(57)【要約】【課題】媒体中の検体を検出するための方法および装置を提供する。【解決手段】基板上のパターンに展開された特定のレセプタに対する検体の結合について表された、又は変化した光の回折に基づいて検定を行うものであり、これはそのパターンの適当な選択によって、高感度を有するものとなる。本発明は、回折に基づく検定において、入射光の回折を生じさせる認識素子のパターンを、検出を容易にし、公知の平行直線のような格子と比較して、検出される信号を向上させるよう選択することができるという原理に基づいている。１形態において、基板自体が回折パターン信号を向上させる表面トポグラフィーを有している。他の形態では、基板は検体特異的レセプタを固着した回折光学素子である。更に他の形態では、回折光学素子は、信号を向上させる検体特異的レセプタのパターンを作成するためのマスタスタンプとして使用される。
2005502065.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子であって：
平坦表面と、該平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を具備してなり；
検体が分析物中に存在するとき該検体が該検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で少なくとも１つの回折スポットのパターンを生じさせるように選択され、該少なくとも１つの回折スポットが前記光線との関連で予め選択された部位に位置し、前記検体特異的認識結合素子手段を除く前記予め選択されたパターンが互いに実質的に等しい幅を以って離間した平行直線ラインで、又は円の周期的列で配列されていることを特徴とする感応素子。
【請求項２】
少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子であって：
平坦表面と、該平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を具備してなり；
検体が分析物中に存在するとき該検体が該検体特異的認識結合素子手段に結合し、
前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で、回折パターンを生じさせ、該回折パターンが前記光線から離間した少なくとも１つの回折スポットを有すると共に、前記回折パターンの十分な強度が、前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示す前記少なくとも１つの回折スポットに位置していることを特徴とする感応素子。
【請求項３】
前記検体特異的認識素子のパターンが、前記検体特異的認識素子で塗布されたスタンプを使用するスタンピングにより前記平坦表面に適用されたものであることを特徴とする請求項２記載の感応素子。
【請求項４】
前記スタンプが、母型として表面凹凸パターンを有する回折光学素子を用いて作られたものであることを特徴とする請求項２記載の感応素子。
【請求項５】
前記検体特異的認識素子のパターンが、前記媒体中に存在する第1の検体を結合するための第1のパターンであり、前記媒体中に存在する第２の検体を結合するための検体特異的認識素子の少なくとも第２のパターンを含むことを特徴とする請求項２記載の感応素子。
【請求項６】
少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子であって：
検体特異的レセプターを表面に結合した基板を具備してなり、
該基板の表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に十分な数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにしたことを特徴とする感応素子。
【請求項７】
前記表面トポグラフィーが、前記表面を横切って延びた正弦波表面パターンにより画定されていることを特徴とする請求項６記載の感応素子。
【請求項８】
前記正弦波表面パターンが、光線の波長の約１／２から１０倍の範囲の周期性を有し、回折スポットの予め選択された数が１回折スポットであることを特徴とする請求項７記載の感応素子。
【請求項９】
少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子であって：
選択された検体と結合するため検体特異的レセプターを表面に結合してなる回折光学素子を具備してなることを特徴とする感応素子。
【請求項１０】
前記回折光学素子が、回折光ビームスプリッターであって、単一の入射光ビームにより照射されたとき、ほぼ等しい強度の所定数の光線を生じさせるようになっていることを特徴とする請求項９記載の感応素子。
【請求項１１】
媒体中の検体を検出するための回折結合検定法であって：
選択された検体特異的レセプターを表面に結合した基板を用意する工程であって、該基板の表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に予め選択された数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにするものと；
前記基板の表面に上記媒体を十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記表面における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記媒体が、前記基板の屈折率にほぼ整合する屈折率を有する溶液であって、前記基板が前記溶液中に浸漬されると、前記基板表面と前記溶液との間の界面が実質的に可視できないものであり、検体が前記検体特異的レセプターに結合する前において光が屈折されることがなく、検体の前記検体特異的レセプターへの結合により、前記溶液と基板との間に整合する屈折率を減少させ、前記回折スポットを生じさせるようにしたことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記表面トポグラフィーが、前記表面を横切って延びた正弦波表面パターンにより画定されていることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記正弦波表面パターンが、光線の波長の約１／２から１０倍の範囲の周期性を有し、回折スポットの予め選択された数が１回折スポットであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記基板が実質的に透明であり、前記表面が前記基板の1側から照射され、前記基板から回折された光を前記基板の反対側にて検出するようにしたことを特徴とする請求項１１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記基板が部分反射性を有し、前記表面が前記基板の1側から照射され、前記基板から回折された光を前記基板の同一側にて検出するようにしたことを特徴とする請求項１１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記基板が反射性のものであって、前記表面が前記基板の1側から照射され、前記基板から回折された光を前記基板の同一側にて検出するようにしたことを特徴とする請求項１１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記基板表面を前記媒体に曝す前に、前記基板から回折された光を検出し、検体が存在しないときの前記基板および検体特異的レセプターのパターンによるベースライン回折像を形成する工程を更に含み、更に、前記ベースライン回折像を記憶する工程を含むことを特徴とする請求項１１から１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折スポットの存在についての前記回折光の分析が、前記回折像を前記ベースライン回折像と比較することを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記光線が実質的に干渉性の単色レーザービームであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
前記レーザービームが赤外線、可視光又は紫外線であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
媒体中の検体を検出するための回折結合検定法であって：
回折光学素子を用意し、選択された検体を結合させるため、前記回折光学素子の表面に検体特異的レセプターを塗布する工程と；
前記回折光学素子の表面を媒体と十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記回折光学素子における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す十分な強度の回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記媒体が、前記回折光学素子の屈折率にほぼ整合する屈折率を有する溶液であって、前記回折光学素子が前記溶液中に浸漬されると、前記表面と前記溶液との間の界面が実質的に可視できないものであり、検体が前記検体特異的レセプターに結合する前において光が屈折されることがなく、検体の前記検体特異的レセプターへの結合により、前記溶液と基板との間に整合する屈折率を減少させ、前記回折スポットを生じさせるようにしたことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
媒体中の検体を検出するための回折結合検定法であって：
平坦表面と、該平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を用意する工程であって、ここで、検体が分析物中に存在するとき該検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に十分な数の回折スポットを生じさせるように選択され、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにすることと；
前記基板の平坦表面に上記媒体を十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記平坦表面における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記媒体が、前記基板の屈折率にほぼ整合する屈折率を有する溶液であって、前記基板が前記溶液中に浸漬されると、前記基板表面と前記溶液との間の界面が実質的に可視できないものであり、検体が前記検体特異的レセプターに結合する前において光が屈折されることがなく、検体の前記検体特異的レセプターへの結合により、前記溶液と基板との間に整合する屈折率を減少させ、前記回折スポットを生じさせるようにしたことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記検体特異的認識素子のパターンが、前記検体特異的認識素子で塗布されたスタンプを使用するスタンピングにより前記平坦表面に適用されたものであることを特徴とする請求項２４又は２５記載の方法。
【請求項２７】
前記スタンプが、母型として表面凹凸パターンを有する回折光学素子を用いて作られたものであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置であって：
照明源と；
平坦表面と、該平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを有する基板を含む感応素子であって、検体が分析物中に存在するとき該検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で少なくとも１つの回折スポットのパターンを生じさせるように選択され、前記回折パターンの強度の実質的部分が前記少なくとも１つの回折スポットの部位に位置し、前記照射源が前記基板表面を照射するように配置されているものと；
前記基板表面から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する１又はそれ以上の検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする装置。
【請求項２９】
光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置であって：
照明源と；
選択された検体を結合するための回折光学素子の表面に結合した検体特異的レセプターを有する前記回折光学素子を含む感応素子であって、前記照射源が前記回折光学素子を照射するように配置されているものと；
前記回折光学素子から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする装置。
【請求項３０】
光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置であって：
照明源と；
平坦表面と、選択された検体を結合するため表面に検体特異的レセプターを結合してなる基板を含む感応素子であって、前記基板が表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に所定数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにすると共に、前記照明源が前記基板表面を照射するように配置されているものと；
前記照明源から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする装置。
【請求項３１】
前記表面トポグラフィーが、前記表面を横切って延びた正弦波表面パターンにより画定されていることを特徴とする請求項３０記載の感応素子。
【請求項３２】
前記正弦波表面パターンが、光線の波長の約１／２から１０倍の範囲の周期性を有し、回折スポットの予め選択された数が１回折スポットであることを特徴とする請求項３１記載の感応素子。
【請求項３３】
前記処理手段が、前記検出手段と接続され、かつ、前記回折光に対応する前記検出手段からの出力である信号を記憶するための記憶手段を含み、更に、前記処理手段が前記回折像をデコンボルート(解巻)するための画像分析手段を含むことを特徴とする請求項３０，３１又は３２のいずれか１項記載の装置。
【請求項３４】
前記処理手段が、前記検体の、検体特異的レセプターとの結合の相互作用の動力学を、時間の関数として記憶された前記回折光から計算するための信号処理手段を含むことを特徴とする請求項３３記載の装置。
【請求項３５】
前記照射源が、干渉性の単色平行光線を生じさせるものであることを特徴とする請求項３０から３４のいずれか１項記載の装置。
【請求項３６】
前記照射源が、UV線、可視光、近赤外線又は赤外線波長を生じさせるレーザーであることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項３７】
前記基板を照射する光が、光ファイバーを介して放出されるものであることを特徴とする請求項３５記載の装置。
【請求項３８】
検体について検査される上記媒体を収容するチャンバーを格納するセルを更に含み、該セルが前記基板の選択された領域を前記媒体と接触させた状態で受理可能になっていて、更に前記セルが少なくとも１つの光学窓を有し、現場で前記媒体中の検体について検出を行うため光を通過させ得るようになっていることを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項記載の装置。
【請求項３９】
前記基板の表面を照射するのに使用される光が、基板/媒体界面から内部全反射するようになっていることを特徴とする請求項３８記載の装置。
【請求項４０】
前記セルが、それを介して前記媒体を連続的に流通させるための流体入口および出口を含むことを特徴とする請求項３８又は３９記載の装置。
【請求項４１】
前記基板が、ガラス、シラン化ガラス、シリコン、二酸化珪素、ポリマー、金属、金属酸化物、金属膜、金属酸化物膜、金属を含む部分又は全反射性基板、および金属被覆基板からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項３０記載の装置。
【請求項４２】
前記検出手段が画像化装置であることを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項記載の装置。
【請求項４３】
前記画像化装置が電子画像化装置であることを特徴とする請求項４２記載の装置。
【請求項４４】
前記画像化装置がカメラであることを特徴とする請求項４２記載の装置。
【請求項４５】
前記検出手段が、フォトダイオード検出装置、光電子増倍管、アバランチフォトダイオードおよび位置感応性フォトダイオードのいずれかを含むことを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項記載の装置。
【請求項４６】
前記画像化装置がマトリックス・アレイ検出装置であることを特徴とする請求項４３記載の装置。
【請求項４７】
前記マトリックス・アレイ検出装置がCCDデテクター・アレイ又はCMOSアレイであることを特徴とする請求項４６記載の装置。
【請求項４８】
前記検体特異的レセプターが、抗体‐抗原、酵素‐抑制体、核酸又はオリゴヌクレオチドの相補ストランド、レセプター‐ホルモン、レセプター‐エフェクター、酵素‐基板、酵素‐コファクター、グリコたんぱく質‐炭水化物、結合性たんぱく質‐基板、抗体‐ハプテン、たんぱく質‐リガンド、たんぱく質‐核酸、たんぱく質‐小分子、たんぱく質‐イオン、細胞‐細胞に対する抗体、小分子‐該小分子に対する抗体、小分子‐金属イオンに対するキレータ、および小分子‐関連のエア・ボーン病原体レセプターに対するエア・ボーン病原体からなる群から選択される結合対の１つであることを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項記載の装置。
【請求項４９】
前記感応性素子の表面に直接形成された介在層を更に含み、前記検体特異的レセプターパターンが該介在層の上に展開されることを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項記載の装置。
【請求項５０】
前記介在層がパターン化されたアビジン層であり、前記検体特異的レセプターがビオチニル化検体特異的レセプターであって、上記のパターン化されたアビジン層に結合するものであることを特徴とする請求項４９記載の装置。
【請求項５１】
前記検体特異的認識素子手段のパターンが、前記媒体中に存在する第1の検体を結合するための第1のパターンであり、前記媒体中に存在する少なくとも第２の検体を結合するための検体特異的認識素子手段の少なくとも第２のパターンを含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項５２】
前記表面トポグラフィーが、前記表面基板中の極微小窪みを含み、前記検体に対して相補ジオメトリーを提供し、それにより前記極微小窪みが検体特異的レセプターを構成していることを特徴とする請求項６記載の感応素子。
【請求項５３】
テスト媒体中に浸漬された前記回折光学素子の回折パターンを測定し、前記回折パターンを較正信号として処理手段内に保存する工程を更に含み、前記回折光学素子における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す十分な強度の回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程が、前記回折光を前記較正信号と比較することを含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５４】
前記媒体中に前記基板を浸漬した後、前記回折信号の強度の経時的変化をモニターする工程、およびこの強度の変化を有効運動方程式に当て嵌め、それにより前記媒体中の前記検体種の濃度を計算する工程を更に含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は媒体中の検体（被分析物）を検出するための方法および装置に係わり、特に、本発明は基板上のパターンに展開された特定のレセプターに対する検体の結合について表された又は変化した光の回折に基づいて検定を行うことに関し、これはそのパターンの適当な選択によって、高感度を有するものとなる。
【背景技術】
【０００２】
多くの場合、溶液（媒体）中の特定の物質の存在および含有量を判定することが好ましい。表面に基づく検定は被分析物（検体）の、或る表面との相互作用、すなわち、測定可能な特性の検出可能な変化を生じさせる作用に依存する。（本発明の目的において、“検体”とは検定されるべき物質と定義することができ、これは小さな分子、たんぱく質又はDNAのような巨大分子、細胞、細胞の集合体、バクテリア又はウイルスなどの生物体が含まれ；更にここで使用する、“検体特異的レセプター”又は“認識素子”とはパートナー検体と結合する相補素子を指すもので、これは分子、分子の集合体、生体分子、生体分子の集合体、例えばたんぱく質又はDNA、相補的ジオメトリおよび/又は相互作用を有する基板上の溝又は鋳型凹みなどが含まれる。）。通常、特定の検体を検定するために、その表面を変性し、適当な化学的相互作用を提供することがなされる。例えば、免疫学的検定において、抗体−抗原反応の特異性が利用される。すなわち、溶液中の対応する抗体の存在を検定するために、表面に抗原を塗布する。同様にして、デオキシリボ核酸（DNA）の連鎖を基板に付着させ、溶液中の相補的連鎖の存在を検出するのに使用することができる。これらのいずれの場合も、表面上の認識素子への検体の結合の出現（すなわち溶液中のこの特定の検体の存在を確認させるもの）は、検出可能な変化を伴う。例えば、この結合は界面層での屈折率の変化をもたらし、これは楕円偏光法又は表面プラズモン共鳴により検出することができる。その他、結合した検体分子は発光することがあり、この発光は蛍光ベースのセンサーの場合のように、集光、検出することができる。非光学的信号も、放射線免疫学的検定および音響波感知装置の場合のように、使用することができる。
【０００３】
回折は光の波動の性質により発生する現象である。光がエッジに当ったとき、又は小さな孔を通過したとき、異なる方向に散乱する。しかし、光波は互いに加算（強め合う）又は減算（弱め合う）するように干渉し、従って、光が障害物の非ランダムパターンに当ったとき、結果として、強め合う干渉および弱め合う干渉が、明瞭、かつ、区別し得るパターンを生じさせる。具体例としては回折格子があり、これは均一に離間した線、典型的には表面に直線の平行溝を引くことにより作られる。このような表面に入射した光は高い光強度の均一に離間したスポットのパターンを形成させる。これはブラッグ散乱と呼ばれ、スポット相互間の距離（又はブラッグ散乱のピーク）は回折パターンおよび光源の波長の特異的相関関係にある。実際上、回折は周期的パターンを用いることにより最もよく説明されるが、特定のパターンと、それにより回折された光のパターン（回折像）との間には特異な対応関係がある。なぜならば、これらは高低の光強度の明瞭に規定される領域の認識容易な回折像を生じさせるからである。
【０００４】
回折技術は一般に分子構造の研究に使用されている。特に、X線回折は化合物の特定、たんぱく質の構造の判定に使用されている。しかし、回折の原理は特に光学領域では、検定に利用しようする試みは殆どなかった。
【０００５】
米国特許第4,647,544号（光学的干渉検出を使用する免疫学的検定）には、光学的装置および方法が記載されており、そこではリガンド又は抗体が所定のパターン（好ましくは、ストライプパターン）にて基板上に配置されていて、リガンドと、抗リガンドと間の結合、又は抗体と、抗原との間の結合が、光学的干渉により生じるものと予想されるブラッグ散乱角度で設定されている光学的検出装置により検出されるようになっている。リガンド又は抗体のパターンは、基板上に抗体の均一層を最初にレイアウトし、ついでこの適用範囲のセクションを失活させることにより作成される。
【０００６】
米国特許第4,876,208号（回折免疫学的検定装置および方法）には、結合が行われる生物学的プローブの均一に離間された線状パターン（生物学的回折格子）を有するシリコン又はポリシリコン基板に基づく免疫検定のための装置および試薬が記載されている。このパターンは、最初に、抗体の均一層を基板に塗布し、ついでマスクの使用および紫外光（UV）の使用により或る領域を失活させることにより作成される。このアイデアは米国特許第5,089,387号（DNAプローブ回折検定および試薬）においてDNAの検定に活用されている。すなわち、これには生物学的回折格子およびその製造プロセスが記載されており、この製造プロセスは、平滑表面上にて交雑化剤の均一層を最初に固定し、ついで、回折格子ラインを有するマスクを介して、UV線をその表面に照射させる。このUV線の照射により、交雑化剤が失活され、活性の交雑化剤のラインのパターンが残される。
【０００７】
これら２つの特許文献に記載された装置において、検体の存在および量が、ブラッグ散乱角度の１つに配置された検出装置に到達した信号から得られる。この検出機構は、小さな光信号を検出する技術分野において周知の光電子増倍管、フォトダイオード、種々の光学機器およびロックイン増幅器を利用するものである。
【０００８】
米国特許第5,922,550号（回折像を形成するバイオセンサー装置）には媒体中の検体を検出、定量化するための装置および方法が記載されており、これは金属被覆ポリマーフィルム上で、レセプターを用い自己集合単一層の所定パターンを形成することに基づくものである。検体のサイズは、伝達される光の波長と同一のオーダーのものであり、結合に結果生じる回折パターンは肉眼で見ることができる程度に十分に強力なものである。この特許には更に、金属被覆ポリマー上にレセプターの自己集合単一層をマイクロコンタクト印刷することによりパターン化表面を形成する方法も記載されている。これは米国特許第6,060,256号（光学的回折バイオセンサー）において、レセプター（自己集合のものに限らない）の所定パターンのケースに拡大されている。金属基板上の自己集合単一層のマイクロコンタクト印刷の技法については米国特許第5,512,131号（表面上におけるマイクロスタンプパターンの形成および派生物品）に記載されている。
【０００９】
マイクロコンタクト印刷は、表面上にミクロンオーダの寸法のパターンを、エラストマースタンプを使用して形成する技術であり、パターン化されるべき物質は“インク”として用いられ、この表面に上記スタンプを接触させることにより転写される。シリコン、二酸化ケイ素、ポリスチレン、ガラスおよびシラン化ガラス上のたんぱく質のマイクロコンタクト印刷については、Bernard, A; Delamarche, E.; Schmid, H.; Michel, B.; Bosshard, H.R.; Biebuyck, H.; “Printing Patterns Of Proteins” Langmuir (1998), 14, 2225-2229に記載されている。
【００１０】
表面ベースの検定において回折技法を利用するため、レセプターでパターン化された物質を形成することができることは重要であり、上記の５つの特許文献はそれを行うための方法が概説されている。更に、他の文献に記載されている他の技法もパターン形成に適用してもよい。例えば、写真平板技術を用いて、オリゴヌクレオチドを基板上に整列して固定化し、かつ、各列が別々の種を示すようにする。米国特許第5,831,070号および第5,599,695号には、これをガス相中に脱保護剤を使用してどのように行うかを教示している。このアプローチは回折検定のためのパターンの形成に使用されたことはないが、適当なマスクのデザインを用いてそれに適合させることができる。
【００１１】
従来技術を要約すると、基板上にパターン化されたパートナーレセプターに対し検体を結合させたとき発生する光の回折を検定に使用することができることを示している。米国特許第4,647,544号および第4,876,208号には、均一に離間させたライン（格子）のパターンが使用されており、信号はブラッグピークの予想位置にて検出器により検出される。回折強度は十分に低く、ロックイン増幅器および関連する光学機器、検出のための電子機器の使用を必要とする。米国特許第5,922,550号および第6,060,256号では、検定されるべき検体が十分に大きく、回折パターンが肉眼で見ることができる。表面上のパターンは単純な幾何学的要素、例えば均一のサイズの複数の円からなり、均一に離間している。
【００１２】
従来技術を構成する上記特許文献は、表面上のパターンのタイプの重要性を考慮していないが、本発明ではこのパターンのタイプに基づいている。具体的には、本発明は回折の原理を用いて検定を行うものであり、この場合、表面パターンは、均一に離間したライン（格子）又は均一に離間した円からなる従来の技術のものとは異なる。表面パターンのデザインの選択は、例えば信号を向上させることにより検定の有効性を向上させることができる。
【特許文献１】
米国特許第4,647,544号
【特許文献２】
米国特許第4,876,208号
【特許文献３】
米国特許第5,089,387号
【特許文献４】
米国特許第5,922,550号
【特許文献５】
米国特許第6,060,256号
【特許文献６】
米国特許第5,512,131号
【特許文献７】
米国特許第5,831,070号
【特許文献８】
米国特許第5,599,695号
【非特許文献１】
Bernard, A; Delamarche, E.; Schmid, H.; Michel, B.; Bosshard, H.R.; Biebuyck, H.; “Printing Patterns Of Proteins” Langmuir (1998), 14, 2225-2229
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、パターン化された表面からの光の回折の原理を用いて検体を検定する方法を提供することを目的とするものであり、この検定の感度は表面上のパターンの適当な選択により向上されることになる。この目的に従って、本発明は媒体中の検体を検出する方法、この検出を可能にする物品、その物品を製造するためのプロセス、および上記検定を行うための装置を提供するものである。
【００１４】
本発明の物品は基板であり、その上に認識要素又は検体特異的レセプターのパターン（複数）が展開される。これらのパターンは、所望の位置（例えば、主ビームの散乱から発生するような高いノイズの領域から離れた位置）で大きく回折された信号強度を有するように選択される。
【００１５】
本発明の方法は、上記のパターン化された基板を、パターン化された認識要素に相補する検体を含む媒体に対して十分な時間曝して、結合を行わせることが含まれる。検体と、そのパートナーとの間の結合事象は、基板上の層の局所的厚みの変化、局所的屈折率の変化、又はそれらの双方の変化を伴い、それにより基板と、媒体との間の界面での光学的特性の変化がもたらさせる。しかし、プローブ分子が所定パターンで展開されるから、基板に入射された光は均一に散乱されず、むしろ回折される。上記結合事象は特定の回折像の様相又は変化により示唆される。本発明の1実施形態において、回折した光の強度が測定され、定量検定を可能にしている。
【００１６】
多重検体のケースへの拡張は、選択された領域内に多重パターンを展開し、各パターンの少なくとも一部を入射照明に対し同時に曝すことにより行うことができる。更に、認識要素の各タイプを独特のパターン、つまり、認識要素のあらゆる他のタイプのパターンとは区別されるパターンに展開させる。回折された光のパターンと、基板上のパターンとの間には対応があり、回折光のパターン（回折像）の観察を、当初の媒体中に存在する検体の識別のために使用することができる。その他、異なる認識要素を基板の異なる領域中に同一のパターン又は異なるパターンに展開させてもよい。この場合、各領域は入射照明に対する独立した露光により独立して検定される。多重認識要素の多重パターンの場合は、少なくとも1つの領域が、採用された各パターンと区別されるように高い強度の領域を有することが望ましい。言い換えれば、回折パターン相互がオーバーラップしてもよいが、各パターンは少なくとも１つの特異なスポットを有すべきである。
【００１７】
上記方法を履行するための装置は、光源と、パターン化された基板を支持する手段と、回折された光を収集するために配置され、適当なデータ収集装置に接続された光検知器とを具備してなる。
【００１８】
本発明の1形態において、少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子を提供するものであって、前記感応素子は：
平坦表面と、前記平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を具備してなり；
検体が分析物中に存在するとき前記検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で少なくとも１つの回折スポットのパターンを生じさせるように選択され、前記少なくとも１つの回折スポットが前記光線との関連で予め選択された部位に位置し、前記検体特異的認識結合素子手段を除く前記予め選択されたパターンが互いに実質的に等しい幅を以って離間した平行直線ラインで、又は円の周期的列で配列されていることを特徴とする。
【００１９】
本発明は更に、少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子を提供するものであって、前記感応素子は：
平坦表面と、前記平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を具備してなり；
検体が分析物中に存在するとき前記検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、
前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で、回折パターンを生じさせ、前記回折パターンが前記光線から離間した少なくとも１つの回折スポットを有すると共に、前記回折パターンの十分な強度が、前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示す前記少なくとも１つの回折スポットに位置していることを特徴とする。
【００２０】
本発明は更に、少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子を提供するものであって、前記感応素子は：
検体特異的レセプターを表面に結合した基板を具備してなり、
前記基板の表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に十分な数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにしたことを特徴とする。
【００２１】
本発明は更に、少なくとも１つの検体の存否を検出するための光回折検定に使用される感応素子を提供するものであって、前記感応素子は：
選択された検体と結合するため検体特異的レセプターを表面に結合してなる回折光学素子を具備してなることを特徴とする。
【００２２】
本発明は、媒体中の検体を検出するための回折結合検定法を提供するものであって：
選択された検体特異的レセプターを表面に結合した基板を用意する工程であって、前記基板の表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に予め選択された数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにするものと；
前記基板の表面に上記媒体を十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記表面における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする。
【００２３】
更に、媒体中の検体を検出するための回折結合検定法を提供するものであって：
回折光学素子を用意し、選択された検体を結合させるため、前記回折光学素子の表面に検体特異的レセプターを塗布する工程と；
前記回折光学素子の表面を媒体と十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記回折光学素子における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す十分な強度の回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする。
【００２４】
本発明は更に、媒体中の検体を検出するための回折結合検定法を提供するものであって：
平坦表面と、前記平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを含む基板を用意する工程であって、ここで、検体が分析物中に存在するとき前記検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に十分な数の回折スポットを生じさせるように選択され、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにすることと；
前記基板の平坦表面に上記媒体を十分な時間接触させ、溶液中に存在する予め選択された検体をそれらの検体特異的レセプターと結合させる工程と；
前記基板に光線を照射させ、前記基板表面から回折された光を検出し、前記平坦表面における検体の前記検体特異的レセプターへの結合を表す回折スポットの存在について前記回折された光を分析する工程と；
を具備してなることを特徴とする。
【００２５】
本発明は更に、光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置を提供するものであって、前記装置が：
照明源と；
平坦表面と、前記平坦表面に予め選択されたパターンを以って展開された検体特異的認識結合素子手段とを有する基板を含む感応素子であって、検体が分析物中に存在するとき前記検体が前記検体特異的認識結合素子手段に結合し、前記予め選択されたパターンが、光線による照射の下で少なくとも１つの回折スポットのパターンを生じさせるように選択され、前記回折パターンの強度の実質的部分が前記少なくとも１つの回折スポットの部位に位置し、前記照射源が前記基板表面を照射するように配置されているものと；
前記基板表面から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する１又はそれ以上の検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする。
【００２６】
本発明は更に、光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置を提供するものであって、前記装置が：
照明源と；
選択された検体を結合するための回折光学素子の表面に結合した検体特異的レセプターを有する前記回折光学素子を含む感応素子であって、前記照射源が前記回折光学素子を照射するように配置されているものと；
前記回折光学素子から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする。
【００２７】
本発明は更に、光の回折を用いて媒体中の検体を検出するための装置を提供するものであって、前記装置が：
照明源と；
平坦表面と、選択された検体を結合するため表面に検体特異的レセプターを結合してなる基板を含む感応素子であって、前記基板が表面に表面トポグラフィーを有し、光線による照射および前記検体特異的レセプターに結合された検体により、前記光線から離間した予め選択された位置に所定数の回折スポットを生じさせ、それにより前記検体特異的レセプターに結合された検体の存在を示すようにすると共に、前記照明源が前記基板表面を照射するように配置されているものと；
前記照明源から回折された光を検出するようにして前記感応素子との関連で配置された検出手段と；
１又はそれ以上の検体の、検体特異的レセプターとの結合を表す回折パターンの存在についての前記回折光を分析し、前記媒体中に存在する検体を前記回折パターンから識別するための処理手段と；
を具備してなることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、パターン化された基板からの光の回折の原理を利用した検体の検定のための方法を提供する。従来技術の説明で述べたように、従来技術は、特定のタイプの検体の存在を示すため入射光の回折を使用する可能性を示している。本発明は、回折格子を構成する均等に離間した平行線を使用する回折パターンで通常達成できるものと比較して、回折信号を向上するよう選択された基板上のパターンを利用することにより高感度を達成し得る回折に基づいた検定を提供するものである。
【００２９】
回折に基づいて検定を実行するため、認識素子が基板上に展開され、パターンを画成する。好ましい形として、このパターン化基板は非回折のものである。これらの認識素子に対し相補的な検体の結合は、局所的屈折率および/又はトポグラフィーを変化させ、照射すると、入射光は回折される。このような回折光の検出により、検体とレセプターとの間の結合事象の発生が示唆され、それにより検査される当初の媒体中の検体の存在が示唆されることになる。他の具体例において、当初の基板自体が光を回折する。この場合、結合事象は依然として局所的屈折率および/又はトポグラフィーを変化させ、回折信号の強度が変化する。信号検出を容易にするため、この場合の好ましい装置は、フィルタリングを含み、光学機器又はソフトウエアを使用することにより初期の信号は無くなる。
【００３０】
或るパターンと、そこから回折された光のパターンとの間に対応があることが光学機器の分野では周知となっている。この原理は検定において十分に利用されたことは無かったが、本発明では主題となっている。回折の研究で使用されている最も一般的なパターンは図１に示す均等に離間したライン(格子)である。米国特許第4,647,544号（特許文献１）および第4,876,208号（特許文献２）ではこれに基づいている。格子から生じる回折パターンは一連の均等に離間した明るいドット（ブラッグ・ピーク）であって、光の中心ビームから離れるに従い、光の強度が減少する。ブラッグ・ピークの間隔は格子中のライン間の間隔で決定される。如何なる検定においても、感度を増大させるために、信号/ノイズ比を最大にすることが重要である。図１に示す格子の例を使用する回折ベースの検定において、主ビームの散乱による典型的なノイズが生じ、これは回折信号と比較して大きくなることがある。なぜならば、主ビームの強度が大きいからであり、それにより、結合事象によりもたらされる一般的に小さな変化は沈められ、又は流し出されてしまう。主ビームからのノイズ並びに迷散乱によるノイズを、主ビームからできるだけ離れた回折信号を検出することにより減少することも考えられるが、その回折信号も上述のように主ビームから離れて急激に減少する。このように、図１に示すような格子を用いる回折ベースの検定は、感度および適用性が限定されたものとなる。
【００３１】
本発明は回折ベースの検定で得られる信号を向上させると共に、表面での化学操作の可能性を向上させるための方法および装置を提供するものである。本発明の主たるコンセプトは、回折に基づく検定において、入射光の回折を生じさせる認識素子のパターンを、検出を容易にし、検出される信号を向上させるよう選択することができるという原理に基づいている。従って、基板上のレセプター分子のパターンは、信号を向上させ、検出を容易にするため、極めて複雑に作ることができる。詳細な要件は特定の用途および制約により変化する。このような結果を達成するために、３つの異なる方法および感応素子がここに開示されている。
【００３２】
i)  選択された表面トポグラフィーを有する感応素子基板：
本発明の１例は、パターン認識素子が結合する基板を含む。これは表面トポグラフィーを有し、これは標準回折格子を用いて得られるスポットよりも、強度の大きい主光線から離間した１以上の回折スポットにより特徴づけられる回折像を与えるよう選択される。１つの例は、単に１個の回折スポットが生じるようなパターンであり、従って、回折された強度の殆どがこのスポットに局在化され、これは入射ビームからできるだけ離れて位置され、それにより主ビームによる散乱が抑制される。図２aに示すようなシヌソイド関数sin(kx)(又はcosine(kx))を有する表面は、フーリェ変換において、図２bに示す＋kに位置する正確に１つの素子を生じさせる。Kをできるだけ大きくするため（すなわち、回折光は入射ビームから遠く離す）、sin又はcosineの周期は照明光の波長のほぼ半分にすべきである。この検体特異的レセプターは基板全体をカバーし、従って、パターン化された認識素子は、波形基板プラス表面をカバーする検体特異的レセプターからなる複合体である。検定は、屈折率がパターン化された基板のものとほぼ整合する溶液と接触させて行うことが好ましく、それにより界面が基本的に可視することができず、結合の前には、光は殆ど回折されない。言い換えれば、屈折率の整合が、このタイプの基板では好ましい理由は、トポグラフィーが発生することができる大きい信号は、結合による変化をのみ込むことになるからである。平坦な表面の場合、このような回折信号は存在しないから屈折率の整合は必要とせず、内部全反射を使用することができる。
【００３３】
結合事象は屈折率整合を破壊することにより波形基板を目立たさせ、単独の回折スポットを生じさせる(図２b参照)。Cosine（sine）表面トポグラフィーの使用は単に説明的のもので、シヌソイド以外のトポグラフィーも好ましいことを理解されるであろう。
【００３４】
例えば、均一に離間したラインからなるが、検体レセプターよりも大きいトポグラフィーを有するトポグラフィー格子を使用することができ、検体レセプターを固定して、基板全体をカバーする。これは１つの可能性である。トポグラフィー格子を有する基板および媒体を、最初に屈折率を整合させ、回折が観察されないようにする。媒体中の検体の検体特異的レセプターとの結合は、この屈折率整合を破壊させ、従って格子を目立たせ、回折信号を生じさせる。
【００３５】
上記例では、表面トポグラフィーが検体特異的レセプターよりもスケール的に可なり大きいセンサー基板を説明したが、分子スケールのトポグラフィーでセンサー素子を構築してもよいことを理解されるであろう。例えば、センサー素子は型取りした溝、すなわち大きい分子のサイズのもので、検体に対し相補的ジオメトリーおよび相互作用を有するものを含むことができる。言い換えれば、検体特異的レセプターは、分子ないし極微小サイズの窪みを含むものでもよく、この場合、これら窪みは、テストされるべき検体である特定のたんぱく質又は細胞に対し相補的形状および相互作用を提供するものとなる。
【００３６】
ii)  パターン化された平坦基板：
検定のための感応素子は、その平坦表面に、直接又は介在層を介して、認識素子又は検体特異的レセプターの１セットをパターン状に展開した固体基板であってもよい。このパターンは、特定の検定に望ましい如何なる基準（すなわち解像度の向上、あるいは単に美観であれ）をも満足するように選択される。同一領域上の多重検体についての検定においては、できるだけ異なる回折像を生じさせるような、あるいは他の検体のものとオーバーラップしない高い回折信号強度の領域を少なくとも含むような各検体についての表面パターンを選択することが望ましい。言い換えれば、回折像全体を各検体について区別させる必要はない。必要なことは、各検体の１つの領域又はスポットが他のものから区別されれば宵(すなわち、空間的に十分に分離されている)。本発明の１実施形態において、基板上のレセプターのパターンは、主ビームから離れた回折信号の強度を向上させ、主ビームでの強度をできるだけ減少させるように選択される。回折信号はできるだけ少ない部位で濃縮されることが好ましい。
【００３７】
iii)  回折光学素子：
関心のある他のクラスのパターンは、回折の原理を使用して光を操る光学素子に対応するものであり、一般に所定の明瞭なパターンを生じさせるものである（回折光学素子）。殆どの光学素子は反射又は屈折の原理を用いて光を操作する。回折光学素子は、回折の原理を使用して光を操作する：すなわち、波頭の部分が、ガラスなどの基板上のパターンを使用して選択的に遅延される。しかし、他の物質も同様に使用することができる。回折は、より多様で強力な光操作手段の使用を許容する。これらのパターンは光学素子の表面に形成された表面パターン、あるいは物質の本体(bulk)を介して形成されたバルク（bulk）パターンでもよい。回折光学素子は極めて複雑なパターンを有するものでもよいが、多重光における多様性も回折像の特性を最適化する目的において有用であり；基板上の複雑化したパターンは従って、均等に離間したライン又は円からなる従来のパターンとの比較において好ましい。
【００３８】
回折光学素子は市販されており、あるいは仕様書に従って製造することができる。一般的な例は、レーザーポインターに対するアタッチメントであり、これはフレンチクロス、星形、円などのパターンを形成するものである。本発明においては、表面トポグラフィーパターンのために光を回折させる回折光学素子も発明の対象である。このタイプの回折光学素子は、本発明において、２つの方法において有用である：（１）プローブ分子が不動化され回折光学素子の全表面をカバーするようにし、次いで、上記(i)に記載したように検定される媒体と接触されることになる。この媒体の屈折率はこの回折光学素子のものに整合ないし近似させることが好ましい；（２）この回折光学素子はマイクロコンタクト印刷のためのマスターとして使用され、その表面トポグラフィーからエラストマースタンプが作成される。プローブ分子は従って、マイクロコンタクト印刷の原理に従ってエラストマースタンプを用いて基板上にパターン化される。この基板は上記（ii）のように利用される。
【００３９】
使用時において、回折光学機器自体は、媒体の屈折率整合が成されない限り、大きい回折信号を有するから、この素子がいったん媒体中に浸漬されたときにモニターされるものは強度の差又は変化である。強度測定は、プロセッサーに保存されるベースライン又は較正を得るために、検体を含む媒体への露出の前に行ってもよい。検体の検体特異的レセプターへの結合を表す回折スポットの存在は、測定された回折信号の強度の変化により示唆される。
【００４０】
本発明の回折ベースの検定に使用することができる基板の特定のタイプは、回折光学ビームスプリッターであり、これは１つの入射ビームからほぼ等しい強度の所定数のビームを発生させる。もし、このタイプのパターンが回折ベースの検定に採用された場合は、結合事象は比較的大きい回折信号を発生させ、これは検出の向上にとって望ましいものである。
【００４１】
平坦表面上の複雑なパターンは種々の手段で作成することができる。フォトリソグラフィを多くの方法で使用することができる：すなわち、光を反応開始に使用し表面種(species)を活性化ないし失活させることができ、更に、適当なマスクを使用してパターンを形成することができる。印刷技術、例えば、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷、ロボット・スポッティングなどにより物質を所望のパターンに堆積させることができる。この堆積された物質は物理的吸着により基板上に保持させたり、あるいはパターン認識種に対する特定の結合のために、この物質を基板の表面又は基板上に堆積された表面層に共有結合させることもできる。
【００４２】
例えば、回折光学素子自体を認識素子のための基板として使用することに加えて、回折光学素子をマスターとして使用し、回折光学素子からパターンを平滑平坦基板表面(例えば、ガラス、ポリマー、セラミック、半導体又は金属の表面であって、追加の塗布層を伴う又は伴わないもの)に転写するマイクロコンタクト印刷により極めて好ましいパターン化基板を作成することもできる。回折光学素子は、均等に離間させたラインの格子よりも可なり複雑化させたトポグラフィーパターンを有する。しかし、これらを容易に金型として使用し、マイクロコンタクト印刷に使用されるエラストマースタンプを形成することもできる。このようにして印刷されたパターンは、回折光学素子の正確なリプリカではない。なぜならば、トポグラフィーの要素間の間隙のみが再生されるが、溝の深さは再生されないからである。しかし、回折信号は、平行直線格子ラインからなる通常の格子により作られるものよりも可なり向上させることができる。
【００４３】
検定はパターン化された基板を、検体含有媒体と接触させることにより行われる。認識素子のパターンが展開される固体基板は透明のもの、半透明のもの、あるいは入射光の波長で反射するものであってもよい。透明基板の場合、検体特異的レセプターは基板の一方又は双方の表面にパターン形成される。特定の結合が可能な認識素子(例えば、たんぱく質、オリゴヌクレオチド、抗体など)が上記表面上に所定のパターンで展開されると、検定されるべき媒体をこの基板と接触させ、この媒体中に存在する検体をその相補的認識素子と結合させる。
【００４４】
特定の検体が媒体中に存在するとき、検体とその相補的認識素子との間の結合事象には、基板上の層の局所的厚みの変化および/又は屈折率の変化が伴うことになる。厚みの変化並びに屈折率の変化の双方とも、基板と媒体との間の界面の結合がなされた部位に光学的特性の変化を生じさせる。基板上に所定のパターンを以って認識素子が存在するため、基板に入射した光は均一に散乱することはなく、むしろ回折される。本発明の１実施形態において、このパターン化基板は非回折性のもので、結合事象は、観察可能な回折像を生じさせる。他の実施形態において、このパターン化基板自体が観察可能な回折像を生じさせるが、結合事象は回折信号の強度を変化させる。
【００４５】
回折信号の強さは、既に不動化された検体上に局在化するよう選択された１又はそれ以上の二次種の付加により向上させることができる。この二次種は屈折率の変化を向上させる物質(例えば、クロモフォア、プラズモンバンドを有する金属コロイド、光源波長を有するレゾナント(resonant)、又は適当な試薬を添加したとき析出を生じさせる酵素)、又は基板上の高さを変化させる物質(大きい粒子、金属コロイド、ポリマーコロイド、量子ドット、たんぱく質)、あるいはこれら双方を含むものであってもよい。
【００４６】
その他、検体は予め処理し、結合時に得られる信号を、屈折率の変化、高さの変化、これら双方の変化を介して、向上させる物質に最初に結合させてもよい。この物質はポリマーコロイド、大きい分子、クロモフォア、又は金属コロイドであってもよい。クロモフォア又は金属コロイドは光源の波長で光線を吸収することが好ましい。
【００４７】
本発明の１実施形態において、基板表面が、検体について検査される媒体に曝された後、この基板は回折測定の前に濯ぎ、乾燥にかけられる。他の実施形態において、検定が現場で行われ、その場合、基板は検体を含む溶液中に浸漬される。変質させた表面トポグラフィを有する基板に関して先に述べたように、回折信号を向上させるために屈折率の整合が望ましい場合に、これは好ましいモードである。この場合、結合事象の運動力学が、回折信号の進展をモニターすることにより検査される。この検定は、回折信号の選択された領域での強度を測定し、予め決定された較正基準を使用することにより、又は公知の結合運動力学に当て嵌めることにより定量的に行うことができる。
【００４８】
以上、単一のタイプの検体についての検定を説明した。本発明の方法は、媒体中の複数の検体を検出する場合にも拡張することができ、同一基板内で認識素子の多重のパターンを形成する場合も包含するものである。認識素子の各タイプのパターンは、他のものから区別されるもの、あるいは同一のものではあるが基板の異なる部位に位置するものであってもよい。以下の例は単純な区別し得る非制限的例を挙げたものである：(１)異なる幾何学的要素からなるもの（線、円など）；(２)同一の幾何学的要素からなるが異なる周期で配列されたもの；(３)同一の幾何学的要素および同一の周期からなるが相互との関連で回転するもの(但し、それらのパターンは回転対称を有しない)；(４)上記の例の組合せからなるもの。多重認識素子の多重パターンの場合、少なくとも１つの領域が、用いられた各パターンに対し区別されるような高い強度の領域を有することが望ましい。換言すれば、回折パターンは相互にオーバーラップしても良いが、各パターンは少なくとも１つの特異なスポットを有することを必要とする。
【００４９】
湿気が問題となる用途において、基板は湿気を減少させるために部分的に排気させたセル内に配置させることができる。これは、水の凝縮のため信号の強度を減少させることが望ましい場合に有利となる。しかし、パートナーレセプターではなく、検体が水に好まれる場合は、水の凝縮の存在(凝縮形態（condensation figures）とも呼ばれる)を回折信号の向上に利用することができる。
【００５０】
本発明の他の実施形態において、検定が現場で行われる。この場合、基板がチャンバー内に配置され、このチャンバー内に媒体が導入される。図６aはセル５０を示し、基板５２が１又はそれ以上の検体の存在について試験される液体内に浸漬され、この場合、流体の流通を行わない静的構造が採用されている。検体特異的レセプターは基板５２の一方又は双方の面でパターン化されている。
【００５１】
図６bは、流動構造を示すもので、離間した平行壁５８および６０からなり、検体特異的レセプターのパターンが各壁の内側に形成されたセル５６を有する。液体は操作の間、セルを通って連続的に流され、この場合、矢線で示すように反射モード又は透過モードを採用することができる。図６cはフローセル６６の他の例を示すもので、平行壁６８および７０が互いに離間して設けられ、壁７０には入口７２および出口７４が形成されている。検体特異的レセプターのパターン７６が壁６８の内側表面に形成されており，O−リング７８を使用してフローチャンバーを封止するようにしている。これら実施形態のそれぞれにおいて、チャンバーは入射光に対し透明な少なくとも１つの窓を有することを必要とする。チャンバー内の基板は照射光の直接的ライン上に配置され、検定は上述のように反射モード又は透過モードで行われる。他の例において、流体チャンバーはその窓の１つ又はそれ以上としてパターン化基板を具備するものでもよい。これらの実施形態において、結合事象の時間依存性がすべての検体について同時にモニターされる。これは相対的結合親和性の測定のために有用なものとなる。
【００５２】
後述の実施例で記載するように、或る場合には、回折信号が、正しい照明条件下で肉眼でも見ることができる程度に強力なものとなる。この場合、必要なものは観察者の目、若しくは、より恒久的記録のためのカメラ又は類似する画像化装置である。強度の低い信号の定量化のため、感応性CCDアレイ検出器又はPMTを使用することができる。更なる信号の向上のため、当業者に公知のロックイン検出および増幅機構を採用することができる。前述のように、検出器により電子的信号として得られた画像又はその一部をコンピュータに記憶させておき、次いで、画像分析ソフトウエアを用いて、観察された回折像を生じさせた基板上のパターンを特定し、それによりどの検体が媒体中に存在していたかを特定することができる。コードを基板自体に書き込み、どの検体特異的レセプターが存在しているかを特定するようにしてもよい。回折像内の標準コード化位置との関連で特定部位における信号の存在は、特定の検体の存在に対応するものとなる。画定された部位での信号の定量化は、異なる検体の量の定量化を可能にする。
【００５３】
操作において、特定の結合を行うことができる認識素子(たんぱく質、オリゴヌクレオチド、抗体など)が、予め選択されたパターンで表面に展開される。検定される媒体は基板と接触させ、媒体中に存在する検体をその相補認識素子と結合させる。なお、この認識素子は構造的又はトポグラフィー的特徴、例えば基板の上面に形成された溝であってもよい。なお、この場合、基板はバクテリアなどの関心のある標的を捕捉するための寸法および/又は相互作用を有するものである。本発明の１実施形態において、基板は濯ぎおよび乾燥を行った後、前述の装置の１つに配置され画、この結合した検体を有する基板は光源３２からの光線の直接的ライン上に置かれる。なお、この基板は計量棒であってもよい。
【００５４】
水溶液などの明瞭な媒体を利用することは最も単純ではあるが、この方法では、他の種の媒体中に存在する検体を検定するのに使用することもできる。この媒体は、一般には気体又は液体を含む流体であり、検体には空気中に分散した種々の生物学的病原体、環境毒素、化学的薬剤（chemical warfare agents）が含まれる。本発明の１実施例において、複合媒体中の検体、例えば尿、血液、血清又は他の濁った媒体が検定される。媒体が入射光に対し完全には透明ではない場合、検定は反射機構の下で良好に行うことができる。複合媒体中での検体の検定は、媒体による入射光の散乱および/又は吸収による信号/ノイズの劣化により複雑化される。従って、本発明の１実施例において、検定を行うのに使用される装置は、入射光の、基板‐媒体界面からの内部全反射を利用するものである。図６ｄを参照すると、検体特異的レセプターパターン８６を有する基板８４を、その一方の側にて、試験される媒体８２(チャンバー８０内に収容されている)と接触させる。光は、基板８４と媒体８２との間の界面から全反射される。このセルは、流体がチューブ９０を介してチャンバー８０内に流入され、チューブ９２から流出されるとき、フローセルとして操作される。本発明の他の実施例において、入射光は、その波長において複合媒体が透明を示すものが選択される。例えば、血液などの流体の検定については、近赤外線レーザー波長が使用される。
【００５５】
図５a、５b、５cを参照すると、検出装置３４は、選択された照射光に対し感応するものでなければならない。この検出装置３４は、位置感応性フォトダイオード、光電子増倍管(PMT)、フォトダイオード（PD）、アバランチフォトダイオード(APD)、電荷結合素子（CCD）、CMOSアレイ、肉眼、カメラ、写真乾板、その他の画像化装置などであってよい。本発明の１実施例において、透過した信号又は反射した信号は、画像化光ファイバーにより収集され、画像化検出器に向けられる。この検出装置３４は、電力を提供し、信号収集を可能にし、データ処理を行う適当な付属品に取着される。位置感応性フォトダイオードが使用される場合、最初に較正が行われ、信号の強度が検出装置に当ったパターンの位置を反映するものとなる。フォトダイオード、光電子増倍管又はアバランチフォトダイオードはトランスレーション・ステージ上に装着される。この検出器をこのステージに移動させることにより、高低光レベルのパターンが図面化されることになる。その他、PMT又は(APD)を静止位置に保持させてもよい。ミラーが基板からの光をPMT、PD又はAPDに向けさせるように配置される。このミラーは回転ステージ上に装着され、このステージを回転させることにより、高低光レベルのパターンが、図５cに示すように、PMT、PD又はAPD上に図面化されることになる。
【００５６】
CCDアレイ又は他の画像化装置が使用される場合、全回折像又はその一部を収集するように配置される。後者の場合、画像化装置はトランスレーション・ステージ上に装着され、回折像の選択された領域の検査を行うようにする。ここで、光レベルの強度の変化は結合事象を示唆するものとなる。以下の非制限的実施例は本発明を更に説明することを意図するものである。
【実施例１】
【００５７】
マイクロコンタクト印刷によるパターン化基板の製造：
基板をマイクロコンタクト印刷によりパターン化した。これは文献、Bernard, A; Delamarche, E.; Schmid, H.; Michel, B.; Bosshard, H.R.; Biebuyck, H．; “Printing Patterns Of Proteins”, Langmuir (1998), 14, 2225-22229に記載されている手法に基本的に従って行った。均等に離間させたマスター(回折格子)のため、電子顕微鏡グリッド又は標準フォトリソグラフィに作られたマスターが使用された。その他の種々の回折光学機器(Thor Labs)が使用された。ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)スタンプが、典型的な１０%の架橋(Sylgard 184 Silicone elastomer kit, Dow Corning Corporation; Paisley Products, オンタリオ、カナダ国から購入された)および５０−６０℃で、１４−１８時間のキュアリングにより製造された。この方法で製造されたPDMSスタンプは回折表面が〜５０mm2である。このPDMSスタンプを、蒸留および脱イオン水（ddH2O）/エタノールの２：１溶液中で５−１０分間、超音波処理することにより洗浄し、ついで、窒素ガス（N２）流中で乾燥させ、更に、新しい接着テープの一片をスタンプ表面に適用した。数分後、スタンプ表面から接着テープを剥がし、燐酸緩衝液(PBS)に５０−１００μg/mLの割合で溶かしたたんぱく質１５０−２００μLをスタンプ表面に直ちに適用し、室温にて静置した。３０分後、たんぱく質の溶液を取り除き、インク付けしたスタンプ表面をPBS（２ｘ２ｍL）、ddH2O（２ｘ２ｍL）で洗浄し、最後に、N２流中で乾燥させた。ついで、このスタンプを軽い圧力下で基板に適用し、最初に２：１のddH2O/EtOH液中で超音波処理による洗浄を行い、ついでN２流中で乾燥させた後、数秒間、そのままに放置した。ついで、このスタンプした基板をPBS（２ｍL）、ddH2O（２ｍL）で洗浄した後、N２流中で乾燥させた。このようにして作成された基板が図４に示されている。ここで堆積させた物質を原子間力顕微鏡を用いて可視化させた。
【００５８】
その後のパターンを同一の基板に適用しようとした場合、追加のPDMSスタンプを用い、上記同様にして洗浄し、インク付けし、スタンプすることにより形成することができる。しかし、その場合、基板上に既に存在するパターンから或る角度でずらしてクロススタンプする。
【実施例２】
【００５９】
信号測定：
基板に対し、Nd:YVO４レーザー(ラムダー＝５３２nm)又は赤色ダイオードレーザー(ラムダー＝６５０nm)を用いて照射した。いずれかのレーザーにより照射して得られたクロススタンプされた基板の回折像は、検体の添加の前に透過モード又は反射モードで肉眼で観察することができる。可視的および写真信号的検出のため、検体の添加前に中性密度フィルターを用いて、回折光の強度を或る点まで減少させ、回折像がもはや目では認識できないようにした。電子信号検出のため、中性密度フィルターを用いて上記強度を小さいが測定可能な値まで減少させ、検体の添加前に検出装置の信号範囲を最大にした。
【実施例３】
【００６０】
“ドライ”測定：
“ドライ”測定系において、基板を、検体を含む溶液に所定時間浸漬させた。ついで、この基板をこの検体溶液から取り出し、PBS（２ｍL）およびddH2O（２ｍL）で洗浄した後、N２流中で乾燥させた。この基板をレーザーで照射した。可視化回折像は肉眼で認識することができた。強度は、コンピュータに接続させたCCDリニアアレイ又はCCDエリアアレイ検出器を用いて測定した。その他、ｘ−ｙトランスレーション・ステージ上に装着させた光電子増倍管を用いて、回折像上の特定のスポットの信号強度を測定した。この場合、オシロスコープ上に強度を記録させながら、光電子増倍管を、上記スポトを横切るように移動させた。
【実施例４】
【００６１】
抗ヤギ・ゴールド・コンジュゲートを用いてテストされたヤギIgGパターン化基板：
ヤギIgGを上述のようにして、２つのガラス基板上にパターン化した。この場合、格子および６−ビームスプリッター回折光学機器をそれぞれ使用した。図３aおよび３ｂは、原子間力顕微鏡を用いて可視化させたこれらの基板の像を示すものである。得られたパターン化基板を抗ヤギ・ゴールド・コンジュゲート溶液に３０−６０分間浸漬し、ついで取り出し、PBS（２ｘ２ｍL）、ddH2O（２ｘ２ｍL）で洗浄し、更に、N２流中で乾燥させた。基板上のヤギIgGに対応する透過および反射モードの双方で観察された回折像の発展を可視的にモニターすると共に、CCDカメラを用いて記録した。すなわち、画像分析ソフトウエアを利用し、回折された信号の強度の比較を行った。その結果を、図４aおよび４ｂに要約する。マスターとして回折光学ビームスプリッターから得られたパターン化基板は中央(主ビーム)から離れて部位に強い回折信号を示した。他方、従来の平行線格子を用いて得られた基板は信号の急激な衰退を示した。
【００６２】
ここで用いられている用語、“含む”は他の可能性を示すものと理解されるべきであり、排他的なものではない。具体的には、請求項を含め、本明細書に記載されている“含む”並びに類似の用語は特定された特徴、工程、要素を包含することを意味するものである。これらの用語は他の特徴、工程、要素を排除するものと解釈されるべきではない。
【００６３】
以上の本発明の好ましい実施例の記載は単に本発明の原理を説明することを意図したものであり、本発明をこれら実施例の記載に制限することを意図したものではない。従って、本発明の範囲は、付記した請求の範囲およびその均等の範囲に含まれる全ての具体例により画定されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】格子から生じる対応回折パターンを示す典型的な格子の模式図である。
【図２】図２ａは、正弦波表面を有する感応素子の模式図である。図２ｂは、図２ａの正弦波表面に塗布された検体特異的レセプターに検体が結合したときに得られる対応回折パターンを示す模式図である。図２ｃは、整合する屈折率の媒体と接触させた検体特異的レセプターで被覆された波形表面を示す模式図であって、界面が基本的に可視することができず、検体が検体特異的レセプターと結合したとき、光を回折させる上記界面で屈折率の変化をもたらすことを説明する図である。
【図３Ａ】抗体の均一に離間させたライン（バイオ回折格子）からなる従来のパターンで作られた表面を示す写真図である。
【図３Ｂ】6ビームスプリッター回折光学機器を用いて作られたパターンで形成された表面を示す写真図である。
【図４】図４ａは、図３ａにおいて、パターン化された抗体に結合したときに得られた回折像を示す図である。図４ｂは、図３ｂにおいて、パターン化された抗体に結合したときに得られた回折像を示す図である。なお、縮尺は図４ａ、図４ｂとも同一である。
【図５】図５ａは、透過機構を用い、本発明に従って検定を行うための装置の模式図である。図５ｂは、反射機構を用いて検定を行うための装置の模式図である。
【図６】図６ａは、スタティックモードで検定を行うためのセルの斜視図である。図６ｂは、本発明の検定を行うために構築されたフローセルの具体例を示す断面図である。図６ｃは、本発明に従って構築されたフローセルの他の具体例を示す断面図である。図６ｄは、内部全反射を使用するフローセルを示す断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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