(57)【要約】  電気穿孔用キュベット内に嵌合し得るべく構成されたキュベット用インサート。各インサートは、孔性メンブレンを保持する支持構造を含む。上記キュベット内に位置されたとき、上記メンブレンはキュベット電極に近接して位置されることで細胞のメンブレン式融合を促進する。一定の見地においては上記支持構造を管部材が貫通延在することで、電極接点およびキュベットもしくはキュベット・ホルダの他の構成要素から離間した好都合な箇所における負圧の付与が可能にされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気穿孔用キュベットからメンブレン式融合用キュベットを生成する電気穿孔キュベット用インサートであって、
上側表面および下側表面を有する孔性メンブレンと、
上記メンブレンを保持する支持構造であって、該支持構造が電気穿孔用キュベットの内壁に確実に整合するに十分な寸法を有し、該支持構造は上記キュベット内に挿入されたときに上記メンブレンの上記下側表面の下方にて該キュベット内で実質的にシールされたチャンバを生成する、支持構造と、
上記メンブレンの上記上側表面に対し且つ上記支持構造を貫通して上方に延在する管部材であって、該管部材の末端に対して負圧が付与されたときに上記キュベットの上記シール・チャンバ内に負圧が生成されることで上記孔性メンブレンの上記上側表面における圧力勾配を生成する、管部材と、
を備えて成る電気穿孔キュベット用インサート。
【請求項２】
前記支持構造および管部材はひとつの一体的構造を形成する、請求項１記載のインサート。
【請求項３】
前記管部材は前記支持構造に取付けられる別体片である、請求項１記載のインサート。
【請求項４】
電気穿孔用キュベットと組み合わされる電気穿孔キュベット用インサートであって、
上側表面および下側表面を有する孔性メンブレンと、
上記メンブレンを保持する支持構造であって、該支持構造は電気穿孔用キュベットの内壁に確実に嵌合するに十分な寸法を有し、該支持構造が上記キュベット内に挿入されたときに上記メンブレンの上記下側表面の下方にて該キュベット内で実質的にシールされたチャンバを生成する、支持構造と、
上記メンブレンの上記上側表面に対し且つ上記支持構造を貫通して上方に延在する管部材であって、該管部材の末端に対して負圧が付与されたときに上記キュベットの上記シール・チャンバ内に負圧が生成されることで上記孔性メンブレンの上記上側表面における圧力勾配を生成する、管部材と、
を備えて成る電気穿孔キュベット用インサート。
【請求項５】
前記支持構造および管部材はひとつの一体的構造を形成する、請求項４記載のインサート。
【請求項６】
前記管部材は前記支持構造に取付けられる別体片である、請求項４記載のインサート。
【請求項７】
底部に近接して外部電極接点を有する電気穿孔用キュベットを配備する段階と、
孔性メンブレンを保持する支持構造と該支持構造を貫通延在する管部材とを有するインサートであって上記電気穿孔用キュベットに嵌合すべく構成されたインサートを配備する段階と、
上記支持構造およびメンブレンの下方に実質的に気密であるチャンバを形成すべく、且つ、上記管部材の端部に対して真空を付与することにより上記チャンバ内の負圧と上記メンブレンの上側表面における圧力勾配とが生成される如く、上記電気穿孔用キュベット内に上記インサートを固定する段階と、
を備えて成る、電気穿孔用キュベットから融合式キュベットを形成する方法。
【請求項８】
前記固定段階は前記キュベット内の所定位置に前記インサートを弾性係止(snapping)する段階を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記固定段階は接着剤を付与して前記キュベット内の所定位置に前記インサートを固定する段階を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記管部材およびインサートは別体片であり、且つ、
前記固定段階は前記支持構造における開口に対して上記管部材を取付ける段階を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記管部材およびインサートはひとつの一体的構造を形成する、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記管部材の末端に対して真空源を取付ける段階を更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記電極は前記メンブレンに近接され、
当該方法は、前記チャンバ内に負圧を生成する段階および上記電極に電位(potential)を印加する段階を更に含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記電位はDC電流である、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、“メンブレン式融合を促進する電気穿孔キュベット用インサート”と称されて2001年12月6日に出願された米国仮特許出願第60/337,097号の特典を主張するが、該仮特許出願の全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は概略的には電気融合および電気穿孔システムに関し、より詳細には電気穿孔システムおよびデバイスを用いて電気融合実験が行われるのを可能にするデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
平行な各電極間に懸架されたメンブレンを用いて細胞を融合することは公知である。言及したことにより全ての目的に対して本明細書中に援用される米国特許第6,221,665号は、細胞間電気融合(cell-cell electrofusion)を行う斯かるひとつのシステムを開示している。開示されたシステムにおいてはメンブレンの下方から穏やかな真空が引かれることから、各細胞は上記メンブレン内へと吸引される。図１に示された如く真空は、たとえばシリンジ30または他の真空生成デバイスを用いてメンブレン20の下方の領域10において生成される。次に各電極間には電位(potential)が印加され、隣接する各細胞の膜は破壊される。細胞機構は、隣接細胞が連続的となる如くそれらを再構成する。これにより、通常方法である誘電泳動(各細胞の膜が隣接する如き、特定の電界内における細胞の移動)を引き起こすAC電流を必要とせずに、融合が引き起こされる。
【０００４】
電気穿孔システムにおける斯かる融合システムは、たとえば該電気穿孔システムのDC電源を用いて実施するのが好適であろう。しかし上述された如き融合システムは典型的な電気穿孔キュベット・システム配置においては有用でない、と言うのも、真空ポートが配置される領域はキュベット電極に対する電気接点と同一の領域に在るからである。故に、電極接点領域に干渉せずに標準的な電気穿孔用キュベットから融合用キュベットを生成する簡素で効率的な手段を提供することが望ましい。
【発明の開示】
【０００５】
発明の簡単な要約
本発明は、電気穿孔用キュベット内に嵌合され得るべく構成されたキュベット用インサートを提供する。各インサートは、孔性メンブレンを保持する支持構造を含む。上記キュベット内に位置されたとき、上記メンブレンはキュベット電極に近接して位置されることで細胞のメンブレン式融合(membrane-based fusion)を促進する。一定の見地においては上記支持構造を管部材が貫通延在することで、電極接点およびキュベットもしくはキュベット・ホルダの他の構成要素から離間した好都合な箇所における負圧の付与が可能にされる。
【０００６】
本発明のひとつの見地に依れば、電気穿孔用キュベットからメンブレン式融合用キュベットを生成する電気穿孔キュベット用インサートが提供される。上記インサートは典型的に、上側表面および下側表面を有する孔性メンブレンと、上記メンブレンを保持する支持構造であって、該支持構造は電気穿孔用キュベットの内壁に確実に整合または嵌合するに十分な寸法を有し、該支持構造が上記キュベット内に挿入されたときに上記メンブレンの上記下側表面の下方にて該キュベット内で実質的にシールされたチャンバを生成する支持構造とを含む。該インサートはまた典型的に、上記メンブレンの上記上側表面に対し且つ上記支持構造を貫通して上方に延在する管部材であって、該管部材の末端に対して負圧が付与されたときに上記キュベットの上記シール・チャンバ内に負圧が生成されることで上記孔性メンブレンの上記上側表面における圧力勾配を生成する管部材も含む。
【０００７】
本発明の別の見地に依れば、電気穿孔用キュベットと組み合わされる電気穿孔キュベット用インサートが提供される。該インサートは典型的に、上側表面および下側表面を有する孔性メンブレンと、上記メンブレンを保持する支持構造であって、該支持構造は電気穿孔用キュベットの内壁に確実に嵌合するに十分な寸法を有し、該支持構造が上記キュベット内に挿入されたときに上記メンブレンの上記下側表面の下方にて該キュベット内で実質的にシールされたチャンバを生成する支持構造とを含む。該インサートはまた典型的に、上記メンブレンの上記上側表面に対し且つ上記支持構造を貫通して上方に延在する管部材であって、該管部材の末端に対して負圧が付与されたときに上記キュベットの上記シール・チャンバ内に負圧が生成されることで上記孔性メンブレンの上記上側表面における圧力勾配を生成する管部材も含む。
【０００８】
本発明の更に別の見地に依れば、電気穿孔用キュベットから融合式キュベット(fusion-based cuvette)を形成する方法が提供される。該方法は典型的には、底部に近接して外部電極接点を有する電気穿孔用キュベットを配備する段階と、孔性メンブレンを保持する支持構造と該支持構造を貫通延在する管部材とを有するインサートであって上記電気穿孔用キュベットに嵌合すべく構成されたインサートを配備する段階と、上記支持構造およびメンブレンの下方に実質的に気密であるチャンバを形成すべく、且つ、上記管部材の端部に対して真空を付与することにより上記チャンバ内の負圧と上記メンブレンの上側表面における圧力勾配とが生成される如く、上記電気穿孔用キュベット内に上記インサートを固定する段階とを含む。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点は、図面、請求項および添付物を含む本明細書の残りの部分を参照すれば明確に理解されよう。本発明の更なる特徴および利点ならびに本発明の種々の実施例の構造および作用は添付図面に関して以下に詳述される。図中において、同様の参照番号は同一のもしくは機能的に類似した要素を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
図２は、電気穿孔用キュベット内でたとえばキュベット用の各電極間に載置され得る本発明の実施例に係るインサート40を示している。該インサートはメンブレン領域50を含むと共にシュノーケル管部材60も包含する。図３に示された如く電気穿孔用キュベット70内に載置されたときにシュノーケル管部材60は好適には、各電極または(おそらくはキュベット・カバーを除く)他のキュベット構成要素のいずれとも干渉しない領域において上記キュベットの上方に隆起する。上記管部材に対し(または上記インサートにおける開口に対して直接的に)、負圧を生成する真空生成デバイス(たとえば真空ポンプ)への更なる接続部を備えた撓曲可能な管接続部材が配備され得る。
【００１１】
融合されるべき細胞は、電気穿孔用媒体と共に上記キュベット内に載置される。真空デバイスは好適にはキュベットの頂部から作用すると共に、上記メンブレンに対して細胞を下方に吸引すべく上記メンブレン領域110の下方に負圧を生成する。次に、(不図示の)各電極には電気穿孔用の電圧が印加される。而して、真空を解除することで各細胞は解放される。
【００１２】
インサート40は好適には、単純な型成形部材(たとえば単一の一体的プラスチック型成形構造)を含む。管部材60は、別体の操作(たとえばインサート40の形成の間に生成されたオリフィス内への管部材60の挿入など)として、または、インサートの形成の一部(たとえばプラスチックなどの非伝導材料を用いる型成形、押出し成形もしくは機械加工など)として取付けられ得る。上記メンブレンは好適には、公知の如くインサート構造の形成の後で取付けられる。一実施例において上記インサートは、標準キュベット内に接合される。たとえば上記インサートは、エポキシ、接着剤もしくは他の取付用配合物もしくは物質を用いてキュベットの内壁に接着されまたは取付けられ得る。別実施例においては、当該特殊型成形キュベット内にインサートを確実に締着すべく所定位置にインサートの弾性嵌装(snapping-in)もしくは容易な接合を可能にする特殊型成形キュベットが配備される。キュベットの内壁内には、当該唇部に対するインサートの着座を可能にする唇部が配備され得る。上記インサートにより基材／メンブレンの下方に生成されるチャンバは、上記シュノーケル管部材の端部にて真空が付与されたときにメンブレン50における十分な負圧勾配を生成すべく実質的に気密とされねばならない。
【００１３】
本発明に係るインサートの形状が変更され得ることを理解すべきである。たとえば所望に応じて各電極の種々の間隔、種々のキュベット形状および／または種々の実験を許容すべく、種々のインサート形状が生成され得る。これに加え、メンブレン領域50のサイズおよび寸法は特定用途に対して所望に応じて変更され得る。上記メンブレンとしてはメッシュ、孔性メンブレンもしくは他の孔性材料が挙げられると共に、孔サイズおよび単位面積当たりの孔の個数は調査される細胞の種類に依存して調節され得る。更に一定の見地においては、キュベットの各電極に電気接続すべく、より局所的な電界が望まれる箇所にてインサートには２個以上の電極が配置(deposit)され得る。配置された各電極の端部はたとえば、上記メンブレンに近接してまたは該メンブレン内に位置されることで、該メンブレン内における細胞に対して局所的電界を提供し得る。
【００１４】
故に本発明のインサートは特に好適に、
(1)標準的な電気穿孔用キュベット内におけるメンブレン式融合を可能にする手段、
(2)干渉構造が殆ど無いたとえばキュベットの頂部などの箇所から真空を引く手段、
(3) たとえば、各電極の種々の間隔に対する種々のインサートなどの順応性(adaptability)、
(4) たとえば、特殊なキュベットに対する弾性嵌合インサート(snap-in inserts)などの使用の容易性、
を提供する。
【００１５】
これに加えて本発明のインサートは本出願と同日に出願された同時係属の米国特許出願第10/[]号(代理人処理番号：002558-066910US)に開示された自動化電気穿孔システムおよび電気穿孔用キュベットにおいて特に有用であるが、該同時係属出願は2001年12月6日に出願された米国仮特許出願第60/337,095号の優先権を主張すると共に両件とも“自動化電気穿孔最適化システム”と称されており、また両件の全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される。
【００１６】
本明細書中に記述された電気穿孔システムおよび融合式キュベットに対して種々のタイミングおよび制御パラメータを決定する技術は、本出願と同日に出願された同時係属の米国特許出願第10/[]号(代理人処理番号：002558-066710US)に見出され得るが、該同時係属出願は2001年12月6日に出願された米国仮特許出願第60/337,103号の優先権を主張すると共に両件とも“電気穿孔機器に対する抵抗回路の安定化およびパルス幅制御システム”と称されており、また両件の全ての開示内容は言及したことにより本明細書中に援用される。
【００１７】
本発明は例示的にかつ特定実施例に関して記述されたが、本発明が開示実施例に限定されないことは理解される。逆に、当業者に自明であろう種々の改変および同様の配置構成を包含することが意図される。たとえば一定の見地においては電極に対しDC電流の印加が好適であるが、指数的波形、正方形波、三角形波、正弦波および異なる波形の任意の組み合わせなどの種々の波形を有する電流もしくは電圧信号が利用され得る。故に添付の各請求項の有効範囲は、斯かる改変および同様の配置構成の全てを包含すべく最も広範囲な解釈に従うべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、先行技術のシステムに係る電気融合チャンバを示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例に係るキュベット用インサートを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例に係るキュベット内のインサートを示す図である。
【図１】
2005511081.tif 000002
【図２】
2005511081.tif 000003
【図３】
2005511081.tif 000004
【国際調査報告】
2005511081.tif 000005