(57)【要約】本発明は、ＩＬ−１遺伝子座の内部に見出された新規ＩＬ−１様遺伝子および多型これらの遺伝子内の関連するハプロタイプの構造および構成を含む、ＩＬ−１遺伝子群に由来する遺伝情報の同定および用途に関する方法および組成物を提供する。本発明はそれによって、ＩＬ−１関連表現型（たとえば炎症性疾患のリスクの増大または減少）を予測するためおよびＩＬ−１ハプロタイプ関連炎症性表現型を治療するための、以前に同定されたＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１ＲＮ遺伝子を含むＩＬ−１遺伝子座から利用可能な有用な遺伝情報のレパートリーを広げる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに示されるＩＬ−１対立遺伝子を検出することを含む、被験者がＩＬ−１炎症性ハプロタイプと関連している疾患または状態を有するかどうか、あるいは発症する素因があるかどうかを特定する方法。
【請求項２】
図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに含まれる少なくとも２個の対立遺伝子が検出されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．５の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．６の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．７の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．８の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．９の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項８】
図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、または６Ｂのいずれかに示されるＩＬ−１ハプロタイプの特徴的なパターンを検出することを含む、被験者がＩＬ−１炎症性ハプロタイプ表現型と関連する疾患または状態を有するかどうか、あるいは発症する素因があるかどうかを特定する方法。
【請求項９】
ＩＬ−１ハプロタイプが、図３Ａおよび３Ｂに示されるｈａｐ１パターンを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ｈａｐ１パターンＴ_Ｔ_Ｃ／２_２_１の３個の対立遺伝子を検出することを含む請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ＩＬ−１ハプロタイプが、図４Ａおよび４Ｂに示されるｈａｐ２パターンを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ｈａｐ２パターンＧ_Ｃ_Ｔ／１_１_２の３個の対立遺伝子を検出することを含む請求項８記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬ−１ハプロタイプが、図５Ａおよび５Ｂに示されるｈａｐ３パターンを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１４】
ｈａｐ３パターンＧ_Ｃ_Ｃ／１_１_１の３個の対立遺伝子を検出することを含む請求項８記載の方法。
【請求項１５】
ＩＬ−１ハプロタイプが、図６Ａおよび６Ｂに示されるｈａｐ４パターンを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１６】
ｈａｐ４パターンＣ_Ｃ_Ｃ／１_１_１の３個の対立遺伝子を検出することを含む請求項８記載の方法。
【請求項１７】
図８、９、１０Ａ、１０Ｂ、または１１のいずれかに示されるＳＮＰ配列またはその相補鎖の連続した少なくとも１２ヌクレオチドの新規核酸を含む、ＩＬ−１多型を検出するためのＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項１８】
前記新規核酸配列が、図８、９、１０Ａ、１０Ｂ、または１１のいずれかに示されるＳＮＰ配列、あるいはその相補鎖の連続した少なくとも１４ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１７記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項１９】
前記新規核酸配列が、図８、９、１０Ａ、１０Ｂ、または１１のいずれかに示されるＳＮＰ配列、あるいはその相補鎖の連続した少なくとも１７ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１７記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項２０】
前記ＳＮＰ配列が：
ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１５；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１６；ＤＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１９；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２５ ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３３；およびＩＬ１Ａ ＳＮＰ＃３４；より成る群から選択されるＩＬ−１Ａ ＳＮＰであることを特徴とする請求項１７から１９いずれか１項記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
前記ＳＮＰ配列が：
ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃５；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃６；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃７；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃８；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１７；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１９；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３５；およびＩＬ１Ｂ ＳＮＰ＃３８；より成る群から選択されるＩＬ−１Ｂ ＳＮＰであることを特徴とする請求項１７から１９いずれか１項記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
前記ＳＮＰ配列が：
ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−ＩＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；２９；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；３１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４２；４３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；６８；およびＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃８２；より成る群から選択されるＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰであることを特徴とする請求項１７から１９いずれか１項記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
前記ＳＮＰ配列が：
ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６８；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃８２；およびＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃９３；より成る群から選択されるＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰであることを特徴とする請求項１７から１９いずれか１項記載のＩＬ−１ポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
請求項１７、１８、または１９のいずれかに記載の少なくとも２種類のポリヌクレオチドを含む、ＩＬ−１遺伝子型決定のためのキット。
【請求項２５】
ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１５；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１６；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１９；ＥＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２５ ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３３；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３４；ＩＬ１Ｂ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃５；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃６；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃７；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃８；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１７；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１９；ＩＬ１Ｂ ＳＮＰ＃３５；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；２９；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；３１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４２；４３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；６８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃８２；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６８；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃＳＮＰ＃８２；およびＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃９３；より成る群から選択される少なくとも２種類の連続した少なくとも１２ヌクレオチドのポリヌクレオチドを含むＩＬ−１遺伝子型決定のためのキット。
【請求項２６】
図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに示されるＩＬ−１対立遺伝子を検出することによってＩＬ−１炎症性ハプロタイプを検出し；さらに
検出されたＩＬ−１炎症性ハプロタイプを補正する治療薬を選択する；工程を含む、ＩＬ−１多型と関連する疾患または障害を有するかあるいは発症する素因がある個体のための適当な治療薬を選択する方法。
【請求項２７】
図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに含まれる少なくとも２個の対立遺伝子が検出されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．５の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．６の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．７の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．８の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記２個の対立遺伝子が、少なくとも０．９の連鎖不平衡値（Ｄ'）を有することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
ｈａｐ１ ＩＬ−１ハプロタイプを検出することを含む請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
ある炎症性疾患表現型を有する個体を治療するのに特定の治療薬が有効であるかどうかを特定する方法であって：
図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに示されるＩＬ−１対立遺伝子を検出することによってＩＬ−１ハプロタイプを検出する；
前記個体における炎症性表現型を検出する；
前記個体を前記治療薬で治療する；および
前記治療薬によって前記個体における炎症性表現型が減少または緩和されているかどうかを特定する；工程を含み、
前記治療薬によって前記個体の炎症性表現型が減少または緩和されていれば、前記治療薬がその検出されたＩＬ−１ハプロタイプを有する個体を治療するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記治療薬が栄養補助食品であることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＩＬ−１ ハプロタイプが、ｈａｐ１、ｈａｐ２、ｈａｐ３、およびｈａｐ４より成る群から選択されることを特徴とする請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１５；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１６；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃１９；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２４；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃２５ ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３１；ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３３；およびＩＬ−１Ａ ＳＮＰ＃３４；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃２；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３；ＩＬ−１ＢＳＮＰ＃４；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃５；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃６；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃７；ＩＬ−ＩＢ ＳＮＰ＃８；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃９；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１７；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃１９；ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３５；およびＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ＃３８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃１８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃２６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；２９；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；３１；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３２；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３４；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３６；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃３８；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４０；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃４２；４３；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６５；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃；６８；および ＩＬ−１ＲＮｉｃ ＳＮＰ＃８２；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６７；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃６８；ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃８２；およびＩＬ−１ＲＮｓｅｃ ＳＮＰ＃９３；より成る群から選択される少なくとも１つのＩＬ−１対立遺伝子が検出されることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＩＬ−１は主要な炎症性サイトカインであり、急性および慢性病態の両方の炎症性疾患の媒介に関係するとされている。２種類の機能的に類似した分子、ＩＬ−１αとＩＬ−１βは、別々の遺伝子によってコードされている（それぞれ、ＩＬ１ＡとＩＬ１Ｂ）。そのファミリーの第３の遺伝子（ＩＬ１ＲＮ）は、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βと受容体結合について競合する抗炎症性非シグナル伝達分子である、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）をコードする。ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１ｒａの対比較は各例について２５%未満の同一性を与えるが、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａのＸ線結晶解析はよく類似した折りたたみを明らかにする（非特許文献１；非特許文献２）。構造的には、タンパク質はβ三つ葉として知られる１２の密なβ−シートの一つの領域から成る。充填相互作用の大部分で主鎖原子が主要であるため、少数しかない不変のアミノ酸がＩＬ−１折りたたみを生じるのに必要な残基であり、そのため遺伝子のコード配列の大きな多様化が可能であるという議論がされている。非常に類似した折りたたみがダイズトリプシンインヒビターで、検出可能な配列類似性無しに達成されている。３つすべてのタンパク質は、ＩＬ−１の唯一の機能性シグナル伝達受容体である、タイプＩ ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ１）に結合する（非特許文献３を参照）。
【０００２】
ＩＬ−１は、刺激された単球、マクロファージ、およびケラチン生成細胞の産物として主に特徴づけられているが、重要な役割が平滑筋および内皮細胞から放出されたＩＬ−１について示唆されている（総説は非特許文献４）。ＩＬ−１Ｒ１を通じたシグナル伝達には受容体の細胞質Ｔｏｌｌ様領域が関与する（非特許文献５）。機能性ＩＬ−１受容体は組織中に広く分布している。ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１Ｒ１と第二の受容体成分であるＩＬ−１受容体補助タンパク質ＩＬ−１ＲａｃＰとの間の相互作用を活性化しない点でＩＬ−１と異なると現在信じられている。これは１Ｌ−１Ｒ１と遠い関係のある膜貫通タンパク質で、類似の領域構造を有するが、ＩＬ−１に対する固有の親和性を有しない（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００３】
ＩＬ−１遺伝子群は第２染色体の長腕上にあり（２ｑ１３）、４３０Ｋｂの領域内に少なくともＩＬ−１ａ（ＩＬ−１Ａ）、ＩＬ−１β（ＩＬ−１Ｂ）、およびＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−Ｉ１ＲＮ）の遺伝子を含む（非特許文献８）。末端の遺伝子ＩＬ１ＡとＩＬ−１ＲＮの最大の分離は、ヒトゲノムＤＮＡの制限消化物のパルスフィールドゲル電気泳動によって４３０ｋｂと推定されており（非特許文献８）、３つの遺伝子の方向は物理的クローンの配列分析によって決定されている（非特許文献９）。ＩＬ−１８はＩＬ−１構造ファミリーの第４のメンバーと思われる（非特許文献１０）。それはまた炎症促進性サイトカインでもあるが、その活性はＩＬ−１の活性に匹敵する。ＩＬ−１８はＩＬ−１Ｒ１でなく関連する受容体（ＩＬ−１８Ｒ１）と結合し（非特許文献１１）、ＩＬ−１８Ｒ１は、ＩＬ−１ＲａｃＰでなく関連する補助タンパク質であるＩＬ−１８ＲａｃＰを用いる（非特許文献１２）。ＩＬ−１８遺伝子であるＩＬ１８は、第１１染色体上に存在する（非特許文献１３）。
【０００４】
ＩＬ−１様の要素を含むある種の他のタンパク質が、商用および公開ｃＤＮＡデータベースから同定されている（非特許文献１４；非特許文献１５）；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。一つのＩＬ−１様遺伝子はまた、ＩＬ−１遺伝子群を組み込んだＹＡＣクローンとのハイブリダイゼーションによって、ｃＤＮＡ選択後に同定された（非特許文献１９）。このＩＬ−１遺伝子およびその産物（すなわちインターロイキン−１様タンパク質１遺伝子／産物）は、その内容が引用によって本開示に含まれる我々の出願中の特許文献１に詳細に記載されている。６つの新遺伝子について統一した命名体系が、その遺伝子の発見に関与した研究者たちによって最近合意されており（非特許文献２０を参照）、ここで使用される。４つの以前に知られていたＩＬ−１ファミリーメンバーを認識して、新しいヒト遺伝子はＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ０、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８（すなわちＩＬ−１Ｌ１）、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ１０と命名されている。タンパク質産物は、ＩＬ−１Ｆ７ｂ（ＩＬ１Ｆ７遺伝子の２番目に記載された推定タンパク質産物を意味する）という形で命名される。遺伝子はヒトとマウスとの間で概して保存されているように見える。
【０００５】
特許文献２で、その内容は全体が引用によって本開示に含まれるが、我々はＩＬ−１炎症性ハプロタイプと関連するＳＮＰを含むある種の多型および、炎症性疾患診断および治療薬におけるそれらの用途を以前に記載している。特許文献１および特許文献３（公開番号第２００２／０１８２６１２号）で、その内容は全体が引用によって本開示に含まれるが、我々はＩＬ−１Ｂ対立遺伝子２（＋６９１２）多型に基づく治療薬および診断を以前に記載している。さらに、特許文献４（また特許文献５）で、その内容は全体が引用によって本開示に含まれるが、我々は、ＩＬ−１Ｂ遺伝子の上流領域の、転写ならびに炎症性および感染性疾患に対する感受性に影響するものを含む、機能性多型を記載ならびに特徴づけている。加えて、特許文献１で、その内容は全体が引用によって本開示に含まれるが、我々はＩＬ−１様遺伝子およびその産物（すなわちインターロイキン−１様タンパク質１遺伝子／産物、すなわちＩＬ−１Ｆ８）を以前に記載している。
【特許文献１】米国特許出願第０９／６１７７２０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２６８，１４２号明細書
【特許文献３】米国特許出願第０９／９６９，２１５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第０１０／３０００１１号明細書
【特許文献５】国際特許出願第ＵＳ０２／３７２２２号
【非特許文献１】Ｐｒｉｅｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６；９６６７−９６７）
【非特許文献２】Ｖｉｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９；１２８７４−１２８７９
【非特許文献３】Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０；６１５５−６１５９
【非特許文献４】Ｒｏｓｓ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６２；８０１−９
【非特許文献５】Ｈｅｇｕｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７；２６０５−２６０９
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎｆｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０；１３７５７−１３７５６
【非特許文献７】Ｗｅｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２；７７２７−７７３１
【非特許文献８】Ｎｉｃｋｌｉｎ， ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９；３８２−４
【非特許文献９】Ｎｏｔｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４ １；３７０−３７８
【非特許文献１０】Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３７９；５９１
【非特許文献１１】Ｔｏｒｉｇｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２；２５７３７−２５７４２
【非特許文献１２】Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８）
【非特許文献１３】Ｎｏｌａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５１；１６１−３
【非特許文献１４】Ｍｕｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ５；７０２−６
【非特許文献１５】Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５；１１６９−１１７５
【非特許文献１６】Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５；１０３０８−１０３１４
【非特許文献１７】Ｂｕｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６６；２１３−２１６
【非特許文献１８】Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６；２０５９７−２０６０２
【非特許文献１９】Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０；３２９９−３３０８
【非特許文献２０】Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２；５３６−５３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＬ−１遺伝子座全体が炎症性疾患に中心的に関与していることを認識して、我々はここでさらに詳細なＩＬ−１遺伝子座多型、連鎖、疾患関連、およびヒトＩＬ−１遺伝子座で遺伝子同一性を検出するための機能性分析支援的組成物および炎症性疾患の予測、診断、および治療におけるその用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
総体的に本発明はＩＬ−１ハプロタイプ（たとえば炎症性疾患または状態を発症するリスクの増大またはリスクの減少と関連するＩＬ−１ハプロタイプ）および検出するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、ＩＬ−１ハプロタイプは疾患または状態を発症するリスクの増大またはリスクの減少と関連するものであるが、しかし本発明は必然的に、疾患または状態を発症するリスクの増大とも減少とも関連していないＩＬ−１ハプロタイプ（たとえば「正常」または「ｗｔ」遺伝子型）を検出するための材料および方法を包含する。
【０００８】
好ましい実施形態では、本発明は被験者が、ＩＬ−１炎症性ハプロタイプと関連する疾患または状態を有するかどうか、または発症する素因があるかどうかを、炎症性疾患または障害と関連するＩＬ−１対立遺伝子か、またはそのような対立遺伝子と連鎖不平衡にある任意のＩＬ−１対立遺伝子−たとえば図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに示される、一個以上の連鎖したＩＬ−１対立遺伝子を検出することによって、特定するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、その連鎖した対立遺伝子は、炎症性関連対立遺伝子との連鎖不平衡値（Ｄ'）が少なくとも０．５、および好ましくは少なくとも０．６、０．７、０．８、または０．９である。
【０００９】
別の一実施形態では、本発明は被験者が、ＩＬ−１炎症性ハプロタイプと関連する疾患または状態を発症するリスクの減少を有するかどうかを、炎症性疾患または障害のリスクの減少と関連するＩＬ−１対立遺伝子か、またはそのような「保護」対立遺伝子と連鎖不平衡にある任意のＩＬ−１対立遺伝子−たとえば図１、２Ａ、２Ｂ、７Ａ、または７Ｂのいずれかに示される、一個以上の連鎖したＩＬ−１対立遺伝子を検出することによって、特定するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、その連鎖した対立遺伝子は、「保護」対立遺伝子との連鎖不平衡値（Ｄ'）が少なくとも０．５、および好ましくは少なくとも０．６、０．７、０．８、または０．９である。ある好ましい実施形態では、本発明は、新たに同定されたＳＮＰに基づく、４つの新しいＩＬ−１ハプロタイプ（ｈａｐ１〜４）を含む。好ましい一実施形態では、本発明はＩＬ−１炎症促進性（以前に記載されたハプロタイプ；３３２２１４６１２１と一致）である、ｈａｐ１（ＩＬ−１ハプロタイプパターン１）を提供し、ｈａｐ１は下記を含む：ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子２（ＩＬ−１Ａ（−８８９）対立遺伝子２と１００%ＬＤ）；ＩＬｌＢ（＋３９５４）対立遺伝子２；およびＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子１。別の一実施形態では、本発明は、図３Ａおよび３Ｂに示される通りｈａｐ１ハプロタイプパターンの２個以上の対立遺伝子の重複を含む、ｈａｐ１ハプロタイプを提供する。好ましい実施形態ではｈａｐ１ハプロタイプは、図３Ａおよび３Ｂに示されるＩＬ−１ ＴＴＣ／２−２−１パターンを含む。
【００１０】
別の一実施形態では、本発明は、以前に記載されたハプロタイプ；４４１１２３３２１２と一致する、ＩＬ−１ハプロタイプであるｈａｐ２を提供し、ｈａｐ２は下記を含む：ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子１（ＩＬ−１Ａ（−８８９）対立遺伝子１と１００%ＬＤ）；ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１ ＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子２。別の一実施形態では、本発明は、図４Ａおよび４Ｂに示される通りｈａｐ２ハプロタイプパターンの２個以上の対立遺伝子の重複を含む、ｈａｐ２ハプロタイプを提供する。好ましい実施形態ではｈａｐ２ハプロタイプは、図４Ａおよび４Ｂに示されるＩＬ−１ ＧＣＴ／１−１−２パターンを含む。
【００１１】
さらに別の一実施形態では、本発明は、以前に記載された（「野生型」）対立遺伝子パターン**１１ｌ***と一致する、ＩＬ−１ハプロタイプであるｈａｐ３を提供し、ｈａｐ３は下記を含む；ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子１（ＩＬ−１Ａ（−８８９）対立遺伝子１と１００%ＬＤ）；ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子１；およびＩＬ−１Ｂ（−５１１）対立遺伝子１。好ましい一実施形態では、本発明は図５Ａおよび５Ｂに示される通りｈａｐ３ハプロタイプパターンの２個以上の対立遺伝子の重複を含む、ｈａｐ３ハプロタイプを提供する。好ましい実施形態ではｈａｐ３ハプロタイプは、図５Ａおよび５Ｂに示されるＩＬ−１ｈａｐ３ ＧＣＣ／１−１−１パターンを含む。
【００１２】
さらに別の一実施形態では、本発明は、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子；ＩＬ１Ｂ（−５１１）対立遺伝子１；およびＩＬ−１Ｂ（−３７３７）対立遺伝子１：を含む新しいＩＬ−１ハプロタイプパターン（ｈａｐ４）と一致する、新しく同定されたＳＮＰを提供する。好ましい一実施形態では、本発明は図６Ａおよび６Ｂに示される通りｈａｐ４ハプロタイプパターンの２個以上の対立遺伝子の重複を含む、ｈａｐ４ハプロタイプを提供する。好ましい実施形態ではｈａｐ４ハプロタイプは、図６Ａおよび６Ｂに示されるＩＬ−１ｈａｐ４ ＣＣＣ／１−１−１パターンを含む。
【００１３】
ＩＬ−１遺伝子群からの、および特に、ＩＬ−１遺伝子群の新規ＩＬ−１様遺伝子からの配列情報の使用に関する方法および組成物を提供することは、さらに本発明の目的である。この配列情報を遺伝子データと統合することは他の目的である。その結果、本発明は、遺伝子および関連する多型の構造および構成に関する詳細な情報を提供するＩＬ−１遺伝子群のマップを与える。ＩＬ−１遺伝子群と関連する疾患または障害を予測および診断する方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。図４に示すようにＩＬ−１多型の識別のための一個以上の核酸を含む、多数のヒトＩＬ−１遺伝子群配列識別子を提供することは、さらなる目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．概要
サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−１遺伝子のいくつかのホモログが、以前に同定されたＩＬ−１遺伝子群にマッピングされるが、その領域の公開配列決定は相対的に遅い。そこで我々は遺伝子群全体のコンティグを作成し注釈を行った。加えて、この遺伝子群中の新規ヒト多型遺伝子座（ＩＬ−１Ａ、ＩＬ１Ｂ、およびＩＬ−ＲＮ中のＳＮＰを含む）および関連するＩＬ−１ハプロタイプが、図１〜１１に要約する通り位置決定され同定されている。本発明の特徴は、付属の、発明を実施するための最良な形態および実施例でさらに証明される。
【００１５】
２．定義
便宜上、本明細書、実施例、および付属の請求項中で用いられる一部の用語および語句の意味を下記に示す。
【００１６】
「対立遺伝子」の語は異なる多型領域にみられる異なる配列変異体をいう。たとえば、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）は少なくとも５つの異なる対立遺伝子を有する。配列変異体は一塩基または複数塩基の変化である可能性があり、制限なく挿入、欠失、または置換を含み、あるいは反復配列数変異でありうる。
【００１７】
たとえば、対立遺伝子パターンはＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１については多型部位の１個の対立遺伝子から構成されることが可能であり、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子１はＩＬ−１ＲＮ遺伝子座のＶＮＴＲに少なくとも１コピーのＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子１を有する対立遺伝子パターンである。あるいは対立遺伝子パターンは１個の多型部位での同型接合または異型接合の状態のいずれかから構成されうる。たとえば、ＩＬ１−ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２，２は、ＩＬ−１ＲＮのＶＮＴＲマーカーに第二の対立遺伝子の二個のコピーが存在し、ＩＬ−ＲＮ（ＶＮＴＲ）対立遺伝子２の同型接合状態に相当する対立遺伝子パターンである。あるいは、対立遺伝子パターンは一より多い多型部位での対立遺伝子の特定から構成されうる。
【００１８】
ここで用いられる「抗体」の語はＩＬ−１ポリペプチドと特異的に反応する抗体全体またはその結合断片を含む結合物質をいうことを意図する。抗体は従来の方法を用いて断片化することができ、断片は抗体全体について上述したのと同様の方法で有用性についてスクリーニングすることができる。たとえば、たとえば、Ｆ(ａｂ)２断片は抗体をペプシンで処理することによって生じることができる。結果として得られるＦ(ａｂ)２断片はジスルフィド架橋を還元しＦａｂ断片を生じるよう処理することができる。本発明の抗体はさらに、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によって与えられるＩＬ−１Ｂポリペプチドへの親和性を有する二重特異性、一本鎖、キメラおよびヒト化分子を含むことが意図される。
【００１９】
「生物学的活性」または「生物活性」または「活性」または「生物学的機能」は、互換可能に用いられ、ここでの目的ではＩＬ−１ポリペプチド（天然または変性した立体構造のいずれかで）、またはその任意の部分配列によって直接的または間接的に実行される作用体または抗原機能を意味する。生物学的活性はたとえばＩＬ−１受容体といった標的ペプチドへの結合を含む。ＩＬ−１生物活性はＩＬ−１ポリペプチドに直接影響を与えることによって調節が可能である。あるいは、ＩＬ−１生物活性はたとえばＩＬ−１遺伝子の発現を調節することにより、ＩＬ−１ポリペプチドの濃度を調節することによって調節が可能である。
【００２０】
ここで用いられる「ＩＬ−１ポリペプチドの生物活性断片」の語は、断片が野生型ＩＬ−１ポリペプチドの活性を特異的に模倣または拮抗する完全長ＩＬ−１ポリペプチドの断片をいう。生物活性断片は好ましくはインターロイキン受容体と相互作用することのできる断片である。
【００２１】
「異常な活性」の語は、たとえばＩＬ−１といったポリペプチドの活性に当てはめるように、野生型または天然ポリペプチドの活性と異なるかまたは健常者のポリペプチドの活性と異なる活性をいう。ポリペプチドの活性は天然の対応物の活性より強いために異常でありうる。あるいは、活性は天然の対応物の活性と比較して弱いかまたは存在しないために異常でありうる。異常な活性はまた活性における変化でありうる。たとえば異常なポリペプチドは別の標的ペプチドと相互作用しうる。ＩＬ−１遺伝子座ポリペプチドをコードするＩＬ−１遺伝子座遺伝子の過剰発現または低発現が原因で細胞は異常なＩＬ−１活性を有しうる。
【００２２】
「細胞」、「宿主細胞」または「組み換え宿主細胞」はここでは相互に交換可能に使用される語で特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫または見込まれる子孫もいう。突然変異または環境的影響が原因で、ある種の修飾が後続の世代に起こりうるため、そのような子孫は実際親細胞と同一ではない可能性があるが、ここで用いられる語の範囲になお含まれる。
【００２３】
「キメラ」、「モザイク」、「キメラ哺乳類」などは、そのゲノムを含む細胞の少なくとも一部にノックアウトまたはノックイン構造を持つ遺伝子導入哺乳類をいう。
【００２４】
「対照」または「対照試料」の語は使用した検出方法に適当な任意の試料をいう。対照試料は使用した対立遺伝子検出方法の産物または試験する物質を含みうる。さらに、対照は陽性対照または陰性対照でありうる。一例として、対立遺伝子検出方法がＰＣＲ増幅であって、続いてサイズ分画を行う場合、対照試料は適当なサイズのＤＮＡ断片を含みうる。同様に、対立遺伝子検出方法が変異タンパク質の検出を要する場合、対照試料は変異タンパク質の試料を含みうる。しかし、対照試料は試験する物質を含むことが好ましい。たとえば、対照はゲノムＤＮＡまたはＩＬ−１遺伝子群のクローンした一部の試料であることができる。しかし、試験する試料がゲノムＤＮＡである場合、対照試料は好ましくはゲノムＤＮＡの高度に精製された試料である。
【００２５】
「ＩＬ−１多型に関連する疾患および状態」の語句は、ＩＬ−１複合体内の一個以上の対立遺伝子の同定に基づいて対象者について示すことのできるさまざまな疾患または状態、それに対する感受性をいう。例は以下を含む：下記を含む炎症性または変性疾患：全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）；アルツハイマー病（および慢性神経炎、グリア活性化；小グリア増加；老人斑形成；および治療に対する反応：を含む関連する状態および症状）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、関節炎（および急性関節炎、抗原誘導性関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎に伴う関節炎、コラーゲン誘導性関節炎、若年性慢性関節炎；若年性慢性関節リウマチ、変形性関節炎、予後診断および連鎖球菌誘導性関節炎：を含む関連する状態および症状）、喘息（および気管支喘息；慢性閉塞性気道疾患；慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息および職業性喘息：を含む関連する状態および症状）；心臓血管疾患（およびアテローム性動脈硬化；自己免疫性心筋炎、慢性心低酸素症、鬱血性心不全、冠動脈疾患、心筋症、そして大動脈平滑筋細胞活性化；心細胞アポトーシス；および心臓細胞機能の免疫調節：を含む心臓細胞機能異常：を含む関連する状態および症状；糖尿病および自己免疫性糖尿病、インシュリン依存性（１型）糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症、および糖尿病性腎症を含む関連する状態および症状）；消化管炎症（および腹腔疾患、関連する骨減少症、慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患および潰瘍性大腸炎を含む関連する状態および症状）；胃潰瘍；肝炎、コレステロール胆石および肝線維症、ＨＩＶ感染（および変性反応、神経変性反応、およびＨＩＶ関連ホジキン病を含む関連する状態および症状）、川崎病（および皮膚粘膜リンパ節症候群、頚部リンパ節症、冠状動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度の貧血、皮膚の剥離、発疹、結膜の赤み、血小板増多症を含む関連する疾患および状態；多発性硬化症、腎症（および糖尿病性腎症、末期腎疾患、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、血液透析生存および腎虚血再灌流傷害を含む関連する疾患および状態）、神経変性疾患（および急性神経変性、加齢および神経変性疾患におけるＩＬ−１誘導、視床下部神経細胞のＩＬ−１誘導性可塑性および慢性ストレス反応亢進を含む関連する疾患および状態）、眼疾患（および糖尿病性網膜症、グレーブス眼症、およびブドウ膜炎を含む関連する疾患および状態、骨粗鬆症（（および歯槽、大腿骨、橈骨、脊椎または手首の骨減少または骨折発生率、閉経後の骨減少、質量、骨折発生率または骨減少速度を含む関連する疾患および状態）、中耳炎（成人または小児）、膵炎または膵小葉炎、歯周病（および成人、早期発症および糖尿病性を含む関連する疾患および状態）；慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎，肺硝子膜症、低酸素症およびＳＩＤＳにおける肺疾患を含む肺疾患；再狭窄；慢性関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ性疾患およびリウマチ性心筋炎を含むリウマチ；慢性リンパ球性甲状腺炎を含む甲状腺炎；慢性前立腺炎、慢性前立腺関連疼痛症候群および尿路結石症を含む尿路感染。自己免疫疾患たとえば円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス病、グレーブス眼症、萎縮性硬化症、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、甲状腺疾患（たとえば甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫（橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫）、睡眠障害および慢性疲労症候群および肥満（非糖尿病性または糖尿病と関連する）といった免疫疾患。細菌、ウイルス（たとえばサイトメガロウイルス、脳炎、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス）または原虫（たとえば、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマ）によって引き起こされる、感染症たとえばリーシュマニア症、ハンセン病、ライム病、ライム心炎、マラリア、脳マラリア、髄膜炎、マラリアに伴う尿細管間質性腎炎）に対する抵抗性。脳外傷（脳卒中および虚血、脳炎、脳症、てんかん、周産期脳傷害、長期の発熱性発作、ＳＩＤＳおよびくも膜下出血を含む）、低出生体重（たとえば脳性麻痺）、肺傷害（急性出血性肺傷害、グッドパスチャー症候群、急性虚血再潅流）、心筋機能不全、職業的または環境的汚染物質によって引き起こされたもの（たとえば有毒油症候群珪肺症に対する感受性）、放射線外傷、および創傷治癒反応の効率性（たとえばやけどすなわち熱傷、慢性創傷、外科創傷および脊髄損傷）を含む外傷に対する反応。乳がんに伴う溶骨性転移、悪液質、結腸直腸がん、過剰増殖性疾患、ホジキン病、白血病、リンパ腫、代謝疾患および腫瘍、転移、骨髄腫、および各種のがん（乳房、前立腺、卵巣、大腸、肺、などを含む）、無食欲症および悪液質を含む、新生物に対する感受性。受胎能／妊孕力、妊娠の可能性、切迫早産の発生率、低体重児早産、脳性麻痺、敗血症、低チロキシン血症、酸素依存、頭蓋異常、を含む出生前および新生児期合併症、早発更年期を含むホルモン調節。移植に対する対象者の反応（拒絶または受容）、急性期反応（たとえば発熱性反応）、一般炎症性反応、急性呼吸窮迫反応、急性全身性炎症性反応、創傷治癒、癒着、免疫炎症性反応、神経内分泌反応、発熱の発症および抵抗性、急性期反応、ストレス反応、疾患感受性、反復動作ストレス、テニス肘、および疼痛管理および反応。
【００２６】
「遺伝子の破壊」および「標的破壊」の語句または何らかの同様の語句は、当該遺伝子の野生型コピーと比較して細胞中のその遺伝子の発現を妨げるための天然ＤＮＡ配列の部位特異的割り込みをいう。割り込みは当該遺伝子の欠失、挿入または修飾、またはその任意の組み合わせによって生じうる。
【００２７】
ここで用いられる「ハプロタイプ」の語は、統計的に有意な水準で（Ｐｃｏｒｒ＜０．０５）グループとして一緒に遺伝する（連鎖不平衡にある）対立遺伝子の組をいうことを意図する。ここで用いられるような、「ＩＬ−１ハプロタイプ」の語はＩＬ−１遺伝子座にあるハプロタイプをいう。ＩＬ−１炎症性または炎症促進性ハプロタイプとは、アゴニスト活性の上昇および／またはアンタゴニスト活性の低下の指標となるハプロタイプをいう。
【００２８】
ここで用いられる「ＩＬ−１遺伝子群」および「ＩＬ−１遺伝子座」の語は、第２染色体の２ｑ１３領域かまたはその付近のすべての核酸を含み、少なくともＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１ＢおよびＥＬ−１ＲＮ遺伝子そして結合する他の任意の配列を含む（非特許文献１）。ここで用いられる「ＩＬ−１Ａ」、「ＩＬ−１Ｂ」、および「ＩＬ−１ＲＮ」の語は、それぞれＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１受容体アンタゴニストをコードする遺伝子をいう。ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、およびＩＬ−１ＲＮの遺伝子登録番号はそれぞれＸ０３８３３、Ｘ０４５００、およびＸ６４５３２である。
【００２９】
「ＩＬ−１機能性突然変異」とは、結果として表現型変化を生じる（すなわちＩＬ−１遺伝子またはタンパク質の機能に影響する）ＩＬ−１遺伝子群内の突然変異をいう。例は下記を含む：ＩＬ−１Ａ（＋４８４５）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋３９５４）対立遺伝子２、ＩＬ−１Ｂ（＋６９１２）対立遺伝子２およびＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２。
【００３０】
「ＩＬ−１Ｘ（Ｚ）対立遺伝子Ｙ」は、遺伝子ＸのＩＬ−１遺伝子座多型部位で生じる、Ｙで表す特定の対立遺伝子型をいい、ＸはＩＬ−１Ａ、Ｂ、またはＲＮであってヌクレオチドＺまたはその近傍に位置し、ヌクレオチドＺは主要な転写開始位置と相対的に番号を付与され、その主要な転写開始位置は当該の特定ＩＬ−１遺伝子Ｘのヌクレオチド＋１である。さらにここで用いられる通り、「ＩＬ−１Ｘ対立遺伝子（Ｚ）」の語は、ヌクレオチドＺまたはその近傍に位置する遺伝子Ｘ中のＩＬ−１多型部位のすべての対立遺伝子をいう。たとえば、「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子」の語は、マーカー＋２０１８に位置するＩＬ−１ＲＮ遺伝子の選択的な種類をいう。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１」は、シトシン（Ｃ）をセンス鎖の＋２０１８位に含む種類のＩＬ−１ＲＮ遺伝子をいう。非特許文献Ｃｌａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ９７；７２３−２６， １ ９９６。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２」は、チミン（Ｔ）をプラス鎖の＋２０１８位に含む種類のＩＬ−１ＲＮ遺伝子をいう。対象者が二個の同一のＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子を有する場合、対象者は同型接合である、または同型接合状態を有するという。対象者が二個の異なるＩＬ−１ＲＮ対立遺伝子を有する場合、対象者は異型接合である、または異型接合状態を有するという。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２，２」の語は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子２の同型接合状態をいう。逆に、「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１，１」の語は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１の同型接合状態をいう。「ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）対立遺伝子１，２」の語は、対立遺伝子１と２の異型接合状態をいう。
【００３１】
「ＩＬ−１表現型」の語は、ＩＬ−１遺伝子座の遺伝子同一性の結果として生じる任意の表現型をいうことを意図し、すなわち、炎症性疾患または状態への素因の増大または減少、および炎症性疾患または障害の「正常」（たとえば平均的または「野生型」）に関連する可能性を含む。
【００３２】
ここで用いられる「ＩＬ−１関連」は、ヒト第２染色体（２ｑ１２−１４）上のヒトＩＬ−１遺伝子座遺伝子に関連するすべての遺伝子を含むことを意図する。これらは第２染色体（２ｑ１３−１４）に位置するヒトＩＬ−１遺伝子群のＩＬ−１遺伝子を含み、下記を含む：インターロイキン−１αをコードするＩＬ−１Ａ遺伝子、インターロイキン−１βをコードするＩＬ−１Ｂ遺伝子、およびインターロイキン−１受容体アンタゴニストをコードするＩＬ−１ＲＮ（またはＩＬ−１ｒａ）遺伝子。さらにこれらのＩＬ−１関連遺伝子は、ヒト第２染色体（２ｑ１２）上に位置するタイプＩおよびタイプＩＩヒトＩＬ−１受容体遺伝子、およびマウス第１染色体の１９．５ｃＭ位に位置するそれらのマウス相同体を含む。インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、およびインターロイキン−１ＲＮはすべてがＩＬ−１タイプＩ受容体と結合するほど関連があるが、しかしインターロイキン−１αおよびインターロイキン−１βだけがＩＬ−１タイプＩ受容体を活性化するアゴニストリガンドである一方、インターロイキン−１ＲＮは天然に生じるアンタゴニストリガンドである。「ＩＬ−１」の語が遺伝子産物またはポリペプチドに関して用いられる場合、ヒト第２染色体（２ｑ１２−１４）上のインターロイキン−１遺伝子座によってコードされるすべての遺伝子産物、および他の種に由来するそれらの対応する相同体、またはその機能性変異体をいうことを意図する。ＩＬ−１の語はしたがって、たとえばＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのような炎症反応を促進する分泌されたポリペプチドと、たとえばＩＬ−１受容体アンタゴニストおよびＩＬ−１タイプＩＩ（おとり）受容体のような炎症反応に拮抗する分泌されたポリペプチドを含む。
【００３３】
「ＩＬ−１受容体」または「ＩＬ−１Ｒ」は、ＩＬ−１遺伝子座にコードされるリガンドに結合することのできる、および／またはそのリガンドからのシグナルを伝達することのできる、さまざまな細胞膜結合タンパク質受容体をいう。その語は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）分子に結合することができ、また哺乳類原形質膜タンパク質としての天然の立体構造で、おそらくＩＬ−１によって細胞へ提供されるシグナル伝達に役割を果たす、任意のタンパク質に適用される。ここで用いられるように、その語はＩＬ−１結合またはシグナル伝達活性を有する天然タンパク質のアナログを含む。例は米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されたヒトおよびマウスＩＬ−１受容体を含む。「ＩＬ−１核酸」の語はＩＬ−１タンパク質をコードする核酸をいう。
【００３４】
「ＩＬ−１ポリペプチド」および「ＩＬ−１タンパク質」は、図１、２、および３に示すＩＬ−１ゲノムＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列、またはその断片、およびその相同体を含むポリペプチドを網羅することを意図し、アゴニストおよびアンタゴニストポリペプチドを含む。
【００３５】
「リスクの増大」は、特定の多型対立遺伝子を有する人における、その特定の多型対立遺伝子を有しない集団の成員における疾患または状態の発生率の頻度と比較して、疾患または状態の統計的により高い頻度の発生率をいう。
【００３６】
「リスクの減少」は、特定の多型対立遺伝子を有する人における、その特定の多型対立遺伝子を有しない集団の成員、または全体としてのその集団における疾患または状態の発生率の頻度と比較して、疾患または状態の統計的により低い頻度の発生率をいう。
【００３７】
ここで用いられる「相互作用する」の語は、たとえば自然状態におけるタンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、核酸−核酸およびタンパク質−小分子または核酸−小分子間の相互作用のような、分子間の検出可能な関係または関連（たとえば生化学的相互作用）を含むことを意図する。
【００３８】
ＤＮＡまたはＲＮＡといった核酸についてここで用いられる「単離された」の語は、その巨大分子の天然の起源中に存在する他のＤＮＡ、またはＲＮＡからそれぞれ分離された分子をいう。たとえば、対象ＩＬ−１ポリペプチドの一つをコードする単離された核酸は、好ましくは天然にゲノムＤＮＡ中でＩＬ−１遺伝子に直接隣接する核酸配列の１０キロベース（ｋｂ）しか含まず、より好ましくはそのような天然に存在する隣接する配列の５キロベースしか含まず、非常に好ましくはそのような天然に存在する隣接する配列の１．５キロベース未満を含む。ここで用いられる「単離された」の語はまた、細胞物質、ウイルス物質、または組み換えＤＮＡ法によって製造された場合は培地を、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体または他の化学物質を、実質的に含まない、核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された核酸」は、断片としては天然に生じない、自然状態では見つからない核酸断片を含むことを意図する。「単離された」の語はまたここでは、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドをいうのに用いられ、精製および組み換えポリペプチドの両方を網羅することを意図する。
【００３９】
「ノックイン」遺伝子導入動物は、修飾された遺伝子がゲノムに導入された動物をいい、その修飾された遺伝子は外因性または内因性起源でありうる。
【００４０】
「ノックアウト」遺伝子導入動物は、内因性遺伝子の発現の部分的または完全な抑制（たとえば、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子の少なくとも一部の別の配列との置換、終止コドンの導入、決定的なアミノ酸をコードする塩基の突然変異、またはイントロンジャンクションの除去、などに基づく）が存在する動物をいう。
【００４１】
「ノックアウト構造」は、細胞の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の発現を減少させるかまたは抑制するために用いることのできる核酸配列をいう。簡単な例では、ノックアウト構造は、たとえば活性タンパク質を発現することができないように遺伝子の決定的な部分に欠失があるＩＬ−１ＲＮ遺伝子のような遺伝子から成る。あるいは、タンパク質の早期終止を起こすようにいくつかの終止コドンを天然遺伝子に加えることができ、またはイントロンジャンクションを不活性化することができる。典型的なノックアウト構造では、遺伝子の一部が選択可能なマーカー（たとえばｎｅｏ遺伝子）で置換されており、ゆえに当該遺伝子は下記のように表すことができる：ＩＬ−１ＲＮ５'／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ３'、ここでＩＬ−１ＲＮ５'およびＩＬ−１ＲＮ３'はそれぞれ相対的にＩＬ−１ＲＮ遺伝子の部分より上流および下流であるゲノム配列またはｃＤＮＡ配列をいい、またｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子をいう。別のノックアウト構造では、別の選択可能なマーカーが隣接位置に追加されており、ゆえに当該遺伝子は下記のように表すことができる：ＩＬ−１ＲＮ／ｎｅｏ／ＩＬ−１ＲＮ／ＴＫ、ここでＴＫは先行する構造のＩＬ−１ＲＮ５'またはＩＬ−１ＲＮ３'配列のどちらかに追加することができさらに適当な培地中でそれに対して選択を行うことができる（すなわち、陰性選択可能なマーカーである）チミジンキナーゼ遺伝子である。この２マーカー構造は、典型的にはＴＫ配列を保持する非相同組み換え現象からの、隣接ＴＫマーカーを除去する相同組み換え現象の選択を可能にする。遺伝子欠失および／または置換は、エキソン、イントロン、特にイントロンジャンクション、および／またはたとえばプロモーターのような調節領域からでありうる。
【００４２】
「連鎖不平衡」は、任意の対照集団における各対立遺伝子の存在の別々の頻度から予想されるより高い頻度での、二個の対立遺伝子の同時遺伝をいう。独立に遺伝する二個の対立遺伝子の存在の予想頻度は、第一の対立遺伝子の頻度に第二の対立遺伝子の頻度を掛けたものである。予想頻度で同時に出現する対立遺伝子は、「連鎖平衡」にあると言われる。連鎖不平衡の原因はしばしば不明である。特定の対立遺伝子の組み合わせに対する選択、または遺伝的に不均一な集団の最近の混合に起因しうる。さらに、疾患遺伝子に非常に密に連鎖したマーカーの場合、疾患突然変異が近い過去に生じたためその特定の染色体領域において組み換え現象を通じて平衡が達成されるためには十分な時間が経過していない場合は、対立遺伝子（または一群の連鎖した対立遺伝子）と疾患遺伝子との関連が予想される。一より多い対立遺伝子から成る対立遺伝子パターンに言及する場合は、一つの対立遺伝子パターンを構成するすべての対立遺伝子が別の対立遺伝子パターンの対立遺伝子の少なくとも一つと連鎖不平衡にある場合、第一の対立遺伝子パターンは第二の対立遺伝子パターンと連鎖不平衡にある。連鎖不平衡の一例は、ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）およびＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）多型部位の対立遺伝子間に生じる。ＩＬ−１ＲＮ（＋２０１８）の二個の対立遺伝子は、ＩＬ−１ＲＮ（ＶＮＴＲ）の最も頻度の高い二個の対立遺伝子、対立遺伝子１および対立遺伝子２と１００％連鎖不平衡にある。
【００４３】
「マーカー」の語は、個体間で異なることが知られているゲノム中の配列をいう。たとえば、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子は反復配列数変異（ＶＮＴＲ）から成るマーカーを持つ。
【００４４】
「突然変異遺伝子」または「突然変異」または「機能突然変異」は、遺伝子の対立遺伝子型をいい、突然変異遺伝子を持たない対象と比較して突然変異遺伝子を持つ対象の表現型を変化させることができる。突然変異によって引き起こされた表現型変化は、ある種の物質によって訂正または補正することができる。対象が変化した表現型を持つためにこの突然変異について同型接合でなければならないなら、当該突然変異は劣性であるといわれる。対象の表現型を変化させるために突然変異遺伝子の一コピーで十分であるなら、当該突然変異は優性であるといわれる。対象が突然変異遺伝子の一コピーを持ちそして（その遺伝子について）同型接合の対象と異型接合の対象との中間の表現型を持つ場合、当該突然変異は共優性であるといわれる。
【００４５】
本発明の「非ヒト動物」は、たとえば齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、などといった哺乳類、Ｘｅｎｏｐｕｓ属の成員のような遺伝子導入両生類、および遺伝子導入鳥類（たとえばニワトリ、鳥、など）を含む。「キメラ動物」の語はここでは、組み換え遺伝子がみられる動物か、または組み換え遺伝子が動物のすべてではなく一部の細胞で発現している動物をいうのに用いられる。「組織特異的キメラ動物」の語は、一部の組織で組み換えＩＬ−１遺伝子の一つが存在する、および／または発現しているかまたは破壊されているが他の組織ではそうでないことをいう。「非ヒト哺乳類」の語は、ヒトを除く哺乳綱の任意の成員をいう。
【００４６】
ここで用いられるような、「核酸」の語は、たとえばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適当な場合には、リボ核酸（ＲＮＡ）といった、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。その語はまた、同等物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ（たとえばペプチド核酸）、および記載された実施形態に適用可能な通り、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも解されるべきである。
【００４７】
ここで用いられる「栄養補助食品」の語は、疾患または障害、特に炎症性疾患に関連する疾患または障害を治療するのに価値のある食品および補助食品のＦＤＡの定義を含む。したがって、「栄養補助食品」は健康上の利益を達成するために用いることのできる栄養成分を含む。これらの成分は「食品」すなわち「機能性食品」中に、または補助食品中に存在しうる。１９９４年１０月に、米国栄養補助食品健康教育法（「ＤＳＨＥＡ」）が制定された。ＤＳＨＥＡは、補助食品が健康上の利益を提供しうると何百万もの消費者が信じていることを認めている。これを通過させた連邦議会の意図は、消費者の補助食品入手と、安全性の問題を示すかまたは虚偽か誤解を生じる表示がされた補助食品に反対して行動するＦＤＡの権限との間の均衡を取ることであった。ＤＳＨＥＡは補助食品の安全性および表示のための新たな規制の枠組みを作り出す。ＦＤＡは、ＤＳＨＥＡを達成するような方法でＤＳＨＥＡを実行することに取り組んでいる。したがって、ここで用いられる「栄養補助食品」は、摂取されまた食事を補完することが意図されそして「栄養成分」を含む、当該分野で既知である補助食品（たとえばビタミン、ミネラル、ハーブ、および他の補助食品）を含む。栄養成分は、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、および酵素のような栄養物質を含みうる。栄養成分はまた、これらの成分の、代謝産物、構成成分、抽出物、濃縮物、またはその組み合わせであることもできる。
【００４８】
栄養補助食品は錠剤、カプセル、液体、棒状物を含む形で提供される。
【００４９】
「多型」の語は、一より多い種類の遺伝子またはその一部（たとえば、対立遺伝子変異体）が同時に存在することをいう。少なくとも二つの異なる型、すなわち二つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部分を、「遺伝子の多型領域」という。遺伝子の多型領域の特定の遺伝子配列が対立遺伝子である。多型領域は一塩基であることができ、その同一性は別の対立遺伝子では異なる。多型領域はまたヌクレオチド数個の長さであることができる。
【００５０】
「疾患への傾向」の語、また「素因」あるいは疾患に対する「感受性」または任意の類似の語句は、ある対立遺伝子が、特定の疾患（たとえば血管疾患）と関連しているかまたは対象者がそれを発症する率について予測的であることが発見されたことを意味する。その対立遺伝子はしたがって健常者と比較して患者で過剰な頻度で現れる。したがって、これらの対立遺伝子は、発症前または罹病前の人においてさえも疾患を予測するのに用いることができる。
【００５１】
ここで用いられる「小分子」は、約５ｋＤ未満および非常に好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を持つ組成物をいうことを意図する。小分子は核酸、ペプチド、ペプチドミメティック、糖、脂質または他の有機または無機分子でありうる。
【００５２】
ここで用いられるような、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」の語は、核酸分子が試料核酸の少なくとも連続した約６ヌクレオチドとハイブリダイズする能力をいう。
【００５３】
「転写調節配列」は、たとえば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターといったＤＮＡ配列をいうために本明細書全体で用いられる一般的名称であり、それらが調節可能に結合したタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御する。
【００５４】
ここで用いられるような、「導入遺伝子」の語は、細胞に導入された核酸配列（たとえば、ＩＬ−１ポリペプチドの一つ、またはそれに対するアンチセンス転写物をコードする）を意味する。導入遺伝子は、導入される遺伝子導入動物または細胞に対して部分的にまたは完全に異種、すなわち外来であることができ、あるいは、導入される遺伝子導入動物または細胞の内因性遺伝子に対して同種であるが、挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノムに挿入されるように設計されている、または挿入されている（たとえば、天然遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されているかまたはその挿入の結果ノックアウトが生じる）。導入遺伝子は、一個以上の 転写調節配列および、たとえばイントロンのような、選択した核酸の最適な発現に必要でありうる任意の他の核酸を含みうる。
【００５５】
「遺伝子導入動物」は、動物の一個以上の細胞が、たとえば当該分野でよく知られた遺伝子導入法によって、人為的介入により導入された異種核酸を含む、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類または両生類をいう。核酸は、意図的な遺伝子操作を目的として、たとえばマイクロインジェクションによってまたは組み換えウイルスの感染によって、直接的にまたは間接的に細胞の前駆体への導入によって細胞へ導入される。遺伝子操作の語は古典的な交配またはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を含まないが、組み換えＤＮＡ分子の導入を対象とする。この分子は染色体内に統合されることができ、または染色体外で複製するＤＮＡでありうる。ここに記載する典型的な遺伝子導入動物では、導入遺伝子は細胞に、たとえばアゴニストまたはアンタゴニスト型の、ＩＬ−１ポリペプチドの一つの組み換え形を発現させる。しかし、組み換え遺伝子がサイレントである遺伝子導入動物もまた検討されており、例としては、下記のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存構造である。さらに、「遺伝子導入動物」はまた、一個以上の遺伝子の遺伝子破壊が組み換えおよびアンチセンス技術の両方を含む人間の介入によって引き起こされた組み換え動物を含む。その語はすべての子孫世代を含むことを意図する。したがって、創始者動物およびすべてのＦ１、Ｆ２、Ｆ３、など、その子孫が含まれる。
【００５６】
ここで用いられる「治療する」の語は、状態または疾患の少なくとも一つの症状を治すことならびに改善することを包含することを意図する。
【００５７】
「ベクター」の語は核酸分子をいい、それが結合している別の核酸を輸送することができる。好ましいベクターの一つの種類はエピソーム、すなわち、染色体外複製する能力がある核酸である。好ましいベクターは、自律複製および／または結合している核酸の発現の能力を有するものである。調節可能に結合した遺伝子の発現を指示する能力のあるベクターをここでは「発現ベクター」という。一般的に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはしばしば、ベクター形では染色体に結合していない円形の二本鎖ＤＮＡ環を一般的に指す「プラスミド」の形である。プラスミドはベクターの最も広く用いられている形であるため、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は相互に交換可能に用いられる。しかし、本発明は同等な機能を果たし本分野で今後明らかになるような他の種類の発現ベクターを含むことを意図する。
【００５８】
「野生型対立遺伝子」の語は、対象に二個のコピーで存在する場合、結果として野生型表現型が生じる、遺伝子の対立遺伝子をいう。遺伝子内のある種のヌクレオチド変化は、そのヌクレオチド変化を持つ遺伝子のコピー二個を有する対象の表現型に影響しない可能性があるため、特定の遺伝子のいくつかの異なる野生型対立遺伝子が存在しうる。
【００５９】
３．対立遺伝子の検出
ヒト多型遺伝子座の特定の対立遺伝子を検出するためには多くの方法が利用可能である。特定の多型対立遺伝子を検出するための好ましい方法は、部分的には、多型の分子的性質に依存する。たとえば、たとえば、多型遺伝子座のさまざまな種類の対立遺伝子型は、ＤＮＡの一塩基対で異なりうる。そのような一塩基多型（すなわちＳＮＰ）は遺伝子変異の主要な要因であり、すべての既知の多型のうちおよそ８０％を占め、またヒトゲノム中のそれらの密度は平均して１，０００塩基対当たり１個と推定されている。ＳＮＰは非常にしばしば、２個だけの異なる型で、２対立遺伝子に生じる（ＤＮＡ中に存在する４種類の異なるヌクレオチド塩基に対応する、最大４つの異なる型のＳＮＰが理論的に可能であるが）。にもかかわらず、ＳＮＰは、突然変異において他の多型より安定であり、疾患を引き起こす突然変異をマッピングするのにマーカーと未知の変異体の間の連鎖不平衡が用いられる関連性研究に適することとなっている。さらに、ＳＮＰは典型的には対立遺伝子を２個だけ持つために、鎖長測定でなく単純なプラス／マイナス分析によって遺伝子型解析することができ、より自動化に従いやすい。
【００６０】
個体における特定の一塩基多型対立遺伝子の存在を検出するためにはさまざまな方法が利用可能である。この分野における進歩は、正確で、容易で、そして安価な大規模ＳＮＰ遺伝子型解析を提供している。ごく最近、たとえば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的連結反応、ＴａｑＭａｎシステム、ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＳＮＰチップのようなさまざまなＤＮＡ「チップ」技術を含む、いくつかの新しい方法が記載されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、標的遺伝子領域の増幅を必要とする。侵襲的切断によるシグナル小分子の生成に基づき、次いで質量分析または固定化パッドロックプローブおよびローリングサークル増幅法を行う、さらに他の新しく開発された方法が、最終的にはＰＣＲの必要性を無くしうる。特定の一塩基多型を検出するための当該分野で既知の方法のいくつかを下記に要約する。本発明の方法はすべての利用可能な方法を含むものと解される。
【００６１】
一塩基多型の分析を円滑にするために、いくつかの方法が開発されている。一実施形態では、一塩基多型は、たとえば、Ｍｕｎｄｙ， Ｃ． Ｒ． （米国特許第４，６５６，１２７号明細書）に開示される通り、特異化されたエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを用いることによって検出することができる。その方法によると、多型部位の直接３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーが、特定の動物またはヒトから得られた標的分子とハイブリダイズさせられる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体と相補的であるヌクレオチドを含む場合、その誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。そのような組み込みによってプライマーはエキソヌクレアーゼに耐性となり、それによって検出が可能になる。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の正体が既知であるので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性となったという知見は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応に用いられたヌクレオチド誘導体に存在するヌクレオチドと相補的であったことを示す。この方法は、大量の無関係な配列データの決定を必要としないという利点を有する。
【００６２】
本発明の別の一実施形態では、多型部位のヌクレオチドを同定するために溶液を基礎とする方法が用いられる。Ｃｏｈｅｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． （仏国特許発明第２，６５０，８４０号明細書；国際公開第９１／０２０８７号パンフレット）。米国特許第４，６５６，１２７号明細書のＭｕｎｄｙ法でのように、多型部位の直接３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーが用いられる。本方法は標識ジデオキシヌクレオチドを用いてその部位のヌクレオチドを同定し、標識ジデオキシヌクレオチドは多型部位のヌクレオチドと相補的である場合プライマーの末端に組み込まれる。
【００６３】
遺伝子ビット分析すなわちＧＢＡ（商標）と呼ばれる別の方法がＧｏｅｌｅｔ Ｐ． ｅｔ ａｌ．によって記載されている（国際公開第９２／１５７１２号パンフレット）。Ｇｏｅｌｅｔ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．の方法は標識ターミネーターと多型部位の３'である対立遺伝子配列に相補的なプライマーとの混合物を使用する。組み込まれた標識ターミネーターはこのように、評価される標的分子の多型部位内に存在するヌクレオチドによって決定されまたそれと相補的である。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（仏国特許発明第２，６５０，８４０号明細書；国際公開第９１／０２０８７号パンフレット）の方法と対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．の方法は好ましくは不均一相分析であり、そこではプライマーまたは標的分子は固相に固定化される。
【００６４】
近年、ＤＮＡ中の多型部位を分析するためのいくつかのプライマー誘導型ヌクレオチド組み込み手順が記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ， Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １７；７７７９−７７８４ （１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ， Ｂ． Ｐ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １ ８；３６７１ （１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ， Ａ．−Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８；６８４−６９２ （１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ， Ｍ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８；１ １４３−１ １４７ （１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ， Ｔ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． １；１５９−１６４ （１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ＧＡＴＡ ９；１０７−１ １２ （１９９２）；Ｎｙｒｅｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０８；１７１−１７５ （１９９３））。これらの方法は、それらすべてが多型部位の塩基を識別するのに標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依存する点でＧＢＡと異なる。そのような形式では、シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同一の一続きのヌクレオチド中に起こる多型は、結果としてその一続きの長さに比例するシグナルを生じうる（Ｓｙｖａｎｅｎ， Ａ． −Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ５２；４６ ５９（１９９３））。
【００６５】
タンパク質翻訳の早期終了を生じる突然変異については、短縮タンパク質試験（ＰＴＴ） が効率的な診断手法を提供する（Ｒｏｅｓｔ， ｅｔ． ａｌ．， （１９９３） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２；１７１９−２１；ｖａｎ ｄｅｒＬｕｉｊｔ， ｅｔ． ａｌ．， （１９９４） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０；１−４）。ＰＴＴのためには、利用できる組織からＲＮＡが最初に単離されて逆転写され、目的の部分がＰＣＲによって増幅される。逆転写ＰＣＲの産物は次いで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび真核細胞の翻訳を開始させるための配列を含むプライマーを使用するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いられる。目的領域の増幅後、プライマーに組み込んだ独特のモチーフによって、ＰＣＲ産物の連続的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および翻訳が可能になる。翻訳産物のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動時に、短縮ポリペプチドの出現は、翻訳の早期終了を引き起こす突然変異の存在を示す。この方法の変法では、目的の標的領域が１個のエキソンに由来する場合、ＤＮＡ（ＲＮＡでなく）がＰＣＲテンプレートとして用いられる。
【００６６】
ここに記載の診断に用いる核酸検体を得るために、任意の細胞型または組織を利用することができる。好ましい一実施形態では、ＤＮＡ試料は、既知の方法（たとえば静脈穿刺）で得られた血液または唾液のような体液から得られる。あるいは、核酸試験を乾燥試料（たとえば髪または皮膚）に対して実施することができる。ＲＮＡまたはタンパク質を用いる場合、使用することのできる細胞または組織はＩＬ−１遺伝子を発現しなければならない。
【００６７】
診断的な手順はまたｉｎ ｓｉｔｕで直接、生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定および／または凍結）に対して実施することもでき、核酸精製が不要である。核酸試薬はそのようなｉｎ ｓｉｔｕ手順についてはプローブおよび／またはプライマーとして用いることができる（たとえば、Ｎｕｏｖｏ， Ｇ． Ｊ．， １９９２， ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．を参照）。
【００６８】
一つの核酸配列の検出に主に注目する方法に加えて、プロファイルもまたそのような検出計画で評価しうる。フィンガープリントプロファイルは、たとえば、ディファレンシャルディスプレイ手順、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することによって作成することができる。
【００６９】
好ましい一検出方法は、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子の領域と重なり合い、また約５、１０、２０、２５、または３０ヌクレオチドを突然変異または多型領域の周辺に有するプローブを用いる、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい一実施形態では、再狭窄に関与する他の対立遺伝子変異体と特異的にハイブリダイズする能力のあるいくつかのプローブが、たとえば「チップ」（最大約２５０，０００オリゴヌクレオチドを保持することができる）のような固相担体に結合している。オリゴヌクレオチドは、リトグラフィーを含むさまざまな処理によって固相担体に結合することができる。オリゴヌクレオチドを含むこれらの「ＤＮＡプローブアレイ」とも称するチップを用いた突然変異検出分析はたとえば、Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７；２４４に記載されている。一実施形態では、一つのチップはある遺伝子の少なくとも一つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。固相担体を次いで被験核酸と接触させ、特異的プローブとのハイブリダイゼーションが検出される。その結果、一個以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性を、簡易なハイブリダイゼーション実験で同定することができる。
【００７０】
これらの方法はまた、分析前に核酸を増幅する段階を含むことができる。増幅方法は当業者に既知であり、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的対立遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＡＳＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ｎｅｓｔｅｄポリメラーゼ連鎖反応、ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７；１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ ａｌ．， １ ９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６；１１７３−１１７７）、およびＱ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ， Ｐ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６；１１９７）を含むがこれらに限定されない。
【００７１】
増幅産物は、サイズ分析、制限酵素消化に続くサイズ分析、反応産物中に特定の標識オリゴヌクレオチドプライマーを検出、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的５'エキソヌクレアーゼ検出、配列決定、ハイブリダイゼーション、などを含むさまざまな方法で分析することができる。
【００７２】
ＰＣＲに基づく検出方法は、複数のマーカーの同時の多重増幅を含みうる。たとえば、サイズが重ならない、同時に分析できるＰＣＲ産物を生成するようにＰＣＲプライマーを選択することは当該分野でよく知られている。あるいは、区別して標識され、ゆえにそれぞれを区別して検出することのできるプライマーを有する別々のマーカーを増幅することが可能である。もちろん、ハイブリダイゼーションに基づく検出方法は、試料中の複数のＰＣＲ産物の区別を付けた検出を可能にする。複数のマーカーの多重分析を可能にする他の方法が当該分野で知られている。
【００７３】
単に解説のための一実施形態では、その方法は（ｉ）細胞の検体を患者から得る、（ｉｉ）核酸（たとえば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を検体の細胞から単離する、（ｉｉｉ）核酸検体を、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子と５'および３'へ特異的にハイブリッド形成する一個以上のプライマーと、対立遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で接触させる、および（ｉｖ）増幅産物を検出する段階を含む。これらの検出計画は、核酸分子の検出に、そのような分子が非常に少数で存在する場合に特に有用である。
【００７４】
対象の分析の好ましい一実施形態では、ＩＬ−１炎症促進性ハプロタイプの対立遺伝子が、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定される。たとえば、検体および対照ＤＮＡは単離され、増幅され（随意的に）、一個以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そして断片長サイズがゲル電気泳動によって測定される。
【００７５】
さらに別の一実施形態では、当該分野で既知のさまざまな配列決定反応のうち任意のものを用いて直接に対立遺伝子を配列決定することができる。典型的な配列決定反応は、Ｍａｘｉｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ （（１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４；５６０）またはＳａｎｇｅｒ （Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ （１９７７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４；５４６３）によって開発された方法に基づくものを含む。対象の分析（たとえばＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９５）１９；４４８を参照）を実施する場合、質量分析による配列決定（たとえば国際公開第９４／１６１０１号パンフレット；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３６；１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８；１４７−１５９を参照）を含む、さまざまな自動化配列決定手順のうち任意のものを利用しうることもまた考えられている。一部の実施形態について、配列決定反応において核酸塩基のうち１、２または３個だけの存在を確認する必要があることは当業者に明らかとなる。たとえば、ただ１つだけの核酸が検出されるＡ鎖などといったものを実施することができる。．
さらなる一実施形態では、切断試薬（たとえばヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジン）からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基を検出することができる（Ｍｙｅｒｓ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術的方法は、野生型対立遺伝子を含む（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡを試料とハイブリダイズすることによって生成したヘテロ二本鎖を得ることから始まる。二本鎖二重分子は、対照と試料鎖との間の塩基対ミスマッチが原因で存在するような、二本鎖の一本鎖領域を切断する試薬で処理する。たとえば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＲＮａｓｅで処理することができ、またＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理することができる。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理することができる。ミスマッチ領域の消化後、結果として生じた物質を次いでサイズによって変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、突然変異の部位を決定する。たとえば、Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５；４３９７；およびＳａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７；２８６−２９５を参照。好ましい一実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識することができる。
【００７６】
さらに別の一実施形態では、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一個以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５；１６５７−１６６２）。典型的な一実施形態によると、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子に基づくプローブが、被験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズされる。その二本鎖はＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物はもしあれば電気泳動手順などから検出することができる。たとえば、米国特許第５，４５９，０３９号明細書を参照。
【００７７】
他の実施形態では、ＩＬ−１遺伝子座対立遺伝子を同定するのに電気泳動移動度における変化を用いる。たとえば、突然変異と野生型核酸との間の電気泳動移動度の差を検出するのに、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）を用いることができる（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６；２７６６、Ｃｏｔｔｏｎ （１９９３） Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５；１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ （１９９２） Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９；７３−７９も参照）。試料および対照ＩＬ−１遺伝子座対立遺伝子の一本鎖ＤＮＡ断片は変性され復元させられる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、結果として生じる電気泳動移動度の変化は、一塩基変化さえも検出を可能にする。当該ＤＮＡ断片は標識することができ、または標識プローブで検出することができる。分析の感度は、二次構造が配列における変化により感受性が高いＲＮＡ（ＤＮＡでなく）を用いることによって高めることができる。好ましい一実施形態では、対象の方法はヘテロ二本鎖分析を利用して、二本鎖ヘテロ二重分子を電気泳動移動度の変化に基づいて分離する（Ｋｅｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７；５）。
【００７８】
さらに別の一実施形態では、変性剤のグラジエントを含むポリアクリルアミドゲル中での対立遺伝子の移動を、変性グラジエントゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を用いて分析する（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３；４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合ＤＮＡは、完全には変性しないことを確実にするために、たとえばＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加して修飾される。さらなる一実施形態では、対照と検体ＤＮＡとの間の移動度の差を識別するために、変性剤グラジエントの代わりに温度グラジエントが用いられる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ａｎｄ Ｒｅｉｓｓｎｅｒ （１９８７） Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５；１２７５３）。
【００７９】
対立遺伝子を検出するための他の方法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を含むがこれらに限定されない。たとえば、既知の突然変異またはヌクレオチドの差（たとえば、対立遺伝子変異体において）が中央に置かれるオリゴヌクレオチド プライマーを作製することができ、次いで、完全マッチが見つかった場合に限りハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡとハイブリッド形成することができる（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２４；１６３）；Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６；６２３０）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、オリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる突然変異または多型領域とハイブリッド形成する場合、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合していて標識標的ＤＮＡとハイブリッド形成したとき、反応ごとに一つの突然変異または多型領域を試験するのに用いることができる。
【００８０】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明に関連して用いることができる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、目的の突然変異または多型領域を分子の中心（増幅が差別的ハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７；２４３７−２４４８）または、適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げるかまたは低下させることのできる、一つのプライマーの３'最末端に有しうる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ （１９９３） Ｔｉｂｔｅｃｈ １１；２３８。さらに、切断に基づく検出を行うためには、突然変異の領域に新しい制限部位を導入することが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６；１）。一部の実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて実施することもできることが予想される（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８；１ ８９）。そのような場合には、連結反応は５'配列の３'末端で完全なマッチが存在する場合に限って起こり、増幅の有無を探すことによって特定部位における既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【００８１】
別の一実施形態では、対立遺伝子変異体の同定は、たとえば米国特許第４，９９８，６１７号明細書およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ， Ｕ． ｅｔ ａｌ． （（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１；１０７７−１０８０）に記載されたように、オリゴヌクレオチド連結反応分析（ＯＬＡ）を用いて実施される。ＯＬＡ手順は、標的の一本鎖の隣接する配列とハイブリッド形成する能力を有するように設計された２種類のオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドのうち１種類はたとえばビオチニル化のように分離マーカーと結合しており、もう１種類は検出可能に標識されている。標的分子中に正確な相補的配列が見出される場合、オリゴヌクレオチドはそれらの末端が隣接するようにハイブリッド形成し、連結反応基質を生じる。連結反応は次いでアビジンまたは別のビオチンリガンドを用いて標識オリゴヌクレオチドが回収されるようにする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ．は、ＰＣＲおよびＯＬＡの特性を組み合わせた核酸検出分析法を記載している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７；８９２３−２７）。この方法では、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡの指数的増幅が達成され、標的ＤＮＡは次いでＯＬＡを用いて検出される。
【００８２】
このＯＬＡ法に基づくいくつかの方法が開発されており、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの対立遺伝子を検出するのに用いることができる。たとえば、米国特許第５，５９３，８２６号明細書は、ホスホロアミデート結合を有する結合物質を形成する、３'−アミノ基を持つオリゴヌクレオチドと５'−リン酸化オリゴヌクレオチドとを用いるＯＬＡを開示する。Ｔｏｂｅ ｅｔ ａｌ． （（１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４；３７２８）に記載されたＯＬＡの別の変法では、ＰＣＲと組み合わせたＯＬＡによって１つのマイクロタイターウェル内で２個の対立遺伝子の型分析が可能になる。対立遺伝子特異的プライマーのそれぞれを独特のハプテンすなわちジゴキシゲニンおよびフルオレセインで標識することにより、それぞれのＯＬＡ反応は、別々の酵素レポーターであるアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したハプテン特異的抗体を用いることによって検出することができる。この系は、異なる２色の産生に結びつく高処理量形式を用いて、２個の対立遺伝子の検出を可能にする。
【００８３】
本発明の別の一実施形態は再狭窄を発症する素因を検出するキットに向けられている。このキットは、ＩＬ−１遺伝子座ハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子の５'および３'にハイブリダイズする５'および３'オリゴヌクレオチドを含む、一個以上のオリゴヌクレオチドを含みうる。ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチドは、以降の分析のために便利なサイズのＰＣＲ産物を産生するために、２５から２５００塩基対離れた間、好ましくは約１００から約５００塩基離れた間にハイブリダイズすべきである。
【００８４】
特に好ましいプライマーは図８〜１ １に記載のヌクレオチド 配列を含んだ本発明の方法によるＩＬ−１多型対立遺伝子の増幅および検出に用いるための別のオリゴヌクレオチドの設計は、ヒトＩＬ−１遺伝子座を含むヒト染色体２ｑ１３からの最新の配列情報、およびこの遺伝子座について利用できる最新のヒト多型情報の両方の利用可能性によって促進される。たとえば、ＩＬ−１Α、ＩＬ−１ＢおよびＩＬ−１ＲＮのＤＮＡ配列を図１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３８３３）、２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０４５００）および３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４５３２）にそれぞれ示す。これらの遺伝子中のヒト多型の検出のための適当なプライマーは、この配列情報およびプライマー配列の設計および最適化のための当該分野で既知の標準的方法を用いて容易に設計することができる。そのようなプライマー配列の最適な設計は、たとえば、Ｐｒｉｍｅｒ２．１、Ｐｒｉｍｅｒ３またはＧｅｎｅＦｉｓｈｅｒといった市販のプライマー選択プログラムの使用によって達成することができる（Ｎｉｃｋｌｉｎ Ｍ． Ｈ． Ｊ．， Ｗｅｉｔｈ Ａ． ＤｕｆｆＧ． Ｗ．，「Ａ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｉｏｎ Ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ− １．ａｌｐｈａ．， Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ − １．ｂｅｔａ．， ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｇｅｎｅｓ」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９；３８２ （１９９５）；Ｎｏｔｈｗａｎｇ Ｈ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ −１ ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＹＡＣ／ＰＡＣ Ｃｏｎｔｉｇ ａｎｄ ａ ｐａｒｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｍａｐ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２ｑ１３」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１；３７０（１９９７）；Ｃｌａｒｋ， ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， １４；７８９７−７９１４ [正誤表はＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５；８６８ （１９８７） 、およびＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｇｄｂ．ｏｒｇのゲノムデータベース（ＧＤＢ）プロジェクトも参照）。
【００８５】
キットでの使用のためには、オリゴヌクレオチドはたとえば合成オリゴヌクレオチド、制限断片、ｃＤＮＡ、合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）、などといったさまざまな天然および／または合成の組成の任意のものでありうる。分析キットおよび方法はまた、分析における同定を容易にするため、標識オリゴヌクレオチドを用いることができる。使用することのできる標識の例は、放射性標識、酵素、蛍光化合物、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性部分、金属結合部分、抗原または抗体部分、などを含む。
【００８６】
キットは、随意的に、ＤＮＡサンプリング手段を含むこともできる。ＤＮＡサンプリング手段は当業者によく知られており、たとえば濾紙、ＡｍｐｌｉＣａｒｄ（商標）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ Ｓ１０ ２ＪＦ；Ｔａｒｌｏｗ， Ｊ Ｗ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０３；３８７−３８９ （１９９４）） など；Ｎｕｃｌｅｏｎ（商標）キット、細胞溶解緩衝液、プロテイナーゼ溶液などといったＤＮＡ精製試薬；１０Ｘ反応緩衝液、熱安定ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、などといったＰＣＲ試薬；およびＨｉｎｆＩ制限酵素、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、乾燥血液由来のｎｅｓｔｅｄＰＣＲ用縮重オリゴヌクレオチドプライマーなどといった対立遺伝子検出法を含みうるがこれらに限定されない。
【００８７】
４．薬理ゲノム学
疾患または状態を発症する感受性と関連する特定の対立遺伝子の知識は、単独でまたはその特定の疾患または状態に寄与する他の遺伝子欠陥についての情報と併せて、「薬理ゲノム学」の目標である個体の遺伝子プロファイルに基づいた予防または治療のオーダーメイドを可能にする。したがって、対象者のＩＬ−１プロファイルを血管疾患についての人口のプロファイルと比較することは、特定の患者または患者集団（すなわち、同一の遺伝子変化を有する患者の群）に対して安全で有効であることが予期される薬物または他の治療計画の選択または設計を可能にする。
【００８８】
さらに、遺伝子プロファイルに基づいて、最大の臨床上の利益を示すことが予期される集団を標的にする能力は、１）既発医薬の再位置づけ；２）患者の部分集団に特異的な安全性または有効性の限界の結果として臨床開発が中断された医薬候補の救済；および３）医薬候補のより速やかなより費用のかからない開発とより最適な医薬標示（たとえば、物質のさまざまな用量が原因突然変異に及ぼす影響を測定することは有効量を最適化するために有用であるため）：を可能にすることができる。
【００８９】
ある人の特定の治療薬を用いた治療は、タンパク質（たとえばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、またはＩＬ−ＩＲａ）、ｍＲＮＡおよび／または転写レベルを測定することによって監視することができる。検出されたレベルに応じて、治療計画をその後維持したり調整したりすることができる（用量を増加または減少させる）。好ましい一実施形態では、対象をある薬剤で治療することの有効性は、（ｉ）その薬剤の投与前に対象者から投与前検体を採取すること；（ｉｉ）投与前検体中のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの濃度または量を検出すること；（ｉｉｉ）対象者から一個以上の投与後検体を採取すること；（ｉｖ）投与後検体中のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出すること；（ｖ）投与前検体中のタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを投与後検体中の対応するタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとそれぞれ比較すること；および（ｖｉ）対象者への当該薬剤の投与をそれに応じて変化させること：の段階を含む。
【００９０】
治療薬の投与前後に対象者の細胞を採取し、ＩＬ−１遺伝子以外の遺伝子の発現のレベルを検出して、有害でありうる遺伝子の発現をその治療薬が上昇も低下もさせないことを確認することもできる。このことは、たとえば、転写プロファイリングの方法を用いて行うことができる。このように、治療薬にｉｎ ｖｉｖｏで曝露された細胞に由来するｍＲＮＡと、その治療薬に曝露されていない同じ型の細胞に由来するｍＲＮＡを逆転写して、多数の遺伝子に由来するＤＮＡを含むチップとハイブリダイズさせ、それによってその治療薬で処理したかまたは処理されていない細胞における遺伝子の発現を比較することができる。
【００９１】
５．ＩＬ−１多型に関連する疾患および状態のための治療薬
ＩＬ−１多型またはハプロタイプに関連する疾患および状態の治療法とは、対象者におけるその特定の疾患または状態の症状を防ぐかまたは発症を延期するかまたは緩和する、任意の物質または治療計画をいう（医薬、栄養補助食品および外科的手段を含む）。治療薬は、ポリペプチド、ペプチドミメティック、核酸、または他の無機または有機分子であることができ、好ましくはビタミン、ミネラル、その他の栄養素を含む「小分子」である。好ましくは、治療薬はＩＬ−１ポリペプチドの少なくとも１種類の活性、たとえば、受容体との相互作用を、天然に存在するポリペプチドの効果を模倣または増強（作用）または阻害（拮抗）することによって調節することができる。アゴニストは、野生型の生物活性の少なくとも一つ、たとえば受容体結合活性、を有する野生型タンパク質またはその誘導体でありうる。アゴニストはまた、遺伝子の発現をアップレギュレートするかまたはタンパク質の少なくとも１種類の生物活性を上昇させる化合物でありうる。アゴニストはまた、たとえば受容体といった他の分子とポリペプチドとの相互作用を増大させる化合物でありうる。アンタゴニストは、たとえば受容体、またはシグナル伝達あるいは翻訳後修飾を阻害する物質といった他の分子とタンパク質との相互作用を阻害または減少させる化合物（たとえば、ＩＬ−１変換酵素（ＩＣＥ）阻害因子）でありうる。したがって、好ましいアンタゴニストは受容体への結合を阻害または減少させそれによって以降の受容体活性化を阻害する化合物である。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレギュレートするかまたは存在するタンパク質の量を減少させる化合物でありうる。アンタゴニストはポリペプチドの優性阻害型、たとえば、受容体のような標的ペプチドと相互作用することができるが、受容体の活性化を促進しない、ポリペプチドの一種でありうる。アンタゴニストはまた、ポリペプチドの優性阻害型をコードする核酸、アンチセンス核酸、またはＲＮＡと特異的に相互作用することのできるリボザイムでありうる。さらに他のアンタゴニストはポリペプチドと結合しその作用を阻害する分子である。そのような分子は、たとえば、生物学的活性を持たない、受容体への結合を阻害する型の標的ペプチドといったペプチドを含む。このように、そうしたペプチドはタンパク質の活性部位に結合し、標的ペプチドと相互作用するのを阻害する。さらに他のアンタゴニストは、分子の抗原決定基と特異的に相互作用し、結合がそのポリペプチドの生物学的機能に干渉する抗体を含む。さらに他の好ましい一実施形態では、アンタゴニストはポリペプチドと標的受容体との間の相互作用を阻害することのできる分子のような小分子である。あるいは、その小分子は受容体結合部位以外の部位と相互作用することによってアンタゴニストとして機能することができる。
【００９２】
ＩＬ−１の調節因子（たとえばＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＩＬ−１受容体アンタゴニスト）またはＩＬ−１遺伝子と連鎖不平衡にある遺伝子にコードされるタンパク質は、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、核酸を含む任意の種類の化合物を含みうる。好ましいアゴニストは、核酸（たとえば、ＩＬ−１タンパク質かまたは、ＩＬ−１タンパク質にアップまたはダウンレギュレートされる遺伝子をコードする）、タンパク質（たとえばＩＬ−１タンパク質またはそれによってアップまたはダウンレギュレートされるタンパク質）または小分子（たとえばＩＬ−１タンパク質の発現または結合を調節する）を含む。好ましいアンタゴニストは、たとえばここに記載の分析法によって同定することができ、核酸（たとえば一本鎖（アンチセンス）または二本鎖（三重鎖）ＤＮＡまたはＲＮＡおよびリボザイム）、タンパク質（たとえば抗体）および、ＩＬ−１転写および／またはタンパク質活性を抑制または阻害するように作用する小分子を含む。
【００９３】
６．有効量および処方および用途
そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、培養細胞または実験動物において、たとえばＬＤ５０（集団の５０％に致死的である量）およびＥｄ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を測定するための、標準的な薬学上の手順によって測定することができる。毒性効果と治療的効果との間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用されうる一方、未感染の細胞に対する損傷の可能性を最小化し、それによって副作用を低減するため、そのような化合物を患部組織の部位へターゲッティングする送達系の設計を念入りに行うべきである。
【００９４】
細胞培養分析および動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のためのさまざまな投与量を処方するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくはＥＤ５０を含み毒性をわずかしかまたは全く有しない循環濃度の範囲内にある。投与量はこの範囲内で、使用する剤形および利用する投与経路によって変化させることができる。本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療上の有効量は、最初は細胞培養分析から推定することができる。用量は、培養細胞で測定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大値の半分の阻害が達成される被験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、モデル動物において処方することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中濃度は、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００９５】
本発明に基づく用途のための組成物は、一個以上の生理学的に受容しうる担体または添加物を用いて、従来の方法で処方することができる。このように、化合物およびその生理学的に受容しうる塩と溶媒和物は、たとえば、注射、吸入または通気（口または鼻のいずれかを通して）または経口、舌下、非経口または直腸適用による投与のために処方することができる。
【００９６】
そのような治療法のために、本発明の化合物は、全身および局所および限局性投与を含むさまざまな投与量のために処方することができる。技術および処方は一般的にＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｅａｄｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａに見出すことができる。全身投与には、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射のためには、本発明の化合物は、好ましくはたとえばハンク液またはリンガー液のような生理学的に適合する緩衝液中の溶液に処方することができる。さらに、化合物は固体の形に処方し使用直前に再溶解するかまたは懸濁することができる。凍結乾燥形態もまた含まれる。
【００９７】
経口投与用には、当該組成物はたとえば、結合剤（たとえば、ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（たとえば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルスターチナトリウム）；または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）といった医薬品として受容できる添加物を用いて従来の方法によって錠剤またはカプセルの形状を取ることができる。錠剤は当該分野でよく知られている方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体製剤は、たとえば、溶液、シロップまたは懸濁液の形を取ることができ、あるいは使用前に水または他の適当な賦形剤で構成するための乾燥製品として与えることができる。そのような液体製剤は、懸濁剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水系賦形剤（たとえば、ａｔｉｏｎｄ ｏｉｌ、油状エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および保存料（たとえば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩またはソルビン酸）といった医薬品として受容できる添加物と共に従来の方法によって調製することができる。当該調製物はまた緩衝塩、香料、着色料、および甘味料を必要に応じて含むことができる。
【００９８】
経口投与用の調製物は活性化合物の徐放を与えるよう適当に処方することができる。舌下投与用には当該組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形を取ることができる。吸入による投与用には、本発明に記載の使用のための化合物は、適当な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いて、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー製剤の形で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量した量を送達するためにバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または送気器で使用するためのたとえばゼラチンなどのカプセルまたはカートリッジは、当該化合物の粉末混合物およびたとえば乳糖やデンプンのような適当な粉末基剤を含めて処方することができる。
【００９９】
当該化合物は、たとえばボーラス注射または連続注入のような、注射による非経口投与用に処方することができる。注射用処方は単位投与量剤形で、たとえばアンプルでまたは多回投与容器で、保存料を添加して、提供することができる。当該組成物はたとえば懸濁液、溶液または、油性または水性賦形剤中のエマルションといった形を取ることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤といった添加物を含むことができる。あるいは、有効成分は、たとえば使用前に滅菌パイロジェンフリー水のような適当な賦形剤で構成するための粉末の形であることができる。
【０１００】
当該化合物はまた、たとえばココアバターまたは他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含む、たとえば座剤または保留浣腸剤のような直腸用組成物として処方することもできる。
【０１０１】
前述した処方に加えて、当該化合物はまたデポ剤として処方することができる。そのような長期に作用する処方は、埋め込み（たとえば皮下にまたは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与することができる。このように、たとえば、当該化合物は適当な高分子または疎水性材料（たとえば受容しうる油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と共に、または、やや溶けにくい塩のようなやや溶けにくい誘導体として、処方することができる。他の適当な送達系は、長期にわたる医薬の局所非侵襲送達の可能性を提供するマイクロスフィアを含む。この技術は、冠カテーテルを経由してたとえば心臓またはその他の器官の任意の選択部分へ、炎症または虚血を引き起こすことなく注入することのできる、前毛細管サイズのマイクロスフィアを利用する。投与された治療薬はこれらのマイクロスフィアから徐々に放出され、周囲の組織細胞（たとえば内皮細胞）によって取り込まれる。
【０１０２】
全身投与もまた経粘膜的または経皮的手段によることができる。経粘膜投与または経皮投与用には、浸透すべきバリアに対して適当な浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は一般的に当該分野で既知であり、たとえば、経粘膜投与用には胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。さらに、浸透を促進するために界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与はスプレー式点鼻薬を通じてかまたは座剤を用いることができる。局所投与用には、本発明のオリゴマーは、一般的に当該分野で既知である通り、軟膏、膏剤、ゲル、またはクリームに処方される。外傷または炎症を治療して治癒を加速するために洗浄溶液を局所的に用いることができる。
【０１０３】
当該組成物は、必要に応じて、活性成分の入った、一またはそれ以上の単位投与量剤形を含むことのできる包装またはディスペンサー器具で与えることができる。包装は、ブリスター包装のような、たとえば金属またはプラスチック箔を含むことができる。包装またはディスペンサー器具は、投与のための説明書を付けることができる。
【０１０４】
７．治療薬を同定するための分析法
ＩＬ−１多型またはハプロタイプを伴う疾患または障害の発症を引き起こすかまたはそれに寄与する突然変異の同定に基づいて、本発明はさらに、治療薬を同定するために細胞系および無細胞系分析を取り上げる。一実施形態では、ＩＬ−１受容体、またはＩＬ−１遺伝子と連鎖不平衡にある遺伝子によってコードされるタンパク質の受容体を、細胞膜の外表面上に発現している細胞を、被験化合物単独の存在下または被験化合物および別のタンパク質の存在下でインキュベートし、被験化合物と受容体の間、またはそのタンパク質（好ましくは標識タンパク質）と受容体との間の相互作用を、たとえばマイクロフィジオメーターを用いることによって検出する（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７；１９０６）。受容体と、被験化合物またはタンパク質のどちらかとの間の相互作用は、マイクロフィジオメーターによって培地の酸性化の変化として検出される。この分析系はこのように、たとえばタンパク質−受容体相互作用に干渉することによって機能する分子アンタゴニスト、およびたとえば受容体を活性化することによって機能する分子アゴニストを同定する手段を提供する。
【０１０５】
細胞系または無細胞系分析を用いて、ＩＬ−１遺伝子またはそれと連鎖不平衡にある遺伝子の発現を制御するか、ｍＲＮＡの翻訳を調節するか、あるいはｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性を調節する化合物を同定することができる。その結果、一実施形態では、ＩＬ−１、または他のタンパク質を産生することのできる細胞を被験化合物とインキュベートし、培地中に産生されたタンパク質の量を測定し、被験化合物と接触させていない細胞から産生された量と比較する。そのタンパク質に対する当該化合物の特異性は、さまざまな対照分析、たとえば、一個以上の対照遺伝子の発現を測定することによって確認できる。特に、この分析法はアンチセンス、リボザイムおよび三重鎖化合物の有効性を測定するために用いることができる。
【０１０６】
無細胞系分析もまた、タンパク質と相互作用しそれによって当該タンパク質の活性を修飾する能力のある化合物を同定するのに用いることができる。そのような化合物は、たとえば、タンパク質の構造を修飾しそれによって当該タンパク質が受容体に結合する能力に影響を与えることができる。好ましい一実施形態では、そのような化合物を同定するための無細胞系分析は、本質的に、結合パートナーの存在下または非存在下でタンパク質および被験化合物または被験化合物のライブラリを含む反応混合物にある。被験化合物は、たとえば、生物学的に不活性な標的ペプチドのような結合パートナーの誘導体、または小分子であることができる。
【０１０７】
したがって、本発明の典型的なスクリーニング分析の一つは、タンパク質またはその機能性断片を被験化合物または被験化合物のライブラリと接触させ複合体の形成を検出する段階を含む。検出のために、分子は特定のマーカーで標識することができ被験化合物または被験化合物のライブラリは別のマーカーで標識することができる。次いで被験化合物とタンパク質またはその断片との相互作用を、インキュベート段階と洗浄段階の後に、２種類の標識の濃度を測定することによって検出することができる。洗浄段階後の２種類の標識の存在は相互作用の指標となる。
【０１０８】
分子間の相互作用もまた、光学現象である表面プラズモン共鳴（ＳＦＲ）を検出するリアルタイムＢＩＡ（生物分子相互作用分析、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を用いることによって識別することができる。検出は生体特異的インターフェイスにおける巨大分子の質量濃度の変化に依存し、反応体の標識を必要としない。一実施形態では、被験化合物のライブラリを、たとえばマイクロフローセルの一面を形成するセンサー表面上に固定化することができる。タンパク質またはその機能性断片を含む溶液を次いで連続的にセンサー表面上に流す。シグナル記録上に示される共鳴角の変化が、相互作用が起こったことを示す。この技術は、たとえばＰｈａｒｍａｃｉａのＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋにさらに記載されている。
【０１０９】
本発明のもう一つの典型的なスクリーニング分析は、（ａ）（ｉ）ＩＬ−１または他のタンパク質、（ｉｉ）適当な受容体、および（ｉｉｉ）被験化合物：を含む反応混合物を作る；そして（ｂ）タンパク質と受容体の相互作用を検出する段階を含む。被験化合物の存在下でのタンパク質と受容体の相互作用における統計的に有意な変化（増強または阻害）は、被験化合物の非存在下での相互作用と比較して、被験化合物についてアンタゴニスト（阻害因子）の可能性を示す。この分析の化合物は同時に接触させることができる。あるいは、タンパク質を適当な長さの時間被験化合物と最初に接触させ、次いで受容体を反応混合物に添加することができる。化合物の有効性は、さまざまな濃度の被験化合物を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを提供する対照分析も実施することができる。
【０１１０】
タンパク質と受容体との間の複合体形成はさまざまな方法によって検出することができる。複合体の形成の調節は、たとえば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識されたタンパク質または受容体といった検出可能に標識されたタンパク質を用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量することができる。
【０１１１】
典型的には、タンパク質または受容体のいずれかを固定化することが、それらのタンパク質の一方または両方の非複合型から複合体の分離を促進するため、および分析の自動化に対応させるためには望ましい。タンパク質と受容体の結合は、反応物を閉じ込めるのに適当な任意の容器内で達成することができる。例は、マイクロタイタープレート、試験管、および超遠心チューブを含む。一実施形態では、タンパク質がマトリクスに結合するのを可能にする領域を付加する融合タンパク質を与えることができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、それを次いでたとえば３５Ｓ−標識受容体のような受容体、および被験化合物と結合させ、複合体形成を招く条件下で、たとえば塩およびｐＨについて生理学的条件で、わずかにそれより厳しい条件が望ましいが、混合物をインキュベートする。インキュベート後、ビーズを洗浄して結合していない標識を除去し、固定化したマトリクスおよび放射性標識を直接測定する（たとえばビーズをシンチレーション液に入れる）かまたは続いて複合体を解離させ上清中について測定する。あるいは、複合体をマトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ビーズ画分中に見られるタンパク質または受容体の濃度を、付属の実施例に記載のような標準的電気泳動技術を用いてゲルから定量することができる。タンパク質をマトリクス上に固定化する他の方法もまた本分析に利用することができる。たとえば、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用してタンパク質または受容体のいずれかを固定化することができる。遺伝子導入動物を作製して、アゴニストおよびアンタゴニストを同定するかまたは、治療薬候補の安全性と有効性を確認することもできる。本発明の遺伝子導入動物は、適当な内因性プロモーターの調節下にあるかまたは異種プロモーターの調節下にある再狭窄原因突然変異を有する非ヒト動物を含むことができる。
【０１１２】
遺伝子導入動物はまた、適当なプロモーターまたはその断片の調節下にある、レポーター遺伝子のような導入遺伝子を含む動物であることができる。これらの動物は、たとえば、遺伝子発現を調節することによってＩＬ−１タンパク質の産生を調節するような薬物を同定するのに有用である。遺伝子導入非ヒト動物を得る方法は当該分野でよく知られている。好ましい実施形態では、再狭窄原因突然変異の発現は、たとえば目的のパターンにおいて発現を調節するシス作用配列を利用して、細胞、組織または発生段階の特定の部分集合に限られている。本発明では、タンパク質のそのようなモザイク発現は多くの種類の系譜分析に必須となる可能性があり、また加えてたとえば、他の面では正常な胚の中の組織の小さな区画において発生を大きく変化させうる発現レベルの影響を評価する手段を提供しうる。このような目的で、ある空間的パターンにおいて突然変異の発現を調節するために、組織特異的調節配列および条件的調節配列を用いることができる。さらに、発現の一時的パターンを、たとえば、条件的組み換え系または原核細胞転写調節配列によって提供することができる。遺伝子技術は、ｉｎ ｖｉｖｏの部位特異的遺伝子操作を介して突然変異の発現が調節されうることを可能にし、当該分野の熟練者に既知である。
【０１１３】
本発明の遺伝子導入動物はすべて、複数の細胞内に本発明の原因突然変異導入遺伝子を含み、その導入遺伝子は「宿主細胞」の表現型を変化させる。説明のための実施形態において、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９；６２３２−６２３６；Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） ＰＮＡＳ ８９；６８６１−６８６５）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ'Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１；１３５１−１３５５；国際公開第９２／１５６９４号明細書）のいずれかを用いてｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的遺伝子組み換え系を作製することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在する標的配列の部位特異的組み換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対ヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼに媒介される遺伝子組み換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の向きは、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在する標的配列が切り取られるか反転するかを決定する（Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１ ９８４）Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５９；１ ５０９−１ ５ １ ４）；ｌｏｘＰ配列が順方向反復の向きである場合は標的配列の切り取りを触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆方向反復の向きである場合は標的配列の反転を触媒する。
【０１１４】
したがって、標的配列の遺伝子組み換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。当該リコンビナーゼの発現は、たとえば組織特異的、発生段階特異的、外部から添加された物質によって誘導可能または抑制可能な、調節的制御を受けるプロモーター配列によって調節することができる。この調節された制御は、リコンビナーゼ発現が当該プロモーター配列によって媒介される細胞においてのみ標的配列の遺伝子組み換えを結果として生じる。このように原因突然変異導入遺伝子の発現の活性化は、リコンビナーゼ発現の制御を介して調節することができる。
【０１１５】
原因突然変異導入遺伝子の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の使用は、Ｃｒｅリコンビナーゼと対象タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む遺伝子導入動物の作製を必要とする。Ｃｒｅリコンビナーゼおよび再狭窄原因突然変異導入遺伝子の両方を含む動物は、「二重」遺伝子導入動物の作製を通じて提供することができる。そのような動物を提供する便利な方法は、それぞれ一つの導入遺伝子を含む２種類の遺伝子導入動物を交配することである。
【０１１６】
同様の条件的導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を促進するために原核細胞タンパク質が同時に発現することを必要とする原核細胞プロモーター配列を用いて提供することができる。典型的なプロモーターおよび対応する転写促進原核細胞タンパク質が米国特許第４，８３３，０８０号明細書で与えられている。
【０１１７】
さらに、条件的導入遺伝子の発現は、たとえばリコンビナーゼまたは原核細胞タンパク質のような転写促進タンパク質をコードする遺伝子が、たとえば細胞型特異的な方法で組織へ送達され発現させられる、遺伝子療法的な方法によって誘導することができる。この方法によって、転写活性化因子の導入によって「スイッチが入る」まで、導入遺伝子は成体になるまでサイレントのままに留まることができる。
【０１１８】
典型的な一実施形態では、本発明の「遺伝子導入非ヒト動物」は、非ヒト動物の生殖細胞系列に導入遺伝子を導入することによって作製される。さまざまな発生段階にある胚の標的細胞を、導入遺伝子を導入するのに用いることができる。胚の標的細胞の発生段階によってさまざまな方法が用いられる。本発明を実施するために用いられる任意の動物の特定の系統は、良好な全身の健康、良好な胚収率、胚の中で前核がよく見えること、および良好な繁殖適性について選択される。さらに、ハプロタイプは重要な要因である。たとえば、遺伝子導入マウスを作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＦＶＢ系といった系統がしばしば用いられる（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍｅ．）。好ましい系統は、Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１のようにＨ−２ｂ、Ｈ−２ｄまたはＨ−２ｑハプロタイプを持つものである。本発明を実施するために用いられる系統は、それ自体が遺伝子導入動物であることができ、および／またはノックアウト動物（すなわち、一個以上の遺伝子を部分的にまたは完全に抑制された動物から得られた）であることができる。
【０１１９】
一実施形態では、導入遺伝子構造は一細胞期胚に導入される。接合子はマイクロインジェクションのための最適の標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０マイクロメートルの大きさに達し、ＤＮＡ溶液１〜２ｐＬの再現性のある注入を可能にする。遺伝子導入の標的としての接合子の使用は、ほとんどの場合で注入されたＤＮＡは最初の分裂の前に宿主遺伝子に組み込まれるという大きな長所を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） ＰＮＡＳ ８２；４４３８−４４４２）。結果として、その遺伝子導入動物のすべての細胞が、組み込まれた導入遺伝子を持つことになる。生殖細胞の５０％が導入遺伝子を持つようになるため、このことはまた一般に、創始者の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達にも反映される。
【０１２０】
通常、受精した胚は前核が現れるまで適当な培地中でインキュベートされる。この頃に、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列が雌性または雄性前核に下記の通り導入される。マウスのような一部の種では、雄性前核が好ましい。外因性遺伝物質は、接合子の雄性ＤＮＡ補集合に、それが卵核または接合子の雌性前核によって処理される前に加えるのが非常に好ましい。卵核または雌性前核は、おそらく雄性ＤＮＡのプロタミンをヒストンに交換することによって、雄性ＤＮＡ補集合に影響を与える分子を放出し、それによって雌性および雄性ＤＮＡ補集合が結合して２倍体接合子を形成するのを促進すると考えられている。このように、外因性遺伝物質は、ＤＮＡの雄性補集合またはＤＮＡの任意の他の補集合へ、それが雌性前核に影響を受ける前に添加されるのが好ましい。たとえば、外因性遺伝物質は雄性前核の形成後できるだけ早く、初期雄性前核に添加され、その時は雄性および雌性前核がよく分離していて両方とも細胞膜の近くに位置する。あるいは、外因性遺伝物質は、精子の核に、それが脱凝縮するよう誘導された後に、添加することができる。外因性遺伝物質を含む精子はその後卵子に加えることができ、またはその脱凝縮した精子は導入遺伝子構造を加えられその後できるだけ早く卵子に加えることができる。
【０１２１】
導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚への導入は、たとえば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションといった、当該分野で既知の任意の方法によって達成することができる。導入遺伝子ヌクレオチド配列の胚への導入後、胚はさまざまな長さの時間ｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートでき、または代理母に再移植することができ、またはその両方である。満期までのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養も本発明の範囲内である。一つの一般的方法は、胚をｉｎ ｖｉｔｒｏで、種によって約１〜７日間インキュベートし、次いでそれらを代理母に再移植することである。
【０１２２】
本発明の目的のためには、接合子は本質的に、完全な生物体に発生する能力を有する二倍体細胞の形成である。一般に、接合子は一個の配偶子または複数個の配偶子に由来する二個の半数体核の融合によって、自然にまたは人工的に形成された核を含む卵から成る。このように、配偶子核は自然に適合するもの、すなわち、分化して機能する生物体に発生する能力を有する、生存力のある接合子を生じるものでなければならない。一般に、正倍数性の接合子が好ましい。異数性の接合子が得られた場合は、染色体の数はどちらか一方の配偶子が由来する生物の正倍数に関して１より大きく異なるべきでない。
【０１２３】
同様の生物学的検討事項に加えて、物理的検討事項もまた、接合子の核にまたは接合子核の一部を形成する遺伝物質に加えることのできる外因性遺伝物質の量（たとえば、容積）を支配する。遺伝物質が除去されない場合、加えることのできる外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊を起こさせずに吸収される量によって制限される。一般に、挿入される外因性遺伝物質の容積は、約１０ピコリットルを超えない。添加の物理的影響は、接合子の生存能力を物理的に破壊するほど大きくてはならない。結果として生じる接合子の遺伝物質は、外因性遺伝物質を含め、機能する生物への接合子の分化および発生を開始および維持する能力を生物学的に有しなければならないため、ＤＮＡ配列の数および種類の生物学的限界は、その特定の接合子および外因性遺伝物質の機能に依存して変化し、また当該分野の熟練者には容易に明らかとなる。
【０１２４】
接合子に加えられた導入遺伝子構造のコピー数は、加えられた外因性遺伝物質の総量に依存し、形質転換が起こることが可能な量となる。理論的には一コピーだけが必要である；しかし一般に、一つのコピーが機能することを保証するために、たとえば導入遺伝子構造の１，０００〜２０，０００コピーといった多数のコピーが使用される。本発明に関しては、外因性ＤＮＡ配列の表現型発現を促進するためには、挿入された外因性ＤＮＡ配列のそれぞれの機能するコピーを一より多く有することの利点がしばしばある。
【０１２５】
外因性遺伝物質の核遺伝物質への添加を可能にする任意の方法を、それが細胞、核膜または他の既存の細胞構造または遺伝子構造にとって破壊的でない限り利用することができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって優先的に核遺伝物質に挿入される。細胞および細胞構造のマイクロインジェクションは当該分野で既知であり使用されている。
【０１２６】
再移植は標準的方法を用いて達成される。通常は、代理母は麻酔し、胚は卵管に挿入される。特定の代理母に移植する胚の数は種によって異なるが、通常はその種が自然に生じる産仔数に相当する。
【０１２７】
代理母の遺伝子導入した子は、導入遺伝子の存在および／または発現について任意の適当な方法によってスクリーニングすることができる。スクリーニングはしばしば、導入遺伝子の少なくとも一部と相補的なプローブを用いてサザンブロットまたはノーザンブロット分析によって達成される。導入遺伝子によってコードされたタンパク質に対する抗体を用いたウェスタンブロット分析を、導入遺伝子産物の存在についてのスクリーニングに、代替または追加の方法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡは尾部組織から調製され、導入遺伝子についてサザン分析またはＰＣＲで分析される。あるいは、この分析には任意の組織または細胞型を用いることができるが、導入遺伝子を最高のレベルで発現すると信じられている組織または細胞が、導入遺伝子の存在および発現についてサザン分析またはＰＣＲを用いて分析される。
【０１２８】
導入遺伝子の存在について評価するための代替または追加の方法は、制限無しに、酵素および／または免疫学的分析といった適当な生化学分析、特定のマーカーまたは酵素活性についての組織学的染色、フローサイトメトリー分析、などを含む。血液中の導入遺伝子産物の存在を検出するため、およびさまざまな種類の血球細胞および他の血液成分の濃度に及ぼす導入遺伝子の影響を評価するために、血液の分析もまた有用でありうる。
【０１２９】
遺伝子導入動物を適当なパートナーと交配することによって、または遺伝子導入動物から得られた卵および／または精子のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精によって、遺伝子導入動物の子孫を得ることができる。パートナーとの交配を実施する場合は、パートナーは遺伝子導入および／またはノックアウト動物であってもなくてもよい；遺伝子導入動物である場合は、同一かまたは異なる導入遺伝子、または両方を含みうる。あるいは、パートナーは親系統であることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精が用いられる場合、受精胚は代理母に移植するかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するか、または両方であることができる。いずれかの方法を用いて、子孫は導入遺伝子の存在について上記の方法または他の適当な方法を用いて評価することができる。
【０１３０】
本発明に従って作製された遺伝子導入動物は外因性遺伝物質を含む。さらに、そのような実施形態では、配列は、たとえば好ましくは導入遺伝子産物の発現を特定の種類の細胞で可能にする、転写調節配列たとえばプロモーターと結合される。
【０１３１】
レトロウイルス感染もまた、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するために用いることができる。発生中の非ヒト胚はｉｎ ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで培養することができる。この間に、割球はレトロウイルス感染の標的となることができる（Ｊａｅｎｉｃｈ， Ｒ． （１９７６） ＰＮＡＳ ７３；１２６０−１２６４）。割球の効率的な感染は、透明体を取り除く酵素的処理によって得られる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， Ｈｏｇａｎ ｅｄｓ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８６）。導入遺伝子を導入するのに用いられるウイルスベクター系は典型的には、導入遺伝子を有する非増殖型レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８５） ＰＮＡＳ ８２；６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８５） ＰＮＡＳ ８２；６１４８−６１５２）。割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することによって、遺伝子導入は容易にかつ効率的に得られる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ， 前出；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６；３８３−３８８）。あるいは、感染はより後期で実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は、胞胚腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１ ９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８；６２３−６２８）。遺伝子導入非ヒト動物を形成する細胞の部分集団においてのみ組み込みが起こるため、創始者の大部分は導入遺伝子に関してモザイクとなる。さらに、創始者は、導入遺伝子のさまざまなレトロウイルス挿入を、一般的に子孫で分離するゲノム中のさまざまな位置に含みうる。加えて、妊娠中の胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖細胞系に導入遺伝子を導入することもまた可能である（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２）前出）。
【０１３２】
導入遺伝子導入のための別の種類の標的細胞は胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された移植前胚から得られ、胚と融合される（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２；１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９；２５５ ２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３；９０６５−９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２；４４５−４４８）。導入遺伝子は、ＤＮＡ遺伝子導入によってまたはレトロウイルス媒介形質導入によって効率的にＥＳ細胞に導入することができる。そのような形質転換ＥＳ細胞は、その後非ヒト動物由来の胚盤胞と一体化させることができる。ＥＳ細胞はその後、胚にコロニーを形成し、結果として生じるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。総説はＪａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０；１４６８−１４７４を参照。
【０１３３】
本発明は、いかなる方法でも制限的と理解されるべきでない以下の実施例によってさらに説明される。引用されたすべての参考文献の内容は（本明細書の全体にわたって引用された参照文献、発行済み特許、公開特許公報を含む）ここに明示的に参照によって開示に含まれる。本発明の実施は、別に指定されない限り、当該分野の技術の範囲である従来技術を使用する。そのような技術は文献に完全に説明されている。たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （２ｎｄ ｅｄ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１ ９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．， １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ．， １９８４）；米国特許第４，６８３，１９５号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ & Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．， １９８４）を参照。
【実施例】
【０１３４】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに裏付けるが単独で代表しない。
【０１３５】
実施例１：ＩＬ−１遺伝子座マッピングと特徴づけ
ＩＬ−１折りたたみを有するタンパク質をコードする６つの新規遺伝子が同定されている。古典的ファミリーが炎症性シグナル伝達に関与している。クローン利用のおよび放射ハイブリッドマッピングは、６つ全部の新規遺伝子を、３つの元の遺伝子ファミリーメンバー（ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１ＲＮ）と同じクラスターの近傍またはその中に第２染色体上の〜４００ｋｂ区間に位置づけている。我々は不完全な公開データベース配列を我々の配列と組み合わせ、新規遺伝子のすべてを包含する参照配列およびマップを作製しており、遺伝子構造の決定、エキソンの正確な局在化、および従来のＳＮＰとマイクロサテライトマーカーとの間の距離の決定を可能にしている。動原体からテロメアへの遺伝子の順序はＩＬ１Ａ−ＩＬ１Ｂ−ＩＬ１Ｆ７−ＩＬ１Ｆ９−ＩＬ１Ｆ６−ＩＬ１Ｆ８−ＩＬ１Ｆ５−ＩＬ１Ｆ１０−ＩＬ１ＲＮであって、うちＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、およびＩＬ１Ｆ８だけが動原体に向かって転写される。遺伝子の順序は、遺伝子間の進化上の関係に関連する。エキソン境界の重要な特性は保存されている。当該遺伝子群内には他のＩＬ−１ファミリーメンバーの証拠は無い。
【０１３６】
近年、ＩＬ−１受容体関連タンパク質２（ＩＬ−１Ｒｒｐ２，遺伝子ＩＬ１ＲＬ２）として知られる、ＩＬ−１Ｒ１と最も近縁の受容体が、ＩＬ−１Ｆ９に対する反応性を遺伝子導入細胞に与えること、およびその反応が、ＩＬ−１ｒａに非常に近く類似しているＩＬ−１Ｆ５によって非常に効果的に阻害されることが示された。ＩＬ−１Ｆ５との相互作用は親和性が高いように見える。１Ｌ−１Ｆ５と１Ｌ−１Ｆ９の両方は上皮に相対的に多く、またそれらはこの特定の区画における炎症の調節に役割を果たすことが示唆されている。それ以外の遺伝子の機能は不明であるが、低親和性相互作用がＩＬ−１Ｆ７とＩＬ−１８Ｒ１の間（Ｐａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、およびＩＬ−１Ｆ１０とＩＬ−１Ｒ１の間（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）に報告されている。ＩＬ−１ファミリーメンバーの生物学的役割は調査中であるが、ｍＲＮＡ発現はＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、およびＩＬ−１８で見られたよりも遥かに限られているように見える。したがって、新しいＩＬ−１ファミリーメンバーの機能に関与する細胞型は、ＩＬ−１の場合より遥かに特化している可能性がある。
【０１３７】
材料および方法
配列決定と配列組立
ＢＡＣｓは、パブリック・ドメイン中の部分配列にしたがって同定され（Ｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００ １ ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１ＲＮ、およびＩＬ１Ｆ５を含むとされ、それは以前に一つの遺伝子群にマッピングされていた（Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｎｏｔｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。選択された６種類のＢＡＣｓはＲＰ１１−１Ｉ２４、ＲＰ１１−４７７Ｆ１８、ＲＰ１１−５５４Ｉ７、ＲＰ１１−３６８Ａ１７、ＲＰ１１−４３４Ｉ１３、ＲＰ１１−６７Ｌ１４、ＲＰ１１−７２５Ｊ３、ＲＰ１１−３３９Ｆ２２、ＲＰ１１−９７Ｊ１４、およびＲＰ１１−６５Ｉ１２であった。公開データの大部分は未完であって、順序または方向の情報を含まなかった。個々のＢＡＣｓの公開配列を互いに対して整列させることで、最低限の重なり情報を得た。その領域にわたって最低限に張られた足場を生成するために、７種類のＢＡＣが選択され（ＲＰ１１−４７７Ｆ１８、ＲＰ１１−５５４Ｉ７、ＲＰ１１−４３４Ｉ１３、ＲＰ１１−６７Ｌ１４、ＲＰ１１−７２５Ｊ３、ＲＰ１１−３３９Ｆ２２、ＲＰ１１−９７Ｊ１４）、カバー倍数３倍まで配列決定された。小さい挿入プラスミドクローン（~３５００ｂｐ）が順方向と逆方向の両方に配列決定され、クローンを通じて対になった読みを与えた。ＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（Ｅｗｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ， １９９８）を、７種類のＢＡＣｓの塩基特定および組立に用いた。内部コンティグ観察ツールを用いて、結果として得られた組立を解析した。我々は、対になる読みが他のコンティグ末端と重なるコンティグ末端を合わせることによって、配列決定されたコンティグを並べた。この低いカバー倍数では、ＢＡＣｓは多数のコンティグに組み立てられたが、順序と方向は確立された。内部的に配列決定された７つのＢＡＣｓと、外部的に完了した２つのＢＡＣｓ（ＲＰ１１−１Ｉ２４およびＲＰ１１−６５Ｉ１２）の公開データをＧｅｎｂａｎｋから取り込んだ。さまざまなソフトウェアツールを用いて、内部、公開、および重なり配列を比較および整列し、すべての利用可能なデータにわたって順序および方向情報を与えた。コンティグをその後これらの整列から選択し、その領域にわたって可能な限り連続した配列を作成し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（バージョン４．０．５）を用いて組み立てた。
【０１３８】
配列整列とエキソン割り当て
プライマーおよびｃＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩサーバー上で動作する２配列ＢＬＡＳＴルーチン（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を用いてゲノム配列とマッチングした。エキソン整列は、ＨＧＭＰサーバー（英国ケンブリッジ）上で動作するｅｓｔ２ｇｅｎｏｍｅルーチン（Ｍｏｔｔ， １ ９９７）を用いて行った。プログラムは共通エキソン境界を同定するように設定された。短いために同定できなかった５'エキソンは、共通スプライスドナージヌクレオチド（ＧＴ）で終止する最も近い対応する配列に手動で局在化した。非コード領域の３'末端をマッピングする試みは、ｍＲＮＡサイズデータが大部分入手できないため、行わなかった。
【０１３９】
結果
ＩＬ−１遺伝子群の配列
９００キロベース領域は、内部および公開配列を組み合わせて、１４個の順序づけられた連続した配列に組み立てられた。この配列のテロメア部分は、遺伝子ＰＡＸ８を含む。続いて、コンティグの７つから構成される、計４９６ｋｂのより短い領域がその領域から抽出された。公開データベースの最近のアップデートによって、我々は配列中の６つのギャップのうち５つを埋めることができた（図１７参照）。我々は、本報告書に記載の通り、４９５４７５ヌクレオチドの注釈付き配列を公開データベース（登録番号***）に提出した。残りの１つのギャップ（図１７の印付き「ギャップ」）はＩＬ−１遺伝子群の動原体側である。その配列は完成品質のものではないが、完成配列の枠組みを提供し、またＩＬ−１遺伝子群内のその遺伝子の構造を検討することができる。新しいマップは以前に公表されたマップと合致する（Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｎｏｔｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６）が、不完全な公開ゲノム組立プロジェクトとはかなり異なる（Ｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。
【０１４０】
動原体に向かって最も近い同定された隣接する遺伝子はＩＬ−１とは関係しない。それは形質膜リン酸輸送体ＳＬＣ２０Ａ１（以前にテナガザル白血病ウイルス受容体、ＧＬＶＲ１、登録番号ＸＭ_００２２１７ヒトホモログと同定された）であって、図１の原点の左の６３ｋｂと４５ｋｂの間にマッピングされる。その遺伝子群のテロメアに向かって、ＴＩＣ（登録番号ＮＭ_０１２４５５）があり、それはＡＫＦ６選択性グアニンヌクレオチド交換因子である可能性が非常に高く（ＭＮ ａｎｄ Ｔｏｍａｓ Ｋｌｅｎｋａ， 原稿作成中）、テロメア側隣接配列にある。そのマップ位置は図１７に示す。
【０１４１】
遺伝子構造
我々はすべてのＩＬ−１ファミリーｃＤＮＡ配列をゲノム配列にマッピングしており（図１７）、そこでは遺伝子の範囲が黒長方形で示されている。図１７はＩＬ−１遺伝子群のマップを示す。スケールバー（ｋｂ）がデータの上下にあり、整列を補助する。記載のデータのソースは上の３行で示される。「新規配列」はＧｅｎｏｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにて完全に決定された。「公開ＤＢ」はＧｅｎｂａｎｋから取った配列を指す。「組み合わせ配列」はその２つのソースの組み合わせから組み立てられた。コンティグを表す棒の上に、以前に記載された多型マーカーの位置（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９９６およびｄｉ Ｇｉｏｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００によって要約）が表示付き矢印で示されている。一つの空白のギャップもまた示されている。文中で定義されたＣｐＧリッチ領域は「ＣｐＧｒ」と示されている。以前のマッピングで用いられた稀な切断制限酵素部位群の推定部位もまた「Ｘｒｅｃ」、「Ｙｒｅｃ？」、および「Ｚｒｅｃ」と印が付けられている。図１８のｃＤＮＡ配列のコンティグ上へのマッピングの範囲は、灰色で印された非サイトカイン遺伝子ＴＩＣを除き、コンティグ線の下の黒塗り長方形で示されている。ＣＥ１、ＣＥ２、およびＣＥ３についてコード配列の位置は縦棒で示されている。遺伝子記号の前または後に転写の方向を示すＶ字形が付けられている。図１７はさらにＩＬ−１遺伝子群の詳細構造を示す。各遺伝子は動原体からテロメアへの順序で列挙されている。「遺伝子」はその遺伝子についての従来の遺伝子座名称。「方向」は、置かれた配列がセンス鎖である「順方向」かまたは、アンチセンスである「逆方向」である。「位置」は各エキソンに対応する置かれた配列上のヌクレオチド番号である。
【０１４２】
ｃＤＮＡ配列が不完全であることが判っている場合、エキソンの推定延長は「＜」および「＞」の記号で印されている。「エキソン」は対応する転写物の一つのｃＤＮＡにおけるその存在に基づいて我々が各エキソンに割り当てる名称である；したがってＩＬ１ＲＮａ４／ｂ５／ｃ６は、ｃＤＮＡａ（Ｘ５２０１５）の４番目のエキソン、ｃＤＮＡｂ（Ｍ５５６４６）の５番目、およびｃＤＮＡｃの６番目である。対応するｍＲＮＡｓの同一性は合致している（**）。隣接する記入に対するアスタリスク（*）は、２つのエキソンが別のプロモーターの使用の結果としてスプライスドナー部位を共有することを示す。「エキソン境界」はイントロンに隣接するエキソンの内部の１５ヌクレオチド配列である。どちらかの末端の省略（．．．）は、ｃＤＮＡ配列が短縮しているためエキソンが不完全である可能性があることを示す。「エキソン型」はそのエキソンのコード能力を示す；５'Ｎ、５'−非翻訳領域；５'ＳＯ、翻訳される可能性のある５'短オープンリーディングフレーム；Ｐｓ、ペプチド前配列（これが提案されていることを示す）；ｃｓ、非保存コード配列；ＣＥ、保存エキソン；３'Ｎ、３'−非翻訳領域。省略は、エキソン割り当てがおそらく完全でないこと、および一部またはすべての非コード配列が抜けていることを示す。「コード」は各エキソンによってコードされるアミノ酸配列を示す。エキソンはそれが構成するｃＤＮＡの名称および登録番号（囲みの上に表示）によって特定される。各エキソンのコード容量を小文字で示す。斜体で示す残基は部分的に次のエキソン上にコードされる。上付き数字は記載のエキソンのコドン内に含まれる塩基の数を示す。その残基は次のエキソンから除外される。またがるコドン中のヌクレオチドは「エキソン境界」囲み中に斜体で示す。続くエキソンが選択的である場合、またがる残基は変化しうる。このことは括弧内に示す。下線の残基はエキソンの末端終止コドンからで、それらの コドンは「エキソン境界」囲み内で下線が引かれている。アスタリスクは翻訳終止を示す。ＩＬＡは最も動原体側の遺伝子であって、隣接する遺伝子であるＩＬ１Ｂと同様に、動原体に向かって転写される。遺伝子群の最もテロメア側のメンバーであるＩＬ１ＲＮで終わる残りの遺伝子は、ＩＬｌＦ８を除いて、テロメアに向かって転写される。各遺伝子の最後３個のエキソンは、我々は共通エキソン（ＣＥ）１、２、および３と呼んでいるが、ＩＬ−１−相同領域（図１８に示され別に定義される通り）をコードし、配列内の小さな領域に入る。ＣＥ１，ＣＥ２、およびＣＥ３は図１において縦棒で示されるが、図１７の分解能では、一部は識別できない。コード内容を少ししかまたは全く有しない別のエキソンが、大部分の遺伝子の長さを顕著に伸長している。最大の長さはＩＬ１ＲＮおよびＩＬ１Ｆ８である。後者の場合、最初の非コードエキソンは遺伝子の残りの２０ｋｂテロメア側である。その遺伝子のマッピングの詳細は、各エキソンからのコードされたペプチド配列と共に与えられている。スプライス変異体が存在する場合は、この情報によって読者は異なる可能なタンパク質の形を組み立てることができる。これらの形のすべてが生物学的に意義がある可能性があるかど��かは現在のところ不明である（考察を参照）。
【０１４３】
図１８（１枚目〜７枚目）は、ＩＬ−１ファミリーの既知の１０種類のメンバーの、３種類の共通エキソンのコード配列の整列を示す。各例で共通エキソンは転写物の最後の３つである；たとえばＩＬ−１αの７個のエキソンのうちエキソン５、６、および７。整列は目視により、アミノ酸の同一性および類似の残基の組を探すことによって行った。ギャップはその後最小化した。整列を改良するために、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａについての結晶学データをさらに組み込んで用いた。３つの共通エキソン部分の翻訳を順に示す。数字は各エキソンによってコードされる成熟産物の最初および最後のコドンを示す。遺伝子産物はその推定の系統発生にしたがって列挙されている。（！）はタンパク質分解部位でのプロセシングが成熟タンパク質を与えることを示すが、一部の前配列もまた最初の共通エキソン内にコードされている。区切られた残基は少なくとも３つの配列に共通である。簡略化のために、類似性は示されていない。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１ｒａについて、コード配列の下の最初の行に、（「結晶学」と表示）β−シートの末端のおおよその位置が縦棒で示され、シートの範囲は灰色に斜線を付けられシートの番号を表示されている。次の行に（「接点」と表示）、数字は各残基の側鎖と相互作用するＩＬ−１Ｒの領域を示す。数字付きの残基は、ＲａｓＭｏｌプログラム（Ｓａｙｌｅ ａｎｄ Ｍｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ）を用いて視覚化される通り、タイプＩＩＬ−１受容体の重い原子の４Å以内に存在する少なくとも１個の重い原子（Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ）を含む（ＰＤＢデータ）。ＩＬ−１Ｆ５の下の行で（ＮＭＲと表示）、（^）は、β−シート内に存在する高い可能性を示すと考えられている、強い（＞０．７ｐｐｍ）高磁場シフトをα−１３Ｃ ＮＭＲシグナルに見せるＩＬ−１Ｆ５の残基を示す。その区分の最終行（「共通」と表示）は、小文字で、その位置に１０回中少なくとも７回存在する残基を示す。大文字の場合は、その残基は全例で存在する。省略は、特定配列のシート１がおそらく前のエキソンから開始することを示す。（*）は翻訳終止を示す。
【０１４４】
ＣｐＧリッチ領域
ＣｐＧｐｌｏｔプログラム（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９２）を用いて、６０%Ｃ＋Ｇ含量６０％、ＣｐＧジヌクレオチドの予測頻度６０％、長さ３００ヌクレオチドの、ＣｐＧ集中部の可能性のある５ヶ所を同定した。最初および２つの最後のＣｐＧリッチ配列を除き、これらの領域は短く、おそらく「ＣｐＧ集中部」を構成しない。したがって、ＩＬ−１遺伝子群にはＣｐＧ集中部は存在しない。我々は物理的マッピングに以前に用いられた制限部位の群（Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）の位置を見つけることを試みている。ＣｐＧリッチ配列は図１でＣｐＧｒと表示されている。２つはさらにＸｒｅｃおよびＺｒｅｃと表示されている。これらの２つの領域は、以前に同定された特定の稀な切断制限部位を含み、それでおそらく、以前に割り当てられた通り、その遺伝子群の隣接配列に相当する。配列データは、ハイブリダイゼーションｏｆゲノムＤＮＡの制限消化物のサザンハイブリダイゼーションからの推定４３０ｋｂと比較して、３９２ｋｂの長さを与える。ＮａｅＩとＥａｇＩ部位との近い対合は、以前にＩＬ１Ｂをマッピングするのに用いられたが、Ｙｒｅｃと表示した部位の周辺に見られるが、より厳しくないパラメーターを用いてさえ、ＣｐＧｐｌｏｔプログラムによって選択されなかった。ＸｒｅｃとＺｒｅｃだけが相当なＣｐＧ集中部を示す。データベース検索および公開ゲノム注釈の努力はまだ、これらの遺伝子座のどちらかと関連する遺伝子を明らかにしていない。一つの可能性は、Ｚｒｅｃが、試験したすべての組織で多量に発現されていた（Ｔｏｍａｓ Ｋｌｅｎｋａ ａｎｄ ＭＮ、未発表データ）非サイトカイン遺伝子であるＴＩＣの、未知の上流エキソンを示すということである。
【０１４５】
ＩＬ−１遺伝子群内の多型マーカー
我々はこの領域内に以前に記載された多型を入れている（図１７に矢印で表示、および図１９に列挙）。このことによって、我々には以前に記載された不平衡データ（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９９８）の再評価が可能になっている。我々の分析は、マップ距離と不平衡の衰えとの間に、わずかにより良い相関を与える（データ記載せず）。
【０１４６】
他のＩＬ−１様遺伝子についてのＩＬ−１遺伝子群の走査。
【０１４７】
我々は他のＩＬ−１様配列がＩＬ−１遺伝子群内に存在するかどうかを調べた。その相対的に小さいサイズのため、その遺伝子群のゲノム配列はＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を用いた非常に低い厳しさの検索に従う。２配列ＢＬＡＳＴ比較用のＮＣＢＩサーバーを、ゲノム当たり５０００ヒットを予測するように感度を（デフォルト値の１０から）上げたこと以外はデフォルト設定で使用した。個々のエキソンの翻訳はＩＬ−１遺伝子群ゲノム配列のＴＢＬＡＳＴＮ分析に供した。このアルゴリズムは、ゲノム配列断片から得られた可能な６つの読み枠に対して、コード配列の検索を実施する。我々はエキソン構造が保存されていると仮定し、そのためマッチは、終止コドンで中断されていた場合は、後で無視された。
【０１４８】
それが関係のより遠い配列の一つであるため、我々は最初にＩＬ１ＡのＣＥ３を用いて検索した。これはそれ自身のみとマッチした。ＩＬ１ＢのＣＥ３は、ＩＬ１Ａを除く、ＩＬ−１遺伝子群上のすべての既知のファミリーメンバーを返した。一つの中断されないヒットが見出されたが、それは同一の推定残基６個だけを共有し、ＣＥ３に典型的であるよりは長く、実際にはＩＬ１Ｂ内で逆方向に存在した。対応する上流ＣＥ２候補の証拠が無かったため、その配列は無視された。我々は次いで、ＩＬ１Ｆ５のＣＥ３を用いて検索し、それもまた、ＩＬ１Ａを除く、すべてのＣＥ３を返した。一つの長いＣｐＧリッチエキソン候補はＣＥ３の保存されたコア残基を欠いた。もう一つの外れ値として、我々はＩＬ１８のＣＥ３を用いた（登録番号ＸＭ_０４１３７３）。これはＩＬ−１遺伝子群からＩＬ１Ｆ５を返し、新規配列を返さなかった。我々は次いでＩＬ１ＡおよびＩＬ１Ｂ由来のＣＥ２（エキソン６）を試験した。前者はそれ自身のみを返し、後者はＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ１０を返し他の配列を返さなかった。ＩＬ１Ｆ５のＣＥ２はＩＬ１ＲＮ、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ９、およびＩＬ１Ｆ１０を返したが、新規の中断されないエキソンを返さなかった。ＩＬ１８のＣＥ２は何も返さなかった。最後にＩＬ１Ｆ９のＣＥ２を試験した。それはＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬＦ１０のＣＥ２を返し他の配列を返さなかった。我々は、ＩＬ−１遺伝子群内には他のＩＬ−１ファミリー遺伝子は、高度に異なる配列を有するかまたはより断片化したエキソン構造を有する点で他のファミリーメンバーすべてと異なるのでない限り、存在しないと結論する。
【０１４９】
進化上の考慮
ＩＬ−１ファミリーの系統発生を調査するため、我々はＴｒｅｅ−Ｐｕｚｚｌｅ３プログラム（Ｓｔｒｉｍｍｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｈａｅｓｌｅｒ， １９９６）を図２ａに示すＣＥ３の整列について実行した。ＩＬ−１８はファミリーのグループ外メンバーとして設定された。結果は図３に示す放射状樹状図（Ｐａｇｅ，１９９６）として視覚化された。
【０１５０】
実施例２：炎症性遺伝子および冠動脈心疾患のケースコホート研究
（「地域のアテローム性動脈硬化リスク」（ＡＲＩＣ）プロジェクトの下位研究）
ＡＲＩＣは、アテローム性動脈硬化の病因と自然の過程、臨床的アテローム硬化性疾患の病因、および心血管リスク因子、医療処置、および疾患における、人種、性別、場所と時による変動を調査するために設計された前向きコホート研究である。
【０１５１】
ＡＲＩＣコホートは１５，７９２名の、導入開始時に年齢４５〜６４歳の、米国の４地域からの確率標本から成る。ＩＬＧＮは、２つの共同下位研究の目的に合わせるため必要に応じて、ＡＲＩＣプログラムの全参加者の遺伝子型分析を行うための承認を有する。我々の進行中の、起こった心血管発作の研究において、我々は現在、急性臨床徴候を経験している人とともに無作為に選択されたコホート対照群の、９５５名のＡＲＩＣ参加者からのＤＮＡ検体を有する。これらの検体は、長期観察の最初の１１年間の、すべての起こった心血管症例を表す。全検体の遺伝子型決定が最近完了し、結果の一部が利用可能である。これらの結果は、臨床徴候のリスクとＩＬ−１（＋４８４５）対立遺伝子２との間に有意な関連を総コレステロール（ＴＣ）＜２００ｍｇ／ｄｌの被験者について実証した。これらの知見の重要な面は下記を含む：
＊  ＋４８４５遺伝子型は臨床現象と有意に関連した（生存時間分析相対リスク〜４．０、ｐ＜０．０１）
＊  分析は全年齢を含んだ
＊  多変量モデルにおいて、ＩＬ−１遺伝子型の知見は年齢、性別、喫煙、人種、糖尿病、高血圧、ＢＭＩ、ＬＤＬ、ＨＤＬと独立であった
＊  ＴＣ＜２００である含められた被験者の数は９５５名であった。
【０１５２】
遺伝子座；ＩＬＩＡ（＋４８４５）、総コレステロール＜２００ｍｇ／ｄｌ階層
急性冠動脈疾患発作までの時間
各表内に３つのモデルがある。第一は遺伝子型変数のみを有する大まかなモデルである。これは「調整」の列の「粗」で識別される。「調整」の列の「グループ１」のモデルは、年齢、性別および人種／施設について調整する。「グループ２」のモデルは、年齢、性別、人種／施設、現在喫煙者（該当／非該当）、糖尿病（該当／非該当）、高血圧（該当／非該当）、ＬＤＬコレステロール、およびＨＤＬコレステロールについて調整する。
【表１】
2005529585.tif 000002
【表２】
2005529585.tif 000003
【表３】
2005529585.tif 000004
【０１５３】
実施例３：サンフランシスコ骨粗鬆症骨折研究（ＳＯＦ）
カリフォルニア大学サンフランシスコ校のＤｒ． Ｓｔｅｖｅｎ Ｃｕｍｍｉｎｇｓの指導による骨粗鬆症骨折の多施設研究は、４ヶ所の異なる医療センターからの、ヨーロッパ／コーカサス系の女性の大きなコホートから構成される。これらの女性は１９８６年から、腰、手首、および脊椎骨折、ならびに腰椎および大腿骨頸部の骨塩密度の変化を含むさまざまな医学的および生活習慣上の知見について調べられている。導入時健診（１９８６／１９８７）では、すべての参加者（ｎ＝９，７０４）は、６５歳以上で、歩行可能で、および施設に入所していなかった。血液検体を被験者約４，０００名から採取してＤＮＡ分析用に−７０℃にて保存した。
【０１５４】
ＳＯＦコホートにおける死因の近年の分析は、ＩＬ−１Ａ（４８４５）対立遺伝子２が心疾患からの早期死亡と有意に関連していたことを確認した。
【表４】
2005529585.tif 000005
【０１５５】
実施例４：＋４８４５ＩＬ−１ＳＮＰの機能分析
＋４８４５ＳＮＰは非同義置換ＳＮＰ（すなわち、ＩＬ−１ａサイトカインのアミノ酸を変化させ、そのアミノ酸変化に繋がる、天然に存在する多型）である。変異体タンパク質は昆虫細胞でバキュロウイルスベクターを用いて発現され、構造および機能の差について分析される。昆虫細胞での、および哺乳類細胞でのタンパク質発現に用いられる変異体ｃＤＮＡは配列分析によって、１個のアミノ酸変化に繋がる１個のＳＮＰしか含まないことが確認されている。これはこのＳＮＰに関係する２つのデータである。
【０１５６】
ウェスタンブロット分析で（図１２参照）、我々は、ＩＬ−１ａサイトカインの２つの変異体はカルパイン消化で異なる処理を受けることを示すデータを提供する。カルパインは、完全長ＩＬ−１ａサイトカイン（３１ｋＤａ）を切断して成熟タンパク質（１７ｋＤａ）を形成することが知られている酵素である。対立遺伝子−１（Ａｌａ）ＩＬ−１ａサイトカインは１つの１７ｋＤａ分子を生じる一方、対立遺伝子−２（Ｓｅｒ）ＩＬ−１ａサイトカインは２本のバンドを与え、その１本は対立遺伝子−１について見られるバンドとサイズが同一であるが、加えて、それはまた分子量がわずかに大きいもう１本のバンドも生じる。この結果は、２種類の変異体には構造的な違いがあることを示す。我々はまた、ＡｌａからＳｅｒへの突然変異はタンパク質の異なる翻訳後修飾、たとえば、リン酸化またはミリストイル化における違いに結びつくと仮定する。このアミノ酸変化は、翻訳後修飾のための認識シグナルの変化（付加または除去）に結びつきうる。
【０１５７】
発現ベクター中でａｌａおよびｓｅｒ変異体ｃＤＮＡｓを安定して遺伝子導入された繊維芽細胞は、増殖速度が異なることが見出された。対立遺伝子−２変異体は対立遺伝子−１変異体よりも早い増殖速度を有し、対立遺伝子−２は炎症促進性プロファイルの予測となるという我々の主張を裏付ける（図１３を参照）。したがって、対立遺伝子２変異体中の変化したアミノ酸は、対立遺伝子−１変異体よりも強力な炎症促進性サイトカインの証拠を示す。
【０１５８】
実施例５：ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、およびＩＬ−ＩＲＮＳＮＰの系統的機能分析 
本実施例では、選択されたＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、およびＩＬ−１ＲＮ多型が、それ以外は「野生型」のＩＬ−１配列の背景中で構成され、影響が繊維芽細胞株において測定される。
【０１５９】
レポータープロモーター構造によるＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−１ＲＮ遺伝子プロモーターＳＮＰの転写分析。各遺伝子のデータは別々の図にある（すなわちそれぞれ図１４、１５、および１６）。図１４、１５、および１６の図Ａ（および図１５Ｄ）は、ＳＮＰ、および別々のルシフェラーゼ構造中に作製されたさまざまな対立遺伝子−２突然変異、およびその遺伝子導入分析で調査したＳＮＰを付注した色々な長さのプロモーター−ルシフェラーゼ構造も示す。加えて、野生型（すべての遺伝子座で対立遺伝子−１）に関して遺伝子転写の活性変化を示す機能性ＳＮＰについてだけ、我々はルシフェラーゼ分析結果もまた提供する。Ｂ遺伝子については、我々はＳＮＰ＃１４（−５１１）およびＳＮＰ＃２（−３１）もまた対立遺伝子−２である骨格中での機能性ＳＮＰについてのデータもまた提供する。
【０１６０】
これらの構造は、繊維芽細胞株（すなわちＷＩ３８−炎症反応．におけるＩＬ−１の特定の役割をモデル化する、で試験されたことに注意する。したがって、ＩＬ−１媒介炎症性疾患および障害の別の機械的態様をモデル化する別の細胞株が特に試験されることになる。たとえば、ヒト細胞単球細胞株（たとえばＵ９３７）およびヒトケラチン生成細胞株（たとえばＡ１４３）およびヒト骨芽細胞株において（たとえば骨粗鬆症ＩＬ−１炎症性過程に対する影響を調査するために。
【０１６１】
実施例６：ＩＬ−１遺伝子群ＳＮＰの付注
我々はさらにＩＬ−１遺伝子群全体にわたって多型に付注している（図８〜１１を参照）。ここで裏付けられるように、これらの多型は確立されたＩＬ−１ハプロタイプ内に存在するため（図１〜７を参照）、それらは本出願において裏付けられる組成物および方法を提供する。
【０１６２】
同等物および文献の引用
通常の実験しか用いずに、ここに記載の特定のポリペプチド、核酸、方法、分析および試薬の多数の同等物を、当該分野の熟練者は認識するかまたは確認することができる。そのような同等物は本発明の範囲内にあると考えられ、下記の請求項によって包含される。
【０１６３】
本出願は学術文献、出版記事、および特許出願、および登録済み米国特許および外国特許の多数の引用を含む。これらの引用のすべての全内容はここに参照により開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１はＩＬ−１遺伝子群遺伝子座全体にわたって代表的なＳＮＰの連鎖不平衡を図式的に示す。
【図２】図２（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１遺伝子群遺伝子座全体にわたって代表的なＳＮＰの、連鎖不平衡についての代表的な定量値（Ｄ'値は対角線の下に表示）およびその統計的有意性（１−ｐ値は対角線の上に表示）を示す。
【図３】図３（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ハプロタイプパターン１（ｈａｐ１）のＳＮＰの構成を示す（Ｔ−Ｔ−Ｃ＝２_２_１）。
【図４】図４（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ハプロタイプパターン２（ｈａｐ２）のＳＮＰの構成を示す（Ｇ−Ｃ−Ｔ＝１_１_２）。
【図５】図５（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ハプロタイプパターン３（ｈａｐ３）のＳＮＰの構成を示す（Ｇ−Ｃ−Ｃ）＝１_１_１）。
【図６】図６（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ハプロタイプパターン４（ｈａｐ４）のＳＮＰの構成を示す（Ｃ−Ｃ−Ｃ＝１_１_１）。
【図７】図７（ＡおよびＢ）は、強い連鎖不平衡にあり、またＬＤ表に特に含まれていないＳＮＰを示す。
【図８】図８は、ＩＬ−１Ａ遺伝子多型の同一性および位置を示す。
【図９】図９は、ＩＬ−１Ｂ遺伝子多型の同一性および位置を示す。
【図１０】図１０（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ＲＮｉｃ遺伝子多型の同一性および位置を示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１ＲＮｓｅｃ遺伝子多型の同一性および位置を示す。
【図１２】図１２は、ＩＬ−１Ａ＋４８４５の対立遺伝子１および２に対応するＩＬ−１ａ変異体の、カルパインプロテアーゼによる切断における差を示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ−１＋４８４５の対立遺伝子１および対立遺伝子２変異体を発現するベクターを用いて安定に遺伝子導入した繊維芽細胞の増殖の速度を示す。
【図１４】図１４（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１Ａ ＳＮＰ構造の遺伝子型（Ａ）および繊維芽細胞株における選択されたレポーター活性（Ｂ）を示す。
【図１５】図１５（Ａ〜Ｄ）は、ＩＬ−１Ｂ ＳＮＰ構造の遺伝子型（Ａ）および繊維芽細胞株における選択されたｒｅレポーター活性（Ｂ）；ならびに１４および１５位に対立遺伝子２が存在する別の組のＩＬ−１Ｂ構造の遺伝子型（Ｃ）および繊維芽細胞株における選択されたレポーター活性（Ｄ）を示す。
【図１６】図１６（ＡおよびＢ）は、ＩＬ−１ＲＮの遺伝子型（Ａ）および繊維芽細胞株における選択されたレポーター活性（Ｂ）を示す。
【図１７】図１７はＩＬ−１遺伝子群のマップを示す。スケールバー（単位ｋｂ）を、整列を補助するためにデータの上および下に与える。
【図１８】図１８（Ａ〜Ｇ）は、ＩＬ−１ファミリーの１０種類の既知のメンバーの、３種類の共通エキソンのコードされた配列の整列を示す。
【図１９】図１９は、ＩＬ−１遺伝子群内で多型マーカーを選択するマップ位置を示す。
【図１】
2005529585.tif 000006
【図２Ａ】
2005529585.tif 000007
【図２Ｂ】
2005529585.tif 000008
【図３Ａ】
2005529585.tif 000009
【図３Ｂ】
2005529585.tif 000010
【図４Ａ】
2005529585.tif 000011
【図４Ｂ】
2005529585.tif 000012
【図５Ａ】
2005529585.tif 000013
【図５Ｂ】
2005529585.tif 000014
【図６Ａ】
2005529585.tif 000015
【図６Ｂ】
2005529585.tif 000016
【図７Ａ】
2005529585.tif 000017
【図７Ｂ】
2005529585.tif 000018
【図８】
2005529585.tif 000019
【図９】
2005529585.tif 000020
【図１０Ａ】
2005529585.tif 000021
【図１０Ｂ】
2005529585.tif 000022
【図１１】
2005529585.tif 000023
【図１２】
2005529585.tif 000024
【図１３】
2005529585.tif 000025
【図１４Ａ】
2005529585.tif 000026
【図１４Ｂ】
2005529585.tif 000027
【図１５Ａ】
2005529585.tif 000028
【図１５Ｂ】
2005529585.tif 000029
【図１５Ｃ】
2005529585.tif 000030
【図１５Ｄ】
2005529585.tif 000031
【図１６Ａ】
2005529585.tif 000032
【図１６Ｂ】
2005529585.tif 000033
【図１７】
2005529585.tif 000034
【図１８Ａ】
2005529585.tif 000035
【図１８Ｂ】
2005529585.tif 000036
【図１８Ｃ】
2005529585.tif 000037
【図１８Ｄ】
2005529585.tif 000038
【図１８Ｅ】
2005529585.tif 000039
【図１８Ｆ】
2005529585.tif 000040
【図１８Ｇ】
2005529585.tif 000041
【図１９】
2005529585.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005529585000001.app