(57)【要約】本発明は、遺伝子制御とも称される、細胞中の遺伝子発現の調節に関し、特に種々の疾病の治療に関する。本発明は、細胞にペプチドまたはその機能的類似体を含むシグナル分子を投与することから成る、細胞中の遺伝子発現を調節する方法を提供する。さらに本発明は、細胞にペプチド、またはその誘導体もしくは類似体を投与し、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することを含む、細胞中で遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞に、ペプチドまたはその機能的類似体を含むシグナル分子を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペプチドは、ペプチドＬＱＧ、ＡＱＧ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＡＰＱ、ＶＬＰＡＬＡＱ、ＬＡＧＶ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＡ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＡＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＬＰＡ、ＧＶＬＰＡＬＰ、ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＭＴＲＶ、ＭＴＲ、ＶＶＣ、およびこれらの機能的類似体または誘導体の群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記シグナル分子は、遺伝子転写因子の転座および／または活性を調節することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子転写因子は、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞中の遺伝子の発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定する、または得る方法であって、前記細胞に、ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与することと、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記シグナル分子が膜透過可能であるか否かを測定することをさらに含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子転写因子は、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質を含むことを特徴とする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
細胞中の遺伝子の発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定する、または得る方法であって、前記細胞に、ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与することと、前記細胞において発現した少なくとも１つの遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記細胞において発現した少なくとも１つの遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することをさらに含むことを特徴とする請求項５、６または７記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞において発現した多数の遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することをさらに含むことを特徴とする請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
細胞中の遺伝子の発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定する、または得る方法であって、ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を供給することと、前記ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、遺伝子制御に関連する因子との結合を測定することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
多数のペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を供給することと、少なくとも１つの前記ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体と、遺伝子制御に関連する因子との結合を測定することとをさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子制御に関連する前記因子は、転写因子を含むことを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記転写因子は、ＮＦ−カッパＢ−Ｒｅｌタンパク質を含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞に、前記ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与することと、前記細胞において遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することとをさらに含むことを特徴とする請求項１１〜１４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
細胞に、前記ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与することと、前記細胞において発現した少なくとも１つの遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することとをさらに含むことを特徴とする請求項１１〜１５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞中の遺伝子の発現の調節に有用であり、かつ請求項５〜１６のうちいずれか１項に記載の方法を用いて同定可能な、または得られることを特徴とするシグナル分子。
【請求項１８】
ペプチド、ＬＱＧ、ＡＱＧ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＡＰＱ、ＶＬＰＡＬＡＱ、ＬＡＧＶ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＡ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＡＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＬＰＡ、ＧＶＬＰＡＬＰ、ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＭＴＲＶ、ＭＴＲ、ＶＶＣ、およびこれらの機能的類似体もしくは誘導体の群から選択されることを特徴とする請求項１７記載のシグナル分子。
【請求項１９】
細胞中の遺伝子の発現を調節できるシグナル分子であって、多くとも３０のアミノ酸のペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含むことを特徴とするシグナル分子。
【請求項２０】
前記ペプチドは、約３〜約１５アミノ酸長のオリゴペプチドであることを特徴とする請求項１９記載のシグナル分子。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のうちいずれか１項に記載のシグナル分子を含むことを特徴とするＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質の活性化の阻害剤。
【請求項２２】
遺伝子発現調節用の医薬組成物を製造するための請求項１７〜２０のうちいずれか１項に記載のシグナル分子の使用方法。
【請求項２３】
ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質の活性化を阻害することによって遺伝子発現を調節するための請求項２２記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本特許出願は、米国においては、２００１年１２月２１日に出願された米国特許出願番号第１０/０２８０７５号の一部継続出願である。
【０００２】
遺伝子制御は、一般に、１）転写（開始または終止）、２）一次転写のプロセシング、３）ｍＲＮＡの安定化または不安定化、および４）翻訳、の４つの段階で起こると考えられている。細胞内の遺伝子制御の一次機能は、細胞の酵素機構をその栄養的、化学的および物理的環境に適合させることである。
【０００３】
遺伝子発現は、転写と翻訳の両方の段階で制御されていると一般に考えられている。遺伝子発現の制御または調節には、転写因子と呼ばれる因子を必要とする。用語「遺伝子制御または調節」は、またｍＲＮＡの構築と使用とも言う。制御は、多くの種々の分子段階で発揮され得るが、特異的転写がおそらく最も頻繁に原核生物および真核生物内の特異なタンパク質合成の速度を明示している。活性化蛋白（activator protein）（転写因子または転写活性化物質とも呼ばれる）は、ＤＮＡに結合し、細胞内の転写機構をプロモーターに補充し、それによって遺伝子発現を刺激する。さらに、細胞核内におけるＲＮＡ転写体の特異的プロセシング、細胞質内におけるｍＲＮＡの特異的安定化およびｍＲＮＡのタンパク質への特異的翻訳もまた真核細胞遺伝子制御において重要である。これらのステップは、転写回路における調節とあらゆる段階における誤調節を規定している。
【０００４】
それが原核生物または真核生物由来であっても単細胞においては、単細胞の頻繁な広範囲な変動しやすい環境を反映して、細胞のその環境への応答は外界からの多数の刺激によって影響を受けているのに対して、多細胞生物のほとんどの細胞は、おそらく、かなり一定の環境を経験する。おそらくこの理由で、単細胞生物の場合よりも多細胞生物では、環境変化への応答に専念する遺伝子は全数の遥かに少数部分である。
【０００５】
上記のように、細胞は、細胞外シグナルを通して細胞が感知する環境変化に反応する。これらシグナルは、物理的（例えば光、温度、圧力および電気）または化学的（例えば、食物、ホルモンおよび神経伝達物質）であり得る。細胞は、シグナルの感知と産生の両方をすることが出来る。このことによって、細胞は互いに連絡することが出来る。このことを達成するために、単細胞生物および多細胞生物内には複雑なシグナル感知機構とシグナル産生機構がある。
【０００６】
細胞膜透過性と細胞不透過性の、２つのグループの化学シグナルが識別され得る。細胞透過性シグナル分子は、エストロジェン、プロゲステロンおよびアンドロジェンのようなステロイドホルモンの大きな集団を含んでいる。ステロイドは形質膜を通過し、細胞の細胞質または核中に分布する特異的受容体に結合する。ホルモンの結合の後、受容体はコンフォメーションの変化を起こす。その受容体はそれゆえＤＮＡ自体に結合することが出来るかまたはその結果ＤＮＡと相互作用するタンパク質に結合できる。一般にステロイドはこの過程によって直接遺伝子発現を制御することが出来る。膜不透過性のシグナル分子には、アセチルコリン、成長因子、細胞外基質成分、（ペプチド）ホルモン、神経ペプチド、トロンビン、リゾフォスファチジン酸、酵母交配(yeast mating)因子、そして社会性アメーバキイロタマホコリカビ（Dityostellium discodeum）に関しては、葉酸およびサイクリックＡＭＰが含まれる。それらはそれ自体膜透過性であるが細胞外でのみ作用する。すなわち、細胞の形質膜上に分布する受容体によって認識される。受容体は、１つの特有のシグナル分子、または密接に関連したシグナル分子ファミリーに特異的である。それらのリガンンドが結合したとき、これの受容体は数種の機構でシグナルを伝達する。
【０００７】
多細胞生物の遺伝子制御に特徴的かつ厳格な要件は、正当な遺伝子が正当な細胞内で正当な時に活性化するように厳密な発生上の決定を遂行することである。この発生上の決定は、例えば胚形成および器官形成中に、または疾病への反応で観察されるように生物の発生自体に関係する決定ばかりでなく、子孫を後に残すことなく単にその遺伝的プログラムを実質的に実行する細胞の分化、増殖またはアポトーシスをも包含する。
【０００８】
皮膚細胞、赤血球前駆体、目のレンズ細胞および抗体産生細胞のような細胞も、しばしば個々の細胞の生存ではなく、生物全体の必要性のために働く遺伝子制御のパターンによって制御される。
【０００９】
分子シグナル、レベルおよび機構の少なくとも遺伝子制御の３つの構成要素があることが一般に推測されている。最初に、特異的な遺伝子が応答することのできる特異的シグナル化分子が推測された。２番目に、制御は、タンパク質合成においてＤＮＡの転写からｍＤＮＡの使用まで導いている連鎖反応内で１つまたはそれ以上の段階（すなわち１段階または複数段階）においてなされる。第３に、これらの各段階で特異的分子機構が携わり、最終的に遺伝子が発現するよう統制する。
【００１０】
多くの遺伝子は、細胞内に入るシグナル分子ばかりでなく細胞表面上の特異的受容体に結合する分子によって制御されている。細胞表面受容体とそのリガンド間の相互作用の次にいわゆるセカンドメッセンジャー（ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋、サイクリックヌクレオチド）の細胞内レベルでの変動を含み、細胞内反応のカスケードが続く。その結果、２次伝達物質は、ジアシルグリセロールによって活性化される、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ，カルシウム活性化プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼＣの作用を通じてタンパク質リン酸化へと進む。
【００１１】
細胞表面受容体へのリガンドの結合に対する多数の応答は、細胞質的であって細胞核内で即時には遺伝子活性化に関与しない。しかしながら、いくつかの受容体−リガンド相互作用が、転写活性を特異的でかつ限定された１群の細胞核内で即時に引き起こすことが知られている。たとえば、原始癌遺伝子，ｃ−ｆｏｓは、既知のほとんど全ての２次伝達物質の上昇、および、血小板由来成長因子および上皮細胞成長因子の少なくとも２つの成長因子によって、いくつかの細胞型の内で活性化されることが知られている。しかしながら、正確にどのようにしてそのような活性化が行われるのかを測定することについての進歩は遅かった。少数の例において、細胞表面シグナルに応答する転写タンパク質が特徴付けられている。
【００１２】
先在的な不活性転写因子が活性化し、それに続く細胞表面相互作用が起る明確な例の１つは、核因子（ＮＦ）−カッパＢであり、これはＢリンパ球内でカッパクラスの免疫グロブリンをコード化している遺伝子の転写を刺激することからもともと検出されたものである。カッパ遺伝子内のＮＫ−カッパＢの結合部位はよく規定され（たとえば、P.A .Baeuerle and D. Baltimore, 1988, Science 242:540参照）、活性因子の存在を測定する方法を提供する。この因子は阻害物質と複合化してリンパ球の細胞質内に存在する。分離した複合体をインビボで緩和な変性化条件で処理することによって、複合体は解離し、すなわち、ＮＫ−カッパＢがそのＤＮＡ部位に結合するように遊離する。細胞内の活性化ＮＫ−カッパＢの遊離は、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）および細胞外ポリペプチド並びに細胞内ホスホキナーゼを刺激する化学分子（たとえばホボールエステル）で細胞を処理することを含む種々の刺激の後に起こることが現在知られている。したがって、多くの可能性のある刺激によって引き起こされるリン酸化は、ＮＦ−カッパＢの活性状態への転換のゆえであり得る。活性因子は、それから細胞核へ移行し、活性ＮＦＲ−カッパＢの結合部位を有する遺伝子のみの転写を刺激する。
【００１３】
炎症反応には、連続的なメディエーターの遊離および炎症部位で活性化されさらにメディエーターを遊離する循環白血球の補充が関与している（Nat．Med. 7:1294, 2001。この応答は、自己限定性であって、内因性抗炎症メディエーター遊離と炎症細胞の排泄を通して消散する。白血球の持続的蓄積と活性化は慢性炎症の特徴である。炎症治療の最近の方法は、プロ−炎症メディエーター産生の阻害と炎症応答を開始する機構を阻害することに頼っている。しながら、炎症応答の消散機構は慢性炎症の治療で新しい標的を提供するかもしれない。炎症消散の種々の実験モデルにおける研究によって、いくつかの仮想機構と炎症消散のメディエーターが確認された。我々は、シクロペンテノンプロスタグランジン(ｃｙＰＧｓ)が内因性抗炎症メディエーターであり、インビボで炎症の消散を促進することを示した。他の研究者は、炎症の消散中に、抗炎症リポキシンが一時的に産生されるようになることを示した。近年、アポトーシスがインビボにおける炎症消散の重要な機構として確認された。白血球アポトーシスの欠陥が炎症疾患の病原論において重要であると主張されている。加えて、白血球のアポトーシスを選択的に誘導することは、炎症疾患への新しい治療法を提供する可能性がある。
【００１４】
ＮＦ−カッパＢが、多くの人によって疾患の一次エフェクターであると思われていることを考え（A.S. Baldwin, J. Clin. Invest., 2001, 107:3-6）、慢性および急性疾患状態の治療に使用されるＮＦ−カッパＢの安全な阻害剤を開発するために、数多くの努力がなされつつある。ＮＦ−カッパＢの特異的阻害剤は、ＮＳＡＩＤＳおよびグリココルチコイドのような薬剤に付随する副作用を低減し、人および動物の疾患治療のための重要な可能性を提供するであろう。ＮＦ−カッパＢの阻害によって患者が利益を得ることのできる疾患および症候群は広範であり、リウマチ、アテローム動脈硬化症、多発性硬化症、慢性炎症性脱髄多発性神経根炎、喘息、炎症性腸疾患からヘリコバクタピロリ随伴性胃炎および他の炎症応答までの範囲にわたり、グルチコステロイド、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸、アスピリン、テポキサリン、レフロノミド、クルクミン、抗酸化剤およびプロテアソーム阻害剤のようなＮＦ−カッパＢ活性に影響のある種々の薬剤がある。これら薬剤は非特異的で、しばしば個々の治療のために毒性を現す可能性がある高い濃度でのみ適用可能であると考えられている。
【００１５】
転写因子の細胞質での不活性型は、ＮＦ−カッパＢの場合のように阻害剤を除去することによって、あるいはまた、インターフェロンアルファで刺激された因子（D.E.Levy et al., 1989, Gene and Development 3:1362）の場合のように、それ自身ではいずれも活性ではない２種の(またはそれ以上の)たんぱく質の結合によって活性化され得る。インターフェロンアルファがその細胞表面受容体に結合した後、そのタンパク質の１つは1分間以内またはそれより短い時間内に変化され、2つは結合することができる。活性（結合した）因子は、それから細胞核に移行し、そのタンパク質が結合部位を有する遺伝子の転写のみを刺激する。インターフェロンアルファが病原体および自己抗原で標的とされた身体の応答のメディエーターであることを考えると、インターフェロンアルファで刺激された因子の影響下にある遺伝子の調節を調整することは、人および動物の種々の病気の治療に寄与するであろう。
【００１６】
細胞表面受容体との相互作用を経て遺伝子発現に影響を及ぼすシグナル分子の他の典型的な例は、インシュリン、グルカゴン、ＥＦＧ、ＶＥＦＧのような成長因子などである。
【００１７】
ステロイドホルモンとその受容体は、転写に影響を及ぼす最も理解された事例の１つである。ステロイドホルモンは脂質膜に溶解するので、細胞内に拡散することができる。それらは、部位特異的ＤＮＡ結合分子である特異的な分子内受容体へ結合することによって、転写に影響を及ぼす。細胞内に入り細胞内で作用するシグナル分子の他の例は、甲状腺ホルモン（Ｔｓ）、ビタミンＤおよびレチノイン酸およびその他の、細胞内に入り遺伝子発現を調節する小さい脂溶性のシグナル分子である。これらシグナル分子の受容体の特徴的なＤＮＡ結合部位は応答配列(response  element)としても知られている。
【００１８】
遺伝子発現の調節に関与している小分子のもう1つの例は、たとえば果実の熟成に関与している遺伝子の発現を誘導するエチレンガスである。オーキシンおよびサイトキニンとして知られている植物の小さなホルモンも、遺伝子発現を調節することによって植物の成長および分化を直接調節する。
【００１９】
遺伝子調節の調節因子の重大な役割を考え、遺伝子発現のエラーを修復する方法に使用することができる人工または合成の対応物の開発は、化学と生物学の境界域における長期にわたる目標であった。
【００２０】
本発明者らは、遺伝子調節剤として機能する人工または合成化合物の同定と開発に予期せざる急速な進歩が見込まれる細胞性生物の遺伝子発現における知見、そして医薬組成物の生産のための新規化学物質としての用途またその疾病の治療における用途を明らかにした。生物の内因性タンパク質のタンパク質分解によって派生する、または病原体タンパク質の、すなわち該病原体が宿主に存在している間のタンパク質分解によって派生する多数の小ペプチドが、該生物の細胞で非常に特異的な遺伝子制御活性を発揮するという知見がここで提供される。特有の実施形態で、本発明は、種々の異なった条件および環境下でＮＦκＢ−誘発の遺伝子発現を制御する機構に関する知識の質と量を促進する研究者のために大きな価値がある。
【００２１】
この知見によって、本発明は、特に、細胞内で遺伝子の発現を調節することができるペプチド、その機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または得るためのスクリーニング方法を提供するものであって、それがインビトロまたはサルのような実験動物もしくはラットまたはマウスのような試験室小動物でのインビボであれ、該細胞（または動物）に少なくとも1つのリードペプチド、またはその誘導体もしくは類似体を投与し、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定すること含み、特に該リードペプチドは、３〜１５アミノ酸の長さ、もっとも好ましくは４〜６アミノ酸の長さのものであることを特徴とする。
【００２２】
機能的誘導体および類似体は、たとえばＮＦ−カッパＢ試験でのＮＦ−カッパＢまたはＡＰ−１試験でのＡＰ−１のような適当な転写因子の各転座を測定することによって測定することのできるシグナル分子の効果または活性に関係する。フラグメントは、それでも機能的活性を示すかぎりは、一方または両側で幾分小さく(すなわち１または２アミノ酸)またはそれよりも大きくすることができる。
【００２３】
その方法が、たとえば、処置された細胞または動物のようなものの中でサイトカイン転写段階またはその現実的な存在を検出することによって測定されたサイトカインの転写を前記の遺伝子転写因子が調節しているかどうかを測定することをさらに含むか、または、前記遺伝子転写因子がＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌ蛋白を含むかどうかを測定することを含む、または上記の細胞中で発現された、少なくとも１つの興味ある遺伝子の、もしくは前記細胞内で発現された多数の遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することによる、遺伝子チップ技術または以後に説明する他の方法の何れかで容易に実施されるような、本発明のスクリーニング方法も提供される。
【００２４】
本発明はまた、それがインビトロであれサルまたはラットもしくはマウスのような実験小動物でのインビボであれ、細胞内の遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するためのスクリーニング方法を提供するものであり、この方法は、リードペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を細胞に（または動物に）投与し、該細胞内の少なくとも１つの遺伝子の相対的アップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することを含み、特に、該リード化合物はここで同定される程度の充分小さいものである。
【００２５】
細胞内の遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくはそれらの類似体を含むシグナル分子を同定または得るためにここで提供される方法は、（インビトロであれインビボであれ）リードペプチドまたはその機能的誘導体もしくはその類似体を投与すること、および該ペプチドまたは機能的誘導体もしくはその類似体の、特にサイトカインを調節する転写遺伝子のような遺伝子制御に関連する因子との結合を測定すること、または、該ペプチドが投与された該細胞内の遺伝子転写因子の転写の活性および／または核転座を測定することもまた含むことができる。
【００２６】
好ましくは、前記リードペプチドがそれらの誘導体または類似体のライブラリーの１メンバーであり、特に、該ライブラリーが天然に存在するペプチドから派生したものをもとに選択されることを特徴とする、本発明のスクリーニング方法が提供される。ここで提供されるリードペプチド技術を使用することに基づき、ヒトまたは動物の治療に有用な新規な化学的知見を見出すことを目的とする研究のために、前記タンパク質は哺乳動物のタンパク質が好ましく、ヒトのタンパク質がもっとも好ましい。タンパク質配列は、ヒトゲノムのために提供されるような通常入手可能なデータベースから得ることができる。リードペプチドのライブラリーを入手できる他の有用なタンパク質は、病原体由来のタンパク質である。栽培作物中のタンパク質の有用性を確認するために、いくつかの植物タンパク質データベースが利用される。
【００２７】
好ましい実施形態では、ＭＨＣコンテクスト内で認識されると予測または考えられる前記のライブラリー中のリードペプチドが、タンパク質分解部位の予見の手引きの基に選択されることを特徴とする本発明のスクリーニング方法が提供され、リードペプチドの例として、抗原決定基として認識され、ＨＬＡ分子条件下で提示されると予想される次のｈＣＧ由来ペプチドが例示される。ＴＭＴＲＶＬＱＧＶ、ＶＬＱＧＶＬＰＡＬ、ＶＬＰＡＬＰＱVVＣＮＹＲＤＶＲ，ＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩ，ＬＰＱVVＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩ。もう１つの実施形態では、例えば、ＶＬＱＧＶＬＰＡＬおよびＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣＮＹＲＤＶＲの例に見られるごとく、前記のライブラリー中の少なくとも１つの前記ペプチドが前記のライブラリー中のもう１つのペプチドと本質的に重複していることを特徴とするスクリーニング方法を提供する。有用なリードペプチドの他のセットまたはライブラリーは、たとえばＬＱＧＶ、ＱＧＶＬ，ＧＶＬＰなど、またはＱＧＶＬＰＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＰＡＬＰＱＶなどでここに例示されるように、１つまたは２つのアミノ酸以外の全てを重複するように重複を非常に厳格にすることによって設計することができる。
【００２８】
もちろん、本発明は、細胞内遺伝子の発現を調節するのに有用でかつここで提供される本発明のスクリーニング方法を実施することによって同定可能または取得可能なシグナル分子として働く新規な化学的知見を提供することを目的とする。さらに詳述するように、有用なシグナル分子が、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質の調節剤としてここで充分に提供される。本発明は、たとえば、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質の活性化を阻害することによって遺伝子発現を調節するための医薬組成物の生産用に提供されるシグナル分子の用途、あるいは霊長類または家畜の治療用の医薬組成物の生産のためにその用途をも提供する。
【００２９】
小ペプチド、および分解産物でさえも生物活性を有することができることが既に知られている。内因性のまたは病原体由来タンパク質のタンパク質分解的な分解産物は、たとえばプロテアソームシステムによって日常的に生成されてクラスＩまたはＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の条件下で提示される。古典的に既知の神経ペプチド（ペプチド神経伝達物質としても知られている）または、抗利尿ホルモン、オキシトシン、サイロトロピン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ソマトスタチン、ガストリン、コレシストキニン、サブスタンスーＰ、エンケファリン、ニューロテンシン、アンジオテンシンのような小ペプチドおよびその誘導体または等価物が細胞表面受容体の相互作用によって一般に伝達される個別の生物活性を有することも認識されている。
【００３０】
さらに今や、ある種の小さなそしてアルギニンまたはリジンまたはプロリンに富んだペプチド、すなわち、５０％以上アルギニン、もしくは５０％以上リジンもしくは５０％以上プロリン、または、５０％以上アルギニンとリジン、もしくは５０％以上アルギニンとプロリン、もしくは５０％以上リジンとプロリン、もしくは５０％以上アルギニン、リジンおよびプロリン、の残基を有する小さなペプチドが生物活性を引き起こすことができる個別の膜透過性特性を有していることが知られている。
【００３１】
しかしながら、本発明は、古典的に既知の神経ペプチドまたはペプチドホルモン以外の、または上述のアルギニン、リジンまたはプロリンに富んだペプチド以外の小ペプチドに関する。本発明のペプチドおよび本発明によって提供されるスクリーニング方法でリードペプチドとしての使用されるペプチドは小さいことが好ましい。もっとも好ましい大きさは、４〜６アミノ酸で、２〜３アミノ酸のペプチドまたは7〜９アミノ酸のペプチドも非常によく適しており、１０〜１５アミノ酸のサイズも適しているが本発明の方法を試験するためには有用性が低下し、そして１０〜１５アミノ酸またはそれ以上のものは好ましくは機能的にもっと活性なより小さいフラグメントに分解される。
【００３２】
既述の通り、本発明は、生物の内因性タンパク質のタンパク質分解によって誘導し得るもしくは得られる、または病原体タンパク質のすなわち宿主生物の中に該病原体が存在する間にタンパク質分解によって誘導し得るかもしくは得られる小ペプチドが該生物の細胞上でしばしば非常に特異的な遺伝子調節活性を発揮し得るという知見を提供する。この知見は、遺伝子の発現を調節するために小さな（オリゴ）ペプチド、またはその修飾体もしくは誘導体、（ここでは合わせてリードペプチドと呼ぶ）の能力または資質についての情報を得ることによって、本発明で提供される方法を実践または遂行するための体系的研究方法の直接的な動機を生み出す。ここで提供される方法は、例えば前記ペプチド、その修飾体もしくは誘導体を少なくとも1つの細胞と接触させる段階および該細胞内にまたはそれに由来する遺伝子産物を測定することを含む。
【００３３】
そのような方法は、前記リードペプチドが天然に存在するポリペプチドのフラグメントに対応する配列を含むときに特に有用である。この典型的な方法はこの天然に存在するホルモンが絨毛性ゴナンドトロピンホルモン（ｈＣＧ）のようなホルモンを含むことを特徴とする。しかしながら、免疫グロブリン、熱ショックタンパク質、Ｃｙｓプロテアーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、(セリン／トレオニン,またはチロシン)キナーゼ、受容体タンパク質、プロテインホスファートのような広範囲で多様なクラスから選択される他のタンパク質も、リード化合物が設計されるタンパク質を選択するときにまず考慮される。他のタンパク質は、出発点としても考慮される。出発点として病原体タンパク質を特筆する価値がある。たとえば、ヒトおよび動物に抱虫症を引き起こすチーニアとの関係、住血吸虫、マラリア、またはトリパノソーマ、ジアルジア、ジクチオカウルスなどの関係のように、特に一定期間その宿主と内生的関係で生きている寄生病原体由来のタンパク質を選択する価値がある。他の注目に値する病原体は、（ミコ）バクテリアおよびウイルスに観察されるような細胞内生物である。
【００３４】
１つの実施形態では、たとえば、多数のリードペプチドが試験され、個々のリードペプチドを期待し、または一群のリードペプチドが試験の連続的繰り返しでさらに試験され、それによってたとえば記載したように他の（Ｄ−またはL−、非天然のまたは天然の）アミノ酸または修飾体または誘導体の置換または置き換えによって、所望のものにリードペプチドを修飾することのできる(いわゆるペプチドライブラリー内で)コンビナトリアルケミストリー方法に基づき、本発明で系統的に提供される試験を実施するのが好ましい。特に、そのような最適化の連続的繰り返しによって、本発明は、該細胞にペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を投与し、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定しそれから所望の活性を有する分子を合成することを含む、細胞中で遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得する系統的な方法を提供する。
【００３５】
このようにして、系統的方法で、遺伝子発現を調節するためのリードペプチド、またはその修飾体もしくは誘導体の資質または能力に関する情報、検討中の遺伝子もしくは遺伝子類を調節することを目指す治療方法を得ることが初めて可能である。リードペプチド、またはその修飾体もしくは誘導体の資質または能力についての情報を得る方法が本発明で提供され、この方法は、リードペプチドまたはその修飾体を少なくとも１つの細胞と接触させ該細胞から由来する少なくとも１つの遺伝子の存在を測定する段階を含む。
【００３６】
すでに述べたとおり、リードペプチドは、天然タンパク質のような天然に存在するポリペプチドから誘導することができる。３〜１５アミノ酸を含むリードペプチドが好ましくは使用される。それらは研究中にプロテオームから誘導されて、無作為的に試験され得る。リードペプチドは、重複アミノ酸配列およびポリペプチドの予測された化学的または酵素的な分解／消化により生じたペプチドを含むことができる。リードペプチドは、線状ペプチドおよび環状ペプチドであり得る。天然に存在するタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナンドトロピンホルモン（ｈCG）のような内因性タンパク質であることができる。さらに、それは、たとえば、ボルデテラ、エルジニア、トキソプラザウマゴンディおよびアフリカ豚熱病ウイルスから誘導されたペプチドであることができる。既述のとおり、多数の病原体は、ＮＦ−カッパＢ活性化を阻害することによって宿主の免疫反応を無効にするか回避するために進化した機構を有している。一方、ＨＩＶ−１、ＣＭＶおよびＳＶ−４０を含めていくつかのウイルスは、感染部位で活性化された宿主の因子としてのＮＦ−カッパＢを利用する。病原体のポリペプチドから誘導されるリード化合物の宿主遺伝子発現への影響を測定することを含む、宿主―病原体相互作用の研究法が提供される。
【００３７】
１つの実施形態で、タンパク質配列から誘導される重複リードペプチドの系統的スクリーニングであるリニアースキャン(linear scan)が生物検定と共に実施される。そのような生物検定は、遺伝子発現の調節をするための、リードペプチド、またはその修飾体もしくは誘導体の資質または能力についての情報を得るための検定を含む。たとえば、１５−マー、または１２−マー、または９−マー、または８−マー、または７−マー、または６−マー、または５−マー、または４−マー、または３−マー  ペプチドでのスキャンによって、相互作用部位を形成し遺伝子発現を調節する能力または資質があるリード化合物の同定を可能にするアミノ酸の直線的長さについての有用な情報が得られる。リード化合物は、その遺伝子発現を調節する能力または資質を修飾することができ、それは、レポーターアアッセイのようなインビトロ生物検定で容易に検定できる。たとえば、いくつかの位置のいくつかのアミノ酸は、類似または異なった性質のもう１つのアミノ酸で置換することができる。Ａｌａ残基による各アミノ酸の系統的な置換を含むアラニン（Ａｌａ）置換スキャニングは、遺伝子発現を調節することができるシグナル分子を検索するときに、リードペプチドのアミノ酸組成を修飾するために都合のよい研究法である。もちろんそのような置換スキャニングまたはマッピングは、たとえば、Ｄ−アミノ酸のようなＡｌａ以外のアミノ酸ででも実施することができる。１つの実施形態では、天然に存在するポリペプチドから誘導されるペプチドが、細胞中の遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有するので同定され得る。続いて、種々の合成Ａｌａ−変異体が製造される。これらＡｌａ−変異体は、遺伝子の発現を調節するその向上または改善された能力について、リードペプチドと比較してスクリーニングされる。
【００３８】
さらに、リードペプチドまたはその修飾体は、Ｄ−および／またはＬ−立体異性体を使用して化学的に合成することができる。たとえば、天然由来のオリゴペプチドの逆転換体であるリードペプチドが製造される。ポリペプチド逆変換の概念（天然のＬ−アミノ酸を含有する親配列をＤ−アミノ酸を使用して逆の順序に組み立てること）が、合成ペプチドの合成に適用され成功した。ポリペプチド結合の逆変換修飾は、多数の生物活性ペプチド類に応用された新規生物活性分子の設計のために広く使用された擬似ペプチドの研究に進化した。この配列、アミノ酸組成およびペプチドの長さは、正確な組み立てと生成が実現可能かどうかに影響をおよぼす。この因子はまた最終生成物の溶解性を決定する。粗製ペプチドの純度は、その長さが長くなるにつれ通常、減少する。１５残基以下のアミノ酸配列のペプチドの収率は通常充分で、そのようなペプチドは、通常、困難なく製造することができる。ペプチドの全アミノ酸組成は、重要な設計上の可変要素である。ペプチドの溶解性は組成によって強く影響を受ける。Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐのような疎水性残基の含量が多いペプチドは、水溶液中で限定された溶解度を持つかあるいは完全に溶解しない。このような状況では、実験にペプチドを使用することは困難であり、もし必要なときにペプチドを精製することが困難である。良好な溶解性を得るために疎水性アミノ酸含量を５０％以下に保ち、５個のアミノ酸ごとに少なくとも荷電した残基が確実にあるようにすることが望まれる。生理学的ｐＨでＡｓｐ，Ｇｌｕ，ＬｙｓおよびＡｒｇはすべて、荷電した残基を有する。ＡｌａをＧｌｙで置換するような単一の同類置換、またはＮ−もしくはＣ−末端に１セットの極性残基を加えることによって溶解性を改良できる。複数のＣｙｓ，ＭｅｔまたはＴｒｐ残基を含有するペプチドもまた、これら残基が酸化およびまたは副反応を起こし易いので、高純度で得ることが困難である可能性がある。もし可能なら、これら残基を最少にするように配列を選択すべきである。あるいは、いくつかの残基に同類置換をすることができる。たとえば、Ｍｅｔの置換にＮｌｅが使用でき、Ｃｙｓの低反応性置換として時々Ｓｅｒが使用される。もし、タンパク質配列から多数の連続したまたは重複したペプチドが作られるならば、各ペプチドの出発点を変えると、親水性と疎水性残基間のバランスをより良くすることができる。個々のペプチドに含まれるＣｙｓ，ＭｅｔおよびＴｒｐの数を変えると同様な効果が得られる。本発明のもう１つの実施形態では、遺伝子発現を調節することができるリードペプチドが、化学的に修飾されたペプチドである。ペプチド修飾には（たとえば、Ｔｙｒ，ＳｅｒまたはＴｈｒ残基の）リン酸化、Ｎ−末端のアセチル化、Ｃ−末端アミド化、Ｃ−末端ヒドラジド化、Ｃ−末端メチルエステル化、脂肪酸の付加、スルホン化（チロシン）、Ｎ−末端ダンシル化、Ｎ−末端スクシニル化、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（ＰＡＭ３  Ｃｙｓ−ＯＨ）およびＣｙｓ残基のファルネシル化が含まれる。リードペプチドの系統的化学修飾は、たとえば、リードペプチドの最適化工程で実施することができる。
【００３９】
種々の既知の技術を使用して、合成ペプチドを得ることができる。これには、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）および液相有機合成（ＳＰＯＳ）技術が含まれる。ＳＲＰＳは、ペプチドおよび小さいタンパク質を合成するための迅速かつ容易な方法である。Ｃ−末端アミノ酸が通常交差結合ポリスチレン樹脂に酸に不安定な結合を経てリンカー分子で結合される。この樹脂は合成に使用される溶媒には不溶であり、このことによって、過剰の試薬と副生成物を洗浄除去するのが比較的簡単で迅速である。
【００４０】
一般に、アミノ酸は４つの他の基：水素、アミノ基、カルボキシ基および側鎖基、によって取り囲まれている中心炭素（a−炭素と呼ばれる）から成っている。Ｒと示される側鎖基は、アミノ酸の異なる構造を規定する。ある種の側鎖は、アミド結合の生成を妨げる官能基を含んでいる。従って、アミノ酸側鎖の官能基をマスクすることが重要である。N−末端は 酸に安定であるが塩基で除去できるＦｍｏｃまたはＢｏｃ基で保護することができる。どんな側鎖官能基も、塩基に安定で酸に不安定な基で保護される。各結合を始めるために、樹脂結合アミノ酸／ペプチド上のマスキング基は、N，N−ジメチルホルムアミド（DMF）中の２０％ピペリジンで除去される。それから洗浄されそのアルファカルボキシキ基が活性化された保護アミノ酸が加えられる。その活性化は、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBｔ）エステルをその場で作り出すことによって成される。活性化されたアミノ酸と樹脂結合アミノ酸は、新しいペプチド結合を形成するために塩基の存在下で反応される。この工程は、目的のペプチドが樹脂に組み立てられるまで繰り返される。ペプチドが完成したら、樹脂から切断する準備ができる。これは、トリフルオロ酢酸（TFA）とスカベンジャーの混合物を使用して遂行される。スカベンジャーは、側鎖保護基の除去の間に生成するカチオンを中和するために働く。その溶液は、少なくとも８０％ＴＦＡと、その他フェノール、チオアニソール、水、エタンジチオール（ＥＤＴ）およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の混合物である。樹脂上のリードペプチドは数時間切断用の混合物と反応させられ、それでペプチドが溶液中に生成する。それからペプチドは、ｔｅｒｔ−ブチル  メチルエーテル中で沈殿され洗浄されて、所望により分析または精製される。
【００４１】
あらゆるペプチド鎖中の重要な結合はアミド結合で、それは1つのアミノ酸のアミノ基ともう1つのアミノ酸のカルボキシキ基の縮合によって形成される。イソステリック基によるペプチドフラグメント中の重要なアミド結合の置換は、改良された安定性を有する新規生物活性を創り出すための可能性のある手段として最近、かなりの注目を浴びている。本発明の１つの実施形態では、リードペプチドは、ケトメチレンまたはトランス−アルケン基のようなイソステリック基によって少なくとも１つのアミド結合が置換された合成分子を含んでいる。一般に、よく規定された分子が系統的に修飾され生成化合物が向上した生物活性を求めて分析がされる。より新しいコンビナトリアルケミストリーでは、多数の類似化合物の合成が可能である。次いで、一般にこれは、遺伝子発現を調整する能力の如き生物活性のために、選択またはスクリーニングされる。本発明の１つの実施形態では、リードペプチドはコンビナトリアルケミストリーの方法を用いて、無作為的に合成される。ロボット化スクリーニングの最近の進歩と一体化されたコンビナトリアルケミストリーによって、短時間で多数の化合物の試験をすることが可能である。この技術には、同一の反応容器内で混合物としてまたは個々に平行する合成によって、構造類似の多数の化合物を調製することが含まれている。このようにして、類似化合物の多数の蓄積物が短時間内に合成可能である。コンビナトリアルライブラリーは、液相および固相の両方の化学合成で調製することができる。しかしながら、固相合成は、反応を完結するために過剰の試薬の使用が可能であり、また、ポリマー支持体の簡単なろ過と溶媒での洗浄によって、試薬と副反応物の容易な除去が可能である。したがって、固相合成はスクリーニングの目的のための化学ライブラリーを創り出すための魅力的な方法である。
【００４２】
コンビナトリアルケミストリーは、ペプチドに好適である。固相化学を使用してリードペプチドライブラリーは容易に合成できる。分割合成または平行合成のいずれかを使用して合成中に配列の縮重を取り込むことができる。分割合成法では、各結合段階に先立ち、固相支持体が部分に分割される。アミノ酸のような異なった分子単位（シントン）は、それから各部分に結合される。結合の後、すべての部分は再度一緒にし、合成サイクルが完成される。この「分割と混合」法は、各支持体床上に独特な配列を生成させる利点を有しており、シントンの反応性の多様性は、結合条件を変動させることによって修正することができる。アミノ酸間で反応性に多様性があるペプチド合成は重要で、「分割と混合」法が必要である。樹脂上でのペプチドの先端と末端の環化は、環状化合物への容易な合成経路を提供する。高効率と容易な精製というような固相合成の一般的な利点に加え、ペプチドの樹脂上での先端部と末端部の環化反応は、たとえ高濃度の下でも、分子内反応（たとえば、２量化またはオリゴマー化)の危険性は最小である。これが、線状プチドの分子内副反応の回避に高希釈条件を必要とする液相化学に対するもう１つの有利な点である。
【００４３】
１つの実施形態において、細胞にペプチド、またはその誘導体もしくは類似体を投与し遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することを含む、細胞内で遺伝子の発現を調節することのできるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための方法を提供する。
【００４４】
このように開発された化学物質は、インビボで全身的に、局所的にまたは局部的に投与および導入することができる。ペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体は、そのもの自体で、または（塩酸、臭素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸および燐酸のような）無機酸、または（蟻酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、およびフマル酸のような）有機酸、または（水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような）無機塩基または(モノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンのような)有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸または塩基の付加塩として投与することができる。選択されたペプチドおよび誘導体もまた、糖、脂質、他のペプチド、核酸およびＰＮＡと複合することができ、複合体としてその場で機能するかまたは標的組織もしくは臓器に到達した後に局所的に放出される。
【００４５】
リードペプチドの検出に話を戻すと、たとえば、純粋に無作為的な基準でのそのようなリードペプチドライブラリー、すなわち、試験物質(ここではリードペプチドとも称される)としての、既知のアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体のそれぞれのかつすべての組み合わせのために、好ましくは約３〜１５アミノ酸長の（もっと好ましくは、４〜９、またはむしろ４〜６の）小ペプチドフラグメントを含むライブラリーを創り出すことができ、それから各該リードペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体を少なくとも１つの細胞と接触させ、該細胞内もしくはそれから生じる少なくとも１つの遺伝子産物の存在を測定することができる。しかしながら、たとえば、内因性タンパク質（宿主または病原体）配列から（好ましくは４〜６アミノ酸長の）リードペプチドがタンパク質分解部位の予測に基づき予測され合成されるような内因性タンパク質（宿主または病原体）配列内でのリードペプチドの存在を基にリードペプチドが選択される、より選択的なペプチドライブラリーで開始するのが好ましい。そのような数種のモデルは存在し、たとえば、MＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ特異的なタンパク質分解配列の予測ができるコンピューターモデルを使用するのが好ましい。さらにそのようなペプチドライブラリーのもう１つの例では、該ライブラリー内の試験されるべきリードペプチドは、課題のタンパク質から重複的にペプチドフラグメントを選択し合成することによってタンパク質配列から誘導され（重複法でより長いペプチド配列を試験するときに関与する仕事量を考えると、好ましくは、４〜５のアミノ酸長の短いフラグメント）、そうすることによって連続配列中において重複が、たとえば１、２もしくは３アミノ酸の重複、または１つのアミノ酸を除いてすべてのアミノ酸が重複しているようにすることができる。さらには、ペプチドライブラリーが、上記のようにタンパク質分解部位の予測の手引きの下に最初により長いペプチドを選択することによってタンパク質から誘導されるリードペプチド、および、前記のように、予測されたもっと長い配列から重複方法で誘導される４〜６アミノ酸長のペプチドフラグメントを設計してそれらの長い配列から誘導されるリードペプチド、から構成されているような方法がより好ましい。
【００４６】
リードペプチドとしてさらに試験するためにペプチド配列を誘導することのできるタンパク質のさらなるリストには、これに限定されないが、コラーゲン、ＰＳＧ，ＣＥＡ，ＭＡＧＥ（黒色腫関連成長抗原）、トロンボスポンジン−１(Thrombospondin-1)、成長因子、ＭＭＰｓ、カルモジュリン、嗅覚受容体(Olfactory receptor)、シトクロム  ｐ４５０、キナーゼ、フォン・ウイレブランド(Von Willebrand)因子（凝集因子）、液胞タンパク質（ATP  sythase）、糖タンパク質ホルモン、DNAポリメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン、（エンベロープタンパク質のような）ウイルスタンパク質、エラスチン、冬眠関連タンパク質、不凍化糖タンパク質、プロテアーゼ、スポロゾイト周辺タンパク質（Circumsporozoite）、核受容体、転写因子、サイトカインとそれらの受容体、細菌性抗原、Ｎｒａｍｐ、ＲＮＡポリメラーゼ、細胞骨格タンパク質、造血（神経）細胞膜タンパク質、免疫グロブリン、ＨＬＡ／ＭＨＣ，Ｇ−結合タンパク質(G-coupled protein)およびそれらの受容体、TATA結合タンパク質、トランスフェラーゼ、ジンクフィンガータンパク質、スプライソソームタンパク質、HMG(高速移動群タンパク質)、ROS（反応性酸素種）、スーパーオキシダーゼ、スーパーオキシド  ディムスターゼ、プロトオンコジーン／腫瘍抑制遺伝子、アポリポタンパク質、が含まれる。
【００４７】
情報がマイクロアレイ技術を使用して得られることを特徴とする、遺伝子調節するためのリードペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体の能力または資質についての情報を得るための方法がさらに提供される。マイクロアレイ技術は、特有の条件下に特有の時に生物の特有の細胞タイプにどのような遺伝子が発現しているかという問題に答えるためのゲノム配列決定プロジェクトおよび他の配列決定努力によって創製される配列資源を利用する。マイクロアレイは、相補的な一本鎖にされた核酸配列の優先的結合を利用する。マイクロアレイによって細胞中の遺伝子発現プロフィールの系統的試験が可能である。この技術には、数種の名称、すなわち、DNAマイクロアレイ、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップ、遺伝子チップ、およびその他の名称がある。マイクロアレイは、通常には、その上にＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子が固定位置（スポット）に付着されたガラス（または他の数種の材料の）平板である。アレイ上には１０００の１０倍のスポットがあり、それぞれが２０から１００個の長さの莫大な数の同一のＤＮＡ分子（または同一分子のフラグメント）がある。遺伝子発現研究のために、これら分子のそれぞれは理論的にはゲノム中の１遺伝子または１エクソンを識別するであろう。スポットはロボットによってマイクロアレイ上に印されるか、フォトリソグラフィ（コンピュータチップの生産に類似）もしくはジェットプリンティングによって合成される。
【００４８】
本発明の１つの実施形態において、マイクロアレイ技術は細胞内の少なくとも１つの遺伝子の相対的アップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを制御するペプチドの能力を測定するために使用される。また、１つまたはそれ以上のリードペプチドまたはその誘導体が細胞中に発現された多数の遺伝子のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに及ぼす効果を測定するために、ミクロアレイ技術を利用するための方法が提供される。さらなる実施形態において、たとえばミクロアレイ中で測定された望ましい活性を有するリードペプチドが合成される。遺伝子発現レベルを測定するためにマイクロアレイを使用できる数種の態様がある。最も一般的なマイクロアレイの応用の１つによって、２つの異なる検体中の、たとえば未処置と処置済みの同一タイプの細胞の、遺伝子発現レベルを比較できる。２種の異なる条件における細胞からの全ｍＲＮＡが抽出され２種の異なる染料で標識される。たとえば、条件１の細胞に緑色の染料をそして条件２の細胞には赤色の染料を用いる(さら正確には、標識化は、抽出されたｍＲＮＡに相補的な一本鎖DNAを逆転写酵素と呼ばれる酵素によって合成することによって通常実施される)。両抽出物は、マイクロアレイ上で洗浄される。抽出物からの標識された遺伝子産物はスポット中で、相補的一本鎖核酸配列は互いに引き合う傾向があり相補的部分が長いほど引き付ける力は強いという優先的な結合ゆえに、その相補的配列にハイブリダイゼーションする。染料によってスポットに結合した検体量の測定が、たとえば、蛍光染料がレーザーで励起されたときに発光する蛍光のレベルを測定することによって、可能になる。もしも、条件１中の検体からのRNAが豊富であると、スポットは緑色となるだろうし、条件２中の検体からのRNAが豊富であると、スポットは赤色となるだろう。もし両者が等量ならば、スポットは黄色となるが、一方両者とも存在しなければスポットは蛍光を発せずに黒く見えるであろう。このようにして、各スポットの蛍光強度と色から両検体中の相対的遺伝子発現レベルが評価できる。
【００４９】
詳細な記載で例を挙げるように、マイクロアレイ技術は、細胞中の遺伝子発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするリードペプチドの能力をモニターするための魅力的方法である。典型的な実験では、各検体が異なったリードペプチド修飾体またはその誘導体が投与された少なくとも１つの細胞を含んでいるような並行検体のシリーズが含まれる。また少なくとも１つの細胞を含むがリードペプチドを含んでいない対照検体も含まれる。細胞は抹消血単核細胞（PBMC）細胞のような一次細胞あるいはＪｕｒｋａｔ、CoS-7、MCF-7、２９３Ｔのような実験細胞から誘導される細胞であることができる。一定時間周期でペプチドを検体に加え、混合物の一部分を採取する。リードペプチドの存在下で一定時間の間インキュベートされた細胞を含んでいる混合物の一部から、マイクロアレイ技術を使用して、誘導されおよび抑制された遺伝子（の集団で）の目録が作られる。この時間間隔は、添加以降3時間または2時間もしくは1時間のようなより短時間にすることができる。意外なことに、30分間または20分間のようなより短時間でも、ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体の遺伝子発現に及ぼす効果を測定するために、選択することができる。
【００５０】
本発明のリードペプチドの検出可能な遺伝子制御に及ぼす効果は、通常は数時間、例えば6〜24時間の範囲の長いインキュベーション時間のときに検出し得る遺伝子発現の変化を誘導する、他の遺伝子転写調節因子と比較すると、驚くほど速い。好ましい実施形態では、細胞を、まず、細胞内で遺伝子発現プログラムを変化させると知られている化合物に接触させ、続いて本発明のペプチドを投与する。化合物は、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニストおよび遺伝子転写変化を誘導すると知られている他の化合物を含む。また化合物は、受容体アゴニストまたはアンタゴニストへの自然な応答の間に起こる分子内シグナルに類似する化合物、たとえばイオノマイシンとPMAの組み合わせも含む。もう1つの実施形態において、細胞は、免疫反応を誘導するために、細菌のリポ多糖（LPS）のような微生物作用物質または細菌そのもの（例えば大腸菌、百日咳菌、黄色ブドウ球菌）に接触させられる。典型的実験では、異なったリードペプチド、その類似体もしくは誘導体を細胞内で遺伝子発現プログラムを変化させると知られている化合物と組み合わせて投与された少なくとも１つの細胞を含む１組の並行検体を含む。もう１つの実施形態では、そのような化合物とペプチドが細胞に同時に添加される。さらに他の実施形態では、細胞内で遺伝子発現プロフィールを変化させると知られている化合物を細胞に投与する前または後に、ペプチドまたはその機能的誘導体が細胞に加えられる。それから、マイクロアレイを使用して、誘導および抑制された遺伝子の目録が作成される。この目録から、ペプチドの遺伝子制御に及ぼす調節効果を容易に決定することができる。
【００５１】
ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を細胞に投与し、遺伝子転写因子の活性を測定することを含む、細胞内で遺伝子の発現を調節することができるペプチまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を、同定または取得するための方法も提供される。本発明の１つの実施形態では、細胞内で遺伝子の発現を調節することができるペプチまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子は、レポーター遺伝子検定を使用して確認される。レポーター遺伝子は一般に、容易に検定されるタンパク質をコード化している核酸配列である。それらは、そのタンパク質産生物がもっと検定し難い、他のコード領域を置換するのに使用される。プロモーターで開始している転写がレポーター遺伝子を通って進行するように、レポーター遺伝子は課題のプロモーターの下流に融合される。一般に使用されるレポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベーターガラクトシダーゼ、ベーターグルクロニダーゼおよびルシフェラーゼのような酵素をコード化する。興味あるレポーター遺伝子には、ＵＶの照射で蛍光を発する蛍光タンパク質も含まれる。これらには、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)および、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および藍色蛍光タンパク質(ＣＦＰ)のようなその分光学的変異体もふくまれる。レポーター遺伝子は、レポータータンパク質のみが作成されるようにまたはレポーター遺伝子が他のタンパク質に融合される(融合タンパク質)ように、他の配列に結合することができる。レポーター遺伝子は、プロモーターの長さ、逆遺伝子研究のために天然であるかまたは修飾されたものであるかということ、遺伝子運搬システムの効率および翻訳開始シグナルの効率などの多数の異なった特性と事象を「報告」することができる。レポーター遺伝子の構造は、ＤＥＡＥ−デキストラン、燐酸カルシウム沈殿、アデノウイルスもしくはレトロウイルス仲介遺伝子形質導入、（たとえば、リポフェフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰまたはフジン試薬(Fugene  reagent)を使用して）カチオニックリポソーム形質転換システムおよびエレクトロポレーション技術を使用する既知の技術を含め当該技術分野で既知の多数のトランスフェクション技術の１つを使用して、細胞、たとえば実験細胞株中にトランスフェクションすることができる。リポソームトランスフェクション試薬をＤＮＡと混合すると、血清とともに若しくは血清なしで組織培養培地に直接添加することのできる安定な複合体が即時に形成される。この複合体は細胞表面に付着し、細胞膜と融合しそしてＤＮＡを細胞質中に放出する。このＤＮＡ移動方法は、細胞毒性を回避して非常に穏やかであり、細胞を高効率でトランスフェクションすることができる。レポーター遺伝子構造物でのトランスフェクションは、一時的にまたは安定にすることができる。本発明のリードペプチドまたはその混合物にトランスフェクションされた細胞を接触し、該細胞中のレポーター遺伝子の活性を検定することによって、リードペプチドの遺伝子発現に及ぼす調節効果を測定するための方法が提供される。調節効果は、阻害または促進効果であることができる。好ましい実施形態で���レポーター遺伝子検定は、ＮＦ−カッパＢ活性を検定するために為されるが、１種またはそれ以上の転写因子の活性を検定するために設計されたレポーター遺伝子検定法もまた使用可能である。ルシフェラーゼレポーター遺伝子構造物は、ＮＦ−カッパＢ主導のプロモーターの制御下におくことができる。トランスフェクションされた細胞は、たとえばアミノ酸がＡｌａ残基またはＤ−アミノ酸残基で系統的に置換された天然に存在するポリペプチドまたは合成ペプチドから誘導された種々の長さのペプチドフラグメントの如き一連のリ−ドペプチドに接触される。一定の培養時間の後に、リードペプチドのＮＦ−カッパＢに及ぼす効果を測定するために、ルシフェラーゼ活性が検定される。この分析から、ペプチドが何か遺伝子調節活性を有しているかどうか、そしてもしそうならば、この活性は阻害活性なのか促進活性なのかが明らかである。
【００５２】
レポーター遺伝子検定によって比較的短時間内で多数の異なった検体を分析することができる。それは、９６−ウエルプレートのような多数のウエルのついたプレートを使用することによって容易に実施できる。多数のレポーター遺伝子の活性は、たとえば、自動プレートリーダ内で、比色もしくは蛍光検出を使用して検定することができる。すなわち、レポーター遺伝子検定は、ハイ−スループット方式を使用できる。これは、ペプチドの遺伝子調節のためのスクリーニングを繰り返し実施するとき、たとえばリードペプチドの最適化のプロセスに特に有用である。このタイプの検定では、少数の異なったプロモーター要素に焦点を当てることが好ましい。たとえば、細胞は、ＮＦ−カッパＢ活性の検出のためのレポーター遺伝子構造物で、またはＡＰ−１活性のためのレポーター遺伝子構造物で、もしくはＮＦＡＴ−１活性をすぐに測定するために設計されたレポーターでトランスフェクションされる。細胞は、１種のレポーター遺伝子で並行してトランスフェクションされるが、１つの細胞に１種以上のレポーター遺伝子構造物を与えることも可能である。もちろん異なったプロモーターの活性の区別を可能にするために、各プロモーターの構造物は異なったレポーター遺伝子を含むことが好ましい。本発明の１つの実施形態で、転写活性に対するペプチドまたはその誘導体もしくは類似体の効果を測定するために１種以上のレポーター遺伝子構造物が１つの細胞に投与される。たとえば、２つまたは３つのプラスミドででもコトランスフェクションされ、それぞれの細胞は、課題の別々のプロモーターの下流に融合された別々の蛍光レポーター遺伝子を含む。このことから、各プロモーターに対する前記ペプチドの効果が測定される。そのような実験計画では、コ−トランスフェクションされたレポーター構築物のレポーター遺伝子産物は互いに容易に区別されるのが明らかに好ましい。コ−トランスフェクションレポーター遺伝子検定に使用できる興味あるレポーター遺伝子は、ＧＦＰまたはＥＧＦＰ（エンハンス緑色蛍光タンパク質）および、ＲＦＰ、ＹＦＰおよびＣＦＰのようなその分光学的変異体を含む。本発明のペプチドに前記細胞を接触させてから、各蛍光レポーター遺伝子の活性は、マルチバンドフィルターセットのような適当な光学フィルターセットを使用して蛍光を検出することによって測定される。マルチーバンドセットは、多重の標識化および同時に多重の蛍光発色団を観察するために使用される。各セットの励起、２色性照射によって、分離された、励起バンドと発光エネルギーが生成する。
【００５３】
遺伝子発現に対するリード化合物の効果を検出、特に阻害効果を検出するために、細胞がかなり高いレベルの基本的な遺伝子転写活性を有していることが好ましい。遺伝子発現に対するペプチドの阻害効果の測定を容易にするために、細胞は、遺伝子発現の強い増加を促進すると知られている化合物で処理することができる。この化合物は細胞にリードペプチドを投与するときの前、後または同時に添加することができる。たとえば、ＮＦ−カッパＢ主導のプロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含んでいる細胞をＬＰＳに接触させる。このことで、ＮＦ−カッパＢ依存性の転写活性の基礎レベルが低い未処理の対照細胞に比べて、ルシフェラーゼ活性の増加が誘導されるであろう。
続いてまたは同時に遺伝子発現を調節する能力があるだろうと考えられる少なくとも１つのペプチドが添加される。それから、該ペプチドのＬＳＰ−誘発ルシフェラーゼ活性に対する効果が検定され、ＬＰＳだけが投与されペプチドが投与されなかった細胞を含む並行検体中のルシフェラーゼ活性と比較される。
【００５４】
細胞にペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与し、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定して、細胞中で遺伝子発現を調節することのできるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するためのここで提供される方法を使用することによって、さらに、多数のオリゴまたはリードペプチドのランダム試験で、自動化されたコンビナトリアルケミストリー方式に導くことが可能であり、その方法で、強いシグナル分子を提示している合成ペプチドの分子ライブラリーとともに、きわめて多数のシグナル分子候補物がその活性に関して１つのパターンで（望むなら無作為に）試験され、試験される千の十倍もの(組み合わせの)分子中の特に有用な分子の迅速な検出が可能になる。好ましい実施形態において、本発明は、前記リード化合物または少なくとも活性が、もし望むならコンピュータ管理の位置測定の助けで、位置的にまたは空間的にたとえばアレイ方式内でアドレスできる方法を提供する。アレイ内で上記の大多数はたとえばグリッドまたはマトリックス内におけるそれらの位置によってアドレスできる。
【００５５】
細胞にリードペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を投与し遺伝子転写因子の核転座を測定することを含む、細胞中で遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための方法もまたここで提供される。核転座のための細胞質から核への転座は、転写因子活性化の早期な測定基準である。それは、特異な標的遺伝子の転写活性化のための細胞外刺激と結合して重要な過程とみなされている。転写因子の細胞下の分布と転写因子の核転座を分析するために、種々の技術が当業者に入手可能である。核内画分の転写因子の存在を分析するための一般的方法には、ＥＭＳＡ（電気泳動ゲルシフトアッセイ）および免疫細胞化学が含まれる。蛍光顕微鏡を使用して、ＧＦＰ−ＮＦκＢのような蛍光的に標的化された転写因子の転座を追跡することも可能である。しかしながら転写因子の核転座を調節するリードペプチドの活性について多数の検体を検定するためには、労働力が少ない方法が好ましを使用するのが好ましい。たとえば、転写因子の細胞質から核への転座を便利に測定することのできる市販のキット(転座キット)が最近、商業的に入手可能になった（Cellomics, Inc; www. cellomics. com)。この検定には特異的な一次抗体による転写因子の検出、それに続く蛍光発色団複合二次抗体による該一次抗体の検出が含まれる。ＮＦ−カッパＢ、ＳＴＡＴおよびＡＴＦ−２を含め、種々の転写因子の活性化を測定するために転座キットが使用できる。キットは、特別なソフトウエアと装置で、細胞毎に転写活性を阻害または誘導するペプチドまたはその誘導体のような化合物を同定するための完全自動スクリーニングを含む。検定は、標準高密度ミクロプレート内で実施され、転写因子転座の速度と程度の測定が、生物学的に代表的な情報を備えているそのままの状態の細胞内で実施される。４８０検定分の試薬を含むキットは、たとえば、天然に存在するポポリペプチドから誘導される比較的少量（１０〜１５ぐらい）のペプチドフラグメントの遺伝子調節活性を評価する段階で使用することができる。これによって、遺伝子転写因子の活性を調節することができる少数のリードペプチドを同定することができる。次のスクリーニング段階では、そのようなリードペプチドは、もっと効果のある誘導体または同属体の開発のために使用される。そのようなリードペプチドの最適化の過程で、４８００個の試験検体のための試薬が含まれているキットを使用することができる。さらなる実施形態では、たとえば、コンビナトリアルケミストリーで創出された何千もの無作為のペプチドの調節効果を測定するために、１９２００個の試験検体のための試薬が含まれているキットが使用される。キットは、発光試薬と最適化された検体調整と検定のためのプロトコルを組み合わせており、細胞の溶解、精製または濾過工程を必要としない。固定化の後、光から保護の下、４℃で、細胞と染料のタイプによるが、プレートは１週間から数ヶ月にわたって長期間安定である。
【００５６】
本発明はまた、種々の他の異なる応用と用途を有する。本発明は、臨床と医学的な利益と価値のある、生きた被験物中の組織および器官内でＮＦκＢ依存性遺伝子発現を選択的に制御する機会を提供し、好ましくは霊長類において、本質的にＩＬ−１０のような抗炎症反応をアップレギュレーションすることが可能になり、また本質的にＴＮＦ−アルファ、酸化窒素（ＮＯ），ＩＬ−５，ＩＬ−１ベータに介されたような前炎症をダウンレギュレートするのが可能となる。本発明は、したがって、霊長類における虚血症の治療用の医薬組成物の製造のためのＮＦκＢ調節ペプチドまたはその誘導体の用途を提供し、また、霊長類における虚血症の治療方法を提供する。本発明で提供されるそのような１例としては、虚血症に罹った患者または、無酸素症もしくは梗塞症に罹った患者である。臨床的な例は、生存中の患者の種々の部位の心臓組織の心筋梗塞または慢性心虚血あるいは脳血管梗塞のようなものである。
【００５７】
種々の病理生理学的発育性シグナルに応答して、転写因子のＮＦκＢ／Ｒｅｌファミリーは活性化され、それら自身で、カッパＢ−特異的結合部位を含む標的遺伝子の発現を制御するヘテロ−およびホモ２量体を形成する。ＮＦ−κＢ転写因子は、Ｒｅｌ相同ドメインによって特徴付けられた関連タンパク質のヘテロ−またはホモ２量体である。それらは、２種のサブファミリー、すなわち、活性ドメイン（ｐ６５−ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢおよびｃ−ＲＥＬ）を含むそれと、活性ドメインを欠損しているドメイン（ｐ５０、ｐ５２）を含むそれ、を形成する。原型ＮＦκＢは、ｐ６５（ＲＥＬＡ）とｐ５０（ＮＦ−ｋＢ１）のへテロ２量体である。活性化したＮＦκＢ２量体のうちで、ｐ５０−ｐ６０へテロ２量体は、標的遺伝子の転写亢進に、そして、ｐ５０−ｐ５０ホモ２量体は転写抑制に関与していることが知られている。しかしながら、ｐ６０−ｐ６０ホモ２量体には、標的遺伝子に対し、転写活性化と抑制の両方の活性が知られている。異なったＮＦκＢ２量体に種々の親和性を有するカッパＢ  ＤＮＡ結合部位が種々の真核遺伝子のプロモーター中で発見されており、活性化されたＮＦκＢホモ−およびヘテロ間のバランスが最終的に細胞内の遺伝子発現の性質とレベルを決定している。ここで使用される「ＮＦκＢ−調節ペプチド」の文言は、転写因子のＮＦκＢ／Ｒｅｌファミリーのメンバーの活性化を調節することのできるペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体を意味する。ＮＦκＢの活性化によって標的遺伝子の亢進した転写を導くことができる。それは、標的細胞の転写の抑制を導くこともできる。ＮＦκＢの活性化は複数段階で制御されえる。たとえば、細胞質と細胞核間で不活性ＮＦκＢ２量体のＩカッパＢタンパク質による動力学的封じ込め、リン酸化とプロテアソームの分解による活性化の中絶、ＮＦκＢ因子の直接的リン酸化、アセチル化、活性化されたＮＦκＢ中のＮＦκＢのサブユニットの動的な認識がすべて、ＮＦκＢ活性化とそれに続くＮＦκＢ介在転写過程での鍵となる調節ステップとして確認された。このようにして、ＮＦκＢ調節ペプチドは、転写因子のＮＦκＢ／Ｒｅｌファミリーの制御の下にある遺伝子の調節をすることができる。調節には、転写のアップレギュレーションとダウンレギュレーションが含まれる。
【００５８】
治療を必要とする患者にオリゴペプチド、ペプチドまたはその機能的類似体を含む分子を投与することを含む、急性または慢性炎症疾患を治療する方法も提供される。特に重要なことに、本発明は、霊長類でのサイトカインの産生を調整することのできるペプチドを提供する。これは図５９〜６５に例示されており、図５９〜６５はＴＮＦ−アルファ、Ｉｌ−１ベータ、ＩＬ−８，ＩＬ−６およびＩＬ−５のようなプロ炎症性サイトカインの減少と抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の増加を示している（図５９〜６５）。
【００５９】
好ましくは、そのようなペプチドは、アミノ酸長が３〜１５で、細胞中でサイトカインのような遺伝子の発現を調節することができる。好ましい実施形態で、ペプチドは、細胞の形質膜を通過することができるシグナル分子であるか、または、別の言葉でいうと膜透過性ペプチドである。急性または慢性炎症疾患を治療するために有用なペプチドには、細胞によるＮＯおよび／またはＴＮＦアルファの産生を減少させることのできるペプチドも含まれる。細胞内のＮＯおよび／またはＴＮＦアルファの産生の減少は、ＮＦ−κＢファミリーの転写因子を阻害することによって達成される。この阻害は、ペプチドの直接的な転写因子への結合を含め、数種の異なる段階で起こる。また、本発明で提供されるペプチドは、詳細な説明に示されるようにペプチドの核転座を阻害することができる。
【００６０】
ＮＦ−κＢ経路に影響を与えるかまたは影響を受ける疾患の治療のために、ＮＦκＢ調節ペプチドまたはそのようなペプチドの少なくとも２種の混合物の用途が提供される。好ましい実施形態で、本発明のペプチドは、細胞内の１種またはそれ以上のサイトカインの産生を調節するという戦略で好適に使用される。特に魅力的なのは、たとえば、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーの転写因子の制御下にあるサイトカインの発現を通じて細胞内のサイトカイン産生を阻害する医薬組成物の生産のためのペプチドの用途である。たとえば、医薬組成物の生産用のＮＦκＢ調節ペプチドの用途が、敗血症の治療のために提供される。さらに、たとえば、細胞中のインターターロイキンのような炎症サイトカインの産生の調節または、ＮＯおよび／もしくはＴＮＦアルファの産生の減少を介する、炭疽の治療のための医薬組成物の生産用ＮＦκＢ調節ペプチドの用途が提供される。見かけ上無関係の疾患、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、心血管疾患はすべて、炎症性要素を持っている。前述のように、ＮＦ−κＢは、炎症性疾患を亢進させているＴＮＦ、ＩＬ−１および細胞接着分子をふくめ、広範な炎症性遺伝子の一群の主的調節剤である。リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、慢性炎症疾患のプロトタイプである。ＲＡの動物モデルでの研究により、炎症に調節、アポトーシス、およびリウマチ性の滑膜内での増殖に、ＮＦ−κＢが決定的な関与をしていることが証明された。したがって、ＮＦ−κＢは、ＲＡおよび他の慢性炎症性異常の治療介入のためのきわめて魅力的な標的として明らかである。ＮＦ−κＢ活性化を阻害する論理的な方法は、ＮＦ−κＢの転写活性を制御しているシグナルカスケードを調節することである。詳細な説明で例示されるように、意外なことに、本発明のペプチドでマウスを処理することによって、リウマチの進展を防御し、リウマチの過酷状態を非常に減少することができた。したがって、本発明は、たとえば、細胞によるＮＯおよび／もしくはＴＮＦアルファの産生の減少を導く、ＮＦ−κＢ活性を調節することができる分子であるオリゴペプチド、ペプチドもしくはその機能的類似体を含む分子を、治療を要する患者に投与することから成る、リウマチまたは他の免疫―炎症性疾患を治療する方法を提供する。もう１つの実施形態では、ＮＦκＢ調節ペプチドまたはもう１つのタイプの転写因子を調節することのできるペプチドが、骨疾患の治療用医薬組成物の生産のために使用される。通常の骨リモデリングでは、吸収された骨が完全に新骨組織で置換されるように、破骨細胞と骨芽細胞活性が対になる。骨疾患はしばしば骨形成よりも全体として骨吸収が増加するというような、均衡が乱されることによって特徴付けられる。完全に成熟した機能的破骨細胞は、一般に、破骨細胞の形成、活性および／または生存を亢進する種々のサイトカインと成長因子を産生する。これらには、ＩL−1aおよびｂ、ＩＬ−６，ＩＬ−１１，Ｍ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａが含まれる。本発明は、破骨細胞の分化と成熟を制御する、好ましくは抑制する方法を提供する。これによって、破骨細胞によるサイトカインの産生を制御することができる。たとえば、破骨細胞発生の過程を制御することによっては骨吸収と骨形成間の乱れたバランスを修正するための医薬組成物の製造用のＮＦ−κＢ調節ペプチドの用途が提供される。そのような医薬組成物は、好ましくは、（閉経後）骨粗鬆症および関節炎のような増加した破骨細胞発生に関連する疾患を治療するために投与される。
【００６１】
本発明は、したがって、虚血症に関与するＮＦκＢ依存性細胞内の遺伝子発現の特異的部位の制御のための方法および手段を提供する。心血管疾患は、世界的に男性および女性の両者のいくつかの主要な死亡原因である。冠状動脈性心疾患と発作を筆頭にして、６千万人以上のアメリカ人が、高血圧、先天性心血管欠損および先天性心不全を含め、１つまたはそれ以上のタイプの心血管疾患を持っている。心血管疾患によって、毎日２６００人のアメリカ人が死亡し、１９００年以来１９１８年を除いて米国で１位の死亡原因である。心血管疾患は米国に約３２９２億ドルの費用をもたらすであろう。疾患制御と予防センター（Centers for Disease Control and Prevention （CDC））によると、もしすべての形の心血管疾患が回避されると、平均余命は７年上昇するであろう。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体が、虚血症治療用の医薬組成物の生産のために使用される。虚血症とは、発作または心筋梗塞のように組織への血液の供給が障害された症状であることを言う。この障害によって、冒された血管を覆っている上皮組織は、「粘着性」となり、循環しているは白血球細胞を引き付ける。上皮に結合した白血球は、結局は脳または新組織内に移動し、重大な組織破壊を引き起こす。急性心虚血も発作も直接には炎症によって引き起こされないが、内在する病理の多くと急性虚血症の後に起こる障害は、再灌流、すなわち、冒された器官への血流の回復の間の急性炎症応答によって引き起こされる。したがって、本発明により、本発明のペプチドを、治療を要する患者に投与することからなる、脳血管疾病および虚血性心不全を含めて虚血症の治療のための方法が提供される。特に、プロ炎症サイトカインをコード化している遺伝子発現を調節できるペプチドまたはその修飾体を投与することによって、患部の再灌流の間の急性炎症応答を制御するための方法が提供される。
【００６３】
ＴＮＦ−aは、癌、感染および自己免疫炎症のような多様な病理学的プロセスに関与してきたプロ炎症性かつ多機能性サイトカインである。ＴＮＦ−aは、最近、先天性心不全、心筋炎、拡張性敗血性心筋症、虚血性心疾患を含め種々の心臓関連疾患中に検出された。ＴＮＦ  ｍＲＮＡとＴＮＦ−アルファタンパク質は、拡張心筋症と虚血症のヒトから外植されは心臓内に検出されたが、ＴＮＦ−aは、非不全の心筋には検出されなかった。腫瘍壊死因子受容体  １（ＴＮＦＲ１）と腫瘍壊死因子受容体  ２（ＴＮＦＲ２）の両者に共通しているシグナル経路の完全なポートフォリオは知られていないが、腫瘍壊死因子受容体結合因子と称される最近報告されたジンクフィンガータンパク質が、ＴＮＦＲ１とＴＮＦＲ２の両者に介在されたシグナル伝達に関与していることが示されたことに注目することは興味あることである。したがって、ＴＲＡＦ２介在シグナル伝達は、ＮＦ−κＢを活性化し、抗酸化タンパク質マンガンスーパーオキサイドディムスターゼ（ＭＳＯＤ）の発現の増加をもたらす。
【００６４】
以前の研究は、心筋虚血状態におけるＴＮＦの細胞防御効果は、ＭＳＤＯのＴＮＦ誘導アップレギュレーションを通して成立されることを示唆した。ＴＮＦのような前炎症性サイトカインは、心臓損傷の除去に役割を果たす抗アポトーシス性細胞防御シグナルを早期に提供することおよび組織の修復と一旦心筋損傷が起ったときに組織修復と再構築を促進する遅れたシグナルを提供することの両方で、心筋の圧力応答のタイミングに重要な役割をする可能性があることが示された。本発明のいくつかのペプチドが細胞内の少なくとも1つの遺伝子をアップレギュレーションすることができるという観察を考え、本発明は、今や、ＭＳＯＤ及びその他の、組織防御性のＮＦ−κＢに調節された遺伝子のような遺伝子産物の発現を増加させる方法を提供する。
【００６５】
虚血性心不全を例にとると、ＮＦカッパＢをダウンレギュレーションする本発明のペプチドは、たとえば、合成化合物として、細胞と組織に種々の輸送手段の範囲で直接導入することができる。これは以下のことを含む。
【００６６】
１．心臓内への輸送は、０．０１４インチ血管形成ガイドワイヤーで輸送される3.0ｘ20ｍｍ血管形成バルーンの上に積載した１０ｍｍ  インフューザスリーブ（InfusaSleeve）カテーテル(Local Med, Palo Alto, CA)のような適当な局所輸送カテーテルを用いて、心動脈内に局所的に（すなわち血管壁を通して心筋内に注入することによって）注入可能な（生理食塩水のような）適当な緩衝液内に懸濁された合成ペプチド（または誘導体）のカテーテル使用による輸送によって達成される。輸送は通常、まず、血管形成バルーンを３０ｐｓｉまで膨張させ、次に局所輸送カテコールを通して８０ｐｓｉで３０秒かけて、タンパク質を輸送することによって達成される（これは輸送カテーテルに適するように加減することができる）。
【００６７】
２．予め合成されたペプチド（または誘導体）の心臓内大量注入は、ウルトラヒューズーＸ（Ultrafuse-X）２重管腔カテーテル(SciMed, Minneapolis, MN)または他の適切な器具を通して、心動脈の近位開口部中へ物質を手動式で１０分間かけて注入することによって達成される。
【００６８】
３．合成されたペプチド（または誘導体）の心膜の輸送は、ペプチドを含有している溶液を心膜嚢内に組み込むことによって通常、達成される。心膜には、右動脈穿刺、胸部穿刺または直接的な外科手法を経由して挿入する。一旦挿入されると、ペプチド材料は、囲心腔内に注入され、カテーテルは引き抜かれる。あるいは、輸送は、ヘパリンアルギネートまたはエチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）のような遅放出性のポリマーの補助を介して達成される。両者の場合、ペプチド（または誘導体）がポリマー内に組み込まれると、望ましい量のペプチド／ポリマーが心外膜脂肪の下に挿入されるか、または、たとえば縫合術を使用して心筋表面に固定される。さらに、ペプチド／ポリマー組成物は、心血管の外膜表面に沿って置くことができる。
【００６９】
４．合成されたペプチド（または誘導体）の心筋内輸送は、開胸術に続く直接的画像観察の下に、または胸腔鏡を使用して、またはカテーテルを経るいずれかで達成することができる。どの場合でも、ペプチドを含有している溶液は、注射器または他の適当な器具を使用して心筋に、直接、注射される。
【００７０】
２ｃｃまでの容量をどのような目的の箇所にでも注入することができ、複数位置への注入（３０  注入まで）が、患者毎に可能である。カテーテルに基づく注入は、蛍光透視鏡、超音波またはバイオセンス  ノガ（Biosense NOGA）の手引きによって実施される。すべての場合、左心室へのカテーテル導入の後に、制御された材料の局所輸送を可能にするカテーテルを使用して、心筋の望むべき区域に注射される。
【００７１】
適切な医薬添加物と担体の限界は、通常、当業者に知られている。したがって、無菌投与のために、化合物は、通常、滅菌水または生理食塩水に溶解または懸濁されるであろう。
【００７２】
本発明のペプチドの血管分岐に対する効果を示している図２０〜３０に図示されているように、さらにもう１つの実施形態で、新脈管形成を調節するための方法が提供される。また、血管の厚さを制御するペプチドの能力によって明らかに証明されているように（図３１,３２）、本発明は、脈管形成のプロセスを調節することが可能である。ｈＣＧは、インビボで子宮上皮細胞のための強力な新脈管形成因子であることが報告されており、上皮の新脈管形成におけるｈＣＧの重要な役割が示唆された。重要なことには、我々は、新脈管形成（例えば表５参照）と脈管形成を制御できるｈＣＧ由来ペプチドを同定した。ペプチドがＮＯおよび／またはＴＮＦαの産生を細胞内で減少させることを特徴とする、非常に多種の疾患の治療用医薬組成物を生産用するための本発明のペプチドの用途が提供される。この疾患には、特に限定がないが、敗血ショック、炭疽、骨疾患、関節炎、および、脳血管疾患および虚血性心不全のような虚血症が含まれる。細胞によるＮＯおよび／またはＴＮＦαの産生を減少させることのできる、オリゴペプチド、ペプチドまたはその機能的類似体を含む分子をそのような治療が必要な患者に投与することから成る、これら疾病を治療するための方法も提供される。さらに、オリゴペプチド、ペプチドまたはその機能的類似体を含む分子は、細胞による１種またはそれ以上のサイトカインの産生を調節することのできる分子を含む。たとえば、オリゴペプチド、ペプチドまたはその機能的類似体を含む分子は、細胞による１種またはそれ以上のサイトカインの産生を調節することのできる分子を含む。
【００７３】
本発明は、例えば、また炭疽の治療に関する。胞子形成性バチルスアンスラシス（Ｂ.anthracis）に引き起こされる疾病である炭疽は、アジアおよびアフリカの家畜および野生の草食動物間に世界的な問題として続いており、生物学的戦闘行為または生物テロの生物兵器とされるとき、世界的な脅威を引き起こす。人的感染は感染した動物または汚染された動物製品に接触したときに起こる。突発または流行は、胞子が長期間土壌に残留することができるので、特有の地域にとって常に脅威である。炭疽の定着を防ぐために、その病気が風土的でない場所である種の動物製品の輸入制御が必要である。ヒト炭疽は、宿主への入り口の門脈によって通常分類される。ヒト炭疽病の大多数を占める皮膚炭疽は、一般に緩和な全身症状を伴う局所感染であり、きわめて広範な浮腫に囲まれた痛みのない丘疹によって特徴付けられる。丘疹は、５または６日までに潰瘍化して皮膚炭疽の特徴的な黒色痂に進展する。風媒胞子の吸入によって起こる吸入炭疽、汚染された食物の摂取によって起こる消化管炭疽、そしていくつかの例では、未治療の皮膚炭疽は、重度の敗血症と毒血症の進展を伴い、感染の最初の部位からの細菌の伝染によって特徴付けられる。吸入炭疽では、食細胞が肺気胞から部位リンパ節へ胞子を輸送し、そこで胞子は発芽し細菌が増殖する。その桿菌はそれから血流内に拡散し、そこでそれらは網内皮膚組織系によって一時的に除去される。感染後２〜５日に起こる死亡に先立ち、高血圧、浮腫および広範囲な敗血症と毒血症に起因する致命的ショックによって特徴付けられる急性症状が突然開始する。一般に治療介入は、敗血症の感染がほとんど常に致命的であるので早期に開始しなければならない。
【００７４】
本発明は、炭疽の如き種々の疾患の治療に関連して、遺伝子制御とも称される、細胞内の遺伝子発現の調節に関する。前述のとおり、炭疽は動物およびヒトの疾患であり、生物的な軍事行為とテロリズムの媒介物として重大な脅威をもたらす。抗生物質が効かない部位へ疾患が進展する前の診断の可能性は稀なので、Ｂ．アンスラシス（Ｂ．Anthrasis）胞子が吸入される吸入炭疽は常にほとんど致命的である。Ｂ．アンスラシス（Ｂ．Anthrasis）の主な毒性因子は、ポリ−Ｄ−グルタミン酸嚢と炭疽毒である。炭疽毒は協働する３種の異なるタンパク質からなっている。すなわち、２種の酵素、致死因子（ＬＦ）と浮腫因子（ＥＦ：アデニル酸シクラーゼ）と防御抗原（ＡＰ）である。ＰＡはそのカルボキシ末端ドメインによって宿主細胞の表面に結合する４ドメインタンパク質であり、フリン様プロテアーゼによるそのＮ−末端の分解によって、相同性のＮ−末端ドメインを介して高親和性を有する毒性酵素に結合する７量体を形成することができる。その複合体は貪食され、エンドソームの酸性化は、１４−ストランドベーターバレル構造を形成し、続いて起こる未知機構による細胞質への転座によって、ＰＡ７量体は膜に挿入される。ＰＡとＬＦの対の組み合わせは、静脈内投与したときに動物に急速な死を誘導するのに充分であり、ある種のメタロプロテアーゼ阻害剤が毒素をインビトロで遮断する。したがって、ＬＦは、その触媒活性を阻害するまたはそのＰＡとの結合を遮断する治療剤の重要な標的である。ＬＦは、炭疽の発生において決定的なタンパク質（相対分子量９０，０００）である。それは、４つのドメインを含んでいる。ドメインＩは、炭疽毒の膜転座構成要素、ＰＡに結合する。ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは一緒になって、切断前にマイトジェンで活性化されたタンパク質キナーゼ  キナーゼ−２（ＭＡＰＫＫ−２）の１６−残基のＮ−末端尾部を有する長い深い溝を形成する。ドメインＩＩは、バチルスセレウスのＤＰ−リボース化毒に類似しているが、活性部位は変異されて、基質認識を増大するように強化されている。ドメインＩＩＩは、ドメインＩＩに挿入されており、ドメインＩＩの構造要素の繰り返し重複から立ち上がっているように見える。ドメインＩＶは、かすかにジンクメタロプロテアーゼファミリーに関係しており、触媒中心を有している。それはまたドメインＩにも類似している。このようにこの構造は、遺伝子重複、変異および高いそして異常な特異性を持った酵素への融合のプロセスを経て進化したタンパク質であることを示している。
【００７５】
タンパク質のＭＡＰＫＫファミリーは、ＬＦの唯一の知られた細胞基質である。ＬＦによりそのＮ末端近傍が切断されると、ＭＡＰキナーゼ同属下流に関する結合配列が除去される。腫瘍細胞に対する致死毒の効果は、たとえば、ほとんど確かにＭＡＰＫＫ−１およびＭＡＰＫＫ−２を阻害することによって腫瘍細胞の成長と新脈管形成を阻害することにある。しかしながら、炭疽病の発生によって影響を受ける最初の細胞は、マクロファージである。ＬＦが、マイトジェン細胞膜外信号に制御されたＭＡＰＫＫ−１，ＭＡＰＫＫ−２，ＭＡＰＫＫ−３、およびＭＡＰＫＫ−６、細胞膜外シグナルに制御されたキナーゼ１（ＥＲＫ１）、ＥＲＫ２およびｐ３８の上流活性因子から、短いＮ−末端フラグメントを切断することが示された。最近のデータは、このことが、プロ炎症性メディエーター、ＮＯおよび腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、の生産ではなく遊離を阻害をもたらすことを示している。さらに、高濃度の致死毒によって未知の機構であるが高濃度の致死毒が、数分内でマクロファージが溶解する。最近のデータは、このことは、マクロファージの死を導いている成長因子経路の阻害に起因して起こる、ということを示唆している。これらの観察によると、感染初期段階では致死毒が免疫応答を阻害（または、遅延）し、一方、感染の後期では血流中の細菌の高力価がマクロファージの溶解および高濃度のＮＯとＴＮＦ−アルファの突発的遊離の引き金になっている可能性があることを示唆している。このことによって、劇的な高血圧とショックを導いている宿主マクロファージ炎症性経路の過剰刺激よって特徴付けられている死亡前の症状を説明することができる。この症状は、ＬＰＳに誘導される敗血ショックに類似している。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪのようなＬＰＳに応答しないマウスもまた、炭疽毒に対して完全に抵抗性があることは注目すべきことである。
【００７６】
ＬＰに関する認識部位には、プロリン（Ｐ）残基とそれに続く疎水性残基またはグリシン（Ｇ）残基があることが必要であり、それらの間でＬＦは切断する。認識部位にはさらに、疎水性残基に続く電荷の無いアミノ酸と少なくとも陽電荷したアミノ酸（および、ＡｓｐおよびＧｌｕのような陰電荷していないアミノ酸）がプロリン残基のＮ−末端側への５アミノ酸以内で必要である。配列中の他の残基は、重要なアミノ酸の間またはドナーとアクセプターの間に適当な間隔を作り、したがってそれらの組成は重要ではなく、いかなる天然または非天然アミノ酸を含むことができる。
【００７７】
本発明は、小ペプチドすなわちオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含むシグナル分子を細胞に投与することを含む、細胞中の遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。そのような分子は本明細書中でＮＭＰＦとも呼称され、または番号で呼称される。小ペプチド、およびそのような比較的短いアミノ酸配列の機能的類似体と誘導体は、最近、容易に合成されるので、本発明は、合成ペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体のような容易に入手可能な合成化合物で遺伝子発現の調節するための方法を提供する。
【００７８】
本発明は、治療を要する患者にオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含む分子を投与することを含む炎症性疾患の治療方法であって、該分子は細胞によるＮＯの産生を減少する能力があり、該分子はさらに細胞中に存在する遺伝子転写因子の転座および／または活性を調節する能力があり、特に遺伝子転写因子がＮＫカッパＢ／Ｒｅｌタンパク質を含むものであることを特徴とする、治療方法を提供する。好ましくは、本発明は、細胞中に存在する遺伝子転写因子の転座および／または活性の調節が、細胞によるＴＮＦ−アルファ産生の調節を可能にし、特に、ＴＮＦ−アルファ産生が減少することを特徴とする方法を提供する。ＴＮＦ−アルファが全てでなかったとしてもほとんどすべての炎症性疾患にとってＴＮＦ−アルファが中心的であることを考えると、ＴＮＦ−アルファ産生を減少することによって、本明細書で説明される非常に多数の患者の炎症性疾患を緩和または軽減することができる。特に、炎症性疾患が急性炎症性疾患を含む方法を提供し、特に炭疽でＮＯとＴＮＦ−アルファの両者の減少が疾患の進行を非常に軽減するであろうことを考慮するとき、本発明の方法は、炭疽−関連疾患を治療するのに特に有用である。表６にそのような調節効果を有する本発明のオリゴペプチドが掲載されている。
【００７９】
特に本発明は、細胞によるＮＯの産生を減少させることのできる、オリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含む医薬組成物を患者に投与することを特徴とする治療方法を提供するものであり、好ましくは、該組成物が細胞によるＮＯの産生を減少させることのできる少なくとも２種のオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含むことを特徴とする治療方法を提供する。そして、そのようなオリゴペプチドの組み合わせの例は、表６の手引きの基に選択することができ、それによって、少なくとも２種のオリゴペプチドがＬＱＧＶ、ＡＱＧＶおよびＶＬＰＡＬＰのグループから選ばれるように、所望の効果を有する２種またはそれ以上を選択すれば充分である。
【００８０】
本発明はまた、細胞によるＮＯの産生を減少させることのできる、単離された、好ましくは合成の、オリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体または、そのようなオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体の混合物も提供する。そのような細胞は、これら細胞が炎症性過程で演じる中心的役割を考えると、好ましくはマクロファージまたはＤＣ系統の細胞である。本発明はまた、細胞によるＮＯの産生を減少させることができる、本発明のオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含有する、または、細胞によるＮＯの産生を減少させることができる、少なくとも２種のオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含有する、医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、治療される患者内のマクロファージまたはＤＣによるＮＯ産生を減少させることによって炎症性疾患を治療するための医薬組成物製造用の、細胞によるＮＯの産生を減少させることのできるオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体の用途を提供する。
【００８１】
ペプチドの機能的類似体または誘導体は、配列の機能的特性が必ずしも量的にではなく質的に本質的に同じであるように変化されたアミノ酸配列、または他の配列モノマーとして定義される。類似体または誘導体は、多くの方法によって、例えば同類アミノ酸置換によって提供することができる。出発点として考慮された元のペプチドに機能的または構造的に似ているが、例えば非天然アミノ酸またはポリアミドから構成されるペプチド擬似化合物も設計することができる。同類アミノ酸置換で、１つのアミノ酸残基が概して類似の性質（大きさ、疎水性）を有する他の１つのアミノ酸で、全体的機能が重大に影響されそうにないように置換される。しかしながら、特異的機能を改良することがたいていはもっと望ましい。誘導体もまた、アミノ酸配列の少なくとも１つの所望の特性を系統的に改良することによって提供することができる。これはたとえば、アラ−スキャン(Ala-scan)および／または置換ネットマッピング法によってすることができる。この方法によって、元のアミノ酸配列に基づくけれども少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む、多数の異なったペプチドが創り出される。そのアミノ酸残基は、アラニンによって置換する(アラ−スキャン、Ala-scan)か、または他のいかなるアミノ酸残基ででも置換すること（置換ネットマッピング、replacement  net  mapping）の何れかで置換することができる。このように、元のアミノ酸配列の、多数の位置異型体が合成される。どの位置異型体も特異的活性についてスクリーニングされる。生成されたデータは、改良された一定のアミノ酸配列のペプチド誘導体を設計するために使用される。
【００８２】
誘導体または類似体もまた、たとえば、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換することによって創り出すことができる。自然界に存在しないペプチドに導くこの置換は、アミノ酸配列の特性を改良することができる。保持された活性と増加した半減期を見込んで、たとえば全てのＤ−アミノ酸の逆反転型で既知活性のあるペプチド配列を提供することは有用である。元のアミノ酸配列の多数の位置異型体を創り出し、そして特異的活性のスクリーニングによって、そのようなＤ−アミノ酸を含有する改良されたペプチドは、さらに改良された特性を持つように設計することができる。
【００８３】
当業者は、アミノ酸配列の類似化合物を充分に作ることができる。これはたとえば、ペプチドライブラリーのスクリーニングによって実施される。そのような類似体は必ずしも量ではなく、質においてその配列と同じ機能特性を持っている。また、ペプチドまたは類似体は、たとえばそれらに(末端の)システインを付与することにより環化したり、たとえばリジンまたはシステインもしくは結合または多量体化を可能にする側鎖を有する他の化合物への結合により２量化もしくは多量体化したり、縦に並んだまたは繰り返し立体配置にしたり、複合化したり、または、もしも解離が可能な不安定な結合だけによるならば、当該技術で既知の担体に結合することができる。
【００８４】
本発明はまた、小ペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含む、細胞内で遺伝子発現を調節するためのシグナル分子を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、小ペプチドがシグナル伝達経路と遺伝子発現を調節することができるシグナル分子として働くことを見出した。細胞内で1種またはそれ以上の遺伝子の発現を調節するためのそのようなシグナル分子として働く小ペプチドの機能的類似体または誘導体を、本発明で提供されるシグナル分子を見いだすための種々の方法の少なくとも1つの方法によって同定または取得することができる。
【００８５】
たとえば、細胞内で遺伝子の発現を調節することのできるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための本発明で提供される1つの方法は、細胞にペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を細胞に投与することそして1種またはそれ以上の遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することを含む。そのような活性は、特異的転写因子のために研究中に磨かれた手段および／または方法を用いて種々の方法で測定することができる。詳細な説明で、それは、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質転写および／または活性を検討するために提供されるのみならず、そのような手段が利用できるかまたは計画できるいかなる他の転写因子の転写および／または活性を検討することも、もちろん、容易に可能である。そのような他の1つの転写因子は、たとえば前述のようなインターフェロンアルファで刺激された因子である。この状況で検討するための他の有用な転写因子には、たとえば、c−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｆｏｓおよびそれらの複合体、ＥＬＫ-1、ＥＧＲ-1、ＩＲＦ-1、ＩＲＦ−３／７、ＡＰ-1、ＮＦ−ＡＴ、Ｃ／ＥＢＰｓ、Ｓｐｌ、ＣＲＥＢ、ＰＰＡＲガンマ（PPARgamma）およびＳＴＡＴタンパク質が含まれる。多数のタンパク質は、タンパク質分解的分解を受け、それによってオリゴペプチドフラグメントが生成し、多くのフラグメントは、以前に完全なタンパク質が機能を発揮したように機能を発揮することを考えると、そのようなタンパク質（多数ではない例が詳細な説明に掲載されているが、たとえば、ペプチドＭＬＡＲＲＫＰＶＬＰＡＬＴＩＮＰを生成し、続いてＭＬＡＲＲＫＰまたはＭＬＡＲまたはＶＬＰＡＬＴまたはＶＬＰＡＬを含むペプチドを生成することのできるＭＡＰＫＫ−２ばかりでなく、適当なタンパク質分解の後にペプチドＦＰＧＣもしくはＰＧＣＰ、ＧＶＬＰＡＶＰ、ＬＰＡ、ＶＬＰＡＶＰまたはＰＡＶＰを生成することができる一酸化窒素合成酵素を思い浮かべることができる）のオリゴペプチドが、おそらく遺伝子発現に対する転写因子の効果を調節することによって遺伝子発現を制御しているフィードバック機構に関与していることがここに認められた。さらに、タンパク質のオリゴペプチドのフラグメント（その多数でない明細が詳細な説明に掲載されている）もまた、因子ＸＩＩＩ（因子ＸＩＩＩから得られるオリゴペプチドフラグメントの例には、ＬＱＧＶ、ＬＱＧＶＶＰＲＧＶ、ＧＶＶＰ、ＶＰＲＧＶ、ＰＲＧ、ＰＲＧＶが含まれる）または活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）のような細胞外成分の活性を調節することができ、そのことによって、結局、細胞内シグナル伝達経路と遺伝子発現の調節を導いている。
【００８６】
既述のように、本発明は、シグナル分子として働く活性なオリゴペプチドを提供する。そのようなシグナル分子（特に人工的に製造するときに医薬活性成分として有用である）の改良された生物学的利用能を考慮して、本発明は小ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体が本発明の機能的なシグナル分子として作用することができるかどうかを測定するための方法を提供し、その方法は、さらに、シグナル分子が膜透過性であり、前記で説明したように細胞質膜を通過しそして細胞表面受容体に結合することよってではなくその遺伝子制御効果を発揮するかどうかを測定することを含む。そのようなシグナル分子、すなわち本発明で提供される小ペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体である合成化合物は、従って、好ましくは、細胞膜表面受容体に介在されたシグナル化とそれに続く細胞内のカスケード事象を経由して相互作用するのではなく、直接的な細胞内活性を有する。
【００８７】
細胞にペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与し、遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定して、細胞内で遺伝子の発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための本発明で提供される方法を使用して、さらに、多数のオリゴまたはリードペプチドを（もし必要ならば無作為に）試験することが可能になり、自動化されたコンビナトリアル形式に導き（所望ならば無作為で）、活性なシグナル分子を提示している合成ペプチドの分子ライブラリーと共にきわめて多数のシグナル分子候補物がその活性に関して１つのパターンで（望むなら無作為に）試験され、千の十倍もの試験される分子（の組み合わせ）中の特に有用な分子の迅速な検出が可能になる。好ましい実施形態において、本発明は、前記リード化合物または少なくとも活性が、もし望むならコンピュータ管理の位置測定の助けで、位置的にまたは空間的にたとえばアレイ方式内でアドレスできる方法を提供する。アレイ内で上記の大多数はたとえばグリッドまたはマトリックス内におけるそれらの位置によってアドレスできる。そのような試験されるペプチドフラグメントまたはオリゴペプチド（ここではリードペプチドとも称される）は、少なくとも２〜３アミノ酸長で、約３０アミノ酸長よりは長くないことが有用であるが、これら内因性タンパク質の分解産物が制御的役割を演ずる生物内での明らかな状況に従うために、そのようなペプチドは、もっと小さく、たとえば、１６より小さく、好ましくは１０より小さくさらに好ましくは７アミノ酸より小さく、４〜５アミノ酸長のみでさえも好ましい。
【００８８】
本発明は、たとえば、遺伝子発現を制御するために、オリゴペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体の能力もしくは素質についての情報を得るための工程または方法を提供するものであり、
ａ）オリゴペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体を少なくとも１つの細胞と接触させること
ｂ）細胞中のまたは細胞から由来する少なくとも１種の遺伝子産物の存在を測定すること
の工程を含むことを特徴とする。
【００８９】
オリゴペプチドは、それが、植物もしくは動物、または真核生物もしくは原核生物由来、または制御タンパク質がサイトカインのような（プロ−）炎症性メディエーターであるような細胞中の制御タンパク質の合成酵素のものであろうと、ｈＣＧまたはＭＡＰＫＫまたは他のキナーゼのような天然に存在するポリペプチドのフラグメントに相当するアミノ酸配列を含むことが好ましい。本発明者の観点から見た分析用の第一選択物である候補ペプチドとペプチドフラグメントとが詳細な説明に掲載されているが、当業者および生物工学に関連する特定の分野で働いている者は、かかる研究用に彼または彼女の分野に関連した彼または彼女の目的のためにどのタンパク質を選択すべきか即座に理解するだろう。本発明は、たとえば、遺伝子発現を制御するために、オリゴペプチドの能力もしくは素質、またはその修飾体もしくは誘導体についての情報を得るための工程もしくは方法を提供するものであり、多数のオリゴまたはリードペプチドを（もし必要ならば無作為に）試験することが可能になり、自動化されたコンビナトリアル形式に導き、（所望ならば無作為で）、活性なシグナル分子を提示している合成ペプチドの分子ライブラリーと共にきわめて多数のシグナル分子候補物がその活性に関して１つのパターンで（望むなら無作為に）試験され、千の十倍もの試験される分子（の組み合わせ）中の特に有用な分子の迅速な検出が可能になる。好ましい実施形態において、本発明は、前記リード化合物または少なくとも活性が、もし望むならコンピュータ管理の位置測定の助けで、位置的にまたは空間的にたとえばアレイ方式内でアドレスできる方法を提供する。アレイ内で上記の大多数はたとえばグリッドまたはマトリックス内におけるそれらの位置によってアドレスできる。そのような試験されるペプチドフラグメントまたはオリゴペプチド（ここではリードペプチドとも称される）は、少なくとも２〜３アミノ酸長で、約３０アミノ酸長よりは長くないことが有用であるが、これら内因性タンパク質の分解産物が制御的役割を演ずる生物内での明らかな状況に従うために、そのようなペプチドは、さらに小さいことが好ましく、たとえば、１６より小さく、好ましくは１０より小さくさらに好ましくは７アミノ酸より小さく、４〜５アミノ酸長のみでさえも好ましい。
【００９０】
特に、本発明の工程を実施するために、さらに、工程ｃ)オリゴペプチドオリゴペプチドまたはその修飾体もしくは誘導体と接触されなかった細胞中にもしくは細胞から誘導された遺伝子産物の存在を測定すること、そして、工程ｂで見出された遺伝子産物の工程ｃで見出された遺伝子産物に対する比率を測定することを含む、今日の遺伝子チップ技術（たとえば、本明細書の詳細な説明を参照）と当該技術分野で知られた発現プロファイリングの関連方法で容易に実施することができるような工程を含む方法が提供される。
【００９１】
細胞中で遺伝子発現を調節することができるペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子（一般に短いペプチドである分子を合成する次の工程がすべてその技術内であることを考えて、さらにはシグナル分子そのもの）に関する情報を同定または取得するためにここで提供されるもう１つの方法は、細胞にペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を投与し細胞中の少なくとも１つの遺伝子発現の相対的なアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することを含む。アップレギュレーションは、慣行に従って、たとえばノーザンもしくはウエスタンブロッティングまたはＰＣＲによる核酸検出またはタンパク質の免疫学的検出を通じて、１つの細胞または複数の細胞が、１つの細胞または複数の細胞がペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与された後に、より多くの（アップレギュレーションの場合）またはより少ない（ダウンレギュレーションの場合）ｍＲＮＡのような遺伝子発現産物またはタンパク質を作るかどうかを測定することにより検討することができる。もちろん、本発明の種々の方法を、検討中のペプチドの機能的類似体または誘導体または類似体をよりよく分析するために組み合わせることができる。さらに、位置的にもしくは空間的にアドレス可能なアレイに結合されたまたはアレイ形式におかれた予め測定されたもしくは既知の利用可能な核酸配列もしくはその固有のフラグメントを用い、たとえば、核酸ライブラリーもしくはいわゆる遺伝子チップ発現分析システムを使用して、細胞中に発現された多数のまたは集団の遺伝子の相対的なアップレギュレーションおよびまたはダウンレギュレーションも容易に検討することができる。検討中のペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与された細胞の細胞質および／または核の溶解物または調製物はそれからライブラリーと接触され、ライブラリーの個々の核酸へのたとえばｍＲＮＡの相対的結合が、詳細な説明に説明されているように、測定される。
【００９２】
細胞内で遺伝子発現を調節するためのシグナル分子として働くことのできる小ペプチドの機能的類似体または誘導体は、ペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を供給しそして遺伝子制御に関連する因子へのペプチドまたはその誘導体もしくは類似体の結合を測定することを含む、細胞内で遺伝子発現を調節することができるオゴペプチドまたはその機能的誘導体もしくは類似体を含むシグナル分子を同定または取得するための方法によって同定または取得することもできる。そのような遺伝子制御に関連する因子は、転写（開始または終始のいずれか）、一次転写体のプロセッシング、ｍＲＮＡの安定化または不安定化、およびｍＲＮＡ翻訳に関連するいずれの因子であることができる。
【００９３】
そのような因子へのペプチドまたはその誘導体もしくは類似体の結合は、当該技術で既知の種々の方法で測定することができる。通常には、ペプチドまたは誘導体または類似体は、（放射活性的に）標識されて、因子への結合は、たとえば電気泳動またはその他の当該技術で既知の分離方法によって標識されたペプチド−因子複合体を検出することによって測定することができる。しかしながら、そのような因子への結合を測定するために、多数のペプチドまたはそれらの誘導体もしくは類似体を供給しそして少なくとも１つのペプチドまたはその誘導体もしくは類似体の遺伝子制御に関連する因子への結合を測定することを含む、ペプチドライブラリーと共に使用されるようなアレイ技術もまた使用することができる。
【００９４】
好ましい実施形態において、遺伝子制御に関連する因子は、ＮＦ−カッパＢ−Ｒｅｌタンパク質のような転写因子または検討すべきと望まれる他の転写因子を含む。本発明の機能的類似体のそのような因子への結合がなされたとき、もちろん、細胞にペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与し、そして細胞中の遺伝子転写因子の活性および／または核転座を測定することによって、および／または細胞にペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を投与し、そして細胞中で発現された少なくとも１つの遺伝子のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションを測定することによって、さらに類似体を分析することが可能である。
【００９５】
本発明はこのように、細胞中で遺伝子の発現を調節するのに有用な、および／または細胞によるＮＯ産生を減少させるのに有用な、そして本発明の方法を使用して同定可能なもしくは取得可能なシグナル分子を提供する。そのようなシグナル分子の有用な例は、オリゴペプチドＬＱＧ、ＡＱＧ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＡＰＱ、ＶＬＰＡＬＡＱ、ＬＡＧＶ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＡ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＡＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＬＰＡ、ＧＶＬＰＡＬＰ、ＧＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＶＶ、ＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ、ＲＰＲＣＲＰＩＮＡＴＬＡＶＥＫ、ＥＧＣＰＶＣＩＴＶＮＴＴＩＣＡＧＹＣＰＴ、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳ、ＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＭＴＲＶ、ＭＴＲ、ＶＶＣ、ＱＶＶＣとこれらの機能的類似体または誘導体の群から選択することができる。
【００９６】
本発明のシグナル分子の好ましい大きさは、もっと小さな分子、特にオリゴペプチドサイズの分子が、特に効果的であると示されたが、多くとも３０〜４０アミノ酸である。驚くべきことに、本発明は、遺伝子発現は、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）および成長ホルモンのような大きなポリペプチドまたは線維芽細胞増殖因子、ＥＦＧ、ＶＥＧＥ，ＲＮＡ３‘末端フォスフェートシクラーゼおよびＣＡＰ１８のような成長因子の分解産物であるとほとんど思える小さいペプチドによって調節または制御され得るとの知見を提供する。原則的に、そのような制御ペプチドの配列は、原核および／または真核細胞によって産生されたポリペプチド分子のいずれの部分からも誘導することができ、本発明は、ポリペプチドの分解産物、好ましくはここで提供した大きさとほぼ同じ大きさのオリゴペプチドが遺伝子発現の調節にシグナル分子として本来関与しているという知見を提供する。特に、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン（ベータ−ｈＣＧ）、好ましくはニックドベータ−ｈＣＧから取得できるまたは誘導され得る（合成）ペプチドが、シグナル分子として提供される。ニック  ベータ−ｈＣＧ(nicked  beta-HCG)の分解産物は、免疫調節に（ＰＣＴ国際特許出願Ｗ０９９／５９６７１）または消耗性症候群の治療に（ＰＣＴ国際特許出願Ｗ０９７／４９７２１)関与していると以前は考えられていたが、遺伝子発現の調節との関係はこれらの刊行物には発表されなかった。もちろん、そのようなオリゴペプチドまたはその機能的等価体もしくは誘導体は、分解またはタンパク質分解されかつ遺伝子制御カスケードに近い他のタンパク質から取得または誘導し得そうである。好ましくは、ペプチドシグナル分子は、ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ、ＲＰＲＣＲＰＩＮＡＴＬＡＶＥＫＥＧＣＰＶＣＩＴＶＮＴＴＩＣＡＧＹＣＰＴ、ＣＡＬＣＲＲＳＴＴＤＣＧＧＰＫＤＨＰＬＴＣ、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳ、ＣＲＲＳＴＴＤＣＧＧＰＫＤＨＰＬＴＣ、ＴＣＤＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ、のアミノ酸配列を有するペプチドの如き少なくとも１０アミノ酸を有するペプチドから得られる。
【００９７】
原理に縛られることを望まずに、遺伝子制御の予想外のモードが見出されたとみなされる。内因性ＣＧ，ＥＦＧ等のようなポリペプチドばかりでなくウイルス、細菌のような病原体のポリペプチドまたは原生動物のポリペプチドが、たとえば細胞内タンパク質分解によって、個別のオリゴペプチドに分解させられるのに適している。個別のタンパク質分解酵素が、細胞内で、たとえばリソームのまたはプロテアソームのシステムにおける真核細胞内で、広く利用可能である。いくつかの分解生成物は、３〜１０、好ましくは４〜９、もっとも好ましくは４〜６アミノ酸長であり、これらは驚くべきことに細胞に対していかなる機能または効果も有していないことはなく、ここで証明されたように、内因性ポリペプチドが分解した場合におそらくフィードバック機構で遺伝子発現の調節において、ここで証明されたように、たとえばペプチドLQGV、VLPALPQVVC、LQGVLPALPQ、LQG、GVLPALPQ、VLPALP、VLPALPQ、GVLPALP、VVC、MTRVおよび MTRによるＮＦ−カッパＢの如き遺伝子転写因子の活性または転写の制御によって、シブナル分子として関与している可能性がある。上述のように、これらオリゴペプチドの合成型、およびこれら分解産物の類似体もしくは誘導体が、細胞内で遺伝子発現を調節するためにここに提供され、遺伝子発現の過ちを修復するための方法または疾病の治療に使用される。特に、ＬＱＧ、ＡＱＧ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＡＰＱ、ＶＬＰＡＬＡＱ、ＬＡＧＶ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＡ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＡＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＬＰＡ、ＧＶＬＰＡＬＰ、ＧＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＭＴＲＶ、ＭＴＲ、ＶＶＣのようなオリゴペプチドまたはこれらの機能的類似体もしくはそのもっと長い配列の（分解産物も含めて）誘導体が特に効果がある。
【００９８】
ここで述べたような知見を使用して、好ましい実施形態において、本発明は、細胞にオリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含むシグナル分子を投与することを含む、細胞内の遺伝子の発現を調節するための方法であって、シグナル分子が細胞に入る膜に膜透過性であることを特徴とする、遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。ここに記載されたほとんどの小ペプチドは、分子内関与するように生来の性質をすでに有しているが、ここで提供されるシグナル分子は、アルギニンまたはリジンに富んだアミノ酸の一連のような追加のペプチド配列を備えることもでき、この配列は、脂質２重層膜を通る改良された細胞内への吸収を可能にし、そしておそらくその後、細胞内のタンパク質分解によって切断され得る。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明は、細胞に小ペプチド（アミノ酸配列）またはその機能的類似体もしくは誘導体を含むシグナル分子を投与することから成る、細胞内の遺伝子の発現を調節するための方法であって、シグナル分子がＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質転換または転座を調節することを特徴とする、遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。前述したように、ＮＦ−κＢはもともと、Ｉｇκ軽鎖に関する遺伝子中のエンハンサー要素に結合する遺伝子転写因子として同定され、Ｂ細胞特異的と信じられた。しかしながら、その後の研究によってＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質は、普遍的に発現され、特に免疫、炎症および発育とアポトーシスプロセスに関与する、多数の遺伝子の発現の制御において転写因子として中心的な役割を演じていることが明らかとなった。ＮＦ−κＢ関連遺伝子転写因子は、細菌の産物、プロ炎症性サイトカイン、ＴおよびＢ細胞マイトジェン、および物理的および化学的ストレスのような種々の刺激によって活性化され得る。その代わりに、ＮＦ−κＢは、多数のサイトカイン、ケモカイン、接着分子、急性期タンパク質、および抗菌ペプチドの誘導発現を制御する。
【０１００】
ＮＦ−κＢは、１群の構造的に関連したおよび進化的に保存された遺伝子転写因子を提示する。今のところ、Ｒｅｌ（ｃ−Ｒｅｌ）、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ＮＦ−カッパ−Ｂ１（ｐ５０）とその前駆体ｐ１０５）、およびＮＦ−カッパ−Ｂ２（ｐ５２とその前躯体ｐ１００）と命名された哺乳動物の５種のＮＦ−κＢタンパク質が報告されている。ＮＦ−κＢタンパク質は、ホモまたはヘテロ２量体として存在することができ、ほとんどのＮＦ−κＢ２量体は転写の活性化物質であるが、ｐ５０／ｐ５０およびｐ５２／ｐ５２ホモ２量体はしばしばその標的遺伝子を抑制する。ショウジョウバエでは、Ｄｏｒｓａｌ、ＤｉｆおよびＲｅｌｉｓｈと命名された３種のＮＦ−κＢ相同体が同定され特徴が述べられた。構造的にすべてのＮＦ−κＢ／Ｒｅｌタンパク質は、高度に保存されたＮＨ２−末端Ｒｅｌ相同ドメイン（ＰＨＤ）を共有しており、このドメインは、ＤＮＡ結合、２量化、およびＩκＢとして知られている阻害タンパク質との結合に役割を果たす。休止細胞では、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌ２量体は、ＩκＢに結合し、細胞質内で不活性型のままである。ＮＦ−κＢと同様に、ＩκＢもまた、ＩκＢα、ＩκＢβ、ＩκＢγ、ＩκＢε、Ｂｃｌ−３、プレカーサーＲｅｌ−タンパク質、ｐ１００およびｐ１０５ならびにＣａｃｔｕｓと命名されたショウジョウバエＩκＢを含む哺乳動物の既知のメンバーを含んでいる多重遺伝子族のメンバーである。ＩκＢファミリーは、アンキリン（ankyrin）繰り返し体の複数複写の存在に特徴があり、ＰＨＤを介してＮＦ−κＢと相互作用する蛋白−蛋白相互作用モチーフである。適当な刺激を受けると、ＩκＢは、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫｓ）によってリン酸化され、ユビキチンリガーゼ複合体によってポリユビキチン化されそして２６Ｓプロテアソームによって分解される。その結果、ＮＦ−κＢが放出されそして遺伝子発現を開始するために核内に転座する。
【０１０１】
ＮＦ−κＢ関連転写因子は、先天性免疫応答に重要な役割を果たす広範な種々の遺伝子の発現を制御する。そのようなＮＦ−κＢの標的遺伝子には、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ-α、ＬＴα、ＬＴβおよびＧＭ−ＣＳＦ）、接着分子（たとえば、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、内皮白血球接着分子[ＥＬＡＭ]）、急性期タンパク質（たとえば、ＳＡＡ）および誘導酵素（たとえば、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２）をコード化している遺伝子が含まれる。さらに、数種の進化的に保存された抗菌ペプチド、たとえばβ−デフェンシン（β−defensins）、もまた、ショウジョウバエの場合に類似して、ＮＦ−κＢによって制御されるということが最近、証明された。先天性免疫に関与する分子の発現を制御すると共に、ＮＦ−κＢは、また、ＭＨＣタンパク質のような適応免疫に重要な分子の発現ならびにＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮγのような重要なサイトカインの発現に役割を果たしている。最後に、ＮＦ−κＢは、ａｓｃ−ＩＡＰ−１およびc−ＩＡＰ−２、Ｆａｓリガンドc−ｍｙｃ、ｐ５３、およびサイクリンＤ１のようなアポトーシスプロセスを制御するために重要な遺伝子の発現に影響をおよぼすことによって全体的な免疫応答に重要な役割を果たしている。
【０１０２】
正常な条件下では、ＮＦ−カッパＢは、細菌またはウイルスが侵入したときに急速に活性化され、この活性化は通常、感染に対する宿主の抵抗に相関している。しかしながら、ＮＦ−カッパＢの永続的な活性化は、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのようなプロ炎症性メディエーター過剰量の産生を引き起こし、インシュリン依存性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、クローン病、臓器不全、そして細菌感染に誘導された敗血ショックのように宿主の死にさえ至る結果となる。宿主中で生存するために、日本住血吸虫、ボルデテラ、エルジニア、トキソプラズマゴンディおよびアフリカ豚熱病ウイルスは、ＮＦカッパＢの活性化を阻害することによって宿主システムに対抗または逃れるための進化した機構を有しているということに注目することは興味深いことである。一方、ＨＩＶ−１、ＣＭＶおよびＳＶ−４０を含むいくつかのウイルスは、感染の部位で活性化される宿主因子としてのＮＦ−カッパＢを利用する。
【０１０３】
さらに、本発明は、たとえば大腸菌または他の病原性の細菌のような細菌、カビ、またはカンジダアルビカンス（Candida albicans）のようなイースト、インフルエンザウイルルスのようなウイルス、このような微生物に応答している樹状細胞中の遺伝子発現プロファイル、および本発明のシグナル分子でのこれら疾患に対する（同時の）治療効果を分析することによって、樹状細胞のような抗原提示細胞内の遺伝子発現の微生物暴露に応答する変化を探索する方法を提供する。たとえば、ヒト単球起源の樹状細胞は、１種またはそれ以上の病原体と１〜３６時間培養され、遺伝子発現が、（それが大きかろうと小さかろうと）遺伝子のセットに相当するヌクレオチドアレイを使用して分析される。その病原体が、中心的セットのはっきり認識できる数の遺伝子発現を制御しているときは、これら遺伝子はそれらの発現の動態と機能によって分類することができる。一般に、病原体への暴露の４時間以内に、病原体認識と食作用に連携した遺伝子はダウンレギュレーションされ、一方、抗原のプロセッシングと提示に関する遺伝子は、８時間暴露後にアップレギュレーションされるであろう。本発明のシグナル分子でのそのような樹状細胞の処置によって（それが、病原体での細胞の同時的処置、病原体暴露前のまたは後の処置であっても）、本発明のシグナル分子の病原体への効果と抗原提示細胞への効果を検討することが可能になる。
【０１０４】
要約すれば、本発明は驚くべきことに、細胞内で遺伝子発現を制御することができる、好ましくは約３０アミノ酸の長さの短いペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体である、シグナル分子を提供する。より好ましい実施形態では、そのペプチドは、約３〜約１５アミノ酸の長さ、好ましくは４〜１２、もっと好ましくは４〜９、もっとも好ましくは４〜６アミノ酸の長さのオリゴペプチド、またはその機能的類似体もしくは誘導体である。もちろん、そのようなシグナル分子は、その分子が最終的な位置に入ったときにたとえば（酵素的に）切断され得るような、たとえば（Ｎ−および／またはＣ−末端へ）もっと多くのアミノ酸または他の側鎖基で延長することによる、もっと長いものであることができる。かかる延長は、シグナル分子が延長の最終的な形で活性になることを避けるのが好ましくもありえるが、その分子の核または活性フラグメントは、前述のオリゴペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を含むものである。本発明のかかるペプチドは、アセチルコリン、成長因子、細胞外マトリックス構成要素、（ペプチド）ホルモン、神経ペプチド、トロンビンのような従来知られた膜不透過性シグナル分子が作用するのとは異なった方法で、すなわち、細胞表面受容体介在シグナル化によらずに、その生物活性を発揮する。
【０１０５】
特に、本発明は、本発明のシグナル分子を含むＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質活性化の調節剤を提供する。かかる調節剤は、最近、広範に探求された。さらに本発明は、本発明のシグナル分子の、遺伝子発現を調節するための医薬組成物の生産用の用途を提供する。
【０１０６】
また本発明は、オリゴペプチド、ペプチドまたはその機能的類似体を含む、細胞によるＮＯおよび／またはＴＮＦ−アルファ産生を調節することができる分子を、治療を要する患者に投与することから成る、骨粗鬆症のような骨疾患の治療方法を提供する。かかる治療方法は、ｈＣＧとその分解産物から生理学的に由来するここで提供される、天然由来のいくつかのシグナル分子の投与の恩恵を受けた経験のない閉経後の女性に特に有用である。さらに本発明は、治療を要する患者に、細胞中に存在する遺伝子転写因子、特にＮＦ−カッパ因子の転座および／または活性を調節することができるアルオリゴペプチドまたはその機能的類似体を含む分子を投与することから成る、慢性関節炎または滑膜炎に伴って観察されるような、線維芽細胞のＴＮＦ−アルファ活性に連携した炎症疾患を治療するための方法を提供する。かかる治療は、本発明のシグナル分子の全身投与で実施することができるが、関節、髄液嚢または筋肉腱鞘への局所投与もされる。分子は表６または本発明の方法で同定された分子から選択することができる。治療が患者に、細胞によるＮＯの産生を減少させることもできるオリゴペプチドまたはその機能的類似体を投与することから成る場合、たとえば、組成物はそれぞれが細胞によるＮＯおよび／またはＴＮＦ−アルファの産生を減少させることができる少なくとも２つのオリゴペプチドまたはその類似体を含有していること、特に２つのオリゴペプチドは、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶおよびＶＬＰＡＬＰのグループから選択されるのが好ましい。
【０１０７】
さらに、本発明は、細胞によるＮＯおよび／またはＴＮＦ−アルファの産生を減少させることができるオリゴペプチドまたはその機能的類似体の、炎症性疾患または閉経後の疾患または骨粗鬆症のような骨疾患の治療用医薬組成物または体重減少を誘導するための医薬組成物を製造するための用途を提供する。ここで使用する用語「医薬組成物」は、活性なシグナル分子のみと、または薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは添加物とシグナル分子とを一緒に含有する組成物との両者を包含する。ここに詳細な説明に記載されるオリゴペプチドの許容される希釈剤は、たとえば生理食塩水またはリン酸塩緩衝溶液である。本発明の１つの実施形態において、シグナル分子は有効濃度でたとえば静脈内、筋肉内または腹腔内投与で動物または人に全身投与される。もう１つの投与方法には、インビボであれエクスビボデあれ、本発明のシグナル分子を含有する灌流液で臓器または組織を灌流することが含まれる。軟膏またはスプレーでの経皮投与もまた、皮膚もしくは、たとえば口、鼻もしくは生殖器の粘膜表面の炎症に適用することもできる。局所投与は、関節、髄液嚢もしくは筋肉腱鞘内に、神経束が分岐している場所の脊髄内もしくはその周囲、ヘルニアの位置、嚢もしくは心臓内の破損域周辺などに投与される。投与は、単回投与量として、種々の投与量を不連続であるが繰り返して、または、連続投与の場合には遺伝子発現の実質的調節が可能になる充分な期間連続して投与することができ、投与の継続時間は、当業者に容易に認識できる因子の数に依存して変化させることができる。
【０１０８】
活性分子の投与量はかなり広い範囲にわたって変えることができる。投与可能な活性分子の濃度は下限濃度における効力と上限での化合物の溶解度で制限されるであろう。最適投与量または特別な患者に対する投与量は、医者または関与する医学専門家によって、症状、体重および患者の年齢などのよく知られた適切な因子を考慮して決定すべきであり、また決定できる。
【０１０９】
活性分子は、たとえばリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような適切な担体に入れてまたはアルコールもしくはＤＭＳＯ溶液で直接投与することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施形態にしたがって、活性分子は、たとえば遅放出性デリバリーシステムのような薬物輸送システムを使用して単一投与で投与することができ、このことで、遺伝子の適切な調節に充分な期間、活性分子の所望の濃度を保持することが可能である。適切な薬物輸送システムは、薬学的に不活性か少なくとも許容できるものである。それは、好ましくは、免疫性でもなく炎症反応を引き起こすものでもあるべきでなく、その有効濃度を所望の期間維持するように活性分子を放出させることができるものである。非常に多様な代替物が当該技術内で持続性放出の目的に適していると知られ、これらは本発明の範囲内と考えられる。好適な担体には、これに限定されず、次のマイクロカプセルまたはマイクロスフェアーが含まれる。すなわち、リポソーム、および他の脂質に基づく放出システム、粘性点滴液、吸収性および／または生物的に分解可能な力学的担体およびインプラント、およびポリエチレンオキサイド／ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー、ポリエステル、交差結合ポリビニルアルコール、ポリ無水物、ポリメタアクリレートおよびポリメタアクリルアミドヒドロゲル、陰イオン性炭化水素ポリマーなどのようなポリマー製の輸送材料である。有用な輸送ステムは、当該技術でよく知られている。
【０１１０】
活性分子を放出する非常に好適な製剤には、ポリ（ｄｌ-ラクチド）、ポリ（ｄｌ−ラクチド−グリコリド共重合体）、ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリ乳酸−グリコリド、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリエステルまたはポリアセタールのような生物分解可能なポリマー製の注射可能なマイクロカプセルまたはマイクロスフェアーが含まれる。約５０〜約５００マイクロメータの直径を有するマイクロカプセルまたはマイクロスフェアーを含む注射可能なシステムは、他の輸送システムよりも有利である。たとえば、それらは、一般に低活性の分子を使用し準医療従事者によって投与することができる。さらにそのようなシステムは、マイクロカプセルの大きさおよびマイクロスフェアーの大きさの選択によって、持続性と異なる医薬放出比率、薬剤負荷および投与量の設計に本質的に柔軟性がある。さらに、それらはガンマ線照射によってうまく殺菌できる。
【０１１１】
マイクロカプセルとマイクロスフェアーの設計、製造および使用は、当業者がよく達成できる範囲内であり、これらの点に関する詳細な情報は、文献で利用できる。生物分解ポリマー（ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトン  ポリマーのような）はまた、たとえば予備調製フィルムのような、マイクロカプセルおよびマイクロスフェアー以外の製剤に使用することができ、活性分子を含むこれらポリマーを噴霧し作成したフィルム（spray-on film）は本発明に従い使用するのに好適であろう。活性分子を含有する繊維またはフィラメントも本発明の意図する範囲内である。
【０１１２】
本発明の活性分子の単回投与輸送（single-dose delivery）のためにきわめて好適なもう１つの製剤には、リポソームが含まれる。活性分子をリポソームまたは薄膜多層小胞にカプセル状に包み込むことは、標的薬物輸送と持続てき薬物保持によく知られた技術である。薬物担持リポソームの製剤と用途は、当業者が充分達成できる範囲であり、文献によく記載されている。
【０１１３】
さらに、本発明の活性分子の単回投与輸送のためのもう１つの好適な方法には、粘性液体（viscous installates）の使用が含まれる。この技術では、高分子量の担体が活性分子と混合して使用され、高粘度の溶液を産生する構造となる。好適な高分子量担体には、これには限らないが、次のものが含まれる。すなわち、デキストランとシクロデキストラン、ハイドロゲル、粘弾性体を含む（交差結合）粘性材料、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸である。薬物担持粘性液体の調製および使用は、当業者によく知られている。
【０１１４】
さらにもう１つの方法に従って、活性分子は酸化再生セルロースのような吸収性力学的担体と一緒に投与することができる。活性分子は共有結合でまたは非共有結合（たとえば、イオン結合）でそのような担体に結合するか、またはその中に単に分散することができる。
【０１１５】
ここで提供される医薬組成物は、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質の活性化を阻害することによって遺伝子発現の調節に特に有用である。
【０１１６】
ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌタンパク質は、構造的に関連する、かつ進化的に保存されたタンパク質（Ｒｅｌ）のグループである。よく知られたものは、c−Ｒｅｌ、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ＮＦ−カッパＢ１（ｐ５０とその前駆体ｐ１０５）およびＮＦ−カッパＢ２（ｐ５２とその前駆体ｐ１００）である。ほとんどのＮＦ−カッパＢの２量体は、転写の活性化剤であるが、ｐ５０／ｐ５０とｐ５２／ｐ５２ホモ２量体はそれらの標的遺伝子の転写を抑制する。全てのＮＦ−カッパＢタンパク質は、高度に保存されたＮＨ２−末端Ｒｅｌ相同ドメイン（ＲＨＤ）を共有している。ＲＨＤは、ＤＮＡへの結合、２量化、およびＩカッパＢｓとして知られる阻害タンパク質との結合の役割を果たしている。休止している細胞内で、ＮＦ−カッパＢ／Ｒｅｌ２量体はＩカッパＢｓに結合し、細胞質内で不活性型のままである。ＩカッパＢｓは、多重遺伝子族（ＩカッパＢアルファ、ＩカッパＢベータ、ＩカッパＢガンマ、ＩカッパＢエプシロン、Ｂｃｌ−３および前駆体Ｒｅｌ−タンパク質、ｐ１００およびｐ１０５）のメンバーである。アンキリン繰返しの複数コピーの存在は、ＰＨＤを介してＮＦ−カッパＢと相互作用する（蛋白−蛋白相互作用）。適当な刺激を受けると、ＩカッパＢは、ＩカッパＢキナーゼ（ＩＫＫｓ）によってリン酸化され、ユビキチンリガーゼ複合体によってポリユビキチン化されそして２６Ｓプロテアソームによって分解される。ＮＦ−カッパＢは放出され、核内に転座して遺伝子発現を開始する。
【０１１７】
遺伝子発現のＮＦ−カッパＢによる制御には先天性免疫応答が含まれる。すなわち、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ-アルファ、ＬＴ−アルファ、ＬＴ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦによって制御される免疫応答、接着分子（ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、内皮白血球接着分子[ＥＬＡＭ]）、急性期タンパク質（ＳＡＡ）、i誘導酵素（ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２）および抗菌ペプチド（β−デフェンシン）の発現である。適応免疫に関しては、ＭＨＣタンパク質、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−アルファは、ＮＦ−カッパＢによって制御されている。全体的な免疫応答には、アポトーシスの制御に重要な遺伝子の制御が含まれる（ｃ−ＩＡＰ−１およびc−ＩＡＰ−２、Ｆａｓリガンド、c−ｍｙｃ、ｐ５３、およびサイクリンＤ１）。
【０１１８】
ＮＦ−カッパＢと関連する転写因子が主要なプロ炎症性転写因子であること、および、本発明がＮＦ−カッパＢと恐らく他のプロ−炎症性転写因子も阻害することができるオリゴペプチドとその機能的類似体または誘導体のようなシグナル分子、ここではＮＦ−カッパ阻害剤とも称される、を提供することを考えて、本発明は、ＮＦ−カッパＢで活性化された遺伝子を調節する方法、特に発現を阻害する方法すなわち中心的プロ−炎症性経路を阻害する方法を提供する。
【０１１９】
このプロ−炎症性経路を阻害するこの効力の結果は、広範囲に及ぶものである。本発明は、たとえば、喘息のような炎症性気道疾患を緩和または治療する方法を提供する。一般に、喘息患者は、呼吸器官の輪郭を形成している細胞のＮＦ−カッパＢの永続的活性化状態を示す。たとえばエアゾル投与によってこれら患者に、ＬＱＧＶまたはＡＱＧＶまたはＭＴＲＶまたはその機能的類似体もしくは誘導体のような本発明のシグナル分子を投与すると、細胞のＮＦ−カッパＢ活性化を阻害することによってこれら個人の炎症性気道応答を緩和するだろう。かかる組成物は、リポソーム内に吸収されたシグナル分子で有利に作成することができる。
【０１２０】
既述のように、炎症には、プロ−炎症性メディエーターおよび抗−炎症性メディエーターの両者の産生を導く、シグナル経路の逐次的な活性化が関与している。炎症を開始するプロ−炎症性経路に多くの注意の焦点が当てられたことを考えると、炎症を止めかつ炎症反応を消散する機構についてはあまり知られていない。転写因子ＮＦ−κＢは、プロ−炎症性遺伝子発現の誘導に中心的役割を果たしていると考えられ、炎症疾患の治療の新しい標的として興味を引いた。しかしながら、炎症の開始中に補充された白血球のＮＦ−κＢ活性化もまたプロ−炎症性遺伝子の発現を伴うが、炎症消散中のそのような活性化には抗炎症性遺伝子の発現とアポトーシスの誘導が伴う。炎症の消散中におけるＮＦ−κＢの阻害は、炎症を長引かせ、アポトーシスを妨げる。このことは、ＮＦ−κＢがインビボで抗炎症の役割を有し、炎症消散の制御に関与していることを示している。本発明は、終期における炎症を調節する手段を提供し、ここで提供するようなシグナル分子または調節剤によってインビボでの炎症反応の異なる段階でＮＦ−カッパＢ経路の調節が可能になり、そして特定の実施形態で、本発明は、たとえば白血球のアポトーシスの制御を介して炎症の消散に使用するための、ＮＦ−カッパＢの調節剤を提供する。有用なオリゴペプチドはショック症状を加速するオリゴペプチドから見出すことができる。
【０１２１】
本発明は、また、症状が長期化した肺炎症または気管支肺異型症を発現する早産児にしばしば観察され、早産児の慢性肺疾患とも呼ばれる新生児の肺疾病を緩和または治療する方法も提供する。そのような早産児を、本発明で提供されるオリゴペプチドＬＱＧＶまたはその機能的類似体もしくは誘導体のようなＮＦ−カッパＢ阻害剤で処置することによって、そのような肺症状を予防または改善することもできる。
【０１２２】
最近の骨生態学は、骨疾患の発病に知見を提供する。さらに本発明は、破骨細胞の分化の調節と阻害ならびに骨芽細胞のＴＮＦ−アルファ誘導アポトーシスを阻害することより成る、骨粗鬆症のような閉経後の疾患の治療方法を提供し、それによって、さもなければ天然由来のｈＣＧをもう持たずそれ故ここで示されたようなｈＣＧ由来のシグナル分子の調節効果に欠ける閉経後の女性に極めて顕著な骨構造の溶解を、制限する。このように、本発明はまた（閉経後の女性に限るわけでないが閉経後の女性にしばしば観察される）骨粗鬆症のような骨疾患の治療方法をも提供する。さらに、ここで提供されるＮＯとＴＮＦ−アルファ調節剤は、歯根膜炎での炎症反応と骨損失を阻害する。さらに、ＴＮＦ−アルファ活性と強直性脊椎炎おける臨床徴候の激烈さとに相互関係があることを考え、本発明はここで提供されるシグナル分子の使用による脊椎炎の治療法を提供する。
【０１２３】
さらに、インシュリン依存性真性糖尿病（１型）の進展における重要な病原性要素には、樹状細胞に観察されるようにＮＦ−カッパＢ経路の過剰活性化が含まれることを考え、本発明のＮＦ−カッパＢ阻害剤での治療は、糖尿病の徴候の減弱または少なくともその疾病の発病までの時間の延長をもたらすであろう。この状況において特に有効な本発明のオリゴペプチドシグナル分子は、非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤ）で糖尿病発症の遅延を示した、ＧＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＱＧＶ、ＭＴＲＶ、ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＬＰＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ、およびＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳである。もう１つの糖尿病、特にインシュリン非依存性糖尿病（２型）、の治療方法には、オリゴペプチドシグナル分子またはその機能的類似体もしくは誘導体でのＰＰＡＲガンマカスケードの阻害が含まれる。
【０１２４】
提供されるもう１つの用途は、自己免疫疾患と戦うかまたは自己免疫疾患を治療する方法に関する。自己免疫疾患の一覧には、以下のものが含まれるが、これに限定されない。
【０１２５】
橋本甲状腺炎、原発性筋水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アディソン病（Addison's disease）、早期閉経、インシュイン依存性真性糖尿、スティッフ−マン症候群（stiff-man syndrome）、グウドパスチャ症候群（Goodpasture's syndrome）、重症無筋症、男性不妊症、尋常天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、突発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シグレン症候群（Sjgren's syndrome）、リウマチ性関節炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、強皮症、混合性結合織病、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデス。
【０１２６】
提供されるもう１つの用途は、微生物に起因する感染、特に感染中にＮＦ−カッパＢ経路を活性化する微生物によって引き起こされる感染と戦うかまたはこれら感染を治療するための方法に関する。
【０１２７】
そのような微生物は、細菌、ウイルス、カビおよび原生動物を含み多様であるが、他の病原体（たとえば蠕虫）にも同様の効果を有する。一般に微生物感染によるＮＦ−カッパＢの活性化は、トール様（Toll-like）受容体経路の活性を介して起こる。本発明は、１つのトール様（Toll-like）受容体を経て一般に活性化される生物の炎症反応に係る遺伝子発現の１部分を調節および特に阻害するための方法を提供する。
【０１２８】
トール様（Toll-like）受容体を介するＮＦ−カッパＢ活性化は、宿主による病原体の認識において中心的である。そのような病原体の認識は一般に、生殖細胞系でコードされた分子、いわゆるパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）を通じて起こる。これらのＰＲＲｓは、広範な病原体結合分子パターン（ＰＡＭＰｓ）を認識する。パターン認識受容体は、膜結合したまたは可溶性のいずれかのタンパク質として発現される。それらには、ＣＤ１４、ベータ２−インテグリン（ＣＤＩＩ／ＣＤ１８）、Ｃ−型レクチン、マクロファージスカベエンジャー受容体、相補受容体（ＣＲ１／ＣＤ３５、ＣＲ２／ＣＤ２１）およびトール様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（ＴＬＲｓ）が含まれる。ＴＬＲｓは、異なる病原体クラス間で認識または区別する能力によって、他のＰＲＲｓと区別される。ＴLＲｓは、タイプＩＩＬ−１受容体の膜内シグナルドメインに重要な相同を有するレクチンに富む繰り返し（ＬＲＲｓ）および細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ−ＩＲ（ＴＩＲ）モチーフの複数コピーを含んでいる細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質のファミリーを表現する。したがって、ＴＬＲｓは、ＩＬ−１Ｒスパーファミリーに属すると考えられている。
【０１２９】
病原体結合分子パターン（ＰＡＭＰＳ）は、宿主によっては発現されないが、病原性微生物の構成要素である。そのようなＰＡＭＰＳには、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポタンパク質（ＢＬＰ）、ペプチドグリカン（ＰＧＭ）、リポアラビノマンアン（ＬＡＭ）、リポタイコ酸（lipoteichoic acid、ＬＴＡ）、ＤＮＡ含有非メチル化Ｃｏｐモチーフなどの細菌細胞壁の構成要素、イーストとカビ細胞壁マンナンおよびベータ−グルカン、２重鎖ＲＮＡ、数種の特異な糖化タンパク質および原生動物の脂質などが含まれる。
【０１３０】
これらのＰＡＭＰＳの認識は、まず第１にＴＬＲｓによる病原体の特異な認識のために提供される。たとえば、ＴＬＲ２は、一般にＢＬＰｓ、グラム陽性菌のＰＧＮｓ、ミコバクテリアのＬＡＭおよびイーストのマンナンへの応答で活性化され、一方、ＴＬＲ４は、しばしばグラム陰性菌のＬＰＳおよびグラム陰性菌のＬＴＡによって活性化され、また分泌された小分子ＭＤ−２はＴＬＲ４シグナル化の源になることができる。
【０１３１】
遺伝子発現の調節をすることができる本発明の数種のオリゴペプチドは、インビボとエクスビボの両方で、また小動物で以前に試験されたが、遺伝子発現の調節との関係については追及されなかった。マウスにおいてＬＰＳ誘発敗血症に対するこれらオリゴペプチドの有用な効果、すなわち敗血症の阻害効果が観察された。Ｔ細胞試験のような試験で、これらオリゴペプチドの免疫調節効果がインビボおよびエクスビボで観察され、病理的ＴＨ１免疫応答の阻害、炎症性サイトカイン（ＭＩＦ）の増加、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０，ＴＧＦ−ベータ）の産生減少ならびに、樹状細胞、単球およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）への免疫調節効果を示した。
【０１３２】
今や、たとえばｈＣＧのような内因性タンパク質からタンパク質分解によって誘導することのできる分解産物に類似した特有の合成オリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体が、たとえばＮＦ−カッパＢ阻害による遺伝子発現の調節に使用でき、そのようなオリゴペプチドはもっと広範な応用があるという知見が提供された。細胞内での活性ＮＦ−カッパＢの放出は、細胞の細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）での処理およびトール様（Toll-like）受容体との相互作用を含む種々の刺激の後に起こるということが今や知られている（たとえば、Guha and Mackman, Cell. Sign. 2001,13 : 85-94参照）。特に、樹状細胞、単球およびマクロファージのＬＰＳ刺激は、本発明のシグナル分子によって調節され得るＮＦ−κＢ、ｐ５０、ＥＧＲ−１、ＩＲＦ−１および他の因子のような転写因子による活性化の影響を受ける多数の遺伝子を誘導する。ＴＮＦ−アルファの最大の誘導には、ＥＧＲ−１のＬＰＳによる誘導が必要とされることを考えると、ＥＧＲ−１の阻害は、ＬＰＳ活性化の後に観察される敗血症の影響をかなり減ずると予見される。今や、ここで提供されるオリゴペプチドのようなシグナル分子の遺伝子調節効果を知ることによって、敗血症に見られる症状をもっと緩和するシグナル分子混合物の論理的設計が可能になる。そのような混合物の１つ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶおよびＶＬＰＡＬの１：１：１混合物が、グラム陰性菌誘発のアカゲザル敗血症モデルで、霊長類に敗血症ショックの防御のために投与され、この霊長類モデルで有効であることが発見された。従って本発明は、霊長類の敗血症治療のための医薬組成物および本発明のシグナル分子、好ましくはこのようなシグナル分子の混合物を霊長類に投与することから成る、霊長類の敗血症の治療方法を提供する。そのようなシグナル分子または混合物の投与は、好ましくは、たとえば静脈内または腹膜内投与による全身投与である。さらなる実施形態で、かかる治療にはたとえば抗生物質の使用も含まれるが、これは、治療を受けた個体内でこのような抗生物質の作用を受けた細菌の溶解のためにさらに毒物の負荷が生成し危険性があるので、そのような使用が禁忌でないときだけである。
【０１３３】
意図する他の用途は、ウイルス感染、特に、感染中にＮＦ−カッパＢ経路を活性化するウイルスにより引き起こされる感染と戦うかまたはウイルス感染を治療する方法に関する。そのようなウイルス感染は種々であり、古典的例は、ＮＦ−カッパＢの永続的な活性化による、肝炎Ｂウイルス−誘発の細胞変質である。本発明のシグナル分子の用途が、この細胞変質に対抗するためにまたは予防するためにここに提供される。
【０１３４】
永続的なＮＦ−カッパＢ活性化が本発明のシグナル分子で有利に阻害される他の疾患は、とくに、骨髄移植、急性または慢性異種間移植拒絶反応および輸血後血小板減少症に伴う移植関連免疫応答、移植片対宿主病のような、移植関連疾患である。
【０１３５】
永続的なＮＦ−カッパＢ活性化が本発明のシグナル分子で有利に阻害される他の例は、梗塞後に観察される、たとえば脳もしくは心臓のインビボでまたは臓器のエクスビボでまたは移植のようなさらなる用途の調製のために調整または貯蔵されている組織に観察される、虚血関連組織損傷の予防または軽減に見いだされる。虚血関連組織損傷は今や、ＮＦ−カッパＢ活性化を阻害する本発明のシグナル分子で（前）虚血領域を灌流することによって緩和することができる。虚血（灌流欠乏（underperfusion）とも呼ばれる）が役割を果たす疾患の例には、新しい脳の画像技術によって検出される病変の証拠と一致して、血管収縮により生じる病巣の脳虚血であるとされ得る、子癇が含まれる。ＨＥＬＬＰ（溶血、亢進した肝臓酵素、そして低血小板数）症候群に固有の肝臓機能不全もまた急性灌流欠乏が原因である可能性がある。虚血の他の疾患は、冠動脈閉塞後に観察され、冠動脈閉塞とインビボでの再灌流の遅延期間による不可逆的な心筋損傷をもたらし、このことについては既にＰＣＴ／ＮＬＯ１／００２５９においても論じられている。
【０１３６】
今や、たとえばｈＣＧのような内因性タンパク質からタンパク質分解によって誘導することのできる分解産物に類似の、特有の合成オリゴペプチドが、たとえばＮＦ−カッパＢ阻害によって遺伝子発現の調節に使用でき、そのようなオリゴペプチドはもっと広範な応用があるという知見が提供された。たとえば、本発明は、すくなくとも１つの本発明のシグナル分子を含む灌流液で移植片を灌流するための方法を提供する。そして、ＮＦ−カッパＢの活性化に起因する虚血または移植片中の移植前損傷が極めて軽減でき、移植片の広範な使用が可能になる。
【０１３７】
本発明は、細胞中の遺伝子発現の調節に有用なシグナル分子を提供する。医学または獣医学的疾患治療用の医薬組成物生産のための、このようなシグナル分子の用途の数例がここに示される。１つの実施形態で、本発明は、免疫介在不全症の治療、特にそれによって免疫応答でＮＦ−Ｂ／Ｒｅｌタンパク質の中心的役割が見つけ出される疾患の治療の如き用途を提供する。しかしながら既述のように、ＡＰ−１またはＰＰＡＲガンマおよびその他のような他の転写因子の活性調節を介して遺伝子発現を調節することも提供され、今や、オリゴペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のようなシグナル分子の役割を調節している遺伝子が理解される。また既述のように、オリゴペプチドが、分解産物がおそらく、遺伝子発現の調節に中心的役割を果たしていることを今や知り、本発明は、オリゴペプチドを調節しているさらなる遺伝子発現を同定するための確実な方法を提供し、またこれらの合成物ならびにその類似体とその誘導体を、広範な種々の不全症で使用するために、ならびに広範な種々の医薬組成物の調製で使用するために提供する。このような治療および有用な医薬組成物の例は、たとえば、免疫介不全症が糖尿病、多発性硬化症または急性または慢性移植拒絶のような慢性炎症を含む疾患、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ‘ｓ）もしくは樹状細胞（ＤＣｓ）が（過剰反応）と永続的なＮＦ−カッパＢ発現によって亢進された疾患、または免疫介在不全症が敗血症もしくはアナフィラキシーショックもしくは移植拒絶のような急性炎症を含む疾患に関連して見出される。本発明のシグナル分子を含有する医薬組成物で治療できる他の免疫介在不全症には、全身性エリテマトーデスもしくはリューマチ性関節炎（とくに、これら遺伝子発現におけるＮＦ−カッパＢ活性を阻害することによるＩＬ−８および／またはＩＬ１５産生阻害によって）のような自己免疫疾患、喘息もしくは寄生虫疾患のようなアレルギー、ウイルスもしくは細菌（特に、エルシナペプシス、エボラウイルス、黄色ブドウ球菌（たとえば タンポン-病の場合）のような微生物での感染によって引き起こされた急性出血性疾患を含む応答において）のような感染物に対して向けられた過剰免疫応答、細菌性（髄膜炎症菌のような）またはウイルス性髄膜炎および／または脳炎、および他の生命を脅かす疾患が含まれる。係る過剰免疫応答には、たとえば子癇前症、頻発性自然流産（ＲＳＡ）または早産または他の妊娠関連不全症が含まれる。特に、腫瘍成長因子ベータ−１のプログラムされた産生増加を一般に伴う子癇／前子癇の状態に対して本発明の治療が推奨される。また、妊娠中にＲＳＡが、たとえば好ましくない対立遺伝子の存在、特にＴＮＦ−アルファをコード化するプロモーター内のＧからＡへの多型の存在のためにＩＬ−１０濃度増加またはＴＮＦ−アルファ活性増加に起因しそうな状況では、ここで提供される医薬組成物での治療が推奨される。そのような妊娠に関連した免疫不全症を指向した治療法が、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性を活性化するように誘導されたＮＫ−カッパＢの活性を阻害することによって、ここにまた提供される。また妊娠雌豚に観察される、ＬＰＳ−誘導による受精率の低下または流産は、ここに提供され���シグナル分子または方法の適用によって減少させることができる。
【０１３８】
免疫介在不全症の治療におけるこのような使用には、好ましくは、治療される個体中のリンパ球、樹状もしくは抗原提示細胞小母集団の相対的比率および／またはサイトカイン活性を制御することが含まれ、特にこの小母集団がＴｈ１もしくはＴｈ２、またはＤＣ１もしくはＤＣ２細胞であることを特徴とする。他の本発明の実施形態には、本発明のシグナル分子の、冠状動脈閉塞症のような心血管または循環不全症を調節するための医薬の製造のための使用、および、妊娠関連の心血管または循環不全においての使用も含まれる。
【０１３９】
さらに、本発明は、心血管もしくは循環不全症、特に妊娠関連の心血管もしくは循環不全症を調節するための、本発明のシグナル分子またはその混合物を含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物は心血管もしくは循環不全症、特に妊娠関連の心血管もしくは循環不全症を調節する方法に使用され、少なくとも１種の本発明のシグナル分子で動物（特に哺乳動物）を治療することを含む。非妊娠関連不全症たとえば高コレステロール血症もまた、本発明のシグナル分子での治療を受け入れる余地がある。たとえば、アポリポ蛋白Ｅ（アポＥ）欠陥は、異常脂血症、アテクローム性動脈硬化、アルツハイマー病、体重増加および短命を含む一連の病理状態に関連している。多型アポＥ遺伝子の異なった対立遺伝子の遺伝は、ほとんどの人々の血漿コレステロールの１０％の変動の原因となっている。１変異体であるアポＥ２に関する同型接合個体は、もしそれ以上の遺伝的または環境的因子が存在すると、ＩＩＩ型異常βリポタンパク質血症を発現する可能性がある。アポＥのいくつかのもっと稀な対立遺伝子は、同型接合個体でこの不全症の優先的発現を産生する。アポＥはＬＤＬ受容体のリガンドであり、その血中コレステロールへの影響は、変異アポＥタンパク質を保持しているリポタンパク質用のＬＤＬ受容体の親和性の相違によって仲介されている。アポＥ遺伝子転写を制御する因子はトランスジェニックマウス内での遺伝子構造の発現によって広く研究され、第１イントロンにおける５´プロモーター領域の、および構造遺伝子から何キロベースも離れた３´領域のエレメントを結合する因子間の複雑な相互作用に関係している。アポＥの欠失には、リポタンパク質代謝（血漿中全コレステロール）、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ／ＴＣおよびＨＤＬ／ＬＤＬ比率、アポＢ−喪失血漿中のエステル化速度、血漿トリグリセリド、肝臓のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、肝臓のコレステロール含量の変化、血漿中ホモシスチン（ホモシステイン）とグルコース濃度減少、および重度のアテクローム性動脈硬化症と皮膚黄色腫症がともなう。本発明は、アポＥおよびその他のアポ蛋白ファミリーのような機能障害のあるＬＤＬ受容体に付随する病態の治療のための方法とシグナル分子を提供する。特に、ＧＶＬＰＡＬＰＱおよび／またはＶＬＰＡＬＰまたはその機能的類似体もしくは誘導体を含むシグナル分子の使用が好ましい。
【０１４０】
本発明は、また、免疫介在不全の治療または免疫介在不全の治療方法のための医薬組成物製造用の用途使以外の、医薬組成物または医薬の製造および種々の医学上の病態の治療方法のためのシグナル分子の用途も提供する。たとえば、本発明は、湿疹、乾癬のような皮膚疾患ばかりでなく紫外線での過剰暴露に関係する皮膚疾患の予防または緩和のための、本発明のシグナル分子を含有するたとえば軟膏またはスプレーなどの皮膚外用薬を提供する。
【０１４１】
また、それによってＣＯＸ２経路が発効されるようにプロスタグランジン合成経路に関連する遺伝子が調節されることを特徴とする疾患緩和管理での使用法も意図される。
【０１４２】
さらに、本発明は、ＨＩＶ感染に罹っている特別な個体の治療のような消耗性症候群の治療もしくはこのような個体の消耗性症候群の治療方法のための医薬組成物製造における用途以外の、種々の疾病のための医薬組成物もしくは医薬の製造および種々の医学上の病態の治療方法のためのシグナル分子の用途も提供する。
【０１４３】
１つの実施形態において、本発明は、新脈管形成もしくは血管新生、特に胎芽発育中の新脈管形成もしくは血管新生を調節するための、または移植後に移植された臓器中への血管新生を刺激するかもしくは以後の段階でそれを阻害するための、医薬組成物もしくは医薬の製造用に本発明のシグナル分子の用途を提供する。新脈管形成をもたらすシグナル分子は詳細な説明でここに開示されている。
【０１４４】
ここで提供される用途には、細胞上でのＴＮＦ−アルファ受容体(たとえば、ＣＤ２７)発現を制御することが含まれ、それによって処置された個体中におけるリンパ球、樹状細胞または抗原提示細胞小母集団の相対比率および／またはサイトカイン活性を調節する。たとえば、詳細な説明で述べられたように、本発明の特定のオリゴペプチドは、Ｔ−細胞系の細胞上でのＣＤ２７発現をダウンレギュレーションすることができる。
【０１４５】
ＴＮＦ−アルファそれ自身をダウンレギュレートすることも、特に、ＴＮＦ−アルファ活性増加を示すばかりでなくさらにＮＯのようなほかの炎症性化合物を放出する敗血症ショック様の病態に有用である。ＮＯの産生は、血管と炎症性反応の中心的なメディエーターである。我々の結果は、ＬＰＳのような炎症的に活性な化合物で刺激されたマクロファージのような炎症性細胞が大量のＮＯを産生することを示す。しかしながら、ほとんどのＮＭＰＦペプチド（ＮＭＰＦペプチド１から１４まで、４３から６６まで、および６９）で共刺激されたこれらの細胞が、非常な低投与量（１ｐｇ／ｍｌ)でさえもＮＯの産生を阻害した。ＴＮＦ−アルファおよびＮＯ産生をダウンダウンレギュレートすることによって好ましくは治療することのできる典型的な敗血症ショック様の疾患には、炭疽菌（Bacillus anthracis）およびペスト菌（Yersinia pestis）毒または生物テロリズムに関係しそうなこれらの微生物による感染によって引き起こされる疾患が含まれる。炭疽毒は、炭疽菌によって産生され、炭疽の原因物質であり、この疾患の主たる症候群の原因となる。臨床的に炭疽は稀であるが、生物戦争およびテロリズムでの炭疽菌の潜在的使用の心配が増えつつある。炭疽に対するワクチンは存在するが、種々の要因で多数のワクチン接種は実用的でない。その細菌は、抗生物質での処置によって宿主から撲滅することができるが、毒素の継続的作用によって、そのような治療法は一旦症状が現れたときにはほとんど価値がない。その毒素は、「防御的抗原（protective antigen）」（ＰＡ）と呼ばれる単一受容体に結合する部分と、「浮腫因子（edema factor）」（ＥＦ）および「致死因子（lethal facto）」（ＬＦ）とよばれる２つの酵素部分とから構成されている。細菌から非毒性分子として放出された後に、これらの３種のタンパク質は哺乳動物の細胞表面に拡散しそして、毒性の細胞結合複合体を形成する。
【０１４６】
細胞表面タンパク質分解酵素による２つのフラグメントへのＰＡの切断によって、細胞に結合したままのフラグメント、ＰＡ６３、が７量体になり強い親和性でＥＦおよびＬＦを結合する。受容体を介する飲食作用による内在化の後に、その複合体はエンドソームに引き渡される。そこで、低ｐＨで、ＰＡ部分は膜に挿入し、ＥＦとＬＦの細胞質ゾルへの転座を仲介する。ＥＦは、専門食細胞に阻害作用を有するアデニル酸シクラーゼであり、ＬＦは、マクロファージに特異的に作用するタンパク質分解酵素であって、マクロファージの死と宿主の死をもたらす。
【０１４７】
さらにまた本発明は、遺伝子発現調節用医薬組成物製造のための発明に従うシグナル分子の使用と、遺伝子発現調節による治療方法における使用とを提供する。それぞれのペプチドによって調節されうる遺伝子をここに挙げる。特に図７０にそれらを示す。
【０１４８】
ダウンレギュレートしているＴＮＦアルファそれ自身および／またはここにおいても挙げているＴＮＦアルファ受容体も、Ｃｈａｇａｓ心筋症の個体に有益である。
【０１４９】
また、傷、特に熱傷の治療における、血管新生または新脈官形成調節のための医薬組成物の調製のための発明に従うシグナル分子の使用が提供される。またここに提供される医薬組成物の使用は術後の生理的ストレスのケースにおいて提供され、それによって血管新生について治療の効果を得るだけでなく、患者の容態も総合的に良好になる。
【０１５０】
本発明に従うシグナル分子の他の使用は、癌の治療のための他の医薬組成物の調製のためのその使用を含む。このような医薬組成物は好適には、調節およびアップレギュレートするアポプトーシス応答を介して作用し、かかる応答は一般的にはＮＦ−カッパＢの作用によってダウンレギュレートされる。本発明に従うシグナル分子によってこの作用を抑制することは、癌細胞の細胞死の増加を可能にする。ここに提供されるシグナル分子の他の抗癌作用は、特にヒトの造血腫のケースにおける、ｃ−ｍｙｂのダウンレギュレーションを含む。この意味において、１４．３．３蛋白のダウンレギュレーションも提供される。
【０１５１】
本発明に従うシグナル分子のさらなる使用は、癌治療のためのさらなる薬剤組成物の調製のためのその使用を含む。かかる医薬組成物は好適には、調節およびダウンレギュレートするトランスフェリン受容体の利用を介して、特に癌細胞に作用する。トランスフェリン受容体はＮＦ−カッパＢ作用によって典型的にはアップレギュレートされる。本発明に従うシグナル分子によりその作用を抑制することは、鉄分の摂取の低下と癌細胞の細胞死の増加を可能にする。特に、赤血球および血栓細胞がその治療を受け入れることができる。
【０１５２】
さらに、本発明に従うシグナル分子のさらなる使用は、レトロウィルス由来悪性疾患および他のウィルス由来の悪性疾患の症例のように、癌治療用の、特にウィルスによって引き起こされる癌の治療のための他の医薬組成物調製のためのその使用を含む。かかる医薬組成物は好適には、ウィルス由来の転写またはＮＦ-カッパＢ活性によって典型的にはアップレギュレートされる細胞増殖性応答を調節しダウンレギュレートするによって作用する。本発明に従うシグナル分子でその活性化を抑制することは、癌細胞の増殖の低下と癌細胞の細胞死の増加を可能にする。かかる医薬組成物もＩＬ-８によって誘発される脈管形成応答を調節することによって作用し得るものであり、それによって、たとえば、ＩＬ-８発現を転写因子ＡＰ-１またはＮＦ-カッパＢの抑制によって抑制することは、血管新生に依存する癌成長を抑制する結果となる。
【０１５３】
さらにまた、本発明は、ヒトまたは動物の受胎能および胎芽生存の最適化のための医薬組成物の調製のためのシグナル分子の使用、およびヒトまたは動物の受胎能および胎芽生存の最適化のための方法を提供する。詳細には、本発明は受胎された個体内のＴＮＦアルファのダウンレギュレーションを、好適にはその個体内のＩＬ−１０をアップレギュレートするための組成物および方法と関連させて、可能にする方法及び組成物を提供する。かかる組成物および方法はヒトおよび動物の病気のための医薬の両方にすぐに使用可能である。
【０１５４】
また、本発明は、特に、本発明に従ったシグナル分子を適用し、ペルオキシソーム増殖活性化レセプタガンマ（ＰＰＡＲガンマ）および脂質代謝の影響下にある遺伝子の遺伝子発現を調節することによって、個体の体重を調節するための医薬組成物の調製のためのシグナル分子の使用を、および本発明に従うシグナル分子を個体に投与することを含む、体重を調節するための方法を提供する。
【０１５５】
ここにおいて提供されるシグナル分子のさらなる使用は、たとえば図７０に示されているように、培養された細胞における遺伝子の発現の調節にある。ここにおいて提供されるかかる方法は、本発明に従うシグナル分子を培養細胞に投与することを含む。培養細胞（当該技術分野において知られたインビトロの細胞培養条件下にあった、または、ある細胞）の増殖および／または分化は、本発明に従うシグナル分子に培養細胞を投与することによって調節することが可能である。たとえば、幹細胞研究などの、細胞の増殖または分化の研究は、遺伝子調節に影響する第３の主たる経路が存在することを理解し、合成ペプチドおよびその類似物または誘導物の利用の容易性を考慮することが大いに有益となるであろうことが考慮される。
【０１５６】
さらにまた、特に、そのようなバクテリアはすでに、ここにおいて同定されたシグナル分子を模倣する分解産生物を宿主に付与することによって、ここにおいて提供されるような遺伝子調節において見出されたこの第３の経路をすでに利用したことが仮定されるマイコバクテリア発現ｈＣＧ様タンパクを考慮して、ここにおいて提供されるシグナル分子には、特に最近のアジュバントに付随する、または典型的に利用されるマイコバクテリアアジュバントに代わるワクチンにおける共刺激物質としての好適な使用があることを意図している。ここにおいて提供される治療と使用は、動物のみに制限されず、植物および他の有機体も、ここに提供される第３の経路下におかれる。さらにまた、このような経路の存在が実証された現在、それを診断物質にすること、さらにまた、たとえば、ここにおいて提供されたシグナル分子の存在または不存在を測定すること、または（好ましくは内因性の）タンパク質からかかるシグナル分子を生成することが可能なプロテアーゼの存在または不存在を測定することを含む方法において、細胞の遺伝子調節状態を測定することが提供される。
【０１５７】
発明の詳細な説明
細胞は環境と固有の変化に反応し、それらを、細胞内シグナルのみならず、細胞外および細胞内シグナルを介して感知する。これらのシグナルの特性は、たとえば、物理的または化学的であり得る。さらにまた、血液中に存在する種々の分子が互いに反応し、他の分子への直接の影響を有するカスケード反応を誘発し、および／または結局には細胞が応答し、たとえば補償システムおよび血液凝固タンパクにつながる。
【０１５８】
多くの遺伝子が、細胞に入るシグナル分子ではなく、細胞表面上の特異的受容体、たとえば、酵素活性を有する受容体（受容体チロシンキナーゼ、受容体様タンパクチロシンホスファターゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、ヒスチジンキナーゼ、グアニリルシクラーゼ）、および酵素活性を有しない受容体（サイトカイン受容体、インテグリン、Ｇ−タンパク結合受容体）に結合する分子によってレギュレートされる。細胞表面受容体とそれらのリガンド間の相互作用には、いわゆる２次メッセンジャー（ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋、環状ヌクレオチド、イノシトール（１，４，５）トリホスフェート、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリホスフェート、ホスファチジルイノシトール転移タンパク（ＰＩＴＰ））の細胞内レベルの変動を含む、１つまたはそれ以上の細胞内導入タンパク質を調節する細胞内事象のカスケードが続き得る。これはいわゆる“エフェクタータンパク”の活性化または阻害につながる。２次メッセンジャーは、次いで、タンパクの変化につながる。たとえば、環状ＡＭＰ、環状ＧＭＰ、カルシウム活性化タンパク質キナーゼ、または、タンパク質キナーゼ（たとえばＡＧＣ群セリン／トレオニンタンパクキナーゼ、ＣＡＭＫ群セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、ＣＭＧＣ群セリン／トレオニンキナーゼ、タンパク質トレオニンキナーゼ群、または、ＭＥＫ／Ｓｔｅ７ｐなど）の作用を介するタンパクリン酸化につながる。タンパクキナーゼによるリン酸化は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路、ＭＡＰキナーゼ経路、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、ｗｎｔ−経路などの異なる細胞経路を調節するシグナル伝達における調節機構の１つである。多くの例において、これはすべて、遺伝子発現の改変につながる（たとえば、他の遺伝子、細胞生存、成長、分化、成熟、機能活性の調節のための遺伝子）。
【０１５９】
細胞表面受容体へのリガンドの結合に対する応答の多くは、細胞質のものであり、核における速やかな遺伝子活性化には関与しない。いくつかの例では、細胞表面相互作用に続く以前から存在する、速やかな遺伝子活性化につながる不活性転写因子が活性化される。たとえば、タンパクＮＦ‐カッパＢは、膜受容体（たとえば、病原体関連分子パターンに結合するＴｏｌｌ様受容体などのパターン認識受容体）、ＴＮＦ‐α、ＩＬ−１などの炎症性サイトカイン、Ｔ細胞活性化シグナル、成長因子、ストレス誘導物質を含む種々の刺激物質よって、数分内に活性化され得る。
【０１６０】
我々の、ＮＭＰＦペプチドＬＱＧＶについての遺伝子試験は、細胞がわずか４時間処理された後に、シグナル伝達と遺伝子制御に非常にすばやい効果を示した。この短期間でＬＱＧＶは、強い刺激剤の存在下に（ＰＨＡ／ＩＬ−２で刺激されたＴ−細胞系（ＰＭ１））、少なくとも１２０の遺伝子をダウンレギュレートし、少なくとも６遺伝子をアップレギュレートして、本発明のシグナル分子の意味深い効果と遺伝子発現に対する調節効果を証明した。ＬＱＧＶによって影響を受けた遺伝子には、癌遺伝子、転写に関する遺伝子、細胞内酵素、膜受容体、分子内受容体、シグナル伝達タンパク質（たとえばキナーゼ）および未知分子に関するいくつかの遺伝子が含まれる。このことが、ここに記載された合成シグナル分子（オリゴペプチドまたはその機能的類似体もしくは誘導体）の１例としてのＬＱＧＶが、種々の細胞内および細胞外段階で広範なスペクトルを有していることを示している。これに加えて、我々のＨＰＬＣ／ＭＳデータは、半時間以内にマクロファージ細胞系（ＲＡＷ２６７．４）の核内にＬＱＧＶが存在していることを示し、そしてまた、ＮＦ−カッパＢ実験でさらに支持される、ＤＮＡ段階と細胞内段階への直接効果を示す。究極的なＬＱＧＶの調節効果は、たとえば、細胞の型および細胞の分化と成熟状態、他の調節分子の機能状態と存在に依存している。このことは、種々のＮＭＰＦペプチドが疾患に対し類似または異なる効果を示したショック実験によって明らかである。同じ結果が、ＤＣ，受精鶏卵実験およびＣＡＯ実験で得られた。すなわち、ＮＭＰＦの効果は、共刺激（ＧＭ−ＣＳＦのみまたはＬＰＳもしくはＶＥＧＦと組み合わせて）のタイプと処置時間に依存している。このことから、ＮＭＰＦは、種々の段階で細胞応答を調節することができる。
【０１６１】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。
実施例
材料および方法
ペプチド合成
本明細書において記載されたペプチド、たとえばＬＱＧ、ＡＱＧ、ＬＱＧＶ、ＡＱＧＶ、ＬＱＧＡ、ＶＬＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰ、ＶＡＰＡＬＰ、ＡＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＡＰＱ、ＶＬＰＡＬＡＱ、ＬＡＧＶ、ＶＬＡＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＡ、ＶＬＰＡＬＰＱ、ＶＬＡＡＬＰＱ、ＶＬＰＡＬＰＡ、ＧＶＬＰＡＬＰ、ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ、ＲＰＲＣＲＰＩＮＡＴＬＡＶＥＫＥＧＣＰＶＣＩＴＶＮＴＴＩＣＡＧＹＣＰＴ、ＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳ、ＬＱＣＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ、ＬＰＧＣ、ＭＴＲＶ、ＭＴＲおよびＶＶＣを、固体支持体としての２クロロトリチルクロライド樹脂（Barlos, 1991）とともに、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／第３ブチルに基づく方法論（Atherton, 1985）を用いて、固相合成（Merrifield, 1963）によって調製した。グルタミンの側鎖を、トリチル化して保護した。ペプチドを、手作業で合成した。各結合は、次のステップからなる。（ｉ）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のピペリジンによるアルファアミノＦｍｏｃ保護の除去、（ｉｉ）Ｆｍｏｃアミノ酸（３ｅｑ）の、ＤＭＦ／Ｎ−メチルホルムアミド（ＮＭＰ）におけるジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）との結合、および（ｉｉｉ）残りのアミノ官能基の、ＤＭＦ／ＮＭＰ中での無水酢酸／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）でのキャッピング。合成が完成すると、ペプチド樹脂を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）９５：２．５：２．５の混合物で処理した。３０分後、ＴＩＳを、脱色するまで加えた。この溶液を、真空中で蒸発させ、このペプチドを、ジエチルエーテルで沈殿させた。粗ペプチドを、水（５０〜１００ｍｇ／ｍＬ）中で溶解し、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製した。ＨＰＬＣ条件は、カラムを、Vydac TP21810C18（10×250ｍｍ）とし、溶出系を、水ｖ／ｖ（Ａ）中の０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル（ＡＣＮ）ｖ／ｖ（Ｂ）中の０．１％ＴＦＡの濃度勾配系とし、流速を、６ｍＬ／分とし、吸光度を、１９０〜３７０ｎｍで検出した。種々の濃度勾配系を用いた。たとえば、ペプチドＬＱＧおよびＬＱＧＶについては、１０分間の１００％Ａ、次いで５０分間で直線勾配０〜１０％Ｂであった。たとえば、ペプチドＶＬＰＡＬＰおよびＶＬＰＡＬＰＱについては、５分間の５％Ｂ、次いで直線勾配１％Ｂ／分であった。採集された画分を、４０℃で、減圧下で回転膜蒸発によって約５ｍＬまで濃縮した。残りのＴＦＡを、アセテート型の陰イオン交換樹脂（Merck II）カラムで２度溶出することによってアセテートと交換した。溶出物を、２８時間で濃縮し、かつ凍結乾燥した。後に、ペプチドを、ＰＢＳ中にこれらを溶解することによって、使用のために調製した。
【０１６２】
転写因子実験
マクロファージ細胞系。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)（マナッサス、ＶＡ）から得たＲＡＷ２６４．７マクロファージを、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含有するＤＭＥＭを用いて、５％ＣＯ２中で、３７％で培養した。細胞（１×１０６／ｍＬ）を、２ｍＬの体積中でペプチド（１０μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。８時間の培養後、細胞を、核抽出のために洗浄かつ調製した。
【０１６３】
核抽出。核抽出およびＥＭＳＡを、Schreiber et al.方法（Schreiber et al. 1989, Nucleic Acids Research 17）に従って調製した。手短に言えば、ペプチドの刺激を受けた、または受けていないマクロファージからの核抽出物を、細胞溶解によって調製し、続いて核溶解を行った。細胞を、その後、４００μＬの緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＫＣＬ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害物質）中で懸濁させ、１５秒間活発に攪拌し、１５分間４℃で放置し、２分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットにされた原子核を、氷上で３０分間緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０％グリセロール、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、およびプロテアーゼ阻害物質）中で再懸濁させ、その後、溶解物を、２分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。可溶性核タンパク質を含有する上清を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に使用されるまで、−７０℃で保存した。
【０１６４】
ＥＭＳＡ。電気泳動移動度シフトアッセイを、対照（ＲＡＷ２６４．７）およびペプチドで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から調製された核抽出物を、ＮＦ−カッパＢ結合配列を表すように合成された３２Ｐ標識の二本鎖プローブ（５´ＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＧＡＧ３´）とインキュベーションすることによって実行した。間もなく、プローブを、製造者の使用説明書（プロメガ(Promega)社製、マディソン、ＷＩ）に従って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識した。アニーリングしたプローブを、次のように核抽出物とインキュベーションした。ＥＭＳＡにおいて、結合反応混合物（２０μＬ）は、５ｍＭのＥＤＴＡ、２０％Ｆｉｃｏｌｌ、５ｍＭのＤＴＴ、３００ｍＭのＫＣｌおよび５０ｍＭのＨＥＰＥＳからなる結合緩衝液中で、０．２５μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）（アメルシャム・ファーマシア・バイオテック社製）および２０，０００ｒｐｍの３２Ｐ標識のＤＮＡプローブを含む。結合反応を、細胞抽出物（１０μｇ）を追加して開始し、室温で３０分間継続した。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、６％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することによって遊離オリゴヌクレオチドから分離した。ゲルを、乾燥させ、Ｘ線フィルムに曝した。
【０１６５】
アポＥ実験
アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）は、脂質代謝異常(dyslipidemia)、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、体重増加、および寿命短縮を含む一連の病理状態に関連する。ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＣ（多型性）アポＥ遺伝子の対立遺伝子の遺伝は、大部分の人々において血漿コレステロールの１０％の変動の原因となっている。１つの変異体であるアポＥ２とＨＯＭＯＺＹＧＯＵＳ（同型接合）の個体は、追加の遺伝的または環境的要因が存在すれば、III型高脂血症を生じさせ得る。いくつかの相当稀なアポＥの対立遺伝子は、同型接合の個体においてこの症状の優性発現を生じさせる。アポＥは、ＬＤＬレセプターのリガンドであり、血漿コレステロールにおける効果は、種々のアポＥタンパク質を輸送するリポタンパク質のＬＤＬレセプターの親和性における相違によって、仲介される。アポＥ遺伝子転写を調節する因子は、トランスジェニックマウスの遺伝子構成の発現によって広範囲に調査され、第１イントロンにおける５´プロモーター領域の、および構造遺伝子から何キロベースも離れた３´領域の、エレメントを結合する因子間の複雑な相互作用に関係している。アポＥ遺伝子の欠失は、リポタンパク質の代謝（血漿総コレステロール）、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ／ＴＣおよびＨＤＬ／ＬＤＬの割合、アポＢ劣化血漿のエステル化率、血漿トリグリセリド、肝臓ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性、肝臓コレステロール含有量の変化、減少した血漿ホモシスチン（ホモシステイン）、およびグルコースレベル、ならびに重度のアテローム性動脈硬化症および皮膚黄色腫症に関連する。
【０１６６】
結果
ＮＦ−ｋＢ実験
転写因子ＮＦ−ｋＢは、様々な遺伝子の転写調節に関与する。核タンパク質抽出物を、ＬＰＳおよびペプチドで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から、またはＬＰＳで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から調製した。ペプチドが核へのＮＦ−ｋＢの転座を調節するか否かを決定するために、これらの抽出物においてＥＭＳＡを実行した。図３３は、４時間ＬＰＳまたはペプチドと組み合わせたＬＰＳによって処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の核抽出物に存在するＮＦ−ｋＢの量を示す。ここで、我々は、ＮＦ−ｋＢに関する標識オリゴヌクレオチドの量が減少するので、実際にいくつかのペプチドが、ＮＦ−ｋＢの転座を調節可能であることが見える。本実験において、ＮＦ−ｋＢの転座の調節を示すペプチドは、（ＮＭＰＦ−１）ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、（ＮＭＰＦ−２）ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ、（ＮＭＰＦ−３）ＬＱＧ、（ＮＭＰＦ−４）ＬＱＧＶ、（ＮＭＰＦ−５）ＧＶＬＰＡＬＰＱ、（ＮＭＰＦ−６）ＶＬＰＡＬＰ、（ＮＭＰＦ−７）ＶＬＰＡＬＰＱ、（ＮＭＰＦ−８）ＧＶＬＰＡＬＰ、（ＮＭＰＦ−９）ＶＶＣ、（ＮＭＰＦ−１１）ＭＴＲＶ、（ＮＭＰＦ−１２）ＭＴＲである。
【０１６７】
マクロファージにおけるＮＦｋＢ分析
マウスマクロファージ細胞系。ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージを、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％または２％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプロマイシンおよびグルタミンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、２時間、全体積１ｍＬ中に１２ウェルプレート（３×１０６細胞／ｍＬ）に播種し、その後ＬＰＳ（E.coli026、ディフコラボラトリーズ(Difco Laboratories)社製、デトロイト、ＭＩ、米国）および／またはＮＭＰＦ（１  ｇ／ｍＬ）で刺激した。インキュベーションの３０分後、プレートを、遠心分離し、細胞を、核抽出のために採集した。
【０１６８】
核抽出。核抽出物およびＥＭＳＡを、Schreiber et al.方法（Schreiber et al. 1989, Nucleic Acids Research 17）に従って調製した。細胞を、管中で採集するとともに、４℃、２０００ｒｐｍ（毎分回転数(round per minute)）で５分間、遠心分離した（Universal 30 RF, Hettich Zentrifuges）。ペレットを、氷冷のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳｐＨ７．４）で洗浄するとともに、４００μＬの低張緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、およびプロテアーゼ阻害物質反応混液（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ、ロシュ(Roche)社製））中で再懸濁させ、１５分間氷上で放置した。２５μＬの１０％ＮＰ−４０を、追加し、試料を遠心分離した（２分間、４０００ｒｐｍ、４℃）。上清（細胞質画分）を、採集するとともに、−７０℃で保存した。核を含有するペレットを、５０μＬの緩衝液Ａで洗浄し、５０μＬの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害物質反応混液ならびに１０％グリセロール）中で再懸濁させた。試料を、少なくとも６０分間４℃で、振ったままにした。最後に、試料を、遠心分離し、上清（核画分）を−７０℃で保存した。
【０１６９】
Bradford試薬（シグマ(Sigma)社製）を、抽出物中の最終タンパク質濃度を決定するために用いた。
【０１７０】
ＥＭＳＡ。電気泳動移動度シフトアッセイのために、ＮＦ−ｋＢ結合配列（５´−ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＡＣ ＴＴＴ ＣＣＧ ＡＧＡ Ｇ−３´）を表すオリゴヌクレオチドを合成した。１００ピコモルのセンスオリゴおよびアンチセンスオリゴを、アニーリングし、製造者の使用説明書（プロメガ社製、マディソン、ＷＩ）に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識化した。核抽出物（５〜７．５μｇ）を、室温で、０．５μｇポリｄＩ−ｄＣ（アメルシャムファーマシアバイオテック社製）を含有する結合反応混合物（２０μＬ）および結合緩衝液ＢＳＢ（２５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴおよび２０％フィコール）中で、７５０００ｃｐｍプローブと３０分間インキュベーションした。ＤＮＡタンパク質複合体を、４〜６％のポリアクリルアミドゲル（１５０Ｖ、２〜４時間）中で電気泳動によって遊離オリゴヌクレオチドから分離した。その後、このゲルを、乾燥させるとともに、Ｘ線フィルムに曝した。
【０１７１】
結果
転写因子ＮＦ−ｋＢは、様々な遺伝子の転写調節に関与する。核タンパク質抽出物を、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＭＰＦ（１ｍｇ／ｍＬ）またはＮＭＰＦと組み合わせたＬＰＳのいずれかで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から調製した。ＮＭＰＦペプチドが核へのＮＦ−ｋＢの転座を調節するか否かを決定するために、これらの抽出物においてＥＭＳＡを実行した。図５４および図５５は、処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の核抽出物に存在するＮＦ−ｋＢの量を示す。図５４は、ＮＭＰＦペプチドがＮＦ−ｋＢの基礎レベルとＬＰＳ誘導レベルとを調節可能であることを示す。本実験において、ＮＦ−ｋＢのＬＰＳ誘導転座の阻害を示すＮＭＰＦペプチドは、ＮＭＰＦ−１（ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）、ＮＭＰＦ−２（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−３（ＬＱＧ）、ＮＭＰＦ−４（ＬＱＧＶ）、ＮＭＰＦ−５（ＧＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−６（ＶＬＰＡＬＰ）、ＮＭＰＦ−９（ＶＶＣ）、ＮＭＰＦ−１２（ＭＴＲ）およびＮＭＰＦ−１４（環状ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）である。本実験においてＮＦ−ｋＢのＬＰＳ誘導転座を促進させるＮＭＰＦペプチドは、ＮＭＰＦ−７（ＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−８（ＧＶＬＰＡＬＰ）およびＮＭＰＦ−１１（ＭＴＲＶ）である。核中のＮＦ−ｋＢの基礎レベルは、ＮＭＰＦ−１（ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）、ＮＭＰＦ−２（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−３（ＬＱＧ）およびＮＭＰＦ−４（ＬＱＧＶ）によって低下した一方で、核中のＮＦ−ｋＢの基礎レベルは、ＮＭＰＦ−５（ＧＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−７（ＶＬＰＡＬＰＱ）、ＮＭＰＦ−８（ＧＶＬＰＡＬＰ）、ＮＭＰＦ−９（ＶＶＣ）、ＮＭＰＦ−１１(ＭＴＲＶ)、ＮＭＰＦ−１２（ＭＴＲ）およびＮＭＰＦ−１３（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）によって上昇した（図５５）。他の実験において、ＮＭＰＦ−１０（ＱＶＶＣ）はまた、核へのＮＦ−ｋＢの転座の調節を示した（データは示さない。）。
【０１７２】
ＤＣにおけるＮＭＰＦの効果（ex vivo／in vitro）
ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウス。本研究において用いられた全てのマウスを、オランダ、ロッテルダム、エラスムスメディカルセンター(Erasmus Medical Centre)（Ｃ５７ＢＬ／６）、またはオランダ、バルクブルク、ラッキーファームカンパニー(Lucky Farm Company)（ＮＯＤ）の病原体未感染施設で維持した。全てのマウスについて、食料および水の入手を自由にした。これらの実験は、オランダ、ロッテルダム、エラスムスメディカルセンターの動物実験委員会によって承認された。
【０１７３】
in vivo処理。１３〜１４週齢のメスＮＯＤマウスを、本実験に用いた。１０匹（ＮＭＰＦ−３、４、５および６）または１３匹（ＮＭＰＦ−７、４＋５、４＋６、５＋６および４＋５＋６）のマウスからなる１０のグループをランダムに形成し、ＰＢＳ（ＰＢＳグループ）またはＮＭＰＦ（ＰＢＳ中で溶解）のいずれかで処理した。各ＮＭＰＦの注射量を、１００  Ｌの全体積中で１００  ｇとした。処理の５週間後、マウスを、犠牲にし、脾臓をＤＣ精製のために単離した。
【０１７４】
脾臓のＤＣの単離。ＰＢＳおよびＮＭＰＦで処理されたマウスの脾臓を、無菌状態で摘出した。その後、脾臓を、４５分間、３７℃で、ＲＰＭＩ−１６４０中で、コラゲナーゼＤ（ビブコ(Gibco)ＢＲＬ社製、ライフテクノロジー）およびＤナーゼ１によって消化し、単細胞懸濁液を生成した。赤血球を、溶けかかっている氷の上で５分間、Ｇｅｙの培地でインキュベーションすることによって除去した。これらの細胞を、洗浄するとともに、製造者のプロトコルに従って、ＣＤ１１ｃ−発現細胞を、Ｎ４１８磁気ビーズ（ミルテニバイオテック(Miltenyi Biotec)社製、ビズリー(Bisley)、U.K.）およびオートＭＡ（ミルテニバイオテック(Miltenyi Biotec)社製、ベルギッシュグラートバハ(Bergisch Gladbach)、ドイツ）を製造者のプロトコルに従って用いて富化した。富化された集団は、フローサイトメトリック分析によって決定されるように、８０〜９０％ＣＤ１１ｃ＋およびＭＨＣII＋細胞から構成された。グループ毎に得たＤＣを溜めて、２時間１２ウェルプレート（ナルジェヌンクインターナショナル(Nalge Nunc International)社製）において培養し（３×１０６細胞／ｍＬ）、その後、３０分間１  ｇ／ｍＬのＬＰＳ（シグマ社製、E.coli026.B6）によってin vitroで刺激した。その後、細胞を、核抽出のセクションに記載されたプロトコルに従って溶解し、ＮＦｋＢ（ｐ６５）についてＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ（商標）キット（クロンテック(Clontech)社製、ＢＤ）を用いて分析した。
【０１７５】
骨髄由来ＤＣの単離。本実験のために、未処理のメスＮＯＤ（１３〜１４週齢）およびＣ５７ＢＬ／６（１３〜１４週齢）マウスを用いた。大腿骨および脛骨を、摘出し、骨髄を、０．４５ｍｍ針を有する注射器を用いてＲＰＭＩ−１６４０によって洗浄した。骨髄懸濁液中のクラスターを、活発なピペッティングによって解離させ、７０μｍ細胞濾過器を通して濾過した。懸濁液中の赤血球を、Ｇｅｙの培地によって溶解するとともに、洗浄した。約４〜６×１０７の骨髄細胞を、マウス毎に得た。
【０１７６】
培養の開始において、細胞濃度を、Ｒ１０培地（１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸塩、５０ｕＭの２−ＭＥ、１０％ｖ／ｖの熱不活化したウシ胎仔血清（バイオウィッタカー(Bio Whittaker)社製、ヨーロッパ）および２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスの顆粒球−単球コロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ、バイオソースインターナショナル(BioSource International, Inc.)社製、米国）を補充した、ＨＥＰＥＳなしのＲＰＭＩ−１６４０倍地）において１ｍＬあたり２×１０５の細胞に調整した。その後、細胞を、１０ｍＬの体積中で１００ｍｍの非粘着性細菌ペトリディッシュ（ファルコン(Falcon)社製）に播種した。各条件について、６つのペトリディッシュを用いた。培養液を、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターに配置した。培養の開始後３日毎に、１０ｍＬの新鮮なＲ１０培地を、各ディッシュに加えた。培養の開始から１１日後、非粘着性ＤＣ細胞を、採集し、コールターカウンター（コールター(Coulter)社製）で計数した。マウス毎に得たＤＣを溜めて、２時間、１２ウェルプレート（ナルジェヌンクインターナショナル社製）において培養し（３×１０６細胞／ｍＬ）、その後、３０分間、５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（シグマ社製、E.coli026.B6）またはＬＰＳおよび１μｇ／ｍＬのＮＭＰＦ（ＮＭＰＦ−１、２、５または６）によってin vitroで刺激した。その後、細胞を、核抽出のセクションに記載されたプロトコルに従って溶解し、ＮＦｋＢ（ｐ６５）についてＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ（商標）キット（クロンテック社製、ＢＤ）を用いて分析した。
【０１７７】
核抽出物。核抽出物およびＥＭＳＡを、Schreiber et al.方法（Schreiber et al. 1989, Nucleic Acids Research 17）に従って調製した。細胞を、管中で採集するとともに、４℃、２０００ｒｐｍ（毎分回転数）で５分間、遠心分離した（Universal 30 RF, Hettich Zentrifuges）。ペレットを、氷冷のトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳｐＨ７．４）で洗浄するとともに、４００μＬの低張緩衝液Ａ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、およびプロテアーゼ阻害物質反応混液（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉ、ロシュ社製））中で再懸濁させ、１５分間氷上で放置した。２５μＬの１０％ＮＰ−４０を、追加し、試料を遠心分離した（２分間、４０００ｒｐｍ、４℃）。上清（細胞質画分）を、採集するとともに、−７０℃で保存した。核を含有するペレットを、５０μＬの緩衝液Ａで洗浄し、５０μＬの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、４００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよびプロテアーゼ阻害物質反応混液ならびに１０％グリセロール）中で再懸濁させた。試料を、少なくとも６０分間４℃で、振ったままにした。最後に、試料を、遠心分離し、上清（核画分）を−７０℃で保存した。
【０１７８】
Bradford試薬（シグマ社製）を、抽出物中の最終タンパク質濃度を決定するために用いた。
【０１７９】
転写因子分析。ＥＬＩＳＡに基づくＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ（商標）キット（クロンテック社製、ＢＤ）を、製造者の使用説明書に従ってＮＦｋＢサブユニットｐ６５の分析に用いた。
【０１８０】
結果
処理されたＮＯＤマウスの脾臓ＤＣ中のＮＦｋＢ
高血糖症が核中の比較的高いレベルのＮＦｋＢに関連することが広く知られている。ＮＭＰＦ−３、４、５、４＋５、４＋６、５＋６、および４＋５＋６で処理されたＮＯＤマウスは、糖尿病発症率の減少を示し、ＰＢＳで処理されたＮＯＤマウスに比べて低いレベルの血糖を有した（データは示さない。）。これらのマウスからの脾臓ＤＣの核抽出物を、ＮＦｋＢについて分析すると、ＮＭＰＦ処理されたマウスからのＤＣは、比較的低いレベルのＮＦｋＢを示した（図５６）。
【０１８１】
ＮＯＤおよびＣ５７ｂ１６マウスの骨髄由来ＤＣ中のＮＦｋＢ
近年、Weaver et al. J. Immunol 2001およびその他が、異常に活発なＩＫＫを原因とするＮＯＤマウスおよび１型糖尿病患者からのＤＣにおけるＮＦｋＢ調節の欠陥を述べている。これらは、ＮＯＤマウス由来のＤＣが、様々な形態のＮＦｋＢ刺激に対し、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＤＣよりも感受性を有することを示した。これは、糖尿病誘発応答中に、病原Ｔｈ１（Ｔｃ１）細胞の発生に寄与するＩＬ−１２産生物を分泌するためのＮＯＤのＤＣの能力を向上させる。Hegazy DM et al. Genes Immun 2001は、ＮＦｋＢ遺伝子の多形性および１型糖尿病に対する感受性を示し、Ａ１０対立遺伝子を有する個体は、Ａ１４対立遺伝子と比較して糖尿病の発症する可能性が高い。したがって、我々は、ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウスからのＤＣ中のＮＦｋＢにおけるＮＭＰＦの効果を試験した。我々は、これらのマウスから骨髄（ＢＭ）を単離し、ＢＭ由来のＤＣを産生するためにＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した。我々は、粘着性、および非粘着性の細胞の両方を採集した。得られた細胞集団を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣII（Ｉ−ＡＫ）およびＭＨＣＩ（Ｈ−２ＢＤ）に対する抗体を用いてＦＡＣＳによって、第１に特徴付けた（データは示さない。）。ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウス両方では、細胞の９５％がＣＤ１１ｃ＋であり、９０％がＣＤ１１ｂ＋であった。しかしながら、ＮＯＤマウスでは、８６％がＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１１ｂ＋である一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、たった６７％がＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１１ｂ＋であった。これは、ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウス中のＤＣの成熟および分化レベルが同一でないことを示唆する。我々は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに比較して著しく（ｐ＝０．０００１）少ないＤＣ産生量を観察した。この後、ＤＣを、３０分間、ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）およびＮＭＰＦ１、２、５または６で刺激し、その後ＮＦｋＢ活性を決定した。
【０１８２】
５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激すると、Ｃ５７ＢＬ／６のＤＣは、未処理のＤＣと比較してＮＦｋＢ活性の増加を示さなかった（図５７）。しかしながら、ＮＯＤのＤＣは、ＬＰＳで刺激した後、ＮＦｋＢ活性の２倍の増加を示した。ＬＰＳによる刺激が、ＮＦｋＢ活性を引き起こさなかったので、ＮＦｋＢにおけるＮＭＰＦの効果を、Ｃ５７ＢＬ／６のＤＣにおいては検出することができなかった。しかしながら、ＮＯＤのＤＣにおいては、ＮＭＰＦはＬＰＳで誘導されたＮＦｋＢ活性を阻害することができた（ＮＭＰＦ１、２、５および６）(図５７)。
【０１８３】
これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６のＤＣと比較してＮＯＤのＤＣ中のＮＦｋＢが過応答性を有することを示すとともに、ＮＭＰＦが、ＮＯＤのＤＣ中の過反応性ＮＦｋＢ活性を阻害することを示す。
【０１８４】
ペプチドの核位置実験
逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法を、核抽出物中に合成オリゴペプチドが存在することを証明するために用いた。我々は、バイダック(Vydac)単量Ｃ１８カラム（カラム２１８ＭＳ５４、ＬＣ／ＭＳ Ｃ１８逆相、３００Ａ、５  ｍ、４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍＬ）を備えた島津ＨＰＬＣシステムを用いた。溶出系を、水ｖ／ｖ中０．０１％ＴＦＡおよび５％アセトニトリル（ＣＡＮ）（Ａ）、ならびに８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）ｖ／ｖ中０．０１％ＴＦＡ（Ｂ）の勾配系とし、流速を０．５ｍＬ／分とし、吸光度を、１９０〜３７０ｎｍで検出した。勾配時間プログラムは、以下のとおりであった。
【０１８５】
時間（分）            緩衝液Ｂ濃度
０．０１                ０
５．０                  ０
３０．０                ８０
４０．０                １００
６０．０                １００
６５．０                ０
７０．０                ０
【０１８６】
ペプチドＬＱＧＶの溶出時間を、別個のラン(run)で２  ｇのペプチドを注入することによって決定した。可能性のあるＮＭＰＦ−４（ＬＱＧＶ）を含有した画分の質量分析（ＭＳ）を（溶出時間を同一または別個のランでペプチドを注入することによって決定した。）、ＬＣＱＤｅｃａＸＰ（サーモフィニガン(Thermo Finnigan)社製）で実行した。
【０１８７】
結果
ペプチドの核位置実験
ＥＭＳＡ実験に用いた核タンパク質抽出物を、ＭＰＬＣおよびＭＳによって、ＬＱＧＶの存在についても検査した。図３４は、ＨＰＬＣクロマトグラフィー（波長２０６）を示し、ここにおいて、ＬＰＳ、およびＮＭＰＦ−４（ＬＱＧＶ）と組み合わせたＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞の各タンパク質抽出物から得たデータプロフィールが、オーバーレイされる。この図はまた、ＬＰＳで処理された細胞の核抽出物と比較して、オリゴペプチド＋ＬＰＳで処理された細胞の核抽出物中の分子シグナル数の有無を示す。ＬＱＧＶのＨＰＬＣプロフィールは、ペプチドが１２分前後で溶出することを示した（データは示さない。）ので、１０〜１５分の範囲に対応する画分を、採集し、ＭＳにおいてこのペプチドの存在について分析した。
【０１８８】
ペプチドの分子量は、４１６ダルトン前後である。４１６の質量の他、図３５は、その他のいくつかの分子量を示す。これは、二量体およびナトリウム付加化合物の形態を誘導させるペプチドの高い濃度によって説明されるものである（ｍ／ｚ４１６−［Ｍ＋Ｎ］＋，４３８−［Ｍ＋Ｎａ］＋，８３１−［２Ｍ＋Ｈ］＋，８５３−［２Ｍ＋Ｎａ］＋，１２４５−［３Ｍ＋Ｈ］＋，１２５７−［３Ｍ＋Ｎａ］＋）。図３６は、１０〜１５分のＭＳ結果を示す。核抽出物の画分は、ＬＰＳ刺激細胞から得た。これらの結果は、４１６ダルトン量の不存在を示す一方で、図３７は、４１６ダルトン量の存在を示し、その中、ＭＳｎデータ（図３７）およびＭＳ配列は、ＬＱＧＶ＋ＬＰＳで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞から得た核タンパク質抽出物におけるＬＱＧＶの存在を確証する。
【０１８９】
エンドトキシンショックモデル（敗血症）
敗血症。エンドトキシンモデルに関し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、８〜９ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（E.coli026:B6、ディフコラボラトリーズ社製、デトロイト、ＭＩ、米国）をｉ．ｐ．注射した。対照グループ（ＰＢＳ）を、ＰＢＳのみでｉ．ｐ．処理した。異なるソース（合成の、商業的なｈＣＧ製剤［ｃ−ｈＣＧ］）からのＮＭＰＦの効果を試験するために、我々は、投与量３００〜７００ＩＵの異なるｈＣＧ製剤（ＰＧ２３（プレグニール(Pregnyl) バッチＮｏ．２３５８６３），ＰＧ２５（プレグニール  バッチＮｏ．２５５９５７）と、ＬＰＳ注射２時間後に合成ペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）で、ＢＡＬＢ／ｃを処理した。他の実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０ｍｇ／ｋｇまたは１１ｍｇ／ｋｇのいずれかのＬＰＳ（E.coli026:B6、ディフコラボラトリーズ社製、デトロイト、ＭＩ、米国）を注射した。続いて、マウスを、ＬＰＳ処理の２時間後、および２４時間後にＮＭＰＦペプチドによって処理した。
【０１９０】
半定量的疾患測定。マウスを、次の測定計画を用いて疾患の重度について記録した。
１  浸透された毛皮、しかし通常のマウスと比べて異なる検出可能な行動はなし。
２  浸透された毛皮、縮こまる反射運動、健康なマウスと同様に取り扱い中活発で、刺激（ケージを叩くなど）に対して応答する。
３  ケージ叩きに対して、よりゆっくりとした応答、手を触れても無抵抗、またはおとなしい、しかし、新しい環境で１匹になると、まだ好奇心を示す。
４  好奇心の欠如、刺激に対してほとんどまたは全く応答しない、全く動かない。
５  強制呼吸、転がした後に自力で戻る能力がない、または戻るのが遅い（瀕死）。
６  犠牲にした。
【０１９１】
結果
エンドトキシンショックモデル（敗血症）
敗血症実験。高投与量のＬＰＳショックモデルにおける合成ペプチド（ＮＭＰＦ）の効果を測定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、異なる投与量のＬＰＳを腹腔内注射し、５日間毎日、生存を評価した。（ＬＰＳエンドトキシンモデルに関する）本実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、８〜９ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（E.coli026:B6、ディフコラボラトリーズ社製、デトロイト、ＭＩ、米国）をｉ．ｐ．注射した。対照グループを、ＰＢＳのみでｉ．ｐ．処理した。我々は、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＬＰＳ注射の２時間後、投与量３００〜７００ＩＵの異なるｈＣＧ製剤（ＰＧ２３（プレグニール バッチＮｏ．２３５８６３），ＰＧ２５（プレグニール  バッチＮｏ．２５５９５７））によって、またはペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）によって処理した。
【０１９２】
これらの実験は、ＮＭＰＦペプチド４、６、６６およびＰＧ２３が、完全にショックを阻害した一方で（全てのマウスは、最初の２４時間に２よりも高くない疾患スコアを有し、その後すぐに、これらは、完全に回復し、０の疾患スコアを有した。）、ペプチド２、３および７が、ショックを促進させたこと（全てのマウスは、最初の２４時間に５の疾患スコアを有し、これらのほとんどが死亡した一方で、ＬＰＳ＋ＰＢＳで処理された対照マウスは、最初の２４時間で３〜４の疾患スコアを有し、これらのほとんどが５の疾患スコアで４８時間後に死亡した（７２時間で１７％の生存率）。）を示した（表１）。さらに、ペプチド１、５、８、９、１１、１２、１３、１４および６４は、異なる実験において、効果および活性の種類（阻害対促進）の可変性を示した。この可変性は、種々のペプチドの崩壊率と、種々のペプチドおよびこれらの崩壊物がin vivoで有する異なる効果とに原因がありそうである。さらに、これらの実験はまた、抗ショックおよびショック促進ＮＭＰＦの存在下での変化の原因になりそうなｃ−ｈＣＧ製剤における抗ショック活性の可変性をも示す。疾患の目に見える兆候は、全ての実験動物において明白であるが、反応速度およびこの疾患の重度は、著しく異なる。これらのデータは、少なくとも１０の個別実験の代表例である。
【０１９３】
表２において、我々は、敗血症ショック実験において、ペプチドＬＱＧ、ＬＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰ、ＶＬＰＡＬＰＱにおけるＡＬＡ−置換（ＰＥＰＳＣＡＮ）の効果を目にする。我々は、中性アミノ酸によるさらに１つのアミノ酸の変化が、異なる活性を引き起こし得ることを結論付けた。したがって、これらのペプチドにおけるゲノム相違および多形性は、免疫応答を非常に精密に調節することができる。これらのペプチドの誘導体はまた、たとえば（限定されない）、古典的および非古典的なアミノ酸の追加による誘導体、合成中または合成の後のたとえば、ベンジル化、アミド化、グリコシル化、タンパク質分解的切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドへの結合で種々修飾された誘導体が、活性のより好ましい効果を引き起こし得る。
【０１９４】
ＮＭＰＦによるＢＡＬＢ／ｃマウスの処理が疾患の異なる段階で敗血症ショックを阻害するか否かを決定するために、合成ペプチド（ＮＭＰＦ）を、高投与量のＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）で敗血症ショックを誘導した後２時間および２４時間でｉ．ｐ．注射した。
【０１９５】
表３および４に示すように、対照マウスは、ショック誘導後ＰＢＳで処理され、１４時間および２４時間で５の疾患スコアに達し、ＰＢＳによる第２の注射後もそのままであった。対照グループの生存率は、４８時間で０％であった。対照マウスとは対照的に、ＮＭＰＦ９、１１、１２、４３、４６、５０および６０で処理されたマウスは、敗血症ショックの誘導後２４時間で２〜３の最高疾患スコアに達し、また、ＮＭＰＦの第２注射後４８時間で１〜２の最高疾患スコアに達した。さらに、ＮＭＰＦ５、７、８、４５、５３および５８で処理されたマウスは、５の疾患スコアに達し、ＮＭＰＦによる第２注射後、全てのマウスは、１〜２の疾患スコアに戻り、ＮＭＰＦグループの生存率は、１００％であった。ＮＭＰＦ３で処理されたマウスは、３〜４の疾患スコアに達し、第２  ＮＭＰＦ注射はこれらのマウスを救った。これらの実験は、ＮＭＰＦペプチドが、この疾患の異なる段階で抗ショック活性を有すること、およびＮＭＰＦが、それ以外には回復不可能な損傷を受けた場合の疾患段階でさえ、抗ショック活性を有することを示す。これは、ＮＭＰＦが異なる細胞レベルで効果を有し、また、修復および再生能力を有することを示す。
【０１９６】
樹状細胞実験
マウス。本研究で用いたマウスの種は、ＢＡＬＢ／ｃ(ハーラン(Harlan)、ビスター(Bicester)、オクスフォード(Oxon)、ＧＢ）であった。実験で用いられる全てのマウスは、８〜１２週齢の間のメスであった。
【０１９７】
マウスを、特定病原体未感染施設で収容した。オランダ、ロッテルダム、エラスムス大学の動物使用委員会は、全ての研究を承認した。
【０１９８】
in vivo処理。グループ毎に少なくとも６匹のマウスに、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ、シグマ社）で腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。ＬＰＳ誘導の２時間および２４時間後、マウスに、１００μＬの体積中の、ＮＭＰＦ（５ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかを、ｉ．ｐ注射した。このモデルにおけるＬＰＳ誘導ショックは、４８時間で９０％以上の死亡率を有した。
【０１９９】
骨髄細胞培養。処理されたマウスから、骨髄細胞を、単離し、次のように培養した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＯ２で窒息死させた。大腿骨および脛骨を、摘出し、無菌状態で筋肉および腱を除いた。骨を、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ１６４０、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２Ｍのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび１０％ウシ胎仔血清（バイオウィッタカー(Bio Whittaker)社製）、ヨーロッパ）に配置した。
【０２００】
その後、骨を、無菌の組織を用いることによって、より完全にクリーンにし、２ｍＬのＲ１０培地を有する氷冷のモルティエ(mortier)に転移した。骨を、骨から細胞を出すためにmortelで粉砕した。細胞を、殺菌した１００μＭフィルタ（ベクトンディキンソンラブウェア(Beckton Dickinson Labware)社製）で濾過し、５０ｍＬの管(ファルコン社製)で採集した。この手順を、骨部分が半透明に見えるまで反復した。
【０２０１】
単離した細胞を、１０ｍＬのＲ１０中に再懸濁させ、３０ｍＬのＧｅｙの培地を追加した。細胞懸濁液を、赤血球を溶解するために３０分間氷上で維持した。したがって、細胞を、Ｒ１０培地で２回洗浄した。培養の開始において、細胞濃度を、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウス顆粒球−単球コロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ，バイオソースインターナショナル社製、米国）を補充したＲ１０培地において１ｍＬあたり２×１０５の細胞に調整し、１００ｍｍの非付着性細菌ペトリディッシュ（ファルコン社製）において播種した。各条件について、６つのペトリディッシュを用い、さらなる分析のために、細胞を溜めて、前述のように分析した。培養を、３７℃で５％のＣＯ２インキュベーターに配置した。培養開始から３日毎に、２０ｎｇ／ｍＬでｒｍＧＭ−ＣＳＦを補充した１０ｍＬの新鮮なＲ１０培地を、各ディッシュに加えた。
【０２０２】
培養開始から９日後、非付着細胞を、採集し、コールターカウンター（コールター社製）で計数した。
【０２０３】
代替的に、未処理マウスからのＢＭ細胞を、単離し、上述のように培養し、以下の条件でin vivoで処理した。ＮＭＰＦ４、ＮＭＰＦ４６、ＭＭＰＦ７、ＮＭＰＦ６０（２０μｇ／ｍＬ）を、培養開始から０日後または６日後のいずれかに、培養液に加えた。
【０２０４】
免疫蛍光染色法。細胞（２×１０５）を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡおよび０．０２％のアジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）で洗浄し、丸底型９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）に転移した。染色に用いる抗体は、ＭＨＣ−II（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）ＰＥおよびＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８ＦＩＴＣ（ファーミンジェン(PharMingen)／ベクトンディキンソン社製、フランクリンレイク、ＮＪ、米国）に対するものであった。
【０２０５】
細胞を、抗体あたり２．５ｎｇ／μＬの濃度で両方の抗体を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。細胞を、その後、４℃で３０分間インキュベーションした。その後、細胞を、３度洗浄し、最後に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ベクトンディキンソン社製、ハイデルベルグ、ドイツ）におけるフローサイトメトリック分析のために２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。全てのＦＡＣＳデータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ベクトンディキンソン社製、ハイデルベルグ、ドイツ）で分析した。
【０２０６】
統計分析。２０％よりも大きい相違の全てが、有効とみなされる。
結果
樹状細胞実験
ex vivoでの骨髄細胞培養の細胞収率。ｒｍＧＭ−ＣＳＦによる骨髄の９日間培養から得た細胞収率におけるＬＰＳおよびＮＭＰＦ処理のin vivoでの効果を測定するために、細胞を、処理されたマウスのＢＭから単離し、培養し、採集し、前述のように計数した。図１および２において示されるように、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）で処理されたマウスの骨髄培養の細胞収率は、ＰＢＳで処理されたマウスと比べて著しく減少する。ＬＰＳショック誘導後にＮＭＰＦ４、ＮＭＰＦ７、ＮＭＰＦ４６およびＮＭＰＦ６０で処理されたマウスは、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下でＬＰＳに比べて細胞収率を著しく増加させた。さらに、ＮＭＰＦ４６で処理されたマウスからのＢＭ培養物は、ＰＢＳグループと比べて細胞収率を著しく増加させた。
【０２０７】
in vivoで処理された骨髄由来ＤＣの免疫蛍光染色。ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下でＢＭ細胞の培養は、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−IIに陽性の細胞集団の増加を引き起こした。これらの細胞膜マーカに陽性の細胞は、骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）である。ＤＣは、有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であって、免疫応答を調節する。骨髄由来ＤＣの成熟状態を測定するために、細胞を、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−IIで染色した。
【０２０８】
図３において示すように、ＭＨＣ−II分子の発現は、ＰＢＳグループに比べてＬＰＳで処理されたマウスからのＣＤ１１ｃ陽性細胞において著しく低下した。ＭＨＣ−II発現のこの低下は、ＮＭＰＦ４およびＮＭＰＦ４６によるin vivoでの処理によってさらに増強された。しかしながら、ＮＭＰＦ７およびＮＭＰＦ６０によるマウスの処理は、ＰＢＳグループに比べてＭＨＣ−II分子の発現を著しく増加させた。
【０２０９】
in vitroでの骨髄細胞培養の細胞収率。骨髄細胞の９日間培養の細胞収率におけるin vitroでのＬＰＳおよびＮＭＰＦの効果を測定するために、我々は、未処理のＢＡＬＢ／ｃマウスからＢＭ細胞を単離し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した。ｒｍＧＭ−ＣＳＦに加えて、培養液に、６日目にＬＰＳを追加して、または追加せずに、０日目または６日目のいずれかにＮＭＰＦを補充した。
【０２１０】
図４〜７に示すように、ＰＢＳと比べて、ＬＰＳで処理されたＢＭ細胞の細胞収率は著しく減少する。ＬＰＳなしにｔ＝０またはｔ＝６の時点でＮＭＰＦ４、７、４６または６０で処理されたＢＭ細胞は、ＰＢＳグループに比べて、細胞収率の著しい上昇を示した。しかしながら、ｔ＝６の時点でＮＭＰＦ４で処理されたＢＭ細胞培養液は、ＰＢＳグループに比べて細胞収率の著しい減少を示し、この効果は、ＬＰＳの効果に匹敵する（図４）。さらに、ＬＰＳと組み合わせてｔ＝６の時点でＮＭＰＦ４、７、４６または６０で処理されたＢＭ細胞は、ＬＰＳグループに比べて細胞収率の著しい上昇を示し、さらに、ＮＭＰＦ７のグループにおいて、細胞収率は、ＰＢＳグループと比較して著しく上昇した。
【０２１１】
in vitroで処理された骨髄由来ＤＣの免疫蛍光染色。ＤＣの成熟状態を測定するために、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を、ＭＨＣ−II抗体のために染色した。図７〜１１は、in vivo実験と比較してＭＨＣ−II発現におけるＬＰＳの逆効果が存在することを示し、すなわち、ＭＨＣ−II発現は、ＰＢＳと比べてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＰＳ処理によって著しく増加する。ＬＰＳと共に用いたＮＭＰＦ４は、ＬＰＳの効果をさらに増強した一方、ＬＰＳと共に、またはＬＰＳを共に使用しないＮＭＰＦ７（ｔ＝６）は、それぞれＬＰＳおよびＰＢＳに比べてＭＨＣ−IIの発現を著しく阻害した。しかしながら、ＬＰＳなしでＮＭＰＦ４６で処理された細胞は（ｔ＝０）は、ＣＤ１１ｃ陽性細胞におけるＭＨＣ−IIの著しく上昇した発現を示した。さらに、ＬＰＳありの、またはＬＰＳなしのＮＭＰＦ６０グループにおいては、ＬＰＳおよびＰＢＳで処理された細胞と比較して、ＭＨＣ−II発現における重大な相違は発見されなかった。
【０２１２】
ｒｍＧＭ−ＣＳＦを有する骨髄の９日間培養から得た細胞収率におけるＬＰＳおよびＮＭＰＦ処理のin vivoでの効果を測定するために、細胞を、処理されたマウスのＢＭから単離し、培養し、採集し、上述のように計数した。「付着（attached）」細胞の細胞収率は、ＮＭＰＦ４、７、９、１１、４３、４６、４７、５０、５３、５８、６０によって著しく増加し、さらに、ＮＭＰＦ７、４６および６０において、細胞収率は、ＰＢＳグループと比較して、著しく上昇した（図１４および図１５）。さらに、「非付着(un-attached)」細胞の細胞収率は、ＮＭＰＦ４、７、９、１１、４６、５０、５３、５８、６０によって著しく上昇し、ＮＭＰＦ４６のグループにおいて、細胞収率は、ＰＢＳグループと比較して著しく上昇した（図１２および１３）。
【０２１３】
メスのＮＯＤマウスの骨髄細胞の９日間培養の細胞収率におけるＬＰＳおよびＮＭＰＦのin vitroでの効果を測定するために、我々は、未処理ＮＯＤマウスからＢＭ細胞を単離し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養した。ｒｍＧＭ−ＣＳＦに加えて、培養液に、ＮＭＰＦを補充した。これらの実験において、「非付着」細胞の骨髄細胞収率は、ＰＢＳグループと比較してＮＭＰＦ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１２および１３によって著しく上昇し、ＮＭＰＦ１１によって効果は観察されなかった（図１６）。これらの実験の「付着」骨髄細胞は、「非付着」細胞とは異なる収率を示し、すなわちＮＭＰＦ３および１３で処理された培養液中の細胞収率を著しく上昇させ、その一方でＮＭＰＦ２および６で処理された培養液は、ＰＢＳに比べて細胞収率の著しい減少を示した（図１７）（さらなる追加の結果は、表５に要約される。）。
【０２１４】
冠動脈閉塞（ＣＡＯ）実験
ＣＡＯ誘導および処理。ＮＭＰＦは、慢性炎症マウスモデルと急性炎症マウスモデルとで免疫調節効果を有する。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１およびＲＯＳ（反応性酸素種）のような特定のサイトカインが、虚血および心筋梗塞を引き起こすin vivoでの冠動脈閉塞および再灌流の持続性発作によって生じた不可逆的な心筋損傷に関係したので、我々は、任意に供給されたオスのウィスター(Wistar)ラット（３００ｇ）でペプチドの心臓保護特性を検査した。この実験は、アメリカ生理学会によって承認された動物実験における指針に従って、かつエラスムス大学ロッテルダムの動物実験委員会の規則に従って、実行された。すなわち、ラット（ｎ＝３）を、３０分間固定し、続いて、１０分間で１ｍＬのペプチド処理（０．５ｍｇ／ｍＬ）をｉ．ｖ．で行った。処理の完了から５分後、ラットを、６０分間冠動脈閉塞（ＣＡＯ）を受けさせた。ＣＡＯの最後５分間で、ラットに、再度、１ｍＬのペプチド（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、１０分間に渡ってｉ．ｖ．処理し、続いて１２０分間の再灌流（ＩＰ）を行った。実験および外科手術手順は、Cardiovascular Research 37 (1998) 76-81に詳細に記載されている。各実験の終期に、冠動脈を、再閉塞するとともに、通常に灌流された心筋を紺色に染色して危険のある非染色領域（ＡＲ）を線引きするために、１０ｍＬのトリパンブルー（０．４％、シグマケミカル(Sigma Chemical Co.)社製、）で再灌流した。その後、心臓を、素早く摘出し、頂部から基部まで１ｍｍのスライスに切断した。各スライスから、右心室を摘出し、左心室を、マイクロ手術のはさみを用いて、ＡＲと残りの左心室とに分割した。その後、ＡＲを、３７℃のニトロブルーテトラゾリウム（シグマケミカル社製、１ｍｇ／ｍＬのソレンセン緩衝液、ｐＨ７．４）中で１０分間インキュベーションし、これは、生きている組織を紫に染色したが、梗塞形成された組織は未染色のままであった。梗塞領域（ＩＡ）が非梗塞領域から単離された後、ＬＶの種々の領域を、乾燥し、個別に計量した。梗塞の寸法は、ＡＲの割合で表された。対照のラットを、ＰＢＳで処理した。
【０２１５】
結果
冠動脈閉塞（ＣＡＯ）実験
我々のＣＡＯデータは、ＰＢＳのみで処理され、６０分間のＣＡＯ後に２時間の再灌流がされた対照グループにおける１５匹のラットが、７０±２％（平均±標準誤差）の梗塞領域を有していることを示した。その一方で、ペプチドＶＬＰＡＬＰ、ＬＱＧＶ、ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ、ＬＡＧＶ、ＬＱＡＶおよびＭＴＲＶで処理されたラットが、それぞれ、６２±６％、５５±６％、５５±５％、６７±２％、５１±４％、６２±６％、および６８±２％の梗塞領域を示した。ここで、我々は、特定のペプチド（ＶＡＬＰＡＬＰ，ＬＱＧＶ，ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，ＬＡＧＶなど）が梗塞の危険性のある領域で保護効果を有することがわかる。さらに、ペプチドＬＱＡＶは、比較的小さい梗塞領域を示したが、ある場合に、この領域は、出血性梗塞であった。さらに、ＮＭＰＦ−６４（ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ）はまた、ＣＡＯ実験において保護効果（３５％）を有した。特定の前述のペプチドで処理されたマウスが、血液のより低い粘性を示したことに注目することが重要である。血液凝固因子との特定の相同性が存在するので（ＮＭＰＦペプチドの追加結果に関して、表５を参照。）、免疫学的効果を除いて、これらのペプチドはまた、直接にまたは間接に血液凝固系に影響し得る。したがって、両方のモデルにおいて、循環系は、疾患の発生において重要な役割を果たす。
【０２１６】
ニワトリ卵実験
ＮＭＰＦによるニワトリ受精卵のin vivoでの処理。ニワトリ受精卵（ドロスト・ロースドレヒトＢＶ(Drost Loosdrecht BV)社製、オランダ）を、３７℃および３２％の相対湿度で、インキュベーター（Pas Reform BV、オランダ）において、対角位置でインキュベーションした。
【０２１７】
ＮＭＰＦペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）およびＶＥＧＦの溶液を、ＰＢＳ中で生成した。少なくとも１０個の卵に、条件毎に注射した。処理を、次のように行った。インキュベーション０日目、気室を開けるために卵殻に穴をドリルで開けた。注射のために、第１の穴から１０ｍｍ右下方に、第２の穴をドリルで開けた。これらの卵殻の穴を、jodiumで消毒した。ＮＭＰＦペプチド（１００ｕｇ／卵）および／またはＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を、１００μＬの体積で注射した。これらの卵殻の穴を、テープ（Scotch Magic（商標）テープ、３Ｍ社製）で密封し、卵を、インキュベーターに配置した。
【０２１８】
新脈管形成(angiogenesis)の数量化。インキュベーション７日目において、卵を、胚が通常の方法で成長しているか、および死亡した胚が計数されるかを検査するために、ＵＶランプのもとで視察した。インキュベーション８日目において、胚を、卵の底の殻を開けることによって、卵から除去した。卵殻膜を、慎重に切り裂き、除去した。胚を、１００ｍｍペトリディッシュに配置した。胚および血管を、顕微鏡（Zeiss Stemi SV6、ドイツ）を使用してin vivoで撮影した（Nikon E990、日本）。１枚の概要写真を撮り、４枚の血管の詳細写真を撮った。生きている胚を有する卵のみを評価した。
【０２１９】
データ分析。新脈管形成の数量化は、血管枝の数を計数することによって達成された。脈管形成(vasculogenesis)の数量化は、血管の厚さを測定することによって、達成された。血管枝の数および血管の厚さは、コーレルドロー(Corel Draw)７を用いて写真（写真４枚／卵）において計測した。その後、血管枝の数および血管の厚さを、対照用の顕微鏡（１０ｍｍ２）のラスターに関連付けた。各条件の枝の平均数および血管の平均厚さを、算定し、Ｔ検定（Student’s T-test）を用いてＰＢＳ対照卵と比較した。
【０２２０】
結果
ニワトリ卵実験
新脈管形成および脈管形成でのＮＭＰＦの効果を決定するために、我々は、材料および方法の部分で述べたように、ＮＭＰＦ、またはＶＥＧＦと組み合わせたＮＭＰＦによってニワトリ受精卵を処理した。図２０〜３０は、ＮＭＰＦ３、４、９および１１は、新脈管形成を促進させる一方（ｐ＜０．０５）、ＮＭＰＦ ＶＥＧＦ、７、４３、４４、４５、４６、５１および５６は、新脈管形成を阻害した（ｐ＜０．０５）ことを示す。ＮＭＰＦ６、７、１２、４５、４６および６６は、ＶＥＧＦによって誘導された新脈管形成を阻害することができた。さらに、ＮＭＰＦ６自体は、新脈管形成におけるいずれの効果も示さないが、ＮＭＰＦ３で誘導された新脈管形成を阻害した（ｐ＜０．０５）。
【０２２１】
図３１および図３２は、ＮＭＰＦ１、２、３、４、６、７、８、１２、５０、５１および５２が脈管形成阻害（ｐ＜０．０５）効果を有した一方、ＮＭＰＦ４４のみが、脈管形成を促進させた（ｐ＜０．０５）ことを示す。
【０２２２】
ＮＯＤ実験
マウス。１３〜１４週齢のメスＮＯＤマウスに、ＰＢＳ（ｎ＝６）またはＮＭＰＦペプチド（ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，ＬＱＧＶ，ＧＶＬＰＡＬＰＱ，ＶＬＰＡＬＰ，ＶＬＰＡＬＰＱ，ＭＴＲＶ，ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ，ＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳ，ＬＰＧＣ，ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，ＶＶＣＮＹＲＤＶＲＦＥＳＩＲＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳＹＡＶＡＬＳＣＱＣＡＬ）（５ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）を、２週間、１週間あたり３度ｉ．ｐ．注射した。４日毎に、尿を、グルコースの存在について検査した（Gluketur test、ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)社製、マンハイム、ドイツ）。これらの研究において用いられた全てのマウスは、無菌施設において維持された。マウスは食料および水を自由に摂取できるようにした。これらの実験は、オランダ、エラスムス大学ロッテルダムの動物実験委員会によって承認された。糖尿病を、アボットメディセンスプレシジョングルコメータ(Abbott Medisense Precision glucometer)を用いて静脈血のグルコースレベルを測定することによって評価した。マウスは、２つの連続的なグルコース測定値≧１１ｍｍｏｌ／Ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）の後、糖尿病と判断された。糖尿病の兆候は、最初の連続的な計測値から始まった。
【０２２３】
グルコース耐性試験（ＧＴＴ）を、腹腔内に（ｉ．ｐ．）１ｇ／ｋｇのＤグルコースを注射することによって、２８週齢で絶食したマウス（ｎ＝５）においてに実行した。０分（絶食中）、５分、３０分および６０分で血液試料を、尾から採取し、グルコース含有量について試験した。
【０２２４】
ＮＯ実験。
細胞培養。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡ）から得られたＲＡＷ２６４．７ネズミマクロファージ細胞系を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２Ｍのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、および５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ（バイオホイッタカー社製、ヨーロッパ）を用いて、５％ＣＯ２中で、３７℃で培養した。培地を、２日毎に交換した。
【０２２５】
亜硝酸塩測定。亜硝酸塩産生量を、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ上清中で測定した。細胞（７．５×１０５／ｍＬ）を、５００ｍＬの培地において４８ウェルプレート中で培養した。細胞を、２４時間、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍＬ）および／またはＮＭＰＦ（１ｐｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ）で刺激し、その後、培地を採集した。亜硝酸塩を、培地の１００μＬの試料に、１００μＬのグリース(Griess)試薬（シグマ社製）を加えることによって、測定した。ＯＤ５４０を、マイクロプレートリーダーを用いて測定し、亜硝酸塩濃度を、培地中の亜硝酸ナトリウムの標準溶液を用いて生成されたＯＤ５４０と比較することによって算定した。
【０２２６】
結果
ＮＯＤ実験
ＮＭＰＦがＮＯＤマウスにおいて疾患発症に影響を与えるか否かについて測定するために、我々は、１３〜１４週齢の糖尿病前のメスＮＯＤマウスにおけるＮＭＰＦを試験した。処理（隔日にＮＭＰＦ（５ｍｇ／ｋｇ）の注射）から２週間だけ後に、全てのＮＯＤマウスの糖尿レベルを、１７週齢で分析した。意味深い抗糖尿病効果（糖尿に陰性のマウス）が、ＰＢＳグループと比較して、種々のＮＭＰＦグループ、特に、ペプチドＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ、ＶＬＰＡＬＰ、ＭＴＲＶ、ＬＰＧＣＰＲＧＶＮＰＶＶＳおよびＬＰＧＣで処理されたＮＭＰＦグループにおいて、観察された。加えて、グルコース耐性試験の欠陥は、膵島炎に肯定的に関連性を有したが、機能的なベータ細胞の数に否定的に関連性を有し、また、この試験は、ＮＭＰＦで首尾よく処理されたＮＯＤマウスが、ＰＢＳグループに比べてグルコースに関して耐性を有することを示した。我々の結果は、ＰＢＳで処理されたＮＯＤマウスが、２３週齢で全て糖尿病であったことを示す。ところが、２週間、１週あたり３回ＮＭＰＦで処理されたＮＯＤマウスは、糖尿病発症の意味深い阻害を示した。最も強い抗糖尿病効果は、ＮＭＰＦ−１、４、５、６、７、６５、６６、および市販のｈＣＧ製剤（プレグニール、オルガノン、オス、オランダ、バッチＮｏ．２３５８６３）によって観察された。これらのマウスは、低い空腹時血糖レベルを有し、グルコースに関して耐性を有した（データを部分的に示す）。しかしながら、ＮＭＰＦ−７１は、糖尿病の発症への影響を示さなかった一方で、ＮＭＰＦ−６４およびＮＭＰＦ−１１は、適度な抗糖尿病効果を有した。
【０２２７】
ＮＯ実験
ＮＯ産生は、脈管および炎症反応の中心的な仲介物質である。我々の結果は、ＬＰＳで刺激されたマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）が大量のＮＯを産生することを示す。しかしながら、極少の投与量（１ｐｇ／ｍＬ）でも、ほとんどのＮＭＰＦペプチド（ＮＭＰＦペプチド１〜１４、４３〜６６および６９）によって共刺激されたこれらの細胞は、ＮＯの産生を阻害した。
【０２２８】
結果
アポＥ実験
本発明は、アポＥおよびその他のアポリポタンパク質ファミリの一員などの機能障害ＬＤＬレセプターに関連する疾患を治療するための方法およびシグナル分子を提供する。特に、ＧＶＬＰＡＬＰＱ（ＮＭＰＦ−５）および／もしくはＶＬＰＡＬＰ（ＮＭＰＦ−６）、またはこれらの機能的な類似体もしくは誘導体を含むシグナル分子の使用が好適である。アポＥ不完全マウス（グループあたりｎ＝６）のグループに、高コレステロールの餌を与え、ＰＢＳまたはＮＭＰＦを腹腔内に隔日に投与した。２．５週間後、体重を、下表に示すとおり測定した。
【０２２９】
平均体重(ｇ)     ＳＤ(ｇ)      ｐ−値
アポＥ−／−ＰＢＳ          ３１．６６７    １．００７
アポＥ−／−ＮＭＰＦ−４    ３１．２５６    １．４９６    ０．５３６
アポＥ−／−ＮＭＰＦ−５    ２９．７４３    １．１６０    ０．０１９
バックグラウンド／ＰＢＳ    ２６．７６０    １．５８２    １０−６
アポＥ−／−ＮＭＰＦ−６    ２９．６１４    １．０６４    ０．００４
【０２３０】
データベース中の種々のペプチドの分析
ペプチドが分析された種々のデータベースの例は、次のとおりである。
【０２３１】
プロテオミクスツール：類似性検索
ＢＬＡＳＴデータベース（ＥｘＰａｓｙ、ＮＣＢＩ）
ＳＭＡＲＴ（ＥＭＢＬ）
ＰＡＴＴＩＮＰＲＯＴ（ＰＢＩＬ）
翻訳後修飾予測
シグナルＰ（ＣＢＳ）
一次構造分析
ＨＬＡペプチド結合予測（ＢＩＭＡＳ）
ＭＨＣタイプＩおよびIIペプチド結合の予測
（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ）
アミノ酸スケール表示（疎水性、その他の立体配座パラメータなど）（ＰＲＯＴＳＣＡＬＥ）
ヘリカルホイールとしてのタンパク質フラグメントの表示（へリックスホイール(HelixWheel)／へリックスドロー(HelixDraw)）
【０２３２】
結果
本発明のシグナル分子を同定するための方法の応用に有用な関連オリゴペプチドの非広範囲リストは、タンパク質データベースから導き出すことができる。
ｐｄｂ｜１ＤＥ７｜１ＤＥ７−Ａ  アルファ−トロンビンを有する因子ＸＩＩＩ活性化ペプチドの相互作用
ＬＱＧＶ，ＬＱＧＶＶ，ＬＱＧＶＶＰ
ｐｄｂ｜１ＤＬ６｜１ＤＬ６−Ａ  ヒトＴＦＩＩＢＮ末端ドメインの溶液構造
ＬＤＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＱＭＨ｜１ＱＭＨ−Ａ  ＲＮＡ３´末端リン酸シクラーゼの結晶構造、ユビキタス酵素(ubiquitous enzyme)
ＬＱＴＶ，ＶＬＰＡＬ，ＬＶＬＱＴＶＬＰＡＬ
ｐｄｂ｜１ＬＹＰ｜１ＬＹＰ  ＣＡＰ１８（残基１０６〜１３７）
ＩＱＧ，ＩＱＧＬ，ＬＰＫＬ，ＬＬＰＫＬ
ｐｄｂ｜１Ｂ９Ｏ｜１Ｂ９Ｏ−Ａ  ヒトアルファラクトアルブミン
ＬＰＥＬ
ｐｄｂ｜１ＧＬＵ｜１ＧＬＵ−Ａ  グルココルチコイドレセプター（ＤＮＡ−結合ドメイン）
ＰＡＲＰ
ｐｄｂ｜２ＫＩＮ｜２ＫＩＮ−Ｂ  ドブネズミ(RATTS NORVEGICUS)からのキネシン（単量体）
ＭＴＲＩ
ｐｄｂ｜１ＳＭＰ｜１ＳＭＰ−Ｉ  ＭＯＬ＿ＩＤ：１，分子：サラチアメタロプロテイナーゼ，鎖：Ａ
ＬＱＫＬ，ＬＱＫＬＬ，ＰＥＡＰ，ＬＱＫＬＬＰＥＡＰ
ｐｂｄ｜１ＥＳ７｜１ＥＳ７−Ｂ  ＢＮＰ−２および２つのＢＭＰレセプターＩＡエクトドメインの複合体
ＬＰＱ，ＰＴＬＰ，ＬＱＰＴＬ
ｐｄｂ｜１ＢＨＸ｜１ＢＨＸ−Ｆ  ヒトアルファトロンビンと阻害物質ＳＤＺ２２９〜３５７との複合体のＸ線構造
ＬＱＶ，ＬＱＶＶ
ｐｄｂ｜１ＶＣＢ｜１ＶＣＢ−Ａ  ＶＨＬ−ＥｌｏｎｇｉｎＣ−ＥｌｏｎｇｉｎＢ構造
ＰＥＬＰ
ｐｄｂ｜１ＣＱＫ｜１ＣＱＫ−Ａ  ＭＡＫ３３抗体からのＣＨ３ドメインの結晶構造
ＰＡＡＰ，ＰＡＡＰＱ，ＰＡＡＰＱＶ
ｐｄｂ｜１ＦＣＢ｜１ＦＣＢ−Ａ  フラボシトクロム
ＬＱＧ
ｐｄｂ｜１ＬＤＣ｜１ＬＤＣ−Ａ  Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ：シトクロムｃ酸化還元酵素（フラボシトクロムＢ＝２＝）（E.C.1.1.2.3）の、ビルビン酸塩と複合されたＰＨＥ（Ｙ１４３Ｆ）によって置換されたＴＹＲ１４３を有する変異体
ＬＱＧ
ｐｄｂ｜１ＢＦＢ｜１ＢＦＢ  ヘパリン４量体フラグメントと複合された基礎線維芽細胞増殖因子
ＬＰＡＬ，ＰＡＬＰ，ＰＡＬＰＥ
ｐｄｂ｜１ＭＢＦ｜１ＭＢＦ  マウスＣ−ＭＹＢ ＤＮＡ−結合ドメインリピート１
ＬＰＮ
ｐｄｂ｜１Ｒ２Ａ｜１Ｒ２Ａ−Ａ  タンパク質キナーゼＡの分子的機序
ＬＱＧ，ＬＴＥＬＬ
ｐｄｂ｜１ＣＫＡ｜１ＣＫＡ−Ｂ  Ｃ３Ｇペプチド（ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＬＥＵ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＡＲＧ）と複合されたＣ−ＣＲＫ（Ｎ末端ＳＨ３ドメイン）（Ｃ−ＣＲＫＳＨ３−Ｎ）
ＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＲＴＱ｜１ＲＴＱ−Ｒ  高タンパク質リガンドＲＬＰ２（ＲＡＬＰＰＬＰＲＹ）（ＮＭＲ，最小平均構造）と付記烏合されたＣ−ＳＲＣ（ＳＨ３ドメイン）
ＬＰＰＬ，ＰＰＬＰ
ｐｄｂ｜１ＴＮＴ｜１ＴＮＴ
ＬＰＧ，ＬＰＧＬ，ＬＰＫ
ｐｄｂ｜１ＧＪＳ｜１ＧＪＳ−Ａ  連鎖球菌タンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインの溶液構造
ＬＡＡＬ，ＬＡＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＧＢＲ｜１ＧＢＲ−Ｂ  ＳＯＳ−Ａペプチド（ＮＭＲ，２９構造）で複合された成長因子レセプター結合タンパク質２（ＧＲＢ２，Ｎ末端ＳＨ３ドメイン）
ＬＰＫＬ，ＰＫＬＰ
ｐｄｂ｜１Ａ７８｜１Ａ７８−Ａ  ヒキガエル卵巣ガレクチンとチオ−ジガラクトースとの複合
ＶＬＰＳＩＰ
ｐｄｂ｜１ＩＳＡ｜１ＩＳＡ−Ａ  鉄（II）スーパーオキシドジスムターゼ（E.C.1.15.1.1）
ＬＰＡＬ，ＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＦＺＶ｜１ＦＺＶ−Ａ  ２．０Ａ分解能における、ヒト胎盤成長因子−１（ＰＬＧＦ−１）、血管新生タンパク質の結晶構造
ＰＡＶＰ，ＭＬＰＡＶＰ
ｐｄｂ｜１ＪＬＩ｜１ＪＬＩ  ＮおよびＣ末端両方で先を切り取られ、かつ１４残基変化による、ヒトインターロイキン３（ＩＬ−３）変異体、ＮＭＲ、最小平均。
ＬＰＣ，ＬＰＣＬ，ＰＣＬＰ
ｐｄｂ｜１ＨＳＳ｜１ＨＳＳ−Ａ  小麦からの０．１９アルファアミラーゼ阻害物質
ＶＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜３ＣＲＸ｜３ＣＲＸ−Ａ  ＣＲＥリコンビナーゼ／ＤＮＡ複合中間体Ｉ
ＬＰＡ，ＬＰＡＬ，ＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＰＲＸ｜１ＰＲＸ−Ａ  ＨＯＲＦ６新しいヒトペルオキシダーゼ酵素
ＰＴＩＰ，ＶＬＰＴＩＰ
ｐｄｂ｜１ＲＣＹ｜１ＲＣＹ  チオバチルスフェロオキシダンス
ＶＬＰＧＦＰ
ｐｄｂ｜１Ａ３Ｚ｜１Ａ３Ｚ  １．９オングストロームにおける還元されたラスチシアニン
ＰＧＦＰ，ＶＬＰＧＦＰ
ｐｄｂ｜１ＧＥＲ｜１ＧＥＲ−Ａ  ＦＡＤと複合されたグルタチオンレダクターゼ（E.C.1.6.4.2）
ＬＰＡＬＰ，ＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＰＢＷ｜１ＰＢＷ−Ａ  ＢＣＲホモロジー（ＢＨ）ドメイン
ＰＡＬＰ
ｐｄｂ｜１ＢＢＳ｜１ＢＢＳ  レニン（E.C.3.4.23.15）
ＭＰＡＬＰ
ＡＩ１８８８７２  １１．３  ３６６  ３２７  １８  ３８２［ホモサピエンス］ｑｄ２７ｃ０１．ｘ１
ソアレス(Soares)＿胎盤＿８〜９週＿２ＮｂＨＰ８ｔｏ９Ｗ
ホモサピエンスｃＤＮＡクローン画像：ｇｂ（Ｊ００１１７絨毛性ゴナドトロピンベータ鎖前駆体（ヒト））に類似する１７２４９２８ ３´；ｍＲＮＡ配列；マイナス鎖；翻訳
ＭＸＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，ＭＸＲＶ，ＭＸＲ
ＡＩ１２６９０６  １９．８  ４１８  ３４３  １  ４１８［ホモサピエンス］ｑｂ９５ｆ０１．ｘｌ
ソアレス＿胎仔＿心臓＿ＮｂＨＨ１９Ｗ
ホモサピエンスｃＤＮＡクローン画像：ｇｂ（Ｊ００１１７絨毛性ゴナドトロピンベータ鎖前駆体（ヒト））に類似する１７０７８６５  ３´；ｍＲＮＡ配列；マイナス鎖；翻訳
ＩＴＲＶＭＱＧＶＩＰＡＬＰＱＶＶＣ
ＡＩ２２１５８１  ２９．１  ４５６  ３４１  ２３  ５１０［ホモサピエンス］ｑｇ２０ａ０３．ｘｌ
ソアレス＿胎盤＿８〜９週＿２ＮｂＨＰ８ｔｏ９Ｗ
ホモサピエンスｃＤＮＡクローン画像：ｇｂ（Ｊ００１１７絨毛性ゴナドトロピンベータ鎖前駆体（ヒト））に類似する１７６００４４  ３´；ｍＲＮＡ配列；マイナス鎖；翻訳
ＭＴＲＶＬＱＶＶＬＬＡＬＰＱＬＶ
Ｍｍ．４２２４６．３  Ｍｍ．４２２４６  １０１．３  ８３７  ３０４  ２８  ７６８  ＧＥＮＥ＝Ｐｃｋ１  ＰＲＯＴＳＩＭ＝ｐｉｒ：Ｔ２４１６８ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１，サイトゾル；翻訳
ＫＶＩＱＧＳＬＤＳＬＰＱＡＶ，ＬＤＳＬ，ＬＰＱ
Ｍｍ．２２４３０．１  Ｍｍ．２２４３０  ２０９．４  １２７５  １５７  ７５  １５３５  ＧＥＮＥ＝Ask-pending  ＰＲＯＴＳＩＭ＝pir：Ｓ期キナーゼ(S-phase kinase)のＴ０２６３３活性化因子；翻訳
ＶＬＱＡＩＬＰＳＡＰＱ，ＬＱＡ，ＬＱＡＩＬ，ＰＳＡＰ，ＬＰＳ
Ｈｓ．６３７５８．４  Ｈｓ．６３７５８  ９３．８  ３０９２  １２１０  ５１  ２７１９  ＧＥＮＥ＝ＴＦＲ２  ＰＲＯＴＳＩＭ＝ｐｉｒ：Ｔ３０１５４トランスフェリンレセプター２；翻訳
ＫＶＬＱＧＲＬＰＡＶＡＱＡＶ，ＬＱＧ，ＬＰＡ，ＬＰＡＶ
Ｍｍ．１２９３２０．２  Ｍｍ．１２９３２０  １７３．０  ３２２０  ５７１  ５５  ２７６９  ＧＥＮＥ＝ＰＲＯＴＳＩＭ＝国際公開第９９５０２８４号からのｐｉｒ：Ｔ１６４０９配列８
ＬＶＱＫＶＶＰＭＬＰＲＬＬＣ，ＬＶＧ，ＬＰＲＬ，ＰＭＬＰ
Ｍｍ．２２４３０．１  Ｍｍ２２４３０  ２０９．４  １２７５  １５７  ７５  １５３５  ＧＥＮＥ＝Ask-pending  ＰＲＯＴＳＩＭ＝Ｓ期キナーゼのＴ０２６３３活性化因子，翻訳
ＶＬＱＡＩＬＰＳＡＰＱ，ＬＱＡ，ＬＱＡＩＬ，ＰＳＡＰ，ＰＳＡＰＱ
Ｐ２０１５５  ＩＡＣ２＿ヒトアクロシン−トリプシン阻害因子II前駆体（ＨＵＳＩ−II）［ＳＰＩＮＫ２］［ホモサピエンス］
ＬＰＧＣＰＲＨＦＮＰＶ，ＬＰＧ，ＬＰＧＣ
Ｒｎ．２３３７．１  Ｒｎ．２３３７  １１３．０  ３２２  １０４  １  ３２７  ＧＥＮＥ＝ＰＲＯＴＳＩＭ＝ＰＲＦ：１４０２２３４Ａ  ラット膵臓分泌腺トリプシン阻害物質II型（ＰＳＴＩ−II）ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；マイナス鎖；翻訳
ＬＶＧＣＰＲＤＹＤＰＶ，ＬＶＧ，ＬＶＧＣ
Ｈｓ．２９７７７５．１  Ｈｓ．２９７７７５  ４３．８  １１６７  ７５３  ３１  １２９１  ＧＥＮＥ＝ＰＲＯＴＳＩＭ＝ｓｐ：Ｏ００２６８ＥＳＴｓ，Ｔ２Ｄ３＿ヒト転写開始因子ＴＦＩＩＤ１３５ＫＤＡサブユニット［Ｈ．サピエンス］に弱く類似する；マイナス鎖；翻訳
ＰＧＣＰＲＧ，ＰＧＣＰ
Ｍｍ．１３５９．１  Ｍｍ．１３５９  ＰＲＯＴＳＩＭ＝ｐｉｒ．Ａ３９７４３  ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター
ＬＰＧＣＰ，ＰＧＣＰ，ＬＰＧ，ＬＰＧＣ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｏ５６１７７｜Ｏ５６１７７  エンベロープ糖タンパク質
ＶＬＰＡＡＰ，ＰＡＡＰ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｑ９Ｗ２３４｜Ｑ９Ｗ２３４  ＣＧ１３５０９  タンパク質．//：トレンブル｜ＡＥ００３４５８｜ＡＥ００３４５８＿７遺伝子：“ＣＧ１３５０９”；キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ゲノム足場物質
ＬＡＧＴＩＰＡＬＰ，ＬＡＧ，ＰＡＴＰ
ｓｗｉｓｓ｜Ｐ８１２７２｜ＮＳ２Ｂ  ヒト  一酸化窒素シンターゼＩＩＢ（EC1.14.13.39）（ＮＯＳ，II型Ｂ）（ＮＯＳＩＩＢ）（フラグメント）
ＧＶＬＰＡＶＰ，ＬＰＡ，ＶＬＰＡＶＰ，ＰＡＶＰ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｏ３０１３７｜Ｏ３０１３７  ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ  １７．２ＫＤＡ
ＧＶＬＰＡＬＰ，ＰＡＬＰ，ＬＰＡＬ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｑ９ＩＹＺ３｜Ｑ９ＩＹＺ３  ＤＮＡポリメラーゼ
ＧＬＬＰＣＬＰ，ＬＰＣ，ＬＰＣＬ，ＰＣＬＰ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｑ９ＰＶＷ５｜Ｑ９ＰＶＷ５  核タンパク質ＮＰ２２０
ＰＧＡＰ，ＬＰＱＲＰＲＧＰＮＰ，ＬＰＱ，ＰＲＧＰ，ＰＮＰ
Ｈｓ．３０３１１６．２  ＰＲＯＴＳＩＭ＝ｐｉｒ；Ｔ３３０９７間質性細胞由来因子２様１；翻訳
ＧＣＰＲ
ｐｄｂ｜１ＤＵ３｜１ＤＵ３−Ａ  ＴＲＡＩＬ−ＳＤＲ５の結晶構造
ＧＣＰＲＧＭ
ｐｄｂ｜１Ｄ０Ｇ｜１Ｄ０Ｇ−Ｒ  アポ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに結合されたデスレセプター５（ＤＲ５）の結晶構造
ＧＣＰＲＧＭ
ｐｄｂ｜１ＢＩＯ｜１ＢＩＯ  isatoic anhydride inhibitorと複合したヒト補体Ｄ因子
ＬＱＨＶ
ｐｄｂ｜４ＮＯＳ｜４ＮＯＳ−Ａ  阻害物質を有するヒト誘導型一酸化窒素シンターゼ
ＦＰＧＣ，ＰＧＣＰ
ｐｄｂ｜１ＦＬ７｜１ＦＬ７−Ｂ  ヒト濾胞刺激ホルモン
ＰＡＲＰ，ＶＰＧＣ
ｐｄｂ｜１ＨＲ６｜１ＨＲ６−Ａ  イーストミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ
ＣＰＲＣ，ＬＫＧＣ
ｐｄｂ｜１ＢＦＡ｜１ＢＦＡ  組み換え二元機能ハーゲマン因子／アミラーゼ阻害物質
ＰＰＧＰ，ＬＰＧＣＰＲＥＶ，ＬＰＧＣ，ＰＧＣＰ，ＣＰＲＥ
ｓｗｉｓｓｎｅｗ｜Ｐ０１２２９｜ＬＳＨＢ  ヒト  ルトロピンベータ鎖前駆体
ＭＭＲＶＬＱＡＶＬＰＰＬＰＱＶＶＣ，ＭＭＲ，ＭＭＲＶ，ＬＱＡ，ＬＱＡＶ，ＶＬＰＰＬＰ，ＰＰＬＰ，ＱＶＶＣ，ＶＶＣ，ＶＬＰＰＬＰＱ，ＡＶＬＰＰＬＰ，ＡＶＬＰＰＬＰＱ
ｓｗｉｓｓｎｅｗ｜Ｐ０７４３４｜ＣＧＨＢ  ＰＡＰＡＮ  絨毛性ゴナドトロピンベータ鎖前駆体
ＭＭＲＶＬＱＡＶＬＱＡＶＬＰＰＶＰＱＶＶＣ，ＭＭＲ，ＭＭＲＶ，ＬＱＡ，ＬＱＡＧ，ＶＬＰＰＶＰ，ＶＬＰＰＶＰＱ，ＱＶＶＣ，ＶＶＣ，ＡＶＬＰＰＶＰ，ＡＶＬＰＰＶＰＱ
ｓｗｉｓｓｎｅｗ｜Ｑ２８３７６｜ＴＳＨＢ  ウマ  甲状腺刺激ホルモンベータ鎖前駆体
ＭＴＲＤ，ＬＰＫ，ＱＤＶＣ，ＤＶＣ、ＩＰＧＣ，ＰＧＣＰ
ｓｗｉｓｓｎｅｗ｜Ｐ９５１８０｜ＮＵＯＢ  ＭＹＣＴＵ  ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼＩ鎖Ｂ
ＬＰＧＣ，ＰＧＣＰ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｑ９Ｚ２８４｜Ｑ９Ｚ２８４  好中球エラスターゼ
ＰＡＬＰ，ＰＡＬＰＳ
ｓｐｔｒｅｍｂｌ｜Ｑ９ＵＣＧ８｜Ｑ９ＵＣＧ８  尿ゴナドトロピンペプチド（フラグメント）
ＬＰＧＧＰＲ，ＬＰＧ，ＬＰＧＧ，ＧＧＰＲ
ＸＰ＿０２８７５４成長ホルモン放出ホルモン［ホモサピエンス］
ＬＱＲＧ，ＬＱＲＧＶ，ＬＧＱＬ
【０２３３】
更なる非限定リストは、コラーゲン、ＰＳＧ、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ（黒色腫関連成長抗原）、トロンボスポンジン−１、成長因子、ＭＭＰｓ、カルモジュリン、嗅覚レセプター、シトクロムｐ４５０、キナーゼ、フォン・ウイレブランド因子（凝固因子）、液胞タンパク質（ＡＴＰシンターゼ）、糖タンパク質ホルモン、ＤＮＡポリメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシン、ウイルスタンパク質（エンベロープタンパク質など）、エラスチン、冬眠関連タンパク質、不凍化糖タンパク質、プロテアーゼ、スポロゾイト周囲、核レセプター、転写因子、サイトカインおよびこれらのレセプター、細菌抗原、Ｎｒａｍｐ、ＲＮＡポリメラーゼ、細胞骨格タンパク質、造血（神経）膜タンパク質、免疫グロブリン、ＨＬＡ／ＭＨＣ、Ｇ結合タンパク質およびこれらのレセプター、ＴＡＴＡ結合タンパク質、トランスフェラーゼ、ジンクフィンガータンパク質、スプライソソームタンパク質、ＨＭＧ（高移動度群タンパク質）、ＲＯＳ（反応性酸素種）、スーパーオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、プロトオンコジーン／腫瘍抑制遺伝子、アポリポタンパク質を含む。
【０２３４】
2005519867.tif 000002
【０２３５】
【表１】
2005519867.tif 000003
【０２３６】
【表２】
2005519867.tif 000004
【０２３７】
【表３】
2005519867.tif 000005
【０２３８】
【表４】
2005519867.tif 000006
【０２３９】
【表５】
2005519867.tif 000007
【０２４０】
【表６】
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2005519867.tif 000009
【０２４１】
サル実験
敗血症ショックの予防のために、グラム陰性誘導されたアカゲザルの敗血症モデルに投与されたＮＭＰＦ、ここではＬＱＧＶ、ＡＱＧＶおよびＶＬＰＡＬＰの混合１：１：１の有効性。
【０２４２】
絶大な炎症および免疫の応答は、敗血症ショックの不可欠な特徴であり、敗血症によって誘導される組織損傷、多臓器障害および死亡の病原において中心的な役割を果たす。サイトカイン、特に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、インターロイキン（ＩＬ）−１ベータ、およびマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、敗血症ショックの重要な仲介物質であることを示した。また、従来の抗ＴＮＦおよび抗ＩＬ−１療法は、重度の敗血症の患者にとって多くの利益を示さなかった。我々は、たとえ、ペプチドによる処理がＬＰＳ注射の２４時間後までに開始される場合であっても、マウス中でＬＰＳ誘導敗血症ショックを完全に阻止するペプチドを設計した。これらのペプチドはまた、ＭＩＦの産生を阻害することも可能である。この発見は、敗血症ショックを被る患者の処置のためのこれらのペプチドの治療使用の可能性を提供する。霊長類がヒトに比較的近く進化しているので、我々は、霊長類系において、安全および有効性について、これらのペプチドを試験した。
【０２４３】
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【０２４４】
実験未使用のサルのみを、事前処理によるいずれの相互作用も排除するために、本前臨床研究において用いた。これらの動物を、塩酸ケタミンで鎮静させた。動物に、経口で挿管し、自由に呼吸可能にした。動物を、Ｏ２／Ｎ２Ｏ／イソフルレンで麻酔した。動物は、Ｏ２／Ｎ２Ｏ／イソフルレンの前投薬として、アトロピンを受けた。手術の麻酔のレベルは、２時間のE.coliの注入期間中およびE.coli投与に続く６時間維持され、その後、気管内管を除去し、動物を安楽死させた。細菌を誘導する前に、心拍および血圧の１時間の注入前観察を実行した。２匹のアカゲザルに、１０１０ＣＦＵ／ｋｇのグラム陰性細菌E.coliを、致命的な敗血症ショックを誘導するために注入した。１匹のサルに、プラシーボ処理を与え、麻酔からの回復なしに細菌の注入後７時間以内に犠牲にした。第２のサルには、試験化合物による処理を与え、同じ時点で犠牲にした。
【０２４５】
同一の菌株によって１９９１年に行われた限定的な用量漸増実験において、用いられた投与量は、８時間以内に致命的なショックを誘導することを証明した。近年の実験においては、３倍少ない投与量を用い、致命的な結果なく敗血症ショックの明らかな臨床的かつ病理形態学的兆候を誘導した。サルを、観察期を通して麻酔維持し、病理検査のために、細菌注入の開始後７時間で犠牲にした。動物に、全体的な解剖検査に受けさせ、ここにおいて、腹腔および胸腔を開き、in situで臓器を検査した。
【０２４６】
３匹のアカゲザル実験の全説明
本研究は、アカゲザル（Maccaca mulatta）で実行された。事前の処理とのいずれの相互作用をも排除するために、実験未使用のサルのみを研究で用いた。実験の前に、動物の健康状態を、獣医によって身体的に評価した。全ての動物は、健康良好であると宣言され、病原性の外部寄生虫および内部寄生虫、ならびに一般の細菌感染（ペスト菌(Yersinia pestis)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・シュードツベルクローシス(Yersinia pseudotuberculosis)、赤痢菌(Shigella)、アエロモナス細菌(Aeromonas Hydrophilia)、病原性カンピロバクター菌種(pathogenic Campylobacter species)およびサルモネラ菌(Salmonella)）は存在しなかった。
【０２４７】
試薬。大腸菌(Escherichia coli)を、ＡＴＣＣから購入した（E-coli、０８６ａ：Ｋ６１血清型、ATCC 330985）。対照実験において、この株は、ヒトおよびアカゲザル血清型において細菌因子に対し等しい感受性を有することを証明した。実験の前に、新鮮な培養を設定した。E.coli株を、１日間培養し、採集し、遊離エンドトキシンを除去するために、全面的に洗浄した。動物への注入前に、細菌の数および生存能力を評価した。E.coli株の連続希釈液を、ＢＨＩ寒天において培養し、３７℃で夜通し培養した。各プレートのコロニーを計数し、１ｍＬ当たりのコロニー形成ユニットの数を算定した。実験日の体重測定を、E.coli投与量を算定するために用い、E.coli株を、注入（注入のための全投与体積約１０ｍＬ／ｋｇ）に必要な濃度で、等張の生理食塩水（Ｎ．Ｐ．Ｂ．Ｉ、Emmer-Compascuum、オランダ）中で懸濁させた。E.coli懸濁液を、注入まで氷上で維持した。
【０２４８】
抗生物質を、サルにおいてショック誘導を同期させるために用いた。バイトリル(Baytril)（バイトリル２．５％、バイエル(Bayer)社製、ドイツ）を、ゲンタマイシンの代わりに用いた。なぜなら、株が、後者の抗生物質に対しわずかしか感受性を有しないことを証明したからである。
個別の動物を、胸部に入れ墨された数字または文字の組み合わせで識別した。
【０２４９】
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【０２５０】
麻酔。全ての動物を、実験の前に夜通し空腹にした。実験の朝に、動物を、塩酸ケタミン（Tesink、オランダ）で鎮静させ、手術に運んだ。動物を、体温を支持するために温度制御された加熱パッド上に横にして配置した。直腸温を、Ｖｅｔ−ＯＸ５７００を用いて観察した。動物に、経口で挿管し、自由に呼吸可能にした。動物を、E.coli注入期間中およびE.coli投与に続く７時間の観察期間中、Ｏ２／Ｎ２Ｏイソフルレン吸入麻酔によって麻酔維持し、その後気管内管を除去し、動物を、安楽死させるか、または麻酔から回復可能にした。大腿静脈および橈側皮静脈を、カニューレ挿入し、等張生理食塩水注入、生E.coli注入および抗生物質投与のために用いた。不感流体損失を、３．３ｍＬ／ｋｇ／時の割合で、２．５％グルコース（フレゼニウス(Fresenius)社製、セントヘンボス('s-Hertogenbosch)、オランダ）を含有する等張生理食塩水を注入することによって補償した。
【０２５１】
準備行為。麻酔期間中、動物の血圧（自動カフ）、心拍および体温を測定するための機器を備えた。等張生理食塩水を、流体損失を補うために、３．３ｍＬ／ｋｇ／時で注入した。大腿部の血管に、E.coliおよび抗生物質の注入のためにカニューレを挿入した。温度制御された加熱パッドを、体温を支持するために用いた。サルを、E.coli投与の期間中および６時間のE.coli投与に続く期間中、連続して観察した。７時間後、２匹の動物（対照動物およびＮＭＰＦで処理されたもの）を、組織学レベルで化合物の異なる効果を比較するために犠牲にした。ＮＭＰＦで処理された３匹目の動物を、麻酔から回復可能にし、回復後、最初の１２時間集中的に観察し、続いて頻繁に毎日観察した。３匹目の動物を回復可能にする決定を、獣医の助言後に行った。
【０２５２】
敗血症ショックの誘導。E.coliの注入前に、心拍および血圧の１時間の注入前観察を実行した。３匹の動物全てに、致死量１０×１０９ＣＦＵ／ｋｇ体重でE.coli０８６（ｋ６１血清型、ATCC33985）の．ｖ．注入を受けさせた。１９９１年に実行されたこのバッチによる用量漸増研究において、この細菌投与量は、注入開始後８時間以内に致命的なショックを誘導した。注入期間は２時間であった。
【０２５３】
抗生物質。バイトリルを、２時間のE.coli注入（ｉ．ｖ．、投与量９ｍｇ／ｋｇ）の終了後直ちに静脈内投与した。
【０２５４】
ＮＭＰＦによる処理。３０分のE.coli注入開始後、動物に、ＮＭＰＦオリゴペプチド混合物の単一の静脈内ボーラス注射を投与した。このオリゴペプチド混合物は、次のＮＭＰＦペプチドを含有した。ＬＱＧＶ（５ｍｇ／ｋｇ）、ＡＱＧＶ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＶＬＰＡＬＰ（５ｍｇ／ｋｇ）。これらのＮＭＰＦペプチドを、注射のために、０．９％塩化ナトリウム中に溶解した（Ｎ．Ｐ．Ｂ．Ｉ．、Emmer Compascuum、オランダ）。
【０２５５】
結果
サルの予備試験の結果
オリゴペプチド混合物で処理されたサルにおける敗血症の試験化合物の抗ショック効果、すなわち、霊長類モデルの前半７時間の軌跡における敗血症効果の阻害を観察した。これらのペプチドによる免疫調節効果を、in vitro/ex vivoで、Ｔ細胞アッセイにおける、病原性Ｔｈ１免疫応答の阻害、炎症サイトカイン（ＭＩＦ）の抑制、抗炎症サイトカイン（ＩＬ−１０，ＴＧＦ−ベータ）の産生増加、および樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の免疫調節効果などを観察した。
【０２５６】
次の器官を計量し、細菌計数を実行した。
腎臓
肝臓
肺
リンパ節
肉眼的障害
全ての器官の組織を、中性のリン酸塩水溶液で緩衝化した４％ホルムアルデヒド溶液中で保存した。リンパ器官を、低温保存した。全ての組織は、組織病理学検査のために処理される。
【０２５７】
３匹のサルの実験で得られたさらなる結果
サル４２９（対照）。メスのサル（５．６６ｋｇ）は、E.coli０８６（１０Ｅ１０ＣＦＵ／ｋｇ）のｉ．ｖ．注入を受けた。１９９１年に実行されたこのバッチによる用量漸増研究において、この細菌投与量は、注入開始後８時間以内に致命的なショックを誘導した。注入期間は２時間であった。バイトリルを、２時間のE.coli注入（．ｖ．、投与量９ｍｇ／ｋｇ）の完了後直ちに静脈内に投与した。E.coli注入後、サルは、ＮＭＰＦ処理を受けたサルであることを知ることなく公認獣医によって観察された。臨床観察は以下のとおりであった。嘔吐、検地不能な脈拍、心不整脈、ＥＣＧの異常（心室拡張／心代償不全（長期のＱＲＳ群、超過心臓収縮））、血液凝固低下、および強制呼吸。さらに、心拍数の大きな変動（３０〜１５０拍／分）、収縮期および拡張期血圧両方の破綻（３５／２０ｍｍＨｇ）、および血中酸素濃度の低下（８０〜７０％）が、存在した。E.coli注入開始から７時間後、サルは、血液および糞を嘔吐するとともに、発作を開始した。最後の検査の後、獣医は、このサルを目覚めさせる許可を与えなかった。この時点において、対照サルを、安楽死させた。その後、解剖検査を実行し、臓器をin situで検査した。多量の内出血が、病理学者によって発見された。
【０２５８】
サル４５９（ＮＭＰＦ）。メスのサル（５．４４ｋｇ）に、E.coli０８６（１０Ｅ１０ＣＦＵ／ｋｇ）の．ｖ．注入を受けさせた。１９９１年に実行されたこのバッチによる用量漸増研究において、この細菌投与量は、注入開始後８時間以内に致命的なショックを誘導した。注入期間は２時間であった。E.coli注入の開始から３０分後、ＮＭＰＦを、単一のボーラス注射でｉ．ｖ．注射した。バイトリルを、２時間のE.coli注入（．v．、投与量９ｍｇ／ｋｇ）の完了後直ちに静脈内に投与した。E.coli注射の後、このサルはまた、ＮＭＰＦ処理を受けたサルであることを知ることなく公認獣医によって観察された。臨床観察は次のとおりであった。通常脈拍、心音通常、通常ＥＣＧ、高心拍数しかし安定的（１８９拍／分）、非低血圧（７５／３０ｍｍＨｇ）、通常の血中酸素濃度（９５〜８５％）、肺音通常、通常のトルゴール。E.coli注入の開始から７時間後、サルの臨床状態は安定していた。最終検査の後、獣医は、安定的な状態を原因として、このサルを目覚めさせる許可を与えた。しかしながら、対照と、ＮＭＰＦで処理されたサルとで血液学および免疫学パラメータを比較可能にするために、この時点において、ＮＭＰＦ処理されたサル４５９を、安楽死させた。その後、解剖検査を実行し、臓器をin situで検査した。マクロな内出血は、病理学者によって発見されなかった。
【０２５９】
サル４２７（ＮＭＰＦ）。メスのサル（４．８４ｋｇ）に、E.coli０８６（１０Ｅ１０ＣＦＵ／ｋｇ）の．ｖ．注射した。１９９１年に実行されたこのバッチによる用量漸増研究において、この細菌投与量は、注入開始後８時間以内に致命的なショックを誘導した。注入期間は２時間であった。E.coli注入の開始から３０分後、ＮＭＰＦをｉ．ｖ．注射した。バイトリルを、２時間のE.coli注入（．ｖ．、投与量９ｍｇ／ｋｇ）の完了後直ちに、静脈内に投与した。E.coli注射後、このサルはまた、ＮＭＰＦ処理を受けたサルであることを知ることなく公認獣医によって観察された。臨床観察は以下のとおりであった。通常の脈拍、心音通常、通常のＥＣＧ、中程度に高い心拍数しかし安定的（１６０拍／分）、非低血圧（７０／３０ｍｍＨｇ）、通常の血中酸素濃度（９５〜９０％）、肺音通常、通常のトルゴール。E.coli注入の開始から７時間後、サルの臨床状態は安定していた。最終検査の後、獣医は、安定的な状態を原因として、このサルを目覚めさせる許可を与えた。サルは、素早く目覚め、機敏であり、水腫はゆっくり消失した。
【０２６０】
病理報告の要約叙述
病理報告の比較評価のために、明らかな研究に関連する変化を示すそれらの器官、および実験中の約７時間で安楽死または死亡した２匹のサル（４２９および４５９）が特別に強調された。
【０２６１】
肝臓は、好中球−顆粒球区分を有する、多巣性の、著しい（亜全以下の）小葉壊死領域によって示された動物４２９において、最も重い損傷を受けた。この動物は、多巣性急性肝細胞壊死、肝細胞の解離および類洞白血球増加症を示した。
【０２６２】
対照的に、動物４５９は、肝細胞の混濁腫脹が、肝細胞膜機能（すなわち、細胞膜、ならびに小胞体およびゴルジ装置のような亜細胞区画の膜）の損傷の存在を明白に示したけれども、４２９の前述の変化に比べて重要な肝細胞の損傷を示さなかった。しかしながら、エネルギ依存性膜の輸送作用における障害は、最終的に一時的な性質となるかもしれない。
【０２６３】
上述の動物アカゲザル４５９の肝臓組織の病理形態学的特徴の要約は、相対的に、最小の変化を示した。
【０２６４】
胃の粘膜は、動物４２９において、著しい急性広汎性出血を示し、この変質は、内毒素血症に関連すると考えられる。さらに、動物４２９は、子宮周囲の腹腔において急性出血を有した。類似の所見は動物４５９で存在しなかった。
【０２６５】
類似の所見はその他の動物で見られなかった。
副腎の比較評価は、３匹の動物の間で著しい相違を示さなかった。両動物の副腎は、多発性を示し、皮質の好中球−顆粒球浸透が広がっていた。
【０２６６】
要約叙述：組織損傷は、動物４２９で最も重く判断される一方、動物４５９は、量的に、かつ質的に、相対的にわずかだけ組織変質を示す。
【０２６７】
ゲノム実験
ＡＮＮＥＭＩＥＫ
ＰＭ１Ｔ細胞系を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(マナッサス、ＶＡ)から得、５％ＣＯ２において３７℃で培養した。これらの細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬグルタミン、ならびに抗生物質ペニシリンおよびストレプトマイシン中で維持かつ培養した。ゲノム実験のために、細胞（２×１０６／ｍＬ）を、６ウェルプレート中で、２ｍＬの体積で、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ、１０  ｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍＬ）またはＰＨＡ、ＩＬ−２およびペプチドＬＱＧＶ（１０ｍｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。培養の４時間後、１０×１０６細胞を、洗浄し、ジーンチップ(genechip)プローブアレイ実験のために調製した。ジーンチップ発現解析を、製造者の使用説明書（Expression Analysis, Technical Manual, Affymetrix Genechip）に従って実行した。以下の主要なステップは、ジーンチップ発現解析の概要を説明する。１）目標物の調製、２）目標物のハイブリダイゼーション、３）実験およびfluidics stationの設定、４）プローブアレイ洗浄および染色、５）プローブアレイスキャン、および６）データ解析。
【０２６８】
結果
ゲノム実験
ジーンチップ発現解析は、ＰＨＡ／ＩＬ−２の存在下での４時間のＰＭ１（Ｔ細胞系）細胞のＬＱＧＶ処理が原因となって、少なくとも１２０の遺伝子を、（ＰＨＡ／ＩＬ−２によって刺激された）対照ＰＭ１細胞のみと比較して２倍以上ダウンレギュレーションしたことを明らかにした。
【０２６９】
さらに、少なくとも６の遺伝子は、対照細胞と比較して、ペプチドで処理された細胞において、２倍以上アップレギュレーションされた。
【０２７０】
ゲノム実験におけるＬＱＧＶによる処理を原因とするダウンレギュレーション遺伝子の同定。遺伝子の変化倍率(-Fold Change)および受託番号または説明が与えられる。
【０２７１】
2005519867.tif 000012
【０２７２】
2005519867.tif 000013
【０２７３】
ＬＱＧＶ処理を原因とするアップレギュレーション遺伝子の同定。変化倍率および受託番号または遺伝子の説明が表される。
【０２７４】
2005519867.tif 000014
【０２７５】
さらなる使用例
異なる疾患病原に関与する異なるレセプター−細胞内シグナル経路の例であり、ここにおいて本発明に従ったシグナル分子がこれらの用途を見出す。
【０２７６】
異なるＴｏｌｌ様レセプターを介する抗原提示細胞（ＤＣ、マクロファージ、単球など）のＬＰＳ刺激は、ＭＡＰＫ経路、ＥＲＫ，ＪＮＫおよびｐ３８経路を含む異なるシグナル経路を活性化する。これらの経路は、Ｅ１ｋ−１、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、ＡＴＦ−１、ＡＴＦ−２、ＳＲＦ、およびＣＲＥＢを含む様々な転写因子を、直接的に、または間接的に、リン酸化かつ活性化する。さらに、ＬＰＳは、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、およびＴＲＡＦ６のＩＫＫ経路を活性化する。ＴＡＫＩ−ＴＡＢ２およびＭＥＫＫ１−ＥＣＳＩＴの複合体は、ＩＫＫｂをリン酸化させ、そのかわりにＩＫＫｂは、ＩｋＢｓをリン酸化させる。続いて起こるＩｋＢｓの分解は、ＮＦｋＢ／Ｒｅｌ複合体、たとえばｐ５０／ｐ６５の核転座を可能にする。さらに、Ｐ１３ｋ−Ａｋｔ経路は、未知のキナーゼを介してＰ６５をリン酸化かつ活性化する。これらの経路のうちいくつかは、ホルモン／成長因子レセプターチロシンキナーゼ（ＰＫＣ／Ｒａｓ／ＩＲＳ経路）およびサイトカインレセプター（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路）のようなその他のレセプターシグナル分子によって調節されることもできる。Ｔ細胞系によるゲノム実験において、これらの遺伝子のいくつかは、用いられるペプチド（ＩＱＧＶ）によってダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされるようであった。Ｔ細胞中のその他のペプチドならびにその他の細胞型の同じペプチドおよびその他のペプチドが、これらの転写因子およびシグナル分子のいくつかを、同様にダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションすることは現在明らかである。ＤＣおよび受精卵実験において、ＮＭＰＦは成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ，ＶＥＧＦ）およびＬＰＳシグナルを調節する能力を有した。ＮＦ−ｋＢおよび関連転写因子の調節障害に関連するいくつかの疾患は、アテローム性動脈硬化症、喘息、関節炎、炭疽病、悪液質、癌、糖尿病、甲状腺異常症候群、エイズ、炎症性腸疾患、発作、（敗血症）敗血症ショック、炎症、神経障害疾患、自己免疫、血栓症、心血管疾患、心理的疾患、術後機能低下、創傷治癒、熱創傷治癒、および神経変性疾患である。
【０２７７】
ＰＫＣは、Ｖａｖ／Ｒａｃ経路を介してＴ細胞シナプスに選択的に転座する、たとえばＡＰ−１およびＮＦ−ｋＢの刺激を介したＴ細胞活性における不可欠な役割を果たす。ＰＫＣは、内服薬の標準テキストブックから明らかな様々な免疫学的または非免疫学的な疾患（たとえば、代謝病、癌、脈管形成、免疫仲介疾患、糖尿病など）に関与する。
【０２７８】
ＬＰＳおよびセラミドは、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、Ｆｃ−ｇＲIII、ＣＤ３６、ＴＡＰＡ、ＤＡＦおよびＴＬＲ４を含む異なる多重結合レセプター複合体を誘導する。このシグナル形質導入経路は、高コレステロール血症および脂質性疾患における単球の変化した機能を明らかにする。
【０２７９】
酸化低密度リポタンパク質は、アテローム発生過程の段階に寄与し、酸化低密度リポタンパク質の特定の濃度が、シグナル伝達経路を通してマクロファージのアポトーシスを誘導する。これらの経路は、アテローム性動脈硬化症、血栓症などの様々な血管性疾患に関与する。
【０２８０】
細菌のＤＮＡは、先天性免疫系の細胞によって認識される。この認識は、エンドソームの成熟を必要とし、ＮＦ−ｋＢおよびＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こす。近年、シグナルがＴｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）およびシグナルアダプタータンパク質ＭｙＤ８８を必要とすることが示された。ウイルス感染期間中のｄｓＲＮＡの認識は、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼＰＫＲによる細胞内認識に依存するようである。ＴＬＲは、免疫系において不可欠な役割を果たし、これらは、先天性免疫および適応的免疫の調整および調和に重要である。これらのレセプターまたはこれらの下流シグナル経路の調節は、感染、癌、免疫仲介疾患、自己免疫、免疫学的成分による特定の代謝病、血管性疾患、炎症性疾患などの様々な免疫学的状態の治療に重要である。
【０２８１】
、ＮＦ−ｋＢとリウマチ滑膜細胞における炎症性サイトカイン発現とにおよぼす成長因子ＰＤＧＦ−ＡＡの効果：ＰＤＧＦ−ＡＡは、ＮＦ−ｋＢ活性およびＩＬ−１ｂ、ＩＬ−８およびＭＩＰ−１ａのｍＲＮＡ発現を増大させた。したがって、ＰＤＧＦ−ＡＡは、炎症の進行、およびＲＡにおける滑膜細胞の増殖に、重要な役割を果たし得る。
【０２８２】
樹状細胞（ＤＣ）活性化は、免疫応答の誘導に関する重要な事象である。ＬＰＳによって誘導されるＤＣ活性化は、２つの区別可能な過程に分離され得る。第１は、ＭＨＣおよび共刺激分子のアップレギュレーションを引き起こす成熟であり、第２は、成長因子（生存）の投与中止直後のアポトーシスからの救出である。ＬＰＳは、ＮＦ−ｋＢ転写因子を誘導する。ＮＦ−ｋＢ活性化の阻害は、ＭＨＣおよび共刺激分子のアップレギュレーションの期間中、ＤＣの成熟を阻止した。さらに、ＬＰＳは、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化させ、ＭＥＫ１、すなわちＥＲＫを活性化するキナーゼの特定の阻害は、アポトーシスを防止するＬＰＳの能力を取り消すが、ＤＣ成熟またはＮＦ−ｋＢ核転座を阻害しない。これは、ＥＲＫおよびＮＦ−ｋＢが、ＬＰＳで誘導されたＤＣ活性化の異なる様相を調節することを示す。我々のＤＣデータおよびＮＦ−ｋＢデータはまた、ＬＰＳの存在下、または不存在下で、ＤＣ成熟および増殖に対するＮＭＰＦペプチドの様々な効果を示す。ＮＭＰＦペプチドは、これらの経路を調節するとともに、ＤＣ機能の調節および免疫調節のための新規なツールである。これは、免疫性疾患、特に、免疫系が不均衡な（ＤＣ１−ＤＣ２、Ｔｈ１−Ｔｈ２、調節細胞など）疾患の治療に関する新しい方法を開く。
【０２８３】
ＤＣは、腫瘍成長阻害を生じさせ得るＮＫ細胞活性を仲介する。ＤＣ細胞およびその他の抗原提示細胞（マクロファージ、Ｂ細胞など）は、免疫系において不可欠な役割を果たし、これらはまた、先天性免疫および適応的免疫の調整および調和に重要である。これらの細胞またはこれらの下流シグナル経路の調節は、感染症、癌、免疫仲介疾患、自己免疫、免疫学的成分による特定の代謝病、血管性疾患、炎症性疾患などの様々な免疫学的状況の治療に重要である。マスト細胞が、マスト細胞のＴＬＲによる病原菌の認識後の、炎症性サイトカインの放出および好中球の漸増による先天性免疫の作用に重要な役割を果たす。
【０２８４】
結核菌(Mycobacterium tuberculosis)に感染したネズミマクロファージにおいて、ＪＡＫ経路を介してＳＴＡＴ１が活性化され、ＳＴＡＴ１の活性化は、ＩＦＮ−ｇ−誘導ＭＨＣクラスII阻害に関与する主要な転写因子となり得る。
【０２８５】
ＴＬＲを介するマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の認識は、感染に応答して、多重免疫機構に影響を与え、先天性免疫に関与する。先天性免疫と適応免疫との調和は、調和された免疫系のために極めて重要であり、免疫系の調節障害は、炎症性疾患、自己免疫、感染性疾患、妊娠関連疾患（流産および子癇前症など）、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、およびその他の代謝病などの異なる領域の疾患を引き起こす。
【０２８６】
核因子カッパＢ（ＮＦカッパＢ）は、心筋虚血再灌流障害に関与する多重遺伝子の転写のために極めて重要である。臨床的および実験的研究は、心筋虚血再灌流障害が、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、腸虚血、出血性ショック肺障害および脳梗塞などにおいて、古典的な経路および代替的な経路の両方によるＴＬＲおよび補体系の活性化を生じさせることを示した。
【０２８７】
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）は、脂質およびリポタンパク質代謝、グルコースホメオスタシス、影響細胞増殖、分化およびアポトーシスの調節因子、ならびに炎症性反応のレギュレーターとして機能するリガンド活性化転写因子である。ＰＰＡＲアルファは、肝臓、筋肉、腎臓および心臓において相当発現し、そこで脂肪酸のベータ酸化分解を刺激する。ＰＰＡＲガンマは、主に腸および脂肪組織において発現し、そこにおいて含脂肪細胞分化の引き金となり、脂質蓄積を促進する。近年、ＰＰＡＲアルファおよびＰＰＡＲガンマの発現はまた、単球／マクロファージ、内皮細胞、および平滑筋細胞などの血管壁の細胞中でも報告された。脂質低下薬フィブラート(fibrate)および抗糖尿病薬グリタゾン(glitazone)は、それぞれ、ＰＰＡＲアルファおよびＰＰＡＲガンマの合成リガンドである。さらに、脂肪酸誘導体およびエイコサノイドは、天然のＰＰＡＲリガンドであり、ＰＰＡＲアルファは、ロイコトリエンＢ４によって活性化され、その一方でプロスタグランジンＪ２は、ＰＰＡＲガンマリガンドであって、９−および１３−ＨＯＤＥなどの酸化ＬＤＬのいくつかの成分でもある。これらの観察は、代謝のみならず、炎症制御、および結果として、アテローム性動脈硬化症などの関連疾患におけるＰＰＡＲの潜在的な役割を示唆した。つい最近、ＰＰＡＲ活性化物質は、血管壁細胞におけるＮＦ−カッパＢ、ＳＴＡＴ、およびＡＰ−１シグナル経路に消極的に干渉することによって、炎症性応答遺伝子（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦアルファおよびメタロプロテアーゼなど）の活性化を阻害することを示した。さらに、ＰＰＡＲはまた、アテローム斑の細胞中の脂質代謝を制御することができる。ＰＰＡＲはまた、内服薬の標準テキストブックから明らかな様々な免疫学的および非免疫学的疾患（代謝病、癌、血管新生、免疫仲介疾患、糖尿病など）に関与する。
【０２８８】
前述のように、核レセプターＰＰＡＲｇは、脂質生成、脂質蓄積に重要であり、アテローム性動脈硬化症に関与する。脂肪組織において発現する一方、このレセプターはまた、マクロファージおよび大腸においても発現する、さらに、ＰＰＡＲｇは、癌および炎症などの多数の過程で関係する。さらに、ＴＬＲによって代表される、同族レセプターを介する微生物は、ＰＰＡＲｇ依存性代謝機能を調節する能力を所有し、それ自体は、消化管における微生物叢と代謝制御との間の複雑な相互作用を表す。
【０２８９】
シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）、すなわちプロスタグランジンＨシンターゼの誘導イソ型は、炎症の間にプロスタグタンジン合成を仲介するとともに、大腸腫瘍に選択的に過発現するが、大腸発癌に重要な役割を果たすと考えられる。炎症性サイトカインまたは低酸素誘導された酸化ストレスによるＣＯＸ２の誘導は、核因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）によって仲介され得る。したがって、ＮＦ−ｋＢの阻害は、ＣＯＸ経路を調節し、ＮＦ−ｋＢのこの阻害は、ＣＯＸが関与する疾患、たとえば、炎症、痛み、癌（特に結腸直腸癌）、炎症性腸疾患およびその他の疾患において治療上有用となり得る。
【０２９０】
通常の脳におけるニューロンのサブセットは、構成上、機能的に有能なＣ５ａレセプターを発現する。Ｃ５ａレセプターの機能的役割は、Ｃ５ａが、タンパク質キナーゼＣの迅速な活性化、ならびにＮＦ−カッパＢ転写因子の活性化および核転座の引き金になることを明らかにした。さらに、Ｃ５ａは、Ｃ５ａＲについて新規な作用である、未分化のヒト神経芽細胞腫細胞(neuroblastoma cells)の分裂促進因子となることが発見された。これに反して、Ｃ５ａは、アミロイドＡベータペプチドによって仲介された毒性から、末期的に分化されたヒト神経芽細胞腫細胞を保護する。これは、通常の海馬ニューロンならびに未分化および分化ヒト神経芽細胞腫細胞が機能的なＣ５ａレセプターを発現することを示す。これらの結果は、通常のニューロン発達、ニューロンホメオスタシス、アルツハイマー病などの神経性炎症状態において、ニューロンＣ５ａＲレセプターの役割を示す。
【０２９１】
補体系の活性化は、アテローム性動脈硬化症の病原において重要な役割を果たす。炎症性サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−６は、この疾患の進行に潜在的に関与する。ここで、補体系は、酸化ストレスの発症およびレドックス感受性転写因子ＮＦ−ｋＢおよびＡＰ−１の活性化に関与するＧｉ依存的な経路によってヒト血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）からのＩＬ−６放出を誘導する。補体系の調節は、血液疾患、感染症、いくつかの代謝病（糖尿病）、血管性疾患、移植拒絶および関連疾患、自己免疫疾患、ならびにその他の免疫学的疾患など、広い範囲の疾患に重要である。
【０２９２】
ＮＦ−ｋＢのような異なる転写因子と、異なるキナーゼなどの細胞内シグナル分子はまた、複数の薬剤耐性に関与する。したがって、ＮＭＰＦペプチドが複数の薬剤耐性に対して効果的であると信じることは正当である。さらに、我々のゲノムデータは、腫瘍形成および転移に関与する多数の遺伝子およびシグナル分子が調節されることを示す、さらに、オリゴペプチドがまた血管新生に有効であるので、したがってこれらのペプチドはまた、血管新生が調節を必要とする癌および関連疾患の治療に用いられ得るであろう。
【０２９３】
増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）は、後天性の失明の主要な要因の一つである。ＰＤＲの顕著な特徴は、新血管形成（ＮＶ）であって、異常な新脈管形成は、重度の硝子体腔出血および／または網膜剥離を最後に引き起こす。ＮＭＰＦペプチドは新脈管形成の刺激および阻害効果を有するとともに、成長因子（インスリンなど）に関与する細胞内シグナルを調節する能力を有するので、特定のＮＭＰＦペプチドによる薬理療法は、代謝制御（グルコースなど）を向上させ、または高血糖症の生化学的帰結を鈍らせることができる（たとえばアルドーズ・レダクターゼ、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＰＡＲが関与する機構を通して）。この代謝制御、または糖尿病（２型）に関して、ＮＭＰＦ（ＬＱＧＶ，ＶＬＰＡＬＰ，ＶＬＰＡＬＰＱ，ＧＶＬＰＡＬＰＱ，ＡＱＧ，ＬＡＧ，ＬＱＡ，ＡＱＧＶ，ＶＡＰＡＬＰ，ＶＡＰＡＬＰＱ，ＶＬＰＡＬＰＡ，ＬＰＧＣ，ＭＴＲ，ＭＴＲＶ，ＬＱＧ，ＣＲＧＶＮＰＶＶＳ）が推奨される。ＰＤＲにおける新脈管形成はまた、前述のオリゴペプチドによっても治療可能である。
【０２９４】
敗血性関節炎実験
マウス。ＮＭＲ１マウスを、本実験に用いた。１つの処理グループあたり１０匹のマウスを、本実験に用いた。
【０２９５】
細菌および接種。S.aureusＬＳ−１を、自然発生関節炎ＮＺＢ／Ｗマウスの腫れた関節から最初に単離した。ブドウ球菌株の特性の１つは、多量のＴＳＳＴ−１、すなわち超抗原特性を有する外毒素を産生することである。細菌を、２４時間血液寒天で培養し、その後、さらに２４時間血液寒天で再インキュベーションした。これらを、使用するまで、５％ウシ血清アルブミンおよび１０％のジメチルスルホキシド（Ｃ２Ｈ６ＯＳ）を含有するＰＢＳ（０．１３Ｍの塩酸ナトリウム，１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）において−２０℃で凍結維持した。使用に先立って、細菌溶液を、解凍し、ＰＢＳ中で洗浄し、所望の細菌濃度を達成するようにＰＢＳ中に希釈した。マウスに、尾の静脈のいずれかに細菌を接種した（２００ｍＬ）。生存数を、残りの細菌溶液から計数し、連続希釈し、その後、注射された細菌数を確認するために、血液寒天プレートで培養した。細菌の．ｖ．注射の後、１つのグループのマウスに、ＰＢＳを、２週間、１週あたり３回、ｉ．ｐ．処理し、その他のグループのマウスに、ＮＭＰＦ−６（１００μｇ）を、２週間、１週あたり３回、ｉ．ｐ．処理した。追加の期間の１３日間中に、関節炎の重症度、死亡率、および体重減少を測定した。
【０２９６】
関節炎の臨床評価。全てのマウスを、個別に追跡検査した。関節、すなわち、指／つま先、および手首／足首を、定期的な間隔、すなわち、少なくとも隔日または２日おきに、視覚的に検査した。関節炎を、目に見える関節の紅斑および／または少なくとも１つの関節の腫れと定義した。関節炎の強度を評価するために、臨床スコーリング（関節炎指数）を、微視的検査は、各肢０〜４ポイントのスコアを生じさせるシステム（０、腫れ、紅斑のいずれもなし、１、軽い腫れおよび／または紅斑、２、中程度の腫れおよび紅斑、３、際立った腫れおよび紅斑、４、最大の腫れおよび紅斑（瀕死のマウス））を用いて実行した。さらに、関節炎頻度および重さを測定した。
【０２９７】
結果
体重減少。体重減少の点で２つのグループの間で相違は発見されなかった（図６６）。
【０２９８】
生存率。１０日目まで、生存率に関して主要な相違は観察されなかった（ＰＢＳ処理グループ：７０％，ＮＭＰＦ処理グループ：８０％）。本研究の終わりに、ＰＢＳで処理されたマウスは、４０％の生存率を有し、ＮＭＰＦで処置されたマウスは、８０％の生存率を有した（図６７）。
【０２９９】
関節炎の重症度。グループ間での関節炎の重症度において明確な相違を測定した。相違は、早期から視認することができ、時間が経るにつれて増大した。１０日目、ＰＢＳで処置されたマウスの関節炎指数は２．４であり、ＮＭＰＦで処置されたマウスにおいては１．０であった。１３日目、ＰＢＳで処置されたマウスの関節炎指数は、３．８であり、ＮＭＰＦで処置されたマウスにおいては、０．９であった（図６８）。
【０３００】
関節炎マウスの頻度。０〜６日目の関節炎頻度の相違は、マウスの２つのグループ間で観察されなかった。その後、ＰＢＳで処置されたグループの関節炎頻度は上昇し続けたが（１３日目１００％）、ＮＭＰＦで処置されたグループについては減少した（１３日目５０％）（図６９）。
【０３０１】
結論として、これらの結果は、ＮＭＰＦ−６（ＶＬＰＡＬＰ）処置が、マウスの関節炎の発症を防止すること、さらに、関節炎の重症度を大いに減少させることを示す。
【０３０２】
破骨細胞発生評価
骨吸収と骨形成との間の精巧な調和が、骨の強度および完全性の維持において重要であり、ここで骨吸収破骨細胞および骨形成骨芽細胞が、その中心的な役割を果たす。つまり、骨再生と称されるこの生理的過程は、厳格に調節されなければならず、破骨細胞に優勢となるように調和が傾くことは、自己免疫性関節炎、歯周炎、（閉経後）骨粗鬆症、パジェット病および骨腫瘍などの病理状態で観察される破骨の原因となる。
【０３０３】
破骨細胞分化の調節は、自己免疫性関節炎および骨粗鬆症などの骨疾患の病原理解および治療に重要な様相である。破骨細胞発生に不可欠な腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の一員であるＲＡＮＫＬ（ＮＦ−カッパＢリガンドのレセプター活性物質）による過度のシグナルは、このような病理状態に寄与すると考えられる。マトリクス劣化および過度の骨損失を原因とする関節破壊は、骨溶解、骨関節炎、およびリウマチ様関節炎などの炎症性骨疾患を特徴付ける。炎症部位における炎症性細胞およびこれらの分泌物の蓄積は、破骨細胞およびこれらの前駆細胞を引き付け、骨成分のさらなる劣化を生じさせる。腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびＲＡＮＫＬ（ＯＰＧＬおよびＯＤＦとしても知られている。）は、炎症部位において豊富であり、破骨細胞の漸増、分化および活性化を促進させることで知られる。破骨細胞分化自体は、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ経路の活性化を必要とする。
【０３０４】
破骨細胞（ＯＣ）形成におけるＲＡＮＫＬおよびＴＮＦアルファの役割は、明確に確立された。ＮＭＰＦの破骨細胞形成の効果を測定するために、我々は、多核破骨細胞の分化のためのモデル系として、骨髄（ＢＭ）細胞およびＲＡＷ２６４．７マウス単球を用いた。
【０３０５】
ＯＣ産生および特徴付け。ＯＣを、ＮＭＰＦ（１０μｇ／ｍＬ）とともに、またはＮＭＰＦなしに、７日間、組み換え水溶性ＲＡＮＫＬ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）でＢＭ細胞を培養することによって産生した。ＯＣをまた、Ｍ−ＣＳＦなしに、またはＴＮＦアルファとともに、ＲＡＮＫＬ（２０ｎｇ／ｍＬ）でＲＡＷ２６４．７細胞を培養することによって産生し、ＮＭＰＦで処理した。両培養システムは、多量のＴＲＡＰ＋多核細胞を産生し、これらは、典型的なＯＣ産生物質を発現した。破骨細胞形成を、細胞化学染色を用いて、多核ＴＲＡＰ陽性細胞（３原子核より多い）の存在量を計ることによって、測定した。
【０３０６】
結果。予想通り、我々は、細胞を、ＮＦ−カッパＢ活性を阻害する能力を有するこれらのペプチドと共インキュベーションしたとき、リガンド（ＲＡＮＫＬ、ＭＣＳ−Ｆ、ＴＮＦアルファ）によって誘導される破骨細胞産生の顕著な阻害を観察した。破骨細胞形成を阻害するペプチドのこのセットの能力は、リガンドを受けたのみの対照細胞と比較して多核ＴＲＡＰ陽性細胞の数が減少したことによって証明されるように、ＢＭにおいてのみならず、ＲＡＷ２６４．７のモデル系においても観察された。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
図１〜２。処置されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の骨髄（ＢＭ）細胞収率。ＢＭ細胞を処置されたマウスから単離し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、９日間インビトロで培養した。これらの図は、ＰＢＳ、ＬＰＳ、または、ＮＭＰＦペプチド４,４６,７および６０と組合わせてＬＰＳで処置されたマウスから単離されたＢＭ細胞を９日間培養した後の細胞収率を示している。これらの図において、細胞収率は、ＰＢＳと比較した細胞の相対百分率で表されている。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差は有意とみなされ、ラインの棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３０８】
図３。ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＭＨＣ−ＩＩ発現へのインビボ処置の影響。ＢＭ細胞を処置されたマウスから単離し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、９日間インビトロで培養した。これらの図は、ＰＢＳ、ＬＰＳ、または、ＮＭＰＦと組合わせたＬＰＳから単離されたＢＭ細胞を９日間培養した後の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表されたＭＨＣ−ＩＩ発現を示している。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差が有意とみなされ、ラインの棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３０９】
図４〜７。インビトロ処置されたＢＭ培養物の骨髄（ＢＭ）細胞収率。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）からのＢＭ細胞をインビトロで培養し、ＰＢＳ、ＬＰＳ（ｔ＝６日）、ＮＭＰＦ４,７,４６,６０（ｔ＝０またはｔ＝６日）またはＮＭＰＦのＬＰＳとの組合わせ（ｔ＝６日）のいずれかで、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、９日間処置した。これらの図は、ＢＭ細胞を９日間培養した後の、ＰＢＳと比較した細胞の相対百分率で表された細胞収率を示している。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差は有意とみなされ、ラインの棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表し、ドットの棒グラフはＰＢＳ群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３１０】
図８〜１１。ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＭＨＣ−ＩＩ発現へのインビトロ処置の影響。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）からのＢＭ細胞をインビトロで培養し、ＰＢＳ、ＬＰＳ（ｔ＝６日）、ＮＭＰＦ４,７,４６,６０（ｔ＝０またはｔ＝６日）またはＮＭＰＦのＬＰＳとの組合わせ（ｔ＝６日）のいずれかで、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、９日間処置した。これらの図は、ＢＭ細胞を９日間培養した後のＣＤ１１ｃ陽性細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表されたＭＨＣ−ＩＩ発現を示している。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差が有意とみなされ、ラインの棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表し、ドットの棒グラフはＰＢＳ群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３１１】
図１２〜１５。処置されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）の骨髄（ＢＭ）細胞収率。ＢＭ細胞を処置されたマウスから単離し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、９日間エックスビボで培養した。これらの図は、懸濁（非付着）およびペトリ皿付着（付着）ＢＭ細胞を９日間培養した後の細胞収率を示す。ＢＭ細胞をＰＢＳ、ＬＰＳ、または、種々のＮＭＰＦペプチドと組合わせたＬＰＳで処置されたマウスから単離した。これらの図において細胞収率は、ＰＢＳと比較した細胞の相対百分率で表されている。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差は有意とみなされ、棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３１２】
図１６〜１７。ＮＯＤマウスからのインビトロ処置されたＢＭ培養物の骨髄（ＢＭ）細胞収率。１５週齢雌のＮＯＤマウス（ｎ＝３）からのＢＭ細胞をインビトロで培養し、ｒｍＧＭ−ＣＳＦの存在下にて、ＰＢＳまたはＮＭＰＦで９日間処置した。これらの図は、懸濁（非付着）およびペトリ皿付着（付着）ＢＭ細胞を９日間培養した後の細胞収率を示す。これらの図において細胞収率は、ＰＢＳと比較した細胞の相対百分率で表されている。各条件は、６つのペトリ皿から成り、これらの図面に示された結果は、６皿のものを表している。≧２０％の差は有意とみなされ、棒グラフは、ＬＰＳ対照群と比較した有意なデータを表し、ドットの棒グラフはＰＢＳ群と比較した有意なデータを表している。代表的な実験が示されている。すべての実験条件に関連する結果が３つの追加実験において完全に再現された。
【０３１３】
図１８。マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）におけるＬＰＳ誘導ＮＯ産生（マイクロモル）に対するＮＭＰＦ−１，２，３，４，５，６，１０，１１および１３の影響。この図は、１０μｇ／ｍｌＮＭＰＦごとの、０．７８ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲のＬＰＳ濃度におけるＮＯ産生の有意の阻害を示す。
【０３１４】
図１９。ＪｕｒｋａｔＴ細胞を、ＮＭＰＦ４（ＬＱＧＶ），８７（ＶＧＱＬ），６（ＶＬＰＡＬＰ），および８８（ＰＬＡＰＬＶ）の存在下または不存在下において、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で処置した。３時間インキュベーションした後、核抽出物を調製し、各転写因子（ｐ６５，ｐ５０，ｃ−ＲＥＬ，ｃ−ＦＯＳ，ＣＲＥＢ１，ＡＴＦ２）について分析した。この図は、これらの転写因子に対するＮＭＰＦの影響を示している。
【０３１５】
図２０〜３２。ＮＭＰＦによる受胎したニワトリの卵のインビボ処置とＮＭＰＦの新脈管形成についての影響。受胎したニワトリ卵（０日）をＰＢＳ、ＮＭＰＦ、ＶＥＧＦ、またはＮＭＰＦと組合わせたＶＥＧＦのどれかで処置した。１０の卵に、各条件で注射を行った。インキュベーション８日で、胚を卵から除去し１００ｍｍペトリ皿に載置した。胚と血管を顕微鏡を使ってインビボで撮影した。各卵について概観写真を１枚撮り、血管の詳細写真を４枚撮った。新脈管形成（血管分枝）の定量化を血管分枝の数を数えて行った。この脈管形成の定量化は、血管厚みを計測して行った。血管分枝の数と血管厚みは写真において行われ、比較のために、１０ｍｍ２のラスタで相関させた。各条件（Ｎ＝１０）の分枝の平均数と血管の平均厚みを計算し、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ試験を使い、ＰＢＳまたはＶＥＧＦ対照のどちらかと比較した。線の棒グラフはＰＢＳ対照群と比較した有意（ｐ<０．０５）なデータを表し、ドットの棒グラフはＶＥＧＦ対照群と比較した有意（ｐ<０．０５）なデータを表す。図２０〜３０はＮＭＰＦの血管への影響を示している。図３１〜３２はＮＭＰＦの血管厚みへの影響を示している。
【０３１６】
図３３。ＥＭＳＡを介するＮＦ−カッパＢの検出。この図はＬＰＳ、またはＬＰＳと組合わせてＮＭＰＦで、４時間処置されたＲＡＷ２６４．７細胞の核抽出物におけるＮＦ−カッパＢの存在を示す。１〜１３の数字はＮＭＰＦおよびＬＰＳで処置された細胞からの核抽出物に対応する。ＣＴＬはＬＰＳのみで処置された細胞からの核抽出物に対応する。放射能によって標識されたＮＦ−カッパＢプローブの特異性は、ＣＴＬの核抽出物を含む、３種の濃度における（１ｘ，１０ｘ，１００ｘ）標識されていないオリゴヌクレオチド（ｕ１，ｕ２，ｕ３）と、標識されたオリゴヌクレオチドのみを含む（核抽出物なし）試料に対応するｏｌｇとの比較によって示している。記載：（ＮＭＰＦ-１）ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，（ＮＭＰＦ−２）ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ（ＮＭＰＦ−３）ＬＱＧ，（ＮＭＰＦ‐４）ＬＱＧＶ，（ＮＭＰＦ‐５）ＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ，（ＮＭＰＦ−６）ＶＬＰＡＬＰ，（ＮＭＰＦ−７）ＶＬＰＡＬＰＱ，（ＮＭＰＦ−８）ＧＶＬＰＡＬＰ，（ＮＭＰＦ−９）ＶＶＣ，（ＮＭＰＦ−１１）ＭＴＲＶ，（ＮＭＰＦ−１２）ＭＴＲ
【０３１７】
図３４。ＨＰＬＣクロマトグラフ（波長２０６）であるが、ＬＰＳ、およびＮＭＰＦ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞と組合わされたＬＰＳの核タンパク抽出物から得られたデータプロファイルがオーバーレイされている。
【０３１８】
図３５。ＮＭＰＦ−４ペプチドのＭＳｎ分析
図３６。ＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞の核抽出物からの画分のＭＳｎ分析。上部はその画分の全スペクトルを示し、下部は質量４１３．１３のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【０３１９】
図３７。ＮＭＰＦ−４刺激ＲＡＷ２６４．７細胞と組合わせたＬＰＳの核抽出物からの画分のＭＳｎ分析。上部はその画分の全スペクトルを示し、下部は質量４１６．０７のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【０３２０】
図３８〜４９。アカゲザルにおける敗血症性ショック症候群に対するＮＭＰＦの影響。７０分の時点にて、Ｅ．ｃｏｌｉを注入し、Ｅ．ｃｏｌｉ注入の終了時（１９０分の時点）に、抗生物質Ｂａｙｔｒｉｌを注射した。対照サル（サル４２９）を、１００分の時点で、０．９％ＮａＣｌで処置し、ＮＭＰＦ処置のサル（サル４５９および４２７）は、対照サルと同じ時点でＮＭＰＦ処置を受けた。実験中の各時点（分）における、対照サル４２９（図３８〜４１）、ＮＭＰＦ処置サル４５９（図４２〜４５）および４２７（図４６〜４９）の心拍数（拍数／分）、血圧（ｍｍＨｇ）心収縮期と心拡張期の血圧の差、および血中酸素濃度（飽和度（％））を示す。
【０３２１】
図５０。これらの図（部分Ａ〜Ｃ）は、異なるＮＭＰＦペプチド（１ｐｇ／ｍｌ）で共刺激された、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）刺激ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生を示す。
【０３２２】
図５１。これらの図（部分Ａ〜Ｃ）は、３つの異なる濃度の異なるＮＭＰＦペプチド（１ｐｇ／ｍｌ）で共刺激された、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）刺激ＲＡＷ２６４．７マクロファージのＮＯ産生を示す。
【０３２３】
図５２。この図は、種々のＮＭＰＦペプチドで２週間処置された糖尿病ＮＯＤマウスのパーセンテージを示す。
【０３２４】
図５３。この図は、ＮＭＰＦペプチド（Ａ）で処置されたＮＯＤマウスにおいて実施されたグルコース耐性試験（ＧＴＴ）（Ａ）、および絶食血中グルコースレベル（Ｂ）を示す。
【０３２５】
図５４および５５。処置されたＲＡＷ２６４．７細胞の核酸抽出物中に存するＮＦ−カッパＢの半定量的量。（Ａ）、ＮＦ−カッパＢのＬＰＳ誘導転位の阻害を示すＮＭＰＦペプチドは：ＮＭＰＦ-１（ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ），ＮＭＰＦ−２（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ），ＮＭＰＦ−３（ＬＱＧ），ＮＭＰＦ‐４（ＬＱＧＶ），ＮＭＰＦ‐５（ＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ），ＮＭＰＦ−６（ＶＬＰＡＬＰ），ＮＭＰＦ−９（ＶＶＣ），ＮＭＰＦ−１２（ＭＴＲ），ＮＭＰＦ−１４（環状ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）。ＮＦ−カッパＢのＬＰＳ誘導転位を促すＮＭＰＦペプチドは：ＮＭＰＦ−７（ＶＬＰＡＬＰＱ），ＮＭＰＦ−８（ＧＶＬＰＡＬＰ），およびＮＭＰＦ−１１（ＭＴＲＶ）。この図において、レーンＡは、標識されていないオリゴとの１倍比較を表し、レーンＢは標識されていないオリゴのみを表し、レーンＣは、１０倍非標識オリゴとの比較を表し、レーンＤは１００倍非標識オリゴとの比較を表す。比較のためには、ＬＰＳ処置細胞からの標識された抽出物を、標識されていないオリゴとともに使用した（レーン‘＋ＬＰＳ’参照）。核中のＮＦ−カッパＢ基礎レベルは、ＮＭＰＦ-１（ＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ），ＮＭＰＦ−２（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ），ＮＭＰＦ−３（ＬＱＧ）およびＮＭＰＦ‐４（ＬＱＧＶ）によって減少し、一方、核中のＮＦ−カッパＢ基礎レベルは、ＮＭＰＦ‐５（ＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ），ＮＭＰＦ−７（ＶＬＰＡＬＰＱ），ＮＭＰＦ−８（ＧＶＬＰＡＬＰ），ＮＭＰＦ−９（ＶＶＣ），ＮＭＰＦ−１１（ＭＴＲＶ），ＮＭＰＦ−１２（ＭＴＲ）およびＮＭＰＦ−１３（ＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱＶＶＣ）によって増加した（図５５）。
【０３２６】
図５６。処置されたＮＯＤマウスの脾臓ＤＣにおけるＮＦカッパＢ
ＮＯＤマウスをＰＢＳまたはＮＭＰＦのどちらかで処置した。その後、脾臓ＤＣを単離し、核ＮＦカッパＢｐ６５について分析した。ＮＭＰＦ−３，４，５，４＋５，４＋６，５＋６および４＋５＋６で処置したＮＯＤマウスはＮＦカッパＢｐ６５レベルは低下した。
【０３２７】
図５７。ＮＯＤおよびＣ５７ｂｌ６マウスにおける骨髄由来ＤＣのＮＦカッパＢ
インビトロで、ＮＯＤおよびＣ５７ＢＬ／６マウスからのＤＣにおけるＮＦカッパＢへのＮＭＰＦの影響をテストした。骨髄を単離し、ＧＭ−ＣＳＦの存在下にて培養しＢＭ誘導ＤＣを産生した。得られたＤＣをＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）およびＮＭＰＦ１，２，５または６で３０分刺激し、次いでＮＦカッパＢｐ６５活性を測定した。
５ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで刺激されたとき、Ｃ５７ＢＬ／６ＤＣは、未処置のＤＣと比較して、ＮＦカッパＢ活性化の増加を示さなかった。しかしながら、ＮＯＤ  ＤＣは、ＬＰＳで刺激した後、ＮＦカッパＢ活性化の２倍の増加を示した。ＮＦカッパＢへのＮＭＰＦの影響をＣ５７ＢＬ／６ＤＣにおいては検出することはできなかった。ＬＰＳによる刺激はＮＦカッパＢ活性化につながらなかったからである。しかしながら、ＮＯＤ  ＤＣ  ＮＭＰＦは（ＮＭＰＦ  １，２，５および６）ＬＰＳ誘導ＮＦカッパＢ活性化を阻害することができた（図５７）。これらの結果は、Ｃ５７ＢＬ／６ＤＣと比較して、ＮＯＤ  ＤＣにおけるＮＦカッパＢの超応答性を示し、ＮＭＰＦはＮＯＤ  ＤＣにおける超活性ＮＦカッパＢ活性化を阻害することを示す。
【０３２８】
図５８。この図（図５８Ａ）は、８日目で投与されたＮＭＰＦ１〜９の新脈管形成への影響を示す。ＮＭＰＦ１，２，３，５，６，７，８および９は、ＰＢＳ処置と比べて、新脈管形成について有意な阻害を示す。一方、ＮＭＰＦ−４は新脈管形成を有意に増加させる。この図は、８日目におけるＶＥＧＦ処置だけで新脈管形成を有意に増加させることも示している。図５８Ｂは、ＮＭＰＦ２，３，５，７，８および９による８日目におけるＶＥＧＦ誘導新脈管形成の有意な阻害を示す。さらに、ＶＥＧＦによる０日目におけるＮＭＰＦ１および６の処置は新脈管形成を有意に阻害する（データは示されていない）。
【０３２９】
図５９〜６５。これらの図は、Ｅ．ｃｏｌｉ注射８時間後に犠牲にされた処置されていないサル（４２９）、処置なしのサルと同時に犠牲にされたＮＭＰＦ処置サル（４５９）、および、生存していたが、Ｅ．ｃｏｌｉ処置３８時間後に死亡したＮＭＰＦ処置サル（４２７）のＴＮＦアルファ（図５９）、ＩＬ−１ベータ（図６０）、ＩＬ−８（図６１）、ＯＬ−６（図６２）、ＩＬ−５（図６３）、ＩＬ−１０（図６４）およびＩＦＮ−ガンマ（図６５）の血清レベルを示す。
血液試料は以下の時点で採取した：０，３０（Ｅ．ｃｏｌｉ注射），４５，６０（プラシーボまたはＮＭＰＦ処置），７５，９０，１０５，１２０，１３５，１５０（Ｂａｙｔｒｉｌ処置），１６５，１８０，１９５，２１０，２２５，２４０，２５５，２７０，３００，３３０，３６０，４２０，４５０，４８０，５１０，５４０，５７０，６００および６３０分。
【０３３０】
図６６〜６９。これらの図は、ＮＭＲ１マウスを用いた敗血関節炎実験の結果を示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＬＳ−１バクテリアを静脈注射した後、ある群のマウスには週に３回のＰＢＳ処置を２週間行ない、もう一方の群のマウスには週に３回のＮＭＰＦ−６（１００μｇ）処置を２週間行なった。各群のマウスは１０個体とする。続く１３日間、体重減少（図６６）、生存率（図６７）、関節炎の重症度（図６８）および関節炎頻度（図６９）について測定した。
【０３３１】
図７０は、ＰＭＢＣを刺激するＬＰＳやＰＨＡを調節し、本発明によってペプチド制御遺伝子を処置された遺伝子をリストアップしている。７０Ａ〜７０Ｅは細胞を刺激するＬＰＳに関し、７０Ｆ〜７０Ｊは細胞を刺激するＰＨＡに関する。７０Ａは、ペプチド処置はされておらずＬＰＳによってのみ刺激された細胞における制御実験を、７０ＢはＶＶＣ処置による影響、７０ＣはＭＴＲＶ処置による影響、７０ＤはＭＴＲ処置による影響、７０ＥはＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ処置による影響を示す。７０Ｆは、ペプチド処置はされておらずＬＰＳによってのみ刺激された細胞における制御実験を、７０ＧはＶＶＣ処置による影響、７０ＨはＭＴＲＶ処置による影響、７０ＩはＭＴＲ処置による影響、７０ＪはＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ処置による影響を示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は分離される。ヘパリン添加静脈血中のＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の密度勾配遠心分離法により分離される。ＰＢＭＣは３回洗浄され、Ｌ−グルタミンを２ｍＭ、ペニシリンを１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシンを５０μｇ／ｍｌ、ピルビン酸化合物を１ｍＭ、１０％の熱不活性化ヒト血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０に５．０ｘ１０ｅ６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ懸濁された。２ｍｌの細胞懸濁液（１０ｘ１０ｅ６  ｃｅｌｌｓ）を６つの好培地に置き、それぞれＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳおよびＮＭＰＦ（１μｇ／ｍｌ）、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）、ＰＨＡおよびＮＭＰＦ（１μｇ／ｍｌ）、同等量のＰＢＳのみで処置した。未処置のＰＢＭＣ、ＬＰＳ処置ＰＢＭＣ、ＬＰＳおよびＮＭＰＦ処置ＰＢＭＣは１．５時間培養し、未処置のＰＢＭＣ、ＰＨＡ処置ＰＢＭＣ、ＰＨＡおよびＰＢＭＣ処置は３時間培養した。全ての細胞（付着したものおよび付着していないもの）をインキュベーションした後、収集して３回洗浄し、マイクロアレイ実験に用いた。本実験で試験したＮＭＰＦは、ＮＭＰＦ−９（ＶＶＣ）、ＮＭＰＦ−１１（ＭＴＲＶ）、ＮＭＰＦ−１２（ＭＴＲ）、ＮＭＰＦ−７０（ＭＴＲＶＬＱＧＶＬＰＡＬＰＱ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０Ａ−１】
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【図７０Ａ−２】
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【図７０Ａ−３】
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【図７０Ａ−４】
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【図７０Ｂ−１】
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【図７０Ｂ−２】
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【図７０Ｃ−１】
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【図７０Ｃ−２】
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【図７０Ｄ−１】
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【図７０Ｄ−２】
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【図７０Ｄ−３】
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【図７０Ｅ−１】
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【図７０Ｅ−２】
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【図７０Ｅ−３】
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【図７０Ｆ−１】
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【図７０Ｆ−２】
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【図７０Ｆ−３】
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【図７０Ｆ−４】
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【図７０Ｆ−５】
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【図７０Ｆ−６】
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【図７０Ｇ−１】
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【図７０Ｇ−２】
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【図７０Ｇ−３】
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【図７０Ｈ−１】
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【図７０Ｈ−２】
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【図７０Ｈ−３】
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【図７０Ｉ−１】
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【図７０Ｉ−２】
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【図７０Ｉ−３】
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【図７０Ｊ−１】
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【図７０Ｊ−２】
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【図７０Ｊ−３】
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【図７０Ｊ−４】
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【図７０Ｊ−５】
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【国際調査報告】
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