(57)【要約】本発明は、Ａβペプチドに関連した病態または疾患を有する被検体の治療方法を提供し、この方法は被検体にＡβを認識する抗体を投与することを含み、この抗体は可溶性Ａβに10-9Mよりも高い親和性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体におけるＡβに関連した病態または疾患の認知症状の治療方法であって、可溶性Ａβに10-9Mよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む方法。
【請求項２】
Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の疾患の進行を低下させる方法であって、可溶性Ａβに10-9Mよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む方法。
【請求項３】
被検体におけるＡβに関連した病態または疾患の認識症状の治療方法であって、可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42に10-9Ｍよりも高い親和性(KD)を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む方法。
【請求項４】
Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の疾患の進行を低下させる方法であって、Ａβ1-40またはＡβ1-42に10-9Mよりも高い親和性(KD)を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む方法。
【請求項５】
被検体におけるＡβに関連した病態または疾患の認知症状の治療方法であって、可溶性Ａβ抗体に対して266が有する親和性よりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で投与することを含む方法。
【請求項６】
Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の疾患の進行を低下させる方法であって、可溶性Ａβに対して抗体266が有する親和性よりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で投与することを含む方法。
【請求項７】
抗Ａβ抗体が可溶性Ａβに対して10-10Mよりも高い親和性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗Ａβ抗体が可溶性Ａβに対して10-11Mよりも高い親和性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗Ａβ抗体が可溶性Ａβに対して10-12Mよりも高い親和性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗Ａβ抗体の親和性が可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42について測定されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
被検体がヒトであり、抗Ａβ抗体がヒトまたはヒト型抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗Ａβ抗体が、抗体266が認識するエピトープと同じエピトープを認識するか、または可溶性Ａβへの結合に関して抗体266と競合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
病態または疾患がアルツハイマー病である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
病態または疾患がダウン症である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
病態または疾患が、大脳アミロイド脈管障害である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
病態または疾患が脈管性痴呆である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
病態または疾患が軽度の認知障害である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ａβに関連した病態または疾患の認知症状を治療するための医薬を製造するための、可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42に対して10-9Mよりも高い親和性(KD)を有する抗Ａβ抗体の使用。
【請求項１９】
Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の疾患の進行を低下させるための医薬を製造するための、可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42に対して10-9Mよりも高い親和性(KD)を有する抗Ａβ抗体の使用。
【請求項２０】
Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の認知症状を治療するための医薬を製造するための、可溶性Ａβに対して抗体266が有するよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体の使用。
【請求項２１】
Ａβに関連した病態または症状を有する被検体の疾患の進行を低下するための医薬を製造するための、可溶性Ａβに対して抗体266が有するよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法で用いる医薬を製造するための、抗Ａβ抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮出願出願番号60/313,576(2001年８月17日出願)および米国仮出願出願番号60/383,851 (2002年５月28日出願)の優先権を主張する(これらは両方とも、特に本明細書中に参照して組み込む)。
【０００２】
本発明は医薬の分野におけるものである。より具体的には、本発明はＡβペプチドに関連した病態および疾患(アルツハイマー病、ダウン症、大脳アミロイド脈管障害、軽度の認知欠陥等)の治療の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
Ａβ内の特定のＮ末端エピトープを認識する抗体(凝集型Ａβ1-42に対して惹起されたポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体3D6および10D5等)の長期(数ヶ月)にわたる投与は、PDAPPマウスの脳におけるアミロイド斑を減少させた[Bardら、Nature Med. 6:916-919 (2000); Schenkら、WO00/72880、2000年12月７日]。Schenkは、抗体がＡβに対して106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1または1010 M-1より高い親和性を有する選択性の記載にもかかわらず、斑の減少の効力は凝集型Ａβに対する抗体親和性に関連しないことを見出した。これらの親和性は、凝集型Ａβに対する親和性に関するものに違いない。なぜならば、１）凝集型Ａβに関する親和性が特異的抗体に関する開示に具体的に記載されている唯一の親和性であり、２）この開示はワクチン接種用の凝集型Ａβによる活性な免疫化を報告しており、３）この開示は、凝集型Ａβに対して惹起されたポリクローナル抗体、または他の抗Ａβ抗体での受動免疫の後のＡβ斑の減少には、斑中の凝集型Ａβへの抗体の接着と、それに続く細胞媒介性の斑のクリアランスを必要とする、ということを報告しているからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
種々の研究が、凝集型Ａβの投与が、アルツハイマー病の動物モデルへの長期投与(数週間〜数ヶ月)後に記憶および認知に関する種々の試験における能力を改善することを示した[Weinerら、Ann. Neurol. 48:567-579 (2000)；Janusら、Nature 408:979-982 (2000); Morganら、Nature 408:982-985 (2000)]。しかしながら、これらの研究者は、凝集型Ａβ、そしておそらく凝集型Ａβに対して得られたポリクローナル抗体を用いた。認知を改善するために明らかにいくらか有効であるこのような処置は、非常に長期的なものであり、効率の悪いものである。さらに、抗原としてのＡβ型の使用は有害なものであるかもしれず、制御し難く、被検体間で非常に多様な免疫反応を生じる。
【０００５】
DeMattosら[Proc. Nat’l Acad. Sci. (USA) 98:8850-8855 (2001)]は、抗体266[Seubertら、Nature 359:325-327 (1992)]または4G8 [Shojiら、Science 258:126-129 (1992)](Ａβの13位から28位の間のアミノ酸のエピトープを認識する抗体)の投与後のＡβ抗体複合体を同定した。Ａβの他の部分を認識する抗体を投与した場合は、可溶性Ａβに対して4G8と同様の親和性を有する場合でさえ、複合体は観察されなかった。Ａβの13〜28の領域中のエピトープを認識する抗体は、複合体の形成を引きおこし、血漿中のＡβを隔離(隔絶)すると結論付けられた。Ａβに対する抗体の親和性は、血漿中のＡβの隔離に重要な因子ではないと考えられた。また、DeMattos は、266の投与が、投与後数時間以内にCNSから血漿への迅速で大量のＡβの流入を引き起こすことを示した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回、本発明者らは、抗体の投与後、最初の24時間以内でのＡβの流入速度が可溶性Ａβに対する抗体の親和性に関連していること、および可溶性Ａβに対してより高い親和性を有する抗体がより迅速な可溶性Ａβの流入を引き起こすことを見出した。最も驚くべきことに、認知能力の迅速な回復が特定の抗体の投与後24時間以内に観察された。相対的な回復の程度は、最初の24時間以内の可溶性Ａβの流入速度、および可溶性Ａβに対する抗体の親和性に相関していた。
【０００７】
本発明は、以前は認識されておらず、先行技術からは推論されていなかった、抗Ａβ抗体の重要な特性に対する初めての認識に由来する(事実、有効な抗Ａβ抗体の重要な特性は、認識する特定のエピトープ(例えば、Ｎ−末端)または凝集型Ａβに対する抗体の親和性のいずれかであると教示されていた)。新しく認識された、抗Ａβ抗体の重要な特性は、可溶性型のＡβに対する親和性である。可溶性Ａβに対してより高い親和性を有する抗体は、Ａβペプチドに関連する病態または疾患の処置においてより有効である。
【発明の効果】
【０００８】
発明の要旨
したがって、本発明はＡβペプチドに関連した病態(状態)または疾患を有する被検体の治療方法を提供し、この方法はＡβを認識する抗体を被検体に投与することを含み、この抗体は可溶性Ａβに対して10-9Mよりも高い親和性を有する。より具体的には、本発明は、被検体におけるＡβに関連した病態または疾患の認知症状の治療方法であり、可溶性Ａβに対して抗体266が有するよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む。より具体的には、親和性はＡβ1-40またはＡβ1-42に関するものである。
【０００９】
本発明は、Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体における疾患の進行を低下(減少)させる方法に関し、この方法は可溶性Ａβに対して10-9Mよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む。より具体的には、本発明はＡβに関連した病態または疾患を有する被検体における疾患の進行を低下させる方法であり、この方法は可溶性Ａβに対して抗体266が有する親和性よりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む。より具体的には、親和性はＡβ1-40またはＡβ1-42に関するものである。
【００１０】
また、本発明は、被検体におけるＡβと関連した病態または疾患の認知症状の治療方法を含み、この方法は、可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42に対して、10-9Mより高い、より具体的には抗体266の親和性よりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体を有効量で被検体に投与することを含む。
【００１１】
Ａβに関連した疾患の進行を低下させる、またはＡβに関連した病態または疾患の認知症状を治療するための医薬を製造するための、可溶性Ａβ1-40またはＡβ1-42に対して10-9Mよりも高い親和性(すなわち、抗体266よりも高い親和性)を有する抗Ａβ抗体の使用もまた、含まれる。さらに具体的には、本発明は、可溶性Ａβに対して抗体266が有するよりも高い親和性を有する抗Ａβ抗体の、Ａβに関連した病態または疾患を有する被検体の、認知症状を治療するため、または疾患の進行を低下させるための医薬の製造における使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
「認知(認識)(cognition)」は、短期記憶、長期記憶、精神集中(abstraction)、判断、言語、応用(練習)(praxis)、空間能力、行動または人格(personality)を意味する。認知は、広範な種々の試験のいずれか[Weinerら、Ann. Neurol. 48:567-579 (2000)；Janusら、Nature 408:979-982. (2000)；Morganら、Nature 408:982-985 (2000)；Dodartら、Neuroreport. 8:1173-1178 (1997)]および本明細書中に記載の方法を用いて非ヒト被検体で評価することができる。ヒトにおける認知は、以下に記載の試験のいずれか、およびアルツハイマー病評価尺度認知下位尺度(ADAS-Cog)(Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive subscale)構成要素[Rosenら、Am J Psychiatry 141：13561364 (1984)]のような試験を用いて評価することができる。ADAS-Cogは、痴呆を有する患者の記憶、言語能力および他の認知機能を簡単に評価する70ポイント試験である。
【００１３】
「被検体」は、哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。被検体が、被検体の脳における毒性型および／または集積した可溶性Ａβの存在により、引き起こされるか、またはこれらに関連した認知欠損または精神異常を有する場合に、被検体は本発明の恩恵を被る。被検体の脳におけるＡβの性質または濃度が確実に分っていないとしても、Ａβ関連疾患に罹患していると推測されるか、または知られている被検体を周知の認知試験で処理することは、本発明の方法の恩恵を受ける多数の被検体を同定するのに十分である。他の被検体に関しては、臨床評価、被検体病歴およびおそらく実験室または他の診断評価の組み合わせが、本発明の利益を受け得る被検体の同定に必要かもしれない。
【００１４】
言語、記憶、視覚空間機能、実行機能(予め獲得した情報、複数処理(multitasking)、抽象概念、判断力、計算力などを操作する能力)、人格および機嫌のような認知領域の精神状態の試験は、おそらく本発明により利益を受ける被検体を同定する際に助けとなる。見込み(probable)ADの診断の判断基準を満たす被検体(すなわち、痴呆、40〜90歳、２つ以上の認知領域の認知欠損、６ヶ月より長い欠損の進行、意識障害および他の妥当な診断の欠如)は、本発明により利益を受ける。同様に、ダウン症を有する被検体は本発明により利益を受ける。
【００１５】
ミニメンタル簡易痴呆検査(Mini-Mental State Examination)(MMSE)は、年齢および教育について調整された基準とともに、広く用いられている[Folsteinら、J. Psych. Res. 12:196-198 (1975)；Anthonyら、Psychological Med. 12: 397-408 (1982)；Cockrellら、Psychopharmacology 24: 689-692 (1988)；Crumら、J. Am. Med. Assoc'n 18:2386-2391 (1993)]。MMSEは成人における認知状態の、簡単な定量的測定である。認知欠損をスクリーニングするため、所定の時点での認知障害の重篤度を推定するため、時間経過にわたる個体の認知変化の経過を追跡するため、および治療に対する個体の反応を立証するために用いることができる。被検体の認知評価には、９ヶ月以上間を空けた追跡試験による正式な神経心理学試験が必要かもしれない(ヒトの場合)。本発明により処置される「認知症状」は、本明細書中に記載の通り、Ａβに関連した病態および疾患と関連していることが公知である認知欠損である。
【００１６】
検査室評価または構造的画像化研究により、可逆的な認知障害の原因を同定することができるかもしれず(おそらく本発明に反応しない）、そして局所性病変である脈管性痴呆に関係した重篤な白質疾患(重篤な一時的な萎縮)が同定されるかもしれない。ADでは、ポジトロン断層撮影法(PET)またはシングルフォトン断層撮影法(SPECT)等の機能研究は、通常、頭頂葉および側頭葉の両方で最も顕著な異常を示す。これらの研究は、通常の加齢に由来する初期のADまたは頭側頭葉型変性を区別する際に特に有用である。これらは、本発明により利益を受ける可能性のある被検体を同定するためには必要ではない。しかしながら、構造的画像化により決定される中央部の一時的な萎縮と、機能的画像化で測定される頭頂部欠損の組み合わせは、ADの有用なバイオマーカーである。MRIは、重篤な脳血管疾患を有する被検体を排除するために用いることができる。
【００１７】
ApoE遺伝子型決定は独立して有用ではないが、患者がE4対立遺伝子を有さず診断が疑問視される場合に、診断の特異性を上げることができる。別の強力なバイオマーカーは、脳脊髄液(CSF)Ａβ42およびtau濃度の複合評価である。低いＡβ42および高いtau濃度は、見込み(推定)ADという臨床診断に基づいて高い予測値 (90％)およびネガティブ予測値(95％)を有する。
【００１８】
「Ａβに関連した病態または疾患」は、１）脳の中のβアミロイド斑の発生、２）異常形態のＡβの合成、３）特に毒性形態のＡβの形成、または４）異常な速度のＡβの合成、分解またはクリアランス、に関連している病態および疾患を意味する。臨床的および発症前のアルツハイマー病、ダウン症候群、大脳アミロイド脈管障害、特定の血管性痴呆および軽度認知障害のような病態および疾患が、Ａβとの関連を有することが知れられているか推定されている。「疾患の進行」は、病態または疾患の兆候または症状が経時的に悪化することを意味する。
【００１９】
上記のアルツハイマー病は、Ａβに関連する最も多い疾患である(痴呆の60〜80％）。ADの明確な診断は、現在、検死を用いてのみ可能である。しかし、見込みADの診断はAD病理と非常に関連している。血管性痴呆(VaD)、レビー小体を伴う痴呆(DLB)および前頭側頭型痴呆(FTD)を合わせると痴呆の約15％〜20％を占め、他の障害(たとえば、水頭症、ビタミンB12欠乏症)は約５％を占める。これらのうち、特定の血管性痴呆のみが顕著なＡβ成分を有すると疑われる。
【００２０】
しばしばADへと進行する、認知問題に関する危険性の上昇または初期の徴候は、軽度認知障害 (MCI)と称される。MCIは、記憶欠損により特徴付けられる臨床概念であり、他の認知領域における重篤な機能不全および日常生活動作(ADL)機能の障害は伴わない。MCIの初期の診断および治療(本発明の使用を含む)が重要である。MCIを有する被検体の30〜50％が３〜５年以内にADを発症しているので、病状発現前のADの現在最も良い予測物は、MCIの診断である。被検体がADを発症すると推測することができるMCIの形態上の相関物の１つは海馬の体積である。MCIを有する被検体は年齢が同等のコントロールよりも小さい海馬を有しており、より迅速な速度で構造体の萎縮を受けると思われる。
【００２１】
「投与」は、製薬薬剤の被検体体内への導入行為を意味する。非経口経路は、本発明の方法における抗体の好ましい投与経路である。好ましい非経口経路としては、皮下、静脈内および腹腔内が挙げられる。
【００２２】
「有効用量」は、被検体に投与した場合に認知の改善を引き起こす抗体の量を意味する。有効用量での抗体の量は、熟練した医師または臨床薬理学者により、被検体の体重、年齢、性別、Ａβが関連する病態または疾患の重篤度、可溶性Ａβに対する抗体の親和性、投与経路、ならびに医師および薬理学者に周知の同様の因子、を考慮に入れて容易に決定することができる。有効用量は、例えば、抗体の総重量(グラム、ミリグラムまたはマイクログラム等)または抗体対体重の重量比(キログラムあたりのグラム(g/kg)、キログラムあたりのミリグラム(mg/kg)またはキログラムあたりのマイクログラム(μg/kg)等)で表すことができる。本発明の方法での抗体の有効用量は、１μg/kg〜100mg/kgの範囲である。本発明における有効用量に関してより好ましい範囲は、１μg/kg〜30 mg/kgの間である。さらにより好ましい範囲は、１μg/kg〜10 mg/kg、１μg/kg〜10 mg/kg、１μg/kg〜１mg/kg、１μg/kg〜0.3 mg/kg、および１μg/kg〜0.1 mg/kgである。
【００２３】
「Ａβペプチド」および「Ａβ」は、タンパク質分解切断によるアミロイド前駆体タンパク質(「APP」−アルツハイマー病アミロイドA4タンパク質[前駆体])に由来するペプチドを意味する。全長Ａβペプチドは、例えば、ヒトでは39〜43アミノ酸長である。全長Ａβペプチドはさらにインビボ切断をうけて、Ｎ末端、Ｃ末端または両方で１〜数アミノ酸だけさらに短いＡβフラグメントを生じ得る。可溶性全長Ａβペプチドまたはそのフラグメントを抗原として用いて、高い特異性および親和性で可溶性Ａβペプチドに結合する抗体を惹起させることができる。例えば、この目的のために用いられる多数のＡβペプチドフラグメントの中でも、Ａβ13-28フラグメント(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを介して抗CD3抗体と結合している)を用いて抗体266を惹起させた[Seubertら、Nature 359:325-327 (1992)]。可溶性Ａβの選択的測定のための抗体266の使用は周知である[Schenkら、米国特許番号5,593,846、5,766,846、5,872,672および6,284,221 B1]。「可溶性Ａβ」への結合の評価は、本明細書中以下に記載するように非凝集形、主に単量形のＡβを用いて行う。
【００２４】
「抗Ａβ抗体」との表現は、可溶性Ａβに結合する抗体を意味する。好ましくは、抗体は可溶性Ａβに高い親和性で結合する。抗体266の親和性よりも高い親和性が好ましい。10-9Mよりも高い親和性が好ましい。10-10Mよりも高い親和性がより好ましい。10-11Mよりも高い親和性がさらにより好ましい。10-12Mよりも高い親和性が非常に好ましい。文中の用語「Ａβ」は、インビボでのタンパク質分解によるAPPタンパク質由来の39、40、41、42および43アミノ酸ペプチド、およびこれらのペプチドの任意のフラグメント[例えば、これらのペプチドに由来するＮ末端で短くしたペプチド(例えば、x-42(ｘ＝１、２、３)で示されるもの等)、１-39、40、41および42ペプチドに由来するＣ末端で短くしたペプチド、両方の末端で短くしたペプチドのようなペプチド]を含む。表現「Ａβ40」は、40位で終了する、Ａβ Ｃ末端でのみ結合する抗体に結合するペプチドを表すために用いられる。表現「Ａβ42」は、42位で終了するＡβ Ｃ末端でのみ結合する抗体に結合するペプチドを意味する。
【００２５】
「親和性」は、１つの抗原結合部位の抗原性決定基との結合の強さを意味する。抗体と単独のハプテンまたは抗原決定基との間の結合の強さの基準である。親和性は抗体結合部位と抗原決定基との間の立体科学的な適合の親密さ、それらの接触領域のサイズ、および荷電基および疎水性基の分布に依存する。「アビディティ(親和力)」の概念を含み、これは可逆的な複合体形成の後の抗原抗体結合の強さを意味する。抗体親和性を測定するための最も直接的な方法は、周知の平衡透析法である。平衡透析よりも必要とする時間または材料が少ない方法が知られており、例えば、Griswoldらの方法(Immunology Letters 9:15-18 (1985))および本明細書中に記載の反応速度BIAcore法が挙げられる。BIAcore法は、表面プラズモン波が金属/液体界面で励起された時に生じる表面プラズモン共鳴(SPR)の現象を利用する。光はサンプルと接触していない側の表面に向けられ、そこから反射し、角度と波長が特定の組合せのとき、SPRは反射光強度の減少を生じる。２分子結合事象は表面層での屈折率に変化を起こし、SPRシグナルの変化として検出される。
【００２６】
解離定数(KD)および結合定数(KA)は親和性の定量的基準である。平衡状態では、遊離抗原(Ag)および遊離抗体(Ab)は抗原抗体複合体(Ag-Ab)と平衡状態にあり、個々の反応の速度は速度定数(kaおよびkd)で示される。
【数１】
2005500389.tif 000002
【００２７】
平衡状態では、ka [Ab][Ag]＝kd [Ag-Ab]である。解離定数KDは以下の式により与えられる：KD＝kd/ka＝[Ag][Ab]/[Ag-Ab]。KDは濃度の単位を有し、最も一般的には、M、mM、mM、nM、pM等である。KDで表される抗体親和性を比較した場合、Ａβに対する親和性が高ければ高いほど、より低い値で示される。結合定数KAは以下の式により得られる：KA＝ka/kd＝[Ag-Ab]/[Ag][Ab]。KAは濃度の逆数の単位を有し、最も一般的にはM-1、mM-1、μM-1、nM-1、pM-1等である。KAで表される抗体親和性を比較した場合、Ａβに対する親和性が高ければ高いほど、より高い値で示される。「可溶性Ａβに対する親和性」は、本明細書中に記載するように、Ａβ(通常、適度に凝集型を含まないＡβであるＡβ１-40またはＡβ1-42)のサンプルを用いて測定される。可溶性Ａβに対して高い親和性を有する抗体に関しては、本明細書中以下に記載するBIAcore法を用いる場合に特に注意しなければならない。
【００２８】
本明細書中で用いる用語「治療(処置)」は、処置される病態がすでに存在することが知られている場合の治療的処置、および予防、すなわち、病態の将来の発生の可能性の予防または改善を含む。用語「治療する(処置する)」は、徴候、症状、病態、疾患または障害の予防(防止)、暖解(減少または逆転)または排除を含む。
【００２９】
「抗体」は完全抗体を意味し、動物由来の抗体(マウス等)、キメラ、ヒト型、ヒト配列、組換え、トランスジェニック、グラフト型および単鎖抗体など、ならびにそれらの任意の融合タンパク質、結合体、フラグメントまたは誘導体を含むがこれらに限定しない。抗体は、タンパク質が抗原への結合部位を含み、この結合部位が３対の相補性決定基からなるという広い意味で、抗体に似ているタンパク質を含む。抗体は完全イムノグロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体またはこれらのうちのいずれかの免疫学的に有効なフラグメントを含む。抗体フラグメントまたは単にフラグメントは、Fv、ジスルフィド架橋型Fv、scFv、Fab、Fab’またはF(ab’)2フラグメントを意味し、この単語は当業者に周知である。本明細書中の文脈において、フラグメントは具体的に強調して記載されている。それ以外の場合にはフラグメントが特記されているかどうかにかかわらず、用語「抗体」がそのようなフラグメントならびに１本鎖形態を含むことが理解される。タンパク質が目的の標的に特異的に結合する能力を保持している限り、用語「抗体」に含まれる。また、定義「抗体」には単鎖形態も含まれる。好ましくは、しかし必ずしも必須ではないが、本発明に有用な抗体は組換え技術により産生される。体内での長期残留が望ましい場合、または中和抗体の発生危険性を最小にすることが望ましい場合のようないくつかの状況においてはグリコシル型抗体が好ましいが、抗体はグリコシル化されていても、グリコシル化されていなくとも良い。おそらく、ペプチドまたは他の化学的な鎖により鎖間で架橋が達成される特定のタイプを除いて、抗体はジスルフィド結合で正確に架橋されている。
【００３０】
基本的な抗体構造単位は、四量体であることが知られている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１本の「軽」鎖(約25kDa)および１本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主な抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を担う定常部を規定する。
【００３１】
軽鎖はκおよびλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして抗体イソタイプを規定する。IgGイソタイプが好ましい。IgGサブクラスの中でも、IgG1およびIgG4が好ましい。
【００３２】
各軽鎖／重鎖対の可変部は抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな非フラグメント抗体および特定のフラグメント(例えば、F(ab’)２フラグメント)は２つの結合部位を有するが、ほとんどのフラグメントは１分子あたり１つの結合部位のみを有する。鎖は全て、３つの超可変部(相補性決定基またはCDRとも呼ぶ)により連結された比較的保存されているフレームワーク領域(FR)の同じ全体構造を示す。各対の２つの鎖に由来するCDRをフレームワーク領域により整列させ特異的エピトープに結合しうるようにする。Ｎ−末端からＣ−末端で、軽鎖および重鎖は両方とも、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の配置は、周知の慣例に従って行う[Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991；Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothiaら、Nature 342:878-883 (1989)]。
【００３３】
「ヒト型抗体」は、非ヒト相補性決定基(CDR)を有する抗体の配列を変更することによりヒト抗体生殖細胞系に由来するアミノ酸配列により部分的または完全に構成される抗体を意味する。また、ヒト型抗体はCDR-グラフト型または再成型(reshaped)抗体とも称される。ヒト型イムノグロブリンは、マウス可変部およびヒト定常部を有するキメラ抗体は含まない。しかしながら、抗体の可変部、およびCDRでさえも、当該分野において現在周知である技術によりヒト型にされる。可変部のフレームワーク領域を、対応するヒトフレームワーク領域で置換し、非ヒトCDRは実質的にインタクトなままで残す。上記のように、本発明の方法での使用に関しては、抗体の免疫学的に特異的なフラグメント(単鎖形態を示すフラグメント)を用いれば十分である。
【００３４】
分子生物学の技術を用いて遺伝子操作したヒト型mAbを製造する方法は比較的単純であるが、異種(通常、げっ歯類)相補性決定基(CDR)のヒトフレームワークへの単純なグラフト化により常に本来のmAbの結合親和性および特異性が再構築されるとは限らない。遺伝子操作したmAbの設計は、本来の分子の機能の再生において重要な工程である。この設計は種々の選択を含む：CDRの範囲、用いるヒトフレームワーク、およびげっ歯類mAbからヒトフレームワーク領域への残基の置換 (バック変異(backmutations))。これらのバック変異の位置は、主に、配列/構造分析または可変域の3D構造のホモロジーモデルの分析により同定されている。近年、ファージライブラリーは選択した位置でアミノ酸を変更するために用いられている。同様に、多数のアプローチがげっ歯類CDRをグラフト化するための最も適切なヒトフレームワークを選択するために用いられてきた。げっ歯類可変部と高い配列同一性を有する可変部(ホモロジーマッチングまたはベストフィット)、コンセンサス配列または生殖系細胞配列、または種々の異なるヒトmAb由来の各軽鎖または重鎖可変部内のフレームワーク配列のフラグメントを用いることができる。あるいは、表面げっ歯類残基を、ヒトmAbで最も一般的に見出される残基で置き換えても良い(「再舗装(resurfacing)」または「被覆(veneering)」)。
【００３５】
本発明において重要であることが見出された特性を有する非ヒト抗体から開始するヒト型イムノグロブリンの設計は、以下のようにして行うことができる。ヒトフレームワーク領域に関しては、CDR提供(CDR-providing)非ヒトイムノグロブリンのフレームワークまたは可変部アミノ酸配列を、ヒトイムノグロブリン可変部配列コレクションの対応する配列と比較し、同一アミノ酸を高い割合で有する配列を選択する。アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合は、用いるヒトイムノグロブリン(アクセプターイムノグロブリン)のフレームワークアミノ酸を、CDR提供非ヒトイムノグロブリン(ドナーイムノグロブリン)由来のフレームワークアミノ酸により置き換える。
(a)アクセプターイムノグロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置のヒトイムノグロブリンにとっては異常であるが、ドナーイムノグロブリン内の対応するアミノ酸はその位置ではヒトイムノグロブリンにとっては典型的なものである。
(b)アミノ酸の位置はCDRの１つに直ちに隣接している。
(c)３次元イムノグロブリンモデルにおいて、フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、CDRアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム(中心〜中心)内にある[Queenら、Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 86:10029-10033 (1989); Coら、Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 88:2869 (1991)]。アクセプターイムノグロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸、およびドナーイムノグロブリン内の対応するアミノ酸はそれぞれ、その位置ではヒトイムノグロブリンにとっては異常である場合、このようなアミノ酸はその位置ではヒトイムノグロブリンにとっては典型的なアミノ酸により置き換えられる。
【００３６】
ヒト抗体は、公知の方法(例えば、ヒト免疫ドナー、ファージライブラリーおよびマウスのようなトランスジェニック動物由来)を用いて簡単に入手することができる。B細胞のEBV形質転換またはPCRクローニングおよびファージディスプレイのいずれかを用いて免疫ヒトドナーから抗体を回収することができる。合成ヒト抗体V領域の無作為組み合わせを用いる合成ファージライブラリーを作製することができる。抗原上での選択により、いわゆる「十分なヒト抗体」を製造することができ、これは本質的にV領域が非常にヒト類似であると推定される。トランスジェニックマウスはヒトイムノグロブリン生殖細胞遺伝子セグメントのレパートリーを有するように作製することができる。これらのマウスは、可溶性Ａβを用いて免疫すると可溶性Ａβに対するヒト抗体を作製する。
【００３７】
本発明に用いるための高親和性ヒト型またはヒト抗体の製造は当該分野において周知の方法(周知の技術を用いるモノクローナル抗体の製造および高親和性抗体に関するスクリーニング、または最初に適度な高親和性を有するモノクローナル抗体を同定し、次いで例えば、米国特許番号5,976,562、5,824514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、WO97/29131、Thomasら、J. Biol. Chem. 277:2059-2064 (2002)；Shreder, Methods 20:372-379 (2000)；Boderら、Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 97:10701-10705 (2000)；Chenら、J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)；Wuら、Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 95:6037-6042 (1998)；Hoogenbloom, Trends Biotechnol. 15:62-70 (1997)；Raderら、Curr. Opin. Biotechnol., 8:503-508 (1997)；Crameriら、Nature Medicine 2:100-102 (1996)；Crameriら、Nature Medicine 2:100-103 (1996)；Schierら、J. Mol. Biol. 255:28-43 (1996)；Yangら、J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)；Yangら、J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)；Yeltonら、J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Stemmer, Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) 91:10747-10751 (1994)；Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)；Huseら、Internat’l Rev. Immunol. 10:129-137 (1993)(これらのうちの各々の高親和性抗体の製造を有する部分を本明細書中に参照して組み込む) に記載されるような周知の方法を用いて親和性を改善することを含む)により行うことができる。
【００３８】
本発明で用いる抗体は組換え宿主中で最も都合よく発現されるか、周知の技術を用いて精製される[Pageら、Bio/Technol. 9, 64-68 (1991)；Carrollら、Mol. Immunol. 29, 821-827 (1992)；Colomaら、J. Immunol. Meth. 152, 89-104 (1992); Bebbingtonら、Bio/Technol. 10, 169-175 (1992)；Deyevら、FEBS Lett. 330, 111-113 (1993)；Benderら、Hum. Antibodies Hybridomas 4, 74-79 (1993); Norderhaugら、J. Immunol. Meth. 204, 77-87 (1997); Poulら、Eur. J. Immunol. 25, 2005-2009 (1995)、これらを各々本明細書中に参照して組み込む]。
【００３９】
本発明での使用に好ましい抗体は、266が結合するＡβ上のエピトープと同一のエピトープに結合する抗体、または266とヒトまたはマウスＡβとの結合を競合的に阻害する任意の抗体である。当業者であれば、任意の特定の抗体が266とヒトＡβとの結合を競合的に阻害するかどうかを周知の方法を用いてどのように決定するかを知っている。例えば、競合的ELISA方法を用いることができる。96ウェルELISAプレート(例えば、Nunc-Immunoプレート、カタログ番号439454, NalgeNunc)のウェルをＡβペプチド (１-40が特に好都合であるが、他の長さもまた使用することができる)でコーティングし、場合によりアルブミンのようなより長いタンパク質に結合させる。ウェルを洗浄した後、必要に応じてブロックし、次いでリンスして適当に乾燥させる。ビオチン化266抗体(例えば、ビオチン化ヒト型266、軽鎖として配列番号11に記載のアミノ酸配列および重鎖として配列番号12に記載のアミノ酸配列を有する)(最終濃度0.3μg/ml)等、および競合抗体(最終濃度750μg/mlから開始する３倍の系列希釈物)の混合物を１ウェルあたり最終容量100μｌで加える。競合物質なし、およびバックグラウンドコントロールを用いて実行する。ELISAプレートを適当な温度で適当な時間の間インキュベートし、次いでウェルを洗浄する。ウェルの洗浄後、HRP結合型ストレプトアビジン(カタログ番号21124, Pierce)または等価物を各ウェルに加える(例えば、１μg/mlを100μl)。プレートを室温で適当な時間の間(例えば、30分)インキュベートし、次いで完全に洗浄する。呈色させるために、ABTSペルオキシダーゼ基質(Kirkegaard & Perry Laboratories)(100μl/ウェル)または等価物を加える。呈色を停止し、吸光度を読み取る(例えば、415 nm)。吸光度を競合物の濃度のlog値に対してプロットし、曲線をデータ点に当てはめ(例えば、Prismまたは等価物を用いる)、当該分野で周知の方法を用いてIC50を決定する。266のIC50の100分の１よりも高いIC50を有する抗体は、266のＡβへの結合を競合的に阻害するとみなす。可溶性Ａβに対する抗体の親和性を、当該分野において周知の方法または本明細書中に記載の方法を用いて決定することができる。
【００４０】
抗体266はCDRとして以下のアミノ酸配列を有する。
【化１】
2005500389.tif 000003
【００４１】
266のヒト型バージョンでは、ヒトフレームワーク領域は、場合により、ヒト型抗体266の結合の強さ又は特異性を維持するために、マウス266由来の残基の１〜数個の残基の置換を有する[WO01/62801]。ヒト型266抗体の好ましい軽鎖可変部は以下のアミノ酸配列を有する。
【化２】
2005500389.tif 000004
［配列中、
２位のXaaはValまたはIleであり、
７位のXaaはSerまたはThrであり、
14位のXaaはThrまたはSerであり、
15位のXaaはLeuまたはProであり、
30位のXaaはIleまたはValであり、
50位のXaaはArg、GlnまたはLysであり、
88位のXaaはValまたはLeuであり、
105位のXaaはGlnまたはGlyであり、
108位のXaaはLysまたはArgであり、
109位のXaaはValまたはLeuである］。
【００４２】
ヒト型266抗体の好ましい重鎖可変部は以下のアミノ酸配列を有する。
【化３】
2005500389.tif 000005
［配列中、
１位のXaaはGluまたはGlnであり、
７位のXaaはSerまたはLeuであり、
46位のXaaはGlu、Val、AspまたはSerであり、
63位のXaaはThrまたはSerであり、
75位のXaaはAla、Ser、ValまたはThrであり、
76位のXaaはLysまたはArgであり、
89位のXaaはGluまたはAspであり、
107位のXaaはLeuまたはThrである］。
【００４３】
ヒト型266抗体の特に好ましい軽鎖可変部は以下のアミノ酸配列を有する。
【化４】
2005500389.tif 000006
【００４４】
ヒト型266抗体の特に好ましい重鎖可変部は以下のアミノ酸配列を有する。
【化５】
2005500389.tif 000007
【００４５】
ヒト型266抗体の好ましい軽鎖は以下のアミノ酸配列を有する。
【化６−１】
2005500389.tif 000008
【化６−２】
2005500389.tif 000009
【００４６】
ヒト型266抗体の好ましい軽鎖は以下のアミノ酸配列を有する。
【化７−１】
2005500389.tif 000010
【化７−２】
2005500389.tif 000011
【化７−３】
2005500389.tif 000012
【００４７】
本発明での使用に好ましい抗体は266のアナログであり、これは重鎖(配列番号５)のCDR2内でのN-グリコシル化部位がグリコシル化されないように遺伝子操作されている。このようなアナログは、Ａβに対して266より高い親和性を有し、軽鎖は、マウスモノクローナル抗体266(配列番号１〜３)由来の３個の軽鎖相補性決定基(CDR)を含み、重鎖はマウスモノクローナル抗体266由来の重鎖CDR1およびCDR3(それぞれ、配列番号４および６)および配列番号13により示される配列を有する重鎖CDR2を含む。
【化８】
2005500389.tif 000013
［配列中、
７位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし、８位のXaaがAspでもProでもなく、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではなく、
８位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaがSerまたはThrである場合、８位のXaaはAspまたはProであり、
９位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない］。
【００４８】
「任意のアミノ酸」は、天然に存在する任意のアミノ酸を意味する。好ましい天然に存在するアミノ酸は、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrである。
【００４９】
好ましい抗体群は、軽鎖CDR1〜CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3としてそれぞれ配列番号４および６の配列を有するものであり、配列中、重鎖CDR2の配列は配列番号13であり、
配列番号13の７位のXaaは、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択されるが、ただし、８位のXaaがAspでもProでもなく、９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではなく、
配列番号13の８位のXaaは、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択されるが、ただし、７位のXaaがAsnであり、９位のXaaがSerまたはThrである場合、８位のXaaはAspまたはProであり、
配列番号13の９位のXaaは、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択されるが、ただし、７位のXaaがAsnであり、８位のXaaがAspでもProでもない場合、９位のXaaはSerでもThrでもない。
【００５０】
好ましい群の別の説明は、軽鎖CDR1-CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3としてそれぞれ配列番号４および６の配列を有し、重鎖CDR2の配列が以下からなる群から選択されている、抗体またはそのフラグメントである：
１）配列番号１４
【化９】
2005500389.tif 000014
［配列中、
配列番号14の７位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号14の８位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号14の９位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択される］、
２）配列番号１５
【化１０】
2005500389.tif 000015
［配列中、
配列番号15の７位のXaaはAsnであり、
配列番号15の８位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択され、
配列番号15の９位のXaaはAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、TrpおよびTyrからなる群から選択される］、
３）配列番号１６
【化１１】
2005500389.tif 000016
［配列中、
配列番号16の７位のXaaはAsnであり、
配列番号16の８位のXaaはAspおよびProからなる群から選択され、
配列番号16の９位のXaaはSerおよびThrからなる群から選択される］。
重鎖のCDR2に好ましい配列としては、ただ１つのアミノ酸が変化している、アミノ酸２つのみが変化している、または３つ全てが変化している配列が挙げられる。７位のAsnを置換すること、または９位のThrを置換すること、または両方を置換することが好ましい。１、２または３個全ての位置での保存的置換が好ましい。最も好ましい種は、７位のAsnがSerまたはThrで置換されているものである。
【００５１】
本発明での使用に好ましい脱グリコシル型266抗体は、重鎖のCDR2内(すなわち、上記の配列番号13内)において、以下のとおりである；
７位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択されるが、ただし９位のXaaがSerまたはThrである場合、７位のXaaはAsnではなく、
８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
９位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択されるが、ただし７位のXaaがAsnである場合、９位のXaaはSerでもThrでもない。
【００５２】
好ましい脱グリコシル型266抗体の別の説明は、軽鎖CDR1-CDR3としてそれぞれ配列番号１〜３の配列、重鎖CDR1およびCDR3としてそれぞれ配列番号４および６の配列を有し、重鎖CDR2の配列が以下からなる群から選択されている、抗体またはそのフラグメントである：
１）配列番号17
【化１２】
2005500389.tif 000017
［配列中、
配列番号17の７位のXaaはAla、Gly、His、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号17の８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号17の９位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択される］、
２）配列番号18
【化１３】
2005500389.tif 000018
［配列中、
配列番号18の７位のXaaはAsnであり、
配列番号18の８位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
配列番号18の９位のXaaはAla、Gly、His、AsnおよびGlnからなる群から選択される］。
【００５３】
本発明での使用に好ましいヒト型抗体は、配列番号７の軽鎖可変部、および以下の配列番号19：
【化１４】
2005500389.tif 000019
［配列中、
１位のXaaはGluまたはGlnであり、
７位のXaaはSerまたはLeuであり、
46位のXaaはGlu、Val、AspまたはSerであり、
56位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし57位のXaaはAspでもProでもなく、59位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではなく、
57位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProであり、
58位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、57位のXaaがAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもなく、
63位のXaaはThrまたはSerであり、
75位のXaaはAla、Ser、ValまたはThrであり、
76位のXaaはLysまたはArgであり、
89位のXaaはGluまたはAspであり、
107位のXaaはLeuまたはThrである］
で示される重鎖可変部を有する。
【００５４】
本発明での使用に好ましいヒト型抗体は、配列番号９の軽鎖可変部、および以下の配列番号20：
【化１５】
2005500389.tif 000020
［配列中、
56位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし57位のXaaがAspでもProでもなく、59位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではなく、
57位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProであり、
58位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、57位のXaaがAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもない］
で示される重鎖可変部を有する。
【００５５】
本発明での使用に好ましいヒト型抗体は、配列番号11の軽鎖可変部、および以下の配列番号21：
【化１６−１】
2005500389.tif 000021
【化１６−２】
2005500389.tif 000022
【化１６−３】
2005500389.tif 000023
［配列中、
56位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし57位のXaaがAspでもProでもなく、59位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではなく、
57位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、58位のXaaがSerまたはThrである場合、57位のXaaはAspまたはProであり、
58位のXaaは任意のアミノ酸であるが、ただし56位のXaaがAsnであり、57位のXaaがAspでもProでもない場合、58位のXaaはSerでもThrでもない］
で示される重鎖可変部を有する。
【００５６】
配列番号19、配列番号20および配列番号21の重鎖可変部を有する好ましい脱グルコシル型266抗体は、以下に従う：
56位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択されるが、ただし、58位のXaaがSerまたはThrである場合、56位のXaaはAsnではなく、
57位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択され、
58位のXaaはAla、Gly、His、Asn、Gln、SerおよびThrからなる群から選択されるが、ただし、56位のXaaがAsnである場合、58位のXaaはSerでもThrでもない。
【００５７】
重鎖配列番号19、配列番号20および配列番号21のCDR2(56位、57位および58位)に好ましい配列としては、１個のアミノ酸のみが変化している、２個のアミノ酸のみが変化している、または３個全てのアミノ酸が変化している配列が挙げられる。56位のAsnを置換することが好ましい。58位のThrをSer以外のアミノ酸で置換することが好ましい。57位のSerをProまたはAspで置換することにより、266重鎖のCDR2中のN-グリコシル化部位を破壊しないことが好ましい。１、２または３個全ての位置での保存的置換が好ましい。最も好ましい種は、56位のAsnがSerまたはThrで置換されているものである。特に好ましい抗体は、配列番号19、配列番号20または配列番号21の56位がSerまたはThr、57位がSer、そして58位がThrであるものである。
【００５８】
最も好ましい種は、配列番号11の軽鎖および配列番号21の重鎖を含む抗体であって、配列番号21中、56位のXaaがSer、57位のXaaがSer、そして58位のXaaがThrである(「N56S」)か、または配列番号21中、56位のXaaがThr、57位のXaaがSer、そして58位のXaaがThr(「N56T」)である。
【００５９】
抗体(免疫学的に反応性のフラグメントを含む)を、上記のとおり確認した被検体に、標準的な非経口的な末梢投与方法を用いて、静脈内、腹腔内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、鼻内、経頬粘膜、舌下または坐剤での投与により被検体に投与する。好ましい投与経路は、静脈内、皮下および腹腔内である。
【００６０】
本発明に用いる抗体の許容可能な医薬製剤の製造(強度、賦形剤、pH、等張性、提示方法(presentation)、投与形態等)は、当業者に周知である。本発明で用いるための医薬組成物は選択した投与態様に適切であるべきであり、製薬上許容可能な賦形剤(緩衝化剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等)が必要に応じて用いられる。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, 最新版(本明細書中に参照して組み込む)は、通常、当業者に公知の製薬技術の概説を提供する。本発明で用いるための医薬製剤は、滅菌されているか、または少なくともほぼ滅菌されており、必要であれば保存化(preserved)されるか、または静菌的にされる。
【００６１】
以下の実施例は、本発明の限定ではなく例示を意図する。実施例はマウスの系で行った実験を記載しており、それゆえマウスモノクローナル抗体の使用は満足のいくものである。しかし、本発明の治療方法ではヒトでの使用を意図しており、ヒト型または十分なヒト抗体が好ましい。
【実施例】
【００６２】
実施例１
抗Ａβ抗体266の投与後の認知における迅速な改善
APPV717Fトランスジェニックマウス(PDAPPマウス、11ヶ月齢)を用いた[Gamesら、Nature 373:523-527 (1995)]。行動試験の前５日間、マウスを毎日、処理した。動物は全て、食餌および水を自由に摂取させた。室温(23±１℃)で、午前６時に明かりをつけて12:12時間の明暗サイクルで飼育した。明期間である午前８時〜午後２時の間に行動実験を行った。
【００６３】
物体認識課題は、げっ歯類が見慣れた物体よりも新しい物体を探索する無意識の傾向を有することに基づく[Ennaceur et Delacour, Behavioral Brain Research. 31:47-59 (1988); Dodartら、Neuroreport. 8:1173-1178 (1997)]。この課題は、ブラックPlexiglasTMオープンフィールド(50×50×40cm)で行った。識別する物体はビー玉(1.5 cm直径)およびプラスチックのさいころ(１辺1.8 cm)であった。各試行の後、物体は使い捨て手袋で扱ってアルコールに浸して匂いの印(olfactory cues)を取り除いた。実験の前に、試験環境に馴化させるために雄性マウスを数匹オープンフィールドにおいた。試験の最初の日に、マウスを空のオープンフィールドに30分間配置してマウスに習熟セッションを行い、コンピューター援用ビデオトラッキングシステム(San Diego Instrument, CA)を用いて移動距離(cm)を５分間隔で記録した。翌日、試行の間に３時間の間を空けて、マウスに10分の試行を２回行った。第１試行では、マウスに物体Ａ(ビー玉またはさいころ)を置いたオープンフィールドを探索させた。移動距離(cm)および物体の探索に費やした時間(物体から1cm以下の距離に鼻を向ける)を、それぞれ、ビデオトラッキングシステムおよび手で記録した。第２試行では、マウスに２つの物体：慣れた物体(「物体Ａ」)および新しい物体(「物体Ｂ」)(例えば、ビー玉およびさいころ)を置いたオープンフィールドを探索させた。
【００６４】
各動物に関して計算した認識指標は比で表した：(tB×100)/(tA＋tB)[式中、tAおよびtBは、それぞれ、物体Ａおよび物体Ｂで費やした時間である]。動物の処理状態を知らない観察者が物体探索時間を記録した。
【００６５】
マウス抗Ａβ抗体266 [「m266」, Seubertら、Nature 359:325-327 (1992)]および精製マウスIgG１イソタイプコントロール(Pharmingen)は、投与前にストック溶液からPBSで希釈した。動物にm266 (n=8、１mg/mL)、コントロールIgG溶液(n=8、１mg/mL)またはPBS (n=7)を習熟セッションの３時間前(第１試行の24時間前に対応する)に注射した(500μL、i.p.)。野生型マウス(WT)動物のさらなるコントロールグループを平行して物体認識課題(n＝６)で試験した。
【００６６】
第２試行の完了後、血液およびCSF液をサンプリングし、脳を３工程抽出方法を用いて処理した。第１工程は、サンプルを冷却PBSおよびプロテイナーゼインヒビター混合物 (CompleteTM, Boehringer-Mannheim, IN)中でホモジナイズする工程、続いて10,000 rpmで10分間、４℃で遠心分離する工程（この上清をPBS「可溶性」プールとみなす）から構成される。第２工程は、ペレットをRIPA (50mM Tris、150mM NaCl、0.5％ DOC、１％ NP40, 0.1％ SDSおよびCompleteTM, pH 8.0)に再懸濁する工程、続いて10,000 rpmで10分間、４℃で遠心分離する工程（この上清を「界面活性剤可溶性」プールと表す)から構成される。最後に、第３工程は、ペレットを5M グアニジン-HClに再懸濁する工程、チューブを室温で２時間振盪させ、続いて10,000 rpmで10分間、４℃で遠心分離する工程から構成される。この工程は「不溶性」プールを生じる。Ａβ40およびＡβ42を、ELISA [Balesら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:15233-15238 (1999)]を用いて各プールで定量する。
【００６７】
ELISAについて簡単に説明すると、モノクローナル抗体2G3および21F12を用いて、それぞれ40および42残基で終わるＡβペプチドを補足した[Johnson-Woodら、1997]。ビオチン型3D6はＡβ1-5領域を認識し、これをレポーター抗体として用いた。
【００６８】
血漿およびCSFサンプルのタンパク質を、4-20％ TBEゲル(Criterion gel, Bio Rad, CA)を用いて非変性条件下での電気泳動により分離し、CAPS緩衝液(CAPS 10 mM、0.01％ SDS、1％メタノール、pH 11)中でPVDFメンブレンに移した。SuperBlockブロック緩衝液(Pierce, IL)中で１時間ブロックした後、メンブレンをビオチン型3D6 (0.045 mg/ml)でプローブし、その後StreptAvidin (1:200000)と反応させ、SuperSignal West Femto (Pierce, IL)を用いて可視化した。
【００６９】
グループ間の行動データおよびＡβレベルを比較するために、Statview5 software (SAS Institute Inc., NC)を用いて一元配置または二元配置の分散分析 (ANOVA) および相関分析を行った。
【００７０】
図１に示すように、物体認識指標は処置グループ間で有意に異なった(グループ効果：F3,25＝25.085, p＜0.0001)。m266処置tgマウスの能力は、生理食塩水処置tgマウスおよびコントロールIgG処置tgマウスの能力よりも有意に高く(p＜0.0001)、WTマウスに匹敵した。物体認識指標は、生理食塩水-およびコントロールIgG処置tgマウスの間では異ならなかった。さらに、グループ内ｔ検定分析により、m266(t値＝9.526、p＜0.0001)処置tgマウスおよびWTマウス(ｔ値＝9.581、p＜0.0002)が偶然レベル(50％)を超えて実行することを確認したが、他方、生理食塩水およびコントロールIgG処置tgマウスは超えなかった (それぞれ、t値＝0.081および1.157、NS)。グループ効果分析もまた、第１試行(F3,25＝0.555、NS)または第２試行(F3,25＝0.679、NS)の間の全体的な物体探索時間にグループ間で差異は無いことを確認した。移動距離もまた、第１試行(グループ効果：F3,25＝1.326, NS)または第２試行(グループ効果：F3,23＝1.334、NS)の習熟セッションの間はグループ間で異ならないことを確認した(グループ×ブロック相互作用：F15,125＝1.455, NS；グループ効果：F3,25＝1.200、NS)。
【００７１】
m266の投与の後、ELISAにより検出されるように(図２a)、血漿サンプル中でＡβ40およびＡβ42ペプチドのレベルの両方が、生理食塩水およびIgG処置マウスと比較して有意に上昇した(p＜0.0001)。Ａβ40の上昇は、生理食塩水処置マウスと比較すると、約150倍であり、Ａβ42の上昇は約70倍であった。Ａβ40またはＡβ42のレベルはいずれも生理食塩水およびコントロールIgG処置マウスの間では異ならなかった。注目すべきことに、m266処置の後、両方のＡβペプチドの血漿レベルは、物体認識記憶能力と非常に相関していた(Ａβ40に関してはr＝0.774、p＜0.0001；Ａβ42に関してはr = 0.781、p＜0.0001) (図2b)。
【００７２】
CSFサンプルでは、Ａβ40のレベルはグループ間で有意に異なっており(F2,19＝4.798, p＜0.05)、m266処置動物は、生理食塩水またはコントロールIgG処置動物と比較して、ペプチドレベルの上昇を示した(p＜0.05、タンパク質１ml中のＡβ40レベル(ng)：生理食塩水 7.79±1.73；コントロールIgG、8.72±2.9；m266、16.57±3.25)。Ａβ42のCSFレベルの差異は、グループ間で観察されなかった(F2,19＝3.006、NS)。
【００７３】
大脳皮質では、PBS可溶性プールのＡβ40に関してのみ、グループ間で顕著な差異が観察された(F2,20＝7.785、p＜0.01)。m266処置マウスは可溶性Ａβペプチドの上昇を示した。海馬抽出物にはグループ間でＡβのレベルに顕著な差異は観察されなかった (データは示さず)。興味深いことに、物体認識能力もまた、CFSおよび皮質PBS可溶性プール中のＡβ40のレベルと有意に相関した(r＝0.491、p＜0.05およびr＝0.605、p＜0.01)。
【００７４】
11〜12ヶ月齢APPV717F tgマウスでの馴化(habituation)セッションの24時間前に、3D6を１匹あたり360μg投与すると、試験した８匹のマウスのうち２匹のみがOR能力が改善した(図８)(p＜0.05)。この改善は、可溶性Ａβに対して3D6よりも有意に高い親和性を有し、脳からのＡβの流入を3D6よりも有意に高く引き起こし得る抗体266を用いて得られた改善よりも、かなり有意性が低いものであった。
【００７５】
これらの結果は、可溶性Ａβに対して非常に高い親和性を有する(しかし、不溶性Ａβに対しては親和性が非常に低い)抗体の投与が、APPV717Fトランスジェニックマウスにおいて迅速かつ有効に物体認識記憶障害を逆転させることを実証した。この認知機能の迅速な改善は、血漿、CSFおよび皮質可溶性レベルのＡβに有意かつ著しい上昇を伴うが、脳不溶性プール中のＡβに重要な変化は伴わなかった。
【００７６】
実施例２
可溶性Ａβに対する親和性と相関する、抗Ａβ抗体投与の認知に対する迅速な効果
抗Ａβマウス抗体 21F12 (Ａβ42を認識するが、Ａβ40は認識しない)、2G3 (Ａβ40を認識するが、Ａβ42は認識しない)、4G8 (13と28の間でＡβに結合する)、10D5 (１-16を認識する)および3D6 (1-5に結合する)をトランスジェニックPDAPPマウスに、上記のように投与する。
【００７７】
次いで、これらの抗体を投与したマウスの能力を上記の物体認識試験で測定する。能力は、可溶性Ａβの抗体の親和性と正に相関する。すなわち、可溶性Ａβに対する抗体の親和性が高くなればなるほど、通常、抗体の投与後、短時間の間の認識試験の能力は高くなる。
【００７８】
抗体m266はより顕著な血漿中へのＡβの流入を引き起こし、m266の約1000分の１の可溶性Ａβに対する親和性を有する3D6のような抗体よりも早く、より完全な物体認識の回復を引き起こした。可溶性Ａβに対してより高い結合親和性を有する抗体は、より顕著な流入、および認識機能の有意により早く、そしてより良好な改善を引き起こす。
【００７９】
実施例３
単独の抗Ａβ抗体処置の後のAPPV717Fマウスにおける空間学習
被検体は雌性APPV717Fであり、野生型マウスは約11ヶ月齢であった。各マウスに、試験開始24時間前にマウス266抗体またはビヒクル(PBS)を355μg投与した(ip)。連続４日間、マウスをホールボード空間学習アッセイで試験した(図３)。４つの穴に１粒の食餌を入手可能に入れておき、残りの穴は入手可能ではないようにスクリーンの下に餌をおいた。試験前の晩と翌朝はそれぞれマウスを絶食させた。マウスは、１日あたり180秒の試行を４回試験した。試験は４日間連続で行った。
【００８０】
Ａβ抗体(266)の単回投与は、ビヒクル処置トランスジェニックマウスと比較して11ヶ月齢のAPPV717Fマウスの認知機能を有意に上昇させた（図４）。
【００８１】
４日目にはビヒクル処置WTマウスは全エラーが有意に減少したが、他方、抗体処置野生型マウスに関しては３日目と４日目にわたってエラー数は同等であった(図５)。
【００８２】
実施例４
24時間後の血漿および皮質可溶性Ａβ濃度に対する種々の抗体投与の効果
トランスジェニック(+/-)マウス(４ヶ月齢)に各抗体を355μｇ投与した(腹腔内)。サンプルは24時間後に得た。
【００８３】
表１．  種々の抗Ａβ抗体投与24時間後の皮質中の可溶性Ａβ42の濃度(μg/g)
【表１】
2005500389.tif 000024
【００８４】
表２．  種々の抗Ａβ抗体投与24時間後の血漿中のＡβの濃度(ng/mL)
【表２】
2005500389.tif 000025
【００８５】
抗体3D6の投与により、血漿Ａβ40およびＡβ42の上昇が生じた(それぞれ、６倍および８倍)。血漿Ａβ40およびＡβ42レベルは、同様に10D5の投与により上昇した(約3〜4倍)。抗体266の投与により、Ａβ40およびＡβ42の両方で非常に顕著な上昇が生じた (それぞれ、93倍および144倍)。
【００８６】
皮質組織由来の可溶性Ａβ40は266のみで顕著に上昇した。3D6または10D5の投与は脳内の可溶性Ａβ40のレベルに対する影響は有さなかった。
【００８７】
抗体投与の迅速な効果の別の試験では、266、3D6および4G8の各々を355μg、ipで半接合型PDAPPトランスジェニックマウス(３ヶ月齢)に投与した。サンプルは24時間後に得た。
【００８８】
表３．  種々の抗Ａβ抗体投与24時間後の血漿サンプル中のＡβ42濃度(ng/mL)
【表３】
2005500389.tif 000026
【００８９】
抗体の投与の迅速な効果に対する別の試験では、抗Ａβ抗体2G3(Ａβ40のＣ末端を認識するが、Ａβ42は認識しない)、10D5 (ＡβのＮ末端を認識する)および21F12 (Ａβ42のＣ末端を認識するが、Ａβ40は認識しない)を各々355μg、腹腔内で投与した。24時間後にサンプルを得た。血漿Ａβ42レベルの唯一の有意な差は10D5グループにあった。
【００９０】
表４．  種々の抗Ａβ抗体の投与24時間後の血漿サンプル中のＡβ42の濃度(ng/ml)
【表４】
2005500389.tif 000027
【００９１】
表５．  種々の抗Ａβ抗体の投与24時間後の皮質中の可溶性Ａβ40およびＡβ42の濃度(μg/g)
【表５】
2005500389.tif 000028
【００９２】
いずれのグループにおいても不溶性Ａβに顕著な差は存在しなかった。21F12および10D5の投与により、脳中の可溶性Ａβ40レベルの統計上有意な上昇が生じた。Ａβ42の可溶性レベルは、３種の抗体全てでの処置の後、顕著に減少した。
【００９３】
さらに別の試験において、266、3D6または10D5抗体の動物１匹あたり360μgの投与(１グループあたり動物５匹、生理食塩水コントロール)は、平均血漿Ａβ1-40を、それぞれ、約334、92および14倍上昇させ、平均血漿Ａβ1-42をそれぞれ約168、32および19倍上昇させた。これらの反応の相対値は、明らかに抗体の可溶性Ａβに対する相対的な親和性と直接関連している。
【００９４】
まとめると、24時間後の抗Ａβ抗体の投与の効果のこれらの研究は、血漿Ａβのレベルと可溶性Ａβ40およびＡβ42に対する抗体の親和性との間の強い相関関係を示す。また、24時間後の有意に高いＡβの流入(すなわち、266を3D6と比較して)を引き起こす。抗体は、同じ期間に認知の有意に高い回復を引き起こす。したがって、本発明者らは、認知における改善は可溶性Ａβに対してより高い親和性を有する抗体を投与した場合の程度で早く、および／または大きくなると考える。
【００９５】
実施例５
可溶性Ａβに対して種々の親和性を有する抗体の投与後の認知
可溶性Ａβに対して約１nM〜約１pMの間の親和性を有する抗体を入手するか、本明細書中に記載するように製造する。抗体を実施例１に記載のようにトランスジェニックマウスに投与する。可溶性Ａβに対してより高い親和性を有する抗体は、通常、投与後に短期間でより強いＡβの流入を生じ、また、認知の迅速な改善により強く影響を及ぼす。
【００９６】
実施例６
可溶性Ａβの結合親和性
可溶性Ａβに対する抗体親和性を、BIAcoreバイオセンサー2000を用いて測定し、データをBIAevaluation (v. 3.1)ソフトウェアで分析する。補足抗体 (ウサギ抗マウスIgまたは抗ヒトIg)を、バイオセンサーチップのフローセル２ (CM5)上でN-エチル-N-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびN-ヒドロキシスクシンイミド (EDC/NHS)を用いて、遊離アミン基を介してカルボキシル基にカップリングする。非特異的ウサギIgGをバックグラウンドコントロールとしてフローセル１にカップリングする。試験抗体を補足して300共鳴単位(RU)を得る。次いで、可溶性Ａβ1-40または1-42 (Biosource International, Inc.)を減少濃度でチップ上に流す (1000〜0.1×KD)。チップを再生させるために、結合型抗Ａβ抗体をグリシン-HCl (pH 2)を含む洗浄液を用いてチップから溶離させる。アミロイドβを含まないコントロール注入は、ベースラインの除去のためのコントロールとして役立つ。結合相および解離相を示すセンサーグラムを分析してkdおよびkaを決定する。この方法を用いて、１〜42、および／または１〜40に対する以下の抗体の親和性を決定し、表１に示す。抗体10D5に関しては２種類の親和性が見出された。
【００９７】
表６．  可溶性Ａβ1-40および／または可溶性Ａβ1-42に対する種々の抗体の親和性(nＭ)
【表６】
2005500389.tif 000029
【００９８】
図６では、流入対可溶性Ａβに対するlog親和性をプロットする。流入は、上記の実施例４に記載したように、抗体の投与24時間後の血漿Ａβ(40または42)の上昇倍率と規定する。親和性は上記の表２に示す。10D5は可溶性Ａβ42に対して明らかに極度に変動する２種類の親和性を有するので、10D5に関してはＡβ40に対するデータのみを用いた。可溶性Ａβに対する親和性と流入との間の明確な相関関係は明らかである。
【００９９】
図７に、Bardら、Nat. Med. 6:916-919 (2000)から得たデータを用いて流入データを凝集型Ａβに対する親和性に対してプロットする。抗体266は凝集型Ａβに結合しないことが報告されているので、データはプロットしていない。明らかに、凝集型Ａβに対する親和性と流入との間に相関関係は存在しない。
【０１００】
本明細書中に記載するように、抗Ａβ抗体の可溶性(凝集型ではない)Ａβに対する親和性は、抗体投与後24時間以内の、脳由来のＡβの血漿内への流入と正に相関している。さらにまた、Ａβの流入速度は実施例１および図２に記載の認知能力の急速な改善と関係している。可溶性Ａβに対してより高い親和性を有する抗体はより顕著な流入を引き起こし、Ａβに関連した病態および疾患での認知機能の改善に、より迅速でより顕著に影響を与える。さらに、Ａβの可溶性形態に対して高い親和性を有する抗体の長期的な投与は、より効率的に、脳由来のＡβの流入を生じさせ、そして脳組織からＡβを引き離し、これはＡβに関連する病態および疾患を妨げる。最終的に、本発明者らは可溶性(不溶性または凝集型ではない)形態のＡβに対する高い親和性が、Ａβ関連病態および疾患における認知障害を治療するための抗Ａβ抗体の重要な特徴であることを本発明において実証する。本発明者らはまた、可溶性(不溶性または凝集型ではない)形態のＡβに対する高い親和性は、Ａβ関連病態および疾患における認知障害を治療するための抗Ａβ抗体の重要な特徴であると考える。
【０１０１】
実施例７
可溶性Ａβに対する高い親和性を有する抗体の結合親和性の、別の決定方法
この方法は、上記実施例６で用いた方法と非常に類似するが、以下に記載するいくつかの改変を伴う。プロテインＡまたはプロテインA/GをアミンカップリングによりB1またはCM5センサーチップ(BIAcore)のフローセル１および２に固定化する。ついで、試験抗体を所望のレベル (通常、10〜60秒の抗体注入)でフローセル２に補足させ、５分間、抗体を安定化させる。凍結Ａβ1-40溶液にアリコートを融解し、ついで希釈して最高濃度 (例えば、200 nM)をつくり、ついでこれを最低濃度(例えば、6.25nM)まで系列希釈する(1：2の希釈)。各濃度を流速50μL/分の流速で５分間、表面に注入する。高親和性抗体に関してオフ速度(off-rate)の正確な測定を得るために、Ａβ1-40の解離を５時間追跡する。ついで、Ａβ1-40および抗体を、40秒間のグリシン(pH1.5)の注入で両方のフローセルから溶離させる。次のサイクルの前に、シグナルを２分間安定させる。フローセル１のデータをフローセル２のデータから差し引き、緩衝液の差異またはセンサーチップまたはプロテインＡに対する非特異的的結合による任意のバルクシフト(bulk shifts)を明らかにする。種々の濃度を無作為に注入し、各濃度は２連で行う。２回の0nMでの実行を、プロテインAまたはA/G補足表面からの抗体の解離を制御するために用いる。Biaevalutionソフトウェアを用いてデータを分析する。物質移動(mass transfer)および極所的Rmaxを有する１：１モデルを、データにもっとも適したものとして用いる。
【０１０２】
この代替方法を用いて、可溶性Ａβ1-40に対するヒト型266抗体の親和性は0.4 M-9 (± 0.2 M-9)であることを見出した。この親和性の値を、他の抗体に関するデータ(上記)とともに用いて、log(流入)対log(可溶性Ａβ1-40に対する親和性)をプロットした (図８)。可溶性Ａβに対する親和性と流入との間の非常に明確な相関関係は以前明らかなままである。
【０１０３】
可溶性Ａβ1-40ストックおよび希釈サンプルは以下のように製造する。固体Ａβ1-40 (Biosource International, Camarillo California USA 93012)を水に１mg/mL (約230μM)で溶解し、この溶液をすぐに20-50μLにアリコートし、ついで凍結させる (-70℃)。Fezouiら、Amyloid：Int'l J. Exp. Clin. Invest. 7:166-178 (2000)に記載のように、アルカリ条件を用いてＡβを溶解する。凝集型を含まない可溶性ストックＡβ溶液の別の製造方法はZagorskiら[Meth. Enzymol. 309:189-204 (1999)]の方法である。この方法は、順番に、ペプチドをトリフルオロ酢酸(TFA)に溶解すること、TFAを留去すること、ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)に再懸濁すること、HFIPを除去すること、および水に溶解することを含む。アリコート、および凍結は、HFIPの除去前または後のいずれかで行うことができる。ストックＡβ溶液は、当該分野で周知の方法、例えば、光散乱 [Tomskiら、Arch. Biochem. Biophys. 294:630-638 (1992)]、チオフラビンＴ結合 [LaVine, Meth. Enzymol. 309:274-285 (1999)]またはコンゴレッド結合[Klunkら、Anal. Biochem. 266:66 (1999)]により凝集に関してチェックすることができる。使用直前に、ストックアリコートを融解し、用いる最高濃度まで希釈する(通常、約200nMまで約1000倍希釈)。この1000倍希釈したサンプルは主に１量体である可溶性Ａβを含むと予測される。Ａβは自己会合する傾向が強いので、記載したように注意深く製造した場合でさえ、Ａβのサンプルは少しの割合のＡβ２量体(特に)、そしておそらくやはり高次の会合状態を含有するかもしれない。ストックアリコートは融解した後は凍結しない。ストックアリコートは融解した日の後は使用せず、また希釈したサンプルも調製した日の後は使用しない。
【０１０４】
実施例８
雄性カニクイザルでの種々のヒト型抗体の投与24時間後の血漿Ａβ濃度に対する影響
動物(２〜４kg、成体初期〜成体、１グループ動物２匹)に抗体(１mg/kg；ヒト型266−配列番号NO:11および配列番号12を発現するように形質転換した宿主細胞中で発現；N56S-配列番号11および配列番号21を発現するように形質転換した宿主細胞中で発現；またはヒト型3D6−米国特許出願60/287,539、2001年４月30日出願)を静脈内ボーラス投与した。動物を、ステンレス鋼のケージで個別に飼育した。環境コントロールは、18〜29摂氏度、相対湿度30％〜70％、明12時間/暗12時間サイクルを維持するように設定した。認可されている霊長類食餌を１日１回または２回与えた。水は自由に摂取させた。動物は、体重、臨床上の観察、臨床上の病理データおよび必要な場合には他のデータに基づき、試験のために選択した。血漿サンプル (投薬前および投薬24時間後)をEDTA中に回収し、分析まで凍結した。
【０１０５】
免疫反応性のＡβ1-40またはＡβ1-42の血漿濃度を、ELISAアッセイを用いて決定した。免疫反応性Ａβ1-40をマウスモノクローナル抗体2G3を用いてELISAプレートで補足するか、またはＡβ1-42をマウスモノクローナル抗体21F12を用いて補足した。結合した複合体をビオチニル型3D6抗体を用いて、続いてストレプトアビジン-HRPを添加して検出した。呈色は、TMBを基質として用いて行った。光学密度値を450/630nmで読み取り、生データをSTATLIAソフトウェア (Brendan Scientific)を用いて５パラメーターロジスティックアルゴリズムで分析した。免疫反応性Ａβ1-40の血清濃度を、熱処置した活性炭処理(charcoal stripped)ヒト血清中で調製した16〜1000 pg/mlの範囲の校正を用いて推定した。コントロールサンプルの回収率および校正のバックフィット(back-fit)に基づき、このアッセイでの定量の下限および上限を、それぞれ、50および1000pg/mlと推定する。Ａβ1-40に対する結果は以下の表７に示す。投与前濃度が検出限界未満だったので、Ａβ1-42に対する流入は計算できなかった。
【０１０６】
表７．  カニクイザルでの免疫反応性抗体およびＡβ1-40の平均濃度 (１グループあたり動物２匹)
【表７】
2005500389.tif 000030
ヒト型266およびN56Sの投与24時間後の血漿Ａβ1-40の増加は、ほぼ同じであり、ヒト型3D6の投与後の上昇よりもかなり高い。通常のサル(すなわち、Ａβ代謝に影響を与える任意の既知の欠損または任意の既知のＡβ関連病態または疾患を有さない)で得られたこれらのデータは、本明細書中に記載のマウス試験、すなわち、抗体投与24時間以内の可溶性(凝集型ではない)Ａβに対する抗Ａβ抗体の親和性が脳から血漿へのＡβの流入と正に相関していることと一致した。N56Sは、ヒト型266または3D6よりも速いターンオーバーを有している(投与量は同じであるが、血漿中、N56Sの5.5倍の266、および8.6倍の3D6)。従って、存在する抗体の濃度に対して正規化した場合、N56Sに関して24時間目のＡβ1-40レベルは、本発明に基づき予測されるように、ヒト型266に対するものより高く、これはN56Sが可溶性Ａβに対してヒト型266よりも高い親和性を有するためである。266および3D6により引き起こされる流入の差異は、本明細書中に記載の他の実験で用いたサルまたはマウスのいずれかにおける２種の抗体の薬物動態での差異に起因するかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】m266抗Ａβ抗体の投与24時間後の、物体認識記憶能力。認識の指標は、試行２(テスト試行)の間に新規な目的物を調査するために費やした時間の割合である。生理食塩水およびコントロールのIgGで処理したtgマウスは両方とも偶然レベル(認識指標＝50％)で実行したが、他方、m266で処理したtgマウスおよびWTマウスは偶然よりも有意に高く実行した(ｔ検定分析)。値は平均±SEM；**はp＜0.0001(生理食塩水およびIgG処理したtg群に対して)を表す；＃＃はp＜0.0001(野生型(WT)マウスに対して)である。
【図２】m266の投与24時間後の血漿Ａβ40およびＡβ42レベル。血漿レベルは物体認識記憶能力に相関した。(Ａ)両方のペプチドの血漿レベルは、生理食塩水またはコントロールIgGで処理したtgマウスと比較して、m266を急速に投与したAPPV717Ftgマウス中で顕著に上昇する。値は平均値±SEMである；(Ｂ)二変量散布図は、Ａβの血漿レベルおよび物体認識記憶能力の間に非常に有意な相関を示す。
【図３】ホールボード空間学習アッセイ用に用いた装置。
【図４】急速なＡβ抗体治療は、APPV717Fマウスにおける参照記憶を改善した。
【図５】急速なＡβ抗体治療は、APPV717Fマウスにおける全エラーを減少させた。
【図６】Log(Ａβ流入)とLog(可溶性Ａβに対する種々の抗Ａβ抗体の親和性)の間の相関関係。
【図７】Log(Ａβ流入)およびLog(不溶性Ａβに対する種々の抗Ａβ抗体の親和性)の間の相関関係の欠落。
【図８】266または3D6抗Ａβ抗体の投与24時間後の物体認識記憶能力(＊はp＜0.05(生理食塩水またはIgGに対する)を意味し、＊＊＊はp＜0.001(生理食塩水またはIgGに対する)を意味する。
【図９】Log(Ａβ流入)およびLog(改変BIAcore法を用いた可溶性Ａβに対する種々の抗Ａβ抗体の親和性)の間の相関関係。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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