(57)【要約】  本発明は小分子有機塩素剤農薬に対する卵黄抗体を生産する方法に関連し、当該方法は、家禽鳥類の胸部筋肉において所望のハプテン−タンパク質接合体により周期的免疫化をすること及び当該抗体を５週間隔で卵黄から収穫することを含んで成る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法であって、当該方法は：
（a）適切な家禽鳥類を選択し；
（b）前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該各アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H３７Ra、ATCC２５１７７）１mg、０．８５mlのパラフィン及び０．１５mlのマンニドモノオレエートを含んで成り；
（c）前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、２，４，５トリクロロフォキシ酢酸βアラニンから選択された接合体１０００μgで免疫し；
（d）前記鳥類を再度、段階（c）で示したハプテン−タンパク質接合体、５００μgの所望のハプテン接合体で免疫し；
（e）前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で２、３及び５週の間隔にて免疫し；
（f）この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り５週間隔にてハプテン−タンパク質接合体で免疫せしめ；
（g）前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記所望のハプテン−タンパク質接合体が、DDT、エンドスルファン及びヘキサクロロへキサンに対する結合特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対し結合するDDT−OHを生産する方法であって、
（a）２，２−ビス（４−クロロフェニル）−１，１，１−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用しスクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し；
（b）N−ヒドロキシスクシンイミド１８３．５mg、０．５mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下１：１：１：１．２（ハプテン：NHS：DCC：DMAP）の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ；そして
（c）ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンを生産する方法であって：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中、加熱することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を、約３．０２gの収量、融点２３８℃で獲得し、１．０９g；
（g）前記生成物を処理しプレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（c）のように、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体ハプテン、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニン(TCB)ハプテンを生産する方法であって：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン(９mmol、７．４mlの１MのNaOH中０．６６g）と０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e) 生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物ハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露らすことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の単一のスポットが、融点１６９〜７０℃の融解範囲にて示され；
(l) 融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加えてこの混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄（yolk）を破裂せずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液塩類溶液を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清に対して水溶性タンパク質画分１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄を、卵黄膜を破裂させることなく卵殻から獲得し；
(b)各１０mlの卵黄ごとに、１０mlの蒸留水を加え；
(c)約０．１５％のκカラーギナンを加えて３０分に渡り室温で撹拌し；
(d)この溶液をろ過して１５分に渡り遠心し；
(e)２０mMのリン酸緩衝液pH８．０により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ；
(f)０．２Mのリン酸緩衝液pH８．０で溶出せしめ；
(g)溶出物を回収して２８０nmでの吸光度を読み；そして
(h)抗体を含有するピーク画分をプールして４℃で保存する、
ことでも行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで２度沈殿され、そして遠心され、上清から抗体を最大７５％の収率で獲得する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、８０〜９０％の収率で獲得するために、pH５．０に調整されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗体の収率が７３％程度である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
超免疫卵(hyper immune egg)が毎日回収され、そして更なる使用迄４０℃で保存されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の生産が免疫化後、第７日目に始まり、そして６０日に渡り続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生産された抗体の力価が１６５〜２２５mg／mlである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル／モノクローナル抗体に対し、一層／同等の感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記卵黄抗体の生産が農薬の小分子に関連する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体の生産に関連する。本発明は、所望のハプテン−タンパク質接合体による家禽鳥類の胸部筋肉での周期的免疫化にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
有機塩素系農薬は、組織中に蓄積する殺虫剤の一般に大多数を占め、そしてそれらは非常に長い半減期を有するので分解することが難しい。
【０００３】
有機塩素系殺虫剤は作物の、穀物、果物、野菜、マメ科植物、綿、コーヒー及び茶、森林の処理、公衆衛生及びイエ蚊／マラリア抑制計画のために幅広く使用されている。
【０００４】
小有機分子の農薬などは、それら自身、免疫原性ではないが、タンパク質など適切な担体に対する化学接合後に免疫原性になりうる。接合と担体タンパク質の部位と性質は、生産される抗体の特異性と親和性に対して、当業者が十分には予測できないような態様で影響を及ぼす。例えば、DDA−GABA（ウシ血清アルブミンと結合した本発明中で使用されているハプテンに対して非常に関連のある化合物）の調製で、DDTと有用に反応する抗血清を生産する接合体は生産されなかった（Amitarani，B.E.，Akmal Pasha and Karanth N.G.K.（１９９８，データ未公開））。
【０００５】
近年、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）を生産する技術が開発されてきており、それにより非常に相同性が高く、非常に特異性の高い抗体が生産可能になる。一般に、ポリクローナル抗体は診断産業において非常に良く使用されている。最も共通して、それらは、ウサギ、マウス、ラット、ウマ及びヒツジなどの動物中で発生せしめられている。この形態の抗体生産法は、いくつかの不都合な点を有し、それは大型のホニュウ動物は維持するの支出がかさむことであり、しかも小型のホニュウ動物は抗体を少量しか生産しないことだ。加えて、動物から血液を周期的に引き出すことに対する要請がある（Deignanら、２０００）。獲得されるIgG（抗体）の量は通常３〜８mg/ml血清である。この方法には、抗体を獲得するためにウサギを数回出血せしめることも伴い、何故なら、力価が２〜３回のブースト後第８〜１０日目の間でのみ最高であるからだ。モノクローナル抗体は、動物をタンパク質で免疫化し、当該動物から抗体生産細胞を獲得し、そして当該抗体生産細胞とメラノーマ細胞の系統即ち、腫瘍細胞とを融合せしめ、モノクローンとして単離されて培養されるハイブリドーマを生産する、ことによって生産されている。モノクローナルハイブリドーマは、in vitroで培養されているかあるいは細胞、腹水流体もしくは腫瘍を含む宿主動物の血清いずれかに由来しうる。各抗体生産細胞は単一のユニーク抗体を生成するので、ハイブリドーマの各モノクローナル培養により同族抗体が生産される。ハイブリドーマクローンの全てではなくて、メラノーマ細胞と抗体生産細胞との融合によりもたらされるものが、所望の農薬（又はかかるクラスの分子の農薬特性を示す官能基）に対して特異的であり、何故なら、多くのハイブリドーマが抗体を生産するだろうし、そしてそれが接種された動物は外来物質との反応を引き起こしているからである。対象抗原に対する抗体がクローンごとに異なっていてさえも、抗体は様々な細胞によって生産されているので、同分子の様々な抗原決定基と反応しうる。従って、各クローンから生じる抗体を獲得し、そしてその対象農薬との反応性の試験を行い、そしてその特異性を、どのような有機塩素系農薬がそれを認識するか詳細に特定することによって、試験することが必要である。更に、所定の抗体又は抗血清機能のみを特異的免疫アッセイ形式又は構成において特定することも必要である。Polson及びLoshe、Uの米国特許第４，３８７，２７２号及び４，５５０，０１９号は、卵黄抗体の生産を主張し、そして免疫の受身伝達の多くの用途において使用されている。
【０００６】
Stolleらの米国特許第４，７４８，０１８号は、卵黄の経口摂取を繰り返すよってHEYに対する寛容性を予め高め、しかる後に、選定の細菌抗原に対するHEY抗体の腹腔内注射することを含んで成る細菌感染に対する受動免疫化の方法を開示している。
【０００７】
Tokoroらの米国特許第５，０８０，８９５号は、抗細菌雌鶏卵黄抗体の経口投与よる新生子豚の大腸菌（E.Coli）赤痢の予防法を開示している。
【０００８】
Hamada、S.、Infection and Immunity Vol.５９（No.１１）：pp.４１６１〜４１６７（１９９１）及びOtake、S.、J.Dental Research Vol.７０(No.３）：pp.１６２〜１６６（１９９１）を参照にすれば、経口的にS.ミュータンス（S.mutans）に対する雌鶏卵黄抗体を経口的に投与する受動免疫化の手段によってラットを虫歯から保護するBeckの結果を再現している。
【０００９】
Bartz.Cら、Infectious Disease Vol.１４２（No.３）：pp.４３９〜４４１（１９８０）を参照にすれば、免疫化された雌鶏の卵の水溶性断片を経口投与することによってマウスにおけるマウスロタウィルス感染症を予防している。
【００１０】
Yokoyama、H.ら、Infection and Immunity Vol.６０（No.３）：pp.９９８〜１００７（１９９２）を参照にすれば、免疫化された雌鶏の卵に由来する粗製の卵黄免疫グロブリン断片を経口投与することによって腸管毒素原生大腸菌感染症から新生子豚を受動的に保護することに成功している。
【００１１】
Yolken、R.らの動物の研究、Pediatrics、Vol.８１（No．２）：pp.２９１〜２９５（１９８８）；及びJournal Clint Immunol Vol.１０（No.１０）：８０S〜８７S（１９９０）を参照にすれば、ヒトのロタウィルス感染症など腸管感染症の予防と治療のために抗ウィルス性HEY免疫グロブリンを経口投与することを提案している。免疫グロブリンの経口投与するための方法と処方は公知である（Hardieの米国特許第４，４７７，４３２号）。しかし、農薬など小分子に対する卵黄抗体の生産に関する報告はない。
【発明の開示】
【００１２】
発明の開示
本発明の主たる目的は、有機塩素系殺虫剤に対する、超免疫化雌鶏の卵黄に由来する抗体（HEY抗体）を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、一貫して多量の、回収及び保存が容易でありうる、高い力価及び特異的抗体の連続供給を供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、非侵襲性故に動物を出血せしめる必要がない抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる他の目的は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体のどちらとも同じかあるいはそれ以上に感受性である抗体を提供することである。
【００１６】
発明の概要
本発明は、家禽鳥類を胸部筋肉において、所望のハプテン−タンパク質接合体により周期的免疫化することによって、小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産する方法に関連する。抗体は卵黄から５週間隔の後に収穫されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の説明
従って、本発明は小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法を供し、当該方法は：
（a）家禽鳥類から適切なものを選択し；
（b）前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H３７Ra、ATCC２５１７７）１mg、０．８５mlのパラフィン及び０．１５mlのマンニドモノオレエートを含んで成り；
（c）前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、２，４，５トリクロロフォキシ酢酸βアラニンからなる群から選択された接合体１０００μgで免疫し；
（d）前記鳥類を再度、段階（c）で示したハプテン−タンパク質接合体、５００μgの所望のハプテン接合体で免疫し；
（e）前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で２、３及び５週の間隔にて免疫せしめ；
（f）この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り５週間隔でハプテン−タンパク質接合体で免疫し；
（g）前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
段階を含んで成る。
【００１８】
本発明の実施態様は、所望のハプテン−タンパク質接合体がDDT、エンドスルファン及びHCHに対する結合特性を有する。
【００１９】
本発明の他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対して結合するDDT−OHの生産であり、それは以下のとおり：
（a）２，２−ビス（４−クロロフェニル）−１，１，１−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用し、スクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し；
（b）N−ヒドロキシスクシンイミド１８３．５mg、０．５mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下にて１：１：１：１．２（ハプテン：NHS：DCC：DMAP）の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ；そして
（c）ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
ことである。
【００２０】
本発明の更なる他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中で、加熱することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを、０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を約３．０２gの収量融点２３８℃で獲得し、１．０９g；
（g）前記生成物を処理し、プレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；そして
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
ことである。
【００２１】
更に尚本発明の他の実施態様は、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニントリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン９mmol、０．６６gと７．４mlの１MのNaOH中０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e)生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物のハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露すことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の１つのスポットが、１６９〜７０℃の融解範囲にて示され；
(l)融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加え、そしてその混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
ことである。
【００２２】
本発明の更なる他の実施態様において、抗体の収穫は以下のとおり：
(a)卵黄（yolk）を破裂させずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液生理食塩水を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清に対して水溶性タンパク質画分１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
ことで行われている。
【００２３】
本発明の更なる実施態様では、抗体の収穫は以下のとおり：
(a)卵黄を、卵黄膜を破裂させずに卵殻から獲得し；
(b)各１０mlの卵黄ごとに、１０mlの蒸留水を加え；
(c)約０．１５％のκカラーギナンを加えて３０分に渡り室温で撹拌し；
(d)溶液をろ過して１５分に渡り遠心し；
(e)２０mMのリン酸緩衝液pH８．０により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ；
(f)０．２Mのリン酸緩衝液pH８．０で溶出させ；
(g)溶出物を回収して２８０nmでの吸光度を読み；そして
(h)抗体を含有するピーク画分をプールして４℃で保存する、
ことでも行われうる。
【００２４】
本発明の更なる他の実施態様は、卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用して２度沈殿され、そして遠心されて、上清から抗体が最大７５％の収率で獲得されている。
【００２５】
本発明の更なる他の実施態様において、脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、８０〜９０％の収率で獲得するために、pH５．０に調整されている。
【００２６】
本発明の更なる他の実施態様は、抗体の収率が７３％程度である。
【００２７】
本発明の更に他の実施態様において、超免疫卵(hyper immune egg)は毎日回収されており、そして更なる使用迄４０℃で保存されている。
【００２８】
本発明の更に他の実施態様において、抗体の生産は免疫化の第７日目から始まりそして６０日に渡り続く。
【００２９】
本発明の更なる実施態様では、生産された抗体の力価は１６５〜２２５mg／mlである。
【００３０】
本発明の更なる他の実施態様において、卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル／モノクローナル抗体に対し、一層／同等の感受性である。
【００３１】
本発明の更に他の実施態様は、農薬の小分子に関連する卵黄抗体の生産である。
【００３２】
本発明の更に他の実施態様は、以下の：
a)(DDT−１，１’−(２，２，２−トリクロロエチレン)ビス(４−クロロベンゼン)、
b)HCH−１，２，３，４，５，６−ヘキサクロロへキサン、
c)エンドスルファン−６，７，８，９，１０，１０−ヘキサクロロ−１，５，５ａ，６，９，９ａ，ヘキサヒドロ−６，９−メタノ−２，３，４，−ベンゾジオキサチエピン−３−オキシド、
から選択された有機塩素系殺虫剤に対して結合する卵黄抗体の生産である。
【００３３】
以下の例は本発明を例示するために与えられており、従って本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３４】
実施例
実施例−１
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各１０mlに対して、トリス塩類緩衝溶液を１００ml加えた。形成された沈殿を遠心によって除去した。この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を加えて再度遠心した。ペレットを捨て、そしてこの上清に対していわゆる水溶性タンパク質画分１２％ポリエチレングリコールを加え、そして１０分に渡りインキュベートして遠心した。抗体が沈殿する。１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加えて沈殿を溶かした。次いで、この抗体溶液を０℃に冷却して１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加えた。この溶液を４℃で遠心して、沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かしてリン酸緩衝液中４℃で２４時間に渡り透析した。収率６０％。
【００３５】
実施例−２
卵黄から脂質を、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで、上清から２度沈殿させて遠心した。収率−７５％。
【００３６】
実施例−３
脂質を除去した後に獲得した水溶性タンパク質画分のpHを調べ、抗体を更に沈殿させるためにpH５．０に調整した。収率−８０〜９０％。
【００３７】
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各１０mlに対して、蒸留水を１０ml加えた。０．１５％のκカラーギナンを加えて室温で３０分に渡り撹拌した。次いで、この溶液をろ過して１０，０００gで１５分に渡り遠心した。この上清溶液のpHを８．０に設定し、そして２０mMのリン酸緩衝液pH８．０で調製されたDEAE−セファセルカラムを通過せしめた。抗体を０．２Mのリン酸緩衝液pH８．０で溶出させた。溶出物を回収して２８０nmでの吸光度を読んだ。抗体を含むピーク画分をプールして４℃で保存した。収率−７３％。
【００３８】
これらの抗体の効率も本発明を通じて推定されている。
【００３９】
利点
本発明の主な利点は以下のとおりである。
（a）超免疫化雌鶏の卵黄に由来する抗体（HEY抗体）の免疫学的手段のための使用は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体に伴う制限を解消する。何故なら本発明の方法は、一貫して多量の、高い力価特異的且つ感受性の、容易に回収及び保存できる抗体の連続供給を担うからである。
（b）アッセイの感度はウサギ抗体以上である。
（c）家禽鳥類を免疫する方法は非侵襲性であり且つ検体に対する親和性が良い。
【００４０】
ニワトリによって生産された抗体のウサギを超える利点は更に以下の表Ｉに供した表形式で説明している。
【表１】
2005511539.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月10日(2004.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子有機塩素系農薬に対して結合する卵黄抗体を生産するための方法であって、当該方法は：
（a）適切な家禽鳥類を選択し；
（b）前記家禽鳥類を既知の完全アジュバントで免疫し、当該各アジュバントmlごとには熱殺菌し且つ乾燥させたマイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）（H３７Ra、ATCC２５１７７）１mg、０．８５mlのパラフィン及び０．１５mlのマンニドモノオレエートを含んで成り；
（c）前記鳥類を胸部筋肉において、DDT−OHハプテン、オクタクロロサイクリックハプテン、２，４，５トリクロロフォキシ酢酸βアラニンから選択された接合体１０００μgで免疫し；
（d）前記鳥類を再度、段階（c）で示したハプテン−タンパク質接合体、５００μgの所望のハプテン接合体で免疫し；
（e）前記鳥類をハプテン−タンパク質接合体で２、３及び５週の間隔にて免疫し；
（f）この後、前記鳥類を当該鳥類が卵を産む限り５週間隔にてハプテン−タンパク質接合体で免疫せしめ；
（g）前記鳥類の卵黄から抗体を収穫する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記所望のハプテン−タンパク質接合体が、DDT、エンドスルファン及びヘキサクロロへキサンに対する結合特性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、DDTに対し結合するDDT−OHを生産する方法であって、
（a）２，２−ビス（４−クロロフェニル）−１，１，１−トリクロロエタノールを一晩、ピリジン中で過剰の無水コハク酸を使用しスクシニル化してN−ヒドロキシスクシンイミドを獲得し；
（b）N−ヒドロキシスクシンイミド１８３．５mg、０．５mmolをジクロロメタン中、ジシクロヘキシルウレアとジメチルアミノピリジン触媒の存在下１：１：１：１．２（ハプテン：NHS：DCC：DMAP）の比で反応せしめ、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへと転換させ；そして
（c）ジシクロへキシルウレアを単離してジクロロメタンを蒸発せしめることによって、接合において使用するためのDDT−OHハプテンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の段階（c）において使用されているような、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンを生産する方法であって：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中、加温することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を、約３．０２gの収量、融点２３８℃で獲得し；
（g）前記１．０９gの結晶生成物を処理しプレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階（c）のように、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体ハプテン、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニン(TCB)ハプテンを生産する方法であって：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン(９mmol、７．４mlの１MのNaOH中０．６６g）と０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e) 生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物ハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露らすことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の単一のスポットが、融点１６９〜１７０℃の融解範囲にて示され；
(l) 融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加えてこの混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄（yolk）を破裂せずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液塩類溶液を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の段階(g)に記載の抗体を収穫する方法であって：
(a)卵黄を、卵黄膜を破裂させることなく卵殻から獲得し；
(b)各１０mlの卵黄ごとに、１０mlの蒸留水を加え；
(c)約０．１５％のκカラーギナンを加えて３０分に渡り室温で撹拌し；
(d)この溶液をろ過して１５分に渡り遠心し；
(e)２０mMのリン酸緩衝液pH８．０により調製したDEAE−セファセルカラムを通過させ；
(f)０．２Mのリン酸緩衝液pH８．０で溶出せしめ；
(g)溶出物を回収して２８０nmでの吸光度を読み；そして
(h)抗体を含有するピーク画分をプールして４℃で保存する、
ことでも行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
卵黄から脂質が、リンタングステン酸と塩化マグネシウムの沈殿化溶液を使用することで２度沈殿され、そして遠心され、上清から抗体を最大７５％の収率で獲得する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
脂質の除去後に獲得された水溶性タンパク質画分のpHは、抗体を更に沈殿させ、８０〜９０％の収率で獲得するために、pH５．０に調整されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
抗体の収率が７３％程度である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
超免疫卵(hyper immune egg)が毎日回収され、そして更なる使用迄４０℃で保存されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体の生産が免疫化後、第７日目に始まり、そして６０日に渡り続く、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
生産された抗体の力価が１６５〜２２５mg／mlである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵黄抗体の生産は、ホニュウ動物を使用して生産されたポリクローナル／モノクローナル抗体に対し、一層／同等の感受性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記卵黄抗体の生産が農薬の小分子に関連する、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の更なる他の実施態様は、ハプテン−タンパク質接合体、即ち、エンドスルファンに対して結合するオクタクロロサイクリックハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
（a）約３．７３gのヘプタクロルを０．１molの氷酢酸中で、加温することによって溶かし；
（b）１．０８５gの次亜塩素酸Tert−ブチルを、０．１mmolの氷酢酸中に溶かし、そして段階（a）で獲得した第一溶液に加え；
（c）この混合物を水浴中１時間に渡り還流せしめ；
（d）ヘプタクロルのアセチルクロロ誘導体の微細結晶を分離し；
（e）前記結晶をアセトンで洗浄して空気で乾燥させ；
（f）結晶生成物を約３．０２gの収量、融点２３８℃で獲得し；
（g）前記１．０９gの結晶生成物を処理し、プレハプテン１，３，４，５，６，７，８，８−オクタクロロ−２−ヒドロキシ−４，７−メタノ−３ａ、及び４，７，７a−テトラヒドロインダンを獲得し；
（h）前記プレハプテンをジクロロメタン中、N−ヒドロキシスクシンイミドを加えることによって溶かしてこの混合物を０℃に冷却し；そして
（i）ジシクロへキシルカルボジイミド、その後ジメチルアミノピリジンを加え；
（j）この混合物を一晩撹拌し；そして
（k）ジクロロメタンをろ過してジクロロメタンを蒸発せしめエンドスルファンの活性エステルを獲得する、
ことである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
更に尚本発明の他の実施態様は、ヘキサクロロへキサンに対して結合する接合体、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸β−アラニントリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの生産であり、それは以下のとおり：
(a)５．９５mlの塩化チオニル(９５０mmol)中、１０mM、２．５５gの２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸を懸濁することによってβ−アラニンスペーサーアームを２，４，５トリクロロフェノキシ酢酸に対して加え；
(b)１時間に渡り還流し、そして反応しなかった塩化チオニルを蒸発によって除去し；
(c)この生成物をβ−アラニン９mmol、０．６６gと７．４mlの１MのNaOH中０℃で撹拌し；
(d)前記生成物を１６時間超に渡り室温で加温し；
(e)生成される酸を酸性化することによって単離し；
(f)酢酸エチル中へと分配し；
(g)水と塩水で洗浄し；
(h)２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸(２，４，５−T)を不純物として含有する粗製生成物のハプテンをある収量で得て；
(i)前記不純物をアセトン中に溶かしトリクロロベンゼン(TCB)ハプテンの無色のフレークを獲得し；
(j)前記無色TCBハプテンをろ過してアセトンで洗浄して空気中で乾燥させ；
(k)シリカゲルで予め被覆されたアルミニウムプレート及び溶離液としてクロロホルムとメタノール８５：１５の混合物を使用し、アセトン中２％のo−トルイジンを噴霧してUV光線／日光へ露すことによって検出されたTLC分析におけるRf値０．４５の１つのスポットが、１６９〜１７０℃の融解範囲にて示され；
(l)融解範囲１０２〜１０４℃におけるハプテン２，４，５-T-βアラニンの活性エステルを、ジクロロメタン中に溶かすことによって合成し；
(m)N−ヒドロキシスクシンイミドを加え、そしてその混合物を氷浴中で冷却し；
(n)ジメチルスルホキシド(DMSO)を前記混合物に対しハプテンが溶ける迄滴下し；
(o)ジシクロへキシルカルボジイミドを前記混合物に対して加え、しかる後にジメチルアミノピリジン触媒を加え；
(p)前記混合物を一晩撹拌して温度を室温へと徐々に高め；
(q)ろ過してアセトンを蒸発せしめ；そして
(r)活性エステルを無色固体として分離する、
ことである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の更なる他の実施態様において、抗体の収穫は以下のとおり：
(a)卵黄（yolk）を破裂させずに卵黄（eggyolk）を獲得し；
(b)１００mlのトリス緩衝液生理食塩水を卵黄１０mlごとに加え；
(c)遠心によって沈殿物を除去し；
(d)この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を遠心のために加え；
(e)ペレットを捨て；
(f)前記上清水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え；
(g)１０分に渡りインキュベートして再度遠心し；
(h)抗体を沈殿させ；
(i)沈殿を溶かすために１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加え；
(j)抗体溶液を０℃に冷却し；
(k)１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加え；
(l)溶液を４℃で遠心して沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かし；そして
(m)リン酸緩衝液に対する透析を４℃で２４時間に渡り行い抗体の産物を獲得する、
ことで行われている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
実施例
実施例−１
卵黄を卵殻から慎重に卵膜を破裂させることなく取り出した。前記膜に対して接着していたアルブミンを全体的に洗い流した。そして卵黄膜を破裂せしめ、そして漏斗を介して測定用シリンダーへと移した。卵黄各１０mlに対して、トリス塩類緩衝溶液を１００ml加えた。形成された沈殿を遠心によって除去した。この上清に対して、塩化マグネシウムとリンタングステン酸の沈殿化溶液を加えて再度遠心した。ペレットを捨て、そしてこの上清、いわゆる水溶性タンパク質画分に対して１２％ポリエチレングリコールを加え、そして１０分に渡りインキュベートして遠心した。抗体が沈殿する。１０mlの１０mMリン酸緩衝液を加えて沈殿を溶かした。次いで、この抗体溶液を０℃に冷却して１０mlの予め冷却しておいたエタノールを加えた。この溶液を４℃で遠心して、沈殿物を１０mMのリン酸緩衝液中に溶かしてリン酸緩衝液中４℃で２４時間に渡り透析した。収率６０％。
【国際調査報告】
2005511539.tif 000003
2005511539.tif 000004
2005511539.tif 000005