各々に同定された。このモチーフのうち４種は、蛋白質のアミノ末端半部に位置しており、２種は蛋白質のカルボキシル末端に近接していた。モチーフの位置はまた、３種のＣｒｔＯ酵素において保存されている。ＣｒｔＯ酵素に共通の６種のモチーフは、ＣｒｔＷ酵素には見出すことができず、逆にＣｒｔＷ酵素のアライメントにおいて以前に同定された４つの保存領域（カジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：３４３〜３５２頁）は、ＣｒｔＯ酵素に存在しない。さらにモチーフ分析により、ＣｒｔＯ酵素とＣｒｔＷ酵素は、それらの機能は類似しているかもしれないが、配列レベルにおいては相同ではないという知見が支持される。
【０１４６】
モチーフのアライメントによって生成されたコンセンサス配列を、ＭＡＳＴプログラム（上記ベイリイおよびグリブスコフ）を用いてＥＭＢＬおよびスイスプロットデータベースを探索するために用いた。データベースにおける他の蛋白質で、３種のＣｒｔＯ酵素のように６種全てのモチーフを有しているものはない。ＭＡＳＴからのもので最高に合っていたものは、２種または３種のモチーフのみを有した数種のフィトエンデヒドロゲナーゼＣｒｔｌ酵素であった。６種のモチーフの存在と位置は、ＣｒｔＯタイプのカロテノイドケトラーゼの指標と考えられる。
【０１４７】
実施例４：ロドコッカスＣｒｔＯの変異体におけるカロテノイド色素の分析
ロドコッカスＣｒｔＯの中断変異体は、ＡＴＣＣ４７０７２における相同的組換えによって生成した。ＰＣＲプライマーＡＮ１２＿１２＿Ｆ（５’−ＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＣＧＡ−３’：配列番号：１３）およびＡＮ１２＿１２＿Ｒ（５’−ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＡ−３’：配列番号：１４）が、ＡＮ１２  ｃｒｔＯ配列に基づいてデザインされ、Ｎ末端において２７５ｂｐを切断し、Ｃ末端において１７３ｂｐを切断したＡＴＣＣ４７０７２由来の１１５１ｂｐ  ｃｒｔＯ内部フラグメントを増幅させるために用いられた。ＡＴＣＣ４７０７２から増幅されたｃｒｔＯの同一性は、配列決定により確かめられ、ロドコッカスＡＮ１２  ｃｒｔＯに対してＤＮＡレベルで９５％の同一性を示した。ｃｒｔＯフラグメントを、最初にｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。このＴＯＰＯクローンを次に、Ｎｃｏｌ（プライマー配列における下線のＮｃｏｌ制限部位）により消化し、ＴＯＰＯクローンの内部ｃｒｔＯフラグメントを、引続きｐＢＲ３２８のＮｃｏｌ部位にクローン化した。生じた構築物を、配列決定により確認し、ｐＤＣＱ１０２と名付けた。ｐＤＣＱ１０２のおおよそ１μｇＤＮＡを、エレクトロポレーションによりロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２に導入し、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンと共にＮＢＹＥプレート上に延ばした。ｐＢＲ３２８ベクターは、ロドコッカスにおいて複製されない。３０℃での３〜４日のインキュベート後に得られたテトラサイクリン耐性形質転換体が、染色体組込みにより生成された。ＡＴＣＣ４７０７２染色体上の標的ｃｒｔＯ遺伝子への組込みはＰＣＲによって確認された。遺伝子特異的プライマー（ｐＤＣＱ１０２上の挿入体の外側）１２＿ＯＰ５（５’−ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＡ−３’：配列番号：１７）および１２＿ＯＰ３（５’−ＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＴ−３’：配列番号：１８）と対合したベクター特異的プライマーＰＢＲ３（５’−ＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧ−３’：配列番号：１５）とＰＢＲ５（５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’：配列番号：１６）が、テンプレートとしてテトラサイクリン耐性形質転換体から調製された染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ用に使用された。予想されたサイズのＰＣＲフラグメントが、テトラサイクリン耐性形質転換体から増幅されたが、野生型ＡＴＣＣ  ４７０７２からはＰＣＲ産物が得られなかった。２種の遺伝子特異的プライマーを用いた場合、大型ベクターＤＮＡの挿入のため、テトラサイクリン耐性形質転換体によるＰＣＲフラグメントは得られなかった。ベクター特異的プライマー類および遺伝子特異的プライマー類により得られたＰＣＲフラグメントを配列決定した。ベクターとｃｒｔＯ遺伝子とを接合させる配列分析により、単一交差組換え事象が予想部位に生じ、標的のｃｒｔＯ遺伝子を中断していることを確認した。
【０１４８】
ＣｒｔＯ変異体のコロニーは、その野生型株に見られるピンク色と比較して黄色であるので、種々のカロテノイド色素がＣｒｔＯ変異体で産生されたことが示唆された。ＣｒｔＯ変異体株からカロテノイド類を抽出するために、ＮＢＹＥ（０．８％栄養ブイヨン＋０．５％酵母エキス）中の１００ｍｌの細胞培養液を定常期まで振とうしながら２６℃で一晩増殖させた。４０００ｇで１５分間、細胞を振り落とし、細胞ペレットを１０ｍｌアセトンに再懸濁した。室温で１時間一定に振とうさせてカロテノイド類をアセトンに抽出した。細胞を振り落として、上澄液を採取した。抽出をもう一度繰り返し、両抽出物の上澄液を合わせて窒素下で乾燥した。乾燥物質を０．５ｍｌメタノールに再度溶解し、不溶物を、エッペンドルフ・ミクロ遠心機５４１５Ｃにより１６，０００ｇで２分間、遠心分離により除去した。０．２ｍｌのサンプルをＨＰＬＣ分析用に用いた。ベックマン・ゴールド・ヌーボー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）付属のベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ（登録商標））ＨＰＬＣ（メリーランド州コロンビア）がこの試験に用いられた。０．１ｍｌの粗アセトン抽出液を、対応するガードカラム付きの１２５×４ｍｍＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（カリフォルニア州サンフェルナンドのヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ））上に乗せた。この流速は１ｍｌ／分であり、溶媒プログラムは、０〜１１．５分の直線勾配の４０％水／６０％メタノールから１００％メタノール、１１．５〜２０分の１００％メタノール、２０〜３０分の４０％水／６０％メタノールであった。スペクトルデータは、ベックマン・フォトダイオード・アレイ検出器（１６８モデル）を用いて採取した。
【０１４９】
ＨＰＬＣ分析により、ＣｒｔＯ変異体は、野生型株の主カロテノイドピークを欠いていることが示された。ＣｒｔＯ変異体において観察された主ピークは、４３５ｎｍ、４５８ｎｍおよび４８６ｎｍの吸収極大を有し、溶出時間が１５．６分であり、これは、野生型株の副ピークの特徴と一致する（図４）。これらの結果により、ＣｒｔＯ変異体は、野生型株と比較して異なるカロテノイド類を産生することが確証された。
【０１５０】
実施例５
野生型ロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２由来のケトカロテノイドの立証
実施例５は、単環性および二環性カロテノイド類からのケトカロテノイド類産生に関する生化学的証拠を提供する。
【０１５１】
カロテノイド類上の特定の官能基に対する幾つかの試験は、分光光度計のキュベット中で便宜上実施でき、スペクトル中の特徴的変化をモニターできる。例えば、ＮａＢＨ４による還元が、カロテノイド中のアルデヒド基またはケトン基の存在を判定するために用いることができる。共役カルボニル基の対応するアルコールへの還元は、浅色移動（短波長へ）となり、スペクトルピークの微細構造を増加させる。
【０１５２】
野生型ロドコッカス属の主カロテノイドの丸み形吸収（４６５ｎｍ）により共役カルボニル官能基の存在が示された。この知見に基づき、野生型ＡＴＣＣ４７０７２から産生した１０μｇのカロテノイド類に１ｍｇのＮａＢＨ４の添加により化学的還元を実施した。カロテノイドの色がピンクから黄色に２分間で変化したことから、カロテノイド中にケトン基の存在がさらに示唆された。黄色還元産物を、ＨＰＬＣにより分析すると、主ピークスペクトルが、丸み形４６５ｎｍ（％ＩＩＩ／ＩＩは０）から野生型株の副ピークスペクトルと同じの微細構造（４３５ｎｍ、４５８ｎｍ、４８６ｎｍ、％ＩＩＩ／ＩＩは０．４２）へと浅色移動することが示された。しかし、これは、野生型株の副ピーク（１５．６分）よりも早い１４．４分で溶出したことから、この還元化合物は、野生型株における副ピークの化合物よりも極性であることを示唆した。このことは、野生型株の主要カロテノイド中にケトン基が存在し、これがＮａＢＨ４還元時に水酸基に還元されたことと矛盾しない。水酸基を有する還元化合物は、ケトン基または水酸基のない同様の野生型副化合物よりも極性であった。
【０１５３】
【表１】
2005511011.tif 000003
【０１５４】
実施例６
ロドコッカスＣｒｔＯ変異体における主要カロテノイドの分子量測定
ロドコッカスＣｒｔＯ変異体における主要カロテノイドを精製し、分子量を測定した。ＣｒｔＯ変異体を、ＮＢＹＥ（０．８％栄養ブイヨン＋０．５％酵母エキス）中１００ｍｌを定常期まで振とうしながら２６℃で一晩増殖させた。４０００ｇで１５分間、細胞を振り落とした。カロテノイド類を細胞ペレットからメタノールに抽出し、メタノール中５％ＫＯＨにより室温で、一晩けん化した。けん化後、大部分のカロテノイドをヘキサンに抽出した。抽出サンプルを、最初にシリカゲルカラムを通して中性脂質から分離した。カラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）に、シリカゲル６０（粒径０．０４０〜０．０６３ｍｍ、ニュージャージー州ギッブスタウンのＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））を詰めて、ヘキサンで洗浄した。カロテノイドサンプルを充填し、９５％ヘキサン＋５％アセトンで洗浄し、８０％ヘキサン＋２０％アセトンを用いて溶出した。溶出したカロテノイド類を、逆相Ｃ１８薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート（ニュージャージー州フィリップスバーグのジェイ・ティー・ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ））上、移動相として８０％アセトニトリル＋２０％アセトンによりさらに分離した。主カロテノイドバンド（Ｒｆ０．５）を切除してアセトンで溶出した。ＡＴＣＣ４７０７２ＣｒｔＯ変異体の精製カロテノイドの分子量（ＭＷ）を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定すると、５３６ダルトン（ナトリウム体では５５９ダルトン）であった。これは、ＡＰＣＩ（大気圧の化学的イオン化）でのＬＣ−ＭＳによっても確認され、プロトン化化合物の分子量が５３７ダルトンであることを示した。野生型ＡＴＣＣ４７０７２における主および副カロテノイドの分子量は、それぞれ５５０ダルトンおよび５３６ダルトンであることが以前に決定された（米国仮特許出願第６０／２８５、９１０号、本明細書に援用されている）。スペクトル分析の微細構造により、５５０ダルトンの主カロテノイドは、共役ケトン基を有しており、５３６ダルトンの副カロテノイドは、共役ケトン基を欠いていることを示唆した。１４ダルトンの差は、主カロテノイドにおける恐らく１個のケトン基の付加（ＣＨ２からＣＯ、Ｏの付加と２Ｈの除去）によるものと思われる。ＣｒｔＯ変異体におけるカロテノイドは、分子量の合致、ＨＰＬＣ分離およびスペクトルデータ（実施例４）から示唆されるように、野生型株における副カロテノイドと同じ構造を有していると思われる。ＣｒｔＯは、ケトン基を導入するカロテノイドケトラーゼをコードしてケト−カロテノイドを産生する可能性がある。ケトン基の付加は、ＣｒｔＯ変異体では妨害された。
【０１５５】
実施例７
ロドコッカスＣｒｔＯの異種性発現による大腸菌におけるケトカロテノイドの合成
β−カロテンを産生する大腸菌ＭＧ１６５５株を、ロドコッカスｃｒｔＯ遺伝子の発現宿主として用いた。この大腸菌株は、ピー・スチュワート（Ｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢクラスタをクローン化することにより構築された。ｃｒｔＥＸＹＩＢクラスタを、以下の方法によりパントエ・スチュワート（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ８１９９）から増幅した。プライマーは、エルヴィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）の配列を用いてデザインし、ＰＣＲによってｃｒｔ遺伝子を含有するフラグメントを増幅した。これらの配列は：
５’−ＡＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧ−３’（配列番号：４４）
５’−ＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣ−３’（配列番号：４５）を含んだ。
【０１５６】
染色体ＤＮＡは、パントエ・スチュワート（Ｐａｎｔｏｅａ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ））（ＡＴＣＣ番号８１９９）から精製し、Ｐｆｕターボ（Ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼ（カリフォルニア州ラ・ホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を以下の条件（９４℃、５分；９４℃（１分）−６０℃（１分）−７２℃（１０分）を２５サイクル、および７２℃で１０分間）でＰＣＲ増幅反応に用いた。６．３ｋｂの単一産物が、ゲル電気泳動後に観察された。Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー）を７２℃で１０分間の反応に用いて、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングするＴＯＰＯ用フラグメントに３’アデノシンヌクレオチドをさらに加えた。エレクトロポレーションによる大腸菌（ＥｃｏＲＩ）ＤＨ５α（メリーランド州ロックビレのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））への形質転換後、カロテノイド化合物を産生していること示す鮮やかな黄色の数個のコロニーが出現した。ｃｒｔ遺伝子クラスタ（ｃｒｔＥＸＹＩＢ）を含有する６．３ｋｂの大腸菌フラグメントを、広範囲宿主ベクターｐＢＨＲ１（フロリダ州マーコアイランドのモビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）、ＬＬＣ）にクローン化して、ｐＢＨＲ−ｃｒｔ１を形成した。野生型ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスタを含有するｐＢＨＲ−ｃｒｔ１を有する大腸菌株は、β−カロテンを産生した。ｐＢＨＲ１ベクター上のクロラムフェニコール耐性遺伝子プロモータが、ｃｒｔ遺伝子の機能発現を指令したと思われる。ロドコッカスｃｒｔＯ遺伝子をプライマー：１２−Ｎ：
ＡＴＧＡＧＣＧＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＣＧＣＣ（配列番号：４６）および１２−Ｃ：
ＴＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＣＧＡＣ（配列番号：４７）
を用いてＲ．エリスロポリスＡＮ１２から増幅させた。増殖させた１．６ｋｂのＰＣＲ産物をｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ発現ベクターにクローン化した正しい方向の２種のクローン（ｐＤＣＱ１１７＃３および＃９）を、β−カロテンを合成した大腸菌株ＭＧ１６５５（ｐＢＨＲ−ｃｒｔ１）に形質転換した。β−カロテンを合成した大腸菌コロニーは黄色であった。ｐＤＣＱ１１７で形質転換された大腸菌株ＭＧ１６５５（ｐＢＨＲ−ｃｒｔ１）は橙色となり、宿主株におけるβ−カロテンが新規なカロテノイド（類）に変換されたことを示した。
【０１５７】
両方の形質転換体からの色素を、実施例４に記載された方法を用いてＨＰＬＣにより分析すると、図５と同じプロフィルを示した。９２％の色素を含んでなる主ピークは、１３．８分で溶出し、λｍａｘ＝４７５ｎｍの丸み形スペクトルを有した。これは、シグマから購入したカンタキサンチンの標準品と一致する。６％の色素を含んでなる副ピークは、１４．８分で溶出し、λｍａｘ＝４６５ｎｍの丸み形スペクトルを有した。これは、１個のケト基だけが付加された中間体、エキネノンに関して報告されたものと類似している。大腸菌におけるケトカロテノイド類の合成により、ロドコッカスｃｒｔＯが大腸菌において機能的であるカロテノイドケトラーゼをコードすることを立証した。
【０１５８】
実施例８
ロドコッカスＣｒｔＯのケトラーゼ活性に関するインビトロアッセイ
さらに、ｃｒｔＯがケトラーゼをコードしているかどうかを確認するために、我々は、インビトロのケトラーゼ活性の存在についてｐＤＣＱ１１７を含有する大腸菌の抽出細胞物をアッセイした。インビトロ酵素アッセイを、ｃｒｔＯを発現する大腸菌ＴＯＰ１０（ｐＤＣＱ１１７）の粗製細胞抽出液を用いて実施した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００ｍｌのＬＢ培地に、一晩培養した新鮮なＴＯＰ１０（ｐＤＣＱ１１７）細胞１ｍｌを接種した。細胞は、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させた。次に、細胞を、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導して、さらに３時間増殖を続けた。遠心分離（４０００ｇ、１５分）によって５０ｍｌの培養液から収穫した細胞ペレットを凍結し、一度解凍し、０．２５％のトリトンＸ−１００を含有する２ｍｌの氷冷５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁した。５０μｌのアセトン中の１０μｇのβ−カロテン基質（スペクトラム・ラボラトリー・プロダクツ・インク（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．））を、前記懸濁液に加え、ピペッティングにより混合した。混合液を２本の管に分配して、２５０ｍｇのジルコニア／シリカビーズ（０．１ｍｍ、オクラホマ州バートレスビレのバイオスペック・プロダクツ・インク（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．））を各管に加えた。２分間ビーズでたたくことにより細胞を破壊し、細胞の破片を、エッペンドルフ・ミクロ遠心機５４１４Ｃ中１０，０００ｒｐｍで２分間回転することにより除去した。合わせた上澄液（２ｍｌ）を５０ｍｌフラスコ中、３ｍｌの５０ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液で希釈し、反応混合物を、種々の時間、１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートした。反応を５ｍｌメタノールを添加することにより中止し、５ｍｌジエチルエーテルで抽出した。５００ｍｇのＮａＣｌを加えて抽出のために２相を分離した。上相のジエチルエーテル相のカロテノイド類を採取し、窒素下乾燥した。カロテノイド類を０．５ｍｌのメタノールに再度溶解し、０．１ｍｌを、実施例４に記載されたＨＰＬＣ分析用に用いた。
【０１５９】
２時間反応と１６時間反応のＨＰＬＣ分析を図６に示す。１６時間反応混合物の４７０ｎｍにおける３本のピークを同定した。標品と比較して、保持時間１５．８分のピークは、β−カロテンであり、保持時間１３．８分のピークは、カンタキサンチンであることが決定された。１４．８分のピークは、１個のケトン基だけが付加された中間体のエキネノンである可能性が高い。２時間の反応混合物においては、エキネノン中間体が、唯一の反応物であり、カンタキサンチンは産生しなかった。インキュベート時間がより長いとエキネノンがより高濃度となり、カンタキサンチンに相当するピークが出現した。カンタキサンチンは、２個のケトン基の付加を表すこの段階での最終産物である（表２）。ケトラーゼ活性がｃｒｔＯ遺伝子に特異的であることを確認するために、基質としてβ−カロテンを使用しないコントロール細胞の抽出物でもアッセイを実施した。コントロール反応混合物では産物のピークは検出されなかった。
【０１６０】
要約すると、インビトロアッセイデータにより、ｃｒｔＯはケトラーゼをコードし、それがβカロテンを、中間体としてエキネノン（１個のケトン基）を経由してカンタキサンチン（２個のケトン基）に変換することが確証された。ロドコッカスＣｒｔＯのこの対称的なケトラーゼ活性は、シネコシスチスＣｒｔＯの非対称的機能に関して報告されたものとは異なる。我々はまた、外因性補助因子の効果を調べた。反応混合物に対して０．２〜２ｍＭのＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨまたはＦＡＤの添加によって、ケトラーゼ活性は刺激されず、この反応に必要な補助因子は、アッセイに用いられた粗細胞抽出液で十分供給されていたものと推定された。
【０１６１】
【表２】
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【０１６２】
実施例９
デイノコッカス遺伝子ＤＲ００９３はＣｒｔＯタイプケトラーゼをコードする
デイノコッカス遺伝子ＤＲ００９３は、データベースにおいて恐らくフィトエンデヒドロゲナーゼであるとして、現在注釈がつけられているが、これは、ロドコッカスｃｒｔＯ遺伝子に密な相同性を有している。ＤＲ００９３の機能を測定して、これがカロテノイドケトラーゼまたはフィトエンデヒドロゲナーゼをコードするかどうかを調べた。
【０１６３】
ＤＲ００９３遺伝子を、実施例７に記載されたように本質的に大腸菌で発現させた。ＤＲ００９３を、プライマーｃｒｔｌ２＿Ｆ（デイノ）（５’−ＡＴＧＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＴＣＧ−３’：配列番号：２１）およびｃｒｔｌ２＿Ｒ（デイノ）（５’−ＴＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣＧＴＣ−３’：配列番号：２２）を用いてデイノコッカス−ラジオデュランス株Ｒ１（ＡＴＣＣ１３９３９）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ発現ベクター（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化すると、ベクター上のｔｒｃプロモータにそれぞれ前方方向にクローン化されたデイノコッカスｃｒｔＯ遺伝子を有するプラスミドｐＤＣＱ１２６を生じた。β−カロテンを合成する大腸菌におけるｐＤＣＱ１２６の発現も、実施例７に記載されたように特徴付られたケトカロテノイド類（カンタキサンチンおよびエキネノン）を産生した。
【０１６４】
β−カロテン基質と共にインキュベートされた大腸菌ＴＯＰ１０（ｐＤＣＱ１２６）の粗製細胞抽出液を用いてインビトロ酵素アッセイを実施した。アッセイ法とその後のＨＰＬＣ分析は、実施例８に記載されたものと同じであった。この結果を表３に要約する。インビトロ活性アッセイにより、デイノコッカス遺伝子ＤＲ００９３は、２個のケトン基をβ−カロテンに付加でき、エキネノンを経由してカンタキサンチンを形成するロドコッカスＣｒｔＯと類似したＣｒｔＯタイプのケトラーゼをコードすることが確証された。
【０１６５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ヒドロキシラーゼ酵素とともにケトラーゼにより産生される一般的なカロテノイド産物を表している。
【図２】カロテノイドケトラーゼ類の系統関係を表している。
【図３】ＣｒｔＯタイプのケトラーゼ類において同定された保存的モチーフを表している。
【図４】野生型ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ＡＴＣＣ  ４７０７２およびＣｒｔＯ変異体由来のカロテノイド類に関するＨＰＬＣプロフィルの比較を表している。
【図５】ＣｒｔＯを発現する大腸菌の色素のＨＰＬＣ分析を表している。
【図６】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）由来ＣｒｔＯのインビトロケトラーゼ活性に関するＨＰＬＣ分析を表している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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