(57)【要約】ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と試験物質を、水酸化酵素の基質の存在下、試験物質の不在下で基質中のアスパラギンが水酸化される条件下で接触させるステップ、及び基質の水酸化を決定するステップを含む、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）の水酸化を調節する作用物質を同定する方法。基質は、ＨＩＦ−１αを含むＨＩＦポリペプチド、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３又はＨＩＦ−１αのペプチド類似体を含むその断片、又はＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に同等なアスパラギンを含むその断片が好ましく、その場合Ａｓｎ８０３又は前記同等のアスパラギンの水酸化を決定する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）の水酸化を調節する作用物質を同定する方法であって、
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と試験物質を、前記水酸化酵素の基質の存在下、前記試験物質の不在下で前記基質中のアスパラギンが水酸化される条件下で、接触させるステップ、及び
前記基質の水酸化を決定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記基質が、ＨＩＦポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＩＦポリペプチドが、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３を含むその断片、又は、ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に同等のアスパラギンを含むＨＩＦ−１αのペプチド類似体若しくはその断片を含み、且つＡｓｎ８０３又は前記同等のアスパラギンの水酸化を決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、ヒトＨＩＦ−１α配列のＣＡＤ領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも６０％の相同性を有し、且つＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を有するその変異体、又は
（ｃ）ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を有するそのどちらかの断片を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、請求項３に記載のＨＩＦポリペプチドを含み、且つ前記基質の水酸化が、前記ＨＩＦポリペプチドとｐ３００のＣＨ１領域との間の相互作用をモニタリングすることによって決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質の水酸化が、ｐ３００のＣＨ１領域との相互作用、ＨＩＦが媒介する転写、又はＨＩＦが調節するプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現から選択される、ＨＩＦが関連する活性をモニタリングすることによって決定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
さらに、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素のモジュレーターとして同定された作用物質を薬剤として許容されるレシピエントと共に処方するステップを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記請求項のいずれか一項に記載のアッセイ方法によって同定した作用物質。
【請求項１０】
療法によってヒト又は動物体を治療する方法に使用するための、請求項９に記載の作用物質、請求項５に記載のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素、請求項５に記載のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
ＨＩＦレベル又は活性の増加又は低下に伴う状態の治療、或いはＨＩＦ活性の調節が所望される状態の治療のための薬の製造における、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性のモジュレーター、請求項９に記載の作用物質、請求項５に記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターの使用。
【請求項１２】
前記状態が、虚血、創傷治癒、自家移植、同種移植、及び異物移植、全身性高血圧症、癌、炎症性疾患、並びに糖尿病からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素のモジュレーターが、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素ポリペプチドの選択的阻害剤であり、且つ前記状態がＨＩＦレベル又は活性の低下に伴う状態である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
治療有効量の請求項９に記載の作用物質、請求項５に記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリペプチドの活性のモジュレーター、請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含むベクターをそれを必要とする個体に投与するステップを含む、ＨＩＦ活性の増加又は低下に伴う状態、又はＨＩＦ活性の調節が所望される状態を治療する方法。
【請求項１５】
細胞をＨＩＦ水酸化酵素のアスパラギン水酸化酵素活性を阻害する物質と接触させるステップを含む、細胞中のＨＩＦが媒介する活性を調節する方法。
【請求項１６】
ＨＩＦ−αのアスパラギン残基の水酸化プロモーターのアッセイであって、
低酸素状態下でＣＡＤ結合部分を含むＨＩＦ−α又はその断片を得るステップであって、前記ＨＩＦ−α又はその断片が前記ＣＡＤ領域中にアスパラギン残基を含むステップ、
推定上の水酸化促進剤を得るステップ、及び
前記作用物質が前記アスパラギンを水酸化するかどうかを決定するステップ
を含むアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）に作用し、ＨＩＦ関連活性の活性化に関与する水酸化酵素（ヒドロキシラーゼ）に関する。本発明は、そのような水酸化酵素のモジュレーター、及び治療方法におけるその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の低酸素状態は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）と称する転写複合体の誘導によって広範な恒常性応答を活性化させる。ＨＩＦは、α−及びβ−サブユニットのヘテロ二量体であり、α−サブユニットの翻訳後修飾によって媒介される二酸素（ｄｉｏｘｙｇｅｎ）の利用能によって調節される。哺乳動物細胞中では、少なくとも２つのＨＩＦ−αサブユニットアイソフォーム（ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２α）が二酸素濃度によって調節される。ＨＩＦ−α蛋白質はそれぞれ、蛋白質分解調節用の標的モチーフを含む内部酸素依存性分解領域（ＯＤＤＤ）、及び蛋白質の存在量の変化に関係なく活性化補助因子ｐ３００のＣＨ１領域との相互作用を介して二酸素によって独立に調節されるＣ末端トランス活性化領域（ＣＡＤ）を含む。
【０００３】
蛋白質分解によるＨＩＦ−αの酸素依存性分解は、ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）ユビキチン化複合体によるＨＩＦ−αの認識を媒介する特異的プロリル残基（ヒトＨＩＦ−１αのＰｒｏ−４０２及びＰｒｏ−５６４）の水酸化、その結果生じるプロテアソーム分解によって調節される。構造分析と遺伝子アプローチの組合せによって、ヒトＨＩＦプロリル水酸化酵素の３つのアイソフォーム（ＰＨＤ１〜３、プロリル水酸化酵素領域）が一連の生物での相同物と共に同定された。配列及び突然変異分析と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によって、これらはＦｅ（ＩＩ）のサブファミリー及び２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）依存性酸素添加酵素に属していることが同定された。低酸素状態での酸素の利用能の制限、或いはコバルトイオン及び鉄キレート剤によるＰＨＤ酵素の直接阻害によって、ＨＩＦ−αは水酸化及びｐＶＨＬによる認識から免れることができ、それによってこうした刺激がＨＩＦ−α分解を抑制し、転写カスケードを活性化する機序への洞察が提供される。
【０００４】
以前のＨＩＦ−αのＣＡＤの分析によって、蛋白質分解と同様に、低酸素の作用はコバルトイオン及び鉄キレート剤によっても模倣されることが示唆されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＩＦ−αのＣＡＤの質量分析及び突然変異分析によって、特異的なアスパラギニル残基（ＨＩＦ−１αのＡｓｎ−８０３）が調節的水酸化されることが実証されている。酸素の存在下では、この部位が水酸化されるとｐ３００のＣＨ１領域との相互作用が妨害されるが、低酸素では、修飾が抑制されてｐ３００との相互作用及び転写の活性化が可能になる。このモデルと一致して、ＣＨ１と複合体を形成したヒトＨＩＦ−１αのＣＡＤのＮＭＲ研究から、未修飾のＡｓｎ−８０３が蛋白質間の界面に埋め込まれていることが示唆される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今回、本発明者らは、ＨＩＦ−１α中のＡｓｎ−８０３水酸化が因子抑制ＨＩＦ（ＦＩＨ）によって触媒されることを同定している。Ａｓｎ−８０３が水酸化されると、ｐ３００のＣＨ１領域との相互作用が妨害され、それによってＨＩＦによって媒介された転写の活性化が減少する。
【０００７】
本発明によれば、ＨＩＦのアスパラギン水酸化を調節する作用物質を同定するためのアッセイが提供され、その方法は、
−  ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と試験物質を、水酸化酵素基質の存在下、試験物質の不在下で基質が水酸化される条件下で接触させるステップ、及び
−  基質の水酸化を決定するステップを含む。
【０００８】
本発明は、健常な又は正常な濃度に比して変化したＨＩＦ濃度に伴う状態又は疾患、或いはＨＩＦ活性の改変が所望される状態の治療に、本発明のアッセイによって同定した物質及び本明細書に記載したアスパラギン水酸化酵素のモジュレーターを使用することにも関する。
【０００９】
配列の説明
配列番号１は、ＦＩＨ、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素のヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む。
配列番号２は、ＦＩＨのアミノ酸配列を含む。
配列番号３は、改変ＦＩＨアミノ酸配列を含む。
配列番号４から１３は、実施例で使用したプライマーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の同定に関し、ＨＩＦが媒介する活性のモジュレーターを同定するアッセイ方法へのそのような水酸化酵素の使用を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、本発明に従って使用するためのＨＩＦ水酸化酵素、変異体、又は断片は、ＨＩＦ−１αの１つ又は複数の残基、好ましくはＨＩＦのアスパラギニル残基、特にＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３、又はそのようなアスパラギニルを含んでいるＨＩＦ−１ペプチド類似体若しくはその断片を水酸化する能力を有する。好ましい、本発明によるＨＩＦアスパラギン水酸化酵素変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも６０％の配列相同性を、好ましくは７０％を超える、より好ましくは約８０％を超える、９０％、又は９５％の配列相同性を有する。
【００１２】
本発明は、本発明のポリペプチドの活性部分、断片、誘導体、及び機能的模倣体の使用も含む。ポリペプチドの「活性部分」は、前記全長ポリペプチドより短いが、水酸化酵素活性を保持し、特にＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を維持しているペプチドを意味する。そのような活性断片を融合蛋白質、例えば、異なるすなわち異種リガンドの結合部分を含む蛋白質の一部として含めてよい。
【００１３】
典型的には、配列番号２のアミノ酸配列と約６０％を超える相同性、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の相同性を有するポリペプチドをその蛋白質の変異体としてみなす。そのペプチドがアスパラギン水酸化酵素活性を保持する限り、そのような変異体には対立形質の変異体並びにその蛋白質配列内の単一アミノ酸又はアミノ酸群の欠失、修飾、又は付加を含めてよい。配列番号２の変異体は、ＦＩＨと同じ領域構造、すなわち８本鎖βバレル型ゼリーロールを有することが好ましい。
【００１４】
アミノ酸置換は、例えば、１、２、又は３〜１０、２０、又は３０個が置換されていてよい。保存的置換は、例えば、下表に従ってなされてよい。第２列の同じブロック内のアミノ酸、好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸を互いに置換することができる。
【表１】
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【００１５】
本発明の範囲内の変異体ポリペプチドは、任意の適当な方法によって、例えば、遺伝子シャッフリング（分子育種）技術によっても生成することができる。
【００１６】
短いポリペプチド配列も本発明の範囲に属する。例えば、長さが少なくとも２０アミノ酸、又は５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００アミノ酸のペプチド断片も本発明の範囲に属すると見なされる。特に、ただし排他的ではなく、本発明のこの態様は、蛋白質が完全な蛋白質配列の断片であり触媒領域を表し得る場合、ＨＩＦ−αのＡｓｎ８０３を水酸化が可能な状態を包含する。そのような断片を使用してキメラ分子を構築することができる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾、例えば、翻訳後修飾することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化することができ、又は修飾したアミノ酸残基を含むこともできる。本発明のポリペプチドは、その精製を補助するためにヒスチジン残基を加えること、核への転座を促進するために核局在配列を加えること、又は水酸化又はリン酸化を含む翻訳後修飾によって修飾することができる。そのような改変ポリペプチドも本発明の用語「ポリペプチド」の発明の範囲に属する。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、ＨＩＦなどの基質に対するアスパラギニル水酸化酵素活性アッセイに使用することができる。適当な基質の水酸化に、特にそのような基質のアスパラギニル水酸化に、特にアスパラギン酸などの他の残基の水酸化がほとんど又は皆無な、アスパラギンの特異的水酸化が所望されるような場合にもこのポリペプチドは使用することができる。本発明のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の変異体又は活性断片は、典型的には、以下により詳細に記載するように水酸化酵素活性をモニタリングすることによって同定することができる。
【００１９】
そのようなＨＩＦアスパラギン水酸化酵素は、真核生物のポリペプチド、好ましくは哺乳動物のポリペプチド、より好ましくは配列番号２のポリペプチドなどのヒトのポリペプチドでよい。
【００２０】
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素は、最小限８本鎖からなるゼリーロール（２本鎖ベータへリックス／βバレルゼリーロール）構造を含むのが好ましい。典型的には、ゼリーロール構造は、８本鎖を含むことができるが、挿入は、ゼリーロールのβ鎖４と５の間に存在することが好ましい。ＨＩＦ水酸化酵素は、次の配列を含むのが好ましい。
ＨＸＤ／Ｅ［Ｘ］ｎＨ
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ｎは１〜２００、２０〜１５０、又は３０〜１００アミノ酸であり、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸である。
【００２１】
ＨＩＦアスパラギニル水酸化酵素をコードする本発明によるヌクレオチドは、本発明による蛋白質の生成に有用であり、この生成は試験管内で、生体内で、又は生体外で行うことができる。ヌクレオチドは、組換え蛋白質合成に、又は実際にはそれのみで遺伝子治療技術に使用される治療薬として関与してよい。ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素をコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、アンチセンス配列、又は干渉ＲＮＡは遺伝子治療にも使用することができる。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、背景濃度より高い濃度で配列番号１のコード配列又は同コード配列の相補体とハイブリッド形成することができる。背景ハイブリッド形成は、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に他のｃＤＮＡが存在するために生じ得る。本発明のポリヌクレオチドと、配列番号１のコード配列又は同コード配列の相補体との間の相互作用によって生じたシグナルレベルは、通常、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍であり、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用と同じ強さである。相互作用の強度は、例えば３２Ｐを用いる、例えば放射標識プローブによって測定することができる。選択的ハイブリッド形成は、通常、高ストリンジェンシーに合わせた培地条件を使用して、達成することができる。しかし、そのようなハイブリッド形成は、当技術分野で知られている任意の適当な条件下で実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。例えば、高ストリンジェンシーが必要とされる場合、適当な条件は０．１〜０．２×ＳＳＣで６０℃から６５℃までを含む。低いストリンジェンシーが必要な場合、適当な条件は２×ＳＳＣで６０℃を含む。
【００２３】
配列番号１のコード配列は、ヌクレオチド置換、例えば、１、２、又は３〜１０、２５、５０、又は１００個の置換によって改変することができる。配列番号１のポリヌクレオチドは、１つ又は複数の挿入及び／又は欠失によって、並びに／或いはどちらかの末端又は両端の延長によって代わりに又は加えて修飾することができる。ポリヌクレオチドは、１つ又は複数のイントロンを含めてよく、例えば、ゲノムＤＮＡを含めてよい。一般に、修飾ポリヌクレオチドは、アスパラギン水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする。変性置換を行うことができ、且つ／又は修飾配列が翻訳、例えば、上表に示すように翻訳されたとき、保存的アミノ酸置換をもたらすはずの置換を行うことができる。
【００２４】
一般に、配列番号１のＤＮＡコード配列の相補体に選択的にハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列は、配列番号１のコード配列に少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば、少なくとも４０、少なくとも６０、より好ましくは少なくとも１００個の隣接ヌクレオチドの領域にわたって、又は最も好ましくは配列番号１の全長にわたって、少なくとも５０％、少なくとも５７％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性を有する。ヌクレオチド配列は、ＦＩＨと同じ領域構造を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。
【００２５】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用する（例えば、そのデフォルト設定に使用する）ことができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１２号３８７〜３９５頁）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．第３６号２９０〜３００頁、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５号４０３〜４１０頁に記載されているようにＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは相同性の計算又は（通常、そのデフォルト設定について）配列を並ばせるために使用できる。
【００２６】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して市場で入手することができる。このアルゴリズムは、最初に、検索配列中の長さＷの短い単語をデータベース配列中の同じ長さの単語と並べた場合、ある正の値の閾値スコアＴに適合し又は満足させる単語を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する必要がある。Ｔは、近傍単語スコア閾値を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）。これらの初期近傍単語ヒットは、それらの単語を含むＨＳＰを検出するためのサーチ開始用シードの役割をする。単語ヒットは、累積整合スコアが上昇し得る限り各配列に沿って両方向に伸展する。各方向へ伸びる単語ヒットの伸展は以下の場合に停止する：累積整合スコアがその最高到達値から量Ｘ低下する、１つ又は複数の負のスコア残高整合の蓄積のために累積スコアがゼロ以下に下がる、又はどちらかの配列端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸが、整合の感受性及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして以下を使用する：単語長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９号１０９１５〜１０９１９頁を参照のこと）整合（Ｂ）５０、予測（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較。
【００２７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の近似統計分析を実施する。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０号５８７３〜５７８７頁、並びにＡｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ、（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２６６号４６０〜４８０頁を参照のこと。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供された１つの近似測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、この確率は２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率を表示する。例えば、第１配列と第２配列の比較の最小合計確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、１つの配列は別の配列に近似すると考えられる。
【００２８】
上記の配列相同性及び最小寸法のどんな組合せも本発明のポリヌクレオチドを明示するために使用することができ、よりストリンジェントな組合せ（すなわち、より長い長さにわたるより高い配列相同性）が好ましい。それによって、例えば、２５ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％の配列相同性を有するポリヌクレオチドが本発明の一態様を形成し、４０ヌクレオチドにわたって少なくとも９５％配列相同性を有するポリヌクレオチドも同様である。
【００２９】
本発明は、本発明の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターも含む。そのような発現ベクターは、分子生物学の技術分野で常法に従って構築され、例えば、プラスミドＤＮＡの使用、並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、及び例えば、ポリアデニル化シグナルなどの他の要素を含んでよく、このシグナルは必要である可能性が高く、蛋白質を発現するように正しい向きに配置する。他の適当なベクターは、当業者に明らかなはずである。これについてさらに例として本発明者らは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を挙げる。
【００３０】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡを生成するために上記ベクター中にアンチセンス方向に挿入することもできる。アンチセンスＲＮＡ又は他のアンチセンスポリヌクレオチドは、合成手段によっても生成することができる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のアッセイの試験化合物として使用することができ、或いは療法によって人体又は動物体を治療する方法で使用することができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉で使用される２本鎖ＲＮＡを設計するために使用することもできる。そのようなＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと同じ配列を有する短い２本鎖ＲＮＡを含む。そのような配列を使用してｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。或いは、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素をコードする遺伝子の小断片を得、プラスミド中で連続してクローン化することができる。発現によって所望の２本鎖ＲＮＡが生成される。そのような短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、例えば、アッセイ又は療法において本発明のＨＩＦ水酸化酵素の発現を低減し又は阻害することができる。本発明は、そのようなｓｉＲＮＡにも関する。この水酸化酵素コード遺伝子の保存配列領域を基礎にｓｉＲＮＡ配列を作製することによって、本発明のＨＩＦ水酸化酵素群を阻害するためにそのようなｓｉＲＮＡを設計することができる。或いは、阻害すべき特定の水酸化酵素遺伝子のコード遺伝子に特有の配列を選択することによって、ｓｉＲＮＡを特定のＨＩＦ水酸化酵素に特異的なものにすることができる。
【００３２】
好ましくはベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によってコード配列が発現されるようにする制御配列に動作可能に結合され、すなわちこのベクターは発現ベクターである。用語「動作可能に結合」は、記載成分を所期の方式で機能できるようにする関係にある並置をさす。コード配列に「動作可能に結合」されるプロモーターなどの調節配列は、調節配列と共存できる条件下でコード配列の発現が実現するように配置する。
【００３３】
ベクターは、例えば、複製起点、場合によっては前記ポリヌクレオチド発現プロモーター、及び場合によってはプロモーターのレギュレーターを備えた、プラスミドベクター、ウイルスベクター、又はファージベクターでよい。ベクターは、人工染色体でよい。ベクターには、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、真菌ベクターには耐性遺伝子を含めてもよい。ベクターは、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの生成用にｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができ、或いは宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトし又は形質転換するために使用することができる。ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、遺伝子治療法で使用するために適合させてもよい。
【００３４】
プロモーター及び他の発現調節シグナルを選択して発現を設計するための宿主細胞と共存できるようにすることができる。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｎｍｔｌ及びａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に呼応して誘発され得るメタロチオネインプロモーターを含む。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターやアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用することができる。ＩＲＥＳプロモーターも使用することができる。これらのプロモーターは全て、当技術分野で容易に入手することができる。
【００３５】
β−アクチンプロモーターなどの哺乳動物プロモーターを使用することができる。組織特異的プロモーターが特に好ましい。誘導性プロモーターも好ましい。例えば、低酸素状態誘導性プロモーターを使用することができる。ウイルスプロモーター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、アデノウイルス、（ＨＳＶ  ＩＥプロモーターなど）ＨＳＶプロモーター、又はＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を使用することもできる。ウイルスプロモーターは、当技術分野で容易に入手することができる。
【００３６】
ベクターは、さらに、真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、又はウイルスゲノム配列に相同の配列を含むポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドを側置する配列を含むことができる。これにより相同組換えによって本発明のポリヌクレオチドを真核細胞又はウイルスのゲノム中に導入できるようになる。特に、ウイルスの配列を側置する発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適当なウイルスベクターを調製することができる。相同組換えは、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素をコードする、細胞中の内在配列を撹乱し又は変異させるために使用することもできる。適当なウイルスベクターの他の例には、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びＨＰＶウイルスを含め、単純ヘルペスウイルスベクターやレトロウイルスが含まれる。これらのウイルスを使用する遺伝子転移技術は当業者に知られている。レトロウイルスベクターを使用して、例えば、そのポリヌクレオチドを生じるポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定して組み込むことができる。それとは対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターは、依然としてエピソーム状であり、したがって一過的に発現することができる。
【００３７】
本発明は、本発明のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を発現するように修飾してある細胞も含む。
【００３８】
アッセイ
本発明者らのデータは、ＨＩＦ−αＣＡＤの水酸化が、アスパラギン水酸化酵素によって媒介されることを示している。責任を担う酵素は、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と称しＦＩＨを含む。ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素、特にヒトＨＩＦ水酸化酵素の作用は、ＨＩＦ−αを制御するために新規な標的の代わりを務める。ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を遮断することによって、この酵素はＨＩＦ−αの水酸化を減少させ、それによってｐ３００、特にＣＨ１領域との相互作用を増大させ、したがって転写を活性化する。これが、脈管形成、赤血球新生、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能の促進を含めてよい低酸素又は虚血に対する全身的な局所防御を順次活性化させ、アポトーシス応答／増殖応答にも作用する。
【００３９】
本発明者らは、以下に、ＨＩＦ水酸化酵素活性、特にアスパラギン水酸化酵素活性のモジュレーター、又は細胞中でのＨＩＦ−αとｐ３００との相互作用の調節に作用し、したがってＨＩＦが媒介する活性に作用するモジュレーターを同定するために実施することができる、いくつかの異なるアッセイをより詳細に説明する。これらのアッセイのいくつかでは、ＨＩＦポリペプチド、特に本発明によるＨＩＦアスパラギン水酸化酵素が使用される。典型的には、アッセイは、ＦＩＨやヒトＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の断片又は変異体など、ヒトＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を使用することができる。非ヒトＨＩＦ水酸化酵素も使用することができる。これらの成分については以下により詳細に記載する。そこで必要とされるこれら成分のそれぞれは、精製形又は未精製形で、例えば、細胞抽出物として又はそのような抽出物由来の関連成分を精製することによって得ることができる。或いは、関連成分は、組換え発現技術を使用し発現させ、アッセイで使用するために精製することができる。或いは、成分を組換え手法により細胞中で発現させ、細胞を基にしたアッセイで使用することができる。
【００４０】
通常、発現ベクター内には、関連成分をコードするポリヌクレオチドを備えさせる。そのような発現ベクターは、当技術分野で常法に従って構築され、例えば、プラスミドＤＮＡの使用、及び適切な開始剤、プロモーター、エンハンサー、例えば、ポリアデニル化シグナルなどの他の要素を伴ってよく、このポリアデニル化シグナルは必要とされる可能性が高く、完全な蛋白質が発現されるように正しい向きに配置する。適当なベクターは、ＨＩＦ水酸化酵素に関して本明細書でより詳細に記載したベクターなど、当業者には極めて容易に明らかなはずである。プロモーター配列は、選択したアッセイ形式によって誘導性プロモーターであっても構成的プロモーターであってもよい。プロモーターは、組織特異性であってよい。発現ベクターで使用されるプロモーター及び他のフランキング配列の例は、本発明のＨＩＦ水酸化酵素、特に本発明のヒトＨＩＦ水酸化酵素に関して本明細書により詳細に記載する。
【００４１】
ＨＩＦポリペプチド及びペプチド類似体
本発明のアッセイには、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の基質、特にこの酵素の基質を含むアスパラギンを使用することができる。特に、そのような基質をアッセイに使用してＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性のモジュレーターの活性をモニターすることができる。基質は、ＨＩＦポリペプチド又はそのペプチド類似体でよい。通常、ＨＩＦポリペプチドは基質として使用する。
【００４２】
アスパラギン残基が配列番号２のＨＩＦ水酸化酵素によって水酸化される、任意の適当な基質を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、そのような基質は、ＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−２αサブユニット蛋白質、そのどちらかの断片、サブユニット又は断片のペプチド類似体など、ＨＩＦポリペプチドである。ＨＩＦ−αペプチドは、酸素調節応答を伝達するのが好ましい。ＨＩＦ−αペプチドは、ＣＡＤ領域を有し、ｐ３００との間で酸素調節相互作用を行い、下流転写を活性化できることが好ましい。そのようなＨＩＦ−αペプチドは、ｐ３００のＣＨ１領域と相互作用できることが好ましい。そのようなＨＩＦポリペプチド、断片、又はペプチド類似体には、ＨＩＦ−１αに関して定義したＡｓｎ８０３と同等なアスパラギン残基を組み込むことが好ましい。ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に同等なアスパラギンは、ＨＩＦ変異体、断片、又はＨＩＦ−１α配列類似体を整列させることによって最良の配列の並びを得、それによってＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に同等なアスパラギンを同定することによって決定することができる。ＨＩＦポリペプチドは、真核生物起源、特にヒト又は他の哺乳動物起源、ＨＩＦ−αサブユニット蛋白質、又はその断片でよい。或いは、ポリペプチドは、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）起源でよい。ｐ３００との相互作用によってＨＩＦ−αの水酸化をモニターするそれらのアッセイでは、ＨＩＦポリペプチドは野生型全長ｐ３００蛋白質又はＣＨ１領域を含むその断片に結合する能力を有する。そのような結合は、低酸素細胞環境で転写を活性化できることが好ましい。
【００４３】
いくつかのＨＩＦαサブユニット蛋白質がクローン化されている。これらには、その配列がＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ２２４３１として入手することができるＨＩＦ−１α、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ８１９８４として入手することができるＨＩＦ−２α、及び、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ００７１９３及びＡＣ０７９１５４として入手することができるＨＩＦ−３αが含まれる。これらは全て、ヒトＨＩＦαサブユニット蛋白質であり、全てを本発明に使用することができる。マウスＨＩＦ−１α（受託番号ＡＦ００３６９５、Ｕ５９４９６、及びＸ９５５８０）、ラットＨＩＦ−１α（受託番号Ｙ０９５０７）、マウスＨＩＦ−２α（受託番号Ｕ８１９８３及びＤ８９７８７）及びマウスＨＩＦ−３α（受託番号ＡＦ０６０１９４）を含め、他の種に由来するＨＩＦ−αサブユニット蛋白質も本発明に使用することができる。
【００４４】
特に重要な１つのＨＩＦ−α蛋白質は、Ｃ．エレガンスのＨＩＦ−αサブユニット蛋白質である。Ｃ．エレガンス系は、本発明のアッセイに使用することができる。
【００４５】
現在までに同定されている２個のＨＩＦ−αサブユニット蛋白質中にはいくつかの共通する構造特徴が見出されている。これらの特徴のいくつかはＯ’Ｒｏｕｒｋｅらが同定し（１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７４号２０６０〜２０７１頁）、ＨＩＦ−αサブユニット蛋白質のトランス活性化機能に関与し得る。１つ又は複数のこれらの共通する構造特徴は、ＨＩＦポリペプチドの好ましい特徴である。
【００４６】
自然に存在するＨＩＦ−αサブユニット（特に、例えばＨＩＦ−１αなどのヒトＨＩＦ−αサブユニット）に少なくとも４５％のアミノ酸相同性、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の相同性を有する合成変異体など、上記ＨＩＦ−αサブユニット変異体を使用することができる。そのような変異体には、ＨＩＦ水酸化酵素に関して上記した置換又は修飾を含めてよい。アミノ酸活性は、上記したようにＨＩＦ水酸化酵素に関して算出することもできる。
【００４７】
ＨＩＦ断片は、非ペプチジル官能基を含むことができ、そのような相同性のレベルが低減されるようなアッセイ目的のために最適化することができる。そのような官能基は、糖類などの共有結合でも金属イオンなどの非共有結合でもよい。
【００４８】
本明細書に記載したＨＩＦαポリペプチドは、ＨＩＦ−αサブユニット蛋白質の断片又は上記した変異体でよいが、ただし前記断片は野生型ｐ３００のＣＨ１領域と相互に作用する能力を保持する。蛋白質構成アミノ酸残基を使用した場合、そのような断片は、大きさが少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも４０、５０、７５、１００、２００、２５０、又は４００アミノ酸が望ましい。そのような断片は、アスパラギン８０３を含むのが望ましい。
【００４９】
細胞を基にした本発明のアッセイは、内在性ＨＩＦ−αの上方調節又は組換え技術によるＨＩＦ−αの発現、特にＨＩＦ−１αの発現を伴うことができる。
【００５０】
アッセイ方法
本発明は、低酸素誘導因子のアスパラギン水酸化を調節する作用物質を同定するためのアッセイ方法を提供する。方法は、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と、潜在的阻害剤などの試験物質を、水酸化酵素の基質の存在下で、試験物質がなくてもアスパラギンが水酸化される条件下で接触させるステップ、及び基質のアスパラギン水酸化の程度を決定するステップを含む。或いは、アッセイを使用してＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を増大する物質を、活性の増大をアッセイすることにより検出することができる。
【００５１】
本明細書に記載の実験によって、ＦＩＨはＣＡＤ領域内のアスパラギン残基でＨＩＦ−αを水酸化することが見出された。この水酸化は、ｐ３００の結合を媒介し、詳細にはｐ３００の結合を低減させる。そのような結合は転写の活性化をもたらす。この相互作用及び活性化を本発明のアッセイのベースとして使用することもできる。
【００５２】
本発明のそのようなアッセイは、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性の阻害剤を同定するために使用することができ、したがって試験物質がなくてもアスパラギンの水酸化が生ずるはずの条件下で実施するのが好ましい。代替法では、このアッセイを使用してアスパラギン水酸化酵素活性のプロモーターの探索を、例えば、試験物質の不在下で実施したアッセイと比較して増大したアスパラギン基質の水酸化を探索することによって行うことができる。低酸素条件下などの水酸化が減少する、又は生じない条件下でアッセイを実施することもでき、水酸化の存在又は増大をそのような条件下でモニターすることができるであろう。本発明のアッセイを使用してＨＩＦアスパラギン水酸化酵素に特異的であり、且つ例えば、ＨＩＦプロリル水酸化酵素や他のアスパラギン／アスパルタム酸水酸化酵素など、他の水酸化酵素には活性でない又は余り活性ではない阻害剤又はアクチベーターを同定することもできる。
【００５３】
本発明は、他のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を同定するためのアッセイ方法も提供する。典型的には、方法は、試験ポリペプチドを得るステップ、ＨＩＦポリペプチドがＨＩＦ水酸化酵素によってアスパラギン残基で水酸化される条件下で、ＨＩＦポリペプチドと試験ポリペプチドを接触させるステップ、ＨＩＦポリペプチドがアスパラギン残基で水酸化されているかどうかを決定するステップを含む。
【００５４】
さらに、活性部位残基、特にＨＩＦ中で水酸化されるアスパラギン残基の結合に関与している残基を含む配列によって、他の蛋白質がＦＩＨに明瞭に関係付けられる。これらには以下のＳＷＡＬＬデータベースコードによって表される配列が含まれる：ヒトのＱ９ＮＷＪ５、Ｑ８ＴＢ１０、Ｑ９Ｙ４Ｅ２、Ｏ９５７１２、Ｑ９Ｈ８Ｂ１、Ｑ９ＮＷＴ６、及びマウスのＱ９１Ｗ８８、Ｑ９ＥＲ１５（ＦＩＨ＝Ｑ９６９Ｑ７）。これらの一部又はすべては、既に転写に関連しており（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ  ＰＭ、Ｐｏｎｔｉｎｇ  ＣＰ、ＪｍｊＣ、「十文字、無毛、及びホスホリパーゼＡ（２）ベータのクピン型金属酵素様領域（ｃｕｐｉｎ  ｍｅｔａｌｌｏｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｊｕｍｏｎｊｉ，ｈａｉｒｌｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ（２）ｂｅｔａ）」ＴＲＥＮＤＳ  ＢＩＯＣＨＥＭ、ＳＣＩ  ２６（１）：７−９ＪＡＮ２００１）、したがってＦＩＨ活性単独の特異的調節、又は関連酵素の少なくとも１つと合わせたＦＩＨ活性の調節が重要である。
【００５５】
本発明は、本発明のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の代替基質を同定するアッセイ方法も提供する。典型的には、そのようなアッセイ方法は、通常、その水酸化酵素によってＨＩＦがアスパラギンで水酸化するはずの条件下で、試験ポリペプチドと本発明のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素とを接触させるステップ、及び試験ポリペプチドがアスパラギンで水酸化されているかどうかを決定するステップを含む。
【００５６】
調節をモニタリングする方法
本発明のスクリーニング又はアッセイ方法のどれかの正確な形式は、常法の技術及び知識を使用する当業者によって変わり得る。当業者は、さらに適切な制御実験を使用する必要があることを周知している。本発明のアッセイには、適当な基質のアスパラギン水酸化のモニタリング、基質及び補助基質の利用のモニタリング、酵素とその基質の間の予想される生成物の生成のモニタリングを含めてよい。本発明のアッセイ方法には、この系中の成分間の直接相互作用のスクリーニングも含めてよい。或いは、アッセイは、ｐ３００によるＨＩＦの結合などの下流効果、及び適当なレポーター構築体を使用する、ＨＩＦが媒介する転写など、ＨＩＦによって媒介された下流効果のモニターを実施することができ、或いは遺伝子の上方調節又はＨＩＦにより直接的又は間接的に調節されることが知られている遺伝子の発現パターンの変更をモニタリングすることによってアッセイを実施することができる。
【００５７】
水酸化を決定する様々な方法が、当技術分野で知られており本明細書に記載し例示する。基質又は補助基質の利用、ペプチドの水酸化などの生成物の外観、水酸化生成物又は非水酸化生成物によって媒介される下流効果などによって、任意の適当な方法をＨＩＦ水酸化酵素の活性の決定に使用することができる。
【００５８】
ＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３残基が、アスパラギン水酸化酵素によって水酸化されるという本発明者らの知見は、この工程の阻害剤又はプロモーターをスクリーニングするように設計したアッセイ方法の基礎を提供するものである。任意の適当な方法を使用して、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦポリペプチド、又はその類似体の水酸化をモニターすることもできる。関連のアスパラギン残基又は別の位置の水酸化を直接モニターするためにアッセイを実施することができる。或いは、補助因子及び補助基質の枯渇をモニターするためにアッセイを実施することができる。或いは、そのようなアッセイは、ＨＩＦの水酸化の下流効果、実際はＨＩＦの水酸化阻害を、例えば、ＨＩＦとｐ３００の間の相互作用又はＨＩＦが媒介する転写をモニタリングすることによってモニターすることができる。或いは、ＨＩＦが調節するプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子構築体を使用することができる。ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性エンハンサーを同定するためのアッセイも提供される。そのようなエンハンサーを使用してＨＩＦα活性を低減することができる。
【００５９】
一実施形態では、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の適当な基質を提供する。これは、ＨＩＦ−α又はＣＡＤ領域を含む、又はＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３に同等な残基を含むその断片でよい。基質は、当初Ａｓｎ８０３位置で水酸化されていてはならない。これは、合成ポリペプチド基質を提供することによって、或いは細菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞中に、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系中にＨＩＦ−αポリペプチドを生成することによって実現することができる。或いは、アッセイの流れの中で初めは未水酸化形で基質が生成されるように選択した時間コースでアッセイを実施することができる。
【００６０】
基質、酵素、及び潜在的阻害剤化合物は、阻害剤が存在しないときにはＡｓｎ８０３が水酸化される条件下で共にインキュベーションすることができ、基質の水酸化を決定することによって阻害剤の作用を決定することができる。これは、任意の適当な手段によって実現することができる。小さいポリペプチド基質を回収し、質量分析やクロマトグラフィーなどの物理的分析、又はｐ３００に結合する（又はｐ３００からレポーター分子を転置する）能力などの機能分析にかけることができる。そのような方法は、当技術分野でそのようなものとして知られており、常法の技術及び知識を使用し実施することができる。決定は、決定的でも定性的であってもよい。どちらの場合でも、特に後者では、定性的決定は、適当な対照、例えば、潜在的阻害剤なしにインキュベーションした基質と比較して実施することができる。
【００６１】
この方式で同定した阻害剤化合物を回収し薬剤組成物として製剤することができる。
【００６２】
本発明の別のアッセイは、ＨＩＦ−αサブユニットのアスパラギン水酸化のプロモーター向けである。典型的には、ＨＩＦ−αサブユニット又はその部分を上記したように調製し、低酸素条件下でインキュベーションする。「低酸素」は、０．１％未満などの、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満のＯ２を意味する。ＨＩＦ−αサブユニットを上記したようにＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を含む細胞抽出物と共に、場合によっては、さらに第一鉄（ＦｅＩＩ）イオン供給源、及び／又は他の補助因子の存在下でインキュベーションする。適当な濃度の第一鉄イオンは、１〜５００μＭ、２５〜２５０μＭなど、特に５０〜２００μＭの範囲である。第一鉄イオンは、塩化第一鉄、硫酸第一鉄などの形で供給することができる。
【００６３】
本発明のこの実施形態では、基質を潜在的水酸化促進剤の存在下でインキュベーションし、作用物質の作用は、Ａｓｎ８０３の水酸化の決定によって決定する。上記した本発明の他の態様のアッセイと同様に、決定は決定的でも定性的であってもよく、いずれの場合でも適当な対照に比べて決定することができる。
【００６４】
ＨＩＦとｐ３００の間の相互作用は、ＨＩＦの水酸化によって媒介される。本発明によるアッセイは、ｐ３００とＨＩＦの間の相互作用のモニタリングを含んでよい。特に、相互作用は、例えば、蛍光偏光測定、表面プラスモン共鳴、又は質量分析の使用によってモニターすることができる。まず第一に、ｐ３００との相互作用が生じたとき、試験ポリペプチドに結合させた染料の蛍光偏光測定は変化し、その相互作用はそれ自体試験ポリペプチドの水酸化状態に依存する相互作用である。第二に、試験ポリペプチドは、結合事象がチップにかかる力の変化によって検出することができるように構築したチップ上に固定することができる。「天然の」又は「ソフトイオン化」質量分析を水酸化酵素活性用アッセイとして使用することができ、すなわちＨＩＦαポリペプチド又はＣ末端トランス活性化領域を含むその断片とｐ３００との間の相互作用を質量分析によって観察するが、水酸化と同時にこの相互作用は低減し又は阻害され得る。ＨＩＦの存在によって上方調節又は下方調節されることが分かっている遺伝子の転写及び発現とモニターすることができる。特に、ＨＩＦによって調節される遺伝子の上方調節は、アスパラギン水酸化の阻害を実証するはずであり、それに対して下方調節はアスパラギン水酸化の上昇又は促進を示唆するはずである。
【００６５】
別の実施形態では、ＨＩＦによって媒介されるプロモーターが、レポーター遺伝子に動作可能に結合されているレポーター構築体を提供することができる。例えば、比色アッセイ、蛍光アッセイ、蛍光共鳴アッセイ、又は分光アッセイで使用することができる酵素など、任意の適当なレポーター遺伝子を使用することが可能である。
【００６６】
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素は２ＯＧ依存性酸素添加酵素である。本明細書に記載のアッセイ方法では、典型的には、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素と水酸化酵素の基質を２−オキソグルタル酸（２ＯＧ）や二酸素などの補助基質の存在下で接触させる。ＨＩＦ水酸化酵素の水酸化酵素活性は、補助基質の代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の決定によって決定することができる。これは、水酸化された基質やコハク酸など、反応生成物の存在及び／又は量の決定によって実現することができる。生成物の量は基質の量に比べて決定することができる。典型的には、そのような実施形態では基質はＨＩＦ−αポリペプチドでよく、例えば、測定する生成物は水酸化されたＨＩＦ−αポリペプチドでよい。例えば、水酸化の程度は、反応で生じた水酸化ＨＩＦαポリペプチドの量、コハク酸塩、又は二酸化炭素を測定することによって、又は２ＯＧ又は二酸素の枯渇を測定することによって決定することができる。これらのそれぞれのモニタリング方法は、科学文献で知られている。
【００６７】
ＨＩＦαアスパラギン水酸化酵素活性は、Ｍｙｌｌｙｈａｒｊｕ  Ｊ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６（６）：１１７３〜１１８０頁（１９９１）又はＣｕｎｌｉｆｆｅ  Ｃ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２４０号６１７〜６１９頁（１９８６）に記載されている通り、前記２ＯＧのコハク酸塩及びＣＯ２への代謝回転を決定することによって、或いはＣＯ２、炭酸水素塩、又はコハク酸塩の生成に向けた他の適当なアッセイによって決定することができる。
【００６８】
未使用の２ＯＧは、それだけには限らないが、ヒドラジン誘導体やオルト−フェニレンジアミン誘導体に例示される化学試薬によって誘導体化されて、表示性発色団又は蛍光発色団を生じることができ、この発色団を決定し試験ポリペプチドの水酸化の程度を表すことができる。それだけには限らないが「Ｃｌａｒｋｅ型」電極に例示される溶存酸素電極又は蛍光消光を使用する電極を使用してアッセイ混合物中の酸素消費を追うことができ、次いで、この酸素消費を使用して上記と同様の方式で試験ポリペプチドの水酸化程度を示すことができる。
【００６９】
或いは、終点決定は、ＨＩＦα又はＨＩＦα由来の（合成及び組換えペプチドを含む）ペプチド断片の検出可能な生成物への転化を基にすることができる。ペプチドは、アッセイを容易にするために改変することができ、その結果アッセイを迅速に実施することができ、高処理スクリーニングに適当なものにすることができる。
【００７０】
例えば、本明細書で例示したように逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−４オクタデシルシランカラム）を使用して、アスパラギン水酸化生成物からＨＩＦ水酸化酵素用出発合成ペプチド基質を分離することができる。アスパラギン水酸化生成物はカラム中での保持時間が短いからである。ＨＩＦ水酸化酵素活性に向けたこのアッセイの改変又は代替アッセイには、例えば、当技術分野で周知のように質量分析、分光分析、及び／又は蛍光法を使用することができる（Ｍａｓｉｍｉｒｅｍｂｗａ  Ｃ．ら、「コンビナトリアルケミストリ及び高処理スクリーニング法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（２００１）４（３）２４５〜２６３頁、Ｏｗｉｃｋｉ  Ｊ．、（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５（５）２９７〜３０５頁、Ｇｅｒｓｈｋｏｖｉｃｈ  Ａら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｓ．、３３（３）１３５〜１６２頁、Ｋｒａａｆｔ  Ｇ．ら、（１９９４）Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第２４１号７０〜８６頁）。蛍光技術には、分光アッセイ又は蛍光アッセイを実施し又は最適化するような方式で改変した基質の異形を使用する。
【００７１】
例えば、ＨＩＦαポリペプチドは、例えば、ビーズやプレート上に固定することができ、残基が水酸化されないときからアスパラギン８０３が水酸化されるときに異なる親和性でＨＩＦαのＣＡＤ結合領域と結合する抗体又は他の結合分子を使用し、適切な残基の水酸化を検出することができる。そのような抗体は、例えば水酸化ＨＩＦαペプチドを使用し、当技術分野で周知の標準的な技術によって得ることができる。
【００７２】
ＨＩＦαポリペプチドの水酸化形と非水酸化形を区別する分子の結合は、当業者が利用することができるあらゆる技術を使用して評価することができ、その技術には適当な標識の存在の決定を含めてよい。
【００７３】
本発明のアッセイ方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの形を取ることもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、酵母株などの細胞系で実施することができ、その場合導入した１つ又は複数のベクターから関連ポリペプチド又はペプチドが細胞中に発現される。
【００７４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
アッセイは、細胞を基にしたアッセイ、器官を基にしたアッセイ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施する動物全体のアッセイを使用し実施することができる。そのようなアッセイは、ＨＩＦ水酸化酵素ヌクレオチド及び／又はポリペプチドの内在性発現を利用することができる。本発明の他の形態では、特異的内在性ＨＩＦ水酸化酵素の上方調節は、その発現を刺激する物質によって実現することができる。そのような刺激物質は、特異的ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を上方調節する増殖因子又は化学薬品でよい。本発明の別の形態では、ヌクレオチド構築体を細胞又は遺伝子組換え動物に導入して、１つ又は複数の特異的ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の生成を増大させることができる。或いは、１つ又は複数の特異的ＨＩＦ水酸化酵素の発現を低減し又は阻害するように、ヌクレオチド構築体を細胞に導入することができる。それだけには限らないが、相同組換え、アンチセンス発現、リボザイム発現、及びＲＮＡ干渉を含む適切な方法は、本明細書に概説され当業者によって知られている。
【００７５】
本発明の前述の形態によって得られた組織インキュベーション細胞、器官、動物、及び他の生体系を、ＨＩＦ水酸化酵素の別の供給源を得るために使用することができ、又はアッセイに、特に試験物質の活性の比較アッセイに使用することができ、特異的ＨＩＦ水酸化酵素の活性を阻害し増大し遮断するにせよ、そうでないにせよ、この活性を調節することができる。
【００７６】
ＨＩＦ水酸化酵素の活性は、前述の方法のいずれかによって、又は細胞、組織によって、又は変化したＨＩＦ水酸化酵素活性の作用を測定するｉｎ  ｖｉｖｏで実施する他のアッセイによってアッセイすることができる。
【００７７】
ｐ３００と複合体を形成したＨＩＦは低酸素応答要素を活性化し、この応答要素は前記ＨＩＦ複合体によって調節される内在性遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー中に見出される。レポーター遺伝子又はその生成物を検出し及び／又は決定することによってＨＩＦ複合体活性をアッセイするために、そのような低酸素応答要素を単離しレポーター遺伝子に操作的に関連付けることもできる。したがって、本発明の別の形態では、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素によって調節されるＨＩＦ−αポリペプチド活性は、内在性遺伝子又はＨＩＦ結合低酸素応答要素と機能的に関連付けられレポーター遺伝子の発現に及ぼすＨＩＦ複合体の影響を測定することによってアッセイされる。この方式で調節される内在性遺伝子の例は、遺伝子発現の低酸素誘導におけるアリール炭化水素核輸送体（ＡＲＮＴ）の役割に見出されることとなり、例えば、「ＡＲＮＴ不完全細胞の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ＡＲＮＴ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｓ．Ｍ．Ｗｏｏｄ、Ｊ．Ｍ．Ｇｌｅａｄｌｅ、Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ、Ｏ．Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２７１号（１９９６）１５１１７〜１５１２３頁、及び「腫瘍関連炭酸脱水酵素の低酸素誘導性発現（Ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｙｈｙｄｒａｓｅｓ）」、Ｃ．Ｃ．Ｗｙｋｏｆｆ、Ｎ．Ｊ．Ｐ．Ｂｅａｓｌｅｙ、Ｋ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ、Ｊ．Ｐａｓｔｏｒｅｋ、Ａ．Ｓｉｂｔａｉｎ、Ｇ．Ｄ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈ．Ｔｕｒｌｅｙ、Ｋ．Ｔａｌｋｓ、Ｐ．Ｈ．Ｍａｘｗｅｌｌ、Ｃ．Ｗ．Ｐｕｇｈ、Ｐ．Ｊ．Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ、Ａ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第６０号（２０００）７０７５〜７０８３頁を参照のこと。実施例には、それだけには限らないが、ブドウ糖輸送担体アイソフォーム１、ホスホグリセラテキナーゼ−１、炭素脱水酵素アイソフォーム９、血管内皮細胞増殖因子が含まれる。前記遺伝子のそれぞれは、１つ又はそれ以上の低酸素応答要素を含み、ＨＩＦ水酸化酵素の活性に一致して変化するＨＩＦ−αポリペプチドの活性を測定するためにこの応答要素を単離し、単一又は多数の複製としてレポーター遺伝子に操作的に関連付けることができる。
【００７８】
ＨＩＦ水酸化酵素の活性に一致するＨＩＦ−αポリペプチドによって調節される遺伝子又は遺伝子産物の活性は、本発明の別の態様を提供する方式で細胞生理、器官生理、及び動物生理に作用する。したがって、本発明の別の実施形態は、特異的機能応答を利用するアッセイを準備し、この機能応答はＨＩＦ水酸化酵素活性に一致してＨＩＦ−αポリペプチドの活性にしたがって調節される。そのような応答は、代謝されないブドウ糖又はブドウ糖類似体の摂取速度、脈管形成による血管増殖、炭酸脱水酵素活性を含む。細胞又は全身レベルで作動する他の多くの応答は、ＨＩＦ水酸化酵素の活性に一致してＨＩＦ−αポリペプチドの活性によって制御され、前記ＨＩＦ水酸化酵素活性のアッセイとして本発明の別の態様で使用できることが分かっている。
【００７９】
ＨＩＦ水酸化酵素の基質であるＨＩＦ−αポリペプチドは、別のポリペプチドに融合させることができる。それによって前記ＨＩＦ水酸化酵素の活性を引き起こして融合ペプチドの活性を調節するためである。したがって、本発明の別の形態は、融合ポリペプチドの活性のアッセイを準備する。好ましい形態では、そのような融合ポリペプチドには、特にＡｓｎ８０３又はＣＡＤ領域を含め、ＨＩＦ−αポリペプチドの一部または全体を含めてもよい。Ｇａｌ結合上流活性化配列（ＵＡＳ）と共にアミノ酸１−１４３を含むＧａｌ４ＤＮＡ結合領域は、そのような転写因子であり、その作動が当業者によってアッセイすることができる同族ＤＮＡ応答要素の一例である。
【００８０】
試験化合物
本明細書に記載のアッセイ方法を使用しスクリーニングすることができる化合物は、薬物スクリーニングプログラムで使用される天然又は合成化合物でよい。いくつかの特徴付けられている又は特徴付けられていない成分を含む、植物、微生物、又は他の生物の抽出物も使用することができる。
【００８１】
コンビナトリアルライブラリー技術（固相合成法及びパラレル合成法を含む）は、潜在的に莫大な数の異なる物質の相互作用を調節する能力を試験する効率的方法を提供する。様々な自然生成物、特に小分子及びペプチドのためのそのようなライブラリー及びその使用が当技術分野で知られている。ある種の状況ではペプチドライブラリーの使用が好ましいかもしれない。
【００８２】
潜在的阻害剤化合物は、市販のコンビナトリアルライブラリーから得た分子などの小分子であるポリペプチドであってよい。使用することができる小分子化合物には、２−オキソグルタル酸類似体、ＨＩＦ−α類似体、又は両２−オキソグルタル酸の特徴を組み込み、且つこの酵素の作用を阻害するＨＩＦ−αに影響する化合物が含まれる。したがって、本発明は、脈管形成などの細胞増殖の促進を必要とする患者の状態の治療薬を製造するため、アスパラギン水酸化酵素阻害剤として作用する化合物の使用を提供する。本発明は、細胞増殖の促進によって治療することができる状態を患う患者の治療方法も提供し、この方法は前記患者に有効量のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素阻害剤を投与することを含む。
【００８３】
潜在的促進剤は、広範な供給源から、特に市販されている小化合物ライブラリーからスクリーニングすることができる。酸素含有化合物を、スクリーニングすべき候補化合物に含めてよく、例えば、２−オキソグルタル酸類似体を含めてよい。
【００８４】
ＨＩＦ−αポリペプチドのアスパラギン水酸化を増大し、増進し、刺激し、撹乱し、低減し、相互作用し、或いは全体的に又は部分的に終止させ、それによってＨＩＦ活性を調節することができる試験化合物は、本明細書に記載のアッセイ方法を使用し同定し及び／又は得ることができる。
【００８５】
アスパラギンの水酸化を増大し又は増進する作用物質は、正の試験作用物質の不在下では水酸化を制限し又は防止する条件下で、同定し及び／又は得ることができる。そのような作用物質を使用して、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の機能を増進し、増大し、強化し、又は刺激することができ、腫瘍に見出される細胞など、低酸素条件下の細胞に対して影響を及ぼすことができ、その際水酸化されないことによってＨＩＦαの蓄積、それに伴う脈管形成の促進、及び他の増殖を促進する事象がもたらされる。
【００８６】
試験試料のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の存在を決定し、場合によってはその量を決定する方法は、例えば、本明細書で論じたどんな医療状態（例えば癌などの増殖疾患）の診断又は予診の目的のために、或いはそのような状態を治療するための療法の評価のために用いることができる。
【００８７】
様々な態様では、本発明は、本発明のスクリーニング方法によってＨＩＦαアスパラギン水酸化のモジュレーター、例えば、水酸化酵素のアスパラギン水酸化酵素活性を阻害し又は低減し、増大し又は増進する物質であると同定した作用物質又は化合物を提供する。
【００８８】
モジュレーターの同定に続き、物質をさらに精製し及び／又は調査し（例えば改変）、及び／又は製造することができる。モジュレーターを使用して、例えば、当業者には周知であり本明細書で論じた方法によって、ペプチジル又は非ペプチジル模倣体を得ることができる。モジュレーターは、例えば、選択的に増大するように、本明細書に記載した通り改変することができる。モジュレーターは、以下に論じるように治療状況で使用することができる。
【００８９】
選択性
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素を、単一標的として又は選択した水酸化酵素群及びファミリー全体で選択的に調節することも有利で有り得る。したがって、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を調節する作用物質は、特異的、すなわち、他の２ＯＧ依存性酸素添加酵素に比べてＨＩＦアスパラギン水酸化酵素に対する作用が増大し又は強化していることが好ましい。
【００９０】
したがって、本明細書に記載したアッセイ方法は、さらに前記２ＯＧ依存性酸素添加酵素が通常活性である条件下で、試験化合物と１つ又は複数の２ＯＧ依存性酸素添加酵素を接触させるステップ、及び前記酸素添加酵素の活性を決定するステップを含んでもよい。試験化合物の有無の比較における活性の差は、１つ又は複数の２ＯＧ依存性酸素添加酵素の活性を調節する試験化合物を示す。
【００９１】
１つ又は複数の２ＯＧ依存性酸素添加酵素に比べてＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の調節を増大し又は高める試験化合物は、ＨＩＦ水酸化酵素に関しての選択性又は特異性を示す。
【００９２】
２ＯＧ依存性酸素添加酵素には、例えば、クラバミント（ｃｌａｖａｍｉｎｔｅ）合成酵素、デアセトキシセファロスポリンＣ合成酵素、コラーゲン−プロリル−４−水酸化酵素、コラーゲンプロリル−３−水酸化酵素、リシル水酸化酵素、アスパルチル水酸化酵素、フィタノイル補酵素Ａ水酸化酵素、又はガンマ−ブチロベタイン水酸化酵素を含めてよい。２ＯＧ依存性酸素添加酵素は、哺乳動物ポリペプチドでよく、ヒトポリペプチドが好ましい。
【００９３】
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性を調節するときは、その酵素活性を阻害しないことが望ましいかもしれないヒト２ＯＧ酸素添加酵素は、ＡｌｋＢ、コラーゲンプロリル水酸化酵素、リジン水酸化酵素、内皮増殖因子領域を水酸化することが知られているアスパルチル／アスパラギン水酸化酵素、フィタノイルＣｏＡ水酸化酵素、ガンマ−ブチロベタイン水酸化酵素、トリメチルリジン水酸化酵素；ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＨＤ３を含むＨＩＦプロリル水酸化酵素アイソフォーム；及び以下の番号によって参照されるＳＷＡＬＬデータベースの蛋白質を含むＦＩＨに密接に関係する酵素：ヒトのＱ９ＮＷＪ５、Ｑ８ＴＢ１０、Ｑ９Ｙ４Ｅ２、Ｏ９５７１２、Ｑ９Ｈ８Ｂ１、Ｑ９ＮＷＴ６、及びマウスのＱ９１Ｗ８８、Ｑ９ＥＲ１５、並びにこれらの酵素の相同物を含む。状況によっては、ＦＩＨ及び１つ又は複数の前述の酵素、特に１つ又は複数のＨＩＦプロリル水酸化酵素アイソフォームの阻害が有利となり得ることも認識されている。さらに、上記の酵素のいくつかの阻害では、ＦＩＨを阻害しないことが有利となるかもしれず、この方法はＦＩＨ阻害剤ではなくＰＨＤ阻害剤の発見方法に使用することができる。
【００９４】
本発明は、ＨＩＦ活性の低減に伴う状態の治療薬の製造でのそのようなＨＩＦアスパラギン水酸化酵素選択的阻害剤の使用を提供する。
【００９５】
本発明の別の態様では、他の２ＯＧ依存性酸素添加酵素の阻害剤又はアクチベーターとして同定されている作用物質が、そのような酸素添加酵素に特異的であるか、又は少なくともＨＩＦアスパラギン水酸化酵素に作用しないかを確立するためにアッセイを使用することができる。特に、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素活性に対して作用する作用物質の影響を、関連するＨＩＦプロリル水酸化酵素に影響を及ぼさずに、又はその逆に、確立することができる。したがって、アッセイは、コラーゲンプロリル水酸化酵素などの２ＯＧ依存性酸素添加酵素阻害剤として同定されている作用物質又は作用物質の改変体を使用して実施し、そのような作用物質がコラーゲンプロリル水酸化酵素に特異的であり活性ではないか、又は、ＨＩＦ水酸化酵素に対する活性、特にそのアスパラギン水酸化酵素活性が低減しているかを同定することができる。
【００９６】
治療適用例
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の水酸化酵素活性に作用する能力を有することが判明した化合物、物質、又は作用物質は、先に論じたいくつかの状況で治療可能性及び他の可能性を有する。治療には、そのような化合物を、例えば、放射線治療や化学療法など、抗腫瘍療法、別の抗腫瘍化合物、又は療法用の任意の他の作用物質と組合せて使用することもできる。
【００９７】
１回又は複数の１次スクリーニング（例えば無細胞系で）を使用してＨＩＦ水酸化酵素のＨＩＦαアスパラギン水酸化活性を調節する能力を有するとして同定した作用物質は、さらに１回又は複数の２次スクリーニングを使用し評価することができる。２次スクリーニングは、作用物質の不在に比べて作用物質の存在下で細胞中に存在し、例えば、ＨＩＦ標的遺伝子のレベル又は工程によって顕れるような、ＨＩＦ−α又はＨＩＦの活性量の増大又は減少試験を含めてよい。
【００９８】
ＨＩＦ水酸化酵素又はＨＩＦポリペプチドは、全長ポリペプチド又はその断片にせよ、そうでないにせよ、（例えば、抗体などの他の活性剤と併せて含めて安定性を強化し又は狙いを確実にするために）修飾したポリペプチドによる治療を含む治療に使用することができる。例えば、Ａｓｎ８０３を別のアミノ酸残基と置換するためにＨＩＦ−１αを変化させることは水酸化を防止し、それによってＨＩＦ−αとｐ３００の間の相互作用を促進し転写の活性化を刺激することができる。
【００９９】
一般に、本発明によるモジュレーターである作用物質、化合物、又は物質は、単離し及び／又は精製した形で、すなわち十分に高純度で提供する。これは、組成物であることを含めてもよく、その場合組成物とは少なくとも約９０％の活性成分、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の活性成分を表す。しかし、どんなそのような組成物にも不活性担体物質、或いは活性剤の正しい送達、放出、及び／又は安定化に必要な賦形剤など、薬剤的に及び生理的に許容される他の賦形剤を含めてよい。以下に記すように、本発明による組成物には、開示したモジュレーター化合物の他に、抗腫瘍剤など、治療使用の１つ又は複数の他の分子を含めてよい。
【０１００】
本発明のアッセイによって得られる生成物
本発明は、本発明のアッセイ方法によって得られる化合物、及び化合物が、薬剤として許容される担体又は希釈剤との混合物である薬剤組成物など、前記化合物を含む組成物をさらに提供する。担体は、液体、例えば、生理食塩水、エタノール、グリセロール及びそれらの混合物、或いは固体、例えば錠剤の形で、デポ（ｄｅｐｏｔ）製剤としてゲル製剤などの半固形の形で、又は経皮パッチなど経皮投与用ビヒクルでよい。
【０１０１】
本発明は、さらに、ＨＩＦ水酸化酵素によってＨＩＦαポリペプチドのアスパラギン標的残基の水酸化と相互作用する作用物質を患者に投与することを含む治療方法を提供する。そのような作用物質には、アスパラギン水酸化酵素活性阻害剤を含めてよい。
【０１０２】
治療／予防目的は、低下した、最高ではない、又は増大したＨＩＦ濃度又は活性に伴う状態、或いは以下の状態など、ＨＩＦ濃度は正常であるが、ＨＩＦ活性の増大又は低減などのＨＩＦ活性の調節が望ましい状態の治療に関係してよい。
（ｉ）虚血状態、例えば、冠血管、脳血管、及び末梢血管不全を含む器官虚血。２つの方式：宣告された組織損傷、例えば、心筋梗塞に続いて（組織損傷を制限するため）、又は虚血を予防するために予防的に、例えば、狭心症の治療での冠側副血行の促進するために療法を適用することができる。
（ｉｉ）創傷治癒及び器官再生
（ｉｉｉ）自家移植、同種移植、及び異物移植
（ｉｖ）全身血圧
（ｖ）癌：通常、ＨＩＦαは腫瘍細胞で上方調節され、腫瘍増殖及び脈管形成に大きく作用する。
（ｖｉ）炎症性疾患
（ｖｉｉ）肺動脈血圧、神経変性疾患
（ｖｉｉｉ）糖尿病
【０１０３】
ヒト、器官、又は１群の細胞のＨＩＦアスパラギニル水酸化酵素活性の調節を治療上の利益を得るために異なる方式で利用することができる。
【０１０４】
（ａ）非細胞自律的：ＨＩＦ系は、他の細胞にシグナルを送る物質の生成に作用するために細胞によって使用される。次いで、これらのシグナルは、（ｉ）遠隔部位で（例えば、エリスロポエチンが骨髄に作用する）又は（ｉｉ）局所的に（血管形成増殖因子が局所的な血管形成を増大させる）作用することができる。したがって、水酸化酵素活性を変化させることによる非細胞自律的行動の操作は、貧血、及び局所性虚血、例えば、眼、脳、心臓、及び体肢の虚血の治療に有用である。生理的恒常性の態様に関与する他の多くのシグナルは、ＨＩＦ活性化によって調節することができ、又は調節されることが知られている。したがって、ＨＩＦアスパラギニル水酸化酵素活性の変化を治療上の利益のための有益な応答を高め又は開始し、或いは有害な応答を防止し又は改善するために利用することができる。例えば、この手法は、食欲、又は全身的又は肺血管床（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｂｅｄ）の血圧を改めるために使用することができる。
【０１０５】
（ｂ）細胞自律的：ＨＩＦ系は、細胞代謝、或いは分化、増殖、及びアポトーシスに関する決定を調節するためにも細胞によって使用される。したがって、ＨＩＦ系の操作を細胞の生存度及び行動を改めるために使用することができる。細胞生存度の上昇は、例えば虚血組織でのＨＩＦの活性化（ａｃｉｔｉｖａｔｉｏｎ）の上昇によって実現することができる。糖尿病を改善する手段として膵臓ベータ細胞の生存度の改善、或いはパーキンソン病、運動ニューロン疾患、又は痴呆形成の１つ又は複数の群のニューロンの生存度又は機能の改善にこの手法を使用することもできる。異なる手法では、ＨＩＦシグナルは、１群の細胞増殖を防止し、又はその死又は分化を促進するために操作することができる。例えば、悪性腫瘍でのＨＩＦ系の一時的な活性化を、かなりの数の腫瘍細胞死を引き起こすために使用することができる。
【０１０６】
薬剤組成物
したがって、他の様々な態様では、本発明は、そのような目的のための薬剤組成物、薬剤、薬物、又は；他の組成物、その場合組成物は本明細書に記載した１つ又は複数の、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素阻害剤を含む薬剤、化合物、又は物質を含み；医療法でのそのような組成物の使用、その場合方法はそのような組成物を患者に投与することを含み、例えば上記した医療状態の（予防的治療を含めることができる）治療を含み；そのようなどんな目的、例えば、本明細書に記載した状態の治療のために投与するための組成物、薬剤、又は薬物の製造でのそのような作用化合物又は物質の使用；並びにそのような作用物質、化合物、又は物質と、薬剤として許容される賦形剤、ビヒクル、又は担体、場合によっては他の成分を混合するステップを含む薬剤組成物の製造方法を提供する。
【０１０７】
一実施形態では、通常、薬剤組成物を提供する方法は以下を含むことができる。
（ａ）本発明のアッセイ方法によって作用物質を同定するステップ
（ｂ）作用物質を製剤し、それによって薬剤として許容される賦形剤を用いて同定するステップ
【０１０８】
本発明の薬剤組成物には、本発明による作用物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、又は抗体、並びに薬剤として許容される賦形剤を含めてよい。
【０１０９】
作用物質は、例えば、放射線治療や化学療法など、抗腫瘍療法、別の抗腫瘍化合物、又は療法に向けて、単一の活性剤として、或いは別の１つの又はどんな他の作用物質と組合せて使用することもできる。
【０１１０】
本発明の医療法で使用される作用物質がなんであろうと、投与は、（場合によっては、予防は治療と見なしてよいが）「予防有効量」又は「治療有効量」であることが好ましく、これは個体に恩恵を示すのに十分である。投与する実際の量、投与の割合及び時間経過は、治療するものの性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、用量などの決定は、一般医及び他の医師の責任の範囲にある。
【０１１１】
作用物質又は組成物は、単独で又は他の治療と組合せて、同時に又は逐次で治療する病状、例えば上記した病状に依存して投与することができる。
【０１１２】
本発明による薬剤組成物、及び本発明に従う使用のための薬剤組成物には、活性成分の他に薬剤として許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、又は当業者には周知の他の材料を含めてよい。特に、薬剤組成物には、薬剤として許容される賦形剤を含めてよい。そのような材料は、無毒であるべきで、活性成分の効力に干渉してはならない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、投与経路は、経口、或いは注射例えば経皮、皮下、又は静脈内でよい。
【０１１３】
経口投与用薬剤組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、又は液剤形でよい。錠剤には、ゼラチンやアジュバントなどの固形担体を含めてよい。一般に、液体薬剤組成物は、水、石油、動物油又は植物油、鉱油又は合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース又は他の糖液、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコールを含めてよい。
【０１１４】
静脈内、経皮、皮下注射、又は苦痛部位への注射については、活性成分は発熱物質を含まず適当なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口で許容される水溶液形をとる。適切な技術を有する当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用し適当な溶液を準備することができる。保存料、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤を必要であれば含めてよい。
【０１１５】
リポソーム、特に陽イオンリポソームを担体処方に使用することができる。上記の技術及びプロトコルの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０年に見出すことができる。
【０１１６】
物質又は組成物は、局所方式で特定の部位に投与することができ、又は特定の細胞又は組織を標的にする方式で、例えば、動脈内ステントを基にした送達を使用し送達することができる。
【０１１７】
標的治療は、一定の型の細胞に作用物質を送達するために使用することができ、より詳細には抗体や細胞特異的リガンドなどの標的系の使用によって送達する。標的を定めることは、様々な理由で、例えば、作用物質が許容できないほど有毒である場合、そうでない場合は過度に高用量が必要とされる場合、そうでない場合は標的細胞に侵入できない場合に望ましいかもしれない。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、ＨＩＦレベル又は活性の増大又は減少に伴う状態を治療する薬剤の製造に本発明の作用物質の使用を準備する。状態は、例えば、虚血、創傷治癒、自家移植、同種移植、及び異物移植、全身性高血圧症、癌、及び炎症性疾患からなる群から選択することができる。
【０１１９】
遺伝子治療
本発明のＨＩＦアスパラギン水酸化酵素は、標的細胞中でＨＩＦ−αの水酸化を促進し又は強化するために使用することができる。したがって、そのような水酸化の促進は、ｐ３００との相互作用を低減し、転写の活性化を低減することができる。これは、血管形成の低減に役立ち、標的細胞中での他のアポトーシス応答及び増殖応答に作用することになる。したがって、本発明のこの態様によれば、ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素をコードする核酸を、それを必要とする標的細胞に提供することができる。
【０１２０】
物質がペプチド又はポリペプチドの場合は、細胞に導入したコード核酸、例えば、ウイルスベクターから発現させることによって、それらを標的細胞中で生成させることができる。ベクターは、治療対象となる特異的細胞を標的とすることができ、又はベクターには標的細胞によって多少選択的に切り替わる調節要素を含めてよい。
【０１２１】
ＨＩＦ水酸化酵素によってＨＩＦαのアスパラギン水酸化を調節する、例えば、干渉することができる物質、例えば、ペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療法、例えば、疾患の予防又は（全体的に又は部分的な）治癒を目指して、例えば、個体の治療に使用することができる。
【０１２２】
本明細書に記載したＨＩＦアスパラギン水酸化酵素をコードする核酸は、ＨＩＦ水酸化酵素活性のアンチセンス調節に使用することもできる。ＨＩＦ水酸化酵素コード遺伝子の発現の下方調節は、アンチセンス技術又はＲＮＡ干渉を使用し実現することができる。
【０１２３】
遺伝子発現を下方調節するためにアンチセンス遺伝子又は部分的遺伝子配列を使用する際には、ヌクレオチド配列は、転写によってＲＮＡが生じるような具合にプロモーターの制御下「逆進方向」に配置し、このＲＮＡは標的遺伝子の「センス」鎖から転写される正常ｍＲＮＡに相補的である。例えば、Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ、第３３４号７２４〜７２６頁を参照のこと。アンチセンス技術もＦｌａｖｅｌｌ、（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、第９１号３４９０〜３４９６頁に概説されている。
【０１２４】
コード配列の逆進方向に対応する完全配列は使用すべきではない。例えば、十分な長さの断片を使用することができる。抗センス阻害のレベルを最適化するために、コード配列の様々な寸法の、及び様々な部分からの断片をスクリーニングすることは当業者には慣例の事柄である。メチオニンＡＴＧ開始コドンを含めることは有利となるかもしれず、おそらく開始コドン上流の１つ又は複数のヌクレオチドも有利となるかもしれない。さらに、遺伝子の保存配列、例えば、調節配列など、１つ又は複数の遺伝子に特徴的な配列を標的にすることも可能である。
【０１２５】
使用配列は、５００ヌクレオチド以下、およそ約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、又は約１００ヌクレオチドでよい。かなり短い１４〜２３ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することは可能かもしれないが、長い断片、一般に５００をさらに超える長さのヌクレオチドも可能な場合は好ましい。
【０１２６】
所与のＤＮＡ配列（例えば天然ポリペプチド又はその突然変異体）によってコードされるＨＩＦ水酸化酵素の生成に干渉し、その結果その発現を低減し又は共に阻止して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを核酸、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、又は成熟ｍＲＮＡの相補的配列とハイブリッド形成するように設計することができる。例えば、５’フランキング配列中の遺伝子のコード配列、制御配列を標的とするためにアンチセンス技術を使用することができ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドは制御配列に干渉することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡでよく、長さ約１４〜２３ヌクレオチド、特に約１５〜１８ヌクレオチドでよい。アンチセンス配列の構築及びその用途は、Ｐｅｙｍａｎ及びＵｌｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０号５４３〜５８４頁（１９９０）、及びＣｒｏｏｋｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第３２号３２９〜３７６頁（１９９２）に記載されている。
【０１２７】
標的配列の発現の下方調節に使用された配列と標的配列には完全な配列相同性があることが好ましいかもしれないが、配列の全相補性又は類似性は必須ではない。標的遺伝子から使用された配列では１つ又は複数のヌクレオチドが異なってよい。したがって、本発明による遺伝子発現の下方調節で使用される配列は、１つ又は複数のヌクレオチドの、そのような配列の挿入、付加、欠失、又は置換として得ることができた配列、すなわち突然変異体、誘導体、変異体、又は対立遺伝子から選択した野生型配列（例えば遺伝子）でよい。
【０１２８】
配列は、読み枠を含んでいなくても、又は翻訳可能なはずのＲＮＡを特徴付けなくてもよい。ハイブリッド形成するそれぞれのセンスＲＮＡ分子に十分な相同性があることが好ましいかもしれない。使用する配列と標的遺伝子の間に約５％、１０％、１５％、又は２０％以上のミスマッチがある場合でさえ遺伝子発現の下方調節はあるかもしれない。
【０１２９】
ＨＩＦアスパラギン水酸化酵素の発現を調節するために使用できる遺伝子の特異的下方調節に対する他の手法は、特異的核酸配列を切断するように設計したリボザイムの使用を含めてよく知られている。リボザイムは、核酸分子、実際にはＲＮＡであり、このリボザイムはｍＲＮＡなどの１本鎖ＲＮＡを定義した配列で特異的に切断し、その特異性は設計することができる。ハンマーヘッドリボザイムが好ましいかもしれない。というのは、ハンマーヘッドリボザイムは長さ約１１〜１８塩基の塩基配列を認識し、長さ約４塩基の配列を認識するテトラヒメナ型リボザイムより高い特異性を有するが、このテトラヒメナ型リボザイムは一定の状況で有用である。リボザイムの使用についての参照文献にはＭａｒｓｃｈａｌｌら「細胞及び分子神経生物学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９４、１４（５）５２３頁；Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４号５８５頁（１９８８）、及びＣｅｃｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．、第２６０号３０３０頁（１９８８）が含まれる。
【０１３０】
ウイルスベクターなどのベクターは、多彩な異なる標的細胞に核酸を導入するために従来技術で使用されてきた。典型的にはベクターを標的細胞に曝露し、その結果細胞の十分な割合でトランスフェクションを生じさせて、所望のペプチドの発現から有用な治療又は予防効果を得ることができるようにする。トランスフェクトさせた核酸は、標的細胞のそれぞれゲノム中に永久に組み込んで長く持続する効果を提供することができ、或いはこの治療を定期的に反復する必要があるかもしれない。
【０１３１】
ウイルスベクター及びプラスミドベクターの様々なベクターが、当技術分野で知られており、米国特許第５，２５２，４７９号及びＷＯ９３／０７２８２号を参照されたい。特に、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶを含むヘルペスウイルス、レトロウイルスを含めて、いくつかのウイルスが遺伝子転移ベクターとして使用されてきた。従来技術の多くの遺伝子治療プロトコルが不活化したマウスレトロウイルスを使用してきた。
【０１３２】
遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用の代替法として、細胞に核酸を導入する他の周知の方法には、マイクロインジェクションなどの機械的術式、リポソームにより媒介される転移、及び受容体媒介ＤＮＡ転移が含まれる。
【０１３３】
リガンドが標的細胞の表面に存在する受容体に特異的である状態で、核酸をポリリジンによって蛋白質リガンドと結合させる受容体媒介遺伝子転移は、核酸を特定の細胞に特異的に標的とさせる術式の一例である。
【０１３４】
したがって、他の様々な態様では、本発明は、上記した医療状態の治療方法で使用される薬剤組成物、薬剤、薬物、又は他の組成物を提供し、組成物は本明細書に記載の単離した核酸分子を含み；医療法でのそのような組成物の使用；方法は患者にそのような組成物を投与することを含み、例えば上記した医療状態の（予防的治療を含めることができる）治療を含み；そのような任意の目的、例えば本明細書に記載した状態の治療のために投与するための組成物、薬剤、又は薬物の製造でのそのような作用化合物又は物質の使用；並びにそのような作用物質、化合物、又は物質と、薬剤として許容される賦形剤、ビヒクル、又は担体、場合によっては他の成分を混合するステップを含む薬剤組成物の製造方法を提供する。
【０１３５】
ポリペプチドの使用
本発明の別の態様は、本明細書に記載したＨＩＦ水酸化酵素の使用、又はＨＩＦポリペプチドのアスパラギンを水酸化させるためのその断片、又はＨＩＦ水酸化酵素のアスパラギン含有基質を提供する。
【０１３６】
特に、本発明は、ＦＩＨはＨＩＦ−α中のアスパラギン残基を水酸化するが、アスパラギン酸残基の水酸化には活性を有するとは思われないことを確立している。したがって、ほとんど又はまったくアスパラギン酸を水酸化せずに、基質中のアスパラギン残基を特異的に水酸化するために、配列番号２である本発明のポリペプチド、及び上記したその変異体を使用することができる。
【０１３７】
本発明によるＨＩＦアスパラギン水酸化酵素ポリペプチドを、ＨＩＦ水酸化酵素の別の基質を同定するために使用することもできる。例えば、他の水酸化酵素又は他のペプチドによって水酸化されることが予め実証されているペプチドを本発明によるＨＩＦ水酸化酵素に接触させて、そのようなペプチドのアスパラギンの水酸化をモニタリングすることができる。本発明の水酸化酵素による水酸化を高めることが分かっている作用物質及び補助因子の提供を含めて、任意の適当な状態を選択することができる。補助因子の濃度のモニタリングを含む任意の適当な方法によって又は水酸化生成物によって基質の水酸化はモニターすることができる。
【０１３８】
本発明の他の様々な態様及び実施形態は、本開示に照らして当業者には明らかとなる。
【０１３９】
次に、本発明のある種の態様及び実施形態を実施例によって、且つ以下に記載した図面に関して例示する。
【実施例】
【０１４０】
実験用手順
ｆｉｈ／ＦＩＨのクローニング、発現、及び精製
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ付きＦＩＨ融合蛋白質を生成するために、ｆｉｈ遺伝子をＩｍａｇｅクローン４１３８０６６からＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片としてｐＥＴ２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にサブクローン化した。
【化１】
2005526515.tif 000004
増幅に続いて、ｆｉｈの統合性がＤＮＡ配列決定によって確認された。ｆｉｈ／ｐＥＴ２８ａ（＋）構築体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン３０μｇ／ｍｌを含有する２ＴＹ培地中３７℃で増殖し、イソプロピル−β−（Ｄ）−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘発した。ニッケルアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用し、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグＦＩＨ融合蛋白質を精製し、トロンビンで切断することによってＦＩＨからＮ末端Ｈｉｓ６タグを除去した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳｕｐｅｒｄｅｘＳ７５）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による純度＞９５％のＦＩＨがもたらされた。エレクトロスプレーイオン化ＭＳによって明らかになった単離ＦＩＨの質量は、その予想されるアミノ酸配列から推定した質量と一致した（観察４０５５６Ｄａ、算出４０５６７Ｄａ）。
【０１４１】
ＨＩＦ−１α断片のクローニング、発現、及び精製
Ｎ末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付き融合蛋白質を生成するために、所望のヒトＨＩＦ−１αセグメントをＳａｃＩＩ／ＡｓｃＩ断片としてｐｃＤＮＡ３ベクターから（Ｏ  Ｒｏｕｒｋｅら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、第２７４号２０６０〜２０７１頁）改変形ｐＧＥＸ−６Ｐ−ｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に直接クローン化した。構築体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する２ＴＹ培地中３７℃で増殖しＩＰＴＧで誘発した。ＧＳＴタグ付き融合蛋白質は、グルタチオンセファロース（商標）４Ｂレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し精製した。必要な場合は、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ処理によってＧＳＴタグをＨＩＦ−１α断片から除去した。サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による純度＞９５％の蛋白質がもたらされた。ＨＩＦ−１αＨｉｓ６タグ付き断面をＥｐｓｔｅｉｎら、２００１．Ｃｅｌｌ、第１０７号４３〜５４頁に記載の通りに調製した。
【０１４２】
ＨＩＦ−１α７７５−８２６の突然変異誘発研究
突然変異体ＧＳＴ  ＨＩＦ−１α７７５−８２６アイソザイムを、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し野生型構築体から生成した。
【化２】
2005526515.tif 000005
【０１４３】
ＦＩＨアッセイ
上記Ｅｐｓｔｅｉｎらに報告された通り、放射性標識した２−ＯＧ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を使用し２−ＯＧの脱炭酸のアッセイを実施した。アスコルビン酸塩、ＤＴＴ、カタラーゼ、２−ＯＧ、ＦＩＨ、及び基質を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４に含めたインキュベーションを３７℃で通常２０分間実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４（１０ｃｍ×４．６ｍｍ）カラムで、０．１％ＴＦＡ中ＣＨ３ＣＮの直線勾配を使用することによってＨＰＬＣ分離を行った。阻害及び金属依存アッセイについては、ＧＳＴＨＩＦ−１α７７５−８２６を基質として３０μＭで使用し、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）、塩化コバルト（ＩＩ）、塩化亜鉛（ＩＩ）、及びＮ−オキサロイルグリシンを最終濃度０、２、１０、４０、８０、及び２００μＭで共に使用した。ＭｃＮｅｉｌｌら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ、２００２、第１２号１５４７〜１５５０頁で報告された通りに１８Ｏ２雰囲気下でのアッセイを実施した。
【０１４４】
ＧＳＴプルダウンアッセイ
ｐ３００に結合するＨＩＦ−１αに対するＦＩＨの作用を検証するために、ＨＩＦ−１α７７５−８２６のアミノ酸を発現するＧＳＴ融合蛋白質及びＮ８０３Ａ突然変異体を、水酸化を促進するように設計した条件下で組換えＦＩＨに暴露した。必要な場合は、Ｎ−オキサロイルグリシンを５ｍＭに加えた。グルタチオンセファロースビーズを２５℃で４０分間加え、次いで５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５％ＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＤＴＴで洗浄した。処理したＧＳＴ  ＨＩＦ融合蛋白質を備えたビーズをウサギ網状赤血球ライセート中で生成した３５Ｓ標識ＣＨ１−ｐ３００（ｐ３００のアミノ酸３００−５２８をコードするｐｃＤＮＡ３Ｇａｌ−ｐ３００−ＣＨ１）と混合した。２５℃で１時間結合を実施し、次いでビーズを同じ緩衝液中で洗浄した。結合した蛋白質をＳＤＳ泳動用緩衝液中に溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィによって分析した。
【０１４５】
蛍光偏光測定アッセイ
ＨＩＦポリペプチドの水酸化アッセイを５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で行うことができる。インキュベーションは、４ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭのＤＴＴ、８０μＭの２ＯＧ、ポリペプチド、４６８ｎＭのＧＳＴ−ｐ３００複合体（ＧＳＴがグルタチオンＳトランスフェラーゼである場合、精製助剤）、１５μＭ鉄（ＩＩ）、及び０．３ｎＭのＨＩＦ水酸化酵素を含む。インキュベーションは、２９℃で行うことができる。ｐ３００の存在下で標識（Ｃｙ５蛍光染料）ＨＩＦ断片を用いてＨＩＦ水酸化酵素をインキュベーションすることからデータをグラフにリアルタイムでプロットすることができ、水酸化したペプチドがこのｐ３００に結合することによって異方性の増大がもたらされる。
【０１４６】
ＦＩＨはＨＩＦ−αＣＡＤ水酸化酵素である
構造及び機能が分かっている２−ＯＧ酸素添加酵素の配列に照らして予想されるＦＩＨアミノ酸配列の予備分析は、ＦＩＨがＦｅ（ＩＩ）因子に結合する残基の保存性ＨＸ（Ｄ／Ｅ）．．．Ｈ「表面上三連構造」を含むことを示唆した。報告されているＦＩＨとＨＩＦ−１αのＣ末端活性化領域の間の相互作用、及びそのトランス活性化を下方調節する能力を考えれば、本発明者らは、ＦＩＨがＡｓｎ−８０３水酸化酵素として機能すると判断する。
【０１４７】
したがって、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中でＮ末端Ｈｉｓ６タグ付きＦＩＨ遺伝子を生成し純度＞９５％まで精製した。次いで、２−ＯＧの脱炭酸をモニターするアッセイを使用し、同定された３つ全ての水酸化部位を包含するＨＩＦ−１αポリペプチドを精製組換えＦＩＨの仮想基質として検証した（表１、事項１〜６）。結果は、事前にＰＨＤアイソザイムの基質と思われたＨＩＦ断片のＦＩＨ媒介水酸化はなかったことが明瞭に示唆され、それによってＦＩＨはＨＩＦプロリル水酸化酵素ではないことが暗示される（表１、事項４〜６）。それに反して、ＣＯ２生成は、Ｃ末端活性化領域を含むＨＩＦ−１α断片の存在下で著しく刺激を受けた（ＣＡＤ、表１、事項１〜３）。ヒトＨＩＦ−１αのＣＡＤ（残基７７５−８２６）を包含するポリペプチドのＧＳＴ融合体及び遊離体は、ＦＩＨ媒介２−ＯＧ代謝回転を著しく刺激することが認められた。高率（＞１０：１）の１次基質結合：未結合２−ＯＧ代謝回転は、遊離７７５−８２６基質の場合に認められ、２−ＯＧ代謝回転アッセイを使用し得られたこのペプチドの予備的動的パラメーターはＫｍ（ペプチド）＝１０μＭ、Ｋｍ（２−ＯＧ）＝１０μＭ、Ｖｍａｘ＝０．３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇであった。
【０１４８】
表１：ＨＩＦ−１αポリペプチドを用いたＦＩＨの基質選択性。ＨＩＦ−１α中の分かっている３つの水酸化部位（Ｐｒｏ−４０２、Ｐｒｏ−５６４、Ａｓｎ−８０３）を含む蛋白質を用いてＦＩＨをインキュベーションした。３列目は、標準的アッセイ条件下ＣＯ２放出によってアッセイしたポリペプチドの活性を示す。４列目は、同じ条件下で基質としてペプチド７７５−８２６の活性と比べた基質それぞれの活性を示す。アッセイの詳細は実験を参照のこと。
【表２】
2005526515.tif 000006
【０１４９】
２−ＯＧ代謝回転アッセイでは１次基質の酸化が直接測定されないので、ＦＩＨ媒介水酸化の明白な実証を質量分析から探求した。基質としてＨＩＦ−１α７７５−８２６ペプチドを使用し標準条件下で、生成物のＨＰＬＣ単離後１６Ｄａの質量の増加が認められた（図１ａ、パネルａ及びｂ）。結果は、ＦＩＨがＨＩＦ−αのＣＡＤを変化させる２−ＯＧ依存性水酸化酵素であることを実証する。この活性がｐ３００活性化補助因子との間の相互作用を調節するかどうか試験するために、ＧＳＴ融合ＨＩＦ−１αのＣＡＤを２−ＯＧの脱炭酸を支持する条件下で精製組換えＦＩＨに暴露し、精製し、ＧＳＴプルダウンアッセイによって３５Ｓ標識ＣＨ１と相互作用する能力をアッセイした。図１ｂは、ＦＩＨでの前処理によってＨＩＦ−１αのＣＡＤポリペプチドのＣＨ１と相互作用する能力が著しく低減されたことを示す（レーン１及び２を比較）。
【０１５０】
ＨＩＦ−１αのＣＡＤ中の改変残基としてＡｓｎ−８０３の事前のＭＳ／ＭＳの割当に続き、本発明者らは、この部位で一連の突然変異を構築し、さらに２−ＯＧ脱炭酸及び突然変異体ポリペプチドを使用し相互作用アッセイを実施した。ＧＳＴ  ＨＩＦ−１α７７５−８２６中のＡｓｎ−８０３をアラニンへ突然変異させると２−ＯＧ脱炭酸アッセイ中の全活性が無効になり（表１、事項８〜１０）、相互作用アッセイ中のＣＨ１結合の調節が阻止された（図１ｂ、レーン４及び５）。グルタミン及びグルタミン酸塩への突然変異も活性を無効にした一方で、Ａｓｐ−８０３突然変異体は依然として多少２−ＯＧ代謝回転を支持したが、Ａｓｎ−８０３類似基質の最大７％にすぎなかった（表１、事項７）。
【０１５１】
これらの結果を合わせるとＦＩＨは二酸素要求Ａｓｎ−８０３水酸化酵素であり、この酵素は、ＨＩＦ−αのＣ末端のトランス活性化を、ｐ３００のＣＨ１領域との間の相互作用を調節することによって制御することが実証される。ＦＩＨが基質としてアスパルチル残基ではなくアスパラギニル残基を明白に優先することは、事前に報告されているヒトＡｓｐ／Ａｓｎ水酸化酵素と対照をなし、この酵素はアスパルチル残基及びアスパラギニル残基のβ−炭素で水酸化を触媒する。この観察から、ＦＩＨが媒介する水酸化はＡｓｎ−８０３のβ−炭素では生じないが別の原子で生じるという可能性が生まれる。第１級アミドのα−炭素又はカルボニル酸素の酸化は、Ａｓｐ−８０３及び他の突然変異体の活性の相対的な欠如をもたらすことはないように見え、推定上の生成物を不安定にするように思われる。第１級アミドの窒素は、水酸化されてヒドロキサム酸（ＣＨ２ＣＯＮＨＯＨ）を生じる可能性が高いように思われる。そのような修飾が、ＣＡＤとｐ３００の間の相互作用を崩壊するはずであることを得られたＮＭＲデータは示唆している。
【０１５２】
ＦＩＨ活性のさらに詳細な特徴付け
ＦＩＨの機序及びｉｎ  ｖｉｖｏＨＩＦ活性化の特性との関係を探求するために、精製組換え蛋白質を使用しＦＩＨのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を実施した。モノ鉄触媒部位の操作と一致して、精製組換えＦＩＨは蛋白質各１個につき約１個の金属イオンを含むことが分析によって明らかになった（未公開データ）。ＨＩＦ−１αのＣＡＤによるＣＨ１の捕獲のバイオアッセイで（図１ｂレーン２及び３を比較）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ動力学的アッセイ（ＩＣ５０、２５μＭ）で、ＦＩＨはＰＨＤアイソザイム及び他の２−ＯＧ酸素添加酵素の既知の阻害剤であるＮ−オキサロイルグリシンによって阻害された。コバルト（ＩＩ）も組換えＦＩＨ活性を阻害し（ＩＣ５０、１０μＭ）、これらの物質のＨＩＦ−１αのＣＡＤ活性を調節する能力を示した。興味深いことに、外来性鉄（ＩＩ）を精製ＦＩＨ／ＨＩＦ−１αのＣＡＤアッセイに加えると活性がさらに増大することはなく、ＦＩＨによる比較的緊密な金属結合が暗示された。これは、水酸化アスパラギン生成物が鉄と錯体を形成する能力を反映しているのかもしれない。ＦＩＨとクピンファミリー由来の亜鉛（ＩＩ）結合蛋白質の関係のために（以下を参照）、本発明者らは亜鉛（ＩＩ）の作用も試験し、コバルト（ＩＩ）を用いた作用に類似する阻害を見出した（ＩＣ５０、１０μＭ）。亜鉛（ＩＩ）は、ＨＩＦ転写応答を誘発しないが、最近の研究では亜鉛（ＩＩ）はＨＩＦ−１αを安定化させるが、ＣＡＤを欠く短い形態への代わりのスプライシングを誘発することによってトランス活性化を遮断することが実証されている。これらの知見の生理学的関連性は依然として不明であるが、しかしそれによって亜鉛（ＩＩ）はＦＩＨ及びＰＨＤ酵素を阻害するように思われる。
【０１５３】
ＦＩＨの補助基質としての二酸素の要求は、ＰＨＤアイソザイムと同様にＦＩＨが細胞酸素センサの役割をし得ることを示している。実際、雰囲気酸素の段階的な減少条件下でアッセイを行った場合、ＨＩＦ−１αのＣＡＤが結合した２−ＯＧ脱炭酸が、約５％Ｏ２以下で大量に進行して減少することがＦＩＨによって実証された。これは、ＰＨＤ１に関しては、活性は生理学的範囲内の酸素濃度によって制限されることを示唆している。二酸素との相互作用をさらに探求するために、１８Ｏ２気体雰囲気下でのインキュベーションと、それに続く質量分析によって生成物中に組み込まれた酸素原子の起源を調査した。結果から水酸化生成物中の酸素供給源は＞９８％が二酸素に由来することが判明し（図１ａ、パネルｃ）、ＰＨＤ１とプロコラーゲンプロリル水酸化酵素に関して示されるようにＦＩＨと二酸素の間の直接互作用を証明した。これらの結果は、微生物性２−ＯＧ酸素添加酵素を用いての同様の組込み実験と対照的であり、そこでは水からの酸素及び二酸素の組込みが観察される。水の５配位フェリル種への結合によって生じることが交換プロセスによって提案されきた［Ｆｅ（ＩＶ）＝Ｏ＜−＞Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｏ］。ＦＩＨとＰＨＤ１の場合には、活性部位での大型のペプチド基質の存在が水の経路を遮断し、その結果交換が妨害されるのかもしれない。
【０１５４】
生物学的及び構造的暗示
ＰＨＤアイソザイムとは異なる２−ＯＧ酸素添加酵素スーパーファミリーの別の構成員がＨＩＦトランス活性化の調節に関与することは、いくつかの生物学的問題を引き起こす。第一には、その関与は、二酸素の有用性とＨＩＦ活性との間に、低酸素への転写応答の生理学的特性を形作ることに役立ち得る別の結合を定義する。第２には、その関与は、孤立した分解及びＨＩＦ−αサブユニットの活性化領域に対する低酸素効果の模倣に際してコバルト特有の作用を説明する。第３には、その関与は、さらに、虚血／低酸素疾患のＨＩＦ活性を増大させる治療薬の開発に向けた標的を提供する。第４には、ヒストン脱アセチル化酵素及びｐＶＨＬとＦＩＨとの間の報告されている相互作用は、ＨＩＦ転写応答又は他の経路に作用する別の酸素調節プロセスにこれらの蛋白質が関与し得ることを示唆する。
【０１５５】
本発明者らの知見は、２−ＯＧ酸素添加酵素及び関連酵素に関して興味深い構造及び進化の問題も提起する。配列を比較することによってＰＨＤアイソザイムと同様に、ＦＩＨは他の２−ＯＧ酸素添加酵素中に見出された保存性ＨＸ（Ｄ／Ｅ）．．．Ｈモチーフから形成された２−Ｈｉｓ−１−カルボキシル酸塩表面上三連構造を利用することが判明している。結晶学的洞察及び２次構造の予測と併せて、分析によってＦＩＨが他の２−ＯＧ酸素添加酵素に共通のゼリーロールβ−シートコア（２本鎖β−へリックス）を有することが暗示される。それらの洞察及び予測によってＦＩＨが８本鎖ゼリーロールモチーフ（図２ａ）のβ鎖４と５の間に約４０残基の挿入物を有することも判明し、ＦＩＨの構造が互いに密接に関係しているＰＨＤアイソザイムとは著しく異なることが示唆される。
【０１５６】
動力学的分析は、ＦＩＨが２−ＯＧを要求することを明瞭に実証しているが、ＦＩＨの異常な特徴は２−ＯＧの５−カルボキシル酸塩の結合に関与する残基の素性に関係する。分析は、ＦＩＨがゼリーロールのβ−鎖８上に位置するアルギニン残基又はリジン残基を持たず、この残基はＰＨＤ中に存在する２−ＯＧの５−カルボキシル酸塩と、他の多くの２−ＯＧ酸素添加酵素との結合に関与することを暗示している（図２ａ）。
【０１５７】
したがって、ＦＩＨは、おそらく、２−ＯＧ酸素添加酵素の新規な構造のサブファミリーの第１の構成員を構成し、ＰＨＤアイソザイムに対するＦＩＨに選択的な阻害剤又はその逆の阻害剤の開発が可能なはずである。
【０１５８】
Ｍａｈｏｎらは、ＢＬＡＳＴサーチを使用してＦＩＨに配列が近似する蛋白質を同定した。これらの１つ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ  １６８３６２．１）は、ｊｕｍｏｎｊｉ転写因子中に存在するＪｍｊＣ相同性領域であり、この領域はクピン構造スーパーファミリーの構成員として同定されている。Ｚｎ（ＩＩ）によって阻害されるＦｅ（ＩＩ）依存性酸素添加酵素としてＦＩＨを同定することによって、本発明者らは２−ＯＧの結晶構造とクピンスーパーファミリーの結晶構造の比較に駆り立てられた。これらの分析によってクラバミン酸合成酵素（ＣＡＳ１２）を例とする２−ＯＧ酸素添加酵素のコアと、リン酸マンノース異性化酵素（ＰＭＩ３）（２７）を例とするクピンスーパーファミリーとの間に際立った近似性があることが明らかになり、この近似性は、保存モチーフの存在と共に２−ＯＧ酸素添加酵素がクピンスーパーファミリーに属することを示唆している（図２ｂ）。さらに、ＨＸＨ．．．Ｈ金属結合モチーフは、（例えばケルセチン２，３−ジオキシゲナーゼ中の）クピンスーパーファミリー内に首尾よく確立され、ＩＩ型ＰＭＩの場合にはＱＸＨ．．．Ｈモチーフに改変される。興味深いことに、ＪｍｊＣ転写因子は細胞増殖及び心臓の発生に関与し、２−ＯＧ酸素添加酵素と同様に保存性ＨＸ（Ｄ／Ｅ）．．．Ｈモチーフを保持し、ＦＩＨ及びＰＨＤアイソザイムと同様に、それらは転写の調節に関与する鉄酸素添加酵素かもしれないことを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１ａ】二酸素から生成物中への酸素の組込みを証明するＨＩＦ−１α７７５−８２６エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルを示す図である。ａ）反応前ＨＩＦ−１α７７５−８２６、算出した質量６６９７．３１Ｄａ、観察された質量（ＭＨ＋）＝６６９４．７Ｄａ、ｂ）常酸素下（１６Ｏ２）反応から単離したペプチド、増加質量＝１６．５Ｄａ、ｃ）１８Ｏ２雰囲気下反応から単離したペプチド、増加質量＝１８．３Ｄａ。
【図１ｂ】ＦＩＨは、ｐ３００のＣＨ１領域に結合するＨＩＦ−１αのＣＡＤを調節する。組換えＦＩＨで予めインキュベーションした、又はインキュベーションしなかったＨＩＦ−１αのＣＡＤによる３５Ｓ標識したＣＨ１の捕獲を示すオートラジオグラフである。ＦＩＨでの事前インキュベーションによってＨＩＦ−１αのＣＡＤがＣＨ１を捕獲する能力は際立って低減された（レーン１及び２を比較）。ＦＩＨ／ＨＩＦ−１αのＣＡＤ反応ステップにＮ−オキサロイルグリシンを含めることによってＦＩＨの作用が阻害された。構成的に活性なＮ８０３Ａ突然変異ＨＩＦ−１αのＣＡＤへのＣＨ１の結合は、ＦＩＨでの事前インキュベーションによって影響を受けなかった（事前インキュベーション４及び５）。
【図２ａ】保存２次構造と結合モチーフを比較して、ＣＡＳ１の配列（クラバミン酸合成酵素１、Ｑ０５５８１）、ＰＨＤ３（蛋白質３を含むプロリル水酸化酵素領域、Ｑ９Ｈ６Ｚ９）、ＦＩＨ１（因子抑制ＨＩＦ−１、Ｑ９６９Ｑ７）、ＰＭＩ（リン酸マンノース異性化酵素ＩＩ型、Ｐ３４９４８）を示す図である。ＣＡＳ１の結晶学的な２次構造を配列の上に、ＰＭＩを配列の下に示し、ゼリーロールβ鎖に番号を付す。ゼリーロール中にはないα−へリックス及びβ鎖を見ることもできる。ＦＩＨのゼリーロールのβ鎖の４と５の間に通常存在する挿入物は、ＣＡＳ１及びタウリンジオキシゲナーゼ（図示せず）中にも存在し、このタウリンジオキシゲナーゼは２−ＯＧジオキシゲナーゼのサブファミリーを定義することを留意されたい。既知の／予想される金属結合リガンドを三角形によって示す。報告されている酵素では：Ｆｅ（ＩＩ）：２−ＯＧ構造  ２−ＯＧの５−カルボキシル酸塩はアルギニン残基の側鎖と静電相互作用を形成する（三角形によって表示）。ＦＩＨは、２−ＯＧ５−カルボキシル酸塩を結合するとして同定されたＲＸ３Ｔ（ＰＨＤと同様に）又はＲＸＳモチーフを持たず、（プロコラーゲンプロリル水酸化酵素と同様に）これらのモチーフのアルギニンに似た位置にあるリジンも持たない。ＦＩＨでは、第８ゼリーロールβ鎖上に位置するＴｈｒ−２９０及びＴｈｒ−２９２は、２−ＯＧ結合に関与してよい。
【図２ｂ】亜鉛と錯体を形成したリン酸マンノース異性化酵素（左）の構造と、Ｆｅ（ＩＩ）と錯体を形成したクラバミン酸合成酵素２−ＯＧ及び（Ｌ）−Ｎ−α−アセチルアルギニン基質（右）の構造の比較を示す図である。このゼリーロールモチーフの挿入物であるコアゼリーロールモチーフ、及び他の２次構造を見ることができる。同様に位置した金属結合残基、及びＣＡＳ１の２つの基質も見ることができる。ＰＭＩはＣＡＳ１と同様にゼリーロールモチーフに伸展した挿入物（〜１１５残基）を有しＦＩＨと予想されることに留意されたい。
【配列表】
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【図１ｂ】
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【国際調査報告】
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