(57)【要約】【課題】ジンクフィンガードメインライブラリーの提供。【解決手段】キメラジンクフィンガードメインのライブラリーが開示されている。ライブラリーは天然型タンパク質、たとえば、哺乳類タンパク質およびヒトタンパク質から由来する２つ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。有用なキメラジンクフィンガードメインがこのライブラリーから同定できる。特定の部位を認識するジンクフィンガードメインのアミノ酸配列もまた開示されている。
2005500068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のポリペプチドを含むライブラリーであって、各々のポリペプチドが第１および第２のジンクフィンガードメインを含み、（１）前記第１および第２のジンクフィンガードメインが各々天然型タンパク質から由来するジンクフィンガードメインと同一であると同時に、（ｉ）同じ天然型タンパク質には存在しないか、（ｉｉ）前記ポリペプチドとは異なる配列を有する同じ天然型タンパク質に存在し、（２）第１のジンクフィンガードメインが前記複数のポリペプチドにおいて多様に現れ、（３）第２のジンクフィンガードメインが前記複数のポリペプチドにおいて多様に現れるライブラリー。
【請求項２】
前記複数のポリペプチドの各ポリペプチドが５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）で標的ＤＮＡ部位に結合する、請求項１記載のライブラリー。
【請求項３】
前記複数のポリペプチドのうち、一つ以上のポリペプチドの第１のジンクフィンガードメインが、表５、６および７のいずれか一つに記載されているジンクフィンガードメインから選ばれる、請求項１記載のライブラリー。
【請求項４】
前記複数のポリペプチドのうち、各々のポリペプチドの第１のジンクフィンガードメインが表５、６および７のいずれか一つに記載されているジンクフィンガードメインから選ばれる、請求項３記載のライブラリー。
【請求項５】
前記複数のポリペプチドのうち、一つ以上のポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインが表５、６および７のいずれか一つに記載されているジンクフィンガードメインから選ばれる、請求項３記載のライブラリー。
【請求項６】
天然型タンパク質が真核細胞のタンパク質である、請求項１記載のライブラリー。
【請求項７】
天然型タンパク質が哺乳類のタンパク質である、請求項６記載のライブラリー。
【請求項８】
天然型タンパク質がヒトタンパク質である、請求項７記載のライブラリー。
【請求項９】
前記複数のポリペプチドの各ポリペプチドが固体支持体に固定化されている、請求項１記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記複数のポリペプチドの各ポリペプチドがウイルスまたはウイルス粒子の表面にディスプレイされている、請求項１記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記複数のポリペプチドの各ポリペプチドが第３のジンクフィンガードメインをさらに含む、請求項１記載のライブラリー。
【請求項１２】
第３のジンクフィンガードメインが天然型タンパク質のドメインである、請求項１１記載のライブラリー。
【請求項１３】
第３のジンクフィンガードメインが天然型タンパク質のドメインでない、請求項１３記載のライブラリー。
【請求項１４】
第３のジンクフィンガードメインが６個以下のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって天然型タンパク質のドメインと区別される、請求項１３記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記複数のポリペプチドの各ポリペプチドが転写調節ドメインをさらに含む、請求項１記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記複数のポリペプチドが１００個以上の異なるポリペプチドからなる請求項１記載のライブラリー。
【請求項１７】
複数のポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、各々のポリヌクレオチドが請求項１〜８または１１〜１６のいずれか一項のライブラリーの異なるポリペプチドをコーディングするライブラリー。
【請求項１８】
各々のポリヌクレオチドがプラスミドまたはファージミドの断片である、請求項１７記載のライブラリー。
【請求項１９】
各々のポリヌクレオチドが細胞内に存在する、請求項１７記載のライブラリー。
【請求項２０】
細胞が真核細胞である、請求項１９記載のライブラリー。
【請求項２１】
細胞が酵母細胞である、請求項２０記載のライブラリー。
【請求項２２】
細胞がプロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む異種レポーター構造物を含む、請求項１９記載のライブラリー。
【請求項２３】
各々のポリヌクレオチドが、ウイルスまたはウイルス粒子中に包装されている、請求項１７記載のライブラリー。
【請求項２４】
（ａ）各々の核酸が天然型タンパク質から由来するジンクフィンガードメインをコーディングする配列を含む核酸のセットを提供し、
（ｂ）前記セットの各核酸を前記セットの一つ以上の他の核酸に連結して複数のキメラ核酸を形成することを含む、
複数のキメラ核酸を生産する方法。
【請求項２５】
前記セットが異なる天然型タンパク質から由来するジンクフィンガードメインをコーディングする配列を少なくとも２個以上含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記セットが同じ天然型タンパク質から由来するジンクフィンガードメインをコーディングする配列を少なくとも２個以上含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
段階（ａ）が、保存されたドメイン境界部をコーディングする配列に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）混合物、または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）混合物からジンクフィンガードメインをコーディングするポリヌクレオチドの集合を増幅させることを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
段階（ａ）が、（ｉ）各々のドメインが対象標的部位内の配列に対する特異性を有する複数のジンクフィンガードメインを選択し、（ｉｉ）各々のポリヌクレオチドが一つ以上の選択されたジンクフィンガードメインをコーディングする複数のポリヌクレオチドを提供することによって、ポリヌクレオチドセットを提供することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のジンクフィンガードメインがジンクフィンガードメインとそれらの各結合部位に関連する情報を含むデータベースを検索することによって選ばれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１のポリペプチドライブラリーを提供する段階；
標的ＤＮＡ部位を前記ライブラリーのポリペプチドと接触させる段階；および
前記標的ＤＮＡ部位に特異的に結合する一つ以上のポリペプチドを同定する段階を含む、
標的ＤＮＡ部位に特異的に結合する人工ジンクフィンガーポリペプチドの生成方法。
【請求項３１】
ライブラリーのポリペプチドが固体支持体に固定化されている、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ライブラリーの各ポリペプチドがウイルスまたはウイルス粒子の表面にディスプレイされている、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
請求項１７のポリヌクレオチドライブラリーを提供する段階；
標的ＤＮＡ部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含有する細胞を提供する段階；
前記細胞において複数のポリヌクレオチドを発現させる段階；
標的ＤＮＡ部位を認識するポリペプチドがない場合の発現水準に比べてレポーター遺伝子の発現水準が変化した細胞を同定する段階；および
複数のポリヌクレオチドのうち、前記細胞で発現されたポリヌクレオチドを同定することによって、標的ＤＮＡ部位を特異的に認識するポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを同定する段階を含む、
標的ＤＮＡ部位を特異的に認識するジンクフィンガーポリペプチドをコーディングする核酸の同定方法。
【請求項３４】
標的ＤＮＡ部位に対する同定されたジンクフィンガーポリペプチドの結合特異性を変化させることなく、ジンクフィンガーポリペプチドのアミノ酸配列を修飾する段階をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
標的部位が６個以上の予め決定されたヌクレオチドを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
細胞が酵母細胞である、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ポリヌクレオチドを各細胞に導入する段階をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
レポーター遺伝子を含有する細胞とポリヌクレオチドライブラリーを含む細胞を融合させる段階をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
表５、６および７のジンクフィンガードメインから選ばれる第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチド。
【請求項４０】
第３のジンクフィンガードメインをさらに含み、３つのジンクフィンガードメインのセットが表１０の横列に記載されている、請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３７のポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
【請求項４２】
配列番号：１６７，１６８，１６９，１７０，１７１，１７２，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，１９１，１９３，１９５および１９６からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２のポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含む核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子のようなＤＮＡ−結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの遺伝子は、通常プロモータまたはエンハンサー領域内にある該遺伝子内の特定のＤＮＡ部位に結合するポリペプチド転写因子による転写水準で調節される。これらのタンパク質は、プロモータ部位でＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を活性化または抑制することによって標的遺伝子の発現を調節する。活性化因子（activator）または抑制因子（repressor）にかかわらず多くの転写因子は、構造的に単位モジュール性（module）を有する。そのような単位モジュールは、構造的に別個のドメインとしてフォールディングが可能であり、ＤＮＡ結合、二量化（dimerization）または転写機構（transcriptional machinery）との相互作用のような特定の機能を有する。活性化ドメインまたは抑制ドメインのようなエフェクター（effector）ドメインは、異種転写因子のＤＮＡ−結合ドメインに連結されてもその機能を維持する（BrentおよびPtashne, (1985) Cell 43:729-36;Dawson et al., (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31）。ジンクフィンガードメイン（zinc finger domain）、ホメオドメイン（homeodomain）およびヘリックス・ターン・ヘリックス（helix-turn-helix）ドメインを含む多くのＤＮＡ−結合ドメインの３次構造がＮＭＲおよびＸ線結晶データで決定されている。
【非特許文献１】
BrentおよびPtashne著、１９８５年発行、Cell 43:729-36
【非特許文献２】
Dawsonら著、１９９５年発行、Mol. Cell Biol. 15:6923-31
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明は、迅速かつ大規模でキメラタンパク質、たとえば、転写因子を同定し、製造するための細胞的方法を提供する。そのような転写因子は、生物医学および生物工学的応用などにおいて内因性遺伝子の発現を変化させるために使用できる。前記転写因子は生体内、すなわち、培養中の、損傷されずに生きている細胞内で分析される。分析結果からデータベースを構築できる。前記データベースを他のキメラ転写因子を考案するために使用できる。キメラ転写因子ライブラリーを製造してスクリーニング（screening）できる。また、キメラタンパク質は、ＤＮＡでない分子、たとえば、タンパク質およびＲＮＡを、特に小さい非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡｓ）に結合して、調節することもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一実施形態によれば、本発明は、キメラジンクフィンガータンパク質をコーディング（encode）する核酸ライブラリーを特徴とする。「ライブラリー」という用語は、類似するが、同一ではない生物分子の物理的な集合（collection）を意味する。この集合は、たとえば、一つの容器に共存するか、別の容器または固体支持体上の別の位置（グループとして、または個別的に）に物理的に分離されていてもよい。ライブラリーの各構成体が複数その集合に存在してもよい。
【０００５】
一番目のライブラリーは、少なくとも第１、第２および第３のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を複数含む。本願に用いられる「第１、第２および第３」という用語は、ポリペプチドに任意の順序に存在する３個の分離されたドメインを示し、各ドメインは他のドメインのいずれか一つまたは両方に対してＮ−末端またはＣ−末端に存在することができる。第１のジンクフィンガードメインは複数の核酸において多様な形で存在する。第２のジンクフィンガードメインは複数の核酸において多様な形で存在する。１０個以上の異なる第１のジンクフィンガードメインがライブラリーにある。本発明の一実施形態によれば、ライブラリー構成員の０．５、１、２、５、１０または２５％以上は次の性質の一つまたは両方とも有している：（１）各々は一つ以上のｐ１Ｇレポータープラスミドの転写をインビボで１．２５倍以上抑制する；そして、（２）各々は一つ以上の標的部位（target site）に７、５、３、２、１、０．５または０．０５ｎＭ以下の解離定数で結合する。第１および第２のジンクフィンガードメインは異なる天然型タンパク質から由来するか、天然型タンパク質におけるそれらの相対的な位置と異なる配列で位置している。たとえば、第１および第２のジンクフィンガードメインはポリペプチドにおいて隣接しているが、天然型タンパク質においては一つ以上の介在（intervening）ジンクフィンガードメインによって分離されている場合もある。
【０００６】
本願に用いられる「解離定数（dissociation constant）」は、一つの９−塩基対標的部位を含む２８−塩基対の二本鎖ＤＮＡに結合するためのポリペプチドの平衡（equilibrium）解離定数を意味する。解離定数は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０Ｍ  ＺｎＳＯ４、１０％グリセロール、０．１％ノニデット（Nonidet）Ｐ−４０、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（bovine serum albumin）中に室温で結合させた、精製されたタンパク質を用いたゲルシフト分析（gel shift analysis）によって決定される。さらに詳しくは、実施例１０およびレバーとパボの論文（Rebar and Pabo(1994) Science 263:671-673）から提供される。
【０００７】
本願に用いられる「ｐ１Ｇレポータープラスミドの転写抑制」は、図１２に示すように、ＴＡＴＡボックスの下流に位置する特定の９−塩基対標的部位を有するｐ１Ｇレポータープラスミドのルシフェラーゼレポーター遺伝子の抑制倍数（fold repression）を意味する。抑制倍数は、適切な発現プラスミドおよびレポータープラスミドでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることを必要とする、実施例６８に示す分析法によって決定される。
【０００８】
第１および第２のジンクフィンガードメインは、たとえば、後述するように天然型ドメインであってもよい。
【０００９】
二番目の特別ライブラリーは、少なくとも第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を複数含む。各ポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインは、（１）異なる天然型タンパク質のジンクフィンガードメインと同じであるか（そして、同じ天然型タンパク質には一般的に存在しないか、天然型タンパク質におけるそれらの相対的な位置と異なる配列で位置する。）、（２）天然型タンパク質のドメインと４，３，２または１個以下のアミノ酸が異なるか、（３）天然型タンパク質由来の非隣接ジンクフィンガードメインである。同じジンクフィンガードメインは、一番目の金属配位残基（metal coordinating residue）（主に、システイン）から最後の金属配位残基（主に、ヒスチジン）までの各アミノ酸が同一であるジンクフィンガードメインを指す。第１のジンクフィンガードメインは複数の核酸において多様であり、第２のジンクフィンガードメインも複数の核酸において多様である。天然型タンパク質は、任意の真核生物ジンクフィンガードメイン、たとえば、菌類（例：酵母）、植物、または動物タンパク質（例：ヒトまたはネズミタンパク質のような哺乳類タンパク質）であってもよい。各ポリペプチドは第３、第４、第５および／または第６のジンクフィンガードメインをさらに含み得る。各ジンクフィンガードメインは哺乳類、たとえば、ヒトのジンクフィンガードメインであってもよい。同じ天然型タンパク質から第１および第２のジンクフィンガードメインが由来し、以前はＮ−末端であったものがＣ−末端となるように人工的に配列された場合、前は隣接しなかったドメインが隣接するようになる場合とが典型的である。
【００１０】
上述の一番目および二番目の特別ライブラリーに関し、各ポリペプチドの第１および／または第２のジンクフィンガードメインは表５、６および７から選択できる。他の例において、少なくとも一つのポリペプチドの第１および／または第２のジンクフィンガードメインは表５、６および７から選択できる。一実施形態によれば、表５、６および７に記載されたジンクフィンガードメインの１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％以上、またはすべてが複数の核酸のうち少なくとも一つによってコーディングされる。複数の核酸の各構成員によってコーディングされる複数の第１のジンクフィンガードメインは１０、２０、３０、４０または５０個以上の異なる３−塩基対ＤＮＡ部位に特異的に結合するのに十分な数の異なるジンクフィンガードメインを含む。
【００１１】
もしもＺｉｆ２６８のフィンガー１および２とある特定のジンクフィンガードメインを含むキメラタンパク質がＺｉｆ２６８のフィンガー１および２が認識する５’−ＧＧＧＣＧ−３’の５−塩基対配列と特定の３−塩基対ＤＮＡ部位を含む標的配列に５ｎＭ以下の親和度を有すれば、その特定のジンクフィンガードメインは特定の３−塩基対ＤＮＡ部位に「特異的に結合する」という。Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２はポリペプチド配列ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＴＴＨＩＲＴＨ（配列番号：１９８）を有する。「認識する」と「特異的に結合する」という用語は、相互交換的に用いられ、前記ｚｉｆ２６８融合分析においてジンクフィンガードメインの結合部位（binding site）とは区別された意味を有する。
【００１２】
任意的に、複数の核酸は１０、２０、３０、４０または５０個以上の異なる３−塩基対ＤＮＡ部位を認識するのに十分な数の異なるジンクフィンガードメインを集合的にコーディングする。一実施形態によれば、複数の核酸は４０、３０、２０、１０、または５個以下の異なる３−塩基対ＤＮＡ部位を認識するのに十分な数の異なるジンクフィンガードメインを集合的にコーディングする。
【００１３】
複数の核酸は５、１０、２０、３０、または４０個以上の異なる第１のジンクフィンガードメイン、および／または５、１０、２０、３０、または４０個以上の異なる第２のジンクフィンガードメインを集合的にコーディングできる。複数の核酸は１０、５０、２００、５００、１０００、５０００、１００００、２００００、２５０００、または４００００個以上の異なる核酸（すなわち、異なる配列を有する）を含み得る。ある場合に、複数の核酸は１００、５００、２０００、５０００、１５０００、３００００、または５００００以下の核酸を含み得る。複数の核酸はモル比（molar ratio）でライブラリーの２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上、または１００％を構成し得る。
【００１４】
一実施形態によれば、複数の核酸によってコーディングされるポリペプチドは異なる数のジンクフィンガードメインを含む。たとえば、一番目のサブセット（subset）によってコーディングされるポリペプチドは４個のジンクフィンガードメインを含み、二番目のサブセット（subset）によってコーディングされるポリペプチドは５個のジンクフィンガードメインを含み得る。他の組合せは３、４および５個のドメインまたは４、５および６個のドメインからなる。
【００１５】
一実施形態によれば、複数の核酸によってコーディングされるポリペプチドは異なるタイプの転写調節ドメインを含む。たとえば、一番目のサブセットによってコーディングされるポリペプチドは転写活性化ドメインを、二番目のサブセットによってコーディングされるポリペプチドは転写抑制ドメインを含み得る。異なるサブセットは転写調節ドメインがなくてもよい。このような例は転写因子の特定のタイプに対する偏り（bias）なしにライブラリーをスクリーニングできるようにする。
【００１６】
一実施形態によれば、各核酸は固体支持体に固定化される。他の実施形態によれば、各核酸はそれがコーディングするポリペプチドに付着されている。この付着は共有または非共有結合であってもよい。たとえば、各核酸によってコーディングされたポリペプチドはウイルスまたはウイルス粒子の表面に付着でき、核酸はウイルスまたはウイルス粒子中に包装され得る（packaged）。「ウイルス」とは、宿主細胞を感染させ、自家複製できる遺伝物質をいう。「ウイルス粒子」とは宿主細胞を感染させることができるが、自家複製できない遺伝物質をいう。ウイルス粒子の一例はファージミド核酸を含む線状ファージコートパッケージ（filamentous phage coat package）である。ウイルスまたはウイルス粒子は哺乳動物細胞（例：レトロウイルスおよびアデノウイルス）または細菌細胞（例：バクテリオファージ）を感染させることができる。他の例において、ポリペプチドは核酸にピューロマイシン連結などによる共有結合で付着されている。
【００１７】
他の例において、各ポリペプチドは活性化または抑制ドメインをさらに含む。各ポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインは互いに隣接するか、介在ドメインまたはリンカー（linker）などによって分離されていてもよい。
【００１８】
一実施形態によれば、ライブラリーの各核酸は細胞内にある。核酸は細胞内で発現できる。細胞はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結された標的ＤＮＡ部位を含む異種レポーター構造物を含み得る。細胞は酵母細胞；哺乳類、トリ、昆虫の細胞のような動物細胞；細菌細胞；または植物細胞であってもよい。
【００１９】
ライブラリーのすべての核酸は一つの容器（container）内または単一表面上に位置させ得る。他の例において、複数の核酸のサブセットは別の容器に、別の表面に、または同じ表面の別の部分に位置させてもよい。また他の例において、ライブラリーの各核酸は住所として、たとえば、一つだけの住所として指定される（uniquely addressable）。「アドレサブル（addressable）」要素は住所が定められた要素を検索する適当な条件でアクセスできる限定された空間的位置に位置する。たとえば、各核酸は、マイクロタイタープレートの一つのウェルに、平面アレイ上に、または細胞凍結試料中に位置させ得る。
【００２０】
ライブラリーの各核酸は、その核酸によってコーディングされるポリペプチドの標的部位を認識する能力に関する情報につながるポインター（pointer）によって機械で読み取り可能な媒体（machine-readable medium）の形で参照できる。このような情報は、たとえば、標的部位に対するポリペプチドの結合親和度（affinity）を表示する値、標的部位を認識するポリペプチドの能力を予報する（predictive）値、または細胞（例：ヒト細胞）内で内因性遺伝子の発現に対するポリペプチドの効果を反映するセット（set）を含む。
【００２１】
また、本発明は、ポリペプチドのライブラリーを提供する。ライブラリーは本願に特徴付けられた核酸ライブラリーの核酸によって各々コーディングされる複数のポリペプチドを含む。ポリペプチドライブラリーは、その特徴がタンパク質水準で現れる他は、本願に記述された核酸ライブラリーの適切なある特徴も含み得る。
【００２２】
本発明はまた、標的ＤＮＡ部位を認識するポリペプチドの能力に対する情報が暗号化されて含まれている、機械で読み取り可能な媒体と本願に記述されたライブラリーを含むキットを提供するが、ここで、ライブラリーの各核酸またはポリペプチドは、前記核酸によってコーディングされる各ポリペプチドの標的ＤＮＡ部位を認識する能力に対する情報に関連するポインターによって機械で読み取り可能な媒体の形で参照できる。たとえば、前記情報は標的部位に対するポリペプチドの結合親和度を表示する値または標的部位を認識するポリペプチドの能力を予報する値を含む。キットは使用者が前記情報に対してインターフェースで接続できるようにするコンピュータで読み取れる指示（instruction）をさらに含み得る。
【００２３】
他の一実施形態によれば、本発明は第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドを特徴とする。各ジンクフィンガードメインは表５、６および７から選択される配列を有する。第１および第２のジンクフィンガードメインは異なる天然型タンパク質から由来する。ポリペプチドは第３、第４および第５のジンクフィンガードメインをさらに含み得る。このドメインの各々はまた表５、６および７から選択された配列を有することができる。典型的に、ジンクフィンガードメインは互いに隣り合って位置してジンクフィンガードメインのアレイ（array）を形成する。このようなアレイは他のタイプの構造的または機能的タンパク質ドメインが中間に挟まれていないポリペプチド単位である。
【００２４】
本発明はまた、第１、第２および第３のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドを特徴とする。各ドメインは天然型（naturally occurring）である。そのドメインのうち２つ以上は異なる天然型ポリペプチドに存在する。さらに、このポリペプチドは次の特徴の一つまたは両方ともを有する：（１）各々はインビボで一つ以上のｐ１Ｇレポータープラスミドの転写を１．２５、１．５、１．７、１．９、２．０、または２．５倍抑制し；（２）各々は一つ以上の標的核酸部位に７、５、３、２、１、０．５、または０．０５ｎＭ以下の解離定数で結合する。標的部位はＤＮＡであるか、ＲＮＡであってもよい。第１、第２および／または第３のフィンガーは表５、６および７から選択できる。一実施形態によれば、各々与えられたポリペプチドの第１、第２および第３のジンクフィンガードメインは表１０の一列、たとえば、１１３列の上の列、たとえば、すべてのヒトジンクフィンガードメインを含む列に共に記載されたドメインで表示される。一実施形態によれば、ポリペプチドは天然型ポリペプチド（例：哺乳類、例：ヒトポリペプチド）から由来するドメインのみを含む。
【００２５】
一実施形態によれば、第１ドメインは第２のドメインに対してＮ−末端にあり、第２のドメインは第３のドメインに対してＮ−末端にあり、第２のドメインは第１のドメインとは異なる天然型ポリペプチドに存在する。第１、第２および第３のドメインの各々は他の２つとは異なる天然型ポリペプチドに存在してもよい。
【００２６】
任意の特徴的ポリペプチドに関連して、ポリペプチドは異種配列、たとえば、核位置シグナル（nuclear localization signal）、小さい分子結合ドメイン（例：ステロイド結合ドメイン）、エピトープタグ（tag）または精製道具、触媒ドメイン（例：核酸修飾ドメイン、核酸切断ドメイン、またはＤＮＡ修理触媒ドメイン）、転写機能ドメイン（例：活性化ドメイン、抑制ドメインなど）、タンパク質伝達（transduction）ドメイン（例：HIV tatから）、および／または調節部位（例：リン酸化部位、ユビキチン化部位またはプロテアーゼ切断部位）をさらに含み得る。
【００２７】
ポリペプチドはビード、マトリックスまたは平面アレイなどの固体支持体に（共有または非共有結合で）結合できる。ポリペプチドはまた放射性化合物、蛍光化合物、他の感知可能な物質、または感知系の成分（例：化学発光試薬）のような標識に結合できる。
【００２８】
本発明はまた、前述したポリペプチドの一つをコーディングする分離された核酸配列を含む。核酸は作動可能に連結された調節配列、たとえば、プロモータ、転写エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ウイルスパッケージング配列、および／または選択マーカーなどをさらに含み得る。核酸は、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスまたはアデノウイルスなど哺乳類細胞を感染させ得るウイルスなどのウイルス内に包装されてもよい。
【００２９】
本発明は核酸を含む細胞をさらに提供する。細胞は対象生物体の組織にあるか、培養体である。細胞は動物（例：哺乳類）、植物、または微生物（例：菌類または細菌）細胞であってもよい。本発明はまた、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ウシ、ヤギやヒツジのようなヒトでない遺伝子移植（transgenic）哺乳類をさらに含み得る。遺伝子移植哺乳類の遺伝的補完物は前述したか、本明細書の他の個所で説明したキメラジンクフィンガーポリペプチドをコーディングする核酸配列を含む。本発明はまた、たとえば、核酸を発現してポリペプチドを生産する方法および、たとえば、細胞内の内因性遺伝子またはウイルス遺伝子を調節するためにポリペプチドを使用する方法を含む。
【００３０】
他の実施形態によれば、本発明の特徴は核酸ライブラリーによってコーディングされる一つ以上のポリペプチドを評価する方法である。この方法は次を含む：複数のライブラリー核酸の各々が一つの細胞内にあるライブラリーを提供する段階（特定の細胞内にライブラリー構成体の全部ではないが、一つ以上が存在し得る）；複数の核酸の各々がある細胞内で核酸を発現させる段階；およびライブラリー構成体のない細胞に比べてレポーター遺伝子の発現が変化した細胞を同定することによって、標的ＤＮＡ部位を認識するポリペプチドをコーディングする核酸を同定する段階。
【００３１】
他の一実施形態によれば、本発明はキメラジンクフィンガータンパク質のライブラリーを構成する方法を特徴とする。この方法は次を含む：表５、６および７から選択されたジンクフィンガードメインをコーディングする配列を各々含む核酸のセットを提供する段階；およびセットの各核酸をセットの一つ以上、好ましくは２つ、３つまたは４つの他の核酸に連結して複数のキメラ核酸を形成する段階。各キメラ核酸は哺乳類発現ベクターのようなベクター内に位置してもよい。
【００３２】
一実施態様によれば、前記方法は核酸の連結後に、複数のキメラ核酸のうち一つ以上を細胞に導入し、一つ以上のキメラ核酸を発現させることをさらに含む。他の実施態様によれば、前記方法は一つ以上のキメラ核酸を哺乳類細胞のような細胞に各々導入し、キメラ核酸を発現させ、細胞内で遺伝子またはタンパク質の発現を監視することをさらに含む。細胞はキメラ核酸によってコーディングされるポリペプチドが標的部位に結合してレポーター遺伝子の発現を促進するか、抑制するように、前記ポリペプチドによって認識されると予測される標的部位を含む構造物のようなレポーター構造物を含み得る。
【００３３】
他の実施形態によれば、本発明は本明細書で説明されたジンクフィンガータンパク質のようなキメラジンクフィンガータンパク質を特徴づける（characterizing）方法を提供する。この方法は、タンパク質をコーディングする核酸を細胞内に導入する段階；核酸の発現段階；および細胞内の内因性遺伝子の発現プロファイルを決定する段階を含む。このような発現プロファイルは複数の値を含むが、各値は異なる遺伝子、または一つの遺伝子のスプライシングまたは対立遺伝子（allelic）変異体の発現（すなわち、ｍＲＮＡ水準）や翻訳産物の量（すなわち、タンパク質水準）に対応する。その値は遺伝子の発現水準または遺伝子の翻訳産物の質的または量的評価、すなわち、１）遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたは２）遺伝子からコーディングされたポリペプチドの量の評価を表わす。
【００３４】
前記方法は、決定された発現プロファイルを一つ以上の対照発現プロファイルと比較することによって、キメラジンクフィンガータンパク質の特徴を示すことを含み得る。対照プロファイルは異種のキメラジンクフィンガータンパク質を含まないが、対照ベクターを含む関連細胞の発現プロファイルであり得る。この比較を通じて、キメラジンクフィンガータンパク質によって変更された一つ以上の遺伝子の調節を確認できる。一実施形態によれば、標本発現プロファイルを対照プロファイルと比較して異なるプロファイルを作ることもできる。標本発現プロファイルはまた対照プロファイルの集合と多次元的に比較できる。一実施形態によれば、試料発現プロファイルは核酸アレイを用いて決定される。他の実施形態によれば、試料発現プロファイルはアレイを必要としない方法および／または装置（例：ＳＡＧＥまたは複数のプライマーを用いる定量的ＰＣＲ）を用いて決定される。
【００３５】
前記方法はポリペプチドの標的結合部位を決定するか推定し、ポリペプチドによってその調節が変わる遺伝子の調節部位の核酸配列内に標的結合部位が存在するかを確認することをさらに含み得る。この方法は直接的な標的と間接的な標的を区別するのに使用できる。
【００３６】
他の実施形態によれば、本発明は次の段階を含む方法を特徴とする：各々第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする複数の核酸を提供する段階（この際、複数の各核酸によってコーディングされるポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインは哺乳類タンパク質のジンクフィンガードメインと同一であり、第１のジンクフィンガードメインは複数の核酸において多様に現れ、第２のジンクフィンガードメインも複数の核酸において多様に現れる）；導入前に指定された特性（trait）を有する細胞に複数の各核酸を導入して複数の細胞を得る段階；複数の細胞の各々に挿入された核酸を発現させる段階；指定された特性が変わった複数の細胞中の細胞を同定する段階。この方法は本明細書に記述された他の特徴を含み得る。例示的な特性はストレスのような状態に対する向上した敏感性または抵抗性、変形された増殖能力、変更された病原性、および変更された産物生産（例：代謝産物の生産）を含む。
【００３７】
また他の実施形態によれば、本発明は特定の標的部位に結合できるキメラジンクフィンガータンパク質を確認する方法を特徴とする。この方法は次の段階を含む：天然型ヒトジンクフィンガードメインに対する識別子（identifier）を、その識別子によって対照されるジンクフィンガードメインによって認識される３−または４−塩基対の下位部位（subsite）と連結させる各記録を含む資料記録の提供段階；標的部位を２つ以上の３−または４−塩基対の下位部位に分解する段階；各下位部位に対してそれらを認識するジンクフィンガードメインに対する識別子を含む一つのセットの識別子を資料記録から検索する段階；および、各下位部位に対するセットから識別子によって対照される、各下位部位に対するジンクフィンガードメインを含むポリペプチドの考案段階。
【００３８】
資料記録は表５、６および７から選択されたヒトジンクフィンガードメインを同定する記録を含み得る。前記方法はインビトロ（in vitro）でポリペプチドをコーディングする核酸の合成および／またはポリペプチドの合成段階をさらに含み得る。この方法はまた、たとえば、インビトロ結合分析またはレポーター遺伝子発現に対する分析のようなインビボ（in viro）分析を用いて標的部位に対するポリペプチドの結合を評価する段階を含み得る。合成されたポリペプチドは抑制または活性化ドメインをさらに含み得る。
【００３９】
他の実施形態によれば、前記方法は一つ以上の内因性遺伝子の発現を変更させるポリペプチドの能力を評価することをさらに含む。前記評価は、たとえば、核酸マイクロアレイを用いて複数の内因性遺伝子の発現を調査することを含み得る。この方法はまた、たとえば、インビトロ内でポリペプチドを標的範囲を含むＤＮＡと接触させることをさらに含む。
【００４０】
他の実施形態において、この方法は第１および第２のジンクフィンガードメインをコーディングする配列を含む各核酸を含むアドレス（address）が指定された核酸ライブラリーからポリペプチドをコーディングする核酸を検索することをさらに含む。
【００４１】
本発明はまた次の段階を含む方法を特徴とする：ジンクフィンガードメイン識別子を、その識別子によって対照されるジンクフィンガードメインによって認識される一つ以上の３−または４−塩基対下位部位と連結させる各記録を含む資料記録を機械で読み取り可能な媒体に格納する段階；関心のある下位部位に関連する一つ以上の識別子を格納された記録から検索する段階；および（ａ）一つ以上の検索された識別子のうち一つによって対照されるジンクフィンガードメインおよび（ｂ）ジンクフィンガードメインであってもよい第２のＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を製造する段階。
【００４２】
前記製造は検索された識別子によって対照されるジンクフィンガードメインをコーディングする配列を含む各核酸からなる複数の核酸を製造することを含み得る。この方法は、各核酸に対してその核酸を細胞内で発現させ、その核酸発現時の特定の遺伝子の転写水準の変化をその核酸の不在または非発現時のその遺伝子の転写水準に対して評価することをさらに含み得る。前記評価はさらに、たとえば、プロファイリング（profiling）によって複数遺伝子の転写水準を強化することをさらに含み得る。
【００４３】
また他の実施態様によれば、本発明は次の段階を含む、コンピュータを用いた方法を特徴とする：（ａ）表５、６および７に記述された複数の天然型ジンクフィンガードメインの各々と（ｂ）そのドメインによって認識される一つ以上の下位部位との間の連関性を含む情報を格納する段階；標的核酸配列を指定するストリング（string）を含む使用者の質問を受け付ける段階；標的核酸配列内の一つの部位を認識すると予測されるジンクフィンガードメインの組合せを同定するための情報の濾過（filtering）段階。
【００４４】
前記方法はさらに使用者にその組合せを見せるか、核酸またはポリペプチドのアドレス指定されたライブラリーから同定されたジンクフィンガードメイン組合せの一つを含むライブラリー核酸またはポリペプチドを物理的に位置指定することを含み得る。
【００４５】
また他の実施形態によれば、本発明は機械で読み取り可能な媒体に格納されたデータベースを特徴とする。データベースは、（ｉ）（ａ）各々の天然型ジンクフィンガードメイン、（ｂ）核酸部位、および（ｃ）複数の天然型ジンクフィンガードメインを含むキメラポリペプチドを示すデータ；および（ii）（１）個別ジンクフィンガードメインと各々の個別ドメインによって認識される核酸部位、（２）キメラポリペプチドとこれらの各構成ジンクフィンガードメイン、および（３）キメラポリペプチドと各々のキメラポリペプチドによって認識される核酸部位を連関させる結合を含む。前記データベースは使用者が標的核酸配列内の部位を認識すると予測されるジンクフィンガードメインの組合せを同定できるようにできる。
【００４６】
前記データは（ｄ）アレイされたポリペプチドライブラリーのキメラポリペプチドに関連する位置のアドレスを指定できる位置、または（ｅ）前述の発現プロファイルをさらに示すことがある。各発現プロファイルはキメラポリペプチドと連関されることがある。
【００４７】
本発明はまた、複数のポリペプチドを含むライブラリーを特徴とするが、各ポリペプチドは第１および第２のジンクフィンガードメインを含み、各ポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインは異なる天然型ポリペプチドから由来する哺乳類のジンクフィンガードメインと同一であり、第１のジンクフィンガードメインは複数のポリペプチドにおいて多様に現れ、第２のジンクフィンガードメインは複数のポリペプチドにおいて多様に現れる。ライブラリーの各ポリペプチドは固体支持体（例：ビード、マトリックスまたは平面アレイ）に付着されてもよい。
【００４８】
本発明は、試験核酸のプロファイリング方法をさらに提供する。この方法は次の段階を含む：試験核酸を本明細書に記述されたライブラリーのポリペプチドと接触させる段階；および試験核酸に特異的に結合する一つ以上のポリペプチドを同定する段階。ポリペプチドはアドレスを指定できるアレイに固定化されるか、ウイルス粒子に付着されてもよい。
【００４９】
本発明は、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方法を特徴とする。この方法は、本明細書においてしばしば「ドメイン選別法」または「インビボスクリーニング法」と称される。前記方法は（１）レポーター構造物（reporter construct）を含有する細胞および（２）複数のハイブリッド核酸を提供する段階を含む。レポーター構造物は召集部位（recruitment site）および標的部位（target site）を有するプロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を有する。レポーター遺伝子は転写因子がプロモータの召集部位および標的部位をすべて認識する場合（すなわち、基準を超える程度の結合）には所定の水準を超えて発現されるが、転写因子がプロモータの召集部位のみを認識する場合にはそうでない。複数のハイブリッド核酸の各々は、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）召集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（iii）試験ジンクフィンガードメインのような要素を含む非天然的なタンパク質をコーディングする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は複数のハイブリッド核酸間で異なる。前記方法は次の段階をさらに含む：複数の核酸のいずれか以上が一つ以上の細胞に入るようにする条件下で複数の核酸を細胞と接触させる段階；細胞内でハイブリッド核酸の発現を許容する条件下で細胞を維持する段階；および細胞が標的部位を認識する試験ジンクフィンガードメインをコーディングするハイブリッド核酸を含むという表示として、レポーター遺伝子を所定の水準以上に発現する細胞を同定する段階。
【００５０】
ＤＮＡ結合ドメイン、すなわち、召集部位を認識し、複数のハイブリッド構成員の間で変わらないドメインは、たとえば、一つ、２つ、３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。前記方法に用いられる細胞は原核または真核細胞であってもよい。真核細胞の例としては、サッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces cerevisiae）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、または、ピチア・パステウリス（Pichia pasteuris）のような酵母細胞；Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；および繊維芽細胞またはリンパ球のような哺乳類細胞を挙げることができる。
【００５１】
ここで、「所定の水準（given level）」は転写因子が召集部位を認識するが、標的部位は認識しない場合に観察される発現量である。ある場合には「所定の水準」は０であってもよい（少なくとも用いられる分析法の検出限度内で）。
【００５２】
前記方法は、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ混合物、またはｃＤＮＡ混合物のような核酸から試験ジンクフィンガードメインをコーディングする核酸源（source nucleic acid）を増幅させて増幅された断片を生産する付加的な段階を含み得る。核酸源はオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅できる。オリゴヌクレオチドプライマーは保存されたドメイン境界部をコーディングする核酸にアニーリング（annealing）する一つのセットの縮退オリゴヌクレオチド（たとえば、異なる核酸配列を有する特定のオリゴヌクレオチド、またはイノシンのような非天然的塩基を有する特定のオリゴヌクレオチドのプール）のいずれかであってもよい。一方、前記プライマーは特定のオリゴヌクレオチドであってもよい。増幅された断片は前述の方法に用いられた複数のハイブリッド核酸に含まれるハイブリッド核酸を生産するために用いられる。
【００５３】
前記方法は次の段階をさらに含み得る：（ｉ）候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を配列データベースで確認する段階；（ii）候補ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列をコーディングする候補核酸を提供する段階；および（iii）候補核酸を用いて前述の方法に用いられた複数のハイブリッド核酸に含まれるハイブリッド核酸を製造する段階。前記データベースは、公知および／または予測されるタンパク質のような複数のアミノ酸配列に関する記録だけでなく、ｃＤＮＡ、ＥＳＴｓ、ゲノムＤＮＡ、または予測されるイントロンを除去するためにコンピュータ処理されたゲノムＤＮＡのような複数の核酸配列に関する記録も含み得る。
【００５４】
必要な場合には、前記方法は第２の標的部位（たとえば、第１の試験ジンクフィンガードメインによって認識されるものと異なる部位）を認識する第２の試験ジンクフィンガードメインを同定するために繰り返すことができる。後続的に、同定された第１および第２の同定された試験ジンクフィンガードメインをすべてコーディングする核酸を製作できる。コーディングされたハイブリッドタンパク質は第１の試験ジンクフィンガードメインの標的部位および第２のジンクフィンガードメインの標的部位を含む標的部位を特異的に認識できるであろう。
【００５５】
本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインがプロモータ上の標的部位を認識するか否かを決定する方法に関するものである。本明細書においては、この方法をしばしば「部位選別法」と称する。前記方法はレポーター構造物およびハイブリッド核酸を提供する段階を含む。レポーター遺伝子は召集部位および標的部位を含むプロモータに作動可能に連結され、転写因子がプロモータの召集部位および標的部位をすべて認識する場合には所定の水準を超えて発現され、転写因子がプロモータの召集部位のみを認識する場合にはそうでない。ハイブリッド核酸は、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）召集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（iii）試験ジンクフィンガードメイン要素を含む非天然型タンパク質をコーディングする。前記方法は次の段階をさらに含む：レポーター構造物が細胞内に入るようにする条件下で、レポーター構造物を細胞と接触させる段階；前記段階前、段階後、または前記段階と同時に、ハイブリッド核酸が細胞内に入るようにする条件下で、ハイブリッド核酸を細胞と接触させる段階；前記細胞をハイブリッド核酸が細胞内で発現できるようにする条件下で維持する段階；および細胞内レポーター遺伝子の発現を検出する段階。レポーター遺伝子の発現水準が所定の水準よりも高いということは試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識するという指標である。
【００５６】
前記レポーター構造物およびハイブリッド核酸は別途のプラスミドに含まれてもよい。２つのプラスミドは細胞内に同時にまたは連続的に導入できる。一つのプラスミドまたは２つのプラスミドとも選別マーカーを含み得る。また、レポーター構造物とハイブリッド核酸が同じプラスミド内に含まれてもよく、この場合は、２つの核酸を細胞内に導入するためにただ一回の接触段階のみが必要である。また他の実施形態によれば、２つの核酸のいずれか、または両者とも細胞のゲノム内に安全に挿入される。前記方法の場合、本明細書に記述された任意のインビボ方法において、転写活性化ドメインは転写抑制ドメインに代替でき、この場合は、レポーター遺伝子の発現水準が所定水準の未満に減少する細胞を同定するようになる。
【００５７】
本発明のまた他の方法によれば、２つの細胞の融合によって試験ジンクフィンガードメインの結合選好度の迅速な決定が容易になる。この方法は次の段階を含む：レポーター遺伝子を含有する第１細胞を提供する段階；ハイブリッド核酸を含有する第２細胞を提供する段階；第１細胞および第２細胞を融合させて融合細胞を製造する段階；融合細胞内でハイブリッド核酸の発現を可能にする条件下で融合細胞を維持する段階；および融合細胞内レポーター遺伝子の発現を検出する段階（ここで、レポーター遺伝子の発現水準が所定の水準よりも高いということは試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識することを示す指標である）。たとえば、第１細胞および第２細胞は組織培養細胞または菌類細胞である。前記方法の例示的な一実施形態では、Ｓ．セレビジエー（S. cerevisiae）細胞を用いる。第１細胞は第１交配型（たとえば、ＭＡＴａ）を有し、第２細胞は第１交配型と異なる第２交配型（たとえば、ＭＡＴ）を有する。２つの細胞を相互接触させると、酵母交配（yeast mating）によって第１細胞および第２細胞の両方のゲノムを含有する核を有する単一細胞（たとえば、ＭＡＴａ／α）が作られる。本方法は、すべて同一な第１交配型であるが、異なる標的部位を有するレポーター構造物を有する複数の第１細胞を提供する段階を含み得る。すべて同一な第２交配型であるが、各々異なる試験ジンクフィンガードメインを有する複数の第２細胞もまた提供される。すべての可能な双交配（pair-wise mating）のような複数の双交配でマトリックスを作る。このような方法は複数の結合部位（たとえば、可能な標的部位の完全な集合）に対する複数の試験ジンクフィンガードメインの結合選好度を決定するのに用いられる。
【００５８】
本発明はまた、試験ジンクフィンガードメインの結合選好度を分析する方法を提供する。本方法は、（１）すべてハイブリッド核酸を含有する細胞、および（２）複数のレポーター構造物を提供する段階を含む。複数のレポーター構造物の各々は召集部位および標的部位を有するプロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を有する。レポーター遺伝子は転写因子がプロモータの召集部位および標的部位をすべて認識する場合には所定の水準を超えて発現されるが、転写因子がプロモータの召集部位にのみ結合する場合はそうでない。第２の標的部位は複数のレポーター構造物の構成員間で多様に現れる。ハイブリッド核酸は、（ｉ）転写活性化ドメイン、（ii）召集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（iii）試験ジンクフィンガードメインのような要素を有するハイブリッドタンパク質をコーディングする。本方法は次の段階をさらに含む：複数のレポーター構造物の一つ以上が一つ以上の細胞に入るようにする条件下で複数のレポーター構造物を細胞と接触させる段階；細胞内で核酸の発現を許容する条件下で細胞を維持する段階；細胞内にレポーター構造物を含有し、細胞内レポーター構造物がジンクフィンガードメインによって認識される標的部位を有するということを示す指標として、所定の水準以上にレポーター構造物を発現させる細胞を同定する段階。
【００５９】
試験ジンクフィンガードメインが一つ以上の標的部位に対して結合選好度を有するとき、各々異なる標的部位を有する複数の細胞を前記方法によって同定できる。前記方法は最高水準のレポーター遺伝子の発現を示す細胞を同定することをさらに含み得る。別の方法として、レポーター遺伝子発現の臨界水準（たとえば、レポーター遺伝子発現が２，４，８，２０，５０，１００，１０００倍またはそれ以上増加する水準）を決定し、臨界水準を超えるレポーター遺伝子の発現を示すすべての細胞を選択できる。
【００６０】
標的結合部位は、たとえば、２〜６ヌクレオチドの長さであってもよい。複数のレポーター構造物は標的結合部位の２、３、または４またはそれ以上の位置にＡ、Ｔ、ＧおよびＣヌクレオチドのすべての可能な組合せを含み得る。
【００６１】
また他の実施形態によれば、本発明は、複数のジンクフィンガードメインを同定する方法を特徴とする。この方法は第１の試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を行い、第１の試験ジンクフィンガードメインの標的部位とは異なる標的部位を認識する第２の試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を再度行うことを含む。また他の特徴はキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を生成する方法であり、この方法は第１および第２の試験ジンクフィンガードメインを同定するためにドメイン選別法を２回行い、第１および第２の試験ジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を製作することを含む。この核酸は２つの下位部位（subsite）からなる部位を特異的に認識する２つのドメインを含むハイブリッドタンパク質をコーディングできる。前記下位部位は各々第１の試験ジンクフィンガードメインの標的部位および第２の試験ジンクフィンガードメインの標的部位である。追加のジンクフィンガードメインを同定し、たとえば、核酸結合部位を特異的に認識するために、第３、第４、第５、第６またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む、ポリペプチドをコーディングする核酸を製作するために前記方法を繰り返すことができる。
【００６２】
さらに他の実施形態によれば、本発明はジンクフィンガードメインによって認識されるＤＮＡ配列を同定する方法に関する。本方法は、第１の試験ジンクフィンガードメインに対する第１の結合選好度を同定するために部位選別法を行い、および第２の試験ジンクフィンガードメインに対する第２の結合選好度を同定するために部位選別法を再度行うことを含む。同定された第１および第２の試験ジンクフィンガードメインをすべてコーディングする核酸を製作できる。この核酸は第１の試験ジンクフィンガードメインの標的部位および第２の試験ジンクフィンガードメインの標的部位を含む部位を特異的に認識する２つのドメインを含むハイブリッドタンパク質をコーディングできる。追加のジンクフィンガードメインを同定し、たとえば、核酸結合部位を特異的に認識するために、第３、第４、第５、第６またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含む、ポリペプチドをコーディングする核酸を製作するために前記方法を繰り返すことができる。
【００６３】
本発明はまた、ＤＮＡ上の標的部位を認識するペプチドドメインを同定する方法を特徴とする。この方法は、（１）レポーター構造物（reporter construct）を含有する細胞および（２）複数のハイブリッド核酸を提供することを含む。レポーター構造物は召集部位および標的部位を有するプロモータに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を有する。レポーター遺伝子は転写因子がプロモータの召集部位および標的部位をすべて認識する場合（すなわち、基準を超える程度の結合時）には所定の水準未満に発現されるが、転写因子がプロモータの召集部位のみを認識する場合はそうでない。複数のハイブリッド核酸の各々は、（ｉ）転写抑制ドメイン、（ii）召集部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン、および（iii）試験ジンクフィンガードメインのような要素を含む非天然型タンパク質をコーディングする。試験ジンクフィンガードメインのアミノ酸配列は複数のハイブリッド核酸間で相互間に異なる。前記方法は次の段階をさらに含む：複数の核酸のいずれか以上が一つ以上の細胞に入るようにする条件下で、複数の核酸を細胞と接触させる段階；細胞内でハイブリッド核酸の発現を許容する条件下で細胞を維持する段階；および細胞が標的部位を認識する試験ジンクフィンガードメインをコーディングするハイブリッド核酸を含むことを示す指標として、レポーター遺伝子を所定の水準未満に発現させる細胞を同定する段階。本方法のさらに他の実施形態も転写活性化ドメインを用いる類似の方法に関するものと同様である。同様に、本明細書に記述された任意の他の選別法も転写活性化ドメインの代わりに転写抑制ドメインを用いて行うことができる。
【００６４】
また他の実施形態によれば、本発明は特定の精製されたポリペプチドおよび単離された核酸を特記する。本発明の精製されたポリペプチドは下記のアミノ酸配列を一つ以上有するポリペプチドを含み得る：
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Cys-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：６８）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-His-X-Ser-Asn-Xb-X-Lys-His-X3-5-His（配列番号：６９）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Ser-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：７０）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Thr-Xb-X-Val-His-X3-5-His（配列番号：７１）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Val-X-Ser-Xc-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：７２）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-His-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：７３）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Asn-Xb-X-Val-His-X3-5-His（配列番号：７４）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Xc-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：７５）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ala-His-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１５０）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Phe-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１５１）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-His-Xb-X-Thr-His-X3-5-His（配列番号：１５２）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-His-Xb-X-Val-His-X3-5-His（配列番号：１５３）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Asn-Xb-X-Ile-His-X3-5-His（配列番号：１５４）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１５５）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Thr-His-Xb-X-Gln-His-X3-5-His（配列番号：１５６）、
Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Thr-His-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１５７）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Asp-Lys-Xb-X-Ile-His-X3-5-His（配列番号：１５８）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１５９）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Gly-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６１）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Asp-Glu-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６２）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Asp-His-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６３）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Asp-His-Xb-X-Thr-His-X3-5-His（配列番号：１６４）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Asp-Lys-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６５）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Ser-His-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６６）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Arg-X-Thr-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６０）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-His-X-Ser-Ser-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６７）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Ile-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６８）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Lys-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１６９）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-Asn-Xb-X-Lys-His-X3-5-His（配列番号：１７０）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Gln-X-Ser-His-Xb-X-Thr-His-X3-5-His（配列番号：１７１）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Val-X-Ser-Asn-Xb-X-Val-His-X3-5-His（配列番号：１７２）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Asp-X-Ser-Cys-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１９３）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Ile-X-Ser-Asn-Xb-X-Val-His-X3-5-His（配列番号：１９４）、
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Trp-X-Ser-Asn-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１９５）、または
Xa-X-Cys-X2-5-Cys-X3-Xa-X-Asp-X-Ser-Ala-Xb-X-Arg-His-X3-5-His（配列番号：１９６）、
（ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘｂは疎水性残基であり、Ｘｃはセリンまたはトレオニンである。）。本発明の核酸は前記のポリペプチドをコーディングする核酸を含む。一実施態様によれば、前記のアミノ酸配列は天然型（naturally occurring）配列である。
【００６５】
さらに、本発明の精製されたポリペプチドは、配列番号：２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，１０３，１０５，１０７，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９、または１９１と少なくとも５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９３％，９５％，９６％，９８％，９９％，または１００％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。前記ポリペプチドは、ポリペプチドの核酸接触残基に相応するアミノ酸位置において配列番号：２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，１０３，１０５，１０７，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，または１９１と同じであってもよい。または、前記ポリペプチドはポリペプチドの核酸接触残基に相応する残基の一つ以上の残基が配列番号：２３，  ２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，１０３，１０５，１０７，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９，または１９１と異なってもよい。前記ポリペプチドはまた、ＤＮＡ接触残基外の一つ以上の残基が異なってもよい（下記の説明を参照）。たとえば、所定のジンクフィンガードメインにおいてポリペプチドは前述のアミノ酸配列と一つのアミノ酸が異なるか、２つ、３つまたは４つのアミノ酸が異なっていてもよい。この差は本明細書で定義された保存的代替（conservative substitution）のためである。一実施形態において、前述の配列と異なるアミノ酸は二番目のジンク配位システインと−１ＤＮＡ接触部位（後述するＤＮＡ接触部位のナンバリングシステムを参照）の間に位置する。特に、２つの配列の比較および２つの配列間の同一性の百分率の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列の間の同一性の百分率は、ブロッサム６２スコアリングマトリックス（Blossum 62 scoring matrix）を１２ギャップ罰則（gap penalty）、４ギャップ拡張罰則（gap extend penalty）および、５フレームシフトギャップ罰則（frame shift gap penalty）の条件で用いて、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムに含まれているNeedlemanとWunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）アルゴリズムを用いて決定される。
【００６６】
前記精製されたポリペプチドはまた、異種ＤＮＡ結合ドメイン、核位置シグナル、小分子結合ドメイン（例：ステロイド結合ドメイン）、エピトープタグまたは精製道具、触媒ドメイン（例：核酸改質ドメイン、核酸切断ドメイン、またはＤＮＡ復旧触媒ドメイン）および／または転写機能ドメイン（例：活性化ドメイン、抑制ドメインなど）の一つ以上を含み得る。一実施形態において、前記ポリペプチドは第２のドメイン、たとえば、本明細書に記述された配列を有する第２のドメインをさらに含み得る。たとえば、前記ポリペプチドは２つ以上のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガーのアレイを含み得る。各ドメインは配列番号：６８−７５、１５０−１７２と１９３−１９６やそのサブセットから構成されたグループから選択された配列を有してもよい。さらに、各ドメインは配列番号：２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５，６７，１０３，１０５，１０７，１１１，１１３，１１５，１１７，１１９，１２１，１２３，１２５，１２７，１２９，１３１，１３３，１３５，１３７，１４１，１４３，１４５，１４７，１４９，１７３，１７５，１７７，１７９，１８１，１８３，１８５，１８７，１８９および１９１、およびそのサブセットから構成されたグループから選択された配列を有してもよい。
【００６７】
本明細書に記述したように、前記ポリペプチドは細胞内で生産され、各ジンクフィンガードメインが認識する下位部位を含む部位のような標的位置に結合して、細胞内で内因性遺伝子のような遺伝子を調節できる。たとえば、表５、６および７を参照。
【００６８】
本発明はまた、前記ポリペプチドをコーディングする単離された核酸配列、および配列番号：２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２，６４，６６，１０２，１０４，１０６，１１０，１１２，  １１４，１１６，１１８，１２０，１２２，１２４，１２６，１２８，１３０，１３２，１３４，１３６，１４０，１４２，１４４，１４６，１４８，１５０，１７４，１７６，１７８，１８０，１８２，１８４，１８６，１８８，１９０，１９２の配列またはそれらの相補物から構成されたグループから選択された配列を有する一本鎖プローブに非常に厳しい条件下でハイブリッド化する単離核酸配列を含む。本発明は本発明のポリペプチドを異種核酸結合ドメインに融合させて細胞内で発現させる方法をさらに含む。この方法は前記融合タンパク質をコーディングする核酸を細胞内に導入することを含む。本発明の核酸は誘導性プロモータ（例：ステロイドホルモン調節性プロモータ、小分子調節性プロモータ、またはテトラサイクリンＴｅｔ−ＯｎおよびＴｅｔ−Ｏｆｆシステムのような操作された誘導性システム）のような異種核酸配列によって作動可能に調節できる。
【００６９】
「塩基接触位置」、「ＤＮＡ接触位置」、または「核酸接触位置」という用語は、配列番号：２１においてアルギニン７３、アスパラギン酸７５、グルタミン酸７６、およびアルギニン７９の位置に構造的に対応するジンクフィンガードメインの四つのアミノ酸位置を指す。これらの位置はまた、−１，２，３，および６番位置として称されることもある。検索配列内で塩基接触位置に相応する位置を同定するためには、検索配列のシステインおよびヒスチジン残基がＺｉｆ２６８のフィンガー３のシステインおよびヒスチジン残基と整列されるように検索配列を関心ジンクフィンガードメインと整列させる。ヨーロッパ生物情報研究所（European Bioinformatics Institute）のClustalW WWWサービス（http://www2.ebi.ac.uk/clustalw; Thompson et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）は簡便な配列整列方法を提供する。
【００７０】
保存的アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）は類似する側鎖を有する残基の相互交換可能性を指す。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループはセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトパン；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループはリジン、アルギニンおよびヒスチジン；酸性側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギン酸およびグルタミン酸；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸グループはシステインおよびメチオニンである。状況によって、同じグループ内のアミノ酸を相互交換できる。いくつかの追加的な保存的アミノ酸置換グループは次の通りである：バリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラニン−バリン；アスパラギン酸−グルタミン酸；およびアスパラギン−グルタミン。
【００７１】
「異種（heterologous）ポリペプチド」という用語は非−天然型配列を有するポリペプチド（例：ハイブリッドポリペプチド）、または天然型ポリペプチドと同一であるが、自然的には存在しない方式で存在する配列を有するポリペプチドを指す。
【００７２】
「ハイブリッド」という用語は、（ｉ）２つ以上の異なる天然型配列；（ｉｉ）一つ以上の人工配列（すなわち、非−天然型配列）および一つ以上の天然型配列；または（iii）２つ以上の人工配列（同一または相異）のいずれかから由来するアミノ酸配列を含有する非−天然型ポリペプチドを指す。人工配列の例としては、天然型配列の突然変異および新たに設計された配列がある。
【００７３】
本明細書で用いられる「厳しい条件下のハイブリッド化」という用語は、４５℃で６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリッド化し、次いで６５℃で０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで２回洗浄する条件を指す。
【００７４】
「結合選好度（binding preference）」という用語は、ポリペプチドが他の結合部位に比べて一つの核酸結合部位を選択する識別力を指す。たとえば、２つの異なる核酸結合部位に比べてポリペプチドが量的に制限的である場合、本明細書に記述されたインビボまたはインビトロ分析法において他の部位に比べて選好される部位にさらに多量のポリペプチドが結合するであろう。
【００７５】
本明細書で用いられる「縮退オリゴヌクレオチド」とは、（ａ）各々特定のアミノ酸配列をコーディングする異なるオリゴヌクレオチドの集団、および（ｂ）一つ以上の配列にアニーリングできる単一種のオリゴヌクレオチド、たとえば、イノシンのような非天然型ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの両方を意味する。
【００７６】
本発明は数多くの利点を提供する。特定の配列を認識するＤＮＡ結合ドメインを選別する能力はＤＮＡの特定の部位に結合する新規のポリペプチドのデザインを可能にする。したがって、本発明は選択された標的の発現を調節できる（たとえば、病原体が必要とする遺伝子の抑制、癌増殖に必要な遺伝子の抑制、またはよく発現されないか、不安定タンパク質をコーディングする遺伝子の活性化または過多発現など）新規ポリペプチドの生産を容易にする。
【００７７】
ジンクフィンガードメインを用いることは特に有用である。第一に、ジンクフィンガーモチーフは非常に様々なＤＮＡ配列を認識する。第二に、天然型ジンクフィンガータンパク質の構造は単位モジュール性である。たとえば、「Ｅｇｒ−１」とも呼ばれるＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質は３つのジンクフィンガードメインが直列に構成されてなる。図１はＤＮＡと複合体をなす３つのフィンガーから構成されたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質のＸ線結晶構造である（PavletichおよびPabo,(1991) Science 252:809-817）。各フィンガーはＤＮＡ認識部位の３−４塩基対と独立的に接触する。同じポリペプチド鎖中で数個のジンクフィンガー単位モジュールが協同効果を発揮することによって高親和度の結合が達成される。
【００７８】
細胞内で働くＤＮＡ結合ポリペプチドを得ることはしばしば最終の目標である。好都合なことに、インビボ選別法は細胞内の特定のＤＮＡ部位で機能する最前列のＤＮＡ結合ポリペプチドを同定する。細胞、特に真核細胞内における認識に関連する因子はインビトロ選別シナリオ中に存在する因子とは大いに異なる。たとえば、真核細胞の核内で、ポリペプチドは特定の核酸結合部位に対して数多くの他の核タンパク質と競争しなければならない。ヌクレオソーム（nucleosome）またはその他のクロマチンタンパク質が結合部位を占めるか、閉鎖するか、またはこの結合部位に競争的に作用できる。たとえ他のタンパク質と結合されていなくても、細胞内で核酸の構造は曲げ、スーパーコイル化、捩り、および弛緩にさらされるようになる。ポリペプチド自体はその他の因子のうちプロテアーゼおよびシャペロン（chaperone）に晒されている。さらに、ポリペプチドば全ゲノムの結合可能な部位と直面するようになり、これにより、選別過程で選別されるためには目的とする部位に対して高い特異性がなければならない。インビボ選別とは対照的に、インビトロ選別は最高の特異性を有する結合物よりは最高の親和度を有する結合物を選択できる。
【００７９】
発現されるキメラポリペプチドの結合能力を示すためにレポーター遺伝子を用いることは効果的で簡単であるだけでなく、タンパク質−核酸界面のエネルギー学、および周辺の残基および結合界面に影響を与えるヌクレオチドのような数多くの周辺因子を説明する複雑な相互作用コードを開発する必要がないため有利である（Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763）。
【００８０】
本発明は、ヒトゲノム、または任意の他のゲノムに存在するすべてのジンクフィンガードメインに適用される。ジンクフィンガードメインの構造的フォールディングが占める配列空間のこのように多様な選択は大昔からの自然選択の本質的な利点をさらに有し得る。さらに、宿主種から由来するドメインを用いることによって、本明細書に記述された方法に従って遺伝子治療に適用されるように設計されたＤＮＡ結合タンパク質は宿主免疫系によって外部的なものと取扱われる可能性が減少する。
【００８１】
本明細書に記述された方法によって同定されたＤＮＡ結合タンパク質は様々な適用分野に使用できる。たとえば、ＤＮＡ結合タンパク質は培養細胞または宿主生命体内の細胞内で内因性遺伝子の発現を変更できる。ＤＮＡ結合タンパク質は一定の条件（例：ストレス）に対する感受性または抵抗性の増進、増殖能力の変化、病原性の変化および産物生産（例：代謝産物の生産）の変化のような細胞の表現型を変化させるのに使用できる。
【００８２】
本明細書に記述されたすべての特許、特許出願、および参考文献はどのような目的にしろ、その全部が本明細書に含まれる。本発明の一つ以上の実施形態の具体的な内容は添付の図面および下記説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点はこの説明および図面、および前記請求項から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００８４】
本発明は、試験ジンクフィンガードメインの核酸結合選好度を決定するための新規なスクリーニング法に関するものである。本発明では、様々なタンパク質ドメイン、これらのドメインの様々な源泉、および数多くの設計されたライブラリー、レポーター遺伝子、および選別およびスクリーニングシステムが利用できる。このスクリーニング法は高能力作業処理方式で行うことができる。このスクリーニング法から得られた情報は人為的核酸結合タンパク質をデザインする方法に容易に利用でき、前記核酸結合タンパク質は通常ＤＮＡ結合タンパク質であるが、ある場合はＲＮＡ結合タンパク質であり、他のタンパク質と相互作用するタンパク質でもある。前記デザイン方法は試験ジンクフィンガードメインの結合選好度を用いてキメラ核酸結合タンパク質の単位体的組立てを可能にする。デザインされたタンパク質は前記スクリーニング法によってさらに最適化されるか、または変更できる。
【００８５】
ＤＮＡ結合ドメイン
本発明は、異なる結合特異性を有する核酸結合ドメインの集合体を用いる。高い親和性および高い特異性をもって核酸に結合する様々なタンパク質構造が知られている。これらの構造は数多くの異なるタンパク質に反復的に用いられて核酸の機能を特異的に制御する（二本鎖ＤＮＡを認識する構造的モチーフの総説としては、たとえば、文献［Pabo and Sauer (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:1053-95; Patikoglou and Burley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 289-325；およびNelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-9］を参照）。核酸結合ドメインに対するいくつかの非制限的な例は次を含む。
【００８６】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガーは約３０個のアミノ酸残基からなる小さいポリペプチドドメインであって、そのうち、システインまたはヒスチジンである４個のアミノ酸残基が適切に配置されて亜鉛イオンと配位結合ができる（図１参照；総説としては、たとえば、文献［Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-250; Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:99-102；およびRosenfeld and Margalit, (1993) J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 557-570］を参照）。したがって、ジンクフィンガードメインは亜鉛イオンと配位結合する残基の種類によって、たとえば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２類、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ２類、Ｃｙｓ２−ＣｙｓＨｉｓ類などに分類できる。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーにおいて亜鉛と配位結合する残基は典型的に次のように配置されている：
Ｘａ−Ｘ−Ｃ−Ｘ２−５−Ｃ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ５−Ψ−Ｘ２−Ｈ−Ｘ３−５−Ｈ
ここで、Ψ（プサイ）は疎水性残基であり（Wolfe et al., (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212）（配列番号：７６）、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示し、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、サブスクリプトはアミノ酸の個数を示し、ハイフンでつないだ２つのサブスクリプトは介入アミノ酸の典型的な範囲を示す。普通、介入するアミノ酸はフォールディングされてα−へリックスに対して充填される逆平行（anti-parallel）β−シートを形成するが、β−シートが短く、非理想的、または存在しない場合もある。フォールディングによって、亜鉛と配位結合する側鎖が亜鉛イオンと配位結合するのに適合な四面体構造を有するように配置される。塩基接触残基はフィンガーのＮ−末端に位置し、先行するループ領域内にある（図２）。
【００８７】
便宜のために、ジンクフィンガードメインの主なＤＮＡ接触残基は次の例に基づいて−１、２、３および６として番号付けた。
【００８８】
2005500068.tif 000003
前記例に示したように、ＤＮＡ接触残基はシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）およびアルギニン（Ｒ）である。前記モチーフはＣＳＮＲに略記できる。本明細書に使用されたように、そのような略記は一番目のシステインの２つ前の残基（前記のＸａ、配列番号：６８の開始残基）から金属と配合している最後のヒスチジン（配列番号：６８の最後の残基）までの特定のポリペプチド配列の縮小型である。２つの異なる配列が同じモチーフを有する場合、各配列を区別するために数字を使用できる（例：ＣＳＮＲ１、ＣＳＮＲ２）。文脈から明らかに分かる場合、４文字の縮小型は一般的にモチーフを指す。
【００８９】
ジンクフィンガーＤＮＡ−結合タンパク質は通常直列に配置された３つ以上のジンクフィンガードメインから構成できる。
【００９０】
ジンクフィンガードメイン（「ＺＦＤ」）は最もありふれた真核生物ＤＮＡ−結合モチーフ中の一つであって、酵母から高等植物およびヒトに至る様々な種から発見される。ヒトゲノムにも数千個以上、たぶん４，５００個以上のジンクフィンガードメインが存在すると推測される。ジンクフィンガードメインはジンクフィンガータンパク質から同定されるか、それから単離できる。ジンクフィンガータンパク質の非制限的な例としては、ＣＦ２−ＩＩ；クルッペル（Kruppel）；ＷＴ１；バソヌクリン（basonuclin）；ＢＣＬ−６／ＬＡＺ−３、赤血球クルッペル−類似転写因子；転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４；転写抑制剤ＹＹ１；ＥＧＲ１／Ｋｒｏｘ２４；ＥＧＲ２／Ｋｒｏｘ２０；ＥＧＲ３／Ｐｉｌｏｔ；ＥＧＲ４／ＡＴ１３３；Ｅｖｉ−１；ＧＬＩ１；ＧＬＩ２；ＧＬＩ３；ＨＩＶ−ＥＰ１／ＺＮＦ４０；ＨＩＶ−ＥＰ２；ＫＲ１；ＺｆＸ；ＺｆＹ；およびＺＮＦ７などがある。
【００９１】
後述する電算化方法を用いて配列が明らかになったゲノムまたは核酸データベース中にコーディングされたすべてのジンクフィンガードメインを同定できる。そのようなジンクフィンガードメインはどれでも使用できる。また、電算化方法などの人為的ジンクフィンガードメインがデザインされている（例：Dahiyat and Mayo, (1997) Science 278:82-7）。
【００９２】
多くのジンクフィンガードメインはＤＮＡ部位に結合するが、いくつかのジンクフィンガードメインはＲＮＡ部位および他のタンパク質のような他のリガンドに結合できる。ある実施態様によれば、キメラジンクフィンガータンパク質が標的タンパク質または標的ＲＮＡ部位のような非−ＤＮＡリガンドに結合するように作られる。標的ＲＮＡ部位は天然のｎｃＲＮＡのようなｎｃＲＮＡ上の部位である。
【００９３】
ホメオドメイン
ホメオドメインは、ＤＮＡの副溝（minor groove）と接触するＮ−末端アーム、および、次いで主溝（major groove）と接触する３つのα−ヘリックスから構成された簡単な真核生物ドメインである（たとえば、Laughon, (1991) Biochemistry 30: 11357-67参考）。３番目のα−ヘリックスは主溝に位置し、最も重要なＤＮＡ−接触側鎖を含有する。ホメオドメインは三番目のα−ヘリックスに至る転換点（turn）に存在する高度に保存されたモチーフを有する。このモチーフは、ドメインの疎水性コア中に充填される不変のトリプトパンを含む。このモチーフは、プロサイト（Prosite）データベース（Falquet et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:235-238参照）にＰＤＯＣ０００２７（［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｇ］−［Ａ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｒ］−Ｘ（２）−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｃ／Ｎ］−Ｘ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ］−Ｘ  （４）−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｉ／Ｙ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｋ／Ｈ］−Ｗ−［Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｃ］−Ｘ−［Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｈ］−Ｘ（５）−［Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｗ］；配列番号：７７）として公知である。ホメオドメインは細胞同一性を決定し、有機体の発生過程中に位置的な情報を提供する転写因子から普通発見される。そのような古典的なホメオドメインは、ゲノム上にクラスター（cluster）の形で存在するが、クラスターのホメオドメインの順序はボディー軸（body axis）に沿ってそれらの発現パターンにほぼ相応する。ホメオドメインは、たとえば、Ｈｏｘ−１のようなホメオドメインとの整列（alignment）によって、またはホメオドメインプロファイルまたはホメオドメインヒドン・マルコフ・モデル（hidden Markov Model；ＨＭＭ；下記参照）、たとえば、ＰｆａｍデータベースのＰＦ０００４６またはＳＭＡＲＴデータベースの「ＨＯＸ」との整列によって、または前記プロサイトモチーフＰＤＯＣ０００２７によって同定できる。
【００９４】
ヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質
このＤＮＡ結合モチーフは多くの原核生物転写因子から普通発見される。たとえば、ＬａｃＩ族、ＡｒａＣ族など多くの亜族がある。名称における２つのヘリックスは、二番目のα−ヘリックスをＤＮＡの主溝内に配置させ、その主溝に対して充填される一番目のα−ヘリックスおよび前記二番目のα−ヘリックスをいう。これらのドメインはＨＭＭ、たとえば、ＳＭＡＲＴデータベースから得られるＨＴＨ＿ＡＲＡＣ，ＨＴＨ＿ＡＲＳＲ，ＨＴＨ＿ＡＳＮＣ，ＨＴＨ＿ＣＲＰ，ＨＴＨ＿ＤＥＯＲ，ＨＴＨ＿ＤＴＸＲ，ＨＴＨ＿ＧＮＴＲ，ＨＴＨ＿ＩＣＬＲ，ＨＴＨ＿ＬＡＣＩ，ＨＴＨ＿ＬＵＸＲ，ＨＴＨ＿ＭＡＲＲ，ＨＴＨ＿ＭＥＲＲおよびＨＴＨ＿ＸＲＥプロファイルとの整列によって同定できる。
【００９５】
ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質
このＤＮＡ結合ドメインは、たとえば、ＭｙｏＤ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｅ１１およびマイオジェニンのような酵母−およびヘテロ−二量体転写因子の間で共通的に発見される。このドメインは二量体およびその間のループからなり、各単量体は２つのα−ヘリックスに寄与する。このドメインは、たとえば、ＳＭＡＲＴデータベースにおいて利用可能な「ＨＬＨ」プロファイルのようなＨＭＭとの整列によって同定できる。たとえ、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質は典型的に二量体性であるが、ポリペプチドリンカーを２つのサブユニットの間に設計して単一オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）が２つのサブユニットおよびリンカーをコーディングすることによって単量体を構築できる。
【００９６】
ＤＮＡ−結合ドメインの同定
様々な方法を用いて構造ドメインを同定できる。
【００９７】
電算化方法（Computational Method）
本明細書に記述された方法によって単離されたＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を公知の配列のデータベース、たとえば、タンパク質配列を注釈したデータベースまたは核酸結合ドメインに対する記入を含む注釈を付けたデータベースと比較できる。また他の実施形態において、特徴づけられていない配列、たとえば、注釈づけられていないゲノム配列、ＥＳＴまたは全長ｃＤＮＡ配列のデータベース；特徴づけられた配列のデータベース、たとえば、SwissProtまたはＰＤＢ；およびドメインのデータベース、たとえば、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍ（Corpet et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:267-269）、およびＳＭＡＲＴ（Simple Modular Architecture Research Tool, Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244）が核酸結合ドメイン配列の供給源（source）を提供できる。検索アミノ酸配列と比較するために、核酸配列データベースを６個すべてのリーディング・フレーム（reading frame）で翻訳できる。候補核酸結合ドメインをコーディングするものと標識された核酸配列を適合な核酸供給源、たとえば、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡから増幅できる。そのような核酸配列を発現ベクターにクローニングできる。コンピュータに基づくドメイン同定の前記過程をオリゴヌクレオチド合成器およびロボットシステムと提携して高い作業処理能力でドメインをコーディングする核酸を生産できる。候補ドメインをコーディングするクローニングされた核酸を宿主発現ベクターに貯蔵し、制限酵素−媒介サブクローニングまたは部位−特異的組換え酵素−媒介サブクローニング（米国特許第５，８８８，７３２号参照）によってＺｉｆ２６８フィンガー１および２とともに発現ベクター、たとえば、翻訳融合ベクターに容易に導入できる。このような高い作業処理能力を有する方式で異なる候補核酸結合ドメインをコーディングする核酸を含有する複数のマイクロタイタープレートを生成できる。
【００９８】
出発配列またはプロファイルからドメインを同定する詳細な方法は当業界に周知されている。たとえば、プロサイト（［Hofmann et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27:215-219］参照）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ（［Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10］参照）などを参照。簡単なストリング（string）検索を行って検索配列または検索プロファイルに対する同一性を有するアミノ酸配列を見つけることができ、たとえば、Ｐｅｒｌを用いてテキストファイルをスキャンできる。このように同定された配列は初期入力配列に対して約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一性を示す。
【００９９】
検索ドメインと類似するドメインを共用のデータベース、たとえば、文献［Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10］のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて同定できる。たとえば、スコア＝５０、単語長さ＝３のＸＢＬＡＳＴパラメーターを用いてＢＬＡＳＴタンパク質の検索を行うことができる。文献［Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402］に記述されたように、検索配列または検索された配列に間隔（gaps）を導入できる。ＸＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムに対するデフォルト変数はアメリカのメリーランド州ベセスダに所在する国立保健院内の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から求められる。
【０１００】
プロサイトプロファイルＰＳ０００２８およびＰＳ５０１５７を用いてジンクフィンガードメインを同定できる。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴが発表した８０，０００個タンパク質配列のうちには上記の２つのプロファイルは各々３１８９および２３１６個のジンクフィンガードメインと検索される。様々な異なる技法を用いて関連タンパク質の多重配列整列からプロファイルを構築できる。グリブスコフ（Gribskov）ら［Gribskov et al., (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159］は、シンボル比較表を用いて残基頻度分布が提供された多重配列整列を各位置に対する加重値に転換した。たとえば、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースおよび文献［Luethy et al., (1994) Protein Sci. 3:139-1465］を参照。
【０１０１】
目標ＤＮＡ結合ドメインのヒドン・マルコフ・モデル（Hidden Markov Models；ＨＭＭ’ｓ）は、たとえば、Ｐｆａｍデータベース、リリース２．１のようなそのようなモデルのデータベースから生成するか、得られる。追加的なドメインを発見するために、たとえば、前記デフォルト変数を用いてＨＭＭでデータベースを検索できる（例：Bateman et al. (2002) Nucleic Acids Research 30:276-280参照）。または、使用者は前記パラメーターを最適化できる。境界スコア（threshold score）を選択して配列データベースを濾過することによって、境界以上のスコアを有する配列が候補ドメインとして表示されるようにできる。Ｐｆａｍデータベースの説明は文献［Sonhammer et al., (1997) Proteins 28(3):405-420］にあり、ＨＭＭに関する詳細な説明は、たとえば、文献［Gribskov et al., (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al,. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al., (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531;およびStultz et al., (1993) Protein Sci. 2:305-314］にある。
【０１０２】
ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Simple Modular Architecture Research Tool, Schultz et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857；およびSchultz et al., (2000) Nucl. Acids Res 28:231）は、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（Durbin et al., (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press.）のヒドン・マルコフ・モデルでプロファイルすることによって、同定されたジンクフィンガードメインのカタログ（ＺｎＦ＿Ｃ２Ｈ２；ＺｎＦ＿Ｃ２Ｃ２；ＺｎＦ＿Ｃ２ＨＣ；ＺｎＦ＿Ｃ３Ｈ１；ＺｎＦ＿Ｃ４；ＺｎＦ＿ＣＨＣＣ；ＺｎＦ＿ＧＡＴＡ；およびＺｎＦ＿ＮＦＸ）を提供する。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションに基づく方法
様々な形態のＤＮＡ結合ドメインをコーディングする核酸集合体を分析してアミノ末端およびカルボキシ末端の保存された境界部配列をコーディングする配列プロファイルが得られる。そのような保存された境界部配列をコーディングする配列にハイブリダイゼーションできる縮退オリゴヌクレオチドをデザインできる。また、そのような縮退オリゴヌクレオチドの有効性はそれらの組成と公知のゲノム配列上の可能なアニーリング部位の頻度を比較することによって評価できる。複数の反復されたデザインによって縮退オリゴヌクレオチドを最適化できる。たとえば、公知のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを比較することによって天然型配列中の隣接フィンガーの間のリンカー領域の共通配列を明らかにている（文献［Agata et al., (1998) Gene 213:55-64］参照）。そのような縮退オリゴヌクレオチドは複数のＤＮＡ結合ドメインを増幅させるのに用いられる。増幅されたドメインを試験ジンクフィンガードメインとしてハイブリッド核酸中に挿入し、後続的に本明細書に記述された方法に従って標的部位に対する結合を分析する。
【０１０４】
核酸結合ドメインの集合体
この方法は、ＤＮＡ結合ドメインをコーディングする核酸の集合体（たとえば、プラスミド、ファージミドまたはファージライブラリーの形態）を機能的核酸結合特性に対してスクリーニングできるようにする。前記集合体は様々な群のＤＮＡ結合ドメインをコーディングでき、さらに異なるフォールディング構造を有するドメインもコーディングできる。一例として、前記集合体はジンクフィンガードメインのような単一フォールディング構造のドメインをコーディングする。たとえ下記方法はジンクフィンガードメインに関して記述されるが、当業界の熟練家であればこれを他の類型の核酸結合ドメインに応用できるであろう。
【０１０５】
突然変異ドメイン
一例として、前記集合体は、縮退パターン化ライブラリーから組み立てられる構造ドメインをコーディングする核酸から構成される。たとえば、ジンクフィンガーの場合、公知のジンクフィンガーの整列を通じて各位置における最適のアミノ酸を同定できる。別法として、構造的研究および突然変異誘発（mutagenesis）実験を通じて各位置でアミノ酸の好ましい特性を決定できる。任意の核酸結合ドメインも突然変異を導入するための構造的基板として使用できる。特に、核酸結合界面に非常に近接した位置またはそのような位置に隣接した位置が突然変異の誘発のための標的となり得る。パターン化された縮退ライブラリーを用いることによって、突然変異された試験ジンクフィンガードメインの任意の突然変異位置で可能なアミノ酸を一定な種類に限定できる。各位置に前記プロファイルをコーディングするために縮退コドンセットを使用できる。たとえば、疎水性残基のみ、脂肪族残基のみまたは親水性残基のみをコーディングするコドンセットを利用できる。フォールディングされたポリペプチドをコーディングする全長クローンのために前記ライブラリーを選別できる。文献［Cho et al., (2000) J. Mol. Biol. 297(2):309-19］は、縮退オリゴヌクレオチドを用いてそのような縮退ライブラリーを製造する方法を提供し、また、全長ポリペプチドをコーディングするライブラリー核酸を選別する方法を提供する。このような核酸を本明細書に記載された選別法に使用するために、簡便な制限酵素切断部位または転位酵素（transposase）または組換え酵素（recombinase）認識部位を用いて発現プラスミド内に容易に挿入できる。
【０１０６】
適合なコドンおよび所定位置における各ヌクレオチドの相対比率の選択は、遺伝子コードを示す表の簡単な調査、または電算化アルゴリズムによって決定できる。たとえば、前記チョ（Ｃｈｏ）らの文献では、タンパク質配列の目的とするプロファイルを入力し、そのプロファイルの配列をコーディングする好ましいオリゴヌクレオチドデザインを出力する電算プログラムが記載されている。たとえば、このデザインはオリゴヌクレオチド集団に対する縮退位置を含み得る。
【０１０７】
ドメインの天然レパートリーの単離
ドメインのライブラリーをヒトのような真核生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから構築できる。このため、複数の方法を利用できる。たとえば、前述のように、利用可能なアミノ酸配列の電算検索でドメインを同定できる。各ドメインをコーディングする核酸を単離し、たとえば、プロモータ、活性化ドメインおよび選別マーカーを含有するベクターのような、細胞内発現に適したベクター内に挿入できる。他の例において、保存されたモチーフにハイブリダイゼーションする縮退オリゴヌクレオチドを用いて、たとえば、ＰＣＲによってこのモチーフを含有する複数の関連ドメインを増幅させる。たとえば、クルッペル（Kruppel）−類似Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを文献［Agata et al., (1998) Gene 213:55-64］の方法によって増幅できる。この方法はまた、たとえば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（配列番号：７８）のパターンを有する配列である、天然型ジンクフィンガードメインリンカーペプチド配列を保有する。さらに、非選別的ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ配列のライブラリーをスクリーニングすることとは異なり、関心のあるドメインに局限された集合体をスクリーニングすることは、ライブラリーの複雑性が著しく減少し、大規模のライブラリーを完全にスクリーニングするに当たっての内在的な難しさによって目的とする配列を見逃す可能性を減少させる。
【０１０８】
ヒトゲノムは複数のジンクフィンガードメインを含有し、このうち多数は特徴付けられず、同定されなかった。ジンクフィンガードメインを有するタンパク質をコーディングする遺伝子は数千個あると推定される［Pellegrino and Berg, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:671-675］。これらのヒトジンクフィンガードメインは、新規なＤＮＡ−結合タンパク質が構築できる様々なドメインの広範囲な集合体である。各ジンクフィンガードメインがユニークな３−〜４−ｂｐ配列を認識する場合、すべての可能な３−〜４−ｂｐ配列に結合するに必要なドメインの総数はただ６４〜２５６（４３〜４４）個である。ヒトゲノムの天然レパートリーがすべての可能な認識部位を特異的に認識できる十分な数のユニークなジンクフィンガードメインを含有できる。これらのジンクフィンガードメインは人為的キメラＤＮＡ結合タンパク質を構築するための貴重な供給源である。天然型ジンクフィンガードメインは、ヒトゲノムから由来する人為的突然変異とは異なり、自然選択圧力下で進化されたものであり、したがって、特定のＤＮＡ配列への結合および生体内機能のために自然的に最適化されたものである。
【０１０９】
ヒトジンクフィンガードメインを、たとえば、遺伝子治療に応用する場合、人体内に導入するときの免疫副作用を誘導する可能性は却って低い。
【０１１０】
特定のＤＮＡ結合特性を有するジンクフィンガードメインのインビト選別
目的とするＤＮＡ認識特性を有するジンクフィンガードメインを次のようなインビボスクリーニングシステムを用いて同定できる。目標複合結合部位をレポーター遺伝子の上流に挿入し、複合結合部位に転写活性化ドメインを誘引し召集することによって、レポーター遺伝子転写を所定の水準以上に増加させる。固定ＤＮＡ結合ドメインに融合された試験ジンクフィンガードメインおよび転写活性化ドメインから構成されたハイブリッドタンパク質をコーディングする発現プラスミドを構築する。
【０１１１】
複合結合部位は２つ以上の要素、すなわち、召集部位および標的部位からなる。このシステムは、固定ＤＮＡ結合ドメインが召集部位を認識するように設計される。しかし、召集部位に対する固定ＤＮＡ結合ドメインの結合親和度は、インビボで単独ではレポーター遺伝子を転写活性化させるのに十分ではない。これは対照群実験から確認できる。
【０１１２】
たとえば、細胞内で発現された場合、固定ＤＮＡ結合ドメインは（試験ジンクフィンガードメインの不在、または非機能的であると知られているか、または公知のＤＮＡ接触残基がアラニンのような代替アミノ酸で置換された試験ジンクフィンガードメインの存在下では）レポーター遺伝子の転写を軽微な水準以上に活性化させて得ないはずである。他の手段によって（たとえば、レポーターに対する競争的抑制剤の使用によって）システムの敏感度を増加できるので、若干の漏れまたは低水準の活性化は許される。固定ＤＮＡ結合ドメインは召集部位に安定的に結合しないと予想される。たとえば、固定ＤＮＡ結合ドメインは約０．１ｎＭ、１ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭまたはそれ以上の解離定数（Ｋｄ）をもって召集部位に結合できる（また、Ｋｄは１００μＭまたは１０μＭ未満であってもよい。）。標的部位に対するＤＮＡ結合ドメインのＫｄは、試験ジンクフィンガードメインの不在下、または第２の標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインの不在下で、電気泳動移動検定法（electrophoretic mobility shift assay; EMSA）によってインビトロで測定できる。
【０１１３】
したがって、ハイブリッドタンパク質が細胞内複合結合部位に安定的に結合し、これにより、レポーター遺伝子を活性化させるためには、たとえば、複合結合部位の可変部位のような標的部位を認識する機能的試験ジンクフィンガードメインの付着が必要である。標的部位に対する試験ジンクフィンガードメインの結合選好度によってレポーター遺伝子の発現が所定水準に比べて増加する。たとえば、観察された発現水準を所定水準に分けて得られるレポーター遺伝子発現の増加倍数は約２、４、８、２０、５０、１００、１０００倍またはそれ以上であってもよい。試験ジンクフィンガードメインが標的部位を認識する場合、ＤＮＡ結合ドメインおよび試験ジンクフィンガードメインを含む転写因子のＫｄは、たとえば、標的部位に対する特異性を有する試験ジンクフィンガードメインを欠いている転写因子に比べて減少する。たとえば、特異性を有する標的部位と複合体をなす転写因子の解離定数（Ｋｄ）は約５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭまたはそれ未満であってもよい。ＫｄはインビトロＥＭＳＡによって測定できる。
【０１１４】
固定ＤＮＡ結合ドメインの生体内結合親和性を増大させる試験ジンクフィンガードメインの能力を測定することによって、敏感で正確にＤＮＡ結合特異性を分析できるという発見はヒトゲノムから新規ジンクフィンガードメインの迅速な単離および特性化を可能にした。
【０１１５】
固定ＤＮＡ結合ドメインは天然型ＤＮＡ−結合タンパク質、たとえば、複数のドメインを有するか、オリゴマーである天然型ＤＮＡ−結合タンパク質から単離された単位モジュール的ドメインを含む。たとえば、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２のような２つの公知のジンクフィンガーを含むアミノ酸配列を、固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用できる。熟練家であれば数多くの核酸結合ドメイン（例：ホメオドメイン、ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインまたはヘリックス−ループ−ヘリックスドメインのような本明細書に記載されたドメイン族、または当業界で特性がよく知られている核酸結合ドメイン）からシステムに適した固定ＤＮＡ結合ドメインを同定できるであろう。固定ＤＮＡ結合ドメインによって認識される召集部位の適切な選択がまた要求される。召集部位は、その固定ＤＮＡ結合ドメインの源泉天然型ＤＮＡ結合タンパク質の天然的結合部位内の下位部位であってもよい。必要によって、固定ドメインまたは召集部位内に突然変異を導入してシステムの敏感性を増加できる。
【０１１６】
インビボスクリーニングシステムに適した細胞は真核細胞および原核細胞の両方を含む。例示的な真核細胞は、たとえば、サッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces cerevisiae）、スキゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）細胞のような酵母細胞を含む。
【０１１７】
前記スクリーニングシステムを用いてジンクフィンガードメインを選別するために、サッカロマイセス・セレビジエーを用いる酵母１−ハイブリッドシステム（yeast one-hybrid system）を変形させた。まず、ＨＩＳ３レポーター遺伝子をコーディングするレポータープラスミドを製造した。あらかじめ決められた４−ｂｐ標的ＤＮＡ配列を短縮された（truncated）結合配列に連結してＤＮＡ−結合ドメインのための複合結合配列を提供し、各々の複合結合配列を別個のプラスミド上のレポーター遺伝子に作動可能に連結した。
【０１１８】
ハイブリッド核酸配列は短縮されたＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガードメインを含むＤＮＡ結合ドメインに連結された転写活性化ドメインをコーディングする。
【０１１９】
本明細書で用いられる結合部位は隣接した部位が頻繁に使用されるが、必ずしも隣接する必要はない。隣接していない部位を認識するタンパク質を製造するためには核酸結合ドメインの間に伸縮性および／または伸張性リンカーを使用できる。
【０１２０】
本発明の一実施形態によれば、Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２から構成され、フィンガー３を欠いているポリペプチドを固定されたＤＮＡ結合ドメインとして使用できる（Ｚｉｆ２６８の３つのジンクフィンガーのうち、フィンガー１はＮ−末端、フィンガー２は中間、フィンガー３はＣ−末端に位置するジンクフィンガードメインを各々指す）。一方、結合部位の特性が明らかにされた任意の２つのジンクフィンガードメインが固定ＤＮＡ結合ドメインとして使用できる。
【０１２１】
その他の有用な固定ＤＮＡ結合ドメインはＳｐ１、ＣＦ２−ＩＩ、ＹＹ１、クルッペル、ＷＴ１、Ｅｇｒ２のような他のジンクフィンガータンパク質、またはＯｃｔ１、Ｏｃｔ２、およびＰｉｔ１のようなＰＯＵ−ドメインタンパク質から得られる。しかし、これらは列挙したものであり、本発明はこれらによって限定されない。
【０１２２】
本発明の一具体的な実施例によれば、最適のＺｉｆ２６８認識配列（５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ−３’）の５’末端から４−ｂｐを欠損させて生成された５’−ＧＧＧＣＧ−３’塩基配列を召集部位として使用できる。３〜４ｂｐのいずれの標的配列でもこれらの召集部位に連結して複合結合配列を生成できる。
【０１２３】
活性化ドメイン
本発明に用いられる転写活性化ドメインは、酵母のＧａｌ４活性化ドメインおよびヘルペスシンプレックスウイルスのＶＰ１６ドメインを含むが、これに限定されない。バクテリアにおいて、活性化ドメインの機能は、野生型ＲＮＡ重合酵素アルファサブユニットＣ−末端ドメインまたは突然変異アルファサブユニットＣ−末端ドメインを召集できるドメイン、たとえば、タンパク質相互作用ドメインに融合されたＣ−末端ドメインを融合させることによって模倣できる。
【０１２４】
抑制ドメイン
望む場合、活性化ドメインの代わりに、抑制ドメインをＤＮＡ結合ドメインに融合できる。真核細胞抑制ドメインの例としては、オレンジ（ORANGE）、グルーチョ（groucho）、およびＷＲＰＷ［Dawson et al (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31］が含まれる。抑制ドメインを使用する場合、毒性レポーター遺伝子および／または非選択性マーカーを減少発現低下のスクリーニングに使用できる。
【０１２５】
他の機能的ドメイン
タンパク質転移（transduction）ドメインを、たとえば、キメラジンクフィンガータンパク質のもののようなＤＮＡ結合ドメインに融合できる。タンパク質転移ドメインは転移ドメインとそれに付着されたポリペプチドを細胞内に入るようにする。タンパク質転移ドメインの一例はＨＩＶ  ｔａｔタンパク質である。
【０１２６】
レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、たとえば、薬物に対する耐性を与える遺伝子または栄養要求性マーカーのような選択性マーカーであってもよい。薬物耐性遺伝子の例としては、サッカロマイセス・セレビジエー（S.cerevisiae）シクロヘキサミド耐性遺伝子（ＣＹＨ）、サッカロマイセス・セレビジエーカナバニン耐性遺伝子（ＣＡＮ１）、およびハイグロマイシン耐性遺伝子などがある。サッカロマイセス・セレビジエー栄養要求性マーカーとしては、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＡＤＥ２およびＴＲＰ１遺伝子などがある。栄養要求性マーカーがレポーター遺伝子である場合は、栄養要求性遺伝子の機能的コピーが欠けているため、特定の代謝物質を生産できる能力を欠いている細胞が用いられる。代謝物質欠乏培地で細胞を保持することによって標的部位に結合する試験ジンクフィンガードメインをコーディングする構造物の選別が可能である。たとえば、ＨＩＳ３遺伝子は、ｈｉｓ３−酵母菌株とともに選択性マーカーとして使用できる。ハイブリッド転写因子をコーディングする構造物の導入後に、細胞をヒスチジン不在下で成長させる。哺乳類細胞で使用するための選択性マーカーであるチミジンキナーゼ、ネオマイシン耐性、およびＨＰＲＴなどもまた熟練された技術者によく知られている。
【０１２７】
一方、レポーター遺伝子はその存在を容易に検出および／または定量できるタンパク質をコーディングする。そのようなレポーター遺伝子の例としては、ｌａｃＺ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、および、たとえば、変更されたか向上した蛍光特性を有するＧＦＰ誘導体（Clontech Laboratories, Inc., CA）などがある。ＬａｃＺを発現する細胞のコロニーは比色基質Ｘ−ｇａｌを含むプレートでコロニーを成長させることによって容易に検出できる。ＧＦＰ発現は励気後蛍光放出を測定して検出できる。個々のＧＦＰ発現細胞は蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣＳ）を用いて同定および単離できる。
【０１２８】
２種類のレポーター遺伝子、たとえば、選択性レポーター遺伝子および非選択性レポーター遺伝子を用いて前記システムを構築できる。選択性マーカーは、適当な成長条件下で目的とするドメインを有する細胞のみが成長するので、目的とするドメインの迅速な同定を容易にする。非選択性レポーターは、たとえば、偽陽性結果を区別するための確認手段および結合程度を定量化する手段を提供する。前記２つのレポーターは、ゲノムの互いに異なる位置に挿入してもよく、ゲノムに一列に挿入してもよく、同じ染色体外の要素（たとえば、プラスミド）に含まれるか、または互いに異なる染色体外の要素に含まれてもよい。
【０１２９】
図５は、目的とするジンクフィンガードメインを選別するために用いられた変形されたワン−ハイブリッドシステム（one-hybrid）の原理を示す。ハイブリッド転写因子のＤＮＡ結合部位は、（ａ）Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２から構成された短縮されたＤＮＡ結合部位および（ｂ）ジンクフィンガードメインＡまたはＢから構成される。レポーター遺伝子のプロモータ領域に位置する結合部位の塩基配列は４−ｂｐ標的配列（ヌクレオチド１〜４，５’−ＸＸＸＸ−３’）および縮小された結合配列（ヌクレオチド５〜９，５’−ＧＧＧＣＧ−３’）からなる複合結合配列（５’−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３’）である。
【０１３０】
ハイブリッド転写因子内試験ジンクフィンガードメイン（図５のＡ）が標的配列を認識するならば、ハイブリッド転写因子は複合結合配列に安定的に結合できる。このような安定した結合はハイブリッド転写因子の活性化ドメイン（図５のＡＤ）の作用を通じてレポーター遺伝子の発現をもたらす。その結果、ＨＩＳ３がレポーター遺伝子として使用される場合、形質転換された酵母はヒスチジン欠乏培地で成長する。一方、ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用される場合、形質転換された酵母はｌａｃＺタンパク質の基質であるＸ−ｇａｌを含む培地で青色コロニーに成長する。しかし、ハイブリッド転写因子のジンクフィンガードメイン（図５のＢ）が標的配列を認識しない場合、レポーター遺伝子の発現は誘導されない。その結果、形質転換された酵母はヒスチジン欠乏培地で成長できないか（ＨＩＳ３がレポーター遺伝子として使用された場合）、Ｘ−ｇａｌを含む培地で白いコロニーに成長するようになる（ｌａｃＺがレポーター遺伝子として使用される場合）。
【０１３１】
変形されたワン−ハイブリッドシステムを用いる前記選別法はこの過程を通じて選別されたジンクフィンガードメインが細胞内環境で機能的であると立証されたので有益である。したがって、このドメインはフォールディングされて核に進入することができ、細胞内プロテアーゼおよび損傷を与える他の細胞内物質に対して耐えられると推測される。さらに、本明細書に開示された変形されたワン−ハイブリッドシステムは容易で速く目的とするジンクフィンガードメインを単離できるようにする。変形されたワン−ハイブリッドシステムでは、目的とするジンクフィンガードメインを単離するためにただ１回の酵母形質転換のみを必要とする。
【０１３２】
本明細書に記述された選別法は、たとえば、植物または動物種（たとえば、哺乳類、たとえば、ヒト）のゲノムのようなゲノムからジンクフィンガードメインを同定するのに使用できる。また本方法は、たとえば、無作為突然変異法によって製造された突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリーからジンクフィンガードメインを同定するのに使用できる。また、２つの方法は共に使用できる。たとえば、特定の３−ｂｐまたは４−ｂｐ  ＤＮＡ配列に対するジンクフィンガードメインがヒトゲノムから単離できないならば、無作為または部位特異的突然変異誘導によって製造されたジンクフィンガードメインのライブラリーをスクリーニングしてそのようなドメインを見つけることができる。
【０１３３】
酵母における変形されたワン−ハイブリッドシステムが所定の標的配列を認識して結合するジンクフィンガードメインを選別するために好ましい手段ではあるが、この技術分野の熟練された技術者であれば、酵母ワン−ハイブリッド選別法外のシステムが使用できることは周知であろう。たとえば、真核生物体のゲノムから由来する天然型ジンクフィンガードメインのライブラリーをスクリーニングするのにファージディスプレイ選別法を用いることもできる。
【０１３４】
本発明は、様々な種類の培養細胞にワン−ハイブリッド法を用いることを含む。たとえば、標的配列に作動可能に連結されたレポーター遺伝子を培養中の原核細胞または動物または植物細胞内に導入でき、その後、培養細胞をジンクフィンガードメインのライブラリーをコーディングするプラスミド、ファージ、またはウイルスでトランスフェクトできる。次いで、レポーター遺伝子が活性化された単離された細胞から標的配列を認識する目的とするジンクフィンガードメインが得られる。
【０１３５】
下記に示す実施例は前記方法が関心のある結合部位に対するジンクフィンガードメインを同定できることを証明する。フィンガー３に位置する様々なジンクフィンガードメインを有するハイブリッド転写因子のライブラリーを製造した。前記ライブラリーから選別された新規ジンクフィンガードメイン（たとえば、ＨＳＮＫ、ＱＳＴＶおよびＶＳＴＲジンクフィンガー；下記参照）のいずれも、相応する天然の源泉（parent）ジンクフィンガータンパク質ではＣ−末端に位置しなかった。これは、ジンクフィンガードメインが単位モジュール性であることと適切なジンクフィンガードメインを混合および組合せて新規ＤＮＡ結合ドメインを構成できるということを明白に証明する。
【０１３６】
本発明の方法によって選別されたジンクフィンガードメインは適切な再整列および組換えによって新規なＤＮＡ結合タンパク質を作るための組立て単位として使用できる。たとえば、ＨＩＶ−１のコレセプターであるヒトＣＣＲ５のプロモータ領域を認識する新規なＤＮＡ結合タンパク質を次のように製造できる。ヒトＣＣＲ５のプロモータ領域は、５’−ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  Ｔ−３’（配列番号：４）の１０−ｂｐ配列を含む。本明細書に開示された変形されたワン−ハイブリッドシステムを用いて、各々５’−ＡＧＧＧ−３’，５’−ＧＴＧＧ−３’、および５’−ＧＡＧＴ−３’の４−ｂｐ標的配列中の一つを特異的に認識する３つのジンクフィンガードメインを単離できる。これらの標的配列はＣＣＲ５標的配列と重なり合う４−ｂｐ断片である。これらの３個のジンクフィンガードメインを適切なリンカーで連結し、ＶＰ１６ドメインおよびＧＡＬ４ドメインのような調節ドメインまたはＫＲＡＢドメインのような抑制ドメインに付着してＣＣＲ５プロモータに特異的に結合する新規な転写因子を生成できる。同様に、ジンクフィンガーは下記配列を認識するように考案できる：
HIV-1 LTR (-124/-115): 5’-GAC ATC GAG C-3’ (配列番号：１）
HIV-1 LTR (-23/-14): 5’-GCA GCT GCT T-3’ (配列番号：２）
HIV-1 LTR (-95/-86): 5’-GCT GGG GAC T-3’ (配列番号：３)
ヒトCCR5 (-70/-79): 5’-AGG GTG GAG T-3’ (配列番号:４)
ヒトCCR5 (+7/+16): 5’-GCT GAG ACA T-3’ (配列番号:５)
これらのジンクフィンガータンパク質はＨＩＶ−１の増殖を防止するための遺伝子治療に使用できる。
【０１３７】
高処理能スクリーニング
下記方法は、複数の可能なＤＮＡ結合部位、または、さらにすべての可能なＤＮＡ結合部位に対する集合体内の各ドメインの相対的な生体内結合親和度の迅速な測定を可能にする。核酸結合ドメインをコーディングする核酸の大規模集合体を製造する。各核酸結合ドメインはハイブリッド核酸構造物において試験ジンクフィンガードメインとしてコーディングされ、一つの交配型の酵母菌株から発現される。これによって、すべての可能な、または目的とするドメインを発現する第１セットの酵母菌株が製造される。レポーター構造物内に前記ドメインの推定標的部位を含むレポーター構造物を含有する酵母菌株の第２セットを反対の交配型で製造する。各々異なる試験ジンクフィンガードメインおよび異なる標的部位レポーター構造物を有する、融合された細胞のマトリックスを生成するために、本方法は複数のまたはすべての可能な双交配を行うことを要求する。各々の融合された細胞でレポーター遺伝子が発現されたかどうかが分析される。これによって本方法は試験されるドメインの結合選好度を迅速で容易に決定する。
【０１３８】
あるプロファイルと一致する推定ドメイン等に対してゲノムデータベースを検査することによって、ドメインの集合体が同定された。前記集合体は、たとえば、１０〜２０個のドメイン、またはすべての同定された数千個またはそれ以上のドメインを含み得る。データベースから確認されたドメインをコーディングする核酸は新たに合成するか、合成オリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡの試料から増幅できる。前記合成オリゴヌクレオチドをデザインする手動的または自動化された方法は本技術分野において周知のものである。追加的なドメインをコーディングする核酸は同じように合成するか、縮退プライマーを用いて増幅できる。前記集合体のドメインをコーディングする核酸を前述の酵母発現プラスミド内にクローニングすることによって、このドメインとＺｉｆ２６８の最初の２つのフィンガーおよび転写活性化ドメインの融合タンパク質を生成できる。複数のドメインをコーディングする核酸をクローニングするために、増幅およびクローニング段階はマイクロタイタープレートの形式で行うことができる。
【０１３９】
一方、酵母発現ベクター内に前記ドメインをコーディングする複数の増幅された核酸を迅速に挿入するために組換えクローニング法を用いることができる。米国特許第５，８８８，７３２号および「ゲートウエー（Gateway）」マニュアル（Life Technologies-Invitrogen, CA, USA）に記述されている前記方法は、増幅プライマーの末端に部位−特異的組換え酵素（recombinase）のための注文型（customized）部位を含ませることを必要とする。発現ベクターは、ドメインをコーディングする増幅された核酸が挿入される位置に追加的な部位を含む。これらの部位は終結コドンを欠くように考案される。組換え反応に増幅産物、発現ベクター、および部位−特異的組換え酵素を付加することによって、増幅された配列がベクター内に挿入される。挿入が成功した後、毒性遺伝子を置換する等のような追加的な特徴を利用すれば、この方法は高効率的であり、高処理能のクローニングに適するようになる。
【０１４０】
制限酵素媒介性および／または組換えクローニングは各々の確認されたドメインをコーディングする核酸を発現ベクターに挿入するのに用いられる。これらのベクターは、バクテリアで増殖でき、各ウェルが互いに異なる、唯一のＤＮＡ結合ドメイン中の一つをコーディングする核酸を有する一つの細胞を含むように目録されたマイクロタイタープレートに凍結できる。
【０１４１】
各々のドメインに対して単離されたプラスミドＤＮＡを得、酵母細胞、たとえば、サッカロマイセス・セレビジエーＭＡＴａ細胞を形質転換させる。発現ベクターは選別マーカーを含むので、形質転換された細胞はマーカーを選別できる栄養条件の最小培地で成長する。そのような細胞を後で使用するために、マイクロタイタープレート等に凍結貯蔵できる。
【０１４２】
第２セットの酵母菌株を、サッカロマイセス・セレビジエーＭＡＴ細胞等で構築する。この酵母菌株セットは様々な異なるレポーターベクターを含む。その後、唯一のＤＮＡ結合ドメインを有する発現ベクターを含有する各酵母菌株を前記レポーター遺伝子セットの各酵母菌株と交配させる。これらの２つの菌株は反対の交配型であり、異なる栄養要求性を有するように操作されたので、二倍体を容易に選別できる。前記二倍体はレポーターおよび発現ベクターの両方を有する。この細胞はまた、レポーターおよび発現プラスミドの両方を選別できる栄養条件下で保持される。ユエツら（Uetz et al. 2000, Nature 403:623-7）は、このような酵母交配のマトリックスを生成することによって、すべての酵母タンパク質の完璧な２−ハイブリッド地図を記述している。
【０１４３】
レポーター遺伝子発現はマイクロタイタープレート等の大容量の形式を用いて検出できる。たとえば、ＧＦＰをレポーターとして使用する場合、交配された細胞のマトリックスを含むプレート蛍光に対してスキャンできる。
【０１４４】
新規なＤＮＡ結合タンパク質の考案
適切なジンクフィンガードメインを混合および配合して標的９−ｂｐまたはより長いＤＮＡ配列を認識する新たなＤＮＡ結合タンパク質を合理的に製造できる。ジンクフィンガードメインの単位モジュール的構造は新たなＤＮＡ結合タンパク質を製造するための再整列を容易にする。図１Ａに示すように、天然型Ｚｉｆ２６８タンパク質に存在するジンクフィンガードメインはＤＮＡ二重螺旋に沿って一列に位置する。各ドメインは異なる３−４ｂｐ  ＤＮＡ断片を独立的に認識する。
【０１４５】
ジンクフィンガードメインのデータベース
前述のワン−ハイブリッド選別システムは、可能な３または４−塩基対結合部位の各々に対して、または代表的な数の前記結合部位に対して、一つ以上のジンクフィンガードメインを同定するのに使用できる。この過程の結果は、ジンクフィンガードメインとそれが選好する３または４−塩基対結合部位間の一連の連関性として蓄積される。そのような連関性の例を表３〜６に示す。
【０１４６】
その結果は、相関的なデータベース、スプレッドシート、またはテキストファイルなどのようなデータベースとして機械に格納できる。そのようなデータベースの各記録は、ジンクフィンガードメインの表示をそのドメインの一つ以上の選好結合部位の配列を表示するストリング（string）と連関させる。データベースの記録は各部位に結合するジンクフィンガードメインの相対的な親和性の表示を含み得る。ある実施形態において、データベースの記録は特定のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸の実際位置を示す情報を含み得る。そのような実際位置は、たとえば、冷凍庫に貯蔵されたマイクロプレートの特定のウェル（well）であってもよい。
【０１４７】
データベースは、ＳＱＬ作動環境、（ＰＥＲＬまたはMicrosoft Excel macroのような）スクリプティング言語、またはプログラミング言語を用いて質問するか、フィルターできるように配置できる。そのようなデータベースは、使用者が特定の３または４−塩基対結合部位を認識する一つ以上のジンクフィンガードメインを同定できるようにする。データベース、およびデータベースサーバーに格納可能な他の情報は、ある装置によって翻訳できる命令または他のシグナルを用いて各装置と意思疎通されるように配置できる。このシステムのコンピュータに基づく態様では、デジタル電子回路、或いは、コンピュータハードウエア、ファームウエア、ソフトウエア、またはこれらの組合せで行われる。本発明のデータベースサーバーなどの装置は、プログラム可能なプロセッサーによって実行するための機械読み取り可能な貯蔵装置に具体化されたコンピュータプログラム産物によって実現させることができ；方法動作は、入力データに作動して出力することによって、本発明の機能を果たすための指示プログラムを実行するプログラム可能なプロセッサーによって行い得る。実行環境の非制限的例の一つはウィンドウＸＰまたはウィンドウＮＴ４．０（Microsoft）またはそれ以上、またはソラリス（Solaris）２．６またはそれ以上（Sun Microsystems）のオペレーティングシステムによって作動されるコンピュータを含む。
【０１４８】
また、前記ジンクフィンガードメインの特異性を立証するために、これらを複数の異なる融合タンパク質内に融合された状況で試験できる。さらに、少量のドメインが利用可能な特定の結合部位は追加的な選別スクリーニングの標的となり得る。そのような選別のためのライブラリーは、類似するが明らかに区別できる部位に結合するジンクフィンガードメインを突然変異させることによって製造できる。利用可能なドメインを最大限活用するために標的結合部位に対してドメインをずらすようにできるので、各々の可能な結合部位に対するジンクフィンガードメインの完全なマトリックスは必須でない。このようなずれは、最も有用な３または４塩基対の結合部位において結合部位を分解し、また、ジンクフィンガードメインの間のリンカーの長さを変化させることによって達成できる。デザインされたポリペプチドが選択性および高い親和度をすべて有するようにするためには、目的とする部位に対して高い特異性を有するジンクフィンガードメインの両側に、さらに高い親和度を有するが特異性に劣る他のドメインを連結できる。本明細書に記述されたインビボスクリーニング法は人為的に組み立てられたジンクフィンガータンパク質およびこれらの誘導体の生体内機能、親和度、および特異性を試験するのに利用できる。同じように、本方法は、多様化されたリンカー組成、ジンクフィンガードメイン単位モジュール、ジンクフィンガードメイン組成などのライブラリーを製造することによって、そのような組み立てられたタンパク質を最適化するに使用できる。
【０１４９】
標的部位の分解
標的９−ｂｐまたはより長いＤＮＡ配列は３−または４−ｂｐ断片に分解される。各々の分解された３−または４−ｂｐ断片を認識するジンクフィンガードメインを（たとえば、  前述のデータベースから）同定する。さらに長い標的配列、たとえば、２０ｂｐ〜５００ｂｐ配列も、内在する９ｂｐ、１２ｂｐ、および１５ｂｐ下位配列を同定できるので、標的配列として適する。特に、データベースに明示されている部位に分解され得る下位配列は最初デザイン標的として用いることができる。
【０１５０】
考案された特定のキメラジンクフィンガータンパク質が細胞内で標的部位を認識する可能性を推定できるようにするために点数制を利用できる。この点数は、前記考案されたタンパク質において各構成フィンガーの選好下位部位に対する親和性、特異性およびその成功度の関数である。
【０１５１】
コンピュータプログラム
前述の機械で読み取り可能なデータベースを用いるため、標的部位を分解するため、そして一つ以上のキメラジンクフィンガータンパク質の考案を出力するためにコンピュータシステムとソフトウエアが使用できる。
【０１５２】
前記技術は、移動または固定コンピュータのようなプログラム可能な機械と、プロセッサー、そのプロセッサーによって読み取れる貯蔵媒体および一つ以上の出力装置を含む同様な装置上で実行されるプログラムで実現できる。各プログラムは、機械システムと意思疎通するために高度の過程または目的志向的プログラミング言語によって実行できる。コンピュータ言語のいくつかの非制限的例はＣ、Ｃ＋＋、ジャバ、フォートラン、およびビジュアルベーシック（Visual Basic）である。
【０１５３】
このような各プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ（compact disc read only memory）、ハードディスク、磁気ディスケット、またはそれと類似する媒体または装置などの貯蔵媒体または装置に貯蔵できるが、これらは本明細書に記述された過程を行うためにコンピュータが貯蔵媒体または装置を読み取るとき、機械を配置し、作動させるための一般的または特定の目的のプログラム可能な機械によって読み取ることができる。このシステムは、プログラムとともに配置された、機械で読み取り可能な貯蔵媒体で実行できるが、このように配置された貯蔵媒体が機械を特定的に予定された方式で作動するようにする。
【０１５４】
コンピュータシステムは内部または外部のネットワークに連結できる。たとえば、コンピュータシステムは、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、またはＸＭＬプロトコールを用いて遠く離れた顧客システムから要求を受け取ることができる。このような要求は、公知の標的遺伝子、または標的核酸の配列を代表するストリングに対する識別子（identifier）であってもよい。前者の場合は、コンピュータシステムがジーンバンクのような配列データベースに入って標的遺伝子の調節領域の核酸配列を検索できる。次いで、調節領域の配列または直接受取った標的核酸配列は下位部位に分解され、前述のようにキメラジンクフィンガータンパク質を考案する。
【０１５５】
システムは遠く離れた顧客に結果を通報できる。一方、システムは、考案されたキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を実際に検索するようにロボットを調整することもできる。この実施形態によれば、キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸のライブラリーを製造して冷凍精製ＤＮＡ、または核酸を含む冷凍細菌菌株として貯蔵する。ロボットはライブラリーの特定のアドレスを見つけることによって、コンピュータシステムのシグナルに反応する。次いで、検索された核酸はプロセスされ、包装されて顧客に配達される。一方、検索された核酸を細胞に挿入して分析できる。コンピュータシステムはネットワークを通じて顧客に分析結果を通報できる。
【０１５６】
選択された単位モジュールからのタンパク質の製造
複数のジンクフィンガードメインを含むキメラポリペプチド配列を一旦デザインすると、デザインされたポリペプチド配列をコーディングする核酸配列を合成できる。合成遺伝子を製造する方法はこの技術分野においては周知のものである。前記方法は注文合成されたオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ媒介されたクローニング、およびメガ−プライマーＰＣＲからの遺伝子製造を含む。下記実施例６６は、選択されたジンクフィンガードメインをコーディングする核酸を連続的に連結してキメラポリペプチドをコーディングする核酸を形成する方法を提供する。追加の配列を、考案されたポリペプチド配列をコーディングする核酸に付け加えることができる。追加の配列は調節機能または目的とする機能のアミノ酸配列をコーディングする配列を提供できる。このような追加の配列の例を本明細書に記述する。
【０１５７】
キメラジンクフィンガータンパク質のライブラリー製造
キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする複数の核酸配列を合成して、ライブラリー等を形成できる。様々なキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸のライブラリーは実施例６７に述べるように連続的な連結によって形成できる。各核酸が３つ、４つまたは５つ以上のジンクフィンガードメインを有するタンパク質をコーディングするようにライブラリーを製造できる。いくつかの実施形態では、特別に大規模のライブラリーを製作するために、各ジンクフィンガータンパク質がジンクフィンガードメインのセットのいずれかを無作為に含むように考案できる。ジンクフィンガードメインのセットは、たとえば、６４個の可能な３−塩基対の下位部位のうち３０、４０、５０またはそれ以上をカバーする範囲の特異性を有するドメインを示すように選択できる。このセットは、約１２、１５、２０、２５、３０、４０または５０個以上の異なるジンクフィンガードメインを含み得る。これらのドメインのいくつかまたはすべては天然型タンパク質から分離されたドメインであってもよい。
【０１５８】
一つの例示的なライブラリーは、各フィンガーごとに３個のジンクフィンガーおよび３０個の可能なドメインを有するキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を含む。完全に表示された形態であるとき、このライブラリーは３０３、即ち、２７，０００個の配列を含む。このライブラリーは、３０個の可能なすべてのドメインをコーディングする核酸のプール（pool）が各段階で付加される連続的な連結によって製造できる。最終のライブラリーはプールとして貯蔵できる。
【０１５９】
一方、各構成員を分離し、住所化が可能な位置に貯蔵し（たとえば、配列し）配列を分析する。４０，０００〜５０，０００個の製造されたライブラリー構成員の高効率配列分析（high throughput sequencing）後に、欠損キメラ組合せは個別的に組み立ててライブラリーの範囲を完全なものにするマイクロタイタープレートなどに一旦整列されると、各構成体は追加の分析または特定の応用のために後でさらに回収できる。特に、各個別構成員は、実施例６８に述べるｐ１Ｇレポーター分析法を用いて生体内転写を抑制できるかどうかを決定することによって確認できる。もし確認される場合、そのライブラリー構成員は、核酸マイクロアレイを用いてプロファイルを得て内因性遺伝子を調節する能力を決定できる（後述の「キメラジンクタンパク質の調節能力プロファイリング」参照）。
【０１６０】
約６〜２００個または５０〜２０００個の構成員を有する小さいライブラリーは標的部位に結合する最適のキメラタンパク質を同定するのに使用できる。このライブラリーはキメラポリペプチド産物内で各位置のジンクフィンガーに対して特定のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸の組合せを適宜選択することによって考案できる。たとえば、特定の位置をコーディングする核酸は、認識特異性がその位置に合う異なるジンクフィンガードメインをコーディングするように多様に選択できる。
【０１６１】
このように考案された小さいライブラリーは連続的な連結によって合成するか、予め作成整列した大きいライブラリーの特定構成員を集めることによって製作できる。追加的な多様性を与えるために、後続段階（たとえば、セクシャルＰＣＲおよび「ＤＮＡシャッフリング（登録商標）」（Maxygen, Inc., CA））を行い得る。
【０１６２】
キメラジンクフィンガータンパク質ライブラリーのスクリーニング
ライブラリーは特別な目的のスクリーニング応用のために考案できるが、その場合、必要な調節および機能配列が含まれるように親ベクターを操作できる。一つの具体的な例において、キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸が部位−特異的組換え部位の間に位置するようにライブラリーを考案できる。そうすれば、米国特許第５，８８８，７３２号および「ゲートウエー(Gateway)」マニュアル(Life Technologies-Invitrogen, CA, USA)等に記述されているような組換えによるクローニングによって、各配列が親ベクターから正確に切り取られて特定の応用目的のベクターに挿入される。したがって、一旦完全なライブラリーが親ベクターに作られると、これを様々なスクリーニングと選択過程に利用できる。
【０１６３】
大きいか小さいライブラリーからのライブラリー構成員が細胞内の標的遺伝子を調節できるかどうかを確認するために、インビボでスクリーニングできる。細胞は培養されるか対象（a subject）内に存在できる。標的遺伝子は、実施例６４に記述されているように、異種レポーター遺伝子に作動可能に連結された目的調節領域を含むレポーター構造物であってもよい。一方、標的遺伝子は内因性遺伝子であってもい。ライブラリー構成員によってコーディングされる一つ以上のタンパク質が正常の染色体環境で内因性遺伝子の調節に及ぼす影響を評価する。スクリーニングはまた、ライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質が、他の遺伝子の転写を変化させるかどうかを評価することを含み得る。核酸整列は、後述する多くの遺伝子の発現をモニタするのに使用できる。
【０１６４】
ライブラリーは、その構成体がコーディングするキメラタンパク質を生化学的に試験するためにディスプレイフォーマットを用いてスクリーニングできる。たとえば、ライブラリーがコーディングするポリペプチドは、米国特許第５，２２３，４０９号および文献［Rebar et al., (1996) Methods Enzymol. 267:129-49.］等に記載されたように、バクテリオファージの表面にディスプレイされてもよい。ライブラリーはまた、ＷＯ００／３２８２３等に記載された方法を用いてライブラリーの各核酸をその核酸がコーディングするポリペプチドに共有結合で連結させてディスプレイしてもよい。ディスプレイされたライブラリーを固体支持体に固定した標的ＤＮＡ部位と接触させ、支持体を洗浄し、結合されているライブラリー構成員を回収することによって特定の結合特性を有する個別ライブラリー構成員を単離できる。この方法は、標的ＲＮＡ部位または標的タンパク質などの他のリガンドに結合するキメラポリペプチドを同定するのにも適用できる。
【０１６５】
一実施形態によれば、各ライブラリー構成員がコーディングするキメラタンパク質は平面アレイの一つのアドレスで生産されて分離される。ポリペプチドアレイを製造する方法は、文献［De Wildt et al., (2000) Nature Biotech. 18:989-994; Lueking et al., (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, H. (2000) Nucleic Acids Res. 28:e3, I-VII; MacBeath and Schreiber, (2000) Science 289, 1760-1763; Haab et al., (2001) Genome Biology 2(2):research0004.1；およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１］等に記述されている。このようなアレイは、特定の標的ＤＮＡ部位に結合するライブラリー構成員を同定するのに利用できる。標的部位を含むＤＮＡを標識（label）してアレイに接触させる。アレイの各アドレスにある標識の量を測定して標的部位に結合するライブラリー構成員を同定する。選択の厳格性を増加させるために、非特異的ＤＮＡまたは競争的ＤＮＡをこの分析に含ませることができる。この方法は、標識された標的ＲＮＡ部位または標識された標的タンパク質等を用いてＤＮＡ外の標的に結合するキメラタンパク質を同定するのにも適用できる。
【０１６６】
ジンクフィンガータンパク質のアレイを複雑な核酸標本のプロファイルを作るのに使用できる。標本を標識してアレイに接触させる。各アドレスに対する結合を定量して標本のプロファイルが得られる。このプロファイルは、標本の特性を確認するために対照プロファイルと比較できる。
【０１６７】
キメラジンクフィンガータンパク質の調節プロファイル
キメラジンクフィンガータンパク質の特性を確認し、このタンパク質が哺乳類細胞のような細胞の内因性遺伝子を調節できるかを決定できる。キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸をまず抑制または活性化ドメインに連結した後、対象細胞内に導入できる。適当な培養およびコーディング核酸の発現誘導後、細胞からｍＲＮＡを抽出し、核酸マイクロアレイを通じて分析する。
【０１６８】
核酸マイクロアレイは、フォトリソグラフィック法（例：米国特許第５，５１０，２７０号参照）、機械的方法（例：米国特許第５，３８４，２６１号に記載された直接流れ［directed flow］法）またはピン基盤（pin based）法（米国特許第５，２８８，５１４号に記載）などの様々な方法によって製作できる。このアレイは、発現された特定の遺伝子に対する核酸を検出するのに適した特別な捕獲プローブ（capture probe）を各アドレスに有するように製作される。
【０１６９】
ｍＲＮＡは、文献［Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, N.Y］等に記述されたように、ＤＮａｓｅを処理し、ゲノムＤＮＡを除去し、オリゴ−ｄＴを結合した固体基質にハイブリダイゼーションすることを含む一般の方法で分離できる。基質を洗浄した後、ｍＲＮＡを溶出させる。分離されたｍＲＮＡを米国特許第４，６８３，２０２号に記載されたように、ｒｔＰＣＲなどによって逆転写させ、任意に増殖させる。増殖または逆転写過程中に標識されたヌクレオチドの挿入によって核酸を認識できる。好ましい標識の例は赤色蛍光染料Ｃｙ５（Amersham）または緑色蛍光染料Ｃｙ３（Amersham）のような蛍光標識を含む。一方、核酸をバイオチンで標識し、ストレプタビジン−ピコエリトリン（Molecular Probes）などの標識されたストレプタビジンとのハイブリダイゼーションで検出できる。
【０１７０】
次いで、標識された核酸をアレイに接触させる。さらに、対照核酸または参考核酸を同じアレイに接触できる。対照核酸または参考核酸を標本核酸の標識とは異なる標識、たとえば、異なる最大放出（emission）波長を有する標識で認識できる。標識された核酸をハイブリダイゼーションの条件でアレイと接触させる。アレイを洗浄した後、アレイの各アドレスで蛍光を検出するために映像化する。
【０１７１】
プロファイルを作って評価する一般的な方法はアレイの各アドレスでハイブリダイゼーションを検出する段階を含む。各アドレスのハイブリダイゼーションの程度は数字で表示してベクター、一次元マトリックス、または一次元アレイで貯蔵する。ベクターｘはアレイの各アドレスに対する値を有する。たとえば、特定のアドレスでハイブリダイゼーションの程度に対する数値はｘａという変数で貯蔵される。この数値は、各地域の背景水準、標本量および他の変異条件に合わせて調節できる。また、対照標本から核酸を準備し、同一または異なるアレイにハイブリダイゼーションできる。ベクターｙはベクターｘと等しく製作する。たとえば、２つのベクターの関数である数学式を用いて標本発現プロファイルを対照プロファイルと比較できる。この比較は、２つのプロファイルの類似性を示す点数などのスカラー（scalar）値として評価できる。アレイによって検出される異なる遺伝子に加重値を与えるために前記ベクターのいずれかまたはすべてはマトリックスによって変換できる。
【０１７２】
発現データはデータベース、たとえば、ＳＱＬデータベース（例：オラクル（Oracle）またはサイベース（Sybase）データベース環境）のような関連データベースに貯蔵できる。データベースは数個の表を有する。たとえば、処理されていない（ｒａｗ）発現データを、各縦列は分析される遺伝子（例：アドレスまたはアレイ）に該当し各横列は標本に該当する一つの表に貯蔵できる。別途の表は、識別子、および使用したアレイのバッチ（batch）数字、日付および他の品質管理情報などの標本情報を貯蔵できる。
【０１７３】
同様に調節される遺伝子は共に調節される遺伝子を同定するために発現データをクラスタリング（clustering）することによって同定できる。このようなクラスターはキメラジンクフィンガータンパク質によって同等に調節される遺伝子セットを表示する。遺伝子は階層的クラスタリング（hierarchical clustering)[例:Sokal and Michener (1958) Univ. Kans. Sci. Bull. 38:1409参照]、ベイジアンクラスタリング（Bayesian clustering）、カッパー平均クラスタリング（k-means clustering）、および自体組織地図（self-organizing maps)［Tamayo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2907参照］を用いてクラスタリングできる。
【０１７４】
標本発現プロファイルの対照発現プロファイル（例：対照細胞）との類似性は、たとえば、標本発現水準のログをプレディクター（predictor）または対照発現値のログと比較し、この比較結果をプロファイル内の例示値のすべての遺伝子に対する重要度によって調整することによって決定できる。
【０１７５】
考案された転写因子の追加的な特徴
ペプチドリンカー
ＤＮＡ結合ドメインは様々なリンカーによって連結できる。リンカーの有用性とデザインはこの技術分野でよく知られている。特に有用なリンカーは核酸によってコーディングされるペプチドリンカーである。したがって、第１のＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、および第２のＤＮＡ結合ドメインをコーディングする合成遺伝子を製造できる。このようなデザインは大規模な合成多数−ドメインＤＮＡ結合タンパク質を製造するために繰り返すことができる。ＰＣＴ  ＷＯ９９／４５１３２およびキムおよびパボ（Kim and Pabo, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7）は、ジンクフィンガードメインを連結するのに適したペプチドリンカーのデザインを記述している。
【０１７６】
無作為コイル、α−螺旋またはβ−ひだ状の３次構造を形成する追加的なペプチドリンカーを使用できる。適した柔軟性のあるリンカーを形成するポリペプチドはこの技術分野でよく知られている（Robinson and Sauer (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34参照）。柔軟性のあるリンカーは典型的にグリシンを含むが、これはグリシンが側鎖を欠いているため唯一の回転自由度を有するアミノ酸であるためである。親水性を増加させるためにセリンまたはトレオニンをリンカーに挿入できる。また、結合親和度を増加させるためにＤＮＡのリン酸骨格と相互作用できるアミノ酸を使用できる。このようなアミノ酸の適切な使用によって親和度の増加と配列特異性の減少との間のバランスを取ることができる。もし、リンカーが厳格な伸張性を要求する場合、文献［Pantoliano et al. (1991) Biochem. 30:10117-10125］に記述された螺旋状リンカーのようなα−螺旋リンカーを使用できる。また、リンカーはコンピュータモデリングによってデザインできる（米国特許第４，９４６，７７８号参照）。分子モデリングのためのソフトウエアは市販のものを使用できる（たとえば、Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA）。このようなリンカーは、タンパク質工学分野で実施される標準的な突然変異誘導技術および適切な生物理学的テスト、および本明細書に記述された機能的分析法を用いて、抗原性を減少させ／減少させるか、安定性を増加させるための目的などに任意に最適化する。
【０１７７】
ジンクフィンガードメインを活用した実施のために、ジンクフィンガー間の天然ペプチドをフィンガーと共に連結するためのリンカーとして使用できる。そのような天然リンカーとして典型的なものはＴｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ−Ｐｈｅ）（配列番号：７８）である（アガタら、前記参照）。
【０１７８】
二量化ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインを連結するまた他の方法は二量化ドメイン、特に異種二量化ドメイン（Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37:965-970参照）を用いることである。この実施形態によれば、ＤＮＡ結合ドメインが別個のポリペプチド鎖で存在する。たとえば、一番目のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインＡ、リンカーおよびドメインＢをコーディングする反面、二番目のポリペプチドはドメインＣ、リンカーおよびドメインＤをコーディングする。当業者は特性が明らかになった多くの二量化ドメインから一つの二量化ドメインを選別できる。同種二量体が好ましくない場合、異種二量体化を選好するドメインを使用できる。特に、適用可能な二量化ドメインはコイル化されたコイルモチーフ、たとえば、二量体平衡または逆平衡コイル化されたコイルである。優先的に異種二量体を形成するコイル化されたコイル配列も入手できる（Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642-8648）。二量化ドメインのまた他の種類として二量化が小分子によってまたは信号伝達経路を通じて誘発されるものがある。たとえば、ＦＫ５０６の二量体形態は２つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを二量化するのに使用できる。このような二量化ドメインは追加的な調節段階を提供するために利用できる。
【０１７９】
機能性分析（Functional Assays）および用途
生化学的分析の他に、核酸結合ドメインまたは本明細書に記述された単位体組立てなどの方法によってデザインされたタンパク質の機能性をインビボで分析できる。たとえば、標的部位、たとえば細胞増殖に必要な遺伝子のプロモータ部位に結合するドメインを選択できる。単位体組立てによって、（１）標的プロモータ部位にわたっての下位部位に各々結合するように選択されたドメインおよび（２）ＤＮＡ抑制ドメイン、たとえば、ＷＲＰＷドメインを含むタンパク質をデザインできる。
【０１８０】
デザインされたタンパク質をコーディングする核酸配列は、カンおよびキムの文献［Kang and Kim, 2000, J. Biol. Chem. 275:8742］等に記載された誘導性発現ベクターなどの発現ベクター内にクローニングされ得る。誘導性発現ベクターは誘導可能なプロモータまたは調節配列を含み得る。誘導可能なプロモータの非制限的例はステロイド−ホルモン反応性プロモータ（例：エクジソン−反応性、エストロゲン−反応性およびグルタコルチコイド−反応性プロモータ）、テトラサイクリン「テト−オン（Tet-On）」および「テト−オフ（Tet-Off）」システム、および金属−反応性プロモータを含む。このような構造物を組織培養細胞または胚芽幹細胞にトランスフェクトすることによって、対象モデルとしての遺伝子移植生物体を生成できる。遺伝子移植動物モデルにおいてタンパク質の発現を誘導し、組織培養細胞の細胞増殖を調査するか、発生学的変化および／または腫瘍の成長を分析することによって、デザインされたタンパク質の効率を決定できる。さらに、標的遺伝子の発現程度は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット等のようなｍＲＮＡを検出する一般的な方法によって分析できる。さらに完璧な測定のためには、デザインされたタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞でｍＲＮＡを精製する。このようなｍＲＮＡの２つのプールを用いて大規模の遺伝子集合物、たとえば、関心対象の状態（たとえば、癌）に関連する遺伝子の集合物または生物体のゲノムで同定された遺伝子の集合物に対するプローブを含有するマイクロアレイを探知する。このような分析は、デザインされたタンパク質の特異性を決定するのに特に有用である。もしタンパク質が高い親和度を有するが、低い特異性をもって結合する場合は、予想される標的遺伝子以外の遺伝子の発現にも影響を与え、色々な面で好ましくない効果をもたらす。このような効果は転写物の全体的な分析によって明らかにされる。
【０１８１】
さらに、考案されたタンパク質は内因性遺伝子を調節するために対象細胞または対象生物体で生産され得る。考案されたタンパク質は前述のように内因性遺伝子の一つの領域に結合して転写活性化または抑制をもたらすように配列される。カンおよびキムの前記文献に記述されたように、考案されたタンパク質をコーディングする核酸の発現は誘導性プロモータに作動可能に連結できる。プロモータに対する誘導体の濃度を変えることによって、内因性遺伝子の発現を濃度依存的に調節できる。
【０１８２】
結合部位選好度の分析
各ドメインの結合部位選好度は、ＥＭＳＡ、ＤＮａｓｅフットプリンティング（footprinting）、表面プラズモン共鳴法、またはカラム結合のような生化学的分析法によって確認できる。結合のための基質としては、標的部位を含む合成オリゴヌクレオチドを使用できる。前記分析は非特定のＤＮＡを競争体として、または特定のＤＮＡ配列を競争体として含み得る。特定の競争体ＤＮＡは一つ、２つ、または３つのヌクレオチド突然変異を有する認識部位を含み得る。したがって、生化学的分析で所定部位に対するドメインの親和度だけでなく、他の部位に対する所定部位の相対的親和度も測定できる。レバーおよびパボ（Rebar and Pabo, 1994, Science 263:671-673）はＥＭＳＡからジンクフィンガードメインに対する見かけ（apparent）Ｋｄ定数を得る方法を記述している。
【０１８３】
（実施例）
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【実施例１】
【０１８４】
ハイブリッド転写因子発現のためのプラスミドの製造
ジンクフィンガー転写因子を発現する発現プラスミドはｐＰＣ８６［Chevray & Nathans (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793］を変形して製造した。ＤＮＡの操作は、文献［Ausubel et al. (1998), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.］に記載された一般の方法に従って行った。ｐＰＣ８６のＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ認識部位の間にＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコーディングするＤＮＡ断片を挿入してｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを作った。このクローニング段階の結果は酵母Ｇａｌ４転写活性化ドメインに３つのＺｉｆ２６８ジンクフィンガーが連結された翻訳融合タンパク質である。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆを酵素宿主内に形質転換させる場合、Ｇａｌ４活性化ドメインとＺｉｆ２６８ジンクフィンガーを含むハイブリッド転写因子が発現される。ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆ内にクローニングされたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコーディングするＤＮＡ配列を図９に示す。
【０１８５】
ジンクフィンガードメインのライブラリーを構築するためのベクターとしてｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆプラスミドを用いた（図８）。ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆは、ｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆのフィンガー３のコーディング領域前に停止コドン（stop codon）およびＰｓｔＩ認識部位を含むオリゴヌクレオチドカセットを挿入して製造した。前記オリゴヌクレオチドカセットは２つの合成オリゴヌクレオチド、すなわち、５’−ＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号：７９）および５’−ＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧ−３’（配列番号：８０）をアニーリングして形成した。停止コドンの挿入は、Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をコーディングするライブラリープラスミドの生成を防止する。
【０１８６】
前記プラスミドは、下記実施例２に記述されているように、ジンクフィンガードメインの製造のためのベクターとして用いられた。
【０１８７】
また、個別ジンクフィンガードメインをコーディングするＤＮＡ配列のギャップ復旧（gap repair）クローニングはハドソンらによって記載された方法（Hudson et al., (1997) Genome Research 7:1169-1173）を若干修正して行った。
【０１８８】
個別ジンクフィンガータンパク質をクローニングするために、２つの重なり合うオリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドはその５’末端に２回目のＰＣＲ（ｒｅＰＣＲ）のための２１−ヌクレオチド長さの共通のしっぽ（tail）および個別ジンクフィンガードメインをコーディングする核酸にアニーリングされた特定の配列を含む前方向および逆方向プライマーの配列は各々５’−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＮ４８−５１−３’（配列番号：１０８）および５’−ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴＮ４２−４５−３’（配列番号：１０９）であり、ここで、Ｎ４８−５１およびＮ４２−４５はジンクフィンガードメインをコーディングする核酸にアニーリングするためにデザインされた配列に該当する。二本鎖ＤＮＡは鋳型核酸を２つのオリゴヌクレオチドの等モル（equimolar）混合物で増幅させることによって製造した。ＰＣＲ条件は、９４℃で３分間の一番目サイクル後、９４℃で１分、５０℃で１分、および７２℃で３０秒の５サイクルから構成された。
【０１８９】
次いで、各ジンクフィンガードメインをコーディングする二本鎖ＤＮＡを２回目のＰＣＲにおいて鋳型として用いた。ｒｅＰＣＲプライマーは、酵母ベクターｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一な第１領域と、前記２１−ヌクレオチド長さの共通のしっぽ配列と同一な第２領域との２つの領域を有する。前方向プライマーの配列は５’−ＴＧＴＣＧＡＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＧＴＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣ−３’（配列番号：１３８）であり、逆方向プライマーの配列は５’−ＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＴＴＡＣＴＴＡＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＧＧＴ−３’（配列番号：１３９）であった。反応混合物は２５ｕｌ中に２．５ｐｍｏｌｅの各プライマー、１．５ｍＭ  Ｍｇ２＋、２単位のＴａｑポリメラーゼおよび０．０１単位のＰｆｕポリメラーゼを含んでいた。反応は、９４℃で３分間行った後、９４℃で１分、６５℃で１分、および７２℃で３０秒または９４℃で３分の２０サイクルを行った後、９４℃で３０秒および７２℃で３０秒の２５サイクルさせて行った。
【０１９０】
ギャップ復旧クローニングは、ｒｅＰＣＲ産物およびＭｓｃＩとＥｃｏＲＩで切断して線形化したｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆベクターの混合物で酵母ＹＷ１細胞を形質転換させることによって行った。酵母ベクターｐＰＣＦＭ−Ｚｉｆと同一な領域が酵母細胞内のベクターとの同種組換えを可能にする。このように形成されたすべての構造物はＤＮＡ配列分析で確認した。
【実施例２】
【０１９１】
個別ジンクフィンガードメインを分析するためのライブラリーの製造
天然型ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーをヒトゲノムからジンクフィンガードメインをクローニングすることによって製造した。ＰＣＲおよび縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、鋳型ヒトゲノムＤＮＡ（Promega Corporation（米国のウィスコンシン州のメディソン）から購入）からジンクフィンガードメインをコーディングするＤＮＡ断片を増幅させた。ヒトジンクフィンガードメインをクローニングするために用いられた縮退ＰＣＲプライマーのＤＮＡ配列は次の通りである。
【０１９２】
５’−ＧＣＧＴＣＣＧＧＡＣＮＣＡＹＡＣＮＧＧＮＳＡＲＡ−３’（配列番号：８１）および
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＮＮＢＲＷＡＮＧＧＹＹＴＹＴＣ−３’（配列番号：８２）
（ここで、ＲはＧおよびＡを示し、ＢはＧ、ＣおよびＴを示し、ＳはＧおよびＣを示し、ＷはＡおよびＴを示し、ＹはＣおよびＴを示し、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴを示す）。
【０１９３】
前記縮退ＰＣＲプライマーは多くの天然型ジンクフィンガータンパク質においてジンクフィンガードメインの間の連結部位（junction）から発見されるアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ／Ｇｌｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ（配列番号：８３）をコーディングする核酸配列にアニーリングする［Agata et al (1998) Gene 213:55-64］。
【０１９４】
ＰＣＲの緩衝液組成は５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （ｐＨ８．３）であった。Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを反応混合物に加え、９４℃で３０秒、４２℃で６０秒、７２℃で３０秒間反応させた。このサイクルを３５回繰り返した後、最後に７２℃で１０分間反応させた。
【０１９５】
前記ＰＣＲ産物を次のようにｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆ内にクローニングした。ＰＣＲ産物を電気泳動させて約１２０ｂｐに該当するＤＮＡ断片を分離した。これをＢｓｐＥＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに連結した。結果として、このプラスミドライブラリーがコーディングするハイブリッド転写因子のＤＮＡ−結合ドメインはＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とヒトゲノムから由来するジンクフィンガードメインからなる。総１０６個の大腸菌形質転換体からプラスミドライブラリーを製造した。前記ライブラリーの製造方法によれば、ジンクフィンガードメイン間には天然型リンカー配列が保持される。
【実施例３】
【０１９６】
個別ジンクフィンガードメインを分析するためのライブラリーの製造
無作為突然変異によって突然変異ジンクフィンガードメインのライブラリーを製造した。Ｚｉｆ２６８のフィンガー３をポリペプチド骨格（framework）として用いた。無作為突然変異は配列番号：２１（Ｚｉｆ２６８のフィンガー３）の７３番位置（アルギニン）、７５番位置（アスパラギン酸）、７６番位置（グルタミン酸）、７７番位置（アルギニン）、７８番位置（リジン）および７９番位置（アルギニン）に各々該当する、α−ヘリックスに沿って−１、２、３、４、５、６番位置に導入した。
【０１９７】
これらのアミノ酸をコーディングする核酸配列位置の各々に無作為化コドン、すなわち、５’−（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ａ／Ｃ／Ｔ）（Ｇ／Ｃ）−３’を導入した。この無作為化コドンは、トリプトパン、チロシン、システインおよびフェニルアラニンの４つのアミノ酸を除く１６個のアミノ酸のいずれか一つをコーディングする。可能な３つの停止コドンもまた除かれた。前記無作為化コドンは下記２つのオリゴヌクレオチドから製造されたオリゴヌクレオチドカセットを用いて導入された：
５’−ＧＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＧＴＣＣＡＧＴＣＧＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号：８４）；および
５’−ＣＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＴＧＳＮＢＳＮＢＡＡＧＳＮＢＳＮＢＳＮＢＳＮＢＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：８５）（ここで、ＢはＧ、ＴおよびＣを示し、ＳはＧおよびＣを示し、ＮはＡ、Ｇ、ＣおよびＴを示す。）
前記２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングした後、３０分間クレノウポリメラーゼ（Klenow polymerase）と反応させてＤＮＡデュプレックスカセットを合成した。これをＡｖａＩとＳａｃＩＩで切断した後、ＳｇｒＡＩおよびＳａｃＩＩで切断したｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに連結した。約１０９個の大腸菌形質転換体からプラスミドを分離した。
【実施例４】
【０１９８】
レポータープラスミドの製造
ＨＩＳ３遺伝子を含むレポータープラスミドをｐＲＳ３１５Ｈｉｓ（Wang & Reed (1993), Nature 364, 121-126）を修正して製造した。また、前記レポータープラスミドは、このプラスミドを有する形質転換体の選別のための目的でＬＥＵ２マーカーをその天然的プロモータの下に含ませた。まず、ｐＲＳ３１５ＨｉｓをＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断して得られた小さい断片と、同プラスミドをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断して得られた大きい断片を結合させることによって、ｐＲＳ３１５Ｈｉｓ内のＳａｌＩ認識配列を除去してｐＲＳ３１５ＨｉｓΔ  Ｓａｌを製造した。その後、オリゴヌクレオチドデュプレックスをｐＲＳ３１５ＨｉｓΔ  ＳａｌのＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ部位の間に挿入してＨＩＳ３遺伝子のプロモータ領域内に新たなＳａｌＩ認識部位を導入した。互いにアニーリングされて前のように挿入されたデュプレックスを形成する２つのオリゴヌクレオチド配列は次の通りである：
５’−ＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＧ−３’（配列番号：８６）；および
５’−ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＴ−３’（配列番号：８７）。
【０１９９】
その結果、生成されたプラスミドをｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳと命名した。
【０２００】
ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳに、目的とする複合配列を挿入して複数のレポータープラスミドを製造した。前記複合配列は複合配列の４コピーを含む直列アレイ（tandem array）として挿入される。前記標的配列はＨＩＶ−１のＬＴＲ領域から発見される下記の１０−ｂｐ  ＤＮＡ配列：
5’-GAC ATC GAG C-3’(配列番号：１)    HIV-1 LTR(-124/-115)
5’-GCA GCT GCT T-3’(配列番号：２)    HIV-1 LTR (-23/-14)
5’-GCT GGG GAC T-3’(配列番号：３)    HIV-1 LTR (-95/-86))
およびヒト遺伝子ＣＣＲ５のプロモータに存在する下記の１０−ｂｐＤＮＡ配列から由来するものである。
【０２０１】
5’-AGG GTG GAG T-3’ (配列番号：４) ヒトCCR5(-70/-79)
5’-GCT GAG ACA T-3’ (配列番号：５) ヒトCCR5(+7/+16))。
これらの各々の１０−ｂｐ  ＤＮＡ配列を４−ｂｐ標的部位成分に分解することによって、この部位の各領域を認識するジンクフィンガードメインを同定できる。モジュール組立て方法を用いてこのようなジンクフィンガードメインをカップリングすることによってインビボで前記部位を認識するＤＮＡ結合タンパク質を製造できる。
【０２０２】
前記の下線部分は４−ｂｐの標的配列の例を示す。これらの各々の４−ｂｐ標的配列をＺｉｆ２６８のフィンガー１および２によって認識される５’−ＧＧＧＣＧ−３’の５−ｂｐ召集配列に連結した。生成された９−ｂｐ配列は複合結合配列を構成した。各々の複合結合配列は５’−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３’の形式を有するが、ここで、ＸＸＸＸは４−ｂｐ標的配列であり、隣接した５’−ＧＧＧＣＧ−３’は召集配列である。
【０２０３】
図７は、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳ内のレポーター遺伝子に作動可能に連結された、挿入された複合結合部位直列アレイのＤＮＡ配列を示す。各々の直列アレイは４コピーの複合結合配列を含む。各々の結合部位に対して、２つのオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングした後、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳのＳａｌＩおよびＸｍａＩ切断部位に連結してレポータープラスミドを製造した。
【実施例５】
【０２０４】
レポータープラスミドの製造
各々の３塩基対の下位部位に対して一対のレポーター（一つはｌａｃＺを有し、もう一つはＨＩＳ３を有する）を含むレポータープラスミド一セットを次の通り製造した。レポータープラスミドは、目的とする標的配列をｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳおよびｐＬａｃＺｉ内に挿入して製造した。各々の３塩基対の標的部位に対して、２つのオリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングし、ｐＲＳ３１５ＨｉｓＭＣＳおよびｐＬａｃＺｉのＳａｌＩおよびＸｍａＩ部位内に挿入してレポータープラスミドを製造した。前記オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は次の通りである：５’−ＣＣＧＧＴ  ＮＮＮＴＧＧＧＣＧ  ＴＡＣ  ＮＮＮＴＧＧＧＣＧ  ＴＣＡ  ＮＮＮＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号：８８）および５’−ＴＣＧＡ  ＣＧＣＣＣＡＮＮＮ  ＴＧＡ  ＣＧＣＣＣＡＮＮＮ  ＧＴＡ  ＣＧＣＣＣＡＮＮＮ  Ａ−３’（配列番号：８９）。総６４対のオリゴヌクレオチドを合成して前記２つのレポータープラスミド内に挿入した。
【実施例６】
【０２０５】
目的とするＤＮＡ−結合特異性を有するジンクフィンガードメインの選択
与えられた標的配列に特異的に結合するジンクフィンガードメインを選択するために、酵母細胞をレポータープラスミドで形質転換させた後、ハイブリッド転写因子をコーディングするハイブリッドプラスミドのライブラリーで形質転換させた。酵母の形質転換およびスクリーニング法は、文献［Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (1998), John Wiley & Sons, Inc.］に記載された方法に従って行った。酵母菌株としては、ｙＷＡＭ２（MATαΔgal4  Δgal80 URA3::GAL1-lacZ lys2801 his3-Δ 200 trp1-Δ63 leu2 ade2-101CYH2）を用いた。
【０２０６】
一例として、まず、レポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５’−ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ−３’（４−ｂｐ標的配列を下線で表示する）を含むレポータープラスミドで酵母細胞を形質転換させた。その後、無作為突然変異法で製造された突然変異ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを前記形質転換された酵母内に導入した。約１０６個程度のコロニーをロイシンおよびトリプトパン欠如培地から得た。レポータープラスミドおよびジンクフィンガードメイン発現プラスミドはマーカー（marker）としてＬＥＵ２遺伝子とＴＲＰ１遺伝子を各々含むので、レポーターおよびジンクフィンガードメイン発現プラスミドをすべて含む細胞を選択するために酵母細胞をロイシンとトリプトパンを共に欠く培地で成長させた。
【０２０７】
一実施形態において、ヒトゲノムから由来するジンクフィンガードメインのライブラリーをレポータープラスミドを含有する細胞内に形質転換させた。このような形質転換は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された異なる５種類の標的配列中の一つを含有する５種類の異なる宿主細胞菌株に対して行われた。ロイシンおよびトリプトパンを欠く培地で、各形質転換に対して約１０５個のコロニーを得た。形質転換体を、ロイシンおよびトリプトパン欠乏合成培地を含有するペトリプレート上で成長させた。培養後、プレートに１０％滅菌グリセロール溶液を加え、コロニーを溶液で掻き落した後、溶液を回収した。細胞はグリセロール溶液中に分株し、凍結保管した。一つの分株液をロイシン、トリプトパンおよびヒスチジン欠乏培地に塗布した。３−アミノトリアゾール（ＡＴ）を各々０、０．０３、０．１および０．３ｍＭの最終濃度で成長培地に添加した。ＡＴはＨｉｓ３の競争的阻害材であって、ＨＩＳ３選択システムの感受性を決定する。ＡＴはＨｉｓ３の基本活性を抑制した。このような基本活性はレポータープラスミドのＨＩＳ３遺伝子の漏れ性（leaky）発現からもたらされる。培地に塗布した約１０７個の酵母細胞のうち、数百個のコロニーがＡＴ欠乏選択培地で成長した。ＡＴの濃度が増加するほどコロニーの数は次第に減少した。０．３ｍＭのＡＴを含む選択培地では数十個のコロニーが成長した。ＡＴ欠乏培地と０．３ｍＭのＡＴを添加した培地で各々いくつかのコロニーを任意に選定した。これらの酵母細胞からプラスミドを分離して大腸菌菌株ＫＣ８（pyrF leuB600 trpC hisB463）を形質転換させた。これからジンクフィンガー転写因子をコーディングするプラスミドを分離し、選択されたジンクフィンガードメインのＤＮＡ塩基配列を決定した。
【０２０８】
各選択されたジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を前記決定されたＤＮＡ配列から演繹した。各ジンクフィンガードメインはそれらの塩基−接触位置、すなわち、アルファ−ヘリックスに沿って−１、２、３および６番目位置の４つのアミノ酸残基をとって命名した。その結果を表１に示す。同定されたジンクフィンガードメインは塩基−接触位置から発見される４個のアミノ酸によって命名される。塩基配列を分析した結果、ある場合は同じジンクフィンガードメインが反復的に得られたことが分かった。表１において、括弧中の数字は同じジンクフィンガードメインが反復されて得られた回数を示す。たとえば、４個の塩基接触位置にＣＳＮＲを有する２つのジンクフィンガーがＧＡＧＣ核酸部位に結合すると同定された（カラム３の「ＧＡＧＣ／ヒトゲノム」参照）。
【表１】
2005500068.tif 000004
【０２０９】
選択されたヒトジンクフィンガードメインをコーディングする全長ＤＮＡ配列と、これを翻訳して得られたアミノ酸配列を図１１に示す。ヒトゲノムにおいて、ジンクフィンガードメインをコーディングするＤＮＡ断片を増幅させるために使用した縮退ＰＣＲプライマーに相補的なＤＮＡ配列に下線を引いた。この配列は、増殖過程中に導入された対立遺伝子（allele）の差または変異によって、報告されたヒトゲノム配列の本来の塩基配列と異なり得る。
【０２１０】
本発明に係るスクリーニングによって同定された大部分のヒトジンクフィンガードメインは新規ポリペプチドであるか、名前が明らかになっていないＯＲＦ（open reading frame）に該当した。たとえば、ＨＳＮＫ（ジーンバンク登録番号ＡＦ１５５１００に報告された配列内に存在）およびＶＳＴＲ（ジーンバンク登録番号ＡＦ０２５７７２に報告された配列内に存在）と命名されたジンクフィンガードメインはその機能がまだ知られていないタンパク質内に存在する。本明細書に記載された結果は、これらのジンクフィンガードメインが配列−特異的ＤＮＡ結合ドメインとして機能できることを示すだけでなく、キメラタンパク質状態におけるこれらの好ましい結合部位選好度に関する記録を提供する。
【０２１１】
また、本発明は、ヒトゲノムから得られた前記ジンクフィンガードメインが新規のＤＮＡ−結合タンパク質を製造するためのモジュール性構成ブロックとして使用できることを示す。本発明のヒトジンクフィンガードメインはこれをＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２のＣ−末端に連結したときの生体内機能性の結果として得られた。したがって、同定されたジンクフィンガードメインは人為的な環境で特定の配列を認識でき、合成転写因子をデザインするためのモジュール性構成ブロックとして適する。
【実施例７】
【０２１２】
双交配（pairwise mating）
各々の３塩基対の標的部位に結合するジンクフィンガードメインの同定を容易にするために、酵母細胞を反復的に形質転換させる必要性をなくし、一回の形質転換で６４個のレポーター構造物の各々に結合する陽性形質転換体を探すために酵母の交配を用いた。ＹＷ１（ＭＡＴα交配型）およびＹＰＨ４９９（ＭＡＴａ交配型）の２種類の酵母菌株を用いた。ＹＷ１はｙＷＡＭ２のｕｒａ３−誘導体を生成するために５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるクローンを選択することによってｙＷＡＭ２から得られるものである。
【０２１３】
ジンクフィンガードメインのプラスミドライブラリーを酵母形質転換によってＹＷ１細胞内に導入した。１０％グリセロール溶液でプレートを掻き落して約１０６個の独立的に形質転換されたコロニーから細胞を回収した。この溶液を小さい分画に分けて冷凍した。また、６４個のレポータープラスミド（ｐＬａｃＺｉまたはｐＲＳ３１５Ｈｉｓから由来）の各対を酵母菌株ＹＰＨ４９９にコトランスフェクトした。２つのレポータープラスミドを含有する形質転換体を回収して冷凍した。
【０２１４】
解凍後、これらの酵母細胞を最小培地で中間−ログ期（mid-log phase）まで成長させた。次いで、この２つの細胞類型を混合し、ＹＰＤで５時間交配させた。Ｘ−ｇａｌおよびＡＴ（１ｍＭ）を含有し、トリプトパン、ロイシン、ウラシルおよびヒスチジンを欠く最小培地で２倍体細胞を選択した。数日後、選択用プレートで成長した青色コロニーを単離した。青色コロニーからジンクフィンガードメインをコーディングするプラスミドを単離し、選択されたジンクフィンガードメインのＤＮＡ配列を決定した。
【０２１５】
青色コロニーから単離された核酸をＹＷ１細胞に個別的に再形質転換させた。各々の単離された核酸に対して、再形質転換されたＹＷ１細胞を６４ＬａｃＺレポータープラスミドの各々を含有するＹＰＨ４９９細胞と９６ウェルプレートで交配させ、Ｘ−ｇａｌを含有し、トリプトパンおよびウラシルを欠く最小培地上に塗布した。６４個の標的配列に対するジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合親和度および特異性は青色の強度によって決定した。Ｚｉｆ２６８ジンクフィンガードメインを用いた対照実験結果、ジンクフィンガードメインと結合部位との間の陽性相互作用は濃青色ないし淡青色コロニー（ここで、青色の強度は結合親和度に比例する）を作り、陰性相互作用は白いコロニーを作ることが分かる。
【実施例８】
【０２１６】
同定されたジンクフィンガードメインと相互作用コードの比較
選択されたジンクフィンガードメインの重要な塩基−接触位置のアミノ酸残基をジンクフィンガードメイン−ＤＮＡ相互作用コード（図３）から予測されるアミノ酸残基と比較した。大部分のジンクフィンガードメインは予想されたパターンを示し、重要な位置のアミノ酸残基がそのコードから予想されるものとよく一致した。
【０２１７】
たとえば、無作為突然変異を通じて製造されたライブラリーから選択されたジンクフィンガードメイン内の共通的アミノ酸残基は、−１番位置においてはＲ（アルギニン；１４個のうち７個）またはＫ（リジン；１４個のうち２個）、３番位置においてはＮ（アスパラギン；１４個のうち６個）、および６番位置においてはＲ（１４個のうち９個）であった（表１）。前記ジンクフィンガードメインはＧＡＧＣプラスミドで選択された（レポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５’−ＧＡＧＣＧＧＧＣＧ−３’を有するレポータープラスミドをＧＡＧＣプラスミドという。同様に、レポーター遺伝子に作動可能に連結された複合結合配列５’−ＸＸＸＸＧＧＧＣＧ−３’を有するレポータープラスミドをＸＸＸＸプラスミドという）。重要な塩基接触位置のこれらのアミノ酸残基はそのコードによって予想されるものと正確に一致する。
【０２１８】
また、一般的に２番位置のアミノ酸残基は塩基認識に補助的な役割のみを果たすと知られている（PavletichおよびPabo(1991) Science 252, 809-817）。しかし、ある場合は２番位置がさらに重要であることもある。
【０２１９】
ヒトゲノムから由来するジンクフィンガードメインのアミノ酸残基もそのコードから予想されるものとかなりよく一致した。たとえば、ＧＡＧＣプラスミドを用いて得られたジンクフィンガードメイン内の−１、３および６番位置の共通アミノ酸残基は各々Ｒ、ＮおよびＲであった（表１、カラム３）。このアミノ酸はコードから予想されるものと正確に一致した。
【０２２０】
ＧＣＴＴプラスミドを用いて得られたジンクフィンガードメイン内の−１、３および６番位置のアミノ酸残基は各々Ｖ、ＴおよびＲであった（表１、カラム４）。ＴおよびＲ残基はコードから予想されるものと一致した。ＧＣＴＴ部位の下線で引いた塩基Ｔと相互作用をすると期待される−１番位置のコードから予想されるアミノ酸残基はＬ、ＴおよびＮである。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲジンクフィンガードメインはこの位置にＬ（ロイシン）と類似する疎水性アミノ酸であるＶ（バリン）を含んでいた。
【０２２１】
全体的に、選択されたジンクフィンガードメイン内のアミノ酸残基は３つの重要位置のうち２個以上の位置でコードから予想されるアミノ酸と一致した。表１において、コードから予想される選択されたジンクフィンガードメイン内のアミノ酸残基に下線を引いて表示した。このような結果は、本明細書に記載された生体内選択システムが予想どおりに作動していることを強力に暗示している。しかし、生体内選択および分析システムが細胞内におけるジンクフィンガータンパク質の実際機能を測定するので、理論的な期待値と一致しない有用な機能およびＤＮＡ結合特異性を有するフィンガーを同定することもできる（例：図３に示されている関係）。
【実施例９】
【０２２２】
再形質転換および交差形質転換（cross-transformation）
偽陽性（false positive）結果を排除し、前記ジンクフィンガータンパク質の配列特異性を調査するために、単離されたプラスミドを用いた酵母細胞の再形質転換および交差形質転換を行った。
【０２２３】
まず、レポータープラスミドとジンクフィンガードメインをコーディングするハイブリッド転写因子プラスミドで酵母細胞を共形質転換させた。酵母形質転換体をロイシンおよびトリプトパン欠乏最小培地に接種し、３６時間培養した。成長培地中の細胞約１，０００個をロイシン、トリプトパンおよびヒスチジンを欠く固体培地（図１０において、−ヒスチジンと表記）とロイシンおよびトリプトパンを欠く固体培地（図１０において、＋ヒスチジンと表記）上に直接スポット（spotting）した後、５０時間３０℃で培養した。その結果を図１０に示す。
【０２２４】
ハイブリッド転写因子のジンクフィンガー部分が複合結合配列に結合してハイブリッド転写因子がＨＩＳ３レポーター遺伝子の発現を活性化させるようにすれば、コロニーはヒスチジン欠乏培地で成長できる。転写因子のジンクフィンガー部分がこの複合結合配列に結合しない場合、コロニーはヒスチジン欠乏培地で成長できない。
【０２２５】
図１０に示すように、単離されたジンクフィンガードメインは相応する標的配列に結合でき、Ｚｉｆ２６８のドメインとは明らかに区別される配列特異性を示した。Ｚｉｆ２６８は他の５個のプラスミドに比べてＧＣＧＴプラスミドと最も高い活性を示し、ＧＡＧＴプラスミドとも比較的に高い活性を示した。しかし、その他の結合配列を含むレポーターをもってＺｉｆ２６８タンパク質を発現させる菌株はコロニーを形成しなかった。
【０２２６】
無作為突然変異ライブラリーから単離されたＫＴＮＲジンクフィンガードメインは本来ＧＡＧＣレポータープラスミドで選択されたものである。予想どおりに、ただＧＡＧＣプラスミドとしかコロニーを形成しなかった。ヒトゲノムから由来するライブラリーから得られたジンクフィンガードメインもまた期待どおりの特異性を示した。たとえば、ＧＡＣＴプラスミドで選択されたＨＳＮＫはただＧＡＣＴプラスミドとともに酵母細胞を形質転換させたときのみに細胞成長を示した。ＧＣＴＴプラスミドで選択されたＶＳＴＲはＧＣＴＴプラスミドと最も高い活性を示した。ＧＡＧＴプラスミドで選択されたＲＤＥＲは４塩基−接触位置でＺｉｆ２６８のフィンガー３と同一なアミノ酸残基を有する。予想どおりに、このジンクフィンガードメインは、Ｚｉｆ２６８のフィンガー３と類似する配列特異性を示した。ＧＡＧＣとＧＡＧＴプラスミドで選択されたＳＮＲはヒスチジン欠乏培地でＧＡＧＣプラスミドとは細胞成長を示したが、ＧＡＧＴプラスミドとは細胞成長を示さなかった。ＡＣＡＴプラスミドで得られたＱＳＴＶはこの分析法で試験された如何なるプラスミドとも細胞成長を示さなかった。しかし、このジンクフィンガードメインは下記で立証されたように、インビトロでＡＣＡＴ配列と強く結合できた。
【実施例１０】
【０２２７】
ゲル移動分析（gel shift assay）
修正されたワン−ハイブリッドシステムを用いて選択されたジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を大腸菌内で発現させ、精製してゲル移動分析に用いた。ハイブリッドプラスミドに挿入されているジンクフィンガータンパク質をコーディングするＤＮＡ断片をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで切断して単離し、これをｐＧＥＸ−４Ｔ２（Pharmacia Biotech）のＳａｌＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローニングした。ジンクフィンガータンパク質は大腸菌菌株ＢＬ２１においてＧＳＴ（Glutathione-  S-transferase）に連結された融合タンパク質として発現された。融合タンパク質をグルタチオン親和性クロマトグラフィー（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて精製した後、トロンビンを用いてＧＳＴ部分とジンクフィンガータンパク質の間の連結部位を切断した。精製されたジンクフィンガータンパク質はＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２、およびＣ−末端に連結された、選択されたジンクフィンガードメインを含んでいた。
【０２２８】
下記のプローブはＤＮＡを合成し、アニーリングし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで３２Ｐ標識して、ゲル移動分析に用いた。
【０２２９】
GCGT；5’-CCGGGTCGCGCGTGGGCGGTACCG-3’(配列番号：９０)
3’-CAGCGCGCACCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：９１)
GAGC；5’-CCGGGTCGCGAGCGGGCGGTACCG-3’(配列番号：９２)
3’-CAGCGCTCGCCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：９３)
GCTT；5’-CCGGGTCGTGCTTGGGCGGTACCG-3’(配列番号：９４)
3’-CAGCACGAACCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：９５)
GACT；5’-CCGGGTCGGGACTGGGCGGTACCG-3’(配列番号：９６)
3’-CAGCCCTGACCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：９７)
GAGT；5’-CCGGGTCGGGAGTGGGCGGTACCG-3’(配列番号：９８)
3’-CAGCCCTCACCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：９９)
ACAT；5’-CCGGGTCGGACATGGGCGGTACCG-3’(配列番号：１００)
3’-CAGCCTGTACCCGCCATGGCAGCT-5’(配列番号：１０１)
様々な量のジンクフィンガータンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．７）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０Ｍ  ＺｎＳＯ４、１０％グリセロール、０．１％ノニデットＰ−４０、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）中で標識されたプローブＤＮＡとともに室温で１時間反応させた後、この反応混合物をゲル電気泳動させた。放射能活性をホスホイメージャー分析機（PhosphorImager（登録商標）TM analysis, Molecular Dynamics）を用いて定量した後、文献［Rebar and Pabo (1994) Science 263:671-673］に記載された方法に従って解離定数（Ｋｄ）を計算した。その結果を表２に示す。２回以上の別途の実験ですべての定数を決定し、平均および標準偏差を表示した。表２にはまた、ヒスチジン欠乏最小培地における酵素形質転換体の細胞成長（図１０）を示す。
【表２】
2005500068.tif 000005
【０２３０】
ヒスチジン欠乏培地で細胞の成長を可能にするジンクフィンガータンパク質は該当するプローブＤＮＡと強く結合した。たとえば、対照群として用いられたＺｉｆ２６８タンパク質はＧＣＧＴおよびＧＡＧＴレポータープラスミドとともに細胞成長を可能にしたが、相応するプローブＤＮＡを用いてインビトロで測定した解離定数は各々０．０２４ｎＭおよび０．１７ｎＭであった。対照的に、Ｚｉｆ２６８タンパク質は他のプラスミドとは細胞成長をできないようにし、相応するプローブＤＮＡで測定した解離定数は１ｎＭ以上であった。
【０２３１】
新規ジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質も類似する結果を示した。たとえば、ＫＴＮＲタンパク質はＧＡＧＣプローブＤＮＡに対して０．１７ｎＭの解離定数と高い親和度を示す反面、ＧＣＧＴおよびＧＡＣＴプローブＤＮＡに対しては各々５．５ｎＭおよび３０ｎＭの解離定数と低い親和度を示した。このタンパク質はＧＡＧＣプラスミドの場合のみに細胞成長を可能にした。ＨＳＮＫタンパク質はＧＡＣＴプローブＤＮＡとは強く結合するが（Ｋｄ＝０．３２ｎＭ）、ＧＣＧＴまたはＧＡＧＴプローブＤＮＡとは結合せず、予想どおり、このＨＳＮＫタンパク質はただＧＡＣＴプラスミドの場合のみに細胞成長を示した。
【０２３２】
ＡＣＡＴレポータープラスミドで選択されたＱＳＴＶタンパク質は如何なる他のレポータープラスミドとも酵母に形質転換させた場合細胞成長を促進しなかった。ゲル移動分析から、このタンパク質が他のプローブＤＮＡに比べてＡＣＡＴプローブＤＮＡにより強く結合することが証明された。すなわち、ＱＳＴＶはＧＣＴＴまたはＧＣＧＴプローブＤＮＡの場合に比べて、各々１３倍および４．３倍さらに強くＡＣＡＴプローブＤＮＡと結合した。
【０２３３】
一般的に、たとえば、３つのジンクフィンガードメインを有するジンクフィンガータンパク質は１ｎＭ未満の解離定数でＤＮＡ配列に結合して細胞成長を可能にする反面、ジンクフィンガータンパク質が１ｎＭ以上の解離定数でＤＮＡ配列に結合する場合には細胞成長を不可能にした。１ｎＭ以上５ｎＭ未満の解離定数で結合するジンクフィンガータンパク質もまた、たとえば、４個のジンクフィンガードメインを有するキメラジンクフィンガータンパク質である場合に有用である。
【実施例１１】
【０２３４】
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」はヒトゲノム配列からインビボ（in vivo）スクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＫＱＣＧＫＡＦＧＣＰＳＮＬＲＲＨＧＲＴＨ（配列番号：２３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：２２）。
【０２３５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって決定されたように、ＧＡＡ＞ＧＡＣ＞ＧＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」とＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＧＡＣ含有部位に対しては０．１７ｎＭ、ＧＡＧ含有部位に対しては０．４６ｎＭ、そしてＧＣＧ含有部位に対しては２．７ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２３６】
ＴＧ−ＺＦＤ−００１「ＣＳＮＲ１」は、たとえば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１２】
【０２３７】
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＫＥＣＧＫＡＦＮＨＳＳＮＦＮＫＨＨＲＩＨ（配列番号：２５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：２４）。
【０２３８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」３−ｂｐ標的配列ＧＡＣに対する認識特異性を示す。この結合部位選好度はインビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって決定されたように、ＧＡＣ＞ＧＡＧ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＮＳＫ」とＺｉｆ２６８のフィンガー１および２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＧＡＣ含有部位に対しては０．３２ｎＭ、ＧＡＧ含有部位に対しては３．５ｎＭ、そしてＧＣＧ含有部位に対しては４２ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２３９】
ＴＧ−ＺＦＤ−００２「ＨＳＮＫ」は、たとえば、ＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１３】
【０２４０】
ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、ヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＫＥＣＧＫＡＦＳＳＧＳＮＦＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号：２７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：２６）。
【０２４１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって結合されたようにＧＡＧ＞ＧＡＣ＞ＧＣＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」とＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＧＡＧ含有部位に対しては０．４５ｎＭ、ＧＡＣ含有部位に対しては０．６１ｎＭ、そしてＧＣＧ含有部位に対しては３．８ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２４２】
ＴＧ−ＺＦＤ−００３「ＳＳＮＲ」は、たとえば、ＧＡＧまたはＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１４】
【０２４３】
ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＥＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号：２９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号：２８）。
【０２４４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１および２とポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特異性を示す。この結合選好度はインビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって決定されたようにＧＣＧ＞ＧＴＧ、ＧＡＧ＞ＧＡＣである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」とＺｉｆ２６８のフィンガー１および２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＧＣＧ含有部位に対しては０．０２７ｎＭ、ＧＡＧ含有部位に対しては０．１８ｎＭ、そしてＧＡＣ含有部位に対しては２８ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２４５】
ＴＧ−ＺＦＤ−００４「ＲＤＥＲ１」は、たとえば、ＧＣＧ、ＧＴＧまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１５】
【０２４６】
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＮＥＣＧＫＡＦＡＱＮＳＴＬＲＶＨＱＲＩＨ（配列番号：３１）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：３０）。
【０２４７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は３−ｂｐ標的配列ＡＣＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって決定されたようにＡＣＡ＞ＧＣＧ＞ＧＣＴである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」とＺｉｆ２６８のフィンガー１および２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＡＣＡ含有部位に対しては２．３ｎＭ、ＧＣＧ含有部位に対しては９．８ｎＭ、そしてＧＣＴ含有部位に対しては２９ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２４８】
ＴＧ−ＺＦＤ−００５「ＱＳＴＶ」は、たとえば、ＡＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１６】
【０２４９】
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＮＹＣＧＫＴＦＳＶＳＳＴＬＩＲＨＱＲＩＨ（配列番号：３３）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：３２）。
【０２５０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＴに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果とＥＭＳＡによって決定されたようにＧＣＴ＞ＧＣＧ＞ＧＡＧである。ＥＭＳＡにおいて、ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」とＺｉｆ２６８のフィンガー１および２、およびＧＳＴ精製ハンドルの融合は、ＧＣＴ含有部位に対しては０．５３ｎＭ、ＧＣＧ含有部位に対しては０．７６ｎＭ、そしてＧＡＧ含有部位に対しては１．４ｎＭの見かけＫｄを有する。
【０２５１】
ＴＧ−ＺＦＤ−００６「ＶＳＴＲ」は、たとえば、ＧＣＴまたはＧＣＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１７】
【０２５２】
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＱＣＮＩＣＧＫＣＦＳＣＮＳＮＬＨＲＨＱＲＴＨ（配列番号：３５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＧＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：３４）。
【０２５３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＣおよびＧＡＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＡＡ＞ＧＡＣ＞ＧＡＧである。
【０２５４】
ＴＧ−ＺＦＤ−００７「ＣＳＮＲ２」は、たとえば、ＧＡＡ、ＧＡＣまたはＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１８】
【０２５５】
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＳＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号：３７）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：３６）。
【０２５６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡおよびＡＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＡ＞ＧＡＡ＞ＡＧＡである。
【０２５７】
ＴＧ−ＺＦＤ−００８「ＱＳＨＲ１」は、たとえば、ＧＧＡ、ＧＡＡまたはＡＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例１９】
【０２５８】
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＧＱＣＧＫＦＹＳＱＶＳＨＬＴＲＨＱＫＩＨ（配列番号：３９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：３８）。
【０２５９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を示す。
【０２６０】
ＴＧ−ＺＦＤ−００９「ＱＳＨＲ２」は、たとえば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２０】
【０２６１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＡＣＨＬＣＧＫＡＦＴＱＣＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号：４１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：４０）。
【０２６２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡおよびＧＡＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０２６３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１０「ＱＳＨＲ３」は、たとえば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２１】
【０２６４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＡＣＨＬＣＡＫＡＦＩＱＣＳＨＬＲＲＨＥＫＴＨ（配列番号：４３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：４２）。
【０２６５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡおよびＧＡＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＡ＞ＧＡＡである。
【０２６６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１１「ＱＳＨＲ４」は、たとえば、ＧＧＡまたはＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２２】
【０２６７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＶＣＲＥＣＧＲＧＦＲＱＨＳＨＬＶＲＨＫＲＴＨ（配列番号：４５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴ−３’（配列番号：４４）。
【０２６８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＡＧＡ、ＧＡＡおよびＣＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＡ＞ＡＧＡ＞ＧＡＡ＞ＣＧＡである。
【０２６９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１２「ＱＳＨＲ５」は、たとえば、ＧＧＡ、ＡＧＡ、ＧＡＡまたはＣＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２３】
【０２７０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＥＣＫＤＣＧＫＡＦＩＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号：４７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：４６）。
【０２７１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を示す。
【０２７２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１３「ＱＳＮＲ１」は、たとえば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２４】
【０２７３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＶＣＲＥＣＲＲＧＦＳＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号：４９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＧＡＧＧＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：４８）。
【０２７４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を示す。
【０２７５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１４「ＱＳＮＲ２」は、たとえば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２５】
【０２７６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＮＴＣＲＫＴＦＳＱＫＳＮＬＩＶＨＱＲＴＨ（配列番号：５１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：５０）。
【０２７７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡおよびＣＡＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０２７８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１５「ＱＳＮＶ１」は、たとえば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２６】
【０２７９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＶＣＳＫＣＧＫＡＦＴＱＳＳＮＬＴＶＨＱＫＩＨ（配列番号：５３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：５２）。
【０２８０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡおよびＣＡＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＡＡＡ＞ＣＡＡである。
【０２８１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１６「ＱＳＮＶ２」は、たとえば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２７】
【０２８２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＤＥＣＧＫＮＦＴＱＳＳＮＬＩＶＨＫＲＩＨ（配列番号：５５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＣＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：５４）。
【０２８３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特異性を示す。
【０２８４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１７「ＱＳＮＶ３」は、たとえば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２８】
【０２８５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＤＶＣＧＫＴＦＴＱＫＳＮＬＧＶＨＱＲＴＨ（配列番号：５７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＣＧＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：５６）。
【０２８６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特異性を示す。
【０２８７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１８「ＱＳＮＶ４」は、たとえば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例２９】
【０２８８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＰＤＣＧＫＳＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号：５９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：５８）。
【０２８９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡおよびＧＣＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２９０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０１９「ＱＳＳＲ１」は、たとえば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３０】
【０２９１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＱＤＣＧＲＡＦＮＱＮＳＳＬＧＲＨＫＲＴＨ（配列番号：６１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：６０）。
【０２９２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡに対する認識特異性を示す。
【０２９３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２０「ＱＳＳＲ２」は、たとえば、ＧＴＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３１】
【０２９４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＮＱＳＳＴＬＴＲＨＫＩＶＨ（配列番号：６３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：６２）。
【０２９５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡおよびＧＣＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０２９６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２１「ＱＳＴＲ」は、たとえば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３２】
【０２９７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＭＥＣＧＫＡＦＮＲＲＳＨＬＴＲＨＱＲＩＨ（配列番号：６５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：６４）。
【０２９８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異性を示す。
【０２９９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２２「ＲＳＨＲ」は、たとえば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３３】
【０３００】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳＬＲＲＨＥＴＴＨ（配列番号：６７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＣＡＴＧＴＡＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：６６）。
【０３０１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＴ、ＧＴＧおよびＧＴＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＴＴ＞ＧＴＧ＞ＧＴＡである。
【０３０２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２３「ＶＳＳＲ」は、たとえば、ＧＴＴ、ＧＴＧまたはＧＴＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３４】
【０３０３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＫＥＣＧＱＡＦＲＱＲＡＨＬＩＲＨＨＫＬＨ（配列番号：１０３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＧＣＣＴＴＴＡＧＡＣＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＡＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：１０２）。
【０３０４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を示す。
【０３０５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２４「ＱＡＨＲ」は、たとえば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３５】
【０３０６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＨＱＣＧＫＡＦＩＱＳＦＮＬＲＲＨＥＲＴＨ（配列番号：１０５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡ
ＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１０４）。
【０３０７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を示す。
【０３０８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２５「ＱＦＮＲ」は、たとえば、ＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３６】
【０３０９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨ（配列番号：１０７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号：１０６）。
【０３１０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を示す。
【０３１１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２６「ＱＧＮＲ」は、たとえば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３７】
【０３１２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨ（配列番号：１１１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：１１０）。
【０３１３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡおよびＧＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたように（ＡＧＡおよびＣＧＡ）＞ＴＧＡ＞ＧＧＡである。
【０３１４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２８「ＱＳＨＴ」は、たとえば、ＡＧＡ、ＣＧＡ、ＴＧＡまたはＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３８】
【０３１５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨ（配列番号：１１３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１１２）。
【０３１６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は３−ｂｐ標的配列ＣＧＡ、ＡＧＡおよびＴＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＣＧＡ＞ＡＧＡ＞ＴＧＡである。
【０３１７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０２９「ＱＳＨＶ」は、たとえば、ＣＧＡ、ＡＧＡまたはＴＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例３９】
【０３１８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＭＣＳＥＣＧＲＧＦＳＱＫＳＮＬＩＩＨＱＲＴＨ（配列番号：１１５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：１１４）。
【０３１９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＡＡＡおよびＣＡＡに対する認識特異性を示す。
【０３２０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３０「ＱＳＮＩ」は、たとえば、ＡＡＡまたはＣＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４０】
【０３２１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＥＫＣＧＫＡＦＮＱＳＳＮＬＴＲＨＫＫＳＨ（配列番号：１１７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号：１１６）。
【０３２２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＡに対する認識特異性を示す。
【０３２３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３１「ＱＳＮＲ３」は、たとえば、ＧＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４１】
【０３２４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＮＥＣＧＫＦＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＲＲＳＨ（配列番号：１１９）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＡＧＡＣＡＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＡＣ−３’（配列番号：１１８）。
【０３２５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は３−ｂｐ標的配列ＧＴＡおよびＧＣＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＴＡ＞ＧＣＡである。
【０３２６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３２「ＱＳＳＲ３」は、たとえば、ＧＴＡまたはＧＣＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４２】
【０３２７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨ（配列番号：１２１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１２０）。
【０３２８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は３−ｂｐ標的配列ＡＧＡ、ＴＧＡおよびＣＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＡＧＡ＞（ＴＧＡおよびＣＧＡ）である。
【０３２９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３３「ＱＴＨＱ」は、たとえば、ＡＧＡ、ＴＧＡまたはＣＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４３】
【０３３０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＲＨＲＲＩＨ（配列番号：１２３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＣＧＡＴＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１２２）。
【０３３１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＡ、ＧＡＡおよびＡＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＡ＞（ＧＡＡおよびＡＧＡ）である。
【０３３２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３４「ＱＴＨＲ１」は、たとえば、ＧＧＡ、ＧＡＡおよびＡＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４４】
【０３３３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＨＫＣＬＥＣＧＫＣＦＳＱＮＴＨＬＴＲＨＱＲＴ（配列番号：１２５）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＣＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：１２４）。
【０３３４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＧＡに対する認識特異性を示す。
【０３３５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３５「ＱＴＨＲ２」は、たとえば、ＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４５】
【０３３６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＨＣＤＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号：１２７）である。これは、ヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＧＴＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号：１２６）。
【０３３７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧおよびＧＴＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０３３８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３６「ＲＤＥＲ２」は、たとえば、ＧＣＧまたはＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４６】
【０３３９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＲＣＳＷＥＧＣＥＷＲＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＦＲＫＨ（配列番号：１２９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＴＴＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＡＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：１２８）。
【０３４０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＣＧおよびＧＴＧに対する認識特異性を示す。
【０３４１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３７「ＲＤＥＲ３」は、たとえば、ＧＣＧまたはＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４７】
【０３４２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＳＣＳＷＫＧＣＥＲＲＦＡＲＳＤＥＬＳＲＨＲＲＴＨ（配列番号：１３１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：１３０）。
【０３４３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＣＧおよびＧＴＧに対する認識特異性を示す。
【０３４４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３８「ＲＤＥＲ４」は、たとえば、ＧＣＧまたはＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４８】
【０３４５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＡＣＳＷＱＤＣＮＫＫＦＡＲＳＤＥＬＡＲＨＹＲＴＨ（配列番号：１３３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＡＣＴＡＣ
ＣＧＣＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：１３２）。
【０３４６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＣＧに対する認識特異性を示す。
【０３４７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０３９「ＲＤＥＲ５」は、たとえば、ＧＣＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例４９】
【０３４８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＨＣＮＷＤＧＣＧＷＫＦＡＲＳＤＥＬＴＲＨＹＲＫＨ（配列番号：１３５）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＴＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：１３４）。
【０３４９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は３−ｂｐ標的配列ＧＣＧおよびＧＴＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＣＧ＞ＧＴＧである。
【０３５０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４０「ＲＤＥＲ６」は、たとえば、ＧＣＧまたはＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５０】
【０３５１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＬＣＱＹＣＡＱＲＦＧＲＫＤＨＬＴＲＨＭＫＫＳＨ（配列番号：１３７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＣ−３’（配列番号：１３６）。
【０３５２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＧおよびＧＧＧに対する認識特異性を示す。
【０３５３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４１「ＲＤＨＲ１」は、たとえば、ＧＡＧまたはＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５１】
【０３５４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨ（配列番号：１４１）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＡＧＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：１４０）。
【０３５５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧおよびＧＧＧに対する認識特異性を示す。
【０３５６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４３「ＲＤＨＴ」は、たとえば、ＴＧＧ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５２】
【０３５７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＡＣＥＶＣＧＶＲＦＴＲＮＤＫＬＫＩＨＭＲＫＨ（配列番号：１４３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＡＣ−３’（配列番号：１４２）。
【０３５８】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＧＧに対する認識特異性を示す。
【０３５９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４４「ＲＤＫＩ」は、たとえば、ＧＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５３】
【０３６０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＫＬＮＲＨＫＫＲＨ（配列番号：１４５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＴＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号：１４４）。
【０３６１】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＧおよびＡＧＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＧ＞ＡＧＧである。
【０３６２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４５「ＲＤＫＲ」は、たとえば、ＧＧＧまたはＡＧＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５４】
【０３６３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨ（配列番号：１４７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：１４６）。
【０３６４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＧ、ＧＴＧに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＡＧ＞ＧＴＧである。
【０３６５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４６「ＲＳＮＲ」は、たとえば、ＧＡＧまたはＧＴＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５５】
【０３６６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＬＣＳＥＣＤＫＣＦＳＲＳＴＮＬＩＲＨＲＲＴＨ  （配列番号：１４９）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：１４８）。
【０３６７】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を示す。
【０３６８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４７「ＲＴＮＲ」は、たとえば、ＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５６】
【０３６９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４８「ＨＳＳＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４８「ＨＳＳＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＫＣＰＶＣＧＫＡＦＲＨＳＳＳＬＶＲＨＱＲＴＨ  （配列番号：１７３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＴＣＡＡＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＴＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＧＣＡＣＧＣＡＣ−３’（配列番号：１７４）。
【０３７０】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４８「ＨＳＳＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＴＴに対する認識特異性を示す。
【０３７１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４８「ＨＳＳＲ」は、たとえば、ＧＴＴ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５７】
【０３７２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４９「ＩＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０４９「ＩＳＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＲＣＫＹＣＤＲＳＦＳＩＳＳＮＬＱＲＨＶＲＮＩＨ（配列番号：１７５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＧＧＴＧＴＡＡＧＴＡＣＴＧＣＧＡＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１７６）。
【０３７３】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０４９「ＩＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＡＡ、ＧＡＴおよびＧＡＣに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたように  ＧＡＡ＞ＧＡＴ＞ＧＡＣである。
【０３７４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０４９「ＩＳＮＲ」は、たとえば、ＧＡＡ、ＧＡＴまたはＧＡＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５８】
【０３７５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５０「ＫＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５０「ＫＳＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＧＣＨＬＣＧＫＡＦＳＫＳＳＮＬＲＲＨＥＭＩＨ（配列番号：１７７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＧＡＣＧＡＣＡＴＧＡＧＡＴＧＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：１７８）。
【０３７６】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５０「ＫＳＮＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＡＧに対する認識特異性を示す。
【０３７７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５０「ＫＳＮＲ」は、たとえば、ＧＡＧ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例５９】
【０３７８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５１「ＱＳＮＫ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５１「ＱＳＮＫ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＴＱＳＳＮＬＴＫＨＫＫＩＨ（配列番号：１７９）である。これは下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＴＡＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＴ−３’（配列番号：１８０）。
【０３７９】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５１「ＱＳＮＫ」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＡ、ＧＡＡおよびＴＡＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＡＡ＞ＴＡＡ＞ＡＡＡである。
【０３８０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５１「ＱＳＮＫ」は、たとえば、ＡＡＡ、ＧＡＡ、ＴＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質の製造のためのモジュールとして用いられる。
【実施例６０】
【０３８１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５２「ＱＳＮＴ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５２「ＱＳＮＴ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＶＱＣＧＫＧＦＴＱＳＳＮＬＩＴＨＱＲＶＨ  （配列番号：１８１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：１８２）。
【０３８２】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５２「ＱＳＮＴ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＡＡＡに対する認識特異性を示す。その認識特異性はインビボスクリーニング結果によって決定されたようにＡＡＡである。
【０３８３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５２「ＱＳＮＴ」は、たとえば、ＡＡＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例６１】
【０３８４】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５３「ＶＳＮＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５３「ＶＳＮＶ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＤＨＣＧＫＡＦＳＶＳＳＮＬＮＶＨＲＲＩＨ  （配列番号：１８３）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＴＧＡＡＴＧＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１８４）。
【０３８５】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５３「ＶＳＮＶ」は３−ｂｐ標的配列ＡＡＴ、ＣＡＴおよびＴＡＴに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＡＡＴ＞ＣＡＴ＞ＴＡＴである。
【０３８６】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５３「ＶＳＮＶ」は、たとえば、ＡＡＴ、ＣＡＴまたはＴＡＴ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例６２】
【０３８７】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５４「ＤＳＣＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５４「ＤＳＣＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＴＣＳＤＣＧＫＡＦＲＤＫＳＣＬＮＲＨＲＲＴＨ（配列番号：１８５）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＴＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴ−３’（配列番号：１８６）
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５４「ＤＳＣＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＣＣに対する認識特異性を示す。
【０３８８】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５４「ＤＳＣＲ」は、たとえば、ＧＣＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例６３】
【０３８９】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５５「ＩＳＮＶ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５５「ＩＳＮＶ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＥＣＤＨＣＧＫＡＦＳＩＧＳＮＬＮＶＨＲＲＩＨ（配列番号：１８７）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＡＣＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴ−３’（配列番号：１８８）
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５５「ＩＳＮＶ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＡＡＴに対する認識特異性を示す。
【０３９０】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５５「ＩＳＮＶ」は、たとえば、ＡＡＴ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例６４】
【０３９１】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５６「ＷＳＮＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５６「ＷＳＮＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＹＲＣＥＥＣＧＫＡＦＲＷＰＳＮＬＴＲＨＫＲＩＨ（配列番号：１８９）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＧＴＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：１９０）
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５６「ＷＳＮＲ」は３−ｂｐ標的配列ＧＧＴおよびＧＧＡに対する認識特異性を示す。その結合部位選好度は、インビボスクリーニング結果によって決定されたようにＧＧＴ＞ＧＧＡである。
【０３９２】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５６「ＷＳＮＲ」は、たとえば、ＧＧＴおよびＧＧＡ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【実施例６５】
【０３９３】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５７「ＤＳＡＲ」
ＴＧ−ＺＦＤ−０５７「ＤＳＡＲ」はヒトゲノム配列からインビボスクリーニングによって同定された。そのアミノ酸配列はＦＭＣＴＷＳＹＣＧＫＲＦＴＤＲＳＡＬＡＲＨＫＲＴＨ（配列番号：１９１）である。これは、下記のヒト核酸配列によってコーディングされる：
５’−ＴＡＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号：１９２）。
【０３９４】
Ｚｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２とのポリペプチド融合時、ＴＧ−ＺＦＤ−０５７「ＤＳＡＲ」はインビボスクリーニング結果によって決定されたように３−ｂｐ標的配列ＧＴＣに対する認識特異性を示す。
【０３９５】
ＴＧ−ＺＦＤ−０５７「ＤＳＡＲ」は、たとえば、ＧＴＣ配列を含むＤＮＡ部位を認識するための目的で、複数個のジンクフィンガードメインからなるキメラＤＮＡ結合タンパク質を製造するためのモジュールとして用いられる。
【０３９６】
以上述べたジンクフィンガードメインとそれらの特異性を下記表に要約する。
【表３】
2005500068.tif 000006
【表４Ａ】
2005500068.tif 000007
【表４Ｂ】
2005500068.tif 000008
【表５】
2005500068.tif 000009
【表６】
2005500068.tif 000010
【表７】
2005500068.tif 000011
【実施例６６】
【０３９７】
個別３−フィンガータンパク質の製造
哺乳類細胞においてキメラジンクフィンガータンパク質を発現させるためにベクター  Ｐ３を用いた。Ｐ３はｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen, San Diego CA）の変形を通じて作った。連結可能な突出末端（overhang）を有する合成オリゴヌクレオチド二本鎖をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断したｐｃＤＮＡ３に連結した。この二本鎖はヘマグルチニン（ＨＡ）タグと核位置シグナルをコードする核酸を含む。また、前記二本鎖はＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ切断部位および、停止コドンを含む（図１１Ａ）。さらに、このように生成されたベクターをＸｍａＩで処理し、切断部位の突出末端を埋めた後、両末端を再連結することによって、このベクターのＳＶ４０複製開始部位のＸｍａＩ切断部位を除去した。
【０３９８】
３つの特定のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を製造するために、第１のジンクフィンガーをコードする核酸をＰ３ベクターに連結した。第２および第３のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸を下記のようにダイナビーズ（Dynabeads（登録商標））とＭＰＣ−Ｓ（Dyna1）を用いて連結した。第２および第３のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸を、ＸｍａＩ切断部位を有する前方向プライマー（forward primer）およびＡｇｅＩとＮｏｔＩ切断部位を有する逆方向プライマー（reverse primer）を用いて合成した。第２のジンクフィンガードメインの前方向プライマーはビオチンで標識された。第２のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸をＡｇｅＩで切断した後、第３のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸をＸｍａＩで切断したものと連結した。室温で１時間連結した後、反応試料をダイナビーズ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Dynal）に室温で１５分間結合させた。ビード（bead）をＴＥ緩衝液（10mM Tris HCl 0.1 mM EDTA, pH8.0）で３回洗浄した。ビードに付いている連結試料を３７℃で３時間ＸｍａＩおよびＮｏｔＩで切断した。ＸｍａＩおよびＮｏｔＩ切断によって溶出される核酸をＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製し、第１のジンクフィンガーをコーディングする核酸を含むＰ３ベクターと連結した。この産物を大腸菌に形質転換させた後、Ｐ３ベクター内に正確なサイズの挿入体を含むクローンを同定した。結果として作られた３−フィンガーＺＦＰをコーディングする核酸をＤＮＡ配列確認によって確認した。
【実施例６７】
【０３９９】
３−フィンガータンパク質ライブラリーの製造
図１１Ｂは、様々な３−フィンガーライブラリーを製造する一つの方法を示す。まず、Ｐ３ベクターに各々のジンクフィンガードメインをコーディングする核酸をクローニングして「単一フィンガー」ベクターを作った。「単一フィンガー」ベクターを各々同量混合してプール（pool）を作った。このプールを２つに分けてＡｇｅＩおよびＸｈｏＩと、ＸｍａＩおよびＸｈｏＩの２セットの酵素で各々切断した。３０分間のホスファターゼ（phosphatase）処理後に、ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩで処理したプールの切断されたベクター核酸を、ベクターＸｍａＩおよびＸｈｏＩで切断して得られた核酸断片と連結した。この断片は各々一つのジンクフィンガードメインをコーディングする。切断されたベクター核酸を核酸断片に連結することによって２つのジンクフィンガードメインをコーディングするベクターを生成する。この連結産物を大腸菌に形質転換させ、約１．４×１０４個の形質転換体が得られ、これらは２−フィンガーライブラリーをなす。４０個のコロニーに対するコロニーＰＣＲ分析によって前記２−フィンガーライブラリーの挿入体のサイズを測定した。ライブラリーの９５％に正しいサイズの挿入体が存在することを確認した。
【０４００】
次に、この２−フィンガーライブラリーをＡｇｅＩ−ＸｈｏＩで切断した。２つのジンクフィンガードメインをコーディングする核酸配列を有する切断されたベクターをＸｍａＩおよびＸｈｏＩで処理して製造された１−フィンガー断片のプールに連結した。このように連結された産物を大腸菌に形質転換させ、約２．４×１０５の独立的な形質転換体を得た。挿入体領域を検査して、ライブラリー構成員の大部分が正確に製造されたことを、すなわち、各々が３つのジンクフィンガードメインをコーディングすることを確認した。
【実施例６８】
【０４０１】
３−フィンガータンパク質のインビボ分析法
キムおよびパボ（Kim and Pabo (1997) J Biol Chem 272:29795-29800）は、Ｚｉｆ２６８タンパク質が標的遺伝子の転写開始部位付近に結合する場合、ＶＰ１６で活性化された標的遺伝子の転写を効果的に抑制することを記述している。このような結合ジンクフィンガータンパク質がＲＮＡ重合酵素ＩＩ複合体のような基本的転写装置のプロモータに対する結合またはＴＦＩＩＤの転写開始部位またはＴＡＴＡボックスに対する結合を妨げると推定された。
【０４０２】
新たな３−フィンガータンパク質がインビボで機能するかどうかを確認するために類似するインビボ抑制分析法を用いた。この分析法においては、前述のキムおよびパボの構造物において、Ｚｉｆ２６８部位の位置に匹敵する位置に標的部位が存在するルシフェラーゼレポーター構造物を用いた。
【０４０３】
このルシフェラーゼレポータープラスミドはｐＧＬ３−ＴＡＴＡ／Ｉｎｒ（Kim and Pabo、前記文献参照）の変形ベクターであるｐΔＳ−ｍｏｄｉから製造した。これらのレポーターはレポータータンパク質としてホタルルシフェラーゼを用いた。ＴＡＴＡボックス上流のＳａｃＩ部位はｐΔＳ−ｍｏｄｉから除去した。新たなＳａｃＩ部位を転写開始部位の次に挿入した。各ＺＦＰが結合する特異的９塩基対の結合部位を含むオリゴマーをＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐΔＳ−ｍｏｄｉの転写開始部位の１２ｂｐ下流に位置する１４ｂｐと入れ替えた。結果として得られたレポータープラスミドをｐ１Ｇ−ＺＦＰ  ＩＤ（ここで、ＺＦＰ  ＩＤは、特定のレポーターの結合位置によって決定される）と命名した。ｐΔＳ−ｍｏｄｉおよびｐ１Ｇの塩基配列を図１２に示す。
【０４０４】
特定の３−フィンガータンパク質のインビボ活性を下記のように測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、特定の３−フィンガータンパク質を発現させるプラスミド１４ｎｇ、前述のレポータープラスミド１４ｎｇ、ＧＡＬ４−ＶＰ１６を発現させるプラスミド７０ｎｇ、およびレニラー（Renillar）ルシフェラーゼを発現させるプラスミド１．４ｎｇの４つのプラスミドでトランスフェクト（transfection）した。ＧＡＬ４−ＶＰ１６はレポーターに存在する最小合成プロモータの転写を活性化させるので、特定の３−フィンガータンパク質による抑制を明確に検出し、他の３−フィンガータンパク質と比較できる。レニラールシフェラーゼを発現させるプラスミドはトランスフェクション効率を測定するための対照となる。
【０４０５】
トランスフェクションのためにリポフェクタミン（Gibco-BRL）を用いた。細胞を９６−ウェルプレートのウェルで３０−５０％の懸濁度（confluency）であるときトランスフェクトし、２日間培養した後ルシフェラーゼ分析のために収穫した。ルシフェラーゼ活性をデュアル−ルシフェラーゼレポーター分析システム（Dual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System, Promega）を用いて測定した。観察されたホタルルシフェラーゼ活性を観察されたレニラールシフェラーゼ活性を用いて補正した。抑制程度或いは抑制倍数はジンクフィンガータンパク質不在時の補正されたレポーター発現値をジンクフィンガータンパク質存在時の補正されたレポーター発現値で分けて算出した。
【０４０６】
ジンクフィンガータンパク質はトランスフェクション分析において２倍以上の転写抑制を示すと、高い厳格性のカットオフ（cut-off）値を満たすものとし、または１．５〜２倍の転写抑制を示すと、低い厳格性のカットオフ値を満たすものとして分類した。
【実施例６９】
【０４０７】
ジンクフィンガータンパク質とその特異的レポーターの結合分析結果
インビボ分析で観察された活性を結合親和度と連関させるためにゲル移動分析を用いた。ゲル移動分析を通じて得られた解離定数と上述のトランスフェクション分析における転写抑制水準間に良好な相互関連性が確認された。表８は、様々なＤＮＡ部位に対するＺｉｆ２６８の結合親和度と前記トランスフェクション分析を用いた相応する生体内抑制データを示す。
【０４０８】
一般的に、トランスフェクション分析において２倍以上の抑制（すなわち、５０％の抑制）を示すジンクフィンガータンパク質は、ゲル移動分析を通じて測定されたように１ｎＭ以下の解離定数を示した。
【表８】
2005500068.tif 000012
【実施例７０】
【０４０９】
３−フィンガータンパク質の特性確認
２種類の３−フィンガーキメラジンクフィンガータンパク質を製造した。１種類は天然型ジンクフィンガードメインと同一なヒトジンクフィンガードメインのみからなるキメラタンパク質を含む。もう一種類は、天然型ジンクフィンガードメインと同一でないジンクフィンガードメインを含むキメラタンパク質を含む。後者のジンクフィンガードメインは天然型ジンクフィンガードメインをインビトロでのファージディスプレイ選択によって同定した。そのようなドメインは自然進化の厳格性を避けたものである。
【０４１０】
構成ジンクフィンガードメインを表９に記載する。総３６個のジンクフィンガードメイン（１８個のヒトのジンクフィンガードメインと１８個の突然変異されたジンクフィンガードメイン）が試験３−フィンガータンパク質の一つのセットを組み立てるのに用いられた。突然変異ジンクフィンガードメインは、文献［Choo and Klug. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11168-11172; Desjarlais and Berg (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:11099-11103; Dreier et al. (2001) J Biol Chem. 276:29466-29478; Dreier et al. (2000) J Mol Biol. 303:489-502; Fairall et al. (1993) Nature 366:483-487; Greisman and Pabo. (1997) Science. 275:657-661; Kim and Pabo (1997) J. Biol. Chem. 272:29795-29800; and Segal et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-2763など］に記述されている。
【表９】
2005500068.tif 000013
【０４１１】
各３６個のドメインをコーディングする核酸をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断したＰ３ベクターに各々サブクローニングした後、生成されたプラスミドをキメラジンクフィンガータンパク質の製造のための出発物質として用いた。
【０４１２】
３−フィンガータンパク質をコーディングする核酸は２つの異なる方法で製造した。
【０４１３】
一番目の方法において、すべてのジンクフィンガードメインをコーディングする核酸を実施例６８に記載されたように無作為に混合した後、３−フィンガー構造物を無作為に選択し、次のような分析を行った。各構造物の塩基配列を分析し、それがコーディングするポリペプチド中の構成ジンクフィンガードメインを決定した。その後、無作為に分類された各々の３−フィンガータンパク質に対して標的ＤＮＡ配列を合成した。標的ＤＮＡ配列は予想される選好塩基配列に基づいている。この標的を、前述のルシフェラーゼレポーターベクターにクローニングした。このような接近方式を「ジンクフィンガータンパク質−優先」接近方式という。
【０４１４】
二番目の方法においては、実施例６６に記載されたように、キメラ３−フィンガータンパク質をコーディングする核酸を所定の標的ＤＮＡ配列に基づいて組み立てた。ジンクフィンガードメインの認識部位と標的ＤＮＡ配列を連結するためにコンピュータアルゴリズムを用いた。周知の遺伝子のプロモータ配列を入力標的ＤＮＡ配列として用いた。プロモータ配列をスキャニングして、９個のヌクレオチド長さであり、入手可能なジンクフィンガードメインの特定集合から得られたキメラ３−フィンガータンパク質が認識できる標的である断片を同定した。一旦同定されると、このキメラ３−フィンガータンパク質をコーディングする核酸を製造した。このような接近方式を「標的部位−優先」接近方式という。
【０４１５】
塩基接触残基の２番位置にアスパラギン酸残基を含むジンクフィンガードメインを特別に考慮して分析した。そのようなジンクフィンガードメインとしては、ＲＤＥＲ１、ＲＤＨＴ、ＲＤＮＲ、ＲＤＫＲ、ＲＤＴＮ、ＴＤＫＲおよびＮＤＴＲがある。ＤＮＡに結合しているＺｉｆ２６８のＸ線共結晶構造（X-ray co-crystal structure）は２番位置のアスパラギン酸がジンクフィンガーが認識する３−ｂｐ下記部位以外の一つの塩基と水素結合を形成できることを示す。その結果、２番位置にアスパラギン酸を有するＲＤＥＲフィンガーは４−塩基部位である５’−ＧＣＧ（Ｇ／Ｔ）−３’を選好した。コンピュータアルゴリズムはこのような付加的な特異性も考慮した。同様に、２番位置にアスパラギン酸を有するフィンガーを含み、前記のような４−ｂｐ部位に対する規則を違反した、無作為に組み立てられた３−フィンガータンパク質を本明細書に記載された他の分析から除外した。
【０４１６】
総１５３個の３−フィンガーキメラタンパク質を「ジンクフィンガータンパク質−優先」接近方式と「標的部位−優先」接近方式で製造した。これらのタンパク質を実施例６８に記述された一時的コトランスフェクション分析法で試験した。その結果を下記表１０に示す。
【表１０】
2005500068.tif 000014
【０４１７】
2005500068.tif 000015
【０４１８】
2005500068.tif 000016
【０４１９】
2005500068.tif 000017
【０４２０】
高い厳格性基準及び低い厳格性基準に係る結果の分布を表１１および１２に示す。表１１から分かるように、１５３個のキメラジンクフィンガータンパク質のうち３１個が高い厳格性基準である２倍抑制（ＲＦ２；ＲＦ＝抑制倍数）以上を示した。表１２から分かるように、すべて天然型ヒトジンクフィンガードメインから構成されたタンパク質の場合、２８．１％（９６個のうち２７個）が高い厳格性基準を通過し、５９．４％は低い厳格性基準（ＲＦ１．５）を通過した。２つの天然型ジンクフィンガードメインと一つの突然変異ドメインから構成されたタンパク質の場合、３３．３％が低い厳格性基準を通過し、２０％のみが高い厳格性基準を通過した。
【０４２１】
対照的に、一つのヒトドメインと２つの突然変異ドメインから構成された１７個のタンパク質の場合、ただ一つのタンパク質（５．９％）のみが高い厳格性基準を通過し、２つのタンパク質（１１．８％）のみが低い厳格性基準を通過した。驚くことに、すべて突然変異ドメインのみからなるジンクフィンガータンパク質のいずれも抑制分析法において高い厳格性基準を満たさなかった。そのようなタンパク質のうちただ一つ（４％）のみが低い厳格性基準を満たした。これらの結果は、天然型ヒトジンクフィンガードメインが新たなＤＮＡ−結合タンパク質を製造するにおいて突然変異ドメインよりも一般的に遥かに良好なビルディングブロックであることを示す。
【表１１】
2005500068.tif 000018
【表１２】
2005500068.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０４２２】
【図１】３つのジンクフィンガードメインから構成され、ＤＮＡ配列５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  Ｔ−３’（配列番号：１９７）と結合するｚｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質の３次構造を示す。黒い円はジンクイオンの位置である。
【図２】Ｚｉｆ２６８のアミノ酸残基とＤＮＡ塩基間の水素結合相互作用を示す。α−ヘリックスに沿って−１、２、３および６位置のアミノ酸残基は特定の位置の塩基と相互作用する。太い線は理想的な水素結合を示し、点線は潜在的な水素結合を示す。
【図３】ＤＮＡ塩基ジンクフィンガードメインのα−ヘリックスに沿って−１、２、３および６番位置のアミノ酸残基間の相互作用を要約した認識コード（recognition code）表である。
【図４】アミノ酸残基およびこれらの相応する３塩基トリプレット（3 base triplet）の位置を示す図である。太い線は観察される主な相互作用を示し、点線は補助相互作用を示す。
【図５】本明細書に開示されたインビボ（in vivo）選別システムの原理を説明する模式図である。様々なジンクフィンガー突然変異のうち、ジンクフィンガードメインＡは標的配列（ＸＸＸＸで表示）を認識し、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の転写を活性化させる。結果的に、酵母コロニーはヒスチジン欠乏培地で成長する。これとは対照的に、ジンクフィンガードメインＢは標的配列を認識しないので、レポーター遺伝子は抑制されたまま残っている。その結果、ヒスチジンが欠乏培地ではコロニーが成長しない。ＡＤは転写活性化ドメインを示す。
【図６】ＨＩＶの長い末端繰り返し部位（Long Terminal Repeat; LTR）およびＨＩＶ−１のコレセプター（coreceptor）をコーディングするヒト遺伝子であるＣＣＲ５のプロモータ部位から発見される１０−ｂｐ配列の目録である（各々配列番号：１−５）。下線部分は本発明の選別で使用された４−ｂｐ標的配列を示す。
【図７】レポーター遺伝子に連結された結合部位の塩基配列を示す（各々配列番号：６−１７）。各々の結合部位は４つの複合結合配列が直列に整列されて構成される。各々の複合結合配列はＺｉｆ２６８のフィンガー１およびフィンガー２によって認識される切断された結合配列５’−ＧＧＧＣＧ−３’を４−ｂｐ標的配列に連結して製造した。
【図８】ハイブリッドプラスミドのライブラリーの製造に使用可能なプラスミドであるｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆの模式図である（配列番号：１８および１９）。
【図９】ｐＰＣＦＭＳ−Ｚｉｆに挿入されたＺｉｆ２６８ジンクフィンガータンパク質をコーディングする遺伝子に対する塩基配列および相応する翻訳されたアミノ酸配列を示す（各々配列番号：２０および２１）。制限酵素によって認識される部位は下線で表示されている。
【図１０】インビボ選別システムによって選択されたジンクフィンガータンパク質を用いた再形質転換（retransformation）および交差形質転換（cross-transformation）から得られた酵母細胞を有する培養プレートの写真である。
【図１１Ａ】Ｐ３ベクターのポリリンカー領域の核酸配列である（配列番号：２５１）。この領域外の配列は親ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）と同じである。各酵素切断部位はイタリック体で表示されており、ＨＡタグは下線で表示されている。転写開始部位と終結部位は太字で表示する。また、核位置信号（ＮＬＳ）も表示する。
【図１１Ｂ】ジンクフィンガータンパク質ライブラリーを製作するための一つの例示的方法を示す模式図である。
【図１２】レポーター構造物および転写開始領域近傍の断片の塩基配列を示す図である。５ＸＧａｌ４は５つのＧＡＬ４結合部位を、ＴＡＴＡはＴＡＴＡボックスを、Ｉｎｒは転写開始部位を示す。ＮＮＮＮＮＮＮＮＮは特定のＺＦＰに対する同種の結合部位を示す。各位置は転写開始点（＋１）を基準として番号を付け、同じヌクレオチドは「−」で表示した。「＞」は該当ヌクレオチドの欠失を意味する。
【図１】
2005500068.tif 000020
【図２】
2005500068.tif 000021
【図３】
2005500068.tif 000022
【図４】
2005500068.tif 000023
【図５】
2005500068.tif 000024
【図６】
2005500068.tif 000025
【図７】
2005500068.tif 000026
【図８】
2005500068.tif 000027
【図９】
2005500068.tif 000028
【図１０】
2005500068.tif 000029
【図１１Ａ】
2005500068.tif 000030
【図１１Ｂ】
2005500068.tif 000031
【図１２】
2005500068.tif 000032
【国際公開パンフレット】
2005500068.tif 000033
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【国際調査報告】
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