(57)【要約】コレステロール代謝をアルツハイマー病と関連付ける、新たな遺伝的危険因子としての、LIPA遺伝子中の一塩基多型の予期せぬ同定に基づき、本発明は、アルツハイマー病を診断もしくは予見する方法、または、被験者がアルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因を決定する方法を提供する。その方法は、酵素酸コレステリルエステルヒドロラーゼをコードするLIPA遺伝子における変異の存在または不存在を検出することを含む。更に、本発明は、CH25H遺伝子および／またはLIPA遺伝子ならびにそれらの対応する遺伝子産物を使用することによって、アルツハイマー病を診断する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者においてアルツハイマー病を診断もしくは予見する方法、または被験者のアルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因を決定する方法であって、前記被験者から得られる試料中のＬＩＰＡ遺伝子中の変異の存在または不存在を検出することを含み、前記被験者におけるＬＩＰＡ遺伝子中の変異の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、前記遺伝子中の変異を持たない被験者と比べて、アルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因が高いことを示す、前記方法。
【請求項２】
前記ＬＩＰＡ遺伝子中の変異は、３’−非翻訳領域中の一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs13500）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異は、ＣからＴへのトランジションである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記LIPA遺伝子中の変異は、３’−非翻訳領域中の一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs1131706）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異は、AからTへのトランスバージョンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験者における請求項３の変異および請求項５の変異の両方の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、両変異を持たない被験者と比べて、アルツハイマー病を発症する傾向または素因が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者からの試料中のアポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在を検出することを更に含む、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者中のアポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、アルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因が更に高いことを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験者からの試料中のCYP46遺伝子中の変異の存在を検出することを更に含む、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項１０】
前記CYP46遺伝子中の変異は、エクソン３の151bp 5'位での一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs754203）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異は、CからTへのトランジションである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者におけるCYP46遺伝子中の変異の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、アルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因が更に高いことを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
被験者において神経変性病を診断もしくは予見する方法、または被験者の前記病気を発症する傾向もしくは素因を決定する方法であって、
前記被験者からの試料中の、
(i) CH25H遺伝子および／またはLIPA遺伝子の転写産物、
(ii) CH25H遺伝子および／またはLIPA遺伝子の翻訳産物、
(iii) 前記転写または翻訳産物のフラグメント、または誘導体、または変異体、
からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質のレベルおよび／または活性を決定し；ならびに、既知の病気または健康な状態を表す対照値と前記レベルおよび／または前記活性を比較することにより、前記被験者における前記神経変性病を診断もしくは予見し、または、前記被験者の前記神経変性病を発症する傾向もしくは素因を決定することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記神経変性病は、アルツハイマー病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験者における神経変性病、特にアルツハイマー病を診断もしくは予見するか、または、被験者のそのような病気を発症する傾向もしくは素因を決定するためのキットであって、
(a) (i) CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、(ii) CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、(iii) LIPA遺伝子中の変異の存在もしくは不存在を選択的に検出する試薬、からなる群から選ばれる少なくとも１つの試薬；
ならびに、
(b) (i) 前記被験者からの試料中の、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルおよび／もしくは活性を検出し；ならびに／または、(ii) 前記被験者からの試料におけるLIPA遺伝子中の変異の存在もしくは不存在を検出し；ならびに、(iii) 神経変性病、特にアルツハイマー病を診断もしくは予見し、または、前記被験者のそのような病気を発症する傾向もしくは素因を決定することによって、神経変性病、特にアルツハイマー病を診断もしくは予見し、または、被験者の前記病気を発症する傾向もしくは素因を決定するための説明書、
を含み、
既知の健康な状態を表す対照値と比較して、前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルおよび／もしくは活性が変化したこと、または、前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルおよび／もしくは活性が、既知の病気の状態を表す対照値と類似もしくは同等であること、または、LIPA遺伝子中の変異の存在が、神経変性病、特にアルツハイマー病の診断もしくは予見、または、そのような病気の発症の傾向もしくは素因が高いことを示す、前記キット。
【請求項１６】
前記LIPA遺伝子中の変異は、３’−非翻訳領域中の一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs13500）である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
変異がCからTへのトランジションである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記LIPA遺伝子中の変異は、３’−非翻訳領域中の一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs1131706）である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
前記変異がAからTへのトランスバージョンである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記被験者における請求項１７の変異および請求項１９の変異の両方の存在は、神経変性病、特にアルツハイマー病の診断もしくは予見、または、両変異を持たない被験者と比べて、そのような病気を発症する傾向または素因が高いことを示す、請求項１５に記載のキット。
【請求項２１】
アポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在または不存在を選択的に検出する試薬を更に含む、請求項１５〜２０に記載のキット。
【請求項２２】
アポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在は、神経変性病、特にアルツハイマー病の診断もしくは予見、または、そのような病気の発症の傾向もしくは素因が更に高いことを示す、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
CYP46遺伝子中の変異の存在または不存在を選択的に検出する試薬を更に含む、請求項１５〜２０に記載のキット。
【請求項２４】
前記CYP46遺伝子中の変異は、エクソン３の151bp 5'位での一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs754203）である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記変異はCからTへのトランジションである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記被験者におけるCYP46遺伝子中の変異の存在は、神経変性病、特にアルツハイマー病の診断もしくは予見、または、そのような病気を発症する傾向もしくは素因が更に高いことを示す、請求項２３〜２５に記載のキット。
【請求項２７】
被験者における神経変性病、特にアルツハイマー病を治療または予防する方法であって、前記被験者からの試料中の、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子、または、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の転写産物、または、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質のレベルおよび／または活性に直接的または間接的に影響を及ぼす薬剤（類）を、治療または予防に効果的な量で前記被験者に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
(i) CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子、ならびに／または、(ii) CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii) CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv) (i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質の活性および／またはレベルのモジュレーター。
【請求項２９】
CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物をコードする外来遺伝子配列、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体を含む組み換え型非ヒト動物であって、
(i)前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子標的構成体の提供、ならびに、
(ii)前記標的構成体の非ヒト動物の幹細胞への導入、ならびに、
(iii)前記非ヒト動物幹細胞の非ヒト胚への導入、ならびに、
(iv)前記胚の偽妊娠非ヒト動物への移植、ならびに、
(v)前記胚を所定期間成長させること、ならびに、
(vi)そのゲノムが両対立遺伝子中に前記遺伝子配列の一次変異を含む非ヒト遺伝子組み換え動物の同定、ならびに、
(vii)段階(vi)の非ヒト遺伝子組み換え動物を飼育し、そのゲノムが前記内因性遺伝子の一次変異を含む非ヒト遺伝子組み換え動物を得ること（但し、前記分裂により、神経変性病または関連する病気もしくは機能障害の症状の発症の素因を示す前記非ヒト動物が得られる）、
によって得られ得る、前記動物。
【請求項３０】
神経変性病、特にアルツハイマー病を調査するための動物モデルとしての請求項２９に記載の組み換え型非ヒト動物の使用。
【請求項３１】
(i)Ch25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子、ならびに／または、
(ii)CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の転写産物、ならびに／または、
(iii)CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、
(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体
からなる群から選ばれる１つ以上の物質の、神経変性病、特にアルツハイマー病、または関連する病気もしくは機能障害のモジュレーターをスクリーニングするためのアッセイであって、前記方法は、
(a)細胞を試験化合物と接触させること；
(b)(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
(c)前記試験化合物と接触させない対照細胞中の(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；ならびに、
(d)段階(b)および(c)の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較すること、
を含み、接触させた細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化が、試験化合物が、前記病気または機能障害のモジュレーターであることを示す、前記アッセイ。
【請求項３２】
(i)CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子、ならびに／または、
(ii)CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の転写産物、ならびに／または、
(iii)CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、
(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体
からなる群から選ばれる１つ以上の物質の、神経変性病、特にアルツハイマー病、または関連する病気もしくは機能障害のモジュレーターのためのスクリーニング方法であって、前記方法は、
(a)(i)〜(iv)に列挙した物質に関して、神経変性病または関連する病気もしくは機能障害の症状の発症の素因をあらかじめ与えられるか、または既にそれら症状が発症した試験動物に試験化合物を投与すること；
(b)(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
(c)(i)〜(iv)に列挙した物質に関して、神経変性病または関連する病気もしくは機能障害の症状の発症の素因をあらかじめ与えられるか、または既にそれら症状を発症し、かつ、そのような試験化合物が投与されなかった、対応する対照動物における、(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
(d)段階(b)および(c)の動物中の物質の活性および／またはレベルを比較すること、を含み、試験動物中の物質の活性および／またはレベルの変化が、試験化合物が前記病気または機能障害のモジュレーターであることを示す、前記方法。
【請求項３３】
前記試験動物および／または前記対照動物は、未変性CH25H遺伝子ではない転写制御要素および／またはLIPA遺伝子転写制御要素の制御下で、CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体を発現する組み換え型動物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体とリガンドとの間の結合を阻害するための化合物を試験する、好ましくは複数の化合物をスクリーニングする方法であって、
(i)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体の液体懸濁物を、複数の容器に添加する段階；
(ii)前記結合の阻害をスクリーニングされるべき化合物、好ましくは複数の化合物を、前記複数の容器に添加する段階；
(iii)検出可能なリガンド、特に蛍光によって検出可能なリガンドを、前記容器に添加する段階；
(iv)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体の液体懸濁物、ならびに前記化合物、好ましくは前記複数の化合物、ならびに前記リガンドをインキュベートする段階；
(v)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体に関連する検出可能なリガンドまたは蛍光の量を測定する段階；ならびに、
(vi)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体への前記リガンドの結合の、１つ以上の前記化合物による阻害の程度を決定する段階
を含む、前記方法。
【請求項３５】
化合物を試験して、好ましくは複数の化合物をスクリーニングして、前記化合物（類）とCH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体との結合の程度を決定する方法であって、
(i)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体の液体懸濁物を、複数の容器に添加する段階；
(ii)前記結合をスクリーニングされるべき、検出可能な化合物、好ましくは複数の検出可能な化合物、特に蛍光によって検出可能な化合物を、前記複数の容器に添加する段階；
(iii)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体の液体懸濁物、ならびに前記化合物、好ましくは前記複数の化合物をインキュベートする段階；
(iv)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体に関連する検出可能な化合物または蛍光の量を測定する段階；ならびに、
(v)前記CH25H遺伝子産物および／もしくはLIPA遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体との、１つ以上の前記化合物による結合の程度を決定する段階
を含む、前記方法。
【請求項３６】
CH25H遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性である抗体。
【請求項３７】
LIPA遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性である抗体。
【請求項３８】
被験者からの試料中の細胞の病理的状態の検出のための請求項３６または３７に記載の抗体の使用であって、前記抗体による前記細胞の免疫細胞化学的染色を含み、既知の健康な状態を表す細胞と比較した、前記細胞における染色度の変化または染色パターンの変化が、前記細胞の病理的状態を示す、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者の神経変性病の診断、予見、または発症(develop)の素因の決定方法に関する。更に、神経変性病の治療制御方法および調節剤(modulating agents)のためのスクリーニング方法が提供される。
【０００２】
神経変性病、特にアルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の生命を激しく衰弱させる影響を有する。更に、これらの病気は、非常に大きな健康、社会、および経済的負担を与える。ADは、すべての痴呆のケースの約７０％の割合を占める、最も一般的な神経変性病であり、６５歳以上の人口の約１０％、８５歳以上の４５％までに影響を及ぼす、おそらく最も破壊的な(devastating)年齢に関連する神経変性状態である（近年の報告については、ビッカーズ(Vickers)ら、プログレス・イン・ニューロバイオロジー(Progress in Neurobiology) 2000、60:139-165を参照）。現在、これは、ＵＳ、ヨーロッパ、および日本において、推定１２００万ケースに達する。この状況は、先進国における老人の人口増加（“ベビーブーマーの高齢化”）に伴い、必然的にいっそう悪くなるであろう。アルツハイマー病を患う人々の脳において起こる神経病の特徴は、アミロイド−βタンパク質からなる老人斑、ならびに、異常なフィラメント様構造物の出現および神経原線維のもつれの形成と同時に起こる、深刻な(profound)細胞骨格変化である。ＡＤは、記憶形成における早期欠陥(deficits)に関連し、最終的に、より高い認知機能の完全な衰退を引き起こす、進行性疾患である。アルツハイマー病は、遺伝的に複雑である。ADの発症(development)の危険性は、この機能障害の主な病態生理学的経路に関連する遺伝子の変異によって決定される。この危険性のかなりの部分は、アポリポタンパク質E遺伝子のe4対立遺伝子（APOE*４）の遺伝によるものである。しかし、いくつかの更なる遺伝子および遺伝的相互作用は、ADの発症に対する全体的な遺伝的に決定される感受性（susceptibility）を増大させる。
【０００３】
中枢性の病気に関連する経路(central disease-related pathways)に関するタンパク質をコードする遺伝子は、ADの遺伝学において特に興味深い。海馬および中葉（MTL）中のβ-アミロイドペプチド（Aβ）の過剰生産および凝集は、ADの病因において決定的な段階である。よって、Aβの蓄積を引き起こすメカニズムに関係する遺伝子は、ADの感受性遺伝子の調査における見込みのある候補である。
【０００４】
β-アミロイドペプチド（Aβ）の脳沈着は、ADの病因における決定的な段階である（ハーディ(Hardy) JAら、サイエンス(Science), 256:184-5, 1992）。それは、ニューロン内で神経原線維のもつれの形成を引き起こし得る（ゴーツ(Goetz) Jら、 サイエンス(Science), 293:1491-5, 2001; ルイス(Lewis) Jら、サイエンス(Science), 293:1487-91, 2001）。アミロイドペプチドAβ４２の濃縮物(concentration)は、ADに関する遺伝子座を同定するための代理としての定量的形質(trait)として使用され得る（エルテキン−タナー(Ertekin-Taner) Nら、サイエンス(Science), 290:2303-4, 2000）。よって、Aβ形成およびその分解の制御に関連する遺伝子は、ADに対する感受性遺伝子の候補である。近年の観察は、コレステロールの脳レベルをAPPのエンドプロテオリティックプロセッシング（endoproteolytic processing）の制御およびAβ生成と結びつける（シモンズ(Simons) Mら、ニューロロジー(Neurology), 57:1089-93, 2001; プグリエリ(Puglielli) Lら、ネイチャー・セル・バイオロジー(Nature Cell Biology), 3:905-912, 2001）。コレステロールの減少は、インビトロのAβの生成を阻害し（シモンズ(Simons) Mら、Proc Natl Acad Sci USA, 95:6460-4, 1998）、スタチンとしてのそのようなコレステロール低減薬は、インビトロおよびインビボでAβのレベルを低減する（ファスベンダー(Fassbender) Kら、Proc Natl Acad Sci USA, 98:5856-61, 2001）。更に、臨床的観察は、スタチンが痴呆およびADに対する危険性を低減することを示唆する（ジック(Jick) Hら、Lancet, 356:1627-31, 2000; ウォロジン(Wolozin) Bら、Arch Neurol, 57:1439-43, 2000）。
【０００５】
コレステロール代謝に関連する１つの重要な酵素は、酸コレステリルエステルヒドロラーゼ(acid cholesteryl ester hydrolase)としても知られている、リソソーマル酸リパーゼ（LIPA）である。LIPAをコードするヒト遺伝子は、染色体１０に位置する。より具体的には、LIPA遺伝子は、細胞遺伝学的バンド10q23.2-q23.3に位置する(maps)（アンダーソン(Anderson)ら、ゲノミクス(Genomics), 15:245-247, 1993）。LIPAのジェンバンク（GenBank）受入番号は、NM000235である。
【０００６】
LIPA遺伝子のゲノム機構の調査により、１０個のエクソンの存在が明らかになった（アスラニディス(Aslanidis)ら、ゲノミクス（Genomics）20:329-31, 1994）。主にリソソーマルコンパートメント中で、細胞下に(subcellularly)位置するリソソーマル酸リパーゼは、リポタンパク質粒子のレセプター媒介エンドサイトーシスによって内在化される、コレステリルエステルおよびトリグリセリドの細胞内加水分解において、臨床的作用を発揮する。２つの遺伝的機能障害、重症の早期発症ウォルマン(Wolman)病および軽症の遅発型コレステリルエステル貯蔵病（CESD）、は、LIPA遺伝子の異なる部分における変異によって引き起こされる（アンダーソン(Anderson)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 91:2718-2722, 1994）。上記機能障害の両方とも、リソソーマル酸リパーゼの活性の低減に関連する（アスラニディス（Aslanidis）ら、ゲノミクス（Genomics）, 33:85-93, 1996）。これら慢性肝臓病の両方の特徴的な組織病理学的特徴は、トリグリセリドおよびコレステロールエステルの過剰なリソソーマル貯蔵ならびに副腎石灰化（adrenal calcification）である。しかし、脂質の封入は、肝臓系の細胞に限定されず、中枢および末梢神経系の細胞においても報告されている（バード(Byrd)およびパワード(Powers), Acta Neuropathol, 45:37-42, 1979）。
【０００７】
CH25H遺伝子は、コレステロール代謝のもう１つの重要な酵素である、コレステロール25-ヒドロキシラーゼをコードする。CH25H遺伝子（ジェンバンク(GenBank)受入番号：NM 003956）は、LIPAの遺伝子座にきわめて近接して位置している（即ち、LIPA遺伝子の3’-末端の更に約６０００ｂｐ下流）。コレステロール25-ヒドロキシラーゼは、疎水性基質の水酸化を触媒し、それにより、コレステロールをオキシステロールに転換する（ラッセル(Russell)およびルンド(Lund), WO0023596; ルンド(Lund)ら、J Biol Chem, 273:34316-34327, 1998）。細胞中のオキシステロール、特に25-ヒドロキシコレステロールのレベルは、ステロール応答要素結合タンパク質(SREBP)のタンパク質分解プロセッシングを抑制し、それにより、ステロール合成をネガティブに(negatively)制御する（ラッセル(Russell), Biochim Biophys Acta, 1529:126-135, 2000）。LIPA遺伝子およびCH25H遺伝子は、一緒に非常に近接して配置されているため、両遺伝子は、それらの制御領域に関して重複し得る。従って、LIPAおよびCH25Hは、両遺伝子を含む染色体DNAセグメントに関連して(within the context of)、それらの発現に重要な特定の制御要素も共有し得る。CH25HとLIPAがこのように非常に近接しているため、２つの遺伝子のうちの１つのヌクレオチド配列中の一塩基多型のような変異は、他方の遺伝子または両遺伝子の活性および機能への影響またはインパクトを有し得る。更に、LIPA遺伝子のヌクレオチド配列中の変異とアルツハイマー病との間の観察された関連は、LIPA遺伝子内またはLIPA遺伝子にきわめて近接した、例えばCH25H遺伝子中の異なる座との連鎖不均衡（LD）に起因し得る可能性がある。同様に、CH25H遺伝子のヌクレオチド配列中の変異とアルツハイマー病との間の観察された関連は、CH25H遺伝子内またはCH25H遺伝子にきわめて近接した、例えばLIPA遺伝子中の異なる座との連鎖不均衡（LD）に起因し得る可能性がある。
【０００８】
コレステロール代謝において更に重要な酵素の１つは、コレステロール24-ヒドロキシラーゼである。その酵素は、血液脳関門をすぐに横切る（ルチョハン(Lutjohann) Dら、Proc Natl Acad Sci USA, 93:9799-804, 1996）、24S-ヒドロキシコレステロール（24-OH-Chol）へのコレステロールの転換に触媒作用を及ぼすことにより、脳からのコレステロール除去において重要な役割を果たす（Lund EG, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 96:7238-43, 1999）。よって、水酸化は、脳からのコレステロール除去における、律速段階である（ブジョルケム(Bjorkhem) Iら、J Biol Chem, 272:30178-84, 1997; ibid, J Lipid Res, 39:1594-600, 1998）。コレステロール24-ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、CYP46は、シトクロムP450サブファミリーのメンバーである；それは、染色体14q32.1 に位置する(ジェンバンク(GenBank)受入番号: NM006668; XM007242; AF094480)。ヒトにおいて、CYP46は、主に灰白質において見られるｍRNAによって、脳において顕著に発現される。マウス脳のインサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションは、大脳皮質、海馬、歯状回、および視床のニューロン中に十分な(abundant)ｍRNAを示した。
【０００９】
本発明の目的は、アルツハイマー病を診断または予見する方法を提供することであった。本発明の更なる目的は、この病気の進行をモニターする方法およびそのための治療を評価する方法を提供することであった。この目的は、コレステロール代謝とアルツハイマー病とを関連付ける、新規な遺伝的危険因子としての、LIPA遺伝子中の一塩基多型の同定に基づいていた。本発明の目的は、独立項の特徴による方法およびキットによって解決された。本発明の更に好ましい態様は、そのサブクレームにおいて規定される。
【００１０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される単数形、“a”、“an”、および“the”は、特に断らない限り(unless the context dictates otherwise)、複数形を含む。例えば、“細胞(a cell)”は、複数の細胞も意味する、以下同様。本明細書および特許請求の範囲で使用される、“および／または(and/or)”という語は、この後の前後の語句が、二者択一(alternatives)として、または組み合わせて考えられることを意味する。例えば、“レベルおよび／または活性の決定”という語は、レベルのみ、または活性のみ、またはレベルと活性の両方が決定されることを意味する。ここで使用される“レベル”という語は、転写産物、例えばｍＲＮＡ、または翻訳産物、例えばタンパク質もしくはポリペプチド、の量または濃度の尺度(gage)または指標(measure)を含む意味である。ここで使用される“活性”という語は、転写産物もしくは翻訳産物の生物学的効果をもたらす能力の指標、または、生物学的活性分子のレベルのための指標として理解される。“活性”という語は、酵素活性も意味する。ここで使用される“レベル”および／または“活性”という語は、更に、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性を意味する。遺伝子発現は、遺伝子産物の生成をもたらす転写および翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用として定義され得る。“ディスレギュレーション（Dysregulation）”は、遺伝子発現のアップレギュレーション（upregulation）またはダウンレギュレーション（downregulation）を意味する。遺伝子産物は、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかを含み、かつ、そのような遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかの指標として使用され得る。本明細書および特許請求の範囲で使用される“遺伝子”という語は、コード領域（エクソン）ならびに非コード領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列のような非コード制御要素）の両方を含む。“ＯＲＦ”という語は、“オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）”の頭字語であり、少なくとも１つのリーディングフレーム中に終止コドンを持たないため、アミノ酸の配列に潜在的に翻訳され得る核酸配列を意味する。“制御要素”は、誘発性および非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ならびに遺伝子発現を操作および制御する他の要素を含む。ここで使用される“フラグメント”という語は、例えば、選択的スプライシングされた、または短小化された、または別の方法で切断された(otherwise cleaved)転写産物または翻訳産物を含む意味である。ここで使用される“誘導体”という語は、変異体(mutant)、またはＲＮＡ修正(RNA-edited)、もしくは化学的変性、もしくは別の方法で変更された転写産物、または、変異体、または化学的変性、もしくは別の方法で変更された翻訳産物を意味する。例えば、“誘導体”は、変更されたリン酸化反応、もしくはグリコシル化反応、もしくはアセチル化反応、もしくは脂質付加反応(lipidation)のようなプロセスによって、または、変更されたシグナルペプチド切断、もしくは他の種類の成熟切断によって生成され得る。これらのプロセスは、翻訳後に起こり得る。本発明および特許請求の範囲において使用される“モジュレーター(modulator)”という語は、遺伝子���または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または変更させ得る分子を意味する。好ましくは、“モジュレーター”は、遺伝子の転写産物または翻訳産物の生物学的活性を変化または変更させ得る。前記調節(modulation)は、例えば、酵素活性の増加もしくは減少、結合特性の変化、または前記遺伝子の翻訳産物の生物学的、機能的、もしくは免疫学的性質の何らかの他の変化もしくは変更であり得る。“モジュレーター”、“薬剤(agent)”、“試薬(reagent)”、または“化合物(compound)”は、細胞、組織、体液に、または、何らかの生物学的システム、もしくは試験される何らかのアッセイシステムの関連で(within the context of)、プラスまたはマイナスの生物学的効果を有する、何らかの物質、化学物質、組成物、または抽出物を意味する。それらは、ターゲットのアゴニスト(agonists)、アンタゴニスト(antagonists)、部分アゴニストまたはインバースアゴニストであり得る。そのような薬剤、試薬、または化合物は、核酸、天然もしくは合成ペプチド、またはタンパク質複合体、または融合タンパク質であり得る。それらは、抗体、有機または無機分子または組成物、小型分子、薬剤、および上記の薬剤のいずれかの何らかの組み合わせでもあり得る。それらは、試験のために、診断のために、または治療目的のために使用され得る。“オリゴヌクレオチドプライマー”または“プライマー”という語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって所定のターゲットポリヌクレオチドにアニールすることができ、かつ、ポリメラーゼによって伸長され得る短い核酸配列を意味する。それらは、特定の配列に特異的であるように選択され得るか、または、それらは、無作為に選択され得る。例えば、それらは、混合物中で可能な配列すべてを開始する(prime)。ここで使用されるプライマーの長さは、１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変わり得る。“プローブ”は、ここで記載され、かつ開示される核酸配列の短い核酸配列であるか、または、それらと相補的な配列である。それらは、完全長配列、または、所定の配列のフラグメント、誘導体、イソ型、もしくは変異体を含み得る。“プローブ”とアッセイされる試料との間のハイブリダイゼーション複合体の同定により、その試料内の他の類似配列の存在を検出することができる。ここで使用される、“相同体(homolog)または相同性(homology)”は、当分野において、ヌクレオチドまたはペプチド配列と別のヌクレオチドまたはペプチド配列との関連性を説明するために使用される語であり、前記比較される配列間の同一性および／または類似性の程度によって決定される。ここで使用される“変異体(variant)”という語は、本発明において開示されるポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明の未変性(native)ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端に、ならびに／または、未変性アミノ酸配列内に、１つ以上のアミノ酸が付加ならびに／または置換ならびに／または欠失ならびに／または挿入された、何らかのポリペプチドまたはタンパク質を意味する。更に、“変異体”という語は、何らかの、より短いか、またはより長いタイプのポリペプチドまたはタンパク質を含む。“変異体”は、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％の配列が一致し、より好ましくは少なくとも約９０％の配列が一致し、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列が一致する配列も含む。そのような“変異体”は、例えば、高度にコンサバティブな(conservative)領域に、コンサバティブなアミノ酸置換を有するポリペプチドまたはタンパク質を含む。本発明の“タンパク質およびポリペプチド”は、本発明において開示されるタンパク質またはポリペプチドの変異体、フラグメント、および化学的誘導体を含む。それらは、自然界から単離され得るか、または、組み換えおよび／もしくは合成手段によって生成され得るタンパク質およびポリペプチドを含み得る。未変性タンパク質またはポリペプチドは、自然発生的な短小化されたか、または分泌された型、自然発生的な変異型(例えばスプライスバリアント)、および自然発生的対立遺伝子変異体を意味する。ここで使用される“単離された(isolated)”という語は、それらの自然環境から除去される、即ち、細胞またはその中でそれらが自然発生する生きた有機体(living organism)から単離される分子であって、それらが自然界で会合することが見られる共存する成分から分離されるか、または本質的に単離される分子を意味すると考えられる。この概念は、更に、そのような分子をコードする配列が、それらが自然な状態ではつながれないポリヌクレオチドと、人の手によってつながれ得ること、および、そのような分子が、組み換えおよび／または合成手段によって生成され得ることを意味する。たとえ前記の目的のためであっても、それら配列は、当業者に既知の方法によって、生きているか、または生きていない有機体に導入され得て、かつ、たとえそれら配列が前記有機体の中に依然として存在するとしても、それらは、依然として単離されると考えられる。本発明において、“危険性(risk)”、“感受性(susceptibility)”、および“素因(predisposition) ”という語は同等であり、神経変性病、好ましくはアルツハイマー病の発症の確率について使用される。
【００１１】
“多型(polymorphism)”という語は、１つより多い型の遺伝子または遺伝子の一部の存在を意味する。それは、所定の集団内、かつ通常１％超の頻度での、ゲノム中の所定のヌクレオチド位置における、ヌクレオチド配列中の遺伝的変異を意味する。多型を含む(harboring)領域は、所定の遺伝子領域、遺伝子のコード部もしくは非コード部、または、遺伝子間領域でもあり得て、かつ、“多型領域”と呼ばれる。それらは、ヌクレオチド配列ならびにポリペプチド配列、タンパク質の一次変異(protein modifications)、遺伝子およびタンパク質発現プロセス、およびDNA複製の違いを引き起こし得る。“一塩基多型(single nucleotide polymorphism (SNP))”という語は、ゲノム中の所定の単一のヌクレオチド位置での、ヌクレオチド配列中の多型性変異を意味する。一塩基多型は、欠失、挿入、または塩基交換のような、何らかの単一の塩基変化を含み得る。一塩基多型は、コードされたポリペプチド配列の変化も引き起こし得る。特定のSNPは、病気の状態、特異的な特徴、または病気の発症の危険性を示し得る。“対立遺伝子”または“対立遺伝子変異体”は、特定の表現型をもたらす特別な特徴を典型的に有する遺伝子またはその一部の数種の選択的な型の１つを意味する。“対立遺伝子”という語は、ゲノム中の所定の位置に位置する遺伝子のDNA配列中の何らかの遺伝的変異を含む。個人または被験者は、二倍体有機体(diploid organism)の所定の遺伝子の２つの対立遺伝子が、所定の変異または多型に関して一致している場合に、“同型(homozygous)”である。“ハプロタイプ(haplotype)”という語は、単一のDNA鎖上に位置する多型および単一の染色体上のいくつかの密接に関連した(closely linked)遺伝子座における一連の対立遺伝子を意味する。“連鎖不均衡(linkage disequilibrium)”という語は、密接に関連する遺伝子座において意図的に会合させられ、１ｃM未満の距離で作用する対立遺伝子を意味する。
【００１２】
“AD”という語は、アルツハイマー病を意味する。ここで使用される“AD型神経病理学”は、本発明中に記載されており、かつ、当分野の文献から一般に知られている、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的、および臨床的特徴を意味する（参照：イクバル(Iqbal), スワーブ(Swaab), ウィンブラド(Winblad)およびウィスニウスキー(Wisniewski), アルツハイマー病および関連する機能障害(Alzheimer`s Disease and Related Disorders) (Etiology, Pathogenesis and Therapeutics), ウイリー＆サンズ(Wiley & Sons), ニューヨーク, ワインハイム(Weinheim), トロント(Toronto), 1999; シント(Scinto)およびドラフナー(Daffner), アルツハイマー病の早期診断(Early Diagnosis of Alzheimer`s Disease), フマナプレス(Humana Press), トトワ(Totowa), ニュージャージ, 2000; マイエウックス(Mayeux)およびクリステン(Christen), アルツハイマー病の疫学(Epidemiology of Alzheimer`s Disease): 遺伝子から予防まで(From Gene to Prevention), スプリンガープレス(Springer Press), ベルリン, ハイデルベルグ(Heidelberg), ニューヨーク, 1999; ヨウンキン(Younkin), タンジ(Tanzi)およびクリステン(Christen), プレセニリンおよびアルツハイマー病(Presenilins and Alzheimer`s Disease), スプリンガープレス(Springer Press), ベルリン, ハイデルベルグ(Heidelberg), ニューヨーク, 1998）。
【００１３】
本発明による神経変性性の病気または機能障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、フロント−テンポラル・デメンチア(fronto-temporal dementia)、進行性核麻痺(progressive nuclear palsy)、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆(cerebro-vascular dementia)、多系統萎縮症(multiple system atrophy)、好銀粒痴呆(argyrophilic grain dementia)、および他のタウオパシー(tauopathies)、ならびに、軽度認知障害(mild-cognitive impairment)を含む。神経変性プロセスを含む更なる状態は、例えば、虚血性脳卒中、加齢性黄斑変性症、ナルコレプシー、運動ニューロン疾患、プリオン病、外傷性神経損傷および回復、ならびに多発性硬化症である。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、被験者においてアルツハイマー病を診断もしくは予見する方法、または被験者のアルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因を決定する方法を特徴とする。その方法は、前記被験者から得られた試料中のＬＩＰＡ遺伝子中の変異の存在または不存在を検出することを含み、前記被験者におけるＬＩＰＡ遺伝子中の変異の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、前記遺伝子中の変異を持たない被験者と比べて、アルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因が高いことを示す。LIPA遺伝子は、酸コレステリルエステルヒドロラーゼとも呼ばれる、酵素リソソーマル酸リパーゼをコードする。LIPA遺伝子のジェンバンク(GenBank)受入番号は、NM000235である。ここで使用される“傾向(propensity)”または“素因(predisposition)”という語は、アルツハイマー病の発症に関してほぼ同じ意味で用いられ(used interchangeably)、“感受性”または“危険性”という語と同等である。LIPA遺伝子中の変異は、LIPA遺伝子の自然発生的核酸配列中の何らかの変化(alteration)、即ち、野生型からの何らかの変化と理解され得る。変異は、LIPAの一つのコピーまたは両方のコピー中に存在し得る。換言すれば、被験者は、前記変異に対して異型(heterozygous)または同型(homozygous)であり得る。
【００１５】
好ましい態様において、LIPA遺伝子中の変異は、遺伝子の３’−非翻訳領域中の一塩基多型である（一塩基多型識別番号：rs13500）。更に好ましい態様において、変異はCからTへのトランジション(transition)である。
【００１６】
別の好ましい態様において、LIPA遺伝子中の変異は、遺伝子の３’−非翻訳領域中の一塩基多型である（一塩基多型識別番号：rs1131706）。好ましくは、前記変異は、AからTへのトランスバージョン(transversion)である。
【００１７】
本発明の特に好ましい態様において、両変異、SNP rs13500のT変異体およびSNP rs1131706のT変異体の存在によって、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または被験者における、前記変異を両方とも持たない被験者、即ち、SNP rs13500のC変異体およびSNP rs1131706のＡ変異体を有する被験者と比べた、アルツハイマー病の発症の傾向もしくは素因の増加が示される。
【００１８】
本発明による方法は、アルツハイマー病の発症の危険にさらされている人々の同定のために特に有用であり得る。従って、本発明による方法は、病気の過程で回復不可能なダメージが与えられる前に、病気の発症前の早期予防手段または治療的介入のために、同定された人々を標的にする(targeting)ための手段として役立ち得る。
【００１９】
LIPA遺伝子の多型または変異の存在または不存在の決定は、前記被験者からのDNAの一部のヌクレオチド配列を決定することを含み得る。前記の一部のヌクレオチド配列は、前記多型または変異の存在または不存在を示す。前記多型または変異の存在または不存在を決定するために、前記被験者からのDNAによってポリメラーゼチェーン反応を行うことが、更に好ましいこともある。そのような技術は、当業者に知られている（レウィン(Lewin) B, ジーンズ(Genes) V, オクスフォード・ユニバーシティ・プレス（Oxford University Press）, 1994を参照）。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、その方法は、前記被験者からの試料中のアポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在を検出することを含み、前記被験者におけるLIPA遺伝子中の一方または両方の変異の存在およびアポリポタンパク質E4対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、前記LIPA遺伝子中の変異の一方のみ、もしくは両方、または、アポリポタンパク質E4対立遺伝子を持つか、前記LIPA遺伝子中の変異の一方または両方も、アポリポタンパク質E4対立遺伝子も持たない被験者と比べて、アルツハイマー病の発症の傾向もしくは素因が更に高いことを示す。この態様の方法は、リソソーマル酸リパーゼ（LIPA）ならびに／もしくはコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(CH25H)およびアポリポタンパク質E4をコードする遺伝子間の予期せぬ相乗作用を持つ相互作用の驚くべき発見をもたらす。
【００２１】
本発明の別の好ましい態様において、その方法は、前記被験者からの試料中のCYP46遺伝子中の変異の存在を検出することを更に含み、前記被験者におけるLIPA遺伝子中の変異の一方または両方の存在およびCYP46遺伝子中の変異の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、前記LIPA遺伝子中の変異の一方のみもしくは両方、または前記CYP46中の変異のみを持つか、前記LIPA遺伝子中の変異も前記CYP46遺伝子中の変異も持たない被験者と比べて、アルツハイマー病の発症の傾向もしくは素因が更に高いことを示す。前記CYP46遺伝子中の変異が、エクソン３の151 bp 5`位での一塩基多型（一塩基多型識別番号：rs754203）であることが好ましい。前記変異がCからTへのトランジションであること、およびその変異が前記被験者の両対立遺伝子中に存在すること、即ち、前記変異に関して、被験者が同型であること（即ち、CYP46*TT遺伝子型）が更に好ましい。この態様の方法は、リソソーマル酸リパーゼ（LIPA）ならびに／またはコレステロール25-ヒドロキシラーゼ（CH25H）およびコレステロール24-ヒドロキシラーゼ（CYP46）をコードする遺伝子間の予期せぬ相乗作用を持つ相互作用の驚くべき発見をもたらす。
【００２２】
本発明の好ましい態様において、分析のために被験者から採取された試料は、体液、組織、または、容易に入手可能な何らかの適当な細胞から得られるDNAを含む。好ましくは、試料は血液試料である。但し、試料は、唾液、尿、血清血漿、鼻粘膜、または脳脊髄液のような体液からなることもできる。
【００２３】
更なる態様において、本発明は、被験者において神経変性病を診断もしくは予見する方法、または、被験者の前記病気を発症する傾向もしくは素因を決定する方法であって：前記被験者からの試料中の、LIPA遺伝子の転写産物またはLIPA遺伝子の翻訳産物からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質の、レベルまたは活性または前記レベルと前記活性の両方を決定すること；ならびに、前記物質の少なくとも１つの前記レベルまたは前記活性または前記レベルと前記活性の両方を、既知の病気または健康な状態を表す対照値と比較することにより、前記被験者中の前記神経変性病を診断もしくは予見するか、または前記被験者の前記神経変性病を発症する傾向もしくは素因を決定することを含む、前記方法を特徴とする。CH25H遺伝子とLIPA遺伝子が非常に近接しているので、２つの遺伝子の一方のヌクレオチド配列中の一塩基多型のような変異は、他方の遺伝子または両遺伝子の活性および機能への影響またはインパクトを有し得る。更に、LIPA遺伝子のヌクレオチド配列中の変異とアルツハイマー病との間の観察された関連は、LIPA遺伝子内またはLIPA遺伝子にきわめて近接した、例えばCH25H遺伝子中の異なる座との連鎖不均衡（LD）に起因し得る可能性がある。よって、前記被験者からの試料中のCH25H遺伝子の転写産物またはCH25H遺伝子の翻訳産物からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質のレベル、または活性、または前記レベルと前記活性の両方を更に決定することが望ましいこともある。
【００２４】
本発明は、本発明において開示される、核酸配列またはそれらのフラグメントもしくは変異体に特有のプライマーおよびプローブの構成(construction)および使用に関する。オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光物質、生物発光物質、磁性物質、または放射性物質によって特異的にラベルされ得る。本発明は、更に、前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを適当な組み合わせで使用する、前記核酸配列またはそれらのフラグメントおよび変異体の検出および生成に関する。当業者に周知の方法であるＰＣＲ−分析を前記プライマーの組み合わせによって行い、核酸を含む試料から、前記遺伝子特異的核酸配列を増幅することができる。そのような試料は、健康な被験者または病気の被験者のいずれかから得られ得る。増幅によって特異的核酸生成物が得られるか否か、および、異なる長さのフラグメントが得られるか否かは、神経変性病、特にアルツハイマー病を暗示し得る。よって、本発明は、神経変性病、特にアルツハイマー病に関連し得る、調べられるべき核酸配列を含む所定の試料における遺伝子変異および一塩基多型の検出に有用な、少なくとも１０塩基長から全コード遺伝子配列までの核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この特徴は、好ましくはキットの形式でもあり得る、迅速なＤＮＡに基づく診断テストの開発に有用である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、被験者における神経変性病の進行をモニターする方法であって：前記被験者からの試料中の、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、または、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質のレベルまたは活性または前記レベルと前記活性の両方を決定すること；ならびに、前記物質の少なくとも１つの前記レベルまたは前記活性または前記レベルと前記活性の両方を、既知の病気または健康な状態を表す対照値と比較することにより、前記被験者における前記神経変性病の進行をモニターすることを含む、前記方法を提供する。
【００２６】
更なる態様において、本発明は、神経変性病の治療を評価する方法であって、前記病気を治療される被験者から得られる試料中の、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、または、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質のレベルまたは活性または前記レベルと前記活性の両方を決定すること；ならびに、前記物質の少なくとも１つの前記レベルまたは前記活性または前記レベルと前記活性の両方を既知の病気または健康な状態を表す対照値と比較することにより、前記神経変性病の前記治療を評価することを含む、前記方法を提供する。
【００２７】
ここに記載の(herein claimed)本発明の方法、キット、組み換え型動物、分子、アッセイ、および使用の更に好ましい態様において、前記神経変性性の病気または機能障害は、アルツハイマー病であり、前記被験者は、アルツハイマー病を患う。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、分析されるべき試料は、体液、好ましくは脳脊髄液、唾液、尿、粘液、鼻粘膜、血液もしくは血清プラズマ、または組織、または皮膚線維芽細胞のような細胞から採取される。最も好ましくは、試料は脳脊髄液または血液から採取される。好ましくは、本発明による、神経変性病のための診断、予見、進行のモニターおよび治療の評価方法は、肉体外で(ex corpore)行われ得る。そして、そのような方法は、好ましくは、被験者または患者から除去、回収、または単離された試料、例えば、体液または細胞に関する。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、前記対照値は、前記神経変性病を患っていない被験者からの試料中の、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物またはLIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物のレベル、または活性、または前記レベルと前記活性の両方の値である。
【００３０】
好ましい態様において、前記被験者からの試料細胞、または組織、または体液中の、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、またはLIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性の、既知の健康な状態を表す対照値に対する変化は、神経変性病、特にADの診断、または予見、または病気になる危険性の増加を示す。
【００３１】
LIPA遺伝子および／またはCH25H遺伝子の転写産物のレベルの決定は、被験者からの試料中で、被験者の試料から抽出されたRNAの逆転写によって得られるｃDNAから前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせによる定量的PCR分析を用いて行われ得る。前記遺伝子に特異的なプローブによるノーザンブロットも適用され得る。チップに基づく(chip-based)マイクロアレイ技術によって、転写産物を測定することが更に好ましいこともある。これらの技術は、当業者に知られている（例えば、サンブロック(Sambrook)およびラッセル(Russell), モレキュラークローニング(Molecular Cloning): ラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual), コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press), コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor), ニューヨーク, 2000を参照）。
【００３２】
更に、LIPA遺伝子の翻訳産物（即ち、リソソーマル酸リパーゼ、もしくは酸コレステリルエステルヒドロラーゼ）、および／または、CH25H遺伝子の翻訳産物（即ち、コレステロール25-ヒドロキシラーゼ）のレベルおよび／または活性は、免疫アッセイ、酵素活性アッセイ、および／または結合アッセイを用いて検出され得る。これらのアッセイは、抗ポリペプチド抗体または抗ポリペプチド抗体に結合する二次抗体のいずれかに結合する、酵素的、量子色力学的（chromodynamic）、放射性、磁性、または発光ラベルの使用により、前記翻訳産物と抗ポリペプチド抗体との間の結合の量を測定することができる。また、他の高アフィニティリガンドも使用され得る。使用され得る免疫アッセイは、例えば、ELISA類、ウエスタンブロット、および当業者に知られている他の技術を含む（ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane), アンチボディズ(Antibodies): ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual), コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press), コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor), ニューヨーク, 1999、を参照）。これら検出技術はすべて、マイクロアレイ、タンパク質アレイ、抗体アレイ、エレクトロニックバイオチップ、またはタンパク質チップに基づく技術の形式でも使用され得る。リソソーマル酸リパーゼ酵素活性およびコレステロール25-ヒドロキシラーゼ酵素活性は、インビトロで、細胞に基づくアッセイによって、または、インビボアッセイによって測定され得る。都合のよいことには、コレステロール25-ヒドロキシラーゼ酵素活性は、例えば、ヒドロキシラーゼ活性アッセイを用いて決定され得る。同様に、リソソーマル酸リパーゼ酵素活性は、例えば、コレステリルエステラーゼ活性アッセイを用いて決定され得る。
【００３３】
好ましい態様において、被験者における神経変性病を診断もしくは予見するか、または、被験者がそのような病気を発症する傾向もしくは素因を決定するか、または神経変性病の治療をモニターするか、もしくはその治療を評価する、提供される方法は、前記被験者から採取した一連の試料中のLIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、または、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物のレベル、または活性、または前記レベルと前記活性の両方を所定期間(over a period of time)比較することを更に含む。別の好ましい態様において、前記被験者は、１つ以上の試料収集前に治療を受ける。前記試料中の前記レベル、または前記活性、または前記レベルと前記活性の両方を、前記被験者の前記治療の前後に決定することが、更に好ましい態様である。
【００３４】
別の態様において、本発明は、被験者における神経変性病、特にＡＤを診断もしくは予見するか、または、被験者の神経変性病、特にＡＤを発症する傾向もしくは素因を決定するためのキットであって、
(a) (i) ＬＩＰＡ遺伝子および／もしくはＣＨ２５Ｈ遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬、(ii) ＬＩＰＡ遺伝子および／もしくはＣＨ２５Ｈ遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、(iii) LIPA遺伝子中の変異の存在もしくは不存在を選択的に検出する試薬、からなる群から選ばれる少なくとも１つの試薬；
ならびに、
(b) −前記被験者からの試料中の、ＬＩＰＡ遺伝子および／もしくはＣＨ２５Ｈ遺伝子の前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルもしくは活性もしくは前記レベルと前記活性の両方を検出し；ならびに／または、前記被験者からの試料におけるLIPA遺伝子中の変異の存在もしくは不存在を検出し；ならびに、
−神経変性病、特にＡＤを診断もしくは予見し、または、前記被験者のそのような病気を発症する傾向もしくは素因を決定することによって、
神経変性病、特にＡＤを診断もしくは予見し、または、被験者のそのような病気を発症する傾向もしくは素因を決定するための説明書、
を含み、
既知の健康な状態を表す対照値と比較して、前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルもしくは活性もしくは前記レベルと前記活性の両方が変化したこと；または、前記転写産物および／もしくは前記翻訳産物のレベルもしくは活性もしくは前記レベルと前記活性の両方が、既知の病気の状態を表す対照値と類似もしくは同等であること；または、LIPA遺伝子中の変異の存在が、神経変性病、特にＡＤの診断もしくは予見、または、そのような病気の発症の傾向もしくは素因が高いことを示す、前記キット、を特徴とする。本キットの特別な態様において、両変異、ＳＮＰ rs13500のＴ変異体およびSNP rs1131706のＴ変異体の存在によって、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、前記変異を両方とも持たない被験者、即ち、SNP rs13500のC変異体およびSNP rs1131706のＡ変異体を有する被験者と比べた、被験者におけるアルツハイマー病を発症する傾向もしくは素因の増加が示される。
【００３５】
キットの試薬がＬＩＰＡ遺伝子の３’−非翻訳領域中の変異（一塩基多型識別番号：rs13500）を選択的に検出することが好ましい。変異がＣからＴへのトランジションであることが更に好ましい。
【００３６】
キットの試薬がＬＩＰＡ遺伝子の３’−非翻訳領域中の変異（一塩基多型識別番号：rs1131706）を選択的に検出することが更に好ましい。好ましくは、前記変異はＡからＴへのトランスバージョンである。
【００３７】
別の好ましい態様において、キットは、アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子の存在または不存在を選択的に検出する試薬を更に含む。アポリポタンパク質Ｅ４対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、アルツハイマー病の発症の傾向もしくは素因が更に高いことを示す。この態様は、リソソーマル酸リパーゼおよびアポリポタンパク質Ｅ４をコードする遺伝子間の予期せぬ相乗作用を持つ相互作用をもたらす。
【００３８】
別の好ましい態様において、キットは、ＣＹＰ４６遺伝子中の変異の存在または不存在を選択的に検出する試薬を更に含む。ＣＹＰ４６遺伝子中の変異の存在は、アルツハイマー病の診断もしくは予見、または、アルツハイマー病の発症の傾向もしくは素因が更に高いことを示す。この態様は、リソソーマル酸リパーゼ（ＬＩＰＡ）およびコレステロール24-ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ４６）をコードする遺伝子間の予期せぬ相乗作用を持つ相互作用をもたらす。
【００３９】
本発明によるキットは、神経変性病、特にＡＤの発症の危険にさらされている人々を同定するために特に有用であり得る。従って、本発明によるキットは、病気の過程で回復不可能なダメージが与えられる前に、病気の発症前の早期予防手段または治療的介入のために、同定された人々を標的にするための手段として役立ち得る。更に、好ましい態様において、本発明に特徴的なキットは、被験者における神経変性病、特にＡＤの進行をモニターするために有用である。それは、前記被験者のそのような病気の治療(therapeutic treatment)の成功または失敗のモニターにおいて更に有用である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、被験者における神経変性病、特にアルツハイマー病を治療または予防する方法であって、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、ならびに／または、(ii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメントもしくは誘導体のレベル、または活性、または前記レベルと前記活性の両方に直接的または間接的に影響を及ぼす薬剤(類)を、治療または予防に効果的な量で前記被験者に投与することを含む、前記方法、を特徴とする。前記薬剤は小型分子を含み得るか、または、それは、ペプチド、オリゴペプチドもしくはポリペプチドも含み得る。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体のアミノ酸配列を含み得る。本発明による、神経変性病、特にADを治療または予防するための薬剤は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドからなることもできる。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向に(in sense orientation or in antisense orientation)、LIPA遺伝子および／またはCH25H遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。
【００４１】
好ましい態様において、その方法は、前記薬剤（類）を投与するための、遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術のそれ自体既知の方法の適用を含む。一般に、遺伝子治療は、いくつかのアプローチ：変異(mutated)遺伝子の分子置換、新たな遺伝子の添加による治療に有効な蛋白質の合成、および組み換え発現法または薬剤による内因性細胞遺伝子発現の調節、を含む。遺伝子導入技術は詳細に記載されており（例えば、ベーレ(Behr)、Acc Chem Res 1993、26:274-278およびムリガン(Mulligan)、サイエンス(Science)、1993、260: 926-931を参照）、かつ、細胞内へのDNAの機械的マイクロインジェクションのような直接的な遺伝子導入技術、ならびに、生物学的ベクター（例えば組み換え型ウイルス、特にレトロウイルス）、もしくはモデルリポソームを使用する間接的な技術、または、ポリカチオンとのDNA共沈殿によるトランスフェクションに基づく技術、化学的（溶媒、洗浄剤、ポリマー、酵素）もしくは物理的手段（機械的ショック、浸透圧によるショック、熱的ショック、電気的ショック）による細胞膜振動（cell membrane pertubation）を含む。中枢神経系への出生後の遺伝子導入は、詳細に記載されている(例えば、ウォルフ(Wolff)、Curr Opin Neurobiol 1993、3:743-748を参照)。
【００４２】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療、即ち、所定の重大な(critical)細胞へのアンチセンス核酸またはそれらの誘導体の導入による、不適当に発現されたか、または不完全な遺伝子のダウンレギュレーション(down-regulation)、によって、神経変性病を治療または予防する方法を特徴とする（例えば、ギレスピー(Gillespie)、DN&P 1992、5:389-395；アグローワル(Agrawal)およびアクター(Akhtar)、Trends Biotechnol 1995、13：197-199；クローク(Crooke)、バイオテクノロジー(Biotechnology) 1992、10：882-6を参照）。
【００４３】
ハイブリダイゼーションストラテジーのほかに、病気の情報を運ぶＲＮＡを破壊する、リボザイム、即ち、酵素の役割を果たすＲＮＡ分子の適用も記載されている（例えば、バリナガ(Barinaga)、サイエンス(Science) 1993、262：1512-1514を参照）。好ましい態様において、治療されるべき被験者はヒトであり、かつ、治療に有効なアンチセンス核酸またはそれらの誘導体は、ヒトLIPA遺伝子および／またはCH25H遺伝子に対するものである。被験者の中枢神経系、特に脳の細胞がそのように治療されることが好ましい。細胞浸透(Cell penetration)は、アンチセンス核酸およびそれらの誘導体の担体粒子への結合のような既知のストラテジー、または上記の技術によって行われ得る。目的の(targeted)治療に有効なオリゴデオキシヌクレオチドを投与するためのストラテジーは、当業者に知られている（例えば、ウィクストロム(Wickstrom)、Trends Biotechnol、1992、10： 281-287を参照）。いくつかの場合には、輸送は単なる局所的適用によって行われ得る。更なるアプローチは、アンチセンスＲＮＡの細胞内発現に関する。このストラテジーでは、ターゲット核酸の領域と相補的なＲＮＡの合成のための組み換え型遺伝子によって、エクスビボ(ex vivo)で細胞を形質転換させる。細胞内で発現したアンチセンスＲＮＡの治療的使用は、遺伝子治療と手法的に(procedurally)類似している。ＲＮＡ干渉(RNAi)としてさまざまに知られている、近年開発された、二本鎖ＲＮＡの使用による遺伝子の細胞内発現の制御方法は、核酸治療のための別の効果的なアプローチであり得る（ハノン(Hannon)、ネイチャー(Nature) 2002、418：244-251）。
【００４４】
更に好ましい態様において、その方法は、ドナー細胞を、前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳へ移植することを含み、または、ドナー細胞は、移植片拒絶を最少化または低減するように処理されていることが好ましい。ここで、前記ドナー細胞は、前記薬剤（類）をコードする少なくとも１つのトランス遺伝子の挿入によって遺伝的に変更されている。前記トランス遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれ得る。トランス遺伝子は、トランス遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス的な物理的トランスフェクションによって、特にマイクロインジェクションによって、ドナー細胞内へ挿入され得る。トランス遺伝子の挿入は、エレクトロポレーション、化学的に媒介されたトランスフェクション、特にリン酸カルシウムトランスフェクションまたはリポソーム媒介トランスフェクションによって行うこともできる。
【００４５】
好ましい態様において、神経変性病、特にＡＤの治療および予防のための前記薬剤は、被験者の細胞を前記被験者に導入することを含む工程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与され得る治療に有効なタンパク質である。前記被験者の細胞は、前記治療に有効なタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されていて、インビボで前記被験者において治療に効果的な量の前記治療に有効なタンパク質を発現する。前記ＤＮＡセグメントは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって、インビトロで前記細胞内に挿入され得る。前記薬剤、特に治療に有効なタンパク質は、融合タンパク質の注射または全身投与を含む工程によって前記被験者に更に投与され得る。前記融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインの前記薬剤との融合からなる。
【００４６】
本発明による治療方法は、前述の細胞および遺伝子治療法のいずれかと組み合わせた、治療的クローニング、移植、ならびに、胚幹細胞または胚細胞(embryonic germ cell)および大人の神経幹細胞を用いた幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は、分化全能性または多能性であり得る。それらは、組織特異的でもあり得る。病気の、および／または、ダメージを受けた脳細胞または組織の修復のためのストラテジーは、(i)大人の組織からのドナー細胞の採取を含む。それら細胞の核は、遺伝的材料が取り除かれた未受精卵細胞内へ移植される。胚幹細胞は、体細胞核輸送を受けた細胞の胚盤胞段階から単離される。その後、分化因子の使用により、特殊化した細胞型、好ましくは神経細胞への幹細胞の方向付けられた(directed)発達が引き起こされる（ランザ(Lanza)ら、ネイチャー・メディスン(Nature Medicine) 1999、9：975-977）。または、病気の、および／または、ダメージを受けた脳細胞または組織の修復のためのストラテジーは、 (ii)インビトロ拡大(expansion)およびその後の移植(grafting and transplantation)のための中枢神経系、もしくは骨髄から単離された大人の幹細胞（間葉幹細胞）の精製、または、(iii)直接、内因性神経幹細胞を増殖、移動、および機能的ニューロンへ分化させることを含む(ピーターソン(Peterson) DA、Curr. Opin. Pharmacol. 2002、2：34-42)。大人の脳の胚中心は、ニューロン損傷または機能障害がないので、大人の神経幹細胞は、ダメージを受けたか、または病気の脳組織を修復するための多くの可能性を有する（コルマン(Colman A)、ドラッグ・ディスカバリー・ワールド(Drug Discovery World) 2001、7：66-71）。
【００４７】
好ましい態様において、本発明による治療または予防のための被験者は、ヒト、実験動物、例えば哺乳動物、マウス、ラット、魚、昆虫、蠕虫；家畜または非ヒト霊長類であり得る。実験動物は、神経変性性の機能障害のための動物モデル、例えばＡＤ型神経病理学を有するトランスジェニックマウスおよび／またはノックアウトマウスであり得る。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子をコードする遺伝子、ならびに／または、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質の活性、またはレベル、または前記活性と前記レベルの両方のモジュレーターを特徴とする。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、前記モジュレーター、および好ましくは薬学的担体を含む薬学的組成物を特徴とする。前記担体は、それとともにモジュレーターが投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクル(vehicle)を意味する。
【００５０】
更なる態様において、本発明は、薬学的組成物に使用するための、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、ならびに／または、(ii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質の活性、またはレベル、または前記活性と前記レベルの両方のモジュレーターを特徴とする。
【００５１】
別の態様において、本発明は、神経変性病、特にADを治療または予防するための薬剤の調製のための、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、ならびに／または、(ii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる少なくとも１つの物質の活性、またはレベル、または前記活性と前記レベルの両方のモジュレーターの使用を提供する。
【００５２】
１つの態様において、本発明は、治療または予防に効果的な量の前記薬学的組成物を充填した１つ以上の容器を含むキットも提供する。
【００５３】
更なる態様において、本発明は、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物をコードする外来(non-native)遺伝子配列、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体を含む、組み換え型非ヒト動物を特徴とする。前記組み換え型非ヒト動物の生成は、(i)前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子標的構成体の提供、ならびに、(ii)前記標的構成体の非ヒト動物の幹細胞への導入、ならびに、(iii)前記非ヒト動物幹細胞の非ヒト胚への導入、ならびに、(iv)前記胚の偽妊娠非ヒト動物への移植、ならびに、(v)前記胚を所定期間成長させること(develop to term)、ならびに、(vi)そのゲノムが両対立遺伝子中に前記遺伝子配列の一次変異(modification)を含む非ヒト遺伝子組み換え動物の同定、ならびに、(vii)段階(vi)の非ヒト遺伝子組み換え動物を飼育し、そのゲノムが前記内因性遺伝子の一次変異を含む非ヒト遺伝子組み換え動物を得ること、を含む。前記遺伝子は、異所発現されるか(mis-expressed)、または低発現されるか(under-expressed)、または高発現され(over-expressed)、かつ、前記分裂または変更(alteration)により、神経変性病または関連する病気もしくは機能障害の症状の発症の素因を示す前記非ヒト動物が得られる。そのような動物の生成および構成のためのストラテジーおよび技術は、当業者に知られている（例えば、カペッチ(Capecchi)、サイエンス(Science)、1989、244：1288-1292およびホガン(Hogan)ら、1994、マウス胚の操作(Manipulating the Mouse Embryo)：ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨークを参照）。神経変性病、特にＡＤを調査するための動物モデルとして、そのような組み換え型非ヒト動物を利用することが好ましい。
【００５４】
別の態様において、本発明は、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、ならびに／または、(ii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる１つ以上の物質の、神経変性病、特にアルツハイマー病、または関連する病気および機能障害のモジュレーターのためのスクリーニングのためのアッセイを特徴とする。このスクリーニング方法は、(a)細胞を試験化合物と接触させること、ならびに、(b)(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質のレベル、または活性、またはレベルと活性の両方を測定すること、ならびに、(c)前記試験化合物と接触させない対照細胞における前記物質のレベル、または活性、またはレベルと活性の両方を測定すること、ならびに、(d)段階(b)および(c)の細胞における物質のレベルを比較すること、を含み、接触させた細胞における前記物質のレベルおよび／または活性の変化は、試験化合物が前記病気または機能障害のモジュレーターであることを示す。
【００５５】
１つの態様において、本発明は、(i)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、ならびに／または、(ii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の転写産物、ならびに／または、(iii)LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子の翻訳産物、ならびに／または、(iv)(i)〜(iii)のフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体からなる群から選ばれる１つ以上の物質の、神経変性病、特にアルツハイマー病、または関連する病気および機能障害のモジュレーターのためのスクリーニングアッセイであって、(a)神経変性病または関連する病気もしくは機能障害の症状の発症の素因をあらかじめ与えられるか、または既にそれら症状が発症した試験動物に試験化合物を投与すること、ならびに、(b)(i)〜(iv)に列挙した１つ以上の物質のレベルおよび／または活性を測定すること、ならびに、(c)前記神経変性病または関連する機能障害の症状の発症の素因をあらかじめ同様に与えられるか、または既にそれら症状を発症し、かつ、そのような試験化合物が投与されなかった、対応する(matched)対照動物における前記物質のレベルおよび／または活性を測定すること、ならびに、(d)段階(b)および(c)の動物における物質のレベルおよび／または活性を比較すること、を含むスクリーニングアッセイを特徴とする。ここで、試験動物における物質のレベルおよび／または活性の変化は、試験化合物が前記病気および機能障害のモジュレーターであることを示す。
【００５６】
好ましい態様において、前記試験動物および／または前記対照動物は、未変性LIPA遺伝子および／またはCH25H遺伝子転写制御調節要素ではない転写調節要素の制御下で、LIPA遺伝子および／もしくはCH25H遺伝子、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体を発現する組み換え型非ヒト動物である。
【００５７】
別の態様において、本発明は、(i)上記スクリーニングアッセイの方法によって神経変性病のモジュレーターを同定する段階、および、(ii)モジュレーターを薬学的担体と混合する段階、を含む、薬剤の製造方法を提供する。ただし、前記モジュレーターは、他のタイプのスクリーニングアッセイによっても同定され得る。
【００５８】
別の態様において、本発明は、LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体とリガンドとの間の結合を阻害するための化合物を試験する方法、好ましくは、複数の化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。前記方法は、(i)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体の液体懸濁物を、複数の容器に添加する段階、ならびに、(ii)前記阻害をスクリーニングされるべき化合物、好ましくは複数の化合物を、前記複数の容器に添加する段階、ならびに、(iii)検出可能なリガンド、好ましくは蛍光によって検出可能なリガンドを、前記容器に添加する段階、ならびに、(iv)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体の液体懸濁物、および前記化合物、および前記検出可能なリガンドをインキュベートする段階、ならびに、(v)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体に関連する検出可能なリガンドまたは蛍光の量を測定する段階、ならびに、(vi)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体への前記リガンドの結合の、１つ以上の前記化合物による阻害の程度を決定する段階、を含む。蛍光によって検出可能なラベルの利用の代わりに、いくつかの態様では、当業者に既知の何らかの他の検出可能なラベル、例えば、放射性ラベルを使用し、それによりそれを検出することが好ましいこともある。前記方法は、新規化合物の同定のために、ならびに、LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体とのリガンドの結合を阻害するそれらの能力が改善されたか、さもなければ最適化された化合物の評価のために有用であり得る。１つの更なる態様において、本発明は、(i)上記阻害結合アッセイにより、LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物とリガンドとの間の結合の阻害剤として化合物を同定する段階、および、(ii)その化合物を薬学的担体と混合する段階、を含む、薬剤の製造方法を提供する。ただし、前記化合物は、他のタイプのスクリーニングアッセイによっても同定され得る。
【００５９】
１つの更なる態様において、本発明は、化合物を試験する方法、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするためのアッセイであって、前記化合物（類）とLIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体との結合の程度を決定する方法を特徴とする。前記方法は、(i)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、の液体懸濁物を、複数の容器に添加する段階、ならびに、(ii)前記結合をスクリーニングされるべき、検出可能な化合物、好ましくは複数の検出可能な化合物、特に蛍光によって検出可能な化合物を、前記複数の容器に添加する段階、ならびに、(iii)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体の液体懸濁物、および前記検出可能な化合物、好ましくは前記複数の検出可能な化合物をインキュベートする段階、ならびに、(iv)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体に関連する検出可能な化合物または蛍光の量を測定する段階、ならびに、(v)前記LIPA遺伝子産物および／もしくはCH25H遺伝子産物、またはその前記フラグメント、もしくは誘導体との１つ以上の前記化合物による結合の程度を決定する段階、を含む。このタイプのアッセイでは、蛍光ラベルを使用することが好ましいこともある。但し、何らかの他のタイプの検出可能なラベルも使用され得る。前記方法は、新規化合物の同定のために、ならびに、LIPA遺伝子産物および／またはCH25H遺伝子産物へ結合するそれらの能力が改善されたか、さもなければ最適化された化合物を評価するために有用であり得る。１つの更なる態様において、本発明は、(i)上記の結合アッセイによって、LIPA遺伝子産物および／またはCH25H遺伝子産物への結合剤として化合物を同定する段階、ならびに、(ii)その化合物を薬学的担体と混合する段階、を含む、薬剤の製造方法を提供する。ただし、前記化合物は、他のタイプのスクリーニングアッセイによっても同定され得る。
【００６０】
別の態様において、本発明は、ここに記載のスクリーニングアッセイによるいずれかの方法によって得られ得る薬剤を提供する。１つの更なる態様において、本発明は、ここに記載のスクリーニングアッセイによるいずれかの方法によって得られる薬剤を提供する。
【００６１】
本発明は、神経変性病、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断用ターゲットとしての使用のための、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である蛋白質分子を特徴とする。
【００６２】
本発明は、神経変性病、好ましくはアルツハイマー病を予防または治療、または改善する試薬、化合物、または物質のためのスクリーニングターゲットとしての使用のための、CH25H遺伝子および／もしくはLIPA遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である蛋白質分子を更に特徴とする。
【００６３】
本発明は、LIPA遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性である抗体を特徴とする。更に、本発明は、CH25H遺伝子の翻訳産物、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体である免疫原に対して特異的に免疫反応性である抗体も特徴とする。免疫原は、前記遺伝子の翻訳産物の一部の免疫原性または抗原性エピトープを含み得る。翻訳産物の前記免疫原性または抗原性部は、ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、動物中で抗体応答を誘発し、前記ポリペプチドは、前記抗体と免疫特異的に結合する。抗体の生成方法は、当分野で周知である（ハーロー(Harlow)ら、アンチボディズ(Antibodies)、ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨークを参照）。“抗体”という語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組み換え型、一本鎖抗体、ならびにそのフラグメントのような、当分野で既知のすべての形の抗体を含む。本発明の抗体は、例えば、LIPA遺伝子および／またはCH25H遺伝子の翻訳産物の検出を含む、様々な診断方法および治療法において有用である。
【００６４】
本発明の好ましい態様において、前記抗体は、前記抗体による前記細胞の免疫細胞化学的染色を含む、被験者からの試料中の細胞の病理的状態の検出のために使用され得る。ここで、既知の健康な状態を表す細胞と比較した、前記細胞における染色度の変化または染色パターンの変化は、前記細胞の病理的状態を示す。好ましくは、病理的状態は、神経変性病、特にアルツハイマー病に関する。細胞の免疫細胞化学的染色は、当分野で周知の多くの異なる実験法によって行われ得る。ただし、抗体結合の検出のために、自動化された方法（細胞の染色度の決定、または、細胞の細胞もしくは細胞以下の染色パターン、もしくは、細胞表面上もしくは細胞内の細胞小器官(organelles)および他の細胞以下の構造間のトポロジー分布(topological distribution)の決定が、米国特許６１５０１７３号に記載の方法によって行われる）を適用することが好ましいこともある。
【００６５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図面の説明および実施例から明らかであるが、それらは説明のためだけのものであって、開示の残りを多少なりとも限定するものではない。
【００６６】
表１は、対照被験者およびアルツハイマー病患者におけるSNP rs13500遺伝子型および対立遺伝子分布を示す。
【００６７】
表２は、従変数としてのアルツハイマー病の診断による、無条件の(unconditional)ロジスティック回帰分析（前方および後方）を示す。それは、SNP rs13500遺伝子型とAPOEおよびCYP46遺伝子型との相互作用ならびにアルツハイマー病の危険性も示す（組み合わせた試料）。
【００６８】
表３は、組み合わせた試料中のAD患者と対照被験者との間のCH25Hχ4 ハプロタイプ、CH25H*1 TおよびCH25H*2 A対立遺伝子の異なる分布を示す。HCS：健康な対照被験者；AD：アルツハイマー病患者。
【００６９】
表４は、CH25Hハプロタイプと対立遺伝子との間の内側の(medial)側頭葉中の脳β−アミロイドロード(load)の違いを示す。値は、β−アミロイドロードの無作為に記録されたフェーズ（blindedly scored phase）を表し、メジアン±メジアンの標準誤差で示される。統計学的比較：H-テスト(CH25Hχハプロタイプ), U-テスト (CH25H*1 および CH25H*2 対立遺伝子)。
【００７０】
表５は、６人のAD患者（１．３２から２．６９倍）および３人の健康な同等の年齢の(age-matched)対照の人々（１．２７から１．４７倍）における前頭葉に対する海馬中のCH25H遺伝子発現レベルを示す。
【００７１】
図１は、研究されたゲノム領域の配置図(schematic representation)を示す。それは、ヒトの染色体10p.上のCH25H遺伝子に対して、LIPA遺伝子中のSNP rs13500がきわめて近接していることを示す。SNP情報は、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(National Center for Biotechnology Information) ( HYPERLINK http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)によって確立された、一塩基多型のデータベース(dbSNP)から得た。
【００７２】
図２：遅いブラーク段階における(in late Braak stages)、損傷を受けやすい脳領域中のCH25H mRNA高発現。CH25H mRNAの発現分析は、０〜６の範囲のブラーク段階の１２人の高齢の人々の脳からの下側頭葉(inferior temporal lobe)および前頭葉において行われた。０％の値は、下側頭葉および前頭葉において、CH25H mRNA発現レベルが同じであることを示す。バーは、発現比率の平均±SEMを表す。ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した（Normalization for housekeeping genes）。P=0.016 (スピアマン順位相関(Spearman's rank correlation))。
【００７３】
図３：-6443 bp でのSNP CH25H*1と6627 bp でのSNP CH25H*2との間の連鎖不均衡（CH25Hの開始コドンに対して）。ハプロタイプは、一方または両方のSNPについて同型の人々を含むことによって再構築された。両SNPについて異型の被験者は排除した。
【００７４】
図４：CH25Hの５’UTR中のSNPは、ADと顕著に関連していた；(a)染色体10q上のSNPとADとの対立遺伝子的関連。ｙ軸上の値は、優位性Pの対数に負号をつけたものを表す（対立遺伝子的関連に関するχ2テスト）。水平の実線は、０．０５の優位性レベルを表
し、点線は、すべての分析されたSNPに対するボンフェローニの補正(Bonferroni-correction)後の優位性の値を表す。p-terからの距離は、NCBIマップに従い、x軸にcMで示す；(b)90cMでのCH25H座のファインマッピング(Fine-mapping)。CH25H*1: [T-6443C]、はSNP rs13500に対応する; CH25H*2: [A-6627T]、はSNP rs1131706に対応する; CH25H*3: [C1710T]; CH25H*4: [A1054G]; CH25H*5: [A44G]; CH25H*6: [T503C]; CH25H*7: [A656G]; LIPA*1: はSNP rs1556478に対応する。SNPの位置は、CH25Hの開始コドンに関して算出された。
【００７５】
図５：(a)病気のノンキャリア(non-cariers)と比べて、CH25H(4ハプロタイプの病気のキャリアにおけるラソステロールのCSF濃度は更に高い*P=0.046 (スチューデントt-検定(Student's t-test))；(b) CH25Hχ4キャリアにおける可溶性Aβ42のCSF濃度は低く、CH25Hχ3キャリアにおける濃度は中程度であり、CH25Hχ2キャリアにおける濃度は高い*P=0.002 (アノバ(ANOVA))；病気のCH25Hχ3キャリアと比べて、病気のCH25Hχ4キャリアにおける可溶性Aβ42のCSF濃度は著しく低い*P=0.014 (スチューデントt-検定)。健康なCH25Hχ3 キャリアとCH25Hχ2キャリアとの間の違いは顕著ではなかった。バーは、平均±SEMを表す。AD：AD患者；HCS：健康な対照被験者。
【００７６】
図６は、定量的RT-PCRによるAD脳組織におけるヒトCH25H遺伝子の差次的発現（differential expression）の確認を示す。AD患者（図6a）および健康な同等の年齢の対照の人々（図6b）の前頭葉（F）および海馬（H）から回収されたRNA試料からのRT-PCR産物の定量を、ライトサイクラー(LightCycler)高速熱循環技術によって行った。遺伝子発現レベルの顕著な違いを示さなかった一組の標準遺伝子の組み合わせた平均値に対してデータを標準化した。前記一組の標準遺伝子は、リボソーマルタンパク質S9、トランスフェリンレセプター、GAPDH、サイクロフィリンB、およびベータ−アクチンに対する遺伝子からなるものであった。図は、その蛍光によって測定された、増幅された材料の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の速度論(kinetics)を示す。なお、反応の対数期(exponential phase)中の正常な対照の人の前頭葉と海馬の両方からのCH25H cDNAの増幅速度論は並列する(juxtaposed)のに対し、AD（図6a、矢印）では、対応する曲線の顕著な分離があり、これにより、２つの分析された脳領域におけるCH25H遺伝子の差次的発現が示される。
【００７７】
実施例１
LIPA遺伝子中の一塩基多型（SNP）rs13500がADの危険性の増加に関連し得るかを決定するために、我々は、集団ベースのケースコントロール関連研究（population-based case-control association stud）を行い、遅発型ADの患者と痴呆でない対照被験者との間のSNP rs13500の対立遺伝子および遺伝子型の違いを試験した。
ADの患者および対照被験者の両方において、SNP rs13500の遺伝子型分布は、ハーディ・ワインベルグの平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)の下で予想されるものであった（p ( 0.20）。試料中の遺伝子型分析により、対照被験者と比べて、ADの患者におけるrs13500*C/TまたはT/T遺伝子型の頻度が有意に高いことが明らかになった（それぞれ２６．４％対１５．３％、p = 0.005）（表１）。ADの発症の危険性に対する年齢、rs13500、APOE、 およびCYP46遺伝子型の影響の同時評価のために、前方および後方の無条件なロジスティック回帰分析が行われた（表２）。年齢は、連続型変数として含まれていた（１年間隔）。SNP rs13500、APOEおよびCYP46遺伝子型は、二項のカテゴリー的な変数（binomial categorial variables）であった。試料の分析により、ADの危険性に対して、rs13500、APOEおよびCYP46遺伝子型の影響が有意であることが明らかになった（それぞれp < 0.004; p < 0.0001、およびp = 0.005）。APOE*4-キャリアにおけるADの発症に関する調節されたオッズ比は、２．４３であり、CYP46*T対立遺伝子の同型キャリアに関する対応する値は１．８８であり、rs13500*T対立遺伝子の同型または異型キャリアの両方に関する対応する値は２．２１であった（表２）。
我々は、rs13500遺伝子型とAPOEとの間の、ならびに、rs13500遺伝子型とCYP46との間の顕著な相互作用を観察した（表２）：ロジスティック回帰分析は、単離して調べた場合のこれら遺伝子型のそれぞれよりも、これらの相互作用のADの危険性に対するインパクトが高いと予想した：rs13500およびAPOE*4遺伝子型の相互作用ターム(interaction term)は、２．０６のORに達し、有意性が非常に高かった（95% CI: 1.45-2.92, p=0.000049）。これは、１．８１のORのCYP46*TTおよびrs13500遺伝子型の相互作用タームでも見られた（95% CI: 1.30-2.53, p=0.0005）。
【００７８】
遺伝的関連性研究のための被験者および方法：白人集団の４２２人の参加者において、遺伝的研究を行った。医学的なインタビュー、健康診断、神経心理検査、脳MRIまたはCT、ならびに血液検査に基づいて、NINCDS-ADRDA基準に従って、ADの診断を行った。全患者集団(n=193)の精神状態小試験(Mini-Mental State Examination (MMSE))スコアの平均は、１９．７であり、平均年齢は７３．６歳であり、AD発症の平均年齢は７０．５歳であった。対照グループ(n=229)は、AD患者の配偶者または参加団体の外来患者向け診療所から募集した被験者である、認知機能を有する健康な年配の人々(cognitively healthy elderly individuals)を含んでいた。平均年齢は７３．７歳であり、平均MMSEスコアは２９．０であった。
【００７９】
SNP選択および遺伝子型同定：LIPAおよびCH25Hの多型部位上の情報を、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション( HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html" www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)によって確立された一塩基多型のデータベース(dbSNP)から得た。遺伝子型同定のために、染色体１０上の２１個のSNP類を選択した。これらの２１個の潜在的SNP類の中で、１６個が５０人の参加者の副標本(sub-sample)において多型であることがわかった。一塩基多型rs13500は、LIPAとCH25Hとの間に位置しており、CからTへの塩基置換を予想する。LIPAおよびCH25HのSNP類を、ココリス(Kokoris)らによるマスコード（Masscode）技術によって遺伝子型同定した(Mol. Diagn., 5:329-40, 2000) (www.qiagengenomics.com)。SNP rs754203（CYP46遺伝子のエクソン３の151塩基 5'に位置する）を、ピロシーケンシング(pyrosequencing)法(www.pyrosequencing.com)によってPSQ96システムにおいて遺伝子型同定した。rs754203に対する前方および後方増幅プライマーは、それぞれ、5'-AAT GCA TGC TAC CAA AAG AG-3'および5'-AAT CAT TTG ATT CCC AGG AC-3'であった。後方プライマーを３’末端でビオチン化した。シーケンシングプライマーは、5'-GGC AGA GCC TTG CCC-3'であった。APOE遺伝子型同定は、ヒクソン(Hixson)およびベルニエール(Vernier)(J Lipid Res, 31:545-8, 1990)に従って行われた。
【００８０】
統計学：AD患者と対照との間の遺伝子型および対立遺伝子頻度を、ピアソンのχ2 検定(Pearson's χ2 tests)によって比較した。ADの発
症の危険性に対する年齢、性別、APOE、CYP46およびrs13500遺伝子型の影響の同時評価のために、前方および後方の無条件なロジスティック回帰分析を行った。推定ハプロタイプ頻度(estimated haplotype frequencies (EH))プログラムを使用して、SNP間のLDを試験した。それにより、ハプロタイプ頻度に関する最尤推定値(maximum-likelihood estimates)が計算され、関連性がないこと(H0)および対立遺伝子関連性(H1)が推定され、かつ、対数尤度間で２倍の違いがあるχ2統計値が算出される
（ターウィリンガー(Terwilliger) JDら、ハンドブック・オブ・ヒューマン・ジェネティック・リンケージ(Handbook of Human Genetic Linkage), ボルチモア(Baltimore): ジョーンズホプキンスユニバーシティプレス(The Johns Hopkins University Press), 1994, pp.189-198）。
【００８１】
実施例２
CH25H遺伝子およびLIPA遺伝子を含むゲノム領域中の一塩基多型がADの危険性の増加に関連し得るかを決定するために、我々は、オープンリーディングフレームおよびCH25Hの５’領域の6.8kbを配列決定し、２つの同義の一塩基多型(SNP類)、４つの３’SNP類、および６つの５’SNP類を同定した。ハプロタイプ分析により、6443 bp でのSNP CH25H*1および6627 bp でのSNP CH25H*2から構成される、CH25Hχ2、CH25Hχ3およびCH25Hχ4と呼ばれる３つの共通するハプロタイプが明らかになった（図３）。染色体10qにおける連鎖ピーク(linkage peak)は、複数の感受性遺伝子の組み合わせの効果から得られ得る。従って、我々は、ADと10q23-24上の20cMの幅広い領域内の１８個の関係するかもしれない遺伝子との間の関連性を評価した。SNPと伸長させたハプロタイプの両方を、２つの独立した集団からの３５３人のAD患者および３２５人の関連のない対照被験者において分析した。SNP CH25H*1は、ADとの有意な対立遺伝子関連性を示した(P=0.0001、図4a)。CH25H*1周辺の18kbの大きな領域のファインマッピングおよびその後の推定ハプロタイプ分析により、地中海人集団(P= 0.20)ではなく、スイス人集団(P= 0.007)における、SNP CH25H*1とCH25H*2との間の連鎖不均衡（LD）が明らかになった。スイス集団における、CH25H中の２つの同義のSNP、遺伝子の５’領域における５つのSNP、および隣接するLIPA遺伝子中の３つのSNPの関連性マッピング(Association mapping)により、ADとCH25H*1、CH25H*2、およびCH25H*7との有意な対立遺伝子関連性が明らかになった（図4b）。ハプロタイプCH25Hχは、ADとの関連性の最も高い有意性に達した（P=0.0003）。ADとCH25H*1、CH25H*2およびCH25Hχとの有意な対立遺伝子的およびハプロタイプ的関連性は、組み合わせた試料中でも観察された（それぞれP=0.0001、P=0.034、P= 0.00005）（表３）。地中海人の試料では、CH25H*1およびCH25Hχ (それぞれP=0.012、 P=0.013)について有意な関連性が観察されたが、CH25H*2 (P=0.48)については観察されなかった。APOE4対立遺伝子およびCH25Hχ4ハプロタイプがない人々と比べて、APOE４とCH25Hχ4の両方のキャリアについてのオッズ比(OR)は５．５であった(95% CI: 2.8-10.9)。ORおよび95% CIは、APOE4キャリアについては3.1 (2.1-4.5)、CH25Hχ4については2.7 (1.5-4.8)であった。CH25Hχに加えて、CH25H*1を含む２つの更なるハプロタイプは、有意ではあるがあまり顕著ではないADとの関連性を示した（図4b）。10q上の試験した領域内の１７個の遺伝子は、研究した集団において、ADとの有意な対立遺伝子関連性を示さなかった。
SNP CH25H*2は、ステロイド産生(steroidogenic)因子１(SF-1)に対する機能的結合部位のコア配列（CTTG）内に位置する(クワント(Quandt)ら、Nucleic Acids Res 23:4878-84, 1995; ヒュー(Hu)ら、Mol Endocrinol 15:812-8, 2001)。SF-1は、ステロイドヒドロキシラーゼおよびリポタンパク質レセプターの転写領域中に含まれる(ララ(Lala)ら、ステロイズ(Steroids) 60:10-4, 1995; ロペツ(Lopez)ら、エンドクリノロジー(Endocrinology) 140:3034-44, 1999)。CH25H*2の対立遺伝子Aは、SF-1結合部位を除去することによりSF-1依存性制御領域の活性が正常に機能しなくなるので、および、CH25Hがコレステロール合成の強力な制御物質であるので、我々は、CH25H*2含有ハプロタイプCH25Hχがコレステロール合成の前駆体と関連するかを調べ、CH25Hχ4キャリアの脳脊髄液（CSF）中のコレステロール前駆体ラソステロールの濃度が、ノンキャリア中よりも有意に高いことを見出した（図5a）。これらのデータは、CH25Hの転写制御におけるこのハプロタイプの考えられ得る(possible)生理学的関係と一致する。CH25H(が病態生理学的に関係するか調べるために、我々は、CH25Hハプロタイプが、βアミロイド斑病変に異なった影響を与えるか調べた。５５人の年配の被験者（享年( 60歳）からの脳の定量的神経病理学により、CH25Hχ4とCH25Hχ3の両方が、脳βアミロイド沈着の高スコアと関連するのに対し、CH25Hχ2キャリアにはβアミロイド沈着が存在しないことが示された（P=0.004、表4）。対照的に、ブラークのNFTステージング(Braak's NFT staging) (ブラーク(Braak)およびブラーク(Braak), Acta Neuropathol 82:239-59, 1991)は、ハプロタイプグループ間で類似していた（P=0.7）。脳βアミロイド沈着におけるCH25Hχに関連する違いは、CH25Hχ4キャリア中のAβ42のCSFレベルが低いこと、CH25Hχ3キャリア中のレベルが中程度であること、および、CH25Hχ2キャリア中のレベルが高いことと一致した（図5b、c）。総合的なディファレンシャルディスプレイ(comprehensive differential display)技術(ファンデル・カマー(von der Kammer)ら、Nucleic Acids Res 27:2211-8, 1999)およびリアルタイム定量的PCR分析を使用することによって、我々は、AD患者中の下側頭皮質および海馬のような損傷を受けやすい脳領域においてCH25H遺伝子発現の増加を観察した（図２）。
【００８２】
遺伝的関連性研究のための被験者および方法：遺伝的研究を、２つの独立した集団：スイス人試料（３４２人の参加者）および地中海人集団（ギリシャおよびイタリアからの３３６人の参加者）、において行った。医学的なインタビュー、健康診断、神経心理検査、脳MRIまたはCT、ならびに血液検査に基づいて、NINCDS-ADRDA基準に従って、ADの診断を行った。患者集団(n=353)の精神状態小試験(MMSE)スコアの平均は、２０．７であり、平均年齢は７２．９歳であり、AD発症の平均年齢は６９．５歳であった。患者グループ中で女性の参加者は２１５人（６０．９％）であった。対照グループ(n=325)は、AD患者の配偶者または参加団体の外来患者向け診療所から募集した被験者である、認知機能を有する健康な年配の人々を含んでいた。平均年齢は７１．１歳であり、平均MMSEスコアは２９．０であった。このグループ中の女性の参加者は１７２人（５２．９％）であった。
【００８３】
神経病理学的方法：顕著な神経病理学的異常性がなく、臨床的痴呆評価（CDR）スケールによって測定した、痴呆のサインがない５５人の年配の人々（平均享年：７１．３歳、範囲６０−９１歳、２３人の女性）の脳において、神経病理学的試験を行った（ヒュージズ(Hughes)ら、Br J Psychiatry 140:566-72, 1982）。これらの被験者の中央の側頭葉におけるβアミロイドーシスの進化段階(evolutionary phase)(0-4)を、タル(Thal)ら(J Neuropathol Exp Neurol 59:733-48, 2000; Neurology 58:1791-800, 2002)によって記載されたように決定した。神経原線維のもつれ（NFT）のステージング(0-6)を、ブラーク(Braak)およびブラーク(Braak)（上記）に従って行った。遺伝子型決定のために、標準的なプロトコルに従って、小脳の新鮮な凍結組織試料からDNAを抽出した。
【００８４】
ADの患者からの脳組織解剖：AD患者および同等の年齢の対照被験者からの脳組織を、死後５時間以内に回収し、直ちにドライアイス上で凍結した。診断の病理組織学的確認のために、各組織からの試料片を、パラホルムアルデヒドに固定した。差次的発現分析のための脳領域を同定し、RNA抽出を行うまで、-80℃で保存した。
【００８５】
全ｍRNAの単離：RNeasyキット(キアゲン(Qiagen))を用いて、製造者のプロトコルに従って、死後の脳組織から全RNAを抽出した。アジレント(Agilent) 2100 バイオアナライザー(Bioanalyzer)(アジレントテクノロジーズ(Agilent Technologies))を用いて、DNA LabChipシステムによって、正確なRNA濃度およびRNA品質を決定した。調製したRNAの更なる品質試験、即ち、部分的な分解を除き、DNA汚染を試験するために、特別にデザインしたイントロンGAPDHオリゴヌクレオチドおよび参照の対照としてのゲノムDNAを使用して、製造者のプロトコル（ロシュ(Roche)）に記載のライトサイクラー(LightCycler)技術によって融解曲線を得た。
【００８６】
定量的RT-PCRによる差次的mRNA発現：注意深く選択された死後の脳組織（海馬、前側頭皮質および下側頭皮質）からのRNA群を比較するために、ならびに、CH25Hをコードする遺伝子の差次的発現を分析するために、ライトサイクラー(LightCycler)技術(ロシュ(Roche))を用いるqPCRを使用した。この技術は、ポリメラーゼチェーン反応のための高速熱循環および増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を特徴とし、それにより、エンドポイント読み出し(endpoint readout)よりもむしろ速度論を使用することによって、RT-PCR産物の非常に正確な定量を可能にする。海馬または側頭皮質および前頭皮質からのCH25H cDNAの割合を決定した（相対的な定量）。
【００８７】
第一に、CH25Hをコードする遺伝子に対する特異的プライマー：
5'-GGTCAACATCTGGCTTTCCG -3'
および5'-CACCAGTCTGTGAGTGGACCAA -3'.
によるPCRの効率を決定するために、検量線を作成した。
ライトサイクラー−ファーストスタートDNAマスターSYBRグリーンI ミックス(LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I mix)(ファーストスタート(FastStart) Taq DNAポリメラーゼ、反応バッファー、dTTP の代わりにdUTP を含むdNTPミックス、SYBRグリーン(Green) I色素、および1 mM MgCl2を含む;ロシュ(Roche))、0.5μM プライマー、2μlのcDNA希釈物シリーズ(最終濃度40、20、10、5、1および0.5 ng ヒト全脳cDNA; クロンテック(Clontech)) ならびに、使用するプライマーによって、更に3 mM MgCl2を含む20μl容量中で、PCR増幅（95℃で1秒、56℃で5秒、および72℃で5秒）を行った。融解曲線分析は、目に見えるプライマー二量体なしに、約84.3℃で単一ピークを示した。DNA LabChipシステム(アジレント(Agilent) 2100 バイオアナライザー(Bioanalyzer)、アジレントテクノロジーズ(Agilent Technologies))によって、PCR産物の品質およびサイズを決定した。試料の電気泳動図において、CH25H遺伝子について、予想サイズ70bpの単一ピークが観察された。
同様に、PCRプロトコルを適用して、定量のための対照標準として選択した一組の対照遺伝子のPCR効率を決定した。本発明では、５つのそのような対照遺伝子の平均値を決定した：（１）サイクロフィリンB、MgCl2（3mMの代わりに更に1mMを添加した）以外は特異的プライマー5'-ACTGAAGCACTACGGGCCTG-3'および5'-AGCCGTTGGTGTCTTTGCC-3'を使用。融解曲線分析は、目に見えるプライマー二量体なしに、約87℃において単一ピークを示した。PCR産物のアガロースゲル分析によって、予想サイズ(62bp)の１つの単一バンドが示された。（２）リボソームタンパク質S9（RPS9）、特異的プライマー5'-GGTCAAATTTACCCTGGCCA-3'および5'- TCTCATCAAGCGTCAGCAGTTC-3'を使用（例外：3mMの代わりに更に1mMのMgCl2を添加した）。融解曲線分析は、目に見えるプライマー二量体なしに、約85℃において単一ピークを示した。PCR産物のアガロースゲル分析によって、予想サイズ(62bp)の１つの単一バンドが示された。（３）ベータアクチン、特異的プライマー5'-TGGAACGGTGAAGGTGACA-3'および5'-GGCAAGGGACTTCCTGTAA-3'を使用。融解曲線分析は、目に見えるプライマー二量体なしに、約87℃において単一ピークを示した。PCR産物のアガロースゲル分析によって、予想サイズ(142bp)の１つの単一バンドが示された。（４）GAPDH、特異的プライマー5'-CGTCATGGGTGTGAACCATG-3'および5'-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3'を使用。融解曲線分析は、目に見える二量体なしに、約83℃において単一ピークを示した。PCR産物のアガロースゲル分析によって、予想サイズ(81bp)の１つの単一バンドが示された。（５）トランスフェリンレセプター、TRR、特異的プライマー5'-GTCGCTGGTCAGTTCGTGATT-3'および5'-AGCAGTTGGCTGTTGTACCTCTC-3'を使用。融解曲線分析は、目に見えるプライマー二量体なしに、約83℃において単一ピークを示した。PCR産物のアガロースゲル分析によって、予想サイズ(80bp)の１つの単一バンドが示された。
値の計算のために、まず、CH25Hをコードする遺伝子および５つの対照標準遺伝子について、cDNA濃度の対数を、サイクル数Ctの閾値に対してプロットした。すべての遺伝子について、検量線の傾きおよび切片（即ち直線回帰）を算出した。第二段階において、前頭皮質および海馬からのcDNAを並行に分析し、サイクロフィリンBに対して標準化した。Ct値を測定し、対応する検量線を使用して、全脳cDNAのngに換算した：
【式１】
【００８８】
2005511057.tif 000002
【００８９】
前頭皮質および海馬CH25H cDNAに関する値をサイクロフィリンBに対して標準化し、以下の式によって割合を算出した：
【式２】
【００９０】
2005511057.tif 000003
【００９１】
第三段階において、一組の対照標準遺伝子を並行に分析して、各個人の脳試料について、対照標準遺伝子の発現レベルの前頭皮質に対する海馬の割合の平均値を決定した。段階２および段階３においてサイクロフィリンBを分析し、そして異なる操作における１つの遺伝子から別の遺伝子への割合を一定に保ったので、１つの単一遺伝子のみに対して標準化する代わりに、一組の対照標準遺伝子の平均値に対して、CH25Hに関する値を標準化することができた。全ハウスキーピング遺伝子の平均値からのサイクロフィリンBの偏差で上記に示した割合を割ることによって計算を行った。CH25H遺伝子に関する１つのそのような定量的RT-PCR分析の結果を、図６に示す。
【００９２】
脳脊髄液分析：チューリッヒにおける遺伝的研究の参加者の小集団(subset)において、腰椎穿刺によってCSFを得た。45人のAD患者(平均年齢：70.1歳)および27人の健康な年配の被験者（平均年齢：65.4歳）を含んでいた。CSF Aβ42分析のために、我々は、捕獲(capturing)抗体としてのAβ42のフリーのC末端（ペプチド配列Aβ33-42）に特異的なmAb 21F12、および、ディテクターとしてのAβ42のN末端（ペプチド配列Aβ1-5）に特異的なmAb 3D6によるサンドイッチELISA(INNOTEST βアミロイド1-42、イノジェネティクス(Innogenetics))を使用した。ガスクロマトグラフィーとマススペクトロメトリーを組み合わせることによって、CSFラソステロールを測定した(ゼレトビック(Dzeletovic)ら、Anal Biochem 225:73-80, 1995)。
【００９３】
SNP選択および遺伝子型同定：10q23-24の多型部位上の情報を、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)によって確立された一塩基多型のデータベース(dbSNP)から得た。以下の遺伝子を選択した：PTEN (ホスファターゼおよびテンシンホモログ(Phosphatase and tensin homolog))、ACTA2 (アルファ2アクチン)、TNFRSF6 (腫瘍壊死因子レセプターサブファミリー、メンバー6)、CH25H (コレステロール25-ヒドロキシラーゼ)、LIPA (リパーゼA)、PPP1R3C (タンパク質ホスファターゼ1、制御サブユニット3C)、CYP2C8 (シトクロムP450、サブファミリーIIC (メフェニトイン4-ヒドロキシラーゼ)、ポリペプチド8)、TLL2 (トロイド様(Tolloid-like)2)、SLIT1 (スリットホモログ1)、PGAM1 (ホスホグリセレートムターゼ1)、SFRP5 (分泌された収縮関連(Secreted frizzled-related)タンパク質5)、HPA2 (ヘパラナーゼ(Heparanase) 2)、GOT1 (グルタミック−オキサロアセティックトランスアミナーゼ(Glutamic-oxaloacetic transaminase) 1)、COX15 (COX15ホモログ)、WNT8B (無翅型MMTV 統合部位群)、NEURL (精神誘導型様(Neuralized-like))、SLK (Ste20-関連セリン/スレオニンキナーゼ)およびGSTTLp28 (グルタチオン-S-トランスフェラーゼ様)。ABI PRISM 310ジェネティックアナライザー(Genetic Analyzer)における40個の染色体の二本鎖シーケンシングによって、CH25HのORF、５’および３’領域、におけるSNP同定を行った。SNP遺伝子型同定のために、マスコードシステムを使用した(ココリス(Kokoris)ら、Mol Diagn 5:329-40, 2000)。
【００９４】
統計学：フィッシャーの直接確率検定(Fisher's exact tests)によって、AD患者と対照との間の遺伝子型および対立遺伝子頻度を比較した。ADの発症の危険性に対する年齢、性別、APOEおよびCH25H遺伝子型の影響を同時に評価するために、前方および後方の無条件のロジスティック回帰分析を行った。SNP間のLDおよびADのケースと対照との間のハプロタイプ分布の有意性を試験するために、推定ハプロタイプ頻度プログラムを使用した(ターウィリンガー(Terwilliger)ら、上記)。ウィルコキソン(Wilcoxon)、マン(Mann)およびホットニー(Whitney)によるU検定によって、グループ間のβアミロイドーシスの段階を比較した。CH25H mRNA発現レベルとNFT段階との間の相関の有意性を、スピアマン順位相関係数によって評価した。CSF Aβ42およびラソステロールレベルの比較のために、t-検定を使用した。
【００９５】
【表１】
2005511057.tif 000004
【００９６】
【表２】
2005511057.tif 000005
【００９７】
【表３】
2005511057.tif 000006
【００９８】
【表４】
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【００９９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、研究されたゲノム領域の配置図を示す。
【図２】図２は、遅いブラーク段階における、損傷を受けやすい脳領域中のCH25H mRNA高発現を示す。
【図３】図３は、-6443 bp でのSNP CH25H*1と6627 bp でのSNP CH25H*2との間の連鎖不均衡（CH25Hの開始コドンに対して）を示す。
【図４】図４は、CH25Hの５’UTR中のSNPが、ADと顕著に関連していたことを示す。
【図５】(a)病気のノンキャリアと比べて、CH25Hχ4ハプロタイプの病気のキャリアにおけるラソステロールのCSF濃度は更に高い；(b) CH25Hχ4キャリアにおける可溶性Aβ42のCSF濃度は低く、CH25Hχ3キャリアにおける濃度は中程度であり、CH25Hχ2キャリアにおける濃度は高い；病気のCH25Hχ3キャリアと比べて、病気のCH25Hχ4キャリアにおける可溶性Aβ42のCSF濃度は著しく低い*P=0.014。健康なCH25Hχ3 キャリアとCH25Hχ2キャリアとの間の違いは顕著ではなかった。
【図６】図６は、定量的RT-PCRによるAD脳組織におけるヒトCH25H遺伝子の差次的発現の確認を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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