(57)【要約】      （修正有）【課題】改善された薬物動態性質を示し、強化された効率で核酸などの巨大分子を多種多様の細胞種および組織に送達することができる改善されたカチオン性およびイオン化可能な脂質となる新規化合物、及び該化合物を含む薬学的組成物の提供。【解決手段】下式で示される新規化合物、及び該化合物を含む薬学的組成物の提供。2018095653.tif 000031（Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和/不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル等；Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立して、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニル；ＸがＣ５−Ｃ２０アルキル）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化２６】
2018095653.tif 000029
を有する化合物であって、式中、
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルであり、そして
ｘがＣ５−Ｃ２０アルキルである、
化合物。
【請求項２】
構造：
【化２】
2018095653.tif 000030
を有する化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
前記組成物が、脂質ナノ粒子である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、化学修飾を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡが、酵素またはタンパク質をコードする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡが、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、α−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
Ｃ１４−ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００、ＤＯＰＥ、およびコレステロールをさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
１つ以上の治療薬をさらに含む、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記治療薬が、ポリヌクレオチドである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
対象の疾患を治療するための、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドを形質移入するインビトロでの方法であって、前記１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドが形質移入されるように、前記１つ以上の標的細胞を請求項１５に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、インビトロでの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本出願は、２０１２年３月２９日に出願された米国仮出願第６１／６１７，４６８号の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
核酸のリポソーム送達は、被包されたプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡに基づく療法の部位特異的送達を実現する手段として採用されてきたが、核酸の標的細胞および組織への効率的な送達、ならびに後続のそのような標的細胞および組織への形質移入は、いまだ技術的な課題である。細胞および組織への送達を容易にするための多くのリポソームに基づく系およびビヒクルが利用可能であるにも関わらず、生体内および生体外用途の両方において、多くの問題が尚存在する。例えば、リポソーム送達系の大きな欠点は、所望の標的細胞および／または細胞内区画に達するのに十分な細胞培養または生体内安定性を有するリポソームの構築、ならびにそのようなリポソーム送達系がその被包された材料をそのような標的細胞に効率的に放出する能力に関連する。
【０００３】
さらに、そのようなリポソームに基づくビヒクルを構築するために採用されるカチオン性脂質の多くは、一般的に標的細胞に毒性である。特に、治療有効量の被包された薬剤を送達するために必要であるそのようなカチオン性脂質の量は、標的細胞に毒性であり得る。したがって、カチオン性脂質に関連する毒性は、特に治療有効量の被包された材料を標的細胞に首尾よく送達するために必要な量での非ウイルスベクターとしてのそれらの一般的な使用に大幅な障害を示す。
【０００４】
前述の制限にも関わらず、そして被包された材料を保護し、それを１つ以上の標的細胞に送達するのを容易にするその能力の結果、リポソームに基づくビヒクルは治療薬において魅力的な担体と考えられ、依然開発の努力が続けられている。カチオン性脂質成分を含むリポソームに基づくビヒクルは、被包、安定性、および部位局在化に関して有望な結果を示してきたが、リポソームに基づく送達系の改善の多大な必要性が残存する。特に、改善された薬物動態性質を示し、強化された効率で核酸などの巨大分子を多種多様の細胞種および組織に送達することができる改善されたカチオン性およびイオン化可能な脂質の必要性が残存する。重要なことには、毒性が減少し、被包された核酸およびポリヌクレオチドを標的細胞、組織、および臓器に効率的に送達することができることを特徴とする、新規のカチオン性のイオン化可能な脂質の特定の必要性も残存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
新規カチオン性およびイオン化可能な脂質化合物、そのような化合物を含む薬学的組成物、ならびに関連するそれらの使用方法が、本明細書において説明される。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、１つ以上の標的細胞への送達および後続のその形質移入を容易にするためのリポソーム組成物またはリポソーム組成物の成分として有用である。ある実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物は、カチオン性および／またはイオン化可能な脂質である。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、アミンなどの塩基性のイオン化可能な官能基を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、例えば形質移入の効率を強化するため、または特定の生物学的成果を促進するための１つ以上の所望の特徴または性質に基づいて設計された。
【０００６】
本明細書に開示されるある実施形態では、脂質化合物は、一般的に、極性親水性ヘッド基、および非極性疎水性テール基を含む。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、一般的に、１つ以上のアルキルまたはアリール置換基を有するアミン官能基などの１つ以上のカチオン性および／またはイオン化可能な官能ヘッド基を含み得る。ある実施形態では、本明細書に開示される脂質化合物は、２つのアルキル官能基、置換基、または部分（例えばＲ１基およびＲ２基、ここでＲ１およびＲ２の両方は独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキルからなる群から選択される）に結合される（例えば共有結合）カチオン性のイオン化可能なアミノ官能ヘッド基を含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、親水性ヘッド基（例えばアルキルアミノ基）は、疎水性（親油性）テール基に結合される（例えば共有結合）。例えば、本明細書に開示される化合物の親油性テール基（例えばＬ１基およびＬ２基のうちの１つ以上）は、コレステロールまたは任意に置換された可変的に不飽和のアルキル（例えば任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンまたはオクタデカ−６，９−ジエン）などの１つ以上の非極性基を含み得る。
【０００８】
ある実施形態では、本発明は、式（Ｉ）
【０００９】
【化１】
2018095653.tif 000002
の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択され（例えばｍは３である）、ｎはゼロまたは任意の正の整数である（例えばｎは１である）。
【００１０】
ある実施形態では、化合物は、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。そのような実施形態では、化合物の極性カチオン性ヘッド基は、イオン化可能なジメチルアミノ基を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニルである。例えば、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルである化合物が想定される。他の実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである。また他の実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）である。さらに他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。
【００１２】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、ゼロである。代替として、他の実施形態では、ｏは、正の整数（例え
ば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。
【００１３】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、４である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、３である。
【００１４】
式（Ｉ）の構造を有する化合物も、本明細書に開示され、式中、ｎは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。他の特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、ｎは、ゼロである。
【００１５】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは、４であり、ｎは、ゼロであり、ｏは、１である。例えば、ある実施形態では、本発明は、化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミンに関する。ある実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の構造を有する化合物（本明細書において「ＨＧＴ５０００」と称される）に関する。
【００１６】
【化２】
2018095653.tif 000003
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは、３であり、ｎは１であり、ｏは、ゼロである。例えば、ある実施形態では、本発明は、化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミンに関する。ある実施形態では、本発明は、式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物（本明細書において「ＨＧＴ５００１」と称される）に関する。
【００１７】
【化３】
2018095653.tif 000004
ｎが１である、本明細書に開示されるこれらの実施形態では、そのような化合物は、シス異性体、トランス異性体、または代替として、それらのラセミ混合物であり得ることを理解するべきである。例えば、ｎが１である、ある実施形態では、式（ＩＶ）
【００１８】
【化４】
2018095653.tif 000005
の構造を有する化合物によって表されるように、ｎは、シス異性体である。
【００１９】
代替として、ｎが１である、他の実施形態では、式（Ｖ）
【００２０】
【化５】
2018095653.tif 000006
の構造を有する化合物によって表されるように、ｎは、トランス異性体である。
【００２１】
式（ＶＩ）
【００２２】
【化６】
2018095653.tif 000007
の構造を有する化合物も開示され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍ、ｎ、およびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物を対象とし、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。他の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物を対象とし、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびメチルからなる群から選択される。
【００２４】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も想定され、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニルである（例えば、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルであるか、またはＬ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである）。ある実施形態では、本明細書において開示される、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）である。他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。
【００２５】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合Ｉ物に関し、式中、ｍは、４である。ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、少なくとも５である（例えば、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上である）。
【００２６】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も、本明細書に開示され、式中、ｎは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。他の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、ｎは、ゼロである。
【００２７】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、少なくとも５である（例えば、ｏは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上である）。代替として、他の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、ｏは、ゼロである。
【００２８】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も想定され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは４であり、ｎおよびｏの両方は、ゼロである。例えば、ある実施形態では、本発明は、化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミンに関する。ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩ）
【００２９】
【化７】
2018095653.tif 000008
の構造を有する化合物（本明細書において「ＨＧＴ５００２」と称される）に関する。
【００３０】
本明細書において、式（ＶＩＩＩ）
【００３１】
【化８】
2018095653.tif 000009
の構造を有する化合物も開示され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和もしくは不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルまたはアルケニル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−
Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｘは、Ｃ１−Ｃ２０アルキルおよび可変的に不飽和のＣ１−Ｃ２０アルケニルからなる群から選択される。
【００３２】
ある実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択される。
【００３３】
他の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである。例えば、ある実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンである（例えば、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換のオクタデカ−９，１２−ジエンまたはオクタデカ−６，９−ジエンである）。ある他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。
【００３４】
ある実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、Ｃ６アルケニルである。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、ｘは、ヘキサンである。また他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、ヘキサ−１−エンである。さらに他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、ヘキサ−２−エンである。ある実施形態では、ｘは、ヘキサンではない。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、Ｃ６−１０アルケニルまたはＣ６−１０アルキルである。
【００３５】
特定の一実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｘは、ヘキサンである。別の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｘは、ヘキサ−１−エンである。さらに別の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｘは、ヘキサ−２−エンである。
【００３６】
化合物が１つ以上の不斉またはキラル分子（例えば１つ以上の不飽和炭素−炭素２重結合）を有する、本明細書に記載されるこれらの実施形態では、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）両方の異性体は、この発明の範囲内であることを理解するべきである。
【００３７】
本明細書に開示される組成物は、１つ以上の薬学的組成物および／またはリポソームビヒクル（例えば脂質ナノ粒子）を調製するために使用され得る。そのような実施形態では、そのような薬学的組成物またはビヒクルは、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含み得る。したがって、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（例えば、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）は、被包された材料（例えば１つ以上の治療薬）の１つ以上の標的細胞への送達および放出を容易にする、または強化するために（例えばそのような標的細胞の脂質膜を透過する、またはそれと融合することにより）、リポソーム組成物の成分として使用され得るカチオン性またはイオン化可能な脂質である。本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む富化されたリポソーム組成物は、毒性を改善する（例えば減少させる）か、ないしは別の方法で、その
ような富化されたリポソーム組成物に１つ以上の所望の性質（例えば、被包されたポリヌクレオチドの１つ以上の標的細胞への送達の改善、および／またはリポソーム組成物の生体内毒性の減少）を付与する手段として使用され得る。したがって、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む薬学的組成物、特にリポソーム組成物も想定される。ある実施形態では、そのような薬学的およびリポソーム組成物は、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質のうちの１つ以上を含む。例えば、本明細書に開示される化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）のうちの１つ以上を含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）、ならびに１つ以上のヘルパー脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾された脂質成分が想定される。本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含み、１つ以上の追加のカチオン性脂質をさらに含む薬学的およびリポソーム組成物も想定される。同様に、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２化合物のうちの１つ以上、ならびにＣ１２−２００、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＣＨＯＬ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ−２０００、ＩＣＥ、ＤＳＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ、およびＣ８−ＰＥＧ−２０００のうちの１つ以上を含むリポソーム組成物ならびに薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）も想定される。ある実施形態では、そのような薬学的組成物およびリポソーム組成物は、例えば１つ以上の生物学的に活性なポリヌクレオチドなどの材料で充填されるか、ないしは別の方法で被包される。
【００３８】
ある実施形態では、本明細書に開示される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上は、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上、および１つ以上の追加の脂質を含む。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む、ないしは別の方法でそれにより富化される脂質ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＩＣＥのうちに１つ以上をさらに含み得る。一実施形態では、薬学的組成物は、ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、および／またはＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、および／またはＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子を含む。また別の実施形態では、薬学的組成物は、ＨＧＴ５００２、ＤＯＰＥ、コレステロール、および／またはＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む脂質ナノ粒子を含む。
【００３９】
ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物のうちの１つ以上は、１つ以上のＰＥＧ修飾された脂質を含み得る。例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む、ないしは別の方法でそれにより富化される脂質ナノ粒子は、１つ以上のＣ６−Ｃ２０アルキルを含む脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含むＰＥＧ修飾された脂質のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【００４０】
同様に、本明細書に開示される薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含み得るか、ないしは別の方法でそれにより富化され得、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＳ（１
，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）、セラミド、スフィンゴミエリン、およびコレステロールからなる群から選択されるヘルパー脂質のうちの１つ以上をさらに含み得る。
【００４１】
ある実施形態では、本化合物、ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ）を含む。他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのロックド核酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１６、１８、２０以上のロックド核酸残基またはモノマー）を含む。１つ以上の被包されたポリヌクレオチドがＲＮＡを含む場合、そのようなＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【００４２】
ある実施形態では、その薬学的およびリポソーム組成物に被包されたポリヌクレオチドは、例えば機能性ポリペプチド、タンパク質、または酵素をコードするｍＲＮＡを含み、１つ以上の標的細胞によって発現される（すなわち翻訳される）とき、機能性発現生成物（例えばポリペプチド、タンパク質、または酵素）が生成され、いくつかの場合では、標的細胞によって対象の末梢循環（例えば血漿）内に分泌される。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物、ならびに薬学的およびリポソーム組成物を含む（ないしは別の方法でその中に充填もしくは被包された）ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、対象によって異常に発現される核酸（例えばポリペプチド）をコードする。ある実施形態では、そのような化合物およびリポソームもしくは薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）を含む被包されたポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、機能タンパク質または酵素をコードする。例えば、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、アルファ−グルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、アルファ−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネート、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、およびアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードし得る。
【００４３】
ある実施形態では、被包されたポリヌクレオチドは、酵素をコードし、そのような酵素は、尿素回路酵素（例えばオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、またはアルギナーゼ１（ＡＲＧ１））であり得る。ある実施形態では、被包されたポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、リソソーム貯蔵障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡを含む（例えば被包されたポリヌクレオチドは、酵素α−ガラクトシターゼＡ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、ベータ−グルコシダーゼ、およびガラクトセレブロシダーゼのうちの１つ以上をコードするｍＲＮＡである）。
【００４４】
本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上と、１つ以上のポリヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）、特に１つ以上の化学修飾を含むポリヌクレオチドとを含む薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）も、本明細書において想
定される。想定されるポリヌクレオチド修飾には、例えば糖修飾または糖置換（例えば２′−Ｏ−アルキル修飾、固定されたポリヌクレオチド（ＬＮＡ）、またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）のうちの１つ以上）を挙げることができる。糖修飾が２′−Ｏ−アルキル修飾である実施形態では、そのような修飾は、２′−デオキシ−２′−フルオロ修飾、２′−Ｏ−メチル修飾、２′−Ｏ−メトキシエチル修飾、および２′−デオキシ修飾を含むが、これらに限定されない。修飾が核酸塩基修飾である、ある実施形態では、そのような修飾は、５−メチルシチジン、プソイドウリジン、２−チオウリジン、５−メチルシトシン、イソシトシン、偽イソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンシトシン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００４５】
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであるこれらの実施形態では、それらの化学修飾は、好ましくは、ｍＲＮＡにより良い安定性（例えばヌクレアーゼ分解に対するより良い耐性）を付与し、例えばｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域の末端保護修飾を含み得る。ある実施形態では、化学修飾は、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域への部分配列のＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の包含を含む。他の実施形態では、化学修飾は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へのポリＡテールの包含を含む。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域へのＣａｐ１構造の包含を含む化学修飾も想定される。さらに他の実施形態では、化学修飾は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域へのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列の包含を含む。
【００４６】
本明細書に記載される化合物および薬学的組成物は、１つ以上の標的細胞、組織、および臓器を特異的に標的とする、ならびに／または形質移入するように製剤化され得る。ある実施形態では、そのような化合物および薬学的組成物は、１つ以上の機構（例えば融合に基づく放出および／または標的細胞の脂質２重層膜のプロトン−スポンジ媒介破壊）によるそのような標的細胞の形質移入を容易にする。想定される標的細胞は、例えば、肝細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑液系列統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞を含む。
【００４７】
対象の疾患（例えば遺伝子または核酸の異常発現に関連する疾患）を治療する方法も開示され、本方法は、本明細書に記載される化合物および／または薬学的組成物のうちの１つ以上を対象に投与することを含む。１つ以上の標的細胞に１つ以上のポリヌクレオチドを形質移入する方法も想定され、本方法は、１つ以上の標的細胞に被包された１つ以上のポリヌクレオチドが形質移入されるように、１つ以上の標的細胞を本明細書に記載される化合物または薬学的組成物と接触させることを含む。
【００４８】
上述および本発明の多くの他の特徴および付随する利点は、付随する実施例と組み合わされるとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによりさらに理解されるだろう。本明細書に記載される様々な実施形態は、補足的であり、本明細書に含まれる教示を考慮して、当業者によって理解される様式で一緒に組み合わされるか、または使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、１週間の期間にわたって１日目と再度５日目に、９０μｇ、６０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、または１０μｇの単回静脈内投与量のＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡを２回投与された野生型（ＷＴ）マウスの血清において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を図示する。ＧＬＡタンパク質の血清濃度は、２回目の静脈内投与量の投与６時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に決定された。８日目の２回目の静脈内投与量の投与７２時間後にマウスを屠殺した。図１に示されるように、２回目の投与量のＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子内に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの静脈内注射後のヒトＧＬＡタンパク質の実質的なレベルは、６時間以内にマウスの血清において検出することができ、ＧＬＡタンパク質は、さらに投与後４８時間に検出可能であった。
【図２】図２は、１週間の間にわたって１日目と再度５日目に、９０μｇ、６０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、または１０μｇの単回静脈内投与量のＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡを２回投与された野生型（ＷＴ）マウスの肝臓、腎臓、および脾臓において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を示す。８日目の２回目の静脈内投与量の投与７２時間後にマウスを屠殺し、野生型（ＷＴ）マウスの肝臓、腎臓、および脾臓のＧＬＡタンパク質の濃度を決定した。図２に図示されるように、ヒトＧＬＡタンパク質のナノグラム濃度は、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後の肝臓、腎臓、および脾臓において検出可能であった。
【図３】図３は、単回９０μｇ静脈内投与量のＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの静脈内投与後７２時間にわたってファブリー病のマウスモデルの血清において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を図示する。ＧＬＡタンパク質の超生理学的濃度は、単回９０μｇ投与量のＨＧＴ５０００に基づくナノ粒子内に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与２４時間後のファブリーマウスの血清において検出された。
【図４】図４は、単回投与量のＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡの静脈内投与２４時間後および７２時間後のファブリー病のマウスモデルの肝臓、腎臓、脾臓、および心臓において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を示す。ＧＬＡタンパク質は、図４に示されるように、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与２４時間後および７２時間後のファブリーマウスの評価された臓器において検出可能であった。
【図５】図５は、３０μｇ投与量のＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの静脈内注射後２４時間にわたって野生型（ＷＴ）マウスの血清において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を図示する。図５に示されるように、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与６時間以内に、ヒトＧＬＡタンパク質は、正常な生理学的レベルを１００倍超える濃度で血清において検出された。同様に、ＧＬＡ  ＲＮＡの投与２４時間以内に、ヒトＧＬＡタンパク質は、正常な生理学的レベルを３０倍超える濃度で血清において検出された。
【図６】図６は、ＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子内に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの静脈内注射後２４時間にわたって野生型（ＷＴ）マウスの肝臓、腎臓、および脾臓において検出されたヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）タンパク質の濃度を図示する。図６に示されるように、ヒトＧＬＡタンパク質の実質的なレベルは、ＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子に被包されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの静脈内投与２４時間後に、ＷＴマウスの肝臓、腎臓、および脾臓において検出することができた。
【図７】図７は、単回投与量のＨＧＴ５０００またはＨＧＴ５００１のいずれかに基づく脂質ナノ粒子に被包されたＥＰＯ  ｍＲＮＡの静脈内投与２４時間後にスプラーグドーレイラットにおいて検出されたヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）タンパク質の血清濃度を比較する。図７に図示されるように、ＥＰＯタンパク質の顕著な濃度は、ＨＧＴ５０００およびＨＧＴ５００１の両方に基づく脂質ナノ粒子におけるＥＰＯ  ｍＲＮＡの静脈内投与６時間後、１２時間後、１８時間後、および２４時間後に検出された。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
例えばリポソーム送達ビヒクルまたはリポソーム送達ビヒクルの成分として有用である新規化合物が、本明細書において開示される。ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物または代替としてリポソーム組成物の成分として（例えば脂質ナノ粒子として）使用され得る。薬学的組成物（例えば脂質ナノ粒子）およびそのよう
な薬学的組成物に関連する使用方法も開示される。ある実施形態では、そのような化合物および組成物は、例えば被包された材料（例えばポリヌクレオチド）の１つ以上の標的細胞、組織、および臓器への送達を容易にする。
【００５１】
本明細書に開示されるカチオン性および／またはイオン化可能な化合物は、一般的に、極性（親水性）ヘッド基または部分および非極性（疎水性または親油性）テール基または部分の両方を含む。ある実施形態では、そのような極性ヘッド基および非極性テール基は、一般的に、相互に結合される（例えば水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用、および共有結合のうちの１つ以上によって結合される）（例えば任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ１０アルキルまたはアルケニルによって相互に共有結合されたヘッド基およびテール基）。ある実施形態では、ヘッド基または部分は、親水性（例えば任意に置換されたアルキルアミノを含む親水性ヘッド基）である。本明細書で使用される、用語「親水性」は、官能基が水を好むことを性質上の用語で示すために使用され、そのような官能基は水可溶性である。例えば、１つ以上の親水性基（例えば親水性ヘッド基）に結合された可変的に不飽和のアルキル官能基を含む化合物が、本明細書において開示され、そのような親水性基は、アミノ基または任意に置換されたアルキルアミノ基を含む。
【００５２】
ある実施形態では、選択された親水性官能基または部分は、化合物、またはそのような化合物が成分であるリポソーム組成物の性質を変更する、ないしは別の方法でそれに性質を付与することができる（化合物が成分である脂質ナノ粒子の形質移入の効率を改善することによって）。例えば、本明細書に開示される化合物への親水性ヘッド基としてのアミノ基の組み込みは、そのような化合物（またはそのような化合物が成分であるリポソーム組成物）の、１つ以上の標的細胞の細胞膜との融合性を促進し、それによって、そのような化合物の形質移入の効率を強化することができる。同様に、１つ以上のアルキルアミノ基または部分の、開示される化合物（例えばヘッド基として）への組み込みは、そのようなアミノ基の融合性を利用することにより、エンドソーム／リソソーム膜の破壊をさらに促進することができる。これは、組成物のアミノ基のｐＫａだけでなく、アミノ基が六方晶相遷移を受け、小胞膜と融合する能力にも基づく。（Ｋｏｌｔｏｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：７８−８１。）結果は、小胞膜の破壊、および脂質ナノ粒子の内容物の放出を促進すると考えられる。
【００５３】
同様に、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物への例えば正荷電されたまたはイオン化可能な親水性ヘッド基の組み込みは、本発明のリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）に被包される、例えば内容物のエンドソームまたはリソソーム放出を促進する働きをし得る。そのような強化された放出は、プロトン−スポンジ媒介破壊機構および／または強化された融合機構のうちの１つまたはそれらの両方によって達成され得る。プロトン−スポンジ機構は、化合物、特に化合物の官能部分または基がエンドソームの酸性化を緩衝する能力に基づく。これは、化合物、またはそのような化合物を含む官能基のうちの１つ以上（例えばアミノ）のｐＫａによって操作されるか、ないしは別の方法で制御され得る。そのようなエンドソーム破壊性質は、同時に、浸透膨潤およびリソソーム膜の破壊、それに続くその中に充填または被包されたポリヌクレオチド材料の標的細胞内への形質移入または細胞内放出を促進する。
【００５４】
本明細書に開示される脂質化合物は、一般的に、１つ以上のアルキルまたはアリール置換基を有するアミン官能基などの１つ以上のカチオン性および／またはイオン化可能な官能ヘッド基を含み得る。ある実施形態では、本明細書に開示される脂質化合物は、疎水性官能基、置換基、または部分（例えばＲ１基およびＲ２基、ここでＲ１およびＲ２の両方は独立して、Ｃ１−Ｃ１０アルキルからなる群から選択される）に結合される（例えば共有結合）カチオン性のイオン化可能なアミノ官能ヘッド基を含み得る。ある実施形態では、そのような親水性および疎水性官能基は、中間基（例えばアルキルまたは可変的に不飽
和のアルケニル）により相互に結合される（例えば共有結合）。
【００５５】
本明細書に記載される化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、およびＨＧＴ５００２）は、特にＣ１２−２００などの従来の脂質およびカチオン性脂質に対するそれらの減少した毒性も特徴とする。したがって、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上は、有効量の１つ以上の薬剤を標的細胞および組織に送達するのに必要な量では毒性と特徴付けられる１つ以上の従来の脂質の代わりに使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物は、リポソーム組成物に関連する毒性を減少させる、ないしは別の方法で排除する手段として、本明細書に開示されるイオン化可能なカチオン性脂質化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）のうちの１つ以上を含むように調製され得る。カチオン性のイオン化可能な化合物または脂質（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）は、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物のうちの１つ以上において単一のカチオン性脂質として使用されるか、または代替として、従来のカチオン性脂質（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮまたはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、および／またはヘルパー脂質と組み合わされ得る。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物、または代替として薬学的およびリポソーム組成物の全カチオン性脂質成分は、そのような薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１％〜約９０％、約２％〜約７０％、約５％〜約５０％、約１０％〜約４０％のモル比、または好ましくはそのような薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約２０％〜約７０％を含み得る。加えて、リポソームビヒクルを、本明細書に開示されるカチオン性のイオン化可能な脂質化合物と組み合わせる、またはそれで富化することにより、リポソームビヒクルの他の脂質成分の濃度において対応する減少を可能にし、それによって、リポソームビヒクルに同様に存在し得る他のカチオン性脂質（例えばＣ１２−２００）に関連する毒性を減少させる、ないしは別の方法で緩和させる手段を提供する。
【００５６】
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物を含む部分の官能基のうちの少なくとも１つは、性質が疎水性（例えばコレステロールなどの天然に生じる脂質を含む疎水性テール基）である。本明細書で使用される、用語「疎水性」は、官能基が水を避けることを性質上の用語で示すために使用され、そのような官能基は水可溶性ではない。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物の疎水性または親油性テール基（例えばＬ１基およびＬ２基のうちの１つ以上））は、コレステロールまたは任意に置換された可変的に不飽和のアルキルまたはアルケニル（例えば任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエン）などの１つ以上の非極性基を含み得る。
【００５７】
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、例えば少なくとも１つの親水性ヘッド基と、少なくとも１つの疎水性テール基とを含み、それぞれが、例えば任意に置換された可変的に飽和もしくは不飽和のアルキルまたはアルケニルによって相互に結合され、それによって、そのような化合物に両親媒性を付与する。化合物または組成物を説明するために本明細書に使用される、用語「両親媒性」は、極性（例えば水）および非極性（例えば脂質）の両方の環境に溶解する能力を意味する。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、少なくとも１つの親油性テール基（例えばコレステロールまたはＣ６−Ｃ２０アルキルもしくはアルケニル）と、少なくとも１つの親水性ヘッド基（例えばアルキルアミノ）を含み、それぞれ、中間Ｃ１−Ｃ２０アルキルまたはアルケニル基（例えばヘキサンまたはヘキセン）に結合される。
【００５８】
本発明の化合物、特にそのような化合物を含む官能基を説明するために使用される、用語「ヘッド基」および「テール基」は、他の官能基に対する１つ以上の官能基の配向を説明するために容易に参照できるように使用されることに留意するべきである。例えば、あ
る実施形態では、親水性ヘッド基（例えばアミノ）は、（水素結合、ファンデルワールス力、イオン相互作用、および共有結合のうちの１つ以上によって）アルキルまたはアルケニル官能基（例えばヘキサ−１−エン）に結合され、これは、同時に、疎水性テール基（例えばコレステロールまたはＣ６−Ｃ２０の可変的に不飽和のアルケニル）に結合される。
【００５９】
本明細書において、式（Ｉ）
【００６０】
【化９】
2018095653.tif 000010
の構造を有する化合物も開示され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルもしくはアルケニル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍおよびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択され（例えばｍは３である）、ｎはゼロまたは任意の正の整数である（例えばｎは１である）。
【００６１】
ある実施形態では、化合物は、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。そのような実施形態では、化合物の極性カチオン性ヘッド基は、イオン化可能なジメチルアミノ基を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉ）の構造を有し、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニルである。例えば、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルである化合物が想定される。他の実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである。また他の実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）である。さらに他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。ある実施形態では、Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンである。ある実施形態では、Ｌ１およびＬ２のそれぞれは、クタデカ−６，９−ジエンである。
【００６３】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、ゼロである。代替として、他の実施形態では、ｏは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。
【００６４】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、４である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し
、式中、ｍは、３である。
【００６５】
式（Ｉ）の構造を有する化合物も、本明細書に開示され、式中、ｎは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。他の特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、ｎは、ゼロである。
【００６６】
ある実施形態では、ｍおよびｏは独立して、ゼロ、１（アルキルがエチルであるように）、２（アルキルがメチルであるように）、３（アルキルが、例えばプロピルまたはイソ−プロピルであるように）、４（アルキルが、例えばブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、またはｔｅｒ−ブチルであるように）、５（アルキルが、例えばペンタンであるように）、６（アルキルが、例えばヘキサンであるように）、７（アルキルが、例えばヘプタンであるように）、８（アルキルが、例えばオクタンであるように）、９（アルキルが、例えばノナンであるように）、または１０（アルキルが、例えばデカンであるように）からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは、４であり、ｎは、ゼロであり、ｏは、１である。例えば、ある実施形態では、本発明は、化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミンに関し、式（ＩＩ）の構造を有する（本明細書において「ＨＧＴ５０００」と称される）。
【００６８】
【化１０】
2018095653.tif 000011
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは、３であり、ｎは１であり、ｏは、ゼロである。例えば、ある実施形態では、本発明は、化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミンに関し、式（ＩＩＩ）の構造を有する（本明細書において「ＨＧＴ５００１」と称される）。
【００６９】
【化１１】
2018095653.tif 000012
ｎが１である、本明細書に開示されるこれらの実施形態では、そのような化合物は、シス異性体、トランス異性体、または代替として、それらのラセミ混合物であり得ることを理解するべきである。例えば、ｎが１である、ある実施形態では、式（ＩＶ）
【００７０】
【化１２】
2018095653.tif 000013
の構造を有する化合物によって表されるように、ｎは、シス異性体である。
【００７１】
代替として、ｎが１である、他の実施形態では、式（Ｖ）
【００７２】
【化１３】
2018095653.tif 000014
の構造を有する化合物によって表されるように、ｎは、トランス異性体である。
【００７３】
式（ＶＩ）
【００７４】
【化１４】
2018095653.tif 000015
の構造を有する化合物も開示され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルもしくはアルケニル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍ、ｎ、およびｏはそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択される。
【００７５】
いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物を対象とし、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。他の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物を対象とし、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびメチルからなる群から選択される。
【００７６】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も想定され、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニル（例えば、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルであるか、またはＬ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである）である。ある実施形態では、本明細書において開示されるＬ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）である。他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。
【００７７】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合Ｉ物に関し、式中、ｍは、４である。ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｍは、少なくとも５である（例えば、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上である）。
【００７８】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も、本明細書に開示され、式中、ｎは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。他の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、ｎは、ゼロである。
【００７９】
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、正の整数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）である。ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、ｏは、少なくとも５である（例えば、ｏは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上である）。代替として、他の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の構造を有する化合物に関し、ｏは、ゼロである。
【００８０】
式（ＶＩ）の構造を有する化合物も想定され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｍは４であり、ｎおよびｏの両方は、ゼロである。例えば、ある実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩ）
【００８１】
【化１５】
2018095653.tif 000016
の構造を有する化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミンに関する（本明細書において「ＨＧＴ５００２」と称される）。
【００８２】
本明細書において、式（ＶＩＩＩ）
【００８３】
【化１６】
2018095653.tif 000017
の構造を有する化合物も開示され、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和もしくは不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキルまたはアルケニル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｘは、Ｃ１−Ｃ２０アルキルおよび可変的に
不飽和のＣ１−Ｃ２０アルケニルからなる群から選択される。
【００８４】
ある実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルである。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルからなる群から選択される。
【００８５】
他の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである。例えば、ある実施形態では、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンである（例えば、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、非置換のオクタデカ−９，１２−ジエンまたはオクタデカ−６，９−ジエンである）。ある他の実施形態では、Ｌ１は、水素であり、Ｌ２は、コレステロールである。
【００８６】
ある実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、Ｃ６アルケニルである。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、ｘは、ヘキサンである。また他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、ヘキサ−１−エンである。さらに他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、ヘキサ−２−エンである。ある実施形態では、ｘは、ヘキサンではない。他の実施形態では、開示される化合物は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有し、式中、ｘは、Ｃ６−Ｃ１０アルケニルまたはＣ６−Ｃ１０アルキルである。
【００８７】
特定の一実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｘは、ヘキサンである。別の特定の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｘは、ヘキサ−１−エンである。さらに別の実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する化合物に関し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエン（またはオクタデカ−６，９−ジエン）であり、ｘは、ヘキサ−２−エンである。
【００８８】
本明細書で使用される、用語「アルキル」は、直鎖および分枝鎖両方のＣ１−Ｃ４０炭化水素（例えばＣ６−Ｃ２０炭化水素）を指し、飽和および不飽和両方の炭化水素を含む。ある実施形態では、アルキルは、１つ以上の環式アルキルおよび／または酸素、窒素、もしくは硫黄などの１つ以上のヘテロ原子を含み得、置換基（例えばアルキル、ハロ、アルコキシル、ヒドロキシ、アミノ、アリール、エーテル、エステル、またはアミドのうちの１つ以上）で任意に置換され得る。ある実施形態では、想定されるアルキル疎水性テール基は、（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエンを含む。ある実施形態では、想定されるアルキル疎水性テール基は、（またはオクタデカ−６，９−ジエンを含む。例えば「Ｃ６−Ｃ２０」などの指定の使用は、列挙される範囲の炭素原子を有するアルキル（例えば直鎖または分枝鎖、ならびにアルケンおよびアルキルを含む）を指すことが意図される。
【００８９】
本明細書で使用される、用語「アリール」は、環部分に６〜１０個の炭素を有する芳香族基（例えば単環式、二環式、および三環式構造）を指す。アリール基は、利用可能な炭素原子を通して任意に置換され得、ある実施形態では、酸素、窒素、または硫黄などの１つ以上のヘテロ原子を含む。
【００９０】
化合物が１つ以上の不斉またはキラル分子（例えば１つ以上の不飽和炭素−炭素２重結合）を有する、本明細書に記載されるこれらの実施形態では、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）異性体の両方は、この発明の範囲内であることを理解するべきである。
【００９１】
本明細書に記載される化合物は、被包された材料（例えば１つ以上の治療用ポリヌクレオチド）の１つ以上の標的細胞への送達および放出（例えば透過またはそのような標的細胞の脂質膜との融合により）を容易にする、または強化するリポソーム組成物を構築するために使用され得る。例えば、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含むか、ないしは別の方法でそれにより富化されるとき、１つ以上の標的細胞の脂質２重層における相転移は、１つ以上の標的細胞への被包された材料（例えば、脂質ナノ粒子に被包された１つ以上の治療用ポリヌクレオチド）の送達を容易にすることができる。同様に、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、生体内でのそれらの減少した毒性を特徴とするリポソームビヒクルを調製するために使用され得る。ある実施形態では、減少した毒性は、そのような組成物の換算量が所望の治療応答または成果を達成するように対象に投与され得るような、本明細書に開示される組成物に関連する高い形質移入効率の関数である。
【００９２】
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物は、そのような化合物に、他の同様に分類される脂質に対する利点を提供する１つ以上の性質を有することを特徴とする。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が成分であるその性質を制御および製作することを可能にする。特に、本明細書に開示される化合物は、形質移入の効率および特定の生物学的成果を誘発するその能力の強化を特徴とし得る。そのような成果は、例えば、細胞取り込みの強化、エンドソーム／リソソーム破壊機能、および／または細胞内での被包された材料（例えばポリヌクレオチド）の放出の促進を含み得る。
【００９３】
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物）は、被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）の、１つ以上の標的細胞への送達、および後のそれらへの形質移入を容易にするための多機能戦略を採用する。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物（ならびにそのような化合物を含む薬学的およびリポソーム組成物）は、そのような化合物に、受容体媒介飲食作用、クラスリン媒介およびカベオラ媒介飲食作用、食作用およびマクロ飲作用、膜融合、エンドソームまたはリソソーム破壊、ならびに／または他の同様に分類される脂質に対する利点をもたらす放出可能性質のうちの１つ以上を有することを特徴とする。
【００９４】
ある実施形態では、化合物ならびにそのような化合物が成分（例えば脂質ナノ粒子）である薬学的およびリポソーム組成物は、１つ以上の標的細胞に形質移入する強化された（例えば増加された）能力を呈する。したがって、本明細書において、１つ以上の標的細胞に形質移入する方法も提供される。そのような方法は、一般的に、１つ以上の標的細胞にその中に被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）が形質移入されるように、１つ以上の標的細胞を、本明細書に開示される化合物および／または薬学的組成物（例えば、１つ以上のポリヌクレオチドを被包するＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２に基づく脂質ナノ粒子）と接触させるステップを含む。本明細書で使用される、用語「形質移入する」または「形質移入」とは、１つ以上の被包された材料（例えば核酸および／またはポリヌクレオチド）を細胞、好ましくは標的細胞内に細胞内導入することを指す。導入されたポリヌクレオチドは安定であるか、または標的細胞内に一過的に維持され得る。用語「形質移入の効率」とは、そのような被包された材料（例えばポリヌクレオチド）が形質移入を受ける標的細胞によって取り込まれる、その中に導入される、および／またはそれによって発現される相対的な量を指す。特に、形質移入効
率は、形質移入後に標的細胞によって生成されたレポーターポリヌクレオチド生成物の量によって推定することができる。ある実施形態では、本明細書に記載される化合物および薬学的組成物は、高い形質移入効率を示し、それによって、被包された材料（例えば１つ以上のポリヌクレオチド）の適切な投薬量が病変部位に送達され、後に発現される可能性を改善すると同時に、化合物またはそれらの被包された内容物に関連する全身的な有害作用の可能性または毒性を最小にする。
【００９５】
薬学的または治療効果を与えることができる広範囲の材料が、本発明の化合物、組成物、および方法を用いて、標的細胞に送達することができる。したがって、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物は、細胞内送達に適する任意の材料を被包するために使用され得る。ある実施形態では、そのような被包された材料は、そのような材料が送達される細胞に対して、治療または診断利益を付与することができ、任意の薬物、生物製剤、および／または診断薬を含み得る。材料は有機または無機であり得る。有機分子は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロール、核酸（ペプチド核酸を含む）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ある実施形態では、本明細書に開示される薬学的およびリポソーム組成物は、２種類以上の材料、例えば、タンパク質、酵素、および／またはステロイドをコードする２つ以上の異なるポリヌクレオチド配列を含む、ないしは別の方法で被包することができる。ある実施形態では、被包された材料は１つ以上のポリヌクレオチドおよび核酸である。
【００９６】
本明細書で使用される、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、遺伝的材料（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すように互換的に使用され、そのような用語が本明細書に記載される化合物および組成物（例えば脂質ナノ粒子）に関して使用されるとき、一般に、そのような化合物および組成物（例えば脂質ナノ粒子）によって被包される遺伝的材料を指す。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。好適なＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡを含む。想定されるポリヌクレオチドは、一般にタンパク質をコードしないが、むしろ例えば免疫シグナル伝達、幹細胞生物学、および疾患の発達において機能する大きな遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）も含む。（例えば、Ｇｕｔｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，４５８：２２３−２２７（２００９）、およびＮｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４２：１０３５−１０３６（２０１０）を参照のこと、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ある実施形態では、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、またはタンパク質もしくは酵素をコードする安定化されたＲＮＡ（例えば、α−ガラクトシターゼＡまたはアリールスルファターゼＡをコードするｍＲＮＡ）を含む。本発明は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号、米国仮出願第６１／４９４，８８１号（代理人整理番号ＳＨＩＲ−０２５−００１）（２０１１年６月８日に出願された）に開示されるように（それらの教示は両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、標的細胞によって発現され、それによって、そのような標的細胞による機能酵素またはタンパク質の生成（およびある場合では、排出）を促進することができる治療薬としてのそのようなポリヌクレオチド（特に、ＲＮＡまたは安定化されたＲＮＡ）の使用を想定する。例えば、ある実施形態では、標的細胞による１つ以上のポリヌクレオチドが発現されるとき、対象が欠乏する機能酵素またはタンパク質（例えば尿素回路酵素またはリソソーム貯蔵障害に関連する酵素）の生成が観察され得る。タンパク質または酵素を限定するために本明細書で使用される、用語「機能」とは、タンパク質または酵素が、生物活性を有するか、または別の方法としては、未変性もしくは正常に機能するタンパク質または酵素と同じもしくは類似する機能を実行することができることを意味する。
【００９７】
ある実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物は、混合製剤または組成物として製剤化される。例えば、一実施形態では、薬学的組成
物は、ＨＧＴ５０００を含む第１の脂質ナノ粒子と、ＨＧＴ５００１を含む第２の脂質ナノ粒子を３：１の割合で含む混合製剤を含む。したがって、例えば、２０１１年６月８日に出願された米国仮出願第６１／４９４，７１４号（代理人整理番号ＳＨＩＲ−０２１−００１）（その教示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、１つ以上の標的細胞および組織においてポリヌクレオチドの発現を調節するための混合薬学的組成物および関連する方法も、本明細書において提供される。例えば、１つ以上の標的細胞による、そのような混合薬学的組成物に被包された１つ以上のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）によってコードされる１つ以上の機能ポリペプチド、タンパク質、または酵素の生成および／または分泌を調節する（例えば、増加させる、または相乗的に増加させる）ための方法も想定される。
【００９８】
本発明との関連において、用語「発現」は、その広い意味において、特定の遺伝子もしくはポリヌクレオチドが少なくとも１つのｍＲＮＡ転写物へ転写される、または少なくとも１つのｍＲＮＡもしくはポリヌクレオチドがタンパク質または酵素に翻訳されるかのいずれかを指すように使用される。例えば、ある実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的もしくはリポソーム組成物は、機能タンパク質または酵素をコードするポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）を含む。そのようなｍＲＮＡポリヌクレオチドとの関連において、用語「発現」は、そのようなｍＲＮＡが翻訳され（例えば標的細胞により）、それによってコードされるポリペプチドもしくはタンパク質を生成することを指す。
【００９９】
ある実施形態では、本明細書に提供される化合物および薬学的組成物は、１つ以上の標的細胞および組織において異常に発現した核酸およびポリヌクレオチドを調節することができる。したがって、本明細書において、本明細書に記載される有効量の化合物および／または薬学的もしくはリポソーム組成物を対象に投与することにより、対象の疾患を治療する方法も提供される。ある実施形態では、そのような方法は、１つ以上の標的細胞および組織（例えば肝細胞）において、ポリヌクレオチドの発現を強化（例えば増加）する、および／または機能性ポリペプチド生成物の生成および分泌を増加することができる。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織は、本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上によって被包されたポリヌクレオチドを異常に発現する。１つ以上の標的細胞、組織、および臓器（例えば肺、心臓、脾臓、肝臓、および／または腎臓）において１つ以上のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の発現を増加させる方法も、本明細書において提供される。一般に、そのような方法は、標的細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ないしは別の方法で被包する１つ以上の化合物および／または薬学的もしくはリポソーム組成物と接触させることを含む。
【０１００】
ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソームとして、またはリポソームの成分として使用され得る。具体的には、ある実施形態では、本明細書に開示される化合物は、リポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の脂質（例えばカチオン性脂質）成分として使用され得る。そのようなリポソームは、材料を被包し、そのような材料の、１つ以上の標的細胞、組織、および器官への送達を容易にするために使用され得る。本明細書で使用される、用語「リポソーム」とは、一般に、１つ以上の球状２重層または２重層に配置された脂質（例えば両親媒性脂質）から構成される小胞を指す。ある実施形態では、リポソームは、脂質ナノ粒子（例えば、本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子）である。そのようなリポソームは、親油性材料から形成された膜、および１つ以上の標的細胞、組織、および器官に送達される被包された材料（例えばポリヌクレオチド）を含む水性内部を有する単層または多層の小胞であり得る。ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物は、１つ以上の脂質ナノ粒子を含む。想定されるリポソームは、脂質ナノ粒子を含む。本明細書において想定されるリポソームおよび脂質ナノ粒子を形成するために使用することができる好適
な脂質（例えばカチオン性脂質）の例としては、本明細書に開示される化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）のうちの１つ以上が挙げられる。そのようなリポソームおよび脂質ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧ−ＰＥＧ−２０００、非カチオン性脂質、コレステロールに基づく脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ修飾された脂質などの追加のカチオン性脂質、ならびにホスファチジル化合物（例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、および前述の組み合わせまたは混合物も含み得る。
【０１０１】
いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは商業的に入手可能である。ある実施形態では、そのようなカチオン性脂質は、本明細書に開示される化合物または脂質（例えばＨＧＴ５０００）のうちの１つ以上に加え、本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウムまたは「ＤＯＴＭＡ」が使用される（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５）。ＤＯＴＭＡは単独で製剤化されるか、または中性脂肪、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質を用いて脂質ナノ粒子内に組み合わされ得る。他の好適なカチオン性脂質には、例えばＣ１２−２００、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドもしくは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムもしくは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンもしくは「ＤＯＤＡＰ」、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンもしくは「ＤＯＴＡＰ」が含まれる。想定されるカチオン性脂質には、１，２−ジステアロイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−塩化ジメチルアンモニウムもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−臭化ジメチルアンモニウムもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ‐ヒドロキシエチル臭化アンモニウムもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５′−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３′−オキサペントキシ）−３−ジメチル  １−１−（シス，シス−９′，１−２′−オクタデカジエンオキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ′−ジオレイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンもしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２−Ｎ，Ｎ′−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもし���は「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２−ジリノレオイルカルバミル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、またはそれらの混合物も含む。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。組成物（例えば脂質ナノ粒子）を製剤化するためのコレステロールに基づくカチオン性脂質の使用も本発明により想定される。そのようなコレステロールに基づくカチオン性脂質は、単独で、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質との組み合わせのいずれかで使用され得る。好適なコレステロールに基づくカチオン性脂質は、例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール），１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンを含む（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）。
【０１０２】
加えて、形質移入の有効性を強化するためにいくつかの試薬が市販されている。好適な例としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＵＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥが挙げられる。ジアルキルアミノに基づく、イミダゾールに基づく、およびグアニジウムに基づく脂質等のカチオン性脂質も想定される。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号（その教示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、例えば、カチオン性脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）−１０，１３−ジメチル−１７−（（Ｒ）−６−メチルヘプタン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパン酸、または「ＩＣＥ」の使用も想定される。
【０１０３】
好ましくは本明細書に開示される化合物および脂質のうちの１つ以上との組み合わせで、本明細書に記載されるリポソームおよび薬学的組成物にＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む、誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾されたリン脂質および誘導化された脂質の使用および包含も想定される。想定されるＰＥＧ修飾された脂質には、Ｃ６−Ｃ２０の長さのアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が含まれるが、これに限定されない。そのような化合物の追加は、複合体の凝集を防止することができ、また循環生存期間を増加させ、脂質−ポリヌクレオチド組成物の標的組織への送達を増加させる手段も提供することができるか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、またはそれらは、生体内で製剤から迅速に交換するように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。特に有用な交換可能な脂質は、短いアシル鎖（例えばＣ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ−セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾されたリン脂質および誘導体化された脂質は、リポソーム脂質ナノ粒子に存在する総脂質の約０％〜約２０％、約０．５％〜約２０％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含み得る。
【０１０４】
本発明は、薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上における非カチオン性脂質の使用も想定する。そのような非カチオン性脂質は、好ましくは、本明細書に開示される化合物および脂質のうちの１つ以上と組み合わせて使用される。本明細書で使用される、句「非カチオン性脂質」とは、任意の中性、双極性イオン、またはアニオン性の脂質を指す。本明細書で使用される、句「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨ等の選択されたｐＨで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスフ
ァチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ＤＬＰＥ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＰＰＳ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、セラミド、スフィンゴミエリン、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は単独で使用することができるが、好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）のうちの１つと組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用されるとき、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子に存在する総脂質の５％〜約９０％、または好ましくは約１０％〜約７０％のモル比を含み得る。
【０１０５】
本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子にポリマーを含むことも想定される。好適なポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリアクチド、ポリアクチド−ポリグリコシドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、およびポリエチレンイミンを含み得る。そのようなポリマーは単独で使用することができるが、好ましくは、他の賦形剤、例えば本明細書に開示されるカチオン性脂質化合物（例えばＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、および／またはＨＧＴ５００２）のうちの１つと組み合わせて使用される。
【０１０６】
ある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、一部、標的細胞への形質移入（例えばポリヌクレオチドの）を容易にするその能力に基づき製剤化される。別の実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、ポリヌクレオチドの標的細胞、組織、または器官への送達を最適化するように選択および／または調製され得る。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、薬学的および／またはリポソーム組成物（例えば大きさ、電荷、および／またはｐＨ）の性質は、そのような組成物（例えば脂質ナノ粒子）を標的細胞または器官に効率的に送達する、免疫クリアランスを低下させる、および／またはその標的器官における保持を促進するように最適化され得る。別の方法としては、標的組織が中枢神経系である場合、薬学的およびリポソーム組成物の選択および調製は、血液脳関門に浸透させる、およびその内に保持する、ならびに／またはそのような組成物（例えば脂質ナノ粒子）をそのような標的組織に直接送達する代替え手段（例えば脳血管内投与を介して）を使用することを考慮しなければならない。ある実施形態では、薬学的もしくはリポソーム組成物またはその構成要素である脂質ナノ粒子は、被包された材料の移動を容易にする薬剤（例えば、血液脳関門への浸透を妨害または改善し、それによってそのような被包されたポリヌクレオチドの標的細胞への移動を強化する薬剤）と組み合わされ得る。本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上のポリヌクレオチド等の被包された材料の標的細胞への導入を容易にすることができ、ポリカチオン（例えばポリＬ−リジンおよびプロタミン）を、例えばコポリマーとして薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上に付加することによっても容易にすることができ、いくつかの場合では、生体外および生体内における多くの細胞系において、いくつかの種類のカチオン性リポソームの形質移入の
効率を２〜２８倍顕著に強化する。（Ｎ．Ｊ．Ｃａｐｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９５；２：６０３、Ｓ．Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９７；４，８９１を参照。）
本発明のある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、１つ以上の材料または治療薬（例えばポリヌクレオチド）を被包するように調製される。所望の治療薬（例えばｍＲＮＡ）をリポソームまたは脂質ナノ粒子中に組み込むプロセスは、本明細書において、「充填」または「被包」と称される（Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２）。脂質ナノ粒子充填または被包された材料（例えばポリヌクレオチド）は、脂質ナノ粒子の内部空間、脂質ナノ粒子の２重層膜内に完全に、または部分的に位置するか、または脂質ナノ粒子の外表面に会合し得る。
【０１０７】
例えばポリヌクレオチドを脂質ナノ粒子中に充填または被包することにより、そのようなポリヌクレオチドを迅速に排出させる、そのようなポリヌクレオチドおよび／または系もしくは受容体を分解する酵素もしくは化学物質（例えば血清）を含み得る環境からポリヌクレオチドを保護する働きをする可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、特にそのようなポリヌクレオチドが曝される環境に関して、それによって被包されたポリヌクレオチド（複数可）の安定性を強化することができる。例えばポリヌクレオチド等の材料を、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上の中に被包することにより、そのようなポリヌクレオチドの標的細胞および組織内への送達も容易にする。例えば、本明細書に記載される脂質化合物のうちの１つ以上を含む脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオチドを標的細胞に到達させことができるか、または被包されたポリヌクレオチドを優先的に標的細胞または器官に差別的に到達させることができる（例えば脂質ナノ粒子は、そのような脂質ナノ粒子が投与される対象の肝臓または脾臓において濃縮され得る）。別の方法としては、脂質ナノ粒子は、被包されたポリヌクレオチドの、被包されたポリヌクレオチドの存在が望ましくない、または利用を限定するものであり得る他の非標的細胞または器官への送達を制限することができる。
【０１０８】
ある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、複数の脂質成分（例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上）を１つ以上のポリマー成分と組み合わせることにより調製される。例えば、脂質ナノ粒子は、ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、ＣＨＯＬ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を用いて調製され得る。脂質ナノ粒子は、例えばＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含む、様々な割合の追加の脂質の組み合わせから構成され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾された脂質の選択、ならびにそのような脂質の相互に対する相対的モル比は、選択された脂質（複数可）の特性、意図される標的細胞または組織の性質、および脂質ナノ粒子によって送達される材料またはポリヌクレオチドの特性に基づく。さらなる考慮事項は、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質（複数可）の大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性、および毒性を含む。
【０１０９】
本明細書で使用するための薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、現在当該技術分野において既知である様々な技法により調製され得る。多層小胞（ＭＬＶ）は、例えば、脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させ、器の内部上に薄いフィルムを残すことにより、または噴霧乾燥により、選択された脂質を好適な容器もしくは器の内壁上に堆積させることによる従来の技法により調製され得る。次いで、ＭＬＶの形成をもたらす渦動運動している器に水相が添加され得る。次いで、単層小胞（ＵＬＶ）は、均質化、音波処理、または多層小胞の押出により形成され得る。加えて、単層小胞は洗剤除去法により形成され得る。
【０１１０】
ある実施形態では、本発明の薬学的およびリポソーム組成物は、被包されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）が脂質ナノ粒子の両表面上に会合され、同じ脂質ナノ粒子内に被包される、脂質ナノ粒子を含む。例えば、本発明の組成物の調製中、本明細書に記載され、脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質化合物のうちの１つ以上は、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）と、そのようなポリヌクレオチドとの静電相互作用を通して会合し得る。
【０１１１】
ある実施形態では、本発明の薬学的およびリポソーム組成物は、生体外および生体内用途の両方で検出可能である診断用放射性核種、蛍光材料、または他の材料で充填され得る。例えば、本発明の使用に好適な診断用材料には、ローダミン−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（Ｒｈ−ＰＥ）、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ、ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ、およびホタルルシフェラーゼｍＲＮＡが含まれ得る。
【０１１２】
本明細書に記載されるリポソーム組成物の調製中、水溶性の担体薬剤も、水和溶液にそれらを含むことにより水性内部に被包され得、親油性分子は、脂質製剤に含まれることにより脂質２重層中に組み込まれ得る。ある分子（例えば、カチオン性またはアニオン性の親油性ポリヌクレオチド）の場合において、ポリヌクレオチドの予め形成された脂質ナノ粒子またはリポソーム内への充填は、例えば、米国特許第４，９４６，６８３号に記載される方法（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）により達成され得る。ポリヌクレオチドの被包後、脂質ナノ粒子は、ゲルクロマトグラフィー、膜分離精製法、または限外濾過等のプロセスを通して被包されていないｍＲＮＡを除去するために処理され得る。例えば、本明細書に記載されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の表面から外部的に結合されたポリヌクレオチドを除去することが望ましい場合、そのような脂質ナノ粒子は、ジエチルアミノエチルＳＥＰＨＡＣＥＬカラムに曝すことができる。
【０１１３】
被包された材料（例えばポリヌクレオチドまたは１つ以上の治療薬もしくは診断剤）に加え、脂質ナノ粒子に含まれるか、または被包され得る。例えば、そのような追加治療薬は、脂質ナノ粒子の表面と会合し得、脂質製剤に含む、または予め形成された脂質ナノ粒子内に充填することにより、脂質ナノ粒子の脂質２重層中に組み込まれ得る（米国特許第５，１９４，６５４号および第５，２２３，２６３号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１４】
本明細書に開示されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の大きさを減少させる、または「寸法決定」するための方法がいくつかあり、寸法決定が本発明の一部として使用されるとき、一般に、それらの方法のいずれかを採用することができる。押出方法は、リポソーム寸法決定の一方法である。（Ｈｏｐｅ，Ｍ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｅｄ．）Ｖｏｌ．１．ｐ１２３（１９９３））。本方法は、リポソームの大きさを比較的明確に定義された大きさ分布に減少させるために、小さい細孔のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通してリポソームを押出すことからなる。典型的に、所望のリポソームの大きさ分布が達成されるまで、膜を通して１回以上懸濁液が巡回される。リポソームは、リポソームの大きさの漸進的な減少を達成するように、連続的により小さい細孔膜を通して押出され得る。
【０１１５】
脂質ナノ粒子の集団を寸法決定するために、当該技術分野において既知の様々な代替え方法が利用可能である。そのような寸法決定の一方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。槽またはプローブ超音波処理
のいずれかによるリポソームまたは脂質ナノ粒子懸濁液を超音波処理することにより、直径が約０．０５ミクロン未満の小さいＵＬＶに漸進的に大きさの減少をもたらす。均質化は、大きいリポソームをより小さいものに細分化するための、せん断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順において、ＭＬＶは、典型的に約０．１〜０．５ミクロンの選択されたリポソームの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。脂質ナノ粒子の大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−４５０（１９８１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される擬電場光散乱（ＱＥＬＳ）により決定され得る。平均脂質ナノ粒子直径は、形成された脂質ナノ粒子の音波処理により減少させることができる。間欠超音波処理周期は、十分なリポソーム合成を誘導するためにＱＥＬＳ評価と交互に行われてもよい。
【０１１６】
本明細書に記載されるリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の適切な大きさの選択は、標的細胞または組織の部位、およびある程度脂質ナノ粒子が作製される用途を考慮しなければならない。本明細書で使用される、句「標的細胞」とは、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物のうちの１つ以上が誘導される、または標的とされる細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、特定の組織または器官を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、関心のタンパク質または酵素が欠乏している。例えば、ポリヌクレオチドを肝細胞に送達することが所望される場合、肝細胞は標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的またはリポソーム組成物（および例えばその中に被包されたポリヌクレオチド材料）は、非差別的に標的細胞に形質移入される（すなわち、非標的細胞に形質移入されない）。本発明の組成物および方法は、肝細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、肺胞細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば髄膜、星状膠細胞、運動ニューロン、後根神経節および前角運動ニューロンの細胞）、視細胞（例えば杆体および錐体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑液系列統細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。
【０１１７】
例えば、本明細書に開示される薬学的またはリポソーム組成物を含む１つ以上の脂質ナノ粒子に被包されたポリヌクレオチドによる１つ以上の標的細胞への形質移入後、そのようなポリヌクレオチドによってコードされた生成物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）の生成が、好ましくは刺激され得、そのような標的細胞がポリヌクレオチドを発現し、例えば関心のポリペプチドまたはタンパク質を生成する能力が強化される。例えば、ｍＲＮＡを被包する１つ以上の化合物または薬学的組成物による標的細胞への形質移入は、そのようなｍＲＮＡによってコードされるタンパク質または酵素の生成を強化（すなわち増加）する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドのある細胞または組織への形質移入を制限することが望ましい場合がある。例えば、肝臓は、一部、代謝およびタンパク質の生成におけるその中心的な役割のため、本発明の組成物に重要な標的器官を表し、したがって肝臓特異的遺伝子生成物（例えば尿素回路障害）における異常により生じる疾患は、細胞（例えば肝細胞）の特異的標的によって利益を得る場合がある。したがって、本発明のある実施形態では、標的組織の構造的特性は、本発明の薬学的およびリポソーム組成物（例えばＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子）をそのような標的組織に直接分布されるのを誘導するために利用され得る。例えば、肝細胞を標的とするために、本明細書に記載される薬学的またはリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、その寸法が肝臓の内皮層系統肝類洞の開窓よりも小さいように寸法決定され得、したがって、そのような脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような内皮開窓を容易に透過し、標的肝細胞に到
達することができる。別の方法としては、脂質ナノ粒子は、リポソームの寸法がある細胞または組織内への分布を制限する、または明確に回避するのに十分な直径のものであるように寸法決定され得る。例えば、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子は、その直径が内皮層系統肝類洞の開窓より大きく、それによってリポソーム脂質ナノ粒子の幹細胞への分布を制限するように寸法決定され得る。そのような実施形態では、大きいリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、内皮開窓を容易に透過せず、代わりに、肝臓の類洞を覆うマクロファージクッパー細胞により除去されるだろう。したがって、例えば薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子の寸法決定は、被包されたポリヌクレオチドの発現が１つ以上の標的細胞において強化され得る程度をさらに操作し、正確に制御する機会を提供することができる。一般に、本発明の薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの少なくとも１つの大きさは、約２５〜２５０ｎｍの範囲内、好ましくは約２５０ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、または１０ｎｍ未満である。
【０１１９】
同様に、本発明の組成物は、心臓、肺、腎臓、脾臓等の他の標的組織、細胞、または器官に優先的に分布されるように調製され得る。例えば、本発明の脂質ナノ粒子は、標的細胞および組織への送達の強化を達成するように調製され得る。したがって、本発明の組成物は、組織または細胞をさらに標的とするために、追加のカチオン性、非カチオン性、およびＰＥＧ修飾された脂質で富化され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物（例えばＨＧＴ５００２に基づく脂質ナノ粒子）は、その中に被包されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の送達、形質移入、および後の肝臓の細胞および組織による発現、ならびにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の対応する生成を強化するために、肝臓の細胞および組織に分布される。そのような組成物は肝臓の細胞および組織内に優先的に分布されるが、発現したポリヌクレオチドの治療効果およびそれによってコードされたタンパク質の後の生成は、標的細胞および組織に制限される必要はない。例えば、標的とされる細胞（例えば肝細胞）は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８４５７号（代理人整理番号ＳＨＩＲ−００４−ＷＯ１）おおび米国仮出願第６１／４９４，８８１号（代理人整理番号ＳＨＩＲ−０２５−００１）（それらの教示は両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、機能タンパク質または酵素を発現または生成し、それらを全身的または抹消的に排出することができる「リザーバ」または「デポ」として機能することができる。したがって、本発明のある実施形態では、本明細書に記載される薬学的およびリポソーム組成物を含む脂質ナノ粒子（例えばＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子）のうちの１つ以上は、肝細胞を標的とし、かつ／または送達時に肝臓の細胞および組織に優先的に分布され得る。そのような脂質ナノ粒子のうちの１つ以上に被包されたポリヌクレオチドによる標的幹細胞への形質移入後、そのような機能生成物が所望の治療効果を及ぼすことが可能である場所に、そのようなポリヌクレオチドが発現し（例えば翻訳される）、機能生成物（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が分泌され、全身的に分布される。
【０１２１】
本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物のうちの１つ以上に被包されたポリヌクレオチドは、標的細胞または組織に送達および／または形質移入され得る。いくつかの実施形態では、被包されたポリヌクレオチドは発現することができ、機能ポリペプチド生成物が標的細胞によって生成され（いくつかの場合では分泌される）、それによって例えば標的細胞または組織に有益な性質を付与する。そのような被包されたポリヌクレオチドは、例えば、ホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチド、または関心の他のタンパク質をコードすることができる。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチドは、内因性核酸または遺伝子の発現を調節する、ないしは別の方
法で減少させる、または排除する目的のために、低干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡをコードすることもできる。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチドは本来天然であるか、または組み換えであってもよく、センスまたはアンチセンスのいずれかの機構の作用を用いて（例えば標的遺伝子または核酸の発現を調節することにより）、治療活性を及ぼすことができる。
【０１２２】
例えば２つの独特の治療薬またはポリヌクレオチドを単一脂質ナノ粒子に組み合わせることによって、本発明に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物により、１つ以上の独特のポリヌクレオチドを標的細胞に共送達することも本明細書により想定される。単一の障害または欠乏を治療するために、１つ以上の被包されたポリヌクレオチドを１つ以上の標的細胞に送達することも想定され、それぞれのそのようなポリヌクレオチドは異なる機構の作用によって機能する。例えば、本発明の薬学的またはリポソーム組成物は、例えば脂質ナノ粒子に被包され、内因性タンパク質または酵素欠乏を補正することが意図される第１のポリヌクレオチドと、機能不全の内因性ポリヌクレオチドおよびそのタンパク質もしくは酵素生成物を不活性化または「ノックダウン」することが意図される第２のポリヌクレオチドとを含み得る。そのような被包されたポリヌクレオチドは、例えばｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡをコードすることができる。
【０１２３】
生体外転写されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は標的細胞内に形質移入され得るが、そのようなポリヌクレオチドは、生体内で細胞により容易にかつ効率的に分解され得、よってそのようなポリヌクレオチドを無効にする。さらに、いくつかのポリヌクレオチドは、体液において（特にヒトの血清）不安定であり、標的細胞に到達しないうちに分解または消化され得る。加えて、細胞内で、天然のｍＲＮＡは、３０分〜数日の半減期で減衰し得る。したがって、ある実施形態では、本明細書に提供される被包されたポリヌクレオチド、特に本明細書に提供されるｍＲＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、１つ以上の標的細胞内で発現するか、または翻訳され、それによって機能タンパク質または酵素を生成する少なくともいくつかの能力を保持する。
【０１２４】
ある実施形態では、薬学的およびリポソーム組成物は、本明細書に開示される脂質化合物のうちの１つ以上と、遺伝子の発現を調節する、または１つ以上の標的細胞内で機能ポリペプチドもしくはタンパク質を生成するように発現または翻訳され得る、１つ以上の安定したポリヌクレオチド（例えば、生体内ヌクレアーゼ消化または分解に対して安定化されたｍＲＮＡ）を含む、または被包する１つ以上の脂質ナノ粒子とを含む。ある実施形態では、そのような被包されたポリヌクレオチド（例えば機能タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ）の活性は、長期間にわたり延長される。例えば、ポリヌクレオチドの活性は、薬学的組成物が半週または隔週で、またはより好ましくは毎月、隔月、４半期、または年１回、対象に投与され得るように延長される。本発明の薬学的組成物、特に被包されたｍＲＮＡの活性の拡張または延長は、そのようなｍＲＮＡから翻訳された機能タンパク質または酵素の量に直接関係する。同様に、本発明の組成物の活性は、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの翻訳をさらに改善または強化するために行われる化学修飾によってさらに拡張または延長され得る。例えば、コザックコンセンサス配列はタンパク質の翻訳の開始に関与し、そのようなコザックコンセンサス配列を被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドに含むことにより、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの活性をさらに拡張または延長させることができる。さらに、標的細胞によって生成された機能タンパク質または酵素の量は、標的細胞に送達されたポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の量、およびそのようなポリヌクレオチドの安定性の関数である。本発明の化合物または組成物によって被包されたポリヌクレオチドの安定性が、改善または強化され得る程度において、半減期、翻訳されたタンパク質または酵素の活性、および化合物の投与頻度がさらに拡張され得る。
【０１２５】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、安定性（例えば、野生型または天然に存在す
るｍＲＮＡの型および／または標的細胞に天然に内因性であるｍＲＮＡの型に対する安定性）を付与するために、化学的に修飾され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される被包されたポリヌクレオチドは、例えば生体内でのヌクレアーゼ消化に対する耐性の改善を含む、増加または強化された安定性をポリヌクレオチドに与える少なくとも１つの化学修飾を含む。用語「安定した」および「安定性」は、そのような用語が本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチドに関するとき、特にｍＲＮＡに対するとき、通常そのようなＲＮＡを分解することが可能であるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解に対して増加または強化された耐性を指す。安定性の増加は、例えば、加水分解、あるいは内因性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞もしくは組織内の状態による他の破壊に対する低感受性、それによって標的細胞、組織、対象、および／または細胞質におけるそのようなポリヌクレオチドの耐性を増加または強化することを含み得る。本明細書に提供される安定化されたポリヌクレオチド分子は、その天然に存在する未修飾の対応物（例えばポリヌクレオチドの野生型の型）よりも長い半減期を示す。
【０１２６】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドにおいて天然に見られない３´および／または５´非翻訳（ＵＴＲ）配列を組み込むことにより修飾され得る。例えばタンパク質の翻訳開始において機能する配列（例えばコザックコンセンサス配列）の包含を含む、ｍＲＮＡポリヌクレオチドの翻訳を改善または強化する変更も、句「化学修飾」および「化学的に修飾された」によって、そのような用語が本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたポリヌクレオチドに関するとき、想定される。（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１５（２０）：８１２５−４８（１９８７））。本明細書で使用される、句「化学修飾」は、天然に存在するポリヌクレオチドに見られるものと異なる化学物質を導入する修飾、例えば、修飾されたヌクレオチドの導入（例えば、ヌクレオチド類似体、またはそのようなポリヌクレオチド分子において天然に見られないペンダント基の包含）等の共有結合修飾も含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の脂質ナノ粒子における被包前に、それらにより安定性を付与するために、化学修飾または生物学的修飾を受けた。ある実施形態では、ポリヌクレオチドに導入することができる例示的な化学修飾としては、プソイドウリジン、２−チオウラシル、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンシトシンが挙げられる。ポリヌクレオチドに対する例示的な化学修飾は、塩基の欠失（例えば、１つのヌクレオチドの欠失により、または１つのヌクレオチドを別のものと置換することにより）、または塩基の化学修飾を含む。
【０１２７】
加えて、好適な修飾は、コドンが同じアミノ酸をコードするが、ポリヌクレオチドの野生型の型に見られるコドンより安定するように、コドンの１つ以上のヌクレオチドにおける変更を含む。例えば、ＲＮＡの安定性と高い数のシチジン（Ｃ）および／またはウリジン（Ｕ）残基との間の反比例関係が示され、ＣおよびＵ残基を欠失するＲＮＡは、大半のＲＮａｓｅｓに対して安定であることが分かった（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２６９，２１３１−８（１９９４））。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列におけるＣおよび／またはＵ残基の数が減少した。別の実施形態では、Ｃおよび／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同じまたは関連するアミノ酸をコードする別のコドンと置換することによって減少する。本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドに対して想定される修飾は、プソイドウリジンの組み込みも含む。プソイドウリジンを、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたｍＲＮＡポリヌクレオチドの中に組み込むことにより、安定性および翻訳能力ならびに生体内の免疫原性の
縮小を強化することができる。（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ１６（１１）：１８３３−１８４０（２００８）を参照）。本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチドに対する置換および修飾は、容易に当業者に既知の方法によって実施され得る。
【０１２８】
配列におけるＣおよびＵ残基の数の減少に対する制限は、非翻訳領域と比較して、ｍＲＮＡのコード領域内で大きい可能性がある（すなわち、メッセージが所望のアミノ酸配列をコードする能力をなお維持しながら、メッセージに存在するＣおよびＵ残基の全てを排除することは不可能であり得る）。しかしながら、遺伝コードの縮退は、同じコード能を保持しながら、配列に存在するＣおよび／またはＵ残基の数を減少させる機会を提示する（すなわち、どのアミノ酸がコドンによってコードされるかに依存し、ＲＮＡ配列の修飾のいくつかの異なる可能性が可能であり得る）。例えば、Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＣの代わりに、ＧＧＡまたはＧＧＧに変更され得る。
【０１２９】
用語「化学修飾」は、例えば非ヌクレオチド連結または修飾されたヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチド配列（例えば、機能タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３’および５’のうちの１つまたはその両方に対する末端遮断修飾）の組み込みも含む。そのような修飾は、塩基のポリヌクレオチド配列への付加（例えば、ポリＡ末端またはより長いポリＡ末端の包含）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの変更、ポリヌクレオチドの薬剤（例えば、タンパク質または相補的ポリヌクレオチド分子）との複合化、および（例えば二次構造を形成する）ポリヌクレオチド分子の構造を変更する要素の包含を含み得る。
【０１３０】
ポリＡ末端は、天然メッセンジャーおよび合成センスＲＮＡを安定化させると考えられる。したがって、ある実施形態では、長いポリＡ末端は、ｍＲＮＡ分子に付加され、よってＲＮＡにより安定性を付与することができる。ポリＡ末端は、様々な当該技術分野で認識される技法を用いて付加することができる。例えば、長いポリＡ末端は、ポリＡポリメラーゼを用いて合成または生体外転写されたＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターも長いポリＡ末端をコードすることができる。加えて、ポリＡ末端は、ＰＣＲ生成物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’端にも連結され得る（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．．  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１
ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。ある実施形態では、ポリＡ末端の長さは、少なくとも約９０、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチドである。ある実施形態では、ポリＡ末端の長さは、本発明の修飾されたセンスｍＲＮＡ分子の安定性、よってタンパク質の転写を制御するために調節される。例えば、ポリＡ末端の長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼすことができるため、ポリＡ末端の長さは、ｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する耐性のレベルを変更し、それによって標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現およびタンパク質の生成の経過時間を制御するように調節され得る。ある実施形態では、安定化されたポリヌクレオチド分子は、生体内での分解に対して十分に耐性であるため（例えばヌクレアーゼによって）それらは脂質ナノ粒子なしで標的細胞に送達され得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、被包されたポリヌクレオチド（例えば欠損タンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、例えばそのようなポリヌクレオチドの安定性および／または半減期を改善する、またはそのようなポリヌクレオチドの翻訳を改善する、ないしは別の方法で容易にする化学的または生物学的修飾を任意に含み得る。
【０１３２】
ある実施形態では、化学修飾は、本発明の薬学的組成物を含む１つ以上のポリヌクレオチドの末端遮断修飾である。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドにおいて天然に見られない３’および／または５’非翻訳（ＵＴＲ）配列を組み込むことによって修飾され得る。ある実施形態では、天然にｍＲＮＡに隣接し、第２の無関係なタンパク質をコードする３’および／または５’隣接配列は、それを修飾するために、タンパク質または機能タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の中に組み込むことができる。例えば、安定しているｍＲＮＡ分子からの３’または５’配列（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、センスｍＲＮＡポリヌクレオチド分子の３’および／または５’領域の中に組み込むことができる。
【０１３３】
ポリヌクレオチドの３’端および５’端のうちの１つまたは両方に行われたポリヌクレオチド配列に対する修飾も、本発明によって想定される。例えば、本発明は、ヌクレアーゼ耐性を改善する、および／またはポリヌクレオチド（例えば配列番号１等）の半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含む、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の３’端および／または５’端に対する修飾を想定する。ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列の安定性を増加させることに加えて、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列の（例えばｍＲＮＡの５’非翻訳領域および３’非翻訳領域のうちの１つ以上への）包含がｍＲＮＡの翻訳をさらに強化することが意外にも発見された。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の３’および５’端のうちの１つまたはそれらの両方に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列、またはその断片を含むことも想定される。一般的に、想定される化学修飾は、未修飾のそれらの対応物に対するポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態の性質（例えば半減期）を改善し、例えばそのようなポリヌクレオチドの生体内ヌクレアーゼ消化に対する耐性を改善するために行われる修飾を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物、その中に含まれる２つ以上の脂質ナノ粒子、またはそのような脂質ナノ粒子によって被包されるポリヌクレオチドは、安定化試薬を含み得る。組成物は、ポリヌクレオチドに直接または間接的に結合し、ポリヌクレオチドを安定化させ、それによって標的細胞の細胞質における滞留時間を強化する１つ以上の製剤試薬を含み得る。そのような試薬は、好ましくは、標的細胞において、ポリヌクレオチドの半減期の改善をもたらす。例えば、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の効率は、細胞内で天然に生じるポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）と複合体を形成する「安定化試薬」の組み込みにより増加させることができる（例えば米国特許第５，６７７，１２４号を参照）。安定化試薬の組み込みは、例えば薬学的組成物を含む１つ以上の脂質ナノ粒子内にｍＲＮＡを充填または被包する前に、ポリＡおよびタンパク質を生体外で安定化されるｍＲＮＡと組み合わせることにより達成され得る。例示的な安定化試薬は、１つ以上のタンパク質、ペプチド、アプタマー、翻訳補助タンパク質、ｍＲＮＡ結合タンパク質、および／または翻訳開始因子を含む。
【０１３５】
本明細書に記載される薬学およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）の安定化は、脂質ナノ粒子に化学的または物理的に結合される、ないしは別の方法で組み込まれる（例えば、脂質可溶性アンカーの膜自体内への挿入により、または膜脂質の活性基に直接結合することにより）典型的に大きい親水性ポリマーであるオプソニン化阻害部分の使用によっても改善され得る。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、マクロファージ−単球系および細網内皮系によるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する（例えば米国特許第４，９２０，０１６号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、細網内皮系による脂質ナノ粒子の取り込みにおける遅延は、細網内皮系によるリポソームに基づく脂質ナノ粒子の認識および取り込みを遮蔽する
ために、脂質ナノ粒子上に、またはその中に親水性ポリマー表面コーティングを付加することにより容易にすることができる。例えば、ある実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような脂質ナノ粒子の標的細胞および組織への送達をさらに強化するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたはＰＥＧ修飾された脂質を含む。
【０１３６】
ＲＮＡが相補的ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）とハイブリッド形成するとき、ヌクレアーゼから保護され得る。（Ｋｒｉｅｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｌｔｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１９８７；１５５，３９７−４１５）。ハイブリッド形成されたｍＲＮＡの安定性は、大半のＲＮａｓｅｓの固有の１本鎖特異性による可能性が高い。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを複合化するように選択された安定化試薬は、真核生物のタンパク質（例えば哺乳類のタンパク質）である。さらに別の実施形態では、センス療法に使用するポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）は、第２のポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成することにより修飾され得る。全ｍＲＮＡ分子が相補的ポリヌクレオチド分子とハイブリッド形成する場合、翻訳開始が減少し得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子の５’非翻訳領域およびＡＵＧ開始領域は、任意に、ハイブリッド形成されないままであってよい。翻訳開始後、リボソーム複合体の巻き戻し活性は、翻訳が進行することができるように高親和性２本鎖上でも機能することができる。（Ｌｉｅｂｈａｂｅｒ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２；２２６：２−１３、Ｍｏｎｉａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：１４５１４−２２。）ポリヌクレオチドの安定性を強化するための上述の方法のいずれも、単独で、または他の上述の方法および／または組成物のいずれかのうちの１つ以上と組み合わせて使用することができることを理解する。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明の薬学的組成物は、脂質ナノ粒子−被包されたポリヌクレオチドの１つ以上の標的細胞、組織、または器官への送達を強化する。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的細胞への送達の強化は、標的細胞に接触する、ないしは別の方法でそれに送達されるポリヌクレオチドの量を増加することを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞への送達の強化は、非標的細胞と接触するポリヌクレオチドの量を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、標的細胞への送達の強化は、少なくともいくつかの標的細胞に被包されたポリヌクレオチドを形質移入させることを含む。いくつかの実施形態では、本薬学的組成物およびそれによってコードされた機能タンパク質または酵素の対応する生成物を含む脂質ナノ粒子によって被包されたポリヌクレオチドの発現レベルは、標的細胞において増加する。
【０１３８】
本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物により被包されたポリヌクレオチドは、任意に、例えば、ポリヌクレオチドの標的細胞または組織への送達の決定を容易にするレポーター遺伝子（例えば、ポリヌクレオチドのコード領域の上流または下流）と組み合わせられ得る。好適なレポーター遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦＰｍＲＮＡ）、ウミシイタケルシフェラーゼｍＲＮＡ（ルシフェラーゼｍＲＮＡ）、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。例えば、ＧＦＰ  ｍＲＮＡは、血漿、または１つ以上の標的細胞、組織、もしくは臓器におけるｍＲＮＡ局在化の確認を容易にするために、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ（配列番号４）またはＥＰＯ  ｍＲＮＡ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドと融合され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物は、脂質ナノ粒子からのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡ）を標的細胞の細胞内区画に移動させるのを容易にする１つ以上の追加分子（例えば、タンパク質、ペプチド、アプタマー、またはオリゴヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、追加分子は、ポリヌクレオチドの、例えば標的細胞の細胞ゾル、リソソーム、ミトコンドリア
、核、核小体、またはプロテアソーム内への送達を容易にする。その小器官における欠乏を治療するために、細胞質からの関心の翻訳されたタンパク質をその正常な細胞内位置（例えばミトコンドリアにおいて）に輸送するのを容易にする薬剤も含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、タンパク質、ペプチド、アプタマー、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、対象の１つ以上の機能タンパク質および／または酵素の内因生成、特にその組み換えにより調製された対応物に対して少ない免疫原性を示すタンパク質および／または酵素の生成を容易にする。本発明のある実施形態では、脂質ナノ粒子は、欠乏タンパク質または酵素のｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。そのような組成物が標的組織に分布され、後にそのような標的細胞に形質移入されるとき、組成物を含む脂質ナノ粒子内に充填または被包された外因性ｍＲＮＡは、そのような被包されたｍＲＮＡによってコードされる機能タンパク質または酵素（例えば、対象が欠乏するタンパク質または酵素）を生成するように、生体内で翻訳され得る。したがって、ある実施形態では、本発明の組成物は、外因的にまたは組み換えにより調製されたｍＲＮＡが外因的に翻訳されたタンパク質または酵素を生成し、それによって機能タンパク質または酵素を生成する（適用可能な場合、排出する）対象の能力を利用する。翻訳されたタンパク質または酵素は、組み換えにより調製されたタンパク質または酵素において不在である場合が多い未変性翻訳後修飾を生体内に含み、それによって翻訳されたタンパク質または酵素の免疫原性をさらに減少させることも特徴とし得る。
【０１４１】
ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子内への被包およびそのような脂質ナノ粒子を含む薬学的組成物の投与は、標的細胞内の特定の小器官（例えばミトコンドリア）にｍＲＮＡを送達する必要性を回避する。むしろ、標的細胞の形質移入時および被包されたｍＲＮＡの標的細胞の細胞質への送達時、脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ含有物が翻訳され、機能タンパク質または酵素が生成され得る。
【０１４２】
本発明は、受動的または能動的の両方の標的手段により、１つ以上の標的細胞および組織の差別的標的も想定する。受動的標的の現象は、１つ以上の標的細胞による脂質ナノ粒子の認識を強化するための追加の賦形剤の使用に依存することなく、生体内での脂質ナノ粒子の自然な分布パターンを利用する。例えば、細網内皮系の細胞による食作用を受ける脂質ナノ粒子は、肝臓または脾臓に蓄積される可能性が高く、したがって、組成物のそのような標的細胞への送達を受動的に誘導するための手段を提供することができる。
【０１４３】
別の方法としては、本発明は、脂質ナノ粒子に結合して（共有結合的または非共有結合的に）、ある標的細胞または標的組織でそのような脂質ナノ粒子の局在化を助長することができる、本明細書において「標的リガンド」と称される追加の賦形剤の使用を伴う能動的標的を想定する。例えば、標的は、標的細胞または組織への分布を助長するために、１つ以上の内因性標的リガンド（例えばアポリポタンパク質Ｅ）を脂質ナノ粒子に、またはその上に含むことにより媒介され得る。標的組織による標的リガンドの認識は、標的細胞および組織による脂質ナノ粒子および／またはその含有物への組織分布およびその細胞取り込みを積極的に容易にする。例えば、ある実施形態では、医薬製剤を含む脂質ナノ粒子のうちの１つ以上は、そのような脂質ナノ粒子を認識する、および例えば肝細胞によって発現される内因性低密度リポタンパク質受容体に結合することを容易にする、または助長するそのような脂質ナノ粒子に、またはその上にアポリポタンパク質−Ｅ標的リガンドを含み得る。本明細書に提供される、組成物は、１つ以上の標的細胞に対する組成物の親和性を強化することが可能なリガンドを含み得る。標的リガンドは、製剤化中または製剤化後に、脂質ナノ粒子の外側の２重層に連結され得る。これらの方法は当該技術分野において既知である。加えて、いくつかの脂質ナノ粒子は、ＰＥＡＡ、赤血球凝集素、他のリポペプチド等の膜融合ポリマー（米国特許出願第０８／８３５，２８１号および第６０／０
８３，２９４号を参照、参照により本明細書に組み込まれる）、および生体内および／または細胞内送達に有用な他の特徴を含み得る。他の実施形態では、本発明の組成物は改善された形質移入の効率を示し、かつ／または関心の標的細胞または組織に対する強化された選択性を示す。したがって、１つ以上の標的細胞または組織に対して組成物またはその構成要素である脂質ナノ粒子およびそのポリヌクレオチド含有物の親和性を強化することが可能である１つ以上のリガンド（例えば、ペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、または他の分子）を含む組成物または脂質ナノ粒子が想定される。好適なリガンドは、任意に、脂質ナノ粒子の表面に結合または連結され得る。いくつかの実施形態では、標的リガンドは、脂質ナノ粒子の表面に及ぶか、または脂質ナノ粒子内に被包され得る。好適なリガンドは、その物理的、化学的、または生物学的性質（例えば選択的な親和性および／または標的細胞表面マーカーもしくは特徴の認識）に基づき選択される。好適な標的リガンドは、標的細胞の独特な特性が利用され、よって組成物が標的細胞を非標的細胞と区別することができるように選択される。例えば、本発明の組成物は、肝細胞の認識またはそれに対する親和性を選択的に強化する（例えば、そのような表面マーカーの受容体媒介による認識およびそれへの結合により）表面マーカー（例えばアポリポタンパク質−Ｂまたはアポリポタンパク質−Ｅ）を有し得る。加えて、標的リガンドとしてのガラクトースの使用は、本発明の組成物を柔肝細胞に誘導することが予測されるか、または別の方法としては、標的リガンドとしての糖残基を含むマンノースの使用（例えば、肝細胞に存在するアシアロ糖タンパク質受容体に優先的に結合することができる糖残基を含むマンノース）は、本発明の組成物を肝臓内皮細胞に誘導することが予測されるだろう。（Ｈｉｌｌｅｒｙ  ＡＭ，ｅｔ  ａｌ．”Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ”（２００２）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．を参照）。好適な標的リガンドの例としては、１つ以上のペプチド、タンパク質、アプタマー、ビタミン、およびオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１４４】
本明細書で使用される、用語「対象」とは、本発明の化合物、薬学的またはリポソーム組成物および方法が投与され得る、ヒト、ヒト以外の霊長類、げっ歯類等を含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば哺乳類）を指す。典型的に、用語「対象」および「患者」は、本明細書において、ヒト対象に関して互換的に使用される。
【０１４５】
本明細書に記載される化合物および薬学的またはリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）が被包されたポリヌクレオチドの発現およびポリペプチドもしくはタンパク質の生成を調節または強化する能力は、疾患または病的状態の宿主の治療のために、ポリペプチドおよびタンパク質の生体内生成をもたらす新しい、より効率的な手段を提供する。そのような脂質ナノ粒子組成物は、タンパク質または酵素をコードする核酸の異常発現に関連する疾患または病的状態の治療に特に適している。例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドの、肝臓、特に幹細胞等の標的器官への成功裏の送達は、肝臓に局在化する代謝の先天性異常の治療および補正に使用され得る。したがって、本明細書に記載される化合物、薬学的組成物、および関連する方法は、広範囲の疾患および病的状態、特にタンパク質または酵素欠乏によるそれらの疾患を治療するために採用され得る。本明細書に記載される化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されたポリヌクレオチド（例えばＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子）は、機能生成物（例えば、タンパク質、酵素、ポリペプチド、ペプチド、機能ＲＮＡ、および／またはアンチセンス分子）をコードし得、好ましくは生体内生成が望まれる生成物をコードする。
【０１４６】
本発明の化合物、薬学的組成物、および関連する方法は、多くの障害を治療するための、ポリヌクレオチド等の治療薬、特にｍＲＮＡの送達に広く適用可能である。特に、本発明のそのような化合物、組成物、および関連する方法は、タンパク質および／または酵素の欠乏に関連する疾患または障害の治療に適している。ある実施形態では、脂質ナノ粒子
−被包されたポリヌクレオチドは、１つ以上の標的細胞によって、周囲の細胞外流体（例えばホルモンおよび神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）内に排出または分泌される機能タンパク質または酵素をコードする。別の方法として、別の実施形態では、本発明の化合物または薬学的およびリポソーム組成物によって被包されるポリヌクレオチドは、１つ以上の標的細胞（例えば尿素回路またはリソソーム貯蔵代謝障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡ）の細胞質ゾルに残存する機能タンパク質または酵素をコードする。本発明の化合物、薬学的組成物、および関連する方法が有用である他の障害は、ＳＭＮ１関連脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；ＧＡＬＴ関連ガラクトース血症；嚢胞性線維症（ＣＦ）；シスチン尿症を含むＳＬＣ３Ａ１関連障害；アルポート症候群を含むＣＯＬ４Ａ５関連障害；ガラクトセレブロシダーゼ欠損症；Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィーおよび副腎脊髄神経障害；フリードライヒ運動失調症；ペリツェウス・メルツバッヘル病；ＴＳＣ１およびＴＳＣ２関連結節性硬化症；サンフィリポＢ症候群（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ）；ＣＴＮＳ関連シスチン症；脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群および脆弱Ｘ早期閉経症候群を含むＦＭＲ１関連障害；プラダー−ウィリー症候群；ファブリー病、遺伝性出血性末梢血管拡張症（ＡＴ）；ニーマン−ピック病Ｃ１型；若年型神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）、若年型バッテン病、サンタオブオリ−ハルティア病（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヤンスキー−ビールショースキー病、ならびにＰＴＴ−１およびＴＰＰ１欠損症を含む神経セロイドリポフスチン関連疾患；中枢神経系エミリン形成不全／白質消失を伴うＥＩＦ２Ｂ１、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、およびＥＩＦ２Ｂ５関連小児期運動失調症；ＣＡＣＮＡ１ＡおよびＣＡＣＮＢ４関連発作性運動失調症２型；典型的レット症候群、ＭＥＣＰ２関連重度新生児脳症、およびＰＰＭ−Ｘ症候群を含むＭＥＣＰ２関連障害；ＣＤＫＬ５関連非定形レット症候群；ケネディ病（ＳＢＭＡ）；皮質下梗塞および白質脳症を伴うノッチ−３関連常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）；ＳＣＮ１ＡおよびＳＣＮ１Ｂ関連痙攣障害；アルパース−ヒュッテンロッチャー（Ｈｕｔｔｅｎｌｏｃｈｅｒ）症候群、ＰＯＬＧ関連感覚運動失調神経障害、構音障害、および眼麻痺、ならびにミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺を含むポリメラーゼＧ関連障害；Ｘ連鎖型副腎発育不全；Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症；ならびにウィルソン病などの障害を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、特にｍＲＮＡは、機能タンパク質または酵素をコードすることができる。例えば、本発明の組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、またはアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、α−ガラクトシターゼＡ、エリスロポエチン（例えば配列番号４）、α１−抗トリプシン、カルボキシペプチダーゼＮ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモン、生存運動ニューロン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、または低密度リポタンパク質受容体をコードするｍＲＮＡを含み得る。
【０１４７】
一実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸性アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、α−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転
移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする。
【０１４８】
本明細書に記載される化合物および薬学的組成物は、対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の追加のポリヌクレオチド、担体、標的リガンド、もしくは安定化試薬、または他の好適な賦形剤と組み合わせて製剤化される。薬物の製剤化および投与の技法は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．の最新版に見出すことができる。
【０１４９】
本発明の化合物ならびに薬学的およびリポソーム組成物（例えば脂質ナノ粒子）は、対象の臨床状態、被包された材料の性質、投与の部位および方法、投与予定、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関する他の要因を考慮して、現在の医行為に従い投与および投薬され得る。本明細書の目的において、「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、および医療分野の当業者に既知である、そのような関連する考慮事項によって決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、疾患の進行、後退、または改善の適切な処置として当業者により選択される、少なくともある程度の症状の安定化、改善または排除、および他の指標を達成するのに十分である。例えば、好適な量および投与レジメンは、標的細胞における１つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも一過性の発現をもたらすものである。
【０１５０】
本明細書に開示される化合物および薬学的組成物の好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、膣、経粘膜、または腸管投与、非経口送達（筋肉内、皮下、髄内注射、ならびにくも膜下腔内、脳室内、直接的な脳室内、静脈内、腹腔内、経鼻、または眼内注射もしくは注入を含む）を含む。ある実施形態では、対象に本明細書に記載される化合物または組成物（例えば脂質ナノ粒子）を投与することにより、そのような化合物または組成物を１つ以上の標的細胞、組織、または器官に接触させることを容易にする。
【０１５１】
代替的に、本発明の化合物および組成物は、標的細胞の構成要素である脂質ナノ粒子への接触をさらに容易にすることができるように、例えば、薬学的組成物の標的組織への直接注射または注入を介して、好ましくはデポ製剤または持続放出製剤で、全身よりもむしろ局所様式で投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により、様々な方法で影響を受ける場合がある。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは吸引され得る（鼻、気管、または気管支送達用）、本発明の組成物は例えば外傷、疾患徴候、または痛みの部位内に注射され得る、組成物は経口、気管、もしくは食道用途用にロゼンジ剤で提供され得る、胃もしくは腸に投与するために液体、錠剤、もしくはカプセルの形態で供給され得る、直腸もしくは膣用途用に坐剤形態で供給され得る、またはクリーム、滴剤、またはさらには注射の使用により眼にも送達され得る。治療用分子またはリガンドと複合される本発明の化合物を含む製剤は、例えば、組成物を移植の部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と関連して外科的にも投与され得る。別の方法としては、そのような組成物は、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用
され得る。
【０１５２】
例えば２０１１年６月８日に出願された米国仮出願第６１／４９４，８８２号（代理人整理番号ＳＨＩＲ−０２３−００１）（その教示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように、本明細書に開示される化合物のうちの１つ以上を含む凍結乾燥された薬学的組成物、およびそのような凍結乾燥された組成物を使用するための関連する方法も、本明細書において想定される。
【０１５３】
ある実施形態では、本発明の組成物は、それらが例えばその中に被包されたポリヌクレオチドまたは核酸の持続放出に適するように製剤化される。そのような持続放出組成物は、延長された投与間隔で、適宜対象に投与され得る。例えば、ある実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、１日１回、または２日に１回、対象に投与される。ある実施形態では、本発明の組成物は、１週間に２回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または好ましくは４週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、８週間に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、６ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、または１年に１回、対象に投与される。長期間にわたりポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）の送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内に、皮下に、硝子体内に）用に製剤化される組成物および脂質ナノ粒子も想定される。好ましくは、採用される持続放出手段は、安定性を強化するために、ポリヌクレオチド内に導入される修飾（例えば化学修飾）と組み合わされる。
【０１５４】
本発明のある化合物、組成物、および方法がある実施形態に従い具体的に記載されてきたが、以下の実施例は、単に本発明の化合物を図示するのに役立ち、それを限定することは意図されない。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために参照される刊行物、参考資料等のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、特に逆が明確に記載されない限り、複数対象を含むように理解されるべきである。群の１つ以上のメンバー間に「ｏｒ」を含む特許請求の範囲または説明は、逆が記載されない、ないしは別の方法で内容から明らかでない限り、１つ、２つ以上、または全ての群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する場合満たされたと考えられる。本発明は、正確に群のうちの１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実施形態を含む。本発明は、２つ以上または全群のメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、採用される、ないしは別の方法で関係する実施形態も含む。さらに、本発明は、特に記載されない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙される特許請求の範囲のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記述用語等が同じ基本特許請求に依存する（または関連する任意の他の特許請求として）別の特許請求に導入される全ての変形、組み合わせ、および置換を包含することを理解する。要素がリスト（例えばマルクーシュ群または同様の形式で）として提示される場合、要素のそれぞれの小群も開示され、任意の要素（複数可）は群から取り除かれ得ることを理解する。一般に、本発明または本発明の態様は、特定の要素、特徴等を含むものと見なされ、本発明のある実施形態または本発明の態様は、そのような要素、特徴等からなるか、または本質的にそれらからなることも理解するべきである。簡潔化する目的のため、これらの実施形態は、全ての場合において、本明細書において明確に、具体的に記述されない。本発明の任意の実施形態または態様は、特定の除外が本明細書に列挙されるか否かに関わらず、特許請求の範囲から明示的に除外され得ることも理解するべきである。本発明の背景を説明し、その実践に関する追加の詳細を提供するために参照される刊行物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５６】
実施例１
化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（本明細書において「ＨＧＴ５０００」と称される）は、下の反応１に示される一般合成スキームに従い調製された。
【０１５７】
【化１７】
2018095653.tif 000018
上の反応１において化合物（２）と特定される中間体化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−６−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］テトラコサ−１５，１８−ジエン−１，６−ジオールは、次のように調製された。１００ｍＬの丸底フラスコに、窒素下で、１０ｇ（３０ｍｍｏｌ）の化合物（１）（臭化リノレイル）および乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）を添加した。室温で、マグネシウム粉末（１．１１ｇ、４５ｍｍｏｌ）、続いてジブロモエタン２滴を、攪拌した反応溶液に添加した。反応混合物を５０℃で１時間攪拌し、乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）で希釈した。反応混合物を、室温でさらに１５分攪拌した。
【０１５８】
窒素下、別の２５０ｍＬの三つ口フラスコに、乾燥ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のｅ−カプロラクトン（１．４４ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を入れた。攪拌した溶液に、カニューレを通して０℃のグリニャール試薬を添加した。得られた混合物を８５℃で３時間加熱した。室温に冷却した後、次に、反応混合物をＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。混合抽出物を鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサンから３：２のヘキサン／ＥＡに勾配溶出）により、残留物を２回精製し、油状物として化合物（２）を得た。収率：５．４６ｇ（６５％）。  １Ｈ  ＮＭＲ  （３０１  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）
δ：  ５．２５  −  ５．４５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．９５  −  ２．１  （ｍ，  ８Ｈ），  １．２  −  １．７０  （ｍ，  ５０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ６Ｈ）。
【０１５９】
上の反応１において化合物（３）と特定される中間体化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−６−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−オールは、次のように調製された。化合物（２）（４．４ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７０ｍｌ）に溶解した。窒素下で溶液を０℃で攪拌し、Ｅｔ３ＳｉＨ（８．０７ｍＬ、５０．０８ｍｍｏｌ）を添加した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物（８．７７ｍＬ、７１．５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加した。次に、反応混合物を同じ温度で３時間、その後室温で３０分間攪拌した。次に、反応を１０％の炭酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）でクエンチした。得られた混合物をジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）で２回抽出した。混合抽出物を鹹水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサンから２：１のヘキサン／ＥＡに勾配溶出）により、粗生成物を精製し、油状物として、所望の中間体生成物化合物（３）を得た。収率：３．８６ｇ（９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３０１  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２  −  ５．５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．６２
（ｑ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，
４Ｈ），  １．９  −  ２．１  （ｍ，  ８Ｈ），  １．５  −  １．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  １．１  −  １．４５  （ｍ，  ４８  Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ６Ｈ）。
【０１６０】
上の反応１において化合物（４）と特定される中間体化合物（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−１９−（５−ブロモペンチル）ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエンは、次のように調製された。窒素下、０℃でジクロロメタン（８０ｍＬ）中の化合物（３）（３．８６ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌した。トリフェニルホスフィン（１．８６ｇ、７．１０ｍｍｏｌ）、続いてテトラブロモメタン（２．１４ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。反応混合物を０℃で３時間、その後室温で３０分間攪拌した。ＴＬＣは尚も開始材料の存在を示したため、トリフェニルホスフィンの別の一部（０．４ｇ）を０℃で添加した。３０分後、全ての開始材料は消費され、次に、反応混合物を濃縮した。残留物にエーテルとヘキサン（２：１、２００ｍＬ）の混合物を添加し、スラリーを１５分間攪拌した。固体を濾別し、減圧下で濾過物を濃縮した。複数のカラムクロマトグラフィー（ヘキサンから３：２ヘキサン／ＥＡに勾配溶出）により、残留物を精製し、所望の中間体生成物である化合物（４）を得た。収率：２．７ｇ（６３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３０１  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．２  −  ５．５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．４０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ４Ｈ），  １．８  −  ２．１  （ｍ，  ８Ｈ），  １．１５  −  １．５
（ｍ，  ４６Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ６Ｈ）。
【０１６１】
ＨＧＴ５０００化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン）を調製するために、ＴＨＦ（２０４ｍＬ、１００当量）中のジメチルアミンの２Ｍ溶液に化合物（４）（２．７０ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）を溶解した。得られた溶液を室温で１６時間、窒素下で攪拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０％〜１０％のメタノールの勾配溶出）により、残留物を精製し、淡黄色油状物としてＨＧＴ５０００化合物を得た。収率：２．５２ｇ（９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３０１  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．４２  −  ５．２９  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．７７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．２８  −  ２．２４  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．０１  −  ２．０８  （ｍ，  ８Ｈ），  １．６６  −  １．６３（ｍ，  ２Ｈ），  １．４１  −  １．２０  （ｍ，  ４８Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ６Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ：  １３０．３，  １２８．０，  ５９．９，  ４５．３，  ３７．５，  ３３．８，  ３１．６，  ３０．３，  ２９．８，  ２９．７，  ２９．４，  ２８
．０，  ２７．５，  ２７．３，  ２６．８，  ２６．７，  ２５．７，  ２２．７．  
ＡＰＣＩ  ［Ｍ＋Ｈ］  ６２６．６．    Ｒｆ＝０．４８（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ）。
【０１６２】
実施例２
化合物（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン（本明細書において、「ＨＧＴ５００１」と称される）は、下の反応２に図示される一般合成スキームに従い調製された。
【０１６３】
【化１８】
2018095653.tif 000019
上の反応２において、それぞれ、化合物（６）および（７）と特定される中間体化合物（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルギ酸塩（６）および（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オールは、アルゴン下で、Ｍｇ（０．５ｇ、２０．８３ｍｍｏｌ、１．３７当量）およびＩ２（結晶１つ）で充填された、オーブンで乾燥させた３つ口５００ｍＬフラスコ中で調製された。フラスコを高真空管路で脱気し、その後、アルゴンを流し（プロセスを４回繰り返した）、次に、室温で約５分間攪拌した。無水エーテル（２２ｍＬ）をこのフラスコに添加し、スラリーを約１０分間攪拌した。次に、５ｇ（１５．２ｍｍｏｌ、１当量）の化合物（５）（臭化リノレイル）をアルゴン下で添加し（約４．５ｍＬの化合物（５）を添加した後に、色の変化が観察された）、反応物を室温で攪拌した。約５分間室温で攪拌した後、発熱反応が観察された。よって、約２分間、氷水浴を使用して、混合物を冷却し、その後、氷浴を取り外し、反応混合物を室温で２分間攪拌し、灰色の反応混合物が得られ、全てのＭｇは消費されなかった。混合物を０℃に冷却し、ＨＣＯ２Ｅｔ（０．５８ｍＬ、７．１７ｍｍｏｌ、０．４７当量）を
滴下して溶液に直接添加した。室温で３時間攪拌した後（生成物はＭＳおよびＴＬＣによって１時間後に観察された）、混合物を移し、Ｍｇ形成物（ｔｕｒｎｉｎｇｓ）をエーテルで洗浄した。混合洗浄物をエーテル（１００ｍＬ）で希釈し、１０％のＨ２ＳＯ４（２×５０ｍＬ）、水、鹹水で洗浄し、その後、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶液を濾過し、濃縮して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、残留物を精製した。
【０１６４】
ヘキサン中５〜７％のエーテルは、残留物からアルコール（化合物（７））を溶出した。収率：０．３４ｇ（８％）。化合物７：１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．３８−５．３１  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．０４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ８Ｈ），  １．３９−１．２６  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ６Ｈ）。    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５２７，  ５１１  （−Ｈ２Ｏ）。
【０１６５】
ヘキサン中２％のエーテルは、残留物からギ酸塩（化合物（６））を溶出した。収率：１．７ｇ（４０％）。化合物６：１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ５．４２−５．２８  （ｍ，  ８Ｈ），  ４．９９−４．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．０４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ８Ｈ），  １．３９−１．２６  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ６Ｈ）。    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５５７．化合物（６）から化合物（７）を得るために、ＫＯＨ（粉末、０．７６ｇ、１３．５ｍｍｏｌ、１．４当量）を、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（９０ｍＬ／１６ｍＬ）中の化合物（６）の濁った溶液に添加した。反応混合物を、Ｎ２ａｔｍ下で一晩、室温で攪拌した。次に、この混合物を濃縮し、エーテルで希釈し、５％の水性ＨＣｌ（２×１００ｍＬ）、水で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶液を濾過し、濃縮し、その後、高真空下で乾燥させ、無色の油状物として化合物（７）を得た。収率：４．９ｇ（９６％）。１Ｈ
ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．３８−５．３１  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５８  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．０４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ８Ｈ），  １．３９−１．２６  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ６Ｈ）．    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５２７，  ５１１  （−Ｈ２Ｏ）。
【０１６６】
上の反応２において化合物（８）として特定される中間体化合物（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オンは、次のように調製された。無水ＣＨ２Ｃｌ２（２３０ｍＬ）中の化合物（７）（４．８１ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、１５分の期間にわたってＮａ２ＣＯ３（０．４９ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）、そして次にＰＣＣ（４．９ｇ、２２．７ｍｍｏｌ、２．５当量）を少量ずつ添加した。黒色の混合物を室温で１．５時間攪拌した。ＴＬＣは、反応の完了を示した。シリカゲルパッド（２００ｇ）を通して反応混合物を濾過し、パッドをＣＨ２Ｃｌ２（３×４００ｍＬ）で洗浄した。濾過物を濃縮し、高真空管路で乾燥させ、無色の油状物としてケトン化合物（８）を得た。収率：４．５ｇ（９８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００
ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．３６−５．３３  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．３７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．０４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ８Ｈ），  １．３２−１．２７  （ｍ，  ３６Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ６Ｈ）．    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５２７。
【０１６７】
上の反応２において化合物（９）として特定される中間体化合物（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−１９−（メトキシメチレンヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエンは、次のように調製された。化合物（８）（２．７ｇ、５．１２ｍｍｏｌ、１当量
）と（メトキシメチル）トリフェニル塩化ホスホニウム（２．６３ｇ、７．６７ｍｍｏｌ、１．５当量）の混合物を高真空下で脱気し、アルゴンを流した（４回）。無水ＴＨＦ（６８ｍＬ）、続いて、シリンジでＴＨＦ中の１Ｍ  ＫＯｔ−Ｂｕ（７．６７ｍＬ、７．６７ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下して添加した。得られた赤い溶液を、室温で一晩攪拌した。反応混合物をエーテルで希釈し、水、鹹水で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒の除去および残留物のクロマトグラフィー  （ヘキサン中１〜４％エーテル）により、無色の油状物として生成物化合物（９）を得た。収率：２．７ｇ（９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ５．３６−５．３３  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．０５−１．９８  （ｍ，  １０Ｈ），  １．８５−１．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３１−１．２７  （ｍ，  ３６Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ６Ｈ）．    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５５５。
【０１６８】
上の反応２において化合物（１０）として特定される中間体化合物（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエナールは、次のように調製された。ジオキサン／Ｈ２Ｏ（５６ｍＬ／２９ｍＬ）溶液中の化合物（９）（１．３ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）の濁った溶液に、１０分にわたって０℃のジオキサン（２９ｍＬ、１１６ｍｍｏｌ、４９当量）中の４Ｍ  ＨＣｌを滴下して添加した。混合物を室温に温め、その後、室温で４０時間攪拌した（ＴＬＣによって監視された）。次に、混合物をエーテルで希釈し、０℃に冷却し、その後水性ＮａＨＣＯ３でゆっくりクエンチした。有機層を分離し、鹹水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。ヘキサン中１％のエーテルは、無色の油状物として生成物化合物（１０）を溶出した。収率：１．２１ｇ（９６％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３６−５．３３  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  ４  Ｈ），  ２．２３−２．１８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０５−１．９６  （ｍ，  ８Ｈ），  １．６１−１．１６  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７  Ｈｚ，  ６Ｈ）．    ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ５４１。
【０１６９】
中間体化合物（４−ジメチルアミノブチル）臭化トリフェニルホスホニウム（化合物（１４））は、反応３に示される、下に示される一般合成スキームに従い調製された。
【０１７０】
【化１９】
2018095653.tif 000020
上の反応３に示される中間体化合物（４−ブロモブチル）臭化トリフェニルホスホニウム（化合物（１２））は、１０ｇ（４６．３ｍｍｏｌ）の１，４−ジブロモブタン（化合物（１１））および１２．１ｇのＰＰｈ３（４６．３ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン（７４ｍＬ）中に設置し、混合物を還流に加熱し、一晩煮沸することにより調製された。形成された固体を濾過し、トルエンで洗浄し、真空下で乾燥させ、白色固体として生成物化合物（１２）を得た。収率：１６．１ｇ（７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ７．８４−７．６８  （ｍ，  １５Ｈ），  ４．０３−３．９３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３６−２．２８
（ｍ，  ２Ｈ），  １．８９−１．７６  （ｍ，  ２Ｈ）．  ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ３９７  （Ｍ−Ｂｒ），  ３９９  （Ｍ＋２−Ｂｒ）。
【０１７１】
中間体化合物（４−ジメチルアミノブチル）臭化トリフェニルホスホニウム（化合物（１４））は、Ｎ２下で、３ｇ（６．２８ｍｍｏｌ、１当量）の化合物（１２）を、０℃のＴＨＦ（３１．４ｍＬ、６２．８ｍｍｏｌ、１０当量）中の２Ｍジメチルアミンの溶液に滴下して添加することにより調製された。得られた懸濁液を室温で４時間攪拌した。次に、ＣＨ３ＣＮ（３５ｍＬ）をこの懸濁液に添加し、室温で一晩さらに攪拌した。次に、反応混合物に窒素ガスを気泡として通し、過剰なジメチルアミンおよび溶媒を除去した。得られた固体を高真空下で乾燥させ、淡黄色の固体として乾燥生成物化合物（１３）を得た。収率：３．１６ｇ（９６％）。生成物化合物（１３）を、１５分間、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１１０ｍＬ）と共に攪拌し、凍結乾燥させて、淡黄色の固体を生成した。この固体をクロロホルムと共に攪拌し、濾過した。濾過物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、残留物を、４５℃の高真空下で乾燥させ、淡いピンク色の固体として生成物化合物（１４）を得た。収率：２．７ｇ（９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ７．８９−７．７５  （ｍ，  ９Ｈ），  ７．７１−７．６５  （ｍ，
６Ｈ），  ３．９３−３．８３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２５  （ｓ，  ６Ｈ），  １．９４−１．８７  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７５−１．６２  （ｍ，  ２Ｈ）．  ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ３６２  （Ｍ−Ｂｒ）。
【０１７２】
ＨＧＴ５００１（（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−１−アミン）は、荷電した中間体化合物（１４）（０．５８ｇ、１．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を火炎乾燥させたＲＢフラスコ（３つ口、１００ｍＬ）に添加することにより調製され、次に、フラスコは、磁気攪拌棒で装備された。この設定は脱気され（高真空下で）、アルゴンで流された（３回）。その後、シリンジで無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）をフラスコに添加した。得られた懸濁液をアルゴン下で５分間攪拌し、次に−７８℃に冷却した。次に、ＫＨＭＤＳ（ＴＨＦ中１Ｍ、１．３２ｍＬ、１．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を反応フラスコに滴下して添加し、黄色がかったオレンジ色の濁った溶液を得た。この溶液を−７８℃で４５分間攪拌した。冷却浴を取り外し、反応物を室温で１５分間攪拌し、赤みがかったオレンジ色の溶液を得た。混合物を再び−７８℃に冷却し、乾燥ＴＨＦ（１３ｍＬ）中の中間体化合物（１０）（０．４７ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の溶液を、カニューレを通して添加した。反応混合物の色は淡黄色に変化した。反応混合物を−７８℃で４５分間攪拌し、次に、冷却浴を取り外し、室温でさらに３０分間、攪拌を継続した。混合物を再び−２０℃に冷却し、次に、水（７ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をエーテルで希釈し、１０分間攪拌した。有機層を分離し、鹹水で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラム上でカラムクロマトグラフィーにより精製した。クロロホルム中１．５〜２％のメタノールは、淡黄色の油状物としてＨＧＴ５００１生成物を溶出した。収率：０．４３ｇ（７９％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｃ６Ｄ６）：  δ  ５．５２−５．４６  （ｍ，  ９Ｈ），  ５．２２−５．１２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．８９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ２．４３  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ２．２４−２．０３  （ｍ，  １８Ｈ），  １．５５−１．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３５−１．２２  （ｍ，  ４０Ｈ），  ０．８８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ６Ｈ）。      ＡＰＣＩ［Ｍ＋Ｈ］  ６２４。Ｃ４４Ｈ８１Ｎに関して計算された元素分析（理論値、実測値：  Ｃ  （８４．６７，  ８４．４８）；  Ｈ  （１３．０８，  １３．１２）；  Ｎ  （２．２４，  ２．１９）。
【０１７３】
実施例３
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを被包する脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（
１９９３）９５：５１−５６．）。脂質のエタノール貯蔵溶液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で前もって調製され、−２０℃で保管された。
【０１７４】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからの生体外転写、続いて、ゲル電気泳動により決定される、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）、および長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールの付加により合成された。ＥＰＯ  ｍＲＮＡに存在する５’および３’非翻訳領域は、下に示されるように、配列番号１において、ＸおよびＹと表される。
【０１７５】
ヒトエリスロポエチンｍＲＮＡ：
配列番号１
ＸＡＵＧＧＧＧＧＵＧＣＡＣＧＡＡＵＧＵＣＣＵＧＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＵＵＣＵＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＵＣＡＵＣＵＧＵＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＵＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＡＣＣＵＣＵＵＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＡＧＣＵＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＵＣＵＡＵＧＣＣＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＧＵＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＵＡＧＡＡＧＵＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＵＧＵＵＧＧＵＣＡＡＣＵＣＵＵＣＣＣＡＧＣＣＧＵＧＧＧＡＧＣＣＣＣＵＧＣＡＧＣＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＵＵＣＧＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＧＧＧＣＵＣＵＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＣＵＣＣＡＣＵＣＣＧＡＡＣＡＡＵＣＡＣＵＧＣＵＧＡＣＡＣＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＣＧＡＧＵＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＵＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＵＧＡＹ
Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２）
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号３）  。
【０１７６】
ＥＰＯ  ｍＲＮＡは、使用するときまで、−８０℃で、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、水中で保管された。全てのｍＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して決定された。ｍＲＮＡの被包は、０．１％のトリトン−Ｘ１００の存在下、または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを行うことにより計算された。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ））およびゼータ電位は、それぞれ、１×ＰＢＳおよび１ｍＭ  ＫＣｌ溶液において、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を使用して決定された。
【０１７７】
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別に、ＥＰＯ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、  ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．８２ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ  ｍＲＮＡ（被包された）。Ｚ平均＝１０５．６ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝５３．７ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝１５７ｎｍ）。
【０１７８】
実施例４
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み、ヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡを被包する脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１−５６．）。脂質のエタノール貯蔵溶液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で前もって調製され、−２０℃で保管された。
【０１７９】
ヒトＧＬＡ  ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからの生体外転写、続いて、ゲル電気泳動により決定される、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）、および長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールの付加により合成された。ＧＬＡ  ｍＲＮＡに存在する５’および３’非翻訳領域は、下に示されるように、配列番号４において、ＸおよびＹと表される。
【０１８０】
アルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡ：
配列番号４
ＸＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＵＧＣＧＣＧＣＵＵＧＣＧＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＣＧＵＵＵＣＣＵＧＧＧＡＣＡＵＣＣＣＵＧＧＧＧＣＵＡＧＡＧＣＡＣＵＧＧＡＣＡＡＵＧＧＡＵＵＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＵＡＣＣＡＵＧＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＧＧＧＡＧＣＧＣＵＵＣＡＵＧＵＧＣＡＡＣＣＵＵＧＡＣＵＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＵＵＣＣＵＧＣＡＵＣＡＧＵＧＡＧＡＡＧＣＵＣＵＵＣＡＵＧＧＡＧＡＵＧＧＣＡＧＡＧＣＵＣＡＵＧＧＵＣＵＣＡＧＡＡＧＧＣＵＧＧＡＡＧＧＡＵＧＣＡＧＧＵＵＡＵＧＡＧＵＡＣＣＵＣＵＧＣＡＵＵＧＡＵＧＡＣＵＧＵＵＧＧＡＵＧＧＣＵＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＵＵＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＵＣＡＧＣＧＣＵＵＵＣＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＵＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＣＵＡＡＵＵＡＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＡＵＵＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＵＧＧＡＡＡＵＡＡＡＡＣＣＵＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＵＵＵＧＧＡＵＡＣＵＡＣＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＣＣＣＡＧＡＣＣＵＵＵＧＣＵＧＡＣＵＧＧＧＧＡＧＵＡＧＡＵＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＧＡＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＧＵＧＡＣＡＧＵＵＵＧＧＡＡＡＡＵＵＵＧＧＣＡＧＡＵＧＧＵＵＡＵＡＡＧＣＡＣＡＵＧＵＣＣＵＵＧＧＣＣＣＵＧＡＡＵＡＧＧＡＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＵＵＧＵＧＵＡＣＵＣＣＵＧＵＧＡＧＵＧＧＣＣＵＣＵＵＵＡＵＡＵＧＵＧＧＣＣＣＵＵＵＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＵＵＡＵＡＣＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＣＡＧＵＡＣＵＧＣＡＡＵＣＡＣＵＧＧＣＧＡＡＡＵＵＵＵＧＣＵＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＧＵＡＵＡＡＡＧＡＧＵＡＵＣＵＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＵＵＵＵＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＵＵＧＵＵＧＡＵＧＵＵＧＣＵＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧＧＵＵＧＧＡＡＵＧＡＣＣＣＡＧＡＵＡＵＧＵＵＡＧＵＧＡＵＵＧＧＣＡＡＣＵＵＵＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＣＡＡＧＵＡＡＣＵＣＡＧＡＵＧＧＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＵＧＣＵＣＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＧＵＣＵＡＡＵＧＡＣＣＵＣＣＧＡＣＡＣＡＵＣＡＧＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＵＣＵＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＡＡＧＧＡＣＧＵＡＡＵＵＧＣＣＡＵＣＡＡＵＣＡＧＧＡＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＧＧＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＧＧＧＣＵＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＣＧＣＵＣＵＵＡＵＡＣＣＡＵＣＧＣＡＧＵＵＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＵＡＡＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＣＣＵＧＣＵＵＣＡＵＣＡＣＡＣＡＧＣＵＣＣＵＣＣＣＵＧＵＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＵＵＣＵＡＵＧＡＡＵＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＧＵＵＡＡＧＡＡＧＵＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＡＧＡＡＡＡＵＡＣＡＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＡＡＡＡＧＡＣＵＵＡＣＵＵＵＡＡＹ
Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２）
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号３）  。
【０１８１】
ＧＬＡ  ｍＲＮＡは、使用するときまで、−８０℃で、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、水中で保管された。全てのｍＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して決定された。ｍＲＮＡの被包は、０．１％のトリトン−Ｘ１００の存在下、または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを行うことにより計算された。粒径（動的光散乱（ＤＬＳ））およびゼータ電位は、それぞれ、１×ＰＢＳおよび１ｍＭ  ＫＣｌ溶液において、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ機器を使用して決定された。
【０１８２】
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別に、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．３８ｍｇ／ｍＬのＧＬＡ  ｍＲＮＡ（被包された）。Ｚ平均＝７７．７ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝６２．３ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝９１．７ｎｍ）。
【０１８３】
実施例５
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み、ヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡを被包する脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１−５６．）。脂質のエタノール貯蔵溶液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で前もって調製され、−２０℃で保管された。
【０１８４】
アルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからの生体外転写、続いて、ゲル電気泳動により決定される、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）、および長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールの付加により合成された。ヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡに存在する５’および３’非翻訳領域は、下に示されるように、それぞれ、配列番号４においてＸおよびＹと表される。
【０１８５】
ヒトアルファ−ガラクトシターゼ（ＧＬＡ）ｍＲＮＡ：
配列番号４
ＸＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＵＣＵＧＧＧＣＵＧＣＧＣＧＣＵＵＧＣＧＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＵＧＧＣＣＣＵＣＧＵＵＵＣＣＵＧＧＧＡＣＡＵＣＣＣＵＧＧＧＧＣＵＡＧＡＧＣＡＣＵＧＧＡＣＡＡＵＧＧＡＵＵＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＣＣＵＡＣＣＡＵＧＧＧＣＵＧＧＣＵＧＣＡＣＵＧＧＧＡＧＣＧＣＵＵＣＡＵＧＵＧＣＡＡＣＣＵＵＧＡＣＵＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＵＵＣＣＵＧＣＡＵＣＡＧＵＧＡＧＡＡＧＣＵＣＵＵＣＡＵＧＧＡＧＡＵＧＧＣＡＧＡＧＣＵＣＡＵＧＧＵＣＵＣＡＧＡＡＧＧＣＵＧＧＡＡＧＧＡＵＧＣＡＧＧＵＵＡＵＧＡＧＵＡＣＣＵＣＵＧＣＡＵＵＧＡＵＧＡＣＵＧＵＵＧＧＡＵＧＧＣＵＣＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＵＵＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＵＵＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＵＣＡＧＣＧＣＵＵＵＣＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵＵＣＧＣＣＡＧＣＵＡＧＣＵＡＡＵＵＡＵＧＵＵＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＣＵＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＡＵＵＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＵＧＧＡＡＡＵＡＡＡＡＣＣＵＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＡＧＵＵＵＵＧＧＡＵＡＣＵＡＣＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＣＣＣＡＧＡＣＣＵＵＵＧＣ
ＵＧＡＣＵＧＧＧＧＡＧＵＡＧＡＵＣＵＧＣＵＡＡＡＡＵＵＵＧＡＵＧＧＵＵＧＵＵＡＣＵＧＵＧＡＣＡＧＵＵＵＧＧＡＡＡＡＵＵＵＧＧＣＡＧＡＵＧＧＵＵＡＵＡＡＧＣＡＣＡＵＧＵＣＣＵＵＧＧＣＣＣＵＧＡＡＵＡＧＧＡＣＵＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＵＵＧＵＧＵＡＣＵＣＣＵＧＵＧＡＧＵＧＧＣＣＵＣＵＵＵＡＵＡＵＧＵＧＧＣＣＣＵＵＵＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＡＵＵＡＵＡＣＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＣＡＧＵＡＣＵＧＣＡＡＵＣＡＣＵＧＧＣＧＡＡＡＵＵＵＵＧＣＵＧＡＣＡＵＵＧＡＵＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＡＧＵＡＵＡＡＡＧＡＧＵＡＵＣＵＵＧＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＵＵＵＵＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＡＵＵＧＵＵＧＡＵＧＵＵＧＣＵＧＧＡＣＣＡＧＧＧＧＧＵＵＧＧＡＡＵＧＡＣＣＣＡＧＡＵＡＵＧＵＵＡＧＵＧＡＵＵＧＧＣＡＡＣＵＵＵＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＣＡＡＧＵＡＡＣＵＣＡＧＡＵＧＧＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＵＧＣＵＣＣＵＵＵＡＵＵＣＡＵＧＵＣＵＡＡＵＧＡＣＣＵＣＣＧＡＣＡＣＡＵＣＡＧＣＣＣＵＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＣＵＣＵＣＣＵＵＣＡＧＧＡＵＡＡＧＧＡＣＧＵＡＡＵＵＧＣＣＡＵＣＡＡＵＣＡＧＧＡＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＧＧＵＡＣＣＡＧＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＵＧＵＧＧＧＡＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＧＧＧＣＵＧＵＡＧＣＵＡＵＧＡＵＡＡＡＣＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＵＵＧＧＵＧＧＡＣＣＵＣＧＣＵＣＵＵＡＵＡＣＣＡＵＣＧＣＡＧＵＵＧＣＵＵＣＣＣＵＧＧＧＵＡＡＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＵＧＵＡＡＵＣＣＵＧＣＣＵＧＣＵＵＣＡＵＣＡＣＡＣＡＧＣＵＣＣＵＣＣＣＵＧＵＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＵＡＧＧＧＵＵＣＵＡＵＧＡＡＵＧＧＡＣＵＵＣＡＡＧＧＵＵＡＡＧＡＡＧＵＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＵＧＵＵＵＵＧＣＵＵＣＡＧＣＵＡＧＡＡＡＡＵＡＣＡＡＵＧＣＡＧＡＵＧＵＣＡＵＵＡＡＡＡＧＡＣＵＵＡＣＵＵＵＡＡＹ（配列番号２）
Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２）
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号３）  。
【０１８６】
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別に、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝０．６８／ｍＬのＧＬＡ  ｍＲＮＡ（被包された）。Ｚ平均＝７９．６ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝５７．２６ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝１００ｎｍ）。
【０１８７】
実施例６
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを被包する脂質ナノ粒子は、標準的なエタノール注入法を介して形成された（Ｐｏｎｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９３）９５：５１−５６．）。脂質のエタノール貯蔵溶液は、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で前もって調製され、−２０℃で保管された。
【０１８８】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからの生体外転写、続いて、ゲル電気泳動により決定される、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００５）８６：１２３９−１２４９）、および長さが約２００ヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールの付加により合成された。ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡに存在する５’および３’非翻訳領域は、下に示されるように、それぞれ、配列番号１においてＸおよびＹと表される。
【０１８９】
ヒトエリスロポエチンｍＲＮＡ：
配列番号１
ＸＡＵＧＧＧＧＧＵＧＣＡＣＧＡＡＵＧＵＣＣＵＧＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＣＵＵＣＵＣＣＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＣＵＣＣＣＵＣＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＡＧＵＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＵＣＡＵＣＵＧＵＧＡＣＡＧＣＣＧＡＧＵＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＡＣＣＵＣＵＵＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＵＧＵＧＣＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＡＧＣＵＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＵＵＡＡＵＵＵＣＵＡＵＧＣＣＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＧＵＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＵＡＧＡＡＧＵＣＵＧＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＣＵＧＵＣＧＧＡＡＧＣＵＧＵＣＣＵＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＵＧＵＵＧＧＵＣＡＡＣＵＣＵＵＣＣＣＡＧＣＣＧＵＧＧＧＡＧＣＣＣＣＵＧＣＡＧＣＵＧＣＡＵＧＵＧＧＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵＣＡＧＵＧＧＣＣＵＵＣＧＣＡＧＣＣＵＣＡＣＣＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＧＧＧＣＵＣＵＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＵＣＵＣＣＣＣＵＣＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＵＣＡＧＣＵＧＣＵＣＣＡＣＵＣＣＧＡＡＣＡＡＵＣＡＣＵＧＣＵＧＡＣＡＣＵＵＵＣＣＧＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＣＧＡＧＵＣＵＡＣＵＣＣＡＡＵＵＵＣＣＵＣＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＣＵＧＵＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＵＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＵＧＡＹ
Ｘ＝ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣ（配列番号２）
Ｙ＝ＵＵＵＧＡＡＵＵ（配列番号３）  。
【０１９０】
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容積に希釈した。別に、ＥＰＯ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液から調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液中に迅速に注入し、振盪し、２０％のエタノール中に最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．０９ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ  ｍＲＮＡ（被包された）。Ｚ平均＝６２．１ｎｍ（Ｄｖ（５０）＝４５．２ｎｍ；Ｄｖ（９０）＝７４．６ｎｍ）。
【０１９１】
実施例７
ヒトＧＬＡ  ｍＲＮＡを被包し、上の実施例４に従い調製されたＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子が被包されたポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞に送達することができるか否かを決定するために、ヒトＧＬＡタンパク質生成に関して後に監視された野生型（ＣＤ−１）マウスにおいて、投与量反応研究が行われた。
【０１９２】
前述の研究は、各実験の開始時において約６〜８週齢の雄または雌のＣＤ−１マウスを使用して行われた。１日目と再度５日目の１週間にわたって、単一のボーラス尾静脈注射によりサンプルを導入した。ＧＬＡタンパク質の血清濃度は、２回目の静脈内投与量の投与６時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後に決定された。マウスを、８日目の２回目の静脈内投与量の投与７２時間後に屠殺し、臓器を生理食塩水で潅流した。各マウスの肝臓、脾臓、および該当する場合、脳を採取し、２つに配分し、１０％の中性緩衝ホルマリンに保管するか、または急速凍結して、８０℃で保管するかのいずれかであった。
【０１９３】
図１に図示されるように、ＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に充填された１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、６０μｇ、または９０μｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡの２投与量の静脈内注射後の、実質的なレベルのヒトＧＬＡタンパク質が、６時間以内にマウス血清において検出することができた。さらに、検出可能なレベルのＧＬＡタンパク質は、２回目の単回投与量の静脈内投与４８時間後に血清において観察することができた。図２に図示されるように、ナノグラムレベルのヒトＧＬＡタンパク質も、２回目のＧＬＡ  ｍＲＮＡのボーラス尾静脈注射の投与７２時間後に、肝臓、腎臓、および脾臓などのマウスの選択臓器において検出可能であった。
【０１９４】
ヒトＧＬＡ  ｍＲＮＡを被包し、上の実施例４に従い調製されたＨＧＴ５０００に基づくナノ粒子を評価する追加の研究も、ファブリー病のマウスモデルを使用して行われた。サンプルは、尾静脈注射を介して、９０μｇの単回ボーラス投与量（被包されたＧＬＡに基づく）のＧＬＡ充填された脂質ナノ粒子により導入された。超生理学的レベルのＧＬＡタンパク質（約５０倍高い）が、単回９０ｕｇ投与量のＧＬＡの投与２４時間後の血清において検出された。図３および図４に図示されるように、ヒトＧＬＡタンパク質は、ＧＬＡ  ｍＲＮＡを被包するＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子のボーラス尾静脈注射の投与後のファブリーマウスの血清および選択臓器において検出可能であった。特に、ヒトＧＬＡタンパク質は、７２時間の期間にわって、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ充填されたＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子の投与後のファブリーマウスの血清において検出された。ヒトＧＬＡタンパク質レベルも、投与２４時間後および７２時間後両方のＧＬＡ  ｍＲＮＡ充填されたＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子の投与後の選択ファブリーマウスの臓器において検出可能であった。
【０１９５】
実施例８
ヒトＧＬＡ  ｍＲＮＡを被包し、上の実施例５に従い調製されたＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子が被包されたポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞に送達することができるか否かを決定するために、ヒトＧＬＡタンパク質生成に関して後に監視された野生型（ＣＤ−１）マウスにおいて、投与量反応研究が行われた。
【０１９６】
前述の研究は、各実験の開始時において約６〜８週齢の雄または雌のＣＤ−１マウスを使用して行われた。サンプルは、単回ボーラス尾静脈注射により導入された。マウスは、指定された時間点で屠殺され、臓器は生理食塩水で潅流された。各マウスの肝臓、脾臓、および該当する場合、脳を採取し、２つに配分し、１０％の中性緩衝ホルマリンに保管するか、または急速凍結して、−８０℃で保管するかのいずれかであった。
【０１９７】
３０μｇの単回投与量のＨＧＴ５０００１に基づくＧＬＡ  ｍＲＮＡ充填された脂質ナノ粒子を野生型マウスに投与し、図５および６に図示されるように、投与６時間後、ヒトＧＬＡタンパク質は、正常な生理学的レベルを１００倍超える濃度で血清において検出された。図５にも示されるように、ＨＧＴ５００１に基づくＧＬＡ  ｍＲＮＡ充填された脂質ナノ粒子の野生型マウスへの投与２４時間後、ヒトＧＬＡタンパク質は、正常な生理学的レベルを３０倍超える濃度で依然として検出可能であった。さらに、図６に示されるように、ヒトＧＬＡタンパク質の実質的な濃度は、ＨＧＴ５００１に基づくＧＬＡ  ｍＲＮＡ充填された脂質ナノ粒子の投与２４時間後の処置後の野生型マウスの肝臓、腎臓、および脾臓において検出することができた。
【０１９８】
実施例９
ＨＧＴ５０００に基づく、およびＨＧＴ５００１に基づく両方の脂質ナノ粒子が被包されたヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを野生型スプラーグドーレイラットの１つ以上の標的細胞に送達する能力をさらに示すために、即時研究が行われた。ＨＧＴ５０００およびＨＧＴ５０００１に基づくＥＰＯ  ｍＲＮＡ充填された脂質ナノ粒子は、前述の実施例に記載されるプロトコルに従い調製された。サンプルは、単回ボーラス尾静脈注射により投与された。血流中に分泌されたＥＰＯタンパク質の濃度を、２４時間の期間にわたって監視し、血清サンプルを、投与６時間後、１２時間後、１８時間後、および２４時間後に得た。
【０１９９】
ヒトＥＰＯタンパク質は、２４時間の期間にわたって、ＥＰＯ  ｍＲＮＡ充填されたＨＧＴ５０００およびＨＧＴ５００１に基づく脂質ナノ粒子の投与後のスプラーグドーレイラットの血清において検出された。図７に示されるように、ＨＧＴ５０００に基づく、およびＨＧＴ５００１に基づく両方の脂質ナノ粒子は、野生型スプラーグドーレイラットにおいて、有効なタンパク質生成をもたらした。顕著なレベルのヒトＥＰＯタンパク質が、ＨＧＴ５０００およびＨＧＴ５００１に基づく両方のナノ粒子系に関するこの研究過程にわたって検出された。したがって、本実施例は、ＨＧＴ５０００およびＨＧＴ５００１に基づく両方の脂質ナノ粒子がポリヌクレオチド構築物を１つ以上の標的細胞に送達する非常に有効な手段を提供し、そのような脂質ナノ粒子のそのような標的細胞への発現後、被包されたｍＲＮＡによってコードされた発現タンパク質が血清において検出可能であったことを図示する。
【０２００】
考察
前述の研究は、本明細書に開示される脂質化合物がリポソーム送達ビヒクルとして、またはリポソーム送達ビヒクルの成分として有用であることを図示する。特に、そのような化合物および組成物は、被包されたポリヌクレオチド（例えば、機能タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）を１つ以上の標的細胞、組織、および臓器に送達することを容易にし、それによって、そのような細胞にポリヌクレオチドを発現させる。例えば、ＨＧＴ５０００に基づく脂質ナノ粒子に被包された所与の投与量のｍＲＮＡポリヌクレオチドの単回静脈内注射後、コードされたタンパク質の実質的なレベルは、対象マウスの血清および１つ以上の標的臓器の両方において検出された。さらに、実施例８により明らかなように、多くの場合、発現タンパク質の濃度は、治療有効性に必要なそれらの濃度を十分に超え、したがって、投与された組成物の投与量の一部のみが、血漿、標的臓器、組織、または細胞内の治療的に有効な濃度を達成するのに必要であることを示唆する。結果として、治療有効量の被包された薬剤を送達するのに必要であるカチオン性脂質の総投与量を減少させることができ、組成物の毒性において対応する減少をもたらす。
【０２０１】
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
構造
【化２０】
2018095653.tif 000021
を有する化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、水素、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、
ｍおよびｏがそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択され、
ｎが、任意の正の整数である、化合物。
（項目２）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルである、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニルである、項目１に記載の化合物。
（項目４）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルである、項目１に記載の化合物。
（項目５）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである、項目４に記載の化合物。
（項目６）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンである、項目１に記載の化合物。
（項目７）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンである、項目５に記載の化合物。
（項目８）
ｍが、３である、項目１に記載の化合物。
（項目９）
ｎが、１である、項目１に記載の化合物。
（項目１０）
ｎが、シス異性体である、項目９に記載の化合物。
（項目１１）
ｎが、トランス異性体である、項目９に記載の化合物。
（項目１２）
ｏが、ゼロである、項目１に記載の化合物。
（項目１３）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｍが、３であり、ｎが、１であり、ｏが、ゼロ０である、項目１に記載の化合物。
（項目１４）
ｎが、シス異性体である、項目１３に記載の化合物。
（項目１５）
ｎが、トランス異性体である、項目１３に記載の化合物。
（項目１６）
項目１に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項目１７）
カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目１６に記載の薬学的組成物。
（項目１８）
１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、項目１６に記載の薬学的組成物。
（項目１９）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、化学修飾を含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
上記ｍＲＮＡが、酵素またはタンパク質をコードする、項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
上記ｍＲＮＡが、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、α−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、項目２３に記載の薬学的組成物。
（項目２５）
構造
【化２１】
2018095653.tif 000022
を有する化合物。
（項目２６）
構造
【化２２】
2018095653.tif 000023
を有する化合物。
（項目２７）
構造
【化２３】
2018095653.tif 000024
を有する化合物。
（項目２８）
項目２５または２６に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項目２９）
上記組成物が、脂質ナノ粒子である、項目２８に記載の薬学的組成物。
（項目３０）
上記脂質ナノ粒子が、対象に投与されたとき、実質的に非毒性である、項目２９に記載の薬学的組成物。
（項目３１）
カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の脂質をさらに含む、項目３０に記載の薬学的組成物。
（項目３２）
Ｃ１４−ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００、ＤＯＰＥ、およびコレステロールをさらに含む、項目３０に記載の薬学的組成物。
（項目３３）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目３０に記載の薬学的組成物。
（項目３４）
上記治療薬が、ポリヌクレオチドである、項目３３に記載の薬学的組成物。
（項目３５）
構造
【化２４】
2018095653.tif 000025
を有する化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、
ｍ、ｎ、およびｏがそれぞれ独立して、ゼロおよび任意の正の整数からなる群から選択される、化合物。
（項目３６）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルである、項目３５に記載の化合物。
（項目３７）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ６−Ｃ２０アルケニルである、項目３５に記載の化合物。
（項目３８）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換された多価不飽和Ｃ１８アルケニルである、項目３５に記載の化合物。
（項目３９）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである、項目３８に記載の化合物。
（項目４０）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンである、項目３９に記載の化合物。
（項目４１）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンである、項目３９に記載の化合物。
（項目４２）
ｍが、４である、項目３５に記載の化合物。
（項目４３）
ｎが、３５である、項目３５に記載の化合物。
（項目４４）
ｏが、ゼロである、項目３５に記載の化合物。
（項目４５）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｍが、４であり、ｎおよびｏが、ゼロである、項目３５に記載の化合物。
（項目４６）
項目３５に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項目４７）
カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目４６に記載の薬学的組成物。
（項目４８）
１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、項目４６に記載の薬学的組成物。
（項目４９）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、化学修飾を含む、項目４８に記載の薬学的組成物。
（項目５０）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、項目４８に記載の薬学的組成物。
（項目５１）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４８に記載の薬学的組成物。
（項目５２）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、項目４８に記載の薬学的組成物。
（項目５３）
上記ｍＲＮＡが、酵素またはタンパク質をコードする、項目５２に記載の薬学的組成物。
（項目５４）
上記ｍＲＮＡが、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、α−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、項目５３に記載の薬学的組成物。
（項目５５）
構造
【化２５】
2018095653.tif 000026
を有する、化合物。
（項目５６）
項目５５に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項目５７）
上記組成物が、脂質ナノ粒子である、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目５８）
上記脂質ナノ粒子が、対象に投与されたとき、実質的に非毒性である、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の脂質をさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目６０）
Ｃ１４−ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００、ＤＯＰＥ、およびコレステロールをさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目６１）
１つ以上の治療薬をさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目６２）
上記治療薬が、ポリヌクレオチドである、項目６１に記載の薬学的組成物。
（項目６３）
構造
【化２６】
2018095653.tif 000027
を有する化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、
ｘが、Ｃ５−Ｃ２０アルキルおよび可変的に不飽和のＣ１−Ｃ２０アルケニルからなる群から選択される、化合物。
（項目６４）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルである、項目６３に記載の化合物。
（項目６５）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、非置換の多価不飽和Ｃ１８アルケニルである、項目６３に記載の化合物。
（項目６６）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、任意に置換されたオクタデカ−９，１２−ジエンである、項目６３に記載の化合物。
（項目６７）
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンである、項目６６に記載の化合物。
（項目６８）
ｘが、Ｃ６アルケニルである、項目６３に記載の化合物。
（項目６９）
ｘが、ヘキサンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７０）
ｘが、ヘキサ−１−エンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７１）
ｘが、ヘキサ−２−エンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７２）
ｘが、ヘキサンではない、項目６３に記載の化合物。
（項目７３）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｘが、ヘキサンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７４）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｘが、ヘキサ−１−エンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７５）
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、メチルであり、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ、オクタデカ−９，１２−ジエンであり、ｘが、ヘキサ−２−エンである、項目６３に記載の化合物。
（項目７６）
項目６３に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項目７７）
カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾された脂質、非カチオン性脂質、およびヘルパー脂質からなる群から選択される１つ以上の化合物をさらに含む、項目６３に記載の薬学的組成物。
（項目７８）
上記組成物が、脂質ナノ粒子である、項目７６に記載の薬学的組成物。
（項目７９）
１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、項目７８に記載の薬学的組成物。
（項目８０）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、化学修飾を含む、項目７９に記載の薬学的組成物。
（項目８１）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む、項目７９に記載の薬学的組成物。
（項目８２）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目７９に記載の薬学的組成物。
（項目８３）
上記１つ以上のポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含む、項目７９に記載の薬学的組成物。
（項目８４）
上記ｍＲＮＡが、酵素またはタンパク質をコードする、項目８３に記載の薬学的組成物。
（項目８５）
上記ｍＲＮＡが、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン、α１−抗トリプシン、酸アルファグルコシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、カルボキシペプチダーゼＮ、α−ガラクトシターゼＡ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズロネートスルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ−グルコサミニドアセチル転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、ベータ−ガラクトシターゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム酸リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルバモイル−リン酸シンセターゼ１（ＣＰＳ１）、アルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ１）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）からなる群から選択されるタンパク質または酵素をコードする、項目８４に記載の薬学的組成物。
（項目８６）
構造
【化２７】
2018095653.tif 000028
を有する化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して、任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ１−Ｃ２０アルキル、および任意に置換された可変的に飽和または不飽和のＣ６−Ｃ２０アシルからなる群から選択され、
Ｌ１およびＬ２がそれぞれ独立して、任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキル、任意に置換された可変的に不飽和のＣ１−Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されたＣ１−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、
ｘが、Ｃ１−Ｃ１０アルケニルである、化合物。
（項目８７）
対象の疾患を治療する方法であって、上記対象に、項目３３、６１、または７９に記載の有効量の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
（項目８８）
上記薬学的組成物が、上記対象に投与されたとき、実質的に非毒性である、項目８６に記載の薬学的組成物。
（項目８９）
１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドを形質移入する方法であって、上記１つ以上の標的細胞にポリヌクレオチドが形質移入されるように、上記１つ以上の標的細胞を項目３３、６１、または７９の薬学的組成物と接触させることを含む、方法。
【図１】
2018095653.tif 000032
【図２】
2018095653.tif 000033
【図３】
2018095653.tif 000034
【図４】
2018095653.tif 000035
【図５】
2018095653.tif 000036
【図６】
2018095653.tif 000037
【図７】
2018095653.tif 000038
【配列表】
2018095653000001.app