(57)【要約】対象の血液または血漿から代謝成分の濃度を除去または低減するための電気泳動システムであって、該システムが、（ａ）陰極領域の陰極と、（ｂ）陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、（ｃ）電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、（ｄ）それらの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、（ｅ）対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、（ｆ）陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、（ｇ）対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段と、を含み、電位の適用によって、血液または血漿からの代謝成分が少なくとも１つのバリアから陰極領域または陽極領域の少なくとも１つに移動させられるシステム。
2005527247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の血液または血漿から代謝成分の濃度を除去または低減するための電気泳動システムであって、該システムが、
（ａ）陰極領域の陰極と、
（ｂ）陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、
（ｃ）電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、
（ｄ）それらの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、
（ｅ）対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、
（ｆ）陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、
（ｇ）対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段であって、電位の適用によって、血液または血漿からの代謝成分が少なくとも１つのバリアから陰極領域または陽極領域の少なくとも１つに移動させられる手段と、
を含むシステム。
【請求項２】
（ｈ）処理血液または血漿を対象に戻すように構成された手段をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
第１および第２のバリアが同じ所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
第１および第２のバリアが異なる所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記バリアがポリアクリルアミドで形成された膜ヒドロゲルである、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記バリアが、それを通して血清アルブミンの移動を可能にしない所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記バリアが、約６０ｋＤａ未満の公称分子量カットオフを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
第２の処理チャンバーを形成する電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第３のイオン透過性バリアをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
複数の処理チャンバーを形成する電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する複数のイオン透過性バリアをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記処理チャンバーを形成する前記バリアが、システムの電極領域間に配置されたカートリッジまたはカセットとして提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記カートリッジまたはカセットがカートリッジを含有し、または受入れるように構成された電気泳動装置から取外し可能である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記冷却手段が、気体、液体、または固体の熱伝達方式、冷却流体ジャケット熱交換器、およびペルチェ冷却器からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記冷却手段が、気体、液体、または固体の熱伝達方式である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記陰極領域および陽極領域が、ポンプ手段によって透析液または緩衝液で供給される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
血液または血漿がポンプ手段によって処理チャンバーに供給される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記電極領域および処理チャンバーが、それぞれの透析液および血液／血漿のフローを可能にし、それを通して流れを形成するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
対象の血液または血漿中の代謝成分の濃度または量を除去または低減するための方法であって、該方法が、
（ａ）陰極領域の陰極と、陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、それらの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段と、を含む電気泳動システムの処理チャンバーにおいて対象からの血液または血漿を配置するステップと、
（ｂ）陰極と陽極との間に電位を適用し、血液または血漿からの代謝成分をバリアを通じて電極領域の少なくとも１つに移動させるステップと、
（ｃ）血液または血漿からの代謝成分の所望量の除去が達成されるまで、ステップ（ｂ）を維持するステップと、
（ｄ）処理チャンバー中の処理血液または血漿を対象に戻すステップと、
を含む方法であって、該方法により実質的に血液または血漿が約３７℃の生理的温度より高温に加熱されることがない方法。
【請求項１８】
前記血液または血漿が、電気泳動システムの処理チャンバーに通される前に血液または血漿の温度を低下させる電気泳動システムの冷却手段を通過する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液または血漿が、対象に戻される前に処理チャンバーにおいて生理温度まで加熱される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が腎透析患者である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液または血漿が対象と処理チャンバーとの間で再循環されることが好ましい、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
電気泳動中に、前記血液または血漿の細胞および生体分子成分が実質的に処理チャンバー中に保持され、またはバリアに入る場合は、実質的に陰極領域または陽極領域に入ることが阻止される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記代謝成分が、溶質、窒素廃棄物、平均重量のタンパク質、不要なタンパク質、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶質がリン酸塩であり、前記窒素廃棄物が尿素および尿酸であり、前記平均重量のタンパク質がベータ−２ミクログロブリンであり、前記不要なタンパク質が自己抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法中に適用される電位が、実質的に血液または血漿中に存在する細胞またはタンパク質に有害な影響を及ぼすことがない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記処理チャンバーへの血液または血漿の流量が２０〜１０００ｍＬ／分である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記電位が約１００ボルトまで適用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
血液透析が、電気泳動装置への血液または血漿の適用前に、適用後、および／または適用中に対象上で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
患者の血液または血漿中の代謝成分の濃度または量を除去または低減するための方法であって、該方法が、
（ａ）患者の血液または血漿で血液透析を行うステップと、
（ｂ）血液透析された患者からの血液または血漿を請求項１７に記載の方法にかけるステップと、
を含む方法。
【請求項３０】
腎患者の透析における請求項１に記載のシステムの使用。
【請求項３１】
患者の透析を補助する人工腎、血漿分離装置、または血漿成分分離装置と併せた、請求項１に記載の電気泳動システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜電気泳動法を用いた血液または血漿からの不要な成分、または諸成分、特に代謝産物の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全において、腎機能の喪失により、タンパク質代謝の塩、水、および毒性崩壊産物の血中の蓄積によって特徴づけられる尿毒症症候群が生じる。世界中に約百万人の慢性腎不全患者がおり、年間増加率は約９％である。現行の療法は、伝導法（拡散−透析膜上の血液から透析液への溶質の受動輸送）、伝達法（限外ろ過−透析膜上の血液コンパートメントから透析液への溶媒および溶質の同時輸送）、および吸着法（タンパク質吸着は膜の疎水性によって左右される）に基づく。特定の療法の適切さを判定するために、尿素、クレアチニン、およびビタミンＢ１２などのマーカー分子の低減が測定された。マーカー分子、特に尿素は、治療の適切さの尺度として用いられている。尿素は病態生理的影響を有することがなく、かつ透析患者における尿素濃度は、それが主要な毒素ではないことを示す。しかし、尿素の生成は、タンパク質代謝の毒性産物の生成を示す。腎、または他の臓器不全により生成される毒素のすべてはまだ同定されていない。したがって、６５％の尿素のクリアランスが、適切な腎透析セッションであるとみなされる。末期腎疾患（ＥＳＲＤ）患者の大多数（８５％）は、受動拡散法を用いる血液透析と呼ばれる方法を用いて治療されている。しかし、血液透析患者の生活は、正常な生活には程遠い。彼らは、血液透析法が正常な生体腎の機能を完全に置換することが不可能であるための副作用、または合併症に苦しんでいる。
【０００３】
血液透析は、人工腎の中に血液を通過させることを必要とするが、ここで塩や尿素（低分子量分子）などの尿毒症毒素が半透過性膜上を等張透析液に拡散し、結果として血中の毒素濃度が低減する。しかし、毒素分子のサイズが増大するにつれて、拡散によって除去されるその能力は低下する。通常、中分子量分子と呼ばれる大分子の１０％〜４０％のみが、透析セッション中に除去される。したがって、これらの毒素は異常に高いレベルに達し、やがて身体に損傷を与え始める。中分子量毒素（例えば、β−２ミクログロブリン）やリン酸塩などの尿毒症毒素の非効率的な除去は、現行の腎透析技術の重要な制限を示す。現在、尿毒症毒素の最小限の適切な除去を達成するために、各メーカーおよび腎臓専門医は、人工腎の表面積を増大し、患者の治療時間を延長する試みを行っている。限界は、血液充填量（無駄になる）がヒトの血液再生時間を超える場合に達する。また、治療時間を増大させることにより、患者の生活の質が低下し、医療および補助スタッフの要求が増大する。注目すべきは、一部の会社および病院が、患者の生活の質を増強し、医療スタッフの要求を低減する自宅の毎夜透析の研究を行っていることである。
【０００４】
健常な個人において、腎は血液循環から過剰な水、塩、および小タンパク質を除去するように機能する。腎によって除去される窒素廃棄物としては、尿素、過剰な食事由来窒素の最終代謝産物（ｄｅｓｔｉｎｙ）、筋活動中に生成されるクレアチニン、およびヌクレオチド代謝の指標である尿酸が挙げられる。現行の腎透析技術は、平衡／拡散原理および膜間圧に依拠し、慢性または急性の腎不全に直面する患者の血流から窒素廃棄物、塩、および過剰な水を除去する。これには毎週３〜４回ベースで２〜３時間の透析治療が必要である。使用される透析膜の最適状態には及ばない生体適合性、リン酸塩など一部の溶質の除去における既存技術の不適切さ、およびベータ−２ミクログロブリンなど低分子量タンパク質の不十分な除去を含めて、既存の透析技術の重要な欠陥が存在する。
【０００５】
電気泳動技術、またはその変形を用いて、従来の透析における以上の欠陥に対処しうるように、腎機能代行療法のために血液透析を行うことができる。以上の欠陥は、血液透析チャンバーを通じて、リン酸イオンおよびタンパク質などの荷電溶質、ならびにナトリウム、カリウム、塩化物等など荷電窒素廃棄物および他の塩イオンの除去を促進する電位の適用を含むことによって対処しうる。電気泳動技術は、そのタンパク質によって仲介される疾患症状の治療を意図した、血液循環または血漿循環からの特定のタンパク質の除去に適用することができる。かかる疾患状態の例としては、患者の血液循環からの自己抗体または他の疾患関連タンパク質の選択的除去によって治療されうる関節リウマチおよび他の自己抗体仲介自己免疫疾患の宿主が挙げられる。
【０００６】
国際的に、８００，０００人が、その腎臓があるべき状態で機能しえないことを意味する慢性腎不全に罹患している。医学において、透析は、腎不全による身体から毒性廃棄物を排除する療法である。２つの主要なタイプの透析、すなわち血液透析と腹膜透析がある。
【０００７】
血液透析は通常、透析センターにおいて実行されるが、そこでの治療は週３回約４時間の透析を必要とする。これは患者の生活の質、および一般社会に対するその生産性を激しく妨げる。現在の技術は、身体からプラスチック毛細管で製造されたフィルターへの血液のルート変更を必要とする。血液は、これら微小毛細管の膜上を廃棄物が血液から拡散すると浄化される。次いで、血液は、通常、腕の静脈を通って身体に戻る。本システムの主な利点は、患者の訓練が不要であるという点である。主な不利点は、透析グラフト不全が一般的であり、治療のための透析センターへ報告すべき要件のため患者側の自由の欠如がある点である。
【０００８】
腹膜透析では、身体独自の膜がフィルターとして使用され、かつ腹部内外に排出される流体が毒素の除去における腎を代行する。このシステムには、これを自宅で行うことができることを含む、いくつかの大きな利点がある。しかし、これの家庭内使用は、注意深い手技を必要とし、腹膜炎および膜不全という追加の不利点がある。
【０００９】
ベータ−２−ミクログロブリン（β２ｍ）関連アミロイドーシスは、長期透析患者に影響を及ぼす重篤かつ衰弱性の合併症である。正常な生理的条件下では、自由に循環するβ２ｍが低濃度（１〜３ｍｇ／ｌ）で血漿中に見出しうる。しかし、このレベルは、長期透析患者において５０倍の高さまでになりうる。健常な個人においては、近位尿細管における糸球体ろ過および異化作用が、β２ｍを効果的に除去する。腎機能の障害はしばしばβ２ｍの保持、およびその循環濃度のその後の上昇をもたらすが、それはその異化作用に対する限られた代替があるためである。さらに、現行の透析治療は、種々の筋骨格構造におけるアミロイド原線維の一部としてその蓄積および堆積をもたらすのに十分な速度でβ２ｍを効果的に除去することができない。これらのアミロイド堆積物は主に骨関節性であり、手根幹症候群、関節痛および硬直、骨嚢胞、病的骨折、および軟組織塊など種々の臨床症状と関係がある。β２ｍアミロイドーシスと関係がある臨床に関する問題は、長期透析患者における死亡率の主な原因をなす。
【００１０】
ベータ−２ミクログロブリンは、９９アミノ酸残基の一本鎖ポリペプチドを含む１１．９ｋＤａの非グリコシル化タンパク質である。これは染色体１５上の単一遺伝子によってコード化され、かつ１８残基シグナルペプチドで合成される。β２ｍは、全有核細胞の表面上に遍在的に発現し、ここで重鎖との非共有結合によってＨＬＡクラスＩ分子の軽鎖として機能し、細胞表面での錯体の輸送および発現に必要とされる。また、ＩｇＧ（ＣＨ３）の定ドメインおよび重鎖ＨＬＡクラスＩのアルファ−３ドメインと相同性のアミノ酸配列を有することも示されている。β２ｍの一部のイソ型であり、それぞれ５．７および４．８〜５．３の等電点を有する、長期透析患者において見出される天然β２ｍおよびより酸性の変形が記載されている。
【００１１】
リン酸塩の保持は、１．２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３の腎合成の低減によって透析患者における二次性副甲状腺機能亢進症の病因においてきわめて重要な役割を果たす。したがって、血清リン酸塩レベルのコントロールが、副甲状腺機能亢進症治療の方法の中心となる。リン酸塩レベルのコントロールにおいて実施しうる幾つかの方法としては、食事によるリン酸塩の制限、リン酸塩結合薬の投与、およびリン酸塩透析除去（ＰＤＲ）が挙げられる。
【００１２】
既存の腎透析法では、拡散性および／または対流的手段を使用し、血液からの汚染分子を除去する。血液は使い捨てカートリッジを通過し、そこで血液は１つの方向および透析液に移動し、半透膜によって血流から分離し、反対方向に流れる。
【００１３】
血流拡散性除去は、血液が生理的透析液に対して透析されると、血中には存在するが透析液には存在しない汚染分子が、その濃度勾配を拡散し、血流から出し、透析液に入れることを意味する。これは「従来式腎透析」において使用される汚染物除去の様式である。このタイプの透析は通常、低分子量溶質の除去には十分であるが、より大きな血液成分またはβ２ミクログロブリンのような汚染物の除去には完全に不十分である。
【００１４】
対流的除去は、流体（細胞ではない）を膜に押し通すのに十分な圧力で血液が膜上で処理されることを意味する。これは血液ろ過と呼ばれ、血液からの流体の大きな流れによって行われる血液汚染物の除去を可能にする。一部の流体除去は、代替溶液を患者に注入し、正確な体液バランスを維持することによってバランスが保たれる。
【００１５】
様式除去の拡散性および対流的手段は、比較的高い圧力で維持された血液が、低圧で維持された透析液に対して透析される血液ろ過として知られる透析様式に一体化されうる。溶質は半透膜上を拡散しうるが、膜間圧によって誘発される血液からの同時の大量の流体除去が溶質除去の速度を増す。ＨＤＦでは、代替溶液も用いられて流体バランスを維持し、透析カートリッジにおける処理前後の血液に添加されうる。
【００１６】
グラジフロー（Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ）（商標）は、分離が分子の荷電およびサイズの二元的方法を用いて達成される、グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（オーストラリア）によって開発された膜分取電気泳動技術である。この技術の顕著な機能は、一連のヒドロゲル膜、および分離を推進するこれら膜上の電位の適用である。これらの機能の使用により、多くのタンパク質精製において証明されている、汚染物または複合原料からの産物の選択的除去が可能となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
こうして本発明により、血液（および）血漿を処理し、不要な代謝産物を除去するために適した膜電気泳動システムが開発された。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の開示
第１の態様において、本発明は、対象の血液または血漿から代謝成分の濃度を除去または低減するための電気泳動システムであって、該システムが、
（ａ）陰極領域の陰極と、
（ｂ）陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、
（ｃ）電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、
（ｄ）それらの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、
（ｅ）対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、
（ｆ）陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、
（ｇ）対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段であって、電位の適用によって、血液または血漿からの代謝成分が少なくとも１つのバリアから陰極領域または陽極領域の少なくとも１つに移動させられる手段と、
を含むシステムを提供する。
【００１９】
好ましい形態において、前記システムは、
（ｈ）処理血液または血漿を対象に戻すように構成された手段をさらに含む。
【００２０】
代謝成分は、小化合物および中分子量のタンパク質など血液または血漿中の任意の不要な代謝成分でありうる。好ましくは、代謝成分は、リン酸塩、尿素や尿酸のような窒素廃棄物を含む溶質、またはベータ−２ミクログロブリンを含む高分子、および自己抗体を含む他の不要なタンパク質である。
【００２１】
従来の透析法はリン酸塩およびベータ−２−ミクログロブリンを有効に除去しえないため、本発明によるシステムは、標準の透析治療の補助的手段として特に適している。
【００２２】
対象は、例えば、腎透析を必要とする腎異常を有する患者、または肝異常を有する患者でありうる。
【００２３】
陰極領域および陽極領域が、適切なポンプ手段によって適切な透析液または緩衝液で供給される。血液または血漿は、適切なポンプ手段によって処理チャンバーに供給される。
【００２４】
第１および第２のバリアは、同一の所定の孔径および孔径分布、または異なる所定の孔径および孔径分布を有しうる。好ましくは、バリアは、ポリアクリルアミドまたは他の適切なポリマーで形成されたヒドロゲル膜である。血液または血漿の処理における使用のために、これらの膜は、血清アルブミンの移動を許さない所定の孔径および孔径分布を有することが好ましい。通常、バリアまたは膜は、約６０ｋＤａ未満の公称分子量カットオフを有する。
【００２５】
バリアまたは膜の分子量カットオフの選択は、処理される試料および除去される代謝成分によって左右される。しかし、他の膜の化学作用または要素を本発明のために使用しうることは明らかであろう。
【００２６】
２つ以上の処理チャンバーが必要とされる状況もありうる。その場合には、本発明によるシステムは、第２の処理チャンバーを形成する電界域に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第３のイオン透過性バリアをさらに含みうる。同様に、複数の処理チャンバーが必要とされることもある。その場合には、本発明によるシステムは、複数の処理チャンバーを形成する電界域に配置された所定の孔径および孔径分布を有する複数のイオン透過性バリアをさらに含みうる。
【００２７】
１つの好ましい形態において、処理チャンバーを形成するバリアまたは膜は、システムの電極領域間に配置されたカートリッジまたはカセットとして提供される。好ましくは、カートリッジまたはカセットは、カートリッジを含み、または受入れるように構成された電気泳動装置から取外し可能である。電極は、電気泳動装置に格納され、またはカートリッジ内に配置されうる。カートリッジは、使い捨て式であり、または再利用のように構成されうる。異なる処理のために異なる膜が必要とされうるため、組合せが、必要に応じて無菌の形で、１回使用のために供給されうる。あるいは、カートリッジは分解され、新しいバリアまたは膜が挿入されうる。
【００２８】
好ましくは、電極領域および処理チャンバーは、流れを形成するそれぞれの透析液および血液／血漿の流れを可能にするように構成される。この形態では、大量の血液または血漿を迅速かつ効果的に処理することができる。好ましくは、透析液は、適切なポンプ手段によってリザーバから電極領域を通じて移動または再循環される。好ましい実施形態では、透析液および血液／血漿を移動するためのポンプ手段として蠕動ポンプが用いられる。
【００２９】
好ましくは、冷却手段は、気体、液体、または固体の熱交換システムまたは諸システム、冷却流体ジャケット熱交換器、またはペルチェ冷却器である。より好ましくは、冷却手段は、気体、液体、または固体の熱交換システムまたは諸システムである。
【００３０】
血液／血漿は、対象からシステムに再循環され、不要な代謝産物の量が減少するまで、ある期間にわたって対象に戻されることも可能である。
【００３１】
システムは通常、生体適合性であり、かつ洗浄、消毒、または滅菌のために容易に分解される部品によりモジュール形式で構築されている。
【００３２】
使用時、血液または血漿は、対象から除去され、冷却手段を通過し、血液または血漿の温度を低下させ、処理チャンバーに入る。透析液が電極領域に供給され、電界域に電位がかけられ、血液または血漿中の少なくとも１つの代謝成分を少なくとも１つのバリアまたは膜の中に移動させ、それぞれの陰極領域または陽極領域に入れる。処理後、血液または血漿は対象に戻される。血液または血漿は、システムを通じて患者から再循環によって連続的に処理され、または血液または血漿を処理チャンバーに保持することによってバッチ処理されうる。
【００３３】
本発明によるシステムは、動物、特にヒトの腎透析に適している。
【００３４】
システムの部品は、生体適合性であることがわかっており、透析後に元の患者に戻した場合に血液成分に対して有害な影響を及ぼすことがない。
【００３５】
第２の態様において、本発明は、対象の血液または血漿中の代謝成分の濃度または量を除去または低減するための方法であって、該方法が、
（ａ）本発明の第１の態様による電気泳動システムの処理チャンバー内に対象からの血液または血漿を配置するステップと、
（ｂ）２つの電極間に電位をかけ、血液または血漿から膜を通じて代謝成分を移動させ、電極領域のの少なくとも１つに入れるステップと、
（ｃ）血液または血漿からの代謝成分の所望量の除去が達成されるまで、ステップ（ｂ）を維持するステップと、
（ｄ）処理チャンバー中の処理血液または血漿を対象に戻すステップと、を含む方法であって、該方法により実質的に血液または血漿が約３７℃の生理的温度より高温に加熱されることがない方法を提供する。
【００３６】
好ましくは、血液または血漿は、処理チャンバーに通される前に冷却手段を通じて挿入される。本発明者によって、処理チャンバーに通される前に血液または血漿を冷却することが好ましいことが確認されている。血液または血漿は、血液または血漿が処理チャンバー内で処理される場合に生じることが予想される加熱の量によって生理的温度（約３７℃）より低温に冷却されることが好ましい。電気泳動中に血液の望ましくない溶血、もしくは血液または血漿の破壊あるいは不活性化の原因となりうる一部の加熱が生じるため、処理により血液または血漿が実質的に生理的温度（約３７℃）より高温に加熱されてはならない。処理前に血液または血漿を冷却することにより、処理中の血液または血漿の過熱に伴う問題が克服される。
【００３７】
好ましい形態では、血液または血漿は、本発明の第１の態様による電気泳動システムの冷却手段を通じて挿入され、電気泳動システムの処理チャンバーに通される前に血液または血漿の温度を低下させる。このステップにより、血液または血漿が約３７℃の生理的温度より高温に加熱されることが予防される。チャンバー内での電気泳動中に、血液または血漿は、対象に戻される前に所望の温度まで加熱されうる。
【００３８】
好ましい実施形態では、対象は腎透析患者または肝不全患者である。
【００３９】
血液または血漿は、対象と処理チャンバーとの間で再循環されることが好ましい。
【００４０】
バリアは、代謝成分の明らかな分子量に近い分子量カットオフを有しうる。しかし、バリアが適用によって必要な分子量カットオフを有することが明らかであろう。
【００４１】
好ましくは、電気泳動中に、血液または血漿の細胞および生体分子の成分が実質的に処理チャンバー内に保持され、またはバリアに入る場合は、実質的に電極チャンバーに入ることが予防される。
【００４２】
好ましくは、代謝成分は、リン酸塩、尿素や尿酸のような窒素廃棄物を含む溶質、またはベータ−２ミクログロブリンを含む高分子、および自己抗体を含む他の不要なタンパク質である。
【００４３】
好ましくは、バリアは、約３〜約６０ｋＤａの分子量カットオフを有し、アルブミンなどのより大きなタンパク質が血液または血漿から失われないことを保証する膜である。しかし、必要な処理工程によって、他のサイズの膜が適用可能であることは明らかであろう。多くの異なるバリアまたは膜も所望の、または有用な構成で用いることができる。
【００４４】
方法中に適用される電位は、血液または血漿中に存在する細胞またはタンパク質に実質的に有害な影響を及ぼさないことが好ましい。約１００ボルトまでの電位が適切であることがわかっている。しかし、他の電圧が使用しうることが明らかであろう。
【００４５】
血液／血漿試料または透析液の流量は、代謝成分の分離に影響を与えることがある。２０ｍｌ／分の速度が適切であることがわかっている。しかし、分離の規模を増大することにより流量も増大する。２００〜８００ｍｌ／分の流量が、拡大された電気泳動システムにおいて達成可能であることが予想されよう。電気泳動システム（補助または独立型ユニット）の適用に応じて、２０〜１０００ｍｌ／分の流量が予想されよう。
【００４６】
印加電圧および／または電流の選択または適用は、適用に応じて変動する。通常、約１００ボルトまでを使用できるが、電圧の選択および変化は、装置の構成、透析液、および処理される試料に左右されることになる。重要なことには、使用される電圧により血液または血漿が「過熱」され、結果的に血液または血漿成分の溶血もしくは不活性化または破壊をもたらさないことである。最適化冷却システムの使用により、システム上にかけられる電位の増大が可能となる。電気泳動システムを拡大することにより、結果としてシステム上にかけられる電位も増大することになる。
【００４７】
必要に応じて、電位は定期的に停止および／または逆転され、バリアまたは膜に入った成分の移動をひき起こし、チャンバー内の試料に戻すと同時に、バリアまたは膜を完全に通過しない成分をバリアまたは膜を通じて戻すことを実質的にひき起こさないようにしうる。
【００４８】
電位の逆転は、任意選択であるが、別の選択肢は静止期である。静止（電位がかけられない期間）は、任意選択の電位逆転の代わりとなりうる、またはその前後に含まれうる任意選択のステップである。この静止法はしばしば、電位の逆転の代替または補助として特定の用途のために実施できる。
【００４９】
１つの形態では、少なくとも１つの血液成分が、拡散性血液透析、対流的血液透析、血液ろ過、血液透析ろ過、またはステップ（ａ）の前、その後、または同時の組合せなどの処理を受けた。
【００５０】
第３の態様において、本発明は、対象の腎透析のための方法であって、該方法が、対象の血液または血漿での血液透析を行った後、本発明の第２の態様による方法に対象の血液または血漿を処理するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
従来の血液透析はしばしば、一部の代謝成分を腎患者の血液から除去することができず、これによりこれらの成分の蓄積が生じうるため、本発明の第２の態様による方法を用いた第２の処理方法は、これらの成分を選択的に除去する可能性を有する。
【００５２】
好ましくは、前記方法は、
（ａ）患者の血液または血漿の血液透析を行うステップと、
（ｂ）本発明の第１の態様による電気泳動システムの処理チャンバー内に血液透析された患者のからの血液または血漿を配置するステップと、
（ｃ）血液または血漿から代謝成分の所望量の除去が達成されるまでステップ（ｂ）を維持するステップと、
（ｄ）処理チャンバー内の処理血液または血漿を対象に戻すステップであって、該方法により実質的に血液または血漿が約３７℃の生理的温度より高温に加熱されることがないステップと、
を含む。
【００５３】
成分は、リン酸塩、またはベータ−２ミクログロブリンあるいは自己抗体などのタンパク質でありうる。しかし、他の不要な代謝成分がこの方法において除去されうることも明らかであろう。
【００５４】
第４の態様において、本発明は、腎患者の透析における本発明の第１の態様によるシステムの使用に関する。
【００５５】
第５の態様において、本発明は、人工腎、血漿分離装置、または血漿成分分離装置といっしょに患者の透析の補助に適合された電気泳動システムの組合せに関する。
【００５６】
本明細書の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数、またはステップ、あるいは要素、整数、またはステップの群の包含を意味するが、他の要素、整数、またはステップ、あるいは要素、整数、またはステップの群の除外を意味しないと理解されるであろう。
【００５７】
本明細書に含まれている文書、法令、材料、装置、物品などの考察は、単に本発明の背景を提供する目的のためである。これらの内容のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成し、または本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在した本発明に関する分野における一般的な常識であったと認めるべきではない。
【００５８】
本発明がより明らかに理解されるために、以下の図面および実施例を参考にして好ましい形態を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
発明の実施形態
略語および用語
本明細書では、血液処理における膜電気泳動およびその使用、ならびに試験された代謝パラメータと関連した特定のコンパートメントおよび工程を記載するために略語が用いられる。以下は、簡単な説明とともに略語のリストである。
Ａ−Ｇ比−アルブミン：グロブリン比
ＡＳＴ−アミノトランスフェラーゼ。
ＢＦ２００−グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）（オーストラリア）によって製造された一般グラジフロー（Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ）（商標）実験電気泳動モデル。
緩衝液流または透析液流−膜の外側を循環する流れ。この流れには通常フレゼニウスの形の透析液が配置された。
Ｃ３ａ−補体因子Ｃ３ａ。最終的に膜を生成する補体カスケードに関与するタンパク質は、免疫反応中の錯体を攻撃する。
カートリッジ構成の１つの流れ（透析）−１つの流れ（Ｓ１）を形成した１つの制限膜および１つの分離膜を用いて構成された膜カートリッジ。カートリッジは通常、上部の制限膜、および株の分離膜で構成され、結果として試料の流れがＳ１にロードされる。カートリッジ構成を記載するための仕様は、上部から下部であったが、上部制限−分離は、例えば、１００−１００ｋＤａ分子量カットオフ。
カートリッジ構成の２つの流れ−２つの流れ（Ｓ１およびＳ２）を形成する２つの制限膜間の１つの分離膜を用いて構成された膜カートリッジ。カートリッジ構成を記載するための仕様は、上部から下部であったが、上部制限−分離−下部制限は、例えば、３−１００−３ｋＤａ分子量カットオフ。
Ｃ−ビリルビン−抱合型ビリルビン。
ＣＫ−クレアチンキナーゼ。
コンソート電源−低導電率環境下に３００Ｖ／２Ａ／１５０Ｗ（通常、タンパク質分離において２５０Ｖ／１Ａ／１５０Ｗに制限）に達する能力がある電源。
ＤＦ１００−透析フロー１００と呼ばれる本発明のために開発された膜電気泳動モデル。
ＥＳＲＤ−末期腎疾患。
ガンマＧＴ−ガンマグルタミルトランスフェラーゼ。
ＧＬＤＨ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ。
Ｈｂ−ヘモグロビン。
ＭＣＨ−平均細胞Ｈｂ。
ＭＣＨＣ−平均細胞Ｈｂ濃度。
ＭＣＶ−平均細胞容積。
ＰＣＶ−パック細胞容積。
ＲＢＣ−赤血球。
ＲＤＷ−ＲＢＣ分布幅。
ＲＳ電源−高導電率環境下に最大６３．３Ｖ／３Ａで操作可能な電源。
Ｓ１−電気泳動システムの流れ１。
Ｓ２−電気泳動システムの流れ２．
Ｔ−ビリルビン−総ビリルビン。
ＷＣＣ−白血球数。
電気泳動システム
本発明に適したシステムの一般的な機能を例示する目的で分離装置２０を利用する電気泳動システム１０の概略図が図１に示されている。この純粋に例示的な実施例において、２つの電極領域（陰極領域２２、陽極領域２４）が陽極液流路に接続されている。流路４０は、陽極液リザーバ４２、陽極液管４４、および陽極液ポンプ４６を含む。
【００６０】
試料流路４８は、冷却手段５０、管５２、およびポンプ５４を含有する。試料５６は、対象５０から熱交換器６０の形の冷却手段に管５２を通じてポンプ５４まで流れ、次いで入口を通じて処理チャンバー２６に流れ込む。１つの実施形態において、処理チャンバー２６における陽極液３６と試料５６の方向は反対である。試料５６は出口で分離装置２０を出て、管５２を通じて流れ、管５２を通じて対象５０に戻る。別の実施形態では、処理チャンバーにおける試料５６と陽極液３６の流れ方向は同じである。
【００６１】
好ましくは、すべての管４４および５２は、加圧滅菌耐性であり、化学的に耐性であり、かつ生物学的に不活性である蠕動管である。かかる管の１つが、マスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）（登録商標）Ｃ−フレックス（ＦＬＥＸ）（登録商標）５０Ａ管である。また、ポンプ４６および５４は、陽極液３６および試料５８と接触しない蠕動ポンプであることが好ましい。現在の好ましい実施形態では、熱交換器６８はステンレス鋼で構成されているが、当業界で周知の他の材料が適切に使用される。好ましくは、熱交換器６８は、加圧滅菌耐性であり、化学的に耐性であり、生物学的に不活性であり、かつ血液または血漿試料の熱交換の促進が可能である。
【００６２】
さらに、患者がシステム１０に接続されている場合、試料流路４８および陽極液流路４０は完全に封入され、汚染または交差汚染を予防することが好ましい。
【００６３】
分離装置２０は、電極８８ａおよび８８ｂをさらに含む。好ましくは、それぞれの電極は、陰極領域および陽極領域に配置され、イオン透過性バリアによって処理チャンバーから分離されている。
【００６４】
電極８８ａおよび８８ｂは、適切に標準の電極であり、または好ましくは白金コートチタン幅広メッシュで形成され、良好な機械的特性、電界の均一な分布、高耐用性、および費用効率が得られる。電極８８ａおよび８８ｂは、好ましくはイオン透過性バリア３０および３２に比較的接近して配置され、かけられた電位の良好な利用および熱発生の減少が得られる。約０．１〜６ｍｍの間隔がシステムに適していることがわかっている。より大きな種類では、間隔はイオン透過性バリアの数とタイプ、および電極領域と処理チャンバーのサイズと容積によって決まる。好ましい間隔は、ほぼ約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍ程度となる。
【００６５】
分離装置２０は、分離装置２０を電源７２に接続するために用いられる電極コネクタ７８を含むことも好ましい。好ましくは、電源７２は分離装置２０の外部であるが、しかし、分離装置２０は内部電源７２に対応するように設定可能である。電極コネクタ７８は、好ましくは加圧滅菌耐性である。
【００６６】
血液または血漿試料からの代謝成分の移動は、電位が分離装置２０にかけられると達成される。電界強度（電位）の選択は、分離に応じて変動する。通常、電界強度は、１Ｖ／ｃｍ〜約５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは１０Ｖ／ｃｍ〜８０Ｖ／ｃｍであり、約１Ａまでの電流をもたらす。装置の総電力消費量を最小限に、所望の分離および生産速度と釣り合いを取って維持することが好ましい。
実験計画法
現行の腎透析療法では、リン酸塩および問題のある中分子量分子が十分には除去されない。腎透析設定において、本発明によるシステムおよび方法のタンパク質除去と電解質透析の結合特性は、腎不全患者の治療における大きな潜在的可能性を有する。本発明による電気泳動システムおよび方法では電位を用いて分離を推進するため、リン酸塩などの大きな電荷：質量比を有する分子は、きわめて迅速に除去された。アルブミンより小さい分子量のタンパク質である傾向がある中分子量毒素は、特定のｐＨで特定の電荷を有する。タンパク質上の電荷、および膜の分子量カットオフを用いることによって、中分子量タンパク質の低減が達成しうる。
【００６７】
腎透析設定における膜電気泳動の潜在的利点の初期評価には、尿毒症毒素が出発原料から除去できたかどうかの判定が含まれた。窒素廃棄物除去の調査は当初、少量（１２ｍｌ）の出発試料を用いるＢＦ２００モデルグラジフロー（Ｇｒａｄｉｆｌｏｗ）（商標）を用いて行われた。すべての実行のために、酢酸−炭酸水素塩血液透析透析液（フレゼニウス（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ））または乳酸腹膜透析液（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ））のいずれかを緩衝液として用いた。市販の透析液は、腎透析治療において生理的に適合性であることが確認されており、現行の透析療法の補助として電気泳動システムを用いる容易な手段をも提供したため、これらを用いた。少量の窒素廃棄物除去実験では当初、ＢＦ２００における１５Ｖ電位を用いて、分子の移動プロフィールを生成した。試験した分子の一部は電荷対質量比が低く、したがって運動性が低かったため、６３．３Ｖの電位を用いて分子移動速度を増大させた。
【００６８】
少量（１２ｍｌ）の窒素廃棄物除去実験では、電気泳動システムが、スパイクされた尿毒症毒素（尿素、尿酸、クレアチニン、リン酸塩、およびβ−２−ミクログロブリン）を緩衝液から除去できたかどうかの評価が含まれた。次いで、緩衝液を正常かつスパイクされた血漿、血液、および腎患者の透析液と交換した。腎患者の透析液を中分子量の毒素β−２−ミクログロブリン低減実験の代替源として用いた。
【００６９】
電気泳動システムを用いた場合に血液／血漿から特定の尿毒症毒素が除去されたことを確認することにより、工程が生体適合性であったかどうかの判定が得られた。文献の検討によりポリアクリルアミドヒドロゲル膜（ポリアクリルアミド含有コンタクトレンズと皮膚パッチの使用に関する情報は一致したが、この情報は血液接触生体適合性とは無関係であった）および電位が生体適合性であったかどうかについて明らかな指標は得られなかったため、両方を調査した。ＢＦ２００の生体適合性データを透析状態とより関連させるため、処理量を１２ｍｌから１００ｍｌに変更した。開始量を増大させることにより、平均的な人において確認されるものと同様の血液量を電気泳動システムで処理することが可能である。血液／ヒドロゲル／電位の相互作用の予備的概要を得るために選択された生体適合性パラメータは、溶血、凝固、補体、および白血球経路であった。この試験からの結果は、「生体適合性態様」において確認することができる。
【００７０】
ＢＦ２００によって生じる溶血の量を低減し、電気泳動システムをより臨床的に実用向きにするため、透析電気泳動システムの試作品を開発した。透析試作品は透析フロー１００（ＤＦ１００−ＢＦ２００とＤＦ１００との違いは以下に記載されている）で示した。ＤＦ１００は溶血を低減し、ＢＦ２００の同じ生体適合性態様を維持した。
【００７１】
ヒトにおいて確認される血液量を処理するＤＦ１００をスケーリングするために必要なパラメータを決定するために、複数のパラメータを調査した。調査したパラメータは、生体適合性、電位、緩衝液および電解質分析、および大量の尿毒症性廃棄物除去であった。
【００７２】
インビトロ工程により尿毒症性廃棄物の除去が可能であり、測定された生体適合性マーカーが重大な有害作用を示さなかったことを確認することにより、動物試験を行った。動物試験の目的は、ヒツジモデルにおける電気泳動システムのインビボ生体適合性を調査することであった。第１相動物試験からの結果は、以下で確認することができる。
【００７３】
動物試験から得られた結果により、電気泳動システムが医療機器としての使用が推測上可能であることが確認された。
結果
窒素／尿毒症性廃棄物除去
目的は、スパイクされた緩衝液、血漿、および全血からの尿毒症性廃棄物（尿素、クレアチニン、および尿酸）およびリン酸塩のその除去能について電気泳動システムを評価することであった。
方法
血液および血漿を健常ボランティアから得た。１ｍｇ／ｍｌ尿素（６０Ｄａ）、０．１ｍｇ／ｍｌクレアチニン（１１３Ｄａ、ｐＫｂ１０．４）、０．２５ｍｇ／ｍｌ尿酸（１６８Ｄａ、ｐＫａ５．７５）、および０．１ｍｇ／ｍｌリン酸塩を、血液または血漿の試料１２ｍｌに添加した。このスパイクされた血液または血漿を電気泳動システムＢＦ２００のＳ１に配置した。炭酸水素塩血液透析透析液（フレゼニウス・メディカルケア・東南アジア（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔ  Ａｓｉａ）Ｐｔｙリミテッド（Ｌｔｄ）（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州（ＮＳＷ）、スミスフィールド））を緩衝液流中で用いた。これらの実験のために、中間分離膜なしにカートリッジを組立て、１つの試料流れを得た。１５Ｖの電位を２５ｋＤａ／２５ｋＤａ膜カートリッジ上にかけた。１時間にわたり５分毎に試料を採取し、標準の臨床試験キット（トレース・サイエンティフィック・リミテッド（Ｔｒａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）（オーストラリア、ビクトリア州（Ｖｉｃ）、メルボルン）を用いて、尿素、クレアチニン、尿酸、およびリン酸塩の除去について検査した。観察される分子移動の明らかなプロフィールために１５Ｖの電位を選択した。これらの分子の大半は電荷対質量比が高く、したがって移動性が高いため、確立される比較プロフィールのために高電圧が分子をきわめて迅速に移動した。
【００７４】
β２ミクログロブリンのレベルが高い（１２ｋＤａ、ｐｌ５．８）腎透析患者から血漿を得た。この血漿を電気泳動システムＢＦ２００のＳ１に配置した。炭酸水素塩血液透析透析液（フレゼニウス・メディカルケア・東南アジア（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔ  Ａｓｉａ）Ｐｔｙリミテッド（Ｌｔｄ）（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州（ＮＳＷ）、スミスフィールド））をＳ２および緩衝液流れに配置した。６３Ｖ（ＲＳ電源）の電位を従来の構成の３−２００−３ｋＤａ膜配列上に配置した。Ｓ１およびＳ２から試料を採取し、ベーリング（Ｂｅｈｒｉｎｇ）比濁計１００アナライザーおよびデイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）比濁計試薬（デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）社、ドイツ）を用いて、β２−ミクログロブリンの除去について検査した。タンパク質の移動を可能にするために６３Ｖの電位を用いた。上述した分子よりも低いタンパク質の電荷対質量比により、高い電位が必要であった。
結果
尿素
血液透析と同じ原理の受動拡散によって、血漿、スパイクされた血液、およびスパイクされた血漿から非荷電分子の尿素を除去した。血漿は、１時間後に４９％のクリアランスを示したが、スパイクされた血液およびスパイクされた血漿からの除去はそれぞれ、２１％および４３％であった（図２）。
クレアチニン
クレアチニンは生理的条件でわずかに陽性の電荷を有し、結果として電圧依存除去となる。１時間後、４１％のクレアチニンが正常血漿試料から除去され、スパイクされた血液およびスパイクされた血漿から得られた除去はそれぞれ、１４％および２５％であった（図３）。
尿酸
生理的環境下では、尿酸は陰性の電荷を有し、したがって除去が電圧依存であることもわかった。１時間後、尿酸の８９％が正常血漿試料から除去された。スパイクされた血液の除去は６６％であり、９６％がスパイクされた血漿から除去された（図４）。
リン酸塩
リン酸塩もｐＨ７．４で陰性の電荷を有し、これもまた電圧依存除去率をもたらした。スパイクされた血漿からは、開始リン酸塩濃度の９８％が１時間後に除去された（図５）。
結論
電気泳動システムは、少量の血液および血漿から尿毒症毒素を除去する能力があった。これらの結果は、腎不全患者の治療における電気泳動システムの潜在的可能性を示す。受動拡散または電圧依存手段のいずれかによる尿毒症毒素の除去は、独立型透析装置または既存の透析技術の補助としての電気泳動システムの役割を示唆した。最も重要な利点は、透析患者において一定のコントロールを必要とする問題のある分子であるリン酸塩の除去において確認された。
β−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩除去
スパイクされた緩衝液実験
目的は、スパイクされた緩衝液からのβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動を調査することであった。
材料と方法
市販のβ−２−ミクログロブリン（リサーチ・ディアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ））およびリン酸塩を２０ｍｌの流れ１緩衝液（緩衝液＋２０ｍｇ／ｍｌデキストラン−遮断薬）にスパイクし、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ（３．２３ｍｍｏｌ／ｌ）とした。流れ２は、１０ｍｌ緩衝液＋デキストランを有した。０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、および６２分の時点で、流れ１および流れ２から試料を採取した。６０分の時点で、電圧のスイッチを切り、最後の試料が採取される前の２分間、各流れを再循環させた。各実験を３通り行い、各時点の試料を３通り分析した。
【００７５】
β−２−ミクログロブリンの２０ｍｇ／ｍｌ保存溶液の試料（３００μｌ）およびリン酸塩の２００ｍｇ／ｍｌ保存溶液の３０μｌを緩衝液６０ｍｌにスパイクし、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
結果
電気泳動システムは、β−２−ミクログロブリンとリン酸塩の両方を移動させた。リン酸塩の移動は、電位には依存していたが、ｐＨ、イオン強度、および膜の孔径には非依存性であった（図６、図７、および図８）。しかし、β−２−ミクログロブリンの移動は、膜の孔径、ｐＨ、イオン強度、および印加電位に依存していた（図７）。
【００７６】
電圧が印加されると、電位が印加されたすべての条件下に９５％を超えるリン酸塩が１時間後に除去された。β−２−ミクログロブリンについては、電位が上昇するにつれて、β−２−ミクログロブリンの除去率が上昇する。β−２−ミクログロブリンの電圧依存除去により、５０Ｖ、１００Ｖ、および２００Ｖの適用による除去は１時間後にそれぞれ、６０±１２％、８８±１％、および９２±１％となった（図６）。
【００７７】
β−２−ミクログロブリンの除去率は、より基本的な条件下に上昇し、ｐＨ７．６での７７±３％、およびｐＨ７．２５での４１±１６％と比べ、ｐＨ８．４では３０分以内に９０±１％のβ−２−ミクログロブリンが除去された。しかし、６０分後、７５．６％を超えるβ−２−ミクログロブリンがすべてのｐＨ条件下に除去された（図７）。
【００７８】
しかし、β−２−ミクログロブリンの除去率は、膜の孔径に依存していた。結果は、膜の孔径が１０ｋＤａから１００ｋＤａに増大すると、β−２−ミクログロブリンのＳ１からの除去がそれぞれ、７６±１０％から９３±１％に上昇したことを示した（図８）。２５ｋＤａ、５０ｋＤａ、および１００ｋＤａによるβ−２−ミクログロブリンの移動率に有意差は認められなかった。
スパイクされた血液および血漿
目的は、スパイクされた血液および血漿からのβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動を調査することであった。
材料と方法
流れ１は、正常な腎機能を有するボランティアからの新鮮へパリン添加血漿または血液３０ｍｌを含有した。Ｓ１における血液または血漿を市販のβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩でスパイクし、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ（３．２３ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。緩衝液１５ｍｌ＋デキストラン２０ｍｇ／ｍｌおよびへパリン１２単位／ｍｌをＳ２に配置した。０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０、および１２２分の時点で流れＳ１と流れＳ２の両方から試料を採取した。１２０分の時点で、６３Ｖの電位のスイッチを切り、最後の試料が採取される前の２分間、各流れを再循環させた。各実験を２通り行い、各時点の試料を３通り分析した。
【００７９】
β−２−ミクログロブリンの２０ｍｇ／ｍｌ保存溶液の試料（１５０μｌ）およびリン酸塩の２００ｍｇ／ｍｌ保存溶液の１５μｌを血液または血漿３０ｍｌにスパイクし、β−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００８０】
β−２−ミクログロブリンの代替源は、透析患者の血漿由来であった。これらの実験のために、透析患者の血漿３０ｍｌを含有したＳ１を使用した。緩衝液１５ｍｌ＋デキストラン２０ｍｇ／ｍｌおよびへパリン１２単位／ｍｌをＳ２に配置した。０、５、１０、１５、２０、３０、４５、および６０の時点で流れＳ１と流れＳ２の両方から試料を採取した。６０分の時点で、６３Ｖの電位のスイッチを切り、最後の試料が採取される前の２分間、各流れを再循環させた。各実験を３通り行い、各時点の試料を３通り分析した。
結果
スパイクされた市販のβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動は、緩衝液と比べ、へパリン添加血液または血漿にスパイクされると遅れた。６３．３Ｖの電位では、５±１４％および１０±８％のβ−２−ミクログロブリンがそれぞれ、１００ｋＤａおよび２００ｋＤａの膜を用いた１２０分で血液から移動した。比較すると、７％および１０±１２％のβ−２−ミクログロブリンが同じ条件下に血漿中で移動した（図９）。β−２−ミクログロブリンの除去は、アルブミン（β−２−ミクログロブリンの５倍のサイズ）と同等であった。より大きな孔径の膜によるβ−２−ミクログロブリンの除去の改善傾向が確認された。注目すべきは、アルブミンが分離に対する第２のタンパク質マーカーとして除去されたことである。電気泳動システムが医療機器として用いられる場合、用途に適した孔径の膜が使用されることになる。腎透析の場合、アルブミンの除去を除外する孔径が推奨されるであろう。
【００８１】
対照的に、リン酸塩の除去率は高く、スパイクされた血液からは５６〜６４％が除去され、スパイクされた血漿からは７９〜８１％が除去された（図９）。高い割合のリン酸塩の除去は、尿毒症患者の治療における電気泳動システムの役割を示唆する。
【００８２】
透析患者の血漿におけるβ−２−ミクログロブリンの移動の分析では、電気泳動システムによるβ−２−ミクログロブリンの除去が、現行の透析治療において見られる膜吸収によるものではなかったことがわかった（図１０）。これは、Ｓ１におけるβ−２−ミクログロブリンの７０〜１００％が、電気泳動システムを用いることによって、Ｓ２に輸送されたと結論された。図１０において、下の棒は、０〜２００Ｖの種々の電圧印加後にＳ１からのβ−２ミクログロブリンの除去率を示す。上の棒は、処理後のＳ１からのＳ２におけるβ−２ミクログロブリンの蓄積率を示す。図１１は、現行の４時間の透析治療と比べ、１時間の電気泳動システム治療におけるβ−２ミクログロブリンの効率的な除去を示す。結果は、現行の血液透析治療による約０〜４０％と比べ、６０％までのβ−２−ミクログロブリンが除去されたことを示す。
生体適合性態様
この研究の部の目的は、ヒト血漿および血液の細胞および生化学成分上のヒドロゲル膜および電位の生体適合性の疑問に答えることであった。
方法
生体適合性を調査するために、電気泳動システムによって全血および血漿を処理し、溶血、凝固、補体、および細胞活性化を測定した。
【００８３】
血液および血漿を健常ボランティアから得て、０．３８％クエン酸ナトリウムまたは１２単位／ｍｌへパリンのいずれかで抗凝固処理した。できる限り透析設定を厳密に表すことが可能な抗凝固剤としてへパリンを選択した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の分析用に、研究の分析のために抗凝固剤としてクエン酸を必要とした。
【００８４】
血液または血漿の試料（１００ｍｌ）を、抗凝固処理した腎透析酢酸／炭酸水素透析液（フレゼニウス・メディカルケア（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ）の緩衝液流で透析用に構成した電気泳動システム機器内で再循環した。６３Ｖの電位を血液／血漿上に印加し、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、および６０分の時点で試料を採取した。特定の時点で、溶血、凝固（活性化部分トロンボプラスチン時間［ＡＰＴＴ］およびトロンビン／抗トロンビンＩＩＩ複合体［ＴＡＴ］）および補体（Ｃ３ａ−ｄｅｓ  Ａｒｇ）活性化指標を測定し、電気泳動システムの生体適合性を評価した。各グラフ上の点は平均値を示す（ｎ＝３、ｘ±ＳＤ）。
溶血
５４０ｎｍでのヘモグロビンの吸光度を用いて溶血を測定した。溶解の量を可能な全溶解の割合として計算し、開始と終了との間の差、または種々の時点を溶解の発生と考えた。
ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）
グラジポア（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ）の０．２Ｍ塩化カルシウムおよびデイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）（ドイツ）のＰＴＴ試薬を用いて、ＭＬＡエレクトラ（Ｅｌｅｃｔｒａ）８００自動凝固計でＡＰＴＴを分析した。
ＴＡＴ（トロンビン抗−トロンビンＩＩＩ複合体）
エンザイグノスト（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ）ＴＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ドイツ）を用いてＴＡＴの形成を測定した。
Ｃ３ａ（補体因子Ｃ３ａ）
クイデル（Ｑｕｉｄｅｌ）（米国、カリフォルニア州）（サーモ・トレース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ）によって供給）のＣ３ａ−ｄｅｓ  ａｒｇ  ＥＬＩＳＡキットを用いてＣ３ａを分析した。
血小板、リンパ球、および好中球の活性化
血小板およびリンパ球の活性化分析をフローサイトメトリーによって行った。電位の適用の有無によって電気泳動システムで全血を処理した。血小板の活性化については、アリコートを取り、ＣＤ６１  ＰｅｒＣＰおよびＣ６２Ｐ  ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国、ニュージャージー州）で染色し、ＦＳＣ／ＳＳＣ−およびＣＤ６１−染色特性に基づきゲートした。リンパ球については、ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰおよびＣＤ６２Ｌ  ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国、ニュージャージー州）を活性化の尺度として用いた。ＦＳＣ／ＳＳＣ／ＣＤ４５ゲートを用いてリンパ球を同定し、ＣＤ６２Ｌの発現について分析した。好中球については、ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰおよびＣＤ６２Ｌ  ＰＥモノクローナル抗体（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、米国、ニュージャージー州）を活性化の尺度として用いた。ＦＳＣ／ＳＳＣ／ＣＤ４５ゲートを用いて好中球を同定し、ＣＤ６２Ｌの発現について分析した。
結果
溶血
溶血率を測定し、抗凝固処理した全血に対する電位の影響を判定した。国際標準に従い、５％未満の溶血が医療機器用に許容可能である。データは、電位の適用の有無によって、観察された溶血が許容可能な範囲内であることを示した（図１２）。結果は、電位が再循環血液の溶血を増大させることも示した。しかし、電界の１回の通過後、わずか０．０５％の赤血球が溶解した。
ＡＰＴＴ
これらの実験では、クエン酸添加全血および血漿の凝固性に対する電位の影響が測定された。結果は、電位が血液または血漿のいずれかに適用された場合にＡＰＴＴ時間のわずかな減少が確認されたが、この変化は健常成人の２５〜３９秒の基準範囲内であったことを示した（図１３）。ＡＰＴＴ時間の変化は５秒未満であったが、１０秒以内が健常個人の対照と関連した正常範囲であった。
ＴＡＴ
これらの結果は、へパリン添加血液におけるＴＡＴ形成を示さず、凝固活性化が起こらないことを示した。ＴＡＴ複合体濃度または溶解のわずかな低下が３０分後に確認され、これはＴＡＴ複合体から離れた補助因子および小分子の移動に帰するとみられる（図１４）。ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルコポリマー（ＡＮ６９）、キュプロファン、およびポリスルホンの試験により、２７分後に７５〜１７５ｎｇ／ｍｌのＴＡＴが生じたが、電位をかけたポリアクリルアミド膜は、６０分後に対照から３ｎｇ／ｍｌ未満のＴＡＴを生じた。
Ｃ３ａ
へパリン添加血液からのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの測定値は、ポリアクリルアミド膜および電位が、補体経路を活性化しないことを示した。ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルコポリマー（ＡＮ６９）、キュプロファン、およびポリスルホンの比較試験では、８０ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌを超えるＣ３ａが、基準対照から２７分以内に生じた。電気泳動システムにより、Ｃ３ａレベルの最大の上昇は３０分の時点で基準対照から４４ｎｇ／ｍｌであり、これは実行中の血液から低下または除去された（図１５）。
血小板
電位の適用の有無によって電気泳動システムで全血を処理した。アリコートを取り、ＣＤ６１  ＰｅｒＣＰおよびＣ６２Ｐ  ＰＥモノクローナル抗体で染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣおよびＣＤ６１染色特性に基づき血小板をゲートした。ＣＤ６２Ｐの発現を血小板の活性化の指標として測定した。全血への電位の適用は、顕著な血小板の活性化をひき起こさなかった（図１６）。血小板の活性化の陽性対照は、ＡＤＰによる処理であった。
リンパ球
全血を図１２におけるように処理した。ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰおよびＣＤ６２Ｌ  ＰＥモノクローナル抗体でアリコートを染色した。ＦＳＣ／ＳＳＣ／ＣＤ４５ゲートを用いてリンパ球を同定し、ＣＤ６２Ｌの発現について分析した。陽性対照は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）による処理であり、表面ＣＤ６２Ｌの急速な喪失をひき起こした。電位の有無による全血の処理は、リンパ球ＣＤ６２Ｌの発現に顕著な変化をひき起こさなかった（図１７）。
好中球
電位の適用の有無によって電気泳動システムで全血を処理した。全血への電位の適用は、顕著な好中球の活性化をひき起こさなかった（図１８）。
結論
これらの実験の結果は、ポリアクリルアミド膜および電位印加による電気泳動システムを用いた血液および血漿の処理が、生体適合性の工程であったことを示す。示された結果は、補体系および凝固系、ならびに細胞血液成分が、電気泳動システムによって有害な影響を受けなかったことを示す。この生体適合性のデータを、電気泳動システムは窒素廃棄物を除去する能力があったという以前の所見と組合せると、本技術が腎不全患者の治療おいて大きな潜在的可能性を有することが示される。この可能性は、体液からの毒性物質の除去を必要とする他の疾患状態の治療的処理におけるその使用についても存在した。
電気泳動システムの設計
この部では、２つの電気泳動装置、すなわちＢＦ２００およびＤＦ１００を使用した。ＢＦ２００は、主にタンパク質の精製／分離に使用される初期のモデルであった。ＤＦ１００は、本発明による小規模の臨床透析装置としての使用に設計された。
【００８５】
ＢＦ２００装置の使用に際して３つの主な問題が確認された。これらは、高レベルの溶血、血液の温度コントロール、および衛生化であった。流量低下のゾーン（デッドゾーン）、鋭い表面の存在、およびＢＦ２００血液路における温度をコントロールするアイスバケットの使用が、観察された溶血の原因と考えられた。血液が分離装置を通過した後、温度は許容可能な生理的限界以上に上昇したため、温度も潜在的に問題をはらんでいた。これらの問題を克服するために、一部の修正を行ってＤＦ１００を製造し、これらが以下に記載されている。
分離装置とハウジング
ＤＦ１００を製造するために用いられた分離装置とハウジングは、容易に分解され、加圧滅菌および化学的方法を含む種々の手段によって衛生化されるように設計された。ハウジング装置は、Ｓ１、Ｓ２、および緩衝液タンクの開放容器を囲むことができ、これらの領域間の交差汚染を予防することができる。分離装置は、洗浄目的のために容易に分解されるように設計され、かつカートリッジの漏出汚染除去のための領域も包含した。ＤＦ１００は、ＢＦ２００において見られるよりもはるかに少ないデッドゾーンまたは鋭い内側面をも有した。ＤＦ１００のすべての部品は、加熱または化学的方法によって浄化しえた。
管
ＢＦ２００は、一般の実験用グレードのＰＶＣおよびファーメド（Ｐｈａｒｍｅｄ）を用いた成分によるシリコーンを含む管の混合物を包含した（すべての管がマスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）製）。ＢＦ２００は、血液から異なる反応を禁じうる各種の異なる管を包含したため、単一の管タイプの使用がＤＦ１００に導入された。ＤＦ１００用に選択された最初の管タイプは、メーカーがＣ−Ｆｌｅｘは「優れた生体適合性」を有すると報告した、Ｃ−Ｆｌｅｘ（マスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ）であった。しかし、Ｃ−Ｆｌｅｘは、試験すると、生体適合性の反応が生じることはなく、長期使用後に十分に長持ちしなかった。ポンプは、実験中に流れＳ１、Ｓ２、または緩衝液に管の小さな断片を放出する傾向があった。断片化の問題を除去し、医療ガイドラインを満たし、将来に試験される必要のある材料の量を削減するために、使用される最後の管は、病院のブラッドライン（Ｂｌｏｏｄｌｉｎｅ）で現在見られるものであった。現行のブラッドラインの大半はＰＶＣで製造されているため、Ｃ−Ｆｌｅｘを医療グレードの蠕動ＰＶＣ（マスターフレックスによるタイゴン（Ｔｙｇｏｎ）ＬＦＬ）と交換した。
温度コントロール
ＢＦ２００における血液および血漿の実験中の温度測定値は、温度をコントロールするアイスバケット法が、血液／血漿の作業に際して理想的ではないことを示した。ＢＦ２００の異なる構成（血液／血漿、平行／逆電流、プラス／マイナス冷却、異なるパワーパック、単一／複数パス）は、構成に応じて、温度が５℃〜２２℃の間で変化しうることを示した（図１９）。ＢＦ２００試験からの結果は、分離装置によって平均８℃の上昇が生じたことを示した。生理的な３７℃の血液試料からの８℃の上昇は、許容不可能であると考えられた。温度の問題を解決するために、分離装置、ＢＦ２００の反対、および現行の透析療法に入る前に血液／血漿を冷却するようにＤＦ１００を構成した。血液がＤＦ１００の分離装置を出ると、血液は生理的温度であり、患者に戻るために適していることが予想された。ＤＦ１００流体路の設計により、血液および緩衝液が分離装置に入る前に外部の熱交換器／冷却装置によって冷却されることになった。熱交換器／冷却装置は、アイスバケットの代わりに用いられ、システムの良好な温度コントロールが得られた。
【００８６】
ＤＦ１００流体路の温度分析は、血液／血漿回路について、１時間にわたって−０．８℃±０．９℃（平均±Ｓ．Ｄ．）の総温度変化が得られたことを示した。ＤＦ１００は、ＢＦ２００を用いた場合に観察された８℃の上昇から大幅な改善を示した。
【００８７】
ＤＦ１００の開発は、溶血、血液温度のコントロール、および衛生化を改善することであり、これは修正が電気泳動システムの生体適合性を変化させたかどうを判定する試験によってフォローされた。
生体適合性
目的は、電気泳動システムＤＦ１００の生体適合性を評価することであった。
方法
生体適合性を評価するために、全血および血漿を電気泳動システムによって試験し、溶血、凝固、補体、および細胞の活性化を生体適合性態様試験により測定した。
結果
溶血
溶血率を測定し、抗凝固処理した全血における赤血球溶解に対する電位の影響を判定した。国際標準に従い、５％未満の溶血が医療機器用に許容可能である。データは、電位の適用の有無によって、観察された溶血が許容可能な範囲内であることを示した。結果は、電位が再循環血液の溶血を増大させることも示した。溶血の増大は、再循環血液に８０Ｖの電位がかけられると確認された。８０Ｖの適用は、赤血球の１％未満の溶解をもたらしたが、これは許容される国際標準（５％）未満であり、推定上温度の上昇によってひき起こされる。しかし、血液が６３．３Ｖの電位で再循環された後、０．５％未満の溶血が確認された。６３．３Ｖの使用による溶血は、０Ｖ背景値の誤差範囲内であった（図２０）。
凝固
ＤＦ１００のＡＰＴＴの測定値は、ＢＦ２００の生体適合性調査において確認されたものとの違いを示さなかった。
ＴＡＴ形成
へパリン添加血液におけるＴＡＴ形成は、凝固活性化が起こらないことを示した。ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルコポリマー（ＡＮ６９）、キュプロファン、およびポリスルホンの試験により、２７分後に７５〜１７５ｎｇ／ｍｌのＴＡＴが生じたが、電位をかけたポリアクリルアミド膜は、６０分の実験内で６±２ｎｇ／ｍｌＴＡＴのＴＡＴ濃度を維持した（図２１）。
補体Ｃ３ａ
へパリン添加血液からのＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの測定値は、ポリアクリルアミド膜および電位が、補体経路を活性化しないことを示した。ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルコポリマー（ＡＮ６９）、キュプロファン、およびポリスルホンの比較試験では、８０ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌを超えるＣ３ａが、基準対照から２７分以内に生じた。電気泳動システムにより、Ｃ３ａレベルの最大の上昇は基準対照から平均４６ｎｇ／ｍｌであり、電位の適用によるＣ３ａ活性化における顕著な変化は認められなかった（図２２）。
結論
ＤＦ１００の生体適合性実験からのデータは、溶血の改善を示した。凝固および補体の測定値は、工程に対する改良はなされていたが、これらの因子に顕著な改善が認められないことを示した。６０Ｖと８０Ｖの溶血データ間の比較に基づき、８０Ｖでの溶血は５％未満であったため、より大きな電位を用いて尿毒症の低減処置を加速しうる。
電位
目的は、細胞損傷の尺度として溶血を用いてＤＦ１００における血液上にかけられうる最大の電位を調査することであった。
方法
２Ａおよび１５０Ｗに制限したコンソート電源を用いて、血液（１００ｍｌ）を１時間、ＤＦ１００を通過させた。印加電圧は、６３Ｖ、８０Ｖ、１００Ｖ、１２５Ｖ、１５０Ｖ、および２００Ｖであった。本明細書において既述された分光測光法を用いて、０、５、１０、１５、３０、４５、および６０分の時点で溶血を測定した。
結果
これらの実験から得られた結果は、１００Ｖ、１２５ｖ、１５０Ｖ、および２００Ｖのデータがｎ＝１であったが、しかし０Ｖ、６３Ｖ、および８０ＶではＮ≧４であったため、主に予備的である。データは、仮の「Ｓ］曲線の仕方での溶解増大が電圧およびワット数として上昇する傾向を示した（図２３）。溶血の増大は、実際の電位よりも分離装置内で生じる熱（ワット数）に多く帰すると思われる。ワット数が増大し、分離装置を通過する血液の温度が上昇するにつれ、対応する溶解の増大が確認された。血液をより効果的に冷却する利点は、２つの１５０Ｖの実験を比較すると確認された（図２３）。１つの実行のための血液路は、熱交換器を通じて２回閉回路にされるが、他の実行は血液を熱交換器に１回通過させた。血液を熱交換器に２回通過させることにより、血液は分離装置に入る前にさらに冷却され、溶血の減少がもたらされた。しかし、血液が分離装置に入る前に冷却されうる下限があるとみられる。この血液冷却限界の背景理由は、血液／血漿の温度が低下するにつれ、タンパク質が潜在的に沈殿を開始し、または生物系が生理的条件への再加熱で活性化しうることである。
第１相動物試験−電気泳動システムの生体適合性の調査
本試験の目的は、インビボのヒツジモデルを用いて、電気泳動システム技術の生体適合性を判定することであった。電気泳動システムを用いて６匹のヒツジを処理し、細胞および血漿に対する影響を分析した。さらに別の６匹のヒツジを用いて、電気泳動システムの部品なしの体外回路の基準の影響を判定した。体外回路および頸動脈−頸静脈シャント経由のアクセスを用いて、全血と血漿の両方の処理における生体適合性を評価した。生体適合性は、血液学的および生化学的パラメータに対する実験および対照の手順の影響を測定することによって評価された。
実験手順
血液（図２４）および血漿（図２５）の処理に際しての電気泳動システムの生体適合性を調査するモデルとしてヒツジを用いた。使用したヒツジ９９は、健康な交雑種去勢ヒツジであり、体重が約５０〜７０ｋｇ、年齢が２歳であった。すべての手順において、血管アクセスは、全身麻酔下の動物の頸動脈および外頸静脈の直接切開によって得た。「生体材料の血液適合性試験のためのヒツジ頸静脈シャントモデル」（タタリノフ（Ｔａｔａｒｉｎｏｆｆ）Ｖ、プール・ワレン（Ｐｏｏｌｅ−Ｗａｒｒｅｎ）ＬＡ、タンステル（Ｔｕｎｓｔｅｌｌ）Ａとシンドヘルム（Ｓｃｈｉｎｄｈｅｌｍ）Ｋ。心臓技術のための共同研究センター、ニュー・サウス・ウェールズ大学生体医用工学大学院（シドニー２０５２）。生体材料の血液適合性試験のためのヒツジ頸静脈シャントモデル）に概要が示された手順に従い、シャント１００を頸動脈と頸静脈との間に挿入した。
【００８８】
ラストバッグに添加した１００００ＩＵへパリンとともに生理食塩水を体外回路に注入した。使用時、電気泳動システムのカートリッジを直接注入して排出した。処置中、へパリンの初期ボーラス（５０００ＩＵ）の後、毎時５０００ＩＵボーラスのへパリンによって抗凝固を達成した。電気泳動システムを用いる一部の手順では、抗凝固法は、電気泳動システムラインへのへパリンの連続的注入によって補完された。へパリン注入は、ポンプ１０５を用いてへパリン溶液１０４を市販の滅菌へパリンライン１０６を通じて動静脈回路１０１に挿入することによって達成された。
【００８９】
血液アクセスが達成された後、シャントから基準の血液試料を採取した。次いで、動脈１０１ラインおよび静脈１１３ラインをそれぞれ、頸動脈および頸静脈に接続し、ガンブロ（Ｇａｍｂｒｏ）血液ポンプ１０３を用いて、血液回路を通じて血流を確立した。動脈１０２および静脈１１２の血液試料が採取される前の１０分間、血液を循環させた。血漿分離装置１１４が用いられる手順では、別の一連の動脈１０２および静脈１１２の血液試料が採取される前のさらに５分間、血漿流を確立した。
【００９０】
電気泳動システム１０８の工程は、血液を電気泳動システム１０８に輸送するポンプとともに、血液または血漿の温度を維持するために必要なカートリッジおよび補助的装置の前のラインの熱交換器といっしょにカートリッジで構成された。電気泳動システムの手順は、細胞成分および再構成された以下の処理から分離された全血（図２４）または血漿（図２５）に対する電気的活性化の有無によって行われた。全血を処理する場合、電気泳動システム１０８と結合したポンプを用いて管１０７を通じて動静脈回路１０１から直接、血液を採取した。次いで、電気泳動システム１０８によって血液を処理し、管１０９を通じて、血液収集容器１１０に再融合させた。管１１１、試料ポート１１２、および管１１３を通じて血液をヒツジ９９に戻した。血漿を処理する場合、膜血漿分離装置１１４が用いられたが、ここで血漿は血漿出口１１５から出ると同時に、血液の細胞物質は血液出口１１７から出た。血漿は、血漿出口ポート１１５からポンプ１１６によって血漿分離装置１１４から輸送され、管１１７を通じて細胞物質で再構成され、血液収集容器１１０に入った。血管１１０内の融合した全血は、管１１１、試料ポート１１２、および管１１３を通じて、ヒツジ９９に輸送されて戻された。電気泳動システム１０８によって血漿を試験する場合、電気泳動システム１０８と結合したポンプを用いて血漿分離装置１１４から直接、血漿を採取した。次いで、電気泳動システム１０８によって血漿を処理し、管１０９を通じて輸送し、血液収集容器１１０内の血液の細胞成分と再融合させた。血液は、管１１１、試料ポート１１２、および管１１３によってヒツジ９９に戻された。
【００９１】
電気的活性化を用いる場合、これはＡＢＡＢフォーマットで行われた。電気的活性化は最初に１時間オフにし（Ａ）、次いで１時間オンにし（Ｂ）、１時間オフ（Ａ）、さらにまた１時間オンにし（Ｂ）、ヒツジの血液化学に対する電界の影響を確認した。
【００９２】
１２匹のヒツジを試験で用いた。３匹のヒツジの全血を電気的活性化の有無によって処理した（群１）。さらに３匹のヒツジの血漿を電気的活性化の有無によって処理した（群２）。群１と群２の両方について、血液および血漿を２０ｍｌ／分で電気泳動システムを通じて処理した。電気泳動システムＡＢＡＢ手順の各期間中に０時点から５、１０、３０、および６０分後に同時に動脈および静脈の試料採取ポートから血液および血漿試料を採取した（表１、表２）。群１と群２の両方について、最後の血液試料を採取した後、ヒツジを安楽死させ、膀胱の内容物を採取した。さらに別の６匹のヒツジを基準試験のために用いて、手術および処置中の体外血液回路の影響を確認した。これらの処置は、回路内で電気泳動システムなしに行われた。３匹のヒツジが全血および血漿分離なしの処置（群３）であり、３匹のヒツジが血漿分離の処置（群４）であった。群３と群４について、０時点を血液または血漿回路が確立した後にマークした。０時点から５、１０、３０、６０、９０、１２０、１８０、および２４０分の時点で、動脈および静脈の血液試料を採取した（表３、表４）。最後の血液試料を採取した後、ヒツジを安楽死させ、膀胱の内容物を採取した。
【００９３】
脈、呼吸数、酸素分圧（ＳｐＯ２）、および温度を全処置中、１０分間隔で記録した。処置の前、最中、後に採取した血液試料を検査し、血液の細胞成分、ならびに肝機能および電解質に対する処置の影響を判定した。血液試料は、表５に記載された被分析物について外部の実験室によって検査された。
【００９４】
【表１】
2005527247.tif 000003
【００９５】
【表２】
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【００９６】
【表３】
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【００９７】
【表４】
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【００９８】
【表５】
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【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
【表９】
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【０１０３】
【表１０】
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【０１０４】
【表１１】
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【０１０５】
統計的方法
「濃度曲線下面積」と同等の加重平均を各１時間について計算した。これは、台形法によって計算された。注意すべきは、平均がこのよにして計算される場合、３０分と６０分の時点の所見は、０、５、および１０分の時点の所見よりもはるかに重みを持っていることである。また、処置前（基準）試料が計算に含まれていないことも注意すべきである。
【０１０６】
測定変数に影響を及ぼしうる因子は、実験群、Ｇ＝｛ＢＧ、ＰＧ、Ｂ、Ｐ｝、期間Ｐ＝｛Ａ１、Ｂ１、Ａ２、Ｂ２｝、試料採取部位Ｓ１＝｛Ａ、Ｖ｝、およびヒツジＳ＝｛１、２、．．．．、１２｝である。実験群は、４つのレベルの１因子として、または２つの交差因子、血漿ＰＬ＝｛０、１｝および電気泳動システムＧＲ＝｛０、１｝として処理することができる。
【０１０７】
ヒツジ因子は、処置のために選択された特定のヒツジによるランダム変動、およびその他の場合には原因とはなりえない他の日々の変動を含む包括的である。処置中の溶質の濃度は、基準の処置前レベルを反映しうる。分析はこの点を考慮しうることが理想である。
【０１０８】
実験デザインは、２つのヒツジ間因子、ＰＬとＧＲ、および２つのヒツジ内因子、ＰとＳＩによる「反復測定型」であった。ヒツジ間因子、ＰＬとＧＲの検定は、共変量としての基準レベル（最初の動脈試料）とともに、各ヒツジの８つの所見（４期間ｘ２部位）にわたって計算された平均の共分散の分析を用いて行った。この方法は、フリソン（Ｆｒｉｓｏｎ）とポコック（Ｐｏｃｏｃｋ）（フリソンＬとポコックＳＪ、臨床試験における反復測定、平均サマリー統計を用いた分析およびデザインのためのその意義。Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９２年（１１）、ｐ．１６８５〜１７０４）によって、基準レベルにおける変動の影響を調整する最適な方法として推奨されている。例えば、この方法により、回路における電気泳動システムによる実験の平均レベルＸが、電気泳動システムによらない実験の平均レベルと異なるかどうか判定される。
【０１０９】
ヒツジ内因子、ＰとＳＩ、およびそれらのＰＬとＧＲとの交互作用の全体的な検定を、フューン・フェルト（Ｈｕｙｎｈ−Ｆｅｌｄｔ）補正因子による分散の反復測定分析を用いて行った（スタータ社（ＳｔａｔａＣｏｒｐ）、１９９９年、スタータ統計ソフトウェア、リリース６．０．カレッジ・ステーション（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ）ＴＸ、スタータ社）。これらの検定により、Ｙのレベルが処置中に変化したかどうか、差異のパターンが電気泳動システムによって影響を受けたかどうか判定される。
【０１１０】
特定の対比の検定をハリス（Ｈａｒｒｉｓ）（ハリスＲＪ、「分散分析（Ａｎｏｖａ）、分散プライマーの分析」、１９９４年、Ｆ．Ｅ．ピーコック（Ｐｅａｃｏｃｋ）、イリノイ州、アイタスカ）によって記載されたように行った。これらの検定により、差異のパターンが調査され、そのパターンが、電気泳動システムが回路内にあった場合、または電源がオンであった場合に異なっていたかどうか明らかにされる。
【０１１１】
ＰおよびＳＩのレベル間の多くの対比が各ヒツジについて計算され、各対比が、変数の全体的な平均が０と異なる追加の検定を含めて、ＰＬとＧＲに対する変数の通常の単変量解析における従属変数として検定された。例えば、ＰＬとＧＲに対する対比Ｐ１の分散分析において、ＧＲに対するＦ比は、Ｐ１×ＧＲ交互作用の検定となる。
【０１１２】
期間の間の４つの対比を検定した。係数は、動脈および静脈を比較する定数Ｓ１とともに以下に示されている。Ｐ１は、Ｂ期間とＡ期間との対比である（電気泳動システムが使用された場合、電源オンと電源オフに対応）。Ｐ２は、第２のＡＢサイクルを第１のサイクルと比較し、Ｐ３は、第２のサイクルのＢ−Ａ差を第１のサイクルのＢ−Ａ差と比較している。これら３つの対比は直交であり（それらの係数ベクトルのドット積は０である）、かついっしょにそれらは４つの期間の間のすべての変動の原因である。対比Ｐ４は、単に第１のサイクル中のＢおよびＡを比較している。
【０１１３】
溶質Ｙのレベルの着実な増加または減少の傾向が認められる場合は、Ｐ２の値はＰ１の値の２倍となり、Ｐ３は０となる。電気泳動システムの電源オンによりＹのレベルが上昇する場合は、電気泳動システム群の陽性Ｐ１のみが認められ、したがって、ＧＲ×Ｐ１交互作用は陽性となる。
主要かつ優先的な関心であった特定の検定
Ｐ＊ＧＲ交互作用。もしあれば、電気泳動システムが回路内にあった場合、パターンは時間の経過とともに異なっていたか。これは、反復測定分散分析で検定された。
【０１１４】
Ｐ１＊ＧＲ交互作用。Ｂ−Ａ差異は電気泳動システムに依存していたか。これは、定数Ｐ１で分散分析を行うことによって検定された。
【０１１５】
Ｐ４＊ＧＲ。Ｂ１−Ａ１差異は電気泳動システムに依存していたか。電源は実際には第２のサイクルでも凝固のためオンではなかったため、この比較は電気泳動システムの活性化についてより明らかであろう。
結果と考察
生体適合性なる用語は、単一の、包括的な、かつ一様に容認された定義を有さない。ジョナサン・ブラック（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｂｌａｃｋ）（ブラックＪ著、材料の生物学的性能、生体適合性の基礎、第２版、１９９２年、デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク）は、これを「その状況に適していると判断される特定の用途における生物学的性能」と記載した。これは、生物系の生理に対する処置、装置、または材料の影響を評価する概念である。
【０１１６】
本試験の目的は、電気泳動システムの生体適合性を評価することであった。電気泳動システムは、生体適合性に関する複数の問題をかかえている。まず、カートリッジ、膜、熱交換器、および管のデザインおよび材料がすべて処置の生体適合性に影響を及ぼしうる。次に、血液または血漿に対する電界の影響が生体外の設定で未だ確立されていなかった。
【０１１７】
試験中、全動物は体外処置を生き延び、一般に、電気泳動システムの処置は動物によって十分に耐えられた。試験中、１６０００を超えるデータポイントが収集され、分析された。生化学的または血液学的な値について、対照群と治療群との間に統計的に有意な有害作用は確認されなかった。
【０１１８】
共分散の分析によるヒツジ間検定の結果は、表６−分散分析概要に示されている。分散の反復測定分析による試料採取部位および期間の影響についての全体的なヒツジ内検定の結果は、表７−反復測定概要−ＳＩおよびＰに示されている。特定のヒツジ内対比の統計分析の概要は、表８−ヒツジ内対比の通りである。
【０１１９】
生化学的および血液学的データの統計分析は、グロブリン、アルブミン、および総タンパク質のレベルが回路内の電気泳動システムの存在によって影響を受けることを示した。その影響は、２つの成分に分類しえた。すなわち、電気泳動システムが回路内にある場合の大きな血液希釈による最初の降下、および電気泳動システム処置中の大きな試料採取による減少傾向である。また、膜よりも小さいタンパク質が、特に電界が活性化された場合に電気泳動システムによって除去されたことも考えられる。
【０１２０】
グロブリン、アルブミン、および総タンパク質のレベルは、体外回路の血液希釈作用により全動物において最初は低下し、その後は安定したままであり、または処置中にゆっくり低下し続けた。共分散の分析は、血漿フィルターと電気泳動システムの両方が平均タンパク質レベルを低減し、それらの影響が付加的であったことを示した。これは各成分が体外容積に付加したため予想されよう。期間の間のレベルの有意差および有意なＰ＊ＧＲ交互作用も認められた。ヒツジ間の対比Ｐ１とＰ２は、グロブリン、アルブミン、および総タンパク質についてきわめて有意であり、Ｐ２＊ＧＲ交互作用は３つすべてについて有意であった（Ｐ＜０．０５）。この影響は、電気泳動システム処置中に生じた血液採取の増加に起因した。この影響は、低分子量のアルブミンが大きなタンパク質よりも処置中に血管外貯蔵所からより迅速に補充されるという事実により、アルブミンよりもグロブリンおよび総タンパク質でより顕著であった。したがって、アルブミン：グロブリン比は時間とともに増大した。
【０１２１】
ほぼすべての動物において、グルコースレベルは安定のままであり、または４時間の処置中にわずかに上昇した。結果は、電気泳動システムの存在に関係なく、全群におけるグルコースレベルの一般的な上昇傾向を示した。
【０１２２】
総および抱合ビリルビンレベルは大半の動物において比較的安定であり、処置の経過にわたって両方のわずかな上昇が明らかであった。しかし、これらの傾向が処置中の電気泳動システムの存在と無関係であったと結論づけることが無難と思われる。
【０１２３】
ＧＬＤＨレベルは対照と治療動物で安定であったが、アルカリホスファターゼレベルは処置の経過にわたって上昇する傾向があった。統計分析は、ＧＬＤＨまたはアルカリホスファターゼレベルに対する血漿ろ過または電気泳動システムの有意な影響を示さなかった。
【０１２４】
ＡＳＴおよびガンマＧＴレベルは、処置の全体を通じて比較的安定であり、大半の動物において処置の経過にわたってＡＳＴのわずかな減少が確認された。統計分析は、電気泳動システムの存在と無関係のガンマＧＴの動脈と静脈のレベル間に有意差があることを示した。
【０１２５】
Ｂ−ＯＨＢＵＴおよびＣＫレベルは処置の全体を通じて全動物で比較的安定しており、大半の動物において処置の経過にわたってわずかな上昇が確認された。電気泳動システムで血液処理された動物１匹は、電界が最初に非活性化されるとＣＫレベルの急な低下を示した。次いで、この動物のレベルは残りの処置の間、低いままであった。ＣＫの静脈レベルは、全群および全期間にわたって動脈よりも一貫して平均２．５Ｕ／ｌ高かった。
【０１２６】
尿素、クレアチニン、大部分の電解質など生化学的な値は、予想通り、体外処置中に比較的安定であった。
【０１２７】
カリウムレベルは全動物で比較的安定であり、統計分析は、処置における電気泳動システムの存在と無関係に全群で上昇傾向を示した。
【０１２８】
炭酸水素塩レベルは、ほぼすべての動物でわずかな上昇を示し、パターンは４群にわたって一貫していた。静脈レベルは、全群および全期間にわたって動脈よりも一貫して平均０．６ｍＭ低かった。
【０１２９】
統計分析は、マグネシウムおよびカルシウムレベルが回路内の電気泳動システムの存在と無関係に処置中に低下したことを示した。
【０１３０】
ＲＢＣ、ＰＣＶ、およびヘモグロビンレベルは、体外回路の血液希釈効果により最初は低下し、次いで、大半の動物において、比較的安定したままであり、残りの処置の試料採取により緩徐な低下を示した。統計分析は、ＲＢＣ、ＰＣＶ、またはヘモグロビンの群間差は有意ではないことを示した。他の有意な影響は認められなかった。
【０１３１】
ＭＣＶ、ＭＣＨ、およびＭＣＨＣは、処置の全体を通じて大半の動物において比較的安定していた。統計分析は、ＭＣＶ、ＭＣＨ、またはＭＣＨＣの群間差は有意ではなかった。
【０１３２】
白血球数（ＷＣＣ）は、処置の開始時点で全例において減少した。この影響は、血漿群で最も劇的であり、実質的に、完全ではないにせよ、好中球数の減少によるものであった。血漿群では、好中球は最初の３０〜６０分間に循環から有効に不在であった。その後、血球数は全群において処置の全体を通じて着実に増大した。この早期好中球減少症の結果として、平均ＷＣＣは血漿群において有意に低かった（ｐ＝０．０２）。平均好中球数も低かったが、その差は統計的有意性に合致することはなかった（ｐ＝０．０６）。分散の反復測定分析によれば、血球数の増大傾向はＷＣＣと好中球の両方についてわずかに高く、この傾向は血漿フィルターまたは電気泳動システムによて影響されなかった。
【０１３３】
リンパ球、好酸球、および単球のレベルは大半の動物において比較的安定であった。
【０１３４】
膀胱尿量は、処置後に一般に低かった。動物の体液平衡は、複数の因子によって影響を受けた。第一に、体外回路への接続により、処置の開始時点で１００ｍｌ（血液対照）〜２５０ｍｌ（血漿）の正味喪失が生じた。これは、接続した回路からの同等量のへパリン添加食塩水で平衡化された。第二に、試料の総量範囲が、１５０ｍｌ（血液対照）〜２７５ｍｌ（血漿）であった。第三に、呼吸による体液喪失が、４時間の処置中に３００ｍｌまでになった。最後の体液喪失は、処置中に静脈内投与されたハルトマン液で交換された。しかし、平均で、３リットルのハルトマン液が各処置で投与され、一部の動物については体液過負荷の可能性が生じた。
【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
【表１４】
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【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
【表１６】
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【０１４０】
【表１７】
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【０１４１】
緩衝液および電解質実験
これらの実験の目的は、全血の電気泳動システム処理中の電解質濃度を調査することであった。また、電気泳動システム処理による全血に対する異なる緩衝液（乳酸および酢酸−炭酸水素緩衝液）および緩衝液濃度の変化の影響を試験した。
方法
乳酸緩衝液および種々の濃度のフレゼニウス緩衝液を血液および血漿の電気泳動システムの実行において用いた。０、５、１０、１５、３０、４５、および６０分の時点で電気泳動システムの実行をサンプリングした。血液を遠心分離し、血漿を遊離ヘモグロビンについて分析した。血液血漿および血漿試料を電解質およびグルコース濃度についてＮＡＴＡ認定病理実験室によって分析した。
結果
電解質
大量の尿毒症性廃棄物除去の実験中、尿素、クレアチニン、およびリン酸塩とともに電解質（カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン酸塩、カリウム、およびナトリウム）濃度を測定した。電解質の分析の結果、血液を電気泳動システムによって処理した後、ナトリウムと塩化物の濃度が正常レベル以上に上昇することを示した（図２６）。しかし、他の電解質（カリウム、マグネシウム、リン酸塩、およびカリウム）濃度が、血液を電気泳動システムによって処理すると低下した。血漿を処理したところ、すべての電解質レベルが低下した（図２７）。電気泳動システムによる処理後に血漿を全血電解質濃度と比較すると、血液の細胞成分がナトリウムおよび塩化物の濃度に影響を与えていることを示す。ナトリウムおよび塩化物の増大が緩衝液依存であるかどうを確認するために、乳酸緩衝液（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）ＰＤ透析液）を酢酸−炭酸水素透析液の代わりに用いた。緩衝液を変更したところ、ナトリウムおよび塩化物レベルの同じ増大が確認された（図２８）。
【０１４２】
電気泳動システムによって処理された後の血中ナトリウムおよび塩化物濃度の増加を低減するために、酢酸−炭酸水素緩衝液の濃度を低下させた。透析液食うの塩化ナトリウムの濃度を低下させることによって、その結果として起こる増大は低減されよう。透析液のナトリウム濃度を１３９．８ｍＭから１３０ｍＭに低減することによって、ナトリウムおよび塩化物濃度のほんのわずかな変化が、電気泳動システム処理後に確認された（図２９）。次いで、水によるフレゼニウス透析液の１：１の大きな希釈を、血中のナトリウムおよび塩化物の増加に対する影響について検査した。１：１希釈透析液の等張性を維持するため、グルコースを添加し、浸透圧を最初の値に戻した。１：１透析液の使用により、電気泳動処理後の血中のナトリウムおよび塩化物の蓄積が減少した（図３０）。しかし、これは、血中グルコースの大幅な増大をももたらした（図３０）。
【０１４３】
予備的結果は、透析液の塩分濃度を低減し、溶液の等張性を調整することにより、最終ナトリムおよび塩化物レベルが改善されたことを示した。透析液は、過剰なナトリウムおよび塩化物を、処理中に低減することがわかった他の電解質と交換することによって調製されうる。あるいは、電解質は、透析液の等張性を維持する非イオン性分子と交換しうる。もう１つの対案は、現行の再循環透析システムを、単一の通過システムに変更することであろう。
溶血
透析液中に存在する塩分濃度は希釈によって低減されているため、溶血に対して示しうる影響を検討することが必要であった。これらの実験は、ナトリウム濃度を１３９．８ｍＭから１３０ｍＭに低減するフレゼニウスのわずかな希釈（「希釈フレゼニウス」）が、わずかであるが望ましくない溶質量の増大をひき起こしたことを示す。フレゼニウス緩衝液を水で１：１に希釈し、希釈による総浸透圧を補正するようにグルコースで補償することにより、８０ボルトの電位でそのままの濃度でのフレゼニウスと比べ、溶血に対する有利な効果を有することが示された。これは、フレゼニウス透析液の希釈により低い伝導性がもたらされ、したがって電圧がかけられた場合に低い温度の上昇が生じるという事実によるものであったとみられる。乳酸腹膜透析液（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ））は推定上、溶血を増大させ、したがって、透析用の電気泳動システムとともに用いられる適切な緩衝液ではありえない（図３１）。
結論
このデータから、低い伝導性の緩衝液が溶質の対して有利な効果を有するだけではなく、ナトリウムおよび塩化物の血流における塩分のプールを低減することも示唆されよう。
電気泳動システムの他の用途
体液から毒性物質の除去を必要とする他の疾患状態の処理における治療的用途。一部のオプションが簡単に以下に記載されている。
肝透析
肝不全の死亡率は、８０〜９０％であり、有効な肝移植なしに急死（１週間または２週間）する。肝不全中、毒性窒素産物（すなわち、アンモニア、トリトファン、ベンゾジアゼピン、ＧＡＢＡ、アセトアミノフェン）、外来生物学的要素、体内の電解質および水分不均衡が、重篤な損傷の原因となりうる。現行の技術は、適切な移植臓器が確認されるまでの時間を埋める技術を開発中である。これらの技術では、種々型のフィルターが使用され、血中に蓄積した過剰な分子および毒素の形成を除去する。腎透析用途において、電気泳動システムは、代謝産物、過剰な塩分の除去能、選択的タンパク質の除去、および体液不均衡のコントロールのほか、生体適合性システムであることが示されている。したがって、本発明によるシステムは、補助として、適切な肝移植臓器発見の橋渡しの増加を支援する肝透析治療に組込まれる潜在的可能性を有する。
サイトカイン
ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインは、敗血症、ショック、および臓器不全の病因において役割を果たす。すべてのサイトカインを除去することは好ましくないが、患者に存在する過剰な量のサイトカインを低減する研究が行われている。ある研究では、サイトカインに対する治療的モノクローナル抗体の応用例が用いられたが、可溶性受容体および／または受容体拮抗薬により臨床的に重要な結果は得られていない。別の調査では、存在するサイトカインの量を低減する血液ろ過／血液透析ろ過の使用を伴うが、しかしそれらはその結果の臨床的妥当性のためさらに調査が必要であった。予備的データは、本発明によるシステムがサイトカインを低減／除去する潜在的可能性を有することを示す。これらの実験の結果は、ＩＬ−６などのサイトカインが、本発明によるシステムを用いて除去されうることを示している。
全般的考察と結論
本試験の目的は、臨床的医療機器として使用するための膜電気泳動の実行可能性を判定することであった。凝固、補体、溶血、および予備的細胞活性化などのインビトロおよびインビボの生体適合性パラメーターは、本発明によるシステムおよび方法による血液および血漿の処理が、測定された生体適合性パラメーターについて、生体適合性の工程であることを示した。動物試験中、本発明による処置は動物によって十分に耐えられた。生化学的または血液学的値について対照群と治療群との間に統計的に有意な有害な作用は認められなかった。分子クリアランスのインビトロ分析では、リン酸塩などの高電荷質量の尿毒症毒素が、本発明によるシステムによって最も有効に除去されたことを示した。一方、尿素（中性）など、生理的条件下に低い電荷質量比を有した尿毒症毒素は、本発明によるシステムおよび方法によって有効に除去されなかった。したがって、リン酸塩や荷電中分子量毒素などの問題のある尿毒症毒素の除去は、既存の基準の補助として電気泳動システムの使用で増強されるであろう。本発明によるシステムは、血液透析、血液ろ過、血液透析ろ過、ＲＥＤＹ吸着剤血液透析および／または血漿交換も含めて、既存の医療技術のいずれかと併用しうる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
臨床機器としての本発明による電気泳動システムの使用を微調整し、かつシステムのスケーリングのための要件の判定を補助するために、複数の予備的調査を開始した。血液上にかけられうる最大限の電圧を判定する実験は、電位パラメーターの増大により対応する溶血の増大がもたらされたことを示す。溶血の増大は、電位そのものではなく、電位によって生じる熱の増加と関連していると思われる。
【０１４５】
緩衝液の組成についての調査では、透析液の塩分濃度を低減すると同時に、等張性環境を維持することが、生理的食塩水の使用の代替となりうる可能性を示した。低い伝導性および塩分濃度の利点としては、以下の点が挙げられる。
【０１４６】
生理的食塩緩衝液を使用した場合に見られる血流中に増加したナトリウムおよび塩化物の低減。
【０１４７】
低い伝導性による移動／除去速度の増大の可能性。電位を増大させる能力により同定された問題のある尿毒症毒素の移動速度の改善が可能となりうる。
【０１４８】
熱の低減。熱の発生が少ないことで、細胞の溶解が少なくなり、システム上にかけられうる最大限の電位の増大が可能になりうる。
【０１４９】
インビボおよびインビトロの調査に基づき、本発明によるシステムに対する論理的な改善としては、以下の点が挙げられる。
【０１５０】
緩衝液の伝導性をコントロールする自動フィードバック機構。
【０１５１】
温度をコントロールする自動フィードバック機構。
【０１５２】
熱交換器は、金属（例えば、チタン）およびポリマーなどの異なる生体適合性材料で製造またはコーティングされるように改良しうる。
【０１５３】
熱交換器の全体を、温度をコントロールする異なる手段、例えば、ペルチェ冷却システムを導入することによって用途と合うように改良しうる。
【０１５４】
血液および血漿などの粘性の体液に適合する入口および出口ポートの変更、乱流や角度の少ないカートリッジへの変更、グリッド構造をより薄くなるようにし、または処理される体液に適合する異なるパターンを組込むように変更し、カートリッジに対する静脈または動脈の影響を低減またはコントロールする手段を含め、熱交換器および／または分離装置の前に自動的に抗凝固剤を導入する手段を導入するなどの分離装置の改良、体液を方向づけ、または輸送し、細胞を損傷させず、または溶解することのないポンプまたは装置の使用、処理中の体液パラメーター、クリアランスレベル、および安全性態様を測定する適切なモニター、個々の処理に適合する各種成分を組込む緩衝液の使用、処理を増強する緩衝液の使用、単一または循環性の緩衝液システム、または部分的循環性システムの使用、体液レベルのコントロール、処理を増強する異なる膜の特性の使用。
【０１５５】
本発明による電気的に活性化された透析液は、基本的に異なる推進力、すなわち電界を使用し、患者の血液から汚染溶質を除去する。腎透析用途、または尿毒症毒素の血液からの除去のための電界の使用は、これまで文献には記載されていない。本発明による患者の血液からの溶質および小タンパク質の除去は、汚染分子の電荷質量比の関数である、小タンパク質の電気泳動移動度によって左右される。溶質除去のこの基礎は、汚染分子の単にサイズまたは拡散性移動度に基づく、溶質除去の以前の様態とは異なる。
【０１５６】
精選された尿毒症毒素の除去とともに、本発明は、中分子量分子として知られるタンパク質を除去するために用いられた。長期腎透析患者を苦しめる中分子量分子が、β２−ミクログロブリンであり、これは血中に蓄積し、次いで骨や関節に重合し、重大な臨床的結果を示す。患者の生活の質を改善するために、膜電気泳動が、β２−ミクログロブリンを低減する実験において用いられた。
【０１５７】
透析治療は、無駄な代謝物や他の問題の分子を除去することが可能であるためだけに必要なのではなく、これらの治療法は患者の安全であるために必要であった。安全性の重要な態様が、膜材料および治療システムの生体適合性である。次いで、本調査は、膜電気泳動処理が、現在臨床的に使用されている既存の膜タイプと比べると、凝固および補体の領域における生体適合性の改善を示した。同様に、これら標準の生体適合性測定値のいずれに対しても膜電気泳動処理の有害な作用は認められなかった。
【０１５８】
大まかに記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく具体的な実施形態において示された本発明に対する多くの変化および／または変更がなされうることが当業者には明らかであろう。本実施形態は、したがって、すべてについて例示的であり、限定的ではないとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】本発明のよる膜電気泳動システムの構成を示す概略図である。
【図２】血漿、スパイクされた血液、およびスパイクされた血漿からの尿素の除去を示す図である。
【図３】血漿、スパイクされた血液、およびスパイクされた血漿からのクレアチニンの除去を示す図である。
【図４】血漿、スパイクされた血液、およびスパイクされた血漿からの尿酸の除去を示す図である。
【図５】スパイクされた血漿からのリン酸塩の除去を示す図である。
【図６】トリスホウ酸塩（ｐＨ８．４）を用いた５０ｋＤａ分離膜を通じてのβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動に対する電位の影響を示す図である。
【図７】２００Ｖ電位を用いた５０ｋＤａ分離膜を通じてのβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動に対するｐＨの影響を示す図である。
【図８】２００Ｖ電位を用いたβ−２−ミクログロブリンおよびリン酸塩の移動に対する膜の孔径の影響を示す図である。
【図９】６３Ｖ電位を用いた１００ｋＤａおよび２００ｋＤａ分離膜を通じての血液および血漿からのアルブミン、スパイクされたβ−２−ミクログロブリン、およびリン酸塩の移動を示す図である。
【図１０】ベータ−２ミクログロブリンの除去が膜吸収によるものではなかったことを示す図である。下部の一連の棒（負の値）は、Ｓ１から除去されたベータ−２ミクログロブリンの割合を示し、上部の棒（正の値）は、処理後のＳ１からＳ２で収集されたベータ−２ミクログロブリンの割合を示す。
【図１１】ベータ−２ミクログロブリンの除去における現行の透析療法と比較した本発明による電気泳動システムの性能の比較を示す図である。本グラフに記載された現行の透析療法は、現在市販の材料（キュプロファン、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリスルホン、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ））からなる血液透析（ＨＤ）膜である。
【図１２】血液透析に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１３】凝固（ＡＰＴＴ凝固時間）に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１４】凝固（ＴＡＴ形成）に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１５】補体活性化（Ｃ３ａ）に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１６】全血における血小板活性化に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１７】全血におけるリンパ球活性化に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１８】全血における好中球活性化に対する膜電気泳動処理の影響を示す図である。
【図１９】さまざまに構成された膜電気泳動システムにおけるＳ１およびＳ２の温度変動を示す図である。各棒グラフの番号は、以下のように設定されている。グラフ１：正常フロー、氷冷却透析液、２つの流れ、ＲＳ電源；グラフ２：Ｕ／Ｓ逆電流フロー、氷冷却透析液、２つの流れ、ＲＳ電源；グラフ３：正常フロー、室温、２つの流れ、ＲＳ電源；グラフ４：正常フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、ＲＳ電源；グラフ５：逆電流フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、ＲＳ電源；グラフ６：血液、正常フロー、室温、２つの流れ、ＲＳ電源；グラフ７：血液、Ｓ１逆電流フロー、室温、２つの流れ、ＲＳ電源；グラフ８：血液、正常フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、ＲＳ電源；グラフ９：血液、逆電流フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、ＲＳ電源；グラフ１０：血液、正常フロー、室温、２つの流れ、単一パス、ＲＳ電源；グラフ１１：血液、逆電流フロー、室温、２つの流れ、単一パス、ＲＳ電源；グラフ１２：血液、正常フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、単一パス、ＲＳ電源；グラフ１３：血液、逆電流フロー、室温、１つの流れ（Ｓ１）、単一パス、ＲＳ電源。
【図２０】血液透析に対する本発明による電気泳動システムを用いた処理の影響を示す図である。
【図２１】凝固、トロンビン／抗トロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）形成に対する本発明による電気泳動システムを用いた処理の影響を示す図である。
【図２２】補体（Ｃ３ａ）活性化に対する本発明による電気泳動システムを用いた処理に対する影響を示す図である。
【図２３】溶血レベルに対する異なる電圧の影響を示す図である。
【図２４】実験ヤギモデルにおける血液回路を示す図である。
【図２５】実験ヤギモデルにおける血漿回路を示す図である。
【図２６】８０Ｖでの本発明による電気泳動システムにおける１倍のフレゼニウス緩衝液を用いた場合のへパリン添加血液からの塩イオンの除去を示す図である。
【図２７】８０Ｖでの本発明による電気泳動システムにおける１倍のフレゼニウス緩衝液を用いた場合のへパリン添加血漿からの塩イオンの除去を示す図である。
【図２８】８０Ｖでの本発明による電気泳動システムにおけるわずかに希釈されたフレゼニウス緩衝液を用いた場合のへパリン添加血液からの塩イオンの除去を示す図である。フレゼニウス緩衝液は、Ｎａ＋濃度が１３９．８ｍＭから１３０ｍＭへ低減されるように希釈された。
【図２９】８０Ｖでの本発明による電気泳動システムにおける乳酸腹膜透析を用いた場合のへパリン添加血液からの塩イオンの除去を示す図である。
【図３０】８０Ｖでの本発明による電気泳動システムにおける２分の１倍のフレゼニウス緩衝液を用いた場合のへパリン添加血液からの塩イオンの除去を示す図である。グルコースを用いて浸透圧を２９６．１ｍＭの１倍のフレゼニウス浸透圧にした。
【図３１】本発明による電気泳動を用いた溶血に対する異なる緩衝液および緩衝液濃度の影響を示す図である。
【図１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月5日(2003.5.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の血液または血漿から代謝成分の濃度を除去または低減するための電気泳動システムであって、該システムが、
（ａ）陰極領域の陰極と、
（ｂ）陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、
（ｃ）電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、
（ｄ）第１および第２のバリアの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、
（ｅ）対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、
（ｆ）陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、
（ｇ）対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段であって、電位の適用によって、血液または血漿からの代謝成分が少なくとも１つのバリアから陰極領域または陽極領域の少なくとも１つに移動させられる手段と、
を含むシステム。
【請求項２】
（ｈ）処理血液または血漿を対象に戻すように構成された手段をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
第１および第２のバリアが同じ所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
第１および第２のバリアが異なる所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記バリアがポリアクリルアミドで形成された膜ヒドロゲルである、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記バリアが、それを通して血清アルブミンの移動を可能にしない所定の孔径および孔径分布を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記バリアが、約６０ｋＤａ未満の公称分子量カットオフを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
第２の処理チャンバーを形成する電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第３のイオン透過性バリアをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
複数の処理チャンバーを形成する電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する複数のイオン透過性バリアをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記処理チャンバーを形成する前記バリアが、システムの電極領域間に配置されたカートリッジまたはカセットとして提供される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記カートリッジまたはカセットは、カートリッジを含有し、または受入れるように構成された電気泳動装置から取外し可能である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記冷却手段が、気体、液体、または固体の熱伝達方式、冷却流体ジャケット熱交換器、およびペルチェ冷却器からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記冷却手段が、気体、液体、または固体の熱伝達方式である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記陰極領域および陽極領域が、ポンプ手段によって透析液または緩衝液で供給される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
血液または血漿がポンプ手段によって処理チャンバーに供給される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記電極領域および処理チャンバーが、それぞれの透析液および血液／血漿のフローを可能にし、それを通して流れを形成するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
対象の血液または血漿中の代謝成分の濃度または量を除去または低減するための方法であって、該方法が、
（ａ）陰極領域の陰極と、陽極領域の陽極であって、陰極と陽極との間に電位を適用することによってそれらの間の電界域において電界を生成するために陰極に対して配置された陽極と、電界域において配置された所定の孔径および孔径分布を有する第１のイオン透過性バリアと、第２のイオン透過性バリアであって、第１と第２のバリアとの間に処理チャンバーを画定するために陰極領域と第１のバリアとの間に配置された所定の孔径および孔径分布を有する第２のイオン透過性バリアと、対象からの血液または血漿を冷却するように構成された手段と、陰極領域および陽極領域に透析液を供給するように構成された手段と、対象からの血液または血漿を処理チャンバーに供給するように構成された手段と、を含む電気泳動システムの処理チャンバーにおいて対象からの血液または血漿を配置するステップと、
（ｂ）陰極と陽極との間に電位を適用し、血液または血漿からの代謝成分をバリアを通じて電極領域の少なくとも１つに移動させるステップと、
（ｃ）血液または血漿からの代謝成分の所望量の除去が達成されるまで、ステップ（ｂ）を維持するステップと、
（ｄ）処理チャンバー中の処理血液または血漿を対象に戻すステップと、
を含む方法であって、該方法により実質的に血液または血漿が約３７℃の生理的温度より高温に加熱されることがない方法。
【国際調査報告】
2005527247.tif 000051
2005527247.tif 000052