(57)【要約】本発明は、骨統合及び骨リモデリングについて改良された異種移植片用骨粒子の使用方法を提供し、また霊長類からブタまでの免疫応答を確立された骨プロセシング技術を使用して減少させる。この研究は、アンレー移植片移植後の処理されたブタ骨支材の免疫適合性及び骨リモデリングを決定するために脱石灰化骨を使用して実施された。新生骨形成は、融合及び骨再建を生じさせる細胞性材料の浸潤を含めて明らかであった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種移植片用の脱無機質化及び脱抗原化骨基質において、該骨基質がα−Ｇａｌエピトープを除去するためのα−ガラクトシダーゼによる処理後に増大した骨伝導性及び骨誘導能を有する異種移植片用脱無機質化及び脱抗原化骨基質。
【請求項２】
改良された異種移植片用脱無機質化及び脱抗原化骨基質を動物の骨に移植することを含む異種移植片用脱無機質化及び脱抗原化骨基質を骨移植片として使用する方法。
【請求項３】
動物が霊長類又は齧歯類である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
霊長類がヒト又はアカゲザルである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
骨が皮質骨である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
骨が海綿骨である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
移植片を骨格系の欠陥のために使用する請求項２に記載の方法。
【請求項８】
移植片の効果を、定量的ラジオグラフィー、組織学、ねじれ生体力学及び異所性移植試験法よりなる群から選択される技術を使用して確認する、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、欠陥のある骨の治療法、特に、非ヒト科動物からの実質的に免疫適合性のある骨基質を使用して欠陥のある又は損傷を受けた骨を置換又は修復することに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格の欠陥を処置するための選択治療として自家骨移植が長期にわたって確立されてきた。米国の外科医は、毎年、骨移植を必要とする４００，０００を超える処置を遂行していると見積もられている（Ｌａｎｅ他，Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ６（１）：６１−６４（２０００）、Ｐｉｐｅｒ−Ｊａｆｆｒａｙ，Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ（１９９９））。これらの移植片は、脊髄融合、骨折偽関節、全関節修正及び顎顔面再建の処置に使用されている。腸骨綾部位から採取された自家骨についての問題は、供与部位の罹患率及び利用できる移植片材料の全体的な容量についての制限である（Ｓｅｉｌｅｒ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｓｏｕｔｈ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ａｓｓｏｃ．Ｓｕｍｍｅｒ：９（２）：９１−７（２０００）、Ｂｏｄｅｎ他．Ｓｐｉｎｅ２０：４１２−４２０（１９９５））。
【０００３】
様々な天然及び合成の骨移植片代用物又は増量剤が開発されてきたが、これは３つの一般的なカテゴリーに分類される：（ａ）合成物、（ｂ）バイオセラミックス及び（ｃ）生体由来物である（Ｋｅｎｌｅｙ他，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０（１０）：１３９３−４０１（１９９３年１０月）、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎ他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｄｅｎｔ．１６（６）：５２４−３７（１９９６年１２月），Ｌａｎｅ他，Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ６（１）：６１−６４（２０００））。生体由来の骨移植片代用物は、精製コラーゲン骨格から同種移植片及び異種移植片の無機質化及び脱無機質化基質材料までの範囲にある。同種移植片は、近年では、固有の骨伝導性、プロセス決定骨誘導性及び生体材料適合性のために大部分の非自家移植処置に使用されており且つ現在まで最高の臨床結果を達成している（Ｂａｕｅｒ＆Ｍｕｓｃｈｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．３７１：１０−２７（２０００年２月）、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．（３８１）：６８−７６（２０００年１２月））。死体由来の材料は、アンレー／増強処置用の機械加工された支材又はドエルにおける無機質化及び応力支持構成物と欠陥及び空隙修復のための外科的置換及び骨統合の速度を最適化する脱灰粒状物処方物とに集中している。
【０００４】
ブタ組織をヒトへの移植組織として使用するための大きな免疫学的な障害は、ヒト及びサルの抗体の１％を占め、しかもブタ糖蛋白質上で発現するα−Ｇａｌエピトープ（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）に結合する天然の抗Ｇａｌ抗体である。クロスカート社は、組換えα−ガラクトシダーゼを使用することによってα−Ｇａｌエピトープを除去するための方法を開発した。この酵素は、末端ガラクトシル単位を開裂させることによってα−Ｇａｌエピトープを破壊する。Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲがＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ＋Ｇａｌに開裂した後に、ガラクトースが放出される。
【０００５】
これまでの研究により、ブタのα−Ｇａｌエピトープが霊長類／ヒトの移植に対して免疫原性として寄与することが明らかに示され、また、それによってα−ガラクトシダーゼ酵素を使用してこの応答を除去するための方法が考案された（Ｇａｌｉｌｉ＆Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｊ．Ｈｕｍａｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ２９：４３３（１９９５）、Ｇａｌｉｌｉ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：１１２９（１９９８））。これらの研究は、ブタの関節と繊維軟骨結合組織のα−ガラクトシダーゼ処理及び霊長類モデルでの評価を包含する（Ｇａｌｉｌｉ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：６４６（１９９７））。α−Ｇａｌエピトープは、主としてブタについて霊長類／ヒト異種移植片の拒絶反応を担当し、また、拒絶反応がブタ起源の非成長性結合組織ではこのα−Ｇａｌエピトープを酵母で産生された組換え酵素のα−ガラクトシダーゼによる酵素不可逆反応で破壊することによって克服できることを示している。
【０００６】
死体骨の供給が制限されていること及び病気の伝染の可能性を考慮すると、斯界には、異種移植用骨移植材料の骨伝導特性、内因性成長因子に起因するブタ骨の骨誘導能及びヒト適合性のブタを得るという究極的な目的のための霊長類骨移植に対して特異的なブタ免疫適合性をさらに理解する必要性が存在する（Ａｉｃｈｅｌｍａｎｎ−Ｒｅｉｄｙ＆Ｙｕｋｎａ，Ｄｅｎｔ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  Ｊｕｌ，４２（３）：４９１−５０３（１９９８））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、α−Ｇａｌエピトープを除去するためのα−ガラクトシダーゼによる処理後に骨伝導性及び骨誘導能を有する、効果のある異種移植片用の脱無機質化及び脱抗原化骨基質を提供する。この骨基質は、増大した免疫適合性を有する。また、本発明は、異種移植片用骨粒状物のための処理戦略も提供し、またヒトからブタまでの免疫応答を減少させつつ骨伝導及び骨誘導特性を示す。確立された骨及び新規異種移植片のプロセシング技術を証明された評価ツール及び動物モデルと共に使用する。本発明は、脱無機質化及び脱抗原化ブタ骨基質を骨移植片として骨格系の欠陥のために使用することを容易にするのに有用である。この骨移植片材料源は、外科医に臨床用途の自家移植片、同種移植片及び合成移植片に代わる選択肢を提供する。
【０００８】
いくらかの具体例では、本発明は、免疫学的プロファイルのために処理された皮質支材を使用し、また骨伝導性、骨誘導性及び生体適合性をラジオグラフィーと組織学によって評価するためにラット頭蓋欠陥モデルで脱無機質化ブタ骨プロセシングを使用する。
【０００９】
図面の簡単な説明
図１は、手術後２６週目での処理されていない（凍結のみ）皮質支材移植部位からの非脱灰組織断片についての一組の写真図である。顕微鏡写真図の表記：（Ｆ）＝大腿骨、Ｇ＝異種移植片支材、Ｎ＝新生骨。図１Ａは左大腿骨である。図１Ｂは右大腿骨である（１×倍率、塩基性フクシン染色）。
【００１０】
図２は、外科手術後２６週目での２つの処理済み（α−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒド）皮質支材移植部位からの非脱灰組織断片についての一組の写真図である（１×倍率、塩基性フクシン染色）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
ここで、異種移植片用脱無機質化及び脱抗原化骨基質の効果は、骨伝導性、見込まれる骨誘導性及び免疫学的特性とその特徴に関して評価される。最初の免疫学評価は、α−ガラクトシダーゼ処理ブタ皮質支材を霊長類大腿骨のアンレー研究に使用する。最後の評価は、α−ガラクトシダーゼで処理してα−Ｇａｌエピトープを除去した脱灰骨粒状物を使用する。この脱無機質化基質の生体適合性、骨伝導性及び骨誘導能は、ラットの頭蓋欠陥モデルにおいてラジオグラフィー及び組織学を使用して評価される。
【００１２】
本発明の全体にわたる一体化の技術思想は、α−ガラクトシダーゼで処理された処理加工異種移植片用ブタ脱無機質化骨が骨伝導性、骨誘導性及び免疫適合性であることである。また、α−ガラクトシダーゼで処理された異種移植片用ブタ脱無機質化骨は、生体適合性、多孔性、吸収性及び空間保持性でもある。
【００１３】
用語「異種移植片」とは、ある種の動物から別の種のものに移される移植片をいう（Ｓｔｅｄｍｅｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，バルチモア，ＭＤ（１９９５））。用語「異種」とは、例えば異種軟組織などの場合に、ある種の動物から別の種の動物に移される軟組織をいう。いったんある個体に移植されたならば、異種移植片は異種移植片の慢性及び超急性拒絶反応のような免疫原性反応を引き起こす。ここで使用されるときに、用語「慢性拒絶反応」とは、ある個体に移植された異種移植片に対する該個体の免疫反応をいう。典型的には、慢性拒絶反応は、異種移植片を受け入れた個体の血清中の天然ＩｇＧ抗体と該異種移植片の細胞上で発現する炭水化物部分及び／又はその細胞マトリックス及び／又は細胞外成分との相互作用によって仲介される。例えば、霊長類でないの動物からの軟骨異種移植片（例えば、ブタ又はウシ起源）のヒトへの移植は、主としてヒトの血清中に存在する天然ＩｇＧ抗Ｇａｌ抗体と該異種移植片中で発現する炭水化物構造のＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（α−ガラクトシル又はα−ｇａｌエピトープ）との間の相互作用によって妨げられる（Ｋ．Ｒ．Ｓｔｏｎｅ他，「カニクイザルでのブタ及びウシ軟骨移植」：Ｉ．慢性異種移植片拒絶反応のモデル，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４０−６４５（１９９７）、Ｕ．Ｇａｌｉｌｉ他，「カニクイザルでのブタ及びウシ軟骨移植」：II．慢性拒絶反応中の抗Ｇａｌ応答の変化，６３  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６４６−６５１（１９９７））。慢性拒絶反応では、免疫系は異種移植片の移植の１〜２週間以内に典型的に応答する。「慢性拒絶反応」とは異なり、ここで使用されるときに「超急性拒絶反応」とは、拒絶反応が異種移植片を受け入れた個体の血清中の天然ＩｇＭ抗体と細胞上で発現する炭水化物部分との相互作用によって典型的に仲介される、ある個体に移植された異種移植片に対する該個体の免疫反応をいう。この相互作用は、受容個体の血管床の溶解及び血流の停止に起因して数分から２〜３時間以内に補体系を活性化させる。
【００１４】
次の実施例は、本発明の好ましい具体例をさらに十分に例示するために示す。これらの例は、添付された特許請求の範囲によってもっぱら規定されるような本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例】
【００１５】
例Ｉ
霊長類の海綿骨及び皮質骨モデルにおける異種移植片材料の評価
この例では、α−Ｇａｌエピトープ（Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）を組換えα−ガラクトシダーゼで除去し、そして穏やかなグルタルアルデヒド固定によってサルでの移植されたブタ組織に対する免疫応答を減少させるための方法を開発した。非脱灰骨支材を使用する結果は、骨粒状物を骨修復のために使用する補強証拠を与える。
【００１６】
背景：
これまでに、クロスカート社（サンフランシスコ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、ブタ骨である膝蓋腱骨の前十字靱帯（ＡＣＬ）再建装置を広く特徴付けてきた。この複合装置は、それぞれの端部に皮質／海綿骨栓子を有する無菌の生体適合性コラーゲン腱からなる。照射プロセシング段階は、スパイクされた試料からのウイルス性因子を有意に減少させる。先行する霊長類骨の試験では、クロスカート社は、霊長類の大腿骨でブタ骨移植片を使用して中実な骨融合を評価し、新生骨形成及び移植片と宿主組織との融合についてのプロセス変量を選別した。
【００１７】
方法：
この例では、１８個体の成体の雄のアカゲザル（体重９〜１８．５ｋｇ）を使用して皮質骨治癒及び移植骨の取り込みを特徴付けた。麻酔をかけられたサルは、所定の位置に保持された中大腿骨に近位及び遠位ワイヤーで固定された両側皮質アンレー支材移植片を受け入れ、そしてその遠位大腿骨及び近位頸骨に直径が８ｍｍで深さが８ｍｍの海綿質欠陥を生じさせた。スクリーニング群は、次の処理：（ａ）凍結のみ（ｂ）アルコール＋凍結（ｃ）α−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒド及びα−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒド＋過酸化水素に付された骨移植片用皮質支材（表Ｉ）又は海綿骨（表II）材料から構成された。
【００１８】
１２種の動物は、大腿骨の外側面及び後面上に長さが約５ｃｍ及び幅０．５ｃｍの２つの両側アンレー異種移植片用支材移植片を受け入れた。皮質骨の治癒を移植後６週目と２６週目に評価した。異種移植片海綿質円柱型プラグによる海綿骨の治癒を遠位大腿骨及び／又は近位頸骨の骨幹端領域に生じた両側欠陥で評価した。
【００１９】
１４種の動物における合計３６個の海綿骨欠陥を移植後６、１２及び２６週目に異種移植片プラグを追加して評価した。８種の対照（無充填）の海綿質欠陥を８種の動物の遠位大腿骨で移植後２６週目に評価した。６種の動物を移植後６週目に、１種を１２週目に、１１種を２６週目に剖検した。大腿骨及び頸骨の治癒の進行を検査するために単純フィルム放射線写真を所定の間隔で撮影した。次いで、全ての部分を、組織応答、残余の移植材料、新生骨形成の質と量、移植片の取り込みとリモデリングを決定するために非脱灰組織断片を調製することによって組織学的に試験した。
【００２０】
それぞれの皮質支材及び海綿質欠陥部位を全体の外観について観察した。ワイヤーを除去する前に皮質支材移植片が安定か又は不安定かどうかを手作業で決定した。支材が非常に不安定であった場合には、ワイヤーを所定位置に残した。繊維組織の存在及び支材移植片と大腿骨皮質の間の骨接触の程度を記録した。それぞれの支材移植片のミリメートルでの長さ、幅及び高さを測定し且つ記録した。支材移植片の全体にわたる取り込み及びリモデリングを目視観察して記録し、並びに全体の外観に関するその他のいかなる顕著な所見も記録した。同様に、海綿質欠陥部位を移植片材料の存在、繊維組織、宿主骨による取り込み及び欠陥中又はその周辺の可視変化について観察した。２つの支材をそれぞれの大腿骨上に位置させた。処理のタイプごとの皮質支材アンレー移植片モデルについての移植された移植片材料の概要を以下の表Ｉに示す。
【表１】
2005500090.tif 000002
【００２１】
処理のタイプごとの海綿骨欠陥移植片モデルについての移植された移植片材料の概要を以下の表IIに示す。一つの円柱型プラグ移植片を欠陥部位ごとに位置させた。
【表２】
2005500090.tif 000003
【００２２】
どの動物も移植材料又は外科的処置に関連する不都合な臨床反応を経験しなかった。全ての動物は、第２の手術後週の終期で完全に体重負荷であった。生体内分析は、定期剖検の前の１４日目及び７日目にオキシテトラサイクリン塩酸塩（２０ｍｇ／ｋｇ体重）及び蛍光色素を投与することを包含した。下肢の左右前後及び側方のラジオグラフを手術後直ちに、３月目に及び剖検時に得た。全てのラジオグラフを予定されたラジオグラフ期日の３日以内に撮影した。血液試料を抗Ｇａｌ活性のために断続的に得た。
【００２３】
結果：
処理された異種移植片材料は、非ヒト霊長類モデルに移植されたときに改善された生物学的性能を示した。２６週目の試験結果のみをここに示す。特に、ブタ骨移植片と皮質骨移植片と海綿骨移植片のα−ガラクトシダーゼ及びグルタルアルデヒド処理は、処理していない異種移植片である皮質及び海綿骨移植片の対照と比較したときにより少ない炎症反応を示した。さらに、この検査群は、未処理の対照と比較して、皮質支材移植片において増大したリモデリング、移植片の取り込み及び新生骨形成も示した。同様に、遠位大腿骨及び近位頸骨に位置した海綿質プラグ移植片も未処理異種移植片の対照と比較して増大した移植片の取り込み及びリモデリングを示した。このデータは以下の表IIIに示されており、軸及び長手方向の骨について合計の応答を示している。
【表３】
2005500090.tif 000004
【００２４】
海綿骨欠陥の組織学的データを以下の表IVに示す。
【表４】
2005500090.tif 000005
【００２５】
組織学的分析：
手術後２６週目での未処理（凍結のみ）皮質支材移植部位からの非脱灰組織切片の顕微鏡写真を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａにおいて、移植片の取り込みは左大腿骨でほぼ２０％〜３０％であった。無機質化性軟骨が移植片と宿主骨の間に観察される。残りの骨を図の上部に示し、大腿骨皮質を下部に示す（１×倍率、塩基性フクシン）。右大腿骨（図１Ｂ）での移植片の取り込みは、繊維組織の中間挿入及びかなりの間隙のため相当に低かった。移植片が画像の右の遠位の方に吸収されていることに留意されたい。この顕微鏡写真は１×倍率であり、塩基性フクシンを使用して染色されている。
【００２６】
手術後２６週目での２つの処理（α−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒド）皮質支材移植部位からの非脱灰組織切片の顕微鏡写真を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａにおいて、移植片の取り込みは、この部位ではほぼ５５％であった。新生骨は、大腿骨皮質から残余の移植片に架橋しているのが分かる。図２Ｂにおいて、宿主の大腿骨皮質と新生骨橋と支材移植片との間に有意な接触が観察された。この顕微鏡写真は１×倍率であり、塩基性フクシンを使用して染色されている。
【００２７】
考察：
α−ガラクトシダーゼ及びグルタルアルデヒドで処理した皮質支材移植部位は、手術後６週目で最小の移植片吸収及び制限された新生骨形成を示し、また炎症性応答を示さなかった。手術後２６週目には、移植片に対する宿主の皮質橋に沿ってかなりの量の新生骨形成及び骨質の取り込みと共に最小の移植片吸収があった。いくらかの繊維組織は、支材と宿主皮質の間隙の界面に存在し且つ全ての事例で最小の炎症反応であった。未処理移植片に対する炎症反応は、中程度〜激しいものであり、これは破骨細胞の移植片吸収及び周囲の組織中での異物巨細胞の存在によって特徴付けられた。全ての炎症反応の結果を上記の表III及び表IVに示している。
【００２８】
手術後６週目に評価した海綿質プラグ移植部位の組織学的分析は、非常に速い且つ制限された新生骨形成を示した。移植片の取り込みは、大部分の欠陥において穏和〜中程度であった移植片吸収度に関連していた。６週目での処理海綿質移植片に対する炎症反応は、大部分の部位でなし〜穏和であった。２６週目では、新生骨形成の量は、処理された海綿質プラグ移植部位について６週目で評価されたものと比較するときにより多かった。α−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒドの群では、移植片の取り込みは、移植片吸収の相当する増加及び残余の移植片のより低いパーセンテージに従って、より高かった。大部分の海綿質移植片部位は、なし〜穏和の炎症応答を有していた。
【００２９】
結論：
この実施例の結果は、ブタ膝蓋腱の組換えα−ガラクトシダーゼ処理が抗Ｇａｌ液性応答の有意な減少及び細胞浸潤の制限を生じさせるという先の所見を裏付けるものである（Ｇａｌｉｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３２（１９９８年９月／１０月））。この実施例は、骨移植片をα−ガラクトシダーゼで同様に処理して炎症応答を阻止し且つ移植片取り込みを促進できることを示している。この例Ｉは骨折の骨結合を特に扱うものではないが、このモデルは、骨の結合が予期され、しかも融合及び骨再建を生じさせる細胞性材料の浸潤が積極的に補強される骨修復機構に直接適用できる。
【００３０】
例II
整形外科用途のための異種移植片骨基質
この例は、異種活性組織からのα−Ｇａｌエピトープを除去する際の最大限の利益を得、且つ促進された骨結合を促すために例Ｉの処理方法を改良する。
【００３１】
方法の開発
骨幹骨をヒト移植用のブタ大動脈心臓弁も供給する医学等級の畜殺場からの６〜１２ヶ月のブタから採取する。軟組織の解離、手作業による骨膜の剥離及び骨髄の除去の後、骨片を連続した高張、低張及びアルコールリンスに付す。次いで、この骨を粉砕して規格化された１５０〜５００μｍの粒度にふるい分けする（Ｚｈａｎｇ他，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６８（１１）：１０８５−９２（１９９７））。分粒後、この粒子を連続した過酸化水素及びアルコール洗浄に付す。下流の処理は、別個の塩酸による脱石灰化及び酵素処理を包含する。以下のように、α−ガラクトシダーゼ酵素を特徴付けるためにプロトコルを確立した。
【００３２】
α−ガラクトシダーゼのためのアッセイ
酵素であるα−ガラクトシダーゼ（コーヒー豆から予めクローン化され、酵母ピチア・パストリス（Pichia pastris）内で遺伝学的に発現する）は、よく特徴付けられてきた（Ｚｈｕ他，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３２４：６５（１９９５））。α−ガラクトシダーゼは、自然界に広く分布する分子量４１ｋＤａのエキソグリコシダーゼである。これは、細胞のオリゴ糖から末端α−ガラクトースを分解させることによって作用する。この組換え酵素の活性を希釈した酵素をｐ−ニトロフェニル−α−ガラクトシド基質と１０分間室温で反応させることによって決定する（Ｚｈｕ他，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ８２７：３２４（１９９６））。各溶液でのｐ−ニトロフェノールの吸光度を４０５ｎｍで読む。この酵素は３７℃、２４℃及び４℃で安定であるが、冷凍及び解凍を繰り返すことによって悪影響を受ける。各バッチの酵素活性をアッセイに使用する前に検査する。
【００３３】
α−Ｇａｌエピトープ発現の決定
「ＥＬＩＳＡ抑制」アッセイを様々な組織でのα−ｇａｌエピトープ発現の決定のために開発した。このアッセイは、ほ乳類糖蛋白質を測定するために予め開発されたラジオイムノアッセイ固相法の改良法である。細胞上でのＭ８６抗Ｇａｌ抗体とα−ｇａｌエピトープの相互作用をα−ｇａｌ・ＢＳＡ（固相）によるインキュベーション後に上澄み液中に残存する遊離のＭ８６の活性によって測定する。僅かな改良であるが、このアッセイは骨粒状物のホモジェネート上でのα−Ｇａｌエピトープ発現の決定のために使用できる。脱無機質化された骨粒状物を様々な濃度でモノクローナル抗Ｇａｌ抗体指定Ｍ８６と共に該抗体の１：１００希釈でインキュベートする。一定の回転で一晩インキュベートした後、この粒子及び結合した抗体を遠心分離によって除去する。上澄み液中の残りの抗Ｇａｌ抗体を固相抗原としてのＢＳＡに結合したα−Ｇａｌエピトープ（α−Ｇａｌ・ＢＳＡ）のＥＬＩＳＡによって決定する。骨粒子中で発現するα−Ｇａｌエピトープの数とモノクローナル抗Ｇａｌ抗体のこれらの粒子への結合（即ち上澄み液からの抗体の除去）との間には直接の相関関係が存在する。α−Ｇａｌエピトープを欠失した骨粒状物は、抗Ｇａｌと全く結合しないため、抗体との一晩のインキュベーションの結果として抗体のα−Ｇａｌ・ＢＳＡへのその後の結合を減少させない。
【００３４】
酵素蛋白質濃度の決定−比放射活性の決定
このアッセイは、溶液中の蛋白質量を定量するＳｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ−ＰＲキットを使用する。この反応媒体は、０．０５ミリモル／Ｌのピロガロールレッド、０．１６ミリモル／Ｌのモリブデン酸ナトリウムからなる。蛋白質標準溶液は、防腐剤として０．１％のアジ化ナトリウムを有するヒトアルブミン（５０ｍｇ／１００ｍｌ）生理食塩水からなる。ピロガロール試薬の９５μｌをそれぞれのウェルに添加する。脱イオン水をブランクとして使用する。試験ウェルに５μｌの酵素溶液（１／５０希釈）を添加する。標準アルブミン溶液を個々のウェルに添加する。マルチウェルプレート及び内容物を３７℃で３分間インキュベートする。この吸光度を６００ｎｍで決定する。蛋白質濃度を次式：
2005500090.tif 000006
を使用して算出する。
【００３５】
骨粒状物中でのエピトープ決定のための手順
このアッセイは、ほ乳類糖蛋白質を測定するためにすでに開発されているラジオイムノアッセイ固相法を改良したものである。細胞上でのＭ８６抗Ｇａｌ抗体とα−ｇａｌエピトープの相互作用をα−ｇａｌ・ＢＳＡとのインキュベーション後に上澄み液中に残存する遊離のＭ８６の活性によって測定する。骨粒状物をＰＢＳｐＨ７．２／３中で強く均質化する。次いで最終濃縮液をほぼ２００ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで連続的に希釈する。次いで、それぞれの希釈試料（０．１ｍｌ）を微量遠心分離用チューブにピペットで分注する。次いで、１：５０希釈のモノクローナル抗Ｇａｌ抗体（Ｍ８６）も０．１ｍｌのアリコートでそれぞれのチューブに添加する。Ｍ８６の１：１００の最終希釈は、その後α−ｇａｌ・ＢＳＡへの５０％の最大の結合を与える。この希釈液は、エピトープへの抗Ｇａｌ抗体の結合を決定するのに適切な感度を有する。次いで、ホモジェネート及びモノクローナル抗体を含有するチューブを連続回転で一晩４℃に保持する。この期間中に、Ｍ８６抗体は、ホモジェネート懸濁液の粒子中のα−ｇａｌへの結合プロセスを開始する。最後に、抗体分子に結合する組織断片をエッペンドルフ微量遠心分離用チューブ中で１４０００ｒｐｍ（３５０００×ｇ）で遠心分離することによって除去する。従って、ＥＬＩＳＡの結果は、固相抗原としてのα−ｇａｌ・ＢＳＡ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ第２抗体（ＩｇＭ−ＨＲＰ：アクセルラボラトリーズ社）によって上澄み液中に残存するＭ８６抗体の活性を決定する。ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で含んでなる１０μｌ／ｍｌの３０％過酸化水素含有過酸化物緩衝液（ｐＨ５．５）を添加することによって発色させる。α−Ｇａｌエピトープを含有する粒子は、ＥＬＩＳＡ手順より前に抗体を取り除いているため、この相互作用は、その後にＭ８６が固相α−Ｇａｌ・ＢＳＡに結合するのを阻害する。試験ホモジェネートのＭ８６レベルの阻害曲線とα−Ｇａｌ処理より前のＭ８６抗体レベルから得られた標準値の阻害曲線との比較は、明らかな抗体力価の増加を定量するデータとなる。従って、α−Ｇａｌエピトープの完全な除去を生じさせるα−ガラクトシダーゼ濃度は、Ｍ８６が粒子に全く結合しないことを観察することによって決定される。
【００３６】
血清中の抗骨基質抗体を決定するための手段
骨基質蛋白質に対する抗体産生を固相抗原としての粒状骨基質によるＥＬＩＳＡで決定する。粒子を１〜１０μｍの寸法に均質化し、１００μｇ／ウェルとしてのＥＬＳＡプレート上で乾燥させる。従って、本来軟骨及び靱帯のために使用される手順をこの試験では骨に適用する。ＥＬＩＳＡ試験を、平板培養され、乾燥され且つブロックされた、処理されていないブタ骨粒状物又はα−ガラクトシダーゼ処理された骨粒状物試料のいずれかを使用して実施する。次いで、１：５０で開始する５０μｌ量の血清希釈液をウェルに添加する。このプレートを２時間室温で維持し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、そして１：１０００に希釈された抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ダコ社）と室温で１時間反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに５回洗浄後、ＯＰＤと共に３〜５分の反応時間にわたってインキュベートすると発色する。ＥＬＩＳＡの吸光度値をそれぞれの動物から移植前及び移植後に集められた血清試料で比較する。抗体力価の安定な値又は増加は、抗骨免疫応答についての尺度となる。
【００３７】
骨粒状物中のα−ガラクトシダーゼ含有量の決定
骨粒状物を秤量し、次いで０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えたＰＢＳ（ｐＨ７．０）の固定容量に溶解させ、そして均質化させる。このホモジェネートを３２℃で３０分間保存し、次いで１２０００ｇで１０分間遠心分離する。上澄み液をデカントし、ミリポア社製フィルターで濾過する。α−ガラクトシダーゼ活性をこの上澄み液中で決定する。同様の抽出手順を骨粒状物でα−ガラクトシダーゼ処理後直ちに実施する。これらのデータは、プロセシング後の組織中に残存する残部α−ガラクトシダーゼの正確な濃度に関する情報となる。追加のホモジェネートを既知量のα−ガラクトシダーゼと混合すること及び同様に抽出液の活性を決定することは、このアッセイを有効にする。
【００３８】
プロトコルの概要
酵素最適化を表Ｖに示すようにグループで実施する。
【表５】
2005500090.tif 000007
【００３９】
α−ガラクトシダーゼ酵素（１００単位／ｍｌ）によって処理されたブタ移植片材料は、特定の酵素を使用して１グラムの組織の比までうまく脱抗原化されている（Ｇａｌｉｌｉ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：１１２９（１９９８）、Ｇａｌｉｌｉ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３：６４６（１９９７））。軟骨に関するこれまでの経験に基づけば、この酵素は、脱灰骨粒子に浸透し且つ骨基質中のα−Ｇａｌエピトープを破壊するはずである。α−Ｇａｌエピトープの除去を、先に記載したように、様々なα−ガラクトシダーゼ濃度でα−Ｇａｌエピトープに対するモノクローナル抗体によるＥＬＩＳＡ抑制アッセイで測定する（Ｇａｌｉｌｉ他，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：１１２９（１９９８））。
【００４０】
処理された結合組織の有効表面積は測定しなかったが、破砕した骨粒状物（１５０〜５００μｍの範囲）の有効表面積は、それよりもかなりのオーダー高い。粒状物のプロセシングは、非常に大きな表面積と最小の拡散経路の長さを与え、エピトープ提示及び得られた酵素／産物のクリアランスを最大にする。方法の開発についてのその他の詳細は、尺度化できる工程設計を包含し、これは細胞培養技術からの尺度化できる反応器を導入している。調製された基質材料の最後の処理は、凍結乾燥、バイアリング及び２．５ｍＲＡＤの電離放射線を使用した最終的な滅菌を包含する。いったん最適化及び処理が標準化されたならば、生体内試験用の材料を調製する。
【００４１】
ラット頭蓋欠陥モデルの試験系
ラット頭蓋欠陥モデルは、骨移植用材料の骨伝導性及び骨誘導性のスクリーニングアッセイとして確立されている（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ＆Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．１（１）：６０−８（１９９０年１月）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ他，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．（２６７）：２５５−６３（１９９１年６月））。ロングエバンスラットを使用前に１週間隔離する。このラットをガラス鐘中に置き、吸気麻酔（イソフルオラン）に付す。いったん鎮静したならば、このラットを滅菌手術室に移し、手術の準備をする。次いで、この動物にケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／２０ｍｇ）を最初の誘導投与量として、次いで必要に応じて５０ｍｇ／１０ｍｇのカクテルを持続投与量として注射する。呼吸の深さを監視し、そして足指つねり反射を適用して感覚消失の深さを評価する。眼軟膏を目に塗布して脱水を防止する。
【００４２】
この例のラット頭蓋欠陥モデルは、穿頭器による８ｍｍの欠陥が頭蓋に付与されたロングエバンスラットを使用している（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ他，Ｓｕｒｇｅｒｙ  １０７（１）：５０−４（１９９０年１月））。動物は骨格的に成熟しており、体重２５０〜３００グラムの成体のラットである。ラットモデルの詳細は、試験群当たり６種の動物に関して４週間の評価時点を包含する（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ他，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．（２６７）：２５５−６３（１９９１年６月））、Ｓｃｈｍｉｔｚ他，Ａｃｔａ  Ａｎａｔ（Ｂａｓｅｌ）１３８（３）：１８５−９２（１９９０））。手術部位をベタジン及び７０％イソプロピルアルコールの連続塗布を使用して準備した後、鼻骨から中央矢状稜まで直線状に切開する。軟組織を反映させ、露出した後頭骨、前頭骨及び頭頂骨から骨膜を解離させる。８ｍｍの開頭欠陥を０．９％滅菌生理食塩水で洗浄しながら低速度の穿頭器で生じさせる。頭蓋片の最後の除去をプローブで達成する。次いで、事前に秤量した被検物質を欠陥中に均一に置き、軟組織を吸収性結節縫合糸で閉じる。硬膜及び上矢状静脈洞を穿孔しないよう注意する。動物を２８日の試験中監視する。動物を、Ｉ．Ｖ．０．５ｍｌ／３００ｇｍのＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ−Ｄを使用して安楽死させる。
【００４３】
開頭部位を３〜４ｍｍの周囲の骨と共に前頭後頭複合体から解離させ、さらなる分析のために直ちに７０％エタノール中に置く。
【００４４】
７０％エタノール中で２４時間後に、高分解能放射線フィルムを使用して標本の放射線写真を撮影する。次いで、それぞれのレントゲン写真をデジタル化し、放射線不透過を欠陥部位上に重ね合わせた標準的な８ｍｍ直径の円内で評価する。標準円内で放射線不透過が測定された面積を全面積のパーセンテージとして報告する。
【００４５】
放射線形態測定後、該標本をエタノールでさらに脱水し、メタクリレートに包埋し、そしてミクロトームで４．５μｍの冠状切片を作製した。切片を、細胞の細部のためにトリクロム染色法で調製し、新たに石灰化した組織のためにフォン・コッサ染色法で調製する。欠陥部位内での新生骨形成の定量的評価を、フォン・コッサ染色切片を使用して標準的なグレーレベルが欠陥部位内の細胞構造と新たに石灰化された組織との間に確立された後に評価する。記述統計を全ての群について放射線形態測定及び組織形態測定の一部として実施する。追加の統計分析を、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験とフィッシャー分析を使用した多重比較とによって評価される慎重な比較でＡＮＯＶＡによって達成する。
【００４６】
この例におけるブタ骨基質アッセイ群には、対照として脱石灰化され、放射線照射された骨粒子と酵素／脱抗原化試験群としてα−ガラクトシダーゼ及び最後に滅菌された緩衝液、グアニジン塩酸塩又はグルタルアルデヒドのそれぞれで処理された脱灰粒子とが含まれる。この分析用試験群の選択物には、３種のモデルの対照群：（ａ）無充填の欠陥、（ｂ）内因性成長因子を不活性化させるためのグアニジン塩酸塩で処理された脱無機質化ヒト基質及び（ｃ）それで処理されていない脱無機質化ヒト基質が含まれる（重山他，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６６（６）：４７８−８７（１９９５））。ブタ試験群は、内因性成長因子除去のためのグアニジン抽出を反映し且つ酵素処理されていない対照を包含する。以前に開発された脱抗原化戦略はアルデヒド架橋を包含し、この作業変差も第４のブタ由来試験群に含められる。この試験についての７群を以下の表VIに示す。
【表６】
2005500090.tif 000008
【００４７】
例III
Ｚ−骨プロセス
以下の表VIIは、Ｚ−骨プロセスの一具体例のための段階を与える。
【表７】
2005500090.tif 000009
【００４８】
他の具体例では、実験方法は、一段階の大量凍結乾燥及び乾燥粒状物充填の点で表VIIとは異なる。
【００４９】
本発明の一以上の具体例の詳細は、上記の添付明細書に表されている。ここに記載された方法及び材料に類似し又はそれと均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施又は試験に使用できるが、ここでは好ましい方法及び材料を記載している。本発明のその他の特徴、目的及び利点は、明細書及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。明細書及び添付した特許請求の範囲では、単数の形には文脈に明らかな指示がない限り複数の対象が含まれる。特に定義がない限り、ここで使用した全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書で引用した全ての特許及び文献が参照によってここに含めている。
【００５０】
先の記載は、例示の目的のためにのみ示されており、本発明を開示された厳密な形に限定することを意図するものではないが、ここに添付した特許請求の範囲によって示される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】手術後２６週目での処理されていない（凍結のみ）皮質支材移植部位からの非脱灰組織断片についての一組の写真図である。
【図２】手術後２６週目での２種の処理済み（α−ガラクトシダーゼ＋グルタルアルデヒド）皮質支持移植部位からの非脱灰組織断片についての一組の写真図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005500090.tif 000030
2005500090.tif 000031