(57)【要約】本発明は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫からのポリペプチドをコードする核酸、それによりコードされるポリペプチドならびに殺虫効果を有する新規な化合物の同定のためのそれらの使用に関する。本発明はこれらのポリペプチドのモジュレーターの判定法ならびに昆虫からのＡＣＣａｓｅの阻害剤としてのこれらの化合物の使用にも関する。
2005500810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１に示される配列、
（ｂ）受託番号ＡＡＦ５９１５６に示される配列、
（ｃ）少なくとも１４塩基対の長さである（ａ）及び（ｂ）の下に定義される配列の部分−配列、
（ｄ）昆虫に由来する配列であるか又はそれから誘導される配列であって且つ３７℃〜５０℃のハイブリッド形成温度で（ａ）及び（ｂ）の下に定義される配列とハイブリッド形成する配列、
（ｅ）昆虫に由来する配列であるか又はそれから誘導される配列であって且つ（ａ）及び（ｂ）の下に定義されている配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の下に定義されている配列に相補的である配列、ならびに
（ｇ）遺伝コードの縮重のために、（ａ）〜（ｅ）の下に定義される配列と同じアミノ酸配列をコードする配列
から選ばれる配列を含む核酸。
【請求項２】
請求項１で特許請求した核酸を少なくとも１つ含むベクター。
【請求項３】
原−もしくは真核細胞における核酸の発現を保証する調節配列に核酸分子が操作可能（ｏｐｅｒａｂｌｙ）に連結されていることを特徴とする請求項２で特許請求したベクター。
【請求項４】
請求項１で特許請求した核酸又は請求項２もしくは３で特許請求したベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
原−もしくは真核細胞であることを特徴とする請求項４で特許請求した宿主細胞。
【請求項６】
原核細胞がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項５で特許請求した宿主細胞。
【請求項７】
真核細胞が哺乳類細胞又は昆虫細胞であることを特徴とする請求項５で特許請求した宿主細胞。
【請求項８】
ａ）ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｚ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）から単離されるアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する配列、
ｂ）配列番号：２に示される配列、
ｃ）受託番号ＡＡＦ５９１５６の核酸によりコードされる配列、
ｄ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を保持しているａ）〜ｃ）の下に挙げられる配列の部分−配列、
ｅ）昆虫に由来する配列であるか又はそれから誘導される配列であって且つ（ａ）〜（ｄ）の下に挙げられる配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列
から選ばれる配列を有するポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）請求項１で特許請求した核酸の発現を確実にする条件下で請求項４〜７のいずれかで特許請求した宿主細胞を培養し、
（ｂ）細胞又は培地からポリペプチドを得る
ことを含む請求項８で特許請求したポリペプチドの調製法。
【請求項１０】
請求項８で特許請求したポリペプチドと特異的に反応する抗体。
【請求項１１】
殺虫的及び／又は殺ダニ的に活性な化合物の同定のためのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドの使用。
【請求項１２】
ポリペプチドが請求項８で特許請求したポリペプチドであることを特徴とする請求項１１で特許請求した使用。
【請求項１３】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドのモジュレーターの同定のための方法における、これらのポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項１４】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドをコードする核酸によりコードされるポリペプチドの発現を調節する物質の同定のための、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項１５】
ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのフラグメントが含まれていることを特徴とする請求項１３又は１４で特許請求した使用。
【請求項１６】
以下の：
（ａ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチド又はそのようなポリペプチドを含む宿主細胞を、化学化合物の１つのポリペプチドとの相互作用を許す条件下で化学化合物又は化学化合物の混合物と接触させ、そして
（ｂ）ポリペプチドに特異的に結合する化学化合物を同定する
段階を含む、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドに結合する化学化合物の判定法。
【請求項１７】
ａ）試験物質のアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼとの相互作用を許す条件下で試験物質をアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼと接触させ、
ｂ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼがアセチル−ＣｏＡのビオチン−依存性カルボキシル化を触媒する能力の決定により、起こった試験物質の相互作用を検出し、そして
ｃ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼが試験物質の存在下でアセチル−ＣｏＡのビオチン−依存性カルボキシル化を触媒する能力を、試験物質の不在下でアセチル−ＣｏＡのビオチン−依存性カルボキシル化を触媒するその能力と比較することを特徴とする、昆虫及び／又はダニ類（Ａｃａｒｉｎａ）からのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの活性を調節する物質の同定法。
【請求項１８】
以下の：
（ａ）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を化学化合物又は化学化合物の混合物と接触させ、
（ｂ）ポリペプチド濃度を決定し、そして
（ｃ）ポリペプチドの発現に特異的に影響する化合物を同定する
段階を含む、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドの発現を調節する化合物の判定法。
【請求項１９】
式（Ｉ）
【化１】
2005500810.tif 000010
［式中、
Ａｒは少なくとも１個のオルト−置換基を有する置換アリール又はヘテロアリール（ｈｅｔａｒｙｌ）を示し、
ＲはＨ又はアシル基を示し、そして
Ａは結合Ｃ原子と一緒になって場合により置換されている５−もしくは６−員炭素−もしくは複素環を形成し、適したヘテロ原子は例えばＮ、Ｏ及び／又はＳである］
の化合物の、昆虫アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤としての使用。
【請求項２０】
請求項１７及び１８で特許請求した方法における請求項１９中で式（Ｉ）として特定された化合物の使用。
【請求項２１】
請求項１６又は１７で特許請求した方法により判定される昆虫及び／又はダニ類からのアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのモジュレーター。
【請求項２２】
請求項１６又は１７で特許請求した方法により判定される殺虫的及び／又は殺ダニ的に活性な物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な殺虫的に活性な化合物の同定のための、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの生物学的活性を有するポリペプチド及び酵素調製物の使用ならびにこれらのポリペプチドのモジュレーターの判定法に関する。
【０００２】
下記でＡＣＣａｓｅと呼ぶアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ ６．４．１．２）はアセチル−ＣｏＡのビオチン−依存性カルボキシル化を触媒し、新たな脂肪酸生合成のペースメーカーである。ＡＣＣａｓｅは３個のドメイン：ビオチン−カルボキシル担体（ＢＣＣ）、ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣａｓｅ）及びカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴａｓｅ）を有する。ＡＣＣａｓｅ−触媒反応は２つの段階に分けられ得る。第１段階にＣＯ２基が重炭酸塩からＢＣａｓｅ活性により、ＢＣＣに共有結合しているビオチンにＡＴＰ開裂を用いて転移する。次の段階に、かくして活性化されたカルボキシル基がＣＴａｓｅによりアセチル−ＣｏＡに転移し、マロニル−ＣｏＡが形成される（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ＪＲ，１９８９）。２種の生理学的に異なるＡＣＣａｓｅの形態がある。バクテリア及び植物の葉緑体で見出されるヘテロマー形態（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ）では、３個のドメインが３個の別の分離可能なタンパク質により形成されている。ホモマー（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）ＡＣＣａｓｅは３つすべてのドメインを含む一つのポリペプチド鎖から成り、それは植物、動物及び菌・カビの細胞質ゾルにおいて見出される（Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。植物及び脊椎動物において、ＡＣＣａｓｅは多数の機構により、例えばクエン酸塩、パルミトイル−ＣｏＡによりアロステリック的に、リン酸化／脱リン酸化により、タンパク質キナーゼにより、及び遺伝子発現のレベルにおいて調節される（Ｍｕｎｄａｙ  ＭＲ  ＆  Ｈｅｍｉｎｇｗａｙ  ＣＪ  １９９９；Ｋｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。昆虫からの酵素の調節についての情報は得られていない。
【０００３】
植物、菌・カビ及び脊椎動物からの多数のＡＣＣａｓｅｓの遺伝子がすでにクローニングされているか（例えばＡｂｕ−Ｅｌｈｅｉｇａ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｂａｉｌｅｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｇｏｆｆｅａｕ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＣａｓｅ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＦ１８６３８５４６）、あるいは特許として出願されている（例えばＨａｓｅｌｋｏｒｎ  Ｒ  ＆  Ｇｏｒｎｉｃｋｉ  Ｐ  １９９９；Ｓｏｍｅｒｓ  ＤＡ  １９９９；Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＡＲ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。しかしながら、昆虫からのアノテーション付きの配列、すなわちＡＣＣａｓｅと指定される配列はまだ知られていない。
【０００４】
植物及び菌・カビからのＡＣＣａｓｅの阻害剤はすでに除草剤又は殺菌・殺カビ剤として、植物及び菌・カビに関する多数の生化学論文から既知である（Ｖａｈｌｅｎｓｉｅｃｋ  ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．１９９４；Ｇｒｏｎｗａｌｄ  ＪＷ  １９９４）。他の文書は、昆虫の目に属していないダニ類の抑制のための殺菌・殺カビ剤、ソラフェン（Ｓｏｒａｐｈｅｎ）Ａ及びＢを記載しており、それらはＡＣＣａｓｅ阻害剤として知られている（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【０００５】
ヒトＡＣＣａｓｅの阻害剤の昆虫への効果は公開文献において研究された（Ｐｏｐｈａｍ，ＨＪＲ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）：Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｂｏｒｅｒ，Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｃ：Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９６），１１５（３），２４７−２４９）；しかしながらこの論文は主に生理学の側面を扱っている。
【０００６】
従って本発明の目的は、昆虫からのＡＣＣａｓｅを利用できるようにすること、殺虫剤のための標的としてのその適切性を調べることならびに殺虫的に活性な化合物の同定法を提供することである。
【０００７】
本発明においては、多様な令又は成虫のモモアカアブラムシ（ｐｅａｃｈ  ａｐｈｉｄ）、ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｚ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）から、それらを適した緩衝液中で均質化することにより粗抽出物を得た。これらの粗抽出物を予備−精製し、ＡＣＣａｓｅ活性を放射性酵素アッセイにおいて決定した。
【０００８】
今回、酵素アッセイにおいて昆虫からの、例えばミズス・ペルシカエからのＡＣＣａｓｅの活性を阻害する化合物が存在することが、本発明の範囲内で初めて示された。ある種の化合物がＡＣＣａｓｅを阻害するという発見は、ＡＣＣａｓｅがこれらの活性化合物の標的であり、殺虫的に活性な化合物の標的タンパク質を構成していることを示している。
【０００９】
さらに、特に式（Ｉ）
【００１０】
【化２】
2005500810.tif 000003
【００１１】
［式中、
Ａｒは少なくとも１個のオルト−置換基を有する置換アリール又はヘテロアリールを示し、
ＲはＨを示すか、又はアシル基、好ましくは基ＣＯＲ１及びＣＯ２Ｒ１を示し、
ここで
Ｒ１は場合により置換されていることができるアルキル、フェニル又はヘテロアリールを示し、
Ａは結合Ｃ原子と一緒になって場合により置換されている５−もしくは６−員炭素−もしくは複素環を形成し、適したヘテロ原子は例えばＮ、Ｏ及び／又はＳである］
の環状１，３−ジカルボニル化合物及びそれらのエノール類がＡＣＣａｓｅ阻害剤を構成することが本発明内で示された。そのような環状１，３−ジカルボニル化合物は以下の文書から既知であり、それらは明らかに本出願の内容となる：
ＥＰ−Ａ−３５５ ５９９、ＥＰ−Ａ−３７７  ８９３、ＥＰ−Ａ−４１５ ２１１、ＥＰ−Ａ−４４２ ０７７、ＥＰ−Ａ−４４２ ０７３、ＥＰ−Ａ−４９７ １２７、ＥＰ−Ａ−５０１ １２９、ＥＰ−Ａ−６１５ ９５０、ＥＰ−Ａ−５２１ ３３４、ＥＰ−Ａ−５９６ ２９８、ＥＰ−Ａ−６１３ ８８４、ＥＰ−Ａ−６１３ ８８５、ＥＰ−Ａ−７０６ ５２７、ＥＰ−Ａ−６４３ １５９、ＥＰ−Ａ−７４１７００、ＥＰ−Ａ−６６８ ２６７、ＥＰ−Ａ−７５４ １７５、ＥＰ−Ａ−７９２ ２７２、ＥＰ−Ａ−８０９ ６２９、ＥＰ−Ａ−８２５ ９８２、ＥＰ−Ａ−８３５ ２４３、ＥＰ−Ａ−８３７ ８４７、ＥＰ−Ａ−８９１ ３３０、ＥＰ−Ａ−９１２ ５４７、ＥＰ−Ａ−９１５ ８４６、ＥＰ−Ａ−９１８ ７７５、ＥＰ−Ａ−９４４ ６３３、ＥＰ−Ａ−１ ０１７ ６７４、ＥＰ−Ａ−１ ０２８ ９６３、ＥＰ−Ａ−１ ０５６ ７１７、ＷＯ−Ａ−９９／４８８６９、ＷＯ−Ａ−９９／５５６７３、ＥＰ−Ａ−５２８ １５６、ＥＰ−Ａ−６４７ ６３７、ＥＰ−Ａ−７９２ ２７２、ＥＰ−Ａ−７９９ ２２８、ＥＰ−Ａ−９４４ ６３３、ＥＰ−Ａ−１ ０１７ ６７４、ＥＰ−Ａ−５８８ １３７、ＥＰ−Ａ−７９９ ２２８、ＥＰ−Ａ−７５１ ９４２、ＥＰ−Ａ−５８８ １３７、ＥＰ−Ａ−８７９ ２３２、ＥＰ−Ａ−８６５ ４３８、ＷＯ−Ａ−００／１５６３２、ＷＯ−Ａ−００／２１９４６、ＷＯ−Ａ−００／２４７２９、ＥＰ−Ａ−６７５ ８８２、ＥＰ−Ａ−７６９ ００１、ＥＰ−Ａ−９８７ ２４６、ＥＰ−Ａ−７７３ ９２０、ＥＰ−Ａ−８５４ ８５２、ＥＰ−Ａ−９６６ ４２０、ＥＰ−Ａ−５０８ １２６。
【００１２】
かくして本出願において、上記の環状１，３−ジカルボニル化合物を昆虫におけるＡＣＣａｓｅの阻害剤として使用できることを示す。本発明は、昆虫におけるＡＣＣａｓｅの阻害剤としての式（Ｉ）の化合物の使用も提供する。
【００１３】
さらに本発明において、ＡＣＣａｓｅの阻害が処理される昆虫の死を生ずることを示す。昆虫におけるＡＣＣａｓｅが殺虫的に活性な物質の標的タンパク質であることはこれまで知られていなかった。かくしてＡＣＣａｓｅが昆虫にとって生命の維持に必要な酵素（ｖｉｔａｌ  ｅｎｚｙｍｅ）であり、従ってさらに別の、おそらく向上した殺虫的に活性な化合物の探索における標的タンパク質として用いるのに特に適していることも初めて示す。
【００１４】
本発明はさらにドロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からのＡＣＣａｓｅをその核酸配列により初めて記載し、かくしてそれを利用できるようにする。受託番号ＡＡＦ５９１５６の核酸配列はしばらく前からすでに利用可能であった。しかしながら配列の意味又はそれによりコードされるポリペプチド及びその生物学的機能はこれまで未知であり、この配列セグメントのコード領域も未知であった。
【００１５】
意味、機能及びコード領域ならびにこの核酸によりコードされるポリペプチドを今回、本発明の範囲内で初めて利用できるようにする。かくしてドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅをコードする配列番号：１のｃＤＮＡならびにそれによりコードされる配列番号：２のポリペプチドを本出願において開示し、殺虫的及び適宜殺ダニ的に活性な物質の同定のためのそれらの使用を記載する。配列番号：１の核酸配列及びそれによりコードされる配列番号：２のポリペプチドは同様に本発明の主題である。
【００１６】
ＡＣＣａｓｅｓ、特にまたミズス・ペルシカエ及びドロソフィラ・メラノガステルならびに他の昆虫からの本ＡＣＣａｓｅは、互いに有意な相同性を示すので、関連する相同核酸及び遺伝子ファミリーの他のメンバーによりコードされる相同ポリペプチドを、殺虫的に活性な化合物の、特に式（Ｉ）の化合物の分子標的として用いることも可能である。相同ポリペプチドは特に好ましくは、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、特に好ましくは少なくとも３０の連続アミノ酸の長さに及んで、そして特別に好ましくは全長に及んで、ミズス・ペルシカエもしくはドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅと６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％そして特に好ましくは９５％の同一性を有するものである。
【００１７】
かくして本発明に従うＡＣＣａｓｅｓにより見出され得る殺虫的及び／又は殺ダニ的に活性な化合物は、多数の他のダニ（Ａｃａｒｉｎａ）又は昆虫の種からのＡＣＣａｓｅｓとも相互作用できるが、昆虫又はダニ類において見出される種々のＡＣＣａｓｅｓとの相互作用は常に等しく顕著である必要はない。これは中でもこの酵素に作用する物質の観察される選択性を説明している。特に好ましいＡＣＣａｓｅｓ又はそれらの由来する生物を例として下記の表１に挙げるが、制限としてではない。
【００１８】
【表１】
2005500810.tif 000004
【００１９】
本出願において、モモアカアブラムシ、ミズス・ペルシカエからのＡＣＣａｓｅにより示されるとおり、ＡＣＣａｓｅｓが殺虫的に活性な化合物のための標的タンパク質であり、適した方法（アッセイ）で新しい、向上した殺虫的に活性な化合物の同定のために用いられ得ることを初めて示す。
【００２０】
これに関し、ミズス・ペルシカエ及びドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅは新しい殺虫的及び適宜殺ダニ的にも活性な化合物の同定のために特に適している。
【００２１】
従って本発明は、昆虫及び／又はダニ類におけるＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のための、ＡＣＣａｓｅの生物学的活性を有する昆虫ポリペプチドならびにそれらをコードする核酸、特に昆虫から直接単離されたか又は昆虫に由来する核酸配列もしくはそれらのフラグメントによりコードされ、生体内もしくは試験管内法により得られるポリペプチドの使用に関する。ポリペプチドは特に好ましくは、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、特に好ましくは少なくとも３０の連続アミノ酸の長さに及んで、そして特別に好ましくは全長に及んで、ミズス・ペルシカエもしくはドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅと６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％そして特別に好ましくは９５％の同一性を有するものである。
【００２２】
特に本発明はアブラムシ科（Ａｐｈｉｄｉｄａｅ）及び双翅科（Ｄｉｐｔｅｒｅａ）の昆虫からのＡＣＣａｓｅの使用に関する。
【００２３】
特に本発明は、ミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅ及び配列番号：２に示されるドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅならびに相同ポリペプチドの、昆虫ＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のための使用に関する。
【００２４】
特に本発明は、昆虫ＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のためのミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの使用に関する。
【００２５】
特別に好ましくは、本発明に従うポリペプチドはかくして
ａ）ミズス・ペルシカエから単離される配列、
ｂ）配列番号：２に示される配列、
ｃ）受託番号ＡＡＦ５９１５６の核酸によりコードされる配列、
ｄ）ＡＣＣａｓｅの生物学的活性を保持しているａ）〜ｃ）の下に挙げられる配列の部分−配列、
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の下に挙げられる配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％そして特別に好ましくは９５％の同一性を有する配列
から選ばれる配列を含む。
【００２６】
アミノ酸配列の同一性の程度は、好ましくはプログラムパッケージＧＣＧ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０からのＧＡＰプログラムにより、標準設定を用いて決定される（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。
【００２７】
本発明は昆虫及び／又はダニ類においてＡＣＣａｓｅモジュレーターを同定するための、ＡＣＣａｓｅｓをコードする昆虫核酸の使用にも関する。
【００２８】
特に本発明はＡＣＣａｓｅモジュレーターを同定するための、ミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅをコードする核酸及び配列番号：１に示されるドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅをコードする核酸ならびにそれらと６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％そして特に好ましくは９５％の相同性を有する核酸配列の使用にも関する。
【００２９】
本発明に従う核酸は、特に一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００３０】
好ましい態様はゲノムＤＮＡのフラグメントであり、それはイントロン及びｃＤＮＡｓを含むことができる。
【００３１】
本発明に関して用いられる「ｃＤＮＡ」という用語はＲＮＡ分子の一本−もしくは二本−鎖コピーを指し、生物学的に活性なＲＮＡのコピーであり、従ってイントロンを含まず、すなわち遺伝子のすべてのコード領域が連続した形態で存在する。
【００３２】
本発明に関して用いられる「同一性」という用語は、整列において同一である配列位置の数を指す。それは通常整列の長さのパーセンテージとして示される。
【００３３】
本発明に関して用いられる「パーセント（％）同一性」という用語は、特定の配列又は配列の特定の部分を言う場合、配列を互いに比較する時（「整列」）且つ必要なら同一配列の最大パーセンテージを得るために「ギャップ」として知られるものが導入される時、該特定の配列又はこの配列の特定の部分のヌクレオチドと同一である、研究されている核酸分子中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義され、用いられるプログラムのすべてのパラメーターは「デフォールト」に設定される。
【００３４】
本発明に関して用いられる「類似性」という用語は対照的に、類似性尺度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｒｉｃ）、すなわち例えばバリンとトレオニン又はロイシンの間の、身に付けた望まれる類似性に関する尺度の定義を帯びている（ａｓｓｕｍｅｓ）。
【００３５】
本発明に関して用いられる「パーセンテージ（％）類似性」という用語は、パーセンテージを算出する時に、同一のアミノ酸の他に同類アミノ酸置換を考慮に入れ、上記の用語「パーセント（％）同一性」に対応する。
【００３６】
本発明に関して用いられる「相同性」という用語は今度は、進化的な関係を示す。２つの相同タンパク質は共通の前駆配列から発現した。該用語は、相同配列が通常、非−相同配列より高度の類似性を有する（又は整列においてより多くの同一位置を占有する）という事実と別に、必ずしも同一性又は類似性と関係はない。
【００３７】
本発明に従う核酸は好ましくはゲノム昆虫ＤＮＡに対応するＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメントの形態をとり、核酸は好ましくは双翅類（ｄｉｐｔｅｒａｎｓ）に、特に好ましくはショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）に由来する。
【００３８】
本発明に従う核酸は、特に好ましくはミズス・ペルシカエ又はドロソフィラ・メラノガステルのゲノムＤＮＡに対応するＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメントの形態をとる。
【００３９】
特別に好ましくは、本発明に従う核酸は
（ａ）配列番号：１に示される配列、
（ｂ）受託番号ＡＡＦ５９１５６に示される配列、
（ｃ）少なくとも１４塩基対の長さである（ａ）又は（ｂ）の下に定義される配列の部分−配列、
（ｄ）３７℃〜５０℃のハイブリッド形成温度で（ａ）又は（ｂ）の下に定義される配列とハイブリッド形成する配列、
（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の下に定義される配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％そして特別に好ましくは９５％の同一性を有する配列、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の下に定義されている配列に相補的である配列、ならびに
（ｇ）遺伝コードの縮重のために、（ａ）〜（ｅ）の下に定義される配列と同じアミノ酸配列をコードする配列
から選ばれる配列を含む。
【００４０】
本発明に従って用いられるべき核酸の特別に好ましい態様は、ミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅをコードする配列及びドロソフィラ・メガノガステルＡＣＣａｓｅをコードする配列番号：１に示されている配列を有するｃＤＮＡ分子である。
【００４１】
遺伝コードに基づき、実施例３に記載するとおりに単離し且つ配列決定により限定することができるアミノ酸配列からミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅをコードする核酸配列を推定することができる。
【００４２】
遺伝コードの縮重のために、推定核酸配列を用いてミズス・ペルシカエ中に実際に存在する核酸配列を立証し、適宜これが意味を成す限り推定配列を修正することが重要である。
【００４３】
ゲノムＭ．ペルシカエ配列の単離又は立証は例えばプライマーを用いることにより行われ得、それは推定核酸配列から誘導され且つ熟練者に既知の方法による標的配列の増幅のためのＰＣＲ反応において用いられ得る。
【００４４】
本発明は、本発明に従う核酸によりコードされるポリペプチドにも関する。
【００４５】
本発明に関して用いられる「ハイブリッド形成する」という用語は、一本鎖核酸分子が相補鎖と塩基対合を経るプロセスを記述している。例えば本明細書で言及するか又は推定され得る配列情報から出発して、ドロソフィラ・メラノガステル以外の昆虫からこの方法で、本発明に従うＡＣＣａｓｅの１つの同じもしくは類似の性質を有するＡＣＣａｓｅをコードするＤＮＡフラグメントを単離することができる。
【００４６】
ハイブリッド形成条件は、以下の式により大体算出される：
融解温度Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［ｃ（Ｎａ＋）］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ
（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ＆  Ｚｏｒｂａｓ  １９９８）。
【００４７】
この式において、ｃは塩基対におけるハイブリッド形成セグメントの濃度であり、ｎは長さである。＞１００ｂｐの配列の場合、５００／ｎの項は省かれる（ｄｒｏｐｐｅｄ）。最も高い緊縮はＴｍより５〜１５℃低い温度及び１５ｍＭ  Ｎａ＋のイオン強度における洗浄を含む（０．１ｘＳＳＣに対応する）。ハイブリッド形成にＲＮＡ試料を用いる場合、融点はさらに１０〜１５℃高い。
【００４８】
好ましいハイブリッド形成条件を下記に記載する：
ハイブリッド形成溶液：ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ，ＺＺ）、ハイブリッド形成温度：３７℃〜５０℃、好ましくは４２℃（ＤＮＡ−ＤＮＡ）、５０℃（ＤＮＡ−ＲＮＡ）。
１．洗浄段階：２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ  室温で２ｘ５分；
２．洗浄段階：１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ  ５０℃で２ｘ１５分；好ましくは０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ  ６５℃で２ｘ１５分；特に好ましくは０．２ｘＳＳＣ，６８℃で２ｘ１５分。
【００４９】
核酸の同一性の程度は、好ましくはプログラムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．４．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）により決定される。
【００５０】
本発明に関して用いられる「調節領域」という用語は、問題の遺伝子の非翻訳領域、例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー又はアクチベーター結合部位あるいは停止配列を指し、それらは細胞タンパク質と相互作用し、かくして転写を支配する。
【００５１】
本発明は、本発明に従って用いられるべき核酸及び異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物にも関する。
【００５２】
本発明はさらにＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のためのそのようなＤＮＡ構築物の使用に関する。
【００５３】
本発明に関して用いられる「異種プロモーター」という用語は、もとの生物における問題の遺伝子の発現を制御するプロモーター以外の性質を有するプロモーターを指す。
【００５４】
異種プロモーターの選択は、発現に原核細胞が用いられるか、又は真核細胞が用いられるか、あるいは無細胞系が用いられるかに依存する。異種プロモーターの例はＳＶ４０、アデノウィルスもしくはサイトメガロウィルス初期もしくは後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ファージラムダのメインオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸ホスファターゼプロモーター、バクロウィルス即時型プロモーター及び酵母α−交配因子プロモーターである。
【００５５】
本発明はさらに本発明に従う核酸又は本発明に従うＤＮＡ構築物を含むベクターに関する。用いられ得るベクターは、分子−生物学実験室で用いられるすべてのプラスミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣｓ又は人工染色体である。
【００５６】
本発明はさらに、本発明に従って用いられるべき核酸又は本発明に従って用いられるべきＤＮＡ構築物を含むベクターの、ＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のための方法における使用に関する。
【００５７】
用いられ得るベクターは、分子−生物学実験室で用いられるすべてのファージ、プラスミド、ファージミド（ｐｈａｇｍｉｄｓ）、ファスミド、コスミド、ＹＡＣｓ、ＢＡＣｓ、人工染色体又は粒子衝撃に適した粒子である。
【００５８】
本発明は、本発明に従って用いられるべき核酸、本発明に従って用いられるべきＤＮＡ構築物又は本発明に従って用いられるべきベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００５９】
本発明は、ＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のためのそのような宿主細胞の使用にも関する。
【００６０】
本発明に関して用いられる「宿主細胞」という用語は、自然には本発明に従って用いられるべき核酸を含有していない細胞を指す。
【００６１】
適した宿主細胞は原核細胞、例えばバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属のバクテリア、好ましくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であるが、真核細胞、例えば酵母、哺乳類細胞、両生類細胞、昆虫細胞又は植物細胞も適している。好ましい真核宿主細胞はＨＥＫ  ２９３細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞、Ｋｃ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞又はＢＨＫ細胞、特にアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵細胞である。
【００６２】
本発明に関して用いられる「ポリペプチド」という用語は、一般にペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと呼ばれる短いアミノ酸鎖のみでなく、通常タンパク質と呼ばれるもっと長いアミノ酸鎖も指す。それは自然のプロセス、例えば翻訳−後プロセシングにより、又は化学的な先行技術の方法により変更され得るアミノ酸鎖を含む。そのような変更はポリペプチド中の種々の部位で且つ繰り返し、例えばペプチド主鎖上、アミノ酸側鎖上、アミノ及び／又はカルボキシル末端上で起り得る。例えばそれらはアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体又はホスファチジルイノシトールへの共有結合、環化、ジスルフィド架橋形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、セレノイル化及びｔＲＮＡ−媒介アミノ酸付加を包含する。
【００６３】
本発明に従うポリペプチドは「成熟」タンパク質の形態で、又はもっと大きなタンパク質の部分として、例えば融合タンパク質として存在することができる。それらはさらに分泌もしくはリーダー配列、前−配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、簡単な精製を可能にする配列、例えばポリヒスチジン残基あるいは追加の安定化アミノ酸を示す（ｅｘｈｉｂｉｔ）ことができる。本発明に従うタンパク質は、それらを例えば直接得ることができるそれらのもとの生物においてそれらが自然に存在する形態で存在することもできる。
【００６４】
本発明に関して用いられる「完全ＡＣＣａｓｅ」という用語は、ＡＴＧ開始コドンで始まり、もとの生物中に存在するＡＣＣａｓｅ−コード遺伝子のすべての情報−保有エキソン領域及び正しい転写停止のために必要な信号を含む転写単位の完全コード領域によりコードされるＡＣＣａｓｅを記述している。
【００６５】
本発明に関して用いられる「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の合成を担う細胞のゲノムからのセグメントを指す。
【００６６】
本発明に従うポリペプチドは完全ＡＣＣａｓｅｓである必要はなく、それらのフラグメントが少なくとも完全ＡＣＣａｓｅの生物学的活性を示すかぎり、それらのフラグメントの形態をとることもできる。ミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅ又はドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅと同じ型の生物学的活性を発揮する昆虫からのポリペプチドも本発明に従うと考えられる。これに関し、本発明に従うポリペプチドは、ミズス・ペルシカエもしくはドロソフィラ・メラノガステルＡＣＣａｓｅｓに、それらの配列もしくは触媒活性に関して完全に対応している必要はない。例えば以下の昆虫からのＡＣＣａｓｅ又はＡＣＣａｓｅの生物学的活性を保持しているそれらのフラグメントに相同であるポリペプチドはやはり本発明に従うポリペプチドと考えられるポリペプチドである：
等脚類（Ｉｓｏｐｏｄａ）の目から、例えばオニスクス・アセルス（Ｏｎｉｓｃｕｓ  ａｓｅｌｌｕｓ）、アルマジリジウム・ブルガレ（Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ポルセリオ・スカベル（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ  ｓｃａｂｅｒ）。
倍脚類（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）の目から、例えばプラニウルス・グルラツス（Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ  ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）。
唇脚類（Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）の目から、例えばゲオフィルス・カルポファグス（Ｇｅｏｐｈｉｌｕｓ  ｃａｒｐｏｐｈａｇｕｓ）、スクチゲラ種（Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ  ｓｐｅｃ．）。
結合類（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）の目から、例えばスクチゲレラ・イマクラタ（Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ  ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）。
シミ類（Ｔｈｙｓａｎｕｒａ）の目から、例えばレピスマ・サッカリナ（Ｌｅｐｉｓｍａ  ｓａｃｃｈａｒｉｎａ）。
トビムシ類（Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ）の目から、例えばオニチウルス・アルマツス（Ｏｎｙｃｈｉｕｒｕ  ａｒｍａｔｕｓ）。
直翅類（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアケタ・ドメスチクス（Ａｃｈｅｔａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、グリロタルパ種（Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ  ｓｐｐ．）、ロクスタ・ミグラトリア・ミグラトリオイデス（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ  ｍｉｇｒａｔｐｒｏｐｏｄｅｓ）、メラノプルス種（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓｐｐ．）、シストセルカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｇｒｅｇｅｒｉａ）。
ゴキブリ類（Ｂｌａｔｔａｒｉａ）の目から、例えばブラッタ・オリエンタリス（Ｂｌａｔｔａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ペリプラネタ・アメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ロイコファエア・マデラエ（Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ  ｍａｄｅｒａｅ）、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）。
ハサミムシ類（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）の目から、例えばフォルフィクラ・アウリクラリア（Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ  ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ）。
シロアリ類（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばレチクリテルメス種（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ  ｓｐｐ．）。
シラミ類（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ））の目から、例えばペディクルス・ヒューマヌス・コルポリス（ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ  ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、ハエマトピヌス種（Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、リノグナツス種（Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、トリコデクテス種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ  ｓｐｐ．）、ダマリニア種（Ｄａｍａｌｉｎｉａ  ｓｐｐ．）。アザミウマ類（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばヘルシノツリプス・フェモラリス（Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ  ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）、ツリプス・タバチ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｔａｂａｃｉ）、ツリプス・パルミ（Ｔｈｒｉｐｓ  ｐａｌｍｉ）、フランクリニエラ・オクシデンタリス（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）。
異翅類（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばエウリガステル種（Ｅｕｒｉｇａｓｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ジスデルクス・インテルメジウス（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、ピエスマ・クアドラタ（Ｐｉｅｓｍａ  ｑｕａｄｒａｔａ）、シメクス・レクツラリウス（Ｃｉｍｅｘ  ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）、ロドニウス・プロリクス（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｐｒｏｌｉｘｕｓ）、トリアトマ種（Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｓｐｐ．）。
同翅類（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアレウロデス・ブラシカエ（Ａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ベミシア・タバチ（Ｂｅｍｉｓｉａ  ｔａｂａｃｉ）、トリアレウロデス・バポラリオルム（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ  ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ）、アフィス・ゴシピイ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ブレビコリネ・ブラシカエ（Ｂｒａｖｉｃｏｒｙｎｅ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、クリプトミズス・リビス（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ  ｒｉｂｉｓ）、アフィス・ファバエ（Ａｐｈｉｓ  ｆａｂａｅ）、アフィス・ポミ（Ａｐｈｉｓ  ｐｏｍｉ）、エリオソマ・ラニゲルム（Ｅｒｉｏｓｏｍａ  ｌａｎｉｇｅｒｕｍ）、ヒアロプテルス・アルンジニス（Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ  ａｒｕｎｄｉｎｉｓ）、フィロクセラ・バスタツリクス（Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ  ｖａｓｔａｔｒｉｘ）、ペムフィグス種（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｓｐｐ．）、マクロシフム・アベナエ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｓ  ａｖｅｎａｅ）、ミズス種（Ｍｙｚｕｓ  ｓｐｐ．）、フォロドン・フムリ（Ｐｈｏｒｏｄｏｎ  ｈｕｍｕｌｉ）、ロパロシフム・パジ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉ）、エンポアスカ種（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｐｐ．）、エウセリス・ビロバツス（Ｅｕｓｃｅｌｉｓ  ｂｉｌｏｂａｔｕｓ）、ネフォテティクス・シンクチセプス（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ  ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ）、レカニウム・コルニ（Ｌｅｃａｎｉｕｍ  ｃｏｒｎｉ）、サイセチア・オレアエ（Ｓａｉｓｓｉｔｉａ  ｏｌｅａｅ）、ラオデルファクス・ストリアテルス（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ  ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）、ニラパルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、アオニジエラ・アウランチイ（Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉｉ）、アスピジオツス・ヘデラエ（Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ  ｈｅｄｅｒａｅ）、シュードコックス種（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、プシラ種（Ｐｓｙｌｌａ  ｓｐｐ．）。
鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばペクチノフォラ・ゴシピエラ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、ブパルス・ピニアリウス（Ｂｕｐａｌｕｓ  ｐｉｎｉａｒｉｕｓ）、ケイマトビア・ブルマタ（Ｃｈｅｉｍａｔｏｂｉａ  ｂｒｕｍａｔａ）、リトコレチス・ブランカルデラ（Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ  ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ）、ヒポノメウタ・パデラ（Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ  ｐａｄｅｌｌａ）、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、マラコソマ・ネウスツリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ）、エウプロクチス・クリソルホエア（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ）、リマンツリア種（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｓｐｐ．）、ブクラトリクス・ツルベリエラ（Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ  ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ）、フィロクニスチス・シトレラ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）、アグロチス種（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｐｐ．）、エウクソア種（Ｅｕｘｏａ  ｓｐｐ．）、フェルチア種（Ｆｅｌｔｉａ  ｓｐｐ．）、エアリアス・インスラナ（Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ）、ヘリオチス種（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｐｐ．）、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、パノリス・フラメア（Ｐａｎｏｌｉｓ  ｆｌａｍｍｅａ）、スポドプテラ種（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、カルポカプサ・ポモネラ（Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、ピエリス種（Ｐｉｅｒｉｓ  ｓｐｐ．）、チロ種（Ｃｈｉｌｏ  ｓｐｐ．）、ピラウスタ・ヌビラリス（Ｐｙｒａｕｓｔａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、エフェスチア・クエニエラ（Ｅｐｈｅｓｔｉａ  ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ）、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、チネオラ・ビセリラレ（Ｔｉｎｅｏｌａ  ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ）、チネア・ペリオネラ（Ｔｉｎｅａ  ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ）、ホフマノフィラ・シュードスプレテラ（Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ  ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ）、カコエシア・ポダナ（Ｃａｃｏｅｃｉａ  ｐｏｄａｎａ）、カプア・レチクラナ（Ｃａｐｕａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ）、コリストネウラ・フミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）、クリシア・アンビグエラ（Ｃｌｙｓｉａ  ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ）、ホモナ・マグナニマ（Ｈｏｍｏｎａ  ｍａｇｎａｎｉｍａ）、トルトリクス・ビリダナ（Ｔｏｒｔｒｉｘ  ｖｉｒｉｄａｎａ）、クナファロセルス種（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、オウレマ・オリザエ（Ｏｕｌｅｍａ  ｏｒｙｚａｅ）。
甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばアノビウム・プンクタツム（Ａｎｏｂｉｕｍ  ｐｕｎｃｔａｔｕｍ）、リゾペルタ・ドミニカ（Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ  ｄｏｍｉｎｉｃａ）、ブルキジウス・オブテクツス（Ｂｒｕｃｈｉｄｉｕｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、アカントセリデス・オブテクツス（Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）、ヒロツルペス・バジュルス（Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ  ｂａｊｕｌｕｓ）、アゲラスチカ・アルニ（Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ  ａｌｎｉ）、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、ファエドン・コクレアリアエ（Ｐｈａｅｄｏｎ  ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ）、ディアブロチカ種（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｓｐｐ．）、プシリオデス・クリソセファラ（Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ）、エピラクナ・バリベチス（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、アトマリア種（Ａｔｏｍａｒｉａ  ｓｐｐ．）、オリザエフィルス・スリナネンシス（Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ  ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ）、アントノムス種（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｓｐｐ．）、シトフィルス種（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、オチオリンクス・スルカツス（Ｏｔｉｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｓｕｌｃａｔｕｓ）、コスモポリテス・ソルジズス（Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ  ｓｏｒｄｉｄｕｓ）、セウトリンクス・アシミリス（Ｃｅｕｔｈｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｓｓｉｍｉｌｉｓ）、ヒペラ・ポスチカ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｏｓｔｉｃａ）、デルメステス種（Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ  ｓｐｐ．）、トロゴデルマ種（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、アントレヌス種（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ  ｓｐｐ．）、アタゲヌス種（Ａｔｔａｇｅｎｕｓ  ｓｐｐ．）、リクツス種（Ｌｙｃｔｕｓ  ｓｐｐ．）、メリゲテス・アエネウス（Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ  ａｅｎｅｕｓ）、プチヌス種（Ｐｔｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）、ニプツス・ホロレウクス（Ｎｉｐｔｕｓ  ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ）、ギビウム・プシロイデス（Ｇｉｂｂｉｕｍ  ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ）、トリボリウム種（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、テネブリオ・モリトル（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）、アグリオテス種（Ａｇｒｉｏｔｅｓ  ｓｐｐ．）、コノデルス種（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ  ｓｐｐ．）、メロロンタ・メロロンタ（Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ  ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ）、アンフィマロン・ソルシチチアリス（Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ  ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ）、コステリツラ・ゼアランジカ（Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ  ｚｅａｌａｎｄｉｃａ）、リゾルホプツルス・オリゾフィルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ  ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）。
膜翅類（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の目から、例えばジプリオン種（Ｄｉｐｒｉｏｎ  ｓｐｐ．）、ホプロカンパ種（Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ  ｓｐｐ．）、ラシウス種（Ｌａｓｉｕｓ  ｓｐｐ．）、モノモリウム・ファラオニス（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）、ベスパ種（Ｖｅｓｐａ  ｓｐｐ．）。
双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）の目から、例えばアエデス種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アノフェレス種（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、クレクス種（Ｃｕｌｅｘ  ｓｐｐ．）、ドロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ムスカ種（Ｍｕｓｃａ  ｓｐｐ．）、ファニア種（Ｆａｎｎｉａ  ｓｐｐ．）、カリフォラ・エリスロセファラ（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ）、ルシリア種（Ｌｕｃｉｌｉａ  ｓｐｐ．）、クリソミア種（Ｃｈｒｙｓｉｎｙｕａ  ｓｐｐ．）、クテレブラ種（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ  ｓｐｐ．）、ガストロフィルス種（Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒポボスカ種（Ｈｙｐｐｏｂｏｓｃａ  ｓｐｐ．）、ストモクシス種（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｓｐｐ．）、オエスツルス種（Ｏｅｓｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒポデルマ種（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、タバヌス種（Ｔａｂａｎｕｓ  ｓｐｐ．）、タニア種（Ｔａｎｎｉａ  ｓｐｐ．）、ビビオ・ホルツラヌス（Ｂｉｂｉｏ  ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ）、オシネラ・フリト（Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ  ｆｒｉｔ）、フォルビア種（Ｐｈｏｒｂｉａ  ｓｐｐ．）、ペゴミア・ヒオシアミ（Ｐｅｇｏｍｙｉａ  ｈｙｏｓｃｙａｍｉ）、セラチチス・カピタタ（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ）、ダクス・オレアエ（Ｄａｃｕｓ  ｏｌｅａｅ）、チプラ・パルドサ（Ｔｉｐｕｌａ  ｐａｌｕｄｏｓａ）、ヒレミイア種（Ｈｙｌｅｍｙｉａ  ｓｐｐ．）、リリオミザ種（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ  ｓｐｐ．）。
ノミ類（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）の目から、例えばキセノプシラ・ケオピス（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓ）、セラトフィルス種（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）。
【００６７】
自然に存在するＡＣＣａｓｅｓの対応する領域と比較して、本発明に従うポリペプチドは、それらがまだ完全ＡＣＣａｓｅｓの少なくとも１つの生物学的活性を発揮する限り、欠失又はアミノ酸置換を有していることができる。同類置換が好ましい。そのような同類置換は、１個のアミノ酸が以下の群の中からの他のアミノ酸により置き換えられている変異を含む。
１．小さい脂肪族残基、非極性残基又は小さい極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；
２．極性の負に帯電した残基及びそれらのアミド類：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；
３．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；
４．大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；ならびに
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【００６８】
好ましい同類置換を以下のリストから知ることができる：
【００６９】
【表２】
2005500810.tif 000005
【００７０】
従って本発明は、少なくともＡＣＣａｓｅの生物学的活性を発揮し且つミズス・ペルシカエ配列又は配列番号：１に示される核酸によりコードされるドロソフィラ・メラノガステル配列と少なくとも６０％の同一性、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％の同一性そして特別に好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド及びＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定のためのそれらの使用にも関する。
【００７１】
本発明に関して用いられる「ＡＣＣａｓｅの生物学的活性」という用語は、アセチル−ＣｏＡのビオチン−依存性カルボキシル化を触媒する能力を指す。これに関しては、すべての３つの酵素機能、すなわち重炭酸塩からのＣＯ２基のＡＴＰ−依存性脱離、ビオチン担体機能及びアセチル−ＣｏＡのカルボキシル化あるいはまたこれらの反応の１つもしくは２つのみが含まれ得る。
【００７２】
通常の方法で本発明に従う核酸を調製することができる。例えば核酸分子をその全体において化学的に合成することができるか、あるいはまた本発明に従う核酸の短い断片を化学的に合成することができ、そのようなオリゴヌクレオチドを放射性標識するか又は蛍光色素で標識することができる。標識されたオリゴヌクレオチドを、昆虫ｍＲＮＡから出発して作られるｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに用いることもできる。標識されたオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成するクローンを問題のＤＮＡフラグメントの単離のために選ぶ。単離されたＤＮＡの特性化の後、簡単な方法で本発明に従う核酸が得られる。
【００７３】
あるいはまた、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法により本発明に従う核酸を作ることができる。
【００７４】
本発明に関して用いられる単数もしくは複数の「オリゴヌクレオチド」という用語は、１０〜５０個のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０個のヌクレオチドから成るＤＮＡ分子を指す。それらは化学的に合成され、プローブとして用いられ得る。
【００７５】
さらに、本発明に従う核酸を含む宿主細胞を、本発明に従うポリペプチド、特に配列番号：１に示される核酸配列によりコードされるポリペプチドの調製のために適した条件下で培養することができる。その後所望のポリペプチドを細胞から、又は培地から通常の方法で単離することができる。あるいはまた、ポリペプチドを試験管内システムにおいて作ることができる。
【００７６】
本発明に従うミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの調製のためには、幼虫又は成虫を乳棒と乳鉢を用いて均質化する方法に従うことができる。この目的で、あらかじめ例えば液体窒素中でそれらを急速に凍結することができる。ホモジネートを適した緩衝液中に取り上げる。本発明に従うポリペプチドの調製の例を実施例３に示す。
【００７７】
１つの可能なＡＣＣａｓｅ精製法は、調製的電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過カラム、逆相カラム又は軽く（ｍｉｌｄｌｙ）疎水性のカラムを用いる）、ゲル濾過、分別沈降（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、イオン−交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【００７８】
本発明に従う核酸を用いて宿主細胞により合成される本発明に従うポリペプチドの単離の迅速な方法は、融合タンパク質の発現で始まり、この方法では融合部分をアフィニティー精製により簡単な方法で精製することができる。例えば融合部分はグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼであることができる。次いで融合タンパク質をグルタチオンアフィニティーカラム上で精製することができる。融合部分を、例えば融合部分と精製されるべき本発明に従うポリペプチドの間のリンカーにおける部分的タンパク質分解的開裂により除去することができる。リンカーは、それがトリプシン開裂のための部位を限定する標的アミノ酸、例えばアルギニン及びリシン残基を含むような方法で設計され得る。そのようなリンカーの生成のために、オリゴヌクレオチドを用いる標準的なクローニング法を用いることができる。
【００７９】
可能な他の精製法はまた（ｉｎ  ｔｕｒｎ）、調製的電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過カラム、逆相カラム又は軽く疎水性のカラムを用いる）、ゲル濾過、分別沈降、イオン−交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【００８０】
本発明に関して用いられる「単離又は精製」という用語は、本発明に従うポリペプチドが細胞又は組織の他のタンパク質又は他の巨大分子から分離されることを意味する。本発明に従うポリペプチドを含有する組成物のタンパク質含有率は、宿主細胞調製物中より好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍高い。
【００８１】
本発明に従うポリペプチドを融合部分なしで、ポリペプチドに結合する抗体を用いてアフィニティー精製に供することもできる。
【００８２】
本発明は、ＡＣＣａｓｅに結合する及び／又はその性質を変更する化学化合物の判定法にも関する。ＡＣＣａｓｅの重要な機能のために、活性に影響するモジュレーターは新規な殺虫的及び／又は適宜殺ダニ的に活性な成分を構成する。モジュレーターはアゴニスト又はアンタゴニストあるいは阻害剤又は活性化剤であることができる。
【００８３】
昆虫ＡＣＣａｓｅの阻害剤として作用する性質のために、上記の式（Ｉ）の環状１，３−ジカルボニル化合物及びそれらのエノール類も、場合により標識されていることができる競争者（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒｓ）として昆虫ＡＣＣａｓｅ阻害剤の発見法において用いることができ、それはこの化合物の群に属している必要はない。
【００８４】
本発明に関して用いられる「競争者」という用語は、他の化合物、適宜まだ同定されていない化合物とＡＣＣａｓｅへの結合に関して競争し、前者を酵素から押しのけるか又はそれにより押しのけられる化合物の性質を指す。
【００８５】
本発明に関して用いられる「アゴニスト」という用語は、ＡＣＣａｓｅ活性を促進するか又は向上させる分子を指す。
【００８６】
本発明に関して用いられる「アンタゴニスト」という用語は、ＡＣＣａｓｅ活性を遅めるか又は妨げる分子を指す。
【００８７】
本発明に関して用いられる「モジュレーター」という用語は、アゴニスト又はアンタゴニストに関する一般的用語である。モジュレーターは、本発明に従うポリペプチドに結合する及び／又はそれらの性質、例えばそれらの酵素活性を変更する小さい有機−化学的分子、ペプチド又は抗体であることができる。さらに、モジュレーターは、それ自身が本発明に従うポリペプチドに結合する及び／又はそれらの生物学的活性に影響する分子に結合する小さい有機−化学的分子、ペプチド又は抗体であることができる。モジュレーターは自然の基質及びリガンドあるいはこれらの構造的もしくは機能的模造物であることができる。
【００８８】
モジュレーターは好ましくは小さい有機化学的化合物の形態をとっている。
【００８９】
ＡＣＣａｓｅに作用する化合物又はモジュレーターが、それで処理される昆虫の死を生ずるやり方で細胞プロセスを変更できることが、本発明の範囲内で初めて示された。
【００９０】
従って本発明は、本出願に記載するＡＣＣａｓｅモジュレーターの同定法により見出される昆虫ＡＣＣａｓｅのモジュレーターにも関する。
【００９１】
本発明はさらに本発明に従うポリペプチドの発現を変更する化学化合物の判定法を包含する。そのような「発現モジュレーター」も新規な殺虫的活性化合物であることができる。発現モジュレーターは、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸の調節領域に結合する小さい有機−化学的分子、ペプチド又は抗体であることができる。さらに、発現モジュレーターは、それ自身が本発明に従うポリペプチドをコードする核酸の調節領域に結合し、かくしてそれらの発現に影響する分子に結合する小さい有機−化学的分子、ペプチド又は抗体であることができる。発現モジュレーターはアンチセンス分子であることもできる。
【００９２】
本発明は同様に、殺虫剤又は殺ダニ剤としての本発明に従うポリペプチドのモジュレーター又は発現モジュレーターの使用に関する。
【００９３】
本発明は同様に、発現モジュレーターの発見のための上記の方法により見出されるＡＣＣａｓｅ発現モジュレーターに関する。
【００９４】
本発明に従う方法は高−処理量スクリーニング（ＨＴＳ）及び超−高−処理量スクリーニング（ＵＨＴＳ）を含む。本発明に従う核酸及び／又は本発明に従うポリペプチドを含む宿主細胞及び無−細胞調製物の両方を用いることができる。
【００９５】
モジュレーターの発見の１つの方法は、本発明に従うポリペプチドを含む合成反応混合物（例えば試験管内転写の産物）又は細胞成分、例えば膜、区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）又は他のいずれかの調製物を候補分子の存在下及び不在下で、ポリペプチドの標識された基質又はリガンドと一緒にインキュベーションすることであり、候補分子はアゴニスト又はアンタゴニストの形態をとることができる。候補分子が本発明に従うポリペプチドの活性を向上させるか、又は阻害する能力を、標識されたリガンドの結合の増加又は減少から、あるいは標識された基質の転換速度の向上又は低下から知ることができる。十分に結合し且つ本発明に従うポリペプチドの活性の向上に導く分子はアゴニストである。十分に結合し且つ本発明に従うポリペプチドの生物学的活性を阻害する分子は、優れたアンタゴニストである。それらは上記の種類の殺虫性物質の阻害剤の形態をとることもできるが、全く新規な種類の物質もこの調節活性を示し得る。
【００９６】
本発明に従うポリペプチドの活性又は本発明に従うＡＣＣａｓｅ及び／又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％低下させるモジュレーターが殺虫剤として用いるのに、あるいは殺虫剤を得るためにさらに開発されるのに適している。そのような候補分子を次いで脊椎動物種、例えば哺乳類への毒性に関する、ならびにそれらのバイオアベイラビリティーに関するさらに別の試験において検査する。
【００９７】
本発明に従うポリペプチドの生物学的活性の検出をリポーター系として知られるものにより向上させることができる。この側面において、リポーター系は、生成物に転換される測色的に標識された又は放射性標識された基質あるいは本発明に従うポリペプチドの活性又は発現における変化に応答するリポーター遺伝子あるいは他の既知の結合アッセイを含むがこれらに限られない。
【００９８】
多数のタンパク質、例えば貫膜タンパク質の活性をさらに別の方法で有利に測定することができる。Ｅ．コリにおけるそのようなタンパク質の機能性異種発現は多くの場合に困難であるか又は不可能である。この場合、タンパク質の触媒的に活性な部分を適したクローニング法（例えば適したＰＣＲ戦略を用いて）により分離し、遺伝子産物が可溶性タンパク質又はより良い溶解性を有するタンパク質であり且つ容易に精製され得るようにすることができる。可溶性タンパク質の活性の測定のために広範囲の可能な方法を利用できる。例えば蛍光標識されたリガンド又は基質を用いる蛍光偏光により、特に感度の高い測定を行うことができる。
【００９９】
本発明に従うポリペプチドのモジュレーターを見出すことができる方法のさらに別の例は置換アッセイであり、その方法では、本発明に従うポリペプチド及びモジュレーターの可能性のあるものを適した条件下で、本発明に従うポリペプチドに結合することが知られている分子、例えば自然の基質もしくはリガンド又は基質もしくはリガンド模造物と合わせる。１つの例は上記の式（Ｉ）の化合物である。本発明に従うポリペプチド自身を標識、例えば放射性標識又は測色的に標識し、リガンドに結合したか又は転換を経たポリペプチドの数を正確に決定することができる。この方法でアゴニスト又はアンタゴニストの有効性を決定することができる。
【０１００】
本発明に従う方法の１つにおいて本発明に従う核酸及び／又はポリペプチドを用いて見出される殺虫性の可能性のある化合物を多様な方法で、例えば経口的（実施例４も参照されたい）、局所的又は注入により昆虫に投与することができる。殺虫剤は多くの場合に疎水性分子であり、そのような場合、通常蒸発も可能な（例えばメタノール又はアセトン）あるいは摂取を助長するために低い濃度で加えられる（エタノール、ジメチルスルホキシド）有機溶媒中に溶解されなければならない。
【０１０１】
昆虫実験における第１段階は、一般的に昆虫の長期露出に続くＭＬＤ（最小致死用量）の決定である。通常、化合物を希釈し、０〜４８時間の令の胚及び幼虫の飼料に加える。この方法は、ＭＬＤの他に幼虫がまだ孵化する卵のパーセンテージ及び幼虫の挙動（動き、飼料の摂取）、まださなぎになる幼虫の数及びそれらが生ずる成虫の数も決定する。さらに幼虫を形態学的欠陥に関して調べることができる。ＭＬＤが決定された後、短期及び長期用量（ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｄｏｓｅ）を決定することができる。
【０１０２】
典型的な急性試験（ａｃｕｔｅ  ｔｅｓｔ）では、胚、幼虫又は成虫の食物に化合物を加え、２時間後又は終夜のインキュベーションの後に昆虫を検査する。胚の場合、生育欠陥を有する胚の数及び生き残って成虫になるパーセンテージを決定する。
【０１０３】
幼虫の場合、調べられるパラメーターは例えば異常な挙動、損なわれた動き又は脱皮である。成虫（ａｄｕｌｔ  ａｎｉｍａｌｓ）の場合、酵素の量又は活性に関する欠陥、異常な挙動及び／又は損なわれた繁殖可能性が観察される。
【０１０４】
慢性毒性を決定するための試験を行うためには、成虫を問題の化合物を含有する皿内に例えば４８時間置き、次いでそれらを清浄な容器中に移し、動物の繁殖可能性又はある酵素の活性の量又は昆虫の死を観察する。
【０１０５】
続く実施例は、驚くべきことに、ＡＣＣａｓｅが昆虫において必須の酵素であることを示し；さらにそれらは、酵素が殺虫剤の同定のための適した標的タンパク質であること、殺虫的に活性な化合物の同定のための方法においてそれを使用できることならびに適した方法で同定されるＡＣＣａｓｅモジュレーターを殺虫剤として使用できることを示す。ＡＣＣａｓｅの使用を可能にするために、例としてミズス・ペルシカエからこの酵素を得ることを記載し、最後に殺虫的に活性な化合物の探索における本発明の適用性を示す。
【０１０６】
【実施例】
実施例１：ミズス・ペルシカエからのＡＣＣａｓｅ酵素調製物の調製
ミズス・ペルシカエ幼虫又は成虫の体重を量り、３倍量の抽出緩衝液中で乳棒と乳鉢を用いて均質化する。続いて抽出物を１００００ｇにおいて１０分間、２回遠心する。上澄み液はＡＣＣａｓｅを含有し、それを阻害剤の同定のための酵素アッセイにおいて用いる。
【０１０７】
好ましくは抽出緩衝液として以下の緩衝液を用いる：０．２５Ｍ  スクロース、１５ｍＭ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  クエン酸カリウム（すべての化学品はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから）。
実施例２：モジュレーターの判定のための方法
ＡＣＣａｓｅ酵素調製物を下記に記載するＡＣＣａｓｅモジュレーターの判定のための生化学的アッセイにおいて用いた：第１に実施例１の酵素調製物のアリコートを反応緩衝液及び放射性標識された基質と混合し、混合物をインキュベーションした。ＣＯ２の導入の検出のために、発煙ＨＣｌをピペットで入れ、反応混合物のアリコートをＷａｔｍａｎ濾紙に滴下し、乾燥した。乾燥した濾紙をシンチレーション液と一緒にシンチレーション管中に移した。シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＵＳＡ）で測定を行った。モジュレーターに関するスクリーニングのために、試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解し、第１のインキュベーション段階の前に酵素調製物と一緒に反応混合物に加えた。モジュレーターの効果を、溶媒を含むがモジュレーターを含まない反応混合物におけるＡＣＣａｓｅ活性との比較において決定した。図２ａは、種々の活性成分濃度におけるミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの阻害を示す。図２ｂは、ある範囲の活性成分によるミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの阻害を示す。
【０１０８】
用いられた反応緩衝液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５ｍＭＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、１μｇ／μｌ  ウシ血清アルブミン、１０ｍＭ  クエン酸カリウム、８４ｍＭ  重炭酸ナトリウム（すべての化学品はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから）であった。
【０１０９】
放射性標識された基質として４ｍＭ  １４Ｃ重炭酸ナトリウムを用いた。
実施例３：
ＡＣＣａｓｅ阻害剤の発見のためのＡＣＣａｓｅ活性の測定
ＡＣＣａｓｅ−触媒反応の部分−段階（ｐａｒｔ−ｓｔｅｐ）は、補因子ビオチンにおけるカーボネート基の固定である。この固定はＡＴＰの開裂を用いて行われる：ＡＣＣａｓｅ−ビオチン＋ＨＣＯ３−＋ＡＴＰ→ＡＣＣａｓｅ−ビオチン−ＣＯ２−＋ＡＤＰ＋Ｐｉ。ＡＣＣａｓｅ活性の決定のために、商業的に入手可能なマラカイトグリーン試薬を用い、放出されているホスフェートを検出する。これはホスフェートの一般的（非特異的）検出の形態をとるので、用いられる材料及び試薬のすべてはホスフェートを含んではならない。この検出反応のために、ＡＣＣａｓｅを他のＡＴＰ−開裂酵素から精製しなければならない。
（ａ）ＡＣＣａｓｅ調製物
全昆虫又はそれらから得られる組織／器官を均質化緩衝液（２５０ｍＭ  スクロース、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、プロテイナーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−８３４０））中で微粉砕する（例えば乳棒と乳鉢中又はホモジナイザー棒を用いる微粉砕により）。ホモジネートを次いで遠心し、透明の材料を得る。ＡＣＣａｓｅを含有する上澄み液を次いでさらなる段階のために、４ＰＤ−１０カラム（ＰＨａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を用い、ランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  ＮａＮ３、１０％  グリセロール）との緩衝液交換に供する。粗抽出物を続いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ２６／６０  Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）においてＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）により分離する。得られる画分を（ｂ）の下に記載するとおりにＡＣＣａｓｅ活性に関してアッセイする。最高の特異的ＡＣＣａｓｅ活性を有する画分を合わせ、（ｃ）の下に記載する阻害剤測定のための出発材料を構成する（下記ではＡＣＣａｓｅ溶液と呼ぶ）。
（ｂ）活性アッセイ
（ａ）の下に記載したＡＣＣａｓｅ溶液のアリコートを反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭＡＴＰ、２００μＭ  アセチル−ＣｏＡ）と混合し、混合物を生理学的温度（２４℃〜３７℃）でインキュベーションする。所望の反応時間が経過した後、２体積の染色試薬（ＢｉｏｍｏｌＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔ  ｉｎｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）、製造者により規定されるとおりに調製）を加え、製造者により規定されるとおりに検出反応が明瞭になるまで、混合物のインキュベーションを続ける。非特異的背景活性の決定のために、基質アセチル−ＣｏＡを含まない反応混合物も測定に含め、特異的ＡＣＣａｓｅ活性の算出の時に結果を引き去る。
（ｃ）ＡＣＣａｓｅ阻害剤の同定のための方法
試験物質によるＡＣＣａｓｅの阻害の決定のために、（ａ）のＡＣＣａｓｅ溶液のアリコートを反応緩衝液及び試験阻害剤と混合し、混合物を生理学的温度（２４℃〜３７℃）でインキュベーションする。所望の反応時間が経過した後、（ｂ）の下に記載したとおりに検出反応を行う。平行して、阻害剤を添加しない標準測定を行う。次いでこの標準との比較においてＡＣＣａｓｅ阻害を算出する。供給者：他にことわらなければ、すべての化学品はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡからである。
実施例４：ＡＣＣａｓｅ阻害剤による脂質新生の損傷
モモアカアブラムシ、ミズス・ペルシカエの幼虫又は成虫にサッシェ法（Ｎａｕｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）を用い、同定されたＡＣＣａｓｅ阻害剤の１つを含むかもしくは含まない栄養溶液を２日間与えた。
【０１１０】
例として４−ヒドロキシ−８−メトキシ−３−（２，３，４，６−テトラメチルフェニル）−１−アザスピロ［４，５］デセ−３２−エン−２−オンと呼ぶことができる式（Ｉ−Ａ）
【０１１１】
【化３】
2005500810.tif 000006
【０１１２】
の化合物をこの実験で用いた。
【０１１３】
その後動物を集め、乳棒と乳鉢を用いて有機溶媒中で均質化した。水溶液と一緒に振ることにより有機相を繰り返し抽出することによって、有機相から水溶性成分を除去し、次いで溶媒を蒸発させた。残るペレットを少量の溶媒中に取り上げ、薄−層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した。分離された脂質をアミドブラック（ａｍｉｄｏ  ｂｌａｃｋ）を用いて染色した。２〜３日の露出時間の後、脂質中に導入された１４Ｃ−アセテートをオートラジオグラフィーにより検出した。脂質中への１４Ｃ−導入の定量のために、染色の後に問題のバンドをこすり取り、溶解し、シンチレーションカウンターで活性を決定した。図１ａは、モモアカアブラムシ、ミズス・ペルシカエから分離された脂質抽出物に関して、式（Ｉ−Ａ）の活性成分を含まない（１〜３列）及び含む（４〜６列）アセテート供給の後の脂質の状態を示す。脂質組成及び脂質含有量における有意な差は観察されない。図１ｂは同じＴＬＣプレートのオートラジオグラフを示す。１〜３列において、標準のアブラムシにおける新たな合成の間に放射性標識されたアセテートが導入された脂質が黒い色のために認識可能であるが、活性成分で処理されたモモアカアブラムシ中には標識された脂質が存在しない。かくしてアセテートからの新たな脂質合成は起らなかった。図１ｃも、ＡＣＣａｓｅ阻害剤を含まない標準と比較して、ＡＣＣａｓｅ阻害剤の存在下で（０．０１ｐｐｍ〜１００ｐｐｍ）どの程度の量のアセテートが新たな合成の間にまだ導入されていたかを、グラフ図（ｄｉａｇｒａｍ）の形態で示している。阻害剤濃度の増加は新たな脂質生合成を休止させることが明らかにわかる。
【０１１４】
ＴＬＣクロマトグラフィーのために用いた移動相はｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：氷酢酸（６０：４５：１）であった。
【０１１５】
【表３】
2005500810.tif 000007
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
【表５】
2005500810.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
ＡＣＣａｓｅ阻害剤を含まない（１〜３列）及びそれを含む（４〜６列）アセテート供給に続いてモモアカアブラムシ、ミズス・ペルシカエから分離された脂質抽出物。分離された脂質はアミドブラックを用いて染色された。
【図１ｂ】
図１ａ）で示したＴＬＣプレートのオートラジオグラフ。２〜３日の露出時間の後、画像により１４Ｃ−アセテートを検出した。標準のアブラムシにおいて新たな合成中に放射性標識されたアセテートが導入された脂質は、１〜３列においてそれらの黒色のために認識可能であるが、活性成分で処理されたモモアカアブラムシ中に標識された脂質は存在しない。
【図１ｃ】
新たな脂質合成の間のＡＣＣａｓｅ阻害剤（０．０１〜１００ｐｐｍ）の存在下及び不在下における１４Ｃ−アセテートの導入の比較。
【図２ａ】
種々の活性成分濃度におけるミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの阻害。
Ｓｏｌｖ＝溶媒（標準）。Ｃｏｍｐ＝化合物（活性成分）。
【図２ｂ】
種々の活性成分によるミズス・ペルシカエＡＣＣａｓｅの阻害。
Ｃｏｍｐ＝化合物。
【図３】
２種の物質Ａ及びＢによるモモアカアブラムシ、ミズス・ペルシカエからのＡＣＣａｓｅの阻害。図は標準（阻害剤を含まない混合物は示されていない）と比較された種々の阻害剤濃度におけるそれぞれのＡＣＣａｓｅ活性を示している。
【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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