(57)【要約】本発明は、サンプル中に存在する検体のための化学両論的パートナーとしての酵素−補酵素複合体の用途を含む、酵素反応によるサンプル中の検体を検知するための方法および試薬システムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）補酵素の再生が行われない条件下において、酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と試料とを接触させる工程と、（ｂ）酵素−補酵素複合体の変化によって分析物の反応を検出する工程とを含む、酵素反応による試料中の分析物の検出方法。
【請求項２】
酵素反応が酸化還元反応を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵素として酸化還元酵素を使用し、酸化または還元による補酵素の変化を検出することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
酵素として、グルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）またはアミノ酸脱水素酵素、たとえばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択される脱水素酵素が使用されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
フラビン誘導体、ニコチン誘導体、およびキノン誘導体から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
ＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2、補酵素Ｑ、ＰＱＱ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ／Ｈ+から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
光学的方法によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載の方法。
【請求項８】
吸収、蛍光発光、ＣＤ、ＯＲＤの測定法または屈折率測定法によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
蛍光発光の測定によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出試薬としてその中に挿入される酵素−補酵素複合体を有するゲルマトリックスが使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の方法。
【請求項１１】
ゲルマトリックスが層厚≦５０μｍ、特に≦５μｍを有することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
光重合性物質を基剤とするゲルマトリックスが使用されることを特徴とする請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
体液中の分析物が測定されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
血中のグルコースの測定が実施されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
分析物の反応が≦５秒の持続時間を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
反応が、補酵素との反応を生じ得る媒介物の不存在下に実施されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載記載の方法。
【請求項１７】
分析物に対する化学量論的反応パートナーとして酵素−補酵素複合体が使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）補酵素の再生が行われない形態における酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と、（ｂ）検出試薬を吸収する担体とを含む試料中の分析物の検出のための試薬システム。
【請求項１９】
酵素−補酵素複合体がゲルマトリックス中に挿入されることを特徴とする請求項１８記載の試薬システム。
【請求項２０】
担体が少なくとも部分的に光学的に透明であることを特徴とする請求項１８または１９記載の試薬システム。
【請求項２１】
担体が本質的に平面構造を含むことを特徴とする請求項１８、１９または２０記載の試薬システム。
【請求項２２】
担体が複数の異なる検出試薬を含むことを特徴とする請求項１８、１９または２０記載の試薬システム。
【請求項２３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７記載の方法における請求項１８、１９、２０、２１または２２記載の試薬システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する分析物のための再生不能の、特に化学量論的反応パートナーとして酵素−補酵素複合体の使用を含む、酵素反応による試料中の分析物の検出のための方法および試薬システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素的方法による血中の分析物、たとえばグルコースの検出が知られている。この場合、被測定分析物は好適な酵素および補酵素に接触させられ、酵素が触媒量で使用される。補酵素の還元もしくは酸化により生じる酸化還元当量が媒介物に伝達され、次に別の工程で該媒介物が電気化学的または測光的に検出される。較正により被測定分析物の濃度と測定値との直接的関連性が提供される。
【０００３】
シエラら（Sierra et al）はグルコース酸化酵素の固有蛍光発光に基づく血糖の測定を記載する（たとえばAnal. Chem. 69 (1997)、1471〜1476参照）。この方法の場合も酵素がその補酵素ＦＡＤと共に触媒量で使用され、酸化還元当量が媒介物としての酸素に伝達される。
【０００４】
ナレイアナスウェイミイら(Narayanaswamy et al)はグルコース測定のためのグルコース脱水素酵素とＮＡＤによる蛍光発光測定を記載する（たとえばAnalytical Letters 21 (7)(1988)、1165〜1175参照）。酵素は、この場合、触媒量で、すなわち非化学量論的量で使用される。蛍光発光測定は溶液中の遊離ＮＡＤＨを検出する。
【０００５】
従来技術の検出システムに必要な電気化学的活性物質（媒介物）によって被測定分析物が間接的にのみ、すなわち複数の化学反応を介してのみ検出できる。そのためにしばしば関与物質濃度の複雑な適合が反応速度の最適化のために必要である。さらに、必要な電気化学的活性物質が長期の保管で不安定になる危険がある。
【０００６】
また媒介物はしばしば酵素−補酵素系に対して大過剰分で使用しなければならない。補酵素は高い反応性を有し、そのため補酵素活性は媒介物自体の崩壊により少量で、たとえば１％以下でまたは外来物質たとえば包装材からの物質の蒸発の作用によって明らかに減少する。これは分析測定において誤ったシグナルを引き起こし得る。さらに、もう１つの欠点は、分析物の測定時間が通常少なくとも数秒の範囲、グルコースの場合はたとえば４秒以上の範囲になり、必要な試料体積が大きく、たとえば０．５μｌ以上になることにある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の基礎におく課題は、従来技術の上記欠点を少なくとも部分的に回避することにあった。特に、媒介物または／および指示薬の不在下でも確実な測定結果をもたらす分析物の酵素検出のための不感応性かつ迅速な方法が提供されるべきである。
【０００８】
この課題は、触媒として常法のものに代わり、化学量論的反応パートナーとして酵素−補酵素複合体が使用されることによって解決される。分析物の検出はただ１つの反応工程のみが必要であり、そのためきわめて迅速である。低い安定性と高い妨害発生率を有する複雑な反応混合物の使用に関係する媒介物と指示薬の使用が不要になる。
【０００９】
したがって本発明の目的は、（ａ）酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と試料の接触化において、補酵素の再生が行われない工程と、（ｂ）酵素−補酵素複合体の変化による分析物の反応の検出工程とを含む、酵素反応による試料中の分析物の検出方法である。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、（ａ）酵素−補酵素複合体を含む検出試薬において補酵素の再生が行われない該検出試薬と、（ｂ）検出試薬を吸収する担体とを含む、試料中の分析物の検出のための試薬システムである。
【００１１】
本発明は、非常に短い、有利には≦５秒、特に好ましくは≦１秒、最も好ましくは≦０．１秒の反応時間以内に分析物の簡単な定性的または定量的測定を可能にする。反応は、測定中に補酵素の再生が行われない条件下に実施される。その場合、分子酵素−補酵素複合体が分析物のただ１つの分子のみと反応させることができる。そのため目的に応じて反応は媒介物またはその他の、補酵素の反応を生じ得る物質の不在下に実施される。
【００１２】
検出試薬は、所望の試験フォーマットに対応して分析物の定性的または／および定量的測定を可能にするために充分な量の酵素−補酵素複合体を含有する。特に分析物の定量的測定のために酵素−補酵素複合体は、該酵素−補酵素複合体の反応分子数が試料中に存在する分析物濃度と相関関係にある量で使用される。特に好ましくは、酵素−補酵素複合体が試料中に存在する分析物を基準として少なくとも化学量論的量で、有利には分析物を基準とする化学量論的過剰分で使用される。ここで表現「少なくとも化学量論的量で」とは、試料の大きさが、酵素−補酵素複合体の分子数を基準として、試料中に予想される分析物濃度で分析物と反応する酵素−補酵素複合体の分子数が試料中に存在する分析物濃度と相関関係にあるように調整されることを意味する。好ましくは、「化学量論的量」とは、酵素−補酵素複合体の分子数が被検試料中に予想される最大分析物分子数に相当することを意味する。
【００１３】
この方法および検出システムは、最小の試料量、たとえば試料体積≦１μｌ、特に≦０．１μｌの使用を可能にする。必要な場合は試料を検出試薬と接触させる前にさらに希釈してよい。
【００１４】
本発明による方法および検出システムは、任意の分析物、たとえば血液、血清、血漿または尿のような体液中の、さらにまた排液試料または食品中の、たとえばパラメータの測定に好適である。この方法は、たとえばキュベット中の湿式試験として、または対応する試薬担体上の乾式試験として実施することができる。
【００１５】
分析物として、酵素−補酵素複合体との反応、特に酸化還元反応が生じ得る、たとえばグルコース、乳酸、リンゴ酸、グリセリン、アルコール、コレステリン、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチドなどのような任意の生物学的または化学的物質を測定することができる。
【００１６】
酵素反応は、有利には補酵素の還元または酸化が酵素−補酵素複合体中で生じる酸化還元反応である。この種の反応のために酵素として有利には酸化還元酵素が使用される。特に好ましくは酵素として、たとえばグルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセリン脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）またはアミノ酸脱水素酵素、たとえばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択される脱水素酵素が使用される。その他の好適な酵素は、たとえばグルコース酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）またはコレステロール酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）のような酸化酵素である。
【００１７】
本発明に言う補酵素は、好ましくは酵素に共有結合または非共有結合し、分析物の転換によって変化、たとえば酸化または還元される有機分子である。補酵素の好ましい例は、たとえばＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2等のような、フラビン誘導体、ニコチン誘導体、キノン誘導体、たとえばフラビンヌクレオシド誘導体、たとえばＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ／Ｈ+等のようなニコチンヌクレオシド誘導体、またはたとえば補酵素Ｑ、ＰＱＱ等のようなユビキノンである。
【００１８】
分析物との反応による補酵素の変化は基本的に任意の方法で検出することができる。ここでは基本的に酵素反応を検出する従来技術から公知の全ての方法を使用することができる。しかしながら有利には、補酵素の変化は光学的方法によって検出される。光学的検出方法は、たとえば吸収、蛍光発光、円偏光二色性分光分析法（ＣＤ）、光学回転分散法（ＯＲＤ）、屈折率測定法などの測定法を含む。特に好ましくは補酵素の変化は蛍光発光の測定によって検出される。蛍光発光測定は高感度であり、小型化システムでの分析物の低濃度の検出自体を可能にする。
【００１９】
本発明による方法または検出システムは１種の液体試験を含んでよく、試薬は、たとえば水性または非水性液体中の溶液または懸濁液の形態で、あるいは粉末または親液性物として存在する。しかしながら有利には本発明による方法および検出システムは乾式試験を含み、試薬が担体上に塗布される。この担体は、たとえば被検試液によって湿潤される吸収性または／および膨潤性材料を含む試験用テープを含んでよい。
【００２０】
特に好ましい実施形態において、検出試薬としてその中に挿入される酵素−補酵素複合体を有するゲルマトリックスが使用される。ゲルマトリックスは、有利には層厚≦５０μｍ、特に≦５μｍを有し、担体上に、たとえば少なくとも部分的に光学的に透明の担体上に塗布されている。ゲルマトリックスは、公知の乾式試験システム（たとえばAccuChek Active）の場合のように１種またはそれ以上の可溶性ポリマーを含むマトリックスとしてよく、ナイフ(aufrakeln)の使用および乾燥によって製造することができる。有利には、マトリックスは、たとえばアクリル性モノマーのような光重合性物質を基剤とする、たとえばポリエチレングリコールジアクリレートのようなアクリルアミドまたは／およびアクリル酸エステル、またはビニル芳香族モノマー、たとえば４−ビニルベンゾールスルホン酸、またはそれらの組合せから構成されたポリマーである。この種のゲルマトリックスを製造するために、酵素、光重合性モノマーならびに必要な場合は補酵素、光開始剤または／および非反応性成分を含む試薬を含有する液体を少なくとも部分的に光学的に透明の担体上に、たとえばプラスチックフィルム上に塗布してよく、たとえば紫外（ＵＶ）光で裏側から照射することができ、それによってモノマーまたはモノマー群の重合が所定の層厚になるまで担体上で行われる。この層厚は試薬への吸収性物質の添加によって、または／および照射時間もしくは−強度によって制御することができる。過剰な液状試薬は重合後に除去し、新たに使用してもよい（たとえば図２参照）。
【００２１】
他方、ゲルマトリックスは慣例の被覆プロセスによって製造してもよく、この場合は液状試薬が担体上に塗布され、そこで好適な方法たとえばナイフを用いて所望の厚さにし、次に完全に重合される。
【００２２】
ゲルマトリックス内への単重合または挿入後に、酵素は保護した微小環境にある。ポリマーゲルマトリックスの充分な湿潤により酵素分子は不動化形態で存在する。しかし低分子物質もしくはグルコースまたはその他の分析物または補酵素も網状重合によって自由拡散してもよい。
【００２３】
酵素はその補酵素と共にマトリックス中に単重合させるか、またはマトリックスを重合後に補酵素溶液と接触させるか、そのいずれでもよく、それによって対応する酵素−補酵素複合体が形成される。ゲルマトリックス中の酵素濃度は、有利には非測定分析物との化学量論的反応および反応によって変化する補酵素の直接的測定が可能になるように高く選ばれる。この反応はただ１つの触媒反応、たとえばミリ秒またはマイクロ秒の範囲で経過し得る酸化還元反応からのみ構成される。この反応によって変化した補酵素は酵素の活性中心への結合および必要な場合は付加的にゲルマトリックス中への挿入によって好適に妨害的影響から保護されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
さらに、本発明は以下の図および例によって説明する。
【００２５】
光学的に透明な担体１上に、試薬層２、たとえば酵素−補酵素複合体を有するゲルマトリックスを塗布している。酵素−補酵素複合体は、補酵素の再生が分析物測定中に生じ得ないような形態で存在する。試薬層上に、試料３たとえば血液が付与される。試料３中に含有される分析物と試薬層２中に含有される酵素−補酵素複合体とのあいだの酵素反応の測定は光学的方法によって行う。光源４たとえばレーザーまたはＬＥＤからの光は、後方から（担体を通して）試薬層２に照射される。試料から戻り照射された吸収−または蛍光光は検出器５で検出される。必要な場合−特に蛍光光の検出のために−蛍光励起光の誘導妨害を阻止するため検出器の前に光学フィルタ素子６が接続される。
【００２６】
光学的に透明な担体１１、たとえばプラスチックフィルム上に、液状試薬１２がたとえば第１位置１３で塗布される。液状試薬１２は第２位置で下方から担体１１を通して光源１４からの光で照射される。同時に担体が矢印で示した方向１５に移動される。直接担体１１上に重合した試薬層１６が形成される。ポリマー層１６の上に過剰の液状試薬がある。重合した試薬層１６の厚さは試薬組成物、光照射の時間および強度ならびに担体１１の性質によって制御することができる。
【００２７】
たとえば連続的方法によって図２で製造した、重合した試薬層は切断し、公知の技術を使用して担体２１に塗布することができる。表面への試料の塗布後、光源から下方から励起光２３たとえばＵＶ光が照射される。酵素−補酵素複合体と分析物の反応によって試薬層２２中に生じる蛍光発光２４たとえば青色光が検出器で検出される。
【００２８】
複数の（同じまたは異なる）試薬を担体上に塗布してもよい。円盤の形態のこのような実施形態の一例を図４に示している。光学的に透明な担体３１上に複数の試薬スポット３２が配置されている。
【実施例】
【００２９】
実施例１：キュベット中のグルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）／ＮＡＤ+系中のグルコースの化学量論的検出
ＧｌｕｃＤＨ  １００ｍｇ／ｍｌを緩衝液ｐＨ７に溶解し、相当量のＮＡＤ+と反応させる。グルコース量を増やして添加すると、ＵＶランプ（励起波長３６６ｎｍ）下で視覚的に蛍光発光の上昇を識別できる（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００３０】
この酵素系を含む溶液はグルコースなしに発光しない。またグルコースおよびＮＡＤ+も蛍光発光を生じない。
【００３１】
実施例２：ポリマーフィルム中のＧｌｕｃＤＨ／ＮＡＤ+系内のグルコースの検出
以下の物質の懸濁液をプラスチック試薬ガラスで混合した。
【００３２】
【表１】
2005532796.tif 000002
【００３３】
前記懸濁液０．５ｍｌをＧｌｕｃＤＨ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌと反応させ、この混合物を超音波槽で気泡なしに均質化した。
【００３４】
透明の溶液を厚さ１２５ｍｍのコロナ処理したポリガーボネートフィルム上に注入し、２０分間慣用の露光装置（イーゼルＵＶ露光装置２）で露光した。このフィルムを短く水で洗浄し、それに続き空気で乾燥した。
【００３５】
生じる層厚は＜２μｍであった。新鮮な添加したグルコース／ＮＡＤ+溶液（ＧＫＬ−３−溶液、３００ｍｇ／ｄｌグルコース、１ｍｌ／６．４ｍｇＮＡＤ+）をフィルム上に滴下した。直ちにＵＶランプ下に強い蛍光発光を観察できた。
【００３６】
実施例３：ＵＶ吸収体の添加による層厚の影響
良好に識別するために青色の染料（吸収極大≒６５０ｎｍ）を含有するポリマー層を製造した（調剤２）。別の実験で出発調剤に黄色の染料をＵＶ吸収体として混加した（調剤３）。
【００３７】
【表２】
2005532796.tif 000003
【００３８】
この混合物を攪拌および超音波槽処理によって均質化し、１４０μｍポカロンフィルム（コロナ処理、工程４）にピペットで分配し、ＵＶ露光装置（アクティナＵ４、ヴェー・レンメン有限会社）で１分間露光した。
【００３９】
生じる層厚をマイクロメーターゲージで測定し、２４０．５μｍになった。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
この混合物を、上述のように、フィルム上に分配し、次に重合した。生じる層厚はマイクロメーターゲージで測定し、７９．３μｍになった。
【００４２】
この実験は層厚制御を実現できることを示している。ＵＶ吸収体なしでは、層厚はそれ以外同じ反応条件下で２４０．５μｍになる（上記参照）；ＵＶ吸収体（モルダントイエロー７）を用いると、わずか７９．３μｍである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明による検出システムの第１実施形態である。
【図２】本発明による検出システムの製造である。
【図３】下方からの蛍光発光に基づくセンサの実施形態である。
【図４】円盤の形態の実施形態である。
【図５Ａ】電荷結合（ＣＣＤ）カメラ下に増加するグルコース濃度による本発明による検出システムの蛍光発光である（グルコース脱水素酵素およびＮＡＤ+）。
【図５Ｂ】電荷結合（ＣＣＤ）カメラ下に増加するグルコース濃度による本発明による検出システムの蛍光発光である（グルコース脱水素酵素およびＮＡＤ+）。
【図１】
2005532796.tif 000005
【図２】
2005532796.tif 000006
【図３】
2005532796.tif 000007
【図４】
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【図５】
2005532796.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月7日(2004.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）補酵素の再生が行われない条件下において、酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と試料とを接触させる工程であって、酵素として脱水素酵素が使用される工程と、（ｂ）酵素−補酵素複合体の変化によって分析物の反応を検出する工程とを含む、酵素反応による試料中の分析物の検出方法。 
【請求項２】
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）またはアミノ酸脱水素酵素、たとえばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
フラビン誘導体、ニコチン誘導体、およびキノン誘導体から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項１、２または３記載の方法。
【請求項４】
ＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2、補酵素Ｑ、ＰＱＱ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ／Ｈ+から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
光学的方法によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
吸収、蛍光発光、ＣＤ、ＯＲＤの測定法または屈折率測定法によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
蛍光発光の測定によって補酵素の変化が検出されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
検出試薬としてその中に挿入される酵素−補酵素複合体を有するゲルマトリックスが使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６または７記載の方法。
【請求項９】
ゲルマトリックスが層厚≦５０μｍ、特に≦５μｍを有することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
光重合性物質を基剤とするゲルマトリックスが使用されることを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
体液中の分析物が測定されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の方法。
【請求項１２】
血中のグルコースの測定が実施されることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
分析物の反応が≦５秒の持続時間を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
反応が、補酵素との反応を生じ得る媒介物の不存在下に実施されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３記載記載の方法。
【請求項１５】
分析物に対する化学量論的反応パートナーとして酵素−補酵素複合体が使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）補酵素の再生が行われない形態における酵素−補酵素複合体を含む検出試薬であって、酵素として脱水素酵素が使用される検出試薬と、（ｂ）検出試薬を吸収する担体とを含む試料中の分析物の検出のための試薬システム。
【請求項１７】
酵素−補酵素複合体がゲルマトリックス中に挿入されることを特徴とする請求項１６記載の試薬システム。
【請求項１８】
担体が少なくとも部分的に光学的に透明であることを特徴とする請求項１６または１７記載の試薬システム。
【請求項１９】
担体が本質的に平面構造を含むことを特徴とする請求項１６、１７または１８記載の試薬システム。
【請求項２０】
担体が複数の異なる検出試薬を含むことを特徴とする請求項１６、１７または１８記載の試薬システム。
【請求項２１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載の方法における請求項１６、１７、１８、１９または２０記載の試薬システムの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月6日(2005.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）補酵素の再生が行われない条件下において、酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と試料とを接触させる工程であって、酵素として脱水素酵素が使用される工程と、（ｂ）酵素−補酵素複合体の変化によって分析物の反応を検出する工程とを含む、酵素反応による試料中の分析物の検出方法。
【請求項２】
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）またはアミノ酸脱水素酵素、たとえばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
フラビン誘導体、ニコチン誘導体、およびキノン誘導体から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ＦＡＤ、ＦＡＤＨ2、ＦＭＮ、ＦＭＮＨ2、補酵素Ｑ、ＰＱＱ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨ／Ｈ+、ＮＡＤＰ+、ＮＡＤＰＨ／Ｈ+から選択される補酵素が使用されることを特徴とする請求項３記載の方法。 
【請求項５】
分析物の反応が≦５秒の持続時間を有することを特徴とする請求項１、２、３または４記載の方法。
【請求項６】
反応が、補酵素との反応を生じ得る媒介物の不存在下に実施されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載の方法。 
【請求項７】
（ａ）補酵素の再生が行われない形態における酵素−補酵素複合体を含む検出試薬と、（ｂ）検出試薬を吸収する担体とを含む試料中の分析物の検出のための試薬システム。 
【請求項８】
担体が複数の異なる検出試薬を含むことを特徴とする請求項７記載の試薬システム。 
【国際調査報告】
2005532796.tif 000010
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