(57)【要約】本発明は同一ＨＰＶサブタイプの複数のＨＰＶ遺伝子を同時に検出するために多重フルオロフォアを使用して試料中のＨＰＶサブタイプの有無を検出するための蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。本発明は本発明の方法で使用するＨＰＶサブタイプに特異的なプライマー対とプローブにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核酸ポリメラーゼと複数のオリゴヌクレオチドセットの存在下に核酸を増幅する段階と、
（但し、各オリゴヌクレオチドセットは、
（ｉ）ＨＰＶサブタイプの第１の位置にハイブリダイズするフォワード識別ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉ）第１の位置の下流のＨＰＶサブタイプの第２の位置にハイブリダイズするリバース識別ＰＣＲプライマーと、
（ｉｉｉ）クエンチャー分子と固有放出最大値でエネルギーを放出するフルオロフォアで標識された、第１の位置と第２の位置の間のＨＰＶサブタイプの位置にハイブリダイズする蛍光プローブと、から構成され、
各オリゴヌクレオチドセットは同一ＨＰＶサブタイプに由来する別のＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズする）、
（ｂ）増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各蛍光プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
（ｃ）フルオロフォアとクエンチャー分子の解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
（ｄ）少なくとも２個の放出最大値に蛍光変化が検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であると判定する段階
を含む核酸含有試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプの有無の検出方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドセット数が奇数であり、過半数の放出最大値に蛍光変化が検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドセット数が３である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドセットがＥ６、Ｅ７及びＬ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クエンチャーが非蛍光性である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
フルオロフォアがＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴであり、クエンチャーがＢＨＱ１である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＨＰＶサブタイプがＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＰＶサブタイプがＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項９】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号３６から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
フルオロフォアとクエンチャー分子を更に含む請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１１】
フルオロフォアがヌクレオチド配列の５’末端ヌクレオチドに結合しており、クエンチャーがヌクレオチド配列の３’末端ヌクレオチドに結合している請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１２】
フルオロフォアがＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択される請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
クエンチャー分子が非蛍光性である請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
クエンチャー分子がＢＨＱ１である請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
プライマー対のヌクレオチド配列が配列番号１と配列番号２、配列番号４と配列番号５、配列番号７と配列番号８、配列番号１０と配列番号１１、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１６と配列番号１７、配列番号１９と配列番号２０、配列番号２２と配列番号２３、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２８と配列番号２９、配列番号３１と配列番号３２、及び配列番号３４と配列番号３５から構成される群から選択される、ＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅用プライマー対。
【請求項１６】
（ａ）核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセットの存在下に核酸を増幅する段階と、
（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３に示すプローブから構成され、
第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号４に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号５に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号６に示すプローブから構成され、
第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号７に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号８に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号９に示すプローブから構成される）、
（ｂ）増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
（ｃ）フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
（ｄ）少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ６サブタイプ陽性であると判定する段階
を含む核酸含有試料中のＨＰＶ６の有無の検出方法。
【請求項１７】
第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＴＥＴである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセットの存在下に核酸を増幅する段階と、
（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１０に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１１に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１２に示すプローブから構成され、
第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１３に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１４に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１５に示すプローブから構成され、
第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１６に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１７に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１８に示すプローブから構成される）
（ｂ）増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
（ｃ）フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
（ｄ）少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１１サブタイプ陽性であると判定する段階
を含む核酸含有試料中のＨＰＶ１１の有無の検出方法。
【請求項１９】
第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＴＥＴである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセットの存在下に核酸を増幅する段階と、
（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１９に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２０に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２１に示すプローブから構成され、
第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２２に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２３に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２４に示すプローブから構成され、
第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２５に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２６に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２７に示すプローブから構成される）、
（ｂ）増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
（ｃ）フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
（ｄ）少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１６サブタイプ陽性であると判定する段階
を含む核酸含有試料中のＨＰＶ１６の有無の検出方法。
【請求項２１】
第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＴＥＴである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセットの存在下に核酸を増幅する段階と、
（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２８に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２９に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３０に示すプローブから構成され、
第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号３１に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号３２に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３３に示すプローブから構成され、
第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号３４に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号３５に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３６に示すプローブから構成される）、
（ｂ）増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
（ｃ）フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
（ｄ）少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１８サブタイプ陽性であると判定する段階
を含む核酸含有試料中のＨＰＶ１８の有無の検出方法。
【請求項２３】
第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアがＴＥＴである請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般に臨床試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプの有無を検出するためのＰＣＲアッセイに関する。より詳細には、本発明は単一ＰＣＲ反応チューブで複数のＨＰＶ遺伝子座を同時に検出するために多重フルオロフォアを使用する蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、８０種を越え、良性増殖性疣贅から悪性癌に至る多様な生物表現型を誘因する（ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）参照）。ＨＰＶ６とＨＰＶ１１は最も一般に良性疣贅を伴う型であり、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８は悪性病変を伴うことが最も多いハイリスク型である。従って、臨床試料中の特定ＨＰＶ型の決定はＨＰＶ関連疾患の発症の危険を予測するために不可欠である。
【０００３】
臨床試料中の特定ＨＰＶ型を同定及び定量するためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるウイルス核酸の検出、サザンブロット分析、ハイブリッドキャプチャー又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の数種の核酸法が利用されている。ＰＣＲ法は単一特定ＨＰＶターゲット配列の増幅後に得られたアンプリコンを膜にブロットして放射性標識オリゴヌクレオチドプローブで探索することが多い。
【０００４】
他の方法としては、試料中に存在する多数のＨＰＶサブタイプをＰＣＲ増幅することが可能な市販コンセンサスプライマーの使用により異なるサブタイプの特定ＨＰＶ遺伝子間の高相同性を利用する。その後、サブタイプ特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して特定ＨＰＶサブタイプの有無を同定する。例えばＫｌｅｔｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（８）：２５０８−２５１７（１９９９）；Ｇｒａｖｉｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３８（１）：３５７−３６１（２０００）参照。同様に、縮重ＰＣＲプライマーを使用するアッセイはＨＰＶサブタイプ間の相同性を利用し、特異的プライマーセットを利用する方法よりも多数のＨＰＶ型を検出することができる。例えばＨａｒｗｏｏｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（１１）：３５４５−３５５５（１９９９）参照。このようなアッセイも特定ＨＰＶサブタイプを同定するために付加実験が必要である。
【０００５】
上記ＰＣＲ法はいくつかの問題を伴う。例えば、ＨＰＶサブタイプ間の反応効率の差によりサブタイプ間で増幅が不均衡になる恐れがある。また、試料中に高コピー数で存在するサブタイプの側に増幅の平衡が傾き、ＰＣＲ反応成分が消費され、コピー数の少ないＨＰＶサブタイプが増幅しにくくなる。
【０００６】
リアルタイムでＰＣＲ産物を検出することができ、放射能の不要な５’エキソヌクレアーゼ蛍光ＰＣＲアッセイ（Ｔａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲ）も文献に記載されている。例えば米国特許第５，５３８，８４８号；Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０（１９９１）参照。この方法は、蛍光レポーター（フルオロフォア）とクエンチャーを含み、ＰＣＲプライマー間のターゲットＤＮＡにハイブリダイズする標識プローブを利用している。フルオロフォアを励起すると、フルオロフォアにより蛍光シグナルが発生され、クエンチャーにより消光される。ＰＣＲプライマーの伸長中に遭遇する２本鎖ＤＮＡを分解してプローブからフルオロフォアを遊離するＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によりアンプリコンを検出することができる。その後、蛍光シグナルは消光されなくなり、ターゲットＤＮＡの量に直接相関する蛍光シグナルの蓄積を自動蛍光光度計によりリアルタイムで検出することができる。
【０００７】
Ｔａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲアッセイはＨＰＶサブタイプ検出に適応されている。Ｓｗａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５（４）：８８６−８９１（１９９７））はＬ１遺伝子の一部を増幅する型特異的ＨＰＶプライマーと型特異的プローブを併用する蛍光原性プローブアッセイを開示している。Ｓｗａｎらのアッセイはリアルタイムではなく一定数のＰＣＲサイクル後に蛍光シグナルを測定する（終点読取り）。
【０００８】
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（３）：４９０−９６（１９９９））は各種蛍光色素で標識した型特異的プローブを使用してＥ１遺伝子の高度保存部分をターゲットとするＴａｑ−Ｍａｎアッセイを報告している。特異的プライマーと縮重プライマーの混合物を利用することにより多数のＨＰＶ型を増幅している。Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎらは異なるＨＰＶサブタイプに由来するＥ１遺伝子の一部を検出するように設計した型特異的プローブをアッセイ当たり３個まで利用した。Ｓｗａｎらのアッセイと異なり、Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎは蛍光蓄積をリアルタイムで測定した。
【０００９】
Ｔｕｃｋｅｒら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ６（１）：３９−４７（２００１））はＥ６／Ｅ７境界にまたがる保存領域をターゲットとするアッセイを記載している。Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎのアッセイと異なり、Ｔｕｃｋｅｒらはリアルタイム検出型特異的蛍光プローブを利用した。Ｔｕｃｋｅｒらは更にＨＰＶターゲット配列とアクチン又はグロビン細胞遺伝子座を同一反応チューブで同時に検出するために多重ＰＣＲを利用した。
【００１０】
上記方法は一般にＤＮＡ試料中の単一ウイルス遺伝子座（例えばＬ１遺伝子座）の有無を試験している。単一遺伝子座アッセイは、ＨＰＶ型相互の特定ＨＰＶ遺伝子間の相同度が高いため、偽陽性結果の過剰発生という欠点がある。この相同度が単一ＨＰＶ型に特異的なＰＣＲアッセイを設計しにくくしている。従って、単一ＨＰＶ型の数個の遺伝子座の有無を試験することにより陽性結果を確認することが必要である。陽性結果を確認するために必要な付加実験は面倒で時間がかかる。４種の異なるＨＰＶ型について臨床試料のＨＰＶ状態を検証するには一般に２６〜３０工数が必要である。
【００１１】
単一遺伝子座アッセイは偽陰性結果を生じる恐れもある。ＨＰＶゲノムと染色体宿主ＤＮＡの関係が多段階腫瘍形成過程で変化し得ることは周知である（ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．８２：１５−３３（２００１）参照）。前癌病変はエピソーム形のＨＰＶ  ＤＮＡを伴うことが多いが、後期腫瘍は一般に組込まれたＨＰＶ配列を有している。進んだ進行段階の疾患に相関する組込みの結果として、Ｌ１遺伝子等の特定ＨＰＶ遺伝子のオープンリーディングフレームが破壊する恐れがある。このようなＨＰＶ遺伝子配列の破壊は破壊した配列をターゲットとするアッセイで偽陰性結果を生じる恐れがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記ＨＰＶアッセイが開発されているが、感度と再現性が高く、文献に開示されている方法よりも必要な工数の少ないアッセイが開発されるならば有利であろう。
【００１３】
本発明は同一ＨＰＶサブタイプの複数のＨＰＶ遺伝子座を同時に検出するために多重フルオロフォアを使用して試料中のＨＰＶサブタイプの有無を検出するための蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
より詳細には、本発明は核酸含有試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプの有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと複数のオリゴヌクレオチドセット（但し、各オリゴヌクレオチドセットは（ａ）ＨＰＶサブタイプの第１の位置にハイブリダイズするフォワード識別ＰＣＲプライマーと、（ｂ）第１の位置の下流のＨＰＶサブタイプの第２の位置にハイブリダイズするリバース識別ＰＣＲプライマーと、（ｃ）クエンチャー分子と固有放出最大値でエネルギーを放出するフルオロフォアで標識された、第１の位置と第２の位置の間のＨＰＶサブタイプの位置にハイブリダイズする蛍光プローブから構成され、各オリゴヌクレオチドセットは同一ＨＰＶサブタイプに由来する別のＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズする）の存在下に核酸を増幅して複数のＰＣＲアンプリコンを生成する段階と、
増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各蛍光プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、および
少なくとも２個の放出最大値に蛍光変化が検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であると判定する段階を含む方法に関する。
【００１５】
本発明の１好適態様では、複数のオリゴヌクレオチドセットの各オリゴヌクレオチドセットは被検出ＨＰＶサブタイプの単一遺伝子に特異的である。換言すれば、本発明の方法の各オリゴヌクレオチドセットは同一サブタイプの単一ＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。例えば、第１のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、第２のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＥ７遺伝子にハイブリダイズし、第３のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＬ１遺伝子にハイブリダイズする。その結果、被検出ＨＰＶサブタイプの単一ＨＰＶ遺伝子に各々特異的な複数のＰＣＲアンプリコンが生成される。
【００１６】
本発明の代替態様では、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドセットのフォワード識別ＰＣＲプライマーとリバース識別ＰＣＲプライマーは同一ＨＰＶサブタイプの異なる遺伝子に特異的である。例えば、フォワード識別プライマーはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、リバース識別プライマーはＥ７遺伝子にハイブリダイズする。その結果、少なくとも１個のＰＣＲアンプリコンは２個以上の遺伝子に由来するヌクレオチド配列を含む。前記アンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、例えばＥ６遺伝子に由来するヌクレオチド配列、Ｅ７遺伝子に由来するヌクレオチド配列、又はＥ６／Ｅ７境界にまたがるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。
【００１７】
本発明の１好適態様では、ＨＰＶサブタイプはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される。
【００１８】
本発明の方法の別の好適態様では、オリゴヌクレオチドセット数は３であり、オリゴヌクレオチドセットはＨＰＶのＥ６、Ｅ７及びＬ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする。Ｅ６、Ｅ７及びＬ１遺伝子の２又は３種が検出されるならば、試料は被験ＨＰＶサブタイプに陽性である。
【００１９】
本発明の別態様は単一ＨＰＶ型に特異的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。前記オリゴヌクレオチドプローブは特定オリゴヌクレオチドプライマーを使用するウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られる特定ＨＰＶアンプリコンに結合することができる。本発明の別態様では、前記オリゴヌクレオチドプローブは配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号３６から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明はフルオロフォアとクエンチャー分子を更に含む前記オリゴヌクレオチドプローブにも関する。本発明の１好適態様では、フルオロフォアはＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択され、クエンチャーは非蛍光性である。本発明の特に好適な態様では、クエンチャーはＢＨＱ１である。
【００２１】
本発明は更にフォワード及びリバース両者のＰＣＲプライマーが識別可能であるＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅用プライマー対にも関する。本発明の１好適態様では、プライマー対のヌクレオチド配列は配列番号１と配列番号２、配列番号４と配列番号５、配列番号７と配列番号８、配列番号１０と配列番号１１、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１６と配列番号１７、配列番号１９と配列番号２０、配列番号２２と配列番号２３、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２８と配列番号２９、配列番号３１と配列番号３２、及び配列番号３４と配列番号３５から構成される群から選択される。
【００２２】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は、ワトソン・クリック型塩基対合等の規則的パターンのモノマー−モノマー相互作用によりターゲットポリヌクレオチドと特異的に結合することが可能な天然又は改変モノマー又は連結の直鎖オリゴマー（例えばデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等）を意味する。本発明の趣旨では、オリゴヌクレオチドなる用語はオリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーの両者を含む。
【００２３】
本発明で使用する「プライマー」なる用語は、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成を触媒する条件下におくと、相補鎖に沿う合成開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。このような条件としては適当な温度で適当な緩衝液（「緩衝液」は補因子である成分又はイオン強度、ｐＨ等に作用する成分を含む）中に４種の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸と重合誘導剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の共存下が挙げられる。本明細書で使用するオリゴヌクレオチドプライマーは精製制限消化物のように天然に存在するものでもよいし、合成してもよい。プライマーは増幅効率を最大にするために１本鎖が好ましい。
【００２４】
本明細書で使用する「プライマー対」とは、核酸ポリメラーゼの存在下に核酸セグメントのＰＣＲ増幅に関与してＰＣＲアンプリコンを生成することが可能なフォワードプライマーとリバースプライマーの２種のプライマーを意味する。プライマー対を構成するプライマーは、同一ＨＰＶ遺伝子に特異的であり、単一ＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列から構成されるアンプリコンを生成することができる。あるいは、プライマー対を構成するプライマーは、ＨＰＶゲノム内で相互に極近接する異なるＨＰＶ遺伝子に特異的であり、２種以上の遺伝子に由来するヌクレオチド配列から構成されるアンプリコンを生成することができる。
【００２５】
本発明のフルオロフォアに関して本明細書で使用する「固有」とは、各フルオロフォアが特定アッセイで使用する他の全フルオロフォアに対して異なる放出最大値でエネルギーを放出することを意味する。固有放出最大値のフルオロフォアを使用すると、特定アッセイで使用する複数のフルオロフォアの各々により放出される蛍光エネルギーを同時に検出することができる。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブに関して本明細書で使用する「識別」なる用語は前記プライマー及びプローブが単一ＨＰＶサブタイプに特異的であることを意味する。この用語は単一ＨＰＶサブタイプに特異的であるが、他のＨＰＶサブタイプに多少相同なＨＰＶプライマー及びプローブを含む。本発明の「識別」プライマー及びプローブは少なくとも１ヌクレオチドまたはそれ以上他のＨＰＶサブタイプと３’相同性をもたないオリゴヌクレオチドを含む。特定位置で特定ＨＰＶサブタイプに固有であり、アラインメントにおいて前記ＨＰＶサブタイプを他のＨＰＶサブタイプから識別するように機能する残基を「識別塩基」と言う。オリゴヌクレオチドに関して「識別」なる用語は２種以上のＨＰＶサブタイプに特異的なプライマー及びプローブ即ち２種以上のＨＰＶサブタイプと完全に相同なプライマー及びプローブを含まない。
【００２７】
本明細書で使用する「アンプリコン」とは核酸ポリメラーゼと特定プライマー対の存在下に核酸含有試料のＰＣＲ増幅により生成されたＰＣＲ反応の特定産物を意味する。アンプリコンは単一ＨＰＶサブタイプの単一遺伝子に由来するヌクレオチド配列から構成されるものでもよいし、アンプリコンは単一ＨＰＶサブタイプの２種以上の遺伝子に由来するヌクレオチド配列から構成されるものでもよい。
【００２８】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチドセット」とは単一ＨＰＶサブタイプの特定ヌクレオチド配列にハイブリダイズする１対のオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブの組合せを意味する。前記オリゴヌクレオチドセットは（ａ）ＨＰＶサブタイプの第１の位置にハイブリダイズするフォワード識別ＰＣＲプライマーと、（ｂ）第１の位置の下流のＨＰＶサブタイプの第２の位置にハイブリダイズするリバース識別ＰＣＲプライマーと、（ｃ）フルオロフォアとクエンチャーで標識されており、プライマー間のＨＰＶサブタイプの位置にハイブリダイズする蛍光プローブから構成される。換言すれば、オリゴヌクレオチドセットは単一ＨＰＶサブタイプに特異的なアンプリコンの合成を開始することが可能な１組の特定ＰＣＲプライマーとアンプリコンにハイブリダイズする蛍光プローブから構成される。
【００２９】
本明細書で使用する「複数」とは２以上を意味する。
【００３０】
オリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブに関して本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」とは前記オリゴヌクレオチドセット、プライマー又はプローブが単一ＨＰＶサブタイプにハイブリダイズすることを意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「遺伝子」とはポリペプチド鎖の生成に関与する核酸セグメントを意味する。この用語は翻訳配列（コーディング領域）と５’及び３’非翻訳配列（非コーディング領域）の両者と共に、個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）も含む。本発明の趣旨では、ＨＰＶゲノムはＬ１、Ｌ２及びＥ１〜Ｅ７の９種の遺伝子をもつ。
【００３２】
本明細書で使用する「遺伝子座」とはある形質の遺伝子が存在する染色体上の位置を意味する。遺伝子座なる用語は特定遺伝子の対立遺伝子のいずれか１個を含む。異なるＨＰＶサブタイプに由来する相同遺伝子も含む。例えば、ＨＰＶ１６とＨＰＶ６でＬ１遺伝子を検出するＰＣＲアッセイは異なるＨＰＶサブタイプに由来する配列の検出であるが、単一遺伝子座アッセイである。逆に、例えば単一ＨＰＶ型のＬ１遺伝子とＥ１遺伝子を検出するアッセイは単一ＨＰＶサブタイプを検出するが、多重遺伝子座アッセイである。
【００３３】
本明細書で使用する「ＨＰＶ」とはヒトパピローマウイルスを意味する。「ＨＰＶ」は現在公知であるか将来既述されるかを問わずにいずれかのＨＰＶサブタイプを表すために使用する一般用語である。
【００３４】
本明細書で使用する「フルオロフォア」とは、レーザー、タングステン、水銀もしくはキセノンランプ又は発光ダイオードで励起すると規定スペクトルをもつ光の形態でエネルギーを放出する蛍光レポーター分子を意味する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法により、フルオロフォアから放出された光は励起スペクトルがフルオロフォアの発光スペクトルにオーバーラップする第２の分子を励起することができる。フルオロフォアから別の分子へ発光エネルギーが移動すると、フルオロフォアの発光は消光する。第２の分子はクエンチャー分子として知られている。「フルオロフォア」なる用語は本明細書では「蛍光レポーター」なる用語と同義に使用する。
【００３５】
本明細書で使用する「クエンチャー」又は「クエンチャー分子」とは、フルオロフォアを含む蛍光プローブと結合するとフルオロフォアにより放出されるエネルギーを受容し、フルオロフォアの発光を消光することが可能な分子を意味する。クエンチャーは受容したエネルギーを光として放出する蛍光分子でもよいし、受容したエネルギーを熱として放出する非蛍光分子でもよく、プローブの長手方向の任意位置に結合することができる。
【００３６】
本明細書で使用する「暗クエンチャー」とは非蛍光クエンチャーを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する「プローブ」とはプローブの少なくとも１個の配列とターゲット領域又は被検出領域内の配列の相補性によりターゲット核酸内の配列と二重構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを意味する。「プローブ」なる用語は上記のようなオリゴヌクレオチドを含み、フルオロフォアとクエンチャー分子は結合していてもいなくてもよい。「蛍光プローブ」なる用語はフルオロフォアとクエンチャー分子を含むプローブを意味する。
【００３８】
本明細書で使用する「ＦＡＭ」とはフルオロフォア６−カルボキシフルオレセインを意味する。
【００３９】
本明細書で使用する「ＪＯＥ」とはフルオロフォア６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセインを意味する。
【００４０】
本明細書で使用する「ＴＥＴ」とはフルオロフォア５−テトラクロロフルオレセインを意味する。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
本発明は当分野で公知の他のアッセイに比較して偽陰性結果の危険が実質的に少ない臨床試料中のＨＰＶサブタイプの検出のためのアッセイに関する。
【００４２】
ＨＰＶゲノムと染色体宿主ＤＮＡの関係が多段階腫瘍形成過程で変化し得ることは周知である（ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．８２：１５−３３（２００１）参照）。前癌病変はエピソーム形のＨＰＶ  ＤＮＡを伴うことが多いが、後期腫瘍は一般に組込まれたＨＰＶ配列を有している。進行段階の疾患に相関する組込みの結果として、Ｌ１遺伝子座等の特定ＨＰＶ遺伝子のオープンリーディングフレームが破壊する恐れがある。このようなＨＰＶ遺伝子配列の破壊は破壊した配列を特異的に検出するように設計したアッセイで偽陰性結果を生じる恐れがある。
【００４３】
従って、本発明の１好適態様は試料中の特定ＨＰＶサブタイプの有無の同定方法を提供し、前記方法は単一ＨＰＶサブタイプの複数のＨＰＶ遺伝子を同時に検出及び増幅することを含む。複数のＨＰＶ遺伝子の過半数が本発明の方法により検出されるならば、試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であるとみなす。本発明の別の好適態様は特定ＨＰＶサブタイプの有無のアッセイを提供し、前記アッセイは単一ＨＰＶサブタイプの３種のＨＰＶ遺伝子を同時に検出及び増幅することを含む。３種の遺伝子の少なくとも２種が本発明の方法により検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であるとみなし、３種の遺伝子のうちのひとつも検出されないならばＨＰＶ陰性であるとみなす。前記アッセイは単一ＨＰＶ遺伝子座を試験するアッセイに伴う偽陰性結果の危険が少ない。本発明の方法は特異性と再現性が高い。
【００４４】
臨床試料中のＨＰＶサブタイプを検出する本発明の方法は当分野で公知の他のアッセイに比較して偽陽性結果の危険も実質的に少ない。このような偽陽性結果は、異なるＨＰＶサブタイプに由来する同一ＨＰＶ遺伝子と比較して、特定ＨＰＶ遺伝子間の相同度が高いために生じる。この相同度が単一ＨＰＶサブタイプに特異的なＰＣＲアッセイを設計困難しにくくしている。従って、単一遺伝子座を検出する当分野で公知の他の方法を利用する場合には、単一ＨＰＶ型の数個の遺伝子座の有無を順次試験することにより陽性結果を確認することが必要である。陽性結果を確認するために必要な付加実験は面倒で時間がかかる。４種の異なるＨＰＶ型について臨床試料のＨＰＶ状態を検証するには一般に２６〜３０工数が必要である。
【００４５】
当分野の慣用方法と異なり、本発明は単一ＨＰＶサブタイプの複数の異なるＨＰＶ遺伝子を同時に検出及び増幅し、単一遺伝子座アッセイに一般に付随する偽陽性結果の発生を実質的に減らす方法を提供する。更に、本発明のアッセイは陽性結果を確認するために連続実験を必要とせず、試料のＨＰＶ状態を決定するために必要な工数が著しく減る。従って、本発明の方法は特定ＨＰＶサブタイプの核酸に関する臨床試料の高スループットスクリーニングに適応できる。前記方法は高い特異性と確度を保ちながら例えば９６ウェルＰＣＲフォーマットを使用することにより多数の試料を同時にスクリーニングすることができる。
【００４６】
多重フルオロフォアフォーマットを利用する別のＨＰＶ  ＴａｑＭａｎアッセイも文献に記載されている（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（３）：４９０−９６（１９９９））。この方法は特異的プライマーと縮重プライマーの混合物を利用して多数のＨＰＶサブタイプでＥ１遺伝子の一部を増幅している。アッセイ当たり３個までのプローブを使用し、各プローブは異なるフルオロフォアを含み、各プローブは異なるＨＰＶサブタイプのＥ１遺伝子を検出する。臨床試料中ではなく、ＨＰＶ  ＤＮＡを含むプラスミドを使用してアッセイ感度を試験している。
【００４７】
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎらの開示によると、ＨＰＶ１８ＤＮＡの検出感度は単一プローブアッセイに比較して異なるＨＰＶサブタイプに各々特異的な多重蛍光プローブを同時に使用した場合に実質的に低下した。同様に、ＨＰＶ３５の検出もＨＰＶ３５の単一プローブに比較してＨＰＶ１６、ＨＰＶ３３及びＨＰＶ３５のプローブ混合物を使用した場合に多少低下した。更に、多重プローブアッセイを使用してＨＰＶ１６とＨＰＶ３１を検出した場合にも高コピー数で多少の感度の低下が認められた。
【００４８】
本発明の方法は、複数の蛍光プローブを利用し、各プローブは特定アッセイで使用する他のフルオロフォアに対して相互に固有放出最大値でエネルギーを放出するフルオロフォアを含む。本明細書に記載するアッセイは特異性が高く、３個の遺伝子座でＨＰＶゲノムＤＮＡ１０コピー未満を検出することができる。
【００４９】
１０〜１０６コピー／反応の範囲の濃度で遺伝子座特異的プラスミドを使用して本発明の各ＰＣＲアッセイの直線性と感度を確認した。ＨＰＶ６（図６）、ＨＰＶ１１（図７）、ＨＰＶ１６（図８）及びＨＰＶ１８（図９）多重ＰＣＲアッセイは１０〜１０６コピーの範囲内で直線性を示した。ヒト臨床試料から単離したウイルスＤＮＡを使用してＨＰＶ６（図１０）、ＨＰＶ１１（図１１）、ＨＰＶ１６（図１２）及びＨＰＶ１８（図１３）のＨＰＶ多重ＰＣＲアッセイの感度も確認した。
【００５０】
本発明の方法により示されるような非常に高いアッセイ感度はＨＰＶのコピー数が少ない可能性のある臨床試料のスクリーニングに不可欠である。ＨＰＶ感染の身体顕症は潜在的であることが多く、潜伏期が長いため、未治療状態のままでは癌に進行する恐れのある頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）であると患者が診断されるまでＨＰＶ感染が検出されない可能性がある。一般に、病変程度が高い（ＣＩＮ２，ＣＩＮ３及び癌）ほどＨＰＶコピー数は高く、当分野で公知の慣用方法により検出可能である。しかし、現在使用されている多数のアッセイは低コピー数のＨＰＶを検出するには感度又は特異性が不十分である。従って、ＨＰＶコピー数が少なく、治療介入の効果が高いと考えられる時期にＨＰＶを初期検出するには非常に高い感度が不可欠である。
【００５１】
本発明はより詳細には核酸含有試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプの有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと複数のオリゴヌクレオチドセット（但し、各オリゴヌクレオチドセットは（ａ）ＨＰＶサブタイプの第１の位置にハイブリダイズするフォワード識別ＰＣＲプライマーと、（ｂ）第１の位置の下流のＨＰＶサブタイプの第２の位置にハイブリダイズするリバース識別ＰＣＲプライマーと、（ｃ）クエンチャー分子と固有放出最大値でエネルギーを放出するフルオロフォアで標識された、第１の位置と第２の位置の間のＨＰＶサブタイプの位置にハイブリダイズする蛍光プローブから構成され、各オリゴヌクレオチドセットは同一ＨＰＶサブタイプに由来する別のＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズする）の存在下に核酸を増幅して複数のＰＣＲアンプリコンを生成する段階と、
増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各蛍光プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、
少なくとも２個の放出最大値に蛍光変化が検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であると判定する段階を含む方法に関する。
【００５２】
本発明の１好適態様では、複数のオリゴヌクレオチドセットの各オリゴヌクレオチドセットは被検出ＨＰＶサブタイプの単一遺伝子に特異的である。換言すれば、本発明の方法の各オリゴヌクレオチドセットは同一サブタイプの単一ＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。例えば、第１のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、第２のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＥ７遺伝子にハイブリダイズし、第３のオリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブはＬ１遺伝子にハイブリダイズする。その結果、被検出ＨＰＶサブタイプの単一ＨＰＶ遺伝子に各々特異的な複数のＰＣＲアンプリコンが生成される。
【００５３】
本発明の代替態様では、少なくとも１個のオリゴヌクレオチドセットのフォワード識別ＰＣＲプライマーとリバース識別ＰＣＲプライマーは、同一ＨＰＶサブタイプの異なる遺伝子に特異的である。例えば、フォワード識別プライマーはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、リバース識別プライマーはＥ７遺伝子にハイブリダイズする。その結果、少なくとも１個のＰＣＲアンプリコンは２個以上の遺伝子に由来するヌクレオチド配列を含む。前記アンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは例えばＥ６遺伝子に由来するヌクレオチド配列、Ｅ７遺伝子に由来するヌクレオチド配列、又はＥ６／Ｅ７境界にまたがるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。
【００５４】
蛍光変化は、蛍光プローブのフルオロフォアを励起するための励起法と、ＰＣＲ反応混合物を加熱及び冷却するための手段と、蛍光変化の検出手段の特徴をもつ、Ｔａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲを実施するように設計された自動蛍光光度計により検出することができる。この特徴の組合せを単一Ｔａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲ装置により実施すると、ＰＣＲアンプリコンのリアルタイム検出が可能になり、蛍光増加の速度をリアルタイムで試験することによりＰＣＲ産物増幅を確認することができる。Ｔａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲ反応を実施するための自動蛍光光度計は当分野で公知であり、この特定アッセイで使用するように適応でき、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製品ｉＣｙｃｌｅｒやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）製品Ｍｘ４０００を利用できる。
【００５５】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で本発明の方法を実施した。この装置はスペクトログラフを使用して蛍光発光を（波長に基づいて）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで予想間隔パターンに分離する。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍアプリケーションは蛍光シグナルをＣＣＤカメラから収集し、データ分析アルゴリズムを適用する。
【００５６】
本発明の方法で使用する核酸ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をもっていなければならない。数種の利用可能なポリメラーゼが当分野で公知であり、例えばＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｂｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）及びＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼが挙げられる。ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼが本発明の好適ポリメラーゼである。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性はＰＣＲプライマーの伸長中に遭遇する２本鎖ＤＮＡの分解を特徴とする。アンプリコンにアニールした蛍光プローブも同様に分解され、オリゴヌクレオチドからフルオロフォアを遊離する。フルオロフォアとクエンチャーが解離すると、フルオロフォアから発光される蛍光は消光されなくなるので検出可能な蛍光変化が生じる。ＰＣＲ産物の指数増幅中に、アンプリコン特異的蛍光は配列検出アプリケーションが複合アルゴリズムを複合スペクトルに適用後に非増幅試料のバックグラウンド蛍光から区別できるようになる時点まで増加する。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは更に試料の閾値サイクル（Ｃｔ）（この蛍光が予定閾値よりも増加するサイクル）を決定するソフトウェアアプリケーションも含む。ＰＣＲ陰性試料のＣｔは合計実施サイクル数に等しく、ＰＣＲ陽性試料のＣｔは合計実施サイクル数よりも小さい。
【００５７】
本発明は核酸含有試料中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）サブタイプの有無の検出方法に関する。本発明の１好適態様では、ＨＰＶサブタイプはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される。
【００５８】
本発明の方法の別の好適態様では、オリゴヌクレオチドセット数は奇数であり、過半数のフルオロフォアで蛍光変化が検出されるならば試料は被験ＨＰＶサブタイプに陽性である。
【００５９】
試料中の特定ＨＰＶサブタイプの有無を同定するための本発明の方法の更に別の好適態様では、オリゴヌクレオチドセット数は３である。少なくとも２個のフルオロフォアで蛍光変化が検出されるならば試料は当該ＨＰＶサブタイプに陽性であると判定する。各フルオロフォアに関連する３個の放出最大値の各々で陰性の試料は当該ＨＰＶサブタイプに陰性である。本発明はオリゴヌクレオチドセット数が３であり、ＨＰＶサブタイプがＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８から構成される群から選択される核酸含有試料中のヒトパピローマウイルスの有無の検出方法を提供する。
【００６０】
本発明の方法の別の好適態様では、オリゴヌクレオチドセット数は３であり、オリゴヌクレオチドセットはＨＰＶのＥ６、Ｅ７及びＬ１遺伝子と特異的にハイブリダイズする。Ｅ６、Ｅ７又はＬ１遺伝子の２又は３種が検出されるならば、試料は被験ＨＰＶサブタイプに陽性である。
【００６１】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは多数の方法により合成することができる。例えばＯｚａｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：５２０５−５２１４（１９９２）；Ａｇｒａｗａｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：５４１９−５４２３（１９９０）参照。例えば、オリゴヌクレオチドプローブはＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等の自動ＤＮＡ合成器で合成することができる。得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率に悪影響がない限り、非天然主鎖基をもたらす代替化学（例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート等）も利用できる。
【００６２】
本発明のＰＣＲ増幅段階は当分野で周知の標準技術を使用して実施することができる（例えば参考資料として本明細書に組込むＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；米国特許第４，６８３，２０２号；及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）参照）。ＰＣＲサイクル条件はＰＣＲ反応混合物を約８０℃〜約１０５℃の温度まで約１〜約１０分間加熱することにより実施可能な初期変性段階から一般に構成される。熱変性後に一般に約２０〜約５０サイクルの範囲の多数のサイクルを実施し、各サイクルは通常は初期変性段階に次いでプライマーアニール段階、最後にプライマー伸長段階を含む。プライマーを核酸ポリメラーゼ（例えばＴＡＱポリメラーゼ）で酵素伸長すると、後続サイクルで鋳型として使用可能な鋳型のコピーが生成される。
【００６３】
偽プライミングと非特異的アンプリコンの生成をなくすために本発明の方法と「ホットスタート」ＰＣＲ反応を併用してもよい。この点で、本発明の１好適態様では、核酸ポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲサイクル条件は「ホットスタート」ＰＣＲ反応を含む。前記ポリメラーゼはＰＣＲサイクル前に約１０分間ＰＣＲ反応成分を９５℃でインキュベートすることにより実施可能な活性化まで不活性である。同様の初期インキュベーション段階を含むＰＣＲ法は「ホットスタート」ＰＣＲアッセイとして当分野で公知である。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは約２０〜約４０ヌクレオチド長であることが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブは約１８〜約３０ヌクレオチド長がより好ましい。オリゴヌクレオチドプローブは約２４〜約３０ヌクレオチド長が最も好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの厳密な配列と長さはこのプローブが結合するターゲットポリヌクレオチドの種類によっても異なる。結合位置と長さは特定態様に適したアニーリング及び溶融性が得られるように変えることができる。
【００６５】
オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドはブロックされているか又は核酸ポリメラーゼにより伸長できなくしていることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは３’リン酸でなく３’ヒドロキシルにしかヌクレオチドを付加できないのでこのようなブロックは３’末端ヌクレオチドのリン酸化により実施すると好都合である。
【００６６】
本発明のＨＰＶプライマー及びプローブは他のＨＰＶサブタイプと完全に相同でないことが好ましい。本発明の各プライマーは少なくとも１ヌクレオチドまたはそれ以上３’相同性をもたないように設計すべきである。ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼは３’ 末端からしかプライマーを伸長せず、３’末端を正しくアニールする必要があるので、このようなプライマー設計はプライマーが正しくないＨＰＶサブタイプにアニールする危険を実質的に減らし、所期以外のＨＰＶ型にアニールしようとしてもプライマーは伸長できない。
【００６７】
各プローブが非特異的ＨＰＶターゲットとのオリゴヌクレオチド結合を不安定にするミスマッチをオリゴヌクレオチド配列に含むことも好ましい。遺伝子座を区別するにはオリゴヌクレオチドプローブの配列に１個程度のミスマッチがあれば十分である。本発明のプローブは増幅中のＤＮＡセグメントと結合した場合のみに加水分解して検出されるので、非増幅下のＤＮＡ配列とプローブの非特異的結合は検出されない。
【００６８】
この点で、本発明はフォワード及びリバース両者のＰＣＲプライマーが識別可能であるＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅用プライマー対に関する。本発明の１好適態様では、プライマー対のヌクレオチド配列は配列番号１と配列番号２、配列番号４と配列番号５、配列番号７と配列番号８、配列番号１０と配列番号１１、配列番号１３と配列番号１４、配列番号１６と配列番号１７、配列番号１９と配列番号２０、配列番号２２と配列番号２３、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２８と配列番号２９、配列番号３１と配列番号３２、及び配列番号３４と配列番号３５から構成される群から選択される。
【００６９】
当業者に自明の通り、特定サブタイプのＨＰＶ遺伝子を選択的に増幅する他の識別オリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよい。前記オリゴヌクレオチドプライマーは本明細書に開示するオリゴヌクレオチドプライマーと同一長でもよいし、１２〜４５ヌクレオチドの範囲でもよい。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー長は１８〜３０ヌクレオチドの範囲がより好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドプライマー長は１９〜２９ヌクレオチドの範囲が最も好ましい。
【００７０】
各Ｔａｑ−Ｍａｎプローブが非特異的ＨＰＶターゲットとのオリゴヌクレオチド結合を不安定にするミスマッチをオリゴヌクレオチド配列に含むことも好ましい。遺伝子座を区別するにはオリゴヌクレオチドプローブの配列に１個程度のミスマッチがあれば十分である。本発明のプローブは増幅中のＤＮＡセグメントと結合した場合のみに加水分解して検出されるので、非増幅下のＤＮＡ配列とプローブの非特異的結合は検出されない。
【００７１】
この点で、本発明の１好適態様は単一ＨＰＶ型に特異的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。前記オリゴヌクレオチドプローブは特定オリゴヌクレオチドプライマーを使用するウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅から得られる特定ＨＰＶアンプリコンに結合することができる。本発明の別態様では、前記オリゴヌクレオチドプローブは配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２７、配列番号３０、配列番号３３及び配列番号３６から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を含む。本発明はフルオロフォアとクエンチャー分子を更に含む前記オリゴヌクレオチドプローブにも関する。
【００７２】
本発明のフルオロフォアは５’末端、３’末端又は内部からいずれかの末端までを含むプローブの任意位置でプローブと結合することができ、即ち前記フルオロフォアはプローブを設計した検出対象である特定ＨＰＶ遺伝子にハイブリダイズすることが可能な特定ヌクレオチド配列を含むヌクレオチドの任意の１個と結合することができる。本発明の１好適態様では、フルオロフォアを特定ヌクレオチド配列の５’末端ヌクレオチドに結合し、クエンチャーを特定ヌクレオチド配列の３’末端ヌクレオチドに結合する。
【００７３】
フルオロフォアは結合部分を介してプローブの３’炭素又は末端５’炭素と結合するように誘導体化した蛍光有機色素であることが好ましい。クエンチャー分子も有機色素であることが好ましく、本発明の態様に応じて蛍光でも非蛍光でもよい。例えば、本発明の１好適態様では、クエンチャー分子は非蛍光性である。一般に、クエンチャー分子が蛍光性であるか単に非放射減衰によりレポーターから移動したエネルギーを放出するのみであるかに拘わらず、クエンチャーの吸収バンドはレポーター分子の蛍光発光バンドに実質的にオーバーラップすべきである。励起されたレポーター分子からエネルギーを吸収するが、エネルギーを放射しない非蛍光クエンチャー分子を本明細書では「暗クエンチャー」、「暗クエンチャー分子」、「非蛍光クエンチャー」又は「非蛍光クエンチャー分子」と言う。
【００７４】
数種のフルオロフォア−クエンチャー対が文献に記載されている。例えばＰｅｓｃｅら編，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７０）等参照。文献は蛍光分子及び非蛍光分子とその関連光学的性質についても詳細に記載しており、例えばＢｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７１）が挙げられる。更に、オリゴヌクレオチドに付加できる慣用反応基を介して共有結合するようにレポーター及びクエンチャー分子を誘導体化するための詳細な手引きも文献に記載されている。例えば米国特許第３，９９６，３４５号及び米国特許第４，３５１，７６０号参照。
【００７５】
典型的なフルオロフォア−クエンチャー対はフルオレセイン等のキサンテン系色素とローダミン系色素から選択することができる。これらの化合物はオリゴヌクレオチドとの結合部位として又はオリゴヌクレオチドと結合するための結合官能基として使用可能な置換基をそのフェニル部分に付けた多数の利用可能な形態で広く市販されている。別の分類の蛍光化合物はα又はβ位にアミノ基をもつナフチルアミンである。このようなナフチルアミン化合物としては１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の色素としては３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば９−イソチオシアナトアクリジンやアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレン等が挙げられる。
【００７６】
フルオロフォアとクエンチャー分子はフルオレセイン及びローダミン系色素から選択することが好ましい。これらの色素とオリゴヌクレオチドに結合するのに適した結合方法は当分野で公知である。例えばＭａｒｓｈａｌｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．７：２９９−３０３（１９７５）；及び米国特許第５，１８８，９３４号参照。本発明の１好適態様では、フルオロフォアは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）及び５−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）から構成される群から選択される。
【００７７】
本発明の１好適態様では、クエンチャー分子は非蛍光性である。本発明の１好適クエンチャー分子はＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により開発された非蛍光クエンチャーであるＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）１（ＢＨＱ１）である。別の好適態様では、フルオロフォアはＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択され、クエンチャー分子はＢＨＱ１である。
【００７８】
合成中にオリゴヌクレオチドと結合することができる市販結合部分を利用することが好ましく、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）の製品が挙げられる。
【００７９】
本発明は核酸含有試料中のＨＰＶ６の有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセット（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３に示すプローブから構成され、第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号４に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号５に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号６に示すプローブから構成され、第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号７に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号８に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号９に示すプローブから構成される）の存在下に核酸を増幅する段階と、
増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、
少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ６サブタイプ陽性であると判定する段階を含む方法に関する。
【００８０】
上記試料中のＨＰＶ６の有無の検出方法の１好適態様では、第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＴＥＴである。
【００８１】
本発明は更に核酸含有試料中のＨＰＶ１１の有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセット（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１０に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１１に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１２に示すプローブから構成され、第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１３に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１４に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１５に示すプローブから構成され、第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１６に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号１７に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号１８に示すプローブから構成される）の存在下に核酸を増幅する段階と、増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、
少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１１サブタイプ陽性であると判定する段階を含む方法にも関する。
【００８２】
上記試料中のＨＰＶ１１の有無の検出方法の１好適態様では、第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＴＥＴである。
【００８３】
本発明は更に核酸含有試料中のＨＰＶ１６の有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセット（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号１９に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２０に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２１に示すプローブから構成され、第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２２に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２３に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２４に示すプローブから構成され、第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２５に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２６に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号２７に示すプローブから構成される）の存在下に核酸を増幅する段階と、増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、
少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１６サブタイプ陽性であると判定する段階を含む方法にも関する。
【００８４】
上記試料中のＨＰＶ１６の有無の検出方法の１好適態様では、第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＴＥＴである。
【００８５】
本発明は更に核酸含有試料中のＨＰＶ１８の有無の検出方法であって、
核酸ポリメラーゼと３個のオリゴヌクレオチドセット（但し、第１のオリゴヌクレオチドセットは配列番号２８に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号２９に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３０に示すプローブから構成され、第２のオリゴヌクレオチドセットは配列番号３１に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号３２に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３３に示すプローブから構成され、第３のオリゴヌクレオチドセットは配列番号３４に示すフォワード識別ＰＣＲプライマーと、配列番号３５に示すリバース識別ＰＣＲプライマーと、３’末端をＢＨＱ１で標識し、５’末端をＦＡＭ、ＪＯＥ及びＴＥＴから構成される群から選択されるフルオロフォアで標識した配列番号３６に示すプローブから構成される）の存在下に核酸を増幅する段階と、増幅中に前記核酸ポリメラーゼにより各プローブを分解させて、前記フルオロフォアを前記クエンチャー分子から解離させる段階と、
フルオロフォアとクエンチャーの解離後に核酸増幅の発生に対応する蛍光変化を検出する段階と、
少なくとも２個のプローブで蛍光変化が検出されるならば試料はＨＰＶ１８サブタイプ陽性であると判定する段階を含む方法にも関する。
【００８６】
上記試料中のＨＰＶ１８の有無の検出方法の１好適態様では、第１のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＦＡＭであり、第２のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＪＯＥであり、第３のオリゴヌクレオチドセットのフルオロフォアはＴＥＴである。
【００８７】
以上、添付図面を参考に本発明の好適態様を説明したが、当然のことながら本発明は上記の厳密な態様に限定されず、特許請求の範囲に記載する発明の範囲又は精神から逸脱せずに当業者により種々の変更及び変形を実施することができる。
【００８８】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８９】
識別ＨＰＶプライマー設計
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ．１．０（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して各ＨＰＶサブタイプに対するＰＣＲプライマーを設計した。ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．７（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）とＰｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｇ４パーソナルコンピューター（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）を使用してＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３及びＨＰＶ４５サブタイプのＬ１、Ｅ６及びＥ７遺伝子座のオープンリーディングフレームの遺伝子特異的ヌクレオチド配列を整列させた。次にＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓアプリケーションの対立遺伝子識別モジュールにＰｈｙｌｉｐフォーマットアラインメントファイルをインポートし、各ＨＰＶサブタイプをマークした。
【００９０】
Ｔｍ＝５９〜６１℃、アンプリコンサイズ１００〜２５０ｂｐ、ＧＣ含量２０〜８０％、３’末端位置がグアノシン又はシトシン残基であり、３’末端３塩基内に識別塩基という基準を満たすプライマー対を選択した。識別塩基は特定位置で特定ＨＰＶサブタイプに固有の残基であり、アラインメントにおいてこのＨＰＶサブタイプを他のサブタイプから識別するように機能する。センスプライマーとアンチセンスプライマーの両者が識別可能となるような数種のプライマー対を選択した（図１参照）。
【００９１】
プライマー配列をＡｍｐｌｉｆｙ  ｖ．１．２  ｆｏｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅｎｇｅｌｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｎｔ，ウィスコンシン大学）により固有性とプライマー−ダイマー形成について分析した。明白なダイマー形成がなく、各プライマーがターゲット遺伝子座の一位置のみにアニールすると予測される最適プライマー対を各遺伝子座に選択した。プライマー対によりアンプリコンが規定されたら、Ｔｍ＝６８〜７０℃、長さ≦３０ｎｔ、同一ヌクレオチドが４つ以上連続せず、５’末端がグアノシン残基ではなく、グアノシン残基よりもシトシン残基のほうが多いという基準を満たす二重標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した（図１参照）。
【００９２】
ＢＬＡＳＴによりＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで各配列を検索し、各プライマー及びプローブと他の公知ＨＰＶサブタイプの予測される交差反応性を調べた。殆どのプライマー及びプローブ配列はその設計対象である特定ＨＰＶに固有にヒットし、他のＨＰＶサブタイプとは非相同であった。ＨＰＶ６Ｌ１アンチセンスプライマーはＨＰＶ３、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ２８及びＨＰＶ７０と多少相同である。ＨＰＶ６Ｌ１  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ４５、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６及びＨＰＶ８３と多少相同である。ＨＰＶ６Ｅ６アンチセンスプライマーはＨＰＶ１１と相同である。ＨＰＶ６Ｅ７アンチセンスプライマーはＨＰＶ２と多少相同である。ＨＰＶ６Ｅ７  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ１１、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ５５及びＨＰＶ７４と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｌ１センスプライマーはＨＰＶ６と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｌ１  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶＡＥ８、ＨＰＶ６、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ６４及びＨＰＶ７１と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｅ６アンチセンスプライマーはＨＰＶ５７と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｅ６  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ６と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｅ７センスプライマーはＨＰＶ６、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ５５及びＨＰＶ７４と多少相同である。ＨＰＶ１１Ｅ７  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ６及びＨＰＶ１３と多少相同である。ＨＰＶ１６Ｌ１センスプライマーはＨＰＶ６８と多少相同である。ＨＰＶ１６Ｌ１アンチセンスプライマーはＨＰＶ３５、ＨＰＶ３５Ｈ、ＨＰＶ４２及びＨＰＶ５２と多少相同である。ＨＰＶ１６Ｌ１  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ７、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３５Ｈと多少相同である。ＨＰＶ１８Ｅ６アンチセンスプライマーはＨＰＶ８５と多少相同である。ＨＰＶ１８Ｅ７センスプライマーはＨＰＶ６、ＨＰＶ３９及びＨＰＶ３９と多少相同である。ＨＰＶ１８Ｅ７  ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ５９と多少相同である。
【００９３】
設計したＨＰＶプライマー及びプローブのうちで他のＨＰＶサブタイプと完全に相同なものは皆無であった。各プライマーは少なくとも１ヌクレオチド以上の３’相同性をもたず、これはＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼが３’末端からしかプライマーを伸長せず、３’末端を正しくアニールする必要があることから、プライマーを正しくないＨＰＶサブタイプにアニールしようとしても伸長しないことを示唆している。各ＴａｑＭａｎプローブは非特異的ターゲットとのオリゴヌクレオチド結合を不安定にするミスマッチをオリゴヌクレオチド配列に含む。遺伝子座を区別するにはオリゴヌクレオチドプローブの配列に１個程度のミスマッチがあれば十分である。更に、プローブは増幅中のＤＮＡセグメントと結合した場合のみに加水分解して検出される。非増幅下のＤＮＡ配列とプローブの非特異的結合は検出されない。
【実施例２】
【００９４】
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの合成と標識
オリゴヌクレオチドプライマーはＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）により特注合成及び逆相ＨＰＬＣ精製した。二重標識オリゴヌクレオチドプローブはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により特注合成及び逆相ＨＰＬＣ精製した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている色素を使用し、Ｌ１遺伝子座のオリゴヌクレオチド蛍光プローブは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’標識し、Ｅ６遺伝子座のオリゴヌクレオチド蛍光プローブは６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）で５’標識し、Ｅ７遺伝子座のオリゴヌクレオチド蛍光プローブは５−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）で５’標識した。全オリゴヌクレオチドプローブはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により開発された非蛍光クエンチャーであるＢＨＱ１で３’標識した。凍結乾燥したプライマーとプローブを１×ＴＥ  ｐＨ８．０緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で再構成し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ６００ＤＵスペクトロフォトメーターで２６０ｎｍのＯ．Ｄ．を測定し、オリゴヌクレオチド特異的モル吸光係数を使用して濃度を計算することにより濃度を決定した。
【実施例３】
【００９５】
多重反応の最適化
３個の別個の遺伝子座を同時に検出して特定反応に片寄らずに単一ＰＣＲチューブで増幅できるようにプライマー及びプローブ濃度を最適化した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ装置でＤＮＡ鋳型１００コピー（各遺伝子座をプラスミドにクローニング）を使用してプローブ濃度を上げながら閾値サイクル（Ｃｔ）とΔＲｎを調べることにより蛍光オリゴヌクレオチドプローブ濃度を個々に最適化した。
【００９６】
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ２×ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）２５μＬ、終濃度２００ｎＭの各プライマー、プラスミドＤＮＡ鋳型１００コピー、ＤＥＰＣ処理水（Ａｍｂｉｏｎ）及び各種濃度（２５〜２００ｎＭ）の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含む５０μＬ反応混合物中で試料を増幅した。サイクル条件は５０℃で２分後に９５℃で１０分間の初期段階と、９４℃で１５秒間と６０℃で１分間を４５サイクルとした。
【００９７】
Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックスは（ｄＴＴＰではなく）ｄＵＴＰと、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）と、５０℃で活性化され、ウラシル含有核酸を開裂する酵素を含むものとする。Ｌｏｎｇｏら，Ｇｅｎｅ  ９３：１２５−１２８（１９９０）参照。ＵＮＧは後続実験で持ち越しＰＣＲ産物の再増幅を防止する。
【００９８】
最低Ｃｔ（例えばＨＰＶ１６Ｌ１；図２）とΔＲｎ〜１（例えばＨＰＶ１６Ｌ１；図３）を示す各プローブの濃度を選択した。先に決定した濃度の遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプローブとプラスミドＤＮＡ鋳型１０コピーを使用して精密マトリックスアッセイで各プライマー濃度組合せのＣｔとΔＲｎを調べることによりプライマー濃度を各遺伝子座に最適化した。最低Ｃｔ（例えばＨＰＶ１６Ｌ１；図４）と最大ΔＲｎ（例えばＨＰＶ１６Ｌ１；図５）を示すセンス及びアンチセンスプライマーの濃度を選択した。
【００９９】
次にＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．７５Ｕ／ウェル，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を追加してプライマーとプローブを試験した。ＤＮＡポリメラーゼを追加したのは、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ２×ＰＣＲマスターミックスは既にＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいるが、二重反応に最適化されているのであって、三重反応には最適化されていないためである。ＤＮＡポリメラーゼを追加して２×マスターミックスにＤＮＡポリメラーゼを補充し、反応を強化する。
【０１００】
１０〜１０６コピー／反応の範囲の濃度で遺伝子座特異的プラスミドを使用して各ＰＣＲアッセイの直線性と感度を確認した。ＨＰＶ６（図６）、ＨＰＶ１１（図７）、ＨＰＶ１６（図８）及びＨＰＶ１８（図９）多重ＰＣＲアッセイは１０〜１０６コピーの範囲内で直線性を示した。ヒト臨床試料から単離したＨＰＶウイルスＤＮＡの系列希釈を使用してＨＰＶ６（図１０）、ＨＰＶ１１（図１１）、ＨＰＶ１６（図１２）及びＨＰＶ１８（図１３）のＨＰＶ多重ＰＣＲアッセイの感度も確認した（実施例５参照）。
【実施例４】
【０１０１】
ＤＮＡ単離
Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼの量を推奨量の０．４ｍｇ／ウェルから０．５ｍｇ／ウェルに増加し、ＱＩＡａｍｐフィルタープレートをＳｉｇｍａ遠心機（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で清浄な正方形ウェルブロックに載せて１０分間６０００ＲＰＭで遠心乾燥し、ＤＮＡを予熱（７０℃）溶出緩衝液で溶出させた以外は製造業者のプロトコールに従ってＱＩＡａｍｐ９６ウェルＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してヒト臨床試料からＤＮＡを単離した。
【実施例５】
【０１０２】
ヒト臨床試料のスクリーニング
鋳型ＤＮＡを除くＰＣＲ反応の全成分を含むマスターミックスを調製し、被験ＨＰＶ型毎に９６ウェル光学反応プレート（４６μｌ／ウェル，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にロードした。多重ＰＣＲマスターミックスを加えた各ウェルに精製ＤＮＡ４μｌを加え、光学ＰＣＲキャップ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をウェルに装着した。Ｓｉｇｍａ遠心機で２分間３０００ＲＰＭで遠心後に９６ウェルＰＣＲプレートをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。
【０１０３】
各ＨＰＶサブタイプに特異的な予め設計した鋳型によりＰＣＲサイクルとデータ収集を開始及び制御した。ＰＣＲサイクルが完了したらデータを電子保存し、増幅プレートを廃棄した。次にＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓアプリケーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してデータを分析した。各色素層の閾値を手動設定し、ＦＡＭ色素層閾値は０．０５、ＪＯＥ色素層閾値は０．０３、ＴＥＴ色素層は０．０４に設定した。次に、データをタブ区切りテキストファイルにエキスポートした。次に、データが確かに正しい種類であることをマクロでチェックすることによりテキストファイルと試料名を含むファイルをＨＰＶサブタイプ特異的Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥＸＣＥＬワークブックにインポートした。ロックしたワークシートに組込まれた計算式は各試料の閾値サイクルに基づいて色素層ＰＣＲ陽性度を計算する。次に、全３層の色素層からのデータをワークブックによりコンパイルし、上記規則に基づいて各試料のコンセンサスＨＰＶ  ＰＣＲ陽性度を計算した。
【０１０４】
図１０〜１３はヒト臨床試料から単離したＨＰＶウイルスＤＮＡの系列希釈を使用して測定した夫々ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＨＰＶ多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。臨床試料からの高濃度ウイルスＤＮＡをヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドで１０倍系列希釈し、適当な多重ＰＣＲアッセイで試験した。１００，０００〜１，０００，０００倍希釈（コピー数約１〜１０）後もウイルスＤＮＡは検出可能であった。低コピー数のウイルス検出は全希釈範囲で直線性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１（１−２）】ＴａｑＭａｎ多重ＰＣＲ反応で使用したオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの配列と、オープンリーディングフレーム内のその位置（開始コドンのＡ＝１）と、多重ＰＣＲ反応における各オリゴヌクレオチドの終濃度を示す。各ＨＰＶ型に６種のプライマーを混合して１個の濃厚（１００倍）ヘキサプライマーストックとした。各プローブは濃厚（１００倍）ストックとして保存した。
【図１（２−２）】ＴａｑＭａｎ多重ＰＣＲ反応で使用したオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの配列と、オープンリーディングフレーム内のその位置（開始コドンのＡ＝１）と、多重ＰＣＲ反応における各オリゴヌクレオチドの終濃度を示す。各ＨＰＶ型に６種のプライマーを混合して１個の濃厚（１００倍）ヘキサプライマーストックとした。各プローブは濃厚（１００倍）ストックとして保存した。
【図２】ＨＰＶ１６Ｌ１−ＦＡＭ  ＴａｑＭａｎ二重標識プローブ濃度曲線を示す。ＨＰＶ１６Ｌ１プラスミド１００コピーを鋳型ＤＮＡとして使用して５０μｌ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応液中でＨＰＶ１６Ｌ１プローブ濃度を段階的に上げながら平均（ｎ＝３）閾値サイクル±ＳＤを決定した。同一文字で示した柱は一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較事後試験分析で有意差がない（ｐ＞０．０５）。
【図３】ＨＰＶ１６Ｌ１−ＦＡＭ  ＴａｑＭａｎ二重標識プローブ濃度曲線を示す。ＨＰＶ１６Ｌ１プラスミド１００コピーを鋳型ＤＮＡとして使用して５０μｌ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応液中でＨＰＶ１６Ｌ１プローブ濃度を段階的に上げながら平均（ｎ＝３）ΔＲｎ（Ｒｎ−基線）±ＳＤを決定した。同一文字で示した柱は一元配置ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較事後試験分析で有意差がない（ｐ＞０．０５）。
【図４】各種ＨＰＶ１６Ｌ１プライマー濃度の閾値サイクルを示す。ＨＰＶ１６Ｌ１プラスミド１００コピーをＤＮＡ鋳型として使用してセンス及びアンチセンス両者のプライマーを各種濃度で組合せて試験した。
【図５】各種ＨＰＶ１６Ｌ１プライマー濃度のΔＲｎを示す。ＨＰＶ１６Ｌ１プラスミド１００コピーをＤＮＡ鋳型として使用してセンス及びアンチセンス両者のプライマーを各種濃度で組合せて試験した。
【図６】ＨＰＶ６多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図７】ＨＰＶ１１多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１１Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１１Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１１Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図８】ＨＰＶ１６多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図９】ＨＰＶ１８多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１８Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１８Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１８Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図１０】ヒト臨床試料から精製したウイルスＤＮＡの系列希釈を使用したＨＰＶ６多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図１１】ヒト臨床試料から精製したウイルスＤＮＡの系列希釈を使用したＨＰＶ１１多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１１Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１１Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１１Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図１２】ヒト臨床試料から精製したウイルスＤＮＡの系列希釈を使用したＨＰＶ１６多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図１３】ヒト臨床試料から精製したウイルスＤＮＡの系列希釈を使用したＨＰＶ１８多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特定プローブで得られた結果（平均±ＳＤ，ｎ＝３）を各種記号で表し、四角はＨＰＶ１８Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、丸はＨＰＶ１８Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角はＨＰＶ１８Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。
【図１（１−２）】
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【図１（２−２）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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