(57)【要約】本発明は、1つの局面において、転写アクチベーター（これはその後、関心対象の遺伝子を駆動する）の発現を駆動するための組織選択的プロモーターの使用に基づく二成分性またはバイシストロン性発現系を用いて遺伝子産物を選択的に発現するための方法を提供する。別の局面において、本発明は、任意で二成分性またはバイシストロン性発現系と結合させた組織選択的プロモーター（例えば、hTERTまたはCEA）を使用して、Bax、TRAIL、または種々の他の治療タンパク質を発現させる工程を包含する癌治療の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞型選択的な様式で遺伝子産物を発現させるための方法であって、転写因子が発現されて、選択されたポリペプチドの発現を指示する方法：
（a）転写因子をコードする核酸の発現を指示する細胞型選択的プロモーターを含む第1の発現カセットを提供する工程；
（b）選択されたポリペプチドをコードする核酸の発現を指示する該転写因子に応答性である誘導性プロモーターを含む第2の発現カセットを提供する工程；および
（c）該細胞型特異的選択的プロモーターが活性である細胞に、該第1の発現カセットおよび第2の発現カセットを移入させる工程。
【請求項２】
細胞型選択的プロモーターがhTERT、CEA、PSA、プロバシン、ARR2PB、またはAFPである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
転写因子がGAL4-VP16融合物であり、誘導性プロモーターがGAL4/TATAである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
転写因子がtetR-VP16融合物であり、誘導性プロモーターがtetオペレーターである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第1の発現カセットおよび第2の発現カセットが異なる発現構築物に位置している、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第1の発現カセットおよび第2の発現カセットが同じ発現構築物に位置している、請求項1記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1つの発現カセットがウイルス発現構築物中に位置している、請求項1記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの発現カセットが非ウイルス発現構築物中に位置している、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞が腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
選択されたポリペプチドが腫瘍抑制因子、アポトーシスの誘導因子、サイトカイン、酵素、または毒素である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
腫瘍抑制因子がp53、Rb、PTEN、BRCA1、およびBRCA2である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシスの誘導因子がBax、Bad、Bid、Bik、Bak、TRAIL、FasL、Noxa、PUMA、p53AIP1、TGF-β、GranzymeA、またはGranzymeBである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
サイトカインがIL-2、IL-4、IL-10、IL-12、GM-CSF、MCP-3、TNF-α、またはINF-βである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
酵素がシトシンデアミナーゼである、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
毒素がリシンA鎖、コレラ毒素、および百日咳毒素である、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞が、脳腫瘍細胞、頭頚部腫瘍の細胞、食道腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞、頸部（cervical）腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、直腸腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、または血液腫瘍細胞からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む、癌を有するヒト被験体を治療する方法であって、転写因子が発現されて、治療ポリペプチドの発現を指示する方法：
（a）転写因子をコードする核酸の発現を指示するCEAまたはhTERTプロモーターを含む第1の発現カセットを提供する工程；
（b）治療ポリペプチドをコードする核酸の発現を指示する該転写因子に応答性である誘導性プロモーターを含む第2の発現カセットを提供する工程；および
（c）該第1および第2の発現構築物を、該被験体の癌細胞に移入させる工程。
【請求項１８】
（i）転写因子がGAL4-VP16融合物でありかつ誘導性プロモーターがGAL4/TATAであるか、または（ii）転写因子がtetR-VP16融合物でありかつ誘導性プロモーターがtetオペレーターである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第1および第2の発現カセットが異なる発現構築物中に位置している、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第1および第2の発現カセットが同じ発現構築物中に位置している、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つの発現カセットがウイルス発現構築物中に位置している、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つの発現カセットが非ウイルス発現構築物中に位置している、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
ウイルス発現構築物が、アデノウイルス発現構築物、ヘルペスウイルス発現構築物、レトロウイルス発現構築物、ワクシニアウイルス発現構築物、アデノ関連ウイルス発現構築物、またはポリオーマウイルス発現構築物である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
選択されたポリペプチドが腫瘍抑制因子、アポトーシスの誘導因子、サイトカイン、酵素、または毒素である、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍抑制因子がp53、Rb、PTEN、BRCA1、およびBRCA2である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
アポトーシスの誘導因子がBax、Bad、Bid、Bik、Bak、TRAIL、FasI、Noxa、PUMA、p53AIP1、TGF-β、GranzymeAまたはGranzymeBである、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
サイトカインがIL-2、IL-4、IL-10、IL-12、GM-CSF、MCP-3、TNF-α、またはINF-βである、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
酵素がシトシンデアミナーゼである、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
毒素がリシンA鎖中の毒素、コレラ毒素、および百日咳毒素である、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
癌が脳癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸（cervical）癌、卵巣癌、精巣癌、直腸癌、皮膚癌、または血液癌からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項３１】
外科手術、免疫療法、化学療法、または放射線療法を含む第2の癌治療を行う工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項３２】
以下の工程を含む、ヒト癌患者を治療する方法であって、腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子が発現されて癌細胞の増殖を阻害し、それによって該癌を治療する方法：
（a）腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする核酸の発現を指示するhTERTプロモーターを含む非ウイルス発現カセットを提供する工程；および
（b）該患者に該発現カセットを投与する工程。
【請求項３３】
腫瘍抑制因子がp53、Rb、PTEN、BRCA1、およびBRCA2である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
アポトーシスの誘導因子がBax、Bad、Bid、Bik、Bak、TRAIL、FasL、Noxa、PUMA、p53AIP1、TGF-β、GranzymeAまたはGranzymeBである、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
癌細胞が死滅する、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも1つの発現カセットがウイルス発現構築物中に位置する、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする核酸が、該腫瘍抑制因子または該アポトーシスの誘導因子に融合されたスクリーニング可能なマーカーをさらにコードする、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも1つの発現カセットが非ウイルス発現構築物に位置している、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
外科手術、免疫療法、化学療法、または放射線療法を含む第2の癌治療を行う工程をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
癌が脳癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、精巣癌、直腸癌、皮膚癌、または血液癌からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、2001年8月8日に出願された同時係属中の米国特許仮出願第60/310,905号に対する優先権を主張する。上述の開示の全文は、放棄されることなく、本明細書中に参照として明確に組み入れられる。米国政府は、米国国立衛生研究所からの補助金番号P50CA70907-01によって、本発明における権利を所有する（テキサス大学の肺癌におけるSPORE）。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は一般的に、腫瘍学、分子生物学、および遺伝子治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、治療遺伝子の発現を特定の細胞および組織に制限することが、例えば、送達された遺伝子の毒性減少、および/またはその効果増強における処置上の恩典のために必要とされるような、疾患の遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 関連技術の説明
癌遺伝子治療における最も望ましい目標とは、特定の部位または組織に対する治療遺伝子の薬学的効果の標的化である。発現標的化のための一般的なアプローチの1つは、組織特異的または細胞特異的なプロモーターを介して遺伝子発現を制御することである。すでに同定されたいくつかのプロモーターは、それらが生じた組織または器官よりも特定の腫瘍型においてより活性であり、従って、非特異的遺伝子送達後に腫瘍中でのトランスジーン発現を制限するために広範に開発されてきた。例えば、チロシナーゼプロモーターはメラノーマにおいて；癌胎児性抗原プロモーターは結腸直腸癌細胞または肺癌細胞において；MUC1プロモーターは乳癌において；およびE2Fプロモーターは欠損性網膜芽細胞腫遺伝子を有する癌において、治療遺伝子の特異的発現を達成するために使用されてきた。
【０００４】
これらの報告により、比較的に腫瘍特異的なトランスジーン発現を達成することは実現可能であることが示唆されたが、これらはまたいくつかの制限を示していた。現在腫瘍特異的発現を駆動するために使用されている大部分のプロモーターの主要な問題とは、転写活性の弱さである。実際、一般に使用されるウイルスプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列、およびSV40プロモーター）よりもはるかに弱いものがほとんどである。その結果遺伝子発現が低くなり、発現された治療遺伝子に対応する抗腫瘍活性が欠如する。従って、腫瘍特異的プロモーターは、癌治療のための興味深い選択肢を提供するが、それらの固有の弱点-転写レベルの低さ-のため、使用には根本的な障害が存在する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
従って、本発明に基づくと、細胞型選択的な様式で遺伝子産物を発現するための方法が提供されるが、この方法は以下の工程を含み、ここで、上記転写因子が発現され、かつ上記選択されたポリペプチドの発現を指示する：（a）転写因子をコードする核酸の発現を指示する細胞型選択的プロモーターを含む第1の発現カセットを提供する工程；（b）選択されたポリペプチドをコードする核酸の発現を指示する上記転写因子に応答性である誘導性プロモーターを含む第2の発現カセットを提供する工程；および（c）上記細胞型特異的選択的プロモーターが活性である細胞に、上記第1の発現カセットおよび第2の発現カセットを移入させる工程。
【０００６】
細胞型選択的プロモーターはhTERT、CEA、PSA、プロバシン、ARR2PB、またはAFPであり得る。上記転写因子はGAL4-VP16融合物であり得、上記誘導性プロモーターはGAL4/TATAであり得る。あるいは、上記転写因子はtetR-VP16融合物であり得、および上記誘導性プロモーターはtetオペレーターであり得る。上記第1の発現カセットおよび第2の発現カセットは異なる発現構築物に配置され得るか、または同じ発現構築物に配置され得る。上記発現カセットは、ウイルス発現構築物または非ウイルス発現構築物に配置され得る。上記ウイルス発現構築物は、アデノウイルス発現構築物、ヘルペスウイルス発現構築物、レトロウイルス発現構築物、ワクシニアウイルス発現構築物、アデノ関連ウイルス発現構築物、またはポリオーマウイルス発現構築物であり得る。上記細胞は、脳腫瘍細胞、頭頚部腫瘍の細胞、食道腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞、頸部（cervical）腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、直腸腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、または血液腫瘍細胞のような腫瘍細胞であり得る。
【０００７】
選択されたポリペプチドは、腫瘍抑制因子、アポトーシスの誘導因子、サイトカイン、酵素、または毒素であり得る。上記腫瘍抑制因子は、例えば、p53、Rb、PTEN、BRCA1、またはBRCA2であり得る。上記アポトーシスの誘導因子は、例えば、Bax、Bad、Bid、Bik、Bak、TRAIL、FasL、Noxa、PUMA、p53AIP1、TGF-β、Granzyme A、またはGranzyme Bであり得る。上記サイトカインは、例えば、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、GM-CSF、MCP-3、TNF-α、またはINF-βであり得る。上記酵素は、例えば、シトシンデアミナーゼであり得る。上記毒素は、例えば、リシンA鎖、コレラ毒素、および百日咳毒素であり得る。
【０００８】
別の態様において、癌を有するヒト被験体を治療する方法が提供され、この方法は以下の段階を含み、ここで、上記転写因子が発現され、かつ上記治療ポリペプチドの発現を指示する：（a）転写因子をコードする核酸の発現を指示するCEAまたはhTERTプロモーターを含む第1の発現カセットを提供する工程；（b）治療ポリペプチドをコードする核酸の発現を指示する上記転写因子に応答性である誘導性プロモーターを含む第2の発現カセットを提供する工程；ならびに（c）上記第1および第2の発現構築物を、上記被験体の癌細胞に移入させる工程。
【０００９】
細胞型選択的プロモーターはhTERT、CEA、PSA、プロバシン、ARR2PB、またはAFPであり得る。上記写因子はGAL4-VP16融合物であり得、上記誘導性プロモーターはGAL4/TATAであり得る。あるいは、上記転写因子はtetR-VP16融合物であり得、および上記誘導性プロモーターはtetオペレーターであり得る。上記第1の発現カセットおよび第2の発現カセットは異なる発現構築物に配置され得るか、または同じ発現構築物に配置され得る。上記発現カセットは、ウイルス発現構築物または非ウイルス発現構築物に配置され得る。上記ウイルス発現構築物は、アデノウイルス発現構築物、ヘルペスウイルス発現構築物、レトロウイルス発現構築物、ワクシニアウイルス発現構築物、アデノ関連ウイルス発現構築物、またはポリオーマウイルス発現構築物であり得る。上記細胞は、脳腫瘍細胞、頭頚部腫瘍の細胞、食道腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、胃腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肝臓腫瘍細胞、腎臓腫瘍細胞、前立腺腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞、頸部（cervical）腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、直腸腫瘍細胞、皮膚腫瘍細胞、または血液腫瘍細胞のような腫瘍細胞であり得る。
【００１０】
選択されたポリペプチドは、腫瘍抑制因子、アポトーシスの誘導因子、サイトカイン、酵素、または毒素であり得る。上記腫瘍抑制因子は、例えば、p53、Rb、PTEN、BRCA1、またはBRCA2であり得る。上記アポトーシスの誘導因子は、例えば、Bax、Bad、Bid、Bik、Bak、TRAIL、FasL、Noxa、PUMA、p53AIP1、TGF-β、Granzyme A、またはGranzyme Bであり得る。上記サイトカインは、例えば、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、GM-CSF、MCP-3、TNF-α、またはINF-βであり得る。上記酵素は、例えば、シトシンデアミナーゼであり得る。上記毒素は、例えば、リシンA鎖、コレラ毒素、および百日咳毒素であり得る。上記方法はさらに、外科手術、免疫療法、化学療法、または放射線療法を含む第2の癌治療を行う工程を含み得る。
【００１１】
なお別の態様において、ヒト癌患者を治療する方法が提供され、この方法は、以下の段階を含み、ここで、上記腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子が発現されて癌細胞の増殖を阻害し、それによって上記癌を治療する：（a）腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする核酸の発現を指示するhTERTプロモーターを含む非ウイルス発現カセットを提供する工程；および（b）上記被験体に上記発現カセットを投与する工程。上記癌細胞は単にそれらの増殖が阻害され得るか、またはそれらは死滅（killing）し得る。上記方法はさらに、外科手術、免疫療法、化学療法、または放射線療法を含む第2の癌治療を行う工程を含み得る。件腫瘍抑制因子またはアポトーシスの誘導因子をコードする核酸は、上記腫瘍抑制因子または上記アポトーシスの誘導因子に融合されたスクリーニング可能なマーカーをさらにコードし得る。
【００１２】
添付の図面は本明細書の一部を形成し、かつ本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれるものである。本発明は、本明細書中に提示される特定の態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの1つまたはそれ以上の図面を参照することによって、より良好に理解され得る。
【００１３】
例示的な態様の説明
医師および研究者は一様に、癌遺伝子治療について大きな関心を持ち続けている。多数の臨床試験が行われており、可能性のある何百もの遺伝子に基づく腫瘍治療が試験されている。いかなる遺伝子治療においても2つの潜在的な問題が生じる：（a）遺伝子の発現レベル、および（b）非腫瘍組織における遺伝子発現からの毒性である。明らかに、これらの2つの問題点は互いに対抗して作用することが多い。例えば、強力な構成性プロモーターの使用は、大量の遺伝子産物を生成するために良好であり得るが、これは、特に全身投与が必要な場合に、関連毒性を付与された受容し難い代替物であることが証明され得る。逆に、組織特異的発現は、毒性産物の非常に選択的な発現を提供し得る。しかし、組織特異的発現系が十分なレベルの治療遺伝子産物を生成できないことに主に起因して、組織特異的発現は今日まで成功していない。
【００１４】
I. 本発明
本発明は、組織特異的遺伝子発現に対する新規なアプローチを用いて治療タンパク質を発現する方法を提供することによって、上記に提示した問題点に取り組むことを追求する。これは、種々の腫瘍細胞特異的プロモーターの使用、および組織特異的プロモーターのみを使用して可能であるよりも大量の遺伝子産物を産生するための発現の増幅を含む。同時に、この系は、望ましくない毒性効果を避けて、発現の絶妙な制御を提供する。さらに、本発明は、治療遺伝子であるBaxおよびTRAIL（これら両方は非腫瘍細胞に毒性効果を有することが実証されている）を駆動するためにこの固有の発現系に依存する。本発明の詳細は以下に提供される。
【００１５】
II. 細胞特異的プロモーター
本発明に従って、腫瘍特異的プロモーターは、以下にさらに詳細に記載するように、発現系の増幅と併用され得る。この発現系は、第1の例においては、組織特異的プロモーターが転写トランス活性化因子の発現を駆動する能力に依存するが、これは、その後関心対象の第2のプロモーターを作動させる。実際に、このプロモーターは、腫瘍組織に完全に特異的である必要はないが、むしろ、腫瘍組織中で選択的に活性であるべきである。換言すれば、腫瘍組織と比べて少量の、正常組織における発現は許容され得る。以下の腫瘍特異的（または選択的）プロモーターは、本発明に従う使用が意図される。
【００１６】
A. 癌胎児性抗原（CEA）プロモーター
CEAは、多くの癌において過剰発現され、臨床腫瘍マーカーとして広範に使用されている膜糖タンパク質である。Paxtonら（1987）；Thompsonら（1991）。配列分析により、CEAに密接に関連するいくつかの分子が同定されているが、それには、非特異的交差反応抗原（NCA）および胆汁の糖タンパク質が含まれる。Neumaierら（1988）；Oikawaら（1987）；Hinodaら（1991）。CEAは、いくつかの正常組織で低レベルで発現し、悪性の結腸癌および上皮細胞起源の他の癌において通常過剰発現する。CEAおよびNCAの両方の発現は、転移性の腫瘍中では完全に均質であり、これはおそらく、転移におけるこれらの抗原の重要な機能的役割に起因する。Robbinsら（1993）；JessupおよびThomas（1989）。
【００１７】
特定の細胞型にCEA遺伝子（配列番号：1）の発現を付与するシス作用性配列が同定され分析された。HauckおよびStanners（1995）；Schreweら（1990）；アクセッション番号Z21818およびAH003050。これは、翻訳開始コドンから上流の約400ヌクレオチドからなり、NCAにおける同様の配列と配列相同性を有する。Schreweら（1990）。このプロモーターは、いくつかの自殺遺伝子を駆動するために、および安定にトランスフェクトされた細胞の腫瘍異種移植片において細胞の死滅を媒介するために使用される。Osakiら（1994）；Richardsら（1995）。しかし、その遺伝子治療への応用は、その転写活性が比較的低いために制限される。この問題を解決するために、Kijimaらは、最近、CEAプロモーターからのトランスジーン発現を増強するためにCre/loxP系を使用した。Kijimaら（1999）。彼らの系において、loxP配列に隣接するスタッファーDNAが、トランスジーンと強力な上流プロモーターとの間に配置された。CEAプロモーターによって駆動されるCre遺伝子を発現する第2のベクターとの同時投与のために、スタッファーDNAは除去され、その上流のプロモーターからのトランスジーンの発現を可能にする。しかし、このアプローチは、ベクター分子の再配列を必要とし、そしていくつかの細胞型において弱くあり得る上流のプロモーターの転写活性によって制限される。
【００１８】
B. hTERTプロモーター
最近、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）がいくつかのグループによってクローニングされ、そして初代腫瘍および癌細胞株において高レベルで発現されているが、大部分の体細胞組織では抑制されていることが見い出された。Nakamuraら（1997）；Meyersonら（1997）；Kilianら（1997）；Harringtonら（1997）。データにより、hTERTがテロメラーゼ活性の鍵となる決定因子であることが示唆される。このことは、hTERT発現がテロメラーゼ活性と高度に相関すること、ならびにテロメラーゼ陰性細胞におけるhTERTの異所性発現がテロメラーゼ活性を再構築し、および正常なヒト細胞の寿命を延長するに十分であるという知見を含んでいる。Nakamuraら（1997）；Meyersonら（1997）；Kilianら（1997）；Harringtonら（1997）；Weinrichら（1997）；Nakayamaら（1998）；Counterら（1998）；Bodnarら（1998）。より最近では、正常なヒト上皮細胞および線維芽細胞の直接的な腫瘍形成性転換のためには異所性発現が必要とされるが、十分ではないことが報告された。Hahnら（1999）。
【００１９】
hTERT遺伝子のプロモーター領域もまたクローニングされた。Takakuraら（1999）；Horikawaら（1999）；Congら（1999）；アクセッション番号AB016767およびAF097365。このプロモーターは高度にGly/Cysリッチであり、TATAおよびCAATの両方のボックスを欠くが、いくつかの転写因子（MycおよびSp1を含む）についての結合部位を含む。配列番号：2。hTERTプロモーターの欠損分析により、転写開始部位の約200bp上流のコアプロモーター領域が同定された。一過性アッセイにより、コアプロモーターが癌細胞株中では有意に活性化されるが正常な初代細胞中では抑制されることが示された。
【００２０】
C. PSAプロモーター
前立腺特異的抗原（PSA）またはKLK3（時折このように呼ばれる）は、正常な前立腺上皮と大部分の前立腺癌の両方によって主に合成されるセリンプロテアーゼである。アクセッション番号S81389。PSAの発現は、アンドロゲン受容体（AR）を介して転写レベルでアンドロゲンにより主として誘導される。ARは、そのコンセンサスDNA結合部位であるGGTACAnnnTGTT/CCT（アンドロゲン応答エレメント（ARE）と呼ばれる）とのその相互作用を通して転写を調節する。Schuurら（1996）。そのコアPSAプロモーター領域は低い活性および特異性を示すが、推定のAREを含むPSAエンハンサー配列の包含は、特にPSA陽性細胞における発現を増大させる。発現は、アンドロゲン（例えば、ジヒドロテストステロン）で誘導された場合にさらに増大され得る。Lathamら（2000）。
【００２１】
D. AFPプロモーター
α-フェトプロテイン（AFP）は、卵黄嚢および胎児肝臓に高レベルで発現され、胎児腸において低レベルで発現する。アクセッション番号第L34019。肝臓および腸におけるAFP転写は、出生後28日までわずかに検出可能なレベルまで、誕生時に劇的に抑制される。この抑制は可逆的である。なぜなら、AFP遺伝子は、肝臓再生の間および肝細胞癌において再活性化され得るからである。培養細胞およびトランスジェニックマウスにおける以前の研究は、その発現を制御するAFP遺伝子の上流の5つの別個の領域を同定した。プロモーターおよび3つのエンハンサーは、正の調節エレメントとして機能する一方、負のエレメントとして作用するリプレッサーとして機能する。このプロモーターは、エキソン1のすぐ隣の250bp中に存在する。このリプレッサー（-250と-850との間に位置する600bpの領域）は、出生後のAFP抑制のために必要である。さらに上流の-2.5kb、-5.0kb、および-6.5kbには、エンハンサーI（EI）、EII、およびEIIIと呼ばれる3つのエンハンサーが存在する。これらの3つのエンハンサーは、AFPが発現されている3つの組織中で、変動する程度まで活性である。
【００２２】
E. プロバシンおよびARR2PBプロモーター
前立腺によって独特に産生され、かつ前立腺特異的なシグナルに応答するプロモーター配列によって調節される、最も特徴付けられているタンパク質の1つは、ラットプロバシンタンパク質である。プロバシンプロモーター領域の研究により、組織特異的な転写調節部位が同定され、そして組織特異的遺伝子発現のために有用なプロモーター配列が産生された。5'非翻訳領域の-426〜＋28までの塩基を含むプロバシンプロモーター配列は、CATレポーター遺伝子アッセイにおいて広範に研究されてきた（Rennieら、1993）。プロバシンプロモーターを使用する、トランスジェニックマウスモデルにおける前立腺特異的発現が報告されている（Greenbergら、1994）。これらのモデルにおける遺伝子発現レベルは、成熟期の間（2〜6週間）に見い出される遺伝子発現の70倍の増加を伴う、動物の性的成熟に匹敵した。プロバシンプロモーター（-426〜＋28）は、安定なトランスジェニック株の前立腺中の標的化された過剰発現のために、融合されたプロバシンプロモーター-シミアンウイルス40ラージT抗原遺伝子を使用する前立腺癌トランスジェニックマウスモデルを樹立するために使用された（Greenbergら、1995）。従って、プロバシンプロモーターのこの領域は、RCRベクターの3'LTR  U3領域に組み込まれ、それによって、組織特異的プロモーターエレメントによって標的化された複製適合性のMoMLVベクターを提供する。
【００２３】
プロバシンプロモーターは、他のステロイドホルモンよりもアンドロゲン選択性を付与し、そしてトランスジェニック動物の研究は、プロバシンプロモーターがアンドロゲンを標的化するが、糖質コルチコイドは標的化せず、これは前立腺特異的な様式の調節であることを実証してきた。以前のプロバシンプロモーターは低レベルのトランスジーン発現を標的化したか、または慣用的に使用されるには大きくなりすぎたかのいずれかであった。従って、プロバシンプロモーターは、小さいが、なお高レベルの前立腺特異的なトランスジーン発現を標的化するように設計された（Andrianiら、2001）。このプロモーターはARR2PBであり、これは、2つのアンドロゲン応答エレメントを含むように改変された、ラット前立腺特異的プロバシンプロモーターの誘導体である。ARR2PBプロモーター活性は厳重に調節されておりかつ高度に前立腺特異性であり、そしてアンドロゲンおよび糖質コルチコイドに応答性である。
【００２４】
III. トランス活性化タンパク質/プロモーター
本発明の1つの局面において、種々のトランス活性化可能なプロモーター系の使用が記載される。基本的な要件は、このトランス活性化エレメントは、選択された標的細胞中で機能的である単一の、核酸にコードされた因子である。2つの特定の系が以下に記載される。
【００２５】
A. GAL4-VP16系
真核生物転写調節タンパク質は、Saccharomyces酵母GAL4タンパク質に代表される。これは、これらの機能的エレメントが特徴付けられた最初の真核生物転写活性化因子の1つであった。GAL4は、六炭糖ガラクトースの利用のために必須である遺伝子の調節を担う。ガラクトースは、異化に先立ってグルコースに転換されなくてはならない；Saccharomycesにおいては、このプロセスは、代表的には、4つの反応を含み、これらは、5つの異なる酵素によって触媒される。各々の酵素は、GAL遺伝子（GAL1、2、5、7、および10）によってコードされ、これは、ガラクトースの存在に応答して、トランス活性化因子GAL4によって調節される。
【００２６】
各GAL遺伝子は、そのプロモーター中に、ガラクトースのための上流活性化配列（UASG）と名付けられたシスエレメントを有する。これは、GAL4が特異的に結合する17塩基対の配列を含む。GAL遺伝子は、ガラクトースが存在しないときには抑制されるが、ガラクトースの存在によって、強力かつ迅速に誘導される。GAL4は、ガラクトースが存在しない場合に、調節タンパク質GAL80によって転写活性化を妨害される。GAL80はGAL4に直接的に結合し、そしておそらく、GAL4の活性化ドメインと一般的な転写開始因子との間の相互作用を妨害することによって機能する。酵母がガラクトースを与えられた場合、GAL遺伝子の転写が誘導される。ガラクトースは、GAL4とGAL80との間の相互作用の変化を引き起こし、その結果、GAL4の活性化ドメインが、TFIIDによって代表される一般的な転写因子およびRNAポリメラーゼIIホロ酵素との接触が可能になるように露出し、そしてTATAエレメントにおいてGAL遺伝子の転写を生じるそれらの集合を触媒する。
【００２７】
GAL4の機能的領域は、生化学的および分子遺伝学的なストラテジーの組み合わせによって注意深く規定されてきた。GAL4は、GAL遺伝子のUASG中のその特異的エレメントに二量体として結合する。強固な二量体を形成し、DNAに特異的に結合する能力は、N末端DNA結合ドメインによって付与される。このGAL4の断片（アミノ酸1〜147）は、DNAに効率的かつ特異的に結合し得るが、転写を活性化することはできない。GAL4タンパク質の2つの部分が転写の活性化には必要であり、それらは、活性化領域1および活性化領域2と呼ばれている。これらの活性化領域は、一般的な転写因子と相互作用することによって機能すると考えられている。2つの活性化領域間のGAL4の大きな中心部分は、グルコースの存在に応答したGAL4の阻害のために必要とされる。GAL4のC末端の30アミノ酸は、陰性調節タンパク質GAL80を結合する。このセグメントの欠失は、GAL転写の構成性誘導を引き起こす。VP16断片は、単純ヘルペスウイルスVP16タンパク質由来のトランス活性化因子ドメインである。GAL4のDNA結合部分およびVP16から作製された融合産物は、適切なGAL4プロモーターの強力なトランス活性化因子を生成する。
【００２８】
B. テトラサイクリン系
別のトランス活性化系の導入は、テトラサイクリン耐性オペロン（例えば、大腸菌のTn/10）（HillenおよびWissmann、1989）の調節エレメントに基づいている。ここでは、耐性媒介遺伝子の転写が、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）によって陰性調節される。テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の存在下では、tetRは、オペロンのプロモーター領域中に位置するそのオペレーターに結合せず、転写を可能にする。真核生物の転写を活性化し得るタンパク質ドメインとtetRを組み合わせることによって、テトラサイクリンオペレーター（tetO）配列に融合された最小のプロモーターを刺激するハイブリッドトランス活性化因子が生成される。このタンパク質ドメインは、例えば、（i）酸性ドメイン（例えば、HSVからのVP16のC末端ドメイン（Triezenbergら、1988）もしくは、経験的に決定された遺伝的手段によって、同定された非真核生物酸性ドメイン（GinigerおよびPtashne、1987））または（ii）プロリンリッチドメイン（例えば、CTF/NF-1のプロリンリッチドメイン（Mermodら、1989））または（iii）セリン/スレオニンリッチドメイン（例えば、Oct-2のセリン/スレオニンリッチドメイン（TanakaおよびHerr、1990））または（iv）グルタミンリッチドメイン（例えば、Sp1のグルタミンリッチドメイン（CoureyおよびTjian、1988））である。これらのプロモーターは、低濃度のテトラサイクリンの存在下では実質上サイレントである。これは、テトラサイクリン制御のトランス活性化因子（tTA）がtetO配列に結合することを妨害する。米国特許第5,464,758号、これは、この系の使用を記載しており、参照として組み入れられる。
【００２９】
IV. 治療ポリペプチド
本発明に従って、ベクター系への挿入のための種々の治療遺伝子が提供される。これは、次には、細胞および被験体への遺伝子を送達するために使用される。種々の治療ポリペプチドが以下に記載される。
【００３０】
A. 腫瘍抑制因子
腫瘍抑制因子である発癌遺伝子は過度の細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活性化は、それらの阻害活性を破壊し、調節されない増殖を生じる。腫瘍抑制因子であるp53、Rb、およびC-CAMが以下に記載される。
【００３１】
高レベルの変異型p53が化学的発癌、紫外線照射、およびいくつかのウイルスによって形質転換された多くの細胞において見い出されてきた。p53遺伝子は、広範な種々のヒト腫瘍の変異による不活性化の頻繁な標的であり、一般的なヒトの癌において最も頻繁に変異している遺伝子であることがすでに実証されている。これは、50％を上回るヒトNSCLCで（Hollsteinら、1991）および他の腫瘍の広範なスペクトルにおいて変異されている。
【００３２】
p53遺伝子は393アミノ酸のリン酸タンパク質をコードする。これは、ラージT抗原およびE1Bのような宿主タンパク質と複合体を形成し得る。このタンパク質は、正常な組織および細胞において見い出されるが、形質転換した細胞または腫瘍組織と比較すると、その濃度は微小である。
【００３３】
野生型p53は多くの細胞型において重要な増殖調節因子であると認識されている。ミスセンス変異はp53遺伝子について一般的であり、発癌遺伝子の形質転換能力には必須である。点変異によって促進された単一遺伝的変化は発癌性p53を生成し得る。しかし、他の発癌遺伝子と違って、p53の点変異は少なくとも30の別個のコドンにおいて起こることが知られており、しばしば、ホモ接合性への減少を伴わずに細胞表現型のシフトを生成する優勢な対立遺伝子を作り出す。さらに、これらのドミナントネガティブ対立遺伝子の多くは、生物体中で許容され、生殖系列に伝えられるようである。種々の変異体対立遺伝子は、最小限に機能障害的であるものから、強力に浸透性であるドミナントネガティブ対立遺伝子に至るまでの範囲にわたると考えられる（Weinberg、1991）。
【００３４】
B. アポトーシス誘導因子
アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、正常な胚発生のための本質的なプロセスであり、成人組織のホメオスタシスを維持し、そして発癌を抑制する（Kerrら、1972）。Bcl-2タンパク質のファミリーおよびICE様プロテアーゼが他の系において重要な調節因子およびアポトーシスのエフェクターであることが実証されてきた。濾胞性リンパ腫と関連して発見されたBcl-2タンパク質は、別個のアポトーシス性刺激に応答したアポトーシスの制御および細胞生存の増強の際に顕著な役割を果たしている（Bakhshiら、1985；ClearyおよびSklar、1985；Clearyら、1986；Tsujimotoら、1985；TsujimotoおよびCroce、1986）。進化的に保存されているBcl-2タンパク質は、現在、関連するタンパク質ファミリー（デスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類され得る）のメンバーであると認識されている。
【００３５】
その発見に引き続いて、Bcl-2が種々の刺激によって誘発される細胞死を抑制するように働くことが示された。また、今日では、共通の構造的または配列の相同性を共有する、Bcl-2細胞死調節タンパク質のファミリーが存在することが明らかである。これらの異なるファミリーのメンバーは、Bcl-2に対する類似の機能を有するか（例えば、BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1）、またはBcl-2機能を相殺し、細胞死を促進するか（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）のいずれかであることが示されてきた。
【００３６】
C. 細胞増殖の誘導因子
細胞増殖を誘導するタンパク質は、機能に依存する種々のカテゴリーにさらに分類される。これらのタンパク質のすべての共通性は、細胞増殖を調節する能力である。例えば、PDGF形態のsis発癌遺伝子は、分泌された増殖因子である。発癌遺伝子は、増殖因子をコードする遺伝子からはめったに生じず、今日では、sisが唯一の公知の天然に存在する発癌遺伝子性の増殖因子である。本発明の1つの態様において、細胞増殖の特定の誘導因子に指向されるアンチセンスまたはリボザイムの構築物が、細胞増殖の誘導因子の発現を妨害するために使用されることが意図される。
【００３７】
タンパク質FMS、ErbA、ErbB、およびNeuは増殖因子受容体である。これらの受容体の変異は調節機能の損失を生じる。例えば、Neu受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響する点変異はNeu発癌遺伝子を生じる。erbA発癌遺伝子は、甲状腺ホルモンの細胞内受容体に由来する。改変した発癌遺伝子性ErbA受容体は、内因性甲状腺ホルモン受容体と競合し、制御できない増殖を生じると考えられている。
【００３８】
発癌遺伝子の最も大きなクラスには、シグナル伝達タンパク質（例えば、Src、Abl、およびRas）が含まれる。タンパク質Srcは、細胞質タンパク質チロシンキナーゼであり、プロト発癌遺伝子から発癌遺伝子へのその形質転換は、いくつかの場合において、チロシン残基527での変異を介して生じる。対照的に、GTPアーゼタンパク質rasのプロト発癌遺伝子から発癌遺伝子への形質転換は、1つの例において、配列中のアミノ酸12でのバリンからグリシンへの変異から生じ、rasのGTPアーゼ活性を減少させる。
【００３９】
タンパク質Jun、Fos、およびMycはまた、転写因子として核の機能にそれらの効果を直接的に発揮するタンパク質である。アンチセンス治療のための標的であり得る発癌遺伝子の広範なリストは以下に示される。
【００４０】
1. アンチセンス
アンチセンス法は、核酸が「相補的な」配列と対合する傾向があるという事実を利用する。相補性によって、ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン-クリックの相補性の規則に従って塩基対形成し得るものであることが意味される。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対を形成し、グアニンおよびシトシンの対（G：C）の組み合わせならびに、アデニンおよびチミジンの対（DNAの場合、A：T）またはアデニンおよびウラシルの対（RNAの場合、A：U）のいずれかの組み合わせを形成する。より一般的でない塩基（例えば、イノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチン、およびハイブリダイズする配列中の他の塩基）を含ませることは対合を妨害しない。
【００４１】
ポリヌクレオチドでの二本鎖（ds）DNAの標的化は、三重らせんの形成をもたらす；RNAの標的化は二重ヘリックス形成をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入された場合、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および/または安定化を妨害する。アンチセンスRNA構築物、またはそのようなRNAをコードするDNAは、宿主細胞中で（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物中で）、遺伝子の転写または翻訳またはその両方を、インビトロまたはインビボのいずれかで阻害するために利用され得る。
【００４２】
アンチセンス構築物は、遺伝子のプロモーターおよび他のコントロール領域、エキソン、イントロン、またはエキソン-イントロンの境界にさえ結合するように設計され得る。大部分の効果的なアンチセンス構築物は、イントロン/エキソンスプライシング結合部に相補的な領域を含むことが意図される。従って、好ましい態様は、イントロン-エキソンスプライシング結合部の50〜200塩基以内の領域に対する相補性を有するアンチセンス構築物を含むことが提案される。いくつかのエキソン配列は、その標的の選択性に深刻な影響を与えることなくその構築物中に含まれ得ることが観察されてきた。含まれるエキソン性の物質の量は、使用される特定のエキソンおよびイントロンの配列に依存して変動する。過剰なエキソンDNAが含まれているか否かは、単に正常な細胞機能が影響されるか、または相補的な配列を有する関連遺伝子の発現が影響されるかを決定するためにインビトロで構築物を試験することによって容易に試験し得る。
【００４３】
上記に言及したように、「相補性」または「アンチセンス」とは、それらの全体の長さにわたって実質的に相補的でありかつ非常に少ない塩基のミスマッチを有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、15塩基の長さの配列は、それらが13位または14位まで相補的なヌクレオチドを有する場合に相補的であるといわれ得る。当然ながら、完全に相補的な配列は、それらの全体の長さを通して完全に相補的でありかつ塩基のミスマッチを有しない配列である。低い程度の相同性を有する他の配列もまた、意図される。例えば、高い相同性の限られた領域を有するが、非相同領域もまた含むアンチセンス構築物（例えば、リボザイム；以下を参照されたい）が設計され得る。これらの分子は、50％未満の相同性を有するが、適切な条件下では標的配列に結合する。
【００４４】
特定の構築物を生成するために、ゲノムDNAの一部をcDNAまたは合成配列と組み合わせることは有利であり得る。例えば、最終的な構築物中にイントロンが存在することが望ましい場合、ゲノムクローンが使用される必要がある。cDNAまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分のための、より便利な制限酵素部位を提供し得るので、配列の残り部分に使用される。
【００４５】
アンチセンス構築物のための標的である特定の発癌遺伝子は、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、hst、gsp、bcl-2、およびablである。抗アポトーシス遺伝子および血管形成プロモーターもまた有用であることが意図される。
【００４６】
2. リボザイム
タンパク質は伝統的に核酸の触媒のために使用されてきたが、別のクラスの高分子がこの試みにおいて有用であるとして現れてきた。リボザイムは、部位特異的な様式で核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有する（KimおよびCech、1987；Gerlachら、1987；ForsterおよびSymons、1987）。例えば、多数のリボザイムはリン酸エステル転移反応を高度な特異性で加速し、しばしば1つのオリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断する（MichelおよびWesthof、1990；Reinhold-HurekおよびShub、1992）。この特異性は、化学反応の前に、基質が特異的塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「IGS」）に結合するという要件に起因する。
【００４７】
リボザイム触媒は、主に、核酸を含む配列-特異的切断/ライゲーション反応の一部として観察されてきた（Joyce、1989）。例えば、米国特許第5,354,855号は、特定のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高く、DNA制限酵素の配列特異性に近い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして機能し得ることを報告している。従って、配列特異的なリボザイム媒介の遺伝子発現の阻害は、治療的応用に特に適し得る（Scanlonら、1991；Sarverら、1990）。最近、リボザイムが、それを適用したいくつかの細胞株において、遺伝的変化を誘発したことが報告された；この変化した遺伝子には、発癌遺伝子であるH-ras、c-fos、およびHIVの遺伝子が含まれていた。この研究の大部分は、特異的なリボザイムによって切断される特異的変異コドンに基づく標的mRNAの修飾を含んだ。この態様のための標的には、VEGFのような血管形成遺伝子およびアンジオポエチンならびに発癌遺伝子（例えば、ras、myc、neu、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、hst、gsp、bcl-2、EGFR、grb2、およびabl）が含まれる。
【００４８】
（表１）発癌遺伝子
2005502645.tif 000002
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【００４９】
D. サイトカイン
本発明のアデノウイルスベクターに挿入されることが意図される遺伝子の別のクラスには、インターロイキンおよびサイトカインが含まれる：インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-インターフェロン、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、および腫瘍壊死因子。
【００５０】
E. 毒素
種々の毒素もまた、本発明の発現ベクターの一部として有用であることが意図される。これらの毒素には、リシンA鎖のような細菌の毒素（Burbage、1997）、ジフテリア毒素A（Massudaら、1997；Lidorら、1997）、百日咳毒素Aサブユニット、大腸菌エンテロトキシン毒素Aサブユニット、コレラ毒素Aサブユニット、およびシュードモナス毒素c末端が含まれる。調節可能なジフテリアトキシンA鎖遺伝子の融合タンパク質を含むプラスミドのトランスフェクションは、癌細胞に細胞毒性であることは実証されてきた。従って、調節された毒素遺伝子の遺伝子移入はまた、癌の治療に適用され得る（Massudaら、1997）。
【００５１】
F. 単鎖抗体
なお別の態様において、1つの遺伝子が単鎖抗体を含み得る。単鎖抗体の産生のための方法は、当業者に周知である。このような方法については、当業者は米国特許第5,359,046号（参照として本明細書に組み入れられる）を引用する。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して重鎖および軽鎖の鎖の可変ドメインを互いに融合させることによって作製され、それによって単一の分子上の抗原結合部位を再構築する。
【００５２】
1つの可変ドメインのC末端が15〜25アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他のドメインのN末端につながれている単鎖抗体可変断片（scFv）は、抗原結合または結合の特異性を有意に破壊することなく開発されている（Bedzykら、1990；Chaudharyら、1990）。これらのFvは、天然抗体の重鎖および軽鎖に存在する定常領域（Fc）を欠く。
【００５３】
広範な種々の分子、例えば、発癌遺伝子、増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子、または受容体に対する抗体が意図される。血管形成因子（VEGF/VSP；βFGF；αFGF）および血管形成に必要である内皮抗原（すなわち、V3インテグリン）に対する分泌抗体（血清に標的化される）もまた、意図される。トランスフォーミング増殖因子および血小板由来の増殖因子のような増殖因子が特に意図される。
【００５４】
G. 転写因子および調節因子
有利な組み合わせにおいて適用され得る別のクラスの遺伝子は、転写因子である。その例としては、C/EBPα、IκB、NfκB、Par-4、およびC/EBPαが含まれる。
【００５５】
H. 細胞周期調節因子
細胞周期調節因子は、他の遺伝子と組み合わせた場合に可能性のある利点を提供する。細胞増殖を阻害するために役立つ調節因子の例はp16である。真核細胞の細胞周期の主な遷移はサイクリン依存性キナーゼ（CDK）によって引き起こされる。CDKの1つであるサイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）は、G1を経由する進行を調節する。この酵素の活性は、後期G1においてRbをリン酸化することであり得る。CDK4の活性は活性化サブユニットであるD型サイクリンによって、および阻害サブユニットによって制御されている。阻害サブユニットであるp16INK4は、CDK4に特異的に結合しかつ阻害するタンパク質として生化学的に特徴付けされ、従ってRbリン酸化を調節し得る（Serranoら、1993；Serranoら、1995）。p16INK4タンパク質はCDK4阻害因子であるので（Serrano、1993）、この遺伝子の欠損はCDK4の活性を増大させ得、Rbタンパク質の過剰なリン酸化を生じる。p16もまた、CDK6の機能を調節することが知られている。
【００５６】
p16INK4は、新規に記載されたCDK阻害タンパク質のクラスに属し、これには、p16B、p19、p21WAF1、およびp27KIP1もまた含まれる。p16INK4遺伝子は、多くの腫瘍型においてしばしば欠損される染色体の領域である9p21にマッピングされる。p16INK4遺伝子のホモ接合性欠損および変異は、ヒト腫瘍細胞株においてしばしば起こる。この証拠はp16INK4遺伝子が腫瘍抑制因子遺伝子であることを示唆する。しかし、p16INK4遺伝子の変化の頻度が培養細胞株よりも初代非培養腫瘍において非常に低いという観察によって（Caldasら、1994；Chengら、1994；Hussussianら、1994；Kambら、1994；Okamotoら、1994；Noboriら、1995；Orlowら、1999）、この解釈は困難であった。プラスミド発現ベクターを用いるトランスフェクションによる野生型のp16INK4機能の回復は、いくつかのヒト癌細胞株によるコロニー形成を減少させた（Okamoto、1994）。
【００５７】
他のこのような細胞周期調節因子には、p27、p21、p57、p18、p73、p19、p15、E2F-1、E2F-2、E2F-3、p107、p130、およびE2F-4が含まれる。他の細胞周期調節因子には、可溶性Flt1（ドミナントネガティブ可溶性VEGF受容体）のような抗血管形成タンパク質、可溶性Wnt受容体、可溶性Tie2/Tek受容体、マトリックスメタロプロテアーゼ2の可溶性ヘモペキシンドメイン、および他の血管形成サイトカインの可溶性受容体（例えば、VEGFR1/KDR、VEGFR3/Flt4、どちらもVEGF受容体）が含まれる。
【００５８】
I. ケモカイン
ケモカインをコードする遺伝子もまた、本発明において使用され得る。ケモカインは一般的に、ケモカイン発現の部位に免疫エフェクター細胞を補充するための化学誘因物質として作用する。治療部位に他の免疫系成分の補充を増強するために、例えば、サイトカイン遺伝子と組み合わせて特定のケモカイン遺伝子を発現させることは有利であり得る。このようなケモカインには、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、およびIP-10が含まれる。当業者は、特定のサイトカインもまた化学誘因物質効果を有することが知られており、ケモカインという用語の下に分類され得ることを認識する。
【００５９】
V. 癌を有する被験体の治療
従って、本発明に従って、癌患者は、組織選択的プロモーターを転写活性化系（例えば、テトラサイクリンまたはGAL4/VP16）と組み合わせて利用して、適切な遺伝子治療ベクターで治療され得る。多数の癌、例えば、脳癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮頸（cervical）癌、卵巣癌、精巣癌、直腸癌、皮膚癌、または血液癌が治療され得る。以下に議論するように、構築物および送達の方法は変化し得、適切なように使用され得る。
【００６０】
A. ベクター
「ベクター」という用語は、（核酸配列が複製されるための）細胞への導入のために核酸配列が挿入され得る担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外因性」であり得る。これは、ベクターが導入される細胞に対して外来性であること、または、その配列が細胞中の配列と相同であるが、その配列が通常見つかっていない宿主細胞の核酸中の位置にあることを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、標準的な組換え技術を通してベクターを構築するための準備を十分に行う（例えば、Maniatisら、1988およびAusubelら、1994（両方が参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。
【００６１】
「発現ベクター」という用語は、転写され得るRNAをコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を指す。いくつかの場合において、RNA分子は、次には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生に使用され、翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含み得、これは、特定の宿主細胞中で作動可能に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳のために必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を司る制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を同様に働かせる核酸配列を含み得る（以下に記載する）。
【００６２】
a. 開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルがコード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルには、ATG開始コドンまたは隣接する配列が含まれる。外因性翻訳制御シグナル（ATG開始コドンを含む）もまた、提供される必要があり得る。当業者は、これを決定することおよび必要なシグナルを提供することができる。挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンが所望のコード配列の読み枠と「インフレーム（in-frame）」になければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然であるかまたは合成であるかのいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによて増強され得る。
【００６３】
本発明の特定の態様において、内部リボソームエントリー部位（IRES）エレメントの使用は、多重遺伝子の、または多シストロン性のメッセージを作製するために使用される。IRESエレメントは、5'メチル化キャップのリボソームスキャニングモデル依存性の翻訳をバイパスし、内部部位で翻訳を開始し得る（PelletierおよびSonenberg、1988）。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）からのIRESエレメント（PelletierおよびSonenberg、1988）が、哺乳動物メッセージ（MacejakおよびSarnow、1991）からのIRESと同様に記載されている（PelletierおよびSonenberg、1988）。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写され得、各々はIRESによって分離され、多シストロン性メッセージを生成する。IRESエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために、単一のプロモーター/エンハンサーを使用して、効率的に発現され得る（米国特許第5,925,565号および同第5,935,819号、各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６４】
b. マルチクローニング部位
ベクターはマルチクローニング部位（MCS）を含み得るが、これは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、その全てが、ベクターを消化するために標準的な組換え技術とともに使用され得る（例えば、Carbonelliら、1999；Levensonら、1998；およびCocea、1997（参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。「制限酵素消化」とは、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素を用いる核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は当業者に広範に理解されている。一般に、ベクターは、MCS中で切断する制限酵素を使用して線状化または断片化され、外因性配列がベクターにライゲーションされることを可能にする。「ライゲーション」とは、2つの核酸断片間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。これらは互いに連続していてもしていなくてもよい。制限酵素およびライゲーションを含む技術は組換え技術の分野における当業者に周知である。
【００６５】
c. スプライシング部位
転写された真核生物RNA分子の大部分は、一次転写物からのイントロンの除去のためにRNAスプライシングを受ける。ゲノムの真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の正しいプロセシングを確実にするためにドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る（例えば、Chandlerら、1997を参照されたい）。
【００６６】
d. 終止シグナル
本発明のベクターまたは構築物は、一般的には少なくとも1つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」または「ターミネーター」は、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的な終結に関与するDNA配列からなる。従って、特定の態様において、RNA転写物の産生を終了する終止シグナルが意図される。ターミネーターは、所望のメッセージレベルをインビボで達成するために必要とされ得る。
【００６７】
真核生物系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出させるために新規な転写物の新規な転写物の部位特異的切断を可能にする特定のDNA配列を含み得る。これは、連続した約200塩基のA残基（ポリA）を転写物の3'末端に付加するための特別な内因性ポリメラーゼにシグナルを伝達する。このポリAテールで修飾されたRNA分子はより安定と考えられかつより効率的に翻訳される。従って、真核生物を含む他の態様において、ターミネーターはRNAの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、そしてこのターミネーターシグナルはメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび/またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強するため、およびカセットから他の配列への読み取りを最小化するために役立ち得る。
【００６８】
本発明における使用のために意図されるターミネーターには、本明細書中に記載されたか、または当業者に公知である、任意の公知の転写ターミネーターが含まれ得る。このようなターミネーターには、例えば、遺伝子の終止配列（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター）またはウイルス終止配列（例えば、SV40ターミネーター）が含まれるがこれらに限定されない。特定の態様において、終止シグナルは、例えば配列の短縮化によって、転写可能配列または翻訳可能配列を欠失してもよい。
【００６９】
e. ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物発現において、代表的には、転写物の正しいポリアデニル化をもたらすためのポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の良好な実施のためには決定的ではないと考えられており、いかなるこのような配列も利用され得る。好ましい態様には、種々の標的細胞において便利かつ良好に機能することが知られている、SV40ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大させ得るか、または細胞質輸送を容易にし得る。
【００７０】
f. 複製起点
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、ベクターは、1つまたはそれ以上の複製起点部位（しばしば「ori」と呼ばれる）を含み得、これは、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母の場合には、自立複製配列（ARS）が利用され得る。
【００７１】
g. 選択可能およびスクリーニング可能なマーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般的には、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与する。陽性選択マーカーの存在によりその選択が可能になるが、一方、陰性選択マーカーの存在は、その選択を妨げる。陽性選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【００７２】
通常、薬物選択マーカーの含有は、形質転換体のクローニングおよび同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の区別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色定量的分析に基づいたGFPなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の型のマーカーもまた、意図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のようなスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者はまた、免疫学的マーカーをいかにして（可能ならばFACS分析とともに）利用するかを知っている。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸とともに同時に発現され得る限りは、重要でないと考えられている。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００７３】
h. プラスミドベクター
特定の態様において、プラスミドベクターが宿主細胞を形質転換する用途のために意図される。一般的には、宿主細胞に適合可能な種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主とともに使用される。このベクターは、通常、複製部位、ならびに、形質転換した細胞中で表現型選択を提供し得るマーカー配列を有する。非限定的な例において、大腸菌は、大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換されることが多い。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、従って、形質転換した細胞の同定のための容易な手段を提供する。pBRプラスミドもしくは他の微生物プラスミドまたはファージもまた、例えば、それ自体のタンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターを含まなければならないか、または含むように改変されなければならない。
【００７４】
さらに、宿主微生物に適合可能なレプリコンおよび制御配列を含むファージベクターが、これらの宿主細胞とともに形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージλGEM（商標）-11が宿主細胞（例えば、大腸菌LE392）を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターを作製する際に利用され得る。
【００７５】
さらに有用なプラスミドベクターには、後の精製および分離または切断用のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）可溶性融合タンパク質生成の際に使用される、pINベクター（Inoueら、1985）およびpGEXベクターが含まれる。他の適切な融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを伴うタンパク質である。
【００７６】
発現ベクターを含む細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）は、多数の適切な培地のいずれか（例えば、LB）中で増殖される。特定のベクター中での組換えタンパク質の発現は、当業者によって理解されるように、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な薬剤と接触させることによって（例えば、IPTGを培地に添加することによって）、またはインキュベーションをより高い温度に変更することによって誘導され得る。さらなる時間（一般的には2時間〜24時間の間）細菌を培養した後、細胞を遠心分離によって収集し、洗浄して、残存する培地を取り除く。
【００７７】
i. ウイルスベクター
特定のウイルスが、細胞に感染するかまたは受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、そして宿主細胞ゲノムに組み込まれかつウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力により、そのウイルスは、外来性の核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移入させるための有力候補となる。従って、本発明の核酸はウイルスベクターに含まれ得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例は以下に記載される。
【００７８】
1. アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターのゲノムDNAへの組み込み能力は低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって与えられる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（a）構築物のパッケージングを支持するため、および（b）そこにクローニングされた組織または細胞特異的構築物を最終的に発現するために、十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。遺伝子的な構成の知識、すなわち、アデノウイルス、36kb、直鎖状、二本鎖DNAウイルスにより、アデノウイルスDNAの大部分を最大7kbの外来性配列で置換することが可能になる（Grunhausら、1994）。
【００７９】
2. AAVベクター
核酸は、アデノウイルスで補助されるトランスフェクションを使用して細胞に導入され得る。増加されたトランスフェクション効率は、アデノウイルスの共役した系を使用する細胞系において報告されている（KelleherおよびVos、1994；Cottenら、1992；Curiel、1994）。アデノ関連ウイルス（AAV）は、高頻度の組み込みを有し、およびこれは分裂しない細胞に感染し得、それゆえに、例えば、組織培養（Muzyczka、1992）またはインビボにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子の送達のためにこのウイルスを有用なものにするので、本発明における使用のための魅力的なベクター系である。AAVは、感染性について広い宿主範囲を有する（Tratschinら、1984；Laughlinら、1986；Lebkowskiら、1988；McLaughlinら、1988）。rAAVベクターの産生および使用に関する詳細は、米国特許第5,139,941号および同第4,797,368号（各々が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００８０】
3. レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、宿主ゲノムに自己遺伝子を組み込む能力のため、抗原送達ベクターとして有望であり、大量の外来性の遺伝的物質を移入させ、広いスペクトルの種および細胞型を感染させ、そして特別な細胞株中にパッケージングされる（Miller、1992）。
【００８１】
ワクチンレトロウイルスベクターを構築するために、核酸が特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入され、複製欠損性であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Mannら、1983）。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とともにcDNAを含む組換えプラスミドが特別な細胞株に導入された場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、このパッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、次いでこれは、培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。次いで、組替えレトロウイルスを含む培地が収集され、選択的に濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広い種々の細胞型を感染させることができる。しかし、組み込みおよび安定な発現は宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【００８２】
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、共通のレトロウイルス遺伝子、gag、pol、およびenvに加えて、調節的または構造的機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは当該分野において周知である（例えば、Naldiniら、1996；Zuffereyら、1997；Blomerら、1997；米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：HIV-1、HIV-2およびサル免疫不全ウイルス：SIVが含まれる。レンチウイルスベクターはHIVの病原性遺伝子の弱毒化を増加させることによって生成されてきた。例えば、env遺伝子、vif遺伝子、vpr遺伝子、vpu遺伝子、およびnef遺伝子が欠損されて、生物学的に安全なベクターが作製される。
【００８３】
組換えレンチウイルスベクターは、分裂していない細胞に感染し得、そして、インビボおよびエキソビボの両方での遺伝子移入、ならびに核酸配列の発現のために使用され得る。例えば、分裂していない細胞に感染し得る組換えレンチウイルスの場合、適切な宿主細胞は、パッケージング機能を有する2つまたはそれ以上のベクターでトランスフェクトされる。このパッケージング機能、すなわち、gag、pol、およびenv、ならびにrevおよびtatは、米国特許第5,994,136号において記載され、これは、本明細書に参照として組み入れられる。エンベロープタンパク質の、抗体または特定の細胞型の受容体への標的化のための特定のリガンドとの連結によって、組換えウイルスを標的化し得る。関心対象の配列（調節領域を含む）を、特定の標的細胞上の受容体についてのリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することによって、例えば、ベクターは、標的特異的となる。
【００８４】
4. 他のウイルスベクター
他のウイルスベクターが本発明における発現構築物として利用され得る。例えば、ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルス、および単純ヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが利用され得る。これらは、種々の哺乳動物細胞のためのいくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989；Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。
【００８５】
5. 改変されたウイルスを使用する送達
送達される核酸は、特定の結合リガンドを発現するために操作された感染性のウイルス中に入れられ得る。従って、このウイルス粒子は、標的細胞のコグネイト受容体に特異的に結合し、そして細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特異的送達を可能にするように設計された新規なアプローチは、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によって、レトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を許容し得る。
【００８６】
組換えレトロウイルスの標的化のための別のアプローチが設計された。ここでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用された。これらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによって、ビオチン成分を介して共役された（Rouxら、1989）。主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を使用して、これらは、エコトロピックなウイルスを用いるこれらの表面抗原をかき分けての種々のヒト細胞のインビトロでの感染を実証した。
【００８７】
B. 薬学的製剤および投与の経路
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解したかまたは分散させた、有効量の1つまたはそれ以上の遺伝子構築物を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、動物（例えば、ヒト）に適切に投与された場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の都合の悪い反応を産生しない、分子的な実体および組成物を指す。少なくとも1つのベクターまたはさらなる活性成分を含む薬学的組成物の調製は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990（本明細書中に参照として組み入れられる）に例示されるように、本開示に照らして当業者に公知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与のために、調製物は、FDA  Office  of  Biological  Standardsで要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度標準に合致すべきであることが理解される。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、当業者に公知であるような、任意のおよびすべての、溶媒、分散媒体、被覆剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、色素などの物質、およびこれらの組み合わせが含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990、1289-1329頁（本明細書中に参照として組み入れられる）を参照されたい）。任意の慣用的な担体が活性な成分と適合不可能である程度である場合を除いて、治療的または薬学的組成物におけるその使用が意図される。
【００８９】
本発明の組成物は、それが固体、液体、またはエアロゾルの形態であるか否か、および注射のような投与の経路のために滅菌されることが必要であるか否かに依存して、異なる型の担体を含み得る。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜に、心膜内、臍帯内、眼内、経口的、局所的（topically）、局在的（locally）、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接液につける局所的灌流、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム中で、脂質組成物中で（例えば、リポソーム）、または他の方法によって、または当業者に公知の前述の任意の組み合わせで、投与され得る（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990（本明細書中に参照として組み入れられる）を参照されたい）。特に関心対象となるのは、腫瘍部位に局所的または局部的な送達、腫瘍部位の周辺の治療、および手術後の腫瘍ベッドの治療（体腔のカテーテル治療を含む）である。
【００９０】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の用量は、体重のような物理的および生理学的要因、症状の重篤度、治療される疾患の型、以前のまたは同時的な治療的介入、患者の突発性疾患、および投与の経路によって決定され得る。投与に責任のある実務者は、どのような場合でも、個々の被験体のために、組成物中の活性成分の濃度および適切な用量を決定する。
【００９１】
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位重量の約2％〜約75％の間、または約25％〜約60％の間の単位、および例えば、そこに誘導可能な任意の範囲を含み得る。他の非限定的な例において、用量はまた、投与あたり、約1μg/kg/体重、約5μg/kg/体重、約10μg/kg/体重、約50μg/kg/体重、約100μg/kg/体重、約200μg/kg/体重、約350μg/kg/体重、約500μg/kg/体重、約1mg/kg/体重、約5mg/kg/体重、約10mg/kg/体重、約50mg/kg/体重、約100mg/kg/体重、約200mg/kg/体重、約350mg/kg/体重、約500mg/kg/体重から、約1000mg/kg/体重またはそれ以上まで、およびそこに誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書中に列挙された数値から誘導可能な範囲の非限定的な例においては、上記に記載された数値に基づいて、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などが投与され得る。
【００９２】
いかなる場合でも、本発明の組成物は、1つまたはそれ以上の成分の酸化を遅らせるための種々の抗酸化剤を含み得る。さらに、微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤のような保存剤（パラベン類（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない）によって行われ得る。
【００９３】
滅菌した注射用溶液は、上記に列挙された種々の他の成分を有する適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を取り込むことによって調製され、必要に応じて次にフィルター滅菌を行う。一般的に、分散剤は、基本的な分散媒体および/または他の成分を含む滅菌ビヒクル中に種々の滅菌した活性成分を取り込ませることによって調製される。滅菌した注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョンの調製のための滅菌パウダーの場合には、好ましい調製の方法は、真空乾燥またはフリーズドライ技術である。これらの技術は、以前にフィルター滅菌した液体媒体から、活性成分の粉末および任意のさらなる所望の成分を生じる。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、注射に先立って、十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にするべきである。直接注射のための高度に濃縮された組成物の調製もまた意図され、ここで溶媒としてのDMSOの使用が、極度に迅速な浸透を生じて、小さな領域に高濃度の活性薬剤を送達することが想定される。
【００９４】
本発明の組成物は、製造および保存の条件下で安定でなくてはならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の夾雑作用に対して保存されなくてはならない。エンドトキシンの夾雑は安全なレベルに（例えば、0.5ng/mgタンパク質未満）、最小に保たれるべきであることが理解される。特定の態様において、注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤の組成物中での使用（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組み合わせ）によって実行され得る。
【００９５】
C. 組み合わせ治療
本発明に従う治療の効力を増大させるために、これらの組成物を、過剰増殖疾患の治療において有効な他の薬剤（例えば、抗癌剤）と組み合わせることが所望され得る。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させること（癌細胞におけるアポトーシスを含む）、癌細胞の増殖速度を減少させること、転移の発生および数を減少させること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍もしくは癌細胞への血液の供給を減少させること、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、癌の進行を妨害もしくは阻害すること、または癌を有する被験体の寿命を長くすることによって、被験体中の癌に負の影響を与え得る。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害するために有効な合わせた量で提供される。このプロセスは、細胞に、発現構築物および薬剤もしくは複数の因子を同時に接触させる工程を含み得る。これは、細胞に、単一の組成物、もしくは両方の薬剤を含む薬理学的製剤を接触させること、または2つの別個の組成物もしくは製剤を同時に細胞に接触させることによって達成され得、ここで1つの組成物は、発現構築物を含み、そして他の組成物は第2の薬剤を含む。
【００９６】
化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題を表す。現在の癌研究の1つの目標は、遺伝子治療と組み合わせることによって化学療法および放射線療法の効力を改善するための方法を見い出すことである。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（HS-tK）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達された場合に、抗ウイルス剤ガンシクロビルへの感受性の誘導に成功した（Culverら、1992）。本発明の文脈において、本発明に従う遺伝子治療が、他のプロ-アポトーシス剤または細胞周期調節薬剤に加えて、化学療法的、放射線療法的、または免疫療法的な介入とともに、同様に使用され得ることが意図される。
【００９７】
あるいは、この遺伝子治療は、分から週の範囲にわたる間隔で、進行し得るかまたは他の薬剤治療に続き得る。残りの薬剤および発現構築物が別々に細胞に適用される態様においては、薬剤および発現構築物が、細胞に対して有利な複合効果を発揮し続けることができるように、一般的に、各送達の期間中に有効期間が終了しないことが保証される。このような例において、互いに約12時間〜24時間以内に、より好ましくは、互いに約6時間〜12時間以内に両方の様式で細胞を接触させ得ることが意図される。しかし、いくつかの状況において、治療のための時間の期間を有意に延長することが望ましい。ここでは、数日間（2日、3日、4日、5日、6日、または7日）から数週間（1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間）がそれぞれの投与の間に経過する。
【００９８】
種々の組み合わせが利用され得るが、遺伝子治療は「A」、第2の薬剤（例えば、放射線療法または化学療法）は「B」を示す。
2005502645.tif 000006
【００９９】
本発明の治療用発現構築物の患者への投与は、ベクターの毒性がもしあればこれを考慮して、化学療法剤の投与についての一般的なプロトコールに従う。治療サイクルが必要に応じて反復されることが予想される。種々の標準的治療ならびに外科的介入が、記載された過剰増殖細胞治療と組み合わせて適用され得ることもまた意図される。
【０１００】
a. 化学療法
癌治療はまた、化学的治療および放射線に基づく治療の両方を伴う種々の組み合わせ治療を含む。組み合わせの化学療法には、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合因子、タキソール、パクリタキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、トランス白金化合物、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、ミュータマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、または上記の任意の類似体もしくは誘導体改変体が含まれる。
【０１０１】
b. 放射線療法
DNAの損傷を引き起こし、広範に使用されてきた他の因子には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位元素に向けられた送達として一般的に知られるものが含まれる。マイクロ波およびUV照射といったDNAに損傷を与える因子の他の形態もまた、意図される。これらの因子のすべてがDNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に広範な損害をもたらす可能性が高い。X線についての線量は、（長期間の場合（3〜4週間）の一日線量で50レントゲン〜200レントゲンの範囲から、単回の線量2000レントゲン〜6000レントゲンまでの範囲にわたる。放射性同位元素についての線量の範囲は広く変動し、アイソトープの半減期、放射される放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１０２】
「接触した」および「曝露した」という用語は、細胞に適用される場合、本明細書中では、治療構築物および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並列して配置されるプロセスを記載するために使用される。細胞の死滅または静止を達成するために、両方の薬剤が、細胞を死滅させるため、またはそれが分裂することを妨害するために有効な量で混合され、細胞に送達される。
【０１０３】
c. 免疫療法
免疫療法は、一般的には、癌細胞を標的化および破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼るものである。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。この抗体が単独で治療のエフェクターとして働き得るか、または実際に細胞の死滅をもたらす他の細胞を補充し得る。この抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、単に標的化薬剤として働く。あるいは、このエフェクターは、腫瘍細胞標的と、直接的または間接的のいずれかで、相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞には、細胞毒性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１０４】
従って、免疫療法は、遺伝子治療と組み合わせた、併用治療の一部として使用され得る。併用治療のための一般的なアプローチは以下に議論する。一般的に、腫瘍細胞は、標的化に敏感である（すなわち、他の細胞の大部分に存在しない）いくつかのマーカーを有しているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが本発明の文脈において標的化のために適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、およびp155が含まれる。
【０１０５】
d. 外科手術
癌を有するヒトの約60％が何らかの型の外科手術を受けており、これには、予防的、診断的もしくは段階的、治癒的および対症的な外科手術が含まれる。治癒的外科手術は、例えば、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および/または代替的な治療法などのその他の治療と併用され得る癌治療である。
【０１０６】
治癒的外科手術には、癌組織のすべてまたは一部が物理的に除去、摘出、および/または破壊される切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による治療には、レーザー外科療法、凍結外科療法、電気外科療法、および顕微鏡的に制御された外科療法（モース氏手術）が含まれる。本発明は、表層の癌、前癌、または偶発的な量の正常組織の除去とともに使用されることがさらに意図される。
【０１０７】
癌細胞、組織、または腫瘍の一部またはすべての切除に際して、腔が身体中に形成され得る。治療は、灌流、直接注射、またはさらなる抗癌治療を行う領域の局所的適用によって達成され得る。このような治療は、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、もしくは7日毎、または、1週間毎、2週間毎、3週間毎、4週間毎、および5週間毎、または、1ヵ月毎、2ヵ月毎、3ヵ月毎、4ヵ月毎、5ヵ月毎、6ヵ月毎、7ヵ月毎、8ヵ月毎、9ヵ月毎、10ヵ月毎、11ヵ月毎、もしくは12ヵ月毎に反復され得る。これらの治療は、その上、用量を変化させてもよい。
【０１０８】
e. 他の薬剤
処置の治療的効力を改善するために、他の薬剤が本発明と組み合わせて使用され得ることが意図される。これらのさらなる薬剤には、免疫調節物質、細胞表面受容体およびGAPジャンクションのアップレギュレーションに影響する薬剤、細胞成長抑止剤および分化剤、細胞接着の阻害因子、または、過剰増殖細胞のアポトーシス誘導因子への感受性を増大させる薬剤が含まれる。他の態様において、細胞成長抑止剤または分化剤は、治療の抗過剰増殖効果を改善するために本発明と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害因子は、本発明の効力を改善するために意図される。細胞接着の阻害因子の例は、病巣接着キナーゼ（FAK）阻害因子およびロバスタチンである。過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤（例えば、抗体c225）が、治療の効力を改善するために本発明と組み合わせて使用され得ることがさらに意図される。
【０１０９】
ホルモン治療もまた、本発明と組み合わせて、または以前に記載された任意の他の癌治療と組み合わせて、使用され得る。ホルモンは、特定のホルモン（例えば、テストステロンまたはエストロゲン）のレベルを下げるため、またはその効果をブロックするために、特定の癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸部癌）の治療において利用され得る。この処置は、治療の選択肢として、または転移のリスクを減少させるために、少なくとも1つの他の癌治療と組み合わせて使用されることが多い。
【０１１０】
VI. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術であることを表すこと、ならびに、それゆえに、その実施のための好ましい形態を構成すると見なされ得ることが当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示に鑑みて、多くの変更が、開示される特定の態様においてなされ得、かつ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果がなお得られ得ることを認識するべきである。
【０１１１】
実施例1
GAL4遺伝子調節システムを介する癌胎児性抗原(CEA)プロモーターからの導入遺伝子発現の増加
材料及び方法
細胞系
ヒト肺癌細胞系A549、結腸腺癌細胞系LoVoおよびDLD-1並びに子宮頸癌細胞系HeLaを、5〜10％ FBS、100 U/mlペニシリンおよび100/μg mlストレプトマイシンを添加したRPM1 1640倍地またはダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。正常なヒト肺線維芽細胞(NHFB)はClonetics(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手し、製造業者が推奨する培地で培養した。
【０１１２】
組換えアデノウィルスベクターの構築と作製
いくつかのアデノウィルスベクターを本発明の検討に使用した(表2)。Ad/CMV-LacZ、Ad/GT-LacZ、Ad/CMV-E1-およびAd/PGK-GV16は以前に記載されている(Fangら、1998；Kagawaら、2000b)。Ad/CMV-GFPはT. J. Liu博士から供与された。Ad/CEA-LacZおよびAd/CEA-GV16は以前に記載されているように構築した(Fangら、1997)。簡単に説明すると、pAd/CEAは、pAd/PGKのPGKプロモーターを、pCEA424/2CATから誘導した424bp CEAプロモーターを含有する断片と交換することによって構築した(Schreweら、1990)。次いで、pAd2/CEAのCEAプロモーターとウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の間の部位にLacZまたはGV16 cDNAを挿入することによって、プラスミドpAd/CEA-LacZおよびpAd/CEA-GV16を構築した。293細胞に、pAd/CEA-LacZまたはpAd/CEA-GV16をdl324の35kb Cla I断片と共に同時トランスフェクトすることによって組換えアデノウィルスを構築した。単一プラークの組換え体はDNA分析によって同定し、293細胞中で増殖させ、超遠心で2回精製した。以前に記載されているように(Fangら、1998)、A260nmにおける励起またはTCID50によってウィルス力価を測定した。A260nmの励起によって測定した力価(粒子/ml)はその後の実験に使用したが、TCID50によって測定した力価は追加の情報として使用した。粒子の感染単位に対する比は、通常、30:1〜100:1であった。ウィルス力価は全て、以前に記載されているように(Kagawaら、2000a)、E+ウィルスおよびエンドトキシンによって分析し、汚染がないことを判定した。
【０１１３】
（表２）使用したアデノウィルスベクター
2005502645.tif 000007
【０１１４】
インビトロにおける遺伝子導入
A549、DLD1、LoVo、HeLaおよびNHFB細胞におけるアデノウィルスベクターの形質導入効率は、先ず500〜5000の範囲の種々のMOIのAd/CMV-LacZを細胞に感染させ、次いで感染の24時間後にX-galで細胞を染色することによって判定した。その後、50％形質導入効率を生じるMOIを使用して、異なる細胞系においてCEAプロモーター活性を比較した。簡単に説明すると、感染の1日前に、1×105/ウェルの密度で24ウェルプレートに細胞を播種した。A549およびDLD1細胞に総MOI 2000で感染させ、LoVo、NHFBおよびHeLa細胞に総MOI 1000で感染させた。2つのベクターを用いた同時感染の場合には、2つのベクターの比は1:1に固定した。
【０１１５】
動物における検討
動物実験は、実験動物の福祉と使用に関するガイドライン(the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)(国立衛生研究所公報第82-23号)およびテキサス大学医学部アンダーソン癌センターの研究所のガイドラインに準じ実施した。CEA陽性腫瘍は、1×106個のA549細胞を、成体(6週齢〜8週齢)nu/nuマウスに導入することによって樹立した。次いで、腫瘍が直径0.5cmに達したら、通常は腫瘍細胞接種から約3週間後に、ベクターを腫瘍内に注射する。レポーター遺伝子の発現のため、ベクター注射の2日後にマウスを殺傷した。組織学的検討および組織化学的検討のために腫瘍、肝臓、脾臓、卵巣、脳、腎臓、肺、小腸および心臓を採取した。Bax遺伝子の抗腫瘍作用は、投与あたり100μlの容量中9×1010ウィルス粒子の3回連続腫瘍内注射をマウスに行った。ベクター比はバイナリーベクターシステムでは1:1であった。腫瘍サイズは1週間に3回モニタリングした。腫瘍体積は、以前に記載されているように(Guら、2000；Kagawaら、2000a)、算出した。
【０１１６】
生化学的分析および組織化学的分析
生化学的分析のために、培養した細胞を溶解し、マウスの組織をβ-ガラクトシダーゼアッセイ緩衝液中でホモジナイズした。製造業者の指示により、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、イリノイ州ロックフォード)を使用して、総タンパク質含量を測定した。β-ガラクトシダーゼ活性は、製造業者の指示により、Galacto-Light Plusβ-ガラクトシダーゼアッセイシステム(Tropix, Inc.、マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用して測定した。細胞生存率は、記載されているように(Kagawaら、2000a)、テトラゾリウム染料XTTで染色することによって測定した。組織化学的分析のために、医学部アンダーソン癌センターのthe Histology Laboratory of the Department of Veterinary Medicine and Surgeryにおいて組織および腫瘍を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。X-gal染色のために、培養細胞または8μmの凍結切片を0.5％グルタルアルデヒドで4℃において15分間固定し、5mM K4Fe(CN)6、5mM K3Fe(CN)6、2mM MgCl2および1 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトシドを含有する溶液で37℃において一晩染色し、次いで翌日Nuclear Fast Red(Sigma Chemicals、ミズーリ州セントルイス)で対比染色した。
【０１１７】
統計分析
処置群間の導入遺伝子発現の差は、Statisticaソフトウェア(StatSoft、オクラホマ州ツルサ)を使用して、分散分析(ANOVA)によって評価した。インビボにおける腫瘍増殖の実験では、反復測定モジュールのANOVAを使用した。P≦0.05を有意であると考えた。
【０１１８】
結果
CEA陽性およびCEA陰性細胞系における基底CEAプロモーターレベル
基底CEAプロモーターレベルは、50％形質導入を生じる用量のMOIで細胞にAd/CEA-LacZを感染させることによって、3つのCEA陽性細胞系(A549、DLD-1およびLoVo)および2つのCEA陰性細胞系(NHFBおよびHeLa)において測定した。A549およびDLD1細胞では、その用量は2000粒子/細胞であり、LoVo、NHLBおよびHeLa細胞では1000であった。偽感染細胞をバックグラウンド対照として使用した。同じ用量のAd/E1-またはAd/CMV-LacZを感染させた細胞は陰性または陽性対照として使用した。β-ガラクトシダーゼ活性は、感染の48時間後に測定した。Ad/E1感染および偽感染は、偽感染と同じレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じた(データは示していない)。Ad/CEA-LacZを感染させたCEA陽性細胞系のβ-ガラクトシダーゼ活性は、1.8×106RLU/μg〜3×106（相対受光単位(relative light unit)）RLU/μg細胞タンパク質の範囲であった。これと比較して、Ad/CEA-LacZを感染させたCEA陰性細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性は約4.1〜9.5×104RLU/μg細胞タンパク質であった(表3)。同じ細胞系のAd/CMV-LacZ感染は、通常、Ad/CEA-LacZ感染より15倍〜250倍高いβ-ガラクトシダーゼ活性を生じた(図1)。
【０１１９】
GAL4/VP16によるCEAプロモーターのインビトロにおける増加
CEAプロモーターの転写活性がGAL4遺伝子調節システムによって増加されるかどうかを試験するために、第1のベクター(Ad/GT-LacZ)が、合成の最小プロモーターGTの制御下においてレポーター遺伝子lacZを発現し、第2のベクター(Ad/CEA-GV16)がCEAプロモーターの制御下においてトランス活性化タンパク質GV16を発現するバイナリーベクターシステムを使用した。このバイナリーシステムはインビトロおよびインビボにおいてレポーターまたは導入遺伝子の発現を効果的に誘導することできることを本発明者らは以前に証明した(Fangら、1998；Kagawaら、2000b)。感染させた細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ活性レベルを測定するために、細胞に、Ad/GT-LacZ、Ad/CEA-GV16、Ad/PGK-GV16、Ad/GT-LacZ+Ad/CEA-GV16またはAd/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16を感染させた。各処置群に投与した総MOIは上記と同じであった。次いで、感染から48時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。Ad/GT-LacZで処置したHeLa細胞を除いて、Ad/CEA-GV16、Ad/PGK-GV16、Ad/GT-LacZまたは空のベクターAd/E1-で処置した細胞は、偽感染させた細胞と同じバックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼを発現した。Ad/GT-LacZで処置したHeLa細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性は、バックグラウンドより2倍高かった(P<0.05)。Ad/GT-LacZ+Ad/CEA-GV16またはAd/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16による処置後のβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルは細胞系間で異なった。試験した全ての細胞系では、Ad/GT-LacZ+Ad/CEA-GV16で処置した後のβ-ガラクトシダーゼ活性は、Ad/CEA-LacZで処置した後より有意に高かったが(p<0.05)、バイナリーベクターシステムでのLacZおよびCEAプロモーターの総用量は、シングルベクターシステムの半分だけであった。さらに、バイナリーベクターシステム対シングルベクターシステムで得られたβ-ガラクトシダーゼの増加は、CEA陽性細胞(27倍〜45倍)では、CEA陰性細胞(6倍〜8倍)より高く(表3)、これは、GAL4遺伝子調節成分が導入遺伝子の発現レベルを増加するだけでなく、遺伝子発現レベルの差を大きくしたことを示唆していた。しかし、GAL4システムによる導入遺伝子の発現のこの差次的増加機構は明らかではなかった。
【０１２０】
（表３）アデノウィルスベクターによる感染後のβ-ガラクトシダーゼ活性
2005502645.tif 000008
【０１２１】
樹立した腫瘍におけるインビボにおけるCEAプロモーター発現の増加
2つのベクターを適切な比で投与するとき、バイナリーベクターシステムを使用すると培養中の細胞においてインビトロにおいてアデノウィルスベクターの形質導入効率を低下しなかったことを本発明者らは以前に示した(Kagawaら、2000b)。しかし、ベクターの散在が効率的な形質導入の大きな障害であり、2つのベクターが同じ標的細胞に感染するという絶対条件が形質導入効率を低下する可能性があるインビボにおいてこれが当てはまるかどうかは明らかではない。インビトロにおいて観察されるCEAプロモーターの転写の増加が腫瘍内投与によってインビボにおいて同様に誘導されるかどうかを試験するために、アデノウィルスベクター(5×1010粒子/腫瘍/マウスの一定の総用量)を、ヌードマウスに樹立したA549皮下腫瘍に注射した。2つのベクターを使用すると、ベクター比は1:1であった。アデノウィルス感染の2日後にマウスを殺傷し、細菌のβ-ガラクトシダーゼ活性の生化学的分析および組織化学的分析のために腫瘍および種々の臓器を採取した。腫瘍試料の酵素分析によって示されるように、Ad/CEA-GV16+Ad/GT-LacZによる処置により2.0×107RLU/μg細胞タンパク質が生じた。これと比較して、Ad/CEA-LacZによる処置は1.9×105RLU/μg細胞タンパク質のみしか生じなかった(図2)。Ad/CEA-GV16またはAd/GT-LacZ単独による処置はバックグラウンドレベル程度のβ-ガラクトシダーゼしか生じなかった。明らかに、GAL4遺伝子調節システムは、インビボにおいてもCEAプロモーターの転写活性を有意に増加した(P<0.001)。一方、肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓、脳、腸および卵巣における細菌β-ガラクトシダーゼ活性はいずれの処置群においてもバックグラウンドレベルを超えず、腫瘍内注射後はベクターはほとんどまたは全く腫瘍から漏洩しないことを示唆している。
【０１２２】
皮下腫瘍内部の導入遺伝子発現の分布を試験するために、中心部および中心部の両側2mmの部分を含む各腫瘍の3つの切片をX-galで染色した。β-ガラクトシダーゼの発現は、Ad/CMV-LacZまたはAd/CEA-GV16+Ad/GT-LacZで処置した腫瘍の大半で検出されたが、Ad/CEA-LacZで処置した腫瘍細胞では30％未満しか検出されなかった。明らかに、導入遺伝子発現の総レベルだけでなくlacZ陽性細胞の割合も、GAL4遺伝子調節システムを使用することによって増加した。
【０１２３】
CEA陽性細胞におけるAd/CEA-GV16+Ad/GT-Baxによる細胞死の誘導
本発明者らは、アポトーシス促進性遺伝子Baxの発現のためのバイナリーアデノウィルスベクターシステムを開発した。その投与が高レベルのBax遺伝子発現を誘導するAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16は、細胞死を誘導し、インビトロおよびインビボにおいて腫瘍の増殖を抑制した(Kagawaら、2000a、b)。Ad/CEA-GV16+Ad/GT-Baxの同時投与がCEA陽性細胞において特異的に細胞死を誘導するかどうかを判定するために、A549、LoVoおよびNHFB細胞に記載されている一定の総用量のこのベクターおよび種々の他のベクターを感染させた。次いで、XTTアッセイによって細胞生存率を72時間までモニタリングした。Ad/PGK-Gv16+Ad/GT-Baxによる処置は3つの系統全ての細胞を死滅させるが、Ad/CEA-GV16+Ad/GT-Baxによる処置はA549およびLoVo細胞だけを死滅させた(図3)。従って、GAL4バイナリーシステムをCEAプロモーターと併用すると、Bax遺伝子媒介性のCEA特異的な細胞死が誘導された。
【０１２４】
Ad/CEA-GV16+Ad/GT-BaxによるCEA陽性腫瘍増殖の抑制
Ad/CEA-GV16+Ad/GT-Baxの同時投与がCEA陽性癌系統をインビボにおいて抑制するかどうかを試験するために、CEA陽性LoVo細胞から誘導したヒト結腸癌異種移植片をヌードマウスにおいて樹立した。腫瘍が約0.3 cm〜0.5 cmの直径に達したら、ベクターの腫瘍内投与を実施した。アデノウィルスベクターを3回連続して腫瘍内に注射したら、動物(1群あたり5〜7匹)を腫瘍の増殖についてモニタリングした。Ad/CEA-GV16+Ad/GT-BaxまたはAd/PGK-GV16+Ad/GT-Bax(陽性対照)による処置により、同じレベルの腫瘍増殖抑制が生じ、これはPBSまたはAd/CEA-GV16+Ad/E1-による処置とは有意に異なる(P≦0.01)(図4)。この結果により、CEAプロモーターからのBax遺伝子の発現は、CEA陽性腫瘍系統の増殖を抑制することが証明された。それはまた、Bax遺伝子を発現するバイナリーアデノウィルスベクターの腫瘍内投与が腫瘍増殖を抑制するという最近の知見にも一致した(Guら、2000；Kagawaら、2000a)。
【０１２５】
実施例2
hTERTプロモーターからの腫瘍特異的導入遺伝子発現は治療効果のあるBax遺伝子の癌への標的化を可能にする
材料及び方法
組換えアデノウィルスベクターの構築
ベクターAd/E1-、Ad/CMV-LacZ、Ad/GT-LacZ、Ad/GT-BaxおよびAd/PGK-GV16を、以前に記載されているように構築した(Fangら、1997；Kagawaら、2000b)。Ad/CMV-GFPはT. J. Liu博士から供与された。Ad/hTERT-LacZおよびAd/hTERT-GV16を構築するためには、先ずpGL3-378プラスミド(Takakuraら、1999)をMlu IおよびHind III制限部位で切断して、（その後シャトルベクターAd/RSV-bpAのRSVプロモーターを置換するために使用する）hTERTコアプロモーターを放出することによって、プラスミドAd/hTERT-bpAを構築した。次いで、hTERTプロモーターの下流にLacZおよびGal4/VP16遺伝子を配置することによってAd/hTERT-LacZおよびAd/hTERT-GV16を構築した。単一プラークの組換えウィルスはDNA分析によって同定し、293細胞中で増殖し、塩化セシウム濃度勾配の超遠心で2回精製した。ウィルス力価は、実施例1に先に記載されているように測定した。
【０１２６】
インビトロ遺伝子発現の分析
ヒト肺癌細胞系A549およびH1299並びに子宮頸癌細胞系HeLaは、元はATCCから入手され、本発明者の研究室で維持された。ヒト結腸癌細胞系DLD1およびLoVoはT. Fujiwara博士(岡山大学、日本)から供与された。正常なヒト線維芽細胞(NHFB)細胞および正常なヒト気管支上皮(NHBE)細胞はClonetics(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入し、製造業者が推奨する培地で培養した。細胞は、ベクター感染の1日前に、24ウェルプレートにおいて1×105/ウェルの密度で培養された。次いで、1000ウィルス粒子/細胞のMOI(感染効率)で細胞にアデノウィルスベクターを感染させた。感染の24時間後、β-ガラクトシダーゼ発現を可視化するために細胞をX-galで染色するか、またはβ-ガラクトシダーゼ活性を生化学的に分析するために細胞を回収した。
【０１２７】
生化学的分析および細胞生存率アッセイ
生化学的分析は、実施例1に記載されているように実施した。細胞生存率アッセイのためには、ウィルス感染の1日前に、ウェルあたり1×104の密度で96ウェルプレートで細胞を培養した。次いで、1500ウィルス粒子/細胞の総MOIで細胞にアデノウィルスベクターを感染させた。示したウィルスベクターシステムにより細胞を4つの群に分類した：Ad/CMV?GFP+Ad/PGK-GV16、Ad/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16。各群では、2つのウィルスベクターの比は2:1であり、これは、以前の実験において導入遺伝子発現の誘導に最適であることが示されている比である(Kagawaら、2000b)。PBSは偽感染に使用された。細胞生存率は、実施例1に記載するようにXTTアッセイで測定した。各処置群では、感染から24時間、48時間および72時間経過時に細胞生存率について4つ組ウェルを測定した。これらの実験は、各細胞系について少なくとも2回実施した。
【０１２８】
フローサイトメトリーによるアポトーシス分析
感染の1日前に1×106/100mmプレートの密度で細胞を培養した。次いで、1500ウィルス粒子/細胞のMOIで細胞に組換えアデノウィルスベクターを感染させた。48時間後、接着している細胞および浮遊している細胞をトリプシン処置によって回収し、PBSで洗浄し、70％エタノールで一晩固定した。次いで、DNA含量を分析するために、細胞をヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。フローサイトメトリー分析によってアポトーシス細胞を定量した。
【０１２９】
動物実験
動物実験は、以前の実施例に記載されているように実施した。アデノウィルスベクターのインビボにおける注入およびその後のBALB/cマウスからの組織の取り出しは、Fangら、1997に記載されているように実施した。皮下腫瘍モデルでは、腫瘍を樹立するために、6週齢〜8週齢のヌードマウス(Harlen Sprague Dawley、インディアナポリス)の背側の側腹部の皮下に5×106のH1299細胞を接種した。腫瘍が直径〜5 mmに達したら、1投与あたり100μlの容量に9×1010のウィルス粒子を加えたものの3回連続腫瘍内注射をマウスに行った。腫瘍サイズを1週間に3回測定した。腫瘍体積は、式a×b2×0.5(式中、aおよびbは、それぞれ、大きいほうの直径および小さい方の直径である)を使用して算出した。
【０１３０】
血清ASTおよびALTの組織化学的検討および分析
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色のためには、切片化した組織または腫瘍を以前の実施例に記載されているように処置した。血清ASTおよびALTレベルの分析のためには、アデノウィルス注入から48時間後にマウス尾静脈から採血した。血清ASTおよびALTのレベルは記載されているように測定した(Kagawaら、2000a)。統計分析は以前に記載されているように実施し、P≦0.05は有意であると考えた。
【０１３１】
結果
インビボにおいてhTERTによって誘導される腫瘍特異的導入遺伝子発現
種々の細胞におけるhTERTプロモーターからの導入遺伝子発現を評価するために、本発明は、先ず、378 bp hTERTコアプロモーターによって誘導されるLacZ遺伝子を発現するアデノウィルスベクターを構築した(Takakuraら、1999)。hTERTプロモーター活性は、1000ウィルス粒子のMOIで細胞に感染させることによって、培養中のヒト肺癌細胞系(H1299およびA549)、結腸癌細胞(DLD1およびLoVo)、子宮頸部癌細胞(HeLa)、正常なヒト線維芽(NHFB)細胞および正常な気管支上皮(NHBE)細胞において評価した。次いで、方法に記載されているようにX-gal染色または酵素アッセイによって感染の24時間後に細菌のβ-ガラクトシダーゼの発現を分析した。試験した全ての癌細胞系では、CMVおよびhTERTプロモーターは、X-gal染色によって明らかなように、強いβ-ガラクトシダーゼ発現を誘導したが、2つの正常な細胞系では、Ad/CMV-LacZによる感染だけが高いレベルの導入遺伝子発現を生じた(ほぼ100％)。正常細胞に同じMOIでAd/hTERT-LacZを感染させると、lacZ陽性細胞は非常に少なかった。CMVとhTERTプロモーターの活性は、正常な細胞では500倍を超える差があったのと比較して、癌細胞では2倍〜10倍しか差がなかった(図5)。試験した全ての細胞では、hTERTプロモーター活性は、癌細胞では正常細胞より有意に高かった(P≦0.05)。これらの結果は共に、hTERTプロモーターは種々の癌細胞系では非常に活性であるが、正常細胞ではそうでないことを証明しており、従って、hTERTプロモーターは、腫瘍に導入遺伝子発現を標的化する際に使用する上で十分に強力で、特異的であることを示唆している。
【０１３２】
インビボにおけるhTERTプロモーターの転写活性
インビボにおいてhTERTプロモーターによって誘導される導入遺伝子発現レベルを検討するために、本発明者は、尾静脈を介して6×1010粒子のAd/hTERT-LacZ、Ad/CMV-LacZまたはAd/CMV-GFPをBALB/cマウスに注入した。全てのマウスをベクターまたはPBS注入の2日後に安楽死させ、組織化学的染色および細菌β-ガラクトシダーゼの生化学的分析のために肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、腸、卵巣および脳を各々から摘出した。Ad/CMV-LacZで処置したマウスの肝臓および脾臓において高いレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性が検出された。Ad/CMV-LacZで処置したマウスの他の器官の酵素活性はバックグラウンドの対照と同じであった。一方、Ad/hTERT-LacZで処置したマウスの肝臓、脾臓および他の器官の酵素活性は、全てバックグラウンドの対照、すなわちPBSおよびAd/CMV-GFPで処置したマウスにおいて見られる範囲内であった(図6)。Ad/hTERT-LacZによる感染後に高いレベルの導入遺伝子発現がマウス肺癌細胞系(M109)において検出されたので(データは示していない)、成体マウス組織においてhTERTプロモーターが検出可能なlacZ発現を誘導できなかったのは、hTERTプロモーターがマウスの転写機構を利用できないからではなかった。マウスTERT遺伝子のプロモーター領域が近年クローニングされたことは注目に値するが、これにより癌細胞における高い発現に重要であると考えられているコアプロモーター領域のE-boxおよび2つのSP1結合部位はhTERTとmTERTの間で保存されていることが見出された(Greenbergら、1999)。hTERTプロモーターは、正常な肝臓および脾臓細胞において導入遺伝子発現を抑制し、治療遺伝子の全身送達後にその肝臓および脾臓毒性を小さくするために使用することができることをこれらのデータは共に示唆している。
【０１３３】
hTERTプロモーターによって誘導されるBax遺伝子発現はインビトロにおいて腫瘍細胞を特異的に抑制する
本発明者は、高いレベルの強力なアポトーシスBax遺伝子を発現するアデノウィルスベクターを構築する際の困難を克服することができるバイナリーアデノウィルスベクターシステムを開発した(Kagawaら、2000a、b)。簡単に説明すると、システムは2つのアデノウィルスベクターを有する。これらのベクターの一方は、293パッケージング細胞において優勢である、5つのGal4結合部位およびTATAボックスを含む最小合成プロモーターの制御下においてヒトBax cDNAを有するので、293細胞に対するBax遺伝子の毒性作用を回避し、ベクター(Ad/GT-Bax)作製を可能にする。Bax遺伝子の発現は、バイナリーシステムの第2のアデノウィルスベクターをAd/GT-Baxウィルスに同時感染させることによって誘導することができる(Ad/PGK-GV16)。Ad/PGK-GV16は、マウス3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のハウスキーピング遺伝子プロモーターである、構成的に活性なPGKプロモーターの制御下でGal4-DNA結合ドメインおよびVP16活性化ドメインを含む融合タンパク質からなる、合成トランス活性化因子を有する。このバイナリーベクターシステムを癌細胞に投与すると、インビトロにおいて広範なアポトーシスを誘発し、インビボにおいて腫瘍の増殖を抑制することが以前に示された(Kagawaら、2000a、b)。しかし、ベクターシステムの全身投与も肝臓に広範なアポトーシスを生じ、Bax遺伝子の過剰発現が正常な細胞に毒性であることを示唆している(Kagawaら、2000a)。
【０１３４】
hTERTプロモーターを使用して、正常細胞に対するBax遺伝子の毒性作用を無効にすると同時に、抗腫瘍作用を保存することができるかどうかを試験するために、本発明者は、Ad/PGK-GV16のPGKプロモーターをhTERTプロモーターで置換することによって、組換えアデノウィルスベクター(Ad/hTERT-GV16)を構築した。バイナリーアデノウィルスベクターシステムを使用して、PGKプロモーターと比較した、hTERTプロモーターによって誘導されたときの正常および腫瘍細胞に対するBax遺伝子の影響を試験した(図7A)。ヒト肺癌細胞系H1299およびA549、NHBE細胞およびNHFB細胞を、PBS、Ad/CMV-GFP+Ad/PGK-GV16、Ad/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16で処置した。処置から48時間後に細胞を回収し、FACS分析を実施して、sub-G1集団を定量することによってアポトーシス細胞分画を測定した。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16のどちらかによる感染後ではH1299およびA549におけるアポトーシスの誘導は同程度であり、hTERTプロモーターは、腫瘍細胞においてBax遺伝子発現およびアポトーシスを誘導する際にPGKプロモーターと同じくらい強力であることを示唆している。しかし、2つの正常な細胞系(NHBEおよびNHFB)では、Ad/GT-Bax+Ad/PGK-GV16による処置は実質的なアポトーシスを誘導したが、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16による処置は明らかなアポトーシスを誘導しなかった。hTERTプロモーターは、腫瘍特異的なアポトーシス促進遺伝子発現およびアポトーシス誘導を誘導するために使用することができるが、正常な細胞に対するアポトーシス促進遺伝子の毒性を無効にすることができることをこれらの結果は証明した。
【０１３５】
hTERTプロモーターは腫瘍細胞においてBax遺伝子の特異的な発現を誘導するが、正常な細胞では誘導しないと思われるさらなる証拠を入手するために、本発明者はXTTアッセイを使用して、Ad/GT-Bax+Ad/PGK-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16による処置後の細胞生存率を比較した。どちらのバイナリーベクターによる処置もH1299およびA549細胞に同程度の細胞死滅作用を示した。しかし、NHBEおよびNHFB細胞では、Ad/GT-Bax+Ad/PGK-GV16による処置は劇的な細胞損失を生じたが、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16による処置は細胞生存率にわずかな作用しか示さなかった(図7B)。結果は、さらにウェスタンブロット分析によって裏付けられた。hTERTおよびPGKプロモーターは共にA549細胞において強力なBax発現を誘導した。これと比較して、PGKはNHFB細胞において強力なBax発現を誘導したが、hTERTはしなかった。
【０１３６】
hTERTプロモーターによって誘導されるBax遺伝子発現はインビボにおいて腫瘍の増殖を抑制する
インビボにおけるBax遺伝子治療にhTERTプロモーターを使用する可能性を評価するために、本発明者は、ヌードマウスの皮下にH1299腫瘍を樹立し、その発現がhTERTまたはPGKプロモーターによって誘導されるBax遺伝子で腫瘍を治療した。アデノウィルスベクターを3回連続して腫瘍内に注射した後、腫瘍サイズの変化を3週間モニタリングした。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16による治療は同じレベルの腫瘍増殖抑制を生じたが、これはPBS、Ad/E1-またはAd/GT-LacZ+Ad/hTERT-GV16による治療群と有意に異なった(P≦0.001)(図8)。hTERTプロモーターはインビボにおいて腫瘍内の導入遺伝子発現を効果的に誘導することができることが、これらの結果により証明された。
【０１３７】
hTERTプロモーターはBax遺伝子の肝毒性を防止する
全身遺伝子送達後、hTERTプロモーターを、肝臓におけるBax遺伝子発現の毒性を防止するために使用することができるかどうかを試験するために、成体BALB/cまたはヌードマウスに、PBS、総用量6×1010ウィルス粒子/マウスのAd/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16を尾静脈を介して注入した。治療の24時間後にマウスを安楽死させ、組織学的調査のために肝臓を採取した。大半の肝細胞は、PGKプロモーターによって誘導されたBax発現によりアポトーシスを受けた。これと比較して、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16を注入すると、アポトーシスを受けた肝細胞はごくわずかしか観察されなかった。Bax遺伝子治療による肝毒性をさらに証明するために、ウィルスの静脈内注射の48時間後に血液試料を採取し、肝アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)の血清レベルを測定した(図9)。PBS、Ad/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16による治療は同じ血清ASTおよびALTレベルを生じたが、Ad/GT-Bax+Ad/PGK-GV16による治療は、ASTおよびALTレベルをそれぞれ16倍以上および41倍以上増加した(P≦0.0001)。これらの結果も、hTERTプロモーターは、アポトーシス促進遺伝子の肝毒性を防止するために使用することができることを示唆している。
【０１３８】
実施例3
hTERTプロモーターからのGFP-TRAIL融合タンパク質の標的化された発現は、ヒト一次肝細胞に対する毒性作用を生じることなく抗腫瘍作用を誘導する
方法
アデノウィルス
アデノウィルスベクター、Ad/hTERT-LacZ、Ad/hTERT-GV16、Ad/CMV-LacZ、Ad/PGK-GV16、Ad/CMV-GFPおよびAd/GT-TRAILは以前に記載されている(Kagawaら、2001；Guら、2000；Fangら、1998)。Ad/gTRAILは記載されているように構築した(Fangら、1998；Fangら、1997)。簡単に説明すると、アデノウィルスシャトルベクター(pAd/gTRAIL)を構築した。このベクターは、遺伝子が、5組のGAL4結合部位およびTATAA配列を含む合成最小プロモーター(GTプロモーター)によって誘導されるGFP/TRAIL融合タンパク質用の発現カセット(Kagawaら、2001)、および遺伝子がhTERTプロモーターによって誘導されるトランス活性化因子であるGAL4/VP16用の発現カセットの2つの発現カセットを有する。このシャトルプラスミドを、5型アデノウィルスの35 kbのCla I断片と共に293細胞に同時トランスフェクトした。次いで、相同組換えによって組換えベクターAd/GT-TRAILを作製し、プラーク精製した。発現カセットの配列は、医学部アンダーソン癌センターのDNA配列決定コア施設において自動DNA配列決定によって確認した。使用した全てのベクターの増殖、精製、力価決定および品質分析は、実施例およびGuら、2000に以前に記載されているように実施した。Ad/gTRAILの力価および収率は他のE1欠損アデノウィルスベクターの範囲内であった。
【０１３９】
細胞系およびヒト肝細胞
ヒト肺癌細胞系A549およびH460、並びにヒト結腸癌細胞系DLD-1およびLovoを実施例1に記載されているように増殖させた。NHPHは、Applied Cell Biology Research Institute(ワシントン州カークランド)から入手するか、またはテキサス大学医学部アンダーソン癌センターによって承認されているプロトコールに準拠して肝切除を受けた患者の外科標本から採取した肝硬変の見られない正常な肝組織から単離した。肝標本のコラゲナーゼ消化およびヒト一次肝細胞の培養は記載されているように実施した(Hsuら、1985；Stromら、1982)。簡単に説明すると、肝臓試料をロートに乗せた篩の上に置いた。(ポンプ作用のある管に接続されている)4本のカテーテルを肝臓試料の血管に挿入した。約500mlの単離用緩衝液(8.3 g NaCl、5 g KCL、2.4 g HEPESを含む1000 mlのdH2O、pH 7.4)で残存する血液を完全に洗い流してから、0.5 mg/mlコラゲナーゼおよび5％ウシ血清アルブミンを含有する単離用緩衝液200mlで、肝臓が軟らかくなって崩壊し始めるまで、37℃において潅流した。次いで、試料をコラゲナーゼ溶液中で小片に引き裂き、篩でろ過した。肝細胞を採取し、10％ FBSおよび抗生物質を含有するDMEM培地で24時間培養した。細胞を実験に使用する前に、細胞の培地を無血清培地(Allied Cell Biology Research Institute、ワシントン州カークランド)に変えた。
【０１４０】
インビトロにおける遺伝子導入
以前に記載されているように、最適なMOIを決定した。細胞の50％〜80％が青に染色されるMOIをこの実験に使用した。これらのMOIは、DLD-1、Lovo、A549、NHFBおよびヒト一次肝細胞では1000粒子であり、H460細胞では2000粒子であった。特に明記しない限り、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16を陽性対照として使用し、Ad/CMV-GFPをベクター対照として使用した。PBSだけで処置した細胞は偽対照として使用した。
【０１４１】
生化学的アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイ
β-ガラクトシダーゼ活性は、以前に記載されているように、ルミノメーターおよびGalacto-Light Chemiluminescent Assayキット(Tropix, Inc. マサチューセッツ州ベッドフォード)を使用して測定した(Guら、2000；Kochら、2001)。細胞生存率は、以前に記載されているように、XTTアッセイによって測定した(Kagawaら、2000a；Guら、2000)。各実験は4つ組で実施し、少なくとも2回反復した。蛍光標識細胞分取(FACS)は以前に記載されているように実施した(Kagawaら、2000a、c；Guら、2000)。簡単に説明すると、処置の48時間後に接着細胞および浮遊細胞を採取した。一部は、GFP陽性細胞の割合をFACSによって測定することによってGFP発現を分析するために使用した。試料の残りの部分は、細胞のDNA含量のフローサイトメトリー測定によってアポトーシス細胞を定量するために使用した(Kagawaら、2000a、c；Guら、2000)。ウェスタンブロット分析は記載されているように実施した(Kagawaら、2000a、c；Guら、2000)。この検討に使用した抗体は、抗カスパーゼ-8(R&Dシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス)、抗PARP(BD PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)および抗GFP(Clontech Inc、カリフォルニア州パロアルト)であった。細胞培養培地中の可溶性TRAILの酵素標識免疫吸着アッセイ(ELISA)は以前に記載されているように実施した(Kagawaら、2001)。
【０１４２】
動物実験
動物実験は以前に記載されているように実施した。各マウスの背側の側腹部に2×106DLD-1細胞を皮下接種することによって、ヒト結腸癌異種移植片をヌードマウス(6週齢〜8週齢、Charles River Laboratories Inc.、マサチューセッツ州ウィルミントン)に樹立した。腫瘍が直径0.5 cmに達したら、アデノウィルスベクターまたはPBSの腫瘍内注射を実施した。6×1010粒子/注射/腫瘍の用量の3回の腫瘍内注射を5日ごとに行った。各群の10匹のマウスを1週間に3回追跡調査して、腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は、体積=a×b2/2(式中、a:大きい方の径、b:小さい方の径である)として算出した(Kagawaら、2001)。腫瘍が直径1.5cmに達したら、施設のガイドラインに準拠してマウスを殺傷した。
【０１４３】
全身遺伝子送達後の毒性も、6週齢〜8週齢のBalb/cマウス(Charles River Laboratories Inc.)で検討した。簡単に説明すると、マウスに、総容量200μlのアデノウィルスベクターの6×1010粒子の静脈内注射を行った。注射の2日後、14日後および30日後に、CO2吸入によって3匹のマウスを殺傷した。次いで、組織病理学的調査のために、以前に記載されているように種々の器官(脳、心臓、肺、肝臓、腸、脾臓、膵臓、卵巣、腎臓および副腎)を採取した(Kagawaら、2000a、c；Guら、2000)。肝機能分析のためには、治療の2日後、10日後および30日後に血清試料をマウスから採取した。肝細胞への障害は、以前に報告されているように、血清ALTおよびASTレベルを調査することによってモニタリングした(Guら、2000)。
【０１４４】
TUNEL染色
腫瘍内注射の48時間後に腫瘍を切除した。アポトーシスは、以前に記載されているように、インサイチューTUNEL染色によって評価した(Kagawaら、2001)。簡単に説明すると、パラフィン包埋した切片を脱パラフィンし、脱水した。スライドを3％H2O2のメタノール溶液中で室温において10分間、0.02％プロテアーゼ/PBSと共に37℃において30分間インキュベーションした。製造業者のプロトコールにより、スライドをターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を含有する反応緩衝液と共に30分間インキュベーションした後(Roche Molecular Biochemicals)、ABC試薬で染色した。次いで、スライドをDAB/H2O2溶液と共に1分間〜2分間インキュベーションし、十分に洗浄し、4％メチルグリーンで再度染色した。
【０１４５】
統計分析
治療群間の差は、Statisticaソフトウェア(StatSoft Inc.、オクラホマ州ツルサ)を使用してANOVAによって評価した。インビボにおける腫瘍増殖に関する実験の結果は、反復測定モジュールを用いて、ANOVAによって分析した。P≦0.05は有意であると考えた。
【０１４６】
結果
hTERTプロモーターからの導入遺伝子発現の増加
hTERTプロモーターを、アポトーシス促進遺伝子の治療作用を癌に与えるために使用することができることが、本発明者により観察された(Guら、2000)。癌胎児性抗原(CEA)プロモーターからの導入遺伝子の発現は、プロモーターの特異性を損失することなく、GAL4遺伝子調節システムを介してインビトロおよびインビボにおいて20倍〜100倍以上増加されうることも観察された(Kochら、2001)。GAL4遺伝子調節システムを使用することによって、hTERTプロモーターからの導入遺伝子の発現レベルも増加されうるかどうかを試験するために、hTERTプロモーターから直接発現されるlacZ遺伝子を、アデノウィルス媒介性遺伝子導入後にGAL4成分を介してhTERTプロモーターから発現されるものと比較した。悪性腫瘍細胞および正常細胞を含む細胞系のパネルをこの検討に使用した。hTERTプロモーターによって誘導されるLacZ遺伝子を発現するアデノウィルスベクター(Ad/hTERT-LacZ)を用いて、またはGAL4/TATAプロモーターによって誘導されるLacZ遺伝子を含有するアデノウィルスベクター(Ad/GT-LacZ)および（そのタンパク質がGAL4/TATAプロモーターを特異的に活性化することができる）hTERT誘導性GAL4/VP16融合遺伝子を含有するアデノウィルスベクター(Ad/hTERT-GV16)からなるバイナリーアデノウィルスベクターを用いて、細胞を処置した。Ad/CMV-LacZ、Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-LacZ単独で処置した細胞を処置対照として使用した。PBSで処置した細胞はバックグラウンドの対照として使用した。
【０１４７】
細胞をバイナリーベクターで処置する場合、総ベクター用量はシングルベクターの場合と同じであったが、2つのベクターの比は1:1に設定した。LacZ遺伝子発現レベルは、X-gal染色およびβ-ガラクトシダーゼアッセイによって測定した。Ad/CMV-LacZによる処置により試験した全ての細胞系において高いレベルのLacZ遺伝子発現をもたらしたが、Ad/hTERT-LacZ単独またはAd/GT-LacZ+Ad/hTERT-GV16による処置は癌細胞系においてのみ高いレベルのLacZ遺伝子発現をもたらしたが、正常な線維芽細胞ではもたらさなかった。この結果は、hTERTプロモーターは高いレベルの腫瘍特異的な導入遺伝子発現に使用することができるという以前の知見と一致している(Guら、2000)。一方、Ad/GT-LacZまたはAd/hTERT-GV16単独で処置した細胞は、バックグラウンドレベルのβ-ガラクトシダーゼしか生じず、これはバイナリーベクターシステムでは2つのベクターがLacZ遺伝子発現に必要であることを示している。さらに、バイナリーベクターシステム(hTERTおよびLacZ)の遺伝子用量はシングルベクターシステムの半分だけであったとしても、Ad/GT-LacZ+Ad/hTERT-GV16で処置した癌細胞のβ-ガラクトシダーゼの活性レベルはAd/hTERT-LacZで処置した癌細胞より100倍以上高かった(表4)。しかし、正常な線維芽細胞では、バイナリーベクター処置した細胞対シングルベクター処置した細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性の増加は、癌細胞において見られるものよりはるかに少ない、約38倍であった。この結果は、GAL4成分は、特異性に影響を与えることなく、hTERTプロモーターからの導入遺伝子発現レベルを増加するために使用することができることを示唆している。
【０１４８】
（表４）アデノウィルス媒介性の遺伝子導入後のβ-ガラクトシダーゼ活性*
2005502645.tif 000009
*値は3つ組のアッセイ2回の平均を示す。
【０１４９】
Ad/gTRAILの構築および特徴づけ
GAL4遺伝子調節要素は、特異性を損なうことなく、hTERTプロモーターからの導入遺伝子発現を増加することができることにより、本発明者は、バイシストロン性のアデノウィルスベクター、Ad/gTRAILを設計し、構築するに至った。このバイシストロン性ベクターは、GAL4遺伝子調節システムを介してhTERTプロモーターからのGFP/TRAIL融合遺伝子を発現する(図10)。このベクターは、最初、トランス-リプレッサーGAL4/KRAB-Aを発現する、本発明者の実験室で構築した293細胞中で構築されたが(Witzgallら、1994)(J. V. Bonventre博士、ハーバード大学、ボストンから供与)、いかなる問題を生じることなく、ベクターを増殖し、通常の293細胞から精製することができる。
【０１５０】
このベクターの機能は、TRAIL遺伝子に非常に感受性が強いことが以前に見出されているヒト結腸癌細胞系DLD1において特徴付けられた(Kagawaら、2001)。サイトメガロウィルス(CMV)早期プロモーターからGFPを発現する対照ベクターAd/CMV-GFPを、1000ウィルス粒子(vp)/細胞の感染効率(MOI)でDLD1細胞に感染させた。これにより、蛍光顕微鏡下で検出するとき、約50％のGPF陽性細胞を生じたが、細胞を死滅させなかった。しかし、同じ用量のAd/gTRAILをこれらの細胞に感染させると、同じレベルのGFP陽性細胞を生じたが、形態変化で判断したとき、Ad/gTRAIL処置した細胞の90％を超える細胞が処置から48時間後に死滅した。従って、Ad/gTRAILによる処置は、TRAIL感受性細胞を効果的に死滅させることができる。
【０１５１】
インビトロでの癌細胞におけるAd/gTRAILによる導入遺伝子発現およびアポトーシス誘導
Ad/gTRAILの導入遺伝子発現レベルおよび抗腫瘍作用レベルをさらに証明するために、材料および方法の章に記載するように、ヒト肺癌細胞系(A549およびH460)およびヒト結腸癌細胞系(DLD-1およびLovo)を、一定の総MOIのAd/gTRAIL、Ad/CMV-GFPまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した。PBSで処置した細胞は偽対照として使用した。2日後、細胞を回収し、2部に分割した。一方の部分はGFP発現を分析するために使用し、もう一方の部分はアポトーシスを定量するために使用し、両方の分析はフローサイトメトリーアッセイで実施した。Ad/CMV-GFPまたはAd/gTRAILによる処置は、試験した全ての細胞系において同様のレベルのGFP陽性細胞(70％〜90％)を生じ、2つのベクターの導入遺伝子発現レベルはこれらの癌細胞系ではほぼ同様であったことを示唆している(図11A)。しかし、Ad/gTRAILによる処置は、アポトーシス細胞を劇的に増加させ、野生型ヒトTRAIL(Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16)を発現するバイナリーベクターシステムで処置した細胞の所見と一致する結果である(Kagawaら、2001)。これと比較して、バイナリーベクターはGFP成分を含有しなかったため、Ad/CMV-GFPによる処置は、バックグラウンドレベルのアポトーシスしか生じず、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16による処置はバックグラウンドレベルのGFP陽性細胞しか生じなかった。これらの結果は、Ad/gTRAILによる処置は、癌細胞において高いレベルの導入遺伝子発現および高いレベルのアポトーシスを誘導することができることを証明している。
【０１５２】
XTTアッセイを用いて、Ad/gTRAILの抗腫瘍活性をさらに証明した(図11B)。Ad/gTRAILまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16によるDLD-1、Lovo、A549およびH460の処置は、インビトロにおいて細胞生存率を劇的に低下した。これらの結果は、Ad/CMV-GFPまたは偽対照で処置した細胞に関連する結果とは有意に異なる。これらの結果はまた、アポトーシスマーカーのウェスタンブロット分析によって裏付けられた。Ad/gTRAILまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した群では、感染から早くも12時間後にカスパーゼ-8およびポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)切断が生じたが、Ad/CMV-GFP処置群または偽対照では生じなかった。
【０１５３】
インビボにおけるAd/gTRAILによる腫瘍増殖の抑制
ヒトTRAIL遺伝子を発現するバイナリーアデノウィルスベクターの直接腫瘍内投与は、ヌードマウスにおいてインビボにおけるDLD1腫瘍増殖を抑制した(Kagawaら、2001)。Ad/gTRAILの病巣内投与も腫瘍の増殖を抑制することができるかどうかを試験するために、Ad/gTRAILの抗腫瘍作用をバイナリーベクターと比較した(図12)。直接比較は、Ad/gTRAILの病巣内投与はAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16と同じ抗腫瘍作用を生じることを示し、Ad/gTRAILは、インビボにおける抗腫瘍作用に関してはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16と同じくらい効果的であることを示唆している。これと比較して、Ad/CMV-GFPで処置した腫瘍はPBSで処置したものと同じくらい速く増殖した。腫瘍組織の処置後の組織化学的調査はこれらの結果を裏付けた。Ad/gTRAILまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16による処置はアポトーシスを劇的に増加したが、Ad/CMV-GFPまたはPBSによる処置はバックグラウンド程度のアポトーシスしか生じなかった。
【０１５４】
正常なヒト一次肝細胞におけるAd/gTRAILの導入遺伝子発現および毒性
外科的標本から単離した正常なヒト線維芽細胞(NHFB)またはNHPHに対するAd/gTRAILの影響を評価した。この目的のために、NHPHまたはNHFBを、PBSまたは1000vp/細胞の総MOIのAd/CMV-GFP、Ad/gTRAILもしくはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した。バイナリーシステムを使用する場合、総用量は同じであったが、2つのベクターの比は1:1に設定した。2日後、細胞を回収して、2部に分割した。上記のように、一方の部分はGFP発現を分析するために使用し、もう一方の部分は、フローサイトメトリーアッセイによりアポトーシス細胞を定量するために使用した。NHPHまたはNHFB両方においてAd/CMV-GFPによる処置だけが50％を超えるGFP陽性細胞を生じた。一方、Ad/gTRAILによる処置は1％未満のGFP陽性細胞しか生じず、これは、PBSまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置したNHPHまたはNHFB細胞に見られるものと同様であった(後者にはGFP成分がない、従って、導入遺伝子発現はGFPアッセイによって検出できない)(図13A)。アポトーシスのサイトメトリー分析は、Ad/gTRAILまたはAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16による処置は線維芽細胞ではバックグラウンドレベルのアポトーシスしか生じなかったことを示した。この所見は、TRAILを発現するベクターの処置はNHFBでは細胞死を生じなかったという本発明者の以前の知見に一致する。しかし、興味深いことに、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16による処置は、NHPHにおいてアポトーシス細胞の劇的な増加(30％を超える)を生じた。これと比較して、Ad/gTRAILによる処置は、PBSまたは対照ベクターで処置した細胞において見られるものと同様のバックグラウンドレベルの細胞死しか生じなかった(図13A)。これらのデータは、NHPHは全長のヒトTRAIL分子に感受性であることおよびhTERTプロモーターは、正常なヒト肝細胞における治療遺伝子の発現を防止するために使用することができ、それによって毒性の可能性を防止することを示す。Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16によるNHPHの処置は、顕微鏡による検討で明らかにしたとき、典型的なアポトーシス的な形態変化を生じたか、またはXTTアッセイによって明らかにしたとき、細胞生存の損失を生じたが、Ad/gTRAIL、Ad/CMV-GFPまたはAd/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16ではそうでなかったという事実によってこの知見はさらに裏付けられた(図13B)。Applied Cell Biology Research Institute(ワシントン州カークランド)から入手した一次肝細胞を使用したとき、同じ結果が観察された。
【０１５５】
全身投与後のAd/gTRAILの導入遺伝子発現および毒性
本発明者は、全身投与後のAd/gTRAILの肝臓における導入遺伝子発現レベルおよび毒性の可能性も検討した。この目的のために、成体のBalb/cマウス(6週齢〜8週齢)に、PBS、6×1010粒子/マウスの総用量のAd/CMV-GFP、Ad/gTRAILおよびAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16を尾静脈を介して注入した(この群では比1:1)。本発明者の以前の検討は、90％を超える肝細胞がこの用量で形質導入されることを示している(Guら、2000)。動物は、注射の2日後、14日後および30日後に殺傷した。組織病理学的検討のために肝臓、脾臓、肺、心臓、膵臓、腎臓、腸、性腺および脳を採取した。処置から2日目にはどの動物にも大きな顕微鏡的病変は観察されなかった。2週間目までには、アデノウィルスベクターで処置した全ての動物は、脾臓のリンパ過形成および肝臓の門脈領域の炎症細胞(リンパ球、形質細胞および好中球)の浸潤を示した。また、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した動物は、散在性肝細胞壊死を示し、核を2つまたは3つ持つ肝細胞(polyloidy)および大きい不規則な形状の核を有する肝細胞(巨大核)を有した。肝細胞の変化は30日目までに回復した。血清肝酵素アッセイの結果は、肝臓で観察された組織病理学的変化に一致した。アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)レベルは2日目および30日目には正常範囲内であったが、アデノウィルスベクターで処置した動物では14日目に上昇した(図14)。上昇は、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した動物では顕著であった。注目すべきことに、E1欠損アデノウィルスベクターは免疫原性であり、全身送達後の免疫適格動物の肝臓では亜急性の炎症応答を生じる(Jiら、1999；Yangら、1994)。同程度の炎症性応答はAd/CMV-GFPまたはAd/gTRAILで処置した動物において観察されたので、この応答は、導入遺伝子ではなく、ベクターに関連すると考えられる。興味深いことに、炎症性応答は、Ad/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した動物ではより重症であった。この所見の重要性はまだ不明であるが、この現象はヌードマウスでは観察されなかった(Kagawaら、2001)。
【０１５６】
アデノウィルスベクターの全身投与により肝細胞の形質導入を生じたので(Guら、2000；Fangら、1994)、GFPまたはGFP/TRAIL融合タンパク質発現のウェスタンブロット分析およびウィルスゲノムのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のために、上記動物の肝試料を採取した。Ad/CMV-GFPで処置した動物については、抗GFPポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析が2日目までに強力なGFPバンドを示したが、14日目までにはかなり弱くなった(データは示していない)。GFPは、30日目までにはウェスタンブロットによって検出不可能になった。この結果は、アデノウィルスベクターからの導入遺伝子発現は免疫適格動物では一過的であるという知見に一致している(Fangら、1994、1995、1996)。しかし、Ad/gTRAILで処置した動物では、導入遺伝子発現は、試験した経過時点のいずれにおいてもどの動物においてもウェスタンブロット分析によって検出されなかった。注目すべきことに、使用したGFP抗体は、Ad/gTRAILで処置したDLD1細胞においてGFP/TRAIL融合タンパク質を容易に検出することができる。さらに、半定量PCR分析によって、Ad/CMV-GFPまたはAd/gTRAILで処置した動物の肝臓において同じレベルのウィルスDNAが検出され、Ad/gTRAILによる導入遺伝子発現の欠損はアーティファクトによって生じたものではなかったことを示唆している。これらの所見は、hTERTプロモーターは、Ad/gTRAILの全身投与後の肝臓におけるGFP/TRAIL遺伝子の発現を防止するために使用できることを示唆している。これは、hTERTプロモーターは、Baxを発現するバイナリーアデノウィルスベクターの全身投与後のBax遺伝子に関連する肝毒性を防止するために使用することができるという本発明者の以前の知見に一致している(Guら、2000)。
【０１５７】
実施例4
乳癌細胞におけるhTERTプロモーターから発現されるGFP-TRAIL融合遺伝子による治療
材料及び方法
細胞系と試薬
ヒト乳癌細胞系MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-453およびMDA-MB-468を、10％熱不活性化ウシ胎仔血清および抗生物質およびグルタミンを添加したRPMI 1640倍地で増殖させた。不死化し、形質転換していない乳房上皮細胞系MCF10AおよびMCF10F並びに正常な乳腺上皮細胞(NHMEC)はClonetics(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。正常な乳房組織から単離した正常なヒト一次乳腺上皮細胞(PNHMEC)(StampferおよびYaswen、1994)はYinhua Yu博士(テキサス大学医学部アンダーソン癌センター)から供与された。ドキソルビシン耐性MDA-MB-231細胞は、親細胞をドキソルビシンに段階的に曝露することによって得た。簡単に説明すると、親MDA-MB-231細胞を、2μMの濃度(1.16μg/ml、MDA-MB-231細胞のIC80である)のドキソルビシン(Ben Venue Labs, Inc.、オハイオ州ベッドフォード)で処置した。ほとんどの細胞は処置の4日後に死滅した。次いで、残った生きている細胞を新鮮な培地で増殖させた。これらの残存細胞が培地上で70〜80％の集密度に達したら、同じ濃度のドキソルビシンで再度処置した。このサイクルを数回反復したら、ドキソルビシンの濃度を数倍に増加し、細胞を再度増殖させた。最後に16μMの濃度のドキソルビシンに耐性のMDA-MB-231を選択し(231/ADRと命名)、その後の実験に使用した。これらの実験に使用した他の試薬には、ゲムシタビン(Eli Lilly and Co.、インディアナ州インディアナポリス)、ビノレルビン(Pierre Fabre、Idron 64320、フランス)、パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Co.、ニュージャージー州プリンストン)、イリノテカン(Pharmacia & Upjohn Co.、ミシガン州カラマゾー)、フロキシウリジン(Ben Venue Labs, Inc.、オハイオ州ベッドフォード)およびTRAILタンパク質(R & D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)が挙げられる。
【０１５８】
アデノベクター
アデノベクターAd/CMV-LacZ、Ad/PGK-GV16、Ad/CMV-GFP、Ad/GT-TRAILおよびAd/gTRAILは以前に記載されている(Guら、2000；Kagawaら、2001；Zhangら、2002)。使用した全てのベクターの増殖、精製、力価決定および品質分析は先の実施例に記載されているように実施した。この実験に使用したMOIは、50〜80％の細胞が青に染色されるものとした。細胞系の各々のMOIは以下のようであった：それぞれ、MDA-MB-468は2000粒子、MDA-MB-231およびMDA-MB-453は4000粒子、MCF7は8000粒子。MCF-10A、MCF10FおよびNHMEのMOIは4000粒子であった。特に明記しない限り、Ad/CMV-GFPはベクター対照として使用し、PBSはmock(ウィルスなしの)対照として使用した。
【０１５９】
アッセイ
細胞生存率、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット分析は先の実施例に記載されているように実施した。Guら、2000およびKagawaら、2001も参照されたい。β-ガラクトシダーゼを使用した生化学分析は、実施例1に記載されたように測定した。ウェスタン分析には、抗カスパーゼ-8(R&D systems、ミネソタ州ミネアポリス)、抗カスパーゼ-3(BD PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)、抗PARP(BD PharMingen)、抗GFP(Clontech Inc.、カリフォルニア州パロアルト)および抗hTRAIL(Alexis、カリフォルニア州サンディエゴ)抗体を使用した。腫瘍のアポトーシスは、実施例3に記載するようにインサイチューTUNEL染色によって評価した。
【０１６０】
動物実験
動物実験は先の実施例に記載されているように実施した。ヒト乳癌異種移植片は、各マウスの背側の側腹部に5×106MDA-MB-231または231/ADR細胞を皮下接種することによって、6週齢〜8週齢のヌードマウス(Charles River Laboratories Inc.、マサチューセッツ州ウィルミントン)に樹立した。血清ASTおよびALTレベルは、実施例2並びにGuら、2000およびKagawaら、2001に記載されているように測定した。
【０１６１】
統計分析
処置群間の差は先の実施例に記載されているように評価した。生存はカプランマイヤー法を使用して評価した。細胞増殖を50％阻止する薬物濃度(IC50)は、CurveExpert 1.3ソフトウェア(ミシシッピー州スタークビル)によって算出した。
【０１６２】
結果
乳癌細胞におけるインビトロにおけるAd/gTRAILによる導入遺伝子発現およびアポトーシス誘導
Ad/gTRAILの導入遺伝子発現および抗腫瘍作用のレベルを試験するために、以前に記載されているように、4つのヒト乳癌細胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468およびMCF7)を、一定の総MOIのAd/gTRAILおよびAd/CMV-GFPで処置した。サイトメトリーを使用して、GFP発現を分析し、アポトーシスを定量した。Ad/CMV-GFPまたはAd/gTRAILによる処置により、全ての細胞系において同程度のレベルのGFP陽性細胞(70％〜90％)を生じた(図15A)。しかし、Ad/gTRAILによる処置だけはアポトーシス細胞の数を有意に増加した。Ad/gTRAILによるアポトーシスの誘導はウェスタンブロット分析によって確認した。カスパーゼ-8、カスパーゼ-3およびPARP切断は、Ad/gTRAILまたは、PGKプロモーター24から野生型TRAIL cDNAを発現するバイナリーベクターシステムであるAd/GT-TRAIL+Ad/PGK-GV16で処置した細胞においてだけ観察された。この結果は、細胞生存率分析によって立証された。Ad/gTRAILによる癌細胞系の治療は、Ad/CMV-GFPまたはPBSで治療した細胞と比較して、細胞生存率を有意に低下した(図15B)。これらの結果も、試験した癌細胞系はAd/gTRAILに感受性が高かったことを示唆している。
【０１６３】
これらの細胞が可溶性TRAILタンパク質に同様に感受性であるかどうかを試験するために、細胞を、800ng/ml以下の種々の濃度の組換えTRAILタンパク質で処置した。次いで、処置の24時間後、48時間後および96時間後に細胞生存率を測定した。MDA-MB-231およびMDA-MB-468は種々の濃度のTRAILタンパク質に感受性であったが、MDA-MB-453およびMCF7細胞は800 ng/mlの濃度のTRAILタンパク質にも耐性であった(図16)。しかし、興味深いことに、これら2つの細胞系は、他の細胞系と同じくらいAd/gTRAILに感受性であった。関与する機構は今後特徴付けられるが、この結果は、ある種の細胞では膜結合TRAILは可溶性TRAILより効果的であることを示唆している。
【０１６４】
ドキソルビシン耐性癌細胞に対するAd/gTRAILの影響
Ad/gTRAILが、化学療法に耐性の癌にも効果的であるかどうかを試験するために、MDA-MB-231細胞をドキソルビシンで繰り返し処置し、ドキソルビシン耐性細胞(231/ADR細胞)を選択した。親MDA-MB-231細胞は2μMのドキソルビシンに感受性であったが、231/ADRは16μMの濃度のドキソルビシンに耐性であった(図17A)。実際、種々の化学療法剤のIC50は、親MDA-MB-231細胞と比較して、231/ADR細胞では増加することをその後の検討は示しており、231/ADR細胞は多数の化学療法剤に比較的耐性であることを示唆している(表5)。
【０１６５】
（表５）親細胞およびドキソルビシン耐性MDA-MB-231細胞における、異なる化学療法剤およびAd/gTRAILのIC50
2005502645.tif 000010
【０１６６】
MDA-MB-231および231/ADRにおいてAd/gTRAILが導入遺伝子発現およびアポトーシスを誘導する能力を分析した。フローサイトメトリーは、Ad/gTRAILによって誘導される導入遺伝子発現およびアポトーシスのレベルは、231/ADRおよびMDA-MB-231親細胞においてほぼ同じであることを示した。また、これらの結果は、XTTアッセイによって裏付けられた(図17B)。231/ADR細胞は、親細胞と同じくらいAd/gTRAILに感受性であり、Ad/gTRAILは、従来の治療に耐性の癌を治療する際に有用であることを示唆している。
【０１６７】
正常な細胞に対するAd/gTRAILの影響
本発明者は、外科標本から単離した、形質転換していない乳房上皮不死化細胞系MCF10AおよびMCF10F並びに正常な乳腺上皮細胞(NHMEC)および正常なヒト一次乳腺上皮細胞(PNHMEC)における導入遺伝子発現およびアポトーシスをAd/gTRAILが誘導する能力にも興味を持った。Ad/CMV-GFPで処置した70％を超えるNHMECおよびPNHMECがGFP陽性であったが、Ad/gTRAILで処置した細胞は1％だけがGFP陽性であった。しかし、Ad/CMV-GFPまたはAd/gTRAILによる処置により、これら2つの細胞ではバックグラウンドレベルのアポトーシスしか観察されなかった。この所見は、hTERTプロモーターは正常なヒト細胞においてわずかな活性しかないという最近の知見に一致している(Guら、2000)。しかし、興味深いことに、Ad/gTRAILは、形質転換していない不死化乳房細胞系の2つである、MCF10AおよびMCF10Fの両方においてAd/gTRAILは実質的なレベルの導入遺伝子発現およびアポトーシスを誘導した(図18A)。この結果は、高いhTERTプロモーター活性を有し(Guら、2000)、TRAILに感受性である(Kagawaら、2001)不死化したヒト腎臓上皮細胞系である293細胞における知見に一致する。細胞生存率分析も、サイトメトリーアッセイの結果を裏付けた(図18B)。従って、要約すると、Ad/gTRAILによる処置はMCF10AおよびMCF10F細胞では細胞死を誘導したが、NHMECおよびPNHMECではしなかった。
【０１６８】
インビボにおける腫瘍増殖の抑制
乳癌細胞におけるAd/gTRAILの抗腫瘍作用をさらに評価するために、腫瘍細胞を皮下に接種することによって、MDA-MB-231由来のヒト乳癌移植片を6週齢〜8週齢のヌードマウスに樹立した。腫瘍が直径0.4cm〜0.5cmに達したら、Ad/gTRAILまたは対照の腫瘍内投与を開始した。動物に、9×1010粒子/注射/腫瘍を5日ごとに合計3回注射した。腫瘍の増殖をモニタリングした。肝毒性を試験するためにこれらの動物から血液試料も採取した。Ad/gTRAILの腫瘍内投与は、対照群における腫瘍増殖と比較して、インビボにおいて腫瘍の増殖を有意に抑制した(P<0.01)(図19A)。具体的には、完全な腫瘍退縮が60％の動物において生じ、これらの動物は6ヶ月以上腫瘍を認めなかった。これと比較して、Ad/CMV-GFPで治療した腫瘍はPBSで処置したものと同じくらい速く増殖し、これら2つの群の動物は全て3ヶ月以内に死亡した(図19B)。最初の注射の2日後の腫瘍組織の組織化学的分析は、Ad/CMV-GFPまたはAd/gTRAILによる治療後の腫瘍内における実質的な導入遺伝子発現を示した。しかし、アポトーシスは、Ad/gTRAILで治療した腫瘍においてだけ観察された。アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)の血清肝酵素アッセイは、全ての試料は最初の治療の2日後、12日後および30日後において正常範囲内であることを示した。
【０１６９】
同様の結果は、ドキソルビシン耐性乳癌細胞系231/ADRから誘導した腫瘍を有するマウスにおいて観察された。上記のように、231/ADR腫瘍を有するマウス(10匹/群)をAd/gTRAILまたはAd/CMV-GFPで治療した。対照の腫瘍増殖と比較したとき、Ad/gTRAILは腫瘍増殖を有意に抑制した(P<0.05)(図19C)。また、10匹の動物のうち4匹は、Ad/gTRAILによる治療後3ヶ月経過時に腫瘍が認められなかったが、対照群の動物は全てこの期間中に腫瘍負荷により死亡した(図20D)。
【０１７０】
実施例5
hTERTプロモーターは同質遺伝子系統のマウス腫瘍における腫瘍特異的Bax遺伝子発現および細胞死を誘導し、全身毒性を防止する
材料及び方法
組換えアデノウィルスベクター
ベクターAd/E1-、Ad/hTERT-LacZ、Ad/CMV-LacZ、Ad/GT-LacZ、Ad/GT-Bax、Ad/PGK-GV16、Ad/CMVGFPおよびAd/hTERT-GV16は以前に記載されている。ウィルス力価は先の実施例におけるように測定した。粒子/プラーク比は、通常、50:1〜100:1の範囲内であった。
【０１７１】
インビトロにおける遺伝子発現の分析
マウスUV-2237m線維肉腫細胞を使用した。従来の技法を使用して、正常なマウス線維芽細胞(NMFB)をBALB/cマウスの膵臓から単離した。ルイス肺癌細胞、M109肺癌細胞、LM2肺上皮細胞およびNIH3T3細胞は実験室で維持した。正常なヒト骨髄CD34+始原細胞は、以前に記載されているように磁気的細胞選別(MACS)によって分離した(Andreeffら、1999)。細胞は、ベクター感染の1日前に1×105/ウェルの密度で24ウェルプレートで培養した。次いで、UV-2237m、LLC、M109およびNMFB細胞は3000ウィルス粒子/細胞、NIH3T3細胞は6000ウィルス粒子/細胞、並びにLM2およびヒトCD34+骨髄幹細胞は10,000ウィルス粒子/細胞の感染効率(MOI)のアデノベクターを細胞に感染させた。各細胞系におけるウィルス感染の最適MOIは、60％を超える細胞が感染されると事前に規定した。アデノウィルス感染のこの高い効率を達成するために、記載されているように、LLC、M109、NIH3T3およびCD34+細胞ではSuperfectをアデノウィルスと併用使用した(Howardら、1999)。感染から24時間後、β-ガラクトシダーゼ発現を可視化するために細胞をX-galで染色するか、またはβ-ガラクトシダーゼ活性の生化学的分析のために細胞を回収した。
【０１７２】
組織化学的検討
X-gal染色は、実施例1に記載されているように実施した。Baxタンパク質の免疫組織化学的分析のためには、腫瘍または肝臓を10％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、4μmの切片に切断した。抗原を回収するためには、切片を乾燥させて脱パラフィンし、スチーマー内でクエン酸緩衝液(10 mmクエン酸、pH 6.0)中で加熱した。1.5％ H2O2/メタノールに10分間曝露することによって内因性ペルオキシダーゼを失活してから、切片を室温において阻止抗体(ヤギ血清)と共に30分間、ウサギ抗Baxポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルーズ)と共に1時間、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体と共に30分間インキュベーションした。抗Bax抗体の特異的な結合は、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ試薬(Vector Laboratories、米国カリフォルニア州バーリンゲーム)およびその基質である四塩化ジアミノベンジジン(Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)を用い、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色することによって可視化した。
【０１７３】
アッセイ
β-ガラクトシダーゼ活性、細胞生存率アッセイおよびBax発現のウェスタン分析は、先の実施例および(Kagawaら、2000)に記載されているように実施した。細胞生存率アッセイのためには、細胞に、4500ウィルス粒子/細胞の総MOIのアデノウィルスベクターを感染させた。示したウィルスベクターシステムにより細胞を4つの群に分類した：Ad/CMVGFP+Ad/PGK-GV16、Ad/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16。フローサイトメトリーによるアポトーシス分析のためには、細胞に、4500ウィルス粒子/細胞のMOIの組換えアデノウィルスベクターを感染させた。
【０１７４】
動物実験
動物実験は先の実施例に考察されているように実施した。皮下腫瘍モデルについては、5×106UV-2337m細胞を6週齢〜8週齢のC3Hマウス(National Cancer Institute)の背側の側腹部の皮下に接種して腫瘍を樹立した。血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニントランスアミナーゼ(ALT)のレベルは記載されているように測定した(Kagawaら、2000)。
【０１７５】
結果
マウス細胞系においてhTERTプロモーターによって誘導される導入遺伝子発現
hTERTプロモーター活性は、材料及び方法に記載されているように、細胞にAd/hTERT-LacZを感染させることによって、培養マウス線維肉腫UV-2237m細胞、ルイス肺癌(LLC)細胞、M109肺癌細胞、LM2細胞、NIH3T3細胞および正常なマウス線維芽(NMFB)細胞において評価した。Ad/CMV-LacZは陽性対照として使用し、Ad/CMV-GFPは陰性対照として使用した。細菌β-ガラクトシダーゼの発現は、材料及び方法に記載されているように、X-gal染色または酵素アッセイによって感染の24時間後に分析した。全ての腫瘍細胞では、CMVおよびhTERTプロモーターは共に、Xgal染色で示すとき、強力なβ-ガラクトシダーゼ発現を誘導したが、Ad/CMV-LacZによる感染だけは高いレベルの導入遺伝子発現を生じた。CMVおよびhTERTプロモーター活性は、NMFB細胞の約150倍と比較して、腫瘍細胞では3〜10倍しか違わなかった(図20)。乳頭腫瘍から誘導した形質転換したマウス肺上皮細胞系であるLM2細胞では(Oreffoら、1998)、CMVおよびhTERTプロモーター活性は21倍違ったが、無限増殖することができる形質転換していない特別の「正常な」マウス線維芽細胞系である、NIH3T3細胞では、CMVおよびhTERTプロモーター活性は80倍を上回って異なったことは注目すべきである。これらの結果は、ヒト癌細胞系および正常細胞において得られたものに一致しており(Guら、2000)、hTERTプロモーターはマウス転写装置を効率的に使用することができることおよびhTERTプロモーターはマウス腫瘍細胞および形質転換細胞において活性が高いが、正常細胞では比較的穏やかであることを証明している。
【０１７６】
hTERTプロモーターによって誘導されたBax遺伝子発現はインビトロにおいて腫瘍細胞を抑制する
強力なアポトーシス誘導性Bax遺伝子を高いレベルで発現するアデノウィルスベクターを構築する際の困難を克服するバイナリーアデノウィルスベクターシステムが最近開発された(Kagawaら、2000)。簡単に説明すると、システムは2つのアデノウィルスベクターを含有する。これらのベクターの一方は、293パッケージング細胞において優性である、5つのGal4結合部位および1つのTATAボックスを含む、最小合成プロモーターの制御下でヒトBax cDNAを含有し、それによって293細胞に対するBax遺伝子の毒性作用を回避し、ベクター(Ad/GT-Bax)作製を可能にする。Bax遺伝子の発現は、Gal4 DNA結合ドメインおよびVP16活性化部位を含む融合タンパク質からなる合成トランス活性化因子を発現する別のアデノウィルスベクターをAd/GT-Baxウィルスに同時感染させることによって誘導することができる。このバイナリーベクターシステムを癌細胞に投与すると、インビトロにおいて広範なアポトーシスを誘導し、インビボにおいて腫瘍増殖を抑制した(Kagawaら、2000)。正常な細胞におけるBax遺伝子の毒性は、hTERTプロモーターを使用して、ヒト癌細胞において腫瘍特異的なBax遺伝子発現を誘導することによって防止された(Guら、2000)。
【０１７７】
hTERTプロモーターがマウス腫瘍細胞においてBax遺伝子発現を同様に誘導することができるかどうかを試験するために、hTERTプロモーターによって誘導されたBax遺伝子発現の影響を、マウスハウスキーピング遺伝子3-ホスホグリセリン酸キナーゼの構成的プロモーターである、PGKプロモーターによって誘導されるものと比較した。UV-2237m細胞、LLC細胞およびM109細胞を、PBS、Ad/CMV-GFP+Ad/PGK-GV16、Ad/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16で処置した後にXTTアッセイを使用して細胞生存率を比較した(図21A)。Ad/GT-Bax+Ad/PGK-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16による処置はこれらの腫瘍細胞に同程度の細胞死作用を示したが、全ての対照処置は細胞生存率にわずかな影響しか生じなかった。これらの結果は、hTERTプロモーターはマウス腫瘍細胞においてBax遺伝子発現を誘導し、インビトロにおいて腫瘍細胞増殖を抑制することができることを証明している。Bax発現によって生じる増殖抑制が増殖阻止ではなくアポトーシスによるものであったことを確認するために、蛍光標識細胞選別(FACS)分析を使用した。UV2237m細胞をバイナリーベクターで処置し、処置の48時間後または72時間後に細胞を回収して、FACS分析を実施して、sub-G1集団を定量することによってアポトーシス細胞分画を測定した(図21B)。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16およびAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16処置は同程度のアポトーシス集団を生じ、hTERTプロモーターは、マウス腫瘍細胞においてBax遺伝子およびアポトーシスを誘導する際にPGKプロモーターと同じくらい強力であることを示唆している。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16およびAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16で処置したUV2237m細胞におけるBax遺伝子の発現はウェスタン分析で確認した。hTERTプロモーターおよびPGKプロモーターはUV-2237m細胞において非常に高いBax遺伝子発現を誘導したが、対照細胞ではBax発現はわずかであった。
【０１７８】
hTERTプロモーターはインビボにおいて腫瘍特異的Bax発現を誘導し、同質遺伝子系統の腫瘍増殖を抑制する
同質遺伝子系統の腫瘍に対するインビボBax遺伝子治療にhTERTプロモーターを使用する可能性をさらに評価するために、UV-2237m腫瘍を免疫適格C3Hマウスの皮下に樹立し、腫瘍をhTERTまたはPGKプロモーター誘導性Bax遺伝子ベクターで治療した。ベクターを腫瘍内に3回連続して注射した後、腫瘍サイズの変化を3週間モニタリングした。このときまでに、対照群のマウスは、腫瘍サイズが直径15 mmに達したので、研究所の方針により死亡させなければならなかった。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16による治療は同じレベルの腫瘍増殖抑制を生じ、PBS、Ad/E1-またはAd/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16による治療によって得られる変化とは有意に異なった(図22)。Ad/GT-LacZ+Ad/PGK-GV16で治療した群はまた、おそらくC3Hマウスの免疫応答により軽度の腫瘍増殖阻止も示した(Luら、1999)。腫瘍におけるBax遺伝子の発現は免疫組織化学染色によって確認した。Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16バイナリーベクターの腫瘍内注射はUV-2337m腫瘍において強力なBax遺伝子発現を生じた。これと比較して、バイナリーベクターをマウス尾静脈を介して全身注射すると、PGKプロモーターだけが肝臓において強力なBax発現を誘導したが、hTERTプロモーターは検出可能なBax発現を誘導しなかった。これらの結果は、hTERTプロモーターはマウス腫瘍において活性が高いが、インビボにおいて正常な肝臓では穏やかであることおよびインビボにおいて腫瘍特異的なBax遺伝子発現を効果的に誘導し、同質遺伝子系統の腫瘍増殖を抑制することを証明している。
【０１７９】
hTERTプロモーターは、明らかな長期毒性を生じることなく、Bax遺伝子の急性肝毒性を防止する
マウスにおいてBax遺伝子の全身送達の毒性の可能性を試験するために、10匹からなる群の成体BALB/cマウスに、PBS、6×1010ウィルス粒子/マウス用量のAd/GT-Bax+Ad/CMV-GFP、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16を尾静脈を介して1週間に3回注入した。マウスを6ヶ月までモニタリングした。最後の注射から2日、10日、30日、100日および6ヶ月経過時に血液試料を採取して、血液像並びにASTおよびALTの血清レベルを測定した。最も有意な毒性作用はウィルス注射から1週間以内にAd/GT-Bax+Ad/PGK-GV16で治療した群に生じ、10匹のマウスのうち6匹が急性肝毒性で死亡した(P<0.01)。この群の残りの4匹は回復し、6ヶ月間の実験中生存した。一方、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16群または他の対照群のマウスは実験中死亡しなかった。実験を終了した全てのマウスにおいて、ヘモグロビンレベルまたは白血球数(WBC)もしくは赤血球数(RGC)に有意な差を示すものはなく、アデノウィルス媒介性Bax遺伝子の骨髄毒性は小さいことを示唆している(表6)。以前に報告されているように(Guら、2000)、ASTレベルおよびALTレベルは、ウィルス注射の2日後のAd/GT-Bax+Ad/PGKGV16群のみにおいて他の全ての群より有意に高く(P≦0.001)、Bax遺伝子によって生じる急性肝毒性を示している。10日目以降からは、ASTまたはALTの有意な差は群のいずれにおいても見られなかった(表7)。これらの結果も、hTERTプロモーターは、アポトーシス促進遺伝子の急性肝毒性を全身的に防止するために使用することができ、明らかな長期毒性作用を示さないことを示唆している。
【０１８０】
（表６）アデノウィルス媒介性Bax発現の血液細胞に対する短期および長期の影響
2005502645.tif 000011
値は3個〜5個の試料の平均±s.d.を意味する。a6匹のマウスがアデノウィルス感染から1週間以内に死亡した。
【０１８１】
（表７）アデノウィルス媒介性Bax発現が肝酵素の血清レベルに与える短期および長期の影響
2005502645.tif 000012
値は3個〜5個の試料の平均±s.d.を意味する。aP≦0.001
【０１８２】
造血CD34+始原細胞における最小hTERT活性
アポトーシス促進または細胞毒性遺伝子の発現を誘導するhTERTプロモーターの使用について大きな問題の1つは、幹細胞への毒性の可能性である。hTERTが始原細胞幹細胞において活性であるかどかを試験するために、正常なヒト骨髄CD34+造血始原細胞を単離し、Ad/hTERT-LacZまたはAd/CMV-LacZを感染させた場合のこれらの細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性を比較した。アデノウィルスベクターは幹細胞にあまり感染しない。幹細胞に感染させるためには非常に高用量のアデノウィルスベクターと細胞-ベクターの長期接触が必要であり、このような条件でも、わずかな割合の幹細胞しか感染させられない(Watanabeら、1996；Feldmanら、1997)。しかし、Superfect(Qiagen、ドイツ、ヒルデン)などの多数のリポソーム試薬は、アデノウィルスの幹細胞への感染効率を増加することが示されている(Howardら、1999)。実際、SuperfectをAd/CMV-GFPと組み合わせると、蛍光を示す(すなわち、感染した) CD34+細胞集団は10,000のMOIにおいて60％に達した(データは示していない)。ヒトCD34+始原細胞にAd/hTERTLacZまたはAd/CMV-LacZを同様の条件下において感染させると、β-ガラクトシダーゼ活性の差は100倍を超え(図23)、他の正常細胞とほぼ同じであった(図20)(Guら、2000)。さらに、hTERTプロモーター活性は基底レベルに近似しており、hTERTプロモーター活性はこれらのCD34+始原細胞では非常に低いことを示している。ヒト始原細胞においてhTERTプロモーターの転写活性が低いことおよび長期インビボ検討において血液細胞プロフィールに検出可能な変化が見られないことは、アデノウィルス媒介性のhTERT誘導性アポトーシス促進遺伝子発現の幹細胞に関連する毒性の可能性は、あったとしてもわずかであると思われることを示唆している。
【０１８３】
実施例6
DLD1ヒト結腸癌細胞系におけるアデノウィルス媒介性アポトーシス促進遺伝子治療量に対する耐性の克服
材料及び方法
細胞系およびアデノウィルス
10％ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を添加したRPMI 1640でヒト結腸癌細胞系DLD1の細胞を増殖させた。LipofectAMINE(Invtrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド)を使用して、DLD1細胞にpGT60-hBcl-xL(InvtroGen、米国カリフォルニア州サンディエゴ)をトランスフェクトすることによって、ヒトBcl-xL遺伝子を安定に感染させたDLD1細胞を得た。次いで、500μg/mlハイグロマイシンを含有するRPMI 1640培地で細胞を培養した。Bcl-xLを過剰発現するハイグロマイシン耐性単細胞クローンを採取し、ウェスタンブロット分析によって同定した。使用したアデノウィルスベクター、Ad/PGK-GV16、Ad/hTERT-GV16、Ad/GT-Bak、Ad/GT-Bax、Ad/GT-TRAILおよびAd/CMV-GFPは以前に記載されている(Guら、2000；Kagawaら、2001)。Ad/gTRAILは以前に記載されているように構築した。両方の発現カセットを、GT-GFP/TRAIL-シミアンウイルス40ポリアデニル化シグナル-hTERT-GAL4/VP16ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの右から左の配列順序方向でアデノウィルスE1領域に挿入した。酵母GAL4遺伝子調節システムは、プロモーター特異性を損なうことなく、腫瘍特異的プロモーターからの導入遺伝子発現を増加することができることが最近の検討により示されたので、GAL4遺伝子調節成分をベクターAd/gTRAILに組み入れる(Kochら、2001)。使用した全てのベクターの増殖、精製、力価決定および品質分析は以前に記載されているように実施した(Kagawaら、2000；Guら、2000；Kagawaら、2001)。
【０１８４】
インビトロにおける遺伝子導入、細胞生存率およびフローサイトメトリーアッセイ
インビトロにおける遺伝子導入は、DLD1細胞を使用して、以前に記載されているように実施した。細胞生存率アッセイは、感染の1日前に96ウェルプレートに1×104細胞/ウェルの密度で接種した細胞を使用して、先の実施例に記載されているように実施した。GFP発現およびアポトーシスのフローサイトメトリー分析は以前に記載されているように実施した。
【０１８５】
ウェスタンブロット分析
ウサギ抗ヒトDR4並びにヒトBax、Bak、XIAP、カスパーゼ-2、-7および-8に対するマウスモノクローナル抗体はPharMingen(米国カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。ウサギ抗ヒトDR5はImegenex(米国カリフォルニア州サンディエゴ)から入手した。ウサギ抗ヒト/マウスFLIPはR&D Systems(米国ミネソタ州ミネアポリス)の提供を受けた。ウサギ抗ヒトBcl-2およびBcl-xL/SはSanta Cruz Biotechnology(米国カリフォルニア州サンタクルーズ)から購入した。ウェスタンブロット分析のためには、80μgの総細胞タンパク質を10％〜12％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、次いでHybond化学発光膜(Amersham、米国イリノイ州アーリントンハイツ)に移した。次いで、5％低脂肪乳および0.05％ Tween-20をPBS中に含有するブロッキング用緩衝液で1時間または4℃において一晩膜をブロッキングし、0.05％ Tween-20を含有するPBS(PBST)で3回洗浄し、一次抗体と共に室温において少なくとも1時間インキュベーションした。PBSTで再度洗浄後、膜をペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベーションし、化学発光検出キット(ECLキット、Amersham Pharmacia)で現像した。
【０１８６】
RNase保護アッセイ
総RNA単離キット(PharMingen)を使用して、総RNAを抽出した。RNase保護アッセイは、製造業者のプロトコールにより実施した(RiboQuant Multiprobe RNase Protection Assay System、PharMingen)。ヒトグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAPDH)を、mRNA量正規化の内部対照として使用した。
【０１８７】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、製造業者Applied Biosystems(米国カリフォルニア州フォレスターシティ)のプロトコールにより、ABI Prism 7700 Sequence Detection Systemで実施した。使用した各遺伝子のプライマーおよびプローブは、Applied Biosystems提供の7700 System内臓のソフトウェアを用いて設計され、Invtrogen(米国マサチューセッツ州フレデリック)により合成された。プライマーは、汚染されたゲノムDNAの影響を排除する遺伝子の異なるエキソンに配置した。例えば、Bcl-xLの順方向のプライマーは、エキソン2に位置する
2005502645.tif 000013
であり、逆方向のプライマーはエキソン3に位置する
2005502645.tif 000014
であった。Bcl-xLのプローブ配列は、エキソン2に配置された
2005502645.tif 000015
であった。使用した全てのプローブは、5'末端をレポーター染料(reporter dye)としてカルボキシ-フルオレセインホスホルアミドで標識し、3'末端をクエンチングのためにカルボキシ-テトラメチルローダミンで標識した。ランダムヘキサマーを逆転写プライマーとして使用することによって、各細胞系の1マイクログラムの総RNAをcDNAに逆転写した(TaqMan Reverse Transcription Reagents、Applied Biosystems)。ヒトGAPDH遺伝子を、mRNA量の正規化のためめの内部対照として使用した。典型的なリアルタイムPCR混合物(25μl)は、試料DNA(またはcDNA)、10×TaqMan Buffer(2.5μl)、200μM dATP、dCTP、dGTPおよび400μM  dUTP、5 mM MgCl2、0.65単位のAmpliTaq Gold、0.25単位のAmpEraseウラシルN-グリコシラーゼ(UNG)、200 nMの各プライマー並びに100 nM プローブを含有した。熱サイクル条件は、50℃で  分間および95℃で10分間を1サイクル、並びに95℃で15秒間および60℃で1分間を50サイクルであった。全ての反応は2つ組で実施した。反応後、7700 Systemの内臓ソフトウェアを使用して、全てのデータを分析し、標準曲線を作成した。各試験試料のCt(閾値サイクル(Threshold cycle))値および対応する出発量は標準曲線に基づいた。統計分析は以前に記載されているように実施した。
【０１８８】
結果
DLD1/Bax-RおよびDLD1/TRAIL-R細胞の選択
アデノウィルス媒介性アポトーシス促進遺伝子治療中に耐性が生じるかどうかを判定するために、ヒト結腸癌系統DLD1を、1000 vp/細胞の総MOIのBax(Ad/PGK-GV16+Ad/GT-Bax)またはTRAIL(Ad/PGK-GV16+Ad/GT-TRAIL)を発現するバイナリーアデノウィルスベクターで処置した(Kagawaら、2001；Kagawaら、2000)。感染から72時間後、各処置群の細胞の約95％がアポトーシスを起こした。一方、対照ベクターAd/CMV-GFPによる処置によって、細胞死はバックグラウンドレベル程度であり、偽対照で見られるアポトーシスレベルとほぼ同じであった。これらの結果は、親DLD1細胞は、アデノウィルスベクターが送達したBaxおよびTRAIL遺伝子の両方に感受性であったことを証明している。BaxまたはTRAILを発現するアデノウィルスベクターによる処置後、生きているDLD1細胞を通常の培地で増殖させた。これらの細胞が70％〜80％の集密度に達したら、同じMOIでの2回目の感染を実施した。BaxまたはTRAILいずれかを発現するアデノウィルスベクターによる生きている細胞の4回目の感染の72時間後、各処置群の細胞死レベルは5％未満であり、これらの細胞はアデノウィルスベクターによって送達され、PGKプロモーターによって誘導されたそれぞれの遺伝子BaxまたはTRAILに耐性であったことを示唆している。これらの2つの耐性細胞系を、DLD1/Bax-R細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞と名づけた。
【０１８９】
これら2つの耐性細胞系は、アデノウィルスベクターによって送達され、hTERTプロモーター(Guら、2000)によって誘導されるBaxまたはTRAIL遺伝子にも耐性であるかどうかを試験した。親DLD1、DLD1/Bax-RおよびDLD1/TRAIL-R細胞を、1000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxでまたはバイシストロン性アデノウィルスベクターAd/gTRAILで処置した。PBSを偽対照として使用し、Ad/CMV-GFPをベクター対照として使用した。試験した3つ全ての細胞系において、FACS分析は、PBSまたはAd/CMV-GFPによる処置の48時間後の細胞死レベルはバックグラウンド程度(0.4％〜2.1％)であることを示した。親DLD1細胞では、FACS分析は、アポトーシス(sub-G1)細胞の割合は、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxによる処置の48時間後では52.5％であり、Ad/gTRAILによる処置の48時間後では62.7％であることを示した。一方、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxによる処置の48時間後では5.2％のDLD1/Bax-R細胞だけがアポトーシスを起こし、Ad/gTRAILによる処置の48時間後では6.2％のDLD1/TRAIL-R細胞だけがアポトーシスを起こした(図24A)。これらの結果は、DLD1/Bax-RおよびDLD1/TRAIL-R細胞の耐性の機構はPGKプロモーターに関係しないことを証明した。XTTによる細胞生存率アッセイは、FACSアッセイの結果と同じ結果(図24B)を示した。Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-BaxまたはAd/gTRAILで処置したほとんど全ての親DLD1細胞は感染の3日後にアポトーシスを起こした。一方、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxで処置したDLD1/Bax-R細胞と対照ベクターとの間またはAd/gTRAILで処置したDLD1/TRAIL-R細胞と対照ベクターとの間には細胞死レベルの有意な差はなかった。
【０１９０】
DLD1/Bax-R細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞のアデノウィルス感染の感受性
耐性がアデノウィルスベクター形質導入の低下によって生じるかどうかを判定するために、親DLD1、DLD1/Bax-RおよびDLD1/TRAIL-R細胞におけるアデノウィルスベクターの形質導入効率を評価した。細胞に、1000 vp/細胞の総MOIのAd/CMV-GFPまたはAd/gTRAILを感染させた。感染の48時間後に細胞を回収し、FACS分析を実施した。Ad/CMV-GFPによる処置により、親DLD1細胞は98±2.0％ (平均蛍光強度45±4.3)、DLD1/Bax細胞は70±4.5％(平均蛍光強度4±1.2) 、DLD1/TRAIL-R細胞は99±1.5％(平均蛍光強度42±3.9)がGFP陽性細胞となった。従って、DLD1/TRAIL-R細胞の導入遺伝子発現レベルは、GFP陽性細胞の割合および蛍光強度に関しては、親DLD1細胞とほぼ同じであった。しかし、DLD1/Bax-R細胞では、導入遺伝子発現レベルは劇的に低下した。同様の結果は、3つの細胞系をAd/gTRAILで処置した場合に観察された。Ad/gTRAILは、hTERTプロモーターからGFP/TRAIL融合タンパク質を発現するので、GFP陽性細胞を分析することにより、Ad/gTRAILによる処置後の導入遺伝子発現レベルを推定することができる。導入遺伝子発現レベルは親DLD1細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞ではほぼ同じであったが、DLD1/Bax-R細胞では劇的に低下した(表8)。これらの知見は、ウェスタンブロット分析の結果と一致していた。親DLD1細胞と比較して、DLD1/Bax-R細胞では、1000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxによる処置後では、Baxタンパク質の発現ははるかに少なかった。総ベクター用量を最初の用量の5倍に増加しても(5000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Bax)、Bax-R細胞は、1000 vp/細胞のMOIで処置した親DLD1細胞により発現されるレベルと同様のレベルのBaxタンパク質を発現するようには誘導されなかった。
【０１９１】
（表８）アデノウィルス感染に対する親細胞、Bax-R細胞およびTRAIL-R DLD1細胞の感受性
2005502645.tif 000016
値は4つ組アッセイの平均±s.d.である。親DLD1と比較して、*P<0.05、**P<0.01。
【０１９２】
親DLD1細胞およびDLD1/Bax細胞におけるアデノウィルス感染の感受性の差をさらに検討するために、これら2つの細胞系に、異なるMOIのAd/CMV-GFPを感染させた。次いで、GFP陽性細胞の割合および平均蛍光強度を、上記のようにFACS分析によって測定した。10,000 vp/細胞のMOIで処置したDLD1/Bax-R細胞は、1000 vp/細胞のMOIで処置した親DLD1細胞と同等なGFP発現レベルを示した。これらの結果も、アデノウィルス感染に対する耐性がDLD1/Bax-R細胞の耐性の原因であることを示唆した。
【０１９３】
用量の段階的増量による細胞死滅作用
低い形質導入効率がDLD1/Bax-R細胞の耐性を誘導するのに十分であるかどうかをさらに検討するために、DLD1/Bax-R細胞に10,000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを感染させた。同じ総MOIのAd/CMV-GFPを感染させた細胞を対照として使用した。次いで、FACS分析によってアポトーシスのレベルを測定し、1000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxで処置した親DLD1細胞のアポトーシスレベルと比較した(図25A)。10,000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxで処置したDLD1/Bax-R細胞のアポトーシスレベルは、1000 vp/細胞の総MOIの同じベクターで処置した親DLD1細胞とほぼ同じであった。10,000 vp/細胞のMOIの対照ベクターで処置したDLD1/Bax-R細胞は、偽対照とほぼ同じバックグラウンドレベルの細胞死を示した。この知見は、XTTを用いた細胞生存率アッセイによってさらに裏付けられた(図25B)。親DLD1細胞と同等の導入遺伝子発現を生じるベクター用量は、DLD1/Bax-R細胞の大幅な細胞死を生じ、形質導入効率の低下がDLD1/Bax-R細胞の耐性の原因となることを示唆している。
【０１９４】
別のアポトーシス促進遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに対する感受性
DLD1/Bax-RまたはDLD1/TRAIL-R細胞が、用量の段階的増量を行わないで、別のアポトーシス促進遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに対して感受性であるかどうかを検討した。親DLD1細胞群、DLD1/Bax-R細胞群およびDLD1/TRAIL-R細胞群を、1000 vp/細胞の総MOIのAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Bax、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-BakまたはAd/gTRAILで処置した。アポトーシス細胞はFACSアッセイで定量した。親DLD1細胞は3つの処置全てに感受性であったが、DLD1/Bax-R細胞は、BaxまたはBak遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに耐性であったが、TRAIL遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに感受性であった。Ad/gTRAILによる治療から48時間経過時、36.4％のDLD1/Bax-R細胞がアポトーシスを起こした。一方、BaxまたはBak遺伝子を発現するアデノウィルスベクターによる処置後では、バックグラウンドレベル(<6.5％)のDLD1/Bax-R細胞がアポトーシスを起こした。DLD1/TRAIL-R細胞はAd/gTRAILに耐性を示していたが、BaxまたはBak遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに感受性であった。DLD1/TRAIL-R細胞では、アポトーシスレベルは、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxによる処置の48時間後では45.6％であり、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Bakによる処置の48時間後では54.3％であった(図26A)。XTTを用いた細胞生存率アッセイはほぼ同じ結果を示した(図26B)。Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Bax、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-BakまたはAd/gTRAILで処置したほとんど全ての親DLD1細胞が感染の3日後にはアポトーシスを起こした。一方、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxで、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Bakでまたは対照ベクターで処置したDLD1/Bax-R細胞群間には有意な差は観察されなかったが、Ad/gTRAILで処置したほとんど全てのDLD1/Bax-R細胞は死滅した。DLD1/TRAIL-R細胞では、Ad/gTRAILで処置した細胞と対照ベクターで処置した細胞の間には細胞生存率レベルの差は観察されなかったが、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-BaxまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-BaKで処置した細胞は80％を超える細胞が死滅した。これらの結果も、DLD1/Bax-R細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞は、ベクター用量を段階的に増量することなく、異なるアポトーシス経路または異なる細胞死モデルに関与するアポトーシス促進遺伝子を発現するアデノウィルスベクターに感受性であることを示唆した。
【０１９５】
親DLD1細胞、DLD1/Bax-R細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞の分子的な差
これら3つの細胞間の分子的な差を検討するために、Bcl2、Bcl-xL、Bcl-xS、DR4、DR5、DcR1、FLIP、Bax、Bak、XIAP並びにカスパーゼ-2、-7、-8および-9を含む、Bax媒介性またはTRAIL媒介性のアポトーシス経路に関与することが既知であるいくつかのタンパク質レベルを分析した。RNase保護アッセイおよびリアルタイムPCR分析を使用して、mRNAレベルを測定した。ウェスタンブロット分析を使用してタンパク質レベルを測定した。ヒトGAPDHをmRNAの内部対照として使用した。β-アクチンを、ウェスタンブロット分析の負荷対照(load control)として使用した。ほとんどの場合において、RNase保護アッセイまたはリアルタイムPCRアッセイによって測定したmRNAレベルは、ウェスタンブロット分析によって測定したタンパク質レベルとよく相関した。しかし、いくつかの矛盾があった。例えば、RNase保護アッセイは、DLD1細胞とDLD1/TRAIL-R細胞の間はDR4発現が同等のレベルであり、DLD1/Bax-R細胞ではかなり低いレベルであることを示した。一方、ウェスタンブロット分析は、DLD1細胞とDLD1/Bax-R細胞の間はDR4レベルが同等であるが、DLD1/TRAIL-R細胞ではわずかに低いレベルであることを示した。これらの場合では、2つのアッセイ方法間で一致した値が真の値であると考えた。親DLD1細胞、DLD1/Bax-R細胞およびDLD1/TRAIL-R細胞間にはカスパーゼ-2、-7、-8もしくは-9、DR5、DcR1、Bcl-xS、Bcl-2、Bax、Bak、FLIPまたはXIAPの劇的な差は見られなかった(データは示していない)。しかし、Bcl-xLはDLD1/TRAIL-R細胞ではアップレギュレーションされており、RNA(リアルタイムPCR)およびタンパク質レベルは、親DLD1またはDLD1/Bax-R細胞より約3倍高かった。
【０１９６】
Bcl-xL過剰発現は、TRAIL誘導性、Bax誘導性またはBak誘導性のアポトーシスからDLD1細胞を保護しない
Bcl-xLは、RNAレベルおよびDLD1/TRAIL細胞のタンパク質レベルによって示されるように、過剰発現される唯一の遺伝子であったので、Bcl-xL遺伝子の過剰発現がDLD1/TRAIL-R細胞の耐性の原因であるかどうかを試験した。プラスミドpGT60-hBcl-xLをトランスフェクトすることによって、Bcl-xLを過剰発現するDLD1細胞を構築し、ハイグロマイシンに対して選択した。ウェスタンブロットによってBcl-xL発現について試験した7つのハイグロマイシン耐性クローンのうち、5つがBcl-xLを異なるレベルで過剰発現した。次いで、Bax、BakまたはTRAIL遺伝子を発現するアデノウィルスベクターで処置することにより各クローンに誘導されたアポトーシスレベルを測定した。Bcl-xL発現レベルにかかわらず、試験した5つのクローンは全てAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Bax、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-BakまたはAd/gTRAILによる処置に感受性であった。処置から48時間経過時に、sub-G1期のアポトーシス細胞の割合は30.0％〜71.4％の範囲であった(図27)。これらの結果は、Bcl-xL過剰発現は、TRAIL、BaxまたはBak遺伝子を発現するアデノウィルスベクターからDLD1細胞を保護しないことを示唆した。
【０１９７】
実施例7
インビトロおよびインビボにおける腫瘍特異的bax遺伝子発現および細胞死のための新規シングルテトラサイクリン-調節アデノウィルスベクター
材料及び方法
組換えアデノウィルスベクターの構築
ベクターAd/GT-BaxおよびAd/hTERT-GV16は以前に記載されているように構築した(Guら、2000)。Ad/CMV-GFPはT. J. Liu博士(MDACC、テキサス州ヒューストン)から供与された。Ad/gBaxは、以前に記載されている方法を使用して構築した(Kagawaら、2000)。簡単に説明すると、以下の2つの発現カセットを含有するアデノウィルスシャトルベクター(pAd/hTERT-gBax)を構築した：一方は、その遺伝子がテトラサイクリン応答配列(TRE)およびCMVミニプロモーターからなる合成最小プロモーターによって誘導されるようなGFP-Bax融合用であり、他方は、その遺伝子がhTERTプロモーターによって誘導されるようなトランス活性化因子であるrTA用である。このシャトルプラスミドを、10 mg/mlのテトラサイクリン(Tc)の存在下において5型アデノウィルスの35kb ClaI断片と共に293細胞に同時トランスフェクトした。相同組換えによって組換えベクターAd/gBaxを作製し、プラーク精製した。使用した全てのベクターの増殖、精製、力価決定および品質分析は以前に記載されているように実施した。力価およびAd/gBaxの収率は、テトラサイクリンの存在下において増殖させたとき他のE1欠損アデノウィルスベクターに見られる範囲内であった。
【０１９８】
細胞系およびインビトロにおける遺伝子導入
ヒト肺癌細胞系H1299、A549、H358およびH322、肝癌細胞系HepG2、子宮頸癌細胞系Siha、卵巣癌細胞系OVCAR3、前立腺癌細胞系DU145、膀胱細胞系HTB9並びに骨肉腫細胞系Saos-2は、元はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手されたものである。結腸癌細胞系Lovoは、T. Fujiwara博士(岡山大学、日本)から供与された。正常なヒト肺線維芽 (NHFB) 細胞はClonetics(カリフォルニア州サンディエゴ、米国)から購入した。これらの細胞系についてパイロット実験で判定したとき、80％を超える細胞がレポーターウィルスによって感染された最適MOIは、H1299、H358、LovoおよびHepG2細胞では2000ウィルス粒子/細胞であり、A549、H322、DU145、OVCAR、HTB9およびNHFB細胞では3000 vp/細胞であった。蛍光および細胞の形態実験のためには、細胞を2×55/培養皿の密度で60 mm培養皿で培養し、ウィルスで処置し、48時間後に、GFP発現のためには蛍光顕微鏡で、または細胞の形態のためにはNikonデジタルカメラで写真を撮影した。XTTアッセイは以前に記載されているように実施した。
【０１９９】
アポトーシスアッセイおよび動物実験
フローサイトメトリーおよびTUNEL染色アッセイは以前に記載されているように実施した。フローサイトメトリーアッセイのためには、細胞を1×106/100 mmの密度で培養し、異なる組換えアデノウィルスベクターを感染させた。
【０２００】
動物実験は、皮下腫瘍モデルにおいて、5×106H1299細胞を6週齢〜8週齢のヌードマウス(Harlan-Sprague Dawley、インディアナ州インディアナポリス、米国)の背側の側腹部に皮下接種して腫瘍を樹立した以外は、以前に記載されているように実施した。統計分析は、以前に記載されているように実施した。
【０２０１】
結果
Ad/gBaxの構築
293細胞においてhTERTプロモーターの活性が高いことおよびBaxタンパク質のアポトーシス促進作用が強力であることにより、バイシストロン性アデノウィルスベクター、Ad/hTERT-gBaxを設計し、構築した。改変したこのバイシストロン性ベクターを、Tet-Offシステム(BD Clontech、カリフォルニア州サンフランシスコ、米国)の2つの発現カセットを1つのベクターに組み合わせた(図28)。1つの発現カセットは、VP16活性化ドメインちテトラサイクリンリプレッサー(TetR)との融合体であって、hTERTプロモーターによって誘導されるトランス活性化因子であるtTAからなった。第2のカセットは、TREおよびCMVの最小前初期プロモーターからなる化合物プロモーターの制御下においてGFP/Bax融合タンパク質のcDNAを含有した。組換えウィルスの選択および発現産物の検出を容易にするためにGFPを加えた。Tcが存在しない場合には、hTERTは、tTAタンパク質の発現を誘導し、次いでGFP-Baxの発現を誘導すると思われる。しかし、例えば293細胞にTcを加えると、tTAタンパク質に結合し、tTAがTREに結合するのを阻害し、それによってGFP-Baxの発現を阻止し、293細胞をBax誘導性アポトーシスから保護し、ウィルス粒子のパッケージングおよび増殖を可能にする。上記の方法を使用すると、Ad/gBaxの構築は成功し、テトラサイクリンの存在下において作製されたAd/gBaxの力価は、対照である、毒性のないベクターの力価と一致していた(データは示していない)。H1299肺癌細胞において感染の24時間後にAd/gBaxによって誘導されたGFP-Bax発現、およびTcによる遺伝子発現の抑制力が観察された。1 ng/ml程度のTcがGFP-Bax発現を阻害し始め、5 ng/mlはGFP-Baxレベルを有意に低下させ、1 mg/mlまでには、GFP-Baxは内因性Baxタンパク質に近いレベルが発現された(データは示していない)。しかし、Tc濃度がさらに増加してもGFP-Baxをそれ以上阻害せず(データは示していない)、Tet-Offシステムのボトムライン漏洩を示唆している。
【０２０２】
Ad/gBaxは、ヒト癌細胞において腫瘍特異的GFP/Bax発現を誘導する
Ad/gBaxが腫瘍特異的GFP-Bax遺伝子発現を誘導し、アポトーシスを誘導することができるかどうか試験するために、種々の起源由来のいくつかのヒト癌細胞系を使用し、Ad/CMV-GFPからのGFP発現によりAd/hTERT-gBaxからのGFP-Baxの発現を試験した。これらの癌細胞系には、種々のp53 status H1299(null)、H358 null H322(mut)およびA549(wt)の肺癌、HepG2(肝臓)、Lovo(結腸)、Siha(頸部)、OVCAR3(卵巣)、DU145(前立腺)、HTB9(膀胱)並びにSaos-2(骨)が挙げられる。NHFB細胞は対照として使用した。ウィルス感染から48時間後には、Ad/CMV-GFPは全ての腫瘍細胞および正常細胞において非常に強力なGFP発現を証明したが、Ad/gBaxだけは癌細胞において高いレベルのGFP-Baxを誘導した。NHFB細胞には検出可能なGFP-Baxはなかった。さらに重要なことには、癌細胞系の細胞の多くはアポトーシスを受けており、融合タンパク質GFP-Baxは、無傷のBaxタンパク質の活性と同様に強力なアポトーシス促進作用を有することを示唆している。これらの癌細胞および正常細胞は、明らかにAd/gBaxのアポトーシス作用を決定する際の因子ではない種々の内因性Baxタンパク質発現を示す(データは示していない)。Ad/gBaxは、テロメラーゼを使用する代わりに、テロメア長を維持するためにテロメア維持機構(ALT)経路を使用すると報告されている、いくつかのSaos-2細胞において弱いGF-Bax発現を誘導したことは注目すべきである(Bryanら、1997)。わずかなSaos-2細胞もアポトーシスを受けた。Komataら(2001)は、hTERT/rev-カスパーゼ-6構築物は、2つの不死化ALT経路線維芽細胞系を死滅させないことを最近示した。これと比較して、骨肉腫Saos-2細胞は、明らかにALT経路細胞およびテロメラーゼ経路細胞の不均一な集団を有する。Saos-2細胞をレポーター構築物Ad/hTERT-LacZを感染させ、β-gal陽性細胞について染色すると、約25％の細胞が弱いhTERTプロモーター作用を有する(データは示していない)。
【０２０３】
Ad/gBaxは、インビトロにおいてヒト癌細胞のアポトーシスを誘導する
上記の蛍光顕微鏡観察によって示唆されるAd/gBaxのアポトーシス誘導作用をさらに検討するために、2つの追加の実験を実施した。第1の実験において、Ad/gBaxによる感染の24時間、48時間および72時間経過時においてXTTアッセイによって細胞生存率を測定した。Ad/CMV-GFPを陰性対照として使用し、Bax発現を誘導するために使用される以前に特徴づけたバイナリーシステムであるAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16を陽性対照として使用した。PBSは偽感染として使用した。図29Aに示すように、Ad/gBaxおよびAd/GT-Bax+Ad/TERT-GV16両方は、4つの肺癌細胞系の細胞およびHepG2肝癌細胞を含む、全ての癌細胞において同等の細胞死を生じた。正常細胞ではhTERTプロモーターの活性は低いので、NHFB細胞ではどちらの処置も細胞増殖に明らかな影響を与えた。NHFB細胞または正常なヒト気管支上皮細胞においてBax発現を誘導する構成的に活性なプロモーターPGKはこれらの細胞を死滅させることができるので、正常な細胞がBax誘導性アポトーシスに感受性であることを指摘するべきである(Guら、2000；また、図29A、NHFBパネル、破線も参照されたい)。Ad/CMV-GFPは、これらの細胞系のいずれにもあきらかな影響を与えなかった。第2の実験では、FACS分析を使用して、GFP-Baxによって生じる増殖抑制が増殖阻害ではなくアポトーシスによるものであったことを確認した。全ての癌細胞およびNHFB細胞をAd/gBaxおよびバイナリーベクターで処置した。72時間後に細胞を回収して、FACS分析を実施し、sub-G1集団を定量することによって実施されるアポトーシス細胞分画を測定した(図29B)。Ad/gBaxおよびAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16は癌細胞において同等のアポトーシス集団を生じたが、NHFB細胞に対しては最小の毒性作用しか生じず、Ad/gBaxは腫瘍特異的なGFP-Bax発現を誘導することおよびGFP-Bax融合タンパク質は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する際にBaxタンパク質と同じくらい強力であることを示唆している。同様の結果は他の癌細胞でも得られた。癌細胞におけるGFP、GFP-BaxおよびBaxの発現は、一例としてH1299細胞を使用して確認した。抗GFP抗体または抗Bax抗体の使用は強力なGFP-Bax融合タンパク質バンドを検出した。Ad/gBaxおよびAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16は明らかなカスパーゼ-3活性化およびPARP切断を生じ、Baxはカスパーゼ-3カスケードを活性化することによってアポトーシスを誘導したことを示唆している。一方、0.01 mg/mlのTcはGFP-Baxレベルおよびカスパーゼ-3活性化を劇的に低下させ、Ad/gBaxの毒性作用もほとんど完全に遮断された(データは示していない)。
【０２０４】
Ad/gBaxはインビボにおいて腫瘍特異的GFP-Bax遺伝子発現を誘導し、異種移植片腫瘍増殖を抑制する
インビボにおけるBax遺伝子治療にAd/gBaxを使用する可能性をさらに評価するために、H1299腫瘍をヌードマウスの皮下に樹立し、Ad/gBaxで治療した。また、Ad/CMV-GFPを陰性対照として使用し、Ad/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16を陽性対照として使用し、PBSを偽対照として使用した。ベクターを腫瘍内に3回連続して注射した後、腫瘍サイズを4週間モニタリングした。腫瘍が直径15 mmに達した際に、研究所の方針によりマウスを死亡させなければならなかった。Ad/gBaxおよびAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16は同じレベルの腫瘍増殖抑制を生じ、これは、PBSまたはAd/CMV-GFPで治療した腫瘍の結果と有意に異なった(図30、P<0.01)。Ad/gBaxおよびAd/GT-Bax+Ad/hTERT-GV16治療群の腫瘍は、約30日後には再び増殖し始めたことに注目すべきである。アデノベクターの病巣内投与後の腫瘍の再増殖は第2回目のこのような治療に感受性であり(Kagawaら、2001)、腫瘍の再増殖は最初に形質導入されなかった腫瘍細胞から誘導することを示唆している。腫瘍におけるGFP-Baxの発現は蛍光顕微鏡および免疫染色によって確認された。腫瘍切片のTUNEL染色は、アポトーシスが1回のAd/gBax腫瘍内注射によって生じたことを確認した。一方、Ad/CMV-GFPおよびAd/gBaxをマウスの尾静脈を介して全身注射すると、Ad/CMV-GFPだけが肝臓において強力な蛍光を誘導した。Ad/gBaxは検出可能なGFP-Bax発現を誘導しなかった。しかし、Bax発現を誘導するために構成的に活性なプロモーター(PGK)を使用すると、Baxの広範な発現、肝細胞の広範なアポトーシスおよび肝臓の基本構造の破壊が観察された。これらの結果は、Ad/gBaxはインビボにおいてGFP-Baxを産生し、腫瘍にアポトーシスを誘導するが、正常な組織には生じないことを証明している。
【０２０５】
実施例8
TRAILおよびBax併用遺伝子治療量は、卵巣癌異種移植片を有するマウスの生存を延長した
材料及び方法
細胞系
ヒト卵巣癌細胞SKOV3ipおよびDOV13並びにヒト肺癌細胞系H1299は、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、抗生物質およびグルタミンを添加したDMEMまたはRPMI 1640倍地で増殖させた。正常なヒト卵巣表面上皮細胞(Krukら、1990)は、15％熱不活性化ウシ胎仔血清、抗生物質、グルタミンおよび上皮増殖因子(20 ng/ml)を添加した培地199/MCDB-105で増殖させた。
【０２０６】
アデノウィルス
アデノウィルスベクターAd/hTERT-LacZ、Ad/hTERT-GV16、Ad/CMV-LacZ、Ad/PGK-GV16、Ad/CMV-GFP、Ad/GT-BaxおよびAd/gTRAILは以前に記載されているように構築した。
【０２０７】
インビトロにおけるベクター投与
以前に記載されているように、各細胞系にAd/CMV-LacZを感染させ、β-ガラクトシダーゼの発現を評価することによって最適なMOIを決定した。80％を超える細胞が青に染色されるMOIをこの実験において使用した。これらのMOIは、H1299、正常な卵巣上皮細胞(NHOE)が1000粒子であり、DOV13細胞が2000粒子であり、SKOV3ip細胞が6000粒子であった。
【０２０８】
生化学的アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイ
FACS分析は以前に記載されているように実施したて、インビトロにおけるGFP/TRAIL発現のレベルおよびアポトーシス細胞数を測定した(Kagawaら、2000；Kagawaら、2001)。また、以下の一次抗体を使用してウェスタンブロット分析を以前に記載されているように実施した：抗PARP(4C10-5、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ、米国)、抗Bax(6A7、PharMingen)、抗カスパーゼ-3(CPP32、PharMingen)、抗カスパーゼ-8(3-1-9、PharMingen)および抗アクチン(AC-15、Sigma)。細胞生存率は、先の実施例に記載されているように、XTTにより測定した。
【０２０９】
マウスにおける実験およびインビボにおける導入遺伝子発現アッセイ
動物実験は、SKOV3ip細胞を使用して以前に記載されているように実施した。腫瘍体積の測定、肝臓、脾臓、腸、肺、腎臓、卵巣および心臓の組織病理学的変化の評価並びに血清肝酵素ALTおよびASTアッセイは以前に記載されているように実施した(Kagawaら、2000；Guら、2002；Kagawaら、2001)。また、アデノウィルスベクター送達後の毒性をモニタリングした。マウスを死亡させた後、種々の臓器を採取し、3.8％ホルマリンのPBS溶液で固定した。次いで、これらの臓器を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織病理学的に調査した。インビボ導入遺伝子発現アッセイのためには、細胞接種から26日後に、動物に、1×1011vp/マウスの用量のAd/hTERT-LacZまたは対照ベクターを腹腔内注射した。治療の2日後にこれらの動物を死亡させ、肝臓、脾臓、腸、腎臓、膵臓、肺および卵巣を採取して、凍結切片化し、以前に記載されているようにLacZ遺伝子発現を試験した(Guら、2000)。治療群間の差を評価するための統計分析を以前に記載されているように実施した。
【０２１０】
結果
インビトロにおいて癌細胞における導入遺伝子発現およびアポトーシス誘導
バイシストロン性アデノウィルスベクターAd/gTRAILは2つの発現カセットを含有する。一方のカセットはGAL4/TATA(GT)プロモーターによって誘導されるGFP/TRAIL融合遺伝子を発現するが(Fangら、1997；Fangら、1998)、他方は、hTERTプロモーターによって誘導されるGAL4/VP16(GV16)融合遺伝子を発現する。以前に示されているように、GTプロモーターは、GV16が存在しない場合には哺乳類細胞においてサイレントであるが、GV16の存在下では活性が高い(Fangら、1998)。従って、hTERTプロモーターによって誘導されるGAL4/GV16の発現により、GTプロモーターが活性化され、GFP/TRAIL融合タンパク質が発現される。以前に示されているように、アデノウィルスベクターAd/GT-Baxは、GV16融合タンパク質を発現するアデノウィルスベクターと同時投与されると、Bax遺伝子を発現する(Guら、2000；Kagawaら、2000)。従って、Ad/gTRAILはhTERT活性細胞においてGFP/TRAIL融合タンパク質を発現すると考えられる。Ad/GT-Baxを同時感染させると、Ad/gTRAILはhTERT活性細胞においてBax遺伝子発現も誘導する(図31)。従って、特に記述しない限り、実施した全ての検討では、GFP/TRAILの発現のためにAd/gTRAILを使用し、Baxの発現のためにAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用し、GFP/TRAILおよびBaxの発現のためにAd/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用し、偽対照またはベクター対照としてリン酸緩衝生理食塩液(PBS)およびAd/CMV-GFP+Ad/GT-Baxを使用した。
【０２１１】
癌細胞における導入遺伝子発現レベルを測定するために、処置の48時間後〜72時間後に細胞を回収し、FACSおよびウェスタンブロット分析をそれぞれ使用してGFP/TRAILおよびBaxの発現を分析した。PBSまたはAd/CMV-GFP+Ad/GT-Baxで治療した細胞を偽対照またはベクター対照として使用した。治療の48〜72時間後に細胞を回収し、GFP/TRAILおよびBaxの発現を、それぞれFACSおよびウェスタンブロット分析で分析した。Ad/gTRAIL単独を使用した治療により、試験した癌細胞の84％〜91％がGFP/TRAILを発現した(図31B)。しかし、Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用した治療により細胞の43％〜56％がGFP/TRAILを発現し、これは、この群におけるAd/gTRAILの用量低下を反映している。PBSまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用して細胞を治療した場合には、GFP陽性細胞は検出されなかった。また、Baxタンパク質の過剰発現は、Ad/gTRAIL+Ad/GT-BaxまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用して治療した細胞においてのみ観察された。これらの結果により、Ad/gTRAILは、Ad/GT-Baxが同時投与されると、GFP/TRAIL融合タンパク質自体を発現してBax遺伝子発現を誘導することができることが証明された。
【０２１２】
以前に報告されているように、Bax遺伝子またはGFP/TRAIL融合遺伝子の直接的な導入は癌細胞のアポトーシスを誘導する(Kagawaら、2000；Kagawaら、2001)。GFP/TRAILおよびBax遺伝子の別個および両方によるアポトーシス誘導を調査するために、カスパーゼ-8および-3の活性化並びにポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)の切断を、Bax発現を試験する際に使用したものと同じSKOV3ip試料を使用して試験した。カスパーゼ-8および-3の活性化並びにPARPの切断は、GFP/TRAIL遺伝子及び/またはBax遺伝子を発現するベクターを使用して処置した細胞では検出されたが、PBSまたは対照ベクターを使用して処置した細胞では検出されなかった。また、癌細胞におけるアポトーシス誘導レベルを定量するために、ヒト卵巣癌細胞系SKOV3ipおよびDOV13並びにヒト肺癌細胞系H1299におけるDNA含量をFACSを使用して分析した。アポトーシスは、GFP/TRAIL発現ベクターまたはBax発現ベクターを単独で使用して処置した場合、SKOV3ip細胞およびH1299細胞において誘導された。しかし、同じ総ベクター用量を各細胞系において使用したにもかかわらず、アポトーシス誘導は、GFP/TRAILおよびBaxを発現するベクターであるAd/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用して処置した細胞においてより顕著であった。この現象はSKOV3ip細胞においてより顕著であった(図32A)。しかし、DOV13細胞では、Ad/gTRAIL単独を使用した処置は、Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用したものよりアポトーシス細胞が多かった。これは、DOV13細胞は、GFP/TRAIL発現ベクターに感受性であるがBax発現ベクターに対する耐性が高いという事実によって説明することができる。従って、同じ総感染効率(MOI)では、効果的なベクター(Ad/gTRAIL)の用量は、Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを投与した群と比較して、Ad/gTRAIL単独投与群では2倍となった。にもかかわらず、Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用したDOV13細胞の処置はDOV13細胞のアポトーシスを効果的に誘導したが、Ad/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用した処置は誘導しなかった。
【０２１３】
Bax遺伝子およびGFP/TRAIL遺伝子の別個および両方の細胞死作用をさらに証明するために、処置の1週間以内にXTTアッセイを実施して、細胞生存率を測定した(図32B)。このアッセイの結果は、FACS分析の結果と一致しなかった。具体的には、DOV13細胞は、GFP/TRAIL発現ベクターに高い感受性を示したが、Bax発現ベクターには高い耐性を示した。併用治療の細胞死効果は、従って、主にGFP/TRAILの発現によって誘導された。さらに、併用群における有効ベクター(Ad/gTRAIL)の用量は、Ad/gTRAIL単独群を投与した群の用量の半分だけであったので、Ad/gTRAIL単独を使用して処置した細胞におけるものと比較して、細胞死効果は低かった。一方、SKOV3ip細胞およびH1299細胞では、GFP/TRAIL発現ベクターまたはBax発現ベクター単独を使用した処置は実質的な細胞死を誘導した。GFP/TRAIL遺伝子およびBax遺伝子を使用した併用治療はこれら2つの細胞系の細胞死を増加した。この細胞死の増加は、Bax発現ベクターおよびGFP/TRAIL発現ベクターに中程度に感受性のSKOV3ip細胞においてより顕著であった。
【０２１４】
インビボにおける正常なヒト卵巣表面上皮細胞における導入遺伝子発現およびアポトーシス誘導
Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを使用した治療が正常細胞において導入遺伝子発現およびアポトーシス誘導を生じたかどうかを試験するために、種々のベクターを使用して処置した後の正常なヒト卵巣表面上皮細胞(NHOE)を使用してFACS分析およびXTTアッセイを実施した。また、以前に見出されているように、ほとんどの正常細胞はBax遺伝子の過剰発現に感受性であるので、Ad/PGK-GV16+Ad/GT-Baxを、それらの細胞におけるアポトーシス誘導の陽性対照として使用した(Guら、2000；Kagawaら、2000)。FACS分析は、1000 vp/細胞のMOIのAd/gTRAILを使用した処置により、5％未満の細胞がGFP陽性であることを示した（図33A）。これと比較して、同じMOIのAd/CMV-GFP+Ad/GT-Bax(比、1:1)を使用して処置した場合には、80％を超える細胞がGFP陽性であった。この結果は、正常な卵巣上皮細胞はアデノウィルス感染に感受性であるが、hTERTプロモーター活性は低いことを示唆しており、これはhTERTプロモーターは癌細胞では活性が高いが、インビトロにおいて正常な細胞では比較的穏やかであるという以前の知見に一致している(Guら、2000；Guら、2002)。FACS分析およびXTTアッセイにより、Ad/gTRAIL、Ad/gTRAIL+Ad/GT-BaxおよびAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用した処置は全て、正常な卵巣上皮細胞においてバックグラウンドレベルの細胞死を生じたにすぎないことが示された(図33Aおよび図33B)。これと比較して、細胞を、Ad/PGK-GV16+Ad/GT-Baxを使用して処置すると、実質的なアポトーシスが誘導され、正常な卵巣上皮細胞はBax過剰発現に感受性であることを示唆している。これらの結果はまた、正常細胞はBax遺伝子過剰発現に感受性であることおよびhTERTプロモーターは正常細胞において導入遺伝子発現およびそれに関連する毒性を防止するために使用することができるという以前の知見に一致した(Guら、2000)。
【０２１５】
インビボにおける腹腔内腫瘍増殖および腹水(ascite)形成の抑制
SKOV3ip細胞から誘導した腹部に拡散した腫瘍モデルにおけるインビボにおける併用治療の効果も試験した。具体的には、1×106SKOV3ip細胞をヌードマウスに腹腔内接種した。接種の4日後に、マウスを無作為にグループ分けし(15匹のマウス/群)、6×106ウィルス粒子(vp)/マウス/治療の総用量のベクターの腹腔内投与を開始した。2つのベクターを使用する場合には、総用量は同じにしたが、2つのベクターの比は1:1に設定した。PBSを投与した動物は、偽治療対照として使用した。細胞接種から数週間経過時に、各群の5匹のマウスを殺傷し、腹水の容量および腹腔の最も大きい腫瘍結節を測定した。また、治療を開始する前および腫瘍細胞接種から4週間後にマウスの体重を測定した。PBSまたは対照ベクターを投与した動物では、腹水容量、腹腔内の最も大きい腫瘍結節の体積または体重の差は見られなかった(図34A及び図34B)。しかし、治療前の量と比較して、腫瘍細胞接種の4週間後では、全群においてマウスの体重は高かった。この体重増加はこれらの動物では腹水形成を反映している可能性があり、またこの増加は、Ad/gTRAIL、Ad/gTRAIL+Ad/GT-BaxまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを投与した動物では顕著ではなかった。これら3つの群では、腹水および腹腔内の最大の腫瘍結節は、PBSまたは対照ベクターを投与した動物のものと比較すると有意に低下しており(P<0.05)、これらの治療によって抗腫瘍作用が誘導されたことを示唆している。また、Ad/gTRAIL+Ad/GT-Baxを投与した動物の最大腫瘍結節の体積は、Ad/gTRAILまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを投与した動物のものより有意に低かった(P<0.05)。しかし、腹腔内の腫瘍結節の数は全ての群において数えられなかった。マウスを殺傷したとき、群のいずれにおいても腫瘍のないマウスはいなかった。
【０２１６】
各群の残りの10匹のマウスを生存についてモニタリングした。Ad/gTRAILまたはAd/hTERT-GV16+Ad/GT-Baxを使用した治療は、PBSまたは対照ベクターを投与した動物におけるものと比較したとき、それを投与した動物において生存期間を有意に改善することを結果は示した(P<0.05)。さらに、TRAILおよびBaxの併用治療は、どちらかの遺伝子を単独で使用した治療と比較したとき、生存を有意に延長した(P<0.05)(図35)。PBS、対照ベクター、TRAIL遺伝子、Bax遺伝子およびTRAIL遺伝子とBax遺伝子の両方を投与したマウスにおける平均生存期間は、それぞれ35日、37日、49日、48日および68日であった。従って、有意に長い生存は、ベクター用量を増加しないTRAILとBax遺伝子の併用治療を使用して達成することができる。
【０２１７】
腹腔内ベクター投与による毒性および導入遺伝子発現
以前に示したように、hTERTプロモーターはマウス肝臓においてサイレントであるが、マウス腫瘍細胞において活性である(Guら、2000；Guら、2002)。その検討では、hTERTプロモーターから導入遺伝子を発現するアデノウィルスを全身投与しても、マウス肝臓において導入遺伝子発現は検出されなかった。しかし、腹腔内ベクター投与後の導入遺伝子発現レベルは不明である。従って、本検討において腹腔内投与後のhTERTプロモーターからの導入遺伝子発現を試験するために、SKOV3ip細胞から誘導された腹腔内腫瘍を有するマウスに、1×1011vp/マウスの単回投与でAd/hTERT-LacZまたは対照ベクターを腹腔内注射した。注射の2日後に動物を殺傷し、肝臓、脾臓、腸、腎臓、膵臓、肺、卵巣および腹膜を採取して、凍結切片化し、X-gal染色を使用してインビボにおける遺伝子発現レベルをチェックした。細菌β-ガラクトシダーゼ発現は腹腔腫瘍においてだけ検出され、回収した臓器または漿膜または腹腔内では検出されなかった。これと比較して、細菌β-ガラクトシダーゼ発現は正常な組織および対照ベクターを使用して治療した後の腫瘍において検出されなかった。これらの結果は、腹腔内ベクター投与後のhTERTプロモーターを使用した標的遺伝子発現を確認している。GFP/TRAIL発現ベクターおよびBax発現ベクターの腹腔内投与並びに上記の併用治療法の毒性も試験した。この試験のために、治療前並びに治療終了時から2日および14日後に血清試料を採取した。血清アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)レベルの分析は、それらは試験した全ての治療群および全ての経過時点において正常範囲内であったを示した(図35)。肝臓、脾臓、腸、肺、腎臓、卵巣、膵臓および心臓の組織病理学的変化も、これらの臓器を回収してから調査した。どちらの治療群の臓器のいずれにおいても明らかな病変は見られなかった。これらを考慮すると、これらの結果は、GFP/TRAIL遺伝子およびBax遺伝子を別個にまたは併用して腹腔内投与することにより、導入遺伝子発現がhTERTプロモーターによって制御される場合には毒性が低かったことを示唆している。
【０２１８】
実施例9
癌治療のためのAd/gTRAILおよび化学療法の併用
材料及び方法
腫瘍モデル
2×106の231/ADR乳癌細胞/0.2mlを各マウスの尾静脈に注射することによって、ヒト乳癌肺転移腫瘍モデルを6週齢〜8週齢のヌードマウスに樹立した。次いで、動物を異なる治療群に無作為に割り付けた。Ad/CMV-GFP、パクリタキソール、Ad/gTRAIL、パクリタキソール+Ad/CMV-GFPおよびパクリタキソール+Ad/gTRAILを含む5群とした。治療は、細胞をマウスに接種した1週間後に開始した。パクリタキソールは、1日目および21日目に尾静脈経由で静脈内投与した(4 mg/kg)。アデノウィルス(Ad/GFPまたはAd/gTRAIL)は1日目、7日目、14日目、21日目および28日目にエアゾールで送達した。マウスは、治療開始から35日目に殺傷した。組織病理学的アッセイまたは表面腫瘍結節アッセイ(肺にインクを注射することによる)のために肺を回収した。
【０２１９】
エアゾールによるベクター投与は以下のようである：1×1012粒子のアデノウィルスをPBSで最終容量1mlに希釈し、500μl(5 mg)のプロタミンと混合した。室温で10分間インキュベーションした後、プロタミン-アデノウィルス複合体を5 mlのヒドロコルチゾン(濃度250 ng/mlの水溶液)と混合した。複合体をネブライザーチャンバーに入れた。マウスを収容した密封プラスチックケージにネブライザーからのエアゾールを通した。曝露には約50分間かかり、その間マウスはケージを自由に移動できた。
【０２２０】
結果
ドキソルビシンで反復処置した乳癌細胞系MDA-MB-231によって、ドキソルビシン耐性細胞を選択した(231/ADRと名づける)。Ad/gTRAILアデノベクターと化学療法剤とを併用して、これらのTRAIL耐性または化学療法剤耐性癌細胞を治療できるかどうかを試験した。
【０２２１】
図36により、Ad/gTRAIL耐性細胞系であるヒト結腸癌細胞系DLD1/TRAIL-Rは、ドキソルビシン(ADR)、フロキシウリジン(FuDR)、フルオロウラシル(5-FU)およびムタマイシン(mutamycin)(MMC)などの化学療法剤によってAd/gTRAILに感受性となりうることを示した。この場合では、DLD1/TRAIL-R細胞をPBSでまたは1000ウィルス粒子/細胞のAd/gTRAILもしくはAd/CMV-GFPで処置した。化学療法剤の濃度は各グラフの下に示す。濃度0とは、細胞をPBS、Ad/gTRAILまたはAd/CMV-GFPだけで処置したことを示す。細胞生存率は処置から96時間経過時に測定した。レベルは、2回の4つ組アッセイの平均+/-SDである。図36に示すように、ドキソルビシン、フルオロウラシルおよびムタマイシン(mutamycin)は全て、ある濃度においてDLD1/TRAIL-RをAd/gTRAIL感受性にすることができる。併用治療後のDLD1/TRAIL-R細胞のウェスタンブロット分析は、PARP切断の増加を示した。細胞は、1000 moi(vp)のアデノベクター、5-FU 50μmおよび1.25μm MMCで処置した。併用群では、用量は単一薬剤群と同じであった。処置から96時間後に細胞を回収して、細胞溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。
【０２２２】
エアゾールによるベクター投与による肺転移の治療も試験した。結果は、肺における導入遺伝子発現は、ベクター溶液にプロタミンおよびヒドロコルチゾンを加えることによって劇的に増加されうることが結果により証明された。図37により、プロタミン(1mg/ml)およびヒドロコルチゾン(250ng/ml)を加えることによってレポーター遺伝子LacZ発現が劇的に増加されることが示された。プロタミンおよびヒドロコルチゾンが共に溶液中に存在する場合には、発現レベルはさらに増加される。アデノベクターのその後のエアゾール投与は、ベクター溶液中にプロタミンおよびヒドロコルチゾンを含有する。
【０２２３】
図38は、ドキソルビシンに耐性の乳癌細胞231/ADRから誘導した肺転移を治療するために、Ad/gTRAILをパクリタキソールと併用したエアゾール化ベクター投与の結果を示す。結果は、Ad/CMV-GFPで処置した動物は肺に数多くの腫瘍結節を発症することを示した。これと比較して、パクリタキソールおよびAd/gTRAILのどちらかによる治療は腫瘍結節の数を劇的に低下させた。Ad/gTRAILとパクリタキソールの併用は(見つけるのが困難な)腫瘍の数をさらに低下した。しかし、Ad/CMV-GFPとパクリタキソールの併用は、パクリタキソール単独と同様の結果を示す。
【０２２４】
本明細書に開示され、主張されている全ての組成物および方法は、本発明の開示に鑑みて不要な実験を行うことなく作製され、実施されうる。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物および方法並びに方法の工程または方法の工程の配列に変更を適用することができることは当業者に明らかである。さらに具体的には、化学的および生理学的に関連するある種の薬剤は、同じまたは同様の結果が得られると思われるかぎり、本明細書に記載されている薬剤と置換することができる。当業者に明らかなこのような同様の置換物および改良は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると思われる。
【０２２５】
VII.  参照文献
以下の参照文献は、例示的な手法の詳細または本明細書に記載するものに補足的な他の詳細を提供する程度において、参照として本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】培養細胞中でのCEAプロモーターからの基礎量のおよび増強したトランスジーン発現を示す。A549細胞およびNHFBは、アデノウイルスベクターで処置された。β-ガラクトシダーゼ活性は処置から48時間後に測定され、相対的な光単位（RLU）/μg細胞タンパク質として表現された。各々の値は3回のアッセイの平均＋S.D.を表す。各々の細胞株中のAd/CEA-LacZおよびAd/GT-LacZ＋Ad/CEA-GV16によって誘導される発現間の差異がこの図に示される。両方の細胞株において、発現の差異は有意である（p＜0.01）。
【図２】皮下腫瘍中でのCEAプロモーターからの基礎量のおよび増強したトランスジーン発現を示す。A549細胞由来の皮下腫瘍はヌードマウス中で樹立され、種々のアデノウイルスベクターで処置された。β-ガラクトシダーゼ活性は酵素アッセイによって測定された。処置は各々の棒グラフのバーの下に示す。β-ガラクトシダーゼ活性はRLU/μg細胞タンパク質として表現された。各々の値は少なくとも5匹の動物についての平均±S.D.を表す。
【図３】ベクター処置後の細胞の生存率を示す。細胞の生存率は、3つの細胞株（A549、LoVo、およびNHFB）において、XTTアッセイによって、アデノウイルスベクター処置の0、24、48、および72時間後に測定された。PBSで処置された細胞が対照として使用され、その生存率を1と設定した。各々の値は2回の4つ組のアッセイについての平均±S.D.である。48時間までに、Ad/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16による処置により、48時間での対照と比較した場合に、3つすべての細胞株において細胞の生存率が有意に減少した（P＜0.01）のに対して、Ad/GT-Bax＋Ad/CEA-GV16による処置により、A540およびLoVo細胞においてのみ細胞の生存率が有意に減少した（P＜0.01）。
【図４】アデノウイルス媒介遺伝子移入による腫瘍増殖の抑制を示す。LoVo細胞由来の皮下腫瘍は種々のベクターで処置された。腫瘍の体積が腫瘍細胞の接種後に経時的にモニタリングされた。矢印は処置が行われた時点を示す。値は、群あたり少なくとも5匹の動物の平均±SDを表す。Ad/CEA-GV16＋Ad/GT-BaxまたはAd/PGK-GV16＋Ad/GT-Baxによる処置は、他の対照群とは有意に異なる（P≦0.01）。
【図５】hTERTプロモーター活性のインビトロ分析を示す。これは、β-ガラクトシダーゼ活性の生化学的分析である。この酵素活性は、相対的な光単位（RLU）/μgタンパク質として示される。値は3回のアッセイについての平均＋SDである。
【図６】hTERTプロモーター活性のインビボ評価を示す。BALB/cマウスを種々のベクターで処置し、β-ガラクトシダーゼ活性について分析した。これは、β-ガラクトシダーゼ活性の生化学的分析である。β-ガラクトシダーゼ活性は、相対的な光単位（RLU）/μgタンパク質として示される。値は各群あたり5匹のマウスについての平均＋SDである。。
【図７】図7A〜図7Bは、hTERTまたはPGKプロモーターによって誘導されたBax遺伝子の抗腫瘍効果のインビトロ評価を示す。図7Aは、アポトーシス（sub-G1）細胞のフローサイトメトリー分析を示す。細胞株をパネルの左側に示し、処置をパネルの上部に示し、そしてアポトーシス細胞の割合を各パネルの下に示す。図7Bでは、細胞の生存率は処置後のXTTアッセイによって測定された。PBSで処置された細胞を対照として使用し、次いで、それらの生存率を100％に設定した。値は2回の4つ組のアッセイについての平均±SDである。◆＝PBS、■＝Ad/CMV-GFP＋Ad/PGK-GV16、▲＝Ad/GT-Bax＋Ad/CMV-GFP、○＝Ad/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16、＊＝Ad/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16。
【図８】アデノウイルス媒介性遺伝子移入による腫瘍増殖の抑制を示す。H1299細胞由来の皮下腫瘍が上記に示す種々のベクターで処置された。腫瘍の体積が腫瘍細胞の接種後に経時的に（日数で）モニタリングされた。値は、群あたり少なくとも8匹のマウスの平均±SDを表す。矢印は処置（9×1010総ウイルス粒子/マウス/処置）が行われた時点を示す。◆＝PBS、■＝Ad/E1-、▲＝Ad/GT-LacZ＋Ad/hTERT-GV16、□＝Ad/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16、○＝Ad/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16。
【図９】hTERTまたはPGKプロモーターによって誘導されたBax遺伝子のインビボでの肝臓毒性を示す。静脈内ウイルス注入から48時間後のASTおよびALTの血清レベルを示す。値は、群あたり3匹の動物の平均を表し、バーはSDを表す。
【図１０】Ad/gTRAILの図解を示す。ヒト5型アデノウイルスのE1領域（マップ単位1.3〜9.3）は、GAL/VP16遺伝子およびGFP/TRAIL遺伝子についての発現カセットからなる治療配列によって置き換えられる。BGH遺伝子およびSV40遺伝子からのポリアデニル化シグナル配列がこれらのカセットのために使用される。
【図１１】図11A〜図11Bは、インビトロでのAd/gTRAILのトランスジーン発現および細胞死滅効果を示す。図11Aはフローサイトメトリーアッセイを示す。H460、A549、DLD1、およびLovo細胞が、各カラムの上に示すように処置から48時間後収集された。GEF発現のレベル（上のパネル）およびアポトーシス性の細胞死（下のパネル）はFACSによって測定された。GFP＋またはアポトーシス性「sub-G1」細胞の割合が示される。図11Bは、XTTアッセイによって測定される細胞の生存率を示す。細胞は、PBS（●）、Ad/CMV-GFP（■）、Ad/gTRAIL（▲）、およびAd/GT-TRAIL＋Ad/PGK-GV16（＊）で処置された。生存率は、1に設定された、PBSで処置された細胞の生存率と比較して表現される。値は、4つ組のウェルの平均±s.d.を表す。4つすべての細胞株において、対照ベクターに対する、TRAIL発現ベクターで処置後の生存率は、処置の2日後、4日後、および7日後で有意に異なった（p＜0.001）。
【図１２】Ad/gTRAILによるインビボでの腫瘍増殖の抑制を示す。皮下異種移植モデルにおける腫瘍増殖はDLD1細胞に由来した。腫瘍の体積が、腫瘍細胞の接種後に経時的に（日数で）モニタリングされた。値は、群あたり10匹の動物の平均±標準誤差を表す。Ad/gTRAILまたはAd/GT-TRAIL＋Ad/PGK-GV16で処置した腫瘍についての増殖曲線は、ほぼ完全に重なる。両方は、PBSまたはベクター対照による処置とは有意に異なっていた（p＜0.001）。矢印は処置が行われた時点を示す。
【図１３】図13A〜図13Bは、NHPHおよびNHFBに対するAd/gTRAILの効果を示す。図13Aはフローサイトメトリーアッセイを示す。この分析は、図11Aおよび11Bに記載したように実行された。上のパネルはGFP発現のレベルを示す。下のパネルは、アポトーシス性の細胞死を示す。GFP陽性またはアポトーシス性「sub-G1」細胞の割合が示される。図13Bは細胞生存率アッセイを示す。NHPHおよびNHFBは、PBS（●）、Ad/CMV-GFP（■）、Ad/gTRAIL（▲）、およびAd/GT-TRAIL＋Ad/PGK-GV16（＊）で処置された。生存率は、1に設定される、PBSで処置された細胞の生存率と比較して表現された。値は、4つ組のウェルの平均±s.d.を表す。細胞の生存率は、他の群と比較した場合に、Ad/GT-TRAIL＋Ad/PGK-GV16で処置したNHPHにおいて、処置の2日後、4日後、および7日後で有意に減少した（p＜0.001）。
【図１４】Balb/cマウスにおける全身送達後のインビボ評価を示す。肝臓酵素であるASTおよびALTの14日目の血清中の活性を示す。中空のバーはPBS；ドット模様のバーはAd/CMV-GFP；縞模様のバーはAd/gTRAIL；および黒いバーはAd/GT-TRAIL＋Ad/PGK-GV16。
【図１５】図15A〜図15Bは、インビトロでのAd/gTRAILのトランスジーン発現および細胞死滅効果を示す。図15Aは、トランスジーン発現およびアポトーシス誘導を示す。図15Bは、XTTアッセイによって測定された細胞生存率を示す。
【図１６】TRAILタンパク質についての用量応答曲線を示す。
【図１７】図17A〜図17Bは、Ad/gTRAILによって誘導された231/ADRのアポトーシスを示す。図17Aは、異なる濃度のドキソルビシンで48時間インキュベートしたMDA-MB-231細胞および231/ADR細胞の用量応答曲線を示す。図17Bは、231/ADR細胞中のAd/gTRAILの細胞死滅効果を示す。
【図１８】図18A〜図18Bは、正常なおよび形質転換した胸部細胞中のトランスジーン発現および細胞殺傷性を示す。図18Aでは、Ad/gTRAILで処置したMCF10A細胞、MCF10F細胞、NPMEC細胞、およびNMEC細胞における、sub-G1細胞の割合およびGFPレベルが、処置から48時間後にフローサイトメトリーによって測定された。図18Bでは、Ad/gTRAILの細胞死滅効果が、MCF10A細胞、MCF10F細胞、NPMEC細胞、およびNMEC細胞におけるXTTアッセイによって試験された。
【図１９】図19A〜図19Dは、Ad/gTRAILのインビボでの抗腫瘍効果を示す。MDA-MB-231細胞（図19A、図19B）または231/ADR細胞（図19C、図19D）に由来する皮下異種移植片を有する動物における腫瘍増殖（図19A、図19C）および生存（図19B、図19D）。
【図２０】hTERTプロモーター活性のインビトロ分析を示す。β-ガラクトシダーゼ活性が相対的光単位（RLU）/μgタンパク質として表される。値は3回のアッセイについての平均±s.d.である。
【図２１】図21A〜図21Bは、hTERTまたはPGKプロモーターによって誘導された腫瘍細胞に対するBax遺伝子の抗腫瘍効果のインビトロ評価を示す。図21Aは、XTTアッセイによって測定される細胞生存率を示す。PBSで処置された細胞は対照として使用され、それらの生存率は100％として設定された。値は2回の4つ組のアッセイについての平均＋s.d.を表す。（◆）はPBS；（■）はAd/CMV-GFP＋Ad/PGK-GV16；（▲）はAd/GT-Bax＋Ad/CMV-GFP；（□）はAd/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16；（○）はAd/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16。図21Bは、UV2237m細胞に対するアポトーシス性（sub-G1）細胞のフローサイトメトリー分析を示す。処置はパネルの上部に示し、そして各パネルの下にアポトーシス性細胞の割合を示す。
【図２２】hTERT誘導性のおよび腫瘍特異的なBax遺伝子発現による同質遺伝子的な腫瘍増殖の抑制を示す。UV-223m細胞に由来する皮下腫瘍は、種々のベクターによって処置された。腫瘍の体積が腫瘍細胞の接種後に経時的に（日数で）モニタリングされた。値は一群あたり10匹のマウスの平均±s.d.を表す。矢印は処置（9×1010総ウイルス粒子/マウス/処置）が行われた時点を示す。（◆）はPBS；（■）はAd/E1-；（▲）はAd/GT-LacZ＋Ad/hTERT-GV16；（○）はAd/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16；（□）はAd/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16。Ad/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16またはAd/GT-Bax＋Ad/PGK-GV16で処置した結果は、ANOVAによる他の対照群の結果と比較して有意に異なる（p≦0.001）ことに留意されたい。
【図２３】ヒト骨髄CD34＋前駆細胞中のhTERTプロモーター活性の分析を示す。
【図２４】図24A〜図24Bは、DLD1/Bax-RおよびDLD-1/TRAIL-R細胞の特徴付けを示す。図24Aでは、親のDLD1細胞、DLD1/Bax-R細胞、およびDLD-1/TRAIL-R  DLD1細胞が、総計1000vp/細胞のMOIで別々のアデノウイルスで感染された。図24Bでは、細胞生存率が、処置の24時間、48時間、および72時間後に測定された。PBSで処置された細胞はモックの対照として使用され、それらの生存率は100％に設定された。値は4つ組のアッセイについての平均±s.d.である。親のDLD1細胞において、Ad/hTERT-GV16＋Ad/GT-BaxまたはAd/gTRAILによる処置後のアポトーシスのレベルは、PBSまたはAd/CMV-GFPによる処置後のレベルとは有意に異なっていたのに対して（P≦0.01）、DLD1/Bax-R細胞またはDLD-1/TRAIL-R細胞についての処置群間のアポトーシスレベルの差異は存在しなかった。（◇）はPBS；（□）はAd/CMV-GFP；（△）はAd/gTRAIL；（○）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax。
【図２５】図25A〜図25Bは、用量の増大による細胞の死滅を示す。親のDLD1細胞は、総計1000vp/細胞のMOIでAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Baxに感染した。DLD1/Bax-R細胞は、総計10,000vp/細胞のMOIでAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Baxに感染した。PBSで処置された細胞はモックの対照として使用された。左側に細胞株を示し；上部に処置を示し；各パネル中の数字はアポトーシス細胞の割合を示す。図25Aは、処置から48時間後にFACSによって測定したアポトーシス（sub-G1）細胞の割合を示す。図25Bは、処置の24、48、および72時間後に測定された細胞生存率を示す。（◇）はPBS；（□）はAd/CMV-GFP；（○）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax。
【図２６】図26A〜図26Bは、代替的なプロアポトーシス性遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの効果を示す。親のDLD1細胞、DLD1/Bax-R細胞、およびDLD-1/TRAIL-R細胞が、総計1000vp/細胞のMOIで様々なアデノウイルスに感染した。PBSで処置された細胞が陰性対照として使用された。図26Aでは、アポトーシス（sub-G1）細胞の割合が、処置から48時間後にFACSによって測定された。左側に細胞株を示し；上部に処置を示し；各パネル中の数字はアポトーシス細胞の割合を示す。図26Bは、処置の24時間、48時間、および72時間後に測定された細胞生存率を示す。PBSで処置された細胞が陽性対照として使用され、それらの生存率が100％に設定された。値は、4つ組のアッセイについての平均±s.d.である。DLD1細胞においては、Ad/hTERT-GV16＋Ad/GT-BaxまたはAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-BakまたはAd/gTRAILによる処置後のアポトーシスのレベルは、PBSまたはAd/CMV-GFPによる処置後のレベルとは有意に異なっていた（P≦0.01）。DLD1/Bax-R細胞においては、Ad/gTRAILによる処置後のアポトーシスのレベルは、PBSまたはAd/CMV-GFP（P≦0.01）、Ad/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax、およびAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bak（P≦0.05）による処置後のレベルと有意に異なっていた。DLD-1/TRAIL-R細胞においては、Ad/hTERT-GV16＋Ad/GT-BaxまたはAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bakによる処置後のアポトーシスのレベルは、PBS、Ad/CMV-GFP、またはAd/gTRAILによる処置後のレベルとは有意に異なっていた（P≦0.01）。（◇）はPBS；（□）はAd/CMV-GFP；（△）はAd/gTRAIL；（○）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax；（-）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bak。
【図２７】Bcl-xLの過剰発現の効果を示す。FACSによって測定されたアポトーシス細胞の割合を示す。Bcl-xLトランスフェクトDLD1クローン1-7は、各々総計1000vp/細胞のMOIで様々なアデノウイルスでトランスフェクトされた。PBSで処置された細胞がモックの対照として使用された。アポトーシス（sub-G1）細胞の割合が処置から48時間後にFACSによって測定された。左側にBcl-xLトランスフェクトDLD1クローンを示し；上部に処置を示し；各パネル中の数字はアポトーシス細胞の割合を示す。
【図２８】Ad/hTERT-gBax（Ad/gBax）の図解を示す。
【図２９】図29A〜図29Bは、GFP±Bax遺伝子の、Ad/hTERT±gBaxによって誘導される腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果のインビトロでの評価を示す。図29Aでは、細胞の生存率がXTTアッセイによって測定された。PBSで処置された細胞は対照として使用され、それらの生存率が100％に設定された。値は、2回の4つ組のアッセイについての平均±s.d.である。（▲）はPBS；（■）はAd/CMV-GFP；（□）はAd/hTERT-gBax；（○）はAd/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16。NHFBにおける破線は、Ad/GT±Bax+Ad/PGK±GV16。図29Bは、癌細胞および正常細胞におけるアポトーシス性（sub-G1）細胞のフローサイトメトリー分析を示す。FACS分析はウイルス処置から72時間後に行われた。
【図３０】hTERTプロモーター誘導性および腫瘍特異的Bax遺伝子発現による腫瘍増殖の抑制を示す。H1299細胞に由来する皮下腫瘍は、種々のベクターによって処置された。腫瘍の体積が腫瘍細胞の接種後に経時的に（日数で）モニタリングされた。値は一群あたり10匹のマウスの平均±s.d.を表す。矢印は処置（9×1010総ウイルス粒子/マウス/処置）が行われた時点を示す。（▲）はPBS；（■）はAd/CMV-GFP；（□）はAd/gBax；（○）はAd/GT-Bax＋Ad/hTERT-GV16。Ad/gBaxおよびAd/GT±Bax＋Ad/hTERT-GV16で処置した結果は、ANOVAによって示されるように他の対照群の結果と比較して有意に異なる（p≦0.01）ことに留意されたい。
【図３１】図31A〜図31Bは、癌細胞におけるトランスジーン発現およびアポトーシス誘導を示す。図31Aは、GFP/TRAILおよびBaxの誘導の図解を示す。Ad/gTRAILは、ヒト5型アデノウイルスのE1領域（マップ単位1.3〜9.3）の代わりにGAL4/VP16（GP16）遺伝子およびGFP/TRAIL遺伝子についての発現カセットを含む。図31Bでは、H1299細胞、DOV13細胞、およびSKOV3ip細胞は種々のベクターを用いて処置された。GFPおよびGFP/TRAILの発現は、処置から48時間後のFACS分析によって測定された。左側に細胞株を示し；上側に処置を示し；各パネル中の数字はGFP陽性細胞の割合を示す。
【図３２】図32A〜図32Bは、インビトロでのアポトーシス誘導および細胞死滅の効果を示す。図32Aでは、種々のベクターを用いて処置したH1299細胞、DOV13細胞、およびSKOV3ip細胞が、FACSを用いて細胞DNA含量を分析することによって、アポトーシス誘導について試験された。左側に細胞株を示し；上側に処置を示し；各パネル中の数字はアポトーシス細胞の割合を示す。図32Bでは、処置の1週間後以内に細胞生存率が測定された。PBSを用いて処置された細胞はモックの対照として使用され、それらの生存率が1.0に設定された。各々の値は、4つ組のアッセイについての平均±s.d.である。（◆）はPBS；（□）はAd/gTRAIL；（▲）はAd/gTRAIL＋Ad/GT-Bax；（■）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax；および（＊）はAd/CMVGFP＋Ad/GT-Bax。
【図３３】図33A〜図33Bは、正常ヒト卵巣表面上皮細胞（NHOE）中のトランスジーン発現およびアポトーシス誘導を示す。図33Aは、上記の各パネルに示されるように、処置から48時間後のGFPまたはGFP/TRAILの発現（上のパネル）およびアポトーシス（下のパネル）を示す。各パネル中の数字は、GFP陽性細胞の割合（上のパネル）およびアポトーシス性sub-G1細胞（下のパネル）を示す。図33Bでは、細胞生存率が処置の1週間後以内に測定された。PBSを用いて処置された細胞はモックの対照として使用され、それらの生存率が1.0と設定された。値は、4つ組のアッセイについての平均±s.d.である。（◆）はPBS；（□）はAd/gTRAIL；（▲）はAd/gTRAIL＋Ad/GT-Bax；（■）はAd/hTERT-GV16＋Ad/GT-Bax；および（＊）、Ad/CMV-GFP＋Ad/GT-Bax；（◇）はAd/PGK-GV16＋Ad/GT-Bax。Ad/PGK-GV16＋Ad/GT-Baxを用いる処置のみが正常細胞における有意な細胞死滅を誘発した。
【図３４】図34A〜図34Bは、インビボ抗腫瘍活性を示す。図34Aは、腹腔中の最大の腫瘍の体積；腹水の体積；体重を示す。最大の腫瘍および腹水の体積は、腫瘍細胞接種の28日後に測定されたが、体重は腫瘍細胞接種の4日後および28日後の両方に測定された。処置は腫瘍細胞接種の4日後に開始された。GFP/TRAIL-およびBax-発現ベクターを使用する処置は、別々におよび併用した場合の両方で、PBSまたは対照ベクターを使用する処置と比較した場合に、最大の腫瘍の体積、腹水の体積、および体重において有意な差異を生じた（p≦0.05）。図34Bは、腹腔に拡散したSKOV3腫瘍を有する動物についての生存曲線を示す。その動物は、PBS、Ad/gTRAIL、Ad/GT-Bax、Ad/gTRAIL＋Ad/GT-Bax、またはAd/hTERT-LacZを用いる4種の処置を受けた。次いで、生存をモニタリングした：TRAIL、Bax、またはTRAIL＋Baxを用いる処置を受けた動物の生存期間は、対照を用いる処置を受けたマウスのそれと比較して、有意に異なっていた（P≦0.05）。さらに、TRAIL＋Baxを用いる処置を受けた動物の生存期間は、BaxまたはTRAIL単独を用いる処置を受けた動物のそれと比較して有意に異なっていた（P≦0.05）。
【図３５】hTERT-LacZの腹腔内投与後の血清ASTおよび血清ALTのレベルを示す。血清試料は、処置の開始前（0日目）、最後の処置の1日後（1日目）、および14日後（14日目）に収集された。
【図３６】TRAIL耐性結腸癌細胞DLD1/TRAIL-Rを、ドキソルビシン（ADR）；フロクスウリジン（FuDR）；フルオロウラシル（5-FU）およびムタマイシン（MMC）によって、Ad/gTRAILに対して感作させることを示す。
【図３７】エアロゾルによって送達されたAd/CMV-LacZを示す。プロタミン、ヒドロコルチゾン、またはその組み合わせで処置された細胞の生化学的分析を示す。
【図３８】231/ADR細胞からの肺転移性腫瘍についての組み合わせ治療を示す。パクリタキソールと組み合わせてAd/gTRAILのエアロゾル化されたベクターが投与された。処置された細胞の生化学的分析が示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ａ−３】
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【図１１Ａ−４】
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【図１１Ｂ−１】
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【図１１Ｂ−２】
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【図１１Ｂ−３】
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【図１１Ｂ−４】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１５Ｂ−３】
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【図１５Ｂ−４】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ−１】
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【図１８Ｂ−２】
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【図１８Ｂ−３】
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【図１８Ｂ−４】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ａ−３】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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