(57)【要約】ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼを調節する試薬およびヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子産物に結合する試薬は、心疾患、貧血、癌、炎症性疾患、線維性疾患およびＣＮＳ障害を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）機能不全もしくは疾患の予防、改善、または是正に役割を果たすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３６％一致するアミノ酸配列；および、
ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約３８％一致するアミノ酸配列；および、
ｉｖ）配列番号４に示すアミノ酸配列；
ｖ）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも約２８％一致するアミノ酸配列；および、
ｖｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、３または５の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアスパラギンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その核酸配列が（ａ）ないし（ｃ）に記載の核酸配列から逸脱しており、且つアスパラギンヒドロキシラーゼをコードする、ポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）ないし（ｄ）に記載の核酸配列のフラグメント、誘導体またはアレル変異であり、且つアスパラギンヒドロキシラーゼをコードする、ポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、実質的に精製されたアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド。
【請求項５】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの製造方法：
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、
ｂ）そのアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを宿主培養細胞から回収する。
【請求項６】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生物学的試料中で検出する方法：
ａ）請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドを生物学的試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、
ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの前に生物学的試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを検出する方法：
ａ）生物学的試料を、該ポリヌクレオチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させ；そして、
ｂ）その相互作用を検出する。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる物質についてスクリーニングする方法：
被験化合物を請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドと接触させ；
該被験化合物とアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの結合を検出し、該ポリペプチドと結合する被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質であると同定する。
【請求項１１】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する物質についてスクリーニングする方法：
ａ）被験化合物を、請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされるアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドと接触させ；そして、
ｂ）該ポリペプチドのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を検出し、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を増大させる被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を増大させる可能性のある治療物質と同定し、該ポリペプチドのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下させる被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質であると同定する。
【請求項１２】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる物質についてスクリーニングする方法：
ａ）被験化合物を請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドと接触させ；そして、
ｂ）被験化合物と該ポリヌクレオチドの結合を検出し、該ポリヌクレオチドと結合する被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質であると同定する。
【請求項１３】
以下の工程を含む、アスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる方法：
細胞を、請求項１に記載のいずれかのポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させ、それによりアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる。
【請求項１４】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬であって、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬、および製薬的に許容し得る担体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
疾患においてアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節するための医薬の製造における、請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１７】
該疾患が心疾患、貧血、癌、炎症性疾患、線維性疾患またはＣＮＳ障害である、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なヒトアスパラギンヒドロキシラーゼに関するものである。3種類の新規なアスパラギンヒドロキシラーゼ（以降ＡＳＮＨ−１およびＡＳＮＨ−２およびＡＳＮＨ−３と称する）と、疾患の処置のためのそれらの調節を開示する。
【背景技術】
【０００２】
アスパルチル/アスパラギニル-β−ヒドロキシラーゼ（ＥＣ  １．１４．１１．１６）は、これまでに哺乳動物種からクローニングされ生化学的特性解明がなされた唯一のアスパラギンヒドロキシラーゼである（Korioth F, Gieffers C, and Frey, J. (1994) Gene 150:395-399）。この酵素は、凝固因子（ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）、補体因子およびプロテインＣといった一連のタンパク質の上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン中のアスパラギンまたはアスパラギン酸残基をβ炭素原子の位置で特異的にヒドロキシル化する。
【０００３】
或る種の核因子のアスパラギンヒドロキシル化は、酸素依存性遺伝子発現の調節にも関連している。組織酸素供給の調節は、ヒトの生命の全プロセスにとって非常に重要性である。組織酸素化のレベルは、酸素供給と酸素消費のバランスから生じる。このバランスは、健康な生物では正確に調整されているが、酸素供給の減少を特徴とする肺および心疾患、ならびに罹患組織内の酸素要求の増大を特徴とする癌および炎症といった多くの病的状態下では、このバランスが乱れている。
【０００４】
血管拡張、心拍数の適応等といった直接の生理学的反応に加えて、組織酸素化のバランスが崩れると多数の遺伝子の転写速度の変調を来す。これらの遺伝子には、重要な成長因子やホルモン（例えば、血管内皮成長因子およびエリスロポエチン）ならびに多くの代謝酵素をコードするものがある。転写の変調は、例えば、代謝、成長の長期的な適応、または血管の退化および赤血球生成の増大または減少につながる。
【０００５】
酸素により調節される遺伝子は全て、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）と称する核転写因子の独特なファミリーの標的遺伝子であることが判明している。酸素で調節される遺伝子は、それらの調節エレメント（即ち、プロモーターおよびエンハンサー）にＨＩＦのための明確な結合部位を持っている（Wenger RH, Gassmann M. (1997) Biol Chem. 378(7):609-16; Semenza GL (1999) Annu Rev Cell Dev Biol. 15:551-78; Zhu H, Bunn HF (1999) Respir Physiol. 115(2):239-47）。低酸素誘導性因子はその活性型においてαおよびβサブユニットで構成されている。ＨＩＦ−１βまたはＡＲＮＴと命名されたβサブユニットは組織酸素の変化に応答して調節されないが、αサブユニットは正常酸素または過剰酸素条件下では不安定である。これは、独特のプロリン残基のヒドロキシル化およびポリユビキチン化後に、構成的に翻訳されたαサブユニットがプロテオソーム経路を経て速やかに分解するためである（Masson N, Willam C, Maxwell PH, Pugh CW, Ratcliffe PJ., EMBO J. 2001 Sep 17;20(18):5197-206.）。
【０００６】
Lando et al. (Lando D, Peet DJ, Whelan DA, Gorman JJ, Whitelaw ML, Science. 2002;295(5556):858-61）は、ユビキチン化によるＨＩＦの調節以外に、ＨＩＦ−αサブユニットのカルボキシ末端トランス活性化ドメイン（ＴＡＤＣ）内の独特なアスパラギン残基がこの因子の転写活性にとって重要であることを示した（ヒトＨＩＦ−１αのＮ８０３およびヒトＨＩＦ−２αのＮ８５１）。正常酸素の下ではこのアスパラギン残基はヒドロキシル化される。このヒドロキシル化は、ＨＩＦと多面的転写コアクチベーターｃｂｐ／ｐ３００の相互作用を阻害し、よってＨＩＦを不活性化する。近年、ＨＩＦ−αＴＡＤＣに特異的に結合することにより、ＨＩＦによるリポーター遺伝子のトランス活性化を抑制する、ＨＩＦを阻害する因子（ＦＩＨ−１）が記載された（Mahon PC, Hirota K, Semenza GL, Genes Dev. 2001;15(20):2675-86）。この抑制の基礎となる生化学的機能は解明されていない。したがって、特異的ＨＩＦ−アスパラギンヒドロキシラーゼはこれまでのところ同定されていない。
【０００７】
いかなるＨＩＦ−α特異的アスパラギンヒドロキシラーゼも、血管内皮成長因子、エリスロポエチン、およびｉＮＯＳといった酸素感受性遺伝子の調節のための重要な酸素センサーであり、故に、心血管、新生物および炎症性疾患にとって非常に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要約
本発明の目的は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２、およびＡＳＮＨ−３を調節する試薬および方法を提供することである。この、そしてその他の本発明の目的を、下に記載する１またはそれ以上の態様によって提供する。
【０００９】
本発明の一つの態様は、
ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３６％一致するアミノ酸配列；および、
ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列；
ｉｉｉ）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも約３８％一致するアミノ酸配列；および、
ｉｖ）配列番号４に示すアミノ酸配列；
ｖ）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも約２８％一致するアミノ酸配列；および、
ｖｉ）配列番号６に示すアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１、３または５の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その核酸配列が（ａ）ないし（ｃ）に記載の核酸配列から逸脱しており、且つアスパラギンヒドロキシラーゼをコードする、ポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）ないし（ｄ）に記載の核酸配列のフラグメント、誘導体またはアレル変異であり、且つアスパラギンヒドロキシラーゼをコードする、ポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれる、単離されたポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、アスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、発現ベクターを含む宿主細胞である。この発現ベクターは、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示す実質的に精製されたポリペプチドである。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示す単離されたポリペプチドを製造する方法である。
【００１４】
発現ベクターを含む宿主細胞を、該発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する。このポリヌクレオチドは、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードする。このポリペプチドを該宿主培養細胞から回収する。
【００１５】
本発明の別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生物学的試料中で検出する方法である。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、生物学的試料の核酸材料とハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる。このハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法である。生物学的試料を、このポリヌクレオチドまたはタンパク質と特異的に相互作用する試薬と接触させる。この相互作用を検出する。
【００１７】
本発明の別の態様は、生物学的試料中のヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための診断キットである。
【００１８】
本発明のさらに別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節できる物質についてスクリーニングする方法である。被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドと接触させる。このポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する。該ポリペプチドに結合する被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する可能性のある治療物質であると同定する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する物質についてスクリーニングする方法である。被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドと接触させる。このポリペプチドのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を検出する。アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を増大させる被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を増大させる可能性のある治療物質であると同定する。アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下させる被験化合物を、アスパラギンヒドロキシラーゼの活性を低下させる可能性のある治療物質であると同定する。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する物質についてスクリーニングする方法である。被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。このポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する可能性のある治療物質であると同定する。
【００２１】
本発明の別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する方法である。細胞を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合する試薬と接触させる。それによりヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性が低下する。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドの活性を調節する、精製された試薬である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、癌腫および白血病、貧血、慢性炎症性疾患（関節リウマチを包含するがこれに限定される訳ではない）、および心疾患を処置する医薬の製造における、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドの活性を調節する試薬の使用である。
【００２４】
本発明の別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節する試薬および製薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物である。
【００２５】
本発明の別の態様は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび製薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物である。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、疾患を処置する方法である。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドの活性を調節する試薬またはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび製薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物の有効量を、係る処置を必要とする対象に投与する。
【００２７】
このように本発明は、例えばヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性部位においてアクチベーターまたはインヒビターとして作用し得る被験化合物を同定するために使用できる新規ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼを提供する。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼおよびそのフラグメントはさらに、該酵素をブロックし、その活性を効果的に低下させることのできる特異抗体の作製にも有用である。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、３つの新規なヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ（以下、ＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２およびＡＳＮＨ−３と称する）の発見に基づくものである。文献に記載された唯一のヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ（EC1.14.11.16）は、種々のポリペプチドの上皮細胞増殖因子様ドメイン内のＬ−アスパラギンおよび／またはアスパルタートのヒドロキシル化を触媒するジオキシゲナーゼである。
【００２９】
アスパラギンヒドロキシラーゼによるアスパラギンのヒドロキシル化は、２−オキソグルタラート、Ｏ２、Ｆｅ２＋およびアスコルバートを必要とする。以下はアスパラギンヒドロキシラーゼ反応の一例である：
【００３０】
ペプチドＬ−アスパラギン＋２−オキソグルタラート＋Ｏ2 ←→ ペプチド３−ヒドロキシＬ−アスパラギン＋スクシナート＋ＣＯ2
【００３１】
ＡＳＮＨ−１ないし３は、ＨＩＦのＴＡＤＣ内にある重要なアスパラギン残基のヒドロキシル化を触媒する新規なＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼであり、故に、正常酸素下でのＨＩＦの転写不活性化に関わっている。この活性を機能的に試験した（実験の説明については実施例５を、実験データについては図１を参照されたい）。
【００３２】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−１は配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼのコード配列を配列番号１に示す。
【００３３】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−２は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼのコード配列を配列番号３に示す。
【００３４】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−３は配列番号６に示すアミノ酸配列を含む。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼのコード配列を配列番号５に示す。
【００３５】
本発明に係るヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２およびＡＳＮＨ−３は、癌、心疾患、貧血、ＣＮＳ障害、炎症性疾患、および線維性疾患といった疾患を処置する治療法に有用である。ＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２およびＡＳＮＨ−３はさらに、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ調節物質（アクチベーターおよびインヒビター）についてのスクリーニングに使用できる。調節物質は、前記疾患の処置のための医薬の製造に使用できる。
【００３６】
ポリペプチド
本発明に係るヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列または下記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、もしくは３６９の連続するアミノ酸、または、配列番号４に示すアミノ酸配列または下記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、もしくは３７３の連続するアミノ酸、または、配列番号６に示すアミノ酸配列または下記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、もしくは３４９の連続するアミノ酸を含む。故に本発明に係るアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、アスパラギンヒドロキシラーゼタンパク質の一部、完全長アスパラギンヒドロキシラーゼタンパク質、またはアスパラギンヒドロキシラーゼタンパク質の全体もしくは一部を含む融合タンパク質であってよい。
【００３７】
生物学的活性変異体
生物学的活性な、例えばアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を保持する、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド変異体は、これもまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在するアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド変異体は、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも約２８、３６、３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０、好ましくは約７５、８０、８５、９０、９６、９６、９８、または９９％一致するアミノ酸配列を有する。推定アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド変異体と配列番号２、４または６のアミノ酸配列の一致パーセントは常法により決定する。例えば、Altschul et al., Bull.  Math.  Bio. 48:603 (1986）、およびHenikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad.  Sci. USA 89:10915 (1992）を参照されたい。簡潔に述べると、二つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティー10、ギャップエクステンションペナルティー1、およびHenikoff & Henikoff, 1992の“ASNH-1BLOSUM62”採点マトリックスを使用して、アラインメント評点が最適となるようにアラインメントする。
【００３８】
当業者には、二つのアミノ酸配列をアラインメントするため数多くの確立されたアルゴリズムを利用できることが認識できるであろう。Pearson & Lipmanの“FASTA”類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示のアミノ酸配列と推定変異体のアミノ酸配列が有する一致のレベルを調べるのに好適なタンパク質アラインメント法である。FASTAアルゴリズムはPearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990）に記載されている。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、最初に、保存的アミノ酸置換、挿入、または除去を考慮せずに、問題の配列（例えば配列番号２、４または６）と被験配列が共有する、最高密度の一致（ｋｔｕｐ変数が１である場合）または一致の対（ｋｔｕｐ＝２の場合）のいずれかを有する領域を同定することにより、配列類似性を特性決定する。次に、最高密度の一致を有する１０の領域を、アミノ酸置換マトリックスを用いて全ての対となったアミノ酸の類似性を比較することによって再び採点し、該領域の末端を、最高点に寄与する残基のみを含むよう、「トリム」する。「カットオフ」値より大きな評点を持つ領域が幾つかある場合は（その配列の長さｋｔｕｐ値に基づいて予め定めた式によって算出する）、トリムした最初の領域を調べ、その領域を加えてギャップを持つ近似的アラインメントを作ることができるかどうかを決定する。最後に、その二つのアミノ酸配列のうち最高点の領域を、アミノ酸挿入と除去を施すNeedleman-Wunsch-Sellersアルゴリズム（Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math.26:787 (1974))の改変を用いてアラインメントする。ＦＡＳＴＡ分析のための好ましいパラメータは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエクステンションペナルティー＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータを、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)の追補2に説明されているように、採点マトリックスファイル（“ＳＭＡＴＲＩＸ”）を改変することにより、ＦＡＳＴＡプログラム中に導入できる。
【００３９】
ＦＡＳＴＡを使用して、上に開示のような比率を用いて核酸分子の配列一致を決定することもできる。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は１ないし６、好ましくは３ないし６の範囲であってよく、最も好ましくは３であり、他のパラメータをデフォルトとして設定する。
【００４０】
一致パーセントにおける変異は、例えばアミノ酸置換、挿入、または除去に起因し得る。アミノ酸置換は１個のアミノ酸の置き換えと定義する。置換されたアミノ酸が似通った構造的および／または化学的性質を持っている時、これらは性質が同類である。同類置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００４１】
アミノ酸挿入または除去はアミノ酸配列へのまたはアミノ酸配列内の変化である。これらは典型的には約１ないし５アミノ酸の範囲にある。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの生物学的活性または免疫学的活性を廃失することなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または除去できるかを決定する指針は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのような当分野で周知のコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。例えばKivirikko, K. I., Myllyla, T. (1982) Methods Enzymol. 82, 245-304、またはCuncliffe, C. J., Franklin, T. J., Gaskell, R. M. (1986) Biochem. J. 240, 617-619に記載のようにしてアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を検定することにより、アミノ酸変化が生物学的活性アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを生成しているかどうかを容易に決定することができる。
【００４２】
融合タンパク質
融合タンパク質は、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系における使用にとって有用である。例えば、融合タンパク質を、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質を同定するために使用できる。この目的のために、タンパク質-タンパク質相互作用のためのタンパク質アフィニティークロマトグラフィーまたはライブラリーに基づく検定、例えば酵母2ハイブリッドまたはファージディスプレー系が使用できる。このような方法は当分野でよく知られており、薬物スクリーニングとしても利用することができる。
【００４３】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合によって融合した2個のポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号2に示すアミノ酸配列または上記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、もしくは３６９の連続するアミノ酸、または、配列番号４に示すアミノ酸配列または上記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、もしくは３７３の連続するアミノ酸、または、配列番号６に示すアミノ酸配列または上記定義によるその生物学的活性変異体から選ばれる少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、もしくは３４９の連続するアミノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントは完全長アスパラギンヒドロキシラーゼタンパク質を含むこともできる。
【００４４】
第二のポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質フラグメントであってよい。融合タンパク質の組み立てに通常使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を融合タンパク質組み立てに使用する。その他の融合組み立ては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ  ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合を包含できる。融合タンパク質を、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドコード配列および異種タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むように組み立てることもでき、その結果、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドが開裂してその異種部分が含まれないように精製することができる。
【００４５】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質を２個のポリペプチドセグメントを共有結合で連結することによって、または、分子生物学分野の標準法によって製造する。例えば、第二のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドと共に、配列番号１、３または５から選ばれるコード配列を適切なリーディングフレームに含むＤＮＡ組み立て物を作製し、そしてそのＤＮＡ組み立て物を当分野で知られるように宿主細胞中で発現させることにより、組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質を製造することができる。融合タンパク質を組み立てるための数多くのキットが、Promega Corporation (Madison, WI)、Stratagene (La Jolla, CA)、CLONTECH (Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)、MBL International Corporation (MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Biotechnologies (Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS）といった会社から入手できる。
【００４６】
種相同体の同定
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの種相同体をアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドポリヌクレオチド（下に記載）を用いて取得し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするための適当なプローブまたはプライマーを作製し、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの相同体をコードするｃＤＮＡを同定し、そしてそのｃＤＮＡを当分野で知られるように発現させることができる。
【００４７】
ポリヌクレオチド
アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、配列番号２、４または６に示すアミノ酸配列を有するアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはその生物学的活性変異体のコード配列またはそのコード配列の相補体を含む。配列番号２のコード配列を配列番号１に示し；配列番号４のコード配列を配列番号３に示し；配列番号６のコード配列を配列番号５に示す。
【００４８】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、および配列番号１、３または５に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、９８、または９９％一致する相同的ヌクレオチド配列またはそれらの相補体もまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ギャップオープニングペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２のアフィンギャップ検索を用いて、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用するＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを使用して決定する。生物学的活性アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体、および変異体もまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドである。配列番号１、３、もしくは５の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１５、２０、または２５の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドフラグメントまたはそれらの相補体もまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドである。これらのフラグメントは例えばハイブリダイゼーションプローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用できる。
【００４９】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの変異体および相同体もまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドである。典型的には、相同的アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列は、当分野で知られるように、候補ポリヌクレオチドをストリンジェントな条件下で既知アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって同定できる。例えば、以下の洗浄条件  −  ２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％  ＳＤＳ、室温で２回、各々３０分間；  次いで２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１回３０分間；次いで２×ＳＳＣ、室温で２回、各々１０分間、を使用して、最大で約２５−３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を同定することができる。より好ましくは、相同的核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチ、より好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００５０】
本明細書に開示するアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの種相同体は、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えば、ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍが、相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することはよく知られている（Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973）。それ故、推定的相同アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを、配列番号１、３または５のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの変異体または他の種のアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを同定することができる。この被験ハイブリッドの融点を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融点と比較し、その被験ハイブリッド内の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００５１】
緊縮ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従ってアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドまたはそれらの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドである。緊縮洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, at pages 9.50-9.51に開示されている。
【００５２】
典型的には緊縮ハイブリダイゼーション条件として、温度と塩濃度の組み合わせは、研究対象のハイブリッドの算定Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低く選択すべきである。配列番号１、３または５に示すヌクレオチド配列を有するアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドまたはその相補体と、それらのヌクレオチド配列のうち１つに少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列のハイブリッドのＴｍは、例えばBolton and McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962）の式:
Tm = 81.5℃ - 16.6(log10[Na+])＋0.41(%G＋C) - 0.63(%ホルムアミド) - 600/l)
［式中、ｌ＝ハイブリッドの塩基対長さである］
を用いて算出できる。
【００５３】
緊縮洗浄条件は、例えば、４×ＳＳＣ、６５℃、または５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、４２℃、または０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃を包含する。高度緊縮洗浄条件は、例えば０．２×ＳＳＣ、６５℃を包含する。
【００５４】
ポリヌクレオチドの製造
アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドは、膜成分、タンパク質、および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞によって製造され標準的核酸精製技術を用いて単離でき、または、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような増幅技術を用いて、または自動合成機を用いて合成できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり当分野で周知である。ポリヌクレオチドを取得するためのこのような技術はいずれも、単離されたアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを取得するために使用できる。例えば、制限酵素とプローブを用いて、アスパラギンヒドロキシラーゼヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドフラグメントを単離することができる。単離されたポリヌクレオチドは、他の分子を全く含まないか、または少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００５５】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼｃＤＮＡ分子は、アスパラギンヒドロキシラーゼｍＲＮＡを鋳型として標準的分子生物技術で作製できる。その後、当分野で知られ、Sambrook et al.(1989)のようなマニュアルに開示されている分子生物技術を用いてヒトアスパラギンヒドロキシラーゼｃＤＮＡ分子を複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲのような増幅技術を用いて、本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを取得することができる。
【００５６】
別法として、合成化学技術を用いてアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを合成できる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号２、４、６に示すアミノ酸配列を有するアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはその生物学的活性変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００５７】
ポリヌクレオチドの伸長
ＰＣＲに基づく様々な方法を使用して、本明細書に開示する核酸配列を伸長し、プロモーターおよび調節エレメントといった上流配列を検出することができる。例えば、制限部位ＰＣＲは、既知遺伝子座に隣接する未知の配列を回収するために普遍プライマーを使用する（Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318 322, 1993）。ゲノムＤＮＡをまず、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次にこの増幅した配列を、同じリンカープライマーおよび第一のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二巡目のＰＣＲに付す。各回のＰＣＲ生成物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００５８】
既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988）。商業的に入手できるソフトウェア、例えばOLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.）を使用して、プライマーを、２２−３０ヌクレオチド長であり、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、そして約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするように設計できる。この方法は、遺伝子の既知領域に適当なフラグメントを作り出すような幾つかの制限酵素を使用する。次いでこのフラグメントを分子内ライゲーションによって環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００５９】
利用できるもう一つの方法は、捕捉ＰＣＲであり、これは、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を含むものである（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1, 111-119, 1991）。この方法では、作り出した二本鎖配列をPCR実施の前にDNA分子の未知フラグメント中に挿入するために、複数の制限酵素消化およびライゲーションが利用できる。
【００６０】
未知配列を回収するために利用できるもう一つの方法は、Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991）の方法である。さらに、PCR、入れ子プライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）を使用して、ゲノムDNAを歩行させることができる（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を回避し、イントロン/エキソン接合点の発見に有用である。
【００６１】
完全長ｃＤＮＡについてスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが好ましい。ランダムプライミングしたライブラリーは遺伝子の５’領域を含むより多くの配列を含んでいるという点で好ましい。ランダムプライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない状況にとって特に好ましいかも知れない。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域内に伸長するために有用となり得る。
【００６２】
商業的に入手できる毛細管電気泳動系を用いて、大きさを分析し、またはＰＣＲ生成物もしくは配列決定する生成物のヌクレオチド配列を確認できる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離のための流動ポリマー、レーザー活性化される４種類の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種）、および電荷結合素子カメラによる放射波長の検出を利用できる。出力／光強度を適当なソフトウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR, Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換し、試料のロードからコンピューター解析および電子的データ表示までの全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限定した量で存在するかも知れないＤＮＡ小片の配列決定にとって特に好ましい。
【００６３】
ポリペプチドの取得
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００６４】
タンパク質の精製
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、アスパラギンヒドロキシラーゼ発現組み立て物でトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該ポリペプチドを発現する任意の細胞から精製できる。精製アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、当分野で周知の方法を用いて、その細胞中で通常アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに随伴する他の化合物、例えば或る種のタンパク質、炭水化物、または脂質から分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するがこれらに限定される訳ではない。精製アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの調製品は少なくとも８０％純度であり；好ましくはこの調製品は９０％、９５％、または９９％純度である。この調製品の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で知られる任意の手段によって評価できる。
【００６５】
ポリヌクレオチドの発現
アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを発現させるため、このポリヌクレオチドを、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む発現ベクター中に挿入することができる。当業者に周知の方法を用いて、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列ならびに適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを組み立てることができる。これらの方法は、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを包含する。このような技術は、例えばSambrook et al. (1989) およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989に記載されている。
【００６６】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を含みそして発現する種々の発現ベクター／宿主系を利用できる。これらは、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系を包含するがこれらに限定されない。
【００６７】
調節エレメントまたは調節配列とは、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域  −  エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域  −  である。このような要素はそれらの強度と特異性が異なっている。使用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する数多くの適切な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla, Calif.）またはpSPORT1プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞で使用できる。植物細胞ゲノム（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルス（例えばウイルスプロモーターまたはリーダー配列）から誘導したプロモーターまたはエンハンサーをベクター中にクローニングできる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を複数コピー含むセルラインを作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用できる。
【００６８】
細菌および酵母発現系
細菌系では、意図するそのアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの使用に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体誘導のために大量のアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを必要とする場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターを利用できる。このようなベクターは、BLUESCRIPT（Stratagene）のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包含するがこれに限定されない。BLUESCRIPTベクターでは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、このベクター内で、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列にフレーム内でライゲーションし、ハイブリッドタンパク質を精製させることができる。ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために利用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着とこれに続く遊離グルタチオン存在下での溶離によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。このような系で製造されたタンパク質は、クローニングされた目的ポリペプチドを意のままにＧＳＴ部分から解放できるように、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計することができる。
【００６９】
酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターを使用できる。総説についてはAusubel et al.  (1989) and Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987を参照されたい。
【００７０】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列の発現を幾つかのプロモーターのうちのいずれかによって促すことができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを単独で、またはＴＭＶ（Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯまたは熱ショックプロモーターの小サブユニットのような植物プロモーターが使用できる（Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984; Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991）。これらの組み立て物は、直接的ＤＮＡ形質転換によって、または病原体仲介トランスフェクションによって植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手できる総説に記載されている（例えば、Hobbs or Murray, in MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp. 191 196, 1992）。
【００７１】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現に昆虫系を使用することもできる。例えば、このような１つの系では、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして使用して、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫で外来遺伝子を発現させる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、該ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下におくことができる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、コートタンパク質を欠失する組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスを用いてS. frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させ、そこでアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現させることができる（Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994）。
【００７２】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく幾つかの発現系を用いてアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを哺乳動物宿主細胞で発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三分割リーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を利用して、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを感染宿主細胞で発現させることのできる生存ウイルスを取得できる（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984）。所望により、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００７３】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いてプラスミドに含まれそこで発現されるフラグメントより大きなＤＮＡのフラグメントをデリバリーすることもできる。６Ｍないし１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的デリバリー法（例えばリポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）によってデリバリーする。
【００７４】
特定の開始シグナルを用いてアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することもできる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を包含する。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合は、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ない。しかしながら、コード配列またはそのフラグメントのみを挿入した場合には、外因性翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給せねばならない。この開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするため、正しいリーディングフレームになければならない。
【００７５】
外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成の様々な起源であってよい。発現の効率を、使用する特定の細胞系に適したエンハンサーの包含によって増強することができる（Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994）。
【００７６】
宿主細胞
挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを所望の方法で加工する能力について宿主細胞株を選択できる。該ポリペプチドの係る修飾は、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化、およびアシル化を包含するがこれらに限定される訳ではない。ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳みおよび/または機能を促進するために利用できる。特定の細胞機構および翻訳後活性に特徴的なメカニズムを有する異なる宿主細胞（CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38）を、American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾と加工を確実とするために選択することができる。
【００７７】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを安定に発現するセルラインを、ウイルス複製起点および/または内因性発現要素を含む発現ベクターならびに同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を用いて形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を富化培地で1-2日間増殖させ、その後選択培地に交換する。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、導入されたアスパラギンヒドロキシラーゼ配列を成功裏に発現する細胞の増殖と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986を参照されたい。形質転換されたセルラインの回収のため、数多くの選択系を使用できる。
【００７８】
これらは、それぞれｔｋ！-またはａｐｒｔ！-細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11, 223-32, 1977）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980）遺伝子を包含するがこれらに限定されない。また、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基礎として使用することもできる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキサート耐性を付与し（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980）、ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1 14, 1981）、そしてａｌｓおよびｐａｔは各々クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murray, 1992、上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは、トリプトファンの代わりに細胞にインドールを利用させ、ｈｉｓＤはヒスチジンの代わりに細胞にヒスチノールを利用させる（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988）。アントシアニン類、β-グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンといった可視マーカーを使用して形質転換体を同定し、特定のベクター系に帰すべき一時的または安定なタンパク質発現の量を定量することができる（Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995）。
【００７９】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドもまた存在することを示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列をマーカー遺伝子配列内に挿入するならば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。別法として、マーカー遺伝子を、単一のプロモーターの調節下にアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列と縦列に位置させることができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの発現を示している。
【００８０】
或いは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを含みアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを発現する宿主細胞を、当業者に知られる様々な方法で同定できる。これらの方法には、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための、膜、溶液、またはチップに基づくテクノロジーを包含するＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が包含されるがこれらに限定されない。例えば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在を、プローブまたはフラグメントまたはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列から選択したオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００８１】
該ポリペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）がある。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド上の２個の非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル型イムノアッセイを利用でき、または競合的結合検定を使用できる。これらのそしてその他の検定は、Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS:  A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) およびMaddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983）に記載されている。
【００８２】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、それらを様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製する手段は、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、または標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を包含する。別法として、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、ｍＲＮＡプローブの製造のためのベクター中にクローニングすることもできる。係るベクターは当分野で既知であり、商業的に入手でき、そして標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６の添加によりインビトロでＲＮＡプローブを合成するために利用できる。これらの方法は様々な商業的に入手できるキットを用いて実施できる（Amersham Pharmacia Biotech, Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識は、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセンス、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子等を包含する。
【００８３】
ポリペプチドの発現および精製
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養から該タンパク質を発現させ回収するのに好適な条件下で培養できる。形質転換細胞の産生したポリペプチドは、配列および／または使用ベクターに応じて、分泌されたり細胞内に内包されたりする。当業者には理解できるであろうが、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通過した可溶性アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの分泌を指令し、または膜結合したアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計することができる。
【００８４】
上に述べたように、その他の組み立て物を使用して、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に加えることができる。このような精製促進ドメインは、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系に利用するドメインを包含するがこれらに限定される訳ではない（Immunex Corp., Seattle, Wash.）。精製ドメインとアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの間にある第Xa因子またはエンテロキナーゼに特異的な配列（Invitrogen, San Diego, CA）のような開裂可能なリンカー配列の包含もまた精製の促進に利用できる。このような発現ベクターの一つは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位の前にある６個のヒスチジン残基およびアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー。Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992に記載されている）によって精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は、融合タンパク質からアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを精製する手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはKroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993に開示されている。
【００８５】
化学合成
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする配列を、全部または一部に当分野で周知の化学的方法を用いて合成することができる（Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn et al. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980）。或いは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド自体を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて製造することもできる。（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995）。タンパク質合成は手動法または自動化によって実施できる。自動化合成は例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成できる。所望により、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのフラグメントを別々に合成し、化学的方法を用いて合し、完全長の分子を作製することもできる。
【００８６】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィーによって実質的に精製できる（例えば、Creighton, PROTEINS:  STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983）。合成アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定によって確認できる（例えばEdman分解法；Creighton、上記、を参照されたい）。さらに、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を、直接合成中に他のタンパク質由来の配列に変え、そして/または化学的方法によって他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を製造することができる。
【００８７】
変化したポリペプチドの製造
当業者には理解できるであろうが、非天然コドンを有するアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドコード化ヌクレオチド配列を製造することが好都合である。例えば、特定の原核または真核生物宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現速度を増大させ、または、望ましい性質、例えば天然配列から生成した転写物の半減期より長い半減期を有するRNA転写物を生成させることができる。
【００８８】
様々な動機でアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドコード化配列を変化させる、当分野で一般に知られる方法を用いて、本明細書に開示のヌクレオチド配列を作り上げることができるが、それらの変化には、該ポリペプチドもしくはｍＲＮＡ生成物のクローニング、プロセシング、および／または発現を改変する変化が包含される（但しこれらに限定されない）。ランダムフラグメンテーションによるＤＮＡシャフリングおよび遺伝子フラグメントと合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を用いてこのヌクレオチド配列を作り上げることができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変化させ、スプライス変異体を作製し、突然変異を導入し、等を行うことができる。
【００８９】
抗体
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、当分野で知られる任意の型の抗体を作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、アスパラギンヒドロキシラーゼ−ポリペプチドのエピトープと結合できる、無傷の免疫グロブリン分子、ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖを包含する。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープは、より多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００９０】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は、治療に、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で知られる免疫化学検定に利用できる。種々のイムノアッセイを用いて所望の特異性を有する抗体を同定できる。競合的結合検定または免疫放射線検定のための数多くのプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には免疫原とその免疫原に特異的に結合する抗体の間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００９１】
典型的には、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用した場合、他のタンパク質が提供するシグナルの少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、溶液からアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを免疫沈降させることができる。
【００９２】
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを使用して哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫し、ポリクローナル抗体を作製することができる。所望により、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを、牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンのような担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて様々なアジュバントを使用して免疫反応を増大させることができる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール類、ポリアミン類、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定される訳ではない。人間に使用するアジュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有用である。
【００９３】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、連続セルラインの培養によって抗体分子を産生させる任意の技術を用いて製造できる。これらの技術は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を包含するがこれらに限定されない（Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984）。
【００９４】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして、適当な抗原特異性と生物学的活性を有する分子を取得する、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術を利用できる（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985）。モノクローナルおよびその他の抗体を「ヒト化」して、これを治療に用いた際に患者がその抗体に対する免疫反応を呈することを防ぐこともできる。このような抗体は、治療に直接用いるヒト抗体と配列が充分似通っていることもあれば幾つかの重要残基の変更を要することもある。個々の残基の位置指定突然変異誘発によって、または相補性決定領域全体を移植することによって、ヒト配列の残基と異なる残基を交換して、齧歯類抗体とヒト配列の間の配列相違を最小化することができる。或いは、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のような組換え法を用いてヒト化抗体を作製できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化されている抗原結合部位を含むことができる。
【００９５】
或いは、一本鎖抗体の作製について記載された技術を、当分野で知られる方法を用いて、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体の作製に適合させることができる。関連する特異性を有するが別個のイディオタイプ組成の抗体を、ランダム組み合わせ免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャフリングによって作製することができる（Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991）。
【００９６】
一本鎖抗体は、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを使用し、ＰＣＲのようなDNA増幅法を用いて組み立てることもできる（Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であってよく、二価または四価であってよい。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立てが、例えばColoma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはMallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206に教示されている。
【００９７】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を、下に記載するように、手動または自動化ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準組換えDNA法を用いて発現組み立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、例えば繊維状ファージ技術を用いて一本鎖抗体を直接作製することもできる（Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91）。
【００９８】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体は、リンパ球集団でのインビボ産生を誘導することによって、または免疫グロブリンライブラリーもしくは文献に開示される高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって製造することもできる（Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293-299, 1991）。
【００９９】
他の型の抗体を組み立て、本発明方法において治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のようにキメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価および多重特異性である結合タンパク質、例えばＷＯ  ９４／１３８０４に記載の「ダイアボディ」もまた製造できる。
【０１００】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法で精製できる。例えば、抗体を、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドが結合するカラムを通過させることによりアフィニティ精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出する。
【０１０１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列である。細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、その細胞が生成した天然配列に結合し、複合体を形成して転写または翻訳のいずれかをブロックする。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子はＤＮＡ組み立て物に供給でき、上記のように細胞中に導入して該細胞におけるアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子産物のレベルを減少させることができる。
【０１０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、或るヌクレオチドの５’末端を別のヌクレオチドの３’末端に、非ホスホジエステルヌクレオチド間結合、例えばアルキルホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホノチオアート、アルキルホスホナート、ホスホロアミダート、燐酸エステル、カルバマート、アセトアミダート、カルボキシメチルエステル、カルボナート、および燐酸トリエステルで共有結合させることにより、手動でまたは自動合成機によって合成できる。Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990を参照されたい。
【０１０３】
アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することによって、アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子発現の修飾を達成できる。転写開始部位から誘導したオリゴヌクレオチド、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間が好ましい。同様に、「三重ヘリックス」塩基対合法を用いて阻害が達成できる。三重ヘリックス対合は、二重ヘリックスがポリメラーゼ、転写因子、またはシャペロンの結合に充分な程開く能力の阻害を惹起するため、有用である。三重螺旋DNAを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えば、Gee et al., in Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、転写物がリボゾームに結合するのを妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳をブロックするよう設計することもできる。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドの相補配列の間に複合体がうまく形成されるために、正確な相補性は必要ない。例えばアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドに精確に相補的であり、各々が、隣接するアスパラギンヒドロキシラーゼヌクレオチドに相補的でない１つながりの連続ヌクレオチドで隔てられている、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アスパラギンヒドロキシラーゼｍＲＮＡに対する充分なターゲッティング特異性を提供できる。好ましくは、相補的連続ヌクレオチドの各部分は少なくとも４、５、６、７、もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、算出されたアンチセンス対の融点を用いて、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチド配列の間の、許容できるミスマッチの程度を容易に決定することができる。
【０１０５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドとハイブリダイズするそれらの能力に影響を及ぼすことなく修飾され得る。これらの修飾は、そのアンチセンス分子の内部であってもよいし一端もしくは両端であってもよい。例えば、アミノ基と末端リボースの間に異なる数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を付加することで、ヌクレオシド間燐酸結合を修飾できる。修飾塩基および／または糖、例えばリボースに代わるアラビノース、または、３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに利用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法によって製造できる。例えば、Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987を参照されたい。
【０１０６】
リボザイム
リボザイムとは、触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、RNA配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するために使用できる（例えば、Haseloff et al., 米国特許5641673号）。リボザイムの作用メカニズムは、相補的標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、これに続くエンドヌクレアーゼ的開裂を含む。例として、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレアーゼ的開裂を特異的且つ効果的に触媒する、作り上げられたハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子が包含される。
【０１０７】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドのコード配列を利用して、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを作製できる。トランス型の他のＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂させ得るリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988を参照されたい）。例えば、別個の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイム中に作り上げることにより、リボザイムの開裂活性を特定のＲＮＡに向かわせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに相補的な配列を含み、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerlach et al., EP 321,201を参照されたい）。
【０１０８】
アスパラギンヒドロキシラーゼＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ、を包含するリボザイム開裂部位について標的分子をスキャンすることによって同定できる。同定したならば、開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５ないし２０のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を機能不能にさせることのできる二次構造の特徴について評価する。候補アスパラギンヒドロキシラーゼＲＮＡ標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性を試験することで評価することもできる。標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させるため、より長い相補配列を使用することができる。リボザイムのハイブリダイズ領域と開裂領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡとハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂させるよう、完璧に相関している。
【０１０９】
リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞中に導入され得る。マイクロインジェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈降といった機械的方法を利用して、アスパラギンヒドロキシラーゼ発現の低下を望む細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入できる。別法として、細胞が該ＤＮＡ組み立て物を安定に保持することを望む場合は、当分野で知られるように、組み立て物をプラスミド上に供給し、別々の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に統合することができる。リボザイムをコードするＤＮＡ組み立て物は、細胞におけるリボザイムの転写を制御するために、転写調節エレメント、例えばプロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルを含むことができる。
【０１１０】
Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５６４１６７３号に教示されるように、リボザイムの発現が標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答して起こるようにリボザイムを作ることができる。さらにリボザイムは、リボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に導入された時にのみｍＲＮＡの破壊が起こるよう、さらなるレベルの調節を提供するように作り上げることもできる。
【０１１１】
差別的に発現される遺伝子
その生成物がヒトアスパラギンヒドロキシラーゼと相互作用する遺伝子の同定のための方法をここに記載する。そのような遺伝子は、貧血、癌、心疾患、炎症性疾患、線維性疾患、およびＣＮＳ障害を包含するがこれらに限定されない疾患において差別的に発現される遺伝子であり得る。さらにそのような遺伝子は、係る疾患の進行または処置に関連する操作に応答して差別的に調節される遺伝子であり得る。加えて、そのような遺伝子は、組織または生物の異なる発生段階において増大または減少する、一時的に調節される発現を有するかも知れない。差別的に発現される遺伝子はまた、実験条件に対する制御下でその発現が調節されるかも知れない。さらに、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子または遺伝子産物は、それ自体を差別的発現について試験することができる。
【０１１２】
疾患状態に比して正常状態で発現が異なる程度は、ディファレンシャルディスプレー技術のような標準的特性解明技術によって視覚化するに充分大きな程度でありさえすればよい。発現の相違が視覚化できるその他の係る標準的特性解明技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するがこれらに限定される訳ではない。
【０１１３】
差別的に発現される遺伝子の同定
差別的に発現される遺伝子を同定するためには、全てのＲＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡを目的組織から単離する。例えば、被験対象の組織から、そして対照の対応組織からＲＮＡ試料を取得する。ｍＲＮＡの単離に反する選択をしない任意のRNA単離技術を、係るRNA試料の精製に利用できる。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばChomczynskiの一段階RNA単離プロセス、米国特許4843155号を用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１１４】
差別的に発現された遺伝子により生成されたＲＮＡである、取得ＲＮＡ試料の中にある転写物を当業者に周知の方法で同定する。それらは、例えばディファレンシャルスクリーニング（Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-12, 1988）、差し引きハイブリダイゼーション（Hedrick et al., Nature 308, 149-53; Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2825, 1984）、および好ましくはディファレンシャルディスプレー（Liang & Pardee, Science 257, 967-71, 1992; U.S. Patent 5262311）を包含する。
【０１１５】
差別的発現の情報は、それ自身、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの関与している疾患の処置のための関連法を示唆しているかも知れない。例えば、処置は、差別的に発現される遺伝子および／またはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現調節を包含できる。差別的発現の情報は、差別的に発現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子もしくは遺伝子産物の発現または活性が、アップレギュレーションされるのかダウンレギュレーションされるのかを示すことができる。
【０１１６】
スクリーニング法
本発明は、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドと結合し、またはその活性を調節する被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。被験化合物は好ましくはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物はアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を、被験化合物の不在時に比して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％減少または増大させる。
【０１１７】
被験化合物
被験化合物は、当分野で既に知られている薬理物質であるか、または何らかの薬理活性を有していることが過去に知られていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在していても、実験室で設計されたものであってもよい。これらは微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、また、組換えによって、または当分野で既知の化学的方法によって製造されたものであってもよい。所望により、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定されない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて被験化合物を取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているのに対し、他の４つのアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子ライブラリーの化合物に適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997を参照されたい。
【０１１８】
分子ライブラリーの合成法は当分野で周知である（例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994を参照されたい）。化合物のライブラリーは、溶液で（例えばHoughten, BioTechniques 13, 412-421, 1992を参照されたい）、またはビーズ上に（Lam, Nature 354, 82-84, 1991）、チップ上に（Fodor, Nature 364, 555-556, 1993）、細菌もしくは胞子上に（Ladner、米国特許5223409号）、プラスミド上に（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992）、またはファージ上に（Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990）; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; およびLadner、米国特許5223409号）提供され得る。
【０１１９】
高スループットスクリーニング
被験化合物を、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力またはアスパラギンヒドロキシラーゼ活性もしくはアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子発現に影響を及ぼす能力について、高スループットスクリーニングを用いてスクリーニングすることができる。高スループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験することができ、その結果、膨大な数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範囲に確立されている技術は９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェル微量定量プレートを使用する。微量定量プレートのウェルは、典型的には５ないし５００μｌの範囲の検定容量が必要である。プレートに加えて、マイクロウェルフォーマットに適合した多くの機器、材料、ピペット、ロボット工学、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が商業的に入手可能である。
【０１２０】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁の無い検定が利用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための単純均質検定において色素細胞（メラノサイト）を使用する検定が、Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18 (1994）に記載されている。この細胞をペトリ皿中のアガロースの下に敷き、次いで組み合わせ化合物を担持するビーズをアガロース表面に置く。組み合わせ化合物がビーズから部分的に放出される。化合物がゲルマトリックス中に局所的に拡散されるにつれて活性化合物が細胞を変色させるため、活性化合物は暗色領域として視覚化される。
【０１２１】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、the First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening (Philadelphia, Pa.) (1995年11月7-10日）において報告されたChelsky, “Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches,” に記載されている。Chelskyは、ゲル中の酵素がゲル全体に変色を惹起するように、アガロースゲル内部に炭酸脱水酵素のための単純均質酵素検定を配置した。その後、光リンカーで組み合わせ化合物を担持しているビーズをゲル内部に入れ、該化合物をＵＶ光により部分的に放出させた。酵素を阻害した化合物は、より変色の小さな局所的阻害区域として観察された。
【０１２２】
さらに別の例が、Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996）に記載されている。この例では、寒天中で成長する癌細胞に対して細胞毒性効果を有する化合物について組み合わせライブラリーをスクリーニングした。
【０１２３】
別の高スループットスクリーニング法がBeutel et al.、米国特許5976813号に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックス中に位置させる。次いで、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形態の容易に操作できる固体支持体の中、または上部、または底部に、１またはそれ以上の検定成分を位置させる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されると、それらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざることなく検定が実施できる。
【０１２４】
結合検定
結合検定のためには、被験化合物は好ましくは例えばアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの活性部位に結合してそれを占有し、その結果正常な生物学的活性が妨げられるような小分子である。係る小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するがこれらに限定されない。
【０１２５】
結合検定では、被験化合物またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、検出可能な標識、例えば蛍光、ラジオアイソトープ、化学ルミネセンスまたは酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを含み得る。次に、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに結合している被験化合物の検出を、例えば放射線放出の直接計数によって、またはシンチレーション計数によって、または適当な基質から検出可能生成物への変換を測定することによって達成することができる。
【０１２６】
別法として、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに対する被験化合物の結合を、これらの相互作用物質のいずれも標識せずに測定することもできる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて被験化合物とアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばCytosensor(登録商標)）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位計測センサー（LAPS）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、被験化合物とアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの相互作用の指標として利用できる（McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992）。
【０１２７】
被験化合物のアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドへの結合能力の測定は、実時間Bimolecular Interaction Analysis (BIA) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991、およびSzabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995）のような技術を用いても達成できる。ＢＩＡは、相互作用物質のいずれをも標識せずに実時間で生物特異的相互作用を調査する技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。生体分子間の実時間反応の指標として、光学的事象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が使用できる。
【０１２８】
本発明のさらに別の態様では、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを、２ハイブリッド検定または３ハイブリッド検定における「ベイトタンパク質」として使用して（例えば、米国特許5283317号；Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054, 1993; Bartel et al., BioTechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; およびBrent W094/10300）、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに結合してこれと相互作用し、その活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
。
【０１２９】
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインで構成される殆どの転写因子の調節特性に基づくものである。簡潔に述べると、この検定は２つの異なったＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の組み立て物では、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、既知転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させることができる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物では、未確認タンパク質（「プレイ」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列を、既知転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合させることができる。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存性複合体を形成するならば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインはごく近位にもたらされる。この近位性は、転写因子に応答する転写調節部位に機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、そしてアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡ配列の取得に利用することができる。
【０１３０】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化し、一方または両方の相互作用物質の非結合型から結合型を分離し易くすると共に、検定の自動化に適合させることが望ましいかも知れない。したがって、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、硝子またはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズのような粒子（ラテックス、ポリスチレン、または硝子ビーズを包含するがこれらに限定されない）を包含するがこれらに限定される訳ではない。共有および非共有結合、受動吸収、または、該ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物および固体支持体にそれぞれ結合した一対の結合部分の利用、を包含する、当分野で知られる任意の方法を用いて、酵素ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に結合させることができる。被験化合物は好ましくはアレーで固体支持体に結合させ、その結果、個々の被験化合物の位置を追跡することができる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるに適した任意の容器中で達成できる。係る容器の例は、微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管を包含する。
【０１３１】
或る態様では、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）またはグルタチオン誘導体化微量定量プレートに吸着させ、次にこれを被験化合物または被験化合物および非吸着アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドと合し；次いでこの混合物を、複合体形成を資する条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨについて生理的条件で）。インキュベーション後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して非結合成分を除く。相互作用物質の結合は、上に記載のように直接または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させ、その後結合を測定することもできる。
【０１３２】
固体支持体上にタンパク質またはポリヌクレオチドを固定化するその他の技術もまた、本発明に係るスクリーニング検定に利用できる。例えば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。ビオチニル化アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を当分野で周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockfork, III）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から製造し、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが所望の結合部位、例えばアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの活性部位と相互作用しない抗体を、このプレートのウェルに誘導できる。抗体コンジュゲーションによって非結合の標的またはタンパク質がウェル中に捕捉できる。
【０１３３】
このような複合体を検出する方法は、GST-固定化複合体について上に記載した方法に加えて、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたは被験化合物に特異的に結合する抗体を用いる複合体の免疫検出、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの活性検出に依拠する酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動を包含する。
【０１３４】
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物についてのスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むいかなる細胞も細胞に基づく検定系に使用することができる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドはその細胞内に本来存在するか、または上記のような技術を用いて導入できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの被験化合物の結合は、上記のようにして測定する。
【０１３５】
酵素検定
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドまたはアスパラギンヒドロキシラーゼの生物学的活性を示すポリペプチドのヒドロキシラーゼ活性を調節する（増大または減少させる）能力について、被験化合物を試験できる。アスパラギンヒドロキシラーゼ活性は、例えばKivirikko, K. I., and Myllyla, T. (1982) Methods Enzymol. 82, 245-304; Cuncliffe, C. J., Franklin, T. J., and Gaskell, R. M. (1986) Biochem. J. 240, 617-619; Kaule, G., and Gunzler, V. (1990) Anal. Biochem. 184, 291-297に記載のように測定できる。
【０１３６】
精製アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞のいずれかを被験化合物と接触させた後に酵素検定を実施することができる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物を、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を増大させる可能性のある治療物質であると同定する。
【０１３７】
遺伝子発現
別の態様では、アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現を増大または低下させる被験化合物を同定する。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＲＮＡの発現またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドのポリペプチド生成物を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。するとその被験化合物が、この比較に基づく発現の調節物質と同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が被験化合物不在下よりも存在下における方が大きい場合、この被験化合物を該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質またはエンハンサーであると同定する。或いは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が被験化合物不在下よりも存在下における方が小さい場合、この被験化合物を該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターであると同定する。
【０１３８】
細胞におけるアスパラギンヒドロキシラーゼｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法によって測定できる。定性的または定量的方法のいずれも利用できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドのポリペプチド生成物の存在は、例えばラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、および免疫組織化学といった免疫化学的方法を包含する、当分野で知られる様々な技術を用いて判定できる。別法として、ポリペプチド合成は、細胞培養においてインビボで、または標識化アミノ酸のアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド中への取り込みを検出する事によるインビトロ翻訳系で測定することができる。
【０１３９】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドを発現する任意の細胞を、細胞に基づく検定系で使用できる。アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチドは細胞に本来存在しているか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または樹立セルライン、例えばＣＨＯまたはヒト胚腎臓２９３細胞のいずれかが利用できる。
【０１４０】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えば、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド、アスパラギンヒドロキシラーゼポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド活性の擬似物質、アクチベーターもしくはインヒビターを含むことができる。この組成物は単独で、または少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の生物学的適合性無菌薬用担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１４１】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、薬学的に使用できる製剤中への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有できる。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路で投与できる。経口投与のための医薬組成物は、当分野で周知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量で調合できる。このような担体により、医薬組成物が、患者が服用するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として調合できる。
【０１４２】
経口使用のための薬用調合物は、活性化合物と固体賦形剤を合し、所望により得られた混合物を粉砕し、所望により適当な補助物質を添加した後に顆粒混合物を加工して、錠剤または糖衣剤の芯を得ることにより取得できる。好適な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖類；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１４３】
糖衣剤の芯は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用することができ、さらにアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含有していてもよい。製品の識別または活性化合物の量、即ち用量を特徴付けるため、染料または色素を錠剤または糖衣剤の被覆剤に加える事ができる。
【０１４４】
経口的に使用できる薬用調製物は、ゼラチンでできたはめ込み式カプセル剤ならびにゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた密封軟カプセル剤を包含する。はめ込み式カプセル剤は、乳糖または澱粉といった増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤、ならびに所望により安定剤と混合した活性成分を含有させることができる。軟カプセル剤では、活性化合物を適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに、安定剤を加えてまたは加えずに溶解または懸濁させることができる。
【０１４５】
非経口投与に好適な薬用製剤は、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝剤、例えばハンクス溶液、リンゲル液、または生理学的に緩衝化した食塩水中の水性溶液として調合できる。水性注射用懸濁液は、その懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として製造できる。適当な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまたデリバリーに利用できる。所望により、この懸濁液は適当な安定剤、または、高濃度溶液の製造を可能にするための、化合物の溶解度を増大させる物質を含有することもできる。局所または鼻内投与のためには、透過させようとする特定の障壁にとって適切な浸透剤をその製剤に使用する。係る浸透剤は一般に当分野で知られている。
【０１４６】
本発明に係る医薬組成物は当分野で知られる方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、微粒子化、乳濁化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等を包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて製造できる。塩類は、対応する遊離塩基型よりも水性またはその他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。別の例では、好ましい調製物は、以下の成分のいずれかまたは全てを含有できる凍結乾燥粉末であってよい：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、および２−７％マンニトール、ｐＨ４．５ないし５．５の範囲、使用前に緩衝液と合する。
【０１４７】
製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa.）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の処置についてのラベルを付ける。こうしたラベル表示は、量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１４８】
治療上の適応および方法
新規なヒトアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２、およびＡＳＮＨ−３は、心疾患、貧血、癌、ＣＮＳ障害、炎症性疾患、および線維性疾患の処置のために調整することができる。ＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２、およびＡＳＮＨ−３は広範囲にわたる組織分布を示し、それは酸素感知における中枢機能および／または未だ同定されていないタンパク質の翻訳後修飾に符合している。低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ）に特異的なアスパラギンヒドロキシラーゼとして、ＡＳＮＨ−１−３は、組織酸素化の変化に応答して転写が調節される遺伝子の調節において中心的役割を果たしている。これらのＨＩＦ調節遺伝子のうち、例えば血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管のデノボ形成（脈管新生）に対して中心的重要性を有している。ＬＩＴおよびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、骨髄における赤血球の形成（赤血球生成）の鍵となる調節物質である。
【０１４９】
癌
癌は基本的に腫瘍形成性の細胞形質転換によって惹起される疾患である。形質転換された細胞を正常細胞から識別する、そして癌の病態生理の根底にある、幾つかの特徴がある。これらには、制御不能の細胞増殖、正常な死を誘導するシグナルへの不応答（不死化）、細胞の運動性と侵襲性の増大、新血管形成（脈管新生）の誘導による血液供給動員能の増大、遺伝的不安定性、および調節困難な遺伝子発現が包含される。これら異常な生理と薬物耐性獲得の様々な組み合わせは、しばしば最終的に臓器不全と患者の死が起こる難治性の病態を導く。
【０１５０】
最も標準的な癌治療は細胞増殖を標的とし、形質転換した細胞と正常細胞の間の増殖能の相違にそれらの有効性を依拠している。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞型もまた極めて増殖性であるという事実、および、癌細胞が頻繁にこれらの薬剤に耐性となるという事実によって妨げられている。したがって、常套的な抗癌療法の治療指数が２．０を超えることは稀である。
【０１５１】
ゲノミクスが促した分子標的同定の出現は、より安全でより有効な癌患者の処置を提供する治療的介入のための新たな癌特異的標的を同定する可能性を開拓した。したがって、新たに発見された腫瘍関連遺伝子とその生成物を疾患におけるそれらの役割について調べ、革新的治療を発見および開発するための手段として使用することができる。上に概説した生理プロセスのいずれかにおいて重要な役割を果たしている遺伝子を、癌標的として特性解明することができる。
【０１５２】
ゲノミクスによって同定された遺伝子または遺伝子フラグメントは、機能的組換えタンパク質を生成させるための１またはそれ以上の異種発現系で容易に発現させることができる。これらのタンパク質をそれらの生化学的性質についてインビトロで特性解明し、次いで高スループット分子スクリーニングプログラムにおける手段として利用し、それらの生化学的活性の化学的調節因子を同定できる。このようにして標的タンパク質活性のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを同定し、続いて抗癌活性について細胞およびインビボ疾患モデルで試験することができる。生体モデルにおける反復試験による先行化合物の最適化ならびに詳細な薬動力学的および毒物学的分析が、薬品開発とその後の人間における試験の基礎を形作る。
【０１５３】
１００以上の異なる多様な癌があり、それらは細胞型または起源部位によって大きく６つの範疇に分けられる。癌の最も一般的な型である癌腫は上皮起源であり；肉腫は結合組織を起源とし；リンパ腫はリンパ系の癌であり；白血病は血液形成組織と血液細胞を含み；脳腫瘍は脳を起源とする癌であり；メラノーマを包含する皮膚癌は皮膚を起源とする。
【０１５４】
最も一般的な４種類の癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌である。
【０１５５】
女性の最も一般的な癌である乳癌は、悪性細胞が乳房の組織に見出される疾患である。ざっと１８００００人の女性が毎年この疾患であると診断され、うち４４０００人が死亡する。各々の乳房は葉と呼ばれる１５ないし２０の部分を有し、これらは小葉と呼ばれるより小さな数多くの部分を持っている。葉と小葉は管と呼ばれる細い管で連結している。最も一般的な型の乳癌は、乳管癌である。これは管の細胞に見出される。葉または小葉に起始する癌は葉癌と呼ばれる。葉癌は他の型の乳癌より、両方の乳房にしばしば見出される。遺伝性乳癌は乳癌の全症例のおよそ５％ないし１０％を構成している。
【０１５６】
前立腺癌は加齢男性において最も一般的な癌である。５０歳以上の男性の４０％は前立腺に顕微鏡的癌領域を有するが、８％の男性だけが臨床的に有意な疾患を発症し、３％がこの疾患で死亡するに過ぎない。前立腺は、尿と精液を陰茎から運ぶ管である尿道の上部を取り囲むほぼクルミ大のサイズである。これは、精子を保護し栄養供給する精液の幾らかを産生する。前立腺癌は骨や肺といった身体の他の部分に広がることがある。
【０１５７】
肺癌は両性を冒す二番目に多い悪性疾患である。これは、癌による死亡のうち最も急速に増大している原因であると考えられる。喫煙は肺癌の主たる危険因子であると考えられる。肺癌には２つの基本的種類：肺癌患者全体の三分の一に生ずる小細胞または燕麦細胞癌、および患者の三分の二に生ずる非小細胞癌がある。
【０１５８】
結腸直腸癌は男性および女性において三番目に多い癌である。結腸直腸癌の明確な原因は分かっていないが、環境、遺伝、家族因子および既に存在する潰瘍性大腸炎が、この癌の発症につながっている。殆どの結腸直腸癌は徐々に発症し、小さな良性の結腸直腸腺腫として始まり、数十年かかってより大きくより異形成性の病変に進行し、ついには悪性となる。
【０１５９】
心疾患
心疾患は以下の心臓および血管系の疾患を包含する：鬱血性心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、全ての種類の心房性および心室性不整脈、高血圧性血管疾患、および末梢血管疾患。
【０１６０】
心不全とは、心機能の異常が、心臓が、代謝する組織の要求に釣り合った速度で血液を送り出すことができない原因となっている病態生理学的状態として定義される。これは、基礎原因に関わりなく、高拍出量および低拍出量、急性および慢性、右側または左側、収縮期または拡張期、といった全ての種類のポンプ機能不全を包含する。
【０１６１】
心筋梗塞（ＭＩ）は一般に、冠血流の突然の減少と、これに続く、動脈硬化症により既に狭窄化している冠動脈の血栓性閉塞によって惹起される。ＭＩの予防（一次および二次予防）ならびにＭＩの急性処置および合併症の予防が包含される。
【０１６２】
虚血性疾患は、冠血流が制限され、その結果心筋の酸素要求を満たすには不充分な灌流がもたらされる状態である。この群の疾患は、安定アンギナ、不安定アンギナ、および無症候性虚血を包含する。
【０１６３】
不整脈は、全ての形態の心房および心室の頻拍性不整脈（心房性頻脈、心房粗動、心房細動、心房−心室リエントリー頻脈、早期興奮症候群、心室性頻脈、心室粗動、および心室細動）、ならびに徐脈型の不整脈を包含する。
【０１６４】
血管疾患は、原発性および全ての種類の二次性動脈高血圧症（腎性、内分泌性、神経性、その他）を包含する。ここに開示する遺伝子とそれらの生成物は、高血圧症の処置および全ての合併症の予防のための薬物標的として使用できる。
【０１６５】
末梢血管疾患とは、動脈および／または静脈血流が低下し、その結果、血液供給と組織酸素要求の間に不均衡がもたらされる血管疾患として定義される。これは、慢性末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管疾患、レイノー現象、および静脈疾患を包含する。
【０１６６】
炎症性疾患
炎症性疾患は、外因性物質、例えばウイルス性もしくは細菌性病原体または化学物質に反応した、および／または、正常もしくは変化した構造に反応した（例えば自己免疫疾患）、細胞および／または身体の免疫防御系の産物による、組織の変化および／または破壊を特徴としている。組織の炎症性変化は、血管透過性の障害の結果としての血漿液のデリバリー、免疫防御細胞の沈着、組織硬化と瘢痕形成を伴うコラーゲンの沈着、組織の破壊、および血管のデノボ形成を包含する。炎症性疾患は、関節の急性および慢性変化、例えば関節リウマチ、皮膚の急性および慢性変化、例えば心臓およびその他の内臓の乾癬、例えばエリテマトーデス、ならびに心筋炎の形態を包含する。ここに開示する遺伝子とそれらの生成物は、炎症性疾患の処置のための薬物標的として使用できる。
【０１６７】
線維性疾患
線維性疾患は、肝臓の毒素または炎症による破壊のような、組織変化の二次的反応、または認識可能な病因の無い原発性病変を起源とする。これらは、罹患臓器の間隙にコラーゲンが過剰生産および沈着し、その結果臓器の機能が甚だしく障害されることを特徴とする。線維性疾患は、皮膚、肝臓、肺、および心臓の線維性変化を包含する。
【０１６８】
貧血
貧血は、酸素を運搬する赤血球の欠乏を特徴とする。これにより組織の酸素供給の障害が導かれる。赤血球の欠乏は、出血、赤血球破壊の増大（例えば、毒性物質を原因とする）、赤血球安定性の低下、または骨髄における赤血球デノボ形成の低下の結果であり得る。デノボ形成の障害は、毒性物質への暴露（例えば、癌の化学療法薬）、癌細胞による骨髄への浸潤、または赤血球形成に必要不可欠な成長因子であるエリスロポエチンの欠乏の結果であり得る。エリスロポエチンは主に腎臓から分泌される（但し、専らという訳ではない）。故に、後者の種類の貧血は、主として腎臓に変化を有する患者に観察される（但し専らという訳ではない）。
【０１６９】
ＣＮＳ障害
脳損傷後の原発性および二次性障害、気分障害、不安障害、思考および意欲の障害、睡眠および覚醒の障害、運動単位の疾患、例えば神経原性およびミオパシー性疾患、神経変性疾患、例えばアルツハイマーおよびパーキンソン病、ならびに末梢および慢性疼痛のプロセス、といった、中枢および末梢神経系疾患もまた処置することができる。
【０１７０】
ＣＮＳ障害に随伴する疼痛もまた、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの活性を調節することで処置できる。処置できる疼痛は、中枢神経系疾患、例えば多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、背部外科手術失敗症候群、外傷性脳損傷、癲癇、パーキンソン病、卒中後の、ならびに脳および脊髄における血管病変（例えば、梗塞、出血、血管奇形）に伴う疼痛を包含する。非中枢神経障害性疼痛は、乳房切除術後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、三叉神経痛神経根障害、外科手術後疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌の疼痛、代謝性神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に続発する脈管炎性神経障害）、腫瘍随伴性多発神経障害（例えば肺の癌腫、白血病、またはリンパ腫、または前立腺、結腸もしくは胃の癌腫に随伴するもの）、三叉神経痛、脳神経痛、およびヘルペス後神経痛を包含する。癌および癌の処置に伴う疼痛も処置でき、頭痛（例えば、アウラを伴う片頭痛、アウラを伴わない片頭痛、およびその他の片頭痛疾患）、エピソード性および慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発性頭痛、および慢性発作性片側頭痛もまた処置できる。
【０１７１】
さらに、開示した遺伝子とそれらの生成物は、脳血管の変化に起因する、そして／またはＣＮＳの虚血性および／または低酸素性変化に起因する全てのＣＮＳ障害の予防および処置のための薬物標的として使用できる。
【０１７２】
さらに本発明は、上に記載したスクリーニング検定により同定される新規物質の使用に関するものである。したがって、本明細書に記載のようにして同定した被験化合物を適当な動物モデルで使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載のようにして同定した物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異抗体、リボザイム、またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチド結合分子）を動物モデルに使用して、係る物質による処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。或いは、本明細書に記載のようにして同定した物質を動物モデルに使用して、係る物質の作用メカニズムを決定することができる。さらに本発明は、本明細書に記載の処置のための、上記スクリーニング検定で同定される新規物質の使用に関するものである。
【０１７３】
アスパラギンヒドロキシラーゼ活性に影響を及ぼす試薬をヒト細胞にインビトロまたはインビボで投与して、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下させることができる。この試薬は好ましくはヒトアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現生成物に結合する。この発現生成物がタンパク質である場合、この試薬は好ましくは抗体である。ヒト細胞のエクスビボ処置のために、身体から取り出した幹細胞の調製物に抗体を添加できる。次いでこの細胞を、当分野で知られるように、クローン増殖させてまたはさせずに同じまたは別のヒト身体に移す。
【０１７４】
或る態様では、この試薬をリポソームを用いてデリバリーする。好ましくはこのリポソームは、それが投与される動物中で少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、そしてさらに好ましくは少なくとも約２４時間安定である。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを動物、例えば人間の特定部位にターゲッティングすることができる脂質組成物を含む。好ましくはこのリポソームの脂質組成物は、動物の特定臓器、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚にターゲッティングできる。
【０１７５】
本発明において有用なリポソームは、その内容物を細胞にデリバリーするために、標的とする細胞の細胞質膜と融合できる脂質組成物を含む。好ましくはリポソームのトランスフェクション効率は、約１０６細胞にデリバリーされるリポソーム１６ｎｍｏｌｅにつきＤＮＡ約０．５μｇ、より好ましくは約１０６細胞にデリバリーされるリポソーム１６ｎｍｏｌｅにつきＤＮＡ約１．０μｇ、そしてさらに好ましくは約１０６細胞にデリバリーされるリポソーム１６ｎｍｏｌにつきＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームの直径は約１００および５００ｎｍの間、より好ましくは約１５０および４５０ｎｍの間、そしてさらに好ましくは約２００および４００ｎｍの間である。
【０１７６】
本発明での使用に好適なリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子デリバリー法で標準的に使用するリポソームを包含する。より好ましいリポソームは、ポリカチオン性脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールにコンジュゲートしたコレステロールバックボーンを有するリポソームを包含する。所望によりリポソームは、特定の細胞型、例えばリポソームの外部表面に露出した細胞特異性リガンドにこのリポソームをターゲッティングさせることのできる化合物を含んでいてもよい。
【０１７７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような試薬とリポソームとの複合体形成は、当分野で標準的な方法を用いて達成できる（例えば、米国特許５７０５１５１号を参照されたい）。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇないし約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと合し、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇないし約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと合し、そしてさらに好ましくはポリヌクレオチド約１．０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと合する。
【０１７８】
別の態様では、レセプター仲介ターゲッティングデリバリーを用いて抗体をインビボで特異的組織にデリバリーできる。レセプター仲介ＤＮＡデリバリー技術は、例えばFindeis et al. Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991）に教示されている。
【０１７９】
治療有効用量の決定
治療有効用量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療有効用量とは、治療有効用量の不在時に出現するアスパラギンヒドロキシラーゼ活性に比して、アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を増大または低下させる活性成分の量を指す。
【０１８０】
任意の化合物に対して治療有効用量を細胞培養検定または動物モデル（通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ）のいずれかで最初に推定できる。動物モデルは適切な濃度範囲と投与経路の決定にも利用できる。次いでこのような情報を用いて人間への投与のための有用な用量と経路を決定することができる。
【０１８１】
治療有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）は、標準的薬学的方法により、細胞培養または実験動物で決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１８２】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定と動物実験で得られたデータを人間での使用のための用量範囲の調合に使用する。係る組成物が含有する用量は、好ましくは毒性が殆どまたは全く無いＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用する剤型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
【０１８３】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関する因子を考慮して医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分が提供されるよう、または所望の効果が維持されるように調節する。考慮に入れることのできる因子は、病態の重篤度、対象の一般健康状態、対象の年齢、体重、および性別、食餌、投与の時間と頻度、薬物併用、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答を包含する。長時間作用性の医薬組成物は、その製剤の半減期とクリアランス速度に応じて、３ないし４日毎、毎週、または２週間毎に投与できる。
【０１８４】
通常の用量は、投与経路に応じて０．１ないし１０００００マイクログラムまで、最大総用量約１ｇまで変わり得る。具体的な用量およびデリバリーの方法についての指針は文献に提供されており、当分野の医師が広く利用できる。当業者はタンパク質またはそれらのインヒビターとは異なるヌクレオチドのための製剤を利用できるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのデリバリーが、特定の細胞、状態、位置等に対して特異的となるであろう。
【０１８５】
試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドを組み立て、それを、トランスフェリン−ポリカチオン仲介ＤＮＡ移行、裸のまたはカプセル化された核酸によるトランスフェクション、リポソーム仲介細胞融合、ＤＮＡ被覆されたラテックスビーズの細胞内運搬、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−仲介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定されない）充分確立された技術を用いてエクスビボまたはインビボで細胞中に導入することができる。
【０１８６】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇないし約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇないし約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇないし約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００ないし約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇないし約２００ｎｇ、５００ｎｇないし約５０ｍｇ、約１μｇないし約２ｍｇ、約５μｇないし約５００μｇ、および約２０μｇないし約１００μｇのＤＮＡである。
【０１８７】
発現生成物がｍＲＮＡである場合、この試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のような様々な方法で細胞中に導入できる。
【０１８８】
好ましくは、試薬は、アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現またはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの活性を、該試薬の不在時に比して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現レベルまたはアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの活性を低下させるために選択したメカニズムの有効性は、当分野で周知の方法、例えばアスパラギンヒドロキシラーゼ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの免疫学的検出、またはアスパラギンヒドロキシラーゼ活性の測定を用いて評価できる。
【０１８９】
上記態様のいずれにおいても、本発明に係る任意の医薬組成物を他の適当な治療物質と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的薬学原理に従い当業者が行うことができる。治療物質の組み合わせは、相乗的に作用して、上記の様々な疾患の処置または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、低用量の各物質により治療効果を達成でき、したがって望ましくない副作用の可能性を減らすことができる。
【０１９０】
上記治療方法のいずれかを、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくは人間といった哺乳動物を包含する、係る治療を必要とする任意の対象に適用できる。
【０１９１】
診断方法
ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼはさらに、この酵素をコードする核酸配列における突然変異の存在に関連する疾患および異常または係る疾患および異常に対する感受性を検出するための診断検定に利用できる。例えば、疾患に罹患している個体と正常個体におけるアスパラギンヒドロキシラーゼをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ間の相違を決定することができる。もし突然変異が罹患個体の幾らかまたは全てに観察され、正常個体には観察されなかったならば、その突然変異は該疾患の原因である可能性がある。
【０１９２】
直接ＤＮＡ配列決定法により、レファランス遺伝子と突然変異を持つ遺伝子の間の配列相違を明らかにすることができる。さらに、クローンＤＮＡセグメントをプローブに使用して、特定のＤＮＡセグメントを検出することができる。この方法の感度はＰＣＲと組み合わせると著しく向上する。例えば、配列決定プライマーを、二本鎖ＰＣＲ生成物または改変ＰＣＲにより作製した一本鎖鋳型分子と共に使用できる。この配列決定は、放射標識ヌクレオチドを用いる常法によって、または蛍光標識を用いる自動配列決定法によって実施する。
【０１９３】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子検査を、変性剤有りまたは無しでゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化を検出することによって実施できる。例えば高分解能ゲル電気泳動によって小配列の除去および挿入が視覚化できる。異なるＤＮＡフラグメントの移動度が、それらに特異的な融解温度または部分融解温度に従ってゲル内の異なる位置で遅延する、変性ホルムアミド勾配ゲル上で、異なる配列のＤＮＡフラグメントを識別することができる（例えば、Myers et al., Science 230, 1242, 1985を参照されたい）。特定の位置における配列の変化は、ヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法で明らかにすることもできる（例えば、Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401, 1985）。このように、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの利用といった方法によって特定のＤＮＡ配列の検出を実施することができる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、in situ分析により突然変異を検出することもできる。
【０１９４】
様々な組織においてアスパラギンヒドロキシラーゼレベルの変化を検出することもできる。身体試料、例えば宿主から誘導した血液または組織生検におけるレセプターポリペプチドのレベルの検出に利用する検定は当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。
【０１９５】
本開示に引用した全ての特許および特許出願は引用により本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を概括的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することで得られるが、これらは例示のみの目的で提供しており、本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【０１９６】
実施例１
組換えヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの発現。
Pichia pastoris発現ベクターpPICZB（Invitrogen, San Diego, CA）を使用して大量の組換えヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを酵母で産生させる。アスパラギンヒドロキシラーゼコード化ＤＮＡ配列は配列番号１、３または５から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢに挿入する前にこのＤＮＡ配列を、５’末端に開始コドンを、そして３’末端にエンテロキナーゼ開裂部位、Ｈｉｓ６リポーター標識および終止コドンを有するよう、周知の方法によって改変する。さらに、両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、ｐＰＩＣＺ  Ｂの複数のクローニング部位を対応する制限酵素で消化した後、この改変したＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢにライゲーションする。この発現ベクターを、酵母プロモーターにより駆動されるPichia pastorisにおける誘導的発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて酵母を形質転換する。
【０１９７】
この酵母を５リットル振盪フラスコ中、通常条件下で培養し、組換え産生されたタンパク質を８Ｍ尿素存在下にアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）によって培養から単離する。結合したポリペプチドを緩衝液（ｐＨ３．５）で溶離し、中和する。製造者の指示に従いエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を用いる位置特異的タンパク質分解によってこのポリペプチドのＨｉｓ６リポーター標識からの分離を達成する。精製したヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを取得する。
【０１９８】
実施例２
アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに結合する被験化合物の同定。
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含む精製アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドを９６ウェル微量定量プレートのグルタチオン誘導体化ウェルに吸収させ、小分子ライブラリー由来の被験化合物に、生理的緩衝液中ｐＨ７．０で接触させる。ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドは配列番号２、４および６に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。試料を５分間ないし１時間インキュベートする。対照試料は被験化合物不在下にインキュベートする。
【０１９９】
被験化合物を含有する緩衝溶液をウェルから洗い流す。被験化合物とアスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドの結合を、ウェル内容物の蛍光測定によって検出する。被験化合物がインキュベートされていないウェルの蛍光に比して、ウェルの蛍光を少なくとも１５％増大させる被験化合物を、アスパラギンヒドロキシラーゼポリペプチドに結合する化合物であると同定する。
【０２００】
実施例３
アスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子の発現を低下させる被験化合物の同定。
アスパラギンヒドロキシラーゼ発現組み立て物でトランスフェクトしたヒト細胞の培養に被験化合物を添加し、３７℃で１０ないし４５分間インキュベートする。トランスフェクトされなかった同型細胞の培養を、被験化合物無しで同時間インキュベートして負の対照とする。
【０２０１】
Chirgwin et al.,  Biochem. 18, 5294-99, 1979に記載のようにして２つの培養からＲＮＡを単離する。２０ないし３０μｇの総ＲＮＡを用いてノーザンブロットを作製し、３２Ｐ標識したアスパラギンヒドロキシラーゼ特異的プローブと、Express-hyb (CLONTECH）中65℃でハイブリダイズさせる。このプローブは、配列番号１、３または５の相補物から選択した少なくとも１１の連続ヌクレオチドを含んでいる。被験化合物不在下で得られたシグナルに比してアスパラギンヒドロキシラーゼに特異的なシグナルを低下させる被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼ遺伝子発現のインヒビターであると同定する。
【０２０２】
実施例４
アスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下または増大させる被験化合物の同定。
被験化合物を精製アスパラギンヒドロキシラーゼと適当な反応緩衝液の混合物に添加し、３７℃で１０ないし４５分間インキュベートする。被験化合物を含まないこと以外は同じタイプの混合物を対照として使用する。アスパラギンヒドロキシラーゼ活性をKivirikko, K. I., Myllyla, T. (1982) Methods Enzymol. 82, 245-304; Cuncliffe, C. J., Franklin, T. J., Gaskell, R. M. (1986) Biochem. J. 240, 617-619, Kaule, G., and Gunzler, V. (1990) Anal. Biochem. 184, 291-297の方法を用いて測定する。
【０２０３】
被験化合物不在時のアスパラギンヒドロキシラーゼ活性に比してアスパラギンヒドロキシラーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を低下させる被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼ活性のインヒビターであると同定する。被験化合物不在時のアスパラギンヒドロキシラーゼ活性に比してアスパラギンヒドロキシラーゼのアスパラギンヒドロキシラーゼ活性を増大させる被験化合物をアスパラギンヒドロキシラーゼ活性のアクチベーターであると同定する。
【０２０４】
実施例5
ＨＩＦ−アスパラギンヒドロキシラーゼ活性の検出。
ＡＳＮＨ−３のＨＩＦ−アスパラギンヒドロキシラーゼ活性をＨＥＫ／２９３細胞における細胞同時トランスフェクション検定で調べた。細胞を９６ウェル組織培養プレート（Greiner, Germany）にウェル当たり２×１０４細胞の密度で蒔き、１０％牛胎児血清（ＰＡＡ）と抗生物質を添加したＤＭＥＭ  Ｆ１２組織培養培地（Gibco）中、５％ＣＯ２雰囲気下の加湿組織培養インキュベーター（Heraeus, Germany）内で２４時間３７℃で増殖させた。製造者の指示に従いLipofectamin試薬（Gibco）を使用してプラスミドＤＮＡをこのＨＥＫ／２９３細胞中に導入した。
【０２０５】
以下の発現プラスミドをトランスフェクション実験に使用した。ｐＣＤＮＡ３クローニングベクターはInvitrogenから入手し、ｐＦＡ−ＣＭＶおよびｐＦＲ−ｌｕｃはStratageneから入手した。
【０２０６】
１．  ｐＦＡ−ＣＭＶクローニングベクターに内包される酵母ＧＡＬ4転写因子（Gene bank受理番号：P04386）のＤＮＡ結合ドメインにカルボキシ末端融合させた、マウス低酸素誘導性因子−１α（Gene bank受理番号：NM_010431）のアミノ酸７３６ないし８３６のコード配列を含むｐＦＡ  ＨＩＦ−１αＴＡＤＣ。
【０２０７】
２．  ８１３位のＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ感受性アスパラギン残基をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ位置指定突然変異誘発キット（Stratagene）を用いる位置指定突然変異誘発によりアラニンに置換した、マウス低酸素誘導性因子-1αのコード配列を含むｐＦＡ  ＨＩＦ−１α  Ｎ８１３Ａ  ｐＣＤＮＡ３。Ｎ８１３はヒトＮ８０３のマウスオーソログである。
【０２０８】
３．  ｐＦＡ−ＣＭＶクローニングベクターに内包される酵母ＧＡＬ4転写因子（Gene bank受理番号：P04386）のＤＮＡ結合ドメインにカルボキシ末端融合させた、マウス低酸素誘導性因子−２α（Gene bank受理番号：AF045160）のアミノ酸７７４ないし８７４のコード配列を含むｐＦＡ  ＨＩＦ−２αＴＡＤＣ。
【０２０９】
４．  ８５１位のＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼ感受性アスパラギン残基をQuickChange(登録商標)ＸＬ位置指定突然変異誘発キット（Stratagene）を用いる位置指定突然変異誘発によりアラニンに置換した、マウス低酸素誘導性因子−２αのコード配列を含むｐＦＡ  ＨＩＦ−２α  Ｎ８５１Ａ  ｐＣＤＮＡ３。
【０２１０】
５．  ＴＡＴＡボックス上流に５個のＧＡＬ４結合要素を含む極小プロモーターおよび蛍ルシフェラーゼ遺伝子から成る、ｐＦＲ−ｌｕｃ、ＧＡＬ４リポーター組み立て物（Stratagene）。
【０２１１】
６．  トランスフェクション標準として使用する、ウミシイタケルシフェラーゼのコード配列を含むｐＲＬＴＫ（Promega）。
【０２１２】
７．  配列番号５由来のコード配列を含むＡＳＮＨ−３  ｐＣＤＮＡ３。この配列はGeneBank受理番号NM_017902と同一である（Homo sapiens低酸素誘導性因子１、αサブユニットインヒビター）。
【０２１３】
ｐＦＲ−ｌｕｃリポータープラスミド３０ｎｇおよびｐＲＬＴＫ内部標準１０ｎｇをＡＳＮＨ−３およびｐＦＡ  ＨＩＦ発現プラスミドで同時トランスフェクトした。ｐＦＡ−ＣＭＶからクローニングベクターを補充することにより、トランスフェクトしたｐＣＤＮＡ３プラスミドの量を一定の６０ｎｇに保った。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ緩衝液中で細胞を溶解させた後にHamamatsuカメラ（Hamamatsu Photonics, Japan）を装備したルミボックス中で測定した。
【０２１４】
ＴＡＴＡボックスに結合したＧＡＬ４結合部位の５Ｘ反復が蛍ルシフェラーゼを働かせるルシフェラーゼリポーター組み立て物を、それぞれＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α−ＴＡＤＣ融合プラスミド、ならびに候補ＨＩＦアスパラギンヒドロキシラーゼＡＳＮＨ−３で同時トランスフェクトした（図１）。
【０２１５】
ベクターのみの対照に比較して、ＧＡＬ４−ＨＩＦ−１αＴＡＤＣおよびＧＡＬ４  ＨＩＦ−２α−ＴＡＤＣ融合組み立て物はリポーターを約３００倍活性化した。ＡＳＮＨ−３の同時トランスフェクションは、ＧＡＬ４応答性リポーター遺伝子組み立て物上のＧＡＬ４  ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α融合タンパク質のトランス活性化活性を、約８５％（ＧＡＬ４  ＨＩＦ−１αＴＡＤＣ）および８０％（ＧＡＬ４  ＨＩＦ−２αＴＡＤＣ）というように著明に低下させた（各プラスミドを同量トランスフェクトさせた）（図１）。Ｎ８１３がアラニンに置換されているＧＡＬ４  ＨＩＦ−１αＴＡＤＣ突然変異体は、ｐＦＲ−ｌｕｃリポーター組み立て物上で野生型融合物よりも１１．４倍活性であった。この突然変異体はＡＳＮＨ−３による同時トランスフェクションに対して非感受性であった。これに一致して、Ｎ８５１がアラニンに置換されたＧＡＬ４  ＨＩＦ−２αＴＡＤＣ突然変異体は、対応する野生型融合物よりもｐＦＲ−ｌｕｃリポーター組み立て物上で４．６倍活性であった。また、この突然変異体はＡＳＮＨ−３による同時トランスフェクションに対して非感受性であった。
【０２１６】
実施例６
ＡＳＮＨ−１、ＡＳＮＨ−２およびＡＳＮ−Ｈ３の組織特異的発現。
種々の組織における上記遺伝子の質的な発現パターンを、実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応（TaqMan-PCR, Heid et al., Genome Res 6 (10)) によって、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）で決定した。したがって、様々なヒト組織由来の商業的に入手し得る総ＲＮＡ（Fa. Clontech）１μｇをＤＮアーゼＩで消化し、Superscript-II RT-PCRキット（Gibco, Inc.）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡの２．５％を各々のポリメラーゼ連鎖反応に使用した。
【０２１７】
Primer Express 1.5 Software（Applied Biosystems, Inc.) によって設計したフォーワードおよびリバースプライマーの配列は、ＡＳＮＨ−１の定量については5’-TGCTGCGTTCCATGAAGGT-3’(配列番号7) および5’-TGCCACAAATCCACCATGAA-3’(配列番号8) であり、使用した蛍光生成プローブは5’-6FAM-CAGAGGATGGCCCACGGGTG-TAMRA 3’(配列番号9）であった。ＡＳＮＨ−２については、フォーワードおよびリバースプライマー配列はそれぞれ5’-ACACACAGTGGCTCACAATGG-3’(配列番号10) および5’-AAGGGAGCACCTTCCTTCAAG-3’ (配列番号11）であった。ＡＳＮＨ−２の検出のための蛍光生成プローブの配列は5’−6FAM-CCTCTGGCACCCCAACGTGGC−TAMRA-3’(配列番号12）であった。ＡＳＮＨ−３のためのフォーワードプライマー配列は5’−CATTCCGCGTCTGAGTCAGA−3’(配列番号13）であり、対応するリバースプライマー配列は5’−CCACAGGCTCCTCATTCTCAA−3’(配列番号14）であり、ＡＳＮＨ−３の定量のための蛍光生成プローブの配列は5’−6FAM−CGACCCCCGGGCAGAGGAG−TAMRA−3’(配列番号15）であった。ＰＣＲ増幅の間に、Ｔａｑポリメラーゼの５’−核酸開裂活性がプローブを開裂して、３’失活剤色素ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）から５’リポーター蛍光色素６ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）を分離する。蛍光の放出は特定の増幅された生成物の量に直接比例して増大するため、ＰＣＲ生成物の指数増殖相を検出して始発鋳型濃度の決定に利用することができる。標的ｍＲＮＡレベルに逆相関する閾値サイクルＣｔを、リポーターの蛍光放出がバックグラウンドレベルよりも１０標準偏差増大するサイクル数として測定した。ｍＲＮＡレベルをβ−アクチンｍＲＮＡレベルについて補正して異なる総ＲＮＡ出発量を除外し、相対的ｄＣｔ法を用いて相対発現として算出した（TaqManユーザーガイド、Applied Biosystems, Inc.に記載）。式：expr.=2(20-dCt)を用いて発現を算出し、任意の単位で表記する。
【０２１８】
実施例７
増殖阻害検定：アンチセンスオリゴヌクレオチドは癌セルラインの増殖を抑制する。
試験に使用したセルラインはヒト結腸癌セルラインＨＣＴ１１６である。１０−１５％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０中で細胞を、０．５ｍｌの体積でｍｌあたり１００００細胞濃度で培養し、９５％空気／５％Ｏ２雰囲気下に３７℃に維持した。
【０２１９】
ホスホロチオアートオリゴリボヌクレオチドを、ホスホロアミダイト化学を用いてApplied Biosystems Model 380B DNA合成機で合成する。配列番号１または３のヌクレオチド１ないし２４位に相補的な２４塩基の配列を被験オリゴヌクレオチドとして使用する。対照として別の（ランダムな）配列を使用する：5’−TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG GAC−3’(配列番号16）。組み立てと脱保護の後、オリゴヌクレオチドを２回エタノール沈殿させ、乾燥し、燐酸緩衝化生理食塩水に所望濃度で懸濁する。
【０２２０】
オリゴヌクレオチドの純度を毛細管ゲル電気泳動とイオン交換ＨＰＬＣで検査する。この精製オリゴヌクレオチドを培養基に１０μＭ濃度で１日に１回、７日間添加する。
【０２２１】
被験オリゴヌクレオチドを７日間添加すると、ウェスタンブロッティングで測定したヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの発現が著しく低下する。この効果は対照オリゴヌクレオチドでは観察されない。３ないし７日後、培養中の細胞数を自動細胞計数機を用いて計数する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞数（１００％として表す）を、対照オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞数と比較する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞数は対照の３０％を超えず、この事は、ヒトアスパラギンヒドロキシラーゼの阻害が癌細胞に対する抗増殖作用を有する事を示している。
【０２２２】
実施例８
化合物のインビボ試験／標的の確認
癌
１．  急性メカニスティック検定
１．１  マイトジェン性血漿ホルモンレベルの低下
この非腫瘍検定は、或る化合物が、循環するホルモンの体内レベルまたは生物学的刺激に応答して産生されるホルモンのレベルのいずれかを低下させる能力を測定するものである。齧歯類に被験化合物を投与する（p.o.、i.p.、i.v.、i.m.またはs.c.）。被験化合物投与後、定められた時刻に血漿を採取する。目的とするホルモンのレベルについて血漿を検定する。ホルモンの正常循環レベルが、首尾一貫した結果を得るには低すぎる、そして／または変動している場合は、生物学的刺激による前処置によってホルモンレベルを上昇させることができる（即ち、ＬＨＲＨを３０ｎｇ／マウスの用量でi.m.注射してテストステロン合成のバーストを誘導する）。血漿採取のタイミングを、誘導されたホルモン反応のピークに一致するよう調節する。化合物の効果を媒質処置対照群と比較する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行う。媒質対照群と比較してｐ値≦０．０５で有意である。
【０２２３】
１．２．  作用の中空繊維メカニズム検定
所望のセルラインで中空繊維を作製し、齧歯類に腹腔内および／または皮下移植する。p.o.、i.p.、i.v.、i.m.またはs.c.で化合物を投与する。繊維を特定の読み出し検定プロトコルに従って収穫するが、これらは、遺伝子発現（bDNA、PCR、またはTaqman）についての検定、または特異的生化学的活性（即ち、ｃＡＭＰレベル）についての検定を包含してよい。群間の分散をＦ検定で比較した後、結果をスチューデントのｔ検定またはRankSum検定で分析するが、媒質対照群と比較してｐ≦０．０５で有意とする。
【０２２４】
２．亜急性機能的インビボ検定
２．１．ホルモン依存性組織の体積減少
これは、化合物がホルモン依存性組織（即ち、雄の精嚢および雌の子宮）の体積を減少させる能力を測定する、もう一つの非腫瘍検定である。前もって決められたスケジュールに従い、決められた期間（即ち１週間）、齧歯類に被験化合物を投与する（p.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.）。試験終了時に動物を体重測定し、標的臓器を摘出し、液体があれば搾り出し、臓器の重量を記録する。血漿もまた集める。目的ホルモンのレベルまたは被験物質のレベルについて血漿を検定することができる。臓器の重量を直接比較し、またはそれらを動物の体重について正規化することができる。化合物の効果を媒質処置対照群と比較する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのｔ検定を行う。媒質対照群と比較してｐ値≦０．０５で有意とする。
【０２２５】
２．２中空繊維増殖検定
所望のセルラインで中空繊維を作製し、齧歯類に腹腔内および／または皮下移植する。p.o.、i.p.、i.v.、i.m.またはs.c.で化合物を投与する。繊維を特定の読み出し検定プロトコルに従って収穫する。細胞数のマーカー（即ちＭＴＴまたはＬＤＨ）を測定することにより細胞増殖を測定する。Ｆ検定で群間の分散を比較した後、細胞数および出発接種物からの細胞数の変化をスチューデントｔ検定またはRank Sum検定で分析するが、媒質対照群に比較してｐ≦０．０５で有意とする。
【０２２６】
２．３．脈管形成モデル
２．３．１．角膜脈管形成
成長因子有りまたは無しのhydronペレットまたは細胞を、齧歯類の角膜に外科的に創成した微小嚢に移植する。化合物投与は全身的または局所的であってよい（hydronペレット中の成長因子と混合した化合物）。移植の７日後、コロイド状炭素の心臓内注入の直後に角膜を収穫し、１０％ホルマリンで固定する。読み出しは質的採点および／または画像解析である。質的採点をRank Sum検定によって比較する。新生血管形成の面積を測定することにより画像解析データを評価し（ピクセルで）、群平均値をスチューデントＴ検定によって比較する（２テイル）。成長因子または細胞のみの群に比較してｐ≦０．０５で有意とする。
【０２２７】
２．３．２．マトリゲル脈管形成
単独または化合物、細胞もしくは成長因子を含有するマトリゲルを皮下注射する。化合物はp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。マトリゲル栓子を前もって決められた時点に収穫し、読み出し用に調製する。読み出しは、ヘモグロビン濃度についてのＥＬＩＳＡ型検定および／または組織学的検査（即ち、脈管計数、内皮表面マーカーの特別染色：ＣＤ３１、因子８）。群間の分散をＦ検定によって比較した後、読み出しをスチューデントｔ検定で分析するが、媒質対照群に比較してｐ≦０．０５で有意と定める。
【０２２８】
３．一次抗腫瘍有効性
３．１．初期治療モデル
３．１．１．皮下腫瘍
腫瘍細胞またはフラグメントを第０日目に皮下移植する。通常第１日目に一斉に開始する前もって決められたスケジュールに従い、腫瘍負荷測定能力の前に、媒質および/または化合物をp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。体重および腫瘍の測定値を週に２−３回記録する。正味の体重と腫瘍重量の平均を各々のデータ取得日について算出する。抗腫瘍有効性は、群間の分散をＦ検定で比較した後、与えられた日の処置（Ｔ）および対照（Ｃ）腫瘍の大きさをスチューデントｔ検定で比較することによって最初に決定でき、ｐ≦０．０５で有意と定める。この実験は投与終了後も継続し、この場合、腫瘍の成長遅延を監視するために腫瘍測定値を記録し続ける。腫瘍の成長遅延は、処置群および対照群について、前もって決められた大きさに到達した時間の中央値の差を、対照群がその大きさに到達した時間の中央値で除した値として表す。個々の腫瘍が評価サイズに到達した時間からＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を作製することにより、成長遅延を比較する。ｐ≦０．０５で有意とする。
【０２２９】
３．１．２．腹腔内／頭蓋内腫瘍モデル
腫瘍細胞を第０日目に腹腔内または頭蓋内注射する。前もって決められた第１日目に始まるスケジュールに従い、化合物をp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。罹患および／または死亡の観察を１日に２回記録する。週に２回、体重を測定し記録する。罹患／死亡データを生存時間の中央値で表し、長期生存動物の数を別々に表す。生存時間を用いてKaplan-Meier曲線を作製する。この実験において対照群と比較したlog-rank testにより、p≦0.05で有意とする。
【０２３０】
３．２．確立された疾患モデル
腫瘍細胞またはフラグメントを皮下移植し、処置を開始するために所望の大きさに成長させる。前もって決められた大きさの範囲に達したならば、マウスを処置群に無作為化する。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。週に2-3回腫瘍重量と体重を測定し記録する。接種後全期間にわたる全ての群の平均腫瘍重量を比較のためにグラフ化する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行って処置終了時の処置群および対照群における腫瘍サイズの比較を行う。対照群と比較してｐ≦０．０５  で有意である。腫瘍測定値を投与停止後も記録し、腫瘍の成長遅延を監視することができる。腫瘍の成長遅延は、処置群および対照群について、前もって決められた大きさに到達した時間の中央値の差を、対照群がその大きさに到達した時間の中央値で除した値として表す。個々の腫瘍が評価サイズに到達した時間からKaplan-Meier曲線を作製することにより、成長遅延を比較する。媒質対照群と比較してｐ値≦０．０５で有意とする。
【０２３１】
３．３．同所性疾患モデル
３．３．１．乳房脂肪パッド検定
乳房腺癌起源の腫瘍細胞またはフラグメントを、外科的に露出させ反転させた齧歯類の乳房脂肪パッド中に直接移植する。この脂肪パッドを元の位置に戻し、手術部位を閉鎖する。腫瘍の成長を支援するため、この齧歯類にホルモンを投与してもよい。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。週に2-3回腫瘍重量と体重を測定し記録する。接種後全期間にわたる全ての群の平均腫瘍重量を比較のためにグラフ化する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行って処置終了時の処置群および対照群における腫瘍サイズの比較を行う。対照群と比較してｐ≦０．０５で有意である。
【０２３２】
腫瘍測定値を投与停止後も記録し、腫瘍の成長遅延を監視することができる。腫瘍の成長遅延は、処置群および対照群について、前もって決められた大きさに到達した時間の中央値の差を、対照群がその大きさに到達した時間の中央値で除した値として表す。個々の腫瘍が評価サイズに到達した時間からKaplan-Meier曲線を作製することにより、成長遅延を比較する。媒質対照群と比較してｐ値≦０．０５で有意とする。さらにこのモデルは、このタイプの腫瘍の自然転移の比率を増大させる機会を提供する。転移は、この試験の終了時に、標的臓器あたりの可視病巣の数を数えることにより、または標的臓器の重量を測定することにより、評価できる。これらの終点の平均を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定によって比較するが、この実験の対照群と比較してｐ≦０．０５で有意であると定める。
【０２３３】
３．３．２．前立腺内検定
前立腺腺癌起源の腫瘍細胞またはフラグメントを、外科的に露出させた齧歯類の前立腺背側葉に直接移植する。前立腺を腹部切開により露出させ、その結果、移植片が精嚢に入らないことを確認しつつ、腫瘍を背側葉に限定して移植できる。うまく接種された前立腺を腹部に戻し、腹部と皮膚の切開を閉鎖する。腫瘍の成長を支援するため、この齧歯類にホルモンを投与してもよい。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。週に２−３回体重を測定し記録する。前もって決められた時期に実験を終了し動物を解剖する。一次腫瘍の大きさを、カリパスまたは解剖顕微鏡に取り付けた接眼マイクロメータのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行って処置終了時の処置群および対照群における腫瘍サイズの比較を行う。対照群と比較してｐ≦０．０５  で有意である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自然転移の比率を増大させる機会を提供する。転移は、この試験の終了時に、標的臓器（即ち、肺）あたりの可視病巣の数を数えることにより、または標的臓器の重量（即ち、局所リンパ節）を測定することにより、評価できる。これらの終点の平均を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定によって比較するが、この実験の対照群と比較してｐ≦０．０５で有意であると定める。
【０２３４】
３．３．３．気管支内検定
肺起源の腫瘍細胞を、皮膚を切開して気管を露出させることにより、気管支内に移植できる。２５ゲージ針の斜端で気管を穿刺し、９０°の曲がり角を持つ平端２７ゲージ針を用いて腫瘍細胞を主気管支中に接種する。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。週に２−３回体重を測定し記録する。前もって決められた時期に実験を終了し動物を解剖する。一次腫瘍の大きさを、カリパスまたは解剖顕微鏡に取り付けた接眼マイクロメータのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行って処置終了時の処置群および対照群における腫瘍サイズの比較を行う。対照群と比較してｐ≦０．０５  で有意である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自然転移の比率を増大させる機会を提供する。転移は、この試験の終了時に、標的臓器（即ち、対側肺）あたりの可視病巣の数を数えることにより、または標的臓器の重量を測定することにより、評価できる。これらの終点の平均を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定によって比較するが、この実験の対照群と比較してｐ≦０．０５で有意であると定める。
【０２３５】
３．３．４．盲腸内検定
胃腸起源の腫瘍細胞を、皮膚から腹部切開を行い腸を露出させることにより、盲腸内に移植できる。２７ないし３０ゲージ針を用いて、腸管腔を貫通することなく腫瘍細胞を盲腸壁に接種する。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。週に２−３回体重を測定し記録する。前もって決められた時期に実験を終了し動物を解剖する。一次腫瘍の大きさを、カリパスまたは解剖顕微鏡に取り付けた接眼マイクロメータのいずれかを用いて三次元測定する。Ｆ検定を実施して分散が等しいか等しくないかを判定し、その後スチューデントのＴ検定を行って処置終了時の処置群および対照群における腫瘍サイズの比較を行う。対照群と比較してｐ≦０．０５で有意である。このモデルは、このタイプの腫瘍の自然転移の比率を増大させる機会を提供する。転移は、この試験の終了時に、標的臓器（即ち、肝臓）あたりの可視病巣の数を数えることにより、または標的臓器の重量を測定することにより、評価できる。これらの終点の平均を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定によって比較するが、この実験の対照群と比較してｐ≦０．０５で有意であると定める。
【０２３６】
４．二次（転移）抗腫瘍有効性
４．１．自然転移
腫瘍細胞をs.c.接種し、肺または肝臓への自然転移を調べるため、この腫瘍を前もって決められた範囲に成長させる。次いでこれらの一次腫瘍を切除する。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与するが、このスケジュールは、腫瘍転移の初期段階を阻害することを目的とする治療を評価するための、一次腫瘍の切除に至る期間を含んでいてよい。罹患および／または死亡の所見を毎日記録する。体重を週に２回測定し記録する。潜在的終点は、生存時間、標的臓器あたりの可視病巣の数、または標的臓器重量を包含する。生存時間を終点に利用する場合、他の値は測定しない。生存データを用いてKaplan-Meier曲線を作製する。この実験において対照群と比較したlog-rank testにより、ｐ≦０．０５で有意とする。解剖顕微鏡下で測定した可視腫瘍病巣の平均数、および平均標的臓器重量を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定で比較するが、これらの終点の両方について、この実験の対照群と比較してｐ≦０．０５で有意であると定める。
【０２３７】
４．２．強制転移
実験的（強制的）肺、肝臓、および骨転移研究では、腫瘍細胞を、尾静脈、門脈、または心臓の左心室に注射する。化合物を前もって決められたスケジュールに従いp.o.、i.p.、i.v.、i.m.、またはs.c.投与する。罹患および/または死亡の所見を毎日記録する。体重を週に２回測定し記録する。潜在的終点は、生存時間、標的臓器あたりの可視病巣の数、または標的臓器重量を包含する。生存時間を終点に利用する場合、他の値は測定しない。生存データを用いてKaplan-Meier曲線を作製する。この実験において対照群と比較したlog-rank testにより、ｐ≦０．０５で有意とする。解剖顕微鏡下で測定した可視腫瘍病巣の平均数、および平均標的臓器重量を、Ｆ検定実施後のスチューデントｔ検定で比較するが、両方の終点について、この実験の媒質対照群と比較してｐ≦０．０５で有意とする。
【０２３８】
実施例９
化合物のインビボ試験／標的の確認
ＣＮＳ障害
１．疼痛
急性疼痛
急性疼痛は主にラットにおいて、ホットプレートで測定する。２種類の変形ホットプレート試験を利用する：古典的変形では、動物を加熱表面（５２ないし５６℃）に置き、動物が、足踏みまたは足を舐めるといったような疼痛を不快に感じているような行動を示すまでの潜伏時間を測定する。別の変形は温度上昇ホットプレートであって、この場合、被験動物を普通の温度の表面に置く。その後この表面を、動物が後足を舐め始めるまで徐々に且つ絶えず加熱する。後足を舐め始めた時に到達している温度が疼痛閾値の尺度である。
【０２３９】
化合物を媒質処置対照群に対して試験する。疼痛試験前に、異なる適用経路（i.v.、i.p.、p.o.、i.t.、i.c.v.、s.c.、皮内、経皮）による物質の適用を、異なる時点で行う。
【０２４０】
持続的疼痛
持続的疼痛を、主にラットで、ホルマリンまたはカプサイシン試験で測定する。１ないし５％ホルマリンまたは１０ないし１００μｇカプサイシンの溶液を被験動物の一方の後足に注射する。ホルマリンまたはカプサイシンを適用した後、この動物は、畏縮や、罹患足を舐めたり咬んだりするといったような疼痛不快反応を示す。９０分間までの時間枠内での疼痛不快反応の数が、疼痛強度の尺度である。
【０２４１】
化合物を媒質処置対照群に対して試験する。ホルマリンまたはカプサイシン投与前に、異なる適用経路（i.v.、i.p.、p.o.、i.t.、i.c.v.、s.c.、皮内、経皮）による物質の適用を、異なる時点で行う。
【０２４２】
神経障害性疼痛
神経障害性疼痛を、片側性座骨神経損傷の様々な変形により、主にラットにおいて誘発させる。手術は麻酔下で実施する。座骨神経損傷の第一変形は、総坐骨神経の周囲に結紮糸を緩く縛り付けることにより作り出す。第二変形は、総坐骨神経直径のほぼ半分の、きつい結紮である。次の変形では、Ｌ５およびＬ６脊髄神経のいずれか、またはＬ％の脊髄神経のみに、きつい結紮または離断を施してあるモデルの群を使用する。第四変形は、坐骨神経の３つの終末分岐のうち２つ（脛骨および総腓骨神経）を軸索切断して残りの腓腹神経を無傷のままにする事を含み、一方最後の変形は、脛骨枝のみの軸索切断を含み腓腹神経と総神経を傷つけずに残す。対照動物は偽手術で処置する。
【０２４３】
手術後、神経損傷動物は、慢性の機械的異痛症、寒冷異痛症、および温度痛覚過敏を発現する。機械的異痛症は圧力トランスデューサーにより測定する（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Electronic von Frey System, Somedic Sales AB, Horby, Sweden）。温度痛覚過敏は、放射熱源（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy）または５ないし１０℃の寒冷プレートによって測定し、この場合、冒された後足の疼痛不快反応を疼痛強度の尺度として計数する。寒冷誘発疼痛のさらなる試験は、冒された後肢にアセトンを足底投与した後の疼痛不快反応または疼痛不快反応の持続時間の計測である。一般的な慢性疼痛は、活動の概日リズムを記録することにより（Surjo and Arndt, Universitat zu Koln, Cologne, Germany）、および歩行の相違を採点することによって（足跡パターン；FOOTPRINTSプログラム、Klapdor et al., 1997. A low cost method to analise footprint patterns. J. Neurosci. Methods 75, 49-54）評価する。
【０２４４】
化合物は偽手術および媒質処置対照群に対して試験する。物質の適用を、疼痛試験前に、異なる適用経路（i.v.、i.p.、p.o.、i.t.、i.c.v.、s.c.、皮内、経皮）、異なる時点で行う。
【０２４５】
炎症性疼痛
炎症性疼痛は、０．７５ｍｇのカラギーナンまたは完全フロイントアジュバントを一方の後足に注射することにより、主にラットで誘発する。この動物は機械的異痛症および温度痛覚過敏を伴う浮腫を発現する。機械的異痛症は圧力トランスデューサーにより測定する（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）。温度痛覚過敏は、放射熱源（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy, Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA）によって測定する。浮腫の測定では二つの方法を利用する。第一の方法では、動物を殺し、冒された後足を切断して秤量する。第二の方法は、プレチスモメーター（Ugo Basile, Comerio, Italy）で水置換を測定することによる足体積の相違を含む。
【０２４６】
化合物を、炎症を起こしていない群および媒質処置対照群に対して試験する。物質の適用を、疼痛試験前に、異なる適用経路（i.v.、i.p.、p.o.、i.t.、i.c.v.、s.c.、皮内、経皮）、異なる時点で行う。
【０２４７】
糖尿病性神経障害性疼痛
単回の５０ないし８０ｍｇ／ｋｇストレプトゾトシンの腹腔内注射で処置したラットは、１ないし３週間以内に深刻な高血糖と機械的異痛症を発現する。機械的異痛症は圧力トランスデューサーにより測定する（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc. Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）。
【０２４８】
化合物を、糖尿病および非糖尿病の媒質処置対照群に対して試験する。物質の適用を、疼痛試験前に、異なる適用経路（i.v.、i.p.、p.o.、i.t.、i.c.v.、s.c.、皮内、経皮）、異なる時点で行う。
【０２４９】
２．パーキンソン病
６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）病変
ドパミン作動性黒質線条体および線条体淡蒼球経路の変性がパーキンソン病の中心的病理事象である。黒質緻密部（ＳＮＣ）への６−ＯＨ−ＤＡの単回／連続片側定位注射を用いてこの疾患に似せた状態をラットに実験的に誘発させた。
【０２５０】
実験開始時の体重１８０−２００ｇの雄性ウィスターラット（Harlan Winkelmann, Germany）を使用する。ラットは実験セッションにない時は、１２時間の明／暗サイクルの下で温度と湿度を制御した環境に維持し、餌と水を自由に摂取させた。以下のインビボプロトコルが政府当局に承認された。動物の苦痛を最小限とし、使用動物の数を減らし、そしてインビボ技術の代替手段を利用するために、最大限の努力を払った。
【０２５１】
手術の日に、モノアミンオキシダーゼによる６−ＯＨＤＡの代謝を阻害するためパルジリン（Sigma, St. Louis, MO, USA; 50 mg/kg i.p.）を、そしてノルアドレナリン作動性末端による６−ＯＨＤＡの取り込みを妨げるためデスメチルイミプラミンＨＣｌ(Sigma; 25 mg/kg i.p.）を動物に投与した。３０分後、Ketavet（72 mg/kgケタミン；Pharmacia&Upjohn）およびRompun (9.6 mg/kg Xylacin; Bayer）の生理食塩水溶液（6 ml/kg）をi.p.注射してラットを麻酔し、定位枠に留置した。手術中、加温パッドで体温を３７℃に維持した。ＤＮ黒質線条体経路を損傷するため、６−ＯＨＤＡ  ＨＢｒ（Sigma）８μｇを含有する０．０１％アスコルビン酸−生理食塩水４μｌを、１μｌ／分の速度で左ＳＮＣ中に注射した（Knippel and Konigに対して３．３ｍｍ前方、１．６ｍｍ側方、−２．１ｍｍ腹側）。拡散を起こさせるため、この針をさらに5分間留置した。
【０２５２】
足踏み試験、ラット
改変足踏み試験プロトコルを用いて、損傷配置後３週間の前肢の無動を評価した。簡潔に述べると、実験者は、後肢が固定され、後部が表面の上方に僅かに挙がるよう、片手で動物を保持した。一方の前足をテーブルに触れさせ、次いで、横向きにゆっくりと（１ｍを５秒間で）、まず前方へ、次いで後方へ動かした。前方および後方に動かした際、足踏みを調節した回数を両前足について数えた。試験の順序は、右前足前方向および後方向の足踏み調節、その後左前足の前方向および後方向とした。最初の試験の前に３日間初期訓練期間を経た後、この試験を３回反復して連続３日間実施した。前方調節足踏みでは、損傷動物と健康な対照動物の間に一貫した相違は現れなかった。故に、分析を後方調節足踏みに限定した。
【０２５３】
平衡試験、ラット
足踏み試験セッションの最中に体位チャレンジ後の平衡調節もまた測定した。ラットを足踏み試験で記載したのと同じ位置に保持し、実験者はラットを横向きに動かす代わりに、テーブルに触れている前足の側に傾けた。この操作は平衡の喪失をもたらし、ラットが前足を動かして平衡を回復する能力を０ないし３の範囲のスケールで採点した。正常な前足の配置に評点０を与えた。前足の動きは遅れたが体位の平衡回復が認められた時、評点１を与えた。評点２は、筋収縮により明示される、明確な、但し不充分な前足の反応（しかしながら平衡回復には成功していない）を表し、そして動きの反応無しに評点３を与えた。最初の試験の前に３日間の初期訓練期間を経た後、この試験を各側について１日に３回、連続３日間反復した。
【０２５４】
階段試験（前足伸ばし）、ラット
一次および二次損傷配置の３週間後、階段試験の改変版を利用して、前足伸ばし行動の評価を行った。中央プラットホームと両側に取り外し可能な階段のあるプレキシガラス試験箱を使用した。この装置は、各々の階段で同側の前足だけが使用でき、したがって独立して前足を使用する手段を提供するように設計されている。各試験につき動物を試験箱に１５分間入れておく。二重階段の両側を７×３の餌ペレット（精密食餌ペレット、フォーミュラ:Ｐ、精製齧歯類餌、サイズ４５ｍｇ; Sandown Scientific)で満たした。各試験の後、食べられたペレットの数（うまく回収されたペレット）および各々の足で取られたペレットの数（触れたが落下した）および成功率（食べられたペレット／取られたペレット）を別個に計数した。３日間の食餌禁制（動物１匹につき１日に１２ｇ）の後、動物を８日間試験した。最後の５日間についてのみ完全な分析を実施した。
【０２５５】
ロータロッド試験、ラット
本発明者等は、ＩＢＭ−互換パーソナルコンピュータ、ＣＩＯ−２４データ獲得カード、制御ユニット、および４レーンロータロッドユニットを含むCR-1 Rotamex系（Columbus Instruments, Columbus, OH）による、Rozas and Labandeira-Garcia (1997）の記載した方法の改良法を使用した。このロータロッドユニットは、回転する心棒（直径７．３ｃｍ）と各ラット用の区切りから成る。この系のソフトウェアは、セッションのプロトコルを前もって様々な回転速度（０−８０ｒｐｍ）にプログラムすることができる。ラットがロータロッド下のベースグリッドに落下した時は赤外線で検出する。この系は、落下をそのラットについての実験の終了とし、ロータロッド上にいた合計時間ならびに落下時刻および全ての設定パラメータを記録する。この系はさらに、訓練を助けるため、ベースグリッドに弱い電流を流す。
【０２５６】
握力試験
握力計は標準モデルＧＳＭ１０５４握力計の改良品である。１つの握り横棒を１つの張力計に接続する代わりに、２つの握り棒を同軸で配置し、２つの別個の張力計に接続する。この２つの張力計をプリント配線チップでデジタル読み出し装置に接続し、これが、各ロッドに適用された張力を１ｇ区分で最大２ｋｇまで定量化する。２枚の側壁をおよそ１０ｃｍ離れるよう調節し、ラットがこの装置にいる時、身体が握り棒に対して直角になっているようにする。各試行ではラットの腹部周囲を掴んでこの装置の中に降ろすが、その結果、ラットは２本の握り棒を片足ずつで握り、装置の平滑床に後足で立つ。次に実験者はこのラットの尾基部を掴んで穏やかに後方へ引く。当然ラットは握り棒にしがみつき、引きに抵抗するが、ついには掴まっていられなくなりこれを離す。ラットが２本のロッドから各足を離した時に適用されていた力を張力計で別々に測定する。
【０２５７】
ＭＰＴＰ処置
神経毒１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は齧歯類、非ヒト霊長類、およびヒトの中脳ドパミン作動性（ＤＡ作動性）ニューロンの変性を惹起し、それによってパーキンソン病の症状の多くを再現する。ＭＰＴＰは、ドパミンとその代謝産物のレベル、ならびに線条体のドパミン作動性終末の数を著明に低下させ、そして黒質緻密部のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）−免疫反応性細胞体の著しい喪失を招く。
【０２５８】
重篤で長期間続く損傷を獲得し且つ致死率を下げるため、動物にＭＰＴＰを単回注射し、７−１０日後に損傷の重篤度について調べた。第１、２、および３日目にＭＰＴＰの連続注射を行った。動物に生理食塩水に入れた４ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰヒドロクロリド（Sigma）を１日に１回投与した。注射は全て腹腔内（i.p.）とし、ＭＰＴＰ保存溶液は注射の合間には凍結しておいた。第１１日目に動物を断頭した。
【０２５９】
免疫組織学
行動実験終了時に全動物をチオペンタール（１ｇ／４０ｍｌ i.p.、Tyrol Pharma）３ｍｌで麻酔した。マウスを心臓から、０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で２分間、次いでＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Merck）で１５分間潅流した。脳をはずし、４％パラホルムアルデヒド中、２４時間４℃に維持した。次に脱水のため、これらを０．１Ｍ  ＰＢＳ中２０％スクロース（Merck）溶液に移し、４℃でこれらが沈むまで放置した。−２０℃のメチルブタン中でこの脳を２分間凍結し、−７０℃で保存した。スレッジミクロトーム（mod. 3800-Fribocut, Leica）を用いて脳梁膝（AP 1.7mm）から海馬（AP 21.8mm）まで、およびAP24.16からAP26.72までの２５μｍ切片を取得した。４６枚の切片を切り取り免疫組織化学用に０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を入れたアソーターに保存した。
【０２６０】
一連の切片を自由浮動チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学用に加工した。０．１Ｍ  ＰＢＳで３回すすいだ後、０．３％ Ｈ2Ｏ2 ± ＰＢＳ中で１０分間内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させた。ＰＢＳですすいだ後、切片を遮断剤としての１０％正常牛血清（Sigma）で５分間プレインキュベートし、いずれかの一次抗ラットＴＨウサギ抗血清（１：２０００希釈）に移した。
【０２６１】
室温で一夜インキュベートした後、ＴＨ免疫反応性用の切片をＰＢＳですすぎ（２×１０分間）、ヤギで作製したビオチニル化抗ウサギ免疫グロブリンＧ（１：２００希釈）(Vector）中９０分間インキュベートし、繰り返してすすぎ、Vectastain ABC（Vector）溶液に１時間移した。０．００５％ Ｈ2Ｏ2を添加した０．１Ｍ ＰＢＳ中の３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ；Sigma）を、後の視覚化反応の色原体として利用した。切片をゼラチン被覆スライドにマウントし、一夜放置乾燥させ、漸増濃度のアルコールで脱水したヘマトキシリンで対比染色し、酢酸ブチルで清浄化した。カバーガラスをエンテラン上に載せた。
【０２６２】
３．痴呆症
対象認識課題
齧歯類の認知成績に及ぼす実験操作の効果を評価するため、対象認識課題を設計した。ラットを、２個の同一物体がある開放野に置く。ラットは、対象認識課題の最初の試行の間に両方の物体を検査する。例えば２４時間の保持間隔の後の２回目の試行では、１回目の試行で使用した２個の物体のうち一方、即ち「馴染みのある」物体と新規な物体をこの開放野に置く。それぞれの物体に対する検査時間を記録する。このＯＲ課題における基本的尺度は、２回目の試行でラットが２個の物体の探索に費やした時間である。良好な保持は、「馴染みのある」物体よりも新規な物体により長い探索時間をかけることに反映される。
【０２６３】
１回目の試行の前に推定的認知向上薬を投与すると、主として獲得プロセスに、そして最終的には定着プロセスに及ぼす影響の評価が可能になる。１回目の試行の後に被験化合物を投与すると、定着プロセスに及ぼす影響が評価でき、一方２回目の試行の前に投与すると想起プロセスに及ぼす影響を測定できる。
【０２６４】
受動的回避課題
受動的回避課題はラットおよびマウスにおける記憶成績を評価する。抑制的回避装置は明室と暗室を持つ２室箱で構成されている。２つの部屋は、実験者が操作できるギロチンドアで隔てられている。ギロチンドアを上げると２ｃｍの入り口が２つの部屋を分離する。ドアが開いている時、暗室内の照明は約２ルクスである。明室の床中央における光度は約５００ルクスである。
【０２６５】
２回の馴化セッション、１回のショックセッション、および保持セッションを２４時間のセッション間隔を隔てて行う。馴化セッションと保持セッションでは、ラットにこの装置を３００秒間探索させる。ラットを明室にギロチンドアと反対側の壁に向けて置く。１５秒間の順応時間の後、ギロチンドアを開けて、装置の全ての部分に自由に行き来ができるようにする。ラットは通常明るく照明された領域を避け、数秒以内に暗室に入る。
【０２６６】
ショックセッションでは、ラットの四肢が暗室に入ったならば直ちに両室の間のギロチンドアを下げ、スクランブルさせた１ｍＡのフットショックを２秒間与える。このラットを装置から取り除き元のケージに戻す。保持セッションの手順は馴化セッションの手順と同一である。
【０２６７】
通り抜け潜時、即ち、保持セッション中、最初に暗室に入るまでの潜伏時間（秒）がその動物の記憶成績の指標である；暗室に入るまでの潜時が長いほど保持が良好である。被験化合物をショックセッションの半時間前に、１ｍｇ＊ｋｇ−１のスコポラミンと共に投与する。スコポラミンは２４時間後の保持セッションの間の記憶成績を障害する。被験化合物がスコポラミン処置対照に比して侵入潜時を増大させたならば、この被験化合物は認知向上可能性を有している見込みがある。
【０２６８】
Morris水逃避課題
Morris水逃避課題は、齧歯類の空間見当識学習を測定するものである。これは、ラットおよびマウスの認知機能に及ぼす推定的治療薬の効果を研究するために広く利用されている試験系である。水面の約１ｃｍ下に沈んだ逃避プラットホームを持つ円形水タンク中で動物の成績を評価する。逃避プラットホームは水タンク中を泳いでいる動物には見えない。机、コンピューター装置、第二の水タンク、実験者の存在、および静かに鳴っている棚上のラジオを包含する室内の家具によって、数多くの迷路外手掛かりを与える。
【０２６９】
毎日の獲得セッション５回の間に動物に４回の試行をさせる。試行は、タンクの壁に向けて動物をプール中に入れることで開始する。四分円、東西南北の４つの開始位置の各々を、一連の４回の試行で１回ずつ採用し、その順序はランダムとする。逃避プラットホームは常に同じ位置とする。動物が逃避プラットホーム上によじ登ったならば直ちに、または９０秒間が経過したならば、いずれの事象が先に起こっても試行を終了する。その動物をプラットホーム上に３０秒間とどまらせる。次いでこれをプラットホームから取り、次のセッションを開始する。動物が９０秒以内にプラットホームを見つけられない場合は実験者がこれをプラットホーム上に置き、３０秒間そこにとどまらせる。５日目のセッションの４回目の試行の後、プローブ試行としてさらなる試行を行う。即ち、プラットホームを除去し、動物が４つの四分円にいた時間を３０秒間または６０秒間測定する。このプローブ試行では、全動物を、逃避プラットホームが獲得セッション中に置かれていた四分円とは反対の同じ開始位置から開始させる。
【０２７０】
獲得訓練中の動物の成績を評価するため、４つの異なる尺度：逃避潜時、移動距離、プラットホームからの距離、および水泳速度、を採用する。プローブ試行では以下の尺度：四分円内での時間（秒）および４つの四分円内で移動した距離（ｃｍ）、を評価する。プローブ試行は、動物が逃避プラットホームの位置を如何に良好に学習したかについてのさらなる情報を提供する。もし、動物が、獲得セッション中にプラットホームが置かれていた四分円内で、他のいずれの四分円内よりも長い時間を過ごし、そして長い距離を泳いでいるならば、プラットホームの位置が良好に学習されたと結論付けられる。
【０２７１】
推定的認知向上化合物の効果を評価するため、認知機能を損なう特別の脳損傷を持つラットもしくはマウス、または正常な学習を妨害するスコポラミンもしくはＭＫ−８０１のような化合物で処置した動物、または認知欠損のある加齢動物を使用する。
【０２７２】
Ｔ迷路自発的交替行動課題
Ｔ迷路自発的交替行動課題（ＴｅＭＣＡＴ）はマウスの空間記憶成績を評価するものである。実験者が手動で作動させることのできるギロチンドアを持つＴ迷路の出発アームおよび２本のゴールアームを準備する。訓練開始時にマウスを出発アームに入れる。ギロチンドアを閉める。１回目の試行、「強制試行」では、ギロチンドアを下げて左または右いずれかのゴールアームを封鎖する。出発アームから解放された後、マウスは迷路をうまく通り抜け、ついには開放されているゴールアームに入り、出発位置に戻って来るが、そこでギロチンドアを下げて５秒間閉じ込める。次に動物は、１４回の「自由選択」試行の間に、左右のゴールアーム（全てギロチンドアが開放されている）を自由に選択できる。マウスが一方のゴールアームに入ったならば直ちに他方のアームを閉鎖する。最終的にマウスは出発アームに戻るので、出発アームに５秒間閉じこめた後はどのゴールアームにでも自由に行かせる。１セッションで１４回の自由選択試行を完了した後、動物を迷路から出す。訓練中、動物には手を触れない。
【０２７３】
１４回の試行から交替行動パーセントを算出する。このパーセンテージならびに最初の強制試行とその後の１４回の自由選択試行の完了に要した合計時間（秒）を分析する。通常、訓練セッション開始の３０分前にスコポラミンを注射することにより、認知欠損が誘発される。スコポラミンは交替行動パーセントを偶然レベルまたはそれ以下に低下させる。常に訓練セッションの前に常に投与される認知向上薬は、スコポラミンが誘発する自発交替行動比率の低下に、少なくとも部分的に拮抗する。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】ＡＳＮＨ−３の存在下におけるＧＡＬ４  ＨＩＦ−１αＴＡＤＣおよびＨＩＦ−２αＴＡＤＣおよび対応するアスパラギン／アラニン突然変異体の活性を示す。
【図２】定量的ＰＣＲ技術（TaqMan）により分析したヒト組織におけるＡＳＮＨ−１の発現を示す。
【図３】定量的ＰＣＲ技術（TaqMan）により分析したヒト組織におけるＡＳＮＨ−２の発現を示す。
【図４】定量的ＰＣＲ技術（TaqMan）により分析したヒト組織におけるＡＳＮＨ−３の発現を示す。
【配列表】
2005527217.tif 000002
2005527217.tif 000003
2005527217.tif 000004
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2005527217.tif 000009
2005527217.tif 000010
2005527217.tif 000011
【図１】
2005527217.tif 000012
【図２】
2005527217.tif 000013
【図３】
2005527217.tif 000014
【図４】
2005527217.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月31日(2005.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005527217000001.app
【国際調査報告】
2005527217.tif 000016
2005527217.tif 000017
2005527217.tif 000018
2005527217.tif 000019
2005527217.tif 000020