(57)【要約】本発明は、比較的高い圧力と低い圧力との間を反復して繰り返すことによって、生物材料および非生物材料の滅菌、汚染除去、または消毒を行いうるという発見に基づく。圧力サイクルは低温、周囲温度、または高温でも行いうる（例えば、約-40℃〜約95℃、または中間の範囲）。この発見に基づく新たな方法は、例えば、ワクチンの調製、血漿または血清、植物組織、動物組織およびヒト組織、痰、尿、便、水、および腹水の滅菌、軍用機器、食物および飲料製品の汚染除去、ならびに医療機器の消毒に応用できる。これらの新たな方法を、製造工程または研究手順に組み入れることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの所望の高分子を含む材料を滅菌するための方法であって、
初期圧で該材料を提供する段階；および
圧力を、材料を滅菌するには十分であるが該所望の高分子の生物活性を不可逆的に失活させるには不十分な上昇圧に上昇させ、それによって滅菌された材料を得る段階
を含む方法。
【請求項２】
材料が約1atmの初期圧で提供される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
材料が約-40℃から約95℃の範囲にある初期温度で提供される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
材料が約-40℃またはそれ未満の初期温度で提供される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
材料が約95℃またはそれより高い初期温度で提供される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
上昇圧が約5,000psiから約120,000psiの範囲にある、請求項1記載の方法。
【請求項７】
所望の生体分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、薬剤、ステロイド、および栄養素からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
圧力を低下圧へと低下させる段階、および低下圧と上昇圧との間で圧力サイクルを少なくとも2回繰り返す段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
圧力を低下圧へと低下させる段階、および低下圧と上昇圧との間で圧力サイクルを少なくとも10回繰り返す段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
低下圧が上昇圧の半分またはそれ未満である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
圧力上昇段階の前に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
圧力上昇段階の後に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
滅菌される材料が、生物試料；血漿、血清、または他の植物組織、動物組織、もしくはヒト組織；便；尿；痰；医用または軍用の機器；食料品；医薬製剤；腹水；およびワクチンからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
滅菌される材料が、細菌、プリオン、ウイルス、真菌、原生生物、核酸、およびタンパク質のうちの少なくとも1つによって当初汚染されている、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
細菌、プリオン、ウイルス、感染性核酸、および感染性タンパク質からなる群より選択される、少なくとも1つの感染性因子によって当初汚染されている材料を滅菌するための方法であって、
初期温度および初期圧で該材料を提供する段階；ならびに
圧力を、材料を滅菌するのに十分な上昇圧へと上昇させ、それによって滅菌された材料を得る段階
を含み、該初期温度が60℃未満である方法。
【請求項１６】
材料が約1atmの初期圧で提供される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
上昇圧が約5,000psiから約120,000psiの範囲にある、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
圧力を低下圧へと低下させる段階、および低下圧と上昇圧との間で圧力サイクルを少なくとも2回繰り返す段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
圧力を低下圧へと低下させる段階、および低下圧と上昇圧との間で圧力サイクルを少なくとも10回繰り返す段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
低下圧が上昇圧の半分またはそれ未満である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
圧力上昇段階の前に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
圧力上昇段階の後に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
滅菌される材料が、生物試料；血漿、血清、または他の植物組織、動物組織、もしくはヒト組織；便；尿；痰；医用または軍用の機器；食料品；医薬製剤；腹水；およびワクチンからなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
材料を滅菌するための方法であって、
初期温度および初期圧で該材料を提供する段階；
圧力を、材料を滅菌するのに十分な上昇圧に上昇させる段階；
圧力を低下圧へと低下させる段階；ならびに
上昇および低下の段階を少なくとも1回反復し、それによって滅菌された材料を得る段階
を含み、初期温度が約40℃またはそれ未満である方法。
【請求項２５】
材料が約1atmの初期圧で提供される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
上昇圧が約5,000psiから約120,000psiの範囲にある、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
低下圧が上昇圧の半分またはそれ未満である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
圧力上昇段階の前に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
圧力上昇段階の後に、材料を加温または冷却する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
滅菌される材料が、生物試料；血漿、血清、または他の植物組織、動物組織、もしくはヒト組織；便；尿；痰；医用または軍用の機器；食料品；医薬製剤；腹水；およびワクチンからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
滅菌される材料が、細菌、プリオン、ウイルス、真菌、原生生物、核酸、および感染性タンパク質からなる群より選択される、少なくとも1つの感染性因子によって当初汚染されている、請求項24記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、材料の滅菌ならびにワクチンおよび医薬品の調製のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物材料および非生物材料の滅菌の滅菌、汚染除去（decontamination）または消毒のためには、さまざまな方法および装置が存在する。これらの方法には、熱破壊（例えば、焼却）、加熱滅菌、照射（例えば、紫外線または電離放射線の照射）、ガス滅菌（例えば、エチレンオキシドを使用）、光増感、膜滅菌、または化学消毒剤（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アルコール、水銀化合物、四級アンモニウム化合物、ハロゲン化化合物、溶媒/界面活性剤系または過酸化物）が含まれる。
【０００３】
加熱滅菌（例えば、オートクレーブ滅菌）は、例えば、医用溶液を患者に用いる前に滅菌するためにしばしば用いられる。加熱滅菌は一般に、溶液をオートクレーブ内の加圧下で121℃に最短15分間加熱し、加熱および加圧条件を、溶液中の細菌、真菌および原生生物を死滅させ、ウイルスを失活させるのに十分な時間にわたって維持することを必要とする。しかし、この工程は、ワクチンまたは医薬製剤中に保たれることが望ましいと思われる多くのタンパク質および活性も破壊する。
【０００４】
再利用可能な多くの医用物品および医用材料はオートクレーブ内での消毒または滅菌には適していない。例えば、医療装置のプラスチック部品、血液透析器および光ファイバー装置は通常、化学殺菌剤処理によって滅菌される。一般に、殺菌剤が微生物を失活させるには数時間の処理が必要である。
【０００５】
薬剤製造における無菌性を確保するためには、ガス滅菌がしばしば用いられる。しかし、ガス滅菌（例えば、エチレンオキシドを用いる）は時間がかかる上に、試料チェンバーの予備加湿、加熱および抜気を行った後に高濃度のガスにより1回に最長20時間もの処理を行う必要がある。適切に用いた場合、従来の消毒剤は、増殖性細菌、ある種の真菌、および親油性または中型のウイルスを失活させうる。しかし、これらの消毒剤は、結核菌、胞子形成細菌、または非親油性もしくは小型のウイルスを抑制できないことがしばしばである。細胞を溶解させ、それによって試料を滅菌するためのもう1つの方法が、「Microbiology」（Davisら、Harper & Row、ヘーザーズタウン、、メリーランド、1980）に記載されている。試料を凍結解凍するこの手順は、細菌の懸濁液を凍結した際に細胞内に小さな氷のポケットが形成されることによって効果を発揮すると考えられている。氷晶および局所的に高い塩濃度はいずれも細菌の損傷の原因となる。細菌の一部のみを死滅させるには1回の凍結事象で一般に十分であるが、凍結解凍サイクルの反復によって生存度の漸進的な低下が得られる。死滅率は急速な凍結および緩徐な解凍と相関する。
【０００６】
従来の凍結解凍方法は、試料の中心との熱伝達によって相変化を生じさせるために必要な時間のために、凍結解凍サイクルの速さの点で限界がある。試料が大容積の場合（例えば、約100mlまたはそれ以上）には、平衡速度は特に遅い。従来の方法の滅菌効率は、多数回の凍結解凍サイクルをそうした方法によって実施することの非現実性のために制約される。
【０００７】
従来の食品保存方法には、食品をある期間にわたって高温に保つ低温殺菌法が含まれる。しかし、この方法は風味および「新鮮さ」の損失も招くおそれがある。
【０００８】
タンパク質調製物からの微生物およびウイルスを失活させ、それと同時にタンパク質の完全性および治療的価値も保つための方法を開発することには現在、需要がある。非被包性ウイルスの失活のための方法の開発は、このようなウイルスの外殻が、維持することを望まれているタンパク質と類似したタンパク質を一般に含むために特に困難を伴う。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、比較的高い圧力と低い圧力とを反復して繰り返すことによって、生物材料および非生物材料の滅菌、汚染除去または消毒を行いうるという発見に基づく。本方法により、細胞およびウイルスなどの複雑な生物構造を選択的に失活させ、それと同時に多くのタンパク質などのより単純な構造を相対的に無傷のままに保つことが可能になる。圧力、サイクル条件、温度、および種々の添加物の存在の組み合わせの使用によって微調整が可能なことにより、このアプローチは、病原体または望ましくない活性を選択的に失活させ、それと同時に所望の活性を維持させることを可能にすることにより、ワクチン、治療薬および生物由来の他の材料の調製に特に有用である。圧力サイクルは、低温でも周囲温度でも高温でも行いうる（例えば、約-40℃〜約95℃、例えば、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、または中間の範囲）。この発見に基づく新たな方法は、例えば、ワクチンの調製、血漿または血清、植物組織、動物組織およびヒト組織、痰、尿、便、水、および腹水の滅菌、軍用機器、食物および飲料製品の汚染除去、ならびに医療機器の消毒に応用しうると考えられる。また、これらの新たな方法を、製造工程または研究手順に組み入れることもできる。
【００１０】
一般に、1つの態様において、本発明は、少なくとも1つの所望の高分子（例えば、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、薬剤、ステロイドまたは栄養素）を含む材料を滅菌するための方法を特徴とする。本方法は、初期圧で材料を提供する段階；および圧力を、材料を滅菌するには十分であるが所望の高分子の生物活性を不可逆的に失活させるには不十分な上昇圧（elevated pressure）へと上昇させる段階を含む。
【００１１】
本発明はまた、以下のものから選択される、少なくとも1つの感染性因子（infectious agent）によって当初汚染されている材料を滅菌するための方法も特徴とする：細菌、プリオン、ウイルス、感染性核酸または感染性タンパク質。本方法は、初期温度および初期圧で材料を提供する段階；ならびに圧力を、材料を滅菌するのに十分な上昇圧へと上昇させる段階を含む。初期温度は一般に60℃未満である。
【００１２】
これらの新たな方法による破壊または失活が可能な汚染物質の例には、細菌、プリオン、ウイルス、真菌、原生生物、核酸およびタンパク質が非制限的に含まれる。
【００１３】
いくつかの場合には、本方法はまた、圧力を低下圧（decreased pressure）へと低下させる段階、および低下圧と上昇圧との間で圧力サイクルを少なくとも2回（例えば、2、3、4、5、6、8、10、20、25、50、100、250、500、1000回またはそれ以上）繰り返す段階も含みうる。低下圧は初期圧と同じでも異なってもよく、一般的には（必然的ではないが）上昇圧の約半分またはそれ未満である。したがって、上昇圧が40,000psiであれば、低下圧は一般に20,000psi、10,000psi、5,000psi、1,000psi、500psi、250psi、100psi、50psi、20psi、1atmもしくはそれ未満、または任意の中間値である。
【００１４】
本発明はまた、材料を滅菌するための方法も特徴とする。本方法は、初期温度および初期圧で材料を提供する段階；圧力を、材料を滅菌するのに十分な上昇圧へと上昇させる段階；圧力を低下圧へと低下させる段階；ならびに上昇および低下の段階を少なくとも1回反復する段階を含む。この方法において、初期温度は例えば、約40℃またはそれ未満でありうる。材料は、1つまたは複数の所望の不安定な成分を含みうる。
【００１５】
以上の方法によって滅菌される材料は、例えば、生物試料；血漿、血清もしくは他の植物組織、動物（昆虫、哺乳動物、爬虫類などを含む）組織もしくはヒト組織；便；尿；痰；医用もしくは軍用の機器；食料品；医薬製剤；腹水；ワクチン；または滅菌しようとする任意の他の材料でありうる。
【００１６】
初期圧は、例えば、大気圧（すなわち、約1atmまたは約14.7psi）またはそれ未満の圧力（1atm未満、例えば、0.01psi、0.1psi、1psi、10psi、または中間圧）またはより高い圧力（1atmを超える、例えば、20psi、50psi、100psi、200psi、500psi、1000psi、2000psi、5000psi、10000psi、20,000psiまたはそれ以上）でありうる。材料は、約-40℃〜約95℃の範囲（例えば、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃または中間の範囲）、-40℃もしくはそれ未満（例えば、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃またはそれ未満）または95℃もしくはそれ以上（例えば、95℃、100℃またはそれ以上）の初期温度で提供しうる。
【００１７】
上昇圧は、例えば、約5,000psi〜約120,000psiの範囲（例えば、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、105,000、110,000、115,000、120,000psi、または中間の範囲）でありうるが、100psi、500psi、1000psi、または2000psiなどのより低い圧力もいくつかの用途で有用でありうる。
【００１８】
選択的には、これらの新たな方法は、圧力上昇段階の前または後に材料を加温または冷却する段階も含みうる。
【００１９】
本発明はまた、材料を滅菌するための方法であって、初期圧（例えば、1atm）および初期温度（例えば、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、または中間の範囲）で材料を提供する段階；圧力を、所望のタンパク質または活性を不可逆的に変性させるには不十分であるが（すなわち、約50,000psi未満）、材料を汚染している病原体の少なくとも一部（例えば、少なくとも25％、50％、75％、90％、95％、99％、またはさらには実質的にすべて）を死滅させるのに十分な上昇圧（例えば、約5,000psi〜約120,000psiの範囲、例えば、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、105,000、110,000、115,000、120,000psi、または中間の範囲）に上昇させる段階；およびその後に、滅菌された材料を得るために圧力を初期圧またはその周辺に低下させる段階を含む方法も特徴とする。
【００２０】
圧力を上昇させる前または後に、材料を氷点下の温度（例えば、約-40℃〜約0℃、特に約-20℃〜約-5℃の間）に冷却することができる。温度をその後に上昇させることができ、これは圧力を上昇させる前でも後でもよい。
【００２１】
選択的には、圧力のサイクルを、上昇圧と初期圧との間で反復的に繰り返すこともできる（例えば、2、3、5、10回、またはさらには100回、またはそれより多くの回数）。このようなサイクリングは、初期温度で、低温（例えば、-40℃〜0℃の間または-20℃〜-5℃の間などの氷点下の温度）で、または材料を低温に冷却しながら実施することができる。場合によっては、低温にある試料は、初期圧では固体（すなわち、凍結した）状態にあるが、上昇圧では液体（すなわち、溶融または解凍した）状態にある。このような場合には、圧力サイクリングによって同時に凍結解凍サイクリングが行われる。選択的には、振動の時間的パターンを変更することもできる。各サイクルの間に、圧力は交互に上げ下げされる。高圧にある時間と低圧にある時間との比は「振動パターン比」と呼ばれる。ほとんどの場合には、振動パターン比が1：1を上回る場合に（例えば、2：1またはそれ以上）、汚染物質の最適な失活が得られるが、振動比が1：1未満の方が、正しくフォールディングした感受性のあるタンパク質がより多く保たれる。
【００２２】
滅菌される材料は、例えば、生物試料、血漿、血清、生きている組織、植物組織、動物組織およびヒト組織、痰、尿、便、体液、腹水、医用または軍用の機器、食料品、医薬製剤またはワクチンでありうる。滅菌される材料は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、原生生物、核酸、タンパク質、酵母、プリオンまたは他の感染性因子のうち1つまたは複数によって当初汚染されているものでありうる。
【００２３】
上記の新たな方法のうち任意のものを、特定の病原体に対するワクチンを製造するために用いることもできる。例えば、病原性細胞の懸濁液を入手し、新たな方法の1つ（例えば、氷点下の温度での圧力サイクリング、および可能性としては凍結/解凍サイクリングを伴う方法）によって滅菌した上で、アジュバントと配合してワクチンを製造することができる。懸濁液中に毒素または他の不純物が存在すれば、これらを除去することが可能である（例えば、滅菌段階の後に）。
【００２４】
これらの新たな方法は加圧容器内で行うことができ、この容器は例えば、ガス（例えば、大気、または窒素などの不活性ガス）を含みうる。ガスは例えば、空洞化の過程で含めることができる。高圧によってガスは高度に圧縮され、液体中に容易に溶解するようになる。これらの溶解したガスおよび液体は、高圧下で細胞、ウイルスおよび小胞内に入り込ませることができる。圧力を急激に開放すると、細胞内またはウイルス内にあるガスの突然の膨張のために、空洞化と呼ばれる過程で細胞膜の爆発的な破裂が起こる。この細胞破壊方法を爆発的減圧（explosive decompression）と呼ぶこともできる。
【００２５】
相変化が病原体失活の重要な構成要素である場合には、相転移時期のいずれかの側で圧力サイクルを行えば十分なことがある。この転移の前後にはごくわずかな変化または圧力しか必要でないため、これは非常に迅速に行うことができる。また、相変化触媒（例えば、ガラス粒子）を、滅菌しようとする材料とともに含めることも有用と思われる。触媒はその後、必要であれば遠心処理または濾過によって除去しうる。相変化触媒は例えば、滅菌しようとする材料の内因性成分でもよく、または材料に添加することもできる。
【００２６】
上記の方法の任意のものによって滅菌された材料も、本発明の1つの局面とみなすことができる。
【００２７】
もう1つの態様において、本発明は、材料を滅菌するための器具を特徴とする。本器具は、外圧をそれ自体の内部の材料に伝えるように適合化された加圧容器を含む。容器は、上昇圧（例えば、上記の新たな方法のいずれかの実施に際して遭遇する圧力）に耐えることができる必要があり、圧力サイクリング器具（例えば、PCT US97/03232号に記載されたものなど）内に取り付け可能でなければならず、滅菌された材料の無菌回収を可能する弁を含みうる。場合によっては、器具は、加熱装置および冷却装置（例えば、加熱器および冷却器）、および/または材料の照射または光不活性化を可能にする光ウィンドウも含みうる。試料を保持するため、および処理の際に圧力を伝達するための使い捨て式の装置を含めてもよい。
【００２８】
さらにもう1つの態様において、本発明は、タンパク質、核酸、栄養素、薬剤、脂質、ステロイド、炭水化物、またはこのような高分子の2つもしくはそれ以上のクラスに属するメンバーなどの目的の高分子を含む、試料を滅菌するための方法を特徴とする。本方法は、初期圧で試料を提供する段階；圧力を、病原体を失活させるのに十分な圧力へと迅速に上昇させる段階；ならびに滅菌された試料を得るため、およびタンパク質または他の高分子の高度の凝集、変性または生物活性の失活を避けるために初期圧へと急速に復帰させる段階を含む。
【００２９】
さらにもう1つの態様において、本発明は、タンパク質を含む試料を滅菌するためのもう1つの方法を特徴とする。本方法は、初期圧で試料を提供する段階；1つまたは複数のタンパク質安定化試薬（例えば、グルコースなどの糖；グリセロール；親水性ポリマー；シクロデキストリン；カプリレート；アセチルトリプトファノエート（acetyl tryptophanoate）；プロピレングリコール；抗酸化剤；またはタンパク質特異的リガンド）を試料に添加する段階；圧力を、上昇圧（例えば、タンパク質の安定性に応じて、約10,000〜70,000psi）に上昇させる段階；試料を、タンパク質機能の高度の損失を伴わずに滅菌が行われるのに十分な期間にわたってインキュベートする段階；および圧力を初期圧へと復帰させ、滅菌された試料を得る段階を含む。
【００３０】
本発明はまた、細胞もしくは組織の破壊のため、または微生物の失活のための方法も特徴とする。本方法は、試料を凍結する段階；および試料を凍結温度に保ちながら圧力を振動させ、細胞を破壊する段階を含む。
【００３１】
本発明のもう1つの態様は、試料中のタンパク質を失活させるための方法を特徴とする。本方法は、試料に、アミン、チオレート（thiolate）、カルボキシレート、イミダゾール、またはタンパク質上に通常認められる他の官能基（例えば、イソチオシアネート、マレアミド、スクシンイミド、スルホニルクロリド）と反応しうる部分を含む試薬を添加して、反応混合物を形成する段階；および反応混合物に加圧して、タンパク質を失活させる段階、を含む。選択的には、タンパク質安定剤を添加することもできる（例えば、滅菌の前に）。
【００３２】
以上の方法のいずれにおいても、滅菌しようとする材料は、断裂せずに圧力を伝達しうるパッケージである、最終的なパッケージにある形で提供することができる。例えば、パッケージを、軟質プラスチック中に密閉的に封止することができる。または、パッケージが円柱状であって、圧力をプランジャーを介して伝達することもできる。
【００３３】
本発明はまた、感染性試料に加圧するための方法を特徴とする。本方法は、外圧を試料に伝達するように適合化された容器内に試料を装入する段階；容器を滅菌用化学溶液（例えば、酸化剤を含むもの）中に浸漬する段階；および容器内にある試料に加圧する段階を含む。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「氷点下の温度」という用語は、0℃未満の温度（例えば、-1℃、-5℃、-10℃、-20℃またはそれ未満）を意味する。本明細書中のすべての温度は、別に指定する場合を除いて摂氏温度であり、単に「℃」によって表される。本明細書における圧力の単位は、平方インチ当たりのポンド（psi）または気圧（atm）として表現される。1気圧は約14.7psi、1バールまたは101.3キロパスカルである。
【００３５】
「冷圧工程（cryobaric process）」とは、氷点下の温度で行われる、少なくとも1つの圧力変化を伴う工程のことである。いくつかの冷圧工程においては、温度を氷点下の温度に維持するか、または氷点下の温度の範囲で変動させながら、圧力を2種類の圧力（例えば、約14.7psi〜約35,000psi）の間で循環させる。
【００３６】
「滅菌する」「消毒する」および「汚染除去する」という用語は、文脈によって別の要求がなされない限り、本明細書において互換的に用いられる。「滅菌（すべての微生物の死滅）」は、汚染物質がタンパク質またはプリオンなどの非生存物である特定の作業においては「汚染除去」と同義ではないことに注意すべきである。
【００３７】
これらの新たな方法は、いくつかの利点をもたらす。例えば、本方法は氷点下の温度（例えば、約-40℃〜0℃の間）で実施しうる。氷点下の温度で行われる圧力サイクリングは、有益なことに、生物性汚染物質の細胞または小胞の内側または外側にある種々の水または希釈剤の相の間での振動を誘導しうる。液体状態と固体状態との間の転移は、膜、壁および小胞に対する物理的ストレスを生じ、それによって意図する工程を促進する。新たな方法において一般に用いられる氷点下の温度の範囲は、特定の需要に適した形状およびサイズの範囲で容易に入手しうる比較的安価な機器（例えば、市販の凍結装置）を用いて評価することができる。同様に、本方法の標準的な動作に必要な範囲の圧力（例えば、約14.7psi〜約30,000psi）を、PCT US97/03232号に記載されたような装置によって生成することもできる。
【００３８】
冷圧工程による材料の滅菌のための装置は、一般に、選択した上昇圧で動作しうるチェンバーである、材料を含めるためのチェンバー：ならびにチェンバー内の温度および圧力を制御、変更または調節するためのシステムを含むと考えられる。本装置はまた、滅菌された材料をチェンバーから無菌的な様式で取り出すためのシステムも提供すると考えられる。さらに、新たな方法に用いるための一般的な滅菌器具は、種々の制御装置、調節器、および温度センサーまたは圧力センサーを含みうる。新たな方法を行うために必要な装置は、特定の用途の必要条件に合致するように容易に適合化することができる。例えば、持ち運び可能な小型の装置を入手し、それによって滅菌または汚染除去の手順を野外で行うことが可能である（例えば、医療補助員または軍医務員による）。
【００３９】
加圧媒体は、例えば、水/エチレングリコール溶液もしくは他の非凍結性溶液、または粉末状タルクなどの固体であってよい。
【００４０】
温度の変動は、微生物および汚染性の生物材料の溶解を補助しうる。細胞膜、壁または小胞のタイプが異なれば、滅菌工程の有効性を最大限にするために異なる温度、圧力、サイクル数またはサイクル頻度が必要になると考えられる。
【００４１】
これらの新たな方法は非常に迅速である。例えば、圧力サイクルを約1mHz〜約10Hzの頻度で繰り返して、全滅菌工程を5分間またはそれ以内に完了することが可能である。10Hzを上回るサイクル頻度により生じる熱は脆弱なタンパク質にとって破壊的でありうる。しかしながら、サイクル工程によって生じる熱が特定の試料にとって有害でないと予想される場合、または熱を除去するために適切な対策を講じる場合には、10Hzを上回る頻度を用いることもできる。場合によっては、サイクル時間が短いほど、タンパク質活性がより良く保持され、滅菌の有効性が損なわれないことが見いだされている。例えば、2000年8月10日に提出され、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国特許出願09/636,149号に記載されているように、fVIII活性の保持が望まれるMS2の失活に関する実験において、10〜15秒間続く高圧パルスを含むサイクルによって3-logを上回るMS2失活が得られ、50％を超えるfVIII活性が保持された。より短いパルス（例えば、10秒間に対して1秒間；60秒間に対して10秒間）も、LDH活性をより多く保持させた。
【００４２】
新たな方法により、試料中の病原性生物を、タンパク質または他の高分子を同時に凝集、変性、および失活させることなく中和することが可能になる。新たな方法は、他の方法を用いる生物試料の滅菌でしばしば起こる、所望の分子または活性の変性を回避しうる。
【００４３】
迅速かつ経済的な滅菌を、高分子の凝集、失活、破壊、または変性を最小限にとどめながら達成することができる。このため、これらの新たな方法は、有益なことに高活性ワクチンの製造に用いうる。高温はタンパク質、核酸、栄養素、薬剤、脂質、ステロイド、または炭水化物のような、目的の高分子における共有結合および非共有結合の両方を破壊する原因となり、本明細書で主張する方法よりも程度の大きい不可逆的な変性または失活を招く可能性があるため、これらのワクチンは、より高い温度で製造されたワクチンよりも優れていると考えられる。
【００４４】
新たな方法のその他の利点には、血液画分に化学添加剤を添加する必要性の回避、または減少；単一の単位からプールされた大規模な試料への、または連続的な稼働工程への、工程の拡張可能性；およびタンパク質成分に対する熱失活過程の望ましくない副作用の除去、または減少が含まれる。これらの圧力法は他の失活方法とも適合性があり、多くの場合には、圧力を用いない場合に必要と考えられるよりも低い温度で、より低レベルの変性剤または他の薬剤の添加により、より低レベルの毒性で匹敵しうる程度の失活を得ることが可能である。
【００４５】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。対立が生じた場合には、定義を含め、本明細書が支配的であると考えられる。さらに、材料、方法および例は例示的なものに過ぎず、制限することを意図したものではない。
【００４６】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および上記の特許請求の範囲によって明らかである。
【００４７】
詳細な説明
本発明は、約5,000psi〜約120,000psi（例えば、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、105,000、110,000、115,000、120,000psi、または中間の範囲）の範囲の高圧によって材料の滅菌または汚染除去を行いうる方法を提供する。加圧の前または後に、材料を、材料の望ましい特性を保つとともに、感染性因子または汚染物質を破壊することを可能にする特定の温度に調整する。
【００４８】
温度、圧力、サイクルの数および持続時間、ならびに圧力および温度の変化の相対的時期はさまざまであってよいが、これらの新たな方法は一般に、以下の手順に従って行われる：初期圧（例えば、大気圧、14.7psi）および初期温度（例えば、周囲温度またはそれを超えるもしくはそれ未満の温度、例えば、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、0℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、または中間の範囲）にある材料を用意する。続いて、材料を加圧して上昇圧（例えば、約5,000psi〜約120,000psiの範囲、例えば、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000、105,000、110,000、115,000、120,000psi、または中間の範囲）にする。選択的には、温度を低下させること（例えば、-40℃〜0℃、好ましくは約-20℃〜約-5℃などの氷点下の温度）または上昇させること（例えば、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃または95℃に）が可能である。場合によっては、100℃またはそれを超える温度が有用なこともある（例えば、目的の高分子が耐熱性である場合、または高分子活性の保存を求めていない場合）。続いて、圧力サイクルを上昇圧と周囲圧力との間で繰り返す。試料を最終除圧後に凍結状態で生成させることもでき、または、凍結していない滅菌された生成物を生成させるために除圧前に0℃もしくはそれ以上に加熱することもできる。
【００４９】
その他の作業工程を、これらの作業単位と組み合わせることができる。例えば、試料を溶媒または溶液中に懸濁または溶解し、懸濁液または溶液を直接加圧することはできるが、液体材料への空洞化の導入が有用なこともある（例えば、組織試料の滅菌のために）。この工程では、試料を気体状ヘッドスペースとともに加圧し、その後に圧力を急激に開放する。この工程は試料中に微小な気泡を生じさせうる。
【００５０】
ほとんどの用途に関しては、空気のヘッドスペースがあれば空洞化には十分であると考えられる。しかし、脆弱なタンパク質を単離しようとする場合には、窒素などの不活性ガスを用いることが好ましいと思われる。この場合も、振動を約1mHz〜約10Hzの頻度で加えることができる。生じた熱が試料中のタンパク質などの決定的な成分に損傷を与えない場合、または振動が熱生成による活性の損失を最小限にするために冷却環境で加えられる場合には、より急速な振動（例えば、超音波の範囲）を用いることができる。
【００５１】
滅菌のために必要な空洞化の程度は、生物性汚染物質の種類および滅菌工程の目標に依存する。例えば、細胞壁を含む微生物（例えば、酵母）にはより厳密な空洞化が必要なことがある。微生物細胞の内部にある高分子（例えば、タンパク質；核酸）の生物活性を大きく低下させずに、そのような細胞を破壊しようとして滅菌を行う場合には、空洞化のために不活性ガスを用いることが好ましいと考えられる。新たな滅菌方法とともに用いられるほとんどの空洞化方法において、液体と気体との比は約10：1〜約1：10であると考えられるが、この範囲を超える比を用いてもよい。この工程は、はるかに高い圧力、または高圧および低圧のサイクルを用いる点で、既知の滅菌方法とは異なる。気体の拡散はより迅速であり、微生物の破壊はより高度である。
【００５２】
以上の工程を、既知の静止圧および/または特定の圧力を所定の期間にわたって維持する方法とともに用いることもできる。場合によっては、微生物の失活には十分であるが不可逆的なタンパク質変性のためには不十分な量の時間にわたり、圧力を非常に高いレベルに維持してもよい。
【００５３】
相変化がいずれかの滅菌工程に伴う場合には、その変化を促進するために触媒を添加してもよい。例えば、微細粒ガラスまたは他の材料を、試料もしくは材料の凍結のための核生成部位として、または泡の核形成を誘導するための部位として役立てることができる。
【００５４】
概論
新たな方法によってほぼすべての生物材料または非生物材料の滅菌、汚染除去または消毒を行えるが、脆弱なタンパク質または他の所望の分子を比較的少量（例えば、ng、pg、またはさらにはfgの範囲）または高濃度で含む生物材料は、特にタンパク質または所望の分子の完全性を滅菌工程の全体を通じて維持しようとする場合には、特別な問題となることがある。
【００５５】
新たな方法の用途には、ドナーからの血漿の滅菌（例えば、輸血に用いるため）、水の滅菌、食料品の滅菌（例えば、ジャム、ゼリー、肉、果実または野菜由来の製品、果汁、アップルサイダー、ミルク）、腹水の滅菌、医療機器の汚染除去（例えば、メス、刃物およびドリルなどの外科用および歯科用の器具）、感染性因子を破壊するための医用試料（血液、尿、便、痰、毛、生検試料または他の組織試料）または軍用機器（例えば、計装設備および集積回路）の中和、医薬品の製造（例えば、生物源からのアンチセンス薬剤の作製）および衣料類（例えば、衣服、寝具およびリネン）の消毒が含まれる。新たな方法は、保温したインキュベートした材料の増殖を停止させるため、またはこのような材料を滅菌するために用いうる。また新たな方法を、化粧品、薬剤および工業製品の無菌状態を確保するために用いることもできる。
【００５６】
新たな方法によって失活させうる微生物の例には、親水性ウイルスおよび親油性ウイルスの両方；ほぼすべての細菌、例えば、ブドウ球菌、小球菌、化膿レンサ球菌、類ジフテリア菌（例えば、親油性、非親油性、プロピオバクテリウムなどの嫌気性類ジフテリア菌）、グラム陰性腸内桿菌（例えば、エシェリキア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属）、ナイセリア、好気性有芽胞菌、マイコバクテリウムを含む；真菌、例えば、酵母、ピチロスポルム・オバーレ、ピチロスポルム・オルビクラレ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシロシス、トルロプシス・グラブラータおよび繊維状皮膚糸状菌を含む；原生生物および下等多細胞生物、原生動物性寄生生物および蠕虫性寄生生物を含む；マラリア誘発性生物；プリオン；ジアルジア属；ならびに他の感染性因子が含まれる。
【００５７】
血漿プールはしばしばC型肝炎ウイルス（HCV）を含む。このため、血液製剤を製造するための手順は、HCVおよび他のウイルスを失活させる工程による恩恵を受ける。ヒトパルボウイルスB19（B19）は、血漿の汚染物質として頻度の高いもう1つのものである。A型肝炎ウイルス（HAV）汚染の頻度は低いが、それでも問題である。B19およびHAVはいずれも小型（約15〜30nm）であり、脂質から構成される外包膜を有していず（非包膜性）、熱処理および化学処理に対して抵抗性であり、ナノ濾過によって除去することは困難である。包膜を有するウイルス（例えば、HIV、HBVおよびHCV）もこの新たな方法の標的として想定されるものである。現時点では特徴が決定されていないウイルス、例えば新たに認知された型の肝炎ウイルスおよび輸血伝達性ウイルス（TTV）なども、新たな方法に対して脆弱である可能性がある。さらに、伝染性海綿状脳症などのプリオンをベースとする感染性因子はスクリーニングおよび失活が困難である。しかし、本発明の方法は、適した条件下でタンパク質のアンフォールディングを誘導するため、このような因子を本発明の方法によって失活させうる可能性もある。
【００５８】
破壊されたウイルス粒子が圧力処理後に再集合する可能性があるため、ウイルス内に含まれる核酸を不可逆的に分解することが望ましいと考えられる。中程度の高圧（例えば20,000psi〜 60,000psi）により、ヌクレアーゼ複合体およびそれらの内因性阻害因子を破壊することができる。さらに、中程度の圧力により、阻害されていない酵素の活性を高めることができる。この工程はヌクレアーゼの添加によって強化しうる。クエン酸塩添加血漿の処理のように、場合によっては、マグネシウム非依存性ヌクレアーゼを添加することが望ましい。
【００５９】
または、はるかに高い圧力（例えば50,000psi〜 150,000psi）を、低分子医薬品などの圧力耐性のある材料または耐熱性タンパク質の滅菌のために用いることもできる。圧力サイクリング凍結解凍滅菌法（例えば、例えば氷III、氷IV、氷V、または氷VIなどの高圧凍結のサイクル形成を利用する方法）を用いてもよい。
【００６０】
生物性汚染物質に比較的圧力耐性があり、試料が保持する必要のある不安定タンパク質を含む場合には、この方法の変法を用いることができる。この変法では、圧力を急速に上昇させ（例えば、5秒未満または1秒未満で）、非常に高い最大圧力（例えば、150,000psi）にし、高圧で短時間のみ（例えば、5秒未満）保つ。続いて圧力を急速に開放する（例えば、5秒未満または1秒未満で）。ウイルスなどの病原体の失活は、特に溶液の粘性が高まる高圧かつ低温の条件下では、タンパク質分子の不可逆的な凝集よりもはるかに高い速度で進行しうる。特定の高圧かつ低温の条件下（例えば、110,000psiおよび-10℃）では、高圧氷（すなわち、氷Vまたは氷VI）が形成しうる。高圧氷の格子構造内に捕捉されたタンパク質は凝集する可能性が低い。高圧氷が融解するには限られた量の時間を要し、この時間は試料中のタンパク質が固相内に捕捉されたままで再フォールディングするには十分である。
【００６１】
圧力がさまざまな酵素の活性を高めることも示されている。例えば、RNA分解酵素活性は静水圧の上昇によって高まる。この効果を、ウイルスの失活のために新たな方法と併せて利用することができる。RNAウイルスは以下の高圧処理によって容易に分解される。
【００６２】
圧力処理を行った天然ウロキナーゼを用いた実験により、-40℃〜30℃の間のすべての温度でアミド溶解活性が高度に保存されており（80％活性を上回る）、-40℃で最大活性であることが示された。組換えウロキナーゼは-40℃〜60℃の範囲全体にわたって安定であり、2℃で最大活性であった。
【００６３】
輸血
これらの新たな方法は、輸血の安全性を改善するために用いうる。血漿タンパク質製剤は、例えば、血友病患者、癌患者および腎透析患者に必要とされている。しかし、血液製剤に高頻度に存在するウイルスおよび他の病原体は、そのような製剤を必要とする患者に対してリスクをもたらすおそれがある。多くの細胞を除去する新たな濾過法を用いても、ある種の細菌およびウイルスは製剤中に残留するおそれがある。
【００６４】
通常、血漿は血液試料を採取し、試料を血漿分離管に入れて遠心処理を行った上で、血漿を管内の沈殿物からデカントすることによって単離される。この方法は血漿を細胞の塊から遊離させるが、一部の細胞は不可避的に血漿中に残留する。残留細胞が例えば、細菌またはウイルスを含んでいれば、輸血によって疾患が伝播するおそれがある。新たな方法を、上記のデカント法によって得た血漿に対して行いうる。血漿中に残った汚染物質を新たな方法によって失活させることができる。
【００６５】
試薬および培地の滅菌
新たな方法を、工業製品の滅菌のために用いることもできる。例えば、ウシ血清は分子生物学の研究室で細胞培養のためにしばしば用いられる。供給元からの根源的な貯蔵材料の微生物汚染が起こることは稀である；しかし、これが起これば経済的コストおよび時間の遅れはしばしば重大になるおそれがある。ウシ胎仔血清の滅菌のための現行の方法（例えば、加熱または濾過）は機能的に重要なタンパク質（例えば、増殖ホルモン）を失活させるおそれがあり、ロット毎のばらつきの原因ともなる。その上、根源的な貯蔵材料は最初は無菌であっても、それを研究室で開封すると不注意で汚染されるおそれがある。新たな方法は、生産工程（例えば、バッチ生産または連続生産）に用いることもでき、または個別の研究室で実験の開始前に血清もしくは他の培地の前処理のために用いることもできる。
【００６６】
ワクチン製造
上記の冷圧摂動および超高圧空洞化は、有益なことに、ワクチンの製造に用いることができる。ワクチンは一般に、培養した病原体の溶解物を失活処理（例えば、加熱、または化学変性剤の添加および除去）にかけることによって調製される。
【００６７】
奏功するワクチン調製法は、理想的には、病原体を高度に失活させながら、病原体の溶解物が患者において防御的免疫応答を誘発する能力を保持させる必要がある。冷圧手順は奏功するワクチン製造のために必要な基準を満たすのに非常に適している：低温で圧力変性したタンパク質は加熱または化学的に変性したタンパク質よりもより天然型に近い構造を保持するため、圧力で失活した病原体はより免疫原性が高いと考えられる。また、圧力変性したタンパク質は凝集する可能性が低いため、ワクチンの収量は増加する。本明細書に記載の圧力失活法は、一般に添加または除去する化学物質がない上に、熱とは異なり、圧力は大規模な試料の間を迅速に伝達しうるため、大規模の場合に経済的である。
【００６８】
一般に、これらの新たな方法によるワクチン製造は、上記の氷点下の温度での圧力の振動、および/または超高圧空洞化処理を含む。ワクチン製造のために必要な具体的な条件は、失活させようとする個々の病原体によって異なる可能性がある。例えば、胞子形成性微生物の場合には、選択的には低圧かつ中程度の温度（例えば、10,000psiおよび40℃）による前処理を、胞子に出芽させるために行うことができる。その後、出芽した胞子を本発明の方法によって失活させることができる。
【００６９】
核酸の圧力増強型光増感
滅菌しようとする製品をDNAまたはRNAと選好的に結合しうる化学物質と混合して、核酸と反応させる滅菌方法が記載されている（Radosevich、「Seminars in Thrombosis and Hemostasis」、Vol. 24、No.2、pp.157-161、1998）。場合によっては、化学的部分を活性化するために光が用いられる。このような方法の欠点には、滅菌しようとする製品の所望の分子成分の同時損傷（例えば、化学物質もしくは照射による非特異的反応、または失活用化学物質の病原体の内部への浸透が不完全または緩徐なことによる）が含まれうる。上昇圧の適用により、細胞およびウイルスが透過化されて、失活用化学物質の進入が可能となるために、これらの問題はかなり克服される。また、上昇圧は、分子の核酸に対する親和性および選択性を高め、それによってより低濃度の化学物質またはより少量の照射を用いることを可能にする。このため、より迅速で、より安価で、より効率的な方法が得られる。
【００７０】
光化学的方法の施行のための器具は、水晶またはサファイアなどの材料でできた少なくとも1つの圧力抵抗性ウィンドウを含む反応チェンバー、およびウィンドウを通して試料を照射するための装置を有する、PCT出願、US96/03232号に記載されたものなどの高圧流動系を含みうる。液体の流れは、試料全体が照射領域を通過するようなものである。続いて、試料を無菌的に収集することができる。試料を高圧または低圧にある反応チェンバーに導入した後に、照射を行う前に加圧することができる。
【００７１】
圧力ショック滅菌
本発明のもう1つの態様においては、試料を短時間、上昇圧に供する。圧力および時間は、高度の病原体失活が得られるものの、上昇圧条件によって変性したタンパク質が、天然型へと再フォールディングする前に、不可逆的な複合体の凝集が十分な程度で起こる時間はない程度に短いように選択する。本方法は、凝集速度を遅らせ、タンパク質の再フォールディングの速度を高める条件によって強化しうる。例えば、低温または極めて高い圧力はタンパク質凝集の速度を遅らせることができ、グルコースの添加はタンパク質フォールディングの速度を高めうる。
【００７２】
ウイルスの化学的失活
さまざまな化学物質（例えば、ヨウ素、エチレンイミン、アスコルビン酸、チオホスファミド、コンゴーレッド、パラホルムアルデヒド）を、不安定タンパク質を含む溶液の滅菌に用いることができる。しかし、このような化学物質の使用には、緩徐な失活、タンパク質損傷のおそれ、または化合物が病原体の内部に浸透不能であることを含む負の影響がある。上昇圧は、負の影響を悪化させることなく、これらの化学物質の滅菌活性を高めることができる。
【００７３】
タンパク質および酵素の安定化
場合によっては、上記の滅菌手順のために必要な圧力では不可逆的に変性する不安定なタンパク質を含む溶液または他の試料を滅菌することが望ましいと思われる。これらの場合には、安定剤（例えば、グリシンなどのアミノ酸、または混合物中のタンパク質の特異的リガンド、回収しようとするタンパク質のリガンド、またはグリセロール、キシロースもしくはグルコースなどの糖）を、加圧の前に試料に添加するとよい。例えば、カプリレートおよびアセチルトリプトファノエートを血漿試料に添加すると、特定の血漿タンパク質の過剰な不安定化を伴わずに、続いて血漿試料を冷圧滅菌工程にかけることができる。その後、安定剤は標準的な方法（例えば、透析、濾過、クロマトグラフィー）によって除去しうる。
【００７４】
感染性試料の圧力処理
静水圧または拍動圧は、滅菌、細胞およびウイルスの破壊、ならびに感染症の因子を含む可能性のある試料に関するヌクレアーゼ失活のための有用なツールとなりうる。その上、全般的な安全面の考慮から、試料を取り扱う人の感染予防および他の試料の汚染の回避が求められている。このような汚染を防止するための一つの手法は、滅菌溶液（例えば、10％Clorox（登録商標）漂白剤）または他の酸化剤を加圧媒体として用いることである。
【００７５】
例えば、試料を密閉された柔軟な容器の内側に入れ、続いてそれを化学滅菌溶液中に浸漬することができる。続いて溶液を第2の化学的に不活性な容器の内側に密閉する（すなわち、それが加圧チェンバーの内側の金属パーツと触れるのを避けるため）。次に、不活性加圧媒体を用いて、加圧チェンバーの内側と試料および滅菌溶液を収容する容器との間の空間を充填する。滅菌溶液を収容する容器は、例えば、プラスチック袋、ねじ蓋付きプラスチック容器、蓋付きシリンジまたは収縮包装物であってよい。
【００７６】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
【００７７】
実施例
実施例1：大腸菌を接種した血清の圧力サイクリング失活
アンピシリン耐性大腸菌株の培養物を、LB/amp培地（50g/mlアンピシリンを含むルリア培地）中で飽和するまで増殖させた。成体ウシ血清（Sigma）の試料を、血清1ml当たり30μlの大腸菌溶液とともに接種した。接種した血清のアリコート（各280μl）を9本の微量遠心管に入れた。9本の管に入った試料に対して以下の実験条件を用いた：
【００７８】
試料1は対照として未処理のままとした。
【００７９】
試料2は大気圧（すなわち、約14.7psi）に維持し、約-17℃と周囲温度（すなわち、約25℃）との間で温度サイクルを20回、20分間にわたって行った。
【００８０】
試料3〜6は大気圧で-15℃に冷却した。試料が熱平衡に確実に達するように2分間静置した。続いて試料を約30秒/サイクルまたは2Hzの速度で圧力サイクルにかけた。試料3には約14.7psiと約15,000psiとの間のサイクルを10回、5分間にわたり行った；試料4には約14.7psiと約35,000psiとの間のサイクルを10回、5分間にわたり行った；試料5および6には約14.7と約35,000psiとの間のサイクルを20回、10分間にわたり行った。
【００８１】
試料7には、約14.7psiと約35,000psiとの間のサイクルを20回、周囲温度で6分40秒にわたって行った。
【００８２】
試料8および9には静止圧を2.5分間加えた；試料8は周囲温度で加圧し、試料9は15℃で加圧した。
【００８３】
試料の希釈物をLB/amp培地で作製し、試料をプレーティングした。1ml当たりのコロニー形成単位（CFU/ml）を、対数減少値（すなわち、対照との比較）とともに以下に示す：
2005519710.tif 000002
【００８４】
すなわち、最も有効な処理は、試料#7の約25℃での35,000psiへのサイクリングに相当するものであった。この結果は、同じ温度ではサイクリングが静止圧よりも有効であることを示している（試料#8参照）。
【００８５】
実施例2：λファージの冷圧失活
4つの試料のそれぞれに関して、2.5μlのλファージ保存液（5×10１１pfu/ml）を、約248μlのウシ血清の添加によって100倍に希釈した。第5の2.5μlのλファージ保存試料は懸濁液培地中に100倍に希釈した。2つのファージ-血清試料（250μl）を、エタノール-ドライアイス浴にチューブを浸漬することによって凍結させた；残りの3つの試料は氷上に置いた。
【００８６】
凍結したファージ-血清試料の1つに対して、36,000psi（30秒間）と14.7psi（30秒間）との間のサイクルを5分間行った。圧力処理の間のこの試料の温度は-10℃に維持した。残りの凍結試料は対照として実験全体を通じて14.7psiに維持した。この実験を繰り返す際に、ドライアイス試料を-10℃に加温して5分間おいた。第3のファージ-血清試料は23℃で36,000psiに10分間加圧した。残りの2つの試料は陽性対照として用い、それぞれ圧力処理を加えずに23℃で10分間インキュベートしたファージ-血清試料、および圧力処理も温度処理も加えなかったファージ-懸濁液培地（すなわち、0.0496M塩化ナトリウム、4.06mM硫酸マグネシウム、50mM Tris-Cl pH 7.5および1.0g/lゼラチン）試料であった。圧力処理の後に、ファージ試料の102倍、104倍および106倍希釈物を懸濁液培地によって作製した。
【００８７】
アンピシリン耐性大腸菌の培養物を、Lambda培地（すなわち、10g/lトリプトン、0.042M塩化ナトリウム）、0.2％マルトース、および10mM硫酸マグネシウム（「Current Protocols in Molecular Biology」、ページ1.11.1）中で飽和するまで増殖させた。
【００８８】
感染を誘導するために、100μlのファージ試料を上記のように調製した300μlの大腸菌培養物に添加し、培養物を10分間、37℃でインキュベートした。2.5mlのLambda Top Agar（すなわち、10.0g/lトリプトン、42mM塩化ナトリウム、7g/l寒天）をそれぞれのファージ大腸菌混合物に添加し、ボルテックス処理を行った上で直ちにLambdaプレート（すなわち、10g/lトリプトン、0.042M塩化ナトリウム、10.0g/l寒天を90mmペトリ皿に入れたもの）に播いた。
【００８９】
プレートを37℃で16時間インキュベートした後に、λプラークを計数するか、または高集密度のプレートについてはプラークによって覆われた全表面積を推定した。希釈係数と各プレート上に出現したプラークの数を掛けることにより、プラーク形成単位（pfu）を算出した。
【００９０】
λファージのプラーク形成活性は、-10℃で静水圧を交互に変化させることによって5桁低下した。凍結して圧力サイクルを行った試料の密度は9.4×10５pfu/mlであり、凍結して加圧しなかった対照では3.2×10１１pfu/mlであることが明らかになった。第2の実験では、交代性圧力処理によってプラーク形成活性は9×10１０pfu/mlから6.4×10４pfu/mlに低下した。凍結試料とは異なり、室温試料ではプラーク形成活性は3分の1の低下に過ぎなかった。23℃で36,000psiに5分間保った試料は1.2×10１１pfuであり、14.7psiに維持した対照は3.1×10１１pfuであった。
【００９１】
血清のプラーク形成活性に対する影響は、仮にあるにしても極めてわずかであった。懸濁液培地中に希釈した試料では50×10１１pfuであり、血清中に100倍に希釈した試料では3.1×10１１pfuに低下したに過ぎなかった。大気圧（14.7psi）での1回のみの凍結はプラーク形成活性に対する効果がなかった。凍結試料では3.2×10１１pfuであり、室温（23℃）でインキュベートした試料では3.1×10１１pfuであった。
【００９２】
実施例3：ウイルス失活に対する振動頻度の影響
血清中のλバクテリオファージの失活に対する振動頻度の影響を明らかにするために実験を行った。
【００９３】
血清試料に対してウイルスを接種し、種々の頻度の振動および最大圧40,000psiを用いた点を除いて実施例2のように処理した。各実験において、すべての試料を-6℃で処理し、すべての試料に対する全処理時間は15分とし、高圧および低圧におく時間は7.5分とした。実験はそれぞれの実験条件セットに対して2回ずつ行った。ウイルス力価は実施例2のように測定した。
【００９４】
治療的タンパク質のモデルに対して、その活性が維持されるか否かを調べるために並行実験を行った。抗フルオレセインヤギIgG（Chemicon International；Tecuma、CA）を5％グルコースおよび0.3％NaCl中に4mg/mlの濃度で調製した。続いてこの溶液をバクテリオファージ失活実験と同じ処理に供し、50nMフルオレセイン溶液の蛍光を消光させる能力の測定によってアッセイした。以下のデータが得られた：
2005519710.tif 000003
【００９５】
この実験は、低温での圧力の振動がウイルス失活の速度に対して大きな影響を及ぼし、治療的血液製剤の製造において有用な可能性があることを示している。本工程は正しくフォールディングした治療的タンパク質の高率回収に対応する圧力および温度の条件下で動作可能であり、多くの種類のウイルスに対して有効である。
【００９６】
実施例4：高圧滅菌工程におけるヌクレアーゼ活性の増強
成体ウシ血清を水で50％（v/v）に希釈し、0℃に冷却した。血清の4つのアリコートを250μl微量遠心管に分け、各チューブに25μlの空気が入るようにした。チューブを使用時まで氷上に保った。2μgのpUCl9プラスミドDNAおよび2μgの酵母全RNA（Sigma）（5μlの50mM Tris緩衝液、pH 8.0中にあるもの）を、適切な時点で各試料に添加した。水5μlを試料#4に加圧前に添加した。反応は10mMバナジルリボヌクレオシド複合体を添加し、試料を氷上に置くことによって停止させた。これらの試料に対する処理は以下の通りである：
試料#1：対照試料（すなわち、核酸のみ）。この試料では、バナジルリボヌクレオシドを核酸の前に添加する。
試料#2：血清および核酸混合物、25℃で10分間インキュベートする。反応を上記のように直ちに停止させる。
試料#3：血清および核酸混合物、25℃で60,000psiに10分間加圧。反応を上記のように停止させる。
試料#4：血清、25℃で60,000psiに10分間加圧；続いて核酸を添加し、混合物を10分間インキュベートして、反応を上記のように停止させる。
【００９７】
すべての試料を、タンパク質を除去するために同容積のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合物で抽出し、その後に70％エタノール中で核酸を沈殿させる。核酸ペレットを20μlのTB緩衝液中に再懸濁する。その結果得られた溶液の10μlを、電気泳動用の0.8％アガロースゲルにローディングする。電気泳動の後に、DNAを臭化エチジウム蛍光によって可視化する。残りの試料の5μlをPicoGreenおよびRibogreen色素（Molecular Probes）を用いて定量する。
【００９８】
試料#3および#4はいずれも、試料#2との比較で分解の増大を示す。試料#4中の核酸は試料#3中の核酸よりも分解の程度が大きい。これらの結果は、圧力が、活性を直接刺激することおよび阻害因子を遊離することの両方により、血液ヌクレアーゼを増強することを示している。
【００９９】
実施例5：出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の圧力および温度誘導性失活
出芽酵母をYPD液体培地（1％酵母抽出物、2％ペプトン、2％デキストロース）中で、培養物が2×10６細胞/mlの密度に達するまで増殖させた。続いて、出芽酵母試料をウシ血清で1：10に希釈し、その後にさまざまな圧力および温度を加えた。
【０１００】
第1に、加圧工程の間の温度を23.8℃に一定に保った。1つの試料は23.8℃で36,000psiに10分間維持した。第2の試料には36,000psiと14.7psiとの間の30秒間隔でのサイクルを10分間、23.8℃で行った。第3の試料については陽性対照として圧力および温度をそれぞれ14.7psiおよび23.8℃に一定に保った。
【０１０１】
次の3つの試料については、同等の圧力処理を行いながら温度を低下させた。すなわち、第4の試料は-3.6℃に冷却した後に36,000psiに加圧して10分間おいた。第5の試料も-3.6℃に冷却し、その後に36,000psiと14.7psiとの間の30秒間隔での圧力サイクルを10サイクル行った。陽性対照として、第6の試料は-3.6℃に冷却したが圧力処理は加えなかった。
【０１０２】
必要な圧力処理および温度処理の後に、すべての試料を係数10、100、および1000で希釈してLPDプレート（1％酵母抽出物、2％ペプトン、2％デキストロース、1.5％寒天）に播き、32℃で24時間増殖させた。コロニー数と希釈係数を掛けることにより、コロニー形成単位（cfu）の数を算出した。
【０１０３】
圧力処理による出芽酵母の顕著な失活が23.8℃および-3.6℃の両方で観察された。加圧試料のコロニー形成活性は1×10２cfu〜5.6×10３cfuの範囲であった。陽性対照のコロニー形成活性は1.1×10５cfu〜9.2×10５cfuの範囲であった。すなわち、出芽酵母のコロニー形成能力は約2〜3桁低下した。
【０１０４】
実施例6：モロニーマウス白血病ウイルスの圧力および温度誘導性失活
Phi+（伸長型ウイルスパッケージングシグナル）およびネオマイシン耐性マーカー（Neoｒ）を含むがウイルス構造遺伝子は欠失しているレトロウイルスベクターpLNCXを、パッケージング細胞系NIH-Cyt2とともに用いた。NIH-Cyt2細胞は、粒子形成および複製のために必要なgag、polおよびenvウイルス構造遺伝子を発現するが、RNAパッケージングシグナルPhi+は発現しない。このため、pLNCXベクターおよびNIH-Cyt2細胞系を合わせると、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）と構造的に同一な、複製能のない感染性粒子が生じる。これらの感染性MMLV粒子はpLNCXベクターをコードするRNAを含む。
【０１０５】
10％ウシ血清（CS）を添加したDMEM中に懸濁したMMLV感染性粒子を、下記の圧力処理および温度処理の際を除き、4℃および14.7psiに維持する。1つの試料に対する静水圧は35,000psiと14.7psiとの間のサイクルを30秒間隔で行わせ、その間の温度は2℃に維持する。陽性対照として、第2の試料の温度は2℃に14.7psiで10分間維持する。第3の試料には、-10℃で35,000psiと14.7psiとの間のサイクルを30秒間隔で行う。第4の試料は-10℃で35,000psiに5分間維持する。陽性対照として、第5の試料はドライアイス中で凍結した後に-10℃に5分間加熱する。
【０１０６】
試料をNIH-Cyt2細胞の培養皿に添加し、37℃で30分間インキュベートした上で、細胞にレトロウイルスベクターpLNCXをトランスフェクトする。陰性対照として、細胞の1枚のプレートにウイルス非含有DMEM-CSによる偽トランスフェクションを行う。Neoｒを有する細胞のみの増殖を許容し、それによって安定形質転換体の選択を可能にする10％ウシ血清およびG418を加えたDMEM中で細胞を増殖させる。10日後に培養皿をPBSですすぎ洗いし、メチレンブルーで染色して、PBSで再びすすぎ洗いした後に、コロニーを計数する。希釈係数とコロニー数を掛けることにより、コロニー形成単位（cfu）で表されるウイルス力価を算出する。
【０１０７】
実施例7：大腸菌で汚染された針の滅菌
2本の20G針を剪断し、プラスチック製マウントに結合した3mmの金属シャフトを残した。3mlシリンジのプラスチックシャフトの両端を切断し、各末端に2つのプランジャーのゴム部分を栓として差し込むことによってチューブを構築した。一晩培養した大腸菌1mlを各針に通した。各針を、1mlのLuria培地（LB）の入ったチューブに入れた。各チューブの上方には約0.2mlの空気を残した。
【０１０８】
1本のチューブに対しては、圧力処理を22.2℃で10回行った（各サイクルは37,000psiで30秒間の後に14.7psiで30秒間を含む）。第2のチューブは圧力チェンバーの内部に22.2℃で10分間置いたが、圧力処理は行わなかった。
【０１０９】
圧力処理の後に、針をチューブから取り出し、0.2mlのLBを各針に通した。0.2mlのLBの半分をLBプレートに播いた。残りの0.1mlのLBは希釈し（1：10、1：100、1：1,000、および1：10,000）、4枚のLBプレートに播いた。すべてのプレートを37℃で一晩増殖させた。各プレート上のコロニーを計数し、各LB試料におけるコロニー形成単位（cfu）の数を算出した。
【０１１０】
処理した針を通過させたLB培地と処理しなかった針を通過させたものの間には、コロニー形成活性に関して顕著な差が認められた。圧力処理した針を通過させた0.2mlでは10cfu、未処理の針を通過させたLBに存在したのは9.2×10５cfuであり、ほぼ100,000倍に近い差があった。
【０１１１】
実施例8：圧力ショック滅菌
病原性ウイルスのモデルとして、新鮮凍結血漿に対して、10％グルコースおよび4mMカプリレートナトリウムで安定化した1ml当たり10８プラーク形成単位（pfu）のλバクテリオファージによるスパイク刺激を行う。50％エチレングリコールを含む血漿を、圧力伝達媒体を含む高圧容器に入れ、温度を-10℃で平衡化する。圧力を1秒間かけて150,000psiに上昇させ、その圧力にさらに1秒間保つ。続いて2秒間かけて圧力を開放する。血漿試料を取り出し、希釈物を大腸菌層の上にプレーティングする。血漿試料は感染性ウイルスを実質的に含まないことが見いだされている。血漿タンパク質を、HPLC、IgG抗原結合、HSAによるダンシルサルコシンの蛍光増強、および凝固因子の完全性を評価するための凝固アッセイを含むさまざまな方法によって分析する。
【０１１２】
実施例9：ウイルスの圧力増強型光化学失活
ウシ血清の試料に対して、1ml当たり10８プラーク形成単位（pfu）のλバクテリオファージを接種する。0.15mMのソラレンを添加する。試料を3つのアリコートに分ける。3つの試料を以下のように処理する：
（1）それ以上の処理を行わない
（2）30,000psiに加圧
（3）30,000psiに加圧し、同時にUVA光を10分間照射する。
【０１１３】
すべての試料を実験全体を通じて25℃の温度に保つ。圧力および光による処理は、試料をポリプロピレン製蓋付きの水晶瓶に入れることによって行う。この瓶をエタノールを満たした高圧分光セル（ISS、Champaign、IL）に入れて加圧する。並べた分光セルのウィンドウに固定した距離でUVA灯を照射することによって試料を照射する。処理後に、血清を連続希釈し、大腸菌と混合して寒天上にプレーティングする。37℃で一晩インキュベートした後に、加圧および加圧と照明の併用によるウイルス力価の相対的低下を調べるために、プレート上のプラークを計数する。試料#3において、試料#1および#2よりも有意に高度のウイルス失活が観察されている。実験をより低い濃度のソラレンを用いて繰り返すことにより、圧力とUVA光の併用がUVA単独で得られるものに類似した失活率が得られるが、治療的タンパク質の損傷はそれよりも軽度であるとの結果が得られている。類似の実験により、試料を加圧すると、必要な光強度または照射時間がより少なくて済むことが明らかになる。実験により、酸素とともに作用する核酸結合色素（例えばメチレンブルー）がソラレンで認められたものと類似の結果が得られる。
【０１１４】
実施例10：ウイルスの圧力増強型化学失活
ウシ血清の試料に対して、1ml当たり10８プラーク形成単位（pfu）のλバクテリオファージを接種する。試料を4つのアリコートに分割する。試料を以下のように処理する：
#1  処理せず
#2  0.1mMヨウ素を添加し、10分間インキュベートする
#3  0.1mMヨウ素を添加し、30,000psiで10分間加圧する
#4  30,000psiで10分間加圧する
【０１１５】
すべての試料を、実験全体を通じて25℃の温度に保つ。処理後に、反応を還元剤によって停止させ、血清を連続希釈し、大腸菌と混合した上で寒天上にプレーティングする。37℃で一晩インキュベートした後に、加圧および加圧と化学処理の併用によるウイルス力価の相対的低下を調べるために、プレート上のプラークを算定する。試料#3は、試料#2および#4から得られる低下の合計よりも、ウイルス力価（試料#1と比較して）が有意に低下することが見いだされており、このことは圧力およびヨウ素の相乗作用を意味する。類似の実験をより低濃度の化学添加剤を用いて行うことにより、圧力がより低濃度のヨウ素またはより短いインキュベーション時間で同等のウイルス失活を可能にすることが見いだされている。
【０１１６】
実施例11：凍結試料の圧力振動
出芽酵母（パン酵母）の培養物を30℃のYPD培地中で一晩増殖させ、細胞密度を光学顕微鏡によって算出した。酵母を10,000gでの1分間の遠心処理によって沈殿させ、PBSで洗浄した。上清を廃棄し、ペレットを270μlの溶解バッファー（2％Triton×100、1％SDS、100mM Tris-HCL（pH 8）、1mM EDTA）中に再懸濁した。酵母は使用時まで-20℃で保存した。酵母試料を、エチレングリコールを満たした加圧器具に入れ、-5℃に調節した。圧力を2000psiに上昇させて5分間おき、大気圧に低下させて5分間おいた。続いて試料を短時間ボルテックス処理し、細胞片を除去するために10,000gで1分間の遠心処理を行った。上清を収集し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールによる抽出によって精製して、DNAをPicoGreen蛍光色素（Molecular Probes、WA）によって定量した。この収量を、溶解バッファー中でのガラスビーズを用いたボルテックス処理によって破壊した対照試料と比較した（Rose、Winston、およびHieter、「Methods in Yeast Genetics」）。2000psiに加圧した試料では陽性対照におけるDNAの量の50％が得られたが、15,000psiに加圧した試料から得られたDNAは対照の10％に過ぎなかった。
【０１１７】
実施例12：HIVの失活
失活試験により、HIV-1を+4℃にて用量依存的な様式で容易に失活させうることが示された。HIV-1試料は80,000psiの10サイクルによって完全に失活したが（＞5 log）、50,000psiで処理したHIV-1試料には若干の残留感染性が残っていた。このため、50,000psiでのさらなる圧力処理を種々の温度で行った。圧力処理の後に、各100ulの試料を1mlに希釈し、感染性/TCID50評価のためにSUPT1細胞に一晩吸収させた。細胞を洗浄した後に24ウェルプレートに入れた。各条件に関して、それぞれ細胞4×10５個を含む6つの重複ウェルへのプレーティングを行い、37℃でインキュベートした。p24抗原分析のために無細胞上清を第14日および第28日に収集した。ウイルス力価は50％感染用量（TCID50）として算出し、その結果を以下のグラフに示している（「HIVのPCT（圧力サイクリング技術）失活：温度の影響」）。
HIVのPCT失活
温度の影響
2005519710.tif 000004
【０１１８】
これまで見てきた通り、50,000psiかつ+4℃で処理した試料には、残留HIV-1感染性があった（感染性は約3.5 log低下）。圧力処理を低温（-10℃または-30℃）または高温（+30℃）で行うことにより、HIV-1失活の量のさらなる低下（＞0.7〜1.7 log）が観察された。すなわち、低圧（≦10℃）または高圧（≧30℃）での加圧により、HIVのより効果的な失活を達成することができる。
【０１１９】
実施例13：圧力によるHIVおよびPPVの失活
高圧を用いて、包膜性ウイルスおよび非包膜性ウイルスの両方を失活させることができる。これまでの研究で、本発明者らは、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）および単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）などの包膜性ウイルスを、-10℃での50,000psiの10回のサイクルによって容易に失活させうることを示してきた。これに対して、パルボウイルスなどの非包膜性ウイルスを効率的に失活させるにははるかに高い圧力を必要とする。この場合には、ブタパルボウイルス（PPV）を非包膜性ウイルスのモデルとして用いた。以下のグラフ（「圧力によるウイルス失活」）は、これらの両方のウイルスの失活に関する圧力プロフィールを示している。見てとれるように、HIVは345MPa（50,000psi）で5 logを上回る程度に容易に失活するが、PPVは同等の失活を得るために最大550MPa（80,000psi）というより高い圧力を必要とする。しかしながら、包膜性ウイルスおよび非包膜性ウイルスの両方を低温での高圧によって失活させることが可能である。
圧力によるウイルス失活
2005519710.tif 000005
【０１２０】
実施例14：第VIII因子活性を保ちながらのパルボウイルスB19の失活
PCT失活の有望な用途の1つは、輸血または治療薬用の血漿中のウイルスの失活である。パルボウイルスB19などの耐性の強い非包膜性ウイルスを、治療特性を保ちながら失活させることは特に大きな課題である。これまでの研究で、本発明者らは、免疫グロブリンGおよびM（IgGおよびIgM）活性、ならびに凝固因子のいくつか（因子IX）を含む血漿の多くの生物活性が圧力に対して非常に安定であることを示してきた。他の因子、特に第VIII因子は非常に不安定であり、温度、化学的手段ならびに圧力によって容易に失活する。本発明の利点の1つは、失活条件（圧力、温度、サイクル数および圧力の持続時間）を、第VIII因子などの不安定タンパク質を保ちながら、非包膜性ウイルスでさえも最大限に失活させるように選択しうることである。
【０１２１】
高力価PPVを新鮮凍結血漿に添加した上でPCT処理を行った。-20℃での345MPa（50,000psi）の2分間×10サイクルは、第VIII因子活性の80％が保持される条件下で、PPVを3 log失活させることができた。
PCT処理血漿におけるfVIII活性に対する温度の影響
2005519710.tif 000006
【０１２２】
その後の失活実験により、多数回の極めて短い圧力パルス（10秒間上昇、20秒間低下のサイクルを60回）によってPPVのより高度の失活が得られ、第VIII因子は同程度に保持されることが示された。
【０１２３】
実施例15：圧力およびベンゾナーゼ（Benzonase）によるHIVの失活
ウイルスを高圧に曝露させると疎水結合およびイオン結合の不安定化を招き、水および他の分子がウイルスの内部に浸透することが可能になる（Silva、Trends in Biochemical Sciences、2001；Hummar、PNAS、1998；Paladin、Biochemistry 1981、Gorovitis, J Biol Chem.、1995）。感染性のある程度の失活は起こりうるものの、ウイルス核酸がキャプシド内に存在することが影響を安定化するものとして作用するため、感染性の不可逆的失活を達成するには非常に高い圧力が必要である（Prevelige、Biophys J、1994；Bonafe、Biochemistry、1998）。もう1つの一連の実験において、本発明者らは、HIVを35,000psiで失活させる点での、圧力とヌクレアーゼであるベンゾナーゼとの併用効果を評価した。この検討において、本発明者らは、培地中の低レベルのベンゾナーゼにより、圧力のみの場合よりもHIVの失活が＞2 log増加することを見いだした。ベンゾナーゼのみで圧力を用いない場合はウイルスの明らかな失活は認められなかった。これらの実験は、中程度の圧力であってもヌクレアーゼとの共同的な作用によってウイルスを不可逆的に不安定化させうることを示している。高圧により、ヌクレアーゼがウイルス内部に浸透して核酸を分解し、失活を不可逆的にすることが可能になる。
【０１２４】
実施例16：HIVおよびβ-プロピオラクトンの失活
圧力を、ウイルスを失活させることが知られた化学添加剤とともに用いることもできる。このような薬剤の1つがβ-プロピオラクトンであり、これはタンパク質と共有結合し、ウイルス失活試験のために一般に用いられる。β-プロピオラクトンを血漿に0.1〜0.25％として添加するとHIVを4-6 log失活させることが示されている。β-プロピオラクトンのレベルが低いほど有効性が低く、≦0.025％では1〜2 logの失活が得られる。-10℃での低レベル（例えば0.025％）β-プロピオラクトンと中程度の圧力（35,000〜50,000）psiの併用は圧力またはβ-プロピオラクトン単独よりも有意に高レベルのウイルス失活（4〜6 log）をもたらしうる。
【０１２５】
実施例17：血漿中の細菌種の失活
細菌は圧力によって容易に失活する。ヒト疾患と一般に関連のある一連の細菌、すなわちセレウス菌、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌の2つの種、緑膿菌および黄色ブドウ球菌の高力価培養物を血漿と混合し、-10℃での1分間のPCT処理10サイクルをさまざまな圧力で行った。しかし、総処理時間が同同じ静止圧を用いる同一の条件を比較のために用いた。以下のグラフ（「細菌の失活」）に示されているように、事実上すべての場合に、圧力サイクル条件による345MPa（50,000psi）によって効果的な失活（＞5 log）が達成された。重要なこととして、すべての場合に、圧力サイクリングの方が静止圧の場合よりも失活の程度がかなり大きかった。
細菌の失活
2005519710.tif 000007
【０１２６】
実施例18：乳中の細菌種の失活
PCTのもう1つの用途は、食品中の細菌の失活にある。この一連の実験において、本発明者らは新鮮な乳に一連の高力価細菌を添加し、実施例18のようにPCT処理を行った。上記の細菌に加えて、本発明者らはリステリア菌、蛍光菌および乳酸菌を検討した。この場合も、検討したすべての細菌種が圧力処理条件によって容易に失活した。バシラス属は低圧でも非常に容易に失活するが、ブドウ球菌または大腸菌の2つの種を失活させるにははるかに高い圧力が必要であることに注意されたい。
PCTによる細菌の失活
2005519710.tif 000008
【０１２７】
前の2つのグラフに示されているように、種々の細菌がさまざまな率で失活する。バシラス属は比較的低い圧力で失活するが、ブドウ球菌属はより高圧での失活を必要とし、リステリア菌はその中間のレベルである。同じく、バシラス属は高圧でも低いとはいえ明らかなレベルの生存性が残存しており、これはバシラス属の胞子がこの調製物に残存しているためと考えられる。胞子を失活させるためには、胞子の出芽を誘導するために中程度の圧力をまず加え、低圧で30分間〜数時間のインキュベートを行った後に、残留した生存物を失活させるために細菌にもう1回高圧処理を行う、異なる圧力アプローチが必要と思われる。
【０１２８】
痰の中の結核菌の診断といったいくつかの用途に対しては、種々の細菌の示差的失活が有益と思われる。マイコバクテリウムは圧力に対する安定性が極めて高いため、正常口腔細菌叢を失活させるには十分であるがマイコバクテリウムは生きた状態に残る中程度の圧力で痰試料を処理することにより、培養による鑑別診断が容易になると思われる。
【０１２９】
実施例19：酵素活性の示差的失活
ほとんどの酵素活性、特に酵素が構造の点で小型で単量体であるものは圧力に対して極めて安定である。その例には、アルブミン、免疫グロブリン、アミラーゼ、アルカリホスファターゼ、リパーゼおよび大部分のヌクレアーゼが含まれる。しかし、より複雑な、または多量体の酵素のいくつかは圧力による失活を受けやすい。以下のグラフ（「血清タンパク質活性に対するPCTの効果」）は、いくつかの一般に存在する血漿タンパク質を、ウイルスおよび細菌を顕著に失活させる条件下で実施例13および19に示した条件で処理した場合の圧力プロフィールを示している。
血清タンパク質活性に対するPCTの効果
2005519710.tif 000009
【０１３０】
いくつかの酵素、特にラクトースデヒドロゲナーゼ（LDH）、AST、および程度は落ちるがアラニンLトランスフェラーゼ（ALT）は、他のものよりも不安定である。しかしながら、検討した酵素活性の大半はPCTによるウイルス失活条件下で極めて安定である。適切な圧力、温度および添加剤の条件を用いることで、必要に応じて、より不安定な分子を保つことが可能である。
【０１３１】
実施例20：血中化学物質の安定性
ほとんどの血中化学物質は、PCTによるウイルスおよび細菌の失活条件下で極めて安定である。一般的に測定される血中化学物質には以下のものが含まれる：
2005519710.tif 000010
これらの化学物質はすべて80,000psiを上回る圧力下でも良好に保存される。このため、圧力は、診断用標本のように、これらの化学物質を保持する必要のある材料中の病原体を失活させるために容易に用いうる。血液化学検査またはほとんどの酵素活性検査用の臨床標本（実施例20参照）を、研究室でのアッセイの前にHIVなどの最も一般的なバイオハザードを失活させるためにPCTで処理することが可能であり、これにより、研究室の技術者にとって、特に未知の感染性因子を分析する必要のある場合の、標本の取り扱いがより安全になる。
【０１３２】
実施例21：病原体対照の失活
診断アッセイでは、未知の標本に対する適切な成績を確保するために内部対照および外部対照を必要とすることがしばしばである。現在、これらの対照の多くは培養ウイルスまたは感染性血漿に由来する必要があり、特別な搬送条件および研究室での取り扱い手順を必要とする感染性因子を含んでいる可能性がある。HCV RNAまたはHIV p24抗原の検出といった多くの場合には、一般に用いられるほとんどのウイルス失活法は、測定しようとする所望の核酸または抗原の力価も低下させる。PCTは所望の生物活性を保ちながら病原体を失活させる方法を提供する。これにより、標本を非感染性として搬送することが可能になり、材料を消費者に送る費用が大きく軽減されるほか、アッセイを行う研究室および技術者にもさらに高い安全性が付与される。
【０１３３】
実施例22：プリオンタンパク質の失活
プリオンは感染性のタンパク質性病原体であり、治癒しない致死性の脳疾患である伝染性海綿状脳症を伝染させることが知られている。高圧を、血液製剤またはアッセイ用の標本由来のプリオンを失活させるために用いることができる。プリオンは異常なフォールディングを起こしたPrPタンパク質の非常に大きな凝集物として存在するため、高圧単独、または種々の界面活性剤またはタンパク質結合剤との併用はこれらの構造の破壊および不安定化を助け、それらのアッセイを容易にするとともにその感染性を低下させると考えられる。
【０１３４】
実施例23：圧力失活に対する培地の影響
圧力がウイルスを失活させる能力、または生物活性を保持させる能力における重要な因子は、圧力処理が行われる培地である。以下のチャート（「種々の水性溶液におけるHIVのPCT失活」）は、血漿、培地および緩衝液におけるHIVの失活を比較して示している。高力価HIVをさまざまな希釈剤に添加した上で、-20℃での50,000psi 1分間のサイクルを10回行った。処理を培地中で行ったところはるかに高度の失活が観察され、PBS中では血漿で認められたものよりもさらに高度の失活が認められた。PPVの失活についても同様の結果が得られた。上記の試験および類似の試験により、ウイルスは血漿または高含量のタンパク質の存在下では失活から防御され、低濃度の塩またはタンパク質を含む水性培地中ではより容易に失活するることが示されている。重要なこととして、検討したすべての場合に、圧力サイクリングは、試料に対して適用した総処理時間の同じ静止圧よりも高度の失活をもたらした。
種々の水性溶液におけるHIVのPCT失活
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【０１３５】
その他の態様
本発明をその詳細な記載とともに説明してきたが、以上の説明は本発明を例示するためのものであり、その範囲を制限するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要がある。その他の面、利点および修正は以下の特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
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