(57)【要約】種々の収集、操作、保存、輸送、分離または受精手順の状況において精子細胞の生物学的、化学的、物理的、生理学的もしくは機能的性質を維持または高めるための精液または精子細胞処理システム。また、本発明は、精子細胞を分離する方法であって、哺乳動物の一種のオスから精液を獲得する工程、精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上でこの精液をインキュベートする工程、複数の精子細胞の精子細胞形質を決定する工程、この精子細胞形質に基づいて精子細胞を分離する工程および分離した精子細胞を収集する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子細胞を分離する方法であって、該方法は、以下：
ａ．哺乳動物の一種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程、
ｂ．精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で該精液をインキュベートする工程、
ｃ．複数の該精子細胞の精子細胞形質を決定する工程、
ｄ．該精子細胞形質に基づいて該精子細胞を分離する工程、および
ｅ．分離した精子細胞を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記温度（精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上）において、精子細胞の膜脂質がゲル相へと転移する温度以上で前記精液をインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項３】
前記温度（精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上）において、該精子細胞の膜脂質を該液体に維持する温度で前記精液をインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項４】
精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上の温度で前記精液をインキュベートする前記工程は、該精液をおよそ５℃とおよそ２５℃との間の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項５】
前記温度は、およそ５℃、およそ６℃、およそ７℃、およそ８℃、およそ９℃、およそ１０℃、およそ１１℃、およそ１２℃、およそ１３℃、およそ１４℃、およそ１５℃、およそ１６℃、およそ１７℃、およそ１８℃、およそ１９℃、およそ２０℃、およそ２１℃、およそ２２℃、およそ２３℃、およそ２４℃、および、およそ２５℃からなる群より選択される、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項６】
前記哺乳動物の一種は、哺乳動物のウシの一種、哺乳動物のウマの一種、哺乳動物のヒツジの一種、哺乳動物のブタの一種、哺乳動物のイヌの一種、哺乳動物のネコの一種、哺乳動物のシカの一種、哺乳動物のヘラジカの一種、および哺乳動物の海洋の種からなる群より選択される、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項７】
前記哺乳動物の一種は、ウシの一種を含み、かつ精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上の温度で前記精液をインキュベートする前記工程は、該精液をおよそ１７℃とおよそ１９℃との間の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項８】
前記哺乳動物の一種は、ウシの一種を含み、かつ精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上の温度で前記精液をインキュベートする前記工程は、該精液をおよそ１７℃の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項９】
前記哺乳動物の一種は、ウマの一種を含み、かつ精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上の温度で前記精液をインキュベートする前記工程は、該精液をおよそ１５℃の温度でインキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１０】
精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で前記精液をインキュベートする前記工程は、該精液を該温度（精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上）で、およそ１時間とおよそ１８時間との間インキュベートする工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１１】
精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で前記精液をインキュベートする前記工程の間に、第一の位置から第二の位置へ該精液を移動させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１２】
精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で前記精液をインキュベートする前記工程の前に、該精液に対して抗生物質を添加する工程をさらに包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１３】
前記精液内の複数の精子細胞の精子細胞形質を決定する前記工程は、
該精子細胞の性形質を決定する工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１４】
前記精子細胞形質に基づいて該精子細胞を分離する前記工程は、前記性形質に基づいて該精子細胞を分離する工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１５】
ＫＭＴおよびＩＮＲＡ９６からなる群より選択される増量剤を用いて精液を増量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１６】
精漿の一部を取除くことにより前記精子細胞を濃縮する工程をさらに包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１７】
前記精子細胞を染色する工程をさらに包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１８】
前期精子細胞を染色する前記工程は、該精子細胞内に含まれるＤＮＡを染色する工程を包含する、請求項１７に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項１９】
前記精子細胞内に含まれるＤＮＡを染色する前記工程は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色を用いて該精子細胞内の該ＤＮＡを染色する工程を包含する、請求項１８に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項２０】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色を用いて前記精子細胞内の前記ＤＮＡを染色する前記工程は、およそ３０分とおよそ１時間との間Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２と共に該精子細胞をインキュベートする工程を包含する、請求項１９に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項２１】
前記精子細胞形質に基づいて該精子細胞を分離する前記工程は、フローサイトメーター、およびセルソーターからなる群より選択される装置を使用して該精子細胞を分離する工程を包含する、請求項１に記載の精子細胞を分離する方法。
【請求項２２】
人工受精サンプルであって以下：
ａ．人工受精装置、
ｂ．精子細胞増量剤、および
ｃ．哺乳動物の一種のオスから獲得した精液（複数の精子細胞を含む）であって、該精液は精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で１時間と１８時間との間の期間インキュベートされており、該複数の精子細胞は性形質に基づいて分離され、該分離した精子細胞の一部が、該精子細胞増量剤内に確立され、かつ該精子細胞増量剤内に確立した該分離した該精子細胞の一部は、該人工受精装置内に収容される、精液、
を含む、人工授精サンプル。
【請求項２３】
前記精子細胞増量剤は、卵黄増量剤を含む、請求項２２に記載の人工受精サンプル。
【請求項２４】
前記精子細胞増量剤は、卵黄−ＴＲＩＳ増量剤を含む、請求項２２に記載の人工受精サンプル。
【請求項２５】
前記精子細胞増量剤は、実質的に等量の前記卵黄−ＴＲＩＳ増量剤および卵黄−ＴＲＩＳ増量剤／１２％グリセロールを含む、請求項２２に記載の人工受精サンプル。
【請求項２６】
前記精子細胞増量剤は、およそ０．１ｍｌと２．０ｍｌとの間の容量を有する、請求項２３、２４、または２５に記載の人工受精サンプル。
【請求項２７】
前記人工受精装置は、人工受精ストローを備える、請求項２２に記載の人工受精サンプル。
【請求項２８】
前記精子細胞増量剤内に確立した前記分離した精子細胞の一部は、およそ１００，０００とおよそ２５，０００，０００との間の分離した精子細胞を含む、請求項２２に記載の人工受精サンプル。
【請求項２９】
前記人工受精装置内に収容される、前記精子細胞増量剤中で確立した、前記分離した精子細胞の一部は、凍結されている、請求項２８に記載の人工受精サンプル。
【請求項３０】
前記人工受精装置内に収容される、前記精子細胞増量剤中で凍結されている前記分離した精子細胞の一部が、解凍される、請求項２９に記載の人工受精サンプル。
【請求項３１】
人工受精サンプルを産生する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ．哺乳動物の一種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程、
ｂ．精子細胞の膜脂質が液体相からゲル相へと転移する温度以上で該精液をインキュベートする工程、
ｃ．該複数の精子細胞の性形質を決定する工程、
ｄ．該性形質に基づいて該複数の精子細胞を分離する工程、および
ｅ．該哺乳動物の該種のメスの内部の少なくとも一つの卵子と受精することが可能な分離した精子細胞を含む人工受精サンプルを確立する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
哺乳動物を受精させる方法であって、該方法は以下の工程：
ａ．哺乳動物の一種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程、
ｂ．精子細胞の膜脂質がゲル相へと転移する温度以上で該精液をインキュベートする工程、
ｃ．該複数の精子細胞の性形質を決定する工程、
ｄ．該性形質に基づいて該複数の精子細胞を分離する工程、
ｅ．該哺乳動物の該種のメスの内部の少なくとも一つの卵子と受精することが可能な分離した精子細胞を含む人工受精サンプルを確立する工程、
ｆ．該哺乳動物の該種のメスの内部へ、該受精サンプルの一部を挿入する工程、および、
ｇ．該哺乳動物の該種のメスの内部の少なくとも一つの卵子と受精させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
哺乳動物の子孫を産生する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ．哺乳動物の一種のオスから精液（複数の精子細胞を含む）を獲得する工程、
ｂ．精子細胞の膜脂質がゲル相へと転移する温度以上で該精液をインキュベートする工程、
ｃ．該複数の精子細胞の性形質を決定する工程、
ｄ．該性形質に基づいて該複数の精子細胞を分離する工程、
ｅ．該哺乳動物の該種のメスの内部の少なくとも一つの卵子と受精することが可能な分離した精子細胞を含む人工受精サンプルを確立する工程、
ｆ．該哺乳動物の該種のメスの内部へ該受精サンプルの一部を挿入する工程、
ｇ．該哺乳動物の該種のメスの内部の少なくとも一つの卵子と受精させる工程、および
ｈ．哺乳動物の子孫を産生する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
種々の収集手順、操作手順、保存手順、輸送手順、分離手順または受精手順の状況において精子細胞の生物学的、化学的、物理的、生理学的もしくは機能的性質を維持または増強するための精液または精子細胞操作システム。
【背景技術】
【０００２】
効果的な性別の事前選択は、精子細胞を豊富なＸ染色体保有集団と豊富なＹ染色体保有集団へと分離する安全かつ信頼できる方法の発展の後、多数の家畜種で達成されている。Ｙ染色体保有精子細胞からのＸ染色体保有精子細胞の分離は、本明細書中で開示するようにおよび様々な国際的な特許出願（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７１６５；ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７９０９；ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５２３７；ＰＣＴ／０１／１８８７９；ＰＣＴ／ＵＳ０１／１５１５０；およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０２３０４ならびに米国特許出願０９／５８２，８０９および０９／０１５，４５４（それぞれ本明細書中に参考として援用される）により開示されるように達成され得る。Ｙ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞を分離するこれらの例は、本精子細胞操作系の発明を、フローサイトメトリーソーティング装置またはフローソーティング方法を伴う精子操作技術に限定することを意図せず、むしろ精子細胞を互いから分離し得る様々な操作を例示するおよび本発明が理解され得る状況下で精子細胞を収集、操作、分離、移送、使用または保存する様式の例示であるとされる。
【０００３】
特定の精子細胞特徴に基づいて部分集団へと分離された精子細胞の重大な問題は、運動性低下、生存率低下または受精能低下であり得る。この問題の一つ局面は、部分集団へと精子細胞を分離する前に精液を操作および移送する従来の方法は、一般的に約５℃、または精子細胞膜脂質が液相からゲル相へと転移した温度で実施されることであり得る。精子細胞膜脂質の液相からゲル相への転移は、精子細胞の化学的、物理的、生理学的、または機能的性質を変化させ得、そのような精子細胞の受精率低下をもたらし得るか、または精子細胞死をもたらし得る。この問題の別の局面は、精子細胞膜脂質が液相からゲル相へと転移する温度は、精液を収集した哺乳動物の種に依存して変化し得ることであり得る。従って、哺乳動物の特定種についての精子細胞が精子細胞膜脂質の液相からゲル相への転移を防止するために維持されなければならない温度は、後に続く収集手順、操作手順、移送手順および分離手順より前に決定されなければならない。この問題の別の局面は、収集された精液は、後の操作手順、移送手順、または分離手順の間の精子細胞の生存率および受精率を維持するために温度を減少させなければならないという従来の理解であり、これは、収集した精液を既存の慣行的実務よりも実質的に高い温度でインキュベートするか、または収集した精液の温度を維持する本発明からは離れるように教示する。
【０００４】
精子細胞を部分集団へと分離するための従来の方法に伴う別の重大な問題は、精子細胞が曝される染色剤濃度が、哺乳動物の特定の種より収集された精液に対して非常に高過ぎる濃度であり得ることであり得る。たとえば、ウシの精子細胞を染色するために慣用的に使用されるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色剤の濃度に曝されたウマの精子細胞は、受精能の実質的な低下を示し得る。
【０００５】
精子細胞を部分集団へと分離するための従来の方法に伴う別の重大な問題は、精子細胞が染色剤（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）内でインキュベートされる時間の長さであり得、これは、哺乳動物の特定の種にとって長過ぎるものであり得る。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２内で一時間インキュベートされたウマの精子細胞は、運動性または受精能の実質的減損を示し得る。
【０００６】
精液を操作するための慣用的な方法に伴うさらに別の重大な問題は、精子細胞が、運動性または受精能の実質的な減損を示す組成物を用いた精液の増量であり得る。
【０００７】
たとえ精子細胞を分離する様々な装置および方法が改善されたとしても、収集プロセス、操作プロセス、移送プロセス、分離プロセス、使用プロセス、または保存プロセスの間の精子細胞生存率を維持することに関する重大な問題は残る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の広範な目的は、精子の生存率を維持または増強するための精液または精子細胞の収集、操作、移送、分離のための装置または方法を提供することであり得る。
【０００９】
本発明の別の広範な目的は、精子の生存率を維持または増強するための精液または精子細胞（ウマ、ウシ、ネコ、ヒツジ、イヌ、バッファロー、雄ウシ、ヘラジカ、またはブタを含むがこれらに限定されない種々の哺乳動物種から収集された；または、ある哺乳動物種の獲物個体、絶滅寸前個体、または希少個体から収集された；または動物標本から収集された）を収集、操作、移送、保存、または分離の装置または方法を提供することであり得る。
【００１０】
本発明の別の重要な目的は、ウマの哺乳動物から得られた精子細胞を操作および移送するための装置または方法を提供することであり得る。
【００１１】
別の本発明の重要な目的は、フローソーティングプロセス全体にわたって哺乳動物精子細胞のより高い生存率を維持し得る精子細胞を分離する装置または方法を提供することであり得る。
【００１２】
本発明の別の重要な目的は、哺乳動物の様々な種（例えば、上記）における人工受精のため、またはそのような精子細胞が、豊富なＸ染色体保有精子細胞または豊富なＹ染色体保有精子細胞へと分離されるにせよ、分離されないにせよ、このような人工受精の手順において使用される精子細胞の一般的な数または典型的な数と比較し少ない精子細胞数または減じた精子細胞数を用いる人工受精ため、より高い生存率で精子細胞を維持する装置または方法を提供することであり得る。
【００１３】
本発明の別の重要な目的は、それより上では精子細胞の膜脂質が液相からゲル相へと転移する温度で精子細胞をインキュベートする方法を提供することであり得る。
【００１４】
本発明の別の重要な目的は、精子細胞のフローソーティングによる分離前に種馬精液の移送のための装置または方法を提供することであり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明を実施するための形態）
種々の収集手順、操作手順、保存手順、輸送手順、分離手順または受精手順の状況において精子細胞の生物学的性質、化学的性質、物理的性質、生理学的性質もしくは機能的性質を維持または高めるための精液または精子細胞操作システム。
【実施例】
【００１６】
（実施例１）
精液は、受精可能な３頭の種馬から収集し、タイロードベースのスキムミルク−グルコース増量剤に１ｍＬごとに約２５×１０６精子となるよう希釈し、そして１８時間、約５℃または約１５℃のいずれかにて保存した。保存の後、精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）を、遠心分離し精漿を取り除き、そして精子（ｓｐｅｒｍ）を濃縮し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で染色し、そしてＳＸ  ＭｏＦｌｏ（登録商標）精子ソーターを用いてＤＮＡ含有量に基づいて富化されたＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団とに選別した。
【００１７】
３００μｌの容積での約２０×１０６のフローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）精子を、全て受精のために使用した。２齢から１２齢の３５頭の雌ウマの発情期を、同調化した。直径３５ｍｍ以上の優性小胞が現れた場合、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；３０００  ＩＵ，ｉｖ；Ｃｈｏｒｕｌｏｎ（登録商標），Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ，ＵＳＡ）を投与し、そして雌ウマは、ｈＣＧ投与後約３０時間で受精した。受精の際、雌ウマは、３つの処置群に１頭割り当てた：１）１５℃で精子を保存しビデオ内視鏡の技術を用いて受精させた；２）５℃で精子を保存し、またビデオ内視鏡の方法を用いて受精させた；および３）５℃で精子を保存し、直腸誘導技術（ｒｅｃｔａｌｌｙ  ｇｕｉｄｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて受精させた。
【００１８】
雌ウマを、ブトルファノール（４ｍｇ，ｉｖ；Ｔｏｒｂｕｇｅｓｉｃ（登録商標），Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ  Ｃｏ．，Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）およびデトミジン（６ｍｇ，ｉｖ；Ｄｏｒｍｏｓｅｄａｎ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ，Ｌｅｅｓ  Ｓｕｍｍｉｔ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて受精直前に落ち着かせた。雌ウマを、排卵について毎日評価し、受精後４８時間以内に排卵している雌ウマのみを結果に含めた。妊娠を、排卵後１２日から１４日で超音波診断により決定した。雌ウマは、２周期後の使用のため、排卵後１６日にプロスタグランジンＦ２αを投与した。
【００１９】
１５℃で保存されたソート精子を用いて子宮鏡（ｈｙｓｔｅｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ）により受精させた雌ウマ間の受精率は、表１に示されるように約７２％であり、また５℃で保存された精子を用いた受精率は、約５５％であった。保存されたソート精子を受精させた場合、子宮鏡受精（５５％）と比較して直腸誘導受精（３８％）をした後、妊娠する雌ウマはより少ないという傾向（Ｐ＝０．１２）があった。
【００２０】
【表１】
2005533501.tif 000002
より多い数の雌ウマが、５℃と比較して、選別前に１５℃で保存されたソート精子を用いて受精をした後、妊娠した。受精率としてのこの効果は、５℃と比較し、選別の前に１５℃で１８時間保存された後の種馬と一致した。
【００２１】
標準的な方法（５℃、１２時間から７２時間）により輸送された１×１０９種馬精子による受精後の予想される妊娠率は、６５％である。本研究において得られた妊娠率（７２％）は、目覚しいものであり、簡便な技術を使用して１８時間保存されたフローソート精子細胞を用いて得られた妊娠率（３５％）を超える劇的な改善を示す。この受精率の増加は、フローサイトメトリー前の精子操作に影響し得る。全ての受精した雌ウマの妊娠率が、極めて低い本発明を適用する間の二日間を除いたとしても、本研究の妊娠率は、より高い。
【００２２】
子宮鏡受精は、深部−子宮（ｄｅｅｐ  ｕｔｅｒｉｎｅ）受精よりも高い妊娠率を生じた。これは、Ｒｉｇｂｙら（彼らは、輸送された精子を使用した場合、ビデオ内視鏡受精と直腸誘導受精との間の妊娠率は、類似していると報告した）と対照的である。しかし、これらの結果は、子宮鏡受精に対する１２パーセンテージポイントの利点を示さなかった。その研究と対照的に、本試行では、フローソート精子細胞（受精能獲得前の状態にあることが公知である）を利用した。要約すると、優れた妊娠率は、１８時間保存されたフローソート精子細胞（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ）の子宮鏡受精を用いて得られた。
【００２３】
５℃と比較した場合、約１５℃で精子が維持された場合、全３頭の種馬について妊娠率は、より高かった。１５℃で保存された精子を用いた子宮鏡受精は、５℃で保存された精子の直腸誘導受精よりも、高い妊娠率を得た。
【００２４】
従って、本発明の精子細胞操作システムは、哺乳動物の一種のオスから精子細胞を得ること、哺乳動物のこのような種のこのようなメスのより高い妊娠率を生じる５℃と２５℃との間の範囲内で選択される温度で、哺乳動物の種のメスの人工受精の前に哺乳動物のオス種から得た精子細胞を維持することを包含し得る。ウマの種に関して、および特に開示されたウマの種に関して、ウマのオスから得た精子細胞が、妊娠率を高めるために本発明に従って維持される温度は、約１０℃〜約２０℃との間であり得、具体的には約１５℃であり得る。ウマを含む用途についての以下の実施例を参照のこと。また、ヘラジカの一種のオスから得た精子細胞は、メスヘラジカの受精の前に約２０℃で維持される本発明の用途を示している以下の実施例８を参照のこと。
【００２５】
本発明の精子細胞操作システムは、本発明に従う温度で維持された哺乳動物の一種のオスから得た精子細胞の輸送をさらに含み得る。このような輸送は、一時間より少ない限定された期間を有し得るか、または約１時間と約７２時間との間でより延長された期間を有し得るか、または記載されるように約１８時間の期間であり得る。
【００２６】
本発明は、上記のように、哺乳動物のこのような種のこのようなメスの最高の妊娠率を生じる温度で維持された哺乳動物の一種のオスから得た精子細胞を染色する工程をさらに包含し得る。
【００２７】
本発明は、哺乳動物のその種のそのメスの子宮鏡人工受精または直腸誘導人工受精をさらに含み得る。特に、本明細書中に含まれる参考文献による援用により記載されるように、精子細胞を用いたウマ哺乳動物の子宮鏡受精が、性別事前選択のために選別されこれは、本発明に従って取り扱われ得、そしてさらに哺乳動物の特定種（ウマ哺乳動物を含むがそれに限定されない）のメスを受精させるために代表的に使用される精子細胞の数と比較して少ない数の精子細胞をさらに含み得る。
【００２８】
（実施例２）
８頭の種馬由来の精液を、表２に示すように４つの輸送（ｓｈｉｐｐｉｎｇ）増量剤の各々の中に約２５×１０６精子／ｍｌとなるように希釈した。１８時間の模擬輸送の間、サンプルを、１５℃で保存されたＩＮＲＡ９６内に希釈されたサンプルを除き、周囲温度（２０℃から２４℃）に保った。保存後、サンプルを１０分間６００×ｇで遠心分離し、ペレットを４００×１０６精子／ｍｌまで希釈した。１時間１９℃〜２４℃でインキュベーションし、そして２００×１０６精子／ｍｌまで希釈した後、精子細胞を、２２４μＭのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて１時間、３４℃で染色し、次いでＫＭＴ中で１００×１０６精子／ｍｌまで希釈した。選別条件をシュミレートするため、精子を、ＢＳＡを含まないＨＢＧＭ−３に７００，０００精子／ｍｌとなるように希釈し、２０分間８５０×ｇで遠心分離する前に１．５時間周囲温度で維持した。運動性を、表２で示されるように、４つの化学的環境で評価した。
【００２９】
【表２】
2005533501.tif 000003
表２に示されたデータから理解され得るように、ＫＭＴおよびＩＮＲＡ９６は、特定の精子細胞操作工程を通してより高い運動性を維持した。
【００３０】
本発明の精子細胞操作システムは、哺乳動物の一種のオスから得た精子細胞をＫＭＴに増量する工程をさらに包含し得、特に哺乳動物のウマの一種のオスから得た精子細胞に関して、ＫＭＴは、精子細胞の運動性を有意に増加し得る。
【００３１】
本発明の精子細胞操作システムは、哺乳動物の一種のオスから得た精子細胞をＩＮＲＡ９６に増量する工程をさらに包含し、特に哺乳動物のウマの一種のオスから得た精子細胞に関して、ＩＮＲＡ９６は、精子細胞の運動性を有意に増加し得る。
【００３２】
（実施例３）
８頭の種馬からの精液を、ＫＭＴに２５×１０６精子細胞／ｍｌまで希釈し、４０ｍｌのアリコートを、１８時間５℃、１０℃、１５℃、２０℃、および２５℃で配置した。サンプルを次いで、実施例２の方法と同様に操作した。運動性を、刺激物として２ｍＭのカフェインを用いておよびカフェインを用いることなく両方評価した。死数％のフローサイトメトリー評価を、プロピジウムヨウ化物染色を用いて行った。
【００３３】
【表３】
2005533501.tif 000004
表３に示されるように、ＫＭＴの使用は、５℃、１０℃、または１５℃の保存温度または輸送温度に関して運動性の差異を減少させ得る。
【００３４】
従って、本発明の精子細胞操作システムは、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色剤を用いてこのような精子細胞を染色する前におよびこのような精子細胞のフローソートの前に哺乳動物の一種のオスから得たこのような精子細胞をこのようなＫＭＴ濃度で希釈する工程または維持する工程をさらに含み得る。
【００３５】
（実施例４）
３頭の種馬からの精液中の精子細胞を、始めに、容量、濃度、および運動性について評価した。残りの射精の一部を、０％のさらなる精子細胞のプラズマまたは１０％の精子細胞のプラズマのいずれかを用いてＫＭＴまたはＥＺ混合液のいずれかを用いて、以下の精子細胞／染色剤濃度：５０×１０６精子／ｍＬ、２．６μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ；５０×１０６精子／ｍＬ、３．９μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ；１５０×１０６精子／ｍＬ、７．８μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ；または４５０×１０６精子／ｍＬ、２３．４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔとなるような濃度で希釈し、そして室温にて、直ちに、または１８時間の保存の後に処理する。染色した精子細胞サンプルを次いで、フローサイトメトリー分析により、融解または死数％について評価し、そして運動性を、１４０μｌのＥＺ混合液またはＫＭＴを用いて２０μｌの染色した精子細胞の各サンプルをさらに希釈することにより評価した。
【００３６】
図１をここで主に参照すると、染色濃度が増加するにつれて、精子細胞（特にウマの精子細胞）の総合的運動性および直進性運動性は減少し、精子細胞の死数％は増加し、そしてフローサイトメトリー技術のＹ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞を分離する能力は高まる。
【００３７】
本発明の精子細胞操作システムは、特定の種から得た精子細胞に関する一般的な技術において使用される染色濃度の範囲、または開示されているような染色濃度の他の範囲と比較して、染色した精子細胞の総合的運動性または直進性運動性の増強、フローソートの間のＹ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離の増強；または精子細胞の死数％における減少を提供する染色濃度の範囲を含み得る。特に本発明のウマの用途について、総合的運動性または直進性運動性の増強、フローソートの間のＹ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離の増強；または染色した精子細胞サンプルにおける精子細胞の死数％の減少を提供し得る染色濃度の範囲は、約５０×１０６精子／ｍＬ、２．６μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ；５０×１０６精子／ｍＬ、３．９μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔとの間であり得る。他方、結果があまり好ましくない染色濃度の範囲は、１５０×１０６精子／ｍＬ、７．８μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ〜約４５０×１０６精子／ｍＬ、２３．４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔまでの間であり得る。
【００３８】
図２をここで主に参照すると、ＫＭＴ中で希釈された精子細胞は、新鮮な精子サンプルおよび室温でしばらく保存された（例えば、室温で１８時間）精子サンプルの両者に対してより運動性が残っていることが理解され得る。
【００３９】
本発明はさらに、新鮮な精子細胞、しばらく保存した（例えば、１８時間までまたはそれより長く）精子細胞、あるいは、第一の場所（例えば、精子細胞をオス哺乳動物から得た場所）から第二の場所または複数の場所（オス哺乳動物から得た精子細胞をさらに操作する場所（精子細胞の計算、Ｙ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離、もしくは人工受精のための精子のストロー製品を含むがこれに限定はされない製品を含む精子細胞の調整（選別されるか、または選別されない）が生ずる場所）あるいは第二の場所または複数の場所（哺乳動物のメスの一種の受精が生ずる場所、卵子がインビトロで受精する場所、など）へ移動または輸送した精子細胞の総合的運動性および直進性運動性を高めるために、増量剤としてＫＭＴの使用をさらに含み得る。
【００４０】
（実施例５）
三頭の種馬からの射精液内の精子細胞を始めに、容量、濃度、および運動性について調べた。各射精液の一部の残りは、２５×１０６精子細胞／ｍＬとなるようにＫＭＴ内に希釈し、そして１８時間室温で保存した。保存した射精液は、６００ｇで１０分間遠心することによりペレット化した。ペレット化した精子細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔを伴うＫＭＴ内に４００×１０６精子細胞／ｍＬ、１２．４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔの精子細胞サンプルとなるように再懸濁し、７．１ｐＨまたは７．９ｐＨのいずれかに調製し、次いで３４℃で３０分間または６０分間のいずれかの間インキュベートした。染色した精子細胞サンプルは、１．５μｌ／ｍＬの５％赤食用色素を伴う１ｍＬ  ＫＭＴ；２．０μｌ／ｍＬの５％赤食用色素を伴う１ｍＬ  ＫＭＴ；２．５μｌ／ｍＬの５％赤食用色素を伴う１ｍＬ  ＫＭＴ；または３．０μｌ／ｍＬの２％赤食用色素を伴う１ｍＬ  ＫＭＴのいずれかを用いて希釈した。精子細胞サンプルを次いで、フローサイトメトリー分析により、死数％および分離について調べ、ならびに運動性について、処理されたサンプルをさらに１４０μｌ  ＫＭＴ：２０μｌ精子細胞；１４０μｌ  ＫＭＴ  ２ｍＭカフェイン：２０μｌ精子細胞；１４０μｌ  ＫＭＴ、２．５ｍＭ  ＮａＰｙｒｕｖａｔｅ：２０μｌ精子細胞のいずれかに希釈することにより調べた。
【００４１】
【表４】
2005533501.tif 000005
【００４２】
【表５】
2005533501.tif 000006
【００４３】
【表６】
2005533501.tif 000007
【００４４】
【表７】
2005533501.tif 000008
【００４５】
【表８】
2005533501.tif 000009
【００４６】
【表９】
2005533501.tif 000010
図３をここで主に参照すると、高いｐＨで染色している精子細胞は、フローサイトメトリー分析により調べた際の死精子細胞％を減少させ得ることが理解され得る。
【００４７】
図４をここで主に参照すると、精子細胞を染色するためのインキュベーション時間を一般的な時間の６０分間から３０分間へと短縮させることは、死精子細胞％を減少させ得、ならびにフローサイトメトリーの間におけるＹ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離能を高め得ることが理解され得る。
【００４８】
図５をここで主に参照すると、刺激物（例えば、約２ｍＭの濃度のカフェイン）を添加することは、精子細胞における運動性を刺激し得、ならびに特にストレスを与えたウマ精子細胞を刺激することにおいて効果的であり得ることが理解され得る。
【００４９】
従って、本発明はさらに、その溶液内で哺乳動物の一種のオスから収集した精子細胞を蛍光色素（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ）を用いて染色を行う、その溶液のｐＨを調整する工程を包含し得る。染色溶液のｐＨは、特定の精子細胞サンプルにとって望ましいｐＨまたは染色した精子細胞サンプルの特定のタイプにおける死数％が減少または最小となるｐＨを選択するため、約７．２ｐＨ〜８．０ｐＨの間まで高められ得る。特に、ウマ雄から収集した精子細胞に関しては、染色溶液のｐＨは、約７．５ｐＨ〜８．０ｐＨの間まで高められ得ならびに特に染色した精子細胞サンプルにおける死ウマ精子細胞％を減少させるため７．９ｐＨであり得る。
【００５０】
本発明はさらに、精子細胞を、染色した精子細胞サンプルにおける死数％を減少させるために、または運動性を増加させるために、またはフローソートまたは他のＤＮＡ含有量に基づいて選別する際、Ｙ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離能を高めるために、染色溶液の中でインキュベートする時間を短縮させる工程を包含し得る。本発明において使用した用途に依存して、精子細胞を染色溶液に曝すか、染色溶液内でインキュベートするか、または、そうでなければ染色溶液内に懸濁する時間を、実質的に短縮させ得る。この時間の短縮率は、一般的に使用される時間量から１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上であり得；またはフローソート中の分離能を有意に減少させることなく、蛍光色素を用いて染色することによる死精子細胞数を減少させる時間の減少であり得；または染色したサンプルにおける精子細胞の死数％が有意に増加することなくフローソート中の分離能を高める結果を生ずる時間の短縮であり得る。ウマ精子細胞サンプルが、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔの染色溶液内でインキュベートされる（上記）時間の量は、より大きなフローソートする分離能を得るため、または精子細胞の死数％を減少させるため、約２５分間〜約５０分間との間であり得、そして特に３０分間であり得る。実際の時間の短縮は、染色する直前の精子細胞の集団内における運動性、精子細胞の死数％、および流動選別分解能との間に望ましいバランスを与えるために決定され得る。
【００５１】
本発明はさらに、精子細胞サンプルに刺激物を加える工程を包含し得る。この刺激物は、カフェイン、またはカフェインに類似する刺激物、または精子細胞の運動性もしくは他の精子細胞機能もしくは性質（力学的または生理学的いづれにせよ）を高める刺激物であり得る。刺激物は、精子細胞を操作工程（例えば、保存、輸送、希釈、流動選別、受精、等）に曝す前または曝した後に添加され得る。特に、約１ｍＭと約５ｍＭとの間の濃度のカフェインを使用し得、そして特にウマ精子細胞に関しては、２ｍＭ濃度のカフェインを使用し得る。
【００５２】
（実施例６）
十頭の種馬からの射精液を始めに、容量、精子細胞濃度、および運動性について調べた。各射精液の一部の残りは、Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４  ＫＭＴを用いて調製したＫＭＴまたはＮａＨ２ＰＯ４（ＫＭＴ−ｍｏｄ．）を用いて調製したＫＭＴのいずれかに２５×１０６精子細胞／ｍＬとなるように希釈し、そして１８時間、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃で保存した。操作する精子細胞の１００μｌのアリコートは次いで、１００μｌのＫＭＴまたは１００μｌのＫＭＴ、４ｍＭのカフェインを用いて希釈し、そして精子細胞の運動性を調べた。各サンプルの操作する精子細胞の一部の残りを、６００ｇで１０分間遠心した。その上澄みを約０．７５ｍｌ吸引し、そしてペレット化した精子細胞を、その容量に再懸濁した。遠心後、操作する精子細胞の運動性を、５２０μｌのＫＭＴまたは５２０μｌのＫＭＴ、２ｍＭのカフェインのいずれかを用いて、各サンプルの２０μｌを希釈した後、調べた。
【００５３】
７．１ｐＨに調製された各操作群の２００×１０６精子細胞／ｍＬ、１２．４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔであるアリコートを、３４℃で６０分間インキュベートした。染色した精子細胞サンプルは、１．５μｌ／ｍＬの５％赤食用色素を伴う１ｍＬのＫＭＴを用いて希釈した。希釈度が大きいサンプルは次いで、３ｍＬのＫＭＴまたは３ｍＬのＫＭＴ−ｍｏｄ．および２２ｍＬの５ｍＭ  ＨＢＧＭ−３を１７５μｌの染色した精子（１００×１０６精子細胞／ｍＬ）に加えることにより調製した。
【００５４】
操作する精子細胞サンプルを次いで、フローサイトメトリー分析により、死数％および分離について調べ、そして運動性について、操作するサンプルをさらに１４０μｌ  ＫＭＴ：２０μｌ精子細胞；または１４０μｌ  ＫＭＴ  ２ｍＭカフェイン：２０μｌ精子細胞へ希釈することにより調べた。
【００５５】
【表１０】
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【００５６】
【表１１】
2005533501.tif 000012
【００５７】
【表１２】
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【００５８】
【表１３】
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【００５９】
【表１４】
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【００６０】
【表１５】
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【００６１】
【表１６】
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【００６２】
【表１７】
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【００６３】
【表１８】
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【００６４】
【表１９】
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【００６５】
【表２０】
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図６をここで主に参照すると、精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性は、ＮａＨ２ＰＯ４を用いて調製された改変したＫＭＴの使用により生じた結果を示す。
【００６６】
図７をここで主に参照すると、操作工程（例えば、流動選別するために染色すること）および精子細胞を希釈する工程の後の精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性は、精子細胞を刺激物（例えば、カフェイン）に曝しても、曝さなくても、ＮａＨ２ＰＯ４を用いて調製された改変したＫＭＴの使用により、増加し得ないことが理解され得る。
【００６７】
図８をここで主に参照すると、温度は、総合的な運動性および直進性の運動性を高めるために、哺乳動物の一種のオスからから得た精子細胞の保存、操作、移動、または輸送に合わせて調節され得ることが理解され得る。哺乳動物の特定種由来のいくつかの精子細胞に関しては、約１５℃で、保存、操作、移動、または輸送することは、精子細胞または刺激した精子細胞の総合的な運動性または直進性の運動性の最も高いレベルを維持し得る。
【００６８】
図９をここで主に参照すると、精子細胞を、染色プロトコールの前に移動、保存、または操作する（上記）温度を、精子細胞、または刺激した精子細胞、またはカフェインを用いて刺激した精子細胞の総合的運動性または直進性運動性を増加させるため調節し得ることが理解され得る。本発明の特定の実施形態（ウマ精子細胞を操作、保存、移動または輸送することを含む）に関して、約５℃〜約２５℃の間である温度は、精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性を高め得る。さらに、本発明に従って処理した刺激した精子細胞（ウマ精子細胞を、カフェインを用いて刺激するか、操作するか、保存するか、または移動させることを含む、本発明の実施形態を含む）に関しては、５℃〜約２０℃との間である温度はまた、総合的な運動性および直進性の運動性を高め得る。特に、刺激したウマ精子細胞を操作するために使用される本発明の実施形態は、刺激したウマ精子細胞の操作、保存、または移動を行うため約１０℃〜約１５℃との間の温度を含む。
【００６９】
図１０をここで主に参照すると、精子細胞を、染色プロトコールの前に移動、保存、または操作する（上記）温度が、染色プロトコールの後、精子細胞、または刺激した精子細胞、またはカフェインを用いて刺激した精子細胞の総合的運動性または直進性運動性を増加させるため調節され得るということを理解し得る。本発明の特定の実施形態（ウマ精子細胞を操作、保存、移動または輸送することを含む）に関しては、約５℃から約２０℃との間である温度は、染色プロコールの後の精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性を高め得る。さらに、本発明に従って処理した刺激した精子細胞（ウマ精子細胞を、カフェインを用いて刺激するか、操作するか、保存するか、または移動させることを含む、本発明の実施形態を含む）に関しては、５℃〜約２０℃との間である温度はまた、総合的な運動性および直進性の運動性を高め得る。特に、刺激したウマ精子細胞を操作するために使用される本発明の実施形態は、刺激したウマ精子細胞の操作、保存、または移動を行うため約１０℃〜約１５℃との間の温度を含む。
【００７０】
図１１をここで主に参照すると、染色後の精子細胞の死数％（上記）が、１５℃で精子細胞を保存または輸送することにより減少し得ることを理解し得る。
【００７１】
（実施例７）
十二頭の種馬からの射精液を始めに、容量、精子細胞濃度、および運動性について調べた。各射精液の一部の残りを、ＫＭＴ内に２５×１０６精子細胞／ｍＬとなるように希釈し、そして１８時間、１５℃で保存した。保存後の運動性を、次いで１００μｌのＫＭＴ、４ｍＭのカフェインを用いて希釈する操作する精子細胞の１００μｌのアリコートを使用することにより調べた。各サンプルの操作する精子細胞の一部の残りを、６００ｇで１０分間遠心した。その上澄みを約１．５０ｍＬになるまで吸引し、そしてペレット化した精子細胞を、その容量に再懸濁した。操作する精子細胞は、４００×１０６精子細胞／ｍＬとなるように希釈し、アリコートは以下の操作：
１．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、８．６８μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
２．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、１０．５４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
３．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、１２．４４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
４．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、８．６８μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
５．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、１０．５４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で３０分間インキュベートする
６．２００×１０６精子細胞／ｍＬ、１２．４４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で３０分間インキュベートする
７．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、４．３４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
８．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、５．２７μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
９．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、６．２２μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で６０分間インキュベートする
１０．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、４．３４μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で３０分間インキュベートする
１１．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、５．２７μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で３０分間インキュベートする
１２．１００×１０６精子細胞／ｍＬ、６．２２μｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ７．１ｐＨ、３４℃で３０分間インキュベートする
のために染色チューブに移動させた。
【００７２】
各染色した精子細胞のサンプルを、ＫＭＴ、０．７５μｌ／ｍＬ  ５％赤食用色素を用いて７５×１０６精子細胞／ｍＬとなるように希釈した。高い希釈のサンプルは次いで、３ｍＬ  ＫＭＴおよび２２ｍＬ  ５ｍＭ  ＨＢＧＭ−３を２３４μｌの染色した精子細胞サンプル（７５×１０６精子細胞／ｍＬ）に加えることにより調製した。各染色した精子細胞サンプルを次いで、フローサイトメトリー分析により死数％および分離について調べ、そして運動性を、ＫＭＴおよびＫＭＴ、２ｍＭカフェイン内で調べた。
【００７３】
高希釈サンプルを次いで、３ｍＬ  ＫＭＴおよび２２ｍＬ  ５ｍＭ  ＨＢＧＭ−３を２３４μｌの染色した精子細胞サンプル（７５×１０６精子細胞／ｍＬ）に加えることにより調製し、室温で約１．５時間インキュベートした。高希釈精子細胞サンプルを次いで、ＫＭＴおよびＫＭＴ、４ｍＭカフェイン内の運動性について評価した。
【００７４】
図１２をここで主に参照すると、染色中の精子細胞濃度が、約１００Ｍ／ｍＬ対２００Ｍ／ｍＬであるとき、精子細胞は、分離で損失することなく、より生存し続けることを理解し得る。
【００７５】
精子細胞操作システムの発明の特定の実施形態はさらに、精子細胞を減じる、最小化する、または染色後のサンプル内の死数％が、精子細胞の希釈のさらなる増加で減少しない精子細胞の濃度を得るために約７５Ｍ／ｍｌと２００Ｍ／ｍｌとの間となるように一種の哺乳動物のオスから収集した精子細胞を希釈する工程を包含し得る。特に、本発明のいくつかの実施形態に関して、精子細胞の濃度は、上記染色手順に続くフローサイトメトリーにより調べた際に死数％を減少させるため、２００Ｍ／ｍｌ未満であり得ならびにウマ精子細胞に関しては、約１００Ｍ／ｍｌであり得る。
【００７６】
図１３をここで主に参照すると、染色濃度を高めるにつれて、より少数の精子細胞が生存し、ならびに分離能は増加することを理解し得る。
【００７７】
図１４をここで主に参照すると、染色時間が、フローサイトメトリーにより評価するＸ染色体保有精子細胞集団およびＹ染色体保有精子細胞集団との間の分離能を損失することなく、実質的に短縮され得ることを理解し得る。
【００７８】
従って、本発明の実施形態はさらに、染色した精子細胞サンプル内の死数％が実質的にさらに減少しなくなるまで、上記染色プロトコール内で使用する染色濃度を減少させる工程を含み、そしてさらにＹ染色体保有流動細胞からＸ染色体保有精子細胞の分離能が、６０％未満の純度；または必要なまたは望ましくは、例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９８％未満の％純度；またはオス哺乳動物のその種由来の精子細胞のために達成し得る濃度未満の選別された精子細胞；あるいは約５００選別／秒から約１０００選別／秒との間、約７５０選別／秒から約１２５０選別／秒との間、約１０００選別／秒から約１５００選別／秒との間；約１２５０選別／秒から約１７５０選別／秒との間；約１５００選別／秒から約２０００選別／秒との間；約１７５０選別／秒から約２２５０選別／秒との間；約２０００選別／秒から約２５００選別／秒との間；約２２５０選別／秒から約２７５０選別／秒との間；約２５００選別／秒から約３０００選別／秒との間；約２７５０選別／秒から約３２５０選別／秒との間；約３０００選別／秒から約３５００選別／秒との間；約３２５０選別／秒から約３７５０選別／秒との間；約３５００選別／秒から約４０００選別／秒との間；約３７５０選別／秒から約４２５０選別／秒との間；約４０００選別／秒から約４５００選別／秒との間；約４２５０選別／秒から約４７５０選別／秒との間；約４５００選別／秒から約５０００選別／秒との間以上の選別速度で、Ｘ染色体保有するものまたは、Ｙ染色体保有するものの内一つまたは両方を別のものから選別する流れ以上を、生じるまで使用する染色濃度を減少させる工程を含み得る。
【００７９】
（実施例８．雌雄識別し凍結した精液を用いた雌ヘラジカの受精）
コロラドおよびミネソタの３齢から６齢の雌ヘラジカを、１２日から１４日の間、膣へのプロゲストロンＣＩＤＲの挿入により、９月に発情期を同調させた。ＣＩＤＲを除去し、ｅＣＧの２００ＩＵを、筋肉内に投与し、そしてヘラジカを、６０時間後に時間を合わせ、受精させた。新鮮な精液を、５齢の雄ヘラジカから電気−射精を介して収集し、そして純射精液として、精子−選別研究室への輸送のため約２０℃まで４時間をかけてゆっくりと冷却した。射精液は、１５，０００×ｇで１０秒間、１．５ｍｌのアリコートを遠心することにより、染色するために１×１０９精子／ｍｌまで濃縮した。精液を、１１２μＭ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２内、２００×１０６精子細胞／ｍｌでＴＡＬＰ培地内において３４℃で４５分間、インキュベートし、次いで選別するために１００×１０６／ｍｌまで希釈した。精子を、Ｘ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子のＤＮＡ含有量の違いに基づいて選別した。Ｘ染色体保有ヘラジカ精子は、Ｙ染色体保有精子よりも３．８％多いＤＮＡを含んだ。精子を、ＴＲＩＳ−ベースのシース液を用いて５０ｐｓｉでＭｏＦｌｏ（登録商標）ＳＸオペレーティングを使用し、４時間にわたってフローソートした。アルゴンレーザーの３５１および３６４バンド（１５０ｍＷを放出し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素を励起する）を、ＤＮＡに対し結合させた。Ｘ染色体保有精子およびＹ染色体保有精子の両者を収集した（ＤＮＡに対し超音波操作した精子アリコートを再分析することにより約９２％の純度として確認した）ものを、２０％卵黄−ＴＲＩＳ増量剤を２ｍｌ含むチューブへ、約４，７００精子／秒で収集した。選別した１５ｍｌの容量を連続的に収集した。各性別の約１１０×１０６精子を選別し、９０分間にわたって５℃まで冷却した。増量剤を含む等量のグリセロール（１２％）を、選別する容量とするために５℃で加えた。３０ｍｌを含む選別した精子アリコートを、８５０×ｇで２０分間、４℃で遠心することにより濃縮した。精子ペレットを、貯蔵し、２１．７×１０６精子細胞／ｍｌとなるように調整し、そして０．２５ｍｌのストローにロードした。５×１０６全精子を含む各ストローを、液体窒素の蒸気内で凍結した。コントロールとして、同じ射精液由来の５×１０６全精子を、性識別した精子と同様に、同時に０．２５ｍｌのストロー内で凍結した。３７℃で３０秒間解凍した後、精子の６５％および６０％（コントロールおよび性識別したもの、それぞれ）は、目測により決定される運動性を徐々に有した。３つの異なる場所および３つの異なる管理計画で雌ヘラジカを、慣用的な経−子宮頸部（ｔｒａｎｓ−ｃｅｒｖｉｃａｌ）精液沈着を用いて子宮体内で受精させた。妊娠を、妊娠−特異的プロテインＢ（Ｂｉｏ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｉｄａｈｏ）について血液を分析することにより受精後４０日に決定した。一つの場所における１０頭の雌ヘラジカを、受精の時に貧状態とし、そして妊娠は、性識別した精子およびコントロールの精子のいずれを用いても、達成しなかった。性識別した精子を用いた他の位置における妊娠率（６１％；１１／１８）は、コントロールの受精における妊娠率（５０％；３／６）と類似した。これらの妊娠率（��識別した精子およびコントロールの精子）は、一般的なヘラジカの人工授精において使用するよりもより少量の精子より生じた。１１頭中９頭（８２％）の性識別された子ヘラジカは、予測された性別であった。
【００８０】
本発明はさらに、任意の上記本発明の実施形態に基づいて産生された哺乳動物を含み得、または本発明の様々な実施形態（Ｘ染色体保有精子細胞の富化された集団または、Ｙ染色体保有精子細胞の富化された集団を有する精子細胞人工授精サンプル、または哺乳動物の特定種を用いる受精に対して使用する一般的な数と比較して少数の精子細胞を含む精子細胞受精サンプルを使用する本発明の任意の実施形態に基づいて産生された哺乳動物、または、上記のような本発明に基づいて産生されたヘラジカ子孫を提供する）に基づく哺乳動物の性別の事前決定を含み得る。
【００８１】
前述から容易に理解され得るように、本発明の基本的な概念は、様々な方法で具体化され得る。それは、精子細胞操作を成し得る技術および装置の両方含んでいる両精子細胞操作システムを含む。本出願において、様々な精子細胞操作技術を、記載した様々な装置により達成されることを示す結果の一部として、および本来的に利用するための工程として開示する。それらは単に、意図したようにおよび記載したように装置を利用したことによる当然の結果である。さらに、いくつかの装置を、開示する一方で、これらは特定の方法により達成されるだけではなく、複数の方法に変化し得るものであると理解すべきである。重要なことは、前述の全てに対するのと同様に、これらの一面の全ても、この開示により包含されると理解すべきである。
【００８２】
この非暫定的な用途を含む議論が、基本的な記載として役立つことを意図する。読者は、特定の議論が可能な全ての実施形態を明確に記載したものではないかもしれないことに気づくべきである；多くの代替方法を、潜在的に含む。また、本発明の全ての性質を完全に説明しておらず、ならびに、いかに各特徴またはエレメントが実際に、幅広い機能または非常に様々な代替方法または等価のエレメントを表すものであるか明確に示していないかもしれない。さらに、これらは、暗黙的に本明細書中の開示内に含まれる。本発明を、装置−優先の用語で記載する場合、装置の各エレメントは、暗黙的に機能を果たす。装置の請求項は、記載した装置を含むだけではなく、方法およびプロセスの請求項も、本発明および各エレメントが果たす機能を扱うため含まれ得る。概要および用語を、請求の範囲に限定することを意図しない。
【００８３】
さらに、本発明の様々な各エレメントおよび特許請求の範囲また、多様な様式により達成し得る。本開示は、そのような各バリエーションを含むものとして理解すべきであり、任意の装置実施形態、方法実施形態またはプロセス実施形態のバリエーション、または単にさらにこれらの任意のエレメントのバリエーションの実施形態のはずである。特に、開示が本発明のエレメントに関する場合、各エレメントに対する言葉は、等価な装置の用語または等価な方法の用語（たとえ機能または結果のみが、同一であっても）により表現され得る。そのような等価な用語、幅広い用語、またはより一般的でさえある用語は、各エレメントまたは作用の記載内に含まれると考えるべきである。そのような用語は、本発明が権利化されたところに内在する広い範囲を明らかにすることが望まれた場合に置換され得る。一つの例として、全ての作用は、作用を獲得するための手段として、または作用を生じるエレメントとして表現され得ると理解すべきである。同様に、開示した各物理学的なエレメントは、物理学的なエレメントが容易にする作用の開示を含むと理解すべきである。この最終の局面に関しては、一つの例として、「フローソーター」の開示は、「フローソート（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｉｎｇ）」の作用の開示を含むと理解すべきであり（明確に討議されようとされまいと）、逆に、「フローソート」の作用の効果的な開示があり、そのような開示は、「フローソーター」および「フローソートの手段」さえの開示を含むと理解されるべきである。そのような変更および代替的な用語は、記載内に明確に含まれるものと理解されるべきである。
【００８４】
本特許出願内で述べる任意の原理、規則、調節、もしくは法則の作用、または本特許出願内で述べる特許、刊行物、もしくは他の参考文献は、参考として本明細書中に援用する。さらに、各用語の使用に関して、本出願中その用語の利用が、そのような解釈に矛盾しない場合は、一般的な辞書の定義が、各用語、ならびに参考として、本明細書中に援用され、全ての定義、代替用語、および同意語（例えば、ｔｈｅ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｏｕｓｅ  Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第二版に含まれる）が参考として援用されるものとして理解すべきであると、理解すべきである。
【００８５】
そのため、出願人は、少なくとも、ｉ）本明細書中に開示しおよび記載したような各精子細胞操作装置、ｉｉ）開示しおよび記載した関連方法、ｉｉｉ）各これら装置および方法の類似物、等価物およびさらに黙示のバリエーション、ｉｖ）開示しおよび記載したように示した各機能を果たすそれら代替的な設計、ｖ）開示しおよび記載した機能を果たすように黙示された各機能を達成するそれら代替的な設計および方法、ｖｉ）別個の発明および独立の発明として示した各特徴、構成要素、および工程、ｖｉｉ）開示した様々なシステムまたは構成要素により高められる用途、ｖｉｉｉ）前記システムまたは構成要素により産生する結果産物、およびｉｘ）実質的に本明細書中前記したようなおよび任意の付随的な実施例を参照した方法および装置、ｘ）開示した各エレメントの様々な組み合わせおよび様々な置換、およびｘｉ）提示した各独立した請求項もしくは概念および全ての独立した請求もしくは概念に依存するような潜在的に従属的な各請求項もしくは概念を特許請求するとして理解すべきである。これに関して、実際的理由からおよび潜在的な数百の請求項を加えることを回避するために、出願人は、初めに従属するものだけを伴う請求項を最終的に請求し得るものと理解すべきである。支持は、任意の他の独立の請求項または概念の下、従属するものまたはエレメントとして、一つの独立の請求項または概念の下、提示した任意の様々な従属するものまたは他のエレメントの付加を認める新規事項の法律（欧州特許条約法１２３（２）および米国特許法３５  ＵＳＣ  １３２または他のそのような法が挙げられるがそれらに限定されない）の下必要とされる程度まで存在するものと理解すべきである。さらに、移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用（使用された場合、または使用された時）は、従来の特許請求の範囲の解釈に基づいて、本明細書中の「追加設定型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄ）」請求項を維持するために使用する。そのため、文脈上他の意味を求める場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはバリエーション（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、任意の他のエレメントまたは工程またはエレメントの群または工程の群を排除せず、明確に規定されたエレメントまたは工程またはエレメントの群または工程の群を含むことを意図すると理解すべきである。そのような用語は、出願人に法律的に認められ得る最も広い適用範囲が与えられるように、最も広範な様式で解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、染色剤濃度が増加するにつれて精子細胞の総合的な運動性および直進性の精子細胞の運動性の低下、死精子細胞％の増加、およびＹ染色体精子細胞からＸ染色体保有精子細胞を分離するためのフローサイトメトリー技術の能力の増加を示すグラフを提供する。
【図２】図２は、ＫＭＴ内に希釈された精子細胞は、新鮮な精子サンプルおよび室温で一定期間（例えば、室温で１８時間）保存された精子細胞の両者に関して、より高い運動性を残していることを示すグラフを提供する。
【図３】図３は、より高いｐＨで精子細胞を染色することは、染色された精子細胞サンプルにおける死精子細胞％を減少させ得かつ、フローサイトメトリー分析による評価の際の分離度を高め得ることを示すグラフを提供する。
【図４】図４は、染色のインキュベーション期間を慣用的期間６０分から約３０分のインキュベーション期間へ減少させることは、染色された精子細胞サンプルにおける運動性を高め得、かつ死精子細胞％を減少し得、染色された精子細胞のフローソーティングの間にＹ染色体保有精子細胞からＸ染色体保有精子細胞を分離することを増大し得ることを示すグラフを提供する。
【図５】図５は、刺激物（例えば、カフェイン）の添加は、精子細胞における運動性を高め得ることを示すグラフを提供する。
【図６】図６は、ＮａＨ２ＰＯ４を用いて調製された改変ＫＭＴの使用に関する精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性を示すグラフを提供する。
【図７】図７は、精子細胞の総合的な運動性および直進性の運動性は、精子細胞が刺激物（例えば、カフェイン）に曝されてもいなくても、ＮａＨ２ＰＯ４を用いて調製された改変ＫＭＴを使用することにより高められ得ることを示すグラフを提供する。
【図８】図８は、温度が、総合的な運動性および直進性の運動性を高めるため精子細胞（哺乳動物の一種のオスから得たもの）を保存、操作、移送、または輸送のために調節され得ることを示すグラフを提供する。
【図９】図９は、染色手順より前に精子細胞が移送され、保存され、または操作される温度は、精子細胞または刺激された精子細胞、またはカフェインを用いて刺激された精子細胞の総合的な運動性もしくは直進性の運動性を高めるために、調整され得ることを示すグラフを提供する。
【図１０】図１０は、染色手順より前に精子細胞が移送され、保存され、または操作される温度は、染色手順の後の精子細胞または刺激された精子細胞、またはカフェインを用いて刺激された精子細胞の総合的な運動性もしくは直進性の運動性を高めるために、調整され得ることを示すグラフを提供する。
【図１１】図１１は、染色された精子細胞サンプルにおける死精子細胞％は、１５℃で精子細胞を保存または移送することにより減少させ得ることを示すグラフを提供する。
【図１２】図１２は、精子細胞は、染色中の精子細胞濃度が、フローサイトメトリー分離の損失は除き約１００Ｍ／ｍＬであるとき、２００Ｍ／ｍＬに対して、より高い生存度のままであり得ることを示すグラフを提供する。
【図１３】図１３は、染色剤の濃度を増加するにつれて、より少数の精子細胞しか生存しないことおよび分離度は高まることを示すグラフを提供する。
【図１４】図１４は、染色時間は、フローサイトメトリーにより評価される精子細胞のＸ染色体保有集団とＹ染色体保有集団との間の分離度を損失することなく実質的に減少させられ得ることを示すグラフを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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