(57)【要約】本発明のある態様は、老化関連症状の早期発現または進行に対する被験者の感受性を測定する方法に関する。ある態様において、本発明は、ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の対立遺伝子について被験者の遺伝子型を利用することに関する。別の態様においては、本発明は、治療計画を選択する方法、老化に伴うバイオマーカーを同定する方法、老化に伴う症状の進行を監視方法、および老化関連症状の発現を遅らせるかまたは軽減させる治療薬を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
老化関連症状の早期発現または進行に対する被験者の感受性を特定する方法において、
ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子に関して被験者の遺伝子型を利用する工程を含み、
ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不在が、老化関連症状の早期発現または進行に対する被験者の感受性に関する情報を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、被験者の遺伝子型に関する既知の情報を得る工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、
（ａ）前記被験者から核酸試料を得る工程；および
（ｂ）ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子を検出する工程；を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
被験者がＩＬ−１パターン１の対立遺伝子を有することが、老化関連症状の発現または進行に感受性であることを示唆することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
パターン１の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Ａ（２２２／２２３）対立遺伝子４、ＩＬ−１Ａ（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子４、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域Ｙ３１マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
パターン２の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Α（２２２／２２３）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子４、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のＹ３１マーカーの対立遺伝子６、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
パターン３の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子２およびＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
老化関連症状が、結合組織機能の低下、心臓血管疾患、老化関連の癌、異常な免疫系機能および神経機能の低下より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
被験者のために適当な治療計画または推奨される生活様式を選択する方法において、
ＩＬ−１パターン１またはパターン２またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子に関して被験者の遺伝子型を利用する工程を含み、
ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不在が、老化関連症状の早期発現または進行に対する被験者の感受性に関する情報を提供し、さらに、老化関連症状の早期発現に対する被験者の感受性に適切である治療計画または推奨される生活様式の選択をもたらすことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記治療計画が、栄養補助食品を投与することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１２】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、被験者の遺伝子型に関する既知の情報を得る工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１３】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、
（ａ）前記被験者から核酸試料を得る工程；および
（ｂ）ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子を検出する工程；を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
治療計画または生活様式の変化から受ける可能性のある利益に関して、被験者を分類する工程をさらに含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
被験者に関する追加の臨床上関連する情報を利用する工程をさらに含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１６】
パターン１の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Ａ（２２２／２２３）対立遺伝子４、ＩＬ−１Ａ（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子４、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域Ｙ３１マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２より成る群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１７】
パターン２の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Α（２２２／２２３）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子４、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のＹ３１マーカーの対立遺伝子６、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１より成る群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１８】
パターン３の少なくとも一つの対立遺伝子が、ＩＬ−１Ａ（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（３７３７）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１より成る群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１９】
被験者の内皮細胞の細胞分裂の潜在力を予測する方法において、
ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子に関して被験者の遺伝子型を利用する工程を含み、
ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子の存在または不在が、被験者の内皮細胞の細胞分裂の潜在力に関する情報を提供することを特徴とする方法。
【請求項２０】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、被験者の遺伝子型に関する既知の情報を得る工程を含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、
（ａ）前記被験者から核酸試料を得る工程；および
（ｂ）ＩＬ−１パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子を検出する工程；を含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
被験者の遺伝子型を利用する工程が、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）遺伝子座における遺伝子型を決定する工程を含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
老化関連表現型を特定するのに有用なバイオマーカーを同定する方法において、
（ａ）ＥＯＡ関連対立遺伝子を有する一以上の被験者においてバイオマーカーを測定して、第一の測定値を得る工程；および
（ｂ）非ＥＯＡ関連遺伝子型を有する一以上の被験者において前記バイオマーカーを測定して、第二の測定値を得る工程；を含み、
前記第一の測定値が前記第二の測定値と異なる場合、前記第一の測定値が老化関連表現型であり、かつ前記バイオマーカーが老化関連表現型を特定するのに有用なバイオマーカーであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
老化関連症状の早期発現または進行を防止または軽減させる見込みのある試験物質を同定するために試験物質をスクリーニングする方法において、
（ａ）パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子で構成されるＤＮＡを含む細胞においてバイオマーカーを観察して、バイオマーカーの第一の測定値を得て；
（ｂ）前記細胞を試験物質と接触させ；さらに
（ｃ）前記細胞においてバイオマーカーを観察し、バイオマーカーの第二の測定値を得る；各工程を含み、
老化関連表現型から非老化関連表現型へのバイオマーカーの測定値の変化が、老化関連疾患および症状の早期発現または進行を防止または軽減させる見込みのある試験物質を同定することを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞であることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが、ＩＬ−１ＢｍＲＮＡ、ＩＬ−１ΑｍＲＮＡ、ＩＬ−１ＲＮｍＲＮＡ、ＩＬ−１ｂタンパク質、ＩＬ−１ａタンパク質、ＩＬ−１ｒａタンパク質および培養での累積細胞集団倍加数より成る群から選択されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
被験者における老化関連症状の早期発現または進行を防止または軽減させる見込みのある遺伝子を同定するために、遺伝子をスクリーニングする方法において、
（ａ）一またはそれ以上の細胞に試験遺伝子が導入される条件下で、パターン１、パターン２および／またはパターン３の少なくとも一つの対立遺伝子で構成されるＤＮＡを含む細胞を試験遺伝子と接触させ；さらに
（ｂ）被験者において少なくとも一つのバイオマーカーを観察する；各工程を含み、
老化関連表現型から非老化関連表現型へのバイオマーカーの測定値の変化が、老化関連疾患および症状の早期発現を防止または軽減させる見込みのある試験遺伝子を同定することを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記少なくとも一つのバイオマーカーが、ＩＬ−１ＢｍＲＮＡ、ＩＬ−１ΑｍＲＮＡ、ＩＬ−１ＲＮｍＲＮＡ、ＩＬ−１ｂタンパク質、ＩＬ−１ａタンパク質、ＩＬ−１ｒａタンパク質および培養での累積細胞集団倍加数より成る群から選択されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２について異型接合である培養内皮細胞を含む細胞組成物。
【請求項３０】
前記培養内皮細胞が、ヒト臍帯内皮細胞であることを特徴とする請求項２９記載の細胞組成物。
【請求項３１】
ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２について同型接合である培養内皮細胞を含む細胞組成物。
【請求項３２】
老化関連症状の早期発現または進行を防止または軽減させる方法において、
請求項２４記載の方法に従って同定された物質と、被験者とを接触させる工程を含み、
前記物質と被験者とを接触させることが、老化関連症状の早期発現を防止または軽減させることを特徴とする方法。
【請求項３３】
老化関連症状の早期発現を防止または軽減させる方法において、
請求項２７記載の方法に従って同定された遺伝子と、被験者とを接触させる工程を含み、
前記遺伝子と被験者とを接触させることが、老化関連症状の早期発現を防止または軽減させることを特徴とする方法。
【請求項３４】
培養細胞の老化を防止または軽減させる方法において、
請求項２４記載の方法に従って同定された物質と、細胞とを接触させる工程を含み、
前記物質と細胞とを接触させることが、培養細胞の老化を防止または軽減させることを特徴とする方法。
【請求項３５】
培養細胞の老化を防止または軽減させる方法において、
請求項２７記載の方法に従って同定された物質と、細胞とを接触させる工程を含み、
前記物質と細胞とを接触させることが、培養細胞の老化を防止または軽減させることを特徴とする方法。
【請求項３６】
被験者の老化関連症状の段階を特定する方法において、
（ａ）請求項２２記載の方法に従って同定された少なくとも一つのバイオマーカーを、被験者において観察し；さらに
（ｂ）前記バイオマーカーが老化関連表現型を表す程度を特定する；各工程を含み、
前記バイオマーカーが老化関連表現型を表す程度が大きいほど、老化関連症状の段階が後期であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
老化の細胞的および遺伝的要因
老化は、加齢ともいい、体のさまざまな器官や組織の機能の時間依存的な劣化である。すべての人々が最終的には老化の影響を経験する一方、老化の生じる速度は個人によって甚だしく異なる。老化の速度の違いは、環境的および遺伝的要因が合わさって生じる。ヒトならびに動物における生存と長寿の研究は、老化の過程に対する強い遺伝的因子を明らかにしている。さらに、いくつかのよく知られている遺伝疾患は、早すぎる老化のように思われる症状を患者に生じさせる。たとえば、ウェルナー症候群の患者は、十代でさまざまな老化の症状を経験し、通常は三十歳以前に死亡する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００２】
老化は、生物体全体における老化の機構の一部を成すであろう細胞相関(cellular correlate)を有する。老化関連現象は、特定の細胞型における機能の低下または異常の結果として捉えることができる。たとえば、老化は、細胞レベルでの下記の変化のいずれかの結果として生じうる：アポトーシスの可能性の増大、さらなる細胞分裂の不能、細胞修復系における突然変異、そして遺伝子発現の変化（たとえば成長ホルモンまたは性ホルモンの停止、あるいは反応性酸素最終産物や糖化最終産物の蓄積といったさまざまな原因の結果生じうる）。このように、老化は生物体全体に影響を与える過程であるとはいえ、単一の細胞あるいは培養細胞で起こる事象が老化過程の要因またはマーカーとなりうるという証拠が増大している。
【０００３】
皮膚の皺は、細胞の事象に関連する老化過程の例である。皮膚の皺は高齢者における一般的な症状である。皮膚の皺は主に、繊維芽細胞といった細胞が、皮膚に対する損傷を修復する能力、特に皮膚に構造的支持の大半を与えているコラーゲン繊維への損傷を修復する能力の低下が原因で生じる。老化繊維芽細胞の最近の全ゲノム解析で、これらの細胞はコラーゲン繊維および細胞外マトリクスを産生および再構成するために必要ないくつかの遺伝子の発現に混乱がみられることが実証された（非特許文献３）。同様の細胞機構が、免疫系から神経機能までの範囲に及ぶヒトの生態の側面に及ぼす老化の影響の基礎に成っている可能性がある。
【０００４】
正常なヒト細胞は、細胞が経験することのできる複製の回数によって決められる有限の寿命を持つ。細胞が非分裂状態に入るとき、細胞は、生物体全体の老化に伴う病理に影響を与えるように思われる変化を示す。たとえば、皮膚、骨、結合組織を含む体の構造要素といった組織の恒常的な再構成には、たとえば繊維芽細胞や骨芽細胞といった特定の細胞の複製が必要である。特定の時間における組織の任意の部分で、細胞の一定の割合が複製している。その割合は、組織内の刺激および生化学的調節過程に基づいて増加または減少する。複製シグナルに対して応答することができる細胞がより少数の場合、その組織部分は、再生および再構成する能力に問題を生じる。たとえば、骨は初めの四十〜五十年間は、構造の完全性を明らかに失うことなく常に再構成されている。このことは、骨を破壊する破骨細胞活性と骨を形成する骨芽細胞活性との間の緊密な繋がりによって起こる。たとえば、骨芽細胞活性が反応する能力の僅かな低下といった、その二つの過程の不調和から、骨の完全な状態が失われる結果になる。
【０００５】
ある意味で再構成と同様な過程が、正常な創傷治癒に伴って起こる。組織に何らかの損傷または傷害が生じた場合、体は外傷の部位で、プログラムされた一連の細胞の遊走、複製、および特異的遺伝子発現で応答し、結果として損傷組織の修復と再生が起こる。この過程の主要な要素は、外傷の部位での細胞複製である。複製する能力のある細胞の集団が減少している場合、治癒部位の最終的な完全な状態に何らかの問題が生じる。
【０００６】
細胞が複製していない場合でさえ、細胞は、その組織の調節や反応に参加する化学物質を発現することによって組織の機能に関連している。これが細胞の「形質発現」であり、選択的でかつ組織化された遺伝子発現の結果である。老化した細胞は、変化したパターンの遺伝子発現を有し、したがって、組織機能、究極的には体の機能を変化させやすいことが立証されている。正常細胞の機能のそのような変化は、老化細胞が有毒老廃物を除去することができず、結果として、しばしば老化による疾患を特徴づける石灰化産物およびアミロイドが蓄積することを説明する。
【０００７】
非形質転換細胞は、適当な成長因子および細胞外マトリクスと共に培養した場合、分裂しまたしばらくの間分裂し続けるが、培養での増殖は、最終的には終わる（非特許文献４）。この現象は今、細胞生物学の生得的な部分であると思われ、そして環境による損傷の蓄積あるいは必須微量元素または栄養素の枯渇（時計時間または代謝時間）でなく、細胞の繰り返しの分裂（分裂時間）に起因する（非特許文献５； 非特許文献６）。分裂時計はテロメア長であるという仮説が立てられている（非特許文献７）。この機構は、それによって細胞がその分裂回数を数えるが、計数機構であるだけでなく、細胞老化プログラムの一部でもあるように思われる。テロメラーゼという酵素を欠く、形質転換していない体細胞では、細胞の連続した分裂はテロメア長の短縮の進行に繋がる。染色体のそのような短縮は最終的に、さらなるＤＮＡ合成を損ない、培養での寿命の終わりはＧ１／Ｓ期停止によって特徴づけられる。テロメラーゼの触媒サブユニットの非形質転換細胞への遺伝子導入は、培養での寿命を延長することが示されている（非特許文献８）。テロメア短縮は老化過程の間に起こる；しかしテロメアの加齢によって生じる短縮には顕著な個人差が存在し、この過程において、環境的および遺伝的因子が役割を果たしている可能性が非常に高いことを示唆する。
【０００８】
テロメア短縮およびそれに続く複製老化は、細胞への酸化的損傷の蓄積を反映している可能性がある。年齢依存的なテロメア短縮は、ｉｎ ｖｉｔｒｏではアスコルビン酸の抗酸化型の添加によって弱まる。この過程は、免疫系の老化について重大な役割を果たしている可能性がある。さらに、テロメアの不安定性の増大と成長可能性の減少は、乳癌または卵巣癌の家族歴を有する女性からの卵巣表面上皮における卵巣癌発生と関連づけられている。加速された細胞老化による遺伝子異常の蓄積は、悪性転換や転移に対する感受性の増大に寄与している可能性がある。最後に、テロメア短縮は、血管内皮細胞の老化およびアテローム硬化性疾患の進行に重要な役割を果たしている可能性がある。培養内皮細胞では、テロメラーゼ活性は、老化表現型の発生に先立って低下し、そして面白いことに、重要な抗アテローム因子である一酸化窒素は、内皮細胞の老化およびテロメラーゼ活性の年齢依存的阻害を顕著に低下させる（非特許文献９）。
【０００９】
細胞培養では、細胞の分裂年齢は、累積細胞集団倍加数（ＣＰＤｓ）によって測定される。培養における寿命の終点でのＣＰＤｓの数は、ある程度、細胞型に特異的である。この違いは、細胞培養以前に起こった分裂の回数を反映している可能性があり、あるいは他の細胞特異的機構の作用を示唆する。生物体全体の老化と細胞老化プログラムとの間の関連性は、まだよく理解されていない。高齢者由来の培養繊維芽細胞は、より少ないＣＰＤｓを経験するが、その関連性は厳密でない。加えて、ヒト血管内皮細胞の平均テロメア長は提供者の年齢の上昇につれて減少し、動脈プラークから培養された細胞は、代表的寿命の短縮を示す（非特許文献１０）。一般的に、培養において寿命の終わりに近づきつつある細胞は、全体としての老化過程に関連していると思われる表現型の変化を示すように思われる。
【００１０】
ＩＬ−１遺伝子群の遺伝学
ＩＬ−１遺伝子群は染色体２の長腕（２ｑｌ３）上にあり、少なくともＩＬ−１α（ＩＬ−１Α）、ＩＬ−１β（ＩＬ−１Ｂ）、およびＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＮ）の遺伝子を、４３０Ｋｂの領域内に含む（非特許文献１１）。アゴニスト分子であるＩＬ−１αおよびＩＬ−βは、強力な炎症促進活性を有し、多くの炎症カスケードを開始する。それらの作用は、しばしばＩＬ−６やＩＬ−８といった他のサイトカインの誘導を介して、白血球の活性化と損傷組織への補充、血管作用物質の局所的産生、脳での熱応答、肝急性期反応へ繋がる。三種類すべてのＩＬ−１分子は、Ｉ型およびＩＩ型 ＩＬ−１受容体に異なる親和性で結合するが、Ｉ型受容体だけが細胞の内部にシグナルを伝達する。対照的に、ＩＩ型受容体は細胞膜から脱落し、おとり受容体として作用する。受容体アンタゴニストとＩＩ型受容体は、したがって、その作用において両方とも抗炎症性である。
【００１１】
ＩＬ−１遺伝子群に由来する特定の対立遺伝子は、特定の疾患状態に関連することが既に知られている。たとえば、ＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２は、冠動脈疾患（特許文献１、および特許文献２）、骨粗鬆症（特許文献３）、糖尿病腎症（非特許文献１２）、円形脱毛（症）（非特許文献１３；非特許文献１４）、グレーブス病（非特許文献１５）、全身性エリテマトーデス（非特許文献１６）、萎縮性硬化症（非特許文献１７）、そして潰瘍性大腸炎（非特許文献１８）に関連することが示されている。
【００１２】
さらに、マーカー−８８９からのＩＬ−１Α対立遺伝子２およびマーカー＋３９５４からのＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２は、歯周病に関連していることが見出されている（特許文献４；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。マーカー−８８９からのＩＬ−１Α対立遺伝子はまた、若年性慢性関節炎、特に慢性虹彩毛様体炎に関連していることが見出されている（非特許文献２３）。ＩＬ−１Ｂのマーカー＋３９５４からのＩＬ−１Ｂ（ＴａｑＩ）対立遺伝子２はまた、乾癬およびＤＲ３／４患者においてインシュリン依存性糖尿病と関連していることが見出されている（非特許文献２４；非特許文献２５）。加えて、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１は糖尿病性網膜症に関連していることが見出されている（特許文献５、および特許文献６を参照）。さらにＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の対立遺伝子２は、北米および欧州のコーカサス系人口の潰瘍性大腸炎に関連していることが見出されている（非特許文献１８）。興味深いことには、この関連性は、ドイツ・ロシア・ポーランド系（アシュケナージ系）ユダヤ人と民族的に関係のある集団内で特に強い（特許文献７）。
【００１３】
遺伝子型スクリーニング
遺伝性疾患のスクリーニングのための従来の方法は、異常な遺伝子産物（たとえば、鎌状赤血球貧血）または異常な表現型（たとえば、精神遅滞）の同定のいずれかに依存してきた。これらの方法は、発現の遅い遺伝性疾患や、たとえば早期老化の素因といった識別の難しい表現型には有用性が限られている。容易で費用のかからない遺伝子スクリーニング方法論の開発に伴い、疾患を発症しやすい多型を同定することが、その疾患が多遺伝子起源である場合でさえ現在可能である。分子生物学的方法によってスクリーニングが可能な疾患の数は、多因子病の遺伝的基礎の理解が高まるとともに増え続けている。
【００１４】
遺伝子スクリーニング（遺伝子型解析または分子スクリーニングともいう）は、患者が疾患状態を引き起こすか変化させるか、または疾患状態を引き起こすか変化させる突然変異と「連鎖している」突然変異（または対立遺伝子または多型）を有するかどうかを判定する試験と広く定義することができる。連鎖とは、ゲノム内で互いに近接しているＤＮＡ配列が一緒に遺伝する傾向を有する現象を言う。二つの配列は、同時に遺伝することの何らかの選択的利点のために連鎖する。しかしながら、より典型的には、二つの多型の間の領域内で減数分裂時の組換え現象が起こることが相対的に稀であるため、二つの多型配列は同時に遺伝する。同時に遺伝する多型対立遺伝子は、任意のヒト集団においては、集団の任意の特定成員には両方が同時に存在するかさもなければ全く存在しないかのいずれかである傾向があるため、互いに連鎖不平衡にあると言われている。実際、任意の染色体領域における複数の多型が互いに連鎖不均衡にある場合、それらは準安定的な遺伝的「ハプロタイプ」を定める。対照的に、二つの多型遺伝子座の間で起こる組換え事象は、それらを明らかな相同染色体上に分離させる。二つの物理的に連鎖した多型間の減数分裂時の組換えが十分頻繁に起こる場合、その二つの多型は独立して分離し、連鎖平衡にあると言われる。
【００１５】
二つのマーカーの間の減数分裂時の組換え頻度は、一般的に染色体上のそれらの物理的距離に比例するが、一方で、「突然変異多発領域」や染色体組換えの抑制された領域の発生は、結果として二つのマーカーの間の物理的距離と組換え距離との間の不一致を生じさせる。このように、特定の染色体領域において、幅広い染色体領域にわたる複数の多型遺伝子座は互いに連鎖不平衡にある可能性があり、それによって幅広い遺伝的ハプロタイプを定義する。さらに、疾患を引き起こす突然変異がこのハプロタイプ内にまたはこれと連鎖して見つかる場合、そのハプロタイプの一またはそれ以上の多型対立遺伝子を、疾患を発症する可能性の診断的なまたは予知的な指標として用いることができる。他の点では良性の多型と、疾患を引き起こす多型とのこの関連は、疾患突然変異が近い過去に生じた場合に起こり、組換え事象を通じて平衡が達成されるには十分な時間がまだ経過していない。したがって疾患の要因となる突然変異を含むかまたはそれと連鎖しているヒトハプロタイプの同定は、個人のその疾患を引き起こす突然変異が遺伝している可能性の予知的手段となる。重要なことには、そのような予知的なまたは診断的な手順は、実際の疾患を引き起こす病変の同定と単離を必要とすることなく利用することができる。このことは、疾患過程に関連する分子欠陥の正確な決定は特に炎症性疾患のような多因子疾患の場合には困難でありうるため、重要である。
【００１６】
実際、疾患とＩＬ−１多型との間の統計的相関は必ずしも直接疾患を引き起こす多型を示さない。むしろ、相関する多型は、ヒト進化の近い過去で生じ介在する染色体部分で組換え事象を通じて平衡が達成されるには十分な時間がまだ経過していない、疾患の要因となる突然変異と連鎖している（すなわち連鎖不平衡にある）良性の対立遺伝子変異体である可能性がある。このように、特定の疾患についての診断的および予知的検査の目的のためには、その疾患に関連する多型対立遺伝子の検出を、その多型が直接に疾患の病因に関連しているかどうかを考慮することなく利用することができる。さらに、任意の良性の多型遺伝子座が、見かけ上疾患を引き起こす多型遺伝子座と連鎖不平衡にある場合、その良性の多型遺伝子座と連鎖不均衡にあるさらに別の多型遺伝子座もまた、その疾患を引き起こす多型遺伝子座と連鎖不平衡にある可能性がある。このように、これらの他の多型遺伝子座もまた、疾患の要因となる多型遺伝子座が遺伝しているかどうかの可能性の予知または診断となる。実際、一旦、特定の疾患または症状と対応するヒトハプロタイプとの間に関連性が描かれれば、範囲の広いヒトハプロタイプ（連鎖した一連の多型マーカーの対立遺伝子の同時遺伝の典型的なパターンを表す）を、診断目的の標的とすることができる。このように、一またはそれ以上の疾患に関連する多型対立遺伝子（あるいは一またはそれ以上の疾患に関連するハプロタイプさえ）を特徴づけることによって、要因となる遺伝的変異を必ずしも決定または特徴づけることなく、個人が特定の症状の疾患を発症する可能性の判定を行うことができる。
【特許文献１】
国際特許出願第／ＵＳ／９８／０４７２５号明細書
【特許文献２】
米国特許出願公開第０８／８１３４５６号明細書
【特許文献３】
米国特許第５,６９８,３９９号明細書
【特許文献４】
米国特許第５,６８６,２４６号明細書
【特許文献５】
米国特許出願公開第０９／０３７４７２号明細書
【特許文献６】
国際特許出願第ＧＢ／９７／０２７９０号明細書
【特許文献７】
国際公開第９７／２５４４５号パンフレット
【特許文献８】
米国特許第６,２１０,８７７号明細書
【特許文献９】
米国特許出願公開第０９／３２０３９５号明細書
【特許文献１０】
米国特許出願公開第０９／４３１３５２号明細書
【特許文献１１】
米国特許第４,９６８,６０７号明細書
【特許文献１２】
米国特許第４,６５６, １２７号明細書
【特許文献１３】
仏国特許発明第２,６５０,８４０号明細書
【特許文献１４】
国際公開第９１／０２０８７号パンフレット
【特許文献１５】
国際特許出願第９２／１５７１２号明細書
【特許文献１６】
国際公開第９４／１６１０１号パンフレット
【特許文献１７】
米国特許第５,４５９,０３９号明細書
【特許文献１８】
米国特許第４,９９８,６１７号明細書
【特許文献１９】
米国特許第５,５９３,８２６号明細書
【特許文献２０】
国際公開第９２／１５６９４号パンフレット
【特許文献２１】
米国特許第４,８３３,０８０号明細書
【特許文献２２】
米国特許第５,３２８,４７０号明細書
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【非特許文献１２２】
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【非特許文献１２３】
Ｊａｅｎｉｃｈ, Ｒ．（１９７６）ＰＮＡＳ ７３：１２６０−１ ２６４
【非特許文献１２４】
Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ, Ｈｏｇａｎ ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＩＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, １９８６）
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【非特許文献１２６】
Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８５）ＰＮＡＳ ８２：６１４８−６１５２
【非特許文献１２７】
Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ． ６：３８３−３８８
【非特許文献１２８】
Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８
【非特許文献１２９】
Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６
【非特許文献１３０】
Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５ ２５８
【非特許文献１３１】
Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：９０６５−９０６９
【非特許文献１３２】
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８
【非特許文献１３３】
Ｊａｅｎｉｓｃｈ, Ｒ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４
【非特許文献１３４】
Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．, Ｅａｓｔｏｎ, Ｐ
【非特許文献１３５】
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７
【非特許文献１３６】
Ｄｅｖ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２０：１０５−１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
老化関連症状の発現が、部分的には、遺伝的因子によって決定されることを考えると、これらの遺伝的因子を同定し、またそのような因子を個人について同定する方法を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
概して、本発明は、ある種のＩＬ−１遺伝子型が老化に及ぼす遺伝的影響の指標となり、細胞老化の過程と機構的に関連しているという観察に基づく。ある態様において、本出願は、老化関連症状（ＥＯＡ）の早期発現または進行に対する被験者の感受性を測定する方法に関する。一つの態様では、本発明の方法は、核酸試料を被験者から取得し、パターン１、パターン２および／またはパターン３といったＩＬ−１ハプロタイプの少なくとも一つのＥＯＡ関連対立遺伝子の存在について試験することから成る。
【００１９】
ある実施形態では、本発明の老化関連症状は、結合組織機能低下、心臓血管疾患、老化に伴う癌、異常な免疫系機能および神経機能低下を含む。別の実施形態では、本発明の老化関連症状は、少なくとも部分的には、石灰化産物およびアミロイドの蓄積、酸化的損傷または反応性酸素種の産生の増加の結果として生じる症状である。好ましい実施形態では、老化関連症状は部分的には、アポトーシスの増加、細胞分裂を経験する能力の低下、細胞修復機構における突然変異、および酸化的損傷または糖化の副産物等の望まれていない副生成物の蓄積によって引き起こされる細胞の挙動の変化を含む、細胞老化の結果である。さらに、前述の症状の多くは致命的であり、したがって本発明の方法はより短い平均寿命を検出するのに用いることができると理解される。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明の老化に伴う症状は以下のものを含む：骨粗鬆症、変形性関節症、軟骨細胞プロテオグリカン合成の低下、創傷治癒の低下、皮膚の皺、慢性関節リウマチ、アミロイドーシス、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、Ｔ細胞増殖の減少、ＩＬ−１産生の増加、ＩＬ−１に対する反応性の低下、乾癬に対する抵抗力の低下、海馬神経細胞の長期増強の低下、シナプス可塑性の低下、物忘れ、聴力低下、網膜の変性を含むがそれに限らない眼の変化、うつ病、不眠、学習障害、子宮内膜癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、冠動脈疾患、脳血管疾患（たとえば脳卒中であるがそれに限らない）、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化、鬱血性心不全そして高血圧。
【００２１】
別の態様では、本発明は内皮細胞の細胞集団倍加に関連する症状に関する。ある実施形態では、パターン１またはパターン２ＩＬ−１対立遺伝子の存在が、内皮細胞における細胞分裂の潜在力の低下の指標となる。そのような可能性の低下は、幅広い症状および疾患と関連しているであろう。たとえば、血管新生過程は、新たな血管となる管を形成する内皮細胞の細胞分裂を必要とする。血管新生は、ある範囲の疾患状態、腫瘍転移および内皮細胞による異常増殖において起こる。血管新生過程の結果として作られた脈管構造は、これらの症状でみられる病理的損傷を支持する。調節されない血管新生が原因で生じたさまざまな病理的状態は、血管新生依存性または血管新生関連疾患としてまとめられている。血管新生はまた創傷治癒や再生といった正常の過程にも関連する。
【００２２】
別の実施形態では、パターン１ハプロタイプの好ましい対立遺伝子は：ＩＬ−１Ａ（２２２／２２３）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子３、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子４、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のＹ３１マーカーの対立遺伝子６、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１、を含む。
【００２３】
さらに別の実施形態では、パターン２ハプロタイプの好ましい対立遺伝子は：ＩＬ−１Α（２２２／２２３）対立遺伝子４、ＩＬ−１Ａ（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子４、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のＹ３１マーカーの対立遺伝子３、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２、を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、パターン３ハプロタイプの好ましい対立遺伝子は：ＩＬＩＡ（−８８９）対立遺伝子１、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１、ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１、およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１、を含む。
【００２５】
特に好ましい実施形態では、検出する少なくとも一つの対立遺伝子は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２、ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子２およびＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２より成る群から選択される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有しない一以上の被験者においてバイオマーカーを測定し、そしてＥＯＡ関連対立遺伝子を有する少なくとも一の被験者において前記バイオマーカーを測定することから成る、老化関連表現型を識別するのに有用なバイオマーカーを同定するための方法を提供する。ＥＯＡ関連対立遺伝子を有する被験者と有しない被験者との間で大きな違いを示すバイオマーカーは、ＥＯＡ関連事象を観察し予測するのに有用となるバイオマーカーである。別の実施形態では、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有するかまたは有しない培養細胞でバイオマーカーを測定することによってバイオマーカーを同定しうる。
【００２７】
別の態様では、本発明は、老化関連症状の早期発現を防止または軽減させる見込みのある試験物質を同定するための、試験物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、パターン１またはパターン２ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子から成るＤＮＡを含む細胞を試験物質と接触させ；前記試験物質中の少なくとも一つのバイオマーカーを観察する：各工程を含み、老化関連表現型から非老化関連表現型へのバイオマーカーの変化が、老化関連疾患および症状の早期発現を防止または軽減させる見込みのある試験物質を同定する。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、被験者における老化関連症状の早期発現を防止または軽減させる見込みのある遺伝子を同定するための、遺伝子をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、一またはそれ以上の細胞に試験遺伝子が導入される条件下で、パターン１またはパターン２ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子から構成されるＤＮＡを含む細胞を試験遺伝子と接触させ；前記被験者中の少なくとも一つのバイオマーカーを観察する；各工程を含み、老化関連表現型から非老化関連表現型へのバイオマーカーの変化が、老化関連疾患および症状の早期発現を防止または軽減させる見込みのある試験遺伝子を同定する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は老化関連症状の早期発現を防止または軽減させる方法を提供する。一実施形態では、上記の方法に基づいて同定された物質または遺伝子を、被験者に接触させる。別の態様では、本発明は、培養細胞の老化を防止または軽減させる方法を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は被験者における老化関連症状の段階を特定する方法を提供する。本方法は、上記の方法に基づいて同定された少なくとも一つのバイオマーカーを観察し；そして、バイオマーカーが老化関連表現型を表す程度を特定する；各工程を含む。バイオマーカーが老化関連表現型を表す程度が大きいほど、老化関連症状の段階は後期である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
インターロイキン−１と老化
本発明は、部分的には、個人のＩＬ−１遺伝子型が、その個人の老化の遺伝的および細胞的側面に影響を与えるという知見に基づく。たとえば、ＩＬ−１対立遺伝子は老化関連症状の早期発現に関連している。さらに、ＩＬ−１対立遺伝子は培養細胞における早期老化に関連している。
【００３２】
インターロイキン−１の発現および活性が生物体全体および単離培養細胞の両方において老化に関連していることは、よく立証されている。しかし、老化とＩＬ−１との間の関連性は複雑で、異なる細胞型や組織では影響が異なる。一般的に、ＩＬ−１産生は老化組織で増加すると考えられている。たとえば、ＩＬ−１βの尿中濃度は、高齢の被験者で顕著に上昇し、血流中のＩＬ−１β濃度がより高いことを示した（非特許文献２６）。しかし、ある組織では、ＩＬ−１産生の低下が老化と相関し、別の老化関連症状の結果として生じる可能性がある。ＩＬ−１は、限定はされないが、結合組織機能低下、心臓血管疾患、老化に伴う癌、異常な免疫系機能および神経機能低下を含む多くの老化関連症状に影響を与えると考えられている。ＩＬ−１はまた、少なくとも部分的には、石灰化産物およびアミロイドの蓄積、酸化的損傷または反応性酸素種の産生の増加の結果として生じる症状に影響を与えると考えられる。ある態様において、本発明の方法は、これらの症状のいずれかの早期発現の可能性を予測するのに用いることができる。ある実施形態では、本発明は、特定のＩＬ−１遺伝子型を有する被験者集団が、概して、多くの老化に伴う障害の早期の発現を経験し、またある場合には、老化に伴う障害のより早い進行を経験するという観察に関する。別の態様では、被験者のＩＬ−１遺伝子型を用いて、予防的な治療または積極的または早期治療の候補となる被験者を特定することができる。
【００３３】
心臓血管疾患
心臓血管疾患は幅広い症状を含み、その多くがアテローム性動脈硬化の過程の結果として生じる。老化は、心臓血管疾患、特に虚血性心疾患の重要な危険因子である。４０歳から８０歳の間に、虚血性心疾患による死亡の危険性は１００倍上昇する（非特許文献２７）。一般に、アテローム性動脈硬化の隆起した病変によって覆われた主要血管の領域が、老化に伴って増加する（非特許文献２８；非特許文献２９）。早期老化症候群もまたアテローム性動脈硬化と関連している。
【００３４】
細胞老化は、老化過程と心臓血管疾患との間の重要な繋がりであろう。広く受け入れられた一つの仮説では、アテローム性動脈硬化は、血管内皮への損傷の結果として生じると考えられている。そのような損傷の治癒応答において、血管内皮細胞は細胞分裂を受ける。最終的な結果は、細胞のターンオーバーであり、これは内皮細胞の有限の分裂寿命に負担をかけ、アテローム発生を起こしやすい異常に機能する老化内皮細胞の形成に繋がるであろう。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、内皮細胞は繊維芽細胞の寿命より短い有限の寿命を持つ。この過程の間に、老化マーカーの蓄積がある（非特許文献３０；非特許文献３１）。大部分のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、成長停止状態に入るよりアポトーシスで死ぬ。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、内皮は遅い速度でターンオーバーする（非特許文献３２）が、ターンオーバーは、たとえば血管分岐点のような、アテローム発生の可能性が非常に高い部位でより高い（非特許文献３３）。内皮細胞ターンオーバーは、心臓血管疾患の最もよく知られている危険因子の多くと関連し連鎖している。アテローム性動脈硬化の高脂肪食モデル動物で最初に検出可能な事象は、内皮細胞ターンオーバーの増加である（非特許文献３４）。内皮細胞 ターンオーバーの増加は、高血圧のモデル動物における初期の事象であり、タバコの喫煙と関連している（非特許文献３５；非特許文献３６）。さらに、これらの危険因子は加法的であり、そのことは、それらが細胞ターンオーバーといった共通の機構を共有している可能性があることを示唆する。
【００３５】
テロメア長は、細胞の分裂年齢のマーカーとしてますます受け入れられている。テロメア長測定は、細胞老化が心臓血管疾患において重要な過程であるという仮説を支持する。テロメア制限断片（ＩＬＦ）の長さは培養内皮細胞では細胞分裂に伴って減少し、ＩＬＦ長はアテローム性動脈硬化の発生によって特徴づけられる血管ではより早く減少する（非特許文献１０）。血管内皮細胞にテロメラーゼを遺伝子導入することによってこの過程を逆転できる可能性がある（非特許文献８）。
【００３６】
さらに、炎症は、一般的にアテローム性動脈硬化の発病過程の重要な構成要素と現在見なされている（非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０）。血管を裏打ちする内皮細胞への損傷は、ＩＬ−１、ＴＮＦαを含む炎症性サイトカインの蓄積、およびたとえばプロスタグランジン１２（ＰＧ１２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、そして顆粒球単球細胞刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）といったプロスタノイドと成長因子の放出に結びつく。これらの因子は、たとえば単球といった血管壁内に蓄積する炎症細胞の蓄積および調節に結びつく。単球はその後さらにＩＬ−１、ＴＮＦα、プロスタグランジンＥ２、（ＰＧＥ２）、ｂＦＧＦ、そして形質転換成長因子αおよびβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）を含む追加の炎症性媒介因子を放出する。これらの炎症性媒介因子のすべてが、より多くの炎症細胞を損傷領域に補充し、内皮細胞および平滑筋細胞の挙動を調節し、アテローム斑の蓄積に結びつく。ＩＬ−１遺伝子型パターン１、２および３はすべて、血管形成術後の再狭窄を含む心臓血管疾患のさまざまな側面の素因に関連している（特許文献８；１９９９年５月２６日出願の特許文献９；および１９９９年１１月１１日出願の特許文献１０。）
ＩＬ−１βを含むいくつかの炎症性産物が、アテローム硬化性病変または疾患冠動脈の内皮において同定されている（非特許文献４１）。また、ＩＬ−１βの血清中濃度が冠動脈疾患の患者において上昇していることが見出されている（非特許文献４２）。炎症性物質の存在は、傷害または単球活性化に応答していると従来信じられているが、異常な炎症反応が冠動脈疾患の要因となりまたは冠動脈疾患への感受性の増大を生じることもありうる。
【００３７】
さらに、細胞老化の影響を通じて、ＩＬ−１が心臓血管疾患に影響を与えている可能性がある。培養で老化した内皮細胞が、ＩＬ−１αｍＲＮＡを蓄積することが実証されており、またＩＬ−１αに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが培養内皮細胞の寿命を延長しうることが示されている（非特許文献４３）。この効果は培養によって変動するが、ＩＬ−１ファミリーの効果を強く示唆し続ける（非特許文献４４）。さらに、ＩＬ−１αが内皮細胞に対して増殖阻害的であり、Ｇ１期の増殖を妨げることはよく知られている（非特許文献４５）。我々のグループの未発表の研究は、ＨＵＶＥＣが培養において老化するにつれ、ＩＬ−１βおよびより低い程度でＩＬ−１α合成が増大することを示している。
【００３８】
神経機能
ＩＬ−１βの神経細胞における発現の増加は、老化に伴う神経変性の顕著な特徴である（非特許文献４６；非特許文献４７）。ＩＬ−１発現は、アルツハイマー病の患者の中枢神経系で大幅に増加している（非特許文献４８）。さらに、ＩＬ−１はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の発現を増加させ、ＡＰＰはアルツハイマー病の典型でありそしておそらくアルツハイマー病を引き起こす斑を形成する。この点を支持して、Ｋｏｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（非特許文献４９）は、ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子２について同型接合である被験者は、集団レベルで、一またはそれ以上のＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１を持つ被験者（ここに開示するパターン１関連と一致する）と比較して、アルツハイマー病のより早い発症を示したことを実証した。組換えＩＬ−１βは、マウス海馬の苔状繊維ＣＡＳ経路における長期増強を阻害する（非特許文献５０）。記憶形成は、海馬内のこれらの神経細胞中ＩＬＴＰ によって媒介されると考えられている。このように、ＩＬ−１β濃度の上昇は記憶障害に繋がりうる（非特許文献５１）。さらに、神経機能は、一般に細胞膜を横切る流れの正確な制御に依存する。ＩＬ−１は、脂質を酸化することができかつ膜流動性の低下に結びつく活性酸素種の産生を増加させることが知られている。この方法で、ＩＬ−１は幅広い神経活動を損傷またはそのバランスを崩す（非特許文献５１；非特許文献４７）。ＩＬ−１はさらに、視床下部−下垂体軸によって多くのストレスホルモンの産生を刺激する作用を有する。これらのストレスホルモンは、ＡＣＴＨとコルチコステロンを含む。老化ラットでは、ＩＬ−１によるこれらのホルモンの調節は鈍くなっているが、ストレスホルモンはより長い間産生される。そのような変化したストレスホルモン産生は、老化に伴う鬱病、物忘れ、またはその他の障害に役割を果たしている可能性がある（非特許文献５２）。
【００３９】
結合組織機能
結合組織は、骨、皮膚、軟骨、腱、筋肉および靱帯を含む。これらの組織の多くは、構築と破壊のバランスに依存して動的状態に存在する。骨では、破壊は破骨細胞によって媒介される。破骨細胞の増殖は、ＩＬ−１によって刺激される（非特許文献５３）。さらに、ある種のＩＬ−１ 遺伝子型は、骨粗鬆症の可能性の上昇と関連している（特許文献３）。筋組織は、ストレス下に置かれた場合、炎症性活動の中心を生じ結果としてＩＬ−１βを産生する。ＩＬ−１βは、運動により生じるストレス後に筋肉内に蓄積し、筋タンパク質の破壊を引き起こす（非特許文献５４；非特許文献５５）。とりわけ、運動は若年男性より高齢男性において、より大きい筋タンパク質ターンオーバーを引き起こす（非特許文献５６）。
【００４０】
変形性関節症および慢性関節リウマチは、主に中高年者に起こる。これらの疾患は関節の慢性炎症および軟骨の破壊の結果として生じる。軟骨はプロテオグリカンから成る。ＩＬ−１は、プロテオグリカンの破壊を促し、さらにプロテオグリカン合成を阻害する（非特許文献５７）。したがって、高齢者におけるＩＬ−１濃度の上昇は軟骨のより大きな破壊に結びつくであろう。
【００４１】
高齢者および若年者に由来する繊維芽細胞のマイクロアレイ分析は、コラーゲンおよび結合組織の形成に関与する遺伝子の発現が変化したことを示した。さらに、炎症反応（部分的にＩＬ−１によって媒介される）に関与するタンパク質をコードする遺伝子が増加していた（非特許文献５８；非特許文献３）。
【００４２】
ＩＬ−６は高齢者で増加している。ＩＬ−６は、骨再吸収を促進し、かつ骨粗鬆症に関連していることが知られている。ＩＬ−６産生は、ＮＦ−κＢ転写因子を通じて作用するＩＬ−１によって刺激することができる。ＩＬ−１はまた、未知の他の経路を通じてＩＬ−６産生を促進することができる（非特許文献５９）。ＩＬ−６の増加はまた、部分的に、虚弱、貧血、血小板増多症および痴呆の要因となりうる。
【００４３】
老化関連の癌
多くの癌は強く老化に関連している（非特許文献６０；非特許文献６１）。実際、大部分の重要な癌の発生率は、年齢に伴って概ね年齢の四乗で劇的に上昇する（非特許文献６１）。この年齢との関連性は、部分的には免疫機能の低下と、過剰な増殖を防ぐ正常な細胞相互作用の混乱とによって引き起こされる。ＩＬ−１α産生は、老化に伴う子宮内膜癌に役割を果たしているであろう。子宮内膜間質部繊維芽細胞（ＥＳＦ）は通常、子宮内膜癌の足場非依存性増殖を阻害するが、高齢者由来のＥＳＦは実際に癌細胞の増殖を促進する。面白いことに、老化ＥＳＦは上昇した濃度のＩＬ−１αを産生し、ＩＬ−１経路に拮抗しつつ若年関連の抗癌表現型を回復する。乳癌および前立腺癌もまた強く老化に関連し、間質細胞との同様の相互作用によって影響される（非特許文献６２）。年齢に伴って非常に増加する他の癌は、大腸、食道、胃、直腸、膵臓の癌、および非黒色種皮膚癌を含む。
【００４４】
免疫系機能
高齢のヒトおよび動物はさまざまな免疫機能、特にＴ細胞媒介機能に低下を示すことがよく知られている。表皮における免疫機能は、大部分がランゲルハンス細胞（表皮の主要な抗原提示細胞）、および角化細胞（ＩＬ−１を含むサイトカインの産生者）によって媒介されている。これらの細胞におけるＩＬ−１ 産生はマウスでは年齢に伴って低下し、表皮の免疫機能が悪化しうることを示唆する（非特許文献６３）。高齢マウスは、ＩＬ−２のヘルパーＴ細胞による産生の減少を示す。これは、高齢マウスにおけるヘルパーＴ細胞媒介免疫機能の低下に寄与すると考えられている。この低下は部分的には、高齢マウス由来のマクロファージが刺激時に充分な量のＩＬ−１を産生することができないことによって生じるであろう（非特許文献６４；非特許文献６５）。
【００４５】
アミロイドおよび石灰化
高齢者の多くの疾患は、アミロイド斑または石灰化組織の蓄積の結果生じる。ＩＬ−１はこれらの症状に影響を与えると考えられる。アルツハイマー病は、一つには、アミロイド斑の蓄積によって引き起こされると考えられている。これらの斑はアミロイドタンパク質を含み、アミロイドタンパク質はそれ自身がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解の副産物である。ＩＬ−１はＡＰＰの産生を促進する（非特許文献６６）。アルツハイマー病に関する他の情報については「神経疾患」を参照。
【００４６】
活性酸素種
酸化的損傷は、多くの老化関連症状の要因として関連していると考えられている。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、タンパク質、脂質および核酸を損傷することができ、突然変異ならびに損傷した細胞構成成分の蓄積に繋がり、そのいずれもが老化過程に寄与しうる。ＩＬ−１は、結果として反応性酸素種の産生を起こす炎症過程を促進することが知られている。マクロファージおよび好中球といった免疫細胞は、たとえばＮＡＤＰＨオキシダーゼの一種のようなスーパーオキシドを産生する特定の酵素系を産生する。その結果、ＩＬ−１活性は部分的には、反応性酸素種の産生の増加を起こすことによって老化を促進しうるという仮説が立てられている。
【００４７】
細胞レベルでは、ＲＯＳはさまざまな外因性および内因性の系によって産生され、かつ消費されている。主要な内因性起源は、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リポキシゲナーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびシトクロムＰ４５０を含む。主要な外因性起源は、紫外線、電離放射線、化学療法薬、環境毒素および免疫系活性を含む。抗酸化防御は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン、ビタミン（たとえばＡ、ＣおよびＥ）、などを含む。さまざまなシグナル経路が、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＰＩ（３）Ｋ／ＡＫＴ、ＮＦ−ｋＢ、ｐ５３および熱ショック応答を含むＲＯＳによって影響される。一般的に、ＥＲＫ、ＰＩ（３）Ｋ／ＡＫＴ、ＮＦ−ｋＢおよび熱ショック応答は酸化的ストレスに直面しての生存に寄与し、一方でＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびｐ５３はより一般にアポトーシスに関連する。
【００４８】
細胞の影響
上記の老化に及ぼすｉｎ ｖｉｖｏのＩＬ−１の影響に加えて、ＩＬ−１は培養細胞の老化に対して影響を有する。培養細胞の老化に及ぼすＩＬ−１の影響は、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞に及ぼすＩＬ−１の影響を反映し、ｉｎ ｖｉｖｏの老化過程に及ぼすＩＬ−１媒介効果の大部分またはすべての基礎になりうることが前提となっている。ＩＬ−１αおよびＩＬ−１αが誘導する遺伝子の発現は、年齢に伴って増加する。老化したヒト内皮細胞は、上昇した濃度のＩＬ−１αを発現し、ＩＬ−１αの核局在化は細胞増殖の低下と相関する。ＩＬ−１は、カルシウム非感受性プロテインキナーゼＣアイソタイプの産生を阻害することが見出されているエーテル結合ジグリセリド種（アルキル、アシルおよびアルケニルおよびアシルグリセロール）の産生を促す。これらのＰＫＣアイソタイプは、有糸分裂活性と結びついている；したがってＩＬ−１に刺激されるジグリセリド産生を介したこれらのアイソタイプの阻害は、細胞の増殖停止に役割を果たすであろう。
【００４９】
さらに、細胞老化は早期アポトーシスの結果として生じうる。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、ある場合には、ＮＦ−ｋＢ 転写因子によって促進される。ＮＦ−ｋＢはＩＬ−１活性によって刺激され、したがって、ある状況下では、ＩＬ−１活性はアポトーシスを促進しうる。このことは、ＩＬ−１活性が細胞老化に影響を及ぼすさらに別の機構を表すであろう。
【００５０】
さらに、上記の通り、ＩＬ−１はテロメア維持および細胞寿命に影響を及ぼす。ＩＬ−１シグナル伝達は、モータリンに対する影響を介してテロメア維持に影響を与える。I型ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１ＲＩ）は細胞内で、細胞の有限寿命の表現型に伴うＨＳＰ７０ファミリーの一員であるモータリンと結びついている。細胞質のモータリンは、細胞のテロメア維持機構の抑制に関連する。この関連の機能的な意味合いは明らかでないが、しかしＩＬ−１ＲＩとモータリンとの間の結合は、それによってＩＬ−１が複製の老化において役割を果たしうる経路のひとつである。
【００５１】
これらの研究とその他は、ＩＬ−１遺伝子座の遺伝子が複雑な発現パターンと老化生命体における影響を有することを示す。これらの因子はさまざまな組織においていくつかの明瞭な機構を通じて老化過程に影響を及ぼす可能性が高い。
【００５２】
血管新生
ＩＬ−１が血管新生において役割を果たしうることが予測されている。ここに開示する通り、ある種のＩＬ−１対立遺伝子の存在は内皮細胞における細胞分裂の潜在力の低下の指標となる。そのような可能性の低下は、幅広い症状および障害に影響を与える。たとえば、血管新生の過程は新しい血管となる管を形成するために内皮細胞の細胞分裂を必要とする。血管新生はある範囲の疾患状態、腫瘍 転移および内皮細胞による異常な増殖において起こる。血管新生の過程の結果として作られた脈管構造は、これらの症状で見られる病理的損傷を支持する。調節されない血管新生が要因で生じたさまざまな病理的状態は、血管新生依存性または血管新生関連疾患としてまとめられている。さらに、血管新生は創傷治癒や再生といった正常の過程の一部である。
【００５３】
定義
便宜上、本明細書、実施例、および付属の請求項中で用いられる一部の用語がここに集められている。別に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の通常の技能を有する者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００５４】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、ここでは冠詞の文法的対象の一または一より多く（すなわち、少なくとも一つ）に言及するのに用いられる。一例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は一要素または一より多い要素を意味する。
【００５５】
「異常な活性」の語は、たとえばＩＬ−１といったポリペプチドの活性に当てはめるように野生型または天然ポリペプチドの活性と異なるか、または健常者のポリペプチドの活性とは異なる活性をいう。ポリペプチドの活性が天然の対応物の活性より強いため異常である。あるいは、活性が天然の対応物の活性と比較して弱いかまたは存在しないため異常である。異常な活性はまた、活性における変化である。たとえば異常なポリペプチドは別の標的ペプチドと相互作用する。ＩＬ−１遺伝子座ポリペプチドをコードするＩＬ−１遺伝子座遺伝子の過剰発現または低発現が要因で細胞は異常なＩＬ−１活性を有する。
【００５６】
「老化関連の癌」は、高齢集団において発生率が上昇する任意の形の新生物をいう。大部分の癌は老化に関連し、たとえば乳癌、前立腺癌および子宮内膜癌といった癌は特にそうである。
【００５７】
「老化関連症状」は、高齢集団において上昇する頻度で生じる健康状態の範囲の任意のものである。そのような健康状態は、制限無しに、結合組織機能低下（たとえば骨粗鬆症、変形性関節症、軟骨細胞プロテオグリカン合成の減少と慢性関節リウマチ、創傷治癒の低下、虚弱、筋肉疲労）、異常な免疫系機能（たとえばＴ細胞増殖の低下、ＩＬ−１産生の増加、ＩＬ−１への反応性の低下、感染症に対する感受性の増大）、神経機能低下（たとえばアルツハイマー病、痴呆、長期低下および、聴力低下、網膜変性を含む眼機能低下、短期記憶、シナプス可塑性低下、学習障害、不眠、うつ病）、心臓血管疾患（たとえば冠動脈疾患、脳卒中、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化、鬱血性心不全、高血圧）および老化関連の癌を含む。
【００５８】
「老化関連表現型」は、ＥＯＡと関連するかまたはＥＯＡの可能性の増大と関連する被験者または細胞の表現型である。ＥＯＡ関連表現型はまたＥＯＡ関連対立遺伝子を有する被験者または細胞にみられる任意の表現型であり、そのような表現型はＥＯＡ関連対立遺伝子を欠く被験者または細胞にみられる表現型と異なる。そのような表現型は本質的にバイオマーカーの任意の特性を含む。ＥＯＡ関連表現型は直接ＥＯＡに関与していないかもそれないが、ＥＯＡの指標として働く。「非ＥＯＡ関連表現型」は、ＥＯＡまたはＥＯＡを発症する可能性の増大と関連していない表現型である。
【００５９】
「対立遺伝子」の語は異なる多型領域にみられる異なる配列変異体をいう。たとえば、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）は少なくとも５つの異なる対立遺伝子を有する。配列変異体は一塩基または複数塩基の変化である可能性があり、制限なく挿入、欠失、または置換を含み、あるいは反復配列数変異であってもよい。
【００６０】
「対立遺伝子パターン」の語は、一またはそれ以上の多型領域の一個の対立遺伝子または複数個の対立遺伝子の特定をいう。たとえば、対立遺伝子パターンは、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１に関して、多型部位の単一の対立遺伝子から構成され、その対立遺伝子１はＩＬ−１ＲＮ遺伝子座のＶＮＴＲに少なくとも一コピーのＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子１を有する対立遺伝子パターンである。あるいは、対立遺伝子パターンは、一つの多型部位での同型接合または異型接合の状態のいずれかから構成されていてもよい。たとえば、ＩＬ１−ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２,２は、ＩＬ−１ＲＮのＶＮＴＲマーカーに第二の対立遺伝子の二個のコピーが存在し、ＩＬ−ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２の同型接合状態に相当する対立遺伝子パターンである。あるいは、対立遺伝子パターンは一より多い多型部位での対立遺伝子の特定から構成されていてもよい。
【００６１】
ここで用いられる「抗体」の語はＩＬ−１Ｂポリペプチドと特異的に反応する抗体全体またはその結合断片を含む結合物質を称することが意図されている。抗体は従来の方法を用いて断片化することができ、断片は抗体全体について上述したのと同様の方法で有用性についてスクリーニングすることができる。たとえば、Ｆ(ａｂ)２断片は抗体をペプシンで処理することによって生じることができる。結果として得られるＦ(ａｂ)２断片を処理して、ジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ断片を作成してもよい。本発明の抗体はさらに、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によって与えられるＩＬ−１Ｂポリペプチドへの親和性を有する、二重特異性、一本鎖、キメラおよびヒト化分子を含むことが意図される。
【００６２】
「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」は、互換的に用いられ、ここでの目的では、ＩＬ−１ポリペプチド（天然または変性した立体構造のいずれかで）、またはその任意の部分配列によって直接的または間接的に果たされる、エフェクターまたは抗原機能を意味する。これらの語はまた、たとえば発現レベルおよび翻訳後修飾といったＩＬ−１タンパク質および遺伝子の性質を網羅することも意図する。生物学的活性はたとえばＩＬ−１受容体といった標的ペプチドへの結合を含む。ＩＬ−１生物活性はＩＬ−１ポリペプチドに直接影響を与えることによって調節が可能である。あるいは、ＩＬ−１生物活性は、たとえばＩＬ−１遺伝子の発現を調節することにより、ＩＬ−１ポリペプチドの濃度を調節することによって調節が可能である。
【００６３】
ここで用いられる「ＩＬ−１ポリペプチドの生物活性断片」の語は、断片が野生型ＩＬ−１ポリペプチドの活性を特異的に模倣または拮抗する完全長ＩＬ−１ポリペプチドの断片をいう。生物活性断片は好ましくはインターロイキン受容体と相互作用することのできる断片である。
【００６４】
「バイオマーカー」の語は、被験者または細胞の表現型をいう。バイオマーカーは、幅広い細胞内および細胞外事象ならびに生物体全体の生理的変化を網羅する。バイオマーカーはこれらの任意のものであってよく、必ずしも炎症性反応に関与していない。細胞について、バイオマーカーはたとえば：シグナル分子の産生の濃度または速度、転写因子、中間代謝産物、サイトカイン、プロスタノイド、ステロイドホルモン（たとえばエストロゲン、プロゲステロン、アンドロステンジオンまたはテストステロン）、ゴナドトロピン（たとえばＬＨおよびＦＳＨ）、遺伝子転写物、タンパク質の翻訳後修飾、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、カテコールアミン（たとえばドーパミンまたはノルエピネフリン）、オピオイド、アクチビン、インヒビン、ならびにＩＬ−１生物学的活性といった本質的に細胞機能の任意のものであってよい。バイオマーカーは転写物レベルの全ゲノム分析またはタンパク質レベルでの全プロテオーム分析および／または修飾を含んでいてよい。加えて、バイオマーカーはレポーター遺伝子であってもよい。たとえば、ＩＬ−１プロモーターまたはＥＯＡ関連対立遺伝子を含むＩＬ−１プロモーターは、レポーター遺伝子と調節可能に結合させることができる。別の方法では、プロモーターはたとえばＩＬ−８のようにＩＬ−１に調節されるプロモーターであってもよい。この方法では、レポーター遺伝子の活性は、プロモーターの活性を反映する。適当なレポーター遺伝子は、ＧＵＳ、ＬａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（およびその変異体、たとえば赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質）、または産物が容易に検出される本質的に任意の他の遺伝子を含む。他の好ましいバイオマーカーは、下記の通り、免疫反応および炎症反応に関与する因子、ならびにＩＬ−１産生およびシグナル伝達に関与する因子を含む。被験者においては、バイオマーカーは、たとえば、上記のうち任意のもの、ならびに心電図パラメータ、肺機能、ＩＬ−６活性、尿パラメータまたは組織パラメータでありうる。「ＥＯＡ関連バイオマーカー」は上記のうち任意のものでＥＯＡと相関することが見出されたものか、あるいはＥＯＡ関連対立遺伝子を有する被験者または細胞において優先的に見出されるものである。
【００６５】
「心臓血管疾患」は、ここで定義される通り、臨床症状および臨床徴候を含む臨床事象によって特徴づけられる心臓血管障害である。臨床症状は、病理の存在を臨床医に示す、患者によって報告される経験である。臨床徴候は、病理の存在を臨床医に示す、身体診察または臨床検査についての客観的知見である。「心臓血管疾患」は「冠動脈疾患」および「末梢血管疾患」（脳血管疾患を含む）の両方を含む。心臓血管疾患における臨床症状は胸痛、息切れ、脱力感、失神の発作、意識変容、肢痛、発作性夜間呼吸困難、起坐呼吸、一過性脳虚血発作および患者によって経験される他のそのような現象を含む。心臓血管疾患における臨床徴候はたとえばＥＫＧ異常、末梢脈拍の変化、動脈雑音、異常な心音、ラ音、頚静脈怒張、神経学的変容といった知見および臨床医によって識別される他のそのような知見を含む。臨床症状および臨床徴候は、たとえば心筋梗塞（ＭＩ）あるいは脳卒中（「脳血管発作」または「ＣＶＡ」ともいう）等の心臓血管疾患では一体化することができ、そこでは患者はある種の現象（症状）を報告し臨床医は他の現象（徴候）を認めともに根本にある病理を示す。「心臓血管疾患」は、脆弱性プラーク障害、閉塞性障害および狭窄の心臓血管障害に関連する疾患を含む。たとえば、その語は下記に定義するが、脆弱性プラーク障害に起因する心臓血管疾患は、「脆弱性プラーク疾患」と称することができる。脆弱性プラーク疾患に伴う臨床事象は、脆弱性プラークの破裂とそれに引き続く急性血栓症または遠位塞栓を伴う脆弱性プラークの破裂が顕著な特徴である徴候および症状を含む。脆弱性プラーク疾患の例はある種の脳卒中および心筋梗塞を含む。別の一例として、閉塞性障害に起因する心臓血管疾患は「閉塞性疾患」と称することができる。閉塞性疾患に伴う臨床事象は、動脈の進行性閉塞が標的組織に到達する循環の量に影響を与える徴候および症状を含む。進行性動脈閉塞は結果として、循環の量が組織を維持するのに不十分である場合最終的に組織の死に進行しうる進行性虚血を生じうる。閉塞性疾患の徴候および症状は、跛行、休息痛、狭心症、壊疽、ならびに血管狭窄および遠位血流の減少を示す身体的知見および臨床検査の知見を含む。さらに別の一例として、再狭窄に起因する心臓血管疾患はステント内狭窄疾患と称することができる。ステント内狭窄疾患は、たとえば、ステントの存在が、血管をその新しい拡張構造に保つのを助けることを意図する経皮経管血管形成術のような手順の一部として配置された動脈ステントの進行性閉塞に起因する徴候および症状を含む。ステント内狭窄疾患に伴う臨床事象は、再建された動脈の再狭窄に帰することのできるものである。
【００６６】
「心臓血管障害」は、広く冠動脈障害および末梢動脈障害（脳血管障害を含む）をいう。「心臓血管障害」の語は、構造的、組織学的、生化学的または任意の他の異常であっても、動脈の任意の異常に適用することができる。この語は脆弱性プラークによって特徴づけられる障害（ここでは「脆弱性プラーク障害」と称する）、血管閉塞によって特徴づけられる障害（ここでは「閉塞性障害」と称する）、および再狭窄によって特徴づけられる障害を含む。「心臓血管障害」は一次的には、すなわち、何らかの医学的または外科的介入に先立って、動脈において生じうる。一次性心臓血管障害は、中でも、アテローム性動脈硬化、動脈閉塞、動脈瘤形成および血栓症を含む。「心臓血管障害」は動脈において二次的に、すなわち、医学的または外科的介入に続いて生じうる。二次性心臓血管障害は、中でも、外傷後動脈瘤形成、再狭窄、および手術後移植片閉塞を含む。
【００６７】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」はここでは相互に交換可能に使用される語で特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫または見込まれる子孫もいう。突然変異または環境的影響が要因で、ある種の修飾は後続の世代に起こりうるため、そのような子孫は実際親細胞と同一ではない可能性があるが、ここで用いられる語の範囲になお含まれる。
【００６８】
「キメラ」、「モザイク」、「キメラ哺乳類」などは、そのゲノムを含む細胞の少なくとも一部にノックアウトまたはノックイン構造を持つ遺伝子導入哺乳類をいう。
【００６９】
「成る」および「構成される」の語は包括的な開かれた意味で用いられ、追加の要素が含まれていてよいことを意味する。
【００７０】
「対照」または「対照試料」の語は、使用した検出方法に適当な任意の試料をいう。対照試料は、使用した対立遺伝子検出方法の産物または試験する物質を含んでいてよい。さらに、対照は陽性対照または陰性対照であってもよい。一例として、対立遺伝子検出方法がＰＣＲ増幅であって、続いてサイズ分画を行う場合、対照試料は適当なサイズのＤＮＡ断片を含んでいてよい。同様に、対立遺伝子検出方法が変異タンパク質の検出を要する場合、対照試料は変異タンパク質の試料を含んでいてよい。しかし、対照試料は試験する物質を含むことが好ましい。たとえば、対照は、ゲノムＤＮＡまたはＩＬ−１遺伝子群のクローンした一部の試料であってよい。しかし、試験する試料がゲノムＤＮＡである場合、対照試料は好ましくはゲノムＤＮＡの高度に精製された試料である。
【００７１】
「臨床事象」は疾患の臨床上識別できる徴候、または疾患の臨床上報告できる症状の出現である。「臨床上識別できる」は徴候が医療提供者によって認識されうることを示す。「臨床上報告できる」は、症状が医療提供者によって記載されうる型の減少であることを示す。臨床事象は臨床上報告しうる症状を、それらが一般的に患者によって医療提供者に説明することのできる型の現象であるかぎり、特定の患者が自らそれらを報告することができなくても含む。
【００７２】
「結合組織」はよく知られた語であり、骨、筋肉、軟骨、腱、靱帯および皮膚を含む組織をいう。結合組織機能は、構造的完全性、可塑性、変形性、引張り強さ、収縮強さ、治癒し再構成し損傷に抵抗する能力を含む。
【００７３】
「疾患関連対立遺伝子」または「障害に関連する対立遺伝子」は、被験者におけるその存在が、被験者が特定の障害を有するかまたは発症しやすいことを示す対立遺伝子をいう。疾患関連対立遺伝子の一つの型は「老化関連対立遺伝子」であり、被験者におけるその存在は、被験者が早期老化または老化関連障害の早期発症をおこしやすいことを示す。これらは細胞分裂の能力の低下、細胞の老化および早期死亡に関連する対立遺伝子を含む。老化関連対立遺伝子の例は、ＩＬ−１パターン１を構成する対立遺伝子、すなわちＩＬ−１Α＋４８２５の対立遺伝子２；ＩＬ−１Ｂの＋３９５４マーカーの対立遺伝子２；そしてＩＬ−１ＲＮの＋２０１８マーカーの対立遺伝子１；およびＩＬ−１Ｂ遺伝子の（−５１１）マーカーの対立遺伝子１、または上記の対立遺伝子の一つと連鎖不平衡にある対立遺伝子を含む。
【００７４】
「遺伝子の破壊」および「標的破壊」の語句または何らかの同様の語句は、当該遺伝子の野生型コピーと比較してその遺伝子の発現を妨げる、天然ＤＮＡ配列の部位特異的割り込みをいう。割り込みは当該遺伝子の欠失、挿入または修飾、またはその任意の組合せによって生じる。
【００７５】
「老化関連症状の早期発現」または「老化関連症状の早期発現または進行」または「ＥＯＡ」は、老化関連症状が、特定個人または特定症状について、それ以外の場合に予期されるよりも早く生じるかまたは早く進行する状況をいう。発現の予想年齢はその個人について知られている情報の量によって変化する。たとえば、多くの症状は女性では男性より遅く現れ、したがって、それらの症状については、発現の予想年齢は女性について遅くなる。ウェルナー症候群突然変異を有する人は、老化関連症状の発現は約１０から１５歳であると予想され、人口全体よりはるかに早い。個人に関する情報が無い場合は、予想発現年齢は問題の症状についての人口全体の予想発現年齢となる。
【００７６】
「ＥＯＡ治療薬」は、発症を防ぐかまたは延期するか、あるいは老化関連症状の早期発現の症状を緩和する任意の物質をいう。ＥＯＡ治療薬はポリペプチド、類似構造ペプチド、核酸、他の無機または有機分子、または栄養補助食品、好ましくは「小分子」でありうる。好ましくは、ＥＯＡ治療薬は少なくとも一つのＥＯＡ関連表現型を調節することができる。たとえば、ＥＯＡ治療薬は、たとえばＩＬ−１受容体との相互作用といったＩＬ−１ポリペプチドの活性を、ＩＬ−１ポリペプチドの天然に生じる効果を模倣または増強（作用）または阻害（拮抗）することによって調節できる。ＩＬ−１アゴニストは、野生型ＩＬ−１生物活性の少なくとも一つ、たとえば受容体結合活性、を有する野生型ＩＬ−１タンパク質またはその誘導体である。ＩＬ−１アゴニストはまた、ＩＬ−１遺伝子の発現をアップレギュレートするかまたはＩＬ−１タンパク質の少なくとも一つの生物活性を上昇させる化合物であってもよい。アゴニストはまた、たとえばインターロイキン受容体といった他の分子とのＩＬ−１ポリペプチドの相互作用を増大させる化合物であってもよい。ＩＬ−１アンタゴニストはたとえば、ＩＬ−１受容体のような受容体といった他の分子とのＩＬ−１ポリペプチドの相互作用を阻害または減少させる化合物である。したがって、好ましいアンタゴニストはＩＬ−１受容体への結合を阻害または減少させそれによって以降のＩＬ−１受容体活性化を阻害する化合物である。アンタゴニストはまた、ＩＬ−１遺伝子座遺伝子の発現をダウンレギュレートするかまたは存在するＩＬ−１タンパク質の量を減少させる化合物である。ＩＬ−１アンタゴニストはＩＬ−１ポリペプチドの優性阻害型、たとえば、ＩＬ−１受容体のような標的ペプチドと相互作用することができるが、ＩＬ−１受容体の活性化を促進しない、ＩＬ−１ポリペプチドの一種である。ＩＬ−１アンタゴニストはまた、ＩＬ−１ポリペプチドの優性阻害型をコードする核酸、ＩＬ−１アンチセンス核酸、またはＩＬ−１ＲＮＡと特異的に相互作用することのできるリボザイムであってもよい。さらに他のＩＬ−１アンタゴニストはＩＬ−１ポリペプチドと結合しその作用を阻害する分子である。そのような分子は、たとえば、生物学的活性を持たない、ＩＬ−１によるＩＬ−１受容体への結合を阻害する種類のＩＬ−１標的ペプチドといったペプチドを含む。このように、そうしたペプチドは、ＩＬ−１の活性部位に結合し、たとえばＩＬ−１受容体のような標的ペプチドと相互作用するのを阻害する。さらに他のＩＬ−１アンタゴニストは、ＩＬ−１分子の抗原決定基と特異的に相互作用し、結合がＩＬ−１遺伝子座ポリペプチドの生物学的機能に干渉する抗体を含む。さらに他の好ましい実施形態では、ＩＬ−１アンタゴニストはＩＬ−１ポリペプチドと標的ＩＬ−１受容体との間の相互作用を阻害することのできる分子のような小分子である。あるいは、小分子は、ＩＬ−１受容体結合部位以外の部位と相互作用することによって、アンタゴニストとして機能することができる。アンタゴニストは、核酸、タンパク質、糖、脂質またはその組合せを含む任意の分類の分子であってよいが、治療目的には好ましくは小分子である。
【００７７】
「老化関連症状の早期進行」または「ＥＰＡ」の語は、老化関連症状が被験者において進行する速度が人口全体より早い状況をいう。早期発現および早期進行は、非常に重なり合って関連する状況であり、そして文脈に明瞭に示されない限り、早期発現に関して記載する各実施形態はまた早期進行に適用できる。
【００７８】
ここで用いられる「ハプロタイプ」の語は、統計的に有意な水準で（Ｐｃｏｒｒ０．０５）グループとして一緒に遺伝する（連鎖不平衡にある）対立遺伝子の組をいうことを意図する。ここで用いられるような、「ＩＬ−１ハプロタイプ」の語はＩＬ−１遺伝子座にあるハプロタイプをいう。少なくとも３種類のＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプが知られている。ＩＬ−１（４４１１２３３２）（ここではまたパターン２ともいう）ハプロタイプはＩＬ受容体アンタゴニスト活性の低下と関連している一方、ＩＬ−１（３３２２１４６１）（ここではまたパターン１ともいう）ハプロタイプはＩＬ−１αおよびβアゴニスト活性の上昇と関連している。ＩＬ−１（４４１１２３３２）ハプロタイプは下記の対立遺伝子を含む：ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２；ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２；ＩＬ−１Α（２２２／２２３）対立遺伝子４；ＩＬ−１Α（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子４；ＩＬ−１Ａ（−８８９）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子２；ｇａａｔ．ｐ３３３３０対立遺伝子３；Ｙ３１対立遺伝子３；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８１２）対立遺伝子２；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８６８）対立遺伝子２；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８８７）対立遺伝子２；Ｐｉｃ（１７３１）対立遺伝子２；ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（＋６９１２）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−３１）対立遺伝子２。ＩＬ−１（３３２２１４６１）ハプロタイプは下記の対立遺伝子を含む：ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１；ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１；ＩＬ−１Α（２２２／２２３）対立遺伝子３；ＩＬ−１Ａ（ｇｚ５／ｇｚ６）対立遺伝子３；ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子２；ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２；ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子１；ｇａａｔ．ｐ３３３３０対立遺伝子４；Ｙ３１対立遺伝子６；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８１２）対立遺伝子１；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８６８）対立遺伝子１；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８８７）対立遺伝子１；Ｐｉｃ（１７３１）対立遺伝子１；ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子２；ＩＬ−１Ｂ（＋６９１２）対立遺伝子２；ＩＬ−１Ｂ（−３１）対立遺伝子１。別のハプロタイプ（パターン３）は下記の対立遺伝子を含む：ＩＬ−１Α（＋４８４５）対立遺伝子１；ＩＬ−１Α（−８８９）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子１；ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子２；ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１；ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１。
【００７９】
ここで用いられる「ＩＬ−１アゴニスト」は、ＩＬ−１生物活性またはＩＬ−１生物学的経路中の遺伝子の生物活性を、模倣、アップレギュレート（増強または補足）するかさもなければ上昇させる物質をいう。ＩＬ−１アゴニストは、プロモーター領域でのＩＬ−１遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡスプライシング機構の調節、ｍＲＮＡの安定化、翻訳のためのタンパク質のリン酸化、ＩＬ−１前駆体から成熟ＩＬ−１への変換とＩＬ−１の分泌を含むさまざまな異なるレベルのうち任意のものに対して作用しうる。ＩＬ−１合成を増加させるアゴニストは：リポ多糖、ＩＬ−１Ｂ、ｃＡＭＰ誘導物質、ＮＦκＢ活性化物質、ＡＦ−１活性化物質、ＴＮＦ−α、酸化ＩＬＩＬ、進行型グリコシル化最終産物（ＡＧＥ）、ずり応力、低酸素症、高酸素症、虚血再潅流障害、ヒスタミン、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞刺激因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、補体Ｃ５Ａ、補体Ｃ５ｂ９、フィブリン分解産物、プラスミン、トロンビン、９−ヒドロキシオクタデカエン酸、１３−ヒドロキシオクタデカエン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、Ｈ因子、レチノイン酸,尿酸、ピロリン酸カルシウム、ポリヌクレオシド、ｃ反応性タンパク質、抗トリプシン、タバコ抗原、コラーゲン、インテグリンＩＬＦＡ−３、抗ＩＬＡ−ＤＲ、抗ＩｇＭ、抗ＣＤ３、ＣＤ４０連結反応、フィトヘマグルチニン（ＣＤ２）、ｓＣＤ２３、紫外線Ｂ、ガンマ線、Ｐ物質、イソプロテレノール、メタンフェタミンおよびメラトニン、を含む。ＩＬ−１ｍＲＮＡを安定化するアゴニストは、細菌エンドトキシンおよびＩＬ−１を含む。利用可能なI型ＩＬ−１受容体の数を増やすことによって機能する他のアゴニストは、ＩＬ−１、ＰＫＣ活性化因子、デキサメタゾン、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＰＧ６２を含む。他の好ましいアンタゴニストは、ＩＬ−１によって活性化されるかまたはＩＬ−１シグナル伝達経路で利用されるシグナル伝達因子に干渉するかまたは阻害する（たとえばＮＦκＢおよびＡＰ−１、ＰＤキナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、プロテインキナーゼＣ、ＪＮＫ−１、５−リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ２、チロシンリン酸化、ｉＮＯＳ経路、Ｒａｃ、Ｒａｓ、ＴＲＡＦ）。さらに他のアゴニストは、発現がＩＬ−１によって誘導される遺伝子の生物活性を上昇させ、下記を含む：ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒａ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦ、フィブリノーゲン、ウロキナーゼプラスミノーゲン阻害因子、１型および２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）、フィブリノーゲン受容体、ＣＤ−１１／ＣＤ１８、プロテアーゼネキシン−１、ＣＤ４４、マトリクスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−３、エラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰｌ）、コラーゲン、トリグリセリド増加型ＡｐｏＣＩＩＩ、アポリポタンパク質、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１ＩＬ−セレクチン、デコリン、幹細胞刺激因子、白血病抑制���子、ＩＦＮａ、ｂ、ｇ、ＩＬ−８、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体、ｃ−ｋｉｔ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、２型ホスホリパーゼＡ２、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、エンドセリン−１、３、γーグルタミルトランスフェラーゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｃ反応性タンパク質、フィブリノーゲン、血清アミロイドＡ、メタロチオネイン、セルロプラスミン、リゾチーム、キサンチンデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、血小板由来成長因子Ａ鎖（ＰＤＧＦ）、黒色種成長刺激活性（ｇｒｏ−ａ、ｂ、ｇ）、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、アクチビンＡ、プロオピオメラノコルチコトロピン、コルチコトロピン放出因子、Ｂアミロイド前駆体、基底膜タンパク質−４０、ラミニンＢ１およびＢ２、構成性熱ショックタンパク質ｐ７０、Ｐ４２マイトジェン、活性化プロテインキナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ヘムオキシゲナーゼおよびＧタンパク質αサブユニット）。
【００８０】
ここで用いられる「ＩＬ−１アンタゴニスト」は、ＩＬ−１生物活性をダウンレギュレートするかさもなければ低下させる物質をいう。ＩＬ−１アンタゴニストはプロモーター領域でのＩＬ−１遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡスプライシング機構の調節、ｍＲＮＡの安定化、翻訳のためのタンパク質のリン酸化、ＩＬ−１前駆体から成熟ＩＬ−１への変換とＩＬ−１の分泌を含むさまざまな異なるレベルのうち任意のものに対して作用しうる。ＩＬ−１産生のアンタゴニストは下記を含む：コルチコステロイド、リポキシゲナーゼ阻害因子、シクロオキシゲナーゼ阻害因子、γ−インターフェロン、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、ＡＣＥ阻害因子、ｎ−３多価不飽和脂肪酸、抗酸化剤および脂質還元物質。ＩＬ−１ｍＲＮＡを不安定化するアンタゴニストは脱アデニル化を促進する物質を含む。翻訳のためのＩＬ−１タンパク質のリン酸化を阻害するかまたは妨げるアンタゴニストは、たとえばテブフェロンのようなピリミジル−イミダゾール化合物および微小管形成を阻害する化合物（たとえばコルヒチン、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）を含む。ＩＬ−１前駆体から成熟ＩＬ−１への変換を阻害するアンタゴニストは、インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）阻害因子、ＣＸｒｍ−Ａ、転写物Ｘ、内因性テトラペプチド競合基質阻害因子、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシン、キマーゼ、および他の非特異的プロテアーゼを含む。ＩＬ−１の分泌を阻害するかまたは妨げるアンタゴニストは、陰イオン輸送を阻害する物質を含む。ＩＬ−１受容体相互作用に干渉するアンタゴニストは、下記を含む： I型ＩＬ−１受容体のグリコシル化を阻害する物質、ＩＬ−１ＲＩに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＬ−１ＲＩに対する抗体およびＩＬ−１ＲａｃＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。利用可能なI型ＩＬ−１受容体の数を減らすことによって機能する他のアンタゴニストは、ＴＧＦ−α、ＣＯＸ阻害因子、ＩＩ型ＩＬ−１受容体を増加させる因子、デキサメタゾン、ＰＧＥ２、ＩＬ−１およびＩＬ−４を含む。他の好ましいアンタゴニストは、ＩＬ−１によって活性化されるかまたはＩＬ−１シグナル伝達経路で利用されるシグナル伝達因子に干渉するかまたは阻害する（たとえばＮＦκＢおよびＡＰ−１、ＰＩ３キナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、プロテインキナーゼＣ、ＪＮＫ−１、５−リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ２、チロシンリン酸化、ｉＮＯＳ経路、Ｒａｃ、Ｒａｓ、ＴＲＡＦ）。さらに他のアンタゴニストは、発現がＩＬ−１によって誘導される遺伝子の生物活性に干渉し、下記を含む：ＩＬ−１、ＩＬ−ＩＲａ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−、フィブリノーゲン、ウロキナーゼプラスミノーゲン阻害因子、１型および２型プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、ｐ−セレクチン（ＣＤ６２）、フィブリノーゲン受容体、ＣＤ−Ｉ１／ＣＤ１８、プロテアーゼネキシン−１、ＣＤ４４、マトリクスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−３、エラスターゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ組織阻害因子−１（ＴＩＭＰｌ）、コラーゲン、トリグリ��リド増加型ＡｐｏＣＩＩＩ、アポリポタンパク質、ＩＣＡＭ−１、ＩＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１ＩＬ−セレクチン、デコリン、幹細胞刺激因子、白血病抑制因子、ＩＦＮα、β、ＩＬ−８、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−３受容体、ＩＬ−５受容体、ｃ−ｋｉｔ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、２型ホスホリパーゼＡ２、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、エンドセリン−１、３、γーグルタミルトランスフェラーゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼ、Ｃ−反応性タンパク質、フィブリノーゲン、血清アミロイドＡ、メタロチオネイン、セルロプラスミン、リゾチーム、キサンチンデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、血小板由来成長因子Ａ鎖（ＰＤＧＦ）、黒色種成長刺激活性（ｇｒｏ−ａ、ｂ、ｇ）、インシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、アクチビンＡ、プロオピオメラノコルチコトロピン、コルチコトロピン放出因子、Ｂアミロイド前駆体、基底膜タンパク質−４０、ラミニンＢ１およびＢ２、構成性熱ショックタンパク質ｐ７０、Ｐ４２マイトジェン、活性化プロテインキナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ヘムオキシゲナーゼおよびＧタンパク質αサブユニット）。他の好ましいアンタゴニストは下記を含む：ヒメニアルジシン、ハービマイシン（たとえばハービマイシンＡ）、ＣＫ−１０３Ａおよびその誘導体（たとえば４,６−ジヒドロピリダジノ[４,５−ｃ]ピリダジン−５（１Ｈ）−オン）、ＣＫ−１１９、ＣＫ−１２２、ヨードメタシン、アフラトキシンＢ１、レプチン、ヘパリン、二環式イミダゾール（たとえばＳＢ２０３５８０）、ＰＤ１５３０６ＨＣｌ、ポドカルプ酸誘導体、Ｍ−２０、ヒト[Ｇｌｙ２]グルカゴン様ペプチド−２、ＦＲ１６７６５３、ステロイド誘導体、糖質コルチコイド、ケルセチン、テオフィリン、ＮＯ合成酵素阻害因子、ＲＷＪ６８３５４、ユーカリプトール（１．８−シネオール）、マグノサリン、Ｎ−アセチルシステイン、α−メラトニン刺激ホルモン（ａ−ＭＳＨ）、トリクロサン（２,４,４'−トリクロロ−２'−ヒドロキシルジフェニルエーテル）、プロスタグランジンＥ２および４−アミノピリジン、エタクリン酸および４,４'−ジイソチオシアナトスチルベン２,２'−ジスルホン酸（ＢＩＤＳ）、グルコース、リポホスホグリカン、アスピリン、異化阻害物質、ジアセルヘイン、チオール調節物質、亜鉛、モルヒネ、ロイコトリエン生合成阻害因子（たとえばＭＫ８８６）、血小板活性化因子受容体アンタゴニスト（たとえばＷＥＢ２０８６）、アミオダロン、トラニラスト、Ｓ−メチルＩＬ−チオシトルリン、β−アドレナリン受容体アゴニスト（たとえばプロカテロール、クレンブテロール、フェノテロール、テルブタリン、ヒアルロン酸、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−１α自己抗体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１Ｒ−関連キナーゼ、可溶性ＴＮＦ受容体および抗炎症性サイトカイン（たとえばＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩ型可溶性ＩＬ−１受容体、Ｉ型可溶性ＩＬ−１受容体、組織プラスミノーゲン活性化因子、亜鉛フィンガータンパク質Ａ２０、ＩＬ−１ペプチド（たとえば（ＴｈｒＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）（タフトシン）、（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＳｅｒＧｌｕ）ＩＬ−１−α、Ｖａｌ−ＴｈｒＩＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、インターフェロンα２ｂ、インターフェロンβ、ＩＬ−１−βアナログ（たとえばＩＬ−１−βトリペプチドＩＬｙｓ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ）、グリコシル化ＩＬ−１−α、およびＩＬ−１ｒａペプチド。
【００８１】
ここで用いられる「ＩＬ−１遺伝子群」および「ＩＬ−１遺伝子座」は、少なくともＩＬ−１Α、ＩＬ−１ＢおよびＩＬ−１ＲＮ遺伝子およびすべての他の連鎖した配列を含む、染色体２の２ｑ１３領域またはその近傍のすべての核酸を含む。ここで用いられる「ＩＬ−１Α」、「ＩＬ−１Ｂ」、および「ＩＬ−１ＲＮ」の語は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１受容体アンタゴニストまたはＩＬ−１ｒａをそれぞれコードする遺伝子をいう。この領域のＤＮＡはマッピングされている。非特許文献１１、非特許文献６７；非特許文献６８、正誤表が非特許文献６９。ＩＬ−１ΑおよびＩＬ−１Ｂについての遺伝子番号（ＧＥＮ）はそれぞれＸ０３８３３およびＸ０４５００である。一般的に、ＩＬ−１ＲＮのヌクレオチド位置への参照は、ＧＥＮ Ｘ７７０９０を有する細胞内型が参照されているという明示的に示されるかまたは文脈から示唆される指示が無い限り、当該タンパク質の分泌型であるＧＥＮ Ｘ６４５３２のヌクレオチド配列を参照する。ＩＬ−１ＲＡの二つの型は単一の遺伝子によって、二つの最初のエキソンの択一的な使用によってコードされている。一般的に非特許文献７０を参照。
【００８２】
「ＩＬ−１機能突然変異」は、結果として表現型の変化を生じる（すなわち、ＩＬ−１遺伝子またはタンパク質の機能に影響する）ＩＬ−１遺伝子群内の突然変異をいう。例は下記を含む：ＩＬ−１Α（−４８４５）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋６９１２）対立遺伝子２およびＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２。
【００８３】
「ＩＬ−１Ｘ（Ｚ）対立遺伝子Ｙ」は、遺伝子ＸのＩＬ−１遺伝子座多型部位で生じる、Ｙで表す特定の対立遺伝子型をいい、ＸはＩＬ−１Ａ、Ｂ、またはＲＮまたはＩＬ−１遺伝子座にある他の遺伝子であり、ヌクレオチドＺまたはその近傍に位置し、ヌクレオチドＺは主要な転写開始位置と相対的に番号を付与され、その主要な転写開始位置は当該の特定ＩＬ−１遺伝子Ｘのヌクレオチド＋１である。さらにここで用いられるような、「ＩＬ−１Ｘ対立遺伝子（Ｚ）」の語は、ヌクレオチドＺまたはその近傍に位置する遺伝子ＸのＩＬ−１多型部位のすべての対立遺伝子をいう。たとえば、「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子」の語は、マーカー＋２０１８に位置するＩＬ−１ＲＮ遺伝子の選択的な種類をいう。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１」は、シトシン（Ｃ）をセンス鎖の＋２０１８位に含む種類のＩＬ−１ＲＮ遺伝子をいう。非特許文献７１。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２」は、チミン（Ｔ）をプラス鎖の＋２０１８位に含む種類のＩＬ−１ＲＮ遺伝子をいう。被験者が二個の同一のＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子を有する場合、被験者は同型接合である、または同型接合状態を有するという。被験者が二個の異なるＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子を有する場合、被験者は異型接合である、または異型接合状態を有するという。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２,２」の語は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２の同型接合状態をいう。逆に、「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１,１」の語は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１の同型接合状態をいう。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１,２」の語は、対立遺伝子１と２の異型接合状態をいう。
【００８４】
ここで用いられる「ＩＬ−１関連」は、ヒト染色体２（２ｑ１２−１４）上のヒトＩＬ−１遺伝子座遺伝子に関連するすべての遺伝子を含むことを意図する。これらは染色体２（２ｑ１３−１４）に位置するヒトＩＬ−１遺伝子群のＩＬ−１遺伝子を含み、下記を含む：インターロイキン−１αをコードするＩＬ−１Ａ遺伝子、インターロイキン−１βをコードするＩＬ−１Ｂ遺伝子、およびインターロイキン−１受容体アンタゴニストをコードするＩＬ−１ＲＮ（またはＩＬ−１ｒａ）遺伝子。さらにこれらのＩＬ−１関連遺伝子は、ヒト染色体２（２ｑ１２）上に位置するＩ型およびＩＩ型ヒトＩＬ−１受容体遺伝子、およびマウス染色体１の１９．５ｃＭ位に位置するそれらのマウス相同体を含む。インターロイキン−１ 、インターロイキン−１ 、およびインターロイキン−１ＲＮは大きく関連しているためそれらはすべてＩ型ＩＬ−１受容体と結合するが、しかしインターロイキン−１ およびインターロイキン−１ だけがＩ型ＩＬ−１受容体を活性化するアゴニストリガンドである一方、インターロイキン−１ＲＮは天然に生じるアンタゴニストリガンドである。「ＩＬ−１」の語が遺伝子産物またはポリペプチドに関して用いられる場合、ヒト染色体２（２ｑ１２−１４）上のインターロイキン−１遺伝子座によってコードされるすべての遺伝子産物、および他の種に由来するそれらの対応する相同体、またはその機能する変異体をいうことを意図する。ＩＬ−１の語はしたがって、たとえばＩＬ−１およびＩＬ−１βのような炎症反応を促進する分泌されたポリペプチド、ならびにたとえばＩＬ−１α受容体アンタゴニストおよびＩＩ型ＩＬ−１（おとり）受容体のような炎症反応に拮抗する分泌されたポリペプチドを含む。
【００８５】
「ＩＬ−１受容体」または「ＩＬ−１Ｒ」は、ＩＬ−１遺伝子座にコードされるリガンドに結合することのできる、および／またはそのリガンドからのシグナルを伝達することのできる、さまざまな細胞膜結合タンパク質受容体をいう。その語は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）分子に結合することができ、また哺乳類原形質膜タンパク質としての天然の立体構造で、好ましくはＩＬ−１によって細胞へ提供されるシグナル伝達に役割を果たす、任意のタンパク質に適用される。ここで用いられるような、その語はＩＬ−１結合またはシグナル伝達活性を有する天然タンパク質のアナログを含む。例は特許文献１１に記載されたヒトおよびマウスＩＬ−１受容体を含む。「ＩＬ−１核酸」の語はＩＬ−１タンパク質をコードする核酸をいう。
【００８６】
「ＩＬ−１ポリペプチド」および「ＩＬ−１タンパク質」は、図１、２、および３に示すＩＬ−１ゲノムＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片、およびその相同体を含むポリペプチドを網羅することを意図し、アゴニストおよびアンタゴニストポリペプチドを含む。
【００８７】
「免疫系」は、ウイルス、細菌、寄生生物、寄生虫、真菌、昆虫、原虫などによる感染を防ぐため、および一般的に異物または非自己物質から保護するために機能する、細胞と因子の複雑な系である。免疫系はまた、癌細胞を含む、体の損傷細胞または疾患細胞を破壊するためにも機能する。免疫系はさらに自己と非自己とを識別するためにも機能し、炎症および全身性ショックを媒介する。免疫系機能の低下は、これらの活性のうち任意のものの欠陥をいう。
【００８８】
「含む」の語はここでは「含むがそれに限らない」を意味して用いられる。「含む」と「含むがそれに限らない」は相互に交換可能に用いられる。
【００８９】
「危険性の増大」または「感受性の増大」は、特定の多型対立遺伝子を有する人における、その特定の多型対立遺伝子を有しない集団の成員における疾患または症状の発生率の頻度と比較して、疾患または症状の統計的により高い頻度の発生率をいう。
【００９０】
ここで用いられる「相互作用する」の語は、たとえば自然状態におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸およびタンパク質−小分子または核酸−小分子間の相互作用のような、分子間の検出可能な関係または関連（たとえば生化学的相互作用）を含むことを意図する。
【００９１】
ＤＮＡまたはＲＮＡといった核酸についてここで用いられる「単離された」の語は、その巨大分子の天然の起源中に存在する他のＤＮＡ、またはＲＮＡからそれぞれ分離された分子をいう。たとえば、対象ＩＬ−１ポリペプチドの一つをコードする単離された核酸は、好ましくは天然にゲノムＤＮＡ中でＩＬ−１遺伝子に直接隣接する核酸配列の１０キロベース（ｋｂ）しか含まず、より好ましくはそのような天然に存在する隣接する配列の５キロベースしか含まず、非常に好ましくはそのような天然に存在する隣接する配列の１．５キロベース未満を含む。ここで用いられる「単離された」の語はまた、細胞物質、ウイルス物質、または組換えＤＮＡ法によって製造された場合は培地を、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体または他の化学物質を、実質的に含まない、核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された核酸」は、断片としては天然に生じない、自然状態では見つからない核酸断片を含むことを意図する。「単離された」の語はまたここでは、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドをいうのに用いられ、精製および組換えポリペプチドの両方を網羅することを意図する。
【００９２】
「ノックイン」遺伝子導入動物は、修飾された遺伝子がゲノムに導入された動物をいい、その修飾された遺伝子は外因性または内因性起源であってよい。
【００９３】
「ノックアウト」遺伝子導入動物は、内因性遺伝子の発現の部分的または完全な抑制（たとえば、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子の少なくとも一部の別の配列との置換、終止コドンの導入、決定的なアミノ酸をコードする塩基の突然変異、またはイントロンジャンクションの除去、などに基づく）が存在する動物をいう。「ノックアウト構造」は、細胞の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは抑制するために用いることのできる核酸 配列をいう。簡単な例では、ノックアウト構造は、たとえば活性タンパク質を発現することができないように遺伝子の決定的な部分に欠失があるＩＬ−１ＲＮ遺伝子のような遺伝子から成る。あるいは、タンパク質の早期終止を起こすようにいくつかの終止コドンを天然遺伝子に加えることができ、またはイントロンジャンクションを不活性化することができる。典型的なノックアウト構造では、遺伝子の一部が選択可能なマーカー（たとえばｎｅｏ遺伝子）で置換されており、ゆえに当該遺伝子は下記のように表すことができる：ＤＷＲＮ５'／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ３'、ここでＩＬ−１ＲＮ５'およびＩＬ−１ＲＮ３'はそれぞれ相対的にＩＬ−１ＲＮ遺伝子の部分より上流または下流であるゲノム配列またはｃＤＮＡ配列をいい、またｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子をいう。別のノックアウト構造では、別の選択可能なマーカーが隣接位置に追加されており、ゆえに当該遺伝子は下記のように表すことができる：ＩＬ−１ＲＮ／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ／ＴＫ、ここでＴＫは先行する構造のＩＬ−１ＲＮ５'またはＩＬ−１ＲＮ３'配列のどちらかに追加することができさらに適当な培地中でそれに対して選択を行うことができる（すなわち、陰性選択可能なマーカーである）チミジンキナーゼ遺伝子である。この２マーカー構造は、典型的にはＴＫ配列を保持する非相同組換え事象からの、隣接ＴＫマーカーを除去する相同組換え事象の選択を可能にする。遺伝子欠失および／または置換は、エキソン、イントロン、特にイントロンジャンクション、および／またはたとえばプロモーターのような制限領域におけるものであってよい。
【００９４】
「連鎖不平衡」は、任意の対照集団における各対立遺伝子の存在の別々の頻度から予想されるより高い頻度での、二個の対立遺伝子の同時遺伝をいう。独立に遺伝する二個の対立遺伝子の存在の予想頻度は、第一の対立遺伝子の頻度に第二の対立遺伝子の頻度を掛けたものである。予想頻度で同時に出現する対立遺伝子は、「連鎖平衡」にあると言われる。連鎖不平衡の原因はしばしば不明である。特定の対立遺伝子の組合せに対する選択、または遺伝的に不均一な集団の最近の混合に起因しうる。さらに、疾患遺伝子に非常に密に連鎖したマーカーの場合、疾患突然変異が近い過去に生じたためその特定の染色体領域において組換え事象を通じて平衡が達成されるためには十分な時間が経過していない場合は、対立遺伝子（または一群の連鎖した対立遺伝子）と疾患遺伝子との関連が予想される。一より多い対立遺伝子から成る対立遺伝子パターンに言及する場合は、一つの対立遺伝子パターンを構成するすべての対立遺伝子が別の対立遺伝子パターンの対立遺伝子の少なくとも一つと連鎖不平衡にある場合、第一の対立遺伝子パターンは第二の対立遺伝子パターンと連鎖不平衡にある。連鎖不平衡の一例は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）多型部位の対立遺伝子間に生じる。ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）の二個の対立遺伝子は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の最も頻度の高い二個の対立遺伝子、対立遺伝子１および対立遺伝子２と１００％連鎖不平衡にある。
【００９５】
「マーカー」の語は、個人間で異なることが知られているゲノム中の配列をいう。たとえば、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子は反復配列数変異（ＶＮＴＲ）から成るマーカーを持つ。任意のマーカー部位での異なる配列変異体は対立遺伝子、突然変異または多型と呼ばれる。たとえば、当該ＶＮＴＲマーカーは少なくとも５個の異なる対立遺伝子を有し、そのうち３個は稀である。異なる対立遺伝子は置換、挿入または欠失を含む一塩基の変化を有する可能性があり、あるいは置換、挿入、欠失、反復、逆位およびそれらの組合せを含む複数の塩基に影響する変化を有しうる。
【００９６】
「調節する」は、物質が生物活性を調節する能力をいう。ＩＬ−１生物活性に適用した場合、アゴニストまたはアンタゴニストは、たとえばＩＬ−１合成、受容体相互作用、またはＩＬ−１媒介シグナル伝達機構に作用するかまたは拮抗することによって、生物活性を調節することができる。
【００９７】
「突然変異遺伝子」または「突然変異」または「機能突然変異」は、遺伝子の対立遺伝子型をいい、突然変異遺伝子を持たない対象と比較して突然変異遺伝子を持つ対象の表現型を変化させることができる。突然変異によって引き起こされた変化した表現型は、ある種の物質によって訂正または補正することができる。対象が変化した表現型を持つためにこの突然変異について同型接合でなければならないなら、当該突然変異は劣性であるといわれる。対象の表現型を変化させるために突然変異遺伝子の一コピーで十分であるなら、当該突然変異は優性であるといわれる。対象が突然変異遺伝子の一コピーを持ちそして（その遺伝子について）同型接合の対象と異型接合の対象との中間の表現型を持つ場合、当該突然変異は共優性であるといわれる。
【００９８】
「神経機能」は、中枢神経系、末梢神経系、自律神経系、および神経細胞と神経細胞によって調節される細胞によるホルモンおよび因子の産生を含む、神経系の活動のすべてをいう。
【００９９】
本発明の「非ヒト動物」は、たとえば齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、などといった哺乳類を含む。好ましい非ヒト動物はラットおよびマウスを含む齧歯類から選択され、非常に好ましくはマウスであるが、たとえばＸｅｎｏｐｕｓ属の成員のような遺伝子導入両生類、および遺伝子導入ニワトリもまた、たとえば胚発生および組織形成に影響を与えうる物質を理解し同定するための重要な手法を提供することができる。「キメラ動物」の語はここでは、組換え遺伝子がみられる動物か、または組換え遺伝子が動物のすべてではなく一部の細胞で発現している動物をいうのに用いられる。「組織特異的キメラ動物」の語は、一部の組織で組換えＩＬ−１遺伝子の一つが存在する、および／または発現しているかまたは破壊されているが他の組織ではそうでないことをいう。「非ヒト哺乳類」の語は、ヒトを除く哺乳綱の任意の成員をいう。
【０１００】
ここで用いられるような、「核酸」の語は、たとえばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適当な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）といった、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。その語はまた、同等物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ（たとえばペプチド核酸）、および記載された実施例に適用可能な通り、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも解されるべきである。
【０１０１】
「栄養補助食品」は、ビタミン、ミネラル、タンパク質、アミノ酸、糖、植物性エストロゲン、フラボノイド、フェノール性物質、アントシアニン、カロチノイド、上記の高分子、および上記の混合物を含む物質と定義される。
【０１０２】
ここで用いられる「ｏｒ」の語は、文脈が明瞭にそうでないと示さない限り、「および／または」を意味するものと解されるべきである。
【０１０３】
「多型」の語は、一より多い種類の遺伝子またはその一部（たとえば,対立遺伝子変異体）が同時に存在することをいう。少なくとも二つの異なる種類、すなわち二つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部分を、「多型領域」という。ここで用いられるような、「多型領域」の語は、制限無く、一塩基から成る多型部位、たとえば、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。多型領域の特定の遺伝子配列が対立遺伝子である。多型領域は一塩基であることができ、その同一性は別の対立遺伝子では異なる。多型領域はまた一より多いヌクレオチド長であることができ、あるいは長さが顕著により長い。
【０１０４】
ここで用いられる「傾向」の語は、症状または疾患状態に関して、症状または疾患についての「傾向」の場合のように、「感受性」または「素因」という表現と相互に交換可能に用いられる。症状または疾患状態に関して用いられるような「傾向」の語は、個人が症状または疾患の将来の発症について危険性が増大していることを示す。たとえば、ある対立遺伝子が特定の疾患または症状と関連しているかまたは予測的であることが発見された場合、その対立遺伝子を有する人はその特定の疾患または症状を発症するより高い傾向を有する。
【０１０５】
「反応性酸素種」は、過酸化物、酸素ラジカル、酸化から生じる炭素ラジカル、スーパーオキシドおよび酸化から生じる金属ラジカルを含む。
【０１０６】
ここで用いられる「小分子」は、約５ｋＤ未満および非常に好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を持つ組成物をいうことを意図する。小分子は核酸、ペプチド、ペプチドミメティック、糖、脂質または他の有機または無機分子でありうる。
【０１０７】
ここで用いられるような、「特異的にハイブリッド形成する」または「特異的に検出する」の語は、核酸分子が試料核酸の少なくとも連続した約６ヌクレオチドとハイブリッド形成する能力をいう。
【０１０８】
「転写調節配列」は、たとえば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターといったＤＮＡ配列をいうために本明細書全体で用いられる一般的名称であり、それらが調節可能に結合したタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御する。
【０１０９】
ここで用いられるような、「導入遺伝子」の語は、細胞に導入された核酸配列（たとえば、ＩＬ−１ポリペプチドの一つ、またはそれに対するアンチセンス転写物をコードする）を意味する。導入遺伝子は、導入される遺伝子導入動物または細胞に対して部分的にまたは完全に異種、すなわち外来であることができ、あるいは、導入される遺伝子導入動物または細胞の内因性遺伝子に対して同種であるが、挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノムに挿入されるように設計されている、または挿入されている（たとえば、天然遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されているかまたはその挿入の結果ノックアウトが生じる）。導入遺伝子はまたエピソームの形で細胞内に存在しうる。導入遺伝子は、一またはそれ以上の転写調節配列および、たとえばイントロンのような、選択した核酸の最適な発現に必要でありうる任意の他の核酸を含みうる。
【０１１０】
「遺伝子導入動物」は、動物の一またはそれ以上の細胞が、たとえば当該分野でよく知られた遺伝子導入法によって人間の介入により導入された異種核酸を含む、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類または両生類をいう。核酸は、意図的な遺伝子操作を目的として、たとえばマイクロインジェクションによってまたは組換えウイルスの感染によって、直接的にまたは間接的に細胞の前駆体への導入によって細胞へ導入される。遺伝子操作の語は古典的な交配またはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を含まないが、組換えＤＮＡ分子の導入を対象とする。この分子は染色体内に統合されることができ、または染色体外で複製するＤＮＡでありうる。ここに記載する典型的な遺伝子導入動物では、導入遺伝子は細胞に、たとえばアゴニストまたはアンタゴニスト型の、ＩＬ−１ポリペプチドの一つの組換え形を発現させる。しかし、組換え遺伝子がサイレントである遺伝子導入動物もまた検討されており、例としては、下記のＩＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存構造である。さらに、「遺伝子導入動物」はまた、一またはそれ以上の遺伝子の遺伝子破壊が組換えおよびアンチセンス技術の両方を含む人間の介入によって引き起こされた組換え動物を含む。その語はすべての子孫世代を含むことを意図する。したがって、創始者動物およびすべてのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、など、その子孫が含まれる。
【０１１１】
ここで用いられる「治療する」の語は、疾患の少なくとも一つの症状または障害に伴う少なくとも一つの異常を治すことならびに改善することを網羅することを意図する。
【０１１２】
「ベクター」の語は核酸分子をいい、それが結合している別の核酸を輸送することができる。好ましいベクターの一つの種類はエピソーム、すなわち、染色体外複製する能力がある核酸である。好ましいベクターは、自律複製および／または結合している核酸の発現の能力を有するものである。調節可能に結合した遺伝子の発現を指示する能力のあるベクターをここでは「発現ベクター」という。一般的に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはしばしば、ベクター形では染色体に結合していない円形の二本鎖ＤＮＡ環を一般的にいう「プラスミド」の形である。プラスミドはベクターの最も広く用いられている形であるため、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は相互に交換可能に用いられる。しかし、本発明は同等な機能を果たし本分野で今後明らかになるような他の種類の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１１３】
「野生型対立遺伝子」の語は、対象に二個のコピーで存在する場合、結果として野生型表現型が生じる、遺伝子の対立遺伝子をいう。遺伝子内のある種のヌクレオチド変化は、そのヌクレオチド変化を持つ遺伝子のコピー二個を有する対象の表現型に影響しない可能性があるため、特定の遺伝子のいくつかの異なる野生型対立遺伝子が存在しうる。
【０１１４】
予知医学
老化に関連する多型
本発明は少なくとも部分的には、老化関連症状の早期発現に関連する対立遺伝子の同定に基づく。したがって、被験者中のこれらの対立遺伝子の検出は、単独でまたは他の手段と併せて、被験者がＥＯＡを有するかまたは素因があることを示す。たとえば、ＥＯＡに関連するＩＬ−１多型対立遺伝子は、下記のマーカーそれぞれの対立遺伝子２を含む：ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）または上述の対立遺伝子の一つと連鎖不平衡にある対立遺伝子。特に好ましい実施形態では、上述のＩＬ−１多型遺伝子座の一またはそれ以上の特定の対立遺伝子パターンの存在が、個人のＥＯＡを発症する感受性を予測するのに用いられる。特に、ＥＯＡとのさまざまな関連を示すＩＬ−１遺伝子群中の遺伝子座の対立遺伝子の三種類のパターンがある。これらのパターンはここではパターン１、２および３という。好ましい実施形態では、これらのパターンのうち任意のもののこの検出は、被験者がＥＯＡを発症する可能性についての情報を提供する。パターン１は寿命の短縮に関連している。パターン２の検出は被験者が早期細胞老化の素因を持つことを示す。
【０１１５】
これらのＩＬ−１遺伝子座多型は、ＩＬ１Ａ／ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子群内の一塩基変異を表す（図４参照）。ＩＬ−１Α（＋４８４５）多型は、炎症性サイトカインＩＬ−１ａをコードするＩＬ−１Ａ遺伝子のエキソンＶ内の＋４８４５位の一塩基変異である（対立遺伝子１はＧであり、対立遺伝子２はＴである）（非特許文献７２；および非特許文献７３）。ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）多型は遺伝子のコード領域に存在し、結果としてコードされたタンパク質の一アミノ酸変異を生じる（非特許文献７３）。ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）多型はＴａｑＩ制限断片長多型（ＲＩＬＰ）として最初に記載され（非特許文献２５）、後にＩＬ−１Ｂ遺伝子のエキソンＶ内の＋３９５４位の一塩基変異（対立遺伝子１はＣであり、対立遺伝子２はＴである）として特徴づけられた（非特許文献２４）。このＩＬ−１Ｂの読み枠内の一塩基変化は、対立遺伝子１のＴＴＣフェニルアラニンコドン（Ｆ）の３番目の位置に存在し、したがって対立遺伝子２はＩＬ−１Ｂ遺伝子産物のアミノ酸１０５をコードするこの位置で単にＴＴＴフェニルアラニンコドンに置換するため、コードされたＩＬ−１βポリペプチドの配列に定性的に影響するようには見えない。さらに、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）多型（非特許文献７１）は一塩基変異であり（対立遺伝子１はＴであり、対立遺伝子２はＣである）、またエキソン２（８００６）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ６４５３２ の８００６位）ともいう。最後に、ＩＬ−ＲＮ反復配列数変異（ＶＮＴＲ）多型はＩＬ−１受容体アンタゴニストコード遺伝子の二番目のイントロン内に存在する（非特許文献７４）。ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）多型の対立遺伝子２は８６塩基対配列の２回反復に相当し、一方で対立遺伝子１は４回反復、対立遺伝子３は３回反復、対立遺伝子４は５回反復、および対立遺伝子５は６回反復に相当する（非特許文献７５）。個人におけるこれらのＩＬ−１対立遺伝子変異体のうち任意の一つの検出は、被験者が老化関連症状の早期発現に対して高い感受性を有することを示唆する。
【０１１６】
しかし、これらの対立遺伝子は他の対立遺伝子と連鎖不平衡にあるため、そうした他の連鎖した対立遺伝子の検出もまた、被験者が老化関連症状の早期発現に対して高い感受性を有することを示しうる。たとえば、ＩＬ−１（３３２２１４６１）ハプロタイプの下記の対立遺伝子は連鎖不平衡にある：
【表１】
2005500032.tif 000002
【０１１７】
したがって、ＩＬ−１Ｂ（−５１１）の対立遺伝子１とＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の対立遺伝子１は互いに強い連鎖不平衡にあり、これらのそれぞれがＩＬ−１Ｂの−５１１マーカーの対立遺伝子１と連鎖不平衡にある。さらに、本発明の別の実施形態では、ＩＬ−１Αの２２２／２２３マーカー、ＩＬ−１Αのｇｚ５／ｇｚ６マーカー、ＩＬ−１Αの−８８９マーカー、ＩＬ−１Ｂの＋３９５４マーカー、ＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のｇａａｔ．ｐ３３３３０マーカー、あるいはＩＬ−１Ｂ／ＩＬ−１ＲＮ遺伝子間領域のＹ３１マーカーでの遺伝子型解析が決定され、そして一またはそれ以上の好ましいＥＯＡ−予測対立遺伝子と連鎖している多型対立遺伝子の存在が検出される。
【０１１８】
さらに、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）多型の対立遺伝子２は、今度は４４１１２３３２ヒトハプロタイプの一部であるＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）多型遺伝子座の対立遺伝子２と連鎖不平衡にあることが知られている。４４１１２３３２ハプロタイプは下記の遺伝子型から成る：
【表２】
2005500032.tif 000003
【０１１９】
同様に、ＩＬ−１ＲＮ選択的エキソン（エキソン１ｉｃ、遺伝子産物の細胞内型を産生する）中の３つの他の多型もまたＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の対立遺伝子２と連鎖不平衡にある（非特許文献７１）。これらは下記を含む： ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８１２）多型（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７０９０の１８１２位）；ＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８６８）多型（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７０９０の１８６８位）；およびＩＬ−１ＲＮエキソン１ｉｃ（１８８７）多型（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７０９０の１８８７位）。当該遺伝子の選択的スプライシングされた細胞内型についてのプロモーター内のさらになお別の多型であるＰｉｃ（１７３１）多型（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７０９０の１７３１）もまたＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）多型遺伝子座の対立遺伝子２と連鎖不平衡にある（非特許文献７１）。これらのＩＬ−１ＲＮ多型遺伝子座それぞれについての対応する配列変化を下記に示す。
【表３】
2005500032.tif 000004
【０１２０】
これらの多型遺伝子座のそれぞれについて、対立遺伝子１配列変異体はＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）遺伝子座の対立遺伝子１と連鎖不平衡にあることが調べられている（非特許文献７１）。
【０１２１】
別のハプロタイプは、パターン３と称し、連鎖不平衡にある下記の対立遺伝子から成る：
【表４】
2005500032.tif 000005
【０１２２】
パターン３は、３つのパターンのうち最も低い炎症を与えるように見える。ある研究では、６０歳未満の被験者２３９名をＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度について評価した。明白なパターン１を持つ人はパターン３より７５％高いＣＲＰを有した。明白なパターン２を持つ人はパターン３より１１〜２６％高いＣＲＰを有した。パターン３を持つ被験者は血管形成術およびステント後の冠動脈再狭窄について危険性が増大している。さらに、パターン３を持つ人は下記を示しうることが予測される：
ｉ．早期慢性疾患の危険性の低下、
ｉｉ．抗炎症性物質に対する有害作用、
ｉｉｉ．感染症の危険性の増大およびその合併症。
【０１２３】
上記の対立遺伝子パターンに加えて、当業者は本明細書に照らして、ＥＯＡに関連する対立遺伝子と連鎖不平衡にある他の対立遺伝子（多型および突然変異を含む）を容易に同定することができる。たとえば、既知のＥＯＡ関連対立遺伝子を有しないある被験者群に由来する核酸試料を集めることができ、一またはそれ以上のＥＯＡ関連対立遺伝子を有する別の被験者群に由来するＤＮＡも同様である。核酸試料は次いで、第一の群と比較して第二の群で過剰に現れている対立遺伝子を同定するために比較することができ、ここでそのような対立遺伝子はおそらくＥＯＡに関連している。あるいは、たとえば大きな集団を遺伝子型解析し統計解析を実施してどの対立遺伝子が予想されるよりも多く同時に現れるかを割り出すことによって、ＥＯＡ関連対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子を同定することができる。好ましくはその群は遺伝的に関係のある人から成るように選択される。遺伝的に関係のある人は、同一人種、同一民族集団、あるいは同一家族すらの出身の人を含む。対照群と被験群の血縁度が上昇すると、疾患を引き起こす対立遺伝子とますます遠く連鎖している多型対立遺伝子の予測値も同様に上昇する。これは、創始者集団中で染色体に沿って連鎖している多型を遺伝子交差事象を通じて再配分させるために経過している進化時間がより短いためである。このように、人種特異的、民族特異的、および家族特異的ですらある診断的遺伝子型解析を開発し、ヒトの進化においてますます近年に、たとえば、主要な人種の分岐後、ヒト集団の明瞭な民族集団への分離後、および特定家系の最近の歴史のうちにさえ生じた疾患対立遺伝子の検出を可能にすることができる。
【０１２４】
二個の多型マーカーの間または一個の多型マーカーと疾患を引き起こす突然変異との間の連鎖不平衡は準安定状態である。選択圧または根本にある突然変異事象の散発的な連鎖した再発生が不在であれば、ヒトの進化の過程を通じて多型は最終的には染色体組換え事象によって分離し、したがって連鎖平衡に到達する。このように、疾患または症状と連鎖不平衡にある多型対立遺伝子を発見する可能性は、少なくとも二つの要因における変化に伴って上昇しうる：多型マーカーと疾患を引き起こす突然変異との間の物理的距離を減少させること、および連鎖した対の分離のために利用可能な減数分裂の世代数を減少させること。後者の要因を考慮すると、二名の人により近い血縁があるほど、彼らが連鎖した多型を含む共通の親染色体または染色体領域を共有する可能性は高くなり、この連鎖した対が各世代に起こる減数分裂時の交差事象を通じて連鎖しなくなっている可能性は低くなる。結果として、二名の人により近い血縁があるほど、広く間隔の開いた多型が同時に遺伝する可能性が高くなる。このように、一般的な人種、民族、または家系の血縁関係にある人々については、ますます遠く間隔の開いた多型遺伝子座の信頼性は、疾患を引き起こす突然変異の遺伝の指標として信頼することができる。
【０１２５】
たとえばＩＬ−１Α、ＩＬ−１ＢまたはＩＬ−１ＲＮあるいは関連する遺伝子といった、ＩＬ−１遺伝子座の特定の遺伝子とハイブリッド形成する適当なプローブを設計しうる。これらのゲノムＤＮＡ配列は、図１、２および３にそれぞれ示され、またさらに正式な配列番号１５、１６および１７にそれぞれ対応する。あるいは、これらのプローブは、遺伝子間配列を含む、関連するゲノム遺伝子座の別の領域に組み込むことができる。実際ヒト染色体２のＩＬ−１領域はおよそ４００,０００塩基対にわたり、また、平均して１,０００塩基対毎に１個の一塩基多型を仮定すると、ＳＮＰ遺伝子座だけでおよそ４００個を含む。本発明について利用可能なさらに別の多型は、さまざまな公的情報源から入手可能である。たとえば、ヒトゲノムデータベースは遺伝子内ＳＮＰを集め、配列によって検索可能で現在約２,７００個の登録を含む（ｈｔｔｐ：／／ｈｇｂａｓｅ．ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ．ｄｅ）。マサチューセッツ工科大学によって維持されているヒト多型データベースもまた利用可能である（ＭＩＴ ＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＳＮＰ／ｈｕｍａｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ））。そのような情報源から、ＳＮＰならびに他のヒト多型を見出しうる。
【０１２６】
たとえば、これらのデータベースのうち任意の一つにおけるヒトゲノムのＩＬ−１領域の調査は、ＩＬ−１遺伝子座遺伝子はマイクロサテライトマーカーＡＦＭ２２０ｚｅ３と呼ばれる１２７．４ｃＭ（センチモルガン）の動原体近位側の多型マーカー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１７００８を参照）およびマイクロサテライトアンカーマーカーＡＦＭ０８７ｘａ１と呼ばれる１２７．９ｃＭの遠位側の多型マーカー（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１６５４５を参照）に隣接されていることを明らかにする。これらのヒト多型遺伝子座は両方ともＣＡジヌクレオチド反復マイクロサテライト多型であり、したがって、ヒト集団において高い程度の異型接合性を示す。たとえば、ＡＦＭ２２０ｚｅ３の一つの対立遺伝子は、配列の５'プライマーＴＧＴＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＴＴ−ＴＡＧＡＧＣ（配列番号１８）および配列の３'プライマーＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＡＡ（配列番号１９）を持つ２１１ｂｐのＰＣＲ増幅産物を生じる。さらに、ＡＦＭ０８７ｘａ１の一つの対立遺伝子は、配列の５'プライマーＧＣＴＧＡＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡ（配列番号２０）および配列の３'プライマーＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＣ（配列番号２１）を持つ１７７ｂｐのＰＣＲ増幅産物を生じる。これらのヒト染色体２ＣＡジヌクレオチド反復多型の５'および３'に存在する独特の配列に対応する等価のプライマーは当業者に明らかである。合理的に等価なプライマーは指定されたプライマーの約１ｋｂ以内でハイブリッド形成し、さらに長さ約１７ｂｐから約２７ｂｐまでのどこかであるものを含む。独特のヒト染色体ゲノム配列の増幅用にプライマーを設計するための一般的指針は、プライマーが少なくとも約５０℃の融点を持つことであり、ここで概算の融点はＴｍｅｌｔ＝[２×（ＡまたはＴの数）＋４×（ＧまたはＣの数）]の式を用いて推定することができる。
【０１２７】
いくつかの他のヒト多型遺伝子座はこれらの２個のＣＡジヌクレオチド反復多型の間に存在し、家族またはその他の遺伝的に関係のある人の群においてＥＯＡ予知的な対立遺伝子を測定するためのさらなる標的を提供する。たとえば、米国立生命工学情報センターのウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）はＩＬ−１遺伝子座領域内のいくつかの多型マーカーを列挙しており、また増幅のための適当なプライマーの設計およびこれらのマーカーの分析について指針を提供している。
【０１２８】
したがって、本発明のヌクレオチド断片は、ヒト染色体２ｑ１２−１３の相補鎖またはその領域由来のｃＤＮＡと二本鎖分子を選択的に形成する能力、またはＤＮＡまたはこの領域由来のｃＤＮＡの増幅のためのプライマーを提供する能力について使用しうる。この目的のための適当なプローブの設計はいくつかの要因を考慮する必要がある。たとえば、１０、１５、または１８ヌクレオチドから約２０まで、または約３０ヌクレオチドまでの間の長さを有する断片は、特に有用となる。たとえば、ある実施形態では、４０、５０、８０、９０、１００、最大で完全長までといったより長い配列がさらにより好ましい。少なくとも約１８から２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの長さは、分子プローブとして有用となるために効率的に特異的ハイブリダイゼーションを行わせるのに十分であるとして当業者によく受け入れられている。さらに、想定される用途によっては、標的配列に対するプローブの選択性のさまざまな程度を達成するために、ハイブリダイゼーションのさまざまな条件を使用することが希望される。高い選択性を必要とする用途については、典型的には、ハイブリッドを形成するのに相対的に厳しい条件を使用することが希望される。たとえば、約５０℃から約７０℃までの温度にて０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ ＮａＣｌによって与えられるような、相対的に低い塩濃度および／または高温条件。そのような選択的条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間に、たとえあるとしてもわずかなミスマッチしか許容しない可能性がある。
【０１２９】
他の対立遺伝子またはＥＯＡの他の印は、対象中で上記の対立遺伝子の検出と関連して検出または監視することができる。
【０１３０】
対立遺伝子の検出
ヒト多型遺伝子座の特定の対立遺伝子を検出するためには多くの方法が利用可能である。特定の多型対立遺伝子を検出するための好ましい方法は、部分的には、多型の分子的性質に依存する。たとえば、多型遺伝子座のさまざまな種類の対立遺伝子は、ＤＮＡの一塩基対で異なりうる。そのような一塩基多型（すなわちＳＮＰ）は遺伝子変異の主要な要因であり、すべての既知の多型のうちおよそ８０％を占め、またヒトゲノム中のそれらの密度は平均して１,０００塩基対当たり１個と推定されている。ＳＮＰは非常にしばしば、２個だけの異なる種類で、２対立遺伝子に生じる（ＤＮＡ中に存在する４種類の異なるヌクレオチド塩基に対応する、最大４つの異なる種類のＳＮＰが理論的に可能であるが）。にもかかわらず、ＳＮＰは突然変異上、他の多型より安定であり、疾患を引き起こす突然変異をマッピングするのにマーカー間の連鎖不平衡および未知の変異体が用いられる関連性研究に適することとなっている。さらに、ＳＮＰは典型的には対立遺伝子を２個だけ持つために、鎖長測定でなく単純なプラス／マイナス分析によって遺伝子型解析することができ、より自動化に従いやすい。
【０１３１】
個人における特定の一塩基多型対立遺伝子の存在を検出するためにはさまざまな方法が利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易で、そして安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型解析を提供している。ごく最近、たとえば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的連結反応、ＴａｑＭａｎシステム、ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＳＮＰチップのようなさまざまなＤＮＡ「チップ」技術を含む、いくつかの新しい方法が記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を必要とする。シグナル小分子の生成に基づき、次いで質量分析または固定化パッドロックプローブおよびローリングサークル増幅法を行う、さらに他の新しく開発された方法が、最終的にはＰＣＲの必要性を無くしうる。特定の一塩基多型を検出するための当該分野で既知の方法のいくつかを下記に要約する。本発明の方法はすべての利用可能な方法を含むものと解される。
【０１３２】
一塩基多型の分析を円滑にするために、いくつかの方法が開発されている。一実施形態では、一塩基多型は、たとえば、Ｍｕｎｄｙ, Ｃ． Ｒ．（特許文献１２）に開示される通り、特異化されたエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。その方法によると、多型部位の直接３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーが、特定の動物またはヒトから得られた標的分子とハイブリッド形成させられる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体と相補的であるヌクレオチドを含む場合、その誘導体はハイブリッド形成したプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みによってプライマーはエキソヌクレアーゼに耐性となり、それによって検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の正体が既知であるので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性となったという知見は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応に用いられたヌクレオチド誘導体に存在するヌクレオチドと相補的であったことを示す。この方法は、大量の無関係な配列データの決定を必要としないという利点を有する。
【０１３３】
本発明の別の実施形態では、多型部位のヌクレオチドを同定するために溶液を基礎とする方法が用いられる。Ｃｏｈｅｎ, Ｄ． ｅｔ ａｌ．（特許文献１３；特許文献１４）。特許文献１２のＭｕｎｄｙ法でのように、多型部位の直接３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーが用いられる。本方法は標識ジデオキシヌクレオチドを用いてその部位のヌクレオチドを同定し、標識ジデオキシヌクレオチドは多型部位のヌクレオチドと相補的である場合プライマーの末端に組み込まれる。
【０１３４】
遺伝子ビット分析すなわちＧＢＡ（商標）と呼ばれる別の方法がＧｏｅｌｅｔ Ｐ． ｅｔ ａｌ．によって記載されている（特許文献１５）。Ｇｏｅｌｅｔ, Ｐ． ｅｔ ａｌ．の方法は標識ターミネーターと多型部位の３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する。組み込まれた標識ターミネーターはこのように評価される標的分子の多型部位内に存在するヌクレオチドによって決定されまたそれと相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（特許文献１３；特許文献１４）の方法と対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ, Ｐ． ｅｔ ａｌ．の方法は好ましくは不均一相分析であり、そこではプライマーまたは標的分子は固相に固定化される。
【０１３５】
近年、ＤＮＡ中の多型部位を分析するためのいくつかのプライマー誘導型ヌクレオチド組み込み手順が記載されている（非特許文献７６；非特許文献７７；非特許文献７８；非特許文献７９；非特許文献８０； 非特許文献８１；非特許文献８２）。これらの方法は、それらすべてが多型部位の塩基を識別するのに標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依存する点でＧＢＡと異なる。そのような形式では、組み込まれた標識デオキシヌクレオチドの数にシグナルが比例するため、同一の一続きのヌクレオチド中に起こる多型は、結果としてその一続きの長さに比例するシグナルを生じうる（非特許文献８３）。
【０１３６】
タンパク質翻訳の早期終了を生じる突然変異については、短縮タンパク質試験（ＰＩＴ）が効率的な診断手法を提供する（非特許文献８４；非特許文献８５）。ＰＩＴのためには、利用できる組織からＲＮＡが最初に単離されて逆転写され、目的の部分がＰＣＲによって増幅される。逆転写ＰＣＲの産物は次いで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび真核細胞の翻訳を開始させるための配列を含むプライマーを使用するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いられる。目的領域の増幅後、プライマーに組み込んだ独特のモチーフによって、ＰＣＲ産物の連続的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳が可能になる。翻訳産物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動時に、短縮ポリペプチドの出現は、翻訳の早期終了を引き起こす突然変異の存在を示す。この方法の変法では、目的の標的領域が１個のエキソンに由来する場合、ＤＮＡ（ＲＮＡでなく）がＰＣＲテンプレートとして用いられる。
【０１３７】
ここに記載の診断に用いる核酸試料を得るために、任意の細胞型または組織を利用することができる。好ましい実施形態では、ＤＮＡ試料は、既知の方法（たとえば静脈穿刺）で得られた血液または唾液のような体液から得られる。あるいは、核酸試験を乾燥試料（たとえば髪または皮膚）に対して実施することができる。ＲＮＡまたはタンパク質を用いる場合、使用することのできる細胞または組織はＩＬ−１遺伝子を発現しなければならない。診断的な手順はまたｉｎ ｓｉｔｕで直接、生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定および／または凍結）に対して実施することもでき、核酸精製が不要である。核酸試薬はそのようなｉｎ ｓｉｔｕ手順についてはプローブおよび／またはプライマーとして用いることができる（たとえば、非特許文献８６を参照）。
【０１３８】
一つの核酸配列の検出に主に注目する方法に加えて、プロファイルもまたそのような検出計画で評価しうる。フィンガープリントプロファイルは、たとえば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって作成することができる。
【０１３９】
好ましい一検出方法は、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子の領域と重なり合い、また約５、１０、２０、２５、または３０ヌクレオチドを突然変異または多型領域の周辺に有するプローブを用いる、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい実施形態では、ＥＯＡに関与する他の対立遺伝子変異体と特異的にハイブリッド形成する能力のあるいくつかのプローブが、たとえば「チップ」（最大約２５０,０００オリゴヌクレオチドを保持することができる）のような固相担体に結合している。オリゴヌクレオチドは、リトグラフィーを含むさまざまな処理によって固相担体に結合することができる。「ＤＮＡプローブアレイ」とも称するオリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを用いた突然変異 検出分析はたとえば、非特許文献８７に記載されている。一実施形態では、一つのチップはある遺伝子の少なくとも一つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。固相担体を次いで被験核酸と接触させ、特異的プローブとのハイブリダイゼーションが検出される。その結果、一またはそれ以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性を、簡易なハイブリダイゼーション実験で同定することができる。
【０１４０】
これらの方法はまた、分析前に核酸を増幅する段階を含むことができる。増幅方法は当業者に既知であり、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｎｅｓｔｅｄポリメラーゼ連鎖反応、ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ配列複製（非特許文献８８）、転写増幅系（非特許文献８９）、およびＱ−ベータレプリカーゼ（非特許文献９０）を含むがこれらに限定されない。
【０１４１】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化に続くサイズ分析、反応産物中に特定の標識オリゴヌクレオチドプライマーを検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的５'エキソヌクレアーゼ検出、配列決定、ハイブリダイゼーション、などを含むさまざまな方法で分析することができる。ＰＣＲに基づく検出方法は、複数のマーカーの同時の多重増幅を含みうる。たとえば、サイズが重ならない、同時に分析できるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することは当該分野でよく知られている。あるいは、区別して標識され、ゆえに区別して検出することのできるプライマーを有する別々のマーカーを増幅することが可能である。もちろん、ハイブリダイゼーションに基づく検出方法は、試料中の複数のＰＣＲ産物の区別を付けた検出を可能にする。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の方法が当該分野で知られている。単に解説のための実施形態では、その方法は（ｉ）細胞の試料を患者から得る、（ｉｉ）核酸（たとえば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を試料の細胞から単離する、（ｉｉｉ）核酸試料を、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子と５'および３'へ特異的にハイブリッド形成する一またはそれ以上のプライマーと、対立遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で接触させる、および（ｉｖ）増幅産物を検出する段階を含む。これらの検出計画は、核酸分子の検出に、そのような分子が非常に少数で存在する場合に特に有用である。
【０１４２】
対象の分析の好ましい実施形態では、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの対立遺伝子が、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定される。たとえば、試料および対照ＤＮＡは単離され、増幅され（選択的に）、一またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そして断片長サイズがゲル電気泳動によって測定される。
【０１４３】
さらに別の実施形態では、当該分野で既知のさまざまな配列決定反応のうち任意のものを用いて直接に対立遺伝子を配列決定することができる。典型的な配列決定反応は、ＭａｘｉｍとＧｉｌｂｅｒｔ（非特許文献９１）またはＳａｎｇｅｒ（非特許文献９２）によって開発された方法に基づくものを含む。質量分析による配列決定（たとえば特許文献１６；非特許文献９３；および非特許文献９４を参照）を含む対象の分析（たとえば非特許文献９５を参照）を実施する場合、さまざまな自動化配列決定手順のうち任意のものを利用しうることもまた考えられている。ある実施形態について、配列決定反応において核酸塩基のうち１、２または３個だけの存在を確認する必要があることは当業者に明らかとなる。たとえば、ただ１つだけの核酸が検出されるＡ鎖などといったものを実施することができる。
【０１４４】
さらなる実施形態では、切断試薬（たとえばヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて）からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出することができる（非特許文献９６）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術的方法は、野生型対立遺伝子を含む（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡを試料とハイブリッド形成することによって生成したヘテロ二本鎖を得ることから始まる。二本鎖二重分子は、対照と試料鎖との間の塩基対ミスマッチが要因で存在するような、二本鎖の一本鎖領域を切断する試薬で処理する。たとえば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮａｓｅで処理することができ、またＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理することができる。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、結果として生じた物質を次いでサイズによって変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、突然変異の部位を決定する。たとえば、非特許文献９７；および非特許文献９８を参照。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識することができる。
【０１４５】
さらに別の実施形態では、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する（非特許文献９９）。典型的な実施形態によると、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子に基づくプローブが、被験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリッド形成される。その二本鎖はＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物はもしあれば電気泳動手順などから検出することができる。たとえば、特許文献１７を参照。他の実施形態では、ＩＬ−１遺伝子座対立遺伝子を同定するのに電気泳動移動度における変化を用いる。たとえば、突然変異と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出するのに、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）を用いることができる（非特許文献１００、非特許文献１０１；および非特許文献１０２も参照）。試料および対照ＩＬ−１遺伝子座対立遺伝子の一本鎖ＤＮＡ断片は変性され復元させられる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、結果として生じる電気泳動移動度の変化は、一塩基変化さえも検出を可能にする。当該ＤＮＡ断片は標識することができ、または標識プローブで検出することができる。分析の感度は、二次構造が配列における変化により感受性が高いＲＮＡ（ＤＮＡでなく）を用いることによって高めることができる。好ましい実施形態では、対象の方法はヘテロ二本鎖分析を利用して、二本鎖ヘテロ二重分子を電気泳動移動度の変化に基づいて分離する（非特許文献１０３）。さらに別の実施形態では、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲル中での対立遺伝子の移動を、変性グラジエントゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を用いて分析する（非特許文献１０４）。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合ＤＮＡは、完全には変性しないことを確実にするために、たとえばＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加して修飾される。さらなる実施形態では、対照と試料 ＤＮＡとの間の移動度の差を識別するために、変性剤グラジエントの代わりに温度グラジエントが用いられる（非特許文献１０５）。
【０１４６】
対立遺伝子を検出するための他の方法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を含むがこれらに限定されない。たとえば、既知の突然変異またはヌクレオチドの差（たとえば、対立遺伝子変異体において）が中央に置かれるオリゴヌクレオチド プライマーを作製することができ、次いで、完全マッチが見つかった場合に限りハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡとハイブリッド形成することができる（非特許文献１０６）；非特許文献１０７）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる突然変異または多型領域とハイブリッド形成する場合、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成膜に結合していて標識標的ＤＮＡとハイブリッド形成したとき、反応ごとに一つの突然変異または多型領域を試験するのに用いることができる。
【０１４７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明に関連して用いることができる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、目的の突然変異または多型領域を分子の中心（増幅が差別的ハイブリダイゼーションに依存するように）（非特許文献１０８）または、適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げるかまたは低下させることのできる、一つのプライマーのｅｘｔｒｅｍｅ３'末端に有しうる（非特許文献１０９）。さらに、切断に基づく検出を行うためには、突然変異の領域に新しい制限部位を導入することが望ましい（非特許文献１１０）。ある実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて実施することもできることが予想される（非特許文献１１１）。そのような場合には、連結反応は５'配列の３'末端で完全なマッチが存在する場合に限って起こり、増幅の有無を探すことによって特定部位における既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０１４８】
別の実施形態では、対立遺伝子変異体の同定は、たとえば特許文献１８およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ, Ｕ． ｅｔ ａｌ．（非特許文献１１２）に記載されたように、オリゴヌクレオチド連結反応分析（ＯＬＡ）を用いて実施される。ＯＬＡ手順は、標的の一本鎖の隣接する配列とハイブリッド形成する能力を有するように設計された２種類のオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドのうち１種類はたとえばビオチニル化のように分離マーカーと結合しており、もう１種類は検出可能に標識されている。標的分子中に正確な相補的配列が見出される場合、オリゴヌクレオチドはそれらの末端が隣接するようにハイブリッド形成し、連結反応基質を生じる。連結反応は次いでアビジンまたは別のビオチンリガンドを用いて標識オリゴヌクレオチドが回収されるようにする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ, Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ． は、ＰＣＲおよびＯＬＡの特性を組合せた核酸検出分析を記載している（非特許文献１１３）。この方法では、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡの指数的増幅が達成され、標的ＤＮＡは次いでＯＬＡを用いて検出される。このＯＬＡ法に基づくいくつかの方法が開発されており、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子を検出するのに用いることができる。たとえば、特許文献１９は、ホスホロアミデート結合を有する結合物質を形成する、３'−アミノ基を持つオリゴヌクレオチドと５'−リン酸化オリゴヌクレオチドとを用いるＯＬＡを開示する。Ｔｏｂｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１１４）に記載されたＯＬＡの別の変法では、ＰＣＲと組合せたＯＬＡによって一つのマイクロタイターウェル内で２個の対立遺伝子の型分析が可能になる。対立遺伝子特異的プライマーのそれぞれを独特のハプテンすなわちジゴキシゲニンおよびフルオレセインで標識することにより、それぞれのＯＬＡ反応は、別々の酵素レポーターであるアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したハプテン特異的抗体を用いることによって検出することができる。この系は、異なる２色の産生に結びつく高処理量形式を用いて、２個の対立遺伝子の検出を可能にする。
【０１４９】
本発明の別の実施形態はＥＯＡを発症する素因を検出するキットに向けられている。このキットは、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子の５'および３'にハイブリッド形成する５'および３'オリゴヌクレオチドを含む、一またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含みうる。ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドは、以降の分析のために便利なサイズのＰＣＲ産物を産生するために、２５から２５００塩基対離れた間、好ましくは約１００から約５００塩基離れた間にハイブリッド形成すべきである。
【０１５０】
本発明の診断方法に用いるための特に好ましいプライマー対は下記を含む：
５' ＡＴＧ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＣＡ ３'（配列番号１）および
５' ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ３'（配列番号２）；
５' ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＴ ＧＯＴ ＴＣＡ ＴＣ−３'（配列番号３）および
５' ＧＴＴ ＴＡＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＴＴ−３'（配列番号４）；
５' ＣＴＣ ＡＧＧ ＴＧＴＣＣＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴ ＣＡＡＡ ３'（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．５）および
５' ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＣＣＧ ３'（配列番号６）；
５'−ＣＴＣＡＧＣ．ＡＡＣ．ＡＣＴ．ＣＣＴ．ＡＴ−３'（配列番号７）および
５'−ＴＣＣ．ＴＧＧ．ＴＣＴ．ＧＣＡ．ＧＣＴＡＡ−３'（配列番号８）；
５'−ＣＴＡ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＣＴ ＡＧＴＡＧＣ−３'（配列番号９）および
５'−ＴＡＧ ＧＡＣ ＡＴＩ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＴＧＴ −３'（配列番号１０）；
５'− ＡＴＴＴＴＴ ＴＴＡＴＡＡ ＡＴＣ ＡＴＣＡＡＧ ＣＣＴＡＧＧ ＧＣＡ ３'（配列番号１１）および
５' ＡＡＴ ＴＡＡ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡＡＴＧＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ３'（ＳＥＱ． ＩＤ Ｎｏ．１２）；
５'−ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＡ ＧＧＣ．−３'（配列番号１３）および
５'−ＴＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧ．−３'（配列番号１４）。
【０１５１】
本発明の方法によるＩＬ−１多型対立遺伝子の増幅および検出に用いるための付加するオリゴヌクレオチドの設計は、ヒトＩＬ−１遺伝子座を含むヒト染色体２ｑ１３からの最新の配列情報、およびこの遺伝子座について利用できる最新のヒト多型情報の両方の利用可能性によって促進される。たとえば、ＩＬ−１Α、ＩＬ−１ＢおよびＩＬ−１ＲＮのＤＮＡ配列を図１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３８３３）、２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０４５００）および３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４５３２）にそれぞれ示す。これらの遺伝子中のヒト多型の検出のための適当なプライマーは、この配列情報およびプライマー配列の設計および最適化のための当該分野で既知の標準的方法を用いて容易に設計することができる。そのようなプライマー配列の最適な設計は、たとえば、Ｐｒｉｍｅｒ２．１、Ｐｒｉｍｅｒ３またはＧｅｎｅＦｉｓｈｅｒといった市販のプライマー選択プログラムの仕様によって達成することができる（非特許文献１１；非特許文献６７；非特許文献６８[正誤表は非特許文献６９、およびＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｇｄｂ．ｏｒｇのゲノムデータベース（ＧＤＢ）プロジェクトも参照）。
【０１５２】
キットでの使用のためには、オリゴヌクレオチドはたとえば合成オリゴヌクレオチド、制限断片、ｃＤＮＡ、合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）、などといったさまざまな天然および／または合成の組成の任意のものでありうる。分析キットおよび方法はまた、分析における同定を容易にするため、標識オリゴヌクレオチドを用いることができる。使用することのできる標識の例は、放射性標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性部分、金属結合部分、抗原または抗体部分、などを含む。
【０１５３】
キットは、選択的に、ＤＮＡサンプリング手段を含むこともできる。ＤＮＡサンプリング手段は当業者によく知られており、たとえば濾紙、ＡｍｐｌｉＣａｒｄａｌ（商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ, Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ, Ｅｎｇｌａｎｄ Ｓ１０ ２ＪＦ；非特許文献１１５）；Ｎｕｃｌｅｏｎ（商標）キット、細胞溶解緩衝液、プロテイナーゼ溶液などといったＤＮＡ精製試薬；１０Ｘ反応緩衝液、熱安定ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、などといったＰＣＲ試薬；およびＨｉｎｆＩ制限酵素、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、乾燥血液由来のｎｅｓｔｅｄＰＣＲ用縮重オリゴヌクレオチドプライマーなどといった対立遺伝子検出法を含みうるがこれらに限定されない。
【０１５４】
老化関連治療および薬理ゲノム学
薬理ゲノム学
迅速に患者の遺伝子型分析を行う能力は、治療薬または疾患を防ぐ物質の試験および開発を根本的に変えることを約束する。現在、疾患を治療または予防するための物質の有効性は、その物質を患者の集団で試験することによって評価される。患者集団における多くの変数が制御されている一方、遺伝的変動性の効果は典型的には試験されない。結果として、薬物は遺伝的に多様な集団で試験した場合統計的に効果が無いが、特定の遺伝的特徴を持つ患者の選択群については非常に有効であることが明らかになるであろう。患者を遺伝子型によって分けない限り、選択集団に対して非常に有効である可能性のある薬物の多くが、人口全体に対しては役に立たないとして拒絶される可能性が高い。
【０１５５】
ＥＯＡに関連する特定の対立遺伝子の知識は、単独でまたはＥＯＡに寄与する他の遺伝子欠陥についての情報と併せて（ＥＯＡの遺伝子プロファイル）、薬理ゲノム学の目標である個人の遺伝子プロファイルに対する治療のオーダーメイドを可能にする。たとえば、ここに示す通り、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２のようなＥＯＡ関連対立遺伝子を持つ被験者はＥＯＡの素因がある。このように、被験者のＩＬ−１プロファイルを疾患についての人口のプロファイルと比較することは、特定の患者または患者集団（すなわち、同一の遺伝子変化を有する患者の群）に対して安全で有効であることが予期される薬物の選択または設計を可能にする。
【０１５６】
ＩＬ−１遺伝子プロファイルまたはＥＯＡの遺伝子プロファイルに基づいて、最大の臨床上の利益を示すことが予期される集団を標的にする能力は、１）市場での結果が思わしくない既発医薬の再位置づけ；２）患者の部分集団に特異的な安全性または有効性の限界の結果として臨床開発が中断された医薬候補の救済；および３）医薬候補のより速やかなより費用のかからない開発とより最適な医薬標示（たとえば、物質のさまざまな用量がＥＯＡを起こさせる突然変異に及ぼす影響を測定することは有効量を最適化するために有用であるため）：を可能にすることができる。
【０１５７】
一実施形態では、たとえば運動と食事の変更といった推奨される生活様式をオーダーメイドするのに被験者のＩＬ−１遺伝子型およびＥＯＡ素因を使用することができる。ＩＬ−１遺伝子型はまた、特定のＩＬ−１遺伝子型およびＥＯＡ素因を有する被験者に利益を与えることが予測される栄養補助食品を推奨するのに用いることができる。
【０１５８】
別の実施形態では、一またはそれ以上の治療計画から利益を受ける可能性があるかまたは無い群に患者を分けることによって、治療法のコストを管理するために、試験遺伝子型およびＥＯＡ素因を用いることができる。その被験者の群分けから、被験者のための適当な治療計画に関する決定を行うことができ、そのような手順は、不要であるか無効であるかまたは不適当である治療計画を受ける患者の数を減らしうる。遺伝子型だけに基づいて、またはたとえば生活様式、年齢、肥満度指数、病歴、他の危険因子、などといった情報と組合せた遺伝子型に基づいて、患者を分けることができる。患者は一より多い群に分類することができる。
【０１５９】
ＩＬ−１産生および分子シグナル伝達経路
治療的介入の標的候補およびＥＯＡバイオマーカー候補をよりよく理解するために、ＩＬ−１シグナル伝達および産生の一般的機構を理解する必要がある。ＩＬ−１は細胞間および細胞内シグナル伝達事象の複雑なネットワークの一部である。多くのタンパク質が炎症反応およびより一般的に免疫反応に関与している。一部を挙げると、インターロイキン、ＴＮＦ、ＮＦ−κＢ、免疫グロブリン、凝固因子、リポキシゲナーゼ、ならびに上記に対する修飾受容体、アンタゴニストおよび処理酵素が含まれる。
【０１６０】
ＩＬ−１ポリペプチド、すなわちＩＬ−１αおよびＩＬ−βは、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＮＦ、ＩＬ−１自身、他のマクロファージ由来サイトカイン、またはＣＤ４＋Ｔ細胞との接触によって刺激された活性化マクロファージによって多量に産生される。ＩＬ−１プロモーターは、ｃＡＭＰ応答配列、ＡＰ−１結合部位およびＮＦ−ｋＢ結合部位を含むいくつかの調節配列を含む。ともに、およびＡＰ−１（ＪｕｎおよびＦｏｓ）は、転写を調節するためには活性化され核へ移行しなければならない。ＮＦ−ｋＢは通常はＩｋＢとの結合を通じて細胞質に留まる。ＮＦ−ｋＢ−ＩｋＢ複合体はＩｋＢのリン酸化によって分裂する。ＩｋＢリン酸化は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）経路および他のキナーゼ経路の活性化を介した細胞表面受容体からのシグナル伝達によって調節されうる。ＪｕｎおよびＦｏｓもまた、Ｊｕｎの場合にはＪＮＫのような、調節キナーゼの基質である。
【０１６１】
ＩＬ−１ΑおよびＢ転写物は、ＭＡＰキナーゼ経路によって同じく調節されうる過程によって前駆体タンパク質へ翻訳される。テブフェロンのようなＭＡＰキナーゼリン酸化の阻害因子は、ＩＬ−１転写物の翻訳を減少させる。ＩＬ−１αおよびβ前駆体タンパク質は、膜への局在化および成熟ＩＬ−１への変換のために、インターロイキン変換酵素（ＩＣＥ）またはカスパーゼＩによるミリストイル化を必要とする。トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンおよび肥満細胞由来キマーゼを含む他の細胞外プロテアーゼもまた、ＩＬ−１成熟により小さい役割を果たす可能性がある。ＩＣＥは、ｅＩＣＥアイソフォーム、ＩＣＥα、βおよびγアイソフォームに対する抗体、牛痘由来Ｃｒｍ−Ａタンパク質および内因性テトラペプチド競合阻害因子を含むいくつかの物質によって阻害されうる。
【０１６２】
成熟ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは同様の活性を有し同じ受容体と相互作用する。これらの因子の主要な受容体はＩＩ型Ｌ−１受容体である。活性なシグナル伝達複合体はＩＬ−１リガンド、Ｉ型受容体およびＩＬ−１受容体修飾タンパク質から成る。ＩＩ型受容体、ならびにＩ型およびＩＩ型受容体の可溶型は、生物学的に利用可能なＩＬ−１と競合するおとり受容体として作用するように見える。さらに、ＩＬ−１シグナル伝達の天然の阻害因子であるＩＬ−１受容体アンタゴニストが単球によって産生される。ＩＬ−１ｒａはまた幹細胞によって産生され、肝臓で産生され血液循環中に分泌されて免疫および炎症反応を調節する急性期タンパク質の主要な構成成分である。
【０１６３】
ＩＬ− １シグナル伝達複合体は、上記のＮＦ−κＢおよびＡＰ−１の活性を含むいくつかの細胞内シグナル伝達経路を活性化する。シグナル伝達において、ＩＬ−１は下記を含む多数の因子の活性に影響を与える：ＰＩ−３キナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、プロテインキナーゼＣ、ＪＮＫ経路、５−リポキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ２、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、ｐ４２／４４ＭＡＰキナーゼ、ｐ５４ＭＡＰキナーゼ、Ｒａｃ、Ｒａｓ、ＴＲＡＦ−６、ＴＲＡＦ−２およびその他多数。ＩＬ−１はまた下記を含む多数の遺伝子の発現に影響を与える：ＩＬ−１遺伝子群の成員、ＴＮＦ、他のインターロイキン遺伝子（２、３、６、８、１２、２Ｒ、３Ｒおよび５Ｒ）、ＴＧＦ−β、フィブリノーゲン、マトリクスメタロプロテアーゼ１、コラーゲン、エラスターゼ、白血病抑制因子、ＩＦＮα、β、γ、ＣＯＸ−２、誘導型一酸化窒素合成酵素、メタロチオネイン、さらに多数。
【０１６４】
ＥＯＡ関連バイオマーカー
ＥＯＡについて遺伝子検査を行うことに加えて、被験者のＥＯＡへ向かうまたはＥＯＡの間の進行を監視するための検査を行うことが望ましい。言い換えると、ある種のバイオマーカーは老化関連症状の早期発現のタイミングおよび／または進行の指標となりうる。これらのバイオマーカーを同定しそれらを監視して老化関連症状の発現および進行に関する情報を提供することができることが望ましい。被験者の遺伝子型に合わせてオーダーメイドされたバイオマーカーを見出すことが特に望ましい。
【０１６５】
好ましい実施形態では、ＥＯＡと関連する可能性の高いバイオマーカーは、さまざまなＩＬ−１遺伝子型から成る被験者または細胞を用いることによって同定することができる。バイオマーカーの組は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２またはＩＬ−１（４４１１２３３２）または（３３２２１４６１）ハプロタイプの別の対立遺伝子のようなＥＯＡ関連対立遺伝子を有する被験者または細胞において試験することができる。バイオマーカーのその同じ組は、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有しない別の被験者または細胞において試験することができる。ＩＬ−１遺伝子型に依存する差を示すバイオマーカーは、ＥＯＡを予測するために有用である可能性が高い。これらの差がＥＯＡ関連表現型を構成する。
【０１６６】
特定のバイオマーカーとＥＯＡとの間の関連は、被験者の一部が既に老化関連症状を示し始めている、さまざまな年齢の被験者の集団において特定のバイオマーカーが測定される試験を実施することによって、さらに確証することができる。選択的に、被験者が老化するにつれて長期にわたり複数回の測定を行うことができる。好ましくは、被験者においてＥＯＡ関連対立遺伝子の存在または不在が決定される。バイオマーカーと老化関連症状の早期発現との間の相関を決定するために標準的な統計的手法を用いることができる。
【０１６７】
被験者がＥＯＡを発症する現在の危険性の指標として、または老化過程に向かうがまたはその間の進行の指標として、ＥＯＡ関連バイオマーカーの測定を用いることができる。
【０１６８】
細胞に関して、バイオマーカーはたとえば：シグナル分子の産生の濃度または速度、転写因子、中間代謝産物、サイトカイン、プロスタノイド、ステロイドホルモン（たとえばエストロゲン、プロゲステロン、アンドロステンジオンまたはテストステロン）、ゴナドトロピン（たとえばＬＨおよびＦＳＨ）、遺伝子転写物、タンパク質の翻訳後修飾、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、カテコールアミン（たとえばドーパミンまたはノルエピネフリン）、オピオイド、アクチビン、インヒビン、ならびにＩＬ−１生物学的活性といった本質的に細胞機能の任意の側面であることができる。バイオマーカーは転写物レベルの全ゲノム分析またはタンパク質レベルでの全プロテオーム分析および／または修飾を含みうる。加えて、バイオマーカーはレポーター遺伝子でありうる。たとえば、ＩＬ−１プロモーターまたはＥＯＡ関連対立遺伝子を含むＩＬ−１プロモーターはレポーター遺伝子と調節可能に結合させることができる。別の方法では、プロモーターはたとえばＩＬ−８のようにＩＬ−１に調節されるプロモーターでありうる。この方法では、レポーター遺伝子の活性はプロモーターの活性を反映する。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、ＧＵＳ、ＬａｃＺ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（およびその変異体、たとえばＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰおよびＢＦＰ）、または容易に検出される本質的に任意の他の遺伝子を含む。被験者においては、バイオマーカーは、たとえば、上記のうち任意のもの、ならびに心電図パラメータ、肺機能、ＩＬ−６活性、尿パラメータまたは組織パラメータでありうる。他の好ましいバイオマーカーは、上記の通り、免疫反応および炎症反応に関与する因子、ならびにＩＬ−１産生およびシグナル伝達に関与する因子を含む。
【０１６９】
ＥＯＡ治療薬
ＥＯＡ治療薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、核酸、または栄養補助食品を含む任意の型の化合物を含むことができる。好ましい実施形態では、ＥＯＡ治療薬はＩＬ−１産生またはシグナル伝達に関与する因子の調節因子である。特に好ましい実施形態では、ＥＯＡ治療薬はＩＬ−１生物活性の調節因子である（たとえばＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１受容体アゴニストまたはアンタゴニスト）。好ましいアゴニストは、核酸（たとえばＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１タンパク質によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子をコードする）、タンパク質（たとえばＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１タンパク質によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるタンパク質）または小分子（たとえばＩＬ−１タンパク質の発現を調節するもの）を含む。好ましいアンタゴニストは、たとえばここに記載の分析法を用いて同定することができ核酸（たとえば一本鎖（アンチセンス）または二本鎖（三重鎖）ＤＮＡまたはＲＮＡおよびリボザイム）、タンパク質（たとえば抗体）および、ＩＬ−１転写および／またはＩＬ−１活性を抑制または阻害するように作用する小分子または栄養補助食品を含む。
【０１７０】
Ｉｎ Ｖｉｖｏおよび細胞系スクリーニング分析
ＥＯＡの要因となるかまたはそれに寄与するＩＬ−１突然変異の同定に基づいて、本発明はさらに、たとえばＥＯＡ治療薬を同定するために、ｉｎ ｖｉｖｏおよび細胞系分析を取り上げる。一実施形態では、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有する細胞を試験化合物と接触させ少なくとも一つのバイオマーカーを測定する。少なくとも一つのバイオマーカーが、その細胞の表現型がＥＯＡ関連対立遺伝子を有しない細胞の表現型とよりよく類似するように変化する場合、試験物質はＥＯＡ治療薬として有効である可能性が高い。
【０１７１】
説明のための例として、ＥＯＡに関連するＩＬ−１対立遺伝子が、その対立遺伝子を有する細胞にＩＬ−１ポリペプチドを過剰産生させると仮定する。この場合ＩＬ−１ポリペプチドの濃度がバイオマーカーとして用いられる。試験物質での処理は、その細胞にＩＬ−１ポリペプチドを、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有しない細胞におけるＩＬ−１ポリペプチド産生によりよく似ている、より低いレベルで産生させる。したがって、試験物質はＥＯＡ治療薬として有効である可能性が高い。この方法で、対立遺伝子特異的効果を有する試験物質を同定することができる。ＩＬ−１シグナル経路に対する化合物の特異性は、必要に応じて、たとえば一またはそれ以上の対照遺伝子の発現を測定することのような、さまざまな対照分析によって確認することができる。特に、この分析法はＩＬ−１アンチセンス、リボザイムおよび三重鎖化合物の有効性を測定するために用いることができる。別の変法では細胞は試験化合物およびＩＬ−１タンパク質と接触させ、試験化合物とＩＬ−１受容体との間またはＩＬ−１タンパク質（好ましくは標識ＩＬ−１タンパク質）とＩＬ−１受容体との間の相互作用を、たとえばマイクロフィジオメーターによって検出する（非特許文献１１６）。ＩＬ−１受容体と、試験化合物またはＩＬ−１タンパク質のいずれかとの間の相互作用は、マイクロフィジオメーターによって溶媒の酸性化の変化として検出される。この分析系はこのように、たとえばＩＬ−１タンパク質−ＩＬ−１受容体相互作用に干渉することによって機能する分子アンタゴニスト、ならびにたとえばＩＬ−１受容体を活性化することによって機能する分子アゴニストを同定する手段を提供する。
【０１７２】
本質的に任意の培養可能な細胞型を、細胞型分析に用いることができる。特に、細胞はたとえば単球、マクロファージまたは胸腺細胞のような免疫細胞、またはたとえば繊維芽細胞あるいは雌性生殖器由来の細胞のような他の細胞型であることができる。好ましくは、細胞はＩＬ−１受容体を発現する。
【０１７３】
別の変法では、ＥＯＡ関連対立遺伝子を有する被験者に試験化合物を接触させ、少なくとも一つのバイオマーカーを測定する。少なくとも一つのバイオマーカーが、その細胞の表現型がＥＯＡ関連対立遺伝子を有しない細胞の表現型とよりよく類似するように変化する場合、試験物質はＥＯＡ治療薬として有効である可能性が高い。被験者はヒトまたは遺伝子導入非ヒト動物であることができる。
【０１７４】
好ましい実施形態では、ＩＬ−１遺伝子の発現を調節するか、ＩＬ−１ｍＲＮＡの翻訳を調節するか、または、ＩＬ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性または活性を調節する化合物を同定するのに、細胞またはｉｎ ｖｉｖｏ分析が用いられる。したがって、一実施形態では、ＩＬ−１タンパク質を産生する能力のある細胞を試験化合物とインキュベートし、細胞培地中の産生されたＩＬ−１タンパク質の量を測定し、試験化合物と接触させていない細胞から産生されたＩＬ−１タンパク質の量と比較する。別の変法では、ＩＬ−１生物活性を測定し、試験化合物と接触させていない細胞で測定した生物活性と比較する。加えて、試験物質がさまざまなＩＬ−１対立遺伝子を含むさまざまな細胞に及ぼす影響を比較することができる。
【０１７５】
無細胞系分析
無細胞系分析もまた、ＩＬ−１タンパク質と相互作用しそれによってＩＬ−１タンパク質の活性を修飾する能力のある化合物を同定するのに用いることができる。そのような化合物は、たとえば、ＩＬ−１タンパク質の構造を修飾しそれによってＩＬ−１タンパク質のＩＬ−１受容体に結合する能力に影響を与えることができる。好ましい実施形態では、そのような化合物を同定するための無細胞系分析は、本質的に、結合パートナーの存在下または非存在下でＩＬ−１タンパク質および試験化合物または試験化合物のライブラリを含む反応混合物にある。試験化合物は、たとえば、生物学的に不活性な標的ペプチドのようなＩＬ−１結合パートナーの誘導体、または小分子であることができる。
【０１７６】
したがって、本発明の典型的なスクリーニング分析の一つは、ＩＬ−１タンパク質またはその機能性断片をまたは試験化合物のライブラリと接触させ複合体の形成を検出する段階を含む。検出目的には、分子は特定のマーカーで標識することができ試験化合物または試験化合物のライブラリは別のマーカーで標識することができる。次いで試験化合物とＩＬ−１タンパク質またはその断片との相互作用を、インキュベート段階と洗浄段階の後に、２種類の標識の濃度を測定することによって検出することができる。洗浄段階後の２種類の標識の存在は相互作用の指標となる。
【０１７７】
分子間の相互作用もまた、光学現象である表面プラズモン共鳴（ＳＦＲ）を検出するリアルタイムＢＩＡ（生物分子相互作用分析、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を用いることによって確認することができる。検出は生体特異的インターフェイスにおける巨大分子の質量濃度に依存し、反応体の標識を必要としない。一実施形態では、試験化合物のライブラリを、たとえばマイクロフローセルの一面を形成するセンサー表面上に固定化することができる。ＩＬ−１βタンパク質またはその機能性断片を含む溶液を次いで連続的にセンサー表面上に流す。シグナル記録上に示される共鳴角の変化が、相互作用が起こったことを示す。この方法は、たとえばＰｈａｒｍａｃｉａの非特許文献１１７にさらに記載されている。
【０１７８】
本発明のもう一つの典型的なスクリーニング分析は、（ａ）（ｉ）ＩＬ−１タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ−１受容体、および（ｉｉｉ）試験化合物：を含む反応混合物を作る；そして（ｂ）ＩＬ−１タンパク質とＩＬ−１受容体の相互作用を検出する段階を含む。試験化合物の存在下でのＩＬ−１タンパク質とＩＬ−１受容体の相互作用における統計的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物の非存在下での相互作用と比較して、試験化合物．についてＩＬ−１生物活性アンタゴニスト（阻害因子）候補を示す。この分析の化合物は同時に接触させることができる。あるいは、ＩＬ−１タンパク質を適当な長さの時間試験化合物と最初に接触させ、次いでＩＬ−１β受容体を反応混合物に添加することができる。化合物の有効性は、さまざまな濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを提供する対照分析も実施することができる。
【０１７９】
ＩＬ−１タンパク質とＩＬ−１受容体との間の複合体形成はさまざまな方法によって検出することができる。複合体の形成の調節は、たとえば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識されたＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１受容体といった検出可能に標識されたタンパク質を用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量することができる。
【０１８０】
典型的には、ＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１受容体のいずれかを固定化することが、それらのタンパク質の一方または両方の非複合型から複合体の分離を促進するため、ならびに分析の自動化に対応させるためには望ましい。ＩＬ−１タンパク質とＩＬ−１受容体の結合は、反応物を閉じ込めるのに適当な任意の方法で達成することができる。例は、マイクロタイタープレート、試験管、および超遠心チューブを含む。一実施形態では、タンパク質がマトリクスに結合するのを可能にする領域を付加する融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＩＬ−１β（ＧＳＴ／ＩＬ−１β）融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ, Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、それを次いでたとえば３５Ｓ−標識ＩＬ−１受容体のようなＩＬ−１受容体、および試験化合物と結合させ、複合体形成を招く条件下で、たとえば塩およびｐＨについて生理学的条件で、わずかにそれより厳しい条件が望ましいが、混合物をインキュベートする。インキュベート後、ビーズを洗浄して結合していない標識を除去し、固定化したマトリクスおよび放射性標識を直接測定する（たとえばビーズをシンチレーション液に入れる）かまたは続いて複合体を解離させ上清中について測定する。あるいは、複合体を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ビーズ画分中に見られるＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１受容体の濃度を、付属の実施例に記載のような標準的電気泳動技術を用いてゲルから定量することができる。タンパク質をマトリクス上に固定化する他の方法もまた本分析に利用することができる。たとえば、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用してＩＬ−１タンパク質またはＩＬ−１受容体のいずれかを固定化することができる。
【０１８１】
遺伝子導入動物
上記の通り、たとえばＥＯＡ治療薬のスクリーニングを助けるために遺伝子導入動物を作製することができる。本発明の遺伝子導入動物は、適当なＩＬ−１プロモーターの調節下または異種プロモーターの調節下で、ヒトにおいてＥＯＡの要因となるＩＬ−１突然変異を含む非ヒト動物を含むことができる。本発明の遺伝子導入動物はまた、ＥＯＡ表現型を生じるようなレベルで発現しているＩＬ−１遺伝子を含むことができる。異なるＩＬ−１対立遺伝子の効果を比較するため、遺伝子導入動物はさまざまなＩＬ−１対立遺伝子と共に作製することができ、ＥＯＡ表現型における差異を識別することができる。異なる対立遺伝子および異なる発現レベルを試験することによって、薬物候補を試験するのに最適なＥＯＡ表現型を持つ動物を作製し同定することができる。
【０１８２】
遺伝子導入動物は、ＩＬ−１プロモーターまたはその断片の調節下にあるレポーター遺伝子のような導入遺伝子を含む動物であることができる。これらの動物は、たとえば、遺伝子発現を調節することによってＩＬ−１の産生を調節するような薬物を同定するのに有用である。一部の変法では、ＩＬ−１対立遺伝子はプロモーター突然変異でありうる。この場合、その変化したプロモーターを適当なレポーター遺伝子に調節可能に連合させることが特に望ましい。
【０１８３】
遺伝子導入非ヒト動物を得る方法は当該分野でよく知られている。好ましい実施形態では、ＥＯＡの要因となる突然変異の発現は、たとえば目的のパターンにおいて発現を調節するシス作用配列を利用して、細胞、組織または発生段階の特定の部分集合に限られている。本発明では、ＩＬ−１タンパク質のそのようなモザイク発現は多くの種類の系譜分析に必須となりえ、また加えてたとえば、他の態様では正常な胚の中の組織の小さな区画において発生を大きく変化させうる発現レベルの影響を評価する手段を提供しうる。このような目的で、ある空間的パターンにおいてＩＬ−１突然変異の発現を調節するために、組織特異的調節配列および条件的調節配列を用いることができる。さらに、発現の一時的パターンを、たとえば、条件的組換え系または原核細胞転写調節配列によって提供することができる。遺伝子技術は、ｉｎ ｖｉｖｏの部位特異的遺伝子操作を介してＩＬ−１突然変異の発現が調節されうることを可能にし、当該分野の熟練者に既知である。
【０１８４】
本発明の遺伝子導入動物はすべて、複数の細胞内に本発明のＥＯＡの要因となる突然変異導入遺伝子を含み、その導入遺伝子は「宿主細胞」の表現型を変化させる。説明のための実施例において、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（非特許文献１１８；非特許文献１１９）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系（非特許文献１２０；特許文献２０）のいずれかを用いてｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的遺伝子組換え系を作製することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在する標的配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対ヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼに媒介される遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の向きは、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在する標的配列が切り取られるか反転するかを決定する（非特許文献１２１）；ｌｏｘＰ配列が順方向反復の向きである場合は標的配列の切り取りを触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆方向反復の向きである場合は標的配列の反転を触媒する。したがって、標的配列の遺伝子組換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。当該リコンビナーゼの発現は、たとえば組織特異的、発生段階特異的、誘導型、または外部から添加された物質によって抑制可能な、調節的制御を受けるプロモーター配列によって調節することができる。この調節された制御は、リコンビナーゼ発現が当該プロモーター配列によって媒介される細胞においてのみ標的配列の遺伝子組換えを結果として生じる。このように、ＥＯＡの要因となる突然変異導入遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の制御を介して調節することができる。
【０１８５】
ＥＯＡの要因となる突然変異導入遺伝子の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の使用は、Ｃｒｅリコンビナーゼと対象タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む遺伝子導入動物の作製を必要とする。ＣｒｅリコンビナーゼおよびＥＯＡの要因となる突然変異導入遺伝子の両方を含む動物は、「二重」遺伝子導入動物の作製を通じて提供することができる。そのような動物を提供する便利な方法は、それぞれ一つの導入遺伝子を含む２種類の遺伝子導入動物を交配することである。
【０１８６】
同様の条件的導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を促進するために原核細胞タンパク質が同時に発現することを必要とする原核細胞プロモーター配列を用いて提供することができる。典型的なプロモーターおよび対応する転写促進原核細胞タンパク質が特許文献２１で与えられている。
【０１８７】
さらに、条件的導入遺伝子の発現は、たとえばリコンビナーゼまたは原核細胞タンパク質のような転写促進タンパク質をコードする遺伝子が、たとえば細胞型特異的な方法で組織へ送達され発現させられる、遺伝子療法的な方法によって誘導することができる。この方法によって、転写活性化因子の導入によって「スイッチが入る」まで、導入遺伝子は成体になるまでサイレントのままに留まることができる。
【０１８８】
典型的な実施形態では、本発明の「遺伝子導入非ヒト動物」は、非ヒト動物の生殖細胞系列に導入遺伝子を導入することによって作製される。さまざまな発生段階にある胚の標的細胞を、導入遺伝子を導入するのに用いることができる。胚の標的細胞の発生段階によってさまざまな方法が用いられる。本発明を実施するために用いられる任意の 動物の特定の系統は、良好な全身の健康、良好な胚収率、胚の中で前核がよく見えること、および良好な繁殖適性について選択される。さらに、ハプロタイプは重要な要因である。たとえば、遺伝子導入マウスを作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系といった系統がしばしば用いられる（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ, ＭＥ）。好ましい系統は、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１のようにＨ−２ｂ、Ｈ−２ｄまたはＨ−２ｑハプロタイプを持つものである。本発明を実施するために用いられる系統は、それ自体が遺伝子導入動物であることができ、および／またはノックアウト動物（すなわち、一またはそれ以上の遺伝子を部分的にまたは完全に抑制された動物から得られた）であることができる。
【０１８９】
一実施形態では、導入遺伝子構造は一細胞期胚に導入される。接合子はマイクロインジェクションのための最適の標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０マイクロメートルの大きさに達し、ＤＮＡ溶液１−２ｐＬの再現性のある注入を可能にする。遺伝子導入の標的としての接合子の使用は、ほとんどの場合で注入されたＤＮＡは最初の分裂の前に宿主遺伝子に組み込まれるという大きな長所を有する（非特許文献１２２）。結果として、遺伝子導入動物のすべての細胞が、組み込まれた導入遺伝子を持つことになる。生殖細胞の５０％が導入遺伝子を持つようになるため、このことはまた一般に、創始者の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達に反映される。通常、受精した胚は前核が現れるまで適当な培地中でインキュベートされる。この頃に、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が雌性または雄性前核に下記の通り導入される。マウスのような一部の種では、雄性前核が好ましい。外因性遺伝物質は、接合子の雄性ＤＮＡ補集合に、それが卵核または接合子の雌性前核によって処理される前に加えるのが非常に好ましい。卵核または雌性前核は、おそらく雄性ＤＮＡのプロタミンをヒストンに交換することによって、雄性ＤＮＡ補集合に影響を与える分子を放出し、それによって雌性および雄性ＤＮＡ補集合が結合して２倍体接合子を形成するのを促進すると考えられている。
【０１９０】
このように、外因性遺伝物質は、ＤＮＡの雄性補集合またはＤＮＡの任意の他の補集合へ、それが雌性前核に影響を受ける前に添加されるのが好ましい。たとえば、外因性遺伝物質は雄性前核の形成後できるだけ早く、その時は雄性および雌性前核がよく分離していて両方とも細胞膜の近くに位置するが、初期雄性前核に添加される。あるいは、外因性遺伝物質は、精子の核に、それが脱凝縮するよう誘導された後に、添加することができる。外因性遺伝物質を含む精子はその後卵子に加えることができ、またはその脱凝縮した精子は導入遺伝子構造を加えられた卵子にその後できるだけ早く加えることができる。
【０１９１】
導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚への導入は、たとえば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションといった、当該分野で既知の任意の方法によって達成することができる。導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚への導入後、胚はさまざまな長さの時間ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートでき、または代理母に再移植することができ、またはその両方である。満期までのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養も本発明の範囲内である。一つの一般的方法は、胚をｉｎ ｖｉｔｒｏで、種によって約１〜７日間インキュベートし、次いでそれらを代理母に再移植することである。本発明の目的のためには、接合子は本質的に、完全な生物体に発生する能力を有する二倍体細胞の形成である。一般に、接合子は一個の配偶子または複数個の配偶子に由来する二個の半数体核の融合によって、自然にまたは人工的に形成された核を含む卵から成る。このように、配偶子核は自然に適合するもの、すなわち、分化して機能する生物体に発生する能力を有する、生存力のある接合子を生じるものでなければならない。一般に、正倍数性の接合子が好ましい。異数性の接合子が得られた場合は、染色体の数はどちらか一方の配偶子が由来する生物の正倍数に関して１より大きく異なるべきでない。
【０１９２】
同様の生物学的検討事項に加えて、物理的検討事項もまた、接合子の核にまたは接合子核の一部を形成する遺伝物質に加えることのできる外因性遺伝物質の量（たとえば、容積）を支配する。遺伝物質が除去されない場合、加えることのできる外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊を起こさせずに吸収される量によって制限される。一般に、挿入される外因性遺伝物質の容積は、約１０ピコリットルを超えない。添加の物理的影響は、接合子の生存能力を物理的に破壊するほど大きくてはならない。結果として生じる接合子の遺伝物質は、外因性遺伝物質を含め、機能する生物への接合子の分化および発生を開始および維持する能力を生物学的に有しなければならないため、ＤＮＡ配列の数および種類の生物学的限界は、特定の接合子および外因性遺伝物質の機能に依存して変化し、また当該分野の熟練者には容易に明らかとなる。
【０１９３】
接合子に加えられた導入遺伝子構造のコピー数は、加えられた外因性遺伝物質の総量に依存し、形質転換が起こることが可能な量となる。理論的には一コピーだけが必要である；しかし一般に、一つのコピーが機能性であることを保証するために、たとえば導入遺伝子構造の１,０００〜２０,０００コピーといった多数のコピーが使用される。本発明に関しては、外因性ＤＮＡ配列の表現型発現を促進するためには、挿入された外因性ＤＮＡ配列のそれぞれの機能するコピーを一より多く有することの利点がしばしばある。
【０１９４】
外因性遺伝物質の核遺伝物質への添加を可能にする任意の方法を、それが細胞、核膜または他の既存の細胞構造または遺伝子構造にとって破壊的でない限り利用することができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって優先的に核遺伝物質に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェクションは当該分野で既知であり使用されている。
【０１９５】
再移植は標準的方法を用いて達成される。通常は、代理母は麻酔し、胚は卵管に挿入される。特定の代理母に移植する胚の数は種によって異なるが、通常はその種が自然に生じる産仔数に相当する。
【０１９６】
代理母の遺伝子導入した子は、導入遺伝子の存在および／または発現について任意の適当な方法によってスクリーニングすることができる。スクリーニングはしばしば、導入遺伝子の少なくとも一部と相補的なプローブを用いてサザンブロットまたはノーザンブロット分析によって達成される。導入遺伝子によってコードされたタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析を、導入遺伝子産物の存在についてのスクリーニングに、代替または追加の方法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡは尾部組織から調製され、導入遺伝子についてサザン分析またはＰＣＲで分析される。あるいは、この分析には任意の組織または細胞型を用いることができるが、導入遺伝子を最高のレベルで発現すると信じられている組織または細胞が、導入遺伝子の存在および発現についてサザン分析またはＰＣＲを用いて分析される。
【０１９７】
導入遺伝子の存在について評価するための代替または追加の方法は、制限無しに、酵素および／または免疫学的分析といった適当な生化学分析、特定のマーカーまたは酵素活性についての組織学的染色、フローサイトメトリー分析、などを含む。血液中の導入遺伝子産物の存在を検出するため、ならびにさまざまな種類の血球細胞および他の血液成分の濃度に及ぼす導入遺伝子の影響を評価するために、血液の分析もまた有用でありうる。
【０１９８】
遺伝子導入動物を適当なパートナーと交配することによって、または遺伝子導入動物から得られた卵および／または精子のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精によって、遺伝子導入 動物の子孫を得ることができる。パートナーとの交配を実施する場合は、パートナーは遺伝子導入および／またはノックアウト動物であってもなくてもよい；遺伝子導入動物である場合は、同一かまたは異なる導入遺伝子、または両方を含みうる。あるいは、パートナーは親系統であることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精が用いられる場合、受精胚は代理母に移植するかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、または両方であることができる。いずれかの方法を用いて、子孫は導入遺伝子の存在について上記の方法または他の適当な方法を用いて評価することができる。
【０１９９】
本発明に従って作製された遺伝子導入動物は外因性遺伝物質を含む。さらに、そのような実施形態では、配列は、たとえば好ましくは導入遺伝子産物の発現を特定の種類の細胞で可能にする、転写調節配列たとえばプロモーターと結合される。
【０２００】
レトロウイルス感染もまた、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するために用いることができる。発生中の非ヒト胚はｉｎ ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで培養することができる。この間に、割球はレトロウイルス感染の標的となることができる（非特許文献１２３）。割球の効率的な感染は、透明体を取り除く酵素的処理によって得られる（非特許文献１２４）。導入遺伝子を導入するのに用いられるウイルスベクター系は典型的には、導入遺伝子を有する非増殖型レトロウイルスである（非特許文献１２５；非特許文献１２６）。割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することによって、遺伝子導入は容易にかつ効率的に得られる（非特許文献１２６； 非特許文献１２７）。あるいは、感染はより後期で実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は、胞胚腔に注入することができる（非特許文献１２８）。遺伝子導入非ヒト動物を形成する細胞の部分集団においてのみ組み込みが起こるため、創始者の大部分は導入遺伝子に関してモザイクとなる。さらに、創始者は、導入遺伝子のさまざまなレトロウイルス挿入を、一般的に子孫で分離するゲノム中のさまざまな位置に含みうる。加えて、妊娠中の胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖細胞系に導入遺伝子を導入することもまた可能である（非特許文献１２８）。
【０２０１】
導入遺伝子導入のための別の種類の標的細胞は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された移植前胚から得られ、胚と融合される（非特許文献１２９；非特許文献１３０；非特許文献１３１；および非特許文献１３２）。導入遺伝子は、ＤＮＡ遺伝子導入によってまたはレトロウイルス媒介形質導入によって効率的にＥＳ細胞に導入することができる。そのような形質転換ＥＳ細胞は、その後非ヒト動物由来の胚盤胞と一体化させることができる。ＥＳ細胞はその後、胚にコロニーを形成し、結果として生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。総説は非特許文献１３３を参照。
有効量
そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、培養細胞または実験動物において、たとえばＬｄ５０（集団の５０％に致死的である量）およびＥｄ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を測定するための、標準的な薬学上の手順によって測定することができる。毒性効果と治療的効果との間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療係数を示す化合物が 好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用されうる一方、未感染の細胞に対する損傷の可能性を最小化し、それによって副作用を低減するため、そのような化合物を患部組織の部位へターゲッティングする送達系の設計を念入りに行うべきである。
【０２０２】
細胞培養分析および動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのさまざまな投与量を処方するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくはＥＤ５０を含み毒性をわずかしかまたは全く有しない循環濃度の範囲内にある。投与量はこの範囲内で、使用する剤形および利用する投与経路によって変化させることができる。本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療上有効な量は最初は細胞培養分析から推定することができる。用量は、培養細胞で測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大値の半分の阻害が達成される試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、モデル動物において処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中濃度は、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２０３】
処方および用途
本発明に基づく用途のための医薬組成物は、一またはそれ以上の 生理学的に受容しうる担体または添加物を用いて、従来の方法で処方することができる。このように、化合物およびその生理学的に受容しうる塩と溶媒和物は、たとえば、注射、吸入または通気（口または鼻のいずれかを通して）または経口、舌下、非経口または直腸適用による投与のために処方することができる。
【０２０４】
そのような治療法のために、本発明の化合物は、全身および局所および限局性投与を含むさまざまな投与量のために処方することができる。技術および処方は一般的に非特許文献１３４に見出すことができる。全身投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射のためには、本発明の化合物は、好ましくはたとえばハンク液またはリンガー液のような生理学的に適合する緩衝液中の溶液に処方することができる。さらに、化合物は固体の形に処方し使用直前に再溶解するかまたは懸濁することができる。凍結乾燥形態もまた含まれる。
【０２０５】
経口投与用には、当該医薬組成物はたとえば、結合剤（たとえば、ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（たとえば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）； 崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルスターチナトリウム）；または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）といった医薬品として受容できる添加物を用いて従来の方法によって錠剤またはカプセルの形状を取ることができる。錠剤は当該分野でよく知られている方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、たとえば、溶液、シロップまたは懸濁液の形を取ることができ、あるいは使用前に水または他の適当な賦形剤で構成するための乾燥製品として与えることができる。そのような液体製剤は、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水系賦形剤（たとえば、ａｔｉｏｎｄ ｏｉｌ、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩またはソルビン酸）といった医薬品として受容できる添加物と共に従来の方法によって調製することができる。当該調製物はまた緩衝塩、香料、着色料、および甘味料を必要に応じて含むことができる。
【０２０６】
経口投与用の調製物は活性化合物の徐放を与えるよう適当に処方することができる。舌下投与用には当該組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形を取ることができる。吸入による投与用には、本発明に基づく使用のための化合物は、適当な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー製剤の形で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量した量を送達するためにバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または送気器で使用するためのたとえばゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジは、当該化合物の粉末混合物およびたとえば乳糖やデンプンのような適当な粉末基剤を含めて処方することができる
当該化合物は、たとえばボーラス注射または連続注入のような、注射による非経口投与用に処方することができる。注射用処方は単位投与量剤形で、たとえばアンプルでまたは多回投与容器で、保存料を添加して、提供することができる。当該組成物はたとえば懸濁液、溶液または、油性または水性賦形剤中のエマルションといった形を取ることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤といった添加物を含むことができる。あるいは、有効成分は、たとえば使用前に滅菌パイロジェンフリー水のような適当な賦形剤で構成するための粉末の形であることができる。
【０２０７】
当該化合物はまた、たとえばココアバターまたは他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含む、たとえば座剤または保留浣腸剤のような直腸用組成物として処方することもできる。
【０２０８】
前述した処方に加えて、当該化合物はまたデポ剤として処方することができる。そのような長期に作用する処方は、埋め込み（たとえば皮下にまたは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与することができる。このように、たとえば、当該化合物は適当な高分子または疎水性材料（たとえば受容しうる油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と共に、または、やや溶けにくい塩のようなやや溶けにくい誘導体として、処方することができる。
【０２０９】
全身投与もまた経粘膜的または経皮的手段によることができる。経粘膜投与または経皮投与用には、浸透すべきバリアに対して適当な浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は一般的に当該分野で既知であり、たとえば、経粘膜投与用には胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与はスプレー式点鼻薬を通じてかまたは座剤を用いることができる。局所投与用には、本発明のオリゴマーは、一般的に当該分野で既知である通り、軟膏、膏剤、ゲル、またはクリームに処方される。外傷または炎症を治療して治癒を加速するために洗浄溶液を局所的に用いることができる。
【０２１０】
臨床的状況では、それぞれ当該分野でよく知られているいくつかの方法の任意のものによって、ＥＯＡ治療薬遺伝子に関する遺伝子送達系を患者に導入することができる。たとえば、遺伝子送達系の医薬調製物を全身的に、たとえば静脈注射によって、導入することができ、標的細胞におけるタンパク質の特異的導入は主に、遺伝子送達の媒介物によってもたらされる遺伝子導入の特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型または組織型発現、またはその組合せによって生じる。別の実施形態では、動物への導入が非常に限局化されており、組換え遺伝子の最初の送達はより制限されている。たとえば、遺伝子送達の媒介物はカテーテルによって（特許文献２２を参照）または定位注入によって（たとえば、非特許文献１３５）導入することができる。ＥＯＡ治療薬遺伝子は、たとえば、Ｄｅｖ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１３６）によって記載された技術を用いてエレクトロポレーションによって遺伝子治療構造に送達することができる。
【０２１１】
遺伝子治療構造または本発明の化合物の医薬調製物は、本質的に、受容できる希釈剤中の遺伝子送達系から成ることができ、または遺伝子送達媒介物または化合物が埋め込まれた遅放性マトリクスを含むことができる。あるいは、たとえばレトロウイルスベクターのように、組換え細胞から完全な遺伝子送達系をそのまま産生することができる場合、当該医薬調製物はその遺伝子送達系を産生する一またはそれ以上の細胞を含むことができる。
【０２１２】
当該組成物は、必要に応じて、活性成分の入った、一またはそれ以上の単位 投与量剤形を含むことのできる包装またはディスペンサー器具で与えることができる。包装は、ブリスター包装のような、たとえば金属またはプラスチック箔を含むことができる。包装またはディスペンサー器具は、投与のための説明書を付けることができる。
【実施例】
【０２１３】
これまで本発明を全体的に説明したが、以下の、単に本発明のある態様および実施形態の説明の目的で含まれ、本発明を制限することを意図しない実施例を参照することによってより容易に理解されることとなる。
【０２１４】
実施例１：老化と対立遺伝子との間の関連性
５０２名のコーカサス系成人を含むＭａｙｏ ｃｌｉｎｉｃでの研究において、特定の遺伝子型の保有は年齢とともに顕著に減少することが見出され、老化に伴う疾患のためのこれらの遺伝子型の選択的消失が示唆された（図１および８を参照）。
【０２１５】
共に強い連鎖不平衡にありまた我々がパターン１と称するものに特徴的である、ＩＬ−１Α（＋４８４５）およびＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）について対立遺伝子２の保有は年齢と共に減少した。
【０２１６】
ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）での対立遺伝子２の保有もまた年齢と共に減少を示す。このマーカーは、ＩＬ−１Α（＋４８４５）およびＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）の両方と負の連鎖不平衡にあり、またパターン２に特徴的である。したがってＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２の減少は、単にパターン１の影響を反映しているだけではない可能性が非常に高く、これはＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）（およびパターン２）と老化との間の独立した関連性を示唆するように思われる。
【０２１７】
実施例２：ＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子２は内皮細胞老化と関連している
ＩＬ−１遺伝子型は、内皮細胞寿命の長さを、その細胞型における老化プログラムに影響を及ぼすことによって予測する。ＩＬ−１遺伝子型パターンは、幅広い細胞型における老化を予測するのに用いることができ、また多数の免疫炎症性疾患の進行に役割を果たしている可能性がある。
【０２１８】
試験設計：
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離し、培養で維持した。細胞集団倍加数はこれらの細胞で評価し、ＩＬ−１ＲＮ ＶＮＴＲ多型と相関させた。細胞は北欧コーカサス系の提供者に由来した。試験した提供者ＨＵＶＥＣ集団のうち、１１個がＩＬ−１ＲＮ ＶＮＴＲ １．１を有し、８個がＩＬ−１ＲＮ ＶＮＴＲ １．２を有し、２個がＩＬ−１ＲＮ ＶＮＴＲ ２．２を有した。試験すべき仮説は、稀なＩＬ−１ＶＮＴＲ対立遺伝子２と、老化の指標である細胞集団倍加数の低下との関連性であった。
【０２１９】
結果：
ＩＬ−１ｒａ遺伝子型と培養中の累積細胞集団倍加数との間に有意な関連が見出された。ＶＮＴＲ多型の２対立遺伝子の存在は、培養中のＨＵＶＥＣの増殖能力の低下と関連している。この影響は同型接合状態で非常に著しく、しかしいずれの２対立遺伝子の存在も増殖能力の顕著な低下と関連している（ｐ＝０．０４４８）。ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２はパターン２の一部である。何らかの特定の機構に限定されることを望まない一方、ＩＬ−１遺伝子型が、一酸化窒素濃度に及ぼす影響を通じてＨＵＶＥＣ老化に影響する可能性がある。サイトカインのＩＬ−１ファミリーは一酸化窒素濃度を調節することが知られており、また一酸化窒素は、部分的にはテロメラーゼ活性の年齢に依存する低下を遅らせることによって、培養中の内皮細胞老化を遅らせるように見える。
【０２２０】
実施例３．特定のＩＬ−１対立遺伝子を検出するための典型的な方法
血液は静脈穿刺により採取し、ＤＮＡ抽出前に非凝集状態で−２０℃にて保存する。血液１０ミリリットルを４０ｍＬの低張赤血球（ＲＢＣ）溶解溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．３２スクロース、４ ｍＭ ＭｇＣ１２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に添加し、倒置によって４分間室温（ＲＴ）にて混合する。試料は次いで１３００ ｇ にて１５分間遠心分離し、上清を吸引して廃棄し、新たに３０ ｍＬのＲＢＣ 溶解溶液を細胞沈澱に加える。遠心分離に続いて、沈澱を２ｍＬの白血球（ＷＢＣ）溶解溶液（０．４ Ｍ Ｔｒｉｓ、６０ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、１０％ ＳＤＳ）に再懸濁し、新しい１５ｍＬポリプロピレン試験管に移す。過塩素酸ナトリウムを終濃度１Ｍで加え、試験管を最初、回転ミキサー上で１５分間室温にて倒置し、次いで定期的に倒置させながら６５℃にて２５分間インキュベートする。２ｍＬのクロロホルム（−２０℃にて保存）の添加後、試料は１０分間室温にて混合し、次いで８００Ｇにて３分間遠心分離する。この段階で、３００ μＬのＮｕｃｌｅｏｎ Ｓｉｌｉｃａ懸濁液（Ｓｃｏｔｌａｂ, ＵＫ）および１４００Ｇにて５分間の遠心分離を用いて非常に明瞭な相の区別を得ることができる。結果として得られる水溶性の上層を新しい１５ｍＬポリプロピレン試験管に移し、冷エタノール（−２０℃にて保存）を添加してＤＮＡを沈澱させる。これをガラス鈎に巻き取り、５００μＬのＴＥまたは滅菌水を入れた１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。ＴＥ中で一夜再懸濁後、ゲノムＤＮＡ収量を２６０ｎｍの分光光度法によって計算する。試料の部分標本は１００μｇ／ｍＬにて希釈し、マイクロタイターコンテナに移して４℃にて保存する。ストックは将来の参照のために−２０℃にて保存する。
【０２２１】
一般に、対立遺伝子はＰＣＲとその後の制限酵素消化またはプローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。典型的なプライマーの組および分析が典型的な遺伝子座について提示されている。
【０２２２】
ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）
ＰＣＲプライマーはＲＦＬＰ分析を可能にするために、二個の対立遺伝子上に二ヶ所の酵素切断部位を作るよう設計されている（ゲノム遺伝子とミスマッチしている）。遺伝子登録番号はＸ６４５３２である。オリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＡＧＴＡＧＣ ３'
５' ＴＡＧＧＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴ ３'
サイクリング反応は[９６℃、１分間]；[９４℃、１分間；５７℃、１分間；７０℃、２分間；]×３５；[７０℃、５分間]×１；４℃にて実施する。個々のＰＣＲ反応は２５μＬの部分標本２つに分ける：３μＬの特異的１０Ｘ制限緩衝液の他に、一方に５ユニットのＡｌｕ１を添加し、他方に５ユニットのＭｓｐ１を添加する。インキュベーションは３７℃にて一夜である。電気泳動はＰＡＧＥ９％による。
【０２２３】
二種類の酵素はそれぞれ、二個の異なる対立遺伝子を切断する。Ａｌｕ１は、対立遺伝子１について１２６および２８ｂｐの断片を生じ、その一方で対立遺伝子２（１５４ｂｐ）を消化しない。Ｍｓｐ１は、対立遺伝子２について１２５および２９ｂｐを生じ、一方で対立遺伝子１は切断されない（１５４ｂｐ）。ゆえにその二つの反応（ＰＡＧＥで並んで分離される）は同型接合子については逆転した消化パターンを与え、異型接合子では同一パターンを与える。対立遺伝子頻度は０．７４と０．２６である。
【０２２４】
ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）。ＩＬ１−ＲＮ（ＶＮＴＲ）マーカーは、下記の手順に従って遺伝子型分析することができる。上に示す通り、ＩＬ１−ＲＮ（＋２０１８）マーカーの二個の対立遺伝子は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の二個の最も頻度の高い対立遺伝子、対立遺伝子１および対立遺伝子２と、９７％より大の連鎖不平衡にある。遺伝子登録番号はＸ６４５３２である。ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴ ３'
５' ＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡ ３'
サイクリング反応は[９６℃、１分間]×１；[９４℃、１分間；６０℃、１分間；７０℃、２分間]×３５；[７０℃、５分間]×１；４℃にて実施する。電気泳動は２％アガロースで９０Ｖにて３０分間実施する。ＰＣＲ産物のサイズは反復数の直接的な標示である：最も頻度の高い対立遺伝子（対立遺伝子１）は４１２ｂｐの産物を与える。隣接領域が６６ｂｐにわたって伸びているので、残りの３４４ｂｐが４回の８６ｂｐの反復を示唆する。同様に、２４０ｂｐの産物は２回反復を示し（対立遺伝子２）、３２６は３回反復であり（対立遺伝子３）、４９８は５回（対立遺伝子４）、５８４は６回（対立遺伝子６）である。４種類の最も頻度の高い対立遺伝子についての頻度は０．７３４、０．２４１、０．０２１および０．００４である。
【０２２５】
ＩＬ−１Ａ（−８８９）
ＩＬ−１Α（−８８９）マーカーは、下記の手順に従って遺伝子型分析することができる。非特許文献２３。ＲＦＬＰ分析を可能にするために、対立遺伝子１（−８８９位のＣ）を増幅する場合、ＰＣＲプライマーのうち一つはＮｃｏＩ部位を生じる塩基変化を有する。遺伝子登録番号はＸ０３８３３である。ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＴＡ ＧＧＣ ３'
５' ＴＴＡ ＣＡＴ ＡＴＧＡＧＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＴＧ ３'
ＭｇＣｌ２が終濃度１Ｍで用いられ、ＰＣＲプライマーは０．８μＭで用いられる。サイクリング反応は[９６℃、１分間]×１；[９４℃、１分間；５０℃、１分間；７２℃、２分間]×４５；[７２℃、５分間]×１；４℃にて実施する。個々のＰＣＲ反応に６ユニットのＮｃｏＩを、３μＬの特異的１０Ｘ制限緩衝液の他に添加する。インキュベーションは３７℃にて一夜である。電気泳動は６％ＰＡＧＥによって実施する。ＮｃｏＩ消化によって長さ８３および１６ｂｐの断片が生じ、それに対し当該制限酵素は対立遺伝子２を切断しない。同様に、異型接合子は３本のバンドを有する。２種類の対立遺伝子についての頻度は０．７１および０．２９である。
【０２２６】
ＩＬ−１Α（＋４８４５）
ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）マーカーは、下記の手順に従って遺伝子型分析することができる。ＰＣＲプライマーはＲＦＬＰ分析を可能にするために、対立遺伝子１中にＦｎｕ４Ｈ１制限部位を作成する。遺伝子登録番号はＸ０３８３３である。ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＡＴＧ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＣＡ ３'
５' ＡＡＴ ＧＡＡＡＧＧ ＡＧＧ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＡＡＡ ＴＧＴ ３'
ＭｇＣｌ２が終濃度１Ｍで用いられ、ＰＣＲプライマーは０．８μＭで用いられる。ＤＭＳＯが５％にて添加され、およびＤＮＡテンプレートが１５０ｎｇ／５０μＬＰＣＲにて添加される。サイクリング反応は[９５℃、１分間]×１；[９４℃、１分間；５６℃、１分間；７２℃、２分間]×３５；[７２℃、５分間]×１；４℃にて実施する。個々のＰＣＲ反応に２．５ユニットのＦｎｕ４Ｈ１を、２μＬの特異的１０Ｘ制限緩衝液の他に添加する。インキュベーションは３７℃にて一夜である。電気泳動は９％ ＰＡＧＥによって実施する。
【０２２７】
Ｆｎｕ４Ｈ１消化によって７６ｂｐの一定のバンドを生じ（対立遺伝子に関係なく存在する）、および対立遺伝子１についてさらに二本の２９および１２４ｂｐのバンド、そして対立遺伝子２についてさらに１本の１５３ｂｐのバンドを生じる。２種類の対立遺伝子についての頻度は０．７１および０．２９である。
【０２２８】
ＩＬ−１Ｂ（−５１１）
ＩＬ−１Ｂ（−５１１）マーカーは、下記の手順に従って遺伝子型分析することができる。遺伝子登録番号はＸ０４５００である。ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＴＧＧ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＴ ＧＯＴ ＴＣＡ ＴＣ ３'
５' ＧＴＴ ＴＡＧ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＣＡＣ ＴＴ ３'
ＭｇＣｌ２が終濃度２．５ｍＭで用いられ、ＰＣＲプライマーは１μＭで用いられる。サイクリング反応は[９５℃、１分間]×１；[９５℃、１分間；５３℃、１分間；７２℃、１分間]×３５；[７２℃、５分間]×１；４℃にて実施する。個々のＰＣＲ反応は２つの部分標本に分割する：一方の部分標本に３ユニットのＡｖａＩを加え、他方の部分標本に３．７ユニットのＢｓｕ３６Ｉを加える。両方の部分標本に３μＬの特異的１０Ｘ制限緩衝液を添加する。インキュベーションは３７℃にて一夜である。電気泳動は９％ＰＡＧＥによって実施する。
【０２２９】
二種類の制限酵素のそれぞれが二種類の対立遺伝子のうち一つを切断し、それによってＲＦＬＰ分析が可能になる。ＡｖａＩは、対立遺伝子１について１９０および１１４ｂｐの二種類の断片を生じ、またそれは対立遺伝子２（３０４ｂｐ）を切断しない。Ｂｓｕ３６１は、対立遺伝子２について１９０および１１塩基対の二種類の断片を生じ、またそれは対立遺伝子１（３０４ｂｐ）を切断しない。２種類の対立遺伝子についての頻度は０．６１および０．３９である。
【０２３０】
ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）
ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）マーカーは、下記の手順に従って遺伝子型分析することができる。遺伝子登録番号はＸ０４５００である。ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは：
５' ＣＴＣ ＡＧＧ ＴＧＴ ＣＣＴ ＣＧＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＡＡ Ａ ３'
５' ＧＣＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＣＣＧ ３'
ＭｇＣｌ２が終濃度２．５ｍＭで用いられ、ＤＮＡテンプレートが１５０ｎｇ／５０μＬＰＣＲにて用いられる。サイクリング反応は[９５℃、２分間]×１；[９５℃、１分間；６７．５℃、１分間；７２℃、１分間]×３５；[７２℃、５分間]×１；４℃にて実施する。個々のＰＣＲ反応に１０ユニットのＴａｑＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、３μＬの特異的１０Ｘ制限緩衝液の他に添加する。インキュベーションは６５／にて一夜である。電気泳動は９％ＰＡＧＥによって実施する。
【０２３１】
制限酵素消化によって１２ｂｐの一定のバンドと、対立遺伝子１に相当するさらに二本の８５および９７ｂｐのバンドか、または対立遺伝子２に相当する１８２ｂｐの一本のバンドのいずれかを生じる。２種類の対立遺伝子についての頻度は０．８２および０．１８である。
【０２３２】
ＩＬ−１Ｂ（−３７３７）：この対立遺伝子を検出する方法は、２００１年１１月１９日出願の米国仮特許出願第６０／３３ １ ,６８ １ 号に詳細に記載されている。
【０２３３】
文献の引用
ここで言及したすべての刊行物および特許はその全体が、それぞれの刊行物または特許が具体的にまた個別に参照により開示に含まれると示されているかのように、この参照により開示に含まれる。不一致のある場合は、あらゆる定義を含め、本明細書が支配する。
【０２３４】
同等物
本発明の特定の実施例が考察されている一方、上記明細書は説明のためのものであり制限的ではない。本明細書および下記の請求項の検討によって、本発明の多くの変形が当該分野の熟練者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、請求項をそれらの同等物の完全な範囲とともに、および明細書をそのような変形とともに、参照することによって決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、年齢別の、特定のＩＬ−１対立遺伝子を有する被験者の割合を示す。
【図２】図２は、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞集団倍加数を、ＩＬ−１ｒａ遺伝子型（ＶＮＴＲ多型）の関数として示すグラフである。
【図３】図３は、ＩＬ−１ｒａ（ＶＮＴＲ）１．１遺伝子型を有する細胞と、１．２または２．２遺伝子型を有する細胞とにおける、ＨＵＶＥＣ細胞集団倍加数を示すグラフである。累積細胞集団倍加数の減少はｐ＝０．０４７で有意である。
【図４】図４は、ＩＬ−１Α（ＧＥＮ Ｘ０３８３３；配列番号１）の核酸配列を示す。
【図５】図５は、ＩＬ−１Ｂ（ＧＥＮ Ｘ０４５００；配列番号２）の核酸配列を示す。
【図６】図６は、分泌されたＩＬ−１ＲＮ（ＧＥＮ Ｘ６４５３２；配列番号３）の核酸配列を示す。
【図７】図７は、ＩＬ−１ＲＮ（ＧＥＮ Ｘ７７０９０；配列番号４）の核酸配列を示す。
【図８】図８は、年齢別、または１０年区切りの年齢別の、ＩＬ−１遺伝子型の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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