(57)【要約】【課題】多発性骨髄腫（ＭＭ）を診断する方法を提供すること。【解決手段】特定の実施形態では、ＭＭを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照血清試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＭＭの存在を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を、多発性骨髄腫（ＭＭ）の指標とする方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップと
を含み、前記所定のカットオフ値または（ｂ）の前記対照血清試料中の量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、ＭＭの存在を示し、
前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
【請求項２】
（ｉ）前記生体試料が、血清試料である、または
（ｉｉ）前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｉｉｉ）前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｉｖ）ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、もしくはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出され、前記検出システムが、任意選択でＥＬＩＳＡアッセイであるか、もしくはラテラルフローアッセイである、または
（ｖ）前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体を使用して行い、前記ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体が、任意選択でモノクローナル抗体であるか、もしくはポリクローナル抗体である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の指標とする方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、ＭＭについて処置されている対象の集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップと
を含み、（ｂ）の前記処置された集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、ＭＭを有する対象についての生存の可能性の低減を示し、
前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
【請求項４】
（ｉ）前記対象が、ＭＭと診断されている、または
（ｉｉ）前記対象が、ＭＭについての処置を受けている、または
（ｉｉｉ）前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が１０％低減する、または
（ｉｖ）前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が３０％低減する、または
（ｖ）前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が５０％低減する、または
（ｖｉ）前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が７０％低減する、または
（ｖｉｉ）前記生体試料が、血清試料である、または
（ｖｉｉｉ）前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｉｘ）前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｘ）ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、もしくはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出され、前記検出システムが、任意選択でＥＬＩＳＡアッセイであるか、もしくはラテラルフローアッセイである、または
（ｘｉ）前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体を使用して行い、前記ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体が、任意選択でモノクローナル抗体であるか、もしくはポリクローナル抗体である、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を、多発性骨髄腫（ＭＭ）の進行または処置に対する応答の指標とする方法であって、
（ａ）第１の時点における、ＭＭと診断された患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）第２の時点または処置の後における、前記患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップと
を含み、（ａ）の前記生体試料中の前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記多発性骨髄腫が進行していることを示し、（ａ）の前記生体試料中の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＭＭが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示し、
前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
【請求項６】
（ｉ）前記生体試料が、血清試料である、または
（ｉｉ）前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｉｉｉ）前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、または
（ｉｖ）ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、もしくはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出され、前記検出システムが、任意選択でＥＬＩＳＡアッセイであるか、もしくはラテラルフローアッセイである、または
（ｖ）前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体を使用して行い、前記ＢＡＦＦポリペプチドもしくはその断片に特異的な抗体が、任意選択でモノクローナル抗体であるか、もしくはポリクローナル抗体である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者において多発性骨髄腫を検出し、診断し、生存を予測し、病期分類し、またはモニターするためのキットであって、患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルを決定するのに適した試薬を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清であり、
（ｉ）前記キットは、任意選択でＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を含み、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、任意選択でモノクローナル抗体であるか、もしくはポリクローナル抗体である、または
（ｉｉ）前記キットは、ＥＬＩＳＡアッセイを含む、または
（ｉｉｉ）前記キットは、ラテラルフローアッセイを含む、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月８日に出願された米国仮特許出願第６１／７６２，７５３号における米国特許法§１１９（ｅ）の下で優先権の利益を請求する。上記出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の組成物および方法は一般に、がんの診断、予後予測、およびモニタリングのためのバイオマーカーの検出に関する。特に、本発明は、多発性骨髄腫の診断、予後予測、およびモニタリングのためのＢ細胞成熟抗原の検出のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７、また、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはＣＤ２６９とも命名される）は、Ｔ細胞腫瘍系において最初に同定され（Ｌａａｂｉら、１９９２年）、それに続いてこれらが成熟するにつれＢリンパ球において発現することが示された（Ｌａａｂｉら、１９９４年）受容体である。ＢＣＭＡリガンドは、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）およびＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド；ＴＮＦＳＦ１３）を含む（Ｒｅｎｎｅｒｔら、２０００年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０００年）。多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系において、これらのリガンドは、細胞増殖経路を活性化し、抗アポトーシスタンパク質をアップレギュレートする（Ｍｏｒｅａｕｘら、２００４年）。両方のリガンドはまた、受容体ＴＡＣＩ（膜貫通活性化物質およびＣＡＭＬ相互作用物質；ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）を結合する（Ｇｒｏｓｓら、２０００年；Ｗｕら、２０００年；Ｙｕら、２０００年）。さらに、ＢＡＦＦは、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦＲ；ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）と称される第３の受容体に結合し、一方、ＡＰＲＩＬは、これに結合しない（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００１年；Ｄａｙら、２００５年）。リガンドであるＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬは、腫瘍壊死ファミリー（ＴＮＦ）のメンバーであり、これらの受容体へのＴＮＦメンバーの結合は、アポトーシス、分化または増殖をもたらし得る（Ｓｍｉｔｈら、１９９４年）。ＴＮＦファミリーメンバーは、オートクリン、パラクリンおよびエンドクリン機序を介して作用する（Ｓｍｉｔｈら、１９９４年）。
【０００４】
ＢＡＦＦを過剰発現しているトランスジェニックマウスは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のＴＡＣＩ欠損を提示する症状であり、Ｂ細胞の異常増殖および血清免疫グロブリン（Ｉｇ）のレベルの増加を示す（ＭｃＫａｙら、１９９９年；Ｙａｎら、２００１年；Ｇｒｏｏｍら、２００２年；Ｓｅｓｈａｓａｙｅｅら、２００３年）。ＡＰＲＩＬ欠損マウスは、Ｂ細胞またはＴ細胞の異常を示さない（Ｖａｒｆｏｌｏｍｅｅｖら、２００４年）。ＢＣＭＡ欠損マウスは、正常な末梢性のＢリンパ球が発生し、これらの免疫応答はインタクトなままである（Ｘｕ  ＆  Ｌａｍ、２００１年）。
【０００５】
血清ＢＡＦＦレベルは、自己免疫疾患およびリンパ腫を有する患者において上昇することが報告されている（Ｃｈｅｅｍａら、２００１年；Ｚｈａｎｇら、２００１年；Ｏｋｉら、２００５年）。ＢＣＭＡは、形質細胞系において細胞内にあることが示されてきた（Ｌａａｂｉら、１９９２年、１９９４年）。ＢＣＭＡの表面発現は、ヒト扁桃腺Ｂ細胞（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０００年）、およびヒトＣＤ１３８発現ＭＭ細胞（Ｎｏｖａｋら、２００４年）上に見出された。ホジキンリンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）患者からの悪性細胞はまた、このタンパク質を発現している（Ｅｌｓａｗａら、２００６年；Ｃｈｉｕら、２００７年）。しかし、ＢＣＭＡの血清レベルは、どのような疾患においても従前に報告されてこなかった。
【０００６】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、リンパ系において発生する血液がんの１タイプである。白血病およびリンパ腫協会は、２０１１年において、約５０２，９４３人がＮＨＬを抱えながら生活しており、または寛解期（疾患の徴候なし）にあると推定している。多くの他のがんと同様に、ＮＨＬの発病率は年齢と共に増加する。国立がん研究所は、約７０，０００件の新規な症例が２０１２年に診断を受けると推定している。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、成人の最も一般なタイプの白血病である。小児は、ＣＬＬを発症しない。ＣＬＬの発病率は、５０歳以上の人の間で有意に増加する。少数の成人は、３０歳代および４０歳代において診断される。白血病およびリンパ腫協会は、約１０５，０００人がＣＬＬを抱えながら生活しており（またはＣＬＬの寛解期）、約１４，５００人が米国において２０１１年にＣＬＬと診断されたと推定している。
【０００７】
多発性骨髄腫はまた、よく見られる血液がんであり、全てのがんの概ね１％および全てのがん死亡の２％を表す。多発性骨髄腫の発症のピーク年齢は、６５〜７０歳であるが、最近の統計は発病率の増加および発症年齢の早期化の両方を示す。概ね１００，０００人の米国人が現在骨髄腫を有し、米国がん協会は、概ね２２，０００件の骨髄腫の新規な症例が米国において毎年診断されていると推定している。
【０００８】
Ｂ細胞成熟抗原は、正常および悪性のＢ細胞の表面上に発現する（Ｌａａｂｉら、１９９２年、１９９４年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０００年；Ｎｏｖａｋら、２００４年）。ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬを診断するために使用される大部分の細胞表面マーカーは、関連性のある患者集団の大きなセグメントにおいて上昇せず、または確実に発現されない。例えば、正常および悪性のＢ細胞上に存在する１つの表面受容体であるインターロイキン（ＩＬ）−６受容体は、ＭＭ患者の血清において（Ｊｏｎｅｓら、２００１年）上昇するが、しかし患者の概ね１５％においてのみ上昇することが示されてきた（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、２０１２年）。β２ミクログロブリン（Ｓｉｍｏｎｓｓｏｎ  Ｂら、１９８０年）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）（Ｋａｌｌａｎｄｅｒ  ＣＦＲら、１９８４年）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（Ｌｅｅ  Ｊら、１９８７年）、可溶性ＣＤ２３（Ｓａｒｆａｔｉ  Ｍら、１９８８年）、可溶性ＣＤ２７（Ｖａｎ  Ｏｅｒ’ｓ  ＭＨＪら、１９９３年）およびＩＣＡＭ−Ｉ（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｉら、１９９４年）を含めたＣＬＬのいくつかの血清マーカーは、臨床病期に正に相関することが報告されてきたが、さらに評価する必要がある。研究を行い、ＮＨＬにおける血清分子の臨床的意義を評価した。結果は、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、またはＣＸＣＬ１３が、Ｂ−ＮＨＬおよびＶＥＧＦにおけるリスクが２．８倍から５．５倍増加し、ｂＦＧＦがＢ−ＮＨＬにおける重要な予後因子であることが見出されたことを示す（Ｂｅｎｂｏｕｂｋｅｒ  Ｌら、２０００年）。ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびｓＴＮＦ−Ｒ１、ｓＴＮＦ−Ｒ２のレベルの上昇は、ＮＨＬのリスクの増加と有意に関連した。（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｍ．  Ｐ．ら、２０１１年）。しかし、これらの分子は、ＮＨＬ特異的な診断または予後予測のマーカーではない。
【０００９】
骨髄（ＢＭ）に基づいた悪性腫瘍の場所を評価することにおける困難、および異なるＢＭ部位内での悪性細胞の不均一な関与によって、ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ腫瘍量の測定は間接的であり、したがって、治療に対する応答は決定が困難であることが多い。血液および尿中のモノクローナルＩｇレベルに加えて、ＭＭ腫瘍量を決定するために使用される現存する血液マーカーは、ヘモグロビン、尿素窒素、カルシウム、アルブミン、クレアチニン、単クローン性タンパク質、ベータ−２ミクログロブリン（β２Ｍ）、ＩＬ−６、Ｃ反応性タンパク質、可溶性ＩＬ−６受容体、乳酸デヒドロゲナーゼ、チミジンキナーゼ、およびａ１−アンチトリプシンを含む（Ｋｙｌｅ、１９９４年）。しかし、これらのマーカーはＭＭ細胞によって直接生じず、したがって信頼できない。さらに、現存するマーカーは、恐らく多くの他の非悪性細胞タイプにおけるこれらの広範な存在によって、処置に対する患者の応答をモニターするためにさらにより有用でない（Ｊｏｎｅｓら、２００１年）。このように、現存するマーカーは、ＭＭ、ＣＬＬおよびＮＨＬのための抗がん処置に対する応答の信頼できる診断または予測の判断材料であると証明されてこなかった（Ｋｙｌｅ、１９９４年）。
【００１０】
したがって、当技術分野には、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、および非ホジキンリンパ腫の信頼できる診断用、予後予測用、および処置をモニターするバイオマーカーが欠損している。さらに、現存するバイオマーカーは、抗がん処置に対する応答と、または疾患の程度もしくは重症度と良好に相関しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は一般に、がん、例えば、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を確実に再現性よく診断および／またはモニターするための組成物および方法を提供する。培養したＢＭＭＣの上清、および患者の血清中のＢＣＭＡおよびＢＡＦＦのレベルを、検出し、かつ／または測定し、ベースラインもしくは対照に対して比較し、対象においてＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを確実に再現性よく診断することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）を診断する方法を提供する。特定の実施形態では、ＭＭを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照血清試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＭＭの存在を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００１３】
様々な実施形態では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を診断する方法を提供する。特定の実施形態では、慢性ＣＬＬを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照血清試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＣＬＬの存在を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００１４】
様々な実施形態では、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を診断する方法を提供する。ある種の実施形態では、ＮＨＬを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照血清試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＮＨＬの存在を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００１５】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００１６】
ある種の実施形態では、ＢＣＭＡ断片は、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである。
【００１７】
さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００１８】
特定の実施形態では、検出は、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００１９】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法を提供する。ある種の実施形態では、ＭＭを有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、ＭＭについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＭＭを有する対象についての生存の可能性の低減を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００２０】
様々な実施形態では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法を提供する。ある種の実施形態では、ＣＬＬを有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、ＣＬＬについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＣＬＬを有する対象についての生存の可能性の低減を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００２１】
様々な実施形態では、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法を提供する。ある種の実施形態では、ＮＨＬを有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、ＮＨＬについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＮＨＬを有する対象についての生存の可能性の低減を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００２２】
特定の実施形態では、対象は、ＭＭと診断されている。さらなる実施形態では、対象は、ＭＭについての処置を受けている。
【００２３】
ある種の実施形態では、対象は、ＣＬＬと診断されている。さらなる実施形態では、対象は、ＣＬＬと診断されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＨＬと診断されている。関連する実施形態では、対象は、ＮＨＬと診断されている。
【００２５】
特定の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が１０％低減する。ある種の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が３０％低減する。ある種の特定の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が５０％低減する。他の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が７０％低減する。
【００２６】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００２７】
ある種の実施形態では、ＢＣＭＡ断片は、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである。
【００２８】
さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００２９】
特定の実施形態では、検出は、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００３０】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。特定の実施形態では、ＭＭの進行または処置に対する応答をモニターする方法は、（ａ）第１の時点における、ＭＭと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップであって、（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記多発性骨髄腫が進行していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＭＭが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００３１】
様々な実施形態では、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。ある種の実施形態では、ＣＬＬの進行または処置に対する応答をモニターする方法は、（ａ）第１の時点における、ＣＬＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップであって、（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記ＣＬＬが進行していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＣＬＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００３２】
様々な実施形態では、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。関連する実施形態では、ＮＨＬの進行または処置に対する応答をモニターする方法は、（ａ）第１の時点における、ＮＨＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップであって、（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記ＮＨＬが進行していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＮＨＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００３３】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００３４】
ある種の実施形態では、ＢＣＭＡ断片は、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである。
【００３５】
さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００３６】
特定の実施形態では、検出は、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００３７】
様々な実施形態では、患者において多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を検出し、診断し、生存を予測し、病期分類し、またはモニターするためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルを決定するのに適した試薬を含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００３８】
特定の実施形態では、キットは、ＢＣＭＡに特異的な抗体を含む。ある種の実施形態では、キットは、モノクローナル抗体である、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を含む。さらなる実施形態では、キットは、ポリクローナル抗体である、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を含む。
【００３９】
他の実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡアッセイを含む。他の関連する実施形態では、キットは、ラテラルフローアッセイを含む。
【００４０】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を診断する方法を提供する。ある種の実施形態では、方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照血清試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの存在を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００４１】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００４２】
ある種の実施形態では、ＢＡＦＦ断片は、切断されたＢＡＦＦポリペプチドである。
【００４３】
さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００４４】
特定の実施形態では、検出は、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００４５】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の処置された集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象についての生存の可能性の低減を示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００４６】
特定の実施形態では、対象は、ＭＭと診断されている。さらなる実施形態では、対象は、ＭＭについての処置を受けている。
【００４７】
ある種の実施形態では、対象は、ＣＬＬと診断されている。さらなる実施形態では、対象は、ＣＬＬと診断されている。
【００４８】
いくつかの実施形態では、対象は、ＮＨＬと診断されている。関連する実施形態では、対象は、ＮＨＬと診断されている。
【００４９】
特定の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が１０％低減する。ある種の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が３０％低減する。ある種の特定の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が５０％低減する。他の実施形態では、対象は、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が７０％低減する。
【００５０】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００５１】
ある種の実施形態では、ＢＡＦＦ断片は、切断されたＢＡＦＦポリペプチドである。
【００５２】
さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００５３】
特定の実施形態では、検出は、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００５４】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。ある種の実施形態では、方法は、（ａ）第１の時点における、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップであって、（ａ）の生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記多発性骨髄腫が進行していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示すステップとを含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００５５】
特定の実施形態では、生体試料は、血清試料である。ある種の実施形態では、生体試料は、対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である。ある種の特定の実施形態では、生体試料は、対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００５６】
ある種の実施形態では、ＢＡＦＦ断片は、切断されたＢＡＦＦポリペプチドである。
【００５７】
さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片は、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出する。さらなる実施形態では、検出システムは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイである。
【００５８】
特定の実施形態では、検出は、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う。ある種の実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、モノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００５９】
様々な実施形態では、患者において多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を検出し、診断し、生存を予測し、病期分類し、またはモニターするためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルを決定するのに適した試薬を含み、生体試料は、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である。
【００６０】
ある種の実施形態では、キットは、ＢＡＦＦに特異的な抗体を含む。他の実施形態では、キットは、モノクローナル抗体である、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を含む。関連する実施形態では、キットは、ポリクローナル抗体である、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を含む。
【００６１】
他の実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡアッセイを含む。さらなる実施形態では、キットは、ラテラルフローアッセイを含む。
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
多発性骨髄腫（ＭＭ）を診断する方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、前記所定のカットオフ値または（ｂ）の前記対照血清試料中の量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＭＭの存在を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目２）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を診断する方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、前記所定のカットオフ値または（ｂ）の前記対照血清試料中の量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＣＬＬの存在を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目３）
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を診断する方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、前記所定のカットオフ値または（ｂ）の前記対照血清試料中の量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＮＨＬの存在を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目４）
前記生体試料が、血清試料である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＢＣＭＡ断片が、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記検出を、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
多発性骨髄腫（ＭＭ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、ＭＭについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の前記処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＭＭを有する対象についての生存の可能性の低減を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目１５）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と、ＣＬＬについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の前記処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＣＬＬを有する対象についての生存の可能性の低減を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目１６）
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出したＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の前記量と、ＮＨＬについて処置されている対象の集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の前記処置された集団におけるＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の前記中央値または対応する量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＮＨＬを有する前記対象についての生存の可能性の低減を示すステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である方法。
（項目１７）
前記対象が、ＭＭと診断されている、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記対象が、ＭＭについての処置を受けている、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記対象が、ＣＬＬと診断されている、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記対象が、ＣＬＬについての処置を受けている、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記対象が、ＮＨＬと診断されている、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
前記対象が、ＮＨＬについての処置を受けている、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
前記対象が、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が１０％低減する、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記対象が、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が３０％低減する、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記対象が、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が５０％低減する、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記対象が、中央レベルのＢＣＭＡポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が７０％低減する、項目１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記生体試料が、血清試料である、項目１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記ＢＣＭＡ断片が、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである、項目１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目１４から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記検出を、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目１４から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
多発性骨髄腫（ＭＭ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法であって、
（ａ）第１の時点における、ＭＭと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）第２の時点または処置の後における、前記患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した前記量とを比較するステップであって、（ｂ）の前記生体試料中の前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記多発性骨髄腫が進行していることを示し、（ａ）の前記生体試料中の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＭＭが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目３８）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法であって、
（ａ）第１の時点における、ＣＬＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）第２の時点または処置の後における、前記患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した前記量とを比較するステップであって、（ｂ）の前記生体試料中の前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記ＣＬＬが進行していることを示し、（ａ）の前記生体試料中の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＣＬＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目３９）
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法であって、
（ａ）第１の時点における、ＮＨＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）第２の時点または処置の後における、前記患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において検出した前記量と、ステップ（ｂ）において検出した前記量とを比較するステップであって、（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の前記量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記ＮＨＬが進行していることを示し、（ａ）の前記生体試料中の前記量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＮＨＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示すステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である方法。
（項目４０）
前記生体試料が、血清試料である、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ＢＣＭＡ断片が、切断されたＢＣＭＡポリペプチドである、項目３７から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
前記検出を、ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
患者において多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を検出し、診断し、生存を予測し、病期分類し、またはモニターするためのキットであって、患者から得た生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片のレベルを決定するのに適した試薬を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、キット。
（項目５１）
ＢＣＭＡに特異的な抗体を含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目５１に記載のキット。
（項目５３）
ＢＣＭＡポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目５１に記載のキット。
（項目５４）
ＥＬＩＳＡアッセイを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５５）
ラテラルフローアッセイを含む、項目５０に記載のキット。
（項目５６）
多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を診断する方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、所定のカットオフ値または対照血清試料中で検出した量とを比較するステップであって、前記所定のカットオフ値または（ｂ）の前記対照血清試料中の量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたは断片の増加した量が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの存在を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目５７）
前記生体試料が、血清試料である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目５６から５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目５６から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する、または有することが疑われる対象の生存についての予後予測の方法であって、
（ａ）対象から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出した前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルの中央値とを比較するステップであって、（ｂ）の前記処置された集団におけるＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の中央値または対応する量と比較した（ａ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の増加した量が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象についての生存の可能性の低減を示す、ステップと
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目６７）
前記対象が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断されている、項目６６に記載の方法。（項目６８）
前記対象が、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについての処置を受けている、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が１０％低減する、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が３０％低減する、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が５０％低減する、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
前記対象が、中央レベルのＢＡＦＦポリペプチドを有する対象の生存と比較して、生存の可能性が７０％低減する、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
前記生体試料が、血清試料である、項目６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目６６から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目６６から７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の進行または処置に対する応答をモニターする方法であって、
（ａ）第１の時点における、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｂ）第２の時点または処置の後における、前記患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量を検出するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップであって、（ａ）の前記生体試料中の前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の増加した量が、前記多発性骨髄腫が進行していることを示し、（ａ）の前記生体試料中の量と比較した（ｂ）の前記生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片の減少した量が、前記ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示す、ステップと、
を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、方法。
（項目８３）
前記生体試料が、血清試料である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記生体試料が、前記対象の骨髄単核細胞の培養物から得た上清である、項目８２に記載の方法。
（項目８５）
前記生体試料が、前記対象の末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、項目８２に記載の方法。
（項目８６）
ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片が、免疫組織化学、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイ、またはストリップアッセイからなる群から選択される検出システムを使用して検出される、項目８２から８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記検出システムが、ＥＬＩＳＡアッセイである、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記検出システムが、ラテラルフローアッセイである、項目８６に記載の方法。
（項目８９）
前記検出を、ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体を使用して行う、項目８２から８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
患者において多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫を検出し、診断し、生存を予測し、病期分類し、またはモニターするためのキットであって、患者から得た生体試料中のＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片のレベルを決定するのに適した試薬を含み、前記生体試料が、血清試料、または前記対象の骨髄単核細胞もしくは末梢血単核細胞の培養物から得た上清である、キット。
（項目９３）
ＢＡＦＦに特異的な抗体を含む、項目９９に記載のキット。
（項目９４）
ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、モノクローナル抗体である、項目１００に記載のキット。
（項目９５）
ＢＡＦＦポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体が、ポリクローナル抗体である、項目１００に記載のキット。
（項目９６）
ＥＬＩＳＡアッセイを含む、項目９９に記載のキット。
（項目９７）
ラテラルフローアッセイを含む、項目９９に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＢＭ単核細胞（ＭＣ）における膜結合ＢＣＭＡの検出のためのフローサイトメトリー分析を示す。ＢＭＭＣを、ヤギ抗ヒトＢＣＭＡ  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または対照ヤギＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に４℃にて一晩インキュベートした。細胞を洗浄し、ＢＣＭＡを検出するためにＦＩＴＣとコンジュゲートしたウサギ抗ヤギＡｂを試料に加えた（２時間）。細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を伴うＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００血球計算器を使用してフローサイトメトリー分析を完了した。フローサイトメトリー結果の統計解析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＣＸＰソフトウェアを使用して、ＢＣＭＡを発現している細胞の割合で完了した。
【００６３】
【図２Ａ】図２は、ＭＭ患者からの培養したＢＭＭＣからの上清においてＢＣＭＡが見出されたことを示す。Ａ）ＢＭＭＣを７２時間培養し、上清を集め、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡを行った。活性ＭＭを有する患者は、緩徐進行型多発性骨髄腫（ＭＭ）、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を有する患者、または健康な対照より著しくより高いＢＣＭＡレベルを有した。Ｂ）軽鎖染色によって決定した悪性細胞を有する患者の高い百分率は、これらの培養培地において高濃度のＢＣＭＡを示し、一方では、僅かな軽鎖に制限される細胞を有する患者は、これらの培養培地において低いＢＣＭＡレベルを有した（当初の拡大率９１００）。グラフ化したデータは、３つの反復試験片を使用した平均値±平均値の標準誤差である。
【図２Ｂ】図２は、ＭＭ患者からの培養したＢＭＭＣからの上清においてＢＣＭＡが見出されたことを示す。Ａ）ＢＭＭＣを７２時間培養し、上清を集め、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡを行った。活性ＭＭを有する患者は、緩徐進行型多発性骨髄腫（ＭＭ）、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）を有する患者、または健康な対照より著しくより高いＢＣＭＡレベルを有した。Ｂ）軽鎖染色によって決定した悪性細胞を有する患者の高い百分率は、これらの培養培地において高濃度のＢＣＭＡを示し、一方では、僅かな軽鎖に制限される細胞を有する患者は、これらの培養培地において低いＢＣＭＡレベルを有した（当初の拡大率９１００）。グラフ化したデータは、３つの反復試験片を使用した平均値±平均値の標準誤差である。
【００６４】
【図３】図３は、可溶性ＢＣＭＡが、ＭＭ患者の血清中に見出され、疾患状況および全生存期間と相関することを示す。Ａ）未処置の多発性骨髄腫（ＭＭ）患者は、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）患者および正常な対照と比較して、有意により高い血清ＢＣＭＡレベルを有した（それぞれ、Ｐ＝０．０１５７、Ｐ＜０．０００１）。Ｂ）応答患者からの血清ＢＣＭＡレベルは、進行性疾患を有する患者と比較して低かった（Ｐ＝０．００３８）。Ｃ）中央値（１０．８５ｎｇ／ｍＬ）超のＢＣＭＡレベルを有するＭＭ患者のカプラン−マイヤー全生存期間は、中央値未満の量を有するものと比較して生存の短縮を示した。複数のＢＣＭＡレベルを有する個々の患者は、それらの最初の評価のときから分析した。グラフ化したデータは、三連での試料操作のものであり、中央値として提示する。
【００６５】
【図４】図４は、血清ＢＣＭＡレベルと上清ＢＣＭＡ濃度との相関を示す。Ｃｏｒｖａｃ（商標）血清セパレーターチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）からの血清は、遠心分離によって単離し、−８０℃にて貯蔵した。ＢＭ吸引液をヘパリン処置したチューブ中に集め、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって密度勾配遠心分離を使用してＭＣを単離した。細胞を、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００単位／ｍＬのペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ）中で３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。ＭＭ患者からのＢＭ吸引液からのＭＣを７２時間培養した後に、上清を集めた。
【００６６】
【図５−１】図５は、血清ＢＣＭＡレベルの変化が、抗ＭＭ処置に応答した個々の患者の臨床状況の変化と相関することが見出されたことを示す。個々のＭＭ患者の処置の過程において、血清ＢＣＭＡレベルをＥＬＩＳＡで測定し、グラフ化した。１人の患者（２０１５）において、未処置のＭＭ患者の血清ＢＣＭＡレベルは、個体が部分応答（ＰＲ）または完全応答（ＣＲ）を達成した後で減少したことが見出された。患者が進行性疾患（ＰＤ）を発症したとき、患者の血清ＢＣＭＡレベルは増加した。
【図５−２】図５は、血清ＢＣＭＡレベルの変化が、抗ＭＭ処置に応答した個々の患者の臨床状況の変化と相関することが見出されたことを示す。個々のＭＭ患者の処置の過程において、血清ＢＣＭＡレベルをＥＬＩＳＡで測定し、グラフ化した。１人の患者（２０１５）において、未処置のＭＭ患者の血清ＢＣＭＡレベルは、個体が部分応答（ＰＲ）または完全応答（ＣＲ）を達成した後で減少したことが見出された。患者が進行性疾患（ＰＤ）を発症したとき、患者の血清ＢＣＭＡレベルは増加した。
【図５−３】図５は、血清ＢＣＭＡレベルの変化が、抗ＭＭ処置に応答した個々の患者の臨床状況の変化と相関することが見出されたことを示す。個々のＭＭ患者の処置の過程において、血清ＢＣＭＡレベルをＥＬＩＳＡで測定し、グラフ化した。１人の患者（２０１５）において、未処置のＭＭ患者の血清ＢＣＭＡレベルは、個体が部分応答（ＰＲ）または完全応答（ＣＲ）を達成した後で減少したことが見出された。患者が進行性疾患（ＰＤ）を発症したとき、患者の血清ＢＣＭＡレベルは増加した。
【００６７】
【図６】図６は、最も高い四分位値（２５％）の血清ＢＣＭＡレベルを有するＭＭ患者のカプラン−マイヤー生存は、残りの患者より短かったことを示す。ＭＭ患者（ｎ＝１６２）の中で、最も高い四分位値（＞２４．５６ｎｇ／ｍＬ）のＢＣＭＡレベルを有するものは、患者の残りと比較して著しく短い全生存期間を示した。
【００６８】
【図７−１】図７は、ポリクローナル遮断抗体およびモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（Ａｂ）が、ＭＭ血清中のＢＣＭＡの存在を確認することを示す。Ａ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしたときに、ＢＣＭＡ標準物質は、検出不能であった（左パネル）。（同じ高濃度での）アイソタイプを一致させた対照ヤギＡｂ、または遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを伴わずにインキュベートしたＢＣＭＡ標準物質は、ＢＣＭＡの検出に対して何らの影響を有さなかった（左パネル）。遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを１０分の１の濃度で使用したとき、高濃度のＢＣＭＡ標準物質のみが検出可能であった（右パネル）。ＢＣＭＡ標準物質をポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしなかったとき、ＢＣＭＡを検出した（右パネル）。Ｂ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＭＭ患者１０５６の無希釈および希釈した（１：１６まで）血清からのＢＣＭＡを遮断した。対照的に、遮断抗体の非存在下での同じ患者からの血清においてＢＣＭＡを検出したが、これは段階希釈によって減少した。Ｃ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、ＢＣＭＡ標準物質を検出し（下のパネル）たが、レベルのパターンは、ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを使用したときに得たものと同様であった（上のパネル）。Ｄ）ポリクローナルＡｂ（左パネル）を使用した、未処置であったＭＭ患者（１４２９）、ＶＧＰＲ（１７６４）またはＣＲ（１００４）またはＭＧＵＳ個体（１７２５）からのＢＣＭＡレベルのパターンは、モノクローナルＡｂによって得た結果（右パネル）と同様のパターンを示した。
【図７−２】図７は、ポリクローナル遮断抗体およびモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（Ａｂ）が、ＭＭ血清中のＢＣＭＡの存在を確認することを示す。Ａ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしたときに、ＢＣＭＡ標準物質は、検出不能であった（左パネル）。（同じ高濃度での）アイソタイプを一致させた対照ヤギＡｂ、または遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを伴わずにインキュベートしたＢＣＭＡ標準物質は、ＢＣＭＡの検出に対して何らの影響を有さなかった（左パネル）。遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを１０分の１の濃度で使用したとき、高濃度のＢＣＭＡ標準物質のみが検出可能であった（右パネル）。ＢＣＭＡ標準物質をポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしなかったとき、ＢＣＭＡを検出した（右パネル）。Ｂ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＭＭ患者１０５６の無希釈および希釈した（１：１６まで）血清からのＢＣＭＡを遮断した。対照的に、遮断抗体の非存在下での同じ患者からの血清においてＢＣＭＡを検出したが、これは段階希釈によって減少した。Ｃ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、ＢＣＭＡ標準物質を検出し（下のパネル）たが、レベルのパターンは、ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを使用したときに得たものと同様であった（上のパネル）。Ｄ）ポリクローナルＡｂ（左パネル）を使用した、未処置であったＭＭ患者（１４２９）、ＶＧＰＲ（１７６４）またはＣＲ（１００４）またはＭＧＵＳ個体（１７２５）からのＢＣＭＡレベルのパターンは、モノクローナルＡｂによって得た結果（右パネル）と同様のパターンを示した。
【図７−３】図７は、ポリクローナル遮断抗体およびモノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（Ａｂ）が、ＭＭ血清中のＢＣＭＡの存在を確認することを示す。Ａ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしたときに、ＢＣＭＡ標準物質は、検出不能であった（左パネル）。（同じ高濃度での）アイソタイプを一致させた対照ヤギＡｂ、または遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを伴わずにインキュベートしたＢＣＭＡ標準物質は、ＢＣＭＡの検出に対して何らの影響を有さなかった（左パネル）。遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを１０分の１の濃度で使用したとき、高濃度のＢＣＭＡ標準物質のみが検出可能であった（右パネル）。ＢＣＭＡ標準物質をポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂと共にインキュベートしなかったとき、ＢＣＭＡを検出した（右パネル）。Ｂ）ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）は、ＭＭ患者１０５６の無希釈および希釈した（１：１６まで）血清からのＢＣＭＡを遮断した。対照的に、遮断抗体の非存在下での同じ患者からの血清においてＢＣＭＡを検出したが、これは段階希釈によって減少した。Ｃ）モノクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、ＢＣＭＡ標準物質を検出し（下のパネル）たが、レベルのパターンは、ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂを使用したときに得たものと同様であった（上のパネル）。Ｄ）ポリクローナルＡｂ（左パネル）を使用した、未処置であったＭＭ患者（１４２９）、ＶＧＰＲ（１７６４）またはＣＲ（１００４）またはＭＧＵＳ個体（１７２５）からのＢＣＭＡレベルのパターンは、モノクローナルＡｂによって得た結果（右パネル）と同様のパターンを示した。
【００６９】
【図８】図８は、ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスから取り出したヒトＭＭ異種移植片における抗ＢＭＣＡ抗体による陽性の免疫組織化学染色を示す。Ｍｉｃｒｏｓｕｉｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｉｔｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１）を使用して、スライド（当初の拡大率×１００）を分析した。
【００７０】
【図９】図９は、ＢＣＭＡが腫瘍担持マウスにおいて成長している生きたＭＭ細胞によって生成されることを示す。観察された血清ＢＣＭＡが死んだＭＭ細胞からの膜結合ＢＣＭＡの結果であったかを決定するために、１０００ｍｍ３のＬＡＧκ−２腫瘍を担持するマウスに、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔ）を０．７５ｍｇ／ｋｇで、およびシクロホスファミド（ｃｙ）を１０ｍｇ／ｋｇで投与した。処置の１２時間後に、ヒトＢＣＭＡのレベルを決定した。Ａ）ＬＡＧκ−２担持マウスの腫瘍容積は、未処置のマウスと比較したとき、著しくより小さかった（Ｐ＝０．０００６）。Ｂ）ＬＡＧκ−２担持マウスにおける血清ＢＣＭＡレベルはまた、未処置のマウスと比較したとき、著しくより低かった（Ｐ＜０．０００１）。
【００７１】
【図１０】図１０は、ＬＡＧλ−１ＭＭ腫瘍を担持し、メルファランで処置される重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスが、腫瘍サイズ、ＩｇＧレベル、および血清ヒトＢＣＭＡレベルが有意に低減することを示す。ＩｇＧλタイプの分泌性疾患を示すこのヒトＭＭ異種移植片モデルを担持するマウスに、メルファラン（３ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．注射によって週２回投与した。Ａ）未処置のＳＣＩＤマウス（ｎ＝４）は、大きな腫瘍容積を有し、一方では、メルファラン処置したマウス（ｎ＝７）は、小さな腫瘍容積を有した（Ｐ＜０．０００１）。Ｂ）血清ＩｇＧのレベルは、対照と比較したときに、薬物処置したマウスにおいて有意に低減した（Ｐ＝０．００３３）。Ｃ）血清ＢＣＭＡのレベルは、対照と比較したときに、薬物処置したマウスにおいて有意に低減した（Ｐ＝０．００５５）。提示された結果は、群の平均値±平均値の標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
Ａ．概要
ＢＣＭＡはＢ細胞悪性腫瘍における腫瘍細胞上で発現しているが、血清中では見出されなかった。本発明者らは、ＢＣＭＡが、様々なＢ細胞悪性腫瘍、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を有する患者の血清において存在し、治療に対する患者の応答および全生存期間と相関することを示した。さらに、検出可能なＢＡＦＦのレベルは、病気ではない対象におけるＢＡＦＦレベルと比較して、ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者の血清中で低いことを本発明者らは驚いたことに発見した。当業者は血清中により高いＢＡＦＦレベルを検出したことを報告している。
【００７３】
様々な実施形態では、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を確実に診断するための組成物および方法を提供する。培養したＢＭＭＣの上清、および患者の血清中のＢＣＭＡおよびＢＡＦＦ濃度を、検出し、かつ／または測定し、ベースラインもしくは対照に対して比較し、対象においてＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを確実に診断する。特定の理論に束縛されるものではないが、緩徐進行型疾患、ＭＧＵＳを有する患者、または健康な対象（ＭＭを有さない）と比較して、高い血清ＢＣＭＡレベルが、活性疾患を有するＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者において検出されたため、血清ＢＣＭＡを使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを確実に診断することができると考えられる。同様に、緩徐進行型疾患、ＭＧＵＳを有する患者、または健康な対象と比較した、活性疾患を有する患者における低い血清レベルのＢＡＦＦを使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを確実に診断することができる。
【００７４】
ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬを有する対象の生存の可能性、または抗ＭＭ、抗ＣＬＬ、もしくは抗ＮＨＬ処置に対する対象の応答を決定することにおいて、血清ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦ濃度をまた、予後予測の目的のために使用することができる。特定の理論に束縛されるものではないが、高い血清ＢＣＭＡレベルが、応答性疾患を有する患者と比較して、進行性疾患を有するＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者において検出されたため、ならびに集団の中央値超の血清ＢＣＭＡレベルを有する患者が、全体的により短い生存率を有するため、血清ＢＣＭＡを使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者の生存を確実に決定することができると考えられる。同様に、低い血清ＢＡＦＦレベルが、応答性疾患を有する患者と比較して進行性疾患を有するＭＭ、ＣＬＬおよびＮＨＬ患者において検出されたため、ならびに集団の中央値未満の血清ＢＡＦＦレベルを有する患者が、全体的により短い生存率を有するため、血清ＢＡＦＦを使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者の生存を確実に決定することができると考えられる。
【００７５】
さらに、ＢＣＭＡおよびＢＡＦＦ血清レベルを使用して、対象においてＭＭ、ＣＬＬまたはＮＨＬの重症度または程度をモニターすることができる。特定の理論に束縛されるものではないが、高い血清ＢＣＭＡレベルが、ヒトＭＭ、ＣＬＬおよびＮＨＬ異種移植片において検出され、血清ＢＣＭＡレベルが、抗ＭＭ、抗ＣＬＬ、または抗ＮＨＬ剤に応答した腫瘍容積の変化と相関したため、血清ＢＣＭＡレベルを、ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者の疾患状況および全生存期間をモニターするための効率的なバイオマーカーとして使用することができると考えられる。
【００７６】
本発明の実施は、特に別に示さない限り、当分野の技術の範囲内の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の通常の方法を用いるが、これらの多くを例示の目的のために下記で記載する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、更新２００８年７月）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）を参照されたい。
【００７７】
本明細書において引用した全ての公開資料、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【００７８】
Ｂ．定義
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等な任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態を本明細書に記載する。本発明の目的のために、下記の用語を下記で定義する。
【００７９】
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な目的の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【００８０】
本明細書において使用する場合、「約」または「概ね」という用語は、参照の分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％だけ変化する分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。特定の実施形態では、「約」または「概ね」という用語は、数値に先行するとき、値に１５％、１０％、５％、または１％の範囲をプラスまたはマイナスしたものを示す。
【００８１】
この明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」、「含み」および「含むこと」という単語は、記述したステップもしくはエレメント、またはステップもしくはエレメントの群を含むが、任意の他のステップもしくはエレメント、またはステップもしくはエレメントの群を除外しないことを暗示すると理解される。「からなる」とは、語句「からなる」に続く何らかのものを含み、これに限定されることを意味する。このように、「からなる」という語句は、列挙したエレメントが必要とされ、または必須であり、他のエレメントが存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の後に列挙する任意のエレメントを含み、列挙したエレメントについての開示において特定した活性もしくは作用を妨げず、またはこれに貢献しない他のエレメントに限定されることを意味する。このように、「から本質的になる」という語句は、列挙したエレメントが必要とされ、または必須であるが、他のエレメントが任意選択でなく、これらが列挙したエレメントの活性または作用に影響を与えるか、しないかによって、存在してもよく、または存在しなくてもよいことを示す。
【００８２】
この明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」、「別の実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある種の実施形態」、「さらなる実施形態」もしくは「さらなる実施形態」への言及、またはこれらの組合せは、実施形態に関連して記載した特定のフィーチャー、構造または特徴が、少なくとも本発明の一実施形態に含まれることを意味する。このように、この明細書を通して様々な場所において上記の語句が現れることは、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しない。さらに、特定のフィーチャー、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で合わせてもよい。
【００８３】
本明細書において使用する場合、「ＢＣＭＡ」という用語は、特に別に示されない限り、野性型およびバリアントＢ細胞成熟抗原ポリペプチドの両方を一般に指すことを意図する。ＢＣＭＡポリペプチドは、ＢＣＭＡ遺伝子によってコードされる。当技術分野で一般に使用されるように、「遺伝子」という用語は、５’非翻訳領域（複数可）（ＵＴＲ）、エキソン、イントロン、および３’ＵＴＲを包含するゲノム領域を指すことを意図する。個々のセグメントは、例えば、プロモーター、コード領域などと特に称し得る。完全なＢＣＭＡタンパク質を実現するこのようなセグメントの組合せは、タンパク質コード配列と総称して称し得る。ヒトゲノムにおいてＢＣＭＡ遺伝子の４つの主要なハプロタイプが存在し、本開示において、「ＢＣＭＡ」という用語は、４つの全てを包含することを意味する（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．、２巻：２７６〜９頁、２００１年）。
【００８４】
「ＢＣＭＡポリペプチド」という用語は、完全長天然ポリペプチドおよびその断片、特に、生物活性のある断片、および／または機能ドメイン、例えば、生物活性を有する領域もしくはドメインに対応する断片など；その抗原性断片を含めた、ならびに他のタンパク質またはその部分への対象ポリペプチドの融合体を含めた、公知のＢＣＭＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるアミノ酸配列を包含する。ＢＣＭＡポリペプチドのアミノ酸配列は、開示されてきた。例えば、Ｌａａｂｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻：１１４７〜１１５４頁、１９９４年；Ｌａａｂｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻：３８９７〜３９０４頁（１９９２年）；Ｇｒａｓら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７巻：１０９３〜１１０６頁（１９９５年）；およびＭａｄｒｙら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６９３〜１７０２頁（１９９８年）を参照されたい。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、種々の源から、例えば、ヒト組織タイプまたは生体試料、例えば、血清、骨、髄、または組織から単離することができる。
【００８５】
本明細書において使用する場合、「ＢＡＦＦ」という用語は、Ｂ細胞活性化因子を指す。ＢＡＦＦはまた、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）、ＴＮＦおよびＡＰＯＬに関連する白血球発現リガンド（ＴＡＬＬ−１）、ならびにＣＤ２５７として公知である。「ＢＡＦＦ」という用語は、特に別に示されない限り、野性型およびバリアントポリペプチドの両方を総称して指すことを意図する。ＢＡＦＦポリペプチドは、ＢＡＦＦ遺伝子によってコードされる。当技術分野で一般に使用されるように、「遺伝子」という用語は、５’非翻訳領域（複数可）（ＵＴＲ）、エキソン、イントロン、および３’ＵＴＲを包含するゲノム領域を指すことを意図する。個々のセグメントは、例えば、プロモーター、コード領域などと特に称し得る。完全なＢＡＦＦタンパク質を実現するこのようなセグメントの組合せは、タンパク質コード配列と総称して称し得る。
【００８６】
「ＢＡＦＦポリペプチド」という用語は、完全長天然ポリペプチドおよびその断片、特に、生物活性のある断片、および／または機能ドメイン、例えば、生物活性を有する領域もしくはドメインに対応する断片など；その抗原性断片を含めた、ならびに他のタンパク質またはその部分への対象ポリペプチドの融合体を含めた、公知のＢＡＦＦポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるアミノ酸配列を包含する。ＢＡＦＦポリペプチドのアミノ酸配列は、開示されてきた。（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８９巻（１１号）、１７４７〜１７５６頁（１９９９年）；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７４巻（２３号）、１５９７８〜１５９８１頁（１９９９年）；Ｓｈｕら、Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．、６５巻（５号）、６８０〜６８３頁（１９９９年）を参照されたい）。本発明のＢＡＦＦポリペプチドは、種々の源から、例えば、ヒト組織タイプまたは生体試料、例えば、血清、骨、髄、または組織から単離することができる。
【００８７】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはこれらの類似体を含有し得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を含み得、公知または未知の任意の機能を行い得る。「ポリヌクレオチド」という用語は、単鎖および二本鎖、ならびに三重らせん分子を含む。「オリゴヌクレオチド」は一般に、約５〜約１００ヌクレオチドの単鎖または二本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドを指す。しかし、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限が存在する。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、遺伝子から単離し、または当技術分野において公知の方法によって化学的に合成し得る。
【００８８】
下記は、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である。遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。核酸分子はまた、修飾された核酸分子、例えば、メチル化核酸分子および核酸分子類似体を含み得る。プリンおよびピリミジンの類似体は、当技術分野において公知である。核酸は、天然の、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡでよく、または当技術分野において公知のような合成類似体でよい。このような類似体は、アッセイ条件下での優れた安定性によって、プローブとして使用するために好ましくてもよい。骨格、糖または複素環塩基における変更を含めた天然構造における修飾は、細胞内の安定性および結合親和性を増加させることが示されてきた。骨格化学において有用な変化には、ホスホロチオエート；非架橋酸素の両方が硫黄で置換されているホスホロジチオエート；ホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅｓ）；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートである。アキラルホスフェート誘導体は、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）を含む。ペプチド核酸は、全リボースホスホジエステル骨格をペプチド連結で置き換えている。
【００８９】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これはコードされたアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。様々な実施形態では、ＢＣＭＡポリペプチドは、本明細書において開示されている診断用、予後予測用、またはモニター用の組成物および方法における使用のために企図される。この用語は、これらに限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および相同リーダー配列を有する融合体、Ｎ末端メチオニン残基を有する、または有さない融合体；免疫学的タグ化タンパク質などを含めた融合タンパク質を含む。
【００９０】
「実質的に単離された」または「単離された」物質は、天然でその関連する周囲の材料が実質的に存在しないものである。実質的に存在しないとは、天然で関連している材料の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が存在しないことを意味する。本明細書において使用する場合、「単離された」は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、試料、および抗体を指すことができる。
【００９１】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、広く公知であり、当技術分野で公表されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）を参照されたい。関連性のある条件の例は、（ストリンジェンシーを増加させるために）２５℃、３７℃、５０℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である）、ならびに他の緩衝系を使用したこれらの同等物；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃度；５分から２４時間のインキュベーション時間；１、２、またはそれ以上の洗浄ステップ；１分、２分、または１５分の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄液、または脱イオン水を含む。ストリンジェント条件の例は、５０℃以上にて０．１×ＳＳＣ（９ｍＭのＮａＣｌ／０．９ｍＭのクエン酸ナトリウム）中のハイブリダイゼーションおよび洗浄である。
【００９２】
「標的細胞」という用語は、個々の細胞、生体試料からの細胞、または細胞培養物を含む。標的細胞は、単一の標的細胞の子孫を含み、子孫は、自然、偶発的、または意図的な変異および／または変化によって、当初の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学において、または総ＤＮＡ補体において）であり得ない。特定の実施形態では、標的細胞は、多発性骨髄腫細胞、骨髄または末梢血単核細胞または血漿Ｂ細胞を含む。
【００９３】
多発性骨髄腫は、これらのタイプの細胞の単一のクローンの悪性形質転換によって特徴付けられる成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性腫瘍である。これらの形質細胞は、ＢＭにおいて増殖し、隣接骨、および時折血液に侵入し得る。多発性骨髄腫のバリアント形態は、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫を含む（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（編）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年）を参照されたい）。
【００９４】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球、またはＢ細胞と称される未成熟白血球のゆっくりとした増加をもたらす緩徐進行型（遅い成長）のがんである。がん細胞は血液および骨髄を介して広がり、また、リンパ節または他の器官、例えば、肝臓および脾臓に影響を与えることができる。ＣＬＬは、骨髄の最終的な不全をもたらす。この疾患は、小リンパ球性リンパ腫と称されることがある。
【００９５】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）のがんの大きな群を包含する。これらのタイプのリンパ腫は、任意の年齢において起こり得、正常より大きなリンパ節、熱、および体重減少によって特徴付けられることが多い。多くの異なるタイプの非ホジキンリンパ腫が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性（速い成長）および緩徐進行型（遅い成長）のタイプに分割することができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞およびＴ細胞に由来することができるが、本明細書において使用する場合、「非ホジキンリンパ腫」および「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は、互換的に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫を含む。骨髄または幹細胞移植の後に起こるリンパ腫は通常、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【００９６】
本発明の検出システムは、部分的に、結合剤がＢＣＭＡまたはＢＡＦＦに結合する能力に基づいている。一般に、本発明は、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦを特異的に結合する結合剤の使用を企図し、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦおよび結合剤の検出可能な複合体の形成をもたらす。一実施形態では、本発明は、２種の結合剤である捕獲結合剤および検出結合剤を利用し、これらの両方はＢＣＭＡに結合し、捕獲結合剤、ＢＣＭＡ、および検出結合剤を含む三元複合体の形成をもたらす。別の実施形態では、本発明は、２種の結合剤である捕獲結合剤および検出結合剤を利用し、これらの両方はＢＡＦＦに結合し、捕獲結合剤、ＢＡＦＦ、および検出結合剤を含む三元複合体の形成をもたらす。
【００９７】
例えば、ポリペプチド、糖、および核酸を含めた種々の結合剤のいずれかを使用し得る。さらに別の実施形態では、本発明は、検出結合剤に結合するさらなる結合剤の使用をさらに含む。このようなさらなる結合剤は、例えば、結合した検出結合剤を検出することにおいて有用であり得る。したがって、このようなさらなる結合剤の一例は、検出可能な程度に標識し得、したがって、結合した検出結合剤を検出するために使用され、検出結合剤それ自体が標識の影響を容易に受けやすくないときに特に有用である、抗体の断片、例えば、Ｆｃ断片に特異的な抗体である。ある種の実施形態では、結合剤は、細菌に特異的な抗体である。
【００９８】
「特異的に結合する」という用語は、抗体結合の文脈で、特定のポリペプチドすなわち、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦポリペプチドのエピトープに対する抗体の高い結合活性および／または高い親和性結合を指す。特定のポリペプチド上のエピトープ（また、本明細書において、「エピトープ」と称される）に結合する抗体は好ましくは、任意の他のエピトープ、特に、関連する分子中に、または同じ試料中に存在し得るものへの同じ抗体の結合より強い。これは、対象とする特定のポリペプチドは、例えば、異なるＢＣＭＡエピトープまたは非ＢＣＭＡエピトープに対してより、特定のＢＣＭＡエピトープに対してより強く結合するためである。対象とするポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱くはあるが検出可能なレベル（例えば、対象とするポリペプチドに対して示される結合の１０％以下、５％以下、１％以下）で他のポリペプチドを結合することができ得る。このような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、例えば、適当な対照の使用によって、対象とする化合物またはポリペプチドへの特異抗体結合と容易に識別可能である。一般に、１０７モル／Ｌ以上、好ましくは１０８モル／Ｌ以上の結合親和性を伴って特定のＢＣＭＡポリペプチドに結合する本発明の組成物および方法において使用される抗体は、特定のＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合すると言われる。一般に、１０７モル／Ｌ以上、好ましくは１０８モル／Ｌ以上の結合親和性を伴って特定のＢＡＦＦポリペプチドに結合する本発明の組成物および方法において使用される抗体は、特定のＢＡＦＦポリペプチドに特異的に結合すると言われる。一般に、１０６モル／Ｌ以下の結合親和性を有する抗体は、現在使用される通常の方法論を使用して、検出可能なレベルで抗原を結合しないという点で有用ではない。
【００９９】
一実施形態では、ＢＣＭＡに対するＢＣＭＡ結合剤の特異的結合の親和性、またはＢＡＦＦに対するＢＡＦＦ結合剤の特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍、またはそれ超である。
【０１００】
別の実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２〜約１０００倍、バックグラウンド結合の約２〜５００倍、バックグラウンド結合の約２〜約１００倍、バックグラウンド結合の約２〜約５０倍、バックグラウンド結合の約２〜約２０倍、バックグラウンド結合の約２〜約１０倍、バックグラウンド結合の約５〜約１００倍、バックグラウンド結合の約５〜約５０倍、バックグラウンド結合の約５〜約２０倍、バックグラウンド結合の約１０〜約１００倍、バックグラウンド結合の約１０〜約５０倍、バックグラウンド結合の約５０〜約５００倍、または任意のその間の範囲の親和性である。
【０１０１】
したがって、特異的結合は、結合剤とＢＣＭＡまたはＢＡＦＦとの間に起こり、ここではこの２つの間に相互作用が存在し、これによって抗体／抗原または酵素／基質相互作用の特徴を有する結合した複合体が生成される。特定の実施形態では、対の１つのメンバーが、特定の種に実質的に結合し、結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物のファミリー内の他の種に結合しないとき、特異的結合が特徴付けられる。他の特定の実施形態では、対の１つのメンバーが、１種または複数の特定の種に実質的に結合し、結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物のファミリー内の他の種に結合しないとき、特異的結合が特徴付けられる。他の特定の実施形態では、対の１つのメンバーが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の特定の種に実質的に結合し、結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物のファミリー内の他の種に結合しないとき、特異的結合が特徴付けられる。
【０１０２】
一般的に言えば、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦ（Ｂ）への本発明（Ａ）の結合剤の結合親和性は一般に、下記の反応：［Ａ］＋［Ｂ］−［ＡＢ］からもたらされる化学平衡定数Ｋｄによって表すことができる。次いで、化学平衡定数Ｋｄは、Ｋｄ＝［Ａ］×［Ｂ］／［ＡＢ］によって表される。結合剤の結合が特異的または非特異的であるかどうかは、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦへの結合剤の結合親和性（Ｋｄ値）と、別のポリペプチドへの結合との間の差異から判断することができる。
【０１０３】
Ｋｄ値、およびＫｄ値における差異は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏの結合アッセイ、および／または他の材料、例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレートもしくは分析用バイオセンサー中の特殊化された表面上のアッセイを使用して測定することができる。一実施形態では、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦに対する結合剤のＫｄ値と、望ましくないポリペプチドへの結合との間の差異は、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれ超である。
【０１０４】
別の実施形態では、Ｋｄ値は、１０”４Ｍ未満、１０”５Ｍ未満、１０”６Ｍ未満、１０”７Ｍ未満、１０”８Ｍ未満、１０”９Ｍ未満、１０”１０Ｍ未満であり、１０”１１Ｍ、１０”１２Ｍ未満、１０”１３Ｍ未満、１０”１４Ｍ未満、１０”１５Ｍ未満またはそれ未満であり得る。
【０１０５】
別の実施形態では、Ｋｄ値は、約１０”４Ｍ〜約１０”１５Ｍ、約１０”４Ｍ〜約１０”１２Ｍ、約１０”４Ｍ〜約１０”１０Ｍ、約１０”６Ｍ〜約１０”１５Ｍ、約１０”６Ｍ〜約１０”１２Ｍ、約１０”６Ｍ〜約１０”１０Ｍ、約１０”８Ｍ〜約１０”１５Ｍ、約１０”８Ｍ〜約１０”１２Ｍ、約１０”８Ｍ〜約１０”１０Ｍ、約１０”７Ｍ〜約１０”１０Ｍ、または任意のその間の範囲の親和性である。
【０１０６】
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、これらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を特にカバーする。
【０１０７】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然変異を除いて同一である。一実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体である。
【０１０８】
一実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＢＡＦＦモノクローナル抗体である。
【０１０９】
モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向している。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向している異なる抗体を含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向している。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンに汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成されるという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得たという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製してもよく、または組換えＤＮＡ方法によって作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離し得る。
【０１１０】
モノクローナル抗体は、本明細書において、重鎖および／もしくは軽鎖の一部が、特定の種に由来し、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であり、一方、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来し、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにこれらが所望の生物活性を示す限りこのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。
【０１１１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性の部分配列）である。
【０１１２】
大部分は、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラットまたはウサギのＣＤＲからの残基で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。これらの修飾を行って、抗体の性能をさらに洗練および最大化する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここでは高頻度可変性ループの全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのこれらに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のこれらであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改善させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含み得る。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は典型的には、Ｈ鎖において６以下であり、Ｌ鎖において３以下である。ヒト化抗体はまた最適に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。ヒト化抗体は、霊長類化抗体を含み、抗体の抗原結合性領域は、例えば、マカクザルを対象とする抗原で免疫化することによって生じた抗体に由来する。ヒト化抗体を作製する方法は、当技術分野において公知である。
【０１１３】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含めた当技術分野で公知の様々な技術を使用して生成することができる。ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁（１９９１年）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である。Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１号）：８６〜９５頁（１９９１年）。
【０１１４】
本発明の結合抗体の「機能的断片」は、これらが由来するインタクトな完全鎖分子と実質的に同じ親和性を伴って抗原への結合を保持するこれらの断片である。
【０１１５】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離および／または回収したものである。その天然環境の汚染物質成分は、抗体についての診断上または治療上の使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定して９５重量％超の抗体まで、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによって、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用して還元条件もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一性となるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１種の成分は存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕでの抗体を含む。しかし通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０１１６】
「検出可能な程度に標識された抗体」という用語は、付着した検出可能な標識を有する抗体（またはＢＣＭＡもしくはＢＡＦＦポリペプチドもしくはエピトープのための結合特異性を保持する抗体断片）を指す。検出可能な標識は、化学的コンジュゲーションによって通常付着しているが、標識がポリペプチドである場合、これは遺伝子工学技術によって代わりに付着させることができる。検出可能な程度に標識されたタンパク質の生成のための方法は、当技術分野で周知である。検出可能な標識は、これらに限定されないが、ハプテン、放射性同位体、フルオロフォア、常磁性標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、もしくは検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を放ち、またはその基質への標識の曝露の後に検出可能なシグナルを放つ他の部分もしくは化合物を含めて、当技術分野において公知の種々のこのような標識から選択し得る。様々な検出可能な標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および標識抗体を使用するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい）。
【０１１７】
１つの技術において、ポリペプチドを含む免疫原を、多種多様の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに最初に注射する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、このような抗血清から、例えば、適切な固体支持体にカップリングしたポリペプチドを使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製し得る。一実施形態では、抗体は、抗ＢＣＭＡポリクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は、抗ＢＡＦＦポリクローナル抗体である。
【０１１８】
「生体試料」は、個体から得た種々の試料タイプを包含し、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用することができる。この定義は、血液および生物由来の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本または組織培養物またはそれに由来する細胞およびその子孫を包含する。この定義はまた、例えば、ある種の成分、例えば、ポリヌクレオチドについて試薬による処置、可溶化、または濃縮によって、これらの調達の後に何らかの形で操作されてきた試料を含む。「生体試料」という用語は臨床試料を包含し、また培養物中の細胞、細胞上清、細胞ライセート、血清、血漿、尿、脳脊髄液、体液、および組織試料を含む。試料は、適当な緩衝溶液における希釈によって必要に応じて事前処置し、または必要であれば濃縮し得る。種々の緩衝液の１つ、例えば、ホスフェート、Ｔｒｉｓなどを、好ましくは生理学的ｐＨにて用いるいくつかの標準的な水性緩衝溶液のいずれかを使用することができる。生体試料は、周知の技術、例えば、静脈穿刺、腰椎穿刺、液体試料、例えば、唾液または尿、または組織生検などを使用して、患者に由来することができる。
【０１１９】
本明細書において使用する場合、「と相関する」または「と関連する」という用語は、生理的状態、例えば、疾患状況または疾患の程度、処置に対する応答、および生存と統計的に有意な相関を有する、対象の生体試料中のＢＣＭＡまたはＢＡＦＦのレベルを指す。ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦレベルと、特定の生理的状態が存在すること、または存在しないこととの間の相関の強さは、有意性統計試験によって決定し得る。統計スコアを相関に当てはめることによる、異なって発現した遺伝子の発現レベルと特定の生理的状態との間の相関の強さを決定するための方法は、これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＨｏｌｌｏｗａｙら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３２巻：４８１〜８９頁、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３２巻：４９０〜９５頁、Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３２巻：４９６〜５０１頁；Ｓｌｏｎｉｍ（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３２巻：５０２〜０８頁；およびＣｈｕａｑｕｉら（２００２年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３２巻：５０９〜５１４頁において概説されている。
【０１２０】
「コンジュゲート」とは、融合タンパク質、ならびにアミノ酸またはタンパク質部分、および非タンパク質部分の両方を含有する分子を含めた、別の分子、例えば、ハプテン、小分子、または標識に共有結合的または非共有結合的に結合または接合した任意の分子、例えば、抗体を指す。コンジュゲートは、例えば、固相合成、液相合成、有機化学物質合成技術またはこれらの技術の組合せを含めた種々の当技術分野で公知の技術によって合成し得る。合成の選択は、生み出される特定の分子によって決まる。
【０１２１】
「個体」、「対象」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、これらに限定されないが、マウス、サル、ヒト、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技用動物、および哺乳動物のペットを含めた哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒト、飼育される動物および家畜、ならびに動物園の動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類されている任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、本明細書において、ヒトである。
【０１２２】
Ｃ．多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫の診断、予後予測およびモニタリングの方法
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）のレベルは、これらのがんを有さない正常で健康な対象と比較して、ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者の血清中で増加することを本発明者らは発見した。したがって、本発明の特定の実施形態は、例えば、患者の血流、血清、骨髄、または組織を含めた患者から得た生体試料中で観察されるＢＣＭＡのレベルに基づいた、多発性骨髄腫の診断、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者における生存の予後予測、および処置に対する疾患の応答をモニターするための方法および組成物を提供する。ＢＣＭＡレベルを決定する種々の方法は公知であり、当技術分野で利用可能である。ある種の実施形態では、これらは、ＢＣＭＡ結合剤、例えば、ＢＣＭＡ特異抗体の使用が関与する。本明細書において他の場所で論じるように、当業者に公知であり、かつ試料中のポリペプチドマーカーを検出する結合剤を使用するのに適した種々のアッセイフォーマットが存在する。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローアッセイなど。また、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。
【０１２３】
一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬは、正常な対照対象におけるものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはより高いレベルのＢＣＭＡの存在によって診断される。一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＣＭＡの量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出した量と、所定のカットオフ値または対照生体試料中で検出された量とを比較するステップとを含み、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照生体試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡの増加した量は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの存在を示し、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象を診断する。
【０１２４】
一実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象の生存についての予後予測の方法を提供する。一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断され、かつ／あるいはこれについて処置を受け、かつＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団において検出される血清ＢＣＭＡの中央値超の量の検出された血清ＢＣＭＡを有する対象は、中央値以下の血清ＢＣＭＡレベルを有する集団における対象と比較して生存のより乏しい可能性を有する。特定の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている集団における中央値より高い血清ＢＣＭＡレベルを有する対象は、生存の可能性が約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％またはそれ以上低減する。
【０１２５】
一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象の生存についての予後予測の方法は、（ａ）対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＣＭＡの量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出した量と、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団における血清ＢＣＭＡレベルの中央値とを比較するステップとを含み、（ｂ）の処置された集団における中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＣＭＡの増加した量は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象について生存の可能性の低減を示す。
【０１２６】
臨床医が対象の生存の可能性を増加させる期待において治療の過程を変化させることを可能とするため、生存の可能性の低減を予測できることは有利である。
【０１２７】
ある種の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬの進行、または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬの進行、または処置に対する応答をモニターする方法は、（ａ）第１の時点における、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＣＭＡの量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、対象から得た生体試料中のＢＣＭＡの量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップとを含み、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡの増加した量は、前記ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが進行していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡの減少した量は、前記ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬは、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示す。
【０１２８】
ＢＣＭＡを検出する方法の様々な実施形態では、生体試料は、血清、骨髄、および組織からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡレベルを決定し、一方では、他の好ましい実施形態では、ポリペプチドレベルを決定する。一実施形態では、ＢＣＭＡに特異的な１種または複数のプライマーを使用して検出を行う。別の好ましい実施形態では、ＢＣＭＡに特異的な抗体を使用して検出を行う。
【０１２９】
一実施形態では、患者におけるＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが存在すること、または存在しないことは、（ａ）患者から得た生体試料とＢＣＭＡ結合剤とを接触させ、（ｂ）結合剤に結合したＢＣＭＡポリペプチドのレベルを試料中で検出し、（ｃ）ＢＣＭＡポリペプチドのレベルと、所定のカットオフ値または正常な対照対象から得た値とを比較することによって決定し得る。ある種の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの検出のためのカットオフ値は、固定化された抗体を、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有さない患者からの試料と共にインキュベートしたときに得られる平均シグナルである。
【０１３０】
特定の実施形態では、所定のカットオフ値の３標準偏差超であるシグナルを生み出す試料は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて陽性であると考えられる。代わりの好ましい実施形態では、カットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９８５年、１０６〜７頁の方法によって受信者動作曲線を使用して決定する。手短に言えば、この実施形態では、カットオフ値は、診断試験結果についてのそれぞれの可能なカットオフ値に対応する、真性陽性率（すなわち、感度）および偽陽性率（１００％−特異度）の対のプロットから決定し得る。プロット上で左上コーナーに最も近いカットオフ値（すなわち、最も大きなエリアを取り囲む値）は、最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定したカットオフ値より高いシグナルを生み出す試料は、陽性であると考え得る。代わりに、カットオフ値は、プロットに沿って左にシフトして偽陽性率を最小化し、または右にシフトして偽陰性率を最小化し得る。一般に、この方法によって決定したカットオフ値より高いシグナルを生み出す試料は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて陽性であると考えられる。
【０１３１】
一実施形態では、アッセイは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合し、ＢＣＭＡポリペプチドを試料の残りから取り除く、固体支持体上に固定化されたＢＣＭＡ結合剤の使用が関与する。次いで、結合したＢＣＭＡポリペプチドは、レポーター基を含有し、かつ結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出し得る。このような検出試薬は、例えば、ＢＣＭＡポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合する結合剤、または結合剤、例えば、抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ５タンパク質Ａもしくはレクチンに特異的に結合する他の作用剤を含み得る。
【０１３２】
関連する実施形態では、アッセイは、本明細書において他の場所で論じるようにラテラルフローまたはストリップ試験フォーマットで行い、ＢＣＭＡ結合剤、例えば、抗体は、膜、例えば、ニトロセルロース上に固定化される。ラテラルフロー試験において、試料内のＢＣＭＡポリペプチドは、試料が膜を通過するにつれ固定化された結合剤に結合する。次いで、第２の標識した結合剤は、膜を通って流れる第２の結合剤を含有する溶液としてＢＣＭＡ結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出を上記のように行い得る。ストリップ試験フォーマットにおいて、ＢＣＭＡ結合剤が結合する膜の一端を、試料を含有する溶液に浸す。試料は、膜に沿って第２の結合剤を含有する領域を通り、固定化された結合剤のエリアに移動する。固定化された抗体のエリアにおける第２の結合剤の濃度は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの存在を示す。
【０１３３】
本発明は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの進行を病期分類し、またはモニターし、処置に対する応答を決定するための同様の方法を提供する。血清ＢＣＭＡレベルは疾患の重症度または程度と相関するため、特定の病期と関連するレベルを決定し、対象の血清において観察されるものと比較し、対象の疾患の病期を決定する。同様に、疾患の進行、および処置または治療に対する応答を、疾患の過程の異なる時点、または処置レジメンの前および後において、対象の血清（または他の生体試料）中のＢＣＭＡレベルを比較することによってモニターする。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ血清レベルは、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬ患者において上昇し、ＢＣＭＡのレベルは、疾患病期と相関し、すなわち、ＢＣＭＡレベルは、進行性ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬにおいてより高く、処置または寛解に入ったことに応答してより低くなる。このように、本発明は、対象の血流から得た血清試料を使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬ疾患の進行、または処置に対する応答を検出し、診断し、予後予測、病期分類し、モニターする急速で信頼できる方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、ＢＣＭＡに特異的な抗体を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローアッセイ、またはストリップ試験アッセイによって実施する。
【０１３４】
本発明は、対象から得た生物試料、例えば、血清試料中のＢＣＭＡレベルに適し、またはこれを決定する試薬を含む、多発性骨髄腫を検出し、診断し、予後予測し、病期分類し、またはモニターするためのシステムおよびキットをさらに提供する。一実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー、またはストリップ試験アッセイを行うための試薬、例えば、ＢＣＭＡに特異的な抗体を含む。本発明の検出システムおよびキットを、下にさらに詳細に記載する。
【０１３５】
さらに、本発明者らは、ＢＡＦＦレベルが、これらのがんを有さない正常で健康な対象と比較して、ＭＭ、ＣＬＬ、およびＮＨＬ患者の血清中で減少することを発見した。したがって、本発明の特定の実施形態は、例えば、患者の血流、血清、骨髄、または組織を含めた患者から得た生体試料において観察されるＢＡＦＦのレベルに基づいた、多発性骨髄腫の診断、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された患者における生存の予後予測、および処置に対する疾患の応答をモニターするための方法および組成物を提供する。ＢＡＦＦレベルを決定する種々の方法は公知であり、当技術分野で利用可能である。
【０１３６】
一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬは、正常な対照対象におけるものと比較して、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１０００分の１、またはそれ未満のレベルのＢＡＦＦの存在によって診断される。一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを診断する方法は、（ａ）対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＡＦＦの量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出した量と、所定のカットオフ値または対照生体試料中で検出された量とを比較するステップとを含み、所定のカットオフ値または（ｂ）の対照生体試料中の量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＡＦＦの減少した量は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの存在を示し、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象を診断する。
【０１３７】
一実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象の生存についての予後予測の方法を提供する。一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断され、かつ／あるいはこれについて処置を受け、かつＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団において検出される血清ＢＡＦＦの中央値未満の量の検出された血清ＢＡＦＦを有する対象は、中央値以上の血清ＢＡＦＦレベルを有する集団における対象と比較して生存のより乏しい可能性を有する。特定の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている集団における中央値より低い血清ＢＡＦＦレベルを有する対象は、生存の可能性が約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％またはそれ以上低減する。
【０１３８】
一般に、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象の生存についての予後予測の方法は、（ａ）対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＡＦＦの量を検出するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出した量と、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて処置されている対象の集団における血清ＢＡＦＦレベルの中央値とを比較するステップとを含み、（ｂ）の処置された集団における中央値または対応する量と比較した（ａ）の生体試料中のＢＡＦＦの減少した量は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有する対象について生存の可能性の低減を示す。
【０１３９】
ある種の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬの進行、または処置に対する応答をモニターする方法を提供する。ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬの進行、または処置に対する応答をモニターする方法は、（ａ）第１の時点における、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬと診断された対象から得た生体試料、例えば、血清中のＢＡＦＦの量を検出するステップと、（ｂ）第２の時点または処置の後における、対象から得た生体試料中のＢＡＦＦの量を検出するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）において検出した量と、ステップ（ｂ）において検出した量とを比較するステップとを含み、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡの減少した量は、前記ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが悪化していることを示し、（ａ）の生体試料中の量と比較した（ｂ）の生体試料中のＢＣＭＡの増加した量は、前記ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬは、寛解に入っており、または処置に対して応答していることを示す。
【０１４０】
ＢＡＦＦを検出する方法の様々な実施形態では、生体試料は、血清、骨髄および組織からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｍＲＮＡレベルを決定し、一方では、他の好ましい実施形態では、ポリペプチドレベルを決定する。一実施形態では、ＢＡＦＦに特異的な１種または複数のプライマーを使用して検出を行う。別の好ましい実施形態では、ＢＡＦＦに特異的な抗体を使用して検出を行う。
【０１４１】
一実施形態では、患者におけるＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬが存在すること、または存在しないことは、（ａ）患者から得た生体試料とＢＡＦＦ結合剤とを接触させ、（ｂ）結合剤に結合したＢＡＦＦポリペプチドのレベルを試料中で検出し、（ｃ）ＢＡＦＦポリペプチドのレベルと、所定のカットオフ値または正常な対照対象から得た値とを比較することによって決定し得る。ある種の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの検出のためのカットオフ値は、固定化された抗体を、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを有さない患者からの試料と共にインキュベートしたときに得られる平均シグナルである。
【０１４２】
特定の実施形態では、所定のカットオフ値の３標準偏差未満であるシグナルを生み出す試料は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬについて陽性であると考えられる。
【０１４３】
一実施形態では、アッセイは、ＢＡＦＦポリペプチドに結合し、ＢＡＦＦポリペプチドを試料の残りから取り除く固体支持体上に固定化されたＢＡＦＦ結合剤の使用が関与する。次いで、結合したＢＡＦＦポリペプチドは、レポーター基を含有し、かつ結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出し得る。このような検出試薬は、例えば、ＢＡＦＦポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合する結合剤、または結合剤、例えば、抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ５タンパク質Ａもしくはレクチンに特異的に結合する他の作用剤を含み得る。
【０１４４】
関連する実施形態では、アッセイは、本明細書において他の場所で論じるようにラテラルフローまたはストリップ試験フォーマットで行い、ＢＡＦＦ結合剤、例えば、抗体は、膜、例えば、ニトロセルロース上に固定化される。ラテラルフロー試験において、試料内のＢＡＦＦポリペプチドは、試料が膜を通過するにつれ固定化された結合剤に結合する。次いで、第２の標識した結合剤は、膜を通って流れる第２の結合剤を含有する溶液としてＢＣＭＡ結合剤−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出を上記のように行い得る。ストリップ試験フォーマットにおいて、ＢＡＦＦ結合剤が結合する膜の一端を、試料を含有する溶液に浸す。試料は、膜に沿って第２の結合剤を含有する領域を通り、固定化された結合剤のエリアに移動する。固定化された抗体のエリアにおける第２の結合剤の濃度は、ＢＡＦＦの存在を示す。
【０１４５】
本発明は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの進行を病期分類し、またはモニターし、処置に対する応答を決定するための同様の方法を提供する。血清ＢＡＦＦレベルは疾患の重症度または程度と相関するため、特定の病期と関連するレベルを決定し、対象の血清において観察されるものと比較し、対象の疾患の病期を決定する。同様に、疾患の進行、および処置または治療に対する応答を、疾患の過程の異なる時点、または処置レジメンの前および後において、対象の血清（または他の生体試料）中のＢＡＦＦレベルを比較することによってモニターする。特定の実施形態では、血清ＢＡＦＦレベルは、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬ患者において減少し、ＢＡＦＦのレベルは、疾患病期と相関し、すなわち、そのレベルは、進行性ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬにおいてより低く、処置または寛解に入ったことに応答して増加する。このように、本発明は、対象の血流から得た血清試料を使用して、ＭＭ、ＣＬＬ、もしくはＮＨＬ疾患の進行、または処置に対する応答を検出し、診断し、予後予測、病期分類し、モニターする急速で信頼できる方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、ＢＡＦＦに特異的な抗体を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローアッセイ、またはストリップ試験アッセイによって実施する。
【０１４６】
本発明は、対象から得た生物試料、例えば、血清試料中のＢＡＦＦレベルに適し、またはこれを決定する試薬を含む、多発性骨髄腫を検出し、診断し、予後予測し、病期分類し、またはモニターするためのシステムおよびキットをさらに提供する。一実施形態では、キットは、ＥＬＩＳＡ、ラテラルフロー、またはストリップ試験アッセイを行うための試薬、例えば、ＢＡＦＦに特異的な抗体を含む。本発明の検出システムおよびキットを、下にさらに詳細に記載する。
【０１４７】
Ｄ．検出システムおよびキット
様々な実施形態では、本発明は、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬのための検出システムおよびキットを提供する。本発明の検出システムまたはキットは、生体試料、例えば、対象の血清中での、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬ患者の診断、予後予測、またはモニタリングのために使用し得る。診断キットは、材料に加えて、抗原−抗体反応の検出のための方法を含むことができる。検出方法は好ましくは、フローサイトメトリー、免疫組織化学、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ（ＬＩＡ）、ラテラルフローアッセイおよびストリップアッセイからなる群から選択される。抗原認識材料の反応性は、酵素反応、蛍光、発光、または放射を検出する装置を使用して確認することができる。一実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの診断、予後予測、またはモニタリングは、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む、フローサイトメトリーキット、免疫組織化学キット、ＥＬＩＳＡキットまたはラテラルフローまたはストリップキットで行うことができる。
【０１４８】
一実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの診断、予後予測、またはモニタリングは、抗ＢＡＦＦ抗体またはその抗原結合断片を含む、フローサイトメトリーキット、免疫組織化学キット、ＥＬＩＳＡキットまたはラテラルフローまたはストリップキットで行うことができる。
【０１４９】
一実施形態では、キットまたはシステムは、下記の成分の１つもしくは複数または全てを含み得る。１）本発明のバイオマーカー（複数可）の１つまたは複数、例えば、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦからなる１種または複数の標準物質；２）バイオマーカー（複数可）に特異的な結合剤、例えば、キットを使用するためにアッセイされる１種の抗体または複数の抗体；３）書面での説明書；４）試料および標準物質のための賦形剤；５）洗浄緩衝液；６）発色試薬；７）停止液；ならびに８）担体、例えば、抗体担体、例えば、結合した抗体、またはポリスチレンビーズを有するラテラルフロー装置、またはマイクロプレート。
【０１５０】
一実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬを診断し、予後予測し、またはモニターするために使用される検出システムまたはキットは、本発明によって具現される方法によってバイオマーカー（複数可）の濃度（複数可）を決定する定量的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。アッセイの原理は、定量的サンドイッチ酵素免疫アッセイ技術を使用することであり、バイオマーカーについて選択的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、担体、例えば、そのウェル中へとマイクロプレート上に事前コーティングする。次いで、標準物質および試料をウェル中にピペットで移し、存在するバイオマーカーをこの固定化された抗体に結合させる。次に、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、バイオマーカーに特異的である酵素結合モノクローナルまたはポリクローナル抗体をウェルに加える。洗浄を再び行い、次いで、基質溶液をウェルに加える。引き続いて、第１のステップにおいて結合した本発明のポリペプチドの量に比例して色が発生する。色の発生を、停止液を使用して停止し、色の強度をマイクロプレートリーダーによって測定する。
【０１５１】
他の実施形態では、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬの診断、予後予測、またはモニタリングは、例えば、ラテラルフローアッセイを使用して行い得る。このようなラテラルフローアッセイは、例えば、オンサイトのスクリーニングアッセイのための対費用効果の高い、速く単純であり、感受性の方法である可能性を有する。ラテラルフローアッセイは、ラテラルフローが起こることを可能とする担体を含み、試料または検出試薬は、担体上の１つの場所から別の場所まで移る。本発明によって具現される方法における使用に適したラテラルフローアッセイの多くのフォーマットが存在し、当業者は、特定のフォーマットをどのように選択し、最適化するかについて容易にわかる。本発明のラテラルフロー試験ストリップの一例は、例えば、下記の成分を含む。試料パッド；その上に試験試料を適用する吸収パッド；標的分析物に特異的であり、かつ有色の粒子（通常、金コロイド粒子、またはラテックスミクロスフィア）にコンジュゲートしている抗体を含有する、コンジュゲートまたは試薬パッド；捕獲ゾーンまたは試験ラインとして、その上に膜に亘ってライン状に抗標的分析物抗体が固定化される反応膜、典型的には、疎水性ニトロセルロースまたは酢酸セルロース膜（コンジュゲート抗体に特異的な抗体を含有する対照ゾーンがまた存在し得る）；および給水または廃液レザバー、毛細管作用によって反応膜を横切って試料を引き抜き、これを集めるように設計されたさらなる吸収パッド。
【０１５２】
ラテラルフロー技術についていくつかのバリエーションが存在する。膜上の捕獲ゾーンは、抗体よりむしろ標的分析物によって、固定化された抗原または酵素を含有し得る。マルチプレックス試験を作成するために複数の捕獲ゾーンを適用することがまた可能である。例えば、特定の実施形態では、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦを検出することができる試験ストリップ、および別々に同じ試料中で、多発性骨髄腫のさらなるバイオマーカー、例えば、β２Ｍ、ＩＬ−６、Ｃ反応性タンパク質、および血清単クローン性タンパク質が意図される。ラテラルフロー免疫アッセイは、訓練されていないオペレーターが使用するのに単純であり、一般に、１５分以内に結果が出る。これらは非常に安定的およびロバストであり、長い保存寿命を有し、通常冷蔵を必要としない。これらはまた、生産するのに相対的に安価である。これらのフィーチャーによって、ポイントオブケアにおける使用のために、ならびに現場において、および実験室において試料を試験するために、これらは理想的なものとなる。
【０１５３】
大部分のラテラルフロー免疫アッセイが定性的結果を実現することのみができる一方で、捕獲ゾーンに結合したコンジュゲートの量を測定することによってある程度の定量化を得ることが可能である。これは、有色の試験ラインの強度を測定するための専用の読取り機を使用して行うことができる。例えば、Ｎｅｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、その一連のＲｅｖｅａｌ（登録商標）アッセイキットと共に使用するためのＡｃｃｕｓｃａｎ（商標）ラテラルフロー読取り機を開発し、Ｃｈａｒｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓはまた、そのＲｏｓａ（登録商標）範囲の試験ストリップのための読取り機を供給する。より洗練された技術、例えば、蛍光染料標識したコンジュゲートがまた開発されて、ラテラルフローアッセイの定量的な可能性が改善されてきた。
【０１５４】
キット形態での検出システムは、例えば、少なくとも１つのアッセイのために十分な量で、パッケージ化された試薬として、ＭＭ、ＣＬＬ、またはＮＨＬのための血清学的バイオマーカーを結合する抗体組成物またはモノクローナル抗体組成物を含むことができる。パッケージ化された試薬の使用のための説明書がまた典型的には含まれる。
【０１５５】
キット形態における検出システムはまた、例えば、試験試料と粘度制御剤および安定剤を含有する緩衝系（試薬１）とを反応槽中に合わせ、溶液を混合するための手段を含むことができる。キット形態での検出システムはまた、試料および緩衝液を有する反応槽のパラメーターを読み取るための手段、ならびに試験試料および緩衝液混合物と、反応槽中の前記生物学的物質への蛍光標識リガンド（試薬２）とを合わせ、溶液を混合し、アッセイ溶液を生成するためのさらなる手段を含むことができる。さらに、試薬２を、さらなる希釈容量のアッセイ溶液を伴わずに反応槽に送達し得る。
【０１５６】
本明細書において使用する場合、「パッケージ」という用語は、定められた限度内に抗体組成物またはモノクローナル抗体組成物を保つことができる、固体マトリックスまたは材料、例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどを指す。したがって、例えば、パッケージは、ミリグラム量の企図するポリペプチドを含有するのに使用されるガラス製バイアルでよく、またはマイクログラム量の企図するポリペプチドもしくは抗体が動作可能に添付されているマイクロタイタープレートウェルでよい。
【０１５７】
「使用のための説明書」は典型的には、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ法パラメーター、例えば、混合する試薬および試料の相対量、試薬／試料混合物のための保守期間、温度、緩衝液条件などを記載した具体的な表現を含む。
【０１５８】
特定の実施形態では、本発明の検出システムは、本発明のポリペプチドまたは抗体分子を含有する複合体の形成をシグナル伝達することができる標識または指示手段をさらに含む。
【０１５９】
「複合体」は、本明細書において使用する場合、特異的結合反応、例えば、抗体−抗原または受容体−リガンド反応の産物を指す。例示的な複合体は、免疫反応生成物である。
【０１６０】
本明細書において使用する場合、「標識」および「指示手段」という用語は、これらの様々な文法的形態において、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接的または間接的に関与している単一の原子および分子を指す。任意の標識または指示手段は、本発明の抗体もしくはモノクローナル抗体組成物の部分である発現されたタンパク質、ポリペプチド、もしくは抗体分子に連結し、またはこれに組み込まれ、あるいは別々に使用されることができ、これらの原子または分子は、単独で、またはさらなる試薬と併せて使用することができる。このような標識はこれら自体が臨床診断化学において周知であり、これらが別に新規なタンパク質の方法および／またはシステムと共に利用される限りにおいてのみ、本発明の一部を構成する。
【０１６１】
標識化手段は、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成するために抗体または抗原を変性することなく、抗体または抗原に化学的に結合する蛍光標識剤でよい。適切な蛍光標識剤は、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｔｅ）（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）などである。免疫蛍光分析技術についての記載は、参照により本明細書に組み込まれているＤｅＬｕｃａ、「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｌｔｄ．、１８９〜２３１頁（１９８２年）において見出される。
【０１６２】
ある種の実施形態では、指示基は、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどである。主要な指示基が酵素、例えば、ＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼである場合、さらなる試薬は、受容体−リガンド複合体（免疫反応体）が形成されたという事実を可視化することが必要とされる。ＨＲＰのためのこのようなさらなる試薬は、過酸化水素および酸化染料前駆体、例えば、ジアミノベンジジンを含む。グルコースオキシダーゼと共に有用なさらなる試薬は、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン（ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ）−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１６３】
放射性元素はまた有用な標識剤であり、本明細書において例示的に使用される。例示的な放射標識剤は、γ線放出を生じさせる放射性元素である。それ自体がγ線を放つ元素、例えば、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒは、１クラスのγ線放出を生じさせる放射性元素指示基を表す。特に好ましいのは、１２５Ｉである。有用な標識化手段の別の基は、これら自体がポジトロンを放つこれらの元素、例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎである。このように放たれたポジトロンは、動物の体中に存在する電子との遭遇によってγ線を生じる。また有用なのは、ベータ放射体、例えば、１１１インジウムまたは３Ｈである。
【０１６４】
標識の連結、すなわち、ポリペプチドおよびタンパク質の標識化は、当技術分野で周知である。例えば、ハイブリドーマによって生成される抗体分子は、培養培地中の成分として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝性組込みによって標識することができる。例えば、Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３巻：３〜４６頁（１９８１年）を参照されたい。活性化された官能基によるタンパク質のコンジュゲーションまたはカップリングの技術は特に適用可能である。例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれている、Ａｕｒａｍｅａｓら、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第８巻、Ｓｕｐｐｌ．７：７〜２３頁（１９７８年）、Ｒｏｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３巻：８８９〜８９４頁（１９８４年）、および米国特許第４，４９３，７９５号を参照されたい。
【０１６５】
本発明の検出システムまたはキットを、「ＥＬＩＳＡ」フォーマットにおいて使用して、例えば、体液試料、例えば、血流、血清、骨髄、または組織などにおけるＢＣＭＡまたはＢＡＦＦの存在または量を検出することができる。「ＥＬＩＳＡ」とは、固相に結合した抗体または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを用いて、試料中に存在する抗原または抗体の量を検出および定量化する、酵素結合免疫吸着アッセイを指す。このように、例えば、本発明のポリペプチド、抗体分子組成物またはモノクローナル抗体分子組成物は、固体マトリックスに添付して、対象診断システムにおけるパッケージを構成する固体支持体を形成することができる。試薬は典型的には、水性媒体からの吸着によって固体マトリックスに添付しているが、当業者には周知の他のモードの添付を使用することができる。
【０１６６】
有用な固体マトリックスはまた、当技術分野で周知である。このような材料は水不溶性であり、架橋デキストラン；アガロース；直径が約１ミクロン〜約５ミリメートルのポリスチレンビーズのビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはナイロンをベースとするウェブ、例えば、シート、ストリップもしくはパドル；またはマイクロタイタープレートのチューブ、プレートもしくはウェル、例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルから作製したものが含まれる。
【０１６７】
本明細書に記載されている任意の検出システムの試薬種、標識された特異的結合剤または増幅試薬は、溶液中、液体分散物として、または実質的に乾燥粉末として、例えば、凍結乾燥した形態で提供することができる。指示手段が酵素である場合、酵素の基質をまたシステムの別々のパッケージ中で提供することができる。固体支持体、例えば、前記のマイクロタイタープレートおよび１種または複数の緩衝液をまた、この検出アッセイシステムにおける別々にパッケージ化したエレメントとして含むことができる。
【０１６８】
検出システムに関連して本明細書において論じられている包装材料は、診断システムにおいて従来通り利用されるものである。このような材料は、ガラスおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）のボトル、バイアル、プラスチックおよびプラスチック−ホイルラミネートの封筒などを含む。一実施形態では、本発明の検出システムは、例えば、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦの存在についてアッセイするのに有用である。このようなシステムは、キット形態で、例えば、ＢＣＭＡまたはＢＡＦＦに対する抗体を含有するパッケージを含む。
【０１６９】
この明細書において引用されている全ての公開資料、特許出願、および発行された特許は、それぞれの個々の公開資料、特許出願、または発行された特許が参照により組み込まれていることが特におよび個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１７０】
上記の発明を、理解を明瞭化する目的のために例示および例として少し詳しく記載してきたが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくある種の変化および修飾をこれに行い得ることは本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかであろう。限定としてではなく、例示のためのみに、下記の実施例を提供する。当業者は、変更または修正して本質的に同様の結果を生じさせることができる種々の重大でないパラメーターを容易に認識することができる。
【実施例】
【０１７１】
（実施例１）
ＭＭ患者からのＢＭＭＣはＢＣＭＡ発現を示し、これらの細胞からの培養培地は、高いＢＣＭＡ濃度を示した
多発性骨髄腫（ＭＭ）患者および健康な対象からの骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）（１×１０４個の細胞）上の膜結合Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の発現を、フローサイトメトリー分析を使用して測定した。ＢＣＭＡタンパク質は、健康な対象からのＢＭＭＣの非常に少ない割合で検出し、一方では、ＭＭ患者からの大部分のＢＭＭＣは強いＢＣＭＡ染色を示した（図１）。ＢＣＭＡ発現はまた、形質細胞白血病を有する患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において強かった（図１）。ＭＭ患者からの、ＣＤ１３８を発現し、かつ軽鎖に制限されるＢＭＭＣにおけるＢＣＭＡの存在（データは示さず）をまた確認した。
【０１７２】
活性疾患（ｎ＝１２試料）または緩徐進行型疾患（ｎ＝２）を有するＭＭ患者、２人のＭＧＵＳ個体、および５人の健康な対象からのＢＭＭＣ（１．６×１０６個の細胞／ウェル）を７２時間培養し、ＢＭからのＭＭ細胞が培養培地中にＢＣＭＡを放出することができるかどうかを決定した。ＭＭ患者からの上清は、高いＢＣＭＡ濃度を示し、一方では、健康な対象からのものは無視できる量を示した（図２Ａ）。ＢＣＭＡ上清レベルは、緩徐進行型ＭＭまたはＭＧＵＳを有するものより、活性疾患を有するＭＭ患者において著しくより高かった（図２Ａ）。ＢＣＭＡは、測定可能なモノクローナルＩｇの存在を失った形質細胞白血病を有する患者における非常に高い濃度（１５８９ｐｇ／ｍｌ）（データは示さず）を除いて、ＭＭ患者からのＰＢＭＣからの上清において検出可能でなかった。これらの知見は、大量のＢＣＭＡがＰＢまたはＢＭ  ＭＣ含有ＭＭから放出されることを示す。
【０１７３】
（実施例２）
上清ＢＣＭＡレベルは、ＭＭ形質細胞の百分率と相関する
培養培地中のＢＣＭＡの濃度は、ＢＭＭＣ中のＭＭ形質細胞の百分率と相関する。Ｈ＆Ｅならびにλおよびκ軽鎖染色を行い、悪性の形質細胞を同定した。有核細胞および形質細胞の総数を計数し、悪性細胞の割合を計算した。軽鎖染色を示す細胞の割合によって決定した高い百分率の悪性細胞（ＭＭ腫瘍細胞の＞７０％）を有する患者は、これらの培養培地において高濃度のＢＣＭＡを示し、一方では、僅かな軽鎖染色細胞を有する患者は、これらの培養培地において低いＢＣＭＡレベルを有した（図２Ｂ）。
【０１７４】
（実施例３）
血清ＢＣＭＡレベルは、ＭＭ患者において上昇した
新規に診断されたＭＭを有する患者（ｎ＝５０）、ＭＧＵＳ個体（ｎ＝２３）、ならびに年齢および性別を一致させた健康な対照対象（ｎ＝４０）からの血清中のＢＣＭＡレベルを測定した。ＭＭ患者は、ＩｇＧκ（ｎ＝２４）、ＩｇＧλ（ｎ＝９）、ＩｇＡκ（ｎ＝６）、ＩｇＡλ（ｎ＝３）、ＩｇＭκ（ｎ＝１）、κ軽鎖のみ（ｎ＝４）、およびλ軽鎖のみ（ｎ＝３）の疾患を有するものを含んだ。国際病期分類システム（Ｇｒｅｉｐｐら、２００５年）を使用した。３０人、１２人および７人の患者は、それぞれ、病期１、２、および３であり、１人は不明であった。健康な対照（Ｐ＜０．０００１）およびＭＧＵＳ個体（Ｐ＝０．０１５７；図３Ａ）と比較したとき、ＭＭ患者におけるＢＣＭＡの血清レベルは上昇した。特に、ＭＭ、ＭＧＵＳおよび対照における中央値血清ＢＣＭＡ濃度は、それぞれ、１３．８７ｎｇ／ｍＬ、５．３０ｎｇ／ｍＬ、および２．５７ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７５】
緩徐進行型ＭＭ患者（ｎ＝１６）は、活性ＭＭを有するもの（ｎ＝３４、中央値１７．７９ｎｇ／ｍＬ）より低いレベル（中央値１１．６０ｎｇ／ｍＬ）を有した。さらに、ＭＭまで最終的に進行した１人のＭＧＵＳ患者は、ＭＧＵＳ患者の最も高い血清ＢＣＭＡレベル（１２．６２ｎｇ／ｍＬ）を有し、これはこの女性がＭＭを発症したとき２５．６８ｎｇ／ｍＬへと倍増を超えて増えた。
【０１７６】
ＢＣＭＡレベルは、血清クレアチニンレベルと相関しなかった（データは示さず）。高濃度のヒトＩｇＧ（１０００ｎｇ／ｍＬ）によるＥＬＩＳＡの交差反応性は、０．０１５ｎｇ／ｍＬのみのＢＣＭＡ読み取り情報を伴って無視できた（データは示さず）。
【０１７７】
（実施例４）
ＭＭ患者における血清ＢＣＭＡレベルは、培養したＭＭ  ＢＭＭＣからの上清、疾患状況および全生存期間と相関した
ＭＭ患者（ｎ＝１４試料）の培養したＢＭＭＣの血清および上清からのＢＣＭＡレベルは、強い相関を示した（ｒ＝０．８２；図４）。血清ＢＣＭＡレベルの変化は、抗ＭＭ処置に応答した個々の患者の臨床状況の変化と相関することが見出された。
【０１７８】
応答性（≧ＰＲ）患者（ｎ＝８０試料）は、進行性疾患を示す個体（ｎ＝７９試料）（中央値１９．７６ｎｇ／ｍＬ；Ｐ＝０．００３８；図３Ｂ）より低い血清ＢＣＭＡレベル（中央値４．０６ｎｇ／ｍＬ）を有した。さらに、完全応答（ＣＲ）を達成した患者（ｎ＝２６）は、非常に良好な部分応答（ＶＧＰＲ）（ｎ＝１６、中央値３．３３ｎｇ／ｍＬ）または進行性応答（ＰＲ）（ｎ＝３８、中央値５．４４ｎｇ／ｍＬ）を伴う患者より低いＢＣＭＡレベル（中央値、２．０９ｎｇ／ｍＬ）を有した。
【０１７９】
処置に対して応答する患者は、ＢＣＭＡレベルの減少を示し、一方では、疾患の進行を伴う患者は、ＢＣＭＡレベルの増加を示した（図５）。患者の臨床状況に関わらず、血清ＢＣＭＡレベルは、投与された特異的抗ＭＭ剤の使用と相関しなかった（表１）。
【表１】
2018136344.tif 000002
【０１８０】
１１カ月の中央値経過観察（範囲、＜１〜８３カ月）を伴って、中央値（１０．８５ｎｇ／ｍＬ）超のＢＣＭＡレベルを有するＭＭ患者（ｎ＝１６２）は、中央値濃度未満の量を有するものと比較して生存の短縮を示した（Ｐ＝０．００１４；図３Ｃ）。さらに、最も高い四分位値（≧２４．５６ｎｇ／ｍＬ）における患者は、患者の残りと比較して著しい生存の短縮を示した（Ｐ＝０．０００３；図６）。
【０１８１】
（実施例５）
ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、標準物質およびＭＭ患者からの血清中でＢＣＭＡの検出を遮断した
ＭＭ患者からの血清を、ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（カタログ番号ＡＦ１９３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に４℃にて一晩インキュベートし、ＥＬＩＳＡを行った。抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（４００ｎｇ／ｍＬ）は、標準物質中でＢＣＭＡの検出を遮断し、一方では、同じ高濃度でのアイソタイプを一致させたポリクローナルヤギ対照Ａｂは、ＢＣＭＡの検出に対して何らの影響も有さなかった（図７Ａ、左パネル）。１０分の１の濃度の遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（４０ｎｇ／ｍＬ）を使用したとき、ＢＣＭＡは検出可能となったが、高濃度の標準物質が存在したときのみであった（図７Ａ、右パネル）。
【０１８２】
同様に、ＢＣＭＡは、高濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）の遮断抗ＢＣＭＡ  Ａｂの存在下で、希釈および無希釈のＭＭ血清において検出されなかった（図７Ｂ）。ＢＣＭＡレベルは、無希釈のＭＭ血清中で高く、試料単独を希釈すると減少した（図７Ｂ）。１０分の１の濃度の遮断ポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（１０ｎｇ／ｍＬ）を使用したとき、ＢＣＭＡは検出可能となったが、遮断Ａｂを欠いている血清中より低いレベルであった（データは示さず）。このように、外因的に加えられた抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、ＥＬＩＳＡにおいて使用される標準的抗ＢＣＭＡ  Ａｂで同定されるＢＣＭＡの検出を遮断し、ＢＣＭＡを検出するためのこのアッセイの特異性を示した。
【０１８３】
（実施例６）
モノクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂは、ポリクローナルＡｂをベースとするＥＬＩＳＡで検出するのと同様の血清ＢＣＭＡレベルを検出した
プレートを、捕獲Ａｂとしてモノクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓキットからのＢＣＭＡ標準抗原、または患者の血清を、モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）をコーティングしたプレートと共にインキュベートし、次いで、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓキットに記載されている標準的プロトコルを使用した。ＢＣＭＡはｍＡｂで検出可能であり、ＢＣＭＡ標準物質（図７Ｃ）ならびにＭＭおよびＭＧＵＳ患者からの血清試料（図７Ｄ）を評価するとき、レベルのパターンは、ポリクローナルＡｂで得た結果と一致した。
【０１８４】
（実施例７）
ヒトＭＭ異種移植片を含有するＳＣＩＤマウスはこれらの血清中でヒトＢＣＭＡを含有し、ＢＣＭＡレベルは、腫瘍容積および抗ＭＭ治療に対する応答と相関した
ＳＣＩＤマウスにおいて成長したヒトＭＭ異種移植片を使用し、ヒトＭＭ血清、および培養したＭＭ  ＢＭＭＣからの上清中に検出されたＢＣＭＡが、実際は、悪性細胞に由来したかどうかを決定した。ヒトＭＭを有するＳＣＩＤマウスにおいて成長している唯一のヒト細胞タイプは、腫瘍細胞であった。ＭＭ腫瘍（ＬＡＧκ−２、ＬＡＧλ−１およびＬＡＧκ−１Ａ）を、免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用してヒトＢＣＭＡ発現について分析した。ＢＣＭＡタンパク質を、３つの異種移植片において、マウスＢＣＭＡに結合しない抗ＢＣＭＡ  Ａｂで検出した（図８）。他のマウスの組織染色は観察されなかった（データは示さず）。
【０１８５】
血清ＢＣＭＡは、自然の腫瘍細胞代謝回転からまたは抗ＭＭ処置から、死細胞の結果として検出されなかった。マウスはパラプロテインを生成しないＬＡＧκ−２腫瘍を概ね１０００ｍｍ３にまで成長させ、この時点でマウスをボルテゾミブおよびシクロホスファミドで処置した。マウスは、この併用療法に続いて８〜１２時間出血させ（ｎ＝７）、または未処置の対照（ｎ＝４）であった。未処置の動物と比較して、腫瘍容積（Ｐ＝０．０００６）および血清ヒトＢＣＭＡレベル（Ｐ＜０．０００１）の両方における減少が、薬物処置したマウスにおいて観察された（図９Ａ、Ｂ）。薬物処置に続いて、死細胞からの膜結合タンパク質の可能な放出からの血清ＢＣＭＡレベルの上昇は観察されなかった。このように、マウスの血清中のＢＣＭＡは、生きた形質細胞からであり、死にかけているＭＭ細胞からのその放出の結果ではなかった。
【０１８６】
血清ヒトＢＣＭＡレベルはまた、別のヒトＭＭ異種移植片であるＬＡＧλ−１を担持するマウスにおいて腫瘍成長、ＩｇＧレベルおよび処置に対する応答と相関した。未処置のマウス（ｎ＝４）は、大きな腫瘍容積ならびに高い血清ＩｇＧおよびＢＣＭＡレベルを有した。ｉ．ｐ．注射によって週２回メルファラン（３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）を投与されたマウスは、未処置のマウスと比較してより小さな腫瘍容積、ＩｇＧ、およびＢＣＭＡレベルを示した（腫瘍容積：Ｐ＜０．０００１；ｈＩｇＧ、Ｐ＝０．００３３；ＢＣＭＡ、Ｐ＝０．００５５；図１０Ａ〜Ｃ）。ヒトＢＣＭＡは、腫瘍を担持しないＳＣＩＤマウスの血清中で検出されなかった（データは示さず）。
【０１８７】
（実施例８）
材料および方法
血清収集物ならびにＰＢおよびＢＭＭＣ培養物
ＰＢおよびＢＭ吸引液は、ＭＭ、ＭＧＵＳを有する患者、ならびに年齢および性別を一致させた健康な対照対象から得た。研究は治験審査委員会（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＩＲＢ  ＢＩＯ  ００１）によって承認され、インフォームドコンセントはヘルシンキ宣言に従って得た。
【０１８８】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＩＭＷＧ）の判断基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、２００３年；Ｒａｊｋｕｍａｒら、２０１１年）によって、患者はＭＧＵＳを有すると、ＭＭ患者は緩徐進行型ＭＭまたは症候性疾患と、および処置された患者は進行性または応答性疾患（部分応答（ＰＲ）、非常に良好（ＶＧ）ＰＲ、または完全応答（ＣＲ））を示すと定義された。ＭＭ患者のカプラン−マイヤー生存は、最初の血清ＢＣＭＡ測定の時から死亡または最後の経過観察の日までで決定した。複数のＢＣＭＡ試料を伴う個々の患者は、これらの最初の評価の時から分析した。
【０１８９】
Ｃｏｒｖａｃ（商標）血清セパレーターチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）からの血清を、遠心分離によって単離し、−８０℃で貯蔵した。ＰＢおよびＢＭ吸引液をヘパリン処置したチューブ中に集め、ＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）によって密度勾配遠心分離を使用して単離した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、２５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、２００単位／ｍＬのペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で３７℃および５％ＣＯ２にて培養した。
【０１９０】
血清、およびＢＭＭＣ培養物からの上清液中のＢＣＭＡ濃度の決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ
血清および上清試料を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡから得たＢＣＭＡ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（カタログ番号ＤＹ１９３Ｅ）によって分析した。血清試料を１：５０に希釈し、製造業者のプロトコルによってＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートを、ＫＣ  Ｊｕｎｉｏｒソフトウェアを伴う、４５０ｎｍに設定したμＱｕａｎｔ（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）プレートリーダーを使用して分析した。値は、各標本上の三連試料の平均を表す。このＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡキットは、組換えヒトＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦ、組換えヒトＴＡＣＩ／Ｆｃまたは組換えマウスＢＣＭＡ／ＦｃまたはマウスＢＣＭＡと交差反応しない。
【０１９１】
ポリクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（Ａｂ）遮断実験
Ｂ細胞成熟抗原標準物質を、別のポリクローナルヤギ抗ヒトＢＣＭＡ  Ａｂ（カタログ番号ＡＦ１９３；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または対照Ａｂと共に、高濃度（４００ｎｇ／ｍｌ）または低濃度（４０ｎｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩インキュベートした。ポリクローナルヤギＩｇＧ  Ａｂを、アイソタイプ対照として使用した（カタログ番号ＡＢ−１０８−Ｃ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。本発明者らはまた、一晩のインキュベーションに続くＭＭ患者１０５６の血清からのＢＣＭＡの検出をブロックするこのポリクローナル抗ＢＣＭＡ  Ａｂの能力を試験し、上記のＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡプロトコルを使用してＢＣＭＡレベルを評価した。
【０１９２】
モノクローナル抗ＢＣＭＡ  ＡｂによるＢＣＭＡの検出
ＭＭ患者からのＢ細胞成熟抗原標準物質または血清（１：５０に希釈）を、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡにおいて使用されるポリクローナル「捕獲Ａｂ」の代わりに、マウスのモノクローナル抗ヒトＢＣＭＡ  Ａｂ（カタログ番号ＷＨ００００６０８Ｍ１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してインキュベートした。次いで、ＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡプロトコルによって試料をアッセイした。
【０１９３】
ＭＭ異種移植片研究
６週齢のＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。動物実験委員会によって承認されたプロトコルによって動物試験を行った。ＣＤ３８およびＣＤ１３８を発現しているＬＡＧκ−２腫瘍を確立するために、ＩｇＧκパラプロテインを示すＭＭ患者からのＢＭ生検を、ＳＣＩＤマウスの後肢に埋め込んだ（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＢｅｒｅｎｓｏｎ、２００８年）。異種移植片を含有するマウスからの血清は、ヒトＩｇＧまたは遊離κ軽鎖を示さなかった。したがって、この異種移植片は、非分泌性と特徴付けた。しかし、免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を使用して、κ鎖が腫瘍細胞のサイトゾル中に観察された。ＬＡＧκ−１Ａ腫瘍は、レナリドミドに対して耐性であるＩｇＧκ生成ＭＭを有する患者から発生した（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＢｅｒｅｎｓｏｎ、２００８年）。ＬＡＧλ−１腫瘍は、ＩｇＧλパラプロテインを示したＭＭ患者から発生した（ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＢｅｒｅｎｓｏｎ、２００８年）。異種移植片を切除し、２０〜４０ｍｍ３の小片に切開し、筋肉中に埋め込んだ。腫瘍埋込みの７日後、マウスを処置群に無作為化した。腫瘍が直径２．５ｃｍに達したとき、動物を安楽死させた。
【０１９４】
プロテアソーム阻害剤（ＰＩ）ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液として使用し、０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を使用して希釈した。ボルテゾミブを０．７５ｍｇ／ｋｇで週２回ｉ．ｖ．投与した。シクロホスファミド（Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ、Ｐａｌｍ  Ｈａｒｂｏｒ、ＦＬ、ＵＳＡ）を、ＮａＣｌを有する２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液から溶解し、１０ｍｇ／ｋｇで経口胃管栄養法によって週１回投与した。３ｍｇでのメルファラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１００μＬの酸−ＥｔＯＨ（４７μｌの濃ＨＣｌおよび１ｍｌの１００％ＥｔＯＨ）に溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍＬに希釈し、３ｍｇ／ｍＬのストック溶液を生み出した。薬物を、３ｍｇ／ｋｇの用量で週２回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって投与した。
【０１９５】
標準的なカリパスを使用して腫瘍を測定し、楕円体積についての式を適用した（４／３π×［幅／２］２×［長さ／２］）。腫瘍成長およびＩｇＧ曲線を、処置群の平均値および標準誤差に関して分析した。
【０１９６】
マウスを、後眼窩洞を介して毎週出血させ、ヒトＩｇＧおよびＢＣＭＡレベルを決定した。試料を１０，０００ｒｐｍで５分間スピンし、血清を集めた。ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）を、製造業者の仕様書によって使用した。５５０ｎｍの参照波長を伴う４５０ｎｍでの吸光度を、ＫＣ  Ｊｕｎｉｏｒソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を伴うμＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計で決定した。ヒトＢＣＭＡ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、血清タンパク質レベルを決定した。
【０１９７】
免疫組織化学分析
Ｂ細胞成熟抗原タンパク質発現を、ＭＭおよび正常なＢＭＭＣにおいて、ならびに本発明者らのヒトＭＭ異種移植片において決定した。異種移植片について、４％パラホルムアルデヒドに固定した後、５μｍの切片を切り取った。ＢＭＭＣについて、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、１×１０５個の細胞／スライドをサイトスピンにかけた。スライドを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）および３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温にて（ＲＴ）１時間ブロッキングした。試料を、抗ヒトＢＣＭＡ  Ａｂ（５μｇ／ｍＬ）に４℃にて一晩曝露した。スライドをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＴＢＳＴ中で１：５００に希釈した抗マウス、抗ウサギまたは抗ヤギ抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）とコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼでＲＴにて２時間処置した。スライドを、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）緩衝液中に５分間入れ、ＡＥＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して色を検出した。軽鎖染色のために、ＢＭＭＣを、１００μＬのＰＢＳに再懸濁させ、スライド上でサイトスピンにかけた。試料を３％ＢＳＡでブロッキングし、その後、Ａｂを加えて、非特異的結合を防止した。ヤギ抗ヒトλ軽鎖Ａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ヒトκ軽鎖Ａｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはアイソタイプ対照Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、対応する試料に加えた。これらの抗体を、一晩４℃にてインキュベートした。翌日、抗体を０．０５ｍｏｌ／ＬのＴＢＳＴ緩衝液で洗浄した。次いで、試料を、二次Ａｂの前に、１０％Ｈ２Ｏ２メタノールで処置した。次いで、試料をペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ヤギＡｂ（ＫＰＬ）と共に２時間ＲＴにてインキュベートし、次いで、洗浄した。ペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、３０分間試料に加えた。細胞を、ヘマトキシリンで１分間染色し、試料をマウントした。ＢＣＭＡならびにλおよびκ軽鎖発現は、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１；Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、標準的な染色手順を使用してＢＭＭＣ上で行った。
【０１９８】
統計分析
上清、血清および異種移植片の研究において観察される差異の統計的有意性は、スチューデントｔ検定を使用して決定した。最小有意水準は、Ｐ＜０．０５であった。統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のためのＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭバージョン４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。
【０１９９】
一般に、下記の特許請求の範囲において、使用される用語によって、特許請求の範囲を、明細書において開示されている特定の実施形態、および特許請求の範囲に限定すると解釈すべきではないが、このような特許請求の範囲に与えられる完全な範囲の同等物と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、この開示によって限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
2018136344000001.pdf