(57)【要約】本発明は、組織表面用生体高分子カバー、例えば包帯、ドレープ、例えば包帯コンタクトレンズ、組織を保護する組成物またはカバー、接着を予防し、細菌を排除し、細菌活性を阻害し、または治癒または組織の成長を促進するカバーに関する。上記組成物の例は眼球表面用羊膜カバーである。本発明に基づく組織表面カバーの使用は縫合の必要を排除する。本発明はまた、支持体への膜の固定を容易にする装置、培養挿入物、組成物、方法、キットであって、組織表面用カバーおよび培養挿入物の作成および使用のための物も含む。本発明に基づく組成物は膜表面で培養された細胞または膜に結合させた細胞を含んでよく、このような組成物は組織工学または組織移植用の骨格として使用してよい。徐放性薬物送達ビヒクルとしての組織表面用羊膜カバーの製造および使用方法もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜を培養挿入物に固定する方法であって：
ａ）膜を培養挿入物と接触させる工程；
ｂ）培養挿入物上に膜を配置し、これにより培養挿入物を膜で完全にカバーする工程；
ｃ）円錐形エキスパンダの先端部上に放射状弾性バンドを配置する工程、このエキスパンダは、先端部、底部、およびその先端部から底部へ向かって増加する直径を有する外側表面を有し、この底部は肩部を有する；
ｄ）バンドを受けるための周辺部環状溝を有するリングとエキスパンダの底部を接触させて配置する工程；
ｅ）バンドを、エキスパンダの先端部からエキスパンダの外側表面を越えてエキスパンダの底部の肩部への方向へ押し進め、これによりバンドを伸ばし、放射状に拡張した状態を形成させる工程；
ｆ）バンドを、エキスパンダの肩部を越えて、リングの周辺部環状溝内へ押し進め、これによりバンドをエキスパンダから制御して解放し、バンドをリングに結合させる工程；
ｇ）自身に結合したバンドを有するリングを挿入物上の膜と接触させる工程；
ｈ）バンドをリングから制御して解放し、バンドをリングから挿入物へ移し、これによりバンドを膜上に固定し、そして膜を挿入物に固定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
膜が羊膜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
バンドをエキスパンダの外側表面にわたって押し進める工程を以下の工程によって実行する、請求項１に記載の方法：
ａ）エキスパンダの先端部上に配置されたバンドを、長軸方向に伸長した、近位端部分および遠位端部分を有する套管を含む装置と接触させる工程：
この套管は自身を通って近位端部分から遠位端部分へ長軸方向に伸長する穴の輪郭を示し、この套管はエキスパンダの先端部を覆って同軸上に適合し、遠位端部分で放射状に拡張可能である；
ｂ）バンドを套管の遠位端部分と摩擦によってかみ合わせる工程；
ｃ）套管をエキスパンダの底部方向へ進めることによって、エキスパンダの外側表面にわたってバンドをずらす工程。
【請求項７】
エキスパンダがロッド受けスペースの輪郭を示し、このロッド受けスペースは第一の直径を有し、エキスパンダの先端部から少なくとも部分的にエキスパンダを通ってエキスパンダの底部方向へ長軸方向に伸長し；
套管が套管の穴を通って伸長するロッドをさらに含み、このロッドは第一の直径より小さい第二の直径を有し、このロッドはエキスパンダのロッド受けスペース内に同軸上に適合して、エキスパンダと摩擦によりかみ合い、套管がエキスパンダの先端部を覆って同軸上にはめられてエキスパンダの底部方向へ進められる際に、ストッパーとして作用して、套管の移動を制御する、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
套管が、力学的応力を受けない場合に、実質的に円柱状である第一形状を有し、そして套管の軸と垂直方向に力学的応力を受ける場合には、その遠位端部分が実質的に放射状フランジである第二形状を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
套管の遠位端部分が、自身内の多数の長軸方向カットスリットによって輪郭を定められる多数のセグメントを含み、このセグメントは胴部分および端部分を有し、そしてこの套管がエキスパンダの表面にわたってエキスパンダの底部方向へ進められると、そのセグメントは外向き放射状方向に開き、これにより放射状フランジを形成し、セグメントの端部分はエキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によりかみ合わすことができる、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
穴の輪郭を示す内側表面を有し、Ｏリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリングに膜を固定する方法であって：
ａ）固定用の膜をリングと接触させる工程；
ｂ）リング上に膜を配置し、これによりリングを膜で完全にカバーする工程；
ｃ）Ｏリングを環状溝内へ挿入し、これにより膜をリングに固定する工程
を含む方法。
【請求項１１】
リングが培養挿入物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
膜が羊膜を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
環状溝がリングの周辺部に位置する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
環状溝がリングの内側表面に位置する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの環状溝が存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
Ｏリングがかみ合い適合によってリングと結合可能である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
外側周辺部の環状表面を有するＯリングと穴の輪郭を示す内側環状表面を有し、少なくとも１つの環状溝を有するリングとの間に膜を固定する方法であって：
ａ）固定用の膜をＯリングと接触させる工程；
ｂ）Ｏリング表面で膜を配置し、これによりＯリングを膜で完全にカバーする工程；
ｃ）Ｏリングの外側周辺部の環状表面を覆って膜を包み、包まれたＯリングを形成させる工程；
ｄ）包まれたＯリングを環状溝内へ挿入し、これによりＯリングとリングとの間に膜を固定する工程、
を含む方法。
【請求項２１】
固定された膜が培養挿入物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
膜が羊膜を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
環状溝がリングの内側上に位置する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
包まれたＯリングがかみ合い適合によってリングと結合可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
第一かみ合いリングと第二かみ合いリングとの間に膜を固定する方法、第一かみ合いリングは多数の、間隔をとって配置されたファスナーポストを含む表面を含み、第二かみ合いリングは多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔の輪郭を示す表面を含み：
ａ）固定用の膜を第一リングの表面と接触させる工程；
ｂ）第一リング上に膜を配置し、これにより第一リングを膜で完全にカバーする工程；
ｃ）少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポストが少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔と整列するように第一リングに対して第二リングを配置する工程；
ｄ）第一リングを第二リングと固定してかみ合わせ、これにより第一リングと第二リングとの間に膜を固定する工程、
を含む方法。
【請求項２９】
２つのかみ合いリングの間に固定された膜が培養挿入物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
膜が羊膜を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
周辺部環状表面、および内側環状表面、上面および底面を有し、少なくとも１つの表面がその上に少なくとも１つのカットスリットの輪郭を示すリングに膜を固定する方法であって：
ａ）固定用の膜をリングと接触させる工程；
ｂ）リングの上面または底面に膜を配置し、これによりリングを膜でカバーする工程；
ｃ）膜をカットスリット内へ挿入し、これにより膜をリングに固定する工程、
を含む方法。
【請求項３５】
膜を上面または底面でカットスリット内へ挿入する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
膜を周辺部環状表面のカットスリット内へ挿入する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
固定された膜が培養挿入物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
膜が羊膜を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
組織表面用生体高分子カバーを製造する方法であって：
ａ）生体高分子膜を第一リングの表面と接触させる工程、この第一リングは外側環状エッジを有し、ならびに内側環状エッジを有する第二リングの内径内にスナップ適合するサイズの外径を有する；
ｂ）第一リング上に膜を配置し、これにより第一リングを膜で完全にカバーし、ならびに第一リングの外側環状エッジを覆って膜を包む工程；
ｃ）同軸上に並べるために第一リングを覆って、第二リングを配置する工程；
ｄ）第一リングを第二リングと固定してかみ合わせ、これにより第一リングと第二リングとの間に膜を固定し、組織表面用生体高分子カバーを製造する工程、
を含む方法。
【請求項４３】
生体高分子膜が羊膜である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
生体高分子膜が少なくとも１つの細胞を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
膜を第一リングの表面と接触させる前に、細胞を膜上で培養するか、あるいは細胞を膜と結合させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
膜を第一リングと第二リングとの間に固定した後に、細胞を膜表上で培養するか、あるいは細胞を膜と結合させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
細胞が遺伝子治療用にあらかじめ操作されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
生体高分子膜、第一リング、第二リングがそれぞれ、眼の外側表面への配置用のサイズに合わせられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
生体高分子膜、第一リング、第二リングがそれぞれ、真皮組織、消化管組織、呼吸管組織、生殖系組織、泌尿器系組織、循環系組織、骨組織からなる群から選択される組織表面への配置用のサイズに合わせられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
第一リングおよび第二リングが生分解性である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
第一リングの外側環状エッジが第一グリップ表面を含み、第二リングの内側環状エッジが第二グリップ表面を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
第一および第二グリップ表面が、いが、ファスナーポスト孔の輪郭を示す領域、ファスナーポストからなる群から選択されるグリップ装置を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
少なくとも一方のリングがポリマーを含み、このポリマーがさらに少なくとも１つの生理活性分子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
生理活性分子が治療物質である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：
ａ）外径を有する支持体の少なくとも１つの表面に接着組成物を適用する工程；
ｂ）支持体の表面上で接着組成物を羊膜と接触させる工程、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ；
ｃ）膜上に支持体を配置し、支持体を覆って内向きに膜を折りたたむことを可能にする工程；
ｄ）支持体を覆って内向きに膜を折りたたみ、支持体を膜でカバーし、これにより組織表面用羊膜カバーを製造する工程、
を含む方法。
【請求項５６】
支持体がリングである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
支持体がディスクである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
接着組成物が、フィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：
ａ）外径を有する支持体を羊膜の中央部分に接して配置する工程、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ；
ｂ）支持体の外径を超えて外側に広がった羊膜の表面の部分に接着組成物を適用する工程；
ｃ）支持体を覆って内向きに羊膜を折りたたみ、その支持体を羊膜でカバーし、これにより組織表面用羊膜カバーを製造する工程
を含む方法。
【請求項６１】
支持体がリングである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
支持体がディスクである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
接着組成物がフィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
請求項６０に記載の方法であって：
ａ）第二羊膜の中央部分に組織表面用羊膜カバーを配置する工程、この第二羊膜は当該羊膜カバーの外径より大きい直径を有する表面を持つ；
ｂ）当該羊膜カバーの外径を超えて広がった第二羊膜の表面の部分に接着組成物を適用する工程；
ｃ）第二羊膜を、当該羊膜カバーを覆って内向きに折りたたみ、当該羊膜カバーを第二羊膜がカバーし、これにより組織表面用二重層羊膜カバーを製造する工程、をさらに含む方法。
【請求項６６】
接着組成物がフィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：
ａ）外径を有する支持体を、羊膜の間質側の中央部分に配置する工程、この膜は支持体の外径より大きい直径の表面を有する；
ｂ）支持体を覆って内向きに羊膜を折りたたみ、支持体を羊膜でカバーし、カバーされた支持体を形成する工程；
ｃ）折りたたまれた膜の間質側の部分を膜の間質側の別の部分と接着させ、これによりカバーされた支持体を適所で保持し、そして組織表面用羊膜カバーを製造する工程、
を含む方法。
【請求項６９】
支持体がリングである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
支持体がディスクである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
請求項６８に記載の方法であって：
ａ）カバーされた支持体の下に第二支持体を挿入する工程；
ｂ）カバーされた支持体をカバーする羊膜の少なくとも部分と接触するように第二支持体を配置し、これによりカバーされた支持体と第二支持体との間で羊膜を固定する工程、
をさらに含む方法。
【請求項７２】
請求項４２に記載の方法にしたがって製造した、組織表面用生体高分子カバーの眼に対する使用。
【請求項７３】
請求項５５に記載の方法にしたがって製造した、組織表面用羊膜カバーの眼に対する使用。
【請求項７４】
請求項６０に記載の方法にしたがって製造した、組織表面用羊膜カバーの眼に対する使用。
【請求項７５】
請求項６８に記載の方法にしたがって製造した、組織表面用羊膜カバーの眼に対する使用。
【請求項７６】
先端部、底部、その先端部から底部へ向かって増加する直径の外側表面を有する円錐形エキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によりかみ合わせ、このバンドを、エキスパンダの先端部からエキスパンダの外側表面にわたってエキスパンダの底部への方向へ押し進め、これによりバンドを伸ばし、そして放射状に拡張した状態を形成させるための装置であって：
長軸方向に伸長した、近位端部分および遠位端部分を有する套管を含み、この套管は自身を通って近位端部分から遠位端部分へ長軸方向に伸長する穴の輪郭を示し、エキスパンダの先端部を覆って同軸上に適合し、遠位端部分で放射状に拡張可能である、装置。
【請求項７７】
套管の穴を通って近位端部分から遠位端部分へ長軸方向に伸長したロッドをさらに含む、請求項７６に記載の装置であって、
このロッドは、エキスパンダ内のロッド受けスペースとの、同軸上の、解放可能なかみ合わせへ弾性的に偏らすことができ、このロッドはエキスパンダと摩擦によりかみ合い、套管がエキスパンダの先端部を覆って同軸上にはめられ、エキスパンダの底部方向へ進められる際に、套管の移動を制御するストッパーとして作用する、装置。
【請求項７８】
套管が、力学的応力を受けない場合に、実質的に円柱状である第一形状を有し、套管の軸と垂直方向に力学的応力を受ける場合には、その遠位端部分が実質的に放射状フランジである第二形状を有する、請求項７６に記載の装置。
【請求項７９】
套管の遠位端部分が、自身内の多数の長軸方向カットスリットによって輪郭を定められる多数のセグメントを含み、このセグメントは胴部分および端部分を有し、このセグメントは、套管がエキスパンダの表面にわたってエキスパンダの底部方向へ進められると、互いに離れて外向きに放射状方向に開き、これにより放射状フランジを形成可能であり；
ここにセグメントの端部分は円錐形エキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によりかみ合わすことができる、請求項７８に記載の装置。
【請求項８０】
以下を含む培養挿入物：
穴の輪郭を示す内側表面を有し、かつＯリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；
リングにマウントされた膜、この膜はリングを完全にカバーし；
組立て時にリングに膜を固定する環状溝に挿入されたＯリング。
【請求項８１】
リングの内側表面がＯリングを受けるサイズの環状溝の輪郭を示し、そのＯリングがリングの内側表面上の環状溝に挿入され、膜をリングに固定する、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８２】
リングの周辺部表面がＯリングを受けるサイズの環状溝の輪郭を示し、そのＯリングがリングの周辺部表面上の環状溝に挿入され、膜をリングに固定する、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８３】
少なくとも２つの環状溝が存在する、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８４】
Ｏリングがかみ合い適合によってリングと解放可能に結合している、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８５】
膜が羊膜を含む、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８６】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８７】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８８】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料である、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項８９】
Ｏリングが、シリコーンおよびシリコーンフォームからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む、請求項８０に記載の培養挿入物。
【請求項９０】
以下を含む培養挿入物：
穴の輪郭を示す内側表面および外側周辺部の環状表面を有するＯリング；
Ｏリングにマウントされた膜、この膜はＯリングを完全にカバーし、その外側周辺部の環状表面を覆って包み、包まれたＯリングを形成させる；
穴の輪郭を示す内側環状表面を有し、包まれたＯリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；
包まれたＯリングは、環状溝内に配置され、組み立て時にＯリングとリングとの間で膜を固定する。
【請求項９１】
環状溝がリングの内側環状表面に位置する、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９２】
包まれたＯリングがかみ合い適合によってリングと結合している、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９３】
膜が羊膜を含む、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９４】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９５】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９６】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項９０に記載の培養挿入物。
【請求項９７】
以下を含む培養挿入物：
第一表面を有する第一かみ合いリング；
第一表面上に位置する多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト；
第二表面を有する第二かみ合いリング、この第二表面はその上に多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔の輪郭を示し、２つのリングが組立て時に接合してかみ合った場合、少なくとも１つの孔は少なくとも１つのポストの位置と組み合うように配置される；
２つのかみ合いリングの間に固定された膜。
【請求項９８】
膜が羊膜を含む、請求項９７に記載の培養挿入物。
【請求項９９】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項９７に記載の培養挿入物。
【請求項１００】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項９７に記載の培養挿入物。
【請求項１０１】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項９７に記載の培養挿入物。
【請求項１０２】
以下を含む培養挿入物：
周辺部環状表面、内側環状表面、上面および底面を有し、その上に少なくとも一つのカットスリットの輪郭を示す少なくとも１つの表面を有するリング；
リングの上面または底面に配置された膜、リングをカバーする膜、この膜の少なくとも一部分はカットスリット内へ挿入され、これにより組み立て時に膜をリングに固定する。
【請求項１０３】
膜が上面または底面のカットスリット内へ挿入される、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０４】
膜が周辺部環状表面のカットスリット内へ挿入される、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０５】
膜が羊膜を含む、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０６】
膜がヒアルロナン誘導体を含む、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０７】
膜がコラーゲンまたはコラーゲン誘導体を含む、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０８】
膜が、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルおよびスチレン-アクリロニトリルからなる群から選択される材料から形成されている、請求項１０２に記載の培養挿入物。
【請求項１０９】
以下を含む組織表面カバー：
ａ）外側環状エッジおよび外径を有する第一リング；
ｂ）第一リングを完全にカバーする膜、この膜は第一リングの外側環状エッジを覆って包まれており；
ｃ）内側環状エッジおよび内径を有する第二リング、この第二リングの内径は第一リングの外径を覆ってスナップ適合するサイズであり、これと同軸上に並べるために第一リングを覆って配置される；この膜は、組織表面カバーの組立て時に、第一リングを第二リングと固定してかみ合わせることによって第一リングと第二リングとの間に固定される。
【請求項１１０】
膜が生体高分子膜である、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１１】
膜が羊膜である、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１２】
第一リングおよび第二リングが生分解性である、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１３】
少なくとも一方のリングがさらに少なくとも１つの生理活性分子を含むポリマーを含む、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１４】
生理活性分子が治療物質である、請求項１１３に記載の組織表面カバー。
【請求項１１５】
少なくとも一方のリングがポリメタクリル酸メチルを含む、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１６】
少なくとも一方のリングがシリコーン材料を含む、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１７】
少なくとも一方のリングが、ポリウレタン、ポリエステル、およびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される材料製である、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１８】
膜、第一リング、第二リングがそれぞれ、眼の表面への配置用のサイズに合わせられている、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１１９】
膜、第一リング、第二リングがそれぞれ、真皮組織、消化管組織、呼吸管組織、生殖系組織、泌尿器系組織、循環系組織、骨組織からなる群から選択される組織表面への配置用のサイズに合わせらている、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１２０】
第一リングの外側環状エッジが第一グリップ表面を含み、かつ第二リングの内側環状エッジが第二グリップ表面を含む、請求項１０９に記載の組織表面カバー。
【請求項１２１】
第一および第二グリップ表面が、いが、ファスナーポスト、ファスナーポスト孔の輪郭を示す領域からなる群から選択されるグリップ装置を含む、請求項１２０に記載の組織表面カバー。
【請求項１２２】
第一グリップ表面がファスナーポスト孔の輪郭を示す領域を含み、第二グリップ表面がファスナーポスト孔と空間的に整列したファスナーポストを含む、請求項１２０に記載の組織表面カバー。
【請求項１２３】
第一グリップ表面がファスナーポストを含み、第二グリップ表面がファスナーポストと空間的に整列したファスナーポスト孔の輪郭を示す領域を含む、請求項１２０に記載の組織表面カバー。
【請求項１２４】
第一または第二グリップ表面がファスナーポストを含み、膜がファスナーポストと空間的に整列したファスナーポスト孔の輪郭を示す領域を含み、膜が第一と第二グリップ表面との間に固定される、請求項１２１に記載の組織表面カバー。
【請求項１２５】
以下を含む組織表面用羊膜カバー：
ａ）外径を有する支持体；
ｂ）支持体の少なくとも１つの表面に適用された接着組成物；
ｃ）接着組成物と接触した羊膜、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持ち、組立て時に支持体を覆って内向きに折りたたまれ、これにより支持体は膜でカバーされ、そして接着組成物によって膜に固定される。
【請求項１２６】
接着組成物が、フィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１２７】
接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１２８】
支持体が生分解性である、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１２９】
支持体がさらに少なくとも１つの生理活性分子を含むポリマーを含む、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３０】
生理活性分子が治療物質である、請求項１２９に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３１】
支持体がポリメタクリル酸メチルを含む、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３２】
支持体がシリコーン材料を含む、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３３】
支持体が、ポリウレタン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される材料製である、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３４】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる体組織の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３５】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる角膜の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１２５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３６】
以下を含む組織表面用羊膜カバー：
ａ）外径を有する支持体；
ｂ）支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ羊膜；
ｃ）膜を支持体に固定するために膜の少なくとも１つの表面に適用された接着組成物、この膜は支持体を覆って内向きに折りたたまれ、組織表面用羊膜カバーの組立て時に支持体は接着組成物と接触し、膜によってカバーされる。
【請求項１３７】
支持体がポリメタクリル酸メチルを含む、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３８】
支持体がシリコーン材料を含む、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１３９】
支持体が、ポリウレタン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される材料製である、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４０】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる体組織の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４１】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる角膜の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４２】
接着組成物が、フィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４３】
接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４４】
支持体が生分解性である、請求項１３４に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４５】
支持体がさらに少なくとも１つの生理活性分子を含むポリマーを含む、請求項１３６に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４６】
生理活性分子が治療物質である、請求項１３６に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１４７】
請求項１３６に記載の組織表面用羊膜カバーであって：
ａ）組織表面用羊膜カバーの外径より大きい直径を有する表面を持つ第二羊膜；
ｂ）組立て時に組織表面用羊膜カバーが第二羊膜の中央部分に配置された場合に、この組織表面用羊膜カバーの外径を超えて外側に広がった第二羊膜の表面の部分に適用される第二接着組成物；
ｃ）この第二羊膜は組立て時に、組織表面用羊膜カバーを覆って内向きに折りたたまれ、この組織表面用羊膜カバーは第二羊膜でカバーされ、これにより組織表面用二重層羊膜カバーを作成する
をさらに含む羊膜カバー。
【請求項１４８】
第二接着組成物が、フィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤を含む、請求項１４７に記載の組織表面用二重層羊膜カバー。
【請求項１４９】
第二接着組成物がシノアクラレートを含む、請求項１４７に記載の組織表面用二重層羊膜カバー。
【請求項１５０】
以下を含む組織表面用羊膜カバー：
ａ）外径を有する支持体；
ｂ）支持体の外径より大きい直径を有する表面を持ち、間質側を持つ羊膜；
ｃ）この支持体は膜の間質側の中央部分に配置され、この膜は組立て時に支持体を覆って内向きに折りたたまれ、この支持体は膜でカバーされ、折りたたまれた膜の間質側の部分はこの膜の間質側の別の部分と接着し、これにより支持体を適所で保持する。
【請求項１５１】
支持体がリングである、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５２】
支持体がディスクである、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５３】
請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバーであって：
カバーされた支持体の下に配置された第二支持体、この第二支持体はカバーされた支持体をカバーする膜の少なくとも部分と接触し、これにより組立て時にカバーされた支持体と第二支持体との間に膜を固定する
をさらに含む羊膜カバー。
【請求項１５４】
支持体が生分解性である、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５５】
支持体がさらに少なくとも１つの生理活性分子を含むポリマーを含む、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５６】
生理活性分子が治療物質である、請求項１５５に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５７】
支持体がポリメタクリル酸メチルを含む、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５８】
支持体がシリコーン材料を含む、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１５９】
支持体が、ポリウレタン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される材料製である、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１６０】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる体組織の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１６１】
支持体が、組織表面用羊膜カバーと接触させる角膜の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する、請求項１５０に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１６２】
請求項１３５に記載の組織表面用羊膜カバーの、眼に対する使用。
【請求項１６３】
請求項１３６に記載の組織表面用羊膜カバーの、眼に対する使用。
【請求項１６４】
請求項１４７に記載の組織表面用羊膜カバーの、眼に対する使用。
【請求項１６５】
以下を含むキット：
ａ）請求項７６に記載の装置；
ｂ）円錐形エキスパンダ；
ｃ）Ｏリング；
ｄ）穴の輪郭を示す内側表面を有し、Ｏリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；および
ｅ）リングを完全にカバーするサイズの少なくとも１つの膜。
【請求項１６６】
膜が凍結乾燥された羊膜である、請求項１６５に記載のキット。
【請求項１６７】
さらに接着組成物を含む、請求項１６５に記載のキット。
【請求項１６８】
遺伝子治療用にあらかじめ操作された細胞、レチナール色素上皮細胞、上皮幹細胞、輪部幹細胞、輪部上皮細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項８０、９０、９７、１０２のいずれか一項に記載の培養挿入物。
【請求項１６９】
遺伝子治療用にあらかじめ操作された細胞、レチナール色素上皮細胞、上皮幹細胞、輪部幹細胞、輪部上皮細胞からなる群から選択される細胞をさらに含む、請求項１０９、１２５、１３６、１５０のいずれか一項に記載の組織表面用羊膜カバー。
【請求項１７０】
エキサイマーレーザ手術後の眼痛および角膜混濁を減少させる組成物および人工角膜移植の成功を改善する組成物として使用するための、請求項１０９、１２５、１３６、１５０のいずれか一項に記載の組織表面用羊膜カバー。
【発明の詳細な説明】
【利用分野】
【０００１】
関連技術の出願
本出願は、２００２年３月１４日に出願の米国仮出願第６０／３６５３５６号の出願日の利益を享受するものであり、その教示の内容のすべては、参照により本願明細書に援用したものとする。
政府からの援助
本出願は、援助許可番号EY０６８１９のもとに米国国立保健研究所(National Institutes of Health)からの援助を全面的または部分的に受けたものである。この発明の特定の権利は、政府に帰属するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
羊膜組成物、例えば哺乳類、例えばヒト、ブタ、またはウマ由来の羊膜組織から得られる羊膜および羊膜抽出物は生体成長因子を含む。羊膜は生体膜であり、これは羊膜腔の内側表面に整列し、単層立方上皮、厚い基底膜、およびヒアルロン酸含有の駆血性の間充織層を含む。羊膜組成物は、動物モデルにおいて、炎症、線維血管内殖を減少させ、ならびに上皮化を促進することで既知である。羊膜は胎児における瘢痕を残さない創傷治癒プロセスに役割を担うと考えられる(Tseng, S.-C.-G., et al.,「羊膜マトリクスによる、培養ヒト角膜および輪部線維芽細胞におけるトランスフォーミング成長因子-ベータイソ型、TGF-β受容体II型の抑制および筋線維芽細胞分化(Suppression of Transforming Growth Factor-Beta Isoforms, TGF-β Receptor Type II, and Myofibroblast Differentiation in Cultured Human Corneal and Limbal Fibroblasts by Amniotic Membrane Matrix)」J. Cell. Physiol., 179: 325-335 (1999))。
【０００３】
胎膜は羊膜(amnion, amniotic membrane)および絨毛膜を含み、これは外科手術で使用されており、Davisによる、熱傷した皮膚および潰瘍を生じた皮膚に対するその使用が1910年にはすでに記載されている(Davis, J.W.,「Johns Hopkins Hospitalでの550症例に関する皮膚移植(Skin Transplantation With a Review of 550 cases at the Johns Hopkins Hospital)」Johns Hopkins Med. J., 15: 307 (1910))。1973年の初頭、Trelfordらは、羊膜の他の用途、例えば、骨盤腹膜の置換用途、全層皮膚外傷に対する用途、茎状移植手順での曝露された深面をカバーする用途、全舌切除の外科的欠損に対する移植片としての用途、および頭部外傷後の大脳髄膜接着の予防における用途を報告した(Trelford and Trelford-Sauder,「外科手術での羊膜、過去と現在(The Amnion in Surgery, Past and Present)」Am. J. Obstet. Gynecol., 134: 833 (1979)を参照のこと)。
【０００４】
羊膜組成物は、傷ついた角膜組織の処置に使用されている。例えば、羊膜移植は、急性の化学的および温熱性熱傷に対する眼球表面再構築のために使用されている(Kim, J.-C., and Tseng, S.-C.-G.,「重度に損傷したウサギ角膜における表面再構築のための保存ヒト羊膜の移植(A Transplantation of Preserved Human Amniotic Membrane for Surface Reconstruction in Severely Damaged Rabbit Corneas)」Cornea 14(5): 473-484 (1995))。移植された羊膜は内部的または外部的に組織表面に固定するために縫合の外科的技術を使用する(同上475)。例えば、羊膜は永久移植片として、または一時的パッチとして使用される。傷ついた角膜組織の場合には、縫合は大多数の手術室においてこの膜を患者の眼に固定するために使用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
例えば羊膜は眼球表面に縫合してもよいが、救命医療中の患者を必要な眼の外科手術用の手術室に連れて行くことは不可能である。したがって、傷害組織または患部組織、例えば化学的にまたは熱によって熱傷した角膜組織を処置するための羊膜の使用を容易にする、この膜の適所への縫合を要しない装置が必要とされる。
【０００６】
縫合は羊膜を細胞培養において使用するために、シリコーンリングのような培養挿入物を固定するために使用される。しかしながら縫合法による培養挿入物の作成は時間がかかる。これゆえ、培養挿入物を作成する効率的な方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明はとりわけ以下のものを単独でまやは組み合わせて含む。一実施形態では、羊膜を装置または支持体上に固定するが、この装置または支持体は、例えば角膜表面の部分、角膜表面、または眼球表面全体に適合してこれをカバーするコンフォーマ(conformer)の形状であってもよい。支持体はリング形状であってよい。自身に結合した羊膜を有する支持体を一時的パッチとして使用してもよく、炎症および瘢痕を減少させ、これにより創傷治癒を促進し、快適さおよび視覚を回復させることができる。
【０００８】
本発明は、一面では、膜を支持体、例えば培養挿入物に固定するための方法および装置に関する。この方法は以下の工程を含む：膜を培養挿入物と接触させる工程；培養挿入物上に膜を配置し、これにより培養挿入物を膜で完全にカバーする工程；円錐形エキスパンダの先端部上に放射状弾性バンドを配置する工程、このエキスパンダは、先端部、底部、その先端部から底部へ向かって増加する直径を有する外側表面を有し、この底部は肩部を有する；エキスパンダの底部を、バンドを受けるための周辺部環状溝を有するリングと接触させて配置する工程；バンドをエキスパンダの先端部からエキスパンダの外側表面にわたってエキスパンダの底部の肩部への方向へ押し進め、これによりバンドを伸ばし、放射状に拡張した状態を形成させる工程；エキスパンダの肩部を超えて、リングの周辺部環状溝内へバンドを押し進め、これによりバンドをエキスパンダから制御して解放し、バンドをリングに結合させる工程；自身に結合したバンドを有するリングを挿入物表面の膜と接触させる工程；バンドをリングから制御して解放し、バンドをリングから挿入物へ移し、これによりバンドを膜上に固定し、膜を挿入物に固定する工程。
【０００９】
また本発明はとりわけ以下の実施形態を単独でまたは組み合わせて含む。本発明の方法の一実施形態は、本発明の装置を使用して実行され、この装置とは放射状弾性バンドをエキスパンダの外側表面にわたって押し進めるための装置であり、長軸方向に伸長した、近位端部分および遠位端部分を有する套管を含み、套管は穴の輪郭を示し、この穴は套管を通して近位端部分から遠位端部分へ長軸方向に伸長し、エキスパンダの先端部を覆って同軸上に適合し、遠位端部分で放射状に拡張可能である。このような本発明の装置を使用して、円錐形エキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によりかみ合わせ、このエキスパンダは先端部、底部、その先端部から底部へ向かって増加する直径を有する外側表面を有し、バンドをエキスパンダの先端部からエキスパンダの外側表面にわたってエキスパンダの底部の方向へ押し進め、これによりバンドを伸ばし、放射状に拡張した状態を形成させる。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、穴の輪郭を示す内側表面を有し、Ｏリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリングに膜を固定する方法であり、この方法は以下の工程を含む：固定用の膜をリングと接触させる工程；リング上に膜を配置し、これによりリングを膜で完全にカバーする工程；Ｏリングを環状溝内へ挿入し、これにより膜をリングに固定する工程。したがって本発明の複合物は以下を含む培養挿入物である：穴の輪郭を示す内側表面を有し、ならびにＯリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；リングにマウントされた膜、この膜はリングを完全にカバーする；および組立て時に環状溝に挿入されて膜をリングに固定するＯリング。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、外側周辺部の環状表面を有するＯリングと穴の輪郭を示す内側環状表面を有し、少なくとも１つの環状溝を有するリングの間に膜を固定する方法であり、この方法は以下の工程を含む：固定用の膜をＯリングと接触させる工程；Ｏリング上に膜を配置し、これによりＯリングを膜で完全にカバーする工程；Ｏリングの外側周辺部の環状表面にわたって膜を包み、包まれたＯリングを形成させる工程；および包まれたＯリングを環状溝内へ挿入し、これによりＯリングとリングとの間に膜を固定する工程。
【００１２】
本発明の方法のこの実施形態に記載される２つのリングの間に固定された膜は本発明の複合物である。したがって本発明の複合物は以下を含む培養挿入物である：穴の輪郭を示す内側表面および外側周辺部の環状表面を有するＯリング；Ｏリングにマウントされた膜、この膜はＯリングを完全にカバーし、その外側周辺部の環状表面を覆って包み、包まれたＯリングを形成させる；穴の輪郭を示す内側環状表面を有し、包まれたＯリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；ここに包まれたＯリングは組立て時にＯリングとリングとの間に膜を固定するように環状溝内に配置される。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、第一かみ合いリングと第二かみ合いリングとの間に膜を固定する方法、ここに第一かみ合いリングは多数の間隔をとって配置されたファスナーポストを含む表面を含み、ならびに第二かみ合いリングは多数の間隔をとって配置されたファスナーポスト孔の輪郭を示す表面を含み、この方法は以下の工程を含む：固定用の膜を第一リングの表面と接触させる工程；第一リング上で膜を配置し、これにより第一リングを膜で完全にカバーする工程；少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポストが少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔と整列するように第一リングを越えて第二リングを配置する工程；およびファスナーポスト孔内に少なくとも１つのポストを挿入することによって第一リングを第二リングと固定してかみ合わせ、これにより第一リングと第二リングとの間に膜を固定する工程。
【００１４】
したがって本発明の複合物は以下を含む培養挿入物である：第一表面を有する第一かみ合いリング；第一表面上に位置する多数の間隔をとって配置されたファスナーポスト；第二表面を有する第二かみ合いリング、この第二表面は自身表面上の多数の間隔をとって配置されたファスナーポスト孔の輪郭を示し、ここに組立て時に２つのリングが接合してかみ合った場合、少なくとも１つの孔は少なくとも１つのポストの位置と組み合うように配置される；２つのかみ合いリングの間に固定された膜。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、周辺部環状表面、内側環状表面、上面および底面を有し、少なくとも１つの表面がその上に少なくとも１つのカットスリットの輪郭を示すリングに膜を固定する方法である。この方法は以下の工程を含む：固定用の膜をリングと接触させる工程；リングの上面または底面上に膜を配置し、これによりリングを膜でカバーする工程；膜をカットスリット内へ挿入し、これにより膜をリングに固定する工程。
【００１６】
したがって本発明の複合物は以下を含む培養挿入物である：周辺部環状表面、内側環状表面、上面および底面を有し、少なくとも１つの表面がその上に少なくとも１つのカットスリットの輪郭を示すリング；リングの上面または底面に配置された膜、この膜はリングをカバーし、組立て時に、膜の少なくとも一部分はカットスリット内へ挿入され、これにより膜をリングに固定する。
【００１７】
本発明の別の実施形態は組織表面用生体高分子カバーを製造する方法であって：生体高分子膜を第一リングの表面と接触させる工程、この第一リングは外側環状エッジ、内側環状エッジを有する第二リングの内径内にスナップ適合(snap-fit)するサイズの外径を有する；第一リング表面で膜を配置し、これにより第一リングを膜で完全にカバーし、第一リングの外側環状エッジを覆って膜を包む工程；第一リングを覆って、これと同軸上に並べて第二リングを配置する工程；第一リングを第二リングと固定してかみ合わせ、これにより第一リングおよび第二リングの間に膜を固定し、そして組織表面用生体高分子カバーを作成する工程を含む方法である。
【００１８】
したがって本発明の複合物は以下を含む組織表面カバーである：外側環状エッジおよび外径を有する第一リング；第一リングを完全にカバーする膜、この膜は第一リングの外側環状エッジを覆って包む；内側環状エッジおよび内径を有する第二リング、この第二リングの内径は第一リングの外径を覆ってスナップ適合するサイズであり、この第二リングは第一リングを覆って、これと同軸上に並べて配置される；この膜は、組織表面カバーの組立て時に、第一リングを第二リングと固定してかみ合わせることによって第一リングと第二リングとの間に固定される。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：外径を有する支持体の少なくとも１つの表面に接着組成物を適用する工程；支持体の表面上で接着組成物を羊膜と接触させる工程、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ；膜上に支持体を配置し、支持体を覆って内向きに膜を折りたたむことを可能にする工程；および支持体を覆って内向きに膜を折りたたみ、支持体を膜でカバーし、これにより組織表面用羊膜カバーを作成する工程を含む方法である。
【００２０】
したがって本発明の複合物は以下を含む組織表面用羊膜カバーである：外径を有する支持体；支持体の少なくとも１つの表面に適用された接着組成物；接着組成物と接触した羊膜、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持ち、組立て時に支持体を覆って内向きに折りたたまれ、これにより支持体は膜でカバーされ、接着組成物によって膜に固定される。
【００２１】
本発明の別の実施形態は組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：外径を有する支持体を羊膜の中央部分に接して配置する工程、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ；支持体の外径を超えて広がった羊膜の表面の部分に接着組成物を適用する工程；支持体を覆って内向きに羊膜を折りたたみ、支持体を羊膜でカバーし、これにより組織表面用羊膜カバーを作成する工程を含む方法である。
【００２２】
したがって本発明の複合物は以下を含む組織表面用羊膜カバーである：外径を有する支持体；支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ羊膜；膜を支持体に固定するために膜の少なくとも１つの表面に適用された接着組成物、この膜は、支持体を覆って内向きに折りたたまれ、これにより組織表面用羊膜カバーの組み立て時に支持体は接着組成物と接触し、膜によってカバーされる。
【００２３】
本発明の別の実施形態は組織表面用羊膜カバーを製造する方法であって：外径を有する支持体を、羊膜の間質側の中央部分に配置する工程、この膜は支持体の外径より大きい直径を有する表面を持つ；支持体を覆って内向きに羊膜を折りたたみ、支持体を羊膜でカバーして、カバーされた支持体を形成する工程；折りたたまれた膜の間質側の部分を膜の間質側の別の部分と接着させ、これによりカバーされた支持体を適所で保持し、組織表面用羊膜カバーを作成する工程を含む方法である。
【００２４】
したがって本発明の複合物は以下を含む組織表面用羊膜カバーである：外径を有する支持体；支持体の外径より大きい直径を有する表面を持ち、間質側を有する羊膜；この支持体は膜の間質側の中央部分に接して配置され、この膜は組立て時に、支持体を覆って内向きに折りたたまれ、これによりこの支持体は膜でカバーされ、折りたたまれた膜の間質側の部分はこの膜の間質側の別の部分と接着し、これにより支持体を適所で保持する。
【００２５】
本発明の別の実施形態はキットであって、放射性弾性バンドをエキスパンダの外側表面にわたって押し進めるための本発明の装置；円錐形エキスパンダ；Ｏリング；穴の輪郭を示す内側表面を有し、Ｏリングを受けるサイズの少なくとも１つの環状溝を有するリング；リングを完全にカバーするサイズの少なくとも１つの膜を含むキットである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は多くの利点を有する。本発明の種々の実施形態に記載の装置および方法は膜上に設置された弾性バンドまたはリングを支持体、例えば培養挿入物または組織表面用カバーに固定することを容易にする。リングは支持体に適用され、この時リングは拡張状態であり、リング中に保存された弾性力は収縮力を加え、これにより膜が支持体に固定される。重いリングが使用される場合、拡張に相当の力が必要とされ、このプロセスは大きな労力を要し、時間の浪費である。本発明の方法および装置を使用してリングを拡張し、このリングを支持体に適用すれば、リングの支持体への結合および膜の支持体への固定が容易になる。
【００２７】
本発明の実施形態に記載の組織表面用羊膜カバーは可撓性であるか、一定の組織表面の輪郭に適合するように型どられた支持体から構成できる。例えば、組織表面用羊膜カバーは、眼球表面の輪郭に適合可能であり、眼球表面の部分または眼球表面全体をカバーすること、眼用の包帯を形成することが可能である。
【００２８】
眼の外科手術または眼の傷害の後、眼を覆って閉じた上眼瞼をテープでふさぎ、または眼を覆って上瞼および下瞼をともに縫合し、または羊膜を眼球表面に縫合する代わりに、本発明の実施形態に記載の眼球組織表面用羊膜カバーを眼瞼と角膜との間に設置し、包帯コンタクトレンズとして機能させることができる。羊膜カバーは角膜を保護し、治癒を促進し、眼瞼を固定する必要を排除し、縫合する必要を排除することができ、容易に除去または置換可能であり、また徐放性薬物送達ビヒクルとして使用できる。
【００２９】
本発明の実施形態では組織表面用カバーは支持体を含む。支持体を使用することにより、組織表面へのカバーの挿入または設置および組織表面からのカバーの除去が容易になるばかりか、それに結合した脆弱な膜が引き裂かれる可能性が減少する。
【００３０】
組織表面用羊膜カバーは体内の組織表面の輪郭に適合するように成型でき、所望の組織部位に移植できる。組織表面用カバーはまた、移植組織および被移植者自身の体組織の結合をインターフェースする形状にし、移植組織を被移植者の免疫細胞から遮蔽または隔離することによって被移植者の免疫系による移植組織の許容を促すことができる。
【００３１】
膜を覆ってまたは膜へ成長させる宿主細胞用の永久移植片手段および一時的パッチまたは包帯(dressing, or bandage)手段の両手段による羊膜移植は種々の眼の症状に有用であり、上皮性創傷治癒の促進、ならびに間質性炎症、瘢痕および望ましくない新規血管形成の減少に有効である。
【００３２】
このように本発明は自身に結合した羊膜を伴う支持体を含み、これは任意の諸疾患および損傷を負った眼球表面に適用される一時的パッチとして使用される。これらには眼球表面の急性化学的熱傷(10;11;18;26;27)が含まれるが、これは依然最も破壊的で困難な眼の救急事故の１つである。化学的、特にアルカリによる、熱傷は重度の炎症を生じ、これはしばしば残酷であり、慢性化することがよくある。結果的に、肉芽組織は壊死ととともに例外なく顕著な瘢痕を生じさせる。角膜表面の瘢痕は視覚を低下させ、結膜の瘢痕は運動を制限し、また瞼の瘢痕は露出、力学的微小外傷(誤って配向したまつげおよび角化による)、または乾燥の原因となる。
【００３３】
生命をおびやかす傷害を負った患者はしばしば、救急外科手術、例えば羊膜移植片の移植を受けることができず、眼の化学的または温熱性熱傷を処置できない。眼球表面用羊膜カバーを一時的パッチ、すなわち包帯「コンタクトレンズ」として使用すれば、これは救急処置として使用可能である。眼球表面用羊膜カバーは「無縫合」であるから、患者の手当てを容易にし(例えば、必要な外科手術のために手術室に運べない患者にも集中治療または熱傷治療室において適用可能である)、将来的には他の臨床適用の研究開発を可能にする。更にこれを診療室で使用して、厄介な、費用のかかる外科設備を排除することができる。
【００３４】
諸医療処置を用いて炎症を抑制し、創傷治癒を促す従来の治療はある程度の有効性しか有さない。大多数の、I級重症度より悪化した化学的熱傷患者が最終的に向かう先は、後期段階での重度の眼球表面障害である。最近、一時的パッチととして羊膜を移植すると炎症および瘢痕が減少し、これにより創傷治癒が促進され、快適さおよび視覚が回復することが示された(26)。
【００３５】
また羊膜を一時的パッチとして使用して、首尾良くスティーブンス・ジョンソン症候群(Stevens Johnson syndrome)または中毒性上皮性表皮壊死症の急性期の患者において炎症が抑制され、治癒が促進され、また瘢痕が予防されている(36)。スティーブンス・ジョンソン症候群の患者は集中治療室または熱傷治療室での手当て中に致死的でなくとも、盲目疾患を負うことがよくあるが、これは眼球表面合併症の処置が不十分なせいである。この理由は、患者が救命医療下にある場合、その表面崩壊を急性期に迅速に処置しないからである。
【００３６】
本発明の実施形態に記載の組織表面用羊膜カバーはまたエキシマレーザ手術を受ける患者の眼痛および角膜混濁を減少させるために、また人工角膜移植の成功を改善するために使用してもよい。
【００３７】
本発明の実施形態での使用に適した羊膜は、米国特許第6,152,142号および第6,326,019号の教示内容にしたがって獲得し、処理し、調製してよく、これらの文献の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。本発明の実施形態での使用に適した羊膜は、AmnioGraftTMの商品名でBio-Tissue (Miami, Florida)から市販されている。
【００３８】
保存された羊膜は生存同種細胞を欠いているが、その抗炎症性および抗瘢痕性作用は保持している。この新規調製方法は、他者により証明されている通り、すべての同種細胞を失活させ(6)、これにより同種移植拒絶についての起こり得る副作用を排除するが、本来子宮内に存在する羊膜の性質を保存し、すなわち上皮化の促進、および間質性炎症、瘢痕および望ましくない血管形成を減少させる(2-5)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の好ましい実施形態についてさらに具体的に説明し、前記および他の、本発明の対象、特徴および利点を明確する。好ましい実施形態は添付の図面に説明されているが、図面中では、同様の参照文字はすべての図を通して同一部分を参照する。図面は必ずしも実寸大ではなく、本発明の原理を説明することに重点を置く。
発明の詳細な記述
本発明の好ましい実施形態を以下に説明する。本発明の具体的な実施形態は例示的に示すものであり、本発明を制限するものではないことが理解されよう。初めに、本発明のその最も広い全体側面を説明した後、より詳細に説明する。本発明の組成物および方法の特徴および他の詳細は特許請求の範囲でさらに指摘する。
【００４０】
本発明は膜を支持体に固定するための装置および方法；培養挿入物；組織表面用カバーに関する。本明細書中で使用する用語「膜」には、生体マトリクスまたはポリマーマトリクスから形成されたシート状構造を有する材料が含まれる。本発明の実施形態での使用に適した膜には、例えば、生体高分子膜が含まれる。本明細書中で使用する用語「生体高分子」には、生物系に存在するポリマーまたは生体材料由来のポリマーが含まれる。生体高分子の例には、羊膜、多糖類およびムコ多糖類、例えばヒアルロン酸およびその誘導体、コラーゲンおよびコラーゲン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する用語、羊膜とは、羊膜腔の内側表面に並ぶ生体膜であり、単層立方上皮、厚い基底膜、およびヒアルロン酸含有駆血性間充織層を含む。通常、実施形態での使用に適した膜は約0.001 mm〜約1 mmの範囲の厚さを有する。
【００４１】
本明細書中で使用する用語「支持体」とは、膜またはフィルムと接触した固形材料である。実施形態で使用される支持体は一般に不活性である。支持体は、膜またはフィルムを所望の形状に成形することを支援し、あるいはこの膜またはフィルムが特定の形状を保持することを支援する。本発明の一実施形態では、支持体に固定された膜は培養挿入物である。したがって、本明細書中で使用する用語「培養挿入物」とは、少なくとも１つの細胞または少なくとも１片の組織が加えられたシートまたは膜であり、このシートまたは膜は培地中に挿入または配置される。本発明の実施形態では、培養挿入物は支持体を含む。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「培養(culture)」とは、栄養培地中またはその上での細胞、例えば組織細胞の栽培または育成(cultivation or growth)を意味する。細胞または組織培養分野の当業者に周知であるように、細胞培養は一般に、ヒトまたは他の動物から細胞または組織を取り出し、この細胞を酵素処理して分離し、そして得られた細胞の懸濁液を平面、例えばペトリ皿の底面上に広げることによって開始される。ここで細胞は一般に、細胞の薄層、いわゆる「単層」を形成するが、これは細胞が、自身をプラスチックまたはガラスのペトリ皿に接着させる糖タンパク質様物質を生産することによる。次いで、細胞成長に適した栄養を含有する培地の層が単層の上に置かれ、この培養は細胞の成長を促進するようにインキュベートされる。
【００４３】
多数の型の細胞のうちいずれか１つを本発明に基づく培養挿入物上に増殖してよい。例えば、本発明の培養挿入物上で増殖し、その後本発明に基づく組織表面用羊膜カバーの作成に使用し得る対象の細胞は遺伝子治療の作用を生じさせるために使用する細胞型であってよい。
【００４４】
Tsengが受けた米国特許第6,452,142号にしたがって調製された羊膜は上皮幹細胞を増殖するために優れた基質である。さらに、組織表面用羊膜カバーはこのカバーの羊膜部分表面で増殖した少なくとも１つの型の細胞を含んでもよい。健康な眼から採取した上皮幹細胞、輪部幹細胞および輪部上皮細胞を増殖するための方法は、PCT出願第WO 01/80760号公報に記載されており、この文献の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。WO 01/80760は羊膜(Bio Tissue, Miami, FL)の使用を教示し、この羊膜は、細胞の増殖に関して、Tsengが受けた米国特許第6,452,142号に記載の方法にしたがって処理、保存されたものであり、この文献の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。
【００４５】
本発明の一実施形態では、固定された羊膜を有する固形支持体はさらに凍結保存を伴うか、あるいは伴わずに、これを基質として用いてもよく、基底膜表面を上にして、上皮幹細胞を伴う輪部外植片を培養してもよく、この細胞は、一滴のFBS(胎児ウシ血清)とともに一晩膜の中央に置いて適度に接着させ、次いで以下に詳細に記載されるように適当な培地中で培養する。
【００４６】
上皮幹細胞、輪部幹細胞および輪部上皮細胞は健康な眼から採取し、本発明に基づく培養挿入物の羊膜表面で増殖するが、これらの細胞を治療物質として眼球表面と接触して配置される組織表面用羊膜カバーと接触させて用いてよく、またこれらの細胞を用いて、幹細胞または輪部上皮細胞欠損が生じている疾患を処置してもよい。例えば、眼球表面用羊膜カバーは培養された輪部上皮幹細胞を含んでもよく、これを角膜移植片として用いてもよい。
【００４７】
本発明の一実施形態では、固定された羊膜を有する固形支持体はさらに凍結保存を伴うか、あるいは伴わずに、基質として用いてもよく、基底膜表面の表を上にして、レチナール色素上皮細胞(RPE細胞)を培養してもよく、これは米国仮出願第60/415,986号に教示されている通りである。
【００４８】
本発明に基づく培養挿入物上で成長させた増殖RPE細胞は網膜下腔に移植してもよく、これは米国仮出願第60/415,986号に教示されている方法にしたがう。米国仮出願第60/415,986号の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。この羊膜表面上で増殖したRPE細胞は組織表面用生体分子カバーを作成するために使用しても良い。
【００４９】
単層の代わりに、器官片または器官全体を培養してもよい。いくつかの例では、動物から取り出した組織片または細胞をシートまたは膜表面に置き、この膜を太鼓の皮のように張ることができる。次いでこのシートまたは膜、いわゆる「培養挿入物」を、容器、例えばペトリ皿内に置き、培地でカバーし、インキュベートする。この様式で培養した細胞は、容器の底ではなくシートまたは膜表面で成育させる傾向がある。この培養細胞および膜の用途には移植片用の組織工学が含まれる。
【００５０】
一実施形態では支持体に固定された膜は組織カバーである。本明細書中で使用する用語「組織カバー」、「組織表面用カバー」、および「カバー」は同一の意味を有し、これには、例えば包帯(a dressing, a bandage)、ドレープ、例えば包帯コンタクトレンズ、組織を保護する組成物またはカバー、接着を予防し、細菌を排除し、細菌活性を阻害し、または治癒または組織の成長を促進するカバーが含まれる。本明細書中で使用する用語「組織」は、共通の構造および機能を有する任意の細胞集団または細胞の統合された群、例えば、皮膚細胞、結膜組織、角膜上皮細胞、骨組織、肝臓組織、または膵臓組織を含んでよい。
【００５１】
円錐エキスパンダを用いて膜を支持体に固定するための方法および装置
本発明の方法の一実施形態では、膜を支持体、例えば第一リング上に配置し、これにより第一リングをこの膜で完全にカバーする。図１Ａ-１Ｄおよび図２に描写されるように、放射状弾性バンド(24)は、円錐形エキスパンダ(20)の先端部上に配置し、このエキスパンダは先端部(27)、底部(28)、およびその先端部から底部へ向かって増加する直径の外側表面を有し、この底部は肩部(26)を有する。実施形態での使用に適した円錐形エキスパンダは図１Ａ-１Ｄおよび図２に示される。エキスパンダの底部(28)は第二リングと接触して配置し、このリングはバンドを受けるための周辺部環状溝を有する。例えば、図４Ｃおよび４Ｄを参照のこと、これは周辺部環状溝(23)を有する支持体リング(22)を示す。バンド(24)は次いで、エキスパンダの先端部(27)からエキスパンダの外側表面にわたってエキスパンダの底部(28)の肩部(26)への方向へ偏らせ、これによりバンドを伸ばし、放射状に拡張した状態を形成させる。このバンドはエキスパンダの肩部(26)を超えて、第二リング上の周辺部環状溝内へさらに偏らせ、これによりエキスパンダからバンドを制御して解放し、バンドを第二リングに結合させる。自身に結合したバンドを有する第二リングは次いで、第一リング上の膜と接触させ；バンドを第二リングから制御して解放し、このバンドを第二リングから第一リングへ移し、これによりバンドを膜上に固定し、膜を第一リングに固定する。
【００５２】
本発明の一実施形態では膜は羊膜を含む。本発明の実施形態での使用に適した羊膜を調製する方法は当分野に周知であり、例えばTsengに付与された米国特許第6,326,019 B1号および第6,152,142号に記載されており、これら各文献の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。羊膜を保存する方法はまた、WO 01/08716 A1に記載されており、この文献の教示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。
【００５３】
本発明の実施形態での使用に適した羊膜は哺乳類の胎盤、特にヒト胎盤から得られ、これから絨毛膜が分離されている。実施形態において使用される羊膜はまた、例えば、ウマ、ウシ、またはアルパカソース由来であってよい。本発明の実施形態での使用に適した羊膜は一般に、上皮層、基底膜、間質を含み、この三層の組み合わせは好ましくは約0.05 mm〜約0.5 mmの範囲のトータルの厚さを有する。羊膜のシートは適当なサイズにカットでき、ろ紙にマウントし、保存溶液中で保存する。保存溶液は培地および高浸透圧剤を含み、溶液中では羊膜の水和が維持される。膜は保存前または使用前に治療物質を含浸可能である。
【００５４】
本発明の方法および組成物の別の実施態様では、膜はヒアルロナン誘導体またはコラーゲン誘導体を含む。別の実施形態では、膜はポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルまたはスチレン-アクリロニトリル材料から形成される。別の実施形態では、膜は生体高分子膜、例えばヒアルロナン誘導体またはコラーゲン誘導体であり、この場合、羊膜または別の羊膜組成物の生化学的抽出物をこの生体高分子膜の表面に接触させるか、あるいは生体高分子膜内にトラップする。
【００５５】
一実施形態では、周辺部環状溝を有するリングはポリマー材料、例えば、シリコーンまたはシリコーンフォームから構成される。別の実施形態では、リングはポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリウレタンから構成される。別の実施形態では、リングはガラスまたはセラミックである材料から構成される。
【００５６】
図１Ａ-１Ｄおよび図２に示される本発明の方法の実施形態ではバンドをエキスパンダの外側表面にわたって押し進めるが、これはエキスパンダ(20)の先端部(27)上に配置したバンドを図１Ａ-１Ｄおよび図３ＡおよびＢに示される装置と接触させる工程によって実行する。この装置は図３Ａおよび３Ｂに詳細に示されているが、一実施形態では、近位端部分および遠位端部分（33）を有する長軸方向に伸長した套管(34) を含み、この套管は穴の輪郭を示し、この穴は套管を通って近位端部分から遠位端部分へ長軸方向に伸長し、そしてこの套管はエキスパンダ(20)の先端部(27)を覆って同軸上に適合し、遠位端部分(33)で放射状に拡張可能である。一実施形態では、エキスパンダ(20)上に配置されたバンドは套管の遠位端部分(33)と摩擦によってかみ合い、エキスパンダ(20)の外側表面にわたって偏らせるが、これは套管をエキスパンダ(20)の底部(28)方向へ進めることによる。
【００５７】
本方法の特定の実施形態では、エキスパンダ(20)はロッド受けスペース(29)の輪郭を示し、このロッド受けスペースは第一の直径を有し、エキスパンダの先端部(27)から少なくとも部分的にエキスパンダを通ってエキスパンダの底部(28)へ長軸方向に伸長する(図２を参照)。図１Ａおよび３Ａは、非応力配置の本発明の装置(30)の実施形態を示す。本発明の装置の套管(34)は套管の穴を通って伸長するロッド(32)をさらに含み、このロッドは第一の直径より小さい第二の直径を有し、このロッドはエキスパンダのロッド受けスペース(29)内に同軸上に適合して、エキスパンダと摩擦によりかみ合い、套管がエキスパンダの先端部を覆って同軸上にはめられ、エキスパンダの底部方向へ進められる際に、套管の移動を制御するストッパーとして作用する。
【００５８】
一実施形態では、図１Ａおよび３Ａに示すように、力学的応力を受けない場合には套管は実質的に円柱状である第一形状を有し、套管の軸と垂直方向に力学的応力を受ける場合には、その遠位端部分(33)が実質的に放射状フランジである第二形状を有する(図１Ｃおよび１Ｄに図示)。遠位部分(33)が放射状フランジを形成する套管の第二形状は套管をエキスパンダを覆って進行可能にさせ、エキスパンダの先端部上に配置された弾性バンド(24)の掌握またはこれと摩擦接触させる。
【００５９】
放射状フランジ形状を達成するため、実施形態に記載の装置は可撓性材料から構成されていてよい。本明細書中で使用する用語、可撓性材料(flexible material)とは、折り曲げることができ、あるいは変形可能であり、かつその元の形に回復可能であり、この程度が非可撓性材料より大きい材料である。
【００６０】
図１Ａ-１Ｄおよび３ＡおよびＢに描写される別の実施形態では、装置の套管の遠位端部分(33)は、自身内の多数の長軸方向カットスリット(31)によって輪郭を定められている多数のセグメントを含み、このセグメントは胴部分および端部分を有し、この套管がエキスパンダの表面にわたってエキスパンダの底部へ進められると、そのセグメントは外向き放射状方向に開き(図１Ｂ-Ｄに示す通り)、これにより放射状フランジを形成し、セグメントの端部分はエキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によりかみ合わすことができる。
【００６１】
弾性バンドの拡張は、円錐エキスパンダ(20)の先端部(27)上に配置されたバンドに力を加え、このバンドを先端（27）または小さい直径末端から底部（28）または大きな直径末端に偏らせ、その底部（28）は肩部（26）を有し、それによりバンドを拡張している。エキスパンダ(20)の外側表面にわたって先端部(27)または直径の小さい端から底部(28)、この底部(28)は肩部(26)を有する、または直径の大きい端へ偏らせ、これによりバンドを拡張することによって実行する。このバンドは、肩部(26)を超え、エキスパンダ(22)の底部(28)と接触して配置されたリング上の周辺部環状溝内へさらに偏らせる。一実施形態ではこのバンドは例えば、手でバンドに接触することによって手導で押し進め、しかも肩部を超えて、しかも溝内へバンドを押し込む。
【００６２】
一実施形態では、リング（22）は、例えば、図４Ｂのリングは、周辺部環状溝(23)を有し、エキスパンダ(20)の底部(28)と接触して配置されるが、これは環状リムを有する保持装置であり、このリムは湾曲して、バンドの制御解放を容易にする。一実施形態では、リングまたは保持装置は作動手段、例えばレバーアームを装備され、このレバーアームは、バンドの下からバンドに向かって押し上げることが出来て、バンドおよび保持装置のリムの間に間隙を提供している。一実施形態では、拡張したバンドは次いで間隙を介して制御した様式で自身の保存弾性力により保持装置から支持体、例えば培養挿入物へ移動する。バンドが保持装置から解放されると、そのバンドは保持装置から支持体へ移り、膜が支持体に固定される。
【００６３】
溝のあるリングおよびＯリングの間に膜を固定するための方法および装置
図４Ａ-図４Ｄに示される本発明の別の実施形態は、穴の輪郭を示す内側表面と少なくとも１つの、Ｏリング(24)を受けるサイズの環状溝(23)を有するリング(22)に膜を固定することから構成される装置およびこの装置を作成する方法である。この装置は以下の工程を含む方法によって形成する：固定用の膜をリング(22)と接触させる工程；リング(22)上で膜(35)を配置し、これによりリング(22)を膜で完全にカバーする工程；Ｏリング(24)を環状溝内へ挿入し、これにより膜をリングに固定する工程。したがって本発明の複合物は培養挿入物であって、穴の輪郭を示す内側表面を有し、かつ少なくとも1つの、Ｏリング(24)を受けるサイズの環状溝(23)を有するリング（22）を含む培養挿入物である；リング(22)にマウントされた膜(35)、この膜(35)はリング(22)を完全にカバーする；Ｏリング(24)、これは組立て時に環状溝(23)内に挿入され、膜をリング(22)に固定する、を含む培養挿入物である。
【００６４】
図５Ａ-図５Ｄに示す本発明の方法および装置の別の実施形態では、Ｏリング(25)をまず膜(35)でカバーする。したがって本発明の別の実施形態は外側周辺部の環状表面を有するＯリング(25)と穴の輪郭を示す内側環状表面を有し、かつ少なくとも１つの環状溝(21)を有するリング(22)との間に膜を固定する方法であって、その方法は以下の工程を含む：固定用の膜をＯリング(25)と接触させる工程；Ｏリング(25)上に膜(35)を配置し、これによりＯリング(25)を膜(35)で完全にカバーする工程；Ｏリング(25)の外側周辺部の環状表面を覆って膜を包み(図５Ｂ参照)、包まれたＯリング(図５Ｃ参照)を形成させる工程；および包まれたＯリングを環状溝(21)内へ挿入し(図５Ｄ参照)、これによりＯリング(25)とリング(22)との間に膜(35)を固定する工程。本発明の実施形態にしたがって形成される装置は培養挿入物であり、図５Ｄに示すように培養皿内に置くことができる。
【００６５】
本発明の方法および装置の一実施形態で使用される膜は羊膜を含む。本発明の別の実施形態では、膜はヒアルロナン誘導体、コラーゲンまたはコラーゲン誘導体、またはポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエステルまたはスチレン-アクリロニトリル材料から形成された材料である。一実施形態で使用される膜および支持体は１つまたはそれ以上の生体適合性材料を含む。本明細書中で使用する用語「生体適合性」とは、医学的に許容できない、生物学的機能に対する有毒性または傷害性作用を有しない材料を表す。
【００６６】
一実施形態(図４Ｂに図示)では、環状溝(23)はリングの周辺部に位置する。図５Ｄに示される別の実施形態では、環状溝(21)または、はリングの内側環状表面に位置する。特定の実施形態(図５Ｄ)では、２つの環状溝が存在する。
[0069]  さらに別の実施形態(図６Ａ-６Ｆに図示)では、膜(35)は、この膜(35)を図６Ｂに示される下部支持体リング上に配置し、次いでこのリングはかみ合い適合を有し、膜(35)を図６Ｂのリングと図６Ａのリングとの間にはさむか、あるいはサンドイッチすることにより、かみ合い適合を有する両リングをともにプレスすることにより、支持体に結合可能である。これは図６Ｃ-６Ｆに示す通りである。本明細書で使用する用語「かみ合い適合(snap together fit)」とは、第一リング(図６Ｂ)が第二の同心性リング(６Ａ)内に適合することを表し、この場合２つのリングは、図６Ｃに描写する通り、第一リング(図６Ｂ)の周辺部環状エッジが第二リング(図６Ａ)の内側環状エッジと固定されてかみ合うことにより、互いに結合できる。本明細書中で使用する用語「かみ合いリング(snap together rings)」とは、かみ合い適合する２つの同心性リングを表す。例えば、図６Ｄは２つのかみ合いリングの遠近断面図であり、これらリングは眼球表面のような組織表面用の羊膜カバーの一実施形態の支持体を含む。羊膜(35)が２つのかみ合いリングの間に固定されているカバーは図６Ｆに平面図として示され、これは眼の化学的熱傷または温熱性熱傷に対する包帯(a bandage or dressing)として使用することができる。図６Ｄはこのカバーの全断面図であり、これは図６Ａ-６Ｃのかみ合いリングの間に締め付けられた羊膜(35)を示す。
【００６７】
図６Ｇは２つのかみ合いリングの部分的な側方断面図であり、ここに内側リング(37)はその外側エッジ表面にいが(38)を有する。このいが(38)および縫目(40)は内側リング(37)と外側リング(43)との間の適所での膜の保持を支援するように使用できる。図６Ｈは、図６Ｇの内側かみ合いリングの断面遠近図であり、その外側エッジに沿ったいが(38)を示している。
【００６８】
ファスナーポストおよびファスナーポスト孔を有する支持体膜の使用
本発明の別の実施形態は、ファスナーシステムを使用する装置および方法であり、このファスナーシステムはハードウェアまたは接着剤を要さずに膜を２つの支持体メンバー、例えば２つのリングと結合できる。ファスナーは支持体メンバーの胴と連続していてよく、これは以下の２つのメンバーを含む：ファスナーポスト、これは「雄性スナップピン」と称されることもあり、ファスナーポスト孔、これはファスナーポストに対する受けとして働く。ファスナーポスト孔はまた、「雌性スナップホール」と称される。ファスナーポストは、支持体片またはかみ合いリングのうち一方の表面上のとがった部分または突き出し領域の輪郭を示す。一方の支持体片の表面上ファスナーポスト孔は、間隔をとって配置され、ファスナーポストと接合し、またはこれと固定されてかみ合うように構成される。図７Ａ-７Ｃで説明される実施形態では、膜は第一かみ合いリング(39)(図７Ｃ)と第二かみ合いリング(41)(図７Ａ)との間に固定される。一実施形態では、第一かみ合いリング(39)は多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト(40)を含む表面を含み、第二かみ合いリング(41)は多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔(42)の輪郭を示す表面を含む。別の実施形態では、第一および第二スナップリングの各々は、ファスナーポスト孔の間に、間隔をとって配置されたファスナーポストを含む表面を含む。
【００６９】
実施形態に記載の羊膜および２つの支持体またはリングを使用する組織表面用の培養挿入物または羊膜カバーは容易に組立てることができ、培養挿入物または組織表面用カバーの組立てに必要な羊膜および支持体は、実施形態に記載のキットのコンポーネントとして供給できる。ファスナーポスト孔と接合したファスナーポストを有する支持体のかみ合い連結はしっかり固定されており、ファスナーポストをファスナーポスト孔から分離するには相当の力を要する。
【００７０】
支持体またはリングは特定の実施形態にしたがって可撓性材料から組立て可能である。本明細書中で使用する用語、可撓性材料とは折り曲げることができ、あるいは変形可能であり、かつ非可撓性材料よりより大幅に元の形に復元可能である。実施形態には、例えば、ポリマー、例えばポリエチレン、ビニル、プラスチックおよびシラスティック材料から構成される支持体が含まれる。
【００７１】
この方法は以下の工程を含む：固定用の膜(35)を第一リング(39)の表面と接触させる工程；第一リング(39)上に膜を配置し、これにより第一リング(39)を膜で完全にカバーする工程、これは図７Ｂに描写されている；少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポスト(40)が少なくとも１つの、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔(42)と整列するように第一リング(39)に対して第二リング(41)を配置する工程；ファスナーポスト孔(42)内に少なくとも１つのポスト(40)を挿入することによって第一リング(39)を第二リング(41)と固定してかみ合わせ、これにより第一リング(39)と第二リング(41)との間に膜を固定する工程。一実施形態では、羊膜はかみ合いリングの一面または両面の外側をカバーする。膜はまた、かみ合いリングのまわりを包み、２つのリングの間に、かつリングのエッジを覆って締め付けられる。特定の実施形態では、羊膜(35)はリング(39)上のファスナーポストに対して適合する間隔の穴を有する。
【００７２】
したがって本発明の複合物は培養挿入物または組織表面用羊膜カバーであり、第一表面を有する第一かみ合いリング；第一表面上に位置する多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト；第二表面を有する第二かみ合いリング、この第二表面は自身上に多数の、間隔をとって配置されたファスナーポスト孔の輪郭を示し、組立て時に２つのリングが接合してかみ合った場合、少なくとも１つの孔は少なくとも１つのポストの位置と組み合う間隔で配置される；２つのかみ合いリングの間に固定された膜を含む培養挿入物または羊膜カバーである。
【００７３】
カットスリットを有する支持体の使用
図８Ａ-８Ｅおよび図９Ａ-９Ｄで説明する本発明の別の実施形態は、リング(46)に膜を固定することから構成される装置であって、このリングが周辺部環状表面、内側環状表面、上面および底面を有し、ここに少なくとも１つの表面がその上に少なくとも１つのカットスリット(45)の輪郭を示す装置とこの装置を作成する方法である。図８Ａに描写するように、この方法は以下の工程を含む：固定用の膜をリング(46)と接触させる工程；リング(46)の上面または底面上に膜(35)を配置し、これによりリング(46)を膜(35)でカバーする工程；膜(35)をカットスリット(45)内へ挿入し、これにより膜(35)をリング(46)に固定する工程。特定の実施形態では、膜は上面または底面上の少なくとも１つのカットスリット内へ挿入される。別の実施形態では、膜は周辺部環状表面上のカットスリット内へ挿入される。
【００７４】
図８Ｂはゆるく接着した膜(35)を伴うリング(46)を示し、これはピンセットを使用して型(44)から持ち上げられている。図８Ｃはゆるく接着した膜を伴うリング(46)を示し、リング(46)のまわりで膜(35)で包み、リング(46)をカバーする目的で回転している。別法では、図８Ｄに説明される工程は、膜でカバーされたリングをプレート上に置き、リングの反対側を接触具(probe)で押してリングを回転させることによって実行可能である。このリングは裏返り、図８Ｅで示されるように膜で自らをカバーする。
【００７５】
一実施形態では、羊膜を支持体上のスリット内へ挿入することによって作成される装置は培養挿入物である。別の実施形態では、そのように作成される装置は組織表面用カバーである。
【００７６】
図９Ａ-９Ｄは組織表面用生体高分子カバーの実施形態を示し、羊膜(35)は一方のリング(48)の上面または下面のスリット(50)内へ挿入される。図９Ｄは膜(35)がリング(48)を覆って張っていることを示す。十分に大きい膜片を使用すれば、リング(48)はリング（48）の回転により膜(35)で完全に包まれる。
【００７７】
膜によるリングの包装および第二リング内側の包装リングのスナップ適合
本発明の装置および方法についての別の実施形態では、組織表面用生体高分子カバーを作成するが、これは以下の工程による：生体高分子膜を第一リングの表面と接触させる工程、この第一リングは外側環状エッジを有し、内側環状エッジを有する第二リングの内径内にスナップ適合するサイズの外径を有する；第一リング上で膜を配置し、これにより第一リングを膜で完全にカバーし、第一リングの外側環状エッジを覆って膜で包む工程；第一リングを覆って、これと同軸上に並べて第二リングを配置する工程；第一リングを第二リングと固定してかみ合わせ、これにより第一リングと第二リングとの間に膜を固定し、組織表面用生体高分子カバーまたは培養挿入物を作成する工程。
【００７８】
自身に結合した細胞を含む羊膜
本発明の一実施形態では、第一リングと第二リングとの間に固定された羊膜は組織表面用生体高分子カバーである。本明細書中で使用する用語「組織表面用生体高分子カバー」、「生体高分子カバー」、または「カバー」には、例えば包帯(a dressing, a bandage)、ドレープ、例えば包帯コンタクトレンズ、組織を保護する組成物またはカバー、接着を予防し、細菌を排除し、細菌活性を阻害し、または治癒または組織の成長を促進するカバーが含まれる。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、第一リングと第二リングとの間に固定された羊膜は挿入培養物である。本発明の実施形態、例えば、組織表面用カバーの生体高分子膜、培養挿入物の生体高分子膜、または本発明に基づく任意の他の装置の生体高分子膜は、１つまたはそれ以上の細胞を含んでいてよい。特定の実施形態では、この細胞は膜上で培養または膜に結合させた後に、この膜を第一リング表面と接触または結合させる。別の実施形態では、細胞は、膜を第一と第二リングとの間に固定した後に、膜上で培養するか、膜に結合させる。
【００８０】
表面で培養する細胞は任意の型の細胞であってよく、例えば上皮幹細胞、レチナール色素上皮細胞、輪部幹細胞、輪部上皮細胞である。
【００８１】
実施形態に記載のカバーは、インビトロまたはインビボ組織工学用の骨格またはマトリクスとして使用可能である。細胞をインビトロで培養する方法は組織培養分野の当業者には周知である。例えば、本発明の実施形態に記載される培養挿入物またはシリコーンリングに固定された羊膜はまず、細胞を培養するための、または組織工学を施すための培養に使用可能であり、これは当分野に既知の方法にしたがう。次に、１つまたはそれ以上の細胞を結合させた羊膜を使用して、本発明の実施形態に記載される組織表面用生体高分子カバーを作成可能である。羊膜に結合させる細胞のソースは、被移植部位と生物学的に一致し、かつ組織適合性が一致する健康な部位から採取された生検由来の組織であってよい。
【００８２】
以前に記載したように、羊膜組成物は動物モデルにおいて、治癒を促進し、炎症および線維血管内殖を減少させ、上皮化を促進することが既知である。したがって羊膜を含有するカバーを損傷した組織表面に配置し、目立った改善が生じるまで保持すれば、羊膜を含有するカバーはその治癒または新規組織の成長を支援することができる。
【００８３】
別の実施形態では、組織表面用生体高分子カバーは、遺伝子治療用にあらかじめ操作された１つまたはそれ以上の細胞を、膜に結合して含むことができる。一実施形態では、膜は、遺伝物質、例えば遺伝子またはアンチセンスを取り込んだ細胞を含む。一実施形態では、膜に結合した１つまたはそれ以上の細胞を伴う組織表面用生体高分子カバーを移植片として使用でき、標的組織部位に移植可能である。したがって、この遺伝物質を取り込んだ移植片(graft or implant)は遺伝子治療のために使用可能である。
【００８４】
体組織表面の輪郭に適合する生体高分子カバー
組織表面用生体高分子カバーは、羊膜を伸展させ、または支持体リングを体組織表面の輪郭に適合させるように修飾可能である。例えば一実施形態では、第一リングおよび第二リングをそれぞれ、眼の外側表面に配置するためのサイズおよび輪郭に成形する。
【００８５】
例えば図１９Ａに示すように、支持体はコンフォーマリングであってよく、これは眼球表面の輪郭に成形された表面を有する。同様に、図２０Ａは傾斜した表面(140)を有するコンフォーマリングを描写し、この傾斜した表面は図２１Ａに示されるコンフォーマリングの溝(150)とかみ合い、図２１Ａのリングの表面(146)を覆ってあらかじめ配置された膜をこのリングの間に固定する。２つのリングが互いに固定されて適合する様式は、図２０Ｂを図２１Ｂと比較すれば最もよく理解できる。このリングは、それぞれ独立に、環状または楕円状の形状であってよい。図２０Ａおよび２１Ａ中のリングは可撓性であり、両リングが同一形状でなくても、伸展させてともに固定してよい。図２１Ａに描写される支持体はコンフォーマ様の形状、例えば図１９Ａに示される支持体の形状であってよい。
【００８６】
別の実施形態では、生体高分子膜、第一リング、第二リングはそれぞれ、組織表面への配置用のサイズに合わせられ、ここでこの組織は真皮組織、消化管組織、呼吸管組織、生殖系組織、泌尿器系組織、循環系組織、または骨組織である。
【００８７】
生分解性支持体および制御された薬物放出
一実施形態では、第一リングと第二リングは生分解性である。別の実施形態では、第一リングまたは第二リングのいずれかが生分解性である。本明細書中で使用する用語「生分解性物質」とは、天然の生物学的プロセスによって分解可能な物質である。本発明の特定の実施形態では、生体高分子カバー内の支持体が生分解性であり、かつこのカバーが外科的移植片として使用されるならば、この支持体は、崩壊し、溶解するか、あるいは吸収され、この移植片を外科的に除去する必要を排除する。
【００８８】
一実施形態では、組織表面用生体高分子カバー内の少なくとも１つの支持体またはリングは生理活性分子を含み、この分子は薬剤活性または治療物質、例えば薬物であってよい。本明細書中で使用する用語「生理活性分子」には、標的組織または器官に対して特定作用または反応を誘発可能な物質が含まれる。支持体が生分解性であれば、薬剤活性分子または薬物は支持体の分解にしたがって徐放される。ある支持体の分解速度およびこの支持体に含まれる治療物質の付随する放出速度は、組織表面用カバーの実施形態において、既知の適切な分解速度を有する材料製の支持体を使用すれば、予測可能である。したがって、この実施形態に記載される組織表面用生体高分子カバーは、治療物質用の徐放性送達ビヒクルである。
【００８９】
本発明の実施形態では、通常は薬物であると考えられ、生物学的または薬剤活性を有する任意の物質を薬物コンポーネントとして使用できる。実施形態での使用に適した薬剤活性物質には、細胞、検体、成長因子、酵素、治療薬、生体高分子、抗菌薬、および脱臭剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００９０】
本明細書中で使用する用語「治療薬(therapeutic drug)」または「治療物質(therapeutic agent, therapeutic substance)」には、例えば：公式米国薬局方、米国公式ホメオパシー薬局方、または公式国民医薬品集、またはこれらのうちいずれかの任意の補遺にて認可されている化合物および組成物；人または他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、処置または予防において使用を意図される化合物および組成物；人または他の動物の身体構造またはその任意の機能に作用するための使用を意図される化合物および組成物(食物以外)が含まれる。
【００９１】
治療薬クラスの例には、ステロイド性および非ステロイド性抗炎症薬、ホルモンおよびその任意の合成アナログおよび薬剤活性断片が含まれる。これらが膜または支持体内または表面に分散可能であるか、あるいは膜または支持体表面の基と相互作用して共有結合またはイオン結合または疎水性相互作用または親水性相互作用のいずれかを形成可能である限り、本発明の実施形態での使用に適した治療薬は脂溶性、水溶性、アニオン性またはカチオン性であってよい。
【００９２】
本発明の送達システムは成長因子(例えばインターロイキン、プロスタグランディン、トロンボキサン、ロイコトリエンおよびサイトカイン)、ステロイド性および非ステロイド性避妊薬、抗生物質、鎮痛薬、鎮静薬、バルビツール酸塩、アミノアルキルベンゼン類、カテコールアミン、麻酔、麻酔性アンタゴニスト、抗悪性腫瘍薬および抗凝血薬の投与によく適している。
【００９３】
徐放性薬物送達ビヒクル、例えば本発明の実施形態に記載の、膜または生分解性支持体を含む組織表面用生体高分子カバーであって、この膜または支持体がさらに治療物質を含むカバーは、患部において、所望の臨床効果を達成するために適切なレベルの治療物質の生物学的利用能を提供可能である。薬物の生物学的利用能は、その薬物の性質、使用される薬物送達ビヒクル、および送達経路、例えば経口、局所、経皮、粘膜、注射による投与、吸入による投与、または２つまたはそれ以上の上記経路の組み合わせによる投与に依存する。生物学的利用能は、例えば、胃酸による薬物の分解、消化管からの排除、または薬物の高い水溶解度の結果として低くなり得る。この結果、頻繁な投与が必要とされ、各投与に伴って送達される薬物が多量になる可能性があり、損傷性副作用の発生率を増加させることになる。徐放性(controlled release)薬物送達ビヒクルはいくつかの上記問題を軽減できる。
【００９４】
例えば本発明の一実施形態では、薬物、例えばシクロスポリンＡは内部的に摂取されると重度の損傷性全身作用を有し、これを眼球表面用生体高分子カバーの羊膜または生分解性リング中に包含し、そして局所的に送達し、これにより身体による吸収およびこれに起因する内部器官への損傷を最小化することにより投与可能である。
別の実施形態に基づくグリップ表面を有するかみ合いリング
上記、ファスナーポストおよびファスナーポスト孔の輪郭を示す領域を有する支持体リングを含む本発明の実施形態に加えて、別の実施形態では、２つの支持体片上の他のタイプのグリップ表面を使用する。例えば図１０Ａ-１０Ｃに示されるように、本発明の一実施形態は組織表面用生体高分子カバーとして、または培養挿入物として有用な装置である。図１０Ｄに示される、かみ合いリングの間にサンドイッチされた膜(35)を有する装置は、かみ合いリング(54, 58)を含み、ここに内側リング(54)の外側環状エッジ(56)は第一グリップ表面(56)を含み、外側リング(58)の内側環状エッジ(60)は第二グリップ表面(60)を含む。図１０Ｄのカバーの平面図に示されるように、膜、例えば羊膜(35)は、リング54および58の２つのグリップ表面の間に締め付けて固定する。特定の実施形態では、その部分的な断面遠近図が図１０Ａ-１０Ｃに示されるが、外側リングおよび内側リングのかみ合い適合は、先細化(tapering)または角度付けにより、リング(64)の内側環状エッジ(66)を例えば90°またはそれより大きくし、リング(68)のエッジ(70)を90°またはそれより小さくし、互いに接触するエッジ(66および70)が互いにグリップし、固定されてかみ合うことによって、しっかりと固定できる。
本発明の別の実施形態では、グリップ表面はいがであるグリップ装置を含む。
【００９５】
羊膜を支持体に固定するための接着剤の使用
本発明の方法および組成物の一実施形態では、図１１-１２に示されるように、例えば、膜は支持体に接着される。図１１Ａに示される実施形態では、平滑エッジを有する支持体リング(72)の少なくとも１つに接着組成物(84)を加える。次に、図１１Ｂに示されるように、支持体(72)表面上の接着組成物(84)を羊膜(35)と接触させ、ここにこの膜(35)は支持体(72)の外径より大きい直径を有する表面を持っている。支持体(72)を膜(35)上に配置し、支持体(72)を覆って内向きに膜(76)を折りたたむことを可能にする。次いで図１１Ｃに示されるように、支持体(72)を覆って膜(35)を折りたたみ、これにより支持体(72)は膜(35)でカバーされ、そして接着組成物(84)によって膜(35)と接着し、これにより組織表面用羊膜カバー(78)を作成する。組織表面用羊膜カバーの一実施形態では、支持体はリングである。このカバーの別の実施形態では、支持体はディスクである。このカバーの別の実施形態では、支持体はコンフォーマ、例えば図１９Ａの(134)である。別の実施形態では、上記工程を繰り返し、第二羊膜片を組織表面用羊膜カバー下に配置し、このカバーを覆って折りたたむことによって二重層カバーが形成される。
【００９６】
カバーの一実施形態では、接着組成物は、フィブリノーゲンを含むフィブリン接着剤(これは「フィブリン糊」としても知られる)を含む。別の実施形態では、接着組成物はシノアクラレート(sinoacralate)を含み、これは化学的には2-シアノ-3t-(2)フリル-アクリル酸として知られる。本明細書中で使用する用語「フィブリン接着剤」とは、外科手術中に使用される組織接着剤であり、出血を制御し、組織を封着する。フィブリン接着剤はヒト血漿由来の２つの血液凝固因子、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含有する。本発明の実施形態中の使用に適したウイルス不活化フィブリン接着剤は商品名TISSEEL(登録商標)として市販され(Immuno, Aktiengesellschaft fur Chemischmedizinische Producte Corporation, Austria)、Baxter Healthcare Corporation (Glendale, CA)から入手可能である。実施形態中の使用に適した別のウイルス不活化フィブリン接着剤はVitex Technologies, Inc. (New York, NY)から入手可能である。
【００９７】
膜が接着組成物によって支持体に固定されている組織表面用羊膜カバーである組成物、この組成物を製造する方法の別の実施形態は、図１２Ａおよび１２Ｂに示される。本方法の実施形態では、リング支持体(72)を、支持体(72)の外径より大きい直径を有する表面を持つ羊膜(35)の中央部分上に配置する。接着組成物(84)、例えば上記フィブリン接着剤を支持体(72)の外径を超えて外側に広がった膜（35）表面に加える。それ自身の上に接着剤（84）を有する膜(35)の外側エッジ部分は、次いで図１２Ｂに示されるように支持体(72)を覆って内向きに折りたたまれ、これにより支持体(72)は膜(35)でカバーされ、そしてそれ自身の上に接着組成物を有する膜表面の部分はこの膜の別の部分と接着し、これにより組織表面用羊膜カバーを作成する。一実施形態では、この支持体はリングであり；別の実施形態では、この支持体はディスクである。一実施形態では、この接着組成物はフィブリン接着剤またはシノアクラレートである。
【００９８】
一実施形態では、上記接着組成物によって膜が支持体に固定されている組織表面用羊膜カバーを製造する方法は、組織表面（90）用の二重層羊膜カバーを作成する追加工程を含み、このことは図１３の断面遠近図に示されている。この断面図では、リング(80)を覆う第一羊膜片(35)が見える。この実施形態では、第二羊膜片(86)を組織表面用羊膜カバーを覆って折りたたみ、治療物質を含有可能なポケット(92)を形成する。この方法は以下の追加工程を含む：第二羊膜(86)の中央部分上に組織表面用羊膜カバーを配置する工程、この第二羊膜は羊膜カバーの外径より大きい直径を有する表面を有する；羊膜カバーの外径を超えて外側に広がった第二羊膜（86）の表面部分に接着組成物を適用する工程；および第二羊膜(86)を、羊膜カバーを覆って内向きに折りたたみ、羊膜カバーを第二羊膜(86)でカバーし、これにより組織表面用二重層羊膜カバー(90)を作成する工程。
【００９９】
一実施形態では、羊膜はかみ合い適合を有する２つの支持体リングの各々に結合させ、これにより組織表面用の二重層羊膜カバーを作成できる。例えば、羊膜は図４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２に示される支持体リングの各々および図２０Ａに示される支持体に結合させ、これにより組織表面用の二重層羊膜カバーを作成できる。一実施形態では、ポケットを伴うか、または伴わない羊膜カバーはせん孔を有し、カバーが組織表面に適用されたときには、閉じ込められた空気を逃がしてもよい。組織表面用の二重層羊膜カバーの一実施形態は、２つの膜層の間に形成されたスペースまたはポケット内に１つまたはそれ以上の治療物質を含む。
【０１００】
膜を支持体に固定するための羊膜の「粘着性」間質側の使用
上記のように、羊膜は以下の２つの面を有する：厚い基底膜および無血管性間質。羊膜の間質側は、スポンジ、例えばWECK-CEL(登録商標)スポンジ(Edward Weck, Incorporated, Princeton, NJ)と接触させることによって基底膜側から識別可能である。間質側は粘着性であり、スポンジと接着する。羊膜の間質側の接着性質を図１４ＡおよびＢに示される本発明の別の実施形態に基づく複合物を作成することに使用可能である。この実施形態では、組織表面用の羊膜カバー(100)は以下を含む：外径を有する支持体(96)；支持体(96)の外径より大きい直径の表面を有する羊膜(35)、しかもこの羊膜は間質側(94)を有する；膜(35)の間質側(94)の中央部分に接して配置された支持体(96)、この膜(35)は組立て時に支持体(96)を覆って内向きに折りたたまれ、その支持体(96)は膜(35)でカバーされ、そして折りたたまれた膜の間質側(94)の部分は間質の粘着性によって、この膜(35)の間質側(94)の別の部分と接着し、これにより支持体(96)を適所で保持し、組織表面用の羊膜カバーを作成する。図１４Bでは、非間質側(98)が見えており、羊膜は支持体(96)を覆って折り返されている。一実施形態では、この支持体はリングまたはディスクまたはコンフォーマである。
【０１０１】
図１４Ｃに示すように、別の実施形態では、第二支持体(102)をカバーされた支持体の下に挿入し、第二支持体(102)を支持体をカバーする羊膜の少なくとも部分と接触するように配置し、これによりカバーされた支持体と第二支持体(102)との間に羊膜を固定する。
【０１０２】
図１５Ａ-Ｂおよび１５Ｃ-Ｄは図１４に示される実施形態の別の描写である。
【０１０３】
膜を固定する締め付けリングの使用
図１６Ａ-１６Ｂは組織表面用羊膜カバーまたは培養挿入物の他の実施形態を描写する。図１６Ａに示される実施形態では、羊膜(35)は、周辺部環状溝を含む支持体リング(96)を覆って配置される；縫合糸(106)は溝内に配置され、結び目(108)で膜(35)周りにくくられ、膜(35)を支持体(96)に固定する。別の実施形態では、支持体リングは周辺部環状溝を有さない。別の実施形態では膜は直接支持体に縫合される。
【０１０４】
図１６Ｂに描写される実施形態では、締め付けリング(112)が支持体リング(110)の溝内に配置され、適所で締め付けられている。多くのタイプの締め付けリングが本発明のこの実施形態での使用に適するが、ただしこれらは膜を引き裂きにくい平滑表面を有することを条件とする。次いで支持体リング(96)の外径より大きい直径を有する羊膜(35)が締め付けリング(112)を覆って配置される。膜(35)は次いで縫合糸(106)を用いてリング(96)上の締め付け具(112)内へ押し込まれ、これにより膜(35)を支持体リング(110)に固定する。縫合糸(106)は適所でくくってよく、糸の末端を引っ張って除去してもよい。別の実施形態では、羊膜(35)は、締め付けリング(112)が取り付けられる前に、支持体リング(96)を覆って配置される。締め付けリング(112)は次いで、膜(35)上、支持体リング(96)の溝内へ配置され、適所で締め付けられ、これにより膜(35)を支持体リング(96)に固定する。
【０１０５】
膜を固定する支持体中のスリット、クリップまたは鋲の使用
図１７ＡおよびＢは本発明の実施形態を示し、ここでは羊膜(35)と接触する支持体リング(114)の表面がスリット(117)または空洞(cavity)の輪郭を示す。図１７Ａは、リング(114)の部分の遠近断面図である。羊膜(35)はリング(114)を覆って配置され、減圧を使用して膜(35)をスリット(117)内へ引き込む。別法では、膜(35)はスリット(117)内へ押し込まれる。
【０１０６】
図１７Ｄに示されるように、膜(116)を支持体リング(114)に固定するためにクリップ(118)を使用する。クリップ(118)にひだをつけて支持体リング(114)上に膜(116)をより安定して保持できる。クリップ(118)は生体適合性材料、例えばプラスチック、ステンレス鋼、白金または金製である。
【０１０７】
図１７Ｅに示される別の実施形態では、返りのある先端を有する鋲(120)、この先端は生体適合性材料製であり、この鋲を使用して、膜(35)および支持体リング(114)を貫き、膜(35)を支持体リング(114)に固定する。
【０１０８】
標的組織を処置する、組織表面用生体高分子カバーの使用
組織表面用生体高分子カバー、例えば本発明の実施形態に記載の組織表面用羊膜カバーは、これを標的組織表面に配置して組織を治療処置できる。実施形態に記載されるカバーは、組織の症状に目立った改善を生じさせるのに十分な期間、組織表面の適所で保持される。本発明は、患部組織の表面に組織表面用羊膜カバーを適用することによって組織を処置し、熱傷および傷害の疼痛を緩和し、炎症、膨潤、瘢痕を減少させ、治癒を促進し、罹患または傷害組織を別の様式で処置するための複合物および方法を提供する。
【０１０９】
羊膜の間質は成長因子、抗血管新生および抗炎症性タンパク質、種々プロテアーゼに対する天然阻害剤を含有する。これらの因子は、組織表面と接触して配置された羊膜から拡散し、治癒プロセスを促進するようだ。例えば角膜は、再上皮化された場合に、少なくとも部分的に「治癒された」と考えられる。したがって、本発明の組織カバーの実施形態を皮膚傷害を覆う包帯として使用し、眼球表面の再構築、角膜上皮欠損または間質性潰瘍の処置が可能であり、またこれを標的組織部位に移植して、外科手術における接着を予防し、あるいは軟部組織を再構築できる。
【０１１０】
本発明の実施形態に記載される組織カバーには、その上で培養された細胞またはそれに結合させた細胞を含浸させ、これを骨格としてインビボ組織再構築または遺伝子治療に使用できる。上記治療物質は膜または支持体、特に生分解性支持体中に含ませることができ、本発明の実施形態に記載される組織カバーは徐放性(sustained or controlled release)薬物送達ビヒクルとして使用できる。
【０１１１】
本発明の実施形態に記載の任意の組織表面カバーの膜および支持体はそれぞれ、眼の表面上に、または、例えば真皮組織、消化管組織、呼吸管組織、生殖系組織、泌尿器系組織、循環系組織、骨組織を含む組織の表面上に配置するためのサイズにすることができる。したがって本発明の実施形態の組織表面カバーの支持体は、組織表面カバーと接触させる対象の体組織、例えば角膜の測定基準曲線に対応する湾曲半径を有する。
【０１１２】
支持体および膜を含む本発明の組織表面カバーの実施形態では、支持体は標的組織と順応する。本明細書中で使用する用語「順応する」、「コンプライアンス」、およびその文法上のバリエーションは、例えば、支持体が標的組織の力学的および生理学的性質と密接に適合する能力を表す。
【０１１３】
キット：本発明の実施形態
本発明の実施形態に記載のキットは、本発明の組成物または装置、例えば膜、フィルム、弾性バンド、支持体、リング、組織接着剤、縫合糸、締め付けリング、クリップ、びょう、円錐形エキスパンダ、エキスパンダの先端部上に配置された放射状弾性バンドを摩擦によってかみ合わせるための装置の任意の組み合わせを含むことができる。
【０１１４】
本発明の一実施形態は、組織表面用羊膜カバーを含有する密封パッケージである。この実施形態の一例は、２つの密封区画を有する密封パッケージであり、図１８Ａにその開封前が示される。一方の区画(124)は凍結乾燥した眼球表面用羊膜カバー(128)を含有し、これは包帯コンタクトレンズとして使用される。他方の区画(126)は包帯コンタクトレンズ(128)を水和する媒体を含有する。図１８Ｂは開封後のパッケージを示し、包帯コンタクトレンズ(128)は区画(126)中で水和されている。
【０１１５】
図１９Ａは、眼球表面を覆って適合する形状の支持体(134)の遠近図であり、この支持体は外側周辺部表面の部分に上記接着組成物(84)を有し、羊膜(35)は支持体(134)の内側表面または凹面側に配置されている。図１９Ｂに描写されるように、膜(35)は支持体(134)の内側表面を覆って配置され、これは折り返されて外側周辺部表面を覆い、これにより膜(35)は接着組成物(84)と接触し、そして膜(35)は組成物(84)により適所で保持される。
【０１１６】
別の実施形態では、支持体(134)は外側表面上に周辺部溝(図示せず)を有し；膜(35)は支持体(134)の内側表面に配置され、折り返されて支持体(134)の外側周辺部エッジおよび周辺部溝をカバーする。支持体(134)の内側表面に対して膜(35)を保持するため、第二環状支持体は支持体(134)と同心性であり、支持体(134)の周辺部溝内でスナップ固定(snap-lock)するように設計されたエッジを有し、支持体(134)上に配置され、支持体(134)と適所でスナップ固定され、これにより膜(35)を支持体に固定する。
【０１１７】
上記のように、培養挿入物または組織表面用カバーの組立てに必要な羊膜および支持体はまた実施形態に記載されるキットのコンポーネントとして供給できる。さらに、特定の実施形態に記載されるキットは、１つまたはそれ以上の抗菌性組成物および治療物質のサンプルを含み、これは羊膜に加えられるか、あるいは組織表面用羊膜カバーの使用によって投与される。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例の中で本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は例示的に提供するものであり、いかなる意味においても本発明を制限するためのものではない。
【０１１９】
以下に記載の３つのプロトタイプで使用される固形支持体は、多様な目的を実現するために、材料、寸法、および形状に関して変化させることができる。
【０１２０】
以下に記載される３つのプロトタイプはすべて、インビトロ細胞培養用に使用可能である。さらに、インビトロ培養の間に培養細胞内に治療遺伝子を取り込ませることができ、その後これらのプロトタイプを、将来の有望な遺伝子治療について関心がある遺伝子を過剰発現した培養細胞を送達する手段として使用できる。
【０１２１】
このプロトタイプは、日常的な実験法のみを用いて、その形状が眼球表面によく適合するように上記のように修飾可能である。
【０１２２】
このプロトタイプを使用して、エクスビボ培養細胞を送達可能であり、この細胞は治療的理由で培養されたものである。
【０１２３】
プロトタイプ１：培養挿入物への羊膜の固定
プロトタイプ１は図１Ａ-１Ｄおよび図２、３Ａ、３Ｂに示される一組の装置から構成された。この装置は以下を含む：図１Ａ-１Ｄおよび図２に示される円錐形エキスパンダ(20)；弾性バンド(24)をかみ合わせるための装置(30)、エキスパンダ(20)の底部で弾性バンドを挿入物へ移すためのリング(図１Ａ-１Ｄに示される)。これらの装置の本来の目的は、培養挿入物表面への羊膜の固定を容易にし、これにより細胞は羊膜基質上で培養可能である。したがってプロトタイプ１は、羊膜を弾性バンドによって固形支持体、すなわち培養挿入物上に固定した方法について説明する。プロトタイプ１を作成するこれらの装置の操作は図１Ａ-１Ｄに描写される以下の工程を含むものであった。
【０１２４】
工程１：弾性バンド(24)を円錐形エキスパンダ(20)の先端部上に配置し、一方、エキスパンダの底部を、バンドを受けるための周辺部環状溝を有するリングと接触させた(図１Ａ)。
【０１２５】
工程２：装置(30)を使用して、弾性バンドを摩擦によりかみ合わせ、これをエキスパンダの先端部を覆って適用した(図１Ａ)。
【０１２６】
工程３：装置(20)を使用して、バンドをエキスパンダの先端部からエキスパンダの底部方向へ、更にリング上の周辺部環状溝内へ押し進めた(図１Ｂ-１Ｄ)。
【０１２７】
工程４：羊膜を挿入物表面に配置した。
【０１２８】
工程５：次いでリングを持ち上げ、挿入物上の膜にかぶせて適用した。
【０１２９】
工程６：バンドをリングから挿入物へ移した(図４Ｄ参照)。
【０１３０】
プロトタイプ２：一方がＯリングである２つのリング間での羊膜の固定
プロトタイプ２は図４Ａ-４Ｄおよび図５Ａ-５Ｄに描写されている。このプロトタイプは二組のリングを含み、一方は固形支持体であり、他方は弾性Ｏリング(図４Ａおよび５Ａ)である。このプロトタイプでは、羊膜(35)を固形支持体(22)、すなわち固形リングに固定したが、この固形リングはリング(22)の内側または外側に環状溝(21または23)を有し、この溝は弾性Ｏリング(24または25)を受けるサイズで成形できる。この操作は図４および５に描写される以下の工程を含むものであった。
【０１３１】
工程１：羊膜(35)を、図４Ｄ中(24)または図５Ｄ中(21)の溝を有する固形リング(22)表面に配置した。
【０１３２】
工程２：弾性Ｏリング(24または25)を固形リング支持体(22)へ移し、リングの外側溝(23)(図４Ｄ)またはリングの内側溝(21)(図５Ｄ)内へ挿入することによって膜(35)を固定した。
【０１３３】
プロトタイプ３：スナップ構造による２つの固形リング間での羊膜の固定
プロトタイプ３は図８Ａ-８Ｄおよび図９Ａ-９Ｄに説明されている。このプロトタイプは、図８中(45)および図９中(50)のカットスリットを有するポリマーリングの組立てを含むものであった。この操作は図８Ａ-８Ｅに描写される以下の４工程を含むものであった。
【０１３４】
工程１：羊膜(35)をリング表面に適用し(図８Ａ-８Ｃ)、リングの外側エッジに沿うスリットに押し込んだ。この操作はリングを型(44)内に入れて行い、膜はその中央で下向きに下がり、あるいは垂れることができた。ゆるく接着した膜を伴うリング(46)を次いでピンセットによって型から持ち上げた(図８Ｂ)。固形支持板上に圧力を加え、リングを内側または外側回転によってねじり、膜がこのリングを完全にカバーした(図８Ｄ)。この作業が羊膜をリングに固定させた(図８Ｅ)。
【０１３５】
実験設計および方法
目的１：眼球表面用羊膜カバー、または「包帯コンタクトレンズ」を開発することであり、角膜表面および眼球表面全体をそれぞれカバーするように適合させるコンフォーマの形状に基づく既存のプロトタイプを修飾することによる。
【０１３６】
1)理論的根拠：
発明者らの予備実験では、羊膜を数種類の固形支持体に固定できることが示されている。したがって発明者らは、以下に提唱される実験設計に基づき、角膜表面または眼球表面全体をカバーするように適用することができるように固体支持体を修飾することによって、無縫合の「包帯コンタクトレンズ」を開発することがまた可能であると考える。
【０１３７】
2)実験設計：
本発明の包帯コンタクトレンズの設計には、以下３つの重要な課題を解決することが必要である。
【０１３８】
第一の課題は「レンズ」のサイズである。処置対象の眼球表面の病理学に応じて、包帯コンタクトレンズは、角膜疾患を処置するためには角膜表面全体を、あるいは角膜および結膜の両者が関連する拡散性眼球表面疾患を処置するためには眼球表面全体をカバーする必要がある。したがって発明者らは角膜用途(例えば15 mm)または眼球表面全体用途(例えば結膜弓まで)である、少なくとも2つの包帯コンタクトレンズを設計する。
【０１３９】
発明者らはコンフォーマの形状(または輪郭)を採用する。コンフォーマは、眼瞼と眼球表面との間の間隙に適合する可塑性シェルである。種々のサイズのコンフォーマが市販されている。コンフォーマ(これはSYMBLEPHARON RINGとしても知られる)はJardon Eye Prosthetics, Southfield, MIから入手した、これはLUCITE(登録商標)(ポリメタクリル酸メチル、PMMA)(Dupont de Nemours)として知られるアクリル樹脂製であり、この樹脂はハードコンタクトレンズの製造に使用されるものでもある。現在のコンフォーマおよびコンタクトレンズの設計は患者がこれを装着した際にいかなるエッジ問題も全く生じない。
【０１４０】
眼球形成外科医は再建外科手術の最後にコンフォーマをよく使用し、手術後の瞼球癒着症、すなわち眼瞼の瞼板結膜と球体の眼球結膜との間の線維性接着の形成を予防する。
【０１４１】
第二の課題は、羊膜固定用の固形支持体の製造に使用する材料である。アクリル、シリコーンエラストマー、または両者の組み合わせのいずれかを支持体製造用に試験する。
【０１４２】
第三の課題は、羊膜を固形シリコーン支持体に固定する仕組みをさらに試験することであり、これには、プロトタイプ２の仕組みに基づくアクリルおよびシリコーンエラストマーの使用、または可撓性シリコーンゴム(ポリジメチルシロキサン、トリメチル末端付)支持体の使用が含まれ、ここではスリットをプロトタイプ３の仕組みを使用してＯリング支持体の内側側面に作製する。
【０１４３】
Ｏリング支持体はシリコーンゴム(50±5または75±5ショアＡクラス材料、半透明、USPCL VIに認定される基本材料、他の全ての成分はFDAガイドライン内にある)製である。スカートの外周内に並ぶ各スリットの長さ、深さ、幅を変化させて、羊膜をスカートに最もうまく固定する。
【０１４４】
上述の３つの課題を考慮して、発明者らは本発明の角膜または眼球表面用途の包帯コンタクトレンズを以下のように開発することを提唱する。
【０１４５】
第一に、プロトタイプ３の仕組みに基づいて、種々のサイズ、すなわち13から、15、17、19 mmシリコーン製Ｏリングを得る(DA/PRO RUBBER INC., Tulsa, OK)。顕微鏡下でＯリングを回転式試料台に置き、溝内に固定する。刃物を用いて、Ｏリングの内側表面中に種々の間隔でスリットを作成する。また種々の深さおよび長さのスリットを試験し、羊膜を最もよく固定するスリットを調べる。
【０１４６】
第二に、プロトタイプ３の仕組みに基づいて、発明者らは、スリット口を広げてこのスリット内へ羊膜の周辺エッジを挿入可能にするガイド装置を開発する。この仕組みは平滑エッジの真空針と同様である。
【０１４７】
第三に、発明者らは、目的３ウサギ試験において眼球表面用途のヒトコンフォーマと同様のウサギ眼表面の輪郭を有するＯリングを使用し、ここではコンタクトレンズと類似する輪郭を有する環状構造を角膜用途に採用する。
【０１４８】
3)見込まれる結果および解釈：
上述の実験設計は、予備実験に記載される発明者らの経験に基づき、日常的な実験法のみを用いて完全に達成可能である。発明者らは、羊膜を、角膜表面および眼球表面両用途の固形支持体に密接に固定することを見込む。また発明者らの考えでは、固定の強度は膜に加えられる伸張に耐えるほど十分に強くなくてはならない。包帯コンタクトレンズの強度をインビトロで定量化するために、発明者らはひずみ計装置を使用し、この装置は製造された本発明の包帯コンタクトレンズをその外側輪郭エッジで保持し、また膜上に加えられる圧力を膜がＯリングから脱離するまで変化させる装備を含む。応力・ひずみ関係をPCで記録し、破断点を求める。この装置を用いて、上記の種々の変数によって製造した各包帯コンタクトレンズの強度を比較する。
【０１４９】
4)潜在的な問題および解決策：
眼表面への配置後、組織が及ぼすゆがみ圧(deflection pressure)はかなり小さく、おそらく10グラムより小さい。上記のように評価されたゆがみ力が羊膜を時期尚早にシリコーンＯリングから分離する場合、発明者らはまずＯリングのデュロメーターを50から75に変化させ、Ｏリングとスカートとの間の結合を改良する。
【０１５０】
これら種々の設計に統計上の差異が存在するならば、発明者らは最高の破断点を提供するものを選択する。しかしながら、最高の破断点を有する設計であっても十分な強度でなければ、発明者らはＯリング横断面の形状を環状から楕円状に変化させ、必要であれば、リングを環状から楕円状管腔に変化させ、そのエッジがより先細になって挿入される膜の量を増加させるようにする。
【０１５１】
しかしながら、Ｏリングデュロメーター／硬さの変化および上述のスリット寸法および形状の変更後に満足な固定を達成できない場合、発明者らは固定の仕組みをプロトタイプ３に変化させ、スカートを製造する材料をシリコーンからPMMAおよびシリコーンに変える。すなわち、PMMAスカートの内側エッジまたは外側エッジ内に施された溝へＯリングをはめることによって固定を行う。破断点圧力を測定し、比較して固定強度が改良されたかどうかを調べる。
【０１５２】
しかしながら、プロトタイプ２に基づく設計がPMMAスカートに対する羊膜の固定に関して不十分である場合、発明者らはＯリングアプローチを完全に断念し、２つの空洞注入型を設計し、かみ合う２つの部品のスカートを作成する。この型はSmall Parts Inc., Miami Lakes, FloridaまたはInnovia Inc., Miami, Floridaのいずれかが製造する。これらの２つの部品がかみ合うと、羊膜をサンドイッチして固定し、図２０Ａ、Ｂおよび２１Ａ、Ｂに示されるコンフォーマの元の形状および厚さになる。
【０１５３】
スナップ構造は以下のうちの１つである、これらはすべて以前に記載され、添付の図面に説明されている：1)一方の部品の内側上に適合溝および他方の部品の外側上に隆起したフランジ；2)一方の部品表面に作成されたポストおよび他方の部品表面に作成された穴を有する雄性および雌性結合；または3)一方の部品の鋸歯状表面および他方の相補的表面。
【０１５４】
瞼をまばたきする際の摩擦(friction(chafing))によって生じ得る、眼球表面に対するすべての副作用を回避するコンフォーマの設計にしたがって包帯コンタクトレンズのエッジを成形する。上記問題が存在する場合、発明者らは固形支持体の外側エッジ周囲で過剰の羊膜を包み、羊膜のみが眼組織と接触するようにする。
【０１５５】
目的２：凍結保存後の製造ずみ包帯コンタクトレンズの耐久性および安定性を検査すること
1)理論的根拠：
角膜表面および眼球表面両用途用および包帯コンタクトレンズを首尾良く製造した後、発明者らは、保存媒体中、温度−80℃で一定期間凍結保存した後のその耐久性および安定性を検査することを要する。この保存方法は、現在Bio-Tissueが製造するAmnioGraftTMの調製についての、権利化済み方法(引用により本明細書中に包含されるU.S.P.N. 6,152,142を参照のこと)に記載されたものである。羊膜の抗炎症性および抗瘢痕作用の効力は、AmnioGraftTMがエンドユーザ、すなわち眼科外科医に流通した場合、上記権利化済み保存方法下で維持される。AmnioGraftTMに関して、凍結保存期間、すなわち有効期間は少なくとも１年であることが決定されている。したがって発明者らは、可撓性スカートが上記保存条件下でその完全性を依然維持するかどうかを決定することを要する。事実そうであれば、発明者らはまた、(破断点圧力によって測定される)固定強度が凍結保存の種々の期間後に依然として維持されるかどうかを決定することを要する。支持体に固定された羊膜の凍結保存は随意である。
【０１５６】
2)設計：
発明者らは、選択されたＯリングおよび製造ずみの包帯コンタクトレンズ(固定済み羊膜を有す)の完全性が長期凍結保存後に依然保存されているかどうかを試験する。発明者らは、一連の(異なった材料製の)Ｏリングおよびこれら同一のＯリングの構成材料をAmnioGraftsTMの保存に通常使用される保存媒体を含有する個別のガラスビン中に置く。発明者らはこれらのビンを超低温フリーザー中−80℃で保存する。種々の期間の保存後、発明者らは装置の完全性を解剖顕微鏡下で検査し、任意のひびまたは欠損が存在するかどうかを調べ、破断点圧力試験を使用して元の材料の性質を評価し、それぞれ非凍結膜と比較する。凍結保存期間は１年間継続するが、データポイントはこの期間内毎週である(製造過程の進行中−目的１)。
【０１５７】
3)見込まれる結果および解釈：
発明者らは、自らが実行した予備試験、すなわち３つのタイプのシリコーンゴムＯリング(純粋PDMS、VITON、およびフルオロシリコーンゴム)の−80℃での完全性試験から、包帯コンタクトレンズの可撓性支持体が１年の凍結保存期間中安定であり、固定強度が十分な強度を維持すると考える。発明者らはまた、培養中の上皮成長を支持するその能力を試験する(方法参照)ことによって上記固定された羊膜の、保存後の生理学的作用を試験し、凍結保存期間と同一期間後のAmnioGraftTM未凍結保存コントロールと比較する。
【０１５８】
4)潜在的な問題および解決策：
しかしながら、可撓性支持体の完全性が凍結保存によっておびやかされることを発見した場合、発明者らはまず、この有害作用が時間依存的であるかどうかを決定し、その組立物が無傷である状態を依然として保持できる最短期間を見出す。
【０１５９】
凍結保存期間の短縮が必要であれば、発明者らは最良の材料を使用する包帯コンタクトレンズ製造過程を修飾するが、保存期間に限界を設けることに配慮する。しかしながら、可撓性支持体の完全性および固定強度が不満足であることを発見した場合、発明者らは他のエラストマー材料を研究する。
【０１６０】
別法では、発明者らは、AmnioGraftTMとして凍結保存された膜を分配直前に可撓性支持体に固定し、これにより長期凍結保存に関連し得る問題を回避できる。
【０１６１】
目的３：ウサギ眼表面適用時の包帯コンタクトレンズの安全性を検査すること
1)理論的根拠：
目的１および２の完了後、角膜表面および眼球表面両用途用の満足な包帯コンタクトレンズを得た発明者らは次いで、そのような包帯コンタクトレンズがウサギの眼表面で安全に使用可能であるかどうかを検査する。目的３は目的１の完了後、目的２と平行して開始できる。
【０１６２】
2)設計：
このプロトコルはトータルで25匹のNZWウサギ眼(10％損耗率を見込んで27匹のウサギが必要である)で実行し、製造済み本発明の包帯コンタクトレンズの安全性を試験する。発明者らは、ウサギ角膜表面および眼球表面用途に適合するように製造された包帯コンタクトレンズを使用する。サイズ、湾曲、および輪郭に関する包帯コンタクトレンズの設計は、ウサギ眼のサイズが加齢とともに増加するという知見に基づく。ウサギは体重2-3 kgであり、両性別である。ウサギ包帯コンタクトレンズをウサギ眼表面に挿入後(他方の眼はコントロールとして使用)、各ウサギ眼を３週間、毎日二回の手動光検査、毎週の細隙灯検査によって検査し、レンズ装着に対する任意の有害反応が生じているかどうかを調べる。詳細には、発明者らは細隙灯下、眼球表面、瞼および皮膚を含む外部付属器の組織膨潤、発赤、粘膜発達に関して炎症を調査する。さらに研究の最後に、角膜上皮完全性をフルオレセイン染色によってモニターし、必要であれば組織学的にモニターする。
【０１６３】
さらに、発明者らは挿入包帯コンタクトレンズの完全性を記録する。詳細には、発明者らは膜の完全性(脱離または溶解しているかどうか)、固形支持体に対する膜固定の安定性、眼表面の包帯コンタクトレンズの位置を調査する。また包帯コンタクトレンズの安全な装着期間を決定する。包帯コンタクトレンズ、宿主組織、または両者の組み合わせに関する任意の適合問題が存在する場合には、レンズ装着の終点が存在する。分散分析、その後のポストホック（post-hoc）最小有意差試験による統計学を実行し、結膜注入(conjunctiva injection)(等級0-4)、角膜上皮損傷(フルオレセイン染色)(等級0-4)、パンヌス（pannus）(等級0-4)、および前房細胞発赤(等級0-4)、標準等級：0=なし、1=低度、2=軽度、3=強度、4=重度を使用、に関する群間の統計学的差異を評価する。
【０１６４】
3)見込まれる結果および解釈：
発明者らは、ウサギ眼はウサギ包帯コンタクトレンズを首尾良く装着し、合併症をまったく伴わず、膜の完全性は少なくとも１週間、好ましくは３週間まで持続するであろうと考えるが、これは従来の縫合AmnioGraftsTMを使用してヒト眼球表面疾患を処置するのに十分であることが見出されている期間である。発明者らはこの期間中に、包帯コンタクトレンズ(角膜表面および眼球表面の両用途に関して)、またはウサギ眼球表面組織および付属器の完全性にいかなる適合問題も生じないと考える。
【０１６５】
4)潜在的な問題および解決策：
ウサギ眼はヒトの眼と異なり、低いまばたき速度を有し、鼻球(nasal bulbar)結膜内に追加の瞬膜を有する。前者のせいで眼表面の露出時間が長くなり、ウサギ眼表面の膜が乾燥する可能性がある。発明者らは、露出問題を患うヒト患者において、AmnioGraftsTMの早期、すなわち１週間より短期の溶解を観察した。ウサギのこのような露出問題が望ましくない試験環境を実際に生じる場合、発明者らはまず、包帯コンタクトレンズ挿入前後のウサギのまばたき速度を測定することによってこの問題を検証する。確認後、小縫合性の瞼板縫合、すなわち縫合による上部および下部眼瞼の閉鎖を行ってこの問題に対処し、これが膜の望ましくない時期尚早の膜溶解を減少させるかどうかを調べる。
【０１６６】
ウサギ眼には瞬膜が存在するせいで、包帯コンタクトレンズ、特に、径が小さい角膜表面用途のものに対して力学的摩擦が生じる可能性がある。ヒトの眼には存在しないこの瞬膜によって生じる力学的摩擦および移動は、包帯コンタクトレンズを装着不可能にする可能性がある。その場合、発明者らは包帯コンタクトレンズの挿入前に瞬膜を切除する。
【０１６７】
ヒト羊膜は、特に縫合を伴うウサギ異種移植において移植片として結膜表面へ移植された２週間後に、リンパ球媒介性の炎症反応を誘発する可能性があることが報告されている(31;32)。これが問題になった場合、発明者らは残留膜を組織学的に検査してこれを検証し、包帯コンタクトレンズをウサギでの長期間の装着に関して試験する場合には、ウサギ羊膜の使用に切り替える。
.  主要な方法
1.羊膜の調製：
研究使用のためのヒト羊膜は、IRBプロトコル(# 01/554A、マイアミ大学医学部研究におけるヒト被験者保護のための医学小委員会(the Medical Science Subcommittee for the Protection of Human Subjects in Research of the University of Miami School of Medicine)承認、2002年2月1日)にしたがって獲得し、権利化済みの手法(U.S.P.N. 6,152,142参照、この教示内容は引用により本明細書中に包含される) にしたがって調製するが、この手法は上記の権利化済みの方法を使用するBio-Tissueが確立したものである。Bio-Tissueはドナー情報の守秘義務を守り、この権利申請に関与する人員を一切開示せず、この研究から作成されるいかなる報告においても使用しない。
【０１６８】
目的３の潜在的な問題において上述するように、ウサギ羊膜を使用して試験する必要がある場合、この羊膜はIACUCが承認するプロトコル(UM ACUC#00-127renewal03)に基づいて作成し、ヒト羊膜について記載の様式と同一の様式で調製する。ヒトおよびウサギ羊膜の両者は、Bio-Tissue, Inc.の研究施設でこの申請用に処理し調製する。
【０１６９】
2.羊膜表面での輪部外植体培養：
この方法は必要に応じて羊膜の生理学的作用を試験するために使用する方法であり、発明者らの以前の刊行物に報告済みである(33-35)。簡単には、従来の角膜移植用のトレフィンでの手術後に各ドナー角膜を角鞏膜残留物から輪部外植体を取得する。輪部内0.5 mmおよび輪部を超えて0.5 mmを含む1-2 mm3の外植体を調製し、培養皿に置き、Dispase II (Mg2+およびCa2+を含まないハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中1.2 U/ml)中、加湿5% CO2下、37℃で15〜30分インキュベートし、10% FBS含有DMEMですすぐ。追加の凍結保存工程を伴うか、または伴わない羊膜を固定した固形支持体を基質として使用し、基底膜表面を上向きにして輪部外植体を培養し、外植体を一滴のFBSとともに一晩膜の中央に配置し、適度に接着させた後、等容量のHEPES緩衝化DMEM、炭酸水素塩およびハムF12を含有し、以下を補充する：0.5%ジメチルスルホキシド、2 ng/mlマウスEGF、5 mg/mlインシュリン、5 mg/mlトランスフェリン、5 ng/mlセレン、0.5 mg/mlヒドロコルチゾン、30 ng/mlコレラ毒素Ａサブユニット、5% FBS、50 mg/mlゲンタマイシン、1.25 mg/mlアンホテリシンＢ(包括的に、SHEM培地と称される)からなる培地中で培養する。この培養物を5% CO2および95%空気下37℃でインキュベートし、培地を2-3日毎に変える。
【０１７０】
ヒト輪部組織はFlorida Lion's Eye Bankから得るが、これは屍体ドナー由来であり、その身元は特定できない。ヒト保存羊膜はIRB承認プロトコル(# 01/554A)にしたがって獲得し、Bio-Tissueが処理するが、生体ドナーの身元は特定できない。
【０１７１】
脊椎動物
この動物プロトコルはマイアミ大学で承認済みである(No. 02-142、2002年7月11日)。使用される主要な動物はウサギである。この動物は、そのサイズおよびレンズ挿入操作が容易であることから選択する。広範なMedline、Agricola、Altweb検索により以下キーワードに適合する参考文献を示した：羊膜、コンタクトレンズ、眼球表面、動物。しかしこれらは発明者らの論題に関連しない。したがってウサギは、目的３に記載される包帯コンタクトレンズの前臨床安全性  試験において使用するのに最良の動物である。
トータル25匹のニュージーランド白色ウサギ(および損耗を見込んで追加2匹のウサギを使用)、両性別、体重2-3 Kgを用いる。これらをフィルタカバーケージ内、温度、湿度、光(12時間光サイクル；午前7.00点灯)制御条件下で飼育し、標準固形試料および水を自由に与える。
【０１７２】
各1匹のウサギを使用して、包帯コンタクトレンズ、すなわち角膜表面および眼球表面用途それぞれについて各２つのタイプの設計に関し、レンズ装着が瞬膜の存在によって妨害されるかどうかを試験する。したがってトータル4匹のウサギが必要である。1匹のウサギをコントロールとして使用し、これはレンズ装着に関して試験しない。さらに20匹のウサギを各5匹の４群に細分し、角膜表面および眼球表面用途それぞれについて２つの異なる設計の包帯コンタクトレンズを試験する。これは安全性実験であり、これら４つの異なった群間を比較するために使用するものではない。
【０１７３】
包帯コンタクトレンズの挿入は、ヒト患者のコンタクトレンズの挿入と同一の様式にしたがう。この挿入は一滴の0.5%プロパラカイン(ヒト眼用局部麻酔薬)局所適用後に行う。平常の毎日の検査は手動光または細隙灯によって麻酔せずに行う。しかしながら、レンズ装着条件の知見を得るために詳細な細隙灯検査が必要であると判断されれば、各ウサギは35 mg/kgケタミン、5 mg/kgキシラジン、0.75 mg/kgアセプロマジンの筋肉内注射を受ける。
【０１７４】
包帯コンタクトレンズの装着に対する有害反応が存在し、安楽死が妥当である場合、過量ペントバルビタールの静脈内注射によりこれを実行するが、これは承認プロトコル、ACUC##02-142下の、米国獣医師会の安楽死委員会(Panel on Euthanasia of the American Veterinary Medical Association)の推奨に合致する方法である。発明者らは引き続き、1986年9月改訂の実験動物の人道的保護および使用に関するPHS政策(the PHS policy on Humane Care and Use of  Laboratory Animals)にしたがう。
以下の文献は医者および臨床研究者にとって有用な背景知識であり得るものである。
【０１７５】
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同等物
本発明をその好ましい実施形態を参照して具体的に示し、説明してきたが、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の形式および詳細について種々の変化を施すことができることが当業者には理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１Ａは、放射状弾性バンド(24)を摩擦によってかみ合わせるための装置(30)の部分的な断面立面図であり、この図は以下を示す：装置(30)および円錐形エキスパンダ(20)の先端部上に配置されたバンド(24)、およびバンド(24)を受けるための周辺部環状溝を有するリングと接触したエキスパンダ(20)の底部。図１Ｂ-１Ｄは、バンド(24)をエキスパンダ(20)の先端部からエキスパンダ(20)の底部への方向へ、そしてリング上の周辺部環状溝内へ押し進める装置(30)の使用を描写する。
【図２】図２は、円錐エキスパンダ(20)の部分的な断面立面図である。
【図３】図３Ａは、バンド(24)をエキスパンダの外側表面にわたって押し進めるために使用される装置(30)の部分的な断面立面図である。図３Ｂは、装置(30)の横断面図である。
【図４】図４Ａは、Ｏリング(24)の立面図を描写する。図４Ｂは、周辺部環状溝(23)を有するリング(22)の立面図である。図４Ｃは、羊膜(35)で覆われたリング(22)を描写する。図４Ｄは、リング(22)をカバーする膜(35)を含む培養挿入物を描写し、ここにこの膜は、リング(22)の内側環状溝に挿入されたＯリング(24)によって固定され、この培養挿入物は培養皿内に置かれている。
【図５】図５Ａは、Ｏリング(25)を描写する。図５Ｂおよび５Ｃは、膜(35)で包まれたＯリング(25)を描写する。図５Ｄは、リング(22)の内側環状溝(21)に挿入されている包まれたＯリング(25)を描写し、挿入物を形成させ、この挿入物は培養皿内に置かれている。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、２つのかみ合いリングの断面の遠近図である。図６Ｃは、互いに固定されてかみ合っている図６Ａおよび６Ｂのリングの遠近図である。図６Ｄは、リングの間に固定された膜（３５）を有する図６Ａおよび６Ｂのリングの部分的な断面遠近図である。図６Ｅは、図６Ｄの断面の拡大図であり、膜(35)をよく示す。図６Ｆは、図６Ａと６Ｂのリングとの間に固定された膜(35)の平面図である。図６Ｇは、２つのかみ合いリングの部分的な断面立面図であり、内側リング(37)はその外側周辺部表面上にいがを有する。図６Ｈは、自身の外側エッジ表面にいがを有する内側リング(37)の断面図である。
【図７】図７Ａは、図７Ｃに示される第二リング(39)上のファスナーポストを覆って適合する穴(42)を自身の表面に含むかみ合いリング(41)の遠近図である。図７Ｂは、自身の上に覆われた膜(35)を有するリング(41)の遠近図である。図７Ｃは、自身の上に間隔をとって配置されたファスナーポスト(40)を含むかみ合いリング(39)の透視図である。
【図８】図８Ａは、カットスリット(45)を有するリング(46)に接して配置された膜(35)を描写し、この膜(35)はリング(46)の周辺部表面上のスリット(45)内へ押し込まれている。図８Ｂは、スリット(45)内へ押し込まれ、あるいは挿入されたゆるく接着した膜（３５）を有するリング(46)を描写し、このリング(46)はピンセットによって型(44)から持ち上げられている。図８Ｃは、スリット(45)内へ押し込まれ、あるいは挿入されたゆるく接着した膜（35）を有するリング(46)を描写する。図８Ｄは、ゆるく接着した膜(35)を有するリング(46)を描写し、このリング(46)は羊膜中でリングを包むために回転している。図８Ｅは、膜(35)で包まれたリング(46)を描写する。
【図９】図９Ａは、自身の上面にカットスリット(50)を有するリング(48)の遠近図である。図９Ｂは、リング(48)の部分の横断面図であり、スリット(50)内の膜(35)を示す。図９Ｃは、リング(48)の部分の断面図である。図９Ｄは、リング(48)の平面図であり、リング(48)の部分をカバーする膜(35)を示し、この膜(35)のエッジはスリット(50)内へ挿入されている。
【図１０】図１０Ａは、外側かみ合いリングの部分断面図である。図１０Ｂは、グリップエッジ(56)を有する内側かみ合いリングの部分断面図である。図１０Ｃは、固定されてかみ合った図１０Ａ-１０Ｂのかみ合いリングの部分断面図である。図１０Ｄは、図１０Aおよび１０Bのかみ合いリングの間に固定された膜（35）を有する組織表面用生体高分子カバーの平面図であり、カバーの上面でどのように配置可能であるかを示す。
【図１１】図１１Ａは、表面に加えられている接着剤（８４）を有する支持体（72）の透視図である。図１１Ｂは、支持体(72)を覆って配置された膜(35)と接触している接着剤(84)を有する支持体(72)の透視図である。図１１Ｃは、組織表面用羊膜カバー(78)を形成する支持体(72)を覆って包む膜(35)の透視図である。
【図１２】図１２Ａは、膜(35)と接触して配置された支持体(72)の透視図であり、この膜に接着剤(84)が加えてある。図１２Ｂは、支持体(72)を覆って包み、組織表面用羊膜カバーを形成した膜(35)の透視図である。
【図１３】図１３は、一支持体を覆って折りたたまれ、組織表面用二重層羊膜カバー(90)を形成した２片の膜(35)の断面図である。
【図１４】図１４Ａは、羊膜(35)の間質側(94)の中央部分と接触した支持体(96)の透視図である。図１４Ｂは、組織表面用羊膜カバー(100)の遠近図であり、膜(35)が支持体(96)を覆って折りたたまれ、膜(35)の間質側(94)の部分が間質側(94)の別の部分と接着し、これにより支持体を適所で保持することを示す。図１４Ｃは、カバー(100)の透視図であり、可撓性Ｏリング(102)がカバーされた支持体の下に挿入されている。図１４Ｄは、支持体(96)を覆って配置された羊膜(35)の遠近図である。
【図１５】図１５Ａは、支持体のまわりを包む羊膜(35)の遠近図である。図１５Ｂは、図１５Ａに示される包まれた支持体の遠近図である。図１５Ｃは、図１５Ｂの組織表面用羊膜カバーの支持体の内側に挿入された可撓性Ｏリング(102)の遠近図である。図１５Ｄは、組織表面用カバーの透視図であり、支持体の内側にすえられたＯリング(102)を示す。
【図１６】図１６Ａは、組織表面用羊膜カバーの透視図であり、溝のあるリング支持体(96)上に縫合糸(106)で固定された膜(35)を示す。図１６Ｂは、組織表面用羊膜カバーの透視図であり、溝のあるリング支持体(96)上に締め付けリング(112)および縫合糸(106)で固定された膜(35)を描写する。
【図１７】図１７Ａは、スリット(117)の輪郭を示す表面を有する中空支持体リング(114)の部分断面図である。図１７Ｂは、リング(114)の遠近図であり、これは膜(35)でゆるくカバーされ、スリット(117)内へ押し込まれた膜（35）の部分を有している。図１７Ｃは、クリップの透視図である。図１７Ｄは、培養挿入物の遠近図であり、リング支持体(114)表面にクリップ(118)で固定された膜(35)を示す。図１７Ｅは、膜(35)でカバーされたリング(114)の部分断面図であり、この膜はリング(114)にびょう(120)で固定されている。
【図１８】図１８Ａは、凍結乾燥膜(128)用の密封パッケージの透視図であり、このパッケージは区画(126)内に再水和溶液を、区画(124)内に膜(128)を有す。図１８Ｂは、開封され、再水和溶液中に配置された膜128を有する図１８Ａのパッケージの透視図である。
【図１９】図１９Ａは、眼球表面を覆って適合するように成形された支持体(134)の透視図であり、この支持体は、支持体(134)の外側周辺部表面の部分と接触した前記接着組成物(84)、支持体(134)の内側表面を覆って配置された膜(35)を有し、この膜(35)は、折り返されて支持体(134)の外側周辺部表面を覆い、これにより膜(35)が接着剤(84)と接触し、接着剤(84)により適所で保持されるように配置されている。図１９Ｂは、図１９Ａに示される眼球表面用カバーの立面図である。
【図２０】図２０Ａは、眼球表面用羊膜カバーのための支持体の別の実施形態の平面図であり、この支持体は傾斜した内側環状溝(140)、表面(134)、その周辺部表面の丸い外側エッジ(135)を有する。図２０Ｂは、図２０Ａに示される支持体のプロファイルを描写する部分断面の側面立面図であり、この支持体は傾斜した内側環状表面(134)を有し、この表面は図２１Ａおよび２１Ｂの環状溝(150)と固定されてかみ合う。
【図２１】図２１Ａは、眼球表面用羊膜カバーのための支持体の平面図であり、この支持体は、傾斜した凹形の内側表面(146)；丸い環状エッジ(148)；環状溝(150)を有し、この溝は図２０Ａおよび２０Ｂの傾斜した内側環状表面(134)と固定されてかみ合う。図２１Ｂは、図２１Ａに示される眼球表面をカバーする羊膜用支持体のプロファイル(148)を描写する部分断面の側面立面図であり、内側最底部の垂直壁中に環状溝(150)を包含する。
【符号の説明】
【０１７７】
２０：円錐形エキスパンダ、２１：内側環状溝、２２：支持体リング、２３：周辺部環状溝、２４：放射状弾性バンド、２５：Ｏリング、２６：肩部、２７：先端部、２８：底部、２９：ロッド受けスペース、３０：バンドをエキスパンダの先端部からエキスパンダの底部への方向へ、更にリング上の周辺部環状溝内へ押し進める装置、３１：長軸方向カットスリット、３２：ロッド、３３：遠位端部分、３４：套管、３５：膜、３７：内側リング、３８：いが、３９：第一かみ合いリング、４０：割れ目、ファスナーポスト、４１：第二かみ合いリング、４２：ファスナーポスト孔、４３：外側リング、４４：型、４５：カットスリット、４６：リング、４８：リング、５０：カットスリット、５４：かみ合いリングの内側リング、５６：外側環状エッジ、５８：かみ合いリングの外側リング、６０：内側環状エッジ、７２：支持体リング、７８：組織表面用羊膜カバー、８０：リング、８４：接着組成物、８６：第二羊膜、９０：組織表面用二重層羊膜カバー、９２：ポケット、９４：間質側、９６：支持体、９８：非間質側、１００：組織表面用羊膜カバー、１０２：第二支持体、１０６：縫合糸、１０８：結び目、１１０：支持体リング、１１２：締め付けリング、１１４：支持体リング、１１７：スリット、１１６：膜、１１８：クリップ、１２０：鋲、１２４：区画、１２６：区画、１２８：包帯コンタクトレンズ、１３４：眼球表面を覆って適合するように成形された支持体、傾斜した内側環状表面、１３５：丸い外側エッジ、１４０：傾斜した内側環状溝、１４６：傾斜した凹形の内側表面、１４８：丸い環状エッジ、１５０：環状溝
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2005519694.tif 000026
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
2005519694.tif 000041
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
2005519694.tif 000044
【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2005519694.tif 000052
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
2005519694.tif 000054
【図１６Ａ】
2005519694.tif 000055
【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2005519694.tif 000057
【図１７Ｂ】
2005519694.tif 000058
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2005519694.tif 000060
【図１７Ｅ】
2005519694.tif 000061
【図１８Ａ】
2005519694.tif 000062
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
2005519694.tif 000064
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
2005519694.tif 000066
【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
2005519694.tif 000068
【図２１Ｂ】
2005519694.tif 000069
【国際調査報告】
2005519694.tif 000070