(57)【要約】【課題】アルツハイマー病を検出する方法およびアルツハイマー病と他の痴呆疾患とを区別する方法、関連のペプチドおよびその使用【解決手段】本発明は、定義されたペプチドおよび、健康であるかまたは他の痴呆疾患を患う患者の対照グループの濃度と比較したアルツハイマー病を患う患者の体液中の前記ペプチドの定量的測定に関する。本発明のペプチドは、対応する遺伝子を有するタンパク質前駆体の補体Ｃ３のＣ３ｆ−フラグメントから由来し、特別な様式および方法でプロセシングされ、場合により翻訳後修飾または化学的修飾されている。本発明のペプチドは、それぞれのペプチドに対して特異的に、対照グループと比較して患者中のその濃度が変化する。健康なヒトの濃度と比較してこのペプチドの濃度の特異的および明らかな変化が、アルツハイマー病による疾患を示す。本発明は、更に、進行のコントロールのためおよび診断薬および治療薬の開発のための使用でもある。
2005511063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の生物学的試料中の、少なくとも１種のＭＡＣ３−マーカーペプチドまたはＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１０２４を有する配列またはそれと相同の配列から誘導されているペプチドを測定することにより、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の体質を検出する方法。
【請求項２】
患者の生物学的試料中の少なくとも１種のマーカーペプチドの濃度を測定してアルツハイマー病またはアルツハイマー病の体質を検出する方法において、
ａ）マーカーペプチドとして少なくとも１種のＭＡＣ３−ペプチドまたはＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１０２４を有する配列またはこれと相同の配列から誘導されたマーカーペプチドを使用し、
ｂ）試料中のそれぞれのマーカーペプチドに対して特異的な濃度上昇または濃度低下を確認し、
ｃ）ｂ）に記載した方法でのマーカーペプチドの明らかな濃度変化を、アルツハイマー病に対する陽性の検出結果として評価する
ことを特徴とする、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の体質を検出する方法。
【請求項３】
試料中のペプチドが翻訳後修飾の形または化学的修飾された形、有利にペプチド−オキシドの形で存在し、かつこの形で検出することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
生物学的試料は、脳脊髄液、血清、血漿、尿、滑液、便、涙、リンパ液または組織試料または細胞試料であるかまたはこれらから処理により得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ＭＡＣ３−ペプチドの、測定を質量分析試験または生物学的活性試験または分子生物学的試験または免疫学的試験を用いて、有利にＭＡＣ３−ペプチドと結合するファージ粒子、ＰＮＡ、抗体、アフィニティマトリックスまたはＥＬＩＳＡ−試験を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
試料を測定の前にクロマトグラフィーにより分別しかつ／または沈殿反応を行いかつ／または液相分離を行い、その際に得られたフラクションを引き続き分離して試験することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記の方法を診断の感度および／または特異性の向上のために他の診断方法と組み合わせて実施するか、または
ｂ）マーカーペプチドの濃度を疾患の重度の尺度として使用する
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ＭＡＣ３−ペプチドは、
ａ）配列ＩＤ１〜配列ＩＤ１６に記載のペプチドであるか、または
ｂ）このペプチドの天然由来の補体Ｃ３対立遺伝子の誘導体であるか、または
ｃ）補体Ｃ３−配列の対応する部分と比較して有利に２個より多くのアミノ酸芽異なっていないＭＡＣ３−突然変異体であり、
生物学的試料から単離するか、組み替えにより製造するかまたは化学的に合成することによる、翻訳後修飾されたかまたは化学的に修飾されたペプチドを含めたＭＡＣ３−ペプチドを獲得する方法。
【請求項９】
配列ＩＤ３〜配列ＩＤ１６に記載のペプチド、または配列ＩＤ１〜配列ＩＤ１６に一致するペプチドと相同のペプチド、特に天然由来の補体Ｃ３対立遺伝子の誘導体または点突然変異された、または翻訳後修飾された、酵素的または化学的に修飾された、有利に酸化されたＭＡＣ３−ペプチドまたは前記のペプチドに対応するペプチドミメティック。
【請求項１０】
アルツハイマー病の診断試薬または治療薬の製造または開発、特に診断試薬としての抗体の獲得のための、請求項９記載のペプチドのいずれか１つまたはＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１０２４を有するペプチドと相同のペプチドの使用。
【請求項１１】
ＭＡＣ３−ペプチドに結合する抗体。
【請求項１２】
アルツハイマー病の診断の目的で、関連のペプチドおよびペプチドフラグメントの相対的濃度を間接的に測定するための、配列ＩＤ１〜配列ＩＤ１６に記載されたペプチドまたはＮＣＢＩ登録番号ＸＭ＿００９０１０を有する配列に対応する核酸の使用。
【請求項１３】
ＭＡＣ３−ペプチドをコードする核酸またはＭＡＣ３−ペプチドをコードする核酸に対して相補的な核酸。
【請求項１４】
ＭＡＣ３−ペプチドまたは相応するペプチドミメティックを含有するか、またはＭＡＣ３−ペプチドに対する抗体を含有するか、またはＭＡＣ３−ペプチドをコードする核酸を含有するか、またはＭＡＣ３−ペプチドをコードする核酸に対して相補性を有する核酸を含有する医薬品または診断薬。
【請求項１５】
請求項１４記載の物質と、少なくとも１種の薬理学的に適合性の他の物質、有利に溶剤、充填剤、保存剤、着色剤または矯味剤とを含有する医薬品または診断薬。
【請求項１６】
ＭＡＣ３−ペプチドと結合しかつ固定化された形態かまたは標識された形態で存在するかまたは固定化または標識付けが可能である形態で存在する少なくとも１種の抗体を有する、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の体質を検出するためのテストキット。
【請求項１７】
少なくとも１種のＭＡＣ３−ペプチドからなる標準を更に含有していることを特徴とする、請求項１６記載のテストキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病を検出する方法、特にアルツハイマー病と他の痴呆疾患とを区別することができる方法に関する。このために患者の体液中のまたは他の試料中の所定のペプチド濃度が測定される。さらに、本発明は、この疾患の存在および／または重度を決定するために見出されたペプチド、抗体、核酸など、並びに診断および治療のためのその使用に関する。
【０００２】
痴呆疾患は、平均余命が向上するような人口統計の推移に基づいて、次第に増加する問題である、それというのもこの痴呆疾患は年齢の向上と共にその発症量も増加するためである。痴呆疾患は、大部分は治癒不能であり、患者を長期間続けて介護することが必要となる。
【０００３】
この患者のほぼ半数が入院による看護がなされている。痴呆症状を伴うような疾患を含めて６０以上の痴呆疾患が公知である。アルツハイマー病は痴呆疾患のグループの中で最も頻度の高い疾患である［１］。アルツハイマー病の診断および治療は、従って特に相対的意義が高い。アルツハイマー病は神経変性疾患であり、この神経変性疾患は次の症状により特徴付けられる：精神的能力の低下、短期および長期の記憶障害、錯乱状態および自己存続機能および自己看護機能の低下。精神的能力の悪化は、年齢が原因の精神的能力の悪化に対して付加的に生じる［１］。
【０００４】
従って、アルツハイマー病の診断は困難である、それというのもこのアルツハイマー病は他の痴呆疾患と同様に潜行的に生じ、脳内の神経細胞の破壊が次第に進行して、それに付随して精神的能力の低下と結びつくためである。多様な他の痴呆疾患、例えば血管性痴呆は、極めて類似の症状を示し、これはアルツハイマー病と他の痴呆疾患との診断による区別を極めて困難にしている。
【０００５】
痴呆疾患を認識する広範囲な方法は、「ＭＭＳＥスコア（ＭＭＳＥ  Ｓｃｏｒｅ）」（簡易精神状態試験（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ；ＭＭＳＥ））の測定である［２］。しかしながら、この試験は多様な痴呆疾患を確実に区別することができない。臨床的に測定可能な実験室パラメーターとして、タンパク質−タウおよびβ−アミロイドの４２個のアミノ酸サイズのイソ型の濃度の測定を考慮することができ、その際にアルツハイマー病患者の脳脊髄液中にはタウが高まり、かつβ−アミロイドが減少する。この２つのマーカーは高い選択率を示すが、わずかな特異性を示すだけである。このことはその診断値を極めて著しく制限するため、アルツハイマー病を確実に診断する診断マーカーは現在のところ提供されていないこと言うことができる［３］。
【０００６】
今までにアルツハイマー病の確実な診断も、有効な治療も不可能であったために、アルツハイマー病の検出のためおよびこの神経変性疾患と他の痴呆疾患との区別のために高い信頼性で、臨床的に測定可能なパラメーターを提供することが、重大な医学的進歩を意味する。本発明は、更にアルツハイマー病の治療のための治療法を開発するために著しく重要である、それというのも治療法の開発のためには治療すべき疾患の確実な診断が前提条件であるためである。このことは、類似の症状を有する多様な疾患が存在し、これらの疾患が恐らく多様な原因を有し、かつ従って異なる治療法が必要である場合に特に重要である。アルツハイマー病は今までに他の痴呆疾患と区別することができなかった［３］。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の根底をなす課題は、アルツハイマー病診断時に先行技術の欠点を回避し、かつ早期でかつ高い信頼性で適用可能な、アルツハイマー病と他の痴呆疾患とを診断するおよび区別する方法を提供することであった。
【０００８】
意外にも、アルツハイマー病を患う患者の体液試料、特に脳脊髄液中にだけ、所定のペプチドの濃度が対照値とは相違し、アルツハイマー病の検出並びにアルツハイマー病患者と他の痴呆疾患を患う患者および健康な個体との区別を可能にすることが見出された。例えば対照試料を用いて測定することができる対照値と比較したこのペプチドの濃度の変化は、アルツハイマー病の疾患の存在を示し、従って高い感度および高い特異性での疾患の選択的な検出に適している。
【０００９】
このペプチドは、前駆体分子の補体Ｃ３の断片であり、特に補体Ｃ３から由来する、１７個のアミノ酸長さの定義されたペプチドであり、これはＣ３ｆと称されている［４］。更に、Ｃ末端のアミノ酸のアルギニンが分解されている他のＣ３ｆ−ペプチド（Ｃ３ｆ−ｄｅｓ−Ａｒｇ）は、アルツハイマー病患者の脳脊髄液中に、アルツハイマー病ではないかまたは健康な人のそれぞれのペプチドの濃度とは異なる濃度で検出することができた。
【００１０】
他のＣ３ｆ−ペプチドの新規の、今まで公知でない変異体は、ヒトの血液濾液および血漿中で検出および同定でき、従ってアルツハイマー病患者の診断目的のために使用することができる。
【００１１】
文献中には、Ｃ３ｆの記号ばかりか、Ｃ３Ｆの記号も記載されているが、その際、Ｃ３ＦはＣ３ｆと同じではない。Ｃ３Ｆはむしろ「Ｃ３−ｆａｓｔ」、補体Ｃ３−ポリモルフィズムを表し、これはこのＣ３−変異体の完全な前駆体分子が、ゲル電気泳動の電場中でより早く前へ動くことを表す。
【００１２】
以後、Ｃ３ｆ−ペプチドおよびこのペプチドから誘導されるＣ３ｆ−ペプチド−変異体を「アルツハイマー補体Ｃ３−ペプチド」（ＭＡＣ３−ペプチド）と表示する。Ｃ３ｆの配列は、配列表の配列ＩＤ  １の配列と同一であり、並びにＭＡＣ３−１の配列と同一である。ＭＡＣ３−ペプチドは少なくとも８個、多くとも１７個のアミノ酸を有し、これは配列ＩＤ  １に一致するＣ３ｆの配列中の相当する配列位置でのアミノ酸と同一である。さらに、ＭＡＣ３−ペプチドは２個の点突然変異されたアミノ酸、２個の欠失されたアミノ酸または２個の付加的に内部に挿入されたアミノ酸、ならびに配列ＩＤ  １に相当するＮ末端および／またはＣ末端の延長部を含むこともできる。しかしながら、この場合に、このペプチドは相応する配列位置での配列ＩＤ  １からの配列からなる少なくとも８個のアミノ酸を有していなければならない。更に、Ｃ３ｆ−ペプチドおよびＣ３ｆ−ペプチドフラグメントもＭＡＣ３−ペプチドと表示され、これは天然由来の補体Ｃ３−ポリモルフィズムおよび天然由来のＣ３−突然変異体から誘導される。
【００１３】
前記の課題を解決するために、本発明は、患者の生物学的試料中に少なくとも１種のマーカーペプチドの濃度を測定してアルツハイマー病を検出する方法において、マーカーペプチドとして少なくとも１種のＭＡＣ３−ペプチドを使用して、試料中でそれぞれのマーカーペプチドに対してマーカーペプチドの特異的な濃度上昇または濃度低下を確認し、前記の方法においてマーカーペプチドの濃度変化がアルツハイマー病疾患用の陽性の検出結果として評価されることを内容とする。
【００１４】
この場合に、それぞれのＭＡＣ３−ペプチドに対して根本的に、アルツハイマー病患者の場合にだけペプチド濃度の上昇が起こるか、またはこのＭＡＣ３−ペプチドに対して根本的にアルツハイマー病患者の場合にだけペプチド濃度の減少が起こることができる。定義されたＭＡＣ３−ペプチドについて、個々のアルツハイマー病患者の場合に高いＭＡＣ３−ペプチド濃度が、および他のアルツハイマー病患者の場合に低いＭＡＣ３−ペプチド濃度が同時に生じることはできない。疾患のほとんど全ての医学的診断の場合と同様に、しかしながら、個々の事例において誤った診断が行われることもある、それというのも、ＭＡＣ３−ペプチドの濃度は、それぞれ個々のアルツハイマー病患者の場合に、１００％の確立で対照の場合のＭＡＣ３−ペプチドの濃度と異なるというわけではないためである。
【００１５】
本発明の範囲内で、補体Ｃ３ｆ−配列のフラグメントとして解釈することができるペプチドまたはＣ３ｆ−ペプチド自体が、ＭＡＣ３−ペプチドと表示される。このペプチドは補体Ｃ３ｆ−フラグメントから誘導された相同のペプチドおよびペプチドフラグメントを包含する。このペプチドは、このペプチドの天然由来の対立遺伝子の誘導体および相同の突然変異体、特に有利に補体Ｃ３とは２個より多くのアミノ酸が異なっていない点突然変異した突然変異体を包含する。本発明による有利なマーカーは配列表に記載されていて、配列ＩＤ  １〜１６に対応してＭＡＣ３−１〜ＭＡＣ３−１６と番号付けされていて、その際に、ＭＡＣ３−１は配列ＩＤ  １に対応し、ＭＡＣ３−２は配列ＩＤ  ２に対応し、ＭＡＣ３−３は配列ＩＤ  ３に次々と対応している。
【００１６】
本願明細書において相同の配列とした場合には、少なくとも７０％の相同性を有する配列を意味している。配列間の相同性を決定するために、コンピュータープログラム、例えばＧＡＰ［５］、ＰＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ［６］を含めたＧＣＧ  プログラムパケット（米国、ウィスコンシン州、マディソン、ウィスコンシン州大学、遺伝学コンピュータグループ（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison,Wl, USA））を用いることができるかまたは相同性の決定のために公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ−アルゴリズムを利用することができる。アミノ酸配列−比較のための有利なパラメーターは、のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム［７］、比較マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２［８］、１２のギャップ値（Gap Penalty）、４のギャップ長さ値（Gap Length Penalty）および０の相同性−閾値（Threshold of Similarity）を包含する。このＧＡＰ−プログラムは前記のパラメーターの使用のためにも適している。前記のパラメーターは、アミノ酸配列−比較のためのデフォルトパラメータ（default parameters）であり、その際に、末端でのギャップは相同性−値を低下させない。極めて短い配列を対照配列と比較する場合には、さらに、期待値を１０００００（expectation value）にまで高め、場合によりワードサイズ（word size）を２にまで小さくする必要がある。他の例示されたアルゴリズム、ギャップ−オープニング−値（gap opening penalties）、ギャップ−エクステンション−値（gap extension penalties）、比較マトリックス（Programm- Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997に挙げられたものを含めて）を使用することもできる。この選択は実施すべき比較に依存し、さらに、配列パートナーの間の比較（この場合にＧＡＰまたはベストフィットが有利である）かまたは配列と大規模な配列−データバンクとの間の比較（この場合にＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴが有利である）かどうかに依存して実施される。例
えば、前記のアルゴリズムを用いて測定された７０％の一致は、７０％の相同性と表す。本願明細書において、相同の配列とは、基本的に、少なくとも７０％の一致を示す全ての配列であると解釈され、この場合にこの一致は上記の記載に応じて計算される。これはアミノ酸配列並びに核酸配列にも適用される。
【００１７】
このマーカーペプチドは翻訳後修飾の形でおよび／または酵素によりおよび／または化学的に修飾された形で、有利にペプチド−オキシドの形で存在することができ、およびこの形で検出することができる。化学的に修飾されたまたは翻訳後修飾された補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドは、Ｄ−アミノ酸からならびにＬ−アミノ酸から、同様にＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物からなることもでき、かつ天然由来であるかまたは組み換えによりまたは酵素を用いて製造されるかまたは化学的に合成することもできる。さらに、このペプチド中には異常なアミノ酸、つまり２０種の標準アミノ酸には属さないアミノ酸を含有することもできる。この異常なアミノ酸および翻訳後修飾、例えばリン基およびスルフェート基、グリコシル化、アミノ化、脱アミノ化、プログルタミン酸などの多数の例は、文献およびデータバンクに記載されている［９］。
【００１８】
更に、本発明の範囲内で、唯一のまたは複数のアミノ酸または全体のペプチドがペプチドミメティックからなる構造により置き換えられていてもよい。ペプチドミメティックの概念は、本願明細書において可能な最も広い定義の形で使用されている。ペプチドミメティックは、非ペプチド構造構成要素を含有する物質であり、天然の母分子の生物学的作用を模倣するかまたは拮抗することができる。先行技術では、従来のペプチド構造の代用としてペプチドミメティックを利用することの可能性に関して行われた多数の研究が公知である。
【００１９】
核酸として、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッド分子は天然に由来するものかまたは合成により、酵素によりまたは組み替えにより製造されたものであると見なされる。さらに、核酸、生体内で高い安定性を示す修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエートも含める。このように安定化された核酸は、リボザイム技術、アンチセンス−ＲＮＡｉ（ＲＮＡ仲介干渉（RNA-mediated interference））技術およびトリプレックス核酸技術の適用時にも既に使用される。
【００２０】
本発明による方法は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の場合にその濃度が変化し、かつこの疾患が早期段階で既におよび疾患リスクを早期に示すことができる特異的バイオマーカーを検出する方法である。これは、この疾患の診断のために確かな臨床的マーカーを適用するために重要である。
【００２１】
有利に、試料中のＭＡＣ３−ペプチドの濃度も、複数の所定のＭＡＣ３−ペプチドが出現する特徴パターンも同様に、この疾患の重度と関連していることができる。従って、この新規のマーカーは、アルツハイマー病の治療法の開発およびそれに付随する制御を可能にする、それというのもこの経過および場合により治療法に基づき生じる治癒成果または疾患の進行の抑制を測定できるためである。アルツハイマー病の有効な治療法は、現在のところ不可能であり、アルツハイマー病疾患の確実な検出方法の提供の緊急性を強調されている、それというのもこの疾患の確実な検出が治療法の開発の前提条件であるためである。
【００２２】
ＭＡＣ３−ペプチドの検出は、さらに、アルツハイマー病の新規の治療方法を開発するための臨床研究の範囲内で、高い特異性で、アルツハイマー病を患うが他の疾患を患っていない患者だけを選択することを可能にする。前記のことは、有効な研究結果を得るために重要である、それというのも、アルツハイマー病患者と間違えて診断された患者がアルツハイマー病治療研究の結果の品質に不利に影響を及ぼすためである。
【００２３】
補体Ｃ３生物学
この補体系は、特異的または非特異的な免疫防御システムにおいて中心的な役割があり、３０個より多いタンパク質からなり、これはいくつかのプロテアーゼであり、他にはこのプロテアーゼの基質である。この相補系の機能は連鎖反応の種類に基づき、この連鎖反応の開始時に物質、例えば細菌の細胞膜が相補系の成分を活性化し、これが補体因子を活性化し、更に次々と補体因子を活性化する。この補体活性化は、健全な自分の細胞の溶解も引き起こすことがあり、これは補体活性化部位付近で偶然に認められた。このプロセスは「バイスタンダー」作用とも言われ、広範囲の組織破壊を引き起こしかねない。補体カスケードの進行においてここの補体タンパク質のタンパク質分解により放出されるいくつかのペプチドは、特にアナフィラトキシンのＣ３ａおよびＣ５ａは多岐にわたって免疫細胞を刺激して、局所的炎症反応を引き起こす［１０］。このアナフィラトキシンＣ３ａは例えば、細胞毒、血管拡張および細胞刺激特性を示す。アナフィラトキシンＣ３ａの他に、一連の他の補体Ｃ３−分解生成物、例えばＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｇ、Ｃ３ｅおよびＣ３ｆが公知である（図１）。これらのＣ３−ペプチドの中から、全てではないがいくつかの生物学的機能が公知である。
【００２４】
Ｃ３ｂから、ます最初に因子Ｉにより１７個のアミノ酸長さの小さなペプチドＣ３ｆが分離し、引き続き複数の他のＣ３−ペプチド、特にＣ３ｄｇが分離する。Ｃ３ｄｇは次に更にＣ３ｄとＣ３ｇとに分解される。このようにしてＣ３ｂは不活性化される［１１］。このＣ３ｄ−ペプチドは、無傷のＣ３−分子においてチオールエステル基が存在し、かつ従って補体を活性化する物質と共有結合するＣ３−ペプチドである。学問的な研究は、Ｃ３ｆが現在のところＣ３ａと類似する生物学的作用を媒介することが示されている。Ｃ３ｆとＣ３ａは平滑筋組織の収縮を引き起こし、かつ血管透過性を高める［１１］。更に、Ｃ３ａおよびＣ３ｆの場合ではＣ末端のアミノ酸がアルギニンであり、かつこのアミノ酸の分解により生物学活性がＣ３ａから並びにＣ３ｆから変化する。生じたこの生成物はＣ３ａ−ｄｅｓ−ＡｒｇもしくはＣ３ｆ−ｄｅｓ−Ａｒｇと言われる。恐らく、Ｃ３ｆおよびＣ３ａは、少なくとも部分的に、同じレセプターを使用していて、このことは類似の生物学的作用を説明することができる［１１］。
【００２５】
Ｃ３は主に肝臓によって合成されるが、局所的に単球細胞およびマクロファージによっても合成される。細菌性髄膜炎の進行、つまり脳内での細菌感染の場合に、脳脊髄液中でのＣ３濃度は約２０倍に高まる。アルツハイマー病の場合にも、同様に髄液中のＣ３濃度は上昇するが、２倍程度であり、一方で脳内の他の炎症反応の場合には、例えば無菌製髄膜炎の場合には脳脊髄液中のＣ３濃度は変化しない。補体タンパク質およびそのレセプターは特に小グリア細胞、星状細胞およびニューロンによって合成される。ｍＲＮＡおよび補体タンパク質Ｃ１〜Ｃ９のタンパク質の量は、アルツハイマー病患者の脳内では、健康な人の脳と比べて比較的高い。Ｃ３およびＣ４の濃度は、脳内では２倍高く、肝臓内での変化のない濃度は、健康な人と比較して、最もわずかしか変化していない。多様な他の補体タンパク質は、健康な人と比較して、アルツハイマー病患者の脳内では著しく高まる：Ｃ１ｑ  ｍＲＮＡは２３倍に高まり、Ｃ１ｒは５倍に、Ｃ７は６倍に、Ｃ９は２２倍に高まる［１２］。従って、補体Ｃ３タンパク質のフラグメントがアルツハイマー病に対するマーカーとして適していて、他の補体タンパク質のフラグメントがアルツハイマー病に対するマーカーとして適していないことは、意想外でありかつ予測されなかった。
【００２６】
アルツハイマー病患者の脳内で「プラーク」および「絡まり」の形で存在する堆積物は、恐らくベータ−アミロイドおよびタウ−タンパク質からなる。これらの主成分の他に、しかしながら多数の他のタンパク質が免疫組織学的にこの堆積物中で同定されている。これらのタンパク質には、特に１−アンチ−キモトリプシン、シナプトフィジン、システインＣ、Ｈｅｍｅ−オキシゲナーゼ、多様なアポリポタンパク質、例えばＡｐｏ  Ｅ４、Ａｐｏ  ＪおよびＡｐｏ  Ａ１、ＩＬ−６、ＡＭＹ−抗原、プリオン−タンパク質、ベータ−スペクトリン、アルファ−２−マクログロブリン、ラクトフェリンおよび多様な補体タンパク質、例えばＣ１ｑ、Ｃ３およびＣ４ｄが属する。タンパク質の他に、更にこの堆積物は、糖構造体、例えばヘパラン硫酸も含有する。この堆積物は、従ってタンパク質と他の物質とからなる複合構造体である。既に１９８２年に、Ｅｉｋｅｌｅｎｂｏｏｍらは、アルツハイマー病患者の脳内のこの堆積物が、特に補体Ｃ３を含有し、かつベータ−アミロイドが恐らく補体カスケードを活性化することを発見し、これは以後の研究において実験的に示すことができた［１３］。
【００２７】
多様な体液、例えば血液濾液、結晶または脳脊髄液中に、補体Ｃ３ペプチドＣ３ｆ並びにＣ３ｆの多様な部分配列が検出された。ペプチドＭＡＣ３−３〜ＭＡＣ３−１６はＣ３ｆペプチドフラグメントであり、このペプチドフラグメントは文献中にはいままでに記載されておらず、従って物質として新規である。ＭＡＣ３−１およびＭＡＣ３−２は、文献から既に公知である［４，１１］。しかしながら、今までにこのペプチドのＭＡＣ３−１〜ＭＡＣ３−１６は、神経変性疾患との関連で検討されたことはなく、従って、アルツハイマー病の検出のための診断マーカーとしてのその使用は新規である。従って、このことは特に、前駆体分子の補体Ｃ３が多数の公知でかつ正確に定義されたペプチドにおいてプロセシングされることが知られていて、かつ前駆体分子の補体Ｃ３から唯一Ｃ３ｆ−ペプチドおよび今まで公知でないＣ３ｆ−ペプチドフラグメントがアルツハイマー病の診断のために使用でき、他方で他の補体Ｃ３ペプチドは適当なマーカーとして同定されないことが予期できずかつ当業者に予想できなかったケースである。
【表１】
2005511063.tif 000003
【００２８】
＊  ｒ１はアミノ酸のセリンを表すかまたはこの配列箇所にはアミノ酸は存在せず、ｒ２はアミノ酸１３１３〜１３２０の補体Ｃ３の配列または配列の一部に相当する配列を表し、その際、ｒ２はＣ３前駆体のアミノ酸１３１２から出発し０〜８個のアミノ酸長さであることができる。相応して、ｒ３はアミノ酸１３０４〜１３１１のＣ３前駆体配列またはその一部を表し、その際、ｒ３はＣ３アミノ酸１３１２から出発し、０〜８個のアミノ酸長さであることができる。ｒ４はアミノ酸のアルギニンに相当するか、またはペプチド配列のこの位置には他のアミノ酸は存在しない。
【００２９】
本発明によるこのＭＡＣ３−ペプチドは翻訳後修飾の形または化学的修飾の形で存在することができ、これは特にその質量に関して、従って質量分析による同定に関して、およびクロマトグラフィー、例えば逆相クロマトグラフィーの場合の溶出挙動に関して影響を及ぼす。特に、このペプチドは酸化されて、リン酸化されて、グリコシル化されて、硫酸化されて、アミノ化されて、試験すべき試料中に存在していることができる。天然由来の、補体Ｃ３−多形またはＣ３−突然変異体から誘導された、Ｃ３ｆ−ペプチドおよびＣ３ｆ−ペプチドフラグメントは、同様にＭＡＣ３−ペプチドとして表される。少なくとも８個のアミノ酸がＣ３ｆ−配列（配列ＩＤ  １）と一致することを決定するために、配列の相同性を決定するために使用するのと同じコンピュータープログラムおよびアルゴリズムを使用する［５−８］。
【００３０】
このペプチドは、最大で２つのアミノ酸がＣ３−前駆体分子の相当する配列と異なる場合に、特にＭＡＣ３−ペプチドと見なされる。その際に、ペプチド配列が８〜１７個のアミノ酸長さであり、少なくとも８個のアミノ酸はＣ３−前駆体配列に相対的に保存されていて、かつ最大で２つのアミノ酸がＣ３ｆ−配列とは異なる限りにおいて、点突然変異、欠失、アミノ酸の挿入およびＮ末端および／またはＣ末端の延長が許容される。
【００３１】
疾患の陽性の証明のために、同定された１種以上のＭＡＣ３−ペプチドの濃度が、それぞれのペプチドについて特異的に高い濃度のまたは特異的に低い濃度の個々のそれぞれのペプチドに対して変化していることが想定される。それぞれのペプチドの濃度は、アルツハイマー病の重度の決定のために使用することができ、特に「簡易精神状態試験（Mini-Mental Status Examination）」（ＭＭＳＥ）の実施に代わる方法としてまたは補足する方法として用いることができる。
【００３２】
場合により使用された対照試料は、多様な対照からのプール試料であることができる。この調査すべきアルツハイマー試料は、プール試料であることもでき、その際、陽性の結果の場合に単一試験が行われる。対照試料中の個々のＭＡＣ３−ペプチドの測定の結果から、それぞれ個々のＭＡＣ３−ペプチドについての対照値を決定することができる。アルツハイマー病患者とアルツハイマー病ではない患者との区別のための将来的測定の場合には、次いで、この診断を行うために測定された測定値と対照値を比較することができる。
【００３３】
この体液試料は、有利に（ヒトの）脳脊髄液（髄液、ＣＳＦ）または他の生物学的材料、例えば血清、血漿、尿、便、涙、滑液、リンパ液などの試料であることができる。これらは、特に選択された検出方法（質量分析法、ＥＬＩＳＡなど）の感度に依存する。同様に、細胞試料または組織試料も場合により使用することができる。従って、本発明のもう一つの実施形態の場合には、調査すべき試料の準備のために、例えばバイオプシーの範囲内で得られたヒト組織試料または血液細胞から、細胞または組織ホモジェネートを製造することも想定される。この組織を、例えば手動ホモジェナイザー、超音波ホモジェナイザーまたは電気駆動のホモジェナイザー、例えばＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて破砕し、引き続き当業者に公知の方法で、例えば０．１〜０．２Ｍの酢酸を含有する酸性の水溶液中で１０分間乾燥させる。引き続き、この抽出物にそれぞれの検出方法、例えば質量分析による試験を行う。この試料は通常の方法で準備することができる、例えば場合により希釈または濃縮および貯蔵することができる。
【００３４】
ＭＡＣ３−ペプチドの使用
さらに本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の診断のための少なくとも１種の本発明によるＭＡＣ３−ペプチの使用、ならびにそのＭＡＣ３−ペプチド−特異的結合特性に基づきこの疾患の検出のための診断試薬の開発のために適している抗体または他の抗原の獲得のためのＭＡＣ３−ペプチドの使用にも関する。同様に、本発明は、このペプチドと特異的に結合するか、または反対にＭＡＣ３−ペプチドをその表面に提示しかつＭＡＣ３−ペプチドの結合パートナーを同定することが可能となるファージ粒子の獲得のためのＭＡＣ３−ペプチドの使用にも関する。
【００３５】
ＭＡＣ３−ペプチドのための検出方法
本発明の範囲内で、ＭＡＣ３−ペプチドの検出のために多様な方法を使用することができる。このために、ＭＡＣ３−ペプチドを患者の試料中で特異的に検出できる全ての方法が適している。適当な方法は、特に物理学的方法、例えば質量分析または液体クロマトグラフィー、分子生物学的方法、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または免疫学的検出技術、例えば「酵素リンク免疫吸収アッセイ（Enzyme linked immunosorbent assays）」（ＥＬＩＳＡ）である。
【００３６】
物理学的検出方法
本発明の実施形態は、本発明によるペプチドを定性的または定量的に示すことができる物理学的方法を使用することである。この方法には、特に質量分析、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびＮＭＲ（各磁気共鳴）分光分析などが属する。このために、定量的測定結果は、神経変性疾患、有利にアルツハイマー病を患う患者の集団から得られた試験すべき試料から得られる。この結果から疾患の存在および／またはこの疾患の重度の確率を導き出すことができる。
【００３７】
本発明の有利な実施形態の場合には、試料中のペプチドを、同定の前にクロマトグラフィーにより分離する、有利に逆相クロマトグラフィーにより分離する、特に有利に高解像度逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて試料中のペプチドを分離する。本発明のもう一つの実施形態は、試料の分別のために、沈殿剤、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、トリクロロ酢酸、アセトン、エタノールなどを用いて沈殿反応を実施することである。こうして得られたフラクションはそれぞれの検出法にかけられ、例えば質量分析試験にかけられる。本発明の他の実施形態の場合には、液相抽出を使用する。このために、試料を、例えば有機溶剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と水性塩溶液とからなる混合物と混合する。この物理学的特性に基づき、試料の測定すべき内容物は有機相中に濃縮され、他のものは水相中に濃縮され、相互に分離することができる。
【００３８】
逆相クロマトグラフィー
本発明の特に有利な実施形態は、ヒト脳脊髄液中のペプチドを分離するために、特にＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムを使用して、トリフルオロ酢酸とアセトニトリルとからなる展開剤を用いる逆相クロマトグラフィーを包含する。例えば、それぞれのフラクションを集め、これは使用する展開剤の体積のそれぞれ１／１００を含む。こうして得られたフラクションを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−質量分析（「マトリックス−支援レーザー脱離−イオン化（Matrix-assisted-laser-desorption-and-ionisation）」）を用いて、アセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸およびアセトンからなる混合物中に溶かした、Ｌ（−）フコースとアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸とからなるマトリックス溶液を使用して分析し、所定の質量の存在を確認しかつシグナル強度を定量化する。この質量は、本発明によるペプチドのＭＡＣ３−１〜ＭＡＣ３−１６の質量に相当する。
【００３９】
質量分析
本発明による有利な実施形態の場合には、ＭＡＣ３−ペプチドの同定を質量分析により測定する、有利にＭＡＬＤＩ質量分析で行うことができる。この場合、質量スペクトルによる測定はさらに有利に、それぞれ相応するペプチドの理論的なモノアイソトピック質量を用いて算定した少なくとも１つの次の質量シグナルを有する。この場合、実験誤差および自然のアイソトープ分布に基づく理論的なモノアイソトピック質量の軽微な偏差が生じることがある。さらに、ＭＡＬＤＩ−質量測定の場合には、この測定方法に基づき、ペプチドにプロトンが加わり、それによりこの質量は１ダルトンだけ高まる。次の質量は、適当なソフトウェア（この場合にＧＰＭＡＷ  ４．０２）を用いて計算した同定されたペプチドの理論的なモノアイソトピック質量に相当する。この理論的なモノアイソトピック質量は、試料中で単独でまたは組合わさった形で出現することがある：ＭＡＣ３−１＝２０２００．１／ＭＡＣ３−２＝１８６３．９／ＭＡＣ３−３＝１６３７．８／ＭＡＣ３−４＝１４７９．７／ＭＡＣ３−５＝１２６３．６／ＭＡＣ３−６＝１０７７．６／ＭＡＣ３−７＝１９３３．０／ＭＡＣ３−８＝１７７６．９／ＭＡＣ３−９＝１８４６．０／ＭＡＣ３−１０＝１６８９．９／ＭＡＣ３−１１＝１７１７．９／ＭＡＣ３−１２＝１５６１．８／ＭＡＣ３−１３＝１４４８．７／ＭＡＣ３−１４＝１２１０．６／ＭＡＣ３−１５≧９９０．５およびＭＡＣ３−１６≧９４１．４ダルトン。更に、実験的に測定された質量２０３８および／または２０５４が出現することがある。この両方の実験的に測定された質量は、１箇所または２箇所酸化されたペプチドの形のＭＡＣ３−１である。記号≧（大きいかまたは等しい）は、該当するＭＡＣ３−ペプチドに対して任意に大きな質量が可能であるのではなく、単にこのペプチドの末端に付加的に存在することができるアミノ酸に基づいて生じる質量であると解釈される。このペプチドは全体で最大１７個のアミノ酸長さであることができる。このペプチドの末端には任意のアミノ酸が付加的に存在できるのではなく、この配列位置の補体Ｃ３前駆体分子の配列に基づき存在することができるようなアミノ酸が存在できる。
【００４０】
ＭＡＣ３−ペプチドの配列の質量分析測定
この実施形態をさらに実際に適用する場合には、検出結果の他の検証は、質量に一致するペプチドの同一性を測定し、その際に補体Ｃ３ｆ−ペプチドから誘導することができるペプチドシグナルをもっぱら考慮することにより可能でありかつ推奨される。この検証は、有利に質量分析法を用いて、例えばＭＳ／ＭＳ−分析を用いてペプチドシグナルの同定によって行われる［１４］。
【００４１】
本発明による方法により、初めて補体Ｃ３ｆ−ペプチドの特異的ペプチドフラグメント、並びにＣ３ｆ−ペプチド自体（ＭＡＣ３−１に相当）が同定され、かつその重要性が認識された。このＣ３ｆ−ペプチドおよびその誘導体は、本願明細書ではＭＡＣ３−１〜ＭＡＣ３−１６と表す。この配列は、配列表において配列ＩＤ１〜配列ＩＤ１６で記載した。この配列ＩＤ１５および１６で記載したＭＡＣ３−ペプチド（ＭＡＣ３−１５およびＭＡＣ３−１６）は、Ｎ末端および／またはＣ末端に、補体Ｃ３ｆ−ペプチド（配列ＩＤ１、ＭＡＣ３−１）の対応する配列に応じた付加的なアミノ酸を有することができる。本発明は、非修飾の形、化学的に修飾した形または翻訳後修飾した形の組み換えまたは合成により製造したＭＡＣ３−ペプチドならびに生物学的試料から単離したＭＡＣ３−ペプチドも包含する。この場合に、ＭＡＣ３−ペプチドが少なくとも８個のアミノ酸を有し、このアミノ酸がペプチド配列の中でその同一性およびその位置において補体Ｃ３ｆ−ペプチドと一致する場合に限り、２箇所の点突然変異ならびに他の相違も可能である。
【００４２】
分子生物学的検出技術
最後に、本発明は、補体Ｃ３−フラグメントに相当する核酸、および特に本発明によるＭＡＣ３−ペプチドに相当する核酸、および所属するタンパク質分子の間接的測定および定量化のためのその使用でもある。その中には、例えばコードされない配列、例えばｍＲＮＡの５’−または３’−非翻訳領域である核酸、または特異的ハイブリダイゼーション試験のために補体Ｃ３の核酸配列との十分な配列一致を示す、従って所属するタンパク質、特にＭＡＣ３−ペプチドの間接的な検出に適している核酸も含まれる。
【００４３】
これについての実施例は、患者の組織試料を獲得し、引き続き、補体Ｃ３の遺伝子に一致するかまたは相同の遺伝子に一致するＲＮＡ転写物の濃度を測定することである。この場合、調査すべき試料からの定量的測定結果（強度）を、アルツハイマー病を患う患者の集団および対照集団の場合に得られた測定値と比較する。定量化のために、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）またはノーザンブロットのような当業者に公知の方法を使用することができる。この結果からアルツハイマー病の疾患の存在および／またはその重度の確率を推論することができる。
【００４４】
免疫学的検出方法
本発明の他の有利な実施形態によると、ＭＡＣ３−ペプチドの同定は免疫学的検出システム、有利にＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）を使用して実施することができる。この場合、この免疫学的検出は少なくとも１つのＭＡＣ３−ペプチドを捉える。この特異性を高めるために、さらに有利に、いわゆる「サンドウィッチ−ＥＬＩＳＡ」を使用することができ、この場合にＭＡＣ３−ペプチドの検出は、同じ分子内の異なるエピトープを認識する２つの抗体の特異性に依存する。しかしながら、ＭＡＣ３−ペプチドの検出のために他の免疫学的方法、例えば直接的または競合的免疫学的方法を使用することもできる。同様に、他のＥＬＩＳＡ類似の検出技術、例えばＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ（radio immuno assays））、ＥＬＩ−Ｓｐｏｔ、ルミネッセンス−、化学ルミネッセンス−、電気化学ルミネッセンス−、蛍光−またはバイオルミネッセンス−免疫アッセイ法などが、ＭＡＣ３−ペプチドの免疫学的検出システムとして適している。定量化のための標準として、生物学的試料から単離された、組み換えにより製造されたまたは化学的に合成されたＭＡＣ３−ペプチドを使用することができる。１種または数種のＭＡＣ３−ペプチドの同定は、例えば一般に、ペプチドまたはペプチドフラグメントに結合する抗体を用いて、つまりペプチドに特異的な抗体を用いて行うことができる。ペプチド検出にとって適当な他の検出方法は、特にウェスタンブロット、免疫沈降法、ドット−ブロット（Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ）、プラズモン共鳴スペクトル分析（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））、ファージ粒子、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アフィニティマトリックスなどである。一般に、特異的検出システムを構築することができる全ての物質／分子が検出試薬として適している。
【００４５】
これら全ての免疫アッセイ法の場合には、ＭＡＣ３−ペプチドに対して特異的な結合パートナーを適当なキャリア上に固定化するのが有利である。キャリアとして全ての公知のキャリア、例えばプラスチック小管、微量滴定プレート、粒子、マイクロ粒子、タンパク質チップなどを使用することができる。
【００４６】
結合パートナーをこのキャリアに直接固定化するかまたは固相を吸着または共有結合させて固定化することができる。他の方法は、ＭＡＣ３−ペプチドに対する結合パートナーを個々に一対の結合ペアを介して、例えばビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体などを介して固定化することにある。これらの方法は当業者に公知である。
【００４７】
本発明の他の対象は、少なくとも１つの結合パートナー、有利にＭＡＣ３−ペプチドに対して結合する抗体を有するアルツハイマー病またはアルツハイマー病の体質を検出するためのテストキットである。この結合パートナーは、適当な固相またはキャリアに固定化された形で結合して存在するかまたは固定化が可能である形で提供することができる。例えば、間接的結合としてビオチン／アビジン−相互作用を利用する場合には、結合パートナーはビオチン化されていることができる。
【００４８】
この結合パートナーは、しかしながら同様にテストキット中では標識された形で存在するか、または標識化が可能である形で存在することができる。間接的標識は、結合パートナーの相互作用、例えばアビジン／ビオチンもしくはストレプトアビジン／ビオチンまたはジゴキシン／アンチ−ジゴキシン−抗体を介して挿入することができる。これらの方法は当業者に公知である。
【００４９】
さらに、テストキット中では、固定化されたかまたは標識された結合パートナーの他に、少なくとも１種のＭＡＣ３−ペプチドからなる標準を含有することができる。通常では、標準として異なる公知のＭＡＣ３−ペプチド濃度を有する複数の溶液が提供される。
【００５０】
ＭＡＣ３−ペプチドおよびアンチ−ＭＡＣ３−ペプチド抗体の獲得
本発明によるもう一つの実施形態は、当業者に公知の組み換え発現システム、クロマトグラフィー法および化学的合成プロトコルを使用してＭＡＣ３−ペプチドを獲得することである。こうして得られたＭＡＣ３−ペプチドは、特にそれぞれのＭＡＣ３−ペプチドの定量化のための標準としてまたはＭＡＣ３−ペプチドに特異的な抗体の製造のための抗体として使用することができる。ＭＡＣ３−ペプチドを単離しかつ獲得するための当業者に公知の適当な方法には、ペプチドの組み換え発現が属する。ＭＡＣ３−ペプチドの発現のために、特に細胞システム、例えばバクテリア、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  （Ｓｆ−９）細胞、またはほ乳類細胞、例えば「チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary）」（ＣＨＯ）細胞を使用することができる。これらの細胞は「アメリカ組織培養コレクション（American Tissue Culture Collection）」（ＡＴＣＣ）から得ることができる。ＭＡＣ３−ペプチドの組み換え発現のために、例えばＭＡＣ３−ペプチドをコードする核酸配列を、適当な調節する核酸配列、例えばプロモータ、抗生物質選択マーカーなどと組み合わせて、分子生物学的方法で発現ベクター内へ挿入する。このために適したベクターは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐｃＤＮＡ３．１である。こうして得られたＭＡＣ３−ペプチド発現ベクターを次に適当な細胞内へ例えばエレクトロポレーションにより導入することができる。ＭＡＣ３−ペプチドを化学合成によって製造することは、例えばメリフィールド−固相−合成プロトコルに従って、多様な製造元から入手可能である自動合成装置を使用して行うことができる。本発明のもう一つの実施形態は、生物学的試料からまたは組み換え発現システムの細胞媒体または細胞溶解産物からＭＡＣ３−ペプチドを、例えば逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動などを用いるか、または分取免疫沈降、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶剤などを用いた抽出などの他の方法を用いて単離することである。本発明のもう一つの実施形態は、ＭＡＣ３−ペプチドを使用してモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を獲得することである。抗体の獲得は、通常の当業者に公知の方法で行う。有利な実施形態は、ＭＡＣ３−ペプチドにだけ存在するが、しかしながら完全な補体Ｃ３−前駆体分子中には出現しないｎｅｏ−エピトープを認識するＭＡＣ３−ペプチドに特異的な抗体を製造および獲得することである。このようなアンチ−ＭＡＣ３−ペプチド−抗体は補体Ｃ３−前駆体分子の存在でＭＡＣ３−ペプチドを特異的に免疫学的に検出することができる。
【００５１】
ＭＡＣ３−ペプチド決定による治療法開発および監視
もう一つの適用例は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病に対する開発途中にある治療法の有効性を評価するための前記したペプチドの定量的測定である。この場合には、試験すべき試料からの定量的測定結果と、対照集団および患者のグループで得られた測定値とを比較する。
【００５２】
この結果から治療法の有効性を導き出すことができる。この有効性試験は、治療法の有効な開発のために特に重要であり、今までにはアルツハイマー病に対して信頼することができる臨床的に測定可能なパラメーターは提供されていなかった［３］。
【００５３】
この方法を使用して、アルツハイマー病の脳脊髄液中で対照グループに対して相対的にそれぞれのペプチドに特異的に陽性または陰性に変化する濃度で存在する限定的にプロセッシングされかつ限定的に翻訳後修飾された、補体Ｃ３ｆ−分子のアミノ酸配列から誘導されたペプチド、並びにＣ３ｆペプチド自体が同定された。
【００５４】
ＭＡＣ３−ペプチドの治療的適用の開発
アルツハイマー病患者の場合に、健康なヒトと比較してＭＡＣ３−ペプチドの濃度が明らかに変化している。本発明の他の観点は、従って、アルツハイマー病患者の場合のＭＡＣ３−濃度を通常の濃度にすることでもある。この方法は、アルツハイマー病または類似する神経学的疾患の治療法に使用することができる。補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドの濃度が高められた場合に、この物質の濃度を、例えばアンチ−補体Ｃ３またはアンチ−ＭＡＣ３−ペプチド抗体または補体Ｃ３−特異的アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ−核酸分子またはトリプレックス−核酸またはＭＡＣ３−ペプチド−アンタゴニストまたは補体Ｃ３−アンタゴニストの治療的投与により低減することができる。治療法のために、補体Ｃ３の生体固有の発現または補体Ｃ３からＭＡＣ３−ペプチドへのプロセッシングを抑制する物質を投与することもできる。補体Ｃ３またはＭＡＣ３−ペプチドの欠乏が疾患の原因である場合には、補体Ｃ３、ＭＡＣ３−ペプチド、ＭＡＣ３−ペプチド−アゴニストまたは補体Ｃ３−アゴニストの治療的投与を行うこともできる。補体Ｃ３からＭＡＣ３−ペプチドへのプロセッシングに影響する物質も治療的に使用することができる。もちろん、多様な治療ストラテジーの組み合わせも場合によっては有効であり、可能である。
【００５５】
従って、本発明は、神経学的疾患、特にアルツハイマー病の治療の目的で、補体Ｃ３−ペプチドおよびＭＡＣ３−ペプチドの濃度を直接的または間接的に変化させるために、補体Ｃ３−ペプチド、ＭＡＣ３−ペプチド、ＭＡＣ３−ペプチド−アゴニストおよびＭＡＣ３−ペプチド−アンタゴニスト、補体Ｃ３−ペプチド−アゴニストおよび補体Ｃ３−ペプチド−アンタゴニスト、アンチ−補体Ｃ３抗体およびアンチ−ＭＡＣ３−ペプチド抗体を使用をも包含する。抗体とは別に、抗体フラグメント、抗体融合タンパク質、または他の補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドに選択的に結合する他の物質を使用することもできる。前記のタンパク質およびペプチドとは別に、前記のタンパク質およびペプチドの融合タンパク質を使用することもできる。さらに、本発明は、前記のタンパク質およびペプチドの発現を調節するアンチセンス−核酸、トリプレックス−核酸、ＲＮＡｉ−核酸分子、リボザイムおよび他の核酸を使用することでもある。さらに、本発明は、前記のタンパク質の活性を調節するアゴニストおよびアンタゴニストでもある。
【００５６】
本発明の他の実施形態は、医薬調製物または血液−脳−隔壁および／または血液−髄液−隔壁を有効に通過することができるように記載されたペプチドおよび核酸を化学的に修飾することである。それにより、これらは特に治療的用途に適している。これを達成するために、例えばＭＡＣ３−ペプチド、補体Ｃ３−ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、アゴニストまたはアンタゴニストを、例えば親油性にしてクモ膜下腔内、脳室内並びに脳組織内へ侵入しやすくなるように修飾することができる。これは、疎水性分子成分の導入によるか、またはこの物質を疎水性の物質、例えばリポソーム中に「パッケージング」することにより達成ることができる。さらに、例えば、クモ膜下腔内へ侵入しやすくするか、もしくは反対にクモ膜下腔から外に出にくくするペプチド配列をこのＭＡＣ３−ペプチドまたは補体Ｃ３−ペプチド、核酸、アゴニストまたはアンタゴニストに接合することもできる。
【００５７】
本発明は、前記の治療薬の、多様な経路、例えば静脈内注射として、経口投与可能な物質として、吸入可能なガスまたはエアゾールとしての投与、またはクモ膜下腔、脳室内への直接的注射の形または筋肉、脂肪、脳などの組織への直接的注射の形での投与でもある。それにより、生物学的利用性および有効性を高めることができ、並びに治療薬の局所的濃度を高めることができる。例えば、経口投与したペプチドまたはタンパク質は、耐酸性カプセルにより胃中でのタンパク質分解から保護できる。著しく疎水性の物質は、適当な製剤学的処理によってより親水性にし、従って例えば静脈内注射用により適するようにすることができる。さらに可能な投与形態は、特に作用物質のポリマーおよびゲル中へのパッケージングなどである（米国、コロラド州、フォート・コリンズのアトリックス・ラブズ社（Atrix Labs, Fort Collins, CO, USA）、米国、フロリダ州、デイビーのアンドリクス・ファーマスーティカル社（Andrx Pharmaceuticals, Davie, FL USA））。
【００５８】
本発明の他の実施形態は、ＭＡＣ３−ペプチドまたは補体Ｃ３−ペプチドと選択的に結合するレセプターを同定するための、ＭＡＣ３−ペプチドまたは補体Ｃ３−ペプチドの使用である。このレセプターも、アゴニストまたはアンタゴニストの投与によって調節することができ、このことは神経学的疾患、特にアルツハイマー病の治療のために有効である。補体Ｃ３−ペプチド、ＭＡＣ３−ペプチドおよびこれらの物質の発現および生物学的利用能を変性する作用物質の治療作用の試験のための実施例は、セルラインの培養を包含する。このセルラインは補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドでまたはペプチドミメティックでまたは補体Ｃ３−ペプチドの発現を促進する物質または補体Ｃ３−ペプチドからＭＡＣ３−ペプチドへのプロセッシングを促進する物質で処理することができる。それにより、神経学的疾患、特にアルツハイマー病との関連で補体Ｃ３−ペプチドおよびＭＡＣ３−ペプチドの生物学的特性を測定することができる。融合タンパク質および融合ペプチド、例えばセルライン中への融合タンパク質の輸送を促進するペプチド配列を有する融合タンパク質もセルラインの処理のために使用することができる。可能な融合パラメーターの例は、ＨＩＶ−ＴＡＴ−配列またはアンテナペディア−配列、ヘルペスシンプレックスＶＰ２２−配列などである。同様にセルラインを発現ベクターでトランスフェクションし、この発現ベクターはトランスフェクションされた細胞によって補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドの直接的または間接的発現を引き起こすこの発現ベクターは特にＭＡＣ３−ペプチドまたは補体Ｃ３−ペプチドをコードすることができる。同時に多様なＭＡＣ３−ペプチドおよび／または補体Ｃ３−ペプチドを用いたトランスフェクションも実施することもできる。また、適当なセルラインをアンチ−補体Ｃ３−ペプチド−抗体またはアンチ−ＭＡＣ３−ペプチド−抗体または補体Ｃ３−ペプチドの発現を抑制する核酸、例えば補体Ｃ３−アンチセンス−核酸、補体Ｃ３−トリプレックス−核酸、補体Ｃ３−ＲＮＡｉ−核酸または補体Ｃ３−ｍＲＮＡに対して結合するリボザイムで処理することができる。特別に、神経学的モデルシステムとして補体Ｃ３との関係で適していると考えられるセルラインを、このような試験に用いることもできる。この試験のための「読み出し」装置として、特に処理された細胞の増殖速度、その物質交換活性、細胞のアポトーシス速度、細胞モルホロジーの変化、細胞独自のタンパク質またはレポーター遺伝子の発現または細胞死のためのマーカーとしてのサイトソル性細胞成分の放出を測定する試験を使用することができる。
【００５９】
他の試験システムとして、神経学的疾患用のモデルとして、特にアルツハイマー病用のモデルとして適している実験動物、例えばマウス、ラットまたは他の種の適当な株を使用することができる。これらの実験動物は、ＭＡＣ３−ペプチドまたは補体Ｃ３−ペプチドの濃度の変化を目標とする治療ストラテジーの効果を調査するために使用することができ、その際、これらのペプチドおよびタンパク質は場合により、血液−脳−隔壁および／または血液−髄液−隔壁をより良好に通過できるように製剤学的に調製されていてもよい。製剤学的調製方法として、特にリポソーム−パッケージングタンパク質およびペプチド、トランスポートペプチド、例えばＨＩＶ−ＴＡＴ−配列などと共有結合で融合したかまたは共有結合でなく会合したタンパク質およびペプチドを使用することができる。さらに、ペプチドおよびタンパク質は、親水性の特性を維持し、従って細胞内へ容易に侵入できるように化学的に修飾されていることもできる。水溶液中に難溶性であるペプチドは親水性になるように修飾され、かつ例えば静脈内に注射可能な治療薬として使用することもできる。経口投与すべき敏感な物質を胃内で保護するために耐酸性のカプセルを使用することもできる。
【００６０】
動物モデルを用いた試験の場合の「読み出し」パラメーターは、動物の生存時間、その挙動、その短期記憶能力、学習能力などである。実験動物、例えばラット用に適している記憶試験の例は、「モリス水迷路試験（Morris water maze test）」である。他のパラメーターとして、身体機能、例えば血液試験の測定、脳障害の測定、物質代謝試験、補体Ｃ３−ペプチドおよびＭＡＣ３−ペプチドおよびこの疾患と関連する他のタンパク質の発現、ならびに組織、例えば脳の形態学的および組織学的試験を使用することができる。
【００６１】
補体Ｃ３−ペプチドおよびＭＡＣ３−ペプチドの機能を調査するための他の方法として、分子生物学的方法を使用して、補体Ｃ３−ペプチドまたはＭＡＣ３−ペプチドを産生しないか、または減少された量または高めた量で産生する実験動物、例えば遺伝子的に定義された動物、またはトランスジェニック動物を得ることができる。この場合に、この発現は局所的に、例えば脳内でも、試験動物の全身においてで変更することができる。試験動物としては特にＣ．エレガンス（Caenorhabditis elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophila）、ゼブラフィッシュ、マウス、ラットなどが適している。
【００６２】
本発明を次に実施例を用いて詳細に説明する。この場合に図面も参照される。
【００６３】
図１は、相互に整列させた形で示した同定されたＭＡＣ３−ペプチドの位置を示す補体Ｃ３タンパク質の概略図を表す。ペプチドの理論的なモノアイソトピック質量（ダルトンで表示）はソフトウェアＧＰＭＡＷ４．０２を用いて算出した。ＭＡＣ３−１＝２０２０．１／ＭＡＣ３−２＝１８６３．９／ＭＡＣ３−３＝１６３７．８／ＭＡＣ３−４＝１４７９．７／ＭＡＣ３−５＝１２６３．６／ＭＡＣ３−６＝１０７７．６／ＭＡＣ３−７＝１９３３．０／ＭＡＣ３−８＝１７７６．９／ＭＡＣ３−９＝１８４６．０／ＭＡＣ３−１０＝１６８９．９／ＭＡＣ３−１１＝１７１７．９／ＭＡＣ３−１２＝１５６１．８／ＭＡＣ３−１３＝１４４８．７／ＭＡＣ３−１４＝１２１０．６／ＭＡＣ３−１５≧９９０．５およびＭＡＣ３−１６≧９４１．４ダルトンである。質量分析計で実際に同定された質量は、自然のアイソトープ分布に基づき、ならびにわずかな測定誤差に基づき、理論的なモノアイソトピック質量から変動する。この測定精度は１０００〜４０００ダルトンの質量範囲内でペプチドに対して５００ｐｐｍであり、この場合に４０００ダルトンよりも大きな質量を有するペプチドに対する測定の誤差は段階的に増加する。さらに、全てのペプチドの測定された質量は、使用した測定法に基づき、１プロトンの質量（＝１ダルトン）だけ高くなっている。さらに、このペプチドＭＡＣ３−１は、１個または２個の付加的に共有結合した酸素原子を有するペプチド−変異体の形で同定することができ、その際にそれぞれの酸素原子に相当する約１６ダルトンはペプチドの質量に加算される。この場合に実験的に測定したＭＡＣ３−１の質量は、２０３８および２０５４ダルトンであり、この場合にＭＡＣ３−１の質量はそれぞれの配列において酸素原子の質量分が高くなっている。
【００６４】
図２は、脳脊髄液からのＭＡＣ３−ペプチドの分離および濃縮のための、実施例２による逆相クロマトグラフィーにかけた試料の溶出プロフィールを示す。ＭＡＣ３−１ペプチドが溶出する位置は矢印によりマークされている。
【００６５】
図３は、実施例２によるヒト脳脊髄液の逆相クロマトグラフィーを行った後に、実施例３によるＭＡＣ３−１のＭＡＬＤＩ−質量分析測定により得られたスペクトルを示す。ＭＡＣ３−１は、補体Ｃ３に由来するＣ３ｆ−ペプチドの配列に一致し、矢印によりマークされている。
【００６６】
図４は、本発明によるペプチドのＭＡＣ３−１の実施例４によるＭＳ／ＭＳ−フラグメントスペクトルを示す。図４Ａはこの測定の生データを示し、図４ＢはＭＡＣ３−１の変換した、デコンボリューションした質量分析を示す。図４Ｂ中のピーク形状は、ＭＡＣ３−１に対して特徴的である。ＭＡＣ３−１は補体Ｃ３タンパク質のＣ３ｆ−ペプチドに一致する（配列ＩＤ  １）。
【００６７】
図５は相対的に定量化するＭＳ法としてＭＡＬＤＩにより得られたデータを示す。試料は多様な量の異なる標準ペプチドを混ぜ、標準シグナルならびに代表的な試料シグナルの強度を測定した。標準の全てのシグナル−強度は濃度０．６４μＭ（＝１）の場合のシグナル強度に規格化した。各ペプチドは、シグナル強度と濃度との間で個々の典型的な関係を示し、これについてはこの図中で曲線の上昇によって読み取ることができる。
【００６８】
図６は、２箇所酸化された形（図６ＡおよびＢ）、１箇所酸化された形（図６ＣおよびＤ）、酸化されていない形（図６ＥおよびＦ）および２価の電荷を有するイオンとして（図６ＧおよびＨ）の、ペプチドＭＡＣ３−１についての箱ヒゲ図を示す。図６Ａ〜Ｆ中にはそれぞれ１価の電荷を有するイオンが分析されている。それぞれのＭＡＣ３−１変異体は、アルツハイマー病患者と健康な対照との間の比較において（図６Ａ、Ｃ、ＥおよびＧ）およびアルツハイマー病患者とアルツハイマーではない患者との比較において（図６Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）示されている。
【００６９】
図７〜１１は、箱ヒゲ図の形での、健康な対照と、アルツハイマー病患者とを比較した場合（図Ａ）のおよびアルツハイマー病ではない患者と、アルツハイマー病患者とを比較した場合（図Ｂ）の、ＭＡＣ３−２、ＭＡＣ３−７、ＭＡＣ３−８、ＭＡＣ３−９およびＭＡＣ３−１３の積分されたＭＡＬＤＩ−質量分析によるシグナル強度の比較を示す。
【００７０】
実施例１：ＭＡＣ３−ペプチドの測定のための脳脊髄液の採取
髄液または脳脊髄液（Liquor cerebrospinalis）は４つの脳室中およびクモ膜下腔中に含まれる液体であり、この液体は特に側脳室の脈絡叢中に形成される。脳脊髄液の採取はたいていは腰椎穿刺により、まれに後頭下穿刺または脳室穿刺により行う。脳脊髄液の採取のための腰椎穿刺（脊髄穿刺）の場合に、脊髄クモ膜下腔の穿刺時に第３と第４腰痛の間または第４と第５腰椎の間に長い中空針を穿刺し、髄液を得る。引き続きこの試料を１０分間２０００×ｇで遠心分離し、上澄液をマイナス７０℃で貯蔵する。
【００７１】
実施例２：ＭＡＣ３−ペプチドの質量分析測定のための脳脊髄液（ＣＳＦ）中のペプチドの分離
ＣＳＦ中のＭＡＣ３−ペプチドを質量分析により検出するために、この実施例ではペプチド内容物の分離が必要である。この試料の前処理は、本発明によるペプチドを濃縮し、測定に障害となり得る成分を分離するために用いられる。分離方法としては、逆相クロマトグラフィーが実施される。この場合には、多様なＲＰ−クロマトグラフィー樹脂および展開剤が同程度に適している。次に、例えばＶｙｄａｃ社の４ｍｍ×２５０ｍｍのサイズのＣ１８逆相クロマトグラフィーカラムを使用してＭＡＣ３−ペプチドを分離する。次の組成の展開剤を使用した：展開剤Ａ：：トリフルオロ酢酸０．０６％（ｖ／ｖ）、展開剤Ｂ：トリフルオロ酢酸０．０５％（ｖ／ｖ）、アセトニトリル８０％（ｖ／ｖ）。このクロマトグラフィーを３３℃でアジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies）のＦｌｕｓｓｚｅｌｌｅ  Ｍｉｃｒｏを備えたアジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies）のＨＰ−ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ  １１００を使用して行った。試料としてヒトの脳脊髄液を使用した。髄液４４０μｌを水で１６５０μｌに希釈し、ｐＨを２〜３に調節し、この試料を１０分間１８０００×ｇで遠心分離し、引き続きこうして準備した試料１５００μｌをクロマトグラフィーカラムで分離した。このクロマトグラフィー条件は次のようであった：０分の時点で展開剤Ｂ５％、１〜４５分の時点で展開剤Ｂ濃度を５０％まで連続的に上昇させる、４５〜４９分の時点で展開剤Ｂ濃度を１００％まで連続的に上昇させる、引き続き５３分の時点まで緩衝液Ｂを１００％で保持する。クロマトグラフィーの開始後１０分にそれぞれ０．５ｍｌまでの９６のフラクションの採取を開始した。ここに記載した試験条件下で製造した脳脊髄液試料のこのクロマトグラムを図２に示した。
【００７２】
実施例３：ＭＡＬＤＩ−質量分析を用いたペプチドの質量の測定
質量分析のために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離−イオン化法）においてペプチドの陽イオンスペクトルをプロットした。適当なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析計は、フレーミングハムのパーセプティブ・バイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems Framingham）（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ，Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ、またはＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ）またはブレーメンのブルッカー・ダルトニック社（Bruker Daltonik Bremen）（ＢＩＦＬＥＸ）により製造した。試料の調製のために、試料を、一般に有機酸からなるマトリックス物質と混合する。ペプチド用に適している典型的なマトリックス物質は、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸および２，５−ジヒドロキシ安息香酸である。本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの測定のために、乾燥し、逆相クロマトグラフィーにより得られた当量の相応する４００μｌのヒト脳脊髄液を使用した。このクロマトグラフィー処理された試料をマトリックス−溶液１５μｌ中に溶かした。このマトリックス溶液は、例えばアセトニトリル、水、トリフルオロ酢酸およびアセトンからなる体積比４９：４９：１：１の溶剤混合物中に溶かしたα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸１０ｇ／ｌおよびＬ（−）フコース１０ｇ／ｌを有する。この溶液から０．３μｌをＭＡＬＤＩ−キャリアプレート上に移し、乾燥した試料をパーセプティブ・バイオシステムズ社（PerSeptive Biosystems）のＭＡＬＤＩ−質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲで分析した。この測定は「Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（登録商標）」を用いて「リニアモード（Linear Mode）」で行った。本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの１つの測定についての例として、図３はＭＡＣ３−１のスペクトルを図示する。ペプチドＭＡＣ３−１に相当するピークは矢印によりマーキングされている。
【００７３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−質量分析は、ペプチド、例えば本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの定量化のために、このペプチドが質量分析計の動的測定範囲内にあり、それにより検出器飽和が避けられる濃度で存在する場合に使用することができる。脳脊髄液中の本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの測定に対して、マトリックス溶液１μｌ当たり３３．３μｌの髄液当量濃度の場合がこれに該当する。各ペプチドに対して、質量シグナルと濃度との間の特異的な割合が存在し、このことはＭＡＬＤＩ−質量分析が有利にペプチドの相対的定量化のために使用できることを意味している。この状況は図５に示されている。試料を多様な量の異なる標準ペプチドと混ぜる場合に、標準シグナルならびに試料シグナルの強度を測定することができる。例えば図５は相対的に定量化するＭＳ法としてのＭＡＬＤＩ−測定を示す。標準の全てのシグナル強度は、０．６４μｍｏｌの濃度の場合のそのシグナル強度（＝１）に規格化した。各ペプチドは、シグナル強度と濃度との間で個々の典型的な関係を示し、これについては曲線の上昇によって読み取ることができる。
【００７４】
実施例４：ＭＡＣ３−ペプチドの質量分析による同定
本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの定量化のために、実施例２による脳脊髄液の逆相クロマトグラフィーにより得られたフラクション中のペプチドの分析すべき質量シグナルが実際に本発明によるＭＡＣ３−ペプチドであることが保証されなければならない。そのフラクション中の本発明によるペプチドの同定はｎａｎｏＳｐｒａｙ−ＭＳ／ＭＳで行う［１４］。この場合に、質量分析器中のＭＡＣ３−ペプチド−イオンはその固有のｍ／ｚ（質量／電荷）値を用いて当業者に公知の方法で質量分析器中で選択される。この選択されたイオンは、引き続き衝突ガス、例えばアルゴンまたは窒素を用いた衝突エネルギーの供給により断片化され、生じたＭＡＣ３−ペプチドの断片が質量分析器の組み込まれた分析ユニット内で検出され、相応するｍ／ｚ−値が決定される（タンデム−質量分析の原理）［１５］。ペプチドのこの断片化挙動は、使用した機器の５０ｐｐｍの質量精度で、前駆体分子の補体Ｃ３の配列が登録されている配列データバンク中のコンピュータアシストされた検索方法［１６］を使用して、本発明によるＭＡＣ３−ペプチドの明らかな同定が可能である。分子量が約１６ダルトン分（これは酸素原子の質量に相当する）だけプラス方向へシフトすることを考慮して、この方法を用いて酸化したペプチドも同定することができる。それに従って、他の化学的に修飾されたかまたは翻訳後修飾されたペプチドも同定される。特別な場合には、質量分析による分析は、アプライド・バイオシステムズ−サイエクス社（Applied Biosystems-Sciex）、米国の４極ＴＯＦインストルメント（Quadrupol-TOF-Instrument）モデル「ＱＳｔａｒ−Ｐｕｌｓａｒ」を用いて行った。ＭＡＣ３−１の例示的なＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトルは図４に図示されている。
【００７５】
実施例５：対照試料と患者の試料とのＭＡＣ３−ペプチドの相対的濃度の比較のため
の質量スペクトルによるＭＡＣ３−ペプチドの定量化
対照試料およびアルツハイマー病を患う患者の試料に対しして、実施例１および２による試料準備の後に引き続き、実施例３による本発明によるＭＡＣ３−ペプチドのＭＡＬＤＩ−質量分析を実施した。例示的なＭＡＬＤＩ−シグナル強度は、「箱ひげ図」の形で図６〜１１に視覚化した。図示した「箱ひげ図」は、対照（健康な被験者、アルツハイマー病ではない患者）における多様なＭＡＣ３−ペプチドの積分したＭＡＬＤＩ−質量分析によるシグナル強度と、アルツハイマー病患者の試料中のＭＡＬＤＩ−シグナル強度との比較を可能にする。この場合、「箱」、つまり図６〜１１のグラフ中の角柱部は、それぞれのＭＡＬＤＩ−シグナル強度の５０％が存在す領域（第２および第３の４分位値）であり、この「箱」から上方および下方へ伸びている線状部（「ひげ」）は、それぞれ、最大のシグナル強度を示す測定値の２５％が存在する領域（上方の４分位値）を示すか、もしくは最低のシグナル強度を示す測定値の２５％が存在する領域（下方の４分位値）を示す。角柱部中の実線は中央値を表し、角柱部中の点線は平均値を表す。
【参考文献】
【００７６】
2005511063.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】同定されたＭＡＣ３−ペプチドの位置を示す補体Ｃ３タンパク質の概略図。
【図２】脳脊髄液からＭＡＣ３−ペプチドを分離しかつ濃縮するための逆相クロマトグラフィー
【図３】ペプチドＭＡＣ３−１を例にした質量分析測定（ＭＡＬＤＩ）。
【図４】ＭＡＣ３−ペプチドを例にしたペプチドの同定のためのＭＳ／ＭＳ−フラグメントスペクトル。
【図５】相対的に定量化する質量分析法としてのＭＡＬＤＩ。
【図６】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−１および化学的に修飾されたＭＡＣ３−１（例えば１箇所または２箇所酸化されたペプチド、並びに２価の電荷を有するＭＡＣ３−１ペプチドイオン）の濃度と定量的比較するための箱ヒゲ図。
【図７】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−２の濃度の定量的比較のための箱ヒゲ図。
【図８】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−７の濃度の定量的比較のための箱ヒゲ図。
【図９】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−８の濃度の定量的比較のための箱ヒゲ図。
【図１０】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−９の濃度の定量的比較のための箱ヒゲ図。
【図１１】健康な対照、アルツハイマー病患者およびアルツハイマー病ではない患者中のＭＡＣ３−１３の濃度の定量的比較のための箱ヒゲ図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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