(57)【要約】本発明は、哺乳動物、望ましくはヒト起源の未分化状態の体細胞腸内幹細胞/前駆細胞の分離、培養、および産生のための方法に関するものである。結果として得られた幹細胞/前駆細胞は、形態、生化学的特質、および多能性に関して、胚幹(ES)および多分化能を持つ前駆細胞の特質に類似する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化状態の体細胞腸内幹細胞または前駆細胞を分離および培養する、下記から成る方法:
(a)  哺乳動物起源の腸内上皮組織から取り出した腸内幹細胞または前駆細胞を分離すること;および
(b)  未分化状態における当該腸内幹細胞の成長を許容する培養条件下で、当該腸内幹細胞を支持細胞上で培養すること。
【請求項２】
請求項１の方法には、さらに下記が含まれる:
(c)  胚様体または胚様体類似体を形成するため、当該腸内幹細胞を培養すること。
【請求項３】
請求項１の方法には、さらに下記が含まれる:
(d)  未分化状態における当該胚様体または胚様体類似体の成長を許容する培養条件下で、当該胚様体または胚様体類似体を培養すること。
【請求項４】
ステップ(b)および(または)(d)における当該培養には、細胞分化を阻害する因子および(または)細胞から成る培養培地の使用が含まれる、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の任意の1つの方法であり、さらに下記を含む:
(e)  特定の細胞型への分化を許容する条件下で、当該腸内幹細胞または前駆細胞または当該胚様体または胚様体類似体を培養すること。
【請求項６】
腸内上皮組織がヒト起源である、請求項１〜５に記載の任意の1つの方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の任意の1つの方法で、ステップ(a)には下記が含まれる:
(a1)  胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肛門管および(または)虫垂から哺乳動物起源の上皮組織を得ること:
(a2)  平滑筋を除去すること(存在する場合):
(a3)  抗生物質を含む緩衝溶液中で残存組織を洗浄すること:および
(a4)  組織から取り出した腸内上皮細胞を機械的および(または)酵素処置によって除去すること。
【請求項８】
支持細胞が非ヒトまたはヒト哺乳動物の胚細胞、望ましくは胚線維芽細胞の細胞、またはヒト非胚線維芽細胞から選択されたから選択されたものである、請求項１〜７に記載の任意の1つの方法。
【請求項９】
因子が下記から選択されたものである、請求項４に記載の方法:
(i)  gp130を用いてヘテロ二量体化する能力のある受容体のサイトカインおよびリガンド:
(ii)  細胞内のcAMPレベルを上昇させる化合物:
(iii)  哺乳動物の成長因子:および
(iv)  その任意の組み合わせ。
【請求項１０】
ステップ(e)に腸内細胞とは異なる細胞型への分化が含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
細胞型が神経細胞、例えば脳または脊髄細胞、すい臓細胞、例えばインスリン分泌すい臓の細胞型、肝細胞、心臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、筋細胞、皮膚細胞、または有毛細胞から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腸内幹細胞が多能性細胞のための少なくとも1つのマーカーを発現する能力を持つ、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
多能性細胞のためのマーカーがアルカリホスファターゼ、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct-4、ネスチン、プロミニン(prominin)/AC133、Cdx1、Tcf-4、ビメンチン、およびその任意の組み合わせから選択された、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載の任意の1つの方法で、さらに下記を含む方法:
(f)  当該腸内幹細胞または胚様体または胚様体類似体を遺伝子修飾すること。
【請求項１５】
ステップ(f)に、調節領域の制御下でポリペプチド翻訳領域を包囲するポリヌクレオチドを含んだベクターを当該腸内幹細胞または胚様体または胚様体類似体導入することが含まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(f)に、細胞型特定の分化マーカーまたは治療上のポリヌクレオチドを当該腸内幹細胞または胚様体または胚様体類似体に導入することが含まれる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１３に記載の方法で、さらに下記を含む方法:
(g)  活性成分、例えばタンパク質のような薬剤的に活性成分を当該腸内幹細胞または胚様体または胚様体類似体に導入すること。
【請求項１８】
請求項１〜１７に記載の任意の1つの方法によって入手可能である、分離された未分化状態の腸内幹細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の幹細胞の培養。
【請求項２０】
細胞が胚様体または胚様体類似体を形成する、請求項１９に記載の培養。
【請求項２１】
多能性細胞のための少なくとも１つのマーカーを発現する能力を持つ、請求項１８〜２０に記載の任意の1つの細胞または細胞培養。
【請求項２２】
マーカーがアルカリホスファターゼ、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、Oct-4、ネスチン、プロミニン(prominin)/AC133、Cdx1、Tcf-4、ビメンチン、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２１に記載の細胞または細胞培養。
【請求項２３】
通常の核型を示す、請求項１８〜２２の任意の１項の細胞または細胞培養。
【請求項２４】
遺伝子操作された、培養請求項１８〜２３の任意の1項の細胞または細胞。
【請求項２５】
異種活性成分を含む、請求項１８〜２３の任意の1項の細胞または細胞培養。
【請求項２６】
請求項１８〜２４の任意の1項の細胞または細胞培養に由来する分化細胞。
【請求項２７】
すい臓細胞、神経細胞、例えば脳または脊髄細胞、肝細胞、心臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、筋細胞、皮膚細胞、または有毛細胞から選択された分化細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の個別細胞の培養。
【請求項２９】
請求項１８〜２８の任意の1項の細胞または細胞培養から成る医薬品組成物。
【請求項３０】
治療的使用のための請求項２９の組成物。
【請求項３１】
組織修復または細胞修復のための請求項２９または３０の組成物。
【請求項３２】
糖尿病の自己治療のための請求項２９〜３１の任意の1項の組成物。
【請求項３３】
心臓疾患の自己治療のための請求項２９〜３１の任意の1項の組成物。
【請求項３４】
ニューロン疾患の自己治療のための請求項２９〜３１の任意の1項の組成物。
【請求項３５】
移植のための請求項２９〜３４の任意の1項の組成物。
【請求項３６】
生物学的、化学的または薬理学的な薬剤に対する細胞応答を特徴づけるための請求項１８〜２８の任意の1項の細胞または細胞培養の使用法。
【請求項３７】
薬物ベースのスクリーニングアッセイにおける請求項３６の使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化状態の成体幹細胞の生体外分離および培養分野およびそのような細胞を産出する方法に関するものである。即ち、本発明は、哺乳動物、望ましくはヒトの腸から取り出した幹細胞の産生および遺伝的操作のための方法および組成物、そのような腸内幹細胞に由来する固有細胞の生成、組織代替のためのそれら細胞の治療的使用、および薬物スクリーニングアッセイにおけるそのような細胞の使用法に関するものである。
【０００２】
幹細胞は、自己複製およびさまざまな固有細胞型を作り出す能力を備えている、未分化状態または未成熟の細胞である。ひとたび分化または分化誘導された幹細胞を用いると、損傷した臓器や機能不全の臓器を修復することができる。幹細胞は、胚、胎児または成人から得ることができる。
【０００３】
胚幹細胞は、移植前胚(ES細胞)の内部細胞塊または生殖隆線原始生殖細胞において見出される移植後の胚(EG細胞)から取り出した内部細胞塊から分離することができ、また、除核卵母細胞への核伝達および胚盤胞発生・成長によっても生成することができる。撹拌培養または点滴のような特殊な培養条件で増殖するときには、ES細胞およびEG細胞は両方とも凝集して胚様体(EB)を形成する。EB(胚様体)は、胚形成期間中に存在する細胞に類似する、さまざまなタイプの細胞から構成されている。適切な培地において培養するときには、EBを用いることによって、胚体外の内胚葉、造血細胞、神経細胞およびグリア、心筋細胞、骨格筋細胞、すい臓細胞、肝臓細胞、内皮細胞、脂質細胞、軟骨細胞、骨細胞、および血管筋細胞のような生体外分化表現型を生成することができる。
【０００４】
分子レベルでは、ES細胞およびEG細胞は、これらの細胞未分化状態の様相高度に特異的ないくつかの遺伝子を発現する。転写因子Oct-4 (Pou5f1、Oct-3、Oct3/4とも呼ばれる)は、ES細胞の未分化状態の表現型の樹立および維持に必要とされることが証明されており、胚形成および細胞分化における初期イベントを決定する上で重要な役割を演ずる(Nicholsらの1998, Cell 95:379-391; Niwaらの2000, Nature Genet. 24:372-376)。Oct-4は、造血細胞、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、すい臓のβ細胞、および血管細胞のような固有細胞に分化・成長する幹細胞として下方制御される。時期特異的な胚抗原-1、-3、および-4 (SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4)は、受精後まもない初期胚の発生・成長およびES細胞のためのマーカーにおいて特異的に発現される糖タンパク質である(Solter およびKnowles, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5565-5569; Kannagiらの1983, EMBO J 2:2355-2361)。酵素アルカリホスファターゼ(AP)の上昇発現は、未分化状態の胚幹細胞に関連する別のマーカーである(Wobusらの1984, Exp. Cell 152:212-219; Peaseらの1990, Dev. Biol. 141:322-352)。他の幹/前駆細胞マーカーには、中間神経フィラメントのネスチン(Lendahl らの1990, Cell 60:585-595; Dahlstrand らの1992, J. Cell Sci. 103:589-597)、膜糖タンパク質プロミニン(prominin)/AC133 (Weigmann らの1997, Proc. Natl. Acad. 米国特許94:12425-12430; Corbeil らの1998, Blood 91:2625-22626)、転写因子Tcf-4 (Korinek らの1998, Nat. Genet. 19: 379-383; Lee らの1999, J. Biol. Chem. 274:1566-1572)、および転写因子Cdx1 (Duprey らの1988, Genes Dev. 2:1647-1654; Subramanian らの1998, Differentiation 64:11-18)などが含まれる。
【０００５】
幹細胞の治療上の可能性が十分に認識されている一方、ヒトES細胞およびEG細胞の使用には、これら細胞の分離および生成の際におけるヒト胚の破壊に関連する重要な倫理的かつ社会的な懸念が存在する。胚幹細胞に類似の特性を有する成体幹細胞の分離および増殖は、この倫理的なジレンマを克服するであろう。
【０００６】
高度な自己複製能力を有する成人(体細胞)幹細胞は、表皮(Jones & Wat, Cell 73 (1993), 713-724)、小腸の上皮層(Potten & Loeffler、Development 110 (1990)、1001-1020) 造血システム(Cross & Enver, Curr. Opin. Genet. Dev. 7 (1997), 609-613)のような一部の組織において確認されている。神経幹細胞活性および神経活性は、成人哺乳動物の脳の特定領域内で同定されている(Johansson らのCell 96 (1999), 25-34); Gage, Science 287 (2000), 1433-1438)。他の臓器における幹細胞の修復能力は低い(例えばすい臓、腎臓、脳)か、または同定されていない(例えば心臓)。ところが、成体幹細胞は数が少なく、多くの場合、同定および分離することが難しい。例えば、推定では、骨髄における10 000〜15 000にわずか1の割合の細胞が造血幹細胞である(Weissman, 2000, Cell 100:157-168を参照)。最も良く特徴づけられているのは、造血幹細胞である。これは、細胞表面マーカーおよび機能的特性を利用して精製された中胚葉由来の細胞である。骨髄、血液、臍帯血、胎児の肝臓および卵黄嚢から分離された造血幹細胞は、前駆細胞であるレシピエントの生命のために血球新生の再惹起を行い、複数の造血系統生成する( Fei, R., らの 米国特許番号5,635,387; McGlave, らの 米国特許番号5,460,964; Simmons, P., らの 米国特許番号5,677,136;1 5 Tsukamoto, らの 米国特許番号5,750,397; Schwartz, らの 米国特許番号759,793; DiGuisto, らの米国特許番号5,681,599; Tsukamoto, らの 米国特許番号5,716,827; Hill, B., らの Exp. Hernatol. (1996) 24 (8): 936-943を参照)。
【０００７】
また、成体幹細胞は、生物体の腸内組織内にも見出される。腸内上皮組織は、高度な修復性を持つ組織である。この組織は、4つの分化細胞型(腸細胞、杯状細胞、腸内分泌細胞およびパーネト細胞)から構成されている。絨毛の陰窩において見出される強力な幹細胞によって、上皮組織の全細胞集団の代替が5〜7日ごとに行われる(Clatworthy およびSubramanian, 2001, Mech. Develop. 101:3-9を参照)。腸内細胞の初代培養は上皮凝集体から樹立することができるが、現在、解離細胞から初代培養を樹立する方法は従来の技術では知られていない(例えば、Winton in Stem Cell Biology, D.R. Marshak らのCold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, 550ppを参照)。さらには、当分野で現在利用可能な方法では、別の組織細胞への分化を行う能力のある未分化状態の腸内幹細胞分離および培養を可能にする条件を樹立することができない。
【０００８】
本発明は、哺乳動物、望ましくはヒト起源の未分化状態の体細胞腸内幹(IS)細胞の分離、培養、および産生を行う方法を提供する。IS細胞は、十二指腸、胃、回腸、空腸、または大腸の上皮組織から取り出すことが可能である。具体的には、本発明は、腸内上皮組織の多分化能を持つ幹細胞または前駆細胞の分離、培養、および産生方法を提供する(IE; 本発明における用語「腸内幹細胞(IS)」には、IE由来の細胞のほかに腸内組織の肝細胞も含まれる)。これらの細胞は、種々の細胞および組織型への分化を行う能力を維持する一方、未分化状態または前駆体様状態における細胞の長期的培養を可能にする条件下で培養される。結果として得られたIS細胞は、形態学、生化学的特質に関して胚幹(ES)細胞の特性に似ており、そして多能性における特性にも似ている。
【０００９】
本発明の目的は、ES細胞または多分化能を持つ前駆体様特質を示す、ヒトまたは哺乳動物IS細胞株を産出するための方法を提供することである。本発明の別の目的は、ヒトまたは哺乳動物の多能性IS細胞株を一般的に提供することの他に、IS細胞由来の分化によって作り出された細胞株を提供することでもある。本発明のさらなる実施例では、本発明のIS細胞を用いて、遺伝子操作された細胞、細胞株、または組織が提供されている。本発明の別の実施例では、移植または治療のためのIS細胞または制限発生系統のIS由来の幹細胞を提供することである。本発明のさらに別の実施例では、細胞ベースの薬物スクリーニングアッセイにおける生物学的、化学的、または薬理学的な薬剤に対する細胞応答の特徴づけのためのIS細胞またはIS由来の細胞が提供されている。
【００１０】
本方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１１】
本明細書および請求の範囲で使用された単数形の表記は、文脈から明らかに単数であることが示されている場合を除いては複数も含めて言及されていることに注意しなくてはならない。つまり、例えば、「細胞」には複数の細胞またはその細胞に由来する細胞株が含まれており、「試薬」には複数のそのような異なる試薬が含まれており、「方法」には、本明細書中で記載された方法に適用または代用できる、当業者に公知の等価なステップおよび方法が含まれている。
【００１２】
本発明の根底にある技術的問題は、腸内上皮から取り出した成人体細胞幹(前駆体)細胞の分離、培養、および分化のための方法を提供することである。別の本発明の根底にある技術的問題は、Oct-4およびアルカリホスファターゼ遺伝子のような、特定のマーカーの発現のようなES細胞様の特性および特性を示す未分化状態の腸内幹細胞を得ることである。さらに別の問題としては、腸内上皮または腸内組織から取り出したネスチン陽性の幹細胞のIS分離、増殖、および分化が挙げられる。さらに別の技術的問題は、治療的使用のために、腸内幹細胞をさまざまな種類の細胞型へ分化誘引することである。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例によって達成する。
【００１３】
従って、本発明は、下記から成るES細胞様の特性および特質を示す腸内幹細胞または前駆細胞を得るための方法に関するものである。
【００１４】
(a)  哺乳動物起源、望ましくはヒトの腸内上皮組織から取り出した1つ以上の幹細胞を分離する特性および特質;
(b)  ヒトまたは他の哺乳動物起源の腸内幹細胞または前駆細胞を支持細胞上および培養条件において培養し、未分化の多分化能を持つ状態における成長を許容する特性および特質;
(c)  胚様体または胚様体類似体を形成するために、随意的に当該IS細胞、特にIE由来の多分化能を持つ幹細胞または前駆細胞を培養する特性および特質;
(d)  随意的に培地中のIS由来の胚様体または胚様体類似体を培養し、分化を阻害する因子または細胞を追加することによって未分化状態の幹細胞の成長を許容する特性および特質:および
(e)  随意的に特定の分化培地中のIS細胞由来の胚様体または胚様体類似体を培養し、特定の細胞型への分化を許容する特性および特質。
【００１５】
一実施例では、本発明は、ES細胞様の特性および特質を示す体細胞=ヒトまたは他の哺乳動物の腸内幹細胞または前駆細胞を産出する方法を提供する。出発材料は、例えば、限定するものではないが、膵十二指腸切除(「Whipple手順」としても知られている)、ルーワイ法、胃切除、胃切除術、腹腔鏡検査/腹腔鏡検査のルーワイ法胃バイパス、小腸内視鏡検査、内視鏡治療、または他の外科的処置などの外科的技術によって得た、ヒトまたは他の哺乳動物の腸内組織である。これらの方法当分野で詳細に記載されている;例えば、Sivak, ed., "Gastroenterologic Endoscopy", 2nd Edition, W.B. Saunders Co. 2000, 1611pp; Jamieson and Debas ed., "Surgery of the upper gastrointestinal tract", Lippincott Williams and Wilkins publisher, 1994, 618ppを参照。さらには、ヒトまたは哺乳動物起源の腸内組織は、 死亡したドナーから得ることもできる。この材料は、胎児、新生児、子供、または成人から得ることが可能である。
【００１６】
腸内組織は、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、例えば上行結腸、横行結腸、下行結腸、S状結腸、直腸、肛門管、および(または)虫垂の一部を構成することができる。平滑筋を腸内組織から機械的に除去または切開し、残存する組織は、抗生物質を含む好適な緩衝溶液で数回洗浄する。本発明を実施するための溶液の例としては、0,01〜0,1μg/ml、望ましくは0,05μg/mlのストレプトマイシン(Gibco社/BRL社);0,01〜0,1単位/ml、望ましくは0,05単位/mlのペニシリン(Gibco社/BRL社);10〜100μg/ml、望ましくは50μg/mlのゲンタマイシン(Gibco社/BRL社);1〜100μg/ml、望ましくは2,5μg/mlのアンフォテリシン(Gibco社/BRL社);1〜100mg/ml、望ましくは2mg/mlのシプロベイ(Bayer社)を含むハンクスの平衡塩基溶液(Gibco社/BRL社)が挙げられる。さらに抗生物質としては、例えば、限定するものではないが、バンコマイシン、メトロニダゾール、およびフルコナゾールなどを製造メーカーの推奨に従って加えることができる。次に、腸内組織の細胞を組織の機械的な擦過後、酵素溶液中における解離によって除去する。本発明を実施するための溶液の実施例としては、アキュターゼ(PAA Laboratories社)のような非酵素的な分離溶液中での15〜30分間、または10〜200単位/ml、望ましくは75単位/mlのコラゲナーゼ1型(Sigma社)、および0.01〜10単位/ml、望ましくは0,02単位/mlのディスパーゼ (Gibco社/BRL社)を含む溶液中での30〜60分間の腸内組織の温浸が挙げられる。
【００１７】
細胞をペレット化するための短時間の遠心分離後、腸内細胞をプレーティングし、100 μ g/mlのマイトマイシンCを用いて3時間処理することによって事前に不活化したマウス胚線維芽細胞の支持細胞のような好適な支持細胞、望ましくはヒトまたは非ヒト哺乳動物の胚細胞を含むペトリ皿中で培養する。胚支持細胞の調製方法は当分野で詳細に記載されている; 例えば、Joyner, "Gene Targeting: A Practical Approach", Oxford University Press, New York, 1993; Mansouri "Gene Targeting by Homologous Recombination in Embryonic Stem Cell", Cell Biology: A Laboratory Handbook, second ed., Academic Press, 1998; Wobus らの1984, (前出),  Wobus らの"In Vitro Differentiation of Embryonic Stem Cells and Analysis of Cellular Phenotypes" in: Methods in Molecular Biology: Gene Knockout Protocols, Tymms and  Kola Eds, vol. 158, Humana Press Inc. 2001を参照。或いは、腸内細胞は、市販のマウス胚線維芽細胞のSTO細胞株(ATCC CRL 1503; ATCC 56-X)上、またはヒト胎児の支持細胞層培養上で培養することができる(Richards らのNature Biotechn online, Aug 5, 2002を参照)。
【００１８】
腸内幹(IS)細胞は、望ましくは胚線維芽細胞の支持細胞上で適切な培養培地中において培養する。用語’培養培地’とは、未分化状態の状態にとどまるIS細胞の成長を支持する能力を持つ好適な培地を指す。本発明を実施するための好適な培養培地の実施例は、ダルベッコ改良Eagle培地(DMEM、Life Technologies社)をベースに調製し、15%の熱失活した胎児の子ウシ血清(FCS、Gibco社);500μM〜1mM望ましくは0.1mMの非必須アミノ酸;500μM〜1mM望ましくは0.1mMのβ-メルカプトエタノール;1mM〜10mM望ましくは2mMのグルタミン;500μM〜1mM望ましくは0.1mMのナトリウムピルビン酸;100単位/mlのペニシリン;100μg/mlのストレプトマイシンで補充する。また、DMEMの代わりにDMEMのイスコーブの変法も使用することができる(IMDM、Life Technologies社)。
【００１９】
次に、因子の有効量を加える。本明細書中で使用した用語「有効量」とは、細胞培養分野の当業者には周知の判断を適用することによって、および本明細書中で提供した内容によって、成長の有益な効果およびIS細胞の生存を可能にする本明細書に記載の因子の量のことである。そのような因子は、独立または組み合わせて使用することができる。
【００２０】
最初のタイプの因子は、糖タンパク質130(gp130)と呼ばれる信号伝達分子とヘテロ二量体化することができる受容体のリガンドであるサイトカインおよび因子である。例えば、限定するものではないが、1ng/ml〜1μg、望ましくは10ng/mlの白血病抑制因子(抑制因子;ES細胞分化を防止する成長因子)、または1ng/ml〜100μg/ml、望ましくは50ng/mlのハイパーインターロイキン-6(Fischer らの1997, Nature Biotech. 15:142-145)、インターロイキン-6/可溶インターロイキン-6受容体またはサイトカインのIL-6ファミリーの他のメンバーである。
【００２１】
第2のタイプの因子は細胞内のcAMPレベル上昇させる因子である。例えば、限定するものではないが、1μM〜100μM、望ましくは10μMのフォルスコリン(Sigma社);1μM〜100μM、望ましくは10のμMコレラ毒素、500μM〜10mM、望ましくは0,1mMのイソブチルメチルキサンチンである。
【００２２】
第3タイプの因子は、哺乳動物、例えばヒト起源の成長因子である。例えば、限定するものではないが、1ng/ml〜100μg/ml、望ましくは500ng/mlの基本的な線維芽細胞成長因子(bFGF);1ng/ml〜100μg/ml、望ましくは20ng/mlの上皮成長因子(EGF)である。
【００２３】
腸内上皮由来の幹細胞または前駆前駆細胞を始めとした腸内幹(IS)細胞は、未分化状態の多能性状態において培養することができ、なおも、種々の細胞および組織型へ分化される能力を保持する、ヒトまたは哺乳動物起源の多能性細胞である。本発明によると、用語「多能性」および「多能性細胞」は、膵島細胞およびインスリン産生β細胞、または肝細胞を始めとした、筋細胞、心臓細胞、神経細胞、グリア細胞、上皮細胞、腸内細胞、腎臓細胞、骨細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、すい臓細胞のようなすべての3つの主要原始細胞層(内胚葉、中胚葉、外胚葉)または細胞系譜の広範囲の細胞に分化するための発生能力を維持する細胞を指す。本明細書における用語「成人」および「成体幹細胞」は、細胞から分離された胚を説明する際に使用する用語「胚」、および「胚幹細胞」と対比して、胎児、新生児、子供または成人の生物体に見出される細胞を説明するために使用する。ヒトにおいて、胚は、受精時から胎児となる妊娠8週間の終わりまでのものとして定義する。また、本明細書中における用語「細胞」または「複数形の細胞」は、個々の細胞、細胞株またはそれらの細胞に由来する培養を指す。
【００２４】
本発明の別の実施例は、胚、および当業者に公知の方法によって容易に検査できる、より高度に分化した細胞型に分化する能力を始めとした生体外または生体内でさまざまな種類の細胞型に分化するためのヒトまたは哺乳動物起源のIS細胞の能力である。また、本発明に示したように、腸から分離されたIE由来の幹細胞/前駆細胞によって、例えば、限定するものではないが、脳、脊髄、すい臓、肝臓、および心臓(例えば図2を参照)、また肺、腎臓、骨格筋、平滑筋、皮膚、または毛髪のような別の組織から分化細胞型を生成することもできる。発明者らは本発明において、IS細胞には多能性細胞に対して少なくとも1つのマーカーを発現する能力があることを明らかにした。例えば、成人腸内の上皮組織からの多分化能を持つネスチン陽性の前駆細胞集団は増殖することができ、生体内においてインスリン分泌すい臓細胞型、神経細胞型、間葉細胞型、中胚葉細胞型および肝細胞型を始めとしたさまざまな体細胞の細胞型に成長することができる。
【００２５】
別の実施例において、IS細胞は、アルカリホスファターゼ(AP)の存在に対して陽染する。別の実施例において、IS細胞は、転写因子Oct-4を発現する。また別の実施例において、IS細胞は、中間神経フィラメントタンパク質ネスチンを発現する。また別の実施例において、IS細胞は、SSEA-1、SSEA-3および(または)SSEA-4のような特定の細胞表面抗原を発現する。また別の実施例において、IS細胞は、プロミニン(prominin)/AC133、Cdx1および/またはTcf-4を発現する。さらに、本細胞は、上記のマーカーの任意の組み合わせを発現する。
【００２６】
本発明のさらに別の実施例においては、胚様体または胚様体類似体を形成するために、マウス胚線維芽細胞の支持細胞層上でIS細胞を培養することによってIS細胞を分離および同定することができる。用語「胚様体」または「胚様体類似体」は、ES細胞から生成された「胚様体」に形態学的に類似することがわかっている、細胞構造の凝集塊を指す。ES細胞由来の胚様体は、ES細胞から構成されている細胞凝集体であり、すべての3つの胚原始細胞層(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)からの組織を含み得る。例えば、IS細胞は、1単位/ml〜1000単位/ml、望ましくは56単位/mlのコラゲナーゼ1型(Sigma社)、および1単位/ml〜1000単位/ml、望ましくは4単位/mlのディスパーゼ(Gibco社/BRL社)(室温にて)を用いて10〜60分間当該細胞を温浸し、15%FCS;500μM〜1mM、望ましくは0.1μMの非必須アミノ酸;500μM〜1mM望ましくは0.1mMのβ-メルカプトエタノール;1mM〜10mM、望ましくは2mMのグルタミン;500μM〜1mM、望ましくは0.1mMのナトリウムピルビン酸;10単位/ml〜10000単位/ml、望ましくは1000単位/ml抑制因子;1ng〜100μgbFGF;1μMおよび100μM、望ましくは10μMのフォルスコリン(Sigma社);100単位/mlのペニシリン;100μg/mlのストレプトマイシンで補充したDMEMを含む細菌培養用のプレートに移すことによって解離することができる。IS細胞を、37℃にて5%のCO2を用いて、2〜10日間インキュベートする。
【００２７】
或いは、胚様体を懸滴方法によって生成することができる。400〜800、望ましくは600の解離したIS細胞を、20μlのイスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco社)の点滴で培養し、リン酸緩衝の生理食塩水(PBS)を満たしたペトリ皿の蓋上に置いた20%のFCS、L-グルタミン、非必須アミノ酸および450μMのα-モノチオグリセロールで補充する。胚様体を、5%CO2を用いて懸滴で2〜5日間、37℃にて培養してから、次に、細菌培養用のペトリ皿(Greiner社、ドイツ)に移し、さらに3日間、懸濁培養液中でインキュベートする。5日間後、胚様体をゼラチン被覆の24-ウェルプレート、ペトリ皿または他の好適な培養容器の上にプレーティングし、さらに15〜35日間、37℃にて、5%のCO2を用いて分化培地中で培養する。
【００２８】
また、IS由来の胚様体を、限定するものではないが、10μg/cm2のコラーゲン1型(Becton Dickinson Biosciences社)、0,1%のゼラチン(Fluka社)、10μg/cm2のFibronectin (Life Technologies社)、14μg/cm2のポリ-L-オルニチン(Sigma社)、または141.5ng/cm2のラミニン(Sigma社)のような細胞外の基質を含むペトリ皿上にプレーティングすることもできる。
【００２９】
また、胚様体は、撹拌培養において産生することもできる。例えば、解離したIS細胞を、107細胞/mlの密度で、100培養培地を含む250mlのシリコン処理したスピナフラスコ(Life Technologies社)中において播種することができる。24時間後、250mlの最終容量になるまで、150mlの培養培地を加える。スピナフラスコを、20rpmにて、攪拌装置(IntegrBiosciences社)を用いて攪拌する。該方法は当技術分野で周知であり、必要以上の実験無しに、工業製造用にスケールアップすることができる。(Wobusらの"In Vitro Differentiation of Embryonic Stem Cells and Analysis of Cellular Phenotypes" in: Methods in Molecular Biology: Gene Knockout Protocols, Tymms and  Kola Eds, vol. 158, Humana Press Inc. 2001, およびFriend, J.R.らの: (1999) "Formation and characterization of hepatocyte spheroids", In: Morgan, J.R. and Yarmush, M.L. (eds.) Methods in Mol. Med., vol. 18: Tissue engineering methods and protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJを参照)。
【００３０】
用語「分化培地」は、神経細胞またはすい臓のベータ細胞または肝細胞のような、IS細胞の特定の細胞型への分化を促進する培養培地を表す。肝細胞の分化を支持する分化培地の実施例は、20 % FCS、BSA-FAF、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インシュリン、アスコルビン酸、hEGF、ゲンタマイシン、アンホテリシンで補充された、HBM基底培地(Clonetics Bio Whittaker社)である。肝細胞分化を支持する培地の別の実施例は、20 %のFCS、100 ng/mlのα-FGF (Sigma社)、20 ng/mlのHGF、10 ng/mlのオンコスタチンM (Sigma社)、10-7 Mのデキサメサゾン(Sigma社)、5 ng/mlのインシュリン(Sigma社)、5 mg/mlのトランスフェリン (Gibco社/BRL社)、および5 μg/mlの亜セレン酸塩ナトリウム(Sigma社)で補充されたイスコーブベースの培地である。
【００３１】
IS細胞の神経前駆細胞または神経細胞およびグリアへの分化を促進する培地の実施例は、25 μg/mlのインシュリン、50 μg/mlのトランスフェリン、30 nMの亜セレン酸ナトリウム、1 μg/mlのラミニン (Sigma社)、20 nMのプロゲステロン (Sigma社)、100 μMのプトレッシン(Sigma社)、100単位/mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプトマイシン、20 ng/mlのEGF、および10 ng/mlのbFGFで補充された、DMEM / F12 (1:1比、Sigma社)ベースの培地である。或いは、2%のB27サプリメント(Gibco社/BRL社)、および10 nMのニコチンアミド(Sigma社)を培地に加えて、 すい臓細胞を生成することができる( Lumelsky らの2001, Science 292:1389-1394を参照)。神経細胞およびグリアの分化を促進する培地の別の実施例は、2%のB 27 サプリメント、10%のFCS、1 μg/mlのラミニン、および200 μMのアスコルビン酸(Roth社)、および従来の技術に記載されたような生存促進因子(Rolletschekらによる2001, Mech. Dev. 105:93-104を参照)を補充した、神経細胞培養用基礎培地(Gibco-BRL社)に基づいている。IS細胞の神経細胞およびグリアを始めとしたさまざまな種類の細胞への分化を促進する培地のさらに別の実施例は、5 %のFCS、ヒドロコルチゾン、ヒトβ-線維芽細胞成長因子(FGF)、ヒト血管内皮成長因子(v EGF)、R(3)-インスリン様成長因子、アスコルビン酸、ヒトEGF、ヘパリン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシンで補充した、EBMの基底培地(Clonetics社)である。
【００３２】
インスリン産生細胞、およびすい臓細胞の分化を促進する培地の実施例は、20%のFCS、2 mMのL-グルタミン、1:100比の非必須アミノ酸および450 μMのα-モノチオグリセロール(Sigma社)で補充した、イスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco-BRL社)に基づいている。加えて、そのような培地には、1 ng/ml〜100 μg/ml、望ましくは10 ng/mlのEGF; 1ng/ml〜100 μg/ml、望ましくは2 ng/mlの基本的な線維芽細胞の成長因子(bFGF); 1 nM〜1 mM、望ましくは20 nMのプロゲステロン; 10 ng/ml〜100 μg/ml、望ましくは100 ng/mlの成長ホルモン; 1 nM〜100 μM、望ましくは5 nMのフォリスタチン(R&D); 1〜100 mM、望ましくは2 nMのアクチビン(R&D); またはニコチンアミドを10 nM〜100 mM、望ましくは10 mMを含むことができる。
【００３３】
心筋細胞または骨格筋細胞のような中胚葉細胞を支持する培地の実施例は、20%のFCS、2 ng/mlのTGF β1（Strathmann Biotech社)、50 ng/mlのbFGF、10〜100 ng/mlのBMP2または他のBMP (Genetics Institute社)、20 ng/mlのアクチビン(R&D Systems社)で補充した、イスコーブのMDM (IMDM; Gibco-BRL社)に基づく。また、レチノイン酸 (Wobus らの1997, J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 1525-1539を参照)、アクチビン、またはスラミンのような化学的分化誘発剤を用いると、心筋細胞の分化を促進することができる。
【００３４】
本発明の一実施例においては、ポリペプチド翻訳領域、例えばcDNA、または調節領域の制御下に置かれ、転写の開始を許容し、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性の、DEAEデキストランなどのような形質移入方法により、IS細胞に導入される遺伝子を包囲するポリヌクレオチドから成る発現ベクターを用いることにより、IS細胞を遺伝子操作することができる。そのような方法およびシステムは当分野で詳細に記載されている(例えば、Joyner, "Gene Targeting: A Practical Approach", Oxford University Press, New York, 1993; Mansouri "Gene Targeting by Homologous Recombination in Embryonic Stem Cell", Cell Biology: A Laboratory Handbook, second ed., Academic Press, 1998を参照)。用語「ポリヌクレオチド」は、DNAに転写されるゲノムDNA、cDNA、またはRNA配列の任意の一片を意味する。所定のポリヌクレオチドは、転写または翻訳調節エレメントのような調節エレメントに機能的に結合している。調節エレメントには、例えばプロモーター、開始コドン、終止コドン、mRNA安定性調節エレメント、およびポリアデニル化信号が含まれる。ポリヌクレオチドの発現は、(i) サイトメガロウイルス(CMV) プロモーター/エンハンサー領域のような構成型プロモーター、(ii) インシュリンプロモーター(Soria らの2000, Diabetes 49:157を参照)、神経前駆細胞のためのSOX2遺伝子プロモーター(Li らの1998, Curr. Biol. 8:971-4を参照)、神経細胞のためのMsi-1プロモーター(Sakakibara らの1997, J. Neuroscience 17:8300-8312を参照)、cardiomycte選択のためのα-噴門ミオシン重鎖プロモーターまたはヒト心房性ナトリウム利尿因子プロモーター(Klug らの1996, J. clin. Invest 98:216-24; Wu らの1989, J. Biol. Chem. 264:6472-79)のような組織特定のプロモーター、または (iii) テトラサイクリン誘導型システムのような誘導型プロモーターよって保証される。
【００３５】
別の実施例においては、対象の核酸配列を、発現ベクターのようなベクターに挿入することができる(前出のSambrook らを参照)。また、発現ベクターには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシン耐性遺伝子のような、抗生物質耐性を授与する選択薬剤またはマーカー遺伝子を含むことができる。その選択には、混合分化した細胞集団の抗生物質との接触が含まれ、その所望の細胞株の細胞に対して当該株特異の遺伝子の発現によって耐性が付与されており、それによって他の細胞株の細胞は除去されるが、特定の遺伝子を発現する所望の細胞株の細胞は除去されない。
【００３６】
また、発現ベクターには、IS細胞の特定細胞型または特殊な特性をIS細胞に授与する核酸(遺伝子)への分化を促進する遺伝子を含むことができる。例えば、すい臓の遺伝子をIS細胞に導入して、そのような細胞のインスリン産生細胞への分化を促進することができる。用語「すい臓遺伝子」は、すい臓の発生・成長、より望ましくはβ細胞分化に関連しかつ必要とされる遺伝子またはそのタンパク質の生成物を意味する。そのような遺伝子の特定の例証は、ヒトまたは動物起源のPdx1、Pax-4、Pax-6、ニューロゲニン3 (ngn3)、Nkx6.1、Nkx6.2、Nkx2.2、HB9、β2/ニューロD、Isl1、HNF1-α、HNF1-β、およびHNF3 である。そのような遺伝子によってコードされたポリペプチドは、幹細胞または前駆細胞(相同性)と同一種からのポリペプチドであっても、または異なる種(異種)からのポリペプチドであってもよい。各遺伝子は、独立または組み合わせで使用することができる。転写制御因子(例、Pdx1、Pax-4、Pax-6、ngn3、またはNkx2.2)をコードする遺伝子の導入によって、前駆細胞のより効果的な増殖および分化が提供され、そのような細胞の生体外培養中または生体内の細胞移植後の生存度が高められる。
【００３７】
好適な遺伝子発現ベクターは当技術分野で周知である。Sambrook らの "Molecular Cloning, A laboratory Manual" third ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 2000; Gossen and Bujard, 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551を参照。これらには、限定されるものではないが、非ウイルス性のベクターまたはプラスミドのようなまたはコスミドDNA発現ベクターおよびウィルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴のウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスベクター)が含まれる。
【００３８】
細胞を生体外で培養し、形質移入または他の方法によって異種核酸をコードする外来性遺伝子を細胞に導入する。次に、形質移入された細胞を、生体外で検討するか、または患者または他の被験体に投与する。
【００３９】
対象の特定構成物には、所望のタンパク質の遺伝子発現を阻止するか、または優性阻害の突然変異体の発現を構成するアンチセンス分子が含まれる。所望の遺伝子の発現の上方制御が表現型における変化の容易な検出を結果としてもたらす場合には、例えばlac-Zのような検出可能なマーカーを導入することが可能である。
【００４０】
さらなる実施例では、所望の遺伝子のタンパク質生成物は、直接的にIS細胞に送達できる。例えば、タンパク質の送達は、ポリカチオンリポソーム(Sells らの1995 Biotechniques 19:72-76を参照)、Tat（ウイルス発現促進因子）媒介タンパク質伝達 (Fawell らの1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664-668を参照)によって達成でき、タンパク質をB型肝炎ウィルスのプレS2ドメインからの細胞透過性モチーフに融合することによっても達成できる(Oess およびHildt (2000) Gene Ther. 7:750-758を参照)。細菌、酵母菌または原核細胞からの該タンパク質の調製(調合)、産生および精製は、当業者に公知のものである。
【００４１】
本発明の別の実施例は疾病を治療する方法であり、ここではこれらの細胞を含む幹細胞または前駆細胞または個別細胞または組成物を患者に投与する。分化した細胞型にはさまざまな体細胞細胞型、望ましくは、すい臓(インスリン産生細胞を含む)のニューロン、間葉、中胚葉および肝細胞型が含まれる。疾患としては、例えば、限定するものではないが、糖尿病、ニューロン疾患、肝臓疾患、または心臓疾患などが挙げられる。
【００４２】
さらに本発明の実施例は、移植療法による上記の病気または疾患の治療方法を提供する。この実施例では、当該被験体における分化したIS細胞を導入することによって、ヒト被験体の損傷組織または欠損細胞を修復する方法を提供する。本発明に記載された培養方法に従って細胞を分化した後、細胞または膵島を、グルコースの有無に拘わらず、薬剤的に許容できるキャリア、例えば、細胞培養培地リン酸緩衝食塩水、クレブスリンガー緩衝液、またはハンクス平衡塩類溶液中で懸濁する。分化したIS細胞は、局部注入または全身投与によって被験体の身体に導入することが可能である。本発明を実施するにあたってそのような溶液の実施例は、糖尿病の自己治療のためのインスリン産生細胞に分化したIS細胞の使用法である。被験体に投与細胞懸濁液の量は、被験体サイズ、疾病の重症度、および着床部位および溶液中の細胞量を始めとしたいくつかのパラメータによるが、さまざまに変動する。典型的には、被験体に投与する細胞の量は、治療学的に有効な量であろう。例えば、体重1キログラム当たり3,000〜100,000等価な生存IS細胞由来のインスリン産生細胞を糖尿病患者に導入して有益な効果を得る。
【００４３】
IS細胞から分化したインスリン産生細胞は、当業者に公知の任意の方法によって投与することができる。例えば、その細胞は、皮下注射、または局部麻酔を用いて、経皮的かつ経肝臓的なアプローチを介して門脈内に投与する。そのような外科的技術は当技術分野で周知であり、必要以上の実験無しに実施できるものである。例えば、Pyzd列ski らの1992, New England J. Medicine 327:220-226; Hering らの1993, Transplantation Proc. 26:570-571; Shapiro らの2000, New England J. Medicine 343:230-238を参照.。さらには、細胞を、肝臓の門脈を介して腎臓のカプセルの下に移植することにより投与するか、または脾臓中に投与する。また、細胞を直接的に被験体に対して投与することもできる。他の実施例においては、当技術分野で周知の生物学的に適合な基質を用いて、例えば補助インキュベーションなどにより、投与に先行して細胞をカプセル化する。従来の技術においては、いくつかの封入技術が記載されている。例えば、Lanza らの1996, Nature Biotech 14:1107-1111, Lacy らの1991, Science 254:1782-84, Sullivan らの1991, Science 252:718-712を参照。核酸配列を導入して、移植した組織の拒絶反応の確率を下げることができる。例えば、細胞の免疫原性は、宿主によって異物として認識されるタンパク質を産生する遺伝子の除去によって抑制することが可能であり、または、宿主の免疫系によって自己タンパク質として認識される天然の宿主のタンパク質のようなタンパク質を産生する遺伝子を導入することによって抑制することも可能である。
【００４４】
他の実施例は、数ある中で、限定するものではないが、心筋炎、心筋症、心臓麻痺、心臓発作による損傷、アテローム性動脈硬化症、および心臓弁の機能障害を始めとした心臓疾患を治療するためのIS細胞分化の心筋細胞の使用法である(Orlic らの2001, Nature 410: 701-705を参照)。
【００４５】
他の実施例は、数ある中で、限定するものではないが、急性および慢性肝不全、肝臓疾患(例えば、アルコールが原因の、ウィルス感染、代謝障害、薬物、または代謝の先天異常(例えばHemorhomatosis、A. Wilson))、望ましくは上記移植療法による、肝臓線維症、肝臓肝硬変、自己免疫疾病、胆管および胆嚢の疾患を始めとした肝臓疾患を治療するためのIS細胞分化の肝細胞の使用法である。
【００４６】
神経細胞に分化したIS細胞を用いると、数ある中で、限定するものではないが、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病 (Freed らの2001, N.Engl. J. Med. 344: 710-719を参照)、ハンチントン病、 後天性免疫不全症候群の関連痴呆、脊髄損傷、脳または他の神経に影響する代謝疾患、(Gage, Cell Therapy. Nature 392: 18-24 (1998), and Kirschstein and Skirboll, "Stem cell: scientific progress and future research directions", Report prepared by the NIH, 2001を参照)を始めとした、神経欠損または変性によって疾病を治療することができる。
【００４７】
本発明のさらに別の実施例は、ヒトの発生・成長、例えば、発生上の問題およびそれらを防止するための同定方法につながる遺伝的イベント、分子イベント、および細胞イベントを同定するための初期イベントを研究する、IS細胞またはその分化した誘導体の使用法である。また、そのような個別細胞を用いて、ヒト幼児期の腫瘍を始めとした発育初期の染色体異常の効果を研究することもできる。
【００４８】
本発明のさらに別の実施例は、生物学的薬剤、化学的薬剤、または薬理学的薬剤、例えば細胞ベースの薬物スクリーニングアッセイおよび(または)毒物学研究に対する細胞応答を特徴付ける、IS細胞またはその分化誘導体の使用法である。「薬剤」とは、被験体または細胞に正しく投与されたときに、所望の治療効果のまたは予防効果誘導をする能力のある化学的化合物または組成物を指す。例えば、薬剤は、分子、例えば、本発明のIS由来の分化細胞の生理的な機能を変更または模倣する能力を持つタンパク質または医薬品を表す。例えば、本発明は、β細胞の分化、インシュリン分泌および(または)グルコース応答性を促す化合物を同定および特徴づけるためにIS細胞の生成を可能にする。対象の化合物を、適切な培養系、例えば96ウェルプレートや384ウェルプレートなどで増殖させた分化および未分化のインスリン産生細胞に加える。薬剤がすい臓のインスリン産生細胞に影響を及ぼすかどうかを判断するため、パラメータを定量する。例えば、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび(または)すい臓ポリペプチドのような、すい臓内分泌ホルモンの分泌および(または)発現を分析することができる。ホルモン、例えば治療細胞のインシュリンレベルは、好適な方法、例えば酵素連鎖の酵素免疫測定法(ELISA)または放射免疫測定 (RIA)によって定量化できる。この方法を使用して多数の化合物をスクリーニングすることができ、β細胞の分化を誘引し、ホルモン(例えば、インシュリン)分泌を高める化合物を容易に同定できる。
【００４９】
分化したIS細胞、例えばすい臓細胞をレポーター遺伝子(上記参照)をコードする核酸構成物で形質移入し、対応細胞に存在するタンパク質またはmRNAのレベルまたは様相を検出する方法またはレポーター遺伝子の生物学的活性を検出する方法を用いて、レポーター遺伝子発現の上昇または減少を分析することができる。使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００５０】
また、例えば、すい臓細胞に分化したIS細胞を、β細胞分化中または完全な個別細胞においてその活性化の度合を示して、このタンパク質によって媒介された効果に関する薬剤の生物学的応答を判断する目的で、標的遺伝子をコードする核酸構成物で形質移入することもできる。標的遺伝子は、例えば、その特異的リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストの結合に関する薬剤効果、またはそれらそれぞれの下流のシグナル伝達、例えば細胞のcAMPレベルまたはレポーター遺伝子の転写活性化における増加に関する薬剤効果が監視される、細胞表面受容体であることができる。また、標的遺伝子には、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼまたはニュークレアホルモン受容体、または薬物発見手法に好適なすべて、非幹細胞ベースの細胞スクリーニングアッセイにおける最新技術そのままのような細胞内タンパク質を含むことができる。
【００５１】
そのような薬物スクリーニングアッセイのデザインは、当技術分野で周知である。 Harvey ed.，’Advances in drug discovery techniques’, John Wiley and Sons, 1998; Vogel and Vogel eds.，’Drug discovery and evaluation: Pharmaceutical assays’, Springer-Verlag Berlin, 1997)を参照。
【００５２】
別の実施例においては、IS細胞または個別細胞を用いて、候補治療薬を検査することができる。例えば、動物モデルにおける薬物スクリーニング検査、動物細胞を用いる生体外実験、または動物における毒物検査を含む生体内実験を実施することが可能である。  生体外モデルは、化合物ライブラリをスクリーニングするため、任意の種々薬物スクリーニング技術において使用できる。特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。哺乳動物、望ましくはヒト、IS細胞の培養は、前臨床試験において利用することができる。それら細胞が特定の細胞型に分化できる場合、本発明に記載したように、薬物スクリーニングにとって重要であり、それらIS由来の細胞は、細胞/組織の生体内反応を模倣する可能性が高く、より安全な薬物スクリーニングのためのモデルを提供する。
【００５３】
本発明の別の実施例においては、哺乳動物、望ましくはヒトのIS細胞を、潜在毒素をスクリーニングするために利用することができる。毒素は、多くの場合、異なる動物種では異なる効果を示すので、ヒト細胞におけるそれら毒素の効果を評価するために、最適な生体外モデルを利用することが不可欠である。例えば、肝細胞に分化したヒトIS細胞は、薬物の解毒力の評価に使用することができ、有害作用を監視するためのシステムとなる。
【００５４】
候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００５５】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生することができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。
【００５６】
図1
マウスまたはラット腸内の上皮組織(IE由来の幹細胞/前駆細胞)から取り出したIS細胞の分離および培養の一般的な模式図、およびその結果生じた胚様体への凝集を示す。サイトカインおよび成長因子を次の組み合わせにおいて用いた: (I) 抑制因子; (II) 抑制因子+ H-IL6; (III) H-IL6 + bFGF (10 ng/ml)、+ EGF; (IV) bFGF + EGF; (V) 抑制因子+ H-IL6 + bFGF + EGF。
【００５７】
図2
IE由来の幹細胞/前駆細胞胚様体のさまざまな特定細胞型への分化の一般的な模式図を図示する。
【００５８】
培地HCM (Clonetics Bio Whittaker社): (1): HBM 基底培地+ 20 %のFCS + BSA-FAF + ヒドロコルチゾン+ トランスフェリン+ インシュリン+ アスコルビン酸+ hEGF + ゲンタマイシン/ アンホテリシン;
培地HM: イスコーブのMDM (Gibco-BRL社) + 添加剤 + 20 %のFCS + α-FGF (100 ng/ml、Sigma社) + HGF (20 ng/ml) + オンコスタチンM (10 ng/ml、Sigma社) + デキサメサゾン(10-7 M、Sigma社) + インシュリン(5 ng/ml、Sigma社) + トランスフェリン(5 mg/ml、Gibco-BRL社) + 亜セレン酸塩ナトリウム(5 〜μg/ml、Sigma社);
培地B2: DMEM / F12 (1:1、Sigma社) + インシュリン(25 μg/ml) + トランスフェリン(50 μg/ml) + 亜セレン酸ナトリウム(30 nM) + ラミニン(1 μg/ml、Sigma社) + プロゲステロン(20 nM、Sigma社) + プトレッシン(100 μM、Sigma社) + ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml) + EGF (20 ng/ml) + bFGF (10 ng/ml);
培地EGM: 2MV (Clonetics社): EBM基底培地+ 5 %のFCS + ヒドロコルチゾン+ hrbFGF + hvasc. EGF + R(3)-インスリン様成長因子I + アスコルビン酸+ hEGF + ヘパリン+ ゲンタマイシン+ アンホテリシン;
培地CM: イスコーブのMDM (IDMDM; Gibco-BRL社) + 添加. + 20%のFCS + TGF β1（2 ng/ml、Strathmann Biotech社) + bFGF (50 ng/ml) + BMP 2 (10 ng/ml、Genetics Institute社) + アクチビン(20 ng/ml、R&D Systems社);
培地N2: 培地B2 + 2%のB 27 サプリメント、または培地N2 + ニコチンアミド(10 mM、Sigma社);  培地BDM: イスコーブのMDM  + 添加剤 + 20%のFCS + プロゲステロン(20 nM) + 成長ホルモン(100 ng/ml、ICN) + bFGF (2ng/ml) + EGF (10 ng/ml)。
【００５９】
略語: ECM、細胞外基質。
【００６０】
図3
マイトマイシンC-不活化マウス線維芽細胞の支持細胞層上で育てるラットIS細胞コロニーのコロニー形態を示す。
【００６１】
図4
ラット腸内上皮組織から樹立したAP陽性のIS-細胞コロニーを示す。IS-細胞を、添加剤、15 %のFCSを有するDMEMにおけるマイトマイシンC-不活化マウスの胚線維芽細胞の支持細胞上で培養し、 (A) 抑制因子(10 ng/ml)およびH-IL-6 (B) H-IL-6および(C) 追加サイトカイン不使用によって補充した。細胞およびクラスタを、2〜5日間毎に継代培養しAP 染色を28日目に実施した。Bar = 50 μm。
【００６２】
図5
マウス胚支持細胞上で培養したラット腸内細胞におけるAP陽性コロニーの定量的評価を示す。ラット腸内上皮組織を、添加剤(I)、加えて、抑制因子(10 ng/ml、(II); 抑制因子、H-IL-6、(III); H-IL-6 (IV); H-IL-6、bFGF (10 ng/ml)、EGF (20 ng/ml、V); bFGF、EGF、(VI); 抑制因子、H-IL-6、bFGF、EGF (VII)によって補充した15 %のFCSを有するDMEMにおける支持細胞上で培養した。15 %のFCS、添加剤、および抑制因子およびH-IL-6によって補充した培地中で培養した支持細胞層を有するDMEM中で培養した支持細胞層を、コントロールとして使用した。AP陽性クラスタを、支持細胞層上に増殖したすべてのコロニー数のパーセントとして推定した。
【００６３】
図6
主要な腸内上皮組織(IE)における胚幹細胞特定の転写因子Oct-4の発現、異なるサイトカイン/成長因子存在下での支持細胞上のIS由来のコロニー増殖、およびマウスES細胞を示す。Oct-4 mRNAレベルを、主要なラット腸内上皮組織および、15 %のFCS (I); 加えて、抑制因子(10 ng/ml、II); 抑制因子およびH-IL-6 (III); H-IL-6 + bFGF (10 ng/ml); EGF (20 ng/ml、IV); bFGF + EGF (V)および抑制因子、H-IL-6、bFGF、EGF (VI)で9日目に補充したDMEMを有する支持細胞層上で増殖したIS細胞由来の選択コロニーのRT-PCRによって分析した。ラインR1のマウスES細胞をポジティブコントロールとして使用し、支持細胞層(FL)、抑制因子およびH-IL-6のほかに、トリ蒸留水(H2O)もまたを含むDMEMにおいて培養した支持細胞層をネガティブコントロールとして使用した。HPRTを内部標準として使用した。MW: 分子量 マーカー。
【００６４】
図7
ラットIS細胞の初代培養における胚細胞表面マーカーSSEA-1の発現を示す。(A) 抑制因子(LIF)存在下において支持細胞上で培養した典型細胞。メタノール:アセトン(7:3)比率にて固定後、SSEA-1 エピトープ(抗原決定基)、(B)位相差を認識して、抗体MC-480 (1:10 比率で希釈; Developmental Studies Hybridoma Bank)によって細胞を標識した。(C) 共焦点レーザー顕微鏡 (CLSM 410、Zeiss社)および(D)微分干渉差によるSSEA-1陽性細胞の高い拡大率。Bar = 10 μm。
【００６５】
図8
ラット腸内上皮組織から樹立した多分化能を持つEB由来の株細胞の産生および形態を実証する。(A) DMEM、添加剤、15 %のFCS、トリプシン(0.05 %): EDTA (0.04 %)1:1比率で14日間後に2回継代したH-IL-6を有する支持細胞上で育てるラットIS由来のコロニーの形態。(B、C) コラゲナーゼ(112 U/ml) : ディスパーゼ (4 U/ml、1:1比率)を有するラットIS由来のコロニーの解離によってEBを生成し、  添加剤、15 %のFCS、抑制因子(10 ng/ml)、フォルスコリン(10 μM; Sigma社)およびbFGF (10 ng/ml)によって補充したDMEMにおいて、懸濁培養液中で5日間以内に培養した。(D) DMEM (IMDM、Gibco-BRL社)、20 %のFCS、TGFβ1 (2 ng/ml; Strathmann Biotech社)および  コラゲナーゼ(112 U/ml)を用いたEB解離の3日間後にbFGF (50 ng/ml): ディスパーゼ (4 U/ml、1:1)およびゼラチン(0.1 %)被覆のペトリ皿上のEBのプレーティングのイスコーブの変法において培養したEB由来の増殖(さらなるライン5)の細胞形態。(E)細胞形態of EB由来の継代11でのライン5、 および(F) 5 %のFCSおよび継代10にてコラーゲン被覆のペトリ皿上のヘパリン(すべてをClonetics社、Verviers、ベルギーから得た)によって補充したEGM2MV培地において培養したライン30の形態Bar = 50 μm。
【００６６】
図9
ラットIS細胞の胚様体由来の培養の免疫細胞化学的分析を示す。抗体エピトープとは: (A) ネスチン、(B) GFAP、(C) オリゴデンドロサイト特定のタンパク質、(D) シナプトフィジン、(E) ペリフェリン、(F) デスミンである。
【００６７】
図10
インスリン産生細胞への分化を支持する培地におけるラットIS細胞胚様体由来の培養の免疫細胞化学的分析を示す。上部列、明視野; 下部列、インシュリンに特異的な抗体を用いた染色。
【００６８】
図11
ヒト腸内上皮組織から樹立したAP陽性のIS-細胞コロニーを示す。
【００６９】
図12
支持細胞層上の培養ヒト腸内上皮組織のAP陽性コロニーの定量的評価を示す。(A) 継代4にて13日間培養したヒトIS細胞。(B) 継代7にて25日間培養したヒトIS細胞。異なる培地において培養した細胞のためのAPポジティブ染色領域のパーセンテージ。各変異型20画像をLUCI表示法システムによって分析した。
【００７０】
図13
ヒト腸内上皮由来の前駆幹細胞における生殖細胞特異的転写因子Oct-4および細胞外基質分子TRA-1-60の発現を図示する。A. 主要な腸内上皮組織およびされるハイパーIL6および(または)抑制因子の存在下において培養したIS細胞におけるOct-4 発現のRT-PCR 分析。マウスR1 ES細胞をポジティブコントロールとして使用する。Oct-4は、主要な腸内上皮組織において発現しない。ところが、発現は、上皮組織から分離されたIS細胞において検出することができる。B. ヒトIS細胞の明視野像。C. TRA-1-60を用いたヒトIS細胞の染色。
【００７１】
図14
ラット上皮由来の幹細胞/前駆細胞由来の細胞株の核型を示す。(A) ライン5 (継代8)。(B) ライン30 (継代9)。
【００７２】
図15
Cdx1 (A)およびネスチン(B)発現に対するマウスRosa26由来の腸内上皮組織の免疫組織化学的な分析を示す。(Bの)挿入物は、腸内上皮組織の輸送増幅領域以内でのネスチン陽性細胞の固有の染色を示す。Bar = 50 μm (A,B)および25 μm (挿入物)。
【００７３】
図16
腸内上皮組織(IE)から取り出した多分化能を持つネスチン陽性の前駆細胞の選択的培養および生成の一般的な方法を示す。
【００７４】
図16は、8〜14継代にて胚支持細胞層(FL)上で選択培養することによって段階1の細胞を生成する方法、およびIE由来のクラスタ(段階2)およびIE由来の胚様体(EB)様凝集体(段階3)の選択培養によって段階2および段階3の細胞を取り出しす方法の2つの原理方法を示す。顕微鏡写真は、抑制因子(A)によって補充したDMEMにおいてFL上で6日間増殖したROSA26マウスIE由来のコロニーの形態、およびFL (B)上で4日間増殖したβ-ガラクトシダーゼ染色クラスタを示す。抑制因子および成長因子の存在下でFL上にて9日間培養した後、EB様凝集体を懸濁液培養、および異なる成長因子(GF) (培地I: G、培地II: H)よって補充した異なる培養培地中において異なる細胞外の基質(ECM) タンパク質(E、F: コラーゲンI)上で育てるIE-EB由来の細胞に5日間(C、D)移した。段階1および段階3からのIE由来の細胞、および異なる系統の分化した子孫を共に生成した。Bar = 50 μm。
【００７５】
図16Bは、さまざまな細胞型を分化するため、特定のECM基質上の異なる培地におけるIE由来の幹細胞/前駆細胞の培養方法を示す。
【００７６】
(1) 培地HCM/HM ( Clonetics Bio Whittaker社よりのHCM): HBM 基底培地+ 20 %のFCS + BSA-FAF + ヒドロコルチゾン+ トランスフェリン+ インシュリン+ アスコルビン酸+ hEGF + ゲンタマイシン/ アンホテリシン; IMDM (Gibco-BRL社) + 添加剤 + α-FGF (100 ng/ml、Sigma社) + HGF (20 ng/ml) + オンコスタチンM (10 ng/ml、Sigma社) + デキサメサゾン(10-7 M、Sigma社) + インシュリン(5 ng/ml、Sigma社) + トランスフェリン(5 mg/ml、Gibco-BRL社) + 亜セレン酸塩ナトリウム(5 〜μg/ml、Sigma社) + 20 %のFCS;
(2) 培地B2 (DMEM / F12 (1:1、Sigma社) + インシュリン(25＿g/ml) + トランスフェリン(50μg/ml) + 亜セレン酸ナトリウム(30 nM) + ラミニン(1μg/ml、Sigma社) + プロゲステロン(20 nM、Sigma社) + プトレッシン(100 μM、Sigma社) + ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml) + EGF (20 ng/ml) + bFGF (10 ng/ml)) プラス5%のFCS ; 神経細胞培養用基礎プラスB27プラス15%のFCS;  培地EGM 2MV (Clonetics社): EBM 基底培地+ 5 %のFCS + ヒドロコルチゾン+ hrbFGF + hvasc. EGF + R(3)-インスリン様成長因子I + アスコルビン酸+ hEGF + ヘパリン+ ゲンタマイシン+ アンホテリシン
(3) 培地IMDM プラスMTG プラス抑制因子プラスTGFβプラスβFGF: イスコーブのMDM (IDMDM; Gibco-BRL社) + 添加. + 20%のFCS + TGF β1（2 ng/ml、Strathmann Biotech社) + bFGF (50 ng/ml) + BMP 2 (10 ng/ml、Genetics Institute社) + アクチビン(20 ng/ml、R&D Systems社);
(4) 培地B2 + 2%のB 27 サプリメント、または培地N2 + ニコチンアミド(10 mM、Sigma社);  培地BDM: イスコーブのMDM  + 添加剤 + 20%のFCS + プロゲステロン(20 nM) + 成長ホルモン(100 ng/ml、ICN) + bFGF (2ng/ml) + EGF (10 ng/ml)。
【００７７】
略語: ECM、細胞外基質。
【００７８】
図17
IE由来のクラスタ(段階2)の免疫蛍光および共焦点顕微鏡の分析を示す。IE由来のクラスタ内と周囲の細胞を、細胞核を視覚化するため、ネスチン(緑)およびHoechst社 33342 (青色)によって標識した。ネスチン陽性細胞を、クラスタ内および周囲で観察し、支持細胞層上のIE由来の細胞の9日後の培養(A)および14日後の培養 (B)において示した。ネスチン陽性細胞(C)を、ALP陽性クラスタ(D)において局在化した。9〜14日目(E)の培養中に、ネスチン陽性細胞数の上昇が認められた。抑制因子およびLIF+bFGF+EGFは、それぞれ、基本培地(DMEM)におけるFL上のみで培養した細胞と比較して、ネスチン陽性細胞数を増加した。これに対して、ALP陽性クラスタ数は、抑制因子および成長因子処理(F)によって影響されなかった。されるIE細胞(G)不使用で培養したFL細胞においては、ALP陽性クラスタは検出されなかった。Bar  = 30 μm。
【００７９】
図18
IE-EB由来の細胞の免疫蛍光分析および共焦点顕微鏡を示す。図示したのは、プレーティング2日間後のEB様凝集体の増殖細胞であり、Cdx1 (A、Hoechst社の33342-核標識を含む)-陽性細胞、ネスチン(B)-陽性細胞およびGFAP (C)-陽性細胞を有する。Cdx1-標識後のシグナルを、主に細胞質(A)において検出した。Dは、GFAP陽性細胞(C)のHoechst標識核のノマルスキー顕微鏡 を示す。Bar  = 30 μm。
【００８０】
図19
肝系統およびすい臓系統に分化したIE由来細胞の免疫蛍光分析を示す。肝タンパク質(A-D)およびすい臓タンパク質(E-H)を発現する細胞を、特定の分化培地における分化の14日間後に分析した。 肝細胞様細胞を、ネスチン(A)、アルブミン(B)、α-1-アンチトリプシン(C)およびサイトケラチン18 (D)によって標識し、すい臓細胞をインシュリン(E)、グルカゴン(F)によって標識し、および共焦点顕微鏡後に細胞核(青色)を視覚化するため、インシュリン(赤色)およびグルカゴン(緑)、およびHoechst社の33342によって二重染色した。Bars= 40 μm (A-H)、挿入物 (B-G) = 10 μm。
【００８１】
図20
神経系統および中胚葉/間葉系統への選択分化後のIE-EB由来の細胞の免疫蛍光分析を示す。細胞は、ネスチン(A)、GFAP (B)、オリゴデンドロサイト-特異タンパク質(C)、β-III チューブリン(D)、デスミン(E)およびビメンチン(E)を発現した。また、ネスチン陽性細胞は、デスミン(ここには図示せず)も同時発現した。Hoechst社ｍｐ33342標識を用いて核(青色)を視覚化した。Bar = 40 μm。
【００８２】
図21
IE由来の細胞の初代培養の免疫蛍光研究(第2〜5日目)を示す。細胞を、SSEA-1(赤色)に対する抗体で染色し、細胞核(青色)を視覚化し、共焦点顕微鏡および位相差 (B,E,I、L O)によって観察するため、プロミニン(prominin)、ネスチン、cdx (緑)のそれぞれ、およびHoechst社の33342 で補助染色した。小円形細胞を、SSEA-1発現および高い細胞核/細胞質比率によって特徴付けた。(H、挿入E、I,L,Oを参照)。また、マウスES R1細胞は、SSEA-1ポジティブ(A)でもある。C、FはSSEA-1染色に対するネガティブコントロールを表す。SSEA-1 陽性細胞は、プロミニン(prominin) (G、H、I)を同時発現したが、 cdx1 (J、K、L)およびネスチン(M、N、O)は発現しなかった。Bar = 10 μm。
【００８３】
図22
IE由来の細胞の免疫蛍光分析および共焦点顕微鏡を示す。図示したのは、B27、ニコチン酸アミド(NA)、5%FCS、抑制因子、bFGFで補充したB2培地において(14日間)の分化後の(継代14)細胞。プロミニン(prominin)陽性細胞(A,E)をネスチン(B、F)によって二重染色し、細胞核(C,G)を視覚化するため、Hoechst社の33342で対比染色した。D、Hは、位相差写真をを示す。Bar = 20 μm。
【００８４】
表1、2、3では、個別細胞の生成の定量的評価に関する実施例を示す。
【００８５】
表1
【００８６】
【表１】
2005502356.tif 000002
【００８７】
DMEM + bFGF + 抑制因子+ フォルスコリン(段階2)においてプレーティング後2日間分析した、IE-EB由来の凝集体の免疫標識の定量的評価(9日間FL上で初代培養、5日間懸濁液中でEB培養)を示す。
【００８８】
表2
【００８９】
【表２】
2005502356.tif 000003
【００９０】
神経細胞、すい臓細胞および肝細胞への選択分化後(段階1)のIE由来の細胞株の免疫標識の定量的評価を示す。
【００９１】
表3
【００９２】
【表３】
2005502356.tif 000004
【００９３】
神経細胞、すい臓細胞、肝細胞および間葉細胞への選択分化後のRosa26マウスIE-EB由来の細胞株(段階3)の免疫標識の定量的評価を示す。
【００９４】
表4
【００９５】
【表４】
2005502356.tif 000005
【００９６】
すい臓系統への選択分化後のIE由来の細胞における 細胞内および分泌インシュリンレベル(B27、NA、5%のFCSで補充したB2培地において14日間培養) (段階3) を示す。
【００９７】
実施例
本発明のより良い理解およびその多くのメリットは、図示によって示された次の実施例から明らかであろう。
【００９８】
実施例1
IS細胞の分離
上述したように、好適な実施例においては、腸内幹(IS)細胞は、ヒトまたは哺乳動物起源の腸内上皮組織から採取する(図1)。ヒトIS細胞に関しては、膵十二指腸切除中におよそ1〜10 cmの小腸を得た。哺乳動物起源IS細胞を得るためのモデルとして、ラットを使用する。従って、小腸は、F-344同系交配ラットから切開によってから取り出し分離した(HarlOlac社; 年齢: 15〜24 週間)。0.05 U/mlの ペニシリン、0.05 μg/mlのストレプトマイシン、50 μg/mlのゲンタマイシン(Gibco社/BRL社)、2,5 μg/mlのアンフォテリシン(Gibco社/BRL社)、2 mg/mlのシプロベイ(Bayer社)を含んだハンクス 平衡塩基溶液(HBSS; Gibco-BRL社)を用いて、管腔の内容物を洗い流した後、平滑筋を囲む腸内上皮組織をメスで機械的に除去し、組織を縦方向に切断し、その切断片をHBSS中で最大で10 回まで洗浄した。次に、アキュターゼ(PAA研究所)を用い、擦過および酵素解離によって腸内上皮組織を分離した。培養に関しては、分離した腸内上皮細胞を、15 %のFCS (Biochrom社)で補充したDMEM (Gibco-BRL社)ベースの培地において、マイトマイシンC (50 μl/ml; Serva社)によって不活化したマウス胚線維芽細胞上にプレーティングした。なお、DMEMには次のサイトカインおよび(または)成長因子が含まれるものとする: 0.05 μg/mlの抑制因子(調製用、Faessler らの1996を参照); 50 ng ハイパーIL-6 (H-IL6、ハイブリドーマ細胞株から取り出した上清として使用、Fischer らの1997, Nature Biotech. 15:142-145を参照); 10または500 ng/mlのbFGF (Strathmann Biotech社); 20 ng/mlのEGF (Strathmann Biotech社)。サイトカインおよび成長因子を次の組み合わせにおいて用いた: (I) 抑制因子; (II) 抑制因子+ H-IL6; (III) H-IL6 + bFGF (10 ng/ml)、+ EGF; (IV) bFGF + EGF; (V) 抑制因子+ H-IL6 + bFGF + EGF。細胞を支持細胞上で8日間培養し、継代培養2回行い、9日目に細菌培養用のペトリ皿へ再プレーティングした。小IS細胞クラスタまたは細胞のコロニーは、そのような条件下で得ることがであろう。これらのISコロニーは、胚幹(ES)細胞(図3)に類似の形態を備えていた。IS細胞を密接に緻密化した。細胞質には高密度の顆粒が含有されていた。
【００９９】
実施例2
アルカリホスファターゼ(AP)活性によって決定されたヒトIS細胞およびラットIS細胞の多能性
先に記載したように、多能性細胞のマーカーは、培養基中の幹細胞を同定するため、多くの場合有用である。ラット(図4)またはヒト(図11)起源のIS細胞は、典型的にAP活性を明らかにし、AP陽性細胞は、典型的に多能性である。AP活性は、マウス(Wobus らの1984, Exp. Cell 152:212-219; Pease らの1990, Dev. Biol. 141:322-352)、ラット(Ouhibi らの1995, Mol. Repro. Dev. 40:311-324; Vassilieva らの2000, Exp. Cell Res. 258:361-373)、ブタ (Talbot らの1993, Mol. Repro. Dev. 36:139-137)、cow (Talbot らの1995, Mol. Repro. Dev. 42:35-52)、およびin ヒト(Thomson らの1998, Science 282:1145-1147; Shamblott らの1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:13726-13731; Pera らの2000, J. Cell Science 113:5-1)におけるESおよびES様細胞において実証されている。AP活性は、ヒトIS細胞またはラットIS細胞を、4 %のパラホルムアルデヒド中で室温にて20分間固定した後、TM-緩衝剤 (1M マレイン酸、3.6 g TrISad 1L H2O pH 9.0)中で3回の洗浄を行うことによって決定した。次に、TM-緩衝剤に溶解した0.1 %のファーストレッドTR塩、0.04 %のナフトールAA-MXリン酸塩を用いて、細胞を染色した。25 mlの染色溶液には200 μl の10 %のMgCl2溶液が含まれる。サンプルはPBSで洗浄した。
【０１００】
また、ラットおよびヒト腸内細胞におけるAP陽性コロニー定量的評価も、異なる培養培地を使用したときに決定した。ラット腸内培養に関しては、さまざまなサイトカインおよび成長因子の追加によって、培養(図5)に存在するAPコロニーの量がわずか改善された。但し、ヒト培養(図12a、b)においては、抑制因子およびハイパーIL6のようなサイトカインのIL-6ファミリーメンバーによって、AP陽性のISコロニーの量が著しく 高められた。AP陽性クラスタを、支持細胞層上に増殖したすべてのコロニー数のパーセントとして推定した。
【０１０１】
実施例3
Oct-4発現、SSEA-1発現、またはTRA-1-60発現によって決定される、ヒトIS細胞およびラットIS細胞の多能性。
【０１０２】
IS細胞の多能性もOct-4発現によって研究することができる。転写因子Oct-4は、ES細胞の未分化状態の表現型の樹立および維持に必要とされることが証明されており、胚形成および細胞分化における初期イベントを決定する上で重要な役割を演ずる(Pesce らの1998, Bioessays 20:722-732)。Oct-4は、マウス(Nichols らの1998、Cell 95:379-391)、ラット(Vassilieva らの2000, Exp. Cell Res. 258:361-373)およびヒト(Reubinoff らの 2000, Nature Biotechnol. 18:399-404) ES細胞またはEG細胞において発現することが証明されている。また、Oct-4は、ラットIS細胞(図6)、およびヒトIS細胞(図13a)においても発現する。
【０１０３】
サイトカインの異なる変異体で培養後のラットIS細胞コロニーにおけるOct-4遺伝子発現の分析、および9日目の成長因子の分析を、半定量的な逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)法を用いて実施した。単一コロニーを溶解緩衝液中に捕集し、Dynalbeads mRNA DIRECTマイクロキット(Dynal社)を用いてmRNAを分離した。RT-PCR増幅を製造メーカーの指示に従って実施した。MuLV逆転写酵素(Perkin-Elmer社)を用いて、RT反応 (20 μl)を実施した。マウスOct-4およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)の特定のプライマー配列を内部標準として用いて、cDNAを増幅した。オリゴヌクレオチド配列は、括弧中にアンチセンス-、センス-プライマー、続いて増幅断片長の順序で提供する: Oct-4 (配列認識番号1: 5´-GGC GTT CTC TTT GGAAG GTG TTC-3´および配列認識番号2: 5´-CTC GACCCAT CCT TCT CT-3´; 313 bp ); HPRT (配列認識番号3: 5´-GCC TGT ATC CACAC TTC G-3´および配列認識番号4: 5´-GCG TCG TGTTGCG ATG-3´; 507 bp)。増幅は、各RT反応 からの15 μlで行い、次の条件を用いた: 4 秒変性、95 ℃にて、40秒アニーリング、61 ℃にて、および40秒伸長、72 ℃にて; 40 サイクル。マウスR1細胞は、マウス胚線維芽細胞(FL)、およびネガティブコントロールとして抑制因子およびH-IL-6で培養した支持細胞のポジティブおよび支持細胞層として用いた。超純粋な水は、常にコントロールとして包含した。RT-PCR 産生物を、2 %の寒天ゲル剤上で電気泳動的に分析した。ゲルをUV光で照射し、E.A.S.Yシステム(Herolab社)を用いて、臭化エチジウム蛍光シグナルを保管した。また、ヒト細胞におけるOct-4の発現も、ヒトOct-4遺伝子: センス配列認識番号 5: 5'-TGAGC AGAGGGTCCC-3'; アンチセンス配列認識番号 6: 5'-CCG CAG CTT ACCAT GTT CT-3'に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、上記のように実施した。
【０１０４】
また、多能性またはラットIS細胞も、受精後まもない初期胚の発生・成長において特異的に発現する糖タンパク質、およびES細胞のマーカーである時期特異的な胚抗原-1 (SSEA-1; 図7)の発現によって評価した(Solter およびKnowles, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5565-5569; Kannagi らの1983, EMBO J 2:2355-2361)。間接免疫蛍光分析は、支持細胞層上で4日間培養し、メタノール:アセトン(7:3)比率の溶液を用いて-20℃にて5分間固定した、ラットIS細胞上で行った。PBSで洗浄(3回)後、すべての標本を、PBSにおける10%のヤギ血清で30分間インキュベートした後、続いて一次抗体に特異的なSSEA-1 (比率で希釈 1:10; Developmental Studies Hybridoma Bank)を用いて、37℃にて加湿室内で1 時間インキュベーションした。PBSで洗浄(3回)後、細胞を適切な蛍光標識二次抗体(Jackson Immuno Research社)で1時間、３７℃にてインキュベートし、PBSで(3回)、 およびA. tridest.で(1回)リンスした。ベクタシールドのマウント培地(Vector社、米国)に包理した後、蛍光顕微鏡(Nikon社、ドイツ)または共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM 410、Carl Zeiss社、Jena、ドイツ)を用いて検体を分析した。
【０１０５】
また、ヒトIS細胞の多能性は、胚幹細胞(Andrews, らの1984, Hybridoma 3: 347-361)の特定のマーカーである基質分子TRA-1-60 (図13b、c)の細胞外の発現によって評価した。
【０１０６】
実施例4
さまざまな分化によって作り出された細胞型を生成するため、ラットIS細胞を誘導することができる。
【０１０７】
IS細胞は、胚様体、または胚様体類似体(図8b、c)を形成することができ、分化培地において培養され、限定するものではないが、肝細胞、神経細胞、グリア、心臓細胞、およびすい臓細胞、望ましくはインスリン産生細胞のような特定の細胞型を生成する(図2)。コラゲナーゼ(112 U/ml) : ディスパーゼ (4 U/ml、1:1比率)を有するラットIS由来のコロニーの解離によって胚様体を生成し、  添加剤、15 %のFCS、10 ng/mlのLIF、10 μMのフォルスコリン(Sigma社)および10 ng/mlのbFGFによって補充したDMEMにおいて、懸濁培養液中で5日間以内に培養した。3日間の培養後、胚様体は、コラゲナーゼ(112 U/ml): ディスパーゼ(4 U/ml、1:1)を用いて解離し、コラーゲン被覆(10μg/cm2)のペトリ皿上にプレーティングした。一実施例において、IS細胞由来の胚様体を、EBM基底培地、5 %のFCS、ヒドロコルチゾン、hrbFGF、hvasc. EGF、R(3)-インスリン様成長因子I、アスコルビン酸、hEGF、ヘパリン、ゲンタマイシン、アンホテリシンから成る分化培地EGM 2MV (Clonetics社)において培養した。そのような条件下で、神経前駆細胞、すい臓の前駆細胞、星状細胞、膠（コウ）細胞、神経細胞、末梢性の神経細胞、および筋細胞は、免疫組織学的な分析によって観察することができるであろう(図9)。神経前駆存の在体、およびすい臓前駆細胞(図9a)は、中間構造タンパク質ネスチンの発現によって検出することができる(Lumelsky らの2001、Science 292:1389-1394を参照)。アストロサイト様細胞は、グリアの線維酸性タンパク質(GFAP; 図9b)の発現によって検出することができる。オリゴデンドロサイト様細胞は、オリゴデンドロサイト特定のタンパク質(OSP; 図9c)の発現を特徴とする。神経細胞および末梢性の神経細胞は、シナプス小胞タンパク質シナプトフィジン(図9d)の発現、およびペリフェリン(図9e)の発現によって検出することができる。骨格筋細胞のような筋細胞、および心臓細胞(図9f)は、デスミンの発現によって検出することができる(Wobus らの"In Vitro Differentiation of Embryonic Stem Cells and Analysis of Cellular Phenotypes" in: Methods in Molecular Biology: Gene Knockout Protocols, Tymms and  Kola Eds, vol. 158, Humana Press Inc. 2001を参照)。
【０１０８】
間接免疫蛍光分析を上述の通り行った。次の抗体を分析において使用した: ネスチン(1:2 比率で希釈)、シナプトフィジン(1:250 比率で希釈; Calbiochem社)、オリゴデンドロサイト特定のタンパク質(1:20 比率で希釈; Chemicon社)、ペリフェリン(1:200 比率で希釈; Chemicon社)、GFAP (1:20 比率で希釈; Chemicon社)、デスミン(1:4 比率で希釈; Roche Molecular Biochemicals社)。
【０１０９】
実施例5
ラットIS細胞は、インスリン産生細胞に分化するように誘導することができる。
【０１１０】
胚様体または胚様体類似体の形成後、ラットIS細胞は、DMEM / F12 (1:1、Sigma社)、インシュリン(25μg/ml)、トランスフェリン(50μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(30 nM)、ラミニン(1μg/ml、Sigma社)、プロゲステロン(20 nM、Sigma社)、プトレッシン(100 μM、Sigma社)、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100 μg/ml)、EGF (20 ng/ml)、bFGF (10 ng/ml)、2%のB27サプリメント、ニコチンアミド(10 mM、Sigma社)を含む培地中で細胞を培養することによって、インスリン産生細胞(図10)に分化するように誘導することができる。間接免疫蛍光分析を、一次抗体に特異的なインシュリン(Sigma社)を用いて上述の通り行った。
【０１１１】
実施例6
培養したラットIS細胞は通常の核型を示す。
【０１１２】
樹立した培養における急速な増殖に起因し、胚幹細胞には、多くの場合、異常な核型が含まれる(Abbondanzo, S. J. らのMeth. Enzymol. 225: 803-823, 1993)。ところが、通常の2倍体核型を示す幹細胞は、臨床および他の目的にとって好適である。IS由来の細胞が分離および培養後に通常の核型を持つかどうかを決定するため、本明細書中に記載されたように培養したラットIS細胞を、細胞染色体の構造上異常および数的異常の両方を検討することによって検査した(図14)。ラットIS細胞から取り出した2つの非依存性クローンの核型(ライン5およびライン30)を、その細胞を6 cmのペトリ皿上で育て、次いで、最後の継代培養の2日後に0.05 μg/mlのコルヒチンを用いて90分間処置することによって分析した。細胞は、トリプシン(0.2 %) : EDTA(0.02 %) 1:1比率を用いて分離し、細胞株特定の培地において再懸濁した。遠心分離(1000 rpmで5分間)後、そのペレットを連続振盪によって低浸透圧性のKCl溶液(37 ℃)において再懸濁し、37 ℃にて10分間インキュベートした。細胞を氷酢酸:メタノール(1:3)比率を用いて2回固定し、固視中絶えず振盪した。第3固視は、4 ℃にて60分間行った。細胞標本を氷冷した顕微鏡のスライドガラス上に滴下し、オルセイン酢酸(2 %)によって染色体を染色した。ラットIS細胞は、正常な染色体数(n=42)、および正常な構造組成を持っていた。
【０１１３】
実施例7
固有ネスチン陽性細胞をマウス腸内組織において検出した。
【０１１４】
免疫組織化学によって、成人Rosa26マウスの腸内上皮組織の陰窩および輸送増幅(TA)領域における、著しいCdx1の発現と弱いTcf4 (図示せず)の発現が明らかにされた。パーネト細胞および絨毛領域内の領域は、Cdx1 (図15A)またはTcf4による標識を行わなかった。加えて、強く標識されたいくつかの単一ネスチン陽性細胞を見出し(図15Bの挿入物を参照)、TA領域の中部から上部において検出した。腸内上皮組織におけるこの固有ネスチン陽性細胞の知見は、本発明者らがネスチン陽性細胞の増殖における成功が証明されている方法を適用することを促した(Lee らの2000、(前出); Rolletschek らの2001、(前出))。
【０１１５】
ブアン液固定の検体、パラフィン包埋組織の検体を5 μmにて切断した。異なる腸内領域から取り出した、少なくとも2つの組織ブロックを動物毎に検討した。切片は、シラン処理したスライドガラス上にマウントし、キシレン中で脱パラフィンし、段階的アルコールを介して再水和した。メタノールにおける3%の過酸化水素を用いて30分間処理することによって、内因性の過酸化酵素を急冷した。PBSにおける10%の通常ヤギ血清を1時間室温にて用いて、抗体の非特異的な結合をブロックし、4℃にて加湿室中で一晩一次抗血清を用いてインキュベートした。すべての一次抗体(マウス抗ネスチン抗体1:10、ウサギ抗Cdx-1抗体1:800、マウス抗TCF-4抗体1:500)を1%のBSAを用いてPBSにおいて希釈した。切片を、PBST (リン酸緩衝の生理食塩水 Tween-20)を用いてリンスし、二次抗血清と標識されたそれぞれの複数過酸化酵素(DAKO EnVisionTMおよび西洋わさび過酸化酵素(HRP)-ヤギ抗マウスIgGおよびHRP-ヤギ抗ウサギIgG)を用いてインキュベートした。ジアミノ-ベンジジン(DAB)基質を用いて、抗原を視覚化した。酵素反応は、水に5分間浸漬後に停止した。免疫染色の特異性は、制御マウスIgG (DAKO)と共にインキュベートした切片、または一次抗体の省略後に処理された切片におけるシグナルの不在によって実証された。次に、切片を、ヘマトキシリンを用いて軽く対比染色し、脱水し、キシレン中で洗浄し、DPXマウント培地(BDH社、Pool、UK)にマウントし、従来の光顕微鏡によって検討した。
【０１１６】
実施例8
生体外でネスチン陽性の前駆細胞を選択的に生成するための3段階プロトコルの樹立
小腸を、すべての細胞においてβガラクトシダーゼを構成的に発現する11〜19週間目のROSA26マウス(Jackson Laboratory)から調製した。 ペニシリン(0.05 U/ml)、ストレプトマイシン(0.05 μg/ml)、ゲンタマイシン(50 μg/ml)およびアンフォテリシン(2.5 μg/ml; すべてGibco社より)を含んだハンクス平衡塩類溶液(HBSS、pH 7.3; Gibco-BRL社、Life Technologies社、Eggenstein、ドイツ)を用いて、管腔の内容物を洗い流した後、組織を縦方向に切断し、その切断片をHBSS中で(10回)洗浄した。腸内上皮組織または腸内組織の細胞および凝集体を、アキュターゼを20〜45分間用いて擦過および酵素性解離によって分離した(PAA Laboratories社、Linz、Austria)。類似の技術 (Evans らの(1992) J. Cell Sci., 101 219-231, Booth らの(1999) Exp. Cell Res., 249, 359-366)を用いることによって、機能的腸内幹細胞を分離した。
【０１１７】
これらの細胞懸濁液を、 マイトマイシンC (50 μl/ml、在庫溶液0.2 mg/ml; Serva社、Heidelberg、ドイツ)-不活化マウス胚線維芽細胞(Wobus らの2002, Meth. Mol. Bio. 185:127-156)、DMEM (Gibco社)において、次の添加剤: 2 mMのL-グルタミン(在庫溶液1:100、Gibco社)、0,5 Mのβ-メルカプトエタノール(β-ME、在庫溶液1:100、Serva社)、非必須アミノ酸(NEAA、在庫溶液1:100、Gibco社)、15 %の胎児の子ウシ血清(FCS、選択バッチ; Biochrom社, Berlin, Germany)、ゲンタマイシン(0.5 μg/ml)およびアンフォテリシン(0.25 μg/ml)の支持細胞層(FL)細胞上で培養した。次のサイトカインおよび成長因子を用いた: 抑制因子(10 ng/ml、調整用) を参照、bFGF (10 ng/ml)およびEGF (20 ng/ml; 両者ともStrathmann Biotech社、Hannover、ドイツ)。bFGFおよびEGFの両者は、腸内上皮細胞の増殖を調節することが現在わかっている(Houchen らの(1999) Am. J. Phys. 276, G249-258, Potten らの(1995) Gut, 36, 864-873)。成長因子を2日毎に加え、すべての培養を37℃にて、5 %のCO2でインキュベートした. 4日目または5日目に、IE由来の細胞を、PBS1:1において0.2 %のトリプシン(Gibco社): 0.02 %のEDTA(Sigma社)を用いて解離し、新鮮なFL細胞上で継代培養した。
【０１１８】
IE由来の細胞を、抑制因子+ bFGF for 8- 14 継代を含むDMEM + 15 %のFCSにおいて、FL上で連続的培養し、続いて選択分化(段階1、図16を参照)を行うか、または連続支持細胞層の培養(2〜3継代培養)を9〜14日間(段階2、図16を参照)行うことによって、IE由来のクラスタを生成するかのいずれかを行う。IE由来のクラスタ(段階2)を、コラゲナーゼ(278 U/ml、Sigma社、Steinheim、ドイツ): ディスパーゼ (4 U/ml、Gibco社) 1:1比率で9日目に用いて解離し、添加剤(上記参照)、15 %のFCS、抑制因子(10 ng/ml)、フォルスコリン(10 μM; Sigma社)およびbFGF (10 ng/ml)によって補充したDMEMにおける懸濁液培養として、細菌培養用のペトリ皿に移した。懸濁液中での5日間培養後、IE由来のEB様凝集体(段階3、図16を参照)を生成した。免疫蛍光分析に関しては、これらのIE由来のEBを、ゼラチン被覆(PBSにおける0.1 %、Fluka社、ドイツ)のカバーガラス付き24マイクロウェルプレート上にプレーティングし、懸濁液培養に使用されたものと同一培地で2日間培養した(上記参照)。IE-EB由来の細胞株の生成に関しては、EB様凝集体を異なる培地移した: 培地Iは、EGM-2MV、ヘパリン(Clonetics Bio Whittaker社、Verviers、ベルギー)および抑制因子(10 ng/ml)から構成されており、培地IIは、抑制因子(10 ng/ml)、TGF β1（2ng/ml; Strathmann Biotech社、ドイツ)、bFGF (50 ng/ml)、20 %のFCS、ゲンタマイシン(0.5 μg/ml)およびアンフォテリシン(0.25 μg/ml)によって補充したDMEM (IMDM; Gibco社)のイスコーブ の変法に基づく。培地III (単一細胞クローン化に使用される)は、  20 nM プロゲステロン、100 μMのプトレッシン、1 μg/mlのラミニン、25 μg/mlのインシュリン、30 nMの亜セレン酸ナトリウム(すべてSigma社より)、50 μg/mlのトランスフェリン(Gibco社) (= 「B2」)、5 %のFCS、抑制因子、bFGFおよびEGFによって補充したDMEM/F12から構成されている(濃度に関しては上記を参照)。
【０１１９】
培養プレートをラットコラーゲンI (0.05 mg/ml、Becton Dickinson社、Heidelberg、ドイツ)、ゼラチン(0.1 %、Fluka社)およびポリ-L-オルニチン(0.1 mg/ml)/ラミニン(0.001 mg/ml) (Sigma社)のそれぞれで被覆した。培地IおよびIIにおいて、EB様凝集体の24マイクロウェルプレートのうちの単一ウェルにおける別個の培養後、追加の因子無しの DMEM、またはDMEM + 抑制因子、およびDMEM + 抑制因子+ bFGF + EGFのそれぞれにおいて当初培養した、IE-EB由来の細胞株を生成した(図16を参照) (濃度に関しては、上記を参照)。
【０１２０】
胚線維芽細胞の支持細胞層上のIE由来の細胞の培養中の抑制因子および成長因子のアプリケーションは、ネスチン陽性細胞の成長を選択的に支持した。発明者らは、2つの異なる処置・手技(段階1対段階2および3)が、結果として異なる特質を有する異なる細胞集団をもたらしたことを認めた。1つのプロトコル生成段階1の細胞においては、支持細胞上で分化の誘発前に、IE細胞を連続的かつ選択的に培養した(8〜14継代に対して)が、他方では、における他のプロトコルにおいて、緻密化された クラスタ(段階2)が FL上に現れたので(図16A,B)、次に、懸濁液培養に移し、胚様体(EB)様凝集体(段階3、図16C、D)としてさらに培養した。これらの緻密化EB様の凝集体は、次に、異なる細胞外の基質タンパク質に移し、EB由来の細胞株として増殖した。
【０１２１】
Rosa26マウスの腸内上皮細胞をこれらの2つの処置・手技に従って培養したときには、すべての3段階でネスチン陽性細胞が生成した。ES細胞から生成されたネスチン陽性細胞は、神経細胞(Lee らの2000, Nat. Biotechn. 18:675-679)、およびすい臓(Lumelsky らの2001、前出)細胞に成長できることが証明されており、ES細胞に対して使用されている類似のプロトコルを適用して、IE由来の細胞をすい臓細胞型および神経細胞型に分化した。加えて、肝細胞型および間葉/中胚葉細胞型をマウスES細胞分化研究からの特定のプロトコルによって誘導した。
【０１２２】
実施例9
マウス胚FL上に増殖しIE由来のクラスタは、アルカリホスファターゼおよびネスチンを補助発現する(段階2)
IE由来のクラスタを、アルカリホスファターゼ活性(ALP)のような未分化状態のES細胞において検出されているマーカータンパク質に関して分析した。ALPは、IE由来のクラスタにおいて14 (図17 D、F,G)から28日間の培養後に、抑制因子または抑制因子+ bFGF + EGFの有無に拘わらずに成長培地におけるFL上で検出された。クラスタ周囲にある単一細胞でさえALPポジティブであった(図17 G)。IE由来のクラスタのALP活性においては、抑制因子(91 %)、抑制因子+ bFGF + EGF (89 %)の適用後にも、および追加因子(85 %、図17 F)なしの制御培養(DMEM)においても、培養後14日間のいずれの場合にも有意な相違は観察されなかった。28日間の培養後、ALP陽性クラスタのパーセンテージ は、すべての培養変異体(データは図示せず)において減少し、変異体間における有意な相違は見られなかった。IE無しのFL細胞は、ALP陽性クラスタを示さなかった(図17 F)。
【０１２３】
ALPに加えて、大部分のクラスタを、中間フィラメントタンパク質ネスチンによって標識した(図17 A,BおよびC,D)。神経芽細胞(図17A)および単極性または双極性ネスチン陽性細胞(図17B,C)を両方共見出した。それらの細胞は、R1 ES細胞から生み出されたネスチン陽性の神経前駆細胞として、類似の染色パターンを示した(Rolletschek らの2001、前出)。これらネスチン陽性クラスタのサイズおよびネスチン陽性細胞数は、分析したすべての変異体において、9〜14日目の培養時点で増加したが、ネスチン陽性細胞の増殖を支持することがわかっている抑制因子、またはLIF+bFGF+EGF、因子の存在下で培養した場合には最も著しく増加した(図17E)。
【０１２４】
実施例10
IE-EB様凝集体はネスチンおよびGFAPを発現した(段階3)
IE-EB由来の細胞特性を調査研究するため、EB由来のクラスタの免疫細胞化学的分析を実施した。IE-EB由来の凝集体をプレーティングした後、単極および双極性ネスチン陽性の神経前駆細胞型(図18 B)を見出した。グリア細胞マーカーGFAPをIE-EB由来の増殖において検出した(図18 C)。Cdx1を、細胞の細胞質において主に発現した(図18A)。免疫蛍光分析の結果は表1に要約した。初代培養(段階2)中、抑制因子および成長因子の追加の無い制御培養(DMEM)においては、抑制因子またはLIF+bFGF+EGFの存在下で生成した培養に比較して(それぞれ60%ネスチン、30%GFAP陽性細胞)、より小さなEBおよびより少ない数の細胞が増殖において見られ、より少量の ネスチン(40%)陽性細胞、およびGFAP (20%)陽性細胞が見出された。Cdx-1を、細胞の90%の細胞質において局在化した(図18A)。
【０１２５】
実施例11
IE由来の細胞(段階1)は神経細胞に分化したが主にすい臓細胞および肝細胞に分化した
FL上で培養したIE由来の細胞を神経、肝系統およびすい臓系統に分化するように誘導した。肝細胞促進HCM培地において14〜28日間の肝分化誘発後のIE由来の細胞は、ネスチン(40〜80 %)、アルブミン(20〜40%)、α-1-アンチトリプシン(40〜50%)、およびサイトケラチン18 (80%)に対してポジティブであった (図19、表2)。さらに、Lumelskyらの14-28日間の変法手順に従った、IE由来の細胞のすい臓系統への分化は、高いパーセンテージの細胞がインシュリンおよびグルカゴンを40〜70%の細胞において発現することを明らかにした(図19、表2)。ネスチン陽性細胞を50〜80%の範囲で検出した。抑制因子およびbFGFのような成長因子の分化培地への追加によって、結果が著しく変化することはなかった。表4から明らかなように、細胞はインシュリンを注目すべきレベルで産生した。
【０１２６】
インシュリンを細胞内および分泌レベルで検出した。
【０１２７】
特定の分化条件を適用することによる神経分化は、個別細胞の最大で70 %までが主にネスチン陽性細胞であることを明らかにした一方、神経細胞への分化は弱く、使用した分化条件下ではグリア細胞を観察できなかった(表2を参照)。
【０１２８】
神経性、すい臓のおよび肝表現型への分化に関しては、FL上での培養後、IE由来の細胞を、PBS1:1における0.2 %のトリプシン(Gibco社): 0.02 %のEDTA(Sigma社)によって解離し(継代番号8〜14)、ECM被覆のカバーガラス付き24マイクロウェルプレートに移した(示したように)。
【０１２９】
神経分化に関しては、IE由来の細胞をポリ-L-オルニチン/ラミニン上にプレーティングし、20 nMのプロゲステロン、100 μMのプトレッシン、1 μg/mlのラミニン、25 μg/mlのインシュリン、30 nMの亜セレン酸ナトリウム (すべてSigma社より)、50 μg/mlのトランスフェリン(Gibco社) (= 「B2」)および5 %のFCSによって補充したDMEM/F12において6日間培養した。培地を2日毎交換し、bFGF (10 ng/ml)およびEGF (20 ng/ml)を毎日加えた。6日間後、神経細胞の分化を、2 %のB27 (Gibco社)および10 %のFCSを有する神経細胞培養用基礎培地によって誘導した(Rolletschek らの2001を参照、前出)。
【０１３０】
すい臓細胞型への分化に関しては、IE由来の細胞をポリ-L-オルニチン/ラミニン上にプレーティングし、「B2」成分、2 %のB27および10 mMのニコチン酸アミド(Sigma社)、Lumelsky らの2001 (前出)によって補充したDMEM/F12において14日間培養した。
【０１３１】
肝細胞型への分化に関しては、IE由来の細胞を、ラットコラーゲンI上にプレーティングし、肝細胞培養培地HCM (Modified Williams E Medium, Clonetics, Cambrex社, ベルギー)において20 %のFCSと共に14日間、それぞれ培養した。
【０１３２】
実施例12
IE-EB (段階3)由来の細胞株は、効果的に神経細胞および間葉/中胚葉細胞に分化した
先ず、異なるECMタンパク質上へプレーティングした後、IE-EB由来の細胞株を、培地IおよびIIにおいて培養することによって、生成した(材料および方法を参照) (表3を参照)。追加因子(n = 2)を持たず、抑制因子(n = 3)、および抑制因子+ bFGF + EGFを持つ基本培地(DMEM)において、最初に培養したいくつかのIE-EB由来の細胞株をそれぞれ生成した(図16 E、Fにおける形態を参照)。神経細胞型、中胚葉細胞型/間葉細胞型、すい臓細胞型および肝細胞型への分化は、特定の分化条件下でES細胞のために樹立したプロトコルを用いて培養することによって誘導した。
【０１３３】
IE-EB由来の細胞の肝細胞型への分化能力を調査研究するため、IE-EB由来の細胞を肝細胞-促進培地においておよそ14日間培養した。ネスチンは、細胞の80 %において発現した。使用した細胞外の基質タンパク質にもよるが、アルブミン発現するIE-EB由来の細胞は、10 (ゼラチン)〜70 (コラーゲンI) % と変動した(表3を参照)。肝分化後にα-1-アンチトリプシン(30-40%)、サイトケラチン18 (80%) (図19、表2)を発現したが、サイトケラチン14および19は見出されなかった。FL + 抑制因子+ bFGF + EGF上での培養に由来する培養において、検討した肝マーカーの発現の最も高いパーセンテージが観察された。
【０１３４】
膵分化培地(B2+B27+NA+5%FCS)におけるIE-EB由来の細胞の19日間の培養は、ネスチン陽性細胞(細胞集団の80 %)の形成、およびラミニン被覆のプレート上で培養すると(表3)、細胞において最大で40 %までのインシュリン発現をする細胞の分化を誘導する一方、ゼラチンはインスリン産生細胞の形成を支持しなかった(表3を参照)。
【０１３５】
IE-EB由来の細胞を、選択分化条件下でさらに培養し、神経系統(Rolletschek らの2001、（前出)に従ったEGM-2-MVおよび分化培地)への分化を促進した。表3および図20において明らかなうように、β-III-チューブリン(最大で40 %)およびペリフェリン(最大で5 %)のようなネスチン(図20)、およびニューロンマーカーによって、細胞の70〜-80 %を標識した。GFAPおよびオリゴデンドロサイト特異タンパク質によって標識されたグリア細胞を、それぞれ最大で60 および5 %標識した(表3)。培地上の神経タンパク質の発現の明らかな依存を見出した。EGM2-MVおよび神経細胞培養用基礎培地+B27によって補充した神経分化培地は、神経細胞およびグリア細胞の分化を強く支持した。初代培養への培養変異体、抑制因子および抑制因子+ bFGF + EGFの追加によって、コントロール(DMEM)群と比較してわずかに高い量の神経細胞が得られることが明らかにされた。
【０１３６】
また、IE-EB由来の細胞は、デスミン(図20)の効果的な分化も示し、また、細胞は中間フィラメントビメンチンに対してポジティブに染色されることも示した。細胞は部分的にデスミンおよびネスチンを同時発現した。
【０１３７】
IE由来のEB様凝集体を、ゼラチン-、ポリ-L-オルニチン/ラミニン(神経分化、膵分化)-およびコラーゲン(肝分化)被覆のカバーガラス付き24マイクロウェルプレート上にプレーティングし、添加剤 (上記参照)、15 %のFCS、抑制因子(10 ng/ml)、フォルスコリン(10 μM)およびbFGF (10 ng/ml)によって補充したDMEMにおいて少なくとも8日間培養した。
【０１３８】
神経分化を、20 nMのプロゲステロン、100 μMのプトレッシン、1 μg/mlのラミニン、25 μg/mlのインシュリン、30 nMの亜セレン酸ナトリウム、50 μg/mlのトランスフェリン(= 「B2」)、5 %のFCS、bFGF、EGF (濃度に関しては、上記参照)によって補充したDMEM/F12を用いて6日間培地変化することによって誘導し、続いて、2 %のB27 サプリメントおよび10 %のFCSを用いて神経細胞培養用基礎培地における分化を行った(上記参照)。
膵分化および肝分化に関しては、IE由来のEBを、「B2」(上記参照)、2 %のB27、10 mMのニコチン酸アミド(上記参照)およびLumelsky らの(前出)に従った5 %のFCSによって補充したDMEM/F12において、および20 %のFCSを有する肝細胞培養培地(HCM)において、14〜19日間それぞれ培養した。間葉/中胚葉細胞への分化に関しては、EB様凝集体をゼラチン被覆のカバーガラス上にプレーティングし、培地II (上記参照)において5 週間培養した。
【０１３９】
実施例13
IE由来の細胞におけるSSEA-1およびプロミニン(prominin)の発現
小腸を調製し、実施例8に記載の方法に類似の方法で支持細胞層上で培養した。支持細胞層上で培養したIE由来の細胞を、初代培養において2日目および5日目に免疫蛍光を行うことによって分析し、SSEA-1- プロミニン(prominin)-、Cdx-1-およびネスチン-特異的抗体(図21 D-O)を用いて免疫標識した。SSEA-1免疫染色を、多能性R1 ES細胞(図21A-C) [Nagy らの(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90, 8424-8428]に対して比較的に分析した。
【０１４０】
IE由来のおよびR1細胞を顕微鏡のスライドガラス上で増殖した。PBSでリンス後、培養は、メタノール: アセトン(7:3)比率を20℃にて10分間用いることによって固定した。トリス緩衝生理食塩水 Tween-20 (TBST; すべてのCdx1染色用)中のヤギ血清(10 %)またはFCS (80 %)を用いて非特異的な標識を抑制した。次のマーカーに対する一次抗体を特定の比率で希釈して用いた: ネスチン(ラット401、1:3)、MC-480 (抗SSEA-1、1:10; 両者ともDevelopmental Studies Hybridoma Bankより、Iowa、米国)、Cdx1 (1: 100、BarbarMeyer医師へのギフト)、プロミニン(prominin) (mAb 13A4、1:300、Denis Corbeil医師およびWieland Huttner医師へのギフト)。Cdx1に対する抗体およびCdx1およびSSEA-1 (1:20)に対する二重染色を4℃にて一晩インキュベートした一方、抗プロミニン(prominin)を除いたすべての他の抗体および抗体の組み合わせを37℃にて60分間インキュベートした。抗プロミニン(prominin)とあいまった二重染色に関しては、Corbeil らの(2000) J. Biol. Chem., 275, 5512-5520に従った次のプロトコルを用いた。細胞をCa/Mg-PBSを用い、最初に室温、次には氷上で洗浄し、30分間、4℃にて、抗プロミニン(prominin)を加えることによって標識化した。未結合抗体は、0.2%のゼラチンを含む氷冷のCa/Mg-PBSを用いて5回洗浄することによって除去した。固視に関しては、細胞を3%のパラホルムアルデヒドを用いて室温にて30分間カバーするか、またはメタノール: アセトン(7:3)を用いて、抗SSEA-1による二重染色を -20℃にて10分間行った。固定液を、Ca/Mg-PBSを用いて3回洗浄することによって除去し、残留固定液を、PBSにおいて0.1 Mのグリシンを用いて、30分間急冷した。次に、細胞を、抗ネスチンおよび抗SSEA-1抗体を記載したとおりに用いてインキュベートした。PBSにおけるリンス(3回)後、適切な蛍光標識二次抗体を用いて細胞を処置した。[SSEA-1:Cy3 ( マウスIgM; プロミニン(prominin): FITC ( ラットIgG; Cdx1: FITC ( ウサギIgG; ネスチン: FITC ( マウスIgG; 比率で希釈、Cyc3 = 1:700、FITC = 1:100]。Hoechst社の33342 (1 μg/ml)を用いて核を標識した。検体を共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM 410、Carl Zeiss社、Jena、ドイツ)で分析した。用いたのは、励起ライン/バリア フィルター: 364nm/450-490BP (Hoechst社の33342)、488nm/510-525BP (FITC)、543nm/ 570LP (Cy3)である。
【０１４１】
データ (図21を参照) は、多能性ES細胞、およびof IE由来の細胞の特定の亜集団が胚幹細胞に特徴的な時期特異的な胚細胞表面抗原SSEA-1によって標識されたことを明らかにを示す。IE由来の細胞の他の亜集団を、SSEA-1およびプロミニン(prominin)によって標識した。プロミニン(prominin)Iは、不斉細胞解離に関与することがわかっている、115 kD膜随伴の糖タンパク質であり、ヒトAC133抗原の相同分子種として特徴付けられている (Corbeil らの 2000, J. Biol. Chem. 275, 5512-5520))。
【０１４２】
また、図22に示したデータは、プロミニン(prominin)陽性細胞が、すい臓系統への培養および分化後にも存在することを実証する。プロミニン(prominin)陽性細胞は、通常、ネスチン特異抗体によって補助標識されない。つまり、本発明は、支持細胞層上での培養中(段階1細胞)、および分化の過程では、IE由来の細胞がプロミニン(prominin)の発現を示し、これらの細胞が自己複製および分化する能力を備えていることを示唆することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】マウスまたはラット腸内の上皮組織(IE由来の幹細胞/前駆細胞)から取り出したIS細胞の分離および培養の一般的な模式図、およびその結果生じた胚様体への凝集を示す
【図２】IE由来の幹細胞/前駆細胞胚様体のさまざまな特定細胞型への分化の一般的な模式図を図示する
【図３】マイトマイシンC-不活化マウス線維芽細胞の支持細胞層上で育てるラットIS細胞コロニーのコロニー形態を示す
【図４】ラット腸内上皮組織から樹立したAP陽性のIS-細胞コロニーを示す
【図５】マウス胚支持細胞上で培養したラット腸内細胞におけるAP陽性コロニーの定量的評価を示す
【図６】主要な腸内上皮組織(IE)における胚幹細胞特定の転写因子Oct-4の発現、異なるサイトカイン/成長因子存在下での支持細胞上のIS由来のコロニー増殖、およびマウスES細胞を示す
【図７】ラットIS細胞の初代培養における胚細胞表面マーカーSSEA-1の発現を示す
【図８】ラット腸内上皮組織から樹立した多分化能を持つEB由来の株細胞の産生および形態を実証する
【図９】ラットIS細胞の胚様体由来の培養の免疫細胞化学的分析を示す
【図１０】インスリン産生細胞への分化を支持する培地におけるラットIS細胞胚様体由来の培養の免疫細胞化学的分析を示す
【図１１】ヒト腸内上皮組織から樹立したAP陽性のIS-細胞コロニーを示す
【図１２ａ】支持細胞層上の培養ヒト腸内上皮組織のAP陽性コロニーの定量的評価を示す(A) 継代4にて13日間培養したヒトIS細胞
【図１２ｂ】支持細胞層上の培養ヒト腸内上皮組織のAP陽性コロニーの定量的評価を示す(B) 継代7にて25日間培養したヒトIS細胞
【図１３】ヒト腸内上皮由来の前駆幹細胞における生殖細胞特異的転写因子Oct-4および細胞外基質分子TRA-1−60の発現を図示する
【図１４】ラット上皮由来の幹細胞/前駆細胞由来の細胞株の核型を示す
【図１５】Cdx1 (A)およびネスチン(B)発現に対するマウスRosa26由来の腸内上皮組織の免疫組織化学的な分析を示す
【図１６】腸内上皮組織(IE)から取り出した多分化能を持つネスチン陽性の前駆細胞の選択的培養および生成の一般的な方法を示す
【図１７】IE由来のクラスタ(段階2)の免疫蛍光および共焦点顕微鏡の分析を示す
【図１８】IE-EB由来の細胞の免疫蛍光分析および共焦点顕微鏡を示す
【図１９】肝系統およびすい臓系統に分化したIE由来細胞の免疫蛍光分析を示す
【図２０】神経系統および中胚葉/間葉系統への選択分化後のIE-EB由来の細胞の免疫蛍光分析を示す
【図２１】IE由来の細胞の初代培養の免疫蛍光研究(第2 〜 5日目)を示す
【図２２】IE由来の細胞の免疫蛍光分析および共焦点顕微鏡を示す
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図９】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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