(57)【要約】本発明は、腸絨毛の高さを増加させ、そして腸吸収を促進するための上皮成長因子（ＥＧＦ）産生乳酸菌およびその使用に関する。とりわけ、本発明は、ＥＧＦ産生ラクトコッカス・ラクチスおよびラクトバシラス・カゼイに関する。上記生物は、とりわけ短腸症候群を処置するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦ産生乳酸菌。
【請求項２】
配列番号１を含むＥＧＦ産生乳酸菌。
【請求項３】
配列番号３を含むＥＧＦ産生乳酸菌。
【請求項４】
上記乳酸菌が、ラクトコッカス・ラクチスである、請求項１〜３のいずれか一項記載のＥＧＦ産生乳酸菌。
【請求項５】
上記乳酸菌が、ラクトバシラス・カゼイである、請求項１〜３のいずれか一項記載のＥＧＦ産生乳酸菌。
【請求項６】
腸吸収を促進するための、請求項１〜５のいずれか一項記載のＥＧＦ産生乳酸菌の使用。
【請求項７】
短腸症候群を処置するための、請求項１〜５のいずれか一項記載のＥＧＦ産生乳酸菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸絨毛の高さを増加させ、そして腸吸収を促進するための上皮成長因子（ＥＧＦ）産生乳酸菌およびその使用に関する。とりわけ、本発明は、ＥＧＦ産生ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus luctis）およびラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）に関する。上記生物は、とりわけ短腸症候群を処置するのに有用である。
【０００２】
腸吸収の効率は、良好な食物変換に必須である。腸吸収は、主に腸表面により決定され、とりわけ腸の長さおよび絨毛の高さが作用する。癌またはクローン病の場合のように、腸の一部の外科的手術による除去が必要な場合、これは腸吸収の低下に至り、結果的に不十分な食物変換および栄養の欠乏、脱水、および致死の可能性さえある代謝変化に至り得る。小腸の広範囲の切除により引き起こされるこれらの症候群は短腸症候群として公知である。
【０００３】
短腸症候群の患者の腸吸収の術後適応を改善し、そして腸吸収を増強するためにいくつかの方法が提示されている。米国特許第５２８８７０３号は、成長因子と同様に、成長ホルモンおよびインスリンの双方が、哺乳動物の腸吸収に明確な効果を有していることを開示している。この明確な効果をグルタミンまたはグルタミン等価物の投与により増強することができる。グルタミンおよび成長ホルモンの投与により、絨毛の長さの増加に至る（Guら(2001); Zhouら(2001)）。米国特許第５９７２８８７号は、低用量の外因性肝細胞成長因子の投与による腸粘膜量および患者の吸収機能の低下の逆転を実証している。また、グルカゴン様ペプチド  ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２の使用によっても陽性の効果があった。実験動物（Scottら(1998))およびヒト（Jeppesenら(2001)）に関する研究により、ＧＬＰ−２の濃度の上昇と腸適合の改善との間に明確な相関関係が示された。回腸が除去されている短腸の患者は、食物誘起のＧＬＰ−２分泌の低下を示す（Jeppesenら(1999)）。とりわけこれらの患者をＧＬＰ−２で処置して成功を収めることができる。レプチンもまたラットモデルにおいて腸適合に明確な効果を有していることも示されている（Pearsonら(2001)）。
【０００４】
上皮成長因子（ＥＧＦ、ウロガストロン）の効果に対して多くの興味が向けられている。ＥＧＦは、唾液分泌およびブルンネル腺において産生される、相対的に酸に安定なホルモンである。これは広範な種類の外分泌において、ならびに血液および羊水において見出されている（Martiら(1989)）。成熟ヒトＥＧＦの分子量は、６．２ｋＤａである（Carpenterら(1991)）。ＥＧＦは、系統発生学的に強力に保存され、そして異なる種間で強力に交差反応性である。
【０００５】
ＥＧＦは、ウサギモデルにおいてＨ2Ｏ、Ｎａ+、Ｃｌ-、およびグルコースの吸収を増加させることが解っている（Opleta-Madsenら(1991)）。更に、ＥＧＦは、絨毛の伸長を刺激する。これにより、先端面の増加および栄養の吸収の一般的な増加に至る（Hardinら(1999)）。ＥＧＦ刺激された膵アミラーゼ分泌により、炭水化物の吸収は、更に促進される（Piiperら(1994)）。
【０００６】
いくつかの研究により、短腸症候群の実験動物モデルにおけるＥＧＦの適用の明確な効果が示されている（Helmrathら(1988); Chaetら(1994); O'Loughlinら(1994); Swanikerら(1996); Lukishら(1997); Dunnら(1997)）。
【０００７】
腸切除の後のＥＧＦ媒介効果は、強力に用量依存的である。特定の限界までは、適合は用量の増加と共に増加する。腸研究では、通常の用量は、３０と３００μg/kg体重／日の間に設定されている。全身および経腸適用が、有効であると思われる。しかしながら、副作用の可能性のために全身適用は望ましくない。いくつかの腫瘍は、ＥＧＦレセプターを有しており、そして血中のＥＧＦ濃度の一般的な上昇が、腫瘍形成を刺激するかもしれない。しかしながら、ペプシンが、最初の生物学的活性の２５％しか有さないトランケートされた形態に成熟ＥＧＦをプロセシングし得るので、ＥＧＦの腸適用は、あまり有効ではない（Playfordら(1995)）。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ＥＧＦ産生組換え乳酸菌によりその場でＥＧＦを送達することができることを実証できた。乳酸菌によるＥＧＦの効率的な産生および分泌は明白ではなく、そしてコード化配列の最適化を必要とする。更に、乳酸菌が、胃を通過する間、適当な量のＥＧＦを産生して絨毛の成長を刺激し、栄養吸収を促進し、そして短腸症候群を処置するのに十分に生存していると予測することはできない。
【０００９】
本発明の第１の態様は、ＥＧＦ産生乳酸菌を提供することである。好ましくは、上記乳酸菌は、成長環境において産生されたＥＧＦを分泌している。好ましくは、上記乳酸菌は、ラクトコッカス・ラクチスおよびラクトバシラス・カゼイである。更に好ましくは、上記乳酸菌は、配列番号１および／または配列番号３を含む。好ましい実施態様は、配列番号３を含むＥＧＦ産生ラクトコッカス・ラクチスである。別の好ましい実施態様は、配列番号３を含むＥＧＦ産生ラクトバシラス・カゼイである。
【００１０】
本発明の別の態様は、腸吸収を促進するための本発明によるＥＧＦ産生乳酸菌の使用である。腸吸収を測定するための方法は、当業者に公知である。本発明の更に別の態様は、短腸症候群を処置するための本発明によるＥＧＦ産生乳酸菌の使用である。好ましくは、本発明による乳酸菌を経口的に適用する。当業者に公知のいずれかの処置によりこれを処置して、消化系を通過する間のその生存性を改善することができる。非限定例としては、適当な受体においてこれを凍結乾燥、噴霧乾燥、および／またはカプセル化して、細菌が、小腸においてのみ放出されるようにすることができる。小腸における送達のためのカプセル化および処置については、とりわけ米国特許第５９７２６８５号、国際公開公報第００１８３７７号および国際公開公報第００２２９０９号において記載されている。
【００１１】
本発明による乳酸菌を、腸吸収に関して明確な効果を有し、および／またはＥＧＦの明確な効果を増強する別の化合物と組み合わせることができる。非限定例としては、本発明による乳酸菌と組み合わせてグルタミンを使用することができる。
【実施例】
【００１２】
培地および株
Ｍ１７：      バクト・トリプトン５ｇ
バクト・ソイトン５ｇ
食肉消化産物５ｇ
酵母消化産物２．５ｇ
アスコルビン酸０．５ｇ
ＭｇＳＯ4０．２５ｇ
β−グリセロールリン酸二ナトリウム１９ｇ
脱イオン水１ｌ中
ＧＭ１７：０．５％  グルコース含有Ｍ１７
回復培地：    Ｍ１７  ２×１ml
２Ｍ  スクロース０．５ml
２０％  グルコース５０μl
１Ｍ  ＭｇＣｌ2４０μl
１Ｍ  ＣａＣｌ2４μl
Ｈ2Ｏ４０６μl
１．２％  寒天を添加することにより寒天培地が得られる。
ＢＭ９発現培地  Ｎａ2ＨＰＯ4６０ｇ
ＫＨ2ＰＯ4３０ｇ
ＮＨ4Ｃｌ１０ｇ
ＮａＣｌ５ｇ
５０mM  ＣＯ3バッファー
２mM  ＭｇＳＯ4
０．１mM  ＣａＣｌ2
０．５％  カシトン（Ｄｉｆｃｏ）
０．５％  グルコース
水１ｌ中
ラクトコッカス・ラクチス  ＭＧ１３６３はプラスミドであり、そしてプフロファージ不含のラクトコッカス・ラクチスＮＣＤＯ７２株の誘導体である（Gasson(1983)）。
【００１３】
〔実施例１〕
ラクトコッカスにおける発現のためのＥＧＦコード化配列の最適化
マウスおよびヒトの双方が、公のデータベース（http//:www.ncbi.nlm.nih.gov ｈＥＧＦの受け入れ番号  Ｘ０４５７１、ｍＥＧＦの受け入れ番号  ＮＭ  ０１０１１３）から入手可能である。コード化配列を適合させてラクトコッカスにおける発現を最適化した。これらの配列に基づいて、ｈＥＧＦおよびｍＥＧＦの双方の最適化されたコード化配列を組み立てるためにプライマーセットを設計した。コード化配列の３’末端にＳｐｅＩ制限部位を導入した。プライマーを表１（ｈＥＧＦ）および表２（ｍＥＧＦ）に示す。
【００１４】
【表１】
2005529622.tif 000002
【００１５】
【表２】
2005529622.tif 000003
【００１６】
オリゴヌクレオチドを１００μMの濃度で水に溶解し、そして１０倍希釈濃度で使用した。
各オリゴヌクレオチド１μlをＴａｑバッファー１０μl、２mM  Ｍｇ2+８μl、０．５mM  ＸＴＰ２μl、５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer、Mannheim、ドイツ）および１Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Promega、Madison、米国）に加えた。反応混合物に水を１００μlまで加えた。ＰＣＲ反応を、９４℃で３００秒、続いて９４℃で４５秒、４８℃で３０秒および７２℃で３０秒のサイクルを３０回、最終工程は、１５℃で１０秒で実施した。アセンブル後、ｈＥＧＦおよびｍＥＧＦを、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs; Beverly、米国）１μl、Ｔａｑバッファー１０μl、０．５mM  ＸＴＰ４μl、０．５μM  各プライマー５μl、鋳型ＤＮＡ１μl、２mM  Ｍｇ2ＳＯ4１μl、およびＨ2Ｏ７４μlを含有するＰＣＲ混合物中で増幅した。
【００１７】
ｈＥＧＦの場合、ＨＥＧＦ０１およびＨＥＧＦ０６をプライマーとして使用し、ｍＥＧＦには、ＭＥＧＦ０１およびＭＥＧＦ０６を使用した。ｈＥＧＦでは、第１工程と同一の温度スケジュールを用いた。ｍＥＧＦの場合は、４８℃の代わりに５２℃でハイブリダイゼーション工程を実施した。
アセンブル後、最適化された遺伝子フラグメントのサイズを２％  アガロースゲル上で確認した。
【００１８】
〔実施例２〕
ｐＴ１ｈＥＧＦおよびｐＴ１ｍＥＧＦの構築ならびにラクトコッカス・ラクチスへの形質転換
ＳｐｅＩ切断を組み立てたＥＧＦ（ｈＥＧＦおよびｍＥＧＦの双方）をＮａｅＩおよびＳｐｅＩ消化したｐＴ１ＮＸにライゲートし（Steidlerら(1995)）、ｐＴ１ｈＥＧＦおよびｐＴ１ｍＥＧＦを得た。ｐＴ１ｈＥＧＦの構築の概略図を図１に示す。エレクトロポレーションによりプラスミドをラクトコッカス・ラクチスのコンピテント細胞に形質転換した。予め冷却した２ｍｍキュベット中で細胞５０μlを２５μＦ、２．５ｋＶ、および４００Ω（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  エレクトロポレーター）でエレクトロポレーションに供した。２．５％  グリシン含有ＧＭ１７  ２００ml中、ＯＤ600が、０．５になるまで飽和培養の１／１００希釈物を成長させることにより、ラクトコッカス・ラクチスをコンピテントにした（Wellsら(1993)）。エレクトロポレーションの後、回復培地１mlを加え、そして細胞を２８℃で１．５時間インキュベートした。細胞を、エリスロマイシン５μg/mlを含むＧＭ１７固形培地にプレートした。
【００１９】
ラクトバシラス・カゼイを形質転換するために、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ１００により製造者の指示書に従ってプラスミドをラクトコッカス・ラクチスから単離した。ＤＮＡをコンピテントラクトバシラス・カゼイ細胞に形質転換した。１％  グリシン含有ＭＲＳ（Oxoid LTD.、Basingstoke、Hampshire、英国）５０ml中３７℃で、ＯＤ600が０．６になるまで一晩培養の１／５０希釈物を成長させることにより、ラクトバシラス・カゼイ細胞をコンピテントにした。細胞を収集し、そして５mM  Ｎａ3ＰＯ4（ｐＨ７．４）、１mM  ＭｇＣｌ2１０mlで２回洗浄し、そしてエレクトロポレーションバッファー（０．３Ｍ  スクロース、５mM  Ｎａ3ＰＯ4（ｐＨ７．４）、１mM  ＭｇＣｌ2）５００μlに再懸濁した。ＤＮＡ１０μlをコンピテント細胞５０μlに加え、そしてＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーターでエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーションの後、ＭＲＳ４５０μlを加え、そして細胞を３７℃で２時間インキュベートした。細胞をエリスロマイシン５μg/ml含有ＭＲＳ寒天に蒔いた。プラスミドの存在をＰＣＲを用いて確認した。
【００２０】
〔実施例３〕
ラクトコッカス・ラクチスおよびラクトバシラス・カゼイにおけるＥＧＦの発現
形質転換したラクトコッカス・ラクチス株ＭＧ１３６３［ｐＴ１ＮＸ］、ＭＧ１３６３［ｐＴ１ｍＥＧＦ］、およびＭＧ１３６３［ｐＴ１ｈＥＧＦ］を、エリスロマイシン５μg/mlを含むＧＭ１７  ５mlに入れ、そして３０℃で一晩成長させた。この前培養物をエリスロマイシン含有ＧＭ１７  ５ml中１／１００希釈し、そして２８℃で３時間インキュベートした。培養物を遠心し、そしてＢＭ９発現培地に再懸濁し、そして２８℃で一晩インキュベートした。形質転換したラクトバシラス・カゼイ株を類似の条件下で成長させるが、前培養としてＭＲＳ、および発現培地としてＢＭ９を用いた。
【００２１】
培養上澄に１／１０容量のデゾキシコリン酸ナトリウムを加え、そして混合物を氷上で１０分間維持した。１／１０容量の１００％  ＴＣＡを加え、そして混合物を氷上で１５分間インキュベートした。遠心の後、ペレットをＨ2Ｏ５０μlおよび１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）５０μlに溶解した。２０％  Ｌａｅｍｍlｉタンパク質ゲル上でタンパク質を分析した。１次抗体としてマウスポリクローナル抗ｈＥＧＦおよびウサギ抗ｍＥＧＦを用い、ウェスタンブロットを用いて検出を行った。アルカリ性ホスファターゼ標識抗マウスおよび抗ウサギ２次抗体は、Southern Biotechnology(Birmingham、米国）の提供であった。結果を図２にまとめた。
【００２２】
〔実施例４〕
形質転換した乳酸菌株を用いるマウスのインビボ試験
形質転換した乳酸菌の効果および絨毛の成長および腸吸収を評価するために、７群のＢａｌｂ／ｃマウス（IFFA CREDO CR Broekman/ Sulzfield）をｍＥＧＦまたはｈＥＧＦのいずれかを発現する乳酸菌株で処置した。空ベクターｐＴ１ＮＸまたはＢＭ９培地で形質転換したラクトコッカス・ラクチスおよびラクトバシラス・カゼイを陰性対照としてマウスに与えた。
【００２３】
ラクトバシラス・カゼイ６００μlをエリスロマイシン１０μg/ml含有ＭＲＳ１５mlに入れた。ラクトコッカス・ラクチスの場合、ＭＲＳの代わりにＧＭ１７を用い、そして選択のためにエリスロマイシン５μg/mlのみを使用した。ラクトバシラス・カゼイを３７℃で一晩インキュベートし、ラクトコッカス・ラクチスには３０℃を用いた。一晩培養物を遠心により収集し、そしてペレットをＢＭ９発現培地１．５mlに再懸濁した。この溶液１００μlを４週間毎日供給した。実験の最後にマウスを屠殺し、そして腸を単離した。組織を緩衝ホルムアルデヒドで固定し、そして絨毛の顕微鏡分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンＧを用いて薄片を着色した。いくつかのポイントで絨毛の長さを測定し、代表例の平均を得た。全ての切片を回腸終端部から採取した。
結果を図３にまとめた。とりわけラクトバシラス・カゼイ［ｐＴ１ｈＥＧＦ］は、絨毛成長に明確な効果を有し、そして腸吸収を促進するはずである。
【００２４】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｐＴ１ｈＥＧＦの構築の概要。ｐＴ１ｍＥＧＦの構築は類似の方法で実施した。
【図２】ラクトコッカス・ラクチスおよびラクトバシラス・カゼイにおけるｍＥＧＦ（Ａ）およびｈＥＧＦ（Ｂ）の発現。示したように培養上澄を２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてウェスタンブロットを用いてタンパク質を検出した。
【図３】空ベクターｐＴ１ＮＸ（ｐＴ１ＮＸ）、マウスＥＧＦ（ｍＥＧＦ）を発現するベクターｐＴ１ｍＥＧＦ、またはヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）を発現するベクターｐＴ１ｈＥＧＦで形質転換したラクトコッカス・ラクチスまたはラクトバシラス・カゼイで処置したマウスの絨毛の平均の長さ。ＢＭ９培地で処置したマウスを更なる陰性対照（ＢＭ９）として使用した。
【図１】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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