(57)【要約】本発明には、新規ヒトペリオスチンポリペプチドおよびそれをコードするDNAが含まれる。ヒトペリオスチン特異的抗体、乳癌の骨への転移および子癇前症を調べる診断アッセイ法も同様に本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体。
【請求項２】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体が5H8ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号CRL-2646）、または8H11ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号 ）によって分泌される、請求項3記載の抗体。
【請求項５】
ヒトペリオスチンに結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項６】
ハイブリドーマが5H8ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号CRL-2646）、または8H11ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号 ）である、請求項5記載のハイブリドーマ。
【請求項７】
以下の段階を含む、試料中にヒトペリオスチンを検出する方法：
（a）ヒトペリオスチンに結合する抗体を試料に接触させる段階；および
（b）抗体が試料の成分に結合すれば、試料中にペリオスチンが存在することが示される、抗体が試料の成分に結合するか否かを決定する段階。
【請求項８】
第1の抗体が結合するヒトペリオスチン上のエピトープが、第2の抗体が結合するエピトープとは同じでない、ヒトペリオスチンに結合する第1の抗体に試料を接触させる前に、ヒトペリオスチンに結合する第2の抗体に試料を接触させる段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
第2の抗体が固相基質に結合する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
モノクローナル抗体が5H8ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号CRL-2646）、または8H11ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号 ）によって分泌されるモノクローナル抗体である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
第2の抗体がモノクローナル抗体である、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が5H8ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号CRL-2646）、または8H11ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号 ）によって分泌されるモノクローナル抗体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
第2の抗体がポリクローナル抗体である、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
方法がイムノブロットアッセイ法を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１７】
方法がELISAアッセイ法を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１８】
検出段階が化学発光を検出する段階を含む、請求項7記載の方法。
【請求項１９】
検出段階が、放射活性または蛍光を検出する段階を含む、請求項7記載の方法。
【請求項２０】
検出段階が、可視光または紫外光の吸光度を測定する段階を含む、請求項7記載の方法。
【請求項２１】
抗体がビオチン化されている、請求項7記載の方法。
【請求項２２】
検出段階がアビジンを用いることを含む、請求項7記載の方法。
【請求項２３】
検出段階が、免疫グロブリン分子に結合する抗体を用いることを含む、請求項7記載の方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む、乳癌の骨への転移を診断する方法：
（a）乳癌の骨への転移を有することが疑われる、または有するリスクのある乳癌患者を同定する段階；および
（b）試料中のペリオスチンレベルが対照ペリオスチンレベルと比較して上昇していれば、患者の乳癌が骨に転移していることが示される、患者からの体液試料中のペリオスチンレベルを測定する段階。
【請求項２５】
体液が血液である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
体液が尿である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階を含む、患者における子癇前症を診断する方法：
（a）子癇前症を有することが疑われる、または有するリスクのある妊娠患者を同定する段階；および
（b）試料中のペリオスチンレベルが対照ペリオスチンレベルと比較して上昇していれば、患者が子癇前症を有することが示される、患者からの体液試料中のペリオスチンレベルを測定する段階。
【請求項２８】
体液が血液である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
体液が尿である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
配列番号：6または配列番号：14を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたDNA。
【請求項３１】
核酸配列が配列番号：5または配列番号：13である、請求項30記載の単離されたDNA。
【請求項３２】
DNAが配列番号：4または配列番号：12を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項30記載の単離されたDNA。
【請求項３３】
核酸配列が配列番号：3または配列番号：11である、請求項32記載の単離されたDNA。
【請求項３４】
請求項30記載のDNAを含むベクター。
【請求項３５】
核酸配列が転写調節要素に機能的に結合している、請求項34記載のベクター。
【請求項３６】
請求項35記載のベクターを含む細胞。
【請求項３７】
配列番号：6または配列番号：14を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号：4または配列番号：12を含む、請求項37記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
（a）完全長のポリペプチドより短く、かつ
（b）構成的に配列番号：4の725番目および726番目の残基を含む、または構成的に配列番号：12の768〜771番目の残基を含む、
請求項37記載のポリペプチドの抗原性断片。
【請求項４０】
以下の段階を含む、ポリペプチドを作製する方法：
（a）請求項36記載の細胞を培養する段階；および
（b）培養物からポリペプチドを単離する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2001年8月13日に提出された米国特許仮出願第60/312,123号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、診断方法、より詳しくは、乳癌の骨への転移および子癇前症を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
転移性の骨腫瘍は、成人に認められる悪性骨病変の最も一般的なタイプであり、肺および肝臓に次いで最も発生率が高い転移部位である[Yonedaら（2000）、J. Orthop. Sci. 5(1)：75〜81]。骨芽細胞性骨転移および溶骨性骨転移はいずれも、乳癌患者における病的状態が深刻化し、最終的には死亡の主な原因となる。乳癌のために死亡する女性の約75％が剖検時に骨転移を示す[Galasko、「Incidence and distribution of skeletal metastases」、C.S.B. Galasko（編）、「Skeletal Metastases」、14〜21頁、バターワース、ロンドン、1986；Rubens、「The nature of metastatic bone disease.」、「Bone Metastases, Diagnosis and Treatment」、1〜10頁、スプリンガー、ロンドン、1991]。
【０００４】
子癇前症は、母親の死亡および周産期死亡の最もよくある原因の一つである[Robertsら（1993）、Lancet 341：1447〜1451]。
【０００５】
上記の検討を考慮すると、乳癌の骨転移および子癇前症に関する単純で信頼できる試験を利用できることが重要である。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明者らは、当初骨芽細胞特異的因子-2（OSF-2）と呼ばれ、今ではペリオスチン[Takeshitaら（1993）、Biochem. J. 294：272〜278；Horiuchiら（1999）、J. Bone Miner. Res. 14：1239〜1249]と呼ばれているタンパク質の新規ヒト欠失変種を同定した。新規ペリオスチン変種の一つは、結腸癌細胞から単離され、TCG1と命名されている。特定の変種を明記せずにペリオスチンについて述べているテキストは、本明細書に開示の全ての変種に対して直接関係がある。本発明には、これらの新規ペリオスチンポリペプチド、それらをコードするDNAs、DNAsを含むベクター、およびベクターを含む細胞が含まれる。本発明はまた、ヒトペリオスチンに対して特異的なモノクローナル抗体（mAbs）、および試料（例えば、血液試料）中のペリオスチンを測定するためにそのような抗体を用いるアッセイ法を特徴とする。さらに、本発明は、乳癌の骨への転移および子癇前症を診断する方法を具体化する。
【０００７】
より詳しく述べると、本発明は、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体を特徴とする。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（mAb）、例えば5H8ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号CRL-2646）、8H11ハイブリドーマ（ATCCアクセッション番号 ）、1B11ハイブリドーマ、2C6ハイブリドーマ、6B1ハイブリドーマ、8E3ハイブリドーマ、10A3ハイブリドーマ、もしくは7E4ハイブリドーマによって分泌されるmAbとなりうる。同様に、ヒトペリオスチンに結合するmAbを分泌するハイブリドーマ、例えば上記の任意のハイブリドーマも本発明によって具体化される。
【０００８】
本発明のもう一つの局面は、試料中のヒトペリオスチンを検出する方法である。方法は：（a）ヒトペリオスチンに結合する抗体に試料を接触させる段階；および（b）抗体が試料の成分に結合するか否かを決定する段階を含む。試料の成分に抗体が結合すれば、試料中にペリオスチンが存在することを示している。方法にはさらに、ヒトペリオスチンに結合する第1の抗体に試料を接触させる前に、ヒトペリオスチンに結合する第2の抗体に試料を接触させることが含まれうる。第1の抗体が結合するヒトペリオスチン上のエピトープは、第2の抗体が結合するエピトープと同じではない。第2の抗体は固相基質に結合させることができる。第1の抗体はポリクローナル抗体またはmAbとなりうる。mAbは上記の任意のハイブリドーマによって分泌されるmAbとなりうる。さらに、第2の抗体は、mAb（上記の任意のmAbsのような）またはポリクローナル抗体となりうる。方法は、例えば、イムノブロットアッセイ法またはELISAアッセイ法を含み、検出段階は例えば、化学発光、放射活性、または蛍光を検出することを含みうる。または、検出段階は、例えば、可視光または紫外光の吸光度を測定することを含みうる。第1の抗体はビオチン化することができ、検出段階はアビジンを用いることを含む。または、検出段階は、免疫グロブリン分子に結合する抗体を用いることを含みうる。
【０００９】
乳癌の骨への転移を診断する方法も同様に本発明に含まれる。方法は（a）乳癌の骨への転移が疑われる、または転移のリスクを有する乳癌患者を同定する段階；および（b）患者からの体液試料中のペリオスチンレベルを測定する段階を含む。ペリオスチンの対照レベルと比較して、試料中のペリオスチンレベルが上昇すれば、患者が乳癌の骨への転移を有することが示される。体液は、血液または本明細書において引用した他の任意の体液、例えば尿となりうる。
【００１０】
本発明のもう一つの局面は、患者にける子癇前症を診断する方法である。方法は（a）子癇前症を有することが疑われる、または子癇前症のリスクを有する妊娠患者を同定する段階；および（b）患者からの体液試料中のペリオスチンレベルを測定する段階を含む。ペリオスチンの対照レベルと比較して、試料中のペリオスチンレベルが上昇すれば、患者が子癇前症を有することを示している。体液は、血液または本明細書において引用した他の任意の体液、例えば尿となりうる。
【００１１】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：6または配列番号：14を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたDNAである；核酸配列は配列番号：5または配列番号：13となりうる。または、単離されたDNAは配列番号：4または配列番号：12を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含みうる；核酸配列は配列番号：3または配列番号：11となりうる。本発明にはまた、上記の任意のDNAsを含むベクター、例えば核酸配列が転写調節要素（TRE）に機能的に結合しているベクターも含まれる。同様に、上記の任意のベクターを含む細胞も本発明に含まれる。
【００１２】
配列番号：4または配列番号：6、配列番号：12または配列番号：14を含む単離されたポリペプチドも同様に本発明の特徴である。本発明はまた、任意のポリペプチドの抗原性断片を提供する。断片は完全長のポリペプチドより短い。断片は、構成的に、配列番号：4の725番目および726番目の残基または配列番号：12の768〜771番目の残基を含みうる。本発明の任意のポリペプチドを作製する方法も同様に本発明に含まれる。方法は（a）細胞が含むベクターに、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合したTREが含まれる限り、本発明の任意の細胞を培養する段階；および（b）培養物からポリペプチドを単離する段階を含む。
【００１３】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、長さまたは翻訳後改変によらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【００１４】
本発明において用いられる「単離された」ポリペプチドまたはペプチド断片という用語は、天然に存在する相対物を有しない、または例えば肺、腎臓、もしくは胎盤のような正常組織、結腸癌組織のような腫瘍組織、または血液、血清、もしくは尿のような体液において本来それが付随する成分から分離または精製されているポリペプチドまたはペプチド断片を意味する。典型的に、ポリペプチドまたはペプチド断片は、それが本来会合しているタンパク質および他の天然に存在する有機分子を乾燥重量で少なくとも70％含まない場合に「単離された」と見なされる。好ましくは、本発明のポリペプチド（またはそのペプチド断片）調製物は、本発明のポリペプチド（またはそのペプチド断片）を乾燥重量で少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％である。このように、例えば、ポリペプチドxの調製物は、ポリペプチドxの乾燥重量で少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％である。化学合成されるポリペプチドは、その特性によって、それが本来付随する成分から分離されていることから、合成ポリペプチドは「単離されて」いる。
【００１５】
本発明の単離ポリペプチド（またはペプチド断片）は、例えば、天然起源（例えば、組織または体液）からの抽出によって；ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって；または化学合成によって得ることができる。それが本来由来する起源とは異なる細胞系において産生されたポリペプチドは、それが本来付随する成分を必ずしも含まないことから、「単離されている」。単離または純度の程度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
【００１６】
「単離されたDNA」とは、（1）任意の天然に存在する配列とは同一でない配列を含むDNA、または（2）天然に存在する配列を有するDNA（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）の意味において、対象となるDNAを含む遺伝子が本来存在する生物のゲノムにおいて対象となるDNAを含む遺伝子に隣接する遺伝子を少なくとも一つ含まないDNA、のいずれかである。したがって、この用語には、ベクター、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス、または原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み入れられた組換えDNAが含まれる。用語にはまた、対応するゲノムDNAがイントロンを有し、したがって異なる配列を有するcDNA；少なくとも一つの隣接遺伝子を欠損するゲノム断片；ポリメラーゼ連鎖反応によって産生され、少なくとも一つの隣接遺伝子を欠損するcDNAまたはゲノムDNAの断片；少なくとも一つの隣接遺伝子を欠損する制限断片；融合タンパク質、ムテイン、または所定のタンパク質の断片のような天然に存在しないタンパク質をコードするDNA；およびcDNAまたは天然に存在する核酸の縮重変種である核酸、といった分離された分子が含まれる。配列番号：3、配列番号：5、配列番号：11、または配列番号：13の一部が含まれる組換えDNAも同様に含まれる。「単離されたDNA」という用語には、例えば、cDNAもしくはゲノムDNAライブラリ内に存在するDNA、または例えば制限消化反応混合物もしくは電気泳動ゲルスライス中のゲノムDNA制限消化物は含まれない。
【００１７】
本明細書において用いられるように、ペリオスチンポリペプチドの「抗原性断片」は、完全長のポリペプチドより短く、ペリオスチンに対して特異的な抗体に結合する完全長のポリペプチドの能力の少なくとも5％（例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％またはそれ以上）を有するポリペプチドの断片である。対象となる断片は、組換え、合成、またはタンパク質溶解消化法によって作製することができる。次に、そのような断片を単離して、当技術分野で既知の方法によってペリオスチンに対して特異的な抗体との結合能に関して調べることができる。本明細書において用いられるように、「完全長の」ペリオスチンは、未成熟なペリオスチンであり、このようにペリオスチンの本来のシグナル配列を含む。
【００１８】
本明細書において用いられるように、コード配列に「機能的に結合した」発現制御配列は、発現制御配列がコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子構築物に組み入れられる。
【００１９】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、全抗体分子のみならず、抗原結合断片、例えばFab、F(ab')2、Fv、および一本鎖Fv(scFv)断片も意味する。本明細書において用いられるように、「scFv断片」は、単一のポリペプチド鎖において免疫グロブリン（Ig）重鎖およびIg軽鎖の抗原結合領域を含む抗体分子の組換え断片である。scFv断片は一般的に、（a）Ig重鎖もしくはIg軽鎖の定常領域を含まないか、または（b）Ig重鎖および／またはIg軽鎖の全定常領域より短い定常領域を含むかのいずれかである。同様にキメラ抗体も含まれる。
【００２０】
本明細書において用いられるように、「非小細胞癌（NSCLC）組織におけるペリオスチン遺伝子の発現を調べる」とは、腫瘍内部および腫瘍に直ちに隣接するNSCLC細胞および間質細胞におけるペリオスチン遺伝子の発現を、それがインビボで起こっているように調べることを意味する。
【００２１】
特に定義していなければ、本明細書において用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本文書が優先する。好ましい方法および材料を下記に説明するが、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができる。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。本明細書に開示の材料、方法、および実施例は、説明するためであって、制限すると解釈してはならない。
【００２２】
本発明の他の特徴および長所、例えば、乳癌の骨への転移の試験は、以下の説明、図面、および請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２３】
詳細な説明
様々な組織から単離したRNAの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析のcDNA産物のシークエンシングから、ヒトペリオスチンの新規スプライス変種が明らかとなった。胎盤および肺において発現される一つの変種を、本明細書においてペリオスチンLと呼ぶ。腎臓において発現されるもう一つの変種をペリオスチンKと呼ぶ。さらに、結腸癌組織および正常結腸組織に由来するcDNAのディファレンシャルディスプレイによって誘導されたDNA断片によるヒト癌のcDNAライブラリのスクリーニングから、結腸癌細胞において過剰発現された転写物が同定された。同定されたcDNA分子は、ペリオスチン分子のもう一つの変種（本明細書においてTCG1またはペリオスチンCと名付ける）をコードする。
【００２４】
本発明者らはまた、ペリオスチンに結合するポリクローナル抗体（E17）および多様なモノクローナル抗体を産生した。これらの抗体を用いて、本発明者らは検出のために化学発光を用いる「サンドイッチ」ELISAアッセイ法を開発した。
【００２５】
臨床試験において、本発明者らは、骨転移を有する乳癌患者において（骨転移の兆候を示さない乳癌患者と比較して）、および子癇前症の患者において（血圧が正常な妊娠女性と比較して）ペリオスチンの血清レベルが上昇していることを示した。多様な肺癌を有する患者の試験において、患者の24％の血清中ペリオスチンレベルが上昇していることが判明した。その上、レベルが非常に高い（すなわち、＞1,000 ng/ml）患者は全員死亡した。これらの知見は、ペリオスチンが癌（例えば、肺癌）、特に進行癌のマーカーであることを示唆している。それらはまた、乳癌における骨転移および子癇前症を診断するアッセイ法のための基礎となる。
【００２６】
さらに、卵巣癌および脳腫瘍細胞は、ペリオスチンを過剰発現する[Ismailら（2000）、Cancer Res. 60：6744〜6749；Lalら（1999）、Cancer Res. 59：5403〜5407]。
【００２７】
ペリオスチン核酸分子
本発明のペリオスチン核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、またはRNAとなりえて、二本鎖または一本鎖（すなわちセンスまたはアンチセンス鎖のいずれか）となりうる。これらの分子のセグメントも同様に、本発明の範囲内であると見なされ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって産生することができ、または一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼによる処置によって産生することができる。リボ核酸（RNA）分子は、インビトロ転写によって産生することができる。好ましくは、核酸分子は、長さによらず、通常の生理的条件で可溶性であるポリペプチドをコードする。
【００２８】
本発明の核酸分子は、天然に存在する配列、または天然に存在する配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重のために同じポリペプチドをコードする配列（例えば、配列番号：4、6、12および14のポリペプチド）を含みうる。さらに、これらの核酸分子はコード配列に限定されない、例えばそれらにはコード配列から上流または下流に存在する非コード配列の一部または全てが含まれうる。
【００２９】
本発明の核酸分子は合成することができる（例えば、ホスホラミダイトに基づく合成）、または哺乳類の細胞のような生物細胞から得ることができる。核酸は、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、またはネコの核酸となりうる。これらの核酸種のなかでのヌクレオチドの組み合わせまたは改変も同様に含まれる。
【００３０】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、天然の状態ではそのように認められないセグメントを含む。このように、本発明は、組換え核酸分子（例えば、ベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター）、または異種細胞のゲノム（または、天然の染色体の位置以外の位置で相同な細胞のゲノム）に組み入れられたペリオスチンをコードする単離核酸分子）を含む。組換え核酸分子およびその利用は、下記にさらに詳しく考察する。
【００３１】
遺伝子の検出または調節に関連した技術は、当業者に周知である。そのような技術は、異常なペリオスチン発現に関連した障害を診断および／または治療するために用いることができる。
【００３２】
ペリオスチンファミリー遺伝子またはタンパク質は、それぞれ、関連するペリオスチン遺伝子またはタンパク質とのその類似性に基づいて同定することができる。例えば、同定は、配列同一性に基づくことができる。本発明は、（a）配列番号：2、4、6または8のヌクレオチド配列、および（b）配列番号：3、5、11、または13の少なくとも30（例えば、少なくとも50、100、150、150、200、250、300、350、400、500、700、900、1,100、1,400、1,700、2,000、2,200、2,250、2,300、または2,310）ヌクレオチドのセグメントを含む核酸分子、と少なくとも50％（または55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一である単離された核酸分子を特徴とする。
【００３３】
2つの配列間の％同一性の決定は、KarlinおよびAltschul（1993）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：5873〜5877の数学的アルゴリズムを用いて行われる。そのようなアルゴリズムは、Altschulら（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜410のBLASTNおよびBLASTPプログラムに組み入れられている。BLASTヌクレオチド検索は、ペリオスチンコード核酸と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラムによって、スコア＝100、ワード長＝12で行われる。BLASTタンパク質検索は、ペリオスチンポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTPプログラムによって、スコア＝50、ワード長＝3で行われる。比較目的のためのギャップを挿入したアラインメントを得るために、Altschulら（1997）、Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402に記述されるようなギャップドBLASTを用いる。BLASTおよびギャップドBLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、XBLASTおよびNBLAST）を用いる（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい）。
【００３４】
ハイブリダイゼーションはまた、2つの核酸配列のあいだの相同性の手段として用いることができる。ペリオスチンコード核酸配列またはその一部は、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ペリオスチンプローブと試験源（例えば、哺乳類細胞）からのDNAまたはRNAがハイブリダイズすれば、試験源にペリオスチンDNAまたはRNAが存在することが示される。ハイブリダイゼーション条件は当業者に既知であり、「Current Protocols in Molecular Biology」、ジョンウィリー＆サンズ、ニューヨーク、6.3.1〜6.3.6、1991に認めることができる。中等度のハイブリダイゼーション条件は、2×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）において30℃でのハイブリダイゼーションの後、1×SSC、0.1％SDSにおいて50℃での洗浄と同等であると定義される。非常にストリンジェントな条件は、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）において45℃でのハイブリダイゼーションの後、0.2×SSC、0.1％SDSにおいて65℃での洗浄と同等であると定義される。
【００３５】
本発明はまた、以下を含む：（a）任意の前述のペリオスチン関連コード配列および／またはその相補体（すなわち、「アンチセンス」配列）を含むベクター（下記参照）；（b）コード配列の発現を指示するために必要な任意の転写／翻訳調節要素（その例を下記に示す）に機能的に結合した任意の前述のペリオスチン関連コード配列を含む発現ベクター；（c）ペリオスチンポリペプチドの他に、レポーター、マーカー、またはペリオスチンに融合したシグナルペプチドといったペリオスチンに無関係な配列をコードする発現ベクター；および（d）任意の前述の発現ベクターを含み、それによって本発明の核酸分子を発現する遺伝子操作された宿主細胞（下記参照）。
【００３６】
組換え核酸分子は、ペリオスチンまたは異種シグナル配列を有するペリオスチンをコードする配列を含みうる。完全長のペリオスチンポリペプチド、またはその断片を、下記のようにそのような異種シグナル配列またはさらなるポリペプチドに融合させてもよい。同様に、本発明の核酸分子は、ペリオスチンの成熟型または分泌を促進する外因性のポリペプチドを含む型をコードしうる。
【００３７】
上記で述べたそしてさらに後に記述する転写／翻訳調節要素には、誘導型および非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および当業者に既知で、遺伝子発現を促進またはそうでなければ調節する他の要素が含まれるがこれらに限定されない。そのような調節要素には、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、fd外皮タンパク質の制御領域、3-ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、および酵母α接合因子のプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
同様に、核酸は、さらなるポリペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成することができる。マーカーおよびレポーター遺伝子の例には、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（neor、G418r）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、lacZ（βガラクトシダーゼをコードする）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）が含まれる。本発明の実施に関連する多くの標準的な技法に関して、当業者はさらに有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能の役割を果たすことができるさらなる配列を知っているであろう。一般的に、ハイブリッドポリペプチドには、第1の部分と第2の部分とが含まれ、第1の部分はペリオスチンポリペプチドであり、第2の部分は例えば上記のレポーターまたはIg定常領域もしくはIg定常領域の一部、例えば、IgG2a重鎖のCH2およびCH3ドメインである。他のハイブリッドには、精製を促進するために抗原性タグまたはHisタグが含まれる。
【００３９】
本発明の目的のために用いてもよい発現系には、本発明の核酸分子を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換した細菌（例えば、大腸菌および枯草菌（B. subtilis））；本発明の核酸分子を含む組換え酵母発現ベクターによって形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）およびピチア（Pichia））のような微生物；本発明の核酸分子を含む組換えウイルス発現系（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ペリオスチンヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）もしくはタバコモザイクウイルス（TMV））を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質転換した植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびワクシニアウイルス7.5 Kプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、WI38、およびNIH3T3細胞）が含まれるがこれらに限定されない。同様に宿主細胞として有用であるのは、哺乳類から直接得て、プラスミドベクターをトランスフェクトしたまたはウイルスベクターを感染させた一次または二次細胞である。
【００４０】
本発明の発現ベクターをトランスフェクトまたは形質導入した細胞は、例えば、当技術分野で既知の方法によってペリオスチンポリペプチドまたは抗原性断片をインビトロで大規模または小規模に産生するために用いることができる。本質的に、そのような方法は、ポリペプチドまたは抗原性断片の産生を最大限にする条件で細胞を培養すること、および細胞または培養培地からそれを単離することを含む。
【００４１】
ペリオスチンポリペプチドおよびポリペプチド断片
本発明のポリペプチドには、ペリオスチンL、シグナルペプチドを含まないペリオスチンL、ペリオスチンC、およびシグナルペプチドを含まないペリオスチンCと共に、これらのポリペプチドの抗原性断片が含まれる。ペリオスチンLの抗原性断片には、連続的に（a）配列番号：4の669番目および670番目の残基および／または（b）配列番号：4の725番目および726番目の残基が含まれうる。ペリオスチンCの抗原性断片には、連続的に、（a）配列番号：12の669番目および670番目の残基および／または（b）配列番号：12の768〜771番目の残基が含まれる。抗原性断片にはまた、N末端のアミノ酸残基18、19、20、21、22、23、24、または25個が欠失している任意のペリオスチン分子の完全長型が含まれる。本発明に含まれるポリペプチドにはまた、無関係なアミノ酸配列に融合した完全長のペリオスチン（本明細書に開示の任意の形を含む）またはその抗原性断片のいずれかを含む融合タンパク質が含まれる。無関係な配列は、さらなる機能的ドメインまたはシグナルペプチドとなりうる。シグナルペプチドは下記により詳細に説明して示す。ポリペプチドは、保存的置換を多くて50個（すなわち、多くて、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個）含む上記の任意のポリペプチドとなりうる。
【００４２】
ペリオスチン分子およびその抗原性断片のアミノ酸配列は、それらが野生型ペリオスチン分子において起こるようにそれぞれ、ペリオスチン分子の野生型配列および断片の配列と同一となりうる。または、任意の成分は欠失、付加、または置換のような変異を含みうる。必要条件は、野生型ペリオスチン分子またはその抗原性断片が、野生型ペリオスチン分子において起こるように野生型ペリオスチンに対して特異的な抗体に結合する能力の少なくとも5％（例えば、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％またはそれ以上）を、変異体ペリオスチン分子が有することである。置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換には典型的に、以下の群内での置換が含まれる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００４３】
ポリペプチドは、天然の起源（例えば、血液、血清、血漿、正常な肺もしくは胎盤のような組織もしくは細胞、結腸癌組織、またはペリオスチンポリペプチドを本来産生する任意の細胞）から精製することができる。ペリオスチン分子および抗原性断片は、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、またはネコの分子となりうる。より小さいペプチド（長さがアミノ酸100個未満）も同様に、標準的な化学的手段によって都合よく合成することができる。さらに、ポリペプチドおよびペプチドはいずれも、適当なポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いて、標準的なインビトロ組換えDNA技術およびインビボトランスジェネシスによって産生することができる。当業者に周知の方法を用いて、関連するコード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（第2版）、[コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク、1989]およびAusubelら「Current Protocols in Molecular Biology」[グリーンパブリッシングアソシエーツ＆ウィリーインターサイエンス、ニューヨーク、1989]に記載の技術を参照されたい。
【００４４】
本発明のポリペプチドおよび抗原性断片は、抗ペリオスチン抗体を作製するために、またはペリオスチン機能に関する基礎研究、例えば様々な癌および子癇前症とのその関連の重要性に関する研究のために用いることができる。ポリペプチドおよび機能的断片も同様に、本発明の診断アッセイ法において陽性対照として用いることができる（下記を参照されたい）。
【００４５】
本発明のポリペプチドおよび断片にはまた、インビボで関連するポリペプチドの生存を促進するためにブロッキング剤をアミノおよび／またはカルボキシ末端で付加することによって、インビボで用いられるように改変されている上記のポリペプチドおよび断片が含まれる。これは、ペプチド末端が細胞に取り込まれる前にプロテアーゼによって分解される傾向がある状況では有用となりうる。そのようなブロッキング剤には、投与されるペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端残基に結合させることができるさらに関連するまたは無関係なペプチド配列が含まれうるがこれらに限定されない。これは、当業者に公知の方法によって、ペプチド合成の際に化学的にまたは組換えDNA技術によって行うことができる。
【００４６】
または、ピログルタミン酸または当技術分野で既知の他の分子のようなブロッキング剤をアミノおよび／またはカルボキシ末端に結合させることができ、またはアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカルボキシ基を異なる部分に置換することができる。同様に、ペプチドは、投与前に、薬学的に許容される「担体」タンパク質に共有結合または非共有結合によってカップリングさせることができる。
【００４７】
同様に、機能的ペプチド断片のアミノ酸配列に基づいて設計されたペプチド模倣化合物も重要である。ペプチド模倣化合物は、選択したペプチドの三次元コンフォメーションと実質的に同じである三次元コンフォメーション（すなわち、「ペプチドモチーフ」）を有する合成化合物である。ペプチドモチーフは、ペプチド模倣体が由来するペリオスチン機能的断片と質的に同一のように、ペリオスチンに対して特異的な抗体との結合能を有するペプチド模倣化合物を提供する。ペプチド模倣化合物は、細胞透過性の増加および生物学的半減期の延長のような、インビボ有用性を増強させるさらなる特徴を有しうる。
【００４８】
ペプチド模倣体は典型的に、部分的または完全に非ペプチドである骨格を有するが、側鎖は、ペプチド模倣体が基づくペプチドに起こるアミノ酸残基の側鎖と同一である。いくつかの化学結合種、例えば、エステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレンおよびケトメチレン結合は、当技術分野において、プロテアーゼ抵抗性ペプチド模倣体を構築するためのペプチド結合の一般的に有用な代用結合であることが知られている。
【００４９】
本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片のインビボ半減期はまた、本来の分子または機能的断片のL-アミノ酸残基の全てまたは一部をD-アミノ酸に置換することによって延長させることができる。
【００５０】
ペリオスチン抗体
本発明は、任意のペリオスチンポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの断片に特異的に結合する抗体を特徴とする。そのような抗体は、当技術分野で既知の方法と選択的にアジュバントとを用いて、関連するペリオスチンポリペプチドまたはペプチド断片によって免疫した動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウシまたはブタ）の血清または血漿中に存在するポリクローナル抗体となりうる。そのようなポリクローナル抗体は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、血清、血漿、または腹水から単離することができる。そのようなポリクローナル抗体の例は、E17ポリクローナル抗体である。上記のポリペプチドまたは断片に結合するモノクローナル抗体も同様に本発明に含まれる。モノクローナル抗体を作製およびスクリーニングする方法は当技術分野で周知である。
【００５１】
所望の抗体産生ハイブリドーマを選択してクローニングした後、得られた抗体を当技術分野で既知の多くのインビボおよびインビトロ法によって産生することができる。例えば、ハイブリドーマを適した培地において適した時間インビトロで培養した後、上清から所望の抗体を回収することができる。培養期間および培地は既知であるか、または容易に決定することができる。
【００５２】
さらに、ヒトの部分と非ヒトの部分とを含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような、ペリオスチンに対する特異的な組換え抗体が、本発明の範囲に含まれる。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、Robinsonら、国際特許出願PCT/US第86/02269号；Akiraら、欧州特許出願第184,187号；Taniguchi、欧州特許出願第171,496号；Morrisonら、欧州特許出願第173,494号；Nerbergerら、PCT出願国際公開公報第86/01533号；Cabillyら、米国特許第4,816,567号；Cabillyら、欧州特許出願第125,023号；Betterら（1998）Science 240：1041〜43；Liuら（1987）J. Immnol. 139：3521〜26；Sunら（1987）、PNAS 84：214〜18；Nishimuraら（1987）Canc. Res. 47：999〜1005；Woodら（1985）Nature 314：446〜49；Shawら（1988）J. Natl. Cancer Inst. 80：1553〜59；Morrison（1985）Science 229：1202〜07；Oiら（1986）BioTechniques 4：214；Winter、米国特許第5,225,539号；Jonesら（1986）Nature 321：552〜25；Veroeyanら（1988）Science 239：1534；およびBeidlerら（1988）J. Immunol. 141：4053〜60に記載される方法を用いて、当技術分野で既知の組換えDNA技術によって産生することができる。
【００５３】
ペリオスチンに特異的に結合する抗体の抗原決定ドメインの少なくとも機能的部分を含む抗体断片および誘導体も同様に、本発明の範囲に含まれる。分子の結合ドメインを含む抗体断片は、既知の技術によって作製することができる。例えば、そのような断片には、以下が含まれるがこれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製することができるFab断片；およびパパインと還元剤とによって抗体分子を処理することによって作製することができるFab断片。例えば、米国国立衛生研究所、「1 Current Protocols in Immunology」、Coliganら編2.8、2.10（ウィリーインターサイエンス、1991）を参照されたい。抗体断片にはまた、Fv（例えば、一本鎖Fv(scFv)）断片、すなわち定常領域アミノ酸残基をほとんどまたは全く有しない抗体産物が含まれる。scFv断片は、scFvが由来する抗体の重鎖および軽鎖可変領域の双方を含む単一のポリペプチド鎖である。そのような断片は、例えばその全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,642,334号に記載されるように産生することができる。
【００５４】
本発明の抗体は、すべのペリオスチンスプライス変種、スプライス変種体のサブグループ、または単一のスプライス変種に結合することができる。スプライス変種特異的抗体を作製してスクリーニングする方法は当業者に既知である。例えば、ペリオスチン変種xには存在しないがペリオスチン変種yには存在するペリオスチンドメインに対して特異的な抗体を作製することが望ましい場合、ペリオスチン変種yによって動物（例えば、マウス）を免疫して、ペリオスチン変種yに結合するがペリオスチン変種xには結合しない抗体を選択することができるであろう。または、動物を、対象となるドメインからなるペリオスチンの機能的断片によって免疫することができるであろう。抗体は、ペリオスチンの機能的断片と変種yとに結合できるが、変種xに結合できないことに基づいて選択することができるであろう。
【００５５】
出願人は、ブダペスト条約に基づいて5H8および8H11ハイブリドーマをアメリカ、メリーランド州20852ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託した。5H8ハイブリドーマはATCCアクセッション番号CRL-2646、そして8H11ハイブリドーマはATCCアクセッション番号 を与えられた。ATCCに寄託されたハイブリドーマは、本出願の優先権の日付より前以降、ダナ・ファーバー癌研究所によって維持された寄託物から作製した。ハイブリドーマの寄託は、ATCC寄託所において30年間、一番最近の要請から5年間、または特許の有効期限中のいずれかの長いあいだ、制限されることなく維持され、寄託物がその期間に死滅した場合には取り替えられるであろう。
【００５６】
診断アッセイ法
本発明はさらに診断アッセイ法を特徴とする。そのようなアッセイ法は、ペリオスチンの血清レベルが、骨転移を有する乳癌患者において（骨転移の兆候を示さない乳癌患者と比較して）および子癇前症の患者において（血圧が正常な妊娠女性と比較して）上昇しているという知見に基づいている。これらの知見は、乳癌における骨転移および子癇前症を診断するアッセイ法の基礎を提供する。そのようなアッセイ法は、単独で、または好ましくは関連する臨床状態を調べるための他の技法と共に用いることができる。
【００５７】
本発明のアッセイ法において、（1）癌組織におけるペリオスチンタンパク質もしくはペリオスチンmRNAの存在を調べるもしくはそのレベルを測定する、または（2）体液（例えば、尿、唾液、精液、血液、または血液に由来する血清もしくは血漿）、肺洗浄液、胃洗浄液、直腸もしくは結腸洗浄液、もしくは膣洗浄液のような洗浄液、または細胞培養物からの上清のような液体、のような液体試料中のペリオスチンタンパク質レベルを測定することのいずれかを行う。細胞におけるペリオスチンmRNAレベルの有無を調べるまたはレベルを測定するために、細胞を溶解して、当技術分野で既知の多様な任意の方法によって、総RNAを溶解物から精製または半精製することができる。特定のmRNA転写物レベルを検出または測定する方法も当業者に周知である。そのようなアッセイ法には、検出可能に標識したペリオスチン特異的DNAまたはプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイ法、および適当なペリオスチン特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる定量的または半定量的RT-PCR方法論が含まれるがこれらに限定されない（実施例1を参照されたい）。細胞溶解物におけるmRNAを定量するさらなる方法には、RNA保護アッセイ法および連続遺伝子発現分析（SAGE）が含まれる。または、例えば組織切片または非溶解細胞浮遊液、および検出可能に（例えば、蛍光もしくは酵素）標識したDNAまたはRNAプローブを用いて、定性的、定量的、または半定量的インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ法を行うことができる。
【００５８】
細胞において対象となるタンパク質（例えば、ペリオスチン）のレベルを検出または測定する方法は当技術分野で既知である。そのような多くの方法は、タンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはmAb）を用いる。そのようなアッセイ法において、抗体そのもの、またはそれに結合する二次抗体を検出可能に標識することができる。または、抗体は、ビオチンに結合させることができ、検出可能に標識したアビジン（ビオチンに結合するタンパク質）を用いてビオチン化抗体の有無を検出することができる。当業者に周知であるこれらのアプローチ（「多層」アッセイ法を含む）の組み合わせを用いて、アッセイ法の感度を増強することができる。これらのアッセイ法のいくつか（例えば、免疫組織学的方法または蛍光フローサイトメトリー）を組織切片または非溶解細胞浮遊液に適用することができる。液体試料中のペリオスチンを検出するための下記の方法はまた、細胞溶解物中のペリオスチンを検出するために用いることができる。
【００５９】
液体試料中のペリオスチンを検出する方法（上記）は基本的に、ペリオスチンを含むことが疑われる試料を本発明の抗体に接触させる段階、および試料の成分に対する抗体の結合を調べる段階を含む。そのようなアッセイ法において、抗体は検出可能に標識する必要はなく、ペリオスチンに結合する第2の抗体を用いないで用いることができる。例えば、表面プラズモン共鳴現象を活用することによって、適当な固相基質に結合したペリオスチンに対して特異的な抗体を試料に曝露する。固相基質上の抗体に対するペリオスチンの結合によって、表面プラズモン共鳴の強度が変化して、これを適当な機器、例えばビアコア装置（ビアコアインターナショナルAB（Biacore International AB）、ラプスガタン、スウェーデン）によって定性的または定量的に検出することができる。
【００６０】
その上、液体試料中のペリオスチンを検出するためのアッセイ法は、例えば（a）検出可能に標識した単一のペリオスチン特異的抗体；（b）非標識ペリオスチン特異的抗体および検出可能に標識した二次抗体；または（c）ビオチン化ペリオスチン特異的抗体と検出可能に標識したアビジン、を用いることを含みうる。さらに、細胞におけるタンパク質の検出に関して先に記述したように、当業者に周知のこれらのアプローチ（「多層」アッセイ法を含む）の組み合わせを用いて、アッセイ法の感度を増強することができる。これらのアッセイ法において、ペリオスチンを含むことが疑われる試料（または少量のアリコート）は、例えば液体試料の少量を「スポッティングする」ことによって、または試料もしくは少量のアリコートを電気泳動で分離し、電気泳動ゲルをブロッティングすることによって、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンのような固相基質上に固定することができる。次に、固相基質上のペリオスチンの存在または量を、ペリオスチン特異的抗体の上記の任意の型、および必要であれば、適当な検出可能に標識した二次抗体またはアビジンを用いてアッセイする。
【００６１】
本発明はまた、「サンドイッチ」アッセイ法を特徴とする。これらのサンドイッチアッセイ法では、上記の方法によって固相基質上に試料を固定する代わりに、試料中に存在する可能性がある任意のペリオスチンを、固相基質を試料に曝露する前に、当技術分野で既知の多様な任意の方法によって第2の（「捕獲」）ペリオスチン特異的抗体（ポリクローナル抗体またはmAb）を固相基質に結合させることによって、固相基質に固定することができる。第2のペリオスチン特異的抗体が結合している固相基質に試料を曝露すると、試料（または少量のアリコート）中の任意のペリオスチンが、固相基質上の第2のペリオスチン特異的抗体に結合するであろう。次に、結合した第2のペリオスチン特異的抗体に結合したペリオスチンの有無または量を、単一のペリオスチン特異的抗体を用いる上記の方法と本質的に同じ方法によって、「検出用の」ペリオスチン特異的抗体を用いることによってアッセイする。これらのサンドイッチアッセイ法において、捕獲抗体は、検出アッセイ法と同じエピトープ（またはポリクローナル抗体の場合にはある範囲のエピトープ）に結合してはならないと理解される。このように、mAbを捕獲抗体として用いる場合、検出抗体は、（a）それに対して捕獲mAbが結合するエピトープとは完全に物理的に離れている、もしくはごく部分的に重なっているに過ぎないエピトープに結合するもう一つのmAb、または（b）それに対して捕獲mAbが結合するエピトープ以外のもしくはそのエピトープの他にエピトープに結合するポリクローナル抗体のいずれかとなりうる。一方、ポリクローナル抗体を捕獲抗体として用いる場合、検出抗体は、（a）それに対して捕獲ポリクローナル抗体が結合する任意のエピトープとは完全に物理的に離れている、もしくは部分的に重なり合うエピトープに結合するmAb、または（b）捕獲ポリクローナル抗体が結合するエピトープ以外のまたはそのエピトープの他にエピトープに結合するポリクローナル抗体、のいずれかとなりうる。捕獲および検出抗体を用いることを含むアッセイ法には、サンドイッチELISAアッセイ法、サンドイッチウェスタンブロットアッセイ法、およびサンドイッチ免疫磁気検出アッセイ法が含まれる。
【００６２】
それに対して捕獲抗体が結合することができる適した固相基質には、マイクロタイタープレートのウェルのプラスチックの底および側面、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンのようなメンブレン、ポリマー（例えば、アガロース、セルロース、またはポリアクリルアミド、これらに限定されない）ビーズまたは粒子が含まれるがこれらに限定されない。そのようなビーズまたは粒子に結合したペリオスチン特異的抗体も同様に、ペリオスチンの免疫アフィニティ精製のために用いることができることに注目される。
【００６３】
検出可能な標識を検出または定量する方法は、標識の特性に依存して、当技術分野において既知である。適当な標識には、放射性核種（例えば、125I、131I、35S、3H、32P、または14C）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、またはフィコエリスリン）、発光部分（例えば、クアンタムドットコーポレーション（Quantum Dot Corporation）、カリフォルニア州パロアルト）によって供給されるQdot（商標）ナノ粒子、規定の波長の光を吸収する化合物、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれるがこれらに限定されない。適当な酵素によって触媒される反応産物は、蛍光、発光、もしくは放射活性物質となりうるがこれらに限定されず、または可視光もしくは紫外光を吸収してもよい。検出器の例には、x線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光計、発光計、および濃度計が含まれるがこれらに限定されない。
【００６４】
乳癌の骨転移を診断するアッセイ法において、例えば、一つまたはそれ以上の骨転移を有することが疑われる乳癌患者の血清中のペリオスチン濃度を対照値と比較する。この対照値は、例えば、骨転移が検出されない乳癌患者の対照群におけるペリオスチン濃度の平均値となりうる。または、患者の血清中のペリオスチンレベルは、乳癌診断後の様々な時期に測定することができる。測定前と比較して特定の時点で血清中に検出されたペリオスチンレベルが増加すれば、患者の乳癌が骨に転移したことを示すであろう。この場合、関連する先の測定値が対照値となるであろう。対照値と比較して患者の血清中のペリオスチン濃度が有意に高ければ、患者の乳癌が骨に転移したことを示すであろう。
【００６５】
子癇前症を診断するアッセイ法において、患者の血清中ペリオスチンレベルを対照値と比較する。対照値は、例えば、血圧が正常な妊娠女性の対照群の血清におけるペリオスチン濃度の平均値となりうる。患者および対照被験者からの血清試料は、ほぼ同じ妊娠段階で得られるはずである。子癇前症の患者の血清中のペリオスチンレベルの有意な増加は、レベルが妊娠期と共に上昇する第1トリメスターもの早期に検出することができる。このように、もう一つの対照値は、妊娠初期段階で対象となる患者における血清中ペリオスチンレベルとなりうるであろう。対照値と比較して患者の血清中のペリオスチンの濃度が有意に高ければ、患者が子癇前症を有することが示されるであろう。
【００６６】
診断アッセイ法に関する上記の説明は、血清に関するアッセイ法について言及したが、アッセイ法はまた、本明細書に記載の他の任意の液体試料について行うことができると理解される。さらに、上記の患者および対照被験者は、ヒト患者である必要はないことに注意すべきである。それらは例えば、ヒト以外の霊長類（例えば、サル）、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、モルモット、ハムスター、ラット、ウサギ、またはマウスとなりうる。
【００６７】
以下の実施例は、本発明を説明するためであって制限することを意味しない。
【００６８】
実施例
実施例1．方法および材料
骨転移の試験における患者
本試験には、ダナ・ファーバー癌研究所においてネオアジュバント化学療法および／または骨髄移植を受けた乳癌患者58人と肺の小細胞癌患者44人が含まれた。
【００６９】
全ての試験について血液試料を採取して、採取後2時間以内に処理した。血清はアッセイするまで-80℃で保存した。
【００７０】
子癇前症の試験における患者
子癇前症の未経産妊娠女性30人を、マギー女性病院（ペンシルバニア州ピッツバーグ）の正常な未経産妊娠女性30人と妊娠期に応じてマッチさせた。マギー女性研究所（ピッツバーグ大学、ペンシルバニア州ピッツバーグ）での院内審査委員会が承認した子癇前症に関する縦断的試験の一部としてインフォームドコンセントを得て、第3トリメスター（妊娠約36週）において血液試料を得た。子癇前症は、血圧が拡張期で15 mmHgまたは収縮期で30 mmHg増加し、タンパク尿（カテーテル挿管尿について300 mg/24時間または1+、または排出尿に関して2+、またはタンパク質クレアチニン比が0.3で高尿酸血症がそれぞれの妊娠期の正常値を＞1SD上回る）を有する初めての満期産妊娠女性において診断された。本試験における患者はいずれも、あいまいな血圧の増加を有さず、すなわち患者は全員収縮期圧が少なくとも140 mmHgを維持して、拡張期圧90 mmHgを維持した。
【００７１】
抗体の産生
発現ベクターCMV-6×His-ペリオスチンは、（a）異種リーダー配列；および（b）エンテロキナーゼ認識配列によってヘキサヒスチジン配列、に結合した成熟ヒトペリオスチンC（下記参照）をコードするcDNA配列を含む。発現ベクターCMV-Fc-ペリオスチンは、（a）異種リーダー配列、および（b）マウス免疫グロブリンγ2a重鎖定常領域（「Fc-ペリオスチン」）[Loら（1998）、Protein Eng. 11：495〜500]、に結合した成熟ヒトペリオスチンCをコードするcDNA配列を含む。発現ベクターはいずれも、NS/0マウス骨髄腫細胞株の電気穿孔によってトランスフェクトして、安定にトランスフェクトした細胞をメソトレキセートによって選択した。CMV-6×His-ペリオスチントランスフェクト細胞株によって産生されたペリオスチン（「His-ペリオスチン」）を、HisBind精製キット（ノバゲン（Novagen）、ウィスコンシン州マジソン）を用いて培養上清から精製した。ヒスチジンタグをエンテロキナーゼ（インビトロジェン（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）によって切断した後、ペリオスチンタンパク質をウサギに注射した。この免疫によって産生されたE17ポリクローナル抗体を、Affi-ゲル10をCMV-6×His-ペリオスチントランスフェクト細胞によって産生したペリオスチンに結合させたAffi-ゲル10カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上でアフィニティ精製した。
【００７２】
同様に、Fc-ペリオスチンは、CMV-Fc-ペリオスチントランスフェクト細胞株の培養上清から、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）によって精製した。Fc-ペリオスチン融合タンパク質をマウスに注射して、標準的な技法を用いて5H8モノクローナル抗体（mAb）を産生した。他のヒトペリオスチン特異的mAb（1B11、2C6、6B1、8H11、8E3、10A3、および7E4）は、同じ方法によって誘導した。mAbsは全てIgGクラスである。5H8および8H11 mAbsはIgG1サブクラスであり、κ軽鎖を有する。精製5H8 IgG抗体は、スルホ-NHS-LS-ビオチン化キット（ピアス（Pierce）、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチン化した。
【００７３】
細胞培養
mAb産生ハイブリドーマおよび悪性中皮腫細胞株、JMN1Bを、10％ウシ胎児血清（ギブコBRL（GibcoBRL）、グランドアイランド、ニューヨーク）を含むDMEM（ギブコBRL）において培養した。
【００７４】
免疫組織化学
ヒト浸潤性乳管癌組織の切片をノバゲン（Novagen）から購入した。パラフィン包埋切片をキシレン中でインキュベートしてパラフィンを除去して、段階的なエタノール水溶液において再度水和した。試料をマイクロウェーブオーブンにおいてクエン酸緩衝液（pH 6.0）中で15分間処置した。内因性のペルオキシダーゼは、0.3％H2O2のメタノール溶液によって阻害して、非特異的タンパク質結合部位を正常ウマ血清によってブロックした。切片の染色は、Vecastain（登録商標）Universal Elite（登録商標）ABCキット（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、カリフォルニア州バーリンガム）を用いて行った。切片を、希釈したアフィニティ精製E17ポリクローナル抗体（実施例2を参照されたい）と共に4℃で一晩インキュベートして、洗浄後、ビオチン化二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。さらに洗浄した後、切片を、アビジンとビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼとの予め形成された高分子複合体からなる試薬と共に室温で30分間インキュベートした。色素反応の基質は3,3-ジアミノベンジジンであった。切片をスライドガラスに載せる前にヘマトキシリンによって対比染色した。陰性対照スライドガラスも同時に処理した；この対照スライドガラスでは、E17ポリクローナル抗体の代わりに「免疫前血清」を用いた。
【００７５】
インサイチューRNAハイブリダイゼーション
上記のヒト浸潤性乳管癌の切片およびヒト肺扁平上皮癌組織の他の切片（いずれもノバゲン（Novagen）から購入した）を、インサイチューRNAハイブリダイゼーションのために用いた。パラフィン包埋切片をキシレン中でインキュベートしてパラフィンを除去して、段階的なエタノール水溶液において再度水和した。インサイチューRNAハイブリダイゼーションは、既に記述されているように実施した[Gunnら（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1)：258〜263]。ヒトペリオスチンCのN末端（ATG開始コドンから開始して）をコードする392bp断片を、ヒトペリオスチンcDNAからBam HIおよびEcoRIを用いて切除して、pBluescript（ストラタジーン（Stratagene）、カリフォルニア州ラホヤ）にクローニングした。[35S]-UTPの存在下で、392bp断片を鋳型として用いてT3およびT7 RNAポリメラーゼによってそれぞれ、センスおよびアンチセンスプローブを作製した。この時点で特徴が示されたペリオスチン変種をコードするcDNAは全て、392bp断片に対応するN末端領域において同一のヌクレオチド配列を有し、このように、断片を鋳型として用いて作製されたプローブは全ての変種mRNA分子を検出するであろう。
【００７６】
ペリオスチン化学発光アッセイ法
患者の血清試料を20 mMトリス-塩酸（pH 8.0）によって2倍希釈して、Sep-Pak（登録商標）QMAカートリッジ（マサチューセッツ州ニューベッドフォード）に適用して、これを0.1 M NaClを含む20 mMトリス-塩酸（pH 8.0）によって洗浄した。次にカートリッジを、0.25 M NaClを含む20 mMトリス-塩酸（pH 8.0）によって溶出した。溶出物を直ちに凍結して凍結乾燥した。アッセイ用に凍結乾燥した試料を標準的な希釈緩衝液（0.1％BSAおよび0.05％ツイーン20を含むトリス緩衝生理食塩液（TBS）、pH 7.4）によって溶解して希釈した（8倍または40倍）。
【００７７】
試料は全て、1試料あたり2本ずつアッセイした。Reacti-Bind（商標）NeutrAvidinコーティングポリスチレン白色プレート（ピアス、イリノイ州ロックフォード）を希釈した緩衝液によって予め3回洗浄した。アビジンを予めコーティングしたプレートにビオチン結合5H8モノクローナル抗体（100 μl/ウェル）を加えて、これを4℃で一晩インキュベートした。いくつかのアッセイ法において、正常なプレート（すなわち、アビジンをコーティングしていないプレート）を用いて、これらのアッセイ法では、ビオチンを結合しない5H8モノクローナル抗体をプレートのウェルの底に直接コーティングした。プレートを希釈緩衝液において1回10分間の洗浄を3回行った。ウェルにおける非特異的タンパク質結合部位は、ウシ血清アルブミン（BSA；3％w/v）を含むPBS（リン酸緩衝生理食塩液）をウェルに加えて、プレートを37℃で2時間インキュベートすることによってブロックした。次に、プレートを希釈緩衝液によって3回洗浄した。希釈した試料または精製ペリオスチン（CMV-6×His-ペリオスチンベクターを用いて産生；上記を参照）（標準物質として様々な濃度で）をウェルに加えて、プレートを37℃で3時間インキュベートした。さらに洗浄した後（上記のように）、アフィニティ精製ポリクローナル抗体E17をウェルに加えて、プレートを37℃で2時間インキュベートした。未結合抗体を洗浄して除去し、ウサギIgGに対して特異的なアルカリホスファターゼ結合アフィニティ精製抗体を全てのウェル（トロピクス（Tropix）、マサチューセッツ州ベッドフォード）に加えた。プレートを37℃で2時間インキュベートした。さらに洗浄した後、アッセイ緩衝液（トロピクス）100 μlを加えて、室温で10分間インキュベートした。アッセイ緩衝液はプレートを上下にして軽くたたくことによって完全に除去した。次に、CSPD（3-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3-2'(5'-クロロ)-トリシクロ[3.3.1.1]デカン]-4-イル)フェニルホスフェート）化学発光基質（トロピクス）を加えた。化学発光の強度はFL 600蛍光マイクロプレートリーダー（バイオテックインストルメンツ（Bio-tek Instruments）、バーモント州ウィヌースキ）を用いて製造元の説明書に従って30分以内に読み取った。
【００７８】
ペリオスチンのRT-PCRアッセイ法
多様なヒト組織から単離したポリA＋RNAから合成したcDNAは、カリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Clontech）社から購入した。PCRは以下のように行った。完全長のペリオスチンDNAを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列は、
2005500059.tif 000002
および
2005500059.tif 000003
であった。PCRは、38サイクル（94℃で30秒、49℃で45秒、72℃で150秒）行った。6 μlの少量を1％アガロースゲル上での電気泳動に供して、アンプリコンをエチジウムブロマイド染色によって可視化した。PCRの特異性は、産物のシークエンシングによって確認した。対照PCRは、上記のようにGAPDH特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。
【００７９】
パリンドロームPCR cDNAディスプレイ
Tri試薬（リードメディカルラボ（Leedo Medical Lab.）、テキサス州ハウストン）を用いて、腫瘍もしくは正常組織（外科標本）、または培養細胞からから総細胞RNAを抽出した。外科標本は、既に記述されているように[Barnardら（1992）、Cancer Res. 52：3067〜3072]、ニューイングランドディーコネス病院外科から得た。ポリA＋mRNAはオリゴdT磁気ビーズ（プロメガ（Promega）、ウィスコンシン州マディソン）を用いて精製した。
【００８０】
組織からのポリA＋mRNA（100 ng）を単一のパリンドロームプライマー
2005500059.tif 000004
（2 mM）およびrTh DNAポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス（Perkin Elmer Cetus））0.5単位によって、MnCl2（1.0 mM）の存在下で70℃で12分間cDNAに逆転写した（全量：5 μl）（3サイクル）。逆転写の後に、逆転写に用いた試験管と同じ試験管（全量、25 μl）において、MgCl2（2.0 mM）および[35S]-dATPの存在下で同じパリンドロームプライマー（0.4 mM）およびrTh DNAポリメラーゼによって、パリンドロームPCR反応（94℃で30秒；40℃で100秒；72℃で35秒）を40サイクル行った。増幅されたパリンドロームPCR産物（35S-標識）をポリアクリルアミドゲル上で分解した。腫瘍および隣接する正常組織に由来するcDNAパターンを直接比較した。
【００８１】
対象となるcDNAバンドを切除して、ゲルから回収した。回収したcDNA断片は、トリスPCR緩衝液の代わりにトリシン緩衝液（10 mMトリシン、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、0.001％ゼラチン、pH 8.4）においてTaq DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー）によって再増幅した。再増幅されたcDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００８２】
統計学的方法
統計分析は、対応のない試料に関するマン・ホイトニーU検定を用いて行った。変数間の比例関係は、単純な直線回帰によって決定した。相関係数は、スペアマン検定を用いる順位相関によって決定した。クラスカル・ウォリスの検定およびフィッシャーのPLSD検定を用いて、平均値の差の有意性を調べた。分析は全て、StatView（商標）ソフトウェアパッケージ（アバカスコンセプツインク（Abacus Concepts Inc.））を用いて行った。差は、p値が0.05未満である場合に有意であると見なされた。
【００８３】
実施例2．ペリオスチンJMN1Bは90 kDa分泌タンパク質である
本発明者らのこれまでの研究から、ペリオスチン転写物が多くの癌組織において検出可能であるが、悪性中皮腫細胞株JMNおよびJMN1Bを除き、調べた如何なる癌細胞株にも検出できないことが示された[Behbehaniら（1982）Hum Pathol. 13(9)：862〜866；Demetriら（1989）Blood、74：940〜946]。JMN1B細胞の条件培地を10倍濃縮して、この濃縮物とJMN1B細胞溶解物の双方をウェスタンブロットによって分析した。ヒトペリオスチンに対して産生されたE17ポリクローナル抗体調製物は、ペリオスチンとβigH3の双方に結合する抗体を含んだ。E17ポリクローナル抗体によるウェスタンブロットは、ペリオスチンとβigH3がいずれも細胞溶解物よりもJMN1B上清において量が多いことを明らかにした。固相基質に結合したペリオスチンによるアフィニティ精製後、βigH3に対するE17ポリクローナル抗体の結合能は消失し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）上での90 kDaのバンドとして移動したペリオスチンとの結合能のみが残された。E17ポリクローナル抗体は、ペリオスチンを免疫沈降しなかったが、5H8 mAbは免疫沈降した。このように、ペリオスチンに関する「サンドイッチ」アッセイ法において、5H8モノクローナル抗体は捕獲のために用い、アフィニティ精製E17ポリクローナル抗体はペリオスチンを検出するために用いた。
【００８４】
JMN1B細胞を、細胞内小胞輸送の阻害剤である1.5 μMモネンシン（シグマ（Sigma Co.）、ミズーリ州セントルイス）によって処置した。モネンシンを細胞培養物に添加した5時間後、ペリオスチンは、ウェスタンブロットによって細胞溶解物では検出されたが、培養培地には検出されなかった。さらに、アフィニティ精製E17抗体は対照細胞のゴルジを染色した。しかし、モネンシン処置によって細胞質染色が斑点状となった。
【００８５】
全体として、上記の知見はペリオスチン（JMN1B細胞によって発現される）が90 kDa分泌型タンパク質であることを示している。
【００８６】
実施例3．乳癌におけるペリオスチンの発現
ペリオスチンタンパク質は、上記のように免疫精製されたE17抗体を用いて免疫組織化学によって検出することができた。浸潤性乳癌細胞において強い染色を認めたが、周辺の正常間質細胞はかすかに染色されたに過ぎなかった。強い染色は同様に、腫瘍の中心領域とは対照的に乳癌の進行辺縁部においても認められた。一方、強い染色は、非浸潤性の正常乳腺組織の切片には検出されなかった。ペリオスチンmRNAは、インサイチューRNAハイブリダイゼーションによって検出できた。ペリオスチン遺伝子の高い発現は、乳癌周辺の間質細胞において認めたが、癌細胞にはほとんど発現を認めなかった。本発明は、如何なる特定の作用機序に限定されないが、腫瘍辺縁部の間質細胞の薄い層がペリオスチンを分泌して、これが腫瘍細胞の表面に結合する可能性があるように思われる。本来、腫瘍細胞は、おそらく腫瘍の辺縁部の間質細胞より低いレベルでペリオスチンを産生する可能性がある。正常な乳腺組織切片にはシグナルを認めなかった。
【００８７】
実施例4．癌患者における骨転移の予測物質としての血清中ペリオスチンレベル
調べた乳癌患者58人の臨床および病理学的特徴を表1に示す。これらには、II期7人、III期15人、およびIV期36人が含まれた。年齢の中央値は44.5歳（31〜63歳）であった。IV期患者36人において、15人（42％）が転移部位1個であると診断され、21人（58％）が2個より多い転移部位を有した。患者40人のサブセット（様々な進行期）において、24人（60％）の腫瘍がエストロゲン受容体陽性であった。患者38人のサブセットにおいて、24人（63％）の腫瘍がプロゲステロン受容体陽性であった。患者40人のサブセットにおいて、29人（72.5％）が閉経前であり、11人（27.5％）が閉経後であった。
【００８８】
（表１）  乳癌患者58人の臨床病理学的データ
2005500059.tif 000005
* 患者58人全員に関する年齢とペリオスチンレベルの相関
NS、有意差なし；ER、エストロゲン受容体；PR、プロゲステロン受容体。
【００８９】
肺小細胞癌患者44人の臨床および病理学的特徴を表2に示す。この群の患者には、III期32例およびIV期12例が含まれた。年齢の中央値は51歳（範囲26〜62歳）であった。IV期患者12人において、5人は転移部位1個を有し、7人は、2個より多い転移部位を有すると診断された（表2）。
【００９０】
（表２）  肺小細胞癌患者44人の臨床病理学的データ
2005500059.tif 000006
* このパラメータに関してモニターした患者全員に関するペリオスチンレベルとの相関
NS、有意差なし；LDH、乳酸デヒドロゲナーゼ；CEA、癌胎児抗原
【００９１】
乳癌患者における血清中ペリオスチンの平均値は以下の通りであった：II期、56.1±14.3 ng/ml；III期、28.0±4.7 ng/ml；およびIV期、85.3±20.5 ng/ml（表1）。正常な健康ボランティア（n＝20）では、平均血清中ペリオスチンレベル38.5±5.8 ng/mlを認めた。これらの群では血清中ペリオスチンレベルに有意差を認めなかった。
【００９２】
確立された予後因子に従って、患者の群をさらに階層化した。血清中ペリオスチンレベルは、骨転移の証拠を有しない患者（55.0±16.6 ng/ml；p＝0.04）と比較して骨転移を有する乳癌患者（89.3±21.8 ng/ml）では上昇した（表1）。しかし、エストロゲンまたはプロゲステロン受容体状態（それぞれ、p＝0.8359および0.9758）、腫瘍進行期（p＝0.1890）、閉経状態（p＝0.4309）、単数対複数の転移部位（p＝0.2546）、リンパ節転移の存在（p＝0.5471）、または原発腫瘍の大きさ（T）の状態（T1-T4）に従う血清中ペリオスチンレベルには有意差を示さなかった。T1肺腫瘍は、その最大の寸法が3.0 cmまたはそれ未満であり、肺または臓側胸膜によって取り囲まれ、気管支鏡で葉気管支に対して近位の浸潤の証拠を認めない。T2肺腫瘍は、その最大寸法が3.0 cmより大きく、臓側胸膜に浸潤しているか、または肺門領域に伸びる肺拡張不全または閉塞性肺炎に関連している任意の大きさの肺腫瘍である。気管支鏡では、証明可能な腫瘍の近位の程度は、葉気管支内または気管竜骨に対して少なくとも2.0 cm遠位でなければならない。任意の関連する肺拡張不全または閉塞性肺炎も肺全体に及んではならない。T3肺腫瘍は、（a）心臓、大血管、気管、食道、もしくは椎体を含まない、胸壁（上肺溝腫瘍を含む）、横隔膜、縦隔胸膜、もしくは心膜に直接伸長する任意の大きさの腫瘍、または（b）気管竜骨を含まない気管竜骨の2 cm内部での主要な気管支における腫瘍、または肺全体の肺拡張不全もしくは閉塞性肺炎に関連した腫瘍である。T4肺腫瘍は、縦隔胸膜の浸潤を認め、肺、大血管、気管、食道、椎体、もしくは気管竜骨に及ぶ、悪性胸膜もしくは心膜浸出液が存在する、または同側の原発腫瘍の肺葉内で孤立性腫瘍結節を有する任意の大きさの腫瘍である。
【００９３】
調べた患者の母集団の大きさは限られていたが、HER-2陽性（n＝4）対HER-2陰性（n＝8）患者（p＝0.3958）におけるペリオスチンレベルに有意差を認めなかった。
【００９４】
肺小細胞癌患者における血清中ペリオスチンレベルの平均値は、III期に関して84.9±13.5 ng/ml、IV期患者に関して55.7±17.0 ng/mlであった（表2）。疾患の進行期のあいだに、または患者と正常対照とのあいだに有意差を認めなかった。しかし、異なるT状態（腫瘍サイズの状態）およびN-状態（リンパ節転移の状態）の患者において血清中ペリオスチンレベルに有意差を認めた。血清中ペリオスチンレベルは、T4患者では（126.5±29.7 ng/ml）、T2（64.9±16.1 ng/ml、p＝0.03）およびT1（36.3±7.5 ng/ml、p＝0.01）と比較して上昇していた。N3状態の患者（108.7±17.3 ng/ml）では血清中ペリオスチンレベルの差は、N2状態の患者（49.7±10.9 ng/ml、p＝0.01）とは有意に異なった。血清中ペリオスチンレベルは、骨転移の証拠を有しない患者（75.6±12.7 ng/ml）と比較して、骨転移を有する肺癌患者（88.6±23.9 ng/ml）において差がなかった。同様に、性別（p＝0.3349）、動作状況（身体活動を行う能力）（PS 0-2）、または転移部位1個対2個またはそれ以上の転移部位（p＝0.4649）のようなパラメータに従う血清中ペリオスチンレベルに有意差を認めなかった。ペリオスチンレベルは、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）または癌胎児抗原（CEA）のいずれのレベルとも相関しなかった。
【００９５】
実施例5．正常ヒト組織におけるペリオスチンmRNAの発現
ペリオスチンmRNAは、ヒト肺、腎臓および胎盤からのRNAにおいてRT-PCRによって検出された。しかし、ヒト心臓、肝臓、脳、および骨格筋からのRNAには検出されなかった。肺、腎臓、および胎盤からのRT-PCR産物のDNA配列は、骨肉腫からクローニングされた産物（OSF-2）とは異なるヒトペリオスチンcDNAの型であることが判明した[Takeshitaら（1993）、Biochem. J. 294：271〜278]。OSF-2をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：1）を図1Aに示し、OSF-2のアミノ酸配列（配列番号：2）を図1Bに示す。OSF-2 cDNAと比較して、胎盤および肺からクローニングしたペリオスチンcDNAは、残基2009〜2179位（171塩基対、アミノ酸57個）および残基2360〜2443位（84塩基対、アミノ酸28個）においてそれぞれ2つの欠失を有した。ペリオスチンのこのスプライス変種（ペリオスチンLと命名）をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：3）を図2Aに示し、ペリオスチンLのアミノ酸配列（配列番号：4）を図2Bに示す。ペリオスチンLの成熟型（すなわち、配列番号：3のヌクレオチド1〜63位を欠損する）をコードするcDNAのヌクレオチド配列を、配列番号：5と呼び、成熟ペリオスチンLのアミノ酸配列を配列番号：6と呼ぶ。配列番号：3のヌクレオチド2220位（および配列番号：5の対応するヌクレオチド）は、T残基よりむしろA残基となりうることに注目される。腎臓からクローニングしたペリオスチンcDNAは、残基2009〜2179位（171塩基対、アミノ酸57個）で欠失一つのみを有する。ペリオスチンのこのスプライス変種（ペリオスチンK）をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：7）を図3Aに示し、ペリオスチンKのアミノ酸配列（配列番号：8）を図3Bに示す。ペリオスチンKの成熟型（すなわち、配列番号：7のヌクレオチド1〜63位を欠損する）をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号：9と呼び、成熟ペリオスチンKのアミノ酸配列を配列番号：10と呼ぶ。配列番号：7のヌクレオチド2304位（および配列番号：9の対応するヌクレオチド）は、T残基よりむしろA残基となりうることに注目される。上記の欠失は全てインフレーム欠失である。胎盤および肺からのペリオスチンクローンは、細胞の細胞外マトリクスとの結合に関与しうるαヘリックス部位（残基2403〜2466位）の一部を欠損した。インサイチューハイブリダイゼーションから、ペリオスチンmRNAが正常な胎盤組織の間質に存在することが判明した。
【００９６】
実施例6．子癇前症の患者における血清中ペリオスチンレベル
子癇前症の女性および正常な妊娠女性の試験母集団の臨床特徴を表3に示す。群のあいだで妊娠前体重、ヘマトクリット、または出産時の胎盤重量に有意差を認めなかった。本試験において用いられる分類基準によって必要とされるように、子癇前症の群と正常な妊娠群とのあいだの有意差は、収縮期圧および拡張期圧の双方について認められた。
【００９７】
年齢の有意差を群のあいだに認めた。子癇前症群では出産時の平均年齢は29.8±1.2歳であったのに対し、正常妊娠群では22.8±0.7歳であった。しかし、いずれの群においても母親のペリオスチンレベルと出産時の年齢とのあいだに有意な相関を認めなかった。子癇前症の女性の乳児（2240.1±183.9 g）と正常な妊娠女性の乳児（3413.3±78.7 g）の出生時体重の平均値には統計学的に有意差を認めた。しかし、母親のペリオスチンレベルと乳児の体重のあいだには有意な相関を認めなかった。
【００９８】
妊娠満期時の血清中ペリオスチン濃度は、子癇前症の患者（311.8±56.3 ng/ml）では、正常な妊娠女性（218.8±37.3 ng/ml）と比較して上昇した。正常な健康な非妊娠ボランティア（n＝20）に関する血清中ペリオスチン濃度の平均値は、これまでに38.5±6.1 ng/mlであることが判明している。第1トリメスターでの妊娠ボランティア（n＝58）のペリオスチン濃度は77.5±13.7 ng/mlであった。このように、満期時の子癇前症の患者および正常妊娠女性における血清中ペリオスチン濃度は、非妊娠（p＝0.0001）および第1トリメスター妊娠被験者（p＝0.01）と比較して上昇していた。初期の妊娠および非妊娠女性における濃度は、統計学的な差はなかった。他の要因も同様に決定した（表3）。血清中のTGF-β1レベルは、子癇前症の患者（8.0±0.3 ng/ml）では、血圧が正常な妊娠女性（7.2±0.3 ng/ml、p＝0.0406）より高かった。しかし、TGF-β1濃度は、ペリオスチン濃度（r＝0.03、p＝0.82）と相関しなかった。血清中のVCAM-1濃度（1.74±0.12 mg/ml対1.28±0.07 mg/ml、p＝0.0018）およびE-セレクチン（50.4±4.3 ng/ml対32.0±3.6 ng/ml、p＝0.0007）は、血圧が正常な妊娠女性と比較して子癇前症の患者では有意に上昇した。それらのレベルも同様に血清中ペリオスチンレベルとは相関しなかった。子癇前症の患者の血清中のインターロイキン6のレベル（0.86±0.17 ng/ml）は、正常な妊娠女性（1.33±0.20 ng/ml）より低かったが、差は選択した有意水準に達しなかった。インターロイキン6濃度とペリオスチン濃度は相関しなかった。
【００９９】
（表３）  子癇前症の患者30人と正常血圧の妊娠女性30人に関する臨床病理学データ
2005500059.tif 000007
【０１００】
実施例7．ヒト結腸癌からのTCG1 cDNAの単離
TCG1 mRNAは、パリンドロームPCR cDNAディスプレイ技術を用いて、ヒト結腸癌において過剰発現されているものとして当初同定された。簡単に説明すると、ヒト結腸癌組織および同じ患者からの隣接する正常結腸組織からの対応のあるmRNA調製物を逆転写して、得られたcDNAをパリンドロームPCRによって増幅した。増幅されたPCR cDNA断片（35S-標識）をポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分離した。腫瘍および正常組織のcDNAパターンは類似であったが、発現された一つのcDNA断片は腫瘍組織において顕著であるが隣接する正常組織では顕著でないと同定された。このcDNA断片をポリアクリルアミドゲルから回収して、cDNAディスプレイに用いたものと同じプライマー（PP12）を用いて再増幅した。再増幅されたcDNA断片をPCR2.1 TAクローニングベクター（インビトロジェン、グロニンゲン、ドイツ）にクローニングした。ヌクレオチド配列分析から、この断片が二本鎖cDNAの双方の5'末端で同じPP12プライマーを有する636bpを含むことが判明した。
【０１０１】
636bp TCG1断片をプローブとしてヒト結腸癌由来cDNAライブラリ（ラムダZAP II）をスクリーニングすることによって、完全長のcDNAを得た。完全長のクローンは、予想分子量85 kDaでアミノ酸771個の配列をコードする2313bpのオープンリーディングフレームを有することが判明した。TCG1をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：11）を図4Aに示し、TCG1のアミノ酸配列（配列番号：12）を図4Bに示す。TCG1 cDNAは、OSF-2 cDNA（配列番号：1）のヌクレオチド2009〜2089位および2349〜2432位を欠損する。さらに、OSF-2 cDNAは、2472〜2477位でA残基6個を有するが、TCG1 cDNAは、対応する小配列においてA残基7個を有する。このように、TCG1タンパク質は、（1）配列番号：2のアミノ酸670〜726番目を欠損して、この小配列の代わりにアルギニン残基を有する（配列番号：1のヌクレオチド2009〜2089位の欠失により）；（2）配列番号：2のアミノ酸783〜810番目を欠損する（配列番号：1のヌクレオチド2349〜2432位の欠失により）；および（3）配列番号：2のアミノ酸残基823〜836番目をアミノ酸配列SSRI（配列番号：18）に置換する（TCG1 cDNA配列における余分のA残基により、フレームシフトおよび未成熟な停止コドンが起こる）。さらに、TCG1コード領域（配列番号：11）の最後のコドンの最初のヌクレオチドは、AではなくてTとなりうる。この場合、TCG1の最後のアミノ酸はIではなくてFである。アミノ酸配列分析により、TCG1がN末端シグナルペプチド（SP）または分泌リーダー配列の後にシステインリッチドメイン（CRD）、内部相同反復4個（それぞれ、長さがアミノ酸約135個）、および疎水性C末端ドメインを含むことが判明した（図5）。ペリオスチン変種によって不均一性が起こるのは疎水性C末端ドメインにおいてである。一つのケモカインBファミリーのモチーフ（C-C）が、アミノ酸残基79〜80番目のシステインリッチドメインにおいて認められた。タンパク質は、アミノ酸残基599〜601番目に予想されるN結合グリコシル化（NDT）部位を1個有する。N末端でのシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインがないことから、これが分泌型タンパク質であることが示唆される。TCG1を発現する細胞の培養培地のウェスタンブロット分析から、これが実際に分泌型タンパク質であることが確認された。成熟TCG1（すなわち、配列番号：11のヌクレオチド1〜63位を欠損する）をコードするcDNAのヌクレオチド配列、配列番号：13と呼び、成熟TCG1を配列番号：14と呼ぶ。
【０１０２】
予想アミノ酸配列に関するデータベース検索により、これが、MEC-3T3骨芽細胞からサブトラクティブスクリーニングによって同定されたマウスOSF-2のヒト相同体のスプライス変種であることが判明した[Takeshitaら（1993）、Biochem. J. 294：271〜278]。ノザンブロット分析から、このタンパク質が骨芽細胞特異的ではないことが判明した。OSF-2と骨芽細胞特異的転写因子OSF2/Cbfa1との混同を避けるために、タンパク質をTCG1と命名した（TGF-αおよびTGF-β調節および癌関連遺伝子1）。詳しい分析により、TCG1が、ヒト肺癌A5409細胞から最初に同定されたTGF-β誘導遺伝子であるβigH3と有意な構造および配列相同性を有することが示された[Skonierら（1992）、DNA Cell Biol. 11：511〜522]。TCG1は、アミノ酸レベルでβigH3と45.2％同一性または82.9％類似性を有する（DNAスターアルゴリズム；ウィスコンシン州マディソン）。しかし、TCG1は、C末端でさらなる親水性ドメインを含む。さらに、βigH3タンパク質はC末端で、TCG1には含まれないRGD配列を含む[Skonierら（1992）、DNA Cell Biol. 11：511〜522]。TCG1とβigH3とのアミノ酸配列が相同であって、構造的に類似であることは、それらの機能が類似であることを示している。しかし、C末端でのアミノ酸配列が多様であることは、2つのタンパク質間の機能的な差を反映する可能性がある。実際に、様々な細胞株におけるTCG1およびβigH3の発現パターンは非常に異なっている。さらに、増殖因子によるそれらの発現の調節が異なる。興味深いことに、TCG1およびβigH3はいずれも、キリギリスおよびショウジョウバエからのファシクリンIと有意な相同性を有する[Bastianiら（1987）、Cell 48：745〜755；Zinnら（1988）、Cell 53：577〜587]。ファシクリンIは、昆虫の胚において神経系発達の際の成長円錘の誘導に関係する外因性の膜糖タンパク質である。
【０１０３】
実施例8．ヒト結腸癌および乳癌におけるTCG1の過剰発現
ヒト原発性結腸腫瘍組織（T）およびその隣接する正常結腸組織（N）から個々に単離した全RNA試料27対を、32P-標識TCG1プローブによるノザンブロット分析によって調べた。マッチした対27組中24組において、TCG1 mRNA発現レベルは、隣接する正常結腸組織より腫瘍組織においてかなり大きかった。発現パターンの詳しい分析から、27例におけるTCG1 mRNAのT/N比（腫瘍／正常比）が3.8〜42の範囲であることが示された。T/N比の平均値は16.5であった。TCG1 mRNAのT/N比と結腸癌の疾患進行期とのあいだの相関の可能性を調べるために、T/N比を疾患の進行期に対してプロットした。データは、TCG1 mRNA発現のより高いT/N比と疾患の後期段階との相関を示さなかった。しかし、再発性の結腸癌5例全てにおいて、T/N比は、平均値より有意に高かった。これらの5例におけるT/N比は、22.4〜42の範囲であった（平均値＝29.6）。この結果は、腫瘍細胞におけるTCG1 mRNAの高レベル発現が腫瘍の再発に関連していることを示唆した。腫瘍再発率が高頻度であることは、通常、関連する癌細胞の腫瘍形成性がより強いことを示している。悪性結腸癌はしばしば肝臓に転移する。これらの転移性結腸腫瘍におけるTCG1 mRNAの発現パターンを調べるために、転移性結腸癌とその隣接する正常肝臓組織からの総RNA試料6対を、TCG1 cDNAプローブによるノザンブロット分析によって調べた。TCG1 mRNAレベルは、6例全てにおいて、隣接する正常肝組織より転移性腫瘍においてかなり大きかった。実際に、TCG1 mRNAは、調べた6例中5例において正常肝組織において検出できなかった。
【０１０４】
実施例9．肺癌患者のパネルの血清中ペリオスチンレベルの増加
肺癌患者116人（肺小細胞癌、肺の非小細胞癌、扁平上皮癌、および大細胞癌）の血清中ペリオスチンレベルを、上記のように化学発光アッセイ法の改変版を用いて測定した。上記のアッセイ法のように、5H8モノクローナル抗体を「捕獲」抗体として用いた。しかし、対照的に8H11モノクローナル抗体（E17ポリクローナル抗体ではなく）を、「検出」抗体として用いた。検出抗体としてE17ポリクローナル抗体を用いて行った乳癌試験において、正常被験者20人の群の血清中ペリオスチンレベルの平均値は38.5±5.8 ng/mlを認めた。一方、肺癌患者に対する試験において検出抗体として8H11モノクローナル抗体を用いると、患者の76％からの血清が、アッセイ緩衝液（血清試料の代わりに）を加えたアッセイウェルについて認められた値と有意差がない化学発光値を生じた。このように、検出抗体として8H11モノクローナル抗体を用いるアッセイ法において測定したように、ペリオスチンの「正常な」血清中レベルは、本質的に0であった。重要なことに、このアッセイ法は、2 ng/mlの血清中ペリオスチンレベルを検出するために十分な感度であった（下記の表4における16番の患者を参照されたい）。
【０１０５】
調べた肺癌患者116人において、28人（24％）の血清中ペリオスチンレベルが有意に増加した。これらの患者28人において検出された血清中ペリオスチンレベルを表4に示す。患者116人中、6人（5％）の血清中ペリオスチンレベルは1,000 ng/mlより大きく、22人（19％）の血清中ペリオスチンレベルは1 ng/ml〜400 ng/mlのあいだであった。特に、1,000 ng/mlより高い血清中ペリオスチンレベルを示した患者は全員初回試験の1年以内に死亡した。対照的に、1 ng/ml〜400 ng/mlの範囲の血清中ペリオスチンレベルを示した患者は、その少なくとも10人を、原稿を書いている前に1年以上調べ、原稿を書いているあいだモニターを継続した。
【０１０６】
（表４）  肺癌患者28人における血清中ペリオスチンレベル
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【０１０７】
これらのデータは、体液（例えば、血液または尿）中のペリオスチンレベルが肺癌の有用なマーカーとなりうること、そして高い血清中ペリオスチンレベル（例えば、1,000 ng/mlを超える）は、肺癌患者の予後が不良であることの指標となることを示している。
【０１０８】
本発明に関して多くの態様を説明してきた。それにもかかわらず、様々な改変を行ってもよく、それらも本発明の趣旨および範囲に入ると理解されるであろう。したがって、本発明は添付の請求の範囲に限って制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】完全長のOSF-2をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：1）を示す。
【図１Ｂ】完全長のOSF-2のアミノ酸配列（配列番号：2）を示す。
【図２Ａ】完全長のペリオスチンLをコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：3）を示す。
【図２Ｂ】完全長のペリオスチンLのアミノ酸配列（配列番号：4）を示す。
【図３Ａ】完全長のペリオスチンKをコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：7）を示す。
【図３Ｂ】完全長のペリオスチンKのアミノ酸配列（配列番号：8）を示す。
【図４Ａ】完全長のペリオスチンC（TCG1）をコードするcDNAのヌクレオチド配列（配列番号：11）を示す。
【図４Ｂ】完全長のペリオスチンC（TCG1）のアミノ酸配列（配列番号：12）を示す。
【図５】N末端リーダー配列、システインリッチドメイン（「CRD」）、4つの内部相同反復配列（「1」、「2」、「3」、および「4」）、ならびにペリオスチン変種のあいだで変化するC末端ドメイン（「可変C末端」）の相対的な位置を示す、ペリオスチンC（TCG1）の略図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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