(57)【要約】本発明は未分化甲状腺癌の処置を目的とする薬剤を製造するための式：    【化１】2005533838.tif 000013で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその医薬上許容される塩の使用に関する。
2005533838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化甲状腺癌の処置に使用する薬剤を製造するための、式Ｉ：
【化１】
2005533838.tif 000012
で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその医薬上許容される塩の使用。
【請求項２】
未分化甲状腺癌の処置における、式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその医薬上許容される塩の使用。
【請求項３】
未分化甲状腺癌に罹患したヒトを処置する方法であって、４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその医薬上許容される塩のその疾患に対して有効な用量をその処置が必要なヒトに投与することを含む、方法。
【請求項４】
式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドを日用量５０〜６００ｍｇで成人に投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドのモノメタンスルホン酸塩を投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたはその医薬上許容される塩の医薬的有効量を１日１回３ヶ月またはそれ以上の期間ヒト対象に投与することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドがメシレート塩型であり、およびそのβ結晶形である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または方法。
【請求項８】
未分化甲状腺癌が変異ｐ５３をハーバリングしている、請求項１〜７のいずれかに記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、未分化甲状腺癌を処置する医薬を製造するための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（以下：「化合物Ｉ」と記載）またはその医薬上許容される塩の使用、未分化甲状腺癌の処置における化合物Ｉまたはその医薬上許容される塩の使用、および未分化甲状腺癌に罹患した哺乳類、特にヒトを含む温血動物を処置するために化合物Ｉまたはその医薬上許容される塩の有効用量をその処置を必要とする動物に投与する方法に関する。
【０００２】
甲状腺濾胞細胞由来の癌は病理学的には分化した（乳頭状および濾胞性）癌と分化していない（未分化）癌とに分類される。分化した癌は予後が比較的良好であるが、未分化甲状腺癌は高度に進行性で致死率が極端に高く、治療効果が殆どない。未分化癌における腫瘍サプレッサーｐ５３遺伝子変異の率は７０〜８５％であると報告されているが、分化した癌では０〜９％である。それ故、ｐ５３遺伝子におけるこの変異は甲状腺発癌性における分化の喪失およびこの型の癌の高度に進行性をもたらす分子変化の一つに関連する後期遺伝子事象として認識される。
【０００３】
化合物Ｉは式（１）：
【化１】
2005533838.tif 000003
で示される。化合物Ｉの遊離塩基とその医薬上許容される塩は欧州特許出願第０５６４４０９号に開示されている。
【０００４】
化合物Ｉの医薬上許容される塩は、たとえば、塩酸、硫酸または燐酸のような無機酸またはたとえばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸またはシュウ酸のような脂肪族モノ−またはジ−カルボン酸、またはアルギニンまたはリジンのようなアミノ酸、安息香酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸のような芳香族カルボン酸、マンデル酸または桂皮酸のような芳香族―脂肪族カルボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸のようなヘテロ芳香族カルボン酸、メタン−、エタン−または２−ヒドロキシエタンスルホン酸のような脂肪族スルホン酸、またはベンゼン−、ｐ−トルエン−またはナフタリン−２−スルホン酸などの芳香族スルホン酸などの適当な有機カルボン酸またはスルホン酸との塩のような、医薬上許容される酸付加塩である。
【０００５】
化合物Ｉのメシレートを本明細書では以後「塩Ｉ」と呼称する。化合物Ｉメシレートのα結晶形とβ結晶形とは１９９９年１月に公開の国際特許出願ＷＯ９９／０３８５４に開示されている。
【０００６】
驚くべきことに、塩Ｉが未分化甲状腺癌、特に変異ｐ５３をハーバリングした未分化甲状腺癌を処置するための治療剤として使用できることを見出した。
【０００７】
それ故本発明は、塩Ｉの未分化甲状腺癌、特に変異ｐ５３をハーバリングした未分化甲状腺癌に対して治療的に有効な用量を、処置を必要とする動物に投与することを包含する、未分化甲状腺癌に罹患した温血動物を処置する方法に関する。
【０００８】
本発明は未分化甲状腺癌、特にｐ５３をハーバリングした未分化甲状腺癌に罹患したヒトに、式Ｉで示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドの酸付加塩、好ましくはモノメタンスルホン酸塩を投与する方法に関する。
【０００９】
用語「処置」は癌を治癒させるかまたは癌を退行させる効果またはこの疾患の進行を遅延させる効果を目的として処置が必要な温血動物に塩Ｉを投与することを含む。
【００１０】
本明細書で使用する用語「進行の遅延」は本処置によって癌の増殖または一般的には少なくとも疾患の進行が減速するか、または妨げられること、および処置を受けなかった患者またはプラセボで処置された患者よりも、患者の生存率が高くなることを意味する。
【００１１】
本発明による医薬組成物はそれ自体公知の様式で製造でき、ヒトを含む温血動物への経口投与または経直腸投与のような経腸投与、および非経腸投与に適するものであって、薬理的に活性な成分少なくとも１種の治療的有効量を含有し、その成分単独でまたは医薬上許容される担体、特に経腸投与または非経腸投与に適する担体との組み合わせで含有する。本発明による用量剤の好適な投与経路は経口投与である。
【００１２】
関連分野の熟練者には未分化甲状腺癌に対して本明細書に記載する有益な効果を証明するための関連する試験モデルを選択する完全な能力がある。各化合物の薬理的活性は、たとえば下記の実施例によって、試験管内試験および生体内試験によってヌードマウスまたはトランスジェニックマウスまたは適当な臨床試験によって証明できる。適当な臨床試験は、たとえば、未分化甲状腺癌患者でのオープンラベル非乱数化、用量逓増試験である。この研究では処置の効果は、たとえば、活性成分に適合するプラセボで達成される対照とともに６週間毎の腫瘍サイズの測定で、または適当な血清腫瘍マーカーで、またはシンチグラフィー癌検出法で判定する。
【００１３】
塩Ｉの有効用量は、採用する特定の化合物または医薬組成物、投与の様式、処置すべき甲状腺癌の型または処置すべき甲状腺癌の重篤度に依存して変化させてもよい。用量範囲は患者の腎臓および肝臓の機能を含む更なる様々な因子にしたがって選択される。通常の熟練度を有する医師、臨床医または動物医は容易に病状の進行を予防し、逆転しまたは停止させるために必要な化合物の有効量を決定し、処方することができる。
【００１４】
動物種、年令、個々の病状、投与様式および臨床的状況に依存して、たとえば活性化合物（遊離塩基）約１０〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜６００ｍｇ、特に１００〜４００ｍｇに対応する日用量の塩Ｉの有効用量を体重約７０ｋｇの温血動物に投与する。未分化甲状腺癌、特に変異ｐ５３をハーバリングした未分化甲状腺癌に罹患した成人患者には、初期日用量２００または４００ｍｇが推奨される。処置への応答を評価して応答が不適切な患者には、安全な用量逓増を考慮でき、処置の利益があり、限定的な毒性がない限り患者の処置を続けてもよい。
【００１５】
本発明はまた、未分化甲状腺癌、特に変異ｐ５３をハーバリングした未分化甲状腺癌に罹患したヒトに化合物Ｉまたはその医薬上許容される塩を投与する方法に関し、この方法は、たとえば３ヶ月を越える期間、たとえば毎日１回、化合物Ｉまたはその医薬上許容される塩の医薬上有効な量をヒトに投与することを含む投与方法である。本発明は特にそのような投与方法であって、日用量５０〜６００ｍｇ、好ましくは１００〜４００ｍｇを成人に投与する方法に関する。
【実施例１】
【００１６】
塩Ｉは未分化甲状腺癌細胞にＳ−Ｇ２期移行で細胞停止を誘導する
【００１７】
１）細胞増殖に及ぼす塩Ｉの抑制効果
細胞増殖検定法−実験例１：
細胞培養：検出不能なまたは変異ｐ５３を持つヒトの悪性または未分化甲状腺癌細胞系列ＦＲＯおよびＡＲＯおよび野生型ｐ５３遺伝子を持つ分化した乳頭状甲状腺癌細胞系列（ＫＴＣ−１）を調製する。１Ｆ３細胞系列はＦＲＯに野生型ｐ５３遺伝子を導入した安定な突然変異体である。これらの細胞系列を５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Life Technologies, Inc.）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、５％ＣＯ２加湿雰囲気下に３７℃に維持する。塩Ｉの効果を分析するために、細胞を０.１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＤＭＳＯで希釈した塩Ｉ（最終濃度０.１％）の存在下にインキュベーションする。
【００１８】
細胞を１×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに播種する（ｎ＝５）。１日後（１日目）に細胞を新鮮培地１００μＬ中で１、１０、または５０μＭ−塩Ｉまたは０.１％ＤＭＳＯ液を用いて処理する。４８時間インキュベーション後、各ウェルの細胞数を細胞計数キット（Wako）で測定する。この実験は少なくとも３回行う。
【００１９】
細胞増殖曲線を次のようにサイトメータを用いて試験する：細胞を０.５または０.８×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェル培養プレートに播種する（ｎ＝５）。１日後（１日目）、細胞を１０μＭの塩Ｉまたは０.１％ＤＭＳＯの存在下にインキュベーションする。細胞数を２、３、４および５日目に計数する。この実験は少なくとも３回行う。
【００２０】
結果：０〜５０μＭの濃度範囲の塩Ｉで４８時間処理後、細胞計数キット（Wako）を用いて細胞数を計数した。表に記載した数値は独立した実験５回の平均を示す。
【表１】
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表１：全細胞系列は５０μＭ濃度の塩Ｉで死滅した。しかし、検出不能（ＦＲＯ）または変異ｐ５３（ＡＲＯ）細胞系列は５０μＭまたはそれ以下でも塩Ｉ用量依存性に増殖抑制を示すが、野生型ｐ５３（ＫＴＣ−１）細胞系列では抑制を示さない。
【００２１】
５日間の細胞増殖曲線は、ＦＲＯおよびＡＲＯ細胞を１０μＭ−塩Ｉで処理すると対照細胞と比較して細胞増殖が時間依存性の低下を示す。塩ＩはＫＴＣ−１およびＩＦ３細胞の細胞増殖は変化させない（データ提示せず）。
【００２２】
細胞増殖検定法−実験例２：
各々検出不能またはコドン２７３における変異ｐ５３（Fagin et al. J. Clin. Invest. 1993, 91: 179 - 184）を持つヒトの未分化甲状腺癌細胞系列ＦＲＯおよびＡＲＯを用いた。ヒトの乳頭状癌細胞系列ＮＰＡはコドン２２３および２２６にｐ５３の変異を有する（Fagin et al. J. Clin. Invest., 1993, 91: 179 - 184）が、ＴＰＣ−１およびＫＴＣ−１乳頭状甲状腺癌細胞系列はｐ５３については野生型である（Kurebayashi et al. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2000, 85: 2889 - 96）。野生型ｐ５３を発現するベクターを持つ安定な形質転換体を使用してＦＲＯ細胞から１Ｆ３細胞系列を産生した（Zeki et al. Int. J. Cancer, 1998, 75: 391 - 5）。細胞を５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地中、加湿５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で培養した。一次ヒト甲状腺細胞培養物を以前の報告（Kawabe et al. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1989, 68: 1174 - 83）通りに樹立し、３％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したF12 Nutrient Mixture とＤＭＥＭとの２：１混合物中に維持した（試薬は全てInvitrogen Life Technologies, Paisley, UK製）。
【００２３】
細胞を１×１０３細胞／ウェルの密度で９６−ウェルマイクロタイタープレートに播種した。１日後（１日目）に１、５、１０、２０または５０μＭ−塩Ｉ−ＤＭＳＯ溶液または０.１％ＤＭＳＯ（各薬剤濃度に対して６ウェル）を用いて細胞を新鮮培地１００μＬ中で処理した。７２時間インキュベーションした後、各ウェルの細胞数を細胞計数キット（Wako）で測定した。細胞増殖を５０％低下させる塩Ｉ濃度と定義したＩＣ５０値はｒ＝０.５の線形補間法で判定した。細胞増殖の動力学はサイトメータを使用して次の通りに試験した：細胞を０.５または０.１×１０５細胞／ウェルの密度で１２ウェル培養プレート中に播種した。１日後（１日目）、１０μＭ−塩Ｉまたは０.１％ＤＭＳＯを含有する培地を加え、２、３、４および５日目に計数した。両実験は少なくとも３回行った。
【表２】
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表２：ヒト甲状腺癌細胞系列の増殖に及ぼす塩Ｉの効果。ＩＣ５０値は増殖速度に及ぼす塩Ｉの効果を示す。
【００２４】
甲状腺癌細胞系列５種におよびヒト甲状腺細胞の一次培養物に及ぼす塩Ｉの効果を標準的なＷＳＴ−検定法で測定した。表２に示すように、ｐ５３−変異細胞系列ＦＲＯ、ＡＲＯおよびＮＰＡのＩＣ５０は明らかに野生型ｐ５３細胞系列ＴＰＣ−１およびＫＴＣ−１、および一次甲状腺細胞（ＰＴ）よりも低かった。塩Ｉは未分化甲状腺細胞系列の増殖を選択的に抑制する。データは独立した３回の実験を表す；各測定値は６ウェルの結果をまとめたものである。*）対照対処理群の比較ｐ＜０.０５。
【００２５】
２）ｃ−Ａｂｌ、ＰＤＧＦ受容体およびｃ−ｋｉｔの発現
塩Ｉはｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性、ＰＤＧＦ受容体およびｃ−ｋｉｔを阻害する。甲状腺癌細胞系列から抽出した全ＲＮＡ上の逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）はＦＲＯおよびＡＲＯ細胞にはＰＤＧＦ受容体およびｃ−ｋｉｔを発現されない（データ提示せず）が、全細胞系列（ＡＲＯ、ＦＲＯ、ＴＰＣ、ＫＴＣ、ＮＰＡおよびＰＴ）にはｃ−ＡｂｌのｍＲＮＡが発現することを示す。
【００２６】
３）塩ＩによるＳ−Ｇ２移行の阻害
密集増殖未満の細胞を１０μＭ−塩Ｉまたは０.１％ＤＭＳＯと共に４８時間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析用に細胞を７０％エタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄した。ＲＮａｓｅ Ａ（０.１ｍｇ／ｍＬ）と室温でプレインキュベーションした後、細胞をＰＩ（２５μｇ／ｍＬ）で染色した。蛍光をFACScanフローサイトメータ（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用いて測定した。この実験は少なくとも３回行った。
【表３】
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表３：甲状腺癌細胞系列の細胞周期に及ぼす塩Ｉの効果：細胞を０.１％ＤＭＳＯのみまたは１０μＭの塩Ｉで４８時間処理し、細胞周期をフローサイトメトリーで分析した（結果はＧ２、ＳおよびＧ２−Ｍ期細胞数の百分率で示す）。
【００２７】
細胞周期のＦＡＣＳ分析はＦＲＯ細胞では塩Ｉ処理がＳ期を増加させ（４３％対５４％）、Ｇ２−Ｍ期を減少させる（２５％対１５％）が、ＫＴＣ−１細胞または１Ｆ３細胞中では変化が観察されないことを示した。この結果は、ＦＲＯ細胞では塩ＩがＳ−Ｇ２移行の周期停止を誘導することを示す。
【００２８】
ＦＡＣＳ細胞周期分析は塩Ｉによる処理がＡＲＯ細胞系列ではＧ２／Ｍ期の細胞比率を２倍以上に増加させ（９.２８％対３.７８％）、ＦＲＯではＳ期の細胞数を増加させる（５４％対４３％）ことを示した。ＴＰＣ−１、ＫＴＣ−１および１Ｆ３細胞ではそのような変化は観察されなかった。この細胞系列では、Ｇ１期細胞の比率が増加する傾向があった。しかし、塩Ｉで処理した培地中では増殖阻害は観察されなかった。そこで、塩Ｉを用いる処理はＡＲＯおよびＦＲＯ細胞では各々Ｇ２／Ｍ−およびＳ−期停止を起し、この細胞系列ではこれが観察される増殖阻害の原因であろう。どの細胞系列でもこの薬剤を用いる処理の４８時間後にはアポトーシス分画（サブ−Ｇ１）に明確な増加はなかった。さらに、処理の４８時間後にはＤＮＡラダー検定においてＤＮＡ断片化は検出されなかった（データ提示せず）。
【００２９】
４）ウェスタンブロッティング分析：甲状腺癌細胞系列中の細胞周期制御プロテインに及ぼす塩Ｉの効果。
細胞を１０μＭ−塩Ｉで０、１２、２４、４８時間にわたって処理し、ＲＩＰＡ緩衝液中で細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４０μｇプロテイン／レーン）で分離した。ニトロセルロース膜（Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA）に移した後、ブロットを適当な抗体で検証した。β−アクチンを負荷対照として使用した。使用した抗体は次の通り：抗−ｐ２１ｗａｆ１（Ａｂ−１、Calbiochem, Darmstardt,Germany）、抗−ｐ２７（Ｆ−８、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、抗−サイクリンＡ（Ｃ８８０２０、BD Biosciences, Boston, MA, USA）、抗−サイクリンＢ１（Ｃ２３４２０, BD Biosciences）、抗−ＣＤＫ１／Ｃｄｃ２（Ｃ１２７２０、BD Biosciences）、抗−サイクリンＤ３（Ｃ２８６２０、BD Biosciences）、抗−ホスホ−ｃ−ＡＢＬ（Ｔｙｒ２４５、 Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA）、抗−ｃ−Ａｂｌ（２４−１１、 Santa Cruz Biotechnology）、抗−ｃ−ＫＩＴ（Ｃ−１４、Santa Cruz Biotechnology）、抗−ＰＤＧＦＲα（Ｃ−２０、Santa Cruz Biotechnology）、抗−ＰＤＧＦＲβ（Ｐ−２０、Santa Cruz Biotechnology）、抗−ＥＲＫ１／２（Cell Signalling Technology）、抗−ｐ−ＥＲＫ（Cell Signalling Technology）および抗−アクチン（Ｃ−１１、Santa Cruz Biotechnology）。検出は強化化学発光キット（ECL、Amersham Life Sciences, Buckinghamshire, UK）を用いて行った。免疫ブロッティング実験は少なくとも２回行った。
【００３０】
結果：ウェスタンブロッティング分析は未分化甲状腺癌細胞系列ＦＲＯとＡＲＯとに、およびｐ５３−変異乳頭状癌細胞系列ＮＰＡに、高レベルのｃ−Ａｂｌプロテインが検出された（データ提示せず）。他の塩Ｉ感受性チロシンキナーゼに対応するプロテインバンドはこれらの細胞系列では検出されなかった。ｐ５３の状態がｃ−Ａｂｌプロテインのレベルに影響を及ぼすと考えられるので、１Ｆ３細胞内のｃ−Ａｂｌ発現レベルも測定した。１Ｆ３細胞はＦＲＯ細胞よりも少ないが、正常な甲状腺細胞よりも多いｃ−Ａｂｌを含有する。サイクリン−依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であるｐ２１cip１とｐ２７kip１とは細胞周期のＳからＧ２期へ並びにＧ１からＳ期への移行におけるＣＤＫ活性を阻止できる。塩Ｉに１２時間接触後、ｐ２１cip１の発現はＦＲＯ細胞では顕著に増加したが、ＡＲＯ、ＫＴＣ−１および１Ｆ３細胞では変化しなかった。ＡＲＯおよびＦＲＯ細胞では各々２４および４８時間接触後にはｐ２７kip１の発現が増加した。ＣＤＫの活性はサイクリンサブユニットの相対的な多さおよびＣＤＫ阻害剤の存在に部分的に依存する。サイクリンとＣＤＫとの中で、サイクリンＡ、ＢおよびＣＤＣ２はＧ２からＭ期への進行に関与する。２４時間の塩Ｉ処理はＡＲＯおよびＦＲＯ細胞系列ではサイクリンＡ、Ｂ１およびＣＤＣ２のレベルを低下させ、ＡＲＯ細胞ではサイクリンＤ３のレベルも低下させるが、ＫＴＣ−１および１Ｆ３では影響がない。同じ条件下にβアクチンのレベルは明確な影響は受けない。
【００３１】
５）試験管内キナーゼ検定法：ｃ−Ａｂｌの燐酸化およびＭＡＰＫキナーゼ活性
Ａｂｌは細胞溶解物から記載の抗体を用いて免疫沈澱させた。試験管内キナーゼ検定は以前の報告（Dorey et al, Oncogene, 2000, 56: 8075 - 84）にしたがって行った。放射能標識ＧＳＴ−ＣｒｋはPhosphorImager（Molecular Dynamics Inc. Sunnyvale, CA, USA）を用いて定量化した。細胞を種々の用量の塩Ｉで１２時間処理し、細胞抽出物を燐酸化ｃ−Ａｂｌおよび全ｃ−Ａｂｌに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析にかけた。ｃ−Ａｂｌ活性はＧＳＴ−Ｃｒｋを基質として３２Ｐ−ＡＴＰを用いる試験管内キナーゼ検定によって測定した。ＭＡＰＫキナーゼ活性には、細胞を０.１％ＤＭＳＯまたは１０μＭ−塩Ｉと共に血清不含培地中で２時間インキュベーションした。刺激は２０％ＦＣＳで８分間行い、細胞溶解物を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＲＫ１／２およびＥＲＫ１／２の燐酸化体に対する抗体を用いるウェスタンブロッティングとに付した。実験は全て２回行い、同様な結果を得た。
【００３２】
結果：正常な条件で培養したＡＲＯおよびＦＲＯ細胞は高レベルのｃ−ＡｂｌおよびそのＴｙｒ２４５燐酸化型を有するが、これは以前にｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の明確な活性化に関連付けられている（データ提示せず）。塩Ｉは５０μＭ濃度まででは実験した時間間隔内ではこれらの細胞系列中ｃ−Ａｂｌプロテインのレベルには明らかな影響を与えなかった。しかし、１２時間連続処理はｃ−Ａｂｌのチロシン燐酸化を低下させた。ＧＳＴ−Ｃｒｋ融合プロテインで検定したｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害は、ＡＲＯおよびＦＲＯの塩Ｉ処理の結果としてのｃ−Ａｂｌ燐酸化のレベルに関連付けられた。対照的に塩Ｉはｗｔ−ｐ５３細胞系列（１Ｆ３およびＫＴＣ−１）ではｃ−Ａｂｌの蓄積を誘導し、ホスホ−ｃ−Ａｂｌ濃度を低下させなかった。ｗｔ−ｐ５３甲状腺細胞系列の塩Ｉ処理後にｃ−Ａｂｌが蓄積する原因となる機序は更なる解明を必要とする。成長因子のような細胞外シグナルに対する共通な応答はミトーゲン−活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼカスケードの活性化である。塩Ｉが研究中の各細胞系列の中で発現される受容体チロシンキナーゼの活性を阻害するか否かを決定するために、血清刺激に応答するＥＲＫ１／２の燐酸化に対する塩Ｉの効果を検討した。刺激は飢餓ＫＴＣ−１細胞のｐ−ＥＲＫ１／２レベルを増大させたが、塩Ｉはこの燐酸化には影響を及ぼさなかった。血清刺激は未分化甲状腺癌細胞系列ＡＲＯおよびＦＲＯのＥＲＫ１／２キナーゼ活性を有意に調節せず、また塩Ｉはｐ−ＥＲＫ１／２の濃度には影響を与えなかった。これに加えて、培地にＰＤＧＦ−ＢＢを添加すると、ＰＤＧＦＲαおよび−ＲβのリガンドはＭＡＰキナーゼ活性を変化させず、またＰＤＧＦＲβはＡＲＯおよびＦＲＯ細胞では塩Ｉ処理によって影響を受けなかった（データ提示せず）。これらの結果はｃ−Ａｂｌが本実験で使用した未分化癌細胞系列において活性な塩Ｉの唯一な標的キナーゼであるらしいことを示す。
【００３３】
６）ｃ−Ａｂｌおよびｐ５３の免疫組織学的分析
保管固定組織切片の免疫組織学的研究のための使用は長崎大学病院の倫理委員会に承認されている。各個人からはインフォームドコンセントを得ている。免疫組織化学は以前の報告通りに行った（Hermann et al, Int. J. Cancer, 2001, 92: 805 - 11）。要約すれば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の４μｍ切片を脱パラフィン化し、熱抗原をデマスキング（０.０１モル／Ｌクエン酸緩衝液、ｐＨ６.０）し、一次抗体と室温で１時間接触させた。次の抗体を使用した：マウスモノクローナル抗−ｐ５３抗体、クローンＤＯ−７（DAKO, Copenhagen, Denmark、１：１００希釈）およびマウスモノクローナル抗−ｃ−Ａｂｌ抗体（２４−１１、 Santa Cruz Biotechnology, １：２００希釈）。結合した抗体はビオチン複合２次ヤギ−抗−マウスＩｇＧ／ＩｇＭ−Ｆ（ａｂ）２抗血清およびペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA）を用いて可視化した。スライドは研究の対象である症例について病理学的または臨床的データを知らない独立の観察者２人が検査した。ｐ５３染色を評価するために、陽性に染色された腫瘍細胞の百分率に関して高パワーフィールド（high-power fields；×４００）４つを利用した。以前にHermann et al, Int. J. Cancer 2001, 92： 805 - 11に報告されているように、染色された細胞>１０％を持つ腫瘍を「強陽性」とし、＜１０％ を持つものを「弱陽性」とした。ｃ−Ａｂｌの免疫染色は、染色強度を等級０、１＋、２＋または３＋に類別する、以前に報告した判断基準（Yanagawa et al, Oral Oncol. 2000, 36: 89 - 94）に従う視覚的等級付けシステムによって半定量化した。ｃ−Ａｂｌレベルと甲状腺癌の組織学的特性との関連付けを単純化するために、これらの群をさらに「弱陽性」（等級０、等級１＋）と「強陽性」（等級２＋、等級３＋）とに分類した。
【００３４】
結果：様々な型のヒト甲状腺腫瘍におけるｃ−Ａｂｌとｐ５３との発現に関するさらなる情報を得るために、外科的に切除した様々な型の腫瘍についてこれらのプロテインに関する免疫組織化学染色を行った（データ提示せず）。ｃ−Ａｂｌの高度な発現（核および細胞質の混合免疫染色）は未分化癌では５／６（８３％）に検出されたが、一方、濾胞性癌および乳頭状癌ではフィッシャーのエグザクトテストで、明らかに低率２／９（２２％），ｐ＝０.０４１および１／８（１２％），ｐ＝０.０２６で観察された（表４）。低レベルのｃ−Ａｂｌ発現が腫瘍病巣周囲の正常組織および腺腫性甲状腺腫の症例で観察された。未分化癌では全症例（６／６）で核のｐ５３染色が検出されたが、濾胞性癌および乳頭状癌では各々低率１／９，ｐ＝０.００１４および１／８，ｐ＝０.００５のみで検出された（Fisher's exact test）。検討した良性甲状腺病変（結節性甲状腺腫）の１／１０（１０％）のみが弱い核内ｐ５３発現を示した。このように、免疫組織化学的知見はｐ５３−変異未分化甲状腺癌細胞系列に観察されたｃ−Ａｂｌプロテインの過剰発現に合致する。
【表４】
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表４：未分化癌、濾胞性癌および乳頭状癌および腺腫性甲状腺腫内のｃ−Ａｂｌおよびｐ５３の免疫組織化学法による検出：
切片はｃ−Ａｂｌにはヘマトキシリンで、ｐ５３にはメチルグリーンで対比染色した。註）染色パターン：ｃ−Ａｂｌ：核／細胞質；ｐ５３：ＡＣの核（データ提示せず）。
【００３５】
７）ＦＲＯ細胞に対する塩Ｉの生体内効果
マウス異種移植モデル：マウスは全て長崎大学（長崎、日本）動物舎で飼育し、この報告に記載する動物実験は全て「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the Nagasaki University School of Medicine（長崎大学医学部における実験動物の管理および使用についての指針）」に概説された原理および手順にしたがって行った。ＲＰＭＩ１６４０に懸濁したＦＲＯ細胞５００万個を８週令雌性ＢａｌＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（Charles-River Japan, Tokyo, Japan）の側腹部に皮下注射した。腫瘍サイズは一日おきにカリパスで測定し、腫瘍容積を式：ａ２×ｂ×０.４［ここにａは最小直径であり、ｂはａと直角な直径である］にしたがって算出した。腫瘍が少なくとも１００ｍｍ３に達した後、マウスを無作為に１群５匹の実験群と対象群とに割り付けた。塩Ｉの無菌水溶液を５０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日２週間腹腔内注射した。対照群のマウスには純水を注射した。各動物の体重、摂食行動および運動活性を一般的健康状況の指標として監視した。
【００３６】
統計分析：データは別段の指摘がない限り平均値±標準偏差で記載する。スチューデントのｔ−検定およびマンホイットニーのＵ検定を用いてパラメータデータおよび非パラメータデータについて２群間の比較を行った。ｐ値＜０.０５を統計的有意とした。
【００３７】
結果：塩Ｉの甲状腺未分化癌に対する抗腫瘍効果の可能性を生体内で試験するために、ＦＲＯ細胞を無胸腺マウスに移植し、塩Ｉまたは媒体（Ｈ２Ｏ）を腹腔内に注射した。表５に示す通り、５０ｍｇ塩Ｉ／ｋｇを連続１４日間毎日１回投与すると強い抗腫瘍効果が得られた。塩Ｉを摂取したマウスの体重と身体的活動には顕著な影響が見られなかった。
【表５】
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表５：無胸腺マウスに移植したＦＲＯ細胞における塩Ｉの抗腫瘍効果：
塩Ｉまたはプラセボ（Ｈ２Ｏ）のいずれかの腹腔内注射で各群（ｎ＝５）の動物を処置した。グラフは実験群および対照群における腫瘍増殖の動態をｍｍ３で示す。*）ｐ＜０.０５対照群と実験群を比較。
【００３８】
本研究で、特異的チロシンキナーゼ阻害剤である塩Ｉは変異ｐ５３をハーバリングし、分化がない甲状腺癌に対する抗癌剤になる可能性があることが証明された。塩Ｉを用いる処理はｐ５３に欠陥のあるＦＲＯ、ＡＲＯおよびＮＰＡ細胞系列では顕著な増殖阻害を誘導したが、野生型ｐ５３を持つＫＴＣ−１およびＴＰＣ−１では誘導しなかった。同様に野生型ｐ５３を安定に形質移入したＦＲＯ細胞では塩Ｉの効果がなかったので、塩Ｉの効果がｐ５３の状態に依存することが確認される。ｐ５３−変異未分化癌細胞系列ＡＲＯおよびＦＲＯでは、臨床的に達成可能な濃度（各々、ＩＣ５０５.９および７.８μＭ）で細胞増殖抑制効果が観察された。このＩＣ５０値はＮＰＡ細胞（ＩＣ５０１６μＭ）および他の乳頭状癌細胞系列における値よりも低い。本研究は未分化癌細胞に焦点を絞った。フローサイトメトリーでは塩Ｉによる増殖抑制は該細胞系列のＧ２／Ｍまたは後期Ｓ期における停止に起因することが示された。
【００３９】
塩Ｉの細胞増殖抑制効果はＣＭＬのみでなく、ＰＤＧＦＲの活性増強で特徴付けられる小細胞肺癌および強いｃ−ＫＩＴチロシンキナーゼ活性化を示す胃腸間質腫瘍でも証明されている。
【００４０】
ＲＴ−ＰＣＲ分析は全ての細胞系列にｃ−ＡｂｌのｍＲＮＡが存在することを示した。未分化細胞系列ではＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβおよびｃ−ＫＩＴの発現は検出不能であるかまたは非常に低く、また他の細胞系列では様々なパターンを示した。ウェスタンブロッティングを用いて、未分化甲状腺癌細胞系列ＡＲＯおよびＦＲＯにおけるｃ−Ａｂｌのレベルは一次甲状腺細胞および乳頭状癌細胞系列におけるレベルと比較して顕著に高いことが見出された。ｐ５３変異−乳頭状癌細胞系列ＮＰＡでは、ｃ−Ａｂｌのレベルもｗｔ−ｐ５３乳頭状癌細胞系列ＴＰＣ−１およびＫＴＣ−１におけるよりも高かった。さらに、未分化甲状腺癌細胞系列ＦＲＯへのｗｔ−ｐ５３の安定な形質移入はｃ−Ａｂｌプロテインの発現を低下させた。試験管内でのこのデータと合致して免疫組織化学的研究はｐ５３に強陽性の未分化癌症例の殆どで高レベルのｃ−Ａｂｌ陽性免疫染色が観察されることを明らかにした。このデータはｐ５３の状態が甲状腺癌細胞中のｃ−Ａｂｌプロテインレベルに影響するであろうことを示唆する。
【００４１】
塩Ｉによる細胞増殖阻害の機序を解明するために、ｃ−ＡｂｌおよびＥＲＫ１/２、ＭＡＰキナーゼの燐酸化状態に及ぼすその効果を観察した。塩ＩはＡＲＯおよびＦＲＯ細胞ではｃ−Ａｂｌのキナーゼ活性を用量−および時間依存性の様式で阻害したが、ｗｔ−ｐ５３細胞系列ではホスホ−ｃ−Ａｂｌのレベルは低減できなかった。実験したどの細胞系列でもＭＡＰキナーゼ活性は塩Ｉによって阻害されなかった。それ故、薬剤が誘導する未分化癌細胞における増殖抑制は「受容体型チロシンキナーゼ−ｒａｓ−ＭＡＰＫ」経路によって媒介されるものではなく、ｃ−Ａｂｌキナーゼの阻害に関連するものである。
【００４２】
塩Ｉ処理ＦＲＯ細胞ではサイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１cip１およびｐ２７kip１の発現が増加し、サイクリンＡおよびＢ１の発現が減少する。他種の未分化癌細胞系列ＡＲＯでｐ２７kip１、サイクリンＡおよびＢ１の発現およびサイクリンＤ３の発現低下について同様な変化が観察されたが、ＫＴＣ−１および１Ｆ３のｗｔ−ｐ５３では観察されなかった。それ故、塩Ｉを使用する処理はｐ５３−欠陥甲状腺細胞系列では後期ＳまたはＧ２／Ｍ期移行の停止を誘導した。ｐ５３ｎｕｌｌ／変異Ｔ９８Ｇ細胞（Potapova et al, J. Biol. Chem. 2000, 275： 24767〜75）を含む数種の他種モデル系ではｐ２１cip１過剰発現がＳ期停止に関連付けられていることは注目に値する。われわれの知見に合致して、ＢＣＲ／ＡＢＬを過剰発現するＩＬ−３欠乏プロ−Ｂ細胞系列、ＢａＦ３−ｐ２１０においては塩Ｉとの接触は、ｐ２７kip１のｍＲＮＡおよびプロテインレベルを増大させた（Parada et al, J. Biol. Chem. 2001, 276: 23572 - 80）。それ故、塩Ｉによるｃ−Ａｂｌキナーゼ活性の阻害が細胞周期調節剤の発現／活性の変化を介して細胞増殖の阻害を起すのかもしれないと示唆することは妥当と思われる。塩Ｉがｐ２１cip１およびｐ２７kip１を上方調整する方式の可能性のある説明の一つは次の通りである：ｃ−ＡｂｌキナーゼはＰＫＣ−δを燐酸化でき、これがｃ−ＪｕｎＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）活性の増大を導く（Sun et al, J. Biol. Chem. 2000, 275: 7470 - 3）。われわれは最近の研究で細胞内シグナル伝達カスケードＰＫＣ−δ−ＭＫＫ７−ＪＮＫがＡＲＯ細胞内では活性化されていること（Mitsutake et al, Oncogene, 2001, 20: 989 - 96）およびＪＮＫ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドがｐ２１cip１の誘導を伴ってＳ−期での停止を誘導することを明らかにした。それ故、塩Ｉによるｃ−ＡＢＬ−ＰＫＣ−δ−ＭＫＫ７−ＪＮＫカスケードの阻害はｐ５３−変異甲状腺癌細胞系列の増殖阻害の原因であるかも知れない。結論として、われわれの結果はｐ５３変異／欠陥未分化甲状腺癌細胞系列ではｃ−Ａｂｌが過剰発現されること、および塩Ｉによるｃ−Ａｂｌ活性の選択的阻害はそのような細胞に対して明らかな細胞増殖抑制作用を示すことを証明する。また塩Ｉは明らかな副作用なしに免疫無防備マウスに移植したＦＲＯ細胞の生体内増殖を有効に抑制した。そこで、塩Ｉの使用はヒト未分化甲状腺癌に対する抗癌療法になる可能性がある。
【実施例２】
【００４３】
４−（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミドのメタンスルホン酸塩β結晶入りのカプセル
活性物質として化合物Ｉ（遊離塩基）１００ｍｇに対応する１１９.５ｍｇの塩Ｉを充填したカプセルを次の組成物で製造する：
【表６】
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このカプセル剤は各成分を混合し、混合物をサイズ１の硬ゼラチンカプセルに充填して製造する。
【実施例３】
【００４４】
４−（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミドのメタンスルホン酸塩ｂ結晶を充填したカプセル
活性成分として化合物Ｉ（遊離塩基）１００ｍｇに対応する１１９.５ｍｇの塩Ｉを充填したカプセルを次の組成物で製造する：
【表７】
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このカプセル剤は各成分を混合し、混合物をサイズ１の硬ゼラチンカプセルに充填して製造する。
【実施例４】
【００４５】
不応性進行性甲状腺癌の処置における塩Ｉの臨床試験用プロトコル
Ａ−研究対象−参加基準
１）転移病巣のある甲状腺癌であり、動作状況が等級０〜２（後記表参照）で、原則として、乳頭状癌または濾胞性癌からの未分化形質移入が示唆される疾患の臨床的増悪があり、他の処置に応答しないかまたは応答すると思われないこと。
２）年令２０〜８０才であること。
３）処置開始前にＣＴ／ＭＲＩ撮像および腫瘍マーカー（チログロブリン）で評価可能な病巣を有すること。
４）ある程度の心、肺および腎機能があり、重篤な出血性素因がないこと；即ち原則として次の基準を満たすこと：
ａ）超音波カルジオグラフィーで駆出率>５０％であること；試験参加前１年間に虚血性心疾患歴がないこと。
ｂ）肺転移の有無に拘らず血液ガス分析でｐＯ２>６０ｍｍＨｇであること。
ｃ）肝転移の有無に拘らず血清ビリルビン＜２ｍｇ／ｄＬであること。
ｄ）血清クレアチニン＜２ｍｇ／ｄＬであること。
ｅ）白血球≧２０００／ｍｍ３および血小板≧５００００／ｍｍ３であること。
ｆ）ＰＴ>５０％、ＡＰＴＴ＜５０秒、Ｆｂｇ>１００ｍｇ／ｄＬおよびＦＤＰ＜２０μｇ／ｍＬであること。
５）制御困難な活動性感染症がないこと。
６）この研究への参加の同意および書面によるインフォームドコンセントがあること。
【００４６】
行動状況（Performance Status；ＰＳ）（ＳＷＯＧによる）
【表８】
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この判断基準は動作状況の指標である。動作が局部的に制限される時は臨床的に検討する。
【００４７】
Ｂ−研究の方法
この臨床試験は第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験の一部であり、本質的に説明の役に立つ。
１．処置計画
塩Ｉは１日１回食後に化合物Ｉとして４００ｍｇに対応する用量を投与する。もしも有効であり、副作用を起さないか、または副作用が緩和で受忍可能であれば、塩Ｉによる処置を最大６ヶ月まで継続する。弱い副作用が起きた場合は、副作用の程度に応じて1日1回日用量２００ｍｇまで用量を削減する。処置２ヶ月目に塩Ｉの効果を評価し、その後の処置（処置の継続、用量の増加、処置の中断、など）を決定する。原則として、腫瘍サイズが半減すれば用量を８００ｍｇ／日まで増加させて最大６ヶ月間まで継続する。処置２ヶ月で腫瘍サイズが大きくなった時または腫瘍サイズは不変だがいずれかの腫瘍関連病状に更なる改善が好ましい時は可能ならば塩Ｉ処置と組み合わせた放射線療法の施行を考慮する。抗癌薬の同時使用は原則として認めない。他の病状または症状を改善する薬剤は副作用に注意を払って同時に使用してもよい。
【００４８】
２．効果の評価
塩Ｉの効果は１、２、３、４、５および６ヶ月間の処置後に次の各項について評価する：すなわち１）生理学的知見および腫瘍軟度の変化で決定される病状の改善；２）映像で測定される腫瘍サイズ；および３）腫瘍マーカーの変化。
評価事項
１）対象の背景的因子：医療記録番号、識別番号、初診、性、誕生日、身長、体重；合併症、過去の病歴、現病状、過去の処置、家族歴。
２）化合物Ｉの用量。
３）服薬遵守記録および同時平行的投薬。
４）自覚的症状および客観的所見。
５）血圧および脈拍。
６）血液学（赤血球、白血球、血小板、白血球分類）：毎月２回。
７）生化学（肝機能、腎機能、血糖、ＬＤＨ、ＣＰＫ）：毎月２回。
８）腫瘍マーカー（チログロブリン）：毎月１回。
９）腫瘍占有部位、腫瘍サイズおよびＣＴまたはＭＲＩ映像上の浸潤の程度：２ヶ月毎に１回。
１０）胸部Ｘ線撮影（正面）：２ヶ月毎に１回。
１１）腫瘍関連症状のチェック。
１２）検尿。
【００４９】
Ｃ−予備的結果
最初の患者は２００２年１２月に臨床実験に参加した。他種の治療をすることなしに塩Ｉ処置を開始した。腫瘍は３ヶ月にわたって増殖を停止したが、これは急速な増殖および浸潤が見られた前年の経過とは対照的であった。
【国際調査報告】
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