(57)【要約】本発明は不足レベルのNF-κB経路の成分を有する細胞から得られた実験サンプル中の遺伝子の発現のレベルを測定する工程、生物学的経路の成分のレベルを有する野生型細胞から得られた対照サンプル中の前記遺伝子の発現のレベルを測定する工程、前記野生型サンプルに対して前記実験サンプル中で変調される発現のレベルを有する遺伝子を選択する工程を含むことを特徴とするNF-κB経路に関係する遺伝子の同定方法を提供する。また、本発明はIKKαの活性を変調することによる炎症関連疾患の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.不足レベルのNF-κB経路の成分を有する細胞から得られた実験サンプル中の遺伝子の発現のレベルを測定する工程であって、前記細胞は刺激物質に暴露されている工程、
b.野生型レベルのNF-κB経路の成分を有する野生型細胞から得られた対照サンプル中の前記遺伝子の発現のレベルを測定する工程であって、前記野生型細胞は前記刺激物質に暴露されている工程、
c.前記野生型サンプルに対して前記実験サンプル中で上方又は下方に変調される発現のレベルを有する遺伝子を選択する工程
を含むことを特徴とするNF-κB経路に関係する遺伝子の同定方法。
【請求項２】
刺激物質がTNFα又はIL-1である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞がMEF細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
NF-κB経路の成分がIKKα、IKKβ及びNEMO/IKKγから選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
成分がIKKαである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記実験サンプルの細胞がシグナルソームの成分について-/-遺伝子型を有するノックアウト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が遺伝子発現及び遺伝子発現のレベルを測定するのに使用される系に固有のバックグラウンドのレベルに対して上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ装置による遺伝子発現の分析により測定される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照で約２倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照で約５倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照サンプルで約10倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
a.  NF-κB経路に関係する遺伝子を不足する実験細胞及び前記遺伝子の野生型である対照細胞を刺激物質に暴露し、
b.  NF-κB関係遺伝子の発現のレベルを測定し、
c.  複数の関係遺伝子が変調される場合に、遺伝子を治療介入のための標的として選択することを特徴とする標的遺伝子の実証方法。
【請求項１３】
細胞がIKKα、IKKβ及びNEMO/IKKγを不足している、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がIKKα、IKKβ又はNEMOの遺伝子ノックアウトを有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細胞がIKKαを不足している、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法を使用してIKKαの制御下にあると同定された遺伝子の発現を変調することによる炎症性疾患の治療方法。
【請求項１７】
炎症性疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのデコリン、プロテアーゼ-ネキシン、ISG15、ERG2、Ｇプロテイン結合受容体RDC1、グルココルチコイド調節キナーゼ(SGK)、ホスホリパーゼD3、ヘキソキナーゼ２、及びMkp-3/二重特異性タンパク質ホスファターゼ６、ABCトランスポーター、Fox/フォークヘッド、Wntシグナリング受容体のFrizzledファミリーの員、炎症反応のC-EBPβ及びC/EBPγ相同転写レギュレーター又はSOCS-3の遺伝子発現のモジュレーターの使用。
【請求項１８】
炎症性疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのIKKαの制御下にあると同定された遺伝子産物の活性のモジュレーターの使用。
【請求項１９】
前記遺伝子産物がデコリン、プロテアーゼ-ネキシン、ISG15、ERG2、Ｇプロテイン結合受容体RDC1、グルココルチコイド調節キナーゼ(SGK)、ホスホリパーゼD3、ヘキソキナーゼ２、及びMkp-3/二重特異性タンパク質ホスファターゼ６、ABCトランスポーター、Fox/フォークヘッド、Wntシグナリング受容体のFrizzledファミリーの員、炎症反応のC-EBPβ及びC/EBPγ相同転写レギュレーター並びにSOCS-3から選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
炎症関連疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのIKKαの活性のモジュレーターの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
この出願は2002年５月24日に出願された米国特許出願第60/383018号及び2002年８月29日に出願された米国特許出願第60/406,935号（参考として本明細書にそのまま含まれる）の利益を主張する。
技術分野
本発明の分野は炎症性疾患及び癌の研究及び治療に有益なNF-κBの如き生物学的経路に関係する遺伝子の同定及び実証に使用される方法及び組成物に関する。
【０００２】
背景技術
細胞代謝、細胞サイクル制御、DNA修復及び免疫応答の如き主要な生物学的プロセスは多くの遺伝子の相互作用を伴う複合生物学的経路により作動することが知られている。個々の遺伝子の機能の異常は順に生物学的経路の機能を変化することがあり、しばしば疾患の原因であり得る。生物学的経路の異常を伴う疾患の場合、このような遺伝子は治療介入のための新規標的としての使用に適しているかもしれない。それ故、遺伝子及びそれらが生物学的経路で果たす役割の同定は最新医療に有益である。疾患に関係する複合生物学的経路の例はNF-κB経路である。NF-κB即ち核因子κＢは多数の炎症性遺伝子及び抗アポトーシス遺伝子の発現を誘導することにより炎症性疾患で役割を果たす転写因子である。これらとして、サイトカイン、例えば、IL-1、IL-2、TNFα及びIL-6、IL-8及びRANTESを含むケモカインだけでなく、COX-2を含むその他の炎症性分子並びに細胞付着分子、例えば、ICAM-1、VCAM-1、及びE-セレクチンが挙げられる。静止条件下で、NF-κBはIκBとの複合体として細胞のサイトゾル中に存在する。タンパク質のIκBファミリーはNF-κBのインヒビターとして利用でき、その核局在化シグナルの機能に干渉する（例えば、U. Siebenlistら(1994) Ann Rev Cell Biol 10, 405を参照のこと）。細胞活性化後のIκB-NF-κB複合体の分断後に、NF-κBは核に転移し、遺伝子転写を活性化する。IκB-NF-κB複合体の分断及びその後のNF-κBの活性化はIκBの分解により開始される。
【０００３】
NF-κBファミリーはRelファミリーの員を含むホモダイマー転写因子及びヘテロダイマー転写因子を含む（例えば、P.A. Baeurle及びD. Baltimore. (1996) Cell 87, 13を参照のこと）。NF-κB転写因子は５種の可能なサブユニット（RelA/p65、c-Rel、RelB、p50及びp52）から選択的に誘導されるヘテロダイマー又はホモダイマーとしてDNAに結合し、夫々が保存10塩基対コンセンサス配列（GGGRNWTYCC）の半分に結合する。RelA/p65サブユニット及びp50サブユニットは至る所で発現されるが、p52サブユニット、c-Relサブユニット及びRelBサブユニットは特別な分化細胞型中で一層機能的に重要である（Baldwin, A., Jr. (1996) Annu Rev Immunol 14, 649-683; Liou, H.C.ら(1994) Mol Cell Biol 14, 5349-5359）。細胞質p65/p50ヘテロダイマー、c-Relホモダイマー及びRelBはIκB（NF-κBのインヒビター）に結合され、それによりストレスのような応答を経験していない殆どの細胞の細胞質中でそれらをキレート形成する（Baldwin, A., Jr. (1996) Annu Rev Immunol 14, 649-683; Ghosh, S.ら(1998) Annu Rev Immunol 16, 225-260）。
NF-κBのアクチベーターは近くのリシンをユビキチン化の標的にし、それによりIκBプロテアソーム分解を生じる夫々のIκB中の二つのアミノ末端セリンの部位特異性リン酸化を媒介する。次いでNF-κBが核に自由に転移し、DNAを結合して炎症性応答標的遺伝子の宿主の活性化をもたらす（Baldwin, A., Jr. (1996) Annu Rev Immunol 14, 649-683; Ghosh, S.ら(1998) Annu Rev Immunol 16, 225-260）。最近の証拠はNF-κBサブユニットが細胞質と核の間で著しくシャトルするが、IκBα中の支配的に作用する核輸出シグナルが細胞質への逆のそれらの輸送を確実にすることを示していた。RelA/p65の核保持はIκBαと相互作用する能力をひどく悪化されているアセチル化形態との可逆的アセチル化により調節されることが最近示された（Chen, L.F.ら(2001) Science 293, 1653-1657）。
【０００４】
RelA/p65、c-Rel及びRelBとは対照的に、NF-κB p50サブユニット及びp52サブユニットはカルボキシ末端IκBドメインの除去によりp105前駆体タンパク質及びp100前駆体タンパク質から誘導され、これらはIκBの抑制特性を有し、これらの前駆体タンパク質のプロセシングはシグナル誘導リン酸化により開始される。NF-κBはたいてい転写アクチベーターであると考えられるとしても、或る状況下で、それはまた遺伝子発現を抑制するのに直接関係し得る{（Baldwin, A., Jr. (1996) Annu Rev Immunol 14, 649-683; Ghosh, S.ら(1998) Annu Rev Immunol 16, 225-260）に概説されている}。後者のシナリオでは、NF-κB p50サブユニット及びp52サブユニットの活性化ドメイン不足ホモダイマーがp50/p65ヘテロダイマーを活性化する代わりにNF-κB標的配列に結合する場合に、直接抑制が生じ得る（Kang, S.M.ら(1992) Science 256, 1452-1456; Plaksin, D.ら(1993) J Exp Med 177, 1651-1662; Brown, A.ら(1994) Mol Cell Biol 14, 2926-2935）。NF-κB活性化経路により分解されない多量の核IκBのようなタンパク質である、IκB同族体Bcl-3は、リン酸化のその状態、濃度及び核コファクターとの会合に応じてDNAへのp50ホモダイマー又はp52ホモダイマーの結合について多様な効果を有すると報告されていた（Wulczyn, F.G.ら(1992) Nature 358, 597-599; Bours, V.ら(1993) Cell 72, 729-739; Nolan, G.P.ら(1993) Mol Cell Biol 13, 3557-3566; Dechend, R.ら(1999) Oncogene 18, 3316-3323）。Bcl-3はDNA結合p50ホモダイマー及びp52ホモダイマーと３成分複合体を容易に形成し、その状況で転写アクチベーターのように機能し、その活性化ポテンシャルがTip60ヒストンアセチラーゼとの相互作用により増進される（Bours, V.ら(1993) Cell 72, 729-739; Dechend, R.ら(1999) Oncogene 18, 3316-3323; Fujita, T.ら(1993) Genes Dev 7, 1354-1363; Pan, J.ら(1995) J Biol Chem 270, 23077-23083; Hirano, F.ら(1998) Mol Cell Biol 18, 1266-1274）。Bcl-3/p50ホモダイマーの複合体は生存促進Bcl-2 NF-κB標的遺伝子の転写活性化に寄与することが最近示された（Kurland, J.F.ら(2001) J Biol Chem 276, 45380-45386）。Bcl-3-p50複合体はp50-p65ヘテロダイマーと同じ速度論で形成するが、IκBαからのp50-p65放出とは独立であり、またそれらの生成におけるp105タンパク質分解経路を示す（Heissmeyer, V.ら(1999) Embo J 18, 4766-4778）。
【０００５】
IκBのリン酸化はNF-κB経路の調節における主要な誘発イベントである。NF-κB経路の異常な調節は炎症性疾患と相関関係があると考えられるので、IκBリン酸化の調節は疾患介入に重要な領域であろう。
IκBの誘導リン酸化を担うキナーゼに関する研究はNF-κB分野における主要な焦点の一つであった。IκBリン酸化は少なくとも三つの成分又はサブユニット：二つのIκBキナーゼ：IKKα、IKKβ及び非触媒調節サブユニットNEMOからなる高分子量シグナルソーム複合体（従来、シグナルソームと総称された）により媒介される{（Mercurio, F.ら(1999) Oncogene 18, 6163-6171; Barkett, M.ら(1999) Oncogene 18, 6910-6924; Karin, M. (1999) Oncogene 18, 6867-6874）に概説されている}。多くの研究が行なわれて、役割の一層大きな理解が炎症性疾患の治療のための新しい方法及びアプローチの開発をもたらすかもしれないという考えでNF-κBの調節における成分の夫々の役割を決定していた。NEMOの２分子がIKKα及びIKKβと称されたNEMO結合ドメイン即ちNBDの両方の特別なカルボキシ末端保存残基に結合することにより高分子量シグナルソーム複合体へのIKKの集合を少なくとも一部編成すると考えられる（Krappmann, D.ら(2000) J Biol Chem 275, 29779-29787; Li, X.H.ら(2001) J Biol Chem 276, 4494-4500; Hatada, E.N.ら(2000) Current Opinion in Immunology 12, 52-58; May, M.J.ら(2000) Science 289, 1550-1554）。NEMOはまたIKK複合体へのIκBαの動員を促進し得る（Yamamoto, Y.ら(2001) J Biol Chem 276, 36327-36336）。２種の触媒IKKサブユニットはシグナル誘導された、上流のキナーゼ活性のアレイに対しNEMOにより差別的に応答して、未知のメカニズムによりそれらのMAPKのようなＴ活性化ループ中の一対のセリンの協調リン酸化に到る。
【０００６】
NF-κB活性化におけるIKKの役割がIKKβ、IKKα又はNEMOを欠いているマウスで研究された（Li, Q.ら(1999) Science 284, 321-325; Li, Z.W.ら(1999) J Exp Med 189, 1839-1845; Tanaka, M.ら(1999) Immunity 10, 421-429; Li, Q.ら(1999) Genes Dev 13, 1322-1328; Hu, Y.ら(1999) Science 284, 316-320; Takeda, K.ら(1999) Science 284, 313-316）。NF-κB p65サブユニットを遺伝的に不足しているマウス（Beg, A.A.ら(1995) Nature 376, 167-170）に類似の、遺伝的にIKKβ又はNEMOのないマウス胎児はNF-κB活性化の実際に完全なブロックのために子宮中でひどい肝臓アポトーシスに屈した（Li, Q.ら(1999) Science 284, 321-325; Li, Z.W.ら(1999) J Exp Med 189, 1839-1845; Tanaka, M.ら(1999) Immunity 10, 421-429; Rudolph, D.ら(2000) Genes and Dev. 14, 854-862; Schmidt-Supprian, M.ら(2000) Mol Cell 5, 981-992; Makris, C.ら(2000) Mol Cell 5, 969-979）。これらのIKKβ及びNEMOノックアウト(KO)動物はサイトカイン媒介IκB分解及び核NF-κB DNA結合活性の両方について完全ではないとしてもひどく不足していた（Li, Q.ら(1999) Science 284, 321-325; Li, Z.W.ら(1999) J Exp Med 189, 1839-1845; Tanaka, M.ら(1999) Immunity 10, 421-429; Rudolph, D.ら(2000) Genes and Dev. 14, 854-862; Schmidt-Supprian, M.ら(2000) Mol Cell 5, 981-992; Makris, C.ら(2000) Mol Cell 5, 969-979）。
IKKβ及びNEMO KOマウスとは対照的に、IKKαのない動物は表皮ケラチノサイトの末梢分化のブロックにより生じたひどい皮膚、肢及び骨格の異常のために周産期に死亡した（Li, Q.ら(1999) Genes Dev 13, 1322-1328; Hu, Y.ら(1999) Science 284, 316-320; Takeda, K.ら(1999) Science 284, 313-316）。その後の研究はIKKα（そのキナーゼ活性及びNF-κBの両方とは独立に）がケラチノサイト分化を誘導する可溶性因子の生成を制御することを明らかにした（Hu, Y., Baud, V.ら(2001) Nature 410, 710-714）。更に、IKKαのない胎児はサイトカイン誘導IκBα分解、NF-κB核転移及びNF-κB DNA結合活性の両方について表現型上正常であることが明らかであった（Hu, Y.ら(1999) Science 284, 316-320; Takeda, K.ら(1999) Science 284, 313-316）。加えて、過剰発現人工産物を回避するトランスフェクション条件を使用する、培養哺乳類細胞中の独立の研究は、NF-κB誘導のサイトカイン制御活性化がIKKαではなく、IKKβのin vivo機能であると結論した（Delhase, M.ら(1999) Science 284, 309-313）。
【０００７】
この研究の本体はIKKβ単独が炎症反応媒介物質によるNF-κB活性化に必須であるという当業界で良く受け入れられた考えをもたらした（Karin, M. (1999) Oncogene 18, 6867-6874; Hatada, E.N.ら(2000) Current Opinion in Immunology 12, 52-58; Karin, M.ら(2000) Annu Rev Immunol 18, 621-663）。しかしながら、この考えにもかかわらず、この一般に受け入れられた考えとの不一致の論文が存在した。何とならば、二つのグループがIKKα(-/-)胚繊維芽細胞中のNF-κB転写応答能の或る種の不足を報告していたからである（Li, Q.ら Genes and Dev (1999) 1322-1328）。更に最近、IKKβとは別個かつ特有の機能と調和して、IKKαは少なくとも二つの付加的な新規なin vivo機能を有することが示されていた：(a)それはＢリンパ球成熟（Kaisho, T.ら(2001) J Exp Med 193, 417-426）並びにLTβR及びNIK依存性シグナリング経路によるペイヤーズ(Peyers)パッチ形成（Matsushima, A.ら(2001) J Exp Med 193, 631-636）に必須であり、この場合、NF-κB2(p100)前駆体のサイトカイン誘発プロセシングをターゲッティングして機能性NF-κB p52サブユニットを生成することが必要とされ（Senftleben, U.ら(2001) Science 293, 1495-1499）、かつ(b)それがサイクリンD1を活性化するためのTNFαシグナリングではなく、RANKリガンドに応答する乳上皮細胞の増殖に必要とされる（Cao, Y., Bonizzi, G.ら(2001) Cell 107, 763-775）。これらの研究とは独立に、IKKβはp50のp105前駆体中のIκBのような分解モチーフをリン酸化すると報告され、これがβTrCP含有SCFユビキチンリガーゼの認識部位を生じ、p105のその後のポリユビキチン化がその完全なプロテアソームの分解及びDNA結合p50ホモダイマーの誘導された放出を生じ（Heissmeyer, V.ら(1999) Embo J 18, 4766-4778; Heissmeyer, V.ら(2001) Mol Cell Biol 21, 1024-1035）、IKKβ及びIKKαがNF-κB活性化において異なる役割を有するという概念についての付加的な支持を与える。
【０００８】
NF-κB依存性遺伝子発現の誘導核転移の良く受け入れられた考えに加えて、p65トランスアクチベーションサブユニットのリン酸化を伴う別のメカニズムが現れた。タンパク質キナーゼＡ触媒サブユニットがp65をリン酸化し、これがp65及びp300転写コアクチベーターの会合をもたらす（Zhong, H.ら(1998) Mol Cell 1, 661-671）。
GSK3及びT2Kノックアウトマウスからの細胞はNF-κB核転移を誘導することができるが、NF-κBのトランスアクチベーション機能を刺激するのに欠陥がある（Hoeflich, K.P.ら(2000) Nature 406, 86-90; Bonnardら(2000) Embo J 19, 4976-4985）。IL-1βはAkt依存様式でp65のリン酸化を誘導する。p65のトランスアクチベーションポテンシャルを誘導するAktの能力はIKK及びp38を必要とする（Madrid, L.V., Mayo, M.W., Reuther, J.Y.及びBaldwin, A.S. Jr. (2001) J Biol Chem 276, 18934-18940）。IKKβ-/-MEFではなく、IKKα-/-MEFがIL-1β媒介p38活性化に欠陥がある。このメカニズムはNF-κB活性化遺伝子転写におけるIKKαの役割を部分的に説明するかもしれない。
NF-κB経路の如き生物学的経路に関係する遺伝子の同定及び証明のための方法が疾患を研究し、疾患介入のための新規標的を開発するのに使用し得る。こうして、NF-κBの如き生物学的経路に関係する遺伝子の同定及び証明のための方法が有益と考えられる。加えて、このような生物学的経路に関係する多数の遺伝子（即ち、数十又は数百の遺伝子が単一実験に必要とされる）を同定し、証明することができる方法が有益と考えられる。更に、炎症反応に関係する遺伝子、特にNF-κ経路の影響下の遺伝子の一層大きな理解を与える分析の方法についての要望がある。また、NF-κB経路に関係する遺伝子の役割を理解するための方法についての要望がある。
炎症関連疾患に利用できる治療選択肢は制限されている。喘息の如き炎症性疾患の治療として、グルココルチコイド受容体とNF-κBの間の相互作用により活性化NF-κBを直接抑制するグルココルチコイドの投与が挙げられる。炎症関連疾患を治療するための新規方法及びアプローチについての要望がある。
また、炎症反応に関係する遺伝子の実証方法についての要望がある。何とならば、このような遺伝子が治療介入のための標的としての使用に適しているかもしれないからである。
【０００９】
発明の概要
本発明は炎症反応に関係する遺伝子を実証し、同定するための方法を使用することによるNF-κB依存性遺伝子の活性化についてのIKKβ及びNEMOと一緒のIKKαの重要性の本件出願人の実証に一部基づいている。更に、本発明はIKKαがまた細胞遺伝子（サイクル制御、DNA修復及びアポトーシスの媒介物質を含む）の宿主の協調発現（その発現はNF-κBをIκBαのトランス優性スーパーリプレッサー突然変異体でブロックすることにより救済された）に重要であるという本件出願人の実証に基づいている。
本発明の一局面は最初にNF-κB経路に関係する遺伝子、特にIKKαを含むシグナルソーム複合体又はNF-κB経路の成分をコードする遺伝子の影響下のこれらの遺伝子の同定方法に関する。本発明の方法を使用して同定された遺伝子は免疫疾患の介入のための標的として使用し得る。
本発明の一局面はIKKα、IKKβ及びNEMOがNF-κB媒介炎症反応プログラムに夫々必要とされるが、NF-κB依存性遺伝子発現に差別的に関係することを実証するために本件出願人により使用された方法に一部基づいている。
本発明の別の局面は炎症性疾患の治療のための治療標的として有益な遺伝子の同定であり、従来NF-κB依存性遺伝子であることが知られていなかった前記遺伝子は幾つかのFox/フォークヘッド転写因子、Wntシグナリング受容体のFrizzledファミリーの員、炎症反応のC-EBPβ及びC/EBPγ相同転写レギュレーター及びSTAT3シグナリングの陰性エフェクターである、SOCS3を含む。本発明の方法を使用してまた同定されたNF-κB標的遺伝子はまたシグナル伝達、細胞サイクル及び細胞増殖に関係する遺伝子、例えば、Ｇプロテイン結合受容体RDC1、グルココルチコイド調節キナーゼ(SGK)、ホスホリパーゼD3、ヘキソキナーゼ２、及びMkp-3/二重特異性タンパク質ホスファターゼ６を含む。
【００１０】
本発明の別の局面は
a.不足レベルのNF-κB経路の成分を有する細胞（細胞は刺激物質に暴露されていた）から得られた実験サンプル中の遺伝子の発現のレベルを測定する工程、
b.野生型レベルのNF-κB経路の成分を有する野生型細胞（その対照細胞は前記刺激物質に暴露されていた）から得られた対照サンプル中の前記遺伝子の発現のレベルを測定する工程、
c.前記野生型サンプルに対して前記実験サンプル中で上方又は下方に変調される発現のレベルを有する遺伝子を選択する工程
を含むことを特徴とするNF-κB経路に関係する遺伝子の同定方法である。
本発明の一局面において、前記実験サンプルの細胞はIKKα、IKKβ又はNEMOを不足している。
本発明の別の局面において、前記実験サンプルの細胞はシグナルソームの成分についてゼロの-/-遺伝子型を有するノックアウト細胞である。
本発明の別の局面において、遺伝子発現のレベルはマイクロアレイ装置による分析により測定される。
本発明の別の実施態様は
a.  NF-κB経路に関係する遺伝子を不足する実験細胞及び前記遺伝子の野生型である対照細胞を刺激物質に暴露し、
b.  NF-κB関係遺伝子の発現のレベルを測定し、
c.  関係遺伝子が変調される場合に、遺伝子を治療介入のための標的として選択することを特徴とする標的遺伝子の実証方法を提供する。
本発明の別の局面はIKKαの活性を変調することにより炎症関連疾患を治療する方法を提供する。
本発明の別の局面はIKKαの制御下にある遺伝子の発現を変調することにより炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
下記の定義は本明細書に使用される用語の理解を促すために示される。本明細書に特別に定義されない用語は開示及び状況に鑑みて当業者によりそれらに与えられる意味を与えられるべきである。
本明細書に使用される“細胞”という用語は、組織中に保持される細胞、細胞クラスタ及び個々に分離された細胞を含むが、これらに限定されない、あらゆる形態の細胞を含む。
本明細書に使用される“細胞系”という用語は多くの世代について安定にin vitro成長することができる一次細胞系のクローンを意味する。
本明細書に使用される“実験サンプル”という用語はNF-κB経路の成分の不足レベルを有する細胞からのRNAサンプルを意味し、これらの細胞は刺激物質に暴露されていた。
本明細書に使用される“対照サンプル”という用語はNF-κB経路の成分の野生型活性レベルを有する細胞から得られたRNAサンプルを意味し、これらの細胞は刺激物質に暴露されていた。
本明細書に使用される“遺伝子発現”という用語は遺伝子が観察可能な表現型（タンパク質の最も普通の生成）に変換されるプロセスを意味する。
本明細書に使用される“ノックアウト”という用語は特別な遺伝子の機能性コピーを有しない細胞系を意味する。
本明細書に使用される“炎症性物質”という用語は細胞中で炎症反応を生じることができる化合物を意味する。“炎症性物質”は“刺激物質”と同時に使用し得る。
【００１２】
“上方又は下方の変調”という用語は遺伝子の発現を活性化もしくは増大することによる、又はその発現を抑制もしくは減少することによる遺伝子発現の変調を意味する。上方又は下方の変調は遺伝子発現を測定するのに使用される系に特有のバックグラウンドのレベルに関して見られ、遺伝子発現のレベルはバックグラウンドレベルとは区別されるべきである。例えば、バックグラウンドのレベルが２倍に変化する場合、２倍より大きい遺伝子発現の変調が遺伝子発現の増大又は活性化と考えられるであろう。一般に、遺伝子が発現の野生型レベルに対し対照中で約２倍より大きく、好ましくは発現の野生型レベルに対し対照中で５倍より大きく、最も好ましくは10倍より大きく上方に変調される場合に、前記遺伝子が選択される。また、遺伝子が発現の野生型レベルに対し対照中で約２倍より大きく、好ましくは発現の野生型レベルに対し対照中で約５倍より大きく、最も好ましくは10倍より大きく下方に変調される場合に、前記遺伝子が選択される。
“スーパーリプレッサー”という用語は細胞中で活性状態に留まるように突然変異誘発で変化されたトランス優性作用性抑制性タンパク質生成物又はタンパク質の組み合わせを意味する。例えば、IκBスーパーリプレッサーはIκBがシグナルソームによりリン酸化し得ないように変化され、それにより炎症性刺激の状況でさえもNF-κB活性をブロックするその能力を保持する。
“刺激物質”という用語は疾患メカニズムで生物学的応答を生じる化合物、生物学的物質、元素又は分子を意味する。NF-κB経路の場合、刺激物質はNF-κB媒介免疫応答を生じる化合物、元素又は分子を意味する。
“成分”という用語はNF-κBシグナルソーム複合体のサブユニットを意味する。成分及びサブユニットという用語は互換可能に使用し得る。
【００１３】
本明細書に使用される“IKKα”という用語はIκBキナーゼ複合体のアルファサブユニットを表す。IKKαはIκB、NF-κB p100又はその他のタンパク質基質をリン酸化するキナーゼである。
本明細書に使用される“遺伝子転写”という用語はDNA分子の一つのストランドがRNAポリメラーゼによる相補RNAの合成のための鋳型として使用されるプロセスを意味する。
本明細書に使用される“DNA”という用語はポリヌクレオチド分子、セグメント又は配列を表し、ヌクレオチドの鎖を表すのに本明細書に使用され、夫々が糖デオキシリボース及び４種のアデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)又はシトシン(C)の一つを含む。
本明細書に使用される“RNA”という用語はポリヌクレオチド分子、セグメント又は配列を表し、ヌクレオチドの鎖を表すのに本明細書に使用され、夫々が糖リボース及び４種のアデニン(A)、グアニン(G)、ウラシル(U)又はシトシン(C)の一つを含む。
本明細書に使用される“IKKα活性の変調”という用語は細胞中のIKKαタンパク質の活性のレベルを抑制（減少）又は刺激（増大）することを意味する。IKKα活性はIKKαタンパク質のレベル及び／又は構造の修飾、或いはIKKα遺伝子転写のレベル及び／又は細胞中のIKKαタンパク質活性のレベルが変調されるような構造の修飾により変調し得る。
本明細書に使用される“タンパク質”という用語は単離された天然産ポリペプチド、組換えにより生成されたタンパク質を意味する。このようなタンパク質を調製するための手段が当業界で良く理解されている。タンパク質は末端切断型形態又は成熟形態を含む、分泌されたタンパク質の形態であってもよい。タンパク質は必要により分泌配列又はリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば、多重ヒスチジン残基、或いは組換え生成中の安定性のための付加的な配列を含む付加的なアミノ酸配列を含むように修飾されてもよい。本発明のタンパク質は単離された形態で提供されることが好ましく、実質的に精製されることが好ましい。分泌されたタンパク質を含む、タンパク質の組換え生成された別型は本明細書に記載され、又はそれ以外に当業界で知られている技術を使用して、例えば、Smithら, Gene, 67:31-40 (1988)に記載された１工程方法により実質的に精製し得る。また、本発明のタンパク質は本明細書に記載され、又はそれ以外に当業界で知られている技術を使用して天然源、合成源又は組換え源から精製し得る。
【００１４】
本明細書に使用される“炎症性遺伝子”という用語はNF-κB経路により炎症反応後に誘導されるあらゆる遺伝子を表す。炎症性遺伝子の例として、ベータインヒビン、IL-8、IL-6、インターフェロン刺激タンパク質、TNF誘導タンパク質、Cox2、GRO1オンコジーン、CD44、インターロイキン11、及びスーパーオキサイドジスムターゼが挙げられるが、これらに限定されない。炎症性遺伝子産物は刺激物質として使用し得る。
ヌクレオチド配列は当業界で普通に使用される１文字ヌクレオチド記号をIUPAC-IUB生化学命名法委員会の推奨(1972)に従って使用して左から右に、5'から3'方向に、単一ストランドにより本明細書で表される。
本明細書に記載された方法は炎症性疾患の研究に関係するアッセイに使用し得る。本明細書に使用される“炎症性疾患”という用語はまた炎症反応を伴う自己免疫症状、例えば、骨関節炎、再潅流損傷、喘息、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、トキシックショック症候群、アルツハイマー病、インスリン依存性真性糖尿病、急性及び慢性の痛みだけでなく、炎症の症候及び心血管疾患、卒中、単独又は血栓崩壊治療後の心筋梗塞、熱損傷、成人呼吸困難症候群(ARDS)、トラウマに二次的な多発性臓器損傷、急性腎炎、急性炎症性成分による皮膚病、急性化膿性髄膜炎又はその他の中枢神経系障害、グレーブ病、重症筋無力症、硬皮症及びアトピー性皮膚炎を含み得る。
【００１５】
NF-κB経路の異常な調節、特に過剰刺激は炎症性疾患と相関関係がある。IKKαがTNFαの如き炎症性サイトカインに応答してNF-κB依存性遺伝子の遺伝子発現を全体的に制御するのに必要とされるという予期しない発見は炎症性疾患の重度を減少する化合物を単離するための新しいスクリーニング操作の使用を支持する。
また、本発明はIKKαの活性を変調する生物学的薬剤及び／又は化学薬剤が炎症性疾患の治療に使用し得ることを実証する。特に、IKKα、又はIKKα遺伝子の転写及び／又は翻訳のアンタゴニスト又はインヒビターが冒された組織又は器官中でIKKα活性を減少することにより炎症を減少するための治療目的及び予防目的のために使用し得る。IKKα活性のアンタゴニストはその用語が本明細書に記載されているような多くの炎症性疾患を回復するのに有益であるかもしれない。IKKαの活性を変調するためのその他の方法として、IKKα遺伝子にターゲッティングされるアンチセンスRNA又はDNA或いはこれらのレギュレーターの使用が挙げられる。
また、本発明の方法は先にリストされたものとは無関係のNF-κBの活性化と関連するその他の障害の研究のためのアッセイに使用し得る。例えば、本発明の化合物はまた化学療法薬の有効性を高めることにより癌の研究に関係するアッセイに有益であるかもしれない。
本発明の方法を使用して研究し得るその他の疾患の例として、高血圧、及び中枢神経障害が挙げられる。調節遺伝子のノックアウトを含む細胞は本発明の方法に適した候補であろう。
【００１６】
NF-κB経路に関係する遺伝子の同定
細胞培養
本発明の方法はNF-κB経路の成分又は多成分を不足している実験細胞及び野生型細胞を使用する。前記成分について一種以上の遺伝子の機能性コピーを有しない細胞、例えば、成分についてのノックアウト細胞がまた使用し得る。ノックアウト細胞は当業界で普通に使用される技術を使用してつくられる。Hu, Y.ら(1999) Science 284:316-320; Li, Q.ら(1999) Genes Dev 13:1322-1328; Takeda, K.ら, Science 284:313-316を参照のこと。ノックアウト細胞をつくる方法は当業界で知られており、Gene targeting-a practical approach (2000) 第２編, Oxford University Press（本明細書に含まれる）に開示されている。
実験細胞及びwt細胞は標準成長培地中で標準条件で当業界で知られている方法を使用して培養される。本発明により使用し得る細胞及び組織の型として、炎症物質に対し応答することができる細胞、例えば、マウス胚性繊維芽(MEF)細胞が挙げられる。使用し得るその他の細胞として、炎症物質に対し応答することができるあらゆるマウスpreB細胞、例えば、ヒーラ細胞、Thp.1細胞及びフベック細胞が挙げられ、この場合、NF-κB活性化のシグナリング成分、例えば、マクロファージ及び上皮細胞等の経路が突然変異誘発又は遺伝子サイレンシングによりノックアウトし得る。
【００１７】
刺激物質による細胞の処理
実験細胞及び野生型細胞は刺激物質に暴露される。許される刺激物質はNF-κB経路下で炎症性遺伝子の発現を誘導する化合物である。刺激物質として、TNFα、IL-1及びLPSが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい刺激物質はTNFαである。NF-κB依存性遺伝子の発現に影響するその他の刺激物質が同様に使用し得ることが理解される。刺激時間及び使用される刺激物質の量は使用される刺激物質に応じて変化するであろうが、刺激物質は測定可能な炎症性反応を誘発するのに充分な様式で細胞に投与されるであろう。TNFαは15分間〜24時間にわたって約１〜10ng/mlで細胞に加えられる。IL-1がまた刺激物質として使用でき、また15-30分間から12〜24時間までにわたって約５〜100ng/mlで使用し得る。
RNA及びPCRプライマーの調製
遺伝子発現のレベルは全RNAサンプルからのmRNAの分析により測定し得る。全RNAは刺激物質の送出後に当業者に知られている方法を使用して調製し得る。全細胞RNAはキアゲン（バレンシア、CA）からのRNeasyTMキット及び無Rnase DNaseセットプロトコルを製造業者の記載に従って使用して組織又は細胞サンプルから単離されることが好ましい。遺伝子の発現を測定するための当業界で普通に使用されるあらゆる技術、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、PCR、又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに記載されたようなドットブロット分析が使用し得る。mRNAのレベルは直接に読み取られ、又はmRNAの産物、例えば、mRNAから誘導されたcDNAのレベルが測定し得る。特定遺伝子の遺伝子発現のレベルが実験型と野生型の間で比較される。野生型サンプルに対し上方又は下方に変調される発現のレベルを有する遺伝子がNF-κB経路に関係する遺伝子として選択され、同定される。野生型サンプルに対し上方又は下方に変更される発現のレベルを有する遺伝子が標的遺伝子として実証される。
【００１８】
マイクロアレイ研究
遺伝子発現レベルの分析はまたマイクロアレイ又はcRNAチップ分析を使用して行ない得る。これらの技術は単一実験で多くの遺伝子の分析を可能にする。cRNAの調製、及びハイブリダイゼーションは本明細書に記載された方法又はそれ以外に当業界で普通に使用される方法に従って行なわれる。マイクロアレイ分析は種々の会社から利用できる操作、例えば、アフィメトリックス技術及びアギレント技術を使用して行ない得る。
アフィメトリックス操作が好ましい方法であり、実質的に以下のようにして行なわれる。全RNA５〜10マイクログラムがcDNA合成キットを使用する逆転写により二本鎖cDNAに変換し得る。cDNA合成に好ましいキットはスーパースクリプト・チョイスTM（インビトロゲン、カールスバッド、CA）であり、これはpoly Tトラクトの3'に付加されたT7 RNAポリメラーゼプロモーター部位を含む特別なオリゴ(dT)24プライマー（ゲンセット、ラジョラ、CA）を利用する。二本鎖合成後に、標識cRNAがT7 RNAポリメラーゼ及びリポーティング試薬、例えば、ビオチン-11-CTP及びビオチン-16-UTP（エンゾ、ファーミングデール、NY）を使用するin vitro転写反応によりcDNAサンプルから生成される。当業界で普通に使用されるリポーター薬剤、例えば、P32、S35、フルオレセイン及びビオチンがまた使用し得る。標識cRNAは当業界で普通に使用される技術により精製し得る。好ましい方法はRNeasyスピンカラム（キアゲン、バレンシア、CA）を使用することである。cRNAサンプルは温和なアルカリ処理により断片化し得る。cRNAサンプルは製造業者により示唆されるような断片化緩衝液中で約35分間にわたって約94℃の処理により断片化される。細菌遺伝子及びファージ遺伝子についての対照cRNAの混合物がアレイ間のハイブリダイゼーション効率の比較のため及び測定された遺伝子発現レベルの相対的定量のための手段として利用するために含まれるべきである。ハイブリダイゼーションの前に、cRNAサンプルが５分間にわたって約95℃で加熱され、５分間にわたって45℃で平衡にされ、室温で５分間にわたって遠心分離（14,000xg）により清浄化される。夫々のcRNAサンプルのアリコートが製造業者の指示に従ってアレイにハイブリダイズされる。アレイが製造業者により特定された方法に従って洗浄される。好ましい洗浄は非ストリンジェント（6xSSPE、0.01％のトゥイーン-20、0.005％の消泡剤）及びストリンジェント（100mm MES、0.1M NaCl、0.01％のトゥイーン20）によるものであり、R-フィコエリスリン-ストレプトアビジン（モレキュラー・プローブズ、ユージーン、OR）で染色され、再度洗浄され、560nmの長光路フィルターを有するアルゴンイオンレーザースキャナー（モレキュラー・ダイナミクス；アフィメトリックス、サンタクララ、CA）により走査される。遺伝子発現レベルが増大され、減少され、又は変化されないかどうかを測定するために、データ分析が行ない得る。MAS 5.0ソフトウェア（アフィメトリックス、サンタクララ、CA）の如きソフトウェアが使用されることが好ましい。
【００１９】
遺伝子発現の変調
刺激物質に応答する遺伝子発現の変調が起こったか否かの測定は示されるようなパラメーターに従って行なわれる。遺伝子発現はその発現を活性化もしくは増大することにより、又はその発現を抑制もしくは減少することにより変調し得る。上方又は下方の変調は遺伝子発現を測定するのに使用される系に特有のバックグラウンドのレベルに対して見られ、遺伝子発現のレベルはバックグラウンドレベルと区別されるべきである。例えば、バックグラウンドのレベルが典型的には２倍変化する場合、２倍より大きい遺伝子発現の変調が遺伝子発現の増大又は活性化と考えられるであろう。一般に、遺伝子発現がマイクロアレイ装置で測定される場合、前記遺伝子が発現の野生型レベルに対する基準対照サンプルと比較して実験サンプル中で約２倍より大きく、好ましくは約５倍より大きく、最も好ましくは10倍より大きく上方又は下方に変調される場合に遺伝子が選択される。遺伝子発現の変調が特別な遺伝子について対照サンプルに対して実験サンプル中で見られる場合、その遺伝子がNF-κB経路に関係するとして選択され、同定される。
【００２０】
標的遺伝子の実証
本発明の別の実施態様はNF-κB経路に関係する標的遺伝子の実証方法を提供する。第一工程において、NF-κB経路に関係する遺伝子を不足している細胞及び前記遺伝子の野生型である対照細胞が刺激物質に暴露され、その結果、測定可能な炎症反応が測定し得る。次いでNF-κB経路に関係する遺伝子の発現のレベルが本明細書に他に記載されているような遺伝子発現を測定するために当業界で普通に使用される方法を使用して測定される。遺伝子発現の測定はマイクロアレイ装置で行なわれることが好ましい。遺伝子発現が測定された複数のNF-κB経路に関係する遺伝子で変調される場合に、遺伝子が治療介入のための標的として選択される。本法を使用して選択された遺伝子が実証されたと考えられる。
NF-κB経路に関係していると知られている幾つかの遺伝子が標的遺伝子の実証のための本法に使用し得る。NF-κB経路に関係していると知られている候補遺伝子として、IL-6、IL-1a、MIP 1g、ランテス、血清アミロイドA3が挙げられるが、これらに限定されない。その方法の所定の実験又は反復において、測定されるNF-κB経路に関係する複数の遺伝子が変調されるべきである。変調の変化について測定される遺伝子の半分より多くがwtに対して実験細胞中で発現を変調すべきであった。
本明細書に記載された方法を使用してNF-κB経路に関係すると同定される遺伝子がNF-κB経路に関係している標的遺伝子及び本法を使用する治療介入に可能な標的としての実証のために選択し得る。例えば、遺伝子ｘがNF-κB経路の成分に不足する細胞を使用してNF-κB経路に関係すると同定された場合、遺伝子ｘの機能性コピーを有する細胞が遺伝子ｘを標的遺伝子として実証する方法に使用されるであろう。治療介入のための遺伝子が実証に選択し得る際に、複数のNF-κBに関係する遺伝子が変調される場合、遺伝子ｘは治療介入のための標的遺伝子として選択されるであろう。
【００２１】
発明の好ましい態様
細胞培養及び刺激物質による処理
野生型MEF並びに突然変異体（実験）IKKα(-/-)、IKKβ(-/-)及びNEMO/IKKγ(-/-)MEF（UCサンジエゴのMichael Karin博士から得た）をDMEM、2mMグルタミン、10％ウシ胎児血清、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンからなる成長培地(GM)中でルーチンで培養した。内因性IKK複合体を２時間にわたってヒトTNFα(10ng/ml)（インビトロゲン）もしくはIL-1β(50ng/ml)（ファーミンゲン）シグナリングにより、又はそれ以外は示されたように刺激した。幾つかの実験では、de novo細胞タンパク質合成を10分間のプレインキュベーション、続いて100μMアニソマイシン（シグマ）との同時インキュベーションにより抑制して転写開始をブロックした。セリン32及び36がアラニンに突然変異された、トランス優性IκBα(SS32/36AA)スーパーリプレッサー（IκBαSR）を既に記載されたレトロウイルス感染（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590）により野生型MEFに導入した。IκBαSR-IRES-Puro発現カセットを有する組換えマウスレトロウイルスによる感染後に、プロマイシン耐性MEF集団を１μg/mlのプロマイシン中の6-8日の選択後に得た（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590）。
【００２２】
プローブ調製
全細胞RNAをRNeasyキット（キアゲン）で細胞溶解産物から抽出した。精製RNAをスーパースクリプトキット（ギブコBRL）及びT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ-dTプライマー（GENSET）で二本鎖cDNAに変換した。ビオチン標識cRNAをT7 RNAポリメラーゼ（エンゾキット、エンゾ・ダイアグノスチクス）によるin vitro転写によりcDNAサンプルから生成した。標識cRNAを94℃で35分間のインキュベーションにより35〜200塩基の平均サイズに断片化した。
チップハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション（16時間）、洗浄及び染色プロトコルは記載されていた{アフィメトリクスのアフィメトリクス遺伝子チップR発現分析技術マニュアル；(Mahadevappa, M.ら(1999) Nat Biotechnol 17, 1134-1136)}。本発明者らは約6,000のESTクラスタに加えてマウスUniGeneデータベースの約6,000の機能上特性決定された配列を含むアフィメトリクスMG-U74Av2チップを使用した。チップをストレプトアビジン-フィコエリスリン（モレキュラー・プローブズ）で染色し、ヒューレットパッカードのGeneArrayスキャナーで走査した。
【００２３】
データ分析
MAS 4.0ソフトウェア（アフィメトリクス）を使用して、DNAマイクロアレイチップデータ分析を行なった。発現された夫々の遺伝子の定量を完全にマッチした(PM)プローブ対及びミスマッチした(MM)対照プローブ対の16対のハイブリダイゼーション強さから計算し、夫々のアレイはcRNAハイブリダイゼーションのための多くの内部対照及びデータ標準化のための管理遺伝子（β-アクチン及びGAPDH）を含んでいた（Lockhart, D.J.ら(1996) Nat Biotechnol 14, 1675-1680）（アフィメトリクス）。夫々の遺伝子特異性プローブファミリーについての差（PMマイナスMM）の平均を計算した。そのソフトウェアが種々の異なるパラメーターを演算してRNA分子が存在するか、又は存在しないか（絶対コール）及び夫々の転写産物の発現レベルが基準線と実験サンプルの間で変化したか否か（差異コール）を決定する。比較チップファイル（例えば、TNFα刺激Wt MEF vs. Wt MEF/IκBαSR）について、実験ファイル{Wt(S)}（S=刺激）を基準線ファイル{IκBαSR(S)}と比較した。偽陽性を最小にするために、下記の基準を夫々の一次スクリーンについての有意な変化について選択した。(1)全てのプローブ組にわたる平均差の変化倍率は少なくとも２倍であり、(2)誘導遺伝子について、“増大”又は“限界増大”の差異コールが存在すべきであり、かつ“存在”の絶対コールが実験ファイルと関連すべきであり、(3)抑制遺伝子について、“減少”又は“限界減少”の差異コールが存在すべきであり、“存在”の絶対コールが基準線ファイルと関連すべきである。遺伝子の選択に使用した一次ソフトウェアはMA4.0及びスポットファイアー7.0であった。階層クラスタリングを既に記載された（Eisen, M.B.ら(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 14863-14868）クラスタプログラム（http://rana.lbl.gov/で入手し得る）で行ない、一次スクリーンWt MEF vs. Wt MEF/IκBαSRで少なくとも２倍の変化を示す全ての遺伝子が含まれた。選択された遺伝子の平均差値（mRNAの量を表す）がメジアン観察値を引くことによりメジアン集中され、遺伝子により1.0の行ベクトルの大きさ（値の自乗の合計）に基準化された。標準化データをＫ-meansクラスタリング(K=10)の１サイクルによりクラスタリングし、次いでプログラムクラスタに記載されたようにして、未集中相関関係類似性メトリックを使用してＹ軸（遺伝子）の平均連係クラスタリング分析により更にクラスタリングした。50以下の平均差値をメジアン集中及び標準化の前に50にセットした。クラスタリングされたデータをプログラムTreeView（http://rana.lbl.gov/で入手し得る）により視覚化した。
【００２４】
RT-PCR及びTaqMan実時間定量PCR
RT-PCRを既に記載されたように行なった（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590; McKenzie, F.R.ら(2000) Mol Cell Biol 20, 2635-2649）。それらの相対量を証明するために、cDNAの連続希釈液をβ-アクチン及び内部標準化のためのGAPDH特異性プライマーで増幅した。同様に、線形応答範囲を夫々の遺伝子について測定してそれらの発現レベルを半定量した。全ての場合に、PCR産物のサイズは夫々の遺伝子について予想されたものに相当した。PCRプライマー対は配列番号に示されるように22-24merであった。
TaqMan実時間定量PCRは蛍光原5'ヌクレアーゼアッセイに基づいていた（Livak, K.J.ら(1995) PCR Methods Appl 4, 357-362）。マイクロアレイハイブリダイゼーションのためのプローブを調製するのに使用された同じ全RNAサンプルをDnase I、続いてRNAクリーンアップのためのRNeasy Miniプロトコル（キアゲン）で処理した。TaqManプローブは5'-リポーター色素(FAM)及び3'-クエンチャー色素(TAMRA)を含むオリゴヌクレオチドからなる。標的転写産物の遺伝子コピー数を測定するために、クローン化プラスミド又はマウスゲノムDNAを連続希釈し、いずれかに記載されたように（Li, X.ら(2000) Brain Res Protoc 5, 211-217）標準曲線を生じるのに使用した。TaqManげっ歯類GAPDH対照試薬（アプライド・バイオシステムズ）を使用して、TaqMan PCR分析からのデータをGAPDHのmRNAコピー数に基づいて標準化した。
【００２５】
結果
分化pre-Ｂ細胞系中のNEMOによるIL-1又はLPSシグナリングは新規NF-κB依存性標的遺伝子の宿主を誘導するが、驚くことにまたそれらの抑制についてNF-κBに依存性である大きなグループの遺伝子をまた協調的に下方変調した（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590）。しかしながら、この後者の細胞状況において、本発明者らはこれらの新規NF-κB/NEMO依存性遺伝子（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590）の刺激又は抑制についてのIKKα又はIKKβシグナルソームサブユニットの個々の役割を測定することができなかった。それ故、本発明者らは本発明者らがNF-κB活性化炎症性刺激に対する全体の細胞応答についての夫々のIKKサブユニットの個々の寄与を測定することができる別の生物学的系を探求した。こうして、本発明者らはIKKα、IKKβ又はNEMO/IKKγの遺伝的にない突然変異体MEFで一連のDNAマイクロアレイ分析を開始し、野生型MEF及びトランス優性IκBαスーパーリプレッサー突然変異体を構成的に発現するMEFと比較してTNFα刺激に対するそれらのゲノム応答を調べた。
NF-κBに依存性であるシグナルソーム標的遺伝子のみが評価されることを確かめるために、本発明者らはトランス優性IκBαスーパーリプレッサー（IκBαSR）をレトロウイルス導入によりWt MEFに導入し、２時間のTNFα刺激を用い、又は用いないで二つの独立の一次DNAマイクロアレイスクリーンを行なった。これらの一次スクリーンは２倍以上刺激され、また適当な存在又は不在の絶対コール（方法を参照のこと）に加えて増大の平均差コールを示す約400のNF-κB依存性標的遺伝子を再現性良く同定した。刺激された遺伝子の150までが５倍以上影響された。続いて、Wt MEFをIKKα、IKKβ又はNEMO/IKKγのない突然変異体MEFと比較する平行二次マイクロアレイスクリーンを行なって夫々のシグナルソームサブユニットについてそれらの要求を測定した。IκBαSRスクリーンについて、後者のIKKサブユニットスクリーンの夫々を優れた再現性でもって二つの独立の回数で行なった。突然変異体MEF系中の夫々のIKKサブユニットの発現状態を標的エキソン内のプライマー対によるRT-PCRそしてまたウェスタンブロッティングにより確かめた。既に報告され（Li, Z.W.ら(1999) J Exp Med 189, 1839-1845; Hu, Y.ら(1999) Science 284, 316-320; Makris, C.ら(2000) Mol Cell 5, 969-979）、また予想されたように、IKKα(-/-)、IKKβ(-/-)及びNEMO(-/-)MEF系は標的IKKサブユニット遺伝子の発現がほんのわずかであった（データは示されていない）。
【００２６】
殆どのNF-κB依存性遺伝子がそれらの発現のためにIKKα及びIKKβの両方を必要とする
100の誘導遺伝子を二つの一次Wt MEF vs. Wt MEF/IκBαSRスクリーンから選択し、機能性カテゴリーに集合した（図１を参照のこと）。図１はそれらの活性についてNF-κBに依存性であるMEF中の選択された遺伝子のシグナルソームサブユニット要求を示す。それらの相対的遺伝子発現レベルを維持するためにNF-κBに依存性である、２以上の倍率変化値を有する100の代表的な遺伝子を、一次Wt (+TNFα) vs. IκBαSR(+TNFα)スクリーンから選択した。遺伝子をそれらの生理学的機能又は性質に基づいてカテゴリーにグルーピングした。遺伝子受理番号はそれらの名称及び記載に隣接して離れた左の欄にある。第一のデータ欄に、IκBα(SS32/36AA)スーパーリプレッサーを構成的に発現するWt MEFと比較されたWt MEFの二つの独立の一次マイクロアレイスクリーンで同定された遺伝子の倍率変化が示される。データ欄2-4に、IKKα、NEMO/IKKγ及びIKKβについてのこれらの遺伝子の依存性が６つの独立のマイクロアレイスクリーンで測定され、Wt MEFが個々のIKKサブユニットのない突然変異体MEFと比較された。２回反復スクリーニングからの倍率変化値が一緒にリストされた。一つ以上のシグナルソームサブユニットについての依存性が二つの基準：“存在”(P)及び“増大”(I)平均差コールの野生型MEF絶対コールに従うことにより厳密に評価された。夫々のスクリーンを２時間にわたって10ng/mlのヒトTNFαで刺激された細胞で行なった。TNFα刺激の不在下で独立のマイクロアレイスクリーンを行なうことにより、それらの発現について基礎NF-κBに依存性である遺伝子を同定した。重剰性ヒット（同じ遺伝子の異なるオリゴ領域に相当する）が遺伝子記載欄に記される。NCは“無変化”平均差コールを表し、そのIKKサブユニットについての有意な依存性のないことを示す。TNFαへの暴露の結果が以下のように示された欄中に示される：-（有意な効果なし）、+/-（約2-5倍の刺激）及び+（10倍より大きく刺激された）。二つの独立のスクリーンを全ての場合に行なって同様の結果を得た。
【００２７】
かなりの数の誘導された遺伝子は血清アミロイドA3、IL-6、IL-11、ISG15、IL-1RA、VEGF、Ptx3、β２ミクログロブリン、IL-1α、Mcp-3、RANTES、Mcp-1、Fasリガンド、Jun-B、c-Fos、M/CSF及びGM/CSFを含む既知のNF-κBの正に調節された遺伝子であった{Pahl, H.L.(1999) Oncogene 18, 6853-6866に概説されている}。これらの既知のNF-κB依存性遺伝子の殆どがそれらの活性のために全てのシグナルソームサブユニットを必要とした。夫々のIKKのない系中の合成NF-κBプロモーター誘導ルシフェラーゼリポーター遺伝子の活性がまた野生型MEFと比較してTNFα刺激に応答して低活性〜ごくわずかな活性を示した（データは示されていない）。
両方の独立のマイクロアレイスクリーンで２倍以上に誘導された全ての遺伝子の階層クラスタリング像が図２に示され、これは個々のシグナルソームサブユニットの存在下及び不在下のMEF中のNF-κB依存性/TNFα刺激標的遺伝子の遺伝子発現パターンの階層クラスタ像を示す。２時間にわたってTNFαで刺激されたWt MEF（レーン１＆２）vs. IκBα(SS32/36AA)スーパーリプレッサーを構成的に発現するWt MEF（レーン９＆10）の一次マイクロアレイスクリーンで２倍以上の誘導及び増大の平均差コール（実験プロトコルに記載されたような）を示す全ての遺伝子の発現プロフィールをTNFα刺激(S)IKKα(-/-)（レーン３＆４）、IKKβ(-/-)（レーン５＆６）及びNEMO/IKKγ(-/-)（レーン７＆８）並びに未刺激(US) Wt MEF（レーン11）と比較して階層クラスタリングにかけた。選択された遺伝子の位置が図１に示され、それらの倍率変化値が図１に示される。
【００２８】
図２の最初の二つのレーン中にWt(S)と標識された遺伝子がTNFαシグナリングに応答して誘導されたが、それらの発現は図の９レーン及び10レーンに記されるようにIκBαSRを構成的に発現するMEFの二つのスクリーンで抑制された。階層図の11レーン及び最後のレーンは読者が特定の遺伝子クラスタに関する効果を良く視覚化することを可能にするために実験操作中に記載されたようにプレセットされた未刺激(US)Wt MEF対照である。図２の最初のレーンと最後のレーンの比較は殆どの遺伝子が発現の相対レベルについてTNFαに種々の程度に依存性であったことを明らかにする。しかしながら、それらの活性についてNF-κBの基礎レベルに依存性であったが、有意なTNFα誘導刺激を示さなかった遺伝子のサブセットがまた存在した。驚くことに、後者のTNFα非依存性遺伝子の一部がそれにもかかわらずそれらの発現のために一つ以上のシグナルソームサブユニットに依存性であった（また、図１を参照のこと）。
大いに重要なことに、NF-κB誘導遺伝子の大半はIKKβを有意に必要としないでIKKαを必要とし、またその逆の遺伝子のクラスは例外としてそれらの発現についてIKKα、IKKβ及びNEMO/IKKγに同時依存性であった（図１及び図２を参照のこと）。同様の結果が野生型MEFの独立の源で得られた（データは示されていない）。発現レベルがIKKα、IKKβ又はNEMO/IKKγの損失により有意に変化されなかった遺伝子が図１に無変化(NC)コールとしてリストされる。IKKβ非依存性／IKKα依存性遺伝子の性質を有するNF-κB標的の小さいサブセットは図２で一緒にクラスタ形成した（FoxC2、オステオプロテグリン、PN-1及びシトクロムb-558/p22-Phoxを参照のこと）。また、可能なIKKα非依存性／IKKβ依存性遺伝子のかなり小さいグループが一緒にクラスタ形成した（図２中のRgs16並びにMcp-1/ScyA2及びMcp-3/ScyA7を参照のこと）。また、可能なNEMO非依存性遺伝子の小さいサブセットが存在し（図１中のCRBP1、Plf2、Mrp1/Plf3、RDC1を参照のこと）、これらの遺伝子の三つが同様に図２で一緒にクラスタ形成した（CRBP1、Plf2及びMrp1/Plf3を参照のこと）。また、NEMO非依存性遺伝子のこの後者のグループがTNFα非依存性NF-κB標的のグループの一部であった。
【００２９】
図３に示されるように、三つの付加的なマイクロアレイスクリーンは図１中の100の選択された遺伝子のうちの44がまたIL-1に対するそれらの応答について夫々のIKKサブユニットに依存性であることを明らかにした。図３はIL-1依存性シグナリングについて図１中の選択された遺伝子のシグナルソームサブユニット要求を示す。図１中の100の選択された遺伝子のうちの44が全てのシグナルソームサブユニットへの同様の依存性でもってIL-1シグナリングに応答性であることがわかった。IL-1刺激IKKサブユニットノックアウトMEF突然変異体細胞と比較されたIL-1刺激Wt MEF細胞のDNAマイクロアレイスクリーニングからの倍率変化値がリストされる。初期のTNFαチップスクリーニング（図１）からの倍率変化値が比較のために含まれる。TNFαに依存性ではなかった図１中の18の遺伝子のうちの16がまたIL-1により刺激されなかった。しかしながら、TNFαにより影響されなかった二つのIKK依存性遺伝子である、Mcp-1及びHexIIは、IL-1により刺激された。TNFα結果（図１を参照のこと）と一致して、IL-1によるMcp-1＆３の誘導はIKKαよりもIKKβ及びNEMO/IKKγに依存性であった（図２を参照のこと）。加えて、デコリンはTNFα及びIL-1の両方に対する応答でNEMOにそれ程依存性ではなかった。
【００３０】
TNFαによるNF-κB標的遺伝子の刺激に関するIKKαの重要性を更に評価するために、本発明者らはまた４時間、８時間及び12時間にわたってTNFα刺激を行なった。図４に示されるように、図１（これはTNFα誘導性の証拠を示した）中の82のうちの39が、それらのTNFα誘導についてIKKαに依存性に留まった。図４はTNFαへの延長された暴露後にIKKαへのそれらの依存性を保持するNF-κB標的遺伝子を示す。TNFα刺激の異なる時点におけるIKKα(-/-)MEFと比較されたWt MEF細胞の倍率変化値がリストされる。図１中の82のNF-κB/IKK/TNFα依存性の選択された遺伝子のうちの39が４時間、８時間及び12時間のTNFαへの暴露後にIKKαに依存性に留まった。本明細書に説明されるように、これらの39の遺伝子がサイトカインへの延長された暴露後にそれらのTNFα依存性を保持した図１中のTNFα依存性遺伝子の全てに相当した。また、Wt(S) vs. Wt(US)比較は図４中の39の遺伝子が２時間以上にわたってTNFαに対し有意に応答性に留まった図１中の遺伝子の全てに相当することを示したことを注目することが重要である。こうして実際に、図１中の遺伝子のいずれもがTNFαへの延長された暴露中にそれらのIKKα依存性を選択的に失わない。NF-κB経路がIκBの発現を誘導することによりそれ自体の活性を弱化することが知られていると仮定すると、幾つかのIKK/NF-κB標的遺伝子の誘導された発現レベルを永久に維持するTNFαの能力の低下は驚くことではない（Baldwin, A., Jr. (1996) Annu Rev Immunol 14, 649-683; Ghosh, S.ら(1998) Annu Rev Immunol 16, 225-260）。
【００３１】
本発明者らは半定量RT-PCR又は定量TaqMan実時間PCRによる再試験のためにそれらの誘導発現についてNF-κB及びシグナルソームに同時依存性であった遺伝子の幾つかの例を選択する。２時間のTNFα又はIL-1刺激を用いて、又は用いずに、TaqMan PCRをISG15及びRANTESについて行なった。図５は遺伝子チップスクリーニングからの選択された誘導ヒットのTaqMan実時間PCR実証を示す。２時間のTNFα及び／又はIL-1による刺激を用い、また用いないで、全細胞RNAを野生型及び突然変異体MEFから単離した。TaqMan定量（40ngの全RNA中に検出されたmRNAコピー数を示す）を使用して、RT及びPCRを行なった。遺伝子転写産物のコピー数をDNA標準に従って測定し、GAPDHで標準化した。マウスISG15（X56602）に関するTaqManプライマー及びプローブはフォワードプライマーについて配列番号１であり、リバースプライマーについて配列番号２であり、FAMプローブについて配列番号３である。Rantesに関するTaqManプライマー及びプローブはアプライド・バイオシステムズ（パート番号：4312879P）により提供された。夫々個々のサンプルのTaqMan PCR反応を３回反復で行ない、次いでコピー数及び標準エラーを測定した。
RANTES及びISG15を野生型MEF中でTNFα又はIL-1により強く刺激した。しかしながら、それらの発現はIKKα、IKKβ又はNEMO/IKKγのない細胞中で強く抑制されないとしてもわずかなレベルに低下された。TaqMan結果と一致して、IL-6、C3、SOCS-3、IL-1RA及びISG15に特異性のプライマー対で行なわれたRT-PCRはそれらがそれらの発現についてIKKα及びIKKβに依存性であることを示す。図６は半定量RT-PCRが２時間以内のTNFα刺激で選択されたMEF遺伝子のIKKα及びIKKβ要求を明らかにすることを示す。全てのRT-PCRを夫々の転写産物について線形応答範囲で行ない（GAPDH基準対照と比較して）、産物を６％PAGEで分解し、臭化エチジウム染色により明らかにした。
転写開始をブロックするためにアニソマイシンとともにTNFα刺激を行なうことはTNFα依存性IKK及びNF-κB依存性遺伝子の50％までがおそらくNF-κB/IKKシグナリング経路の直接の標的であることを明らかにした（データは示されていない）。MEF中のNF-κB標的遺伝子のかなりの部分が驚くことに細胞外のNF-κB活性化刺激の不在下でIKKサブユニットに依存性であった。遺伝子の後者のクラスの例として、PLF2＆3、L-Myc、カスパーゼ11、FOXF2、RDC-1、リポカリン、IL-1RA、Mcp-1、CRBP1、エンタクチン及びP450が挙げられた（図１及び図４を参照のこと）。遺伝子の大きいサブセットがそれらの発現の相対レベルについてTNFαシグナリングに部分依存性を示したが、それにもかかわらず刺激の不在下でIKKに極めて依存性に留まった。これらの後者の結果はIKKがNF-κB標的遺伝子の特異性サブセットの差別的発現を確実にするために基礎NF-κB活性を維持するのに必要とされることを示す。この状況で、構成的に活性化されたIKKがヒトリンパ系悪性の特別な型で観察されたことに注目することが重要である（Kordes, U.ら(2000) Leukemia 14, 399-402; Davisら(2001) J Exp Med 194, 1861-1874; Hinz, M.ら(2001) Blood 97, 2798-2807）。こうして、これらのIKK依存性／シグナル非依存性遺伝子がまた一次MEF中に存在するかどうか、又はこれが不死化された樹立細胞の生理学的性質であるか否かをその後の研究で測定することが重要であろう。
【００３２】
検討
IKKαはNF-κB依存性炎症反応遺伝子の全体的誘導に一般的な役割を果たす。
本発明はTNFα及びIL-1刺激に応答してマウス胎児繊維芽細胞中で特別なNF-κB染色体標的遺伝子の宿主に対するそれらの個々の効果を調べることによりNF-κB調節遺伝子発現におけるシグナルソームの夫々の成分の寄与に特別に取り組むための方法を提供する。IKKαはこれらの細胞中のNF-κB依存性、誘導遺伝子の発現についてIKKβ及びNEMO/IKKγと同等に重要であることがわかった。実際に、多くの既知のNF-κB標的遺伝子、例えば、IL-6、RANTES、Fas抗原、C3、Mcp-3、Ptx3、MIP-1γ、c-Fos、血清アミロイドA3、ISG15、VEGF、IL-11、IL-1α、GM/CSF2、M/CSF1、プロエンケファリン、GRO1、β２ミクログロブリン及び幾つかのその他のMHC分子がIKKαの不在下でTNFα又はIL-1により刺激されなかった。これは二つの主要な炎症反応サイトカインに応答してNF-κB依存性遺伝子発現の全体的制御におけるIKKαについての予期しない役割を実証する。実際に、NF-κB依存性遺伝子の最大のサブセットは少ない例外でもってIKKα及びIKKβへの強い同時依存性を示す炎症、ストレス又は免疫のような応答に関係するものであった（図１及び図２を参照のこと）。少ない数のNF-κB依存性染色体標的がまたIKKα又はIKKβへの優先的依存性を明らかにし、NF-κB活性化におけるそれらの役割が同じ細胞バックグラウンドで同じ細胞外のシグナルに応答して標的遺伝子依存性であることが明らかであることを示した。加えて、NF-κB/IKK依存性、シグナル非依存性遺伝子の予期しない存在はシグナルソームがまた活性化NF-κBの基礎レベルにより調節された遺伝子の活性を維持するのに役割を果たし得ることを示唆する。
【００３３】
IKKβがIκBからのNF-κBの放出及びNF-κB DNA結合活性のその後の獲得に必須であることが良く証明されている（Karin, M. (1999) Oncogene 18, 6867-6874; Li, Q.ら(1999) Science 284, 321-325; Li, Z.ら(1999) J Exp Med 189, 1839-1845; Tanakaら(1999) Immunity 10, 421-429; Delhase, M.ら(1999) Science 284, 309-313; Karin, M.及びBen-Neriah, Y. (2000) Annu Rev Immunol 18, 621-663並びにBaud, V.ら(1999) Genes Dev 13, 1297-1308）としても、幾つかの研究はIκBからのその放出とは独立であるNF-κB活性化のサイトカイン及びIKK媒介制御における制御の付加的なレベルの可能性を示していた。ホスファチジルコリン特異性ホスホリパーゼＣ及びタンパク質キナーゼＣのインヒビターはIκBα分解又はNF-κB DNA結合活性に影響しないでTNFα及びIL-1シグナリングによりNF-κBの活性化をブロックすると初期に報告された（Bergmannら(1998) J Biol Chem 273, 6607-6610）。続いて、同様の結果がIL-1シグナリングによるホスファチジルイノシトール-3-OHキナーゼ(PI3K)及びPI3K活性化キナーゼB/Akt依存性NF-κB活性化のメカニズムについて報告され、これはRelA/p65活性化ドメインのリン酸化を伴うことが示された（Sizemore, N.ら(1999) Mol Cell Biol 19, 4798-4805）。NF-κB転写応答能がIκBとは独立に調節されることを示唆する幾つかのその他の研究はタンパク質キナーゼＡの触媒サブユニット(PKAc)がRelA/p65をリン酸化し、それにより転写コアクチベーターCREB結合タンパク質(CBP)及びそのp300同族体へのその結合を促進することを明らかにした（Gerristenら(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 2927-2932; Perkins, N.D.ら(1997) Science 275, 523-527; Zhongら(1997) Cell 89, 413-424; Zhong, H., Voll, R.E.及びGhosh, S. (1998) Mol. Cell 1, 661-671）。
【００３４】
TNFα誘導p65/RelAトランスアクチベーションはp38ストレス及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の特異性インヒビターによりブロックされ（Vanden Berghe, W.ら(1998) J Biol Chem 273, 3285-3290）、TNFα媒介p65リン酸化はp65転写活性化ドメイン(TAD)内のセリン529に局在化された（Wang, D.ら(1998) J Biol Chem 273, 29411-29416）。続いて、c-Relのカルボキシ近位TAD内の多くのセリンがTNFα誘導c-Rel活性化に必要であることが示され、またPI3K及びζPKCが二つの推定の下流エフェクターと同定され、これらの活性がc-Relトランスアクチベーション活性に両方とも必要であった（Martin, A.G.ら(2001) J Biol Chem 275, 24383-24391; Martin, A.G.ら(2001) J Biol Chem 276, 15840-15849）。同じスキームに沿って続いて、PI3K-及びAkt-依存性シグナリング経路がp65TADをIKKβにより刺激すると報告され、またAktの抗アポトーシス活性と機能上かつメカニズム上相関関係があった（Madrid, L.V.ら(2000) Mol Cell Biol 20, 1626-1638）。続いて、RelA/p65セリン536がin vitro及びin vivoでIKKβによりリン酸化されることが示された（Mercurio, F.ら(1997) Science 278, 860-866; Sakurai, H.ら(1999) J Biol Chem 274, 30353-30356）。p65TADのAkt媒介活性化の分子要件が更に細分化されて、(a)p65TADセリン529及び536がAktシグナリングにより両方とも要求され、これがIKKβにより少なくとも一部作用し、かつ(b)Akt及びIL-1シグナリングがまた未同定IKKα依存性経路でp38を活性化し、これがCBP/p300コアクチベーターとのp65のからみ合いを促進することが一部明らかであることを明らかにした（Madrid, L.V.ら(2001) J Biol Chem 276, 18934-18940）。
【００３５】
in vivoのAkt活性化はPI3K活性の天然産物である、PIP3（ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリホスフェート）を必要とし、PIP3はPTEN、脂質ホスファターゼ及び腫瘍サプレッサーによりダウンレギュレートされる（Cantley, L.C.ら(1991) Proc Natl Acad Sci USA 96, 4240-4245）。PTENはTNFα誘導NF-κBトランスアクチベーション及びDNA結合活性を抑制すると初期に報告された（Koul, D.ら(2001) J Biol Chem 276, 11402-11408; Gustin, J.A.ら(2001) J Biol Chem 276, 27740-27744）。しかしながら、更に最近の研究はPTENがp65トランスアクチベーションのみを抑制するが、NF-κB DNA結合を抑制しないことを示し、その結合はPI3K、Akt又はAkt及びIKKの活性化形態の過剰発現により救済され、NF-κBトランスアクチベーションポテンシャルを特異に制御することにおけるPI3K-Akt経路の論争の役割についての付加的な支持を与えた（Mayo, M.W.ら(2002) J Biol Chem 277, 11116-11125）。重要なことに、一層最近の努力は有効なIL-1及びAkt媒介NF-κBトランスアクチベーションがIKKα及びIKKβの両方を必要とすることが明らかであり、これらはまたp65TADリン酸化について互いに同時依存性であることを示していた（Sizemore, N.ら(2002) J Biol Chem 277, 3863-3869）。一緒にされると、上記知見は重要なギャップがDNA結合NF-κBの転写応答能を証明するためにIKK複合体の作用の生理学的重要性及び論争のメカニズムに関する本発明者らの知識に残存することを明らかにする。更に、本発明者らの知見はIKKαがNF-κBの全体的な応答能に予期しない一般的な役割を果たすことを示し、IKKαがおそらくこれらの現象の幾つかの直接又は間接の一因であることを示す。
【００３６】
遺伝子発現、分化及び細胞の運命のレギュレーターをコードする新規NF-κB依存性遺伝子
細胞増殖及び死亡率の陽性エフェクター及び陰性エフェクターがIKK/NF-κBシグナリングに依存性の遺伝子中にあった。
細胞成長に直接影響するタンパク質をコードする遺伝子はそれらの発現のためにIKK及びNF-κBを必要とした。エピレグリン（ケロチノサイトのためのEGFのようなオートクリン成長因子）（Shirakata, Y.ら(2000) J Biol Chem 275, 5748-5753）、グラヌリン／エピセリン前駆体／GEP（インスリンのような成長因子受容体とは独立に機能する強力なMEF特異性成長因子）（Zanocco-Marani, T.ら(1999) Cancer Res 59, 5331-5340）、ストロマ細胞由来成長因子（ストロマ細胞により生じられる強力なリンパ球走化性ケモカイン活性）（Bleul, C.C.ら(1996) J Exp Med 184, 1101-1109）及び白血病抑制因子受容体（Tanaka, M.ら(1999) Blood 93, 804-815）がTNFa応答性IKK依存性遺伝子の中にあった。しかしながら、プロリフェリン2/PLF2及びプロリフェリン3/PLF3/Mrp1（Groskopf, J.C.ら(1997) Endocrinology 138, 2835-2840; Toft, D.J.ら(2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 13055-13059）（これらはまた内皮細胞走化性を刺激する脈管形成特性を有するプロラクチン関連ホルモンである）は、MEF中でTNFα刺激の不在下でIKKα及びIKKβに依存性である遺伝子のサブセットに属した。p75ノイロトロピン受容体、神経成長因子β及びグリア細胞由来神経親和性因子(GDNF)を含む幾つかの神経親和活性がまたそれらの発現のレベルについてIKK及びTNFαシグナリングに依存性であり、p75がまたIL-1シグナリングに応答性であった。
【００３７】
細胞成長、細胞サイクル進行、細胞活力又は炎症反応の幾つかの陰性エフェクターがまた驚くことにそれらのTNF刺激についてIKKα及びIKKβに依存性であり、これらはクラステリン/ApoJ、BMP-2及びシュラフェン２並びにp75ノイロトロピン受容体を含み、一方、カスパーゼ11は細胞外のNF-κB刺激の不在下でIKKα及びNEMOに依存性であることが明らかであった。BMP-2はBax/Bcl-2比を増大し、ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出を増大することによりSMAD非依存性、タンパク質キナーゼＣ依存性経路中でアポトーシスを促進すると報告されていた。トランスジェニックマウス中のシュラフェン２の強制発現は二重陽性胸腺細胞成熟をブロックし、in vitroの繊維芽細胞成長を遅延すると報告されていた（Schwarz, D.A.ら(1998) Immunity 9, 657-668）。神経成長因子はp75ノイロトロピン受容体により神経芽細胞腫細胞に対するプロ-アポトーシス作用を誘発すると報告されていたが、それはまた相同TrkAノイロトロピン受容体によるシグナリング後に生存応答を促進し得る（Bono, F. (1999) FEBS Lett 457, 93-97）。p75NTRはまたベータアミロイドペプチドに結合することによりアポトーシスを促進することが示されており、その効果はIL-1シグナリングにより高められる（Perini, G.ら(2002) J Exp Med 195, 907-918）。TNFαによるIKK媒介NF-κB活性化は神経細胞生存を促進することが示されていたので（Mattson, M.P. (2000) J Neurochem 74, 443-456）、NF-κBによるp75のその後の活性化はまた諸刃の剣であり得、或る生理学的状況下でアポトーシス応答に寄与する。カスパーゼ11/Ich-3は死亡促進タンパク質のice/cedファミリーの員である（Wang, S.ら(1996) J Biol Chem 271, 20580-20587）。それは敗血症性ショックの媒介物質により著しく誘導され、アポトーシスを促進し、これはBcl-2生存因子により終わらせられる（Wang, S.ら Biol Chem 271, 20580-20587）。それ故、或る生理学的状況下で、IKK媒介NF-κB活性化は細胞成長、細胞サイクル進行及び細胞活力に対する予期しない抑制効果を有し得る。
【００３８】
分子シャペロン様糖タンパク質であるクラステリン/ApoJは、種々の症状で組織改造作用及び再生の部位で蓄積することが良く報告されていた（Silkensen, J.R.ら(1994) Biochem Cell Biol 72, 483-488; Rosenberg, M.E.及びSilkensen, J. (1995) Int J Biochem Cell Biol 27, 633-645）。ApoJはまた増殖細胞中で抑制され、その過剰発現がin vitroの形質転換細胞の細胞サイクル進行を妨げることが最近示されていた（Silkensen, J.R.ら(1994) Biochem Cell Biol 72, 483-488; Rosenberg, M.E.ら(1995) Int J Biochem Cell Biol 27, 633-645）。クラステリン/ApoJはまた免疫複合体付着のために高められた腎臓老化を示すApoJ欠乏マウスで免疫複合体代謝及びクレアランスを調節することによりin vivoで抗炎症能で作用することが最近報告された（Rosenberg, M.E.ら(2002) Mol. Cell Biol. 22, 1893-1902）。それ故、NF-κBによるクラステリン/ApoJの誘導はin vivoの免疫複合体媒介炎症反応に対し想像上保護し得る。
【００３９】
シグナル伝達の重要なレギュレーター及びそれらの発現のためにNF-κB/IKKシグナリングを必要とする代謝経路
NF-κB非依存性シグナル伝達及び代謝経路の成分はまたIKK媒介NF-κB活性化の下流の新規標的遺伝子の中にあった。STAT3シグナリングの陰性レギュレーターであるSOCS-3（Starr, R.ら(1997) Nature 387, 917-921）はTNFα依存性NF-κB/IKK標的であり、調節クロストークの新規な型を明らかにし、NF-κBがSTATシグナリング経路を同時に抑制するポテンシャルを有する。SOCS-3はまたマクロファージ中のIL-10誘導抗炎症応答の細胞内エフェクターであることが最近示され、そこでそれはIL-6、TNFα及びGM-CSFを含む幾つかのNF-κB標的遺伝子のLPS誘導発現をブロックすることができた（Berlato, C.ら(2002) J Immunol 168, 6401-6411）。従って、NF-κB/IKKによるSOCS-3の活性化はNF-κB誘導炎症反応を弱化する新規メカニズムに想像上相当する。SOCS-3に加えて、その他のNF-κB非依存性シグナリング経路の細胞内エフェクターはまたNF-κB/IKK依存性であることがわかった。IFN-γに対する細胞応答で活性化された遺伝子の中にあることが知られていた65-kDa GTPaseである、GBP1/Mag-1及びmGBP2（Wynn, T.A.ら(1991) J Immunol 147, 4384-4392; Boehm, U.ら(1998) J Immunol 161, 6715-6723）は、両方ともNF-κBに強く依存性であることがわかり、TNFα及びmGBP1/Mag-1によるその誘導のための夫々のIKKはまたIL-1によるその刺激についてIKKαに依存性であった。重要なことに、インターフェロン（アルファ及びベータ）受容体２（ヒトインターフェロンアルファ受容体のマウス同族体）はまたそのTNFα刺激についてIKKα及びIKKβに依存性であることがわかった（Uze, G.ら(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89, 4774-4778）。本発明者らが分化pre-B細胞系中でNEMO及びNF-κBに依存性であることを既に示していた（Li, J.ら(2001) J Biol Chem 276, 18579-18590）、細菌感染に応答して誘導されたG-プロテイン結合受容体(GPCR)シグナリングの陰性レギュレーターであるRgs16（Beadling, C.ら(1999) J Immunol 162, 2677-2682; Panetta, R.ら(1999) Biochem Biophys Res Commun 259, 550-556）は、NEMOに依存性であったが、MEF中でIKKα又はIKKβに有意に依存性ではなかった。
【００４０】
オーファンG-プロテイン結合受容体及び新規HIV/SIVコレセプターであるRDC1（Shimizu, N.ら(2000) J Virol 74, 619-626）は、そのTNFα非依存性発現についてNF-κB及びIKKαに依存性であったが、NEMO又はIKKβに非依存性であることは明らかではなかった。ダウン症候群の重要な領域に位置され、カルシニューリンシグナリングのブロッカーとして作用し得るMCIP1（ミオサイト濃縮カルシニューリン相互作用タンパク質）（Rothermel, B.ら(2000) J Biol Chem 275, 8719-8725）はそのTNF誘導発現についてIKKα及びIKKβに依存性であった。スーパーオキサイド生成を担い、遺伝性慢性肉芽腫性疾患(CGD)に不在の食細胞NADPH-オキシダーゼの必須成分であるシトクロムb-558/p22-Phoxの22-kDaサブユニット（Parkos, C.A.ら(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 3319-3323; Dinauer, M.C.ら(1990) J Clin Invest 86, 1729-1723）は、TNFαによるその刺激についてIKKβではなくIKKαに依存性であったが、それはIL-1シグナリングによるその活性化について両方の触媒IKKに依存性であった。急性期炎症反応でアップレギュレートされる銅及び鉄結合オキシドレダクターゼであるセルロプラスミン／フェロキシダーゼ（Aldred, A.R.ら(1987) J Biol Chem 262, 2875-2878; Klomp, L.W.ら(1996) J Clin Invest 98, 207-215）は、TNFα及びIL-1によるその発現及び刺激についてIKKに高度に依存性であった。ヘパリンスルフェート分解に必要とされ、稀なオートソーム劣性障害サンフィリポ症候群の原因であることが知られているNAGLU（α-Nアセチルグルコサミニダーゼ）（Aldred, A.R.ら(1987) J Biol Chem 262, 2875-2878; Klomp, L.W., Farhangraziら(1996) J Clin Invest 98, 207-215）は、TNFαに対するその応答についてIKKα及びIKKβを必要とした。加えて、GM2アクチベーター（これはGM2ガングリオシドのリソソーム分解に必須の役割を果たし、神経変性テイ-サックス病及びサンドホフ病の原因の不全である）（Liu, Y., Hoffmann, A.ら(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 8138-8143）は、TNFα及びIL-1に対するその応答について夫々のIKKを必要とした。25-ヒドロキシコレステロールを合成するコレステロール25-ヒドロキシラーゼ（コレステロール生合成を減少し、ステロール調節要素結合タンパク質プロセシングをブロックするコリプレッサー）（Lund, E.G.らJ Biol Chem 273, 34316-34327）は、IKK/NF-κB/TNFα依存性遺伝子の中にあった。プロテオグリカンのロイシンに富むリピートファミリーの二つの員であるデコリン及びオステオグリシンの協調TNFα誘導（Matsushima, N.ら(2000) Proteins 38, 210-225）はまた夫々のIKKサブユニットに依存性であり、またデコリンはIL-1シグナリングに応答性であった。最後に、３種のカテプシンシステインプロテイナーゼ（カテプシンＢ、Ｆ及びＺ）（Qian, F.ら(1991) DNA Cell Biol 10, 159-168; Santamaria, I.ら(1998) J Biol Chem 273, 16816-16823; Santamaria, I. (1999) J Biol Chem 274, 13800-13809）はまたTNFα及びIL-1によるそれらの刺激についてIKKα及びIKKβに協調的に依存性であった。
【００４１】
要約
NF-κB活性化シグナルソーム複合体のIKKβサブユニット及びNEMO/IKKγサブユニットは炎症及びその他のストレスのような刺激によりNF-κBを活性化するのに必須であることが知られている。しかしながら、IKKαサブユニットは後者の応答に必要でないと考えられ、その代わりにその他の新規なNF-κB依存性及び非依存性の機能のin vivo媒介物質として機能する。IKKαの生理学的機能のこの一般に受け入れられる考えとは対照的に、本発明者らはIKKβ及びNEMO/IKKγと同様に、IKKαがまた多くの既知のNF-κB標的、例えば、血清アミロイドA3、C3、IL-6、IL-11、IL-1RA、VEGF、Ptx3、β２ミクログロブリン、IL-1α、Mcp-1＆3、RANTES、Fas抗原、Jun-B、c-Fos、M/CSF及びGM/CSFを含むTNFα及びIL-1応答性IKKシグナルソーム依存性標的遺伝子の全体的レギュレーターであることをマウス胚繊維芽細胞(MEF)中で実証する。ほんの少数のNF-κB依存性標的遺伝子がIKKα又はIKKβに優先的に依存性であった。野生型MEF中のトランス優性IκBαスーパーリプレッサー（IκBαSR）の構成的発現はこれらのシグナルソーム依存性標的遺伝子がまたNF-κBに依存性であることを確かめた。NF-κB標的遺伝子のサブセットは外因性刺激の不在下でIKK依存性であり、シグナルソームがまた樹立MEF中で活性化NF-κBの基礎レベルを調節するのに必要とされたことを示唆した。総合して、分泌されたFrizzled、カドヘリン13、プロトカドヘリン７、C/EBPβ＆δ、オステオプロテグリン、FOXC2＆F2、BMP-2、p75ノイロトロピン受容体、グアニレート結合タンパク質１及び２、ApoJ/クルステリン、インターフェロン（α＆β）受容体２、デコリン、オステオグリシン、エピレグリン、プロリフェリン２＆３、ストロマ細胞由来因子並びにカテプシンＢ、Ｆ及びＺを含むかなりの数の新規NF-κB/IKK依存性遺伝子が同定された。STAT3シグナリングの陰性エフェクターであるSOCS-3はNF-κB/IKK誘導遺伝子であることがわかり、IKK媒介NF-κB活性化がSTATシグナリングに対する負の効果を協調的に誘発し得ることを示唆した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】それらの活性についてNF-κBに依存性であるMEF中の選択された遺伝子のシグナルソーム要求を示す。
【図１−２】個々のシグナルソームサブユニットの存在下及び不在下のMEF中のNF-κB依存性／TNFα刺激標的遺伝子の遺伝子発現パターンの階層クラスタ像を示す。
【図２】IL-1依存性シグナリングに関する選択された遺伝子のシグナルソームサブユニット要求を示す。
【図３】TNFαへの延長された暴露後にIKKαへのそれらの依存性を保持するNF-κB標的遺伝子を示す。
【図４】遺伝子チップスクリーニングからの選択された誘導ヒットのTaqMan実時間PCR実証を示す。
【図５】半定量RT-PCRがTNFα刺激の２時間以内の選択されたMEF遺伝子のIKKα及びIKKβ要求を明らかにすることを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月7日(2005.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a.不足レベルのNF-κB経路の成分を有する細胞から得られた実験サンプル中の遺伝子の発現のレベルを測定する工程であって、前記細胞は刺激物質に暴露されている工程、
b.野生型レベルのNF-κB経路の成分を有する野生型細胞から得られた対照サンプル中の前記遺伝子の発現のレベルを測定する工程であって、前記野生型細胞は前記刺激物質に暴露されている工程、
c.前記野生型サンプルに対して前記実験サンプル中で上方又は下方に変調される発現のレベルを有する遺伝子を選択する工程
を含むことを特徴とするNF-κB経路に関係する遺伝子の同定方法。
【請求項２】
刺激物質がTNFα又はIL-1である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞がMEF細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
NF-κB経路の成分がIKKα、IKKβ及びNEMO/IKKγから選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
成分がIKKαである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記実験サンプルの細胞がシグナルソームの成分について-/-遺伝子型を有するノックアウト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が遺伝子発現及び遺伝子発現のレベルを測定するのに使用される系に固有のバックグラウンドのレベルに対して上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ装置による遺伝子発現の分析により測定される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照で約２倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照で約５倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子が野生型の発現のレベルに対して対照サンプルで約10倍よりも大きく上方又は下方に変調される場合に、遺伝子が選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
a.  NF-κB経路に関係する遺伝子を不足する実験細胞及び前記遺伝子の野生型である対照細胞を刺激物質に暴露し、
b.  NF-κB関係遺伝子の発現のレベルを測定し、
c.  複数の関係遺伝子が変調される場合に、遺伝子を治療介入のための標的として選択することを特徴とする標的遺伝子の実証方法。
【請求項１３】
細胞がIKKα、IKKβ及びNEMO/IKKγを不足している、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がIKKα、IKKβ又はNEMOの遺伝子ノックアウトを有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細胞がIKKαを不足している、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法を使用してIKKαの制御下にあると同定された遺伝子の発現を変調することによる非ヒト患者の炎症性疾患の治療方法。
【請求項１７】
炎症性疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのデコリン、プロテアーゼ-ネキシン、ISG15、ERG2、Ｇプロテイン結合受容体RDC1、グルココルチコイド調節キナーゼ(SGK)、ホスホリパーゼD3、ヘキソキナーゼ２、及びMkp-3/二重特異性タンパク質ホスファターゼ６、ABCトランスポーター、Fox/フォークヘッド、Wntシグナリング受容体のFrizzledファミリーの員、炎症反応のC-EBPβ及びC/EBPγ相同転写レギュレーター又はSOCS-3の遺伝子発現のモジュレーターの使用。
【請求項１８】
炎症性疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのIKKαの制御下にあると同定された遺伝子産物の活性のモジュレーターの使用。
【請求項１９】
前記遺伝子産物がデコリン、プロテアーゼ-ネキシン、ISG15、ERG2、Ｇプロテイン結合受容体RDC1、グルココルチコイド調節キナーゼ(SGK)、ホスホリパーゼD3、ヘキソキナーゼ２、及びMkp-3/二重特異性タンパク質ホスファターゼ６、ABCトランスポーター、Fox/フォークヘッド、Wntシグナリング受容体のFrizzledファミリーの員、炎症反応のC-EBPβ及びC/EBPγ相同転写レギュレーター並びにSOCS-3から選ばれる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
炎症関連疾患の治療のための医薬組成物の製造のためのIKKαの活性のモジュレーターの使用。
【国際調査報告】
2005527215.tif 000009
2005527215.tif 000010