(57)【要約】シアリル化されたオリゴサッカリドを調製するインビトロ／無細胞プロセスを記載する。シアリル化オリゴサッカリドは、ガングリオシドを含む。オリゴサッカリドは、スフィンゴイドおよびセラミドを含む種々の部分に結合した。スフィンゴリド基を含む新規の化合物を開示する。この化合物は、ガングリオシドならびに種々のスフィンゴイドおよびセラミドを含むシアリル化されたオリゴサッカリドを含む。本発明は、選択されたグリコシル化パターンを有する種を調製する方法を提供する。本発明は、広く、酵素的に媒介される無細胞系の、インビトロでの基質のグリコシル化に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2005500058.tif 000018
を有する化合物を調製するためのインビトロ無細胞酵素学的方法であって、
ここでＸ１は、置換または非置換アルキル、検出可能な標識および標的化部分から選択されるメンバーであって；
Ｘは、
【化２】
2005500058.tif 000019
から選択されるメンバーであって：
ここで、ｍは０〜２０の整数であって；
Ｑは、
【化３】
2005500058.tif 000020
から選択されるメンバーであって：
ｎ、ｏおよびｓは、０〜２０から独立して選択される整数であって；
該方法は、以下：
（ａ）トランス−シアリダーゼに対して適切な条件下で、該トランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナー（構造：
【化４】
2005500058.tif 000021
を有する基質）と接触させ、該ドナーから該基質へとＳｉａ部分を移動させ、それによって該化合物を形成する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２】
（ｂ）：工程（ａ）で形成された前記化合物を、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡＣドナーと接触させ、該ドナーから工程（ａ）で形成された該化合物へとＧａｌＮＡｃ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｃ）：工程（ｂ）で形成された前記化合物を、Ｇａｌ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｇａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｂ）で形成された該化合物へとＧａｌ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｄ）：工程（ｃ）で形成された前記化合物を、トランス−シアリダーゼに対して適切な条件下で、該トランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｃ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｅ）：工程（ｄ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｄ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ｄ）：工程（ｃ）で形成された前記化合物を、Ｆｕｃ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｆｕｃ−トランスフェラーゼおよびＦｕｃドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｃ）で形成された該化合物へとＦｕｃ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項３に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）：工程（ａ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ａ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｃ）：工程（ｂ）で形成された前記化合物を、ＧａｌＮａｃ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該ＧａｌＮａｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮａｃドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｂ）で形成された該化合物へとＧａｌＮＡｃ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）：工程（ｃ）で形成された前記化合物を、Ｇａｌ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｇａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｃ）で形成された該化合物へとＧａｌ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｅ）：工程（ｄ）で形成された前記化合物を、トランス−シアリダーゼに対して適切な条件下で、該トランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｄ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｆ）：工程（ｅ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｅ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）：工程（ｂ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｂ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）：工程（ｃ）で形成された前記化合物を、ＧａｌＮａｃ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該ＧａｌＮａｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｃ）で形成された該化合物へとＧａｌＮａｃ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｅ）：工程（ｄ）で形成された化合物を、Ｇａｌ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｇａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌ−ドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｄ）で形成された該化合物へとＧａｌ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｆ）：工程（ｅ）で形成された前記化合物を、トランス−シアリダーゼに対して適切な条件下で、該トランス−シアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｅ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｇ）：工程（ａ）の前に、式：Ｑ−Ｇｌｃ−Ｘ１
を有する基質を、Ｇａｌ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｇａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させ、該ドナーから該基質へとＧａｌ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
（ｇ）：工程（ａ）の前に、式：Ｑ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｘ１
を有する基質を、ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させ、該ドナーから該基質へとＧａｌＮＡｃ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｈ）：工程（ｇ）で形成された前記化合物を、Ｇａｌ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｇａｌ−トランスフェラーゼおよびＧａｌ−ドナーと接触させ、該ドナーから工程（ｇ）で形成された該化合物へとＧａｌ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）：工程（ａ）の後に、工程（ａ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ａ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｊ）：工程（ｉ）を選択された回数繰り返し、それによって前記化合物上でポリ（シアル酸）置換基を形成する工程、
をさらに包含する、
請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
（ｋ）：工程（ａ）で形成された前記化合物を、Ｓｉａ−トランスフェラーゼに対して適切な条件下で、該Ｓｉａ−トランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させ、該ドナーから工程（ａ）で形成された該化合物へとＳｉａ部分を移動させる工程、
をさらに包含する、
請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ｌ）：工程（ｋ）を選択された回数繰り返し、それによって前記化合物上でポリ（シアル酸）置換基を形成する工程、
をさらに包含する、
請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、ここでＸ１は、
【化５】
2005500058.tif 000022
であり、
ここで、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ５から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＯＲ４、ＯＣＯＲ４、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ４、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ４、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４、検出可能な標識および標的化部分から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、検出可能な標識および標的化部分から独立して選択されるメンバーであり；そしてＲ３は、置換または非置換のアルキルおよび置換または非置換のヘテロアルキル基である、
方法。
【請求項２４】
Ｒ１がＮＨ２、ＯＨおよびＳＨから選択されるメンバーである、請求項２３に記載の方法であって、該方法はＲ１をアシル化する工程をさらに包含する、
方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、ここでＸ１は
【化６】
2005500058.tif 000023
であり、
ここで、Ｒ６は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ７、検出可能な標識および標的化部分から選択されるメンバーであり、
ここでＲ７は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、検出可能な標識および標的化部分から選択されるメンバーである、
方法。
【請求項２６】
前記化合物が、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、Ｆｕｃ−ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１α、ＧＴ１β、ＧＱ１Ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、グロボシドおよびポリシアリル化ラクトースから選択されるメンバーである、
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
式：
【化７】
2005500058.tif 000024
を有する化合物であって、
ここで、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ５から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＯＲ４、ＯＣＯＲ４、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ４、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ４、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４、検出可能な標識および標的化部分から独立して選択されるメンバーであり、
ここで
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、検出可能な標識および標的化部分から独立して選択されるメンバーであり；
Ｓａｃは、単糖およびオリゴサッカリドから選択されるメンバーであり；そして
Ｒ３は、少なくとも２の不飽和度を有する、置換または非置換のアルキル基および置換または非置換のヘテロアルキル基である、
化合物。
【請求項２８】
Ｒ３が２つの二重結合を有する非置換アルキルであり、そしてＳａｃがグルコシル以外である、
請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ３が少なくとも１つの３重結合を含む、
請求項２７に記載の化合物。
【請求項３０】
前記化合物がｄ１８：２およびｄ１８：１：１から選択されるメンバーである、
請求項２７に記載の化合物。
【請求項３１】
薬学的に受容可能な賦形剤を含む混合物中に請求項２７に記載の化合物を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個以上のシアル基を含むオリゴサッカリドを調製するための方法の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、セラミドに連結する炭水化物部分を含む構造を有するグリコスフィンゴリピドの１つのクラスである。この炭化水素部分は、少なくとも１つのモノサッカリドおよびシアル酸部分を含む。このシアル酸部分は、１以上のシアル酸基（Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮ−グリコールノイラミン酸）から構成される。
【０００３】
ガングリオシドは、その糖部分内のモノサッカリドの数およびその構造中に存在するシアル酸基の数に従って分類される。ガングリオシドは、シアル酸残基の数に依存して、モノ−シアロガングリオシド、ジ−シアロガングリオシド、トリ−シアロガングリオシド、またはポリ−シアロガングリオシドとして知られている。これらの分子を識別するために使用される略記号としては、「ＧＭ１」、「ＧＤ３」、「ＧＴ１」などが挙げられ、この「Ｇ」は、ガングリオシドを意味し、そして、「Ｍ」、「Ｄ」、「Ｔ」などは、シアル酸残基の数をいい、そしてこの数字またはこの数字に文字を加えたもの（例えば、「ＧＴ１ａ」）は、この分子について観察されたＴＬＣアッセイにおける溶出の順序を示している。Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｇ．２９４〜２９６（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）；Ｗｉｅｇａｎｄｔ，Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄら：Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），１９９〜２６０頁を参照のこと。
【０００４】
例えば、国際記号ＧＭ１ａは、広範に研究されたより一般的なガングリオシドのうちの１つを示す。この記号における「Ｍ」は、このガングリオシドがモノシアロガングリオシドであり、そして「１」はＴＬＣ溶出プロファイルにおけるその位置を規定する。添え字の「ａ」、「ｂ」、または「ｃ」もまた、特定のガングリオシドのＴＬＣアッセイにおける位置を示す。この末端のサッカリドは、炭水化物部分の末端に位置しており、そしてセラミド部分に結合する末端の反対側にあるサッカリドである。
【０００５】
多くのグリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）は、グロコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）に由来し、これは、セラミドおよびＵＤＰ−グルコースから酵素的に形成される。ＧｌｃＣｅｒ形成に関与する酵素は、ＵＤＰグルコース：Ｎ−アシルスフィンゴシングルコシルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＣｅｒ合成酵素）である。生理条件下のＧＬｃＣｅｒ形成の速度は、ＵＤＰ−グルコースの組織レベルに依存し得、順次、特定の組織におけるグルコースのレベルに依存している（Ｚａｄｏｒ，Ｉ．Ｚ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：７９７〜８０３（１９９３））。内在性セラミドに基づくインビトロアッセイは、付加されたセラミドを含む混合物より低い合成速度を生じ、このことは、セラミドの組織レベルがまた、通常は速度限定的であることを示唆している（Ｂｒｅｎｋｅｒｔ，Ａ．らＢｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３６：１８３〜１９３（１９７２））。
【０００６】
ＧＳＬのレベルによって、種々の細胞機能（例えば、増殖、分化、細胞間接着または細胞−マトリクスタンパク質の間の接着、細胞に対する微生物およびウイルスの結合、ならびに腫瘍細胞の転移）が制御される。さらに、このＧｌｃＣｅｒ前駆体、セラミドは、細胞増殖の分化または阻害を引き起こし得（Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０７：２１１〜２１４（１９９２））、そして、ビタミンＤ３の機能化、腫瘍壊死因子α、インターロイキン、およびアポトーシス（プログラム化された細胞死）に関与する。これらのスフィンゴール（ｓｐｈｉｎｇｏｌ）（スフィンゴシン塩基）、セラミドの前駆体、およびセラミドの異化の産物はまた、プロテインキナーゼインヒビターＣ（ＰＫＣ）を阻害することによって多くの細胞に系に影響を与えることが示されている。
【０００７】
ガングリオシドは、神経系において機能的において機能的に重要であることが知られており、そして、ガングリオシドは末梢神経系の障害において治療において有用であることが主張されている。多くのガングリオシドおよびそれらの誘導体は、パーキンソン病（ガングリオシドＧＭ１は、現在、パーキンソン病の処置のために第ＩＩ期の臨床進行において使用されている（ＦＩＤＩＡ，イタリア））および大脳虚血性脳卒中（米国特許第４，９４０，６９４号；同第４，９３７，２３２号および同第４，７１６，２２３号）を含む広範な種々の神経系障害の治療において有用である。ガングリオシドは、食細胞の活性に影響を及ぼすため(米国特許第４，８３１，０２１号)、そして、胃腸疾患を生じる生物体（米国特許第４，７６２，８２２号）を処置するために使用され得る。これらのガングリオシドＧＭ２およびＧＤ２（これらは、動物の脳から精製される）は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化して、そして、アジュバントＱＳ２１と混合され、そして、第ＩＩ期および第ＩＩＩ期の試験における癌ワクチンの基礎としてこれらのガングリオシドに対する免疫応答を誘起するのに使用される（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）。ガングリオシドＧＭ３は、抗がん剤としての用途のために調べられている(ＷＯ  ９８／５２５７７;Ｎｏｌｅら，Ｅｘｐ.Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １６８:３００−９(２００１)））。グリコリピドはまた、炎症性腸疾患の処置において有益である。Ｔｕｂａｒｏら，Ｎａｕｎｙｘ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｇ’ｓ  Ａｒｃｈ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.３４８:６７０−６７８(１９９３）を参照のこと。
【０００８】
ガングリオシドは、組織（特に動物の脳）から精製されることによって一般的には単離される（ＧＬＹＣＯＬＩＰＩＤ  ＭＥＴＨＯＤＯＬＯＧＹ，Ｌｌｏｙｄ  Ａ.Ｗｉｔｔｉｎｇ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＩＩ.１８７−２１４(１９７６）;米国特許第５，８４４，１０４号;同第５，５３２，１４１号；Ｓｏｎｎｉｎｏら．，Ｊ.Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ.３３:１２２１−１２２６(１９９２）;Ｓｏｎｎｉｎｏら，Ｉｎｄ．Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５:１４４−１４９(１９８８）；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.Ｂｉｏｌ.１２５:５３３−４４(１９８０)）。ガングリオシドは、ウシバターミルクから単離される(Ｒｅｎら，Ｊ.Ｂｉｏ.Ｃｈｅｍ.２６７:１２６３２−１２６３８(１９９２）;Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ.Ｂｉｏ.Ｃｈｅｍ.２６１:５６２５−５６３０(１９８６)）。最適な条件下においてさえ、純粋な  ガングリオシド（例えば、ＧＭ２およびＧＭ３）の収量は、限りなく少ない。さらに、哺乳動物組織からの精製は、それとともに、夾雑物（例えば、ウイルス、プリオン粒子など）を伝達する危険性を保持する。したがって、ガングリオシド特異的抗体を確保するための代替的な方法が非常に望まれる。
【０００９】
ガングリオシドの重要性のために、高収量で純粋なガングリオシドを合成すウル方法を開発するのための努力が拡大している。ガングリオシドを化学合成する方法は、Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｊ.Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１(６）:６９９−７１４(１９９２)およびＳｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５６:Ｃ１−Ｃ５(１９８６）に記載されている。米国特許第４，９１８，１７０号は、ＧＭ３およびＧＭ４の合成を開示している。Ｓｃｈｍｉｄｔらは、ＧＭ３の化学合成を記載している(米国特許第５，９７７，３２９号）。これらの参考文献は、困難な保護−活性化−カップリング−脱保護のストラテジーを使用する多段階合成手順（一般的に抽出とカラムクロマトグラフィーを併用することによってこれらの各工程において中間体が精製される）を記載する。さらに、これらの合成方法のいずれも、ガングリオシドの大規模調製にとって適切ではない。
【００１０】
炭化水素の化学合成に関連する困難性の観点において、糖タンパク質の炭水化物部分を合成するための酵素の使用は、糖タンパク質を調製することに対する有望なアプローチである。酵素に基づく合成は、レジオ選択性および立体選択性の利点を有する。さらに、酵素的合成は、未保護の基質を使用して実施され得る。３つの主要なクラスの酵素が、炭水化物の合成において使用される（グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、グリコアミニダーゼ(例えば、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ)およびグリコシダーゼ）。このグリコシダーゼは、以下のようにさらに分類される：エキソグリコシダーゼ(例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、およびエンドグリコシダーゼ(例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）。酵素の３つのクラスの各々は、好適に使用され、炭水化物を調製する。一般的な概説のために、Ｃｒｏｕｔら，Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎ.Ｃｈｅｍ.Ｂｉｏｌ.２:９８−１１１(１９９８)およびＡｒｓｅｑｕｅｌｌ（前出）を参照のこと。
【００１１】
グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴサッカリドを調製するために使用され、そして、十分な立体選択的制御およびレジオ選択的制御を行って特定の生成物を精製するたのに非常に有効であることが示されている。例えば、βｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してラクトサミンを合成して、炭水化物の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの有用性を例示した(例えば、Ｗｏｎｇら，Ｊ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.４７:５４１６−５４１８(１９８２)を参照のこと）。さらに、多くの合成手順が、シアリルトラスフェラーゼを利用してシチジン−５’モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨへとシアル酸を転移させている(例えば、Ｋｅｖｉｎら，Ｃｈｅｍ.Ｅｕｒ.Ｊ.２:１３５９−１３６２(１９９６)を参照のこと）。治療用途について複合糖質（糖結合体）合成の最近の進歩の議論については、Ｋｏｅｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８:８３５−８４１(２０００）を参照のこと。
【００１２】
グリコシダーゼは、通常は、グリコシド結合の加水分解を触媒するが、適切な条件下では、グリコシダーゼはグリコシド結合を形成するために使用され得る。炭水化物合成に使用されるほとんどのグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼであり;グリコシルの転移はその基質の非還元末端で生じる。このグリコシダーゼは、グリコシル酵素（ｇｌｙｃｏｓｙｌｅｎｚｙｍｅ）中間体においてグリコシルドナーを取り上げ、これ水により切り取られて加水分解生成物を与えるかまたはアクセプターにより切り取られて新規のグリコシドまたはオリゴサッカリドを与える。
【００１３】
エキソグリコシドを使用する例示的な経路は、全てのＮ結合糖タンパク質のコアトリサッカリド（よく知られた困難なβ−マンノシダーゼ結合（これは、β−マンノシダーゼの作用によって形成された）を含む）の合成である(Ｓｉｎｇｈら，Ｃｈｅｍ.Ｃｏｍｍｕｎ.９９３−９９４(１９９６））。
【００１４】
これらの使用は、エキソグリコシダーゼの使用よりも一般的ではないが、エンドグリコシダーゼもまた、炭水化物の調製のために使用される。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、（モノサッカリドよりも）オリゴサッカリドが転移されるという利点を有している。オリゴサッカリドフラグメントを、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、ｅｎｄｏ−Ｆ，ｅｎｄｏ−Ｍ）を使用して基質に付加した(Ｗａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７:１９７５−１９７８）;およびＨａｎｅｄａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｒｅｓ.２９２:６１−７０(１９９６））。
【００１５】
化学的合成エレメントと酵素的合成エレメントの両方を合わせる方法もまた、知られている。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏおよび共同研究者ら(Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ.Ｒｅｓ.３０５:４１５−４２２(１９９８）)は、基質であるグリコシル化ペプチドＴをエンドグリコシダーゼを使用して化学酵素的に合成することを報告した。このＮ−アセチルグルコサミニルペプチドは、純粋な化学的手段によって合成された。その後、このペプチドは、ヒトトランスフェリン基質のオリゴサッカリドで酵素的に産生された。このサッカリド部分は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでこのペプチドを処理することによってこのペプチドに付加された。得られたグリコシル化ペプチドは、非常に安定であって、そしてペプチドＴおよびＮ−アセチルグルコサミニルペプチドＴと比較した場合のタンパク質分解に対して耐性があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記のような酵素的合成法の多くの利点にもかかわらず、いくつかの場合において、欠陥が依然として残っている。多くの市販されている重要な組換え的に産生され、またはトランスジェニック的産生された基質の生物学的活性は、特定のグリコフォームの存在、または特定のグリコフォームの非存在に依存するので、インビトロ手順において（特に、セラミド、スフィンゴシン、およびそれらのアナログのような基質における）グリコシル化パターンを酵素的に改変する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
酵素的合成プロトコルを使用して、ガングリオシドおよびガングリオシドアナログが注目すべき収量、高い純度およびすばらしい立体化学的特異性で容易に合成されることを、ここで、発見した。従って、グリコシル化した種を調製する改善された方法についての必要性に応答して、本発明は、グリコシル基と選択された基質との間の結合体の酵素媒介性形成のための方法を提供する。
【００１８】
第１の局面では、本発明は、以下の式Ｉに従う種をグリコシル化する方法を提供する：
（サッカリド）ｑ−Ｘ                                （Ｉ）。
【００１９】
この方法は、適切なドナーの存在下で、（サッカリド）ｓ−Ｘを、トランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触して、（サッカリド）ｓ＋１−Ｘを得る工程を包含する。第１の反応の生成物を、必要に応じて、適切なドナーの存在下で、トランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触して、（サッカリド）ｓ＋２−Ｘを得る。第２の生成物を、必要に応じて、適切なドナーの存在下で、トランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触して、（サッカリド）ｓ＋３−Ｘを得る。所望のサッカリド構造が構築されるまで、このプロセスを続ける。上に提供される構造において、ｓは、０〜３０の整数である。記号ｑは、２〜約３０の整数を表す。本発明のプロセスは、トランスシアリダーゼにより媒介される少なくとも１つのシアリル化、および１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの作用により媒介される２つのグリコシル化を含むことが一般的に好ましい。この方法はまた、好ましくは、反応混合物への細胞成分の非存在下で実施され、そして好ましくは、全体がインビトロで行われる。
【００２０】
別の局面では、本発明は、セラミド、スフィンゴシン、およびそれらのアナログをグリコシル化するための方法を提供する。
【００２１】
なおさらなる局面では、本発明は、スフィンゴシン骨格のアルキル鎖が２以上の程度の不飽和を含む、セラミドおよびスフィンゴシンの誘導体を提供する。本発明のセラミドおよびスフィンゴシンの誘導体を含む薬学的組成物もまた提供される。
【００２２】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００２３】
（発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（略語）
サッカリド部分の略語は、サッカリドの置換アナログおよび非置換アナログの両方をいう。従って、アラビノシル；Ｆｒｕ、フラクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトシル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコシル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノシルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；ならびにＳｉａおよびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。これらの略語は、非修飾サッカリル部分、およびその置換アナログまたは他のアナログの両方を含むことを意図する。
【００２４】
（定義）
他で定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、一般的に、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書中で用いられる命名法および分子生物学、有機化学、および核酸化学における実験手順、ならびに以下に記載されるハイブリダイゼーションは、当該分野で周知かつ一般的に用いられるものである。標準的な技術は、核酸合成およびペプチド合成のために用いられる。一般的に、酵素反応および精製工程は、製造業者の指示書に従って実施される。これらの技術および手順は、一般的に、当該分野で慣習的な方法、および本明細書を通じて提供される、種々の一般的参考文献（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）に従って行われる。本明細書中で用いられる命名法、ならびに以下に記載される分析化学および有機化学の実験手順は、当該分野で公知かつ用いられているものである。標準的な技術、またはその改変が、化学合成および化学分析について用いられる。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、「分析物」は、診断試験が行われる、目的の任意の化合物または分子（例えば、生体高分子または低分子生理活性物質）を意味する。分析物は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、ポリサッカリド、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態アナログ、補因子、インヒビター、薬物、色素、栄養素、成長因子などであり得るが、これらに制限されない。
【００２６】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合を介して互いに連結されるポリマーをいう（あるいは、ポリペプチドといわれる）。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体が用いられ得る。さらに、非天然のアミノ酸（例えば、β−アラニン）、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸もまた、本発明に用いられる。さらに、反応性基を含むように改変されたアミノ酸もまた、本発明において用いられ得る。本発明に用いられるアミノ酸の全ては、Ｄ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が、一般的に好ましい。さらに、他のペプチド模倣物もまた、本発明において有用である。一般的な総説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ２６７（１９８３）を参照のこと。
【００２７】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、および後で修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しされるα−炭素）が同じである化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と基本的な化学構造が同じなままである。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する、化学化合物をいう。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、またはより高度に凝集したハイブリダイゼーションモチーフ、およびその任意の化学修飾物を意味する。修飾としては、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対して、さらなる電荷、分極率、水素結合、静電的相互作用、および流動性を組み込む化学基を提供するものが挙げられるが、これらに限定されない。このような修飾としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド核酸、ホスホジエステル基修飾（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート）、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−ウラシルまたは５−ヨード−ウラシルの修飾；骨格修飾、メチル化、異常な塩基対の組み合わせ（例えば、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニンなど）。修飾としてはまた、３’修飾および５’修飾（例えば、ＰＬ、フルオロフォア、または別の部分でのキャッピング）が挙げられる。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、「反応性官能基」は、以下を含むが、これらに限定されない基をいう：オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、オキシド、塩化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、スルフェート、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン（ｙｎａｍｉｎｅ）、尿素、プソイドウレア、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物。反応性官能基としてはまた、生物結合体（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドなど）を調製するために用いられるものが挙げられる。これらの官能基の各々を調製するための方法は、当該分野で周知であり、そして特定の目的に対するそれらの適用または改変は、当業者の能力の範囲内である（例えば、ＳａｎｄｌｅｒおよびＫａｒｏ編、ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＲＯＵＰ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照のこと）。
【００３０】
グリコシルトランスフェラーゼについての「アクセプター部分」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプターとして作用し得るオリゴサッカリド構造である。アクセプター部分が、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー部分、ならびに他の必要な反応混合物成分と接触され、そして反応混合物が、十分な時間の間インキュベートされる場合、グリコシルトランスフェラーゼは、糖ドナー部分から、アクセプター部分へと糖残基を移す。このアクセプター部分は、頻繁に、異なる型の特定のグリコシルトランスフェラーゼについて変化する。例えば、哺乳動物のガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対するアクセプター部分としては、オリゴサッカリドの非還元末端のＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒが挙げられ；このフコシルトランスフェラーゼは、フコース残基を、α１，２連結を介してＧａｌに結合する。末端のＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮａｃ−Ｒは、それぞれ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，４−フコシルトランスフェラーゼについてのアクセプター部分である。しかし、これらに酵素は、フコースを、アクセプターのＧｌｃＮＡｃ残基に結合する。従って、用語「アクセプター部分」は、特定の適用についての目的の特定のグリコシルトランスフェラーゼに関して用いられる。さらなるフコシルトランスフェラーゼおよび他のグリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプター部分は、本明細書中に記載される。
【００３１】
用語「シアル酸」は、９個の炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーをいう。リンカー、反応性官能基、検出可能な標識および標的化部分で誘導体化されたアナログもまた含まれる。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（頻繁に、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される））である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここで、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は、ヒドロキシル化される。第３のシアル酸ファミリーのメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））である。９置換シアル酸（例えば、９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様の９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、国際出願公開ＷＯ９２／１６６４０（１９９２年１０月１日公開）に開示される。
【００３２】
用語「組換え」は、細胞に関して用いられる場合、細胞が、異種核酸を複製するか、または異種核酸によりコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞の中で見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞において見出される遺伝子を含み得、ここで、遺伝子は、改変され、そして人工的手段により細胞へと再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を包含し；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異誘発、および関連する技術によりえられるものが挙げられる。「組換えポリペプチド」は、組換え細胞により産生されているものである。
【００３３】
用語「単離された」は、ある物質を生成するために用いられる成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。本発明の方法により生成される組成物について、用語「単離された」は、通常、組成物を調製するために用いられる混合物中にある物質を伴う成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。「単離された」および「純粋」は、交換可能に用いられる。代表的には、本発明の方法により生成される単離された化合物は、好ましくは、ある範囲で表される、純度のレベルを有する。ペプチド化合物についての純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、そして純度の範囲の上端は、約７０％、約９０％、または約９０％よりも高い。
【００３４】
本発明の方法により生成された化合物が、約９０％よりも高い純度である場合、これらの純度はまた、好ましくは、ある範囲で表される。純度の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
【００３５】
純度は、当該分野で認識された任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段におけるバンド強度）により決定される。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、「本質的に、集団の各メンバー」とは、前駆体基質に添加された選択したパーセンテージのグリコシルドナーが、基質の集団の個々のメンバーに対して同一のアクセプター部位に添加される、本発明の方法により生成される化合物の集団の特徴を記載する。「本質的に、集団の各メンバー」は、グリコシルドナーに結合体化される基質に対する部位の「均一性」をいい、そして本発明の化合物をいい、これらは、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、およびさらに好ましくは、少なくとも約９５％の均一性である。
【００３７】
「均一性」は、グリコシルドナーが結合体化される、アクセプター部分の集団にわたる構造的一貫性をいう。従って、グリコシル化反応の終りに、反応の間に移動された各グリコシルドナーが、同じ構造を有するアクセプター部位に結合体化される場合、この組成物は、約１００％の均一性であるといわれる。均一性は、代表的には、ある範囲で表される。ペプチド結合体についての均一性の範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、そして純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％よりも高い。
【００３８】
本発明の方法により調製される組成物が、約９０％よりも高いかまたは約９０％に等しい均一性であり、これらの均一性はまた、好ましくは、ある範囲で表される。均一性の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の均一性である。ペプチド結合体の純度は、代表的には、当業者に公知の１つ以上の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など）により決定される。
【００３９】
「実質的に、均一な糖形態」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、本発明の方法により調製された組成物を言及する場合、目的のトランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化されるアクセプター部分のパーセンテージをいう。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的に全て（以下に定義される）のＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化アナログが、本発明の方法により調製される組成物においてフコシル化される場合に、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。出発物質が、グリコシル化アクセプター部分（例えば、フコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含みうることが当業者に理解される。従って、計算されたパーセントのグリコシル化は、本発明の方法によりグリコシル化されるアクセプター部分、および出発物質中の既にグリコシル化されたアクセプター部分を含む。
【００４０】
「実質的に均一」の上記定義における「実質的に」は、一般的に、少なくとも約４０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはより好ましくは、少なくとも約９０％を意味し、そしてさらにより好ましくは、特定のグリコシルトランスフェラーゼについて、少なくとも約９５％以上のアクセプター部分がグリコシル化される。
【００４１】
オリゴサッカリドは、還元末端のサッカリドが、実際に、還元糖であるか否かに関わらず、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。受け入れられている命名法に従って、オリゴサッカリドは、左に非還元末端および右に還元末端を有して、本明細書中で示される。
【００４２】
本明細書中に記載される全てのオリゴサッカリドは、非還元サッカリド（すなわち、Ｇａｌ）についての名前または略語、次いで、グリコシド結合（αまたはβ）の立体配置、環結合（１または２）、この結合に関与する還元サッカリドの環の位置（２、３，４、６または８）、次いで、還元サッカリドの名前または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）を用いて記載される。各サッカリドは、好ましくは、ピラノースである。標準的な糖鎖生物学命名法の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、「連結メンバー」は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む共有化学結合をいう。例示的連結メンバーとしては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−などが挙げられる。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、用語「標的化部分」は、特定の組織または身体の領域に選択的に局在する種をいう。この局在は、分子決定基、標的化剤または標的化結合剤のサイズ、イオン相互作用、疎水性相互作用などの特異的認識により媒介される。特定の組織または領域に対して薬剤を標的化する他の機構は、当業者に公知である。例示的な標的化部分としては、以下が挙げられる：抗体、抗体フラグメント、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、サッカリド、レクチン、レセプター、レセプターに対するリガンド、ＢＳＡのようなタンパク質など。標的化基はまた、低分子であり得、意図される用語としては、非ペプチドおよびペプチドを含む。
【００４５】
記号
【００４６】
【化８】
2005500058.tif 000002
は、結合として利用されても、結合に対して垂直に表されても、表される部分は、分子の残りの部分、固体支持体などに結合される点を示す。
【００４７】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、および水和形態を含む、溶媒和形態で存在し得る。一般的に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であり、そして本発明の範囲内に包含される。本発明の特定の化合物は、複数の結晶形態または非結晶形態で存在し得る。一般的に、全ての物理的形態は、本発明により包含される用途に等価であり、そして本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４８】
本発明の特定の化合物は、非対称炭素原子（光学中心）または二重結合を有し；ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何異性体および個別の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
【００４９】
本発明の化合物は、単一の異性体（例えば、鏡像異性体、シス−トランス、位置、ジアステレオマー）または異性体の混合物として調製され得る。好ましい実施形態では、この化合物は、実質的に単一の異性体として調製される。実質的に異性的に純粋な化合物を調製する方法は、当該分野で公知である。例えば、鏡像異性的に多い混合物および純粋な鏡像異性体化合物は、キラル中心の立体化学を変更しないか、または完全な逆転を生じるかのいずれかの反応と組合わせて、鏡像異性的に純粋である合成中間体を用いて調製され得る。あるいは、合成経路に沿った最終生成物または中間体が、単一の立体異性体へと分解され得る。特定の立体中心を逆転するかまたは変更しないための技術、ならびに立体異性体の混合物を分解するための技術は、当該分野で周知であり、そして特定の状況について適切な方法を選択することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。一般的に、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編），ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．，Ｅｓｓｅｘ，１９９１，８０９−８１６頁；およびＨｅｌｌｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：１２８（１９９０）を参照のこと。
【００５０】
本発明の化合物はまた、そのような化合物を構成する１つ以上の原子について天然にない割合の同位体原子を有し得る。例えば、これらの化合物は、（例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）または炭素１４（１４Ｃ）のような）放射性同位体で放射標識され得る。本発明の化合物のすべての同位体の変化は、放射活性であるか否かに関らず、本発明の範囲に包含されることが意図される。
【００５１】
置換基が、これらの慣用的な、左から右に書かれた化学式により特定される場合、これらは、右から左にその構造を書くことで生じる、化学的に同一な置換基を等しく包含する（例えば、−ＣＨ２Ｏ−は、−ＯＣＨ２−もまた列挙することが意図される）。
【００５２】
用語「アルキル」とは、他のように示されない限り、それ自体または別の置換基の一部として、直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはそれらの組み合わせを意味し、これらは、完全な飽和でも、一不飽和でも、多価不飽和でもよく、そして二価ラジカルおよび多価ラジカルを含み得、指定された数の炭素原子を有する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１０とは、１個〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素ラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチルなどのホモログおよび異性体のような基が挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するアルキル基である。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−プロピニル、および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級のホモログおよび異性体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アルキル」とはまた、他のように示されない限り、以下により詳細に規定されるアルキルの誘導体（例えば、「へテロアルキル」および「アルキレン」）を含むことが意味される。炭化水素基に限定されたアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００５３】
用語「アルキレン」とは、それ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−により例示されるがこれに限定されないような、アルカンから誘導された二価ラジカルを意味し、以下に「ヘテロアルキレン」として記載される基をさらに含む。代表的には、アルキル基（またはアルキレン基）は、１個〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するこれらの基が、本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、短鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、一般的に８個以下の炭素原子を有する。
【００５４】
用語「アルコキシ」「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、これらの従来の意味において用いられ、それぞれ、酸素原子、アミノ基、またはイオウ原子を介して、それらの分子の残りに結合されたアルキル基をいう。
【００５５】
用語「ヘテロアルキル」とは、他のように示されない限り、それ自体または別の用語と組み合わせて、安定した直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素ラジカル、あるいはこれらの組み合わせであって、示された数の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群より選択される少なくとも１つのへテロ原子とからなるものを意味し、ここで、窒素原子およびイオウ原子は、必要に応じて酸化されていてもよく、そして窒素へテロ原子は、必要に応じて四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、およびＳならびにＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内側部分またはアルキル基がその分子の残りに結合されている位置に位置し得る。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３−，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２個までのヘテロ原子が、連続し得る（例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように）。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が例示されるが、これらに限定されない、ヘテロアルキルから誘導された二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、その鎖の末端のいずれかまたは両方を占め得る（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。なおさらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基について、その結合基の方向は、その結合基の式が書かれた方向により意味されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００５６】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」とは、他のように示されない限り、それら自体または他の用語と組み合わせて、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状のバージョンを表す。さらに、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環がこの分子の残りに結合されている位置を占め得る。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、他のように示されない限り、これら自体または別の置換基の一部として、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことが意味される。例えば、用語「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」としては、トリフルロロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されないことが意味される。
【００５８】
用語「アリール」とは、他のように示されない限り、多価不飽和の、芳香族炭化水素置換基を意味し、これは、単一の環または互いに縮合しているか共有結合している複数の環（好ましくは、１つ〜３つの環）であり得る。用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ、およびＳより選択される１個〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）をいい、ここで、窒素原子およびイオウ原子は、必要に応じて酸化されており、そして窒素原子は、必要に応じて四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して、この分子の残りに結合され得る。アリール基およびヘテロアリール基の非限定の例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記アリール環系およびヘテロアリール環系の各々についての置換基は、下記の受容可能な置換基の群より選択される。
【００５９】
簡潔にすると、用語「アリール」は、他の用語と組み合わせて用いられる場合（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記で規定されたアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。従って、用語「アリールアルキル」とは、アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）（炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子により置換されているアルキル基を含む）にアリール基が結合されているこれらのラジカル（フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含むことが意味される。
【００６０】
上記用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）は、示されたラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含むことが意味される。各々の型のラジカルについての好ましい置換基が、以下に提供される。
【００６１】
アルキルラジカルおよびヘテロアルキルラジカルについての置換基（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる置換基を含む）は、０〜（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここで、ｍ’は、そのラジカルにおける炭素原子の総数である）において、以下から選択されるが、これらに限定されない種々の基のうちの１つ以上であり得る：−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２。好ましくは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、各々、独立して、水素、置換または非置換のヘテロアルキル基、置換または非置換のアリール基（例えば、１個〜３個のハロゲンで置換されたアリール基）、置換または非置換のアルキル基、アルコキシ基またはチオアルコキシ基あるいはアリールアルキル基をいう。本発明の化合物が、１つより多いＲ基を含む場合、例えば、各々のＲ基は、１つより多いＲ’基、Ｒ’ ’ 基、Ｒ’’’ 基、およびＲ’’’’基が存在する場合、各々がこれらの基であるように、独立して、選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合されている場合、これらは、窒素原子と組み合わされて、５員環、６員環または７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’としては、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルが挙げられるが、これらに限定されないことが意味される。上記置換基の考察から、当業者は、用語「アルキル」が、水素基以外の基に結合されている炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））を含むことが意味される。
【００６２】
アルキルラジカルについて記載された置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基についての置換基は、変化し、例えば、０から芳香族環系上の開放状態の価数（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の総数までの範囲の数においての、以下から選択される：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル。本発明の化合物が、１より多いＲ基を含む場合、例えば、各々のＲ基は、１つより多いＲ’基、Ｒ’ ’ 基、Ｒ’’’ 基、およびＲ’’’’基が存在する場合、各々がこれらの基であるように、独立して、選択される。
【００６３】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、必要に応じて、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−で置換され得る。ここで、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、そしてｑは、０〜３の整数である。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、必要に応じて、式−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−の置換基で置換され得る。ここで、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、そしてｒは、１〜４の整数である。そのようにして形成された新しい環の単結合のうち１つは、必要に応じて、二重結合で置換され得る。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の２つの置換基は、必要に応じて、式−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−の置換基で置換され得る。ここで、ｓおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、そしてＸは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である。好ましくは、置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、独立して、水素または置換もしくは非置換の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルより選択される。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロ原子」とは、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むと意味される。
【００６５】
（導入）
多くの化合物（例えば、糖脂質）の生物学的活性は、特定の糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の存在または不存在に依存する。グリコシル化パターンの変化した糖脂質組成物の利点としては、例えば、減少したクリアランス速度に起因して増加した治療的半減期、増強されたバイオアベイラビリティー、および変化された生体活性が挙げられる。さらに、化合物のグリコシル化パターンを変更することは、抗原決定基をマスクし得、従って、この化合物に対する免疫応答を軽減または排除する。糖脂質の糖形態の変化はまた、この糖脂質を、変化されたオリゴサッカリドに特異的である特定の組織または細胞表面レセプターに対して標的化するために用いられ得る。この変化されたオリゴサッカリドはまた、その天然のリガンドの結合を防ぐ、レセプターのインヒビターとして用いられ得る。本発明は、グリコシル化基質を調製するための酵素的方法を提供する。本発明の方法は、糖脂質（例えば、セラミド、スフィンゴシン、およびこれらのアナログ）の合成へのこれらの適用を参照して、本明細書中に例示される。議論の焦点を絞ったのは、説明の明瞭さのためのものであり、そして当業者は、本発明が糖脂質の調製に限定されないことを理解する。
【００６６】
（方法）
本発明は、選択されたグリコシル化パターンを有する種を調製する方法を提供する。本発明は、広く、酵素的に媒介される無細胞系の、インビトロでの基質のグリコシル化に関する。当業者は、本発明が、実質的に任意の基質（ペプチド、核酸、合成ポリマー、小さな有機ラジカル、および脂質の成分が挙げられるが、これらに限定されない）に対して実施され得ることを理解する。本発明は、本明細書中において、糖脂質（特に、ガングリオシド）の調製に対するその適用により例示される。ガングリオシドに対する議論の焦点を絞ったのは、説明の明瞭さのためのみであり、そして、それは、本発明の範囲を限定しない。
【００６７】
従って、第一の局面において、本発明は、以下の式Ｉに従う種をグリコシル化する方法を提供する：
（糖類）ｑ−Ｘ      （Ｉ）。
この方法は、（糖類）ｓ＋１−Ｘを産生するために適切なドナーの存在下で、（糖類）ｓ−Ｘをトランス−シアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触させる工程を包含する。この第一の反応の生成物を、必要に応じて、（糖類）ｓ＋２−Ｘを産生するために、適切なドナーの存在下で、トランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触させる。この第二の反応の生成物を、必要に応じて、（糖類）ｓ＋３−Ｘを産生するために、適切なドナーの存在下で、トランスシアリダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼと接触させる。このプロセスを、所望の糖の構造が構築されるまで続ける。上で提供される構造において、ｓは、０〜約３０の整数である。記号ｑは、２〜約３０の整数を表す。一般的には、本発明のプロセスが、トランスシアリダーゼにより媒介される少なくとも１回のシアリル化、および１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの活性により媒介される２回のグリコシル化を含むことが好ましい。好ましくは、この方法はまた、反応混合物に対して細胞成分の非存在下で実施され、好ましくは、完全にインビトロで実施される。
【００６８】
代替的な実施形態において、第一のグリコシル化工程は、トランスシアリダーゼではなく、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナーを利用する。
【００６９】
例示的な実施形態において、Ｘに結合されていない糖類の末端は、ガラクトース残基である。ガラクトース残基が存在しない場合、それは、必要に応じて、例えば、糖類をガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによって付加される。
【００７０】
当業者に理解されるように、本発明の方法の個々のグリコシル化工程は、所望の構造を提供する任意の順番で実施される。この工程を構成する際の実際上の唯一の制限は、基質が、特定の工程で付加されるべきグリコシル単位についてのアクセプターを含まなくてはならないことである。このアクセプターは、本発明の方法により基質に付加され得るか、またはそれは、ネイティブの基質上に存在し得る。それが１回以上のグリコシル化反応により基質の構造に付加されることに加えて、アクセプターは、所望のアクセプターをマスクするグリコシル単位をトリミングし戻すことにより露出され得る。さらに、基質は、所望のグリコシル化工程のためのアクセプターになる構造についての適切なアクセプターである部分にトリミングさ戻され得る。例えば、ＷＯ  ９８／３１８２６を参照のこと。
【００７１】
基質上に存在する炭化水素部分の付加または除去は、化学的または酵素的のいずれかで達成される。好ましくは、化学的な脱グリコシル化は、基質のトリフルオロメタンスルホン酸、または等価な化合物への曝露によって実施される。化学的な脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）により記載されている。基質上の炭化水素部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）により記載されるような種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【００７２】
グリコシル部分の化学的付加は、当該分野において認識される任意の方法により実施される。好ましくは、糖部分の酵素的付加は、本明細書中に示される方法を用いて達成される。糖部分を付加する他の有用な方法は、米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５，７２８，５５４号、および同第５，９２２，５７７号に開示されている。
【００７３】
別の例示的な実施形態において、本発明は、式ＩＩに従う化合物を調製するための、インビトロでの、無細胞系の、酵素的方法を提供する：
【００７４】
【化９】
2005500058.tif 000003
。式ＩＩにおいて、Ｘ１は、置換または非置換のアルキル、検出可能な標識、キャリア分子または標的化部分を表す。記号Ｘは、以下より選択されるメンバーを表す：
【００７５】
【化１０】
2005500058.tif 000004
。記号ｍは、０〜２０の整数を表す。記号Ｑは、以下より選択されるメンバーを表す：
【００７６】
【化１１】
2005500058.tif 000005
。記号ｎ、ｏおよびｔは、独立して、０〜２０より選択される整数を表す。
【００７７】
この方法は、（ａ）トランスシアリダーゼがＳｉａ部分を、ドナーから基質に転移させるのに適切な条件下で、トランスシアリダーゼおよびＳｉａドナーと、式ＩＩＩ：
【００７８】
【化１２】
2005500058.tif 000006
に従う基質とを接触させ、それにより式ＩＩに従う化合物を形成する工程、を包含する。シアル酸部分は、必要に応じて、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナーにより基質に転移され得る。
【００７９】
当業者は、本発明の方法がまた、構造：Ｇｌｃ−Ｘ１を有する基質上で開始し得、この場合、第一の工程が、一般的に、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびガラクトースドナーを用いる、Ｇａｌ部分の付加であることを理解する。
【００８０】
別の例示的な実施形態において、本発明は、（ｂ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼがＧａｌＮＡｃ部分をドナーから工程（ａ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ａ）において形成された化合物を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させる工程、をさらに包含する方法を提供する。
【００８１】
代替的な実施形態において、この方法は、（ｂ）ＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ａ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ａ）において形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、を包含する。
【００８２】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、（ｃ）ＧａｌトランスフェラーゼがＧａｌ部分をドナーから工程（ｂ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｂ）において形成された化合物を、ＧａｌトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させる工程、をさらに包含する。
【００８３】
代替的な実施形態において、この方法は、（ｃ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼがＧａｌＮＡｃ部分をドナーから工程（ｂ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｂ）において形成された化合物を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させる工程、を包含する。
【００８４】
なお別の例示的な実施形態において、本発明の方法は、（ｃ）ＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ｂ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｂ）において形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、をさらに包含する。
【００８５】
本発明の方法は、必要に応じて、（ｄ）トランスシアリダーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ｃ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｃ）において形成された化合物を、トランスシアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、を包含する。
【００８６】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、（ｄ）ＦｕｃトランスフェラーゼがＦｕｃ部分をドナーから工程（ｃ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｃ）において形成された化合物を、ＦｕｃトランスフェラーゼおよびＦｕｃドナーと接触させる工程、を提供する。
【００８７】
代替的な実施形態において、この方法は、（ｄ）ＧａｌトランスフェラーゼがＧａｌ部分をドナーから工程（ｃ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｃ）において形成された化合物を、ＧａｌトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させる工程、をさらに包含する。
【００８８】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、（ｄ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼがＧａｌＮＡｃ部分をドナーから工程（ｃ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｃ）において形成された化合物を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと接触させる工程、を包含する。
【００８９】
なお別の実施形態において、この方法は、（ｅ）ＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ｄ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｄ）において形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、をさらに包含する。
【００９０】
なおさらなる例示的な実施形態において、この方法は、（ｅ）トランスシアリダーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ｄ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｄ）において形成された化合物を、トランスシアリダーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、をさらに包含する。
【００９１】
代替的な実施形態において、この方法は、（ｅ）ＧａｌトランスフェラーゼがＧａｌ部分をドナーから工程（ｄ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｄ）において形成された化合物を、ＧａｌトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと接触させる工程、を包含する。
【００９２】
別の例示的な実施形態において、この方法は、（ｆ）ＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をドナーから工程（ｅ）において形成された化合物へと転移させるのに適する条件下で、工程（ｅ）において形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと接触させる工程、を提供する。
【００９３】
さらなる実施形態において、この方法は、（ｆ）工程（ｅ）で形成された化合物を、トランスシアリダーゼおよびＳｉａドナーと、このトランスシアリダーゼがＳｉａ部分をこのドナーから工程（ｅ）で形成された化合物に転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。
【００９４】
当業者は、トランスシアリダーゼを利用する工程が、シアリルトランスフェラーゼを使用する工程で置き換えられ得ることを理解する。さらに、シアル酸のトランスシアリダーゼ媒介付加の前に、シアリルトランスフェラーゼにより媒介されるシアル酸転移が生じ得る。
【００９５】
別の実施形態において、この方法は、（ｇ）工程（ａ）の前に、式ＩＶ：
Ｑ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｘ１                （ＩＶ）
の基質を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーと、このＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが、ＧａｌＮＡｃ部分をこのドナーからこの基質へと転移するのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。ＱおよびＸ１のアイデンティティは、式ＩＩについて記載されるとおりである。
【００９６】
なおさらなる例示的実施形態において、この方法は、（ｈ）工程（ｇ）で形成された化合物を、ＧａｌトランスフェラーゼおよびＧａｌドナーと、このＧａｌトランスフェラーゼがＧａｌ部分をこのドナーから、工程（ｇ）で形成された化合物へ転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。
【００９７】
別の実施形態において、この方法は、（ｉ）工程（ａ）の後に、工程（ａ）で形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと、このＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をこのドナーから、工程（ａ）で形成された化合物へと転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。
【００９８】
この方法はまた、（ｊ）選択された回数だけ工程（ｉ）を繰り返し、それによりその化合物上にポリ（シアル酸）置換基を形成する工程を包含する。
【００９９】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、（ｋ）工程（ａ）で形成された化合物を、ＳｉａトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーと、このＳｉａトランスフェラーゼがＳｉａ部分をこのドナーから、工程（ａ）で形成された化合物へと転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含する工程を包含する。
【０１００】
この方法はまた、（ｌ）選択された回数だけ工程（ｋ）を繰り返して、それによりこの化合物上にポリ（シアル酸）置換基を形成する工程を必要に応じて包含する。
【０１０１】
本発明の方法は、アシル化ガングリオシドおよびｌｙｓｏ−ガングリオシドの両方に対して実施され得る。このｌｙｓｏ−ガングリオシドは、最終産物へと至る反応サイクルの間の任意の中間点においてアシル化され得るか、または炭水化物構造が完全に適切な配置になったあとにアシル化され得る。
【０１０２】
上述の本発明の方法により形成される例示的な化合物としては、ガングリオシドＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、Ｆｕｃ−ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＭ１ｂ、ＧＤ１α、ＧＴ１β、ＧＱ１Ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ、グロボシド（例えば、グロボ−Ｈなど）およびポリシアリル化ラクトースが挙げられる。
【０１０３】
本発明の方法は、図１〜図９として本明細書に添付されるスキームを参照することによりさらに理解される。これらの図面は、本発明の方法に従う代表的な合成を記載する。
【０１０４】
図１を参照して、基質（アグリコン）は、酵素的（グルコシルトランスフェラーゼ）または化学的のいずれかでグルコースで官能基化される。このグルコシル誘導体を、ガラクトシルトランスフェラーゼで処理して、そしてこのガラクトシル化化合物を、トランスシアリダーゼを使用してシアリル化する。経路１において、ＧａｌＮＡｃは、シアリル化種のガラクトース残基に付けられる。ガラクトースを、ガラクトシルトランスフェラーゼによりＧａｌＮＡｃ部分に結合させ、そしてＧａｌ残基を、フコシルトランスフェラーゼの作用によりフコシル化する。
【０１０５】
図２の経路２において、このシアリル化された基質を、シアリルトランスフェラーゼを使用するシアリル基の既存のシアル酸部分への付加によりさらにシアリル化する。Ｇａｌ残基を、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを使用してＧａｌＮＡｃで修飾する。ガラクトース残基を、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してＧａｌＮＡｃに結合させる。シアル酸部分をシアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。
【０１０６】
図３は、本発明の方法を使用する、ガングリオシド、ならびにそのスフィンゴシンアナログおよびセラミドアナログの例示的合成を記載する。従って、グルコシルスフィンゴイド１を、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用してガラクトシル化する。得られたＧｌｕ−Ｇａｌスフィンゴイド２をトランスシアリダーゼを用いてシアリル化する。シアリル化されたスフィンゴイド部分３の１級アミンを、塩化ステアロイルでアシル化し、対応するセラミド４を生成する。このセラミド４は、次いで、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの存在下でＧａｌＮＡｃと反応し、５を形成する。化合物５は、Ｇａｌドナーの存在下でガラクトシルトランスフェラーゼと接触されて化合物６を生成する。
【０１０７】
図４は、本発明の方法に従う、ガングリオシドの別の例示的な合成を提供する。これにより、１のスフィンゴシン部分の１級アミンを、塩化ステアロイルでアシル化してセラミド７を生成し、これをトランスシアリダーゼによりシアリル化して４を形成する。
【０１０８】
図５は、本発明の方法により調製された選択されたガングリオシドへの一連のスキームである。化合物３をシアリルトランスフェラーゼでシアリル化して、化合物８を形成する。化合物８のアミンを、塩化ステアロイルでアシル化してＧＤ３９を生成する。あるいは、化合物８をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理して化合物１０を生成し、これを、塩化ステアロイルでアシル化してＧＤ２１１を形成する。あるいは、化合物１０をガラクトシル化して１２を形成し、これを塩化ステアロイルでアシル化してＧＤ１１４を生成する。
【０１０９】
図６のスキームは、本発明の方法を使用する、ガングリオシドへのさらなる例示的な経路を記載する。スフィンゴイド１５を、グルコシル化し、１６を形成し、これにガラクトシル残基を付加して１７を形成する。化合物１７をトランスシアリダーゼを用いてシアリル化して１８を形成し、これを１級アミンにおいて塩化ステアロイルを用いて必要に応じてアシル化してＧＭ３２２を生じる。あるいは、１７をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理して１９を生成し、これを必要に応じてアシル化してＧＭ２２３を生じる。あるいは、１９をガラクトシル化して２０を形成し、これを必要に応じてアシル化してＧＭ１２４を生成する。あるいは、２０をフコシル化して２１を形成し、これを必要に応じてアシル化してフコシル−ＧＭ１２５を得る。
【０１１０】
図７は、本発明の方法を使用してガングリオシドを形成する例示的な経路を記載する。スフィンゴシン１８をシアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化し、２６とする。化合物２６を１級アミンにおいて塩化ステアロイルを使用して必要に応じてアシル化してＧＤ３  ３０を形成する。あるいは、２６をＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびＧａｌＮＡｃドナーで処理して２７を形成する。化合物２７をガラクトシル化して２８を形成し、これをシアリルトランスフェラーゼを使用してシアリル化する。化合物２７、２８および２９の各々を、塩化ステアロイルを用いてアシル化してＧＤ２（３１）、ＧＤ１（３２）またはＧＴ１ｂ（３３）をそれぞれ形成し得る。
【０１１１】
図９は、本発明の方法に従ってポリシアリル化スフィンゴシンを調製するためのスキームを提供する。これらのスフィンゴシンは、必要に応じてアシル化されて対応するセラミドを形成する。
【０１１２】
図１０は、インタクトなセラミド基質に対して本発明の方法を実施する例示的なスキームを記載する。セラミド２２をシアリル化してポリシアリル化種（例えば、３５および３６）の混合物を生成し、これにＧａｌＮＡｃを結合して３１を得る。化合物３１をガラクトシル化し、化合物３２を得る。
【０１１３】
サッカリド残基を基質に結合するための本発明により提供される方法は、以前に記載されるグリコシル化方法と異なり、基質メンバーが実質的に均一なグリコシル化パターンを有する基質の集団を提供し得る。したがって、好ましい実施形態において、基質の集団は、その集団の各メンバーのグリコシル化パターンに対して実質的に単分散である。本発明の方法の適用後、所望のサッカリド残基（例えば、フコシル残基）が、高い割合のアクセプター部分に結合される。
【０１１４】
本発明はまた、基質に対して既知のグルコシル化パターンを再生させる方法を提供する。この方法は、基質を予め選択された（すなわち、既知の）レベルまでグリコシル化する（この時点でグルコシル化が停止する）工程を包含する。特に好ましい実施形態において、この基質は、既知のレベルまでフコシル化される。本発明の方法は、治療剤のレプリカである組成物を調製する際に特に有用であり、これは、現在臨床的に利用されるかまたは臨床試験に進んでいる。
【０１１５】
この方法はまた、改変した基質の大規模産生（パイロット規模および工業的規模の両方の調製を含む）のために実用的である。従って、本発明の方法は、選択されたグリコシル化パターンを有する基質の大規模調製のための実用的な手段を提供する。このプロセスは、組成物中に存在する基質に対して増加した一定のレベルの所望のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）を提供する。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、一般的に、本発明の方法を実施する際に使用する１つ以上の酵素、および本発明の方法を実施するための指示書を備える。
【０１１７】
（基質）
本発明の方法は、グリコシルトランスフェラーゼ、トランスシアリダーゼなどに適切なアクセプター部分を含む任意の基質を使用して実施され得る。例示的な基質としては、スフィンゴシンおよびそのアナログ、セラミドおよびそのアナログ、ペプチド、ガングリオシドならびに本発明の方法により改変され得るその他の生物学的構造体（例えば、糖脂質、全細胞など）が挙げられるが、これらに限定されず、この生物学的構造体は、当業者に公知の細胞上の多数の基質および炭水化物構造のいずれかを含む。
【０１１８】
例示的実施形態において、本発明の方法は、Ｘ１の構造が、式Ｖ：
【０１１９】
【化１３】
2005500058.tif 000007
で記載される基質を利用し、
ここで、Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される。記号Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＯＲ４、ＯＣＯＲ４、ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ４、ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ４、ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ４、Ｃ（Ｏ）Ｒ４、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ４、検出可能な標識または標的部分を表す。Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、置換もしくは無置換のアルキル、置換もしくは無置換のヘテロアルキル、検出可能な標識または標的部分から独立して選択されるメンバーである。Ｒ３は、置換または無置換のアルキルおよび置換または無置換のヘテロアルキル基から選択される。例示的な実施形態において、Ｒ３は、少なくとも２度の不飽和を含む。この不飽和は、少なくとも２つの二重結合または少なくとも１つの三重結合の形態で存在し得る。
【０１２０】
なおさらなる例示的な実施形態において、Ｘ１の構造は、式ＶＩ：
【０１２１】
【化１４】
2005500058.tif 000008
で記載され、式中、Ｒ６は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ７、検出可能な標識、および標的部分から選択されるメンバーであり；そしてＲ７は、置換または無置換のアルキル、置換または無置換のヘテロアルキル、検出可能な標識および標的部分から選択されるメンバーである。Ｒ３は、概して上記のとおりである。
【０１２２】
別の例示的な実施形態において、基質は、アシル化される。このアシル化工程は、炭水化物を組み立てるために使用される酵素反応スキームの間の任意の中間の時点において、炭水化物部分を組み立て始める前でも、炭水化物部分が完全に組み立てられた後でもよい。例えば、式Ｖに従う基質が利用され、そしてＲ１がＮＨ２、ＯＨおよびＳＨから選択されるメンバーである場合、この基質は、必要に応じてＲ１においてアシル化される。リゾガングリオシドをアシル化する方法は、当該分野で公知であり、例えば、「Ｌｙｓｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ」Ｇｕｎｔｈｅｒ  ＳｃｈｗａｒｚｍａｎｎおよびＫｏｎｒａｄ  Ｓａｎｄｈｏｆｆ、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１３８巻、３１９〜３４１頁（１９８７）を参照のこと。
【０１２３】
記載された手順に従うアシル化は、従来の様式で（例えば、出発産物を、アシル化剤、特にその残基が導入される酸の反応性官能基誘導体と反応させることにより）実行され得る。例示的な酸の反応性官能基誘導体としては、ハロゲン化物、無水物、および活性エステルが挙げられる。このアシル化は、塩基（例えば、ＴＥＡ、ピリジンまたはコリジン）の存在下で実行され得る。アシル化は、必要に応じて無水条件下で、室温または加熱して行われる。Ｓｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎｎ法はまた、無機塩基の存在下で水性条件下でアシル化を行うために使用され得る。いくつかの場合、反応性官能基誘導体として酸のエステルを使用することも可能である。アシル化のために、活性化カルボキシル誘導体（例えば、ペプチド化学において知られるもの、例えば、混成無水物またはカルボジイミドもしくはイソオキサゾール塩を用いて得られる誘導体を使用する）を含む方法を使用することも可能である。
【０１２４】
アシル化の例示的方法としては以下が挙げられる：（１）リゾガングリオシド誘導体と酸のアジドとの反応；（２）リゾガングリオシド誘導体と、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを用いて酸から得られるこの酸のアシルイミダゾールとの反応；（３）リゾガングリオシド誘導体と、この酸およびトリフルオロ酢酸の混成無水物との反応；（４）リゾガングリオシド誘導体と酸の塩化物との反応；（５）リゾガングリオシド誘導体と酸との、カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような基質の存在下での反応；（６）リゾガングリオシド誘導体と酸との加熱による反応；（７）リゾガングリオシド誘導体と酸のメチルエステルとの高温での反応；（８）リゾガングリオシド誘導体と酸のフェノールエステル（例えば、パラ−ニトロフェノールとのエステル）との反応；および（９）リゾガングリオシド誘導体と、酸の塩とヨウ化１−メチル−２−クロロピリジンとの間の交換反応から誘導されるエステルまたは類似の生成物との反応。
【０１２５】
これらの酸は、飽和または不飽和の、分枝鎖または直鎖の、置換または無置換のアルキル酸、置換または無置換の脂肪酸（例えば、ヒドロキシ脂肪酸）から誘導され得る。このアシル基は、以下の部分構造を含み得る：−(ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、−ＣＨＯＨ−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３、アリール、アルキルアリール、またはリンカー（ここでｐは、０〜４０である）。一般的に、アシル成分の長さは、好ましくは８〜２５個の炭素であり、より好ましくは１０〜２０個であり、そしてより好ましくは１６〜１８個の炭素である。
【０１２６】
遊離のヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、または１級アミノ基もしくは２級アミノ基を含む酸から誘導されるアシル基の特定の場合において、このような基をアシル化反応の間保護することが一般的に好ましい。このような基を保護する方法は、当該分野で利用可能である。このような保護基は、反応の終わりに容易に除去されるべきである。例示的な保護基としては、フタロイル基およびベンジルオキシカルボニル基（これは、アミノ基の保護に有利に作用する）が挙げられる。従って、例えば、γ−アミノ酪酸を服務誘導体の調製において、アミノ基がフタロイル基に結合したこの酸の誘導体が最初に調製され、リゾガングリオシド誘導体とのアシル化の後に、このフタロイル基がヒドラジン分解により除去される。このベンジルオキシカルボニル基は、水素化分解により除去され得る。この残基はまた、ヒドロキシ基の保護にも役立ち得る。カルボキシ基は、例えば、ペプチド化学において使用されるアルコールとのエステル化により保護され得る。
【０１２７】
（化合物）
本発明はまた、基質のアルキル部分（例えば、式ＶまたはＶＩにおけるＲ３）が、２度以上の不飽和を含む化合物を提供する。本発明のこの局面は、そのアルキルキが、少なくとも２つの二重結合または少なくとも１つの三重結合を有するスフィンゴシンおよびセラミドにより例示される。
【０１２８】
本発明の例示的な化合物としては、以下が挙げられる：
【０１２９】
【化１５】
2005500058.tif 000009
ここで、Ｒは、Ｈ、置換もしくは無置換のアルキル、または上記のような酸から誘導されるアシルである。記号ｎは、０〜４０の整数を表し；好ましくは、ｎ＝６または７であり（その結果、例えば、スフィンゴシン塩基は、ｄ１８：２（例えば、トランス  トランス）、ｄ１８：２（例えば、トランス  シス）、ｄ１８：１：１、ｔ１８：１、またはｄ１８：２：９メチルである）、そしてＲは、Ｈまたは脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはパルミチン酸）から誘導されるアシル基である。
【０１３０】
他の例示的な実施形態において、Ｒは、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒａｔｅ）、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸からなる群から選択される脂肪酸から誘導されるアシル部分、またはそれらのα−ヒドロキシ誘導体である。本明細書中で使用される場合、用語「脂肪酸」とは、炭化水素鎖および末端カルボキシル基を有し、そして式ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ここで、ｎ＝１〜２４）を有する酸をいう。特に好ましい実施形態において、Ｒは、ステアリン酸またはパルミチン酸から誘導されるアシル部分である。
【０１３１】
別の例示的な実施形態において、本発明は、化合物の内部エステル（ここで、サッカリド部分のヒドロキシル基の１つ以上が、酸の１つ以上のカルボキシ基でエステル化されている）を調製する方法を提供する。この方法はまた、ガングリオシドの「外部」エステル（すなわち、脂肪族系、アリール脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）系、脂環式系または複素環式系の種々のアルコールとシアル酸のカルボキシ官能基とのエステル）の形成も包含する。シアル酸のアミドもまた含まれる。これらの誘導体の各々を調製する方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第４，７１３，３７４号を参照のこと。
【０１３２】
本発明はまた、遊離のカルボキシ官能基を有する、本発明に従うガングリオシド化合物の金属塩または有機塩基の塩を調製する方法を提供し、そしてこれらは、本発明の一部を形成する。遊離酸官能基を有する本発明の他の誘導体（例えば、二塩基酸とのエステルまたはペルアシル化アミド）の金属塩または有機塩基の塩を調製することも可能である。塩基性官能基（例えば、遊離アミノ官能基）を含むガングリオシド誘導体（例えば、アミノアルコールとのエステル）の酸付加塩もまた本発明の一部を形成する。金属塩または有機塩基の塩のうち、治療において使用され得るものには、特に言及するべきである：例えば、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩（例えば、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウムまたはマグネシウムの塩）、またはアルミニウムの塩、および有機塩基の塩（例えば、脂肪族、芳香族、もしくは複素環式の、１級、２級もしくは３級のアミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ピペリジン、モルホリン、エフェドリン、フルフリルアミン、コリン、エチレンジアミンおよびアミノエタノール））。本発明のガングリオシド誘導体の酸付加塩を与え得る酸のうち、特に言及するべきものは、以下である：水素酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸）、最大７個の炭素原子を有する低級脂肪族酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸およびマレイン酸）。治療的に有用ではない酸または塩基（例えば、ピクリン酸）は、本発明のガングリオシド誘導体の精製に使用され得、そしてまた本発明の一部を形成する。
【０１３３】
グリコシル残基もアシル部分もいずれも含まない基質で本発明の合成を開始するのに加えて、本発明の合成は、所望のガングリオシドに対する前駆体であるリゾガングリオシドで始め得る。リゾガングリオシドは、セラミドデアシラーゼを用いる窒素の酵素的脱アシル化によりガングリオシドから得られ得る（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３：１（１９８８）を参照のこと。出発産物としても使用され得る脱−Ｎ−アシル−リゾガングリオシドは、アルカリ加水分解剤（例えば、テトラアルキルアンモニウムの水酸化物、水酸化（ｈｙｄｒａｔｅ）カリウムおよびその他）を用いてガングリオシドから得られ得る（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：５２５、（１９８５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：７６５７，（１９８０）；Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３６７：２４１（１９８６）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１７９：３９３（１９８８）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４７：１２７（１９８７）を参照のこと）。
【０１３４】
（酵素）
（ａ．選択されたグリコシル化パターンを有する基質を調製するためのグリコシルトランスフェラーゼおよび方法）
本発明の方法は、選択されたグリコシル化パターンを有するサッカリドを生成するそれらの能力について選択されたグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を利用する。例えば、所望の特異性を有するだけでなく、基質中の高い割合の所望のアクセプター基をグリコシル化し得るグリコシルトランスフェラーゼが、選択される。オリゴサッカリドアクセプター部分（例えば、可溶性オリゴサッカリドまたは比較的短いペプチドに結合されたオリゴサッカリド）を使用するアッセイ系を使用して得られた結果に基づいて、グリコシルトランスフェラーゼを選択することが好ましい。特定の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質である。代表的な融合タンパク質としては、２つの異なるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ）の活性を示すグリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。他の融合タンパク質は、同じトランスフェラーゼ活性の２つの異なるバリエーションを含む（例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ）。さらに他の融合タンパク質は、トランスフェラーゼ活性の有用性を増強する（例えば、増強された溶解性、安定性、代謝回転など）ドメインを含む。
【０１３５】
グリコシルトランスフェラーゼを使用して所望のオリゴサッカリド構造を合成する多数の方法が公知であり、そして概して本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１，Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、ならびに米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号および同第５，５４５，５５３号に記載される。
【０１３６】
グリコシルトランスフェラーゼは、活性化糖（ドナーＮＤＰ−糖）の、基質（例えば、タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質または伸長するオリゴサッカリドの非還元末端）への逐次的様式での付加を触媒する。膨大な数のグリコシルトランスフェラーゼが当該分野で公知である。
【０１３７】
本発明の方法は、任意のグリコシルトランスフェラーゼを利用し得る。但し、これは選択された部位に所望のグリコシル残基を付加し得る。このような酵素の例は、Ｌｅｌｏｉｒ経路のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなど）が挙げられる。
【０１３８】
本発明は、トランス−シアリダーゼ（ｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅ）およびグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して、実行される。例えは、当業者は、トランス−シアリダーゼに加えて、シアリルトランスフェラーゼ、およびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合せを使用し得る。１つより多くの酵素を使用する実施形態において、１つより多くの酵素および適切なグリコシルドナーは、必要に応じて、開始反応混合物中に混ぜられる。あるいは、引き続く酵素性反応のための酵素および試薬を、一旦その前の酵素性反応が完了するかまたはほぼ完了して、その反応媒体に添加する。単一容器内で２つの酵素反応を連続して行うことによって、全体の収量は、中間体の種を単離する手順よりも向上される。さらに、余剰の溶媒および副生成物の除去および廃棄が軽減される。
【０１３９】
本発明の方法で使用され得るグリコシルトランスフェラーゼとしては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核生物および原核生物より得られるものが挙げられる。
【０１４０】
グリコシルトランスフェラーゼ反応を含む酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼがクローニングされ得るか、または任意の供給源より単離され得る。多くのクローニングされたグリコシルトランスフェラーゼが、それらのポリヌクレオチド配列のとおり、公知である。例えば、「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列およびアミン酸配列が推定であり得るグリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬおよびその他を含む、様々な公的に利用可能なデータベースに見出される。
【０１４１】
グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、化学合成によるか、適切な細胞もしくは細胞株培養物由来のｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることによるか、適切な細胞からのゲノムライブラリーをスクリーニングすることによるか、またはこれらの手法の組み合せによって、入手され得る。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から形成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて実行され得る。プローブは、公知の手順に従って従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される、蛍光基、放射性原子または化学発光基のような検出可能な基で標識され得る。代替的には、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順の使用によって得られ得、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーがグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製される。Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号、およびＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【０１４２】
グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞において合成され得る。ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅すること、および／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現することのいずれかのために、使用される。発現ベクターは、このグルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡが、適切な宿主において、グリコシルトランスフェラーゼの発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結された、複製可能なＤＮＡ構築物である。このような制御配列の必要性は、選択された宿主および選ばれた形質転換方法に依存して変化する。一般的に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する任意の作動配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写終結および翻訳終結を制御する配列、を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされる全てのものは、宿主細胞中で複製する能力（通常、複製起点のより付与される）、および形質転換体の認識を容易にするための選択マーカーである。
【０１４３】
本発明の組成物の調製における使用のための、適切なグリコシルトランスフェラーゼの例は、本明細書中に記載される。当業者は、様々な量（例えば、１〜１００ｍＵ／ｍｇのタンパク質）の各酵素を、基質（例えば、１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させることによって、他の適切なグリコシルトランスフェラーゼを識別し得、この基質に、目的のグリコシルトランスフェラーゼに対する潜在的なアクセプター部位を有するオリゴコッサリドが結合されている。グリコシルトランスフェラーゼが所望の部位に糖残基を付加する能力を、比較する。基質と結合したオリゴサッカリドの潜在的アクセプター部位を、同じ特異性を有する他のグリコシルトランスフェラーゼよりも効率的にグリコシル化する能力を示すグリコシルトランスフェラーゼは、本発明の方法における使用に適切である。
【０１４４】
いくつかの実施形態のために、基質に対する酵素の低い比率を使用して所望の糖化形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）を達成するグリコシルトランスフェラーゼを使用することは、有利である。いくつかの実施形態において、グリコシル化の所望の程度が、基質１ｍｇにつき約５０ｍＵ以下のグリコシルトランスフェラーゼを使用して得られる。酵素のコストをより下げるために、基質１ｍｇにつき約４０ｍＵ未満のグリコシルトランスフェラーゼが使用され得、よりさらに好ましくは、基質に対するグリコシルトランスフェラーゼの比率は、約３５ｍＵ／ｍｇ以下、そしてより好ましくは約２５ｍＵ／ｍｇ以下である。酵素のコストの観点から最も好ましくは、所望のグリコシル化の所望の程度が、１ｍｇの基質につき約１０ｍＵ／ｍｇ未満のグリコシルトランスフェラーゼを使用して得られる。代表的反応条件は、約５〜２５ｍＵ／ｍｇの基質の範囲、または少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する基質と共に１０〜５０ｍＵ／ｍｌの反応混合物の範囲で存在するグリコシルトランスフェラーゼを有する。複数酵素の反応において、これらの酵素量は、グリコシルトランスフェラーゼ数、スルホトランスフェラーゼ数、またはトランス−シアリダーゼ数に比例して増加され得る。
【０１４５】
しかし、他の実施形態において、より多くの酵素量を使用することが望ましくあり得る。例えば、より早い反応速度を得るために、当業者は、約２〜１０倍まで酵素量を増加させ得る。反応温度もまた、より速い反応速度を得るために増加され得る。例えば、約３０℃〜約３７℃の温度が適切である。
【０１４６】
本発明の方法の有効性は、組換え産生されたグリコシルトランスフェラーゼの使用によって増大され得る。組換え産生は、大規模な基質修飾に必要とされる、多量のグリコシルトランスフェラーゼの産生を可能とする。グリコシルトランスフェラーゼの膜係留ドメインの欠失（このことは、このグリコシルトランスフェラーゼを可溶性にし、従って、多量のグリコシルトランスフェラーゼの産生および精製を容易にする）は、このグリコシルトランスフェラーゼをコードする改変された遺伝子の組換え発現によって達成され得る。グリコシルトランスフェラーゼの組換え生産に適切な方法の記載については、米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと。
【０１４７】
標的基質が固体支持体上に固定化されたグリコシル化方法もまた、本発明によって提供される。用語「固体支持体」はまた、準固体支持体（ｓｅｍｉ−ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）を含む。好ましくは、標的基質は可逆的に固定化されて、グリコシル化反応が完了した後に基質が解放され得る。適切なマトリクスは、当業者に公知である。例えば、イオン交換を使用して、グリコシル化反応が進行する間に、適切な樹脂上に基質を一時的に固定化し得る。目的の基質に特異的に結合するリガンドもまた、親和性ベースの固定化のために使用され得る。目的の基質に結合する抗体が適切である。グリコシル化され得る目的基質に特異的に結合する色素および他の分子もまた適切である。別の実施形態において、１つ以上の酵素がグリコシダーゼである。
【０１４８】
例示的な実施形態において、使用される全ての酵素は、トランス−シアリダーゼを除外して、グリコシルトランスフェラーゼである。
【０１４９】
（１．フコシルトランスフェラーゼ反応）
多くのサッカリドは、生物学的反応を示すために特定のフコシル化構造物の存在を必要とする。細胞内の認識機構は、しばしば、フコシル化オリゴサッカリドを必要とする。例えば、細胞接着分子として機能する多くのタンパク質（Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチンを含む）は、特定の細胞表面フコシル化炭水化物構造体（例えば、シアリルＬｅｗｉｓ  ｘおよびシアリルＬｅｗｉｓ構造体）を結合する。さらに、ＡＢＯ血液型系を形成する特定の炭水化物構造体が、フコシル化される。３つの群の各々の中の炭水化物構造体は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１−ジサッカリド単位を共有する。血液型Ｏの構造体において、このジサッカリドは、末端の構造である。血液型Ａの構造体は、このジサッカリドに末端ＧａｌＮＡｃ残基を付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼによって形成される。血液型Ｂの構造体は、末端のガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによって形成される。これらＬｅｗｉｓ血液型構造体はまた、フコシル化される。例えば、Ｌｅｗｉｓ  ｘおよびＬｅｗｉｓ構造体は、それぞれ、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これらの構造体の両方は、さらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）されて対応するシアリル化構造体を形成し得る。目的の他のＬｅｗｉｓ血液型構造体は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲのそれぞれである、Ｌｅｗｉｓ  ｙ構造体およびｂ構造体である。ＡＢＯ血液型構造体およびＬｅｗｉｓ血液型構造体の構造体およびそれらの合成に関与する酵素の記載については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編、１６章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９９）を参照のこと。
【０１５０】
フコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースからサッカリドアクセプターの特定のヒドロキシルにフコース単位を転移する合成経路において使用されている。例えば、Ｉｃｈｉｋａｗａは、クローニングしたフコシルトランスフェラーゼを用いてシアリル化ラクトースアミンのフコシル化を含む方法によって、シアリルＬｅｗｉｓ−Ｘを調製した（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８（１９９２））。Ｌｏｗｅらは、細胞中で非天然フコシル化活性を発現させ、これによってフコシル化糖タンパク質、フコシル化細胞表面などを作製する方法を記載している（米国特許第５，９５５，３４７号）。
【０１５１】
１つの実施形態において、本発明の方法は、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を有する基質と、フコースドナー部分、フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の試薬を含む反応混合物とを接触させることによって実行される。フコースをフコースドナー部分からフコシルトランスフェラーゼアクセプター部分に転移するのに十分な時間、かつそれに適切な条件下で、基質を反応混合物中でインキュベートする。好ましい実施形態において、このフコシルトランスフェラーゼは、組成物中で、少なくとも６０％のフコシルトランスフェラーゼのそれぞれのアクセプター部分のフコシル化を触媒する。
【０１５２】
多くのフコシルトランスフェラーゼが当業者に公知である。簡潔に述べると、フコシルトランスフェラーゼとしては、ＧＤＰ−フコースからアクセプターの糖のヒドロキシ部分にＬ−フコースを転移する、任意の酵素が挙げられる。いくつかの実施形態において、例えば、アクセプターの糖は、オリゴサッカリドグリコシドにおけるＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ群中のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ  α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（これはヒトの乳から得られる（例えば、Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと））、ならびにβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃ  α（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−Ｖ、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ、Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（これはヒトの血清中に見出される）が挙げられる。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃ  α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形態もまた利用可能である（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、以下によって実施され得る：Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載される方法；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ（Ｔｒｏｔｔｅｉｎら、（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０７：２７９−２８７）由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ；ならびにα１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトおよびマウスのＦｕｃＴ−ＩＸのヌクレオチド配列は、Ｋａｎｅｋｏ（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：２３７−２４２に記載され、そしてヒト遺伝子の染色体座は、Ｋａｎｅｋｏ（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．８６：３２９−３３０に記載される）。最近、アクセプターとしてＮ−連結ＧｌｃＮＡｃを使用する、カタツムリＬｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｌｉｓ由来およびリョクトウ由来の報告されたα１，３−フコシルトランスフェラーゼが、それぞれ、ｖａｎ  Ｔｅｔｅｒｉｎｇら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：３１１−３１４およびＬｅｉｔｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１８３０−２１８３９に記載される。さらに、Ｒａｓｋｏら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４９８８−９４に記載されるような、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のα（１，３／４）フコシルトランスフェラーゼ、ならびにＨ．Ｐｙｌｏｒｉのα１，２−フコシルトランスフェラーゼ（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４５：３２４５−５３）のような、細菌のフコシルトランスフェラーゼがある。また、本発明において有用なフコシルトランスフェラーゼの記載については、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８を参照のこと。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるフコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約１Ｕ／ｍＬ、通常少なくとも約５Ｕ／ｍＬの活性を有する。
【０１５４】
他の実施形態において、本発明の方法における使用のためのフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩが挙げられる。
【０１５５】
特定のＦｕｃＴ分子が、基質をフコシル化するのに著しく効果的である。例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩは、基質をフコシル化するのに、ＦｕｃＴ−Ｖより約８倍効果的である。従って、好ましい実施形態において、本発明は、フコシルトランスフェラーゼを使用して基質上のアクセプターをフコシル化する方法を提供し、このフコシルトランスフェラーゼは、ＦｕｃＴ−Ｖを使用する同一条件下で達成されるよりも、少なくとも約２倍高い、より好ましくは少なくとも約４倍高い、なおより好ましくは少なくとも約６倍高い、さらにより好ましくは少なくとも約８倍高い、フコシル化の度合を提供する。現在好ましいフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩが挙げられる。
【０１５６】
選択された基質に対する特異性は、好まれるフコシルトランスフェラーゼが満たすべき唯一の第１の判定基準である。好ましくは、本発明の方法において使用されるフコシルトランスフェラーゼはまた、種々の基質を効率的にフコシル化し得、そして少なくとも約５００ｍｇの基質のフコシル化を可能とする反応のスケールアップを支持し得る。さらに好ましくは、フコシルトランスフェラーゼは、比較的低コストかつ低い製造設備（ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）要求性で、少なくとも約１ｋｇの基質、そしてさらに好ましくは少なくとも約１０ｋｇの基質の合成を可能とするフコシル化反応のスケールを支持する。
【０１５７】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼ触媒性結合に適切なアクセプター部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ（ここで、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸基、サッカリド基、オリゴサッカリド基またはアグリコン基である）。Ｒは基質に結合するか、または基質の一部である。特定の反応に適切なフコシルトランスフェラーゼは、所望されるフコース結合の型（例えば、α２、α３またはα４）、目的の特定のアクセプター、およびフコシルトランスフェラーゼが所望の高収率のフコシル化を達成する能力に基づいて、選択される。適切なフコシルトランスフェラーゼおよびそれらの特性は、上に記載される。
【０１５８】
組成物中に、基質に結合するオリゴサッカリドの十分な割合がフコシルトランスフェラーゼアクセプター部分を含まない場合、適切なアクセプターを合成し得る。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターを合成するための１つの好ましい方法は、ＧｌｃＮＡｃ残基をＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプター部位（これは基質に結合するオリゴサッカリド上に存在する）に結合させるためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含む。好ましい実施形態において、目的の潜在的アクセプター部分の高率をグリコシル化する能力を有するトランスフェラーゼが選択される。次いで、この得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲは、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして使用され得る。
【０１５９】
得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分は、フコシルトランスフェラーゼ反応の前にガラクトシル化されて、例えば、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基を生じ得る。いくつかの実施形態において、ガラクトシル化工程およびフコシル化工程は、同時に実施され得る。ガラクトシル化アクセプターを必要とするフコシルトランスフェラーゼを選択することによって、所望の生成物のみを生成する。従って、この方法は、以下を包含する：
（ａ）  式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物を、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたは化合物Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを生成するのに十分な条件下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを用いてガラクトシル化する工程；ならびに
（ｂ）  （ａ）において生成した化合物を、フコシルトランスフェラーゼを使用して、ＧＤＰ−フコースの存在下で、以下から選択される化合物を生成するのに十分な条件下で、フコシル化する工程：
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌα１，４（Ｆｕｃ１，α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌα１，３（Ｆｕｃ１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ。
【０１６０】
所望される活性を有するさらなるフコシルトランスフェラーゼを含むことによって、さらなるフコース残基が上記の構造体に付加され得る。例えば、これらの方法は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲのようなオリゴサッカリド決定基を生成し得る。従って、別の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも２つのフコシルトランスフェラーゼの使用を包含する。複数のフコシルトランスフェラーゼを、同時的にまたは連続的にいずれかで使用する。フコシルトランスフェラーゼが連続的に使用される場合、一般的に、フコシル化多段工程の間で糖タンパクが精製されないことが好ましい。複数のフコシルトランスフェラーゼが同時に使用される場合、酵素活性は２つの別々の酵素から導かれ得るか，あるいは１つより多くのフコシルトランスフェラーゼ活性を有する単一の酵素から導かれ得る。
【０１６１】
（２．シアリルトランスフェラーゼ）
基質に対して所望の生物学的活性を付与するオリゴサッカリド決定基は、しばしばシアリル化される。従って、本発明は、高収率で基質に結合したオリゴサッカリドをシアリル化する方法を提供する。好ましい実施形態において、この方法は、メンバーが実質的に一様なシアリル化パターンを有する、基質集団を生成する。代表的に、本発明の方法によって生成される、シアリル化される種を有する基質上の糖鎖は、変更されない基質より、高い割合の末端ガラクトース残基がシアリル化される。好ましくは、基質に結合したオリゴサッカリド上に存在する約６０％より多く、より好ましくは約８０％より多くの末端ガラクトース残基が、本方法の使用によってシアリル化される。より好ましくは、本発明の方法は約９０％より多くのシアリル化を生じ、そしてさらにより好ましくは、約９５％より多くのシアリル化末端ガラクトース残基を生じる。最も好ましくは、組成物中の基質上に存在する、本質的に１００％の末端ガラクトース残基が、本発明の方法を使用した修飾によってシアリル化される。これらの方法は、代表的に、約４８時間以内、より好ましくは約２４時間以内で所望されるレベルのシアリル化を達成し得る。
【０１６２】
組換えシアリルトランスフェラーゼ（アンカードメインを欠損したものを含む）ならびに組換えシアリルトランスフェラーゼを生産する方法の例は、例えば、米国特許第５，５４１，０８３号に見出される。少なくとも１５個の異なる哺乳動物のシアリルトランスフェラーゼが記載され、そしてこれらのうちの１３個のｃＤＮＡが今日までにクローニングされている（本明細書中で使用される系統的な命名法については、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖを参照のこと）。これらのｃＤＮＡは、シアリルトランスフェラーゼの組換え産生のために使用され得、これらシアリルトランスフェラーゼは、次いで本発明の方法において使用され得る。
【０１６３】
シアリル化は、トランス−シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼのいずれかを使用して達成され、シアリルトランスフェラーゼが使用される場合で特定の決定基がα２，６−結合化シアル酸を必要とする場合を除く。本発明の方法は、適切なドナー部分の存在下でアクセプターと適切な酵素とを接触させることによって、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼに対するアクセプターをシアリル化する工程を包含する。シアリルトランスフェラーゼについて、ＣＭＰ−シアル酸が好ましいドナー部分である。しかし好ましくは、トランス−シアリダーゼは、このトランス−シアリダーゼがシアル酸を付加し得ない脱離基を含むドナー部分を使用する。
【０１６４】
目的のアクセプター部分としては、例えば、Ｇａｌβ−ＯＲが挙げられる。いくつかの実施形態において、アクセプター部分を、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で、シアル酸がアクセプター部分の非還元末端に転移される条件下で、シアリルトランスフェラーゼと接触させて、化合物ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ−ＯＲまたは化合物ＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ−ＯＲを生成する。この式において、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸基、サッカリド基、オリゴサッカリド基、またはアグリコン基である。例示の実施形態において，
Ｇａｌβ−ＯＲはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒであり、ここで、Ｒは基質に結合するかまたは基質の一部である。
【０１６５】
例示の実施形態において、本方法はシアリル化およびフコシル化の両方がなされた化合物を提供する。このシアリルトランスフェラーゼ反応およびフコシルトランスフェラーゼ反応は一般的に、連続的に行われる。なぜなら、大部分のシアリルトランスフェラーゼは、フコシル化されたアクセプターに対して活性ではないからである。しかし、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリル化されたアクセプターのみに対して作用する。従って、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリルトランスフェラーゼと共に、同時性の反応において使用され得る。
【０１６６】
トランス−シアリダーゼを使用してシアリル化を達成する場合、フコシル化反応およびシアリル化反応は、同時的に、またはいずれかの順番で連続的にのいずれかで行われ得る。修飾される基質は、適切な量のトランス−シアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を形成し得る）および適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を含む反応混合物と共にインキュベートされる。
【０１６７】
本発明における使用に適切であるシアリルトランスフェラーゼの例としては、以下が挙げられる：ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩ（本明細書中で使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法は、ＴｓｕｊｉらＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）に記載されるとおりである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）として引用される例示のα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃジサッカリドまたはグリコシドの非還元性末端Ｇａｌに転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示のα２，３シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．４）は、シアル酸を、ジサッカリドまたはグリコシドの非還元性末端Ｇａｌに転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４（１９９２）を参照のこと。さらなる例示の酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４）を参照のこと）。α−２，８シアリルトランスフェラーゼをまた使用して、第２のシアル酸残基または複数のシアル酸残基を、本発明の方法において有用な基質に結合し得る。なおさらなる例は、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｃｐｓＫ遺伝子として知られるＳＴ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ由来のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（１ｓｔ遺伝子として知られる）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ由来のα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＨＩ０８７１遺伝子として知られる）である。Ｃｈａｆｆｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１０９−１２２（２００２）を参照のこと。
【０１６８】
（表１：アクセプター基質としてＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列を使用するシアリルトランスフェラーゼ）
【０１６９】
【表１】
2005500058.tif 000010
１)Ｇｏｏｃｈｅｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９:１３４７−１３５５(１９９１)
２)Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１２０:１０４−１１０(１９９６)
３)Ｇｉｌｂｅｒｔら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７１:２８２７１−２８２７６(１９９６）。
【０１７０】
特許請求している方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩであり、これはまた、α(２，３)シアリルトランスフェラーゼ(ＥＣ  ２．４.９９．６）と称される。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃグリコシドまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し(例えば、Ｗｅｎら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６７:２１０１１(１９９２）;Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５６:３１５９(１９９１)を参照のこと)、そして、この酵素は、糖ペプチドにおけるアスパラギン連結オリゴサッカリドのシアリル化を担う。このシアル酸は、Ｇａｌに連結して、２つのサッカリドの間にα結合を形成する。サッカリド間の結合（連結）は、ＮｅｕｌＡｃの２位とＧａｌの３位との間に存在している。この具体的な酵素は、ラットの肝臓(Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２５７:１３８４５(１９８２))から単離され得;ヒトのｃＤＮＡ(Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:２２７８２−２２７８７;ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ(１９９４)Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６９:１３９４−１４０１)およびゲノム(Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６)Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７１：９３１−９３８)のＤＮＡ配列が知られており、組み換え発現によるこの酵素の産生が容易に行われる。好ましい実施形態において、この特許請求されるシアリル化法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０１７１】
本発明の用途における他の例示的なシアリルトランスフェラーゼとしては、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉから単離されるシアリルトランスフェラーゼ（α(２，３)シアリルトランスフェラーゼを含む）が挙げられる。例えば、Ｗ０９９／４９０５１を参照のこと。別の実施形態において、本発明は、二機能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性とα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する。この二機能性シアリルトランスフェラーゼは、適切なサッカリドアクセプター(例えば、末端のガラクトースを有するサッカリド）およびシアル酸ドナー(例えば、ＣＭＰシアル酸)との混合物中におかれた場合、ドナーからα２，３結合におけるアクセプターへの第１のシアル酸の転移を触媒し得る。次いで、このシアリルトランスフェラーゼは、ドナーからα２，８結合おける第１のシアル酸残基への第２のシアル酸の転移を触媒し得る。この型のＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ構造は、ガングリオシドにおいてしばしば、見出される。例えば、欧州特許出願第１１４７２００号を参照のこと。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、本方法において使用されるシアリル化法は、組換え的に産生されるかまたは天然の細菌細胞において産生されるかのいずれかの、細菌のシアリルトランスフェラーゼの使用を通して市販における実用性を増大させた。以下のような２つの細菌シアリルトランスフェラーゼが近年報告された：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ由来のＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ(Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９６)Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１２０:１０４−１１０)およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ(Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６)Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７１:２８２７１−２８２７６。これらの２つの最近記載された細菌酵素は、オリゴサッカリド基質上のＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列へとシアル酸を転移する。
【０１７３】
最近報告されたウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼはまた、本発明のシアリル化法において適切に使用される(Ｓｕｊｉｎｏら（２０００)Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０:３１３−３２０）。この酵素ｖ−ＳＴ３ＧａｌＩは、Ｍｙｘｏｍａウイルス感染細胞から得られ、そして、それぞれの代表的なアミノ酸配列の比較によって示されるように、この酵素は哺乳動物のＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶに関連するのは明白である。ｖ−ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉは、Ｉ型（Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβｌ−Ｒ）アクセプター、ＩＩ型（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−βｌ−Ｒ)アクセプターおよびＩＩＩ型(Ｇａｌβｌ，３ＧａｌＮＡｃβｌ−Ｒ)アクセプターのシアリル化を触媒する。この酵素はまた、フコシル化アクセプター部分(例えば、ＬｅｗｉｓＸおよびＬｅｗｉｓａ）へとシアル酸を転移させ得る。
【０１７４】
（３．ガラクトシルトランスフェラーゼ）
実施形態の別の群において、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的ガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α(１，３)ガラクトシルトランスフェラーゼ(Ｅ.Ｃ.番号２．４.１．１５１。例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５:２９２１(１９９３)ならびにＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５:２２９−２３３(１９９０）を参照のこと。ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９，Ｊｏｚｉａｓｓｅら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６４:１４２９０−１４２９７(１９８９)）、マウス(ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５;Ｌａｒｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６:８２２７−８２３１(１９８９)）、ブタ(ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１:１０１−１０５(１９９５)についても参照のこと）が挙げられる。別の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ(ＥＣ  ２．４.１．３７，Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６５:１１４６〜１１５１(１９９０）(ヒト））である。
【０１７５】
β(１，４)ガラクトシルトランスフェラーゼがまた、本発明の方法における用途について適切であり、これは、例えば、ＥＣ  ２．４.１．９０(ＬａｃＮＡｃシンターゼ)およびＥＣ  ２．４.１．２２(ラクトースシンターゼ）(ウシ(Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら，Ｅｕｒ.Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１８３:２１１−２１７(１９８９)）、ヒト(Ｍａｓｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ.１５７:６５７−６６３(１９８８））、マウス(Ｎａｋａｚａｗａら，Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.１０４:１６５−１６８(１９８８)）、ならびにＥ．Ｃ.２．４.１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ(ＥＣ  ２．４.１．４５，Ｓｔａｈｌら，Ｊ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.Ｒｅｓ.３８:２３４−２４２(１９９４)）を含む。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ(これは、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに由来する。Ｃｈａｐｅｌｌら，Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.Ｃｅｌｌ  ５:５１９−５２８(１９９４)）が挙げられる。他の１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、グロボシドを産生するために使用される１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼである。哺乳動物の酵素および細菌の酵素の両方が使用される。
【０１７６】
遺伝学的操作によってクローニングされた遺伝子に由来する酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ−ＸＩＶのようなタンパク質の産生は、周知である。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号を参照のこと。ある方法は、十分なサンプルの収集の必要を伴い、次いで、この酵素のアミノ酸配列は、Ｎ−末端配列決定によって決定される。次いで、この情報を使用して、全長（膜結合）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離し、その発現に基づいて、昆虫細胞株Ｓｆ９中で発現されると完全に活性な酵素の合成を生じる。次いで、この酵素のアクセプター特異性は、１６の様々なタンパク質における既知のグリコシル部位の周辺にあるアミノ酸の半定量的分析、その後の合成ペプチドのインビトログリコシル化研究を使用して決定され得る。この研究によって、特定のアミノ酸残基がグリコシル化されたペプチドセグメントにおいて過剰発現していること、およびグリコシル化されたセリン残基およびスレオニン残基の周辺の特定の位置の残基は、他のアミノ酸部分よりも、アクセプター効率に対する顕著な影響を有し得ることが証明された。
【０１７７】
本発明の用途における他の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる。適切な反応媒体中におかれると、このβ−１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、ドナー(例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ)から適切なサッカリドアクセプター（例えば、末端のＧａｌＮＡｃ残基を有しているサッカリド）へのガラクトース残基の転移を触媒する。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ（例えば、Ｃ.ｊｅｊｕｎｉ）によって産生されるβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼである。本発明の好ましいβ１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼは、Ｃ.ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４株のβ１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼである。
【０１７８】
ガラクトシルトランスフェラーゼを使用する本発明の方法によって形成される化合物における例示的な連結（結合）としては、以下が挙げられる：(１）Ｇａｌβｌ→４Ｇｌｃ；(２）Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ；(３）Ｇａｌβｌ→３ＧｌｃＮＡｃ；(４）Ｇａｌβ１→６ＧｌｃＮＡｃ；(５）Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ；(６）Ｇａｌβ１→６ＧａｌＮＡｃ；(７）Ｇａｌα１→３ＧａｌＮＡｃ；(８）Ｇａｌα１→３Ｇａｌ；(９）Ｇａｌα１→４Ｇａｌ；(１０）Ｇａｌβ１→３Ｇａｌ；(１１）Ｇａｌβ１→４Ｇａｌ；(１２）Ｇａｌβ１→６Ｇａｌ；(１３）Ｇａｌβ１→４キシロース；(１４）Ｇａｌβ１→１’−スフィンゴシン；(１５）Ｇａｌβｌ→１’−セラミド；(１６）Ｇａｌβ１→３ジグリセリド；(１７）Ｇａｌβ１→Ｏ−ヒドロキシリジン；ならびに(１８）Ｇａｌ−Ｓ−システイン。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号;および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０１７９】
（４.トランスシアリダーゼ）
上記のように、本発明のプロセスは、少なくとも１つの工程を包含し、この工程において、シアル酸の部分が、トランスシアリダーゼを使用して基質に付加される。本明細書中で使用する場合に、用語「トランスシアリダーゼ」は、α２，３グリコシド結合を介するガラクトースへのシアル酸の付加を触媒する酵素をいう。トランスシアリダーゼは、多くのＴｒｙｐａｎｏｓｏｍｙ種およびいくつかの他の寄生生物において見出されている。これらの寄生生物のトランスシアリダーゼは、かなり低い効率であるが、通常のシアリダーゼの加水分解活性を保持しており、そして、ＣＭＰ−シアル酸の非存在下で宿主のシアログリコ結合体（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）から寄生生物の表面糖タンパク質への末端シアル酸の可逆的転移を触媒する。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉ（これはシャガス病を引き起こす）は、表面トランスシアリダーゼ（殆どのシアリダーゼの代表的な加水分解反応の代わりに、末端βガラクトシル残基を含むアクセプターにα−２，３結合シアル酸の転移を優勢に触媒する酵素）を有する（Ｒｉｂｅｉｒａｏら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ.７:１２３７−１２４６(１９９７）;Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２３０:３３３−３４２(１９９５）;Ｓｃｕｄｄｅｒら，Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２６８:９８８６−９８９１(１９９３）;ならびにＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ.２:５４１−５４８(１９９２））。Ｔ.ｃｒｕｚｉトランスシアリダーゼ(ＴｃＴｓ)は、サッカリドアクセプター、グリコリピドアクセプター、および糖タンパク質アクセプターの広範囲のものに対する活性を有しており、このＴｃＴｓは、β結合ガラクトース残基で終わり、そして排他的にα２−３シアロシド結合を合成する(Ｓｃｕｄｄｅｒら，前出）。低い速度で、ＴｃＴｓはまた、合成α−シアロシド（α−ｓｉａｌｏｓｉｄｅ）（例えば、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸）からシアル酸を転移させるが、ＮｅｕＡｃ２−３Ｇａｌβｌ−４(Ｆｕｃα１−３)Ｇｌｃは、ドナー基質ではない。Ｎ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸の改変された２−［４−メチルウンベリフェロン］−α−ケトシド(４ＭＵ−ＮＡＮＡ)およびそれらのいくつかの誘導体はまた、ＴｃＴｓにとってのドナーとしての役割を担う(ＬｅｅおよびＬｅｅ，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２１６:３５８〜３６４(１９９４)）。３’−シアリル−ラクト−Ｎ−ビオース  Ｉの酵素合成は、アクセプターとしてのラクト−Ｎ−ビオース  ＩとＮ−アセチルノイラミニル部分（ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｌ  ｍｏｉｅｔｙ）のドナーとしての２’−(４−メチルウンベリフェリン）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン（ａｃｅｌｙｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ）(Ｖｅｔｅｒｅら，Ｅｕｒ.Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２６７:９４２−９４９(２０００)）からＴｃＴｓによって触媒された。α２，３シアリル化結合体を合成するためにトランスシアリダーゼを使用することに関するさらなる情報は、欧州特許出願第０  ５５７  ５８０  Ａ２号および米国特許第５，４０９，８１７号（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）においても見出され得る。ｌｅｅｃｈ  Ｍａｃｒｏｂｄｅｌｌａ  ｄｅｃｏｒａに由来する分子間���ランスシアリダーゼは、シアログリコ結合体（ｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）における末端のＮｅｕ５Ａｃ（Ｎ−アセチルノイラミン酸）α２，３Ｇａｌ結合の切断に対して厳密な特異性を提示し、そして、分子間トランスシアロシル反応を触媒する(Ｌｕｏら，Ｊ．Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２８５:３２３−３３２(１９９９））。トランスシアリダーゼは、主に、ガラクトースアクセプターに対してシアル酸を付加するが、トランスシアリダーゼは、他のいくつかの糖に対してシアル酸を転移させる。しかし、ＧａｌＮＡｃへのシアル酸の転移は、シアリルトランスフェラーゼを必要とする。トランスシアリダーゼの用途についての更なる情報は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９３／１８７８７;およびＶｅｔｅｒｅら，Ｅｕｒ．Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.２４７:１０８３−１０９０(１９９７）に見出され得る。
【０１８０】
（５．ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドを使用し得る。このβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、反応混合物中に置かれると、ドナー(例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ)から適切なアクセプターサッカリド(代表的には、末端のガラクトース残基を有するサッカリド）へのＧａｌＮＡｃ残基の転移を触媒する。この得られた構造である、ＧａｌＮＡｃβ１，４−Ｇａｌ−は、多くのサッカリド化合物の中でも、ガングリオシドおよび他のスフィンゴイド（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ）において見出される。
【０１８１】
本発明で有用なβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ.ｊｅｊｕｎｉ）によって産生される。本発明において好ましいβ１，４  ＧＡｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｃ.ｊｅｊｕｎｉ  ＯＨ４３８４株のβ１，４  ＧＡｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドである。
【０１８２】
本発明の用途の例示的なＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、以下の連結を形成する：(１）（ＧａｌＮＡｃα１→３）［（Ｆｕｃα１→２）］Ｇａｌβ−；(２）ＧａｌＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；(３）ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ；(４）ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌ；(５）ＧａｌＮＡｃαｌ→３ＧａｌＮＡｃ；(６）（ＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＵＡβ１→３）ｎ；(７）（ＧａｌＮＡｃβ１→４１ｄＵＡα１→３−）ｎ；(８）Ｍａｎβ→ＧａｌＮＡｃαＧｌｃＮＡｃαＡｓｎ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号;および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０１８３】
（６．ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明は、必要に応じて、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを利用する。本発明の実施において有用な例示的Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、以下の連結を形成し得る：(１）ＧｌｃＮＡｃβ1→４ＧｌｃＮＡｃ；(２）ＧｌｃＮＡｃβ→Ａｓｎ；(３）ＧｌｃＮＡｃβ１→２Ｍａｎ；(４）ＧｌｃＮＡｃβ→４Ｍａｎ；（５)ＧｌｃＮＡｃβ→６Ｍａｎ；(６)ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｍａｎ；(７）ＧｌｃＮＡｃα１→３Ｍａｎ；(８）ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌ；(９）ＧｌｃＮＡｃβｌ→４Ｇａｌ；(１０）ＧｌｃＮＡｃβｌ→６Ｇａｌ；(１１）ＧｌｃＮＡｃαｌ→４Ｇａｌ；(１２）ＧｌｃＮＡｃαｌ→４ＧｌｃＮＡｃ；(１３）ＧｌｃＮＡｃβｌ→６ＧａｌＮＡｃ；(１４）ＧｌｃＮＡｃβ１→３ＧａｌＮＡｃ；(１５）ＧｌｃＮＡｃβ→４ＧｌｃＵＡ；(１６）ＧｌｃＮＡｃαｌ→４ＧｌｃＵＡ；(１７）ＧｌｃＮＡｃα１→４ＩｄＵＡ。例えば、米国特許第６，２６８，１９３号;および同第５，６９１，１８０号を参照のこと。
【０１８４】
（７．複数酵素オリゴサッカリ合成）
上で議論したように、いくつかの実施形態において、２以上の酵素を使用して、所望のオリゴサッカリド部分を形成する。例えば、特定のオリゴサッカリド部分は、所望の活性を提示するために、ガラクトース、シアル酸、およびフルクトースの付加を必要とする。したがって、本発明は、２以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、トランスシアリダーゼ、またはスルホトランスフェラーゼ）を使用して所望するオリゴサッカリド決定基の高収量合成を得る方法を提供する。
【０１８５】
いくつかの場合、基質結合オリゴサッカリドは、基質のインビボ生合成の際の目的とする特定のグリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプター部分を含む。このような基質は、この基質のグリコシルパターンを事前に改変することなしに本発明の方法を使用してグリコシル化され得る。しかし、他の場合において、目的の基質が、適切なアクセプター部分を欠いている。このような場合、本発明の方法を使用して、基質のグリコシル化パターンを改変し得、その結果、次いで、基質結合オリゴサッカリドが、事前に選択された目的のサッカリド単位のグリコシルトランスフェラーゼ触媒結合部位のためのアクセプター部位を含み、所望のオリゴサッカリド決定基を形成する。
【０１８６】
基質結合オリゴサッカリドは、必要に応じて、はじめ、全体または部分的のいずれかにおいて「トリミング（ｔｒｉｍ）」され、グリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプター部分または１以上の適切な残基が適切なアクセプターを得るために付加され得る部位のいずれかに曝露され得る。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素は、付加反応およびトリミング反応にとって有用である。
【０１８７】
例示的な実施形態において、上記の節で記載した複数酵素法は、以下を含むサッカリドの形成にいたる：ＧａＩＮＡｃ、グルコース、ガラクトース、フコース、およびシアル酸。
【０１８８】
シアリルトランスフェラーゼまたはトランスシアリダーゼ(α２，３−連結シアル酸についてのみ)のいずれかは、このような方法において使用され得る。このトランスシアリダーゼ反応は、改変されるたんぱく質と反応混合物をインキュベートする工程を包含し、この反応混合物は、以下を含む：適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー(例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、トランスシアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ(これは、α１，３連結またはα１，４連結を生成し得る）、適切なフコシルドナー基質(例えば、ＧＤＰ−フコース）、および二価金属イオン。これらの反応は、連続的または同時にのいずれかで実施され得る。
【０１８９】
シアリルトランスフェラーゼが使用されると、例示的な実施形態において、この方法は、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー(例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、シアリルトランスフェラーゼ（α２，３またはα２，６)ならびに適切なシアル酸ドナー基質(例えば、ＣＭＰシアル酸）を含む反応混合物と共に改変されるタンパク質をインキュベートする工程を包含する。この反応は、完結するまで実質的に進行することが可能となり、次いで、フコシルトランスフェラーゼ(これは、α１，３連結またはα１，４連結を生成し得る)および適切なフコシルドナー基質(例えば、ＧＤＰ−フコース)が付加される。シアリル化した基質(例えば、ＦｕｃＴ  ＶＩＩ）を必要とするフコシルトランスフェラーゼが使用される場合、この反応は同時に実施され得る。
【０１９０】
（８．グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物）
グリコシルトランスフェラーゼ、基質および上述のような他の反応混合物成分は、反応媒体水溶液（溶液）中で混合することよって合わせられる。この媒体は一般的に、約５〜約９のｐＨ値を有している。媒体の選択は、この媒体が所望のレベルでｐＨ値を維持する能力に依存している。したがって、いくつかの実施形態において、この媒体は、約７．５のｐＨ値に緩衝化する。緩衝剤が使用されない場合、この媒体のｐＨは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに依存して約５〜８．５に維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼについて、このｐＨ範囲は、好ましくは、約７．２〜約７．８に維持されている。シアリルトランスフェラーゼについて、この範囲は、好ましくは、約５．５と約６．５との間にある。適切な塩基は、ＮａＯＨであり、好ましくは、６Ｍ  ＮａＯＨである。
【０１９１】
酵素の量または濃度は、活性単位で表現され、これは触媒反応の初期速度の指標である。１活性単位によって、所定の温度（代表的には３７℃）およびｐＨ値（代表的には７．５）における１分間あたり１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。従って、１０単位の酵素は、温度３７℃かつｐＨ値７．５において１分間で１０μｍｏｌの基質が１０μｍｏｌの生成物に変換されるときの触媒量の酵素である。
【０１９２】
反応媒体はまた、必要とされる場合、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ)および有機溶媒（例えば、メタノールまたはエタノール）を含み得る。これらの酵素は、溶液中に遊離して使用され得るかまたはポリマーのような支持体に結合してされ得る。したがって、この反応混合物は開始時において実質的に一様であるが、いくらかの沈降物が、その反応の間に形成し得る。
【０１９３】
上記の過程が実施される温度は、ちょうど凝固点よりも上から最も感受性の高い酵素が変性する温度までの範囲に及び得る。その温度範囲は、好ましくは、約０℃〜約４５℃であり、そして、より好ましくは、約２０℃〜約３７℃である。
【０１９４】
このように形成された反応混合物は、グリコシル化される基質に結合されるオリゴサッカリド基上に存在する所望のオリゴサッカリド決定基を所望する高収量で取得するのに十分な時間に亘って維持される。大規模調製のために、この反応物は、８時間〜２４０時間に亘って進行されることがしばしば可能であり、１２時間と７２時間との間の時間が最も代表的である。
【０１９５】
１より多くのグリコシルトランスフェラーゼを使用して実質的に一様な基質を有する基質の組成物を得る実施形態において、第２のグリコシルトランスフェラーゼ反応のための酵素および試薬は、第１のグリコシルトランスフェラーゼ反応が完結に近づいて直に反応媒体に付加され得る。酵素のいくつかの組合せのために、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する基質が、単一の初期反応混合物中に合わされ得;このような同時反応における酵素は、好ましくは、他の酵素のためのアクセプターとしての役割を果たしえない生成物を形成しない。例えば、殆どのシアリルトランスフェラーゼは、フコシル化したアクセプターをシアリル化せず、その結果、シアリル化されたアクセプター上でのみで機能するフコシルトランスフェラーゼ(例えば、ＦｕｃＴ  ＶＩＩ）が使用されない限り、両方の酵素による同時反応は、最も可能性のある場合として、所望のオリゴサッカリド決定基の所望する高収量を生じない。単一のベッセル中で連続した２つのグリコシルトランフェラーゼ反応を実施することによって、全体の収量は、中間体種を単離する手順よりも改善される。さらに、余分な溶媒および副産物の浄化処理および廃棄処理が軽減される。
【０１９６】
１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応が、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部分として実施され得る。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明が記載されている。多くのグリコシルトランスフェラーゼサイクル(例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル，ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル)が、米国特許第５，３７４，５４１号およびＷＯ  ９４２５６１５  Ａに記載される。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、ＩｃｈｉｋａｗａらＪ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.１１４:９２８３(１９９２），ＷｏｎｇらＪ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.５７:４３４３(１９９２），ＤｅＬｕｃａら，Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.１１７:５８６９−５８７０(１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａらＩｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ.Ｙａｌｔａｍｉ編（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）に記載されている。
【０１９７】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルについて、このプロセスにおいて使用される種々の反応物の濃度および量は、反応条件（例えば、温度およびｐＨ値）およびグリコシル化されるアクセプターサッカリドの選択および量を含む多くの因子に依存する。このグリコシル化プロセスによって、触媒量の酵素の存在下ので、活性化ヌクレオチド、活性化されたドナー糖の再生および産生されたＰＰｉの回収が可能となるので、このプロセスは、上で議論した立体化学的基質の濃度または量によって制限される。本発明の方法に従って使用され得る反応物の濃度についての制限は、このような反応物の安定性によって決定される。
【０１９８】
好ましくは、アクセプターが消費されつくされるまでグリコシル化が進行するように、活性化ヌクレオチド、ホスフェートドナー、ドナー糖、および酵素の濃度が選択される。シアリルトランフェラーゼの状況において、以下に議論される考察は、一般に、他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに応用可能である。
【０１９９】
これらの酵素の各々が、触媒量で存在する。この触媒量の特定の酵素は、酵素の基質の濃度ならびに反応条件（例えば、温値、時間およびｐＨ値）に従って変化する。予め選択した基質濃度および反応条件下の所定の酵素のための触媒量を決定するための手段は、当業者にとって周知である。
【０２００】
別の例示的な実施形態において、この反応混合物は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および二価の金属カチオンを含む。この反応媒体における二価の金属カチオンの濃度は、約２ｍＭと約７５ｍＭとの間で維持されており、好ましくは、約５ｍＭと約５０ｍＭとの間で維持されており、そして、より好ましくは、約５ｍＭと約３０ｍＭとの間で維持されている。
【０２０１】
反応媒体中の金属イオン濃度を周期的にモニタリングし、そして、さらなる量の二価金属イオンをこの媒体に供給することによって、この反応サイクルは、適切な時間枠内で完結するように駆動され得る。さらに、１より多くのグリコシルトランスフェラーゼが使用される場合、構成的なサイクルが、中間生成物を単離することなしに同一の反応溶液内で実施され得る。さらに、阻害性ピロホスフェートを取り除くことによって、この反応サイクルは、実質的に高度の基質（アクセプター）濃度で実施され得る。本発明の使用において好ましい二価金属イオンとしては、Ｍｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃｏ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｚｎ＋＋およびそれらの組合せが挙げられる。より好ましくは、この二価金属イオンは、Ｍｎ＋＋である。
【０２０２】
さらなる例示的な実施形態において、この方法は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）を、１ｍｇの糖タンパク質あたり約５０ｍＵ以下の濃度、好ましくは１ｍｇ糖タンパク質あたり約５〜２５ｍＵの間の濃度で使用して方法が実施される。代表的には、反応混合物中のシアリルトランスフェラーゼの濃度は、１０〜５０ｍＵ／ｍｌであり、この糖タンパク質濃度は、少なくとも約２ｍｇ／反応混合物ｍｌである。好ましい実施形態において、本方法は、サッカリド上の適切なグリコシルアクセプター部分の約８０％を超えるグリコシル化（例えば、シアリル化）を生じる。一般に、約８０％を超えるグリコシル化を得るための必要時間は、約４８時間以下である。
【０２０３】
（９．他のグリコシルトランスフェラーゼ）
他のグリコシルトランスフェラーゼを、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載されたのと同様のトランスフェラーゼサイクルにて置換し得る。特に、このグリコシルトランスフェラーゼは、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４）））、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（例えば、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））であり得る。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１，Ｈｕｌｌら，ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩ、およびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２）およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。適切なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０２０４】
（１０．精製）
上記のプロセスによって生成された生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、いくつかの適用では、基質を精製することが所望される。基質の精製についての標準的な周知技術が適切である。アフィニティクロマトグラフィーは、適切な精製方法の一例である。特定の基質または基質上の特定のオリゴサッカリド決定基に対して親和性を有するリガンドを、クロマトグラフィーマトリクスに結合させ、そしてそのマトリクスを通して、基質組成物を通過させる。必要に応じて行われる洗浄工程の後で、その基質をそのマトリクスから溶出する。
【０２０５】
濾過もまた、基質の精製のために使用され得る(例えば、米国特許第５，２５９，９７１号および同第６，０２２，７４２号を参照のこと）。
【０２０６】
基質の精製が所望される場合、その基質は、実質的に精製された形態で回収されることが好ましい。しかし、いくつかの適用では、基質の精製なしかまたは中程度のレベルのみの基質の精製が必要とされる。
【０２０７】
さらに、本発明の別の局面に従って、膜および有機溶媒を使用して、反応生成物（例えば、本発明のプロセスに従って調製される反応生成物）を精製する改善された方法が提供される。糖脂質およびグリコスフィンゴリピドが、この精製方法によって精製され得る。本明細書中に記載される任意の酵素反応生成物が、この精製方法に従って精製され得る。この方法は、有機溶媒の添加を伴いながら、膜精製系において反応生成物を濃縮する工程を包含する。適切な溶媒としては、アルコール（例えば、メタノール）、ハロカーボン（例えば、クロロホルム）、および炭化水素とアルコールとの混合物（例えば、キシレン／メタノール）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、この溶媒はメタノールである。この濃縮工程は、任意の選択された程度まで、反応生成物を濃縮し得る。例示的な実施形態において、濃縮の程度は、約１倍〜約１００倍（約５倍〜約５０倍を含み、また、約１０倍〜約２０倍を含む）である。膜精製系は、当業者に公知の種々のこのような系から選択される。好ましい実施形態において、膜精製系は、１０Ｋ中空繊維の膜精製系である。例示的な実施形態において、この方法は、１０Ｋ中空繊維の膜精製系を使用して、反応生成物を約１０倍に濃縮する工程、水を添加し、そして最初の容量の約１／１０までその溶液をダイアフィルトレーションする工程、滞留物にメタノールを添加する工程、およびダイアフィルトレーションして、その反応生成物を浸透液に通過させる工程、を包含する。この浸透溶液の濃縮により、反応生成物が生じる。
【０２０８】
上記のプロセスによって生成された生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層クロマトグラフィーもしくは厚層（ｔｈｉｃｋ  ｌａｙｅｒ）クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過のような、グリコシル化サッカリドの回収のための標準的な周知技術が使用され得る。膜濾過を使用すること、より好ましくは、逆浸透膜を利用すること、または本明細書中以降および本明細書中に引用される参考文献において考察されるような、回収のための１つ以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。例えば、膜濾過（ここで、膜は約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する）を使用して、グリコシルトランスフェラーゼのようなタンパク質を除去し得る。次いで、ナノ濾過または逆浸透を使用して、塩を除去し得、および／または生成物のサッカリドを精製し得る（例えば、ＷＯ  ９８／１５５８１を参照のこと）。ナノ濾過膜は、使用される膜に依存して、一価の塩を通過させるが、約１００ダルトン〜約２，０００ダルトンより大きな多価の塩および無電荷の溶質を保持する、逆浸透膜の一種である。従って、代表的な適用において、本発明の方法によって調製されるサッカリドは、この膜に保持され、そして夾雑している塩は通り抜ける。
【０２０９】
本発明の方法によって調製される化合物は、以下から選択される１つ以上の工程によって、不純物から分離され得る：イムノアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはカルボキシメチル基またはスルホプロピル基を含むマトリクスにおいて）、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＷＧＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃｏｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、またはプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにおけるクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ（例えば、付加された脂肪族基を有するシリカゲル）、ゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用する）、および化合物を選択的に結合するカラムにおけるクロマトグラフィー。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明の方法によって化合物を生成する系に由来する上清を、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。この濃縮工程の後で、濃縮物を、適切な精製マトリクスに適用し得る。例えば、適切なアフィニティマトリクスとしては、適切な支持体に結合された糖脂質についてのリガンドを含み得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリクスまたは基質）を使用し得る。適切なマトリクスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において通常使用される他の型のものが挙げられる。あるいは、カチオン交換工程が使用され得る。適切なカチオン交換体としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリクスが挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。
【０２１１】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチド改変体組成物をさらに精製し得る。前述の精製工程のいくつかまたはすべてはまた、種々の組み合わせにおいて、均一な改変糖タンパク質を提供するために使用され得る。
【０２１２】
大規模発酵から得られる本発明の糖脂質は、Ｕｒｄａｌら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４）に開示される方法と類似の方法によって精製され得る。この参考文献は、分取用ＨＰＬＣカラムにおける組換えヒトＩＬ−２の精製のための２つの連続的なＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載している。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーのような技術を使用して、改変糖脂質を精製し得る。
【０２１３】
（結合体化）
本発明の方法によって生成される化合物で、その未結合形態にあるものは、一般的に、治療剤として有用である。本発明の化合物は、広範な種々の化合物に結合体化されて、特異的な標識、プローブ、分離媒体、診断用試薬および／または治療用試薬などを作製し得る。本発明の化合物を結合体化し得る種の例としては、例えば、生体分子（例えば、タンパク質（例えば、抗体、酵素、レセプターなど）、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡなど））、生物活性分子（例えば、薬物、毒素など）、検出可能な標識（例えば、発蛍光団、放射性同位元素）、固体支持体（例えば、ガラスまたはポリマー性のビーズ、シート、繊維、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース）、スライド（例えば、ガラス、石英））およびプローブ；などが挙げられる。
【０２１４】
（リンカー）
本発明の化合物は、その化合物を基に連結する１つ以上のリンカー部分で官能化され得、このリンカーを通して化合物は、必要に応じて、別の種に繋がれ得る。このリンカーは、グリコシル部分（例えば、シアル酸）に付着され得、このグリコシル部分は、その改変にもかかわらず、適切なグリコシルトランスフェラーゼについての基質として役立つ。
【０２１５】
本発明の方法において使用するための改変された糖の調製は、糖残基への改変基の結合、およびグリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物の形成を包含する。従って、架橋剤を使用して、改変基と糖とを結合体化させることがしばしば好ましい。炭水化物部分に改変基を結合させるために使用され得る例示的な二官能性化合物としては、二官能性のポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられるが、これらに限定されない。他の分子に炭水化物を連結させるための一般的なアプローチは、文献において公知である。例えば、Ｌｅｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１８５６（１９８９）；Ｂｈａｔｉａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９）；Ｊａｎｄａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６（１９９０）およびＢｅｄｎａｒｓｋｉら，ＷＯ  ９２／１８１３５を参照のこと。以下に続く考察において、反応性基は、新生改変糖の糖部分において良好なものとして（ａｓ  ｂｅｎｉｇｎ）処理される。この考察の焦点は、例示の明確化である。当業者は、この考察が、改変基における反応性基にも同様に関連することを理解する。
【０２１６】
例示的なストラテジーは、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を使用して、保護されたスルフヒドリルを糖に組み込む工程、次いで、改変基における別のスルフヒドリルとのジスルフィド結合の形成のために、そのスルフヒドリルを脱保護する工程、を包含する。
【０２１７】
ＳＰＤＰが、改変糖のグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する能力に悪影響を与える場合には、一連の他の架橋剤のうちの１つ（例えば、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ））を使用して、ジスルフィド結合を形成する。２−イミノチオランは一級アミンと反応して、すぐに、アミン含有分子上の保護されていないスルフヒドリルを組み込む。ＳＡＴＡはまた、一級アミンと反応するが、保護されたスルフヒドリルを組み込む。このスルフヒドリルは後に、ヒドロキシルアミンを使用して脱アセチル化され、遊離のスルフヒドリルを生成する。各々の場合において、組み込まれたスルフヒドリルは、他のスルフヒドリルまたは保護されたスルフヒドリルと自由に反応して、ＳＰＤＰと同様に必要とされるジスルフィド結合を形成する。
【０２１８】
上記のストラテジーは、本発明において使用されるリンカーの例示であり、そして限定ではない。ペプチドに改変基を架橋するための異なるストラテジーにおいて使用され得る他のリンカーが利用可能である。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジドおよびＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、穏やかな過ヨウ素酸塩での処理によって予め酸化された炭水化物部分と反応し、そのようにして、架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩により生成されたアルデヒドとの間でヒドラゾン結合を形成する。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは、糖に対して２−ピリジルチオン保護スルフヒドリル基を導入し、このスルフヒドリル基はＤＴＴで脱保護され得、次いで、成分間におけるジスルフィド結合の形成のような結合体化のために、引き続いて使用され得る。
【０２１９】
ジスルフィド結合形成が、安定な改変糖の生成のために不適切であることが見出された場合には、成分間においてより安定な結合を組み込む他の架橋剤を使用し得る。ヘテロ二官能性架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−γ（ｇａｍａ）−マレイミドブチリルオキシ（ｍａｌｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ））スクシンイミド）およびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は一級アミンと反応し、そのようにして、マレイミド基を成分に導入する。マレイミド基は、引き続いて、他の成分におけるスルフヒドリル（これは、先に言及した架橋剤によって導入され得る）と反応し得、そのようにして、成分間に安定なチオエーテル結合を形成する。成分間における立体障害が、いずれかの成分の活性に、または改変糖がグリコシルトランスフェラーゼ基質として作用する能力に干渉する場合には、成分間に長いスペーサーアームを導入する架橋剤が使用され得る。この架橋剤は、先に言及したいくつかの架橋剤（すなわち、ＳＰＤＰ）の誘導体を含む。従って、有用である適切な架橋剤は豊富に存在し；その各々は、最適なペプチド結合体生成および改変糖生成に対してそれらが有する効果に依存して選択される。
【０２２０】
別の例示的な実施形態において、脂質は、対応するアルデヒドまたはケトンに変換され（例えば、オゾン化によって）、そしてアミン含有キャリア分子は、改変脂質での還元アミノ化を介して誘導体化される。
【０２２１】
種々の試薬が、分子間の化学的架橋によって改変糖の成分を改変するために使用される（架橋試薬および架橋手順の概説については、以下を参照のこと：Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３−６５１，１９７２；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．，およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，ＥＮＺＹＭＥＳ  ＡＳ  ＤＲＵＧＳ．（ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）３９５−４４２頁，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０−６０９，１９８３；Ｍａｔｔｓｏｎら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７−１８３，１９９３（これらはすべて、本明細書中で参考として援用される））。好ましい架橋試薬は、種々のゼロレングス（ｚｅｒｏ−ｌｅｎｇｔｈ）の架橋試薬、ホモ二官能性の架橋試薬、およびヘテロ二官能性の架橋試薬に由来するものである。ゼロレングスの架橋試薬は、外因性物質の導入を全く伴わない、２つの内因性化学基の直接的な結合を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、このカテゴリーに属する。別の例は、カルボキシル基および一級アミノ基の濃縮を誘導してアミド結合を形成する試薬（例えば、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾール）である。これらの化学試薬に加えて、酵素であるトランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ  ２．３．２．１３）が、ゼロレングスの架橋試薬として使用され得る。この酵素は、基質として一級アミノ基を通常使用して、タンパク質に結合したグルタミニル残基のカルボキサミド基において、アシル転移反応を触媒する。好ましいホモ二官能性試薬およびヘテロ二官能性試薬は、アミノ基、スルフヒドリル基、グアニジノ基、インドール基、または非特異的な基と反応性であり得る、２つの同一の部位または２つの異なる部位をそれぞれ含む。
【０２２２】
例示的な実施形態において、本発明は、式Ｉに従う化合物を提供する。ここで、グリコシル残基またはＹから選択されるメンバーは、以下の式：
【０２２３】
【化１６】
2005500058.tif 000011
を有し、ここでＬ１は、置換アルキルまたは非置換アルキル、置換ヘテロアルキルまたは非置換ヘテロアルキル、および置換アリールまたは非置換アリールから選択されるメンバーであり；そしてＹは、保護された反応性官能基または保護されていない反応性官能基、検出可能な標識、および標的化部分から選択されるメンバーである。
【０２２４】
別の例示的な実施形態において、Ｌ１は、エーテルまたはポリエーテルであり、好ましくは、エチレングリコール、エチレングリコールオリゴマー、およびそれらの組み合わせから選択されるメンバーであり、約６０ダルトン〜約１０，０００ダルトン、より好ましくは、約１００ダルトン〜約１，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２２５】
代表的なポリエーテルベースの置換基としては、以下の構造：
【０２２６】
【化１７】
2005500058.tif 000012
が挙げられるが、これらに限定されず、ここでｊは、好ましくは、１以上１００以下の数である。他の官能化ポリエーテルは当業者に公知であり、そして多くのものが、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｍａ）から、市販されている。
【０２２７】
別の好ましい実施形態において、リンカーは、分子または表面にオリゴサッカリド化合物を結合体化させるための反応性基を含む。代表的な有用な反応性基を、以下に続く節において、より詳細に考察する。有用な反応性基に関するさらなる情報は、当業者に公知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６を参照のこと。
【０２２８】
改変グリコシルドナー種（「改変糖」）は、好ましくは、改変糖ヌクレオチド、活性化された改変糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もされていない単純なサッカリドである改変糖から選択される。任意の所望される炭水化物構造が、本発明の方法を使用して、基質に付加され得る。代表的には、この構造はモノサッカリドであるが、本発明は、改変されたモノサッカリド糖の使用に限定されず；オリゴサッカリドおよびポリサッカリドも同様に有用である。
【０２２９】
改変基は、酵素的手段、化学的手段、またはそれらの組み合わせによって糖部分に結合され、それにより改変糖を生成する。糖は、改変部分の結合を可能にする任意の位置で置換され、それらはなお依然として、その糖が、基質に改変糖を連結させるために使用される酵素に対する基質として機能することを可能とする。好ましい実施形態において、シアル酸が糖である場合、そしてそのシアル酸は、ピルビル（ｐｙｒｕｖｙｌ）側の鎖の９位またはシアル酸において通常アセチル化されているアミン部分の５位のいずれかにおいて、改変基により置換されている。
【０２３０】
本発明の特定の実施形態において、改変糖ヌクレオチドは、基質に改変糖を付加するために利用される。改変形態で本発明において使用される例示的な糖ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドモノホスフェート、ヌクレオチドジホスフェート、もしくはヌクレオチドトリホスフェート、またはそれらのアナログが挙げられる。好ましい実施形態において、改変糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、改変糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。
【０２３１】
本発明はまた、改変糖（例えば、改変ガラクトース、改変フコースおよび改変シアル酸）を使用して、化合物を合成する方法を提供する。改変シアル酸を使用する場合、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ（α２，３−結合型シアル酸に対してのみ）のいずれかを、これらの方法において使用し得る。
【０２３２】
他の実施形態において、改変糖は、活性化された糖である。本発明において有用である活性化された改変糖は代表的には、活性化された脱離基を含むように合成的に改変されたグリコシドである。本明細書中で使用される場合、用語「活性化された脱離基」は、酵素により調節される求核置換反応において容易に置換される部分をいう。多くの活性化された糖が当該分野で公知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏら，ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２．Ｅｒｎｓｔら編，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００；Ｋｏｄａｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照のこと。
【０２３３】
活性化する基の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。本発明において使用するために好ましい活性化された脱離基は、アクセプターへのグリコシドの酵素的転移をさほど立体的に妨害しない基である。従って、活性化されたグリコシド誘導体の好ましい実施形態としては、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシレートが挙げられ、グリコシルフルオリドが特に好ましい。グリコシルフルオリドの中でも、α−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グルコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアリルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グルコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好ましい。
【０２３４】
例として、グリコシルフルオリドは、まず糖をアセチル化し、次いで、それをＨＦ／ピリジンで処理することによって、遊離の糖から調製され得る。これにより、保護（アセチル化）されたグリコシルフルオリドの熱力学的に最も安定なアノマー（すなわち、α−グリコシルフルオリド）が生成される。安定性の低いアノマー（すなわち、β−グリコシルフルオリド）が所望される場合、それは、過アセチル化された糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌで変換してアノマー性の臭化物または塩化物を生成することによって調製され得る。この中間体を、フッ化物の塩（例えば、フッ化銀）と反応させて、グリコシルフルオリドを生成する。アセチル化されたグリコシルフルオリドは、メタノール（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）中における弱（触媒性）塩基との反応によって脱保護され得る。さらに、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。
【０２３５】
他の活性化されたグリコシル誘導体が、当業者に公知の従来の方法を使用して調製され得る。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化された糖のヘミアセタール形態を塩化メシルで処理することによって、次いで、ベンジル基を除去するための触媒性水素添加によって、調製され得る。
【０２３６】
さらに例示的な実施形態において、改変糖は、触角様の構造を有するオリゴサッカリドである。好ましい実施形態において、触角の１つ以上の末端は改変部分を有する。１つより多くの改変部分が、触角様構造を有するオリゴサッカリドに結合される場合、このオリゴサッカリドは、改変部分を「増幅」するために有用である；ペプチドに結合体化された各オリゴサッカリドユニットは、複数のコピーの改変基をペプチドに結合する。
【０２３７】
（反応性官能基）
上記で考察したように、本発明の特定の化合物は、リンカーアームの成分のような反応性官能基を保有し、これらは、任意のアリール核もしくはアリール核に結合された鎖（例えば、アルキル鎖）またはキレート剤の骨格における任意の位置に位置づけられ得る。これらの化合物を、本明細書中では「反応性リガンド」という。反応性基が、アリール核に繋がれたアルキル鎖または置換アルキル鎖に結合される場合、この反応性基は好ましくは、アルキル鎖の末端の位置に位置づけられる。本発明を実施するにおいて有用な反応性基および反応のクラスは、一般的に、生体結合体化学の分野において周知であるものである。本発明の反応性リガンドに利用可能な現在好ましい反応のクラスは、比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらとしては、求核性置換（例えば、アミンおよびアルコールと、アシルハライド（活性エステル）との反応）、求電子性置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の多重結合への付加（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ反応、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ付加）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよび他の有用な反応が、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６；およびＦｅｅｎｅｙら，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２において考察されている。
【０２３８】
有用な反応性官能基としては、例えば、以下が挙げられる：
（ａ）カルボキシル基およびその種々の誘導体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハライド、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むが、これらに限定されない）；
（ｂ）ヒドロキシル基（これはエステル、エーテル、アルデヒドなどに変換され得る）；
（ｃ）ハロアルキル基（ここで、ハライドは、後に求核性基（例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオンまたはアルコキシドイオン）で置換され得、それによりハロゲン原子の部位において新たな基の供給結合を生じる）；
（ｄ）ジエノフィル基（これはＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応に関与し得る（例えば、マレイミド基）である）。
（ｅ）アルデヒド基またはケトン基（その結果、引き続く誘導体化は、カルボニル誘導体（例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシム）の形成を介して、またはＧｒｉｇｎａｒｄ付加もしくはアルキルリチウム付加のような機構を介して、可能となる）；
（ｆ）スルホニルハライド基（例えば、スルホンアミドを形成するための、アミンとの引き続く反応のため）；
（ｇ）チオール基（これはジスルフィドに変換され得るか、またはアシルハライドと反応し得る）；
（ｈ）アミン基またはスルフヒドリル基（これは、例えば、アシル化、アルキル化または酸化され得る）；
（ｉ）アルケン（これは、例えば、付加環化、アシル化、Ｍｉｃｈａｅｌ付加などを受けえる）；
（ｊ）エポキシド（これは、例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応し得る）；ならびに
（ｋ）ホスホルアミダイトおよび核酸合成において有用な他の標準的な官能基。
【０２３９】
反応性官能基は、これらがオリゴサッカリドを構築するのに必要な反応に関与することも、このような反応を妨害することもないように、選択され得る。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって、反応への関与から保護され得る。当業者は、特定の官能基が選択した一連の反応条件を妨害しないように、この官能基をどのように保護するかを理解している。有用な保護基の例については、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと。
【０２４０】
（検出可能な標識）
例示的な実施形態において、本発明の方法により調製される化合物は、検出可能な標識（例えば、蛍光団または放射性同位体）を含む。この検出可能な標識は、標識されたグリコシル部分が本明細書中で考察されるような適切なグリコシルトランスフェラーゼに対する基質として働くことをなお可能にする様式で、リンカーアームによってグリコシル部分（例えば、シアル酸）に付加し得る。
【０２４１】
標識が使用される本発明の実施形態は、蛍光標識の使用によって例示される。蛍光標識は、その取り扱いにおいてほとんど注意をはらう必要がないという利点、およびハイスループット可視化技術（コンピュータを含む一体型システムにおける分析物の画像のデジタル化を含む光学分析）に受け入れられるという利点を有する。好ましい標識は、代表的に、高い感度、高い安定性、低いバックグラウンド、長い寿命、低い環境感度および標識における高い特異性により特徴付けられる。
【０２４２】
多くの蛍光標識は、本発明の組成物中に組み込まれ得る。多くのこのような標識は、例えば、ＳＩＧＭＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他のメーカーから市販されている。さらに、当業者は、特定の用途に適切な蛍光団をどのように選択するかを理解しており、商業的に容易に入手可能ではない場合、必要な蛍光団を新たに合成し得るか、または市販の蛍光化合物を合成的に改変して所望の蛍光標識を達成し得る。
【０２４３】
（ポリマー）
別の例示的な実施形態において、本発明は、式Ｉに従うサブユニットを含むポリマーを提供する。このポリマーは、合成ポリマー（例えば、ポリ（スチレン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（リジン）、ポリエーテル、ポリイミン、デンドリマー、シクロデキストリンおよびデキストラン）、または生体ポリマー（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体、酵素、血清タンパク質）、サッカリド、核酸、抗原、ハプテンなど）であり得る。ポリマーは、このようなポリマー（例えば、抗体）に付随する活性を有し得るか、またはこのポリマーは、単に、キャリア分子（例えば、デンドリマー）として働き得る。
【０２４４】
キャリア分子はまた、多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔまたはｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）の種（例えば、本発明の化合物のダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高級なホモログ、またはその反応性アナログを含む）である本発明の化合物の骨格として使用され得る。多価の種は、本発明の単一の種または１より多い種から構築され得る。例えば、ダイマー構築物は、「ホモダイマー」または「ヘテロダイマー」であり得る。さらに、本発明の化合物およびその反応性アナログ、がオリゴマーフレームワークまたはポリマーフレームワーク（例えば、ポリリジン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチなど）に結合している多価構築物は、本発明の範囲内である。このフレームワークは、好ましくは、多官能性である（すなわち、本発明の化合物を結合するための、多数の反応性部位を有する）。さらに、このフレームワークは、本発明の単一の種または１より多い本発明の種で誘導体化され得る。
【０２４５】
さらに、キャリア分子の特性は、同様には官能化されない類似の化合物よりも増大した水溶性を有する化合物を提供するように選択され得る。従って、本明細書中に記載される任意の置換基は、増大した水溶性を有する類似の基で置換され得る。例えば、ヒドロキシル基をジオールで、またはアミンを４級アミン、ヒドロキシルアミンまたは類似のより水溶性の部分で置換することは、本発明の範囲内である。好ましい実施形態において、さらなる水溶性は、本明細書中に記載される化合物のイオンチャネルに対する活性に必須ではない部位を、親化合物の水溶性を増大する部分で置換することによって、与えられる。有機化合物の水溶性を増大する方法は、当該分野で公知である。このような方法としては、有機核を、永久的に荷電した部分（例えば、４級アンモニウム）、または生理学的に関連したｐＨで荷電される基（例えば、カルボン酸、アミン）で官能化することが挙げられるが、これに限定されない。他の方法としては、有機核を、ヒドロキシル含有基またはアミン含有基（例えば、アルコール、ポリオール、ポリエーテルなど）に付加することが挙げられる。代表的な例としては、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物に適切な官能化化学および方法論は、当該分野で公知である。例えば、Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．ら編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９巻，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照のこと。
【０２４６】
別の実施形態において、本発明の方法によって生成される化合物は、免疫原性キャリアに結合される。一般的に使用されるキャリアは、高度に免疫原性であり、このキャリアに結合したハプテンに免疫原性を与え得る大分子である。キャリアの例としては、タンパク質、脂質二重層（例えば、リポソーム）、合成ポリマーもしくは天然ポリマー（例えば、デキストラン、アガロース、ポリ−Ｌ−リジン）、または合成有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい免疫原性キャリアは、免疫原性を有し、ハプテンとの結合体化のための接近可能な官能基を有し、ハプテンでの誘導体化の後に適度に水溶性であり、そしてインビボで実質的に非毒性である、キャリアである。本発明の好ましいキャリアとしては、例えば、５０００ダルトン以上の分子量を有するタンパク質キャリア、より好ましくは、アルブミンまたはヘモシアニンが挙げられる。
【０２４７】
本発明の方法によって調製される組成物の免疫原性は、この組成物を、細胞免疫応答を引き起こし得る１つ以上のペプチド配列に連結することによって、さらに増大され得る（例えば、ＷＯ９４／２０１２７を参照のこと）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を刺激するペプチド、およびヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激するペプチドが、本発明の化合物に連結するために有用である。これらのペプチドは、上記のようなリンカー部分によって、連結され得る。例示的なリンカーは、代表的には、生理学的条件下で無電荷の比較的小さな中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）から構成される。
【０２４８】
本発明の方法によって調製される化合物は、集団の大部分においてＴヘルパー細胞により認識されるＴヘルパーペプチドに連結され得る。これは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の多く、ほとんどまたは全てに結合するアミノ酸配列を選択することによって達成され得る。このようなＴヘルパーペプチドの例は、８３０〜８４３位の破傷風トキソイドである（例えば、Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２２３７−２２４２（１９８９）を参照のこと）。
【０２４９】
さらに、本発明の方法によって調製される化合物は、免疫原性を増大するために、複数の抗原決定因子に連結され得る。例えば、複数のＨＬＡ型のＴ細胞による認識を誘導するために、複数の重複Ｔ細胞抗原決定因子（クラスターペプチド）をコードする合成ペプチドを使用して、免疫原性を増大し得る（例えば、Ａｈｌｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５６４７−５６６５（１９９３）を参照のこと）。このようなクラスターペプチドは、重複しているが、異なる抗原決定因子を含む。このクラスターペプチドは、本発明のペプチドによって、共直線的に合成され得る。このクラスターペプチドは、１つ以上のスペーサー分子によって、本発明の化合物に連結され得る。
【０２５０】
クラスターペプチドに連結された本発明の化合物を含むペプチド組成物はまた、ＣＴＬ誘導エピトープに連結されたクラスターペプチドとの結合体化において使用され得る。このような組成物は、代替の経路によって、または異なるアジュバントを使用して、投与され得る。
【０２５１】
あるいは、ＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープをコードする複数のペプチドは、本発明の化合物との結合体化において使用され得る。
【０２５２】
ハプテンをキャリアに連結するための多くの方法が、当業者に公知である。例示的な実施形態において、本発明の方法によって調製される糖脂質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（これはＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で活性化されている）と容易に結合するスルフヒドリル基が挙げられる。Ｄｅｗｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５３７４−５３７８（１９８７）。この方法において有用なスルフヒドリル保有脂質は、当該分野で認識されている多数の方法によって合成され得る。例えば、末端カルボキシル基を有する脂質は、脱水剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））を使用して、システアミンに連結されて、ジスルフィド架橋を介して連結されたダイマー糖脂質が形成される。このジスルフィド架橋は、還元によって切断されて、モノマースルフヒドリル誘導体化糖脂質を与える。
【０２５３】
さらに別の好ましい実施形態において、この組成物は、糖脂質とキャリアとの間に位置するリンカー部分を含む。リンカー部分の特徴についての上記の考察は、この実施形態にも実質的に適用可能である。例示的な実施形態において、リンカーアームは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基を含む。この方法における使用のために適切な二官能性ＰＥＧ誘導体は、市販されている（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）か、または当該分野で周知の方法によって調製され得る。例示的な実施形態において、ＳＭＣＣ活性化ＫＬＨ（前出）は、スルフヒドリル基を有するＰＥＧ−糖脂質結合体と反応する。適切な結合体は、当業者に受入れ可能な多数の合成経路によって調製され得る。例えば、市販の製品（例えば、ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）は、脱水剤（例えば、ＤＣＣ）の存在下で、カルボキシル末端糖脂質と反応し、それにより、この糖脂質のＰＥＧアミドを形成する。ｔ−Ｂｏｃ基は、酸処理（例えば、トリフルオロ酢酸、ＴＦＡ）によって除去されて、糖脂質の保護されたアミノＰＥＧアミドを与える。脱保護された糖脂質は、続いて、スルフヒドリル保護分子（例えば、３−メルカプトプロピオン酸または市販のチオール補とシステインおよびアミン保護システイン）と、脱水剤の存在下で反応する。次いで、チオール基が脱保護され、そしてこの結合体は、ＳＭＣＣ活性化ＫＬＨと反応して、ＰＥＧスペーサー基を介してキャリアに結合した自己誘導性アナログを提供する。
【０２５４】
上記の例示的な実施形態は、特定の本発明の化合物の調製において有用な一般的な反応スキームを例示することを意図し、本発明の範囲および本発明の化合物を生成するために有用な経路を限定すると解釈されるべきではない。
【０２５５】
（標的化部分）
ＴＩＡＭおよび他のキレート剤のためのポリマー「支持体」または骨格を提供することに加えて、キャリア分子は、本発明のリガンド（または複合体）を、身体または組織内の特定の領域に、または選択された種または構造にインビトロで標的化するために、使用され得る。標的領域に対してある親和性での、ある種への結合による因子の選択的標的化は、当該分野で周知である。小分子およびポリマー標的化因子の両方が、本発明における用途を有する。
【０２５６】
リガンド（または複合体）は、標的化因子に結合され得、この標的化因子は、このリガンドを身体の細胞、器官または領域に送達する。例示的な標的化因子（例えば、抗体、レセプターに対するリガンド、レクチン、サッカリド、抗体など）は、当該分野で認識されており、本発明の実施を制限することなく、有用である。他の標的化因子としては、特定の分子認識モチーフ（リガンドに分子量を追加する高分子（例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカリド、ポリアミノ酸など）を含む）を含まないクラスの化合物が挙げられる。本発明のリガンド−標的化因子結合体は、核酸−リガンド結合体の使用によって例示される。例示を明確にし、そして本発明のリガンド（または複合体）が結合体化され得る標的化因子の範囲を限定しないために、リガンド−オリゴヌクレオチド結合体に注目する。さらに、「リガンド」が、有利のリガンドおよびその金属複合体の両方を言及することが理解される。
【０２５７】
例示的な核酸標的因子としては、アプタマー、アンチセンス化合物および三重らせんを形成する核酸が挙げられる。代表的には、糖残基のヒドロキシル基、塩基残基由来のアミノ基、またはヌクレオチドのホスフェート酸素は、ヌクレオチドベースの標的化因子をリガンドに連結するために必要な化学官能基として使用される。しかし、当業者は、他の「非天然」反応性官能基が、従来の技術によって、核酸に付加され得ることを容易に理解する。例えば、糖残基のヒドロキシル基は、当該分野で周知の技術を使用して、メルカプト基またはアミノ基に変換され得る。
【０２５８】
アプタマー（または核酸抗体）は、特定の分子標的に結合する、一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ分子である。一般に、アプタマーは、血液中に循環している標的のプールに結合することによって、分子標的（例えば、タンパク質）の作用を阻害することによって、機能する。アプタマーは、化学官能基を有し、従って、本明細書中で記載されるように、リガンドに供給結合し得る。
【０２５９】
種々の分子標的は、アプタマー（小分子薬物、代謝産物、補因子、毒素、サッカリドベースの薬物、ヌクレオチドベースの薬物、糖タンパク質などを含む）と、非共有的であるが特異的な会合を形成し得るが、一般に、この分子標的は、タンパク質またはペプチド（血清タンパク質、キニン、エイコサノイド、細胞表面分子などを含む）を含む。アプタマーの例としては、Ｇｉｌｅａｄの抗トロンビンインヒビターＧＳ５２２およびその誘導体が挙げられる（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）。Ｍａｃａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７４５−９（１９９３）；Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５５：５６４−５６６（１９９２）、およびＷａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１８９９−９０４（１９９３）もまた参照のこと。
【０２６０】
所定の生体分子に特異的なアプタマーは、当該分野で公知の技術を使用して同定され得る。例えば、Ｔｏｏｌｅら（１９９２）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１４８４３；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９１）ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９８１３；ＷｅｉｎｔｒａｕｂおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（１９９２）ＰＣＴ公開番号９２／０５２８５；ならびにＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８（１９９０）を参照のこと。簡潔には、これらの技術は、代表的に、分子標的と、オリゴヌクレオチドのランダム混合物との複合体化を包含する。アプタマー−分子標的複合体は、複合体化していないオリゴヌクレオチドから分離される。このアプタマーは、分離された複合体から回収され、そして増幅される。この分子標的に対する最高の親和性を有するアプタマー配列を同定するために、このサイクルが繰り返される。
【０２６１】
（切断可能基）
本発明はまた、結合（これはサッカリド結合体を切断して、遊離させるように設計される）を介して、別の部分（例えば、ポリマー、標的化部分、検出可能な標識、固体支持体）に結合したオリゴサッカリド結合体を調製する方法を提供する。切断可能基としては、可逆性（例えば、容易に加水分解される）の結合、または部分的に可逆性（例えば、部分的にまたはゆっくりと加水分解される）の結合が挙げられる。この結合の切断は、生物学的プロセスまたは生理学的プロセスを介して生じ得る。他の実施形態において、生理学的プロセスは、因子とデンドリマーとの間の結合の切断の前に、複合体内の他の位置の結合を切断し（例えば、他の場合には感受性の化学官能基に連結されたエステル基または他の保護基を除去する）、部分的に分解された複合体を生じる。他の切断もまた、例えば、スペーサーと標的化因子との間、およびスペーサーとリガンドとの間で生じ得る。
【０２６２】
例示的な実施形態において、本発明の方法において使用される結合は、酵素（例えば、非特異的アミノペプチダーゼまたはエステラーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ、血液凝固カスケートのプロテアーゼなど）によって、分解される。
【０２６３】
あるいは、切断は、非酵素プロセスを介する。例えば、化学的加水分解は、複合体により引き起こされるｐＨの差異により開始され得る。このような場合において、この複合体は、送達ビヒクル中の酸性または塩基性のｐＨにおいてより高い安定性を示すものの、７．４の生理学的ｐＨにおける、高い化学的不安定度によって特徴付けられ得る。このようなプロセスにおいて切断される例示的な複合体は、Ｎ−Ｍａｎｎｉｃｈ塩基結合をそのフレームワーク内に組み込む複合体である。
【０２６４】
切断可能な化合物の別の例示的な群は、本明細書中で考察される非共有結合性タンパク質結合基に基づく群である。分解に対する切断可能基の感受性は、この群の加水分解変換または酵素変換の研究によって確認され得る。一般に、インビトロ活性とインビボ活性との間の良好な相関が、この方法を使用して見出される。例えば、Ｐｈｉｐｐｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７８：３６５（１９８９）を参照のこと、この変換の割合は、例えば、分光光度法によって、または気体−液体クロマトグラフィーもしくは高圧液体クロマトグラフィーによって、容易に決定される。次いで、半減期および他の力学的パラメーターが、標準的な技術を使用して計算され得る。例えば、Ｌｏｗｒｙら、ＭＥＣＨＡＮＩＳＭ  ＡＮＤ  ＴＨＥＯＲＹ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，第２版、Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８１）を参照のこと。
【０２６５】
（組成物）
いくつかの実施形態において、本発明は実質的に均一なグリコシル化パターンを有する組成物を提供する。この組成物は、選択された糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）が所望される基質に結合するサッカリドまたはオリゴサッカリドを含む。この組成物は、本発明の方法によって調製される。
【０２６６】
本発明の組成物において、予め選択されたサッカリド単位が、目的の可能なアクセプター部分の少なくとも約６０％に連結される。より好ましくは、この予め選択されたサッカリド単位は、目的の可能なアクセプター部分の少なくとも約８０％に、さらにより好ましくは、目的の可能なアクセプター部分の少なくとも９５％に連結される。出発基質が目的のオリゴサッカリド構造における不均一性を示す（例えば、出発基質上のオリゴサッカリドのいくつかがすでに、目的のアクセプター部分に結合した予め選択されたサッカリド単位を有している）場合、これらの記載された割合は、このような予め結合したサッカリド単位を含む。
【０２６７】
（薬学的処方物）
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の方法によって生成された化合物を、薬学的に受容可能なキャリアとの混合物で含む薬学的組成物を提供する。
【０２６８】
上記の所望のオリゴサッカリド決定因子を有する基質は、次いで、種々の用途（例えば、抗原として、診断試薬として、または治療剤として）使用され得る。従って、本発明はまた、種々の状態の処置において使用し得る薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、上記の方法に従って作製された基質から構成される。
【０２６９】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用するために適切である。本発明において使用するために適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）において見出される。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【０２７０】
この薬学的組成物は、予防的および／または治療的処置のための、非経口投与、鼻腔内投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与もしくは局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、エアロゾルによる）、または経皮投与が意図される。一般に、この薬学的組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与）される。非経口投与のための調製物としては、滅菌水溶液もしくは非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油（例えば、オリーブオイル）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロール、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または不揮発性油が挙げられ、静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性気体など）もまた、存在し得る。この組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。
【０２７１】
その組成物はまた、免疫原性種（例えば、ＫＬＨ）と結合体化した本発明の方法によって調製された無糖脂質（ａｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）を含み得る。さらに、本発明の方法によって調製される組成物、およびそれらの免疫原性結合体は、アジュバントと混ぜ合わせられ得る。
【０２７２】
これらの組成物を、従来の滅菌技術で滅菌してもいいし、または滅菌濾過してもいい。得られた水溶液を、そのまま使用のためにパッケージしてもいいし、または凍結乾燥しても良く、この凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌水溶性キャリアと合わせられる。この調製物のｐＨは、代表的には、３〜１１の間、より好ましくは５〜９、そして最も好ましくは７〜８である。
【０２７３】
この化合物を含む組成物が、予防的処置および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用においては、上記に記載されるように、すでに疾患に苦しんでいる患者に対して、その疾患および合併症の症状を治療するのに十分な量または少なくとも部分的に停止させる量の化合物を投与する。これを達成する十分量は、「治療的有効用量」と規定される。この使用における有効量は、疾患の重篤度および患者の体重および全身状態に依存するが、一般に、７０ｋｇの体重の患者に対して、１日当り基質量は約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇの範囲であり、１日当り約５ｍｇ〜約２００ｍｇの用量の化合物が、より一般的に使われる。
【０２７４】
予防的適用において、本発明の基質を含む化合物は、特定の疾患に感受性であるか、またはそれ以外にこの疾患の危険にある患者に対して投与される。そのような量は、「予防的有効量」と規定される。この使用において、正しい量は、再度患者の健康状態および体重に依存するが、一般的な範囲は、７０ｋｇの患者につき約０．５〜約１，０００ｍｇの範囲であり、より一般的には、体重７０ｋｇ当り約５ｍｇ〜約２００ｍｇである。
【０２７５】
化合物の単回投与または複数回投与が、処置する医者によって選択される用量レベルおよびパターンで実施され得る。任意の事象において、その薬学的処方物は、患者を効果的に処置するのに十分な量の本発明の基質を提供すべきである。
【０２７６】
この基質はまた、診断試薬としての使用を見出し得る。例えば、標識化基質は、所望のオリゴサッカリド類決定基と対応するリガンドとの間の相互作用に起因して、体の中で基質が濃縮される位置を決定するのに使用され得る。この使用のために、この化合物は、適切な放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃまたはトリチウム）または当業者に公知の他の標識で標識され得る。
【０２７７】
本発明のガングリオシドの投与の用量範囲は、免疫応答の症状がある程度の抑制を示す、所望の効果を生じるのに十分な大きさである。この用量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくなるべきでない。一般に、用量は、年齢、状態、性別および動物内での疾患の程度によって変化し、当業者によって決定され得る。その用量は、あらゆる逆効果（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象の際に、個々の治療者によって調整され得る。
【０２７８】
さらなる薬学的方法が、作用の持続時間を制御するために用いられ得る。制御された調製物の放出は、ガングリオシドを結合体化するか、複合体を形成するかまたは吸着するポリマーの使用により達成される。制御された送達は、放出を制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ、カルボキシメチルセルロースおよび硫酸プロタミン）およびこの高分子の濃度、ならびに取込みの方法を選択することにより、実行され得る。制御された調製物の放出による作用の持続性をコントロールするための別の可能な方法は、ポリマー化した材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレンビニルアセテートのコポリマー）の粒子にガングリオシドを組み込むことである。
【０２７９】
血漿タンパク質との結合からガングリオシドを保護するために、例えば、コアセルベーション技術によるかまたは界面重合体（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））マイクロカプセルによって）によるか、またはコロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中か、またはマクロエマルジョン中に包含されることが望ましい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ａ．Ｏｓｌｏ，編，Ｍａｃｋ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）に開示される。
【０２８０】
本発明のガングリオシドは、目標を定めることの出来る薬物送達系（例えば、高分子複合体形態、ナノカプセル形態、ミクロスフェア形態、またはビーズ形態）、ならびに脂質ベース系の形態（水中の油のエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、および再封される赤血球を含む）の合成ポリマーまたは天然ポリマーにおける使用に、十分に適している。これらの系は、集団的なコロイド薬物送達系として、公知である。代表的に、分散ガングリオシド含むそのようなコロイド粒子の直径は、約５０ｎｍ〜２μｍである。コロイド粒子のサイズは、それらの粒子を静脈内に（例えば、注射によってまたはエアロゾルとして）投与するのを可能にする。代表的に、コロイド系の調製において使われる物質（例えば、アルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシチン、リン脂質、および大豆油）は、濾過滅菌によって滅菌可能であり、無毒性であり、そして生分解性である。高分子コロイド系は、ミクロカプセル化のコアセルベーションに類似のプロセスによって調製される。
【０２８１】
例示の実施形態において、そのガングリオシドは、リポソームの成分であり、標的化送達系として使われる。リン脂質を、水性媒体中に穏やかに分散させる場合、それらは膨張し、水和し、そして自発的に、水性媒体を分離する脂質二重層の層を有する多層状の同心円の二重層ベシクルを形成する。通常、このような系は、多層状の同心円のリポソームまたは多層状の同心円のベシクル（ＭＬＶ）といわれ、約１００ｎｍ〜約４μｍにわたる直径を有する。ＭＬＶを超音波処理する場合、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍにわたる直径を有する、ＳＵＶのコア中に水性媒体を含む小さな単層ベシクル（ＳＵＶＳ）が形成される。
【０２８２】
リポソーム生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルエタノールアミン）が挙げられる。脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、かつ飽和しているジアシルホスファチジルグリセロールが、特に有用である。リン脂質の実例としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０２８３】
本発明のガングリオシドを含むリポソームの調製において、ガングリオシドカプセル化の有効性、ガングリオシドの不安定性、得られるリポソーム集団の均質性およびサイズ、ガングリオシド対脂質の比、調製物の浸透力の不安定性、ならびに処方物の薬学的受容変動性のそのような可変性を、考慮すべきである。Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９：４６７（１９８０）；Ｄｅａｍｅｒ，ら，ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３，２７：Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，４０：８９（１９８６）。
【０２８４】
本発明のガングリオシドを含むこの標的化送達系を、多様な方法（例えば、静脈内に、粘膜内に、皮下に、腹腔内に、血管内に、局所的に、腔内に、経皮的に、鼻腔内に、および吸入により）で、宿主（特に哺乳動物宿主）に対して投与し得る。ガングリオシドの濃度は、特定の用途、疾患の性質、投与の頻度などにより変化する。標的化送達系カプセル化ガングリオシドを、適切かつ生理学的に受容可能な水溶性媒体（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水など）のような、他の化合物を含む処方物中に提供し得る。
【０２８５】
本発明の方法によって生成されるこれらの化合物はまた、特に本発明の化合物と反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生に対する免疫原として用いられ得る。種々の免疫グロブリン分子の産生および操作について、当業者に利用可能である多くの技術が、本発明において用いられ得る。抗体は、当業者に周知である種々の手段で作製し得る。
【０２８６】
非ヒトモノクローナル（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）の産生は、周知であり、例えば、本発明の基質を含む調製物を用いて動物を免疫することによって達成され得る。免疫化動物より得られた抗体産生細胞を、不死化してスクリーニングするか、または始めに所望の抗体の産生についてスクリーニングし、次いで不死化した。モノクローナル抗体産生の一般的な手順の議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【実施例】
【０２８７】
（実施例１：ラクトシルセラミドおよびＧＭ３の合成）
ラクトシルセラミド（ｄ１８：２）（７）。ラクトシルスフィンゴシン（２．２ｇ）を、クロロホルム−メタノール−４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）を含む１１０ｍＬの溶液（６０／４０／９）中に溶解した。次いで、クロロホルム（５５ｍＬ）およびトリメチルアミン（１．１ｍＬ）中に懸濁したＮ−ヒドロキシスクシンイミドステアレート（１３．２ｇ）を添加し、そしてこの反応物を、室温で一晩撹拌した。この溶液を、濃縮して乾燥させ、そしてこの残渣を、アセトン（１１０ｍＬ）中に再懸濁した。次いで、１０％塩化マグネシウムのメタノール溶液（１１ｍＬ）を添加し、そしてこの溶液をドライアイスで１時間冷却した。沈殿物を濾過し、そして冷アセトンで洗浄し、白色固体として３．２ｇのラクトシルセラミド（７）を得た。ＨＰＬＣ（Ｍｅｔａｃｈｅｍ  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ８カラム；８５％アセトニトリル／１５％水、ＵＶ  ２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝２３．１分間、スキーム３を参照のこと。ラクトシルセラミドを合成するための、このプロトコルのさらなるバリエーションを表２に示す。
【０２８８】
（表２：ラクトシルセラミドの合成）
【０２８９】
【表２】
2005500058.tif 000013
ＧＭ３（ｄ１８：２）（４）。ラクトシルセラミド（７）（５．１２ｇ）を、水（４．１Ｌ）および３’−シアリルラクトース（２５３ｇ）および両性洗浄剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４（９．４ｇ）中に再懸濁した。ｐＨを，７．０に調整し、トランス−シアリダーゼ（１７４ｍＬの細胞ホモジネート）を添加し、そしてこの反応物を２時間撹拌した。Ｆｏｌｃｈ抽出を、ＧＭ３を精製するために以下のように使用した。ＫＣｌ（６４ｇ）を、この反応混合物に添加し、２９ＬのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（２／１）で抽出した。この有機層を分離し、そして水（１９Ｌ）で洗浄した。この水層を、１０ＬのＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（２／１）で抽出し、そして合わせた有機層を、濃縮して乾燥させ、６．１ｇのＧＭ３（４）を得た。ＨＰＬＣ（ＭｅｔａＣａｐｓｉｌ  ＡＭＩＮＯカラム；８５％アセトニトリル、１５％  ５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．６；ＵＶ  １９７ｎｍ）、Ｒｔ＝１４．３分間。
【０２９０】
酵素反応後の代替の精製手順として、この反応混合物を、１０Ｋ中空繊維膜精製系を使用して１０倍に濃縮する。次いで、水（４Ｌ）を添加し、この溶液を、最終容量約０．４Ｌまでダイアフィルトレーションする（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）。次いで、メタノール（４Ｌ）を、この保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）に添加し、そしてこの溶液を、ダイアフィルトレーションし、ＧＭ３がこの浸透物中を通過するのを可能にする。メタノール溶液の濃縮してＧＭ３を得る。
【０２９１】
ＧＭ３を合成するための、このプロトコルのさらなるバリエーションを表３に示す。
【０２９２】
（表３：ＧＭ３合成の最適化）
【０２９３】
【表３】
2005500058.tif 000014
（実施例２：ＧＭ３、ＧＭ２、およびＧＭ１の合成）
ラクトシルスフィンガジエニン（ｄ１８：２）（２）。（スキーム２を参照のこと）グルコシルスフィンガジエニン（ｄ１８：２）（１）（０．５０ｍＭ、６．８ｇ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、１４１ｇ）、ＭｎＳＯ４（５０ｍＭ、２．５ｇ）、ＵＤＰ―ガラクトース（４．０ｍＭ、７６．７ｇ）、ＮａＮ３（１６０ｍＭ、５．９２ｇ）および水（３０Ｌ）を、リアクタに添加した。この溶液のｐＨを、７．４に調整し、そして７．０〜７．５の間に維持した。次いで、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（９００単位）を、この反応混合物に添加し、そしてこの溶液を１２時間撹拌して、ＨＰＬＣ分析によって決定されるような７．１ｇのラクトシルスフィンガジエニン（ｄ１８：２）（２）を得た。ＴＬＣ（シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／２．５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ−６０／４０／５／３），Ｒｆ＝０．６７；ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）；３０％〜８０％のアセトニトリルの勾配；ＵＶ  ２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝１１．１３分間および１１．４８分間。ＭＳ（エレクトロスプレー）、ｍ／ｚ  ６２０．２［Ｍ−Ｈ］−。
【０２９４】
リソ−ＧＭ３（ｄ１８：２）（３）。３’−シアリルラクトース（１６ｍＭ、３８８．８ｇ）および両性洗浄剤（６１ｍＭ、２２．５ｇ）を、上記の反応混合物に添加し、そしてこの反応物容量を、水で４５Ｌに調整した。この懸濁液を、３７℃まで加温し、そしてトランス−シアリダーゼ（９０，０００単位）を添加した。この反応混合物のｐＨを、このプロセスの間、７．０〜７．５の間に維持した。３０分後、この溶液を５０℃まで加熱し、次いで、室温まで冷却した。次いで、この反応混合物を、１０Ｋ中空繊維濾過ユニットを使用して約５Ｌに濃縮した。水（１０Ｌ）を、この保持物に添加し、そして保持物を、約５Ｌに濃縮した。次いで、この保持物を、保持物の容量を維持するために水中５０％メタノール（４５Ｌ）を使用してダイアフィルトレーションした。一旦、水中５０％メタノール全体を消費すると、メタノール（１０Ｌ）を、保持物に添加し、そして約２Ｌの容量に濃縮した。次いで、５０％メタノール／水濾過工程の間に収集した浸透物を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムに直接ローディングした。このカラムを、まず水中５０％メタノール、次いで水中８５％メタノールで溶出し、そしてリソ−ＧＭ３（３）を含む適切な画分を収集して、ＨＰＬＣによって決定されるような８ｇの生成物を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．５）；３０％〜８０％のアセトニトリルの勾配；ＵＶ  ２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝１０．２３分間および１０．５６分間。ＭＳ（エレクトロスプレー）；ｍ／ｚ  ９１１．３（［Ｍ＋Ｈ］−、計算値＝９１１．５）。
【０２９５】
ＧＭ３（ｄ１８：２）（４）。次いで、リソ−ＧＭ３を含む上記のカラム画分を、約１．５Ｌに濃縮し、そしてＴＨＦ（４．５Ｌ）を添加した。次いで、この溶液を、１０℃に冷却し、そしてステアロイルクロリド（１６５ｍｍｏｌｅ，５０．０ｇ）を、水酸化ナトリウムの同時添加によりｐＨを約７．７に維持しながら、撹拌しつつ、この反応溶液に滴下した。酸塩化物の添加が完了した後、この反応混合物を２時間撹拌し、そして１μｍバッグフィルターを通して濾過した。この濾液を、逆相（Ｃ１８）カラムにローディングし、そして水中５０％メタノールおよび水中２３％ＴＨＦで洗浄した。この生成物を、まず水中８５％メタノール、次いで水中９０％メタノールで溶出した。適切な画分を収集し、そしてエバポレートして乾燥させた。次いで、この残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、水、濃ＮＨ４ＯＨ；５０／４０／２／０．１）を使用して精製し、濃縮後に白色固体として８．７ｇの（４）を得る。ＴＬＣ（シリカゲル；ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ／２．５Ｎ  ＮＨ４ＯＨ−６０／４０／５０／３），Ｒｆ＝０．６０。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ６．８５）；８分間において６０％〜９５％のアセトニトリルの勾配；ＵＶ  ２０５ｎｍ、１．４ｍＬ／分）、Ｒｔ＝７．７２分間。ＭＳ（エレクトロスプレー）；ｍ／ｚ  １１７７．７（［Ｍ＋Ｈ］−、計算値＝１１７７．７）。
【０２９６】
ＧＭ２（ｄ１８：２）（５）。ＧＭ３（７．１ｍｍｏｌｅ、８．４ｇ）、両性洗浄剤（２９．４ｍｍｏｌｅ、１０．７ｇ）、水溶性ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ／ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１４．７ｍｍｏｌｅ）、アジ化ナトリウム（３７ｍｍｏｌｅ、１．４ｇ）およびＧＭ２シンテターゼ（２８単位）を、反応容器に添加し、そして水を添加して容量を約７．０Ｌにした。この反応混合物を、３７℃で１２時間加熱した。次いで、この反応混合物を、１０Ｋ中空繊維濾過ユニットを使用して約０．７Ｌに濃縮した。この保持物を、保持物の容量を維持するように水（７Ｌ）でダイアフィルトレーションした。水が完全に消費されると、次いで保持物の容量を維持しながら、１００％メタノール（７Ｌ）でダイアフィルトレーションした。メタノールダイアフィルトレーションの間、この生成物を、浸透物中に収集した。この浸透物を、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ５０、水素形態）に通し、そして適切な画分を収集した。溶出液のｐＨを、水酸化ナトリウムで７．４に調整し、そしてこの溶液を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムにローディングした。このカラムを、メタノール／水（５０／５０、８０／２０および９０／１０）で洗浄した。適切な画分を収集し、そして濃縮して乾燥させた。この残渣を水に溶解し、そして凍結乾燥して７．６ｇのＧＭ２（５）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム；４．６×１００ｍｍ、３μｍ粒子径；アセトニトリル／リン酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ６．８５）；８分間において６０％〜９５％のアセトニトリルの勾配；ＵＶ  ２０５ｎｍ、１．４ｍＬ／分）、Ｒｔ＝６．２２分間、（ｄ１８：２、Ｃ１８：０  ＧＭ２）。ＭＳ（エレクトロスプレー）、ｍ／ｚ  １３８０．８（［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１３８０．８）。
【０２９７】
ＧＭ１（ｄ１８：２）（６）（スキーム２を参照のこと）を、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、ガラクトースの添加によりＧＭ２（ｄ１８：２）（５）から合成する。
【０２９８】
（実施例３：ＧＤ３の合成（スキーム９を参照のこと、最上部の反応ＧＭ３（２２）＋シアリルトランスフェラーゼおよびＳｉａドナーによりＧＤ３（３５）を得る））
ＧＤ３（ｄ１８：１）（３５）。両性洗浄剤（０．０５ｍｇ；０．１％）を、ＧＭ３（ｄ１８：１）のメタノール溶液（５００μＭ；０．０３２ｍｇ）に添加し、そしてこの溶液をＮ２ガス流下でエバポレートした。次いで、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＣＭＰ−シアル酸（０．０２ｍｇ）、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ−ＣＳＴ−６８を含む１０％細胞溶解物（５μｌ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；０−１ｍｇ）および５０μｌの最終反応容量までの水を添加した。この反応物を、３７℃で３時間インキュベートした。このシアリル化生成物を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｓｅｐ−ｐａｋ  ｌｉｇｈｔカートリッジを使用して精製した。この溶出液を、エバポレートして乾燥させ、ＧＤ３、ＧＴ３およびＧＭ３の他の多重シアリル化形態の混合物を得た。領域％としてＨＰＬＣにより計算される変換（％）は、：ＧＭ３、３９％；ＧＤ３  ３８％；ＧＴ３、１５％：ＧＱ３、７％であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＹＭＣベーシックカラム−４．６×１００ｍｍ、０．２６５ｍＬ／分で８分間に亘って、１ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液および５０〜９５％アセトニトリル、ＭｅＣＮの勾配で溶出；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、ＧＭ３（保持時間＝２９．５４分、ｍ／ｚ  １１７７．６［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１１７７．７）、ＧＤ３（保持時間＝２２．３４分間、ｍ／ｚ  １４６８．４［Ｍ−Ｈ］−計算値＝１４６８．８、ｍ／ｚ  ７３３．９［Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝７３３．９）、ＧＴ３（保持時間＝１８．７０分間、ｍ／ｚ  １７５９．４［Ｍ−Ｈ］−計算値＝１７５９．９、ｍ／ｚ  ８７９．４［Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝８７９．５）、およびＧＱ３（保持時間＝１７．１９分間、ｍ／ｚ  １０２５．０（Ｍ−２Ｈ］２−、計算値＝１０２５．０）。
【０２９９】
（実施例４：リソ−ＧＤ３の合成（スキーム６を参照のこと））
リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）（８）。両性洗浄剤（０．０５ｍｇ；０．１％）を、リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）のメタノール溶液（５００μＭ；０．０２３ｍｇ）に添加し、そしてこの溶液をＮ２ガス流下でエバポレートした。次いで、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）、ＣＭＰ−シアル酸（０．０２ｍｇ）、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ−ＣＳＴ−６８を含む１０％細胞溶解物（５μＬ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；０．１ｍｇ）および５０μＬの最終反応容量までの水を添加した。この反応物を、３７℃で３時間インキュベートした。このシアリル化生成物を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  Ｓｅｐ−ｐａｋ  ｌｉｇｈｔカートリッジを使用して精製した。この溶出液を、エバポレートして乾燥させ、リソ−ＧＤ３、リソ−ＧＴ３およびリソ−ＧＭ３の他の多重シアリル化形態の混合物を得た。領域％としてＨＰＬＣにより計算される変換（％）は、：リソ−ＧＭ３、３９％；リソ−ＧＤ３  ４２％；リソ−ＧＴ３、１６％：リソ−ＧＱ３、３％であった。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム−４．６×１００ｍｍ、１．０ｍＬ／分で１５分間に亘って、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．５）および３０〜８０％アセトニトリル、ＭｅＣＮの勾配で溶出；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、リソ−ＧＭ３（保持時間＝１１分間）、リソ−ＧＤ３（保持時間＝１０分間）、リソ−ＧＴ３（保持時間＝９分間）、およびリソ−ＧＱ３（保持時間＝９分間）。リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）（８）を、メタノール／水勾配を使用した逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーにより、この混合物から精製した。
【０３００】
（実施例５：リソ−ＧＤ２の合成（スキーム６を参照のこと））
リソ−ＧＤ２（ｄ１８：１）（３１）。両性洗浄剤（０．０７５ｍｇ；０．１％）を、リソ−ＧＤ３（ｄ１８：１）のメタノール溶液（１ｍＭ；０．０６０ｍｇ）に添加し、そしてこの溶液をＮ２ガス流下でエバポレートした。次いで、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．６８）、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（０．０７ｍｇ）、ＧＭ２シンテターゼを含む６０％細胞溶解物（３０μＬ）、ＭｎＳＯ４（１０ｍＭ；０．０８ｍｇ）および５０μＬの最終反応容量までの水を添加した。この反応物を、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、この生成物を、１０Ｋ  ＭＷＣＯスピンフィルターを使用して精製し、浸透物を捨て、そしてメタノールを保持物に添加した。１０，０００ｒｐｍでの遠心分離により、浸透物中の生成物を溶出した。この溶出液を、エバポレートして乾燥させた。この溶出液は、リソ−ＧＤ３およびリソ−ＧＤ２の混合物を含有した。領域％としてＨＰＬＣにより計算される変換（％）は、：リソ−ＧＤ２、３８％；リソ−ＧＤ３  ６１％であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ（ＹＭＣベーシックカラム；２×１００ｍｍ、０．２５０ｍＬ／分で２５分間に亘って、１ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液および３０〜１００％、ＡＣＮの勾配で溶出；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、リソ−ＧＭ３（ＵＶ保持時間＝１４．３８３分間、ｍ／ｚ  １２０５．５［Ｍ−Ｈ］−、計算値＝１２０４．５）、リソ−ＧＤ２（ＵＶ保持時間＝１４．０分間、ｍ／ｚ  １４０８．４［Ｍ−Ｈ］−計算値＝１４０７．４）。
【０３０１】
（実施例６：リソ−ＧＭ３の合成（スキーム５を参照のこと））
リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）（１８）。温度制御リアクタにおいて、３’−シアリルラクトース（１６ｍＭ、４４４．５ｇ）、両性洗浄剤３−１４（０．０５％、２０．１ｇ）、およびラクトシルスフィンゴシン（１７；０．４ｍＭ、１０．０１ｇ）を、２０ＬのＵＳＰ水に添加した。この溶液を、３７℃に加熱した。残りの１９．２５ＬのＵＳＰ水およびα２−３トランス−シアリダーゼ（２０００単位／Ｌ、０．９５Ｌ）を、リアクタに添加し、全合成容量を４０．２Ｌにした。ｐＨを７．０に調整し、そしてこの混合物を３７℃で３０分間撹拌した。次いでこの溶液を、さらに３０分間、５０℃に加熱し、次いでこの反応混合物を室温まで冷却した。
【０３０２】
次いで、この反応混合物（４０．２Ｌ）を、１０Ｋ中空繊維膜精製系を使用して、最初の容量（５Ｌ）の８分の１にまで濃縮した。次いで、水（１０Ｌ）を、この保持物に添加し、そしてこの保持物を、さらなる４０Ｌの水でダイアフィルトレーションした。次いで、この保持物を、５Ｌ容量まで濃縮し、そして１０Ｌのメタノール／水（５０／５０）を、この保持物に添加した。次いで、この保持物を、４０Ｌのメタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、そしてこの保持物を、５Ｌ容量まで濃縮した。この工程において、浸透物中にリソ−ＧＭ３（１８）を溶出した。
【０３０３】
次いで、リソ−ＧＭ３（５１Ｌ）を含む、この浸透物（メタノール／水  ５０／５０）を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムにローディングした。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（５０／５０）で洗浄し、そして生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（８５／１５）で溶出した。適切な画分を収集し、そしてロトエバポレーションにより濃縮して乾燥させ、１２．０３ｇのリソ−ＧＭ３（１８）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム、４．６×１００ｍｍ；勾配、３０〜８０％アセトニトリル／１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ６．５；１５分間にわたって１．０ｍＬ／分；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝１１．１分間。
【０３０４】
（表４．トランス−シアリダーゼ反応、ラクトシルスフィンゴシン）
【０３０５】
【表４】
2005500058.tif 000015
（表５．リソ−ＧＭ３（１８）の膜精製）
【０３０６】
【表５】
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１保持物をこの溶媒で反応混合物の最初の容量まで希釈した。
２この工程において保持物をダイアフィルトレーションするために使用した溶媒の量。ダイアフィルトレーション後、この保持物を、再度濃縮した。３リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１）は、この溶媒濃度において溶出し始めた。
【０３０７】
（実施例７：リソ−ＧＭ２の合成（スキーム５を参照のこと）
リソ−ＧＭ２（ｄ１８：１）（１９）。温度およびｐＨ制御リアクタにおいて、リソ−ＧＭ３（１８；１ｍＭ、１０．０４ｇ）、両性洗浄剤３−１４（０．１５％、１６．５ｇ）、硫酸マグネシウム（１０ｍＭ、１８．６０ｇ）、アジ化ナトリウム（０．０２％、２．２ｇ）、およびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（４ｍＭ、４．２９Ｌｇ）を、１．５ＬのＵＳＰ水に添加した。この反応混合物３７ＥＣに加熱し、そしてｐＨを７に調整した。次いで、ＧＭ２−シンテターゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、７．６Ｕ／Ｌ、０．８５Ｌ）および残りの４．３６ＬのＵＳＰ水をリアクタに添加し、最終容量を１１Ｌにした。この反応混合物を、ｐＨを制御しつつ、３７℃で６５時間撹拌した。次いで、この溶液を５０℃にし、さらに３０分間加熱し、次いで室温まで冷却した。
【０３０８】
次いで、この反応混合物（１１Ｌ）を、３Ｋ中空繊維膜精製系を使用して、最初の容量（４Ｌ）の４分の１まで濃縮した。次いで、水（１０Ｌ）を、この保持物に添加し、そしてこの保持物を、さらなる１０Ｌの水でダイアフィルトレーションした。次いで、この保持物を、５Ｌ容量まで濃縮し、そして１０Ｌのメタノール／水（２５／７５）を、この保持物に添加した。この保持物を、さらなる４０Ｌのメタノール／水（２５／７５）でダイアフィルトレーションし、次いで、この保持物を５Ｌ容量まで濃縮した。次いで、メタノール／水（３５／６５）（１０Ｌ）を、この保持物に添加し、この保持物を、さらなる４０Ｌのメタノール／水（３５／６５）でダイアフィルトレーションし、次いで、５Ｌ容量まで濃縮した。メタノール／水（５０／５０）（１０Ｌ）を、この保持物に添加し、この保持物を、さらなる４０Ｌのメタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、次いで、５Ｌ容量まで濃縮した。リソ−ＧＭ２（１９）は、最初の２つの溶出液中に主に見出され、これらを合わせ、そして逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムにローディングした。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール：水（５０／５０）で洗浄した。生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール／水（７５／２５）および１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール／水（８０／２０）で溶出した。適切な画分を収集し、そして濃縮して乾燥させた。
【０３０９】
この残渣を、９０ｍＬのＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２ＣＩ２（１／１／１）に溶解し、そして等量の４つの部分に分割した。各サンプルを、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＨ４ＯＨ（３０／３０／３０／５）において平衡化したシリカゲルクロマトグラフィーカラムにローディングした。このカラムを、８カラム容量のＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＮＨ４ＯＨ（３０／３０／３０／５）で洗浄し、そしてこの生成物を、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３／ＮＨ４ＯＨ（２０／５０／１０）で溶出した。。適切な画分を収集し、そしてロトエバポレーションにより濃縮して乾燥させ、９．６６ｇのリソ−ＧＭ２（１９）を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム、４．６×１００ｍｍ；勾配、３０〜８０％アセトニトリル／１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ６．５；１５分間にわたって１．０ｍＬ／分；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝１０．７８分間。
【０３１０】
（表６．ＧＭ２−シンテターゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）反応、リソ−ＧＭ３（ｄ１８：１））
【０３１１】
【表６】
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（実施例８：リソ−ＧＭ１の合成（スキーム５を参照のこと））
リソ−ＧＭ１（ｄ１８：１）（２０）。６Ｌフラスコにおいて、リソ−ＧＭ２（１９；０．８ｍＭ、５．００ｇ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（１．４ｍＭ、５．０５ｇ）、塩化マンガン（１０ｍＭ、１１．０８ｇ）、およびアジ化ナトリウム（０．０２％、１．１２ｇ）を、３Ｌの水に添加した。このフラスコ内容物を、３７ＥＣに加熱し、そして３７ＥＣインキュベーターの中に置いた。残りの２．２１Ｌの水およびＧＭ１−シンテターゼ（β１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ、７％粗溶解物、０．３９Ｌ）を、フラスコに添加し、最終容量を５．６Ｌにした。この反応混合物を、そのｐＨがｐＨ６．５あたりにあり続けるように調整して、３７℃で一晩（１６時間）撹拌した。次いで、この溶液を５０℃にして、さらに３０分間加熱し、次いで室温まで冷却した。
【０３１２】
次いで、この反応混合物（５．６Ｌ）を、３Ｋ中空繊維膜精製系を使用して、最初の容量（２Ｌ）の３分の１まで濃縮した。水（１Ｌ）を、この保持物に添加し、そしてこの保持物を、さらなる９Ｌの水でダイアフィルトレーションした。次いで、この保持物を、２Ｌ容量まで濃縮し、そしてメタノール／水（５０／５０）（１Ｌ）を、この保持物に添加した。次いで、この保持物を、さらなる１９Ｌのメタノール／水（５０／５０）でダイアフィルトレーションし、そして２Ｌ容量まで濃縮した。リソ−ＧＭ１（２０）を、メタノール／水（５０／５０）浸透物中に溶出した。
【０３１３】
次いで、生成物を含む浸透物（５０／５０）（２０Ｌ）を、逆相（Ｃ１８）クロマトグラフィーカラムにローディングした。このカラムを、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール／水（５０／５０）で洗浄した。生成物を、１０カラム容量（５Ｌ）のメタノール／水（９０／１０）で溶出した。適切な画分を収集し、そして濃縮して４．８ｇのリソ−ＧＭ１を得た。ＨＰＬＣ（ＹＭＣベーシックカラム、４．６×１００ｍｍ；５３％アセトニトリル／４７％１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−ｐＨ６．５；７分間にわたって１．０ｍＬ／分；ＵＶ＝２０５ｎｍ）、Ｒｔ＝５．０３分間。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ５．８４（ｍ，１Ｈ，ビニルプロトン），５．５０（ｍ，１Ｈ，ビニルプロトン），４．４４（ｄ，Ｊ８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｄ，Ｊ８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．２０（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．４０（ｍ，糖環プロトン），２．７５（ｄｄ，Ｊ４．５および１２．５Ｈｚ，１Ｈ），２．１０（ｑ，３Ｈ），２．０１（２ｓ，６Ｈ，２Ａｃ），１．４２（ｔ，３Ｈ）．１．３０（ｓ，２２Ｈ），０．９０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【０３１４】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示のみを目的とし、それらの種々の改変および変更が当業者に提案され、そして本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内であることが意図される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３１５】
【図１】図１は、アグリコンから始まり、サッカリド単位の連続添加をたどる、ＧＭシリーズ合成およびＧＤシリーズ合成の概要を示す、スキーム１（経路１）である。
【図２】図２は、スフィンゴイドから始まり、サッカリド単位の連続添加をたどる、ＧＭシリーズ合成およびＧＤシリーズ合成の概要を示す、スキーム１（経路２）である。
【図３】図３は、グリコシル−スフィンゴシンｄ１８：２からのＧＭ１（ｄ１８：２）の合成を示す、スキーム２である。スキーム２は、グリコシル−スフィンゴシン（１）が、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、ラクトシルスフィンゴシン（２）へと転換される、一般的なストラテジーの概要を述べる。ラクトシルスフィンゴシン（２）は、トランスシアリダーゼ反応によりｌｙｓｏ−ＧＭ３（３）へと転換される。このｌｙｓｏ−ＧＭ３（３）は、アシル化されて、ＧＭ３（４）を生成する。ガングリオシドＧＭ３（４）は、さらに処理されて、さらなるサッカリドを加える。ＧＭ３（４）は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応により、初めに、ＧＭ２（５）へと転換され、次いで、ＧＭ２（５）は、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、ＧＭ１（６）へと転換される。
【図４】図４は、グルコシルスフィンゴシンｄ１８：２からのＧＭ３（ｄ１８：２）の合成を示す、スキーム３である。スキーム３は、ＧＭ３が、グルコシル−スフィンゴシンから作製される、一般的なストラテジーを示す。このグルコシル−スフィンゴシンは、ガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、ラクトシルスフィンゴシンへと転換される。ラクトシルスフィンゴシンは、アシル化反応によりラクトシルセラミドへと転換される。このラクトシルセラミドは、トランス−シアリダーゼ反応により、ＧＭ３へと転換される。
【図５】図５は、ｌｙｓｏ−ＧＭ３（ｄ１８：２）からの、ＧＤ３（ｄ１８：２）、ＧＤ２（ｄ１８：２）、またはＧＤ１ｂ（ｄ１８：２）の合成を示す、スキーム４である。スキーム４は、サッカリドのｌｙｓｏ−ＧＭ３への添加からの反応性生物をアシル化することにより、ＧＤシリーズにおいてガングリオシドが作製される、一般的ストラテジーの概要を述べる。Ｌｙｓｏ−ＧＭ３（３）は、シアルトランスフェラーゼ反応により、Ｌｙｓｏ−ＧＤ３（８）へと転換される。Ｌｙｓｏ−ＧＤ３（８）は、アシル化によりＧＤ３へと転換され得るか、またはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ反応による、Ｌｙｓｏ−ＧＤ２（１０）へのその転換のような、サッカリド添加についてのアクセプターとして作用し得る。同様に、Ｌｙｓｏ−ＧＤ２（１０）は、アシル化によりＧＤ２（１１）へと転換され得るか、またはガラクトシルトランスフェラーゼ反応により、Ｌｙｓｏ−ＧＤ１（１２）へのその転換のような、サッカリド添加についてのアクセプターとして作用し得る。Ｌｙｓｏ−ＧＤ１（１２）は、アシル化により、ＧＤ１（１４）へと転換され得る。
【図６】図６は、スフィンゴシンｄ１８：１からのＧＭ１（ｄ１８；１）、ＧＭ２（ｄ１８：１）、ＧＭ１（ｄ１８：１）、またはフコシル−ＧＭ１（ｄ１８：１）の合成を示す、スキーム５である。スキーム５は、スフィンゴシンを含まない脂肪酸へのサッカリドの添加により生成される反応生成物のアシル化により、ＧＭシリーズにおけるガングリオシドが作製され得る一般的なストラテジーの概要を述べる。
【図７】図７は、ｌｙｓｏ−ＧＭ３（ｄ１８：１）からの，ＧＤ３（ｄ１８：１）、ＧＤ２（ｄ１８：１）、ＧＴ１ｂ（ｄ１８：１）、またはＧＴ１ｂの合成を示す、スキーム６である。この一般的ストラテジーに従って、ＧＤシリーズのメンバーは、アシル化メンバーへのサッカリドの添加を介するよりもむしろ、それらのｌｙｓｏ−ＧＤ形態のアシル化により作製される。
【図８】図８は、アグリコンとしての、セラミド（ここで、Ｒ１＝Ｈ）およびスフィンゴシン（ここで、Ｒ１＝脂肪酸または脂肪酸誘導体）の代表例を示す。本発明の方法により調製される例示的な化合物としては、サッカリドが存在しないか、または２〜２０のメンバーのオリゴサッカリドであるものが挙げられる。
【図９】図９は、代表的なポリシアリル化スフィンゴシン分子およびセラミド分子の合成を示す、スキーム８である。スキーム８は、非アシル化スフィンゴシンに対するシアリルトランスフェラーゼ反応によるシアル酸の重合添加についての一般的なストラテジーの例を示す。
【図１０】図１０は、ＧＭ３（ｄ１８：１）からの、ＧＤガングリオシド、およびポリシアリル化ＧＤ３の合成を示す、スキーム９である。スキーム９は、シアル酸モノマーの繰返し添加のための一般的なストラテジーの例を示す。
【図１１】図１１は、本発明の方法により調製された、式オリゴサッカリド−Ｘの例示的化合物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500058.tif 000146
【国際調査報告】
2005500058.tif 000147
2005500058.tif 000148