(57)【要約】繊維を含む試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理することを含むアミロイド繊維の精製法を提供する。次いで、処理した試料からアミロイド繊維を回収してもよい。試料中のアモルファス凝集物および可溶性前駆体の消化、分解または変性を許容するが、アミロイド繊維の消化、分解または変性をしない条件下で処理することが好ましい。繊維が試料中の蛋白質の少なくとも80重量％を含むアミロイド繊維の均一な調製物が提供される。
2005519854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 繊維を含む試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理する段階と、
(b) 処理した試料からアミロイド繊維を回収する段階と
を含む、アミロイド繊維を精製する方法。
【請求項２】
段階（a）が試料中のアモルファス凝集物および可溶性前駆体の消化、分解または変性を許容するが、アミロイド繊維の消化、分解または変性をしない条件下で、該試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階（a）が試料をプロテアーゼで処理し、該試料を30分から24時間インキュベートすることを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
段階（a）が試料をプロテアーゼの存在下で20℃から60℃の温度範囲で処理することを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
段階（a）が試料をプロテアーゼで処理することを含み、該プロテアーゼが蛋白質に対し、重量で1：10から1：10000の比で存在する、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
段階（a）が試料をペプシン、トリプシン、プロナーゼ、プロテイナーゼK、パピン、エラスターゼ、トロンビンまたはプラスミンから選択されるプロテアーゼで処理することを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼがペプシンである請求項6記載の方法。
【請求項８】
請求項1または2記載の方法であって、段階（a）が試料を陰イオン性または陽イオン性界面活性剤から選択される界面活性剤で処理することを含む方法。
【請求項９】
段階（a）が試料を尿素またはグアニジンから選択される化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理することを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項１０】
段階（b）が処理した試料を遠心分離または濾過し、それによってアミロイド繊維を回収することを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
アミロイド繊維の均一な調製物であって、該繊維が試料中の蛋白質の少なくとも80重量％を含む調製物。
【請求項１２】
請求項11記載の繊維の均一な調製物であって、該繊維が試料中の蛋白質の少なくとも95重量％を含む調製物。
【請求項１３】
請求項1から10のいずれか一項に記載の方法によって得られるアミロイド繊維の精製された調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は繊維の精製法、ならびに本質的にアモルファス凝集物および可溶性前駆体を含まないアミロイド繊維の調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アミロイド繊維はアルツハイマー病または感染性海綿状脳障害のような病理学的障害に関係した高度に組織化された蛋白質の凝集物である。Tanら、Histopathology 1994 25, 403-414。アミロイド繊維はまた広範な種類の潜在的用途のある新規のナノ構造として探索されている。Lashuelら、Phil Trans R Soc Lond 2001, 256, 133-46。
【０００３】
アミロイド繊維を形成し易い蛋白質は、少なくとも部分的に折りたたまれた状態か、または自然の蛋白質の緻密な性質を欠いている不安定な状態からアミロイド繊維を形成する。蛋白質の数は定常的に増加しており、それらの蛋白質のアミロイド繊維の形成能は、アミロイドの形成が共通の現象であり、ポリペプチド鎖の一般的な性質であることを示唆している。そのようなモデル蛋白質の1つはウシのホスファチジルイノシトール-3'-キナーゼ（PI3-SH3）のαサブユニットのSH3領域であり、その研究によって、アミロイド繊維の形成を促進するプロセスとアミロイド繊維内での蛋白質鎖の分子の充填の詳細について新しい洞察を提供されている。PI3-SH3は低pHの溶液中で部分的に折りたたまれた状態を形成し、その状態から蛋白質はゆっくりとヒトの疾患に関係するアミロイド繊維と区別できない構造上の性質を持った繊維に凝集する。
【０００４】
アミロイド繊維の構造上の特徴がかなり解明されたにもかかわらず、いまだ解明すべき多数の問題がある。アミロイド繊維内の蛋白質鎖の構造上の性質の詳細な定義はそのような問題の1つである。それを定義するための主な問題は多くのアミロイド繊維の試料内に存在する固有の不均一性である。その他に、インビトロで形成されるすべてのアミロイド繊維の試料には、殆ど例外なく可溶性の前駆体と非繊維性の凝集物の両方が存在する。その結果、繊維の中で蛋白質がとる構造を高い精度で研究することができない。従って、他の成分からアミロイド繊維を分離するための方法を開発することはアミロイドの性質の研究にとって価値のある関心事である。本発明者らは、本明細書においてアミロイド繊維を他の成分から精製する方法について報告する。この手法によって、可溶性の前駆体と非繊維性の凝集物からの影響を避けて、FTIR法によってアミロイド繊維内のPI3-SH3によって特徴づけられる二次構造要素を特性づけることが可能になる。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は試料中の他の非繊維性の不純物と繊維の安定性の差、特に試料中の可溶性の前駆体ペプチドと非繊維性の凝集物の安定性の差を利用する。
【０００６】
本発明は、繊維を含む試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理し、処理した試料から繊維を回収することを含むアミロイド繊維試料の精製法を提供する。
【０００７】
特に本発明は、試料中に存在するアモルファス凝集物及び可溶性前駆体の消化または分解が可能な条件下で、試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理するアミロイド繊維の精製法を提供する。本発明の好ましい局面では、そのように製造した繊維を、例えば試料の遠心分離または濾過によって回収し、アミロイド繊維を単離する。
【０００８】
本発明はまた繊維が試料中の蛋白質の少なくとも80重量％、好ましくは85重量％または90重量％、さらに好ましくは少なくとも95重量％を含む精製したアミロイド繊維の調製物に関する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明はアミロイド繊維の精製方法に関する。アミロイド繊維試料は繊維試料中に存在する不均一性を低減するために処理できる。本発明は特に繊維試料中に存在する可溶性の前駆体および非繊維性凝集物を除去することに関係する。
【００１０】
本発明に従って、そのような繊維を含む試料からアミロイド繊維を精製する方法が提供される。本発明は試料中の他の非繊維性の成分との繊維の安定性の差を利用する。特にこの方法は、試料中の可溶性の前駆体ペプチドと非繊維性の凝集物の除去に応用できる。対応した可溶性の前駆体または非繊維性の凝集物に比べ、その試薬中で繊維がより安定な任意の試薬で試料が処理されるのが好ましい。特に、繊維の単離と精製を容易にするために、試料を可溶性の前駆体とアモルファスの凝集物を消化もしくは分解する試薬またはそのような凝集物を変性する試薬で試料を処理してもよい。本発明に従って使用してもよい試薬の例には、プロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬、有機溶剤、例えばアルコール（TFE、HFIP、イソプロパノール）、アセトニトリル、クロロホルムを含み、試料を高温または低温でインキュベートする段階、およびブロモシアンのような化学試薬の使用が含まれる。更なる繊維の形成を助長せず、最初の繊維の集団を不純物として含まない条件が選ばれる。可溶性の前駆体または非繊維性の凝集物の形態において不純物の存在の低減があるかどうかを評価するために、例えばインキュベーションの経過中に試料から回収したアリコートの分析を実施することによって、各々の繊維の試料に適切な試薬を特定することができる。
【００１１】
好ましい態様では、本法は試料を処理するためにプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬を使用する。特に好ましい態様では、繊維を完全なまま残し、試料中の非繊維性のペプチドを分解するために、可溶性ペプチドおよび非繊維性凝集物を分解するプロテアーゼまたは他の試薬が提供される。
【００１２】
本発明に従って、繊維を含む試料をプロテアーゼ、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬で処理し、処理した試料からアミロイド繊維を回収することを含むアミロイド繊維の精製法が提供される。
【００１３】
処理される繊維の試料は適切な任意の経路によって入手できる。繊維は単一または多数のペプチド前駆体から形成された繊維でよく、したがって混合繊維を含んでもよい。例えば精製される試料はインビボで形成されたプラークから単離された試料であってもよい。繊維の試料はAβ、IAPP、トランスサイレチン、β2ミクログロブリン、アポリポ蛋白質、AI、ゲルソリン、リゾチーム、PrPまたは他のアミロイド形成蛋白質のようなポリペプチドを含むアミロイド沈着物を呈する患者および動物の生検および組織試料から得ることができる。または、処理される試料は、繊維形成に導く条件に置かれた蛋白質の試料からインビトロで適切な任意の方法で調製されるものであってもよい。例えば、繊維試料は、蛋白質の場合は少なくとも部分的に変性する条件下で、小さなペプチドの場合は適切な溶液の条件下で、温度、pH、イオン強度、有機溶剤、化学変性剤およびキレート化剤のようなパラメータの通常の調整によって、ポリペプチドをインキュベートして、上述のポリペプチドまたは疾患に関係しないペプチドもしくは蛋白質から得られる。
【００１４】
繊維を含む試料は、試料中のペプチド前駆体、不純物またはアモルファス凝集物よりも繊維がより安定である試薬で処理される。1つの態様では、試料はプロテアーゼで処理される。例えばペプシンのような任意の適切なプロテアーゼを使用してもよい。例えば一定のpHおよび温度条件下で精製する繊維が示す安定性によって、適当なプロテアーゼを選択できる。ペプシンは低pH（最適pH1.8〜2.5、20℃〜37℃）でプロテイナーゼ活性を有する。同様の目的に次のような他のプロテアーゼを選択できる：トリプシン（最適pH7.5〜8.5、20℃〜37℃）、プロナーゼ（最適pH6.0〜8.0、20℃〜40℃）、プロテイナーゼK（最適pH7.5〜10.5、20℃〜37℃）、パパイン（最適pH6.0〜7.5、20℃〜37℃）、エラスターゼ（最適pH7.5〜8.5、20℃〜37℃）、トロンビン（最適pH7.5〜9.0、20℃〜30℃）、プラスミン（最適pH8.0―9.5、25℃）など。
【００１５】
繊維性物質が消化に対して高抵抗性である場合、または例えば繊維のβ構造の形成に含まれている残基を特定するための特性化の目的、およびループ、ヘリックスまたは無秩序な断片のような他の構造要素を繊維から除去するための特性化の目的で繊維性コアの単離が必要な場合は、低特異性プロテイナーゼ（ペプシン、プロテイナーゼK、パパインなど）を使用するのが好ましいと思われる。繊維が分解により敏感である場合またはβ構造のコアに関与しないループおよび他の構造要素または領域（機能性または非機能性）を含む完全な繊維物質が必要な場合は、プラスミン、ファクターX、トロンビンのような特異性の高いプロテイナーゼを使用するのが好ましい。またプロテイナーゼの組み合わせを使用してもよい。
【００１６】
試料は適切な任意の方法を用いてプロテアーゼと接触させてもよい。試料は、試料中のアモルファス凝集物と可溶性前駆体の消化が可能であるが、アミロイド繊維を消化しない条件下で適切なプロテアーゼとインキュベートするのが好ましい。特にインキュベーション条件は試料中の蛋白質不純物が消化され、アミロイド繊維自身は消化しないように選ぶことができる。本発明の好ましい態様において、試料はプロテアーゼで処理され、ついで十分な時間インキュベーションされ、試料からアモルファス凝集物と可溶性前駆体または他の不純物を本質的に除去する。
【００１７】
インキュベーション温度は対象とされるプロテアーゼとアミロイド繊維の安定性に基づいて選ばれる。試料をプロテアーゼで処理するのに適した温度は20℃〜60℃、好ましくは30℃〜40℃、例えば37℃である。処理の条件下で、不純物の消化が起きるのに十分な適切な量のプロテアーゼを試料に加えてもよい。例えばプロテアーゼは試料中に蛋白質に対するプロテアーゼの重量比が約1：1、または1：10から1：10000、好ましくは約1：20から約1：100で存在してもよい。適切な条件の選択は当業者の日常の技術の範囲内である。
【００１８】
試料は、除去すべき不純物の量および安定性によって、10分、好ましくは30分から24時間、2日、3日までの期間、適切にインキュベートしてもよい。
【００１９】
アミロイド繊維は、界面活性剤、化学変性剤またはカオトロピック試薬を用いて精製してもよい。そのような試薬は他のペプチド不純物からの繊維の分離を容易にするためにペプチドを変性し、可溶性および非繊維性ペプチドを解離するために使用してもよい。アミロイド繊維はSDSまたはLDSのような陰イオン界面活性剤による変性に強い抵抗性を示す場合がある。HEWL（鶏卵白リゾチーム）アミロイド繊維について行った実験で、アミロイド繊維は約1％w／vまでの界面活性剤の濃度の存在下でのインキュベーションにおいて完全であることが示された。他の非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を同様な効果を得るのに用いてもよい。
【００２０】
尿素またはグアニジン、特に塩化グアニジンまたはグアニジンチオシアネートのような化学変性剤またはカオトロピック試薬が存在すると、異なった程度で単一の蛋白質、非特異的でアモルファスの凝集物、および十分に構造化されたアミロイド繊維に影響する。従って、またグアニジンまたは尿素のような化学変性剤を使用してもよい。グアニジンは、例えば1Mから4Mのように、4M未満の濃度で使用してもよい。温度およびインキュベーションの長さ等の適切なインキュベーション条件は、使用される各試薬に対して容易に決定できる。適切な温度およびインキュベーション期間にはプロテアーゼについて上に概説したものが含まれる。
【００２１】
本発明の1つの態様において、試料中に存在するアモルファス凝集物または他の不純物の濃度を評価するために処理中の試料からアリコートを採り、そのようなアリコートから繊維を分離し、FTIR（フーリエ変換赤外分光学）分析、SDS-PAGE分析または電子顕微鏡または電子スプレー質量分光測定法のような適切な分析を行ってもよい。そのような分析は精製繊維を得るための好ましい処理条件を評価するために用いてもよい。
【００２２】
例えば遠心分離または濾過のような分離または更なる分析に先立って、試料中のプロテアーゼは、例えば適切なプロテアーゼ阻害剤を添加することによって不活性化してもよい。例えば、ペプシンまたは他のプロテアーゼは炭酸アンモニウムまたはTris pH8.0中で洗浄することによって不活性化してもよい。他のプロテアーゼ阻害剤には、PMSF（例えば1mM）、ベンザミジン（例えば1mM）、リウペプチン（例えば10μg／ml）、ペプスタチン（例えば10μg／ml）、アプロチニン（例えば10μg／ml）、アンチパイン（例えば10μg／ml）、EDTA（例えば10μg／ml）などが含まれる。
【００２３】
プロテアーゼ、界面活性剤または他の試薬による処理後、アミロイド繊維は任意の適切な方法によって試料から分離できる。典型的な単離手順には、例えば孔を制御した膜および遠心分離（沈降）による濾過が含まれる。しかしある場合には、繊維の表面の官能基（スルフィドリル基、リガンド−DNAオリゴ等）を用いて繊維を活性表面（例えば、スルフィドリル基の場合は金の表面など）に結合し洗浄することによって、その目的に使用してもよい。また、可溶性または非繊維性凝集物と選択的に反応し、分離を容易にするために化学架橋剤を用いてもよい。可溶性分子または小さな凝集物に対する繊維の親和性は繊維表面にある大量の活性基のために非常に安定化されるはずである。続く繊維成分の回収には遠心分離または濾過を用いるのが好ましい。例えば、試料を100,000gから500,000gの間で、好ましくは300,000gで、15分から4時間、例えば1時間遠心分離してもよい。上澄を廃棄後、ペレットを回収し、適切な媒体に再懸濁し、遠心分離手順を繰り返してもよい。適切な洗浄を行ってもよい。
【００２４】
精製繊維の試料は、例えば遠心分離で得られたペレットを回収することによって回収してもよい。そのような繊維は、例えばFTIR、電子顕微鏡、電子スプレー質量分光測定法およびSDS-PAGEのような精密試験の実施のような詳細な調査もしくは使用のために、または質量分光測定法およびNMRでモニターされる水素交換のような繊維構造を調査する他の適切な方法のために再懸濁または操作してもよい。または繊維をナノ構造に使用するために操作してもよい。
【００２５】
精製した繊維は凝集物中に含まれている主な残基の確認に使用してもよい。病理学的蛋白質の凝集に関与している主な残基の分析は高純度の繊維が得られる場合だけに実施できる（Hoshinoら、Nature  Struct. Biology. 2002、9；332-336）。凝集に関与しているこれらの残基の確認は、凝集を防ぐ薬物の設計、または疾患関連蛋白質および生物活性ペプチドと薬物として使用される蛋白質もしくは産業で使用される蛋白質の両方で、凝集に抵抗性のある蛋白質の新しい変異体のエンジニアリングに本質的であり得る。
【００２６】
アミロイド繊維はナノ構造体およびナノ物質として使用するために精製してもよい。精製した繊維は、ついで絹様の繊維に紡ぐことができ、ナノワイアー（その伝導性の利点を生かして）、細胞増殖用のマトリックス、移植物中のプラスチックの生体適合性および生体分解性材料、薬物送達用の被包材料、表面に特別な性質（撥水性、防汚性）を付与し、センサー等に使用するために表面の性質を改変（例えば蛍光光放射のような光学的性質の付与）するためのコーティング剤（塗料）として使用できる。
【００２７】
実施例
PI3-SH3から調製されたアミロイド繊維の試料は、少なくともいくらかの非凝集および非繊維性物質を含むことが観察されている。繊維を他の成分から、特に大きな凝集物を分離することは、それらの性質が類似していることとサイズが大きいために通常の生化学の手法で達成するのは困難である。この問題を克服するために、プロテイナーゼによる消化に基づいた新しい手法が試みられた。両種類の凝集物は異なった構造特性を示すと思われるので、プロテイナーゼによる消化に異なった感受性を示す可能性が高い。この目的のために、その低pHでの非特異的プロテイナーゼ活性のためにペプシンが選択された。PI3-SH3凝集物の2種類の異なった試料を常法で調製した。pH1.5でインキュベートした1つの型の試料はアモルファスの凝集物を含み、pH2.0でインキュベートした、他の試料はよく見分けられるアミロイド繊維を含んだ。凝集物の消化は異なるインキュベーション時間でFTIRによってモニターした（図1）。pH1.5で形成されたアモルファスの凝集物に関連したスペクトルの特徴はそのβシートに関連した成分（それぞれ1612cm-1と1684cm-1）の速い消失を示し、非構造形状に関連した約1649cm-1に主なピークを与えた。対照的に、アミロイド繊維（pH2.0でインキュベーション）を含む試料に対応したスペクトルは、凝集に関連した主なβシートのスペクトルの特徴がインキュベーション3時間後でさえ、小さな変化を被るだけなので、時間とともに非常に少ない展開を示す。興味深いことに、約1684cm-1の帯域の強度の低下が、約1618cm-1に中心がある主ピークによる高い波数への小さなシフトを伴って観察できる。これは試料中に存在する若干の凝集物の消化を示し、これがそれぞれ1684cm-1と1612cm-1に影響する。これらの変化は試料中に存在するアモルファス成分がプロテアーゼ抵抗性繊維を残して消化されることを示唆する。無秩序な成分（消化されたペプチド）、即ちペプチド断片の集団が多いために、1640cm-1と1660cm-1の間の強度の増加もある。
【００２８】
ペプシン消化後のアミロイド繊維の完全性を異なった生物物理学的技術で分析した。試料の電子顕微鏡（EM）分析の顕微鏡図は最初の調製物で明らかであった全体の形態を保持する多数のペプシン消化後の完全なアミロイド繊維を示したが、その他の型の凝集物は検出されなかった。アミロイド繊維中の蛋白質分子の完全性を6M Gnd HCLを用いたアミロイド繊維の崩壊後のPI3-SH3の1D-NMRスペクトルの記録と再折りたたみ手順によって評価した。スペクトルは凝集前の自然の蛋白質のスペクトルと区別できなかった。ペプシンの処理前後の繊維からのPI3-SH3のSDS-PSGEに次のレーンをつけた。レーン1: 自然な蛋白質; レーン2:ペプシン添加前の繊維；レーン3: レーン2の試料のペプシンとのインキュベーションによる消化後に得られたペレット；レーン4：レーン2の試料のペプシンによる消化後に得られた上澄。レーン2の単量体の帯域の下に小さな帯域が現れるが、これはアミロイド繊維の形成に必要な低pHでの長時間のインキュベーション後の少量の蛋白質分解によると思われる。この帯域はレーン3には完全に存在せず、従ってアミロイド繊維中にある。興味深いことに、PI3-SH3のアミロイド繊維を含む試料のSDS-PSGEはPI3-SH3単量体が示すのと同じ位置で移動する帯域を示すが、これは繊維が完全な全長の蛋白質で形成されていることを示す。可溶性の任意の成分を除くためにペプシン消化および超遠心分離を受けた繊維を含む試料は再び全長のポリペプチドだけが存在し、他の蛋白質の断片は検出できないことが示された。対照的に、そのような処理後に得られた上澄は観察できる帯域を示さず、これは最初の試料中に存在するすべての可溶性単量体が完全に分解したことを示す。
【００２９】
ペプシン消化とその後の超遠心分離後のアミロイド繊維試料の電子スプレー質量分光測定法による分析は、PI3-SH3領域の全長に対応した質量を与えたが、その他の小さな断片は検出されなかった。従って、洗浄手順後の繊維が示す形態学的および分光学的特性は、PI3-SH3がプロテイナーゼに接近できない非常に緻密な形状を採る可能性が高いために、十分な秩序のあるアミロイド繊維に組み込まれた全長のPI3-SH3に完全に対応することがSDS-PSGEとEMS分析によって示される。
【００３０】
アミロイド繊維がプロテイナーゼ抵抗性であり、対照的に最初の試料中に未だ存在するアモルファス凝集物と可溶性蛋白質が抵抗性でないことを確認した後、FTIRを用いてアミロイド繊維が示す構造の特徴を更に特性づけることを行った。最初の試料および精製試料のFTIRスペクトルは全体的な類似性を示し（図2）、これは最初の試料のアミドI帯域が溶液中に存在する繊維に由来することに大きく影響することを示している。しかし、スペクトルの詳細な分析によって、特に両スペクトルの二次導関数を比較すると明らかないくつかの差が明らかになった。1684cm-1の成分は消化後に実質的に失われ、主な凝集帯域の3つの成分の1つ、即ち1612cm-1の成分が二次導関数解析で存在しない（図2）。これはアモルファス凝集物を含む試料中の主な成分（図1参照）である、1684cm-1と1612cm-1の帯域が精製手順前の試料中に存在する非繊維性物質の特徴であることを示唆する。
【００３１】
従って、アミロイド繊維中に見られる水素結合成分が、主として特徴的なβ構造に対応する1618cm-1と1628cm-1であると仮定できる。1641cm-1と1664cm-1における他の成分は消化後に繊維の中に未だに存在し、これはそれぞれ無秩序な形状とβターンからのいくらかの影響を示唆している。このことは主なβシートの特徴とは別に、蛋白質のいくつかの領域はアミロイド繊維内に柔軟性のあるループとターンを示すことができることを示す。この後者の結論は低温EM分析に基づくSH3繊維帯域のモデルに一致するが、繊維中の蛋白質の加水分解に対する感受性の欠損を考えると顕著である。それはポリペプチド鎖のこれらの領域がよく見分けられなくても、βシート構造が繊維性のアセンブリー内で堅固に保持されている事実を反映するはずである。
【００３２】
FTIR分析は、二次構造の異なった型の証拠を提供するとともに、βシート中の平行形状と抗平行形状を識別すると報告されている。しかし、繊維中のβ鎖の特別な幾何学はこれらの古典的なβシート構造からのIR周波数を混乱させ得た可能性がある。
【００３３】
精製したアミロイド繊維のFTIR分析は1611cm-1から1612cm-1における周知の影響の減少を示し、1684cm-1では実質的に影響はなかった（図2）。この所見は、これらの減少した成分が、アモルファス凝集物（図1）を含む、より低いpH値でインキュベートされた試料で観察されるスペクトルの特徴と一致して、非繊維性の凝集物と関係していることを強く示唆する。約1684cm-1で精製した繊維の成分にほぼ完全に存在しないことは、平行相互作用に対して抗平行相互作用の影響が殆どないことを示唆する。これらの結果は、FTIRのような技術によるアミロイド繊維の分析には、無秩序で可溶性の物質がスペクトルに影響しないことを確実にするために、非常に注意しなければならないことを示す。βシートの平行および／または抗平行の性質と、その見分けがつく凝集物／繊維構造および形態の関係とを確認するために、精製アミロイド繊維のFTIR試験がさらに必要である。興味深いことに、いくつかのアミロイド繊維の試料で固体状態のNMRとFITRが示唆したように、インスリンの高度な繊維性の試料の試験が平行βシート構造を示唆した。しかし、他の著者は未だに平行と抗平行の混合が共存できると仮定しているが、いくつかの他のアミロイドについて抗平行構造も報告されているので、アミロイド内のβ構造に要求される形状、またはその正確な繊維の形態学との関連性は未だに確実でない。従って、アミロイド繊維中のβ鎖の配向を決定的に確立するには、高度に精製された材料の試験が更に必要である。ここに報告したような手法で得られた繊維性物質の試験能はこれらの試験で特に重要である。
【００３４】
アミロイド繊維の化学変性剤に対する抵抗性を評価するために、HEWLの繊維化試料のアリコートを異なったグアニジン濃度の存在下でインキュベートした。この処理で可溶化した蛋白質の量を遠心力300,000gで1時間沈降後評価した。得られた上澄は280nmで測定した。得られたペレットを同時に電子顕微鏡で分析した。結果を図3に示した。
【００３５】
4Mまでの濃度のグアニジンとインキュベートした後に得られたペレットの分析は、無処理の試料が示したのと類似した形状の大量のアミロイド繊維を示した。しかしいくつかの蛋白質はグアニジンの中間濃度（1M〜4M）で可溶化されると思われ、これは緩く結合した蛋白質分子のいくらかの非特異的凝集物が、この処理で除去されることを示唆する。これは、そのような中間濃度の変性剤で処理した後に得られる繊維が出発試料よりも「クリーン」であることを示唆する。
【００３６】
結論として、アモルファス凝集物および可溶性前駆体を含まないアミロイド繊維は蛋白質分解性消化、超遠心、界面活性剤および化学変性剤を用いて製造できる。この方法によって、全長の蛋白質がここで試験したSH3繊維内で保存されていることを証明することが可能になった。FTIR分析は、繊維内の蛋白質が、性格的に主に平行であるβシート構造に典型的なFTIR帯域を有することを示した。ポリペプチド鎖の他の領域はβ鎖と結合している可能性があるターンおよび無秩序な構造を形成するようであるが、これらは繊維構造内で堅固に保持されていると思われる。本明細書に記載した方法は広範な他のアミロイド系に応用できるはずであり、疾患関連の凝集物の研究に重要であるだけでなく、蛋白質繊維から組み立てられた新しい物質の調製する手段および特性づける手段としても重要である。
【００３７】
方法
PI3-SH3の0.5mM溶液をpH1.5の2H2O中、35℃で5日間インキュベーションしてアモルファスの凝集物を調製した。PI3-SH3の0.5mM溶液をpH2.0の2H2O中、35℃で30日間インキュベーションしてアミロイド繊維を調製した。
【００３８】
試料はプロテイナーゼ消化の前にEMで特性づけ、その形状を確認した。35℃で6日間pH1.5でインキュベートした試料は、非繊維性の凝集物を示したが、35℃で30日間インキュベーションpH2.0でインキュベーションした試料は、よく見分けがつく繊維を示した。両方の試料は2H2O中で調製され、測定値はアイソトープ効果につて補正した。
【００３９】
両方の試料を37℃で、ペプシン：PI3-SH3が1：200の重量比でペプシンとインキュベートし蛋白質消化を行った。異なった時間でアリコートを採り、更に加工することなくFTIRで分析した。  
【００４０】
アミロイド繊維の試料は、繊維を直ちに溶解した6M GndHCl中でインキュベートした。pH7.2の20mMの燐酸ナトリウム緩衝液中で透析を行い、GndHClを除去し、蛋白質を自然の形状に再び折りたたんだ。繊維から回収した蛋白質および同一の緩衝液中で新しく調製した蛋白質の1D NMRプロトンスペクトルを記録した。
【００４１】
電気泳動でローディング緩衝液として使用した1％SDSまたはLDSの存在下で繊維をインキュベーションすることで、アミロイド繊維は完全に溶解した。繊維はMS分析の前に10%水酸化アンモニウム中でインキュベーションして解離した。
【００４２】
1mMのPI3-SH3溶液をpH2.0の2H2O中でインキュベートし、それを35℃で30日間インキュベートして調製したアミロイド繊維を含む試料を、37℃で3時間、ペプシン：PI3-SH3が1：100の重量比のペプシンで消化し、ついで300,000gで1時間超遠心分離にかけた。非消化繊維を含むペレットをpH2.0の2H2O中に再懸濁し、再度同一の条件で遠心分離した。ペレットを再度pH2.0の2H2O中に再懸濁し、ついで精製手順前の最初の試料のアリコートとともにFTIRで分析した。
【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】FTIRでモニターした、異なったPI3-SH3凝集物のペプシン消化に対する感受性である。主にアモルファス凝集物（pH1.5）またはアミロイド繊維（pH2.0）のいずれかを含む試料をペプシンの存在下、37℃でペプシン対PI3-SH3の重量比1：200でインキュベーションした。両方の試料のアリコートを異なったインキュベーション時間でとり、それらのFTIRスペクトルを記録した。アミロイド繊維を含む試料（pH2.0）に1684 cm-1（1つの矢印）の成分の減少と1640と1660cm-1（2つの矢印）の間の成分の増加と共に、凝集物の帯域の高い波数へのシフトが見られた。
【図２】精製後のPI3-SH3アミロイド繊維の特性である。（A）精製前（灰色）および精製後（黒色）のFTIRスペクトル。二次導関数がそれぞれの試料中に存在する主成分を示す。（B）精製プロセス前後のアミロイド繊維の曲線のあてはめ。スペクトルをガウスおよびローレンツ成分に当てはめた。成分は二次導関数解析で見出した。1612cm-1までの成分はないにもかかわらず、消化した試料を二次導関数で解析すると、そのような成分の当てはめの決まった手順の前に人工的な強制をすることによって、より良い当てはめが達成された。曲線のあてはめによりペプシン消化後〜1684cm-1および1612cm-1の成分の顕著な減少が示された。
【図３】異なった変性剤濃度におけるHEWLアミロイド繊維からの蛋白質溶解の程度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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