(57)【要約】本発明は、pgsBCA、ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼをコードする遺伝子を有する表面発現ベクターおよび当該ベクターを用い微生物の表面に標的タンパク質を発現させる方法に関する。外来遺伝子が挿入されているベクターにより、微生物は形質転換し、外来タンパク質は微生物の表面で安定して発現する。
2005500054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼ複合体をコードするpgsB、pgsC及びpgsAから選択された一つまたは二つ以上の遺伝子を含む、微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項２】
当該遺伝子がポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼを産生するバチルス属菌株から由来する、請求項１の微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項３】
pgsB、pgsC及びpgsAの遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ、８０％の相同性で、配列番号1、配列番号2及び配列番号3の配列に相同である、請求項１の微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項４】
当該遺伝子は、標的タンパク質をコードする遺伝子および3'-末端に転写終結コドンを含む、請求項１の微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項５】
標的タンパク質をコードする当該遺伝子が、酵素、抗原、抗体、付着タンパク質または吸着タンパク質をコードする遺伝子から選択され得る、請求項４の微生物の表面にタンパク質を発現するための発現ベクター。
【請求項６】
当該発現ベクターがグラム陰性菌に用いられる、請求項１から請求項５のいずれかの微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項７】
請求項６の、微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクターで形質転換されたグラム陰性菌。
【請求項８】
当該発現ベクターがグラム陽性菌に用いられる、請求項１から請求項５のいずれかの微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項９】
請求項６の、微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクターで形質転換されたグラム陽性菌。
【請求項１０】
当該発現ベクターがグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方に用いられる、請求項１から請求項５のいずれかの微生物の表面にタンパク質を産生するための発現ベクター。
【請求項１１】
グラム陰性宿主細胞の微生物の表面に標的タンパク質を発現させるための方法であって：
(a)請求項６の表面発現ベクター中に、標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、組換え発現ベクターを作製する段階；
(b)当該組換えベクターでグラム陰性宿主細胞を形質転換する段階；及び
(c)当該形質転換された宿主細胞を培養し、宿主細胞の表面に当該標的タンパク質を発現させる段階、
を含む当該方法。
【請求項１２】
グラム陽性宿主細胞の微生物の表面に標的タンパク質を発現させるための方法であって：
(a)請求項６の表面発現ベクター中に、標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、組換え発現ベクターを作製する段階；
(b)当該組換えベクターでグラム陽性宿主細胞を形質転換する段階；及び
(c)当該形質転換された宿主細胞を培養し、宿主細胞の表面に当該標的タンパク質を発現させる段階、
を含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、バチルス属菌株由来のポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質(PgsBCA)を用いて外来タンパク質を微生物の表面へ効果的に発現させる新しいベクターに関するものである。また、本発明はバチルス属菌株由来のポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質(ｐｇｓＢＣＡ)を微生物の表面へ発現させるタンパク質の製造方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
最近バクテリオファージ、細菌、酵母等の細胞表面へ必要な外来タンパク質を発現させようとする研究が行われ、新しいワクチンの生産、各種抗原と抗体のスクリーニング、有用な酵素を細胞表面へ固定化するなどの用途として幅広く用いられている。
【０００３】
細菌の表面へタンパク質を発現させようとする試みはワクチンを大量に安定的に生産させるために抗原性を有するペプチド部位を作成することから始まった。従来はワクチンの生産のために病原菌を無作為的に突然変異させて安定的で持続的に力価を示す細菌をスクリーニングし用いた。しかし、このような方法は実際に動物または人間に経口投与する場合、その活性が簡単になくなる短所のために、これを解決するための様々な試みが行われた。先ず、グラム陰性細菌の細胞表面タンパク質を用いて当該遺伝子を抗原として作用できるタンパク質の遺伝子とライゲーションさせて、これを適当な細菌に導入して融合タンパク質 (fusion protein)を効果的に細胞表面へ発現させる試みが行われた。このように製造されたタンパク質は安定的に細胞表面へ突出されるため、効果的に抗原として作用できる。特にグラム陰性細菌の場合、細胞外膜の脂質炭水化物 (lipopolysaccharide, LPS)が細胞表面発現されたタンパク質の抗原性 (antigenicity)を増加させる作用を持っているために非常に効果的であると知られている。
【０００４】
細菌の表面にタンパク質を発現させるためには、細胞内で生合成されたタンパク質が細胞膜を通過できる分泌信号 (secretion signal)が当該タンパク質の一次配列上に存在しなければならない。また、グラム陰性細菌の場合には細胞内膜と細胞膜の空間を通過して細胞外膜へ挿入付着して膜の外部へ突出されて安着しなければならない。
【０００５】
細菌の場合にはこのような分泌信号と細胞表面へ提示させる標的信号 (targeting signal)を有しているタンパク質としては細胞表面タンパク質、特殊な酵素、毒素タンパク質などが例に挙げられる。実際的にこのタンパク質の持っている分泌信号と標的信号などを適当なプロモーターと使用すると細菌の表面へ外来タンパク質が成功的に発現できる。
【０００６】
外来タンパク質の表面発現に使用された細菌の表面タンパク質は細胞外膜タンパク質、脂質タンパク質 (lipoprotein)、分泌タンパク質、細胞表面器官のタンパク質に大きく4つに分類される。現在までに主なグラム陰性細菌に存在する表面タンパク質、例えば、LamB, PhoE, OmpA などを用いて必要な外来タンパク質を細菌の表面へ発現させる試みが行われた。このタンパク質を用いる場合外来タンパク質を細胞表面へ突出したループ (loop)へ挿入させるから構造的にはタンパク質の大きさが制限される。また、挿入される外来タンパク質のC-末端とN-末端が立体的に近く位置しなければならないので、その距離が遠い場合には連結するペプチドで両末端の間を近くさせなければならない問題がある。
【０００７】
実際にLamBまたはPhoEを用いた場合、50−60個以上のアミノ酸から構成された外来ポリペプチドを挿入すると構造的に制限されて安定的な膜タンパク質の形成ができない。[Charbit et al., J. Immunol., 139: 1658-1664 (1987) ; Agterberg et al., Vaccine, 8: 85-91 (1990)].  OmpAを用いて外来タンパク質を突出されたループへ挿入したケースもあるが、構造的な制限を克服するための細胞外膜に安着できる最小限の標的信号を含む一部のOmpA断片だけを用いた。このような方法でβ-ラクタマーゼ(-lactamase)をOmpAの標的信号のＣ-末端に連結して細胞表面へ発現した事例がある。
【０００８】
また、最近知られている表面発現に用いたグラム陰性細菌の細胞外膜タンパク質としてシュードモナス(Pseudomonas)属由来の氷核活性タンパク質(Ice-nucleation protein, INP)を用いた表面発現の試みが行われた[Jung et al., Nat. Biotechnol, 16: 576-560 (1998), Jung et al., Enzyme Microb. Technol, 22(5): 348-354 (1998), Lee et al., Nat. Biotechnol, 18: 645-648 (2000)]。 ジョン(Jung)などはN-末端、中央の繰返しの区間、そしてC-末端で構成された氷核活性タンパク質のC-末端にレバンシュークレイズ(levansucrase)を、そして中央の繰返しの区間に欠損されたN−末端、そしてC-末端で構成された氷核活性タンパク質のＣ−末端にカルボキシルメチルセルローズ(carboxymethylcellulase)を融合させて各々を表面発現させて酵素の活性を測定確認した。リー(Lee)なども同じくN-末端、またはN-末端とＣ−末端で構成された氷核活性タンパク質の各々の末端にＢ型肝炎ウィルスの表面抗原とＣ型肝炎ウィルスのコア(core)抗原を大腸菌またはサルモネラチーピTy21a (Salmonella typhi Ty21a)菌株の細胞表面へ発現させた後、これらが複合生ワクチンとして使用できることを確認した。
【０００９】
脂質タンパク質も表面タンパク質として表面発現に用いられる。特に、大腸菌の脂質タンパク質は当該のＮ−末端に分泌シグナルを有し、細胞内膜を通過することができ、末端のＬ−システイン(L-cysteine)が共有結合で細胞外膜の脂質または細胞内膜の脂質と直接付着している。主な脂質タンパク質であるLppのN-末端は細胞外膜に、Ｃ−末端は細胞壁(peptidoglycan, PG)に結合されて細胞外膜のタンパク質OmpAの断片と融合されると安定的に外来タンパク質を細胞外膜まで分泌して細胞表面で発現できる[Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489: 2713-2717 (1992)]。また、他の脂質タンパク質であるTraTは上記のような脂質タンパク質の特性を用いてポリオウィルスのC3 エピトープのような外来ペプチドを細胞表面発現することに用いた[Felici et al., J. Mol. Biol., 222: 301-310 (1991)]。また、まだ正確な機能は明らかにされていない細胞壁付着型の脂質タンパク質(Peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL)も組換え抗体の表面発現に使われた[Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372(1991)]。この場合においてもPALのC-末端は細胞壁に連結され、またN-末端は組換え抗体に連結されて融合タンパク質として表面発現された。
【００１０】
細胞外膜を通過する分泌タンパク質も表面タンパク質として用いられるがグラム陰性細菌の場合には分泌タンパク質が発達されていないことで、いくつかの分泌タンパク質の場合でのみだけが、その特有の分泌メカニズムに関与するタンパク質が存在して細胞外膜の通過を手伝っている。例えば、クレブシエラ(Klebsiella)属のプルラアーゼ(pullulanase)は脂質タンパク質で、そのN-末端は脂肪質で置換されて細胞外膜へ付着された後完全に細胞培養液中へ分泌される。コネッカ(Kornacker)などがプルラアーゼのN-末端断片を用いてβ-ラクタマーゼを細胞表面へ発現させたが、発現されたプルラアーゼ−β-ラクタマーゼの融合タンパク質は細胞表面へ付着さている時間は短く、すぐに細胞培養液中に遊離されってしまう短所がある。また、これを用いて細胞膜の空間(periplasmic space)のタンパク質であるアルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase)を発現させた場合、当該タンパク質の分泌のためには少なくとも14個以上のタンパク質が関連しているため、安定的に表面発現されなかった[Kornacker et al., Mol. Microl., 4: 1101-1109 (1990)]。
【００１１】
独特な分泌体系を持っている病原微生物のナイセリア(Neisseria)由来の IgAプロテアーゼはC−末端に存在する断片にN−末端に存在しているプロテアーゼを細胞外膜へ安着させるシグナルを持っている。一旦細胞外膜へ到達して細胞表面へ突出したプロテアーゼは自身の加水分解能によって細胞培養液へ分泌される。クライザー(Klauser)などはこのIgAプロテアーゼ断片を用いて約12kDaのコレラ毒素Ｂサブユニットを安定的に細胞表面へ発現させた[Klauser et al., EMBO J., 9:1991-1999 (1990)]。しかし、分泌過程中で細胞膜の空間で起きたタンパク質のフォールディング (protein folding)によって融合タンパク質の分泌は抑制された。
【００１２】
この他にもグラム陰性細菌の場合、細胞表面へ存在して表面発現に応用できる細胞器官としては鞭毛(Flagella), ピリ(Pili)及びフィムブリエ(Fimbriae)などがある。鞭毛の構成ユニットである鞭毛タンパク質(Flagellin)を用いてコレラ毒素BサブユニットとB型肝炎ウィルスから由来したペプチドが安定的に発現されて、これらは当該タンパク質に対する抗体と強力に反応した。[Newton et al., Science, 244: 70-72 (1989)]。細胞表面へ糸のような形のフィムブリエの構成タンパク質であるフィムブリン(fimbrilin)を用いて外来ペプチドの発現を試みした結果、小さいペプチドの場合だけが成功的に発現された[Hedegaard et al.,Gene, 85: 115-124 (1989)]。
【００１３】
上記のようなグラム陰性細菌の表面タンパク質による表面発現の試みの他にグラム陽性細菌の表面タンパク質を用いた表面発現も最近行われた [Samuelson et al., J. Bacteriol., 177: 1470-1476 (1995)]。この場合に置いても細胞内膜を通過できる分泌シグナルと細胞膜に付着される表面発現のキャリアが必要である。実際的にブトウ球菌(Staphylococcus hyicus) 由来のリパーゼを分泌シグナルとして用いて、黄色ブトウ球菌(Staphylococcus aureus)由来のプロテインＡを膜付着へのキャリアとして使用して80個のアミノ酸からなるマラリアの抗原(malaria blood stage antigen)とストレプトコーカスタンパク質G由来のアルブミン付着タンパク質を効果的にグラム陽性細菌の表面へ発現させた事例がある。
【００１４】
上記のグラム陰性及び陽性細菌の表面発現に対する研究を通じて多くの有用なタンパク質発現システムが開発され、米国、ヨーロッパ及び日本などで出願されている。この中でも特にグラム陰性細菌の細胞外膜タンパク質を用いた場合が5件(WO9504069, WO9324636, WO9310214, EP603672, US5356797)報告されてあり、細胞表面器官であるピリ(pili)を用いた場合が1件 (WO9410330)、また細胞表面の脂質タンパク質(lipoprotein)を用いたのも1件(WO9504079)が報告されている。
【００１５】
以上のように細菌の細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を細胞表面へ発現させるためには適当な細胞外膜タンパク質と外来タンパク質を遺伝子のレベルで二つを連結して融合タンパク質が生合成されるように誘導して、これを安定的に細胞内膜を通過して細胞外膜に付着させて維持するようにしなければならない。このためには次のような条件を持つ細胞内膜を選定して表面発現のキャリアとして使用しなけれならない：先ず細胞内膜を通過できる分泌シグナルを有すること、二つ、細胞外膜に安定的に付着する標的シグナルがあること、三つ、細胞表面へ多量に発現されること、四つ、タンパク質の大きさに関係なく安定的に発現されること。
【００１６】
しかしながら、上の条件をすべて満足できる表面発現キャリアは未だに開発されていない状態で、現在までには上記した短所を補完する水準である。
【００１７】
このような背景から、本発明者らはバチルス属菌株由来のポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼ(pgsBCA)を新しい表面発現キャリアとして活用することについて検討・研究したところ、pgsBCAの遺伝子を用いて外来タンパク質を微生物の表面へ効果的に発現させる新しいベクター及び微生物の表面へ外来タンパク質を多量に発現させる方法を開発して本発明を完成した。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、微生物表面で外来性タンパク質を作成するための方法を提供することである。
【００１９】
本発明はグラム陽性微生物とグラム陰性微生物の表面へ外来タンパク質を大量に発現させる新しい表面発現キャリアとしてバチルス属菌株由来のポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択して、これを用いて外来タンパク質またはペプチドを微生物表面へ発現させる表面発現用のベクターを作製し、当該により形質転換された多様な形質転換体から外来タンパク質が効率的に形質転換体の表面へ発現される方法を提供することを目的にする。
【００２０】
前記の目的を達成するために本発明は、ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成している遺伝子pgsB、pgsC及びpgsA中どれ一つまたは二つ以上を含む表面発現用のベクターを提供する。
【００２１】
詳細には、本発明は、微生物表面においてタンパク質を作成するための表面発現ベクターを提供し、この場合、pgsB、pgsC及びpgsA遺伝子は、配列番号１、配列番号２および配列番号３とそれぞれ８０％の相同性を有するヌクレオチド配列を含んでいる。加えて、表面発現ベクターはまた、微生物表面にタンパク質を作成するために提供され、それは、標的タンパク質をコードする遺伝子およびC-末端に転写終止コドンを含んでいる。
【００２２】
更に、細胞形質転換体は、上記発現ベクターを用い形質転換されるように提供される。
【００２３】
最終的に、本発明は、以下の過程：
(ａ)標的タンパク質をコードする遺伝子を表面発現ベクター中に挿入することにより組換え発現ベクターを構成すること、
(ｂ)組換えベクターを用いグラム陰性宿主細胞を形質転換すること、および
(ｃ)当該形質転換宿主細胞を培養し、当該標的タンパク質を当該宿主細胞の表面に発現させること、
に基づき、グラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の微生物表面で標的タンパク質を発現するための方法を提供する。
【００２４】
図面の簡単な説明
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面と共に以下の説明からより明らかに理解される。
図1は本発明によるグラム陰性微生物を宿主にする表面発現用ベクター、pGNBCA及び組換えベクターpGNBCA-HB168の遺伝子地図である。
図2は本発明の組換え発現ベクターpGNBCA-HB168で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光−活性細胞選別測定の結果に基づいている。
図3は本発明による表面発現用ベクター、pGNCA及び組換え発現ベクターpGNCA-HB168の遺伝子地図である。
図４は本発明の表面発現の組換えベクター(pGNCA-HB168:A2, pGNA-HB168:A3そしてpGNHB-A:A4)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光−活性細胞選別測定の結果に基づいている。
図５は本発明の表面発現ベクター、pGNA及び組換え発現ベクターpGNA-HB168の遺伝子地図である。
図６は本発明による表面発現ベクター、pGNCA2及び組換え発現ベクターpGNHB-Aの遺伝子地図である。
図７は本発明による表面発現ベクター、pGNC及び組換え発現ベクターpGNC-PreS1の遺伝子地図である。
図８は本発明の表面発現の組換えベクター(pGNC-PreS1)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスのPreS1タンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングアッセイに基づいている。
図９は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:BCA及び組換え発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168の遺伝子地図である。
図１０は本発明の表面発現の組換えベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原決定基の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光-活性細胞選別測定の結果に基づいている。
図１１は本発明の表面発現ベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陰性微生物の生ワクチン効果を示している。
図１２は本発明の表面発現組換えベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陽性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原決定基の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光-活性細胞選別測定の結果に基づいている。
図１３は本発明の組換え発現ベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陽性微生物の生ワクチン効果を示している。
図１４は本発明にの表面発現用ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1及びpHCE1LB:A-PEDNの遺伝子地図である。
図１５は本発明の表面発現組換えベクター(pHCE1LB:A-TGEN1)で形質転換されたグラム陰性微生物（大腸菌）及びグラム陽性微生物で発現されたTGEウィルスのNタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングに基づいている。
図１６は本発明の発現組換えベクター(pHCE1LB:A-PEDN)で形質転換されたグラム陰性微生物及びグラム陽性微生物で発現されたPEDウィルスのNタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングに基づいている。
図１７は本発明の組換え発現ベクター(pHCE1LB:A-TGEN1及びpHCE1LB:A-PEDN)で形質転換されたグラム陽性微生物の生ワクチン効果を示している。
図１８は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1及びpHCE1LB:A-PreS2の遺伝子地図である。
図１９は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2及びpHCE1LB:A-Lの遺伝子地図である。
図２０は本発明の発現組換えベクター(pHCE1LB:A-PreS1, pHCE1LB:A-PreS1:PreS2)でそれぞれ形質転換されたグラム陰性微生物で発現されたＢ型肝炎ウィルスのPreS1またはPreS1:PreS2タンパク質の表面発現のパターン及び発現組換えベクター(pHCE1LB:A-L)で形質転換されたグラム陰性微生物で発現されたＢ型肝炎ウィルスのLタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングアッセイに基づいている。
図２１は本発明の表面発現ベクターpHCE1LB:A-TNF-aの遺伝子地図である。
図２２は本発明の組換え発現ベクターpGNA-リパーゼの遺伝子地図及び組換え発現ベクターpGNA-リパーゼで形質転換されたグラム陰性微生物の細胞表面へ発現されたリパーゼの活性を示している。
図２３は本発明の組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼの遺伝子地図及び組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼで形質転換されたグラム陰性微生物の細胞表面へ発現されたアミダーゼの活性を示している。
【００２５】
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をより詳細に説明する。
遺伝子pgsBCAがコーディングするタンパク質はバチルス属株に存在する細胞外膜タンパク質であり、バチルスサブチルス (Bacillus subtilis IFO3336; 納豆菌; Biochem. Biophy. Research Comm., 263, 6-12, 1999)、バチルスリチェニホミス(Bacillus licheniformis ATCC9945; Biotech. Bioeng. 57(4), 430-437, 1998)、バチルスアンスラシス(Bacillus anthracis; J. Bacteriology, 171, 722-730, 1989)などから生産される食用、水溶性、陰イオン性、生分解性の高分子物質であり、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する物質である。
【００２６】
納豆菌(Bacillus subtilis IFO3336)の場合、分離された細胞膜タンパク質(pgsBCA)は総922個のアミノ酸で構成されたタンパク質として、pgsBは393個のアミノ酸で、pgsCは149個のアミノ酸で、またpgsAは380個のアミノ酸で構成されている。芦内(Ashiuchi)らはバチルスナット株由来のポリ-γ-グルタミン酸のシンテターゼをクローニングして大腸菌へ形質転換して大腸菌からポリ-γ-グルタミン酸の合成を観察した[Ashiuchi et al., Biochem. Biophy. Res. Communications, 263: 6-12 (1999)]。
【００２７】
しかし前記のポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼ複合体を構成しているタンパク質pgsBCAの具体的な機能についてはまだ明らかにされていない。但し、酵素複合体の構成タンパク質中pgsBはアミドリガーゼ系であり、pgsBのN-末端の特定アミノ酸が細胞膜または細胞壁と相互作用する。pgsAはN-末端とC-末端に特異的な親水性アミノ酸配列を有し、pgsBと共にこれらのアミノ酸配列が細胞内膜を通過できる分泌シグナルと標的及び付着シグナルとして働くと推測される。
【００２８】
本発明者らの研究結果、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質は、そのアミノ酸の一次配列の構造と特性上、表面発現キャリアとして多くの長所があり、外来タンパク質を細胞表面へ発現させ得ることが明らかになった。具体的には、種々の長所がある。一つ、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質はポリ-γ-グルタミン酸の合成及び細胞外へ分泌するために細胞表面に多量発現が可能であり、二つ、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞表面に発現した細胞外膜のタンパク質は細胞周期上、休止期でも安定的に維持され得、三つ、細胞外膜タンパク質は、特にpgsAの場合、構造的に細胞表面へ突出されていること、四つ、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質(pgsBCA)は、グラム陽性細菌の細胞表面から生じ、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌のいずれの細胞表面でも発現され得る。
【００２９】
本発明は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜の特性を用いて外来タンパク質を細胞表面への発現に有用な組換え発現ベクターを提供する。特に、本発明の表面発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質(pgsBCA)の一次配列上に分泌シグナル及び標的シグナルを含むように構成されている。
【００３０】
また、本発明は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の特性を用いた表面発現ベクターを使用して外来タンパク質をグラム陽性微生物とグラム陰性微生物の両方の微生物表面へ発現させる方法を提供する。特に、本発明の外来タンパク質を調製する方法は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜のタンパク質を用いて外来タンパク質を細胞表面へ発現させることで、細胞の破砕またはタンパク質の精製のような特定の過程を省略することができる。
【００３１】
従って、本発明は、表面発現方法で生産された外来タンパク質を多様な用途を提供する。特に、本方法は、抗原及び抗体、抗原をスクリーニングするためのペプチドライブラリー、付着または吸着タンパク質、及び生理活性物質などを効果的に生産する。
【００３２】
バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質に加えて、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している遺伝子を含む全種類の表面発現ベクターはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００３３】
また、本発明のポリ-γ-グルタミン酸のシンテターゼ遺伝子を用いた表面発現ベクターは、外来タンパク質を微生物の表面へ発現するのにすべての菌株に適用できる。望ましくは、これらのベクターは、グラム陰性細菌、最も望ましいにのは大腸菌、サルモネラチーピ(Salmonella typhi)、サルモネラチピムリウム(Salmonella typhimurium)、ビブリオコレラ(Vibrio cholera)、マイコバクテリウムボビス(Mycobacterium bovis)、シゲラ(Shigella)、そしてグラム陽性細菌、望ましくはバチルス(Bacillus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコーカス(Lactococcus)、ブトウ球菌(Staphylococcus)、リステリア(Lysteria)、モノサイトゼネス(Monocytogenesis)、ストレプトコーカス(Streptococcus)の菌株などに適用できる。上記の菌株を用い、外来タンパク質の製造に用いるすべての方法は本発明の範囲に含まれ得る。
【００３４】
必要に応じて、ポリ-γ-グルタミン酸のシンテターゼ遺伝子は、N-末端またはC-末端の全部または一部の制限酵素の多様な認識部位に挿入され得る。これらの制限酵素の認識部位が含まれている表面発現ベクターはすべて本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
具体的に、本発明はバチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸のシンテターゼをすべて含んでいる。これらの間では、pgsA遺伝子は、C-末端への制限酵素の認識部位の挿入、および多様な外来タンパク質遺伝子の容易なクローニングに使用され、それによって、表面発現ベクターpGNBCAを構成する。
【００３６】
本発明はまた、グラム陰性菌の細胞表面上に、Ｓ抗原に対する中和抗体を融合型で形成する抗原決定基を発現し得る、組換え表面発現ベクターpGNBCA-HB168を提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsB、pgsCおよびpgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、B型肝炎ウィルスのS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基のＮ-末端と連結している。
【００３７】
本発明はまた、グラム陰性菌の細胞表面上に、Ｓ抗原に対する中和抗体を融合型で形成する抗原決定基を発現し得る、組換え表面発現ベクターpGNCA-HB168、pGNA-HB168そしてpGNHB-Aを提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsCおよびpgsAタンパク質またはpgsAタンパク質のみの何れかで構成されており、前者の場合、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端、または後者の場合、N-末端またはC-末端は、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基のN-末端と連結する。
【００３８】
本発明はまた、グラム陰性菌の細胞表面上に、Ｓ抗原に対する中和抗体を融合型で形成する抗原決定基を発現し得る、組換え表面発現ベクターpGNC-PreS1を提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsCタンパク質で構成されており、pgsCタンパク質遺伝子のC-末端は、B型肝炎ウィルス表面抗原群由来のPreS1抗原のN-末端と連結する。
【００３９】
本発明はまた、グラム陰性菌用に表面発現ベクターpGNBCAを修飾し、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の何れにも適用できる、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:BCAとpHCE1LB:Aを提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsB、pgsC、およびpgsAタンパク質またはpgsAタンパク質のみの何れかで構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、外来タンパク質遺伝子と連結する。
【００４０】
本発明はまた、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に適用でき、細胞表面に、S抗原に対する中和抗体を融合型で形成する抗原決定基を発現する、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168を提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsB、pgsC及びpgsAで構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、B型肝炎ウィルスのS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基のN-末端と連結する。
【００４１】
本発明はまた、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に適用でき、細胞表面に、核タンパク質Ｎタンパク質を融合型で発現する、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1を提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、豚伝染性胃腸炎(TGE)ウィルスの部分的核タンパク質遺伝子のN-末端と連結する。
【００４２】
本発明はまた、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に適用でき、細胞表面に、核タンパク質Ｎタンパク質を融合型で発現する、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNを提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、豚下痢病(PED)ウィルスの核タンパク質遺伝子のN-末端と連結する。
【００４３】
本発明はまた、細胞表面での、exPreS1、PreS2、PreS1-PreS2またはB型肝炎ウィルス表面L(PreS1-PreS2-S)タンパク質中の全体Ｌタンパク質のそれぞれの融合型での表面発現のためにグラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に適用できる、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-Pres1、pHCE1LB:A-PreS2、pHCE1LB:A-PreS1:PreS2及びpHCE1LB:A-Lを提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、PreS1、PreS2、PreS1-PreS2または全体Ｌタンパク質のN-末端とそれぞれ連結する。
【００４４】
本発明はまた、グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方に適用でき、細胞表面に、TNF-α(Tumor necrosis facter alpha)タンパク質を融合型で発現する、組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-TNF-αを提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質は、pgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、腫瘍壊死因子α、サイトカインのN-末端と連結する。
【００４５】
本発明はまた、グラム陰性菌に適用でき、細胞表面に、リパーゼ及びアミダーゼのような産業用の酵素を融合型で発現する、組換え表面発現ベクターpGNA-リパーゼ及びpGNA-アミダーゼ(amydase)を提供する。詳細には、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の複合体は、pgsAタンパク質で構成されており、pgsAタンパク質遺伝子のC-末端は、産業使用用の酵素群中のリパーゼまたはアミダーゼのN-末端と連結する。
【実施例】
【００４６】
実施例
本発明の実施態様および好ましい態様を以下の実施例で説明する。
【００４７】
しかし、当業者は、本開示を参酌し、本発明の精神および範囲内で修飾および改善を行い得ると認識すべきである。
【００４８】
実施例１：表面発現用ベクターpGNBCAの製造
バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)を利用し、グラム陰性微生物を宿主にしている表面発現用ベクターを製造するために、バチルスサブチルスチョンクッチャン(Bacillus subtilis var. chungkookjang, KCTC 0697BP)の総染色体を用いた。
【００４９】
上記遺伝子pgsBCAは配列番号1に記載された塩基配列で表示されたDNAとしてpgsBからなり、配列番号2に記載された塩基配列で表示されたDNAとしてpgsCからなり、そして配列番号3に記載された塩基配列で表示されたDNA断片としてpgsAからなり、上記連続的塩基配列を持つ。
【００５０】
ポリ-γ-グルタミン酸の生合成に関与している細胞内膜タンパク質のN-末端とC-末端をコードしている遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用いてN-末端には配列番号4(5-gaa cca tgg gct ggt tac tcc tta tag cct g-3)、C-末端には配列番号5(5-ctc gga tcc ttt aga ttt tag ttt gtc act-3)のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)を、鋳型およびプライマーを用い行った。
【００５１】
N-末端に相当する配列番号4のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、発現ベクターpHCE 19T(II)に存在する制限酵素Nco Iの認識部位を含むように構成し、C-末端に相当する配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーは、発現ベクターpHCE 19T(II)に存在する制限酵素BamH Iの認識部位を含むように構成した。ここで、増幅された遺伝子断片は、細胞外膜タンパク質の遺伝子のpgsBのN-末端領域からpgsAのC-末端領域までの範囲の約2.8 kbの大きさであった。ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅された遺伝子断片を制限酵素NcoIとBamHIで消化し、すでにNco IとBamH Iで消化された構成的な高発現ベクターpHCE 19T(II)に挿入した。結果として、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞内膜タンパク質の遺伝子を含む新規発現ベクターは、翻訳終止コドンを含まず、新しい更なる制限酵素の認識部位を含み、約6.5 kbの大きさであり、配列番号6に記載された塩基配列を有しており、そして発現ベクターpGNBCAと命名された(図1参照)。
【００５２】
本表面発現用のベクターは大腸菌に形質転換され、得られた大腸菌は、韓国生命工学研究院の遺伝子銀行(KCTC, 大韓民国 大田広域市)に、２００１年７月２６日付けでKCTC 10025BPの受託番号で寄託した。
【００５３】
実施例２：表面発現用の組換えベクターpGNBCA-HB168の製造
バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現できる組換え発現ベクターpGNBCA-HB168を製造した。
【００５４】
グラム陰性微生物を宿主にする表面発現用ベクターpGNBCAにＢ型肝炎ウィルスS抗原の遺伝子を導入するために、汎用のクローニングベクターのpUC8に含まれる約1.4 kbのB型肝炎ウィルス遺伝子を鋳型として用い、配列番号7及び配列番号8の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、S抗原遺伝子を増幅するように、鋳型およびプライマーを用い行った。結果として、増幅された遺伝子断片は168 bp大きさであった。
【００５５】
ここで、上記配列番号7及び配列番号8のプライマーは、制限酵素BamHIとHindIIIの認識部位が存在するように構成されていた。上記増幅されたB型肝炎ウィルスのＳ抗原遺伝子を制限酵素BamHI、HindIIIで消化し、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子の既に用意のC-末端領域に、翻訳コドンを合わせて連結した。得られた組換え発現ベクターpGNBCA-HB168を図１に示した。
【００５６】
実施例3：組換え発現ベクターpGNBCA-HB168を用いたＢ型肝炎ウィルスＳ抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
上記の組換え発現用のベクターpGNBCA-HB168を用いてB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現を調べた。
【００５７】
実施例2で制作された発現ベクターを大腸菌に形質転換させ、抗生物質のアンピシリン100 mg/Lの添加された50 mlのLB培地（酵母エキス5 g/L、トリプトン 10 g/L, NaCl 5 g/L、 pH 7.0）を含む500 ml フラスコ中で培養することで表面発現を誘導した。
【００５８】
ポリ-γ-グルタミン酸を合成する遺伝子のC-末端と融合されたS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の細菌発現は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行って確認した。具体的には同一な細胞濃度から得たタンパク質を変性(denature)させて、それによって実験試料を準備し、次いでこれをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析して、それによって分画されたタンパク質をPVDF メンブランに移した。得られたPVDFメンブランをブロッキング緩衝溶液(50 mM トリス塩酸、5 % スキムミルク(skim milk)、pH 8.0)で1時間攪拌し、ブロッキングさせた後、S抗原に対する羊由来のポリクローナル1次抗体をブロッキング緩衝溶液で1000培希釈して12時間反応させた。反応終了後、得られたメンブランは緩衝溶液で洗浄し、ビオチンが結合した2次抗体をブロッキング緩衝溶液で1000倍希釈して4時間反応させた。反応したメンブランは緩衝溶液で再洗浄し、アビジン-ビオチン(avidin-biotin)試薬に1時間浸し、洗浄した。浸された(submersed)メンブランに、基質と発色試薬でH202とDAB溶液を添加して発色させ、S抗原および上記融合タンパク質に対する抗体との特異的な結合を確認した（図２のA）。図２から、レーン１は形質転換されてない宿主細胞のJM109、レーン2は形質転換されたpGNBCA-HB168/JM109である。図面から見られるように、発現ベクターpGNBCA-HB168によって約48kDaの融合タンク質のバンドが確認された。
【００５９】
また、Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が大腸菌の表面に位置されて発現したのを直接確認するために、表面発現を誘導した大腸菌形質転換体を超音波破砕し、可溶画分、細胞内膜画分、および外膜分画による細胞外膜画分に分離し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行って確認した。具体的には、上記のような、細胞表面における融合タンパク質の発現の誘導に使用された大腸菌形質転換体および形質転換されてない大腸菌を回収し、同一な濃度になるようにし、そして緩衝溶液(10mM HEPES buffer, pH 7.4)で数回洗浄させた。その後、得られたものを、10 ｇ/ml リゾチーム、1 mM PMSF および1 mM EDTAが含まれた緩衝溶液で浮遊させて4℃で10分間反応させ、DNase (0.5 mg/ml)とRNase (0.5 mg/ml)を添加し、当該混合物をソニケーターで破砕し、未処理大腸菌と細胞残骸を4℃、20分間、10,000 X g の遠心分離により分離された。大腸菌の細胞残骸を4℃、2分間、15,000 X gの遠心分離をし、ペリプラズムと細胞質のタンパク質を含む画分を回収した。そして得られた細胞ペレットは、1% サルコシル (N-ラウリル サルコシネート、ナトリウム塩)を含むPBS緩衝溶液(pH 7.4)中に浸され、4℃、2時間、15,000 X gの遠心分離をし、分離した。
【００６０】
ここで、上清は、大腸菌の内膜中に、細胞ペレットは大腸菌の外膜タンパク質に分画され、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＳ抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って分析した。上記大腸菌画分中、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が細胞外膜で確認された。(図2参照；Ａ：ウェスタンブロティング後の大腸菌の膜画分の結果)。図２に示すように、レーン1は、形質転換されてないJM109株、レーン2は、大腸菌形質転換体pGNBCA-HB168/JM109の全細胞であり、レーン3は、大腸菌形質転換体pGNBCA-HB168/JM109の可溶性画分であり、レーン4は、大腸菌形質転換体pGNBCA-HB168/JM109の細胞内膜画分、およびレーン5は、大腸菌形質転換体pGNBCA-HB168/JM109の細胞外膜画分を示す。
【００６１】
S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基は、ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼタンパク質のC-末端により大腸菌の表面へ発現されることを蛍光-活性細胞選別測定方法(Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow  cytometry)で確認した。免疫蛍光(immunofluorescence)染色のために、表面発現の誘導に使用した大腸菌を同一な細胞濃度になるように回収し、PBS緩衝溶液(pH 7.4)で数回洗浄した。得られた細胞ペレットを、1%牛血清アルブミンを含有する緩衝溶液1 mlを用い懸濁し、S抗原に対する羊由来のポリクローナル１次抗体を1000倍希釈して4℃で12時間反応させた。反応終了後、得られた細胞を再び数回洗浄し、1%牛血清アルブミンを含有している緩衝溶液1 mlに懸濁し、ビオチンが結合されている2次抗体を1000倍希釈して4℃で3時間反応させた。また、反応が済んだ細胞は緩衝溶液で数回洗浄し、1％牛血清アルブミンを含む緩衝溶液0.1 mlで懸濁し、ビオチンに特異的なストレプトアビジンR-フィコエリトリン(streptavidin-R-phycoerythrin)染色薬を1000倍希釈して結合させた。
【００６２】
その後、大腸菌を数回洗浄し、蛍光-活性細胞選別測定方法で測定した。結果として、形質転換されてない大腸菌とは異なるようにS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基のタンパク質が細胞表面へ発現されることを確認した(図2のB参照)。図２に示すように、白色のバンドは、形質転換されてない大腸菌JM109を示し、黒色のバンドは、形質転換体pGNBCA-HB168/JM109から由来されたものを示している。その結果として、形質転換されてない大腸菌は、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定タンパク質が発現されてないが、本発明の表面発現用ベクターによって形質転換された大腸菌より明確に確認された。
【００６３】
実施例4：組換え表面発現用のベクターpGNCA-HB101の作製及びB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
(1)B型肝炎ウイルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現することができる組換え発現ベクターは、バチルス属菌株で由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)を用い、グラム陰性微生物を宿主として製造した。
【００６４】
上記遺伝子pgsCAは、配列番号2に記載された塩基配列で表示されるDNAのpgsC及び配列番号3に記載された塩基配列で表示されるDNAのpgsAが連続されている塩基配列を有する。
【００６５】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質遺伝子のpgsCとpgsAをコードするN-末端とC-末端遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型に用い、N-末端には配列番号9、C-末端には配列番号5の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００６６】
N−末端に相当する配列番号9の配列を含むプライマーはまた、制限酵素Nde Iの認識部位を含むように構成した。ここで、増幅された遺伝子の領域は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsCのN-末端領域からpgsAのC-末端領域まで約1.6 kbの大きさであった。
【００６７】
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素Nde IとBamH Iで切断して既にNde IとBamH Iで切断した構成的な高発現ベクターのpHCE 19T(II)に挿入し、それにより、細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく新しい制限酵素の認識部位が加えられた約5.3 kbの大きさの新しい発現ベクターを作製してこれをpGNCAで命名した(図3参照)。
【００６８】
(2)B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpGNCA-HB168を前記の実施例２での同一な方法で作製した。詳細には、当該組換え発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsCとpgsAを用い、グラム陰性微生物を宿主として、作製した。
【００６９】
このように作製した組換え発現ベクターpGNCA-HB168を図３に示した。
【００７０】
(3)上記の表面発現用のベクターpGNCA-HB168を用いてB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現を以下のように調査した。
【００７１】
上記の表面発現ベクターを大腸菌宿主細胞に形質転換させて、前記の実施例3と同一な過程で発現を誘導した。次いで、細胞外膜タンパク質pgsCAと融合されたS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が大腸菌で発現されていることを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図4参照)。
【００７２】
図4に示すように、レーン1は形質転換されてない宿主細胞のJM109、レーン2は形質転換されたpGNCA-HB168/JM109である。図面で見られるように、組換え発現ベクターpGNCA-HB168によって約48 kDaの融合タンパク質のバンドが確認された。
【００７３】
実施例5：組換え表面発現ベクターpGNA-HB168の作製及びB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中pgsAを用い、グラム陰性微生物を宿主にし、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターを作製した。
【００７４】
前記遺伝子pgsAは配列番号3に記載されたヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜のタンパク質遺伝子由来のpgsAタンパク質をコードするN-末端とC-末端の遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用い、N-末端には配列番号10のヌクレオチド配列およびC-末端には配列番号5のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００７６】
N-末端に相当する配列番号10の配列を含むプライマーはまた、制限酵素Nde Iの認識部位を含むように構成した。ここで、増幅される遺伝子の領域は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsAのN-末端領域からC-末端領域まで約1.1 kbの大きさであった。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素Nde IとBamH Iで切断して既にNde IとBamH Iで切断した構成的な高発現ベクターのpHCE 19T(II)に挿入し、それにより、細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく新しい制限酵素の認識部位が加えられた約4.8 kbの大きさの新しい発現ベクターを作製してこれをpGNAとして命名した(図5参照)。
【００７８】
(2)B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpGNA-HB168を前記の実施例2と同じ方法で作製した。詳細には、当該組換え発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsAを用い、グラム陰性微生物を宿主にして、作製した。
【００７９】
このように作製した組換えベクターpGNA-HB168を図5に示した。
【００８０】
(3)上記の表面発現用のベクターpGNA-HB168を用いてB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現を以下のように調査した。
【００８１】
上記の表面発現ベクターを大腸菌宿主細胞に形質転換させて、実施例3と同一な過程で発現を誘導した。次いで、細胞外膜のタンパク質pgsAと融合されたS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が大腸菌形質転換体で発現されていることを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図5参照)。
【００８２】
図5に示すように、レーン1は形質転換されてない宿主細胞のJM109、レーン2は形質転換されたpGNA-HB168/JM109である。図面で見られるように、組換え発現ベクターpGNA-HB168によって約48 kDaの融合タンパク質のバンドが確認された。
【００８３】
また、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が細胞外膜タンパク質pgsAにより大腸菌細胞の表面に発現されていることを蛍光-活性細胞選別測定方法(Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)で確認した。この目的ために、実施例3と同一な過程を用い、そして形質転換されてない大腸菌の結果とは全く異なり、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が細胞表面で検出された(図4参照)。図４に示されるように、白色のバンドは形質転換されてないJM109、黒色のバンドは大腸菌形質転換体pGNA-HB168/JM109から得たものである。結果として、形質転換されてない大腸菌ではS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が発現されていないが、pgsA遺伝子だけを持っている表面発現用のベクターにより形質転換された大腸菌形質転換体ではS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現が明確に確認された。
【００８４】
実施例6：組換え表面発現ベクターpGNHB-Aの作製及びB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)由来のpgsA遺伝子のN-末端を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現できる組換え発現ベクターを作製した。
【００８５】
上記の遺伝子pgsAは配列番号3に記載されたヌクレオチド配列を含む。
【００８６】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜のタンパク質遺伝子由来のpgsAタンパク質をコードするN-末端とC-末端の遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用い、N-末端には配列番号11のヌクレオチド配列およびC-末端には配列番号12のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００８７】
N-末端に相当する配列番号11の配列を含むプライマーはまた、制限酵素Bam HIの認識部位を含むように構成した。ここで、増幅される遺伝子の領域は、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsAのN-末端領域からpgsAのC-末端領域まで約1.1 kbの大きさである。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素BamH IとHindIIIで切断して、既にBamH IとHindIIIで切断した構成的な高発現ベクターのpHCE 19T(II)に挿入し、それにより、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく、pgsAの遺伝子の前に新しい制限酵素の認識部位が加えた約4.8 kbの大きさの新しい発現ベクターを作製してこれをpGNA2として命名した(図6参照)。
【００８８】
(2)B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpGNHB-Aもまた構成した。詳細には、当該組換え発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsAのN-末端配列を用い、グラム陰性微生物を宿主細胞として、作製した。
【００８９】
B型肝炎ウィルスS抗原遺伝子を表面発現ベクターpGNA2に導入するために、グラム陰性微生物を宿主細胞として用いつつ、汎用クローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.4 kbの肝炎ウィルスの遺伝子を鋳型として用い、配列番号13のヌクレオチド配列および配列番号14のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行ってＳ抗原の遺伝子を増幅した。このとき、増幅された遺伝子の領域は1.6 bpの大きさであった。
【００９０】
上記の配列番号13及び配列番号14のヌクレオチド配列を有するプライマーはまた、表面発現ベクターpGNA2中に存在する制限酵素NdeIとBamH Iの認識部位を含むように構成した。上記の増幅されたＢ型肝炎ウィルスＳ抗原遺伝子を制限酵素NdeIおよびBamH Iで切断して、既に用意されている表面発現用のベクターpGNA2のポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜遺伝子中のpgsA遺伝子のN-末端領域に、翻訳コドンを合わせて連結した。このように作製した組換え発現ベクターpGNHB-Aを図6に示す。
【００９１】
(3)上記の表面発現用のベクターpGNHB-Aを用いてB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現を以下のように調査した。
【００９２】
上記の表面発現ベクターを大腸菌宿主細胞へ形質転換させて、実施例3と同一な過程で発現を誘導した。次いで、細胞外膜タンパク質pgsCAと融合されたS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が大腸菌形質転換体で発現されていることを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図5参照)。
【００９３】
図５に示すように、レーン1は形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2は形質転換されたpGNHB-A/JM109である。図面で見られるように、組換え発現ベクターpGNHB-Aから発現した約48 kDaの融合タンパク質のバンドが確認された。
【００９４】
実施例7：組換え表面発現ベクターpGNC-PreS1の作製及びＢ型肝炎ウィルスのPres1抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsCのC-末端を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターを作製した。
【００９５】
上記の遺伝子pgsCは配列番号2に記載されたヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜のタンパク質のpgsAタンパク質をコードするN-末端とC-末端の遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用い、N-末端には配列番号15のヌクレオチド配列およびC-末端には配列番号16のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００９７】
N-末端に相当する配列番号15の配列を含むプライマーはまた、表面発現ベクターpHCE 19T(II)に存在する制限酵素NdeI認識部位を含むように構成し、配列番号16の配列を含むプライマーは、表面発現ベクターpHCE 19T(II)に存在する制限酵素BamHI認識部位を含むように構成した。ここで、増幅された遺伝子の領域はポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsCのN-末端領域からpgsCのC-末端領域まで約0.45 kbの大きさであった。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素Nde IとBamHIで切断して、既にNde IとBamHIで切断した構成的な高発現ベクターのpHCE 19T(II)に挿入し、それにより、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく、新しい制限酵素の認識部位が加えられた約4.1 kbの大きさの新しい発現ベクターを作製してこれをpGNCとして命名した(図7参照)。
【００９８】
(2)B型肝炎ウィルスPreS1表面抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpGNC-PreS1もまた構成した。詳細には、当該組換え発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsCのN-末端配列を用い、グラム陰性微生物を宿主細胞として用い、作製した。
【００９９】
B型肝炎ウィルスPreS1抗原遺伝子を表面発現ベクターpGNCに導入するために、グラム陰性微生物を宿主細胞として用いつつ、汎用クローニングベクターであるpUC18にクローニングされている約1.5 kbの肝炎ウィルスの遺伝子を鋳型として用い、配列番号17のヌクレオチド配列および配列番号18のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行ってＳ抗原の遺伝子を増幅した。ここで、増幅された遺伝子の領域は356 bpの大きさとなった。
【０１００】
上記の配列番号17及び配列番号18のヌクレオチド配列を有するプライマーはまた、表面発現ベクターpGNC中に存在する制限酵素HindIIIとBamH I認識部位を含むように構成した。上記の増幅されたＢ型肝炎ウィルスPreS1抗原遺伝子を制限酵素HindIIIおよびBamH Iで切断して、既に用意されている表面発現用のベクターpGNCのポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜遺伝子中のpgsC遺伝子のN-末端領域に、翻訳コドンを合わせて連結した。このように作製した組換え発現ベクターpGNC-PreS1を図7に示す。
【０１０１】
(3)上記の表面発現用のベクターpGNC-PreS1を用いたB型肝炎ウィルスのS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現を以下のように調査した。
【０１０２】
上記の発現ベクターを大腸菌宿主細胞へ形質転換させて、実施例3と同じ過程で発現を誘導した。次いで、細胞外膜タンパク質pgsCと融合されたPreS1抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が大腸菌形質転換体で発現されていることをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びPreS1抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図8参照)。
【０１０３】
図8に示すように、レーン1は形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2および3は形質転換されたpGNC-PreS1/JM109である。図面で見られるように、組換え発現ベクターpGNC-PreS1から発現した約27 kDaの融合タンパク質のバンドが確認された。
【０１０４】
実施例8：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:BCAおよびpHCE1LB:BCA-HB168の作製及びＢ型肝炎ウィルスのS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsCのC-末端を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpHCE1LB:BCAを作製した。
【０１０５】
グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方において複製及び選別ができるクローニングベクターとしてはプラスミドpHCE1LBを用いた。上記の発現ベクターpHCE1LBは構成的な高発現のHCE プロモーターを持っており、さらには多様な制限酵素部位を持つクローニング部位があり、グラム陰性菌でも複製ができるオリジン(origin)及びアンピシリンの抗生物質耐性マーカーを持っている。また、発現ベクターpHCE1LBはグラム陽性菌で複製ができるようにラクトバチルス属由来のオリジン及びクロラムフェニコールの抗生物質耐性マーカーを有していた。
【０１０６】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質のpgsBCAタンパク質をコードするN-末端とC-末端の遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用い、N-末端には配列番号4のヌクレオチド配列およびC-末端には配列番号5のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ここで、増幅された遺伝子の領域はポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsBのN-末端領域からpgsAのC-末端領域まで約2.8 kbの大きさであった。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素NcoIとBamHIで切断して、既にNco IとBamH Iで切断した発現ベクターであるpHCE1LBに挿入して、それにより、ポリガンマグルタミンの合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく、新しい制限酵素の認識部位が加えられた約8 kb大きさの、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物の両方を宿主細胞とする新しい発現ベクターを作製してこれをpHCE1LB:BCAとして命名した(図9参照)。
【０１０７】
(2)B型肝炎ウィルスS表面抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168もまた構成した。詳細には、当該組換え発現ベクターは、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)を用い、グラム陰性微生物を宿主として用い、前記と同じ方法で作製した。
【０１０８】
このように作製した組換え発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168を図9に示す。
【０１０９】
(3)上記の表面発現用のベクターpHCE1LB:BCA-HB168を用い、グラム陰性菌であるサルモネラチーピ(Salmonella typhi)Ty21aでB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の発現を以下のように調査した。
【０１１０】
上記の表面発現ベクターをサルモネラチーピTy21a宿主細胞へ形質転換させ、上記実施例3と同じ方法を用い発現を誘導した。次いで、抗原決定基がサルモネラチーピTy21aの細胞表面に発現されることを、可溶性画分、内膜画分および外膜画分を分離し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行うことにより、外膜分画法で行った。その結果として、48 kDaのバンドに相当するpgsAと融合されたS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の産生がサルモネラチーピTy21a画分の外膜画分中で生ずる(situate)ことを確認した(図10参照)。図10に示すように、レーン1は形質転換されてない菌株、レーン2は形質転換された菌株の全体細胞、およびレーン3、4及び５は、それぞれ、形質転換された菌株の可溶性画分、内膜画分及び外膜画分である。
【０１１１】
また、S抗原の中和抗体を形成する抗原決定基が表面に発現されていることを蛍光-活性細胞選別測定方法(Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)で確認した。この目的ために、上記実施例3と同一な過程を用い、そして形質転換されてないサルモネラチーピTy21aの結果とは全く異なり、抗原決定基タンパク質が細胞表面で検出された(図10参照)。図10に示されるように、矢印がない黒色は、形質転換されてないサルモネラチーピTy21a、矢印で表示された黒色は、形質転換されたサルモネラチーピTy21aである。結果として、表面発現用のベクターにより形質転換された大腸菌形質転換体は、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の細胞表面での発現が明確に確認された。
【０１１２】
実施例9：B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現する微生物のワクチン効果の分析
前記実施例8で作製された表面発現用の組換えベクターpHCE1LB:BCA-HB168をグラム陰性菌のサルモネラチーピTy21aへ形質転換させ、実施例3と同じ方法で細胞表面に発現を誘導した。その後、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質と融合されたB型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の抗原性を調査した。
【０１１３】
具体的には、表面発現のための組換えベクターpHCE1LB:BCA-HB168をサルモネラチーピTy21aへ形質転換させ、上記抗原の発現が確認した。その後、幾らかのサルモネラチーピ株をBALB/cマウスの鼻腔に投与し、次いで、数日後、(1)マウスの血清を取り、血清内のS抗原に対するIgG抗体の存在を検査し、(2)マウスの器官を回収し、次いで、当該器官を洗浄した懸濁液中のS抗原に対するIgA抗体の存在をELISA方法(ELISA、Enzyme-linked Immunosorbent assay)で確認した。
【０１１４】
ここで、回収した細胞をPBS緩衝溶液(pH7.4)で数回洗浄し、同一の細胞濃度となるように調節し、次いで、抗原が表面発現する2 X 109のサルモネラチーピTy21aを、4-6週齢のBALB/c マウスの鼻腔に3日間隔で二回、投与した。4週間後、更に三日間隔で二回投与し、次いで、2週間後のマウスの血清及び器官の洗浄に使用した溶液を回収し、S抗原を用いたELISA方法で抗原に対する抗体価を測定した(図11参照)。
【０１１５】
図11に示すように、Aのグラフは血清内のS抗原決定基に対するIgG抗体価を示し、すなわち、発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたサルモネラの抗体価、発現ベクターpHCE1LB:HB168で形質転換されたサルモネラの抗体価、形質転換されてないサルモネラの抗体価。図11では、Bのグラフは器官内のS抗原決定基に対するIgA抗体価を示し、すなわち、形質転換されてないサルモネラの抗体価、発現ベクターpHCE1LB:HB168で形質転換されたサルモネラの抗体価、発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたサルモネラの抗体価。
【０１１６】
図11に示すように、表面発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたサルモネラチーピTy21a形質転換体を投与したBALB/cマウス群の器官の洗浄に使用した溶液および血清は、他の群の結果とは明確に異なり、IgG抗体価及びIgA抗体価をより非常に高く示した。
【０１１７】
そこで、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を細胞表面で発現する本発明の微生物は、生ワクチンとして効果的に作用できることを確認した。
【０１１８】
実施例10：発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168を形質転換したグラム陽性菌での、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現
前記実施例8のように、表面発現のため構成された発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換したグラム陽性菌ラクトバチルスカゼイでの、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現を調査した。
【０１１９】
上記のように作製した表面発現に使用する組換えベクターをラクトバチルスカゼイに形質転換し、抗生物質クロラムフェニコール50 mg/Lを加えた200 mlのMRS培地を含む500 ml フラスコ中、静置培養で増殖させ、表面発現を誘導した。
【０１２０】
ラクトバチルスカゼイの細胞表面に存在する抗原決定基を位置づけるため、細胞形質転換体を、細胞壁分画法で細胞質と細胞壁などのような画分に分離し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びS抗原に対する抗体を用いてウェスタンブロティングを行い分析した。具体的に、融合タンパク質の細胞表面での発現が誘導されたラクトバチルスおよび形質転換されてないラクトバチルスを同一な細胞濃度になるように回収し、TES緩衝液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 25% スクロース)で数回洗浄し、5 mg/ml リゾチーム、1 mM PMSF、および1 mM EDTAが含まれた蒸留水に懸濁し、次いで、-60℃と室温をそれぞれ何回か行い凍結と融解行った。得られた細胞を、DNase (0.5 mg/ml)とRNase (0.5 mg/ml)を添加して超音波で細胞を破砕した。その後、超音波をかけた細胞溶液を4℃、20分間、10,000 X g 遠心分離し、全ラクトバチルスのペレット(全細胞画分)、すなわち、破砕されてない細胞と細胞残骸(上清液)とに分離し、次いで、4℃、1時間、21,000 X gで再び遠心分離し、ラクトバチルスの細胞質タンパク質を含む上清液(可溶性画分)と細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを、1% SDSを含むTE溶液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, pH 7.4)に懸濁させ、ラクトバチルスの細胞壁タンパク質(細胞壁画分)を回収した。
【０１２１】
各々の画分を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びＳ抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行って分析し、抗原決定基がS抗原に対する中和抗体を形成する、細胞壁上の部位を確認した(図12A参照)。図12に示すように、レーン1、3、5は、形質転換されてないラクトバチルスカゼイ、レーン2は、発現ベクターpHCE1B:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルスカゼイの全細胞、レーン4及び6は、それぞれ、形質転換された細胞の可溶性画分及び細胞壁画分である。
【０１２２】
また、ポリ-γ-グルタミン酸シンテターゼタンパク質のＣ-末端由来のS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の表面発現は、蛍光-活性細胞選別測定方法(Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)で確認した。この目的のために、実施例3と同じ過程を用い、形質転換されてないラクトバチルスの結果とは全く異なり、抗原決定基タンパク質が細胞表面で確認された(図12B参照)。図12Bに示すように、白色のバンドは、形質転換されてないラクトバチルス、黒色のバンドは、発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルスから得たものである。結果として、表面発現ベクターで形質転換されたラクトバチルス形質転換体は、S抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基が細胞表面で発現されていることを明確に示した。
【０１２３】
実施例11：Ｂ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を細胞表面で発現する微生物中でのワクチン効果２の分析
実施例8で表面発現のため作製された組換えベクターpHCE1LB:BCA-HB168をグラム陽性菌のラクトバチルスカゼイに形質転換させ、実施例3と同じ方法で細胞表面に発現を誘導した。その後、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質と融合されたＢ型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基の抗原性を調査した。
【０１２４】
具体的には、表面発現のため作製した組換えベクターpHCE1LB:BCA-HB168をラクトバチルスカゼイに形質転換させ、同一の細胞濃度になるように収穫し、PBS緩衝溶液(pH7.4)で数回洗浄した。次いで、抗原が表面発現した5 X 1010のラクトバチルスの細胞を4-6週齢のBALB/c マウスの口腔に1日間隔で3回投与し、次いで、4週間後、更に１日間隔で３回投与した。また抗原が表面発現した1 X 1010のラクトバチルスの細胞をBALB/c マウスの鼻腔に3日間隔で二回投与し、4週間後、更に三日間隔で二回投与した。経口と鼻腔投与後2週後、(1)マウスの血清を回収し、S抗原に対するIgG抗体価を調査し、(2)マウスの器官を回収し、当該器官の洗浄に使用した懸濁溶液内のS抗原に対するIgA抗体価を、ELISA方法を用い測定した(図13参照)。
【０１２５】
図13に示すように、Aのグラフは血清内のS抗原決定基に対するIgG抗体価を示し、すなわち、鼻腔に投与された群における発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルスの抗体価、経口投与した群における発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルスの抗体価、鼻腔に投与した群における発現ベクターpHCE1LB:HB168で形質転換されたラクトバチルスの抗体価、経口投与した群における発現ベクターpHCE1LB:HB168(pgsBCAが除去され、細胞内でHB168を発現し得る)で形質転換されたラクトバチルスの抗体価、経口投与した群における形質転換されてないラクトバチルスの抗体価。図13では、Bのグラフは器官のS抗原決定基に対するIgA抗体価を示し、すなわち、形質転換されてないラクトバチルスの抗体価、発現ベクターpHCE1LB:HB168で形質転換されたラクトバチルスの抗体価、発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルスの抗体価。実験は鼻腔投与群と経口投与群の別の群を用いて実施された。
【０１２６】
図11で示したように、表面発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168で形質転換されたラクトバチルス形質転換体を投与したBALB/cマウス群の器官の洗浄に使用した溶液および血清は、比較の群の結果とは明確に異なり、IgG抗体価及びIgA抗体価をより非常に高く示した。
【０１２７】
従って、B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を細胞表面で発現する本発明の微生物は、生ワクチンとして効果的に作用できることを確認した。
【０１２８】
実施例12：表面発現ベクターpHCE1LB:Aの作製
B型肝炎ウィルスS抗原に対する中和抗体を形成する抗原決定基を発現し得る組換え発現ベクターは、バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsAのみを用い、表面発現ベクターpHCE1LB:Aを作製し、それは、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物を宿主とした。
【０１２９】
ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質中のpgsAタンパク質をコードするN-末端とC-末端の遺伝子を得るために、上記の総染色体を鋳型として用い、N-末端には配列番号10、C-末端には配列番号5のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【０１３０】
ここで、増幅される遺伝子の領域はポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している外膜タンパク質の遺伝子であるpgsAのN-末端領域からC-末端領域まで約1.1 kbの大きさであった。ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された遺伝子を制限酵素Nde IとBamH Iで切断して、既にNde IとBamH Iで切断された発現ベクターであるpHCE1LBに挿入して、それにより、細胞外膜タンパク質の遺伝子の終わりに終止コドンがなく、新しい制限酵素の認識部位が加えられた約6.3 kb大きさの、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物の両方を宿主細胞とする能力のある新しい発現ベクターを作製してこれをpGNCAとして命名した(図14参照)。
【０１３１】
実施例13：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1の作製及びTGE N抗原の表面発現
豚の伝染性消化器の疾病を誘発する伝染性胃腸炎ウィルス(Transmissible Gastroenteritis virus, TGE)の核タンパク質(N)抗原を細胞表面で発現し得る組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1を、バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsAを用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主細胞として、作製した。
【０１３２】
グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主として用い、実施例12で作製された表面発現ベクターpHCE1LB:AにTGEウィルスのN抗原遺伝子の主要抗原決定基領域を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.1 kbのTGEウィルスの遺伝子を鋳型として用い、配列番号19及び配列番号20のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、S抗原の遺伝子を増幅した。結果として、増幅された遺伝子断片は415 bpの大きさであった。ここで、配列番号19及び配列番号20のヌクレオチド配列を有するプライマーはまた、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに存在する制限酵素BamHIとHindIIIの認識部位を含むように構成された。
【０１３３】
その後、TGEウィルスの増幅されたN抗原遺伝子を制限酵素BamHIおよびHindIIIで切断し、既に用意された、表面発現ベクターpHCE1LB:Aの細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsA)のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結した。得られた組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1を図1に示した。
【０１３４】
TGEウィルスのN抗原の表面発現を、組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1を用い大腸菌及びラクトバチルスで調査した。この目的のために、組換え発現ベクターを大腸菌及びラクトバチルスへ形質転換させ、上記と同じ過程で発現を誘導させた。次いで、細胞外膜タンパク質と融合されたTGE N抗原の細胞表面での発現を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びTGE N抗原に対する抗体とpgsAタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロティングを行って確認した(図15参照)。
【０１３５】
図15で示すように、Aにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2、3は細胞形質転換体pHCE1LB:A-TGEN1/JM109であり、Bにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるラクトバチルスカゼイ、レーン2、3は、形質転換されたpHCE1LB:A-TGEN1/ラクトバチルスカゼイである。結果として、発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1から産生される融合タンパク質に相当するバンドは、約57 kDaであった。
【０１３６】
実施例14：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNの作製及びPED N抗原の表面発現
(1)豚伝染性消化器の疾病を誘発する豚伝染性下痢病ウィルス(Porcine Epidemic Diarrhea virus, PED)の核タンパク質(N)抗原を細胞表面で発現し得る組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNを、バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsAを用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主細胞として、作製した。
【０１３７】
グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主として用い、実施例12で作製された表面発現ベクターpHCE1LB:AにPEDウィルスのN抗原遺伝子の抗原決定基領域を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.3 kbのPEDウィルス遺伝子を鋳型として用い、配列番号21及び配列番号22のヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、S抗原の遺伝子を増幅した。結果として、増幅された遺伝子断片は1326 bpの大きさであった。ここで、配列番号21及び配列番号22のヌクレオチド配列を有するプライマーはまた、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに存在する制限酵素BamH IとHind IIIの認識部位を含むように構成された。
【０１３８】
その後、PEDウィルスの増幅されたN抗原遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、既に用意された、表面発現ベクターpHCE1LB:Aの細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsA)のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結した。得られた組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNを図14に示した。
【０１３９】
(2)PEDウィルスのN抗原の表面発現を、組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNを用い大腸菌及びラクトバチルスで調査した。この目的のために、組換え発現ベクターを大腸菌及びラクトバチルスへ形質転換させ、上記と同一の過程で発現を誘導させた。次いで、細胞外膜タンパク質pgsAと融合されたPED N抗原の細胞表面での発現を、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びPED N抗原に対する抗体とpgsAタンパク質に対する抗体をそれぞれ用いるウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行って確認した(図16参照)。
【０１４０】
図16で示すように、Aにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2および3は、形質転換されたpHCE1LB:A-PEDN/JM109であり、Bにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるラクトバチルスカゼイ、レーン2は、形質転換されたpHCE1LB:A/ラクトバチルスカゼイであり、そしてレーン3は、形質転換されたpHCE1LB:A-PEDN/ラクトバチルスカゼイである。
【０１４１】
図面で見られるように、発現ベクターpHCE1LB:A-PEDNから産生される融合タンパク質に相当するバンドは、約90kDaの大きさであった。
【０１４２】
実施例15：TGEウィルス及びPEDウィルスのN抗原を細胞表面に発現するラクトバチルスの生ワクチン効果２の分析
前記実施例13及び14で作製された表面発現用の組換えベクターpHCE1LB:A-TGEN1およびpHCE1LB:A-PEDNをグラム陽性菌のラクトバチルスカゼイへそれぞれ形質転換させ、実施例3と同一な方法で細胞表面に発現を誘導した。その後、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質pgsAと融合されたTGEウィルスのN抗原及びPEDウィルスのN抗原の抗原性を調査した。
【０１４３】
具体的には、表面発現のため作製した組換えベクターpHCE1LB:A-TGEN1およびpHCE1LB:A-PEDNをラクトバチルスカゼイへ形質転換させ、同一な細菌濃度になるように回収し、PBS緩衝溶液(pH7.4)で数回洗浄した。次いで、N抗原が表面発現した5 X 109細胞のラクトバチルスを4-6週齢のBALB/c マウスの口腔に独立して1日間隔で3回投与した。1週後、１日間隔で３回投与した。次いで、初めの投与から4週後、(1)マウスの血清を回収し、N抗原に対するIgG抗体の産生を、N抗原を用いて行ったェスタンブロティングで確認した(図17参照)。
【０１４４】
その結果、図17で示すように、表面発現ベクターpHCE1LB:A:TGEN1(A)及びpHCE1LB:A-PEDN(B)の何れかで形質転換させたラクトバチルス形質転換体を投与したBALB/c マウス群の血清で、N抗原に対する抗体が含まれていることを確認した。
【０１４５】
実施例16：表面発現用組換えベクターpHCE1LB:A-PreS1の作製及びPreS1抗原の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsAだけを用い、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物を宿主にして、B型肝炎ウィルスS抗原からPreS1抗原を細胞表面に発現し得る組換え発現ベクター、すなわち、pHCE1LB:A-PreS1を作製した。
【０１４６】
宿主細胞としてグラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を用い、実施例12で作製したように、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに、B型肝炎ウィルス表面抗原中のPreS1抗原決定基を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.5 kbのB型肝炎ウィルス遺伝子を鋳型として用い、配列番号17及び配列番号18のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【０１４７】
ここで、増幅されたHBVのS抗原の遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、既に用意されている発現ベクターpHCE1LB:Aに、細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsA)のC-末端で翻訳コドンを合わせて連結し、それにより、pHCE1LB:A-PreS1と称する新しい組換え発現ベクターを作製し、図18に示す。
【０１４８】
(2)HBVのPreS1抗原の表面発現を、組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1を用い大腸菌で調査した。この目的のために、組換え発現ベクターを大腸菌へ形質転換させ、実施例3と同一の過程で発現を誘導させた。次いで、細胞外膜タンパク質pgsAと融合されたPreS1抗原の細胞表面での発現をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びPreS1抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図20でのA参照)。
【０１４９】
図20で示すように、Aにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2は、形質転換されたpHCE1LB:A-PreS1/JM109である。
【０１５０】
結果として、発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1から産生される融合タンパク質に相当するバンドは、約 55kDaの大きさであった。
【０１５１】
実施例17：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-PreS2の作製
B型肝炎ウィルス表面抗原中のPreS2抗原を細胞表面に発現し得る組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS2を、バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsA遺伝子を用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主細胞として、作製した。
【０１５２】
宿主細胞としてグラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を用い、実施例12で作製したように、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに、B型肝炎ウィルスのPreS2抗原遺伝子の抗原決定基領域を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.3 kbのB型肝炎ウィルス遺伝子を鋳型に用い、配列番号23および配列番号24のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行ってPreS2抗原遺伝子を増幅した。ここで、増幅された遺伝子領域は約165 bpの大きさであった。配列番号23及び配列番号24のプライマーはまた、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに存在している制限酵素BamH IおよびHind III認識部位を含むように構成された。
【０１５３】
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅したHBVのPreS2抗原遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、既に切断した表面発現ベクターpHCE1LB:Aの細胞外膜タンパク質遺伝子(pgsA)のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結し、これにより、新しい組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS2を作製し、図18に示した。
【０１５４】
実施例18：組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2の作製及びPreS1抗原の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質遺伝子(pgsBCA)の中のpgsAのみを用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主にして、B型肝炎ウィルス表面抗原中のPreS1抗原およびPreS2抗原を融合させた形で細胞表面に発現し得る組換え発現ベクター、すなわち、表面発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2を作製した。
【０１５５】
宿主細胞としてグラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を用い、実施例12で作製したように、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに、B型肝炎ウィルス表面抗原中のPreS1およびPreS2抗原決定基を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約1.5 kbのB型肝炎ウィルス遺伝子を鋳型に用い、配列番号17及び配列番号24のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ここで、増幅された遺伝子領域は522 bpの大きさであった。
【０１５６】
増幅されたHBVのPreS1:PreS2抗原の遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、既に用意された発現ベクターpHCE1LB:Aに、細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsA)のC-末端で翻訳コドンを合わせて連結し、それにより、組換えベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2を作製し、図19に示した。
【０１５７】
(2)HBVのPreS1およびPreS2抗原の表面発現を、組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2を用いて大腸菌で調査した。この目的のために、組換え発現ベクターを大腸菌へ形質転換させ、実施例3と同一の過程で発現を誘導させた。次いで、細胞外膜タンパク質pgsAと融合されたPreS1:PreS2抗原の細胞表面での発現をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びPreS1抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティング(western immunoblotting)を行って確認した(図20でのA参照)。図20で示すように、Aにおいて、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン3は、形質転換されたpHCE1LB:A-PreS1:PreS2/JM109である。
【０１５８】
結果として、発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1から産生される融合タンパク質に相当するバンドは、約60kDaの大きさであった。
【０１５９】
実施例19：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-Lの作製及びL抗原の表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsAを用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主にして、B型肝炎ウィルス表面抗原中のPreS1、PreS2、およびS抗原を融合させた形で細胞表面に発現し得る組換え発現ベクター、すなわち、pHCE1LB:A-Lを作製した。配列番号25のプライマーもまた、表面発現ベクターpHCE1LB:A中に存在する制限酵素BamHIおよびHindIII認識部位を含むように作製された。
【０１６０】
増幅されたB型肝炎ウィルスのL遺伝子を制限酵素BamHIおよびHind IIIで切断し、既に用意されている細胞外膜遺伝子由来のpgsA遺伝子のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結した。組換え発現ベクターpHCE1LB:A-Lを図19に示す。
【０１６１】
(3)PreS1、PreS2およびS抗原からなる融合抗原であるL抗原の表面発現を、表面発現ベクターpHCE1LB:A-Lを用いて大腸菌で調査した。この目的のために、表面発現ベクターを大腸菌宿主細胞へ形質転換させ、実施例3と同一の過程で発現を誘導させた。次いで、大腸菌形質転換体中の細胞外膜タンパク質pgsAと融合されたL抗原の発現をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びPreS1抗原に対する抗体を用いたウェスタンブロティングを行って確認した(図20でのB参照)。図20で示すように、レーン1は、形質転換されてない宿主細胞であるJM109、レーン2および3は、形質転換されたpHCE1LB:A-L/JM109である。
【０１６２】
結果として、組換え発現ベクターpHCE1LB:A-Lから発現される融合タンパク質は、約86kDaのバンドとして確認された。
【０１６３】
実施例20：組換え表面発現ベクターpHCE1LB:A-TNF-αの作製
バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsA遺伝子を用い、グラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を宿主にして、医薬および臨床用のタンパク質の中の一つである腫瘍壊死因子α(TNF-α)タンパク質を融合させた形で細胞表面に発現し得る組換え発現ベクター、すなわち、pHCE1LB:A-TNF-αを作製した。
【０１６４】
宿主細胞としてグラム陰性微生物またはグラム陽性微生物を用い、実施例12で作製したように、表面発現ベクターpHCE1LB:Aに、TNF-α遺伝子を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約0.5 kbのTNF-α遺伝子を鋳型に用い、配列番号26及び配列番号27のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ここで、増幅された遺伝子領域は482 bpの大きさであった。配列番号26及び配列番号27のプライマーには表面発現ベクターpHCE1LB:Aに存在している制限酵素BamH IとHind IIIの認識部位を含むように構成された。
【０１６５】
B型肝炎ウィルスの増幅されたL遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜遺伝子のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結した。組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TNF-αを上記のように作製し、図21に示した。
【０１６６】
実施例21：組換え表面発現ベクターpGNA-リパーゼの作製及びリパーゼの表面発現
バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)中のpgsA遺伝子を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、酵素であるリパーゼを細胞表面に発現し得る組換え発現ベクター、すなわち、pGNA-リパーゼを作製した。
【０１６７】
宿主細胞としてグラム陰性微生物を用い、表面発現ベクターpGNAに、リパーゼの遺伝子を導入するために、汎用のクローニングベクターであるpUC8にクローニングされている約0.5 kbのリパーゼ遺伝子を鋳型に用い、配列番号28及び配列番号29のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ここで、増幅された遺伝子領域は546 bpの大きさであった。配列番号28及び配列番号29のプライマーはまた、表面発現ベクターpGNAに存在している制限酵素BamH IおよびHind IIIの認識部位を含むように構成された。
【０１６８】
B型肝炎ウィルスの増幅されたL遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜遺伝子のC-末端領域に翻訳コドンを合わせて連結した。上記のように作製した組換え発現ベクターpGNA-リパーゼを図22に示す。
【０１６９】
(2)大腸菌でのリパーゼの表面発現を、組換え発現ベクターpGNA-リパーゼを用いて調査した。この目的のために、発現ベクターpGNA-リパーゼを大腸菌へ形質転換させ、実施例3と同一の過程で発現を誘導させた。その後、細胞表面で発現されたリパーゼの酵素活性を、オイルデグラデーション(oil degradation)活性を有する1%トリカプリリン(Tricaprylin)を含む寒天培地(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、0.619%NaCl、0.5%アラビアゴム、1 mM CaCl2、1%トリカプリリン)で測定した。大腸菌形質転換体を1%オイル基質を含む寒天培地にまき、次いで、37℃で9時間、静置培養した。
【０１７０】
結果として、オイル基質のデグラデーションが変化し透明な領域となり(図22参照)、細胞表面でのリパーゼの表面発現を確認した。
【０１７１】
実施例22：組換え表面発現ベクターpGNA-アミダーゼの作製及びアミダーゼの表面発現
(1)バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質の遺伝子(pgsBCA)の中のpgsA遺伝子を用い、グラム陰性微生物を宿主にして、酵素であるアミダーゼを細胞表面に発現し得る組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼを作製した。
【０１７２】
宿主細胞としてグラム陰性微生物を用い、表面発現ベクターpGNAに、アミダーゼ遺伝子を導入するために、大腸菌の発現ベクターであるpGNAにクローニングされている約0.8 kbのアミダーゼ遺伝子を鋳型に用いて、配列番号30及び配列番号31のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ここで、増幅された遺伝子領域は792 bpの大きさであった。配列番号30及び配列番号31のプライマーはまた、表面発現ベクターpGNAに存在している制限酵素BamHIとHindIIIの認識部位を含むように構成された。
【０１７３】
B型肝炎ウィルスの増幅されたL遺伝子を制限酵素BamH IおよびHind IIIで切断し、ポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜遺伝子のC-末端領域で、表面発現ベクターpGNAに翻訳コドンを合わせて連結した。上記のように構成した組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼを図23に示した。
【０１７４】
(2)大腸菌でのアミダーゼ遺伝子の表面発現を、組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼを用いて調査した。この目的のために、発現ベクターpGNA-アミダーゼを大腸菌へ形質転換させ、実施例3と同一の過程で発現を誘導させた。その後、細胞表面に発現するアミダーゼの酵素活性を、基質として10mM D-alaNHおよび補助因子として0.5mM CoCl2を含む100mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に大腸菌を加えることにより、測定した。詳細には、アミダーゼが発現する大腸菌を、数時間反応させた後、HPLC[Hypersil ODS (250x4.6mm)カラム]を用いて分析し、細胞増殖のOD600nm値は単位容積として1であった。ここで、野生型大腸菌および表面発現ベクターpGNAを含む細胞形質転換体を用い、細胞表面に発現するアミダーゼの酵素活性の比較に使用した。
【０１７５】
図23で示すように、本発明の大腸菌形質転換体は、対照群により100倍を超えるアミダーゼ活性を示すことが確認された。そのため、本発明の表面発現のための方法は、細胞表面でアミダーゼ効率的に発現することを確認した。
【０１７６】
産業上の利用可能性
上記解説および確認のように、本発明の新規発現ベクターは、バチルス属菌株から由来したポリ-γ-グルタミン酸の合成に関与している細胞外膜タンパク質(pgsBCA)を表面発現キャリアとして用いることにより、微生物の表面に外来タンパク質を効率的に産生させることができ、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の何れにも安定に適用することができる。標的外来タンパク質のための挿入部位を含み、次いで、外来タンパク質をコードする外来遺伝子を連結する表面発現ベクターで形質転換した細胞形質転換体が、作製され、培養され、細胞表面発現が促進される。
【０１７７】
本発明の表面発現ベクターは、細胞周期に関わらず、細胞表面での、種々の外来タンパク質の安定及び容易に検出可能な表面発現に効率的に使用され得る。それゆえ、提唱した微生物表面発現系を用い、種々の抗原、組換え抗体、組換え酵素、および結合または吸着タンパク質の産生に、種々抗原および抗体のスクリーニング、および生物学的転換(biological conversion)のための酵素の産生に用い得る。具体的に、当該酵素は、細胞表面で発現し得、触媒活性を全く減少することなく使用でき、これにより、本発明は、バイオコンバージョン目的に産業的に適用し得る。
【０１７８】
当業者は、上記説明中に開示の観念および特定態様は、本発明と同じ目的を果たすため他の態様を修飾またはデザインする根拠として容易に用いることができると認識するであろう。
【０１７９】
当業者はまた、その等価の態様は、添付の請求項に開示の本発明の精神および範囲から逸脱することはないと認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図1は本発明によるグラム陰性微生物を宿主にする表面発現用ベクター、pGNBCA及び組換えベクターpGNBCA-HB168の遺伝子地図である。
【図２】図2は本発明の組換え発現ベクターpGNBCA-HB168で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光−活性細胞選別測定の結果に基づいている。
【図３】図3は本発明による表面発現用ベクター、pGNCA及び組換え発現ベクターpGNCA-HB168の遺伝子地図である。
【図４】図４は本発明の表面発現の組換えベクター(pGNCA-HB168:A2, pGNA-HB168:A3そしてpGNHB-A:A4)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原基タンパク質の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光−活性細胞選別測定の結果に基づいている。
【図５】図５は本発明の表面発現ベクター、pGNA及び組換え発現ベクターpGNA-HB168の遺伝子地図である。
【図６】図６は本発明による表面発現ベクター、pGNCA2及び組換え発現ベクターpGNHB-Aの遺伝子地図である。
【図７】図７は本発明による表面発現ベクター、pGNC及び組換え発現ベクターpGNC-PreS1の遺伝子地図である。
【図８】図８は本発明の表面発現の組換えベクター(pGNC-PreS1)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスのPreS1タンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングアッセイに基づいている。
【図９】図９は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:BCA及び組換え発現ベクターpHCE1LB:BCA-HB168の遺伝子地図である。
【図１０】図１０は本発明の表面発現の組換えベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陰性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原決定基の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光-活性細胞選別測定の結果に基づいている。
【図１１】図１１は本発明の表面発現ベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陰性微生物の生ワクチン効果を示している。
【図１２】図１２は本発明の表面発現組換えベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陽性微生物でB型肝炎ウィルスの表面抗原決定基の表面発現を示しており、ウェスタンブロティング及び蛍光-活性細胞選別測定の結果に基づいている。
【図１３】図１３は本発明の組換え発現ベクター(pHCE1LB:BCA-HB168)で形質転換されたグラム陽性微生物の生ワクチン効果を示している。
【図１４】図１４は本発明にの表面発現用ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-TGEN1及びpHCE1LB:A-PEDNの遺伝子地図である。
【図１５】図１５は本発明の表面発現組換えベクター(pHCE1LB:A-TGEN1)で形質転換されたグラム陰性微生物（大腸菌）及びグラム陽性微生物で発現されたTGEウィルスのNタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングに基づいている。
【図１６】図１６は本発明の発現組換えベクター(pHCE1LB:A-PEDN)で形質転換されたグラム陰性微生物及びグラム陽性微生物で発現されたPEDウィルスのNタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングに基づいている。
【図１７】図１７は本発明の組換え発現ベクター(pHCE1LB:A-TGEN1及びpHCE1LB:A-PEDN)で形質転換されたグラム陽性微生物の生ワクチン効果を示している。
【図１８】図１８は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1及びpHCE1LB:A-PreS2の遺伝子地図である。
【図１９】図１９は本発明による表面発現ベクター、pHCE1LB:Aと組換え発現ベクターpHCE1LB:A-PreS1:PreS2及びpHCE1LB:A-Lの遺伝子地図である。
【図２０】図２０は本発明の発現組換えベクター(pHCE1LB:A-PreS1, pHCE1LB:A-PreS1:PreS2)でそれぞれ形質転換されたグラム陰性微生物で発現されたＢ型肝炎ウィルスのPreS1またはPreS1:PreS2タンパク質の表面発現のパターン及び発現組換えベクター(pHCE1LB:A-L)で形質転換されたグラム陰性微生物で発現されたＢ型肝炎ウィルスのLタンパク質の表面発現のパターンを示しており、ウェスタンブロティングアッセイに基づいている。
【図２１】図２１は本発明の表面発現ベクターpHCE1LB:A-TNF-aの遺伝子地図である。
【図２２】図２２は本発明の組換え発現ベクターpGNA-リパーゼの遺伝子地図及び組換え発現ベクターpGNA-リパーゼで形質転換されたグラム陰性微生物の細胞表面へ発現されたリパーゼの活性を示している。
【図２３】図２３は本発明の組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼの遺伝子地図及び組換え発現ベクターpGNA-アミダーゼで形質転換されたグラム陰性微生物の細胞表面へ発現されたアミダーゼの活性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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