(57)【要約】  本発明は、肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または前駆細胞（ＨＰＣ）の移植に関する。より詳細には、本発明は、肝臓へのＨＳＣ／ＨＰＣのホーミングを向上させるためのケモカイン、好ましくはＳＤＦ−１の使用に関する。
2005511661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）のホーミングを向上させるための医薬の製造における、１つ以上のケモカインおよび／または該ケモカインを誘導するＤＮＡ傷害剤の使用。
【請求項２】
前記ケモカインがＣＸＣケモカインファミリーに属する請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記ケモカインが、ＳＤＦ−１またはそのアナログ、融合タンパク質、機能的誘導体、改変体もしくはフラグメントである請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記傷害剤がシクロホスファミドである請求項１、２または３記載の使用。
【請求項５】
前記傷害剤が５−フルオロアシルである請求項１、２または３記載の使用。
【請求項６】
前記傷害剤が照射である請求項１、２または３記載の使用。
【請求項７】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが胚起源である請求項１、２、３、４、５または６記載の使用。
【請求項８】
ＨＳＣ／ＨＰＣが新生児起源である請求項１、２、３、４、５または６記載の使用。
【請求項９】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが臍帯血由来である請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが成体起源である請求項１、２、３、４、５または６記載の使用。
【請求項１１】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが骨髄由来である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが動員末梢血由来である請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが同種細胞である請求項７、８、９、１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが同系細胞である請求項７、８、９、１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１５】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが自系細胞である請求項８、９、１０、１１または１２記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、ＩＬ−３、ＳＬＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦから選択される動員剤をさらに含む請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記動員剤がＧ−ＣＳＦを含む請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣがＣＤ３４＋細胞である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の使用。
【請求項１９】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣがＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗである請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが治療剤を産生する遺伝的に改変された細胞である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９記載の使用。
【請求項２１】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが成長因子で処理される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０記載の使用。
【請求項２２】
前記因子がＩＬ−６である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記因子がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒである請求項２１記載の使用。
【請求項２４】
前記因子がｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラタンパク質である請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
前記因子がＳＦＬである請求項２１記載の使用。
【請求項２６】
前記ＨＳＣ／ＨＰＣが支持細胞で処理される請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５記載の使用。
【請求項２７】
前記医薬が、前記ＨＳＣ／ＨＰＣとは異なる細胞型をさらに含む請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６記載の使用。
【請求項２８】
前記細胞が肝臓型細胞である請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記患者が肝臓疾患に罹患している請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８記載の使用。
【請求項３０】
前記患者が肝臓標的化遺伝子治療が必要である請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９記載の使用。
【請求項３１】
前記患者がゴーシェ病に罹患している請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記患者が糖原病に罹患している請求項３０記載の使用。
【請求項３３】
患者の肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）のホーミングを増大させる方法であって、該細胞を投与および／または動員する工程、ならびに患者を１つ以上のケモカインで処置する工程を含む方法。
【請求項３４】
前記ケモカインがＣＸＣケモカインファミリーに属する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記ケモカインが、ＳＤＦ−１またはそのアナログ、融合タンパク質、改変体、機能的誘導体もしくはフラグメントである請求３３または３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ケモカインが患者の肝臓に注入される請求項３３、３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
前記ケモカインがＤＮＡ傷害剤での処理によって誘導される請求項３３、３４、３５または３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ケモカインが照射によって誘導される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ケモカインがシクロホスファミドによって誘導される請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記ケモカインが５−フルオロアシルによって誘導される請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが胚起源である請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０記載の方法。
【請求項４２】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが新生児起源である請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０記載の方法。
【請求項４３】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣがヒト臍帯血由来である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが成人起源である請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０記載の方法。
【請求項４５】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが骨髄由来である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが動員末梢血由来である請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが同種細胞である請求項４１、４２、４３、４４、４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが同系細胞である請求項４１、４２、４３、４４、４５または４６記載の方法。
【請求項４９】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが自系細胞である請求項４２、４３、４４、４５または４６記載の方法。
【請求項５０】
ＩＬ−３、ＳＬＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦから選択される動員剤の投与をさらに含む請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記動員剤がＧ−ＣＳＦを含む請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記動員剤がサイトカイン処置の前に投与される請求項５０または５１記載の方法。
【請求項５３】
前記動員されるＨＳＣ／ＨＰＣが患者から採集され、そして該患者に投与される請求項５０、５１または５２記載の方法。
【請求項５４】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣがＣＤ３４＋細胞である請求項４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３記載の方法。
【請求項５５】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣがＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞である請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが治療剤を産生する遺伝的に改変された細胞である請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５記載の方法。
【請求項５７】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが、移植される前に成長因子で処理される請求項４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５または５６記載の方法。
【請求項５８】
前記因子がＩＬ−６である請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記因子がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒである請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記因子がｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラタンパク質である請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
前記因子がＳＦＬである請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
前記投与されるＨＳＣ／ＨＰＣが、移植前に支持細胞で処理される請求項４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１記載の方法。
【請求項６３】
異なる型の細胞の投与をさらに含む請求項４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６または５７記載の方法。
【請求項６４】
前記異なる型の細胞が肝臓細胞である請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記動員されるＨＳＣ／ＨＰＣを採集せずに、患者の肝臓に直接移動させる請求項４９、５０、５１または５２記載の方法。
【請求項６６】
前記患者が肝臓疾患に罹患している請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が肝臓標的化遺伝子治療が必要である請求項３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５または６６記載の方法。
【請求項６８】
前記患者がゴーシェ病に罹患している請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記患者が糖原病に罹患している請求項６７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または前駆細胞（ＨＰＣ）の肝臓への移植に関する。より詳細には、本発明は、ＨＳＣ／ＨＰＣの肝臓へのホーミングを向上させるためのケモカイン、好ましくはＳＤＦ−１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生および分裂して、より多くの幹細胞および分化細胞を誘導することができる。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、致死量の照射を受けた者を造血不全から助けるのに十分な造血活性を導く能力を有する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。
【０００３】
骨髄は、間葉細胞および造血細胞を含む。間葉幹細胞は、骨髄の間質細胞を含め、脂質細胞、軟骨細胞および骨細胞系統を導く（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。造血幹細胞は、リンパ、骨髄および赤血球系統を導くことが見出されている。
【０００４】
マウスにおいて、ＨＳＣは、全骨髄の０．０１％というごく少量の割合を示し、そして以下のマーカーの組み合わせを用いて単離されている：Ｔｈｙlow  Ｌｉｎneg  Ｓｃａｌ+  ｃｋｉｔhigh（ＫＴＬＳ）。ヒトにおいて、ＣＤ３４＋  Ｔｈｙ−１＋  Ｌｉｎ−の造血幹細胞は、マウスＫＴＬＳ造血幹細胞のヒト等価物である（Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。哺乳動物造血細胞は、米国特許第５，０８７，５７０号明細書に、そしてヒト造血幹細胞は米国特許第５，０６１，６２０号明細書に記載されている。
【０００５】
循環造血前駆細胞（ＨＰＣまたはＨＳＣ）を導く機構は、臨床的に意義がある。なぜなら、幹細胞移植の成功は、受容者の骨髄中の移植細胞の効果的な標的化に依存するからである（Ｍａｚｏ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ａｄｒｉａｎ  １９９９）。骨髄移植が、任意のほかの器官の移植の場合のように侵襲的な外科手術は必要なく、単純な静脈内注入によって実施できるのは、移植された細胞のこのホーミングによるものである。ＨＰＣのホーミングは、循環ＨＰＣを認識、結合させて、骨髄内皮細胞をこえて移動させ、そして、骨髄の独特の造血促進微環境においてＨＰＣの蓄積を生じるという一連の分子相互作用として定義できる。前駆細胞のホーミングは、多段階現象として考えられ得る。骨髄に到着したＨＰＣは、まず骨髄内皮の管腔表面と相互作用するに違いない。この相互作用は、ＨＰＣが骨髄微小血管に侵入した後、数秒以内に起こり、そして、付着細胞が、血流により影響されるせん断力に抵抗できるのに十分な機械強度を提供するに違いない。ついで、付着性ＨＰＣは内皮層を通過して、造血区画に侵入するに違いない。管外遊出後、ＨＰＣは、分化した間質細胞と遭遇する。ここで、この間質細胞との近位が、系統特有のＨＰＣ分化、増殖、成熟に加えて、自己再生プロセス、間質誘導サイトカインおよび他の増殖シグナルを含むプロセスによる未成熟プールの維持を支持する。
【０００６】
マウスＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βのｃＤＮＡは、それぞれ８９および９３のアミノ酸のタンパク質をコードする（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ，ｗｗｗ．ｃｏｐｅｗｉｔｈｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｄｅ／ｃｏｐｅ．ｃｇｉ）。これらのアミノ酸配列は、ＳＤＦ−１βのＣ末端にさらに４つアミノ酸が存在することで異なるのみであり、同一である。ＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βの配列は、ヒトにおける対応物と９２パーセントを超えるほどの同一性を有する。ヒトＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βは、単一遺伝子によってコードされ、選択的スプライシングによって生じる。ヒトＳＤＦ−１遺伝子は、染色体１０ｑ１１．１に位置する。その因子のＮ末端９残基に対応するペプチドは、それほど強力ではないがＳＤＦ−１と類似の活性を有することが見出された。ヒトおよびマウスのＳＤＦ−１は、交差反応性であることを見出した。
【０００７】
ＳＤＦ−１遺伝子は、偏在的に発現される（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ）。ＳＤＦ−１は、インビトロで種々のリンパ細胞および骨髄細胞に対して作用し、そしてインビボでは単核細胞に対する非常に強力な化学誘引物質である。さらに、ＳＤＦ−１はまた、リンパ球における細胞内アクチン重合を誘導する。インビトロおよびインビボではＳＤＦ−１は、ＣＤ３４（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ）およびＣＸＣＲ４を発現するヒト造血前駆細胞に化学誘引物質として作用して、雑多な型の前駆細胞、およびより初期の型を導く。走化性反応は、百日咳毒によって阻害される。ＳＤＦに応答するＣＤ３４（＋）細胞の走化性は、インビトロでＩＬ−３によって上昇される。ＳＤＦはまた、これらの細胞の細胞質カルシウムの一過性の向上を誘導することも示されている。
【０００８】
ＳＤＦ−１は、前Ｂ細胞成長刺激因子（ＰＢＳＦ）とも呼ばれ、リンパ球、単球および前駆ＣＤ３４＋細胞の強力な化学誘引物質（ケモカイン）であると報告されている。ＳＤＦ−１は、ＳＤＦ−１の濃度勾配（末梢血では低く、そして骨髄では高い）によって決定される細胞の移動および細胞移動の配向を誘導する走化性因子である（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  １９９８）。ＳＤＦ−１は、骨髄間質細胞によって産生されるので、ＳＤＦ−１勾配は、血液系に対する骨髄微環境間で形成されると仮定された。この勾配は、ＨＰＣを誘引し、骨髄微環境にＨＰＣを保持する。ただし、この勾配が投与または誘導された血液中のエフェクター分子によって崩壊された場合は除く。
【０００９】
ＳＤＦ−１のレセプターであるＣＸＣＲ４は、骨髄細胞、動員された骨髄細胞骨髄細胞臍帯血細胞を含め、多くの細胞型で発現される。ここで、動員された骨髄細胞臍帯血細胞には、多能性の造血前駆細胞である臍帯血ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞の部分母集団が含まれる。移植前の抗ＣＸＣＲ４抗体でのヒトＨＰＣ、ＣＤ３４＋の処理により、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける骨髄移植が減少する（Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９）。
【００１０】
未成熟ヒトＣＤ３４＋細胞および初期のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞（インビトロでは、ＳＤＦ−１の勾配に向かって移動せず、かつインビボのマウス骨髄においてホーミングおよび再集合しない）は、移植の前にサイトカン（たとえば、ＳＬＦおよびＩＬ−６）による短期間１６〜４８時間のインビトロ刺激で機能的再集合細胞になり得る（Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｌａｐｉｄｏｔ  ２００１）。これらのサイトカンは、表層ＣＸＣＲ４発現、ＳＤＦ−１への移動およびインビボホーミングおよび再集合を増大させる。
【００１１】
ＳＤＦ−１はまた、骨髄微環境における内皮細胞へのヒト幹細胞付着という刺激の鍵となる因子であることも報告されている（Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １９９９）。したがって、ＳＤＦ−１は、幹細胞および前駆細胞の化学誘引物質としてだけでなく、骨髄における移植に必要なインテグリン依存性細胞付着および内皮横断移動（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）のメディエーターとしても関与している。
【００１２】
ＨＰＣは、注入されたサイトカイン（たとえば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびスチール因子（ＳＬＦ））に応答して、骨髄から末梢血に移動され得る［Ｓｉｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｄｕｈｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｄｒｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６］。移植手順において、供与者の骨髄から血液へ幹細胞を動員し、血液からそれらを回収する手順が、世界中でだんだん使用されつつあり、侵襲的な外科手術を用いて供与者の骨髄から幹細胞を回収する手順と置き換わりつつある。動員は、照射および化学的療法の処置前に患者から回収および蓄えておいた自身のＨＳＣにより、骨髄に再集合できる（自系移植）。ＨＳＣの回収は、臍帯血および骨髄外科手術からの動員よりも多かった。
【００１３】
肝臓は、大規模な再生が可能な器官である。組織の損失または化学的な損傷は、サイトカイン（たとえば、ＴＮＦ−α）の放出を誘導する。サイトカインは、成長因子とともに肝臓再生の引き金となる（Ｂｌａｕ  ＨＭ  ２００１  Ｃｅｌｌ  １０５：８２９，Ｂｒｙｏｎ  Ｅ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００１，２７：５９０），Ｗｅｂｂｅｒ  ＥＭ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９８  ２８：１２２６に概説）。
【００１４】
現在、肝臓移植は、末期の肝不全に対して利用できるだけの治療法である。しかし、これらの患者の多くが、毎年、適当な組織適合ドナー器官を待ちながら死亡する。
【００１５】
肝臓再生の研究のために、部分的な肝切除術の単純な実験モデルがラットにおいて開発された。これらのモデルにおいて、肝臓質量の２／３を取り除いた。興味深いことに、作業後１週間未満で、残りの葉が大きくなり、損失した肝臓組織を元通りにする（Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。これらの研究は、再生プロセスにより、ほぼ確実に成熟肝細胞を増殖させる結果となることを確立した。後に、細胞治療は、原発性肝細胞（細胞の最も機能的な細胞）を用いるげっ歯類モデルにおいて首尾よく適用されてきた（Ｗｅｇｌａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。たとえば、食物の毒によって引き起こされる肝細胞の損失後の肝臓再生は、損傷に応答する基本的な機構である。肝細胞移植は、肝不全中の代謝を支持するため、および主要な代謝肝疾患において全器官移植を置き換えるために、患者間に全器官移植を橋渡しするのに有用であり得ることが、臨床研究により示唆される（Ｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。しかし、肝細胞の使用の可能性には、同種移植片拒絶の限界、肝細胞の単離後の生存可能性および後で使用するためのこれらの細胞の不充分な低温保存が立ちはだかっている。肝臓幹細胞またはそれらの子孫は、肝臓再生の良好な代替物である。しかし、幹細胞およびそれらの子孫が、肝臓の再生プロセスにも関与しているか、またそれらが持続可能な再生の唯一の供給源であるかどうかは未知である。肝臓幹細胞はいまだ同定されていない。成熟肝細胞が再生できない特定の条件下で、幹細胞および前駆細胞、場合によっては卵細胞は、成人の肝臓において増殖し、最終的には肝細胞に分化することが、今や認められている。肝臓内に、肝細胞および胆管子孫の両方のクローン原性前駆体を見出した研究所もある（Ｇｒｉｓｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。
【００１６】
肝臓幹細胞の前駆体は、別の組織に存在し得ることが提唱されている。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、成熟骨髄が卵細胞および肝細胞の潜在的な供給源であると示唆している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。これらの報告は、前駆細胞の性質を証明するものではなく、それらが肝臓機能を再構成できるかを証明するものでもない。骨髄は異なる起源の細胞の混合集団からなる。前記した、骨髄、ＨＳＣに存在する少なくとも２つの型の幹細胞、ならびに軟骨細胞、骨細胞および脂肪細胞などの種々の細胞型に分化し得る間葉幹細胞が存在する。さらに、骨髄には、内皮、骨格筋および脳の前駆体が含まれることが示唆されている。それらの以前の研究では、ＨＳＣ、間葉幹細胞または骨髄に存在する今のところ未知の前駆細胞が、肝臓移植に寄与するかどうかは認められいない。
【００１７】
肝臓損傷は、オス骨髄を移植されたメスラットで誘導され、肝臓増殖を阻害する薬剤で処理された（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。Ｙ染色体のマーカー、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ酵素、およびＬ２１−６抗原は、骨髄起源の肝細胞を同定するために使用された。再生した肝細胞の割合が、供与者由来の、すなわち骨髄起源の細胞であったことが見出された。
【００１８】
研究は、男性の供与者から骨髄移植を受けている女性の患者において実施された（Ａｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。肝臓におけるＹ染色体の存在は、ＤＮＡ特定プローブを用いてモニターされた。Ｙ陽性細胞が肝臓において見出されたという事実は、これらの細胞は肝外起源であることを示す。肝臓におけるＹ陽性細胞の肝臓の性質は、サイトケラチン８のそれらの免疫発現によって確認された。これらの結果は、成熟ＨＳＣが肝臓において見出され、かつ肝細胞に分化できることを示す。
【００１９】
その著者は、骨髄細胞が、肝臓に存在することが公知である卵細胞に分化でき、生理病理学条件下では、肝臓に存在する２つの型の上皮細胞（小管細胞および肝細胞）に分化できることを示唆する。この概念を支持するために、彼らは、卵細胞が、骨髄肝細胞（たとえば、ＣＤ３４＋）マーカーの代表であるいくつかの表現型形質を有することを示した（Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｎｏｖｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９６，Ｖａｎ  Ｅｙｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９３  ａｎｄ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。
【００２０】
致死の遺伝性肝臓疾患である１型チロシン血症の誘導性動物を用いて、成熟骨髄から高度に精製されたＣＤ４５＋の豊富なＨＳＣが、肝臓および造血の再構成活性を有することを実証している（Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００ｂ）。
【００２１】
肝細胞を誘発するために造血幹細胞を用いる可能性は、Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって概説されている。
【００２２】
国際公開第０１／７１０１６号パンフレット（Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、造血幹細胞から非造血組織を発生する方法を開示する。より詳細には、それはＨＳＣ移植が肝細胞を再生し得ることを開示する。
【００２３】
肝細胞を生じるＨＳＣのこの驚くべき可能性は、肝臓再生のために肝細胞単独の使用よりもかなり有用であり得る。骨髄は容易に得られ得る。そして、生存している血縁のＨＬＡ一致ドナーおよび患者自身の同一のＨＳＣ細胞も用いることが可能である。しかし、ＨＳＣが肝細胞に変換されるのに数週間から数ヵ月かかるので、マウスにおける現在のプロトコルでは実現できない。
【００２４】
したがって、増大した数の患者の処置を可能にする肝臓再生できる実現可能なＨＳＣ細胞ベースの治療方法を提供する必要がある。
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、１つ以上のケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）またはそのアナログ、融合タンパク質、改変体もしくはフラグメントの使用、ならびに／あるいは患者の肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）のホーミングを向上させるための医薬の製造における薬剤（ａｇｅｎｔ）を提供する。詳細には、該ＨＳＣ／ＨＰＣは、同種同系、同系もしくは自系、および／または胚、新生児（たとえば、ヒト臍帯血由来）、および／または成体起源（たとえば、骨髄および／もしくは動員末梢血）であり得る。より詳細には、ＨＳＣ／ＨＰＣは、ＣＤ３４＋細胞について、好ましくはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞について富化され得る。
【００２６】
さらに、本発明のＨＳＣ／ＨＰＣは、治療剤を産生する遺伝的に改変された細胞であり得る。
【００２７】
さらに、本発明のＨＳＣ／ＨＰＣは、成長因子（たとえば、ＳＦＬまたはＩＬ−６、好ましくはＩＬ−６およびそのレセプター、より好ましくはＩＬ−６およびそのレセプターを含むキメラタンパク質）で予め処理され得るか、支持細胞で予め処理され得る。
【００２８】
さらに、本発明の医薬は、動員剤（たとえば、ＩＬ−３、ＳＬＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよび好ましくはＧ−ＣＳＦ）をさらに含み、そして／または前記ＨＳＣ／ＨＰＣ（たとえば、肝細胞）から分化される細胞をさらに含み得る。
【００２９】
一態様において、本発明は、患者の肝臓へのＨＳＣ／ＨＰＣの移動を向上させるための医薬の製造における、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）の使用に関する。より詳細には、肝臓疾患に罹患している患者および／またはゴーシェ病および糖原病などの疾患において肝臓標的化遺伝子治療を必要とする患者のための医薬における使用に関する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、患者の肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）のホーミングを増大させる方法であって、該細胞を投与および／または動員する工程、ならびにケモカイン、好ましくはＳＤＦ−１またはそのアナログ、融合タンパク質、改変体もしくはフラグメントで患者を処置する工程を含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、患者の肝臓への造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または造血前駆細胞（ＨＰＣ）のホーミングを向上および／または指向させるための医薬の製造における、ケモカイン、好ましくはＣＸＣケモカイン、より好ましくはＳＤＦ−１またはそのアナログ、融合タンパク質、改変体もしくはフラグメントの使用に関する。
【００３２】
本発明は、移植されたＨＳＣおよび／または前駆細胞が、肝臓に直接移動すること、およびそのような移動がＳＤＦ−１などのケモカインによって仲介されるという発見に基づいている。
【００３３】
より詳細には、本発明は、ＨＳＣの移動またはホーミングのための実験動物モデルを用いて得られた結果に基づいている。実験動物モデルにおいて、ヒト（供与者）ＨＳＣ（たとえば、骨髄細胞から得られたＨＳＣ、ヒト臍帯血細胞または動員末梢血細胞から得られたＨＳＣ）は、亜致死量の照射を受けた非肥満糖尿病（ｎｏｎ  ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（受容者）に投与される。細胞投与から数時間（たとえば、１６時間）後、特定の器官に到達するヒトＨＳＣがモニターされる（Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。このような実験モデルを用いて、供与者ヒトＨＳＣが受容者の肝臓に直接ホーミングすることが初めて見出された。開示された結果はまた、ヒトＨＳＣが抗ＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１のレセプター）中和抗体で前処理および同時移植された場合、肝臓へのホーミングが顕著に減少されたことを示している。この結果は、肝臓へのヒトＨＳＣのホーミングにはＣＸＣＲ４の活性が必要であることを証明するものである。
【００３４】
照射は骨髄ＳＤＦ−１を増大し、その結果、ＨＳＣの骨髄への移動を増大させることが知られており（Ｐｏｎｏｍａｒｙｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、前記発見はＨＳＣの肝臓への移動におけるＳＤＦ−１活性の関与を示すので、ＨＳＣの肝臓への移動に対する照射の効果が検討された。前記実験モデルを用いて、移植されたヒトＨＳＣの肝臓への移動が測定され、そして非照射のマウスと照射したマウスを比較した。得られた結果は、ヒトＨＳＣの肝臓への移動が、非照射のマウスでは顕著に減少することを示す。非照射のマウスにおける移動のこのような減少の原因の１つが肝臓におけるＳＤＦ−１発現の欠損であるかを調査するために、非照射のマウスにおける肝臓へのヒトＨＳＣの移動を測定し、肝臓にＳＤＦ−１を注入したマウスと非処理マウスとを比較した。得られた結果は、非照射マウスの肝臓へのヒトＨＳＣの移動がＳＤＦ−１投与で顕著に向上することを示す。さらに、非照射マウスにおける幹細胞の抗ＣＸＣＲ４抗体との同時移植は、ＳＤＦ−１処置マウスにおけるホーミングを阻害し、注入されたＳＤＦ−１とそのレセプターであるＣＸＣＲ４との相互作用によって肝臓へのホーミングが特別に誘導されることを実証している。
【００３５】
したがって、これらの発見は、照射の際に、ＳＤＦ−１が肝臓において発現されることならびにその走化性の役割がヒト幹細胞および前駆細胞の肝臓への移動に必要であることを実証するものである。照射に加えて、他のＤＮＡ傷害剤（たとえば、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシル）は、肝臓においてＳＤＦ−１発現を誘導し得る。また、そのようなＤＮＡ傷害剤は、ＳＤＦ−１に加えて、ＨＳＣの肝臓への移動に役割を有する他のケモカインの発現を誘導し得る。
【００３６】
本発明の文脈において、語句「移動」および「ホーミング」は、同意語として用いられる。
【００３７】
化学誘引物質およびケモカインは、正の走化性（たとえば、ＳＤＦ−１）を誘導する走化性因子である。ケモカインは、サイトカインのＳＩＳファミリー、サイトカンのＳＩＧファミリー、サイトカンのＳＣＹファミリー、血小板第４因子スーパーファミリーまたはケモカイン（Ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅｓ）の一員とこれまで呼ばれている炎症前活性化誘導性サイトカンのファミリーである。これらのタンパク質は、おもに異なる細胞型について走化性である（ゆえに、走化性サイトカイン（（ｃｈｅｍｏ）ｔａｃｔｉｃ  ｃｙｔｏ（ｋｉｎｅｓ））から派生した名前である）。ＣＸＣケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）の最初の２つのシステイン残基は、単一のアミノ酸によって分離されている。
【００３８】
インビボアッセイ（たとえば、前記実験モデル）において試験され、そしてＨＳＣの肝臓への移動に正の影響を与えることが見出されたケモカイン（ＳＤＦ−１など）が、本発明にしたがって用いられ得る。たとえば、候補ケモカインは、発現が、照射などのＤＮＡ傷害剤での処理後に肝臓において誘導されるものであり得る。また、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の肝臓への移動を向上するためのケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１、ＩＬ−６およびＳＬＦ）の組み合わせを含む混合物の使用も、本発明にしたがって考慮される。
【００３９】
本発明にしたがって使用される造血ヒト幹細胞および／または前駆細胞は、胚および／または新生児の、たとえば、ヒト臍帯血細胞および／または成熟幹細胞（たとえば、Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１に記載される骨髄、動員末梢血細胞）であり得る。幹細胞および／または前駆細胞の供給源は、同種（たとえば、ＨＬＡ不一致供与体）、好ましくは同系（たとえば、ＨＬＡ一致同胞）、そしてもっとも好ましくは自系（すなわち、患者自身から得たもの）であり得る。
【００４０】
幹細胞および／または前駆細胞は、動員誘導剤（たとえば、Ｇ−ＣＳＦ）で処置した供与者または患者の末梢血から採集および単離できる。この薬剤は、造血器官（たとえば、骨髄）から末梢血へのこのような幹細胞および／または前駆細胞の動員を誘導する。さらに、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）またはケモカインの混合物は、移植されたＨＳＣおよび／または前駆細胞の肝臓への移動を指向するための動員ＨＳＣ／前駆細胞の移植の前に、患者に投与され得る。また、あるいは、ケモカインまたはケモカインの混合物の発現は、ＤＮＡ傷害剤（たとえば、イオン化照射および５−フルオロウラシル）での処置によって患者に誘導され得る。本発明によれば、ケモカインまたはケモカイン混合物は、好ましくは患者の肝臓に投与または誘導される。
【００４１】
動員幹細胞は、ケモカインもしくはケモカインの混合物および／またはケモカイン発現誘導剤の投与の前、間または後に適切な時に注入され得る。自系移植物の特定の場合、患者自身の幹細胞の動員の後、このような細胞は採集も再注入もされ得ないが、動員の前、後または間に、ケモカインの投与またはケモカイン発現誘導剤によって、肝臓への移動が直接誘導され得る。
【００４２】
動員により、骨髄外科手術よりも多く造血幹細胞および前駆細胞が得られることが公知であるので、本発明により使用される幹細胞および／または前駆細胞は、動員によって得られるのが好ましい。
【００４３】
臍帯血細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＪ）の臍帯血バンクから購入できる。また、その細胞が誕生後低温保存される場合は、自身の臍帯血細胞が使用され得る。
【００４４】
造血幹細胞および前駆細胞は、標準的な技術によって、造血供給源中の成熟血液細胞とそれらの細胞の混合物から単離される（Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。たとえば、血液試料は、Ｍｇ+2／Ｃａ+2を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１：１で希釈される。低密度単核細胞が、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ．Ｓｗｅｄｅｎ）での標準的な分離後に採集され、そしてＰＢＳで洗浄される。ＣＤ３４+細胞は、製造業者の指示にしたがって、ＭＡＣＳ細胞単離キットおよびＭｉｄｉＭａｃｓカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製でき、９５％よりも高い純度が得られる。単離されたＣＤ３４+細胞は、ホーミング実験直後、または１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補充したＲＰＭＩ、もしくは無血清で幹細胞因子（ＳＣＦ）（５０ｎｇ／ｍＬ）で補充したＲＰＭＩで一晩インキュベーションした後のいずれかに使用できる。種々の技術を使用して、専用系統の細胞をまず除去することによって細胞が分離できる。特定の系統のマーカーを認識する抗体は、必要な細胞の分離に使用できる（たとえば、ＣＸＣＲ４レセプターに対する抗体）。また、富化ＣＤ３４+細胞は、ヒト特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗ＣＤ３４  ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および抗ＣＤ３８ＰＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）でさらに標識され、そして、ＦＡＣＳｔａｒ+（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によってＣＤ３４+ＣＤ３８-/low精製部分母集団またはＣＤ３４+ＣＤ３８+精製部分母集団に分類され、９７％〜９９％の純度が得られ得る。
【００４５】
異なる効果の種々の技術を使用して、細胞の富化調製物が得られ得る。このような細胞の富化調製物は、最大で１０％、通常は５％以下、好ましくは約１％以下であって、マーカーを有しない全細胞の富化調製物が、保持される細胞富化集団となるはずである。
【００４６】
ＨＳＣ／前駆細胞系統の分離についての手順は、物理的な分離（たとえば、密度勾配遠心分離、細胞表面（レクチンおよび抗体アフィニティ）、磁気分離など）を含む。良好な分離を提供する好ましい技術は、フローサイトメトリーである。
【００４７】
細胞表層マーカーの存在または非存在を測定する方法は、当該分野で周知である（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．Ｒｏｉｔｔ，Ｄｅｌｖｅｓ，Ｖｏｌ−１  １３４）。代表的には、マーカーに特異的な標識化抗体を使用して、細胞集団が同定される。ヒト細胞表層マーカーであるＴｈｙ−１およびＣＤ３４に特異的な試薬は当該分野で公知であり、市販されている。
【００４８】
末梢血に幹細胞を動員する方法は当該分野で公知であり、一般的に、化学治療薬（たとえば、シクロホスファミド（ＣＹ）およびサイトカイン（たとえば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ  ＩＬ３など））での処置を含む。
【００４９】
単離された造血幹細胞は、本発明にしたがってホーミングコンピテント造血幹細胞の生存および増殖を支持する成長因子とともに移植される前に、エキソビボで処理できる。さらに、支持細胞（たとえば、間質細胞またはフィーダ層細胞）とともに移植される前に、ＨＳＣは共培養される。
【００５０】
本発明による造血幹細胞／前駆細胞は、異なる型（たとえば、肝臓細胞）由来の細胞と組み合わせて使用できる。
【００５１】
一般的に、改変ＨＳＣ産生治療剤は、本発明の方法により使用され得る。ＨＳＣおよび／または前駆体への遺伝子導入は、たとえば、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０００およびＬｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２に記載される治療剤をコードするアデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノレトロウイルスキメラの導入によって行われ得る。このような遺伝子改変ＨＳＣは、肝臓標的化遺伝子治療が所望される疾患に本発明にしたがって使用され得る。たとえば、リソソーム酵素βグルコセレブロシダーゼを産生する遺伝子改変ＨＳＣは、ゴーシェ病の処置に、また、グルコース−６−ホスファターゼを産生する遺伝子改変ＨＳＣは糖原病における処置に、本発明にしたがい使用できる。
【００５２】
本発明によれば、移植または動員された内因性ＨＳＣの肝臓へのホーミングは、患者の肝臓にヒトＳＤＦ−１および／または他のケモカイン、好ましくはＣＸＣファミリーのケモカインを注入することによって達成され得る。ＤＮＡ傷害剤（たとえば、イオン化照射、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシル）は、ＳＤＦ−１の増大の原因であるので（Ｐｏｎｏｍａｒｙｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、そのような薬剤は、ＳＤＦ−１またはケモカイン処置に加えて、あるいはＳＤＦ−１またはケモカイン処置の代替物として使用できる。好ましくは、ＳＤＦ−１発現誘導剤は、肝臓に直接投与される。また、肝臓内のＳＤＦ−１濃度を上昇させるために、患者の肝臓領域を、細胞移植の前、後または間に照射することも可能である。
【００５３】
肝臓造血幹細胞は、Ｌａｇａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）およびＡｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に実証されるように肝細胞にいったん分化すると、肝臓を再集合し得る。造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または前駆細胞の肝臓へのホーミングは、肝臓再集合の開始の第１工程であるので、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の肝臓への効果的なホーミングまたは移動は、肝臓再集合の成功に重要である。したがって、本発明によるＨＳＣおよび／または前駆細胞、好ましくはＣＤ３４+富化集合、より好ましくは初期のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞の、肝臓への移動の指向および肝臓再集合は、肝臓移植の代替物を提供するものである。
【００５４】
本発明によるＨＳＣ移植は、肝不全中の代謝の支持を提供するため、および代謝肝疾患において全器官移植を置き換えるために、全器官移植を待っている患者に橋渡しするのに有用であり得る。
【００５５】
最近の刊行物は、成熟骨髄が卵細胞および肝細胞の潜在的な供給源であることを示唆している。肝細胞を生じるＨＳＣのこの可能性は、肝臓再生のための肝細胞単独の使用よりもかなり利点を有し得る。たとえば、骨髄は容易に得られることができ、生存している血縁のＨＬＡ一致供与体および患者自身の同一のＨＳＣ細胞でも用いることが可能である。肝臓肝細胞を生じるＨＳＣの能力は、マウスにおいて現在利用可能なプロトコルとともに文献において報告されているが、ＨＳＣの肝細胞への変換には、数週間から数ヵ月かかる。注入されたＨＳＣ細胞のほとんどが骨髄に達し、ほんの少ししか肝臓に達しない場合、骨髄中の細胞は移植されており、骨髄での移植した後にのみ肝臓に達し得る。したがって、本発明に記載の方法でＨＳＣのホーミングを肝臓へ指向する能力は、この変換の時にかなり減少し、このアプローチを実行可能にさせ得る。
【００５６】
本発明によるホーミングは、肝臓におけるＳＤＦ−１の濃度を上昇させることによって、および／またはＨＳＣ／前駆細胞の膜のＣＸＣＲ４レセプターを増大させる処置によって達成できる。ＨＳＣ細胞におけるＣＸＣＲ４レセプターの増大は、発現を上昇させることで知られるサイトカインとともに細胞を予めインキュベーションすることによって、またはＣＸＣＲ４の細胞表面への曝露（たとえば、「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ」タンパク質または国際公開第００６７０４号パンフレットに記載のとおり、別々に加えられた融合していないＩＬ−６およびｓＩＬ−６Ｒ）によってなされ得る。「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ」（「ＩＬ６ＲＩＬ６」またはＩＬ−６キメラとの呼ばれる）は、天然に存在する可溶性ＩＬ−６レセプターδ−Ｖａｌの全コード配列を、天然に存在する成熟ＩＬ−６の全配列（これらの配列はともにヒト起源である）に融合することで得られる組換え糖タンパク質である。ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、任意の適切な真核細胞（たとえば、酵母細胞、昆虫細胞など）において産生され得る。好ましくは哺乳動物細胞、もっとも好ましくは国際公開第９９０２５５２号パンフレットに記載の遺伝子組換えＣＨＯ細胞において産生される。ヒト起源のタンパク質が好ましいが、本明細書に記載される生物学的活性を保持していれば、任意のほかの起源の類似の融合タンパク質が本発明にしたがって使用され得ることは、当業者に理解されるだろう。
【００５７】
プラスチック表面上での末梢血ＣＤ３４＋細胞のインキュベーション（約１６時間）により、非常に高い割合のＣＸＣＲ４＋細胞と非常に高いレベルのＣＸＣＲ４発現を生じることが報告されている（Ｌａｔａｉｌｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。あるいは、ＨＳＣは、ＣＸＣＲ４遺伝子およびそのアナログをコードする発現ベクターを導入することによって、ＣＸＣＲ４およびそのアナログを安定的または一時的に過剰発現させることができる。アナログは、以下のとおり、ＳＤＦ−１のアナログと同じように定義および調製される。また、本発明によって使用されるＣＸＣＲ４で富化されたＨＳＣの集団は、国際公開第００６７０４号パンフレットに記載のとおり、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって単離できる。
【００５８】
ＣＸＣＲ４の内因性産生を誘導および／または向上させるベクターの使用もまた、本発明にしたがって考慮される。ベクターは、ＣＸＣＲ４を発現するのに所望の細胞において機能的な調節配列を含み得る。このような調節配列は、たとえば、プロモーターまたはエンハンサーであり得る。ついで、調節配列は、相同組換えによってゲノムの正しい遺伝子座に導入され、遺伝子と調節配列とが作動可能に連結される。その遺伝子の発現には、誘導または促進されることが必要である。この過剰発現は、安定的または一時的であり得る。この技術は、通常「内因性遺伝子活性化（ＥＧＡ）」といわれ、たとえば、国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【００５９】
本発明は、ＳＤＦ−１のアナログに関する。このアナログは、ＳＤＦ−１の天然に存在する配列のみを本質的に有するＳＤＦ−１と本質的に同じ生物学的活性を保持する。そのような「アナログ」は、ＳＤＦ−１タンパク質において約３０個までのアミノ酸残基が欠失、付加または他のアミノ酸で置換されていて、それによりこの種の改変が、タンパク質それ自体に関して、タンパク質アナログの生物学的活性を実質的に変化しないようなものであればよい。
【００６０】
このようなアナログは、公知の合成法によりおよび／または部位特異的変異技術により、またはそれに適した任意の他の公知技術により調製される。
【００６１】
そのようなアナログはいずれも、好ましくは元のＳＤＦ−１のアミノ酸配列と充分に重複するアミノ酸配列を有し、たとえば、元のＳＤＦ−１と実質的に同じ活性を有する。したがって、以下の実施例に示す生物学的活性試験に所定のアナログを供することを含む慣用的な実験手段によって、所定のアナログが元のＳＤＦ−１タンパク質と同じ活性を実質的に有しているかを決定できる。
【００６２】
本発明にしたがい使用され得るＳＤＦ−１タンパク質のアナログまたはそれをコードする核酸は、過度な実験をしなくても本明細書に示された教示および指針に基づいて当業者によって慣用的に得られ得る置換ペプチドまたは置換ポリヌクレオチドと実質的に一致する配列の有限集合を含む。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８；およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。ヌクレオチド配列置換（たとえば、コドン選択）の提示については、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８７−１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｙ，１９８９を参照のこと。
【００６３】
本発明に基づくアナログの好ましい変更は、「保存的」置換として知られるものである。天然に存在するＳＤＦ−１配列を本質的に有するキメラタンパク質におけるアミノ酸の保存的アミノ酸置換は、十分に同じ物理化学的性質を有する群内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間の置換は、分子の生物学的機能を保存するものである（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１８５，ｐｐ．８６２−８６４（１９７４））。また、アミノ酸の挿入および欠失が、前記配列の機能を変更することなく、とくに、挿入または欠失が、わずかなアミノ酸（たとえば、３０以下および好ましくは１０以下）のみに生じるように、また機能的な構造に重要であるアミノ酸（たとえば、システイン残基）が除去または置換しないように、前記配列においてなされ得ることは明らかである。Ａｎｆｉｎｓｅｎ，「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｇｏｖｅｒｎ  Ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈａｉｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１８１，ｐｐ．２２３−２３０（１９７３）。このような欠失および／または挿入によって産生されるアナログは、本発明の範囲内である。
【００６４】
好ましい同義アミノ酸の群は、表Ｉに記載のとおりである。より好ましい同義アミノ酸の群は、表ＩＩに記載のとおりである。そしてもっとも好ましい同義アミノ酸の群は、表ＩＩＩに記載のとおりである。
【００６５】
【表１】
2005511661.tif 000003
【００６６】
【表２】
2005511661.tif 000004
【００６７】
【表３】
2005511661.tif 000005
【００６８】
本発明に使用するためのタンパク質のアナログを得るために使用され得る、タンパク質でのアミノ酸置換の製造例は、Ｍａｒｋらの米国特許ＲＥ第３３，６５３号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；Ｋｏｔｈｓらの米国特許第５，１１６，９４３号明細書、Ｎａｍｅｎらの米国特許第４，９６５，１９５号明細書、Ｃｈｏｎｇらの米国特許第４，８７９，１１１号明細書、Ｌｅｅらの米国特許第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された任意の公知の方法工程；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ）に示されたリジン置換タンパク質などがあげられる。
【００６９】
本発明のもう１つの好ましい実施態様では、本発明に使用するためのＳＤＦ−１タンパク質のアナログはいずれも、前記本発明のＳＤＦ−１タンパク質のアミノ酸配列に本質的に一致するアミノ酸配列を有する。用語「本質的に一致する」とは、キメラタンパク質の基礎的な特徴に影響しない、特にＳＤＦ−１が関与するその能力の範囲内で、元のキメラタンパク質の配列に比較的重要でない変化を有するアナログを包含することを意味する。通常「本質的に一致する」との用語内に入るとみなされる変化の種類は、本発明のＳＤＦ−１タンパク質をコードするＤＮＡの慣用的な変異誘発技術から得られ、結果としてわずかな比較的重要でない改変が生じており、前述の方法で所望の活性に対しスクリーニングされたものである。
【００７０】
本発明は、ＳＤＦ−１の改変体も包含する。好ましいＳＤＦ−１改変体は、ＳＤＦ−１のアミノ酸配列に少なくとも８０％アミノ酸同一性を有するものであり、より好ましいＳＤＦ−１改変体は少なくとも９０％同一性を有するものであり、最も好ましい改変体は９５％同一性を有するものである。
【００７１】
本明細書において使用される用語「配列同一性」は、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラム（ＣｌｕｓｔａｌＷ  多重配列アライメントプログラムのウインドウズインターフェイスである）を用いて、ＨａｎｋｓおよびＱｕｉｎｎ（１９９１）に従い低い相同領域を精錬して整列することにより、アミノ酸配列を比較するものである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／ｃｌｕｓｔａｌｘ／でインターネットから利用可能である。もちろん、このリンクが使えなくなっても、当業者は、過度の実験をすることなく、標準的なインターネットの検索技術を用いて他のリンクでこのプログラムのバージョンを見つけることができるということは理解されるべきである。特段の定めのない限り、本明細書に言及されるプログラムの最も新しいバージョン（本願の有効な出願日の時点で）が、本発明の実施のために使用されるものである。
【００７２】
前記の「配列同一性」の決定方法が、何らかの理由で使用できないとみなされる場合は、以下の技術によって配列同一性を決定し得る。配列を、ギャップオープンペナルティー（ギャップの最初の空白に対して）−１２およびギャップ延長ペナルティー（ギャップにおけるさらに連続した各空白につき）−４の規定値（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（値−４から＋１１まで）を使用するＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＤＡＰのバージョン９（グローバルアライメントプログラム）を用いて整列する。整列後、％同一性は、一致した数を、要求する配列内のアミノ酸の数の百分率として表わすことにより算出される。
【００７３】
本発明によるアナログは、本発明によるＳＤＦ−１タンパク質（天然に存在するＳＤＦ−１をコードする配列は本質的に全て含む）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ、およびＳＤＦ−１タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によりコードされているものを含む。たとえば、そのようなハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡは、同一のタンパク質をコードするものであり得るが、そのタンパク質のヌクレオチドは、遺伝子コドンの縮重（すなわち、ヌクレオチド配列が多少異なっても同じアミノ酸をコードするもの）により、ヌクレオチド配列においては天然由来のヌクレオチド配列と異なるものであり得る。さらに、前述したように、アミノ酸の変化（欠失、付加、置換）の量は、約３０個のアミノ酸までに制限される。
【００７４】
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基の対合を通してその相補鎖と結合することによるいずれの方法をも包含すべきである（Ｃｏｏｍｂｓ  Ｊ，  １９９４，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｓｔｏｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）。「増幅」は、核酸配列の付加的なコピーの産生として定義され、通常当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて行なわれる（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，  １９９５，  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ  ＮＹ）。
【００７５】
「ストリンジェンシー」は、通常約Ｔｍ−５℃（プローブの融点より５℃低い）からＴｍの約２０℃〜２５℃以下の範囲内で生じる。
【００７６】
用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が、慣習的に、「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８７−１９９５；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  １９８９を参照のこと。
【００７７】
本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験に使用される温度、一価のカチオンのモル濃度およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合の関数である。所定の一連の条件にかかわるストリンジェンシーの程度を決定するために、まずＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融点Ｔｍとして表わされる１００％同一のハイブリッドの安定性を決定するためのＭｅｉｎｋｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）の方程式を使用する。
【００７８】
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドの割合であり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌはハイブリッドの塩基対の長さである。１００％同一のハイブリッドに対して算出されるＴｍからＴｍが減少する１Ｃ毎に、許容されるミスマッチの量は約１％ずつ増加される。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度で所定のハイブリダイゼーション実験に使用されるＴｍが、Ｍｅｉｎｋｏｔｈの方程式より１００％ハイブリッドに対して算出されるＴｍから１０Ｃ低い場合、ハイブリダイゼーションは最大約１０％のミスマッチがある場合もあるだろう。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」は、前記式により計算される場合、または実測の場合のどちらかで、標的配列との完全な二重鎖に存在するだろうＴｍよりも１０Ｃ以下低いＴｍを提供する条件である。「中程度にストリンジェントな条件」は、前記式により計算される場合、または実測の場合のどちらかで、標的配列との完全な二重鎖に存在するだろうＴｍよりも２０Ｃ以下低いＴｍを提供する条件である。制限するわけではないが、高度にストリンジェント（ハイブリッドの計算または実測Ｔｍより５〜１０Ｃ低い）および中程度にストリンジェント（ハイブリットの計算または実測Ｔｍより１５〜２０Ｃ低い）の例は、ハイブリッドの計測Ｔｍより適当に低い温度での２×ＳＳＣ（標準クエン酸生理食塩水）および０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液の使用を条件付けるものである。とくに使用されるハイブリダイゼーション条件が、安定なハイブリッドと共に低安定性のハイブリッドも形成させる条件である場合、最終的なストリンジェントな条件は、主に洗浄条件による。その結果、より高いストリンジェンシーでの洗浄条件により、低安定性のハイブリッドは除去される。前記の高度のストリンジェントから中程度のストリンジェントの洗浄条件で使用され得る一般的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍより約２０〜２５Ｃ低い温度での、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ（標準食塩−リン酸−ＥＤＴＡ））、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。
【００８０】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＳＤＦ−１またはそのアナログもしくはフラグメントからなるポリペプチドを意味する。したがって、ＳＤＦ−１は、たとえば免疫グロブリンまたはそのフラグメントといった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、「機能的誘導体」は、本技術分野において公知の方法で、残基の側鎖またはＮ末端基もしくはＣ末端基として存在する官能基から製造され得るＳＤＦ−１の誘導体ならびにそれらのアナログおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＳＤＦ−１の活性と実質的に類似するタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００８２】
これらの誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含むことができ、該側鎖は、抗原部位を覆い、かつＳＤＦ−１の体液中での滞留を拡大し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級もしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル基またはトレオニル基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００８３】
ＳＤＦ−１、そのアナログおよび融合タンパク質の「フラグメント」としては、本発明は、該フラグメントが、ＳＤＦ−１と実質的に類似の活性を有する場合、タンパク質分子単独、または該タンパク質分子と連結した関連分子もしくは残基（たとえば、糖またはリン酸残基）のポリペプチド鎖のフラグメントまたは前駆体、あるいは該タンパク質分子もしくは糖残基単独の集合体に及ぶ。
【００８４】
ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独またはケモカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＳＤＦ−１およびＳＬＦ）の組み合わせが、患者の肝臓に、造血幹細胞／前駆細胞の移動を支持するために使用され得る。また、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独またはケモカイン（たとえば、ＩＬ−６、ＳＤＦ−１およびＳＬＦ）の組み合わせは、ＨＳＣおよび／または前駆細胞の移植および／または移動の前、間または後に、患者に投与され得る（ここでの移植は、自系または他系である）。
【００８５】
ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独または他のケモカインとの組み合わせは、肝臓移植治療を必要とする患者において、一致する供与者を待っている間、または肝臓移植の代替として、本発明にしたがって使用され得る。ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独または他のケモカインとの組み合わせは、肝臓移植が拒絶される患者において本発明にしたがって使用され得る。
【００８６】
ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独または他のケモカインとの組合わせは、遺伝子治療を必要とする患者において、本発明にしたがって使用され得る。ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）単独または他のケモカインとの組み合わせは、遺伝的に改変されたＨＳＣおよび／または前駆細胞の移植（ここで、ＨＳＣおよび／または前駆細胞が自系または他系である）の前、間または後に、患者に投与され得る。
【００８７】
本発明による肝臓へのＨＳＣおよび／または前駆細胞の移動の向上を含む本発明の方法は、肝臓疾患に罹患している患者に有益であり得る。肝臓疾患には多くの原因がある。肝炎は、肝細胞への炎症および傷害に関与する。肝炎は、感染、毒物または免疫学的剤の結果であり得る。Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は、ウイルスが原因である。アルコールの乱用および薬物の慢性的な使用が、肝臓傷害を引き起こし得る。肝臓は、自己免疫障害（たとえば、リウマチ病、エリテマトーデスおよび慢性関節リウマチ）、腸炎（たとえば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）に影響され得る。
【００８８】
本発明はまた、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）またはそのアナログ、融合タンパク質、機能的誘導体および／もしくはフラグメント、またはケモカインの混合物の投与のために、ケモカインを、生理的に許容可能なキャリア、および／または安定化剤および／または賦形剤と混合することによって調製され、そして、たとえば、投与バイアルにおける凍結乾燥によって投与形態に調製される薬学的組成物に関する。
【００８９】
本発明はさらに、肝臓へのＨＳＣおよび／または前駆細胞のホーミングを向上させるのにとくに有用である薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、治療的有効量のＳＤＦ−１および／または治療的有効量の種々のケモカインおよび／または薬学的有効量のケモカインの混合物を含む。
【００９０】
本発明はさらに、薬学的に許容可能なキャリアおよびケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）またはそのアナログ、融合タンパク質、機能的誘導体および／もしくはフラグメント、あるいは、ケモカインの混合物を含む、肝臓疾患の治療用の薬学的組成物に関する。好ましくは、ＳＤＦ−１は、細胞移植および／または移動の前、後または間に、肝臓実質に直接注入することによって投与され得る。あるいは、ＳＤＦ−１は、ＤＮＡ傷害剤の局所投与（たとえば、照射および／または化学療法）によって誘導されるのが好ましい。
【００９１】
前記のとおり、ＳＤＦ−１またはそのアナログ、誘導タンパク質、機能的誘導体および／もしくはフラグメントは、薬学的組成物の好ましい活性成分である。
【００９２】
薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）またはそのアナログ、融合タンパク質、機能的誘導体もしくはフラグメント、および、任意にさらに誘導する１つ以上のケモカインを含み得る。
【００９３】
「薬学的に許容可能な」の定義は、活性成分の生物学的活性の効果と干渉せず、かつそれが投与される宿主に対して無毒である任意のキャリアを包含することを意味する。たとえば、非経口投与に関して、活性タンパク質は、ビヒクル（たとえば、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液）での注入のために、単一用量形態に処方され得る。
【００９４】
本発明による薬学的組成物の活性成分は、種々の方法で個体に投与され得る。投与の治療的に有効な経路（たとえば、上皮もしくは内皮組織を介する吸収、または遺伝子治療（ここで、インビボで発現および分泌される活性剤として寄与する活性剤をコードするＤＮＡ分子が患者に投与される（たとえば、ベクターを介して））によって）が使用され得る。さらに、本発明のタンパク質は、薬学的に許容可能な界面活性剤、賦形剤、キャリア、希釈剤およびビヒクルなどのほかの生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。
【００９５】
非経口（たとえば、静脈内、筋肉内）投与については、活性タンパク質は、薬学的に許容可能な非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）と共同して、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として処方され得る。処方は、一般的に使用される技術により滅菌される。
【００９６】
本発明の活性タンパク質の生物学的利用能も、人体において分子の半減期を増加させる共役前駆体を使用すること、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているとおり分子をポリエチレングリコールに連結することにより改善され得る。
【００９７】
活性タンパク質の治療的有効量は、使用されるケモカインの型、ケモカインによって示される任意の残存細胞傷害活性、投与経路、患者の臨床状態を含む多くの変数の関数である。
【００９８】
「治療的有効量」は、投与した際に、ケモカインが、ＨＳＣの肝臓への向上された移動を生じるようなものである。単回または複数回投与として個体に投与される用量は、ケモカインの薬物動態特性、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時治療、治療の頻度ならびに望ましい効果を含む多様な因子に依存して変化する。確立された用量の範囲の調整や操作は、個体におけるケモカインの効果を測定するインビトロおよびインビボ法と同様、当業者の能力の範囲内である。
【００９９】
本発明による好ましい投与経路は、肝臓実質への直接注入によって投与される。
【０１００】
本発明によれば、ケモカイン（たとえば、ＳＤＦ−１）は、ほかの治療法（たとえば、多剤療法）または治療的有効量での治療剤、とくに、移植されたＨＳＣおよび／または前駆細胞および／または動員剤および／またはＤＮＡ傷害剤の前に、同時にまたは連続して個体に投与され得る。
【０１０１】
本発明はさらに、薬学的に有効量のケモカインを、それを必要とする患者に投与することからなる肝臓疾患の処置方法に関する。
【０１０２】
これまで本発明を充分に説明してきたので、同等のパラメータ、濃度および条件の範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、また過度の実験をすることなく行うことができることは当業者によって充分理解されるだろう。
【０１０３】
本発明は、その特定の態様に関連して説明されているが、さらなる変更が可能であるということが理解されるだろう。この出願は、以下の本発明の任意の変化、使用、適用に及ぶことを意図しており、概して、本発明の本質、ならびに本発明の属する技術分野の既知のまたは一般的な手法の範囲内となる程度の本開示からの逸脱、および下記の通り添付のクレームの範囲で前記の本質的な特徴にあてはまる程度の本発明からの逸脱を含む。
【０１０４】
本明細書において引用されるすべての参考文献（雑誌の論文もしくは要旨、公開もしくは非公開の米国もしくは外国特許出願、発行された米国もしくは外国特許または任意のほかの参考文献）は、引用される参考文献に示されたすべてのデータ、表、図および文章を含めて、言及により本明細書中に完全に包含される。さらに、本明細書において引用される参考文献中で引用される参考文献の全内容も、言及により本明細書中に完全に包含される。
【０１０５】
既知の方法手段、常套的な方法手段、既知の方法または常套的な方法への言及は、本発明のあらゆる態様、記載または実施態様が関連技術において開示、教示または示唆されるものであると認めるものではない。
【０１０６】
特定の実施形態の先行する記載は、第三者が、当業者の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験をすることなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、特定の実施態様などのさまざまな適用のために、容易に修飾および／または適応させることができるほど、本発明の全体的な性質を充分に示すものであろう。したがって、本明細書で紹介された教示および手引きに基づく、そのような適応および修飾は、開示された実施態様と同等の範囲の意味であると意図される。本明細書の表現または専門用語は、本明細書で紹介された教示および手引きによる見地と当業者の知識とを組み合わせて、当業者に理解されるものであるため、本明細書での表現または専門用語は、説明を目的とするものであって限定するためのものではない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
移植されたヒト造血幹細胞の肝臓へのホーミング
供与体であるラットから造血幹細胞が、受容者であるラットの肝臓へ達し、そして肝細胞に再生し得ることが報告されている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。しかし、それらが直接または造血器官（たとえば、骨髄または脾臓）を介して肝臓に到達するか否かは不明である。この点を明確にするために、健常な供与者の動員末梢血（ＭＰＢ）からのＣＤ３４＋富化ヒト幹細胞（０．５〜１×１０6）を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植し（Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  ａｎｄ  Ｋｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、そして移植からまもなく（１６時間）、マウスを犠牲死し、肝臓中のヒト細胞の存在をモニターした。
【０１０８】
富化ＣＤ３４＋細胞（８０％以上の富化）を得るために、ヒト動員末梢血（ＧＣＳＦで処置した健常な供与者）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で低密度単核細胞（ＮＭＣ）の画分化に供し、ついで、ミニＭＡＣＳキットに供した（Ｍｉｌｔｎｅｙ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１０９】
ヒト富化ＣＤ３４＋動員抹消血（ＭＰＢ）細胞をインキュベートし、抗ＣＸＣＲ４抗体（１２Ｇ５，１０μｇ／マウス）または培地単独（対照）を同時移植した。０．５〜１×１０6ＣＤ３４＋ＭＰＢ細胞を、３７５ｃＧｙの亜致死照射から２４時間後、静脈内（ＩＶ）注入によってＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。マウスを１６時間後に犠牲死した。単一細胞懸濁液を調製し、抗ヒトＣＤ３４ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３８ＰＥを用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析に導入した（図１）。
【０１１０】
得られた結果は、ヒト幹細胞および前駆細胞が骨髄および脾臓にホーミングすることを示し、そしてプレインキュベーション（３０分）および抗ＣＸＣＲ４抗体での同時移植が、骨髄および脾臓へのホーミングを非常に阻害することから、このホーミングは、以前に報告したとおりＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４に依存することを示す。
【０１１１】
相当数のヒト幹細胞および前駆細胞は、これらのマウスの肝臓でも見出された。ＣＤ３４＋富化幹細胞を予め処理し、そしてＣＸＣＲ４中和抗体と同時移植した場合、ヒトＣＤ３４＋富化幹細胞の肝臓へのホーミングが顕著に減少した。このことは、骨髄および脾臓と同様に、肝臓へのホーミングがＣＸＣＲ４を介するＳＤＦ−１シグナル伝達に依存することを示す。
【０１１２】
これらの結果は、まず、造血幹細胞および前駆細胞が肝臓に直接ホーミングし得ること、および、このホーミングがＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を必要とすることを示すものである。
【０１１３】
実施例２
ＨＳＣの肝臓へのホーミングを媒介するＳＤＦ−１
ＳＤＦ−１は、ヒト骨髄骨芽細胞および内皮細胞によって高度に発現される。臨床骨髄移植には、幹細胞移植の前に照射または化学療法での受容者の調整が必要である。イオン化照射、シクロホスファミドおよび５−フルオロウラシルなどのＤＮＡ傷害剤でのマウスの調整が、ＳＤＦ−１発現およびＣＸＣＲ４依存性ホーミングの増大ならびにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒト幹細胞による骨髄の再集合を引き起こすことが報告されている（Ｐｏｎｏｍａｒｙｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ヒト前駆細胞のマウス肝臓への移動には、ＣＸＣＲ４を介するシグナル伝達が必要であるので（前記実施例の結論を参照）、ＳＤＦ−１のレベルを、照射マウスの肝臓において測定し、非照射マウスにおけるＳＤＦ−１のレベルと比較した。ＳＤＦ−１発現の顕著な増大が、全身照射ののちに肝臓において見出された（示さず）。
【０１１４】
以下の実験は、ヒトＣＤ３４＋富化ＭＰＢ細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肝臓へのホーミングには、肝臓における高濃度のヒトＳＤＦ−１が必要となるかどうかを試験するために実施した。
【０１１５】
凍結させたマウス動員末梢血（ＭＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を融解し、そして回収のために５０ｎｇ／ｍｌＳＬＦとともに３７℃で一晩インキュベーションした。実施例１に記載した実験とは対照的に、本実施例を、非照射マウス（予め調整されていない）を用いて実施した。そして、非照射マウスにおいても、移植の直前にヒトＳＤＦ−１を肝臓に直接注入した。
【０１１６】
簡潔には、非照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを麻酔し、そして１μｇのＳＤＦ−１（ＰＢＳ中５０μｌ）を、肝臓の右葉に注入した。ついで、処理した対照マウスの静脈内に８×１０5ＣＤ３４＋ＭＰＢ富化細胞を移植した。一群では、ＣＤ３４＋細胞を、１０μｇの中和抗ヒトＣＸＣＲ４ｍＡｂ（１２Ｇ５）とともに４℃で３０分間インキュベーションし、そして洗浄することなく同時移植した。
【０１１７】
４時間後、注入した葉を採取し、単一細胞懸濁液を調製し、そして、ヒト特異的抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３８−ＰＥｍＡｂを用いてフローサイトメトリー分析に導入した。ＳＤＦ−１の肝臓への注入は、肝臓における正の勾配および血液における負の勾配を作る。この勾配は、約４時間だけ維持した。そのため、このマウスを犠牲死し、そしてホーミングを迅速（細胞注入から４時間後）に試験した。以下の表１に要約した結果は、肝臓へのホーミングが非照射マウスにおいて非常に低かったことを示す。対照的に、相当数のヒト幹細胞および前駆細胞は、ヒトＳＤＦ−１を肝臓に注入した非照射マウスにおいて観察された。幹細胞の抗ＣＸＣＲ４（１２Ｇ５）抗体との同時移植によって、ヒトＳＤＦ−１処理マウスにおけるホーミングが阻害された。これは、肝臓へのホーミングがヒトＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４とのその相互作用によって特異的に誘導されることを示す。
【０１１８】
【表４】
2005511661.tif 000006
【０１１９】
実施例３
造血ヒト細胞の肝臓へのホーミングにおけるＳＬＦおよびｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラの効果
幹細胞因子（ＳＬＦ（スチール因子またはｃｋｉｔリガンド））は、受容者骨髄における長期間移植が可能である、最も初期の多能性造血幹細胞の生存および増殖に重要であることが見出されている（ＭｃＫｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ＳＬＦおよびＩＬ−６は、ＣＤ３４＋細胞における表層ＣＸＣＲ４発現およびそれらのＳＤＦ−１勾配への移動を増大させることが知られている。ｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラタンパク質（ＩＬ−６に連結された可溶性ＩＬ−６Ｒを含む）はまた、ＣＤ３４＋幹細胞（ＩＬ−６レセプターを欠損しているが、ＧＰ１３０レセプターを有する）内のより初期の幹細胞集団において作用し得る。造血幹細胞および前駆細胞のホーミングにおけるＳＬＦおよび／またはｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６の効果を研究するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｐｅｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９およびＫｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１および実施例１）を、亜致死照射に供し、そしてＳＬＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）および／またはｓＩＬ６Ｒ／ＩＬ６（１００ｎｇ／ｍｌ）で３日間液体培地において維持される０．５〜１×１０6ヒトＣＤ３４＋富化ＭＰＢを尾脈に注入し、その後移植した。１６時間後、マウスを犠牲死し、そして肝臓を取り出して、ヒトＣＤ３４＋細胞の存在をモニターする。マウスの肝臓へのヒト細胞のホーミングを、ＣＤ３４＋標識化細胞のＦＡＣＳ分析で評価する（実施例１参照）。
【０１２０】
サイトカインで処理した細胞を注入したマウスは、ヒトＣＤ３４＋の、肝臓への増大したホーミングを示す。
【０１２１】
したがって、造血幹細胞および前駆細胞における細胞表層ＣＸＣＲ４の増大が、肝臓への移動を支持し得る。
［参考文献］
【０１２２】
2005511661.tif 000007
【０１２３】
2005511661.tif 000008
【０１２４】
2005511661.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ヒトＭＰＢ  ＣＤ３４＋富化細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの肝臓へのホーミングがＣＸＣＲ４依存性であることを示す。ヒト富化ＣＤ３４＋動員抹消血（ＭＰＢ）細胞をインキュベートし、抗ＣＸＣＲ４抗体（１２Ｇ５，１０μｇ／マウス）または培地単独を同時移植した。０．５〜１×１０6ＣＤ３４＋ＭＰＢ細胞を、３７５ｃＧｙの亜致死量の照射から２４時間後、静脈内（ＩＶ）注入によってＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。マウスを１６時間後に犠牲死した。単一細胞懸濁液を調製し、抗ヒトＣＤ３４ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ３８ＰＥを用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析に導入した。ｎ＝３。実験、４マウス／群。
【図１】
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【国際調査報告】
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