(57)【要約】本発明は、チップベースのゲル電気泳動を使用して、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を決定する方法を提供し、例えば、このポリペプチドは、不完全に形成されたヘテロ二量体半抗体と比較して、完全に形成された四量体抗体である。本発明は、キットをさらに特徴とし、このキットは、チップおよび上記の方法を実施するための指示書を含む。本発明の方法およびキットは、組換え治療抗体の産生および品質管理のモニタリングのためのハイスループット適用に対して改変可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの存在を検出するための方法であって、以下：
選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの移動に対する障害として作用するのに有効な分離媒体を有するチャネルを含むチップ上に、該選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドを含むサンプルをロードする工程であり、そして、少なくとも２つの電極が、電場を誘導するために該チャネル内に配置される、工程、
該チップの分離媒体を横切って電場を印加する工程であって、これにより、該選択されたジスルフィド結合パターンを有さないＩｇＧ４ポリペプチドと比較して、該選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの分離が、達成される、工程、ならびに
該選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
サンプル中の選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を検出するための方法であって、該サンプルは、２つ以上のポリペプチド鎖を有するポリペプチド多量体の混合物からなり、かつ、該ポリペプチド鎖間に少なくとも１つのジスルフィド結合を含み、該方法は、以下：
該選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの移動に対する障害として作用するのに有効な分離媒体を有するチャネルを含むチップ上に、該ポリペプチド多量体の混合物を含むサンプルをロードする工程であり、そして、少なくとも２つの電極が、電場を誘導するために該チャネル内に配置される、工程、
該チップの分離媒体を横切って電場を印加する工程であって、これにより、該選択されたジスルフィド結合パターンを有さないポリペプチドと比較して、該選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの分離が、達成される、工程、ならびに
該選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記方法が、ポリペプチド不純物の存在を決定する工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドが、半抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択されたジスルフィドを有するポリペプチドが、半抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記半抗体が、ＩｇＧ４クラスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドが、組換え産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、組換え産生される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドが、組換え産生される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記選択されたジスルフィド結合パターンを有さないＩｇＧ４ポリペプチドが、抗インテグリン抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物が、抗インテグリン抗体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗インテグリン抗体が、組換え産生される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが、細胞培養物の増殖培地から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、約１〜約５０００μｇ／ｍｌの選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離媒体が、ゲルポリマーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離媒体が、非還元的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドの移動が、蛍光検出器を使用して検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記電場が、非交互的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記分離が、等電点電気泳動をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離が、前記ポリペプチドの分子量に従う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記チップが、プレキャストゲルポリマーを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を検出するためのキットであって、該キットは、チップおよび請求項１に記載の方法を実行するための指示書を含む、キット。
【請求項２３】
選択されたジスルフィド結合パターンを有する治療ポリペプチドの純度を決定するためのキットであって、該キットは、チップおよび請求項１に記載の方法を実行するための指示書を含む、キット。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のキットであって、該キットが、分離媒体、非還元的緩衝液、タンパク質色素、調合緩衝液、および分離媒体を通って電場を誘導するための手段からなる群より選択される構成要素をさらに含む、キット。
【請求項２５】
前記キットが、ポリペプチド不純物の存在を決定するための指示書をさらに含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットが、１つ以上のポリペプチド標準をさらに含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連情報）
本出願は、２００２年６月２８日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３９３,０３８号、および２００１年１２月１９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３４１,９３８号に対する優先権を主張し、この両者の全体の内容は、本明細書によって参考として援用されている。
【０００２】
本明細書を通じて引用される任意の特許、特許出願、および参考文献の内容は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫応答は、身体が、それに侵入し、感染または疾患を引き起こす外来物質に対してそれ自身を防御する機構である。この機構は、これらの外来物質の抗体による識別および結合に基づいている。一旦、物質が抗体によって結合されると、この物質は、破壊の標的となる。
【０００４】
抗体は、２つが軽鎖であり、そして２つが重鎖である、４つのポリペプチド（Ｌ：Ｈ：Ｈ：Ｌ）で構成されている。大部分の抗体は、それら４つのポリペプチド鎖間にジスルフィド結合を含む。しばしば、いわゆる半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が生じ、これでは、重鎖ポリペプチド間にジスルフィド結合は形成されない。
【０００５】
ＩｇＧ４クラスのようないくつかの抗体では、２５〜３０％のＩｇＧ抗体が、これら分子が組換えによるか、または天然に産生されるか否かにかかわらず、１つの重鎖および１つの軽鎖を含む半抗体として産生される。その他の抗体アイソタイプおよびサブアイソタイプについて、半抗体形成は、異常タンパク質形態と関連している。例えば、半抗体形成は、ＩｇＧ４抗体におけるように、ヒンジ領域の構造に起因し得るか、または特定の骨髄腫により産生される抗体でのように、重鎖定常ドメイン中の欠失である。
【０００６】
半抗体は、明確な臨床症状をともなわないが、しかし、それらは、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、および形質細胞腫のような種々の疾患をもつ患者の血清および尿中で同定されている。ある程度までの半抗体はまた、マウスハイブリドーマおよび骨髄腫によって産生され、そして動物および細菌細胞の両方における組換え抗体産生の副産物である。これら抗体の多くは、不完全であるとき、潜在的に生物学的により活性でなく、そしてそれ故、このような半抗体を含む薬学的調製物の治療有効性を弱める能力を有している。従って、このような分子を検出する能力が所望される。
【０００７】
サンプル中の半抗体の量を決定する代表的な方法は、標準的なゲル電気泳道による。この方法は、遅延および誤る傾向にある。
【０００８】
従って、抗体を基礎にする薬物をモニターし、そしてその品質管理を改善するために、（完全に形成された抗体と比較するとき）半抗体の存在を決定する改良された方法に対する必要性が存在している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、完全に形成された抗体に比べて、選択されるジスルフィド結合化ポリペプチド（例えば、半抗体）の存在を検出するための改良法を提供することによって、標準ゲル電気泳動の前述の問題を解決する。代表的には、完全に形成された抗体は、ジスルフィド結合（Ｌ：Ｈ：Ｈ：Ｌ）によって結合される２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチドを含むテトラマーであるが、半抗体は、対応する軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチド（Ｈ：Ｌ）と不完全にジスルフィド結合されたまたは完全に結合していないジスルフィド結合された軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチド（Ｌ：Ｈ）である（図１１）。本明細書中に記載される方法に受け入れられる他の代表的な分子としては、１つ以上のジスルフィド結合を有する任意の多量体ポリペプチドが挙げられる。本発明の方法は、ヒト治療的応用での使用、ならびに診断的応用および研究的応用での使用に予定されるジスルフィド結合化多量体ポリペプチドの特性を決定するために特に有用である。
【００１０】
例えば、本方法は、所望の数のまたは所望の配置のジスルフィド結合を有するポリペプチドと比較して、不完全に形成されたポリペプチド、すなわち、不十分な数のジスルフィド結合を有するポリペプチドを、容易にかつ迅速に同定しうるチップベースのゲル電気泳動を用いる。２つの顕著な実施例は、ジスルフィド結合によって一緒に保持される４つのポリペプチド鎖を含む抗体（例えばＩｇＧ４）、および多重鎖リガンド（例えば、増殖因子）を含む。
【００１１】
従って、本発明は、以下を含むがこれらに限定されないいくつかの利点を有する：
不完全に結合されたポリペプチド（例えば、半抗体）または所望されない不純物と比較して、選択されたジスルフィド結合化ポリペプチド（例えば、完全に形成された抗体）の量を迅速に決定し得る改良された忠実度をもつ検出法
例えば、ヒト被験体において治療的に使用するためのポリペプチド多量体（例えば、抗体）の産生（例えば、組換え産生）の間品質管理をモニターするための方法、および
本発明の方法を行うための市販のチップとともに使用され得る、キット
従って、１つの側面において、本発明は、試料中の選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。ここでは、選択されるジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドを含有するサンプルは、選択されるジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの遊走に対して障害として働くために有効な分離培体を有するチャネル、および電場を誘導するために、チャネル内に置かれる少なくとも２つの電極を備えるチップ上にロードされる。電場は、そのチップの分離培体を通って印加され、それによって、選択されたジスルフィド結合パターンを有さないＩｇＧ４ポリペプチドの分離と比較して、選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの分離が達成される。選択されたジスルフィド結合パターンを有するＩｇＧ４ポリペプチドの存在は、例えば、完全に形成された（すなわち、ジスルフィド結合した）抗体、半抗体の量（例えば、割合）、またはその比を決定される。
【００１２】
関連する局面において、本発明は、２つ以上のポリペプチド鎖を有し、そしてこれらのポリペプチド鎖の間に少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチド多量体の混合物からなるサンプル中の、選択されたジスルフィド結合のパターンを有するポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。この方法に従って、ポリペプチド多量体の混合物を含むサンプルは、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの移動に対して障害として働くのに有効な分離媒体を有するチャネルおよびこのチャネル内に配置され、電場を誘導する少なくとも２つの電極を備えるチップにロードされる。電場は、チップの分離媒体を横断して印加され、それによって、選択されたジスルフィド結合パターンを有さないポリペプチドと比較して選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの分離が、達成される。選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在が、検出される。このようなペプチドは、例えば、完全に形成された抗体または半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。
【００１３】
特定の実施形態において、本方法は、ＩｇＧ４半抗体、ＩｇＧ４抗体、ポリペプチド不純物の存在、または前述のいずれかの抗体もしくはポリペプチドの比を検出するために使用される。
【００１４】
関連する実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体、特に、抗インテグリン抗体（例えば、抗−α−４−β−１（ＶＬＡ−４）抗体、抗−α−４−β−７（ＶＬＡ−７）抗体、またはＶＬＡ−４およびＶＬＡ−７の両方に結合する抗体（例えば、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ））））である。
【００１５】
別の実施形態において、本サンプルは、ポリペプチド（例えば、ジスルフィド結合を有するポリペプチド（例えば、抗体のリガンド））を、約１μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ（その中の任意の範囲のポリペプチド濃度（例えば、１〜１０μｇ／ｍｌ；１０〜１００μｇ／ｍｌ；１００〜５００μｇ／ｍｌ；５００〜１０００μｇ／ｍｌ；および１０００〜５０００μｇ／ｍｌならびに前述のポリペプチド濃度範囲の任意の重複する範囲またはより狭い範囲）を含む）で含む。
【００１６】
別の実施形態において、本方法は、選択されたジスルフィド結合パターン（例えば、不完全に形成された結合パターンに比べて完全に形成された結合パターン）を有するリガンドであるポリペプチドを検出する。
【００１７】
別の実施形態において、上記方法は、組換え産生されたポリペプチド中の選択されたジスルフィド結合を検出するために適切である。
【００１８】
別の実施形態において、上記方法は、組換え産生されたポリペプチド中の選択されたジスルフィド結合を検出するために適切である。
【００１９】
関連する実施形態において、本方法は、前述のリガンド、抗体、半抗体、またはジスルフィド結合されたポリペプチドの存在下で、ポリペプチド不純物を検出するために適切である。
【００２０】
関連する実施形態において、本方法は、細胞培養の増殖培地から単離されたポリペプチド中の選択されたジスルフィド結合を検出する。
【００２１】
関連する実施形態において、上記方法において使用される分離媒体は、ゲルポリマー（例えば、非還元ゲルポリマー）である。
【００２２】
関連する実施形態において、分離媒体中でのポリペプチドの移動は、蛍光検出器を使用して検出される。
【００２３】
関連する実施形態において、ポリペプチドは、これらの分子量に従って分離される。
【００２４】
関連する実施形態において、分離機構は、等電点電気泳動を含み、ここで、分子は、これらの等電点に基づいて分離される。
【００２５】
別の実施形態において、本分離方法において使用されるチップは、プレキャストゲルポリマーを含む。
【００２６】
なお別の実施形態において、本発明は、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を検出するためのキットを提供する。このキットは、チョップおよび選択されたジスルフィドパターンを有するポリペプチド（例えば、抗体、半抗体、またはポリペプチド不純物あるいは前述の抗体またはポリペプチドの任意の割合）の存在を検出するための本明細書に記載される方法を実施するための説明書を備える。
【００２７】
なお別の実施形態において、本発明は、選択されたジスルフィド結合パターンを有する治療的ポリペプチドの純度を決定するためのキットを提供する。このキットは、チップおよび選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチド（例えば、抗体、半抗体、またはポリペプチド不純物あるいは前述の抗体またはポリペプチドの任意の割合）の量を決定するための説明書を備える。
【００２８】
関連する実施形態において、本発明は、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在または純度を決定するためのキットを特徴とし、このキットは、チップ、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの量を決定するためのアッセイを実施するための説明書、ならびに以下の成分のうちの１つ以上（例えば、分離培体、非還元緩衝液、タンパク質色素、処方緩衝液または、分離培体を介する電場を誘導するための方法）からなる。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
明細書および特許請求の範囲の明確な理解を提供するために、以下の定義が、下に簡便に提供される。
【００３１】
（定義）
本明細書中に使用される場合、用語「選択されたジスルフィド結合を有するポリペプチド」は、選択されたジスルフィド結合が、軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドとの間に生じ、重鎖ポリペプチド間には生じない、半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含む。
【００３２】
用語「チップ」は、媒体を横切って電場が適用され得る分離媒体を含むための手段を有する任意の固体基材を含み、その結果、チップは、高分子（例えば、多量体ポリペプチド（例えば、抗体および半抗体））を分離するために使用され得る。
【００３３】
用語「分離媒体」は、高分子（例えば、多量体ポリペプチド（例えば、抗体および半抗体））を示差的に分離するために使用され得る任意の化合物（例えば、ポリマーゲル）を含み、そして、一般に、適切な緩衝溶液を含むと理解される。
【００３４】
用語「半抗体」は、抗体を含み、この抗体内で、重鎖間ジスルフィド結合が存在しておらず、その結果１つの軽鎖ポリペプチドおよび１つの重鎖ポリペプチドが、対応する１つの軽鎖ポリペプチドおよび１つの重鎖ポリペプチドに結合しない形態を形成する。
【００３５】
用語「ＩｇＧ４クラス」は、二次免疫応答の間に産生され、血液中に最も一般的に見出されるＩｇＧ免疫グロブリンのサブクラスを含む。これらのＩｇＧ抗体は、代表的にγ４重鎖を含む。
【００３６】
用語「非還元」は、ジスルフィド結合（ｂｏｎｄ）（例えば、ジスルフィド結合（ｌｉｎｋａｇｅ））が、保存される条件をいう。具体的には、ジスルフィド結合が、インタクトのままであり、かつスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒｉｌ）に変換されない条件をいう。
【００３７】
用語「等電点電気泳動」は、高分子が、それらの等電点（ｐＩ）に従って、キャリア両性電解質の溶液に電荷を適用することによって確立されたｐＨ勾配で移動および集束する方法を含む。
【００３８】
用語「インテグリン」は、細胞外マトリックスへの細胞の粘着に関与することからそのように命名された、膜貫通タンパク質の大きなファミリーを代表する任意のポリペプチドを含む。従って、用語「抗インテグリン抗体」は、このような分子と結合する抗体である。抗インテグリン抗体の例としては、抗α−４−β−１（ＶＬＡ−４）抗体、抗α−４−β７（ＶＬＡ−７）抗体、およびＶＬＡ−４およびＶＬＡ−７の両方に結合する抗体（例えば、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（例えば、米国特許第６，０３３，６６５号および米国特許第５，８４０，２９９号を参照のこと））のような抗体が挙げられる。
【００３９】
（詳細な説明）
チップベースのゲル電気泳動を用いて、選択されたジスルフィド結合を有するポリペプチド（例えば、抗体）の存在を検出する方法が、開発されてきた。この方法は、不完全に形成された抗体（例えば、重鎖間ジスルフィド結合を欠く半抗体（これは、ジスルフィド結合したヘテロダイマーである））と比較した、完全に形成された抗体（例えば、ＩｇＧ４抗体）（これは、ジスルフィド結合したテトラマーである）の存在、非存在または相対的な量（比率）を検出するために、特に十分適切である。さらに、この方法を用いて、サンプル中の不純物（例えば、ポリペプチド不純物）の存在を検出し得る。この方法は、代表的にＰｒｏｔｅｉｎ２００（または２００Ｐｌｕｓ）ＬａｂＣｈｉｐキットおよびＰｒｏｔｅｉｎ２００アッセイソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）と組み合わせて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いるが、同様に適合されたハードウェア、試薬、およびソフトウェアが使用され得る。
【００４０】
原理の証拠として、本明細書中に記載される本発明の方法は、治療的用途のための組換え抗体の産生の間に得られた試験サンプル（特に抗インテグリン抗体）を使用するが、この方法は、天然由来か（例えば、血清から）、細胞株（例えば、ハイブリドーマ）によって産生されたかまたはトランスジェニック生物中で産生されたかどうかをいずれかの抗体サンプルに等しく適用され得ることが理解される。
【００４１】
この方法は、現在のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に対するいくつかの利点を提供し、例えば、チップベースのゲル電気泳動は、より高度に自動化され、そして使用するのが容易である。簡便なＳＤＳ−ＰＡＧＥと対照的に、さらなるマニュアルの染色工程または脱色工程を必要としない。さらに、自動化は、産生プロセスの間の異なる段階（例えば、細胞株（例えば、細胞バンク（ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）由来）のクローンの選択から細胞培養物の拡大までおよび最終の産生フェーズ）でのポリペプチド産生のリアルタイムに近い分析を可能にする。
【００４２】
この方法は、選択されたジスルフィド連結パターンを有するポリペプチド、例えば、１つ以上のジスルフィド結合または連結によってまとまった多量体ポリペプチド（例えば、抗体または半抗体）を含むサンプルを得ること、および分離媒体またはゲル（例えば、有機ポリマー、これは、チップのような固体基板上の開口またはチャネルに閉じこめられる）でサンプルをロードすることまたはこれらとサンプルとを接触することによって行われる。次いで、分離媒体またはゲルは、電場に供され（すなわち、電流はゲルに適用される）、その結果、ポリペプチド分子が分子量に基づいて分離媒体を通って移動する。分離媒体またはゲルを通るポリペプチドの移動は、ポリペプチドのジスルフィド連結パターン（またはジスルフィド結合）を保存する条件下（例えば、非還元条件下）で行われる。従って、異なるジスルフィド連結パターンを有するポリペプチドは、区別され得、そして特に、四量体抗体のような多量体ポリペプチドは、ヘテロ二量体の半抗体と区別され得る。
【００４３】
１つの実施形態において、選択されたジスルフィド連結を有するポリペプチドの移動パターンの実際の検出は、染料（例えば、蛍光染料）を使用して行われ、この染料は、ポリペプチドと相互作用し得、そして例えば、光学検出デバイス（例えば、蛍光読み取り機）を使用して視覚的にモニターされ得る。
【００４４】
伝導ゲル電気泳動のための条件、試薬濃度、検出染料および適切な機器は、当該分野で周知である。さらに、本発明の方法に適応され得る緩衝液条件および検出試薬の多くのバリエーションが存在する。従って、本発明は、広範な再最適化を必要としない、確立されたプロトコルに簡便に取り込まれる利点を有する。さらに、本発明の方法は、ジスルフィド連結を有する任意のポリペプチドの性質をモニタリングするのに使用され得る。
【００４５】
１つの特定の実施形態において、本発明の方法は、上記のように、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００（または２００  Ｐｌｕｓ）ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔおよび専用のＰｒｏｔｅｉｎ  ２００アッセイソフトウェア（これは、４５分以内に１０サンプルまでのポリペプチドサイズおよび濃度の詳細なデータを提供する）と共にＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して行われる。ソフトウェアの計算が行われ、サンプル中で検出された各ポリペプチドについての分子量（時間に対する検出された蛍光の量に基づく）、検出された互いのポリペプチドに対応する相対的なポリペプチド濃度およびサンプル中の全相対ポリペプチド濃度と比較した各ポリペプチドの量（パーセンテージ）を提供する。この方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うのに必要なさらなる手順を必要とせずに、所定のサンプル中の半抗体分子の量（パーセンテージ）の迅速な測定を可能にする。この方法はまた、不純物（例えば、ポリペプチド不純物）の検出を可能にする。
【００４６】
以下の実施例に示されるデータは、特に、完全に形成された抗体、比較的不完全に形成された抗体（すなわち、半抗体）ならびに不純物の量を測定するための本方法の高度な正確さを証明する。さらに、チップベースのゲル電気泳動アプローチを使用する本発明の方法は、チップ上の複数の操作（例えば、タンパク質サンプルを染色し、分離しそして希釈すること）を組み込む機械（ｐｏｗｅｒ）の例であり、これによって簡便なゲル電気泳動法に対する優れたアプローチを提供する。
【００４７】
本発明はまた、本発明の方法の簡便な実施のためのキットを提供する。１つの実施形態において、本発明は、選択されたジスルフィド結合パターンを有するポリペプチドの存在を検出するためのキットを提供し、このキットは、チップおよび本明細書中に記載される方法を実施するための指示書を含む。このキットはまた、少なくとも１つの他の成分（例えば、分離媒体、非還元的緩衝液、タンパク質色素、調合緩衝液、および分離媒体を通して電場を誘導するための手段）を備え得る。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、上記キットのいずれも、このキットが、分離媒体、非還元的緩衝液、タンパク質色素、チップ、および／または分離媒体を通して電場を誘導するための手段とともに簡便に使用され得るように、指示書とともに、さらに設計、パッケージングまたは提供され得る（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である（米国特許第６，２５４，７５４号を参照のこと））。
【００４９】
本明細書中に開示される方法を実施するために、他の市販の分離媒体（ゲル）、検出剤（色素）、検出器、チップ、および電場を誘導するための装置が、本発明によって包含されることが理解される（例えば、米国特許第６，１７６，９９０号；同第６，２６１，４３０号；同第５，７５０，０１５号；同第５，４４９，４４６号；および同第５，４２７，６６３号を参照のこと）。
【００５０】
本発明の方法は、生物産生（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、研究、診断適用、および法医学を含む種々の使用に適用可能である。
【００５１】
（生物産生）
本発明の方法およびキットは、ジスルフィド結合を有するポリペプチドの生物産生において種々の適用を有する。実際に、抗体（多量体リガンド）は、ジスルフィド結合によって結合される多量体ポリペプチドである、商業的に産生される好ましい分類の治療ポリペプチドである。
【００５２】
従って、本明細書中において例示されるような、本発明の方法は、ジスルフィド結合ポリペプチド生物産生の任意の関連する段階（例えば、クローンバンクからのクローン選択、細胞培養物増殖、ならびに小規模および大規模の産生（例えば、バイオ発酵槽を使用する））のモニタリングまたは品質管理（ＱＣ）に容易に適用される。本発明の方法が迅速であり、自動化され得るので、ほぼリアルタイムの分析が、産生の間に実行され得、そして所望の場合、産生物産出量の質に影響するように産生パラメーターを変更するために使用され得る。
【００５３】
（研究適用）
本発明の方法およびキットは、種々の研究適用を有する。例えば、これらは、分析が迅速に実行されなければならないかまたはジスルフィド結合を有するポリペプチド（例えば、抗体またはリガンドのような多量体ポリペプチド）を含む制限された量のサンプルについての任意の研究適用に有用である。
【００５４】
研究的使用のための本発明の方法の他の適用は、当業者に容易に明らかである。
【００５５】
（診断適用）
本発明の方法およびキットは、種々の診断適用（例えば、患者における不適切に結合されたポリペプチド（例えば、半抗体）の検出）において有用である。
【００５６】
本明細書中に記載される本発明の方法およびキットはまた、疾患（例えば、遺伝障害または細胞障害（例えば、癌））に関連する抗体および／または半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）を、検出または特徴づけするために使用され得る。
【００５７】
（法医学適用）
法医科学は、犯罪の証拠の科学的分析に関する。法医生物学は、分子生物学、生化学および遺伝学の実験技術を、例えば、犯罪の加害者をポジティブに同定する目的のための、生物学的証拠の試験に適用する。代表的に、このような生物学的証拠（例えば、血液）のサンプルサイズは小さいが、なお、本発明の方法に従って検出され得る、十分量のポリペプチド（例えば、抗体）を含む。
【００５８】
従って、本発明の改善されたチップベースのゲル電気泳動技術は、ごく小さい生物学的サンプルから、ポリペプチドを検出するため（例えば、抗体を同定するため）に使用され得る。
【００５９】
以下の実施例は、例示の目的で含まれ、本発明の限定として解釈されるべきではない。
【００６０】
（実験）
実施例全体を通じて、他に示されない限り、以下の材料および方法を使用した。
【００６１】
（材料および方法）
一般に、本発明の実施は、他に示されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、免疫グロブリン技術）および電気泳動における標準的技術の従来技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）．Ｂｏｕｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｚｉｎｇ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，１２０７−１２１２（２００１）；Ｋｎａｐｐら、Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  μＴＡＳ  ２００１  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｒａｍｓｅｙ，Ｊ．Ｍ．＆  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ａ．，７−１０（２００１）；ならびにＭｈａｔｒｅら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｔｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖｉａ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１３（２４）２５０３−２５１０（１９９９）を参照のこと。
【００６２】
（装置およびサンプル）
抗体サンプルの分離および検出を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００（または２００  Ｐｌｕｓ）ＬａｂＣｈｉｐキットおよび専用のＰｒｏｔｅｉｎ  ２００アッセイソフトウェアと合わせて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用して行った。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒは、６３０ｎｍで発光する１０−ｍＷの半導体レーザーを用いた、落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）検出を使用する。この機器はまた、１６個の独立してプログラム可能な高電圧供給源を備える。
【００６３】
【表１】
2005526956.tif 000002
（サンプル調製）
タンパク質サンプルを、処方緩衝液（例えば、ＰＢＳ、または１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−８０ＫＲ）を使用して必要に応じて希釈し、そして変性緩衝液と２：１の比で混合することによって変性し、そして５分間で１００℃まで加熱した。変性緩衝液は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００  Ａｓｓａｙキットで提供され、４％のＳＤＳおよび２９０μｇ／ｍｌのミオシン内部マーカーを含む。変性後、実験のためのサンプルを、脱イオン化水中のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの下側（ｌｏｗｅｒ）マーカー色素（ｄｙｅ）の１０％溶液（励起波長／発光波長  ６５０／６８０ｎｍ）で、１：１５に希釈した。最適なタンパク質濃度は、３０００μｇ／ｍｌであると決定された。標準的な技術を使用してＮＳＯ細胞中で組換え的に産生された抗インテグリン抗体の、１０個を超えるそれぞれのサンプルを、以下のアッセイ中で使用した。
【００６４】
（チップ調製（チッププライミング））
全ての分離実験のために、ガラスチップ中のあらゆるチャネルを、篩マトリクス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を「Ｇ」と標識された右上のウエル中にロードし、そしてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔキットガイド（２０００）（参考として援用される）に記載される標準的な手順に従って圧力を１分間適用することによってロードした。使用される篩マトリクスは、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（ｐＨ７．６）（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、４２ｍＭ  Ｔｒｉｓ）中、３．２５％の、ポリジメチルアクリルアミドベースのポリマーであり、０．２５％のＳＤＳ（８．７ｍＭの最終濃度）および４μＭの下側マーカー（「Ａｇｉｌｅｎｔ」色素）として使用されるのと同じ色素を含んでいる。この篩マトリクスは、キット中に提供される試薬を使用して、標準的な手順に従って調製される。「Ｇ」と標識された４つのウエル全てをこの溶液で満たした。ＳＤＳ希釈ウエル（「ＤＳ」と標識される）は、篩マトリクスとＴｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液のみを含む。タンパク質サンプル（総容量６μｌ）は、底部の、Ｇの次のウエルを除いて、チップ上の残りのウエル全てに適用される。このウエル（ラダーマークを付けられている）は、１４〜２１０ｋＤの分子量を有する７つのタンパク質を含むタンパク質ラダーでロードされる。
【００６５】
（データの取りこみおよび分析）
チップ中で、電気泳動は、そのウエルから中心チャネルまで各サンプルまで引き続いて移動する。サンプルが中心チャネルまで下に移動するにつれて、これらのサンプルはサイズで分けられ、最終的にサンプルに結合する蛍光色素を励起させるレーザーを通過する。データの捕捉および分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョンＡ．０２．０１）を用いて実施する。このソフトウェア分析データは、蛍光強度  対  時間に基づく。濃度の定量およびタンパク質のサイズ決めは、サイズ決めラダーおよび内部標準（「マーカー」）に対して比較することによって達成され、この内部標準は、各サンプルと共に移動する。このデータは、ゲル様画像、電気プログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）として、ならびに移動時間、蛍光強度（「Ｃｏｒｒ領域」として）、サイズ、相対濃度、吸収濃度（選択）、および「総％」にデータを含む、タブラーフォーマット（ｔａｂｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔ）（結果を合わせた表）で示される。
【００６６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒからの電気プログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）は、タンパク質の分子量（ｋＤ）に従って、それらの分離を可視化する。このＰｒｏｔｅｉｎ  ２００ラダーは、設計されたラダーウエルから各チップ上に電気泳動する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２００ラダーの分析後、このソフトウェアは、ラダー中の各タンパク質の分子量に対して移動時間の較正曲線を作成する。次いで、この較正曲線を使用して、１０個のサンプルにおいて検出されたタンパク質の各々のサイズを決定する。１０個のサンプルの各々と共に電気泳動される下側マーカーおよび上側マーカーは、移動時間のわずかなドリフトを補正し、正確なサイズ決めを確実にする。このソフトウェアは、内部マーカーおよび外部タンパク質標準との整列に基づいて自動でサイズ決めを実施する。分子量の決定は、測定された電気泳動移動時間（秒）に基づく。
【００６７】
相対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）を、ピーク面積の測定、およびそれらと既知のタンパク質濃度の内部基準（上側のマーカー）との比較に基づいて決定した。全％を、相対濃度に基づいて計算する。
【００６８】
検出が完了すると、各サンプルの結果を、リアルタイムで表示する。第１の結果を、７分間で取得し、ここで各々の引き続く分析が、２分間隔で続く。これらの結果を、各サンプルについて、表形式、ゲル様イメージおよびエレクトロフェログラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）で示す。
【００６９】
各エレクトロフェログラムは、下側マーカーピーク、システムピーク及び上側マーカーピークを含む。上側マーカーは、９５％純粋であり、そして１８ｋＤおよび２５ｋＤの２種の小さな不純物を含む。この上側マーカーの不純物レベルは、濃度決定のためのソフトウェアによって補正される。これらのピークは、相対的に低分子量であるので、これらのピークは、抗体（または半抗体）のピークを妨害しない。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
（チップベースのゲル電気泳動のサイジングの精度および再現性を決定するための方法）
抗インテグリン抗体サンプルの分析によって、完全に形成された抗インテグリン抗体（ＭＷ  約１６０ｋＤ）に対応する１つの主要なピーク、および半抗体に対応する約８９ｋＤの小さいピークを特定した。同じピークパターンが、異なる抗インテグリン抗体サンプル（これもまた、非還元条件下で処理された）について見出された。異なるサンプルについてのこれら２つのピークの分子量を、図２に示し、そして異なるタンパク質濃度における抗インテグリン抗体についての同じデータを、図１に示す。このデータは、非常に再現性があるが、主要なピークの分子量は、サンプル濃度が、５０から４９００μｇ／ｍｌまで増加する場合、減少し、その平均ＭＷは、インタクトな抗インテグリン抗体について１６１．１、半抗体について８９．１であった。
【００７１】
（表２．チップベースの方法のサイジングの精度）
【００７２】
【表２】
2005526956.tif 000003
（実施例２）
（チップベースのゲル電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥとの比較）
抗インテグリンサンプル中に半抗体は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、８０ｋＤまで移動するバンドとして検出可能である。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたデータを、チップベースの方法によって得られたデータと比較した。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、標準的な技術に従って実施した（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）を参照のこと）。代表的に、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析について、通常、３μｇのタンパク質サンプルを、ゲルにロードする。チップベースの方法について、１μｇほどの少量で十分である。
【００７３】
引き続いて、いくつかの抗体サンプルについて、正確な比較を実施するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、チップベースの方法についてと同じ低タンパク質濃度（またはロード量のタンパク質）で実施した（表３および図５）。これらのチップベースの結果は、これらの２つの方法の間の良好な相関を実証する。高い割合の半抗体を示す広範な種々の抗体サンプルに対して得られるデータは、表３に提示される。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法とチップベースの方法との両方が、高い割合の半抗体を、抗インテグリン抗体サンプル５、８、９および１０において検出した（表４）。これらの結果もまた、これらの２つの方法の間の良好な相関を実証する。
【００７４】
【表３】
2005526956.tif 000004
抗インテグリン抗体サンプル１を、異なる濃度で、チップベースの方法（半抗体の割合を、合わせた結果表から決定した）および従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００７５】
【表４】
2005526956.tif 000005
示される濃度での異なる抗体サンプルを、チップベースの方法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法によって分析した。
【００７６】
（実施例３）
（アッセイの線形ダイナミックレンジを決定するための方法）
この実施例は、このアッセイからの結果が正確であるタンパク質濃度の範囲を決定するために使用され得る方法を提供する。このアッセイの線形ダイナミックレンジを決定するために、１２．５〜４９００μｇ／ｍｌの濃度の抗インテグリン抗体サンプルを分析した。図２（パネルＡ〜Ｄ）は、最低濃度（１２．５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）（Ｂ、Ｃ、Ｄ）における異なる抗インテグリン抗体および処方緩衝液を含むコントロールサンプル（Ａ）の分析の結果を示す。
この半抗体バンドに対応するピークは、５０μｇ／ｍｌの総サンプル濃度でのみ検出され得る（Ｃ）が、インタクトな抗体のピーク（ＭＷ約１７１）は、１２．５μｇ／ｍｌで容易に認められ得る（Ｂ）。チップベースの方法に使用される染色アプローチを用いると、いくらか比較的高い濃度のタンパク質において、染色の飽和に達し得ることが予測されるべきである。不十分な量の染料は、定量的な様式でＳＤＳ−タンパク質複合体に結合することが示され得る。結果として、サンプル中のタンパク質量は、過小評価／過大評価される。従って、シグナル（蛍光強度／相対濃度）と「真の」サンプル濃度との間の線形相関を与えるサンプル濃度を同定することが重要である。「真の」サンプル濃度は、Ａ２８０に基づく標準的な手順によって決定された。これらのデータは、総サンプル濃度として、および抗体および半抗体に対応する濃度（約１０％）として示される。合わせた結果の表は、蛍光強度を含むアッセイ結果の異なるパラメーターを（「Ｃｏｒｒ．ａｒｅａ」、サンプルの相対濃度、およびサンプルの絶対濃度として）示す。
【００７７】
実験により、真のサンプル濃度と蛍光強度との間の相関が低いことが示されたので、「相対サンプル濃度」を試験した。相対タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）は、ピーク面積を測定し、これらの測定値を、各サンプルの内部標準として使用される上側マーカー（ミオシン）に対して比較することに基づいて得られる。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアは、未知のタンパク質のピーク面積および各サンプルの上側マーカーを自動的に決定する。１サンプル内の未知のタンパク質の相対濃度は、次いで、上側マーカーの既知の濃度に基づいて、ソフトウェアにより計算される。各サンプル中に上側マーカーを含めることにより、分離したチャネルへのサンプル注入における差異が較正され、再現可能な定量が可能になる。真のサンプル濃度は、抗インテグリン抗体および半抗体について別々にソフトウェアによって決定される濃度（相対および絶対）と比較される（「Ｘ」）。参照標準のサンプル（サンプル７）を、図３から６に示されるように、希釈および試験した。報告されたサンプル濃度は、サンプルをチップにロードする前に、水でのサンプルの１５倍希釈を含まない。
【００７８】
このアッセイは、インタクトな抗インテグリン抗体に対応するピークに基づいて、例えば、検出下限（１２．５μｇ／ｍｌ）から２０００μｇ／ｍｌまで、２桁の規模を超えて線形である（図４）。この線形性は、わずかではあるが、徐々に２０００μｇ／ｍｌを過ぎると低下する（図５）。Ｒ２＝０．９８の相関係数が、５００〜４９００μｇ／ｍｌのサンプル濃度についてのインタクトな抗体ピークに基づいて決定された。１００〜２０００μｇ／ｍｌの濃度において、Ｒ２＝０．９９６が観察された（図４）。
【００７９】
（実施例４）
（チップベース法の線形動的範囲を決定するための方法）
以下の実施例は、チップベース法の動的範囲を決定し得る方法を提供する。抗インテグリン抗体標準（サンプル７）を、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、および４９００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で分析した。濃度４９００μｇ／ｍｌのストック溶液を希釈した（濃度は、Ａ２８０に基づいて決定した）。インタクトな抗体ピーク（図３および図４）ならびに半抗体ピーク（図５および図６）に対応するピークの相対濃度を、組み合された結果の表（ソフトウェアによって提供される；表４）に基づいてタンパク質濃度の範囲で決定し、そしておおまかな線形動的範囲を、観察した。
【００８０】
（実施例５）
（決定された絶対性および関連抗体および全抗体サンプル濃度の間の相関作用を決定するための方法）
以下の実施例は、タンパク質サンプルの実濃度および相対濃度を相関され得る方法を提供する。抗体標準（サンプル７）の２つのセットを、以下のタンパク質濃度で分析した：１）１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、および４９００μｇ／ｍｌならびに２）１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ、および４９００μｇ／ｍｌ。ストック溶液を希釈した（濃度は、Ａ２８０に基づいて決定した）。４９００μｇ／ｍｌを除いて、全てのサンプル濃度を、絶対濃度の決定についてキャリブレーション曲線を使用した。全相対濃度および絶対濃度を、組み合された結果表から決定した。
【００８１】
半抗体ピークに基づく同様のグラフは、５０μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌの濃度でのサンプルについて線形動的範囲を示す。Ｒ２＝０．９４９の相関係数を、１００μｇ／ｍｌ〜４９００μｇ／ｍｌのサンプル濃度について決定した（図５）。１００μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｒ２＝０．９８７（図６）の相関係数を観察した。より低い濃度は、予備データが、１０〜２０μｇ／ｍｌでの半抗体ピークの非存在をすでに示したので、試験しなかった。図７は、ソフトウェア分析によって決定されたサンプルの相対濃度と絶対濃度との間の良好な相関、およびＡ２８０測定に基づいて決定された実サンプル濃度を示している。低い全サンプル濃度では、パーセント（％）半抗体（半抗体の相対濃度）は、より高いサンプル濃度（線形範囲）で得られた％半抗体より低い。
【００８２】
（実施例６）
（最適なサンプル濃度を決定するための方法）
以下の実施例は、最適な結果を得るために使用されるべきである最適なタンパク質濃度を決定するための方法を提供する。最適なサンプル濃度を決定するために、異なるサンプル濃度で得られた％半抗体の結果を分析した（図８および９）。低濃度で決定された％半抗体は、有意に低い（１００μｇ／ｍｌ以下）。これらの結果に基づいて、推奨最適サンプル濃度は、３０００μｇ／ｍｌである。
【００８３】
（実施例７）
（検出限界（ＬＯＤ）の決定のための方法）
以下の実施例は、半抗体が正確に検出される最低濃度を決定するための方法を提供する。検出限界を、半抗体の最低検出濃度が５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度において２．７μｇ／ｍｌであるという観察に基づいて、決定した。検出される低い％半抗体（平均１０％と比較して、４．５％、以下を参照のこと）で生じたこの決定された濃度、故に、サンプル中の半抗体の実際の濃度は、２倍高くあり得る（約５μｇ／ｍｌ）。従って、このアッセイについて示唆される最適なサンプル濃度は、約３０００μｇ／ｍｌである。この仮定に基づいて、％半抗体についての定量限界は、５μｇ／ｍｌ（２ｎｇの負荷）および０．１７％（５μｇ／ｍｌ／３００μｇ／ｍｌ）の半抗体濃度として決定され得る。％半抗体が約１０％である場合、これは、５０μｇ／ｍｌのサンプル濃度に相当する。
【００８４】
この計算を、相対濃度データに基づいて行った。図１０は、５０μｇ／ｍｌにおける未加工データを示す。ＭＷ  ８９．６６を有する半抗体のピークは、バックグラウンドから明確に区別される。
【００８５】
（実施例８）
（定量限界（ＬＯＱ）を決定するための方法）
以下の実施例は、半抗体決定が正確である最大濃度を決定する方法を提供する。詳細には、定量限界を決定するために、異なるサンプル濃度で決定された％半抗体を比較した。ＬＯＱを、６１３μｇ／ｍｌのサンプル濃度および／または１．９％であると決定する。これを、最適サンプル濃度が３０００μｇ／ｍｌであり、抗体参照基準の平均％半抗体が９．１％であるという仮定に基づいて計算した。線形回帰を、平均（７．３〜１１％）より２０％高いかまたは低い％半抗体を与える点（サンプル濃度）に適用した。
【００８６】
（実施例９）
（チップベース法の再現性および正確性を決定する方法）
以下の実施例は、チップベースアッセイの再現性および正確性を試験する方法を提供する。複数のチップを用いる場合、または同じサンプルと異なるチップを用いる場合の、アッセイの再現性を、同じサンプルおよび同じチップを用いることによって試験した。抗体参照標準（サンプル７）は、チップベース法の再現性を確認するために使用した。同じチップ上で同じサンプルを流して得られたデータを表５に示す。これらのデータ（％半抗体、「％合計」は、合わせた結果の表から決定した）は、抗体および半抗体について、それぞれ、ＳＴＤＥＶ＝０．５ならびに％ＳＴＤＥＶ＝０．５および６．０と非常に類似している。
【００８７】
（表５．同じチップ上で流した異なるサンプルについての比較データ）
【００８８】
【表５】
2005526956.tif 000006
異なるチップ上での同じサンプルの泳動のデータ分析を、表６に示す。０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５μｇで決定された％半抗体についての平均は９．５であり、ＳＴＤＥＶは０．３、および％ＳＴＤＥＶは３．３６である。
【００８９】
（表６．異なるチップ上で流した同じサンプルについての比較データ）
【００９０】
【表６】
2005526956.tif 000007
抗体サンプル（すなわち、１２番）を、％半抗体および抗体を決定するために、０．１、０．２、０．３、０．４、および０．５μｇの量（濃度３７０、７５０、１１００、１５００、および１８７０μｇ／ｍｌ）でロードした。このアッセイは、多種のサンプル緩衝液および添加物を許容し得ることもまた観察された。
【００９１】
（実施例１０）
（不純物を検出するためのチップベースの方法の再現性および精度を決定するための方法）
以下の実施例は、サンプル（例えば、組換え抗体を含有するサンプル）中の不純物を検出するためのチップベースのアッセイの再現性および精度を試験するための方法を提供する。
【００９２】
このアッセイの再現性を、例えば、意図的に加えられた特定の濃度の既知のマーカータンパク質、または他の手段（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検出される、標準的な組換えタンパク質の調製プロセスおよび回収プロセスからの残留不純物のいずれかを有する、いくつかの組換え抗体サンプルを使用することによって、試験した。
【００９３】
１つの実験において、３つのマーカータンパク質（トリプシンインヒビター（ＭＷ  ２１ｋＤ）、オボアルブミン（ＭＷ  ４６ｋＤ）、およびガラクトシダーゼ（ＭＷ  １１６ｋＤ））を、組換え抗体参照標準物質（すなわち、ナタリツマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ））に加え、その結果、このサンプルの最終濃度は、４８００μｇ／ｍｌであり、マーカータンパク質の最終濃度は、０．７５％不純物、１％不純物、１．２％不純物、および１．５％不純物に対応した。回収データを、表７および／または図１２に示す。
【００９４】
（表７．組換えタンパク質サンプル中の不純物の回収）
【００９５】
【表７】
2005526956.tif 000008
チップベースの方法の感度を決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびチップベースの方法によって得られた不純物分析データの比較を行った（図１３および図１４）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、チップベースの方法が、０．１％の検出限度（ＬＯＤ）、および０．５％の定量限度（ＬＯＱ）を有することを示した。
【００９６】
従って、チップベースの方法は、ポリペプチドサンプル（例えば、抗体のような組換えタンパク質を含むサンプル）中の不純物を検出および定量するのに有効でかつ信頼性のあるアプローチであることと結論付けた。
【００９７】
（等価物）
慣習的に過ぎない実験を使用する当業者のために、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物が存在している。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、インタクトな抗体（抗インテグリン抗体）および、対応する半抗体に対する方法のサイジングの正確さ（泳動時間によって）をサンプル濃度の関数として示すクロマトグラフを示す。
【図２】図２は、アッセイの線形ダイナミックレンジを決定するための、コントロールと比較した抗体（抗インテグリン抗体）の増加量（パネルＡ〜Ｄ）を示すクロマトグラフを示す。
【図３】図３は、１００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲を用いて、抗体（抗インテグリン抗体）の正確なサンプル濃度（Ａ２８０読み取りによって決定する）に対する相対的濃度（サンプルと、泳動させた既知濃度のマーカーとの比較による蛍光の決定により計算する）を、プロットすることによる方法の線形性を示す。
【図４】図４は、１００μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌの濃度範囲を用いて、抗体（抗インテグリン抗体）のサンプル濃度に対する相対的な濃度を、プロットすることによる方法の線形性を示す。
【図５】図５は、半抗体のサンプル濃度に対する相対的濃度を、１００μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲を用いて、プロットすることによる方法の線形性を示す。
【図６】図６は、１００μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌの濃度範囲を用いて、半抗体のサンプル濃度に対する相対濃度をプロットすることによる方法の線形性を示す。
【図７】図７は、ソフトウェア分析および吸光度の読み取りに基づく実サンプル濃度により決定されたサンプルの相対濃度と絶対濃度との間の相関を示す。
【図８】図８は、０．１μｇ〜０．５μｇの範囲のサンプルタンパク量での半抗体のパーセンテージを示すグラフを示す。
【図９】図９は、最適サンプル濃度を決定するために使用される１０μｇ／ｍｌ〜４９００μｇ／ｍｌの範囲のサンプルタンパク質濃度の、半抗体のパーセントを示す図式を示す。
【図１０】図１０は、上記アッセイを使用して、半抗体の検出可能な最低濃度を決定するために使用されたクロマトグラフを示す。
【図１１】図１１は、示される鎖内ジスルフィド結合および鎖間ジスルフィド結合を伴う抗体の構造を示す。代表的に、ＩｇＧ４鎖内ジスルフィド結合は、軽鎖残基２３と９２との間；１３８と９８との間に生じ；重鎖残基２２と９６との間；１４５と２０１との間；２６２と３２２との間；そして３６８と４２６との間に生じる。ＩｇＧ４重鎖間のジスルフィド結合は、代表的に、残基２２７および残基２３０にて生じる。
【図１２】図１２は、チップに基づくゲル電気泳動方法を使用して、不純物の検出のレベルを決定するためのマーカータンパク質によって表した、既知の濃度の「不純物」を有する例示的なサンプルの棒グラフを示す（例えばまた、表７および明細書を参照のこと）。
【図１３】図１３は、例示的な試験サンプルおよび組み換え抗体調製においてチップに基づくゲル電気泳動法を使用して検出され得る混入物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のデジタルな画像を示す。右を示す矢印は、既知の混入タンパク質のバンド（サンプル／レーン１は、トリプシンインヒビターを含む、サンプル／レーン２は、卵白アルブミンを含む、サンプル／レーン３は、β−ガラクトシダーゼを含む、そしてサンプル／レーン４はコントロール標準物を含む）を示す。左を示す矢印は、組み換えサンプルからの混入タンパク質を示し、そして「ＨＣ」および「ＬＣ」は、それぞれ、組み換え抗体（すなわち、ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）の重鎖および軽鎖を示す。
【図１４】図１４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１３）によって前に試験した混入タンパク質を含む代表的なサンプルのチップに基づく方法を使用したクロマトグラフを示す。上から下までに表すパネルは、図１３に示すゲル画像のレーン１〜４に相当する。各々の場合、マーカータンパク質（すなわち、トリプシンインヒビター、一番上のパネル；卵白アルブミン、下の２番目のパネル；βーガラクトシダーゼ、下の３番目のパネル）は、ピークとして容易に検出され（矢印を参照のこと）、これは、コントロール標準（最下のパネル）において生じない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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