(57)【要約】  本出願は、骨関節症の治療法を指図しており、タンパク質のトランスフォーミング増殖因子メンバーを取得すること、遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞集団または遺伝子をコード化するいかなるベクターを含まない培養結合組織細胞集団を取得すること、次いで、そのタンパク質および結合組織細胞を、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペース内に移入させ、その結果、関節スペース内における混合作用によって、結合組織が再生されることを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む骨関節症の治療方法。
a) タンパク質のトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーを生成または取得すること、
b) 遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞群、または遺伝子をコード化するいかなるベクターも含まない培養結合組織細胞群を生成または取得すること、
c) ステップ a) のタンパク質およびステップb)の結合組織細胞を薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、関節スペース中の混合作用によって、結合組織が再生させること
【請求項２】
結合組織細胞がウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結合組織細胞が軟骨細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
軟骨細胞が同種異系または自己由来細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トランスフォーミング増殖因子（TGF）スーパーファミリーメンバーが、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7またはBMP-9である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
以下を含む硝子軟骨の再生方法。
a) タンパク質のトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのメンバーを生成または取得すること、 
b) 遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞集団、または遺伝子をコード化するいかなるベクターを含まない培養結合組織細胞集団を生成または取得すること、 
c) ステップa)のタンパク質およびステップb)の結合組織細胞を薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、関節スペース中の混合作用によって、結合組織が再生させること
【請求項９】
結合組織細胞がウイルスベクターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
結合組織細胞が軟骨細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
軟骨細胞が同種異系または自己由来細胞である、請求項１２に記載の方法。 
【請求項１４】
トランスフォーミング増殖因子（TGF）スーパーファミリーメンバーが、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7またはBMP-9である、請求項８に記載の方法。 
【請求項１５】
以下を含む硝子軟骨の再生方法。
a) 機能を発揮するようにプロモーターに連結している、トランフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーのタンパク質をコード化するDNA配列を含んだ、組み換えウイルスまたはプラスミドベクターを生成すること、 
b) 前記組み換えベクターで培養同種異系軟骨細胞集団をin vitro で形質移入し、その結果、形質移入された同種異系軟骨細胞集団を生成すること、 
c) 前記形質移入同種異系軟骨細胞を、薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、前記関節スペース内で前記DNA 配列が発現し、硝子軟骨が再生されること 
【請求項１６】
トランスフォーミング増殖因子（TGF）スーパーファミリーメンバーが、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7またはBMP-9である、請求項15に記載の方法。 
【請求項１７】
以下を含む骨関節症の治療方法。
a) 機能を発揮するようにプロモーターに連結している、トランフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーのタンパク質をコード化するDNA配列を含んだ、組み換えウイルスまたはプラスミドベクターを生成すること、 
b) 前記組み換えベクターで培養同種異系軟骨細胞集団をin vitro で形質移入し、その結果、形質移入された同種異系軟骨細胞集団を生成すること、 
c) 前記形質移入同種異系軟骨細胞を、薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、前記関節スペース内で前記DNA 配列が発現し、硝子軟骨が再生されること 
【請求項１８】
トランスフォーミング増殖因子（TGF）スーパーファミリーメンバーが、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7またはBMP-9である、請求項17に記載の方法。 
【請求項１９】
以下を含む関節中の結合組織外傷の治療方法。
a) タンパク質のトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのメンバーを生成または取得すること、 
b) 遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞集団、または遺伝子をコード化するいかなるベクターを含まない培養結合組織細胞集団を生成または取得すること、 
c) ステップa)のタンパク質およびステップb)の結合組織細胞を薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、関節スペース中の混合作用によって、結合組織が再生させること
【請求項２０】
以下を含む関節中の結合組織外傷の治療方法。
a) 機能を発揮するようにプロモーターに連結している、トランフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーのタンパク質をコード化するDNA配列を含んだ、組み換えウイルスまたはプラスミドベクターを生成すること、 
b) 前記組み換えベクターで培養同種異系軟骨細胞集団をin vitro で形質移入し、その結果、形質移入された同種異系軟骨細胞集団を生成すること、 
c) 前記形質移入同種異系軟骨細胞を、薬剤として利用可能なキャリアを用いて、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに関節内注入させ、その結果、前記関節スペース内で前記DNA 配列が発現し、硝子軟骨が再生されること 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物ホスト内の結合組織の再生に適用するために、トランスフォーミング増殖因子β スーバーファミリーのメンバーをコード化する少なくとも1つの遺伝子を、少なくとも1つの哺乳動物の結合組織内に導入する方法に関連している。本発明はまた、哺乳動物ホスト内の結合組織の再生に適用するために、トランスフォーミング増殖因子β スーバーファミリーの遺伝子生成物の少なくとも1つのを、少なくとも1つの哺乳動物の結合組織細胞に導入する方法にも関連している。本発明は、トランスフォーミングβスーバーファミリーメンバーをコード化する遺伝子を含む、さらにDNAベクター分子を宿す結合組織細胞株にも関連している。
【背景技術】
【０００２】
整形外科領域において、関節炎または変形性関節炎は、スポーツ活動への参加による外傷と共に、最も頻繁に起こる軟骨損傷に関連する状態である。骨関節炎の場合、膝、腰、肩、また手首も含め、身体の殆どすべての関節が影響を受ける。この疾患の病因は、硝子関節軟骨の変形（退化）である（Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982）。この関節の硝子軟骨は、変形し、繊維化し、最終的に掘削状態となる。仮に変形（退化）軟骨がどうにかして再生できたとしても、殆どの患者には体を衰弱させる痛みが常にあり、生活を楽しむことはできないであろう。損傷した硝子軟骨を再生する方法は現在までに、報告されていない。
【０００３】
ドラッグデリバリーの従来の経路、つまり経口、静注または筋注投与などは、関節に薬物を送達するには非効率的である。一般的に関節内に注入された薬物の半減期は短い。関節内薬物注入の別な欠点は、関節炎のような慢性状態の治療には、満足する薬物濃度を得るために、関節域に頻繁に関節注入を反復する必要がある。従来の治療薬は、選択的に関節を標的とすることができなかったため、関節内部に治療用量を維持させるには、哺乳動物ホストの全身に高濃度薬物を暴露する必要があった。この方法による非標的臓器への暴露は、抗関節炎薬の使用を深刻化させ、重篤な副作用、つまり哺乳動物ホストに胃腸障害、血液、心血管、肝腎系への障害などを与えている。
【０００４】
整形外科領域で、一部のサイトカインは整形外科疾患の治療候補薬として考えられてきた。骨形態形成タンパク質は、骨形成の有効な刺激物質であることが考えられており（Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in Ortho, 101-107, 1994）、TGF-β は、骨生成および軟骨生成の刺激物質として報告されている（Joyce et al., J Cell Biology, 110:2195-2207, 1990）。
【０００５】
トランスフォーミング増殖因子-β (TGF-β) は、多機能サイトカインであると考えられており（Sporn and Roberts, Nature (London), 332: 217-219, 1988）、細胞成長、分化および細胞外マトリックスのタンパク質合成を調節する役割を演じている（Madri et al., J Cell Biology, 106: 1375-1384, 1988）。TGF-β は、in vitro での上皮細胞および破骨様細胞の成長を抑制するが（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 5683-5687, 1988）、軟骨内骨化を刺激し、最終的にin vivo での骨形成を促進する（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993; and Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220, 1994）。TGF-βによって誘発される骨形成は、骨膜下多能性細胞の刺激に仲介され、最終的に軟骨形成細胞に分化する（Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990; and Miettinen et al., J Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994）。
【０００６】
整形外科において、TGF-β の生体への作用が報告されている（Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37:573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107:1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5):553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8:215-220, 1994）。マウス胚の染色によって、TGF-β が、結合組織、軟骨、骨などの間葉組織から誘導された組織に、密接に関連していることが示されている。発生学的な知見に加え、TGF-β は骨および軟骨形成部位に存在している。また、ウサギの脛骨骨折の治療を促進することも可能である。最近、TGF-β による治療の有用性が報告されている（Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; and Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993）、しかし、短期間効果及び高コストが広い臨床利用を制限している。
【０００７】
以前は、関節炎の治療において、TGF-β の関節内注入は望ましくないと判断されていた。TGF-β がin vivoで不活性型に分解され、注入された場合の作用時間が短いからである。そのため、TGF-β を長時間放出する新たな方法が、硝子軟骨の再生には必要である。
【０００８】
軟骨細胞の自己移植による関節軟骨の再生に関する報告がある（Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889-895, 1994）が、この処置は、軟組織を広範囲に切除する2種類の手術が必要である。同種異系細胞の関節注入、つまり外因性のTGF-β タンパク質、または軟骨内部のTGF-β をコード化する遺伝子を含むベクターから製造されたTGF-β タンパク質の、いづれかを加えた軟骨細胞の注入が、変形性関節炎の治療に十分である場合、患者への経済的および生理的利点は大きくなる。
【０００９】
遺伝子療法は、特定タンパク質を特定部位に転移させる方法であり、この問題を解決できる可能性がある（Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. Wolff, 3-25, 1994; and Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16): 1182-1184, 1997）。
【００１０】
米国特許5,858,355 と5,766,585 は、IRAP（インタロイキン-1受容体拮抗タンパク質）遺伝子のウイルスまたはプスミドのコンストラクトの作成を開示している。すなわち、コンストラクトによる滑膜細胞（5,858,355）および骨髄細胞（5,766,585）の形質移入、さらに形質移入した細胞のウサギの関節への注入である。しかし、TGF-β スーパーファミリーに属する遺伝子を使った結合組織の再生については開示していない。
【００１１】
米国特許5,846,931 および5,700,774 では、TGF β "スーパーファミリー"に属する骨形態発生タンパク質（BMP）を含む組成を、切断型副甲状腺ホルモン関連ペプチドと共に注入し、その結果軟骨組織形成を維持し、軟骨組織を誘発させることを開示している。しかし、BMP遺伝子を用いた遺伝子療法については開示していない。
【００１２】
米国特許5,842,477 は、足場、骨膜/軟骨膜組織と、間質細胞好ましくは軟骨細胞を組み合わせて、軟骨変形領域に移植することを開示している。この特許の明細書には、これら3つの要素がすべて移植系に存在していることが必要であり、足場、または骨膜/軟骨膜組織の移植を必要としない、本発明のような簡単な遺伝子療法を開示または提言していない。
【００１３】
これらの優先する技術分野の開示にかかわらず、長時間作用しながら安定に軟骨を再生する方法の必要性が、非常に現実的で実質的となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は前述した必要性を満たしている。生成物をコード化する少なくとも1つの遺伝子を、哺乳動物の少なくとも1つの結合組織細胞に導入し、哺乳動物ホスト内結合組織の再生に使用する方法を、本発明で提供している。本方法は、生成物をコード化する遺伝子を含むDNAベクター分子を生成する組換え技術の使用と、生成物をコード化する遺伝子を含むDNAベクター分子の結合組織細胞内への導入から構成される。DNAベクター分子は、着目する生成物をコード化する遺伝子が安定に発現できるような、標的細胞または組織内に送達・維持されるならいずれのDNA分子であってもよい。本発明で利用する好ましいDNA ベクター分子は、ウイルスまたはプラスミドのいずれかのDNAベクタ-分子である。本法は、好ましくは、生成物をコード化する遺伝子を哺乳動物の結合組織細胞に投入して、治療に利用することも含んでいる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下に示す、骨関節炎の治療法も指図している。
【００１６】
a) タンパク質のトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのメンバーの生成または取得。
【００１７】
b) 遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞集団、または遺伝子をコード化するいかなるベクターを含まない培養結合組織細胞集団の生成または取得。
【００１８】
c) ステップa)のタンパク質とステップb)の結合組織細胞を、関節内注入によって、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに転移させ、関節スペース内の混合作用によって結合組織を再生する。
【００１９】
結合組織細胞がタンパク質をコードする遺伝子を含有ベクターを含む場合、組換えベクターは、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターでよいが、これだけに限定されない。ベクターは、プラスミドベクターでもよい。
【００２０】
本発明の方法には、移植前に先立つ、結合組織細胞集団の保存法も含まれる。細胞は、移植に先立ち液体窒素下10% DMSO 中で保存することができる。
【００２１】
結合組織細胞には、繊維芽細胞、骨芽細胞または軟骨細胞が含まれるが、これに限定されない。繊維芽細胞は、NIH 3T3 細胞またはヒト包皮骨芽細胞であってよい。軟骨細胞は自己由来または同種異系でよい。好ましくは、軟骨細胞は同種異系がよい。
【００２２】
結合組織には、軟骨、靱帯、または腱が含まれるが、これに限定されない。軟骨は硝子軟骨でよい。
【００２３】
本発明の方法では、TGF-βを含むトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのメンバーを使用する。トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーのメンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、ないしはBMP-7であってよい。好ましくは、TGF-βはヒトまたはブタのTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3がよい。
【００２４】
本発明は、以下に示す硝子軟骨の再生法も指図している。
【００２５】
a) タンパク質のトランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーの生成または取得。
【００２６】
b) 遺伝子をコード化するベクターを含む可能性のある培養結合組織細胞集団、または遺伝子をコード化するいかなるベクターを含まない培養結合組織細胞集団の生成または取得。
【００２７】
c) ステップa)のタンパク質とステップb)の結合組織細胞を、関節内注入によって、哺乳動物ホストの関節炎の関節スペースに転移させ、関節スペース内の混合作用によって硝子軟骨を再生する。
【００２８】
形質移入した細胞を使用する場合、その方法はリポソーム封入、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、およびDEAE-デキストラン媒介などの方法によって、実施することができる。
【００２９】
本発明は、トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーをコード化するDNA配列を含有する、組み換えウイルスまたはプラスミドベクターを含む結合組織細胞株についても指図している。結合組織細胞株は、繊維芽細胞株、軟骨細胞株、骨芽細胞株、または骨細胞株を含むこともあるが、これだけに限定されない。軟骨細胞は自己由来または同種異系でよい。好ましくは、軟骨細胞は同種異系がよい。
【００３０】
本発明よる結合組織細胞株は、トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーの1を含んでいる。好ましくは、トランスフォーミング増殖因子スーパーファミリーメンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6またはBMP-7である。
【００３１】
本発明に対するこれらの目的およびその他の目的は、以下に記載する本発明の説明、添付された参照図、および本文書の最後の請求項から十分に理解される。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本明細書で使用する"患者"とは、ヒトだけに限定されず動物界の種も含む。
【００３３】
本明細書で使用する"哺乳動物ホスト"とは、ヒトだけに限定されず動物界の種も含む。
【００３４】
本明細書で使用する"軟骨"とは、脱分化または再分化を行なったか否かにかかわらず、単離した軟骨細胞集団を意味する。in vitro 培養を数回通過後、軟骨細胞は、繊維芽細胞のように他の細胞タイプに脱分化することが観察されている。しかし、誘導によって、これらの細胞は軟骨細胞に再分化する可能性もある。本発明の目的で"軟骨細胞"とは、最初に開始した軟骨細胞培養を含むサンプルのことを意味し、サンプルには時間と共に脱分化した軟骨細胞もオプションとして含むこともある。
【００３５】
本明細書で、"結合組織"とは、他の組織や臓器を結合・支持するあらゆる組織のことであり、哺乳動物ホストの靱帯、軟骨、腱、骨、骨膜などを含むが、これだけに限定されない。
【００３６】
本明細書で、"結合組織細胞"または"結合組織の細胞"とは、繊維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞（骨芽細胞）などの結合組織内に見られる細胞が挙げられ、脂肪細胞（含脂肪細胞）および平滑筋細胞と同様に、コラーゲンの細胞外マトリックスを分泌する。好ましくは、結合組織細胞は、繊維芽細胞、軟骨細胞、骨細胞である。さらに好ましくは、結合組織細胞は、軟骨細胞である。好ましくは、軟骨細胞は同種異系細胞がよい。本発明は一種類の細胞と、結合組織の混合培養細胞で実施可能であることが認識されよう。この組織細胞が、化学的または放射線照射などによって処理され、その結果組織細胞が、着目する遺伝子、好ましくはTGF-βを安定に発現することも認識されている。好ましくは、結合組織細胞は、ホスト微生物中への注入時に、免疫反応を陰性にさせない方がよい。細胞介在遺伝子療法または体細胞療法として、同種異系細胞は自己細胞と同様に、この関点から使用できることが分かっている。
【００３７】
本明細書で使用する"結合組織細胞株"は、共通の親細胞を起源とする大多数の結合組織細胞を含む。
【００３８】
本明細書で使用する"硝子軟骨"とは、関節スペースを覆っている結合組織のことである。実施例の場合では、硝子軟骨には、関節軟骨、肋骨軟骨、鼻軟骨が含まれるが、限定されない。
【００３９】
特に、硝子軟骨は、自己再生することが知られており、変化にも対応し、摩擦の少ない安定な動きを与える。硝子軟骨は同じ関節内または関節間で見出され、厚さ、細胞密度、マトリックス組成、メカニックな特性は様々であるが、同じ一般構造と機能を保持している。硝子軟骨の一部の機能として挙げられるのは、圧縮への驚くべき剛性、復元力、重量負荷に対する異常な能力、肋軟骨への最大ストレスを最小化する能力、および高い耐久性などである。
【００４０】
肉眼的・組織学的に、硝子軟骨の外観は、変形に耐えるような滑らかく堅い表面である。軟骨の細胞外マトリックスは、軟骨細胞を含んでいるが、血管、リンパ管あるいは神経はない。軟骨細胞とマトリックス間の相互作用を維持する、精巧で高度に規則正しい構造によって、硝子軟骨の構造と機能が保持される一方、代謝活性は低く保たれている。文献O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998 では、硝子軟骨の構造と機能の詳細を説明しており、本明細書でも参考文献としてその全文を添付している。
【００４１】
本明細書で使用する"トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）スーパーファミリー"とは、構造的に関連するタンパク質のグループなどであり、胚発生中、広範囲に分化プロセスに影響を与える。ファミリーには、正常な男性性器発生に必要な（Behringer, et al., Nature, 345:167, 1990）ミュラー管抑制物質（MIS）、背腹軸形成と成虫盤の形態発生に必要な（Padgett, et al., Nature, 325:81-84, 1987）ショウジョウバエのDPP（TGF-β/BMPホモログ）遺伝子生成物、卵の植物性極に局在する（Weeks, et al., Cell, 51:861-867, 1987）Xenopus Vg-1 遺伝子生成物、ゼノパス胚中で中胚葉と前部構造の形成を誘導する（Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990）アクチビン（Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986）、およびde novo 軟骨と骨形成を誘導する（Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990）骨形態形成タンパク質（BMP-2、3、4、5、6 および7、 オステオゲニン、OP-1などのBMP）などが含まれる。TGF-β 遺伝子生成物は、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、造血形成、上皮細胞分化など、様々な分化プロセスに影響を与える可能性がある（Massague, Cell 49:437, 1987を参照）。本明細書に参考文献として全文を添付してある。
【００４２】
TGF-β ファミリーのタンパク質は、まず大型の先駆体タンパク質として合成され、続いて、C末端から約110-140 個の基本アミノ酸残基クラスターでタンパク質開裂が起こる。タンパク質のC末端領域は、すべて構造的に関連しており、異なるファミリーメンバーは、それらの相同性の大きさに基づいて別々のサブグループに分類することができる。特定のサブグループの相同性は、アミノ酸配列の同一性が70% 〜90% の範囲であるが、サブグループ間の相同性は有意に低く、一般的に20% 〜50%の範囲である。いづれの場合も、活性種は、C末端フラグメントのジスルフィド結合二量体であるように思われる。試験した殆どのファミリーメンバーに対し、ホモダイマー種は生体活性であることが認められたが、インヒビン（Ung, et al., Nature, 321:779, 1986）やTGF-β'S（Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987）のような他のファミリーメンバーでは、ヘテロダイマーも検出され、相当するホモダイマーと生物学的特性が異なるように思われる。
【００４３】
TGF-β 遺伝子のスーパーファミリーメンバーには、TGF-β3、TGF-β2、 TGF-β4 (チキン)、TGF-β1、TGF-β5 (アフリカツメガエル)、BMP-2、BMP-4、ショウジョウバエ DPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、ショウジョウバエ 60A、GDF-1、アフリカツメガエルVgf、BMP-3、インヒビン-βA、インヒビン-βB、インヒビン-α、および MISなどが含まれる。これらの遺伝子はMassague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998において考察されており、本明細書の参考文献として全文を添付してある。
【００４４】
好ましくは、TGF-β 遺伝子のスーパーファミリーメンバーはTGF-βである。さらに好ましくは、メンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、or BMP-7がよい。さらになお好ましくは、メンバーは、ヒトまたはブタのTGF-βである。また、さらになお好ましくは、メンバーは、ヒトまたはブタのTGF-β1、TGF-β2、またはTGF-β3である。最も好ましくは、ヒトまたはブタのTGF-β1である。
【００４５】
本明細書で使用する"選択可能なマーカー"とは、導入したDNAを安定に維持する細胞によって発現された遺伝子生成物などであり、その細胞に、形態学的転移または酵素活性など、変化した表現型を発現させる。形質移入された遺伝子を発現する細胞の単離は、選択可能なマーカーをコード化する二番目の遺伝子を、同じ細胞中に導入することによって達成される。そのマーカーには、例えば、抗菌薬あるいは他の薬物に耐性を与える酵素活性を有するマーカーが含まれる。選択可能なマーカーには、チミジンキナーゼ、ジハイドロ葉酸還元酵素、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンチシンなどのアミノ配糖体抗生物質に耐性を示すアミノ配糖体転移酵素、ハイグロマイシンBリン酸転移酵素、キサンチン-グアニンホスホリボシル基転移酵素、CAD酵素 （de novo ウリジン-カルバミルリン酸合成酵素、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼおよびジハイドロオロターゼの3つの酵素活性有する1つのタンパク質）、アデニン脱アミノ酵素、およびアスパラギン合成酵素（Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989）が含まれるが、これだけに限定されない。本明細書の参考文献としてその全文が添付されている。
【００４６】
本明細書で使用する"プロモーター"とは、活性なすべてのDNA配列でよく、真核細胞の転写を制御する。プロモーターは、真核、原核細胞のいずれか、または両方に活性な可能性がある。好ましくは、プロモーターは哺乳動物細胞中で活性である。プロモーターは、構造的に発現または誘導される可能性がある。好ましくは、プロモーターは誘導され得る。好ましくは、プロモーターは外部の刺激によって誘導され得る。さらに好ましくは、プロモーターは、ホルモンまたは金属によって誘導され得る。さらにもっと好ましくは、プロモーターは、重金属によって誘導され得る。最も好ましくは、プロモーターはメタロチオネイン遺伝子プロモーターである。同様に、転写を制御する"転写促進因子要素"は、DNAベクターコンストラクトに挿入することができ、本発明のコンストラクトと共に用いて、着目する遺伝子の発現を促進させる。
【００４７】
本明細書で使用する"DC-chol（Cholesteryl N-(dimethylaminoethyl)  carbamate ）"とは、カチオンコレステロール誘導体を含むカチオンリポソームを意味する。"DC-chol"分子は、3級アミノ基、中間長のスペーサーアーム（2原子）およびカルバモイルリンカー結合（Gao et al., Biochem. Biophys. Res, Commun., 179:280-285, 1991）を含んでいる。
【００４８】
本明細書で"SF-chol"とは、陽イオンリポソームの1タイプのことである。
【００４９】
本明細書でリポソームに関連して使用される"生体活性"とは、機能的な DNA とタンパク質の両方または一方を、標的細胞内に導入する能力のことである。
【００５０】
本明細書で核酸、タンパク質、タンパク質フラグメントまたは誘導体に関連して使用される"生体活性"とは、核酸またはタンパク質の野生型によって引き出される既知の生体機能を、その核酸やアミノ酸配列が模倣する能力のことである。
【００５１】
本明細書リポソーム送達の内容で使用される"メンテナンス"とは、導入DNA が細胞中に存在し続ける能力のことである。他の内容で使用される場合は、標的DNAが、治療効果を与えるために標的細胞または組織に存在し続ける能力を意味する。
【００５２】
遺伝子療法 
【００５３】
本発明は、着目するDNA配列を、哺乳動物ホストの結合組織細胞に送達する、ex vivo およびin vivo 技術を開示している。ex vivo 技術には、標的結合組織細胞を培養し、DNA配列、DNAベクターまたは着目する他の送達用賦形剤を結合組織細胞にin vitro で形質移入し、引き続き、改変結合組織細胞を哺乳動物ホストの標的関節に移植し、その結果、着目する遺伝子生成物のin vivo 発現を効果的にすることが含まれる。
【００５４】
足場または骨格となる物質を、色々な外来組織と同様に、本発明の遺伝子療法プロトコールで移植することは可能であるが、本発明では、そういった足場や組織は注入系に入れないことが好ましい。好ましい実施形態で、本発明は、細胞介在遺伝子療法または体細胞療法における、形質移入または形質導入した結合組織細胞集団の、関節スペースへの簡便な注入方法を指図しており、その結果、外来のTGFスーパーファミリータンパク質が関節スペースで発現される。
【００５５】
軟骨細胞のin vitro 代替え操作法では、着目生成物をコード化する遺伝子がリポソーム内に導入され、さらにリポソームが結合組織細胞と共に融合する場所である、関節領域に直接注入され、その結果、TGF-β スーパーファミリーに属する遺伝子生成物のin vivo 遺伝子発現が起こる。
【００５６】
結合組織細胞の追加のin vitro 代替え操作法では、着目生成物をコード化する遺伝子が、裸のDNAとして関節領域に導入される。裸のDNAは、結合組織細胞に入り、その結果、TGF-β スーバーファミリーに属する遺伝子生成物のin vivo 遺伝子発現が起こる。
【００５７】
本明細書を通じて開示された、結合組織障害のex vivo 治療方法の1つでは、タンパク質またはその生体活性フラグメントをコード化するDNA配列を含む、ウイルスまたはプラスミドの組換えベクターを最初に生成する。続いて、この組換えベクターを使って、in vitro培養結合組織細胞集団を感染または形質移入させ、その結果、ベクターを含む結合組織細胞集団ができる。続いてこれらの結合組織細胞は、哺乳動物ホストの標的関節スペースに移植され、関節スペース内でタンパク質またはそのフラグメントの連続発現をもたらす。この着目するDNA配列の発現は、結合組織障害に関連する、少なくとも1つの有害な関節病変を顕著に減少させるのに有用である。
【００５８】
患者の治療に好ましい細胞源は、自己軟骨細胞のような患者自身の結合組織細胞であるが、同種異系細胞も、その細胞の組織適合性に関係なく使用可能であることは、当分野の熟練技術者なら理解できよう。
【００５９】
さらに具体的には、本方法は、遺伝子として、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーメンバー、または生体活性誘導体あるいはそのフラグメント、また選択可能なマーカーあるいは生体活性誘導体またはそのフラグメントをコード化できる遺伝子を採用することも含んでいる。
【００６０】
さらに本発明の実施形態は、遺伝子として、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーメンバー、または生体活性誘導体あるいはそのフラグメントを、少なくとも1つコード化できる遺伝子を採用すること、および、利用するデリバリー法に関係なく、デリバー中の標的細胞または組織内で安定なメンテナンスが可能な、当分野の技術者に既知のいかなるDNAプラスミドベクターをも、DNAプラスミドベクターとして採用することを含んでいる。
【００６１】
その方法の1つは、ウイルスまたはプラスミドにかかわらず、DNA ベクター分子を標的細胞または組織に直接送達することである。この方法は、遺伝子として、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーメンバー、または生体活性誘導体あるいはそのフラグメントを、コード化できる遺伝子を採用することを含んでいる。
【００６２】
本発明の別の実施形態では、生成物をコード化する少なくとも1つの遺伝子を、哺乳動物ホストの治療に使用する結合組織の少なくとも1つの細胞に導入する方法を提供している。この方法では、生成物のコード化遺伝子を結合組織細胞に導入する、非ウイルス的方法を採用している。さらに具体的には、本方法は、リポソーム封入、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔法、またはDEAE-デキストラン介在を含み、遺伝子として、トランスフォーミング増殖因子 スーパーファミリーメンバー、または生体活性誘導体あるいはそのフラグメント、また選択可能なマーカーあるいは生体活性誘導体またはそのフラグメントをコード化できる遺伝子を採用することも含んでいる。
【００６３】
本発明の別の実施形態では、生成物をコード化する少なくとも1つの遺伝子を、哺乳動物ホストの治療に使用する結合組織の少なくとも1つの細胞に導入する追加方法を提供している。この追加方法には、DNAベクター分子を標的細胞または組織に送達するために、ウイルスを利用する生物的方法の採用が含まれる。好ましくは、ウイルスは偽ウイルスであり、ゲノムはすでに変化しており、そのため偽ウイルスは、標的細胞内での送達と安定なメンテナンスのみ可能であり、標的細胞あるいは組織内で複製能力を維持することはできない。変化したウイルスゲノムは、組換えDNA技術によってさらに操作され、そのウイルスゲノムは、標的細胞または組織内で発現する着目異種遺伝子を含むDNAベクター分子として作用する。
【００６４】
発明の好ましい実施形態は、本明細書内で開示したex vivo 技術を用い、TGF-β 遺伝子を、レトロウイルスベクターを通じて哺乳動物ホストの結合組織に送達することにより、TGF-β を標的関節スペースに送達する方法である。言い換えると、機能的TGF-β タンパク質またはそのフラグメントをコード化する着目するDNA 配列は、選択したレトロウイルスベクター内にサブクローン化され、組換えウイルスベクターは続いて適当なタイターに成長させ、in vitro 培養結合組織細胞を感染させるのに使用され、さらに形質導入された結合組織細胞、好ましくは自己移植細胞が、着目する関節に好ましくは関節内注入によって移植される。
【００６５】
本発明の別な好ましい方法は、TGF-β スーパーファミリー遺伝子を、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（AAV）ベクター、または単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターのいづれかを利用して、哺乳動物ホストの結合組織にin vivo で直接送達することを含む。言い換えると、機能的なTGF-β タンパク質またはそのフラグメントをコード化する着目するDNA配列がそれぞれのウイルスベクターにサブクローン化される。ウイルスベクターを含んだTGF-β は、続いて適切なタイターまで増殖し、好ましくは関節内注入によって関節スペースに導入される。
【００６６】
着目遺伝子を含むDNA分子の関節内直接注入の結果、レシピエントの結合組織細胞の形質移入が起こり、従って、除去、in vitro 培養、形質移入、選択、繊維芽細胞を含むDNAベクターの移植は不要であり、着目する異種遺伝子の安定な発現を促進する。
【００６７】
DNA分子を関節の標的結合組織に与える方法には、DNA分子のカチオンリポソーム内への封入、着目するDNA配列のレトロウイルスまたはプラスミドベクターへのサブクローン化、またはDNA分子の関節への直接注入などがあるが、これだけに限定されない。DNA分子は、膝関節への適応形態に関係なく、好ましくは、DNAベクター分子、つまり組換えウイルスDNAベクター分子あるいは組換えDNAプラスミドベクター分子として提供される。着目する異種遺伝子の発現は、活性なプロモーターフラグメントを、異種遺伝子のコード化領域上流に直結する真核細胞内に挿入することによって確認される。当分野の技術者は、ベクター構築についての既知対策や技術を利用し、DNA分子の結合組織への挿入後、確実に適切レベルで発現することができる。
【００６８】
好ましい実施形態では、遺伝子療法のデリバリーシステムとしてその後利用するために、膝関節から回復した軟骨細胞をin vitro 培養する。出願人が、開示した特定結合組織への使用に限定されないことは明らかであろう。in vitro 培養技術用に他の組織源を使用することも可能であると思われる。本発明の遺伝子使用方法は、関節炎の予防および治療方法の両方に採用できる。出願人が、膝関節部位での予防または治療法だけに限定されないことも明らかであろう。いかなる関節の関節炎処置に対する予防または治療法として、本発明を利用することは可能であると思われる。
【００６９】
本発明の別の実施形態において、予防または治療に効果的な用量を患者に非経口的に投与する物質は、TGF-β スーパーファミリータンパク質をコード化する遺伝子および適当な賦形剤を含むことが条件である。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態では、前述したように、in vitroで遺伝子を細胞内に導入する方法を含む。本方法は、引き続き感染細胞を哺乳動物ホスト内に移植することも含んでいる。本方法は、結合組織細胞の形質移入を達成後、しかし感染細胞の哺乳動物ホストへの移植前に、形質移入した結合組織細胞を保存する方法をも含む。当分野の技術者には、感染した結合組織細胞が液体窒素下10% DMSO中で冷凍保存できることが分かるであろう。本方法は、関節炎を非常に発生し易い哺乳動物ホストにおいて、関節炎の発生を十分に予防する方法を含む。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、生成物をコード化する少なくとも1つの遺伝子を、哺乳動物ホストの治療用にその結合組織の少なくとも1つの細胞内に導入する方法を含み、また前述したように、生成物用のコード化遺伝子を含むウイルスベクターを哺乳動物ホスト内に直接導入することによって、in vivo で細胞の感染を達成させることも含んでいる。好ましくは、本方法は、関節内注入による、哺乳動物ホストへの直接導入の達成を含む。本方法は、関節炎を非常に発生し易い哺乳動物ホストにおいて、関節炎の発生に十分な予防方法の使用を含む。本方法は、関節炎哺乳動物ホストの治療方法に使用することを含む。さらに、本方法は、前述したように、結合組織を修復し再生するための方法の使用を含む。
【００７２】
当分野の技術者は、レトロウイルスが結合組織細胞の感染および統合を達成することが必要な場合、リポソームを用いるウイルスベクターは、細胞分裂によって限定されないことを理解するであろう。前述したような非ウイルス手段を用いる本方法は、遺伝子として、TGF-β スーパーファミリーに属するメンバーをコード化できる遺伝子、および選択可能なマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子などの使用を含む。
【００７３】
本発明の別の実施形態は、本明細書内で開示したあらゆる方法によって、TGF-β スーパーファミリーメンバーをコード化するDNA配列を、哺乳動物ホストの結合組織に送達し、その結果、軟骨などの結合組織の再生のため、コラーゲンのin vivo 発現を達成することである。
【００７４】
例として開示した特定方法において、本発明だけに限定されないが、TGF-β コード化配列を含むDNAプラスミドベクターは、メタロチオネインプロモーター下流で連結されている。
【００７５】
結合組織は、治療の的を絞るには難しい臓器である。当技術分野で知られているドラッグデリバリーの静脈および経口経路では、これらの結合組織に到達するのは難しく、治療薬剤が哺乳動物ホストの全身に暴露するという欠点がある。さらに具体的には、既知の関節内注入法では、タンパク質は直接関節内に投与される。しかし、タンパク質の封入型を注射すると、殆どの場合、関節内半減期は非常に短い。本発明は、哺乳動物ホストの治療に使用できるタンパク質をコード化する、哺乳動物ホスト遺伝子を結合組織内に導入することによって、これらの問題を解決している。さらに具体的には、本発明は、抗関節炎特性を持つタンパク質をコード化する哺乳動物ホスト遺伝子を結合組織内に導入する方法を提供している。
【００７６】
本発明では、TGF-β投与に関連する作用の短さと高コストの問題を解決するために、遺伝子療法を適用した。形質移入した細胞は、形態学的変化なして、組織培養中に6週間以上生存可能性がある。作用の実現性と期間を確認するために、細胞をウサギのアキレス腱に注入した。栄養源補給がin vivo細胞に適切であれば、その細胞は生存し、周辺細胞を刺激するのに十分な期間TGF-β を生成する可能性がある。それらの細胞は、腱内および関節内の両環境で機能を発揮した。
【００７７】
形質移入細胞の濃度は、局所作用には重要な因子である。以前の実験（Joyce et al., supra, 1990）では、組織のタイプによってTGF-βの投与量が決定された。特にその投与量を低くすると、軟骨形成と膜内骨形成の比率が減少した。TGF-β は、一次骨芽細胞とMC3T3細胞の刺激には二相性反応でもある（Centrella et al., Endocrinology, 119:2306-2312, 1986）。すなわち、TGF-β は濃度によって、刺激性も阻害性にもなり得る（Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687, 1988）。本明細書の実施例で、NIH 3T3-TGF-β1 細胞は104、105、106 個/mlの色々な濃度でコラーゲンの合成を刺激した。腱は、106 個/mlの濃度で最も増大した。
【００７８】
実施例では、関節に0.3 ml of 106 個/ml 濃度を注入した。試験片を注入後2-6週間で回収した。関節の環境は腱とは異なる。細胞は関節内で自由に移動することができる。細胞は、細胞と特異な親和性を持つ領域に移動するであろう。滑膜、半月板、および軟骨の欠損領域は、細胞の接着が可能な部位である。注入6週間後、部分的および完全に損傷した軟骨欠損領域に、再生された組織が観察されたが、骨膜または半月板には認められなかった。損傷領域への特異的な親和性は、臨床応用にとって別な利点となる。退行性関節炎が、細胞の関節への注入だけで治癒される可能性がある場合、患者は大きな手術をせずに適切な治療をすることができる。
【００７９】
注入された細胞によって分泌されるTGF-β は、2つ方法で、硝子軟骨の再生を刺激する可能性がある。1つは、損傷した領域に残っている軟骨細胞が、その細胞表面でTGF-β 受容体を生成することである（Brand et al., J Biol Chem, 270:8274-8284, 1995; Cheifetz et al., Cell, 48:409-415, 1987; Dumont et al., M Cell Endo, 111:57-66, 1995; Lopez-Casillas et al., Cell, 67:785-795, 1991; Miettinen et al., J Cell Biology, 127:6, 2021-2036, 1994; and Wrana et al., Nature, 370:341-347, 1994）。これらの受容体は、損傷領域に接着している注入細胞が分泌するTGF-β によって、刺激されている可能性がある。TGF-β は、in vivo では潜在型で分泌される（Wakefield et al., J Biol Chem, 263, 7646-7654, 1988）ので、潜在型TGF-β には活性化プロセスが必要である。もう一つは、潜在型TGF-β または形質移入細胞から分泌するTGF-β がすでに、部分的に損傷した軟骨層の細胞外マトリックスで、TGF-β 結合タンパク質（LTBT）と結合していた可能性があることである（Dallas et al., J Cell Biol, 131:539-549, 1995）。
【００８０】
作用メカニズムが何であれ、硝子軟骨合成の知見は、高濃度TGF-β を長期間投与することにより、硝子軟骨の再生が刺激されることを示している。局所高濃度に対する賦形剤は、局所刺激に重要な因子ではないが、理論的には、TGF-β を軟骨の損傷領域に送達するための最も適当な賦形剤は、軟骨細胞であるといえる（Brittberg et al., New Engl J Med 331:889-895, 1994）。コラーゲンの二層マトリックスが、形質移入細胞の局所分布に対し可能性のある、他の賦形剤である（Frenkel et al., J Bone J Surg (Br) 79-B:831-836, 1997）。
【００８１】
新たに形成される組織の特性は、組織学的な方法で測定された。H&E 染色において、新たに形成された組織は、周囲の硝子軟骨と同一であった（図4）。新たに形成された組織の特性を評価するために、サフラニン-O （Rosenburg, J Bone Joint Surg, 53A:69-82, 1971）で組織を染色した。繊維質なコラーゲンの白色に対し、新たに形成した組織は紅く染まり、硝子軟骨であることを示唆している（図5）。
【００８２】
完全に損傷した領域の細胞は繊維質なコラーゲンを生成した。骨様マトリックスはTGF-β 刺激のバリヤーとなるので、周辺の骨芽細胞は刺激を受けた可能性はない。NIH 3T3-TGF-β1 細胞は、周辺の細胞を刺激する代わりに、オートクリンの刺激によって繊維質なコラーゲンを生成した。細胞がオートクリンとパラクリンの活性化によって刺激された事実により、TGF-β1 発現コンストラクトを安定に形質移入した軟骨による、退行性関節炎の治療の可能性が増大した。
【００８３】
TGF-β1 発現コンストラクトによって安定に形質移入された細胞株は、腱や膝関節で生存することができる。その細胞株は、腱および完全に損傷した軟骨領域に繊維質なコラーゲンを生成する。しかし、その細胞株は、部分的に損傷した関節軟骨内に硝子軟骨を生成する。オートクリンおよびパラクリンの作用様式による刺激メカニズムは、TGF-β スーパーファミリーメンバーを用いる遺伝子療法が、硝子軟骨外傷に対する新たな治療法になることを示している。
【００８４】
発明者は、TGF-β 発現コンスラクトを形質移入することにより、安定な繊維芽（NIH 3T3-TGF-β1、およびヒト包皮繊維芽細胞TGF-β1）細胞株を作成した。これらのTGF-β生成細胞は、長期間にわたりin vivo で活性なTGF-β 濃度を高く保持した。
【００８５】
遺伝子療法、特に細胞介在遺伝子療法の可能性に関して、答えるべき最初の疑問点は、in vivo細胞の生存能力である。TGF-β はin vitroで免疫細胞を抑制できるが、免疫細胞は非常に効率的な免疫監視系によって、他の種の組織では生存できる可能性が少ない。2番目の疑問は、in vivo 遺伝子発現の至適濃度を評価しなければならないことである。この疑問に答えるために、3種濃度の細胞をウサギのアキレス腱に注入した。使用する関節内注入濃度を、腱内注入の至適濃度から決定した。第3の疑問点は、どうやって細胞は関節内で軟骨再生を刺激するかである。注入細胞には2種類の作用様式がある。1つは、分泌されたTGF-β による周辺細胞の活性化（パラクリン活性）（Snyder, Sci Am, 253(4): 132-140, 1985）であり、もう一つは、自己活性化（オートクリン活性）である。細胞濃度が、その経路に影響するかもしれないが、周辺環境が作用様式の決定に最も重要な因子となる可能性がある。関節内液と内部靱帯が、血液供給、栄養供給および周辺細胞に対する2つの異なる環境である。細胞の作用様式を見つけるために、形質移入細胞をこの2つの環境内に注入した。本試験の全体の目的は、整形外科疾患におけるTGF-β-遺伝子療法を評価し、in vivo作用様式を確認することであった。
【００８６】
治療物質の組成 
【００８７】
本発明は、軟骨再生に関連している。特定な実施形態において、本発明方法は、トランスフォーミング増殖因子βスパーファミリーメンバーまたは生体活性誘導体あるいはそのフラグメントである、遺伝子生成物の利用を含んでいる。The TGF βスパーファミリータンパク質は、同種異系を含む軟骨細胞など、結合組織細胞と共に投与される。TGFβタンパク質は、軟骨が治療部位に再生される限り、細胞と同時に投与しても、あるいは細胞投与前後に投与してもよい。
【００８８】
本発明の別の実施形態において、予防または治療に効果的な用量を患者に非経口投与する物質の条件は、TGF-β スーパーファミリータンパク質および適当なキャリアを含んでいることである。
【００８９】
治療に応用する場合、TGF β タンパク質は、局所投与用に製剤化されることもあり、同種異系を含む軟骨などの結合組織細胞と共に投与されることもある。本発明で、TGF β タンパク質は、一般的に希釈用賦形剤などのキャリアと混合されることもある。投与様式と投与剤型に依存して、希釈剤には、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、腐食化ポリマーまたは潤滑剤等が含まれる。典型的な投与剤型には、粉末、懸濁液、乳濁液および溶液などの液剤、顆粒、およびカプセルなどがある。
【００９０】
本発明のTGF β タンパク質は、被験者投与に際し、薬剤的に可能なキャリアと混合されることもある。適切な薬剤キャリアの例には、N-(1-2,3-ジオレイロキシ)プロピル}-n,n,n-トリメチルアンモニウム クロライド (DOTMA) 及びジオレオイルホスホチジル エタノールアミン(DOPE)など、様々なカチオン性脂質があるが、これだけに限定されない。リポソームは、本発明のTGF β タンパク質分子の適切なキャリアでもある。別の適切なキャリアは、TGF β タンパク質分子を含む徐放ゲルまたはポリマーである。
【００９１】
TGF β タンパク質は、生理食塩液または他の適切な液体など、生理的に容認できる量のキャリアまたは希釈剤と混合してよい。TGFタンパク質分子は、TGFタンパク質とその生体活性型を、標的まで到達するまで、および/またはTGFタンパク質またはその生体活性型の組織バリヤー横断を促進するまで、分解から保護するために他のキャリアと混合してもよい。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、細胞の形質移入前の結合組織細胞の保存を含む。本分野の技術者は、結合組織細胞が液体窒素下10% DMSO中で冷凍保存できることを分かるであろう。本方法は、関節炎を非常に発生し易い哺乳動物ホストにおいて、関節炎の発生を十分に予防する方法の使用を含む。
【００９３】
治療に使用する化合物の剤形は、当技術分野で一般的に知られており、Remingtonの Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USAを参照すると簡単に調製できる。例えば、1日体重1kg当たり、0.05μg〜20 mg が投与できる。治療に対する適切な反応が得られるように、投与方法を調節することが可能である。例えば、数回に分けた用量を毎日投与するか、またはその用量を治療状況の緊急性に応じて徐々に減少させることもできる。有効成分は、経口、静注（水溶性）、筋注、皮下、鼻腔内、皮内、または座薬のような一般的な方法、あるいは移植（腹腔内経路による徐放分子によって、または生体外（培養）で感作され、レシピエントに養子性に転移された単球あるいは樹状突起細胞によって）によって投与され得る。投与経路に依存して、ペプチドは酵素、酸類、および他の当該成分を不活性化させる可能性のある、自然条件の反応から保護するために、ある材料物質で被覆する必要があるかもしれない。
【００９４】
例えば、低親油性のペプチドだと、ペプチド結合を開裂する酵素によって胃腸管で分解され、酸加水分解によって胃で分解されるであろう。非経口投与（注射など）以外でペプチドを投与するためには、不活性化を防ぐための物質で被覆するか、その物質と併用投与することになる。例えば、ペプチドは、酵素阻害剤と併用した補助剤と、またはリポソームと混ぜて投与できる。本発明で検討した補助剤には、レゾルシノール、ポリオキシエチレン オレイルエーテルおよびn-ヘキサデシル ポリエチレンエーテルなどの非イオン性表面活性剤が含まれる。酵素阻害剤には、膵性トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（DEP）およびトラシロールを含む。リポソームには、W/O/Wトリプル型CGFエマルジョンと従来のリポソームが含まれる。
【００９５】
有効成分を、非経口あるいは腹膜内投与してもよい。分散物はグリセロール液体ポリエチレングリコール、それらの混合物、および油中で調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために保存剤を含んでいる。
【００９６】
注入使用に適切な薬剤形には、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、および滅菌注射液または分散媒の用時調製用の滅菌粉末が含まれる。常に剤形は滅菌され、容易に注入できる範囲の液体でなければならない。剤形は、製造および保存条件下で安定であり、細菌や真菌類のような微生物による汚染作用から保護しなければならない。キャリアは、溶媒または分散媒で、例えば、水、エタノール、ポリオール（例：グレセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、および類似物）、それらの適当な混合液、および植物油を含むものであってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンによる被覆、分散液に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、theomersalおよび類似物によって、微生物の作用を防ぐことができる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。注入可能な組成は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど吸収遅延成分の使用により、長期間吸収させることができる。
【００９７】
滅菌注射液は、有効成分の必要量を、上記で列挙した他の色々な成分と共に、適切な溶媒に混合して調製する。必要なら、滅菌ろ過を引き続き行なう。一般的に、分散液は色々な滅菌活性成分を滅菌媒体に混合して調製する。その媒体は、分散媒基剤および上記で列挙した成分のうち必要な成分を含んでいる。滅菌注射液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および冷凍乾燥である。この乾燥法により、活性成分の粉末中に、以前に滅菌ろ過した溶液から必要な追加成分がプラスされる。
【００９８】
ペプチドが上述したように適切に保護される場合、有効成分は、例えば、不活性な希釈剤または同化食用キャリアと共に経口投与でき、または、硬質あるいは軟質のシェルゼラチンカプセルに封入したり、錠剤に圧縮したり、食品として直接摂取することもできる。経口治療投与の場合、有効成分は、賦形剤と混合し、摂食錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤、類似製剤などの剤型として投与できる。このような組成および製剤は、有効成分を少なくとも1% （重量）含んでいる必要がある。組成および製剤の割合は、もちろん様々であるが、ユニット重量の約5%から約80% の間が適切である。治療に有用な組成中の有効成分量は、適切な投与量が得られるような量とする。本発明による好ましい組成または製剤を調製すると、各経口投与ユニット剤型には、有効成分が0.1 μg から2000 mg 含まれる。
【００９９】
錠剤、丸剤、カプセルおよび類似製剤には、以下のような添加剤も含む可能性がある。トラガカントガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸およびその類似物質などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤など、またはペパーミント、ウィンターグリーンオイル、またはチェリーフレーバーなどの香料などが添加されることもある。投与ユニット剤型がカプセルの場合、上述の物質にさらに液体キャリアを含むこともある。他の様々な材料物質が被覆剤として、あるいはそれ以外に投与ユニットの物理的剤型を改変するために、存在することもある。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、セラック、砂糖またはブロスで被覆できる。シロップまたはエリキシル剤は、有効成分、甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、染料およびチェリーやオレンジフレーバーの香料を含んでいる。もちろん、あらゆる投与ユニット剤型の調製で使用する材料物質はすべて、その使用量において、薬剤的に純粋であり、実質的に無毒でなければならない。さらに、有効成分を、徐放製剤および剤型に混合することもできる。
【０１００】
本明細書で使用する"薬剤的に利用可能なキャリアおよび/または希釈剤"には、いかなる溶媒、分散媒体、抗菌および抗真菌剤の被覆剤、等張で吸収遅延剤およびその同等物質を含む。薬剤的に有効な物質にそのような媒体や試薬を使用することは、当分野の技術では良く知られている。有効成分に適合しない従来の媒体または物質を除き、治療薬組成に使用することが検討される。補助的有効成分も治療薬組成として混合できる。
【０１０１】
服用の容易性および投与量の均一性を考慮して、投与ユニット剤型に非経口組成を処方することは特に有益である。本発明で使用する投与ユニット剤型とは、治療する哺乳動物の単位投与量として適切な物理的に個別のユニットを示す。つまり、各ユニットには、前もって定量した有効成分量を含んでおり、その量は、必要な薬剤的キャリアに関連して必要な治療作用を生み出すように計算されている。本発明の投与ユニット剤型の明細は、(a) 有効成分と得られる特有な治療作用の特有な性質、(b) 疾病状態にある、つまり健康障害を持つ被験生体の治療に有効な成分を混合する当分野の技術の限界、によって決定され、直接依存する。
【０１０２】
主な活性成分は、投与ユニット剤型において、薬剤的に利用可能なキャリアによって、有効量を、簡便で有効に投与できるように混合される。例えば、1ユニット投与剤型には、0.5 μg から約2000 mg範囲の主要有効成分が含まれる。この値に応じて表すと、有効成分は通常、キャリア1ml中0.5 μg/ml存在していることになる。補助有効成分を含む組成の場合、投与量は、当該成分の通常の用量と投与方法を参考にして決定される。
【０１０３】
デリバリーシステム
【０１０４】
色々なデリバリーシステムが知られており、本発明の組成を投与するのに用いることができる。例えば、リポソームによるカプセル化、微粒子、微カプセル、化合物の発現可能な組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部として核酸の構築などである。導入方法には、皮内、筋内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口などを含むが、これだけに限定されない。化合物または組成は、いずれの簡便な経路、例えば、輸注またはボーラス注入、上皮または粘膜皮膚内壁（例：口内粘膜、腎および腸粘膜など）などから投与でき、他の生物学的活性物質と共に投与してもよい。全身および局所投与ができる。さらに、本発明の薬剤化合物または組成を、心室内および髄膜内など適切な経路で、中枢神経系に導入することが望ましいかもしれない。心室内注入は、心室内カテーテル、例えば、Ommaya リザーバーのようなリザーバーが付いたカテーテルによって容易に行なうことができる。肺への投与は、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアゾール剤の剤形を使用して行なうことができる。
【０１０５】
特定な実施形態において、治療を要する領域に局所的に、本発明の薬剤物質または組成を投与することが望ましい。この局所投与は、例えば、手術中の局所輸注、局部適用（例えば術後の創傷包帯と併せて）、注射、カテーテル、座薬、または移植（すなわちsialastic 膜あるいはファイバーなどの膜を含む、多孔、非多孔、またはゼラチン材質の当該インプラント）によって達成することができる。好ましくは、抗体あるいは本発明のペプチドなどタンパク質を投与する場合、タンパク質を吸収しない物質を使用するように注意を払わなければならない。別の実施形態では、化合物または組成は、ベシクル、特にリポソーム中で送達されることもある。さらに別な実施形態では、化合物または組成は、放出制御システムで送達することができる。1つの実施形態では、ポンプを使用してもよい。別実施形態では、重合物質を使用する場合もある。さらに別な実施形態では、放出制御システムを、治療標的の近くに配置することができ、その場合の用量は、全身投与量の一部ですむ。
【０１０６】
組成は、その投与がレシピエント動物によって忍容されれば、「薬理学的または生理学的に容認される」と言え、それ以外は、その動物への投与は適切である。そのような薬剤は、投与量が生理学的に有意である場合、「治療に有効な量」の投与と言える。薬剤の存在により、レシピエント患者に検出可能な生理的変化が見られる場合、その薬剤は生理学的に有効である。
【０１０７】
本発明は、ここで説明する特定な実施形態の範囲だけに限定されない。事実、ここの説明に追加された本発明の色々な変更は、前述の説明と添付の図から、これらの当技術分野の専門家には明確になるであろう。このような変更は、付録の請求範囲内に含むことが意図されている。以下の実施例は、本発明を図解することによって提供されるが、それだけに限定されない。 
【実施例１】
【０１０８】
材料と方法 
【０１０９】
プラスミドの構築 
【０１１０】
メタロチオネインの発現コンストラクト（pM）を生成するために、増幅で使用するオリゴヌクレオチド内に構築されたXba I 及びBam HI 制限部位を使用した、ゲノムDNAを用いたPCRによって、メタロチオネインIプロモータ（-660/+63）を生成した。増幅フラグメントは、pBluescript （Stratagene, La Jolla, CA）のXba I-Bam HI 部位内にサブクローン化された。プラスミドpmTβ1 は、TGF-β1 コード化配列を含む1.2-kb Bgl II フラグメントと、3'位末端の成長ホルモンポリA 部位を、pMのBam HI-Sal I 部位にサブクローン化することにより作成した。
【０１１１】
細胞培養と形質移入
TGF-β cDNA を繊維芽細胞（NIH 3T3-TGF-β1）またはヒト包皮繊維芽細胞/TGF-β1内に形質移入した。それらを10% ウシ胎児血清を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium （GIBCO-BRL, Rockville, MD）で培養した。TGF-β1 cDNA 配列を、メタロチオネイン遺伝子プロモーターと共にpmTβ1 ベクター内に追加した。ネオマイシン耐性遺伝子配列もベクター内に挿入した。
【０１１２】
このベクターの細胞内への挿入には、リン酸カルシウム法を使用した。形質移入された遺伝子配列によって細胞を選択するために、ネオマイシン（300 μg/ml）を培地に添加した。続いて、生存コロニーを選択し、ノザン分析とTGF-β1 ELISA法（R & D Systems）によってTGF-β1 mRNAの発現を確認した。TGF-β1 が発現している細胞を液体窒素中で保存し、注入直前に培養した。
【０１１３】
ノーザンプロット法による分析
総RNAを、イソシアン酸グアニジウム/フェノ−ル/クロロホルムによって細胞から単離した。RNA10 μg を0.66M ホルムアルデヒド含有1.0 % アガロースゲル上で電気泳動し、DURALON-UV 膜に転移させ、UV STRATALINKER (STRATAGENE)でクロスリンクした。ブロットを、1% ウシ血清アルブミン溶液、7% (w/v) SDS、0.5 M リン酸ナトリム、および1 mM EDTA 中65°Cで、予備的にハイブリダイズし、そしてハイブリダイズした。ハイブリダイズしたブロットを、フィルム露出前に、0.1 % SDS、1 X SSC で20分間50°C で洗浄した。RNAブロットを、ヒトTGF-β1に対する32P標識化cDNAプローブでハイブリダイズした。βアクチン用プローブを使用して、サンプル装填の制御を行なった。
【０１１４】
ウサギへの細胞注入
試験動物として体重2.0 〜2.5 kg のニュージランド白ウサギを選んだ。ケタミンおよびルンプン（roumpun）で麻酔した後、各ウサギを滅菌した布でおおった。アキレス腱を露出し、104、105、106 個/ml 濃度の細胞0.2 〜 0.3 ml を腱の中間部へ注入した。形質移入したDNAの発現用に、硫酸亜鉛をウサギの飲水に添加した。アキレス腱の実験で至適濃度を決定した後、関節内注入を実施した。膝関節を露出し、ナイフで、部分的および完全に軟骨を欠損させた。肋軟骨を露出させないように注意を払いながら、硝子軟骨層を部分的に欠損させた。すべての硝子軟骨を取り除いた後、完全に欠損させ、肋軟骨を露出させた。手術の創傷を閉じた後、106 個/ml 濃度の細胞を関節内に注入し、硫酸亜鉛を飲水に添加した。
【０１１５】
組織学的検査
腱と膝関節を収集した後、検体をホルマリンで固定し、硝酸で脱灰した。パラフィンブロックに埋め込み、0.8 μm の厚さにカットした。ヘマトキシリン-エオシンおよびサフラニ-O染色を用いて、顕微鏡下で再生した組織を観察した。
【実施例２】
【０１１６】
結果 
【０１１７】
安定な細胞株
形質移入は、リン酸カルシウムの共沈法によって実施された(図 1)。生存コロニーの約80% が導入遺伝子mRNAを発現した。これらの選択したTGF-β1産生細胞を硫酸亜鉛溶液中でインキュベートした。細胞を100 μM 硫酸亜鉛溶液中で培養すると、mRNAを産生した。TGF-β 分泌速度は、24 時間で細胞106 個につき約32 ngであった。
【０１１８】
ウザギにおける関節軟骨欠損の再生
ウサギのアキレス腱を観察し、NIH 3T3-TGF-β1 細胞の生存能力をチェックした。106 個/ml の細胞濃度における腱は、104や105個/ml 濃度よりも顕著に厚かった。部分的および完全な軟骨欠損を作成した後、106 個/ml 濃度のNIH 3T3-TGF-β1 細胞0.3 ml を膝関節に注入した。注入後2〜6週間後に関節を診察した。部分的欠損軟骨で新たに形成された硝子軟骨が認められた。すなわち、注入2週間後、硝子軟骨が現れ、6週間後に軟骨欠損部は硝子軟骨によって覆われた（図2）。再生された軟骨の厚さは、時間と共に厚くなった（図3）。注入した細胞はTGF-β1を分泌し、それは、TGF-β1 抗体による免疫組織化学染色によって観察することができた（図3）。TGF-β1 の形質移入していない正常な繊維芽細胞を注入した対側は、硝子軟骨で覆われていなかった。部分的損傷領域の再生した硝子軟骨は、サフラニン-O 染色により赤色となった（図4）（新たに形成した軟骨の深さは、損傷部とほぼ同一であった。）。この知見は、注入した細胞が、パラクリン様式の作用によって周辺の正常軟骨細胞を活性化することを示唆している。
【０１１９】
完全に損傷した軟骨中の再生組織は、硝子軟骨ではなく繊維質コラーゲンであった。サフラニン-O染色によってそのコラーゲンは、硝子軟骨の赤色とは異なり、白色となった（図5）。軟骨は、繊維性組織によって覆われ、それらの細胞がオートクリン様式でのみ活性されることを意味している。TGF-βによって刺激され得る周辺骨細胞は、厚い石灰化骨マトリックスの存在によって、TGF-β の刺激から遮断されていたように見えた。注入した細胞は、このバリヤーのため、骨細胞を刺激できなかった可能性がある。
【０１２０】
TGF-β1 を形質移入した細胞をウサギのアキレス腱に注入した。遺伝子操作を受けた腱は、対照の腱よりも顕著に厚い形態を示した（図7）。この腱のH&E 染色断面を、顕微鏡下で観察すると、ウサギのアキレス腱中に注入したNIH 3T3-TGF-β1 細胞が生存しており、繊維性コラーゲンが生成していることが分かった（図8）。TGF-β1 抗体で免疫組織化学的に染色した再生腱組織を顕微鏡で観察すると、腱中にTGF-β1 が発現していることが示された（図9）。
【実施例３】
【０１２１】
NIH3T3コントロール細胞またはNIH3T3-TGF-β1 細胞（5-7 x 105）のどちらかを、6000線量で照射し、ウサギの膝関節に注入した。これらの照射細胞は、組織培養皿で3週間のうちに完全に死んだ。注入プロセスは未処理細胞の以前のプロトコールと同一であった。膝関節は、注入後3または6週間後に収集した。検体をホルマリンで固定し、硝酸で脱灰した。検体断面を作成し、パラフィンで埋め込み、0.5 μm の厚さにカットした。図10では、その断面をサフラニン-O 染色（A-D & A'-D'）およびヘマトキシリン-エオシン染色（E-F および E'-F'）し、顕微鏡で再生軟骨組織を観察した。（原倍率： (A、B、A'、 B') x12.5; (C-F および C'-F') x400）。
【実施例４】
【０１２２】
コントロールのヒト包皮繊維芽細胞（hFSF）またはhFSF-TGF-β1 細胞を、大腿関節丘上の部分的軟骨欠損（3mm x 5mm、深さ1.5mm ）を含むウサギの膝関節内に注入した。これらの細胞（2 x 106 個/ml濃度を0.5ml）を以前のプロトコールに従って注入するか、同じ濃度の細胞20〜25 μl を欠損上部に入れた。後者の場合、細胞を欠損部に15〜20 分間残し、縫合前に細胞を欠損底部で安定させた。両者とも同様な軟骨再生レベルが得られた。検体を注入6週間後に収集し、顕微鏡で観察した。図11AとBは、hFSF (A) またはhFSF-TGF-β1 細胞(B)を注入後6週間の大腿関節丘の写真である。C、E、Gは、コントロールhFSF 細胞を注入した大腿関節丘断面のサフラニン-O （C と E）とH&E 染色（G）を示す。D、F、Hは、hFSF-TGF-β1 細胞を注入した大腿関節丘断面のサフラニン-O （D と F）とH&E 染色（H）を示す。（原倍率：（C と D）x12.5、（E〜H）x400）。
【実施例５】
【０１２３】
コントロールNIH3T3 またはNIH3T3-TGF-β1 細胞を、大腿関節丘上に部分的軟骨欠損（6mm x 6mm、深さ2mm ）を含むイヌの膝関節内に注入した。これらの細胞（2 x 106 個/ml濃度を4ml）を以前のプロトコールに従って注入するか、同じ濃度の細胞30〜35 μl を欠損上部に入れた。後者の場合、細胞を欠損部に15〜20 分間残し、縫合前に細胞を欠損底部で安定させた。両者とも同様な軟骨再生レベルが得られた。検体を注入6週間後に収集し、顕微鏡で観察した。図12AとBは、NIH3T3(A) またはNIH3T3-TGF-β1細胞(B)を注入後6週間の大腿関節丘の写真である。C、E、Gは、コントロールNIH3T3 細胞を注入した大腿関節丘断面のサフラニン-O （C と E）とH&E 染色（G）を示す。D、F、H は、NIH3T3-TGF-β1細胞を注入した大腿関節丘断面のサフラニン-O （D と F）とH&E 染色（H）を示す。（原倍率：（C と D）x12.5、（E〜H）x400）。
【実施例６】
【０１２４】
再生した軟骨組織中のTGF-β1 タンパク質の発現を検討するために、注入3週間後に、TGF-β1 抗体を用いて、修復組織の免疫組織化学的染色を行なった。再生した軟骨細胞中でのみ高濃度のTGF-β1 タンパク質発現が見られ、軟骨細胞の多くは、新たに作成されたように見えた（図13、A と B）。二次抗体のみでプローブした同一組織の断面には、染色部分は認められなかった（図13、C）。（原倍率：A x12.5、 (B〜C) x40）
【０１２５】
ウサギの膝関節を収集後、検体をホルマリンで固定し、硝酸で脱灰した。検体断面を作成し、パラフィンで埋め込み、0.8 μm の厚さにカットした。断面は、キシレンとエタノール中で連続的にインキュベーションし、脱パラフィンし、水和した。1x PBS 中で2分間洗浄後、断面を3% H2O2 で10 分間ブロックした。TGF-β1 タンパク質に対する一次抗体を、その断面に適用し、1時間インキュベートした。コントロールの断面を、このステップで一次抗体なしの1x PBS中でインキュベートした。HRP抱合二次抗体でインキュベートする前に、断面を洗浄し、1x PBS 中5% ミルクで20分間ブロックした。1x PBS中0.05% ジアミノベンジジン（DAB）で色素原反応を5分間行なった。続いてヘマトキシリンで断面を染色し、固定した。
【０１２６】
この試験での免疫組織化学的染色データおよびイヌをモデルにしたデータは、現在の細胞療法による硝子軟骨再生に対する分子メカニズムの可能性を示唆している。膝関節に注入した繊維芽細胞は、"可逆的分化"型プロセスのような、未知の経路によってなんとか軟骨細胞に分化した可能性がある。この経路は恐らく、in vivoで注入した繊維芽細胞が分泌したTGF-β1 によって開始され、これが原因となり、既存の軟骨細胞と繊維芽細胞が様々な因子をリリースさせ、パラクリンまたはオートクリン様式のTGF-β1 作用によってこの経路が進行したと思われる。
【実施例７】
【０１２７】
in vivo で同時注入した組換えTGF-β1 タンパク質によって刺激された正常軟骨細胞が、軟骨組織の再生を誘導する可能性が考察された。ヒト軟骨細胞を色々な量の組換えTGF-β1 タンパク質と混合した。この混合物を、ウサギまたはイヌの大腿関節丘上に部分的に厚い軟骨欠損を持つ、膝関節内に注入した。
【０１２８】
図14A〜14D は、正常なヒト軟骨細胞（hChon）と組換えTGF-β1 タンパク質の混合物による、ウサギにおける軟骨再生を示す。hChon と組換えTGF-β1 タンパク質の混合物またはhChonコントロールのいずれかを、大腿関節丘上に部分的に厚い軟骨欠損（3mm x 5mm、深さ1-2mm ）を持つ、ウサギの膝関節に注入した。混合物（2 x 106 NIH3T3 個/ml 15-20μl と組換えTGF-β1 タンパク質1、20、50、または90ng）を、欠損上部に入れ、欠損部を15〜20 分間そのままにし、縫合前に混合物を創傷部に浸透させた。検体を注入6週間後に収集し、顕微鏡で観察した。図 1A と 1C は、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質の混合物または、hChonのみ（C）を注入し、6週間後の大腿部関節丘の写真である。図1Bと1Dは、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質の混合物または、hChonのみ（D）を注入した、大腿関節丘断面のMason三色染色を示す。
【０１２９】
結果は、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質1ng の混合物では軟骨再生は起こらず（データの掲載なし）、一方、混合物中の組換えTGF-β1タンパク質の量を10、50、または90ng にすると硝子様軟骨が誘発されることを示している。これらの結果は、また硝子様軟骨の再生は、混合物中の組換えTGF-β1 タンパク質の量を増やすと誘発されること、つまり軟骨再生は投与するTGF-β1 タンパク質の量に依存することを示している。
【実施例８】
【０１３０】
図15A〜15F は、正常なヒト軟骨細胞（hChon）と組換えTGF-β1 タンパク質の混合物による、イヌにおける軟骨再生を示す。hChon と組換えTGF-β1 タンパク質の混合物またはhChonコントロールのいずれかを、大腿関節丘上に部分的に厚い軟骨欠損（3mm x 10mm、深さ1-2mm ）を持つ、イヌの膝関節に注入した。混合物（2 x 106 hChon個/ml 20-25μl と組換えTGF-β1 タンパク質100、200、または400ngを混合）を、欠損上部に入れ、欠損部を15〜20 分間そのままにし、縫合前に混合物を創傷部に浸透させた。検体を注入8週間後に収集し、顕微鏡で観察した。図 2A、2C、2E は、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質200ng (A) または 400ng (B) の混合物あるいは、hChonのみ（E）を注入した、8週間後の大腿部関節丘の写真である。図2B、2D、4F は、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質200ng (B) または 400ng (D) の混合物あるいは、hChonのみ（F）を注入した、大腿関節丘断面のMason三色染色を示す。
【０１３１】
結果は、hChonと組換えTGF-β1 タンパク質100ngの混合物では軟骨再生は起こらず（データの掲載なし）、一方、混合物中の組換えタンパク質の量を200 または 400ng  にすると硝子様軟骨が誘導されることを示している。イヌにおけるこれらの結果も、硝子様軟骨の再生は、混合物中の組換えTGF-β1 タンパク質の量に依存することを示している。
【０１３２】
本発明の特定の実施形態を図を使用して上述したが、付録の請求項に定義してあるように、本発明の詳細として多数のバリエーションが、発明範囲から外れずに実施できることは、当分野の技術者には明らかであろう。
【０１３３】
本明細書で引用しているすべての参考文献は、その全文が添付されている。
【０１３４】
参考文献 
【０１３５】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
本発明は、以上に記載する本発明の詳細な説明と、実例のみを示した添付図面（つまり本発明に限定されない）から十分に理解される。その図面についてここで説明する。
【０１３７】
【図１】図1は、TGF-β1 mRNAの発現を示す。全RNA は、NIH 3T3細胞またはTGF-β1発現ベクターであるpmTβ1を安定に形質移入したNIH 3T3 細胞から単離し、亜鉛の不在または共存下で増殖させた。全RNA （15 mg）を、TGF-β1 cDNA またはコントロールのβ アクチン cDNA のいずれかでプローブした。
【図２】図2A〜2B は、再生された軟骨の肉眼所見である。  2A.長方形の部分的軟骨欠損を大腿関節丘に作り、膝関節にTGF-β1 形質移入なしのNIH 3T3 細胞を注入した。欠損は覆われていなかった。  2B.NIH 3T3-TGF-β1 細胞の注入後6週間で、欠損部は新たに形成された組織で覆われた。再生組織の色は、周辺軟骨と殆ど同一であった。
【図３】図3A〜3D は、再生軟骨の顕微鏡所見である（X 200）。  3A および 3B.コントロール細胞注入4週間後と6週間後の欠損部のヘマトキシリン−エオシン（H&E）分析。欠損開始領域は組織で覆われていない。  3C および 3D.TGF-β1形質移入細胞注入4週間後と6週間後の欠損部のヘマトキシリン−エオシン（H&E）分析。TGF-β1形質移入細胞注入後4週目、部分的欠損領域は硝子軟骨は覆われている。注入後4週と6週目で、再生組織はさらに厚くなり、その厚さは6週目には正常軟骨とほぼ一致した。組織学的に、再生軟骨（矢印）は周辺の硝子軟骨と同一であった。
【図４】図4A〜4B は、ウサギの関節におけるTGF-β1 発現の免疫組織化学的分析（x 200）を示す。茶色の免疫ペルオキシダーゼ反応生成物は、NIH 3T3-TGF-β1 細胞（4B）において組み換えTGF-β1 発現が高濃度であることを示している。  4Aは、コントロール細胞を注入したウサギの関節中の硝子軟骨を示す。
【図５】図5A〜5B は、再生組織のH&E 染色（A）とサフラニン-O 染色（B）の顕微鏡所見（X 200）を示す。  5A.H&E 染色によって、部分的損傷領域に、再生された硝子軟骨が認められる（黒矢印）。  5B.完全に裸になった軟骨領域に再生された組織は繊維性コラーゲンであった（白矢印）。
【図６】図 6 はpmTβ1のプラスミドマップを示す。
【図７】図7A〜7D は、TGF-β1を形質移入した細胞を注入した、ウサギのアキレス腱の肉眼形態所見を示す。  7A.コントロール細胞を注入した腱  7B.TGF-β1 形質移入細胞の注入6週間後の腱  7C.7Aの腱の横断面  7D.7Bの腱の横断面
【図８】図8A〜8F は、ウサギのアキレス腱に再生した組織のH&E 染色による顕微鏡所見を示す。  8A、8B、8C は、コントロール細胞の注入6週間後の腱を示す。8A. 倍率x50 8B. 倍率x200  8C. 倍率x600  8D、8E、8F は、TGF-β1 形質移入細胞の注入6週間後の腱を示す。8D. 倍率x50 8E. 倍率x200  8F. 倍率x600 。腱に注入したTGF-β1 形質移入細胞は、内因性腱細胞よりも丸く見える。オートクリンおよびパラクリン様式の作用によって、繊維性コラーゲンを生成し、腱を増大させた。TGF-β1 形質移入細胞の注入後、腱は増大した。
【図９】図9A〜9B は、ウサギのアキレス腱中の再生組織をH&E 染色（A）およびTGF-β1 抗体を用いた免疫組織化学染色（B）した、顕微鏡所見を示す。茶色の免疫ペルオキシダーゼ反応生成物は、NIH 3T3-TGF-β1 細胞において組み換えTGF-β1 発現が高濃度であることを示している。
【図１０】図10A〜10F と 10A'〜10F' は、照射したNIH3T3- TGF-β1 繊維芽細胞による軟骨再生を示す。
【図１１】図11A-H は、TGF-β1を産生するヒト包皮繊維芽細胞による軟骨再生を示す。
【図１２】図12A-H は、イヌをモデルとしたNIH3T3-TGF-β1 細胞による軟骨再生を示す。
【図１３】図13A〜C は、繊維芽細胞を産生するTGF-β1の注入3週後の、TGF-β1 抗体を用いた再生軟骨の免疫組織化学染色を示す。
【図１４】図14A〜14D は、部分的に厚い欠損を持つウサギにおける、ヒト軟骨細胞（hChon）と組換えTGF-β1 タンパク質の混合物による、軟骨再生を示す。
【図１５】図15A〜15F は、部分的に厚い欠損を持つイヌにおける、ヒト軟骨細胞と組換えTGF-1 タンパク質混合物注入による軟骨再生を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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