(57)【要約】二糖類及び金属イオンでの治療により皮膚刺激原因物質又は皮膚過敏化原因物質により生ずる皮膚悪反応を低減する組成物、並びに皮膚刺激原因物質又は皮膚過敏化原因物質により生ずる皮膚悪反応を低減するための方法、及び二糖類及び／又は金属イオン組成物の適用により、少なくとも一つの炎症原因物質に対する炎症応答を治療するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚悪反応性原因物質、皮膚刺激原因物質又は皮膚過敏化原因物質、並びに治療に有効な量の二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する組成物。
【請求項２】
皮膚過敏化原因物質が、治療剤、金属、香料、化粧品、織物、花粉、農薬、プラスチック及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
治療剤が、抗生物質、抗ウィルス剤、鎮痛剤及び鎮痛配合剤、食欲不振剤、抗関節炎剤、抗喘息剤、血液凝固阻止剤、抗痙攣剤、抗欝剤、抗糖尿病剤、抗下痢剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗偏頭痛剤、抗乗物酔い製剤、抗悪心剤、抗新生物剤、抗パーキンソン剤、抗掻痒剤、抗精神病剤、解熱剤、鎮痙剤、抗コリン作用剤、交感神経興奮剤、キサンチン誘導体、心血管疾患剤、抗不整脈剤、高血圧剤、血管拡張剤、中枢神経作用剤、咳止め及び風邪製剤、鬱血除去剤、診断薬、ホルモン、催眠剤、筋弛緩剤、副交感神経遮断剤、副交感神経作用剤、精神刺激剤、鎮静剤、体重制御及び食欲抑制剤、精神安定剤を含む作用剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
抗炎症剤が、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルフレックス（ｓａｌｆｌｅｘ）、サリチルアミド、サルサラート、ジサルシド（ｄｉｓａｌｃｉｄ）、トロラミンサリチレート、トリシレート（ｔｒｉｓｉｌａｔｅ）、ケトプロフェン、プロスタグランディン、フルルビプロフェン、ジクロフェナック、インドメタシン、ピロキシカム及びイブプロフェンを含む作用剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
二糖類における少なくとも一つの単糖類が、ヘキソース、ペントース、テトロース及びトリオースから選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
二糖類における少なくとも一つの単糖類が、エリスロース、トレオース、エリスルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、デオキシリボース、キノボース、ラムノース及びフコースから選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
二糖類がトレハロースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
金属イオンが二価の金属イオンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
二価の金属イオンが亜鉛である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
金属イオンが金属酸化物の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
金属酸化物が酸化亜鉛である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
配合物中に二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び
皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために治療有効量の前記配合物を対象者に局所的に投与する工程
を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の皮膚悪反応を治療する方法。
【請求項１３】
皮膚刺激原因物質が、水、洗浄剤、アルカリ、酸、有機溶媒、酸化剤及びそれらの組み合わせを含む化合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚過敏化原因物質が、治療剤、金属、香料、化粧品、織物、花粉、農薬、プラスチック及びそれらの組み合わせから選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を経皮的に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
皮膚過敏化原因物質が治療剤であり、経皮用パッチから皮膚悪反応防止、低減又は制御剤及び治療剤を投与することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配合物中に二糖類及び金属イオンを含有する炎症防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び
炎症応答を防止、低減又は制御するために有効用量の前記配合物を対象者に投与する工程
を含む、少なくとも一つの炎症原因物質の存在に対する、対象者における皮膚の炎症応答を治療する方法。
【請求項１８】
経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により有効用量を投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
炎症応答の治療が、炎症防止、低減又は制御剤の投与の不存在下で観察されるサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類の刺激と比較した、サイトカイン、成長因子及び、ケモカイン類の刺激における低減により証明される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
炎症応答の治療が、炎症防止、低減又は制御剤の投与の不存在下で観察されるサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類の刺激と比較した、インターロイキン−１α及び腫瘍壊死因子−αケモカイン類の刺激における低減により証明される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症応答が、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルフレックス、サリチルアミド、サルサラート、ジサルシド、トロラミンサリチレート及びトリシレートから選ばれる作用剤の存在に対する応答である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
配合物中に二糖類を含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び
皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の二糖類配合物を対象者の悪反応部位に投与する工程
を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の悪反応を治療する方法。
【請求項２３】
経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与又は経口投与により二糖類配合物を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
配合物中に金属イオンを含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び
皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の金属イオン配合物を対象者の悪反応部位に投与する工程
を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の悪反応を治療する方法。
【請求項２５】
経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与又は経口投与により金属イオン配合物を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
配合物中に二糖類を含有する、炎症防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び
炎症を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の二糖類配合物を対象者に投与する工程
を含む、少なくとも一つの炎症原因物質の存在に対する、対象者における炎症応答を治療する方法。
【請求項２７】
経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により二糖類配合物を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
治療に有効な量の二糖類及び金属イオンを含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する、皮膚悪反応を治療することにおいて有効な組成物。
【請求項２９】
治療に有効な量の二糖類及び金属イオンを含有する、炎症防止、低減又は制御剤を含有する、炎症応答を治療することにおいて有効な組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術的分野及び背景技術
本発明は、二糖類及び／又は金属イオンを含有する配合物を用いて、炎症原因物質又は皮膚過敏化もしくは皮膚刺激原因物質に対する悪応答を防止する又は治療するための組成物及び方法に関する。
【０００２】
発明の概要
本発明の一般的な態様において、皮膚悪反応原因物質又は皮膚過敏化原因物質、並びに有効量の二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する組成物が提供される。本発明の一つの態様によると、皮膚過敏化原因物質は、治療剤、金属、香料、化粧品、織物、花粉、農薬、プラスチック及びそれらの組み合わせであり得る。
【０００３】
本発明の他の態様において、前記組成物の皮膚過敏化原因物質は、抗生物質、抗ウィルス剤、鎮痛剤及び鎮痛剤組合せ、食欲不振剤、抗関節炎剤、抗喘息剤、血液凝固阻止剤、抗痙攣剤、抗欝剤、抗糖尿病剤、抗下痢剤、抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、抗偏頭痛剤、抗乗物酔製剤、抗悪心剤、抗新生物剤、抗パーキンソン剤、抗掻痒剤、抗精神病剤、解熱剤、鎮痙剤、抗コリン作用剤、交感神経興奮剤、キサンチン誘導体、心血管疾患剤、抗不整脈剤、高血圧剤、血管拡張剤、中枢神経作用剤、咳止め及び風邪製剤、鬱血除去剤、診断薬、ホルモン、催眠剤、筋弛緩剤、副交感神経遮断剤、副交感神経作用剤、精神刺激剤、鎮静剤、体重制御及び食欲抑制剤、精神安定剤を含む治療剤であり得る。
【０００４】
本発明のさらに他の態様において、本発明の組成物の皮膚過敏化原因物質は、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルフレックス(ｓａｌｆｌｅｘ)、サリチルアミド、サルサラート、ジサルシド(ｄｉｓａｌｃｉｄ)、トロラミンサリチレート、トリシレート(ｔｒｉｓｉｌａｔｅ)、ケトプロフェン、プロスタグランディン、フルルビプロフェン、ジクロフェナック、インドメタシン、ピロキシカム及びイブプロフェンを含む抗炎症剤であり得る。
【０００５】
本発明の他の態様により、皮膚悪反応原因物質又は皮膚過敏化原因物質、並びに有効量の二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する組成物であり、二糖類における少なくとも一つの単糖類が、ヘキソース、ペントース、テトロース及びトリオースから選ばれる、組成物が提供される。より特定すると、二糖類における少なくとも一つの単糖類が、グリセルアルドヒド、ジヒドロキシアセトン、エリスロース、トレオース、エリスルロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、デオキシリボース、キノボース、ラムノース及びフコースから選ばれ、より特定すると、前記組成物中の二糖類は、トレハロースである。
【０００６】
さらに他の態様により、皮膚悪反応原因物質又は皮膚過敏化原因物質、並びに有効量の二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する組成物であり、金属イオンが二価の金属イオン、例えば、亜鉛、マグネシウム、マンガン、銅、鉄、アルミニウム、カルシウム、コバルト、銀及びカドミウムである組成物が提供される。より特定すると、金属イオンは、金属酸化物、例えば、酸化亜鉛、酸化マグネシウム、酸化マンガン等、の形態においてである。
【０００７】
本発明の他の態様により、配合物中に二糖類及び金属イオンを含有する皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために治療有効量の前記配合物を対象者に局所的に投与する工程を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の皮膚悪反応を治療する方法が提供される。
【０００８】
他の態様では、皮膚刺激原因物質が、水、洗浄剤、アルカリ、酸、油、有機溶媒、酸化剤及びそれらの組み合わせを含む化合物である。
【０００９】
又は、皮膚刺激原因物質は、治療剤、金属、香料、化粧品、織物、花粉、農薬、プラスチック及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれ、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤は局所的に投与され、又は皮膚過敏化原因物質は治療剤であり、前記方法は、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤、並びに経皮用パッチからの治療剤を投与することをさらに含む。
【００１０】
本発明による他の態様により、配合物中に二糖類及び金属イオンを含有する炎症防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び炎症応答を防止、低減又は制御するために有効用量の前記配合物を対象者に投与する工程を含む、少なくとも一つの炎症原因物質の存在に対する、対象者における皮膚の炎症応答を治療する方法が提供される。
【００１１】
さらに他の態様により、経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により有効用量を投与することをさらに含む、三番目の一般的態様による、対象者における炎症応答を防止する方法が提供される。
【００１２】
他の態様により、炎症応答の治療が、サイトカイン類、成長因子及びケモカイン類の刺激により、例えば、インターロイキン−１α及び腫瘍壊死因子−αの刺激により証明される、三番目の一般的態様による炎症応答を防止する方法が提供される。
【００１３】
さらに他の態様により、配合物中に二糖類及び金属イオンを含有する炎症防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために有効量の前記配合物を対象者に局所投与する工程を含む、炎症応答を治療する方法が提供される。
【００１４】
特に、炎症応答が、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸コリン、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サルフレックス、サリチルアミド、サルサラート、ジサルシド、トロラミンサリチレート及びトリシレートから成る群から選ばれる原因物質の存在に対する応答である、炎症応答を治療する方法が提供される。
【００１５】
さらに他の態様により、配合物中に二糖類を含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の二糖類配合物を対象者の悪反応部位に投与する工程を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の悪反応を治療する方法が提供される。より特定すると、この方法は、経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により有効用量の二糖類配合物を投与することをさらに含み得る。
【００１６】
他の態様により、配合物中に金属イオンを含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び皮膚悪反応を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の金属イオン配合物を対象者の悪反応部位に投与する工程を含む、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質の少なくとも一つの存在に対する、対象者における皮膚の悪反応を治療する方法が提供される。より特定すると、この方法は、経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により有効用量の金属イオン配合物を投与することをさらに含み得る。
【００１７】
さらに他の態様により、配合物中に二糖類を含有する、炎症防止、低減又は制御剤を提供する工程、及び炎症を防止、低減又は制御するために適するキャリアー中の有効量の二糖類配合物を対象者に投与する工程を含む、少なくとも一つの炎症原因物質の存在に対する、対象者における炎症状態を治療する方法が提供される。より特定すると、この方法は、経皮用パッチ又はテープ配合を含む局所的投与、皮下投与、非経口投与、静脈注射投与、筋肉内投与及び経口投与により有効用量の二糖類配合物を投与することをさらに含み得る。
【００１８】
さらに他の態様には、治療に有効な量の二糖類及び金属イオンを含有する、皮膚悪反応防止、低減又は制御剤を含有する、皮膚悪反応を治療することにおいて有効な組成物が含まれる。
【００１９】
又、治療に有効な量の二糖類及び金属イオンを含有する、炎症防止、低減又は制御剤を含有する、炎症応答を治療することにおいて有効な組成物が提供される。
【００２０】
特定の態様の詳細な記載
定義  本明細書及び特許請求の範囲において用いられているように、下記の用語は、文脈が他に要求していない場合は、示された意味を有する：
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「炎症防止剤」は、非炎症原因物質の投与の後に測定される又は炎症原因物質のみの投与の後に測定されるサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類のレベルと比較した、炎症防止剤の、炎症原因物質と一緒の投与の後に観察されたサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類、特にインターロイキン−１α及び腫瘍壊死因子−αケモカイン類の上昇しないレベルの繰り返される曝露後測定により示される、炎症原因物質に対する炎症応答を防止することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「炎症低減剤」は、炎症原因物質のみの投与の後に測定されたサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類のレベルと比較した、炎症低減剤の、炎症原因物質と一緒の投与の後に観察されるサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類、特にインターロイキン−１α及び腫瘍壊死因子−αケモカイン類の低減されたレベルの繰り返される曝露後測定により示される、炎症原因物質に対する炎症応答を低減することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「炎症制御剤」は、炎症原因物質のみの投与の後に測定される時間経過でのサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類のレベルと比較した、炎症制御剤の、炎症原因物質と一緒の投与の後に観察されたサイトカイン類、成長因子及びケモカイン類、特に、時間経過で変わらないインターロイキン−１α及び腫瘍壊死因子−αケモカイン類のレベルの繰り返される曝露後測定により示される、炎症原因物質に対する炎症応答を制御することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２３】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「皮膚悪反応防止剤」は、皮膚非過敏化原因物質もしくは皮膚非刺激原因物質の投与後に観察される／報告される、又は皮膚過敏化原因物質もしくは皮膚刺激原因物質のみの投与後に測定される皮膚状況に関する客観的及び主観的証明と比較した、皮膚悪反応防止剤の、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質と一緒の投与後に観察される及び／又は報告される痒くない、刺激されない、痛くない、腫れない、赤くない、できものがない、炎症がない又は正常の皮膚外観及び皮膚感覚の客観的及び主観的証拠により示される、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質に対する皮膚悪反応を防止することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「皮膚悪反応低減剤」は、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質のみの投与の後に観察される／報告される皮膚状況に関する客観的及び主観的証明と比較した、皮膚悪反応防止剤の、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質と一緒の投与後に観察される及び／又は報告される痒くない、刺激されない、痛くない、腫れない、赤くない、できものがない、炎症がない又は正常の皮膚外観及び皮膚感覚の客観的及び主観的証拠により示される、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質に対する皮膚悪反応を低減することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２５】
本明細書及び特許請求の範囲で用いられている「皮膚悪反応制御剤」は、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質のみの投与の後に観察される／報告される皮膚状況に関して支持される客観的及び主観的証明と比較した、皮膚悪反応制御剤の、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質と一緒の投与後に観察される及び／又は報告される痒くない、刺激されない、痛くない、腫れない、赤くない、できものがない、炎症がない又は正常の皮膚外観及び皮膚感覚の支持された客観的及び主観的証拠により示される、皮膚過敏化原因物質又は皮膚刺激原因物質に対する皮膚悪反応を制御することができるいずれかの作用剤、分子、化合物、配合物等を意味する。
【００２６】
表皮ケラチン生成細胞は、ＩＬ−１α及びＴＮＦ−αを含む、前炎症性媒介様サイトカイン類、成長因子及びケモカイン類の合成及び生成により、皮膚における一次接触刺激及び接触過敏反応の刺激において活性な役割を果たす。サリチル酸メチル(ＭＳ)は、筋骨格の痛み及び痒みを緩和することが示されている、種々のＯＴＣ局所的製剤において用いられている冬緑油における活性成分である。局所的製剤の潜在的系統的毒性及び皮膚の刺激の危険要素は、文献によく記載されており、ＭＳのような化合物のヒト細胞における種々の作用の属性であるとされている。
【００２７】
以前に、本願発明者らは、ＭＳが、表皮ケラチン生成細胞において、主要サイトカイン類、特に、ＩＬ−１α、の遊離を刺激し、抗刺激原因物質様エタクリン酸(ＥＴＡ)が、ＭＳによるＩＬ−α遊離を阻害することを示した。それらの結果は、局所的に適用されたＭＳの皮膚刺激潜在力を予測するためのマーカーとして、表皮ケラチン生成細胞によるサイトカイン遊離が用いられ得ることを示唆した。本研究では、ＭＳにより刺激されたＩＬ−１α遊離を妨げるのに、市販のトレハロース、二糖類の有効性を試験した。本願発明者らは、３つの市販のトレハロース製剤、すなわち、トレハロースＡ、Ｂ及びＣを用いた。この研究に用いられた、その３つのトレハロース製剤は、一つ（トレハロースＡ）は、痕跡量の金属イオンを含有し、他の２つ（トレハロースＢ及びＣ）は、金属イオンを含有しない高度に精製された形態であるという点で異なっている。結果は、効果を有しなかったトレハロースＢ及びＣとは異なり、トレハロースＡのみがＭＳ誘導ＩＬ−１α遊離を阻止することができたことを示した。それらのトレハロース製剤の化学的分析により、３つの製剤の間の唯一の違いは、トレハロースＡ製剤における金属イオンの存在であったことが確認された。その分析により、又、亜鉛が、トレハロースＡ製剤において見出された最も富んだ金属イオンであることが示された。従って、ＭＳ誘導ＩＬ−１αを阻害する酸化亜鉛の能力を試験した。結果は、トレハロースＡのように効果的にＭＳ誘導ＩＬ−１α生成を阻止することができ、従って、それらの化合物の表皮ケラチン生成細胞における新規な抗刺激効果を明らかに示した。それらの発見は、トレハロースＡ又は酸化亜鉛は、皮膚刺激を防止するための経皮薬デリバリーシステムにおいて用いられ得ることを示唆した。
【００２８】
方法
作用剤である、サリチル酸メチル、エタクリン酸、トレハロースＡ、Ｂ及びＣをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリー州セントルイス）から得た。トレハロース類をケラチン生成細胞培地中に溶解した。サリチル酸メチルをケラチン生成細胞培地中で希釈した。エタクリン酸をＤＭＳＯ中に溶解した。ケラチン生成細胞をＡＴＣＣにより与えられた指示により１００％集密に成長させた。次に、細胞をトリプシン処理をし、細胞を解離させ、３,０００ｒｐｍで３分間回転させた。上清を吸引し、細胞を新しい培地中にｍｌ当り１.０×１０６細胞の密度で再懸濁した。細胞再懸濁液をピペットで９６ウエルプレートに入れ（ウエル当り２００ｕｌ）、細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。翌朝、培地を吸引し、１００ｕｌの、サリチル酸メチルを含有する(２％)新しい培地を、（−）対照のウエルを除いたすべてのウエルに添加した。（−）対照のウエルは、ＭＳを含まなかった。種々の試験作用物質を含有する新しい培地１００ｕｌを、最終的な濃度が図２乃至７に示されているようにそれらのウエルに添加した。次に９６ウエルプレートをインキュベーションした。３６℃で４時間インキュベーションした後に、ウエルから上清を遠心管に移し、遠心分離し、細胞崩壊物を除去した。次に、ＩＬ−１αの存在を、ＥＬＩＳＡキット(Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．)を用いて製造業者の説明書により決定した。ウエル中に残存する細胞を、ＭＴＴ溶液を含有する予め温めた培地で処理し、４時間インキュベーションした。次に、ウエル中のホルマザン生成物(ＭＴＴの代謝性生物)を可溶化し、プレート読み取り装置を用いて吸光度を測定した。
【００２９】
結果
この研究において用いたトレハロース製剤の３つの異なる種類（トレハロースＡ、Ｂ及びＣ）は同じ化学式及び構造並び同じ光学異性(図１を参照)を有した。それらの製剤の間の唯一の違いは、それらが精製された手法である。その精製法により、トレハロースＢ及びトレハロースＣから金属イオンは除去され、トレハロースＡ製剤は、痕跡量の亜鉛イオンを示した。
【００３０】
ＩＬ−１α生成が、陽性の対称と比較して半分低減される最適なトレハロース濃度を見出すために、ヒトのケラチン生成細胞を、トレハロース化合物の不存在下又は存在下でＭＳで刺激した。
【００３１】
図２は、ＩＬ−１α濃度におけるトレハロースＡ及びＢのより高い濃度の効果を示している。０.１６％におけるエタクリン酸(ＥＴＡ)及び１０％のトレハロースＡは、ＭＳ１％(陽性の対照)と比較してＩＬ−１αレベルにおいて５０％を超える低減を示している。５％のトレハロースＡは、ずっと低い程度の低減であり、２.５％のテレハロースＡは効果がない。１０％のトレハロースＡにおいて、ＩＬ−１αにおける低減は、０.１６％のエタクリン酸の低減とほとんど同じ大きさである。それらの濃度のいずれにおいてもトレハロースＢは効果を有しない。トレハロースＡ、Ｂ及びＣの１０％より高い濃度は、試料を溶解することにおける困難さのために選ばれなかった。０.１乃至２.５％の低い濃度においてはトレハロースＡもＢも効果を示さなかった。
【００３２】
図３は、１％のサリチル酸メチルにより刺激されたケラチン生成細胞におけるＩｌ−１αレベルにおけるトレハロースＣの効果を示す。一方、トレハロースＢ及びＣは、試験されたいずれの濃度においても効果を有しなかった(図２及び図３参照)。ＩＬ−１αの阻止はトレハロースＡでのみ生じ、試験したトレハロース類の間の違いは、トレハロースＡにおける亜鉛の存在のみであるので、トレハロースＡの阻止効果が、亜鉛又はトレハロースＡ化合物の単独により生じたかを決定するために実験を行った。
【００３３】
酸化亜鉛単独又はテレハロースＡ、Ｂ又はＣとの組み合わせを用いて実験を行った。図４は、１％サリチル酸メチルで刺激されたケラチン生成細胞におけるＩＬ−１αレベルにおける試料Ａ(酸化亜鉛のみ)の高濃度の効果を示している。−対照、＋対照及びエタクリン酸(０.１６％)のウエルは、図１乃至３において先に示している。高濃度の酸化亜鉛を含有する細胞をインキュベーションしたときに、ＭＳで刺激されたＩＬ−１αレベルの劇的な低減があったが、その細胞は活性でなかった。高濃度乃至中濃度においてさえ、ＩＬ−１αレベルは有意に低減し、そのことは酸化亜鉛の可能な抗刺激潜在力を示している。試料Ａは、１０％乃至１.２５％の濃度レベルにおいてＩＬ−１αにおける大きな低減を示している。０６.３％以下の濃度において、試料Ａは、ＥＴＡ(エタクリン酸０.１６％)により示される阻止と同様なＩＬ−１αの阻止を示している。トレハロースＡ及びＢとの間の主な違いは、金属イオン、亜鉛の存在であり、亜鉛はトレハロースＢ製剤からは除去されていた。
【００３４】
更なる研究により、より低い濃度においてさえ、ケラチン生成細胞におけるサリチル酸メチル誘導ＩＬ−１αレベルにおける用量依存低減を有することが示された。図５は、１％のサリチル酸メチルにより刺激されたケラチン生成細胞におけるＩＬ−１αレベルにおけるＥＴＡ(エタクリン酸)、テレハロースＡ及びＢ、並びに試料Ａ(酸化亜鉛)の効果を示している。−対照、＋対照、及びＥＴＡ(エタクリン酸０.１６％)ウエルは、先に示したＩＬ−１α濃度を示している。テレハロースＡの１０％は、ＩＬ−１α濃度の５０％より大きい阻止を示す。トレハースＢは、１％のサリチル酸メチルにより刺激されたケラチン生成細胞におけるＩＬ−１αレベルにおける効果を有しない、試料Ａ(酸化亜鉛)は、ＩＬ−１α濃度において有意な用量依存低減を示す。酸化亜鉛濃度の非常に低いレベルにおいて、サリチル酸メチルにより刺激されたケラチン生成細胞におけるＩＬ−１αの低減が用量依存挙動で示されている。０.０００１２５％のような低い濃度において、酸化亜鉛は、ＩＬ−１α濃度において５０％より大きな低減を明らかに示しており、このことは、可能な抗刺激潜在力を示している。
【００３５】
それらの結果は、阻止が、トレハロースＡにおける亜鉛の存在に依存していることを示唆している。それらの結果を確認するために、酸化亜鉛とトレハロースＢ(不活性である)の組み合わせを用いた。図６は、酸化亜鉛と組み合わされたトレハロースＢの、ケラチン生成細胞におけるＩＬ−１αにおける効果を示している。その実験の対照は、先の実験と一致しているデーターを示している。トレハロースＢとの組み合わせの酸化亜鉛は、サリチル酸メチルにより誘導されたＩＬ−１α濃度において大きな用量依存低減を示す。酸化亜鉛レベルを低減させると、同じトレハロースＢ濃度においてＩＬ−１α濃度における増大があり、これらのことは、亜鉛に加えたトレハロースＢがＩＬ−１α濃度を低減させることを示している。従って、興味深いことに、酸化亜鉛との組み合わせでトレハースＢはＭＳで刺激されたＩＬ−１αレベルを阻止することができた。
【００３６】
方法の項に記載されたＭＴＴアッセイを用いてケラチン生成細胞における酸化亜鉛の細胞毒性を試験した。図７は、ケラチン生成細胞におけるＭＴＴレベルにおける酸化亜鉛の効果を示している。−対照、＋対照及びＥＴＡ(エタクリン酸０.１６％)ウエルは、先に示した通りである。酸化亜鉛は、ＭＴＴを紫の染料のホルマザン塩に代謝する健康な細胞により示される、ケラチン生成細胞におけるＭＴＴ濃度レベルにおいて効果を示さない。従って、ＺｎＯが、ＭＳにより刺激されたＩＬ−１α遊離を示した濃度は、細胞生存力において効果を有しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、トレハロースＡ及びトレハロースＢの構造を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１αにおけるトレハロースＡ及びトレハロースＢの効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＩＬ−１αにおけるトレハロースＣの効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＩＬ−１αにおける酸化亜鉛の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＩＬ−１αにおける酸化亜鉛の濃度効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＩＬ−１αにおける、トレハロースＢ及び酸化亜鉛の効果を示すグラフである。
【図７】図７は、ケラチノサイト細胞生存力における酸化亜鉛の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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