(57)【要約】本発明は、個体から得た試料中のアルファ２−マクログロブリン（α２−ＭＧ）を検出し、該個体から得た試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）を検出し、個体から得た試料中のメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤を検出し、さらにα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の有無またはレベルに基づいてその個体における肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、中程度線維症ないし重度肝線維症（Ｆ２〜Ｆ４）と非肝線維症ないし軽度肝線維症（Ｆ０〜Ｆ１）とを区別するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における肝線維症の存在または重症度を診断する方法であって、
（ａ）個体から得た試料中のα２−マクログロブリンを検出する工程と
（ｂ）該個体から得た試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）を検出する工程と、
（ｃ）該個体から得た試料中のメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤を検出する工程と、
（ｄ）α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の存在またはレベルに基づいて該個体における肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、を包含する、方法。
【請求項２】
多くても３つの線維症マーカーを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体から得た試料中で、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーがＹＫＬ−４０である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記個体から得た試料中で、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢからなる群から選択される２つ以上のマーカーを検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個体がウイルス性肝炎を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染している、請求項７に記載の方法。
【請求項８】
前記個体がＢ型肝炎ウイルスに感染している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記個体が自己免疫性肝疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体がアルコール性肝疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体が脂肪性肝疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記個体が薬物誘発性肝疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｃ）が、前記試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記α２−ＭＧタンパク質のレベルを、１種類以上のα２−ＭＧ特異的結合剤を用いて決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記α２−ＭＧタンパク質のレベルを、１種類以上の抗α２−ＭＧ抗体を用いて決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）が、α２−ＭＧ活性のレベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）が、前記試料中のＨＡのレベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＡのレベルが、１種類以上のＨＡ特異的結合剤を用いて決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＡのレベルが、１種類以上のＨＡ結合タンパク質を用いて決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＡのレベルが、１種類以上の抗ＨＡ抗体を用いて決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ｃ）が、前記試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルが、１種類以上のＴＩＭＰ−１特異的結合剤を用いて決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルが、１種類以上の抗ＴＩＭＰ−１抗体を用いて決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ｃ）が、ＴＩＭＰ−１活性のレベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ａ）がα２−ＭＧタンパク質のレベルを決定することを包含し、
前記工程（ｂ）が前記ＨＡのレベルを決定することを包含し、そして
前記工程（ｃ）が前記ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを決定することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１タンパク質の各々のレベルが、酵素結合アッセイを用いて決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体から単一の試料が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝臓組織からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が血清試料である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
非肝線維症または軽度肝線維症を、中程度の肝線維症ないし重度の肝線維症と区別することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
個体における非肝線維症または軽度肝線維症を中程度の肝線維症ないし重度の肝線維症と区別する方法であって、
（ａ１）α２−ＭＧと抗α２−ＭＧ抗体との第１の複合体を形成するために適切な条件下で、該個体から得た試料の適当な希釈物を抗α２−ＭＧ抗体と接触させる工程と、
（ｂ）未結合の分子を除去するため該第１の複合体を洗浄する工程と、
（ｃ）α２−ＭＧを含有する第１の複合体の量を決定する工程と、
（ｄ）ＨＡとＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）との第２の複合体を形成するために適切な条件下で、該個体から得た試料の適切な希釈物をＨＡＢＰと接触させる工程と、
（ｅ）未結合の分子を除去するために該第２の複合体を洗浄する工程と、
（ｆ）ＨＡを含有する第２の複合体の量を決定する工程と、
（ｇ）ＴＩＭＰ−１と抗ＴＩＭＰ−１抗体との第３の複合体を形成するために適切な条件下で、該個体から得た試料の適切な希釈物を抗ＴＩＭＰ−１抗体と接触させる工程と
（ｈ）未結合の分子を除去するために該第３の複合体を洗浄する工程と、
（ｉ）ＴＩＭＰ−１を含有する第３の複合体の量を決定する工程と、
（ｊ）α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１含有複合体の量に基づいて、該個体中の非／軽度の肝線維症を中程度／重度の肝線維症と区別する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３２】
患者における抗線維症療法の有効性をモニターする方法であって、
（ａ）抗線維症療法が施された患者から得た試料に含まれるα２−マクログロブリンを検出する工程と、
（ｂ）該患者から得た試料に含まれるヒアルロン酸（ＨＡ）を検出する工程と、
（ｃ）該患者から得た試料に含まれるメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害剤を検出する工程と、
（ｄ）α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の存在またはレベルに基づいて該患者での肝線維症の存在または重症度を決定し、それによって抗線維症治療法の有効性をモニターする工程と、を包含する、方法。
【請求項３３】
前記工程（ｄ）で決定された肝線維症の存在または重症度を、それよりも先の前記患者における肝線維症の存在または重症度と比較する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
多くても３種類の線維症マーカーを検出することを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記患者から得た試料中に、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢからなる群から選択される少なくとも１種類のマーカーを検出する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）が、前記試料中のα２−ＭＧタンパク質を決定することを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記α２−ＭＧタンパク質のレベルが、１種類以上の抗α２−ＭＧ抗体を用いて決定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記工程（ｂ）が、前記試料中のＨＡのレベルを決定することを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＨＡのレベルが、１種類以上のＨＡ結合タンパク質を用いて決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程（ｃ）が、前記試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを決定することを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルが、１種類以上の抗ＴＩＭＰ−１抗体を用いて決定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
個体の非／軽度肝線維症を中程度／重度肝線維症と区別する方法であって、
（ａ）該個体から得た試料中のα２−ＭＧレベルを決定する工程と、
（ｂ）該個体から得た試料中のＨＡのレベルを決定する工程と、
（ｃ）該個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１レベルを決定する工程と、
（ｄ）該α２−ＭＧのレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ１よりも低いか、該ＨＡのレベルがＨＡカットオフ値Ｙ１よりも低いか、あるいは該ＴＩＭＰ−１のレベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ１よりも低い場合は、非／軽度肝線維症を有するものとして該個体を診断する工程であって、該α２−ＭＧのレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ２よりも高く、該ＨＡのレベルがＨＡカットオフ値Ｙ２よりも高く、および前記ＴＩＭＰ−１のレベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ２よりも高い場合は、中程度／重度肝線維症を有するものとして該個体を診断し、残りの個体を、不確定状態を有するものとして判断する工程と、
を有する方法。
【請求項４３】
前記個体が、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪性肝疾患、および薬物誘発性肝疾患からなる群から選択される疾患を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染している、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝臓組織からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記α２−ＭＧのレベル、ＨＡのレベル、およびＴＩＭ−１レベルそれぞれが血清試料中で決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｘ１が１．８ｍｇ／ｍｌないし２．２ｍｇ／ｍｌの値であり、
Ｙ１が３１ｎｇ／ｍｌないし３９ｎｇ／ｍｌの値であり、
Ｚ１が９００ｎｇ／ｍｌないし１，１００ｎｇ／ｍｌの値であり、
Ｘ２が１．８ｍｇ／ｌないし２．２ｍｇ／ｍｌの値であり、
Ｙ２が５４ｎｇ／ｍｌないし６６ｎｇ／ｍｌであり、そして
Ｚ２が１，４１５ｎｇ／ｍｌないし１，７３５ｎｇ／ｍｌである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
Ｘ１＝２．０ｍｇ／ｍｌ、
Ｙ１＝３５  ｎｇ／ｍｌ、
Ｚ１  ＝１，０００  ｎｇ／ｍｌ、  
Ｘ２＝２．０  ｍｇ／ｍｌ、
Ｙ２＝６０  ｎｇ／ｍｌ、そして
Ｚ２＝１，５７５  ｎｇ／ｍｌである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｘ１＝２．０  ｍｇ／ｍｌ、  
Ｙ１＝３７ｎｇ／ｍｌ、  
Ｚ１＝１，１００ｎｇ／ｍｌ、
Ｘ２＝２．０ｍｇ／ｍｌ、
Ｙ２＝６０  ｎｇ／ｍｌ、そして
Ｚ２＝１，５７５  ｎｇ／ｍｌである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
肝線維症罹患率が３０％までである集団で、該集団中の個体の少なくとも６５％が、少なくとも８０％の正確度で、非／軽度線維症または中程度／重度線維症を有すると診断される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
肝線維症罹患率が３０％までである集団で、該集団中の個体の少なくとも６５％が、少なくとも９０％の正確度で、非／軽度線維症または中程度／重度線維症を有すると診断される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
肝線維症罹患率が３０％までである集団で、該集団中の個体の少なくとも６５％が、少なくとも９０％の陽性予測値および少なくとも９０％の陰性予測値で、非／軽度線維症または中程度／重度線維症を有すると診断される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
肝線維症罹患率が１０％までである集団で、該集団中の個体の少なくとも７０％が、少なくとも９０％の正確度で非／軽度線維症または中程度／重度線維症を有すると診断される、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
個体の肝線維症の存在または重症度を診断する方法であって、
（ａ）該個体の第１の肝線維症マーカーＸのレベルをカットオフ値Ｘ１と比較し、該第１の肝線維症マーカーＸに対して該個体が陽性であるかどうかを決定する工程と、
（ｂ）該個体の第２の肝線維症マーカーＹのレベルをカットオフ値Ｙ１と比較し、前記第２の肝線維症マーカーＹに対して該個体が陽性であるかどうかを判断する工程と、
（ｃ）ＸおよびＹに対して陽性または陰性であることに基づいて、該個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
を包含し、肝線維症罹患率が４０％までである集団で、該母集団の少なくとも６５％の個体が少なくとも９０％の正確度で診断される、方法。
【請求項５５】
さらに、（ｄ）  前記個体の第３の肝線維症マーカーＺのレベルをカットオフ値Ｚ１と比較して、該第３の肝線維症マーカーＺに対して該個体が陽性であるかどうかを判断する工程と、
（ｅ）Ｘ、Ｙ、およびＺに対して陽性または陰性であることに基づいて、該個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の肝線維症マーカーがα２−ＭＧであり、前記第２の肝線維症マーカーがＨＡであり、そして前記第３の肝線維症マーカーがＴＩＭＰ−１である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも３種類の肝線維症マーカーのレベルが比較される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
３種類の肝線維症マーカーのレベルが比較される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも４種類の肝線維症マーカーのレベルが比較される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも５種類の肝線維症マーカーのレベルが比較される請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記診断が、非または軽度肝線維症を、中程度の肝線維症ないし重度の肝線維症と区別する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
肝線維症罹患率が３０％までの集団で、該母集団の少なくとも６５％の個体が、少なくとも９３％の正確度で診断される、請求項５４または請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
肝線維症罹患率が２０％までの集団で、該母集団の少なくとも７０％の個体が、少なくとも９４％の正確度で診断される、請求項５４または請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
肝線維症罹患率が１０％までの集団で、該集団の少なくとも７０％の個体が、少なくとも９６％の正確度で診断される、請求項５４または請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
個体の肝線維症の存在または重症度を診断する方法であって、
（ａ）該個体の第１の肝線維症マーカーＸのレベルをカットオフ値Ｘ１と比較して、該第１の肝線維症マーカーＸに対して該個体が陽性であるかどうかを決定する工程と、
（ｂ）該個体の第２の肝線維症マーカーＹのレベルをカットオフ値Ｙ１と比較し、該第２の肝線維症マーカーＹに対して該個体が陽性であるかどうかを決定する工程と、
（ｃ）ＸおよびＹに対する陽性または陰性に基づいて該個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
を包含し、ここで、該カットオフ値Ｘ１およびＹ１を個々に最適化して所望の性能特性を得る、方法。
【請求項６６】
さらに、（ｄ）  前記個体の第３の肝線維症マーカーＺのレベルをカットオフ値Ｚ１と比較し、該第３の肝線維症マーカーＺに対して該個体が陽性であるかどうかを決定する工程と、
（ｅ）Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性に基づいて前記個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
を包含し、ここで、前記カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１を個々に最適化して所望の性能特性を得る、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の肝線維症マーカーがα２−ＭＧであり、前記第２の肝線維症マーカーがＨＡであり、さらに前記第３の肝線維症マーカーがＴＩＭＰ−１である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記カットオフ値が、実験計画法（ＤＯＥ）分析を用いて最適化される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも３種類の肝線維症マーカーのレベルが比較される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
３種類の肝線維症マーカーのレベルを比較される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記診断が非または軽度の肝線維症を中程度ないし重度の肝線維症と区別する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法であって、
（ａ）該個体中の第１の肝線維症マーカーＸのレベルを２つのカットオフ値Ｘ１およびＸ２と比較し、該第１の肝線維症マーカーＸに対して該個体が陽性であるかどうかを判断する工程と、
（ｂ）該個体の第２の肝線維症マーカーＹのレベルを２つのカットオフ値Ｙ１およびＹ２と比較し、該第２の肝線維症マーカーＹに対して該個体が陽性であるかどうかを判断する工程と、
（ｃ）ＸおよびＹに対する陽性または陰性に基づいて、該個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
を包含し、ここで、該カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２を個々に最適化して所望の性能特性を得る、方法。
【請求項７３】
さらに、（ｄ）  前記個体における第３の肝線維症マーカーＺのレベルを２つのカットオフ値Ｚ１およびＺ１と比較し、該第３の肝線維症マーカーＺに対して該個体が陽性であるかどうかを判断する工程と、
（ｅ）Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性に基づいて該個体の肝線維症の存在または重症度を診断する工程と、
を包含し、ここで、該カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２が個々に最適化されて所望の性能特性を与える、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記カットオフ値が、実験計画法（ＤＯＥ）分析を用いて最適化される、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、概ね肝臓病学および線維症の分野に関し、より詳しくは肝線維症の診断に一緒に用いられる複数の血清学的マーカーのパネルに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓、腎臓、肺、および他の器官の進行性線維症は、しばしば臓器移植または死に至る器官の機能不全を生じ、米国および世界中で何百万もの人々が羅患している。例えば肝線維症は、米国では非悪性の胃腸管系の主な死亡原因であり、線維症の進行は、慢性肝疾患の患者において罹患率および死亡率を決定する唯一最大の要因である。さらに、線維形成の過程は、多様な病因による複数の肝疾患に共通したものであり、該肝疾患として慢性のウイルス性Ｂ型およびＣ型肝炎、自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、ならびに薬物誘導性肝疾患が挙げられる。これらの障害に見られる線維症は、ウイルス感染、アルコール、または薬物等による肝臓に対する慢性的な侵襲が原因である。
例えばＣ型肝炎は、米国では慢性肝疾患の主な原因の１つであり、３９０万の人々が慢性的にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染していると推定され、毎年、新たに約３０，０００件の急性ＨＣＶ症例が報告されている（Ａｌｔｅｒ、Ｓｅｍｉｎ．  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．  １５：５−１４（１９９５））。Ｃ型肝炎の羅患率は、米国で１．８％であると推定され、慢性Ｃ型肝炎感染による死亡は年間１０，０００件にまでおよぶと考えられている（Ａｌｔｅｒ、上掲、１９９５）。
肝線維症が細胞外マトリックスの蓄積を生じる可逆的な過程である一方で、肝硬変は、完全に実質を囲んで結節を形成するマトリックスの厚いバンドが特徴である不可逆的な過程である。治療がなされなければ、肝線維症は硬変に至り、最終的には末期の肝疾患または癌に至る。肝硬変の一般症状は、しばしば気づかれない。例えば、デンマークの一般人口から得た多数の試料では、肝硬変の羅患率は４．５％であり、そのうち三分の一が死亡時まで診断を受けていなかった（Ｇｒａｕｄａｌ、Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ２３０：１６５−１７１（１９９１））。
【０００３】
肝線維症を適時正確に診断することが効果的に治療をおこなう上で重要である。例として、Ｃ型肝炎および硬変の患者は、それほど進行していな疾患の患者と比べて、α−インターフェロンによる治療効果を示しにくい（Ｄａｖｉｓ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６（Ｓｕｐｐ．  １）：１２２−１２７Ｓ）。同様に、慢性ＨＣＶ感染の治療は、組織学的に進行した非代償性疾患の患者では禁忌となる（ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６（Ｓｕｐｐｌ．  １）：２５−１０５Ｓ（１９９７））。早期診断の重要性は、硬変に関連した静脈瘤破裂等の重度の早期合併症によってその重要性がさらに強調されている。すなわち、これらの合併症は、硬変を早期に検出することによって予防することができる（ＣａｌｅｓおよびＰａｓｑｕａｌ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  １２：２４５−２５４（１９８８））。
【０００４】
線維症肝の有無または重症度の診断は困難であり、肝生検が現在利用できる最も信頼された方法である。残念ながら、肝生検を制限するものが複数ある。すなわち、約３０％の患者で痛みがあること、出血または感染のような重度の合併症の危険性があること、死亡率が１０，０００件あたり３件あること、さらに入院費用がかかることである（Ｎｏｒｄ、Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．  Ｅｎｄｏｓｃ．  ２８：１０２−１０４（１９８２）；Ｃａｄｒａｎｅｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：４７−４８１（２０００）；およびＰｏｙｎａｒｄら、Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １４：５４３−５４８（２０００））。さらに、Ｃ型肝炎のような緩慢に進行する疾患では、疾患の進行を連続的に評価するために生検を繰り返すことが必要となるため、処置の危険性および費用がさらに増すことになる。最終的には、肝臓での病理学的変化が不均一に広がるために、生検では疾患が検出されない可能性がある。すなわち、生検を受けた症例のうち、あとで偽陰性とされる例がかなりの割合であることは、驚くことではない（Ｎｏｒｄ、上掲、１９８２）。
【０００５】
何年もの間、肝疾患での線維症過程を反映し、かつ肝生検の代わりとしての役割を果たすことができる生化学的または血清学的マーカーが捜し求められてきた。しかし、どのような単一マーカーであっても、線維症を検出または段階を評価する際の生検処置の代わりとなりうるような十分に優れたものではなかった。したがって、肝線維症の有無または重症度を診断する非侵襲的方法が求められている。本発明は、連続試験に適し、かつ肝線維症を検出するための簡便で信頼できる方法を提供することにより、このような要望に応える。関連する利点もまた提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、個体から得た試料中のα２−マクログロブリン（α２−ＭＧ）を検出することと、個体から得た試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）を検出することと、個体から得た試料中のメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を検出することと、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の存在またはレベルにもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、中程度線維症ないし重度肝線維症（Ｆ２〜Ｆ４）と非肝線維症ないし軽度肝線維症（Ｆ０〜Ｆ１）とを区別するのに有用である。
【０００７】
肝線維症の有無または重症度を診断するための本発明の方法は、限定はされないが、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、および薬物誘導性肝疾患等の多様な患者母集団で有用である。一実施形態では、本発明の方法を用いて、Ｃ型肝炎ウイルスに感染された個体で、肝線維症の有無または重症度を診断する。
【０００８】
試料中のα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出するために、多様な手段が有用である。一実施形態では、例えば、坑α２−ＭＧ抗体等、１種類以上のα２−ＭＧ特異的結合因子を用いて、診断される個体から得た試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することにより、本発明を実施する。別の実施形態では、個体から得た試料中のα２−ＭＧ活性のレベルを測定することによって、本発明を実施する。
【０００９】
本発明の方法では、多様な手段を用いて、試料中のヒアロルン酸を検出することもできる。一実施形態では、例えば、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）または抗ＨＡ抗体等の１種類以上のＨＡ特異的結合因子を用いて試料中のＨＡのレベルを測定することによって、本発明を実施する。
【００１０】
同様に、本発明の方法では、多様な手段を用いて、試料中のＴＩＭＰ−１を検出することができる。一実施形態では、診断される個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定することにより本発明を実施する。ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを、例えば、抗ＴＩＭＰ−１抗体等の１種類以上のＴＩＭＰ−１特異的結合因子を用いて測定することができる。別の実施形態では、診断される個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１活性をアッセイすることにより本発明を実施する。
本発明は、例えば、個体から得た試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することと、個体から得た試料中のＨＡのレベルを測定することと、個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定することと、ならびにα２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルにもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。必要に応じて、α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを、それぞれ酵素結合アッセイを用いて測定することができる。
【００１１】
本発明の方法を実施する上で多様な試料が有用であり、該試料として血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝組織が挙げられる。一実施形態では、診断される個体から単一の試料を入手する。このような試料は、例えば、血清試料であり得る。また該試料としては、例えば、組織試料（例えば、肝生検試料）であり得る。
【００１２】
本発明はさらに、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する方法を提供する。この方法は、α２−ＭＧと抗α２−ＭＧ抗体とからなる第１の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、抗α２−ＭＧ抗体と接触させる工程と、第１の複合体を洗浄して、未結合分子を除去する工程と、α２−ＭＧを含有する第１の複合体の量を測定する工程と、ＨＡとＨＡ結合タンパク質とからなる第２の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、ＨＡ結合タンパク質と接触させる工程と、第２の複合体を洗浄して、未結合分子を除去する工程と、ＨＡを含有する第２の複合体の量を測定する工程と、ＴＩＭＰ−１と抗ＴＩＭＰ−１抗体とからなる第３の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、抗ＴＩＭＰ−１抗体と接触させる工程と、第３の複合体を洗浄して、未結合分子を除去する工程と、ＴＩＭＰ−１を含有する第３の複合体の量を測定する工程と、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を含有する複合体の量にもとづいて、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する工程とを含む。
【００１３】
付加的な血清学的マーカーを検出することなく、３種類のマーカー、すなわちα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出することにより本発明の方法を実施でき、また本発明の方法を１種類以上の付加的マーカーを検出する方法と組み合わせることもできる。したがって、一実施形態では、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出し、さらに以下の線維症マーカーの少なくとも１つを検出することにより本発明を実施する。すなわち、Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩプロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０，ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、またはアポＢである。さらに別の実施形態では、肝線維症の有無または重症度を、個体から得た試料中のα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、およびＹＫＬ−４０を検出することによって診断する。
【００１４】
本発明は、抗線維症療法を施された患者から得た試料中のα２−マクログロブリンを検出することと、患者から得た試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）を検出することと、患者から得た試料中のメタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を検出することと、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の存在またはレベルにもとづいて、患者の肝線維症の有無または重症度を測定することとにより抗線維症療法の効果をモニターすることによって、患者で抗線維症療法の効果をモニターする方法も提供する。このような方法はさらに、必要に応じて、工程（ｄ）で測定された肝線維症の有無または重症度を、それより早い時期での患者の肝線維症の有無または重症度と比較することを含むことができる。本発明の方法を用いて、例えば、１つ以上の抗線維症療法を処置された患者で、期間中の線維症の進行または軽減をモニターすることができ、また、例えば、２通り以上の抗線維症療法の効果を比較することができる。
【００１５】
一実施形態では、多くとも３種類の線維症マーカーを検出する。別の実施形態では、本方法は、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０，ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢからなる群より選択される少なくとも１つのマーカーを、患者から得た試料中で検出する工程を含む。
【００１６】
本発明の方法では、α２−ＭＧ、ＨＡ，およびＴＩＭＰ−１を検出するために、多様な手段が有用である。例えば試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することにより工程（ａ）を実施できる。一実施形態では、１つ以上の抗α２−ＭＧ抗体を用いて、α２−ＭＧタンパク質のレベルを測定する。例えば試料中のＨＡのレベルを測定することにより工程（ｂ）を実施できる。一実施形態では、１つ以上のＨＡ結合タンパク質を用いて、ＨＡのレベルを測定する。例えば該試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定することにより工程（ｃ）を実施できる。一実施形態では、１つ以上の抗ＴＩＭＰ−１抗体を用いて、ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定する。
【００１７】
さらに本明細書中では、個体から得た試料中のα２−ＭＧレベルを測定することと、個体から得た試料中のＨＡレベルを測定することと、個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１レベルを測定することと、さらにα２−ＭＧレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ１を下回る場合、ＨＡレベルがＨＡカットオフ値Ｙ１を下回る場合、またはＴＩＭＰ−１レベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ１を下まわる場合に、非肝線維症または軽度肝線維症であるとして個体を診断することと、α２−ＭＧレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ２を上回り、ＨＡレベルがＨＡカットオフ値Ｙ２を上回り、かつＴＩＭＰ−１レベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ２を上回る場合に、中程度または重度の肝線維症であるとして個体を診断することと、それ以外の個体は確定していない状態であると診断することとにより、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する方法を提供する。
【００１８】
α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１マーカーのレベルに対する二重（デュアル）カットオフ値にもとづく本発明の方法は、多様な患者母集団で、中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別するのに有用である。本発明の方法は、例えば、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、または薬物誘導性肝疾患等の肝疾患を患う個体を診断するのに有用である。一実施形態では、本発明の方法を用いて、Ｃ型肝炎ウイルスに感染された患者で、中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する。本発明の方法に有用な試料としては、限定されないが、血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝組織が挙げられる。一実施形態では、診断される個体から得た１つ以上の血清試料中のα２−ＭＧレベル、ＨＡレベル、およびＴＩＭＰ−１レベルを測定することにより本発明の方法を実施する。
【００１９】
したがって、本発明は、例えば、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する方法を提供し、その中で、区別は、１．８ｍｇ／ｍｌないし２．２ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３１ｎｇ／ｍｌないし３９ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、９００ｎｇ／ｍｌないし１，１００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、１．８ｍｇ／ｍｌないし２．２ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、５４ｎｇ／ｍｌないし６６ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，４１５ｎｇ／ｍｌないし１，７３５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とにもとづく。特定の実施形態では、区別は、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３５ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、１，０００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、６０ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，５７５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とにもとづく。別の実施形態では、区別は、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３７ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、１，１００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、６０ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，５７５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とにもとづく。さらに別の実施形態では、最大で３０％の肝線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団で個体の少なくとも６５％を、非／軽度の線維症または中程度／重度の線維症であるとして診断するように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択する。別の実施形態では、最大で３０％の肝線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の陽性予測値および少なくとも９０％の陰性予測値で、該母集団の個体の少なくとも６５％を、非／軽度の線維症または中程度／重度の線維症であるとして診断するように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択する。さらに別の実施形態では、最大で１０％の線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団の個体の少なくとも７０％を、非／軽度の線維症または中程度／重度の線維症であるとして診断するように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択する。
【００２０】
本発明はまた、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、カットオフ値Ｘ１と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定することと、個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、カットオフ値Ｙ１と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定することと、ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法も提供し、最大で４０％の線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団の個体の少なくとも６５％を診断する。
【００２１】
本発明の方法は、必要に応じて、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、カットオフ値Ｚ１と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定することと、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断することを包含することができる。一実施形態では、第１の線維症マーカーはα２−ＭＧであり、第２の線維症マーカーはＨＡであり、第３の線維症マーカーはＴＩＭＰ−１である。
【００２２】
別の実施形態では、少なくとも３つの線維症マーカーのレベルを比較し、さらに別の実施形態では、厳密に３つの線維症マーカーのレベルを比較する。付加的な実施形態では、少なくとも４つのまたは少なくとも５つの線維症マーカーのレベルを比較する。本発明の方法は、例えば、中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症または軽度肝線維症とを区別するのに有用であり得る。
【００２３】
具体的な実施形態では、本発明の方法は、最大で３０％の線維症羅患率を有する母集団で、個体の少なくとも６５％を、少なくとも９３％の正確度で診断をおこなう。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、最大で２０％の線維症羅患率を有する母集団で、個体の少なくとも７０％を、少なくとも９４％の正確度で診断するのに役立つ。さらに別の実施形態では、本発明の方法は、最大で１０％の線維症羅患率を有する集団で、個体の少なくとも７０％を、少なくとも９６％の正確度で診断を行なうのに役立つ。
【００２４】
本発明はさらに、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、カットオフ値Ｘ１と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定することと、個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、カットオフ値Ｙ１と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定することと、ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断することにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供し、カットオフ値Ｘ１およびＹ１を個々に最適化して所望の性能特性を与える。
【００２５】
必要に応じて、本発明の方法は、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、カットオフ値Ｚ１と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定する工程と、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断する工程とを包含することができ、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１を個々に最適化して所望の性能特性を与える。一実施形態では、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１のレベルを比較する。別の実施形態では、実験計画法（ＤＯＥ）分析を用いて、カットオフ値を最適化する。さらに別の実施形態では、厳密に３種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、または少なくとも５種類の線維症マーカーのレベルを比較する。本発明の方法は、例えば中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症または軽度肝線維症とを区別するのに有用であり得る。
【００２６】
本発明により、さらに、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、２つのカットオフ値Ｘ１およびＸ２と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定することと、個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、２つのカットオフ値Ｙ１およびＹ２と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定することと、ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断することにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供し、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２を個々に最適化して所望の性能特性を与える。本発明の方法はさらに、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、２つのカットオフ値Ｚ１およびＺ２と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定する工程と、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて個体の肝線維症の有無または重症度を診断する工程とを包含し得、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を個々に最適化して所望の性能特性を与える。例えばＤＯＥ分析を用いて、カットオフ値を簡便に最適化できる。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に開示するように、慢性Ｃ型肝炎であり、かつＦ０ないしＦ４の既知のＭｅｔａｖｉｒ段階（線維症スコア）を有する患者母集団で、多数の生化学的マーカーの血清レベルを解析した。Ｆ０は非常に低度の線維症または線維症が存在しないことを表し、Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３は、中程度の線維症段階を表し、Ｆ４は、重度の線維症を表す（Ｋｎｏｄｅｌｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １：４３１−４３５  （１９８１））。表２および３を参照せよ。複数のカットオフ値の同時変化に対する実験計画法（ＤＯＥ）分析を用いて、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ＰＩＩＩＮＰ、ＩＶ型コラーゲン、およびα２−マクログロブリン（α２−ＭＧ）で構成される４マーカーパネルを同定し、６０％の線維症羅患率を有する患者母集団で、Ｆ２〜Ｆ４（中程度ないし重度）の線維症から、Ｆ０〜Ｆ１（非または軽度）の線維症を約７７％の正確度で区別することが可能になった。
【００２８】
さらに本明細書中実施例Ｉで開示するように、ＤＯＥ分析を用いてカットオフを最適化した際、Ｆ２〜Ｆ４線維症からＦ０〜Ｆ１線維症を区別する際に、２種類の３マーカーパネル（α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１およびα２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０）がまた適切に働いた。特に、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１パネルおよびα２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０パネルはそれぞれ、４マーカーパネルより優れた能力を示し、調査母集団で、Ｆ２〜Ｆ４線維症からＦ０〜Ｆ１線維症を約８０％の正確度で区別することができた。例えば、表６の１５行目に見られるように、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１パネルは、６０％の線維症羅患率を有する調査母集団で、感度８３．４８％および特異度７５．９５％で作用した。これらの結果により、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１である３マーカーパネルは、中程度から重度の線維症から、非または軽度の線維症を区別するのに有用であり得ることが証明される。
【００２９】
これらの知見にもとづいて、本発明は、個体から得た試料中のα２−ＭＧを検出することと、個体から得た試料中のＨＡを検出することと、個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１を検出することと、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の有無またはレベルにもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、中程度から重度（Ｆ２〜Ｆ４）の肝線維症から非または軽度（Ｆ０〜Ｆ１）の肝線維症を区別するのに有用であり得る。
【００３０】
（肝障害よび他の線維症障害）
本発明の方法は、線維症が特徴である肝障害の危険性があるか、またはそれの１つ以上の症状を有する個体を含む多様な個体で、肝線維症の有無または重症度を診断するのに有用であり得る。本発明の方法を用いて、例えば、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型肝炎ウイルス等のようなウイルス性肝炎またはＨＩＶ−１等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、慢性持続性肝炎または慢性活動性肝炎、自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を含む非アルコール性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、胆管閉鎖症、医療処置が原因の肝疾患（薬物誘導性肝疾患）、あるいは先天性肝疾患を有する個体で、肝線維症を診断することができる。本発明の方法は、例えばメトトレキサート療法が原因の潜在的な肝障害の懸念を緩和するのに非常に有用であり得る。本発明の非侵襲的方法を用いて、肝障害のリスクを伴うメトトレキサートまたは他の薬物で処置される個体の肝線維症を定期的にモニターすることを、肝生検に伴うリスクなしに、簡便に実施することができる。
【００３１】
一実施形態では、本発明の方法は、Ｆ２、Ｆ３、またはＦ４のＭｅｔａｖｉｒスコアを有する個体から、Ｆ０またはＦ１のＭｅｔａｖｉｒスコアを有する個体を区別するのに有用である。Ｍｅｔａｖｉｒスコアリングは、肝生検標本を段階評価するために十分に受け入れられているシステムであり、Ｋｎｏｄｅｌｌ（上掲、１９８１）に記載されている。Ｆ０は線維症していないことに相当し、Ｆ１は隔壁を持たない門脈の線維症を示す。Ｆ２は少数の隔壁を持つ門脈の線維症を示す。Ｆ３は硬変のない多数の隔壁を示す。Ｆ４は硬変を示す。
【００３２】
本発明の方法は、肝線維症、肺線維症、腎線維症、前立腺線維症、乳腺線維症を含むが、これらに限定されない多様な線維症障害に関連する線維症の有無または重症度を診断するのに有用であることが理解される。本発明の方法を適用して、制限なく、例えば特発性肺線維症または肺気腫のような肺線維症、腎線維症、膀胱線維症、尿管周囲線維症または後腹膜線維症、心内膜心筋線維症、大動脈瘤線維症、リウマチ関節炎等のリウマチ様疾患または全身性エリテマトーデス、あるいはアルツハイマー症等の他の線維症障害の有無または重症度を診断することができる。肝線維症の有無または重症度を診断するのに有用なα２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０、またはα２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１／ＹＫＬ−４０パネル、あるいは本明細書に開示するマーカーの他の組み合わせを用いて、別の障害での線維症の有無または重症度を診断することも可能であることが理解される。
【００３３】
本発明の診断方法は、慢性または活動性疾患を有する個体、線維症疾患の１つ以上の症状を有する個体、無症状または健康な個体、および１つ以上の線維症疾患の危険にさらされている個体を含む多様な個体に適用可能であることが理解される。さらに、本発明の方法は、例えば、疾患の初期診断を裏づけするために、または線維症疾患の従来の一定の診断を用いて個体の線維症の進行を測定する上で有用であり得ることが当業者にとって明確である。本発明の方法を用いて、一定期間にわたり線維症疾患の状態をモニターすることができ、必要に応じて、さらに治療処置の効果をモニターすることができる。必要に応じて、治療を受けた個体の試料から得た結果を、例えば治療以前の個体のベースライン結果、治療中のそれより早い時期の結果、または過去の値もしくは参考の値と比較することができる。
【００３４】
本発明の方法は、個体の肝線維症または他の線維症の重症度を診断するのに有用である。したがって、本発明の方法は、肝線維症または他の線維症の「段階」または程度を測定するのに有用であり得る。一実施形態では、本発明の方法を用いて、例えばウイルス性Ｃ型肝炎を有する個体のような個体のＭｅｔａｖｉｒスコアを測定する。上記に示したように、Ｍｅｔａｖｉｒスコアリングは、Ｆ０（非存在）、Ｆ１（隔壁を持たない門脈の線維症）、Ｆ２（少数の隔壁を持つ門脈の線維症）、Ｆ３（硬変は存在せずに、多数の隔壁を持つ門脈の線維症）、およびＦ４（硬変）の値を用いた適切に確立された線維症スコアリングシステムである。他の実施形態では、本発明の方法を用いて、例えばウイルス性Ｃ型肝炎を有する個体のような個体のＫｎｏｄｅｌｌスコア（組織活性指標）、Ｉｓｈａｋスコア（改良組織活性指標）、またはＳｃｈｅｕｅｒ分類を測定する。さらに別の実施形態では、本発明の方法を用いて、例えばＢｒｕｎｔの提言（Ｂｒｕｎｔら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ９４：２４６７−２４７４（１９９９））にしたがって重症度を測定することによって、ＮＡＳＨを有する個体の肝線維症の重症度を測定する。本発明の方法にしたがって肝線維症または他の線維症の重症度を測定する際、線維症の重症度を示す結果を報告する上で、上記のまたは当該技術分野で受け入れられているかもしくは明確に定義されているスコアリングシステムのいずれも有用であり得ることが理解される。
【００３５】
（試料）
本発明の方法を実施する際、様々な試料が有用であり得、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝組織が挙げられる。一実施形態では、診断される個体から単一の試料を入手する。このような試料は、例えば血清試料であり得る。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「試料」とは、α２−ＭＧ、ＨＡ、またはＴＩＭＰ−１等の線維症マーカーを１種類以上含む生物学的標本を意味する。試料としては、例えば、全血、血漿、唾液、尿、滑液、または他の体液等の液状試料、あるいは肺、肝臓、腎臓、前立腺、または胸部組織試料等の組織試料が可能である。当業者は、必要に応じて、分析前に、液状試料を希釈できることを理解している。
【００３７】
当業者は、診断される個体から単一の試料を入手でき、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出前に細分できることを理解している。当業者はまた、必要に応じて、診断される個体から２つ以上の試料を入手することができ、試料が同一または異なる種類であってもよいことを理解している。一実施形態では、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１をそれぞれ血清試料で検出する。別の実施形態では、単一の血清試料を個体から入手し、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出する前に細分する。
【００３８】
（α２−マクログロブリン）
本発明の方法は、部分的に、試料中のα２−マクログロブリンを検出することに依拠する。α２−ＭＧは、血漿の保存された非常に多量の成分であり、広範なプロテアーゼ結合タンパク質として機能して、組織液から活性プロテアーゼを除去する。活性部位プロテアーゼ阻害剤とは異なり、α２−マクログロブリンファミリーのメンバーは、それらのプロテアーゼ基質の触媒作用的活性を不活性化することはないが、α２−ＭＧファミリーメンバーのフォールド内への標的プロテアーゼの物理的な取り込みにより作用する。α２−ＭＧ自体は、標的プロテアーゼにより切断され、α２−ＭＧ分子の再編成により、α２−ＭＧ分子の内部ポケット内に標的プロテアーゼを隔離する（Ｓｔａｒｋｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３１：８２３−８３１（１９７３））。α２−ＭＧに取り込まれたプロテアーゼは、タンパク質等の巨大分子基質と相互作用することを立体的に妨げられる一方で、アミドおよびエステル化合物等の低分子質量基質に対して依然活性があり、α２−ＭＧケージ中に拡散して酵素部位に行き着くことができる。したがって、α２−ＭＧ活性は、タンパク質分解活性を阻害するがプロテアーゼ基質のアミド分解活性を阻害しない能力により部分的に特徴付けられる。α２−ＭＧは、取り込まれたプロテアーゼを抗体および高分子質量活性部位阻害剤から防護する能力によっても特徴付けられる。例えば、α２−ＭＧに結合したトリプシンは、大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）による阻害から防御される。
【００３９】
活性部位プロテアーゼ阻害剤の限定的な特異性と比べて、α２−ＭＧは多様な基質特異性および触媒作用活性により、広範なプロテアーゼに作用する。このような標的プロテアーゼとしては、トリプシン、スブチリシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモライシン、およびパパインが挙げられる。基質の多様性は、部分的に、α２−ＭＧ「ベイト」領域により測定される。この「ベイト」領域は、非常に柔軟性のある溶媒に露出される３０〜４０の残基の配列であり、タンパク質分解酵素の主要なクラスの各々によって切断されやすい少なくとも１つの部位を含む。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「α２−マクログロブリン」とは、「α２−ＭＧ」と同義であり、ヒトα２−ＭＧ（配列番号２）とかなりの構造的相同性を有し、かつ広範なプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質を意味する。α２−ＭＧは、メチルアミン等の小第１級アミンにより不活性化される特有のチオールエステル結合を含む。したがって、α２−ＭＧ活性は、メチルアミン感受性プロテアーゼ阻害活性により部分的に特徴付けられ得る。必要に応じて、関連するプロテアーゼ結合タンパク質ならびに補体系のＣ３、Ｃ４およびＣ５等のα２−マクログロブリンファミリーの他のメンバーから、α２−ＭＧを区別することができる（Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ、”α２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｈｉｏｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｕｔｎａｍ（編）、Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｒｌａｎｄｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、１９１−２９１ページ）。α２−ＭＧを検出するためのアッセイは、α２−ＭＧに対して特異的であることが可能であるか、またはα２−マクログロブリンファミリーの１つ以上の他のメンバーを付加的に検出可能であることが理解される。
【００４１】
本発明の方法は、部分的に、試料中のα２−マクログロブリンを検出することに依拠する。本明細書で使用するように、フレーズ「α２−ＭＧを検出する」とは、α２−ＭＧの存在を測定するための任意の定量的または定性的アッセイを意味する。本明細書で使用するように、フレーズ「α２−ＭＧのレベルを測定する」とは、α２−ＭＧに対する任意の直接または間接的な定量的アッセイを意味する。
【００４２】
同様に、試料中の任意の特異的な繊維症マーカーを検出することとは、試料中にマーカーが存在するか否かを測定して、該繊維症マーカーが肝繊維症または本明細書中で上述したような別の繊維症障害に対して陽性または陰性の相関性を有することを意味する。検出とは、例えば特定の形質あるいは可変基質、生化学的基質、または血清学的基質の存在または非存在のような非定量的分析を意味することが可能であることが理解される。
【００４３】
診断は、繊維症マーカーまたは他の特色の存在またはレベルに関して試料を分析し、それを参考値と比較することに基づき、参考値は、他の個体から、繊維症障害の人々を区別することを補助する役割を果たす。繊維症マーカーが生化学的または血清学的マーカーである際、試料中の「レベル」を測定することとは、例えば、繊維症マーカーのＲＮＡ、タンパク質、または活性の相対量または絶対量を測定することにより繊維症マーカーを定量することを意味する。したがって、試料中のレベルを測定することとは、相対的および絶対的なＲＮＡ、タンパク質、および活性レベルの分析と、以下にさらに論じるような繊維症マーカーの他の直接的および間接的測定とを包含するがこれらに限定されない。繊維症マーカーの「レベル」を測定するのに有用な任意のアッセイは、マーカーを「検出する」のにも有用であることが理解される。
【００４４】
α２−ＭＧを検出する様々なアッセイが当該技術分野で公知であり、α２−ＭＧ  ＲＮＡ、α２−ＭＧタンパク質、およびα２−ＭＧ活性に関する直接的および間接的アッセイを含む。例えばノーザン分析またはＲＴ−ＰＣＲ、あるいはα２−ＭＧコード配列の一部分に相補的な核酸配列へのハイブリダイゼーションにもとづく他の方法のような通常の技術を用いて、α２−ＭＧ  ｍＲＮＡレベルを分析することにより、α２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧレベルを測定することができる。例えば、ヒト試料中のα２−ＭＧ  ＲＮＡのノーザン分析およびＲＮＡスロットブロットハイブリダイゼーションに対する条件およびプローブについては、Ｏｒｔｅｇｏら（Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．６５：２８９−２９９（１９９７））およびＳｉｍｏｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３１１２−３１１７（１９９６））にそれぞれ記載されている。
【００４５】
様々な方法でα２−ＭＧタンパク質をアッセイすることによっても、α２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧレベルを測定することができる。さらに以下に記載するように、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、および二抗体サンドイッチアッセイを含むイムノアッセイが本発明の方法で有用である。例えば、比濁分析アッセイでは、α２−ＭＧと抗α２−ＭＧ抗体との複合体により、ピークレートシグナルに変換される光散乱の増加が生じており、これは試料α２−ＭＧ濃度の関数である。例えば、ベーリングネ  フェロメーターアナライザー（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｆｉｎｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７：２６１−２７６（１９８９））およびＮａｖｅａｕら（Ｄｉｇ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｃｉ．３９：２４２６−２４３２（１９９４））に記載されるウサギ抗ヒトα２−ＭＧ抗血清を用いて、またはベックマンコーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）（Ｂｒｅａ、Ｃａ；キット番号４４９４３０）より市販されている比濁分析アッセイを用いたレーザー免疫比濁分析によっても、α２−ＭＧを検出することができる。さらに、イムノアッセイに有用なモノクローナルおよび多クローン抗α２−ＭＧ抗体は、多様な供給源から容易に入手することができる。例として、ＥＬＩＳＡアッセイおよびウエスタンブロッティング等のイムノアッセイに好適な親和性精製ヤギ抗ヒトα２−ＭＧ抗体およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトα２−ＭＧ抗体は、シーダーレーンラボラトリー社（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；ＣＬ２００１０ＡＰおよびＣＬ２００１０ＡＰＨＰ）ならびにアフィニティーバイオロジカルズ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；ＧＡＡ２Ｍ−ＡＰおよびＧＡＡ２Ｍ−ＡＰＨＲＰ）から入手可能である。精製したα２−ＭＧタンパク質の量を定量することによっても、α２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することができる。例えば、ＨＰＬＣを単独で、または質量分光測光法と組み合わせることによって、あるいは、例えば、ＨａｌｌおよびＲｏｂｅｒｔｓ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７１：２７−３８（１９７８））またはＩｍｂｅｒおよびＰｅｚｚｏ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：８１３４−８１３９（１９８１））に記載されているように、α２−マクログロブリンの精製を実施することができる。ブラッドフォードアッセイ、クーマシーブルー染色法、および放射線標識タンパク質に対するアッセイを含む周知の方法により、定量化を測定することができる。
【００４６】
α２−ＭＧ活性に対する多様なアッセイは、本発明の方法に係る試料中のα２−ＭＧの検出またはα２−ＭＧのレベルの測定にも有用であり得る。例えば、アミド分解活性の対応する阻害なしに、標的プロテアーゼ活性の阻害の関数として、間接的に、α２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧのレベルを測定することができる。上記に論じたように、タンパク質等の高分子質量基質は加水分解され得ない一方で、α２−ＭＧ結合プロテアーゼは少量の基質のアミドおよびエステル結合を加水分解する能力を保有する（例えばＡｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｃｏｍｐａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３７５−３９０（１９９９）を参照せよ）。例として、アミド分解活性の阻害なしに、トリプシン、スブチリシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモライシン、またはパパイン活性の阻害をアッセイすることにより、α２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧのレベルを測定することができる。分析するために都合のよい基質としては、１４Ｃで標識したカゼインおよび１２５Ｉ−フィブリンが挙げられる。
【００４７】
広範なプロテアーゼ基質特異性の特性により、プロテアーゼ活性部位の阻害剤からα２−ＭＧが区別される。この特性にもとづいて、異なる活性部位特異性を有する２つ以上のプロテアーゼの活性の阻害をアッセイすることにより、α２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧのレベルを測定することができる。例えば、２種類以上の標的プロテアーゼ（例えばトリプシン、スブチリシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモライシン、およびパパインのうちの２種類以上のプロテアーゼ）のプロテアーゼ活性の減少を分析することによって、試料中のα２−ＭＧを検出することができ、またはα２−ＭＧのレベルを測定することができる。そのような方法では、１４Ｃ−カゼインまたは１２５Ｉ−フィブリン等の標識プロテアーゼ基質が有用であり得る（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、上掲、１９９９）。
【００４８】
抗体または高分子量阻害剤から、結合プロテアーゼを防護するα２−ＭＧの能力にもとづいても、α２−ＭＧを検出することができ、またα２−ＭＧのレベルを測定することができる。トリプシン、スブチリシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモライシン、またはパパイン等の標的プロテアーゼを血漿試料に添加することができる。例えば抗プロテアーゼ抗体を用いた免疫沈降により未結合のプロテアーゼを除去した後、低分子質量アミドまたはエステル基質を用いて、α２−ＭＧに結合されたプロテアーゼの量を測定することができる。加水分解された低分子質量基質の量は、防御されたα２−ＭＧ結合のプロテアーゼの量、およびα２−ＭＧの濃度の量の指標となる。同様に、アミドＢＡｐＮＡ（Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンｐ−ニトロアニリド）等の低分子質量基質を用いて残存するトリプシン活性をアッセイする前に、まず試料をトリプシンのようなプロテアーゼと反応させ、その後大豆トリプシン阻害剤のような過剰なプロテアーゼ阻害剤と反応させることができる（Ｇａｎｒｏｔ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ  １４：４９３−５０１（１９６６）；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．２３６：１−９（１９８５））。α２−ＭＧに隔離されなかったトリプシンをトリプシン阻害剤により不活性化すると、残っているα２−ＭＧに防御されたトリプシンのみが基質の加水分解をできる。したがって、大豆トリプシン阻害剤アッセイでの陽性反応は、α２−ＭＧを検出し、かつα２−ＭＧ量の定量的測定である（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、上掲、１９９９）。当業者には、α２−ＭＧ結合酵素を不活性化することができる低分子質量プロテアーゼ阻害剤の存在が該アッセイを用いて得た結果に影響及ぼすことが可能であることが理解される。さらに、α２−ＭＧ  ＲＮＡまたはタンパク質レベルと同様に、α２−ＭＧ活性に対するこれらのアッセイおよび他の通常のアッセイは、本発明の方法で、α２−ＭＧの検出またはα２−ＭＧのレベルの測定に有用であり得ることが理解される。
【００４９】
（ヒアルロン酸）
本発明の方法はさらに、部分的に、試料中のヒアルロン酸の検出またはヒアルロン酸のレベルの測定に依拠する。ヒアルロン酸は、ヒアルロネートまたはヒアルロナンとしても知られており、グルクロン酸と、β−１，４結合により結合されるβ（１，３）−Ｎ−アセチルグルコサミン部分とが交互になる構造をもつ分岐していない主鎖を有する高分子量の多糖である。ヒアルロン酸の長さは、少数から１，０００の二量体単位以上であり、各二量体単位の分子量は、約４５０Ｄである。ヒアルロン酸は、主に線維芽細胞および他の特定の結合組織細胞により産生され、結合組織マトリックスで、構造的役割を果たす。さらに、ヒアルロン酸は、体中に広く分布し、例えば血漿、滑液、および尿中で遊離分子として見出されることができる。血漿中では、ヒアルロン酸は、相対的に短い半減期を有する。
【００５０】
血清ＨＡレベルは、肝硬変を含む肝疾患で増加する（Ｂｒａｍｌｅｙら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１３：８−１３（１９９１）；Ｕｅｎｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１０５：４７５−４８１（１９９３）；Ｏｂｅｒｔｉら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１３：１６０９−１６１６（１９９７）；およびＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５：９４５−９５１（２０００））。血清ＨＡレベルは、リウマチ関節炎で見られる滑膜炎症および軟骨破壊中でも増加する。これらのレベルは、疾患活動性および滑膜が関与する度合いに相関することが知られている（Ｋｏｎｔｔｉｎｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １９３：３９−４８（１９９０）；Ｐｏｏｌｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３７：１０３０−１０３８（１９９４）；  Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３４：７９９−８０７（１９９１）；およびＥｍｌｅｍら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．２３：９７４−９７８（１９９６））。ＨＡの血清レベルの増加は、例えば骨関節炎（ＯＡ）、進行性全身硬化症（ＰＳＳ）、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者にも存在する可能性がある。
【００５１】
本明細書で使用するように、用語「ヒアルロン酸」とは、「ＨＡ」と同義であり、グルクロン酸と、β−１，４結合により結合されるβ（１，３）−Ｎ−アセチルグルコサミン部分とが交互になる２つ以上の二量体単位のポリマーを意味する。本明細書で使用するように、「ＨＡを検出する」というフレーズは、ＨＡの存在を測定するための任意の定量的または定性的アッセイを意味し、「ＨＡのレベルを測定する」というフレーズは、ＨＡに対する任意の直接または間接の定量的アッセイを意味する。上記の観点から、「ＨＡを検出する」というフレーズは、「ＨＡのレベルを測定する」ことを包含することが理解される。
【００５２】
ＨＡ結合タンパク質または抗ＨＡ抗体にもとづく様々な公知のアッセイの１つを用いて、あるいは精製されたＨＡの定量により、ＨＡを検出でき、またＨＡのレベルを測定できる。ＨＡ結合タンパク質は、例えばＨＡを検出する際有用である。１２５Ｉ標識ＨＡ結合タンパク質に基づいたＨＡに対する放射アッセイは、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（Ｇｕｅｃｈｏｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：５５８−５６３（１９９６）から入手可能である。ＨＡ結合タンパク質にもとづく他の商業用アッセイは、例えばコルゲニックス（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ）（Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ、Ｃｏ；キット０２９００１）から入手可能である。さらに、ＭａｉｎｇｏｎｎａｔおよびＤｅｌｐｅｃｈ（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：３０５−３０６（１９９１））に記載されるようにヒアルロネクチンを用いて、またはナルジェナンクインターナショナル（Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ；ＤｅｌｐｅｃｈおよびＢｅｒｔｒａｎｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４９：５５５−５６５（１９８５））から入手可能なキットを用いて、ＨＡを検出でき、またＨＡのレベルを測定できる。ＨＡの検出またはＨＡのレベルの測定のためのアッセイとしては、様々な競合および非競合結合アッセイが挙げられ、例えば、とりわけ、１２５Ｉ標識ＨＡ結合タンパク質を用いた競合結合アッセイ、アルカリ性ホスファターゼ標識ヒアルロネクチン（ＨＮ）にもとづく競合結合アッセイ、およびペルオキシダーゼ標識プロテオグリカンまたはペルオキシダーゼ標識ＨＡ結合タンパク質にもとづく非競合結合アッセイが挙げられる（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：１２７−１３２（１９９２））。ＤｅｌｐｅｃｈおよびＢｅｒｔｒａｎｄ、上掲、１９８５；Ｅｎｇｓｔｒｏｍ−Ｌａｕｒｅｎｔら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４５：４９７−５０４（１９８５）；Ｂｒａｎｄｔら、Ａｃｔａ  Ｏｔｏｌａｒｙｎ．４４２（Ｓｕｐｐｌ．）：３１−３５（１９８７）；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：４４８−４５８（１９８８）；Ｃｈｉｃｈｉｂｕら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １８１：３１７−３２４（１９８９）；Ｌｉら、Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１９：２４３−２５４（１９８９）；Ｐｏｏｌｅら、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３３：７９０−７９９（１９９０）；Ｐｏｏｌｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：６０２０−６０２５（１９８５）；ならびにＬａｕｒｅｎｔおよびＴｅｎｇｂｌａｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９：３８６−３９４（１９８０））も参照せよ。ラジオイムノアッセイおよび酵素結合イムノアッセイを含む様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、試料中のＨＡの検出またはＨＡのレベルの測定のためのアッセイを実施できる。イムノアッセイに有用な抗ＨＡ抗血清としては、例えばバイオトレンド（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ；＃５０２９−９９９０）から入手可能な親和性精製ヒツジ抗ＨＡ抗血清が可能である。
【００５３】
試料からＨＡを精製し、精製した多糖の量を定量することによってもＨＡのレベルを測定できる。高速液体クロマトグラフィーを、単独または質量分光測光と組み合わせて用いることができる。例として、ＨＰＬＣを用いて、内部標準物質を含む試料のヒアルロニダーゼでの消化、逆相オクタデシルシリルカラムによる分離、およびｐＨ７．３５での０．０１Ｍテトラブチルアンモニウム・リン酸アセトニトリルによる溶出（８３：１７、ｖ／ｖ）後に、ＨＡレベルを測定することができる（Ｐａｙａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５６６：９−１８（１９９１））。
【００５４】
ＨＡレベルは、ヒアルロニダーゼレベルと相関することが示されている（Ｂｒａｙら、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．３：２８４−２８８（１９９１））。したがって、ヒアルロニダーゼ活性をアッセイすることによって、間接的に、ＨＡを検出することができ、またはＨＡのレベルを測定することができる。Ｂｒａｙら（上掲、１９９１）に記載されているように、ヒアルロニダーゼ活性に対するアッセイは当該技術分野で公知である。当業者には、ヒアルロニダーゼまたはＨＡレベルを測定するためのこれらのアッセイおよび他の通常のアッセイは、「ＨＡを検出する」および「ＨＡのレベルを測定する」というフレーズに包含され、本発明の方法にしたがって肝繊維症の有無または重症度を診断するのに有用であることが理解される。
【００５５】
（ＴＩＭＰ−１）
本発明の方法はまた、試料中のＴＩＭＰ−１の検出にも基づいており、特定の実施形態では、試料中のＴＩＭＰ−１のレベルの測定に基づいている。メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を調節するものであり、このマトリックスメタロプロテアーゼは、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）を含むＥＣＭ分解酵素の重要なグループである。正常肝臓では、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ウンジュリン、およびエンタクチン等のマトリックス成分は、マトリックス分解酵素により定常的に再構築されて、細胞外マトリックスの沈着を抑制する。ＴＩＭＰレベルの増加は、ＭＭＰ活性の阻害をもたらし、細胞外マトリックスの蓄積を支持する。ＴＩＭＰは、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３、およびＴＩＭＰ−４を含み、マトリックスメタロプロテアーゼと１：１の化学量論で相互作用し、かつ可逆的非共有結合を介して、メタロプロテアーゼ活性を阻害する。ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、およびＴＩＭＰ−３は、それらの局在化および調節は異なるが、同様のＭＭＰ阻害活性を有し、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、プロテオグリカナーゼ、およびメタロエラスターゼのタンパク質分解活性を阻害する（Ｃａｗｓｔｏｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」Ｂａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ  （編）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ５８９−６１０ページ（１９８６））。
【００５６】
ヒトＴＩＭＰ−１は、分子量が２８．５ｋＤａであり１８４個のアミノ酸からなるシアロ糖タンパク質である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９５：１６７−１７０（１９８１）；Ｄｏｃｋｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：６６−６９（１９８５）；およびＢｏｄｄｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１８９４３−１８９５２（１９９４））。ＴＩＭＰ−１は、例えば、間質コラゲナーゼＭＭＰ−１、さらにストロメライシンおよびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）等の全ての活性メタロプロテアーゼを阻害する。ヒトＴＩＭＰ−１の核酸配列（配列番号３）および対応するアミノ酸配列（配列番号４）を図２に示す。
【００５７】
本明細書で使用するように、用語「メタロプロテアーゼ−１の組織阻害剤」とは、「ＴＩＭＰ−１」と同義であり、ヒトＴＩＭＰ−１と同様の特異性を有するメタロプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害するヒトＴＩＭＰ−１（配列番号４）に対しかなりの構造的相同性を有するタンパク質を意味する。７−６Ｃｌまたは７−２３Ｇ９のような既知の特異的抗ＴＩＭＰ−１抗体と反応するエピトープの存在により、ヒトＴＩＭＰ−１の存在を簡便に検出することができる。
【００５８】
本明細書で使用するように、「ＴＩＭＰ−１を検出する」という表現とは、ＴＩＭＰ−１の存在を測定するための任意の定量的または定性的アッセイを意味し、「ＴＩＭＰ−１のレベルを測定する」という表現は、ＴＩＭＰ−１に対する任意の直接または間接の定量的アッセイを意味する。上記の観点から、「ＴＩＭＰ−１を検出する」という表現は、「ＴＩＭＰ−１のレベルを測定する」ことを包含するものであると理解される。      
【００５９】
ＴＩＭＰ−１の検出およびＴＩＭＰ−１のレベルの測定のためのアッセイとして、ＴＩＭＰ−１ＲＮＡ、タンパク質、および酵素活性に対する周知のアッセイが挙げられる。ノーザン分析またはＲＴ−ＰＣＲによりＴＩＭＰ−１  ＲＮＡレベルを測定する方法は、以下に詳しく説明するように、当該分野で周知である（Ｙｏｓｈｉｊｉら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６９：１３１−１３４（１９９６）；Ｊａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら、Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２８：１２７４−１２８５（２０００）；および  Ｇｒｏｆｔら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８５：５５−６３（２００１））。例えば、Ｂｒｏｐｈｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １６７：８９８−９０３（１９９０））に記載されるラジオイムノアッセイにより、またはＭｕｒａｗａｋｉら（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ２１８：４７−５８（１９９３））に記載される二抗体サンドイッチアッセイにより、ＴＩＭＰ−１タンパク質を検出でき、またＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを簡便に測定できる。アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（実施例ＩＩＩも参照せよ）から市販されるキットを用いたＥＬＩＳＡにより、ＴＩＭＰ−１タンパク質の血漿濃度をアッセイできる。精製されたＴＩＭＰ−１タンパク質の量を定量することによっても、ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定できる。例えばＨＰＬＣを単独で、または質量分光測光と組み合わせることにより、あるいは例えばＭｕｒｐｈｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９５：１６７−１７０（１９８１））またはＳｔｒｉｃｋｌｉｎおよびＷｅｌｇｕｓ（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：１２２５２−１２２５８（１９８３））に記載されるように、ＴＩＭＰ−１の精製を実施することができる。例えばＫｏｓｓａｋｏｗｓｋａら（Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５３：１８９５−１９０２（１９９８））に記載されるように逆ゼラチン電気泳動像（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いて、１つ以上のメタロプロテアーゼの活性の阻害をアッセイすることによっても、ＴＩＭＰ−１を検出することができ、またＴＩＭＰ−１のレベルを測定するこができる。ＴＩＭＰ−１  ＲＮＡ、タンパク質、または活性に対するアッセイについては、明細書中で後述するとともに、当業者には、ＴＩＭＰ−１を検出するためのこれらのアッセイおよび他の慣用のアッセイが本発明の方法により包含されることが理解される。
【００６０】
（包括／除外（Ｒｕｌｅ−ｉｎ／Ｒｕｌｅ−ｏｕｔ）分析）
本明細書に開示するように、２セットのカットオフ値を用いて、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１の３マーカーパネルに基づくアッセイの正確度を向上することができる。実施例ＩＩで説明するように、初めに線維症を除外（ｒｕｌｅ  ｏｕｔ）するために、感度に対する最適化に基づいて、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１に対するカットオフ値の第１のセットを選択し、次に、特異度に対して最適化されたカットオフ値の第２のセットを用いて「陽性」母集団の分析を行って、重度の線維症の存在を測定した。表７は、１９４人のＨＣＶ患者調査母集団に関する二重最適化戦略の結果を示す。α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１に対して、第１のカットオフをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、および１，０００ｎｇ／ｍｌに設定し、第１の分析での高い感度を達成した。第１のカットオフ値を上回るα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の３通りのレベル全てを有する任意の試料を、Ｆ２〜Ｆ４の線維症に対して陽性であると暫定的に示し、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１に対するカットオフ値をそれぞれ、特異度に対して最適化することにより得られた２．０ｍｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、および１，５７５ｎｇ／ｍｌとした第２のセットを用いてさらに評価した。
【００６１】
高い特異度に対して最適化したカットオフ値の第２のセットを用いて、初めにＦ２〜Ｆ４の線維症に対して陽性であると示された１２２人の患者のうち５４人が陽性であると確証され、そのうち１人のみが偽陽性であった。要約すると、調査母集団中の１９４人のＨＣＶ患者のうち、７２人が陰性（Ｆ０〜Ｆ１の線維症を有する）として分類され、５４人が陽性（Ｆ２〜Ｆ４の線維症を有する）として分類された一方で、６８個の試料は未確定結果であり、分類されなかった。未確定試料を除外すると、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１パネルは、約９８％の陽性予測値および約７９％の陰性予測値で機能した。さらに、３０％の線維症羅患率であるより典型的な患者母集団では、同パネルは、９３％に近い陽性および陰性予測値で機能する。これらの結果により、第１および第２のカットオフレベルを使用して、感度を初めに最適化し、次に特異度を最適化することによって、３つのマーカー試験の全体的な正確度を向上することができ、試験された試料の約７０％を占める未確定ではない試料に対して、約９３％の正確度を有するパネル試験に至ることが示される。
【００６２】
したがって、本発明は、個体から得た試料中のα２−ＭＧレベルを測定することと、個体から得た試料中のＨＡレベルを測定することと、個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１レベルを測定することと、α２−ＭＧレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ１を下まわるか、ＨＡレベルがＨＡカットオフ値Ｙ１を下まわるか、またはＴＩＭＰ−１レベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ１を下まわる場合に、個体を肝線維症を有さないか、または軽度の肝線維症を有すると診断することと、α２−ＭＧレベルがα２−ＭＧカットオフ値Ｘ２を上回り、ＨＡレベルがＨＡカットオフ値Ｙ２を上回り、かつＴＩＭＰ−１レベルがＴＩＭＰ−１カットオフ値Ｚ２を上回る場合に、中程度または重度の肝線維症を有するとして個体を診断することと、残りの個体は未確定状態であると診断することとにより、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する方法を提供する。
【００６３】
α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１マーカーのレベルに対する二重カットオフ値に基づく本発明の方法は、多様な患者母集団で、中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する際、有用であり得る。このような方法は、例えば、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎等の自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、または薬物誘導性肝疾患のような肝疾患を有する個体を診断する際、有用であり得る。一実施形態では、本発明の方法を用いて、Ｃ型肝炎ウイルスに感染された個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する。二重カットオフ値に基づく本発明の方法に有用な試料としては、限定はされないが、血液、血清、血漿、尿、唾液、および肝組織が挙げられる。一実施形態では、１つ以上の血清試料中のα２−ＭＧレベル、ＨＡレベル、およびＴＩＭＰ−１レベルを測定することによって、本発明の方法を実施する。
【００６４】
さらに別の実施形態では、本発明は、個体での中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症ないし軽度肝線維症とを区別する方法を提供し、区別は、１．８ｍｇ／ｍｌないし２．２ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３１ｎｇ／ｍｌないし３９ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、９００ｎｇ／ｍｌないし１，１００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、１．８ｍｇ／ｍｌないし２．２ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、５４ｎｇ／ｍｌないし６６ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，４１５ｎｇ／ｍｌないし１，７３５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とに基づく。別の実施形態では、区別は、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３５ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、１，０００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、６０ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，５７５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とに基づく。さらに別の実施形態では、区別は、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ１カットオフ値と、３７ｎｇ／ｍｌのＹ１カットオフ値と、１，１００ｎｇ／ｍｌのＺ１カットオフ値と、２．０ｍｇ／ｍｌのＸ２カットオフ値と、６０ｎｇ／ｍｌのＹ２カットオフ値と、１，５７５ｎｇ／ｍｌのＺ２カットオフ値とに基づく。さらなる実施形態では、３０％までの肝線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団での個体の少なくとも６５％を、非線維症または軽度の線維症あるいは中程度の線維症ないし重度の線維症であるとして診断するように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択する。さらに別の実施形態では、最大で１０％の肝線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団での個体の少なくとも７０％を、非線維症または軽度の線維症あるいは中程度ないし重度の線維症であるとして診断するように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択する。
【００６５】
上記に説明したように、本発明の方法は、アッセイされる全患者母集団のサブグループで、線維症の有無または重症度を測定するのに非常に正確である。例えば、表７に示すように、本発明の方法は、３０％の肝線維症羅患率を有する患者母集団の約７０％で、Ｆ０〜Ｆ１またはＦ２〜Ｆ４線維症状態を測定する際、９３％より大きい正確度で機能する。患者母集団の残りの３０％は、未確定状態であることが示される。本明細書で使用するように、用語「未確定状態」とは、個体を十分な予測値で確信的に診断できないことを意味する。
【００６６】
本明細書で使用するように、用語「Ｘ１」または「Ｘ２」とは、α２−ＭＧカットオフ値を意味し、それに対して実験用α２−ＭＧ試料レベルが比較される。同様に、本明細書で使用するように、用語「Ｙ１」または「Ｙ２」とは、ＨＡカットオフ値を意味し、それに対して実験用ＨＡレベルが比較される。本明細書で使用するように、用語「Ｚ１」または「Ｚ２」とは、ＴＩＭＰ−１カットオフ値を意味し、それに対して実験用ＴＩＭＰ−１レベルが比較される。Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１カットオフを組み合わせて、試料中の線維症の有無または重症度を測定する。同様に、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ１カットオフ値を組み合わせて、試料中の線維症の有無または重症度を測定する。Ｘ１より小さいα２−ＭＧレベル、Ｙ１より小さいＨＡレベル、またはＺ１より小さいＴＩＭＰ−１レベルを有する試料は、Ｆ０〜Ｆ１の線維症であるとして分類される。Ｘ１を超えるα２−ＭＧレベル、Ｙ１を超えるＨＡレベル、およびＺ１を超えるＴＩＭＰ−１レベルを有する試料は、Ｆ２〜Ｆ４線維症に対して陽性である可能性があり、さらに分析を要する根拠となる。さらに、Ｘ２を超えるα２−ＭＧレベル、Ｙ２を超えるＨＡレベル、およびＺ２を超えるＴＩＭＰ−１レベルを有する試料は、Ｆ２〜Ｆ４の線維症であるとして分類される。Ｘ１を超えるα２−ＭＧレベル、Ｙ１を超えるＨＡレベル、およびＺ１を超えるＴＩＭＰ−１レベルを有しているが、１つ以上のレベルがＸ２、Ｙ２、またはＺ２より下である試料は、「未確定状態」として分類される。Ｘ２は一般にＸ１と等しいかそれより大きく、Ｙ２は一般にＹ１と等しいかそれより大きく、Ｚ２は一般にＺ１と等しいかそれより大きいことが理解される。
【００６７】
当業者は、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値のＸ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択して、特定の線維症羅患率を有する患者母集団に対して、所望の感度または特異度、あるいは所望の陰性予測値、陽性予測値、または正確度のような１つ以上の臨床的に有効なパラメーターを達成できる。実験計画としても知られる要因計画最適化の方法論を用いて、例えば、適当なカットオフ値を選択できる。実施例ＩＩで本明細書に記載するように、中心複合計画実験で最適化ソフトウェア（Ａｉｒ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＯ．）から得られるＤＯＥ  Ｋｅｅｐ  Ｉｔ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ）を用いて、３つのカットオフＸ１、Ｙ１、およびＺ１を同時に変化させ、その後３つのカットオフＸ２、Ｙ２、およびＺ２を同時に変化させた。具体的には、α２−ＭＧカットオフを２．０から５．０ｍｇ／ｍｌに変化させ；ＨＡカットオフを２５から７５ｎｇ／ｍｌに変化させ；ＴＩＭＰ−１カットオフを１，０００から１，７００ｎｇ／ｍｌに変化させた。指定されたＸ１、Ｙ１、およびＺ１カットオフを用いて、データベースで、１９４人の患者に対して測定された試験結果を比較することによって（表４参照）、１９４の試料それぞれを真陽性、真陰性、偽陽性、または偽陰性であると測定し、調査患者母集団に関して、感度、特異度、陰性予測値、陽性予測値、および正確度の臨床パラメーターを測定した。α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値の測定は、ＤＯＥ  ＫＩＳＳプログラムを用いて本明細書で説明されているが、当業者には、複数の変数間の協調的相互作用を特定するため、かつ連立方程式算出を実行するための他のコンピュータープログラムも使用できることが理解される。例えば、ＥＣＨＩＰ社（ＥＣＨＩＰ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（Ｈｏｃｋｅｓｓｉｎ、ＤＥ）から入手できるＥＣＨＩＰ最適化ソフトウェア（ＥＣＨＩＰ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）、またはＳＴＳＣ社（ＳＴＳＣ，  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手できるステートグラフィック最適化ソフトウェア（Ｓｔａｔｇｒａｐｈｉｃｓ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅも、本発明の方法で有効なα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を測定するのに有用である。
【００６８】
真陽性、偽陽性、真陰性、および偽陰性を用いて、感度、特異度、陰性予測値、陽性予測値、および正確度の臨床パラメーターを算出する。「真陽性」試料とは、臨床生検に準じた線維症の指示段階に対して陽性の試料であり、本発明の方法によっても陽性であると診断される。「偽陽性」試料とは、生検による線維症の指示段階に対して陰性の試料であり、本発明の方法によって陽性であると診断される。同様に、「偽陰性」とは、生検による線維症の指示段階に対して陽性の試料であり、本発明の方法によって陰性であると診断される。「真陰性」とは、生検による線維症の指示段階に対して陰性の試料であり、本発明の方法によっても線維症に対して陰性である。例えばＭｏｔｕｌｓｋｙ（編）、Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照せよ。
【００６９】
本明細書で使用するように、用語「感度」とは、試料が陽性であるとき（例えばＦ２〜Ｆ４のＭｅｔａｖｉｒスコアを有する線維症であるとき）、本発明の診断方法により、陽性結果が与えられる可能性を意味する。感度は、真陽性および偽陰性の合計で割った真陽性の結果の数値として算出される。感度は、本質的に、線維症疾患にかかっている人々をどの程度正確に方法が特定するかについての尺度である。本発明の方法では、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％において、あるいはアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％において、個体を診断する感度は、少なくとも約７０％であり、さらに例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％となるように、Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２値を選択できる。
【００７０】
本明細書で使用するように、用語「特異度」とは、試料が陽性ではない（例えばＦ２〜Ｆ４のＭｅｔａｖｉｒ線維症段階ではない）場合に、本発明の診断方法により、陰性結果が与えられる確率を意味する。特異度は、真陰性および偽陽性の合計で割った真陰性の結果の数値として算出される。特異度は、本質的に、線維症に患っていない個体を、どの程度うまく方法が除外するかについての尺度である。本発明の方法では、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、あるいはアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、感度が少なくとも約７０％であるとき、個体を診断する特異度は７０〜１００％の範囲であり、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％であるように、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択できる。実施例ＩＩで説明するように、３０％の線維症羅患率を有する患者母集団の約７０％にあたる未確定ではない患者母集団で、９８％を上回る特異度および約７７％の感度を達成した。
【００７１】
本明細書で使用するように、用語「陰性予測値」とは、「ＮＰＶ」と同義であり、線維症ではないと診断された個体が、実際に疾患にかかっていない確率を意味する。陰性予測値は、真陰性および偽陰性の合計で割った真陰性の数値として算出することができる。分析される母集団での線維症の羅患率とともに診断方法の特性により陰性予測値を測定する。本発明の方法では、１０％までの肝線維症羅患率を有する母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、陰性予測値は７５〜９９％の範囲であり、さらに例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。また、２０％までの肝線維症羅患率を有する母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、陰性予測値は７５〜９９％の範囲であり、さらに例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。さらに、３０％までの肝線維症羅患率を有する母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、陰性予測値は７５〜９９％の範囲であり、さらに例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。
【００７２】
本明細書で使用するように、用語「陽性予測値」とは、「ＰＰＶ」と同義であり、線維症であると診断された個体が、実際にその病状を有している確率を意味する。陽性予測値は、真陽性および偽陽性の合計で割った真陽性の数値として算出することができる。分析される母集団での線維症の羅患率とともに診断方法の特性により陽性予測値を測定する。本発明の方法では、１０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本方法の陽性予測値は、少なくとも約７５％であり、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。また、２０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本方法の陽性予測値は、少なくとも約７５％であり、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるようにも、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。同様に、３０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本方法の陽性予測値は、少なくとも約７５％であり、さらに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。
【００７３】
陰性および陽性予測値を含む予測値は、分析される母集団での疾患の羅患率に影響される。本発明の方法では、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を選択して、特定の肝線維症羅患率を有する臨床母集団に関する所望の臨床パラメーターを発生させることができる。例えば肝臓病学者の研究室で見られる１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、または３０％までの肝線維症羅患率に対してカットオフ値を選択できる。一般開業医の診察室で見られる線維症羅患率の代表的なものであり得る１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、または８％までの肝線維症羅患率に対してもカットオフ値を選択できる。
【００７４】
本明細書で使用するように、用語「正確度」とは、診断方法と疾患状態との間の包含的な一致を意味する。正確度は、試料結果の総数で割った真陽性および真陰性の合計として算出され、分析される母集団での線維症の羅患率に影響される。１０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本発明の方法の正確度は、少なくとも約８０％であり、さらに例えば少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。また、２０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本発明の方法の正確度は、少なくとも約８０％であり、さらに例えば少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％となるようにも、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。同様に、３０％までの肝線維症羅患率を有する患者母集団中で、アッセイされる患者母集団の少なくとも６０％で、例えばアッセイされる患者母集団の少なくとも６５％、７０％、７５％、または８０％で、本発明の方法の正確度は、少なくとも約８０％であり、さらに例えば少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％となるように、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフ値を選択できる。
【００７５】
（特異的マーカーに限定されない方法）
本発明は、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、カットオフ値Ｘ１と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定することと、個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、カットオフ値Ｙ１と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定することと、ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法も提供し、４０％までの線維症羅患率を有する母集団で、少なくとも９０％の正確度で、この母集団の個体の少なくとも６５％を診断する。
【００７６】
本発明の方法は、所望される場合、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、カットオフ値Ｚ１と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定することと、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することを含むことができる。一実施形態では、第１の線維症マーカーはα２−ＭＧであり、第２の線維症マーカーはＨＡであり、第３の線維症マーカーはＴＩＭＰ−１である。
【００７７】
別の実施形態では、少なくとも３つの線維症マーカーのレベルを比較し、さらなる実施形態では、厳密に３つの線維症マーカーのレベルを、それらのそれぞれのカットオフ値と比較する。付加的な実施形態では、少なくとも４つのまたは少なくとも５つの線維症マーカーのレベルを比較する。本発明の方法は、例えば、中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症または軽度肝線維症とを区別するのに有用であり得る。
【００７８】
具体的な実施形態では、本発明の方法は、３０％までの線維症羅患率を有する母集団で、個体の少なくとも６５％を、少なくとも９３％の正確度で診断をおこなう。さらなる実施形態では、本発明の方法は、２０％までの線維症羅患率を有する母集団で、個体の少なくとも７０％を、少なくとも９４％の正確度で診断をおこなう。なおさらなる実施形態では、本発明の方法は、１０％までの線維症羅患率を有する母集団で、個体の少なくとも７０％を、少なくとも９６％の正確度で診断をおこなう。
【００７９】
本発明の方法は、肝線維症の有無または重症度を診断する際、比類の無い成果を提供する。全ての患者が診断を受けているわけではないが、大多数が非常に優れた正確度で診断されている。例として、約４０％の線維症羅患率を有する患者母集団で、この母集団のほぼ７０％は、９１％を超える正確度と、９６％を超える陽性予測値および８９％を超える陰性予測値とで診断される。この優れた成果を、Ｐｏｙｎａｒｄら（Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１０６９（２００１））の方法等の別の方法と対比させる。６つのマーカーα２−ＭＧ、α２−グロブリン、総ビリルビン、γ−グロブリン、アポＡ１、およびＧＧＴの分析に基づいたＰｏｙｎａｒｄらの方法を用いて、約８９％の正確度のみで、約４０％の線維症羅患率を有する母集団の約５０％のみを診断する（表８を参照のこと）。したがって、本発明の方法によって、患者母集団の著しくより大きな％値（約５０％と比べて約７０％）を、８９％付近の正確度と比べて９１％を超える正確度で診断するという点で改良がなされる（表８を参照のこと）。本発明の方法の新規の成果特性により、代表的に、患者母集団の少なくとも６５％で生検が不必要になり、診断される患者は、９０％を超える正確度である診断を信頼できるようになる。
【００８０】
本発明の他の方法と同様に、少なくとも２つの線維症マーカーの比較にもとづく本発明の方法を用いて、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎のような自己免疫性肝疾患、アルコール性肝疾患、脂肪肝疾患、または薬物誘導性肝疾患を含む任意の肝障害、あるいは本明細書中上記に記載した任意の他の肝疾患に罹っているか、または罹っている疑いのある個体で、肝線維症の有無または重症度を診断する。同様に、少なくとも２つの線維症マーカーの比較にもとづく本発明の方法を用いて、肺線維症、腎線維症、前立腺線維症、乳腺線維症、またはリウマチ様疾患、あるいは本明細書中で記載のまたは当該技術分野で公知の別の線維症障害を含む線維症障害の有無または重症度を診断できる。
【００８１】
本発明の方法は、所定のカットオフ値に対する線維症マーカーのレベルの比較に依存する。線維症と陽性に相関するマーカーに対して、陽性は、所定のカットオフ値より大きいレベルで示される。線維症と陰性に相関するマーカーに対して、陽性は、所定のカットオフ値より小さいレベルで示される。本明細書に記載するように、例えば実験計画法（ＤＯＥ）分析を用いて、本発明の方法に有効なカットオフ値を測定し得る。
【００８２】
本発明の他の診断方法に関しては、当該技術分野で公知であるか、または本明細書中に記載される種々の線維症マーカーを用いて、これらの方法を実施することができる。このような線維症マーカーとしては、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、またはアポＢが挙げられるが、これらに限定されない。付加的な血清学的、生化学的、臨床的、および超音波検査の線維症マーカーは、本明細書で上述したもの、または当該技術分野で公知のものであり、本発明の方法において任意の組み合わせで含ませることができる。さらに、第１および第２の線維症マーカーと、任意の付加的な線維症マーカーとの比較を、同時に、または任意の順番で、かつアッセイフォーマットの任意の組み合わせを用いて、実行することが可能であると理解される。
上述のように、線維症マーカーの「レベル」とは、例えばＲＮＡ、タンパク質、または活性の相対量または絶対量であり得、線維症マーカーの直接的または間接的測定値となり得る。さらに、医師または診断研究所のような２次的供給源からレベル値を得ることができ、また、本明細書中上記で記載したものを含むが、これらに限定されない任意の都合のよい試料およびアッセイを用いて測定することができる。本発明の方法に含まれる比較を実行するために、線維症マーカーのレベルを測定するのに有用な方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡブロット分析等のハイブリダイゼーション法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含むイムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、定量的ウエスタンブロッティング、ならびにタンパク質レベルを測定するための他の標準的アッセイを包含し、適用可能であれば、線維症マーカーの活性に対するアッセイを包含する。このようなアッセイは、当該技術分野で常用されており、また本明細書中で上述されている。
【００８３】
本発明はさらに、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、カットオフ値Ｘ１と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定すること；個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、カットオフ値Ｙ１と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定すること；ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供し、カットオフ値Ｘ１およびＹ１を個々に最適化して所望の性能特性を与える。
【００８４】
所望される場合、本発明の方法は、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、カットオフ値Ｚ１と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定するステップと、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断するステップとを含むことができ、カットオフ値Ｘ１、Ｙ１、およびＺ１を個々に最適化して所望の性能特性を与える。一実施形態では、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１のレベルを比較する。別の実施形態では、厳密に３つか、少なくも３つか、少なくとも４つか、または少なくとも５つの線維症マーカーのレベルを比較する。本発明の方法は、例えば中程度肝線維症ないし重度肝線維症と非肝線維症または軽度肝線維症とを区別するのに有用であり得る。本明細書に記載するように、例えばＤＯＥ分析を用いて、カットオフ値を最適化することができる。
本発明により、さらに、個体の第１の線維症マーカーＸのレベルを、２つのカットオフ値Ｘ１およびＸ２と比較して、個体が第１の線維症マーカーＸに対して陽性であるかを測定することと、個体の第２の線維症マーカーＹのレベルを、２つのカットオフ値Ｙ１およびＹ２と比較して、個体が第２の線維症マーカーＹに対して陽性であるかを測定することと、ＸおよびＹに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供し、ここでカットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２は個々に最適化されて所望の性能特性を得る。このような成果特性としては、本明細書中上述したように、特定の感度、特異度、ＰＰＶ、ＮＰＶ、および正確度が挙げられる。
【００８５】
本発明の方法はさらに、個体の第３の線維症マーカーＺのレベルを、２つのカットオフ値Ｚ１およびＺ２と比較して、個体が第３の線維症マーカーＺに対して陽性であるかを測定するステップと、Ｘ、Ｙ、およびＺに対する陽性または陰性にもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断するステップとを包含することができ、ここでカットオフ値Ｘ１、Ｙ１、Ｚ１、Ｘ２、Ｙ２、およびＺ２を個々に最適化して所望の性能特性を与える。本発明の方法では、例えばＤＯＥ分析を用いて、カットオフ値を簡便に最適化できる。
【００８６】
（方法論）
試料中のα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出するため、かつα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰのレベルを測定するために、多様な手段が有用であり得る。一実施形態では、例えば抗α２−ＭＧ抗体等の１種類以上のα２−ＭＧ特異的結合因子を用いて、診断される個体から得た試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することにより本発明を実施する。別の実施形態では、個体から得た試料中のα２−ＭＧ活性をアッセイすることにより本発明の方法を実施する。
【００８７】
本発明の方法では、多様な手段を用いて、試料中のＨＡを検出すること、またはＨＡのレベルを測定することもできる。一実施形態では、ＨＡ結合タンパク質または抗ＨＡ抗体等の１種類以上のＨＡ特異的結合因子を用いて、試料中のＨＡのレベルを測定することにより本発明を実施する。
【００８８】
同様に、本発明の方法では、多様な手段を用いて、試料中のＴＩＭＰ−１を検出すること、またはＴＩＭＰ−１のレベルを測定することができる。一実施形態では、診断される個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定することにより本発明を実施する。ＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを、例えば抗ＴＩＭＰ−１抗体等の１種類以上のＴＩＭＰ−１特異的結合因子を用いて測定することができる。別の実施形態では、診断される個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１活性をアッセイすることにより本発明を実施する。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明は、個体から得た試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することと、個体から得た試料中のＨＡのレベルを測定することと、個体から得た試料中のＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルを測定することと、α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルにもとづいて、個体の肝繊維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝繊維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。必要に応じて、酵素結合アッセイを用いて、α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１タンパク質のレベルをそれぞれ測定することができる。
【００９０】
さらに別の実施形態では、本発明は、α２−ＭＧと抗α２−ＭＧ抗体との第１の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、抗α２−ＭＧ抗体と接触させることと、第１の複合体を洗浄して、未結合分子を除去することと、α２−ＭＧを含有する第１の複合体の量を測定することと、ＨＡとＨＡ結合タンパク質との第２の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、ＨＡ結合タンパク質と接触させることと、第２の複合体を洗浄して、未結合分子を除去することと、ＨＡを含有する第２の複合体の量を測定することと、ＴＩＭＰ−１と抗ＴＩＭＰ−１抗体との第３の複合体を形成するのに適した条件下で、個体から得た試料の適当な希釈物を、抗ＴＩＭＰ−１抗体と接触させることと、第３の複合体を洗浄して、未結合分子を除去することと、ＴＩＭＰ−１を含有する第３の複合体の量を測定することと、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を含有する複合体の量にもとづいて、個体での中程度肝繊維症ないし重度肝繊維症と非肝繊維症ないし軽度肝繊維症とを区別することとにより、個体での中程度肝繊維症ないし重度肝繊維症と非肝繊維症ないし軽度肝繊維症とを区別する方法を提供する。
【００９１】
以下でさらに論じるように、タンパク質または多糖の量を直接アッセイすることによって、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出またはα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＹＫＬ−４０の検出を実行でき、α２−ＭＧおよびＴＩＭＰ−１の場合は、ＲＮＡレベルをアッセイするか、あるいはα２−ＭＧまたはＴＩＭＰ−１によって制御されるプロテアーゼの酵素活性をアッセイすることによって測定できることが理解される。同様に、本発明の方法で、１つ以上の付加的な繊維症マーカーを検出する際、マーカーを直接アッセイすることができ、あるいはマーカーのレベルと相関するＲＮＡのような前駆体、分解産物、タンパク質分解産物、または活性をアッセイすることができる。α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、およびＹＫＬ−４０のレベル、または任意の付加的な繊維症マーカーのレベルの測定を、例えばＲＮＡレベル、タンパク質レベル、または酵素活性に対する絶対値を用いて実行することができ、あるいは１つ以上の参照値との比較で相対値として測定できることが理解される。
【００９２】
３つの繊維症マーカーアッセイ（α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１またはα２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０）のそれぞれならびに任意のさらなるアッセイを、任意の順番で他のものから独立して実行すること、およびアッセイフォーマットの任意の組み合わせは本発明により包含されることがさらに理解される。例として、ＴＩＭＰ−１酵素活性をアッセイすることによりＴＩＭＰ−１のレベルを測定する一方で、α２−ＭＧおよびＨＡの濃度をアッセイすることによって、α２−ＭＧおよびＨＡのレベルを測定できる。別の例としては、酵素結合アッセイを用いてＨＡおよびＴＩＭＰ−１のレベルを測定する一方で、ラジオイムノアッセイを用いてα２−ＭＧのレベルを測定できる。当業者には、３つの繊維症マーカー（α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１またはα２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０）の検出および任意のさらなるマーカーの検出を、同時に、または任意の順番で実行できることが理解される。さらに、血清試料のような単一の試料を個体から得て、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＰＭ−１、またはα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出用の３つの部分に細分でき、あるいは異なる試料を用いてマーカーを検出することができる。この試料は、同一もしくは異なるタイプであることも可能であるとともに、未希釈であるか、または同程度もしくは異なる程度に希釈さていることも可能である。２つ以上の試料を用いる際、通常、例えば数日から数週間の比較的短期間内で試料を個体から得る。
【００９３】
（ＲＮＡ方法）
ハイブリダイゼーション法を用いて、α２−ＭＧまたはＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡを検出でき、あるいはα２−ＭＧもしくはＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡのレベル、またはＹＫＬ−４０のような本発明で有用な別の繊維症マーカーのｍＲＮＡのレベルを測定できる。相補的な核酸プローブを用いた特異的または選択的ハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡレベルを測定するための多数の方法が当該技術分野で周知である。このようは方法としては、溶液ハイブリダイゼーション法と、プローブまたは試料を固相支持体に固定する固相ハイブリダイゼーション法とが挙げられる。有用な方法の具体的な例としては、標的およびシグナル増幅法のような増幅法が挙げられ、さらにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）および逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と、転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と、分岐鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃｈａｉｎ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）と、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）とが挙げられる。本発明で有用なさらなる方法としては、ＲＮアーゼプロテクションと、ノーザン分析、または他のＲＮＡブロット、ドットブロット、もしくは膜を利用した技術と、ディップスティックと、ピンと、チップに固定される２次元アレイとが挙げられる。溶液および固相ハイブリダイゼーション法の両方を用いたｍＲＮＡレベルの定量的測定のための条件は、当該技術分野で周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９））に記載されている。
【００９４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＲＴ−ＰＣＲは、本発明の方法で有用である。単離されたＲＮＡ、未精製試料、または例えば全血試料からペレットにした細胞のような部分的に分画された試料を用いて、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを実行することができる。ＰＣＲ法は当該技術分野で周知であり、例えばＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））に記載されている。二次元アレイのようなマルチ試料フォーマットでは、１度のアッセイで、多数の異なる試料を分析するという利点がある。固相ディップスティックを利用した方法も本発明で有用であり得、液体試料を迅速に分析し、素早く結果を得ることができるという利点を持つ。
【００９５】
α２−ＭＧおよびＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡの検出用またはα２−ＭＧおよびＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡレベルの測定用プローブは当該技術分野で周知である。当業者は、例えば図１に示すヒトα２−ＭＧ核酸配列（配列番号１）のいくつかまたは全て、あるいは図３に示すヒトＴＩＭＰ−１核酸配列のいくつかまたは全てにそれぞれ対応するプローブを使用することができる。α２−ＭＧおよびＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡを検出するための、またはα２−ＭＧおよびＴＩＭＰ−１ｍＲＮＡレベルを測定するための様々なアッセイフォーマットに関する適当な条件は当該技術分野で周知であるか、また通常の方法を用いて確立することができる。例としては、ヒト試料中のα２−ＭＧ  ＲＮＡのノーザン分析用の条件およびプローブについては、例えばＯｒｔｅｇｏら（上掲、１９９７）に記載されている。別の例としては、ヒト試料中のα２−ＭＧ  ＲＮＡ発現を測定するためのＲＮＡスロットブロットハイブリダイゼーション用の条件およびプローブについては、Ｓｉｍｏｎら（上掲、１９９６）に記載されている。同様に、例えばＹｏｓｈｉｊｉら（上掲、１９９６）に記載されているように、ヒト試料中のＴＩＭＰ−１ＲＮＡのノーザン分析を実行できる。ヒト試料中のＴＩＭＰ−１に対するＲＴ−ＰＣＲアッセイも当該技術分野で周知であり、例えばＪａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋら（上掲、２０００）およびＧｒｏｆｔら（上掲、２００１）に記載されている。当業者には、α２−ＭＧ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０のＲＮＡを検出するために、あるいはα２−ＭＧ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０のＲＮＡレベルまたは本発明の方法に有用な他の繊維症マーカーのレベルを測定するために、これらのアッセイおよび他のアッセイが有用であり得ることが理解される。
【００９６】
（イムノアッセイ）
競合的および非競合的イムノアッセイフォーマット、抗原捕獲アッセイ、ならびに二抗体サンドイッチアッセイを含む様々なイムノアッセイフォーマットも本発明の方法で有用である（ＳｅｌｆおよびＣｏｏｋ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：６０−６５（１９９６））。一実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の抗原捕獲アッセイに依拠する。抗原捕獲アッセイでは、抗体を固相に結合させ、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＹＫＬ−４０、または別の繊維症マーカー抗原が抗体に結合されるように試料を付加する。未結合タンパク質を洗浄により除去した後、例えばラジオアッセイを用いて（必要に応じて）、結合している抗原の量を定量できる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８））。当業者には、抗体過剰の条件下で、または抗原の競合として、本発明に有用なイムノアッセイを実行し、抗原量を定量することによって、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０のレベルを測定することが理解される。
【００９７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、本発明の方法に有用であり得る。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、またはウレアーゼのような酵素は、例えば抗α２−ＭＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ＴＩＭＰ−１抗体、抗ＹＫＬ−４０抗体、または本発明の方法で使用される２次抗体に結合することができる。例えば発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに、西洋わさびペルオキシダーゼ検出系を用いることができ、これにより、過酸化水素の存在下で、４５０ｎｍで検出可能な可溶性産物が生成される。他の都合のよい酵素結合系としては、例えばアルカリホスファターゼ検出系が挙げられ、発色基質のｐ−ニトロフェニルホスフェートとともに使用して、４０５ｎｍで容易に検出できる可溶性産物を生成することができる。同様に、発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに、β−ガラクトシダーゼ検出系を用いて、４１０ｎｍで検出可能な可溶性産物を発生させることができ、または尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のような基質とともに、ウレアーゼ検出系を用いることができる。有用な酵素結合１次抗体および２次抗体を、下記にさらに記載するように、ジャクソンイムノ・リサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）等の多数の商業的供給元から得ることができる。
【００９８】
α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０を検出するために、あるいはα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０のレベル、または本発明の方法に準じた別の繊維症マーカーのレベルを測定するために、化学発光検出も有用である。Ａｍｅｒｓｈａｍ等、様々な供給元から化学発光２次抗体が市販されている。
【００９９】
α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０を検出するために、あるいはα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０のレベル、または本発明の方法での別の繊維症マーカーのレベルを測定するために、蛍光検出も有用である。有用な蛍光色素としては、制限はなく、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンが挙げられる。抗α２−ＭＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ＴＩＭＰ−１抗体、または抗ＹＫＬ−４０抗体のような、フルオレセイン標識またはローダミン標識されたα２−ＭＧ特異的結合因子、ＨＡ特異的結合因子、ＴＩＭＰ−１特異的結合因子、またはＹＫＬ−４０特異的結合因子、あるいはフルオレセイン標識またはローダミン標識２次抗体が本発明で有用であり得る。下記にさらに記載するように、例えばＴａｇｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から、有用な蛍光抗体が市販されている。
【０１００】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）も本発明の方法で有用であり得る。このようなアッセイは当該技術分野で周知である。例えばＢｒｏｐｈｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６７：８９８−９０３（１９９０））がＴＩＭＰ−１の検出に対するラジオイムノアッセイについて記載しており、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、１２５Ｉ標識ＨＡ結合タンパク質を用いたＨＡの定量（Ｇｕｅｃｈｏｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：５５８−５６３（１９９６））のためのラジオメトリックアッセイが製造されている。例えば１２５Ｉ標識１次抗体または２次抗体を用いて、ラジオイムノアッセイを実行することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上掲、１９８８）。
【０１０１】
例えば、発光基質からの色を検出するための分光光度計、１２５Ｉ検出用のガンマカウンターのような放射線を検出するための放射線測定器、または特定の波長の光の存在下で蛍光発光を検出するための蛍光光度計を用いて、検出可能な試薬からのシグナルを分析することができる。酵素結合アッセイを利用する際、ＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）のような分光光度計を用いて、製造元の指示に従いα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０の量、または別の繊維症マーカーの量の定量的分析を実行できる。必要に応じて、本発明のアッセイを自動化することができ、またはロボット的に実行することができるとともに、複数の試料からのシグナルを同時に検出できることが理解される。
【０１０２】
本発明の方法は、キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（ＣＥＩＡ）の使用も包含し、必要に応じて自動化することができる。例えばＳｃｈｍａｌｚｉｎｇおよびＮａｓｈａｂｅｈ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２１８４−９３（１９９７））ならびにＢａｏ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．６９９：４６３−８０（１９９７））に記載されているように、レーザー誘導蛍光と組み合わせて、イムノアッセイを用いることもできる。フローインジェクションリポソームイムノアッセイおよびリポソーム免疫センサーのようなリポソームイムノアッセイを用いても、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０を検出することができ、あるいはα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０のレベル、または本発明の方法に準じた別の繊維症マーカーのレベルを測定することができる（Ｒｏｎｇｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４：１０５−１３３（１９９７））。
【０１０３】
サンドイッチ酵素イムノアッセイも本発明の方法で有用である。二抗体サンドイッチアッセイでは、第１の抗体を固相支持体に結合させ、抗原が第１の抗体に結合するのを可能にする。α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＹＫＬ−４０、または別の繊維症マーカー抗原の量を、繊維症マーカーに結合している第２の抗体の量を測定することによって定量する。
【０１０４】
例として、Ｍｕｒａｗａｋｉら（前出、１９９３）に記載されるように、ＴＩＭＰ−１のレベルを測定するために、ニ抗体サンドイッチイムノアッセイが有用であり得る。簡略すると、血清（２５μｌ）を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１．０ｍｌ、ｐＨ７．０）を用いて４１倍で希釈する。希釈した試料（２０μｌ）を、西洋わさびペルオキシダーゼで標識した５０ｎｇ／ｍｌモノクローナル抗体（クローン７−６Ｃ１のＦａｂ）、１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．００５％チメロサールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液０．３ｍｌ（ｐＨ７．０）と混和する。混和した溶液の０．１ｍｌアリコートを、異なるエピトープ特異性を有する第２のモノクローナル抗体（クローン７−２３Ｇ９）で予め被覆した各マイクロプレートウエルに移し、室温で３０分間、振とうせずにプレートをインキュベートする。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液０．３ｍｌ（ｐＨ７．０）で、プレートを３回洗浄する。０．５ｍｇ／ｍｌο−フェニレンジアミンおよび０．０２％Ｈ２Ｏ２を含む０．１５Ｍクエン酸リン酸ナトリウム緩衝液０．１ｍｌ（ｐＨ４．９）を用いた室温での１５分間のインキュベーションにより、プレートに結合したペルオキシダーゼ活性をアッセイする。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を０．１ｍｌ加えて反応を停止させた後、ヒト血清ＴＩＭＰ−１の標準品を用いて、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍでの吸光度を測定する。対数目盛でグラフ化することによって、ＴＩＭＰ−１の量および４９２ｎｍでの吸光度間の直線性が示され、１ウエルに対して約１．５から３００μｇの測定範囲を生ずる。
【０１０５】
定量的ウエスタンブロッティングを用いても、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０を検出することができ、あるいはα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、もしくはＹＫＬ−４０のレベル、または本発明の方法での別の線維症マーカー抗原のレベルを測定することができる。スキャニングデンシトメトリーのような周知の方法により、ウエスタンブロットを定量することができる。例としては、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉゲル上で、タンパク質試料を電気泳動する。例えばヒトα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、またはＹＫＬ−４０に対して、１次マウスモノクローナル抗体をブロットで反応させ、事前のスロットブロット実験を用いて、抗体結合が直線性であるかを確認する。ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体（ＢｉｏＲａｄ）を２次抗体として用いて、シグナル検出を、例えばＲｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で、製造元の指示に従い化学発光を用いて実行する。スキャニングデンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ブロットのオートラジオグラフを分析し、陽性対照に標準化する。例えば実測値と陽性対照間の比率（デンシトメトリーの指数）として値がレポートされる。このような方法は当該技術分野で周知であり、例えばＰａｒｒａら（Ｊ．  Ｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  ２８：６６９−６７５（１９９８））に記載されている。
【０１０６】
（抗体の供給源）
本明細書中で上述したように、限定はされないが、酵素結合免疫吸着アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および定量的ウエスタン分析を含むイムノアッセイは、本発明の診断方法で有用である。このようなアッセイは、１種類以上の抗体、例えば抗α２−ＭＧ抗体、抗ＨＡ抗体、抗ＴＩＭＰ−１抗体、または抗ＹＫＬ−４０抗体に依拠する。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、その最も広義の意味で用いられ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体とともに、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＹＫＬ−４０、または関連する線維症マーカー抗原に対して、少なくとも約１ｘ１０５Ｍ−１の結合活性を保有する抗体のポリペプチドフラグメントを含む。当業者には、抗α２−ＭＧ抗体、抗−ＨＡ抗体、抗ＴＩＭＰ−１抗体、および抗ＹＫＬ−４０抗体フラグメントのような抗体フラグメント、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖフラグメントを含む抗体フラグメントは、関連する線維症マーカー抗原に対する結合活性を保有することができるので、本明細書で使用する場合に、抗体という用語の定義内に含まれることが理解される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を調製する方法は、当該技術分野でルーチンであり、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上掲、１９８８）に記載されている。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、抗体という用語は、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＹＫＬ−４０、または関連する線維症マーカー抗原と特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体、および一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）のような、１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを最低限含む非天然に生じる抗体およびフラグメントも包含する。Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５））に記載されているように、このような非天然に生じる抗体を、固相ペプチド合成を用いて構築するか、組換え的に生産するか、または例えば可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１０８】
様々な有用な抗α２−ＭＧ、抗ＨＡ、抗ＴＩＭＰ−１、および抗ＹＫＬ−４０モノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体が当該技術分野で周知であり、多くの場合、市販されている。例えば、α２−マクログロブリンに対する比濁分析アッセイは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（キット番号４４９４３０）から入手可能であり、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングに適した親和性精製ヤギ抗ヒトα２−ＭＧ抗体およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトα２−ＭＧ抗体は、例えばＣｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＬ２００１０ＡＰおよびＣＬ２００１０ＡＰＨＰ）ならびにＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＧＡＡ２Ｍ−ＡＰおよびＧＡＡ２Ｍ−ＡＰＨＲＰ）から入手可能である。同様に、親和性精製ヒツジ抗ＨＡ抗血清をＢｉｏｔｒｅｎｄ（番号５０２９−９９９０）から得ることができる。
【０１０９】
抗ヒトＴＩＭＰ−１抗体も、様々な商業的供給源から容易に入手できる。例えば、抗ヒトＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体１４７−６Ｄ１１は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング分析に適しており、Ｍｅｄｉｃｏｒｐ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）から得ることができ、さらに例えばウエスタンブロッティングまたはサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで使用するための抗ヒトＴＩＭＰ−１モノクローナル抗体ＭＡＢ９７０は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手できる。サンドイッチＥＬＩＳＡによってＴＩＭＰ−１を検出するために、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のビオチン標識抗ヒトＴＩＭＰ−１抗体（ＢＡＦ９７０）とＭＡＢ９７０を組み合わせることもできる。さらに、例えばウエスタンブロッティングに適し、かつ化学発光検出を向上させるウサギ抗ヒトＴＩＭＰ−１多クローン抗血清およびマウス抗ヒトモノクローナル抗体を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．（ＲＤＩ−ＴＩＭＰ１ａｂｒおよびＲＤＩ−ＴＩＭＰ１−Ｃ１）から得ることができる。
【０１１０】
（活性に対するアッセイ）
上記で論じたように、α２−ＭＧ、ＨＡ、またはＴＩＭＰ−１を検出するために、あるいはα２−ＭＧ、ＨＡ、もしくはＴＩＭＰ−１のレベル、または別の線維症マーカーのレベルを測定するために、線維症マーカーの活性にもとづくアッセイが有用であることから、本発明の方法でも有用である。例えば、本発明の方法では、試料中のα２−ＭＧの検出またはα２−ＭＧのレベルの測定のために、α２−ＭＧ活性に対する様々なアッセイが有用である。α２−ＭＧ結合プロテアーゼは、阻害されたタンパク質分解活性を示すが、少量の基質のアミドおよびエステル結合を加水分解する能力を保有するので、アミド分解活性を阻害することなしに、トリプシン、スブチリシン、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、サーモライシン、もしくはパパイン活性、または別の標的プロテアーゼの活性の阻害をアッセイすることによって、α２−ＭＧを検出することができ、またレベルを測定することができる。標的プロテアーゼ活性の阻害をアッセイするために、標識カゼインまたは標識フィブリンのような基質が有用である。さらに、その広範なプロテアーゼ基質特異性にもとづいて、例えば１４Ｃ−カゼインおよび１２５Ｉ−フィブリンを用いて、２つ以上の標的プロテアーゼの活性の阻害をアッセイすることによって、α２−ＭＧのレベルを測定することができる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、上掲、１９９９）。抗体または高分子量阻害剤から結合プロテアーゼを防護するα２−ＭＧの能力にもとづいても、α２−ＭＧを検出することができ、またα２−ＭＧのレベルを測定することができる。例えばトリプシンと、その後トリプシン阻害剤と試料を反応させた後、アミドＢＡρＮＡ等の低分子質量基質を用いて、残存するトリプシン活性をアッセイする（Ｇａｎｒｏｔ、上掲、１９６６；およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇら、上掲、１９８５）。トリプシン阻害剤で処理した後のトリプシン活性は、α２−ＭＧの指標である。α２−ＭＧ活性に対するこれらのアッセイおよび他の周知のアッセイは、本発明の方法で有用である。
【０１１１】
同様に、ＴＩＭＰ−１活性に対するアッセイが当該技術分野で周知である。具体的には、例えばリバースゼラチンザイモグラフィーを用いて、マトリックスメタロプロテアーゼのプロテアーゼ活性を阻害する能力をアッセイする。ゼラチナーゼＡ等のゼラチナーゼを、ゼラチン基質を有するゲルミックスに含ませることによって、リバースゼラチンザイモグラフィーを実行する。ゼラチナーゼの簡便な供給源として、仔ハムスター腎臓細胞由来の馴化培地等、馴化培地を用いることができる。血漿試料を電気泳動し、得られたパターンを、例えばヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）のスキャナーを用いた走査による計数化により分析する。ＴＩＭＰ−１活性は、ゼラチン分解の減少として観測される。例えばＫｏｓｓａｋｏｗｓｋａら（上掲、１９９８）を参照せよ。当業者には、ＴＩＭＰ−１活性に対するこれらのアッセイおよび他のルーチンのアッセイが本発明の方法で有用であることが認識される。
【０１１２】
（付加的なマーカー）
必要に応じて、任意の付加的なマーカーをアッセイせずに、または任意の他の臨床もしくは超音波検査特性を評価せずに、３種類のマーカーα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出することによって、本発明の方法を実施できることは明瞭である。さらに、１つ以上の付加的な線維症マーカーアッセイまたは１つ以上の臨床もしくは超音波検査の変数の評価と組み合わせて、これらの３種類のアッセイを１つのパネルとして用いることができる。特定の実施形態では、本発明は、試料中のα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１を検出することと、少なくとも１つの以下のマーカー：ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、またはアポＢも検出することによって、個体の肝線維症の存在または重症度を診断する方法を提供する。一実施形態では、肝線維症の存在または重症度を診断するための本発明の方法は、試料中のα２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、およびＹＫＬ−４０を検出する工程を含む。さらなる実施形態では、本発明の方法は、α２−ＭＧ、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、およびＹＫＬ−４０を検出することに限定され、付加的な線維症マーカーは検出されない。
【０１１３】
上記の観点から、線維症の１つ以上の付加的な生化学的または血清学的マーカーに対するアッセイあるいは線維症に関連する１つ以上の臨床変数または超音波検査変数の評価は、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出と組み合わせて、肝線維症の存在または重症度を診断できることは明瞭である。付加的な生化学的および血清学的マーカーの例としては、限定はされないが、ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢが挙げられる。本発明で有用な付加的な生化学的および血清学的マーカーとしては、制限はなく、コラーゲンタイプＩのようなコラーゲンと、フィブロネクチンと、ビトロネクチンと、エンドセリンと、ウンジュリンと、セレクチン、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、および細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）のような接着分子と、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のような炎症誘発性サイトカインと、偽コリンエステラーゼと、マンガンスーパーオキシドジスムターゼと、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧ）と、グルタチオンペルオキシダーゼと、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）と、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）と、ＰＤＧＦ受容体と、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）と、誘導型一酸化窒素合成酵素と、ニトロチロシンと、ビリルビンと、フェリチンおよびα−フェトプロテインと、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）と、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）と、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）と、ＡＳＴ／ＡＬＴ比と、アルブミンと、γ−グロブリンと、βγ−ブロックと、プロトロンビン指数と、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアと、ＰＧＡ指数（プロトロンビン時間、ＧＧＴ濃度、およびアポＡ１濃度）と、ＰＧＡＡ指数（α２−マクロブリンレベルを用いたＰＧＡスコア）と、ヘモグロビンと、平均赤血球容積と、リンパ球数と、コレステロールと、尿と、クレアチニンと、ナトリウムと、血小板数とが挙げられる。
【０１１４】
臨床または超音波検査変数も本発明の方法で有用な線維症「マーカー」であり得る。したがって、１つ以上の臨床または超音波検査変数の分析を、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出と組み合わせて、肝線維症の存在または重症度、あるいは本明細書中上述したような別の線維症障害を診断できる。例としては、このような臨床変数は、患者年齢または性別、手掌紅斑の存在、デュピュイトラン拘縮、ばち状指、クモ状母斑、硬化した肝臓、脾腫、あるいは側副循環とすることができる。本発明の方法で有用な超音波検査変数としては、例えば肝臓の長さ（右腎）、不均整な肝臓表面、肝臓の不均質性、脾臓の長さ、腹水、または側副循環が挙げられる。例えばＯｂｅｒｔｉら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１１３：１６０９−１６１６（１９９７））を参照せよ。これらの、かつ他の周知の臨床または超音波検査変数の分析が本発明の方法で有用であることが理解される。さらに、本発明の方法は、例えば肝臓の触診のような臨床または超音波検査変数の測定を包含し、あるいは１つ以上の歴史的な、または従来測定された臨床もしくは超音波検査変数に依拠することができる。
【０１１５】
本発明で有用な生化学的または血清学的マーカーを検出するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、多くの場合市販されている。このようなアッセイとしては、限定はされないが、ＲＴ−ＰＣＲのような増幅を利用した方法およびＲＮＡレベルの定量分析に対する他の方法と、ラジオイムノアッセイ、酵素結合アッセイ、二抗体サンドイッチアッセイ、および定量的ウエスタン分析のようなイムノアッセイと、酵素活性のような生物学的活性に対するアッセイとが挙げられる。ＰＩＩＩＮＰ、ラミニン、テネイシン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＹＫＬ−４０、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９／ＴＩＭＰ−１複合体、ｓＦａｓリガンド、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−１０、アポＡ１、アポＡ２、およびアポＢに対するアッセイは、表１に概説するように様々な供給源から市販されている。
【０１１６】
本発明の方法で、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１の検出と組み合わせることができる付加的な生化学的または血清学的マーカーに対するアッセイも当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手できる比濁分析アッセイにより、フィブロネクチンを簡便にアッセイできる。べーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）から入手できる標準的手法を用いて、偽コリンエステラーゼ（ＰＣＨＥ）をアッセイできる。Ｃｏｒｔｅｃｓ診断から入手できるキットを用いて、酵素活性をアッセイすることによって、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧ）のレベルを測定できる。例えばＢｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍから入手できるキットを用いたＥＬＩＳＡによって、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（Ｍｎ−ＳＯＤ）レベルを簡便に測定できる。例えばＲａｎｄｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ、ＣＡ）から入手できるキットを用いて、酵素活性をアッセイすることによって、グルタチオンペルオキシダーゼレベルを測定できる。
【０１１７】
【表１】
2005519271.tif 000002
Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ試薬とともに、Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１７  Ａｕｔｏｍａｔｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等の自動分析装置を用いて、総ビリルビンまたは直接ビリルビン、ＧＧＴ、ＡＳＴ、およびＡＬＴレベルを測定することができる。Ｄｏｕｍａｓら（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３１：８７−９６（１９７１））に記載されているように、例えばブロモクレゾールグリーン法によって、アルブミンレベルを測定でき、例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒから入手できるイムノアッセイを用いて、フェリチンおよびα−フェトプロテインレベルを簡便に測定できる。さらに、例えばオートマティックシステム（Ｈｙｄｒａｓｙｓ  ａｎｄ  Ｈｙｒｙｓ、Ｓｅｂｉａ；  Ｉｓｓｙ−Ｌｅｓ−Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）での血清タンパク質の電気泳動によって、α１グロブリン、α２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリンのレベルを測定することができる。プロトロンビン活性を測定する方法も当該技術分野で周知であり、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｋａ（Ｗｅｓｔ  Ｏｒａｎｇｅ、ＮＪ）から入手できる凝固方法を含む。Ｐｏｙｎａｒｄら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １００：１３９７−１４０２（１９９１））に記載されているようにＰＧＡ指数を測定でき、Ｎａｖｅａｕら（Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ．  ３９：２４２６−２４３２（１９９４））に記載されているような周知の方法により、ＰＧＡＡ指数も測定できる。
【０１１８】
様々な手法により、例えばＢａｙｅｒ−Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ｈ２分析器（Ｂａｙｅｒ−Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を用いて、血小板数、リンパ球数、平均赤血球容積、および関連する変数を測定できる。例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒから入手できる標準的手法によりコレステロールレベルを測定できる。したがって、上記のものを含むが、限定はされない様々な手法が当該分野で周知であり、本発明の診断方法で有用であることが当業者には明瞭である。
【０１１９】
（α２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０パネル）
本発明は、試料中のα２−ＭＧを検出することと、試料中のＨＡを検出することと、試料中のＹＫＬ−４０を検出することと、α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＹＫＬ−４０の有無またはレベルにもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法も提供する。本発明の方法は、例えば中程度から重度（Ｆ２〜Ｆ４）の肝線維症から、非または軽度（Ｆ０〜Ｆ１）の肝線維症を区別するのに有用であり得る。
【０１２０】
一実施形態では、本発明は、個体から得た試料中のα２−ＭＧタンパク質のレベルを測定することと、個体から得た試料中のＨＡのレベルを測定することと、個体から得た試料中のＹＫＬ−４０タンパク質のレベルを測定することと、α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＹＫＬ−４０タンパク質のレベルにもとづいて、個体の肝線維症の有無または重症度を診断することとにより、個体の肝線維症の有無または重症度を診断する方法を提供する。必要に応じて、酵素結合アッセイを用いて、α２−ＭＧタンパク質、ＨＡ、およびＹＫＬ−４０タンパク質のレベルをそれぞれ測定することができる。
【０１２１】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、試料中の線維症マーカーＹＫＬ−４０のレベルを測定することに部分的に依拠する診断方法を提供する。ＹＫＬ−４０は、ヒト軟骨糖タンパク質３９（ＨＣ  ｇｐ−３９）としても知られており、４０ｋＤａの分子量と、タンパク質のアミノ末端配列チロシン・リシン・ロイシン（ＹＫＬ）にちなんで名づけられている。キチナーゼファミリー（１８−糖質加水分解酵素）の哺乳類メンバーであるこの糖たんぱく質は、へパリンおよびキチンに結合するレクチンであり、軟骨細胞、滑膜細胞、活性化されたマクロファージ、好中球、およびＭＧ−６３骨肉腫細胞により産生される（Ｈａｋａｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２５８０３−１５８１０（１９９３）；ＮｙｉｒｋｏｓおよびＧｏｌｄｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８：２６５−２６８（１９９０）；Ｒｅｎｋｅｍａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：５０４−５０９（１９９８）；Ｖｏｌｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １１０：３５１−３６０（１９９８）；ならびにＪｏｈａｎｓｅｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．  ７：５０１−５１１（１９９２）。正常組織および患部組織中のＹＫＬ−４０の発現パターンは、この糖タンパク質が細胞外マトリックスリモデリングまたは組織炎症で機能することができることを示している（ＮｙｉｒｋｏｓおよびＧｏｌｄｓ、上掲、１９９０；Ｒｅｎｋｅｍａら、上掲、１９９８；ならびにＶｅｒｈｅｉｊｄｅｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４０：１１１５−１１２５（１９９７））。さらに、ＹＫＬ−４０ｍＲＮＡを肝臓中で発現されており、初期の研究により、ＹＫＬ−４０の発現は、慢性的な肝疾患の患者中で増加することと、増加した血清ＹＫＬ−４０は、線維症および繊維形成に関連する可能性があることとが示された（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ３２：５８２−５９０（１９９７）；およびＪｏｈａｎｓｅｎ、Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ３２：９１１−９２０（２０００））。
【０１２２】
血清および関節液のような試料中のＹＫＬ−４０のレベルを測定する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＹＫＬ−４０に対して作製したウサギ抗体に基づいたＹＫＬ−４０に対するラジオイムノアッセイについては、Ｊｏｈａｎｓｅｎら（Ｂｒ．  Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ３２：９４９−９５５（１９９３））に記載されている。さらに、マイクロリットルストリップウエルフォーマットでのサンドイッチ酵素イムノアッセイは、Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。Ｍｅｔｒａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓアッセイでは、ビオチン結合モノクローナル抗ＹＫＬ−４０抗体のＦａｂフラグメントは、ストリップ上のストレプトアビジンに結合し、試料中のＹＫＬ−４０を捕獲する。アルカリホスファターゼ結合ポリクローナル抗ＹＫＬ−４０抗血清を、捕獲されたＹＫＬ−４０抗原に結合させ、ＹＫＬ−４０濃度の指標としてｐ−ニトロフェニルリン酸基質を用いて、アルカリホスファターゼの活性を検出する。ＹＫＬ−４０ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを検出または測定するために、これらのアッセイまたは他の通常のアッセイを用いて、本発明の方法を実施できることが理解される。
【０１２３】
以下の実施例は、説明を目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１２４】
（実施例Ｉ）
（肝線維症の非侵襲性診断用マーカーパネル）
この実施例により、ＨＣＶに感染された患者で、線維症段階Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４を段階Ｆ０およびＦ１から区別するのに有用なパネルとしていくつかの血清学的マーカーを組み合わせることができることを証明する。
【０１２５】
ＲＮＡおよび免疫分析によりＣ型肝炎ウイルスに対して陽性であり、かつアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの増加を有する１９４人のＨＣＶ患者から得た血清試料を既存の血清ライブラリーから無作為に選択した。各患者は、治療の一環として肝生検を受けた。患者試料を選択して、他の通常の血液マーカーの比較およびＨＣＶウイルス量を含む通常の医療に伴う身体的検査結果の比較を可能した。
【０１２６】
研究の組み入れ基準（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）は、患者が１）肝生検および血清抽出時に確認したＣ型肝炎感染を有すること、２）研究から独立した医療の一環として肝生検を受けたこと、および３）あらかじめインフォームドコンセントを行ったことである。インフォームドコンセントを行わなかった患者または拘留されていた患者は研究から除外した。
【０１２７】
フランスのメタビル（Ｍｅｔａｖｉｒ）共同研究グループ（Ｔｈｅ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｅｔａｖｉｒ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ）（Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２０：１５−２０（１９９４））に説明される基準にしたがって、治療に先立って、針生検標本の組織病理学的検査により１９４人の患者に関する線維症スコア（Ｍｅｔａｖｉｒ段階）を確立した。全てのＭｅｔａｖｉｒ線維症スコアは、同病理学者により確立された。全ての分析に関して、Ｆ０およびＦ１のＭｅｔａｖｉｒスコアを「非／軽度」の線維症としてまとめて分類し、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４のスコアを「中程度／重度」の線維症としてまとめて分類した。表２に示すように、グループ中のＦ２〜Ｆ４スコアの比率にもとづいて、１９４名の患者グループでの線維症羅患率の測定結果は６０％であった。
【０１２８】
【表２】
2005519271.tif 000003
上記の表に示すように、ＨＣＶ患者試料のパネルは、非常に高度の線維症段階（Ｆ４）を有する３７の試料と、非常に低度または全く無い線維症段階（Ｆ０）を有する患者から得た３９の試料と、線維症段階Ｆ１、Ｆ２、またはＦ３を有する患者から得た１５８の試料とを含む。
【０１２９】
ラミニン、ＹＫＬ−４０、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＰＩＩＩＮＰ、ＩＶ型コラーゲン、およびα２−ＭＧを含む複数の推定線維症マーカーの存在に関して血清試料をアッセイした。市販のキットを用いて、製造元の指示に従いアッセイを実行した（表３を参照せよ）。ラミニン、ＹＫＬ−４０、ＨＡ、ＴＩＭＰ−１、ＰＩＩＩＮＰ、ＩＶ型コラーゲン、およびα２−ＭＧに対して分析された１９４の試料に関して得られた結果を表４に示す。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
【表４−１】
2005519271.tif 000005
【０１３２】
【表４−２】
2005519271.tif 000006
【０１３３】
【表４−３】
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【０１３４】
【表４−４】
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【０１３５】
【表４−５】
2005519271.tif 000009
【０１３６】
【表４−６】
2005519271.tif 000010
【０１３７】
【表４−７】
2005519271.tif 000011
【０１３８】
【表４−８】
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【０１３９】
【表４−９】
2005519271.tif 000013
【０１４０】
【表４−１０】
2005519271.tif 000014
【０１４１】
【表４−１１】
2005519271.tif 000015
【０１４２】
【表４−１２】
2005519271.tif 000016
【０１４３】
【表４−１３】
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【０１４４】
【表４−１４】
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非／軽度の線維症（Ｆ０〜Ｆ１）から著明な線維症（Ｆ２〜Ｆ４）の存在を区別することができる最善のマーカーの組み合わせに関して、様々な統系学的アルゴリズムを用いて臨床成果のパラメーターを分析した。分析した統計学的アルゴリズムとしては、一変量分析、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）、ロジスティック回帰、判別関数分析、および要因配置実験最適化が挙げられる。
【０１４５】
ＲＯＣ分析の結果を表５に示す。曲線下面積（ＡＵＣ）値は、指定されたカットオフでの単一マーカーの相対的な診断値を表す。ＡＵＣ値の減少により見出されるように、指定されたカットオフで単独で用いられるとき、ＨＡは、最高の診断値を持つことが示され、ＰＩＩＩＮＰ、ＴＩＭＰ−１、α２−ＭＧ、およびＩＶ型コラーゲンがそれに続いた。
【０１４６】
【表５】
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線維症マーカーの様々な組み合わせに関する臨床成果のパラメーターを表６に示す。Ｆ２〜Ｆ４からＦ０〜Ｆ１を区別するための２から４つのマーカーとアルゴリズムの組み合わせと同様に、単一マーカーを含む最善のサブセットがロジスティック回帰により生じた。マーカーには、ＰＩＩＩＮＰ、α２−ＭＧ、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンが含まれた。図５に示すように、診断成果パラメーター（感度、特異度、ＰＰＶ、およびＮＰＶ）は、約６０％の線維症羅患率を有する調査母集団でのロジスティック回帰により同定された２つ、３つ、および４つのマーカーの組み合わせに関して同様であった（２〜４行目および６〜９行目を参照せよ）。
【０１４７】
表６の５行目に示すように、ステップワイズ判別関数分析（ＳＡＳ）により、３つのマーカーサブセット（ＰＩＩＩＮＰ、α２−ＭＧ、およびラミニン）が同定された。この組み合わせの臨床成果は、ロジスティック回帰を用いて同定されたマーカーの組み合わせと同様であった。
【０１４８】
実験計画ソフトウェア（ＤＯＥ  ＫＩＳＳ、Ｂｕｉｌｄ  ８、Ａｉｒ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて、複数の変数のカットオフを同時に最適化し、線維症を予測する際の試験パネルの最善成果を得た。ＤＯＥ  ＫＩＳＳを用いて、マーカーの組み合わせに関してコンピューター支援の中心複合計画が生じた。この計画行列は、組み合わせでのマーカーのそれぞれに対するカットオフの一連の組み合わせからなる。Ｆ２〜Ｆ４線維症からＦ０〜Ｆ１を区別するためのこれらの実験から得た結果（感度、特異度、および正確度）がＤＯＥの計画用紙に記録された。パラメーター（感度、特異度、および正確度）のそれぞれに対して回帰分析を実行し、組み合わせでの各変数に関するカットオフ値が得られ、パラメーターに対する最大成果を達成した。
【０１４９】
ＲＯＣ分析で最善の診断成果を有する５つのマーカー（最大ＡＵＣ）は、ＨＡ、ＰＩＩＩＮＰ、ＴＩＭＰ−１、α２−ＭＧ、およびＩＶ型コラーゲンであった（表５を参照せよ）。この５つのマーカーパネルでの各マーカーのカットオフを最大正確度に対して最適化した。表６の１０行目に示す結果により、最適正確度（６９．６％）では、特異度（３２．９％）は低すぎるため有効ではなかった一方で、感度（９４．８％）は高かったことが示される。感度または特異度に対してマーカーを最適化した際、同様の結果が得られた。回帰分析により、ＴＩＭＰ−１は、この５つのマーカーパネルでの正確度、感度、または特異度に関して十分な効果を持たないことが示された。
【０１５０】
表６の１１行目に示すように、ＤＯＥにより類似の４つのマーカーパネルを同様に分析した。ＴＩＭＰ−１を除外して、正確度（７７．８％）に対して４つのマーカーパネルを最適化して、感度および特異度は、それぞれ７９．１％および７９．５％で得られた。これらの結果により、Ｆ２〜Ｆ４線維症からＦ０〜Ｆ１線維症を区別する際、ＨＡ、ＰＩＩＩＮＰ、α２−ＭＧ、コラーゲンＩＶ、およびＴＩＭＰ−１で構成される５つのマーカーパネルよりもＨＡ、ＰＩＩＩＮＰ、α２−ＭＧ、およびコラーゲンＩＶの４つのマーカーパネルのほうが有効であることが実証された。
【０１５１】
４つのマーカーパネルのうちのいくつかの３つのマーカーサブセットについてもＤＯＥによって分析した。１２行目は、ＨＡ、コラーゲン、およびα２−ＭＧの組み合わせに関して得られた結果を示しており、この結果は正確度に対して最適化したものである。この３つのマーカーパネルにより、３０％に満たない非常に低い特異度が与えられた。それに対して、ＨＡ、ＰＩＩＩＮＰ、およびα２−ＭＧで構成される３つのマーカーパネルを正確度に対して最適化すると、成果は４つのマーカーパネルと同様であった（表６の１３行目と１１行目とを比較せよ）。
【０１５２】
ＨＡおよびα２−ＭＧの２つのマーカーパネルの同様の分析によって、表６の１４行目に示す結果が得られた。この組み合わせでは、ＨＡ、ＰＩＩＩＮＰ、およびα２−ＭＧの３つのマーカーパネルを超える特異度の向上が得られた（７８．３％と比べて８４．４％）。
【０１５３】
【表６−１】
2005519271.tif 000020
【０１５４】
【表６−２】
2005519271.tif 000021
一変量分析で線維症の良好な判別子となることが観察されたＴＩＭＰ−１を２つのマーカーパネルに付加した。１５行目に示すように、ＨＡ、α２−ＭＧ、およびＴＩＭＰ−１の３つマーカーパネルの成果は、２つのマーカーパネルを用いて得られたものと同様であり、３つのマーカーパネルのＨＡ／ＰＩＩＩＮＰ／α２−ＭＧパネルと比べて、感度が向上された（７８．３％と比べて８３．５％の感度）。さらに、予備的回帰試験では、ＴＩＭＰ−１は、重度の線維症の高羅患率を有する調査母集団で、線維症の判別に著しく寄与した。
【０１５５】
Ｆ２〜Ｆ４の線維症からＦ０〜Ｆ１を区別する際の正確度に対して、ＨＡ、α２−ＭＧ、およびＹＫＬ−４０で構成される別の３つのマーカーパネルも最適化した。表６の１６行目に示すように、この３つのマーカーパネルは、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１パネルと同様の成果を有していた。
【０１５６】
以上のことから、これらの結果は、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１またはα２−ＭＧ／ＨＡ／ＹＫＬ−４０パネルがＦ２〜Ｆ４線維症からＦ０〜Ｆ１を区別するのに有用であり得ることを示している。
【０１５７】
（実施例ＩＩ）
（α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰの３つのマーカーパネルの分析に対する二重最適化戦略）
この実施例により、α２−ＭＧ−、ＨＡ−、およびＴＩＭＰ−１に関する複数のカットオフを使用して、アッセイされた全患者母集団のサブセットで、相対的に高度の正確度が達成されることを説明する。
【０１５８】
α２−ＭＧ、ＨＡ−、およびＴＩＭＰ−１セットのカットオフがそれぞれ３５ｎｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、および１，０００ｎｇ／ｍｌである３つのマーカーパネルα２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１を用いて、試料は、それらの変数の３つ全てがカットオフ値を超えると陽性であり、α２−ＭＧ、ＨＡ、またはＴＩＭＰ−１レベルの１つ以上が指定カットオフ値より下であると陰性であるということが確定された。表７に示すように、１９４人の患者母集団で、総数で７２の陰性結果があり、そのうち１５は偽陰性であった。このことから、約６０％の線維症％値の研究羅患率で、７９％の陰性予測値（ＮＰＶ）が与えられた。肝臓学臨床で典型的な羅患率である３０％の羅患率では、陰性予測値は９２％を超えており、これはＦ２〜Ｆ４の線維症の存在を除外するのに有効である（尤度比０．２２）。
【０１５９】
さらに、３５ｎｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、および１，０００ｎｇ／ｍｌカットオフを用いた１２２の試験陽性のうち、試験陽性の２１は偽であり、８２．８％の陽性予測値（ＰＰＶ）が与えられた。しかし、より典型的な羅患率である３０％の線維症では、陽性予測値は約５８％に落ちる（表７を参照せよ）。したがって、典型的な羅患率を有する母集団では、陽性結果は、診断として有効である十分な予測値を有してはいないことになるだろう。
【０１６０】
全患者母集団の少なくとも１つのサブセットに関して陽性予測値を高めるために、第１のセットより高いカットオフ値である第２のセットを用いて、第１分析により陽性であった試料を３つのマーカーの陽性に関してさらに評価した。第１分析後に陽性であったそれらの試料をより高いカットオフで評価することによって、このグループ内の重度の線維症試料は、相対的に高い的中率で陽性であると確定され得る。第２の評価により試験陰性であったそれらの試料は、それらの線維症状態が良好な的中率で測定されえなかったという点で「未確定」とみなされる。
【０１６１】
【表７−１】
2005519271.tif 000022
【０１６２】
【表７−２】
2005519271.tif 000023
【０１６３】
【表７−３】
2005519271.tif 000024
【０１６４】
【表７−４】
2005519271.tif 000025
【０１６５】
【表７−５】
2005519271.tif 000026
表７は、二重最適化戦略を用いたα２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１パネルアッセイの成果を示す。第１のカットオフを２．０ｍｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、および１，０００ｎｇ／ｍｌに設定して、第１の分析で相対的に高い感度を達成した。指定カットオフ値を超えるα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１レベルの３つ全てを有する任意の試料は、陽性であると示された。α２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１カットオフとして２．０ｍｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、および１，５７５ｎｇ／ｍｌを用い、かつ試料が陽性であるためには指定カットオフ値を超えるα２−ＭＧ、ＨＡ、およびＴＩＭＰ−１値を有していなければならないという基準を用いて、第１の分析により得た１２２の試験陽性を再評価した。
【０１６６】
カットオフ値の第２のセットを用いて、１２２人の患者のうち５４人が陽性であると確定され、そのうち１人のみが偽陽性であった。５９．８％の線維症羅患率では、陽性予測値は９８．２％であり、より典型的な３０％の線維症羅患率では９３．９％であった。以上のことから、１９４人の患者のうち、７２人が陰性として分類され、５４人が陽性として分類された一方で、６８の試料は未確定の結果であり、確定的に分類され得なかった。さらに、未確定試料を除外すると、３つのマーカーアッセイは、３０％の線維症羅患率を有する典型的な母集団で、９３％を超える陽性予測値と、９３％に近い陰性予測値とを有する。
【０１６７】
表８は、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１の３つのマーカーパネルと、Ｐｏｙｎａｒｄら（Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１０６９（２００１））に記載される６つのマーカーパネルとの成果の比較を示す。
【０１６８】
【表８】
2005519271.tif 000027
これらの結果により、α２−ＭＧ／ＨＡ／ＴＩＭＰ−１の３つのマーカーパネルは、非常に優れた正確度で、Ｆ２〜Ｆ４の線維症からＦ０〜Ｆ１の線維症を区別するのに有用であり得ることが示される。これらの結果によりさらに、組み合わせ線維症マーカーアッセイは、非常に優れた正確度で試験された患者の一部の線維症状態を測定するのに有用であり得る一方で、残りの患者は生検の候補者であることが示される。
【０１６９】
（実施例ＩＩＩ）
（α２−マクログロブリン、ヒアルロン酸、およびメタロプロテイナーゼ−１組織阻害剤に対するアッセイ）
Ａ．ヒトα２−マクログロブリン（α２−ＭＧ）の定量
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ（登録商標）３６０  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、以下のようにヒトα２−マクログロブリンの血清レベルを定量し、０．７５〜２７０ｍｇ／ｍｌの範囲のα２−ＭＧレベルを測定した。
【０１７０】
α２−ＭＧ濃度の測定用にＢｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ（登録商標）３６０  ｓｙｓｔｅｍを用いた。このシステムは、ヒトα２−ＭＧに対する抗体と、試料中のα２−ＭＧ抗原との間の免疫沈降反応により生じる光散乱形成速度を測定する比濁計を利用する。フローセル中の溶液に光線が透過された後、溶液中に懸濁された不溶性複合体の形成された巨大分子粒子により散乱された光の強度が比濁計により検出および測定される。抗原−抗体反応より生じた光散乱の増加は、試料中のα２−ＭＧ濃度に比例してピーク速度シグナルに変換される。得られた複合体形成および結果として生じた散乱光の強度の変化は、初めは緩慢に、その後急激に増加し、最終的には分析される成分に対する変化のピーク速度まで進行する割合で生じる。
【０１７１】
ＮＣＣＬＳの出版物Ｈ  １８−Ａに示されるように、絶食している個体から血清試料を抽出し、回収時間から２時間以内に細胞から概ね物理的に分離した。７２時間以内にアッセイされなかった試料は、−１５℃ないし−２０℃で冷凍保存した。冷凍された試料は、多くて１度解凍した。著しく溶血しているか、非常に脂肪血性であるか、または濁っている標本を、この後の分析用には不合格とした。
【０１７２】
４℃で、貯蔵から試薬を取り出して直ちに使用した。緩衝液および希釈液を完全に転倒混和した後、機器に添加した。１：３６に希釈された試料を用いて、製造元の指示に従いセットアップ、プライミング、およびキャリブレーションを実行した。該して、希釈していない試料または１：６の希釈度のような比較的濃厚な試料を避けた。アッセイをする前に、著しく脂肪血性の試料を、希釈剤を用いて１：２で希釈した。反応溶液中の無関係な光散乱シグナルを引き起こす塵埃粒子または他の粒子物質を避けた。試料をアッセイする前に、使い捨てホールピペットまたはピペットチップを用いて泡を吸引することによって、試料カップおよび試薬びん中の全ての気泡または泡を除去した。作業領域中のＤＴＴを避けた。  
【０１７３】
以下のように、α２−ＭＧ濃度に関して試料を分析した。機器上の試薬ホイール（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｗｈｅｅｌ）（左側ホイール）のスペース番号２中にＡＭＧ抗血清を装填した。希釈セグメントに、扇形セグメントの広い側のウエル中の対照または試料の１５０μＬを装填した。セグメントおよび初期希釈対照／試料カップに、特定のため、印をつけた。対照および血清試料を装填する間、泡を避けた。
【０１７４】
ＶｉｇｉｌＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌ  １および３（３滴）をカップ１および３にそれぞれ入れた。Ｂｉｏｒａｄ  ＬｉｑｕｉｃｈｅｋＴＭ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌ  ２（１５０μＬ）をカップ２に入れた。患者試料（１５０μＬ）を一連のカップに添加した。セグメントをポジション番号１で始まる右側ホイール上に配置した。蒸発防止用カバーを試薬および試料ホイール上に配置した。
【０１７５】
Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎメニュー上で、ＲＥＳＵＬＴＳ  ＲＥＣＡＬＬ（Ｆ３）を選択した後に、（Ｆ４）ＣＬＲ  ＣＵＲ  ＲＵＮを選択した。ＭＡＳＴＥＲ  ＳＣＲＥＥＮに戻った後、ＳＡＭＰＬＥ  ＰＲＯＧＲＡＭ（Ｆ１）を選択した。試薬ホイール（Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｈｅｅｌ）番号１が現れたら、各カップ番号で、ＥＮＴＥＲを選択した。対照ＩＤまたは試料登録番号を入力した。テスト「２」を選択し、各カップに対してＳＡＶＥ  ＣＵＰ（Ｆ１）を選択した。ＳＴＡＲＴを選択し、分析を開始した。プログラム実行の最後で、ＣＬＥＡＲ  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＲＵＮ＆ＳＴＡＲＴ  ＮＥＸＴ  ＲＵＮに応じて（Ｙ）を選択した。
【０１７６】
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ（登録商標）３６０により、Ｐｒｏｓ  Ｓｙｓｔｅｍで、整数を用いたｍｇ／ｄｌで、結果がレポートされた。機器により試料を慣用どおりに１：３６に希釈した。７５０ｍｇ／ｄｌより大きい試料を、機器により１：２１６希釈度でアッセイした。１：３６希釈度で７５ｍｇ／ｄｌより小さい濃度を有する試料は、＜７５ｍｇ／ｄｌとしてレポートされる。初期希釈で、Ｂｅｃｋｍａｎ分析範囲は７５〜７５０ｍｇ／ｄｌであった一方で、拡大範囲は７５〜２７，０００ｍｇ／ｄｌであった。Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで証明されたように、正常個体に対する範囲は１０３〜２７４ｍｇ／ｄｌであった。
【０１７７】
品質管理を以下のように実行した。３つの対照レベルを用いた。すなわち低度、中度、および高度である。プログラム実行が２の標準偏差内の２つの対照と、２および３の標準偏差間の第３の対照とで許容された以外は、対照は２の標準偏差内であった。使用した対照は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｖｉｇｉｌ  ＩおよびＩＩＩならびにＢｉｏｒａｄ  Ｌｅｖｅｌ  ＩＩであった。各試料プログラム実行で、対照をアッセイした。
【０１７８】
１４日ごとと、試薬ロットに変化が生じるときまたは機器で大幅な変化が生じたときとに、アッセイをキャリブレーションする。適当な直線性物質を用いて、６ヶ月ごとに直線性を確認する。これは、期間中の一定した性能を確保するためおよび米国国家規格（Ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に従うために行われる。
【０１７９】
期間中の一貫性を確保するために、アッセイキャリブレーション検証を６ヶ月ごとに実行する。最小、中間、最大濃度を含む５つの検証試料の最小値を６ヶ月ごとに評価する。患者試料結果のレポートを出すためには、検証試料結果の変動係数（％ＣＶ）は１５％より少なくなければならない。
【０１８０】
Ｂ．ヒアルロン酸（ＨＡ）の定量
Ｃｏｒｇｅｎｉｘのヒアルロン酸（ＨＡ）定量試験キット（カタログ番号０２９００１）を用いて、本質的に以下のようにＨＡの血清レベルを測定した。
【０１８１】
血清試料を−７０℃で保存した。多数回の冷凍／解凍サイクルを避け、試料ごとの冷凍／解凍サイクルは最大で４回までとした。キットを２〜８℃で保存した。
【０１８２】
使用前に、キットおよび患者試料を室温（１８〜２８℃）に平衡にした。被覆されたストリップの袋も開封前に室温に平衡にした。３３×ＰＢＳ洗浄濃縮物を蒸留水で希釈し、最終溶液のｐＨをｐＨ７．３５＋／−０．１に調整することによって、洗浄溶液（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．３５＋／−０．１）を調製した。
【０１８３】
ブランク、標準品、対照、および試料全てを二連でアッセイした。各プレートには分光光度計のキャリブレーション用の水ブランクを備えておき、読み取りの直前に水を２００μｌ添加するまで空にしておいた。血清試料を含まない反応緩衝液を、０ｎｇ／ｍｌのＨＡ参照溶液を表す試薬ブランクとして用い、後のアッセイステップで、患者試料および参照溶液と同様に処理した。３つの既知の患者試料（低度、中度、および高度）に対して各アッセイを実行した。さらに、各キットで補充された５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＡ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＨＡ、２００ｎｇ／ｍｌ  ＨＡ、５００ｎｇ／ｍｌ  ＨＡ、および８００ｎｇ／ｍｌ  ＨＡの参照溶液を下記に記載するようにアッセイした。
【０１８４】
反応緩衝液２５０μｌに参照溶液または試料を２５μｌ添加して、ＨＡ参照溶液および患者試料を１：１１で希釈し、穏やかにボルテックスして混和した。希釈した参照液、試料、および対照を各ウエルに添加した（１００μｌずつ）。水ブランクは空のままにしておいた。プレートを覆い、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、ウエルの内容物を吸引によって除去した。プレートを１×洗浄溶液で４回洗浄し、洗浄の間プレートを乾かないようにした。最後の洗浄の後に、ペーパータオル上で、プレートを激しくブロットして、残存している緩衝液を除去した。
【０１８５】
ＨＲＰと結合させたＨＡ結合タンパク質溶液（１００μｌ）を水ブランク以外の全てのウエルに添加し、その後プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後に、プレートを上述のように４回洗浄した。その後、基質溶液（１００μｌ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素、安定化）を水ブランク以外の各ウエルに添加した。覆ったプレートを、その後室温で３０分間インキュベートした。プレートを暗所に放置した。
【０１８６】
８００ｎｇ／ｍｌのＨＡ標準品のＯＤ６５０を測定した。０．５００より少ないＯＤに関しては、基質のインキュベーションを続行し、ＯＤをモニターしてＯＤが０．５００に達したかどうかを測定した。０．５００より大きいＯＤまたは基質インキュベーションの１時間後のＯＤに関しては、ＯＤが０．５００に達していなかったとしても、停止液（０．３６Ｎ  硫酸）１００μｌを水ブランク以外の各ウエルに加えて反応を停止させた。基質溶液の添加と同様の順番で、かつほぼ同様の割合で停止液を添加した。光学密度を読み取る前に、蒸留水２００μｌを水ブランクに添加した。水ブランクに対してプレートリーダーを「ゼロにして」から１時間以内に各ウエルのＯＤを４５０ｎｍ（６５０ｎｍ参照）で読み取った。
【０１８７】
以下の基準を用いて、アッセイが信頼できるかどうかを判断した。試薬ブランク（ゼロ標準）の平均ＯＤ値は０．１０より下であった。０．１０より大きい読み取り値は、基質または試薬汚染の可能性を示唆しているものとして、これらの条件下で結果はレポートされなかった。５００ｎｇ／ｍｌのＨＡ参照液の平均ＯＤ値は０．８００以上であった。３つの既知の患者試料に対する対照は以下の範囲内であった。すなわち、低度対照は７８．６〜１１７．２ｎｇ／ｍｌであり、中度対照は１４８．５〜２１４．１ｎｇ／ｍｌであり、高度対照は２９７．８〜４６０．７ｎｇ／ｍｌであった。８００ｎｇ／ｍｌより大きいＨＡ濃度を有する試料をさらに希釈し、２回目のアッセイを行いより正確な結果を得た。
【０１８８】
Ｓｏｆｔｍａｘを用いて生じた４パラメーターの標準曲線から、既知の患者対照および試料が決定され、ｎｇ／ｍｌでレポートされた。患者値は、濃度が最も高い標準品の濃度を超えた場合レポートされなかった。１：１１希釈度での最も高い標準品の濃度より大きい患者値に対して、試料を１：５５希釈度でアッセイし、必要に応じて、より高い希釈度で行った。
【０１８９】
ＨＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを６ヶ月ごとに評価し、期間中の一定した性能を確保する。操作者に対する盲検法で、従来の既知のＨＡ値を有する５つの試料の最小値を評価する。アッセイ性能を許容可能なものにするため、陰性試料の結果は陰性と、陽性試料の結果は陽性とされなければならず、収率は、先に得られた値の１５％以内となる。２０％より多い検証試料が性能基準に達していない場合、トラブルシューティングを実行し、許容可能なアッセイ性能が再確立されるまで、患者データをレポートするためにはこのアッセイを使用しない。
【０１９０】
Ｃ．メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）の定量
Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のＢｉｏｔｒａｋＴＭ試験キット（カタログ番号ＲＰＮ２６１１）を用いて、本質的に以下のようにＴＩＭＰ−１の血清レベルを測定した。
【０１９１】
キット内容物を解凍し、２０〜２５℃に平衡にした。血清試料を−７０℃で冷凍保存した。試料の冷凍／解凍サイクルの繰り返しは最小にし、最大で６回の冷凍／解凍サイクルとした。
【０１９２】
アッセイ試薬を以下のように調製し、最大で７日間、２〜８℃で保存した。アッセイ緩衝液濃縮物に蒸留水を添加し、最終容積を１００ｍｌに調整して、アッセイ緩衝液１（０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．５）を調製した。
【０１９３】
本質的に以下のように、抗ＴＩＭＰ−１西洋わさびペルオキシダーゼ結合体をアッセイ緩衝液１中で調製した。凍結乾燥された結合体を含む保存びんに、希釈したアッセイ緩衝液１を１１ｍｌ添加した。激しく攪拌せずに、泡立たないようにしながら、完全に溶解するまで内容物を穏やかに混和した。洗浄緩衝液濃縮物に蒸留水を添加し、最終容積が５００ｍｌになるようにして、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７．５）を調製し、その後完全に混和した。
【０１９４】
１００ｎｇ／ｍｌのＴＩＭＰ−１保存溶液を以下のように調製し、２〜８℃で保存した。０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液０．１Ｍ（ｐＨ７．５）中で、凍結乾燥されたＴＩＭＰ−１標準品を再構築し、１００ｎｇ／ｍｌの標準ＴＩＭＰ−１保存溶液を作製した。激しく攪拌せずに、また泡立たないようにして、完全に溶解するまで内容物を穏やかに混和した。各アッセイ前に、１００ｎｇ／ｍｌ保存溶液の２倍連続希釈液を１．２ｍｌ希釈チューブ中のアッセイ緩衝液１に添加して、標準曲線用のさらなる標準品（１．５６５、３．１３、６．２５、１２．５、２５、および５０ｎｇ／ｍｌ）を新たに調製した。ゼロ標準品（ブランク）も調製した。
【０１９５】
マイクロタイタープレートを含む袋を、室温に平衡にした後開封した。全ての試料および標準品を二連でアッセイし、標準曲線用の標準品が各プレート上に存在した。各プレート上に、７つの標準品、２つの対照、および最大で異なる３９の試料が二連で存在した。
【０１９６】
５９５μｌアッセイ緩衝液１と５μｌ血清とを混和して、チューブ中で試料を１：１２０で希釈した。希釈液をボルテックスして混和した。マルチチャンネルピペッターを用いて、１００μｌのブランク、標準品、および希釈試料をマイクロタイタープレート上の個々のウエルに添加した。プレートを所定の蓋で覆い、厳密に２時間室温でインキュベートした。２時間インキュベーションした後、ウエルの内容物を吸引し、各ウエルを洗浄緩衝液で４回洗浄した。各洗浄後に、ウエルを完全に満たしてから吸引した。最終の洗浄後に、プレートをペーパータオル上でブロットして、残存する洗浄緩衝液を除去した。
【０１９７】
マルチチャンネルピペッターを用いて、ペルオキシダーゼ結合体（１００μｌ）を各ウエルに添加し、覆われたプレートを厳密に２時間室温でインキュベートした。インキュベーション後に、ウエルを吸引し、前と同様に洗浄した。インキュベーションを終了してすぐに、室温に平衡にしたＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン／過酸化水素を含む２０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド）１００μｌを各ウエルに添加した。プレートを覆い、厳密に３０分間室温でインキュベートした。一部の例では、反応を６３０ｎｍでモニターした。１Ｍ硫酸１００ｕｌを全てのウエルに添加して、反応を停止した。３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１９８】
Ｓｏｆｔｍａｘを用いて得られた標準曲線（４パラメーターの曲線フィット）を用いて、対照および患者試料値を決定した。標準曲線から得られた濃度値に希釈係数（１２０）をかけると実際の濃度が得られ、ｎｇ／ｍｌでレポートされた。既知の血清試料を用いて、アッセイの品質を確認した。低度対照は、６６８．１〜９７９．９ｎｇ／ｍｌの範囲であった。高度対照は、２６７７．９〜３３００．２ｎｇ／ｍｌの範囲であった。患者値は、概ね、最も高い標準品のｎｇ／ｍｌでの濃度を超えなかった。１：１２０の希釈度で、患者値が最も高い標準品の濃度より大きい場合、結果は、最も高い標準品の１２０倍濃度より大きいとしてレポートされた。
【０１９９】
ＴＩＭＰ−１  ＥＬＩＳＡアッセイを６ヶ月ごとに検証し、期間中の一定した性能を確保する。操作者に対する盲検法で、従来の既知値を有する５つの試料の最小値を評価する。陰性試料に関する結果は陰性でなければならない。陽性試料に関する結果は陽性でなければならず、収率は、先に得られた値の１５％以内にならなければいけない。２０％を超える検証試料が性能基準に達していないときは、トラブルシューティングを実行する。許容可能なアッセイ性能が再確立されるまでは、さらなる患者データをレポートしない。
【０２００】
括弧または他の方法で上記に提示される全ての刊行物の論文、参考文献、および特許引用は、先述されているかどうかに関らず、全文が本明細書中に参考として援用される。
【０２０１】
上記に提示した実施例を参照して本発明を説明したが、本発明の要旨から逸脱しない範囲で種々の変更が可能であることが理解されるべきである。したがって、本発明は請求項のみにより限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】図１は、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号Ｍ３６５０１から入手可能な成熟ヒトα２−マクログロブリンの核酸配列（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】図２は、ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号ＮＭ＿００３２５４から入手可能なヒトメタロプロテアーゼ−１組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）の核酸配列（配列番号３）および対応するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【配列表】
2005519271.tif 000028
2005519271.tif 000029
2005519271.tif 000030
2005519271.tif 000031
2005519271.tif 000032
2005519271.tif 000033
2005519271.tif 000034
【図１】
2005519271.tif 000035
2005519271.tif 000036
【図２】
2005519271.tif 000037
2005519271.tif 000038
【国際調査報告】
2005519271.tif 000039
2005519271.tif 000040
2005519271.tif 000041