(57)【要約】【課題】              インドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積に関連するＡＢＣＧ２ポリペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドの多型、及びその検出方法を提供すること。【解決手段】          哺乳動物から試料を採取し、ＡＢＣＧ２遺伝子における核酸配列の多型、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドにおけるアミノ酸配列の多型を決定する。本発明の好ましい実施形態において、前記核酸配列の多型は配列番号１の３４番目、３７６番目及び４２１番目からなる群より選択される位置における１以上の一塩基多型であり、前記アミノ酸配列の多型は配列番号２の１２番目、１２６番目及び１４１番目からなる群より選択される位置における１以上のアミノ酸の多型である。
2005529618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から試料を採取し、ＡＢＣＧ２遺伝子における核酸配列の多型、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドにおけるアミノ酸配列の多型を決定することを特徴とする哺乳動物細胞の薬物輸送能を予測する方法。
【請求項２】
前記ＡＢＣＧ２遺伝子が配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含み、前記核酸配列の多型が、配列番号１の３４番目、３７６番目及び４２１番目からなる群より選択される位置における１以上の一塩基多型である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一塩基多型が、Ｇ３４Ａ、Ｃ３７６Ｔ及びＣ４２１Ａからなる群より選択される一塩基多型である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列の多型が、ダイレクト・シークエンシング法、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法、質量分析法、ＲＣＡ法、及びＤＮＡチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法を用いて決定されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＢＣＧ２ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、前記アミノ酸配列の多型が配列番号２の１２番目、１２６番目及び１４１番目からなる群より選択される位置における１以上のアミノ酸の多型である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の多型がＶａｌ１２Ｍｅｔ、若しくはＧｌｎ１４１Ｌｙｓのアミノ酸置換、又は１２６番目から下流のアミノ酸配列の欠失である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アミノ酸配列の多型が質量分析法、二次元電気泳動法、及びプロテインチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法を用いて決定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物である請求項１〜７何れか一項に記載の方法：
【化１】
2005529618.tif 000010
ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、若しくはホルミルアミノ基を示すか、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基、及び置換基を有していてもよいチエニル基からなる群より選択されるいずれか１つによって置換されていてもよい低級アルキルアミノ基を示し、Ｇは五炭糖基、若しくは六炭糖基、又はアミノ基によって置換されていてもよいそれらの誘導体を示す。
【請求項９】
配列番号１の３４番目、３７６番目、及び４２１番目からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型を有するポリヌクレオチドにおいて、前記いずれかの一塩基多型部位を含み、且つ、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記一塩基多型がＧ３４Ａ、Ｃ３７６Ｔ、Ｃ４２１Ａ、及びそれらの相補的な一塩基多型からなる群より選択される請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１のポリヌクレオチドにおける塩基多型配列であって、該塩基多型配列の翻訳アミノ酸の１２番目がメチオニンである塩基多型、１２６番目が停止コドンである塩基多型、及び１４１番目がリジンである塩基多型からなる群より選択される１以上の塩基多型を有し、前記塩基多型部位の中に位置する１以上の塩基を含む、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対。
【請求項１３】
前記ＰＣＲプライマー対が配列番号５と６、配列番号９と１０、配列番号１１と１２からなる群より選択される何れかのプライマー対である請求項１２に記載のＰＣＲプライマー対。
【請求項１４】
ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の位置におけるＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出することのできるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、ダイレクト・シークエンシング法、インベーダー法、ＲＣＡ法、質量分析法、ＴａｑＭａｎ法及びＤＮＡチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法において使用することのできる請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドに多型変異を有する変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドであって、配列番号２の１２番目及び１４１番目の何れか又は両方のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記置換されたアミノ酸を含み前記変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド断片、又は配列番号２の１２６番目から下流のアミノ酸配列が欠失したポリペプチド。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチド
【請求項１７】
請求項１６に記載の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列のＶａｌ１２Ｍｅｔ及びＧｌｎ１４１Ｌｙｓの何れか又は両方のアミノ酸置換を有するＡＢＣＧ２ポリペプチドを発現する形質転換細胞。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチド
【請求項１９】
請求項１８に記載の形質転換細胞を使用する薬物輸送活性測定方法。
【請求項２０】
被験者から得た生物学的試料を分析し、請求項９〜１１何れかに記載のポリヌクレオチド、又は請求項１６に記載のポリペプチドが存在するか否かを決定することを特徴とする薬物感受性の診断方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ポリペプチドを有する被験者が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物に感受性であることを示唆する請求項２０に記載の方法：
【化２】
2005529618.tif 000011
ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、若しくはホルミルアミノ基を示すか、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基、及び置換基を有していてもよいチエニル基からなる群より選択されるいずれか１つによって置換されていてもよい低級アルキルアミノ基を示し、Ｇは五炭糖基、若しくは六炭糖基、又はアミノ基によって置換されていてもよいそれらの誘導体を示す。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｆ）の何れか１以上を含むことを特徴とする薬物感受性の診断キット。
（ａ）請求項９〜１１何れか一項に記載のポリヌクレオチド
（ｂ）請求項１２又は１３に記載のプライマー対
（ｃ）請求項１４又は１５に記載のポリヌクレオチド
（ｄ）請求項１６に記載のポリペプチド
（ｅ）請求項１７に記載の抗体
（ｆ）請求項１８に記載の形質転換細胞
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含んでなるＡＢＣＧ２多型データを解析するためのコンピュータシステム。
（ａ）入出力装置
（ｂ）多型データを含む記憶媒体
（ｃ）中央演算処理装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌化学療法剤等の薬物を細胞から排出するポリペプチド及びこれをコードする遺伝子に関し、より詳しくはＡＢＣＧ２遺伝子の一塩基多型、及び／又はＡＢＣＧ２ポリペプチドのアミノ酸多型を決定することによる哺乳動物細胞の薬物輸送能を予測する方法、並びにその方法に使用するポリヌクレオチド、ポリペプチド及びキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌化学療法剤に対する感受性の予測は、従来の癌化学療法剤による癌治療における課題である。癌細胞の違い及び患者個人の体質の違いによって、化学療法剤の抗腫瘍活性は大きく異なる。化学療法剤は、患者によって高い効果が得られる場合と、耐性を示す場合とがある。また、腫瘍は最初は化学療法剤に良く反応するが、後には様々な薬剤に対しても耐性になる。しかし、従来法では、特定の患者に対し化学療法剤が有効であるかどうかを判断することは非常に困難であった。
【０００３】
このような化学療法剤感受性の主要な原因として、薬剤排出能の違いによる細胞内薬剤濃度の違いがあげられる。これらの癌細胞において化学療法薬剤を細胞外へ排出する輸送体はいずれもＡＢＣ輸送体スーパーファミリー（ATP-binding cassette transporter superfamily)の一員であり、細胞膜に局在しＡＴＰの加水分解を利用して基質を輸送する一群の分子である。
【０００４】
該輸送体の代表例としてＭＤＲ１遺伝子にコードされるＰ−糖タンパク質（以下、「Ｐ−ｇｐ」と称する）及びＭＲＰ1、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３などのＭＲＰサブファミリー遺伝子にコードされる多薬剤耐性関連タンパク質（以下、「ＭＲＰ」と称する）が報告されている。Ｐ−ｇｐは多くの腫瘍タイプの多剤耐性に関係するとして古くから知られた分子ポンプであり、またＭＲＰは最初に肺癌における多剤耐性に関係することから判明し、後に他の癌タイプでも発現することが判明した(Cole, S. P. C. et al., Science 258, 1650-1654 (1992)、及びLeslie E.M. et al., Toxicology 167, 3-23 (2001))輸送体である。
【０００５】
近年、新たなＡＢＣファミリー分子が次々と発見され、Ｐ−ｇｐやＭＲＰの他にも薬剤耐性への関与が示唆される分子ポンプが明らかになりつつある。このような分子の一つとして、ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ／ＭＸＲ／ＡＢＣＰ）と称される分子ポンプがある。これらには胎盤特異的に発現する遺伝子としてＡＢＣＰ(Allikmets, R. et al., Cancer Res. 58, 5337-5339 (1998))、アドリアマイシンで選択した耐性細胞株から取得された遺伝子としてＢＣＲＰ(Doyle, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 15665-15670 (1998))、及びミトキサントロンで選択した耐性細胞株から取得された遺伝子としてＭＸＲ(Miyake, K. et al., Cancer Res.59, 8-13 (1999))が各々ＡＢＣＰ、ＢＣＲＰ及びＭＸＲと命名され報告された。これら３種の遺伝子は各遺伝子間で塩基置換に由来する１ないし４アミノ酸の相違がみとめられる。
【０００６】
ＢＣＲＰとして報告された配列をＭＣＦ−７細胞に導入、発現させた細胞株の解析から、この遺伝子の発現がミトキサントロンやアドリアマイシンに耐性を付与することが示され、新たな多剤耐性因子として注目されている(Doyle, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15665-15670 (1998))(ＷＯ９９／４０１１０)。
【０００７】
このような状況で本出願人は、インドロカルバゾール系化合物の排出ポンプが配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子であることを見いだした(Komatani, H. et al., Cancer Research, 61, 2827-2832 (2001), WO02/28894)。 ＢＣＲＰとして報告された遺伝子は４８２番目のコドンがスレオニンをコードしているのに対し、該配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子は４８２番目のコドンがアルギニンをコードしている新規な塩基配列であった。
【０００８】
配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「インドロカルバゾール系化合物」と総称する。）に選択的な耐性を細胞に付与する遺伝子である：
【０００９】
【化１】
2005529618.tif 000003
ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、若しくはホルミルアミノ基を示すか、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基、及び置換基を有していてもよいチエニル基からなる群より選択されるいずれか１つによって置換されていてもよい低級アルキルアミノ基を示し、Ｇは五炭糖基、若しくは六炭糖基、又はアミノ基によって置換されていてもよいそれらの誘導体を示す。前記化合物は、より具体的には、化合物Ａ（前記一般式（Ｉ）において、Ｘ１は１−ヒドロキシ基、Ｘ２は１１−ヒドロキシ基、Ｒはホルミルアミノ基、Ｇはβ−Ｄ−グルコピラノシル基を示す。）及び化合物Ｂ（前記一般式（Ｉ）において、Ｘ１は２−ヒドロキシ基、Ｘ２は１０−ヒドロキシ基、Ｒは（１−ヒドロキシメチル−２−ヒドロキシ）エチルアミノ基、Ｇはβ−Ｄ−グルコピラノシル基を示す。）である。
【００１０】
例えば、配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子は、すべての化合物Ａ及び化合物Ｂ（Yoshinari, T. et al., Cancer Res. 59, 4271-4275 (1999)）に対する耐性細胞で高発現していることがノーザンブロッティング解析により示されており、かつ、化合物Ａ及び化合物Ｂ等によって代表されるインドロカルバゾール化合物に選択的に、細胞内への化合物蓄積を抑制する(Komatani H. et al., Cancer Res.61, 2827-2832 (2001), ＷＯ０２／２８８９４)。従って、配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子を含むＡＢＣＧ２の活性又は発現に影響を及ぼす遺伝子多型を解析することは、治療に用いる抗癌剤の選択に有用であると考えられる。しかしながら、このような遺伝子多型は、これまで知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
かかる状況下において、個々の患者において化学療法薬剤を細胞外へ排出する輸送体遺伝子の排出能力を診断する方法の開発が望まれている。例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン及びミトキサントロン等のアントラキノン(anthraquinone)骨格を持つ癌化学療法剤は、前記Ｐ−ｇｐ、前記ＭＲＰ又は前記ＢＣＲＰの高発現が検出される場合には、十分に有効であるとは言えない。
【００１２】
インドロカルバゾール系化合物は、前記Ｐ−ｇｐ又は前記ＭＲＰの発現の有無に関わらず有効な抗癌剤であるが、ＡＢＣＧ２が高発現している癌細胞に対しては効果は低い。
【００１３】
しかしながら、ＡＢＣＧ２の活性又は発現に影響を及ぼす遺伝子多型をあらかじめ検出することができれば、癌治療における抗癌剤の選択や、癌治療において併用するＡＢＣＧ２活性阻害剤の選択に有用である。
【００１４】
例えば、広く見いだされる配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子がインドロカルバゾール系化合物に選択的な耐性を細胞に付与する遺伝子であるのに対してその４８２番目のアミノ酸がスレオニンに変異した遺伝子であるＡＢＣＧ２−Ｔｈｒ４８２遺伝子はインドロカルバゾール系化合物に加えてミトキサントロンやアドリアマイシンに対しても耐性を付与するので、これらの両遺伝子の違いを検出する方法は、癌治療における抗癌剤の選択に有用である。
【００１５】
また、例えば、ＡＢＣＧ２の活性を低下させるようなＡＢＣＧ２遺伝子多型をあらかじめ検出することは、癌治療におけるインドロカルバゾール系化合物の最適投与量を見いだすのに有用である。
【００１６】
従って、本発明は、インドロカルバゾール系化合物の細胞内蓄積に関連するＡＢＣＧ２ポリペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドの多型を提供することを課題とする。また、本発明は癌患者由来の被験試料におけるＡＢＣＧ２ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドの多型の有無を、ＡＢＣＧ２ポリペプチドに対する抗体又はＡＢＣＧ２関連遺伝子の多型に特異的な核酸を用いて検出する方法を提供することを課題とする。さらに、本発明はＡＢＣＧ２ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドの多型の有無を検出することにより、インドロカルバゾール系化合物の効果的な使用方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明者らは数多くのヒト癌細胞株及び臨床サンプルから抽出したゲノムＤＮＡを解析してＡＢＣＧ２遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定した。これらのＳＮＰｓは、ＡＢＣＧ２ポリペプチドの特定部位のアミノ酸置換や欠失等の変異を起こすことが分かった。そこで、特定の変異型ＡＢＣＧ２ポリペプチドを発現する細胞株を作製してその薬剤耐性能を調べたところ、変異型ＡＢＣＧ２ポリペプチドの薬物輸送能が野生型ＡＢＣＧ２に比べて著しく低下していることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明はその第一の視点において、哺乳動物から試料を採取し、ＡＢＣＧ２遺伝子における核酸配列の多型、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドにおけるアミノ酸配列の多型を決定することを特徴とする哺乳動物細胞の薬物輸送能を予測する方法を提供する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＡＢＣＧ２遺伝子は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含み、前記核酸配列の多型が、配列番号１の３４番目、３７６番目及び４２１番目からなる群より選択される位置における１以上の一塩基多型である。更に、前記一塩基多型は、Ｇ３４Ａ、Ｃ３７６Ｔ及びＣ４２１Ａからなる群より選択される一塩基多型であることが好ましい。ここで、「Ｇ３４Ａ」とは、３４番目のグアニンがアデニンに置換したことを、「Ｃ３７６Ｔ」とは、３７６番目のシトシンがチミンに置換したことを、及び「Ｃ４２１Ａ」とは、４２１番目のシトシンがアデニンに置換したことを示す。また、前記核酸配列の多型は、ダイレクト・シークエンシング法、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法、質量分析法、ＲＣＡ法、及びＤＮＡチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法を用いて決定することができる。
【００２０】
本発明の他の好ましい実施形態において、前記ＡＢＣＧ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、前記アミノ酸配列の多型が配列番号２の１２番目、１２６番目及び１４１番目からなる群より選択される位置における１以上のアミノ酸の多型である。更に、前記アミノ酸の多型は、Ｖａｌ１２Ｍｅｔ、若しくはＧｌｎ１４１Ｌｙｓのアミノ酸置換、又は１２６番目から下流のアミノ酸配列の欠失であることが好ましい。また、前記アミノ酸配列の多型は、質量分析法、二次元電気泳動法、及びプロテインチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法を用いて決定することができる。
【００２１】
本発明のなお好ましい実施形態において、前記薬物は下記一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、「インドロカルバゾール系化合物」と総称する）である。
【００２２】
【化２】
2005529618.tif 000004
［式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、若しくはホルミルアミノ基を示すか、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基、及び置換基を有していてもよいチエニル基からなる群より選択されるいずれか１つによって置換されていてもよい低級アルキルアミノ基を示し、Ｇは五炭糖基、若しくは六炭糖基、又はアミノ基によって置換されていてもよいそれらの誘導体を示す。］
【００２３】
本発明の第２の視点において、配列番号１の３４番目、３７６番目、及び４２１番目からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型を有するポリヌクレオチドにおいて、前記いずれかの一塩基多型部位を含み、且つ、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、前記一塩基多型は、Ｇ３４Ａ、Ｃ３７６Ｔ、Ｃ４２１Ａ、及びそれらの相補的な一塩基多型からなる群より選択される。
【００２４】
一つの実施形態において、配列番号１のポリヌクレオチドにおける塩基多型配列であって、該塩基多型配列の翻訳アミノ酸の１２番目がメチオニンである塩基多型、１２６番目が停止コドンである塩基多型、及び１４１番目がリジンである塩基多型からなる群より選択される１以上の塩基多型を有し、前記塩基多型部位の中に位置する１以上の塩基を含む、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドが提供される。
【００２５】
本発明の第３の視点において、ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対が提供される。好ましい実施形態において、前記ＰＣＲプライマ−対は、配列番号５と６、配列番号９と１０及び配列番号１１と１２からなる群より選択される何れかのプライマー対である。
【００２６】
本発明の第４の視点において、ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の位置におけるＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出することのできるポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ダイレクト・シークエンシング法、ＴａｑＭａｎ法、インベーダー法、質量分析法、ＲＣＡ法、及びＤＮＡチップ法からなる群より選択される何れか一つの方法において使用することができる。
【００２７】
更に、本発明の第５の視点において、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド、又は（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチド、に多型変異を有する変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドであって、配列番号２の１２番目及び１４１番目の何れか又は両方のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記置換されたアミノ酸を含み前記変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列からなるポリペプチド断片、又は配列番号２の１２６番目から下流のアミノ酸配列が欠失したポリペプチドが提供される。
【００２８】
本発明の第６の視点において、前記第５の視点における変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。
【００２９】
本発明の第７の視点において、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド、又は（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列のＶａｌ１２Ｍｅｔ及びＧｌｎ１４１Ｌｙｓの何れか又は両方のアミノ酸置換を有するＡＢＣＧ２ポリペプチドを発現する形質転換細胞が提供される。
【００３０】
本発明の第８の視点において、前記第７の視点における形質転換細胞を使用する薬物輸送活性測定方法が提供される。
【００３１】
本発明の第９の視点において、被験者から試料を採取し、前記第２の視点におけるポリヌクレオチド、又は前記第５の視点におけるポリペプチドが存在するか否かを決定することを特徴とする薬物感受性の診断方法が提供される。好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを有する被験者は、前記インドロカルバゾール系化合物に感受性であることが示唆される。
【００３２】
本発明の第１０の視点において、前記第２の視点におけるポリヌクレオチド、前記第３の視点におけるプライマー対、前記第４の視点におけるポリヌクレオチド、前記第５の視点におけるポリペプチド、前記第６の視点における抗体、及び前記第７の視点における形質転換細胞の何れか１以上を含むことを特徴とする薬物感受性の診断キットが提供される。
【００３３】
更に、本発明の第１１の視点において、（ａ）入出力装置、（ｂ）多型データを含む記憶媒体、及び（ｃ）中央演算処理装置を含んでなるＡＢＣＧ２多型データを解析するコンピュータシステムが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（定義）
本明細書において、以下の用語は特記しない限り次のように定義される。「ＡＢＣＧ２」とは、ＡＢＣ輸送体スーパーファミリーに属する一つの分子ポンプであって、癌化学療法剤を細胞から排出するポリペプチド又はこれをコードする遺伝子の名称である。遺伝子とはｃＤＮＡ、及びゲノム遺伝子を含む。
【００３５】
「多型」(polymorphism)とは、遺伝子やポリペプチド又はその一部において２以上の型が存在することをいう。少なくとも２つの異なる型、即ち、異なる塩基配列を有する遺伝子断片を「遺伝子の多型部位」という。多型部位は一塩基対の場合も、或は一定の長さの塩基対の場合もある。１個の塩基が他の塩基に置き換わっているものを一塩基多型（ＳＮＰ）といい、ＳＮＰはヒトゲノムにおいては数百塩基対から１０００塩基対に１ヶ所の割合で存在すると推測されている。また、この他に２塩基から数十塩基を１単位とする配列が繰返し存在する部位において、その繰返し回数が個人間で異なるものも存在し、ＶＮＴＲ（variable number of tandem repeats）やマイクロサテライト多型と呼ばれている。ＳＮＰはその存在する位置によって機能が異なり、ポリペプチドの翻訳領域に存在してアミノ酸配列の置換や欠失を引き起こし、遺伝子の機能に影響を与えるものや、プロモーターやイントロン等の発現調節領域に存在して遺伝子発現量に影響を与えるもの、あるいは他の領域に存在して遺伝子発現への影響はほとんど無いもの等がある。
【００３６】
本明細書において、「哺乳動物細胞」とは、哺乳類に属する動物の生体を構成している組織、細胞、又はそれらの細胞を体外培養したものを意味する。また、「試料」とは、生物に由来するポリヌクレオチドを含有する試料であって、種々の組織や細胞から採取される、生きている、若しくは死滅した、又は考古学的な試料をも含む。具体的には体液（血液、尿、唾液等）、皮膚、毛根、粘膜、内臓、胎盤、臍帯血等である。
【００３７】
本明細書において、「薬物」とは生理活性のある生体異物を意味し、癌の治療の目的で用いられる癌化学療法剤を含む。合成化合物、植物若しくは微生物由来の天然化合物、又は前記天然化合物をもとに合成される半合成化合物が含まれる。好ましくは、下記一般式（Ｉ）：
【００３８】
【化３】
2005529618.tif 000005
［ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、アミノ基、若しくはホルミルアミノ基を示すか、又は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基、及び置換基を有していてもよいチエニル基からなる群より選択されるいずれか１つによって置換されていてもよい低級アルキルアミノ基を示し、Ｇは五炭糖基、若しくは六炭糖基、又はアミノ基によって置換されていてもよいそれらの誘導体を示す。］で表される化合物（以下、「インドロカルバゾール系化合物」と総称する。）を意味する。さらに好ましくは該一般式（Ｉ）において、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立に、ハロゲン原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒは水素原子、ホルミルアミノ基、又は低級アルキルアミノ基であって当該低級アルキルアミノ基は１ないし３個のヒドロキシ基、置換基を有していてもよいピリジル基および置換基を有していてもよいチエニル基からなる群から選ばれるいずれか１つによって置換されてもよく、そしてＧはアミノ基によって置換を有されてもよい六炭糖基を示す。］で表される化合物を意味する。上記のインドロカルバゾール系化合物の製造方法等については、先の特許出願・特許（ヨーロッパ特許公開公報  ０５２８０３０Ａ１、米国特許第５５９１８４２号明細書、米国特許第５６６８２７１号明細書、米国特許第５８０４５６４号明細書、ＷＯ９５／３０６８２、ＷＯ９６／０４２９３、ＷＯ９８／０７４３３、特開平１０−２４５３９０）で開示されている。特に化合物Ａ及び化合物Ｂの製造方法については、それぞれ特開平６−１２８２８３及びＷＯ９５／３０６８２で開示されている。
【００３９】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのいずれをもいい、それらは非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡおよびそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定しないが、一般的には約１０塩基以上をいう。一方、「ポリヌクレオチド」よりも比較的短いものを「オリゴヌクレオチド」という場合もあり、「オリゴヌクレオチド」の長さは、一般的には、約５０塩基以下である。
【００４０】
本明細書において「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチド又はオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含む。ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれていてもよい。また、修飾されたアミノ酸を含むことがあり得る。これらの修飾アミノ酸は生体内において、例えば、翻訳後のプロセッシングにおいて、或は、当業者に公知の化学修飾法によって生成される。これらの修飾は、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、又はカルボキシル末端において起こり得、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化等を含む。
【００４１】
（薬物輸送能の予測方法）
本発明の一つの実施形態において、哺乳動物から試料を採取し、ＡＢＣＧ２遺伝子における核酸配列の多型、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドにおけるアミノ酸配列の多型を決定することを特徴とする哺乳動物細胞の薬物輸送能を予測する方法が提供される。ここで、ＡＢＣＧ２遺伝子とは、化合物Ａによって代表されるインドロカルバゾール系化合物への耐性を細胞に付与する遺伝子である配列番号１に示された塩基配列のヒト由来ｃＤＮＡを含む。更に、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ薬物輸送能を有するポリペプチドをコードするヒト由来の同質遺伝子、及び哺乳動物におけるそれらの相同物も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という条件は当業者において周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、２つの核酸断片が、サムブルックら(Sambrook,J.)の「大腸菌におけるクローン遺伝子の発現(Expression of cloned genes in E.coli)」(Molecular Cloning:A laboratory manual:2nd. edition(1989))Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA,9.47-9.62および11.45-11.61に記載されたハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する。
【００４２】
より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシーとしての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシーとしての約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択すること、ができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジェエンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増大させることができる。なお、当業者であれば、ＳＳＣの希釈率、ホルムアミド濃度、温度などの諸条件を適宜選択することで、上記の条件と同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を実現することができる。従って、この同質遺伝子には、従来から公知の種々の変異体遺伝子も含まれる。例えば、アドリアマイシン耐性細胞株から取得されたＢＣＲＰ遺伝子、胎盤特異的に発現するＡＢＣＰ遺伝子、及びミトキサントロンで選択した耐性細胞株から取得されたＭＸＲ遺伝子は、配列番号１のヒトＡＢＣＧ２遺伝子とは数個の塩基配列が異なるが、何れも配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子の同質遺伝子であり、本発明における「ＡＢＣＧ２遺伝子」に含まれるものである。
【００４３】
ＡＢＣＧ２ポリペプチドとは、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド、（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチド、又は（ｃ）哺乳動物における（ａ）又は（ｂ）の相同物である。ここで、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチドとは化合物Ａによって代表されるインドロカルバゾール系化合物に選択的な耐性を細胞に付与するポリペプチドである。同質ポリペプチドとは、ＡＢＣＧ２ポリペプチドの機能である薬物輸送能を有する限り配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加される変異を有してもよいが、機能的に同等なポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数は、通常、全アミノ酸の１０％以内、好ましくは１０アミノ酸以内、さらに好ましくは変異数が３アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）である。
【００４４】
上記ＡＢＣＧ２遺伝子多型及びＡＢＣＧ２ポリペプチドの多型は特定の位置に存在し、これらの多型が特定の母集団において一定の頻度以上存在する場合に遺伝学的に重要な意味をもつこととなる。本発明の好ましい実施形態において、図１に示される具体的なＳＮＰｓが開示される。図１は本発明に係るＳＮＰ部位を表したＡＢＣＧ２ポリペプチドが細胞膜と結合して存在する様式を模式的に表したものである。ＡＢＣＧ２ポリペプチドは、Ｎ末端に細胞膜への局在に必要なリーダーシークエンス、続いてＡＴＰ結合領域（アミノ酸６１−２７０）、薬物輸送に関与する６回膜貫通ドメインを含む。図１には、４ヶ所のＳＮＰ部位を示しており、それらは、配列番号１の３４番目のグアニンがアデニンに（以下「Ｇ３４Ａ」と称する。）、３７６番目のシトシンがチミンに（以下「Ｃ３７６Ｔ」と称する。）、４２１番目のシトシンがアデニンに（以下「Ｃ４２１Ａ」と称する。）、及び４５８番目のシトシンがチミンに（以下「Ｃ４５８Ｔ」と称する。）にそれぞれ置換した変異である。これらのＳＮＰｓに伴なってＡＢＣＧ２ポリペプチドのアミノ酸配列はＮ末端から１２番目のバリンがメチオニンに置換し（以下「Ｖａｌ１２Ｍｅｔ」と称する。）、１２６番目のグルタミンが終止コドンとなり（以下「Ｇｌｎ１２６Ｔｅｒｍ」と称する。）、１４１番目のグルタミンがリジンに置換し（以下「Ｇｌｎ１４１Ｌｙｓ」と称する。）及び１５３番目のスレオニンがメチオニン（以下「Ｔｈｒ１５３Ｍｅｔ」と称する。）にそれぞれ置換している。Ｖａｌ１２Ｍｅｔの変異は、ＡＢＣＧ２ポリペプチドが細胞膜へ局在するために必要なリーダーシークエンス内に存在し、Ｇｌｎ１４１Ｌｙｓ及びＴｈｒ１５３Ｍｅｔの変異は、輸送エネルギーであるＡＴＰの結合に重要なＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）領域内に存在するため、これらの変異がＡＢＣＧ２ポリペプチドの薬物輸送活性に影響を与える可能性が大きい。Ｇｌｎ１２６Ｔｅｒｍの変異は、完全なＡＢＣＧ２ポリペプチドが合成されないため薬物輸送活性を失うことは明らかである。
【００４５】
これらの変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの薬物輸送活性は、組換えＤＮＡ技術により変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドを発現する形質転換細胞を作製して調べることができる。本明細書において以下に詳細に説明するように、これらの形質転換細胞を用いた薬物感受性の測定によって上記Ｖａｌ１２ＭｅｔとＧｌｎ１４１Ｌｙｓの変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの薬物輸送活性が野生型ＡＢＣＧ２に比べて著しく低下していることが分かる。
【００４６】
あるいは、特定の薬物に高い感受性を示す被験者集団と一般集団から得た生物学的試料を分析し、本発明に係る多型性との関連を統計的に分析することによっても、これらの変異が薬物感受性と関連しているか否かを検定することができる。統計的解析は、当業者に公知のプログラム等を用いて行うことができる。
【００４７】
上記核酸配列の多型を決定する方法としては、以下のような種々の公知技術を用いて、（１）少なくとも多型部位を含む対立遺伝子の一部の塩基配列の決定、（２）多型部位に特異的にハイブリダイズするプローブ（アレル特異的プローブ）による検出、（３）多型部位を含む遺伝子断片の分子量の測定等の方法により行うことができる。例えば、ダイレクト・シークエンシング法等によりゲノムＤＮＡから直接ＳＮＰを検出することができる。一方、特定のゲノムＤＮＡ領域を増幅した後、上記（１）〜（３）の検出手段を用いることもできる。ＤＮＡを増幅するための種々の方法は当業者に公知であり、例えば、所望のＤＮＡ断片をクローン化したり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、連結酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増殖方法(ＳＤＡ；Walker G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 392-396 (1992))、転写反応に基づいた増殖方法（ Kwoh D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 1173-1177 (1989))、自己持続複製反応(Guatelli J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1874-1878 (1990))、Ｑ−βレプリカーゼシステム(Lizardi P. et al. Bio/Technology 6, 1197-1202 (1988))、核酸配列に基づいた増殖反応（ＮＡＳＢＡ；Lewis R. Genetic Engineering News 12, 1 (1992))、修復連鎖反応（ＲＣＫ）、ＬＡＭＰ法（WO00/28082）等により行うことができるがこれらに限定されない。
【００４８】
増殖反応産物は、種々の方法によりＳＮＰを決定することができ、例えば、塩基配列の決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等による分子量の測定、及び制限酵素断片長の解析（ＲＦＬＰ）等が含まれる。一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）による検出技術もまた種々のＳＮＰ決定方法の一例であり、非変性条件下でアクリルアミドゲル等に基づいて分離する。ＳＮＰ決定は、好適なキャピラリー電気泳動によって行うこともできる。この技術は、種々のＤＮＡ断片をそれらの立体配置（コンフォメーション）に従って識別し得る(Orita et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (1989), Cotton Mutat. Res. 285, 125-144 (1993), Hayashi Genet. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992))。
【００４９】
ＴａｑＭａｎ法（商標）と呼ばれる方法は、アレル特異的なオリゴヌクレオチドと鋳型とのハイブリダイゼーション、及びＰＣＲ法を同時に行い、蛍光エネルギー移動現象を用いてＳＮＰを検出する方法である（Livak et al., PCR Methods and Applications 4:357-362, 1995、及び米国特許第５５２８８４８号参照）。蛍光色素と消光物質により標識したアレル特異的プローブを標的部位にハイブリダイズさせて、この部位を含む領域を増幅するように設計したプライマーでＰＣＲを行うと、プライマーからの伸長反応が進むと同時にＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断される。蛍光色素が消光物質と離れると蛍光が生じ、また、ＰＣＲ反応により鋳型が増幅するため蛍光強度は指数関数的に増強する。２種類のアレルに特異的なプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば、１回のアッセイでホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００５０】
ＤＮＡの増幅を伴なわない種々の方法が開発されている。例えば、インベーダー法（商標）は２種類のオリゴヌクレオチド（インベーダープローブとアレルプローブ）を用い、これらのプローブが鋳型ＤＮＡと形成する特異的な構造を認識して切断する特殊な酵素反応に基づいており、例えば、米国特許第５８４６７１７号、第５６１４４０２号、第５７１９０２８号、第５５４１３１１号及び第５８４３６６９号等に記載されている。この方法は目的とする塩基配列を２種類の異なるプローブで認識する。第１のプローブは一般的にインベーダープローブと呼ばれ、目的塩基配列の第１の部位に実質的に相補的である。第２のプローブはアレルプローブと呼ばれ、その３’末端側は目的塩基配列の第２の部位と実質的に相補的であるが、５’末端側には鋳型と非相補的で一本鎖を形成するテール又はフラップと呼ばれる配列を含む。これらのプローブが鋳型の隣接する領域にハイブリダイズすると、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入し、この構造がCleavaseにより切断されてフラップが遊離する。遊離したフラップはあらかじめ標識しておくことにより定量することができる。好ましくは、遊離したフラップを定量するために蛍光色素とクエンチャーで標識された第３のＦＲＥＴ(fluorescence resonance energy transfer)プローブ（フラップと相補的な配列、及び自己相補的な配列を含む）を用いることができる。遊離したフラップはＦＲＥＴプローブと結合して特異的な構造を形成し、CleavaseによりＦＲＥＴプローブの蛍光色素部分が切断されて蛍光が発生する。フラップ−ＦＲＥＴプローブを２組用意し、異なる蛍光色素で標識することにより、１回のアッセイで各ホモ接合体とヘテロ接合体とを区別することができる。
【００５１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法は、プライマーの蛍光標識を必要とせず、短時間で大量のサンプルを処理することができる方法である。ＳＮＰ部位に隣接するプライマーを作製し、ＰＣＲ増幅させたサンプルＤＮＡを鋳型として、ｄｄＮＴＰを用いて１塩基分だけプライマー伸長反応を行う。伸長反応生成物の質量分析により、付加したｄｄＮＴＰを識別する。
【００５２】
ＲＣＡ(rolling circle amplification)法は、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼがその上を移動しながら長い相補鎖ＤＮＡを合成していくＤＮＡ増幅手段をＳＮＰタイピングに応用したものである。ＳＮＰ（アレル）の識別をＲＣＡ法による増幅の有無で行う。すなわち、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になりうる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせて連鎖反応を行う。プローブの端を識別したいＳＮＰの部位としておけば、その部位がマッチしていれば連結され環状となってＲＣＡによる増幅が起こるが、ミスマッチであれば連結されず環状とならないためＲＣＡ増幅は起こらない。この２種類の増幅反応を識別することによってＳＮＰを決定することができる(Lizardi, P.M. et al., Nat. Genet. 19, 225 (1998))。
【００５３】
多型部位を含む種々のオリゴヌクレオチドプローブをマイクロアレイ上に配置したＤＮＡチップを用いて、ＰＣＲ増幅させた蛍光標識ｃＤＮＡやｃＲＮＡとハイブリダイゼーションするＤＮＡチップ法は、多くのＳＮＰｓを迅速に検出する手段として有用である。オリゴヌクレオチドを光リソグラフィー技術によりアレイ上で合成して１チップ上に数千から数十万個のプローブを配置させたもの(Affymetrix社製、米国特許第５４２４１８６号、同第５７４４１０１号、及び同第６０４０１３８号等参照)や、あらかじめ調製したｃＤＮＡやオリゴヌクレオチドをピン又はインクジェット方式によりガラス上に固定化する方法等が知られている(米国特許第６０４０１３８号参照)。
【００５４】
また、上記アミノ酸配列の多型を決定する方法としては、種々の方法が公知であり、例えば、二次元電気泳動法やマイクロフルーイディクス法（Vreeland, Wyatt N and Barron, Annelise E, Current Opinion in Biotechnology, Vol 13, Pages 87-94 (2002)）によるプロテオーム解析、質量分析装置を用いたペプチドマッピングとアミノ酸配列分析、プロテインシークエンサーによるアミノ酸配列分析及びプロテインチップ等を用いてポリペプチドとリガンドとの相互作用を検出する方法等が挙げられる。
【００５５】
二次元電気泳動法とは、一般的には、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を行うものであり、１枚のゲルで数千のタンパク質を分離することができる。等電点電気泳動には従来から両性担体(carrier-ampholyte)が用いられていたが、近年、固定化ｐＨ勾配ゲル(immobilixed pH-gradient gel; IPG)ストリップが市販されるようになり、ｐＨドリフトを起こすことなく再現性よく分離できるようになった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、１種類のｐＨの緩衝液を用いる連続緩衝液系と、複数のｐＨの緩衝液を用いる不連続緩衝液系とがある。また、分離するタンパク質の種類によって、低ＢＩＳ濃度ゲル電気泳動、濃度勾配ゲル電気泳動、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどを用いることができる。分離されたタンパク質は一般的にはクーマシーブルーなどの色素により染色して定量することができる。銀染色法はクーマシーブルー染色の２０〜１００倍の感度でタンパク質を同定することができる。あるいは、市販されているSYPRO RubyやSYPRO Orangeなどの蛍光試薬を用いてゲル上で感度よく検出できる（Patton, W.F. Electrophoresis, 21, 1123-1144 (2000)）。また、ＡＢＣＧ２ポリペプチドに対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法により、ＡＢＣＧ２ポリペプチドを特異的に検出することもできる。
【００５６】
質量分析法は、質量（分子量）を正確に測定する技術であるが、近年、タンパク質等の極性の高い（親水性の）高分子を、分解せずにイオン化する方法が実用化され、上述した核酸やタンパク質の分子量を正確に測定できるようになった。このような質量分析方法の一つとしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/mass spectrometry)が知られている。タンパク質試料とシナピン酸(Sinapinic acid: 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid)等のレーザー光を吸収するマトリクスとの混合、乾燥後に強力なパルスレーザー光を照射し、マトリクスからのエネルギー移動によるタンパク質試料のイオン化を行い、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差でイオンの分子量を分析する方法である。ペプチドを質量分析計内部で断片化し、断片の質量解析から構造情報（アミノ酸配列やアミノ酸組成など）を得るためには質量分離部を複数連結したタンデム質量分析法(MS/MS)が利用され、この目的には、エレクトロスプレーイオン化法を用いた三連四重極型やハイブリッド型、あるいはイオントラップ型分析計等も使用される。
【００５７】
プロテインチップ法は基板上に並べたタンパク質やペプチド等と試料との相互作用を包括的にかつ迅速に行おうとする技術であり、基板上にはりつけるものとして、ペプチド、抗体、発現タンパク質等が開発されている。
【００５８】
（ポリヌクレオチド、プライマ−対、及びキット）
本発明の他の実施形態において、上記ＡＢＣＧ２遺伝子多型を含むポリヌクレオチド、上記多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、上記多型を検出するためのポリヌクレオチド及びそのためのキットが提供される。
【００５９】
一つの実施形態において、本形態のポリヌクレオチドは、配列番号１の３４番目、３７６番目、及び４２１番目からなる群より選択される１以上の位置における一塩基多型を有するポリヌクレオチドにおいて、前記いずれかの一塩基多型部位を含み、且つ、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド又はその相補的な配列からなるポリヌクレオチドである。従って、上記３ヶ所の一塩基多型の何れも含まないポリヌクレオチド、即ち上記３ヶ所の塩基配列が配列番号１と同一のポリヌクレオチドは本形態に含まれない。これらの塩基配列は好ましくは３４番目のグアニンがアデニンに、３７６番目のシトシンがチミンに、又は４２１番目のシトシンがアデニンに置換されているものであるが、これら以外においてもＡＢＣＧ２ポリペプチドのＮ末端から１２番目のアミノ酸のコドンがメチオニンへ、１４１番目のコドンがロイシンへ、又は１２６番目のコドンが終止コドンへ変異するような塩基配列の置換であるものを含む。
【００６０】
これらのポリヌクレオチドは、天然物であっても、合成物であっても良い。例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞内で複製して製造することができる。あるいは、試験管内で合成して製造しても良い。合成方法としてはＰＣＲ等によりＤＮＡを増幅することも、化学的に合成することもできる。また、当業者であれば、公知の方法を用いて配列番号１のＡＢＣＧ２遺伝子中に部位特異的に変異を導入し、本形態のポリヌクレオチドを調製することが可能である。当業者に公知の部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）が挙げられる。
【００６１】
これらのポリヌクレオチドは、本発明に係る遺伝子多型を検出するために用いることができる。また、アンチセンスＤＮＡとして発現を抑制するために用いることもできる。
【００６２】
他の一つの実施形態において、ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、前記遺伝子の一部からなるＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲプライマー対であって、増幅されたＤＮＡ断片が、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の塩基を含むことを特徴とするＰＣＲプライマー対が提供される。本形態のプライマー対は、ＡＢＣＧ２遺伝子の上記多型部位の上流及び下流の特定の領域の各鎖と実質的に相補的になるように設計される。これらの各プライマーは、２５〜２５００塩基対離れた領域においてハイブリダイズすることができるが、増幅産物の塩基配列の決定又は分子量の解析を容易にするため、増幅産物の大きさが１００〜５００塩基対であることが好ましい。より好ましくは、増幅産物の大きさは８０〜２００塩基対である。これらのオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好ましくは配列番号５と６、配列番号９と１０、配列番号１１と１２に示したそれぞれ２０〜２２塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。これらのプライマーは増幅されたＤＮＡ断片の検出を容易にするために標識することができる。標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、ストレプトアビジン、アビジン、磁気ビーズ、抗原及び抗体等が用いられる。
【００６３】
さらに別の実施形態において、ＡＢＣＧ２遺伝子と特異的にハイブリダイズし、配列番号１に示す塩基配列の３４番目、３７６番目又は４２１番目の位置におけるＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出することのできるポリヌクレオチドが提供される。検出方法には種々の方法があるが、例えば、インベーダー法による検出を行う場合は、ＳＮＰ部位から鋳型の３’側に相補的に結合するように設計されたインベーダープローブとＳＮＰ部位から鋳型の５’側に相補的な配列を含み、その５’側に鋳型の配列とは無関係な配列（フラップ）を有するアレルプローブとが提供される。ＳＮＰ部位の配列であるインベーダープローブの３’末端は任意の塩基でよい。
【００６４】
ＴａｑＭａｎプローブは、ＳＮＰ部位を含み、鋳型と相補的な約２０塩基程度の長さのポリヌクレオチドである。５’末端はＦＡＭやＶＩＣ等の蛍光色素により、また、３’末端はクエンチャー（消光物質）により標識される。
【００６５】
ＲＣＡ法に用いるパドロックプローブは、両端がゲノム上のＳＮＰ周辺約２０塩基ずつからなり、その２つをバックボーンと呼ばれる特異的な配列が連結する。
【００６６】
好ましくは上記検出は、ゲノムＤＮＡを直接又は、増幅されたＤＮＡ断片を用いて塩基配列を決定することにより行う。塩基配列決定用のシークエンスプライマーとしては、ＳＮＰ部位の上流又は下流の適当な部位と実質的に相補的になるように設計される。これらのシークエンスプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好ましくは、
配列番号３７、３８、４１、４２、４３、４４に示した正方向プライマー（センスプライマー）又は逆方向プライマー（アンチセンスプライマー）を用いることができる。これらのオリゴヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。また、検出を容易にするために標識されたものであっても良い。標識方法としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性微粒子、抗原及び抗体等を用いることができる。
【００６７】
他の実施形態において、哺乳動物の薬物輸送能を予測、検出するためのキットが提供される。このキットには、上記ＡＢＣＧ２多型を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対、及び上記多型を検出するためのポリヌクレオチドの何れか又は両方が含まれる。被験試料からまず目的ＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを用いて遺伝子多型を決定することができる。一方、ＤＮＡの増幅反応を行わずに、ゲノムＤＮＡから直接多型を決定することも可能である。このような方法としてはインベーダー法等が挙げられる。キットには、任意に選択されるものとして、ＤＮＡの抽出試薬、精製試薬、ＰＣＲのための試薬、例えば１０倍濃縮緩衝液や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）等を含むことができる。
【００６８】
（ポリペプチド）
本発明の更に他の実施形態において、ＡＢＣＧ２ポリペプチド又はその同質ポリペプチドに本発明に係る多型変異を有するポリペプチドが提供される。ＡＢＣＧ２ポリペプチドとは配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、その同質ポリペプチドとはＡＢＣＧ２ポリペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有するポリペプチドである。従来から公知のＢＣＲＰ、ＡＢＣＰ、ＭＸＲと呼ばれている変異体ポリペプチドも含まれる。本形態の多型変異とは、配列番号２の１２番目及び１４１番目の何れか又は両方のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、又は配列番号２の１２６番目から下流のアミノ酸配列の欠失である。上記アミノ酸置換は配列番号２に示したアミノ酸残基以外であれば何でも良いが、好ましくは配列番号２の１２番目及び１４１番目のアミノ酸はそれぞれメチオニン及びリジンに置換される。
【００６９】
また、本形態においては、配列番号２の１２番目及び１４１番目の何れか又は両方のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換された前記ＡＢＣＧ２ポリペプチド又はその同質ポリペプチドのポリペプチド断片を含む。ポリペプチド断片は少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列からなり、好ましくは２０個以上の連続するアミノ酸配列であり、より好ましくは３０個以上のアミノ酸配列の長さを有する。これらのポリペプチド又はその断片は、上記多型変異を有するポリペプチドに対する抗体を作製するために有用である。
【００７０】
これらの多型変異を有するポリペプチドは、化学合成法により製造することができる他、天然のポリペプチド、又は遺伝子組み換え技術を利用した組換えポリペプチドとして調製したものをも含む。天然のポリペプチドは、例えば、本形態のヒト変異型ＡＢＣＧ２ポリペプチドが発現していると考えられる胎盤など組織から抽出、精製したものであっても良い。一方、組換えポリペプチドは、後述するように本形態のヒト変異型ＡＢＣＧ２ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００７１】
発現され、又は単離されたポリペプチド又はその断片は公知の方法により検出することができ、例えば、クーマシーブルー染色、銀染色、多型変異を有するポリペプチドに特異的な抗体を使ったウエスタンブロッティング法等により検出できる。さらにこれらのポリペプチドは従来から公知の方法によって精製することができる。これらの方法は、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー又は免疫クロマトグラフィー等を含む。
【００７２】
（抗体）
また、本発明の一つの実施形態において、本発明に係る多型性を有する変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。本形態の抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ポリクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの免疫動物に適量の本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、以下の如く行う。本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドもしくはその部分ペプチドを、上記と同様に免疫動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドのアフィニティー精製のために用いられる他、本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの発現量の検出などに利用することが可能である。また、該抗体により哺乳動物細胞での該本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの発現量を検出し、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に対する感受性を有する哺乳動物細胞を検出することができる。また、この抗体による癌細胞や癌患者における本発明の変異体ＡＢＣＧ２ポリペプチドの検出は、薬物感受性という患者の体質を検査して最適な薬物を投与する薬理遺伝学的な治療にも利用することが可能である。
【００７３】
（形質転換細胞及び該形質転換細胞を使用する薬物輸送活性測定方法）
また、本発明は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるヒトＡＢＣＧ２ポリペプチド、又は（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１２番目、１２６番目及び１４１番目を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ薬物輸送能を有する（ａ）の同質ポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列のＶａｌ１２Ｍｅｔ及びＧｌｎ１４１Ｌｙｓの何れか又は両方のアミノ酸置換を有するＡＢＣＧ２ポリペプチドを発現する形質転換細胞に関する。「形質転換細胞」とは組換えベクターにより宿主細胞に外来ＤＮＡが組み込まれた細胞であり、宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であっても良く、例えば細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞など本発明の目的で使用できるならいずれの細胞であっても良い。具体的には次のような方法で組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得ることができる。大腸菌の形質転換は、Ｈａｎａｈａｎ法（Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983)）、電気穿孔法（Dower, W. J. et la., Nucl., Acid Res. 16, 6127-6145 (1988)）などで行う。酵母の形質転換は、例えば、スフェロプラスト法（Beach, D. and Nurse, P., Nature 290, 140 (1981)）、酢酸リチウム法（Okazaki, K. et al., Nucleic Acids Res. 18., 6485-6489 (1990)）などにより行われる。昆虫細胞の形質転換は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology 6, 47-55 (1980)）などに記載の方法に従って行うことができる。哺乳動物細胞への組換えＤＮＡの導入は、リン酸カルシウム法（Graham, F. L. and van derEb, A. J., Virology 52, 456-467 (1973)）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Sussman, D. J. and Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, 1641-1643 (1984)）、リポフェクション法（Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1987)）、電気穿孔法（Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841-845 (1982)）などで行われる。このようにして作製された形質転換細胞は、薬物輸送活性測定方法又は薬物排出機構の解析や薬物輸送能を調節する化合物のスクリーニング等に使用することができる。
【００７４】
（診断方法及び診断キット）
本発明の異なる実施形態において、本発明に係る多型性を検出することにより被験者における薬物感受性を診断する方法、又はそのためのキットが提供される。薬物には癌化学療法剤が含まれ、これらについての感受性を診断することは、臨床上有用である。例えば、特定の癌患者に化学療法剤を投与した場合、患者の応答性はさまざまで、著効を示すもの、有効性の低いもの、全く効果を示さないもののように大きな違いがある。これは、患者によって遺伝的な背景が異なるため該化学療法剤を癌細胞から排出する活性が大きく異なっている可能性があるからである。従って、本形態の診断方法は、どの種類の化学療法剤又は化学療法剤群を投与するかという決定、及び／又は化学療法剤又は化学療法剤群の有効量を決定するために極めて有用である。好ましい実施形態において、本明細書の表３に示した多型を有する被験者は、上記一般式（Ｉ）で表されるインドロカルバゾール系化合物に感受性であることが示唆される。従って、上記化合物が有効な癌患者に、有効な量の該化合物による治療を施すことができ、治療効果の著しい向上と共に副作用の大幅な低減が期待される。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチド、プライマー対、ポリペプチド、抗体及び形質転換細胞のいずれか１以上を含んでなる薬物感受性の診断キットが提供される。この診断キットは、構成試薬を安定に保管するための適当な包装及び、本発明に係る方法を説明するための添付文書を含むことができる。さらに、適当な緩衝液、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、例えば耐熱性ポリメラーゼや検出用の蛍光物質を含むことができる。
【００７６】
（コンピュータシステム）
本発明の別の実施形態において、ＡＢＣＧ２遺伝子の少なくとも一つのＳＮＰ、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドに関する少なくとも１つの多型変異体ポリペプチド配列を保存し、及びこれらを表示するためのコンピュータシステムが提供される。このコンピュータシステムは、入出力装置、中央演算装置及び上記多型配列データを保存した読み取り可能な記憶媒体を含む。前記多型配列データは、被験集団におけるＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列、遺伝子型、ハプロタイプ、又はＡＢＣＧ２ポリペプチドのアミノ酸配列、二次元電気泳動によるスポット、質量分析データ等を含む。これらのデータは種々のプログラムによって処理され、遺伝子型決定、連鎖不平衡解析などに使用することができる。好ましい実施形態において、これらの解析結果は、哺乳動物細胞の薬物感受性の予測に用いることができる。
【実施例】
【００７７】
以下に本発明の実施例として、ヒトゲノムＤＮＡを用いてＡＢＣＧ２遺伝子の一塩基多型を同定し、次いで変異型ＡＢＣＧ２を発現する細胞株を作製してその機能解析を行った結果について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
[実施例１]ヒトＡＢＣＧ２遺伝子におけるＳＮＰの同定
まず本発明者等は、ヒト由来の３０種の癌細胞株と１４９人分のヒト臨床サンプル（白人）からゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＢＣＧ２遺伝子をシークエンスすることによりＳＮＰを同定した。
【００７９】
３０種の癌細胞株は、A-427、DLD-1、NCI-H69、HelaS3、PC-13、MKN-45、UM-UC-3、HCT116、PA-1、RT4、MKN1、SK-OV-3、MADH、KATOIII、U118、HS746、T24、MSTO-211H、OVCR3、Lu135、Lx-1、SCC25、Cal27、MKN-74、SCaBER、BxPC-3、Hela、J82、NCI-H 187、及びES-2である。これらの細胞株からTrizol reagent (GIBCO BRL社製)を用いてＤＮＡを抽出した。ヒト臨床サンプルはIMPATH-BCP Co.から購入した。ＡＢＣＧ２遺伝子の１６個のエクソンとその周辺のイントロンの塩基配列をダイレクト・シークエンシング法により決定した。まず最初に、表１に示したそれぞれのプライマー対を用いてＰＣＲ法(LA Taq Takara)によりゲノムＤＮＡから１６個のエクソンを増幅した。次に、増幅したＤＮＡ断片をExoSAP-IT(ＵＳＢ社)で処理して残存するプライマーを消化し、不必要なｄＮＴＰｓを除去した。そして、このＤＮＡ断片と表２に示したセンスプライマーを用いて、ダイ・ターミネーター法(Dynamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit  アマシャム社製)でサイクルシークエンシングを行った。Ｇ−５０ゲルろ過カラムによりダイ・ターミネーターを除去した後、MegaBACE1000キャピラリー・シークエンサー（Molecular Dynamic社）を用いて塩基配列及びＳＮＰｓを決定した。同定されたＳＮＰｓは、表２に示したアンチセンスプライマーを用いて塩基配列を決定し再確認した。
【００８０】
【表１】
2005529618.tif 000006
【００８１】
【表２】
2005529618.tif 000007
【００８２】
上記塩基配列の決定に基づいて、ヒト由来の３０種の癌細胞株と１４９人分のヒト臨床サンプル（白人）中に同定されたＳＮＰｓの結果を表３にまとめた。表３において、ドメイン欄に記載したＡＢＣはＡＴＰ結合カセット(ATP binding cassette)を、ＥＣは細胞外領域(extra cellular region)を、ＴＭは膜貫通領域(trans membrane)を、及びＵＴＲは非翻訳領域(untranslated region)を表す。例えば、翻訳開始コドンの最初のアデニンを１番目として数えて変異部位を示すと、Ｇ３４Ａは、３０種の癌細胞株の中で５株（１６．７％）に認められ、１４９人のヒト臨床サンプルの中では２９人（１９．５％）に認められた。また、イントロン３の５’側から数えて１０番目のアデニンがグアニンに置換した変異は、「Ａ＋１０Ｇ」と表し、イントロン１３の３’側から数えて２１番目のシトシンがチミンに置換した変異は「Ｃ−２１Ｔ」と表した。表３の中のいくつかのＳＮＰｓの位置をＡＢＣＧ２ポリペプチドの模式的な構造と共に図１に示した。これらのＳＮＰｓの内、Ｇ３４Ａは、ＡＢＣＧ２ポリペプチドの細胞膜への局在に重要なリーダーシクエンス内に存在し、また、Ｃ４２１Ａは輸送エネルギーであるＡＴＰの結合に重要なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）領域内に存在する変異であった。従って、これらの変異はＡＢＣＧ２ポリペプチドの活性に影響を与える可能性が高い。また、Ｃ３７６ＴはＡＢＣ領域内に存在する終止コドンへの変異であり、ＡＢＣＧ２が活性を失うことは明らかな変異である。なお、表３において、Ｃ４９６Ｇ、Ｔ６２３Ｃ、Ａ１４４４Ｇ、及びＧ１４４５Ｃの各ＳＮＰは、それぞれNCBI SNP CLUSTER ID: rs1061017、NCBI SNP CLUSTER ID: rs1061018、Cancer Res. 59, 8-13, 1999、及びProc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15665-15670, 1998に報告されているが、上記細胞株及びヒト由来のサンプル中には検出されなかった。
【００８３】
【表３】
2005529618.tif 000008
【００８４】
[実施例２]変異型ＡＢＣＧ２を発現する細胞株の作製
実施例１で同定された多型性変異体のうち、ＡＢＣＧ２ポリペプチドの機能が影響を受ける可能性が高い２つの変異体Ｇ３４Ａ及びＣ４２１Ａを作製し、動物細胞へ導入することでその機能解析を試みた。変異型ＡＢＣＧ２遺伝子の作製は、ＰＣＲ法を用いて点突然変異を導入した。目的の変異が導入されたことを塩基配列の決定によって確認した後、遺伝子発現ベクターpcDNA3.1(+)へクローン化して各変異体の発現プラスミドを作製した。対照として、野生型（ＷＴ）のＡＢＣＧ２を発現するプラスミド、ＡＢＣＧ２遺伝子を含まないベクターのみのプラスミドpcDNA3.1(+)を用い、これら４種類の発現プラスミドを動物細胞（ブタ腎臓細胞株）ＬＬＣ−ＰＫ１へ、リポフェクション法(Lipofectamine; GIBCO BRL社)により遺伝子導入した。1500μg/ml（マイクログラム/ミリリットル） のGeneticin(GIBCO BRL)を含む培地で２週間培養して安定な形質転換株を選択し、細胞株を樹立した。各細胞株のＡＢＣＧ２の発現量を調べるために、各形質転換細胞及びHela細胞からTrizol(GIBCO BRL)を用いて全ＲＮＡを抽出した。各細胞クローンから抽出した７ｍｇの全ＲＮＡと、３２Ｐで標識したＡＢＣＧ２完全長ｃＤＮＡ（２．２ｋｂ）プローブを用いてノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。ＡＢＣＧ２の発現量の違いによる影響をなくすためにＡＢＣＧ２ｍＲＮＡの発現量が同等なクローンを選択し、その結果を図２に示した。図２においてレーン２〜４の形質転換細胞は、それぞれ同程度のＡＢＣＧ２ｍＲＮＡを発現していることが分かる。なお、各細胞で発現するｍＲＮＡの内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。レーン５はベクターのみによって形質転換された対照クローンでありＡＢＣＧ２ｍＲＮＡが発現していないことが分かる。
【００８５】
[実施例３]化合物Ｂに対する耐性度の評価
実施例２で選択したＡＢＣＧ２ｍＲＮＡの発現量がほぼ同等な形質転換細胞を、１ｍＭのＬ−グルタミン、50 units/mlのペニシリン、50 mg/mlのストレプトマイシン、及び１０容量％の牛胎児血清を添加した１９９培地で培養した。全ての培養は、５％炭酸ガスを含む湿潤化空気内で３７℃にて保温して行った。抗癌剤に対する細胞毒性は、スルホローダミンＢ染色法を用いて比較した。即ち、種々の濃度の化合物Ｂ又はカンプトテシンを添加した培養液で４種類の形質転換細胞クローンを７２時間、３７℃で培養後、トリクロロ酢酸で固定化し、１％酢酸溶液に溶かした０．４％スルホローダミンＢで染色した。結合しなかった色素を１％酢酸溶液で４回洗浄して除去した後、ポリペプチドに結合した色素を緩衝作用のない１０ｍＭトリス塩基で抽出した。抽出液の５６４ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定し、ＩＣ５０を決定した。その結果を表４に示す。野生型ＡＢＣＧ２を発現する細胞株（１−５８）はベクターだけを遺伝子導入した細胞株（Ｃ４）と比較して４００倍以上化合物Ｂへの耐性度が増加していた。それに対し、ＡＢＣＧ２のリーダーシークエンス内にＶａｌ１２Ｍｅｔの変異を有する細胞株（２−５１）、及びＡＢＣ領域内にＧｌｎ１４１Ｌｙｓの変異を有する細胞株（３−２８）の化合物Ｂへの耐性度は、Ｃ４よりそれぞれ７．７倍、４８．２倍増加したが、野生型と比較すると１／１０程度若しくはそれ以下であった。ＡＢＣＧ２の基質にはならないカンプトテシンに対しては各細胞間で耐性度に有意な差は無かった。これらの結果より、２種類の変異体ＡＢＣＧ２（Ｖａｌ１２Ｍｅｔ及びＧｌｎ１４１Ｌｙｓ）は野生型ＡＢＣＧ２に比べて明らかにトポイソメラーゼ阻害剤である化合物Ｂの細胞外への排出能力が低下していることが示唆される。
【００８６】
【表４】
2005529618.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の方法を使用することにより、哺乳動物細胞の薬物輸送能を予測することができ、これによって、抗癌剤等の種々の薬物に対する患者の感受性を診断して治療方法の指針とすることができる。すなわち、癌治療における抗癌剤の選択、特にインドロカルバゾール系化合物に感受性の高い癌細胞を検出することにより、該化合物の選択的な治療応用が可能となる。更に、癌治療におけるインドロカルバゾール系化合物の最適投与量を見出すと共に、該化合物の副作用を軽減することによって、インドロカルバゾール系化合物の極めて有効な使用方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に係る一塩基多型の位置を示したＡＢＣＧ２ポリペプチドの模式図である。
【図２】種々の形質転換細胞においてＡＢＣＧ２ｍＲＮＡの量を調べたノーザンブロット解析の結果である。
【図１】
2005529618.tif 000012
【図２】
2005529618.tif 000013
【配列表】
2005529618000001.app
【国際調査報告】
2005529618.tif 000014
2005529618.tif 000015
2005529618.tif 000016
2005529618.tif 000017
2005529618.tif 000018