(57)【要約】  適切なコア領域と結合した結合ペプチドを創製するための手段と方法、それにより生成したタンパク様分子ならびにその用途が提供される。本発明は、結合分子の用途に関係する問題解決をその用途の全範囲にわたって提供する。異常温度またはｐＨのような、異常な使用条件に適応するために、結合分子を設計することができる。また、環境のきわめて微細な変化に応答する結合分子を設計することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合ペプチドおよびコアを含む合成または組み換えタンパク様分子であって、該コアは少なくとも４つのストランドを含むｂ−バレルを含み、該ｂ−バレルは少なくとも２つのｂ−シートを含み、該ｂ−シートのそれぞれが該ストランドの２つを含み、該結合ペプチドは、該ｂ−バレル中の２つのストランドを連結するペプチドであり、そして該結合ペプチドは、その天然コンテクストの外側にあることを特徴とする、タンパク様分子。
【請求項２】
上記ｂ−バレルが少なくとも５ストランドを含み、少なくとも上記シートが上記ストランドの３つを含むことを特徴とする、請求項１記載のタンパク様分子。
【請求項３】
上記ｂ−バレルが少なくとも６ストランドを含み、上記シートの少なくとも２つが上記ストランドの３つを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク様分子。
【請求項４】
上記ｂ−バレルが少なくとも７ストランドを含み、上記シートの少なくとも１つが上記ストランドの４つを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項５】
上記ｂ−バレルが少なくとも８ストランドを含み、上記シートの少なくとも１つが上記ストランドの４つを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項６】
上記ｂ−バレルが少なくとも９ストランドを含み、上記シートの少なくとも１つが上記ストランドの４つを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項７】
上記結合分子が、上記バレル上の開口側で上記バレルの２ストランドを連結し、上記シートの少なくとも１つが上記ストランドの４つを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項８】
上記結合分子が、上記バレルの上記の少なくとも２つのｂ−シートを連結することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項９】
少なくとも１つのさらなる結合ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項１０】
３つの結合ペプチドおよび３つの連結ペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項１１】
少なくとも４つの結合ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項１２】
少なくとも１つの結合ペプチドが、少なくとも１つの他の結合ペプチド以外のもう１つの標的分子を認識することを特徴とする、請求項１１記載のタンパク様分子。
【請求項１３】
改変された結合特性を有するタンパク様分子を同定する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のタンパク様分子のコアに改変を導入し、該タンパク様分子から改変された結合特性を有するタンパク様分子を選択することを含むことを特徴とする、タンパク様分子を同定する方法。
【請求項１４】
改変された構造特性を有するタンパク様分子を同定する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１つに記載のタンパク様分子のコアに改変を導入し、そして該タンパク様分子から改変された結合特性を有するタンパク様分子を選択することを含むことを特徴とする、タンパク様分子を同定する方法。
【請求項１５】
上記改変が翻訳後修飾を含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記改変が上記の少なくとも１つのタンパク様分子をコードしている核酸中に導入され、上記のタンパク様分子を産生することのできる発現システム中で該核酸を発現することをさらに含むことを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の方法で得ることのできるタンパク様分子。
【請求項１８】
免疫グロブリンスーパーファミリーから誘導されることを特徴とする、請求項１〜１２または１７のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項１９】
タンパク様分子の外形が、その誘導元となった免疫グロブリンスーパーファミリー分子に免疫学的に類似していることを特徴とする請求項１８に記載のタンパク様分子。
【請求項２０】
請求項１〜１２、１７〜１９のいずれか１つに記載のタンパク様分子を含む細胞。
【請求項２１】
少なくとも１つの所望のペプチド配列を提示することのできるタンパク様分子をコード化している核酸を産生するための方法であって、該所望のペプチド配列またはかかる配列が挿入され得る領域によって少なくとも第１および第２の構造領域が分離された少なくとも第１および第２の構造領域をコード化している核酸配列を提供すること、および、少なくとも1つの所望のペプチド配列を提示する能力のある該タンパク様分子をコード化している所望の核酸を得るために、該第１および第２構造領域をコード化している該核酸を変異させることを含むことを特徴とする、核酸を産生するための方法。
【請求項２２】
所望のペプチド配列を提示するための方法であって、ｂ−バレルを形成しているｂ−シートの少なくとも２つのｂーシートをコード化し、該所望のペプチド配列をコード化している配列を挿入するための領域を含んでいる核酸を提供し、所望のペプチド配列を含む核酸を挿入し、そして、該核酸を発現させ、該ｂ−シートが請求項２１記載の方法によって取得可能であることを特徴とする、所望のペプチド配列を提示するための方法。
【請求項２３】
人工結合ペプチドを含むライブラリを産生する方法であって、種々の特異的結合ペプチドをコード化する少なくとも１つの核酸鋳型を提供し、該鋳型の核酸誘導体の変異によって該鋳型の核酸誘導体の収集物を産生し、そして、該収集物またはその一部を人工結合ペプチドを含む該ライブラリを産生するためにペプチド合成システムに提供することを含むことを特徴とする、ライブラリを産生する方法。 
【請求項２４】
少なくとも２つの核酸鋳型を提供することを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１０の核酸鋳型を提供することを含むことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記変異が、上記鋳型の変異を起こし易い核酸増幅で導入されることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
上記増幅が非縮重プライマーを使用することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの非縮重プライマーが、さらに縮重領域を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記核酸増幅が、ｄＩＴＰ，ｄＰＴＰの存在下の少なくとも１つの延長工程を含むことを特徴とする、請求項２６〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの鋳型が少なくとも１４アミノ酸を含む親和性領域を有する特異的結合ペプチドをコード化することを特徴とする、請求項２３〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
上記親和性領域が少なくとも１６アミノ酸を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記親和性領域が２４アミノ酸の平均長を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記親和性領域が少なくとも１４の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
上記鋳型の少なくとも１つが請求項１〜１２、１７〜１９のいずれか１つに記載のタンパク様分子をコード化することを特徴とする、請求項２３〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
人工ペプチドの上記ライブラリ中のペプチドのための潜在的な結合相手を提供し、該結合相手に特異的に結合することのできるペプチドを該ライブラリから選択することを特徴とする、請求項２３〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
上記ライブラリがファージディスプレイライブラリとして提供されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５もしくは３６に記載の方法によって得られる請求項１〜１２、１７〜１９のいずれか１つに記載のタンパク様分子、または、表２、３、１０、１３もしくは１６に記載のタンパク様分子。
【請求項３８】
混合物から物質を分離するための、請求項１〜１２または１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子の使用方法。
【請求項３９】
上記混合物が、生物学的液体であることを特徴とする、請求項３８に記載の使用方法。
【請求項４０】
上記生物学的液体が、生物の分泌産物であることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記分泌産物が、ミルクまたはミルクの誘導体であることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記混合物が、血液またはその誘導体であることを特徴とする、請求項３９に記載の使用方法。
【請求項４３】
医薬として使用するための、請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項４４】
望ましくない蛋白質、細胞または微生物が関与する病状の処置のための薬学的製剤の調製に、請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子を使用する方法。
【請求項４５】
診断薬の調製に請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子を使用する方法。
【請求項４６】
請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子と目的の遺伝子とを含む遺伝子輸送担体。
【請求項４７】
請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子をコード化する核酸と目的の遺伝子をコード化する核酸配列とを含む遺伝子輸送担体。
【請求項４８】
目的のモイエティにコンジュゲートされた、請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子。
【請求項４９】
目的のモイエティが、毒性モイエティであることを特徴とする、請求項４８に記載のタンパク様分子。
【請求項５０】
請求項１〜１２、１７〜１９または３７のいずれか１つに記載のタンパク様分子と充填材料とを含むクロマトグラフィーカラム。
【請求項５１】
請求項２１に記載の方法で得られる核酸。
【請求項５２】
請求項５１に記載の種々の核酸の収集物を含む核酸ライブラリ。
【請求項５３】
種々の親和性領域をコード化する核酸の収集物をさらに含むことを特徴とする、請求項５２に記載の核酸ライブラリ。
【請求項５４】
発現ライブラリであることを特徴とする、請求項５２または５３に記載のライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、それが結合特性または他の特性であろうと、改良された特性を有する結合分子を提供する方法および手段ならびに、新規な結合分子そのものに関する。さらに、本発明は、これら分子をそれらの全ての多機能性に応用する方法に関する。
【０００２】
近年の生物工学において、最も目覚しいものの1つでありかつ多くの場合に証明された応用は、全ての種類の物質および／または標的のためのタンパク様分子の親和性に依存している。タンパク様の結合分子は、混合物からの物質の精製、広範な物質に関する診断分析ならびに医薬品の調製などに応用されてきた。通常、免疫グロブリン（または他の多数の免疫グロブリンスーパーファミリー）、受容体および酵素のような天然に生成するタンパク様分子が使用されてきた。また、このような分子から誘導されるペプチドもまた使用されてきた。現存する（修飾された）天然分子を使用するには、もちろん、これら分子が進化によって授かった特性に限界がある。これが、これら分子がそれらの用途が予想され得る全ての分野に応用されなかった理由の１つである。また、進化は、常に天然由来の結合分子の種々の機能間の妥協に帰着するので、これらの分子は、それらの予想される用途に最適化されなかった。通常、技術は、現存する(修飾された)結合分子の結合特性を変える方向に進展した。(一本鎖)抗体のファージディスプレイのような技術でほとんどのどんな結合特異性をも得ることができる。しかしながら、結合領域は全て同じコンテクスト(context)内にある。したがってその結合領域とそのコンテクストの組み合わせはしばしばまだ最適ではなく、タンパク様結合分子の用途がその技術では制限されている。
【０００３】
本発明は、所望の親和性領域を提示するための多機能性コンテクストを提供する。本発明は、多数の結合蛋白質に生じるとここで確認された（コア構造と呼ばれる）共通の構造エレメントに基づき設計される構造コンテクストを提供する。このいわゆる共通コアが、１種またはそれ以上の所望の親和性領域が付与され得る新規なタンパク様分子として産生された。このタンパク様構造はいかなるアミノ酸配列にも依存せず、共通の構造エレメントにのみ依存する。それは、意図する応用のために種々のアミノ酸配列および／または配列中のアミノ酸残基を提供することによって適応することができる。それは、表示される特異な親和性領域の要求に適応することができる。したがって、本発明は、所望の目的のために最適なタンパク様結合分子を得るために結合される構造コンテクストおよび親和性領域のライブラリをも提供する。
【０００４】
したがって、本発明は、結合ペプチドおよびコアを含む合成または組み換えタンパク様分子を提供するものであり、該コアは少なくとも５つのストランドを含むβ−バレルを含み、該β−バレルは少なくとも２つのβ−シートを含み、該β−シートの少なくとも１つは該ストランドの３つを含み、該結合ペプチドは、該β−バレル中の２つのストランドを結合するペプチドであり、そして該結合ペプチドは、その天然コンテクストの外側にあることを特徴とする。我々は、ガラクトシダーゼからヒト（およびたとえば、ラクダ）抗体までとその中間も含め全ての種類の分子の範囲までの多数の蛋白質中のこのコア構造を同定した。所望のペプチド配列を提示するために、自然界は明らかにこの構造エレメントを設計した。我々は、このコアを、単離された形で、ならびに、同一または類似の構造エレメントをまだ保有する多数のその変異形態で産生させた。この新規構造は、他の結合分子が使用される全ての応用に、およびここで説明されるようにそれらの応用を超えてさえも使用することができる。１つの親和性領域（所望のペプチド配列）および１つのバレルを形成している２つのβ−シートを含む構造は、発明されたタンパク様結合分子の最も基本的な形である。(タンパク様とは、それらは本質的にアミノ酸配列であるが、しかし側鎖および／または全ての種類の基が存在できることを意味する。もちろん、アミノ酸配列は構造に少しか関連していないので、空間で同じ配向を有しペプチド的な親和性領域を提示することのできる非タンパク様の他の分子を設計することは可能である。空間の配向は重要なパラメータである。本発明はまた、所望の目的に従い安定性の低いアミノ酸がもっと安定な残基（またはその反対）で置換された、最適化されたコア構造をも開示する。
【０００５】
再度述べるが、重要なパラメータは空間における分子の配向であるから、他の置換または完全に現状の構造に関連していないアミノ酸配列でさえも含まれている。結合特性と構造特性の両者はより好ましくかつ高い期待値をもつよう設計できるので、本発明に従い、基本構造よりももっと進歩したコア構造を利用するのが好ましい。
【０００６】
したがって、本発明は、好ましくは、上記β−バレルが少なくとも５ストランドを含み、少なくとも上記シートが該ストランドの３つを含むことを特徴とする、本発明のタンパク様分子を供するものであり、さらに好ましくは、該β−バレルが少なくとも６ストランドを含み、該シートの少なくとも２つが該ストランドの３つを含むことを特徴とする、本発明のタンパク様分子を提供する。上記シートの各々が少なくとも３ストランドを含んでいるβ−シートは、充分安定であり、一方、同時にコア／親和性領域(結合ペプチド)を特殊な目的に適用させる充分な変異可能性を提供する。そうは言うものの、１シート当りに少ないストランドを含むコアについて好適な特徴もまた見出すことができる。
【０００７】
したがって、１シートがわずかに２ストランドを含むことを特徴とする変異体は本発明の範囲内である。もう１つの実施形態で、本発明は、上記のβーバレルが少なくとも７ストランドを含み、上記シートの少なくとも１つが該ストランドの４つを含むことを特徴とする、本発明のタンパク様分子を提供する。あるいはまた、本発明は上記β−バレルが少なくとも８ストランドを含み、上記の少なくとも１つのシートが該ストランドの４つを含むことを特徴とする、本発明のタンパク様分子を提供する。もう１つの実施形態では、上記β−バレルが少なくとも９ストランドを含み、上記シートの少なくとも１つが該ストランドの４つを含むことを特徴とする、本発明のタンパク様分子が提供される。コア構造には、天然物が親和性領域を提示する比較的に開口した側面がありそして結合している配列が存在する比較的閉ざされた側面がある。好ましくは、少なくとも１つの親和性領域は、上記の比較的に開口した側面に位置する。
【０００８】
したがって、本発明は、上記結合ペプチドが、上記バレルの開口側面上の上記β−バレルの２つのストランドに連結することを特徴とする本発明のタンパク様分子を提供する。所望のペプチド配列の位置（親和性領域）は、２つのストランドのどこにでも位置することができるが、所望のペプチド配列は、バレルの２つのシートを連結することが好ましい。したがって、本発明は、上記結合ペプチドが上記バレルの少なくとも２つのβ−シートを連結することを特徴とする、本発明のタンパク様分子を提供する。1つの親和性領域でも充分であるが、より良い結合分子となるためにより多くの親和性領域が存在することが好ましい。好ましくは、これらの領域は、それらが結合に（たとえば、バレルの開口側の両側上で）協調できるように配置されている。したがって、本発明は少なくともさらにもう1つの結合ペプチドを含む本発明のタンパク様分子を提供する。全く成功したコアエレメントは、３つの親和性領域および３つの領域を有するものである。この単離された形でのコアは、本発明の好ましい実施形態である。しかしながら、本発明で発明された結合分子の多用途性ゆえに、バレルの比較的少ない開口側上の連結配列も親和性領域として使用され得る。このようにして、非常に小さい２特異性結合分子が得られる。したがって、本発明は、すくなくとも４つの結合ペプチドを含む本発明のタンパク様分子を提供する。ここで、２特異性とは、結合分子が（同一または異なる）２つの標的分子に結合する可能性を有するということを意味する。コア中の種々のストランドは、好ましくは、単一の転写解読枠によってコード化されるのが好ましい。種々のストランドを連結しているループは、いかなる形の立体配位をもとることができる。 コアの多機能性を過度に制限しないために、ループはコアの同一側上のストランドを連結していること、および、すなわち、ストランドのＮ−端が（ｂ）コアの閉口側上または開口側上のどちらか一方の（a）ストランドのＣ−端に連結していることが好ましい。ループは、同一のβ−シート中でまたは反対側のβ−シートにまたがって連結することができる。コア中の種々のストランドを連結するための好ましい配列は、実施例および図、並びに詳細な図１で示されている。コア中のストランドは、互いにいかなる方向（並行または反対並行）であってもよい。好ましくは、ストランドは、図１に示される立体配置にある。
【０００９】
既述のとおり、本発明の目的は、結合特性および構造特性（種々の環境下での安定性（温度、ｐＨなど）、抗原性など）の両者において結合分子を最適化することである。このことは、本発明に従い、本発明の少なくとも1つの（本発明のタンパク様分子をコード化している）核酸を取り、コード化された構造領域もしくは親和性領域のいずれかをまたはその両者を変異し、そして所望の結合特性と構造特性を有する分子が得られたかどうか試験することによって達成される。したがって、本発明は変換された結合特性を有するタンパク様分子を同定する方法であって、本発明のタンパク様分子のコアに改変を導入し、該タンパク様分子から改変された結合特性を有するタンパク様分子を選択することを含む方法、ならびに、改変された構造特性を有するタンパク様分子を同定するための方法であって、本発明のタンパク様分子のコアに改変を導入し、そして該タンパク様分子から改変された構造特性を有するタンパク様分子を選択することを含む方法を提供する。これら改変は種々の種類にわたってすることができ、1つの例は翻訳後修飾である。当業者は、他の適切な変異を設計することができる。
【００１０】
既に説明したとおり、変異は通常、コード化している核酸を変異することおよび該核酸を、微生物の、真核細胞の、または細胞なしの適切なシステムで発現させることによって、することができるであろう。いったん選択されると、もちろん選択システムと異なるシステムを使用することができる。
【００１１】
本発明は、また、少なくとも１つの所望のペプチドを提示する能力のあるタンパク様分子をコード化する核酸を産生する方法のごとき、本発明のタンパク様結合分子をコード化している核酸を産生するための方法であって、該所望のペプチド配列またはかかる配列が挿入され得る領域によって少なくとも第１および第２の構造領域が分離された少なくとも第１および第２の構造領域をコード化している核酸配列を提供すること、および、少なくとも１つの所望のペプチド配列を提示する能力のある該タンパク様分子をコード化している所望の核酸を得るために該第１および第２構造領域をコード化している該核酸を変異させることを含むことを特徴とする核酸を産生するための方法、および、好ましくは所望のペプチド配列を提示するための方法であって、β−バレルを形成しているβ−シートの少なくとも２つのβーシートをコード化しており、該所望のペプチド配列をコード化している配列を挿入するための領域を含んでいる核酸を提供し、所望のペプチド配列を含む核酸を挿入し、そして、該核酸を発現させ、該β−シートが上記の方法によって取得可能であることを特徴とする、所望のペプチド配列を提示するための方法を提供する。本発明はさらに、混合物、すなわち体液または分泌液のような、血液またはミルクのような、または血清および乳清のような、典型的な複雑な生物学的な混合物からの分離のように、今日まで結合分子が存在すると予想されてきた全ての分野における新規な結合分子の応用を提供する。もちろん、薬剤としておよび診断薬としての用途は、当業者にとって明らかである。診断薬の用途では、本発明の分子に標識を付けることができる。薬剤の用途では、本発明の分子に他のモイエティを結合することができる。両者の場合、このことは化学的にまたは組み換え融合によってすることができる。診断薬への応用および薬剤への応用は、通常の結合分子に関して当該技術分野で極めて詳細に述べられてきた。本発明の新規結合分子に関して、当業者にとってさらに詳細に説明することは不必要である。標的方式の遺伝子治療は、本発明の結合分子が遺伝子輸送担体（それは、ウイルス性（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレンチウイルスなど）または非ウイルス性（リポソームおよびそのようなもの）であることができる）に付与される多数の例のうちの１つである。輸送される遺伝子は当該技術で良く知られている。遺伝子輸送担体は、また、標的に輸送され、おそらく毒性モイエティに融合される本発明の結合分子をコード化することもできる。結合分子への毒性モイエティの複合も当該技術でよく知られており、本発明の新規結合分子のために参入される。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、以下の記載でさらに詳細に説明されるであろう。本発明は、分子結合に関与することのできる1つまたはそれ以上の領域を含む蛋白質の設計、構築、生成、スクリーニングおよび使用に関する。本発明はまた人工の結合ドメインを付与された天然の蛋白質、特別の構造構成エレメントが付与され1つまたはそれ以上の人工結合部位が付与された再構築された天然蛋白質、1つまたはそれ以上の人工結合部位が付与された（構造的または他の）いくつかのエレメントを備えた再構築された天然蛋白質、1つまたはそれ以上の結合部位が付与された標準のコア構造モチーフを含む人工蛋白質に関する。かかる全ての蛋白質は、ここではＶＡＰｓ（多機能親和性蛋白質）と称する。本発明はさらに、本発明の方法および類似コア構造を含有する天然蛋白質上の結合部位の転移によって同定された新規ＶＡＰｓに関する。かかる天然蛋白質の３Ｄモデリングまたは変異は、選択されたＶＡＰ上に存在する親和性領域による抗原結合能を保持または確保するために転移する前にするのが望ましい。さらに、本発明は、本発明で記述されたように、選択されたＶＡＰ（ｓ）により結合されることのできる選択されたリガンドの精製、除去、マスキング、遊離、阻害、刺激、捕捉などのために、選択されたＶＡＰｓを使用する方法に関する。
【００１３】
リガンド結合蛋白質
（推定）の分子結合部位を含む多数の天然蛋白質は、２つの機能的に異なる領域を含んでいる。現実に提示された結合部位および分子結合部位またはポケットの周りに包まれた領域は、本願明細書でスキャッフォールドと称される。これら２つの領域は、機能、構造、組成および物性が異なっている。スキャッフォールド構造は、蛋白質全体のために安定な３次元立体配位を確保し、事実上の認識領域のために踏み台として機能する。
【００１４】
リガンド結合蛋白質の２つの機能的に異なるクラスを区別することができる。
この区別は、遺伝子的に可変または不変リガンド結合領域の存在に基づいている。一般に、不変リガンド結合蛋白質は、一定数、一定組成および不変のアミノ酸配列をその種の細胞内の結合ポケットに含んでいる。かかる蛋白質の例は全て、たとえばＮ−ＣＡＭおよびＶ−ＣＡＭのような細胞接着分子、たとえばキナーゼおよびプロテアーゼのような酵素ファミリー、およびたとえばＥＧＦ−Ｒ、ｂＥＧＦ−Ｒのような成長因子受容体のファミリーである。これに対して、リガンド結合蛋白質の一般に可変クラスは、結合ポケット内およびおそらくその周辺で生物または細胞にアミノ酸の数、組成および配列を変化することを可能にしている、活性な遺伝子のシャフリング、変異または再配列機構の制御下にある。これらの例は、抗体の軽鎖および重鎖の全タイプ、Ｂ−細胞受容体の軽鎖および重鎖、およびＴ−細胞受容体アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタ鎖である。野生型のスキャッフォールドの分子構成は大きな程度で変化することが出る。たとえば、両蛋白質は特異的標的に結合することができるが、ジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合分子は、（アミノ酸組成および構造を見ると）抗体と全く異なるスキャッフォールドを含有している。
【００１５】
スキャッフォールドおよび結合領域
免疫化によって得られる抗体
可変（推定）抗体結合ドメイを発現するリガンド結合蛋白質のクラスは、リガンド結合蛋白質を探索するのに大きな価値があることが示された。リガンド結合蛋白質を生成するための通常の方法は、動物の免疫システムを利用する。このシステムには異物に対する生物の防御が関与している。かかる高度に多様な異物の有機体を認識し、結合し除去するための1つの方法は、これら分子に対する抗体を生成することである。免疫システムは、抗原を認識する抗体産生細胞を選択しそして増加させることができる。この工程はまた、活性免疫化の手段でまねることができる。一連の免疫の後に、抗原を認識し結合する抗体が、産生される。遺伝的再配列および変異によって産生され得る、異なる親和性領域を有する抗体の可能な数は、１０４０の数を超える。しかしながら実際には、少数の抗体タイプが、免疫オシステムによって篩いにかけられ最適化される。適正な抗体産生細胞の単離とこれに続くこれらの細胞の不朽化、または、この代わりに直接選択された抗体遺伝子、抗原−抗体対のクローニングは、将来の（商業的および非商業的）使用に、保存することができる。
【００１６】
このようにして得られた抗体の使用は、限られた数の応用にのみに限定される。
動物の抗体はヒトで見出された抗体と異なっている。動物起源の抗体のヒトへの導入、たとえば、医療への応用は、導入された抗体の効果に反してほとんど確実に免疫応答（たとえば、ＨＡＭＡ反応）を引き起こす。商業的目的でヒトを活発に免疫化することは許されていないので、この方法でヒト抗体を得ることは不可能かまたはほとんど可能ではない。これらの不都合のために、動物特異的抗体の産生を迂回する方法が開発された。1つの例は、マウス免疫システムの除去とかかるマウスへのヒト免疫システムの導入である。免疫化の後に得られる全ての抗体はヒト起源のものである。しかしながら動物の使用にもまた２つの不都合な点がある。第1に、行動生物学者、調査官、世論によって、動物愛護がだんだん注目を浴びるようになりつつある。免疫化には、苦痛でかつ緊張の多い操作を伴い、できるだけ避けなければならない。第2に、免疫化は抗体を必ずしも産生するわけでないか、または、結合力、抗体特異性などのような所望の特性を有する抗体を必ずしも産生しない。この理由は、多種多様であり得る。すなわち、免疫システムは、かかる推定抗体の同時発生によって免疫システムが失敗に終わる、最初に生成した抗体が毒性または有害である、最初に生成した抗体も動物特異的分子を認識する、その結果、かかる抗体を産生する細胞が破壊されるであろう、または、エピトープが免疫システムによってマップ化され得ない（これは、いくつかの理由がありえる）。
【００１７】
別の仕方で得られる抗体
上述のごとく、免疫化手法はリガンド結合蛋白質の生成をもたらすことができるが、それらの使用は限られ、柔軟性に欠けそして制御できない。抗体断片の細菌による産生方法の発明(Skerra and Pluckthun,1988 ; Better et al.,1988)は、動物の使用と免疫化手法を迂回するための新しい有力な手段である。クロー化された抗体断片、（フレームワーク、親和性領域およびこれらの組み合わせ）は、人工的なシステムで発現させることができ、インビボの（推定の）特異的標的を認識する抗体と誘導体（Ｆａｂ，ＶＬ，ｓｃＦＶおよびＶＨＨ）の調節と産生を可能にすることが示された。新しい選別技術および改良された変性戦略は、膨大な人工の（とりわけヒトの）抗体断片ライブラリに向けられた。かかるライブラリは、本質的に選択された１つまたはそれ以上のリガンドに結合することができる抗体断片を含んでいる。これらの抗体特異的推定リガンドは、スクリーニングと選択手段によって回収することができる。したがって、特異標的のリガンド結合蛋白質は動物の免疫化をすることなく加工し、回収することができる。
【００１８】
他の免疫グロブリンスーパーファミリーから誘導されるスキャッフォールド
ほとんどのエネルギと努力が天然由来またはコピーされたヒト抗体由来のライブラリの開発と最適化に注がれたが、他のスキャッフォールドもまた１つまたはそれ以上のリガンド結合ドメインのために成功的なスキャッフォールドとして記載されてきた。天然抗体を基礎にしたスキャッフォールドの例には、ミニボディ（Pessi et al. , 1993）、カラクダ科ＶＨＨ蛋白質(Davies and Riechmann, 1994; Hamers-Casterman et al.,1993)および可溶VH変異体(Davies and Riechmann,1994; Hamers-Casterman et al.,1993)が包含される。親和性領域挿入のために使用されている他の２つの天然蛋白質はもちろん免疫グロブリンスーパーファミリーの一員でもある。すなわち、T−細胞受容体鎖(Kranz et al., WO. Patent 0148145)およびフィブロネクチン  ドメイン−３領域(Koide US Patent 6,462, 189 ; Koide et al. , 1998)である。フィブロンエクチンに関して研究者は２つの領域しか記載していないが、この２つのＴ−細胞受容体鎖はそれぞれ本発明にしたがい３つの親和性領域を保持することができる。
【００１９】
非免疫グロブリン由来スキャッフォールド
免疫グロブリン由来スキャッフォールドと共に、非免疫グロブリンドメイン含有スキャッフォールドが研究された。研究された全ての蛋白質は、ただ1つの蛋白質の鎖と１つから４つの親和性関連領域を含んでいる。スミス(Smith)とその同僚は(1998)、スキャッフォールドとしてノッティンス（（knottins）小さなジスルフィドで結合された蛋白質のグループ)の使用についいて報告した。彼らは、７つの変異アミノ酸を有するノッティンス（knottins）に基づきライブラリの創製に成功した。蛋白質の長さと安定性は優れているが、ランダム化され得る低数のアミノ酸と親和性領域の単一性はノッティン蛋白質を非常に強力にはしない。クウとシュルツ（Ku and Schultz、１９９５）は、シトクロームｂ５６２の４−ヘリックス−バンドル構造に２つのランダム化された領域を導入することに成功した。しかしながら、選択されたバインダーは、所望のナノモルまたはそれより良い値のかわりにマイクロモルのＫｄ値で結合することが示された。使用された他のその代わりのフレームワークは蛋白質のテンダミスタート(tendamistat)ファミリーに属する。マックコンネルとヘス（McConnell and Hoess、１９５５）はストレプトミセス  テンダ(Streptomyces tendae)由来のアルファーアミラーゼ阻害剤（７４アミノ酸  ベータ−シート  蛋白質）が、リガンド結合ライブラリのスキャッフォールドとして役立つことを証明した。２つのドメインが変性領域を受容し、リガンド結合で機能することが示された。バインダーの大きさと特性は、テンダミスタートがミメトープス（mimetopes）と呼ばれるリガンド模倣品としてよく機能することを示した。このオプションは今や開発された。リポカリン(Lipocalin)蛋白質もまた、最大の４つの親和性領域のための良好なスキャッフォールドであることが示された(Beste et al. , 1999; Skerra, 2000 BBA; Skerra, 2001 RMB)。リポカリンは、レチノイド、アラキドン酸および数種のステロイドのごとき小分子の結合に関与している。個々のリポカリンは、１つまたはそれ以上の特異的リガンドを認識し結合する特異な領域を有している。スケラ（Skerra（２００１））は、リガンド結合ドメインの部位で可変領域を導入するためにリポカリンＲＢＰおよびリポカリンＢＢＰを使用した。ライブラリの構築とそれに続くスクリーニングの後に、研究者は選択されたリガンドにナノモルの特異性を有する数種の特異なバインダーを単離し特定した。どのようにして効率的なリポカリンが細菌またはカビの細胞内で産生できるのか、現在のところ知られていない。リポカリンの大きさ（約１７０アミノ酸）は、ＶＨＨ鎖（約１００アミノ酸）に関連してかなり大きく、工業的な応用には大きすぎるかもしれない。
【００２０】
コア構造の開発
商業的工業的応用において複数鎖のペプチドの替わりに単鎖ペプチドを使用することは、かかるペプチドの製造工程での低コストと高効率のゆえにきわめて興味あることである。工業的応用で使用しえる１つの例は、ＶＨＨ抗体である。かかるペプチドは、非常に安定で高い選択性を有することができそして比較的小さいものである。しかしながら、スキャッフォールドは、工業的応用のためにではなく、免疫依存機能のために進化論的に最適化されてきた。これに加え、１つの抗体プールに存在するフレームワーク領域の高多様性プールが、モジュラー最適化法の使用の障害となる。したがって、新しいスキャッフォールドはＶＨＨ蛋白質の好適な安定性を基本にして設計された。３Ｄ−モデリングと比較モデリングソフトウエアは、多機能親和性蛋白質（ＶＡＰｓ）の必要要件を満足させるスキャッフォールドを設計するために使用された。しかしながら、現在のところ、全ての可能性のある蛋白質構造、蛋白質の安定性およびその他の特性を計算することは、何ヶ月ものコンピュータ計算容量を要するので、まだ可能ではない。したがって、我々は、ファージディスプレイまたはそれに類するもののようなディスプレイ技術を使用することによって、研究室でもっとも有望なコンピュータで設計されたスキャッフォールドを試験した。このようにして、比較的短時間内で多数のスキャッフォールドをスクリーニングすることが可能である。
【００２１】
免疫グロブリン様（ｉｇ−様）折りたたみ構造（ｆｏｌｄｓ）は、自然界のいたるところできわめて共通している。特に動物分野では、多数の蛋白質はこのクラスに属する蛋白質内で折りたたみ領域を有している。ｉg様折りたたみを含む蛋白質の機能を考察し、そしてその特異的蛋白質内のこのｉg様折りたたみの機能を考察すると、これらのほとんどのドメインは全てでないにしてもリガンド結合に関与していることが明らかである。ｉｇ様折りたたみ含有蛋白質のいくつかの例は、Ｖ−ＣＡＭ、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、免疫グロブリンの定常領域、Ｔ−細胞受容体、フィブロネクチン、レオウイルス外殻蛋白質、ベータ−ガラクトシダーゼ、インテグリン、ＥＰＯ−受容体、ＣＤ５８、リブロースカルボキシラーゼ、デスルホフェロドキシン、スーパーオキシド様物質、ビオチンデカルボキシダーゼおよびＰ５３コアＤＮＡ結合蛋白質である。ほとんどのｉｇ様折りたたみ構造の分類は、ＳＣＯＰデータベース(Murzin A. G et al, 1995; http://scop. mrc-lmb. cam. ac. uk/scop)およびＣＡＴＨ(Orengo et al, 1997; http://www. biochem. ucl. ac.uk/bsm/cathnew/index. html)から得ることができる。ＳＣＯＰはこれらの折りたたみ構造を、免疫グロブリン様ベータ−サンドイッチを有する全ベータ蛋白質として分類し、折りたたみ構造を有するいくつかのメンバーはさらに追加のストランドを有しているが、このサンドイッチは２シート中に7ストランドを含んでいる。ＣＡＴＨは、主としてこれら折りたたみを、コード２．６０．４０で示された免疫グロブリン様折りたたみ中にサンドイッチ様の構造を有するベータ−蛋白質として分類している。ＣＥ(Shindyalov etal. 1998 ; http ://cl. sdsc. edu/ce. htm)、ＶＡＳＴ(Gibrat et al., 1996; http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/VAST/vast. shtml) および ＦＳＳＰ(Holm et al, 1998; http://www. ebi. ac.uk/dali/fssp)のような構造データベースにおいて、同様な分類が使用されている。
【００２２】
Ｃｎ３Ｄ (ＮＣＢＩ; http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/CN3D/cn3d. shtml)、ＩｎｓｉｇｈｔII (ＭＳＩ; http://www. accelrys.com/insight) およびその他の構造ビューアを使用して、種々の蛋白質由来のこれら折りたたみ構造の投影によって、ｉｇ様折りたたみ構造は種々のサブ−ドメインを有していることが示された。構造の図式投影図が図１に示されている。
【００２３】
最も保存された構造が、コアと呼ばれる折りたたみの中央部に観測された。コア構造は、長さにほとんど変化はなく比較的保存された空間的制約があるが、それらは配列とアミノ酸組成の両者において大きく異なっていることが見出された。コアの両側上にサブ−ドメインが存在する。これらは連結ループと呼ばれる。これら連結ループはアミノ酸含量、配列、長さおよび配位において変化することができるので、極めて可変的である。コア構造はそれゆえこれら蛋白質の内で際立って最も重要なドメインとして任じられている。コアを形成するベータ−エレメントの数は、６ストランドコア構造も重要であるが、７と９の間で変動する。コアの全てのベータ−エレメントは、２つのベータ−シート内に配置されている。
【００２４】
各ベータ−シートは反並行に向いたベータ−エレメントで構築されている。観察された１ベータ−シート中のベータ−エレメントの最小の数は３エレメントであった。観察された１ベータ−シート中のベータ−エレメントの最大数は５エレメントであったが、それ以上の数のベータ−エレメントが可能であることは排除することはできない。連結ループはバレルの片方上のベータ−エレメントに連結する。いくつかはベータ−シートに交差して連結し、一方、その他は１つのベータ−シート内に位置するベータ−エレメントに連結する。特に、Ｌ２、Ｌ４，Ｌ６およびＬ８として示されたループは、自然界ではリガンド結合のために使用され、それゆえ、結合蛋白質／親和性領域の導入または修飾に好適な部位である。Ｌ１，Ｌ３、Ｌ５およびＬ７の、長さ、構造、配列およびアミノ酸組成の高可変性は、これらループもまた少なくとも人工的な型でリガンド結合のために使用され得ることを明瞭に示している。コアの方向に突き出されておりそれゆえコアの中心で空間を埋めている現実のコアを形成するベータ−エレメント内のアミノ酸の鎖は互いに、水素結合（H結合）、共有結合（システイン架橋）およびその他の結合力を通じて相互作用することができ、そして折りたたみ構造の安定性を決定する。内部に結集するベータ−エレメント部分の残基のアミノ酸組成と配列は、極めて可変であることが見出されたので、多数の他の構成が形成され生成され得ると結論された。
【００２５】
このｉｇ様折りたたみを含む新しいタイプの蛋白質の設計のための出発点として、構造の基本概念を得るために、ｉｇ様折りたたみ構造を含むドメインの投影図が使用された。ＩｎｓｉｔＩＩ、Ｃｎ３ＤおよびＭｏｄｅｌｌｅｒプログラムが最小のエレメントと長さを決定するために使用された。加えて、構造のＣ−アルファ原子のみが、これらが折りたたみ構造の最小の特徴を描いているので投影された。これらベータ−エレメントの空間位置（座標）の小さい差は、許容された。ｉｇ様折りたたみのコアのＣ−アルファ原子の座標を表示しているＰＤBファイルが、新規な９、８、７．６および５ベータ−エレメント含有構造の開発のために使用された。８ストランド構造に関して、ベータエレメント１または９は省略できるのみならずエレメント５または６も省略できる。
【００２６】
したがって８ストランドコアは、好ましくは、エレメント２〜８および1または９の一方を含む。もう1つの好ましい８ストランドコアは、エレメント１〜４、７〜９およびストランド５またはストランド６の一方を含む。７ストランド構造に関しては、中でもエレメント1と９、１と５、６と９、９と５、および４と５を組み合わせる２ベータ−エレメントは除去可能である。エレメント４と５の除去は、空間的拘束の故に好ましい。好ましくはエレメント１，４および５、または４，５および９ばかりでなく他の形を欠く６ストランド構造もまたＩｎｓｉｇｈｔとＭｏｄｅｌｌｅｒによって分析され、処理目的のために充分信頼できることが示された。
多数の基本スキャッフォールドが構築され、蓄えられた。
【００２７】
全てのコンピュータ設計蛋白質は単に見積推測である。基本スキャッフォールドにおける1つの変異または複数のアミノ酸の変化によって、それを成功のスキャッフォールドにするかまたは予測されたよりもより好ましくそれを機能するようにすることができる。
このことを達成するために、構築された基本スキャッフォールドは、反応混合物中での非等モルｄＮＴＰ濃度、マンガンもしくは他の添加物の添加、またはｄＩＴＰ(Spee et al., 1993)もしくはｄＰＴＰの(Zaccolo et al., 1996)のようなヌクレオチド類似体の添加のごとき、エラープロンＰＣＲを含むＰＣＰ増幅による穏やかな変異操作がなされ、このことによって最終的に基本スキャッフォールドのアミノ酸組成およびアミノ酸配列を変えることができる。このようにして新規（第２次の）スキャッフォールドが創製される。
【００２８】
スキャッフォールドの、要求されたまたは所望された機能性、安定性およびその他の特性を試験するために、リゾチームを結合するための１ＭＥＬおよびＲＮアーゼを結合するための１ＢＺＱのような既知の１セットの親和性領域が、調節して構築された基本スキャッフォールドに挿入された。構築されたＶＡＰｓの機能性、熱および化学的安定性は折りたたみされない条件で測定される。化学的および熱的処理の後の機能性は、結合試験（ＥＬＩＳＡ）によって測定され、一方、非折りたたみを誘導した温度は円２色性(CD)偏光計によって測定された。ファージディスプレイ技術は所望のスキャッフォールドを選択するためにまたはスキャッフォールドの最適化のために使用された。
【００２９】
ライブラリ構築のための最初の親和性領域
本発明において新規かつ特異的な領域が必要である。親和性領域は天然資源、縮重プライマーまたは集積されたＤＮＡトリップレットから得ることができる。
【００３０】
これら全ての資源は、上述のとおり、ある種の重要な制限を有している。我々の新規な設定において、我々は、制限が少なく、モジュラシステムに使用でき、極めて使用および最適化に柔軟性があり、生成および調製が迅速かつ容易であり、低いパーセントの終止コドンを有し、極めて低いパーセントのフレームシフトを有する、新規かつ強力に改良された親和性領域の源であって、重要な構造特性が新規に形成されたクローンの大部分で保存されしかも新規構造エレメントが導入され得ることを特徴とする親和性領域の源を設計した。
【００３１】
通常の抗体の軽鎖および重鎖両者中の主な重要親和性領域（ＣＤＲ３）は、１１(マウス)と１３(ヒト)アミノ酸の間の平均長を有している。かかる抗体中で軽鎖および重鎖中のＣＤＲ３は、共同して抗原結合剤として機能するので、かかる結合の強さは、両領域相互の結果である。
【００３２】
これに反して、ＶＨＨ抗体（ラクダ科）の結合は、軽鎖が存在していないので１つのＣＤＲ３の結果である。１６のアミノ酸平均長が見積もられ、これらＣＤＲ３領域は通常のＣＤＲ３領域よりも顕著に長い(Mol. Immunol. Bang Vu et al. , 1997,34, 1121-1131)。
【００３３】
長いまたは多重のＣＤＲ３領域は、潜在的にリガンとのもっと多くの相互作用位置を有し、それゆえもっと特異的でありかつもっと強い力で結合できる、と強調することができる。
【００３４】
もう１つの例外は、雌ウシ（ボス  タウラス）のＣＤＲ３領域で発見されている(Berens et al.,1997)ＣＤＲ３領域である。雌ウシの抗体は軽鎖と重鎖から構成されているが、それらのＣＤＲ３領域はマウスおよびヒトで見出されたものよりもっと長く、長さはラクダ科ＣＤＲ３領域で見出されたものに匹敵する。主要親和性領域の兵緊張は、好ましくは約１６アミノ酸であるべきである。できるだけ多く機能的ＣＤＲ領域の長さを含むために、主要親和性領域は、１と５０の間のアミノ酸またはそれ以上のアミノ酸に変化させることができる。 ＣＤＲ３領域の構造および構造上のクラスは（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関してと同様に）解明されておらずまた理解されていないので、決定的なアミノ酸の位置および特性が適正になるように長い親和性領域を設計することは不可能である。
【００３５】
したがってほとんどのライブラリは少なくともいくつかの正しい領域を見出すために完全に縮重した領域が供給される。
【００３６】
本発明において我々は、新規な親和性領域のための鋳型として天然のラクダ科ＶＨＨＣＤＲ３ならびにウシ由来ＶＨＣＤＲ３領域の使用を説明するが、もちろんその他のＣＤＲ領域（たとえばＣＤＲ１およびＣＤＲ２）ならびに長さがこれに一致するさまざまな配列も使用することができるであろう。ＣＤＲ３領域は、ラクダ科の種々の動物または長いＣＤＲ３領域を含有しているその他の種々の動物由来のＶＨＨ抗体をコード化しているｍＲＮＡからＰＣＲ技術によって増幅される。次に、アミノ酸組成、アミノ酸配列、推定の構造上の分類および長さのコード化において異なる約１０８の異なるＣＤＲ領域のこの蓄積物が、上述したようにＰＣＲによって変異工程にかけられる。その結果、ほとんどの生成物は、元来の鋳型とは異なり、したがって潜在的に異なる親和性領域を有するコード化領域を含むであろう。他の非常に重要な結果は、生成物はそれらの長さを保持し、蓄積物はそれらの長さの分布を保持し、重要部分は構造的に重要な情報を保持するであろうが、一方その他は構造の非天然クラスを形成し、生成物はフレームシフトを含まないかまたは非常にまれにしか含まず、生成物の大多数は終止コドンを欠くだろうということである。これらの新規な親和性領域は、モジュラー親和性とスキャッフォールド転移（Modular Affinity and Scaffold Transfer）技術（ＭＡＳＴ）の手段で選択されたスキャッフォールドにクローン化することができる。この技術は、上述の設計されかつ構築された全てのスキャッフォールドは、モジュラー構造を有しているのでベータ−ストランドに結合している全てのループはＶＡＰの全体の構造を変えることなく他のループで容易に置き換えることができるという事実に基づいている（図２参照）。新しく構築されたライブラリは、当該技術分野の経験のある使用者によって知られた通常のスクリーニングに類似のスクリーニング手法にかけることができる。したがって、人工の結合ペプチドを含むライブラリを産生する方法であって、種々の特異的結合ペプチドをコード化することを特徴とする少なくとも１つの核酸鋳型を提供し、該鋳型の核酸誘導体の変異によって該鋳型の核酸誘導体の収集物を産生し、そして該収集物またはその一部を人工の結合ペプチドを含む該ライブラリを産生するためにペプチド合成システムに提供することを含む、ライブラリを産生する方法がさらに提供される。
【００３７】
ライブラリの複雑さはライブラリを産生するために使用される種々の鋳型の数の増加に伴い増加する。このようにして増加する数の種々の異なる構造が使用される。
【００３８】
したがって、好ましくは少なくとも２つの核酸鋳型、より好ましくは少なくとも１０核酸鋳型が提供される。変異は、種々の方法と手段を使用して導入することができる。
好ましくは、その方法は、核酸鋳型またはその誘導体の塩基を変えることによって変異を導入する。誘導体は、鋳型と比較して少なくとも１つの導入された変異を含む核酸を意味する。このようにして、親和性領域の大きさは影響を受けない。適した修飾戦略には、たとえば不均衡なｄＮＴＰｓの濃度(Cadwell et al.,(1992); Leung et al.,(1989)1; Kuipers, (1996)、ｄＩＴＰ(Xu et al (1999); Spee et al (1993; Kuipers, (1996)、ｄＴＰＴ (Zaccolo et al., 5 (1996))、８−オキソ−ｄＧ(Zaccolo et al., (1996) )、Ｍｎ２＋ (Cadwell et al., (1992); Leung et al., (1989) 1, Xu et al., (1999))、高い取り込みミス濃度でのポリメラーゼ(Mutagene（登録商標）、 Stratagene)の添加、のようなＰＣＲ戦略を包含する増幅戦略が含まれる。変異を取り込むための部位特異なプロトコルはもちろん使用し得るが、しかしながら、かかる方法を使用してライブラリを生成するためにはかなりの時間と努力が必要なので、部位指向変異のみを基礎とする戦略が選ばれるであろう。ハイブリッド戦略ももちろん使用できる。初期ストランドの延長中にｄＩＴＰおよび／またはｄＴＰＴの取り込みを含む変異戦略は、かかる戦略がそれぞれのサイクルで導入できる変異の数について制御が容易であるので、好ましい。この方法は、複雑性を導入するために縮重プライマーの使用に依存しない。したがって、１つの実施形態では、該増幅は非縮重プライマーを使用する。しかしながら、(部分的)縮重プライマーも使用可能であり、したがって少なくとも１つの非縮重プライマーがさらに縮重領域を含む方法もまた提供される。結合ペプチドのライブラリを生成するための方法は、上述の好適なもっと大きな親和性領域の生成のために特に適している。これで、類似構造の同一性質を保持しながら多数の変化が導入し得る。したがって少なくとも１つの鋳型は、少なくとも１４アミノ酸、好ましくは１６アミノ酸を含む親和性領域を有する特異的結合ペプチドをコード化する。 
【００３９】
この本発明の実施形態で非連続領域も使用され得るが、その領域は少なくとも１４の連続アミノ酸を含むのが好ましい。複数の鋳型が使用される場合、領域は２４アミノ酸の平均長を含むことが好ましい。
【００４０】
結合ペプチドのライブラリを生成するための方法は、好ましくは本発明のコア領域とその生成のための方法と組み合わせることができる。たとえば、一旦適当な結合領域が選択されると、コアは期待する特別な使用に適用するために設計または選択することができる。しかしながら、結合ペプチドの意図する用途の理由で特異なコア領域を選択することもできる。続いてコアを有するライブラリと結合ペプチドの既述のライブラリとを創製することができる。かかるライブラリの用途はもちろん多種多様である。
【００４１】
あるいは、コアのライブラリを有する結合ペプチドのライブラリを創製するために、戦略を組み合わせて使用することが出飽きる。個々のライブラリの複雑さは、もちろん特別な用途に組合わせライブラリを適用するために制御することができる。したがって好ましい実施形態では少なくとも１つの該鋳型が本発明のタンパク様分子をコード化する。
【００４２】
既述のペプチド、コアおよび組み合わせライブラリは本発明のタンパク様分子を選択するために使用することが出来、したがってここでさらに、ペプチドのための潜在的な結合相手を人工ペプチドの該ライブラリ中に提供し、該結合相手に特異的に結合できるペプチドを該ライブラリから選択することを含む方法が提供される。該方法を使用して得られる選択されたタンパク様分子ももちろん提供される。 選択されたタンパク様分子の容易な産生と回収を可能にするために、少なくともコアと結合ペプチドは、提示されたコア／ペプチド  タンパク様分子をコード化している核酸を含む複写パッケージ上に提示されることが好ましい。好ましくは、複写パッケージは、ファージディスプレイ戦略で使用されるようなファージを含む。したがって、本発明の少なくとも１つのタンパク様分子を含むファージディスプレイライブラリも提供される上述のとおり、結合ペプチドのライブラリを創製するための方法は、コア領域に有利に適用することができる。したがって、人工コアを含むライブラリを産生する方法であって、鋳型が種々の特異的コアをコード化することを特徴とする少なくとも１つの核酸鋳型を提供し、その変異を通じて該鋳型の核酸誘導体の収集物を産生し、そして人工コアの該ライブラリを産生するために、該収集物またはその部分をペプチド合成システムに提供することを含む、ライブラリを産生する方法もまた提供される。好ましい結合蛋白質ライブラリは、好ましくは、雌ウシ（ボス  タウラス(Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ)）またはラクダ科（ラマパコス（lama pacos）およびラマグラマ（lama glama））由来のＣＤＲ３領域を含む鋳型から誘導される。
【００４３】
親和性領域（ＡＲ‘Ｓ）
蛋白質−リガンド相互作用は生命の基本原理の１つである。
全ての蛋白質リガンドに仲介される蛋白質間、蛋白質と核酸間、蛋白質と糖間および蛋白質とその他の型の分子間のいずれかの自然の相互作用は、蛋白質表面に存在する境界とリガンド表面の分子特性を通して仲介される。蛋白質−リガンド相互作用に関与する蛋白質表面のほとんどは、生物のライフサイクルを通じて保存されている。これらのクラスに属する蛋白質はたとえば、受容体蛋白質、酵素および構造蛋白質である特異的リガンドのための双方向表面領域は、通常、一定である。しかしながら、いくつかの蛋白質のクラスは、たとえば変異、組み換えまたはその他の型の天然の遺伝子工学プログラムによって露出した表面領域のそれらの性質を調節することができる。この作用の理由は、それらのリガンドまたはリガンド型が極めて大きい程度に変化できるということである。かかるクラスに属する蛋白質はたとえば、抗体、Ｂ−細胞受容体およびＴ−細胞受容体蛋白質である。両クラスの蛋白質に原理的には差はないが、両クラスに関し表面変化の速度が異なる。最初のクラスは主として進化力（種の寿命）に敏感であり、一方、第２のクラスは（生物の寿命内における）変異力にもっと敏感である。
【００４４】
受容体とリガンドの間の結合特異性と親和性は、両分子の露出した境界面の間の相互作用によって仲介される。蛋白質表面はその位置に存在するアミノ酸の型によって支配される。自然界によくある２０の異なるアミノ酸は、それぞれ、それら固有の化学的かつ物理的特性を有するそれ自身の側鎖を持っている。他の分子と相互作用する役割を担っているのは、一定の露出した表面の全てのアミノ酸の累積した効果である。静電気力、疎水性、水素結合、共有結合およびその他の型の特性が、リガンドとの結合特異性と結合力を決定する。
【００４５】
蛋白質−リガンド相互作用に関与する蛋白質の最も洗練された型は抗体のそれである。かかる蛋白質をコード化することのできる遺伝子内の、位置と変異レベル、組み換えとその他の遺伝子変化を制御する巧妙なシステムが発展された。遺伝子変化力は、推定リガンドの結合に関与する抗体の露出された表面域を形成するこれら領域に主として焦点が当てられている。（理論的に）形成され得る、莫大な数の種々の抗体は、抗体の力を示す。たとえば、もしリガンドと抗体の重鎖の両者の中でリガンド結合に直接関与しているアミノ酸数が各鎖につき８アミノ酸だと仮定すると（これは、確かに楽観的でない）、１０２０に近い１０２＊８(２０アミノ酸タイプ、２つの鎖、８残基)の異なる抗体が生成され得る。もし近くに位置するアミノ酸の間接的効果が、直接相互作用アミノ酸を含みそして／または増加させるならば、それは天文学的な多数に達する。１つの生物が、リガンドに対する抗体の選択において、これらの全てまたはこれら組み合わせの部分でさえも試験することは全く不可能である。
【００４６】
露出した表面領域に存在する全てのアミノ酸がリガンド結合に等しく関与しているわけではない。いくつかのアミノ酸は、リガンド結合特性に顕著な変化をすることなくまたは小さい変化だけで他のアミノ酸に変えることができる。また、蛋白質のほとんどの表面領域は非常に柔軟性があり、リガンド表面の影響の下に容易に変形し、リガンド表面との結合をするようになるが、これは非柔軟性リガンド−結合領域とは起こらない。
【００４７】
上述したような蛋白質とリガンド間の相互作用力は、このようにこの変形を導くかまたは触媒する。一般に、多数のしかし限られた数の遺伝子は、アミノ酸の代理機能性とともに変化し、そして、表面の柔軟な性質は結合力と一緒になって、有効なリガンド結合蛋白質の産生を導くことができる。
【００４８】
天然由来の抗体とその親和性領域は、免疫選択方法である程度最適化された。これらの選択は、免疫システムでのかかる分子の作用に基づいている。免疫システム外での抗体の応用は、免疫選択基準の性質と制限のために妨げられる可能性がある。したがって、工業的、美容的研究とその他の応用には、しばしばリガンド結合蛋白質の異なった特性が要求される。結合分子が応用できる環境は、たとえば極端なｐH条件、塩条件、異常温度など、抗体構造のために極めて過酷である可能性がある。その応用によっては、ＣＤＲｓは天然抗体からスキャッフォールドに移植されたりされなかったりする。少なくともいくつかの応用のために、異常な親和性領域が必要となるであろう。したがって、人工的に構築されて注意深く選択されたスキャッフォールドと親和性領域は、他の応用に必要であろう。
【００４９】
スキャッフォールド上の親和性領域は、いくつかの起源から得ることができる。まず第１に、天然の親和性領域を使用することができる。抗体フラグメントをコード化しているｃＤＮＡのＣＤＲｓは、ＰＣＲを使用して単離することができ、スキャッフォールドに適正な位置で挿入することができる。かかる領域の源は、免疫化されたまたは免疫化されない動物のものであることができる。第２に、全合成のＡＲ‘ｓを縮重プライマーを使用して構築することができる。第３に、いくつかの領域のみが縮重している半合成ＡＲ‘ｓを構築することができる。第４に、選択されたアミノ酸のトリプレットコード（単一特異的または混合物）を、あらかじめ定められた形で融合することができる。第５に、（免疫されたまたは生まれつきの動物の）天然由来の親和性領域であって、（たとえばマンガンイオンのような）変異条件または（たとえばｄＩＴＰのような）試薬を反応中に導入することによって（たとえばＮＡＳＢＡまたはＰＣＲのような）増幅操作中に変異される。
【００５０】
前に述べた理由によって、免疫を基礎とするＣＤＲｓは成功させることができるが、リガンドまたはリガンド領域の大部分は、抗原性ではないであろう。強力な選択と最適化戦略を組み合わせて、人工親和性領域は、変えられないものでないなら、よりいっそう重要になってきている。高いレベルの終止コドン、フレームシフト、困難な配列、あまりも多いランダム化、比較的少ない数の変異終止（最大約８つの停止）および短いランダムストレッチ（８アミノ酸以下）のゆえに、鋳型を基礎とする戦略は非常に強力ではない。非天然由来ＡＲ‘ｓの力も、予想どおり正しく折り重なっている、すなわち問題のＡＲ’ｓまたはスキャッフォールドを折りたたむことなくスキャッフォールド上に存在することのできるＡＲ‘ｓのパーセントに依存する。現在、ＡＲ‘ｓ中に存在する構造と領域についての情報はほとんど入手できない。したがって、正しく折りたたまれて提示されたランダム化で構築された人工のＡＲ‘ｓのパーセント、特に長いＡＲ’ｓのそれは、構築されたＡＲｓの長さに反比例するであろう。ＣＤＲとＡＲ構造の知見は、将来ほとんど確実に入手できるであろうが、まだ入手できない。
【００５１】
高い親和性と高い特異性が必要な適用に使用される、単一のスッキャッフォールド蛋白質には、リガンドとの相互作用のための充分露出されたアミノ酸側鎖を持つために一般に少なくとも１つの長い親和性領域または複数の中間長のＡＲｓが必要である。鋳型またはトリプレット融合戦略を使用して合成で構築された高機能の長いＡＲｓは、上述の理由で非常に効果的ではないであろう。かかる合成ＡＲｓを含むライブラリは、機能が低いかまたは取り扱うにはあまりにも多すぎるであろう。長いＡＲｓのための唯一入手可能な資源は、（抗体の重鎖中のＣＤＲ３が最も頻繁な）動物資源から得ることのできるものである。特に、雌ウシとラクダ科由来のそれぞれＶｈ鎖とＶｈｈ鎖のＣＤＲ３領域は、異常に長い。これら領域の長さは、平均で１３アミノ酸以上であるが、３０アミノ酸またはそれ以上も例外ではない。
【００５２】
免疫化された動物から得られるかかるＡＲＳで構築されたライブラリは、免疫学的に活性なこれらリガンドまたはリガンドドメインのために成功する。非免疫性リガンドまたはリガンドドメイン、およびほかの点で免疫応答（毒性、自己認識など）しないように見えるリガンドは、リガンド特異的な長いＣＤＲｓを産生するための免疫システムの引き金とはならないであろう。したがって、かかる標的の結合を仲介する長いＣＤＲｓはこの方法では得られないかほとんど得られず、したがってそれらは、単一スッキャッフォールド蛋白質に使用することのできる特異的な長いＡＲｓを提供する技術では、得られない。似たような結論が、ラマ  Ｖｈｈスッキャッフォールド上の合成ＡＲＳの使用を分析したムイデルマンズ(Muidermans)によっても引き出されている(Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001) 277- 302)。 
【００５３】
PCRの方法でのCDR領域、特にCDR3の単離によって、入手可能なCDR領域に存在する全ての長さの変異体の使用と全ての構造上の変異体が使用可能になる。たとえばPCRのような核酸増幅技術による、微小な、ゆるい、中間程度または高程度のランダムな変異の導入によって、新規な型の親和性領域が生じるであろう。かかるAR蓄積物の利点は、このように生成された領域の長さの分布が保存されるということである。また、もしランダム鋳型を基礎とする方法に比べると比較的低数の変異のゆえに、終止コドンの導入とフレームシフトが高程度で防止できるであろう。さらに、変異パーセントに依存して、産生物の重要部分または大部分でさえも、動物中に存在するそれらの原型の鋳型に同一または少なくとも部分的に同一な構造情報を提示するペプチド配列をコード化するであろう。これらの変異のゆえに、改変されたアミノ酸配列が、生成物の巨大部分によって生成し、その結果これらは新規な結合特性を有するであろう。結合特性は、原型の鋳型にくらべ、強さばかりではなく特異性および選択性においても改変することができる。
このようにして、長いＡＲ領域のライブラリは、もし合成、半合成および天然で得られるARｓと比較するならば、上述したように、技術的または物理的の問題を減少して創製することができる。
【００５４】
近年、新規でかつ強力なインビトロ変異化方法および試薬が開発された。変異化法の１つは、（位置指向変異化方法と反対に）位置に無関係に変異体を産生する。
【００５５】
ＰＣＲ修飾戦略には、たとえば、不均衡なｄＮＴＰｓ濃度(Cadwell et al. , (1992); Leung et al.,(1989)1; Kuipers, (1996)、ｄＩＴＰ(Xu et al (1999); Spee et al (1993; Kuipers, (1996)、ｄＴＰＴ (Zaccolo et al., 5 (1996) )、８−オキソ−ｄＧ(Zaccolo et al., (1996) )、Ｍｎ２＋ (Cadwell et al. , (1992); Leung et al. , (1989) 1,, Xu et al. , (1999))、高い取り込みミス濃度でのポリメラーゼ(Mutagene（登録商標）、 Stratagene)の添加が含まれる。
【００５６】
親和性変異
１回またはそれ以上の選択操作の繰り返しののちに、選択されたリガンドを認識するＶＡＰｓに富んだ群が形成される。リガンドに対してより良い、異なった、またはそのほか変化されたＶＡＰｓを得るために、領域またはその１部分をコード化しているＶＡＰを、そのモジュールの性質ゆえに上述のような変異プログラムの対象にすることができる。
【００５７】
いくつかの戦略が可能である。第１に、全ＶＡＰまたはＶＡＰｓを鋳型として使用することができる。第２に、唯一のまたはそれ以上の親和性領域を変異することができる。第３に、フレームワーク領域を変異することができる。第４に、ＶＡＰすべての断片を鋳型として使用することができる。もちろん、もっと多くの領域を変えるために繰り返し工程を適用することができる。変異体の平均数は、ＰＣＲ条件を変えることによって変化させることができる。このようにして、全ての所望の領域を変異させることができ、また全ての所望のレベルの変異数を独立して適用することができる。変異操作の後に、リガンドに対して新規かつ改良されたＶＡＰｓを見出すために、ＶＡＰｓの新しく生成した蓄積物を再スクリーニングおよび再選択することができる。変異操作は、再開始して必要に応じて多くの回数、適用することができる。この変異プログラムの効果は、所望の親和性と特異性を有する親和性領域１および２を得ることができるばかりでなく、選択された親和性領域３の微小変化を導入することができるということである。この主たる結合領域における変異プログラムはリガンド結合特性を強力に増大することができる。
結論として、ここに記載された発明は、変異段階できわめて強力である。
【００５８】
産業上の利用分野
本発明のＶＡＰは、非常に多様な用途において、たとえば治療から抗体まで、検出試薬から精製モジュールまで多様な用途に使用可能である。各用途においては、リガンド結合蛋白質は、たとえば温度安定性、プロテアーゼ抵抗、標識などを有するべきであるという特徴を、環境と下流の用途が決定する。スキャッフォールドの選択が何であろうとも、いかなるものもすべからく自らの特異的特性を有するものである。いくつかの特性はある用途にとっては都合がよいが、また一方で、他の特性は受容できないものである。大量生産の商業用用途にとっては、スキャッフォールドが容易かつ速やかに領域の突然変異、除去、挿入、交換を可能とするためにモジュラーデザインを含むことは重要なことである。モジュール方式によって、標準化された手順を介して、必要な特性について最適化することが可能となり、ドメイン交換プログラム、すなわちプリメードカセットの交換が可能となる。最適なモジュラースキャッフォールド遺伝子は特異的特性を満たしているべきであることから、自然に得られる遺伝子がこのような特性を含むことはありそうにないことであり、それらをデザインして合成によって構築することが必要である。
【００５９】
モジュール性に加えて、スキャッフォールド遺伝子またはタンパクに存在すべき、または存在すべきでない他の特性がいくつかある。天然タンパクに存在するフレームワークに基づくすべてのスキャッフォールド系はそれらの自然特性も受け継いでいる。これらの特性は、この特異的タンパクが作用する系についての進化する力によって最適化されてきた。特異的特性とは,たとえばコドン使用、コドン出現頻度、発現レベル、折りたたみパターンおよびシステイン架橋形成などを包含する。しかしながら、かかるタンパクの商業生産は経済的利益の達成にとって最適な発現、翻訳および折りたたみを要求する。遺伝子情報が産生有機体にとって和合性を有し、受容可能であるべきであるだけでなく、タンパク特性もその用途のタイプに最適でなければならない。かかる特性とは、感熱性、ｐＨ感受性、塩濃度感受性、蛋白質感受性、安定性、精製可能性その他多くのものがある。このように、アフィニティプロセスにおいて実際に使用できるものであるためには、特異的結合能力のみでは十分ではない。特異的結合剤は、カラム中の担持物質、不溶性ビーズ、プラスチック、金属または紙の表面、または他の有用な表面などの固相に結合されることが可能なものでもなければならない。理論上、この結合は、特異的結合活性に対して悪影響なく達成することはできない。それ故この結合は好ましくは、特異的アフィニティ領域から比較的離れたＶＡＰ分子中の領域で達成される。
【００６０】
本発明の重要な実施の形態は、多孔性シリカなどの上に固定された特異的結合剤であって、ＶＡＰ分子の選択を有する特異的結合剤を有する親和性吸収物質である。本発明の特に重要な実施の形態は、孔のサイズが少なくとも３０Aであって、１０００Aを超えない、シリカ、不活性硬質ポリマーなどの多孔性担持物質上に固定された特異的結合剤であって、ＶＡＰ分子の選択を有する特異的結合剤を有する親和性吸収物質である。好ましくは、担持物質の孔サイズは少なくとも６０Aである。好ましくは、孔のサイズは５００Aを超えず、さらに好ましくは３００Aを超えない。支持物質への蛋白質の結合は、研究および産業界で広く利用されている（Narayanan and Crane, bas(1990))。ＶＡＰの支持または担持物質としてのポリマーは、ナイロン、ビニルポリマー、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオライド、セルロース、キチン、キトサン、アガロース、タンパクを含むが、これらに限られない。活性化された（すなわちタンパク結合の用意ができた）支持物質は市販されている。または当業者によって化学的に活性化することも可能である。
【００６１】
シリカ、不活性ポリマーなどの担持媒体の孔のサイズは、たとえば標準的なサイズ排除技術または他の公開された方法を使用して決定することが可能である。公称孔サイズは、しばしば平均孔径と呼ばれ、ホイーラー方程式によって計算されるように（ＭＰＤ＝（４０,０００×孔の体積）／孔表面積）、孔の体積および表面積の関数として表される。孔の体積および表面積は、標準窒素吸収法によって決定することができる。
【００６２】
ＶＡＰを最終製品まで、および、最終製品においてもＶＡＰを存在させておく方法においてＶＡＰを利用することが可能である製品の例としては、非常に広範な範囲のものがある。また、ＶＡＰが、固定され、好ましくは再利用のために再生産可能な方法においても、ＶＡＰの主たる利点が充分に利用されている。たとえば、比較的低コストのＶＡＰは、大量の親和性体を使用する必要がある大量生産用途に特に適している。以下のリストは用途を示すものであるが、決してこれらに制限されるわけではない。製品または方法の例は以下のとおりであり、括弧内に可能な用途を挙げている；
【００６３】
（１）産業用食品加工、たとえば、乳清、トマトのしぼりかす、カンキツ類の果物などの加工、または、たとえば、ジャガイモ、コーン、コメ、コムギ、ダイズ、綿、ヒマワリ、テンサイ、サトウキビ、タピオカ、アブラナなど（これらに限られないが）の大量の作物から、デンプン、油脂、タンパク、繊維、糖などの抽出など、農産物の大量の原料に関連する加工。他の加工の例は、たとえばチーズ、バター製造における日誌関連産業にある。ＶＡＰは既存の加工工程のラインにおいて使用が可能であり、かつＶＡＰは支持物質に不可逆的に固定化されている結果として最終製品にはならないので、それらは例外的に農作・食品加工産業において慣習となっている大規模工業環境に適している。
【００６４】
もっと詳細な例では、チーズ製造加工の結果物である乳清画分は、自然抗体、食品添加物などとして、たとえば新生児の発育において重要な生物学的機能を有する低存在量タンパクを比較的多く含む。かかるタンパクの例としては、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、リゾチーム、アンギオゲニン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）インシュリン受容体、ＩＧＦ結合タンパク、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、結合および可溶性ＴＧＦ受容体、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ受容体リガンドインターロイキンー１受容体アンタゴニストがある。乳清から回収されうる下位のクラスの他の有益な化合物は、乳汁または初乳中に存在する免疫調整ペプチドである。特異的ＶＡＰも乳清からホルモンを回収するために選択することが可能である。乳汁にあるホルモンの例としては、プロラクチン、ソマトスタチン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、カルシトニン、エストロゲン、プロゲステロンがある。
【００６５】
（２）消費者向け食品、たとえば、アイスクリーム；油、マーガリン、ドレッシング、マヨネーズなどの油脂ベース製品；スープ、ソース、調理済み食品、ソフトドリンク、ビール、ワインなどの他の加工済み食品
（直接的抗生物質活性または酵素の選択的阻害を介する腐敗の予防および防止；加工中の感受性モチーフの、たとえば、活性な形態で存在することによって最終製品の質に影響する酵素または化合物からの保護；香味およびにおいの放出の制御；ビール醸造工業における苦味成分の保護または除去など、香味およびにおいを保護するまたは強めるための分子模倣；殺虫剤または他の汚染物質の除去；加工中における感受性モチーフの保護、たとえば好ましくは、変性加工工程の下流で活性であることが必要である酵素の保護、それによって特異的ＶＡＰとの結合が変性される酵素の活性部位を保護するであろう。）
【００６６】
（３）パーソナルケア製品
粉末、ペースト、錠剤または液体などの異なる形態において適用される、シャンプー、毛染め液、洗浄液、洗濯用合成洗剤、ゲル（フケまたは皮膚に関連する他の微生物を抑制するための抗菌作用、練り歯磨きおよび口内洗剤用抗菌作用、合成洗剤中の汚れおとし酵素用強化特性、たとえば温度またはｐＨ安定性などを高めるための石鹸または合成洗剤中の不安定な酵素の安定化、染毛製品用結合作用の増強、靴の中敷、化粧紙など、皮膚用途または衣料用途における、体臭の原因となる酵素の抑制。）
【００６７】
（４）非食品用途
印刷用インク、接着剤、塗料、紙、化粧紙など（たとえばプラスチックボトルまたは容器などの印刷が困難である表面のための、または、非常に特殊な結合が必要である表面、たとえば電子チップ製造におけるリソグラフ工程、有価証券証明用表面のための、表面−特定インク、接着剤、塗料など。
【００６８】
（５）環境保護処理
浄水、生物治療、浄化加工水、汚染物質の濃縮（微生物、ウイルス、水浄化プラントまたは温室の水循環システム中の有機汚染物質の除去、換気ダクトからの生物学的危険要因の除去）
【００６９】
（６）乾燥または湿式形式の動物飼料製品（ウシ飼育場および養魚場向け飼料成分においてしばしば起こる反栄養要因の影響の除去、マスキング、阻止、特に、プロテアーゼ阻害物質またはフィチン酸などの負の要因、抗菌剤としてのＶＡＰの添加による、現在一般的な抗生物質のタンパクベースの抗生物質との置換）
【００７０】
本特許の好ましい実施の形態は産業用プロセスを含むけれども、親和性クロマトグラフィによるＶＡＰの使用は、これらの用途に限られない。等級として“少量／高価値”の側おいては、古典的な免疫応答において抗体を生じさせることが困難であることが知られているリガンドに対してＶＡＰを利用することが可能であるために、価格がそれほど重要ではない医薬、診断および研究目的では、種々の用途が考えられる。また、サイズが小さく安定性が高いため、“少量／高価値”の用途が提供され、ＶＡＰは、従来の抗体またはそれらのフラグメントよりも優れている。
【００７１】
（７）医薬用途
ＶＡＰは、治療薬そのものとして使用することが可能であり、特に、コアを天然蛋白質に似るようにデザインする、または治療薬のための適切な親和性領域および／またはコア領域を同定するようにデザインするときには、治療薬として使用がすることが可能である。
【００７２】
（８）診断用途
ＶＡＰは、通常使用されている抗体または抗体フラグメントとは本質的方法において異なる３次元構造の結果として、異なる種類の分子を検出することが可能である。たとえば、感染によって伝播するプリオンの検出。この場合は、感染した状態を引き起こす突然変異が生来の分子内に隠されている。従来の抗体は、変性した状態下での感染する形態を分別することが可能なだけであるが、小さくて暴露されているＡＲまたはＶＡＰはもっと内方に置かれたペプチドシーケンスを認識することが可能である。
【００７３】
（９）研究用途
ＶＡＰは、たとえば、プレート表面または組織などに結合し、検出レベルを高め、固定された表面に特定の化合物を配置し、トレーサ分子を適所に、または、特異的ＶＡＰについてコードする選択された遺伝子が、一時的に、持続的に、または制御された方法のいずれかで、細胞環境においてかかる遺伝子を翻訳することによって発現されるところであって、および、その標的とされた発現を介して、標的分子の機能的にノックアウトされるところに固定する。たとえば、受容体リガンドを模倣することは、正常なシグナル−導入経路と干渉することがあり得る、または酵素阻害物質として機能するＶＡＰは代謝経路と干渉することがあり得る。
【００７４】
上記の例とは異なり、それらの用途との組合わせにおいてマトリックスを形成する以下のカテゴリによって示されるように、ＶＡＰを適用することが可能な方法には共通するものがある。
【００７５】
１．  親和性クロマトグラフィ
ＶＡＰを適切な支持体に、たとえば、一列に、または直列に、または完全に連続運転される回転式の構成において使用することが可能であるクロマトグラフカラムに固定する。また、パイプ、チューブ、ラインフィルタなどを固定されたＶＡＰと一列に並べることも可能である。ＶＡＰを固定することが可能な支持物質は圧縮安定性、フロー特性、化学的不活性、温度安定性、ｐＨ安定性、溶剤安定性などについてのプロセス要件に合ったものを選択することが可能である。比較的圧縮ができない担持体が好ましく、特にシリカまたは硬質不活性ポリマーが好ましい。これらは産業用規模のクロマトグラフィにおいての使用に利点があるが、これは、アガロースなどの比較的柔らかい担持体に適用することが可能であるよりも、実質的に、より高圧で運転可能なカラムに詰めることが可能だからである。かかる種々の支持物質にタンパクを結合する結合手順はよく知られている。カラムに、選択したプロセス流を装填した後、ｐＨまたは塩濃度の変化などの周知の手順を介して、結合リガンドを、固定されたＶＡＰから放出させ、その後ＶＡＰを新たなサイクルのために再生することが可能である。選択されたＶＡＰが高度に安定であるために、例外的に、それらを繰り返しサイクルに適したものとし、したがって、このような回収および精製手順のコスト効率を改善する。親和性クロマトグラフィの原理および汎用性は非常に数多くの用途において広く述べられている。
【００７６】
２．不溶性ビーズは、ＶＡＰが固定される支持物質が適所に固定されていない、異なる形式の親和性クロマトグラフィであるが、たとえば、シリカ、金属、磁性粒子、樹脂などのビーズとして利用可能である。これらは、プロセス流において混合し、特定のリガンドをたとえば流動床または攪拌タンクにおいて結合させ、その後ビーズを重力、磁力、フィルタなどを用いて、単純な手順でプロセス流から分離させることが可能である。
【００７７】
３．ＶＡＰと標的リガンドを架橋することによる、そのリガンドの凝結。それによってその溶解性を低下させ、沈殿によりリガンドを濃縮する。この目的のために、ＶＡＰは２価であるべきであり、すなわち少なくとも２つのＡＲをスキャッフォールドのいずれか側に構築せねばならない。この２つのＡＲは同じ分子標的を有し得るが、２つの異なる分子標的は架橋または凝集効果を与えるには好ましい。
【００７８】
４．加工工程中に感受性モチーフを保護するために特定の分子をマスキングする。これによって好ましくないｐＨ、温度または溶媒条件に対する標的リガンドの安定性を高める、または、変質または劣化酵素に対する耐性を高める。分子マスキングの他の機能的効果は、揮発性分子のマスキングであり、これによってかかる分子のセンソリ認識力を変えることが可能である。それに対して、かかる分子のＶＡＰからのゆっくりとした条件付の解放を、より下流のプロセス行程において、消費または消化中に、または、生物医薬または研究用途にとって適切な部位にＶＡＰリガンド錯体を標的した後に、予想することが可能である。また、特異的受容体結合能力を備えたＶＡＰを使用する揮発性化合物の模倣は、消費者用製品からの匂いのマスクに使用することが可能である。
【００７９】
５．不溶性物質をＶＡＰで被覆することによって、高度に特異的表面親和性特性を付与する、または、ＶＡＰまたは可能性としてのフュージョン製品（すなわち、ＶＡＰに化学的に結合されている製品、またはタンパクの場合には、ＶＡＰの特異性が変わることなく残るような方法でＶＡＰと共に共転化される製品）を特異的表面に結合する。たとえば、ＶＡＰを使用して、特異的分子をたとえば組織にプレート上で固定し、検出レベルを高め、固定された表面に特定の化合物を局在化し、トレーサ分子を適所に固定する。
【００８０】
自然スキャッフォールドがすべて商業的および／または工業的観点から興味深いわけではない。たとえば、全タンパクの安定性および感受性は、提案された用途に付随する要件を満足するものでなければならない。酸性環境におけるリガンド結合タンパクは、それ自体においては、高レベルの塩環境または高温の環境においては有用なものではない。すべてのスキャッフォールドにとっての１つのものとして機能する可能性のあるすべての特性を有する１つのスキャッフォールドをデザインすることはできない。たとえば、感受性の鈍い、蛋白質分解スキャッフォールドを必要とする用途がある一方で、他の用途はスキャッフォールド中に特異的プロテアーゼ切断部位を必要とする。これらの用途および多くの他の用途のために、すべての要件を満足させる１つのスキャッフォールドをデザインすることは不可能である。それゆえ、我々は異なるスキャッフォールドをデザインし、これらのスキャッフォールドを異なる要件を満たすように適合させた。本発明に示すように、熱安定性、広範なｐＨ抵抗、および高い塩濃度においてすら結合するリガンドなどの特性を有するスキャッフォールドをデザインし構築することが可能である。さらにまた、これらのスキャッフォールドを、リガンド特異性を変えずに、たとえば、システインブリッジの導入または除去、または、可能性として存在するＮ−グリコシル化部位の除去など、コア中のアミノ酸、または内側または外側に向けられたアミノ酸のいずれかを変えることによって、必要な特性に適合させることが可能である。このことを心にとめ、リガンド結合ドメインの特性と空間的位置とを変えることなく、多種のリガンド結合環境において使用することが可能なスキャッフォールド構築することが可能である。以上に説明されたＭＡＳＴ技術によって、選択された親和性領域を１つのスキャッフォールドから別のスキャッフォールドにそれらのリガンド特異性を失うことなく交換することが可能であり、すなわち、一旦選択された親和性を、スキャッフォールドを変えるだけで、いくつかの異なる用途に使用することができるということを意味している。
【００８１】
本発明はさらにまた、タンパク様分子、それのための方法、それを使用した方法、またはその使用を提供し、かかるタンパク様分子は、表２,３,１０,１３,または１６に挙げた分子を有する。
【００８２】
実施例
実施例１
コア座標の決定
免疫グロブリン様（ｉｇ様）折りたたみ構造は、自然全体に渡って大変普遍的である。多くの蛋白質は、特に動物界において、この分類に属する蛋白質内に折りたたみ構造領域を有する。ｉｇ様折りたたみ構造を含有する蛋白質の機能を調べるとともに、その特定の蛋白質内のこのｉｇ様折りたたみ構造の機能を調べると、全部ではないが、これらのドメインの多くがリガンド結合に関与していることが明らかである。蛋白質を含有するｉｇ様折りたたみ構造のいくつかの例は、Ｖ−ＣＡＭ、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、免疫グロブリン定常領域、Ｔ細胞受容体、フィブロネクチン、レオウイルス外殻蛋白質、ベータガラクトシダーゼ、インテグリン、ＥＰＯ受容体、ＣＤ５８、リブロースカルボキシラーゼ、デスルホフェロドキシ(desulphoferrodoxine)、スーパーオキシド様、ビオチンデカルボキシラーゼ、およびＰ５３コアＤＮＡ結合蛋白質である。多くのｉｇ様折りたたみ構造の分類は、ＳＣＯＰデータベース（Murzin A. G et al, 1995; http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop）と、ＣＡＴＨ（O rengo et al, 1995; http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/index.html）とから得ることができる。ＳＣＯＰは、これらの折りたたみ構造を、免疫グロブリン様ベータサンドイッチを有する全てのベータ蛋白質として分類し、ここにおいて、折りたたみ構造を含有するいくつかのメンバーは追加のストランドを有するけれども、このサンドイッチは、２つのシート中に７本のストランドを含有する。ＣＡＴＨは、これらの折りたたみ構造を、主として、コード２．６０．４０で示された免疫グロブリン様折りたたみ構造におけるサンドイッチ様の構造を有するベータ蛋白質として分類する。ＣＥ（Shindyalov et al. 1998; http://cl.sdsc.edu/ce.htm）、ＶＡＳＴ（Gibrat et al., 1996; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml）、およびＦＳＳＰ（Holm et al, 1998; http://www.ebi.ac.uk/dali/fssp）のような構造データベースにおいて、類似の分類が用いられている。
【００８３】
Ｃｎ３Ｄ（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml）、インサイトII（MSI; http://www.accelrys.com/insight）およびその他の構造ビューアのソフトウェアを用いるこれらの折りたたみ構造の投影は、ｉｇ様折りたたみ構造が種々のサブドメインを有することを示した。構造の概略的な投影が図３のＡに表される。最も保存された構造は、折りたたみ構造の中心部、すなわちコアにおいて観察された。コア構造は、長さにおいてほとんど異ならず、相対的な保存された空間的制約を有するが、これらは、配列およびアミノ酸組成の両方において、大きく異なることが発見された。コアの両側には、極めて可変的なサブドメインが存在し、これらは、連結ループと称される。これらの連結ループは、アミノ酸内容物、配列、長さおよび立体配置において異なり得る。したがって、コア構造は、これらの蛋白質内の最も重要なドメインとして指定される。コアを形成するベータエレメントの数は、６ストランドのコア構造は重要なものとなり得るけれども、７〜９の間で異なり得る。ベータエレメントは、２つのベータシートにおいて全て配置される。各ベータシートは、逆平行のベータエレメントの配向から構築される。観察された１つのベータシートにおける最も少ない数のベータエレメントは、３つのエレメントである。観察された１つのベータシートにおける最も多い数のベータエレメントは、５つのエレメントである。より多い数のベータエレメントが可能であろう。連結ループは、バレルの一方側にベータエレメントに連結する。いくつかの連結は、ベータシートを交差する一方で、その他は、１つのベータシート内に位置するベータエレメントに連結する。特に、Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６よびＬ８と示されるループは、リガンド結合のために現実に用いられる。Ｌ１、Ｌ３、Ｌ５およびＬ７ループの長さ、構造、配列およびアミノ酸組成における相当な多様性は、これらのループが、少なくとも人工的な形式でリガンド結合にも用いられることを明らかに示す。
【００８４】
コアの内部に向かって突出し、コアの中心部でスペースを満たす、現実のコアを形成するベータエレメントにおけるアミノ酸の側鎖は、折りたたみ構造を安定化させるために、Ｈ結合、共有結合（システイン架橋）およびその他の力を介して互いに相互作用し得る。内部に並ぶベータエレメント部分の残基のアミノ酸組成および配列が極めて可変であると発見されたので、多くのその他の構成がまた形成され得るという結論が下された。
【００８５】
このｉｇ様折りたたみ構造を含有する新しいタイプの蛋白質の設計に関する出発点として、構造の基本概念を得るために、ｉｇ様折りたたみ構造を含有するドメインの投影が用いられた。インサイト(Insight)II、Ｃｎ３Ｄ、およびモデラー(modeller)プログラムを、最低限のエレメントおよび長さを測定するために用いた。加えて、アミノ酸の識別情報を全く重要性のないものとして決定したので、構造のＣアルファ原子のみを投影した。なぜなら、これらは、折りたたみ構造の最低限の特性を表すからである。これらのベータエレメントの空間的位置（座標）のわずかの相違は許容された。９つのベータエレメントを含有するこのような構造の４つの例を測定し、ＰＤＢ形式（座標描写、表１を参照のこと）に変換したが、構造内の多くのわずかの相違はまた、ｉｇ様折りたたみ構造の定義（たとえばＣＡＴＨおよびＳＣＯＰを参照のこと）に従う折りたたみ構造である限り、重要なものと推測された。ｉｇ様折りたたみ構造のコアのＣアルファ原子の座標を表すこれらのＰＤＢファイルを、新しい９、８、７および６のベータエレメントを含有する構造の開発に用いた。８ストランド構造に関して、ベータエレメント１または９が除外されてもよいが、エレメント４または５が除外されてもよい。７ストランド構造に関しては、ベータエレメント１および９を除去し、または好ましくはエレメント４および５を除外した。エレメント４および５の除外は、空間的制約のために好ましい（図３）。６ストランド構造は、好ましくはエレメント１、４および５、または４、５および９を欠失するが、その他の形式もまた、インサイトおよびモデラーで分析されるとともに、工学目的のために十分信頼されるように示された（図３Ｃ）。
【００８６】
実施例２
９ストランド折りたたみ構造の設計
蛋白質の折りたたみは、アミノ酸バックボーン原子とアミノ酸の側鎖に存在する原子との間の相互作用に左右される。ベータシートが両方のタイプの相互作用に左右される一方で、２つのベータシート間、たとえば前述の構造間の相互作用は、主として、対向する残基のアミノ酸側鎖の相互作用を介して仲介される。アミノ酸側鎖の空間的制約、物理的かつ化学的な特性は、特異的構造および折りたたみ構造に関する可能性と、と、したがって、折りたたみ構造または構造における特定の位置で用いられ得るアミノ酸のタイプとを限定する。空間的制約を満たすアミノ酸配列と、前述の構造（実施例１）の３次元構造に適した特性とを得るために、３次元分析ソフトウェア（モデラー(Modeller)、プロサ(Prosa)、インサイトII、ホワットイフ(What if)、およびプロチェック(Procheck)）を用いた。現在のコンピュータの計算力、ならびに限定されたモデルの正確度およびアルゴリズムの信頼性は、計算かつ評価され得る残基および推測上の構造の数を限定する。
【００８７】
前述のような９ベータストランド折りたたみ構造を形成し得るアミノ酸配列を得るために、異なるレベルの検査を必要とし、たとえばＰＤＢファイル１に記載されるようにＣアルファバックボーントレースで開始する。第１に、折りたたみ構造の内部が、設計され、かつ検査される必要がある。第２に、ベータエレメント連結ループが、付着され、かつ計算される必要がある。第３に、外部のアミノ酸、すなわち環境にアミノ酸側鎖を露出するアミノ酸が、得られた推定折りたたみ構造を妨げることなく適応することが必要とされる。加えて、外部アミノ酸側鎖は、好ましくは、可溶性のある産生物を生じさせなければならない。第４および最後の段階において、全体のモデルが、偶然に導入された空間的不調和に関して再計算される。不和合性を引き起こすアミノ酸残基は、より正確でかつ信頼性のある適応性を示すアミノ酸と置換される。第１段階において、前述および実施例１の基準を満たす、正確に折りたたまれた二重ベータシート構造の内部を並べるアミノ酸配列を、たとえばＶＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml）における構造配列に関してＰＤＢファイルを提示することによって得た。ＰＤＢファイル１に示すようなＰＤＢファイルの提示は、数千のヒットをすでに生じさせた。これらの蛋白質の大部分は、ここで意味する折りたたみ構造としてＳＣＯＰまたはＣＡＴＨ（前述を参照のこと）に従って分類される少なくとも１つのドメインを含有する蛋白質である。
【００８８】
提示された構造の内部を並べるいくつかのユニークな配列を、産生物例の産生のために用いた。この構造配列実験からの関心ある配列を、分類と、２乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ値）と、ＶＡＳＴスコア値（高い値ほど、より正確な適応を示す。）と、配列識別情報と、種の起源と、ヒットから提示された生物学的機能との基準で、選択した。フィブロネクチン様蛋白質、抗体関連蛋白質、細胞接着分子、ウイルスコア蛋白質、および多くのその他としての構造。Ｃアルファバックボーンによって表される構造は、コア構造と称される。
【００８９】
第２の段階において、ループを、得られた産生物に付着した。最終産生物の構造を解明するいくつかの分析方法が用いられてもよいが、最も魅力的な特徴は、完全な機能的リガンド結合特性を有するコア配列中の親和性領域の提示であろう。最終産生物の機能性を検査するために、既知のリガンドを認識する親和性ループを、コア構造に移植することができる。抗ニワトリリゾチーム（１ＭＥＬとして知られている構造）がよく記録され、これらの親和性領域（抗体においてＣＤＲ’ｓと呼ばれる。）の特徴がはっきりと記載されるので、これらのループを、第１段階において記載した方法を介して得たコア配列中の正確な位置で挿入した。正確な位置を、構造配列、すなわち、１ＭＥＬの３次元構造を記載しているファイル（ＰＤＢファイル、例）ですでに得られた折りたたみ構造の重複投影を介して決定した。類似の投影およびそれに続くループの移植を、１ＢＺＱ（ＰＤＢ）によって記載された構造から抽出されたウシＲＮａｓｅＡ結合親和性領域に関して実行した。移植された親和性ループは、ベータエレメントの一端をその他の端に連結する。親和性領域１は、ベータエレメント２と３とを結合し（Ｌ２）、ＡＲ２は、ベータエレメント４と５とを連結し（Ｌ４）、ＡＲ３は、ベータエレメント６と７とを連結し（Ｌ６）、ＡＲ４は、ベータエレメント８と９とを連結する（Ｌ８）。各ベータエレメントの他端部を、ループによって連結し、このループは、エレメント１および２（Ｌ１）、エレメント３および４（Ｌ３）、エレメント５および６（Ｌ５）、エレメント７および８（Ｌ７）をそれぞれ連結する（図３Ａの概略的な投影を参照のこと）。もちろん、あらゆる種類のループが、ベータエレメントを連結するために用いられてもよい。ループ配列源およびループ長は、たとえば、ループモデリング（ソフトウェア）を介して得られたループと、ＳＣＯＰおよびＣＡＴＨなどの指示された分類に記載された自然発生的なループからの利用可能なデータから得られたループとを包含する。ループ１（Ｌ１）、ループ３（Ｌ３）、ループ５（Ｌ５）、およびループ７（Ｌ７、図３Ａ）を表すループのＣアルファバックボーンを、たとえば１ＮＥＵ、１ＥＰＦ−Ｂ、１ＱＨＰ−Ａ、１ＣＷＶ−Ａ、１ＥＪ６−Ａ、１Ｅ５０−Ｃ、１ＭＥＬ、１ＢＺＱおよび１Ｆ２Ｘのような構造から選択したが、類似の結果を有する多くのその他のものを用いてもよかった。たとえば構造１ＥＰＦ、１ＮＥＵ、１ＣＷＶ、１Ｆ２Ｘ、１ＱＨＰ、１Ｅ５０および１ＥＪ６のＰＤＢファイルに存在する構造情報から得られたループ位置とともに、前述の第１段階で得られたコア構造の３次元配列は、強力なコンピュータと、Ｃｎ３Ｄ、モデラー、および／またはインサイトソフトウェアとを用いて、実現された。対応するループを、第１段階のモデル中の正確な位置に挿入した。ループは、ある程度のエネルギおよび／または空間的自由が存在し得るので、コアに正確に適合することを必要としない。実際にループを形成するアミノ酸のタイプ、およびループ内のこれらのアミノ酸の位置は、ループのこのエネルギの自由度を決定する。種々の源からのループが、ループ領域をシャッフルするために用いられてもよい。この特徴は、種々のループが、物理的特性、化学的特性、発現的特性、翻訳後修飾など、種々の特性を有するので、将来の蛋白質における新しい特徴を実現することができる。同様に、ベータエレメントの数が減少することに起因してより少ないループを含有する構造が、９つのベータエレメントおよびこれらに対応する数のループを有する蛋白質に変換されてもよい。ここで、たとえば１ＥＰＦ、１ＱＨＰ、１Ｅ５０および１ＣＷＶのような７ストランド蛋白質のループのＣアルファトレースバックボーンが、９ストランドコア鋳型のための鋳型として用いられ得ることが、実証される。この場合において、追加のループ（Ｌ３）を、９ストランド鋳型１Ｆ２Ｘから取り出したが、評価分析に従って信頼性を有するその他のループも用いることができた。蛋白質構造の内部を示すアミノ酸側鎖の性質は、空間的制限によって制限され、かつ決定された。したがって、いくつかの限定された構造が、モデリングソフトウエアを用いて３次元構造投影に従って可能であった。
【００９０】
第３段階において、外部に露出されるアミノ酸側鎖、すなわち環境において構造から突き出る側鎖の全ての可能性のある識別情報を、個別に各位置で計算した。最適な用途のために、非常に好ましい可溶性を有する蛋白質を用いることが好ましく、したがって、非疎水性のアミノ酸を選択した。このようなアミノ酸は、たとえばＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＴである。メチオニンに属するコドン（ＡＴＧ）が、異常な翻訳開始に起因してもう一方の蛋白質産生物を生じさせ得るので、好ましくは、メチオニンを除外した。また、遊離システインがシステイン−システイン結合を生じさせ得るので、システイン残基を除外した。したがって、遊離システインは、遊離システインを含有する望まれない共有蛋白質−蛋白質相互作用を生じさせ得る。グリシン残基は、極度の空間的制約を有する位置で導入され得る。これらの残基は側鎖を有さず、したがって、活性中は多少中性である。しかしながら、グリシン残基の相互作用する側鎖の極度の柔軟性および欠損は、不安定化を招き、したがってグリシン残基は一般的に用いられなかった。
【００９１】
第４の段階において、モデルを、モデラーを用いて評価した。モデラーを、適切なときにシステイン−システイン架橋を受け入れるようにプログラムした。次いで、全ての予測された蛋白質構造を、プロサII（http://www.came.sbg.ac.at/Services/prosa.html）、プロチェック、およびホワットイフ（http://www.cmbi.kun.nl/What if）で評価した。−４．７１未満のプロサＩＩｚｐ−ｃｏｍｂスコアは、in vivoで所望のベータモチーフ(beta motif)に折り重なり得る蛋白質配列を示すと推測された。表１に示される７つの蛋白質配列は、前述の全ての基準を満たす許容可能な解決手段の収集を示す。プロチェックおよびホワットイフ評価はまた、これらの配列がモデルに適合し、信頼性を有することを示した（たとえば０．８０よりも大きいｐＧ値、Sanchez et al., 1998）。
【００９２】
実施例３
合成スキャッフォールドの組立て
合成ＶＡＰを、これらの予測された３次元構造に基づいて設計した。アミノ酸配列（表３）を、腸内細菌遺伝子発現（インフォマックス(Informax)社製、ベクターＮｔｉ(Vector Nti)）に関する好ましいコドン使用頻度を用いて、ＤＮＡ配列（表４）に翻訳し戻した。得られたＤＮＡ配列を、将来のクローニングステップｗｐ妨害するかもしれない望まれない制限部位に関して検査した。このような部位を、アミノ酸コドンを変化させることなくＤＮＡ配列を変化させることによって除去した。次いで、ＤＮＡ配列は、ＡＴＧ開始コドンを導入するために、５´末端においてはＮｄｅＩ部位を、３´末端においてはＳｆｉＩ部位を形成するように適合され、両方とも一方向クローニングの目的のために必要とされる。ＰＣＲの組立ては、次の４つのステップからなる。オリゴプライマー設計（オペロン(operon)社でオーダーされる）、遺伝子組立て、遺伝子増幅、およびクローニング。スキャッフォールドを、次の方法で組み立てた。第１に、ＤＮＡ配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を、約３５ｂｐのオリゴヌクレオチドプライマーに分割し、かつ対向するストランドをコード化するオリゴヌクレオチドプライマー対を、これらが約１６〜１７塩基の相補的な重複を有するようにして設計した。第２に、各合成スキャッフォールドについて全てのオリゴヌクレオチドプライマーを、等モル量で混合し、１００ｐｍｏｌのこのプライマー混合物を、３０秒９２℃、３０秒５０℃および３０秒７２℃の３５サイクルで、最終容量５０μＬの１ｕｎｉｔＴａｑポリメラーゼ（ロシュ(Roche)社製）、１ｘＰＣＲ緩衝液＋ｍｇＣｌ２（ロシュ社製）および０．１ｍＭのｄＮＴＰ（ロシュ社製）を用いるＰＣＲ組立て反応に用いた。第３に、５μＬのＰＣＲ組立て産生物を、合成スキャアフォールドの両方の外側プライマー、１ＵｎｉｔＴａｑポリメラーゼ、１ｘＰＣＲ緩衝液＋ｍｇＣＬ２、および最終容量５０μＬの０．１ｍＭのｄＮＴＰを用いる、３０秒９２℃、３０秒５５℃、１分７２℃の２５サイクルの標準的なＰＣＲ増幅反応で用いた。第４に、ＰＣＲ産生物を、アガロースゲル電気泳動法で分析し、正確なサイズのＰＣＲ産生物を、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩで消化するとともに、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩで線状にされたベクターｐＣＭ１２６に連結反応させた。連結反応産生物を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２％のグルコースとを含有する２ｘＴＹプレートにおいて３７℃で夜通し成長したＴＯＰ１０感応細胞（インビトロジェン(InVitrogen)社製）に転換した。単一のコロニーを、１００μｇアンピシリンを含有する培養液中で成長させ、プラスミドＤＮＡを、単離し、配列分析のために用いた。
【００９３】
実施例４
発現ベクターＣＭ１２６の構築
ｐＥＴＡに基づく有効な蛋白質発現（ＣＭ１２６、図４Ａを参照のこと）のためのベクターを構築した。好都合な制限部位、リンカー、ＶＳＶタグ、６倍Ｈｉｓタグおよび停止コドンを含むダミーＶＡＰ、ｉＭａｂ１００を挿入した（表４，３を参照のこと）。その結果、シグナルペプチドＯｍｐＴをｐＥＴ−１２ａから削除した。ｉＭａｂ１００を、５´ＮｄｅＩオーバーハング配列を含有するフォワードプライマー１２９（表５を参照のこと）と、全てのリンカー、タグ配列およびＢａｍＨＩオーバーハング配列を含有する非常に長いリバースオリゴヌクレオチドプライマー３０６（表５を参照のこと）とを用いてＰＣＲ増幅した。増幅後、ＰＣＲ産生物およびｐＥＴ−１２ａを、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ゲル精製の後、産生物を製造手順に従ってキアゲン(Qiagen)ゲル溶出システムを介して精製した。ベクターとＰＣＲフラグメントとを、連結反応させ、E.coliＴＯＰ１０細胞に電気穿孔法で形質転換した。正確なクローンを選択し、配列によってこれらの配列を確認した。ダミーＶＡＰを含むこのベクターは、その他のＶＡＰの発現分析のための基本ベクターとして作用した。その他のＶＡＰの挿入を、プライマー１２９および５１（表５を参照のこと）による増幅と、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩによる消化と、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩで消化したＣＭ１２６への連結反応とによって実行した。
【００９４】
実施例５
ｉＭａｂ１００の発現
E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン(Novagen)社製）を、発現ベクターＣＭ１２６−ｉＭａｂ１００で形質転換した。細胞を、アンピシリン（２００μｇ／ｍＬ）を補充された５０ｍＬの２＊ＴＹ培地（１６ｇ／Ｌのトリプトン，１０ｇ／Ｌの酵母エキス，５ｇ／ＬのＮａＣｌ（メルク(Merck)社製））を含有する２５０ｍＬのシェイカーフラスコ中で成長させ、かつ３０℃で攪拌した。イソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、蛋白質発現が開始するように、ＯＤ（６００ｎｍ）が１に達したときに最終濃度０．２ｍＭで加えた。これらの細胞を、ＩＰＴＧの追加から４時間後に採集し、遠心分離し（４０００ｇ，１５分、４℃）、ペレットを、使用されるまで−２０℃で保存した。
【００９５】
蛋白質発現を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。これは、ｉＭＡｂ１００を発現するE.coliＢＬ２１（ＣＭ１２６−ｉＭａｂ１００）に関して、図Ｘレーン２において実証される。
【００９６】
実施例６
加熱による封入体からのｉＭａｂ１００蛋白質の精製
ｉＭａｂ１００を、実施例５において記載されるようにE.coliＢＬ２１（ＣＭ１２６−ｉＭａｂ１００）中で発現させた。多くの発現されたｉＭａｂ１００を、封入体に挿入した。これは、図Ｘレーン３において実証され、これは溶解（フレンチプレス（French press））およびそれに続く遠心分離（１２，０００ｇ，１５分）の後のE.coliＢＬ２１（ＣＭ１２６）の可溶性蛋白質を表す。封入体を次のように精製した。（５０ｍＬの培養液からの）細胞ペレットを、５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８）中で、２０ｇｃｄｗ／Ｌまで再懸濁するとともに、冷たいフレンチプレス細胞破砕機（シム・アミンコ(Sim-Aminco)社製）に２回通過して溶解した。封入体を、遠心分離（１２，０００ｇ，１５分）によって収集するとともに、膜結合蛋白質を可溶性にし、かつ除去するために１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＩＣＮ）を含有するＰＢＳ中で再懸濁した。遠心分離（１２，０００ｇ，１５分）後、ペレット（封入体を含有する）を、ＰＢＳで２回洗浄した。単離された封入体を、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で再懸濁し、１０分間６０℃でインキュベーションした。これは、図５において実証されるようにｉＭａｂ１００のほぼ完全な可溶化を生じさせた。レーン１は、ｉＭａｂ１００の単離された封入体を表す。レーン２は、１０分間、６０℃で、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で、単離された封入体のインキュベーション後の、可溶化されたｉＭａｂ１００を表す。上清を、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）スーパーフロー(superflow)カラムに搭載し、キアゲン社によって記載された標準プロトコルに従って精製した（ＱＩＡエクスプレッショニスト（商標），第５版，２００１）。精製されたｉＭａｂ１００とニワトリリゾチームとの結合が、ＥＬＩＳＡによって（実施例８に従って）分析され、表６にまとめられている。
【００９７】
実施例７
尿素およびマトリクス支援リホールディングを用いる、封入体からのｉＭａｂ１００蛋白質の精製
代替的に、ｉＭａｂ１００を、８ｍの尿素を用いて封入体から可溶化するとともに、マトリクス支援リホールディングによって活性型に精製した。封入体を、実施例６に記載されたように準備し、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ８）＋８ｍの尿素中で可溶化した。可溶化された蛋白質を、遠心分離（１２，０００ｇ，３０分）によって不溶性の材料から透明化し、続いて、ＰＢＳ（ｐＨ８）＋８Ｍの尿素で平衡化されたＮｉ−ＮＴＡスーパーフローカラム（キアゲン社製）に搭載した。非特異的蛋白質を、４容量のＰＢＳ（ｐＨ６．２）＋８Ｍの尿素によってカラムを洗浄することによって溶出した。結合されたＨｉｓタグされたｉＭａｂ１００を、室温でＰＢＳ（ｐＨ８）中の尿素濃度を段階的に低下させることによって、カラム中でリホールディングを可能にした。カラムを、２容量のＰＢＳ＋４Ｍの尿素で洗浄し、続いて、２容量のＰＢＳ＋２Ｍの尿素、２容量のＰＢＳ＋１Ｍの尿素、および２容量の尿素無しのＰＢＳで洗浄した。ｉＭａｂ１００を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（ｐＨ８）で溶出した。溶離されたｉＭａｂ１００が、ＰＢＳ（ｐＨ８）（４℃）に対して夜通し透析し、凍結乾燥によって濃縮され、そして結合および構造測定のために特徴付けられた。
【００９８】
ｉＭａｂ１００の精製された画分を、図６レーン１３において実証されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９９】
実施例８
ｉＭａｂ１００蛋白質とニワトリリゾチームとの特異的結合（ＥＬＩＳＡ）
ｉＭａｂ蛋白質とターゲット分子との結合を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡを、所望の抗原（ニワトリリゾチームなど）でマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルをコーティングするとともに、適切なブロッキング物質、たとえば３％スキムミルクパウダー溶液（ＥＬＫ）でブロッキングすることによって実行した。単一のコロニー由来の精製されたｉＭａｂ蛋白質または精製されたファージ（１０８〜１０９）を、各ウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートを、プレートウォッシャー（バイオテック(Bio-Tek Instruments)社製）を用いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで過度に洗浄した。結合されたｉＭａｂ蛋白質またはファージを、抗ＶＳＶ−ｈｒｐ複合体（ロシュ社製）または抗Ｍ１３−ｈｒｐ複合体（ファーマシア(Pharmacia)社製）をそれぞれ用いて標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって検出した。比色分析アッセイを、基質としてＴｕｒｂｏ−ＴＭＢ（３，３´，５，５´―テトラメチルベンジジン，ピアース(Pierce)社製）を用いて実行した。ｉＭａｂ１００とニワトリリゾチームとの結合を、次のとおり検定した。１００μＬにおける精製されたｉＭａｂ１００（〜５０ｎｇ）を、ＥＬＫ（対照）またはリゾチーム（＋ＥＬＫ（ブロッキング物質として））のいずれかで好ましくコーティングされたマイクロタイタープレートに加え、テーブルシェイカー（３００ｒｐｍ）上で室温１時間でインキュベーションした。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ（３回）、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（３回）、およびＰＢＳ（３回）で過度に洗浄した。結合されたｉＭａｂ１００を、抗ＶＳＶ−ＨＲＰ複合体（ロシュ社製）を含有する１００μＬのＥＬＫとウェルを１時間室温でインキュベーションすることによって検出した。
【０１００】
ＰＢＳ（３回）、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（３回）、およびＰＢＳ（３回）を用いて過度に洗浄した後、ウェルを１００μＬのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢと５分間インキュベーションした。反応を、１００μＬ、２ＭのＨ２ＳＯ４で停止し、吸光度をマイクロタイターリーダ（バイオラッド(Biorad)社製）を用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１０１】
実施例６および実施例７に記載されたように調製された精製ｉＭａｂ１００は、ニワトリリゾチームに強く特異的に結合するようであり、このことは表６に示されている。
【０１０２】
実施例９
サイズ排除クロマトグラフィ
ｉＭａｂ１００を実施例７に記載されたように精製した。精製されたｉＭａｂ１００について、移動相として４０％アセトニトリル、６０％ミリＱ、および０．１％ＴＦＡを有するＳｈｏｄｅｘ８０３カラムを用いて分子量分布を分析した。９０％の蛋白質は、分子量２１．５ｋＤに対応する１４．７分の保持期間で溶出した。これは、コンピュータ計算された分子量（１９．５ｋＤ）とよく一致しており、多くの蛋白質が単量型で存在することを示す。
【０１０３】
実施例１０
９５℃でのｉＭａｂ１００の長期的な安定性
ｉＭａｂ１００の安定性を、ＥＬＩＳＡによって９５℃で測定した。１０μｇ／ｍＬのｉＭａｂ１００を、１０分〜２．５時間、９５℃まで加熱し、非加熱のｉＭａｂを投入対照として用いた。
加熱後、試料を、２０℃で配置し、検定されるまで維持した。
【０１０４】
これらの試料のリゾチーム結合を、１：２０００にＰＢＳ中で希釈した抗ＶＳＶ−ｈｒｐ（ロシュ社製）を用いてＥＬＩＳＡ測定によって試験した。ＴＭＢ−ウルトラ（ピアース社製）を、ｈｒｐ酵素レベルのために、基質として用いた（図７）。ｉＭａｂ１００は、高温で非常に安定であった。活性の非常に緩やかな減少が検出された。
【０１０５】
実施例１１
２０℃でのｉＭａｂ１００の長期的な安定性
ｉＭａｂ１００の安定性を、２０℃で５０日の期間にわたって測定した。ｉＭａｂ１０（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、２０℃で配置した。７日毎に、試料を採取し、各試料を、実験条件の機能停止および凍結を防止するために少なくとも２時間−２０℃で保存した。試料を、ＰＢＳで２００倍希釈した。これらの試料のリゾチーム結合を、１：２０００にＰＢＳ中で希釈した抗ＶＳＶ−ｈｒｐ（ロシュ社製）を用いてＥＬＩＳＡ測定によって試験した。ＴＭＢ−ウルトラ（ピアース）を、ｈｒｐ酵素レベルのために基質として用いた（図８）。ｉＭａｂ１００は、室温で非常に安定的であった。ｉＭａｂ１００の活性は、長期にわたってほとんど減少せず、したがって、ｉＭａｂスキャッフォールドおよびその親和性領域が極めて安定的であると結論付けることができる。
【０１０６】
実施例１２
ｉＭａｂ１００のサイズ測定、ｐＨ４．８環境に対する抵抗性のゲルによる試験に、精製されたｉＭａｂ１００（図６に記載されたような）を、酢酸カリウムを用いて(最終濃度５０ｍＭ)ｐＨ４．８にし、蛋白質の沈殿を生じさせた。沈殿物を、遠心分離（１２０００ｇ，３０分）によって採集し、ｐＨ７．７のＰＢＳ中で溶解し、続いて残りの沈殿物を除去するために０．４５μｍフィルタで濾過した。
【０１０７】
ｐＨショック前後の試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングによって分析するとともに、ＥＬＩＳＡを用いて結合を調べた（実施例８）。
【０１０８】
全てのｉＭａｂ１００が、ｐＨ４．８で沈殿され、ｐＨ７．５のＰＢＳ中へ再溶解し濾過後に完全に回収し得ることが実証された。ＥＬＩＳＡ測定は、沈殿およびそれに続く可溶化が活性の損失を生じさせないことを実証した（表７）。ＶＳＶタグが精製および沈殿の期間中損なわれないこと、および分解産物が形成されないことが確認された。
【０１０９】
実施例１３
スキャッフォールドの構造分析
ｉＭａｂ１００の構造を、円偏光二色性偏光計（ＣＤ）を用いて分析し、別の構造と比較した。参考として、Ｖｈｈ分子である、Ｖｈｈ１０−２／２７１１０２（、Kuwaaitaal  ワーヘニング大学からの親切な贈与）を含有する自然発生的な９ベータストランドを測定した。両方の蛋白質は、Ｃ末端に付着されたタグを有する。これらのタグのアミノ酸配列および長さは同一である。これらの２つの蛋白質間の構造的な相違のみが、ＣＤＲ３（Ｖｈｈ）対応親和性ループ４（ｉＭａｂ１００）に存在する。システム設定は、感受性＝標準（１００ｍｄｅｇ）、開始＝２６０ｎｍ、終了＝２０５ｎｍ、インターバル＝０．１ｎｍ、遅れ＝１秒、速度＝５０ｎｍ／分、蓄積＝１０であった。
【０１１０】
ｉＭａｂ１００およびＶｈｈ１０−２／２７１１０２を、ｐＨ７．５のＰＢＳおよびＣＣＤ２８０  １．０において純度９８％で準備した。試料を、０．１ｃｍクオーツキュベットに搭載し、ＣＤスペクトルを、コンピュータ制御されたＪＡＳＣＯコーポレーションＪ−７１５分光偏光計ソフトウェア（スペクトルマネージャ、バージョン１．５３．００、ＪＡＳＣＯコーポレーション（日本分光株式会社）製）で測定した。ベースライン補正を、ＰＢＳのスペクトルを測定することによって得た。得られたＰＢＳ信号を、溶媒および塩効果を補正するために、全ての測定からの基礎とした。各試料による初めの測定を、最大の信号を測定するために行った。必要に応じて、試料を、光電子増倍管信号の最適の分解能のために、１倍ＰＢＳで希釈した。ＲＮａｓｅＡのＰＢＳ溶液を、ＣＤ装置を検証するために用いた。観察されたＲＮａｓｅＡのスペクトルは、ｉＭａｂ１００およびＶｈｈスペクトルと比較すれば、完全に相違した。図９Ｌは、遠紫外線(far-UV)（２０５〜２６０ｎｍ）におけるｉＭａｂ１００およびＶｈｈ蛋白質のＣＤスペクトルを表す。大部分のスペクトルパターンは同一であった。スペクトルの相違が、２２０ｎｍ未満の波長で主として観察された。スペクトルの観察された相違は、おそらく、ＣＤＲ３／ＡＲ４の構造的相違における相違に起因する。ｉＭａｂ１００中のＡＲ４の構造は、これは１ＭＥＬから取り出されたが、ランダムコイル様として分類され得る。また、ｉＭａｂ１００に存在するＡＲ４は、Ｖｈｈ蛋白質のＣＤＲ３よりも約１０アミノ酸だけ長い。
【０１１１】
ｉＭａｂ１００蛋白質の温度安定性を、測定を行う温度が調節されることを除いては、ＣＤ−メーターを用いて類似の方法で測定した。
【０１１２】
室温での測定に加えて、折りたたみおよびリホールディングを、２０、５０、８０（図示しない）および９５℃でアッセイした。希釈されたＰＢＳ中の新鮮なｉＭａｂ１００蛋白質溶液を、２０℃で第一に測定した。次いで、上昇する温度でのスペクトルを、測定し、最後に、２０℃のスペクトルを再測定した。ベースライン修正をＰＢＳのスペクトルで適用した（図９Ａ）。その結果は、上昇する温度での楕円率の漸増を示す。加熱後の２０℃スペクトルの再出現は、スキャッフォールドの完全なリホールディングを力強く示す。この結論はまた、ＥＬＩＳＡによる試料の後のリゾチーム結合能力検出によって、実証された（図示しない）。
【０１１３】
実施例１４
E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を、９βストランドを全て含有するｉＭａｂ１３０２、ｉＭａｂ１６０２、ｉＭａｂ１２０２およびｉＭａｂ１２２に関して、種々のＶＡＰ挿入物を含有する発現ベクターＣＭ１２６で形質転換した。成長および発現は、実施例５において記載されたものと類似していた。
【０１１４】
全ての９ストランドｉＭａｂ蛋白質を、実施例７に記載されたものと類似するマトリクス支援リホールディングによって精製した。ｉＭａｂ１３０２、ｉＭａｂ１６０２、ｉＭａｂ１２０２およびｉＭａｂ１２２の精製された画分を、図１０レーン１０、９、８および７にそれぞれ実証されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１１５】
実施例１５
種々の９ストランドｉＭａｂ蛋白質の、ニワトリリゾチームに対する特異的な結合（ＥＬＩＳＡ）
精製されたｉＭａｂ１３０２（〜５０ｎｇ）、ｉＭａｂ１６０２（〜５０ｎｇ）、ｉＭａｂ１２０２（〜５０ｎｇ）およびｉＭａｂ１２２（〜５０ｎｇ）を、実施例８に記載されるものと類似するＥＬＫ（対照）またはリゾチーム（＋ＥＬＫ（ブロッキング物質として））のいずれかとの結合について分析した。ＥＬＩＳＡは、表６に実証されるように、精製されたｉＭａｂ１３０２、ｉＭａｂ１６０２、ｉＭａｂ１２０２およびｉＭａｂ１２２の、ニワトリリゾチームとの特異的な結合を確認した。
【０１１６】
実施例１６
種々の９ストランドｉＭａｂのＣＤスペクトル
ｉＭａｂ１００、ｉＭａｂ１２０２、ｉＭａｂ１３０２およびｉＭａｂ１６０２を、実施例１４に記載されるように精製し、実施例１３に記載されるようにＣＤスペクトルについて分析した。ｉＭａｂ１２０２、ｉＭａｂ１３０２およびｉＭａｂ１６０２のスペクトルを、スキャッフォールドの安定性とリホールディング特性とを試験するために、２０℃、９５℃で、および２０℃に戻して測定した。対応するスペクトルを、それぞれ図９Ｄ、図９Ｅ、および図９Ｆにおいて実証する。２０℃で測定されるスペクトルを、二次構造の類似性の程度を測定するために、２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した（図９Ｊを参照のこと）。全ての異なる９ストランドスキャッフォールドが、同一であることを結論付けることができる。これは、これらのスキャッフォールドの基本構造が同一であることを示す。連続２０−９５−２０℃処理後得られたデータは、全てのスキャッフォールドがこれらの当初の配座に戻ることを明確に示す。
【０１１７】
実施例１７
７ストランドｉｇ様折りたたみ構造の設計
実施例２に記載されるような手順を、コアにおける７ベータエレメントおよび３＋３連結ループからなるｉｇ様折りたたみ構造を含有する配列の開発に用いた。この手順は、実施例２に記載されたような工程と同一である、新しい配列の開発が導かれる４つの段階を伴う。段階１において、９ストランドコア構造についてＰＤＢ表１に示されるようなＣアルファ原子の座標を、適合させた。ベータエレメント４および５を表すＣアルファ原子ＰＤＢファイルから除去し、結果としてコアの７ストランドの見本を生じさせた（ＰＤＢ表８）。ベータシートの内部に並ぶアミノ酸鎖を、実施例２に詳細に記載されるように得て、かつ挿入した。第２段階において、連結ループを加えた。１つの部位において、ベータエレメントを、構造１ＭＥＬまたは１ＢＺＱの抗ニワトリリゾチーム結合領域（Ｌ２、Ｌ６およびＬ８）から得られた抗ニワトリリゾチーム結合領域から取り出された親和性領域によって互いに連結した。構造の他端において、ベータエレメントを、いくつかの異なる源（１Ｅ５０、１ＣＷＶ、１ＱＨＰ、１ＮＥＵ、１ＥＰＦ、１Ｆ２ｘまたは１ＥＪ６）から得られたＣアルファバックボーントレースループと連結させた。ループの付着および適合に関する手順は、図２に詳細に記載される。第３段階において、コアおよびループ１，３，７に位置する蛋白質の溶解度を決定するアミノ酸側鎖を、図２に記載されるように決定した。最後の段階において、モデルを、インサイトを用いて構築した。インサイトを、適切なときにシステイン−システイン架橋を受け入れるようにプログラミングした。次いで、インサイトで構築された全ての予想される蛋白質構造を、プロサII、プロチェック、およびホワットイフで評価した。−４．７１未満のプロサIIｚｐ−ｃｏｍｂスコアは、in vivoで所望のｉｇ様ベータモチーフ折りたたみ構造に折り重なる蛋白質配列を示す（表９）と推測した。表１０に示される多数の例の配列は、信頼性を有するであろう収集物を表す。プロチェックおよびホワットイフ評価はまた、これらの配列が、モデルに対し、信頼性を有するものとして適合することを示した（たとえば、ｐＧ値は、０．８０よりも大きい。Sanchez et al., 1998）。
【０１１８】
実施例１８
E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を、７ベータストランドを全て含有するｉＭａｂ１３００、ｉＭａｂ１２００、ｉＭａｂ１０１およびｉＭａｂ９００に関する種々のＶＡＰ挿入物を含有する発現ベクターＣＭ１２６で形質転換した。成長および発現は、実施例５に記載されたものと類似であった。
【０１１９】
全ての７ストランドｉＭａｂを、実施例７に記載したものと類似するマトリクス支援リホールディングによって精製した。ｉＭａｂ１３００、ｉＭａｂ１２００およびｉＭａｂ９００の精製された画分を、図１０レーン２、３、５および６にそれぞれ実証されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２０】
実施例１９
精製されたｉＭａｂ１３００（〜５０ｎｇ）、ｉＭａｂ１２００（〜５ｎｇ）、ｉＭａｂ１０１（〜２０ｎｇ）およびｉＭａｂ９００（〜１０ｎｇ）を、実施例８に記載されるものと類似するＥＬＫ（対照）またはリゾチーム（＋ＥＬＫ（ブロッキング物質として））のいずれかとの結合に関して分析した。ＥＬＩＳＡは、表６において実証されるように、精製されたｉＭａｂ１３００、ｉＭａｂ１２００、ｉＭａｂ１０１およびｉＭａｂ９００と、ニワトリリゾチームとの特異的な結合を確認した。
【０１２１】
実施例２０
種々の７ストランドｉＭａｂ蛋白質のＣＤスペクトル
ｉＭａｂ１２００およびｉＭａｂ１０１を、実施例１８に記載されるように精製し、実施例１３に記載されるようにＣＤスペクトルに関して分析した。ｉＭａｂ１２００およびｉＭａｂ１０１のスペクトルを、スキャッフォールドの安定性とリホールディング特性とを試験するために、２０℃、９５℃、および２０℃に戻して測定した。対応するスペクトルは、図９Ｈおよび図９Ｇにそれぞれ明示されている。２０℃でｉＭａｂ１２００およびｉＭａｂ１０１のスペクトルを、二次構造の類似性の程度を測定するために互いに比較した（図９Ｋを参照のこと）。異なる７ストランドスキャッフォールドが一致して挙動することを結論付けることができる。これは、これらのスキャッフォールドの基本構造が同一であることを示す。さらに、９ストランドスキャッフォールド（実施例１６）から得られたシグナルは、ここで提示される７ストランドについて観察されたシグナルと類似しているので、両タイプのスキャッフォールドが同一の配座を有することも結論付けることができる。連続２０−９５−２０℃処理の後に得られたデータは、全てのスキャッフォールドがこれらの当初の配座のままであることを明確に示す。
【０１２２】
実施例２１
６ストランドｉｇ様折りたたみ構造の設計
実施例２および３に記載されるような手順を、コアおよび３＋３連結ループにおいて６ベータエレメントからなるｉｇ様折りたたみ構造を含有する配列の開発のために用いた。
この手順は、実施例２および３に記載されるような工程と同一の４つの段階を伴い、これらを通して新しい配列の開発を導く。段階１において、９ストランドコア構造に関してＰＤＢ表１に示されるようなＣアルファ原子の座標を、適合させた。ベータエレメント１、４および５を表すＣアルファ原子を、ＰＤＢファイルから除去し、その結果、コアの６ストランドの例を生じさせた（表１１）。ベータシートの内部に並ぶアミノ酸側鎖を、実施例２および３に詳細に記載されるように得、そして挿入した。第２段階において、連結ループを加えた。１つの部位において、ベータエレメントを、構造１ＭＥＬ、またはＩＢＺＱのウシＲＮａｓｅＡ結合領域から得られた抗ニワトリリゾチーム結合領域（Ｌ２、Ｌ６およびＬ８）から取り出された親和性領域によって互いに連結した。構造の他端において、ベータエレメントを、いくつかの異なる源（１Ｅ５０、１ＣＷＶ、１ＱＨＰ、１ＮＥＵ、１ＥＰＦ、１Ｆ２ｘまたは１ＥＪ６）から得られたＣアルファバックボーントレースループと連結した。ループの付着および適合のための手順は、実施例２および３に詳細に記載されている。第３段階において、コアおよびループＬ１，Ｌ３，Ｌ７に位置する蛋白質の溶解度を決定するアミノ酸側鎖を、実施例２および３に記載されるように決定した。最終段階において、モデルを、モデラーを用いて評価した。モデラーを、適切なときにシステイン−システイン架橋を受け入れるようにプログラミングした。次いで、全ての予想される蛋白質構造を、プロサII、プロチェックおよびホワットイフで評価した。プロサIIｚｐ−ｃｏｍｂスコアを、形成された蛋白質配列が、in vivoで所望のｉｇ様ベータモチーフ折りたたみ構造に適合するかどうかを示すために測定する（表１２）。プロチェックおよびホワットイフ評価を、配列がモデルに適合するかどうかを検査するために用いた（表１３）。
【０１２３】
実施例２２
６ストランドｉＭａｂ蛋白質の精製
E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を、６ベータストランドを含有するｉＭａｂ７０１に関してＶＡＰ挿入物を含有する発現ベクターＣＭ１２６で転換した。成長および発現は、実施例５に記載されるものと同様であった。
【０１２４】
ｉＭａｂ７０１蛋白質を、実施例７に記載されるものと類似するマトリクス支援リホールディングによって精製した。ｉＭａｂ７０１の精製された画分を、図６レーン４に明示されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１２５】
実施例２３
６ストランドｉＭａｂ蛋白質とニワトリリゾチームとの特異的な結合（ＥＬＩＳＡ）
精製されたｉＭａｂ７０１（〜１０ｎｇ）を、実施例８の記載と同様にして、ＥＬＫ（対照）およびリゾチーム（＋ＥＬＫ（ブロッキング物質として））のいずれかに対する結合について分析した。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡによって、表６に明示されているように、精製されたｉＭａｂ７０１とニワトリリゾチームとの特異的な結合が確認された。
【０１２７】
実施例２４
６ストランドｉＭａｂ蛋白質のＣＤスペクトル
ｉＭａｂ７０１を、実施例２２において記載されているように精製し、実施例１３に記載されるようにしてＣＤスペクトルについて分析した。ｉＭａｂ７０１のスペクトルを、スキャッフォールドの安定性とリホールディング特性とを試験するために、２０℃、９５℃で、および再度２０℃で測定した。対応するスペクトルは、図９Ｉにおいて明示されている。６ストランドスキャッフォールドは、実施例２０に記載されるような７ストランドスキャッフォールドと同一の挙動をすると結論付けることができる。これは、このスキャッフォールドの基本構造が７ストランド含有スキャッフォールドの構造と同一であることを示す。さらに、９ストランドスキャッフォールド（実施例１６）からえられたシグナルは、は、ここで提示されるような６ストランドスキャッフォールドについて観察されるシグナルと類似しているのっで、両タイプのスキャッフォールドは、類似の配座を有することも結論付けることができる。連続２０−９５−２０℃の処理の後に得られたデータは、全てのスキャッフォールドがこれらの当初の配座のままであることを明確に示す。
【０１２８】
実施例２５
動物の主要なスキャッフォールドの設計
最低限のスキャッフォールドが、実施例１に記載されるような要件および特徴に従って、設計される。しかしながら、４つまたは５つのベータエレメントしか、スキャッフォールドにおいて用いられない（図１を参照のこと）。５ベータエレメントの場合、新しいスキャッフォールドのマントルを形成するベータエレメント２、３、６、７および８のアミノ酸側鎖は、水系の環境のために調節される必要がある。免疫グロブリンキラー受容体２ｄｌ２（ＶＡＳＴコード２ＤＬＩ）を、５ベータエレメントからなる新しい小さいスキャッフォールドを設計するために、比較モデル用鋳型として用いる。
【０１２９】
実施例２６
表面残基の置換手順：リジン置換
リジン残基は、たとえばＶＡＰの共有結合手順に便宜な、化学的に活性なアミノ基を含有している。共有結合は、表面の蛋白質の固定化またはその他の分子のターゲットに対する不可逆的結合のために用いられることができる。ＶＡＰ内のリジン残基の空間位置は、固定化後、表面におけるＶＡＰの位置決めを決定する。誤った位置決めは、ＶＡＰの表面に露出する、奇数の配置されたリジン残基によって、容易に生じる可能性がある。したがって、いくつかのＶＡＰ構造に関し、特定の位置、特に親和性領域の有効性の低下を生じさせ得るそれらの位置から、リジン残基を除去することが必要とされ得る。
【０１３０】
外面に位置する残基の置換戦略の一例として、ｉＭａｂ１００外面リジン残基を変化させた。３次元画像は、ｉＭａｂ１００に存在する全てのリジン残基が外面に実際に位置することを示した。３次元モデリングおよび分析ソフトウェア（インサイトII）は、このような置換の空間的帰結を決定した。モデラーソフトウェアを、ベータシート間のシステイン架橋構成を考慮に入れるか、あるいはシステイン架橋を分析で無視するかのいずれかの方法でプログラミングした。全ての取り出されたモデルを、多少客観的な結果序列のために、プロサIIソフトウェアで構築した。プロサIIのｚｐ−ｃｏｍｂパラメータは、モデルの信頼性を示した。結果は、実質的には、全てのタイプのアミノ酸がリジン残基を置換し得ることを示した。しかしながら、表面露出アミノ酸側鎖は、蛋白質の可溶性を決定する。したがって、蛋白質を可溶化するアミノ酸のみを、考慮に入れるとともに、Ｘと標識付けた（表１４を参照のこと）。
【０１３１】
ｉＭａｂ１００の配列：下線を付けたリジン残基を置換した。
2005511089.tif 000002
【０１３２】
実施例２７
外部でのアミノ酸変化：グリコシル化部位の除去。
【０１３３】
Ｎ−グリコシル化は、グリコシル化部位がたとえば推定リガンド結合部位に存在する場合、蛋白質機能と強く干渉し得る。ｉＭａｂ１００蛋白質が、ピキア酵母(Pichia pastoris)細胞においてグリコシル化されること、およびリガンドに結合することができないことが示された。分析は、ＡＲ３において推定Ｎグリコシル化部位が存在することを示した。モデラーソフトウェアによる鋳型モデリング戦略を用いるｉＭａｂ１００構造の検査は、この部位が、グリコシル化による妨害に起因してリガンド結合を潜在的にブロッキングしていることを明らかにした。この部位は、２つの異なる方法、すなわち、グリコシル化される残基を除去することによって、またはＮ−グリコシル化のための認識モチーフを変化させることによって、除去され得る。ここでは、グリコシル化部位それ自体（…ＲＤＮＡＳ…）を除去した。全ての残基が、アミノ酸を置換するために用いられ、この後、プロサII、ホワットイフ、およびプロチェックを、各個別のアミノ酸の信頼性を検査するために用いた。しかしながら、いくつかのアミノ酸は、不都合な化学的または物理的特性を導入する可能性がある。システインは、たとえば、蛋白質を、遊離システイン基を担う蛋白質と共有二量化の影響を受けやすくする可能性がある。また、非親水性アミノ酸は、折りたたみ工程を妨げる可能性があり、除去された。他方、メチオニンは、ＡＴＧによってコード化され、ＤＮＡに異常な開始部位を導入し得る。ＡＴＧ配列の導入の結果、潜在的な代替的開始部位に起因して、代替的な蛋白質産生物が生じるかもしれない。メチオニン残基は、その他のアミノ酸が適合しない場合に、評価されるのみであった。その他の全てのアミノ酸残基を、プロサII、ホワットイフおよびプロチェックによって評価した。ＮのＱでの置換は、実現可能かつ信頼性を有すると考えられた。
【０１３４】
グリコシル化部位を有するｉＭａｂからの蛋白質配列：
2005511089.tif 000003
グリコシル化部位なしのｉＭａｂからの蛋白質配列：
2005511089.tif 000004
【０１３５】
ピキア酵母におけるｉＭａｂ１００の発現を、プライマス９６(Primus 96)ＰＣＲ装置（ＭＷＧ）で、２ユニットＴａｑポリメラーゼ（ロシュ社製）、２００μｍｏｌの各ｄＮＴＰ（ロシュ社製）緩衝液（ロシュＴａｑ緩衝系）、２．５マイクロモルのプライマー１０７および１０８を含む１００μＬのＰＣＲ反応混合物中での１００ｎｇのＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００ＤＮＡを次のプログラム２５回（９４℃２０″，５５℃２５″，７２℃３０″）により増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによる消化し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＰＩＣ９（インビトロジェン(InVitrogen)社製）に連結して、実行した。構築物は、配列決定によって検査され、全ての正しいｉＭａｂ１００配列を示した。ピキア酵母の形質転換を、製造者のプロトコルに従って電気穿孔法によって実行した。メタノールによる蛋白質発現の成長および誘導を、製造者のプロトコルに従って実行した。ｉＭａｂ１００の発現の結果、E.coliにおいて発現されるｉＭａｂ１００のサイズは２１ｋＤである一方で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては、５０ｋＤのサイズを示す蛋白質の産生が生じた。この相違は、おそらく、前述したようなｉＭａｂ１００に存在する推定Ｎ−グリコシル部位のグリコシル化に起因している。したがって、このグリコシル化部位を、プライマー１３６（表５）を用いる点を除いては実施例２６に記載したものと類似の方法で、アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）で置換によって除去した。この結果、ｉＭａｂ１１５が生じた。E.coliにおけるｉＭａｂ１１５の発現の結果、２１ｋＤの蛋白質の産生が生じた。ＥＬＩＳＡ実験によって、リゾチームに対するこのｉＭａｂの特異性を確認された。したがって、ｉＭａｂ１１５におけるＡＲを、正確に位置決めし、さらに具体的にいえば、ＡＲ３におけるアスパラギンのグルタミンでの置換は、ＡＲ３の特性を改変しなかった。
【０１３６】
実施例２８
コアの内部におけるアミノ酸変化：システイン残基の除去
ｉｇ様構造中で折り重なっている得られた配列は、異常なアミノ酸配列ではなく同様に折りたたまれた構造の修復に用いることができる。アミノ酸はその他のアミノ酸で置換することができ、これによって、鋳型蛋白質と比較して新しい蛋白質の物理的および化学的特性を推定上変化させることができる。蛋白質構造の外側における変化は、むしろ容易であることが示された。ここで、我々は、コアの内部で並ぶアミノ酸を変化させた。隣接するアミノ酸側鎖の空間的な制約、およびコア構造それ自体の空間的な制約は、これらの位置に存在し得る側鎖のタイプを決定かつ限定する。加えて、隣接する側鎖の化学的特性はまた、置換の結果に影響し得る。いくつかの置換研究において、適切な、かつ信頼性のある置換を得るためにターゲットの残基に近接している追加アミノ酸を置換する必要があった。ここで、コアにおいてシステイン架橋を形成する可能性を除去した。１つのシステインのみを除去すると、コアにおけるシステイン架橋を形成する可能性がすでに防止される。しかしながら、二重の置換はまた、in vivoまたはin vitroにおける折りたたみまたはリホールディングの期間中に遊離システインが他の遊離システインと相互作用することを防止するために実行されてもよい。まず、個別のシステイン残基を、その他の共通アミノ酸（合計で１９）で置換した。このようにして、２回、１９のモデルを取り出した。全てのモデルを、プロサII（ｚｐスコア）、ホワットイフ（第二次世代パッキングクオリティ、バックボーン配座）およびプロチェック（外側許容領域の残基数）を用いて評価した。いくつかの信頼性のあるモデルを得た。表１５は、９６位におけるシステイン置換のｚｐ複合プロサスコア(zp-combined Prosa scores)を示す。この方法を、実証するために、システインのうち１つをバリンで置換がin vivoで試験された。このクローンを、ｉＭａｂ１１６と特定し（表３を参照のこと）、実施例３に記載したような手順に従って構築した（表４）。このクローンの完全なｉＭａｂ配列を、次のようにしてＣＭ１２６に形質転換した。ｉＭａｂ配列、ｉＭａｂ１１６を、プライマーｐｒ１２１およびｐｒ１２９とともに、鋳型としてＣｙｓ−ｍｉｎ ｉＭａｂ１１６を用いて、ＰＣＲによって単離した。その結果生じたＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩで消化し、ＮｄｅＩおよびＳｆｉＩで線形化されたＣＭ１２６に結合した。ＣＭ１２６−ｉＭａｂ１１６と特定されたこのクローンを、更なる試験のために選択し、かつ用いた。
【０１３７】
実施例２９
ｉＭａｂ１１６の精製
E.coliＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を、９ベータストランドを含有し、かつコアにおいてシステイン架橋を潜在的に欠失するｉＭａｂ１１６のためのＶＡＰ挿入物を含有する発現ベクターＣＭ１２６によって、形質転換した（実施例２７に記載）。成長および発現は、実施例５の記載同様であった。ｉＭａｂ１１６を、実施例７の記載と同様にマトリクス支援リホールディングによって精製した。ｉＭａｂ１１６の精製された画分を、図６レーン１１に明示されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１３８】
実施例３０
ｉＭａｂ１１６とニワトリリゾチームとの特異的な結合
精製されたｉＭａｂ１１６（〜５０ｎｇ）を、実施例８の記載と同様に、ＥＬＫ（対照）およびリゾチーム（＋ＥＬＫ（ブロッキング物質として））のいずれかとの結合について分析した。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡによって、表６に明示されているように、精製されたｉＭａｂ１１６とニワトリリゾチームとの特異的な結合が確認された。
【０１４０】
実施例３１
ｉＭａｂ１１６蛋白質のＣＤスペクトル
ｉＭａｂ１１６を、実施例２８に記載されているように精製し、実施例１３に記載されているようにＣＤスペクトルについて分析した。ｉＭａｂ１１６のスペクトルを、スキャッフォールドの安定性およびリホールディングの特徴を試験するために、２０℃、９５℃、および再び２０℃で測定した。対応するスペクトルは、図９Ｃに明示されている。２０℃で測定されたスペクトルを、二次構造の類似性の程度を決定するために、２０℃でのｉＭａｂ１００およびその他の９ストランドｉＭａｂ蛋白質のスペクトルと比較した（図９Ｊを参照のこと）。得られたスペクトルは、ｉＭａｂ１００のスペクトルを含む、その他の９ストランドスキャッフォールドから得られたスペクトルと同一であるので、内部コアからのシステイン残基の除去は、構造自体に影響を与えないと結論付けることができる。
【０１４１】
実施例３２
コアにおける付加的なシステイン架橋の導入
蛋白質構造における２つのシステイン残基の化学的結合（システイン架橋）は、７０℃未満の温度で蛋白質構造を、劇的に安定化することができる。この温度より上では、システイン架橋は破壊される可能性がある。いくつかの適用例では、当初の蛋白質よりも安定な蛋白質が要求される。実施例１において言及されるようなベータストランド折りたたみ構造のコアの空間的制約は、システイン架橋を可能にする。この結論は、言及された折りたたみ構造を有するいくつかの自然発生的な蛋白質において、システイン架橋がコアの中心に存在するという観察に基づく（たとえば、抗体中の全ての重鎖可変ドメイン）。このようなシステインのＣアルファバックボーン原子間の距離は、６．３〜７．４オングストロームであることがしばしば見出されている。コアモチーフにおいて架橋を推定上形成する新しいシステイン残基の導入を、測定によって分析した。ＰＤＢファイルに記載された蛋白質のＣアルファ原子の座標は、潜在的なシステイン架橋を測定するために用いることができる。個別的な各Ｃアルファ原子と全てのその他のＣアルファ原子との間の距離を、算定することができる。比較モデリングを介して得られたｉＭａｂ１００蛋白質のＣアルファ原子の位置は、図ＢＢＢ３に示す。インサイトソフトウェアは、Ｃアルファ原子間の距離を測定するために用いることができる。しかしながら、（ＰＤＢ座標において表されるような）座標によって示される空間上の２つの位置の間の距離を測定する標準的な数学的アルゴリズムも、用いることができる。エクセルシートを、全ての可能性のある距離を測定するために用いることができた。６．３〜７．４オングストロームの間で現れる距離の値を、推定システイン位置として評価した。分析は、ｉＭａｂ１００内の３３の可能性のあるシステイン架橋位置を示した。ｃｙｓ−番号は、システインの挿入に用いられる構造中のＣアルファ原子の位置を示す（表１６Ａ）。しかしながら、空間中の全ての位置が非常に有用であるのではなく、いくつかの架橋は、すでに有効なシステイン架橋に接近しており、互いに隣接する２つのシステインは、問題を有する可能性があり、同一のベータストランド間の２つのシステイン架橋は、あまり有用ではなく、すぐ隣に位置するその他のアミノ酸側鎖による空間的な制約となる。全ての３３のモデルを、構築するとともに、モデラーにおける鋳型としてのｉＭａｂ１００によって評価した。プロサIIによって得られた評価モデルのｚｐスコアは、大部分のシステイン残基が問題を有することを示した。最適なシステイン位置は、表１６Ｂに示される。太字で示される２つのモデルを、これらのシステイン残基および架橋の、その他の潜在的システイン架橋に対する空間的位置に基づいて選択した。また、いくつかのモデルを、ｚｐスコアは優秀であったが、インサイト（ＭＳＩ）によって検査された折りたたみ構造内でのそれらの位置を原因として拒絶した。
【０１４２】
実施例３３
コアに２つ付加的システインを含むｉＭａｂ１００誘導体の構築。
オリゴヌクレオチド部位指向の変異方法が、２つの付加的システイン残基を受領したｉＭａｂ１００誘導体、ｉＭａｂ１１１（表３）と称する、を構築するために用いられた。ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００が、オリゴヌクレオチドプライマーｐｒ３３、ｐｒ３５、ｐｒ８２、ｐｒ８３（表５参照）と共にＰＣＲ反応のための鋳型として用いられた。初めのＰＣＲ反応において、ｐｒ８２およびｐｒ８３は４０１ｂｐ断片を発生させるのに用いられた。本ＰＣＲ反応において、グルタミンおよびグリシンをコードしている残基が、システインをコードしている配列に変化された。このＰＣＲ断片は、2つの並行したＰＣＲ反応で鋳型として用いられる。一方の反応では、得られたＰＣＲ断片、ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００鋳型とｐｒ３３が使用され、もう一方の反応では、得られたＰＣＲ断片、ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００鋳型とｐｒ３５が使用された。前述の反応では５８４ｂｐ生成物が、後述の反応では５３１ｂｐ生成物が得られた。どちらのＰＣＲ断片もアガロースゲル分離と単離によって単離された（Qiagen ゲル抽出キット）。生成物は等モル比率で混合され、プライマーｐｒ３３およびｐｒ３５による断片重複ＰＣＲ反応は、７１４ｂｐ断片をもたらした。このＰＣＲ断片はＮｏｔＩおよびＳｆｉＩで消化された。生成した４１１ｂｐ断片は、アガロースゲルによって単離され、ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩで線形化したＣＭ１１４中に連結された。配列分析で、生成物、すなわちｉＭａｂ１１１を確認した（表４および３）。
【０１４３】
実施例３４
ｉＭａｂ１１１の発現
ｉＭａｂ１１１の遺伝子は、実施例２８に記載のようにＣＭ１２６にサブクローンされた。ＣＭ１２６−ｉＭａｂ１１１で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、ＩＰＴＧで誘導され、実施例７に記載のように蛋白質が単離された。蛋白質抽出物は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析され、２１ＫＤ蛋白質の著しい誘導が見られた。タグを含むｉＭａｂ１１１の予想された長さも、約２１ｋＤでありこのクローンの高い生成レベルを示す。
【０１４４】
実施例３５
ｉＭａｂ１１１の精製
（実施例３２および３３記載のように）大腸菌(E. coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、特別なシステインブリッジを潜在的に含んでいる９ベータストランドを含むＶＡＰ挿入ｉＭａｂ１１１を持つ発現ベクターＣＭ１２６によって形質転換された。成長と発現は実施例５および３４と同じであった。ｉＭａｂ１１１は、実施例７に記載されているのと同じように、マトリクス援助リホールディングによって精製された。ｉＭａｂ１１１の精製画分は、図６のレーン１２に示されているＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。
【０１４５】
実施例３６
ニワトリリゾチーム（ＥＬＩＳＡ）へのｉＭａｂ１１１の特異的結合
精製されたｉＭａｂ１１１（〜５０ｎｇ）が、実施例８と同様に、それぞれＥＬＫ（対照）とリゾチーム（阻害剤としてＥＬＫを添加）への結合について分析された。ＥＬＩＳＡ分析における蛋白質抽出物の１００倍希釈物は、バックグラウンドシグナルよりも約２０倍高いシグナルをもたらした。ＥＬＩＳＡの結果において、表６に示されているように、ニワトリリゾチームへの精製ｉＭａｂ１１１の特異的結合が確認された。
【０１４６】
実施例３７
ｉＭａｂ１１１のＣＤスペクトラ
ｉＭａｂ１１１は、実施例３２に記載のように精製され、実施例１３に記載のようにＣＤスペクトラについて分析された。ｉＭａｂ１１６のスペクトルは、スキャッフォールドの安定性とリホールディング特性を試すために、２０℃、９５℃、再び２０℃で測定された。該当スペクトラは図９Ｃに示されている。２０℃で測定されたスペクトラは、二次構造の類似度合いを測定するために、ｉＭａｂ１００およびその他の９ストランドｉＭａｂ蛋白質の２０℃でのスペクトラと比較された（図９Ｊ参照）。得られたスペクトラは、ｉＭａｂ１００を含むそのほかの９ストランドスキャッフォールドから得られたスペクトラと全く同じであったので、コアの中心にある追加されたシステイン残基は、その構造自身に何ら影響を与えないことが結論づけることができる。
【０１４７】
実施例３８
特定の用途のための、スキャッフォールド特性の改善
特定の用途のために、スキャッフォールドの特性は最適化される必要がある。例えば、良く機能するためには、一定の環境において、熱安定性、耐酸性または蛋白質分解の安定性が、有利であるかまたは必要であることさえある。変異や再選択プログラムは、同じ結合特性であるがより改善された特性を持つ新しいスキャッフォールドを作るのに適用できる。この実施例においては、選択された結合蛋白質が改善されており、蛋白質分解環境において蛋白質分解に抵抗する。新しいスキャッフォールドは、プロテアーゼの混合物処理または特定のプロテアーゼのカスケード処理によって、耐蛋白質分解について試験することができる。さらに、新しいスキャッフォールドは、スキャッフォールドを導入することによって将来の用途の環境における耐性を試験することができる。耐蛋白質分解スキャッフォールドを得るために、スキャッフォールドをコードする遺伝子は、変異方法によって変異される。次いで、ファージディスプレイライブラリが、変異ＰＣＲ生成物から構築され、新しいスキャッフォールドが外殻蛋白質との融合蛋白質としてファージの外側に発現する。ファージは、目的とする温度で、ある一定時間の間、目的とする蛋白質分解の活性環境に添加される。もとのファージは、述べられているように、標準的なパンニング手順に用いることができる。良く洗浄した後、結合したファージは、溶出され、Ｆ−ｐｉｌｉを担持する大腸菌細胞に感染され、適度な抗生物質を含む寒天培地上で一晩生育される。個々のクローンは、それらの新しい特性が再チェックされ、配列が測定される。変異の導入や選別の工程は、何回か繰り返すことができ、または他の選別条件をさらなる最適化過程に応用することができる。
【０１４８】
実施例３９
スキャッフォールド部分の無作為突然変異生成
目的部分（親和性部分、フレームワーク、ループまたはこれらの組合せ）のちょうど３プライムおよび５プライムをアニ―リングするプライマーは、記載のｄＩＴＰまたはｄＰＴＰの存在下で、増幅のために用いられる。これらの変異された断片は、最初の反応で用いたプライマーの１組と同一の配列を持つが、今や、スキャッフォールド構造にその断片を再クローニングするための制限部位を今や含んでおり、その制限部位で互いにＤＮＡ配列が異なりしたがって蛋白質配列も異なることができるプライマーで第２のＰＣＲで増幅される。ファージディスプレイ作業は、目的とする特性をもつクローンの検索のために用いることができる。
【０１４９】
実施例４０
ファージディスプレイベクターＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００の構築
効果的なファージディスプレイのためのベクター（ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００、図４Ｂ参照）は、ｐＢＡＤ（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ内）の基幹部分を用いて構築された。ｐＢＡＤの必要なベクター部分は、それぞれＡｓｃＩとＢａｍＨＩ張り出し制限部位を含むプライマー４およびプライマー５を用いて増幅された。同時に、合成で構築された断片は、新しいプロモータ遺伝子、最適化ｇ３分泌リーダー、ＮｏｔＩ部位、ダミー挿入、ＳｆｉＩ部位、リンカー、ＶＳＶ−ｔａｇ、トリプシン特異的蛋白質分解部位、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩおよびＡｓｃＩ部位（表４Ｂ参照）を持っている表４に記載の配列を含めて作成された。消化された断片とＰＣＲ増幅したｐＢＡＤとを結合させた後、それら１３ファージｇ３コア蛋白質のコード部分は、プライマー（表５、プライマー６および７）に付けられたＡｓｃＩ張り出し部位を用いて増幅し、ＡｓｃＩ消化後、挿入された。挿入された断片の適切な配列と適切な配向を含むベクターは、さらなる実験でも用いられた。
【０１５０】
実施例４１
ファージディスプレイベクターＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１３の構築
ＡＲ４と他の親和性領域（たとえばｉＭａｂ１００のＡＲ１）との間のシステイン架橋は、システイン架橋形成なしではほぼあり得ないようなある種の構造および安定性に関与する。ある親和性領域４に存在するシステインに結合させるものとしてＡＲ１を使用することができるばかりでなく、ＡＲ２およびＡＲ３も、システイン架橋形成のための明らかに安定化部位である。ＡＲ２は、ＡＲ４とのシステイン形成のための魅力的なもう１つの位置であるので、ＡＲ２のシステインコドンの位置とＡＲ１のシステインコドンの欠落を除いて、ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１００と１００％全く同じ構造である発現ベクターが、構築される。
【０１５１】
３次元モデリング分析(3D modeling analysis)により、ＡＲ２のシステインに最も適した位置は、元来、トレオニンとして決定していた位置であることが明らかになった（・ＶＡＴＩＮ・・から・・ＶＡＣＩＮ・・へ）。分析により、新しいシステイン位置（・・ＶＡＣＩＮ・・）に加え、ＡＲ２中のトレオニン残基の直前のアラニン残基がセリン残基（・・ＶＳＣＩＮ・・）に置換されたことが判った。ＡＲ１中の元来のシステインはセリンによって置換され、これは３次元モディング分析によって適した置換であることが判明した（表３）。
【０１５２】
ｉＭａｂ１１３（表４）と命名された、新たに決定された配列は、前述の（実施例３）遺伝子構築手法によって構築され、ｉＭａｂ１００を置換してＣＭ１１４に挿入された。
【０１５３】
実施例４２
ファージディスプレイベクターＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１４の構築
分子間のシステイン架橋形成が折りたたみしている間に発現効率および適正に折りたたまれた蛋白質の割合に影響するかもしれないから、ＡＲ４と他の領域間のシステイン架橋は常に望ましい訳ではない。また、分解するような環境では、かかるＡＲｓは活性が弱くなったり、不活性になったりさえなる。したがって、システイン架橋なしのスキャッフォールドが望ましい。ＡＲ１、２および３中のシステイン欠落発現ベクターが構築された。このベクターは、ＡＲ１中のシステイン（・・ＰＹＣＭＧ・・）がセリンに変わっている（・・ＰＭＳＭＧ・・、表３）点を除いてＣＭ１１４と１００％同じである。ｉＭａｂ１１４と命名された新たに決定された配列（表４）が、前述の（実施例３）遺伝子構築手法によって構築され、ｉＭａｂ１００を置換してＣＭ１１４に挿入された。
【０１５４】
実施例４３
ラクダ科由来ＣＤＲ３領域の増幅
ラマパコス（Lama pacos）とラマグラマ（Lama glama）血液のリンパ球は、スペネリ（Spinelli）等（Biochemistry３９（２０００）１２１７−１２２２）に記載されている標準手順により単離された。これらの細胞からのＲＮＡは、生成プロトコルに従ってQiagen ＲＮeasymethodsによって単離された。ｃＤＮＡは、生成手順に従いｍｕＭＬｖまたはＡＭＶ（New England Biolabs）を用いて創製された。ＶｈｈｃＤＮＡからのＣＤＲ３領域は、１μlのｃＤＮＡ反応を用いて、２Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｔａｑ  緩衝システム）、２、５μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む１００μlＰＣＲ反応混合液中で、Ｐｒｉｍｕｓ９６ＰＣＲ機器（ＭＷＧ）で次のようなプログラムを３５回（９４℃で２０分、５０℃で２５分、７２℃で３０分）行って、増幅した（図１０参照）。少なくとも1つのシステインを含むＣＤＲ３領域を選ぶために、プライマー５６（表５）がリバースプライマーとして使用され、システ含んでいないＣＤＲ領域を選ぶ場合には、プライマー７６（表５）が最初のＰＣＲラウンドに使用された。どちらの場合も、プライマー１６（表５）がリバースプライマーとして使用された。生成物は１％アガロースゲル上で分離され、正しい長さ（〜２５０ｂｐ）の生成物が単離され、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製された。５μlのこれらの生成物が、プライマー８（表５）およびプライマー９（表５）がＣＤＲ３領域を増幅するために用いられた上述と同様の次のＰＣＲ工程で用いられた。生成物は２％アガロースゲル上で分離され、正しい長さ（〜８０〜１５０ｂｐ）の生成物が単離され、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製された。ラクダ科ＣＤＲ３領域の環境をスキャッフォールドｉＭａｂ１００に適応させるために、サイクル番号を１５サイクルに減少させることを除いて最初のＰＣＲ方法と同様の２つの特別工程が５μlの生成物について遂行された。そこでは、プライマー７３（表５）および７５（表５）がリバースプライマーとして引き続き用いられ、プライマー４９（表５）がリバースプライマーとして用いられた。
【０１５５】
実施例４４
雌ウシ由来のＣＤＲ３領域の増幅
雌ウシ(Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ)血液リンパ球が、Spinelli等（Biochemistry３９（２０００）１２１７−１２２２）に記載されている標準手順に従って単離された。これらの細胞からのＲＮＡは、生成プロトコルにし従い、Qiagen RＮeasymethodsによって単離された。ｃＤＮＡが、生成手順に従いｍｕＭＬｖまたはＡＭＶ（New England Biolabs）を用いて創製された。ＶｈｈｃＤＮＡからのＣＤＲ３領域は、１μlのｃＤＮＡ反応を用いて、２Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）、緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｔａｑ  緩衝システム）、２、５μＭのプライマー２９９（表５）およびプライマー３００（表５）を含む１００μlＰＣＲ反応混合液中で、Ｐｒｉｍｕｓ９６ＰＣＲ機器（ＭＷＧ）で次のようなプログラムを３５回（９４℃で２０分、５０℃で２５分、７２℃で３０分）行って、増幅した（図１０参照）。生成物は２％アガロースゲル上で分離され、正しい長さの生成物が単離され、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製された。観察されたＰＣＲ生成物の長さの分布（図１１参照）は、雌ウシＣＤＲ３領域の平均長を表している。プライマー２９９（２１アミノ酸、表５）およびプライマー３００（２７アミノ酸、表５）中に存在するフレームワーク配列を補正することにより、雌ウシＣＤＲ３の平均長は、ＰＣＲ生成物の平均長１２０塩基から４８フレームワーク配列を引くと、７２塩基、すなわち、２４アミノ酸である、と結論づけることができる。この結果は、Spinelli等（Biochemistry３９（２０００）１２１７−１２２２）により観察された結果と非常に良く一致している。これらのＣＤＲ領域は、従って、ナイーブライブラリの構築に非常に有用である。
【０１５６】
単離および精製された生成物は、ラマ由来のＡＲｓ（実施例４３参照）について記載されたと同様に、いくつかのＰＣＲ修正工程によってフレームワークのコード領域が徐々に変更された方法で、実際のＣＤＲ３／ＡＲ４位置の周辺の配列を変更するために使用することができる。
【０１５７】
実施例４５
増幅されたＣＤＲ３の挿入によってＡＲ４にループの斑入りを含んでいるライブラリ
ＡＲ４中に斑入りを有する核酸ファージディスプレイライブラリは、以下の方法によって調製された。ラクトペルオキシダーゼとラクトフェリンで免疫化されたラマ由来の増幅されたＣＤＲ３領域は、実施例４３に記載のように得られ、ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで消化されて、ＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化され、アルカリホスファターゼ処理されたベクターＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１３またはＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１４中にＴ４ＤＮＡリガーゼで結合された。システイン含有ＣＤＲ３は、ＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１４にクローン化され、一方、システインを持たないＣＤＲ３はベクターＣＭ１１４−ｉＭａｂ１１３にクローン化された。ライブラリは、電気せん孔法により、ＢＴＸ電気細胞マニピュレータＥＣＭ６３０を用いて大腸菌ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞中に構築された。細胞は、ＳＯＢ中に回収され、４％グルコース、２＊ＴＹ−寒天中にmlあたり１００μgアンピシリンを含む培地で育成された。３７℃で一晩培養した後、細胞は２＊ＴＹ培地に集菌し、濃縮された分散体として５０％グリセロール中、８０℃で貯蔵された。一般的に、５ｘ１０８の形質転換細胞は、１μｇＤＮＡで得られ、ライブラリは約１０９の別個のクローンを含んでいた。
【０１５８】
実施例４６
無作為に選んだＣＤＲ３部分の挿入によってＡＲ４に斑入りループをもつライブラリ
無作為に選んだＣＤＲ３部分の挿入によってＡＲ４に斑入りをもつ核酸ファージディスプレイライブラリが、以下の方法によって調製された。免疫化されていないラマと免疫化されたラマからのＣＤＲ３部分は、２番目のＰＣＲラウンドにおいて実施例３５に記載のＳｐｅｅ等（１９９３）によるｄＩＴＰまたはＺａｃｃｏｌｏ等（１９９６）によるｄＰＴＰを含むことを除いて、実施例２８に記載のように増幅された。ライブラリの作成は、実施例２８のように行われた。ｄＩＴＰを用いた場合、変異率は２％に達し、ＰＣＲにｄＰＴＰを含む場合は２０％以上の変異率が得られた。
【０１５９】
実施例４７
標的分子に結合したＶＡＰｓの濃縮
ライブラリストックの約５０μlを、５０ml２＊ＴＹ／１００μｇアンピシリン／４％グルコースに播種し、ＯＤ６００が０．５になるまで培養した。次に、１０１１ＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヘルパーファージが添加された。感染させるために、振とうさせずに３７℃で４５分間置いて培養した。細胞を遠心分離によりペレットにし、上澄みを廃棄した。ペレットを４００ml２＊ＴＹ／１００μｇアンピシリン中に懸濁させ、３７℃で１時間培養し、その後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。感染した培養液は、３０℃で８時間、２００ｒｐｍ振とう台上で培養した。次に、３０分間、４℃、５０００ｇでペレットにすることによりバクテリアを取り除いた。上澄みは、０．４５μｍＰＶＤＦフィルタ膜に通して濾過した。ポリエチレングリコールと塩化ナトリウムを、最終濃度がそれぞれ４％と０．５Ｍになるよう添加した。このようにして、ファージは氷上に沈殿させられ、６０００ｇで遠心分離して、ペレットにさせられた。ファージペレットは、５０％グリセロール／５０％ＰＢＳに溶かし、−２０℃で貯蔵した。
【０１６０】
ファージディスプレイされたＶＡＰｓの選択は以下のように行われた。約１μｇの標的分子（抗原）は、４℃ o/nの０．１ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）中でイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）またはマイクロタータープレート（Ｎｕｎｃ）内に固定化された。この溶液の除去後、チューブはＰＢＳ中の３％スキムミルクパウダー溶液（ＥＬＫ）また同様の阻害剤で、室温または４℃ o/nで少なくとも２時間、阻害された。阻害剤の除去後、室温で１時間阻害緩衝液であらかじめ阻害された、約１０１２−１０１３コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含むファージライブラリ溶液を阻害緩衝液に添加した。培養は、室温で１時間、低回転台上で実施された。チューブはＰＢＳによって３回、０．１％Ｔｗｅｅｎを添加したＰＢＳで２回そして再びＰＢＳで４回洗浄された。固定されたファージは、それぞれｐＨ２．２の０．１mグリシンＰＢＳ３００μlまたは０．１％トリプシンＰＢＳ溶液５００μlの適当な溶出緩衝液で溶出した。回収したファージは、グリシンで溶出したときは直ちにｐＨ８．５の１mトリス−塩酸７００μlで中和された。もう１つの方法として、固定されたファージは、抗原（１−１０μＭ）を含むＰＢＳで培養することによっても溶出した。回収したファージを、上記の方法で、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＴｏｐ１０Ｆ’ （Ｖｉｔｒｏｇｅｎ内）細胞を宿主として増幅した。選択工程は、正のクローンを濃縮するために何度も繰返された。最終段階において、個々のクローンは選ばれ、それらの結合親和性とＤＮＡ配列が決定された。
【０１６１】
ＶＡＰｓの結合親和性は、実施例６に記載のＥＬＩＳＡによって、またはファージ粒子上のｇＩＩＩ−融合蛋白質のようにもしくは例４に記載のＣＭ１２６発現ベクターにＮｄｅＩ−ＳｆｉＩをサブクローニング後に決定された。
【０１６２】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、実施例５に記載の電気せん孔法によって形質転換され、形質転換細胞は、アンピシリン（１００μg／ml）を補充した２ｘＴＹ培地で培養された。細胞培養液のＯＤ６００が約１に達したとき、蛋白質発現がＩＰＴＧ（０．２mＭ）を添加することにより誘導された。３７℃で４時間経過後、細胞は遠心分離によって集められた。蛋白質は実施例５に記載のように単離された。
【０１６３】
実施例４８
ＶＡＰｓに結合しているラクトフェリンの濃縮
精製されたラクトフェリン（ＬＦ）はＤＭＶ−Ｃａｍｐｉｎａにより供給された。実施例４５に記載のＡＲ４に斑入りを有するファージディスプレイライブラリは、ＬＦ結合ＶＡＰｓを選別するのに用いられた。ＬＦ（１ml重炭酸ナトリウム緩衝液中に１０μｇ（０．１m、ｐＨ９．４））が、以下のとおり、イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）中に固定化され、ＰＢＳ中の３％ニワトリ血清によってブロッキングされた。パンニングは実施例３２に記載のように行われた。１０１３ファージがインプットとして用いられた。第１回目のパンニングの後、約１００００コロニーが形成された。第２回目のパンニングの後は、５００〜１０００コロニーが形成された。個々のクローンは培養され、ＶＡＰｓが生成され、実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡで確認された。次のＡＲ４を有するクローについて濃縮物が観察された。
ＣＡＡＱＴＧＧＰＰＡＰＹＹＣＴＥＹＧＳＰＤＳＷ。
【０１６４】
実施例４９
ＶＡＰｓに結合しているラクトペルオキシダーゼの濃縮
精製されたラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）はＤＭＶ−Ｃａｍｐｉｎａにより供給された。
【０１６５】
実施例４５に記載のＡＲ４に斑入りを有するファージディスプレイライブラリは、ＬＰ結合ＶＡＰｓを抽出するのに用いられた。ＬＰ（１ml重炭酸ナトリウム溶液中に１０μｇ（０．１m、ｐＨ９．４））は、ノチューブ（Ｎｕｎｃ）中に固定化され、続いてＰＢＳ中の３％ニワトリ血清でブロッキングされた。パンニングは実施例３２に記載のように行われた。１０１３ファージがインプットとして用いられた。第１回目のパンニングの後、約５０００コロニーが形成された。第２回目のパンニングの後は、５００〜１０００コロニーが形成された。個々のクローンは培養され、ＶＡＰｓは生成され、実施例６に記載の大腸菌により確認された。陽性クローンは配列が決定された。次のＡＲ４を有するクローについて濃縮が観察された。
ＣＡＡＶＬＧＣＧＹＣＤＹＤＤＧＤＶＧＳＷ
ＣＡＡＴＥＮＦＲＩＡＲＥＧＹＥＹＤＹＷ
ＣＡＡＴＳＤＦＲＩＡＲＥＤＹＥＹＤＹＷ
【０１６６】
実施例５０
ＲＮａｓｅＡの結合物、構造成熟およびパンニング
合成ＲＮａｓｅＡ結合ｉＭａｂ、ｉＭａｂ１３０は実施例３（表４、表３）に記載のように合成し、次にＣＭ１１４−ｉＭａｂ１３０を形成するＣＭ１１４中にクローン化された。ｇ３外殻蛋白質との融合蛋白質としてのｉＭａｂ１３０をもつキメラファージは、実施例３２に記載のライブラリ増幅手順の条件下で生成された。ＲＮａｓｅ  Ａイムノチューブに対するこれらのキメラファージのパンニング（実施例３２のパンニング手順参照）は、ｉＭａｂ１３０のＲＮａｓｅ Ａ特異的結合を示さなかった。ＲＮａｓｅ Ａ結合領域の機能的な位置付けは、おそらく周囲のアミノ酸側鎖の軽微なゆがみにより、明らかに失敗した。スキャッフォールドの小さな修正は、ディスプレイＡＲｓを正しい位置に配置するのに役立つであろう。このことを達成するために、ｉＭａｂ１３０コーディング領域は、次の方法を用いて変異させた。ベクターＣＭ１１４中に存在するｉＭａｂ１３０は、ｄＩＴＰまたはｄＰＴＰを用いてプライマー１２０および１２１（表．．．）でのスキャッフォールドの増幅中に変異させられた。変異生成濃度は、１．７ｍＭのｄＩＴＰまたは３００μＭか７５μＭか１０μＭのｄＰＴＰが用いられた。その結果生じたＰＣＲ生成物は、作成手順にしたがって、Ｑｕｉａｇｅｎゲル抽出システムにより寒天培地から単離された。単離した生成物は、ｄＩＴＰやｄＰＴＰを含まない製品とするために、１００μＭのｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で増幅された。ＱｕｉａｇｅｎＰＣＲ除去キットにより精製した後、これらのＰＣＲ断片は、ＮｏｔＩとＳｆｉＩ（ＮＥＢ）で消化され、ＮｏｔＩとＳｆｉＩで線形化したＣＭ１１４に連結された。沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した連結生成物は、電気せん孔法によりＴＧ１に形質転換し、１００μg／mlのアンピシリンと２％グルコースを含んだ２ｘＴＹ培地で培養し、続いて実施例３２に記載のキメラファージ生成物のためのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で感染させられた。形質転換体の一部は、形質転換頻度を決定するために、１００μg／mlのアンピシリンと２％グルコースを含んだ２ｘＴＹプレート上に薄くぬられた。これらのファージライブラリは、実施例３２に記載のようにＲＮａｓｅ Ａパンニング試験に使用された。ＲＮａｓｅ Ａは、イムノチューブに固定化され、パンニングが行なわれた。パンニングの後、ファージは溶出され、ＴＯＰ１０Ｆ’（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の感染に用いられ、２％グルコースと１００μg／mlのアンピシリンと２５μg／mlテトラサイクリンを含んだ２ｘＴＹ培地で、３７℃で一晩培養された。検索されたコロニーの数は、表１７に示されている。
【０１６７】
種々の変異生成レベルのｉＭａｂ１３０に由来したファージライブラリでパンニング後に得られたコロニーの数から結論されるように、ｄＩＴＰ（表１７）による軽度の変異生成レベルにあるライブラリからバインダーの著しい増加が観察できる。
【０１６８】
実施例５１
固定手順
１ｇのエポキシ活性セファロース６Ｂ（製造者Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が、カラム中に詰められ、１０ベッド量のカップリング緩衝液（２００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７）によって洗浄された。結合すべき蛋白質は、１ｍｇ／ｍｌ濃度でカップリング緩衝液中に溶解され、流速０．１ｍｌ／分でカラムを通過した。２０ベッド量の蛋白質溶液を流した後、カラムをカップリング緩衝液で洗浄した。１０ベッド量の０．２Ｍエタノールアミン／２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７を流すと、未反応のエポキシ基がブロックされた。それからレジンを２０ベッド量の５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７で洗浄し、使用の準備が整った。
【０１６９】
実施例５２
リゾチームが固定化されたビーズによるｉＭａｂ１００の精製
リゾチームはＲｏｈｍ製の活性エポキシ−レジン、オイパーギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）、上に固定化され、カラム中で使用された。ｉＭａｂ１００を含む溶液は、カラムに通され、その濃度はダイレクトバイパスおよびカラムからの流れ中で測定された（Ａ２８０ｎｍ）。その差は、カラムに結合したｉＭａｂ１００の量を示した。結合したｉＭａｂ１００は、ｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝液で溶離させることができた。ＢＳＡでの対照実験により、固定化されたリゾチームへのｉＭａｂ１００の結合は特異的であることが示された。
【０１７０】
実施例５３
ｉＭａｂ１００が固定化されたビーズによるリゾチームの精製
ｉＭａｂ１００はオイパーギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）上に固定化され、カラム中で使用された。リゾチームを含む溶液は、カラムに通され、その濃度はダイレクトバイパスおよびカラムからの流れ中で測定された（Ａ２８０ｎｍ）。その差は、カラムに結合したリゾチームの量を示した。
【０１７１】
結合したリゾチームは、ｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝液で溶離させることができた。ＢＳＡでの対照実験により、固定化されたｉＭａｂ１００へのリゾチームの結合は特異的であることが示された。
【０１７２】
実施例５４
乳清画分中におけるｉＭａｂ１００の安定性
いくつかのミルク分画中におけるｉＭａｂ１００の安定性は、リゾチームがコートされたプレートによってＥＬＩＳＡ法（実施例８）で測定された。タグ、スキャッフォールド領域、または親和性領域が蛋白質分解的に分解されるなら、抗リゾチーム活性の減少がみられるだろう。ｉＭａｂ１００は、次のような数種の種々の溶液に希釈された。すなわち、対照としての１ｘＰＢＳ、チーズ乳清からのイオン交換画分、ゴーダチーズ乳清、低殺菌牛乳であり、最終濃度が４０μｇ／ｍｌになるよう１，４μｍフィルタ処理された。全ての画分は、８℃で保管され、サンプルは、０、２および５時間後および１，２，３，４，５，７日後に採取された。サンプルは、さらなる分解を防ぐため−２０℃に置かれた。ＥＬＩＳＡ検出は、実施例８に記載のように行われ、図１２に示された。ｉＭａｂ１００の活性パターンは、実験をとおして類似性が保たれた。したがって、タグを含むｉＭａｂ１００は、検査された牛乳画分において安定であることが結論づけられた。
【０１７３】
表と図面の簡単な説明
表１
ＰＤＢ形式における９ストランド（ストランドのみ）の例。
表２
９ストランドｉＭａｂ蛋白質として折り重なる可能性の高いアミノ酸配列例。
表３
ＶＡＰアミノ酸配列。
表４  
ｉＭａｂＤＮＡ配列。
表５  
用いたプライマーのリスト。
表６  
精製されたｉＭａｂ変異体のリゾチームへの結合特性。
６、７、または９βシートのいずれかを含有する種々の精製されたｉＭａｂを、実施例８、１５、１９および２３に記載されるように、ＥＬＫ（対照）とリゾチームとの結合について分析した。
封入体の加熱誘導可溶化によって追加的に精製されたｉＭａｂ１００を除いて（実施例６）、全てのｉＭａｂを、尿素と、これに続くマトリクス支援リホールディングを用いて精製した（実施例７）。
表７
酢酸カリウムｐＨ４．８による沈殿の前後にリゾチームに対してＥＬＩＳＡで測定された、ｉＭａｂ１００に対するｐＨショックの効果。
表８
空間的配座を示すＰＤＢ２．０形式における７ストランド（ストランドのみ）折りたたみ構造の４つの例。
表９
７ストランドｉＭａｂ蛋白質のためのモデラーからの目的関数に関するプロサII結果（ｚｐ−ｃｏｍｐ）および値。値が低くなるほど、正確に折り重なる可能性の高いｉＭａｂ蛋白質に対応する。
表１０
７ストランドｉＭａｂ蛋白質として折り重なる可能性の高くないアミノ酸配列例。
【０１７４】
表１１
空間的配座を示すＰＤＢ２．０形式における６ストランド（ストランドのみ）折りたたみ構造の４つの例。
表１２
６ストランドｉＭａｂ蛋白質のためのモデラーからの目的関数に関するプロサII結果（ｚｐ−ｃｏｍｐ）および値。値が低くなるほど、正確に折り重なる可能性の高いｉＭａｂ蛋白質に対応する。
表１３
６ストランドｉＭａｂ蛋白質として折り重なる可能性の高いアミノ酸配列例。
表１４
リジンを、その他全ての可能性のあるアミノ酸残基で３、７、１９および６５位それぞれにおいて置換したｉＭａｂ誘導体からのプロサII結果（ｚｐ−ｃｏｍｐ）。天然システイン架橋を有するモデル、および天然システイン架橋を有しないモデルを形成した。比較的好都合な（親水性）誘導体は、Ｘで示す。
表１５
９６位におけるシステインをその他の全ての可能性のあるアミノ酸残基で置換したｉＭａｂ１００誘導体からのプロサII結果（ｚｐ−ｃｏｍｐ）。
表１６
Ａ）ｉＭａｂ１００（参照）のアミノ酸配列、ならびに付加的システイン架橋形成について可能性のある候補物。システイン架橋が形成され得る位置が示される。
Ｂ）システイン架橋のための好適な位置、ならびにそれらに対応するプロサIIスコア（ｚｐ−ｃｏｍｐ）、および対応するｉＭａｂ名。
表１７
パンニング後のバインダーの数におけるｄＩＴＰの変異頻度の効果。
表１８
実施例４０および実施例４において使用されたベクターの配列。
【０１７５】
【表１】
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【０１７６】
【表２】
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【０１７７】
【表３】
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2005511089.tif 000012
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【０１７８】
【表４】
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【０１７９】
【表５】
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【０１８０】
【表６】
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【０１８１】
【表７】
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【０１８２】
【表８】
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【０１８３】
【表９】
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【０１８４】
【表１０】
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【０１８５】
【表１１】
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【０１８６】
【表１２】
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【０１８７】
【表１３】
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【０１８８】
【表１４】
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【０１８９】
【表１５】
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【０１９０】
【表１６】
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【０１９１】
【表１７】
2005511089.tif 000049
【０１９２】
【表１８】
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【０１９３】
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】スキャッフォールドドメインの概略的な３次元トポロジー。  抗原結合部位の提示に用いることのできる蛋白質構造の８つの例のトポロジーを示す。基礎コアベータエレメントは、例Ａにおいて指名される。この基礎構造は、２つのプレートに配置された９ベータエレメントを含有する。１つのベータシートは、エレメント１、２、６および７を含有するとともに、エレメント３、４、５、８および９を含有する。ベータシートを連結するループも示されている。太線は、上端位置にあるベータエレメント間の連結ループである一方で、破線は下端位置に位置する連結ループを示す。破線を開始しそして実線を終える連結はベータエレメントの下端部および上端部の間の連結を示す。ダイアグラムに示されたベータエレメントの番号は、図１および図２において言及された番号および位置に対応する。  Ａ：９ベータエレメントトポロジー。たとえば全ての抗体軽鎖および重鎖可変ドメイン、およびＴ細胞受容体可変ドメイン。  Ｂ：８ベータエレメントトポロジー。たとえば、インターロイキン−４アルファ受容体（１ＩＡＲ）  Ｃ：７ａベータエレメントトポロジー。たとえば免疫グロブリンキラー受容体２ｄｌ２（２ＤＬＩ）  Ｄ：７ｂベータエレメントトポロジー。たとえばＥ−カドヘリンドメイン（１ＦＦ５）  Ｅ：６ａベータストランドトポロジー。  Ｆ：６ｂベータエレメントトポロジー。たとえばＦｃエプシロン受容体タイプアルファ（１Ｊ８８）  Ｇ：６ｃベータエレメントトポロジー。たとえばインターロイキン−１受容体タイプ１（１ＧＯＹ）  Ｈ：５ベータエレメントトポロジー。
【図２】モジュラー親和性およびスキャッフォールド転移(Modular Affinity & Scaffold Transfer)（ＭＡＳＴ）技術。  ここで記載されるようなコア構造を含有する推定抗原結合蛋白質は、転移操作のために用いることができる。加えて、スキャッフォールドまたはコア構造の個々のまたは複数のエレメントまたは領域は、転移作用にも用いることができる。転移操作は、アミノ酸組成の異なる構造的に同一または類似のスキャッフォールドまたはコアの間で生じることができる。推定親和性領域は、たとえばＰＣＲ、制限消化、ＤＮＡ合成またはその他の分子技術によって、あるスキャッフォールドまたはコアから、別のスキャッフォールドまたはコアまで、転移することができる。このような転移の結果は、概略的なダイアグラムでここに示されている。分子Ａ（下端部、親和性領域）からの推定（コード化）結合領域、および分子Ｂ（下端部、フレームワーク領域）のスキャッフォールド（コイード化）領域は、分子手法によって単離することができる。両エレメントの組換え後、新しい分子は、分子Ａの結合特性および分子Ｂのスキャッフォールド特性（ハイブリッド構造）を有するようである。
【図３】免疫グロブリン構造のドメイン通知。  ダイアグラムは、それぞれ９、７および６ベータエレメント（Ｎ末端からＣ末端まで１〜９を示す）からなる蛋白質構造のトポロジーを表す。ベータエレメント１、２、６および７とエレメント３、４、５、８および９は、２つのベータシートを形成する。  ８つのループ（Ｌ１〜Ｌ８）は、全てのベータエレメントの連結に役割をはたす。ループ２、４、６および８は、ダイアグラムの上端部位に位置し、これは、実施例の蛋白質におけるこれらのループの物理的な位置を表す。軽鎖抗体可変ドメインにおけるループ２、４および８の機能は、抗原を結合することであり、ＣＤＲ領域として知られる。Ｌ６の位置（パターン化した領域で標識付けられる）もまた、抗原の結合活性を可能とするが、結合領域として示されなかった。Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ８をそれぞれ、親和性領域１（ＡＲ１）、ＡＲ２、ＡＲ３およびＡＲ４として決定している。ループ１、３、５および７は、蛋白質の反対側の部位に位置する。
【図４Ａ】ベクターＣＭ１２６の概略図
【図４Ｂ】ベクターＣＭ１２６の概略図
【図５】加熱（６０℃）を用いるｉＭａｂ１００の封入体の可溶化  レーン：分子量マーカー（１）、ｉＭａｂ１００の単離された封入体（２）、１０分間６０℃でＰＢＳ（ｐＨ８）＋１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で封入体をインキュベーションしたときに可溶化されたｉＭａｂ１００。
【図６】６、７または９ベータシートのいずれかを含有する精製されたｉＭａｂ変異体。  レーン：分子量マーカー（１）、ｉＭａｂ１３００（２）、ｉＭａｂ１２００（３）、ｉＭａｂ７０１（４）、ｉＭａｂ１０１（５）、ｉＭａｂ９００（６）、ｉＭａｂ１２２（７）、ｉＭａｂ１２０２（８）、ｉＭａｂ１６０２（９）、ｉＭａｂ１３０２（１０）、ｉＭａｂ１１６（１１）、ｉＭａｂ１１１（１２）、ｉＭａｂ１００（１３）。
【図７】９５℃でのｉＭａｂ１００の安定性。  ９５℃で様々な時間でインキュベーションされた、精製ｉＭａｂ１００を、ＥＬＫ（四角）およびリゾチーム（円）への結合について分析した。
【図８】２０℃でのｉＭａｂ１００の安定性。  ２０℃で様々な時間でインキュベーションされた、精製ｉＭａｂ１００を、ＥＬＫ（四角）またはニワトリリゾチーム（円）への結合について分析した。
【図９Ａ】２０℃、９５℃および再度２０℃で測定したｉＭａｂ１００の遠紫外線ＣＤスペクトル（２０５〜２６０ｎｍ）。ｉＭａｂ１００を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に溶解した。
【図９Ｂ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１１１の遠紫外線スペクトル。２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した。
【図９Ｃ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１１６の遠紫外線スペクトル。２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した。
【図９Ｄ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１２０２の遠紫外線スペクトル。２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した。
【図９Ｅ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１３０２の遠紫外線スペクトル。２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した。
【図９Ｆ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１６０２の遠紫外線スペクトル。２０℃でのｉＭａｂ１００のスペクトルと比較した。
【図９Ｇ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１０１の遠紫外線スペクトル。
【図９Ｈ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ１２００の遠紫外線スペクトル。
【図９Ｉ】２０℃で、９５℃で（部分的に）変性した後、および２０℃でリホールディング後測定されたｉＭａｂ７０１の遠紫外線スペクトル。
【図９Ｊ】天然（変性していない）９ストランドｉＭａｂスキャッフォールドのオーバーレイ。
【図９Ｋ】天然（変性していない）７ストランドｉＭａｂスキャッフォールドのオーバーレイ。
【図９Ｌ】ｉＭａｂ１００およびＶＨＨ（Kwaaitaal M、ワーヘニンゲン大学および研究所、ワーヘニンゲン、オランダ国、の好意による）の遠紫外線ＣＤスペクトル。
【図１０】ＭＡＳＴのためのＣＤＲ３のＰＣＲ単離の概略図。
【０１９５】
【図１１】雌牛由来ＣＤＲ３領域の増幅  ２％アガロース−ＴＢＥゲル。  レーン１．プライマー８および９でＰＣＲ増幅した１μｇのラマｃＤＮＡｃｙｓｔ＋。  レーン２．プライマー８および９でＰＣＲ増幅した１μｇのラマｃＤＮＡｃｙｓｔ−。  レーン３．２５ｂｐＤＮＡステップラダー(step ladder)（プロメガ社製）。  レーン４．プライマー２９９および３００でＰＣＲ増幅した０．７５μｇの雌ウシｃＤＮＡ。  レーン５．プライマー２９９および３００でＰＣＲ増幅した１．５μｇの雌ウシｃＤＮＡ。  レーン６．プライマー２９９および３０１でＰＣＲ増幅した０．７５μｇの雌ウシｃＤＮＡ。  レーン７．プライマー２９９および３０１でＰＣＲ増幅した１．５μｇのウシｃＤＮＡ。  レーン８．５０ｂｐジーンルーラーＤＮＡラダー(GeneRuler DNA ladder)（ＭＢＩフェルメンタス(MBI Fermentas)社製）
【図１２】ｉＭａｂ１００についてＥＬＩＳＡで測定されたリゾチーム結合活性。いくつかの異なる溶液を、ｉＭａｂ１００蛋白質における蛋白質分解活性について、経時的に試験した。試験試料を、図Ａおよび図Ｃにおいては１００倍希釈し、一方、図Ｂおよび図Ｃにおいては１０００倍希釈した。ＡおよびＢは、リゾチーム活性を示す一方、ＣおよびＤは、バックグラウンド活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005511089.tif 000063
【図７】
2005511089.tif 000064
【図８】
2005511089.tif 000065
【図９Ａ】
2005511089.tif 000066
【図９Ｂ】
2005511089.tif 000067
【図９Ｃ】
2005511089.tif 000068
【図９Ｄ】
2005511089.tif 000069
【図９Ｅ】
2005511089.tif 000070
【図９Ｆ】
2005511089.tif 000071
【図９Ｇ】
2005511089.tif 000072
【図９Ｈ】
2005511089.tif 000073
【図９Ｉ】
2005511089.tif 000074
【図９Ｊ】
2005511089.tif 000075
【図９Ｋ】
2005511089.tif 000076
【図９Ｌ】
2005511089.tif 000077
【図１０】
2005511089.tif 000078
【図１１】
2005511089.tif 000079
【図１２−１】
2005511089.tif 000080
【図１２−２】
2005511089.tif 000081
【国際調査報告】
2005511089.tif 000082
2005511089.tif 000083
2005511089.tif 000084
2005511089.tif 000085