(57)【要約】脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症などの神経障害の治療および予防のためのmGluR5アンタゴニストの組成物および使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症から選択される神経障害の治療のためのグループI mGluRアンタゴニストの使用。
【請求項２】
脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症から選択される神経障害の治療のための薬学的組成物の製造におけるグループI mGluRアンタゴニストの使用。
【請求項３】
脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症から選択される神経障害の治療を必要とする被験者に、治療上有効量のグループI mGluRアンタゴニストを投与する段階を含む、該被験者において該神経障害の重篤度を軽減または予防する方法。
【請求項４】
脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症から選択される神経障害の治療を必要とする被験者に、治療上有効量のグループI mGluRアンタゴニストを含む薬学的組成物を投与する段階を含む、該被験者において該神経障害を治療する方法。
【請求項５】
mGluRアンタゴニストが、グループII受容体またはグループIII受容体の拮抗作用に対するED50の少なくとも10分の1未満であるグループI受容体の拮抗作用に対するED50を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項６】
mGluRアンタゴニストが選択的mGluR5アンタゴニストである、請求項5記載の使用または方法。
【請求項７】
mGluRアンタゴニストが、mGluR1拮抗作用に対するED50の少なくとも10分の1未満であるmGluR5拮抗作用に対するED50を有する、請求項6記載の使用または方法。
【請求項８】
mGluRアンタゴニストが、イオンチャネル型グルタミン酸受容体の拮抗作用に対するED50の少なくとも100分の1未満であるmGluR5拮抗作用に対するED50を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項９】
mGluRアンタゴニストがmGluR受容体に結合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項１０】
mGluR5アンタゴニストがmGluR受容体シグナル伝達に関係する細胞内G蛋白質に結合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項１１】
アンタゴニストが、(E)-6-メチル-2-スチリル-ピリジン(SIB 1893)、2-メチル-6-[(1E)-2-フェニルエチニル]-ピリジン、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール、LY293558、α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシン(MCPG)、3S,4aR,6S,8aRS-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、2-メチル-6-(フェニルエチニル)-ピリジン(MPEP)、6-(((4-カルボキシ)フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、および3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-カルボキシ)-フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体および誘導体から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項１２】
1回の経口用量形態または1つの経皮パッチとして、患者において脆弱X、自閉症、精神遅滞、精神分裂症およびダウン症から選択される神経障害を治療するために十分な量で提供される1つまたは複数のmGluRアンタゴニストを含むキットであって、該神経障害を治療するための該キットの使用、ならびに任意で、起こりうる副作用および薬物同士または薬物と食物との相互作用の警告を記述した（文字および／または図入りの）指示書と共に提供されるキット。
【請求項１３】
キットが選択的mGluR5アンタゴニストを含む、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
a. 請求項12記載のキットを製造する段階；および
b. 患者の神経障害を治療するために該キットを使用する恩典を医療従事者に販売する段階
を含む、医薬品ビジネスを実施するための方法。
【請求項１５】
a. 請求項12記載のキットを販売するための流通ネットワークを提供する段階；および
b. 患者の神経障害を治療するために該キットを使用する目的で、患者または内科医に指示材料を提供する段階
を含む、医薬品ビジネスを実施するための方法。
【請求項１６】
a. あるクラスの患者における神経障害を治療するために適当な用量のmGluRアンタゴニストを決定する段階；
b. 動物における効力および毒性に対し、段階(a)で同定したmGluRアンタゴニストの1つまたは複数の製剤の治療用プロファイリングを実施する段階；および
c. 許容される治療プロファイルを有していると段階(b)で同定された製剤を販売するための流通ネットワークを提供する段階
を含む、医薬品ビジネスを実施するための方法。
【請求項１７】
調製物を医療従事者に販売するための販売グループを提供するさらなる段階を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
a. あるクラスの患者において神経障害を治療するために適当な用量のmGluRアンタゴニストを決定する段階；および
b. 第3の関係者に、神経障害を治療するためのmGluR5アンタゴニストをさらに開発し販売するための権利を許諾する段階
を含む、医薬品ビジネスを実施するための方法。
【請求項１９】
前記クラスの患者が神経障害に罹患する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
mGluRアンタゴニストが体重1kgにつき約10mg/日〜約1000mg/日の範囲の用量で投与される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項２１】
mGluRアンタゴニストが1μMまたはそれ以下のED50を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項２２】
mGluRアンタゴニストが100nMまたはそれ以下のED50を有する、請求項21記載の使用または方法。
【請求項２３】
mGluRアンタゴニストが10またはそれ以上の治療指数(TI)を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項２４】
mGluRアンタゴニストが100またはそれ以上のTIを有する、請求項23記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
哺乳類の中枢神経系(CNS)では、神経インパルスは、受信ニューロンの興奮が引き起こされる、送信ニューロンにより放出される伝達物質と受信ニューロンの表面受容体との間の相互作用により制御される。CNS中に最も豊富に存在する神経伝達物質であるL-グルタミン酸は哺乳類の主な興奮性経路を媒介し、興奮性アミノ酸(EAA)と呼ばれる。グルタミン酸に応答する受容体は興奮性アミノ酸受容体(EAA受容体)と呼ばれる。Watkins＆Evans、Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology、21:165(1981)；Monaghan、BridgesおよびCotman、Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology、29:365(1989)；Watkins、Krogsgaard-LarsenおよびHonore、Transactions in Pharmaceutical Science、11:25(1990)を参照のこと。
【０００２】
興奮性アミノ酸受容体は2つの一般的な型に分類される。ニューロンの細胞膜中の陽イオンチャネルの開口に直接結合する受容体は「イオノトロピック」と呼ばれる。この型の受容体は少なくとも3つのクラスにさらに分けられ、これは選択性アゴニストN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチルイソキサゾール-4-プロピオン酸（AMPA）およびカイニン酸(KA)の脱分極作用により規定される。高親和性（KA1およびKA2）または低親和性（GluR5、GluR6およびGluR7）カイニン酸受容体のいずれかとして分類される5つのカイニン酸受容体が同定されている(Bleakmanら、Molecular Pharmacology、1996、Vol.49、No.4、pp.581-585)。
【０００３】
第2の一般型の受容体は、G蛋白質または第2メッセンジャー結合「代謝調節型」興奮性アミノ酸受容体である。この第2の型は複数の第2メッセンジャーシステムに結合するグルタミン酸受容体の高異種性ファミリーである。それらのアミノ酸配列相同性、アゴニスト薬理学、導入機序への結合に基づき、現在周知の8つのmGluRサブタイプは3つのグループに分類される。グループI受容体（mGluR1およびmGluR5）はホスホリラーゼCの刺激に結合し、ホスホイノシチド加水分解および細胞内Ca++レベルの上昇につながり、およびいくつかの発現系ではK+チャネル、Ca++チャネル、非選択性陽イオンチャネルまたはNIVIDA受容体などのイオンチャネルの調整に結合することがわかっている。グループII受容体(mGluR2およびmGluR3)およびグループIII受容体(mGluR4、6、7および8)はアデニリルシクラーゼに陰性結合し、哺乳類細胞内で非相同的に発現されるとcAMP形成阻害に結合し、アフリカツメガエル卵母細胞および小脳の単極ブラシ細胞内のG蛋白質により活性化された内方性修正カリウムチャネルに結合することがわかっている。網膜においてのみ本質的に発現されるmGluR6を除き、mGluRは中枢神経系全体で広く発現されると考えられる。
【０００４】
両方の型の受容体は、興奮性経路に沿った通常のシナプス伝達を媒介するだけでなく、発達中および人生を通してのシナプス結合調整に関与するために現れる。Schoepp、BockaertおよびSladeczek、Trends in Pharmacological Science、11:508(1990)；McDonaldおよびJohnson、Brain Research Reviews、15:41(1990)。
【０００５】
興奮性アミノ酸受容体が過剰にまたは不適当に刺激されると、興奮毒性として知られる機序により、神経細胞の傷害または損失が起こる。この過程は、様々な状態での神経変性を媒介することが示唆されている。これらの受容体のアゴニストおよびアンタゴニストは急性および慢性神経変性状態の治療に有益である可能性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、FMRPの抑圧が関係し、脆弱X症候群、ダウン症および他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症を含むが、これらに限定されるものではない神経変性障害を、患者に例えば海馬において、mGluR、好ましくはmGluR1またはmGluR5などのグループI受容体と拮抗する化合物、さらに好ましくはmGluR5に選択的な化合物を投与することにより、治療または予防する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、
a)ダウン症、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症を治療するためのmGluRアンタゴニストの使用、
b)ダウン症、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症を治療するための薬学的組成物の製造におけるmGluRアンタゴニストの使用、
c)ダウン症、脆弱Xおよび自閉症治療を必要とする被験者に治療上有効な量のmGluRアンタゴニストを投与する段階を含む、被験者においてこれらの障害を治療する方法、
d)ダウン症、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症の治療を必要とする被験者に治療上有効な量のmGluRアンタゴニストを含む薬学的組成物を投与する段階を含む、被験者においてこれらの障害を治療する方法
を提供する。
【０００８】
本発明のある態様は、ダウン症、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症を治療するのに十分な量のmGluRアンタゴニストと共に、他の治療薬を患者（ヒトまたは他の動物）に、（例えば、同時にまたは異なる時期に）共に投与する段階を含む、これらの障害を治療するための方法に関する。ある態様では、組成物は経口投与のためのものであり、または経皮投与のためのものである。
【０００９】
本発明の他の局面では、mGluRアンタゴニストは選択的mGluR5アンタゴニストである。
【００１０】
本発明の他の局面では、mGluRアンタゴニストは、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール、α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシン(MCPG)、2-メチル-6-(フェニルエチニル)-ピリジン(MPEP)、3S,4aR,6S,8aRS-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、2-メチル-6-[(1E)-2-フェニルエチニル]-ピリジン、(E)-6-メチル-2-スチリル-ピリジン(SIB 1893)、LY293558、6-(((4-カルボキシ)フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、および3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-カルボキシ)-フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体および誘導体から選択される。他の局面では、mGluR5受容体アンタゴニストは薬学的に許容される希釈剤または担体を用いて製剤化される。
【００１１】
本発明の他の局面は、1回の経口用量形態または1つの経皮パッチとして、患者において脆弱X、ダウン症、および他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症から選択される神経障害を治療するのに十分な量で提供される1つまたは複数のmGluRアンタゴニストを含むキットであって、神経障害を治療するためのキットの使用、ならびに任意で、起こりうる副作用および薬物同士または薬物と食物との相互作用の警告を記述した（文字および／または図入りの）指示書と共に提供されるキットである。
【００１２】
本発明の１つの局面は、医薬品ビジネスを実施するための方法である。したがって、本発明の1つの態様は、以下の段階を含む医薬品ビジネスを実施するための方法である：
a. 1回の経口用量形態または1つの経皮パッチとして、患者において脆弱X、ダウン症、および他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症から選択される神経障害を治療するのに十分な量で提供される1つまたは複数のmGluRアンタゴニストを含むキットであって、神経障害を治療するためのキットの使用、ならびに任意で、起こりうる副作用および薬物同士または薬物と食物との相互作用の警告を記述した（文字および／または図入りの）指示書と共に提供されるキットを製造する段階；および
b. 患者の神経障害を治療するためにそのキットを使用する恩典を医療従事者に販売する段階。
【００１３】
本発明の他の態様は、以下の段階を含む医薬品ビジネスを実施するための方法である：
a. 1回の経口用量形態または1つの経皮パッチとして、患者において脆弱X、ダウン症、および他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症から選択される神経障害を治療するのに十分な量で提供される1つまたは複数のmGluRアンタゴニストを含むキットであって、神経障害を治療するためのキットの使用、ならびに任意で、起こりうる副作用および薬物同士または薬物と食物との相互作用の警告を記述した（文字および／または図入りの）指示書と共に提供されるキットを販売するための流通ネットワークを提供する段階；および
b. 患者の神経障害を治療するためにキットを使用するために患者または内科医に指示材料を提供する段階。
【００１４】
本発明の他の態様は、以下の段階を含む医薬品ビジネスを実施するための方法である：
a. あるクラスの患者において神経障害を治療するために適当な用量のmGLuRアンタゴニストを決定する段階；
b. 動物における効能および毒性に対し、段階(a)で同定したmGluR5アンタゴニストの1つまたは複数の製剤の治療プロファイリングを実施する段階；および
c. 許容される治療プロファイルを有する段階(b)で同定された製剤を販売するための流通ネットワークを提供する段階。
【００１５】
ある態様では、本発明は医療従事者に調製物を販売するための販売グループを提供する追加の段階を含む方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、以下の段階を含む医薬品ビジネスを実施するための方法を開示する：
a. あるクラスの患者において神経障害を治療するために適当な用量のmGLuRアンタゴニストを決定する段階；および
b. 第3の関係者に、神経障害を治療するためのmGluR5アンタゴニストをさらに開発し販売するための権利を許諾する段階。
【００１７】
さらに他の局面では、本発明は、薬物を同時投与するための組成物中でmGluRアンタゴニストおよび薬学的に許容される賦形剤を混合する段階を含む、薬学的調製物を調製するための方法に関する。
【００１８】
さらに他の局面では、本発明は、ダウン症、脆弱X、および他の形態の精神遅滞、自閉症および精神分裂症の治療において、mGluRアンタゴニスト（またはそのプロドラッグもしくは代謝産物）の調製物またはそれぞれの別個の製剤を含むキットを製造し、医療従事者に調製物またはキットを使用する恩典を販売することにより医薬品ビジネスを実施するための方法に関する。
【００１９】
さらに他の局面では、本発明は、コンビナトリアル調製物およびキットを販売するための流通ネットワークを提供し、ダウン症、脆弱X、および他の形態の精神遅滞、自閉症および精神分裂症を治療するためにそのような調製物を使用するために患者または内科医に指示材料を提供することにより、医薬品ビジネスを実施するための方法を提供する。
【００２０】
さらに他の局面では、本発明は、mGluRアンタゴニストの適当な製剤および用量を決定することにより、医薬品ビジネスを実施するための方法に関する。ある態様では、方法は、その調製物を医療従事者に販売するための販売グループを提供する追加の段階をさらに含む。
【００２１】
さらに他の局面では、本発明は、mGluRアンタゴニストの適当な製剤および用量を決定し、第３の関係者に、製剤をさらに開発し販売するための権利を許諾することにより、医薬品ビジネスを実施するための方法を提供する。他の局面では、そのクラスの患者は神経障害に罹患している。
【００２２】
他の態様では、方法は患者に有効量のmGluRアンタゴニストまたはその組み合わせを投与する段階を含む。他の態様では、mGluRアンタゴニストは体重1kgあたり約10mg/日〜約1000mg/日の範囲の用量で投与される。ある態様では、mGluRアンタゴニストは体重1kgあたり約50mg/日〜約800mg/日の範囲の用量で投与される。他の態様では、mGluRアンタゴニストは体重1kgあたり約250mg/日〜約500mg/日の範囲の用量で投与される。
【００２３】
特定の態様では、mGluRアンタゴニストは10μM、1μM、100nm、10nmまたはそれ以下のED50を有する。1つの態様では、TIは10、100、1000またはそれ以上である。特定の態様では、グループI受容体拮抗作用に対するED50は、グループII受容体またはグループIII受容体拮抗作用、例えば、mGluR2、mGluR3、mGluR4、mGLuR6、mGluR7、およびmGluR8のそれぞれに対するED50よりも少なくとも10分の1未満である。
【００２４】
本発明を実施するための最良の様式
発明の詳細な説明
I.概観
脆弱X精神遅滞蛋白質(FMRP)が活性依存性局所シナプス蛋白質合成に関与するという証拠は最近になりようやく明らかになった。主な興奮性神経伝達物質グルタミン酸は、グループI代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)を介して、樹状突起での蛋白質合成を刺激する。グループI mGluRはG蛋白質結合mGluRファミリーのサブグループであり、2つのサブタイプ、mGluR1およびmGluR5から構成される。その後の研究で、FMR1 mRNAが樹状突起に存在すること、FMRPはシナプトニューロソームのmGluR活性化に応答して合成されることが証明された(Weilerら、1997)。FMRP自体はmRNAの翻訳を調節することができるので、mGluR活性化に応じたシナプスでのFMRPの合成は、ニューロン活性が、シナプス可塑性および発達に対し重要な他の蛋白質の合成を調節または制御することができる機序である可能性がある。
【００２５】
mGluR活性化は蛋白質合成、とりわけFMRPの合成を刺激することができることが知られていたが、この機序の機能的な役割は現在までわかっていなかった。シナプス刺激または選択的アゴニストR,S-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)のいずれかによるグループI mGluRの活性化により、ラットの海馬の領域CA1でシナプス応答の長期抑圧(LTD)が誘発されることがいくつかの研究で証明されている(Fitzjohnら、1999；KempおよびBashir、1999；Huberら、2000)。LTDはmGluR5に依存し、最も重要なことは、新規蛋白質の迅速な樹状突起合成を必要とする(Huberら、2000)。このLTD機序は局所樹状突起蛋白質合成のグルタミン酸または活性誘発刺激の機能に対する手がかりを提供する。
【００２６】
LTD様の機序は生後の初期の発達期間中に形成される不適当なシナプスの排除または除去を担うことができることが示唆されている(Colmanら、1997；BearおよびRittenhouse、1999)。最近の証拠によりこの仮説が支持されている。グループI mGluRアゴニストにより海馬ニューロン培養物を処理すると、AMPA-サブタイプグルタミン酸受容体(AMPAR)の表面発現の長期減少が起こり、受容体は興奮性シナプスでのシナプス伝達を担う。LTDのように、AMPAR表面発現の長期減少は蛋白質合成に依存する(Snyderら、2000)。予備データはまた、DHPG処理後のシナプス後末端の数が同時に減少することを示す。また、これらの結果から、mGluR5の活性化により、興奮性シナプスの数の減少または排除により媒介されることが最も多いシナプス強度の減少が起こることが示される。このシナプス排除過程は発達中および成人の記憶の保存における適当なシナプス結合の形成に寄与する可能性がある。
【００２７】
本発明は、FMRPがLTD機序において絶対必要な役割を果たすという発見に基づく。下記で詳細に説明するように、LTDにおけるFMRPの役割は、脆弱X症候群のFMR1ノックアウトマウスモデルを用いて発見された。簡単に説明すると、ノックアウトまたは野生型同腹子のいずれかから、海馬脳切片を調製した。DHPG適用またはペアパルス低頻度刺激(PP-LFS)と呼ばれるシナプス刺激プロトコルのいずれかを用いてLTDを誘発した。驚くべきことに、DHPGおよびPP-LFS処理した切片の両方においてノックアウトマウスでLTDの著しい増強が観察された。これらの結果から、FMRPは標準的にはmGluR依存性蛋白質合成の阻害物質として機能すること、FMRPが存在しないと、LTDに必要とされる蛋白質の合成が統制されないことが示唆される。これらの結果が意味することの1つは、FMR1ノックアウトマウスまたは脆弱X患者における過剰のLTDまたはシナプス排除機序は正常なシナプス発達過程をかき乱し、樹状突起棘構造の異常、ついには認知欠損に至ることがある。代替的または加えて、成人でLTD様の機序が増強されると、脳内での情報記憶が無効となり、精神遅滞の原因となることもある。
【００２８】
精神遅滞に関連するニューロン機序の発見により、脆弱X症候群、ダウン症候群および他の形態の精神遅滞、自閉症、精神分裂症、およびFMRPレベルまたは発現の抑制が関与する他の障害に関連するシナプス異常および認知欠損を阻止するまたは逆転させる治療が提供される。例えば、治療は、生後初期の発達中にmGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニストを投与し、異常に増強されたLTDを減少させ、シナプスの形成と排除の均衡を回復させるものとすることができる。さらに、mGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニストを用いて成人治療を行うと、ニューロンが幾らかの時間の間、樹状突起を形成し受容体の表面発現を調整する能力を保持するという証拠を考えると、学習欠損が減少する可能性がある。
【００２９】
本発明はダウン症候群、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症を治療するために、mGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニストを使用することに関する。mGluRアンタゴニストはmGluRを活性化するリガンド（アゴニスト）の効果を減少させる物質または効果をなくす物質である。このように、アンタゴニストは例えば化学アンタゴニスト、薬物動力学的アンタゴニスト、受容体ブロックによるアンタゴニスト、非競合的アンタゴニスト、または生理学的アンタゴニストとしてもよい。
【００３０】
アンタゴニストは、例えば競合的にまたは非競合的に（例えばアロステリックに）リガンド結合を阻害することにより、リガンドと受容体の相互作用のレベルに作用しうる。他の態様では、アンタゴニストは、例えば受容体とG蛋白質との相互作用を阻害することにより、受容体の下流で作用してもよい。「薬物動力学的アンタゴニスト」は、例えば、活性リガンドの代謝分解の速度を増大させることにより、作用部位での活性薬物濃度を効果的に減少させる。受容体ブロックによる拮抗作用には2つの重要な機序が関係する：1)可逆競合拮抗作用；および2)不可逆または非平衡競合拮抗作用。可逆競合拮抗作用は、受容体からのアンタゴニスト分子の解離速度が十分高く、リガンド添加時に、受容体に結合するアンタゴニスト分子がリガンドにより効果的に置換される場合に起こる。不可逆または非平衡競合拮抗作用は、アンタゴニストが受容体から非常に遅く解離するまたは全く解離せず、リガンドを適用してもアンタゴニスト占有には何の変化もない場合に起こる。このように、拮抗作用は克服できない。本明細書で使用しているように、「競合アンタゴニスト」は、リガンドと受容体との相互作用を立体的に妨害する様式で受容体またはリガンドに直接結合する分子である。
【００３１】
非競合的アンタゴニストはアンタゴニストが受容体に結合するリガンドと直接競合しないが、その代わりにリガンドによる受容体活性化に続くシグナル伝達経路のある点をブロックする状況を説明する。生理学的拮抗作用は、体内での相対する作用が互いに打ち消される傾向のある2つの物質の相互作用を大まかには説明する。アンタゴニストはまた、機能的なmGluRの発現を減少させる物質または発現をなくす物質とすることができる。このように、アンタゴニストは例えば、1)mGluR5をコードする遺伝子の発現、2)mGluR5 RNAの翻訳、3)mGluR5蛋白質の翻訳後修飾、または4)細胞膜へのGluR5の挿入を減少させる物質または挿入をなくす物質とすることができる。
【００３２】
II.定義
「有効量」という用語は、指定された障害に罹患する患者を治療する際に、患者に1回または数回の用量投与すると効果のあるmGluRアンタゴニストを含む化合物の量を示す。
【００３３】
「ED50」という用語は、その最大応答または効果の50％を達成する薬物の用量を意味する。
【００３４】
「IC50」という用語は、例えば細胞死などの状態の頻度を50％減少させることにより、競合ペプチドと蛋白質との結合を50％減少させることにより、または活性レベルを50％減少させることにより、活性または特性を50％阻害する薬物の濃度を意味する。
【００３５】
「LD50」という用語は、試験被験者の50％で致死的な薬物の用量を意味する。
【００３６】
対象の方法により治療される「患者」および「被験者」は、ヒトまたはヒト以外の動物のいずれかを意味することができる。
【００３７】
「組成物」は複数の物質を組み合わせて凝集混合物としたものを示す。
【００３８】
「プロドラッグ」という用語は、生理学的な条件下で、本発明の治療上活性な作用物質に変換される化合物を包含するものである。プロドラッグを製造するための通常の方法は、生理学的な条件下で加水分解され所望の分子が現れるエステルなどの選択された部分を含むものである。他の態様では、プロドラッグは宿主動物の酵素活性により変換される。
【００３９】
「代謝産物」という用語は、患者などの生物環境に化合物を導入すると生成される活性誘導体を示す。
【００４０】
「アゴニスト」は、一定の型の受容体を活性化する分子である。例えば、グルタミン酸分子はEM受容体を興奮させるとアゴニストとして作用する。対照的に、「アンタゴニスト」はアゴニストが受容体に及ぼす効果を阻止するまたは減少させる分子である。「治療指数」という用語はLD50/ED50として規定される薬物の治療指数(TI)を示す。
【００４１】
「経皮パッチ」は、皮膚、または口の内側で見られる粘膜などの粘膜を含む任意の適した外面を介して、患者に薬物を送達することができるシステムを意味する。そのような送達システムは一般に、可撓性の裏当て、接着剤および薬剤保持マトリクスを含み、裏当ては接着剤およびマトリクスを保護し、接着剤は患者の皮膚上で全体を維持する。皮膚と接触すると、薬剤保持マトリクスは薬剤を皮膚に送達し、薬剤は皮膚を通過し患者体内に入ることができる。
【００４２】
本明細書で使用されるように「統計学的に有意である」という用語は、得られた結果が特定のレベルの確率での可能性の揺らぎによるものではないと思われることを意味する。2つの最も一般に特定される有意性のレベルは0.05(p=0.05)および0.01(p=0.01)である。0.05および0.01に等しい有意性のレベルは、それぞれ誤差の確率が100のうち5および100のうち1であることを意味する。
【００４３】
「医療従事者」という用語は、個人、団体などに医療サービスを提供する個人または組織を意味する。「医療従事者」の例としては、医者、病院、継続医療の退職者のコミュニティー、熟練看護施設、亜急性医療施設、診療所、専門が複数である診療所、独立した救急センター、家庭健康代理店、およびHMOが挙げられる。
【００４４】
「流通ネットワーク」は、共にリンクされ、商品を1個人、組織、または場所から複数の他の個人、組織または場所に移す個人または組織を示す。
【００４５】
「販売グループ」という用語は、ある製品の販売に関係する個人の組織を示す。
【００４６】
「認可」という用語は、特許の所有者またはノウハウの保持者が、他のものに、特許組成物もしくは方法またはノウハウを使用する権限を公的に与える、権限のある許諾を意味する。
【００４７】
III.本発明の例示的な化合物
A.例示的なmGluRアンタゴニスト
本発明はグループI mGluRアンタゴニスト、好ましくは選択的mGluR5アンタゴニストの使用を意図する。
【００４８】
例示的なmGluR5アンタゴニストとしては、2-メチル-6-(フェニルエチニル)-ピリジン(MPEP)、(E)-6-メチル-2-スチリル-ピリジン(SIB 1893)、LY293558、2-メチル-6-[(1E)-2-フェニルエチニル]-ピリジン、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール、(RS)-α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシン(MCPG)、3S,4aR,6S,8aRS-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-テトラゾール-5-イル)メチル)オキシ)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-(((4-カルボキシ)フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、および3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-カルボキシ)フェニル)メチル)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-デカヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、類似体および誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
mGluR5のアンタゴニストは、国際公開公報第01/66113号、国際公開公報第01/32632号、国際公開公報第01/14390号、国際公開公報第01/08705号、国際公開公報第01/05963号、国際公開公報第01/02367号、国際公開公報第01/02342号、国際公開公報第01/02340号、国際公開公報第00/20001号、国際公開公報第00/73283号、国際公開公報第00/69816号、国際公開公報第00/63166号、国際公開公報第00/26199号、国際公開公報第00/26198号、EP-A-0807621号、国際公開公報第99/54280号、国際公開公報第99/44639号、国際公開公報第99/26927号、国際公開公報第99/08678号、国際公開公報第99/02497号、国際公開公報第98/45270号、国際公開公報第98/34907号、国際公開公報第97/48399号、国際公開公報第97/48400号、国際公開公報第97/48409号、国際公開公報第98/53812号、国際公開公報第96/15100号、国際公開公報第95/25110号、国際公開公報第98/06724号、国際公開公報第96/15099号、国際公開公報第97/05109号、国際公開公報第97/05137号、米国特許第6,218,385号、米国特許第5,672,592号、米国特許第5,795,877号、米国特許第5,863,536号、米国特許第5,880,112号、米国特許第5,902,817号、許可された米国特許出願第08/825,997号、同第08/833,628号、同第08/842,360号、および同第08/899,319号においても記述されている。これらは全て参照として本明細書に組み入れられる。
【００５０】
例えば、異なるクラスのmGluR5アンタゴニストが、国際公開公報第01/08705号(pp.3〜7)、国際公開公報第99/44639号(pp.3〜11)、および国際公開公報第98/34907号(pp.3〜20)において記述されている。
【００５１】
他のクラスのmGluR1アンタゴニスト、アンチセンスオリゴヌクレオチドが国際公開公報第01/05963号に記述されている。mGluR5に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは類推により調製することができ、所望のようにmGluR5に選択的に拮抗するように使用することができる。
【００５２】
他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第01/02367号および国際公開公報第98/45270号において記述されている。そのような化合物は一般に以下の化学式を有する：
【化１】
2005500260.tif 000002
または
【化２】
2005500260.tif 000003
式中、RはHまたはアルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、もしくはアラルキル部分などの加水分解可能な炭化水素部分を表す。
【００５３】
ある態様では、イソキノリン系は以下の立体化学配列、その鏡像異性体、その2つのラセミ混合物を有する：
【化３】
2005500260.tif 000004
式中、当技術分野で周知のように、炭素上の黒点はこの頁から突き出た水素を示し、2本のダッシュは頁面から下方に延在する水素を示す。
【００５４】
国際公開公報第01/66113号において記述されている他のクラスのアンタゴニストは、以下の化学式を有する：
【化４】
2005500260.tif 000005
式中、
R1は水素、低級アルキル、ヒドロキシル-低級アルキル、低級アルキル-アミノ、ピペリジノ、カルボキシ、エステル化カルボキシ、アミド化カルボキシ、未置換もしくは低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および／またはトリフルオロメチル-置換N-低級アルキル-N-フェニルカルバモイル、低級アルコキシ、ハロ-低級アルキルまたはハロ-低級アルコキシを示し；
R2は水素、低級アルキル、カルボキシ、エステル化カルボキシ、アミド化カルボキシ、ヒドロキシル-低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキシまたは低級アルカノイルオキシ、4-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ピペリジン-1-イルカルボキシ、4-t.ブチルオキシカルボニル-ピペラジン-1-イル-カルボキシ、4-(4-アジド-2-ヒドロキシベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシまたは4-(4-アジド-2-ヒドロキシ-3-ヨード-ベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシを示し；
R3は水素、低級アルキル、カルボキシ、低級アルコキシ-カルボニル、低級アルキル-カルバモイル、ヒドロキシ-低級アルキル、ジ-低級アルキル-アミノメチル、モルホリノカルボニルまたは4-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシであり；
R4は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシ-低級アルキル、アミノ-低級アルキル、低級アルキルアミノ-低級アルキル、ジ-低級アルキルアミノ-低級アルキル、未置換もしくはヒドロキシ-置換低級アルキレンアミノ-低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、アミノ-低級アルコキシ、低級アルキルアミノ-低級アルコキシ、ジ-低級アルキルアミノ-低級アルコキシ、フタルイミド-低級アルコキシ、未置換もしくはヒドロキシ-もしくは2-オキソ-イミダゾリジン-1-イル置換低級アルキレンアミノ-低級アルコキシ、カルボキシ、エステル化もしくはアミド化カルボキシ、カルボキシ-低級アルコキシまたはエステル化カルボキシ-低級アルコキシであり；ならびに
Xは隣接する飽和炭素原子を介して結合された選択的にハロ置換低級アルケニレンまたはアルキニレン基またはアゾ(-N=N-)基であり、R5は芳香族または複素環式芳香族基を示し、この官能基は未置換、または以下の群から選択される1つまたは複数の置換基により置換される：低級アルキル、ハロ、ハロ-低級アルキル、ハロ-低級アルコキシ、低級アルケニル、低級アルキニル、未置換もしくは低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および/またはトリフルオロメチル-置換フェニル、未置換もしくは低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および/またはトリフルオロメチル-置換フェニル-低級アルキニル、ヒドロキシ、ヒドロキシ-低級アルキル、低級アルカノイルオキシ-低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルケニルオキシ、低級アルキレンジオキシ、低級アルカノイルオキシ、アミノ-、低級アルキルアミノ-、低級アルカノイルアミノ-もしくはN-低級アルキル-N-低級アルカノイルアミノ-低級アルコキシ、未置換もしくは低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および/またはトリフルオロメチル-置換フェノキシ、未置換もしくは低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および/またはトリフルオロメチル-置換フェニル-低級アルコキシ、アシル、カルボキシ、エステル化カルボキシ、アミド化カルボキシ、シアノ、カルボキシ-低級アルキルアミノ、エステル化カルボキシ-低級アルキルアミノ、アミド化カルボキシ-低級アルキルアミノ、ホスホノ-低級アルキルアミノ-エステル化ホスホノ-低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ-低級アルキルアミノ-アシルアミノ、N-アシル-N-低級アルキルアミノ、フェニルアミノ、フェニル-低級アルキルアミノ、シクロアルキル-低級アルキルアミノまたはヘテロアリール-低級アルキルアミノ（これらの各々は未置換としても、または低級アルキル-、低級アルコキシ-、ハロ-および/もしくはトリフルオロメチル置換としてもよい）；それらのN-オキシドおよび薬学的に許容される塩も含まれる。
【００５５】
ある態様では、国際公開公報第01/66113号および国際公開公報第00/20001号において開示されているように、これらの化合物は遊離形態または薬学的に許容される塩の形態で、以下の化学式を有する：
【化５】
2005500260.tif 000006
式中、
R1は水素、（C1〜4）アルキル、（C1〜4）アルコキシ、シアノ、エチニルまたはジ（C1〜4）アルキルアミノであり；
R2は水素、ヒドロキシ、カルボキシ、（C1〜4）アルコキシカルボニル、ジ（C1〜4）アルキルアミノメチル、4-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ピペリジン-1-イル-カルボキシ、4-t-ブチルオキシカルボニル-ピペラジン-1-イル-カルボキシ、4-(4-アジド-2-ヒドロキシベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシ、または4-(4-アジド-2-ヒドロキシ-3-ヨード-ベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシであり；
R3は水素、（C1〜4）アルキル、カルボキシ、（C1〜4）アルコキシカルボニル、（C1〜4）アルキルカルバモイル、ヒドロキシ（C1〜4）アルキル、ジ（C1〜4）アルキルアミノメチル、モルホリノカルボニルまたは4-(4-フルオロ-ベンゾイル)-ピペラジン-1-イル-カルボキシであり；
R4は水素、ヒドロキシ、カルボキシ、（C2〜5）アルカノイルオキシ、（C1〜4）アルコキシカルボニル、アミノ（C1〜4）アルコキシ、ジ（C1〜4）アルキルアミノ（C1〜4）アルコキシ、ジ（C1〜4）アルキルアミノ（C1〜4）アルキルまたはヒドロキシ（C1〜4）アルキルであり；ならびに
R5は以下の化学式の官能基である：
【化６】
2005500260.tif 000007
または
【化７】
2005500260.tif 000008
式中、
RaおよびRbは独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、シアノ、（C1〜4）アルキル、（C1〜4）アルコキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシまたは（C2〜5）アルキニル、および
Rcは水素、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシ-（C1〜4）アルキル、（C2〜5）アルカノイルオキシ、（C1〜4）アルコキシ、またはシアノであり、および
Rdは水素、ハロゲンまたは（C1〜4）アルキルである。
【００５６】
国際公開公報01/66113号において開示されている特定の態様では、mGluR5アンタゴニストは以下の化学式の構造、またはその塩もしくはエステルを有する：
【化８】
2005500260.tif 000009
式中、
R6は水素、ヒドロキシ、またはC1〜6アルコキシであり；
R7は水素、カルボキシ、テトラゾリル、-SO2H-、-SO3H、-OSO3H、-CONHOH、または-P(OH)OR'、-PO(OH)OR'、-OP(OH)OR'もしくは-OPO(OH)OR'であって、R'は水素、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、またはアリールC1〜6アリールであり；
R8は水素、ヒドロキシまたはC1〜4アルコキシであり；ならびに
R9はフルオロ、トリフルオロメチル、ニトロ、C1〜6アルキル、C3〜7シクロアルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C1〜6アルキルチオ、ヘテロアリール、選択的に置換されたアリール、選択的に置換されたアリールC1〜6アルキル、選択的に置換されたアリールC2〜6アルケニル、選択的に置換されたアリールC2〜6アルキニル、選択的に置換されたアリールオキシ、選択的に置換されたC1〜6アルコキシ、選択的に置換されたアリールチオ、選択的に置換されたアリールC1〜6アルキルチオ、-CONR''R'''、-NR''R'''、-OCONR''R'''または-SONR''R'''であって、R''およびR'''はそれぞれ水素、C1〜6アルキルもしくはアリールC1〜6アルキルであり、またはR''およびR'''はともにC3〜7アルキレン環を形成する。
【００５７】
さらに他のクラスのmGluRアンタゴニストは国際公開公報第00/63166号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式、ならびにそれらの薬学的に許容される塩を有する：
【化９】
2005500260.tif 000010
式中、
R10は水素または低級アルキルを示し；
R11はそれぞれ独立して、水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲンまたはトリフルオロメチルであり；
XはO、S、または架橋を形成しない2つの水素を示し；
A1/A2は、独立して、フェニルまたは1つもしくは2つの窒素原子を含む6員複素環であり；
Bは以下の化学式の官能基であり
2005500260.tif 000011
（式中、
R12は低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、ベンジル、低級アルキル-シクロアルキル、低級アルキル-シアノ、低級アルキル-ピリジニル、低級アルキル-低級アルコキシ-フェニル、低級アルキル-フェニル（選択的に低級アルコキシにより置換される）、フェニル（選択的に低級アルコキシにより置換される）、低級アルキル-チエニル、シクロアルキル、低級アルキル-トリフルオロメチル、または低級アルキル-モルホリニルを示し、
Yは-O-、-S-または結合を示し、
Zは-O-または-S-を示す）、
または
Bは以下の化学式の5員複素環である
【化１０】
2005500260.tif 000012
【化１１】
2005500260.tif 000013
【化１２】
2005500260.tif 000014
【化１３】
2005500260.tif 000015
（式中、
R13およびR14は、それらのうちの少なくとも1つが水素であるという条件で、独立して、水素、低級アルキル、低級アルコキシ、シクロヘキシル、低級アルキル-シクロヘキシルまたはトリフルオロメチルである）。
【００５８】
他のクラスのmGluR1アンタゴニストは国際公開公報第01/32632号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式、またはその薬学的に許容される塩を有する：
【化１４】
2005500260.tif 000016
式中、
X1はOまたはNHを示し；
Lは結合、またはO、S、SO、SOもしくはNHにより選択的に中断され、および選択的にアルキレン炭素原子上でフルオロ、ヒドロキシ、(1〜4C)アルコキシもしくはオキソにより置換された(1〜6C)アルキレン鎖であり；
R1は未置換もしくは置換炭素環官能基または未置換もしくは置換複素環官能基であり；
R2は水素原子、ハロゲン原子、カルボキシル基、シアノ基、SCH2CN、または化学式X2-R5（ただし、X2は結合、O、S、SO、SO2またはNHを示し、R5は(1〜8C)アルキル、(3〜10C)シクロアルキル、ハロ(1〜6C)アルキル、ヒドロキシ(1〜6C)アルキル、ジヒドロキシ(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルコキシ(1〜4C)のアルキル、(1〜4C)アルカノイル(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルカノイルオキシ(1〜4C)アルキル、カルボキシ(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルキルアミノカルボニル(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルカノイルアミノ、(1〜4C)アルカノイルアミノ(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルカノイルアミノ[(1〜4C)アルキル]2、(1〜4C)アルキルチオ(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルキルスルフィニル(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルキルスルホニル(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルキルスルホニルアミノ(1〜4C)アルキル、(1〜4C)アルキルアミノ-スルホニル(1〜4C)アルキル、ジ(1〜4C)アルキルアミノホスホニル(1〜4C)アルキル、フェニルまたはフェニル(1〜4C)アルキルを示し、任意のフェニル基は未置換、またはハロゲン原子、(1〜4C)アルキルおよび(1〜4C)アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換される）の官能基であり；ならびに
R3およびR4はそれぞれ独立して(1〜4C)アルキルを表し、またはそれらが結合している炭素原子とともに、未置換もしくは置換炭素環または未置換もしくは置換複素環を形成する。
【００５９】
他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第01/14390号に記述されている。これらの化合物は以下の化学式またはそれらの薬学的に許容される等価物を含む：
【化１５】
2005500260.tif 000017
式中、
JまたはKのいずれかは、化学的に合理的な置換パターンで、C、O、SおよびNからなる群より独立して選択される1つまたは複数の追加の原子と一緒になり、3〜7員環の飽和もしくは未飽和の複素環または炭素環を形成し、Lは-CHであり、
または
J、KおよびLは、化学的に合理的な置換パターンで、C、O、SおよびNからなる群より独立して選択される1つまたは複数の追加の原子と一緒になり、4〜8員環の飽和もしくは未飽和の、単環式、二環式、三環式、複素環式または炭素環式環構造を形成し；
Zは金属キレート基であり；
R1およびR2は独立して、水素、C1〜C9アルキル、C2〜C9アルケニル、C3〜C8シクロアルキル、C5〜C7シクロアルケニル、またはArであって、前記アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはArのそれぞれは独立して、未置換、または1つもしくはそれ以上の置換基により置換され；ならびに
Arは炭素環または複素環部分であって、それらは未置換、または1つもしくは複数の置換基により置換される。
【００６０】
さらに他のクラスのmGluR5アンタゴニストは米国特許第6,218,385号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式を有する：
【化１６】
2005500260.tif 000018
R1は水素、ヒドロキシ、低級アルキル、酸素、ハロゲン、または
--OR、--O（C3-C6）シクロアルキル、--O（CHR）n--（C3-C6）シクロアルキル、--O(CHR)nCN、--O（CHR）nCF3、--O(CHR)(CHR)nNR2、--O(CHR)(CHR)nOR、--O(CHR)n-低級アルケニル、--OCF3、--OCF2--R、--OCF2-低級アルケニル、--OCHRF、--OCHF-低級アルケニル、--CF2CRF2、--OCF2Br、--O(CHR)nCF2Br、--O(CHR)n-フェニル（ただし、フェニル基は互いに独立して、1〜3の低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノ基により選択的に置換されてもよい）、
--O(CHR)(CHR)n-モルホリノ、--O(CHR)(CHR)n-ピロリジノ、--O(CHR)(CHR)n-ピペリジノ、--O(CHR)(CHR)n-イミダゾロ、--O(CHR)(CHR)n-トリアゾロ、--O(CHR)n-ピリジノ、--O(CHR)(CHR)n--OSi-低級アルキル、--O(CHR)(CHR)nOS(O)2-低級アルキル、--(CH2)nCH=CF2、--O(CHR)n-2,2-ジメチル-[1,3]ジオキソラン、--O(CHR)n--CHOR--CH2OR、--O(CHR)n--CHOR--(CHR)n--CH2OR、または
--SRもしくは--S(CHR)nCOOR、または
--NR2、--N(R)(CHR)(CHR)nOR、--N(R)(CHR)nCF3、--N(R)(CHR)(CHR)n-モルホリノ、--N(R)(CHR)(CHR)n-イミダゾロ、--N(R)(CHR)(CHR)n-ピロリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)n-ピロリジン-2-オン、--N(R)(CHR)(CHR)n-ピペリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)n-トリアゾロ、--N(R)(CHR)n-ピリジノ、または
R1およびR4は官能基--(CH2)3-5--、--(CH2)2--N=、--CH=N--N=--、--CH=CH--N=、--NH--CH=CH--に相互結合し、または
--NR--CH2--CH2--およびそれらが結合している任意のNまたはC原子と一緒に別の環を形成し；
nは1〜6であり；
Rは水素、低級アルキルまたは低級アルケニルであり、Rが1つより多く存在する場合それぞれが独立しており；
R2はニトロまたはシアノを示し；
R3は水素、低級アルキル、=O、--S、--SR、--S(O)2-低級アルキル、--(C3-C6)シクロアルキルまたはピペラジノを示し、選択的に低級アルキルにより置換され、または、
--CONR2、--(CHR)nCONR2、--(CHR)nOR、--(CH2)n--CF3、--CF3、--(CHR)nOC(O)CF3、--(CHR)nCOOR、--(CHR)nSC6H5（フェニル基は、互いに独立して、1〜3の低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノ基により選択的に置換されてもよい）、
--(CHR)n-1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール、--(CHR)n-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシもしくは--(CHR)n--S-低級アルキル、または
--NR2、--NRCO-低級アルキル、--NRCHO、--N(R)(CHR)nCN、--N(R)(CHR)nCF3、--N(R)(CHR)(CHR)n--OR、--N(R)C(O)(CHR)nO-低級アルキル、--NR(CHR)n-低級アルキル、--NR(CHR)(CHR)n--OR、--N(R)(CHR)(CHR)n--O-フェニル（フェニル基は、互いに独立して、1〜3の低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノ基により選択的に置換されてもよい）、
--N(R)(CHR)n-低級アルケニル、--N(R)(CHR)(CHR)n--O--(CHR)nOR、--N(R)(CHR)nC(O)O-低級アルキル、--N(R)(CHR)nC(O)NR-低級アルキル、--N(R)(CH2)n-2,2-ジメチル-[1,3]ジオキソラン、--N(R)(CHR)(CHR)nモルホリノ、--N(R)(CHR)n-ピリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)n-ピペリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)n-ピロリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)n--O-ピリジノ、--N(R)(CHR)(CHR)nイミダゾロ、--N(R)(CHR)n--CR2--(CHR)n--OR、--N(R)(CHR)n--CR2--OR、--N(R)(CHR)n--CHOR--CH2OR、--N(R)(CHR)n--CHOR--(CHR)n--CH2OR、または
--OR、--O(CHR)nCF3、--OCF3、--O(CHR)(CHR)n--O-フェニル（フェニル基は、互いに独立して、1〜3の低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノ基により選択的に置換されてもよい）
--O(CHR)(CHR)n--O-低級アルキル、--O(CHR)n-ピリジノ、または
--O(CHR)n-モルホリノ；
またはR3およびR4は官能基--(CH2)3-5--、--(CH2)2--N=、--CH=N--N=--、--CH=CH--N=、--NH--CH=CH--に相互結合し、または
NR--CH2--CH2--およびそれらが結合している任意のNまたはC原子と一緒に別の環を形成し；ならびに
R4は水素、低級アルキル、低級アルケニルもしくはニトロ、または
--OR、--OCF3、--OCF2--R、--OCF2-低級アルケニル、--OCHRF、--OCHF-低級アルケニル、--O(CHR)nCF3、または
--(CHR)nCHRF、--(CHR)nCF2R、--(CHR)nCF3、--(C3-C6)シクロアルキル、--(CHR)n(C3-C6)シクロアルキル、--(CHR)nCN、--(CHR)n-フェニル（フェニル基は、互いに独立して、1〜3の低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ニトロまたはシアノ基により選択的に置換されてもよい）
--(CHR)(CHR)nOR、--(CHR)nCHORCH2OR、--(CHR)(CHR)nNR2、--(CHR)nCOOR、--(CHR)(CHR)nOSi-低級アルキル、--(CHR)(CHR)n--OS(O)2-低級アルキル、--(CH2)n--CH=CF2、--CF3、--CF2、--R、--CF2-低級アルケニル、--CHRF、--CHF-低級アルケニル、--(CHR)n-2,2-ジメチル-[1,3]-ジオキソラン、--(CH2)n-2-オキソ-アゼパン-1-イル、--(CHR)(CHR)n-モルホリノ、--(CHR)n-ピリジノ、--(CHR)(CHR)n-イミダゾロ、--(CHR)(CHR)n-トリアゾロ、--(CHR)(CHR)n-ピロリジノ、選択的に--(CH2)nOH、--(CHR)(CHR)n-3-ヒドロキシ-ピロリジノまたは--(CHR)(CHR)n-ピペリジノにより置換され、または
--NR2、--N(R)(CHR)n-ピリジノ、--N(R)C(O)O-低級アルキル、--N(CH2CF3)C(O)O-低級アルキル、--N[C(O)O-低級アルキル]2、--NR--NR--C(O)O-低級アルキル、もしくは-N(R)(CHR)nCF3、--NRCF3、--NRCF2--R、--NRCF2-低級アルケニル、--NRCHRF、--NRCHP-低級アルケニル；
またはXが--N=または=N--である場合存在せず；
R5、R6は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、ニトロ、--SO2NH2もしくはハロゲンであり；または
R5およびR6は--O--CH2--O--に相互結合し、それらが結合しているC原子と一緒に5員環を形成し；
R7、R8は水素、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、ニトロまたはハロゲンを示し；
R9、R10は水素または低級アルキルを示し；
R11、R12は水素、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニルオキシまたは低級アルカノイルオキシを示し；
R13、R14は水素、トリチウムまたは低級アルキルを示し；
R15、R16は水素、トリチウム、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシを示し、もしくは一緒になりオキソ基となり；または
Xは--N=、=N--、--N＜、＞C=もしくは=C＜を示し；
Yは--N=、=N--、--NH--、--CH=もしくは=CH--を示し；ならびに
点線は、R1、R3またはR4が二価の原子を表す場合は一つの結合としてもよく、上記化学式の各化合物の薬学的に許容される塩および上記化学式の各化合物のラセミ形態および選択的に活性な形態も含まれる。
【００６１】
さらに他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第01/02342号および同第01/02340号において記述されている。これらの化合物はそれぞれ、以下の化学式を有し、その立体異性体、または薬学的に許容される塩もしくは水和物も含まれる：
【化１７】
2005500260.tif 000019
【化１８】
2005500260.tif 000020
式中、
R1およびR2は、
1)H；または
2)カルボキシ、ホスホノ、ホスフィノ、スルホノ、スルフィノ、ボロノ、テトラゾール、イソキサゾール、-(CH2)n-カルボキシ、-(CH2)n-ホスホノ、-(CH2)n-ホスフィノ、-(CH2)n-スルホノ、-(CH2)n-スルフィノ、-(CH2)n-ボロノ、-(CH2)n-テトラゾールおよび-(CH2)n-イソキサゾール（ただし、n=1、2、3、4、5または6）からなる群より選択される酸性基
を含む群から選択され；
Xはカルボキシ、ホスホノ、ホスフィノ、スルホノ、スルフィノ、ボロノ、テトラゾール、イソキサゾールからなる群より選択される酸性基であり；
Yは1°アミノ、2°アミノ、3°アミノ、第四アンモニウム塩、脂肪族1°アミノ、脂肪族2°アミノ、脂肪族3°アミノ、脂肪族第四アンモニウム塩、芳香族1°アミノ、芳香族2°アミノ、芳香族3°アミノ、芳香族第四アンモニウム塩、イミダゾール、グアニジノ、ボロノアミノ、アリル、尿素、チオ尿素からなる群より選択される塩基性基であり；
mは0、1であり；
R3、R4、R5、R6は独立して、H、ニトロ、アミノ、ハロゲン、トリチウム、トリフルオロメチル、トリフルオロアセチル、スルホ、カルボキシ、カルバモイル、スルファモイルまたはそれらの許容されるエステルであり；
またはそれらの薬学的に許容される酸または塩基との塩である。
【００６２】
さらの他のクラスのmGluR5アンタゴニストが国際公開公報第00/73283号および同第99/26927号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式を有する：
R-[リンカー]-Ar；
式中、Rは好ましくは5〜12の炭素原子を含む、選択的に置換された直鎖もしくは分枝鎖アルキル、アリールアルキル、シクロアルキル、またはアルキルシクロアルキル基である。Arは10までの炭素原子および4までのヘテロ原子を含む、選択的に置換された芳香族、複素環式芳香族、アリールアルキル、またはヘテロアラルキル部分であり、[リンカー]は-(CH2)n-(ただし、nは2〜6である)であり、4までのCH2官能基は別個に、C1〜C3アルキル、CHOH、CO、O、S、SO、SO2、N、NHおよびNOからなる群より選択される官能基により置換されてもよい。[リンカー]中の2つのヘテロ原子は、これらの原子が（-N=N-または-NH-NH-のように）いずれもNであるまたはスルホンアミドのようにNおよびSである場合を除き、隣接しなくてもよい。[リンカー]中の2つの隣接するCH2官能基はまた、置換もしくは未置換アルケンまたは置換もしくは未置換アルキン官能基により置換されてもよい。この化合物の薬学的に許容される塩もまた提供される。
【００６３】
他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第00/69816号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式、またはその薬学的許容される塩を有する：
【化１９】
2005500260.tif 000021
式中、
nは0、1または2であり；
XはO、S、NHまたはNOHであり；
R1およびR2はそれぞれ独立して、H、CN、COOR、CONHR、C1〜C6アルキル、テトラゾール、またはR1およびR2は一緒になって「=O」を表し；
RはHまたはC1〜C6アルキルであり；
R3はC1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、-CH2OH、-CH2O-アルキル、-COOHであり；
Arは未置換もしくは置換芳香族基または未置換もしくは置換複素環式芳香族基であり；
Zは以下の化合式の官能基を表し
【化２０】
2005500260.tif 000022
【化２１】
2005500260.tif 000023
【化２２】
2005500260.tif 000024
または
【化２３】
2005500260.tif 000025
（式中、
R4およびR5はそれぞれ独立して、H、ハロゲン、C1〜C6アルコキシ、-OAr、C1〜C6アルキル、-CF3、COOR、CONHR、-CN、-OH、-COR、-S-(C1〜C6アルキル)、-SO2(C1〜C6アルキル)であり；
AはCH2、O、NH、NR、S、SO、SO2、CH2-CH2、CH2O、CHOH、C(O)であり；ただしRは上記で規定した通りであり；
BはCHR、CR2、C1〜C6アルキル、C(O)、-CHOH、-CH2-O、-CH=CH、CH2-C(O)、CH2-S、CH2-S(O)、CH2-SO2；-CHCO2R、または-CH-NR2であり、ただしRは上記で規定した通りであり；
Hetはフラン、チオフェン、またはピリジンなどの複素環である））。
【００６４】
さらに他のクラスのmGluR1アンタゴニストは国際公開公報第00/26199号および同第00/26198号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式、またはその薬学的に許容される塩またはエステルを有する：
【化２４】
2005500260.tif 000026
式中、
R1、R2およびR3は独立して、水素、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C6)アルケニル、(C3〜C10)シクロアルキル、未置換もしくは置換アリール、未置換もしくは置換アリール(C1〜C6)アルキル、未置換または置換アリール(C2〜C6)アルケニル、ハロ、カルボキシ、(C1〜C6)アルコキシカルボニルまたは-(CH2)m-OH（ただし、mは1、2または3である）であり；
2005500260.tif 000027
は単結合または二重結合を示し；
XおよびYはそれぞれ独立して、水素であり、またはXおよびYは一緒になり化学式-(CH2)n-(ただし、nは1または2である)の架橋を表し；
A1およびA2はそれぞれ独立して未置換もしくは置換アリールであり；
Zは、Zが-CO-である場合はA1が3,4,5-トリメトキシフェニルではないという条件で、-CO-、-SO2-または-CH2-である。
【００６５】
他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第99/54280号において記述されている。これらの化合物は以下の化学式、その立体異性体、およびその薬学的に許容される塩を有する：
【化２５】
2005500260.tif 000028
式中、
R1はカルボキシル、ホスホノ、ホスフィノ、スルホノ、スルフィノ、ボロノ、テトラゾール、イソキサゾール、-CH2-カルボキシル、-CH2-ホスホノ、-CH2-ホスフィノ、-CH2-スルホノ、-CH2-スルフィノ、-CH2-ボロノ、-CH2-テトラゾール、-CH2-イソキサゾールおよびそれらの高次類似体からなる群より選択される酸性基とすることができ；
R2は1°アミノ、2°アミノ、3°アミノ、第四アンモニウム塩、脂肪族1°アミノ、脂肪族2°アミノ、脂肪族3°アミノ、脂肪族第四アンモニウム塩、芳香族1°アミノ、芳香族2°アミノ、芳香族3°アミノ、芳香族第四アンモニウム塩、イミダゾール、グアニジノ、ボロノアミノ、アリル、尿素、チオ尿素からなる群より選択される塩基性基とすることができ；
R3はH、脂肪族、芳香族または複素環とすることができ；
R4はカルボキシル、ホスホノ、ホスフィノ、スルホノ、スルフィノ、ボロノ、テトラゾール、イソキサゾールからなる群より選択される酸性基とすることができる。
【００６６】
さらに他のクラスのmGluR5アンタゴニストは国際公開公報第99/08678号に記述されている。これらの化合物は以下の化学式、ならびにその薬学的に許容される塩を有する：
【化２６】
2005500260.tif 000029
式中、
Rはハロゲンまたは低級アルキルであり；
nは0〜3を示し；
R1は低級アルキル；シクロアルキル；選択的にヒドロキシ、ハロゲン、低級アルコキシまたは低級アルキルにより置換されたベンジル；選択的にアミノ、低級アルキルアミノまたはジ-低級アルキルアミノにより置換されたベンゾイル；アセチルまたはシクロアルキル-カルボニルを示し；ならびに
2005500260.tif 000030
はN-原子を介して結合され、さらに結合N原子以外に1〜3のN原子を含む芳香族5員環残基を示す。
【００６７】
好ましいアンタゴニストは、あるアンタゴニスト濃度、例えば1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml、または100mg/mlで、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のリガンドによる活性化の減少を提供するものである。拮抗作用の割合(％)は、アンタゴニストが存在する場合および存在しない場合のアッセイ法の比較における、mGluR、例えばmGluR5の活性の減少割合(％)を示す。上記拮抗作用の割合(％)の程度とアンタゴニスト濃度との任意の組み合わせを使用して、本発明のアンタゴニストを規定してもよい。より低い濃度でより高い拮抗作用が得られることが好ましい。
【００６８】
本発明で使用するためのアンタゴニストは一般的にはmGluRのアンタゴニストである比較的非特異的なアンタゴニストであってもよい。しかしながら、好ましくはアンタゴニストは選択的にグループI mGLuRに拮抗する。さらに好ましくは、本発明で使用するアンタゴニストはmGluR5の選択的アンタゴニストである。mGluR5の選択的アンタゴニストはmGluR5に拮抗するものであり、他のmGluRには拮抗しても弱く、もしくは実質的には全く拮抗せず、または、mGluR5に拮抗するEC50に比べ少なくとも10倍、または100倍もしくは1000倍のEC50で少なくとも他のmGluRに拮抗する。最も好ましいアンタゴニストは、低濃度でmGluR5に選択的に拮抗することができるものであり、例えば、100μg/ml以下の濃度で50％またはそれ以上の拮抗作用レベルを引き起こすものである。
【００６９】
本発明の化合物、特に様々な代表的なクラスの置換基を有する変形物ライブラリーはコンビナトリアルケミストリーおよび他の平行合成スキーム（例えば、国際公開公報第94/08051号を参照のこと）に従う。結果は、関連化合物の大きなライブラリー、例えば、可能性のあるmGluRアンタゴニストの多様なライブラリーが、ハイスループットアッセイ法で迅速にスリーニングでき、可能性のある主要な化合物を同定し、主要な化合物の特異性、毒性および／または細胞傷害性-動力学的プロファイルを精密化できることである。
【００７０】
単に例示を目的として、本発明の目的のためのコンビナトリアルライブラリーは、化学的に関連する化合物などの化合物の混合物であり、これらは所望の特性に対し共にスクリーニングしてもよい。1回の反応で多くの関連化合物を調製すると、実施する必要のあるスクリーニング過程の数が大きく減少し、簡略化される。適当な物理特性に対するスクリーニングは従来の方法により実施することができる。
【００７１】
ライブラリーの多様性は様々な異なるレベルのものとすることができる。例えば、コンビナトリアル反応で使用される基質アリール基をコアアリール部分の局面から多様化することができ、例えば環構造における多様化、および／または他の置換基に関して変化させることができる。
【００７２】
対象アンタゴニストなどの小さな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを作成するためには、当技術分野の様々な技術を使用することができる。例えば、Blondelleら(1995) Trends Anal. Chem.14:83；Affymax米国特許第5,359,115号および第5,362,899号；Ellman米国特許第5,288,514号；Stillら、国際公開公報第94/08051号；Chenら(1994)JACS 116:2661；Kerrら(1993)JACS 115:252；国際公開公報第92/10092号、国際公開公報第93/09668号および国際公開公報第91/07087号；ならびにLernerら、国際公開公報第93/20242号を参照のこと）。したがって、対象アンタゴニストの約100から約1,000,000およびそれ以上のダイバーサマー(diversomer)のオーダーの様々なライブラリーを合成し、特別な活性または特性についてスクリーニングすることができる。
【００７３】
例示的な態様では、候補アンタゴニストダイバーサマーのライブラリーをStillら、国際公開公報第94/08051号において記述されている技術に適合させたスキームを使用して合成することができる。例えば、候補アンタゴニストまたは合成中間体の置換基の位置の1つに例えば配置された加水分解可能な、または光分解可能な官能基によりポリマービーズに結合される。Stillらの技術によれば、ライブラリーは1セットのビーズ上で合成され、各ビーズはそのビーズ上の特別のダイバーサマーを同定する1セットのタグを含む。ダイバーサマーは例えば加水分解によりビーズから放出することができ、活性試験を行うことができる。
【００７４】
A)直接的特徴付け
コンビナトリアルケミストリーの分野の成長傾向は、例えば、サブフェムトモル量の化合物の特徴付けを行うのに使用することができる質量分析(MS)などの技術の感度を利用し、コンビナトリアルライブラリーから選択した化合物の化学組成を直接決定することである。例えば、ライブラリーを不溶の支持基体上で提供する場合、離散した化合物の群を支持物から最初に放出し、MSにより特徴付けを行うことができる。他の態様では、MS試料調製技術の一部として、MALDIなどのMS技術を使用して基体から化合物を放出することができ、特にこの場合、化合物を基体につなぐために最初に不安定な結合が使用される。例えば、ライブラリーから選択されたビーズにMALDI段階で放射線照射し、基体からダイバーサマーを放出させ、MS分析のためにダイバーサマーをイオン化することができる。
【００７５】
B)マルチピン(Multipin)合成
対象の方法のライブラリーはマルチピンライブラリーフォーマットを取ることができる。簡単に説明すると、Geysenらは、マイクロタイタプレートフォーマットで配列したポリアクリル酸で格子付けしたポリエチレンピン上での平行合成により化合物ライブラリーを作成するための方法を導入した（Geysenら(1984)PNAS 81:3998〜4002）。Geysen技術を使用すると、マルチピン方法を用いることにより一週間につき数千の化合物を合成し、スクリーニングすることができ、束縛した化合物は多くのアッセイ法で再利用してもよい。適当なリンカー部分もまたピンに付加することができ、そのため、純度評価およびさらなる評価のための合成後、支持体から化合物を開裂させることができる(Brayら(1990)Tetrahedron Lett 31:5811-5814；Valerioら(1991)Anal Biochem 197:168-177；Brayら(1991)Tetrahedron Lett 32:6163-6166)。
【００７６】
C)分割-結合-再結合
さらに他の態様では、分割-結合-再結合戦略を用いて1セットのビーズ上で化合物の多彩なライブラリーを提供することができる（例えば、Houghten(1985) PNAS 82:5131-5135；および米国特許第4,631,211号；同第5,440,016号；同第5,480,971号を参照のこと）。簡単に説明すると、その名が示すように、縮重がライブラリーに導入される各合成過程で、ビーズが、ライブラリーの特別な位置で付加される異なる置換基の数に等しい別個の群に分割され、異なる置換基が別個の反応で結合され、ビーズが再結合されて次のイタレーションのための1つのプールとされる。
【００７７】
1つの態様では、分割-結合-再結合戦略は、Houghtenにより最初に開発されたいわゆる「ティーバッグ」法に類似するアプローチを使用して実施することができる。この場合、化合物合成は樹脂で密閉した内側多孔質ポリプロピレンバッグ上で起こる(Houghtenら、(1986) PNAS 82:5131:5135)。バッグを適した反応溶液中に入れることにより置換基が化合物を保持する樹脂に結合し、樹脂の洗浄および脱保護などの一般的な過程すべてが1つの反応容器内で同時に実施される。合成終了時には、各バッグは単一の化合物を含む。
【００７８】
D)光により誘導され、空間的にアドレス可能な平行化学合成によるコンビナトリアルライブラリー
化合物の特性が合成基質上の位置で与えられるコンビナトリアル合成のスキームは空間的にアドレス可能な合成と呼ばれる。1つの態様では、コンビナトリアル工程は、化学試薬の固体支持物上の特定の位置への添加を制御することにより実施される（Dowerら、(1991)Annu Rep Med Chem 26:271-280；Fodor、S.P.A.(1991) Science 251:767；Pirrungら(1992)米国特許第5,143,854号；Jacobsら(1994)Trends Biotechnol 12:19-26）。フォトリソグラフィーの空間分解能により小型化が可能である。この技術は光に不安定な保護基による保護／脱保護により実施することができる。
【００７９】
この技術の重要な点はGallopら(1994)J Med Chem 37:1233-1251において示されている。合成基質は、光に不安定なニトロベラトリルオキシカルボニル(NVOC)により保護されたアミノリンカーまたは他の光に不安定なリンカーの共有結合によりカップリングさせるために調製する。光を使用して、カップリング用の合成支持体の特定の領域を選択的に活性化する。光に不安定な保護基を光により除去すると（脱保護）、選択された領域の活性化が起こる。活性化後、それぞれがアミノ末端に光に不安定な保護基を有する最初の1セットのアミノ酸類似体が全面に露出される。カップリングは前の過程で光により指定された領域でのみ起こる。反応を停止させ、プレートを洗浄し、基質に再び第2のマスクを介して光照射すると、第2の保護された構成要素との反応のための異なる領域が活性化される。マスクのパターンおよび反応物の順序により生成物およびその位置が規定される。この工程ではフォトリソグラフィー技術が使用されているので、合成可能な化合物の数は適当な分解能で指定することができる合成サイトの数によってのみ制限される。各化合物の位置は正確にわかり、このため他の分子との相互作用を直接評価することができる。
【００８０】
光に誘導される化学合成では、生成物は照射パターンおよび反応物の添加順序に依存する。リソグラフィックパターンを変えることにより、多くの異なるセットの試験化合物を同時に合成することができ；この特性により多くの異なるマスキング戦略の作成につながる。
【００８１】
E)コード化されたコンビナトリアルライブラリー
さらに他の態様では、対象方法はコード化タグシステムが備えられた化合物ライブラリーを使用する。コンビナトリアルライブラリーからの活性化合物の同定における最近の改善は、与えられたビーズが受ける反応段階、および推論によりそれが有する構造を一意的にコードするタグを用いる化学指標システムを採用している。概念的には、このアプローチはファージ表示ライブラリーを模倣し、この場合活性は発現したペプチドから導かれるが、活性ペプチドの構造は対応するゲノムDNA配列から推論される。合成コンビナトリアルライブラリーの最初のコード化はコードとしてDNAを使用した。配列決定可能な生物オリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド）を用いたコード化、および追加の配列決定できないタグを用いたバイナリコード化を含む様々な他の形態のコード化が報告されている。
【００８２】
1)配列決定可能な生物オリゴマーによるタグ
コンビナトリアル合成ライブラリーをコードするためにオリゴヌクレオチドを使用する原理は、1992年（Brennerら(1992)PNAS 89:5381-5383）および翌年に現れたライブラリーの例(Needlesら(1993)PNAS 90:10700-10704)において記述された。Arg、Gln、Phe、Lys、Val、D-ValおよびThr(3文字アミノ酸コード)、(それぞれが特定のジヌクレオチド（それぞれTA、TC、CT、AT、TT、CAおよびAC）によりコードされる)の全ての組み合わせからなる名目上77(=823,543)ペプチドのコンビナトリアルライブラリーが、固体支持体上での一連のペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成の交互ラウンドにより調製された。この研究では、ビーズ上のアミノ結合官能性は、オリゴヌクレオチド合成では保護OH基を形成させ、ペプチド合成では保護NH2基を形成させる（ここでは、1:20の比）試薬とビーズを同時にプレインキュベートすることにより、ペプチドまたはオリゴヌクレオチド合成に向けて特異的に分化された。完了時には、タグはそれぞれ69マー(mer)を有し、その14ユニットがコードを有した。ビーズ結合ライブラリーを蛍光標識した抗体と共にインキュベートして、強く蛍光を発した結合抗体を含むビーズを蛍光-活性化細胞分類（FACS）により回収した。DNAタグをPCRにより増幅し配列決定し、推定されるペプチドを合成した。そのような技術後、対象方法において使用するために化合物ライブラリーを導くことができ、ここで、タグのオリゴヌクレオチド配列はある特別なビーズが受けた連続コンビナトリアル反応を同定し、そのためビーズ上の化合物の特性が提供される。
【００８３】
オリゴヌクレオチドタグを使用すると、著しく感度の高いタグ分析が可能となる。そうであっても、その方法ではタグとライブラリーメンバーの共合成を交互にするのに必要とされる直交セットの保護基の注意深い選択が必要とされる。さらに、タグの化学的不安定さ、特にリン酸および糖アノマー結合により、非オリゴマーライブラリーの合成のために使用することができる試薬および条件の選択が制限されるかもしれない。好ましい態様では、ライブラリーは、アッセイ法のために試験化合物ライブラリーメンバーの選択的脱着を可能とするリンカーを使用する。
【００８４】
ペプチドもまたコンビナトリアルライブラリーのためのタグ分子として使用されている。2つの例示的なアプローチが当技術分野で説明されており、どちらも固体相に対し分枝リンカーを使用しており、固体相上ではコード化およびリガンド鎖が交互に合成されている。第1のアプローチ(Kerrら、(1993)JACS 115:2529-2531)では、コード鎖では酸に不安定な保護および化合物鎖には塩基に不安定な保護を採用することにより合成の直交性が達成される。
【００８５】
他のアプローチ(Nikolaivら(1993)Pept Res 6:161-170)では、分枝リンカーが使用され、コード化ユニットおよび試験化合物のどちらもが樹脂上の同じ官能基に結合できる。1つの態様では、開裂可能なリンカーを分枝点とビーズとの間に配置することができ、そのため開裂によりコードと化合物の両方を含む化合物が放出される（Prekら(1991)、Tetrahedron Lett 32:3891-3894）。他の態様では、ビーズから試験化合物が選択的に分離でき、コードが後に残されるように開裂可能なリンカーを配置することができる。この最後の構成は、コード化官能基を妨害する可能性が無く、試験化合物のスクリーニングが可能であるために、特に有用である。ペプチドライブラリーメンバーおよびその対応するタグの独立した開裂および配列決定の技術分野での例により、タグにより正確にペプチド構造を予測することができることが確認された。
【００８６】
2)配列決定できないタグ：バイナリコード化
試験化合物ライブラリーのコード化の他の形態は、バイナリコードとして使用される1セットの配列決定できないエレクトロフォリック(electrophoric)タグ分子を採用する（Ohlmeyerら(1993)PNAS 90:10922-10926）。例示的なタグは、電子捕獲ガスクロマトグラフィー(ECGC)によりフェムトモルレベル未満でトリメチルシリルエーテルとして検出可能なハロ芳香族アルキルエーテルである。アルキル鎖の長さ、ならびにハロゲン化芳香族置換基の性質および位置を変化させると、そのようなタグが少なくとも40合成することができ、これは原理的には240（例えば、1012より多く）の異なる分子をコードすることができる。もとの報告(Ohlmeyerら、上記)では、光により開裂可能なo-ニトロベンジルリンカーを介してペプチドライブラリーの有効なアミン基の約1％にタグを結合させた。このアプローチはペプチド様の、または他のアミン含有分子のコンビナトリアルライブラリーを調製する場合に好都合である。しかしながら、本質的に任意のコンビナトリアルライブラリーをコードすることができる、より融通のきく系が開発されている。ここで、化合物は光で開裂可能なリンカーを介して固体支持体に結合され、タグは、ビーズ基体中にカルベンを挿入することによりカテコールエーテルリンカーを介して結合される(Nestlerら(1994)J Org Chem 59:4723-4724)。この直交結合戦略により、溶液中でアッセイ用にライブラリーメンバーを選択的に脱着させ、タグセットの酸化的脱着後ECGCによりその後にデコードすることができる。
【００８７】
当技術分野の幾つかのアミド-結合ライブラリーはアミン基に結合されたエレクトロフォリックタグを用いたバイナリコード化を使用しているが、これらのタグを直接ビーズ基体に結合させるとコード化コンビナトリアルライブラリーで調製できる構造によりいっそうの融通性が付与される。このように結合されると、タグおよびそのリンカーはビーズ基体自体とほぼ同様に反応性がない。2つのバイナリコード化コンビナトリアルライブリが報告されている。この場合エレクトロフォリックタグは直接固体相に結合され(Ohlmeyerら(1995)PNAS 92:6027-6031)、対象化合物ライブラリーを作成するための案内が提供される。どちらのライブラリーも、光に不安定なリンカーにより固体支持体にライブラリーメンバーが結合され、タグが激しい酸化によってのみ開裂可能なリンカーを介して結合された直交結合戦略を用いて構成された。ライブラリーメンバーは固体支持体から繰り返し部分的に光溶離させることができるので、ライブラリーメンバーは複数のアッセイで使用することができる。連続光溶離により、スループットの非常に高い反復スクリーニング戦略も可能となる：最初に、複数のビーズを96-ウエルマイクロタイタプレートに入れる；第2に、化合物を部分的に取り外しアッセイプレートに移す；第3に、金属結合アッセイにより活性ウエルを識別する；第4に、対応するビーズを別々に新しいマイクロタイタプレートに再配列する；第5に、単一の活性化合物を同定する；第6に、構造をデコードする。
【００８８】
B.例示的なmGluR5アンタゴニストアッセイ法
ヒトまたは動物の身体の治療、特にダウン症、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症および自閉症の治療のための方法において使用することができるmGluRアンタゴニストを同定するための方法は当技術分野では周知である。そのような方法は本質的には、試験作用物質がmGluR5アンタゴニストであるかどうかを決定する段階と、そのようにして同定したアンタゴニストをダウン症、脆弱X、および／または自閉症の治療において使用することができるかどうかを決定する段階とを含む。
【００８９】
mGluR5のアンタゴニストとして試験化合物の活性を決定するためのアッセイの1つの例は、mGluR5受容体蛋白質をコードするcDNAで形質転換したCHO細胞でmGluR5を発現させる段階を含む(Dagettら、1995、Neuropharmacology、34、871)。その後、キスカル酸および／またはグルタミン酸を添加することによりmGluR5を活性化し、例えば以下のものを測定することにより評価することができる：(1)ホスホイノシトール加水分解(Litschigら、1999、Mol. Pharmacol. 55、453)；(ii)[3H]シチジンホスフェート-ジアシルグリセロールの蓄積(Cavanniら、1999、Neuropharmacology 38、A10)；またはカルシウムの細胞内への流入の蛍光検出(Kawabataら、1996、Nature 383、89-1；Nakaharaら、1997、J. Neurochemistry 69、1467)。試験化合物が試験生成物の活性に拮抗することができるかどうかを決定するために、試験生成物の存在下または非存在下の両方でアッセイ法を実施してもよい。
【００９０】
mGluR5受容体アンタゴニストはまた、クローン化し発現させたヒトGluR5受容体での放射標識したリガンド結合研究により（Korczakら、1994、Recept. Channels 3;41-49）、ヒトGluR5受容体での機能活性の全細胞電圧固定電子-生理学的記録により（Korczakら、1994、Recept. Channels 3;41-49）および鋭く単離したラットの後根ガングリオンニューロンでの電流の全細胞電圧固定電子-生理学的記録により（Bleakmanら、1996、Mol. Pharmacol. 49；581-585）同定してもよい。
【００９１】
適した対照実験を実施することができる。例えば、mGluR5の推定アンタゴニストをmGluR1を用いて試験し、推定アンタゴニストの特異性を決定することができ、またはmGluRと関連のない他の受容体を用いて試験し、推定アンタゴニストが細胞膜受容体の一般的なアンタゴニストである可能性を減少させることができる。
【００９２】
mGluR5アンタゴニストを同定するための適した試験生成物には、コンビナトリアルライブラリー、規定された化学特性、ペプチドおよびペプチド模倣物、オリゴヌクレオチド、ならびに天然生成物ライブラリーが含まれる。試験生成物は、例えば1反応あたり10個の生成物の初期スクリーニングに使用してもよく、拮抗作用を示すバッチの生成物を個々に試験してもよい。さらに、抗体生成物（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ体、およびCDR-グラフト抗体）を使用してもよい。
【００９３】
C.mGluR5アンタゴニストの薬学的調製物
他の局面では、本発明は対象mGluR5アンタゴニストを含む薬学的調製物を提供する。対象方法に使用するためのmGluR5アンタゴニストは、生物学的に許容される非発熱性の、および／または滅菌された媒質、例えば水、緩衝塩、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）または適したそれらの混合物と共に投与するために都合良く製剤化してもよい。選択した媒質中の活性成分の最適濃度は、医薬化学者に周知の手順に従い、経験的に決定することができる。本明細書で使用されているように、「生物学的に許容される媒質」には薬学的調製物の望ましい投与経路に適する任意のおよび全ての溶媒、分散媒質などが含まれる。薬学的に活性な物質に対しそのような媒質を使用することは、当技術分野では周知である。従来の媒質または作用物質がmGluR5アンタゴニストの活性と相容れない範囲を除き、本発明の薬学的調製物中での使用が企図される。適したビヒクルおよび他の蛋白質を含む製剤は例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」という書籍に記述されている（「Remington's Pharmaceutical Sciences.」、Mack Publishing Company、米国、ペンシルバニア州イーストン、1985）。これらのビヒクルは注入可能な「沈積物製剤」を含む。
【００９４】
本発明の薬学的製剤はまた、獣医学的組成物、例えば獣医学的使用、例えば家畜（例えば犬）の治療に適したmGluR5アンタゴニストの薬学的調製物を含むことができる。
【００９５】
再充填可能な、または生物分解可能な装置により導入する方法もまた提供することができる。近年、薬物の送達を制御するために、様々な緩効性ポリマー装置が開発され、インビボで試験されている。生物分解性および非分解性ポリマーの両方を含む様々な生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用して、特別な標的部位でmGluR5アンタゴニストの放出を持続させるためのインプラントを形成することができる。
【００９６】
本発明の調製物は、経口で、非経口で、局所で、または直腸で投与してもよい。本発明の調製物は、当然、望ましい投与経路に適した形態で投与される。例えば、本発明の調製物は錠剤またはカプセル形態で、注射により、吸入、眼用外用水薬、軟膏、坐薬、放出制御パッチなどで投与されてもよく、注射、注入または吸入による投与；外用水薬または軟膏による局所投与；および坐薬による直腸投与としてもよい。経口および局所投与が好ましい。
【００９７】
本明細書で使用されるように「非経口投与」および「非経口で投与される」という用語は腸および局所投与以外の、通常注入による投与様式を示し、静脈内、筋内、動脈内、くも膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨内注射および注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本明細書で使用されているように「全身性投与」、「全身に投与された」、「末梢投与」および「末梢で投与された」は、中枢神経系に直接投与する以外の化合物、薬物または他の物質の投与を意味する。そのため、化合物は患者体内に入り、このため代謝および他の同様の過程、例えば、皮下投与を受ける。
【００９９】
これらの化合物は、経口、経鼻（例えばスプレーにより）、直腸、膣内、非経口、槽内および局所（粉末、軟膏またはドロップとして）、頬および舌下を含む、任意の適した投与経路により治療するために、ヒトおよび他の動物に投与してもよい。
【０１００】
選択した投与経路に関係なく、適した水和形態で使用することができる本発明の化合物および／または本発明の薬学的組成物は、下記で記述するような、または当業者に周知の他の従来法により説明されているような薬学的に許容される投与形態に製剤化される。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与レベルは、患者に毒性がないように、特別な患者、組成物および投与様式に対し所望の治療応答が達成されるのに有効な活性分の量を得るために変動させてもよい。
【０１０２】
選択した投与レベルは、採用した本発明の特別な化合物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、使用した特別な化合物の排出速度、治療期間、使用する特別な再摂取阻害物質と共に使用される他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康および治療する患者の既往症、ならびに当医学分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存すると考えられる。
【０１０３】
当技術分野において通常の技術を有する医者または獣医は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医者または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルより低いレベルで薬学的組成物中で使用される本発明の化合物の投与を始め、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。
【０１０４】
一般に、本発明の化合物の適した一日の用量は、治療効果を得るために有効な最低用量の化合物量である。そのような有効用量は一般に上記因子に依存する。一般に、患者に対する本発明の化合物の静脈内、大脳室内および皮下投与量は、体重1kgあたり約0.0001mg/日〜約100mg/日の範囲である。
【０１０５】
望ましい場合には、活性化合物の1日の有効用量を、選択的には単位投与形態で、1日に適当な間隔で別個に投与する2、3、4、5、6またはそれ以上のサブ用量として投与してもよい。
【０１０６】
「治療」という用語は、予防、治療および治癒法をも含むものとする。
【０１０７】
この治療を受ける患者は必要とされる任意の動物であり、霊長類、特にヒト、ならびにウマ、ウシ、ブタおよびヒツジなどの他の動物；ならびに一般的には飼鳥類およびペット動物が含まれる。
【０１０８】
本発明の化合物は単独で、または薬学的に許容される担体との混合物として投与することができる。本発明の化合物はまた、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシドおよびグリコペプチドなどの他の抗菌作用物質と共に投与することができる。このように結合治療では、最初に投与した活性化合物の治療効果が完全消失する前に次の作用物質を投与する様式で、活性化合物を逐次、同時におよび別個に投与することを含む。
【０１０９】
本発明の化合物が単独で投与することができる場合、その化合物を薬学的な製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明に係る薬学的組成物はヒトまたは獣医学的薬剤において使用するのに好都合な任意の様式で投与するように製剤化してもよい。
【０１１０】
このように、本発明の他の局面は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化された、治療上有効量の1つまたは複数の上記化合物を含む薬学的に許容される組成物を提供する。以下で詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物は、以下のように適合された形態を含む、固体または液体形態で投与するように特別に製剤化されてもよい：(1)経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸薬、粉末、顆粒および舌に塗布するためのペースト；(2)例えば、殺菌溶液もしくは懸濁液として、例えば、皮下、筋内もしくは静脈内注射による非経口投与；(3)例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏もしくはスプレーとして局所塗布；または(4)例えばペッサリー、クリームまたはフォームとして膣内もしくは直腸内投与。しかしながら、特定の態様では、対象化合物を滅菌水中に単に溶解し、懸濁させてもよい。
【０１１１】
本明細書で使用されているように「薬学的に許容される担体」という用語は、対象レギュレータを1つの器官、または身体の一部から、他の器官、または身体の一部に運搬するまたは輸送するのに関係する、液体もしくは固体フィルタ、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化剤物質などの薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と相溶性があり、患者に有害でないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能することができる物質の幾つかの例としては、以下のものが挙げられる：(1)乳糖、ブドウ糖およびショ糖などの糖；(2)トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；(3)カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；(4)粉末トラガカントゴム；(5)モルト；(6)ゼラチン；(7)タルク；(8)ココアバターおよび坐薬蝋などの賦形剤；(9)ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；(10)プロピレングリコールなどのグリコール；(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；(12)オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；(13)寒天；(14)水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；(15)アルギン酸；(16)発熱物質を含まない水；(17)等張生理食塩水；(18)リンガー液；(19)エチルアルコール；(20)リン酸緩衝溶液；ならびに(21)薬学的調剤において使用される他の毒性のない相溶性物質。
【０１１２】
上述したように、本発明のmGluR5アンタゴニストの特定の態様は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含んでもよく、このため、薬学的に許容される酸と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。この点で「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的毒性のない無機および有機酸添加塩を示す。これらの塩は、本発明の化合物の最終単離および精製中にインサイチューで、または遊離塩基形態の本発明の精製化合物を適した有機または無機酸と別々に反応させ、このようにして形成した塩を単離することにより調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Bergeら(1977)「Pharmaceutical Salts」、J. Pharm. Sci. 66:1-19）。
【０１１３】
対象化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば無毒有機または無機酸由来の、その化合物の従来の無毒性塩または第四アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の無毒性塩としては、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸から誘導されるもの；ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの無機酸から調製される塩が含まれる。
【０１１４】
他の場合では、本発明の化合物は、1つまたは複数の酸性官能基を含んでもよく、このため、薬学的に許容される塩基と共に薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合における「薬学的に許容される塩」という用語は比較的毒性のない、本発明の化合物の無機および有機塩基添加塩を示す。これらの塩は同様に、本発明の化合物の最終単離および精製中にインサイチューで、または遊離酸形態の精製化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩などの適した塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一、第二または第三アミンと別々に反応させることにより調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基添加塩の形成に有効な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Bergeらを参照のこと、上記）。
【０１１５】
湿潤剤、乳化剤および潤滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤もまた、組成物中に存在させることができる。
【０１１６】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、(1)水溶性酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(2)油溶性酸化防止剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェノールなど；ならびに(3)金属-キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１１７】
本発明の製剤には、口、鼻、局所（頬および舌下を含む）、直腸、膣、および／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は都合良く単位投与形態で存在してもよく、薬学において周知の任意の方法により調製してもよい。担体物質と結合させて単一の投与形態とすることができる活性成分の量は治療する宿主、投与の特別な様式に依存して変動する。担体材料と合わせて単一の投与形態を得ることができる活性成分の量は一般に、その化合物が治療効果を発揮する化合物量である。一般に、100％のうち、この量は約1％から約99％の活性成分量であり、好ましくは約5％から約70％、最も好ましくは約10％から約30％である。
【０１１８】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明の化合物を担体、および選択的には1つまたは複数の副成分と混合する段階を含む。一般に、製剤は本発明の化合物を液体担体、もしくは細かく分割した固体担体、またはその両方と均一にかつ完全に混合し、その後、必要であれば、製品の成形を行うことにより調製される。
【０１１９】
経口投与に適している本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、ピル、錠剤、トローチ剤（香味主薬、通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを用いる）、粉末、顆粒の形態、または水性もしくは非水性液の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香錠（不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムを使用する）として、および／またはうがい薬などとして存在してもよく、それぞれが活性成分として予め決められた量の本発明の化合物を含む。本発明の化合物はまた、巨丸剤、舐剤またはペーストとして投与してもよい。
【０１２０】
経口投与のための本発明の固体投与形態（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、活性成分は1つまたは複数の薬学的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかと共に混合される：(1)フィラーまたは増量剤、例えば、デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトールおよび／または珪酸；(2)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアラビアゴム；(3)湿潤薬、例えばグリセロール；(4)崩壊剤、例えば寒天-寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の珪酸塩、および炭酸ナトリウム；(5)溶液凝固遅延剤、例えばパラフィン；(6)吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物；(7)加湿薬、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；(8)吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；(9)潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物；ならびに(10)着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。同様の型の固体組成物もまた、ラクトースすなわち乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用するソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中のフィラーとして使用することができる。
【０１２１】
錠剤は、選択的には1つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形により製造してもよい。圧縮錠剤は結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性または分散剤を用いて調製してもよい。成形錠剤は適した機械中で不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を鋳造することにより製造してもよい。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物の錠剤および他の固体投与形態、例えば、糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒は、選択的には分割してもよく、コーティングおよび殻、例えば腸溶コーティングまたは薬学的製剤技術において周知の他のコーティングを用いて調製してもよい。それらは、所望の放出プロファイルを提供するように、例えば様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて中の活性成分の放出を遅くするまたは制御するように製剤化されてもよい。それらはまた、例えば細菌保持フィルタを通して濾過することにより、または滅菌水中に溶解することができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤もしくはいくつかの他の注射可能な滅菌媒質を使用する直前に混合することにより、滅菌してもよい。これらの組成物はまた、選択的に混濁化剤を含んでもよく、活性成分を胃腸管のある部分でのみ、または好ましくはその部分で、選択的には遅延様式で放出する組成物としてもよい。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質および蝋が挙げられる。活性成分はまた、適当であれば、1つまたは複数の上記賦形剤を用いてマイクロカプセル化形態とすることもできる。
【０１２３】
本発明の化合物の経口投与のための液体投与形態としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分の他に、液体投与形態は当技術分野で普通に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【０１２４】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、加湿薬、乳化懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存薬などのアジュバンドを含むことができる。
【０１２５】
活性化合物の他に、懸濁液は、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天-寒天およびトラガカントゴム、およびこれらの混合物などの懸濁剤を含んでもよい。
【０１２６】
直腸または膣投与用の本発明の薬学的組成物の製剤は坐薬として提供されてもよく、これは本発明の1つまたは複数の混合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬蝋またはサリチラートを含む1つまたは複数の適した非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製してもよい。この坐薬は室温では固体であるが、体温では液体となり、そのため直腸または膣腔で溶融し、活性再摂取阻害物質が放出される。
【０１２７】
膣投与に適した本発明の製剤としては、当技術分野において適していることが周知の担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧製剤も挙げられる。
【０１２８】
本発明の化合物の局所または経皮投与用の投与形態には、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬が含まれる。活性化合物は滅菌条件下で薬学的に許容される担体と、および必要とされる任意の保存薬、緩衝剤、または噴射剤と共に混合されてもよい。
【０１２９】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物の他に、賦形剤、例えば動物性および植物性油脂、油、蝋、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【０１３０】
粉末および噴霧は、本発明の化合物の他に、賦形剤、例えば乳糖、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。噴霧はさらに、一般的な噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性未置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含むことができる。
【０１３１】
経皮パッチは本発明の化合物の身体への送達を制御するという追加の利点を有する。そのような投与形態は、再摂取阻害物質を適当な媒質に溶解する、または分散することにより製造することができる。皮膚を横切る再摂取阻害剤の流れを増加するために、吸収増強剤もまた使用することができる。そのような流れの速度は、速度制御膜を提供する、またはポリマーマトリクスもしくはゲルに化合物を分散することのいずれかにより制御することができる。
【０１３２】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、本発明の1つまたは複数の化合物を、1つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散物、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に注入可能な滅菌溶液または分散物に再構成することができる滅菌粉末（酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃化剤を含んでもよい）と共に含む。
【０１３３】
本発明の薬学的組成物中で使用してもよい適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適したそれらの混合物、植物油（例えばオリーブ油）および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。例えば、コーティング材料、例えばレシチンを使用することにより、分散物の場合必要な粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を使用することにより、適当な流動性を維持することができる。
【０１３４】
これらの組成物はまた、保存薬、加湿薬、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の作用は、様々な抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含むことにより、確実に阻止することができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張薬を含むことも望ましい。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質を含有させることにより、注射可能な薬学的形態の長期吸収も起こるかもしれない。
【０１３５】
場合によっては、薬物の効果を長くするために、皮下注射または筋内注射による薬物の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水に対する溶解度が低い結晶またはアモルファス材料の懸濁液を使用することにより達成することができる可能性がある。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、その溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存する可能性がある。また、非経口投与された薬物形態の吸収の遅延は、薬物を油ビヒクルに溶解しまたは懸濁させることにより達成される。
【０１３６】
注射可能なデポー剤形態は、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの生物分解性ポリマー中で対象化合物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することにより製造される。薬物のポリマーに対する比率、および使用する特別なポリマーの性質により、薬物放出速度を制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射可能なデポー製剤はまた、薬物をリポソームまたは、体組織と適合するマイクロエマルジョン中にトラップさせることにより調製される。
【０１３７】
本発明の化合物は、ヒトおよび動物に薬剤として投与される場合、それ自体でまたは、例えば0.1％〜99.5％（より好ましくは0.5％〜90％）の活性成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含む薬学組成物として与えることができる。
【０１３８】
本発明の活性化合物の動物の食事への添加は好ましくは、有効量の活性化合物を含む適切な食事既混合物を調製し、この既混合物を完全な食料に組み入れることにより達成される。
【０１３９】
また、活性成分を含む中間濃縮物または食事補給剤を食事に混合することができる。そのような食事既混合物および完全な食料を調製し、投与できる方法は、参考文献に記述されている（「Applied Animal Nutrition」、W.H.FreedmanおよびCo.,サンフランシスコ、米国、1969または「Livestock Feeds and Feeding」、O and B books、オレゴン州コーヴァリス、米国、1977など）。
【０１４０】
V. 本発明の化合物の例示的な使用
本発明によれば、このようにmGluR5などのグループI mGluR、好ましくはヒトmGluR5のアンタゴニストを、ダウン症候群、脆弱Xおよび他の形態の精神遅滞、精神分裂症または自閉症などの精神状態を治療し、予防する方法において使用するための薬剤の製造において使用することが定められる。様々な態様において、本発明は1つまたは複数の対象mGluRアンタゴニスト使用する治療および予防方式が考案される。
【０１４１】
本発明はまた、ヒトまたは動物の身体の治療法において使用するためのmGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニスト；治療上有効な量のmGluR5のアンタゴニストを宿主に投与する段階を含む、脆弱X、ダウン症候群および他の形態の精神遅滞、精神分裂症または自閉症に罹患した宿主を治療する方法；mGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニスト、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物；または結合調製物として、mGluR5などのグループI mGluRのアンタゴニストおよび治療用物質を含む製品を提供する。
【０１４２】
精神遅滞の根底にある神経機構の大半は知られていない。脆弱X症候群などの精神遅滞の幾つかの形態の遺伝的基礎の発見により、精神遅滞に関連する認識障害の原因となる細胞機構が洞察された。脆弱X症候群は精神遅滞の最も一般的な遺伝形態であり、1500人の男性に1人、2500人の女性に1人に影響する(de Vriesら、1993)。ほとんどの患者が中程度から重症の精神遅滞(IQ=30〜70)、幼少期の発作、視覚空間欠損症、学習障害および自閉症の特徴を含む多くの神経系障害を示す。他の形態の精神遅滞とは異なり、脆弱X患者は認識障害を起こすと考えられる著しい神経解剖学的奇形を示さない(Hintonら、1991;Wisniewskiら、1991)。代わりに、より小規模なシナプスレベルでの神経病理学が存在する。脆弱X症候群患者の皮質ニューロンは、樹状突起長が短く、不規則で非常に長く、薄く、曲がりくねった樹状突起棘が多く、成熟した短くずんぐりした棘が少ないことを特徴とする。これらの長く、薄い棘は、シナプスの成熟中の発達ニューロンにおいて優勢な熟棘または樹状突起糸状足に類似する（Fialaら、1998）。同様の樹状突起病理学がダウン症候群またはレット症候群などの精神遅滞の他の形態と関連する(Marin-Padilla、1972；KnaufmannおよびMoser、2000)。そのため、樹状突起の発達および機能の不全が精神遅滞の基礎となる一般的な機構であるかもしれない。
【０１４３】
脆弱X症候群に対する分子的な基礎は、脆弱X患者では脆弱X精神遅滞(FMR1)遺伝子の5'非翻訳領域の伸張があり、これにより転写サイレンシングが起こることが見出された時に発見された(Imbertら、1998による総説)。そのため、FMR1遺伝子産物、脆弱X精神遅滞蛋白質（FMRP）の損失が脆弱X表現型を担う(Pierettiら、1991；Verheijら1993)。この仮定を支持するために、FMR1遺伝子の「ノックアウト」(KO)により脆弱X症候群のマウスモデルを開発した(BakkerおよびConsortium、1994)。FMR1-KOマウスは学習障害および活動過多を含むヒト脆弱X症候群の徴候を多く有する(Frischら、1999；Paradeeら、1999)。
【０１４４】
FMRPの標準機能の研究により、FMRPが蛋白質合成またはmRNA翻訳のレギュレータであることが示された。FMRPは2つのRNA結合領域を有し、ポリリボソームおよび脳mRNAのサブセットの翻訳に関連する(Khandjianら、1996；Tamaniniら、1996)。非常に稀であるが重篤な形態の脆弱X症候群はFMRPのRNA結合ドメインの1つにおける1アミノ酸突然変異(I304N)により引き起こされる。I304N突然変異を有することが観察された脆弱X表現型の重篤度から、RNA結合およびポリリボソームとの関連がFMRPの機能にとって重要であることが示される（Siomiら、1994）。興味深いことに、ポリリボソームおよびFMRPは樹状突起棘に存在し、シナプスは蛋白質を合成する能力を有することがわかっており、FMRPがシナプスで蛋白質合成を局所的に調節するように特異的に機能することができることが示唆される(StewardおよびReeves、1988；Fengら、1997)。
【０１４５】
近年、多くの研究により、活性に依存するシナプス強化または弱化、例えばそれぞれ、長期増強(LTP)または長期抑圧(LTD)の機構はシナプスの形成および成熟に寄与することが証明されている(Collinら、1997；Constantine-PatonおよびCline、1998による総説)。LTPおよびLTDはどちらもニューロン膜のシナプス領域での神経伝達物質受容体の表面密度レベルの変化を反映することができる。例えば、NMDA受容体もしくはAMPA受容体のいずれかまたは両方の表面発現はLTDでは減少し、LTPでは増加する。そのため、シナプス成熟中の活性に依存するシナプス可塑性の変化が棘の異常および脆弱X表現型の1つの基礎となる源であるかもしれない。さらに、シナプスレベルにおける永続的な変化が、成人の学習および記憶の神経的基礎であると考えられる。影響を受けた患者の成熟脳における変化した活性に依存する可塑性が脆弱X症候群において経験される学習障害の因子であるかもしれない。
【０１４６】
自閉症は、数千人のアメリカ人に影響を及ぼし、多数のサブタイプを含む神経障害であり、様々な原因が推定されており、改善に役立つ治療はほとんど記録されていない。自閉スペクトルの障害は誕生時から存在し、または後に、例えば2〜3歳時に始まることがある。自閉症の明確な生物学的マーカーは存在しない。障害の診断は子供が、制限、反復またはステレオタイプ挙動に加えて、社交性、言葉による、および言葉によらない相互交際における障害を特徴とする行動症候群にどの程度合致するかを考慮して行われる。
【０１４７】
自閉症の遺伝的な基礎は、自閉患者における発達上の異常、自閉患者の子孫における自閉症発生率の増加、および１組の一卵性双生児の両方ともが自閉症である、または自閉症でないのいずれかであるという傾向（障害に対する「一致」とも呼ばれる）などの観察により示唆される。しかしながら、ほとんどの(75％〜80％)自閉症個体では、自閉症の基礎となる理由がわからない。以前の研究で、幾つかの自閉症の例では、セロトニン、ノルエピネフリンおよびヒスタミンを含む神経伝達物質が関係する異常が示された。他の原因因子としては、風疹、妊娠、陣痛および出産中の問題、巨細胞性封入体症、フェニルケトン尿症および脆弱X症候群が挙げられる。自閉症の子供はまた、とりわけ10代に、発作障害、例えばてんかんを発症する危険性が高い。
【０１４８】
自閉症に対しては多くの異なる治療法が開発されている。しかしながら、これらの治療の多くは原因ではなく疾患の症状に取り組むものである。例えば、自閉症の治療には、精神分析から精神薬理学にわたる治療方法が使用されている。臨床症状のいくらかはこれらの治療により軽減することもあるが、せいぜい、それらの症例のわずかな一部においてほどほどの改善が見られるだけである。自閉症患者のうち経済的に独立した成人として働くことができるのはわずかである。
【０１４９】
先天的な精神遅滞の主な原因であるダウン症候群もまた、最も一般的なヒトの出産時の欠陥である。ダウン症は800人の新生児あたり約1人の割合で生じ、35を超えた女性の子供で発生率が著しく増加する。推定100万人の米国人に襲いかかり、これは精神遅滞の主な遺伝的原因であり、平均寿命がより短いことと関連する。他の症状は心臓欠陥および腸欠陥、免疫系および内分泌系の問題、ならびに多数の組織奇形および骨格奇形である。
【０１５０】
ダウン症に罹患した個体の90％を超える個体が、細胞全てに余分の数の21染色体を有し、そのため各々の細胞には正常な46ではなく総数47の染色体が存在する。この理由のため、この状態は「トリソミー21」としても知られている。トリソミー21は、減数分裂または有糸分裂のいずれか中の、染色体不分離または染色体の分離の失敗により生じる。ほとんどのダウン症個体はトリソミー21を有し、逆に言えば、染色体21が関係する転座を有する個体では、および三染色体および正常細胞の両方を有するモザイクでは、症候群の特徴が見られる。しかしながら、染色体21の一部のみが3倍で存在するダウン症の形態はまれである。
【０１５１】
例示
本発明について一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照すると本発明はより容易に理解されると思われる。以下の実施例は、本発明の特定の局面および態様を説明する目的のために含まれているにすぎず、本発明を限定するものではない。
【０１５２】
実施例1：海馬CA1領域でのmGluR5および蛋白質合成に依存する長期抑制の化学的誘発
a.要約
最近の研究では、シナプス刺激の特異なパターンにより、代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)の活性化および迅速蛋白質合成に依存するCA1領域における長期抑圧(LTD)が誘発できることが証明されている。ここで、本発明者らは、同じ型のシナプス変異が、選択的mGluRアゴニスト(RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)の短時間の適用により誘発できることを示す。DHPG-LTDは、1)シナプス可塑性の飽和形態であり、2)mGluR5を必要とし、3)N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)依存性LTDとは機序が異なり、ならびに4)シナプス刺激を用いて引き起こされる蛋白質合成依存性LTDと共通の発現機構を共有する。DHPG-LTDはmGluR5-および蛋白質合成依存性シナプス変異の生物化学分析に有益である。
【０１５３】
b.序文
同シナプス性長期抑圧(LTD)は、脳内のシナプス可塑性の広く発現される形態である。LTDの最もよく理解されている型は、シナプス後の細胞内Ca2+のN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体に依存する上昇および蛋白質ホスファターゼカスケードの活性化を介する低頻度シナプス刺激(LFS)により海馬領域CA1において誘発される(BearおよびAbraham 1996)。適した状況下では、NMDA受容体(NMDAR)の薬理学的活性化によってもこの型のLTDが誘発できる。この「化学-LTD」アプローチは、例えば、NMDARに依存するLTDがシナプス後α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体のGluR1の脱リン酸化と関連することを明らかにする機序の生物化学的特徴付けに有益である(Leeら、1998)。
【０１５４】
最近の研究では、機序が異なる型のLTDもまた他の型のシナプス刺激によりCA1において誘発できることが示されている。例えば、1Hzで15分間繰り返されるペアパルス刺激(PP-LFS)はNMDARと関係がなく、代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)の活性化を必要とするLTDを誘発する（Huberら、2000；KempおよびBashir、1999）。このmGluRに依存する型のLTDは、先在するmRNAの迅速な翻訳も必要とするために、特に興味深い(Huberら、2000)。「化学-LTD」アプローチはこの新規機序を詳細に分析するのに特に有益であろう。実際に、いくつかのグループからの報告により、選択的アゴニスト(RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)によるグループI mGluRの一過性の活性化はLTDを誘発できることが示されている(Camodecaら、1999；Fitzjohnら、1999；Huberら、2000；Palmerら、1997)。しかしながら、全てのプロトコルが同等であるわけではないことは明らかである；例えば、低Mg2+条件下でのみ有効なものもあれば、NMDARに部分的に依存するものもある（Palmerら、1997；Schnabelら1999）。
【０１５５】
ここで、本発明者らは確実に蛋白質合成に依存するLTD(Huberら、2000)を生じさせる化学誘発プロトコルの特徴づけを行う。本発明者らは、LTD誘発にはmGluR5が必要であることを示し、化学的に誘発されたLTDはPP-LFSを用いて誘発されたLTDと共通の飽和発現機序を共有するという新規証拠を提供する。mGluR活性化によりmRNAの翻訳およびシナプスLTDの発現がどのように調整されるかを理解するのに本明細書で記述する方法が有益であることを本発明者らは期待する。
【０１５６】
c.方法
全ての動物は、ブラウンユニバーシティ動物実験委員会(Brown University Institutional Animal Care and Use Committee)により認証された手順に従い使用した。前に記述されているように(Huberら、2000)、生後21日〜30日（P21〜30）のロング・エバンズ（Long Evans）ラット(Charles River、マサチューセッツ州ケンブリッジ)およびmGluR5ノックアウトマウス(Luら、1997)から海馬切片を調製した。ほとんどの実験で、切り出し後直ちにCA3を除去した。切片は1〜2時間、室温（ラット）または30℃（マウス）にて、95％ O2-5％ CO2で飽和させた124 NaCl、5 KCl、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、1 MgCl2、2 CaCl2および10デキストロースを含む人工髄液(ACSF)中で回復させた。記録のために、切片を沈水記録チャンバ内に置き、2ml/分の速度で30℃ ACSFを灌流させた。
【０１５７】
前に記述されているように(Huberら、2000)、シナプスで引き起こされる電場電位(FP)をCA1領域から記録した。Axoclamp 2BおよびAxopatch 1D増幅器(Axon Instruments)をそれぞれ用いて、鋭い微小電極および全細胞電圧-固定記録を行った。鋭い電極(80〜120MΩ)は3M K-酢酸および10mM KClで満たし；パッチピペット(3〜7MΩ)は(mMで表した)134 K-グルコン酸、6 KCl、4 NaCl、10 HEPES、0.2 EGTA、4 MgATP、0.3 TrisGTPおよび14 ホスホクレアチンで満たした。内部溶液のpHはKOHを用いて7.25に調整し、容量オスモル濃度はH2Oまたはショ糖を用いて300mOsmに調整した。直列抵抗の変化が15％未満であった実験のみを分析に含めた。波形を2kHzでフィルタにかけて獲得し、Experimenter's Workbench(DataWave Systems、Boulder、CO)を用いてPC上、10kHzでデジタル化した。
【０１５８】
最大応答の50〜60％が得られる刺激強度(10〜30μA；0.2ms)を用いて10〜30秒毎にベースライン応答を収集した。DHPGまたはLFS前の20分のベースライン期間中の応答の大きさのドリフトが＞5％であった実験は、更なる分析から排除した。mGluR5 KOマウスを用いた実験はすべて、対照として野生型同腹子を用い、後にTherion(Troy、NY)により決定される遺伝子型に対し盲検的に実施した。LFSは1Hzで900パルスから構成される。PP-LFSは1Hzで提供される900ペアの刺激(50msの刺激間隔)により構成される。飽和実験では、刺激持続時間がPP-LFS中では0.2から0.4msに増加された。
【０１５９】
グループデータは以下のように分析した：1)各実験に対するFPの初期勾配および興奮性シナプス後電位(EPSP)、または興奮性シナプス後電流(EPSC)の振幅を前提条件またはDHPGベースライン平均割合(％)として表し、2)各実験における時間尺度を条件付けまたはDHPGの開始からの時間に変換し、および3)時間を適合させ、正規化したデータの平均を実験全体で求め、平均±SEとして本明細書内および図面に示した。グループ間の有意の差を、LESまたはDHPG適用後1時間にとった5分平均で実施した個別のt試験またはANOVAを用いて決定した。
【０１６０】
R,S-DHPGおよびD-2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸(D-AP5)をTocris(ミズーリ州セントルイス)から購入し；他の全ての薬品はSigma Chemicals(ミズーリ州セントルイス)から購入した。DHPGはH2O中で100倍ストックとして調製し、小分けして、-20℃で保存した。新鮮なストックを1週間に1度作成した。AP5の10倍ストックをACSF中で調製し4℃で保存した。これらのストックをACSF中で希釈し最終濃度を実現した。ピクロトキシンを使用直前にACSF中に直接溶解した。
【０１６１】
d.結果
DHPGを5分適用すると、誘発されるFPの急性、用量依存性抑圧が得られた(図1A)。≧50μM濃度では、薬物を洗浄した後FPは完全には回復しなかった。その代わりに、シナプス応答は抑制レベルでは安定化した(50μM：DHPG前ベースラインの69±5％、平均±SE：n=11；100μM：48±1％；n=4)。後の研究全てにおいて、50μM、DHPG(5分)を使用し、本発明者らがDHPG-LTDと呼ぶものを誘発した。他のグループ1 mGluRアゴニスト、キスカル酸(5分；5μM)を適用してもLTDとなり(81±2％；n=4)、効果はDHPG特有のものではないことが確認された。DHPG中に1入力のみを刺激した2経路実験(n=4)では、DHPG-LTD投与が同時シナプス刺激を必要としないことが示された(刺激：62±4％；非刺激：68±5％、P＞0.2；図1B)。DHPG-LTDはまた、飽和の証拠を示した；50μM DHPGの2適用は最大抑制を得るのに十分であった(図1C)。
【０１６２】
細胞内記録により、FPのDHPG-LTDはシナプス伝達の減少を反映する。EPSPの鋭い電極記録およびEPSCの全細胞電圧固定記録(-70mVで記録)により、安定なLTDが明らかになった(EPSP：61±5％；n=6；図1D；EPSC：69±5％；n=5；図1E)。対照的に、DHPGの1時間後に測定した膜電位、入力抵抗、または膜興奮性では有意の長期変化はなかった（データは示さない）。このようにDHPG-LTDはシナプス伝達の長期にわたる変異である。
【０１６３】
競合NMDARアンタゴニストAP5(50μM)は、インターリーブさせた対照切片に比べるとDHPG-LTDの大きさに影響を与えなかった(AP5：83±3％、n=5；対照：85±3％、n=4；P＞0.3；図2A)。5μMのキスクアル酸で誘発したLTDはまたAP5により影響されなかった(79±2％；n=3)。そのため、これらの実験条件下でグループ1 mGluRの薬理学的活性化により誘発されたLTDは同時NMDAR活性化を必要としない。
【０１６４】
CA1領域錐体ニューロン中の主なグループ1 mGluRである(Romanoら、1995)mGluR5の関連を評価するために、この受容体が欠如するマウスでDHPG-LTDを試みた。DHPG-LTDはmGluR5同型接合性変異体には存在しなかった(DHPG適用後1時間で測定した98±3％；n=8；図2A)。野生型同腹子対照(77±2％；n=9；図2B)と比較して、異型接合性変異体では中間量のLTDが観察された(84±4％；n=6)。一方向ANOVAにより、遺伝子型の著しい効果が明らかになった[F(2,19)=10.33、P＜0.001]。その後のTukey試験により、野生型および異型接合体の両方とも同型接合体とは著しく異なることが明らかになった(P＜0.025)。異型接合体では、野生型に比べDHPG-LTDが少ない傾向があるが、これは有意ではない(P=0.5)。このように、DHPG-LTDは厳密にmGluR5に依拠し、mGluRに対する1つの対立遺伝子が存在するとLTD誘発には十分である。DHPG-LTDとは対照的に、LFSにより誘発される典型的なNMDAR依存性LTDは、野生型マウスに比べ(89±5％；n=6)、同型接合型変異体で観察された(87±2％；n=6；P＞0.6；図2C)。これらの結果により、CA1領域では2つの異なるLTD誘発経路(1つはNMDARに依拠し、もう1つはmGluR5に依拠する)が存在することが示される。
【０１６５】
mGluR5ノックアウトからの結果から、NMDAR依存性LTDおよびDHPG-LTDの誘発機序は異なることが示される。これらの2つの形態のLTDが同様の発現機構を使用するかどうかを試験するために次の実験を設計した。LFSを繰り返し加えNMDAR依存性LTDを飽和させた(図3A)。その後DHPGを適用し、DHPG前ベースラインに対しFP勾配値を繰り込むことによりLTDの大きさを測定した。NMDAR依存性LTDおよびDHPG-LTDが共通の発現機構を使用しているなら、NMDAR依存性LTDの前の飽和はDHPG-LTDを減少させるか、または妨害するはずである。しがしながら、DHPGは依然として著しくシナプス応答を抑制し(DHPG前ベースラインの81±5％；n=5；P＜0.05；図3B)、NMDAR依存性LTDおよびDHPG-LTDは異なる発現機構を使用することが示唆される。
【０１６６】
同じアプローチを使用して、DHPG-LTDが、シナプス誘発mGluR依存性LTDと同じ飽和発現機構を使用するかどうかを評価した。NMDARアンタゴニストD-AP5(50μM)の存在下のPP-LFSを使用してmGluR依存性LTDを飽和し、その後DHPG(50μM)を切片に適用した(図3C)。前の閉塞実験とは対照的に、PP-LFSによるLTDの飽和後にDHPGを適用してもさらにLTDが誘発されることはなかった(DHPG前ベースラインの100±5％；n=5；P＞0.5；図3D)。これらの結果から、DHPGおよびPP-LESにより誘発されるmGluR-LTDは共通の発現機構を共有するという顕著な証拠が得られる。
【０１６７】
e.考察
CA1における同シナプス性LTDを誘発するために多くの異なるプロトコルが紹介されている(BerrettaおよびCherubini、1998；Camodecaら、1999；DudekおよびBear、1992；Fitzjohnら、1999；Huberら、2000；KempおよびBashir、1999；Olietら、1997；Overstreetら、1997；Palmerら、1997)。これらの多くでmGluRの関連が示唆されているが、発見の一群は混乱しており、LTDの単一mGluR依存性形態とは完全には一致しない。例えば、成人海馬切片に10分間100μMのDHPGを適用しても、細胞外媒質からMg2+を除去することにより切片の興奮性を増加させなければLTDはほとんど誘発されない(Palmerら、1997；Shcnabelら、1999)。得られたLTDはNMDARアンタゴニストにより部分的にブロックされる。さらに、成人海馬切片におけるPP-LFSは明らかにグループ1 mGluRの活性化またはAMPA/カイネート受容体の活性化を介してLTDを誘発することができる(KempおよびBahir、1999)。対照的に、本発明者らは最近、P21-30ラットで、PP-LFSおよびDHPG(50μM、5分)のどちらもが、1)NMDAR活性化から独立し、2)mGluRアンタゴニストにより完全にブロックされ、および3)mRNA翻訳の移行相に依存するLTDを誘発することを証明した(Huberら2000)。後者の発見は、このmGluR-LTDモデルが、脆弱X精神遅滞において欠けている樹状突起蛋白質合成の調節および機能を解明するのに有益であるはずであるため、特に重要である。
【０１６８】
DHPGおよびPP-LFSの多様な効果のため、異なる実験条件下での前の発見が本発明者らのモデルに当てはまるとは仮定できない。そのため、mGluR-LTDの蛋白質合成依存性形態を特徴づける必要があった。本発明者らは本明細書において、DHPG-LTDがシナプス可塑性の飽和形態であること、mGluR5を必要とすること、NMDAR依存性LTDとは機構が異なること、ならびに重要なことにPP-LFSを用いて誘発されるLTDと共通の飽和発現機構を共有することを示している。DHPG-LTDは同時シナプス刺激を必要としないので、生物化学および生物物理研究に有益である「化学-LTD」の形態(Leeら、1998)である。
【０１６９】
f.参考文献
2005500260.tif 000031
2005500260.tif 000032
【０１７０】
実施例2：mGluR活性化に応じたイオンチャネル型グルタミン酸受容体の内在化
a.要約
グループ1代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)の活性化により、樹状突起蛋白質合成および長期シナプス抑圧(LTD)が刺激されるが、これらの効果がどのように関係するのかは不明なままである。ここで、本発明者らは海馬におけるmGluR活性化の結果、シナプスからAMPA受容体およびNMDA受容体の両方ともが急激に損失する証拠を提供する。mGluR-LTDのように、この変化の安定な発現では蛋白質合成が必要である。これらのデータにより、mGluR-LTDの発現は少なくとも部分的にはシナプス後であり、樹状突起蛋白質合成の機能の結果はグルタミン酸受容体取引の調節であることが示唆される。
【０１７１】
b.序文
2つの機構の異なる別個の形態の同シナプス性長期抑圧(LTD)は海馬で共存する。1つの形態の誘発はN-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)およびシナプス後蛋白質ホスファターゼの活性化に依存し、もう一方の誘発はシナプス後グループ1代謝調節型グルタミン酸受容体(mGluR)および樹状突起mRNAの局所翻訳の活性化に依存する1。NMDAR依存性LTD（NMDA-LTD）はα-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチルイソキサゾール-4-プロピオン酸受容体(AMPAR)のシナプス発現が減少した結果である2〜7。mGluR依存性LTD(mGluR-LTD)の発現については知られていることは少ないが、シナプス前機構が示唆されている8,9。
【０１７２】
最近まで、mGluR-LTDに関する進歩は信頼できるシナプス誘発プロトコルが欠如していたため妨げられていた。他の方法は、選択的アゴニスト(R,S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)によりグループ1 mGluRを一過的に活性化するものである10〜13。海馬切片では、DHPG(50μM、5分)は、蛋白質合成が必要とされ13、パターン化されたシナプス活性により誘発されるmGluR-LTDと同じ飽和発現機構を使用すると考えられるLTDを誘発する14。そのため、本発明者らは、培養物および切片において海馬ニューロンに対しこの化学誘発プロトコルを用い、mGluR-LTDがシナプス後グルタミン酸受容体発現の変化として発現される可能性を調べた。
【０１７３】
c.結果
1)DHPGはAMPARの内在化を刺激する
海馬ニューロンの表面上で発現されたAMPARに対するmGluR活性化の効果を調べるために、本発明者らは、酸ストリップ免疫細胞化学染色プロトコルを使用した3。GluR1サブユニットの細胞外N末端に対する抗体を用いて、生きている培養海馬ニューロン上の表面受容体の標識を行った。細胞をDHPG(50μM、5分)または対照媒質のいずれかで処理し、様々な間隔の後、残りの表面抗体を酢酸洗浄により取り除いた。ニューロンを固定し、膜-透過化条件下で免疫細胞化学を実施し、内在化したAMPARに結合した抗体を検出した。実験者が処理条件を知っていることを除き、全ての分析は盲目的に実施した。
【０１７４】
5分間DHPGを適用して刺激すると、処理開始後15分もの早い時期に観察された内在化したGluR1斑点が2倍よりも多く増加し（樹状突起の10μmあたりの斑点、対照、0.62±0.09、n=65細胞；DHPG、1.44±0.17、n=60細胞；p＜0.0002）および少なくとも1時間持続した(対照、0.58±0.08、n=42細胞；DHPG、1.14±0.15、n=38細胞；図4aおよび図4b)。GluR1の内在化の増加は、グループ1 mGluRを活性化した特異的な結果であった。mGluRアンタゴニストLY344545により完全にブロックされたためである（参考文献15；100μM；対照、0.42±0.10、n=15；DHPG、1.39±0.34、n=14；LY344545のみ、0.32±0.08、n=13；DHPG＋LY344545、0.29±0.04、n=17；図4c）。対照的に、NMDARアンタゴニスト2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸（APV、50μM）は効果がなかった(対照、0.74±0.19、n=7；DHPG、1.49±0.22、n=10；DHPG＋APV、1.51±0.3、n=10)。
【０１７５】
mGluR-LTDの安定な発現には樹状突起蛋白質合成が必要である。本発明者らは、培養物をmRNA翻訳阻害物質シクロヘキシミド(chx、60μM、DHPG前15分適用)で前処理しても、60分に測定される内在化したGluR1のDHPGにより誘発された増加が著しく阻害されることを見出した（対照、0.85±0.14、n=24；DHPG、1.5±0.27、n=20；DHPG＋chx、1.02±0.12、n=25、p＜0.03ではDHPGのみとは異なる、図4d）。機構の異なる蛋白質合成阻害物質、アニソマイシンもまた、mGluRにより刺激されたエンドサイトーシスをブロックした（データは示さず）。シクロヘキシミドもアニソマイシンも内在化した斑点の基本レベルには有意の効果を示さなかった（対照+chx、0.76±0.09、n=10、図4d）。
【０１７６】
2)表面AMPARはDHPG処理後失われる
本発明者らは次に、DHPGに誘発された、内在化したAMPARの増加と同時にシナプスで表面発現受容体クラスタの正味の減少が起こるかどうかを決定した。DHPGの洗浄後、様々な間隔で、細胞を固定し、表面GluR2またはGluR1を、透過化処理せずにN末端抗体で標識した。その後、培養物を透過化し、適当な二次抗体に結合させたシナプス前マーカーシナプシンIまたはシナプトフィシンに対する抗体を用いてシナプスを標識した。対照条件下では、ほとんどのシナプスはAMPARクラスタに対し免疫反応性であった(GluR2、80.6±9.0％；n=10細胞、200シナプス、図5a〜図5d；GluR1、72.5±4.7％；n=15細胞、225シナプス；図5eおよび図5f)。
【０１７７】
AMPARを有するシナプスの割合(％)はDHPG処理により劇的に減少した。シナプスの40.8±11％のみが処理後1時間でGluR2に対する表面染色を有した(n=10細胞、200シナプス；p＜0.03)(図5g〜図5i)。同様の結果がGluR1を用いた追加の実験で得られた(29.3±5.4％ DHPG処理後15分のGluR1陽性シナプス、n=14細胞、210シナプス；20.0±12.0％ DHPG処理後60分のGluR1陽性シナプス、n=15細胞、225シナプス；図5jおよび図5k)。
【０１７８】
シクロヘキシミド(60μM、DHPG前に15分適用)を用いた培養物の前処理で、60分に測定された、DHPGにより誘発されたシナプスGluR1クラスタの減少が阻害された(GluR1を有するシナプス、55.7±5.1％、n=15細胞、225シナプス；p＜0.05対DHPGのみ；図5k)。しかしながら、GluR1陽性シナプスの数は、阻害物質の存在下DHPG開始後15分で減少した（GluR1を有するシナプス、37.8±3.8％、n=15細胞、225シナプス；図5j）。これらの発見から、蛋白質合成が、mGluR活性化により刺激される初期のエンドサイトーシスではなく、内在化した受容体の運命の決定に関係していることが示唆される。
【０１７９】
他のアプローチを用いて表面AMPARでのmGluR活性化の効果を確認するために、本発明者らは高密度培養物をDHPG(50μM、5分)または対照媒質で処理し、表面受容体を60分後にビオチンで標識した。ビオチン化した受容体を沈澱させ、表面の総GluR1に対する比率を定量ウェスタンブロッティング法により決定した。この生物化学分析では、表面AMPARがDHPG処理により対照培養物における値の56.8±4.0％まで減少することが確認された(各処理グループでn=4；p＜0.01；図6)。
【０１８０】
3)DHPG適用によりmEPSC頻度が減少する
免疫細胞化学および生物化学実験により、DHPG処理は、おそらく培養ニューロンにおけるAMPAR媒介シナプス伝達に対し有意の効果を有することが示唆される。この可能性を直接調査するために、AMPAR媒介mEPSCに対するDHPGの効果を調べた。受容体内在化を刺激する他の操作に対し報告されているように（例えば、参考文献16を参照のこと）、本発明者らはmEPSC頻度が著しく減少することを観察した。インターイベント間隔はDHPG処理後15分でベースラインの315％(n=11細胞、p＜0.05)、および60分でベースラインの319％であった(n=9細胞、p＜0.002、図7)。
【０１８１】
頻度の変化の他に、DHPG後15分(94.2％ベースライン；n=11細胞)および60分(92.2％ベースライン；n=9細胞；図7)でmEPSC振幅が減衰する傾向があったが、この効果は統計学的有意性には達しなかった。映像および生物化学結果を共に考えると、mEPSCデータの最も率直な説明は、DHPGはシナプスの離散群をサイレンシングするというものである。AMPARの完全補体が内在化されるからである。
【０１８２】
4)表面NMDARはDHPG処理後に失われる
NMDAR活性化は、NMDARに影響することなくシナプスAMPARの損失を刺激することであると報告されている。mGluR刺激がNMDARクラスタに影響するかどうかを決定するために、細胞をDHPGで処理し、固定し、非透過化処理条件下、NMDARのNR1サブユニットに対するN末端抗体で染色した2。その後、細胞を透過化し、シナプシンIに対する抗体を用いてシナプスを標識した。対照ニューロンでは、シナプスの67±4％(n=20細胞、300シナプス)がNR1免疫反応性斑点を含んだ(図8a〜図8dおよび図8g)。DHPG処理後、NR-1陽性シナプスの割合は15分で28±6％(n=16細胞、240シナプス、p＜0.003)および60分で21±3％(n=19細胞、285シナプス；図8eおよび図8g)まで減少した。AMPARの場合と同様に、DHPG後の表面NR1クラスタにおける変化は、培養物をシクロヘキシミドで処理した場合60分で著しく減衰した(42±5％ 60分におけるNR-1標識；n=20細胞、300シナプス；p＜0.05対DHPGのみ；図8g)。
【０１８３】
DHPG後のシナプスからのNMDARの損失は驚くべきであった。シナプス後ニューロンにおける非特異的な変化の可能性を除外するために、本発明者らはβ1-サブユニットのN末端に対する抗体を用いて、シナプスGABAA受容体の分布変化をモニタした。グルタミン酸受容体を有するシナプスとは異なり、DHPGはGABAAβ1クラスタを有するシナプシン標識斑点の割合には何の影響はも与えなかった（対照、11.8±4％、n=10細胞、150シナプス；DHPG処理後60分、10.9±2％、n=10；データ示さず）。DHPG後の表面NMDARの損失を確認するために、高密度培養物をDHPG(50μM、5分、n=5)、DHPG+シクロヘキシミド(60μM；n=4)、または対照媒質(n=5)で処理し、表面NMDARを60分後にビオチンで標識した。ビオチン化受容体を沈澱させ、表面の総NR1に対する比率を定量ウエスタンブロッティングにより決定した(図8hおよびi)。この分析により、表面NMDARがDHPG処理により対照培養物における値の32.3±8.2％まで著しく減少すること、およびこの変化はシクロヘキシミドにより阻害されること(対照の79.1±14.5％；図8i)が確認された。
【０１８４】
5)NMDAR-EPSCのLTD
シナプスNR1クラスタの損失は明らかに、AMPARに選択的に影響する他の処理からDHPGの効果を識別する2,17〜19。このように、本発明者らのデータにより、AMPARに媒介されるシナプス伝達の抑制の他に、mGluR-LTDの誘発はNMDARにより媒介される伝達にも影響することが示唆される。この仮定を試験するために、前述したように+40mVで電圧固定したCA1ニューロンにおいてNMDARにより媒介された興奮性シナプス後電流(EPSC)をモニタしたように20、本発明者らは生後21〜28日(P21〜28)のラットの海馬切片においてDHPGを用いて化学的にLTDを誘発した14。これらの実験により、DHPG(5分)を適用すると、NMDAR-EPSCの用量依存性LTDが起こることが明らかになった(ベースラインのパーセントしてのDHPG処理後30分のESPC振幅、50μM、70.7±2.9、n=3、p＜0.05；100μM：57.7±1.0、n=5；p＜0.00005ではベースラインとは異なる、両側t検定；図9a)。
【０１８５】
NMDAR機能のmGluRにより誘発される損失に対する付加的な試験として、本発明者らは一次先端樹状突起の近位部分付近で適用したNMDAにより誘発された電流に対する100μM DHPG(5分)の効果を調べた（図9b）。著しいNMDAR電流の抑制が起きた(DHPG処理後50〜60分での％ベースライン、DHPG、61.1±12.0、n=7；対照、97.3±9.4；n=7；p＜0.05)；しかしながら、この変化の時間経過はシナプスにより誘発されたEPSCで観察されたものより遅かった。直ちに抑制するEPSCとは異なり、NMDAにより誘発された電流は一過的に増強し(アゴニスト1-アミノ-シクロペンタン-1,3-ジカルボン酸(ACPD)を用いて前述したように10,21)、その後徐々に1時間にわたり減少した。EPSCの初期LTDはシナプス前機構により、またはシナプスNMDARの迅速分散（即座の内在化無し）により説明できる。膜内でのNMDARの移動は培養細胞22および切片23の両方において証明されている。しかしながら、初期の結果とは関係なく、DHPG処理後60分でのNMDAR EPSCおよびNMDA誘発性応答の同時抑制は、mGluR-LTD中の表面NMDAR発現の実際の減少と一致する。
【０１８６】
d.考察
本発明者らのデータにより、培養海馬ニューロンにおけるグループ1 mGluRの活性化により、シナプスAMPA受容体およびNMDA受容体の同時内在化が刺激されること、ならびにこれらの変化の安定な発現は蛋白質合成阻害物質感受性であることが証明される。海馬切片での同じDHPG処理(50μM、5分)は、シナプス後mRNA翻訳に依存し13、本発明者らが示すように、NMDAR-およびAMPAR媒介伝達における変化として発現されるmGluR-LTDを刺激する。このように、シナプスグルタミン酸受容体の除去は、海馬におけるmGluR-LTDの発現に対する候補機構である。この概念は、グループ1 mGluRの活性化により引き起こされる小脳LTDがAMPARのシナプス後エンドサイトーシスを必要とするという発見と一致する24。
【０１８７】
海馬mGluR-LTDは前に、量子分析の従来の仮定により、シナプス前発現機構を示唆する自発シナプス後応答および誘発シナプス後応答の頻度の減少に関係することが示された8,9。しかしながら、これらのデータはまた、活性化シナプスでの受容体の完全な損失により起こる「シナプスサイレンシング」とも一致する16,17,25。
【０１８８】
mGluR活性化後に本発明者らが観察したように、NMDA-LTDはシナプス後AMPARの発現の減少（および自発興奮性シナプス後電流の頻度の減少2）と関連する。原理として、LTD誘発の2つの経路は同じシナプスでの共通の飽和発現機構に収束可能である；しかしながら、この仮説は、mGluR-LTDおよびNMDA-LTDが互いに妨げないという発見により曖昧である9,14。他の仮説は、mGluRおよびNMDARはおそらく異なるシナプス群で、別個の群のAMPARを調整するというものである。
【０１８９】
いくつかの前の研究により、シナプスNMDARはAMPARに比べて比較的静的であることが示唆された4,19,27。しかしながら、本発明者らは、DHPG処理後NMDARおよびAMPARの両方が同様の時間経過(＜15分)で内在化されることを見出している。NMDARの迅速エンドサイトーシスも基本条件下での未熟皮質培養物において証明されている28。この受容体内在化はシナプス後密度蛋白質PSD95のNR2BサブユニットのC末端への結合により阻害された。このように、DHPGにより刺激されるNMDARエンドサイトーシスに対する可能な機構はPSD95およびNR2Bの相互作用の調節と関係すると考えられる。
【０１９０】
海馬mGluR-LTDへの明らかな関連性の他に、本発明者らは、本発明者らの発見がさらに重要であることを示唆する。第一に、本発明者らは、前の発見13,26,29と共に考えると、シナプス活性の特異的な結果としてシナプス後ニューロンで起こりやすい蛋白質合成に対する独特の役割を示す。アッセイとしてグルタミン酸受容体輸送を使用すると、この調製はmGluR活性化を樹状突起mRNA翻訳調節に結びつける分子機構を詳細に分析するために非常に有益であるに違いない。第二に、DHPG後の、海馬ニューロン上のイオンチャネル型受容体の損失はシナプス排除前に神経筋接合で起こることを暗示し30、グループ1 mGluRは最近では、小脳の発達におけるクライミング線維シナプスの損失に関係している31。このように、本発明者らが本明細書で記述したモデルは、mGluRおよびLTDの機構が大脳皮質における活性依存性シナプス排除に関与するという長年にわたる仮説を試験するのに有益であるはずである32,33。
【０１９１】
e.方法
1)酸ストリップ免疫細胞化学プロトコル
ラット海馬ニューロンの低密度培養物を前に記述されているように作成した34。全てのラットをブラウンユニバーシティ動物実験施設に収容し、ブラウンユニバーシティ動物実験委員会により全ての手順の承認を受けた。簡単に説明すると、海馬をE18ラット胎児から除去し、トリプシン処理(0.25％)し、粉砕により分離し、ポリ-L-リシン(1mg/ml)コートガラスカバーガラス上で4時間培養した(80,000細胞/ml)。その後、カバーガラスを成長培地中のグリア細胞の単層を含む皿に移し、ニューロンを14日〜22日間成熟させた。GluR1サブユニットの細胞外N末端に対する抗体を用いて、生細胞上で表面AMPARを標識した（アミノ酸271〜285位；5μg/ml；Oncogene Research、カルフォルニア州サンディエゴおよびR.Huganiaの贈答品）。その後、ニューロンをグループ1 mGluR DHPG（媒質中50μM）の特定アゴニストまたは対照媒質で5分間処理した。処理後10分または55分に、細胞を4℃、Tris-緩衝生理食塩水(TBS)中で冷却しエンドサイトーシスを中止させ、その後氷上で4分間0.5M NaCl/0.2M 酢酸(pH3.5)に曝露し、細胞外GluR1に結合した抗体を除去した。培養物を4％ショ糖を含む4％パラホルムアルデヒド中で洗浄し、固定した。非特異的染色をブロックし、0.1％ Triton-X、4％ヤギ血清および2％ BSAを含むTBS中で細胞を透過化処理した。内在化した一次抗体を、Cy3-標識二次抗体で1時間インキュベートすることにより視覚化した(1:300)。最初の研究では、脱分極により誘発される神経伝達物質の放出を制限するために、処理は1μＭ テトロドトキシンおよび1μM ω-コノトキシンを含んだ。本発明者らは後に、ω-コノトキシン無しで同じ結果が得られることを見出し、そのためこの処理は後に省略した。
【０１９２】
2)シナプス受容体の免疫細胞化学的位置確認
実験処理後、低密度培養物を4％ショ糖を含む4％パラホルムアルデヒド中で5分間固定した。培養物をPBS中で洗浄し、その後20％胎児ウシ血清を含むPBS中で1時間ブロッキングした。培養物をN末端受容体抗体で一晩中4℃で染色した(GluR2、1:100、Chemicon、カリフォルニア州テルネキュラ；GluR1、1:100、R.Huganirの寄贈品；NR1、1:500、Chemicon MAB363；GABAAβ1、1:100 Santa Cruz Biologicals、カリフォルニア州サンタクルーズ)。その後培養物を0.1％ Triton-Xを含むブロッキング緩衝液中で20分間洗浄し、シナプス前蛋白質（シナプシン1、1:1000、Chemicon；シナプトフィシン、1:100、Boehringer Manheim、カリフォルニア州アーヴィン）に対する抗体に1時間、室温で曝露した。その後培養物を洗浄し、適当な蛍光二次抗体に曝露した(Jackson Immunoresearch、ペンシルバニア州ウエストグローブ)。
【０１９３】
3)免疫細胞化学データの分析
60×1.4 NA対物レンズを用いたNikon E800顕微鏡（ニューヨーク州メルヴィル）により顕微鏡観察を実施した。蛍光画像を、Sensys冷却CCDカメラを用いて収集し、IP-Labsソフトウエアを用いて解析した。別の画像を、60×1.2 NA対物レンズを備えたOlympus Flowview共焦顕微鏡を用いて収集した。全ての分析は培養物の刺激ヒストリに対し盲目的に実施した。顕微鏡視野は複数の別個の過程を備えた滑面体および一般に健康的な形態を示す1〜3のニューロンを有した。1つのニューロンあたり3またはそれ以上の樹状突起の近位50μmに沿って免疫蛍光を分析した。免疫反応性斑点は、ニューロンのバックグラウンド染色の2倍の蛍光強度を有する樹状突起に沿った離散点として規定した。培養物毎に5つの細胞を分析し、1条件ごとに3〜6つの培養物を分析した。各実験を用いて別個の対照実験を実施し、スチューデントt検定を使用して統計学的有意性を決定した。データは特に記述がなければ、樹状突起10μmあたりの斑点として表される。
【０１９４】
4)表面発現受容体の生物化学測定
前に記述されているようにビオチン化実験を実施した35。簡単に説明すると、2週齢の高密度培養海馬ニューロンを対照媒質または50μM DHPGのいずれかで5分間処理し、37℃で1時間インキュベートしエンドサイトーシスを引き起こした。姉妹培養物を氷上に置きエンドサイトーシスを中止させ、124mM NaCl、5mM KCl、1.25mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、0.8mM MgCl2、1.8mM CaCl2、10mM デキストロースを含み、95％O2、5％CO2で飽和させた氷冷人工脳脊髄液（ACFS）で2度洗浄した。その後、培養物を、1mg/mlのスルホ-NHS-LC-ビオチン（Pierce Chemical Company、イリノイ州ロックフォード）を含むACFSを用いて30分間氷上でインキュベートした。培養物をTBS中で洗浄し、ビオチン反応を停止させた。培養物を300μlの調整RIPA緩衝液(1％ Triton X-100、0.1％ SDS、0.5％ デオキシコール酸、50mM NaPO4、150mM NaCl、2mM EDTA、50mM NaF、10mM ピロリン酸ナトリウム、1mM オルトバナジウム酸ナトリウム、1mM PMSF、および1mg/ml ロイペプチン)中に溶解した。ホモジネートを14,000×gで15分間、4℃で遠心分離した。上清の15μl(5％)を取り出して総GluR1またはNR1を測定した；残りの上清の200μl(66.67％)を100μlの50％Neutravidin寒天(Pierce Chemical Company)を用いて3時間4℃でインキュベートし、RIPA緩衝液で3度洗浄し、結合蛋白質を40μlのSDS試料緩衝液中に再懸濁させ、沸騰させた。抗GluR1 C末端(1:1000、Upstate Biotechnology、ニューヨーク州レークプラシッド)および抗NR1 N末端抗体(1:1000、Chemicon)を用いて総およびビオチン化（表面）蛋白質の両方について定量ウエスタンブロットを実施した。オートラジオグラフィーフィルム（Amersham Hyperfilm ECL）上に取り込んだ増強化学ルミネセンス(ECL、Amersham、ニュージャージ州ピスカタウェイ)により免疫反応性バンドを視覚化した。DeskScan II ソフトウエア（Hewlett Packard）を備えたScanJet IIcx（Hewlett Packard、カルフォルニア州パロアルト）上でオートラジオグラフのデンシトメトリ走査により作成したデジタル画像をNIH Image1.60ソフトウエアを用いて定量化した。表面/総比率を各培養物に対して計算し、両側t検定を用いて処理グループを比較した。対照実験により、細胞内蛋白質アクチンはこのアッセイ法ではビオチン化されなかったことが確認された。表示目的で、DHPGの対照値に対する比率としてデータを表した。
【０１９５】
5)mEPSC記録と解析
室温の培養した海馬細胞を、140mM NaCl、3.5mM KCl、10mM HEPES、20mM ブドウ糖、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2、0.05mM ピクロトキシン、0.001mM TTXからなり、pHをNaOHで7.4に調整した媒質中に1ml/分で注いだ。pHを7.3にオスモル濃度を〜300mMに調整した116mM Kグルコン酸、6mM KCl、20mM HEPES、0.5mM EGTA、2mM NaCl、4mM Mg-ATP、0.3mM Na-GTP、10mM リン酸クレアチンナトリウムでパッチ電極(4〜5MΩ)を満たした。細胞を-60mV（細胞の静止膜電位近傍）で電圧固定し、Axopatch １D増幅器を用いてmEPSCを増幅した。記録を2kHzのフィルタにかけ、10kHzでデジタル化し、Experimenter's Workbench(DataWave Systems、コロラド州ボールダー)を用いてコンピュータ上で、およびビデオテープに保存した。直列抵抗および入力抵抗を実験を通してモニタし、これらのパラメータにおいて安定な(＜15％変化)細胞のみをこの分析に含めた。平均入力抵抗は〜600MΩであり、平均直列抵抗は〜15MΩであった。検出しきい値をノイズ値の少なくとも2つの標準偏差よりも大きな値に設定した自動検出プログラム(MiniAnalysis、Synaptosoft、ジョージア州ディケーター)を用いてイベントをオフラインで検出した。検出しきい値は各実験期間中一定なままであった。単調な上昇時間および対数的な崩壊のあるイベントのみを分析に含めた。インターイベント間隔およびmEPSC振幅を10分ベースライン期間および、50μM DHPGを5分間適用した後15分および60分での10分のウインドウにおいて比較した。mEPSCパラメータが正規分布していたため、Wilcoxon有符号ランク試験を用いて統計を実施し、p＜0.05で有意性を付した。
【０１９６】
6)海馬切片生理学
前に記述されているように、P21〜30ロング・エバンズラット(Charles River、マサチューセッツ州ケンブリッジ)から海馬切片を調製した13,14。124mM NaCl、5mM KCl、1.25mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、1mM MgCl2、2mM CaCl2、10mMデキストロースを含み、95％ O2、5％ CO2で飽和した人工脳脊髄液(ACSF)中、室温で1〜2時間、切片を回復させた。記録のために、切片を沈水記録チャンバ内に置き、2ml/分の速度で30℃ ACSFを灌流させた。
【０１９７】
視覚皮質に対し前に記述されているように、シナプス誘発されたNMDAR媒介EPSCをCA1領域から記録した20。一次先端樹状突起の近位部分付近で、1mM NMDA(ACSF中で作製)をピコスプリッツ(picospritzing)し、3.5〜12.5ms適用し、NMDA誘発電流を調べた。NMDA誘発電流は2分毎に1度誘発された。刺激強度またはピコスプリッツパルス持続期間/圧力を、50pAまたはそれ以上の振幅の内向き電流が誘発されるように調整した。
【０１９８】
f.参考文献
2005500260.tif 000033
2005500260.tif 000034
2005500260.tif 000035
【０１９９】
等価物
当業者であれば、本明細書で説明した発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識し、または通常の実験を用いて確認することができると思われる。そのような等価物は添付の特許請求の範囲に含まれると考えられる。
【０２００】
上記特許、出版物および他の参考文献はすべて、参照として全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】(RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン(DHPG)により誘発される長期抑圧(LTD)の特性。Ａ：電場電位(FP)勾配値に対するDHPG適用(5分；下向きの矢印で示す)の効果の用量依存性(10μM DHPG；n=5；50 μM；n=11；100μM DHPG;n=4)。挿入図：単離したCA1海馬切片内の刺激電極(S)および細胞外記録電極(R)の位置を示した図である。50μM DHPG処理した切片から、グラフ上の数字で示した時間に求めた代表的な電場電位(2分平均)。校正：0.5mV、5ms。Ｂ：DHPG-LTDは刺激に依存しない。挿入図：2つの独立した入力を交互に刺激した刺激電極(S1およびS2)の配置。1経路への刺激(オフ経路；○)はDHPG適用直前に切られ、DHPGが洗い流された後30分に再開され、もう一方(オン経路；●)の入力は実験期間中、ベースライン頻度(0.067Hz)で刺激された。オン経路およびオフ経路の両方で同様の大きさの抑圧が観察された(n=4)。Ｃ：DHPG-LTDは飽和可能である。DHPGの2つの適用はLTDを飽和させるのに十分である。第3のDHPG適用により更なる抑圧は誘発されなかった(n=8)。Ｄ：DHPG(50μM；5分)適用により、平均興奮性シナプス後電位（EPSP）勾配値(n=6)の持続抑圧が誘発される。グラフの数字で示される時間に、実験から代表的なEPSP波形(2分平均)が求められる。校正：5mV、10ms。Ｅ：DHPG(50μM；5分)適用では興奮性シナプス後電流(EPSC)振幅が減少する。細胞は-70mVで電圧固定した。記録モードはバーで示されるようにDHPG適用中、および適用5分後に、電圧固定から電流(I)固定に切り換えられた。代表的なEPSC(2分平均)を、グラフ上の数字で示される時間に実験から求めた。校正：125pA、25ms。
【図２】DHPG-LTDは、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)依存性LTDではなく、mGluR5を必要とする。Ａ：DHPG-LTDはNMDARに依存しない。D-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸中での切片の前インキュベーション(AP5；50μM；●;n=5)はインターリーブした対照切片(○；n=4)と比較してDHPG-LTDの大きさに影響しない。Ｂ：DHPG-LTDはmGluR5を必要とする。ホモ接合体mGluR5ノックアウトマウス(-/-；○；n=8)からの切片へDHPGを適用してもLTDを誘発しない。野生型マウスからの切片（wt;●；n=9）に比べ、ヘテロ接合体(+/-；黒四角；n=6)では中間LTDが観察される。Ｃ：低頻度シナプス刺激(LFS)により誘発されるLTDはmGluR5を必要としない。LFSは野生型マウス（wt;●；n=6）に比べ、両方のホモ接合体ノックアウトマウス(-/-；○；n=6)において同様の大きさのLTDを誘発する。
【図３】DHPG-LTDは、NMDAR依存性LTDではなく、PP-LFSにより誘発されるmGluR依存性LTDにより閉塞される。Ａ：LFSの繰り返しエピソードが送達され、NMDAR依存性LTDが飽和された。DHPG(下向き矢印)がその後切片に適用された。Ｂ：DHPG前ベースラインに対する繰り込みFP勾配値(n=8)。Ｃ：PP-LESの繰り返しエピソードが送達され、mGluR依存性LTDが飽和された。DHPG(下向き矢印)がその後切片に適用された。全体の実験を50μM D-AP5中で実施し、NMDAR依存性LTDの誘発を阻止した。Ｄ：DHPG前ベースラインに対する繰り込みFP勾配値(n=5)。
【図４】mGluR刺激はGluR1斑点のエンドサイトーシスを誘発する。(a) 内在化させたGluR1に対する酸ストリップ免疫細胞化学を介して標識されたmGluR刺激後15分のニューロンおよび対照ニューロンの代表的な画像。スケールバー、10μm。(b) 数量化により、15分という早さで、内在化された斑点の密度が2.5倍増加し、少なくとも60分続くことが明らかになった。(c) GluR1のmGluR1により刺激されるエンドサイトーシスはグループI mGluRアンタゴニスト、LY344545によりブロックされる。(d) シクロヘキシミド(60μM)処理による蛋白質合成の阻害はmGluRにより刺激されるエンドサイトーシスを減少させる。
【図５】mGluR刺激はシナプス表面AMPARの損失を誘発する。(a,b) シナプスマーカーシナプシンIに対する抗体(a)およびGluR2のN末端に対する抗体(b)で染色された対照ニューロンの代表的な画像である。スケールバー、10μm。(c,d) より高倍率の同じ細胞の画像であり、(a)シナプシン(c)およびCluR2(d)の共局在化を示す。スケールバー、5μm。(e,f) 同程度の共局在化がシナプトフィシンに対する抗体(e)およびGluR1(f)のN末端に対する抗体を用いて観察された。(g,h) DHPG後1時間ではシナプシン斑点密度の変化は検出されなかったが(g)、シナプスGluR2斑点の数は大きく減少した(h)。スケールバー、10μm。(i) 数量化により、シナプス斑点の80.6±9.0％が対照ニューロン上でGluR2と共に共局在化することが明らかになった。DHPG後1時間で、シナプスの40.8±11％のみがGluR2に対し表面染色された。(j,k) GluR1陽性シナプスはDHPG処理により減少し、この変化の安定な発現はシクロヘキシミドにより阻害される。シナプトフィシン陽性シナプスの29.3±5.4％のみがDHPG後15分にGluR1斑点を発現し、これに比べ、対照培養物では72.5±4.7％であった。このDHPG効果はシクロヘキシミドに影響されなかった(j)。対照的に、シクロヘキシミドはDHPG後60分に測定したGluR1の損失を著しく阻害した(k)。
【図６】mGluR刺激は表面GluR1の損失を誘発する。(a) 対照培養物からの総およびビオチン化した表面GluR1の試料(レーン1および2)およびDHPG処理後60分の総およびビオチン化した表面GluR1の試料(レーン3および4)を示す代表的なブロットである。(b) 濃度定量により、DHPG後60分で、表面GluR1レベルが対照レベルの56.8±4.0％まで減少することが明らかになった。
【図７】DHPGにより誘発されるシナプス抑圧後、AMPARにより媒介されるmEPSC頻度の減少が起こる。(a) DHPG適用前およびDHPG適用後1時間の細胞からの代表的なmEPSC記録。(b) DHPG適用前およびDHPG適用後45分から開始した期間における、(a)に示した細胞に対するインターイベント間隔および振幅に対する累積確率ヒストグラム。(c) DHPG適用前、DHPG適用後15分および1時間での群平均mEPSC振幅およびインターイベント間隔。
【図８】mGluR刺激はシナプス表面NMDARの損失を誘発する。（a,b）シナプスマーカーシナプシンIに対する抗体(a)およびNR1のN末端に対する抗体(b)で染色された対照ニューロンの代表的な画像である。スケールバー、10μm。(c,d) より高倍率の同じ細胞の画像であり、(a)シナプシン(c)およびNR1(d)の共局在化を示す。スケールバー、5μm。(e,f) DHPG後1時間ではシナプシン斑点密度の変化は検出されなかったが(e)、シナプスNR1斑点の数は大きく減少した(f)。スケールバー、10μm。(g) 数量化により、DHPGにより処理開始後60分でNR1に対し陽性のシナプスの割合(％)が減少し、この効果はシクロヘキシミドにより阻害されることが明らかになった。(h)対照における総およびビオチン化した表面NR1の試料(レーン1および2)およびDHPG処理後60分の総およびビオチン化した表面NR1の試料(レーン3および4；図3aのブロットのリプローブ)を示す代表的なブロットである。(i)DHPG処理後60分で、表面NR1レベルが対照レベルの32.3±8.2％まで減少した。シクロヘキシミドにより表面NMDARの損失が対照レベルの79.1±14.5％まで減少した。
【図９】DHPG適用は、シナプスで引き起こされるNMDARにより媒介されるEPSCおよびNMDAにより引き起こされる電流を減衰させる。(a) シナプスで引き起こされるNMDAR EPSCにおけるDHPGにより誘発される抑圧。(b) 100μMのDHPG適用前後のNMDAにより引き起こされる電流振幅の2分平均。(c) 対照のNMDAにより引き起こされる電流の2分平均。(a)および(b)において、矢印は5分のDHPG適用の開始を示し、Rsは直列抵抗を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005500260.tif 000128
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