(57)【要約】シリカ支持体の表面に結合した極性相を有し、かつクロマトグラフィーによる分離に使用するのに適した修飾したシリカ支持体であって、該修飾したシリカ支持体が以下の式（１）を有する支持体：2005519293.tif 000017式中、ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝１〜５０；Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり；Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；かつＲ3及びＲ4はアルキル、アリール、ヒドロキシル、又はケイ素原子に架橋した酸素原子を含む基である。さらに、この支持体を製造するための極性シラン中間体も開示されている。
2005519293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ支持体の表面に結合した極性相を有し、かつクロマトグラフィーによる分離に使用するのに適した修飾したシリカ支持体であって、該修飾したシリカ支持体が以下の式を有する支持体：
2005519293.tif 000015
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝１〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；かつ
Ｒ3及びＲ4はアルキル、アリール、ヒドロキシル、又はアルコキシル基、又はケイ素原子に架橋した酸素原子を含む基である。
【請求項２】
Ｒ1又はＲ2がＣ１〜Ｃ３０のアルキル基である、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項３】
Ｒ1及びＲ2がイオン交換特性、リガンド交換特性、親水性又は逆相特性を修飾したシリカ支持体に与えるのに十分な長さの炭素鎖である、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項４】
Ｘがスルホニルである、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項５】
ｐが少なくとも１である、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項６】
修飾したシリカがシリカゲルである、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項７】
シリカ表面のヒドロキシル基の少なくともいくつかが非極性及び／又は極性基によってエンドキャップされている、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体。
【請求項８】
以下の式の極性シラン：
2005519293.tif 000016
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝０〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり、ただしＸがカルボニル、カルバモイル又はオキシカルボニルである場合には少なくともｐ＝１である；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はアルキル、アリール又は反応性離脱基であり、かつＲ3、Ｒ4又はＲ5の少なくとも一つは離脱基である。
【請求項９】
Ｒ1及びＲ2がＣ１〜Ｃ３０のアルキル基である、請求項８に記載の極性シラン。
【請求項１０】
Ｘがスルホニルである、請求項８に記載の極性シラン。
【請求項１１】
ｐが少なくとも１である、請求項８に記載の極性シラン。
【請求項１２】
離脱基をヒドロキシル、アルコキシル、ハライド、又はアミノ基から選択する、請求項８に記載の極性シラン。
【請求項１３】
請求項８に記載の極性シランをシリカ表面と反応させることによる、請求項１に記載の修飾したシリカ支持体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の式を有するクロマトグラフィー充填材に試料溶液を流すことを含む、クロマトグラフィーによる分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な固定相及びＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＬＣ／ＭＳ及びその他の分離及び分析方法におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、新規なシラン、シリカ支持体上でのその不動化及び修飾したシリカ支持体の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ＬＣ／ＭＳ及びその他の分離及び分析方法における固定相としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＰＬＣは液体試料中の検体を分離するのに広く使用されている。試料をクロマトグラフィーカラム中の溶離液に注入する。吸着、サイズ排除、イオン交換又はクロマトグラフィー充填材との他の相互作用を含む一又は複数の機構によって、試料成分が分離される。次いで試料成分を常用の検出手段、例えばＵＶ、蛍光又は導電度のいずれかによって検出する。
シリカをベースとするＲＰ（逆相）充填材は、通常クロマトグラフィーカラム中で使用される。これらはシリカ表面上に未反応のシラノール基を含む。残存シラノール部位は極性の検体と、特にイオン交換、水素結合及び双極子−双極子機構を介して塩基性化合物と相互反応する可能性がある。これらの相互作用により、保持の増大から過剰のテーリング（tailing）に広がる問題及び試料の不可逆的な吸着を生じる可能性がある。これらの望ましくない作用を、超純粋シリカを使用し、かつ疎水性リガンド及びエンドキャッピング試薬による表面被覆を最大にすることによって、最小化することができる。しかしながら、ＲＰ ＨＰＬＣによる親水性検体の分離を行うために、高度に水性の移動相を必要とすることがよくある。このような条件下で操作した場合、常用のＲＰＣ１８カラムは保持の可逆的な損失を示す。保持の損失の割合及び程度はカラムの相違によって大きく変化し得る。この作用の一般的な説明は、疎水性のアルキル鎖は湿潤性ではなく、シリカ表面に折りたたまれて親水性媒体に露出しないように見える、というものである。この折りたたまれた又はもつれた状態においては、保持の損失が生じる溶質との疎水性相互反応に対するアルキル鎖の表面積は小さくなっている。Reid, T.S.; Henry, R.A., American Laboratory 24-28（７月, 1999）。
【０００３】
ＲＰ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムと高度に水性の移動相との適合性を達成し、かつ塩基性検体のピーク形を改良するために、極性−埋め込み相が提案されている。Majors, R.E., LC-GC 19:272-288(2001)。これらの相は一義的には疎水性であるが、シリカ表面の近くに親水性基が取り込まれている。この修飾の利点は、極性−埋め込み相が水−有機溶媒混合物に対して典型的な逆相の挙動を示し、かつ少量の有機修飾剤が存在するか又はまったくなくても高度に水性の環境下で良好に作動可能なことである。さらに、従来の逆相材料と比較して、親水性部分は異なる選択性と保持特性を付与することができる。残存シラノールへ取り込まれた極性基の遮蔽作用により、極性−埋め込み相は塩基性の検体に対してテーリング特性を改良した。極性基は、望ましくないシラノールの活性をマスクし、かつ誘導化されていないシリカ表面との相互反応を介して親水性の検体が保持されるのを妨げる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
１９９０年代の初期、常用のＣ１８及びＣ８シリカ固定相は塩基性の検体に対して大きなテーリング因子を生じていた。その当時、いくつかの研究グループは、極性官能基がアルキル鎖中に埋め込まれた新規な型の結合相を報告した。これらの材料は、シラノールと塩基性の検体との間の相互作用を減少させることが見出された。最も一般的に使用された極性基はアミド、ウレア、エーテル及びカルバメート官能基であった。
初期に報告された材料は、２段階表面修飾によって製造された。Feibush, B. EP-A-0386926 (1990)。第１段階で、シリカ支持体をアミノプロピルシランと結合させた。第２段階で、このアミノ基を酸クロリドと反応させてアミド結合を形成した。この最初の製造方法には、二つの連続する反応について表面の再現性が低いという問題点がある。官能化した表面には、誘導化したアミノ基と誘導化していないアミノ基の混合物があった。従って、得られた相は未反応の塩基性部位が存在することにより望ましくないイオン交換反応を示した。
その後、材料は１段階表面修飾によって製造され、この方法では極性の官能基がシラン分子中に組み込まれた。Neue, U.D.; Niederlaender, C.L.; Perterson, J.S., EP-B-0579102 (1993)。シランとの１回の表面反応によって、アニオン交換作用がない唯一つのリガンド構造を得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の観点は、シリカ支持体の表面に結合した極性相を有しかつクロマトグラフィーによる分離に使用するのに適した修飾したシリカ支持体に関する。修飾したシリカ支持体は以下の式を有する：
2005519293.tif 000003
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝１〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；かつ
Ｒ3及びＲ4はアルキル、アリール、ヒドロキシル、又はアルコキシル基、又はケイ素原子に架橋した酸素原子を含む基である。
【０００６】
本発明の他の観点は、修飾したシリカ支持体の極性相を形成するための中間体として有用な極性シランに関する。極性シランは以下の式を有する：
2005519293.tif 000004
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝０〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり、ただしＸがカルボニル、カルバモイル又はオキシカルボニルである場合には少なくともｐ＝１である；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はアルキル、アリール又は反応性離脱基であり、かつＲ3、Ｒ4又はＲ5の少なくとも一つは離脱基（例えばアルコキシル、ハライド、ヒドロキシル又はアミノ基）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、修飾したシラン及び修飾したシリカ支持体の形成におけるその使用に関する。シリカ支持体は、該支持体の表面に結合した極性相を有し、かつクロマトグラフィーによる分離における使用に適している。好ましい態様では、該修飾したシリカ支持体は逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにおいて有用であり、逆相クロマトグラフィーは本明細書でより詳細に説明され、かつ先行技術で周知である。
本明細書はまず、本発明に従う極性相を有する修飾したシリカ支持体を説明する。次いで極性相を記載し、修飾したシリカ支持体の種々の製造方法を記載し、それは極性相の製造方法も含む。
修飾したシリカ支持体は以下の式１を有する：
2005519293.tif 000005
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝１〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル（例えばＣ１〜Ｃ３０）、置換アルキル（例えばＣＨ2ＯＨ）、アリール（例えばフェニル）又は置換アリール（例えばＣＨ2Ｐｈ）基であり；
Ｒ2＝アルキル（例えばＣ１〜Ｃ３０）、置換アルキル（例えばＣＨ2ＯＨ）、アリール（例えばフェニル）又は置換アリール（例えばＣＨ2フェニル）基であり；かつ
Ｒ3及びＲ4はアルキル、アリール、ヒドロキシル、又はアルコキシル基、又はケイ素原子に架橋した酸素原子を含む基である。
【０００８】
本発明で使用するシリカ支持体の型は公知のシリカ支持体のいずれをも含み、特にＲＰクロマトグラフィーで使用されるいずれをも含む。修飾する支持体は本技術分野で周知である。シリカ支持体の最も一般的な型はクロマトグラフィーカラムにおけるシリカゲル粒子である。
式（１）について、好ましい態様では、Ｒ1及び／又はＲ2は炭素鎖の長さがＣ１〜Ｃ３０であるアルキル基である。ＲＰクロマトグラフィー充填材として使用する場合、Ｒ1及びＲ2のアルキル炭素鎖は、修飾したシリカ支持体に逆相特性を与えるのに十分な長さであることが好ましい。適切な炭化水素鎖の長さは好ましくはＣ４〜Ｃ１８の範囲であり、より好ましくはＣ１０〜Ｃ１６である。さらに、修飾したシリカ支持体は、イオン交換特性、リガンド交換特性、又は親水性を含むことができる。
好ましい態様において、Ｘはスルホニルである。スルホン類は以下の利点を提供する：
（１）高温で広いｐＨ範囲における化学的安定性及び
（２）特異的な選択性。
置換基の典型的な数値は以下のとおりである：ｍ＝１〜３；ｐ＝１，２；ｎ＝０；Ｒ3及びＲ4＝ＣＨ3；Ｒ1＝Ｃ1〜Ｃ18；Ｒ2＝Ｃ1〜Ｃ18。
【０００９】
シラン極性相は、シラン試薬の型、シリカ粒子及び相の所望の性質に依存する種々の方法によって、シリカに、好ましくはシリカゲルに結合している。シリカ表面を処理する標準的な条件は、多孔質シリカ（例えば６０Å〜２０００Åのシリカ）又は非−多孔質シリカ粒子とシラン類を結合させることを含む。この反応を、高温で、シリカゲルとトルエンのような不活性溶媒のスラリー中で行うことができる。周知のように、表面被覆範囲を広げるために、水又は酸触媒又は塩基触媒の添加を行うことができる。
本発明の修飾したシリカ支持体は極性単位としてアミノアルコールを含む。本発明の極性シラン試薬は、アミノアルコールのアミノ基とヒドロキシ基の異なる反応可能性を利用して、一端において炭化水素鎖により、他端においてシラン官能基によりアミノアルコールを誘導化する。次いで、極性部分を含むシランリガンドによってシリカ表面を修飾する。
修飾したシリカ支持体に埋め込まれた極性相は種々の極性埋め込みＲＰ材料を含み、それにはエタノールアミド及びエタノールスルホンアミドＲＰ相が含まれる。以下に十分に記載するように、好ましい態様では、極性相をシリカ支持体に埋め込む方法を１段階で行うことができ、この場合遊離のアミノ基は結合する前に消費される。この方法はシリカ表面上の残存アミノ基を回避するという利点を有し、該アミノ基は主の疎水性鎖が表面に結合する前にアミノ基が結合する場合に生じる可能性がある。
【００１０】
ある態様では、シランがシリカ支持体に結合してＮ−置換極性官能基で修飾した逆相材料を形成する。このようなシランリガンドは適切には以下の式（２）を有する：
2005519293.tif 000006
式中、
ｍ＝０〜２０；ｎ＝０〜２０；ｐ＝０〜５０；
Ｘはスルホニル、カルボニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり、ただしＸがカルボニル、カルバモイル又はオキシカルボニルである場合には少なくともｐ＝１である；
Ｒ1＝Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ2＝アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール基であり；
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5はアルキル、アリール又は反応性離脱基であり、かつＲ3、Ｒ4又はＲ5の少なくとも一つは離脱基である。
【００１１】
ｐ＝０の場合に式（２）によって製造される分子を、対応するアミノシランとハロゲン化スルホニルから出発するスルホニル化法によって、又は不飽和アミンとハロゲン化スルホニルから出発し、次いで不飽和基をハライド（例えばクロロ）アルコキシ又はアミノシランとで触媒の存在下にヒドロシリル化するいずれかの方法によって、合成することができる。
離脱基は当業者に公知の離脱基を含み、離脱してシリカ支持体上にヒドロキシル基を経由する共有結合を形成することができる基である。このような離脱基はヒドロキシル、アルコキシル、ハライド及びアミノ基又はこれらの基から誘導する基を含むことができる。
【００１２】
アミノアルコールは２官能性分子である。アミノ基とヒドロキシル基の反応性が異なるため、保護基を使用することなく順次に両者の末端基を官能化することができる。一組の反応式が以下の反応によって示される：
Ｎ−置換アリルエーテルの合成
（３ａ）
2005519293.tif 000007
（３ｂ）
2005519293.tif 000008
【００１３】
ヒドロシリル化
（３ｃ）
2005519293.tif 000009
シリカゲルへの極性基の結合は以下のように行われる：
（３ｄ）
2005519293.tif 000010
シリカゲルの遊離ヒドロキシル基のエンドキャッピングは以下の反応によって行われる：
（３ｅ）
2005519293.tif 000011
式中、Ｘ、Ｒ1、及びＲ2は上記の式（１）で定義されている。
【００１４】
アミノアルコールから誘導したシランリガンドの合成及びこれらのリガンドによるシリカ表面の修飾は、以下のように段階（３ａ）−（３ｅ）で適切に行われる：
１．アミノアルコールのアルキル化、例えばエタノールアミンのアルキルブロミドによるアルキル化。段階３ａの第１の反応は、炭酸カリウムの存在下における優勢なＮ−アルキル化として記載されている。この代わりに、強塩基を使用してアミノアルコールの優勢なＯ−アルキル化によってＲ1を導入することもでき、該強塩基は反応しないアミノ基の存在下にヒドロキシル基を脱プロトン化する（示していない）。
２．不飽和部分の導入、例えばＯ−アルキル化によるアリル基の導入も、段階３ａの第２の反応に示されている。Ｏ−アルキル化の代わりに、アミノ基を介して不飽和フラグメントを結合させることができる（示していない）。
３．アミノアルコールのモノ置換アミノ基をアシル化剤、スルホニル化剤、又はイソシアナートと反応させて、ヒドロシリル化（段階３ｃ）のために段階３ｂで形成される前駆体を製造する。
４．段階３ｃで、白金触媒の存在下に、モノ−、ジ−又はトリアルコキシ、クロロ又はアミノシランによってヒドロシリル化を行って、段階３ｄのためのシラン修飾剤を生成する。
５．段階３ｄで、還流下にトルエンのような有機溶媒中で、該シラン修飾剤をシリカゲルに結合させる。
６．任意の段階３ｅにおいて、残存シラノール基がエンドキャッピングされる（例えば式２のような離脱基を有するアルキルシランとの反応により）。
【００１５】
炭化水素の長鎖は、Ｎ−置換エタノールスルホンアミジル及びエタノールアミジルアルキルエーテルを合成するために、アルキル化剤（置換基Ｒ1）、スルホニル化剤又はアシル化剤（置換基Ｒ2）の一部であることができる。例えば、Ｒ1＝Ｃ１８、Ｃ１０又はＣ１６かつＲ2＝ＣＨ3置換基であることが適切である。
Ｎ−置換エタノールスルホンアミジル及びエタノールアミジルアルキルエーテルを合成するために、第２のアミノアルコールを出発物質として使用することができる。この場合、反応系列の第１段階（３ａ）を回避し、Ｒ1及びＲ2置換基の鎖長を反応式（４）に応じて変化させることができ、これはリガンド構造に疎水性の鎖を導入する別の方法を示している。例えば、Ｒ1＝ＣＨ3、かつＲ2＝Ｃ１８、Ｃ１０又はＣ１６置換基であることが適切である。
（４）
2005519293.tif 000012
式中、Ｘ、Ｒ1、Ｒ2は上記の式１で規定されている。
【００１６】
シリカ表面を官能化する適切なＮ−置換極性シランリガンドの例示的なリストは以下の表１に示されているものを含む。
表１
2005519293.tif 000013
【００１７】
Ｎ−置換アリルエーテルの別の合成は以下の反応式（５）に記載されている。
反応式５
2005519293.tif 000014
反応式（５）において、Ｘはカルボニル、スルホニル、カルバモイル、又はオキシカルボニルであり；Ｒ1及びＲ2＝アルキル基、置換アルキル基、アリール基又は置換アリール基である。
本発明がさらに詳細に以下の例に記載されているが、本発明はこれに限定されない。
【００１８】
例１
新規なＮ−置換カルバモイル、スルホンアミジル又はアミジルアリルエーテル（式１）を製造する一般的な手順
エタノールアミン（４００mmol）を炭酸カリウム（２０mmol）とトルエン（１０００ml）中で混合した。次いで、得られた混合物を７０℃で撹拌した。３０分撹拌後、アルキルハライド（４０mmol）を上記混合物にゆっくり添加した。反応混合物を７０℃で２４時間撹拌した。次いで、減圧下に全ての揮発物を除去し、残渣をＥｔ2Ｏ／Ｈ2Ｏで抽出した。次いで、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下に濃縮して対応するＮ−置換アミノ−エタノール１（反応式（３ａ））を得た。合成した化合物の構造は1Ｈ ＮＭＲ分光分析で確認した。
ＴＨＦ（４００ml）中のＮ−置換アミノ−エタノール１（２０mmol）の溶液をＴＨＦ（４００ml）中のＮａＨ（２２mmol）の懸濁液へ室温でゆっくり加えた。次いで、混合物を５０℃で４時間撹拌し、引き続きＴＨＦ（５０ml）中のアリルブロミド（２４mmol）をゆっくり加えた。５０℃で２４時間撹拌後、減圧下に全ての揮発物を除去した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2とＨ2Ｏの混合物に溶解させた。有機相を水でさらに洗浄し、引き続きＮａ2ＳＯ4で乾燥した。有機相から揮発物を除去して、アリルエーテル２（反応式３ａ）を得た。合成した化合物の構造を1Ｈ ＮＭＲ及び質量分光分析で確認した。
置換アリルエーテル２（１５mmol）（反応式３ｂ）をＣＨ2Ｃｌ2（３００ml）中のＥｔ3Ｎ（３０mmol）と混合し、０℃で２０分間保持した。次いで、ＣＨ2Ｃｌ2（５０ml）中の酸クロリド、スルホニルクロリド又はイソシアナート（１５mmol）の溶液をゆっくり加え、反応混合物を周囲温度で１２時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。減圧下に全ての揮発物を除去し、対応するＮ−置換極性アリルエーテル３（反応式３ｂ）を得た。合成した化合物の構造を1Ｈ ＮＭＲ及び質量分光分析で確認した。
【００１９】
例２
ヒドロシリル化の一般的な手順
Ｎ−置換極性アリルエーテル３（１０mmol）をモノ−、ジ−又はトリエトキシシランの混合物に添加した。次いで、触媒、例えば最小量のエタノール中のヘキサクロロ白金酸を添加した。５０℃で２４時間撹拌後、過剰のシラン及び溶媒を減圧下に除去して対応するＮ−置換極性シラン（表１）を得た。合成した化合物の構造を1Ｈ ＮＭＲ分光分析で確認した。
【００２０】
例３
シラノール活性
図１は、開発したエタノールスルホンアミドＣ１６カラムと従来のＣ１８カラム及び市販されている極性−埋め込み相Ａ及びＢを対比させたピリジン試験の比較クロマトグラムを示す。エタノールスルホンアミドＣ１６カラムは優れた効率とピークの形を示している。試験条件：３０℃、ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ＝５０／５０、１ml／分、注入容量５μl、２２６nm。
【００２１】
例４
アミトリプチリン試験
図２は、エタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８相上のアミトリプチリンを含む５個の検体の試験クロマトグラムを示す。両相とも優れたピークの形を示す。試験混合物は、ウラシル、トルエン、エチルベンゼン、アミトリプチリン及びキニザリンを含む。試験条件：３０℃、２０mM ＫＨ2ＰＯ4 ８０％ＭｅＯＨ、ｐＨ＝７．０、ml／分、注入容量５μl、２５４nm。
【００２２】
例５
極性試験
図３は、新規に開発したエタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８相の極性試験の結果を示す。両相は、酸性検体（フェノールとｐ−ブチル安息香酸）及び塩基性検体（ピリジンとＮ，Ｎ−ジメチルアニリン）について優れたピークの形を示す。試験条件：３０℃、５０mM ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ＝３．２）／ＣＨ3ＣＮ＝４０／６０、１ml／分、注入容量５μl、２５４nm。
【００２３】
例６
相崩壊試験
図４は、プローブとしてアデニンを使用し、従来のＲＰ Ｃ１８相と比較した開発したエタノールスルホンアミドＣ１６カラムの相崩壊試験の結果を示す。１００％水性媒体に２４時間さらした後で、従来のＣ１８カラムは保持の損失及びカラム効率の低下という問題点を示す。新たに開発したスルホンアミドＣ１６相は、１００％水性緩衝液に２００時間連続して曝す純粋な水性条件に対して免疫性である。
【００２４】
例７
安定性試験
図５は、新たに開発したエタノールスルホンアミドＣ１６相を使用する極度に過酷な条件下における安定性試験の結果を示す。試験条件：５０℃、１％ＴＦＡ（ｐＨ＝１）ＣＨ3ＣＮ／水、５０／５０、連続流、１ml／分、注入容量５μl、２５４nm、検体：トルエン。トルエンに対する両者のｋ'値及び効率数は４０リットル又は溶離液の追い出しの間変化しない。
【００２５】
例８
極性選択性試験
図６は、従来のＲＰ Ｃ１８カラムと本発明のエタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８極性−埋め込み相の極性選択性試験の結果を示す。試験混合物は、ウラシル、ジメチルフタレート、ブチルパラベン、トルエン及びフェナンスレンの混合物である。エタノールスルホンアミドＣ１６相は従来のＲＰ Ｃ１８材料に類似する選択性を示す一方、エタノールアミド相はトルエンとブチルパラベン検体について異なる順序の溶離を示す。試験条件：３０℃、７０％ＣＨ3ＣＮ、１ml／分、注入容量５μl、２５４nm。
【００２６】
実験に基づく結論
本発明に従う埋め込み相を有する修飾したシリカ支持体は、シリカ表面上の極性基の遮蔽作用により、塩基性検体との相互反応が減少したことを示す。従って、シラノール活性は極端に低い。従来技術の極性−埋め込み相及び従来のＣ１８相と比較すると、緩衝剤を含まない溶離液中のピリジンのピークは、最も低いテーリング因子及び最も高い効率性を新たに開発したエタノールスルホンアミドＣ１６相において有する（図１）。アミトリプチリンのピークの形は、ｐＨ７でエタノールスルホンアミドカラム及びエタノールアミドカラムの両者において優れている（図２）。これらの二つの支持体は酸に対しても優れたピーク特性を与える（図３）。
さらに、シリカ支持体の修飾した固定相は、１００％水性媒体中で使用した場合に優れたクロマトグラフィー特性を有する。１００％の水に連続して２００時間曝した後で、エタノールスルホンアミドＣ１６は再現性のある結果を示し、一方、従来のＲＰ Ｃ１８カラムは２４時間以内に崩壊した（図４）。
【００２７】
スルホンアミド官能基の強化された化学的安定性は、これらの本発明のシリカ材料のさらなる利点である。表１に示したシランリガンドのエタノールスルホンアミドフラグメントは、本技術分野で使用される従来のアミド及びカルバメートと比較して、加水分解に対して優れた耐性を有している。Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis (第２版), John Wiley & Sons (1991)。この説明はｐＨ１、５０℃で得られた安定性試験のデータによって裏付けられる。トルエンの保持及びそのピークの不斉性はエタノールスルホンアミドＣ１６相に変化することなく残っている。Ｃ１６極性−埋め込み相はさらに、これらの過酷な条件下での３０日間の連続流の後で優れたピークの形と良好な効率を提供した。
本発明の合成方法により、アミノアルコールを種々の極性官能基を含む新規な表面修飾剤に転換することが容易になる。本方法が多様であることから、特定のクロマトグラフィーの適用に適する種々の選択性を有する複数群の新規な極性−埋め込み相を得ることができる。エタノールスルホンアミドＣ１６極性−埋め込み相が従来のＲＰ Ｃ１８カラムと類似する選択性を示す一方、エタノールアミドＣ１８相が異なる順序の溶離を有することが図４に示されているように、明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】は、開発したエタノールスルホンアミドＣ１６カラム、従来のＣ１８及び二つの市販の極性−埋め込み相Ａ及びＢを使用した場合のシラノール活性の比較を示す。開発したＣ１６カラムは優れた効率とピークの形を示す。
【図２】は、新たに開発したエタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８相を使用するアミトリプチリン試験の結果を示す。両相とも優れたピークの形を示す。
【図３】は、新たに開発したエタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８相を使用する極性試験の結果を示す。両相とも、酸性検体（フェノールとｐ−ブチル安息香酸）及び塩基性検体（ピリジンとＮ，Ｎ−ジメチルアニリン）に対して優れたピークの形を示す。
【図４】は、従来のＣ１８相に対する開発したエタノールスルホンアミドＣ１６相の“相崩壊（phase collapse）”試験の結果を示す。エタノールスルホンアミドＣ１６極性相は１００％水性緩衝液に２００時間連続して曝した場合に“相崩壊”に対して免疫であるが、一方従来のＣ１８カラムは２４時間で保持の顕著な損失という障害を生じる。
【図５】は、５０℃でｐＨ１の溶離液におけるエタノールスルホンアミドＣ１６カラムに対する安定性試験の結果を示す。
【図６】は、従来のＣ１８相及び開発したエタノールスルホンアミドＣ１６及びエタノールアミドＣ１８極性相に対する極性選択性試験の結果を示す。新規なエタノールスルホンアミドＣ１６カラムは従来のＣ１８相に類似する選択性を有する一方、エタノールアミドをベースとする材料はトルエンとブチルパラベンの検体に対して逆の順序の溶出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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