(57)【要約】精製された、触媒的に活性な、組換えメマプシン２の製造方法が開発された。触媒的に活性な酵素の基質およびサブサイト特異性は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いた基質の初期加水分解速度を決定する方法により決定された。あるいは、メマプシンのサブサイト特異性は、メマプシン２を用いたインヒビターのライブラリーをプロービングし、続いてメマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて結合メマプシン２を検出することにより決定されうる。基質およびサブサイト特異性情報を用いて、メマプシン２の機能を阻害する天然のメマプシン２基質の基質アナログを設計した。基質アナログは、メマプシン２の天然のペプチド基質に関連することが示されたペプチド配列に基づく。基質アナログは、メマプシン２により切断され得ない少なくとも１つのアミド結合のアナログを含む。決定的なアミノ酸残基の部位に同配体を含む基質アナログの合成のためのプロセスが開発され、７０より多くのアナログが合成され、とりわけＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１は、組換えプロ−メマプシン２に対して１．４〜６１．４ｘ１０９Ｍの範囲の阻害定数を有する。これらのインヒビターは、アルツハイマー病の診断ならびに治療および／または予防のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、１０−７Ｍ以下のＫｉを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビター。
【請求項２】
メマプシン２の活性部位の同配体を含有してなる請求項１記載のインヒビター。
【請求項３】
一般形態
Ｘ−Ｌ４−Ｐ４−Ｌ３−Ｐ３−Ｌ２−Ｐ２−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ０−Ｐ１’−Ｌ１’−Ｐ２’−Ｌ２’−Ｐ３’−Ｌ３’−Ｐ４’−Ｌ４’−Ｙ、
式中、Ｐｘは、−Ｌ０−により表される切断部位に関する基質特異性位置を表し、Ｌｘは各基質特異性位置、Ｐｘ間の連結領域を表し、ここでＬ０は、非加水分解性結合であり、Ｐ１’は−Ｒ１ＣＲ３−であり、ここでＲ１はＣＨ２ＯＨ（セリンの側鎖）よりも小さい基であり、少なくとも２つの他のＰ位は疎水性基である、
を有する分子を含有してなる請求項２記載のインヒビター。
【請求項４】
１０−６Ｍ以下のＫｉを有する請求項１記載のインヒビター。
【請求項５】
２ｎＭ以下のＫｉを有する請求項１記載のインヒビター。
【請求項６】
１ｎＭ以下のＫｉを有する請求項１記載のインヒビター。
【請求項７】
配列番号：２のアミノ酸２８〜４４１の側鎖および骨格原子について０．５Å以下の根平均二乗差を有する請求項１記載のインヒビター。
【請求項８】
血液脳関門に透過可能である請求項１記載のインヒビター。
【請求項９】
９００ダルトン未満の分子量である請求項１記載のインヒビター。
【請求項１０】
生理的条件下でメマプシン２による切断をブロックする請求項１記載のインヒビター。
【請求項１１】
１０−６Ｍ以下のＫｉを有する請求項１記載のインヒビター。
【請求項１２】
ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物。
【請求項１３】
ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物。
【請求項１４】
ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれるメマプシン２のインヒビターの有効量を個体に投与することを含む、アルツハイマー病の発症の可能性または進行を減少させるために患者を治療する方法。
【請求項１５】
インヒビターが経口投与される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
インヒビターがＡＰＰの切断をブロックする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ａ）メマプシン２基質の混合物とメマプシン２とを反応させる工程；および
ｂ）メマプシン２基質の混合物の相対初期加水分解速度を測定することによりメマプシン２のサブサイト優先度を決定する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
【請求項１８】
初期加水分解速度が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳデバイスを用いることにより測定され、ここでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定値に由来するイオン強度が、基質、および基質の加水分解により形成されたその産物の相対量の定量に使用される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ａ）メマプシン２インヒビターのコンビナトリアルライブラリーを調製する工程、ここで該インヒビターはＯＭ９９−２から取得された塩基配列を含む；
ｂ）メマプシン２を用いてインヒビターのライブラリーをプロービングする工程、ここでメマプシン２は、１つまたは複数のインヒビターに結合し、１つまたは複数の結合したメマプシン２を生成する；および
ｃ）メマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて、結合したメマプシン２を検出する工程
を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法。
【請求項２０】
インヒビターがビーズに固定される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
塩基配列がＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦであり、メマプシン２のＰ３、Ｐ２、Ｐ２’、およびＰ３’サブサイトが無作為化される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒的アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、１０−７Ｍ以下のＫｉを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
【請求項２３】
ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、１０−７Ｍ以下のＫｉを有し、側鎖およびアミノ酸１８〜３７９の骨格原子について０．５Å以下の根平均二乗差を有する、触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用。
【請求項２４】
ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年３月１４日に出願された米国仮出願第６０／２７５，７５６号、および２０００年１２月２８日に出願された同第６０／２５８，７０５号の利益を主張し、その両者の全体の教示は参考としてその全体が援用される。
【０００２】
発明の背景
本発明は、アルツハイマー病の治療および／または予防に有用なアスパラギン酸プロテアーゼメマプシン（ｍｅｍａｐｓｉｎ）２（ベータ−セクレターゼ、またはβ−セクレターゼ）の特異的インヒビターの設計および合成の分野に属する。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、Ａｌｉｏｓ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒにより、認知能力における劇的な低下を患い、一般的な痴呆を有する彼の患者の１人を検査した後に、１９０７年に最初に記載された脳の変性障害である（Ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｂｉｃｋらによる編集（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７））。これは、高齢者における痴呆の主な原因である。ＡＤ患者は、記憶喪失および正常な個体として機能することができない点まで進行する知性機能に関する増大した問題を有する。知的技術の損失により、患者は、人格変化、社会的に不適当な行動および精神分裂病を示す（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｊｏｒｍによる編集（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７））。ＡＤは、回避不能な神経変性に対する有効な対症的または予防的な治療が存在しないために、被害者および彼らの家族の両方に対して破壊的である。
【０００４】
ＡＤは、皮質、海馬、鉤状回、海馬傍回、および扁桃体において直径２００μｍまでの寸法の神経炎性局面（ｎｅｕｒｉｔｉｃ ｐｌａｑｕｅ）を付随する。神経炎性局面の主要な成分の１つは、アミロイドであり、これは、コンゴーレッドにより染色される（Ｆｉｓｈｅｒ （１９８３）； Ｋｅｌｌｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃｉ． １（９）：２１４−２１９ （１９８４））。コンゴーレッドにより染色されるアミロイド斑は細胞外にあり、明るいフィールドにおいて細胞外のピンクまたはサビ色であり、偏光において複屈折する。局面は、ポリペプチド原線維からなり、しばしば血管の周りに存在し、脳内の種々のニューロンへの血液供給を低減させる。
【０００５】
遺伝的素因、感染性因子、毒素、金属、および頭部外傷等の種々の因子は、ＡＤ神経障害の考えられうる機序として示唆されている。入手可能な証拠は、ＡＤに関する個々の型の遺伝的素因が存在することを示唆する。最初に、分子解析は、所定のＡＤ−罹患家族においてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）における変異の証拠を提供した（Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４−７０６ （１９９１）； Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７− ９９ （１９９１）； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４−８４６ （１９９１）； Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １： ３４５−３４７ （１９９２））。早発性ＡＤの優性な形態のさらなる遺伝子は、第１４染色体および第１染色体にある（Ｒｏｇａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ ３７６：７７５−７７８ （１９９５）； Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７ （１９９５）； Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４−７６０ （１９９５））。ＡＤに関連する別の遺伝子座位が第１９染色体上にあり、アポリポタンパク質Ｅのバリアント形態をコードする（Ｃｏｒｄｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： ９２１−９２３ （１９９３））。
【０００６】
アミロイド斑は、ＡＤ患者および４０歳まで生存しているダウン症候群の個体において豊富に存在する。ダウン症候群におけるＡＰＰの過剰発現は、３０歳以上のダウン症患者におけるＡＤの考えられうる原因として認識されている（Ｒｕｍｂｌｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３２０： １４４６−１４５２ （１９８９）； Ｍａｎｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １０：３９７−３９９ （１９８９））。斑はまた、より少数ではあるが、正常な加齢した脳に存在する。これらの斑は、主としてアミロイドβペプチドからなる（Ａβ； 文献中ではまた、ときにはβ−アミロイドペプチドまたはβペプチドとも呼ばれる）（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． １２０：８８５−８９０ （１９８４）、これはまた、脳血管アミロイド沈着物中の主要なタンパク質成分である。アミロイドは、βプリーツ（ｐｌｅａｔｅｄ）シートに再配列される糸状材料である。Ａβは、４３アミノ酸までを含む疎水性ペプチドである。
【０００７】
そのアミノ酸配列の決定は、ＡＰＰ ｃＤＮＡ（Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−７３５ （１９８７）； Ｇｏｌｄｇａｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：８７７−８８０ （１９８７）； Ｒｏｂａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８４：４１９０−４１９４ （１９８７）； Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２８−５３０ （１９８８））およびゲノムＡＰＰ ＤＮＡ（Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：５１７−５２２ （１９８９）； Ｙｏｓｈｉｋａｉら、Ｇｅｎｅ ８７， ２５７−２６３ （１９９０））のクローニングを導いた。３つの最も豊富な形態、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０を含む、多数の形態のＡＰＰ ｃＤＮＡが同定された。これらの形態は、オルタナティブスプライシングにより単一の前駆体ＲＮＡから生じる。前記遺伝子は、１８エキソンを伴って１７５ｋｂよりも大きい（Ｙｏｓｈｉｋａｉら、１９９０））。ＡＰＰは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Ａβは、疎水性膜貫通ドメインのすぐ外側に２８アミノ酸まで、およびこの膜貫通ドメインの１５残基までからなる。Ａβは、通常、脳ならびに心臓、腎臓および脾臓等の他の組織で見出される。しかし、Ａβ沈着物は、脳において唯一豊富に見出される。
【０００８】
Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈａｖｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２０−１１２２（１９９０）は、ＡＰＰ遺伝子が２組のオランダ人の家族において、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）に堅固に連鎖していることを示した。これは、２名のオランダ人患者におけるＡＰＰコード領域内の点変異の発見により確認された（Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８： １１２４−１１２８ （１９９０））。前記変異は、Ａβの２２位のグルタミン酸をグルタミンに置換した（ＡＰＰ６９５の６１８位、またはＡＰＰ７７０の６９３位）。さらに、所定の家族は、アルツハイマー病（ＦＡＤ）に遺伝的に罹りやすく、全長タンパク質の７１７位でのアミノ酸置換を生じる変異により、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）と呼ばれる条件にある（Ｇｏａｔｅら、（１９９１）； Ｍｕｒｒｅｌｌら、（１９９１）； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、（１９９１））。これらの変異は、家族内の疾患とともに同時分離し、遅発性ＡＤを有する家族では存在しない。アミノ酸７１７でのこの変異は、ＡＰＰからのＡβのＡβ１−４２型の産生を増大する（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：１３３６−１３４０ （１９９４））。別の変異体型は、全長タンパク質の６７０位および６７１位でのアミノ酸の変化を含む（Ｍｕｌｌａｎら、（１９９２））。アミノ酸６７０および６７１へのこの変異は、ＡＰＰからの全Ａβの産生を増大する（Ｃｉｔｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：６２０−６７４ （１９９２））。
【０００９】
ＡＰＰは、３つの部位でインビボにてプロセシングされる。この証拠は、膜会合メタロプロテアーゼによるβ−セクレターゼ部位での切断が生理的事象であることを示唆する。この部位は、原形質膜の管腔表面から１２残基離れてＡＰＰに位置する。β−セクレターゼ部位（原形質膜の管腔表面から２８残基）およびβ−セクレターゼ部位（膜貫通領域内）の切断は、４０／４２−残基β−アミロイドペプチド（Ａβ）を生じ、脳におけるその上昇した産生および蓄積は、アルツハイマー病の病原において中心的な事象である（総説については、Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ．Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３−３１ （１９９９））。プレセニリン１、ヒト脳において見出された別の膜タンパク質、はＡＰＰγβ−セクレターゼ部位での加水分解を制御し、それ自身が原因となるプロテアーゼであると推論されている（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５１３−５１７ （１９９９））。プレセニリン１は、単鎖分子として発現され、プロテアーゼ、プレセニリナーゼによるそのプロセシングは、迅速な分解からそれを防ぐのに必要とされる（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ， Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １７：１８１−１９０ （１９９６）およびＰｏｄｌｉｓｎｙ， Ｍ．Ｂ．ら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ． ３：３２５−３７ （１９９７））。プレセニリナーゼの正体は不明である。β−セクレターゼ部位のインビボプロセシングは、Ａβ産生の律速段階であると考えられ（Ｓｉｎｈａ， Ｓ．＆ Ｌｉｅｂｅｒｂｕｒｇ， Ｉ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９６：１１０４９−１１０５３ （１９９９））、それゆえ、強い治療標的である。
【００１０】
アミロイド斑形成の減少に有効なインヒビターの設計は、４２アミノ酸ペプチド、ＡβのＡβ１−４２型を生じるようなＡＰＰの切断における決定的な酵素の同定に依存する。いくつかの酵素が同定されたが、活性酵素を作製することは可能ではなかった。活性酵素なしでは、全てインヒビターの設計に必須である、基質特異性を確認することも、サブサイト特異性を決定することも、反応速度論または決定的活性部位残基を決定することもできない。
【００１１】
メマプシン２は、β−セクレターゼ、β−アミロイド前駆体タンパク質からのβ−アミロイドペプチドのヒト脳における産生に関与する鍵となるプロテアーゼであることが示された（総説については、Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ．Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３−３１ （１９９９））。現在、一般に、ヒト脳におけるβ−アミロイドペプチドの蓄積は、アルツハイマー病の主要な原因であると認められている。ヒトメマプシン２に対して特異的に設計されたインヒビターは、β−アミロイドペプチドの形成およびアルツハイマー病の進行を阻害または減少するはずである。
【００１２】
メマプシン２は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーに属する。これは、アミノ酸配列において他の真核生物アスパラギン酸プロテアーゼに相同であり、そのファミリーに特異的なモチーフを含む。これらの構造的類似性は、メマプシン２および他の真核生物アスパラギン酸プロテアーゼが共通の触媒機序を有することを予測する、Ｄａｖｉｅｓ， Ｄ．Ｒ．， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ． １９， １８９ （１９９０）。アスパラギン酸プロテアーゼに対する最も良好なインヒビターは、これらの酵素の遷移状態の擬態である。これらのインヒビターは、２つの四面体原子（例えば、ヒドロキシエチレン［−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−］、これは最初にペプスタチンの構造において発見された（Ｍａｒｃｉｎｉｓｚｙｎら、１９７６））により置換されるカルボニル炭素とアミド窒素との間の切断される平面のペプチド結合を有する基質様構造を有する。
【００１３】
β−アミロイド前駆体タンパク質からのβ−アミロイドタンパク質の産生に関与するプロテアーゼの新規な、改善されたインヒビター（例えば、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療に有効なメマプシン２インヒビター等）を開発する必要性が存在する。
【００１４】
発明の要旨
本発明は、メマプシン２活性のインヒビターおよびヒトにおけるアルツハイマー病を治療するためのメマプシン２のインヒビターの使用方法に関する。
【００１５】
一つの態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターであり、該インヒビターは１０−７Ｍ以下のＫｉを有する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物を含む。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物を含む。
【００１８】
別の態様は、ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれるメマプシン２のインヒビターの有効量を個体に投与することを含むアルツハイマー病の発症の可能性または進行を減少させるために患者を治療する方法を含む。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、メマプシン２基質の混合物をメマプシン２と反応させる工程およびメマプシン２基質の混合物の相対初期加水分解速度を測定することによりメマプシン２のサブサイト優先度を決定する工程を含む、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法である。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度を決定する方法を含む。ＯＭ９９−２から取得された塩基配列を含むメマプシン２インヒビターのコンビナトリアルライブラリーが調製される。インヒビターのライブラリーは、メマプシン２でプロービングされ、ここでメマプシン２は、１つまたは複数のインヒビターに結合し、１つまたは複数の結合メマプシン２が生成され、結合メマプシン２はメマプシン２に対して惹起された抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体で検出される。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターをヒトに投与することを含み、該インヒビターは１０−７Ｍ以下のＫｉを有する、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法を含む。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターをヒトに投与することを含み、該インヒビターは１０−７Ｍ以下のＫｉを有し、ここで該インヒビターは配列番号：２のアミノ酸２８〜４４１の側鎖および骨格原子について０．５Å根平均二乗差（ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を有する、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物をヒトに投与することを含む、アルツハイマー病を患うヒトを治療する方法である。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合し、１０−７Ｍ以下のＫｉを有する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビターの使用に関する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の血治療のための医薬の製造のための、２つの触媒性アスパラギン酸残基および基質結合間隙の存在により規定されるメマプシン２の活性部位に結合する触媒的に活性なメマプシン２のインヒビター、該インヒビターは１０−７Ｍ以下のＫｉを有し、ここで該インヒビターはメマプシン２のアミノ酸１８〜３７９の側鎖および骨格原子について０．５Å以下の根平均二乗差を有する、の使用に関する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病の治療のための医薬の製造のための、ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１からなる群より選ばれる化合物の使用に関する。
【００２７】
組換えの触媒的に活性なメマプシン２の基質およびサブサイト特異性を使用して、メマプシン２の機能を阻害しうる天然のメマプシン２基質の基質アナログを設計した。最初に、基質アナログ、ＯＭ９９−２に結合したメマプシン２のＸ線結晶解析結晶学を使用して、メマプシン２の三次元構造、ならびに結合における種々の残基の重要性を決定した。次いで、基質アナログを、メマプシン２の天然のペプチド基質に関連することが示されているペプチド配列および結晶学的構造に基づいて設計した。基質アナログは、メマプシン２により切断され得ないアミド（ペプチド）結合の少なくとも１つのアナログを含む。
【００２８】
触媒的に活性なメマプシン２の基質およびサブサイト特異性は、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（マトリックス補助レーザー脱離／イオン化−飛行時間／質量分析）を用いて基質の初期加水分解速度を測定する方法によりさらに決定された。あるいは、メマプシンのサブサイト特異性を、メマプシン２でインヒビターのライブラリーをプロービングし、続いてメマプシン２に対して惹起した抗体およびアルカリホスファターゼ結合二次抗体を用いて結合メマプシンを検出することによりさらに決定した。基質およびサブサイト特異性情報を用いて、メマプシン２の機能を阻害しうる天然のメマプシン２基質のさらなる基質アナログを設計した。
【００２９】
決定的なアミノ酸残基の部位での同配体を含む基質アナログの合成のプロセスを開発した。基質アナログ、ＯＭ９９−１、ＯＭ９９−２および７０より多くの他の基質アナログを合成した。ＯＭ９９−２は、遷移状態同配体ヒドロキシエチレン基により置換されたＬｅｕ−Ａｌａペプチド結合をともなうオクタペプチドＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号：２８）に基づく。ＯＭ９９−２の阻害定数は、組換えプロ−メマプシン２に対して１．６ｘ１０−９Ｍである。ＭＭＩ−００５、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２５、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３７、ＭＭＩ−０３９、ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０、およびＭＭＩ−０７１の阻害定数は、組換えプロ−メマプシン２に対して１．４〜６１．４ｘ１０−９Ｍの範囲の阻害定数を有する。
【００３０】
メマプシン２アスパラギン酸プロテアーゼ活性を阻害する組成物は小分子であり得、これは血液脳関門を容易に通過し、経口投与され、腸酵素により不活化されない。さらに、かかる組成物は、製造するのに比較的に安価であり、β−アミロイド前駆体タンパク質のメマプシン２切断を優先的に阻害することが望ましい。
【００３１】
この情報は、有機化学および酵素学の当業者が精通している市販のソフトウェアプログラムおよび技術を用いて、さらなる新規インヒビターを設計するために当業者により使用されうる。例えば、インヒビターの側鎖は、阻害効力を増大するために、より強い相互作用（水素結合、疎水性相互作用、電荷相互作用および／またはファンデルワールス相互作用を介して）を生成するために変更され得る。このタイプの情報に基づき、小さな相互作用を有する残基は、インヒビターの分子量を減少するための新規インヒビター設計から除去されうる。酵素に由来する構造的妨害を有さない側鎖は、効果的なインヒビターコンフォメーションにロックするように架橋されうる。このタイプの構造はまた、メマプシン２の結合部位を効率的にふさぎ、さらにより良好な薬学特性を生じうるペプチド代用物の設計を可能にする。インヒビター用化合物の合理的な設計およびスクリーニング、ならびにそれらの特徴付けが本発明において提供される。メマプシン２の阻害に効果的な組成物は、小分子インヒビター、および血液脳関門を通過しうるインヒビターを含む。かかるインヒビターは、メマプシン２、またはその基質と相互作用し、メマプシン２による切断を阻害しうる。
【００３２】
本発明は、メマプシン２活性を阻害する化合物、特にメマプシン２のアスパラギン酸プロテアーゼ活性を阻害する化合物を提供し、これはβ−アミロイド前駆体タンパク質をβ−アミロイドに変換する。本発明の化合物はヒトにおけるアルツハイマー病を治療するために使用されうる。
【００３３】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、本発明の好ましい態様の以下のより詳細な記載から明らかである。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明の特徴および他の詳細は、本発明の工程としてまたは本発明の部分の組合せのいずれかとして、ここでより詳細に記載され、特許請求の範囲に指摘される。本発明の特定の態様は、説明のために示されるのであって、本発明の限定のためではないことが理解される。本発明の原理特徴は、本発明の範囲から逸脱すること無く種々の態様において使用されうる。
【００３５】
Ｉ．インヒビターの設計および合成
メマプシン２の基質アナログの設計
５個のヒトアスパラギン酸プロテアーゼが、相同なアミノ酸配列を有し、類似の三次元構造を有する。活性部位に２個のアスパラギン酸残基があり、各残基は、サインアスパラギン酸プロテアーゼ配列モチーフであるＡｓｐ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−内に見出される。一般に、２個の相同なドメインがアスパラギン酸プロテアーゼ内にあり、基質結合部位は、三次元構造に基づいてこれらの２個のドメイン間に配置される。アスパラギン酸プロテアーゼの基質結合部位は、一般に、８個のアミノ酸残基を認識する。一般に、アスパラギン酸プロテアーゼにより切断されるアミド結合の各側に４つの残基が存在する。
【００３６】
典型的に、各アミノ酸の側鎖は、基質／アスパラギン酸プロテアーゼ相互作用の特異性に関与する。各基質残基の側鎖は、集合的にサブサイトと呼ばれる酵素の領域により認識される。プロテアーゼサブサイトおよびその対応する基質残基のための一般に是認された命名法が以下に示され、ここで二重斜線は、結合切断の位置を表わす。
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【００３７】
アスパラギン酸プロテアーゼ基質認識のための一般的なモチーフがある一方、各プロテアーゼは非常に異なる基質特異性および特異性の幅を有する。一度アスパラギン酸プロテアーゼの特異性がわかると、その特異性に基づいて天然基質が効率よく切断されるのを妨げるようにアスパラギン酸プロテアーゼと相互作用するインヒビターが設計されうる。いくつかのアスパラギン酸プロテアーゼは、首尾よい加水分解のために各サブサイトにおける多くの異なる残基を順応させることができる特性を有する。ペプシンおよびカテプシンＤは、この型の特性を有し、「広範な」基質特異性を有すると言われる。レニンにおけるように非常に少ない残基のみがサブサイトで認識されうる場合、アスパラギン酸プロテアーゼは、ストリンジェントなまたは狭小な特異性を有すると言われる。
【００３８】
アスパラギン酸プロテアーゼの特異性に関する情報は、好ましい残基が特異的なサブサイトに配置され、切断されたペプチド結合が遷移状態のアナログに置換される特異的なインヒビターを設計するために使用されうる。これらのアナログは、遷移状態同配体と呼ばれる。アスパラギン酸プロテアーゼは、アミド結合を加水分解機構により切断する。この反応機構は、アミノ酸のβ−炭素上の水酸化物イオンによる攻撃を伴う。プロトン化が、切断される結合を介してβ−炭素に付着した他の原子で生じる必要がある。β−炭素が不十分に求電子性であるか、または切断対象の結合に付着した原子が不十分に求核性である場合、結合は加水分解機構により切断されないであろう。遷移状態を模倣しないが非加水分解型であるアナログが存在するが、遷移状態同配体は、遷移状態を特異的に模倣し、非加水分解型である。
【００３９】
遷移状態理論は、酵素がその最も高い親和性を有するのは、酵素が触媒する反応の遷移状態中間体であることを示す。所定の酵素に対して最も高い親和性を有するのは、基質の基底構造ではなく、遷移状態構造である。アミド結合の加水分解についての遷移状態は四面体である一方、基底状態構造は平面である。Ｍａｒｃｉｎｉｓｚｙｎ ら（１９７６）によりペプスタチンにおいて最初に発見されたように、アスパラギン酸プロテアーゼの典型的な遷移状態同配体は、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−である。遷移状態アナログ原理は、ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼであるアスパラギン酸プロテアーゼに対するインヒビター薬物に首尾よく応用されている。これらの多くは、現在臨床的に使用されている。インヒビターの構造、特異性および型における情報は、Ｔａｎｇ， Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｄｖ． ｉｎ Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ． ９５（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９７７）； Ｋｏｓｔｋａ， Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ １９８５）； Ｄｕｎｎ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ， Ａｄｖ． ｉｎ Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３０６（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９９１）； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｄｖ． ｉｎ Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３６２（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９９５）； ａｎｄ Ｊａｍｅｓ， Ａｓｐａｒｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ， Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ａｄｖ． ｉｎ Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ４３６（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９９８） において見出され得、その全教示は全体として本発明に取り込まれる。
【００４０】
一般に、基質アナログ組成物は、一般式 Ｘ−Ｌ４−Ｐ４−Ｌ３−Ｐ３−Ｌ２−Ｐ２−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ０−Ｐ１’−Ｌ１’−Ｐ２’−Ｌ２’−Ｐ３’−Ｌ３’−Ｐ４’−Ｌ４’−Ｙ である。基質アナログ組成物は、小ペプチド分子のアナログである。その基本構造は、構造／機能研究を介して決定されたペプチド配列に由来する。 Ｐｘ により表される位置は、−Ｌ０−により表される切断部位に関連する基質特異性位置を表わすことが理解される。 Ｌｘ により表される組成物の位置は、各基質特異性位置 Ｐｘ の間の連結領域を表わす。
【００４１】
メマプシン２に対する天然の基質において、 Ｐｘ −Ｌｘ 対は、切断対象のペプチドの単一のアミノ酸を表わすであろう。この一般式において、式の各 Ｐｘ 部は、それぞれのα−炭素および側鎖官能基がアミノ酸であることを言う。したがって、アラニンに対する Ｐｘ −Ｌｘ 対の Ｐｘ 部分は、ＨＣ−ＣＨ３を表わす。一般の組成物の Ｐｘ 部分を表わす一般式は、−Ｒ１ＣＲ３− である。
【００４２】
一般に、Ｒ１は、ＣＨ３（アラニンの側鎖） 、ＣＨ（ＣＨ３）２ （バリンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖） 、（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（イソロイシンの側鎖） 、ＣＨ２（インドール）（トリプトファンの側鎖） 、ＣＨ２（ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３ （メチオニンの側鎖） 、Ｈ（グリシンの側鎖） 、ＣＨ２ＯＨ（セリンの側鎖） 、ＣＨＯＨＣＨ３（トレオニンの側鎖） 、ＣＨ２（フェノール）（チロシンの側鎖） 、ＣＨ２ＳＨ（システインの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２（グルタミンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＯＮＨ２ （アスパラギンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（リジンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）（ＮＨ２）（アルギニンの側鎖） 、ＣＨ２（イミダゾール）（ヒスチジンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸の側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（ グルタミン酸の側鎖） 、およびこれらの機能的な天然および非天然誘導体または合成置換基のいずれかでありうる。
【００４３】
Ｒ３が単一のＨであることが、最も好ましい。しかしながら、一般に、Ｒ３は、メマプシン２に結合することが可能であるアルケニル、アルキニル（ａｌｋｙｎａｌ） 、アルケニルオキシおよびアルキニルオキシ基でありうる。好ましくは、アルケニル、アルキニル、アルケニルオキシ、およびアルキニルオキシ基は、 ２〜４０個の炭素、より好ましくは２ 〜２０個の炭素、２ 〜１０個の炭素、または２ 〜３ 個の炭素、これらの機能的天然および非天然誘導体またはその合成置換基を有する。
【００４４】
Ｐｘ −Ｌｘ 対の Ｌｘ 部は、Ｐ ｘ 領域を互いに連結する原子を表わす。天然の基質において、 Ｌｘ は、鎖における次のアミノ酸であるアミノ部分に付着するβ−炭素を表わす。したがって、 Ｌｘ は、−ＣＯ−ＮＨ− により表されうる。 Ｌｘ に対する一般式は、Ｒ２により表される。一般にＲ２は、ＣＯ−ＮＨ（アミド） 、ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）（ヒドロキシエチレン） 、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ） （ジヒドロキシエチレン） 、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ（ヒドロキシエチルアミン） 、ＰＯ（ＯＨ）ＣＨ２（ホスフィネート） 、ＣＨ２ＮＨ（還元アミド） でありうる。基質アナログがアスパラギン酸プロテアーゼ機能を阻害するように機能する限り、１つより多いＬ−が同配体でありうることが理解される。
【００４５】
同配体でないＬｓは、アミド結合でありうるか、または非加水分解型であるアミド結合の模倣体でありうる。
【００４６】
Ｘ およびＹ は、アスパラギン酸プロテアーゼ認識部位による認識に典型的には関与しないが、認識を妨げない分子を表わす。これらの分子は、基質アナログの分解に対する耐性を与えることが好ましい。好ましい例は、非加水分解型結合を介して基質アナログに結合したアミノ酸である。他の好ましい化合物は、キャッピング薬剤である。さらに他の好ましい化合物は、ビオチンなどの基質アナログの精製において使用されうる化合物である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、アルキルは、置換または非置換の直鎖、分枝または環状のアルキル基のことを言い；アルコキシは、置換または非置換の直鎖、分枝または環状のアルコキシのことを言う。好ましくは、アルキルおよびアルコキシ基は、 １〜４０個の炭素、より好ましくは１ 〜２０個の炭素、１ 〜１０個の炭素、または１ 〜３ 個の炭素を有する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、アルケニルは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルケニル基のことを言い；アルキニルは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルキニル基のことを言い；アルケニルオキシは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルケニルオキシのことを言い；アルキニルオキシは、置換または非置換の直鎖または分枝のアルキニルオキシのことを言う。好ましくは、アルケニル、アルキニル、アルケニルオキシおよびアルキニルオキシ基は、 ２〜４０個の炭素、より好ましくは２ 〜２０個の炭素、２ 〜１０個の炭素、または２ 〜３ 個の炭素を有する。
【００４９】
本明細書で使用される場合、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）は、アリール置換基を有するアルキル基のことを言い；アラルキルは、アルキル置換基を有するアリール基のことを言い；ヘテロ環−アルキルは、アルキル置換基を有するヘテロ環基のことを言い；アルキル−ヘテロ環は、ヘテロ環置換基を有するアルキル基のことを言う。
【００５０】
アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルケニルオキシ、およびアルキニルオキシ基に対する置換基は、ハロゲン、シアノ、アミノ、チオ、カルボキシ、エステル、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、ヒドロキシ、またはメルカプトでありうる。さらに、この基は、Ｏ 、ＮＨまたはＳ などのヘテロ原子で置換された１つ以上のメチレン基を任意に有しうる。
【００５１】
多数の異なる基質が試験および解析され、メマプシン２に対する切断規則が決定された。解析された基質の結果を表１に示し、この結果から決定した規則を以下に要約する。
【００５２】
（１）メマプシン２の基質に対する主要な特異性部位は、サブサイト位置Ｓ１’ である。これは、メマプシン２における基質特異性に対する最も重要な決定基がアミノ酸のＰ１’ であることを意味する。Ｐ１’ は、メマプシン２が基質を認識するために小さい側鎖でありうる。好ましい態様は、基質アナログであり、ここでＰ１’ 位ノＲ１は、Ｈ（グリシンの側鎖） 、ＣＨ３（アラニンの側鎖） 、ＣＨ２ＯＨ（セリンの側鎖） 、またはＣＨ２ＣＯＯＨ（アスパラギン酸の側鎖） のいずれかである。構造的にＣＨ３（アラニンの側鎖） またはＣＨ２ＯＨ（セリンの側鎖） より小さいＲ１を有する態様もまた好ましい。しかしながら、表１における基質は、そのアミノ酸組成のために、メマプシン２の基質特異性の完全な提示を与えない。それゆえ、Ｐ１’ は、言及した小残基に限定されないが、以下のものも含む：
ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖）
（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（イソロイシンの側鎖）
ＣＨ２（インドール）（トリプトファンの側鎖）
ＣＨ２（ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖）
ＣＨ（ＣＨ３）２ （バリンの側鎖）
ＣＨ２（フェノール）（チロシンの側鎖）
ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３ （メチオニンの側鎖）
ＣＨ（ＣＨ３ＯＨ）（トレオニンの側鎖）
ＣＨ２ＣＯＮＨ（アスパラギンの側鎖）
ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ （グルタミンの側鎖）
ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ （グルタミン酸の側鎖）
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ３（リジンの側鎖）
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＣ（ＮＨ２）２（アルギニンの側鎖）
ＣＨ２（イミダゾール）（ヒスチジンの側鎖）
【００５３】
（２）位置Ｐ４， Ｐ３， Ｐ２， Ｐ１， Ｐ２’， Ｐ３’およびＰ４’ に特異的配列必要条件はない。各部位は、規則第３を満たす限り、特性において任意の他のアミノ酸残基を適応しうる。
【００５４】
（３）残りの７個の位置Ｐ４， Ｐ３， Ｐ２， Ｐ１， Ｐ２’，Ｐ３’ およびＰ４’ の少なくとも２個は、疎水性残基を作製するＲ１を有さなければならない。残りの７個の位置Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ２’ 、Ｐ３’ およびＰ４’ において、少なくとも３個の疎水性残基があることが好ましい。疎水性基を含むこの位置のための好ましいＲ１基は、ＣＨ３（アラニンの側鎖） 、ＣＨ（ＣＨ３）２ （バリンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖） 、ＣＨ３ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（イソロイシンの側鎖） 、ＣＨ２（インドール）（トリプトファンの側鎖） 、ＣＨ２（ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３ （メチオニンの側鎖） 、ＣＨ２（フェノール）（チロシンの側鎖） である。疎水性基が大きな疎水性基であることがより好ましい。大きな疎水性基を含む好ましいＲ１は、ＣＨ（ＣＨ３）２ （バリンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖） 、（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）（イソロイシンの側鎖） 、ＣＨ２（インドール）（トリプトファンの側鎖） 、ＣＨ２（ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３ （メチオニンの側鎖） 、ＣＨ２（フェノール）（チロシンの側鎖） である。疎水性Ｒ１を有する位置が、ＣＨ（ＣＨ３）２ （バリンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖） 、ＣＨ２（ベンゼン）（フェニルアラニンの側鎖） 、ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３ （メチオニンの側鎖） 、またはＣＨ２（フェノール）（チロシンの側鎖） であるのが最も好ましい。
【００５５】
（４）８個の位置Ｐ４， Ｐ３， Ｐ２， Ｐ１， Ｐ１’， Ｐ２’， Ｐ３’ およびＰ４’ のいずれもＲ１位にプロリン側鎖を有さないであろう。
【００５６】
（５）全てのサブサイトが、アナログにおいて表されるＰ を有する必要があるというわけではない。例えば、基質アナログは、Ｘ−Ｐ２−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ０−Ｐ１’−Ｌ１’−Ｐ２’−Ｌ２’−Ｐ３’−Ｌ３’−Ｙ を有しうるか、または Ｘ−Ｌ１−Ｐ１−Ｌ０−Ｐ１’−Ｌ１’−Ｐ２’−Ｌ２’−Ｐ３’−Ｌ３’−Ｐ４’−Ｌ４’−Ｙ を有しうる。
【００５７】
好ましい基質アナログは、Ｐ１およびＰ１’ 間に非加水分解型アナログを持つ表１に開示された配列を有するアナログである。
【００５８】
インヒビターを作製するためのコンビナトリアル化学
コンビナトリアル化学は、小分子または別の高分子のいずれかに結合可能である分子を単離するための全ての方法を含むが、それらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチド、および多糖が、高分子の例である。例えば、所定の機能、触媒性またはリガンド結合を有するオリゴヌクレオチド分子は、ランダムオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離され得、これは「インビトロ遺伝学」と呼ばれている（Ｓｚｏｓｔａｋ， ＴＩＢＳ １９：８９， １９９２、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる） 。１つは、ランダム配列および規定配列を保有する分子のラージプールを合成し、複合混合物、例えば、１００ ヌクレオチドＲＮＡ の１００ μｇ の中約１０１５の個々の配列を、ある選択および富化プロセスに供する。カラム上のリガンドに結合した分子のアフィニティークロマトグラフィーおよびＰＣＲ 増幅の繰り返しサイクルを介して、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ およびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０） は、１０１０ＲＮＡ 分子の中の１つが小分子色素に結合する方法でフォールディングされると見積もった。かかるリガンド結合挙動を有するＤＮＡ 分子は、良好に単離されている（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ， １９９２； Ｂｏｃｋ ら、１９９２、その全教示は、全体として本明細書に取り込まれる） 。
【００５９】
類似の目標を目指す技術が、小有機分子、タンパク質およびペプチドならびに当業者に公知の他の分子について存在する。小さい合成分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質またはペプチドのライブラリーに基づくかどうかの所望の活性に対する分子のスクリーニングセットは、広くコンビナトリアル化学と呼ばれる。
【００６０】
デノボ活性または改変された活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための多数の方法がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーが何年も使用されている。所定の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ およびＳｚｏｓｔａｋ に記載されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ． およびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７）、その教示は全体として本明細書に取り込まれる） 。ペプチドを単離するために設計されたコンビナトリアル法のための別の好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎ らに記載されている（Ｃｏｈｅｎ Ｂ．Ａ． ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５ （２４）：１４２７２−７（１９９８）、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる） 。この方法は、改変ツーハイブリッド技術を利用する。酵母ツーハイブリッドシステムが、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および解析のために有用である。酵母サッカロミセスセレビジエにおいて最初に記載されたツーハイブリッドシステムは、目的のタンパク質に特異的な新規調節分子を同定するための強力な分子遺伝的技術である（Ｆｉｅｌｄｓ およびＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−６（１９８９）、その教示は全体として本明細書に取り込まれる） 。Ｃｏｈｅｎ らはこの技術を改変したので、選択分子に結合する合成または遺伝子工学によるペプチド配列の間の新規相互作用が、同定されうる。このタイプの技術の利益は、選択が細胞内環境においてなされることである。この方法は、酸性活性化ドメインに付着するペプチド分子のライブラリーを利用する。選択ペプチド、例えばメマプシン２の細胞外部分は、Ｇａｌ４などの転写活性化タンパク質のＤＮＡ 結合ドメインに付着する。このタイプのシステムでツーハイブリッド技術を行うことにより、メマプシン２の細胞外部分に結合する分子が同定されうる。
【００６１】
小分子ライブラリーのスクリーニング
これらのより専門化された技術に加えて、当業者に周知の方法論が、種々の小分子またはコンビナトリアルライブラリーと組み合わせて、所望の標的であるメマプシン２またはその基質のいずれかに結合するか、またはそれと相互作用する分子を単離し、かつ特徴付けるために使用されうる。この化合物の関連する結合アフィニティーが比較され得、最適のインヒビターが、当業者に周知の競合または非競合結合研究を用いて同定されうる。好ましい競合インヒビターは、メマプシン２の非加水分解型アナログである。もう１つは、メマプシン２の機能または正しいフォールディングを妨害するアロステリック再配列を生じる。
【００６２】
コンピューター補助合理的薬物設計
インヒビターを単離するための別の方法は、合理的設計を介する。これは、構造情報およびコンピューターモデリングを介して達成される。コンピューターモデリング技術は、選択分子の三次元原子構造の視覚化、および分子と相互作用する新規化合物の合理的設計を可能にする。三次元構造は、典型的には、選択分子のＸ線結晶学解析またはＮＭＲ イメージングに由来するデータに依存する。分子動力学は、力場（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ） データを必要とする。コンピューターグラフィックスシステムは、どのように新規化合物が、標的分子に結合し、結合特異性を完成するための化合物および標的分子の構造の実験操作を可能にするのかに対する予測を可能にする。例えば、ＮＭＲ 分光法を用いて、Ｉｎｏｕｙｅおよび共同研究者は、ＴＳＨＫ（膜貫通センサーヒスチジンキナーゼ）の触媒部位の個々のサブドメインの構造を保持するＮ末端切形ＴＳＨＫフラグメントの構造情報を得ることができた。ＮＭＲ 研究を基礎として、彼らは潜在的なＴＳＨＫインヒビターを同定することができた（Ｉｎｏｕｙｅ、米国特許第 ６，０７７，６８２号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。別の良好な例は、高分解能Ｘ線結晶学を用いて決定されたカルシニューリン／ＦＫＢＰ１２／ＦＫ５０６ 複合体の三次元構造に基づき、カルシニューリン活性部位結合ポケットと補助のＦＫＢＰ１２／ＦＫ５０６ 結合ポケットの両方の形状および構造を得る（Ａｒｍｉｓｔｅａｄ に対する米国特許第 ５，９７８，７４０号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。手中のこの情報を用いて、研究者は、天然のリガンドまたは基質とそれに対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合をよく理解し得、したがって有効なインヒビターを設計および作製しうる。
【００６３】
分子−化合物の相互作用の予測は、小さな変化が一方または両方でなされる場合、分子力学ソフトウエアおよび計算的に強いコンピューターを必要とし、通常分子設計プログラムとユーザーの間の使いやすい、メニュー選択方式接点とあわされる。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗａｌｔｈａｒｎ， ＭＡ である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学機能を行なう。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を行なう。ＱＵＡＮＴＡは、互いの分子の挙動の相互作用構築、改変、視覚化、および解析を可能にする。
【００６４】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ ら、１９８８， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７， １５９−１６６； Ｒｉｐｋａ， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４−５７（Ｊｕｎｅ １６， １９８８）； ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ， １９８９ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２９， １１１−１２２； ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ， ＱＳＡＲ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８９； ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ， １９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６， １２５−１４０ および１４１−１６２ ；および核酸成分に対するモデル酵素に関してＡｓｋｅｗ ら、１９８９ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１， １０８２−１０９０ 、その全教示は全体として本明細書に取り込まれる） などの多くの文献が、特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピューターモデリングを概説する。化学物質を選抜し、線図で描く他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．， Ｐａｓａｄｅｎａ， ＣＡ．， Ａｌｌｅｌｉｘ， Ｉｎｃ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ，およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ， Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｏｎｔａｒｉｏ などの会社から入手可能である。
【００６５】
結合を変更しうる化合物の設計および作製に関して上記したが、天然産物または合成化学物質、およびタンパク質を含む生物学的活性物質を含む公知の化合物のライブラリーを、基質結合または酵素活性を変更する化合物のために選抜することもできる。
【００６６】
ライブラリーのスクリーニング
基質アナログの設計および合理的薬物設計は、活性部位および標的の理解に基づき、酵素およびその基質の詳細な構造を作製するコンピューターソフトウエアプログラム、ならびに単独またはインヒビターの存在下でそれらが相互作用する手段を利用する。これらの技術は、手中のＸ線結晶学データを用いて有意に増強される。インヒビターはまた、触媒的に活性な酵素を阻害するものに対して存在する化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても得ることができる。メマプシン２に関する文献における報告とは対照的に、本明細書に記載の酵素は、天然産生酵素に対して活性類似性を有し、内因性活性を阻害する化合物を同定するための手段を提供する。これらの潜在的インヒビターは、酵素、基質（好ましくは発色基質）および潜在的インヒビター（濃度の範囲全域で通常スクリーニングされる）が混合され、基質の切断の程度が決定される高スループットアッセイを用いて典型的に同定される。潜在的に有用なインヒビターは、切断の量を減少させるものである。
【００６７】
ＩＩ．触媒的に活性な組換えメマプシン２の調製
メマプシン２のクローニングおよび発現
実施例１に記載のように、メマプシン２をクローニングし、ヌクレオチド配列（配列番号：１）および予測アミノ酸配列（配列番号：２）を決定した。ｃＤＮＡをフラグメントから組み立てた。ヌクレオチドおよびその規定するタンパク質配列を、それぞれ配列番号：１および配列番号：２に示す。タンパク質は、ＥＰ ０ ８５５ ４４４ Ａ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， （１９９８年 ７月２９日発行） 、米国特許第 ６，３１９，６８９号明細書、Ｓｉｎｈａ ら、Ｎａｔｕｒｅ ４０２， ５３７−５４０ （１９９９ 年１２月） およびＶａｓｓａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ７３５−７４１（１９９９ 年１０月２２日） （その全教示は全体として本明細書に取り込まれる）に記載のアスパラギン酸プロテアーゼ２（ＡＳＰ２）と同一である。
【００６８】
プロ−メマプシン２は、他のアスパラギン酸プロテアーゼに相同であり、マウスＡＰＳ１とホモロジーを共有する（米国特許第 ６，２９１，２２３号明細書、その教示は全体として本明細書に取り込まれる）。アラインメントに基づいて、プロ−メマプシン２は、プロ領域、アスパラギン酸プロテアーゼ領域、およびＣ末端近くの膜貫通領域を含む。Ｃ末端ドメインは、８０残基長を超える。活性酵素はメマプシン２であり、そのプロ−酵素はプロ−メマプシン２である。
【００６９】
触媒的に活性な酵素の再フォールディング
基質特異性を決定し、かつインヒビターを設計するために、触媒的に活性な組換え酵素を発現させることが必要である。活性部位は膜貫通領域中ではなく、活性は膜固定を必要としないので、メマプシン２は、実施例３に記載のように、２つの異なる長さで、両者とも膜貫通領域無しで大腸菌中で発現させ、精製した。トランスフェクトした細菌の培養、組換えタンパク質の合成の誘導、ならびに組換えタンパク質を含む封入体の回収および洗浄のための手順は、本質的にＬｉｎ ら、（１９９４）（その教示は全体として本明細書に取り込まれる） により記載されたものである。再フォールディングのために、８Ｍ尿素／１００ｍＭ β−メルカプトエタノールなどの強い変性／還元溶液中にタンパク質を溶解させる。タンパク質が再フォールディングされる割合、およびどの溶液中であるかが、活性に重要である。ある方法では、タンパク質が８Ｍ尿素／１００ｍＭ β−メルカプトエタノール中に溶解され、次いで２０容量の２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ 、ｐＨ９．０ 中に迅速に希釈され、それを次いで１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ８ にゆっくり調整する。次に、再フォールディング溶液を、精製を行なう前に２４〜４８時間 ４℃に保つ。第２の方法では、等量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ 、０．５ｍＭ 酸化型／１．２５ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ ９．０が、急速攪拌した８Ｍ尿素／１０ｍＭβ−メルカプトエタノール中のプロ−メマプシン２に添加される。このプロセスが、１時間の間隔でさらに３回繰り返される。次に、最終尿素濃度が０．４Ｍになるように、得られた溶液を十分な容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ベースに対して透析する。次に、溶液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌを用いて８．０ にゆっくり調整する。
【００７０】
次に、分子量排除および／または塩グラジエントを用いる溶出に基づくカラムクロマトグラフィーを用いて再フォールディングタンパク質をさらに精製し、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により解析する。
【００７１】
ＩＩＩ．  基質特異性およびメマプシン２の酵素動力学
インヒビターは、メマプシン２によるその基質の結合および切断の阻害に対してスクリーニングされうる。
【００７２】
基質特異性
脳におけるメマプシン２の存在（Ｍ２）は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） を加水分解しうることを示した。下記のように、詳細な酵素および細胞の研究は、Ｍ２がβ−セクレターゼの基準に全て適合することを示した。Ｍ２の三次元構造を、タイプＩ完全膜タンパク質としてモデル化した。モデルは、その球状プロテアーゼユニットが、膜表面から２０〜３０残基の距離範囲で膜固定したポリペプチドを加水分解しうることを示唆した。脳の膜貫通タンパク質として、ＡＰＰ は潜在的な基質であり、原形質膜表面から約２８残基に位置するそのβ−セクレターゼ部位は、Ｍ２タンパク質分解の範囲内である。
【００７３】
この部位に由来する合成ペプチド（ＳＥＶＫＭ／ＤＡＥＦＲ）（配列番号：５）を、Ｍ２ｐｄ（Ａｌａ−８Ｐ 〜Ａｌａ３２６のアミノ酸を含む改変Ｍ２） によりβ−セクレターゼ部位（／によりしるしをつけた）で加水分解した。ＡＰＰ β−セクレターゼ部位に由来し、「スウェーデン変異（Ｓｗｅｄｉｓｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ）」（Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ． ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ２：３４０−３４２（１９９２） 、その教示は全体として本明細書に取り込まれる） を含む第２ペプチド（ＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲ）（配列番号：６）は、細胞において Ａβ産生のレベルを高めることが知られており（Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ． ら、Ｎａｔｕｒｅ ２６０： ６７２−６７４（１９９２） 、その教示は全体として本明細書に取り込まれる） 、非常に高い触媒効率でＭ２ｐｄにより加水分解された。両方の基質は、ｐＨ４．０ で最適に切断された。プレセニリン１のプロセシング部位に由来するペプチド （ＳＶＮＭ／ＡＥＧＤ） （配列番号：７）もまた、低効率の速度論的パラメーターでＭ２ｐｄにより切断された。ＡＰＰ γ−セクレターゼ部位に由来するペプチド（ＫＧＧＶＶＩＡＴＶＩＶＫ）（配列番号：８）は、Ｍ２ｐｄにより切断されなかった。ペプスタチンＡは、Ｍ２ｐｄをわずかに阻害した（ＩＣ５０約０．３ｍＭ ）。速度論的パラメーターは、プレセニリン１（ｋ ｃａｔ ， ０．６７ｓ −１， Ｋｍ ， １５．２ｍＭ；  Ｋ ｃａｔ ／Ｋ ｍ ，４３．８ｓ −１Ｍ −１）および天然ＡＰＰ ペプチド（Ｋｃａｔ ／Ｋｍ ，３９．９ｓ−１Ｍ −１） の両方がスウェーデン（Ｓｗｅｄｉｓｈ）ＡＰＰペプチド（ｋｃａｔ ， ２．４５ｓ −１，Ｋｍ ， １ｍＭ； Ｋｃａｔ ／Ｋｍ ，２４５０ｓ−１Ｍ −１） ほど良好な基質ではないことを示す。
【００７４】
Ｍ２が、哺乳動物細胞においてＡＰＰ β−セクレターゼ機能を所有するかどうかを決定するために、メマプシン２をＨｅｌａ細胞中で一過性に発現させ（Ｌｉｎ， Ｘ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７：１０７０−１０８０（１９９３）、その教示は、全体として本明細書に取り込まれる） 、３５Ｓ−Ｍｅｔ を用いて代謝的にパルス標識し、次にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動後のＡＰＰ−生成フラグメントの可視化および画像化のために抗−ＡＰＰ抗体を用いて免疫沈降した。パルス−チェイス実験のならし培地（２ｈ）由来の免疫沈降 ＡＰＰ Ｎβ−フラグメント（９７ｋＤ バンド） のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、ＡＰＰ がＭ２により切断されることを示した。対照をＡＰＰ 単独でトランスフェクトし、ＡＰＰ およびＭ２を用いて同時トランスフェクトし、バフィロマイシンＡ１を用いた添加を行なった。ＡＰＰ βＣ−フラグメント（１２ｋＤ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンが、上記と同じ実験のならし培地から免疫沈降された。対照をＡＰＰ 単独でトランスフェクトし；ＡＰＰ およびＭ２を用いて同時トランスフェクトし；ＡＰＰ およびＭ２を用い、バフィロマイシンＡ１を用いて同時トランスフェクトし；スウェーデンＡＰＰ のトランスフェクション；ならびにスウェーデンＡＰＰ およびＭ２の共トランスフェクションを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはまた、免疫沈降Ｍ２（７０ｋＤ）、Ｍ２トランスフェクト細胞；長時間のフィルム曝露後の非トランスフェクトＨｅｌａ細胞；およびＨＥＫ２９３細胞由来の内因性Ｍ２のランであった。異なるＡＰＰ 領域に特異的な抗体を用いた免疫沈降後のならし培地から回収したＡＰＰ フラグメント（１００ｋＤβＮ−フラグメントおよび９５ｋＤβＮ−フラグメント） のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンは、メマプシン２がＡＰＰ を切断することを示した。
【００７５】
ＡＰＰ およびＭ２の両方を発現する細胞は、ならし培地中で９７ｋＤ ＡＰＰβＮ−フラグメント（Ｎ末端からβセクレターゼ部位まで）および細胞溶解産物中で１２ｋＤβＣ−フラグメント（βセクレターゼ部位からＣ末端まで）を産生した。ＡＰＰ 単独でトランスフェクトした対照は、検出可能ではないほどのβＮ−フラグメントを産生し、βＣ−フラグメントを産生しない。バフィロマイシンＡ１は、リソソーム／エンドソームの小胞内ｐＨを上げることが公知であり、かつβ−セクレターゼによりＡＰＰ 切断を阻害することが示されており（Ｋｎｏｐｓ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２４１９−２４２２（１９９５） 、その教示は、その全体が本明細書に取り込まれる） 、同時トランスフェクト細胞におけるβＮ−およびβＣ−の両方のＡＰＰ フラグメントの産生を廃止する。スウェーデンＡＰＰ 単独でトランスフェクトした細胞は、細胞溶解産物においてβＣ−フラグメントバンドを産生しなかったが、スウェーデンＡＰＰ およびＭ２の共トランスフェクションはそれを産生した。このスウェーデンβＣ−フラグメントバンドは、野生型ＡＰＰ よりも強力であた。９７ｋＤβＮ−バンドがまた、ならし培地で見られたが、野生型ＡＰＰ トランスフェクションとほぼ同じ強度であった。
【００７６】
これらの結果は、Ｍ２がエンドソームなどの酸性区画においてＡＰＰ のβセクレターゼ部位をプロセスすることを示す。トランスフェクトされたＭ２遺伝子の発現を達成するために、パルス標識細胞は、溶解され、抗Ｍ２抗体により免疫沈降された。βセクレターゼを発現することが公知のＨＥＫ２９３細胞由来の主要バンドと同じ移動度を有する７０ｋＤのＭ２バンドは、Ｍ２遺伝子でトランスフェクトされた細胞において知見された（Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２６０：６７２−６７４（１９９２）、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。Ｍ２の非常にかすかなバンドがまた、長いフィルム曝露後にトランスフェクトされていないＨｅＬａ細胞において知見され、これは非常に低レベルの内因性Ｍ２を示し、このレベルは、Ｍ２トランスフェクションなしにβＮ−またはβＣ−フラグメントを産生するのには不十分である。Ａβペプチドの残基１〜１７を特異的に認識する抗体Ａβ１−１７を使用して、正確なβセクレターゼ部位切断を確認した。ＡＰＰ およびＭ２でトランスフェクトされた細胞において、βＮ−およびβＮ−フラグメントは共に、両フラグメントに存在するＡＰＰ のＮ 末端領域を認識する抗体を用いて認識できる。抗体Ａβ１−１７は、トランスフェクトされていない細胞において内因性βセクレターゼによって産生されたβＮ−フラグメントを認識する。しかし、この抗体は、ＡＰＰ およびＭ２で同時トランスフェクトされた細胞に存在することが公知のβＮ−フラグメントを認識することができなかった。これらの観察は、βＮ−フラグメントがＡβ１−１７の認識エピトープを破壊したＭ２によるβセクレターゼ部位切断の産物であることを確認した。
【００７７】
特異性研究において、Ｍ２ｐｄが活性化後１６時間のインキュベーションの間にそのプロペプチド（２部位）およびプロテアーゼ部分（２部位）を切断したことを見出した（表１）。上記で考察した３つのペプチドのほかにも、Ｍ２ｐｄはまた、酸化ウシインスリンＢ 鎖および合成ペプチドＮｃｈ を切断した。天然タンパク質は、Ｍ２ｐｄにより切断されなかった。
【００７８】
これらの同じ方法は、メマプシンを阻害する効能をスクリーニングするために開示されているインヒビターと組合わせて使用され得る。
【００７９】
ＩＶ．診断および処置方法
インヒビターは、アルツハイマー病およびそれに関連する状態（例えば、４２アミノ酸ペプチド切断産物のレベルの上昇およびアミロイド（ａｍｙｅｌｏｉｄ）プラークにおけるペプチドの蓄積など）の診断および処置および／または予防に使用され得る。
【００８０】
診断的使用
基質アナログは、実施例に記載されるように、メマプシン２またはメマプシン２アナログに特異的に結合するため、およびメマプシン２単離および精製または特徴付けを補助するための試薬として使用され得る。インヒビターおよび精製組換え酵素は、より遺伝的にアルツハイマー病を発生する傾向のある個体のスクリーニングに使用され得る。
【００８１】
治療的使用
組換えヒトメマプシン２は、配列ＬＶＮＭ／ＡＥＧＤ （配列番号：９）を有する基質を切断する。この配列は、ヒトプレセニリンのインビボプロセシング部位配列である。プレセニン１およびプレセニン２は共に、内在性膜タンパク質である。これらは、プロセスされていない形態からＮ 末端配列を除去するプロテアーゼ切断によってプロセスされる。一旦プロセスされると、プレセニリンは、プロセスされていないプレセニリンと比較して安定な２本鎖ヘテロダイマーを形成する（Ｃａｐｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２０５（１９９８）；Ｔｈｉｎａｋａｒａｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４，４３８（１９９８） ；Ｙｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２；２５４（３）：１２５−８（１９９８）、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プロセスされていないプレセニリンは、速やかに分解される（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２８４１５（１９９７） ；Ｓｔｅｉｎｅｒ ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２３２２（１９９８） 、これら全ての教示はその全体が本明細書中に援用される）。プレセニリンがβセクレターゼのインビボ活性を制御し、次いでＡβ４２の形成をもたらすためにアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ ）を切断することは公知である。脳細胞におけるＡβ４２の蓄積は、アルツハイマー病の主な原因であることが公知である（概略について、Ｓｅｌｋｏｅ，１９９８ を参照のこと、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。従って、プレセニリンの活性は、アルツハイマー病の進行を高める。これは、プレセニリン遺伝子の不在下で、Ａβ４２ペプチドの産生が低下するという観察（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１，３８７（１９９８）、この教示はその全体が本明細書中に援用される）により支持される。プロセスされていないプレセニリンは速やかに分解されるので、プロセスされたヘテロダイマーのプレセニリンがアルツハイマー病をもたらすＡβ４２の蓄積の原因であるはずである。メマプシン２によるプレセニリンのプロセシングは、Ａβ４２の産生を高め、従ってさらにアルツハイマー病の進行を高める。従って、血液脳関門を通過するメマプシン２インヒビターは、Ａβ４２の沈着により媒介されるアルツハイマー病の発生の見込みを減少するか、またはアルツハイマー病の進行を遅らせるために使用され得る。メマプシン２はＡＰＰ をβ切断部位で切断するので、β切断部位でのＡＰＰ 切断の防止は、Ａβ４２の蓄積を防止する。
【００８２】
薬学的に許容可能なキャリア
インヒビターは、経口的にまたは注射によって典型的に投与される。経口投与が好ましい。あるいは、他の製剤は、肺、粘膜または経皮経路によって送達するために使用され得る。インヒビターは、通常、薬学的に許容可能なキャリアと組合わせて投与される。薬学的キャリアは、当業者にとって公知である。適切なキャリアは、投与の方式に基づいて典型的に選択される。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、および鎮痛剤などの１つ以上の活性成分を含み得る。
【００８３】
非経口投与または注射投与のための調製物としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物オイル、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒質が挙げられる）が挙げられる。好ましい非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流動性および栄養充填剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ ）、ならびに電解質充填剤（リンガーブドウ糖に基づくものなど）が挙げられる。
【００８４】
局所（粘膜表面への塗布が挙げられる、口、肺、鼻、膣または直腸が挙げられる）投与のための製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。これらの適用のための製剤は公知である。例えば、多数の肺製剤は、典型的に噴霧乾燥を使用して、薬物あるいはポリマーおよび／または界面活性剤と組合わせた薬物からなる１〜３ミクロンの間の空力学的直径を持つ粒子を有する粉末を製剤化することで開発されている。
【００８５】
経口投与のための組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁剤もしくは溶液、カプセル剤、サシェット（ｓａｃｈｅｔ）、あるいは錠剤が挙げられる。シックナー、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が所望され得る。
【００８６】
本明細書に記載されるようなペプチドはまた、無機酸（例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、および有機酸（例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）および有機塩基（例えば、モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミン）との反応により形成される薬学的に許容可能な酸−または塩基−付加塩として投与され得る。
【００８７】
投与量
投薬は、処置対象の状態の重篤度および敏感性に依存するが、通常、数日〜数ヶ月続く処置の過程、または所属医師がこれ以上利益が得られないと決定するまでは一日あたり１以上の用量である。当業者は、最適投薬、投薬方法論および反復率を決定し得る。
【００８８】
投薬範囲は、メマプシン２媒介障害の症状が緩和される（典型的にはアミロイドプラークのサイズおよび／または数の減少あるいはサイズまたは量の増加がないことに特徴付けられる）、またはＡβ４２ペプチドの切断が減少するという所望の効果を生ずるのに充分大きな範囲である。この投薬は、任意の逆適応（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ ）の場合には個々の医師によって調節され得る。
【００８９】
本発明はさらに、いかなる限定も意図されない以下の実施例によって説明される。
【００９０】
実施例
実施例１．組換えメマプシン２のタンパク質分解活性および切断部位選択
ＡＰＰ のタンパク質切断部位の周りのアミノ酸配列を、メマプシン２の特異性を確立するために決定した。組換えプロメマプシン２−Ｔ１ を、自触切断を作製するために室温にて１６時間０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０ ）中でインキュベートした。この産物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した。プロメマプシン２の分子量よりも小さい分子量に対応するいくつかのバンドを観察した。電気泳動バンドをＰＶＤＦ膜上にトランスブロットした（ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔｔｅｄ ）。４つのバンドを選択し、タンパク質シーケンサー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ）におけるＮ−末端配列決定に供した。これらのバンドのＮ−末端配列は、プロメマプシン２上のタンパク質切断部位の位置を確立した。
【００９１】
さらに、ウシインスリンの酸化β鎖および２つの異なる合成ペプチドをメマプシン２に対する基質として使用して、他の加水分解部位の程度を決定した。これらの反応を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０ ）中で自己活性化プロメマプシン２により実施し、次いでペプチドと共にインキュベートした。加水分解産物を、逆相Ｃ−１８カラム上のＨＰＬＣに供し、溶出ピークをフラグメントの分子量の決定のために電気スプレー質量分光法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）に供した。酸化インスリンＢ 鎖上の２つの加水分解部位を同定した（表１）。３つの加水分解部位をペプチドＮＣＨ−γから同定した。唯一の切断部位を合成ペプチドＰＳ１−γにおいて観察し、その配列（ＬＶＮＭＡＥＧＤ）（配列番号：１０）はヒトプレセニリン１のβプロセシング部位由来である（表１）。
【００９２】
【表１】
2005500979.tif 000003
【００９３】
実施例２．プロメマプシン２の活性および酵素速度論
２２℃にて１６時間の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０ ）中のインキュベーションは、自触反応的にプロＭ２ｐｄをＭ２ｐｄへ変換した。初期加水分解試験のために、２つの合成ペプチドを、２〜１８時間の範囲の種々の期間、０．１Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ４．０ ）中でプロＭ２ｐｄと共に別個にインキュベートした。インキュベートした試料を、加水分解産物の同定のためにＬＣ／ＭＳ に供した。速度論研究のために、同定したＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ）産物ピークを定量のために統合した。プレセニリン１およびスウェーデン（Ｓｗｅｄｉｓｈ ）ＡＰＰ ペプチドに対するＫ ｍ 値およびｋ ｃａｔ 値（表１）を定常状態速度論によって測定した。ＡＰＰ ペプチドに対する個々のＫ ｍ 値およびｋ ｃａｔ 値は、標準的方法により正確に測定できなかった、それゆえ、そのｋ ｃａｔ ／Ｋ ｍ値を、プレセニリン１ペプチドに対する混合基質の競合的加水分解により測定した（Ｆｅｒｓｈｔ， Ａ．「Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、第２版、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． （１９８５）、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。
【００９４】
ｐＨ４．０ でのプロＭ２ｐｄのより小さなフラグメントへの変換を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって示した。プロＭ２ｐｄと変換した酵素との間の移動度の差は、この２つの混合物において明らかである。
【００９５】
実施例３：メマプシン２インヒビターＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２の設計および合成
メマプシン２の特異性研究の結果に基づいて、Ｐ１およびＰ１’ 位についてのよい残基はＬｅｕ およびＡｌａ であると予測した。続いて、Ｐ１’ が小さな残基（例えば、Ａｌａ およびＳｅｒ ）を好むことを特異性データから決定した。しかし、結晶構造（下で決定した）は、この部位が多くのより大きな残基を適応し得ることを示す。メマプシン２のＰ１’ が最もストリンジェントな特異性必要性を有する位置であり、小さな側鎖の残基（例えば、Ａｌａ 、Ｓｅｒ 、およびＡｓｐ ）が好ましいことを示した。Ａｌａ を、主にＰ１’ に対して選択した。なぜならば、Ｓｅｒ およびＡｓｐ を超えるその疎水性が血液−脳関門の透過（アルツハイマー病を処置するためのメマプシン２インヒビター薬物の設計に必要）に有利であるからである。従って、Ｌｅｕ とＡｌａ との間に遷移状態のアナログ同配体を配置（Ｌｅｕ＊Ａｌａ として示され、ここで＊ は遷移状態の同配体、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−を表す）するようにインヒビターを設計し、サブサイトＰ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ２’ 、Ｐ３’ およびＰ４’ をβアミロイドタンパク質由来のスウェーデン変異体のβセクレターゼ部位配列で満たす。
【００９６】
2005500979.tif 000004
【００９７】
Ｌｅｕ＊Ａｌａ ジペプチド同配体を以下のように合成した：
【００９８】
Ｍ２− インヒビターに対するＬｅｕ−Ａｌａ ジペプチド同配体をＬ−ロイシンから調製した。以下の記載における太字数字（例えば２、３、４など）は、合成スキーム１、２および３においてそれぞれ番号を付けた化合物をいう。太字数字はまた、本明細書において合成スキームの「化合物」（例えば、化合物２）としていう。
【００９９】
【化１】
2005500979.tif 000005
【０１００】
スキーム１に示すように、Ｌ−ロイシンを、ジエチルエーテル中１０％ＮａＯＨの存在下ＢＯＣ２Ｏ で１２時間処理することによりそのＢＯＣ 誘導体２として保護した。次いでＢｏｃ−ロイシン２を、イソブチルクロロ蟻酸およびＮ−メチルピペリジンで処理し、続いて得られた混合無水物をＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンで処理することによりＷｅｉｎｒｅｂ アミド３へ変換した（ＮａｈｍおよびＷｅｉｎｒｅｂ 、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８１， ３２：３８１５ 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。ジエチルエーテル中でのリチウムアルミニウム水素化物を用いた３の還元は、アルデヒド４を生成した。プロピオール酸エチルおよびリチウムジイソプロピルアミドの処理から誘導されるプロピオール酸リチウムとアルデヒド４との反応は、４２％の単離収率でアセチレンアルコール５をジアステレオマーの分離不可混合物（５．８ ：１ ）として得た（Ｆｒａｙ， ＫａｙｅおよびＫｌｅｉｎｍａｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６， ５１：４８２８−３３ 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。Ｐｄ／ＢａＳＯ４に通す５の触媒性水素化に続いて、還流でのトルエン中の触媒性量の酢酸を用いた、得られたγヒドロキシエステルの酸触媒ラクトン化は、７３％収率でγラクトン６および７を供給した。
【０１０１】
異性体を、溶出剤としてヘキサン中４０％酢酸エチルを用いることでシリカゲルクロマトグラフィーにより分離した。メチル基のＣ−２ での導入を、メチルヨウ化物を用いる７の立体選択的アルキル化により達成した（スキーム２）。従って、−７８ ℃にて（３０分）テトラヒドロフラン中リチウムヘキサメチルジシラジド（２．２ 当量）を用いるラクトン７のジアニオンの生成および−７８ ℃にて３０分間のメチルヨウ化物（１．１ 当量）でのアルキル化、続いてプロピオン酸（５当量）でのクエンチングは、少量（５％未満）の対応エピマーに加えて所望のアルキル化ラクトン８（７６％収率）を得た（Ｇｈｏｓｈ およびＦｉｄａｎｚｅ 、１９８８ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８， ６３， ６１４６−５４ 、この教示はその全体が本明細書中に援用される）。エピマーｃｉｓ−ラクトンを、溶媒系として酢酸エチルおよびヘキサンの混合物（３：１）を用いてシリカゲルに通すカラムクロマトグラフィーにより除去した。アルキル化ラクトン８の立体化学割り当てを、広範囲１Ｈ−ＮＭＲ ＮＯＥ実験に基づいて作製した。水性水酸化リチウムはラクトン８の加水分解を促進し、続いて、ジメチルホルムアミド中イミダゾールおよびジメチルアミノピリジンの存在下で塩化ｔｅｒｔ− ブチルジメチルシリルを用いるγヒドロキシ基の保護は、酸９を標準的ワークアップ（ｗｏｒｋ−ｕｐ ）およびクロマトグラフィー後９０％収率で得た。ＢＯＣ 基の選択的除去は、１時間０℃にてジクロロメタン中トリフルオロ酢酸を用いる処理によりもたらされた。次いで、得られたアミン塩を、水性ＮａＨＣＯ３の存在下、ジオキサン中で市販の（Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）Ｆｍｏｃ− スクシニミド誘導体と反応させて、Ｆｍｏｃ− 保護Ｌ＊Ａ 同配体１０をクロマトグラフィー後６５％収率で得た。保護同配体１０を無作為配列インヒビターライブラリーの調製に利用した。
【０１０２】
【化２】
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【０１０３】
実験手順
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（化合物２）
１４０ｍＬ のジエチルエーテル中に１０ｇ （７６．２ｍｍｏｌ）のＬ−ロイシンの懸濁液に、８０ｍＬの１０％ＮａＯＨを添加した。全ての固体が溶解した後、２０ｍＬ（８７．１ｍｍｏｌ）のＢＯＣ２Ｏ を反応混合物に添加した。得られた反応混合物を１２時間２３℃にて攪拌した。この期間後、層を分離し、水層を０℃にて１Ｎの水性ＨＣｌ を注意深く添加してｐＨ１ まで酸性化した。得られた混合物を酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ ）。有機層を混合し、鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、さらなる精製なしに次反応に直接使用する表題の産物を得た（収率９７％）。
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【０１０４】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン−Ｎ’−メトキシ−Ｎ’−メチルアミド（ｍｅｔｈｙｌａ−ｍｉｄｅ）（化合物３）
０℃にてＮ２雰囲気下で乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）中塩酸Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミン（５．５２ｇ 、５６．６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、− メチルピペリジン（６．９ｍＬ 、５６．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を３０分間０℃にて攪拌した。別のフラスコに、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（２）（１１．９ｇ 、５１．４ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下でＴＨＦ （４５ｍＬ）とジクロロメタン（１８０ｍＬ ）の混合物中に溶解した。得られた溶液を−２０ ℃まで冷却した。この溶液にｌ−メチルピペリジン（６．９ｍＬ 、５６．６ｍｍｏｌ）、続いてイソブチルクロロ蟻酸（７．３ｍＬ 、５６．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を−２０ ℃にて５分間攪拌し、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミンの上記溶液を添加した。反応混合物を３０分間−２０ ℃で保存し、次いで２３℃に暖めた。この反応を水でクエンチし、層を分離した。水層をジクロロメタンで抽出した（３×１００ｍＬ ）。混合した有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、および鹹水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、表題の化合物３を淡黄色油として得た（１３．８ｇ 、９７％）。
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【０１０５】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナール（ｌｅｕｃｉｎａｌ）（化合物４）
Ｎ２雰囲気下−４０ ℃にて乾燥ジエチルエーテル（６０ｍＬ）中リチウムアルミニウム水素化物（７７０ｍｇ 、２０．３ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液にジエチルエーテル（２０ｍＬ）中Ｎ−ｔｅｒｔ− ブチルオキシカルボニル−Ｌ− ロイシン−Ｎ’−メトキシ−Ｎ’−メチルアミド（５．０５ｇ 、１８．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を３０分間攪拌した。この期間後、この反応を、１０％ＮａＨＳＯ４溶液（３０ｍＬ）でクエンチした。次いで、得られた反応混合物を２３℃に暖め、３０分間その温度にて攪拌した。得られた溶液を濾過し、濾過ケークを２部のジエチルエーテルで洗浄した。混合した有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、鹹水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４ に通して乾燥した。減圧下の溶媒エバポレーションで表題のアルデヒド４（３．４１ｇ ）を淡黄色油として得た。得られたアルデヒドをさらなる精製なしに速やかに使用した。
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【０１０６】
エチル（４Ｓ，５Ｓ）−および（４Ｒ，５Ｓ）−５−［（ｔｅｒｔ− ブトキシカルボニル） アミノ］−４−ヒドロキシ−７− メチルオクト−２− イノエート（化合物５）
Ｎ２雰囲気下０ ℃にて乾燥ＴＨＦ （６０ｍＬ）中ジイソプロピルアミン（１．１ｍＬ 、７．９ｍｍｏｌ ）の攪拌溶液にｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、４．９５ｍＬ、７．９ｍｍｏｌ ）を滴下した。得られた溶液を５分間０℃にて攪拌し、次いで、２３℃に温め、１５分間攪拌した。混合物を−７８ ℃に冷却し、ＴＨＦ （２ｍＬ ）中プロピオール酸エチル（８０１ μＬ ）を５分間にわたって滴下した。混合物を、８ｍＬ の乾燥ＴＨＦ 中Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシナール４（１．５５ｇ 、７．２ｍｍｏｌ ）を添加した後、３０分間攪拌した。得られた混合物を１時間−７８ ℃にて攪拌した。この期間後、反応をＴＨＦ （２０ｍＬ）中酢酸（５ｍＬ ）でクエンチした。反応混合物を２３℃まで暖め、鹹水溶液を添加した。層を分離し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下溶媒のエバポレーションで残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、アセチレンアルコール５の混合物（３：１）を得た（０．９６ｇ 、４２％）。
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【０１０７】
（５Ｓ，１’Ｓ）−５−［１’−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル） アミノ］−３’− メチルブチル］−ジヒドロフラン−２（３Ｈ）− オン（化合物７）
酢酸エチル（２０ｍＬ）中アセチレンアルコール（１．７３ｇ 、５．５ｍｍｏｌ ）の上記混合物の攪拌溶液に、５％Ｐｄ／ＢａＳＯ４（１ｇ）を添加した。生じた混合物を１．５ 時間５０ｐｓｉ で水素化した。この期間後、触媒を、セライトのプラグを介して濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をトルエン（２０ｍＬ）および酢酸（１００ μＬ ）に溶解した。反応混合物を６時間還流した。この期間後、反応を２３℃に冷却し、溶媒をエバポレートして残渣を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（４０％ジエチルエーテル／へキサン）によって精製して、 （５Ｓ，１Ｓ’）−γ− ラクトン７（０．９４ｇ 、６２．８）および（５Ｒ，１Ｓ’）− γ− ラクトン６（０．１６ｇ 、１０．７％）を得た。
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【０１０８】
（３Ｒ，５Ｓ，１’Ｓ）−５−［１’−［（ｔｅｒｔ− ブトキシカルボニル） アミノ］−３’− メチルブチル（ｍｅｔｈｙｌｂｕｔ−ｙｌ）］−３−メチルジヒドロフラン−２（３Ｈ）− オン（化合物８）
Ｎ２雰囲気下−７８ ℃にて乾燥ＴＨＦ （８ｍＬ ）中ラクトン７（４５１．８ｍｇ 、１．６７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３分間にわたってリチウムヘキサメチルジシラザン（３．６７ｍＬ、ＴＨＦ 中１．０Ｍ）を添加した。得られた混合物を３０分間−７８ ℃にて攪拌して、リチウムエノラートを生成した。この期間後、ＭｅＩ （２２８ μＬ ）を滴下して、得られた混合物を２０分間−７８ ℃にて攪拌した。反応を飽和水性ＮＨ４Ｃｌ 溶液でクエンチし、２３℃に暖めた。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ ）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。溶媒のエバポレーションで残渣を得、シリカゲルクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、アモルファス固体としてアルキル化ラクトン８を得た（０．３６ｇ 、７６％）。
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【０１０９】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル） アミノ］−４−［（ｔｅｒｔ− ブチルジメチルシリル） オキシ］−２，７−ジメチルオクタン酸（化合物９）
ＴＨＦ （２ｍＬ ）中ラクトン８（０．３３ｇ 、１．１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、１Ｎ水性ＬｉＯＨ溶液（５．８ｍＬ ）を添加した。得られた混合物を１０時間２３℃にて攪拌した。この期間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残った水性残渣を０℃に冷却し、２５％クエン酸溶液を用いてｐＨ４ に酸性化した。得られた酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×５０ｍＬ）。混合した有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥し、濃縮して白色泡沫として対応するヒドロキシ酸（３３０ｍｇ ）を得た。このヒドロキシ酸をさらなる精製なしに次反応に直接使用した。
【０１１０】
無水ＤＭＦ 中の上記ヒドロキシ酸（３３０ｍｇ 、１．１ｍｍｏｌ ）に、イミダゾール（１．５９ｇ 、２３．３４ｍｍｏｌ ）およびｔｅｒｔ− ブチルジメチルクロロシラン（１．７６ｇ 、１１．６７ｍｍｏｌ ）を添加した。得られた混合物を２４時間２３℃にて攪拌した。この期間後、ＭｅＯＨ（４ｍＬ ）を添加し、混合物を１時間攪拌した。混合物を２５％クエン酸（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×２０ｍＬ）。混合した抽出物を水、鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。溶媒のエバポレーションで粘性油を得、シリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィー（３５％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、シリル保護酸９（０．４４ｇ 、９０％）を得た。
2005500979.tif 000013
【０１１１】
（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［（ フルオレニルメチルオキシカルボニル） アミノ］−４−［（ｔｅｒｔ− ブチルジ− メチルシリル） オキシ］−２，７−ジメチルオクタン酸（化合物１０）
０℃にてジクロロメタン（２ｍＬ ）中酸９（０．１７ｇ 、０．４１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（５００ μＬ ）を添加した。得られた混合物を１時間０℃にて攪拌し、さらなる部（５００ μＬ ）のトリフルオロ酢酸を反応混合物に添加した。混合物をさらに３０分間攪拌し、反応の進行をＴＬＣ によってモニターした。この期間後、溶媒を、５℃を超えないような浴温度にて減圧下で注意深く除去した。残渣を５ｍＬ のＨ２Ｏ 中ジオキサン（３ｍＬ ）およびＮａＨＣＯ３（３００ｍｇ ）に溶解した。この溶液に、５ｍＬ のジオキサン中Ｆｍｏｃ− スクシニミド（１６６．５ｍｇ 、０．４９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を８時間２３℃にて攪拌した。次いで、混合物をＨ２Ｏ （５ｍＬ ）で希釈して、２５％水性クエン酸でｐＨ４ に酸性化した。酸性溶液を酢酸エチルで抽出した（３×５０ｍＬ）。混合した抽出物を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥し、減圧下で濃縮して、粘性油残渣を得た。シリカゲルに通すフラッシュクロマトグラフィーによる残渣の精製で、白色泡沫としてＦｍｏｃ− 保護酸１０（１３７ｍｇ 、６１％）を得た。
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【０１１２】
ＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２の合成を固体状態ペプチド合成手順（Ｌｅｕ＊Ａｌａ が第４工程で組み込まれる）を用いて達成した。合成インヒビターを逆相ＨＰＬＣにより精製し、その構造を質量分光法により確認した。
【０１１３】
実施例４：さらなるインヒビターの設計、合成および分析
ＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２以外の種々の基質アナログを、同様に設計し、合成し得る。例えば、６６個のさらなるインヒビターアナログ（ＭＭＩ−００１ 〜ＭＭＩ−０６２ 、ＭＭＩ−０６５ 、ＭＭＩ−０６６ 、ＭＭＩ−０７０ およびＭＭＩ−０７１ 、これら全てはメマプシン２の活性部位の同配体に似ている）を設計した。さらなる基質アナログの合成はＯＭ９９−１およびＯＭ９９−２の合成に従う。さらなる基質アナログの化学構造を表３に列挙する。種々のインヒビターの一般的合成をスキーム３に概略する。
【０１１４】
【化３】
2005500979.tif 000015
【０１１５】
スキーム３に示すように、標準的なペプチドカップリング手順を用い、バリン誘導体１１を、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２の混合物中、塩酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、トリエチルアミンおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で、ジペプチド同配体９と反応させ、アミド誘導体１２を得た。フッ化テトラブチルアンモニウム含有ＴＨＦでの処理によるシリル保護基の除去により、インヒビター１３（ＭＭＩ−００１）を得た。１３のトリフルオロ酢酸含有ＣＨ２Ｃｌ２への曝露は、ＢＯＣ基の除去をもたらした。得られたアミンのＢＯＣ−アスパラギンとのカップリングによりインヒビター１４（ＭＭＩ−０１１）を得た。標準条件下での１４のトリフルオロ酢酸での処理、および得られたアミンのＢＯＣ−バリンとのカップリングによりインヒビター１６（ＭＭＩ−０１２）を得た。インヒビターＭＭＩ−１５の合成のため、化合物１３をトリフルオロ酢酸と反応させ、得られたアミンをＢＯＣ−メチオニンとカップリングさせて、インヒビター１５（ＭＭＩ−０１５）を得た。１６のＢＯＣ基の除去および得られたアミンのＢＯＣ−バリンとのカップリングによりインヒビター１７（ＭＭＩ−０１７）を得た。
【０１１６】
インヒビターＭＭＩ−００１、ＭＭＩ−０１１、ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１５およびＭＭＩ−１７の調製：
バリン誘導体（化合物１１）の調製：Ｎ−Ｂｏｃバリン（５００ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）およびベンジルアミン（０．５０ｍＬ、４．６０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＨＯＢｔ（３７３ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５２９ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍＬ、１３．８０ｍｍｏｌ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。得られた混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、４４２ｍｇ（６３％）のカップリング生成物を得た。得られたアミンをＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した。次いで、ＴＦＡ（４ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を０．５時間撹拌し、減圧下で濃縮した。アミン１１が定量可能な収率で得られた。
2005500979.tif 000016
【０１１７】
アミド誘導体（化合物１２）の調製：ジペプチド同配体９（４１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびアミン１１（４１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．０ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、５５ｍｄ（９５％）のアミド１２を得た。
2005500979.tif 000017
【０１１８】
インヒビターＭＭＩ−００１（化合物１３）の調製：アミド１２（６１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１．０ｍＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ：０．３ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を２３℃で添加し、一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、ＭＭＩ−００１（１３、４１ｍｇ、８３％）を得た。
2005500979.tif 000018
【０１１９】
インヒビターＭＭＩ−０１１（化合物１４）の調製：１３（４４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−アスパラギン（４１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（３４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製し、１２．５ｍｇ（２３％）のＭＭＩ−０１１（１４）を得た。
2005500979.tif 000019
【０１２０】
インヒビターＭＭＩ−０１５（化合物１５）の調製：化合物１３（６４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（１ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−メチオニン（６５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３５ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、３７．２ｍｇ（４６％）のＭＭＩ−０１５（１５）を得た。
2005500979.tif 000020
【０１２１】
インヒビターＭＭＩ−０１２（化合物１６）の調製：１３（８．４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．２ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−バリン（６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．８ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（５．３ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．１ｍｇ（２１％）のインヒビターＭＭＩ−０１２（１６）を得た。
2005500979.tif 000021
【０１２２】
インヒビターＭＭＩ−１０７（化合物１７）の調製：１５（１４．５ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を２３℃で添加した。０．５時間後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−バリン（１０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６．２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（８．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、ならびにジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ）を逐次０℃で添加した。添加後、反応混合物を２３℃まで加温し、一晩撹拌した。混合物をｓａｔ．ＮａＨＣＯ３（ａｑ）に注入した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４に通して乾燥した。減圧下での溶媒のエバポレーションにより残渣を得、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製し、５．５ｍｇ（３３％）のＭＭＩ−０１７（１７）を得た。Ｒｆ＝（１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。
2005500979.tif 000022
【０１２３】
同配体の酵素活性を上述のようにして測定したが、ＯＭ９９−１、ＯＭ９９−２、またはＭＭＩ−００１〜ＭＭＩ−０６２、ＭＭＩ−０６５、ＭＭＩ−０６６、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１のうちの１つのいずれかを添加した。ＯＭ９９−１は組換えメマプシンを、３×１０−８Ｍと計算されたＫｉで阻害した。使用した基質は、合成の蛍光生成（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）ペプチド基質であった。ＯＭ９９−２の組換えメマプシン２に対する阻害を、同じ蛍光生成基質を用いて測定した。Ｋｉ値は、９．５８×１０−９Ｍと測定された。
【０１２４】
Ｐ１およびＰ１’における残基は、Ｍ２インヒビターが血液脳関門（ＢＢＢ）を透過しなければならないので、非常に重要である。Ｐ１’におけるＡｌａの選択は、ＢＢＢの透過を容易にする。Ａｌａ側鎖のアナログもまた、有効である。例えば、Ａｌａのメチル側鎖に加えて、置換メチル基、およびメチルまたはエチル基とほぼ同じ大きさの基で、Ａｌａ側鎖を置換しうる。Ｐ１におけるＬｅｕもまた、同様の大きさの基またはＬｅｕ側鎖上に置換を有する基で置換されうる。ＢＢＢを透過させるため、インヒビターを小さくすることが望ましい。したがって、ＯＭ９９−１を開始点として使用し、外側サブサイト（ｓｕｂｓｉｔｅ）Ｐ４、Ｐ３、Ｐ３’およびＰ４’を廃棄することができる。次いで、同様にＢＢＢを透過しうる強固結合性Ｍ２インヒビターを置換することにより、保持された構造Ａｓｎ−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ａｌａをさらに発展させる。
【０１２５】
他の基質アナログ、ＭＭＩ−００１〜ＭＭＩ−０７１もまた、酵素阻害について試験した。例えば、ＭＭＩ−０１７、ＭＭＩ−０７０およびＭＭＩ−０７１のＫｉ値は、ＯＭ９９−２の値と同等であり、これらもまた、良好なメマプシンインヒビターであることを示す。ＭＭＩ−０１２、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２６、またはＭＭＩ−０６６のＫｉ値は、ＯＭ９９−２の値より約１等級（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）高く、これらが、メマプシン阻害の有能な候補成分であることを示す。さらなる基質アナログのそれぞれのＫｉ値およびその対応する化学構造を表３に列挙する。
【０１２６】
【表３】
2005500979.tif 000023
2005500979.tif 000024
2005500979.tif 000025
2005500979.tif 000026
【０１２７】
実施例５．メマプシン２（β−セクレターゼ）のサブサイト特異性
ＯＭ９９−２で得られた結果は、８個すべてのサブサイトをＯＭ９９−２で誘発することにより、高度阻害力（ｐｏｔｅｎｃｙ）（Ｋｉ＝１．６ｎＭ）が達成されうること示す。しかしながら、血液脳関門を透過して脳に達するためには、臨床的に有用なメマプシン２インヒビターは小さく（すなわち、典型的には、５００〜７００ダルトン未満で）なければならない。メマプシン２のサブサイト特異性に関する詳細な情報は、小さいが強固結合性のインヒビターの設計のための良好な理解を提供しうる。メマプシン２の完全なサブサイト優先を、基質動力学およびランダム配列インヒビターライブラリーのプロービングの両方の結果に基づいて決定した。
【０１２８】
実験手順
規定の基質混合物の設計
上述のＡＰＰおよびメマプシン２インヒビターＯＭ９９−２におけるβ−セクレターゼ切断部位由来の、鋳型配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号：２２）における８個の位置のそれぞれをプロービングするためのペプチド混合物を合成した。各位置の特性付けのため、７個のアミノ酸誘導体の等モル混合物を、固相合成（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）の適切なサイクルにおいて添加し、１つの位置で７個のアミノ酸のうち１個が異なる７個のペプチドの混合物を生じた。基質および加水分解産物の迅速定量を容易にするため、ハイ・スループットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用した。したがって、いくつかのアミノ酸の質量が同一（これは、その同定を妨げる）であるので、単一の混合物において、すべての共通のアミノ酸側鎖（全部で１９、システインを除く）を置換することは可能でなかった。したがって、異なるアミノ酸置換を、その質量における差を最大にするように３つの群（表４および５）に分け、各サブサイトにおける１９の異なるアミノ酸（システイン以外（ｌｅｓｓ ｃｙｓｔｅｉｎｅ））の完全な組を、１つの位置に各アミノ酸を組み込むようにペプチドが合成された３つの基質混合物に含有した。相対的ｋｃａｔ／Ｋｍの計算のため、混合物間の定量的情報に関連づける目的で、標準的なペプチドを各群に含めた。既知のｋｃａｔ／Ｋｍ値の基質を相対初期速度の正規化および他の基質のｋｃａｔ／Ｋｍ値の計算ための内部標準として利用する。Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’位について、鋳型配列をＣ末端で４残基伸長し（鋳型ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ、配列番号：２３、表４）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるその検出を容易にした。４個のさらなる残基を同様に鋳型のＮ−末端に付加し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４位の特異性を特性付けした（鋳型ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ、配列番号：２４、表５）。
【０１２９】
【表４】
2005500979.tif 000027
【０１３０】
【表５】
2005500979.tif 000028
【０１３１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる初期速度の測定
基質混合物を２ｍｇ／ｍｌで１０％氷酢酸に溶解し、適切な濃度のＮａＯＨ中に希釈し、ｐＨ４．１の酢酸ナトリウム中でμＭ範囲の基質混合物を得た。アリコートを２５℃で平衡化し、メマプシン２のアリコートの添加により反応を開始した。ある時間毎にアリコート（１０μｌ）を取り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（α−ヒドロキシ桂皮酸含有アセトン、２０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、直ちに、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩＩ試料プレート上に２連でスポットした。キャンパス内のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＣｅｎｔｅｒでＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ 装置を用い、１５０ｎｓｅｃ遅延での正モードの２０，０００ボルト加速で作動させたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置を用いることにより試料を解析に供した。質量対電荷比（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｉｏ）（ｍ／ｚ）を有するイオンを４００〜２０００ａｍｕ（原子質量単位）の範囲で検出した。Ｖｏｙａｇｅｒ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ モジュールによりデータを解析し、目的の質量種のイオン強度データを得た。
【０１３２】
ランダム配列インヒビターライブラリー
ランダム配列インヒビターライブラリーは、４個のサブサイト、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ２’およびＰ３’位でのランダムアミノ酸（システイン以外）を有するＯＭ９９−２の配列に基づくものであった。Ｐ１およびＰ１’位を固定するために、合成で二同配体（ｄｉｉｓｏｓｔｅｒｅ）Ｌｅｕ＊Ａｌａ（＊はヒドロキシエチレン遷移状態同配体を表す）を用いた。ペプチドを、固体状態ペプチド合成法により合成し、樹脂ビーズを付着したままにしておいた。「スプリット合成（ｓｐｌｉｔ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」手順（Ｌａｍら、１９９１）を用いることにより、樹脂ビーズのそれぞれは、たった１つの配列を含んだが、該配列はビーズにより異なった。全ライブラリー配列は：
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ここで、Ｘｘｎ残基（ここで、ｎは１，２，３または４のいずれかである）は、１９個のアミノ酸を用いて各位置でランダム化される、
であった。Ｐ２’から始まる、より短い形態のペプチド
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はまた、より長い配列に対して約７：３の比で、各ビーズに存在した。同配体が無い場合、短配列は有意な強度でメマプシン２に結合しないが、その存在は、自動Ｅｄｍａｎ分解による残基の同定にとって都合がよかった。ランダム化位置から同定された残基は以下のとおりである。
【０１３３】
Ｅｄｍａｎサイクル番号      １      ２      ３      ４
配列１、長配列由来：      Ｇｌｙ  Ｘｘ１  Ｘｘ２  Ｌｅｕ
配列２、短配列由来：      Ｘｘ３  Ｘｘ４  Ｐｈｅ  Ａｒｇ
【０１３４】
Ｘｘ３およびＸｘ２割当ては、それぞれ、サイクル１および３で唯一の未知残基であるので、あいまいさはなかった。アミノ酸Ｘｘ１およびＸｘ４を、その相対量により割当てた。メチオニンの存在により、ＣＮＢｒ切断を可能にし、その後、ＭＳ／ＭＳによりペプチドを同定する。
【０１３５】
ランダム配列ライブラリーのプロービング
１．１ｍｌの固定ビーズに含まれると推定される、ライブラリーの１コピーに相当する、約１３０，０００の個々のビーズを、バッファーＡ（５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４Ｍ尿素、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ３．５；５ミクロンフィルターで濾過）中で水和した。ビーズを３％ＢＳＡ含有バッファーＡ中に１時間浸漬し、非特異的結合をブロックし、同じバッファーで２回リンスした。組換えメマプシン２をバッファーＡ中で４ｎＭに希釈し、ライブラリーとともに１時間インキュベートした。１回のストリンジェンシー洗浄を行い、このとき、６．７μＭ遷移状態同配体インヒビターＯＭ９９−２をバッファーＢ（５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０２％アジ化Ｎａ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ５．５；５ミクロンフィルターで濾過）中に含んでいた。その後、さらにＯＭ９９−２を含まないバッファーＢで２回洗浄した。組換えメマプシン２に対して特異的な親和性精製ＩｇＧをバッファーＢ中で１００倍に希釈し、ライブラリーとともに３０分インキュベートした。バッファーＢで３回洗浄した後、親和性精製抗ヤギアルカリホスファターゼコンジュゲートをバッファーＢ中で希釈（１：２００）し、３０分間インキュベートし、続いて３回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）の錠剤１つを１０ｍｌの水に溶解し、１ｍｌをビーズに塗布し、１時間インキュベートした。ビーズを０．０２％アジ化ナトリウム含有水に再懸濁し、解剖顕微鏡下で検査した。ぼんやりと染色されたビーズを視覚によりランク付けし、個々に単離し、８Ｍ尿素中に２４時間ストリップ（ｓｔｒｉｐ）し、ＤＭＦ中で汚れを除いた。キャンパス内のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ にて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｅｒ において、ビーズの配列決定を行ない、逆相ＨＰＬＣを用いてＰＴＨ−アミノ酸を定量した。
【０１３６】
動力学パラメータの測定
単一のペプチドを用いた動力学パラメータ、Ｋｍおよびｋｃａｔならびに遊離インヒビターに対するＫｉを、上述のようにして測定した。
【０１３７】
メマプシン２に結合するＯＭ００−３のモデル構築
メマプシン２との複合体におけるＯＭ９９−２の結晶構造を、初期モデルとして使用した。対応するサブサイト残基を、ＯＭ００−３のものと置換した。側鎖コンホメーションを、非結合相互作用による結合ポケット内への最も良好な適合についてロトマー（ｒｏｔｏｍｅｒ）ライブラリーから視覚的に選択した。次いで、ＥｎｇｈおよびＨｕｂｅｒエネルギーパラメータ（Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ａ４７， ３９２−４００ （１９９１）のＥｎｇｈ， Ｒ．Ａ． およびＨｕｂｅｒ 「Ａｃｃｕｒａｔｅ ｂｏｎｄ ａｎｄ ａｎｇｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ」）を用いるＣＮＳプログラムにより、エネルギー最小化を行った。該最小化プロセス中、Ｃα原子およびインヒビターから５オングストロームを超えた距離を有する該原子を調和拘束（ｈａｒｍｏｎｉｃ ｒｅｓｔｒａｉｎｓ）に供した。
【０１３８】
結果
メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先の測定
メマプシン２の基質裂溝は、結晶構造において示されるような側鎖に対して、８個のサブサイトを適応する。メマプシン２のすべてのサブサイトに対する古典的な酵素動力学により解析された側鎖優先の完全な組は、これまでに、広域特異性を有するいずれのアスパラギン酸プロテアーゼについても達成されていない単調で退屈な作業である、１６０対の個々のｋｃａｔおよびＫｍ値の測定を必要とする。しかしながら、サブサイト優先は、相対的触媒効率、異なる側鎖を有する基質のｋｃａｔ／Ｋｍ値により規定され、これは、基質の規定混合物の相対的初期加水分解速度から測定されうる（Ｆｅｒｓｈｔ， Ａ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， 第２版， Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８５）、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。この方法を、他のアスパラギン酸プロテアーゼの特異性を解析するために良好に使用している（Ｋａｓｓｅｌら、１９９５； Ｋｏｅｌｓｃｈら、２０００、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。速度の測定を、生成物および基質の相対量の定量のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度の使用によりさらに簡素化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度を、血漿および細胞培養物由来の化合物を定量するため（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７４：９０−９７ （１９９９）のＳｕｇｉｙａｍａら、「Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｓｕｌｆａｔｉｄｅ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｄｅｌａｙｅｄ ｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」； Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ６９：３７６７−７１ （１９９７）のＷｕら、「Ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ」、そのすべての教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）、および細胞培養物由来のＡβ４０およびＡβ４２の相対量を測定するため（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ． １９：１８９−２１５ （１９９０）のＤａｖｉｅｓら、「Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅｕｎａｓｅｓ」、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）に適切に使用されている。本方法に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの利点としては、その感度およびデータの迅速な獲得が挙げられる。良好な相間関係を生じた、生成物および基質の混合物に関するイオン強度データの直線性は、混合物中における各基質と一致し、補正係数を必要としなかった。続いて、この方法を用いて、各混合物中の各ペプチドに関する加水分解の初期速度を測定した。これらの初期速度の比率は、その相対的触媒効率ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｆｅｒｓｈｔ， １９８５）に正比例する。
【０１３９】
基質の８個のサブサイト位置に関するメマプシン２の相対的触媒効率を図５に示す。これらの結果は、メマプシン２の８個のサブサイトのいずれも絶対的にストリンジェントでないという以前の観察を確認するものである。Ｐ側およびＰ’側の両方において、中心サブサイト（Ｐ１およびＰ１’）は、外側サブサイト（Ｐ４およびＰ４’）よりもストリンジェントであった。これは、好ましくない残基（バックグラウンド）の加水分解効率を好ましい残基と比較する場合に明白である。ストリンジェンシーの欠如は、Ｐ’側の４個のサブサイト、特に、バックグラウンドが相対的に高いＰ３’およびＰ４’についてより顕著である。これらの２個のサブサイトの不十分なストリンジェンシーは、ＯＭ９９−２のＰ３’およびＰ４’側鎖が、結晶構造内の酵素と有意に相互作用しないという観察に一致する。
【０１４０】
サブサイトＰ４は、ＧｌｎよりもＧｌｕを好むが、次にＧｌｎはＡｓｐよりも好まれる。ＯＭ９９−２のＰ４−Ｇｌｕは、複数の相互作用でＳ４ポケット内に良好に適合する。Ｐ４−ＧｌｕのＧｌｎとの置換による触媒効率の低下は、Ｐ４側鎖のＡｒｇ２３５およびＡｒｇ３０７との電荷相互作用の損失によるものでありうる。Ｐ４−ＧｌｕのＡｓｐとの置換による触媒効率のさらなる低下は、Ｐ２−Ａｓｐへの水素結合の非存在によるものであろう。サブサイトＰ３では、ＯＭ９９−２の場合、ＶａｌよりもＩｌｅが好ましい。これは、Ｓ３疎水性ポケットにおけるより良好な適合によるものである。
【０１４１】
コンビナトリアルライブラリーで測定されたインヒビター側鎖優先
インヒビター結合に対するサブサイト優先も研究した。ビーズ上に固定した約１．３×１０５の異なるインヒビターのコンビナトリアルライブラリーを合成し、メマプシン２でプロービングした。ライブラリーの塩基配列をＯＭ９９−２、ＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ（配列番号：６９）（＊は同配体ヒドロキシエチレンを表す）から採用し、ここで、サブサイトＰ３、Ｐ２、Ｐ２’およびＰ３’（太字）をシステインを除くすべてのアミノ酸についてランダム化した。Ｐ１およびＰ１’を、ライブラリー合成におけるＬ＊Ａの使用のため一定に維持した。Ｐ４およびＰ４’は、ライブリーサイズを操作可能に維持するためにランダム化しなかった。また、それらの外側サブサイトに関する情報は、より小さいインヒビターの設計のためにはあまり重要でない。尿素溶液で洗浄することにより、ライブラリーに対するメマプシン２の結合選択性を増強させた後、ビーズ上に結合したメマプシン２を、メマプシン２に対して惹起した抗体およびアルカリホスファターゼ複合二次抗体により検出した。光学顕微鏡下で観察すると、約１３０，０００個のビーズの約６５個が強く染色されていた。自動Ｅｄｍａｎシークエンシングにより、１０個の最も強く染色されたビーズ由来のインヒビター配列を決定した（表２）。４つのランダム化位置での明白な共通点（太字）がＥＬＤＬＡＶＥＦ（配列番号：７０）であると観察された。陽性ビーズにおける明白な共通点および陰性ビーズにおける共通点の欠如（表２）は、メマプシン２がライブラリー内の好ましい配列に結合した、という論点を裏付ける。また、共通のインヒビター配列は、基質研究から得られた結果と充分に一致する。共通配列ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ（配列番号：７１）を有するインヒビターＯＭ００−３を、上述の方法を用いて合成した。このインヒビターのＫｉは、０．３１ｎＭであることが示され、ＯＭ９９−２のＫｉのほぼ５倍低かった。
【０１４２】
【表２】
2005500979.tif 000031
【０１４３】
メマプシン２の活性部位におけるＯＭ００−３の結合
ＯＭ９９−２の結晶構造とＯＭ２０００−１の分子モデルとの比較は、後者のメマプシン２に対する改良されたインヒビター結合を明らかにする。ＯＭ９９−２と比較すると、ＯＭ００−３のＰ３およびＰ２’サブサイトにおける側鎖の疎水性が大きいほど、改良されたファンデルワールス相互作用によって、酵素サブサイトにより良好に適応する。これらの中には６個の重要な新しい相互作用：インヒビターのＰ３−Ｌｅｗと酵素のＬｅｗおよびＧｌｙ、ならびにＰ２’−ＶａｌとＶａｌ、Ｔｙｒ、ＩｌｅおよびＴｙｒがある。また、モデルは、Ｐ２位置でのＡｓｐによるＡｓｎの置換が、Ｐ２−Ａｓｐの側鎖原子ＣＤ１およびＣＤ２と、Ａｒｇ−２３５のＮＥおよびＮＨ１のものとの間に３つの新しい塩橋を導入することを示す。これらの塩架橋の原子間距離は、それぞれ３．６、３．４および３．５オングストロームである。これらの電荷相互作用は、結合自由エネルギー（ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ）を、ＯＭ９９−２内のＰ２−Ａｓｐのものよりも高くするはずである。２つのインヒビターの結合間で観察されたこれらの構造の違いは、ＯＭ９９−２からＯＭ００−３へのＫｉ値における４．５倍の低下と一致する。
【０１４４】
ＡＤの臨床治療に有用であるためには、メマプシン２インヒビターは、血液脳関門を透過しなければならず、それゆえ、大きさが小さくなければならない（＜７００ダルトン）。ＯＭ００−３などの８残基インヒビターは９１７ダルトンである。より小さいインヒビターは、より少ないサブサイト、おそらく、わずか４か５個にわたるサブサイトを用いて設計することができる。サブサイト優先に関する本明細書に記載の情報ならびにサブサイトの三次元構造に関する情報を、これらのインヒビターの設計に使用することができる。
【０１４５】
実施例６：インヒビターを設計するための結晶構造の使用
薬学的に許容され得るインヒビター薬物は、通常、８００ダルトン未満である。メマプシン２インヒビターの場合、この要件は、血液脳を透過する薬物である必要性により、さらにより厳密でありうる。現在のモデルにおいて、Ｐ４からＰ２’における充分に規定されたサブサイト構造は、かかる薬物の合理的な設計のための充分な鋳型領域を提供する。この結晶構造において明らかにされたような個々のインヒビター側鎖と酵素の対応するサブサイトとの特別な関係は、これらの位置のそれぞれにおける新しいインヒビター構造の設計を可能にする。また、サブサイトＰ２’、Ｐ３’およびＰ４’の特有のコンホメーションをメマプシン２インヒビターの選択性に組み込むことも可能である。現在の結晶構造に基づくインヒビター設計の例を以下に示す。
【０１４６】
実施例Ａ：Ｐ３  ＶａｌおよびＰ１  Ｌｅｕの側鎖は互いに対して束ねられ、これらの間には酵素構造が存在しないので、これらの側鎖を架橋すると、メマプシン２に対するインヒビターの結合強度が増大する。これは、酵素に結合すると、架橋インヒビターが、その非架橋対照物よりも遊離形態と結合形態との間で小さなエントロピー差を有するためである（Ｋｈａｎ， Ａ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７： １６８３９ （１９９８）、その教示はそのまま本発明細書に取り込まれる）。架橋側鎖の可能な構造としては、図１に示すものが挙げられる。
【０１４７】
実施例Ｂ：同じ状況がＰ４  ＧｌｕとＰ２  Ａｓｎとの間にも存在する。現在の結晶構造は、これらの側鎖がすでに互いに水素結合されているため、これらの間の架橋がまたＡに記載のような結合の利点を誘導することを示す。架橋構造としては、図２に示すものが挙げられる。
【０１４８】
実施例Ｃ：現在の結晶構造に基づいて、Ｐ１’  Ａｌａ側鎖を伸長して、新しい疎水性のファンデルワールス力およびＨ−結合相互作用を付加しうる。かかる設計の例を図３に図示する。
【０１４９】
実施例Ｄ：現在の結晶構造に基づいて、２つの原子を付加することにより、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３の領域におけるポリペプチド骨格、ならびにＰ１−Ｌｅｕの側鎖を環に架橋することができる（図４のＡおよびＢ）。また、Ｐ１−Ｌｅｕのβ−炭素にメチル基を付加することができる（図４）。
【０１５０】
本明細書に記載した方法および材料の修正および変形は当業者に自明であり、添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１５１】
発明をその好ましい態様に関して具体的に示し記載したが、当業者は、添付の請求の範囲により包含される本発明の範囲を逸脱することなく本明細書において形態および詳細の種々の変更を行いうることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、メマプシン２のインヒビター模式図である。「Ａ」および「Ｂ」は、位置Ｐ１およびＰ３における側鎖間（例えば、これらのそれぞれの位置のアミノ酸側鎖Ｐ１ＬｅｕおよびＰ３Ｖａｌ）の、任意の数の炭素の脂肪族結合（飽和または部分的に不飽和）を表す。前記インヒビターの他の構造的要素は明解さのために省略する。
【図２】
図２は、メマプシン２のインヒビターの模式図である。「Ａ」は、位置Ｐ２およびＰ４における側鎖間の（例えば、アミノ酸側鎖Ｐ２ＡｓｎおよびＰ４Ｇｌｕ）の任意の数の脂肪族結合（飽和または部分的に不飽和）、を表す。インヒビターの他の構造的要素は明解さのために省略する。
【図３】
図３は、現在の結晶構造に基づく、新規メマプシン２インヒビターのＰ１’サブサイトでの側鎖に関する設計の模式図である。矢印は、メマプシン２とインヒビターとの間の考えられうる相互作用を示す。インヒビターの他の構造的要素は明確さのために省略する。
【図４】
図４は、メマプシン２のインヒビターの模式図である。「Ａ」および「Ｂ」は、位置Ｐ１の側鎖（例えば、この位置のアミノ酸側鎖Ｐ１Ｌｅｕ）とＰ３の骨格原子との間の、任意の数の炭素の脂肪族結合（飽和または部分的に不飽和）を表す。インヒビターの他の構造的エレメントは明確さのために省略する。
【図５】
図５は、位置Ｐ１’〜Ｐ４’のアミノ酸残基についてのメマプシン２の相対特異性を示す。バーの上の文字は、その位置での天然のアミノ酸を示す。触媒効率は、各位置での天然のアミノ酸と比べて表現される。
【図６】
ヒトメマプシン２（配列番号：１）のヌクレオチド配列を示す。
【図７】
図７Ａおよび７Ｂは、シグナルペプチドを除くヒトメマプシン２の部分的タンパク質配列を示す（配列番号：２）。アミノ酸２８〜４８はレムナント推定ペプチド残基である。アミノ酸５８〜６１、７８、８０、８２〜８３、１１６、１１８〜１２１、１５６、１６６、１７４、２４６、２７４、２７６、２７８〜２８１、２８３、および３７６〜３７７は、ＯＭ９９−２インヒビターと接触する残基である。アミノ酸５４〜５７、６１〜６８、７３〜８０、８６〜８９、１０９〜１１１、１１３〜１１８、１２３〜１３４、１４３〜１５４、１６５〜１６８、１９８〜２０２、および２２０〜２２４はＮ−ローブ（ｌｏｂｅ）β鎖である。アミノ酸１８４〜１９１および２１０〜２１７はＮ−ローブヘリックスである。アミノ酸２３７〜２４０、２４７〜２４９、２５１〜２５６、２５９〜２６０、２７３〜２７５、２８２〜２８５、３１６〜３１８、３３１〜３３６、３４２〜３４８、３５４〜３５７、３６６〜３７０、３７２〜３７５、３８０〜３８３、３９０〜３９５、４００〜４０５、および４１８〜４２０は、Ｃ−ローブβ鎖である。アミノ酸２８６〜２９９、３０７〜３１０、３５０〜３５３、３８４〜３８７、および４２７〜４３１はＣ−ローブヘリックスである。
【図８】
図８Ａおよび８Ｂは、ヒトプロメマプシン２のタンパク質配列を表す（配列番号：３）。アミノ酸１〜１５は、ベクター由来残基である。アミノ酸１６〜６３は推定プロペプチドである。アミノ酸１〜１３はＴ７プロモーターに由来する。アミノ酸１６〜４５６はプロ−メマプシン２−Ｔ１である。アミノ酸１６〜４２１はプロメマプシン２−Ｔ２である。
【図９】
図９は、ヒトプレ−プロメマプシン２のアミノ酸配列を示す（配列番号；４）。アミノ酸１〜１３はシグナルペプチドである。アミノ酸４１〜４５４は、図７Ａおよび７Ｂのアミノ酸２８〜４４１、ならびに図８Ａおよび８Ｂのアミノ酸４３〜４５６に対応する。活性部位アスパラギン酸は、アミノ酸位９３および２８９にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005500979.tif 000118
2005500979.tif 000119
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