(57)【要約】  本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明で開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの調節を行なうPTP10D、Tecタンパク質チロシンキナーゼ、またはEDTP相同性タンパク質を開示する。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患などの疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質チロシンホスファターゼPTP10Dの核酸分子、非受容体タンパク質チロシンキナーゼTec、または卵子由来のチロシンホスファターゼ(EDTP)遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドまたは抗体の変異型、PTP10Dの核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体、非受容体タンパク質チロシンキナーゼTec、またはEDTP遺伝子ファミリーまたはそれによって医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)補助剤と共にコードされたポリペプチドから成る医薬品組成物。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫PTP10D、Tec、またはEDTP 核酸、特にショウジョウバエPTP10D (GadFlyアクセッション番号CG1817)、ヒトPTP10D相同性タンパク質(PTPRB、cDNAのためのGenbankアクセッション番号XM＿006789.7 (識別標識番号: 3)、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号XP＿006789.4 (識別標識番号: 4)、およびマウス受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ(cDNAのためのGenbankアクセッション番号AF157628、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号AAF80346)、ショウジョウバエBtk29A (Gadflyアクセッション番号CG18355およびCG8049)、ヒトtecタンパク質チロシンキナーゼ(cDNAのためのGenbankアクセッション番号NM＿003215.1 (旧番号XM＿044444.3) (識別標識番号: 1)、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号NP＿003206.1 (旧番号XP＿044444)(識別標識番号: 2)、およびマウスタンパク質チロシンキナーゼTecIV (Genbankアクセッション番号AAD43402.1)、またはショウジョウバエEDTP (Gadflyアクセッション番号CG6542)、または染色体3上のヒトEDTP相同性タンパク質(cDNAのためのGenbankアクセッション番号XM＿056609.3およびNM＿022485.2、XP＿056609およびタンパク質のためのNP＿071930)、識別標識番号: 6のタンパク質をコードする識別標識番号: 5のcDNA 、Genbankアクセッション番号、XM＿056748、およびBC＿001674から予測されたcDNA、さらにGenbankアクセッション番号AAH35690.1、AAL55787、BAC11211、およびCAD28494を有するヒトタンパク質)、またはその断片またはその変異型をコードする核酸である請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
当該核酸分子が下記の場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で定義した核酸分子またはそれに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする場合;
(b)  核酸分子(a)に対して縮重する場合
(c)   少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99,6％までが請求項2において定義したPTP10D、Tec、またはEDTPポリペプチドと同一のポリペプチドをコードする場合;
(d) (a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような突然変異による核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項 1〜7 の任意の1 項の成分。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸および細胞、細胞塊、臓器および(または)被験者におけるその他の関連障害を始めとする障害の治療、軽減および(または)予防のための検出および(または)検証用薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の1項に記載の組成物。
【請求項１４】
PTP10D、Tec、またはEDTP遺伝子ファミリーの使用法またはそれによってコードされたポリペプチドの使用法または当該核酸分子または当該ポリペプチドの断片または変異体の使用法、またはPTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を制御するための当該核酸分子またはそれによってコードされた当該ポリペプチドを認識する抗体、アプタマーまたは別の受容体の使用法。
【請求項１５】
PTP10D、Tec、またはEDTP遺伝子ファミリーの核酸分子の使用法またはそれによってコードされたポリペプチドの使用法または当該核酸分子の断片または変異型の使用法または当該核酸分子またはそれによってコードされた当該ポリペプチドを認識する当該ポリペプチドまたは抗体、アプタマーまたは別の受容体の使用法  またはPTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するための当該核酸分子またはそれによってコードされた当該ポリペプチド(の)エフェクターの使用法。
【請求項１６】
PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項 16 の動物。
【請求項１８】
請求項1〜6の任意の1項において定義した核酸分子を含む、PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドまたは組換え(型)の宿主細胞の修飾発現を示す組換え(型)の宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a) PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤; および
(ac) 
当該PTP10D、Tec、またはEDTPポリペプチドまたはその断片が基準親和性で特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤;
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該PTP10D、Tec、またはEDTPポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性との間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  PTP10D、Tec、またはEDTP相同性ポリペプチド、またはその断片、および
(ab)   
当該PTP10D、Tec、またはEDTPポリペプチドまたはその断片が基準活性を示す条件下の候補薬剤、
(b)  (候補)薬剤偏向活性を決定するため、当該結合標的に対する当該PTP10D、Tec、またはEDTPポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップおよび
(c)  (候補)薬剤偏向活性と基準活性間との差異を確定するステップ。
【請求項２３】
活性がキナーゼまたはホスファターゼ活性である請求項22記載の方法。
【請求項２４】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する請求項20、22または23に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって同定された薬剤を含む組成物を産出する方法。
【請求項２５】
当該組成物が肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害、およびその他の疾患および障害の防止、軽減または治療のための医薬品組成物である請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患疾患および障害を始めとする疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害、およびその他の疾患と障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項20の方法によって同定される(ポリ)ペプチドの使用法または請求項21、22または23の任意の1項の方法によって同定される薬剤の使用方法。
【請求項２７】
PTP10D、Tec、またはEDTP遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備(preparation)のためのPTP10D、Tec、またはEDTP遺伝子ファミリーまたはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２８】
下記の最低1つを備えたキット。
(aa)  PTP10D、Tec、またはEDTP核酸分子、またはその断片;
(b)  (a)の核酸を含むベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重調節、例えば、限定するものではないが、代謝疾患のような肥満症に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるPTP10D、Tecタンパク質チロシンキナーゼ、またはEDTP相同性タンパク質をコードする核酸配列の使用法、およびそれによってコードされたポリペプチド、およびその使用法およびそのエフェクターの使用法に関するものである。
【０００２】
摂取熱量に対するエネルギー消費量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝の疾患、例えば肥満症および激しい体重の減少がいくつか存在している。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは理想的な体重の20％以上を超える体重として定義され、多くの場合著しい健康機能障害を結果としてもたらす。肥満症を定義するためのさらなるパラメータとしては、ウエストサイズ、皮下脂肪の厚さおよびバイオインピーダンスが挙げられる (特に、前掲のKopelman (1999)、を参照)。 肥満は心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満症に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００３】
ヒトの肥満症は、環境的要因および遺伝的要因によって強く影響され、そのために環境的な影響が多くの場合に(ヒト)肥満症の遺伝子同定の障害物となっている。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的でポジティブな臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満した人のかかりやすい病気には糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸が含まれる。
【０００４】
肥満症は単一障害と考慮されるべきでなく、潜在的に複数の原因をともなう異種の条件群から成る障害と考慮されるべきである。また、肥満症は、空腹時血漿インシュリンの上昇およびグルコースの経口摂取に対する過度なインシュリン反応を特徴とし(Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272〜1284)、2型真性糖尿病における明らかな肥満症の介入が確認されている(Kopelman、Nature 404、2000、635〜643)。
【０００５】
高脂血症および遊離脂肪酸の上昇は、肥満症、インスリン耐性を始めとしたいくつかの疾患の連鎖として定義される「代謝症候群」と明確に相関する。これは多くの場合、同一患者において生じ、そして2型糖尿病および心血管疾病の発生の主要な危険因子である。脂質レベルおよび血糖値のコントロールが、2型糖尿病、心臓病、およびその他の代謝症候群の出現を治療するために必要であることが示されている(例えば、Santomauro A. T. らの(1999) Diabetes、48(9):1836-1841を参照)。
【０００６】
たとえ、いくつかのレプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子について記述されているとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。
【０００７】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００８】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症の調節に関与し、従って摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸などに関連する障害に関与する特定の遺伝子を開示する。とりわけ、本発明ではヒトPTP10D遺伝子、ヒトTec遺伝子およびヒトEDTP遺伝子が上述した条件に関与するものとして記載されている。
【０００９】
用語「GenBankアクセッション番号に示されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド」とは、対応するGenBankアクセッション番号下に貯蔵されるヌクレオチド配列の発現可能な遺伝子に関するものである。用語「GenBankアクセッション番号」とは、 NCBI GenBankデータベースエントリに関するものである(Bensonらの(2000) Nucleic Acids Res. 28: 15-18を参照)。
【００１０】
キナーゼおよびホスファターゼは、ホスファターゼ基のタンパク質への添加およびタンパク質からの除去を行うことによって、多くの異なる細胞増殖、分化、およびシグナル伝達プロセスを調節する。可逆的なタンパクの質リン酸化は、真核細胞におけるタンパク質活性を管理するための主要戦略である。一般的な哺乳動物細胞における活性な一万のタンパク質のうちの千以上がリン酸化によると推定される。活性化を推進する高エネルギーリン酸は通常、タンパク質キナーゼによってアデノシン三リン酸分子(ATP)から特定のタンパク質に伝達され、そしてタンパク質ホスファターゼによってそのタンパク質から除去される。リン酸化は、細胞外シグナル(ホルモン、神経伝達物質、成長因子および分化因子など)、細胞サイクルのチェックポイント、および環境的ストレスまたは栄養ストレスに対する反応で生じ、そして分子スイッチをオン状態にすることにほぼ類似する。スイッチがオン状態になると、適切タンパク質キナーゼが代謝酵素、調節タンパク質、受容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャンネルまたはポンプ、または転写因子を活性化する。非管理のシグナル伝達は種々の炎症、癌、動脈硬化症、および乾癖を始めとした疾病状態に関与している。
【００１１】
チロシンホスファターゼ:
タンパク質チロシンリン酸化は、細胞成長、組織分化および代謝を始めとした幾多の細胞イベントの調節にとって必須である進化的な保存機構であることが明らかにされている(Walton K. M.およびDixon J. E.、(1993) Annu Rev Biochem 62:101-120; Li L.およびDixon J. E.、(2000) Semin Immunol. 12(1):75-84)。数百のタンパク質チロシンホスファターゼ(本明細書中ではPTPと呼ぶ)は異なるクラスに細区画されたヒトゲノムによってコードされる。細胞内局在性に基づいて、PTPは、受容体様または細胞内リン酸塩として分類される。受容体様PTPには、膜貫通ドメイン、受容体様細胞外ドメイン、そして通常は2細胞内PTPドメインが含まれる。わずかな数の受容体PTPには、単一の細胞内PTPドメインが含まれる(例えばショウジョウバエPTP10DおよびヒトPTPRB)。受容体PTPをさらに5つの異なる型に細区画するために細胞外ドメインの特徴が利用される(Mourey R. J.およびDixon、J. E.、(1994) Curr Opin Genet Dev 4(1):31-39)。例えば、ショウジョウバエPTP10Dは、細胞外フィブロネクチン様反復および免疫グロブリン様反復のシリーズを含み、そして3型の受容体PTPに属する。現在わかっているショウジョウバエPTP10Dの唯一の機能(作用)は、胚成長中の軸索ガイダンスの制御における介入である(Sun Q.らの(2000) Development 127:801-812; Kraut R.らの(2001) Curr Biol 11:417-430)。PTP10Dまたはそのヒト相同体のための代謝の調節における機能(作用)は報告されていない。
【００１２】
EDTP:
ショウジョウバエ遺伝子CG6542は、チロシン特異性タンパク質ホスファターゼおよび二重特異性タンパク質ホスファターゼファミリーに対するトリホスファターゼ1タンパク質ドメイン特性を示す卵子由来のチロシンホスファターゼ(EDTP)に対してコード化する。チロシンホスファターゼ活性を示すEDTPは、センチニクバエ(ニクバエ)胚形成に関与する(Yamaguchi S.らの(1999) Eur J Biochem 259(3):946-953を参照)。このタンパク質のさらなる機能は従来の技術において記載されていない。
【００１３】
Tec:
Tecファミリーは、その最初のメンバーであるTecによって代表される非受容体タンパク質-チロシンキナーゼ(PTKs)の、最近になって出現しているサブファミリ(亜科)である。このファミリーは、5メンバー、すなわち、Tec、Btk、Itk/Emt/Tsk、BmxおよびTxk/Rlkから構成されている(例えば、Smith C. I. らの、(2001)、Bioessays 23(5):436-446を参照)。それらは、4構造モジュール: PH (プレクストリン相同性)ドメイン、SH3 (Src相同性3)ドメイン、SH2 (Src相同性2)ドメインおよびキナーゼ(Src相同性1)ドメインを有することを特徴とする。このファミリーの最も顕著な特性は、それらのタンパク質構造におけるPHドメインの存在である。PHドメインは、ホスホイノシチドを結合することが現在わかっている; これに基づくと、TecファミリーPTKはホスホチロシン媒介性およびリン脂質媒介性シグナル伝達系の合流点としての役割を果たすことが可能である。
【００１４】
多くのTecファミリータンパク質は造血組織において豊富に発現され、そして血球の成長および分化プロセスにおいて重要な役割りを演ずることが推定される。これを支持すると、Btk遺伝子における突然変異は、ヒトにおけるX染色体と結合した無ガンマグロブリン血症(XLA)およびマウスにおけるX染色体と結合した免疫不全(Xid)の原因となり、Btk活性がB細胞の個体発生中心性にとって不可欠であるが、種々の細胞プロセスにおける調節性の役割りを転換することを示す。ヒトTecキナーゼファミリーのメンバーは、T細胞抗原受容体(TCR)、B細胞抗原受容体(BCR)およびFcイプシロン受容体のような抗原受容体を介してシグナル伝達において重要な役割を演じる。最近の研究は、分子内および分子間結合に関与するTecキナーゼにおけるドメインへの新たな洞察を生み出している。キナーゼ-ノックアウトマウスの遺伝研究は、リンパ球の発生・発育、分化およびアポトーシスにおけるTecキナーゼの重要性を強調している。
【００１５】
Tecキナーゼは、成長因子受容体、サイトカイン受容体、G-タンパク質共役受容体、抗原受容体およびインテグリンによって伝達される実質的にすべてのタイプの細胞外の刺激に対する応答における信号伝達に関与する(例えば、Lewis C. M.らの(2001)、Curr. Opin. Immunol. 13(3):317-325; Cantrell D. A.、(2001)、J. Cell Sci. 114(Pt 8):1439-1445; Qiu Y.およびKung H. J.、(2000)、Oncogene 19(49):5651-5661を参照)。また、キナーゼは、細胞骨格再編成および細胞運動性における機能(作用)にも機能を有する(例えば、Tsoukas C. D. らの、(2001)、Trends Immunol. 22(1):17-20を参照)。
【００１６】
ショウジョウバエBtk29Aは、ヒトtecタンパク質チロシンキナーゼおよびマウスタンパク質チロシンキナーゼTecIVのような哺乳動物の非受容体型タンパク質-チロシンキナーゼに対して最も高い相同性を有する。ヒトTecタンパク質は、マウスTec型IV (94％の相同性)、マウスTsk/Itk (60％)、およびヒトBtk (57％)を始めとしたTecファミリーのメンバーのそれらに対して高度に相同である。(Sato K. らの(1994)、Leukemia 8(10):1663-1672)。ヒトTecとTecファミリーのその他のメンバー間の相同性は、Src相同性3 (SH3)、SH2、およびキナーゼドメインにおいて観察できるばかりでなく、N末端独特のドメインにおいても観察できる。マウスTecIVは多くの造血細胞株において高度に発現される。
【００１７】
これまでは、PTP10D、Btk29A、またはEDTP、またはヒト相同性タンパク質がエネルギー恒常性および体重調節および関連障害の調節に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患およびその他の疾患における機能は記述されていない。本発明において、PTP10D、Tecタンパク質チロシンキナーゼ、またはEDTPの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、PTP10D、Tec、またはEDTP相同性遺伝子の突然変異が主要なエネルギー保管物質である中性脂肪含有量の著しい増加による肥満症の原因となることを同定した。
【００１８】
PTP10D、Tec、またはEDTPに対して相同性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに、上記のように疾患および障害の診断、治療、および予後に有用である新規組成物も提供する。
【００１９】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００２０】
本発明は、PTP10D、Tec、またはEDTP相同性タンパク質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００２１】
よって、PTP10D、Tec、またはEDTP相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同性核酸、特にヒトRPTP βタンパク質、マウスPTP10D様タンパク質、ヒトtecタンパク質チロシンキナーゼタンパク質およびマウスタンパク質チロシンキナーゼTecIVまたはヒトまたはマウスEDTPタンパク質をコードする核酸である。
【００２２】
本発明においては、発明者らは特にタンパク質チロシンホスファターゼ10D (PTP10Dと呼ぶ)、Brutonのチロシンキナーゼ29A (Btk29Aと呼ぶ)、および卵子由来のチロシンホスファターゼ(EDTPと呼ぶ)、およびショウジョウバエおよび哺乳動物、望ましくはヒト、相同性ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらのタンパク質を本発明のタンパク質としてをコードする配列が含まれるPTP10D、Btk29A、およびEDTP相同性タンパク質(例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、β (PTPRBまたはRPTP β)、tecタンパク質チロシンキナーゼ(Tec)、哺乳動物のEDTP相同性タンパク質)に言及する。特に好適な実施例は下記の通りである:
* ショウジョウバエPTP10D (Gadflyアクセッション番号CG1817)、ヒトPTPRB (cDNAのためのGenbankアクセッション番号XM＿006789.7 (識別標識番号: 3、図8Aを参照)、タンパク質のためGenbankアクセッション番号XP＿006789.4 の(識別標識番号: 4、図8Bを参照)、およびマウス受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ(cDNAのためのGenbankアクセッション番号AF157628、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号AAF80346)、
* ショウジョウバエBtk29A (Gadflyアクセッション番号CG18533、CG8049)、ヒトtecタンパク質チロシンキナーゼ(Genbankアクセッション番号NM＿003215.1 (旧番号XM＿044444.3) (識別標識番号: 1、図3Aを参照)、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号NP＿003206.1 (旧番号XP＿044444) (識別標識番号: 2、図3Bを参照)、およびマウスタンパク質チロシンキナーゼTecIV (Genbankアクセッション番号AAD43402.1)
* ショウジョウバエEDTP (Gadflyアクセッション番号CG6542)、染色体3上のヒトEDTP相同性タンパク質((タンパク質のためのGenbankアクセッション番号XM＿056609.3およびNM＿022485.2 cDNAのための、XP＿056609およびNP＿071930)、識別標識番号: 6 (図12B)のタンパク質をコードする識別標識番号: 5のcDNA(図12A)、Genbankアクセッション番号から取り出した予測cDNA、XM＿056748、およびBC＿001674、さらにGenbankアクセッション番号AAH35690.1、AAL55787、BAC11211、およびCAD28494を有するヒトタンパク質)。
【００２３】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成る。
(a)  本発明のタンパク質および(または)それに対して相補的な配列をコードするヌクレオチド配列、
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および99,6％まで本発明のタンパク質のアミノ酸配列に同一のポリペプチドをコードする配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも 15 塩基、望ましくは少なくとも 20 塩基、より望ましくは少なくとも 25 塩基および最も望ましくは少なくとも50 塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２４】
本発明は、本発明のタンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、それ故エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。 本発明では、肥満症のような代謝疾患を始めとしたそれらに関連する疾患および障害、同様に摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、または治療のための、これらのタンパク質およびポリヌクレオチドまたはその断片またはそのエフェクター、例えば抗体、アプタマー、アンチセンス分子、RNAi分子、リボザイム、ペプチドまたは低分子量有機化合物またはポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するその他の受容体の使用法を記載する。
【００２５】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。キイロショウジョウバエは、生物学において最も集中的に研究された生物体の1つであり、ヒトを始めとした高等真核生物に共通する多くの発生過程および細胞過程の調査のためのモデル系として役に立つ(例えば、Adamsらの(2000) Science 287: 2185-2195)。キイロショウジョウバエのモデル生物体としての成功の大部分は、生物学的プロセスに関与するフォーワード遺伝子スクリーニングの威力に起因する。(Johnston (2002) Nat Rev Genet 3: 176-188; Rorth, (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93: 12418-12422を参照)。スクリーニングのための1つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内在性側面遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしでは、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することにより、その機能を確定することができる。
【００２６】
中性脂肪は、細胞において最も効果的なエネルギーの保管場所であり、肥満した患者において著しく増加されるものである。本発明において、発明者らは、遺伝子スクリーニングを用いて、本発明のタンパク質または相同性遺伝子をコードする遺伝子の突然変異が中性脂肪レベルにおける著しい変化を反映した体重の変化の原因となることを同定した。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を分離するために、数千の専売および公的に提供されているEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後に検査した(実施例に詳細を図解した)。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。
【００２７】
本発明において、6日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有量を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において詳細に記載した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２８】
中性脂肪含有量分析の結果を図1、5、および10に示した。本発面者らは、ホモ接合性EP(2)0715、EP(2)2389、およびEP(2)2390ハエ、ヘミ接合性PX7194.1ハエおよびヘテロ接合性EP(2)2389、およびEP(2)2390ハエが対照(平均中性脂肪レベル)と比べてより高い中性脂肪含有量を有することを見出した。以上の点から、EPベクターが統合されている遺伝子座位における遺伝子活性が、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、それ故、すべての事例において肥満したハエモデルを表している。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２９】
本発明のタンパク質をコードする核酸をiPCR技術を使用して同定した。EPべクター(本明細書中ではEP(2)0715、EP(2)2389、およびEP(2)2390)統合に対して直接的に3'局在化したゲノムDNA配列、およびEPべクター(本明細書中ではPX7194.1統合)に対して5'局在化したゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly、FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27:85-88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって図2、6、および11における遺伝子の転写単位へのベクターのホモ接合性またはヘミ接合性生存またはヘテロ接合性統合部位がこれらの遺伝子座位の分子構造を示すことを確認した。
【００３０】
よって、本発明のタンパク質および相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、本発明のタンパク質のヒト相同体をコードする核酸である。本発明では、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明している。異なる種(マウスおよびショウジョウバエ)のそれぞれのタンパク質間の比較(ClustalX 1.8分析またはClustalW 1.82分析、例えばThompson J. D.らの(1994) Nucleic Acids Res. 22(22):4673-4680; Thompson J. D.、(1997) Nucleic Acids Res. 25(24):4876-4882; Higgins、D. G.らの(1996) Methods Enzymol. 266:383-402を参照)を行った。相同性に基づくと、本発明のショウジョウバエタンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。本発明の請求項に記載の遺伝子に関して、体重制御の調節および肥満症のような関連代謝疾患を記載した機能的データは従来の技術において提供されていない。
【００３１】
発現プロフィール作成の研究(詳細は実施例を参照)は、特定のタンパク質、例えば、PTPRPおよびTecキナーゼの関連性を哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認する。
【００３２】
また、本発明には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、本発明のタンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施例においては、本発明には、本発明のショウジョウバエまたはヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、本発明のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は任意の既知の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。これらの組み合わせは、本発明の天然タンパク質のヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。本発明のタンパク質およびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、望ましくは、適切に選択されたストリンジェントな条件下で本発明の天然タンパク質のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を持つが、実質上異なるコドン使用を有する本発明のタンパク質またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列産生することが有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を増加するようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を改変することなく、本発明のタンパク質およびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上改変する別の理由には、天然配列から産出される転写物より望ましい、例えば長い半減期などの特性を有するRNA転写物の産出が挙げられる。本発明には、本発明のタンパク質およびその誘導体をコードするDNA配列またはその部分のすべてを合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。その上、合成化学を用いて、突然変異を本発明のタンパク質またはその任意の一部をコードする配列の中に導入することも可能である。
【００３３】
また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列、および特に、種々のストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのそれら配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68°にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含される本発明のタンパク質をコードする改造核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または置換が含まれ、機能的に同一または等価な本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００３４】
また、コード化したタンパク質にはサイレント変化を産生するアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ、そして機能的に等価な本発明のタンパク質を結果としてもたらす。計画的アミノ酸代替は、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ; そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン;グリシンおよびアラニン;アスバラギンおよびグルタミン; セリンおよびトレオニン;フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。さらには、本発明は、タンパク質のペプチド断片またはサイクリック ペプチドのようなその誘導体、少なくとも4、望ましくは少なくとも6および最大で50長のアミノ酸を有するレトロinversoペプチドまたはペプチド擬態に関するものである。
【００３５】
また本発明の範囲内には、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００３６】
本発明のタンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993)PCR Methods Applic. 2:318-322)。逆PCR法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である(Triglia、T. らのNucleic Acids Res. 16:8186)。
【００３７】
使用可能な別の方法としてはキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母菌人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅が含まれる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることが可能である(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００３８】
生物学的に活性な本発明のタンパク質を発現するために、本発明のタンパク質または機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を、随意的には融合タンパク質の形態で、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクターに挿入するすることが可能である。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質をコードする配列、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００３９】
調節エレメントには、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドン、mRNA安定性調節エレメント、およびポリアデニル化信号が含まれる。ポリヌクレオチドの発現は、(i)サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター/エンハンサー領域のような構成型プロモーター、(ii)インシュリンプロモーター(Soriaらの2000, Diabetes 49:157を参照)、SOX2遺伝子プロモーター(Liらの1998, Curr. Biol. 8:971-4を参照)、Msi-1プロモーター(Sakakiバーaらの1997, J. Neuroscience 17:8300-8312を参照)、α-噴門ミオシン重鎖プロモーターまたはヒト心房性ナトリウム利尿因子プロモーター(Klugらの1996, J. clin. Invest 98:216-24; Wuらの1989, J. Biol. Chem. 264:6472-79)のような組織特定のプロモーター、または(iii) テトラサイクリン誘導型システムのような誘導型プロモーターよって保証することができる。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子のような、抗生物質耐性を授与する選択薬剤またはマーカー遺伝子を含むことができる。これらの方法には、生体外組換えDNA技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されている。本発明のさらに他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質および相同性タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。
【００４０】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、本発明のタンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴のウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリッド形成法、および(または)増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイには、本発明の当該タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、本発明の当該タンパク質をコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００４２】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体(特異的な)のいずれかを用いる、本発明のタンパク質の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。本発明のタンパク質上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４３】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを産生するための手段には、オリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識または標識ヌクレオチドを用いるPCR増幅、または酵素合成が含まれる。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社)、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００４４】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００４５】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過する本発明のタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、本発明のタンパク質をコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質 A ドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市の Immunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製 ドメインと本発明のタンパク質との間にある XA 因子またはエンテロキナーゼ(腸活素)(カリフォルニア州のサンディエゴ市の Invitrogen 社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて、精製を促進することが可能である。そのような発現ベクターの1つは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ(腸活素)切断部位に先行する本発明のタンパク質および6ヒスチジン残基をコード化する核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。エンテロキナーゼ(腸活素)切断部位は、融合タンパク質から本発明のタンパク質を精製する手段を提供する一方、ヒスチジン残基は、IMIAC (Porath、J.らの(1992、Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)に記載された固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー)上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Kroll, D. J.らの(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)で提供されている。組換え産生に加えて本発明のタンパク質の断片は、固相技術 (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することが可能である。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えばApplied Biosystems 431ペプチドシンセサイザ(Perkin Elmer社)を用いて達成することが可能である。本発明のタンパク質の種々の断片は、完全長分子を産生するために化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能である。
【００４６】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクターが関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、同様に高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害において有用であることを示す。従って、本発明の核酸およびタンパク質の診断目的および治療目的は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、薬剤ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００４７】
本発明の核酸とタンパク質およびは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードするcDNAsおよび特にそのヒト相同体は遺伝子療法において有用であり、そして本発明のタンパク質および特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００４８】
本発明のタンパク質をコードする核酸、またはその断片は、核酸またはそのタンパク質の存在または量が評価される診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成において有用である。
【００４９】
例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質に特異な抗体は、アンタゴニストとして直接的に、または本発明の当該タンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５０】
抗体を産生するため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、本発明のタンパク質、または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって、免疫化することが可能である。 宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。本発明のタンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。
【００５１】
本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、培養中の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５２】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を産生するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、本発明のタンパク質に特異的な一本鎖抗体を産生することが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００５３】
また、本発明のタンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、それらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W. D. らの (1989)Science 254:1275-1281)。
【００５４】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このような免疫学的測定法には、本発明のタンパク質に特異的な一本鎖抗体とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が関与する。本発明のタンパク質の2つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法が望ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００５５】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質のポリヌクレオチドまたは任意のその断片、またはアンチセンス分子のような核酸エフェクター分子、アプタマー、RNAi分子またはリボザイムを治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００５６】
さらなる実施態様によれば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。従って、アンチセンス分子を用いて本発明のタンパク質の活性の調節、または遺伝子機能(作用)の調節を達成することが可能である。現在、このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、本発明のタンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたは本発明のタンパク質をコードするその断片を用いて細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような作成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００５７】
上述のように、プロモーター、エンハンサー、イントロン等の本発明のタンパク質をコード化する遺伝子の制御領域に対して、アンチセンス分子、DNA、RNA、または PNA を設計することによって遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的でデザインすることも可能である。
【００５８】
また、酵素性RNA分子であるリボソームを用いて、RNAの特異的切断を触媒することも可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用することが可能な実施例には、本発明のタンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の特色に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性を検査することにより、評価することが可能である。
【００５９】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、本発明のタンパク質をコードするDNA配列の生体外および生体内における転写によってRNA分子を作成することも可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNAを構成的または誘導的に合成するこれらのcDNA構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RN分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2'O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、生体内、生体外および生体内外交通の使用に対して同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６１】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、本発明のタンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体、擬態、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニスト、または本発明のタンパク質の阻害剤から成り得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で使用した医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing Co.)の最新版を参照。経口投与用の医薬品組成物は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを使用して、経口投与に好適な投与量で製剤することができる。このようなキャリアを用いると、患者による摂取のために、医薬品組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、その他に製剤することが可能となる。
【００６３】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填して治療の対象となる適応症状を標識する。本発明のタンパク質の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記されるであろう。
【００６４】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分、例えば核酸または本発明のタンパク質またはその断片、または抗体の特定の状態を治療するために十分な量のことである。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50％において治療に有効な量)およびLD50(集団の50％に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50 比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００６５】
別の実施例によれば、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、本発明の当該タンパク質の過剰発現または低発現に関連することを特徴とする状態または疾患の診断のため、または本発明の当該タンパク質、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するための測定法において使用することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。本発明のタンパク質に対する診断アッセイには、ヒトの体液または細胞または組織の抽出物において本発明の当該タンパク質を検出するための抗体および標識を利用する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００６６】
本発明のタンパク質を測定するためのELISA、RIA、およびFACSを始めとした種々のプロトコルは、当分野で周知であり、本発明のタンパク質の変化したレベルまたは異常なレベルの発現を診断するための基準 を提供する。本発明のタンパク質の発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被験体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を本発明のタンパク質に対する抗体と結合させることによって樹立する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。対照サンプルおよび疾患、サンプル、例えば生検組織において発現した本発明のタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを樹立する。
【００６７】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体における本発明の当該タンパク質の発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、本発明の当該タンパク質の不在、存在、および過剰発現を判別することが可能であり、そして治療中に本発明の当該タンパク質レベルの調節を監視することも可能である。
【００６８】
一実施形態によれば、本発明のタンパク質および相同性タンパク質または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、それぞれのタンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであり、そして望ましくは、本発明のショウジョウバエまたはヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来するか、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然遺伝子のイントロンを始めとしたゲノム配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団、例えば32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系などを介してプローブに結合したアルカリホスファターゼのような酵素標識によって標識することが可能である。
【００６９】
本発明のタンパク質および相同性タンパク質に特異的なポリヌクレオチド配列は、本発明のタンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することも可能である。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、変異遺伝子の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、さまざまな肥満症のような代謝疾患、ならびに摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害の活性または誘発を検出する測定法において有用であり得る。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織のサンプルに添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。試料における本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変レベルの存在は、関連疾病の存在を示すものである。また、このような測定法を用いて、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することも可能である。
【００７１】
本発明のタンパク質の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロフィールまたは標準プロフィールを樹立する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、本発明の当該タンパク質をコードする配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことが可能である。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００７２】
肥満症のような代謝疾患、同様に摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸のような関連障害に関しては、個々から取り出した生検組織におけるかなり高い量の転写物存在が疾病発生の素因を示すか、または実際の臨床症状の出現に先行する疾病を検出する手段を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。本発明のタンパク質をコードする配列からデザインされたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途は、PCR法の使用に関与し得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に作成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、1つはセンス方向(5prime.fwdarw.3prime)を有し、別の 1つアンチセンス方向(3prime.rarw.5prime)を有し、特定の遺伝子または条件を同定するために最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００７３】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を用いて染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134,およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Vermaらによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝マップデータと相関することが可能である。遺伝マップデータの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。
【００７４】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。遺伝子多型、例えば単一ヌクレオチド遺伝子多型の分析を行うことが可能である。さらに、樹立した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝マップを拡張することも可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。ひとたび疾患または症候群を、例えば AT to 11q22-23 (Gatti, R.A. らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的連鎖によって大まかに位置決めを行なうと、その領域に対してマッピングする任意の配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子を表することが可能である。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００７５】
本発明の別の実施例では、本発明のタンパク質、その触媒断片または免疫原断片またはそのオリゴペプチドを用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節するか、または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、リガンド、または基質を同定することはできるであろう。このようなスクリーニングで用いたタンパク質またはその断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質と検査される薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすこともできる。例えば、本発明のタンパク質のキナーゼまたはホスファターゼ活性は、当技術分野で周知の人工基質、すなわち、限定するものではないがリン酸化または脱リンの際にフルオロフォアまたは発色団に変換されるDiFMUP (Molecular Probes社、Eugene、Oregon)を利用することによって、遺伝子組換え的に発現され精製されたTecキナーゼ、PTPRBまたはEDTPまたはその断片を用いて生体外(試験管内)で測定することができるのではないだろうか。あるいは、キナーゼまたはホスファターゼの生理的基質のリン酸化または脱リン酸は、それらの生理的な基質のリン酸化状態の検出に好適な公知のスクリーニングテクノロジを利用して測定できるのではないだろうか。例えば、限定するものではないが、それらの生理的基質に由来するペプチドのリン酸化状態は、ホスホ側特異性抗体の結合によって監視することができ、複合体分極化の増加を結果としてもたらす。
【００７６】
生体内では、基質に対するTec無修飾ポリペプチドの酵素性キナーゼ活性を適当な刺激によって促進することができ、Tecのリン酸化をトリガーすることができる。これは、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。活性化されたTecを含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。活性化Tecを含んだシステムは、(i) 体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患および障害、同様に、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、および睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、(ii) 本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補、医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、(iii) 本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、(iv) 本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。
【００７７】
加えて、その生理的基質またはその誘導体に対するPTPRB、EDTP、またはtecの活性は細胞ベースのアッセイにおいて測定することができる。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性、または劣化のようなタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼすことができる。また、薬剤は、タンパク質機能(作用)、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用できる。タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で公知である。例えば、結合タンパク質から本発明のタンパク質に(逆の場合もまた同様)派生する蛍光性に標識化されたペプチドの結合は、極性化の変化によって検出することができる。どちらかの完全長タンパク質、同様に、完全長タンパク質としての結合パートナーのいずれでもあり、そして他は単にペプチドであり得る両結合パートナーが蛍光性に標識化される場合、結合は1蛍光色素から他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間の相互作用の検出のために好適な測定法原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen (PerkinElmer社)またはAmersham社によるシンチレーション近接測定法(SPA)が挙げられる。 あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光性に標識化され、そして両タンパク質の相互作用を、例えば限定するものではないが、CellomicsまたはEvotecOAIによって作り出された細胞画像処理読取装置を用いて両タンパク質の共通の転位置の分析によって検出することができるスクリーニングアッセイのための細胞ベースの基準であり得る。すべての事例において、2つの以上の結合パートナーは異なるタンパク質であり得、その1つは本発明のタンパク質、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合には本発明タンパク質自体である。1つ(唯一ではない)の対象の標的機構がそのようなタンパク質/タンパク質相互作用である本発明のタンパク質は、PTPRB、Tec、またはEDTPである。
【００７８】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００７９】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８０】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開 PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物、例えばアプタマー、ペプチド、低分子量化合物などをプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で提供または合成する。試験用化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質と結合可能な中和抗体がタンパク質と結合するため試験用化合物と特に競合し、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では抗体を用いて、タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００８１】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子組換え細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子組換え動物、特に哺乳動物の遺伝子組換え動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの調査のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の食餌条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作成することができる。
【００８２】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスが使用される(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。感受性高い野生型マウス(例えばC57Bl/6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて(実施例4を参照)、これらのマウス用いて、候補修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色測定法、血糖レベル検査、インスリン耐性検査のようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準測定法を用いて検査することもできる。
【００８３】
遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異される場合、胚幹細胞における相同性組換を通して作製することができる。別法として、タンパク質をコードする核酸作成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することも可能であろう。さらには、アンチセンス分子を発現する特定の作成物のような本発明の遺伝子の変異体、または本発明のタンパク質の発現を阻止または変質する優性阻害突然変異の発現はゲノムにランダムに統合し得る。lac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出可能な変化を結果としてもたらす本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同性組換えDNA構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域が含まれる。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。ランダム統合のためのDNA作成物には、組換えを仲介するための相同性の領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA作成物は、本発明のタンパク質、調節元素(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能である。そのような細胞は適切な線維芽細胞-支持細胞層上で増殖し、そして白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞を形質移入してから、遺伝子組換え動物を産生するために用いることができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小さなくぼみに置く。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を桑実胚の近くのそのくぼみに置く。次の日に、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1-世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜など、例えば、マウス、ラット、モ���モット、ヒツジ、ウシ、ブタ、のような任意の非ヒト哺乳動物でよい。遺伝子組換え動物は、機能的研究、薬物スクリーニング、およびその他の用途において使用され、本発明の生体内のタンパク質の機能および調節の試験おいて有用である。
【００８４】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a)  本発明のタンパク質またはその断片またはアイソフォームの1つをコードする核酸分子;
(b)  本発明または断片またはそのアイソフォームにおいて記載されたタンパク質のアミノ酸分子:
(c)  (a) の核酸を備えているベクター;
(d)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(e)  (a)の核酸によってコードされ、 (c)のべクターまたは(d)の宿主細胞によって発現されたポリペプチド;
(f)  (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(g)  (a)の核酸または(d)または(e)または(f)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(h)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【００８５】
本キットは、診断用または治療用に使用することが可能であり、または上記に述べたようにアプリケーションをスクリーニングするため使用することが可能である。さらに、キットには、取扱説明書が含まれることが可能である。
【００８６】
各図は下記を示す:
図1はショウジョウバエBtk29A (GadFlyアクセッション番号CG18355、旧番号CG8049)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、注釈した転写単位(コラム3)におけるPベクターのホモ接合性生存統合によって引き起こされたEP(2)0715ハエの中性脂肪のEPコレクション(「EP対照オス」、コラム1)のすべてのハエのラインを含んだ対照と比較した変化である。
【００８７】
図2は変異型Btk29A遺伝子座の分子構造を示す。
【００８８】
図3はBtk29Aに対するヒト配列相同性を示す。
【００８９】
図3Aはヒトtecタンパク質チロシンキナーゼの核酸配列を示す(配列識別番号1)。
【００９０】
図3Bはヒトtecタンパク質チロシンキナーゼのアミノ酸配列(1文字コード)を示す(配列識別番号2)。
【００９１】
図4は異なる哺乳動物のモデルにおけるtecチロシンタンパク質キナーゼの発現を示す
図4A. 野生型マウス組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した。WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織
図4Bは、野生型マウス(wtマウス)、絶食マウス(fastedマウス)、遺伝的に肥満したマウス(ob/obマウスおよびdb/dbマウス)それぞれの異なる組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析を示す。相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した。WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織
図4Cは、異なる食事制限下(標準食マウスおよびパルミチン酸食マウス)においた野生型マウスの異なる組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析を示す。相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した。WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織
図4Dは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す。
【００９２】
図5はショウジョウバエPTP10B (GadFlyアクセッション番号CG1817)変異体の相対中性脂肪含有量(中性脂肪/重量)を示す。ここに示したのは、注釈した転写単位(コラム2)におけるPベクターのヘミ接合性生存統合によって引き起こされたPX7194.1ハエの中性脂肪の、PX変異体コレクション(全ライン、コラム1)のすべてのハエラインを含んだ対照と比較した変化である。
【００９３】
図6は変異型PTP10D遺伝子座の分子構造を示す。PX7194.1ラインのP挿入部位のMAP （平均動脈圧）において、PTP10Dは遺伝子をコードする受容体タンパク質チロシンホスファターゼ10Dを参照し、bifは二焦点を参照し、そしてRst(1)JHは若年性ホルモンに対する耐性を参照する。
【００９４】
図7はショウジョウバエPTP10Dに対するBLASTp検索の結果を示す。
【００９５】
図8はヒトPTP10D相同性配列を示す。
【００９６】
図8Aはヒトtecタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、B (PTPRB)の核酸配列を示す(識別標識番号: 3)。
【００９７】
図8Bはヒトtecタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、B (PTPRB)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す(識別標識番号: 4)。
【００９８】
図9は哺乳動物組織におけるPTPRB遺伝子の発現を示す。
【００９９】
図9Aは野生型マウス組織におけるPTPRB発現のリアルタイムPCR分析を示す。相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した。WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織
図9Bは、野生型マウス(wtマウス)、絶食マウス(fastedマウス)、および遺伝的に肥満したマウス(ob/obマウス)それぞれの異なる組織におけるPTPRB発現のリアルタイムPCR分析を示す。相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した。WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織
図10はショウジョウバエEDTP (GadFlyアクセッション番号CG6542)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、注釈した転写単位(コラム2、3、4、および5)におけるPベクターのホモ接合性生存統合およびヘテロ接合性統合によって引き起こされたEP(2)2389ハエおよびEP(2)2390ハエハエの中性脂肪の、EPコレクション(「EP対照オス」、コラム1)のすべてのハエラインを含んだ対照と比較した変化である。
【０１００】
図11は変異型EDTP遺伝子座の分子構造を示す。
【０１０１】
図12はヒトEDTP相同性配列を示す。
【０１０２】
図12Aはヒト相同体EDTP(配列認識番号: 5)をコードする核酸配列を示す。
【０１０３】
図12BはEDTP (GenBankアクセッション番号CAD28494.1) (識別標識番号: 6)のヒト相同体のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１０４】
図13は、異なる種から取り出したEDTPタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示し、CG6542-PAは、GadFlyアクセッション番号CG6542、NP＿071930.1、CAD28494.1、XP＿056609、AAH3569.1、BAC11211.1を有するショウジョウバエEDTP遺伝子によってコードされたタンパク質アイソフォームを参照し、そしてAAL55787.1はEDTPのヒト相同体のGenBankアクセッション番号を参照する。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１０５】
この実施例は本発明を図解するものである。
【０１０６】
実施例1: ショウジョウバエにおける中性脂肪含有量の測定
特殊な発現系(EP-element; Rorth P., (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(22):12418-12422)を含んだキイロショウジョウバエの中性脂肪含有量の変化を測定した。変異体ハエはハエ突然変異在庫コレクション(専売のハエ突然変異在庫コレクション; P挿入突然変異在庫センター、Sezged、ハンガリー)から取得した。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加の摂食としてベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ)を与えた。ホモ接合性生存、ヘミ接合性生存、およびヘテロ接合性統合においてEP(2)0715、PX7194.1、EP(2)2389、またはEP(2)2390べクターを含んだショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均増加を対照ハエ(図1、5、および10)と比較して検討した。中性脂肪の定量のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらに、5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することにより、ハエの中性脂肪含有量抽出を確定した。基準として、BIO-RAD DCタンパク質測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定するか、またはハエの重量を測定した。測定を3回繰り返した。図1、5、および10において、EPコレクションのすべてハエの平均中性脂肪レベル(図1および10において「EP対照オス」と呼ぶ)またはPXコレクション(図5において「全ライン」と呼ぶ)100％としてを示した。
【０１０７】
EP(2)0715ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約60％; 図1におけるコラム2)。つまり、染色体2L上の遺伝子座29A1-3における遺伝子活性の損失は、EP(2)0715ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から両事例において肥満したハエのモデルを表している。
【０１０８】
PX7194.1ヘミ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(約60％; 図5におけるコラム2)。つまり、PX7194.1ハエのPXベクターがヘミ接合性生存統合されている染色体X上のPX7194.1統合の遺伝子座における遺伝子活性の変化は、以上の点から、エネルギー保管中性脂肪の代謝の変化の原因である。
【０１０９】
EP(2)2389ホモ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示し(約50％; 図10におけるコラム2)、また、EP(2)2389ヘテロ接合性ハエも、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示し(約25％; 図10におけるコラム4に示したように)、そしてEP(2)2390ホモ接合性およびヘテロ接合性ハエも、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図10においてコラム3および5にそれぞれ示したように約75％)。つまり、遺伝子座54C1-54C3における遺伝子活性の損失は、EP(2)2389ハエまたはEP(2)2390ハエのEP-ベクターがホモ接合性またはヘテロ接合性生存結合している場合、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１１０】
遺伝子機能の潜在的損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【０１１１】
実施例2: 中性脂肪のレベルの変化に関与するショウジョウバエ遺伝子の同定
iPCR法を用いて、EPべクターの統合部位の3'方向に直接的に近接して局在化し(本明細書中ではEP(2)0715、EP(2)2389、またはEP(2)2390)、そしてEPべクターの統合部位の5'方向に近接して局在化した(本明細書中ではPX7194.1)ゲノムDNA配列を分離した。それらの分離されたゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってそのベクターの統合部位を同定した。図2、6、および11はこれらの遺伝子座位の分子構造を示す。
【０１１２】
EP(2)0715ラインにおけるベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座2L、29A1-3にある。図2において、ゲノム配列は、EP(2)0715ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2L上の8157113位置から8182113位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG8049を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。Tecは、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG8049として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(2)0715ラインの統合部位を同定した。EP(2)0715を、Gadflyアクセッション番号CG8049を有するcDNAのアンチセンス方向におけるプロモーター領域 5'に統合する。以上の点から、Btk29A (Gadflyアクセッション番号CG8049)をコードするcDNAの発現は、EP(2)0715ラインのベクターのホモ接合性統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１１３】
PX7194.1ラインにおけるベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座 X, 10C7-D1にある。図6において、数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体X上の220000位置から始まり、染色体X上の280000位置で終わる)。灰色バーは遺伝子のエクソンを予測した(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、GadFly、そしてMagpieによって予測されたように)。PX7194.1ラインに対するべクターの統合部位は222666位置に表示した。PTP10Dは、Tian,S らの(1991) (1991) Cell 67:675およびYang,X. らの(1991) Cell 67:661によって同定およびクローニングされた遺伝子に対してコード化する。遺伝子をコードするPTP10Dの公開された配列を用いて、PX7194.1べクターのヘミ接合性生存統合部位を決定した。それは、PTP10D遺伝子(始動コドンまで5')の第1エキソンおよび第2エキソンの間にあるイントロン中に位置し、中性脂肪含有量の上昇を引き起こす。
【０１１４】
ラインEP(2)2389およびEP(2)2390におけるべクター統合染色体局在性部位は遺伝子座2R、54C1-54-C3にある。図11において、ゲノム配列は、EP(2)2389およびEP(2)239ラインのベクターの統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表されている(染色体2R上の1239400位置から12407500位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG6542を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。EDTPは、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG6542として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(2)2389ラインまたはEP(2)2390ラインの統合部位を同定した。100塩基対のEP(2)2389をアクセッション番号CG6542を有するcDNAの5'エキソンに生存的に統合し、EP(2)2390をアクセッション番号CG6542を有するcDNAの第2のエキソンに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG6542をコードするcDNAの発現は、EP(2)2389またはEP(2)2390ラインのベクターのホモ接合性またはヘテロ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増加につながる。
【０１１５】
実施例 3: ヒトヒトPTP10D、Tec、およびEDTP相同体同定
よって、本発明のタンパク質および相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、本発明のタンパク質のショウジョウバエおよびヒト相同体をコードする核酸である。配列に対して相同性を持つショウジョウバエ本発明のタンパク質は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の非重複タンパク質データベースのプログラムBLASTP 2.2.3を用いて同定した(Altschulらの(1997)、Nucleic Acids Res. 25:3389-2402を参照)。
【０１１６】
特に好適なのは、ショウジョウバエBtk29A (GadFlyアクセッション番号CG18355、CG8049)をコード、ヒトtecタンパク質チロシンキナーゼ(cDNAのためのGenbankアクセッション番号NM＿003215.1 (旧番号XM＿044444.3) (識別標識番号: 1、図3Aを参照)、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号NP＿003206.1 (旧番号XP＿044444) (識別標識番号: 2、図3Bを参照)、およびマウスタンパク質チロシンキナーゼTecIV (Genbankアクセッション番号AAD43402.1)する核酸である。異なる種から取り出したTecのアライメントをClustaWプログラムによって行った。
【０１１７】
特に好適なのは、ショウジョウバエPTP10D (Gadflyアクセッション番号CG1817)、ヒトPTPRB (cDNAのためのGenbankアクセッション番号XM＿006789.7 (識別標識番号: 3、図8Aを参照 )、タンパク質のためGenbankアクセッション番号XP＿006789.4 の(識別標識番号: 4、図8Bを参照)、およびマウス受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ(cDNAのためのGenbankアクセッション番号AF157628、タンパク質のためのGenbankアクセッション番号AAF80346)をコードする核酸である。
【０１１８】
特に好適なのは、ショウジョウバエEDTP (Gadflyアクセッション番号CG6542)、染色体3上のヒトEDTP相同性タンパク質((タンパク質のためのGenbankアクセッション番号XM＿056609.3およびNM＿022485.2 cDNAのための、XP＿056609およびNP＿071930)、識別標識番号: 6 (図12B)のタンパク質をコードする識別標識番号: 5のcDNA(図12A)、Genbankアクセッション番号から取り出した予測cDNA、XM＿056748、およびBC＿001674、さらにGenbankアクセッション番号AAH35690.1、AAL55787、BAC11211、およびCAD28494を有するヒトタンパク質)をコードする核酸である。
【０１１９】
実施例4: 哺乳動物(マウス)の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株 (望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株C57Bl/6J、C57Bl/6 ob/obおよびC57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持し(望ましくは22℃）、湿度40 パーセントおよび明/暗サイクルは望ましくは14/10時間とした。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号sniff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食野生型マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、SchnetzlerらのJ Clin Invest 1993 Jul;92(1):272-80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 16;93(8):3434-8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて保管した。
【０１２０】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)をAmerican Tissue Culture Collection (米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu.らのJ. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; SliekerらのBBRC 251: 225-9、1998)。手短に言えば、細胞はDMEM/10％のFCS (Invitrogen社、Karlsruhe、ドイツ)において50,000細胞/ウェルおよび6ウェルプラスチック皿の二通りにプレーティングし、5％の二酸化炭素、 37℃の加湿環境において培養した。集密日(0日目: d0と定義した)細胞は、DMEM/HamF12 (3:1; Invitrogen社)、フェチュイン(300μg/ml; Sigma社、Munich、ドイツ)、トランスフェリン(2μg/ml; Sigma社)、パントテン酸(17μM; Sigma社)、ビオチン(1μM; Sigma社)、およびEGF (0.8nM; Hoffmann-La Roche社、Basel、スイス)を含んだ無血清(SF)培地に移した。分化は、デキサメサゾン(DEX; 1 μM; Sigma社)、3-メチル-イソブチル-1-メチルキサンチン(MIX; 0.5 mM; Sigma社)、およびウシインスリン(5 μg/ml; Invitrogen社)を添加することによって誘導した。集密日(d4)後の4日間は、分化が完了するまで、細胞をウシインスリン(5 μg/ml)を含んだSF培地中に保持した。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。
【０１２１】
分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日およびホルモン、例えばインシュリン追加)を始めに、10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。
【０１２２】
本発明によるタンパク質のプロフィール分析
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から分離し、さらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製のSuperscript II RNaseH-逆転写酵素を用いる)し、望ましくはTaqman 2xPCR Master Mix (ドイツ、WeiterstadtのApplied Biosystems社; このミックスには、製造者によれば、例えばAmpliTaq ゴールドDNAポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP を有するdNTP、Rox passive referenceおよび最適化された緩衝液成分などが含まれている)を使用してTaqman分析をGeneAmp 5700配列検出システム(ドイツ、WeiterstadtのApplied Biosystems社製)上で行った。
【０１２３】
Tec発現の分析に対しては、次のプライマー/プローブ対を用いてtaqman分析を実施した:
マウスTecフォーワードプライマー(識別標識番号: 7) 5'-TCT TGG CTT GTC TCG GCA C-3';
マウスTec逆プライマー(識別標識番号: 8) 5'-GGA CAT CCT CTG TGT CCT CAG TG-3';
マウスTec Taqman プローブ(識別標識番号: 9) (5/6-FAM) CGC TCC GTC AAG GTG TCG GAC G (5/6-TAMRA)
PTPRB発現の分析に対しては、次のプライマー/プローブ対を用いてtaqman分析を実施した:
マウスPTPRBフォーワードプライマー(識別標識番号: 10) 5'-GAG AAT ACA TCG CCA CTC AGG G-3';
マウスPTPRB逆プライマー(識別標識番号: 11) 5'-CTC CCA CGC CAT CTT CCA-3';
マウスPTPRB Taqman プローブ(識別標識番号: 12) (5/6-FAM) CGC TTC CAG GCA CCA AGG ATG ACT T (5/6-TAMRA)
発現プロフィール作成の研究は、哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子としてのTecキナーゼの特定の関連性を確認する。Tec転写物は、哺乳動物のいくつかの野生型組織において発現され、そして白色脂肪組織(WAT) (図4Aを参照)において明確に発現され、エネルギー恒常性の調節における役割を示す。
【０１２４】
さらに、発明者らは、ショウジョウバエTec遺伝子の哺乳動物相同体が遺伝的に誘導された肥満症において調節されることを明らかにする。本発明においては、本発明者らは、本発明のタンパク質の発現を試験するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスを使用した(例えば、ob (レプチン)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。本発面者らは、代謝的に活性な組織(例えば、茶色脂肪組織(BAT))、同様に遺伝的に肥満した(ob/ob)マウス(図4Bを参照)の白色脂肪組織(WAT)における顕著な上方制御を認め、Tecキナーゼが脂質生成の修飾因子であるという本発明者らのデータを裏付けた。
【０１２５】
発現プロフィール作成の研究は、哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子としてのPTPRBの特定の関連性を確認する。PTPRBはむしろ偏在的に発現され、その中で最も高い発現レベルのは肺組織(図9Aを参照)である。
【０１２６】
さらに、発明者らは、ショウジョウバエPTPRB遺伝子の哺乳動物相同体が絶食によって調節されることを明らかにする。本発明においては、本発明者らは、本発明のタンパク質の発現を試験するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病の実験用マウスを使用した(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質レベルを増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。本発面者らは、例えば、PTPRBの発現が絶食マウス(図9Bを参照)の代謝的に活性組織(例えば、WAT)において強く下方制御されることを見出した。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図1はショウジョウバエBtk29A (GadFlyアクセッション番号CG18355、旧番号CG8049)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２】図2は変異型Btk29A遺伝子座の分子構造を示す
【図３Ａ】図3Aはヒトtecタンパク質チロシンキナーゼの核酸配列を示す
【図３Ｂ】図3Bはヒトtecタンパク質チロシンキナーゼのアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図４Ａ】図4A. 野生型マウス組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析相対RNA発現はY軸に示し、テストした組織はX軸示した
【図４Ｂ】図4Bは、野生型マウス(wtマウス)、絶食マウス(fastedマウス)、遺伝的に肥満したマウス(ob/obマウスおよびdb/dbマウス)それぞれの異なる組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図４Ｃ】図4Cは、異なる食事制限下(標準食マウスおよびパルミチン酸食マウス)においた野生型マウスの異なる組織におけるtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図４Ｄ】図4Dは、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のtecチロシンタンパク質キナーゼ発現のリアルタイムPCR法間接比較を示す
【図５】図5はショウジョウバエPTP10B (GadFlyアクセッション番号CG1817)変異体の相対中性脂肪含有量(中性脂肪/重量)を示す
【図６】図6は変異型PTP10D遺伝子座の分子構造を示す
【図７】図7はショウジョウバエPTP10Dに対するBLASTp検索の結果を示す
【図８Ａ】図8Ａはヒトtecタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、B (PTPRB)の核酸配列を示す
【図８Ｂ】図8Bはヒトtecタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、B (PTPRB)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図９Ａ】図9Aは野生型マウス組織におけるPTPRB発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図９Ｂ】図9Bは、野生型マウス(wtマウス)、絶食マウス(fastedマウス)、および遺伝的に肥満したマウス(ob/obマウス)それぞれの異なる組織におけるPTPRB発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図１０】図10はショウジョウバエEDTP (GadFlyアクセッション番号CG6542)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図１１】図11は変異型EDTP遺伝子座の分子構造を示す
【図１２Ａ】図12Aはヒト相同体EDTP(配列認識番号: 5)をコードする核酸配列を示す
【図１２Ｂ】図12BはEDTP (GenBankアクセッション番号CAD28494.1) (識別標識番号: 6)のヒト相同体のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図１３】図13は、異なる種から取り出したEDTPタンパク質の比較(CLUSTAL W 1.82複数配列アライメント)を示す
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【国際調査報告】
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