(57)【要約】  切断可能なリンカー基を介して検出可能なラベルに連結されているヌクレオシド及びヌクレオチドを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有するヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子。
【請求項２】
塩基がプリン又はピリミジンである、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
塩基がデアザプリンである、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
リボース糖部分又はデオキシリボース糖部分を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。
【請求項５】
リボース糖又はデオキシリボース糖が２’酸素原子又は３’酸素原子を介して取り付けられた保護基を含んでいる、請求項４に記載の分子。
【請求項６】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項７】
検出可能なラベルが蛍光団である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項８】
リンカーが酸不安定性若しくは光不安定性であり、又は、ジスルフィド結合を含んでいる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
【請求項９】
切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有しているヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子を核酸分子に組み込むことを含む、核酸分子の標識方法。
【請求項１０】
前記組み込みがターミナルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ又は逆転写酵素によって達成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
塩基がデアザプリンである、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子がリボース糖部分又はデオキシリボース糖部分を有し、当該リボース糖又はデオキシリボース糖が、２’酸素原子又は３’酸素原子を介して取り付けられた保護基を含んでおり、当該保護基は修飾又は除去されて３’ＯＨ基を露出することができる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド三リン酸である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ラベルが蛍光団である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
リンカーが酸不安定性若しくは光不安定性であり、又は、ジスルフィド結合を含んでいる、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能なラベル及び／又は切断可能なリンカーが、第２のヌクレオチド又は第２のヌクレオシドが核酸分子に組み込まれるのを妨げるのに十分な大きさである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、相補的ヌクレオチドの逐次的な組み込みをモニターすることを含み、前記ヌクレオチドはそれぞれ、切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有し、塩基に連結されたラベルの検出及びそれに続くラベルの除去によって組み込まれた各ヌクレオチドが同定される、方法。
【請求項１８】
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
（ａ）  切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有するヌクレオチドであって、ヌクレオチドの各タイプに連結されている検出可能なラベルが、ヌクレオチドの他のタイプに使用されている検出可能なラベルと検出時に区別され得る、ヌクレオチドを用意すること、
（ｂ）  標的一本鎖ポリヌクレオチドの相補体にヌクレオチドを組み込むこと、
（ｃ）  （ｂ）のヌクレオチドのラベルを検出することよって、組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定すること、
（ｄ）  （ｂ）のヌクレオチドのラベルを除去すること、及び
（ｅ）  ステップ（ｂ）〜（ｄ）を任意的に１回以上繰り返すこと、
を含み、それによって標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。
【請求項１９】
次のヌクレオチドを添加する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去して、各ヌクレオチドを逐次的に標的と接触させ、各ヌクレオチドの添加後又は全４つのヌクレオチドの添加後にラベルの検出及び除去を行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
各ヌクレオチドをまとめて同時に標的と接触させ、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
４つのヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物を標的と接触させ、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１の組成物に含まれない２つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程と、を含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
４つのヌクレオチドのうちの１つを含む組成物を標的と接触させ、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１の組成物に含まれない３つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程と、を含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
４つのヌクレオチドのうちの３つを含む第１の組成物を標的と接触させ、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１の組成物に含まれないヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程と、を含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を各ヌクレオチドが有しており、各ヌクレオチドに連結されている検出可能なラベルが、他の３つのヌクレオチドに使用されている検出可能なラベルと検出時に区別され得る、個々のヌクレオチド、及び
（ｂ）そのための包装材料、
を含むキット。
【請求項２５】
さらに酵素及び当該酵素の作用に適した緩衝剤を含む、請求項２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標識ヌクレオチドに関する。特に、本発明は、除去可能なラベルを有するヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列決定法におけるそれらの用途を開示する。
【背景】
【０００２】
分子研究の進歩は、一つには、分子又はそれらの生物学的反応を特徴づけるために使用される技術の改良によって導かれてきた。特に、核酸であるＤＮＡ及びＲＮＡの研究は、配列解析に使用される技術の発達及びハイブリダイゼーション現象の研究による恩恵を受けてきた。
【０００３】
核酸の研究を改良した技術の一例は、固定化核酸の作製アレイの開発である。これらのアレイは、典型的には、固体支持材料上に固定化されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。例えば、Ｆｏｄｏｒ等，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１９−２６，１９９４を参照されたい。この文献には、適切に修飾されたヌクレオチドホスホルアミダイトを取り付けることができるように所定の領域が露出しているほかはマスクで保護されている化学増感ガラス表面を使って、核酸を構築する方法が記載されている。固体支持体上の所定の位置に既知のポリヌクレオチドを「スポッティング」する技術によって、作製アレイを製造することもできる（例えばＳｔｉｍｐｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３，１９９５）。
【０００４】
アレイ技術の更なる展開は、固体支持材料にポリヌクレオチドを取り付けて単一分子アレイ（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙ）を形成させる技術である。このタイプのアレイは国際公開第ＷＯ００／０６７７０号パンフレットに開示されている。これらのアレイの利点は、反応を単一分子レベルでモニターすることができ、１回の反応で多数の単一分子に関する情報を照合できることである。
【０００５】
ＤＮＡアレイを有用なものとするには、分子の配列を決定しなければならない。米国特許第５，３０２，５０９号明細書には、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドの配列を決定する方法が開示されている。この方法は、固定化されたポリヌクレオチドに、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での、異なる蛍光ラベルを持つ３’−がブロックされた塩基Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴの組み込みに依拠している。ポリメラーゼは標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込むが、更なる付加は３’−ブロック基によって妨げられる。次に、組み込まれた塩基のラベルが決定され、ブロック基を化学的切断によって除去して更なる重合が起こりうるようにすることができる。
【０００６】
Ｗｅｌｃｈ等（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５（３）：９５１−９６０，１９９９）は、光不安定性かつ蛍光性の３’−Ｏ−ブロック基で修飾されたヌクレオチド三リン酸の合成について記述している。これらの修飾ヌクレオチドはＤＮＡ配列決定実験における使用が意図されている。しかし、これらのヌクレオチドはポリメラーゼ酵素活性部位にフィットすることができないため、これらのヌクレオチドを既存のポリヌクレオチドに組み込むことは困難であることが判明した。
【０００７】
Ｚｈｕ等（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２８：２０６−２１１，１９９７）も、塩基を介してヌクレオチドに取り付けられた蛍光ラベルの使用を開示している。これらの標識ヌクレオチドは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験での使用が意図されているが、それには蛍光「バーコード」を生成させるために一連の組み込まれた標識ヌクレオチドが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明では、ヌクレオシド分子又はヌクレオチド分子を、塩基に取り付けられた切断可能なリンカー基を介して、検出可能なラベルに連結することにより、その分子を、標識ヌクレオシド又は標識ヌクレオチドを用いる技術、例えば、配列決定反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究、ならびにポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルトランスフェラーゼ又は他のＤＮＡ修飾酵素などの酵素を用いる他の技術に有用なものとする。本発明は、例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライマーラベリング、エンドラベリング（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるもの）、逆転写又は核酸増幅などの、標識ｄＮＴＰを使用する技術には、とりわけ有用である。本発明の分子は、リボース糖又はデオキシリボース糖にラベルが取り付けられる先行技術又は切断不可能なリンカーを介してラベルが取り付けられる先行技術とは、大きく異なっている。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、ヌクレオチド分子、ヌクレオシド分子又はそれらの類似体は、切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有する。
【００１０】
本発明は、切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有するヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子を特徴とする。塩基はプリン又はピリミジンであってよい。塩基はデアザプリンであってよい。この分子はリボース糖部分又はデオキシリボース糖部分を有していてよい。このリボース糖又はデオキシリボース糖は、２’酸素原子又は３’酸素原子を介して取り付けられた保護基を含んでいてよい。この保護基は３’−ＯＨを露出させるために除去することができる。この分子はデオキシリボヌクレオチド三リン酸であってよい。検出可能なラベルは蛍光団であってよい。リンカーは、酸不安定リンカー又は光不安定リンカーであってよく、ジスルフィド結合を含んでいてもよい。
【００１１】
本発明は、核酸分子を標識する方法であって、ヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子を前記核酸分子に組み込むことを含み、前記ヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子が切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を持つ方法も特徴とする。この組み込みステップは、ターミナルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ又は逆転写酵素によって達成することができる。塩基はプリン又はピリミジンであってよい。塩基はデアザプリンであってよい。ヌクレオチド分子又はヌクレオシド分子はリボース糖部分又はデオキシリボース糖部分を有していてよい。このリボース糖又はデオキシリボース糖は、２’酸素原子又は３’酸素原子を介して取り付けられた保護基を含んでいてよい。この保護基は３’−ＯＨ基を露出させるために除去することができる。この分子はデオキシリボヌクレオチド三リン酸であってよい。検出可能なラベルは蛍光団であってよい。リンカーは、酸不安定リンカー又は光不安定リンカーであってよく、ジスルフィド結合を含んでいてもよい。検出可能なラベル及び／又は切断可能なリンカーは、上記核酸分子に第２のヌクレオチド又は第２のヌクレオシドが組み込まれるのを妨げるのに十分な大きさを有してすることができる。
【００１２】
別の態様として、本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、相補的ヌクレオチドの逐次的な組み込みをモニターすることを含み、前記ヌクレオチドはそれぞれ、切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有し、塩基に連結されたラベルの検出及びそれに続くラベルの除去によって組み込まれた各ヌクレオチドが同定される、方法を特徴とする。
【００１３】
本発明は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、（ａ）切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有するヌクレオチドであって、かつ、各タイプのヌクレオチドに連結されている検出可能なラベルが他のタイプのヌクレオチドタイプに使用される検出可能なラベルと検出時に区別され得る、ヌクレオチドを用意すること、（ｂ）標的一本鎖ポリヌクレオチドの相補体にヌクレオチドを組み込むこと、（ｃ）（ｂ）のヌクレオチドのラベルを検出することによって、組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定すること、（ｄ）（ｂ）のヌクレオチドのラベルを除去すること、及び（ｅ）ステップ（ｂ）〜（ｄ）を任意的に１回以上繰り返すこと、を含み、それによって標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法も特徴とする。
【００１４】
本明細書に記載する方法では、次のヌクレオチドを添加する前に組み込まれていないヌクレオチドを除去しながら、各ヌクレオチドを逐次的に標的と接触させることができ、各ヌクレオチドの添加後又は全４つのヌクレオチドの添加後にラベルの検出及び除去を行う。
【００１５】
本方法では、すべてのヌクレオチドを同時に標的と接触させることができる。すなわち、異なるヌクレオチドのすべてを含む組成物を標的と接触させ、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する。
【００１６】
本方法は、４つのヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１組成物に含まれない２つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程と、を含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返してよい。
【００１７】
また、本明細書に記載する方法は、４つのヌクレオチドのうちの１つを含む組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１の組成物に含まれない３つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程と、を含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返してよい。
【００１８】
また、本明細書に記載する方法は、４つのヌクレオチドのうちの３つを含む第１の組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第１の工程と、第１の組成物に含まれないヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させて、ラベルを検出してラベルを除去する前に、組み込まれていないヌクレオチドを除去する第２の工程とを含み、第１の工程及び第２の工程を任意的に１回以上繰り返してよい。
【００１９】
更に別の態様として、本発明は、（ａ）各ヌクレオチドが切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに連結された塩基を有しており、各ヌクレオチドに連結された検出可能なラベルが、他の３つのヌクレオチドに使用される検出可能なラベルと検出時に区別され得る、個々のヌクレオチド、及び（ｂ）そのための包装材料を含むキットも特徴とする。本キットは、更に酵素及びその酵素の作用に適した緩衝剤を含んでいてよい。
【００２０】
本ヌクレオチド／ヌクレオシドは、例えばＤＮＡ合成及びＤＮＡ配列決定プロトコールなど、ＤＮＡに基づく多種多様な方法論での使用に適している。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法は、相補的ヌクレオチドの逐次的な組み込みをモニターすることを含み、ここで、前記ヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して当該ヌクレオチドの塩基部分に連結された検出可能なラベルを含んでおり、組み込みは前記ラベルをモニターすることによって検出され、かつ、更なるヌクレチドの組み込みが起こりうるように前記ラベルは除去される。
（詳細な説明）
【００２２】
本発明は、切断可能なリンカーを介してラベルを取り付けることによって修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドに関し、これにより、標識分子を酵素と相互作用させることになる技術、例えば、配列決定反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究、ならびにポリメラーゼ、逆転写酵素、ターミナルトランスフェラーゼなどの酵素を用いる技術、標識ｄＮＴＰを使用する技術（例えば、ニックトランスレーション、ランダムプライマーラベリング、エンドラベリング（例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるもの）、逆転写、又は核酸増幅）などにおいて当該分子は有用なものとなる。
【００２３】
当技術分野で知られているように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖及び１つ以上のリン酸基からなる。ＲＮＡでは糖はリボースであり、ＤＮＡでは糖がデオキシリボース、すなわちリボース中に存在する水酸基を１つ欠いた糖である。窒素塩基はプリン又はピリミジンの誘導体である。プリンはアデノシン（Ａ）及びグアニジン（Ｇ）であり、ピリミジンはシチジン（Ｃ）及びチミジン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））である。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１又はプリンのＮ−９に結合している。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、エステル化は糖のＣ−５に結合している水酸基で起こる。ヌクレオチドは通常、一リン酸、二リン酸又は三リン酸である。
【００２４】
「ヌクレオシド」は構造上ヌクレオチドに似ているが、リン酸部分が存在しない。ヌクレオシド類似体の一例として、ラベルが塩基に連結されており、リン酸基が糖分子に結合していないものが挙げられる。
【００２５】
通常は塩基をプリン又はピリミジンと呼ぶが、ワトソン−クリックの塩基対形成を起こすというヌクレオチド又はヌクレオシドの能力を変化させない誘導体及び類似体も利用できることは、当業者には理解されるだろう。「誘導体」又は「類似体」とは、親化合物と同じコア構造又は親化合物とよく似たコア構造を持つが、その誘導体ヌクレオチド又は誘導体ヌクレオシドを別の分子に連結することを許す化学的修飾又は物理的修飾（例えば、異なる側鎖又は追加の側鎖）を持つ化合物又は分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンであってよい。その誘導体は、ワトソン−クリックの塩基対形成を起こす能力を持つはずである。また、「誘導体」及び「類似体」は、修飾塩基部分及び／又は修飾糖部分を持つ合成ヌクレオチド誘導体又は合成ヌクレオシド誘導体も意味する。そのような誘導体及び類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，１９８０）及びＵｈｌｍａｎ等，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４，１９９０で論じられている。ヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホルアニリデート結合及びホスホルアミデート結合などの修飾ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。これらの類似体は、ワトソン−クリック塩基対形成を起こす能力を持つはずである。本明細書で用いる用語「誘導体」と「類似体」は互換的に使用することができ、本明細書に定義する用語「ヌクレオチド」及び「ヌクレオシド」に包含される。
【００２６】
本発明では通常の検出可能なラベルを利用することができる。検出は、任意の適切な方法によって、例えば、蛍光分光法や、他の光学的手段によって行うことができる。好ましいラベルは、エネルギーの吸収後に所定の波長で放射線を放出する蛍光団である。適切な蛍光ラベルは数多く知られている。例えばＷｅｌｃｈ等（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５（３）：９５１−９６０，１９９９）は、本発明に使用することができるダンシル官能基を持つ蛍光部分を開示している。Ｚｈｕ等（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２８：２０６−２１１，１９９７）は、やはり本発明に使用することができる蛍光ラベルＣｙ３及びＣｙ５の使用について記述している。使用に適したラベルは、Ｐｒｏｂｅｒ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：３３６−３４１，１９８７）、Ｃｏｎｎｅｌｌ等（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５（４）：３４２−３８４，１９８７）、Ａｎｓｏｒｇｅ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（１１）：４５９３−４６０２，１９８７）及びＳｍｉｔｈ等（Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：６７４，１９８６）にも開示されていている。市販されている他の蛍光ラベルには、例えば、フルオレセイン、ローダミン（ＴＭＲ、テキサスレッド及びＲｏｘを含む）、アレクサ（ａｌｅｘａ）、ボディピィ（ｂｏｄｉｐｙ）、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンゾアントラセン及びシアニン類などがあるが、これらには限定されない。
【００２７】
本発明では複数のラベルを使用することもできる。例えば、二蛍光団ＦＲＥＴカセット（Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．４６：８８６７−８８７１，２０００）は当該技術分野ではよく知られており、本発明に利用することができる。多蛍光デンドリマー系（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：  ８１０１−８１０８，２００１）も使用することができる。
【００２８】
蛍光ラベルは好ましいが、他の形態の検出可能なラベルも有用であることは、当業者には明らかだろう。例えば、量子ドット（Ｅｍｐｏｄｏｃｌｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３９９：１２６−１３０，１９９９）、金ナノ粒子（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ等，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５−６０２９，２０００）、マイクロビーズ（Ｌａｃｏｓｔｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１７）：９４６１−９４６６，２０００）、及び質量分析法で検出可能なタグなどの微粒子は、いずれも使用することができる。
【００２９】
本発明では多成分ラベルも使用することができる。多成分ラベルは、もう一つの検出用化合物との相互作用に依存しているラベルである。生物学で使用される最も一般的な多成分ラベルはビオチン−ストレプトアビジン系である。ビオチンはヌクレオチド塩基に取り付けるラベルとして使用される。次に、ストレプトアビジンを別個に加えられて検出が起こりうる。他の多成分系も利用できる。例えば、ジニトロフェノールには、検出に利用できる市販の蛍光抗体がある。
【００３０】
本ラベル（又はラベル及びリンカー構築物）は、本発明のヌクレオチド上に更にもう一つのヌクレオチドが組み込まれることに対するブロックとして作用するのに十分な大きさ又は構造を持つことができる。これにより、制御された重合を行うことができる。このブロックは立体障害によるものであってもよいし、大きさ、電荷及び構造の組合せによるものであってもよい。
【００３１】
本発明をヌクレオチドに関して詳しく説明する。しかし、別段の表示がない限り、ヌクレオチドへの論及は、ヌクレオシドにも適用するものとする。また、本発明をＤＮＡに関して詳しく説明するが、その説明は別段の表示がない限り、ＲＮＡ、ＰＮＡ及び他の核酸にも適用できる。
【００３２】
本発明の修飾ヌクレオチドでは、ヌクレオチドにラベルを取り付けるために、切断可能なリンカーを使用する。切断可能なリンカーを使用することにより、必要に応じて、検出後にラベルを除去することができ、それ以降に組み込まれる標識ヌクレオチドとの干渉シグナルを回避できる。
【００３３】
切断可能なリンカーは当技術分野では知られており、通常の化学反応を応用して、リンカーをヌクレオチド塩基やラベルに取り付けることができる。リンカーは、例えば、酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元剤、酸化剤、光、温度、酵素等に曝すなど、適切な方法で切断することができる。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに開示されているように、標準的な化学ブロック基から改良することができる。また、固相合成に使用される適切な切断可能リンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ等（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９２−２１５７，２０００）に開示されている。
【００３４】
「切断可能なリンカー」という用語の使用は、リンカー全体をヌクレオチド塩基から除去する必要があることを意味するものではない。切断部位は、切断後もリンカーの一部がヌクレオチド塩基に結合したままであるようなリンカー上の位置であってよい。
【００３５】
リンカーは、そのリンカーが存在してもワトソン−クリックの塩基対形成を起こすことができるのであれば、ヌクレオチド塩基上のどの位置に取り付けられてもよい。プリン塩基の場合、リンカーは、プリン又は好ましいデアザプリン類似体の７位を介して、８−修飾プリンを介して、Ｎ−６修飾アデノシンを介して又はＮ−２修飾グアニンを介して取り付けると好ましい。ピリミジンの場合は、シチジン、チミジン又はウラシルの５位、及びシトシンのＮ−４位を介して取り付けられることが好ましい。適切なヌクレオチド構造を図１に示す。図１の各構造について、ＸはＨ、リン酸、二リン酸又は三リン酸であってよい。Ｒ１とＲ２は同じであっても異なってもよく、Ｈ、ＯＨ、又はＯＨに変換することが可能な任意の基（例えばカルボニル、ただしこれに限らない）から選択することができる。
【００３６】
適切なリンカーを図２に一般的に示す。適切なリンカーには、ジスルフィドリンカー（１）、酸不安定リンカー（２、３、４及び５；ジアルコキシベンジルリンカー（例えば２）、ジーバーリンカー（例えば３）、インドールリンカー（例えば４）、ｔ−ブチルジーバーリンカー（例えば５））、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光分解性リンカー、還元条件下での切断、酸化条件下での切断、セーフティキャッチ（ｓａｆｅｔｙ−ｃａｔｃｈ）リンカーを使った切断、及び脱離機構による切断などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
Ａ．求電子的に切断されるリンカー
求電子的に切断されるリンカーは、典型的にはプロトンによって切断され、酸感受性の切断がこれに含まれる。適切なリンカーとして、トリチル、ｐ−アルコキシベンジルエステル及びｐ−アルコキシベンジルアミドなどの修飾ベンジル系が挙げられる。その他、適切なリンカーには、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基及びアセタール系（例えば、図３にＯ−Ｃ（Ｒ４）（Ｒ５）−Ｏ−Ｒ６として示すような系）などがある。
【００３８】
チオアセタール又は他の含硫黄保護基の切断に、ニッケル、銀又は水銀などの親硫黄性金属を使用することも、適切なリンカー分子の製造に際して考慮され得る。
【００３９】
Ｂ．求核的に切断されるリンカー
リンカー分子の製造において求核的切断もよく知られている方法である。水中で不安定な（すなわち塩基性ｐＨにするだけで切断することができる）エステルなどの基及び非水性求核剤に対して不安定な基を使用することができる。フッ化物イオンは、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）又はｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）などの基におけるケイ素−酸素結合を切断するために使用することができる。
【００４０】
Ｃ．光分解性リンカー
光分解性リンカーは糖質化学では広く使用されてきた。切断を促進するのに必要な光は、修飾ヌクレオチドの他の成分に影響を及ぼさないことが好ましい。例えば、蛍光団をラベルとして使用する場合、その蛍光団は、リンカー分子を切断するのに必要な波長とは異なる波長の光を吸収することが好ましい。適切なリンカーとして、Ｏ−ニトロベンジル化合物に基づくもの、及びニトロベラトリル（ｎｉｔｒｏｖｅｒａｔｒｙｌ）化合物に基づくものが挙げられる。ベンゾイン化学に基づくリンカーも使用することができる（Ｌｅｅ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３４５４−３４６０，１９９９）。
【００４１】
Ｄ．還元条件下での切断
還元的切断を受け易いリンカーは数多く知られている。パラジウム系触媒を用いる接触水素化は、ベンジル基及びベンジルオキシカルボニル基の切断に使用されてきた。当技術分野ではジスルフィド結合還元も知られている。
【００４２】
Ｅ．酸化条件下での切断
酸化に基づくアプローチは当技術分野ではよく知られている。これにはｐ−アルコキシベンジル基の酸化ならびに硫黄リンカー及びセレンリンカーの酸化が含まれる。ヨウ素水溶液を使ってジスルフィド化合物及び他の硫黄系リンカー又はセレン系リンカーを切断することも、本発明の範囲に包含される。
【００４３】
Ｆ．セーフティキャッチリンカー
セーフティキャッチリンカーは、２段階で切断されるリンカーである。好ましい系では、第１段階が反応性求核中心の生成であり、その後に、切断をもたらす分子内環化を伴う第２段階が続く。例えば、レブリン酸エステル結合は、ヒドラジンで処理されるか光化学的に処理されることによって、活性アミンを遊離することができ、次に、その活性アミンを環化して、分子内の他の位置にあるエステルを切断することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓ等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５−５１６８，１９９７）。
【００４４】
Ｇ．脱離機構による切断
脱離反応も使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ及びシアノエチルなどの基の塩基触媒による脱離、ならびにパラジウム触媒によるアリル系の還元的脱離などを使用することができる。
【００４５】
リンカーは、切断部位だけでなく、スペーサーユニットも含んでいてよい。スペーサーはヌクレオチド塩基を切断部位又はラベルから遠ざける。ヌクレオチドと酵素との間の相互作用を妨害しないようにラベルがヌクレオチドから十分な距離に保たれる限り、リンカーの長さは重要でない。
【００４６】
修飾ヌクレオチドは追加の基又は修飾を糖基に含むこともできる。例えば、リボース環構造上の２つの酸素（２’位と３’位の酸素）を欠いているジデオキシリボース誘導体を製造し、成長しつつあるオリゴヌクレオチド鎖に更なるヌクレオチドが組み込まれるのを防ぐブロックとして使用することができる。保護基は、新生ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みを防ぐという目的をもち、重合が起こりうるように所定の条件下で除去することができる。先行技術とは異なり、検出可能なラベルは、リボースの３’位には取り付けられていない。これにより、ポリメラーゼ酵素との立体障害が減少し、その一方で保護基を使って組み込みを制御することができる。
【００４７】
３’−ＯＨとの相互作用を妨害するためにリボース環に適切な保護基を取り付ける方法は、当業者にはわかるだろう。保護基は３’位に直接取り付けることもできるし、２’位に取り付けることもできる（この保護基は、３’位での相互作用を妨害するのに十分な大きさ又は電荷を持つ）。あるいは、３’位と２’位の両方に保護基を取り付けてもよく、その保護基を切断して３’ＯＨ基を露出させてもよい。
【００４８】
適切な保護基は当業者には明白だろう。適切な保護基はＧｒｅｅｎ及びＷｕｔｓ（前掲）に開示されている任意の適切な保護基から形成させることができる。保護基は、３’ＯＨ基を生成させるために、除去（又は修飾）できるべきである。３’ＯＨ基を得るために使用するプロセスは、任意の適切な化学反応又は酵素反応でよい。
【００４９】
不安定リンカーはブロックと同一条件下で切断可能な官能基からなっていてもよい。この場合、ラベルとブロックの両方を切断するのに必要な処理が一つだけになるので、脱保護プロセスの効率が向上する。したがって、リンカーは図３に記載するような官能基を含んでいてよく、残存ヌクレオシド上又は除去されるラベル上の水酸基で除去され得る。リンカーは、ブロックを切断するために用いる条件に対してたまたま不安定である全く異なる化学官能基からなることもできる。
【００５０】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基と分枝鎖アルキル基の両方を包含する。文脈上別段の指示がない限り、「アルキル」という用語は、１〜８個の炭素原子を持つ基を指し、典型的には１〜６個の炭素原子、例えば１〜４個の炭素原子を持つ基を指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル及びｎ−ヘキシル、ならびにその異性体などがある。
【００５１】
シクロアルキル基の例は３〜１０個の環原子を持つものであり、具体例として、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン及びシクロヘプタンから誘導されるもの、ビシクロヘプタン並びにデカリンが挙げられる。
【００５２】
アルケニル基の例には、エテニル（ビニル）、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、イソプロペニル、ブテニル、ブタ−１，４−ジエニル、ペンテニル、及びヘキセニルなどがあるが、これらに限られない。
【００５３】
シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル及びシクロヘキセニルなどがあるが、これらに限られない。
【００５４】
アルコキシという用語は、別段の表示がない限り、Ｃ１−６アルコキシ、すなわち−ＯＲ（式中、ＲはＣ１−６アルキル基である）を指す。Ｃ１−６アルコキシ基の例には、−ＯＭｅ（メトキシ）、−ＯＥｔ（エトキシ）、−Ｏ（ｎＰｒ）（ｎ−プロポキシ）、−Ｏ（ｉＰｒ）（イソプロポキシ）、−Ｏ（ｎＢｕ）（ｎ−ブトキシ）、−Ｏ（ｓＢｕ）（ｓｅｃ−ブトキシ）、−Ｏ（ｉＢｕ）（イソブトキシ）、及び−Ｏ（ｔＢｕ）（ｔｅｒｔ−ブトキシ）などがあるが、これらに限られない。
【００５５】
アミノという用語は、ＮＲ１Ｒ２型の基を指し、式中、Ｒ１及びＲ２は水素、Ｃ１−６アルキル基から独立して選択される（Ｃ１−６アルキルアミノ又はジＣ１−６アルキルアミノともいう）。
【００５６】
本明細書で使用する「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
【００５７】
本発明のヌクレオチド分子は、ヌクレオチドの検出を必要とする多種多様な方法での使用に適している。
【００５８】
本ヌクレオチドを使って、例えば米国特許第５，３０２，５０９号に概説されているようなＤＮＡ配列決定法を行うことができる。
【００５９】
標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法は、標的ポリヌクレオチドを、異なるヌクレオチドと個別に接触させて、標的ポリヌクレオチドに対する相補体を形成させ、ヌクレオチドの組み込みを検出することによって行うことができる。そのような方法では重合が利用され、ポリメラーゼ酵素が標的上のヌクレオチドに相補的な正しいヌクレオチドを組み込むことによって相補鎖を伸長させる。重合反応には、重合を開始させるために特異的プライマーも必要である。
【００６０】
各サイクルで、標識ヌクレオチドの組み込みがポリメラーゼ酵素によって行われ、次に、その組み込み現象が決定される。多くの異なるポリメラーゼ酵素が存在し、どれが最も使用に適しているかは、当業者には明らかだろう。好ましい酵素には、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ又はベント（ｖｅｎｔ）ポリメラーゼなどがある。特別な性質を持つように操作されたポリメラーゼも使用することができる。
【００６１】
これらの配列決定法は、好ましくは、固体支持体上に配置された標的ポリヌクレオチドを使って行われる。複数の標的ポリヌクレオチドをリンカー分子によって固体支持体上に固定化するか、又は固体支持材料に取り付けることができる粒子（例えば、マイクロスフェア）に取り付けることができる。
【００６２】
ポリヌクレオチドは、ビオチン−アビジン相互作用の利用を含む多くの手段によって、固体支持体に取り付けることができる。固体支持体にポリヌクレオチドを固定化する方法は当技術分野ではよく知られており、例えばリソグラフィー法や、個々のポリヌクレオチドを固体支持体上の所定の位置に「スポッティング」する方法などがある。適切な固体支持体は当技術分野では知られており、例えばガラススライド、ガラスビーズ、セラミック表面、ケイ素表面ならびにプラスチック材料などが挙げられる。支持体は、通常は平坦な表面であるが、微小ビーズ（マイクロスフェア）も使用することができ、その場合は、その微小ビーズを既知の手段で別の固体支持体に取り付けることができる。マイクロスフェアは、典型的には直径１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で、任意の適切な大きさである。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドを平面状の表面に、好ましくは平面状のガラス表面に、直接取り付ける。取り付けは、好ましくは、共有結合を使って行われる。使用するアレイは、好ましくは、例えば国際公開第ＷＯ００／０６７７０号パンフレットに開示されているように、ポリヌクレオチドが光学的に分離可能な相異なる領域に含まれている単一分子アレイである。
【００６３】
配列決定法は、単一ポリヌクレオチド分子アレイでも、多ポリヌクレオチド分子アレイでも、すなわち相異なる個別ポリヌクレオチド分子のアレイでも、１つの個別ポリヌクレオチド分子を複数コピー含む相異なる領域のアレイでも、行うことができる。単一分子アレイでは、各個別ポリヌクレオチドを別々に分離することができる。単一分子アレイの使用が好ましい。単一分子アレイを配列決定することにより、非破壊的に、空間的に位置決めをできるアレイ（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ａｒｒａｙ）を形成させることができる。
【００６４】
本方法では、重合反応を利用して標的の相補配列を生成させる。重合を起こすのに必要な条件は当業者には明白だろう。
【００６５】
ポリメラーゼ反応を行うには、通常は、まず標的ポリヌクレオチドにプライマー配列をアニールさせる必要があるだろう。このプライマー配列は、ポリメラーゼ酵素によって認識され、続いて起こる相補鎖の伸長に開始部位としての役割を果たす。プライマー配列は標的ヌクレオチドに対して別個の成分として加えることができる。あるいは、プライマー及び標的ポリヌクレオチドは、どちらも１つの一本鎖分子の一部であって、プライマー部分が標的の一部と分子内二重鎖（すなわちヘアピンループ構造）を形成してもよい。この構造は、その分子上の任意の点で固体支持体に固定化されていてよい。温度、ｐＨ、緩衝液組成など、ポリメラーゼ反応を行うのに必要な他の条件は、当業者には明白だろう。
【００６６】
次に、本発明の修飾ヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと接触させて、重合を起こさせる。ヌクレオチドは逐次的に添加（すなわち各ヌクレオチドタイプ（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）を個別に添加）してもよいし、合わせて一緒に添加してもよい。ヌクレオチドを合わせて添加する場合は、各ヌクレオチドタイプを異なるラベルで標識することが好ましい。
【００６７】
この重合ステップは、ヌクレオチドを組み込ませるのに十分な時間にわたって進行させる。
【００６８】
次に、例えばアレイを洗浄ステップに供することによって、組み込まれていないヌクレオチドを除去した後、組み込まれたラベルの検出を行うことができる。
【００６９】
検出は通常の手段によって行うことができる。例えばラベルが蛍光部分である場合、組み込まれた塩基の検出は、共焦点走査顕微鏡を使って、アレイの表面をレーザーで走査し、組み込まれた塩基に直接結合している蛍光団をイメージ化することによって行うことができる。あるいは、電荷結合検出器（ＣＣＤ）などの高感度二次元検出器を使って、生成した個々のシグナルを可視化することもできる。しかし、走査型近接場光学顕微鏡法（ＳＮＯＭ）などの他の技術も利用可能であり、高密度アレイをイメージ化する時に使用することができる。例えば、個々のポリヌクレオチド間の距離が１００ｎｍ未満（例えば１０ｎｍ）〜１０μｍである場合、ＳＮＯＭを使用すると、それらを識別することができる。走査型近接場光学顕微鏡法の説明は、Ｍｏｙｅｒ等，Ｌａｓｅｒ  Ｆｏｃｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  ２９：１０，１９９３を参照されたい。ポリヌクレオチドアレイのイメージ化に使用される適切な装置は知られており、技術的設定は当業者には明白だろう。
【００７０】
検出後は、リンカーを切断する適切な条件を使って、ラベルを除去することができる。
【００７１】
本修飾ヌクレオチドの使用はＤＮＡ配列決定技術に限定されるわけではなく、他の技術、例えば、ポリヌクレオチド合成、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ及び一塩基多型研究なども、本発明のヌクレオチドを使って行うことができる。ヌクレオチドと酵素との間の相互作用を伴う技術であれば、どの技術にも本発明の分子を利用することができる。例えば、本分子は、逆転写酵素又はターミナルトランスフェラーゼ酵素の基質として使用することができる。
【００７２】
適切な構造を以下の実施例に記載し、添付の図面に図示する。
【実施例】
【００７３】
実施例１  ジスルフィドリンカーの合成
【００７４】
【化１】
2005511058.tif 000002
【００７５】
【化２】
2005511058.tif 000003
【００７６】
メタノール（１５ｍＬ）に溶解したアルドリチオール（１．３２ｇ，６．０ｍｍｏｌ）に、ｔ−ブチル−Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルバメート（３ｍｍｏｌ，０．５ｍＬ）を滴下した。１．５時間後には反応が完了していたので、溶媒を蒸発させた。酢酸エチル：石油エーテル（１：４）を使ってシリカでクロマトグラフィーを行うことにより、粗生成物を精製した。生成物１ａはわずかに黄色の油状物として得られた（０．７６ｇ，２．６７ｍｍｏｌ，８９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００Ｍｈｚ，Ｄ６−ＤＭＳＯ）：ｄ＝１．３８（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ），２．８８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．２０（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），７．０２（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２４（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５），７．７７（ｄｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），７．８２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），８．４６（ｄｄｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）。
【００７７】
【化３】
2005511058.tif 000004
【００７８】
１ａのアミンを脱保護するために、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）とトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）との混合液に１７ｍｇの１ａ（６０μｍｏｌ）を溶解した。この混合物を室温で２．５時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭ（２ｍＬ）に再溶解して蒸発乾固する操作を３回繰り返した。脱保護された生成物を高真空下で３時間乾燥した後、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。脱保護は完了したとみなした。
【００７９】
ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した５−カルボキシテトラメチルローダミン（１５ｍｇ，３５μｍｏｌ）に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（８．０ｍｇ，７０μｍｏｌ）とＤＣＣ（７．８ｍｇ，３８μｍｏｌ）とを加えた。その混合物を暗所で６時間撹拌した。次に、ＤＩＰＥＡ（２２μｌ，１２６μｍｏｌ）と、脱保護した１ａのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液とを加えた。反応混合物を暗所で終夜撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥した後、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（３：１）を溶剤として、粗混合物をシリカで精製した。１ｂは暗赤色固体として９０％の収率（１９．２ｍｇ，３１．４μｍｏｌ）で単離された。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ＝３．０９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＳＣＨ２），３．６３（ｑ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），６．４８−６．５３（ｍ，６Ｈ，Ｈ−アントラセン），７．２３−７．２６［ｍ，１Ｈ，Ｈ−５（ピリジン）］，７．３２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈｚ，Ｈ−３），７．８１−７．８２［ｍ，２Ｈ，Ｈ−３＋Ｈ−４（ピリジン）］，８．２１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４），８．４３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），８．４７［ｄｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６（ピリジン）］，９．０３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＮＨ）。
【００８０】
【化４】
2005511058.tif 000005
【００８１】
メタノール（２ｍＬ）に溶解した１９．６ｍｇの１ｂ（３２．７μｍｏｌ）に、メルカプトプロピオン酸（２０．６μｍｏｌ，１．８ｍｌ）を加えた。その混合物を暗所で２．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ  １５：１：０．５を溶媒混合物として、シリカでクロマトグラフィーを行うことにより、粗生成物を精製した。１５．５ｍｇ（２６μｍｏｌ，８０％）の暗赤色結晶１ｃを単離することができた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝２．５３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＯＯＨ），２．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ），２．９６−２．９９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），６．５３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−アントラセン），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−アントラセン），７．１２（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ−アントラセン），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３），７．９５（ｄｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２），８．１３（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１）。＋ｖｅエレクトロスプレー（Ｃ３０Ｈ３１Ｎ３Ｏ６Ｓ２）：予想値５９３．１７；実測値５９４．３［Ｍ＋Ｈ］，６１６．２［Ｍ＋Ｎａ］。
【００８２】
【化５】
2005511058.tif 000006
【００８３】
２５．８ｍｇの１ｃ（４３．４μｍｏｌ）を溶解させた３ｍＬのＤＭＦ（乾燥）溶液に、９．９ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８６．８μｍｏｌ）と９．７ｍｇのＤＣＣ（４７．１μｍｏｌ）とを加えた。その混合物を室温にて暗所で５時間撹拌した後、冷蔵庫に一晩入れておいた。脱脂綿栓を通して、その混合物を新しいフラスコに濾過し、そこに、プロパルギルアミノｄＵＴＰの溶液８６５μＬ（１４．７μｍｏｌ，水１ｍＬに１７μｍｏｌ）とホウ酸ナトリウム緩衝液３ｍＬ（０．１Ｍ溶液，ｐＨ９）とを加えた。その混合物を終夜撹拌した。溶媒を除去した後、残渣を可能な限り少量の水に溶解し、ＨＰＬＣで精製した。ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ１８カラムを使用し、緩衝液として０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）とアセトニトリルを使った。３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ＝−４．７３（ｄ），−９．９３（ｄ），１９．０３（ｔ）。−ｖｅエレクトロスプレー（Ｃ４２Ｈ４７Ｎ６Ｏ１９Ｐ３Ｓ２；Ｈ＋対イオンを４つと仮定）：予想値１０９６．１６；実測値１０９２．９。水中でのＵＶ：λ（ｍａｘ）＝５５５ｎｍ，Ａ（５５５）＝０．８８５（ｃ＝０．０３６μｍｏｌ）。
【００８４】
三リン酸エステル（１）はクレノウＤＮＡポリメラーゼを使って組み込むことに成功した。反応は以下の条件で行った：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＭ化合物３、１００ｎＭ  ＤＮＡテンプレート（Ｐ３２及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで前もって標識したもの）及び市販のエキソ・クレノウ（アマシャム社，米国イリノイ州アーリントンハイツ）１０単位。ＤＮＡテンプレートは自己相補的ヘアピン（５’−ＴＡＣＣｇＴＣｇＡＣｇＴＣｇＡＣｇＣＴｇｇＣｇＡｇＣｇＴｇＣＴｇＣｇｇＴＴＴＴＴ（Ｃ６−アミノ）ＴＴＡＣＣｇＣＡｇＣＡＣｇＣＴＣｇＣＣＡｇＣｇ；配列番号１）とした。反応は、１００μＬの液量で、３７℃で行い、タイムポイントを０、１、３、５及び１０分に設定した。反応生成物を変性（８Ｍ尿素）２０％ポリアクリルアミドゲルで下向きに電気泳動し、タイフーン（ｔｙｐｈｏｏｎ）ホスホイメージャーでイメージ化した。１分で完全な一塩基伸長が認められたことから、効率のよいポリメラーゼ組み込みが明らかになった（ジスルフィドリンカーゲル，図４）。図示したもう一組のレーンは、組み込み後に材料をＤＴＴに曝露したものである。異なるバンドシフトを認めることができ、それは色素がＤＮＡコンストラクトから除去されたことを示すので、このジスルフィド化合物を使って、１サイクルのポリメラーゼ組み込みと切断とが示されたことになる。
【００８５】
実施例２  ＴＭＲ−ジーバーリンカー遊離酸の合成
【００８６】
【化６】
2005511058.tif 000007
【００８７】
５−［−９−［９−（フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ］キサンテン−３−イル］吉草酸（４２．８ｍｇ，８０μｍｏｌ）を、炭酸ジスクシンイミジル（２２．５ｍｇ，８８μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１０．８ｍｇ，８８μｍｏｌ）と共にＤＭＦ中、室温にて撹拌した。５分後に、モノ−５−カルボキシＴＭＲエチレンジアミン（１９８．９ｍｇ，４０μｍｏｌ）を加え、次にＤＩＰＥＡ（１３．９μｌ，８０μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で撹拌した。２時間後に、反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、得られた溶液を１Ｍリン酸二水素カリウム水溶液（５０ｍＬ）で抽出した。ＤＣＭ層を分離し、減圧下で蒸発させた。残渣を、短いカラムクロマトグラフィーによって精製した。クロロホルム中の４０％メタノールで溶出する画分を集めて、減圧下で蒸発させた。次に、残渣を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）及びＮ−（２−メルカプトエチル）アミノメチルポリスチレン（２００ｍｇ，４００μｍｏｌ）及びＤＢＵ（１２μｌ，８０μｍｏｌ）に溶解した。室温で１０分後に、上記の樹脂を濾別し、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）ですすいだ。すべての濾液を合わせてから、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した無水コハク酸（８０ｍｇ，８００μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１３９μｌ，８００μｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９．８ｍｇ，８０μｍｏｌ）に加えた。次に、反応混合物を室温で撹拌した。一晩（１６時間）後に、すべての溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を短いカラムクロマトグラフィーで精製した。クロロホルム中の３０％メタノールで溶出させた標題の化合物を、紫色の粉末（２２ｍｇ，総収率６３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ［Ｄ６−ＤＭＳＯ］：８．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．４，ｅｘ．），８．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．９，ｅｘ．），８．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ  １．５），８．２０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ８．０及び１．５），７．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．９，ｅｘ．），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ７．３），７．３０−７．２７（２Ｈ，ｍ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ８．５），７．１６−７．０７（２Ｈ，ｍ），６．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ８．８及び２．５），６．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ２．４），６．４９−６．４３（６Ｈ，ｍ），６．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５．６），３．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．９），３．３９−３．３６（２Ｈ，ｍ），３．３０−３．２７（２Ｈ，ｍ），２．９２（１２Ｈ，ｓ），２．３７−２．３３（２Ｈ，ｍ），２．１４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．２）及び１．７０−１．６２（４Ｈ，ｍ）。ＭＳ［（ＥＳ（＋）］，ｍ／ｚ  ８６８．５（ＭＨ＋）。
【００８８】
実施例３  ＴＭＦ−ジーバーリンカー−ｄＵＴＰ（３）の合成
【００８９】
【化７】
2005511058.tif 000008
【００９０】
ＴＭＲ−ジーバーリンカー遊離酸（４．３４ｍｇ，５μｍｏｌ）を、炭酸ジスクシンイミジル（１．７４ｍｇ，７．５μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．９２ｍｇ，７．５μｍｏｌ）と共にＤＭＦ（１ｍＬ）中、室温にて撹拌した。１０分後に、反応混合物全体を、５−（３−アミノプロピニル）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸のテトラ（トリブチルアンモニウム）塩（１０μｍｏｌ）に加えた。反応液を室温で４時間撹拌し、冷蔵庫に一晩保存した。次に、その反応混合物を冷水（１０ｍＬ）で希釈し、得られた溶液のすべてをＤＥＡＥ  Ａ−２５の短いカラムにのせた。そのカラムをまず０．１Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液で溶出し、次に０．７Ｍ  ＴＥＡＢ緩衝液で溶出した。０．７Ｍ  ＴＥＡＢ溶出液を集めて、減圧下で蒸発させた。残渣をメタノール（１０ｍＬで２回）と共にエバポレートした後、分取ＨＰＬＣで精製した。標題の化合物をトリエチルアンモニウム塩として３１％の収率（水（ｐＨ７）中、５５５ｎｍでのＴＭＲの定量に基づく）で得た。Ｄ２Ｏ中での１ＨＮＭＲは、ジーバーリンカー部分のせいで２つのジアステレオ異性体を示し、約３つのトリエチルアンモニウム対イオンが存在した。１ＨＮＭＲ［Ｄ２Ｏ］：８．１８（１Ｈ，ｍ），８．０６（１Ｈ，ｍ），７．７６（０．５５Ｈ，ｓ），７．７４（０．４５Ｈ，ｓ），７．３６−  ７．０９（５Ｈ，ｍ），６．８９−６．７２（３Ｈ，ｍ），６．５９−６．３７（５Ｈ，ｍ），６．１２（０．５５Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．６），６．０５（０．４５Ｈ，ｔ，Ｊ  ６．６），５．９９（０．４５Ｈ，ｄ，Ｊ  ２．５），５．９１（１．１Ｈ，ｍ），５．８８（０．４５Ｈ，ｓ），４．４９（０．５５Ｈ，ｍ），４．４３（０．４５Ｈ，ｍ），４．００−３．３５（９Ｈ，ｍ），３．３０−２．９５（３２Ｈ，ｍ），２．６５−２．５２（４Ｈ，ｍ），２．２５−２．０５（４Ｈ，ｍ），１．６２−１．４２（４Ｈ，ｍ）及び１．２３（２７Ｈ，ｔ，Ｊ  ７．３）。３１Ｐ［Ｄ２Ｏ］：−９．９１（γＰ，ｄ，Ｊ  １９．２），［−１１．０８（αＰ，ｄ，Ｊ  ２０．１）及び１１．３０（αＰ，ｄ，Ｊ  ２０．１），２つのジアステレオ異性体によるもの］，及び２２．５７（βＰ，ｍ）。ＭＳ［（ＥＳ（−）］，ｍ／ｚ  １３６９．１（Ｍ−）。
【００９１】
三リン酸エステル（３）はクレノウＤＮＡポリメラーゼを使って組み込むことに成功した。反応は以下の条件で行った：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＭ化合物３、１００ｎＭ  ＤＮＡテンプレート（Ｐ３２及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで前もって標識したもの）及び市販のエキソ・クレノウ（アマシャム社，米国イリノイ州アーリントンハイツ）１０単位。ＤＮＡテンプレートは自己相補的ヘアピン（５’−ＴＡＣＣｇＴＣｇＡＣｇＴＣｇＡＣｇＣＴｇｇＣｇＡｇＣｇＴｇＣＴｇＣｇｇＴＴＴＴＴ（Ｃ６−アミノ）ＴＴＡＣＣｇＣＡｇＣＡＣｇＣＴＣｇＣＣＡｇＣｇ；配列番号１）とした。反応は、１００μＬの液量で、３７℃で行い、タイムポイントを０、１、３、５及び１０分に設定した。反応生成物を変性（８Ｍ尿素）２０％ポリアクリルアミドゲルで下向きに電気泳動し、タイフーンホスホイメージャーでイメージ化した。１分で完全な一塩基伸長が認められたことから、効率のよいポリメラーゼ組み込みが明らかになった（ジーバーリンカーゲル，図５）。
【００９２】
実施例４  ＴＭＲ−インドールリンカー−ｄＵＴＰ（４）の合成
【００９３】
【化８】
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【００９４】
三リン酸エステル（４）はクレノウＤＮＡポリメラーゼを使って組み込むことに成功した。反応は以下の条件で行った：５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μＭ化合物３、１００ｎＭ  ＤＮＡテンプレート（Ｐ３２及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで前もって標識したもの）及び市販のエキソ・クレノウ（アマシャム社，米国イリノイ州アーリントンハイツ）１０単位。ＤＮＡテンプレートは自己相補的ヘアピン（５’−ＴＡＣＣｇＴＣｇＡＣｇＴＣｇＡＣｇＣＴｇｇＣｇＡｇＣｇＴｇＣＴｇＣｇｇＴＴＴＴＴ（Ｃ６−アミノ）ＴＴＡＣＣｇＣＡｇＣＡＣｇＣＴＣｇＣＣＡｇＣｇ；配列番号１）とした。反応は、１００μＬの液量で、３７℃で行い、タイムポイントを０、１、３、５及び１０分に設定した。反応生成物を変性（８Ｍ尿素）２０％ポリアクリルアミドゲルで下向きに電気泳動し、タイフーンホスホイメージャーでイメージ化した。１分で完全な一塩基伸長が認められたことから、効率のよいポリメラーゼ組み込みが明らかになった（インドールリンカーゲル，図６）。
【００９５】
本明細書で言及した特許、特許出願及び刊行物はすべて、参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。本発明をその好ましい実施形態について具体的に示し、説明したが、本願請求項に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態及び詳細にさまざまな変更を加えうることは、当業者には理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明で有用な典型的ヌクレオチド構造を示す図である。各構造について、ＸはＨ、リン酸、二リン酸又は三リン酸であってよい。Ｒ１とＲ２は同じであっても異なってもよく、Ｈ、ＯＨ、又はＯＨに変換することが可能な任意の基から選択することができる。
【図２】本発明で有用なリンカーの構造を示す図であり、使用可能なリンカーの一般的定義の他に、（１）ジスルフィドリンカー及び酸不安定リンカー、（２）ジアルコキシベンジルリンカー、（３）ジーバーリンカー、（４）インドールリンカー及び（５）ｔ−ブチルジーバーリンカーを含む。
【図３】本発明で有用な機能分子を、切断可能なリンカーを含めて示している図である。これらの構造において、Ｒ１とＲ２は同じであっても異なってもよく、Ｈ、ＯＨ、又はＯＨ基に変換することが可能な任意の基（カルボニルを含む）であってよい。Ｒ３は、アルキル、アルコキシル、アミノ又はハロゲンから独立して選択される１つ以上の置換基を表す。あるいは、３’−ブロックに使用される任意の不安定官能基から切断可能なリンカーが構築されていてもよい。
【図４】クレノウポリメラーゼを使用した実施例１の三リン酸の組み込みを示す変性ゲルの図である。
【図５】クレノウポリメラーゼを使用した実施例３の三リン酸の組み込みを示す変性ゲルの図である。
【図６】クレノウポリメラーゼを使用した実施例４の三リン酸の組み込みを示す変性ゲルの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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