(57)【要約】本発明は、対象となる標的に結合する多価構成物、ならびに前記構成物の使用に関する種々の方法に関し、同じ標的内の異なる結合部位に結合する小さな標的部分を用いて、対象となる標的への集中化を向上し、標的部位の検出、造影および／または治療の方法を向上させる。  本発明は、同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくとも２つの結合部分からなる多価化合物を提供する。具体的には、図３６に示されるような治療診断用の組成物およびこれを用いた治療および診断方法を提供する。
2005519980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくとも２つの結合部分からなる多価化合物。
【請求項２】
前記化合物は、複数の結合部分からなる多量体化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物は、二量体化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
結合部分の少なくとも１つは、ポリペプチドからなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
結合部分のすべてが、ポリペプチドからなる、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
化合物の標的に対する親和性は、ポリペプチドのいずれか１つの標的に対する親和性よりも、およそ６０倍大きい、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
化合物の標的に対する親和性は、ポリペプチドのいずれか１つの標的に対する親和性よりも、およを５６０倍大きい、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
各々のポリペプチドは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12よりなる群から選択された、請求項４または５に記載の化合物。
【請求項９】
各々のポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29よりなる群から選択された、請求項４または５に記載の化合物。
【請求項１０】
ポリペプチドは、アミノ酸置換、アミド結合置換、Ｄ−アミノ酸置換、糖化アミノ酸、ジスルフィド模倣置換、アミノ酸転座、レトロインヴェルソペプチド、ペプトイド、レトロ−インヴェルソペプトイド、または合成ペプチドを有する、請求項８または９に記載の化合物。
【請求項１１】
標的は、タンパク質である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
標的は、受容体または受容体／リガンド複合体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
結合部分は、タンパク質上の異なったエピトープと結合する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
結合部分は、受容体／リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
上記標的は、血管形成に関与する受容体である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１７】
標的は、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体からなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
結合部分は、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
上記標的は、増殖異常に関与する受容体である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２０】
上記標的は、腫瘍上に発現した受容体である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２１】
標的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭｅｔ）またはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体からなる、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２２】
結合部分は、ｃＭｅｔまたはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
結合部分は、ポリペプチドからなる、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
結合部分は、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12で構成される群から選択された、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２５】
結合部分は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5からなる、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２６】
結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２７】
さらに、少なくとも１つの標識基または治療薬剤を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項２８】
標的が、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体からなる、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
結合部分は、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
標的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭｅｔ）またはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体からなる、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
結合部分は、ｃＭｅｔまたはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
結合部分は、SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9のシーケンスからなる、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３３】
結合部分は、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5のシーケンスからなる、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３４】
結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項４または５に記載の化合物。
【請求項３５】
標識基または治療薬剤は、１つ以上の常磁性金属イオンまたは超常磁性微粒子、超音波造影剤、１つ以上の光標識物質、１つ以上の放射性核種を含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３６】
常磁性金属イオンは、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Pr3+、Cr3+、Co3+、Fe3+、Ti3+、Tb3+、Nd3+、Sm3+、Ho3+、Er3+、Pa4+およびEu2+から選択された、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
さらに、キレート剤を含み、該キーレト剤は、１−置換１,４,７−トリカルボキシメチル１,４,７,１０テトラアザシクロドデカン三酢酸（DO3A）である、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３８】
さらに、ガドリニウム(III）を含む、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３９】
超音波造影剤は、フッ素化ガスを含んだリン脂質安定マイクロバブルまたはマイクロバルーンからなる、請求項３５に記載の化合物。
【請求項４０】
標識基または治療薬剤は、さらにキレート剤を含む、請求項３５に記載の化合物。
【請求項４１】
キレート剤は、DTPA、DOTA、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAMまたはMECAMからなる、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
キレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸、テトラアザシクロドデカン三酢酸、またはこれらのカルボキシメチル置換誘導体からなる、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４３】
放射性核種は、、18F、124I、125I、131I、123I、77Br、76Br、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Auまたは199Auである、請求項３５に記載の化合物。
【請求項４４】
以下の構造から選択された構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000077
【請求項４５】
以下の構造から選択された構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000078
ここで、XはCH2またはOであり、
Yは、C1-C10分岐性または非分岐性アルキル基、C1-C10分岐性または非分岐性ヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基、もしくはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシポリアルコキシアルキル基からなる、C1-C10分岐性または非分岐性アルキル、アリール、アリロキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルまたはアラルキル基であり、Ｊは、Ｃ（＝Ｏ）-、ＯＣ（＝Ｏ）-、ＳＯ2-、ＮＣ（＝Ｏ）-、ＮＣ（＝Ｓ）-、Ｎ（Ｙ）、ＮＣ（＝ＮＣＨ3）-、ＮＣ（＝ＮＨ）-、Ｎ＝Ｎ-、合成または天然アミノ酸に由来するホモポリアミドまたはヘテロポリアミンであり、ｎは1〜100である。
【請求項４６】
以下の構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000079
【請求項４７】
99mTc、186Reまたは188Reをさらに含む、請求項４４または４５に記載の化合物。
【請求項４８】
99mTcをさらに含む、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４９】
以下の構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000080
ここで、Ｒは、アルキル基である。
【請求項５０】
以下の構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000081
ここで、Ｒは、アルキル基である。
【請求項５１】
以下の構造を有する化合物をさらに含む、請求項４３に記載の化合物。
2005519980.tif 000082
【請求項５２】
177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをさらに含む、請求項４９、５０または５１に記載の化合物。
【請求項５３】
結合部分と標識基または治療薬剤との間に、さらにリンカーを含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項５４】
前記リンカーは、置換アルキル基鎖、非置換アルキル基鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子またはこれらの組み合わせからなる、請求項５３に記載の化合物。
【請求項５５】
治療薬剤は、生体活性剤、細胞毒性剤、薬物、化学療法剤または放射線治療剤を含む、請求項２７に記載の化合物。
【請求項５６】
上記化合物は、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１３、Ｄ１７、Ｄ２４、Ｄ２６およびＤ３１から選択された二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
【請求項５７】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000083
【請求項５８】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000084
【請求項５９】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000085
【請求項６０】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000086
【請求項６１】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000087
【請求項６２】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000088
【請求項６３】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000089
【請求項６４】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000090
【請求項６５】
上記化合物は、以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000091
【請求項６６】
マイクロバブルまたはマイクロバルーンと共役した請求項１〜４１または４６〜４７のいずれかに記載の化合物からなる、診断用造影剤。
【請求項６７】
上記マイクロバブルまたはマイクロバルーンは、以下の構造式からなるリン脂質を含む、請求項６６に記載の診断用造影剤。
2005519980.tif 000092
【請求項６８】
上記マイクロバブルまたはマイクロバルーンは、SF6  、フロンおよびペルフルオロカーボンで構成される群から選択された生体適合フッ素化ガスを含む、請求項６６に記載の診断用造影剤。
【請求項６９】
（ａ）請求項１〜４８または５３〜５４のいずれかに記載された、化合物からなる調剤を、患者に投与するステップと、
（ｂ）患者への投与後に、化合物を画像化するステップからなる、診断用画像化方法。
【請求項７０】
画像化ステップは、核磁気共鳴画像法、超音波画像法、光学的画像法、音ルミネセンス画像法、光音響画像法または放射性画像法からなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
投与ステップは、吸引、経皮吸収、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、または動脈内注射からなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
請求項４９〜５５のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、疾病の治療方法。
【請求項７３】
請求項２８、２９または３２〜３３のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、血管新生に関連する疾病の治療方法。
【請求項７４】
請求項３０、３１または３４に記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、過剰増殖に関連する疾病の治療方法。
【請求項７５】
疾病は、新生腫瘍性増殖である、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
請求項１〜３５のいずれかに記載の化合物を含む調剤を、患者に投与するステップからなる、疾病の治療方法。
【請求項７７】
改良された結合親和力を有するヘテロ多量体化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）標的上の異なった結合部位に結合する２つ以上の結合部分を有する、標識化された化合物を調製するステップと、                    
（ｂ）標識化された化合物を、標的と接触させるステップと、
（ｃ）標識化された化合物の解離定数を測定するステップと、
（ｄ）標識化された化合物の解離定数を、1つ以上の個々の結合部分の解離定数と比較するステップからなる方法。
【請求項７８】
上記化合物は、多数の結合部分を有するヘテロ多量体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
上記化合物は、ヘテロ二量体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
結合部分の少なくとも１つは、ポリペプチドからなる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
標的は、タンパク質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
標的は、受容体または受容体／リガンド複合体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
結合部分は、タンパク質上の異なったエピトープと結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
結合部分は、受容体または受容体／リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
上記標的は、血管新生または過剰増殖に関与する受容体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
標的は、ＫＤＲまたはＶＥＧＦ／ＫＤＲ複合体からなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
結合部分は、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
標的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭｅｔ）またはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体からなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
結合部分は、ｃＭｅｔまたはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
結合部分の少なくとも１つのシーケンスは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:12からなる、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
結合部分は、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、またはSEQ ID NO:29からなる、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
構成要素の結合部分の解離定数よりも、およそ２０倍少ない解離定数を有する標識化されたヘテロ多量体化合物を、同定するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項９４】
標的は、受容体または受容体／リガンド複合体である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項９５】
結合部分は、受容体または受容体／リガンド複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項９４に記載の化合物。
【請求項９６】
上記標的は、血管新生に関与する受容体である、請求項９５に記載の化合物。
【請求項９７】
上記受容体は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体である、請求項９６に記載の化合物。
【請求項９８】
標的は、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体からなる、請求項９７に記載の化合物。
【請求項９９】
結合部分は、ＫＤＲまたはＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体上の異なったエピトープと結合する、請求項９８に記載の化合物。
【請求項１００】
上記標的は、過剰増殖に関与する受容体である、請求項９５に記載の化合物。
【請求項１０１】
上記標的は、腫瘍上に発現した受容体である、請求項９６または１００に記載の化合物。
【請求項１０２】
標的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体（ｃＭｅｔ）またはＨＧＦ／ｃＭｅｔ複合体からなる、請求項１００に記載の化合物。
【請求項１０３】
結合部分は、ポリペプチドからなる、請求項９５に記載の化合物。
【請求項１０４】
ポリペプチドは、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12で構成される群から選択された、請求項１０３に記載の化合物。
【請求項１０５】
ポリペプチドは、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5で構成される群から選択された、請求項１０３に記載の化合物。
【請求項１０６】
ポリペプチドは、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、およびSEQ ID NO:29で構成される群から選択された、請求項１０３に記載の化合物。
【請求項１０７】
同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも２つの結合部分からなる多量体化合物を合成する方法であって、該結合部分の少なくとも１つは、２本の側鎖の間にアミド結合を導入することにより形成された環状ポリペプチドからなる方法。
【請求項１０８】
同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも２つの結合部分からなる多量体化合物を合成する方法であって、該結合部分の少なくとも１つは、ポリペプチドと、セリン、トレオニンおよびホモセリンで構成された群から選択された１つ以上の糖化アミノ酸リンカーとからなる方法。
【請求項１０９】
Ｄ１、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ９、Ｄ１０、Ｄ１１、Ｄ１２、Ｄ１３、Ｄ１４、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、Ｄ１８，Ｄ１９、Ｄ２０、Ｄ２１、Ｄ２２、Ｄ２３、Ｄ２４、Ｄ２５、Ｄ２６およびＤ２７で構成される群から選択された、同じ標的上の異なった結合部位に対して特異性を有する、少なくともとも２つの結合部分からなる多量体を合成する方法であって、実施例９に記載のステップからなる方法。
【請求項１１０】
以下の構造式を有する二量体からなる、請求項３に記載の化合物。
2005519980.tif 000093
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は治療および診断用途の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長きにわたって研究者らは、動物（特にヒト）の特定の組織に対する検出標識または治療薬などの組成物を、標的とする特定の細胞に（受容体または他の方法を介して）結合する標的部分またはリガンドの能力を開発しようと試みてきた。こうした状況で、標的部分の標的に結合する能力（親和性、アビジティーおよび／または特異性）は、しかるべき組織を成功裏に標的とする能力に多大な影響を与える。
【０００３】
生体内（in vivo）における標的部分として天然（ポリクローナルなど）およびモノクローナル抗体を用いるため、多数の試みがなされてきた。しかし、こうした抗体を使用することは、それがヒト型に改変された抗体であっても、抗原性が許容不可能なレベルに達するなど、ある種の欠点も示す。また、天然の抗体は、多数の鎖、ジスルフィド結合および糖鎖形成を有するため、組換え型で生成するのが困難である。また天然の抗体は薬物動態学的問題も有する。抗体を画像検査および放射線治療に応用するには多大な問題がある。分子量が大きいため、血管外の標的組織への蓄積、および血管系からの除去にかかる時間がいずれも長いためである。この問題は、分子量の大きい血中化合物の侵入に、さらなる障壁を作る固形腫瘍を扱う場合に特に決定的となる。核磁気共鳴画像法（MRI）、超音波および光線などの他の方法を用いる画像検査に抗体を用いる場合にも、同様の問題が起こる。抗体を診断または治療用途の放射性核種で標識する場合、バックグラウンドに対する標識の比の低さが画像に現れる。また、腫瘍と正常な組織とのあいだに、望ましくない被ばく分布がが起こる。
【０００４】
こうした問題を解決するため、天然の抗体が結合する部位の主要な特性を活かして、同様の結合親和力を有するより小さな成分を構築するための努力がなされてきた。構築されるブロッキング抗体は、典型的に、1価の一本鎖のFvフラグメント（scFv）である。この種のフラグメントを、2価または多価の抗体特性を有するように結合させることには、問題があった。表面に接着させるためには、抗体上の2つの結合部位が、伸縮するヒンジ領域を介して定常領域と結合することが有利である。このため、抗体の結合性を模するためには、結合部位を再構成するだけではなく、2価性（またはそれ以上の力価）および伸縮性がなければならない。この伸縮性が必要なのは、scFVの非結合領域を構成するタンパク質の主要連鎖が、結合部位に比して依然として巨大であるためである。2つのscFvフラグメントを結合させるのに適切な方法が考案されれば、種々のscFvフラグメントを結合させることができるのみならず、天然の抗体に通常に存在する2つ以上のscFv部分を結合させることができる。ある種のscFvフラグメントは、VH／VL境界面およびリンカーの長さの如何によって、自然に二量体または多量体を形成することができる。こうしたいわゆる「ダイアボディー」は天然の抗体より小さく、Fc部分（補体を活性化し、かつ／またはFc受容体に結合する）がないため、その免疫学的特性をもたない。この2つ（またはそれ以上）の結合部位は互いに対して回転するため、抗原は正しい位置に結合してこの構造に適応する。
【０００５】
「ミニ抗体」もダイアボディーと同様の特性を有するが、5〜20の短いアミノ酸リンカーではなく、より伸縮性の高いリンカーをもち、天然の抗体と同じように結合部位が互いに自由な方向を向くことができる。ダイアボディーと同じく、ミニ抗体は分子量が低く、免疫学的に活性のFc二量体フラグメントを有さない。ミニ抗体は、また、細菌系で生成することができる。ミニ抗体は天然の抗体よりも利点を有するものの、やはり分子量が比較的大きく、薬物動態に影響があり、生物学的方法で作成しなければならない。最も分子量の小さいミニ抗体で120kDAである。
【０００６】
抗体の主要な欠点の一つ、すなわち抗体の分子量が大きければ、血管外の標的組織への蓄積および血液からの除去に時間がかかるという問題を解決するべく、二重特異性抗体（2つの異なる標的に結合する抗体）を作成する試みがなされてきた。この二重特異的方法は、「プレターゲティング」と呼ばれてきた。この方法は2段階のプロトコールを用いる。腫瘍関連抗原を認識するアームを少なくとも1本、診断薬または治療薬のエピトープを認識するアームを少なくとも1本有する二重特異性抗体を、初回の注射で投与する。未結合抗体が非標的組織を実質的に除去し、腫瘍内で最大量に達した後、より小さな二重特異性抗体を認識できる診断薬または治療薬を投与する。この診断薬または治療薬は、身体中に迅速に分布して、腫瘍に局在する二重特異性抗体と結合するか、腎臓を介して除去されることが望ましい。
【０００７】
この方法の代替として、アビジン／ビオチン系混合抗体を2段階で用いる試みがある。たとえば、標的抗体をアビジンまたはビオチンのいずれかと結合させて、注射し、治療対象の腫瘍部位を突き止める。その後、画像検査用または放射線療法用の放射性核種で標識したビオチンまたはアビジンのいずれか（標的抗体に結合させた方に対応するいずれか）を注射して、アビジンまたはビオチンとそれぞれ結合させることで最初の抗体の部位に集合させる。
【０００８】
放射薬理学的物質またはその他の診断用造影剤の標的部分として、抗体を用いるもう一つの方法は、2価のハプテンを用いて、循環中の抗体のアビジティーよりも細胞結合二重特異性抗体のアビジティーを高める試みである。この方法は、細胞の表面密度が十分に高いために、細胞結合抗体とともに生じ、濃度が低すぎる循環血液中の抗体とともには生じない、二座配位の結合を利用する。事実、この方法は、細胞上の抗体／抗原が密接になることに起因して、アビジティーが高まることを利用するものである。
【０００９】
ペプチドも標的部分として用いられてきた。アビジティーを高める試みにおいて、異なる標的を選択する2つ以上のペプチドをベースとした標的物質で、二重特異性ペプチド構成物が調製されてきた。たとえば、報告によれば、ソマトスタチン-、GRP-、CCK-、サブスタンスPまたはVIP受容体およびαvβ3インテグリンから選択した2つの標的物質に対応するリガンドを有するハイブリッドペプチドが作成されており、腫瘍細胞との結合能力が試験された。初回の評価では、検査された複合リガンド系において、腫瘍への取り込みに改善は認められなかった。試験担当者は、立体損傷によって、二量体構造の受容体親和性が低下したためと推論した。このほか、αvβ3インテグリンおよびソマトスタチン-2受容体の両方を標的としたRGD-DTPA-Octreotateハイブリッドペプチドが、上記の標的のいずれかを選択するプチドよりも、腫瘍への取り込みを増加させる能力を有するかどうかを確認した試験もある。標的、血管および腫瘍細胞のそれぞれに対する2つの標的部分の結合親和性の差は、より強力な（ソマトスタチンが仲介する）相互作用によって支配される腫瘍に対するアビジティーに帰結した。
【００１０】
上記の種々の方法は、同じ抗原の2つの異なるエピトープを標的とした二重特異性ダイアボディーを用いている。この方法は、標的に対する構成物のアビジティーを高めようとするものである。というのは、各エピトープに対する結合は1価であるが、各結合エピトープは同じ標的分子内に位置するため、全体としての構成物は標的に対して2価であるからである。標的が単一の分子である場合、scFvフラグメントは十分な親和性をもたないことが明らかになっており、アビジティーの増加が必要とされた。
【００１１】
上述の方法は、2つの理論的根拠に基づいている。第1の理論的根拠は、固形腫瘍への抗体送達に関連するいくつかの薬物動態学的問題を解決するため、2つの異なる標的部分を用いるというものである。第2の理論的根拠は、単一分子または腫瘍全体など、任意の標的に対する構成物のアビジティーを高めるため、2つの異なる標的部分を用いるというものである。しかし、上述した方法は、すべてさまざまな欠点を有する。このため、課題となる標的に対して親和性および／またはアビジティーの高い診断用または治療用の物質に対する需要は残っている。また、in vivoで哺乳動物に投与された場合に、許容できる薬物動態学的特性を有する診断用または治療用の物質に対する需要も残っている。
【００１２】
新たな血管の形成である血管新生は、胚の発達、正常な組織の成長および修復の期間に起こるだけでなく、女性の生殖周期、妊娠の確立および維持、創傷および骨折の修復にも関与する。正常な個人に起こる血管新生に加え、血管新生は腫瘍の増殖および転移、ならびに糖尿病性網膜症、乾癬および関節疾患などの血管増殖が促進される他の疾患をはじめとする多数の病理学的過程に関与する。血管新生は腫瘍が過形成性から腫瘍性に移行する場合に重要であるため、血管新生の阻害は癌治療研究で特に活発な分野となってきている。
【００１３】
腫瘍に起因する血管新生は、腫瘍細胞によるプロ-血管新生因子の生成によるものであり、これが、既存の血管を無症状かつ安定に保とうとするその他の力に打ち勝つため、と考えられる。こうしたプロ-血管新生因子のなかで最も性質がよく分かっているのは、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）（Cohenら、FASEBJ., 13:9-22 (1999)）である。VEGFは、低酸素症およびその他の刺激に反応して、様々なタイプの細胞により自然に産生される。多くの腫瘍も大量のVEGFを産生し、かつ／または、その近くに間質細胞を誘導してVEGFを産生させる（Fukumuraら、Cell, 94:715-725 (1998)）。VEGF-Aとも呼ばれるVEGFは、121、145、165、189および206個のアミノ酸の、5つの異なるスプライスのイソ型として合成される。特に腫瘍ではVEGF121およびVEGF165が産生される主要なイソ型である（上記のCohenら 1999を参照）。VEGF121は、VEGF遺伝子のエクソン6および7によりコード化される基本的ドメインを有さないため、VEGF165とは異なり、ヘパリンまたは細胞外マトリックスと結合しない。
【００１４】
VEGFファミリーは主としてチロシンキナーゼ受容体と結合することによって働く。一般にチロシンキナーゼ受容体は、1つ以上の特異的増殖因子と結合することのできる細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン（通常はαヘリックス）、細胞内膜直下（juxtamembrane）ドメイン（たとえばリン酸化によって受容体が調節される部位）、チロシンキナーゼドメイン（受容体の触媒成分）および、多くの受容体でチロシンキナーゼに対する基質の認識および結合に関与するカルボキシル基を末端に有する尾部、を有する糖タンパク質である。VEGFに結合することが知られている内皮細胞特異的チロシンキナーゼ受容体は3種類ある。VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDRまたはFlk-1）およびVEGFR-3（Flt4）である。Flt-1およびKDRは最も高い親和性を有するVEGF受容体として認識されている。Flt-1はVEGFに対してより高い親和性を有するのに対し、KDRは内皮細胞により大量に発現する（Bikfalviら、J. Cell. Physiol., 149:50-59 (1991)）。さらに、KDRは血管新生反応を制御するため、治療および診断上の効果がより期待されている（上記のCohenら 1999を参照）。KDRの発現が多大となるのは、新生血管内、とりわけ、強力な血管新生反応を誘発する腫瘍内である（Veikkolaら、Cancer Res., 60:203-212 (2000)）。KDRが血管新生に果たす重要な役割は、ホモ接合型KDRノックアウトマウスの胚において、血管の発育が全くみられないことで強調される結果となった（Folkmanら、Cancer Medicine、第5版（B.C.Decker Inc.; Ontario, Canada, 2000）pp.132-152）。
【００１５】
KDR（キナーゼドメイン領域）は成熟時には1336個のアミノ酸からなる。糖化したKDRは約205kDAの名目上の分子量で、SDS-PAGEゲルを泳動する。KDRは細胞外ドメインに7つの免疫グロブリン様ドメインを含有しており、最初の3つのドメインがVEGFとの結合に最も重要である（上記のCohenら 1999を参照）。VEGFそれ自体は、2つのKDR分子と同時に結合することのできるホモ二量体である。その結果、2つのKDR分子が結合によって二量体となり、自身をリン酸化し、はるかに活動的となる。キナーゼの活性が高まることにより、今度はVEGFのKDR特異的生物学的作用を仲介する信号経路が開く。
【００１６】
このように、血管新生に重要なのは、KDRの生体内（in vivo）におけるVEGF結合性だけでなく、内皮細胞におけるKDRの増加を検出する能力、あるいはVEGF／KDR結合複合体を検出する能力もまた、血管新生を検出または監視するうえできわめて利益をもたらす。悪性腫瘍の増殖を検出するなどといった診断への応用および、殺腫瘍性の薬剤または血管新生阻害剤を腫瘍部位に到達させるといった治療への応用は特に効果をもたらすと考えられる。
【００１７】
肝細胞増殖因子（分散因子として知られる）は、胚形成、創傷治癒および血管新生をはじめとする種々の生理学的過程に関与する多機能増殖因子である。HGFは高親和性受容体（cMet）との相互作用を通じて、腫瘍の増殖、侵襲および転移に関与することが明らかになっている。事実、cMetの無調整な発現（たとえば、正常な粘膜と比較して、結腸直腸アデノーマの新生表皮細胞、およびその他の悪性腫瘍におけて、cMetが過剰に発現するような場合）および／またはcMetの無調整な活動、ならびにHGFとの自己分泌刺激ループを介したcMet受容体の過剰活動は、種々の腫瘍組織で証明されており、これが特定の細胞系で発癌性形質転換を誘発する。
【００１８】
一般にHGFは、多くの表皮細胞の一部をなす間質細胞により産生される。ただし、腫瘍細胞自身によるHGFの産生は、特定の腫瘍の増殖へと至る主要な経路になると考えられている。HGF／cMet自己分泌刺激ループは、膠細胞種、骨肉腫、乳腺癌、前立腺癌、乳癌、肺癌およびその他の悪性腫瘍で検出されている。
【００１９】
HGFとcMet受容体の相互作用に干渉することで、動物モデルにおける腫瘍の増殖は遅延する。cMetの活性化を介して特定の癌細胞の増殖を刺激するのに加え、HGFは、過度の増殖性表現型に感染しやすい種々の細胞系（乳癌など）において、DNA損傷物質が誘発する細胞毒性を防ぐ。したがって、HGFがcMetと結合するのを防ぐことで、特定の癌細胞が特定の薬物の細胞毒性を受けやすくなるようにすることができる。
【００２０】
増殖性疾患に加え、cMetは血管新生にも関与している。たとえば、cMetを刺激すると血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が産生され、それによって血管新生が促進する。また、cMetを刺激すると創傷治癒が促進する。
【００２１】
cMet受容体を増殖性疾患、血管新生および創傷治癒に対する治療標的とするのに加え、潰瘍性組織およびそれに相当する正常組織における発現レベルの大きな差は、cMetが増殖性疾患に対する画像検査への応用において魅力的な標的であることを示している。
【００２２】
【特許文献１】U.S.S.N.第60／360,851号
【特許文献２】U.S.S.N.第60／440,441号
【特許文献３】WO第86／06605号
【特許文献４】WO第91／03200号
【特許文献５】WO第95／01187号
【特許文献６】WO第95／28179号
【特許文献７】WO第95／28967号
【特許文献８】WO第96／23526号
【特許文献９】WO第97／29783号
【特許文献１０】WO第97／36619号
【特許文献１１】WO第98／18495号
【特許文献１２】WO第98／18496号
【特許文献１３】WO第98／18497号
【特許文献１４】WO第98／18498号
【特許文献１５】WO第98／18501号
【特許文献１６】WO第98／53857号
【特許文献１７】PCT／US第98／01473号
【特許文献１８】PCT／US第98／20182号
【特許文献１９】米国特許第4,718,433号
【特許文献２０】米国特許第4,774,958号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、対象となる標的に結合する多価構成物、ならびに前記構成物の使用に関する種々の方法に関する。本発明では、同じ標的内の異なる結合部位に結合する小さな標的部分を用いて、対象となる標的への集中化を向上し、標的部位の検出、造影および／または治療の方法を向上させる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本明細書は、同一の標的内の異なる結合部位に特異的な、2つ以上の標的部分を含む多価（二量体または多量体）の標的構成物（たとえば結合ポリペプチド）の調製および使用に関して記載する。こうした標的構成物は、検出可能な標識および／または治療薬剤（本明細書に規定）と結合するか抱合体を形成し、その検出可能な標識および／または治療薬剤を対象の標的部位に送達するのに用いられる。このように、標的構成物それ自体に加えて、本発明は診断用の画像検査および種々の病態の治療に有用な診断用途の造影剤および治療薬剤を含む。さらに、本発明は、疾患の治療に、本発明の標的構成物それ自体を使用することを含む。
【００２５】
１つの観点において、本発明は、複数の結合部分を有し、少なくとも2つの結合部分が、同一標的内の異なる結合部位に対して特異性を有する化合物に関する。好ましい実施形態において、多数の結合部分は、ポリペプチドを含む。他の好ましい実施形態において、標的部分はすべて、対象となる標的の異なる部位に結合する結合ポリペプチドである。特定の好ましい実施形態において、この標的はタンパク質、受容体または受容体／リガンド複合体であり、結合ポリペプチドはこのタンパク質、受容体または受容体／リガンド複合体の異なるエピトープに結合する。ある実施形態において、標的は血管新生、増殖性疾患または創傷治癒に関与する受容体である。また別の実施形態において、標的は、タンパク質チロシンキナーゼ受容体をはじめとする、受容体ファミリーを含む。特に好ましい実施形態において、標的はKDRまたはKDR／VEGF複合体であり、結合部分、特に結合ペプチドは、KDRまたはKDR／VEGF複合体の異なるエピトープに結合する。
【００２６】
また別の好ましい実施形態において、標的は肝細胞増殖因子（HGF）受容体（cMet）またはHGF／cMet複合体であり、結合部分（特に結合ポリペプチド）はcMetまたはHGF／cMet複合体の異なるエピトープに結合する。
【００２７】
さらに好ましい実施形態において、本発明の化合物の標的に対する親和定数は、標的に対する構成要素ポリペプチドの親和定数を上回る。
【００２８】
また別の観点において、本発明の化合物は標識基または治療薬剤を含む。特定の実施形態において、本発明の化合物は結合部分と標識基のリンカーを含む。たとえば、このリンカーは置換アルキル基鎖、非置換アルキル基鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子またはこれらの組み合わせを含むことができる。好ましい標識基は、放射性核種、常磁性金属イオン、超音波造影剤および／または光標識物質を含む。たとえば、本発明の化合物に用いるのに好ましい常磁性金属イオンは、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Gd3+、Eu3+、Dy3+、Pr3+、Cr3+、Co3+、Fe3+、Ti3+、Tb3+、Nd3+、Sm3+、Ho3+、Er3+、Pa4+およびEu2+を含む。
【００２９】
放射性核種も好ましい検出標識および治療薬剤である。放射性核種の選択は、目標とする治療または診断用途に基づいて決定される。検出標識が常磁性金属または放射線核種である好ましい実施形態において、本発明の化合物はキレート剤またはキレート化群を含む。好ましいキレート剤は、DTPA、DOTA、DO3A、EDTA、TETA、EHPG、HBED、NOTA、DOTMA、TETMA、PDTA、TTHA、LICAMまたはMECAMを含む。PET剤として用いるには、ペプチドを51Mn、52Fe、60Cu、68Ga、72As、94mTcまたは110Inなどの種々のポジトロン放出金属イオンの一つと複合体を形成させることができる。ヘテロ多量体構成物も、18F、124I、125I、131I、123I、77Brおよび76Brなどの放射性核種を用いるハロゲン化によって標識することができる。シンチグラフィまたは放射線療法に好ましい金属放射性核種は、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Auおよび199Auを含む。金属またはハロゲンの選択は、所望される治療または診断用途に基づいて決定される。たとえば、診断目的に好ましい放射性核種は、64Cu、67Ga、68Ga、99mTcおよび111Inである。治療目的に好ましい放射性核種は、64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186／188Reおよび199Auである。本発明の化合物に用いるのに最も好ましいキレート剤は1-置換4,7,10-トリカルボキシメチル1,4,7,10テトラアザシクロドデカン三酢酸（DO3A）である。好ましくは、177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをはじめとする放射性ランタニドが、DOTAまたはDO3Aとともに、本発明の化合物に用いられる。
【００３０】
本発明の化合物は、以下の構造を有するキレート剤を含む。
【００３１】
2005519980.tif 000003
式中、XはCH2またはOである。
【００３２】
Yは、C1-C10分岐性または非分岐性アルキル基、C1-C10分岐性または非分岐性ヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基、もしくはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシポリアルコキシアルキル基からなるC1-C10分岐性または非分岐性アルキル、アリール、アリロキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルまたはアラルキル基である。Jは、C（＝O）-、OC（＝O）-、SO2-、NC（＝O）-、NC（＝S）-、N（Y）、NC（＝NCH3）-、NC（＝NH）-、N＝N-、合成または天然アミノ酸に由来するホモポリアミドまたはヘテロポリアミンである。nは1〜100である。最も好ましくは、この化合物は99mTc、186Reまたは188Reをさらに含む。
【００３３】
ある実施形態において、本発明の化合物は以下の構造を有するキレート剤を含む。
【００３４】
2005519980.tif 000004
最も好ましくは、この化合物は99mTc、186Reまたは188Reをさらに含む。
【００３５】
また別の実施形態において、キレート剤は以下の構造を有する化合物を含む。
【００３６】
2005519980.tif 000005
最も好ましくは、この化合物は99mTcをさらに含む。
【００３７】
他の実施形態において、本発明の化合物は以下の構造を有するキレート剤を含む。
【００３８】
2005519980.tif 000006
式中、RはCH3などのアルキル基である。最も好ましくは、この化合物は177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをさらに含む。
【００３９】
また別の実施形態において、本発明の化合物は以下の構造を有するキレート剤を含む。
【００４０】
2005519980.tif 000007
式中、RはCH3などのアルキル基である。最も好ましくは、この化合物は177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをさらに含む。
【００４１】
その他の実施形態において、本発明の化合物は以下の構造を有するキレート剤を含む。
【００４２】
2005519980.tif 000008
最も好ましくは、この化合物は177Lu、90Y、153Sm、111Inまたは166Hoをさらに含む。
【００４３】
本発明の化合物での使用に好ましい超音波造影剤は、フッ素化ガスからなるリン脂質安定マイクロバブルまたはマイクロバルーンを含む。
【００４４】
本発明のある好ましい実施形態は、標的の異なる結合部位に対して特異性を有する、2つ以上の結合部分からなる化合物を含む。好ましくは、標的は、単一の受容体または受容体／リガンド複合体（たとえば、KDRまたはKDR／VEGF複合体、またはcMet／VEGF複合体のcMetなど）である。さらに好ましい実施形態において、結合部分は、受容体または受容体／リガンド複合体の種々のエピトープに結合する。特に好ましい実施形態において、この結合部分は、ポリペプチドを含む。その他の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。また本発明は、1つ以上のアミノ酸置換、アミド結合置換、D-アミノ酸置換、糖化アミノ酸、ジスルフィド模倣置換、アミノ酸転座を含めるために修飾されるか、レトロペプチド、ペプトイド、レトロ-インヴェルソ・ペプトイドおよび／または合成ペプチドを含めるために修飾された、上述のアミノ酸配列を１個以上有する化合物を提供する。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:26および／またはSEQ ID NO:27を含む。より好ましい実施形態において、こうした化合物はさらに本明細書に記載の標識基または治療薬剤を含む。
【００４５】
また別の観点において、本発明は標識基を含む本発明の化合物を用いた診断目的の画像検査法に関する。本発明の方法は、標識基を有する本発明の化合物を含む薬物製剤を患者に投与し、患者への投与後にその化合物を画像化するというステップを含む。好ましい実施形態において、画像化ステップは核磁気共鳴画像法、超音波画像法、光学的画像法、音ルミネセンス画像法、光音響画像法または放射性画像法を含む。これらの方法において、投与ステップは吸引、経皮吸収、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、動脈内注射または非経口投与を含む。
【００４６】
また別の観点において、本発明の化合物は、それ自体で治療薬剤として役立ち、かつ／または治療薬剤を含む。特定の実施形態において、本発明の化合物は、結合部分と治療薬剤とのリンカーを含む。たとえば、このリンカーは置換アルキル基鎖、非置換アルキル基鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸またはペプチドスペーサー、糖、脂肪族スペーサー、芳香族スペーサー、脂質分子またはこれらの組み合わせを含むことができる。本発明の化合物に使用するのに好ましい治療薬剤は、生体活性剤、細胞毒性剤、薬物、化学療法剤または放射線治療剤を含む。
【００４７】
また別の観点において、本発明は、本発明の化合物を含む治療薬剤を患者に投与することによる疾患の治療法に関する。１つの実施形態において、化合物の1つ以上の結合部分は、疾病に寄与する生理学的過程を阻害するので、疾患状態を治療するために、化合物を投与することができる。たとえば、この結合部分は、受容体の活性を（たとえば、受容体に対する天然のリガンドとの競争により、または、天然のリガンドが結合するかどうかに関係なく受容体の活性を直接的に阻害することにより、あるいは、この2つを組み合わせることにより）抑制または低減することで、生理学的過程を阻害する。このように、本発明のヘテロ多量体化合物は、KDRまたはcMetなどの活性を阻害し、そのことによって血管新生および／または増殖を阻害し、結果としてこれらの過程が寄与する疾患を阻害する。したがって、本発明は、本発明の化合物を、単独で、または個々の治療薬剤に付着または結合させて、患者に投与することによる疾患の治療法に関する。好ましい実施形態において、本発明は、血管新生または過剰増殖に起因する疾患の治療法に関する。最も好ましい実施形態において、この疾患は新生物性腫瘍の増殖である。
【００４８】
本発明は、結合親和性の高いヘテロ多量体化合物のスクリーニング法にも関する。この方法は、複数の結合部分を含む標識されたヘテロ多量体化合物を作り出すステップ（ここにおいて、2つ以上の結合部分が、1つの標的内の異なる結合部位に結合する）、標識されたヘテロ多量体化合物を標的と接触させるステップ、標識されたヘテロ多量体化合物の結合強度を測定する（たとえば解離定数を測定するなど）ステップ、標識されたヘテロ多量体化合物の結合強度（解離定数）と1つ以上の個々の結合部分の結合強度（解離定数）とを比較するステップを含む。この方法の好ましい実施形態において、結合部分の1つはポリペプチドを含む。また別の好ましい実施形態において、標的はKDRまたはKDR／VEGF複合体である。好ましい実施形態において、本発明に使用するポリペプチドの1つはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:12である。好ましくは、この方法は、構成結合部分の結合強度よりも、低い結合強度を有する標識されたヘテロ多量体化合物を認定（たとえば、解離定数により測定）するステップを含む。。
【００４９】
ある好ましい実施形態において、本発明は、KDRまたはVEGF／KDR複合体の異なる結合部位と結合する、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドを2つ以上含む二量体または多量体の標的構成物に関する。こうしたポリペプチドに関しては、U.S.S.N.第60／360,851号およびU.S.S.N.第60／440,441号に詳細な記述があるが、これらの記載事項はすべて、本明細書に参照として組み込まれる。また、同時係属中の「KDR and VEGF／KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy」と題するU.S.S.N.第      号は、本願と同日に出願されたが、その内容もすべて、参照として本明細書に組みまれる。これらの構成物を本明細書では「KDR標的構成物」と呼ぶ。このKDR標的構成物は、単量体KDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドと比して、ならびに単一KDR結合ポリペプチドの二量体または多量体の構成物に比して、KDRへの高い結合力を示す（特異性および／または親和性および／またはアビジティーが高い）。これらの好ましい化合物は、検出可能な部分と結合または抱合することができ、これらの組成物を用いてKDRを発現する細胞を標的とすることにより、KDRを発現する組織の造影が可能となる。
【００５０】
また別の好ましい実施形態において、本発明は、cMetまたはHGF／cMet複合体の異なる結合部位と結合する、2つ以上のcMetまたはHGF／cMet複合体結合ポリペプチドを含む二量体または多量体標的構成物に関する。こうしたポリペプチドに関しては、同時係属中の「Peptides that specifically bind HGF receptor (cMet) and uses thereof」と題するU.S.S.N.第    号に詳細な記述があり、これは本願と同日に出願されたものであるが、その内容はすべて、参照として本明細書に組み込まれる。これらの構成物を本明細書では「cMet標的構成物」と呼ぶ。このcMet標的構成物は、単量体cMetまたはHGF／cMet複合体結合ポリペプチドと比して、ならびに単一cMet結合ポリペプチドの二量体または多量体の構成物に比して、cMetへの高い結合力を示す（特異性および／または親和性および／またはアビジティーが高い）。
【００５１】
本発明のcMetおよびKDR標的構成物は、治療薬剤と結合または抱合することができ、この治療薬剤をcMetまたはKDRを発現する組織に集中させるために、用いることができる。代替的に、あるいは追加的に、本発明のcMetおよびKDR標的構成物それ自体をは、本明細書に記載するように、治療薬として用いることもできる。
【００５２】
特に好ましい実施形態において、本発明のKDR標的構成物は、下記のKDRおよびVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドを2つ以上含む：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:12。
【００５３】
その他の好ましい実施形態において、本発明のcMet標的構成物は、下記の結合ポリペプチドを2つ以上含む：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28および／またはSEQ ID NO:29。
【００５４】
また別の実施形態において、本発明は、KDR標的構成物の標的への結合能力をスクリーニングする新しい方法を提供し、これにより、構成ポリペプチドの結合力に比して高い結合力を有する、KDR結合ポリペプチドの多量体構成物を認定（たとえば、解離定数により特定）する。また、本発明の方法によれば、多量体の標的構成物がin vivoの血清存在下でも安定であるかどうかの、迅速な判定が可能となる。
【００５５】
2つ以上のKDRまたはKDR／VEGF結合ポリペプチドからなる構成物は、対応する単量体の結合ポリペプチドに比して、標的分子への高い結合力を示す。たとえば、下記の実施例6に示すとおり、本発明が提供するKDR結合ポリペプチドの四量体構成物は、KDRをトランスフェクトした293H細胞に対して高い結合力を示す。単一分子の構成物中で2つ以上の結合ポリペプチドを組み合わせると、単量体の結合ポリペプチドに比して、KDの減少が示すように、構成物のアビジティー向上する。
【００５６】
また、本明細書に記載の通り、KDRおよび／またはKDR／VEGFの異なるエピトープに特異的な、2つ以上の結合ポリペプチドからなる構成物（いわゆる「ヘテロメリック」構成物）が作成された。本明細書で提供される２つ以上の結合ポリペプチドからなる構成物は、KDRまたはVEGF／KDR上の複数の部位をブロックすることが期待される。このヘテロメリック構成物は、対応する単量体、ならびに同じ結合ポリペプチドの複数のコピーからなる四量体構成物よりも、優れた結合能力を示す。さらに、異なるエピトープに特異的な2つ以上の結合ペプチドからなるヘテロメリック構成物は、KDRをトランスフェクトした293H細胞と効率的に結合することができた。このように、異なるエピトープを認識する2つ以上の結合ポリペプチドを含めることにより、KDの減少が示すように、標的分子への構成物のアビジティーをさら高めることができる。
【００５７】
本明細書に記載の結合ポリペプチドのヘテロメリック構成物は、チロシンキナーゼ受容体の機能に対する高い阻害性を示す。本明細書に記載の実験に基づけば、KDRおよび／またはKDR／VEGFの異なるエピトープに特異的な、2つ以上の結合ポリペプチドを含む本発明の二量体または多量体の構成物は、チロシンキナーゼ受容体の機能を阻害することが期待される。特に、こうした構成物はVEGFR-2／KDR、VEGFR-1／Flt-1およびVEGFR-3／Flt-4の機能を阻害することが期待される。また、cMetおよび／またはcMet／HGFの異なるエピトープに特異的な2つ以上の結合部分を含む本発明のヘテロ多量体構成物は、チロシンキナーゼ受容体の機能および特にcMetの機能を阻害することが期待される。
【００５８】
本発明の目的において、チロシンキナーゼ受容体の機能は、受容体のオリゴマー化、受容体のリン酸化、受容体のキナーゼ活性、下流のシグナル分子の動員、細胞増殖の遺伝子誘導の誘発、細胞遊走の促進またはこれらの組み合わせのうちのいずれか1つを含むことができる。たとえば、本明細書に記載の結合ポリペプチドのヘテロメリック構成物は、ヒト内皮細胞においてVEGFが誘発するKDR受容体の不活化を阻害することが、KDR受容体のVEGFによるリン酸化の阻害によって明らかになっている。また、本明細書に記載の結合ペプチドからなるヘテロメリック構成物は、VEGFが促進する内皮細胞遊走を阻害する。本明細書に記載の通り、単一の結合構成物でKDRの2つ以上の異なるエピトープをターゲティングすると、受容体の機能を阻害する能力が著明に高まる。受容体活性の遮断能力が弱い結合ペプチドでも、VEGFが誘発する受容体の機能を遮断する能力に優れたヘテロメリック構成物を生成するのに用いることができる。
【００５９】
また、本明細書にさらに記載するように、cMetの異なるエピトープに特異的な2つ以上の結合ポリペプチドを含む構成物が作成された。本明細書に記載の2つ以上のcMet結合ポリペプチドを含む構成物は、cMetの複数の部位をブロックすることが期待される。こうしたヘテロメリックcMet標的構成物は、これに対応する単量体に比して、優れた結合能力を示す。
【００６０】
したがって、本発明は2つ以上の結合ポリペプチドからなる構成物に関する。本発明の多量体構成物は2つ以上の結合ポリペプチドを含み、構成物中の少なくとも2つの結合ポリペプチドは、KDRおよび／またはKDR／VEGF、cMetおよび／またはcMet／HGFをはじめとする標的の異なるエピトープに特異的である。これらの構成物は本明細書で「ヘテロメリック構成物」「ヘテロ多量体」および／または「ヘテロ多量体構成物」とも呼ぶ。本発明の構成物は、無関連のペプチドまたは対照ペプチドも含むことができる。構成物は2つ以上、3つ以上または4つ以上の結合ポリペプチドを含むことができる。本明細書に記載の教訓によれば、当該分野の通常の専門家は、本明細書に記載の結合ポリペプチドを組み合わせて多量体構成物にすることができ、標的分子への結合能力またはチロシンキナーゼ受容体の阻害能力といった優れた特性を有する多量体構成物を選択することができる。こうした優れた特性を有する多量体構成物は本発明に含まれる。さらに、本明細書に記載の方法および教訓は、種々の異なる標的（KDRおよびcMetなど）への結合力を高め、本発明を幅広く応用できることが明らかになっている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、同一標的内の異なる結合部位に結合する、2つ以上の結合部分を有する化合物は、標的に結合するのにおいて、予期しない著明に高い能力を有するという発見に一部基づくものである。好ましくは、この標的は、受容体または受容体／リガンド複合体である。本発明の化合物（本明細書では、「多価標的構成物」、「ヘテロ二量体」、「ヘテロ四量体」、「ヘテロ多量体」および／または「ヘテロ多量体構成物」と呼ぶ）の標的と結合する優れた能力は、個々の、構成要素である結合部分の標的と結合する能力を比較することによって明らかになると考えられる。たとえば、本発明のヘテロ多量体の結合強度は、その単量体の一つの結合強度と比較することができる。好ましくは、本発明のヘテロ多量体は、（たとえば解離定数によって特定した場合）個々の構成要素である単量体に比して、高い親和性を示す。
【００６２】
定義
本明細書で使用する用語「遺伝子組換え」は、人工的に変化または操作した核酸、外来性の核酸をトランスフェクトした宿主細胞または単離DNAおよび宿主細胞の形質転換の操作によって人工的に発現したポリペプチドを記述するのに用いる。遺伝子組換えは、特に遺伝子工学技術を用いてin vitroで構成したDNA分子を指し、用語「遺伝子組換えの」は特に自然に発生した分子、構成物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除く、分子、構成物、ベクター、トランスフェクトされた細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記述する形容詞として用いる。
【００６３】
用語「バクテリオファージ」は、DNAのコアおよび多数の異なるタンパク質分子が凝集してできた保護シェルを含む細菌性ウイルスと定義される。用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は本明細書では同義に用いられる。
【００６４】
用語「ポリペプチド」は、主鎖（側鎖と反対）を通じてペプチドアミド結合(C(:O)NH-)によって結合した、２つ以上のアミノ酸からなる化合物を指すのに用いる。本明細書で用語「ペプチド」は「ポリペプチド」と同義であるが、一般にアミノ酸40個未満、好ましくは25個未満からなるポリペプチドを指すのに用いる。
【００６５】
用語「結合」は、本明細書に記載するものも含めた標準的分析による定義であり、結合ポリペプチドが任意の標的を認識し、可逆的に結合することを指す。こうした標準的分析は、平衡透析法、ゲル濾過、および結合による分光学的変化の監視を含むが、これに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用する用語「結合ポリペプチド」は、別の分子と複合体を形成することのできるあらゆるポリペプチドを指す。「結合ポリペプチド」の定義には、本明細書に開示のように修飾または至適化されたポリペプチドも含まれる。こうした修飾の特殊な例については以下で検討するが、母体のポリペプチド配列のアミノ酸を、特性を至適化したり、酵素切断部位を除去するために、置換することなどが含まれる。また、結合ポリペプチドを検出可能な造影標識またはその他の基質と結合させる目的で、例を挙げればポリヒスチジンの「尾部」を追加して精製を助けるためのC-またはN末端アミノ酸の置換または伸長、短縮、アミド結合の変化、移動、レトロペプチド、ペプトイド、レトロペプトイド、N末端またはC末端の修飾またはポリグリシンまたはポリリジン断片などのリンカー、ヒドラジド(-NH-NH2)基またはC末端リンカー-Gly-Gly-Gly-Lysをはじめとする基を含めて、本発明による結合ペプチドを堅固な支持体に固定するか蛍光染色剤の付着、薬物動態に影響を及ぼす修飾、構造学的特性を保持するための構造の修飾、水溶性を高めるか調製を容易にするための塩の生成などを含む。本明細書にさらに記載する検出可能な標識に加えて、結合ポリペプチドは、放射線療法剤、細胞毒性剤、抗腫瘍剤または酵素、リポソーム（治療薬、超音波に適切なガスまたはその両方を負荷）と結合または抱合させることができる。また、本発明の結合ポリペプチドは、ウェル、プレート、ビーズ、チューブ、スライド、フィルターまたは皿といった堅固な支持体に付着または結合させることができる。さらに、1つ以上の結合ポリペプチドの二量体または多量体を形成することができる。こうした構成物は、たとえば標的への高いアビジティーを示す。こうした修飾ポリペプチドはすべて、標的と結合する能力を保持しているかぎり「結合ポリペプチド」とみなされる。
【００６７】
本明細書に記載の結合ポリペプチドの「同族体」は、本明細書に記載のまたは当該業者に既知の、改善または至適化技術よって生成することができる。こうした同族体ポリペプチドは、アミノ酸の置換、追加、欠失、またはその他のこうした修飾が、標的への結合能力を失わせないかぎりにおいて、本発明の適応範囲に入り、かつ「結合ポリペプチド」の定義に当てはまることが理解されよう。本明細書に用いる用語「同族体」は、2つのポリマー（ポリペプチド分子または核酸分子など）間の配列の類似性の程度を指す。同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基または実質的に同じ特性を有するアミノ酸残基（保存的な置換）が、比較対象となる2つのポリマーにおいて1つの配列位置を占めた場合、これらのポリマーは、その位置において同族体である。たとえば、2つのポリペプチド配列において、100個のアミノ酸のうち60のアミノ酸残基が合致するか同族体である場合、この2つの配列は60%同族体である。本明細書で用いる同族性率の数字は、その2つのポリマー間で可能な最大の同族性、すなわち、2つのポリマーを、その合致（同族体の）位置が最大数になるように整列した場合の、同族性率を反映するものである。本発明の適応範囲に当てはまるポリペプチド同族体は、本明細書に開示した結合配列の少なくとも1つと、70%以上、望ましくは80%以上同族体である。
【００６８】
「KDR結合ポリペプチド」は、in vitroまたはin vivoにおいて、血管内皮細胞増殖因子受容体-2（またはKDR、Flk-1）と複合体を形成する結合ポリペプチドである。
【００６９】
「VEGF／KDR複合体結合ポリペプチド」は、in vitroまたはin vivoにおいて、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）およびKDRの間で形成される結合複合体、とりわけ、ホモ二量体VEGFと1つまたは2つのKDR分子の複合体（これは血管新生中に内皮細胞の表面に形成されると考えられる）と、複合体を形成する結合ペプチドである。KDRおよびVEGF／KDR結合ポリペプチドの特殊な例は、本明細書の記載の、および参照として本明細書に全内容がが組み込まれているU.S.S.N.第60／360,851号およびU.S.S.N.第60／440,441号、ならびに同時係属中の「KDR and VEGF／KDR binding peptides and their use in diagnosis and therapy」と題するU.S.S.N第      号に記載のペプチドを含むが、これに限定されるわけではなく、これらのペプチドならびにその同族体を組み込んだ、ハイブリッドおよびキメラポリペプチドを含む。
【００７０】
「cMet結合ポリペプチド」は、in vitroまたはin vivoにおいて、HGF受容体であるcMetと複合体を形成する結合ポリペプチドである。
【００７１】
「cMet／HGF複合体ポリペプチド」は、in vitroまたはin vivoにおいて、肝細胞増殖因子（HGF）およびcMetとの間で形成される結合複合体と、複合体を形成する結合ポリペプチドである。cMetおよびcMet／HGF結合ポリペプチドの特殊な例は、本明細書および同時係属出願の「Peptides that Specifically Bind HGF Receptor (cMet) and Uses Thereof」と題するU.S.S.N第      号に記載のペプチドを含むがこれに限定されず、これらのペプチドならびにその同族体を組み込んだ、ハイブリッドおよびキメラポリペプチドを含む。
【００７２】
本明細書で用いる「標識基」または「検出可能標識」は、核磁気共鳴造影法、放射性画像法、超音波画像法、X線画像法、光線画像法などの診断用画像法のための信号を生成することのできる基または部分であるか、放射線療法またはその他の療法に用いることのできる、放射性金属またはその他の物質の部分を、運搬することのできる基または部分である。
【００７３】
用語「特異性」は、他の標的よりも、ある標的に対する結合親和性の高い結合ポリペプチドを指す。結合特異性は、2つの被験標的物質に対する解離平衡定数（KD）または結合平衡定数（Ka）で表される。好ましい実施形態において、本発明の結合ポリペプチドは、目標とする標的に対する解離定数が約10μM未満であり、より好ましくは約1μM未満であり、最も好ましくは約0.5μM未満である。
【００７４】
用語「KDR特異性」は、無関係の標的に比して、KDRへの親和性が高いKDR結合部分を指す。用語「VEGF／KDR特異性」は無関係の標的に比して、VEGF／KDR複合体への親和性が高いVEGF／KDR結合部分を指す。好ましい実施形態において、本発明によるヘテロ多量体は、KDRまたはVEGF／KDR複合体に特異的であり、好ましくは解離定数が約10μM未満であり、より好ましくは約1μM未満であり、最も好ましくは約0.5μM未満である。用語「cMet特異性」は、無関係の標的に比して、cMetへの親和性が高いcMet結合部分を指す。用語「cMet／HGF特異性」は、無関係の標的に比して、cMet／HGF複合体への親和性が高いcMet／HGF結合部分を指す。好ましい実施形態において、本発明によるヘテロ多量体はcMetまたはcMet／HGF複合体に特異的であり、好ましくは解離定数が約10μM未満であり、より好ましくは約1μM未満であり、最も好ましくは約0.5μM未満である。
【００７５】
本明細書で用いる用語「患者」は、あらゆる哺乳類、特にヒトを指す。
【００７６】
用語「製剤学的に許容できる」担体または調剤は、本発明の化合物とともに患者に投与することができ、薬理学的活性を破壊することのない非毒性の担体または調剤を指す。
【００７７】
用語「標的」または「標的分子」は、タンパク質またはポリペプチド、細胞、受容体、炭水化物、脂質など、結合部分または結合ポリペプチドが結合することのできるあらゆる物質を指す。
【００７８】
本明細書で用いる「標的」は、タンパク質-チロシンキナーゼ受容体をはじめとする受容体ファミリーも含む。
【００７９】
用語「治療薬」または「治療の」は、in vivoにおいて効果、治療作用または細胞毒性作用を有する化合物または物質を指す。治療薬は、生物活性剤、細胞毒性剤、薬物、化学療法剤、放射線療法剤、遺伝物質をはじめとする組成物を含む。
【００８０】
本明細書では、以下の略号を頻繁に使用する。9-フロオレニルメチルオキシカルボニル（fmocまたはFmoc）、1-ヒドロキシベノゾトリアゾール（HOBt）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC)、酢酸無水物（Ac2O）、(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘックス-1-イリデン)-3-メチルブチル（ivDde）、トリフルオロ酢酸（TFA）、試薬B（TFA:H2O:フェノール:トリイソプロピルシレン, 88:5:5:2）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-yl)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HBTU）、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-yl)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HATU）、N-ヒドロキシスクシニミド（NHS）、固相ペプチド合成（SPPS）、ジメチルスルフォキシド（DMSO）、ジクロロメタン（DCM）、ジメチルホルムアミド（DMF）およびN-メチルピロリジノン（NMP）。
【００８１】
本発明の二量体および多量体標的構成物
本発明の標的構成物は、単一の標的内の異なる結合部位に結合する2つ以上の結合部分を含む。この結合部分は、同一標的の異なる部位に特異的である。これらは、ペプチド、ペプチド模倣物などであってよく、本明細書に記載の結合ポリペプチドを含むことができる。また、結合部分は小さな結合分子を含む。好ましい実施形態において、結合部分は結合ポリペプチドからなる。こうした標的構成物は、定義において二量体または多量体であり、「多価標的構成物」、「ヘテロ二量体」、「ヘテロ多量体」または「ヘテロマー」と呼ぶことができる。こうした二量体または多量体構成物は、単量体構成物に比して優れた結合能力を示す。構成物が結合ポリペプチドからなる場合、これらポリペプチドの配列は、そのNまたはC末端、または適切に位置したリジン部分のN-エプシロン窒素（または、オキシアミノ付属基などの選択的に誘導体を形成することのできる基、または他の求核基をもつその他の基）で結合するか、1つまたはそれ以上のリンカーを介し、適切な結合化学物質を利用して互いに結合する。この結合化学物質は、アミド、尿素、チオ尿素、オキシムまたはアミノアセチルアミド（クロロまたはブロモアセトアミド誘導体由来）を含むことができるが、これに限定されない。
【００８２】
本発明による好ましい二量体は、最初のペプチドを分岐基、最初のスペーサー、リンカー、第2のスペーサー、最後に第2の結合ペプチドに結合させることによって構築することができる。この二量体の結合スキームは、以下の一般構造式によって表すことができる。
【００８３】
A−B−C−D−E−F
【００８４】
式中、AおよびFは同一の標的の異なる部位に結合する2つの異なる結合ペプチドであり、Bは分岐基、CおよびEはスペーサー、Dはリンカーである。好適なスペーサーおよびリンカーは当該業者に既知のものであり、下記の実施例にも記載されている。種々の実施形態において、C、Dおよび／またはEは任意に不在であってもよい。A受容体成分または類似の基を、分岐基を介して二量体に任意に結合させてもよい。これらの構成要素の正確な配置は、たとえばペプチドがC末端からC末端に結合しているのか、N末端からC末端に結合しているのか、N末端からN末端に結合しているのかによって、きわめて異なってくる。これらの種々の結合スキームの例を図36に示す。
【００８５】
2つの異なる結合ペプチド（または特殊なペプチドの2つの分子）をもつ二量体および標識基の作成は、本明細書に記載の方法、ならびに当該業者に既知の他の方法によって実現することができる。たとえば、完全に保護された結合ペプチドは、自動または手動のFmocペプチド合成手順書を用いて、Ellman型Safety catch樹脂をもとに構築することができる。本明細書の参照に全文を組み入れたBackes, B.J.,ら, J.Am.Chem. Soc.(1996), 118 (12), 3055-6を参照されたい。これとは別に、当該業者に既知のペプチド合成の標準的方法を用いて（たとえば本明細書の参照に全文を組み入れたFields, G.B.ら「Principles and Practice of Solid Phase Synthesis」Synthetic Peptides, A Users Guide, Grant, G.A. ed., W.H.Freeman Co. NY.1992, Chap.3 pp 77-183を参照）、ジリジン誘導体を2-クロロトリチル樹脂をもとに構築することができる。本明細書の参照に全文を組み入れたBarlos, K. and Gatos, D.「Convergent Peptide Synthesis」Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D. eds, Oxford University Press, New York, 2000, Chap 9: pp 215-228を参照されたい。側鎖保護基を除去することなく2-クロロトリチル樹脂からこの誘導体を取り出し、カルボキシル基を活性化させ、アミン基を導入した標識基と結合させることにより、ジリジン誘導体（その保護末端窒素原子は暴かれ、２つの遊離アミノ基を提供する）を得る。上述のSafety Catch樹脂を活性化させ、N末端保護基を外した標識基アミン基ジリジン誘導体を、この活性化したSafety-Catch樹脂に加える。この末端アミノ基は、Safety Catch樹脂結合ペプチド（今は、樹脂およびジリジン構造全体から分離している）のカルボキシル末端によって、アシル化される。Safety Catch樹脂結合ペプチドの過剰分は、ジリジン構成物のアミノ基を完全に反応させるのに用いることができる。このスキームでは、反応パートナーの比率を至適化することにより、収率を至適化することができる。結合ペプチド上の保護基は、トリフルオロ酢酸による分裂プロトコルを用いて除去する。
【００８６】
たとえば、1つの構成物に2つ以上の結合ペプチドが存在する二量体および多量体構成物の合成は容易に達成できる。上述のジリジン誘導体の末端窒素原子を識別するには、直交的保護（Orthogonal protection）スキーム（1個の窒素上のアリロキシカルボニル基およびもう1個の窒素上のFmoc基またはもう1個の窒素上でFmoc基をiV-Dde保護基とともに使用するなど）を用いることができる。アミノ基の1つを露出させ、その結果できた産物を上述の活性化したSafety-Catch樹脂結合ペプチドと反応させることにより、単一の結合ペプチドが付着したジリジン構成物を得る。第2の保護基を除去すると、残った窒素が露出する。本明細書の参照に全文を組み入れたMellor, S.L.ら「Synthesis of Modified Peptides」Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Chan, W.C. and White, P.D. eds, Oxford University Press, New York, 2000, Chap 6: pp 169-176を参照されたい。結果得られた産物を、異なる結合ペプチドをもつ第2のSafety Catch樹脂と反応させて、完全に保護されたヘテロ二量体構成物を得て、トリフルオロ酢酸で保護基を除去して、目的の物質を得る。
【００８７】
あるいは、自動または手動のペプチド結合法、通常はFmocペプチド合成手順書を用いて、結合ペプチドを最初にRink-amide樹脂と組み合わせる。このペプチドは、リンカーまたはリンカー標識基構成物でアミン基をトランスフェクトしたC末端またはN末端を有してよく、このリンカー標識基構成物はたとえばリジン成分のNε-アミノ基などの求核的な基をもう1つ有してよい。保護基の除去は、ペプチドの性状に応じたしかるべき修飾物質とともにトリフルオロ酢酸を用いることで達成することができる。次に、完全に保護基を外されたペプチドを、グルタル酸bis-N-ヒドロキシスクシニミドエステル（Tyger Scientific Inc., 324 Stokes Avenue, Ewing, NJ, 08638で市販）などの大量の2基作用性求電子物質と反応させる。次に、結果得られるモノアミド化したグルタル酸のモノ-N-ヒドロキシスクシニミジルエステルを同じペプチドの等価物または異なる結合ペプチドの等価物で処理する。結果得られた物質をHPLCにより精製することにより、目的の好適な標識基をもつホモまたはヘテロ二量体構成物が得られる。
【００８８】
また異なる方法において、上述の好適な標識基をもつ二量体またはそれ以上の多量体構成物を調製するのに、単位スキームを用いることができる。簡単に説明すると、fmoc-リジン（iV-Dde）Rink-amide樹脂をピペリジンで処理して、fmoc成分を除去する。次にビオチン、5-カルボキシフルオレセインまたはN,N-ジメチル-Gly-Ser(O-t-Bu)-Cys(Acm)-Gly-OHなどの標識基を窒素原子と結合させる。次に、この樹脂をヒドラジンで処理して、iV-Dde基を除去する。丁寧に洗浄した後、この樹脂を塩化シアヌルおよびDMF、NMPまたはジクロロメタンなどの好適な溶媒に溶解したジイソプロピルエチルアミンなどのヒンダード塩基で処理して、樹脂に結合した1基作用性のジクロロトリアジンを得る。次に、残った塩素原子を結合ペプチドの2つの等価物または結合ペプチドの等価物1つのいずれか、続いて第2の結合ペプチドで連続的に置換して、樹脂結合へテロまたはホモ二量体標識基でアミノ基をトランスフェクトした構成物を得る。Falorni, M.,ら、Tetrahedron Lett. (1998), 39(41), 7607-7610；Johnson, C.R.,ら、Tetrahedron (1998), 54(16), 4097-4106；Stankova M and Lebl, M., Mol. Diversity (1996), 2(1／2), 75-80を参照されたい。
【００８９】
必要に応じて、トランスフェクトするペプチドは状況に応じて保護または保護基を外してよい。保護基の除去は、上述のトリフルオロ酢酸を主成分とした保護基除去試薬で可能になる。目的の物質を高速液体クロマトグラフィーで単離する。
【００９０】
これらの方法すべてにおいて、リジン誘導体、オルニチンまたは2,3-ジアミノプロピオン酸を順番に用いることにより、多量体の多数性が高まることが知られている。関連のより堅固な、保護または直交的に保護された窒素原子を必要数もつ分子を用いて、足場物質として働かせる、結合ペプチド間の距離を種々に変える、および構成物の堅固性を高める（互いおよびレポーターに対する結合ペプチドの運動および相対的位置を制限することによって）ことは、本明細書に記載の合成法の適応範囲に完全に当てはまるものである。
【００９１】
結合ポリペプチドの直接的な合成は、固相ペプチド合成、液相合成をはじめとする従来の方法で達成できる。固相合成がより望ましい。本明細書に参照として組み込まれたStewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W.H.Freeman Co., San Francisco；Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154 (1963)；Bodanszky and Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York 1984)を参照されたい。本発明のポリペプチドはペプチド合成をサービスとして行う企業から購入することができる（BACHEM Bioscience Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MAなど）。Perkin-Elmer Applied Biosystems社が製造しているような自動ペプチド合成装置を入手することもできる。
【００９２】
ポリペプチド化合物はいったん単離または合成したら、化学的技術または遺伝子組換えのいずれかで精製するのが望ましい。精製には、C4-、C8-またはC18-シリカなどのアルキル化シリカカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）をはじめとして、使用できる標準的手法が数多くある。一般には、増加する有機含有物の勾配移動相が精製に用いられる。たとえば、通常少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液に対するアセトニトリルなどである。イオン交換クロマトグラフィーも、ペプチドをその負荷によって分離するのに用いることができる。ポリペプチドの純度は、HPLCカラムにおける主要なピーク値の同定をはじめとする種々の方法で測定することができる。HPLCにおいてインプット材料の95%以上の単一のピーク値を示すポリペプチドが望ましい。HPLCカラムのインプット材料の97%以上、98%以上、99%以上、さらには99.5%以上の単一ピーク値を示すポリペプチドはさらに望ましい。
【００９３】
上述の技術のいずれかを用いて得たペプチドが、本発明の組成物に用いるのに望ましいペプチドであることを確認するために、ペプチド組成物の分析を行うことができる。こうした組成物分析は、ペプチドの分子量を測定するための高分解質量分析器を用いて実施することができる。あるいは、ペプチドのアミノ酸含有量を、ペプチドを水性酸で加水分解し、分離、同定して、HPLCで混合物の構成要素を定量することによって、あるいはアミノ酸分析機で確認することができる。ペプチドを経時的に分解し、順番にアミノ酸を同定するタンパク質配列決定装置を用いて、ペプチドの配列を確認することもできる。
【００９４】
たとえば、結合ポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードし、それを遺伝子組換え的に発現させるといった、核酸（ポリヌクレオチド）を用いる遺伝子組換えDNA技術によって生成することもできる。これは、たとえば外来性核酸分子を既知の方法でトランスフェクトすることで宿主細胞を操作して、これらの細胞に目的の結合ポリペプチドを生成させるという方法で行う。こうした方法は当該業界の可能性の範囲内にあるものである（本明細書に全文が組み込まれているDavisら、Basic Method in Molecular Biology、(1986)を参照されたい）。本明細書に記載のような短鎖のポリペプチドを遺伝子組換えによって生成するのは、直接的な合成方法よりも実用性に欠けるが、遺伝子組換えによる生成は、本発明の結合部分がハイブリッドポリペプチドまたは融合タンパク質に組み込まれている場合は、きわめて有益になることがある。
【００９５】
本発明のある実施形態において、ヘテロ多量体または構成要素である結合部分の標的に対する、他のタンパク質または標的と相対的にみた場合の親和性の測定は、有用な方法であり、その標的に対する親和性と呼ばれる。結合部分の定量および親和性の測定のための従来の測定法には、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過または結合部分とその標的との相互作用による多数の分光的変化（蛍光偏光の変化など）の監視が含まれる。こうした技術またはその改良方法は、リガンド（またはタンパク質）の濃度に比例する結合および遊離リガンドの濃度を測定するものである。結合へテロ多量体またはポリペプチドの濃度（[Bound]）は下記の公式に記載の通り、遊離ヘテロ多量体またはポリペプチド（[Free]）の濃度およびポリペプチドの結合部位、すなわちKDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはcMet／HGF複合体（N）の濃度に比例する。
【００９６】
2005519980.tif 000009
データをこの公式に当てはめることで、結合親和性の定量的測定値である結合定数Kaが得られる。結合定数Kaは解離定数KDの逆数である。親和性の測定ではKDの方が頻繁に用いられる。好ましい実施形態において、本発明のヘテロ多量体および構成要素である結合ポリペプチドは、標的すなわちKDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはcMet／HGFと結合し、その標的に対するKDは1ナノモル（nM）〜100マイクロモル（μM）、好ましくは50μM未満、好ましくは1μM未満、さらに好ましくは50μM未満、最も好ましくは10μM未満である。
【００９７】
ヘテロ多量体を造影剤として用いる場合、このほかの結合親和性の側面がより重要となる。たとえば、こうした造影剤は力学系において、造影剤の標的（活性化した内皮細胞のKDRまたはVEGF／KDR複合体など）との結合が画像検査期間を通じて常に安定な平衡状態にないように働く。たとえば、造影剤を最初に注射すると、造影剤の濃度および造影剤-標的複合体の濃度は迅速に上昇する。しかし、注射直後から、循環血液中の（遊離）造影剤は、腎または肝を通して排出されはじめ、造影剤の血中濃度は急激に低下しはじめる。この血中の遊離造影剤の濃度の急激な低下は、時として造影剤-標的複合体の解離を招く。ある造影剤の有用性は、造影剤-標的の解離速度と、造影剤の排出速度との差に左右される。理想的には解離速度が排出速度よりも緩徐であり、造影剤-標的複合体が高濃度で、血中の遊離造影剤（バックグラウンド信号）が低濃度である造影時間が長くとれるのがよい。
【００９８】
本発明のようなヘテロ多量体結合化合物の利点は、これらが一般にその構成要素である単量体に比してきわめて緩徐な解離速度を有することにある（Tissotら、J. Immunol. Methods 236(1-2): 147-165 (2000)を参照）。また、標的分子の2つの異なるエピトープに同時に結合できるヘテロ多量体化合物は、細胞表面の標的分子間の距離に関係なく、多量体としての結合が可能である。これに対し、ホモ多量体結合化合物では、ホモ多量体がその間の距離をまたぐだけ近くに2つ以上の標的分子が隣接していなければならない。このように、本発明のヘテロ多量体結合化合物は、量に乏しく、したがって細胞表面における互いの距離が長い受容体およびその他の細胞表面分子に結合するのに際立って好適である。
【００９９】
解離速度の定量的測定は、光ファイバー蛍光定量法（たとえばAndersonとMiller、Clin. Chem., 34(7): 1417-21 (1998)を参照）、表面プラズモン共鳴法（Malmborgら、J. Immunol. Methods, 198(1): 51-7 (1996)およびSchuck、Current Opinion in Biotechnology, 8:498-502 (1997)を参照）、共振ミラーおよび回折格子結合型平面導波路（grating coupled planar waveguiding）（たとえばHutchinson、Molec. Biotechnology, 3:47-54 (1995)を参照）をはじめとする、当該業者に既知のいくつかの手法を用いて容易に実施することができる。結合動態を測定するには、次の自動バイオセンサーを購入することができる：BIAcore surface plasmon resonance sensor（Biacore AB, Uppsala SE）、IAsys resonant mirror sensor（Fisons Applied Sensor Technology, Cambridge GB）、BIOS-1 grated coupled planar waveguiding sensor（Artificial Sensor Instruments, Zurich CH）。
【０１００】
結合ポリペプチドの修飾または至適化
ヘテロ多量体の修飾または至適化は本発明の適応範囲内にある。特に、修飾または至適化したヘテロ多量体は「ヘテロ多量体」の定義に含まれる。同様に、修飾または至適化した結合ポリペプチドは「結合ポリペプチド」の定義に含まれ、文節「KDRおよびVEGF／KDR複合体結合ポリペプチド」には修飾または至適化したKDRおよびVEGF／KDR結合ポリペプチドが含まれ、文節「cMetおよびcMet／HGF複合体結合ポリペプチド」には修飾または至適化したcMetおよびcMet／HGF結合ポリペプチドが含まれる。特に、本発明のヘテロ多量体に使用するポリペプチド配列は、その力価、薬物動態学的挙動、安定性および／または他の生物学的、物理学的および化学的特性を修飾または至適化することができる。
【０１０１】
アミノ酸残基の置換
同じ分類に属するアミノ酸の置換方法（たとえば1つの塩基性アミノ酸を別のものと置換する方法）は、当該業界において既知である。たとえば、ポリペプチド親配列において以下の空間的配置が同じおよび／またはごくわずかなアミノ酸置換によって、結果得られたポリペプチドが上述の特性を同等またはそれ以上に有することを期待することができる。
【０１０２】
アルキル置換疎水性アミノ酸の置換：アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、S-2-アミノ酪酸、S-シクロヘキシルアラニンまたはその他の単純αアミノ酸を、分岐、環状および直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル置換基をはじめとする1〜10個の炭素からの脂肪族側鎖で置換する。
【０１０３】
芳香族置換疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、1-ナフチルアラニン、2-ナフチルアラニン、2-ベンゾチエニルアラニン、3-ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモまたはイオド）またはアルコキシ（C1-C4）-前述の芳香族アミノ酸の置換型。例を挙げれば、2-,3-,または4-アミノフェニルアラニン、2-,3-,または4-クロロフェニルアラニン、2-,3-,または4-メチルフェニルアラニン、2-,3-,または4-メトキシフェニルアラニン、5-アミノ-、5-クロロ-、5-メチル-または5-メトキシトリプトファン、2'-,3'-または4'-アミノ-、2'-,3'-または4'-クロロ、2-,3-,または4-ビフェニルアラニン、2'-,3'-または4'-メチル-2-,3-または4-ビフェニルアラニンおよび2-または3-ピリジルアラニン。
【０１０４】
塩基性官能基を含有するアミノ酸の置換：置換基がヘテロ原子（α窒素または遠位窒素または窒素など）上にあるか、たとえばプロR位置にあるα炭素上にあるかによって、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルチニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、アルキル、アルケニルまたは前記のアミノ酸のアリール置換型（C1-C10分岐、直鎖または環状）誘導体。例として挙げられる化合物は次のものである。N-エプシロン-イソプロピル-リジン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-グリシン、3-(4-テトラヒドロピリジル)-アラニン、N,N-γ、γ'-ジエチル-ホモアルギニン。また、アルキル基がα炭素のプロR位置を占有している場合は、αメチルアルギニン、αメチル2,3-ジアミノプロピオン酸、αメチルヒスチジン、αメチルオルニチンといった化合物も挙げられる。また、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（そのヘテロ芳香族が1個以上の窒素、酸素または硫黄原子を単一または組み合わせで有している場合）、カルボキシル酸または塩酸、活性エステル、活性アゾリドおよび関連誘導体といった多くの既知の活性化誘導体およびリジン、オルニチンまたは2,3-ジアミノプロピオン酸も挙げられる。
【０１０５】
酸性アミノ酸の置換：アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、アルキル、アリール、アラルキルおよび2,3-ジアミノプロピオン酸のヘテロアリールスルホンアミド、オルニチンまたはリジンおよびテトラゾール置換型アルキルアミノ酸。
【０１０６】
側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミンおよびアルキルまたはアスパラギンまたはグルタミンの芳香族置換誘導体。
【０１０７】
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：セリン、セレオニン、ホモセリン、2,3-ジアミノプロピオン酸およびアルキルまたはセリンまたはセレオニンの芳香族置換誘導体。
【０１０８】
上記のカテゴリーに属するアミノ酸はすべて、同族の別のアミノ酸と置換することができることも知られている。
【０１０９】
アミド結合の置換
本発明の適応範囲に入るもう一つの置換は、結合ポリペプチドの骨格内のアミド結合の置換である。たとえば、生物活性を低減または消失させてしまう望ましくないタンパク質分解または血清安定性を低減するその他の分解経路を低減または除去するため、あるいは構造の屈曲性を制限または高めるため、既存の構造を模倣するか、望ましい方法で構造を変化させる官能基を有するペプチドの骨組み内のアミド結合を置換することはよく行われる。こうした変更により、結合親和性が高まるか、薬物動態学的挙動が向上する。ペプチド合成に関与する当該業界においては、こうした知識により下記の2つのアミノ酸を結合させるアミド結合を少しでも変化させて、結果得られるペプチドが同じまたはより高い活性を得られるようにできることが知られている：α-N-メチルアミドまたはペプチドアミド骨格チオアミドを挿入する、カルボニル基を除去して同族の第２級アミンを生成する、あるアミノ酸をアザアミノ酸と置換して、セミカルバゾン誘導体を生成する、E-オレフィンおよび置換型E-オレフィンをアミド結合の代替物として使用する。
【０１１０】
D-アミノ酸の導入
本発明の適応範囲内のまた別の方法は、D-アラニンまたはその他のD-アミノ酸を、不安定なペプチド結合の遠位または近位に導入することである。D-アミノ酸の側鎖の置換が置換されるL-アミノ酸のそれに比してわずかではない場合に、こうしたD-アミノ酸の置換は時に行わなければならないものである。これは、キラリティーの差つまり側鎖の方向の差が原因であり、その結果、置換されたL-アミノ酸の側鎖が有していたのとは異なる負荷、疎水性、立体化学的要件をもつ成分を有する標的の結合部位において、当初は明らかにされていなかった領域に到達することができる。
【０１１１】
薬物動態学的または薬力学的特性を向上させるための変更
本発明のヘテロ多量体構成物を特殊な方法で応用する場合、ペプチドまたはペプチドの調剤を変更して薬物動態学的および薬力学的挙動を向上させる必要が生じることがあることも知られている。ペプチドの特性は望ましい物理的または化学的特性をもたらすのに前提条件となる成分の付着によって変化することが期待される。ヘテロ多量体が結合ポリペプチドを含む場合、こうした薬物動態学的および薬力学的挙動を変化させる成分は、酸またはアミンを用いて、それぞれアミド結合または尿素結合を介して、ペプチドのNまたはC末端、または好適に位置したリジンまたはリジン誘導体、ジアミノプロピオン酸、オルニチンまたは末端アミノ基または末端アルコキシアミノ基またはヒドラジン基を有するペプチド内のその他のアミノ酸の末端アミノ基に付着させることによって、ペプチドに追加してよい。トランスフェクトする成分は、対象ペプチドおよびその特性の変更に求められる実際の要件に応じて、疎水性、塩基性または非極性のアルキルまたは芳香族であってよい。
【０１１２】
アミノ酸残基の糖化
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、結合部分またはリンカー成分のいずれかまたはその両方を、単一または組み合わせて、糖化したアミノ酸残基（セリン、セレオニンまたはアスパラギン残基など）を用いることである。従来の方法を用いて実施することのできる糖化は、可溶性を高め、薬物動態および薬力学を変化させ、グリコシド成分が関与する特異的または非特異的相互作用を介して結合力を高めるために用いることができる。また別の方法では、O-(2-アセタミド-2-デオキシ-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)セリンまたは類似のトレオニン誘導体（DまたはL-アミノ酸のいずれか）などの糖化アミノ酸を、手動または自動固相ペプチド合成中、または手動または自動液相ペプチド合成中に、ペプチドに組み込んでよい。同様に、D-またはL-Nγ-(2-アセタミド-2-デオキシ-3,4,6-トリ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-アスパラギンを用いることができる。末端の酸素、窒素または硫黄基上で、糖化に用いることのできる好適に官能基化し活性化させた炭水化物成分で糖化したアミノ酸を使用するのが望ましい。こうした炭水化物基は単糖類、二糖類またはそれ以上のオリゴ糖の組み合わせであることができる（Kihlberg, Jan. (2000) Glycopeptide synthesis. In: Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach (Chan, W.C. and White, P.D. Eds) Oxford University Press, New York, NY Chap.8, pp195-213）。
【０１１３】
また望ましいのは、アノマー炭素上の脱離基の活性化による糖化以外の手段で炭水化物基をアミノ酸に付着させることである。アミノ酸をグリコシドに結合させることは、炭水化物基のアノマー炭素への結合の形成に制限されない。それどころか、炭水化物成分のアミノ酸への結合は、いかなる好適な十分に活性を有する酸素原子、窒素原子、炭素原子またはその他の炭水化物基の末端元素によって、当該業界で既知のC-ヘテロ原子、C-Cまたはヘテロ原子-ヘテロ原子（S-S、O-N、N-N、P-O、P-N）結合方法を用いることによって達成することができる。
【０１１４】
塩の生成
水溶性またはこうしたペプチドの調製のしやすさを高めることのできる種々の塩を生成することも、本発明の適応範囲内にある。これらはN-メチルグルカミン（メグルミン）、酢酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩などを含むがこれらに限定されない。
【０１１５】
構造的特性を残した構造的変更
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、環状ポリペプチドの短縮である。本発明による多くのポリペプチドの環状形態では、特に環状の範囲内ではペプチド配列が利用できる立体配座のスペースが制限される。このため、N末端またはC末端領域のいずれかで環の遠位または場合によっては近位の1個以上の残基によってペプチドを短縮することで、短縮したペプチドに同等あるいはより高い生物学的活性をもたせることができる。結合活性の役割を担うある特定のアミノ酸配列、場合によっては3個ほどの小さなアミノ酸配列が、RGDペプチドで明らかにされているように、同定されている。たとえばE.F.Plowら、Blood(1987), 70(1), 110-5; A. Oldbergら、Journal of Biological Chemistry (1988), 263(36), 19433-19436; R. Taubら、Journal of Biological Chemistry (1989 Jun.5), 264(1), 259-65;A. Andrieuxら、Journal of Biological Chemistry (1989 Jun.5), 264(16), 9258-65;および本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許番号第5,773,412号および第5,759,996号を参照されたい。
【０１１６】
また、大きなペプチド環は実質的に短縮され、外来のアミノ酸が除去されるが、重要な結合のための残基は実質的に残ることが文献で明らかにされている。本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許番号第5,556,939号を参照されたい。短縮した環状ペプチドは、好適に位置したカルボキシル酸基およびアミノ基のジスルフィド結合またはアミド結合を用いて生成することができる。
【０１１７】
さらに、D-アミノ酸をペプチド配列に追加して、（グリシンの場合は特に）回転特性を安定化することができる。また別の方法において、いくつかを下記の構造式1、2および3に示したα、β、γまたはδジペプチドまたは回転模倣物（α、β、γまたはδ回転模倣物）を用いて、構造的モチーフおよびペプチドの回転特性を模倣し、同時にタンパク質分解から安定性を守り、構造的安定性および可溶性などをはじめとする他の特性を高めることができる（構造式1：Hartら、J. Org. Chem., 64, 2998-2999 (1999)；構造式2：Hanessianら、"Synthesis of a Versatile Peptidomimetic Scaffold" in Methods in Molecular Medicine, Vol.23: Peptidomimetics Protocols, W.M. Kazmierski Ed. (Humana Press Inc. Totowa N.J. 1999), Chapter 10, pp.161-174；構造式3：WO第01／16135号）。
【０１１８】
2005519980.tif 000010
ジスルフィド模倣物の置換
本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、本発明による結合ポリペプチド内のジスルフィド結合を模したジスルフィド模倣物の置換である。ジスルフィドを含有するペプチドをヘテロ多量体構成物の生成に用いる場合、ジスルフィド結合を置換して、ジスルフィド結合の存在によって時に起こる特定の問題を避けることが必要になる場合がある。ヘテロ多量体の99mTc（または他の放射性核種）を主成分とする放射線治療剤または特定の他のヘテロ多量体構成物を生成する場合、ジスルフィド結合の存在が重大な問題になることがある。ジスルフィド結合の完全性は、過テクネチウム酸イオンの還元およびそれに続く還元されたTc種のTcに適応したキレート基をもつ配列への組み込みに頼った経路を介して、99mTcを組み込むべく設計された手順では、維持するのが困難である。これは、ジスルフィド結合が放射線治療剤のワンステップ調製のためのキットに通常用いられている還元剤によって、容易に還元されてしまうのが原因である。このため、ジスルフィド結合がTcキレート化中に還元されてしまう容易性のために、ジスルフィド結合の模倣物で置換する必要が生じることがある。したがって、本発明の適応範囲内のまた別の変更方法は、本明細書に開示の方法または当該業界で既知の方法を用いて、本発明で用いる結合ポリペプチドの活性およびその他の望ましい特性は維持したまま、模倣物でジスルフィド成分を置換することである。
【０１１９】
1）オキシムリンカー
多数の状況で研究者によってオキシム成分はリンカーとして用いられてきた。最も興味深い研究は、Wahl, F and Mutter, M, Tetrahedron Lett. (1996) 37, 6861-6864)である。アミノアルコール基を含有するアミノ酸（4）およびアルコキシアミノ基を含有するアミノ酸（5）を、ペプチド鎖に組み込むが、これは必ずしもペプチド鎖の末端でなくてもよい。ペプチドを生成した後、側鎖の保護基を除去する。アルデヒド基を露出させ、オキシム結合を形成する。
【０１２０】
2005519980.tif 000011
2）ランチオニンリンカー
ランチオニンは環状硫化物であり、そのなかでジスルフィド結合（S-S）が（C-S）結合に取って代わられたものである。このため、還元に対する不安定性がはるかに低く、この結合は塩化第一錫に対して安定である。ランチオニンは多数の方法で調製することができる。
【０１２１】
ブロモアセチル化ペプチドを用いたランチオニンの調製
ランチオニンは既知の方法で容易に調製することができる。たとえば、Robeyら（Robey, F.A. and Fields, R.L. Anal Biochem. (1989) 177, 373-377）およびInmanら（Inman, J.K.; Highet, P.F.; Kolodny, N.; and Robey, F.A. Bioconjugate Chem. (1991) 2, 458-463; Ploinsky, A. Cooney, M.C. Toy-Palmer, A. Osapay, G. and Goodman, M.J.Med. Chem. (1992)35, 4185-4194; Mayer, J.P.; Zhang, J.; and Liu, C.F. in: Tam, J.P. and Kaumaya, P.T.P. (eds), "Peptides, Frontiers of Peptide Science", Proceedings of the 15th American Peptide Symposium, June 14-19 Nashville, Tenn. Klumer Academic Pub. Boston. pp291-292; Wakao, Norihiro; Hino, Yoichi; Ishikawa, Ryuichi. Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1995), 7 pp. JP 07300452 A2 19951114 Heisei; JP 95-49692 19950309; JP 94-41458 19940311がこの分野では発表されている。Boc自動ペプチド合成機を用いてペプチドを調製し、その後ペプチド末端をブロモ酢酸と結合させることで、優れた収率でブロモアセチル化ペプチドを得ることができる。ペプチドの分解および保護基の除去は、HF／アニソールを用いて行うことができる。ペプチドがシステイン基を含んでいる場合、その活性は低pHで制御することができる。媒質のpHが6〜7まで上昇すると、ペプチドの重合または環化が起こる。重合は高濃度（100mg／mL）で促進するのに対し、環化は低濃度（1mg／mL）で促進する。下記の図1で、6が環化して7になる場合を例示する。
【０１２２】
2005519980.tif 000012
Inmanらは、Nα-(Boc)-Nε-[N-(ブロモアセチル)-β-アラニル]-L-リジンをブロモアセチル基の担体としてBocペプチド合成に用いることができ、それによって配列内のどの位置でもブロモアセチルを有する成分を配置することができることを示した。予備的実験において、彼らは4〜6個のアミノ酸からなるペプチドが、システインからブロモアセチル-リジン誘導体を分離し、環化しやすいことを明らかにし、この方法の潜在的有用性を示した。
【０１２３】
アクリルアミドへのシステインチオールの追加を介したランチオニンの調製
この方法にはいくつかのやり方がある。樹脂結合セリンを用いて、臭素化法-デヒドロ臭素化法-チオール追加配列法またはジスクシニミジルカルボネートで分解した後チオールを追加する方法のいずれかで、樹脂上にランチオニン環を調製する。Ploinskyら、M.J.Med.Chem., 35:4185-4194 (1992); Mayerら、"Peptides, Frontiers of Peptide Science" in Proceedings of the 15th American Peptide Sympsium, Tam & Kaumaya (eds), June 14-19, 1995, Nashville, Tenn. (Klumer Academic Pub. Boston) pp.291-292。アクリルアミドにチオールを抱合体として追加できることも多数の文献によって明らかにされており、2-メルカプトエタノールをアクリルアミドに追加する場合の参照も記載する。Wakaoら、Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JP 07300452 A2 (1995)。
【０１２４】
3）ジアリールエーテルまたはジアリールアミン結合
アリールボロン酸およびチロシンの分子内環化によるジアリールエーテル結合
アリールボロン酸とフェノール、アミンおよびヘテロ環状アミンを酢酸銅の存在下、空気中、室温で、ジクロロメタン中で、塩基としてピリジンまたはトリエチルアミンのいずれかを用いて反応させると、非対称なジアリールエーテルおよび関連のアミンが優れた収率（98%）で得られることが報告されている。Evansら、Tetrahedron Lett., 39:2937-2940 (1998); Chanら、Tetrahedron Lett., 39:2933-2936 (1998); Lamら、Tetrahedron Lett., 39:2941-2944 (1998)を参照されたい。フェノールとしてNで保護されたチロシン誘導体を用いる場合も収率は98%と高い。これは、アミノ酸アミド（ペプチド）が成分置換に対して安定であり、高収率が期待できることを示している。ペプチドからラクタムへの分子内環化の容易性、SNAr反応に基づく分子内バイアリールエーテルの生成、高希釈率または樹脂における分子内環化反応の一般性（この場合は偽希釈作用が高希釈率の状況を模倣する）の観点からは、分子内反応の先例が存在する。
【０１２５】
4）分子内の本来の化学結合を介するラクタム結合を用いた環状ペプチドの生成
2005519980.tif 000013
用いることのできるまた別の方法は、ビシナルアミノメルカプタン基（通常はたとえばシステインを直線配列の末端に配置することによって得られるか、リジンの側鎖窒素を介して配列につながる）およびアルデヒド基を好適に配置して分子内環化を起こし、チアゾリジンを得て、主鎖の残基で形成された一つの環およびチアゾリジン環を有する二環式ペプチドを形成するものである。上記の図2はその例を示したものである。望ましいアルデヒド基は、リジン成分の側鎖アミノ基の末端に付着することで鎖につながった保護基のないセリンとして存在することのできる、好適に配置されたビシナルアミノアルコール基を過ヨウ素酸ナトリウムで分解することによって生成することができる。場合によっては、望ましいアルデヒド基は、鎖のC末端またはN末端で保護基のあるアルデヒド誘導体を露出することによって生成することができる。この方法の例はBotti, P.; Pallin, T.D. and Tam, J.P. J.Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10018-10034にみることができる。
【０１２６】
5）末端アミノ基と樹脂上のカルボキシル基の分子内環化に基づくラクタム
大環状ペプチドは、頭部から尾部または末端基の環化によるラクタム生成によって調製することができる。基本的な方法は、完全に保護され、アミン保護基およびカルボキシ保護基を選択的に除去することが可能なペプチドを調製することである。直交的保護スキームが作成されている。作成されているスキームのうちでも、アリル、トリチルおよびDde法が最もよく使用されている。Mellorら、"Synthesis of Modified Peptides" in Fmoc Solid Phase Synthesis: A Practical Approach, White and Chan (eds) ([Oxford University Press,, New York, 2000]), Chapt.6, pp.169-178を参照されたい。Dde法は、カルボキシル酸基（Dmabエステル）およびアミノ基（Dde基）の両方に対して類似した保護基を用いることから、最も有益である。いずれの保護基もDMF中で室温にて2〜10%ヒドラジンで除去する。あるいは、Dde法はアミノ基に対して用いることができ、アリル基をカルボキシル基に用いることができる。
【０１２７】
従来のペプチド結合試薬（HATU、PyBOPなど）を介する分子内結合によって得られるラクタム基は、ジスルフィド結合の代替物として働くことができた。Dde／Dmab法を下記の図3aに示す。
【０１２８】
2005519980.tif 000014
このように、たとえばDdeで保護されたリジンおよびDmabエステルを含有する直線の配列は、低濃度（0.1〜0.2mmol／g未満）でTentagelを主成分とするRinkアミド樹脂上で調製することができる。両方の保護基をヒドラジンで除去した後、樹脂上で環化して目的の産物を得る。
【０１２９】
2005519980.tif 000015
図3bに示すアリルを用いる方法では、環化の対象となる末端カルボキシル基はアリルエステルとして保護され、末端アミノ基はalloc基として保護される。DMF中のN-メチルモルフォリンおよび酢酸の存在下で、パラジウムトリ-トリフェニルホスフィンによる処理によって、いずれも選択的に樹脂上で露出する。残留したパラジウム塩は、DMF中のDIEA存在下にてジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムで除去した後、DMFで洗浄する。次に、N-メチルモルフォリンの存在下でラクタム環をHATU／HOAtを用いて生成する。上述のように他の結合剤を使用することができる。続いて上述のようにペプチド処理を行い、目的のペプチドラクタムを得る。
【０１３０】
続いて樹脂からの切断および精製を行ってよい。ペプチドN末端を官能基化するため、trans-4-(iV-Dde)メチルアミノシクロヘキサンカルボキシル酸、trans-4-(iV-Dde)メチルアミノ安息香酸などのアミノ酸またはそのallocな類似体を使用することもできることが知られている。また別の方法は、樹脂からの切断中に分子内でラクタムを生成するsafety catch法を用いるものである。
【０１３１】
6）オレフィン複分解に基づく環状ペプチド
Grubbs反応（下記の図4）は、オレフィン結合の複分解／環化に関与するもので、下図に示す。Schusterら、Angewandte. Chem. Int. Edn Engl., 36:2036-2056 (1997); Millerら、J.Am.Chem.Soc., 118:9606-9614 (1996)を参照されたい。
【０１３２】
2005519980.tif 000016
開始材料がジオレフィン（16）である場合、結果生成される産物は環状化合物（17）であることは容易に分かる。事実、この反応はオレフィンで官能基化したペプチドによる環の生成に応用されてきた。Pernerstorferら、Chem. Commun., 20:1949-50 (1997); Covalent capture and stabilization of cylindrical beta-sheet peptide assemblies, Clarkら、Chem.Eur.J., 5(2):782-792 (1999); Highly efficient synthesis of covalently cross-linked peptide helices by ring-closing metathesis, Blackwellら、Angew.Chem., Int. Ed., 37(23):3281-3284 (1998); Synthesis of novel cyclic protease inhibitors using Grubbs olefin metathesis, Ripkaら、Med.Chem.Lett., 8(4):357-360 (1998); Application of Ring-Closing Metathesis to the Synthesis of Rigidified Amino Acids and Peptides, Millerら、J.Am.Chem.Soc., 118(40):9606-9614 (1996); Supramolecular Design by Covalent Capture, Design of a Peptide Cylinder via Hydrogen-Bond-Promoted Intermolecular Olefin Metathsis, Clarkら、J.Am.Chem.Soc., 117(49):12364-12365 (1995); Synthesis of Conformationally Restricted Amino Acids and Peptides Employing Olefin Metathesis, Millerら、J.Am.Chem.Soc., 117(21):5855-5856 (1995)を参照されたい。C末端をアリル化したアミノ酸または可能であればN末端をアリル化したアミノ酸のいずれかを調製することができ、それらをこの反応に使用して、ジスルフィド結合を含有するペプチドの代替としてカルバミルで架橋した（carba-bridged）環状ペプチドを調製することができる。
【０１３３】
また、オレフィン基を用いて新たな化合物を調製することもできる。オレフィンを含有する鎖でチロシンヒドロキシルを官能基化することも一つの方法である。たとえば、リジンε-アミノ基もオレフィン含有単位をアシル化成分の一部として付着させるまた別の方法である。その代わりに、オレフィンを含有する鎖でリジン側鎖アミノ基をアルキル化する場合でも、これもレポーターの付着点として機能することができる。リジン、オルニチンまたはジアミノプロピオン側鎖アミノ基のアシル化剤として5-ペンタン酸を使用することもまた別の可能性である。オレフィンを含有する鎖の長さは、構造活性関係を探求するべく種々にすることができる。
【０１３４】
ペプチド配列の操作
本発明の適応範囲内の他の変更方法には、同等またはより優れた生物学的特性を有するペプチドを得ることが期待できるペプチド配列の操作が含まれる。これらには、アミノ酸の転座（アミノ酸を配列中で交換すること）、元々の配列または改変した元々の配列の位置におけるレトロペプチド、ペプトイド、レトロペプトイド配列および合成ペプチドの使用が含まれる。特異的な残基がペプチドではなくペプトイドであり、結果として完全にペプチドでも完全にペプトイドでもないハイブリッド分子ができる構造も検討することができる。
【０１３５】
リンカー
また、本発明の範囲内の変更方法には、結合部分または結合ポリペプチドの標的配列と検出可能標識または治療薬剤との間にリンカーまたはスペーサーをトランスフェクトすることが含まれる。たとえば、こうしたリンカー／スペーサーを用いることにより、結合ペプチドの関連特性が向上する（たとえば血中安定性が高まるなど）。これらのリンカーには、当該業界でよく知られている置換型または非置換型アルキル鎖、ポリエチレングリコール誘導体、アミノ酸スペーサー、糖または脂肪族または芳香族のスペーサーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
たとえば、好適なリンカーには、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性架橋分子が含まれる。ホモ二官能性分子は少なくとも2つの同じ反応性官能基を有する。このホモ二官能性分子の反応性官能基は、たとえば、アルデヒド基および活性エステル基である。アルデヒド基を有するホモ二官能性分子には、たとえばグルタルアルデヒドおよびsubaraldehydeが含まれる。
【０１３７】
少なくとも2つの活性エステル単位をもつホモ二官能性リンカー分子には、ジカルボキシル酸およびN-ヒドロキシスクシニミドのエステルが含まれる。こうしたN-スクシニミジルエステルの例は、スベリン酸ジスクシニミジルおよびジチオ-ビス-(プロピオン酸スクシニミジル)、およびその可溶性ビス-スルホン酸およびそれらのナトリウムおよびカリウム塩などのビス-スルホン酸塩が含まれる。
【０１３８】
ヘテロ二官能性リンカー分子は、少なくとも2つの異なる反応性基を有する。反応性ジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性試薬には、N-スクシニミジル3-(2-ピリジル-ジチオ)プロピオン酸塩（Carlssonら、1978, Biochem J. 173:723-737）、S-4-スクシニミジルオキシカルボニル-α-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウムおよび4-スクシニミジルオキシカルボニル-α-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエンが含まれる。N-スクシニミジル3-(2-ピリジル-ジチオ)プロピオン酸塩が望ましい。チオール基と反応する二重結合をもつ反応性基を含有するヘテロ二官能性試薬の例としては、スクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸塩およびスクシニミジルm-マレイミド安息香酸塩が挙げられる。その他のヘテロ二官能性分子には、スクシニミジル3-(マレイミド)プロピオン酸塩、スルホスクシニミジル4-(p-マレイミド-フェニル)酪酸塩、スルホスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル-シクロヘキサン)-1-カルボン酸塩、マレイミドベンゾイル-5N-ヒドロキシ-スクシニミドエステルが含まれる。
【０１３９】
さらに、上述の分子および／または成分の組み合わせであるリンカーも、ペプチドの特性に特別な利益をもたらすべく使用することができる。リンカーをもつ脂質分子を付着させ、超音波バブル、リポソームまたはその他の凝集を主成分とする構成物を調製することができる。こうした構成物はターゲティングおよび診断用レポーター、治療薬（たとえば治療用の化学的「弾頭」など）またはその組み合わせの送達のための物質として使用することができる。
【０１４０】
ヘテロ多量体構成物の使用
本発明によるヘテロ多量体構成物は、イムノ分析（ELISAなど）、種々の疾患の治療に有用な治療薬剤、in vivoにおける診断および治療への使用など、多数の応用がきく。たとえば、本明細書に記載のヘテロ多量体構成物は、in vitroまたはin vivoにおいて、組織を含有する標的の検出および／または画像化にきわめて有用である。たとえば、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体構成物は、KDRまたはVEGF／KDR複合体を含有する組織の検出および／または画像化にきわめて有用であり、特に上記に説明したとおりVEGFおよびKDRが密接に関与する血管新生の部位の検出および／または画像化にきわめて有用である。KDRまたはVEGF／KDR複合体の分析または画像化に好適なあらゆる方法を用いることができる。同様に、cMetまたはHGF／cMet複合体結合へテロ多量体構成物は、cMetまたはHGF／cMet複合体を含有する組織の検出および／または画像化にきわめて有用であり、特に上記に説明したとおりHGFおよびcMetが密接に関与する腫瘍またはその他の増殖部位の検出および／または画像化にきわめて有用である。cMetまたはHGF／cMet複合体の分析または画像化に好適なあらゆる方法を用いることができる。
【０１４１】
また、本発明の化合物は、単独で使用しても別の治療薬剤と組み合わせて使用しても、種々の病態の治療に有用である。たとえば、上述のように、病態に寄与する生物学的過程を阻害する本発明の化合物は、それ自体で治療用組成物または製剤学的組成物として使用することができる。あるいは（または組み合わせで）、本発明の化合物は1つ以上の追加的治療薬剤を含むことができる。ある実施形態において、本発明は、それ自体で治療薬剤として用いることができるか、1つ以上の治療薬剤（化学療法剤、放射線治療剤、遺伝物質など）を血管新生の部位または多数の病原体に関係する部位をはじめとするKDR発現細胞に集中するのに用いることのできるKDRまたはVEGF／KDR複合体結合部分を含むヘテロ多量体を含む。また別の実施形態において、本発明は、それ自体で治療薬剤として用いることができるか、1つ以上の治療薬剤（化学療法剤、放射線治療剤、遺伝物質など）を腫瘍、増殖部位または血管新生部位をはじめとするcMet発現細胞に集中するのに用いることのできるcMetまたはHGF／cMet複合体結合部分を含むヘテロ多量体を含む。
【０１４２】
本発明のヘテロ多量体構成物は、内皮細胞に関与する病態を治療するための治療薬剤として特に有用である。内皮細胞の重要な機能は血管新生または血管の生成であるため、本発明のヘテロ多量体は、たとえば固形腫瘍、腫瘍の転移および良性腫瘍をはじめとする血管新生に関与する病態を治療するのに特に有用である。こうした腫瘍および関連疾患は当該業界においてよく知られており、たとえば黒色腫、中枢神経系腫瘍、神経内分泌腫瘍、肉腫、多発骨髄腫ならびに乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、頭頚部癌および卵巣癌を含む。このほかの腫瘍および関連疾患については、2000年2月15日付でMosesらに発行された米国特許第6,025,331号の表1に記載があり、これらは本明細書に参照として組み込まれている。良性腫瘍には、たとえば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫が含まれる。血管新生に関与するその他の関連疾患には、たとえばリウマチ様関節炎、乾癬および糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒否反応、血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖症などの眼疾患、rebeosis、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、乳頭上新生血管、毛細血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫および創傷肉芽形成が含まれる。その他の血管増殖に関与する関連疾患または病態には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症および肥厚性瘢痕および潰瘍が含まれる。さらに、本発明のヘテロ多量体は、たとえば避妊薬として着床に必要な子宮の血管新生を低減または予防するのに用いることができる。
【０１４３】
溶液中の標的の検出のため、本発明のヘテロ多量体は検出可能なように標識することができる。たとえば、蛍光標識、酵素的標識、放射性核種または常磁性金属による標識、バブルへの付着を行った後、溶液と接触させ、ヘテロ多量体と標的との複合体の形成を検出することができる。一例としては、蛍光で標識したKDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体構成物を、in vitroのKDRまたはVEGF／KDR複合体検出分析に用いることができ、その分析においてヘテロ多量体構成物は、結合が起こるような条件下でKDRまたはVEGF／KDR複合体の被験対象となる溶液に添加する。蛍光で標識したKDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体構成物と、KDRまたはVEGF／KDR複合体標的との複合体は、検出することができ、遊離したヘテロ多量体と比較した場合のKDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体構成物の蛍光偏光の上昇を測定することによって堤了することができる。cMet結合部分を含有するヘテロ多量体も同様に使用することができる。
【０１４４】
あるいは、ヘテロ多量体構成物をプラスチック管またはウェルなどの固相支持体に固定し、標的を含有することが疑われる溶液をこの固定化したヘテロ多量体構成物と接触させ、非結合材料を洗い流し、複合体を形成した標的をたとえば標的を認識するモノクローナル抗体などの好適な検出試薬を用いて検出するといった、サンドイッチ型「ELISA」分析を用いることができる。このモノクローナル抗体は、当該業界で既知の従来の方法で検出することができる。例を挙げれば放射性標識、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素との抱合または蛍光標識などである。
【０１４５】
たとえば、溶液中の可溶性標的を検出するか、溶液から可溶性標的を分離する場合、本発明のヘテロ多量体をクロマトグラフィー支持体またはその他のマトリックス材料などの固相に固定化し、その後固定化したヘテロ多量体を、ヘテロ多量体：標的複合体の形成に好適な条件下で、溶液で負荷するか溶液と接触させる。溶液の非結合部分を除去し、複合体をたとえば抗結合ポリペプチド抗体（抗KDR、抗VEGF／KDR複合体、抗cMetまたは抗cMet／HGF複合体抗体など）などの標的に対する抗体を用いて検出するか、ヘテロ多量体：標的複合体をしかるべき溶離条件で結合部分から放出させる。
【０１４６】
血管新生の生物学および血管新生を開始し維持するのにVEGFおよびKDRが果たす役割については、多くの研究者によって試験されており、現時点でも活発な研究および開発分野である。こうした研究開発の推進において、純粋なKDRまたはVEGF／KDR複合体を大量に生成する方法が望まれており、本明細書に記載のKDRおよびVEGF／KDR複合体ヘテロ多量体は、上述の一般的な生成方法を用いる場合、特にその目的に有用である。同様に、腫瘍およびその他の増殖組織の生物学および、これらを開始し維持するのにcMetおよびHGFが果たす役割については、多くの研究者によって試験されており、現時点でも活発な研究および開発分野である。こうした研究開発の推進において、純粋なcMetまたはHGF／cMet複合体を大量に生成する方法が望まれており、本明細書に記載のcMetまたはHGF／cMet複合体ヘテロ多量体は、上述の一般的な生成方法を用いる場合、特にその目的に有用である。
【０１４７】
診断用造影検査
しかるべく標識された本発明のヘテロ多量体構成物は、特異的組織または異常細胞を造影するのに、in vivoにおいて診断への応用を行うことができる。本発明によるヘテロ多量体構成物の特に好ましい使用は、標的を発現するか含有する組織を目に見える形で画像化することである。この実施形態において、本発明のヘテロ多量体は診断用検出にふさわしい標識と、任意にはリンカーを介して抱合させる。好適なリンカーは、置換型または非置換型アルキル鎖、アミノ酸鎖（ポリグリシンなど）、ポリエチレングリコール、ポリアミドおよび当該業界で既知のその他の簡単なポリマーリンカーであることができる。好ましくは、他の血清タンパク質よりも標的に対してはるかに高い特異性を示すヘテロ多量体を、使用する検出方法にふさわしい標識と抱合体を形成させるか、結合させる。たとえば、本発明のヘテロ多量体は、リンカーを介して、または介さずに、磁気共鳴造影法（MRI）に好適な常磁性キレート、X線検査、PETまたはシンチグラフィーに好適な放射性標識（必要であれば放射性活性金属には本明細書に記載のようなキレート剤を含む）、超音波検出法に好適な超音波造影剤（安定化したマイクロバブル、マイクロバルーン、ミクロスフェアまたは「リポソーム」を満たすガスとして呼ばれるものなど）、または光学的検査用染料と抱合させることができる。
【０１４８】
たとえば、本発明のKDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体構成物または本発明のcMetまたはHGF複合体結合へテロ多量体構成物は、生存および転移のために血管新生を必要とする腫瘍または血管新生作用のある他の部位の造影に用いることができる。この実施形態において、KDRおよびVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドまたはcMetまたはHGF／cMet複合体結合ポリペプチドを含むヘテロ多量体構成物は、本明細書に記載の通り診断用検出にふさわしい標識と、任意にはリンカーを介して抱合させることによって、造影試薬に変換する。
【０１４９】
一般に、検出可能に標識したヘテロ多量体構成物を用いる技術は、その標識が患者の体外から検出できる信号を生成するという前提に基づいている。たとえば、ある実施形態において、本発明による検出可能に標識したヘテロ多量体を、（たとえば腫瘍に起因する）血管新生が起こっている患者に投与する場合、KDRまたはVEGF／KDR複合体のヘテロ多量体に含まれるKDRまたはVEGF／KDR複合体結合部分により、ヘテロ多量体構成物は血管新生部位に結合して、標識を血管新生部位に蓄積させる。標識したヘテロ多量体構成物が血管新生部位に集中するには十分な時間を要する。標識したペプチドが生成する信号を、使用する標識の種類によって種々に異なるスキャン機器で検出し、その後その信号を血管新生部位の画像へと変換する。
【０１５０】
また別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体を検出可能な標識または放射線療法構成物で直接的に標識するよりも、本発明のヘテロ多量体は検出可能な標識または放射線療法剤と結合するアビジン、ビオチンまたは抗体または抗体断片と抱合させることができる。たとえば、ある実施形態において、ヘテロ多量体はストレプトアビジンまたはアビジンと抱合させて、in vivoで標的を含有するか発現する細胞と結合させることができる。未結合のヘテロ多量体を体内から排出させた後、ビオチン化した検出可能な標識または放射線治療構成物（放射性活性金属と複合体を形成したキレート分子など）を注入し、迅速に標的構成物が結合する部位に集中させる。いくつかの状況においてこの方法は、検出可能な標識を投与してから、造影が行えるまでの時間を短縮することができる。また、これにより、標的部位における信号／ノイズ比が高まり、必要とされる検出可能な標識または放射線療法構成物の用量が減少する。これは特に、放射性活性標識または放射線療法剤を用いる場合に有用である。なぜなら、体内の正常であるが放射線照射に感受性の高い部位（骨髄、腎および肝など）に送達される放射線の照射量を抑えることができるからである。時にプレターゲティングまたはツーステップ、またはスリーステップ法と呼ばれるこの方法は、S.F.Rosebrough (本明細書に参照として組み込まれているQ.J.Nucl.Med.40:234-251; 1996,)によって検討されている。好ましい実施形態においては、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合部分を含むヘテロ多量体構成物を使用する。また別の好ましい実施形態においては、cMetまたはHGF／cMet複合体結合部分を含むヘテロ多量体構成物を使用する。
【０１５１】
A  磁気共鳴画像法
本発明のヘテロ多量体は、1つ以上の常磁性金属キレートとより有利に抱合体を形成して、MRIに使用する造影剤を形成する。好ましい常磁性金属イオンは原子番号21〜29、42、44または57〜83である。これは、1つおよびより好ましくは5つ以上の不対電子を有し、磁気モーメントが少なくとも1.7ボーア磁子である遷移金属または希土類のイオンを含む。好ましい常磁性金属には、クロム（III）、マンガン（II）、マンガン（III）、鉄（II）、鉄（III）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、プラセオジミウム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ガドリニウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ユーロピウム（III）およびイッテルビウム（III）が含まれるがこれらに限定されない。また、本発明のヘテロ多量体は1つ以上の超常磁性粒子と抱合体を形成することができる。
【０１５２】
Gd（III）は緩和能が高く、毒性が低く、生物学的に酸化状態になる経路が1つしかないことから、MRIに特に好ましい。Gd（III）キレートは、1988年から臨床応用および放射線学的MR応用がなされてきており、現在でもMR検査の約3割がガドリニウムを主成分とする造影剤を用いている。
【０１５３】
当該業界に精通する業者は、標的を含有する組織に必要な用量を考慮し、金属の患者に対する毒性などの他の因子を考慮して金属を選択する。Tweedleら、「Magnetic Resonance Imaging (2nd ed.)」, vol.1, Partainら eds. (W.B. Saunders Co. 1988), pp.796-7を参照されたい。一般に、個々の金属について望ましい用量はその緩和能に比例し、その生体内分布、薬物動態および代謝によって変更される。3価のカチオンであるGd3+は、緩和能が高く毒性が低く、生物学的に酸化状態になる経路が1つしかないことから、患者における金属の望ましくない代謝を最小限に抑えることができるため、MRI造影剤に特に好ましい。また別の有用な金属は、比較的安価なCr3+である。
【０１５４】
常磁性金属キレート剤は、常磁性金属のリガンドとして働き、常磁性金属と複合体を形成する1つ以上の極性基を有する分子である。好適なキレート剤は当該業界において既知であり、メチレンホスフィン酸基、メチレンカルボヒドロキシアミン酸基、カルボキシエチリデン基またはカルボキシメチレン基を有する酸を含む。キレート剤の例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）、1-置換型1,4,7-トリカルボキシメチル1,4,7,10テトラアザシクロドデカン三酢酸（DO3A）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸（TETA）が挙げられるが、これに限定されない。また別のキレート化リガンドは、エチレンビス-(2-ヒドロキシ-フェニルグリシン)（EHPG）および5-Cl-EHPG、5Br-EHPG、5-Me-EHPG、5t-Bu-EHPGおよび5sec-Bu-EHPGをはじめとするその誘導体、ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ-DTPA）およびジベンゾ-DTPA、フェニル-DTPA、ジフェニル-DTPA、ベンジル-DTPAおよびジベンジルDTPAをはじめとするその誘導体、ビス-2(ヒドロキシベンジル)-エチレン-ジアミン二酢酸(HBED)およびその誘導体、少なくとも3個、好ましくは少なくとも6個の炭素原子を含み、少なくとも2個のヘテロ原子（Oおよび／またはN）を含む大環状化合物、1つの環またはヘテロ環要素で合わさった2〜3つの環からなる大環状化合物、たとえばNOTAが1,4,7-トリアザシクロノナンN,N',N''-三酢酸であるベンゾ-DOTA、ジベンゾ-DOTAおよびベンゾ-NOTA、DOTMAが1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-テトラ(メチル四酢酸)であるベンゾ-TETA、ベンゾ-DOTMA、TETMAが1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-(メチル四酢酸)であるベンゾ-TETMA、1,3-プロピレンジアミン四酢酸(PDTA)およびトリエチレンテトラアミン六酢酸(TTHA)の誘導体、1,5,10-N,N',N''-トリ(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)-トリカテコレート(LICAM)および1,3,5-N,N',N''-トリ(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン(MECAM)の誘導体である。本発明に用いるのに好ましいキレート剤はDTPAである。代表的なキレート剤の例および本発明で検討されたキレート基については、WO第98／18496号、WO第86／06605号、WO第91／03200号、WO第95／28179号、WO第96／23526号、WO第97／36619号、PCT／US第98／01473号、PCT／US第98／20182号および米国特許第4,899,755号、米国特許第5,474,756号、米国特許第5,846,519号および米国特許第6,143,274号に記載があり、これらはすべて全文が本明細書の参照に組み込まれている。キレートDO3Aを使用するのが特に好ましい。
【０１５５】
本発明のある実施形態において、MRI造影剤のキレート剤は、たとえばKDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドまたはcMetまたはHGF／cMet複合体結合ポリペプチドからなるようなヘテロ多量体と結合させる。キレートの位置は、ヘテロ多量体構成物の結合親和性または特異性を干渉しないように選択する。キレートはN末端またはC末端のいずれかに付着させるのが好ましいが、キレートは配列内のどの位置に付着させてもよい。好ましい実施形態においては、中央に遊離するカルボキシル酸基を1つ有するキレート剤（DTPA-Asp(β-COOH)-OtBuなど）を用いて、N末端に結合ペプチドをアミド結合の形成を介して付着しやすいようにする。キレートはリンカーの助けを借りてC末端に付着させてもよい。あるいは、イソチオシアン酸塩抱合を、DTPAを有するしかるべきイソチオシオン酸塩基をペプチド配列内のどこかで遊離アミノ基に結合する方法に用いることができる。
【０１５６】
たとえば、ヘテロ多量体は金属キレート剤（または他の検出可能な標識）と直接的または共有結合によって結合させるか、リンカーを用いて金属キレート剤と結合または抱合させることができる。このリンカーはアミド、尿素、アセタール、ケタール、二重エステル、カルボニル、カルバメート、チオ尿素、スルホン、チオエステル、エステル、エーテル、ジスルフィド、ラクトン、イミン、ホスホリルまたはホスホジエステル結合；置換型または非置換型、飽和または不飽和アルキル鎖；単一のアミノ酸または種々のアミノ酸の直鎖、分岐、または環状アミノ酸鎖（結合部分のN末端またはC末端の延長など）；ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンまたはポリビニルピリジン鎖の誘導体または非誘導体；置換型または非置換型ポリアミド鎖；ポリアミン、ポリエステル、ポリエチレンイミン、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアルコール）、ポリグリセロールまたはオリゴ糖（デキストランなど）鎖の誘導体または非誘導体；交互ブロック共重合体；マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸；カプロン酸；単純ジアミンおよびジアルコール；本明細書に開示の他のリンカーのいずれか；または当該業界で既知のその他の単純なポリマーリンカーのいずれかであることができるが、これに制限されない（WO第98／18497号、WO第98／18496号を参照）。リンカーの分子量は厳しく制御されるのが好ましい。分子量は100未満〜1000以上であることができる。好ましくは、リンカーの分子量は100未満である。また、in vivoで生分解できるリンカーを用いて本発明の造影試薬の排泄経路を十分確保するのが望ましい。リンカー内の位置に応じて、こうした生分解できる官能基は、エステル、二重エステル、アミド、ホスホエステル、エーテル、アセタールおよびケタール官能基を含むことができる。
【０１５７】
一般に、金属キレートと本発明のヘテロ多量体をこうしたリンカーを用いて結合させるのには、既知の方法を用いることができる。WO第95／28967号、WO第98／18496号、WO第98／18497号および本明細書の考察を参照されたい。たとえば、ヘテロ多量体は、構成要素である結合部分のN末端またはC末端を通して、たとえばアミド結合を介して、金属キレートの金属骨格の窒素または金属キレートそれ自体の酢酸塩のアームに結合させることができる。本発明は、キレートのあらゆる位置における結合を考察しており、金属キレートが金属にしっかりと結合する能力を保持しており、毒性が最小限に抑えられることを前提としている。同様に、ヘテロ多量体の構成要素である結合部分を改変または延長して、金属キレートの付着のための場所を作り、こうした改変または延長が標的への結合能力を失わせないことを前提としている。
【０１５８】
本明細書の開示に基づいて調製したMRI造影剤は、従来のMRI造影剤と同じ方法で用いることができる。たとえば血管新生部位などの標的を含む組織を造影する場合、その背景となる血液および組織と造影部位とのコントラストを明瞭にするために、特定のMR技術およびパルスシーケンスが好ましい。これらの技術には、たとえば血液を暗くするための高速スピンエコーシーケンス（たとえばAlexanderら、Magnetic Resonance in Medicine, 40(2):298-310 (1998)参照）およびflow-spoiled勾配エコーシーケンス（たとえばEdelmanら、Radiology, 177(1):45-50 (1990)参照）などのblack blood血管造影シーケンスが含まれる（がこれに限定されない）。これらの方法は、血管新生を行う腫瘍などの標的を含む組織と、背景の組織とのコントラストを明瞭にする反復回復または飽和回復シーケンスなど、コントラストの差を強調するのに血流に依存しない技術も含む。最後に、磁化移動法もこれらの造影剤によるコントラストを明瞭にすることができる（たとえばGoodrichら、Investigative Radiology, 31(6):323-32 (1996)参照）。
【０１５９】
標識した試薬は患者に注射できる剤形で投与する。MRI造影剤の投与法は、好ましくは非経口的すなわち静脈内、動脈内、髄腔内、間質内または腔内投与である。活性を有する血管新生を造影するには、静脈内または動脈内投与が好ましい。
【０１６０】
MRIでは、患者は標的部位（たとえば血管新生部位）でMR信号を少なくとも10%強調するのに十分な用量の造影剤を投与される。MRI試薬を含むヘテロ多量体構成物を注入した後、患者はMRI装置でスキャンされ、標的を含有するあらゆる部位の位置を測定される。治療の場では、標的の位置を決めてから、細胞毒性剤または治療剤を必要であればただちに投与し、その後患者をスキャンして治療効果を画像化する。
【０１６１】
好ましい実施形態において、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合部分を含むヘテロ多量体は、任意にリンカーを介して、1つ以上の常磁性金属キレートまたは1つ以上の超常磁性粒子と抱合する。また別の好ましい実施形態においては、cMetまたはHGF／cMet複合体結合部分を含むヘテロ多量体を用いる。こうしたヘテロ多量体構成物は1つ以上の常磁性金属と複合体を形成させ、MR信号を少なくとも10%強調するのに十分な用量を投与する。注入後、患者はスキャンされ、血管新生部位（血管新生作用を有する腫瘍など）または増殖組織の位置を測定される。必要であれば、血管新生部位または増殖部位の位置を決めた後、たとえばVEGF阻害剤（またはKDRを活性化するVEGF阻害剤）などの抗血管新生剤または抗腫瘍剤を投与することができる。必要であれば、患者を再度スキャンし、腫瘍の退縮、血管新生の停止などを画像化／追跡することができる。
【０１６２】
B  超音波画像法
超音波がある物質を通して伝達される場合、その物質の音波特性はその伝達の速度および物質の密度に依存する。音波特性の変化は、異なる物質（個体、液体、ガス）間の界面において最も顕著となる。超音波造影剤は、造影剤とその周囲の組織との音波的差による高密度な音波反射材である。ガスを含有するまたはガスを生成する超音波造影剤は、液体（血液など）とガスを含有するまたはガスを精製する超音波造影剤との音波的差が大きいことから、特に有用である。その大きさにより、マイクロバブル、マイクロバルーンなどからなる超音波造影剤は、注入後他の検出可能成分よりも長時間血流に留まることができ、このため、標的とされる超音波剤は標的を発現または含有する組織をよりよく画像化することができる。
【０１６３】
本発明のこの観点において、ヘテロ多量体構成物は超音波画像法に有用な材料を含むことができる。たとえば、本発明のヘテロ多量体は小胞（マイクロバブル、マイクロバルーン、ミクロスフェアなど）を形成するのに用いられる材料、または検出可能標識として機能する液体またはガス（エコー生成ガスまたはエコー生成ガスを生成することのできる材料など）を含有する懸濁液と結合させることができる。こうした小胞の調製のための材料には、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物および合成または天然ポリマー剤が含まれる。本明細書の参照に全文が組み込まれているWO第98／53857号、WO第98／18498号、WO第98／18495号、WO第98／18497号、WO第98／18496号およびWO第98／18501号を参照されたい。
【０１６４】
安定化したマイクロバブル（好ましい実施形態）、リン脂質および特に飽和リン脂質からなる造影剤が好ましい。好ましいガスで満たされたマイクロバブルは、当該業界で既知の方法、たとえば、以下の特許のいずれか一つに記載された方法で調製することができる。本明細書の参照に全文が組み込まれている欧州特許第554213号、米国特許第5,413,774号、米国特許第5,578,292号、欧州特許第744962号、欧州特許第682530号、米国特許第5,556,610号、米国特許第5,846,518号、米国特許第6,183,725号、欧州特許第474833号、米国特許第5,271,928号、米国特許第5,380,519号、米国特許第5,531,980号、米国特許第5,567,414号、米国特許第5,658,551号、米国特許第5,643,553号、米国特許第5,911,972号、米国特許第6,110,443号、米国特許第6,136,293号、欧州特許第619743号、米国特許第5,445,813号、米国特許第5,597,549号、米国特許第5,686,060号、米国特許第6,187,288号および米国特許第5,908,610号。好ましい実施形態において、少なくとも1つのリン脂質成分は、下図の式18または19の構造を有しており、これについては本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許第5,686,060号に記載がある。
【０１６５】
2005519980.tif 000017
2005519980.tif 000018
好適なリン脂質の例には、1つまたは2つの（同じまたは異なる）脂肪酸分子を有するグリセロールエステルが含まれる。この場合今度はリン酸残基がコリン、セリン、イノシトール、グリセロール、エタノールアミンなどの親水性基に結合する。リン脂質に存在する脂肪酸は一般に、長鎖脂肪族系酸であり、典型的には12〜24個、好ましくは14〜22個の炭素原子を含み、飽和しているか1つ以上の不飽和酸を含有することができる。好適な脂肪酸の例は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。リン脂質のモノエステルは、当該業界でリン脂質の「リソ」型とも呼ばれている。
【０１６６】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸すなわち脂肪酸を有するグリセロール-リン酸のジエステル、スフィンゴミエリンすなわち脂肪酸を有するグリセロールジエステルの残基がカルバミド鎖に取って代わられたホスファチジルコリン類似体、カルジオリピンすなわち脂肪酸を有する1,3-ジホスファチジルグリセロールのエステル、ガングリオシド、セレブロシドなどである。
【０１６７】
本明細書で用いる用語リン脂質は、単一または混合物として使用することのできる天然に発生したか、半人工的または人工的に調製した産物のいずれかを含む。
【０１６８】
天然に発生したリン脂質の例は、典型的には大豆または卵黄レシチンといった天然レシチン（ホスファチジルコリン（PC）誘導体）である。
【０１６９】
半人工的リン脂質の例は、この天然に発生したレシチンを部分的または完全に水素化した誘導体である。
【０１７０】
人工的リン脂質の例は、たとえばジラウリロイル-ホスファチジルコリン（「DLPC」）、ジミリストイルホスファチジルコリン（「DMPC」）、ジパルミトイル-ホスファチジルコリン（「DPPC」）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（「DAPC」）、ジステアロイル-ホスファチジルコリン（「DSPC」）、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン（「MPPC」）、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン（「PMPC」）、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチド-イルコリン（「PSPC」）、1-ステアロイル-2-パルミトイル-ホスファチジルコリン（「SPPC」）、ジオレオイルホスファチジルコリン（「DOPC」）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン（エチル-DSPC）、ジラウリロイル-ホスファチジルグリセロール（「DLPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジアラキドイルホスファチジルグリセロール（「DAPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジミリストイルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジパルミトイルホスファチジルグリセロール（「DPPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジステアロリホスファチジルグリセロール（「DSPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジオレオイルホスファチジルグリセロール（「DOPG」）およびそのアルカリ金属塩であるジミリストイルホスファチジン酸（「DMPA」）およびそのアルカリ金属塩であるジパルミトイルホスファチジン酸（「DPPA」）およびそのアルカリ金属塩であるジステアロイルホスファチジン酸（「DSPA」）、ジアラキドイルホスファチジン酸（「DAPA」）およびそのアルカリ金属塩であるジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（「DMPE」）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（「DPPE」）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）、ジミリストイルホスファチジルセリン（「DMPS」）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（「DAPS」）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（「DPPS」）、ジステアロイルホスファチジルセリン（「DSPS」）、ジオレオイルホスファチジルセリン（「DOPS」）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（「DPSP」）およびジステアロイルスフィンゴミエリン（「DSSP」）である。
【０１７１】
その他の好ましいリン脂質には、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジン酸およびジパルミトイルホスファチジルセリンが含まれる。この組成物はPEG-4000および／またはパルミチン酸も含有する。本明細書に開示または当該業界で既知のガスのいずれかを用いる。ただし、SF6などの不活性ガスまたはCF4、C3F8およびC4F10などのフッ化炭化水素が好ましい。
【０１７２】
好ましいマイクロバブル懸濁液は、好適な溶媒に溶解した天然のリン脂質溶液の凍結乾燥または噴霧乾燥などの既知の工程、または本明細書の明細に全文が組み込まれている欧州特許第554213号、米国特許第5,413,774号、米国特許第5,578,292号、欧州特許第744962号、欧州特許第682530号、米国特許第5,556,610号、米国特許第5,846,518号、米国特許第6,183,725号、欧州特許第474833号、米国特許第5,271,928号、米国特許第5,380,519号、米国特許第5,531,980号、米国特許第5,567,414号、米国特許第5,658,551号、米国特許第5,643,553号、米国特許第5,911,972号、米国特許第6,110,443号、米国特許第6,136,293号、欧州特許第619743号、米国特許第5,445,813号、米国特許第5,597,549号、米国特許第5,686,060号、米国特許第6,187,288号および米国特許第5,908,610号に記載のある工程を用いて調製することができる。最も好ましくは、リン脂質を有機溶媒に溶解し、その溶液をリポソーム形成段階を飛ばして乾燥させる。これは、リン脂質を好適な有機溶媒に親水性安定剤または有機溶媒および水のいずれにも溶解する化合物とともに溶解し、その溶液を凍結乾燥または噴霧乾燥することで実現することができる。この実施形態において、親水性安定剤の選択基準は、選択した有機溶媒への可溶性である。水および有機溶媒に溶解する親水性安定剤化合物の例は、たとえば、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエチレングリコール（PEG）など、リンゴ酸、グリコール酸、マルトールなどである。こうした親水性化合物は、マイクロバブルサイズ分布を均一化するのに役立ち、貯蔵下における安定性を高める。好適な有機溶媒は、続く乾燥工程を容易にするだけその沸点が十分に低く、融点が十分に高いかぎり、どのようなものでも用いることができる。典型的な有機溶媒は、たとえば、ジオキサン、シクロヘキサノール、第三級ブタノール、テトラクロロジフルオロエチレン（C2Cl4F2）または2-メチル-2-ブタノールを含むが、2-メチル-2-ブタノールおよびC2Cl4F2が好ましい。
【０１７３】
水性担体に分散させることでマイクロバブルの懸濁液を調製する前に、凍結乾燥または噴霧乾燥したリン脂質粉末を空気または別のガスと接触させる。水性担体と接触すると、その構造が破壊された粉末化したリン脂質は、層状化または薄層化した断片を形成し、これが分散するガスのマイクロバブルを安定化させる。この方法により、長期間保存しても安定であり、乾燥薄層リン脂質（望ましいガスの存在下で保存）を振盪することも激しく撹拌することもなく単に溶解するだけで得られるマイクロバブル懸濁液を製造することができる。
【０１７４】
あるいは、マイクロバブルは、WO第97／29783号に記載のあるとおり、ガスを水性溶液に高速撹拌で懸濁させることによって調製することができる。マイクロバブルの調製に関するさらなる工程は、同時係属出願の欧州特許第03002373号に開示されており、これは本明細書の参照に組み込まれている。これは、リン脂質の存在下で水性媒質に有機溶媒を乳濁させ、続いてこの乳濁液を凍結乾燥して、任意に洗浄および／または濾過工程を経るというものである。
【０１７５】
当該業界に精通した業者に既知の添加剤を、安定化したマイクロバブルの懸濁液として含めることができる。たとえば、ポリオキシプロピレングリコールおよびポリオキシエチレングリコールなどのフィルム非形成界面活性剤および同様の化合物、ならびにその種々の共重合体；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはその誘導体などの脂肪酸、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェノール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビルおよびブチルヒドロキシトルエンを添加することができる。フィルム非形成界面活性剤の量は、界面活性剤の総量の通常は重量にして50%までであるが、好ましくは重量にして0〜30%である。
【０１７６】
開示されている他のガス含有懸濁液は、たとえば本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許第5,798,091号およびWO第97／29783号を含む。これらの物質はいずれも本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許第5,798,091号およびWO第97／29783号に記載の通り調製する。
【０１７７】
また別の好ましい超音波造影剤はマイクロバルーンからなる。用語「マイクロバルーン」は、ガスで満たされた材料境界膜または包膜のことである。マイクロバルーンの調剤および調製方法に関するさらなる情報は、欧州特許第A-0324938号、米国特許第4,844,882号、米国特許第5,711,933号、米国特許第5,840,275号、米国特許第5,863,520号、米国特許第6,123,922号、米国特許第6,200,548号、米国特許第4,900,540号、米国特許第5,123,414号、米国特許第5,230,882号、第5,469,854号、第5,585,112号、米国特許第4,718,433号、米国特許第4,774,958号、WO第9501187号、米国特許第5,529,766号、米国特許第5,536,490号および米国特許第5,990,263号に記載があり、これらはみな本明細書の参照に全文が組み込まれている。
【０１７８】
好ましいマイクロバルーンは、生分解できる生理学的に適合しうるポリマーまたは生分解できる固形の脂質を含む包膜を有する。本発明のマイクロバルーンの調製に有用なポリマーは、本明細書の参照に全文が組み込まれている欧州特許第458745号、米国特許第5,711,933号、米国特許第5,840,275号、欧州特許第554213号、米国特許第5,413,774号および米国特許第5,578,292号に記載のものをはじめとする、生分解できる生理学的に適合するポリマーのなかから選択することができる。特に、このポリマーは、水溶性の低い多糖、ポリラクチドおよびポリグリコリドおよびその共重合体、ε-カプロラクトン、γ-バレロラクトンなどラクチドおよびラクトンの共重合体、およびポリペプチドなどの生分解できる生理学的に適合するポリマーのなかから選択することができる。他の好適なポリマーとしては、ポリ（オルト）エステル（たとえば米国特許第4,093,709号、米国特許第4,131,648号、米国特許第4,138,344号、米国特許第4,180,646号を参照）；ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびその共重合体、たとえばDEXON（J.Heller, Biomaterials 1 (1980), 51;poly(DL-lactide-co-ε-caprolactone), poly(DL-lactide-co-γ-valerolactone), poly(DL-lactide-co-γ-butyrolactone参照）、ポリアルキルシアノアクリル酸塩；ポリアミド、ポリヒドロキシ酪酸塩；ポリジオキサノン；ポリ-β-アミノケトン（A.S.Angeloni, P.Ferruti, M.Tramonitini and M Casolaro, The Mannich bases in polymer synthesis: 3. Reduction of poly(beta-aminoketone)s to poly(gamma-aminoalcohol)s and their N-alkylation to poly(gamma-hydroxquaternary ammonium salt)s, Polymer 23, pp 1693-1697, 1982）；ポリホスファゼン（Allcock, Harry R. Polyphosphazenes: new polymers with inorganic backbone atoms (Science 193(4259), 1214-19 (1976)）およびポリ無水物が挙げられる。また、本発明のマイクロバルーンは本明細書の参照に組み込まれているWO第A-96／15815号に記載の方法に従って調製することもできる。この方法では、マイクロバルーンを生分解可能な脂質、好ましくはモノ-、ジ-、トリ-グリセリド、脂肪酸、ステロール、ワックスおよびその混合物から選択した脂質からなる生分解可能な膜から作成する。好ましい脂質は、たとえばジ-またはトリ-ミリスチン、-パルミチンまたは-ステアリンなどのジ-またはトリ-グリセリドで、特にトリパルミチンまたはトリステアリンである。
【０１７９】
マイクロバルーンは本明細書に開示のガスまたは当該業者に既知のあらゆるガスを用いてもよい。ただし、フッ素化ガスなどの不活性ガスが好ましい。マイクロバルーンは製剤学的に許容できる液体担体に、当該業界で既知の添加剤または安定剤を任意に用いて、懸濁させることができる。
【０１８０】
他のガスを含有する造影剤としては、ガスを含有するかガスと関連させた（たとえばその表面にガスを吸収させるか、その空隙、腔または孔にガスを充填するか、またはその両方）マイクロ粒子（特にマイクロ粒子の凝集体）が挙げられる。こうした物質の調製方法は、欧州特許第0122624号、欧州特許第0123235号、欧州特許第0365467号、米国特許第5,558,857号、米国特許第5,607,661号、米国特許第5,637,289号、米国特許第5,558,856号、米国特許第5,137,928号、WO第9521631号およびWO第9313809号に記載があり、これらはみな本明細書の参照に全文が組み込まれている。
【０１８１】
これらの超音波組成物はいずれも、できるかぎり、血液と等張であるべきである。このため、注入前に少量の等張剤を上記の超音波造影剤懸濁液のいずれかに添加することができる。この等張剤は、医療の現場で通常使用されている生理食塩水であり、これらは食塩水（0.9%NaCl）、2.6%グリセロール溶液、5%デキストロース溶液などからなる。また、超音波組成物は、従来の製剤学的に許容できる添加剤、たとえば乳化剤、粘度調整材、凍結防止剤、分散防止剤、増量剤などを含むことができる。
【０１８２】
本発明に有用な超音波造影剤には、あらゆる生体適合ガスを使用することができる。本明細書で用いる用語「ガス」は、正常なヒトの体温において実質的にガスの状態であるあらゆる物質（混合物も含む）を指す。このため、ガスはたとえば空気；窒素；酸素；CO2；アルゴン；キセノンまたはクリプトン、フッ素化ガス（たとえばペルフルオロカーボンのSF6、SeF6を含む）、低分子量炭化水素（1〜7個の炭素原子を含有するものなど）、たとえば、メタン、エタン、プロパン、ブタンまたはペンタンなどのアルカン、シクロプロパン、シクロブタンまたはシクロペンタンなどのシクロアルカン、エチレン、プロペン、プロパジエンまたはブテンなどのアルケンまたはアセチレンまたはプロピンおよび／またはその混合物などのアルキンを含むことができる。ただし、フッ素化ガスが好ましい。フッ素化ガスは、SF6フレオンなどのフッ素原子を少なくとも1つ（1個以上の炭素原子およびフッ素原子を含有する有機化合物、たとえばCF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、CBrF3、CCI2F2、C2CIF5およびCBrClF2）、およびペルフルオロカーボンを含有する材料を含む。用語ペルフルオロカーボンは、炭素およびフッ素原子のみを含有する化合物を指し、特に飽和、不飽和および環状ペルフルオロカーボンを含む。通常好ましいとされる飽和ペルフルオロカーボンの化学式はCnFn+2であり、式中nは1〜12、好ましくは2〜10、最も好ましくは3〜8、さらに好ましくは3〜6である。好適なペルフルオロカーボンは、たとえばCF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18およびC9F20である。最も好ましくは、ガスまたはガス混合物は、SF6またはC3F8、C4F8、C4F10、C5F12、C6F12、C7F14、C8F18からなるグループから選択されたペルフルオロカーボンからなり、C4F10が特に好ましい。WO第97／29783号、WO第98／53857号、WO第98／18498号、WO第98／18495号、WO第98／18496号、WO第98／18497号、WO第98／18501号、WO第98／05364号およびWO第98／17324号も参照されたい。
【０１８３】
特定の状況で、ガス物質に前駆物質（たとえば、in vivoでガスに変換することのできる材料、「ガス前駆物質」とよく呼ばれる材料）を含めることが望ましいことがある。好ましくはこのガス前駆物質およびそれが生成するガスは、生理学的に許容可能なものである。ガス前駆物質は、pH活性型、光活性型、温度活性型などであることができる。たとえば、特定のペルフルオロカーボンは温度活性型ガス前駆物質として用いることができる。ペルフルオロペンタンなどのこうしたペルフルオロカーボンは、室温（またはその物質が生成および／または貯蔵される温度）以上の液相／ガス相遷移温度を有するが、この遷移温度は体温以下でなければならない。このため、こうした物質は位相変位を辿り、体内でガスに変換される。
【０１８４】
上述の通り、ガスはガスの混合物を含むことができる。下記の組み合わせが特に好ましいガス混合物である。ガス（A）および（B）の混合物で、ガス（B）の少なくとも1つが体積にして0.5〜41%量存在し、分子量が80ダルトン以上であって、フッ素化ガスであり、（A）は空気、酸素、窒素、二酸化炭素およびこれらの混合物からなるグループから選択され、混合物のバランスはガスAが担うもの。
【０１８５】
超音波に用いる小胞は、本明細書に記載の他の検出可能標識に比して大きいため、複数のヘテロ多量体と結合または抱合して、その造影剤のターゲティング有効性が高まる。上述の（または当該業界で既知の）超音波造影剤への結合は、結合ポリペプチドと小胞の形成に使用する材料とのあいだの直接的な共有結合か、前述のようなリンカーを介して行われる。たとえば、一般にペプチドと二官能性PEGリンカーとの結合の後、リポソーム組成物と反応させる旨を記述したWO98／53857号を参照されたい。また、Lanzaら、Ultrasound in Med.& Bio.,23(6): 863-870 (1997)も参照されたい。
【０１８６】
ヘテロ多量体と抱合させたマイクロバブルの懸濁液の調製には多数の方法を用いることができる。たとえば、マレイミド由来マイクロバブルは、5%（w／w）N-MPB-PE（1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-4-(p-マレイミド-フェニルブチルアミド)、（Avanti Polar-Lipids, Inc）をリン脂質調剤に組み込むことによって調製することができる。その後、脱アセチル溶液（50mMリン酸ナトリウム、25mM EDTA、0.5MヒドロキシルアミンHCl、pH7.5）で培養しておいたメルカプトアセチル化したヘテロ多量体の溶液（DMF中で10mg／mL）をこのマレイミド由来マイクロバブル懸濁液に添加する。暗所でゆっくりと撹拌しながら培養した後、遠心分離によってヘテロ多量体が抱合したマイクロバブルを単離する。
【０１８７】
マイクロバブルの誘導体化に用いることのできる化合物は、典型的には次の構成要素を含む。（a）疎水性成分、マイクロバブルまたはマイクロバルーンの包膜を形成する材料とは適合して、小胞の包膜内に化合物を有効に組み込むことができるもの；前記成分は典型的には脂質成分（ジパルミチン、ジステアロイル）によって代表される；および（b）スペーサー（典型的には種々の分子量のPEG）、場合によってはその使用は任意であり（スペーサーが長すぎるとマイクロバブルは凍結乾燥しにくくなるなど）または場合によってはその使用が好ましい（短いスペーサーでマイクロバルーンと抱合したペプチドは活性が低くなるなど）；（c）抱合対象のペプチド上の反応性成分と反応することのできる反応性基（システインの-SH基を有するマレイミドなど）。
【０１８８】
あるいは、マイクロバブルと抱合したヘテロ多量体は、ビオチン／アビジンを用いて調製することができる。たとえばアビジンと抱合させたマイクロバブルは、上述のようにマレイミド由来リン脂質マイクロバブル懸濁液を用いて調製することができ、それを（脱アセチル溶液で培養しておいた）メルカプトアセチル化アビジンに添加する。次に、ビオチン化したヘテロ多量体（本明細書に記載のように調製）をアビジン抱合マイクロバブル懸濁液に添加して、ヘテロ多量体に抱合したマイクロバブル懸濁液を得る。
【０１８９】
凍結乾燥残基は、特殊な貯法を必要とする過分極化したガスを含有していないかぎり、周辺環境の温度調節の必要なしに保存および輸送することができ、特に病院および医師に供給されて施設ですぐに使える投与可能な懸濁液に調製する場合にも、こうしたユーザーは特殊な貯蔵施設を備える必要がない。こうした場合、好ましくは、2つの個別の容器または2槽式容器をもつ2つの部材からなるキットの形で供給することができる。前者の場合、好ましくはこの容器は従来の仕切りのある密封バイアルであって、バイアルには段階b）の凍結乾燥残基を入れて中仕切りで密封し、この中仕切りを通して担体である液体を任意に装填したシリンジを用いて注入することができる。こうした場合、2つ目の部材の容器として用いるシリンジは、次にその造影剤を注入する場合にも用いる。後者の場合、好ましくは、2槽式容器は2槽式シリンジであり、いったん凍結乾燥剤を再調製して、しかるべく混合またはゆっくりと振盪したら、個の容器は造影剤を注入するのに直接用いることができる。いずれの場合でも、十分な発泡エネルギーを容器の内容物が有するために指示書を供給する。ただし、上述のように本発明による安定した造影剤では、ガスマイクロバブルの大きさは、再調製した乾燥製品に加えられる振盪エネルギーの量とは実質的に無関係である。このため、手でゆっくりと振る以上の行為が必要になることは一般になく、均一な大きさのマイクロバブルを有する再現可能な製品を得ることができる。
【０１９０】
その他の滅菌状態で乾燥粉末を水溶液と結合させることのできる2槽式再調製システムも本発明の適応範囲内にあることは、当該業界に精通した業者には評価されるものである。こうしたシステムは、水相が非水溶性ガスと周辺環境とのあいだに入り込むことができ、製品の有効期限が延長する場合に特に有益である。造影剤を生成するのに必要な材料（再調製時に凍結乾燥剤の結合対象となる標的になるリガンドなど）が容器内に入っていない場合、キットのなかの他の部材として、好ましくはキットの他の部材と容易に組み合わせることができるような形または容器で包装することができる。
【０１９１】
特別な容器、バイアルまたは接続システムが必要になることはない。本発明は従来の容器、バイアルおよびアダプタを用いることができる。唯一の要件は、栓と容器とのあいだの密封をしっかりとすることだけである。このため、密封の品質が最も重要な検討事項となる。密封の完全性が何らかのかたちで劣化するようであれば、望ましくない物質がバイアルに入ってしまう。滅菌性を保証するのに加えて、真空状態の保持が、大気圧または減圧状態で栓をされた製品が、安全かつ適切に再調製されるようにするのに重要である。栓は、単一の化合物であっても、ポリ（イソブチレン）またはブチルゴムなどのエラストマーに基づいた多要素からなる組成物であってもよい。
【０１９２】
本発明に準拠して用いられる超音波画像技術には、カラードップラー、パワードップラー、ドップラー幅、刺激音波画像法（stimulated acoustic imaging）および2次元または3次元画像法などの既知の技術が含まれる。画像化は、調和振動モード（共鳴周波数）または基音モードで行ってよいが、調和振動モードが好ましい。
【０１９３】
超音波に応用する場合、リン脂質で安定化したマイクロバブルによって形成された造影剤は、たとえば注入されるリン脂質の量が0.1〜200μg／kgの範囲内、好ましくは約0.1〜30μg／kgの範囲内になるような用量で投与することができる。マイクロバルーンを含有する造影剤は、壁を形成するポリマーまたは脂質の量が約10μg／kgから約20mg／kgになるような用量で投与するのが通常である。
【０１９４】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の超音波造影剤は、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合部分およびKDRを発現する標的組織からなる1つ以上のヘテロ多量体と抱合させる。これらの標的となる超音波造影剤は、血管新生部位およびその他のKDR発現組織に集中し、血管新生作用を有する組織を明瞭に画像化することができる。また別の好ましい実施形態において、本明細書に記載の超音波造影剤は、cMetまたはHGF／cMet複合体結合部分およびcMetを発現する標的組織からなる1つ以上のヘテロ多量体と抱合させる。これらの標的となる超音波造影剤は、増殖または血管新生部位（腫瘍を含む）およびその他のcMet発現組織に集中し、こうした組織を明瞭に画像化することができる。
【０１９５】
C  光学的画像法、音ルミネセンスまたは光音波画像法
本発明に従って、KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet複合体などの標的の位置を、患者に光学的標識を施したヘテロ多量体構成物を注入した後、in vivoにおける照明画像法で測定するのに、多数の光学的パラメータを用いることができる。画像を作成する上で検出対象となる光学的パラメータには、透過される電磁波、吸収、蛍光または燐光の放出、光線の反射、吸収幅または最大量の変化、および弾力的な散乱線が含まれる。たとえば、生物学的組織は、650〜1000nmの近赤外線（NIR）の波長の光線を対して比較的半透明となる。NIR照射線は、組織の中に数センチまで侵入することができるため、本発明のヘテロ多量体構成物を使用してin vivoにおける標識を含有する組織を画像化することができる。たとえば、KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet結合ポリペプチドのヘテロ多量体構成物は、in vivoにおけるKDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet複合体の光学的画像法に用いることができる。
【０１９６】
また別の実施形態において、本発明のヘテロ多量体構成物は、光学的染料など有機的発色団または蛍光団を含み、広範な非局在化環系を有し、吸収極大または放出極大の波長が400〜1500nmである光標識と抱合体を形成することができる。本発明の化合物は、あるいは生物発光分子で誘導体化することができる。光標識の吸収極大の波長の範囲は、ヘモグロビンからの信号による干渉を最小限にするべく、好ましくは600〜1000nmである。好ましくは、光吸収標識は＞105cm-1M-1といった高いモル吸光係数を有するのに対し、白色蛍光光学的染料は高い量子収率を有する。光学的染料の例は、WO第98／18497号、WO第98／18496号、WO第98／18495号、WO第98／18498号、WO第98／53857号、WO第96／17628号、WO第97／18841号、WO第96／23524号、WO第98／47538号および本明細書で言及する参照に記載のあるものを含むが、これに限定されない。たとえば、光標識は本発明のヘテロ多量体、たとえばKDRまたはVEGF／KDR複合体結合ペプチドからなるヘテロ多量体と直接的に共有結合させることができるか、こうしたヘテロ多量体と前述のようなリンカーを介して結合させることができる。
【０１９７】
光学的に標識したヘテロ多量体構成物を注入した後、造影剤に用いた光標識にふさわしい波長の1つ以上の光源（レーザーなど）で患者をスキャンする。用いる光線は単色または多色であり、持続的またはパルスであることができる。透過、分散または反射した光線を、1つまたは複数の波長に調節した光検出器を介して検出し、患者内の標的含有組織（KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet複合体を含有する組織など）の位置を測定する。光学的パラメータの変化を経時的に監視し、標的部位（血管新生部位など）における光学的に標識した試薬の蓄積を検出する。本発明の光学的造影試薬とともに、従来の画像処理機器および検出機器を用いることができる。
【０１９８】
上述の光学的造影試薬も、光学的に標識した造影剤で実施する音波光学的または音ルミネセンス画像検査に用いることができる（米国特許第5,171,298号、WO第98／57666号およびその参照文献を参照されたい）。音波光学的画像法においては、超音波照射を患者に対して行い、透過、放出または反射する光線の光学的パラメータに影響を与える。音ルミネセンス画像検査では、照射する超音波が実際に検出対象となる光線を生成する。こうした技術を用いた好適な画像法に関しては、WO第98／57666号に記載がある。
【０１９９】
D  放射性画像法（放射性核種画像法）および放射線治療
本発明のヘテロ多量体は、シンチグラフィー、SPECTまたはPET画像検査に適切な放射性核種レポーターまたは放射線療法に適切な放射性核種と抱合体を形成することができる。本発明のヘテロ多量体が、診断用画像検査に有用な放射性核種のキレート剤および放射線療法に有用な放射性核種のキレート剤の両方と抱合体を形成する構成物は、本発明の適応範囲内にある。
【０２００】
PET剤として用いる場合、ヘテロ多量体は51Mn、52Fe、60Cu、68Ga、72As、94mTcまたは110Inなどの種々のポジトロン放出金属イオンの一つと複合体を形成することができる。ヘテロ多量体構成物は、18F、124I、125I、131I、123I、77Brおよび76Brなどの放射性核種を用いてハロゲン化によって標識することができる。シンチグラフィーまたは放射線療法のための好ましい金属放射性核種としては、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Auおよび199Auが挙げられる。金属またはハロゲンの選択は、目的の治療または診断への応用に基づいて決定する。たとえば、診断目的において好ましい放射性核種としては、64Cu、67Ga、68Ga、99mTcおよび111Inが挙げられる。治療目的において好ましい放射性各種としては、64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Lu、186／188Reおよび199Auが挙げられる。99mTcは低価格であり、その入手容易性、造影特性および特異的活性が高いことから、診断への応用に特に好ましい。Tc-99mはその核特性および放射活性により、理想的なシンチグラフィー造影剤になる同位元素である。この同位元素は、単光子エネルギーが140keVであり、放射活性の半減期が約6時間であり、99Mo-99mTc生成器から容易に入手できる。
【０２０１】
金属放射性核種は、たとえば直鎖、大環状、テルピリジンおよびN3S、N2S2またはN4キレート剤によってキレート化することができ（米国特許第5,367,080号、米国特許第5,364,613号、米国特許第5,021,556号、米国特許第5,075,099号、米国特許第5,886,142号も参照されたい）、および当該業界で既知の他のキレート剤でキレート化することができる。このキレート剤には、HYNIC、DTPA、EDTA、DOTA、TETAおよびビスアミノビスチオール（BAT）キレート剤（米国特許第5,720,934号も参照されたい）が含まれるが、これに限定されない。たとえば、N4キレート剤については、米国特許第6,143,274号、第6,093,382号、第5,608,110号、第5,665,329号、第5,656,254号および第5,688,487号に記載がある。特定のN3Sキレート剤については、PCT／CA94／00395号、PCT／CA94／00479号、PCT／CA95／00249号および米国特許第5,662,885号、第5,976,495号および第5,780,006号に記載がある。また、キレート剤は、MAMA（モノアミドモノアミンジチオール）、DADS（N2Sジアミンジチオール）、CODADSなどのN3SおよびN2S2系を含有するキレート化リガンドであるメルカプト-アセチル-アセチル-グリシル-グリシン（MAG3）の誘導体を含むことができる。これらのリガンド系および種々の他の系については、LiuとEdwards、Chem Rev. 1999,99,2235-2268および本明細書の参照に記載がある。
【０２０２】
また、キレート剤は4叉の配列で金属を供与されないリガンド原子を含有する複合体を含むことができる。これらは、本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許第5,183,653号、第5,387,409号および第5,118,797号に記載のあるようなテクネチウムおよびレニウムジオキシムのボロン酸付加生成物を含む。
【０２０３】
また別の実施形態において、本発明の結合ポリペプチドのジスルフィド結合は、99mTcなどの放射性核種のキレート化のための2つのリガンドとして用いる。この方法において、ペプチドループはTc（ペプチド-S-S-ペプチドがペプチドS-Tc-S-ペプチドに変化）をトランスフェクトすることによって広がる。これは、文献（J.Q.Chen, A.Cheng, N.K.Owen, T.H.Hoffman, Y.Miao, S.S.Jurisson, T.P.Quinn. J.Nucl.Med. 2001,42,1847-1855）のペプチドを含有しつつも、生物学的活性を維持している他のジスルフィドでも用いられてきた。Tcの他のキレート化基は、骨格のアミド窒素、別のシスチンアミノ酸または他のアミノ酸の変更物によって供給することができる。
【０２０４】
特に好ましい金属キレート剤は、下記の化学式20、21および22のキレート剤（常磁性Gd3+などの111Inおよびランタニド、およびたとえば177Lu、90Y、153Smおよび166Hoなどの放射活性を有するランタニド）および化学式23、24および25のキレート剤（99mTc、186Reおよび188Re）を含む。これらおよびその他の金属キレート化基については、本明細書の参照に全文が組み込まれている米国特許第6,093,382号および第5,608,110号に記載がある。また、化学式22のキレート化基については、たとえば米国特許第6,143,274号に記載があり、化学式24のキレート化基については、たとえば米国特許第5,627,286号および第6,093,382号に記載があり、化学式25のキレート化基については、たとえば米国特許第5,662,885号、第5,780,006号および第5,976,495号に記載がある。
【０２０５】
2005519980.tif 000019
2005519980.tif 000020
2005519980.tif 000021
2005519980.tif 000022
2005519980.tif 000023
上記の化学式20および21において、Rはアルキル、好ましくはメチルである。上記の化学式24において、XはCH2またはOのいずれかであり、YはC1-C10分岐型または非分岐型アルキルのいずれかであり、Yはアリール、アリロキシ、アリールアミノ、アリールアミノアシルであり、アルキル基またはアリール基に付着した基がC1-C10分岐型または非分岐型アルキル基、C1-C10分岐型または非分岐型ヒドロキシまたはポリヒドロキシアルキル基またはポリアルコキシアルキルまたはポリヒドロキシ-ポリアルコキシアルキル基である場合、Yはアリールキルであり、JはC（＝O）-、OC（＝O）-、SO2-、NC（＝O）-、NC（＝S）-、N（Y）、NC（＝NCH3）-、NC（＝NH）-、N=N-、合成または天然に発生したアミノ酸に由来するホモポリアミドまたはヘテロポリアミンであり、式中すべてでnは1〜100である。これらの構造式の他の亜型については、たとえば米国特許第6,093,382号に記載がある。前述の特許、応用および参照の開示内容については、本明細書の参照に全文が組み込まれている。
【０２０６】
キレート剤はヘテロ多量体と直接共有結合させることができるか、前述の通りリンカーを介してヘテロ多量体と結合した後、選択した放射活性金属で直接標識することができる（WO第98／52618号、米国特許第5,879,658号および米国特許第5,849,261号を参照）。
【０２０７】
放射活性テクネチウムの複合体は診断用画像検査に特に有用であり、放射活性レニウムの複合体は放射線療法に特に有用である。放射活性テクネチウムと本発明の試薬との複合体を形成する場合、テクネチウム複合体、好ましくはTc-99m過テクネチウム酸塩を、還元剤の存在下で試薬と反応させる。好ましい還元剤は、亜ジチオン酸塩、第一錫イオンまたは第一鉄イオンであり、最も好ましい還元剤は塩化第一錫である。こうした複合体を調製するには、あらかじめ量を測定した標識対象となる本発明の試薬および試薬をTc-99mで標識するための十分量の還元剤とを入れた密封バイアルからなるキットが便利である。あるいは、適切なキレート剤と抱合体を形成した本発明のヘテロ多量体をあらかじめ調製した不安定なテクネチウムの複合体およびその他の移送リガンドとして知られている化合物と反応させて、複合体を形成する。この過程はリガンド交換と呼ばれるもので、当該業界においてよく知られている。この不安定な複合体は、たとえば酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩またはマンニトールなどの移送リガンドなどを用いて形成することができる。本発明に有用なTc-99m過テクネチウム酸塩のなかに含められるのは、ナトリウム塩またはアンモニウム塩または低分子量のアルキルアンモニウム塩などのアルカリ金属塩である。
【０２０８】
金属が放射活性レニウムである場合の本発明の複合体の調製は、+5または+7酸化状態でレニウム開始材料を用いることで達成することができる。レニウムがRe（VII）状態にある化合物の例は、NH4ReO4またはKReO4である。たとえば、Re（V）はたとえば[ReOCl4]（NBu4）、[ReOCl4]（AsPh4）、ReOCl3（PPh3）2およびReO2（ピリジン）4+として入手することができる（Phはフェニル、Buはn-ブチルである）。レニウム複合体を形成することのできるその他のレニウム試薬も使用することができる。
【０２０９】
本発明による放射活性物で標識したシンチグラフィー用造影剤は、好適な放射活性量を有する形で提供される。Tc-99m放射活性複合体を形成するには、一般に放射活性を約0.01ミリキュリー（mCi）〜100mCi／mLの濃度で含有する溶液中で放射活性複合体を形成するのが好ましい。
【０２１０】
一般に、投与する用量単位は約0.01〜約100mCi、好ましくは1〜20mCiの放射活性を有する。注射溶液の用量単位は約0.01〜約10mLである。
【０２１１】
本発明の放射性核種で標識したヘテロ多量体構成物の典型的用量は、10〜50mCiである。ヘテロ多量体放射性核種造影剤を患者に注入した後、PETカメラまたは造影剤に組み込んだ核種のガンマ線エネルギーで較正したγカメラを用いて、造影剤の取り込み部位を画像化し、その部位に存在する放射活性量を定量する。in vivoにおける部位の画像化には、数分かかることがある。ただし、画像化には必要であれば、放射線標識したペプチドを患者に注入してから数時間またはそれ以上時間をかけることができる。ほとんどの場合、十分量の投与量が部位に蓄積され、約6分以内に画像化して、シンチフォトを撮影することができる。
【０２１２】
本発明の放射線治療用化合物の適切な投与スケジュールは、当該業界に精通した業者に既知である。化合物は単回または反復投与のIVまたはIP注射を含むがこれに限定されない多くの方法で投与することができ、使用する放射活性量は標的組織に損傷を与えるか焼灼できるのに十分な量でありつつ、非標的部位（正常組織）に実質的な損傷を与えない程度の量とする。必要な量および用量は、構成物が異なれば異なり、使用する同位元素のエネルギーおよび半減期、取り込みの程度および体外への造影剤の排出、ならびに腫瘍の体積に左右される。一般に、用量は単回投与約30〜50mCiから、約3キュリーの蓄積用量までの範囲内とできる。
【０２１３】
本発明による放射線療法組成物には、生理学的に許容可能な緩衝材を含めることができ、注入前に化合物が放射線分解による損傷を受けないように放射線安定剤を必要とすることができる。放射線安定剤は当該業界に精通した業者に既知であり、たとえばパラアミノ安息香酸、アスコルビン酸、ゲンチシン酸などを含むことができる。
【０２１４】
本発明の放射製剤を調製するのに必要な構成要素を放射性核種を除きすべて含む単回または反復投与用バイアルキットは、本発明の完全な一部である。
【０２１５】
単回投与用バイアルキットは好ましくはキレート化リガンド（金属放射性核種を使用する場合）、第一錫塩の供給源（還元が必要な場合、すなわちテクネチウムを用いる場合）、またはその他の製剤学的に許容しうる還元剤を含み、製剤学的に許容しうる酸または塩基でしかるべく緩衝して、pHを約3〜約9に調節する。使用する還元剤の量および種類は、形成する交換複合体の性状にきわめて左右される。適切な条件は当該業界において既知である。キットの内容物は凍結乾燥されているのが好ましい。こうした単回投与用バイアルキットは任意に、グルコヘプトネート、グルコネート、マンニトール、マレート、クエン酸または酒石酸などの不安定リガンドまたは交換リガンドを含むことができ、最終製品の放射化学的純度および安定性を向上させるのに役立つジエチレントリアミン-五酢酸（DPTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、またはα、βまたはγシクロデキストリンのような反応調節剤も含むことができる。また、このキットは安定剤、凍結乾燥工程で役立つべく設計されたマンニトールなどの増量剤、およびその他の当該業界に既知の添加剤を含むことができる。
【０２１６】
反復投与用バイアルキットは好ましくは同じ一般的な構成要素を含むが、放射製剤を再調製するのに1つ以上のバイアルを使用する。たとえば、1つのバイアルには、不安定なTc（V）複合体を形成するのに必要な成分のすべてが入っており、後で過テクネチウム酸塩（第一錫の供給源またはその他の還元剤）を添加する。過テクネチウム酸塩をこのバイアルに添加し、しかるべき時間待機した後、このバイアルの内容物をリガンドならびにpHを至適値に調節するのに適切な緩衝材の入った第二のバイアルに入れる。約5〜60分の反応時間の後、本発明の複合体が形成される。この反復投与用バイアルキットの2本のバイアルの内容物はいずれも凍結乾燥されているのが有益である。上述の通り、反応調節剤、交換リガンド、安定剤、増量剤などが2本のバイアルのいずれか、または両方に存在していてもよい。
【０２１７】
他の治療への応用
本発明のヘテロ多量体構成物は、治療薬剤の活性および／または有効性を、その薬剤の標的に対する親和性を高めるか、標的への貯留時間を長くすることによって、向上させるのに用いることができる。この実施形態において、ヘテロ多量体は治療薬剤と抱合体を形成する。あるいは、上述のように、治療薬剤を含有するリポソームまたはバブルを、本発明のヘテロ多量体と抱合させることができる。この治療薬剤は、上述の放射線治療剤、薬物、化学療法剤または抗癌剤、遺伝材料または遺伝子送達賦形剤などであることができる。この抱合体のヘテロ多量体部分により、この治療薬剤は標的発現／集中部位に「住み着く」ことができ、これらの部位に対する抱合体の親和性が高まることから、抱合体の治療活性はより限局したものとなり、標的部位に集中する。たとえば、ある実施形態において、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、腫瘍で起こるものなど望ましくない血管新生に対して、KDRまたはVEGF／KDR複合体に対する親和性を提供するか向上させ、血管新生を行う内皮細胞上のKDRまたはVEGF／KDR複合体での貯留時間を提供するか延長させることによって、治療薬剤（抗血管新生剤または抗癌剤など）の活性を向上させるのに用いることができる。本発明のこの観点において、ハイブリッド剤は、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体と治療薬剤を抱合することによって提供される。こうしたヘテロ多量体構成物は、血管新生に起因する疾患、特にヒトを含む哺乳動物における腫瘍の増殖および転移の治療に有用である。治療方法は、治療を必要とする哺乳動物に、治療薬剤と抱合させたKDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドのヘテロ多量体構成物の有効量を投与することからなる。また、本発明は、ヒトをはじめとする哺乳動物の血管新生に起因する疾患の治療薬剤の製造にこうした抱合体を用いる方法も提供する。cMetまたはHGF／cMet複合体結合部分からなる本発明のヘテロ多量体構成物は、同様に増殖または血管新生に起因する疾患の治療に用いることができる。
【０２１８】
本発明のこの観点において好適な治療薬剤としては、プラチナ化合物（スピロプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチンなど）、メトトレキセート、アドリアマイシン、ミトマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイシン、シトシン、アラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトポリリジン、ビンクリスチン、ブスルファン、クロラムブチル、メルファラン（PAM、a,L-PAMまたはフェニルアラニンマスタードなど）、メルカプトプリン、マイトタン、塩酸プロカルバジン、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD）、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、ミトマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、アミノグルテチミド、エストラムスチンリン酸ナトリウム、フルタミド、酢酸塩、酢酸メゲストロール、クエン酸タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン（m-AMSA）、アスパラギナーゼ（Ｌ‐アスパラギナーゼ）Erwinaアスパラギナーゼ、エトポシド（VP-16）、インターフェロンCX-2a、インターフェロンCX-2b、テニポシド（VM-26、硫酸ビンブラスチン（VLB）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ブレオマイシン、アドリアマイシンおよびアラビノシルなどの抗腫瘍剤；SU5416およびSU6668（Sugen／Pharmacia & Upjohn）、エンドスタチン（EntreMed）、アンギオスタチン（EntreMed）、コンブレタスタチン（oxigene）、シクロスポリン、5-フルオロウラシル、ビンブラスチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ダウノルビシン、イムノトキシンなど、血管新生および／または腫瘍の増殖に重要なシグナル分子に対する活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤などの抗血管新生剤；凝固因子；アシクロビル、アマンタジン、アジドチミジン（AZTまたはジドブジン）、リバビリンおよび一水和ビダラビン（アデニンアラヒノシド、ara-A）などの抗ウイルス剤；抗生物質、抗マラリア剤、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、メトロニダゾール、キニンおよびアンチモン酸メグルミンなどの抗原虫剤、ジフルニサル、イブプロフェン、インドメタシン、メクロフェナメート、メフェナミン酸、ナプロキセン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダック、トルメチン、アスピリンおよびサリチル剤などの抗炎症
剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
ヘテロ多量体構成物が他の組織を標的とし、その他の病態を治療するのに有用である場合、当該業界に精通した業者は適切な治療薬剤と置換することができる。
【０２２０】
本発明のヘテロ多量体構成物は、遺伝材料を特異的細胞にターゲティングするのに用いることもできる。たとえば、本発明のヘテロ多量体構成物は、遺伝材料を目的の標的を含む細胞または組織に限局させるのに用いることができる。このため、こうした構成物は遺伝子治療に有用である。遺伝材料としては、組換えRNAおよびDNAおよびアンチセンスRNAおよびDNAを含む、天然または人工のいずれかのRNAまたはDNAなどの核酸が挙げられる。使用することのできる遺伝材料の種類としては、たとえば遺伝子を運搬する発現ベクターであるプラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（YAC）および欠損ウイルスまたは「ヘルパー」ウイルス、抗原核酸、一本鎖および二本鎖RNAおよびDNAおよびホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートオリゴデオキシヌクレオチドといったその類似体が挙げられる。また、遺伝材料は、たとえば脂質、タンパク質または他のポリマーと結合させることができる。遺伝材料の送達賦形剤としては、たとえばウイルス粒子、レトロウイルスまたはその他の遺伝治療用ベクター、リポソーム、脂質（特にカチオン性脂質）と遺伝材料との複合体、デキストラン誘導体と遺伝材料との複合体などが挙げられる。
【０２２１】
好ましい実施形態において、本発明のヘテロ多量体構成物は、血管新生に起因する疾患の治療における遺伝子治療に用いられる。個の実施形態において、血管新生に起因する疾患の治療に有用な遺伝材料または遺伝材料を含有する1つ以上の送達賦形剤は、本発明のKDRまたはVEGF／KDR複合体結合へテロ多量体またはcMetまたはHGF／cMet複合体結合へテロ多量体1つ以上と抱合させ、患者に投与する。
【０２２２】
遺伝材料および本発明のKDR結合へテロ多量体を含む構成物は、特に血管新生を行う内皮細胞に選択的に遺伝子をトランスフェクトするのに用いることができる。これは癌を治療するのに有用なだけではなく、血管新生を阻害することで再狭窄が阻害されるという血管形成術後にも有用である。
【０２２３】
治療薬剤および本発明のヘテロ多量体は、本明細書に記載のリンカーのいくつかを用いて、既知の方法で結合または融合させることができる。好ましいリンカーは、置換型または非置換型アルキル鎖、アミノ酸鎖、ポリエチレングリコール鎖およびその他の当該業界で既知の単純なポリマーリンカーである。より好ましくは、治療薬それ自体がタンパク質であり、それをコードするDNA配列が既知である場合は、治療薬のタンパク質および本発明の結合ポリペプチドは、上述のように組換えDNA技術を用いて作成した同じ合成遺伝子から共発現させることができる。たとえば、こうした配置が治療薬タンパク質または結合ポリペプチドのいずれかの必要とされる生物学的機能を破壊しないと判断される場合は、結合ポリペプチドをコードする配列を、治療薬タンパク質をコードする配列の枠組みに融合させ、そのペプチドが治療薬タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端で、または、末端間の場所で発現できるようにする。この一般的方法の特に有益な点は、多数の一列に並んだ結合ポリペプチドをconcatamerizationすることが可能で、それにより各々の治療薬タンパク質に関連する結合部位の数および濃度が増加する。この方法では、結合ペプチドの結合力は高まり、それにより組換え治療薬融合タンパク質の有効性が高まることが期待される。
【０２２４】
1つ以上の結合ポリペプチドのコード配列を含有する遺伝子組換えタンパク質も同様に、画像検査または治療への応用に有用である。たとえば、上で考察した種々のプレターゲティング法において、KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet結合ペプチドのコード配列を、たとえば放射性核種（または他の検出可能標識）のキレート剤と結合する抗体（または抗体断片または抗体を含む遺伝子組換えDNA構成物など）をコードする配列の枠組み内に融合させることができる。次に、KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet結合ポリペプチドを発現する抗体を患者に投与して、KDR-またはcMet-発現組織に限局または結合させる。未結合抗体を排出させた後、抗体が認識することのできるキレート剤-放射性核種（または他の検出可能標識）複合体を投与すれば、KDR-またはcMet-発現組織の画像化または放射線治療が可能になる。また、結合ペプチドのコード配列は、たとえば、血清タンパク質または他の生物学的作用（アポトーシス、凝固、内在化、異化、細胞静止、免疫系の促進または抑制、またはこれらの組み合わせ）を発揮するタンパク質をコードする配列と枠組み内で融合させることができる。結果得られた遺伝子組換えタンパク質は、画像検査、放射線治療および血管新生が関与する癌および他の疾患または本明細書に記載の病原体に起因する疾患の治療に有用である。
【０２２５】
また、本発明のヘテロ多量体は、それ自体治療薬として多数の疾患を治療するのに用いることができる。たとえば、タンパク質または他の分子（増殖因子、ホルモンなど）の結合が疾患の進行に必要であるか、寄与している場合、結合部分がこうした結合を阻害することから、こうした結合部分を含むヘテロ多量体が治療薬として有用となる。同様に、結合部分それ自体の結合が疾患の進行を阻害する場合、こうした結合部分を含有するヘテロ多量体も治療薬として有用となる。
【０２２６】
血管新生活性には、VEGFの結合およびKDRの活性化が必要である。ある実施形態において、VEGFがKDRに結合するのを阻害する（または何らかの別の方法でKDRの活性化を阻害する）KDRまたはVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、抗血管新生剤として用いることができる。KDRの活性化を阻害する本発明の特定のヘテロ多量体を実施例で検討する。特に好ましいヘテロ多量体は、ヘテロ二量体を含有する形成物D1（実施例9に構造式を記載）である。このほか、好ましいヘテロ二量体構成物は、D4、D5およびD6（実施例9および15に構造式を記載）である。これらおよびその他のヘテロ多量体は、癌または関節炎、アテローム斑、トラコーマ、角膜移植片血管新生、乾癬、強皮症、血管腫、肥厚性瘢痕、血管癒着、血管線維腫、および糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒否反応、血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖症などの眼疾患、rebeosis、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、乳頭上新生血管、毛細血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫および創傷肉芽形成などの不適切または過度の血管新生に起因する他の疾患の治療に有用である。血管新生に関与するその他の疾患は、たとえば固形腫瘍、腫瘍転移および良性腫瘍である。こうした腫瘍および関連疾患は当該業界において基地であり、たとえば、黒色腫、中枢神経系腫瘍、神経内分泌腫瘍、肉腫、多発骨髄腫ならびに乳癌、肺癌、前立腺癌、大腸癌、頭頚部癌および卵巣癌を含む。このほかの腫瘍および関連疾患は2000年2月15日付でMosesらに発行された米国特許第6,025,331号の表1に記載があり、これらは本明細書に参照として組み込まれている。良性腫瘍には、たとえば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫が含まれる。その他の血管増殖に関与する関連疾患または病態には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症および肥厚性瘢痕および潰瘍が含まれる。さらに、本発明のヘテロ多量体は、たとえば避妊薬として着床に必要な子宮の血管新生を低減または予防するのに用いることができる。
【０２２７】
本発明のヘテロ多量体は、VEGFがKDRと結合した場合に起こる血管透過性異常の治療にも有用である。腎不全では、抗VEGF抗体が損傷を回復させることが明らかになっており、同様に本発明の化合物もたとえば糖尿病のような腎透過性の病態を回復させることができる。
【０２２８】
HGFとcMet受容体の相互作用によって干渉されることにより、腫瘍の増殖は緩徐となるため、また別の実施形態において、cMetとHGFとの結合を阻害する（または何らかの別の方法でcMetの活性化を阻害する）cMetまたはHGF／cMet複合体結合ポリペプチドは、腫瘍およびその他の増殖性疾患を治療するのに用いることができる。cMetを阻害する特別なヘテロ多量体については実施例に記載がある。好ましいヘテロ多量体はD28（実施例9に構造式を記載）である。
【０２２９】
さらに、本発明のヘテロ多量体は、たとえばマラリア菌、HIV、SIV、サル出血熱ウイルスなどの特定の病原体に起因する疾患を治療するのに有用である。NCBIにおいてBLASTプログラムを用いたファージディスプレイで同定したKDR結合ペプチドの配列相同性の探索は、病原体の表面に存在することが既知または期待されている多数の同族体を同定してきた。KDRとVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドおよび種々のマラリア菌、HIV、SIV、サル出血熱ウイルスおよび腸管出血性大腸菌由来のタンパク質との間に相同性葉認められなかった。同族体のタンパク質のなかでも、PfEMP1およびEBL-1などのいくつかは、病原性において役割を果たすことが既知である突然変異性の高い接着タンパク質である。これらのタンパク質は複数の結合部位を有しており、宿主細胞の表面で1つ以上の標的分子と結合することができる。突然変異性が高く、遺伝子組換え速度が速いため、これらのタンパク質は迅速に新たな結合部位を発現して、生存および／または侵入を促進する。同様に、HIVのgp120のようなタンパク質（これも本明細書に開示のKDR結合ペプチドのいくつかと相同性を有する）は、病原体のその宿主への接着に重大な役割を果たす。これまでに報告されていないが、本明細書に開示のKDR結合ペプチドと相同性を有する病原体タンパク質の多くもKDRに結合すると考えられる。病原体タンパク質配列とこれに相当するペプチド配列を比較すると、ペプチド配列の変化またはその他の変化がその結合特性を高めていることが示唆される。また、本明細書に開示のKDR結合ペプチド配列を含むヘテロ多量体構成物は、相同性を有する病原体による感染を遮断するのに有用である。事実、HIV感染を予防するために、ウイルスエンベロープタンパク質がCD4などの既知の細胞表面標的と結合するのを阻害するという試みが現在行われている。Howie SEら、FASEB J 1998 Aug; 12(11):991-8, "Synthetic peptides representing discontinuous CD4 binding epitopes of HIV-1 gp120 that induce T cell apoptosis and block cell death induced by gp120"。このように、KDRは多数の病原体のこれまで未知であった標的を代表するものであり、KDRまたはVEGF／KDR複合体結合ペプチドを含むヘテロ多量体構成物は、こうした病原体に起因する疾患の治療に有用である。
【０２３０】
上述の治療法において、化合物は治療薬剤に従来用いられているあらゆる経路で投与してもよい。たとえば、非経口的、経腸的、鼻腔内的、好ましくは注射またはボーラス注射、または蓄積注射または徐放製剤などである。好ましい実施形態において、組成物は、人間に対する経静脈投与に適合した製剤学的組成物と同じようにルーチンな方法に準じて製造することができる。通常、静脈内投与の粗生物は、滅菌等張性水性緩衝材を用いた溶液である。このほか、製剤学的に許容しうる担体は、滅菌水、食塩水、緩衝化食塩水（リン酸塩または酢酸塩などを含む緩衝材）、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、パラフィンなどが挙げられるが、これに限定されない。必要であれば、組成物は、活性成分と反応して劣化させないことを条件に、溶解剤、注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩、潤滑剤などを含むことができる。同様に、組成物は、活性成分と反応して劣化させないことを条件に、非経口的、経腸的または鼻腔内的投与に好適な従来の調剤、すなわち製剤学的に許容しうる有機または無機担体を含むことができる。一般に、成分は個々にまたは混合して、用量単位の剤形で供給される。たとえば、凍結乾燥粉末、または水を入れていない濃縮物をアンプルまたは小袋などの密封容器にいれ、活性成分の活性単位量を記載しておく。組成物を点滴によって投与する場合、これは滅菌の製剤学的等級「注射用水」または生食水を入れた注射用ボトルに分散させることができる。粗生物を注射によって投与する場合、注射用滅菌水または生食水のアンプルを提供して、成分が投与前に混合されるようにする。
【０２３１】
投与する材料の量は、病態の重症度によって左右される。たとえば、血管新生性疾患たとえば腫瘍の増殖を治療する場合、腫瘍の位置および大きさが、投与する材料の量に影響を与える。使用する正確な用量および投与方法については、当然ながら愁訴の性状の観点から、治療を監視する医師によって決定が下されなければならない。一般に、ヘテロ多量体／治療薬剤抱合体の用量は、治療薬剤単独でルーチンになっている用量に従うが、本発明の標的に対する親和性が優れていることから、従来の用量よりも減量できることがある。
【０２３２】
こうした抱合体製剤学的組成物は、好ましくは非経口的投与、最も好ましくは静脈内または筋肉内投与用に製造されているのがよい。一般に、また投与経路が静脈内または筋肉内である場合は特に、製剤学的組成物はボーラスで、2回以上の用量を間隔をあけて、または常に、または非直線的点滴で投与することができる。
【０２３３】
ヘテロ多量体は、病態の性状および目的とする転帰によって、ある個人に好適な期間投与することができる。ヘテロ多量体構成物は、予防的に、すなわち疾患の診断前にまたは個人にその病態の素因が現れてから投与することができる。あるいは、本発明のヘテロ多量体は患者が疾患の症状を呈している最中か、症状が収まった後か、あるいはその他の何らかの方法で緩和した後（たとえば腫瘍の除去手術後など）に投与することができる。また、本発明のヘテロ多量体は維持療法の一環として、たとえば症状または疾患の再発を予防または低減させる目的で、投与することができる。本明細書に記載の通り、本発明のヘテロ多量体は、全身投与または局所投与することができる。
【０２３４】
本明細書で用いる用語「治療の」は、任意の病態の症状を少なくとも部分的に緩和することを意味する。本発明のヘテロ多量体構成物は、有用とされるのに必ずしも症状を完全に緩和する必要はない。たとえば、ある個人の治療により、腫瘍または病変部位の大きさが退縮するか、腫瘍または病変部位のサイズが大きくなるのを予防するか、他の症状が部分的に緩和することがある。治療により、対象部位の血管数が減少したり、対象部位の血管数の増加を予防することができることがある。治療により、原発腫瘍の転移先での増殖の数またはサイズが予防または低減することがある。
【０２３５】
ある実施形態において、緩和できる症状には、VEGF受容体活性および内皮細胞移動能といった生理学的特性が含まれることがある。本発明のヘテロ多量体は、VEGF-2／KDR、VEGF-1／Flt-1およびVEGF-3／Flt-4などのVEGF受容体の活性を阻害することができる。こうした阻害は、たとえば結合ペプチドまたはその構成物の存在下または治療後に、受容体のリン酸化状態を測定することによって検出できる。本明細書に記載の教訓に基づけば、当該業界に精通した業者は、本明細書に記載の結合ポリペプチドまたはその構成物を好適な用量どのように投与することができるか、および投与前、投与後にどのように測定することができるかについては既知のはずである。また別の実施形態において、関連受容体のリン酸化状態または、対象部位の内皮細胞の移動能は、その個人から採取した試料で計測することができる。VEGF受容体および内皮細胞を試料から単離し、本明細書に記載の分析を用いる。
【０２３６】
ヘテロ多量体の用量は、個人の年齢、性別、健康状態および体重によって異なり、病態の性状および全体的な治療法によっても異なる。多量体の生物学的作用を本明細書に記載する。このため、本明細書に記載のヘテロ多量体の生物学的作用、および目的の治療による転帰に基づき、投与経路至適化手段を通じて、当該業界に精通した業者によって用量を決めることができる。通常、1日の投与量は約0.1μg／kgから約1mg／kgである。
【０２３７】
本明細書に記載のヘテロ多量体は、製剤学的に許容しうる調剤とともに単一の活性成分として投与することができるか、他の結合ポリペプチドおよびその構成物、他の治療薬剤、またはその組み合わせとともに投与することができる。また、ヘテロ多量体は治療薬剤と抱合体を形成して、たとえば特異性を高め、体内での貯留時間を延長し、治療効果を向上する。こうした他の治療薬剤としては、たとえば他の抗血管新生化合物、抗腫瘍剤などが挙げられる。治療薬剤は、抗体も含むことができる。
【０２３８】
さらに、本発明のヘテロ多量体は、内皮細胞の生着器として用いることもできる。このため、ヘテロ多量体構成物は、たとえば治療ポリペプチドをコードする核酸と抱合体を形成し、核酸を内皮細胞にターゲティングする。いちど核酸に曝されると、それによって治療ペプチドが標的細胞に送達される。
【０２３９】
また別の実施形態において、治療薬剤は超音波造影化合物とともに用い、KDR、VEGF／KDR複合体、cMet、またはHGF／cMet結合ペプチドを含むその前記超音波造影剤は前述のように造影剤を構成する包膜を形成する材料（特にマイクロバブルまたはマイクロバルーン）に結合する。たとえば、前記造影剤／治療薬剤の結合については、本明細書に記載として全文が組み込まれている米国特許第6,258,378号に記載がある。このように、KDR、VEGF／KDR複合体、cMetまたはHGF／cMet複合体の発現病的部位に結合した超音波造影剤および任意の造影剤の投与後、この病原部位をエネルギー光線（好ましくは超音波たとえば0.3〜3MHz）で照射して、上述の米国特許第6,258,378号の例に開示されているように、小胞体の破裂を引き起こす。治療薬剤の治療効果は、このように小胞体の破裂によって放出するエネルギーによって有利に促進され、特に治療薬剤を標的とする病原部位に有効に送達することができる。
【０２４０】
上述のように、ヘテロ多量体は好適な経路ではどこからでも投与できる。好適な投与経路は、局所塗布、経皮的、非経口的、経胃腸管的、膣内、および肺胞内投与を含むがこれに限定されない。目的の投与経路用の組成物は、製剤業界で既知のあらゆる方法を用いて調製することができる。用量、剤形、投与法、組成などに関する詳細は、標準的な製剤学テキスト、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Alfonso R. Gennaro, ed (Mack Publishing Co., Easton, PA 1990) などにさらなる考察があり、これは本明細書に参照として組み込まれている。
【０２４１】
局所塗布では、ヘテロ多量体はたとえばクリーム、ゲルまたはリンスに懸濁して、ポリペプチドまたは構成物が皮膚から侵入して血流に入り、全身に送達されるようにするか、対象部位に接触させて局所的送達を行うようにすることができる。局所塗布に好適な組成物には、ポリペプチドが少なくとも最小限は溶解できる製剤学的に許容しうるあらゆる基剤が含まれる。
【０２４２】
経皮的投与の場合、ヘテロ多量体は、好適な経皮的機器または「パッチ」に製剤学的に許容しうる懸濁液で塗布することができる。本発明のヘテロ多量体の投与に好適な経皮的機器の例については、たとえば2000年12月26日付でFoldvariらに発行された米国特許第6,165,458号、2001年8月4日付でSintovらに発行された米国特許第6,274,166B1号に記載があり、これらの教訓は本明細書の参照に組み込まれている。
【０２４３】
非経口的投与では、ヘテロ多量体は、たとえば製剤学的に許容しうる滅菌等張溶液、たとえば生食水およびリン酸緩衝生食水で懸濁することができる。次に、本発明の構成物を静脈内、動脈内、腹腔内または皮下に注射することができる。
【０２４４】
経胃腸管投与および膣内投与では、ヘテロ多量体は、製剤学的に許容しうる粉末、ピルまたは飲用液に組み込むことができ、直腸または腟への投与では坐剤に組み込むことができる。
【０２４５】
肺胞内、口腔内または肺内投与では、ヘテロ多量体は、エアロゾルおよび吸入または口漱に好適な製剤学的に許容しうる調剤に懸濁させることができる。肺胞内投与に好適なアトマイザーやバポライザーなどの機器も、本発明の適応範囲内に含まれる。口腔または肺経路を通じてポリペプチドをエアロゾルの形で送達するのに好適な調剤の例は、2001年11月6日にPankaj Modiに発行された米国特許第6,312,665B1号に記載があり、その教訓は本明細書の参照に組み込まれている。
【０２４６】
また、本発明のヘテロ多量体は経鼻的または経眼的に投与することができ、その場合ヘテロ多量体は点眼・点鼻に好適な製剤学的に許容しうる液体で懸濁する。
【０２４７】
本発明のヘテロ多量体は、ポリペプチドが患者の体内で長期間放出（持続的または制御された放出）されるように投与することができる。たとえば、単回投与により本発明の構成物が少なくとも1週間、または1年かそれ以上にわたって送達されるように、ヘテロ多量体を組成物に調製することができる。放出制御系としては、モノリシックまたはレザバー型のマイクロカプセル、蓄積インプラント、浸透圧ポンプ、小嚢、ミセル、リポソーム、経皮パッチおよびイオントランスフェクト機器が挙げられる。ある実施形態において、本発明のヘテロ多量体は緩徐に分解する非毒性のポリマーで封入するか、混合する。本発明の構成物の制御放出に好適なこのほかの調剤については、1983年7月5日付でFolkmanらに発行された米国特許第4,391,797号に記載があり、その教訓は本明細書の参照に組み込まれている。
【０２４８】
本発明のヘテロ多量体をある個人に送達するまた別の好適な方法は、in vivoにおいてポリペプチドを生成するというものである。ポリペプチドをコードする遺伝子を患者に投与し、コードされたポリペプチドが発現できるようにすることができる。遺伝子は一時的に発現させることができる。特別な実施形態において、ポリペプチドをコードする遺伝子は患者から採取した細胞にトランスフェクトする。この方法は、ex vivo遺伝子治療と呼ばれる。次に、ポリペプチドを発現するようになった細胞を患者の体内に戻す。ex vivo遺伝子療法の手法は当該業界内で既知であり、たとえば1998年3月21日付でAndersonらに発行された米国特許第4,391,797号に記載があり、その教訓は本明細書の参照に組み込まれている。
【０２４９】
本発明に準拠するヘテロ多量体構成物の調製および試験について、さらに以下の実施例を用いて説明する。以下の実施例に含まれている特異的パラメータは、本発明の実施例を説明することを意図したものであって、本発明の適応範囲をいかなるかたちでも制限するものではない。
【０２５０】
［実施例１］
ペプチド合成およびフルオレセイン標識
陽性ファージ分離株に対応する、選択されたKDRまたはVEGF／KDR結合ペプチドが、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（9-fluorenylmethloxycarbonyl）のプロトコルを用いて、固相合成され、逆相クロマトグラフィーにより浄化された。ペプチドの分子量は、エレクトロスプレー質量分析により確認され、ペプチドは、吸光度２８０ｎｍで計量された。合成のため、ペプチドが摘出されたファージベクター配列から、２つのＮ末端アミノ酸および２つのＣ末端アミノ酸が確保され、-グリシン-グリシン-グリシン-リジン-NH2リンカーが、ペプチドの各々のＣ末端に付加された。選択されたリジン残基を伴ったペプチドは、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオクロシクロヘックス-1-イリデン）-3-メチルブチル（ivDde)で保護される。ivDdeは、Ｃ末端リジンとの選択的なカップリングを可能とし、ペプチド分裂の間は除去されず、結合後に、２％のヒドラジンを加えたDMFの中か、０．５Ｍのヒドロキシルアミンを加えたｐＨ８の水の中で、除去することができる。
【０２５１】
各々のペプチドは、フルオレセイン（Ｎ-ハイドロキシスキニミド・エステル誘導体）またはフルオレセインイソシアネート（FITC）を用いて、２％のジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を入れたDMFの中で、Ｃ末端リジン上にフルオレセイン標識された。ペプチドが、ivDde保護リジンを含んでる場合は、２％のヒドラジン（すべての遊離NHS-フルオレセインと反応し、内部保護基を除去する）を加えることにより、反応を抑制した。その他すべてのペプチドについては、０．５ＭのヒドロキシルアミンｐＨ８を同量加えることにより、反応を抑制した。抑制反応は、次に、DMFが１０％未満になるまで水で希釈され、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを使用して精製された。ペプチドは、ＬＣ-ＭＳシステム（ＳＣＩＥＸ  ＡＰ１５０単４極質量分析計付き、ＨＰ１１００HPLC）で、純度および正確な質量を測定された。
【０２５２】
蛍光異方性測定およびBiaCore分析
蛍光異方性測定は、３８４-ウェル・マイクロプレート内で、容量１０μＬの結合緩衝液（PBS、０．０１％Tween-２０、ｐＨ７．５）内で、テカン・ポラリオン・フルオレセイン・ポラリゼーション・プレート・リーダー（Tecan Polarion fluorescence polarization plate reader）を使用して、実施された。幾つかのケースでは、ヘパリン（０．５μｇ／mL）または１０％のヒト血清を、結合緩衝液に加えた。フルオレセインで標識されたペプチドの濃度は、一定（２０ｎＭ）に維持され、KDR-Ｆｃ（または同様の標的）の濃度は様々に変化させた。結合混合液は、測定の前の１０分間、３０℃でマイクロプレート内で平衡化された。観察された異方性の変化は、見かけのＫDを得るための非線形回帰を介して、以下の等式（１）に適合した。等式（１）から、合成ペプチドおよびＨＳＡが、化学量論で１：１の溶液内において、可逆複合体を形成することが推定される。
【０２５３】
2005519980.tif 000024
ここで、robsは、観測された異方性であり、rfreeは遊離ペプチドの異方性であり、rboundは、結合ペプチドの異方性であり、ＫDは、見かけの解離定数であり、KDRは、KDR全体の濃度であり、Ｐは、フルオレセインで標識されたペプチド全体の濃度である。
【０２５４】
KDR-Ｆｃ（またはその他のタンパク質標的）は、標準のアミンカップリング処置（０．５mg／ｍL溶液、１：２０希釈、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０、ＲLKDR-Ｆｃ＝１２８５９）により、ＣＭ５センサーチップのデキストラン表面に交差結合した。実験は、ＨＢＳ-Ｐ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ、塩化ナトリウム、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））内で実施された。減衰係数により定量化されたペプチド溶液は、HBS-P内で４００ｎＭに希釈された。また、２００、１００、５０および２５ｎＭ溶液を得るため、一連の希釈が実施された。会合のため、キンジェクト（kinject）プログラムを使用して、ペプチドを１分間、２０μＬ／mimで注入した。１分の解離を行った後、残ったペプチドは、５０μＬ／mimで１Ｍ塩化ナトリウムを２５秒間急速に注入することより、標的表面から引き剥がされた。全てのサンプルは、二重に注入された。各々のシリーズのペプチド間で、緩衝液の注入および非標的結合ペプチド注入は、追加の制御として機能した。センサ質量は、ＢＬＡ評価ソフトウェア３．１における、同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して、分析された。
【０２５５】
以下の通常の略語は、本仕様書を通じて、使用される。：９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（9-fluorenylmethloxycarbonyl）（ｆｍｏｃまたはＦｍｏｃ）、1-ヒドロキシベンオゾトリアゾール（1-hydroxybenozotriazole）（HOBt）、N,N'-ジイソプロピルカーボジイミド（N,N'-diisopropylcarbodiimide）（DIC）、N-メチルピロリドン（ＮＭＰ）、無水酢酸（Ａｃ2Ｏ2)、(4,4-ジメチル-2,6-ジオクロサイクロヘックス-1-イリダイン）-3-メチルブチル（ivDde)、トリフルオラ酢酸（ＴＦＡ）、試薬Ｂ（TFA:水：フェノール：トリイソプロピルシラン、８８：５：５：２）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｏ-（1H-ベンゾトライアゾール-1-yl）-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェイト（ＨＢＴＵ）、Ｏ-(7-アザベンゾトライアゾール-1-yl）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘクサフルオロホスフェイト（HATU）、Ｎ-ヒドロキシスキニミド（ＮＨＳ）、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、ジメチル・サルファオキシド（DMSO）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルフォーマミド（ＤＭＦ）、ヒト結晶アルブミン（ＨＳＡ）および放射化学精製水（ＲＣＰ）。
【０２５６】
実験方法
本実施例では、以下の方法が用いられた。
【０２５７】
方法１：  ＡＣＴ３５７ＭＰＳおよびＡＣＴ４９６ＭＯＳシンセサイザー用
ペプチドは、Fmocペプチド合成プロトコルを採用する、AdvancedChemTechＡＣＴ３５７またはＡＣＴ４９６シンセサイザーを使用して、NovaSynnTGR（Rinkアミド）樹脂（０．２mmol／ｇ）上に、特に、カップリング試薬としてHOBt／DICを使用し、溶剤としてＮＭＰを使用して、合成された。Fmocは、NobsSynTRG（Rinkアミド：ノヴァバイオケム、サンディエゴ、カリフォルニア州から入手）樹脂結合ペプチドを、２５％のピペリジンを加えたDMF内で、２度（４分と１０分）処理することにより、除去された。すべてのアミノ酸は、ＮＭＰ（アミノ酸が純粋なＮＭＰに溶けない場合は、ＤＭＦが加えられた）内で溶解された。アミノ酸濃度は、０．２５Ｍであって、HOBtおよびDICは、０．５Ｍであった。
【０２５８】
０．０４mmol規模の合成のために：
典型的なアミノ酸カップリングサイクル（洗浄ステップを含まない）は、ピペリジン溶液（２．４mL）を、各々のウェルに分配し、４分間混合し、その後全てのウェルを空するこのにより行われた。ＮＭＰ（３２０μＬ）、HOBt溶液（３２０μＬ、４当量）、アミノ酸（６４０μＬ、４当量)およびDIC（３２０μＬ、４当量）溶液が、それぞれのウェルに分配された。カップリング時間は、３時間であり；その後、樹脂は洗浄された。このサイクルは、それぞれのアミノ酸で繰り返された。最後のアミノ酸カップリングの後、樹脂結合ペプチドは、２５％ピペリジンにより処理され、Fmoc保護基を除去された。洗浄後、樹脂結合ペプチドは、１．０ＭのＡｃ2Ｏ（ウェル毎に１．２mL）およびＤＭＦ中のジイソプロピルエチルアミンにより、任意に混合液の中に様々な量のHOBtを含めて、３０分間キャップされた。樹脂は、最初にメタノールで洗浄され、次にジクロロメタンにより洗浄され、乾燥された。樹脂からのペプチドの切断および側鎖保護基の解離は、試薬Ｂを用いて、４．５時間で成し遂げられた。切断溶液は、収集され、樹脂は、試薬Ｂの追加分により洗浄した。結合した溶液は、乾燥するまで濃縮された。その残留物に、エーテルを渦巻き状に、またはかき混ぜるように加え、ペプチドを沈殿させた。エーテルの上澄みは、別の容器に移され、固形物が集められた。この過程は、不純物を除去するために２、３回、繰り返された。粗製ペプチドは、DMSOと水の混合液に溶解され、HPLC（カラム：Water'sAssociatesXterraＣ１８、１９×５０ｍｍ；溶液：０．１％ＴＦＡを加えた水および０．１％ＴＦＡを加えたＣＨ3ＣＮ；ＵＶ２２０ｎｍ；流量：５０〜６０mL／min）により精製された。ペプチドを含む溶液は、凍結乾燥され、望ましいペプチドが、白色のふわふわとした凍結乾燥物（＞９０％の純度）として得られた。
【０２５９】
純粋な直鎖ジシステインを含むペプチドは、０．１mg／mLから０．２mg／ｍLの間の濃度の、水-アセトニトリルの混合液、または水-DMSOの混合液に、溶解された。溶剤の選択は、溶剤内における粗製のペプチドの溶解能力で決定された。溶液のｐＨは、アンモニア水、炭化アンモニウム水、または重炭酸アンモニウム水で、７．５〜８．５に調製された。混合液は、大気中で２４〜４８時間、活発に攪拌された。DMSOを含まない溶剤系の場合には、溶液のｐＨは、トリフルオロ酢酸水で、２に調製された。混合液は、ペプチドを含む粗製の環状ジスルフィドを提供するよう、凍結乾燥された。環状ジスルフィド・ペプチドは、最小のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を含む１〜２mLの溶液（０．１％ＴＦＡ）の中に溶解された。得られた溶液を、逆相カラムに充填し、Ｃ１８またはＣ８のHPLCカラム（半調製用または調製用）を使用して、アセトニトリルの水中への勾配溶出により、所望の合成物を得た。DMSOを含む溶液の場合は、溶液は、DMSO濃度が、ペプチドの沈殿なしで最小化されるまで、希釈された。結果として得られた混合液は、即座に、希釈トリフルオロ酢酸でｐＨ２に酸性化され、逆相HPLCシステムにかけられ、前述のように精製された。望ましい物質を含む留分は、プールされ、ペプチドは、凍結乾燥により単離された。
【０２６０】
方法２：  ＡＣＴ３５７ＭＰＳおよびＡＣＴ４９６ＭＯＳシンセサイザー用
ペプチドは、以下の変更以外は方法１と同様にして合成された。ＨＢＴＵ／HOBt／ＤＩＥＡをカップリング試薬として、ＮＭＰを溶剤として使用した。前述のNovSyn-TGR樹脂から調整された低負荷（〜０．２mmol／ｇ)のFmoc-GGGK（Boc)-NovSyn-TGR樹脂が、０．０１mmol規模のペプチド合成のために用いられた。
【０２６１】
０．０１mmol規模の合成のために：
Fmoc基が除去された後、標準のカップリング過程が、HOBt（７２０μＬ、６当量）、アミノ酸（８０４μＬ、６．６当量)、ＨＢＴＵ（７２０μＬ、６当量）およびＤＩＥＡ（７９８μＬ、１３．３当量）の溶液を使用して行われた。混合液は、１５分間攪拌され、空にされ、樹脂が洗浄された。前述のように、全てのカップリングを済ませた後、切断および精製を経て、所望の直鎖ペプチドを含む溶液は、凍結乾燥され、ペプチドが、白色のふわふわとした固形物（＞９０％の純度）として得られた。
【０２６２】
エーテル沈殿した直鎖ジシステインを含む粗製ペプチドは、アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）の水溶液、またはDMSO水溶液に溶解することにより、環化された。なお、溶液のｐHは、アンモニア水、炭酸アンモニウム水、または重炭酸アンモニウム水を加えることにより、７．５〜８．５に調製された。ペプチドの濃度は、０．１mg／mL〜２．０mg／mLの間であった。混合液は、大気中で２４〜４８時間、活発に攪拌され、溶液のｐＨは、トリフルオロ酢酸水で、２に調製され、調製用逆相HPLCを用いて、アセトニトリルの水中への勾配により精製された。望ましい物質を含む留分は、プールされ、ペプチドは、凍結乾燥により単離された。
【０２６３】
方法３：  ＡＣＴ４９６ＭＯＳシンセサイザー用
ペプチドは、AdvancedChem TechＡＣＴ４９６ＭＯＳシンセサイザーを方法１のように使用して、合成された。低負荷（〜０．２mmol／ｇ）のFmoc-GGGK（Boc)-NovSyn-TGR樹脂が、ペプチド合成に使用された。カップリング溶剤は、ＮＭＰ／DMSOが８：２であった。合成は、カップリング時間を３時間とし、０．０２mmol規模で、実行された。さらに、粗製の直鎖ペプチドは、前述の方法１と同様に処理された。
【０２６４】
方法４：  ＡＣＴ４９６ＭＯＳシンセサイザー用
ペプチドは、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡをカップリング試薬、ＮＭＰを溶剤として用い、ＡＣＴ４９６で方法３を使用して合成された。２、４、６-collidineの１Ｍ溶液を基剤として用いた。低負荷（〜０．２mmol／ｇ）のFmoc-GGGK（ivDde)-NovSyn-TGR樹脂が、ペプチド合成に使用された。カップリング時間は、３０分とした。粗製の直鎖ペプチドは、前述の方法１と同様に処理された。
【０２６５】
方法５  ＡＢＩ４３３Ａシンセサイザー用
ペプチドの合成は、FastMocプロトコル（AppliedBiosystemsInc.）を使用して、０．２５mmol規模で行われた。このプロトコルの各々のサイクルにおいて、追加のNMPを加えたDMF中に、０．９mmolのHBTU、２mmolのDIEA、および０．９mmolのHOBtを加えた溶液に、カートリッジ内の１ｍｏｌの乾燥した保護アミノ酸を溶解した。ペプチドは、０．１mmolのNovSyn-TGR（Rink amide)樹脂（樹脂置換０．２mmol／ｇ）を用いて作られた。本プロトコルのカップリング時間は、２１分であった。Fmocの除去は、２０％のピペリジンを加えたNMP内で行われた。ラストサイクルの最後に、合成されたペプチドは、無水酢酸／DIEA／HOBt／NMPを使用して、アセチル化された。ペプチド樹脂は、洗浄され、さらなる操作のために乾燥されるか、樹脂（試薬Ｂを使用して）から切断された。一般的に、切断されたペプチドは、前述の方法１と同様に、環化された。
【０２６６】
方法６：  樹脂結合ペプチドのビオチニル化
ペプチドは、方法５により調製された。Ｃ末端リジン上のivDde保護基は、１０％のヒドラジンを加えたDMN内で処理され、選択的に除去された。その後、DIEAの存在するDMF中に、ビオチン-N-hydroxysuddinimidylを加えた溶液で、樹脂は処理された。洗浄後、樹脂は乾燥され、試薬Ｂを使用して切断された。樹脂は、濾過により取り除かれ、濾過物は、乾燥するまで濃縮された。ビオニチル化されたペプチドは、水を加えていないDMSOに溶解され、DIEAで処理され、ジスルフィドの環化が達成されるまで、４〜６時間、攪拌された。粗製の混合物は、調製用HPLCにより精製された。
【０２６７】
典型的な実験においては、２００mgの樹脂結合ペプチドが、１０％のヒドラジンを加えたDMF（２×２０mL）内で処理され、DMF（２×２０mL）で洗浄され、次にジクロロメタン（１×２０mL）で洗浄された。樹脂は、DMF（１０mL）中に再懸濁され、ビオチン-ＮＨＳエステル（０．２mmol、５当量）およびDIEA（０．２mmol）の溶液で処理され、樹脂は、試薬で４時間、混合された。反応の完了は、ニンヒドリン試験でチェックされた。ペプチドは、試薬Ｂ（１０mL）で４時間の処理することにより、樹脂から解放された。樹脂は、濾過により取り除かれ、試薬Ｂは、真空で除去され、ペプチドは、無水エーテルを加えることにより沈殿させた。固体形成物は、収集され、エーテルで洗浄され、乾燥された。固形物は、無水DMSOに溶解され、混合物は、DIEAでｐＨ７．５に調製され、ジスルフィドの環化が達成されるまで、４〜６時間、攪拌された。ジスルフィドの環化反応は、分析用HPLCによりモニターされた。環化の完了後、混合溶液は、アセトニトリル２５％の水溶液で希釈され、逆相Ｃ-１８カラムの上で、HPLCを用いて、アセトニトリルの水中への（共に０．１％ＴＦＡを含む）勾配により、直接的に精製された。留分は、分析用HPLCにより分析され、純粋な生産物を含む部分が、収集され、所望のビオチニル化ペプチドを得るため、凍結乾燥された。
【０２６８】
方法７：  精製されたペプチドのビオチニル化
遊離アミノ基を含む精製されたペプチド（１０mg、方法１〜５により用意された）は、無水DMFまたはDMSO（１mL）に溶解され、（５当量）のビオチン-ＮＨＳエステルおよびDIEA（５当量）が加えられた。反応は、HPLCによりモニターされ、反応の完了（１〜２時間）の後、粗製反応混合物は、調製用HPLCにより直接的に精製された。留分は、分析用HPLCにより分析され、純粋な生産物を含む部分が、収集され、所望のビオチニル化ペプチドを得るため、凍結乾燥された。
【０２６９】
方法８：  リンカーを含む樹脂結合ペプチドのビオチニル化
典型的な実験においては、４００mgの樹脂含有ペプチド（ABI-４３３Aシンセサイザー使用して、かつ、ivDde保護リジンを付加して作られた）が、１０％のヒドラジンを加えたDMF（２×２０mL）内で処理された。樹脂は、DMF（２×２０mL）およびＤＣＭ（１×２０mL）で洗浄された。樹脂は、DMF（１０mL）に再懸濁され、
Fmoc-aminodioxaoctanoic酸（０．４mmol）、HOBt（０．４mmol）、DＩＣ（０．４mmol）、DIEA（０．８mmol）で、４時間混合して処理された。反応後、樹脂は、DMF（２×１０mL）およびＤＣＭ（１×１０mL）で洗浄された。樹脂は、２０の％ピペリジンを加えたDMF（２×２０mL）内）で、１０分間処理された。樹脂は、洗浄され、Fmoc-aminodioxaoctanoic酸とのカップリングおよびFmoc保護基の除去が、もう一度繰り返された。得られた樹脂は、遊離アミノグ基を伴ったペプチドを含み、DMFにビオチン-ＮＨＳエステル（０．４mmol、５当量）およびDIEA（０．４mmol、５当量）を加えた溶液内で、２時間、処理された。ペプチド樹脂は、洗浄され、前述のように乾燥され、試薬Ｂ（２０mL）を用いて、４時間処理された。混合物は、濾過され、濾過物は乾燥するまで濃縮された。残留物は、固形物を生成するまで、エーテルと攪拌され、得られた固形物は、収集され、エーテルで洗浄され、乾燥された。固形物は、無水DMSOに溶解され、ｐＨは、DIEAによりｐＨ７．５に調製された。混合物は、ジスルフィドの環化が達成されるまで、４〜６時間攪拌され、環化反応を、分析用HPLCでモニターした。環化の完了後、DMSO溶液は、２５％アセトニトリルの水溶液で希釈され、逆相Ｃ-１８カラムを直接的に適用した。留分は、分析用HPLCにより分析され、純粋な生産物を含む部分が、収集され、所望のビオチニル化ペプチドを得るため、凍結乾燥された。
【０２７０】
方法９：  ５-カルボキシフルオレセインで標識されたペプチドの形成
方法５により合成された、リジンのエプシロン窒素上にivDde保護基を含むペプチド樹脂は、DMFにヒドラジンを加えた溶液内に（１０％ヒドラジン／DMF、２×１０mL、１０分）混合され、ivDde基を除去された。リジンのエプシロン窒素は、DMN内で、フルオレセイン-５-イソチオシアネート（０．１２mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１２mmol）により標識された。混合物は、１２時間、攪拌された（フルオレセイン含有の化合物は、光から保護された）。樹脂は、DMF（３×１０mL）で洗浄され、ＣＨ2Ｃｌ2（１０mL）で二度洗浄され、窒素下で１時間、乾燥させた。ペプチドは、試薬Ｂを４時間使用して、樹脂から切断され、溶液は、濾過により収集された。揮発物質は、減圧下で除去され、残留物は、真空下で乾燥された。ペプチドは、エーテルで沈殿され、収集され、沈殿物は、窒素流で乾燥させた。沈殿物は、水（１mg／mL）を加わえられ、混合物のｐＨは、１０％のメグルミン水溶液で、８に調製された。ペプチドの環化は、４８時間実行され、溶液は凍結乾燥された。粗製環化ペプチドは、水に溶解され、C１８カラム上で、RP-HPLCを用いて、アセトニトリルの水中への直線的勾配により精製された（いずれの相も０．１％TFAを含んだ）。純粋な生成物を含む留分は、収集され、凍結乾燥された。ペプチドは、ES-MSにより特性付けされ、純度は、RP-HPLC（水の中へのアセトニトリルの直線的勾配／０．１％TFA）により測定された。
【０２７１】
方法１０：  単一のアミノ酸のカップリングによるＴｃ結合用ペプチドキレートの調製
ペプチドは、まず、０．１mmolのNovaSyn-TGR樹脂（０．２mmol／ｇ置換）で調製された。次に、非保護（ivDde）樹脂が、Fmoc（グリシン）-OH、Fmoc-システイン（Acm）-OHおよびFmoc-セリン（tBu）-OHを組み込むため、プロトコルＡに従って処理された。
【０２７２】
単一のアミノ酸の手動カップリングのためのプロトコルＡ：
１．対応するFmoc-アミノ酸４当量、ヒドロキシベンゾトリアゾール４．１当量、HOB４．１当量およびDIC４．１当量で、５時間、処理する。
２．DMF（３×１０mL）で洗浄する。
３．２０％のピペリジンを加えたDMF（２×１０mL、１０分）内で処理する。
４．DMF（３×１０mL）で洗浄する。
【０２７３】
Fmoc-保護ペプチド負荷樹脂は、２０％のピペリジンを加えたDMF（２×１０mL、１０分）内で処理され、DMF（３×１０mL）で洗浄した。N,N-ジメチルグリシン（０．１１mmol）、HATU（１mmol）およびDIEA（１０mL）のをDMF（１０mL）に加えた溶液が、ペプチド負荷樹脂に加えられ、手動カップリングを、５時間続けた。反応後、樹脂は、DMF（３×１０mL）で洗浄され、ＣＨ2Ｃｌ2（３×１０mL）で洗浄され、真空中で乾燥された。
【０２７４】
方法１１：  S-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシニミドエステルを使用したメルカプト-アセチル化ペプチドの形成
ペプチド（０．００５mmol、遊離アミンと共に方法１-５から得られた）を加えたDMF溶液に、Ｓ-アセチルチオグリコール酸Ｎ-ヒドロキシスクシニミドエステル（SATA）（０．００５５mmol）を加え、反応混合物は、常温で６時間、攪拌された。揮発物は、真空下で除去され、０．１％のTFAを含んだアセトニトリル-水を使用して、調製用HPLCにより精製された。純粋な生成物を含む留分は、収集され、メルカプト-アセチル化ペプチドを生産するために凍結乾燥された。メルカプト-アセチル化ペプチドは、ESI-MSにより特性付けされ、純度は、アセトニトリルの水中への（両者は、０．１％ＴＦＡを含む）直線的勾配を用いた逆相ＰＨＬＣ分析により測定された。
【０２７５】
方法１２：  Ｓ-アセチルチオグリコール酸を使用したメルカプト-アセチル化ペプチドの形成
方法５から得られた精製ペプチドは、ジスルフィド環化の後、NMP内で、Ｓ-アセチルチオグリコール酸（１．５-１０当量）／HOBt（１．５-１０当量）／DIC（１．５-１０当量）に、室温で２〜１６時間、カップリングされた。混合物は、調製用HPLCにより精製され、純粋なペプチドを含む留分は、結合され、凍結乾燥された。ivDde基に保護されたもう１つの樹脂を含む化合物の場合は、保護基除去反応を、２％のヒラジンを加えた
DMSO内で、室温で３時間行った。反応混合物の精製により、純粋なペプチドが産出された。
【０２７６】
２つのアミノジオキサオクタン酸基およびペプチドに結合したＳ-アセチルチオグリコール酸を伴う化合物を用意する場合は、方法５から得られた精製ペプチド（遊離アミノ基を有する）が、NMP内で、AcSCH2-CO-(NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO)2-OH（３０当量）／HOBt（３０当量）／DIC（３０当量）に、室温で４０時間カップリングされた。混合物は、精製され、ivDde基が除去された。第２の精製により、最終生成物が白い冷凍乾燥物として得られた。
【０２７７】
代替的に、Fmoc-アミノジオクサオクタン酸は、連続して２回、ペプチド（方法５により生産された）とカップリングされ、続いてFmoc基が除去され、Ｓ-アセチルチオグリコール酸とカップリングされた。
【０２７８】
方法１３：  ホモ二量体およびヘテロ二量体の調製
所望の精製ペプチドは、方法５を使用してSPPSにより調製された。ホモ２量体を調製するために、２量体を作るために必要とされるペプチドの半分は、DMFに溶解され、１０当量のＮ-ヒドロキシスクシニミドエステル・ビス・グルタル酸で処理された。反応の進行は、HPLC分析および質量スペクトル計によりモニターされた。反応が完了すると、揮発物は、真空で除去され、未反応のビス-ＮＨＳエステルを除去するため、エチル酢酸で洗浄された。残留物は、乾燥され、無水DMFに再溶解され、２当量のDIEAの存在下、ペプチドのもう一方の半分で処理された。反応は、２４時間進められた。混合物は、直接、Waters AssociatesC-18XTerra RP-HPLCカラムに適用され、水中へのアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡを含む）の直線的勾配溶出により、精製された。
【０２７９】
ヘテロ二量体の場合、単量体の１つは、グルタル酸のビスＮＨＳエステルと反応させ、ビスＮＨＳエステルの過剰分を洗浄により除去した後、第２のアミンが、DIEAの存在下で加えられた。反応後、混合物は、調製用HPLCにより精製された。
【０２８０】
KDRおよびVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドの調製
前述の方法を利用して、表１のKDRおよびVEGF／KDR複合体結合ポリペプチドが調製された。表１において、ペプチドのアミノ酸配列内の「Ｊ」の文字は、スペーサーまたはリンカー、８-アミノ-３，６-ジオクサオクタノイルを意味する。また、表１において、「Ｃ*」の表記は、ジスルフィド結合に寄与するシステイン残基を意味する。KDRに結合するビオチニル化ポリペプチドの能力は、以下に述べる試験セットを使用して判定された。
【０２８１】
以下のビオチニル化ペプチドは、KDR発現細胞とよく結合する。：
P13-XB（Kd 1.81 nM+/-0.27），P5-XB（Xd 14.87+/-5.07nM，４実験の平均），P6-XB（Kd 10.00+/-2.36nM，４実験の平均），P12-XB（Kd 4.031+/-0.86nM，３実験の平均），およびP12-F-XB（Kd 3.02+/-0.75nM，１実験）。
【０２８２】
表１．ペプチドおよびペプチド誘導体のアミノ酸配列または構造
2005519980.tif 000025
2005519980.tif 000026
2005519980.tif 000027
2005519980.tif 000028
［実施例２］
ファージ提示法により同定されたペプチドのKDR-発現細胞に結合する能力を確認するビーズ結合分析
以下の実験は、KDR-結合ペプチドの、KDR-発現細胞に結合する能力を判定するために実行された。本実験において、KDR-結合ペプチドＰ５-ＢおよびＰ５-XBおよびＰ６-ＢおよびＰ６-XBは、フルオレセインビーズに共役され、KDR-発現２９３Ｈ細胞に結合する能力が、判定された。実験は、ビーズのような断片をKDR-発現部位に結合するために、両方のペプチド配列を用いることができることを示した。一般的に、Ｐ６ペプチドの方が、Ｐ５よりも、KDR発現細胞によく結合した。しかし、両ペプチドの結合力は、スペーサーの追加とともに、改善された。
【０２８３】
抗-KDR抗体のビオチニル化
Sigma（V-9134）からの抗-KDR（たとえば、腹水）は、Molecular Probes （F-6347）のキットを使用して、製造者の指示に従いビオチニル化された。
【０２８４】
ペプチド共役フルオレセインビーズの調製
各々のビオチニル化ペプチド（前述のように、５０％DMSO内で調製された）の０．２ｍＭ原液０．１ｍが、中性アビジンでコーティングした赤いフルオレセインのミクロスフィア（２μｍ径、Molecular Probe オーダーメイド）０．１mL、および０．２mLの５０ｍＭMES（シグマM-8250）緩衝液で、ｐＨ６．０で、回転装置に載せて室温で１時間、培養された。正の制御として、ビオチニル化された抗-KDR抗体は、前述のように中性アビジンでコーティングされたビーズで培養された。ただし、ペプチド溶液の代わりに、PBS(Gibco 14190-13)内で調製されたビオチニル化抗体を０．０３mg用いた。ビーズは、必要となるまで、１週間以内であれば４℃で保存できる。
【０２８５】
２９３Ｈ細胞のトランスフェクト
２９３Ｈ細胞は、実施例６に述べるプロトコルを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒／透明９６-ウェルプレート（Becton Dikinson #354640）内で実施された。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は、偽-トランスフェクト（DNA無しで）され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に８０〜９０％が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。
【０２８６】
結合分析
前記のように調製したビーズのうち０．１２mLを、マイクロ遠心分離器で、１０分間２０００rpmで、室温で回転させた。上澄みは除去され、０．０６mLのpH６．０のMESが、加えられた。各々のビーズ溶液は、水浴内で１５分間、旋回攪拌され、超音波分離された。１．４７mLのDMEMに、１×MEN非必須アミノ酸溶液(NEAA）（GIBCO11140-050）を伴った高ブドウ糖（GIBCO111965-084）、および４０％FBS(Hyclone SH30070.02）０．０３mLの超音波分離で調製されたビーズが、加えられた。カラム１〜６内で偽-トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞、およびカラム７〜１２内でKDR-トランスフェクトされた２９３Ｈ細胞を接種された９６ウェルプレートは、排水され、DMEM、１×NEAAおよび４０％FBSを伴った高ブドウ糖で、一度洗浄された。各々のウェル（ビーズ調製ごとに６つのウェル）に、０．１mLのビーズ溶液が加えられた。室温で３０分間培養された後、ウェルは、プレートを逆さにすることにより排水され、Ｃａ++Ｍｇ++（GIBCO14040-117）入りの０．１mLのPBSで４回、室温で５分間、いずれも、振ることにより洗浄された。排水後、０．１mLのPBSが、ウェル毎に加えられた。プレートは、Packard Fluoro Count蛍光光度計で、励起５５０ｎｍ／放射６２０ｎｍで、読み取られた。分析において、非共役中性アビジンビーズは、負の制御として用いられ、一方、ビオチニル化された抗-KDR抗体共役ビーズは、正の制御として使用された。
【０２８７】
ウェル毎に結合したビーズの数を計算するために、同じフルオレセインビーズの数の増加を示す検量線を、各々の分析プレートに含めた。検量線は、各々のウェルのフルオレセインの蛍光強度に基づいて、結合したビーズの数をウェル毎に計算するために使用された。
【０２８８】
図１に示されるように、抗-KDRを伴う正の制御ビーズは、明らかにKDR-発現細胞と優先的に結合したのに対し、何も添付されないアビジンビーズは、いずれのタイプの細胞とも結合しなかった。ビオチニル化されたＰ５ビーズは、偽-トランスフェクト細胞よりも、KDR-トランスフェクト細胞に、際立って多く結合するというわけではなかったが、ペプチド部分とビオチン基の間に親水性のスペーサーを加えると、偽-トランスフェクト細胞に対する結合は増加しなかったが、KDR細胞に対する結合は増加した。ビオチニル化Ｐ６ビーズは、KDRトランスフェクト細胞に対し、より多く結合した。Ｐ５の場合のように、ペプチド部分とビオチン分子との間に親水性のスペーサーを加えると、トランスフェクト細胞内のKDRとの特異的な結合が、顕著に向上した。従って、Ｐ５およびＰ６の両ペプチド配列は、ビーズのような微粒子を、KDR発現部位に結合するために使用され得る。
【０２８９】
［実施例３］
KDR-トランスフェクト２９３細胞に結合するためのKDR-結合ペプチドおよび125Ｉ標識VEGFの競合
以下の実験は、トランスフェクト２９３Ｈ細胞に発現したKDRと結合するために、KDR-結合ペプチドが125Ｉ標識VEGFと競合する能力を判定したものである。KDR-結合ポリペプチドＰ４は、125Ｉ標識VEGFと顕著には競合しなかったが、Ｐ５-XB、Ｐ６およびＰ１２-XBは、125Ｉ標識VEGFと非常によく競い合い、125Ｉ標識VEGFの結合を、９６．２９±２．９７％および１０４．４８±２．０７％阻害した。
【０２９０】
２９３Ｈ細胞のトランスフェクト
２９３Ｈ細胞は、実施例６に述べるプロトコルを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒／透明９６-ウェルプレート（Becton Dikinson #354640）で実施された。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は、偽-トランスフェクト（DNA無しで）され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に８０-９０％が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。  
Ｍ１９９媒体の調製
分析のためＭ１９９媒体を調製するために、１つのＭ１９９媒体パケット（GIBCO，cat.#31100-035）、２０mLの１ｍＭHEPES（GIBCO , cat.#15630-080）、および２ｇのDIFCOゼラチン（DIFCO , cat. #0143-15-1）が、９５０mLの２度蒸留した（dd）Ｈ2Ｏに加えられ、溶液のｐＨは、約４mLの１N NaOHを加えることにより、７．４に調整された。ｐＨ調整の後、Ｍ１９９媒体は、水浴の中で３７℃に２時間温めて、ゼラチンを溶かし、０．２μｍフィルター（Corning , cat. #43109）を使用して濾過殺菌し、後の分析に使用するため、４℃で保管した。
【０２９１】
ペプチド溶液の調製
５０％DMSO中に、ペプチドＰ６、Ｐ４、Ｐ５-XB、およびＰ１２-XB（前述のように調製した）を加えて３ｍＭのペプチド原液が調製された。
【０２９２】
分析のための125Ｉ標識VEGFの調製
２５μＣｉの凍結乾燥した125Ｉ標識VEGF（Amersham , cat. #IM274）を、２５０μＬのddＨ2Ｏで戻して、原液を製造し、後の使用のために-８０℃で保存した。各分析毎に、上記Ｍ１９９媒体原液を希釈して、125Ｉ標識VEGFの３００ｐＭ溶液が、新鮮に製造された。125Ｉ標識VEGFの濃度が、その日の独特な物質活性に基づいて、日々計算された。
【０２９３】
３００ｐＭの125Ｉ標識VEGF内における３０μＭおよび０．３μＭペプチド溶液の調製
各９６ウェルプレートのために、Ｍ１９９媒体内に１０mLの３００ｐＭ125Ｉ標VEGFを加えて、４℃で調製した。各ペプチド溶液（３ｍＭ、前述のように調製）は、３００ｐＭの125Ｉ標識VEGFを伴う３００μＬのＭ１９９媒体内で、１：１００および１：１００００に希釈され、３００ｐＭの125Ｉ標識VEGFを含む３０μＭおよび０．３μＭペプチド溶液が調製された。一度、調製されると、使用準備が整うまで、溶液は氷の上に保たれた。３００ｐＭの125Ｉ標識VEGFを含むＭ１９９媒体内のペプチド溶液の希釈は、各実験毎に新鮮に行われた。
【０２９４】
２９３Ｈ細胞内における125Ｉ標識VEGFとの競合を調べるための分析
細胞は、トランスフェクトの２４時間後に使用され、分析用の細胞を調製するために、室温のＭ１９９媒体で３回洗浄され、冷蔵庫内に置かれた。１５分後、Ｍ１９９媒体は、プレートから除去され、Ｍ１９９媒体内の７５μＬの３００ｐＭの125Ｉ標識VEGF（前述のように調製）によって置き換えられた。各々の希釈物が、偽-およびＫＤＲトランスフェクト細胞の３つの別個のウェルに加えられた。４℃で２時間培養された後、プレートは冷たい結合緩衝液で５回洗浄され、やさしく吸着して乾燥させ、顕微鏡で、細胞の消失をチェックされた。１００μＬの溶解補助溶液（２％のトリトンX-100、１０％グリセロール、０．１％のBSA）が、各々のウェルにも加えられ、プレートは室温で３０分間培養された。各ウェル内の溶解補助溶液は、ピペットで上げ下げされることにより混合され、１．２mL管に移された。各ウェルは、１００μＬの溶解補助溶液で２回洗浄され、洗薬が、対応する１．２mL管に加えられた。その後、各１．２mL管は、１５．７ｍｍ×１０ｃｍ管に移され、ＬＫＢ Gamma Counter（125Ｉウインドウ１分）で計数された。
【０２９５】
２９３Ｈ細胞内におけるペプチドの125Ｉ標識VEGFとの競合
KDR-結合ペプチドＰ６、Ｐ４、Ｐ５-XBおよびＰ１２-XBが、125Ｉ標識VEGFのKDRへの結合を、特異的にブロックする能力は、偽-トランスフェクトおよびKDRトランスフェクト細胞内で評価された。Ｐ４は、分析において、負の制御として使用された。選択された理由は、P４は、FP分析において、KDRへの弱い結合を阻害するのみであり、したがって、VEGFと置換したり、VEGFとの競合が期待されないからである。KDRへの特異的な結合を計算するため、偽-トランスフェクト細胞への125Ｉ標識VEGFの結合は、KDRトランスフェクト細胞から引かれた。したがって、KDR-結合ペプチドによる、125Ｉ標識VEGFの２９３Ｈ細胞への結合の阻害が計算される場合、KDR（２９３Ｈ細胞内に存在してもしなくても）以外の部位への125Ｉ標識VEGFの結合は、含まれない。
【０２９６】
図２は、ペプチド（Ｐ６、Ｐ４、Ｐ５-XBおよびＰ１２-XB）による、125Ｉ標識VEGFのKDR-トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合の阻害を、２つの異なる濃度（３０μＭおよび０．３μＭ）において、パーセンテージで示したものである。阻害率は、式［（Ｙ１-Ｙ２）×１００／Ｙ１］を使用して計算された。ここで、Ｙ１は、ペプチド不在下のKDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合であり、Ｙ２は、ペプチドまたはDMSO（伝達手段）存在下のKDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。KDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、偽-トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合をKDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から引くことにより算出した。Ｐ６、Ｐ４およびＰ５-XBの結果は、３つの実験±ＳＤの平均であり、Ｐ１２-XBの結果は、１つの実験からのものである。
【０２９７】
図２に示されたように、その相対的に高いＫｄ（＞２μＭ、KDR-Fcに対するFPにより測定）のため、負の制御として使用されたＰ４は、顕著には125Ｉ標識VEGFに対抗しなかった（３０μＭで１２．６９±７．１８％、０．３μＭで-５．４５±９．３７％）（図２）。これに対して、Ｐ６、Ｐ１２-XBは、125Ｉ標識VEGFと非常によく競い合った（それぞれ、３０μＬで９６．２９±２．９７％、１０４．４８±２．０７％、および０．３μＭで５２．２７±３．７８％、８０．９６±３．８％125Ｉ標識VEGFの結合を阻害した）。Ｐ５-Ｘ-Ｂの125Ｉ標識VEGFの結合阻害率は、３０μＬで４７．９５±５．０９％、０．３μＬで２４．４１±８．４３％であった。このように、KDRに弱くしか結合しない１つのペプチドは、VEGF結合をほとんどブロックしなかったが、その他の３つのKDR-結合ペプチドは、VEGFとよく競い合い、これらの能力は、結合親和力とともに高まった。また、この分析は、KDRとしっかり結合するが、VEGFとは競い合わないペプチドを同定するためにも有益である。この特徴は、腫瘍内のKDRを画像化するのに利用可能である。腫瘍内では、しばしばVEGFの局所的な集中が見られるが、さもなくば、VEGFはKDR-標的分子の結合をブロックしてしまう可能性があるからである。
【０２９８】
［実施例４］
ファージ提示法により同定されたペプチドによるVEGFが誘発するKDR受容体活性化の抑制
ファージ提示法により認定されたKDR-結合ペプチドの、VEGFが誘発するKDRの活性化（リン酸化）を抑制する能力は、以下の分析を用いて評価された。本発明のペプチドの多くが、単量体および／または４量体の構造（Ｐ５-Ｄ、Ｐ６-Ｄ、Ｐ１０-ＤおよびＰ１１-Ｄなど）で、KDRの活性化を抑制することが示された。前述したように、KDRの活性化を抑制するペプチドは、抗-血管新生剤として使用され得る。
【０２９９】
ヒトのへその緒の静脈内皮細胞（HUVECs）（Biowhittaker Cat No.CC-2519）は、ドライアイス上で凍結して得られ、解凍されるまで、液体窒素に保存された。これらの細胞は解凍されて、継代培養され、製造者の記述通りに、ＥＧＭＭＶ媒体（Biowhittaker Cat No.CC-3125）内に維持された。１００ｍｍ皿の中に接種された細胞は、融合性となり、血清を欠いた基礎ＥＢＭ媒体（Biowhittaker Cat No.CC-3121）に、一晩、培養された。翌朝、皿の媒体は、３７℃で１０ｍＬの新鮮なＥＢＭ媒体と取り替えられた。なお、該EBM媒体は、付加物を含まなくてもよいし（負の制御）、５ｎｇ／ｍＬVEGF（Calbiochem Cat No.676472またはPerprotech Cat 100-20）（正の制御）、指定のKDR-結合ペプチド（前述のように調製）濃縮物を加えた５ｎｇ／ｍＬVEGFを含んでもよい。いくつかのケースにおいては、中性の抗-KDR抗体（Cat No.AF357、Ｒ＆ＤSystems）が、活性化抑制の正の制御として使用された。そのような場合、抗体は、VEGF抗体の両者を含む新鮮な媒体を加える前に、３７℃で３０分間、予め試験細胞で培養された。３７℃の組織培養物で５分間培養された後、皿は、カルシウムおよびマグネシウムを含むDulbeccoの氷で冷やしたリン酸緩衝液（D-PBS）で、３回洗浄され、最後の１０ｍＬのＤ-ＰＢＳを除去せずに、氷の上に置かれた。セットの最初の皿は、排水されて、０．５ｍＬのトリトン・リーシス緩衝液（２０ｎＭのトリス基剤ｐＨ８．０、１３７ｎＭのＮａＣｌ、１０％のグリコール、１％のトリトンX-100、２ｍのＭＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、１ｍＬのＰＭＳＦ（フェニルメチルサルホニフルオライド）、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＦ、５０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１０μｇ／ｍＬのアプロチニン）が加えられた。細胞は、細胞スクレイパー（Falcon Cat No.353087）を使用して、素早くスクレープしてリーシス緩衝液に入れられ、細かくピペットで上げ下げされることにより分散され、結果として得られた溶解液は、ペアの第２の排水された皿に移された。もう一方の０．５ｍＬのリーシス緩衝液は、第１の皿を濯ぎ出すために使用され、第２の皿に移され、その後同様にスクレープされ、分散された。２つの皿にプールされた溶解液は、１．５ｍＬのEppindorf管に移された。以上の過程は、各々の制御および試験サンプル（KDR-結合ペプチド）につき、１度に１回繰り返された。溶解液は、全てのサンプルが処理されるまで、氷の上に保管された。この点では、サンプルは、−７０℃に保管されるか、分析の最後まで中断無く処理された。
【０３００】
新鮮に調製されるか、凍結および解凍された溶解液は、２０μＬのプロテインＡ-sepharoseビーズ（Sibma３３９１、Ｄ-ＰＢＳ内で予め膨張させた）を加えられて、予備洗浄され、超過量のＤ-ＰＢＳで３回洗浄され、５０％のスラリーを生成するために６ｍＬのＤ-ＰＢＳで再構成され、４℃で３０分間揺り動かされた。ビーズは、Picofuge
（Stratgene Cat No.400550）内で２分間、遠心分離により２０００xgで、小球形にされ、上澄みは、１．５ｍＬの新たな管に移された。２０μｇの抗Ｆｌｋ-１抗体（Santa Cruz Biotechnology, Cat No.sc-504）が、各々の管に加えられ、管は、KDRを免疫沈降させるため、４℃で一晩（１６〜１８時間）、回転装置上で培養された。翌日、４０μＬのプロテインＡ-sepharoseビーズが、管に加えられ、回転装置の上で、４℃で１時間培養された。その後、いずれのチューブのビーズも、Picofuge内で２分間遠心分離し、上澄みを捨てて、新たに加えられた１ｍＬのＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭのトリス基剤ｐＨ７．５、１３７ｍＬのＮａＣｌ、および０．１ｍＬのTween２０）にビーズを分散させることにより、３回洗浄された。遠心分離し、最後の洗浄液を除去した後、４０μＬのLaemmliＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Bio-Rad, Cat No.161-0737）を、各々の管に加え、管をキャップして、５分間沸騰させた。冷却後、各管内のビーズは、遠心分離により小球形にされ、免疫沈降したKDRを含む上澄みは、新しい管に移され、即座に使用されるか、後の分析のために−７０℃で保管された。
【０３０１】
リン酸化KDRの検出、および免疫沈降物内の総KDRの検出は、免疫ブロット法により実行される。各々の免疫沈降物の半分（２０μＬ）は、Laemmli法（イギリス、Laemmli"Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4" Nature(１９７０）、２２７、６８０-６８５）に従い、７．５％のプレキャストReady Gel（Bio-Rad, Cat  No.161-1154）に溶解された。
【０３０２】
Bio-Rad mini-Protean３装置（Cat No.165-3302）を使用した。各ゲルに溶解したタンパク質は、Matsudaira法(P. Matsudaira "Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidine diflouride membranes" J.Biol. Chem. (1987); 262, 10035-10038)に従い、ＣＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭのＣＡＰＳ、Sigma Cat No.
C-6070、１％のＡＣＳ級メントール、ｐＨ１１．０）中で、Bio-Rad mini Trans-Blot細胞（Cat No. 170-3930)内のＰＶＤＦ膜（Bio-Rad, Cat No.162-0174）に、２時間１４０ｍＡで、電気的にブロットされた。ブロットは、予め２時間加熱して３７℃に温めた５％のBlotto-TBS（Pierce Cat No.37530)内で、室温でブロックされた。ブロットは、まず最初に、０．１％のTween ２０を加えた５％のBlotto-TBS内で、１：２００に希釈された抗-リン酸チロシン抗体（Transduction Labs, Cat No.P11120）で、室温で２時間検査された。結合していない抗体は、０．１％のTween２０を含んだＤ-ＰＢＳ(D-PBST）で、１回につき５分、４回ブロットを洗浄することにより、取り除かれた。その後、ブロットは、０．１％のTween ２０を加えた５％のBlotto-TBS内で、１：２５，０００に希釈されたＨＲＰ-共役の羊の抗-マウス抗体（Amersham Bioscience Cat No.NA931）で、室温で１時間検査され、Ｄ-ＰＢＳＴで４回洗浄された。最後に、ブロットは、表面に散布された2ｍLの化学発光媒体（ECL Plus, Amersham Biosciences Cat No. RPN2132)で２分間培養され、 プラスチックシートプロテクター（C-Line Products, Cat No.62038）の中に置かれ、Ｘ線フィルム（Kodak Bio Max ML, Cat No.1139435）に、様々な長さの時間で晒して、最適なコントラストを得た。
【０３０３】
分析において同量のKDRが比較されたということを確認するために、ブロットは、ｐＨを塩酸で２．４に調整したＴＢＳＴ内で、３７℃で３分間培養することにより引き剥がされ、０．１％のTween２０を加えた５％のBlotto-TBS（Blotto-TBST）でブロックされ、正常な山羊の血清を１％加えた５％のBlotto-TBS内で、１：２００に希釈された抗-Flk-１ポリクローン抗体（Santa Cruz Biotech Ct No.sc-315）で、室温で２時間、再検査された。結合していない抗体は、Ｄ-ＰＢＳＴで、１回につき５分、４回ブロットを洗浄することにより除去された。その後、ブロットは、５％のBlotto-TBS内で、１：１０，０００に希釈されたＨＲＰ-共役のロバの抗-ウサギ第２抗体（Amersham Bioscience Cat No.NA934）で、室温で１時間検査され、Ｄ-ＰＢＳＴで４回洗浄された。最後に、ブロットは、2ｍLの化学発光媒体で２分間培養され、 上記のようにＸ線フィルムに晒された。
【０３０４】
予めVEGFで刺激したHUVEC、および未刺激のHUVECから調整されたKDR免疫沈降物の免疫ブロット法は、図３に示されるように、HUVECがVEGFで刺激されている場合に、活性化（リン酸化）KDRが検出可能であることを実証した。リン酸チロシン抗体（ＰＹ-２０）は、未刺激のＨＵＶＥＣからのKDRのブロット上の移動位置付近には、リン酸化タンパク質を検出しなかった。しかしながら、VEGF刺激を与えると、５分後には、猛烈なバンドが、予想通りの位置に、一貫して観察された（図３、上部パネル）。酸溶液内で培養することにより、ブロットから結合抗体を剥ぎ取り、抗-KDR抗体（ｓｃ-３１５）で再検査したところ、このリン酸化タンパク質バンドは、KDRであることが確認された。さらには、未刺激のＨＵＶＥＣからの免疫沈降物は、VEGF刺激ＨＵＶＥＣからの免疫沈降物とほぼ同量の、総ＫＤＲを含んでいることが観察された（図３、下部パネル）。
【０３０５】
検出されたリン酸化KDRは、予め存在するKDRから、VEGF結合の結果として生じたKDR２量体の自己リン酸化を通じて、形成されたと結論するのが妥当である。なぜなら、５分という時間は、KDRのような大きな糖化した細胞表面の受容体を合成し、処理するには、十分な時間とはいえないからである。  
VEGFによるKDRの活性化をブロックすることが可能な媒体を検出する分析の能力は、VEGFと結合したHUVECに一連の化合物を加え、KDRのリン酸化を前述の免疫ブロット法分析で測定することにより、判定された。負および正の制御のとして、未刺激HUVECからの免疫沈降、および、いかなる試験化合物も伴わずにVEGFで刺激したHUVECからの免疫沈降物が、すべての分析において検査された。中和−抗-KDR抗体（R&D Systems Cat No.AF-357）を、VEGFと化合させると、KDRのリン酸化は著しく減少し（図４、上部パネル）、KDRと結合してKDRを活性化させるVEGFの能力を、抗体が妨害し得るということを示した。この結果は、予想されていた。なぜなら、VEGFが誘発するＤＮＡ合成をブロックする抗体の能力は、製造者が抗体について実施する品質管理検査の一部だからである。抗-KDR抗体でブロットを再検査したところ（図４、下部パネル）、VEGFのみで処理したレーン（＋Ｖ）と比較して、VEGF＋抗体で処理したレーン（＋Ｖ＋α-KDR）に存在した総KDRは、わずかに少なかったことが分かった。しかしながら、この違いは、抗体で処理されたレーン内において、リン酸化KDRの量が著しく少なかったことを説明するのに充分なほど、大きなものではなかった。
【０３０６】
ファージ提示法で同定されたKDR-結合ペプチド（Ｐ１０-Ｄ）の能力を評価するために、Ｐ１０-Ｄでの実験が、VEGFの存在下で繰り返された。Ｐ１０-Ｄは、VEGFが誘発するKDRのリン酸化を、大きく抑制することができた。総KDRを調べるためにブロットを再検査したところ、VEGF＋Ｐ１０-Ｄで処理された細胞（＋Ｖ＋Ｐ１０-Ｄ）内には、VEGFのみで処理された細胞（＋Ｖ）内よりも、むしろ総KDRが多いことが分かった（図５、下部パネル）。したがって、Ｐ１０-Ｄの存在下で減少したKDRのリン酸化は、サンプルが担ったた量の違いによるものではなく、VEGFによるKDRの活性化を抑制する成分の能力によるものであることは、明白である。
【０３０７】
この実施例の方法を使用しすることにより、以下のペプチドが、１０μＭで、VEGFが誘発するKDRリン酸化を、少なくとも５０％の抑制することが実証された：
Ｐ２-Ｄ、Ｐ３-Ｄ、Ｐ６-Ｄ、Ｐ７-Ｅ、Ｐ８-Ｄ、Ｐ９-Ｄ、Ｐ１０-Ｄ、Ｐ１１-Ｄ。
【０３０８】
Ｐ２およびＰ６は、この分析において、もっとも有力な成分であり、１μＭで、VEGFが誘発するKDRリン酸化を、少なくとも５０％抑制した。
【０３０９】
以下のペプチドは、この分析で検査されたが、１０μＭでは、KDRの活性化をあまり抑制しなかった：
Ｐ５-Ｅ、Ｐ１４-Ｄ、Ｐ１５-Ｄ、Ｐ１６-Ｄ、Ｐ１７-Ｄ、Ｐ１８-Ｅ、Ｐ１９-Ｅ、Ｐ２０-Ｅ、Ｐ２１-Ｅ、Ｐ２３-Ｄ。
【０３１０】
加えて、ビオチニル化誘導体の４量体複合体Ｐ６-XBまたはＰ１２-XB（前述のように調製され、以下の実施例６に論じる、）は、１０ｎＭで、VEGFが誘発するKDRのリン酸化を、少なくとも５０％抑制した。
【０３１１】
［実施例5］
Tcで標識したP12-CとＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞との結合
本実施例では、Tcで標識したP12-CがKDRに対して結合する能力を、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて評価した。本結果は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞に対するTc標識化P12-C結合は、KDRを偽−トランスフェクトした293H細胞に対する結合に比べて有意に優れていたとともに、Tc標識化P12-Cポリペプチドの濃度とともに直線的に結合が増加したことを示している。
【０３１２】
SPPS（固相ペプチド合成）による、Tcへの結合に用いるペプチド性キレート（P12-C）の調製
2005519980.tif 000029
250mlのSPPS反応容器に、6.64molのH-Gly-2-Cl-トリチル樹脂（0.84mmol／g、Novabiochem社）を加えた。これを80mlのDMF中で一時間膨張（swelling）させた。各カップリングサイクルにおいて、26.6mmolのDIEA、26.6mmolのFmocアミノ酸（EM Science社）を含むDMF、26.6mmolのHOBT（Novabiochem社）を含むDMF、および26.6mmolのDICを、この樹脂に加えた。DMFの全容積は80mlであった。反応混合物を4時間振盪した。次に、この樹脂をろ過し、DMFで洗浄した（3×80ml）。20％のピペリジンを含むDMF（80ml）溶液をこの樹脂に加え、これを10分間振盪した。この樹脂をろ過して、ピペリジン処理を繰り返した。最終的に、この樹脂をDMF（3×80ml）で洗浄し、次のカップリングサイクルに備えた。最終的なカップリングサイクルでは、HATU／DIEA活性化剤を用いてN,N-ジメチルグリシン（Aldrich）を結合した。すなわち、N,N-ジメチルグリシン（26.6mmol）を含むDMF懸濁液に対して、26.6mmolのHATU（Perseptive Biosystems社）を含むDMF溶液、および53.1mmolのDIEAを加えた。この透明溶液を樹脂に加え、16時間振盪した。合成後、この樹脂をろ過し、DMF（3×80ml）、CH2Cl2（3×80ml）で洗浄し、乾燥した。この樹脂を80mlのAcOH／CF3CH2OH／DCM（1／1／8、v／v／v）と混合し、45分間振盪した。この樹脂をろ過し、ろ液を濃縮してペーストとした。25％MeOH／DCMを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより粗製物を精製して、2.0gの最終生成物を得た。
【０３１３】
ペプチド性キレート（P12-C）のペプチドへのカップリング（フラグメントのカップリング）
精製Me2N-Gly-Cys-(Trt)-Ser(tBu)-Gly-OHおよびヒドロキシベンゾトリアゾール（0.0055mmol）の混合物を含むDMF（0.25ml）に、プロピルカルボジイミド（0.0055mmol）を加え、この混合物をRTにて6時間攪拌した。ペプチド（0.0055mol）を含むDMF（0.25ml）を反応混合物に加え、さらに6時間攪拌を続けた。真空下でDMFを除去し、残渣を試薬Bで処理し、3時間攪拌した。減圧下でTFAを除去し、この残留物を、0.1％TFAを含むアセトニトリル−水を用いた調製用HPLCで精製した。純粋な生成物を含む画分を採取し、凍結乾燥することによりペプチドを得た。このペプチドはES-MSにより特定され、その純度はRP-HPLC（アセトニトリル−水／0.1％TFA）のグラジエント（勾配）により測定された。
【０３１４】
99mTcで標識したペプチドの合成
13mgのグルコヘプトン酸ナトリウムを含む、1.0mlの窒素パージを行なった水に対し、20μg／mlのSnCl22H2O溶液が含まれる窒素パージを行なった1NのHCl  2mlを加えて、錫グルコン酸溶液（stannous gluconate solution）を調製した。50／50エタノール／H2Oに溶解した20〜40μl（20〜40μg）のP12-Cリガンド、生理食塩水に溶解した6〜12mCiの99mTcO4−、および100μlの錫グルコン酸溶液（stannous gluconate solution）を4mlのオートサンプラーバイアルに加えた。この混合物を100℃で22分間加熱した。1ml／分の流量にて、66％H2O（0.1％TFA）／34％ACN（0.085％TFA）を用いて溶出したVydac C18ペプチドおよびタンパク質のカラム（Vydac C18 Paptide and Protein column）によって分析したところ、得られた放射化学的純度（RCP）は10〜47％であった。流量1ml／分、水相として0.1％のTFAを含む水、有機相として0.085％のTFAを含むアセトニトリルを用いたVydac C18カラム（4.6mm×250mm）のHPLCにより反応混合物を精製した。勾配は以下の通り：29.5％有機相（org.）を35分間、85％有機相（org.）へと傾斜を5分以上、10分間放置。99mTc-P12-Cを含む画分（もはやACM保護基を含まないもの）を、5mg／mlのアスコルビン酸および16mg／mlのヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリンを50mMのリン酸緩衝液に溶解したものを含む安定化用緩衝液500μl中に採取した。アセトニトリルを除去するために高速真空装置を用いて混合物を濃縮し、0.1％のHASを50mMのpH＝5のクエン酸緩衝液に溶解したもの200μlを加えた。得られた生成物のRCPは100％であった。動物に投与する前に、この化合物を通常の生理食塩水で希釈して、所望の放射性物質濃度（radioconcentration）とした。
【０３１５】
293H細胞へのトランスフェクト
アビジンHRPの実施例に記載されたプロトコルを用いて、293H細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトは黒色／透明の96ウェルプレート（Becton Dickinson、カタログ番号354640）で行なわれた。プレートの片側半分（48ウェル）の細胞には（DNAを持たない）偽−トランスフェクト（偽トランスフェクト）が行なわれ、プレートの他の半分の細胞には、KDRｃDNAがトランスフェクトされた。トランスフェクト時点において細胞の80〜90％が融合し、翌日の分析時点では全ての細胞が融合していた。それ以外の場合、分析を中止した。
【０３１６】
0.1％HSAを含むopti-MEMI培地の調製
opti-MEMIはInvitrogen社（カタログ番号11058-021）より入手し、ヒト血清アルブミン（HSA）はSigma社（カタログ番号A-3782）より入手した。0.1％HASを含有するopti-MEMIを調製するために、0.1％（w／v）のHASをopti-MEMIに添加し、室温にて20分間攪拌した後、0.2μMのフィルターで、ろ過殺菌を行なった。
【０３１７】
分析に用いる、Tcで標識したペプチド希釈液の調製
Tcで標識したP12-Cの原液（117μCi／ml）を、0.1％HASを含有するopti-MEMI中で1：100、1：50、1：25および1：10となるように希釈し、Tcで標識したP12-Cの最終濃度が1.17、2.34、4.68および11.7μCi／mlである溶液を準備した。
【０３１８】
Tcで標識したペプチドの結合を検出する分析
トランスフェクト後、24時間が経過した細胞を使用し、分析に備えるために、室温にて、0.1％HASを含有するopti-MEMI  100μlで1回（1×）、これらの細胞を洗浄した。洗浄後、0.1％HASを含有するopti-MEMIをプレートから除去し、70μlの1.17、2.34、4.68および11.7μCi／mlのTcで標識したP12-C（上記に従って調製）で置き換えた。偽−トランスフェクトおよびＫＤＲ−トランスフェクト細胞の3つの異なるウェルに対し、各希釈液を添加した。室温にて1時間の後、4℃にて15分間の培養を行ない、100μlの冷却したバインディング緩衝液ー（0.1％HASを含有するopti-MEMI）で5回洗浄して、静かに滴下、乾燥し顕微鏡下で細胞の損失を調べた（gently blotted dry and checked under microscope for cell loss）。各ウェルに対し、100μlの可溶化溶液（Triton X-100  2％、グリセロール  10％、BSA  0.1％）を加え、プレートを37℃にて10分間培養した。各ウェルの可溶化溶液をピペットで上下して混合し、1.2mlの試験管に移し替えた。各ウェルを100μlの可溶化溶液で一回洗浄し、この洗浄液を対応する1.2mlの試験管に添加した。LKB Gamma Counter（Tc-window、20秒間）で計数するために、1.2mlの各試験管から15.7mm×100cmの試験管へと移し替えた。
【０３１９】
Tcで標識したペプチドとＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合
Tcで標識したP12-CのKDRに対する特異的結合能を、一過性にトランスフェクトした293H細胞を用いて実証した。図6に示されるように、Tc標識化P12-CとＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞との結合は、KDRを偽−トランスフェクトした293H細胞との結合に比べて有意に優れていた。KDRに対する特異的結合を計測するために、Tcで標識されたP12-Cと偽−トランスフェクト細胞との結合を、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合からサブトラクトした（差し引いた）。図7に示されるように、Tcで標識されたP12-Cの濃度の増加に伴い、Tcで標識されたP12-CとKDRとの結合が直線的に増加する様子が観察された。Tcで標識したP12-Cの濃度はわずか100pM程度（この分析における試験では、最高濃度でさえ11.7μCi／ml）であり、これは、（アビジンHRP分析を用いて算出したように）P12のKD値である3〜4nM程度に対して非常に低い値であり、結合が飽和状態になっていたとは推測できないと考えられることから、直鎖結合であったことが推測される。
【０３２０】
［実施例6］
KDR結合ペプチド／アビジンHRP複合体とＫＤＲ−トランスフェクト293H細胞との結合
ファージディスプレイにより特定されたペプチドと、一過性にトランスフェクトされた293H細胞内で発現されたKDRとの結合を測定するために、neutravidin HRPと複合化したビオチン化ペプチドと、トランスフェクトされた細胞表面のKDRとの結合を測定する、新規な分析を構築した。本分析は、上述のビオチン化ペプチドをスクリーニングするために使用された。neutravidinには、レクチンと結合する糖鎖部分が存在せず、また、細胞接着レセプターと結合するRYD領域が存在しないことから、ビオチン以外の分子に対して非特異的に結合することがより少ないため、ストレプトアビジンあるいはアビジンの代用としてneutravidin HRPが使用された。
【０３２１】
本明細書に記載の試験において、KDR結合ペプチドの四量体複合体であるP6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XB、ならびに対照ペプチドであるP1-XBを調製し、一過性にＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞に対するこれらの結合能力を調べた。この4種の四量体複合体はいずれもKDR産生細胞に結合したが、P13-XBが最も高いKd値を示した（1.81nM）。KDR結合性ペプチドP6-XBおよびP5-XBは、同一ペプチドの単量体よりも良好な結合を示した。さらに、これらの構造にスペーサーを（KDR結合性ペプチドとビオチンとの間に）挿入することにより、結合が改善するということが、実験Bにおいて示された。
【０３２２】
実験Cでは、本分析を用いた、本願発明のペプチドとKDRおよびVEGF／KDR複合体との結合に対する血清の影響の評価が示されている。P5-XB、P6-XBおよびP13-XBの結合は、血清の存在によって顕著な影響を受けることはなかったが、P12-XBの結合は、血清の存在によって50％を超えて減少した。
【０３２３】
実験Dは、KDRおよびVEGF／KDR複合体結合ペプチドの異なる組み合わせの評価において、一種類を超えるKDRおよびVEGF／KDR複合体結合ペプチドを含み、多量体を標的とする構成物に対して本分析を使用することが有用であることを示している。さらに、実験DおよびEは異なる結合部位に結合する2またはそれ以上のKDR結合ペプチドであるヘテロメリックな構成物は、標的ペプチドのみからなる「ホモ四量体」構成物に対して優れた結合を示したことを実証している。
【０３２４】
実験A
m-RNAおよび5’RACE ready cDNAライブラリーの調製
HUVEC細胞を、175cm2の組織培養フラスコ（Becton Dickinson社、Biocoat、カタログ番号6478）中にて80％コンフルーエンスになるまで培養し、次に10ng／mlのbFGF（Oncogene社、カタログ番号PF003）を加え、24時間KDRの発現を誘発した。Invitrogen社のmicro-fast track 2.0キット（カタログ番号K1520-02）を用いてmRNAを単離した。キットの使用説明書に従い、12μgのmRNA（吸光度260nmで測定）を2個のフラスコから得た。2μgのmRNA、オリゴdTプライマー（5’-(T)25GC-3’）および／またはsmart IIオリゴ（5’AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTA CGCGGG-3’）にて、モロニーマウス白血病ウィルス（Moloney Murine Leukemia Virus、MMLV）の逆転写酵素を用いて、cDNA産生を目的とした逆転写を行なった。総量を20μlとして反応を行ない、また、反応溶液中には2μlのRNA、1μlのsmart IIオリゴ、1μlのオリゴdTプライマー、4μlの5×first-strand緩衝液（トリスHCl  250mM  pH＝8.3、KCl  375mM、MgCl2  30mM）、1μlのDTT（20mM、逆転写酵素も共に補給）、dNTP混合物（ddH2O中、各10mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、Stratagene社、カタログ番号200415）、9μlのddH2Oおよび1μlのMMLV逆転写酵素（Clonetech社、カタログ番号8460-1）が含まれていた。逆転写反応を42℃にて90分間行ない、250μlのトリシン-EDTA緩衝液（トリシン  10mM、EDTA  1.0mM）を添加して反応を停止した。逆転写産物である5’RACE ready cDNAライブラリーは−20℃にて3ヶ月間保存することが可能である。DNAおよびRNAの使用のために用いた水はすべて、USBから入手したものであり（カタログ番号70783）、DNAseおよびRNAseフリーであった。
【０３２５】
TOPOIIベクター内へのs-KDRのクローニング
s-KDRをクローニングするために、5’オリゴ（G ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G）および3’オリゴ（C CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC A）を使用した。これらは、pfuポリメラーゼ（Stratagene社、カタログ番号600135）によるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）法を用いて5’RACE ready cDNAライブラリー（先の記載に従って調製）からKDRの完全な細胞外領域（約2.2kbps）を増幅するためにデザインされたものである。PCR反応は総量50μlとして行なわれ、反応混合物には2μlの5’RACE ready cDNAライブラリー、1μlの5’オリゴ（10μM）、1μlの3’オリゴ（10μM）、5μlの10×PCR緩衝液［pfu酵素に1％のDSMOおよび8％のグリセロールを加えたものを補給したPCR緩衝液（トリスHCl  200μM  pH＝8.8、MgSO4  20mM、KCl  100mM、(NH4)2SO4  100mM）］、1μlのdNTP混合物（10mM）および40μlのddH2Oが含まれていた。PCR反応は、94℃にて1分間、68℃にて1分間、および72℃にて4分間を40サイクルとしたプログラムセットを用いて行なわれた。このPCR産物を、容積1の（1 volume of）クロロホルムで抽出することにより精製し、容積3のエタノールおよび容積1／10の3M・酢酸ナトリウムを用いて沈殿させた。PCR産物を17μlのddH2O、2μlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液（トリスHCl  100mM  pH＝8.8、KCl  500mM、MgCl2  15mM、0.01％ゼラチン）に再懸濁し、1μlのTaqポリメラーゼ（Stratagene社、カタログ番号600131）を添加して産物の各末端にA-オーバーハングを作製した。72℃にて1時間培養した後、TOPO-sKDRを得るため、製造業者のプロトコルに従い、修飾された産物を直接invitrogen社のTOPO IIベクター（カタログ番号K4600-01）にクローニングした。Taq（PCR酵素）処理化PCR産物内にA-オーバーハングがあるために、TOPOベクターは、PCR産物のクローニングを容易にすることができる。
【０３２６】
TOPOIIベクター内への、KDRの膜透過および細胞質領域のクローニング
KDRの膜透過領域および細胞質領域をクローニングするために、5’オリゴ（TCC CCC GGG ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG）および3’オリゴ（C AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C）を使用した。これらは、pfuポリメラーゼによるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）法を用いて5’RACE ready cDNAライブラリー（先に記載）からKDRの完全な膜透過および細胞質領域（約1.8kbps）を増幅するためにデザインされたものである。PCRの反応条件およびプログラムは、上述のs-KDRと完全に同一であった。s-KDR配列と全く同様に、このPCR産物を、フェノールクロロホルム抽出を用いて精製し、Taqポリメラーゼによる処理を行ない、そしてinvitrogen社のTOPO IIベクターにクローニングしてTOPO-CYTOを得た。
【０３２７】
pcDNA6ベクターへの、完全長KDRのクローニング
完全長レセプターを作製するために、細胞外領域および細胞質領域（膜透過領域を伴う）を、それぞれ別々にTOPO-sKDRおよびTOPO-CYTOからPCR法で増幅し、次に連結して完全長レセプターを作製した。TOPO-sKDRから細胞外領域をPCR法により増幅するために、細胞外領域の5’末端にNot1部位を持つオリゴ（A TAA GAA TGC GGC CGC AGG ATG GAG AGC AAG GTG CTG CTG G）、および細胞外領域の3’末端に相補的なオリゴ（TCC CAA GTT CGT CTT TTC CTG GGC ACC）を使用した。同様に、TOPO-CYTOからKDRの細胞質領域（膜透過領域を伴う）をPCR法で増幅するために、5’オリゴ（ATC ATT ATT CTA GTA GGC ACG GCG GTG）、およびNot1部位を持つ3’オリゴ（A TAA GAA TGC GGC CGC AAC AGG AGG AGA GCT CAG TGT GGT C）を使用した。双方のPCR産物をNot1で切断し、これをひとつに連結することによって完全長のレセプターを作製した。完全長レセプターをエンコードするcDNAはアガロースゲル上に精製され、pcDNA6／V5−HisCベクターのNot1部位に連結される。DNAの精製および連結（ライゲーション）は先にpsKDR関して記載したように行なった。連結反応はDH5αバクテリアの培養物を形質転換するために使用され、また、インサートの存在と適応について、EcoRI酵素を用いた各クローンの精製プラスミドの制限分析により、個々のクローンが大量に分析された。
【０３２８】
細胞培養
293H細胞をInvitrogen社より入手（カタログ番号11631）し、推奨培地に1ml／L pen／strep（Invitrogen社、カタログ番号15140-148）を加えた培地での単層培養によって生育させた。全細胞は、日常的な培養の間は（for everyday culture）抗生物の存在下で生育させたが、トランスフェクト前の16〜20時間は抗生物フリーの培地にこれらを隔離した。
【０３２９】
トランスフェクトに用いるDNAの調整
pf-KDRを含む大腸菌DH5αを、グリセロールストックから50μg／mlアンピシリンを含むLBプレート（US biological社製のLBアガー；カタログ番号75851、およびSigma社製のアンピシリン；カタログ番号A2804）にストリークし、これらのプレートを37℃のインキュベータに放置して一晩培養した。翌朝、単一コロニーをプレートから採取して3mlのLB／アンピシリン培地（US biological社製のLB；カタログ番号75852、）で37℃にて培養した。8時間後、3mlの試験管から100μlの細菌培養物を250mlのLB／アンピシリン培地に移し替えて、37℃にて一晩インキュベーションを行なった。Lab-Lineインキュベータシェーカーに設置した500mlの容器（Beckman社、カタログ番号355605）内で220rpmで回転攪拌（circular agitation）を行ないながら細菌を生育させた。翌日、maxi-prep kit（QIAGEN社、カタログ番号12163）を用いて細菌培養物を処理した。通常、250mlの細菌培養物から約1mgのプラスミドDNA（吸光度260nmにて定量）が得られた。
【０３３０】
96ウェルのプレートにおける293H細胞のトランスフェクト
ポリ-D-リジンでコートした96ウェルプレートを使用して、リポフェクタミン2000のプロトコル（Invitrogen社、カタログ番号11668-019）に推奨される方法でトランスフェクトした。96ウェルプレートによるトランスフェクトのために、0.1ml中、1ウェルに対して320ngのKDR DNA（pc-DNA6-fKDR）を使用した。血清を含む培地中でトランスフェクトし、6〜8時間後に細胞からトランスフェクト用試薬の混合物を除去し、標準的な血清含有培地へと置換した。トランスフェクトは、黒色／透明の96ウェルのプレート（Becton Dickson社、カタログ番号354640）で行なわれた。プレートの一方の半分（48ウェル）の細胞には（DNAを持たない）偽−トランスフェクトを行ない、プレートの他方の半分の細胞にはKDR cDNAをトランスフェクトした。トランスフェクト時点において細胞の80〜90％が融合し、翌日の分析時点では全ての細胞が融合していた。そうでなかった場合には、分析を中止した。
【０３３１】
M199培養液の調製
先の記載に従い、M199培養液を調製した。
【０３３２】
SoftLink soft releaseアビジンセファロースの調製
Promega社から入手したセファロース（カタログ番号V2011）を、12,000rpmにて2分間遠心分離器にかけてSoftLink soft releaseアビジンセファロースを調製し、氷温水で2回洗浄を行ない（洗浄の間に遠心分離）、沈殿物を氷温水中に再懸濁して50％スラリーを含むddH2Oを作製した。各実験のために、新鮮なアビジンセファロースの50％スラリーを調製した。
【０３３３】
ペプチド／neutravidin HRP溶液の調製
ビオチン化ペプチドP6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XB、ならびに対照ペプチドP1-XB（先の記載に従って調製）を用いて250μM原液を含む50％DMSOを調製するとともに、2mgのneutravidin HRP（Pierce社、カタログ番号31001）を1mlのddH2Oに溶解して33μMのneutravidin HRP原液を調製した。ペプチド原液を−20℃で保存し、一方neutravidin HRP原液を−80℃で保存した。ビオチン化ペプチドの構造を表1に示した。ペプチド／neutravidin HRP複合体を調製するために、10μlの250μMビオチン化ペプチド原液および10μlの33μM neutravidin HRPを、1mlのM199培養液に加えた。この混合物を4℃にて60分間、ローテーターで培養した後、50μlのSoftLink soft releaseアビジンセファロース（ddH2O中に50％スラリーを含む）を加えて余剰のペプチドを除去し、4℃にて30分間、ローテーターで再度インキュベーションを行なった。最後に、室温で12,000rpmにて5分間の遠心分離を行ないsoft releaseアビジンセファロースを沈殿させて、得られた上澄み液を用いて分析を行なった。各実験のために、新鮮なペプチド／neutravidin HRP複合体を調製した。
【０３３４】
分析に用いるペプチド／neutravidin HRP希釈液の調製
飽和結合試験用として、M199培養液の1.2mlのアリコートに、120μl、60μl、20μl、10μl、8μl、6μl、4μlおよび1μlのペプチド／neutravidin HRP複合体を加えて、最終濃度がそれぞれ33.33nM、16.65nM、5.55nM、2.78nM、1.67nM、1.11nMおよび0.28nMの複合体を含む希釈液を作製した。
【０３３５】
トランスフェクトされた293H細胞に用いるブロッキング溶液の調製
20mlのM199培養液を10mgの凍結乾燥した非標識化neutravidin（Pierce社、カタログ番号31000）に加えてブロッキング溶液を調製した。各実験のために、新鮮なブロッキング溶液を調製した。
【０３３６】
ペプチド／neutravidin HRPの結合を検出するための分析
トランスフェクトの24時間後、293H細胞の各ウェルを100μlのM199培養液で1回洗浄し、これを80μlのブロッキング溶液を用いて37℃で培養した。1時間後、細胞を100μlのM199培養液で2回洗浄し、これを70μlのP1-XB、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBのペプチド／neutravidin HRP希釈液を用いて室温で2時間半培養した。偽−トランスフェクトおよびＫＤＲ−トランスフェクト293H細胞の3種の異なるウェル（2個のプレートは各飽和結合試験に使用された、）に各希釈液を加えた。室温で培養した後、プレートを4℃へと移して、さらに半時間の培養を行なった。次に、氷温のM199培養液で細胞を5回洗浄し、氷温のPBSで1回（この順番で）洗浄した。最終洗浄の後、氷温のTMB溶液100μlを各ウェルに加え、各プレートはエアーインキュベータ内で37℃、30分間培養された。最後に、各ウェルに対して50μlの１Nリン酸を添加してHRP酵素反応を停止し、マイクロプレートリーダー（BioRadモデル3550）を使用して450nmにおける吸光度を測定することにより結合数を定量した。
【０３３７】
ペプチド／neutravidin HRPとＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合
この分析において、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBペプチド、ならびに対照ペプチドP1-XBとneutravidin HRPの複合体を、先の記載に従い調製し、これらとKDRを、一過性にトランスフェクトした293H細胞との結合能を測定した。ペプチド／neutravidin複合体の調製中、neutravidin中の４ヶ所のビオチン結合部位すべてに結合が起こるようにneutravidin HRPに対して7.5倍過剰のビオチン化ペプチドが用いられた。複合体の形成後、遊離のビオチン化ペプチドとneutravidin HRPと複合体を形成したビオチン化ペプチドとの競合を完全に避けるため、soft releaseアビジンセファロースを用い、余剰の遊離ビオチン化ペプチドを除去した。
【０３３８】
P5-XBおよびP6-XBの飽和結合曲線（図8A）を作成するためには0.28nM〜33.33nM、ならびにP12-XBおよびP13-XBの飽和結合曲線（図8B）を作成するためには0.28nM〜5.55nMとさまざまな異なる濃度のペプチド／neutravidin HRPについて実験を行なった。各試験濃度における各種ペプチド／neutravidin HRPについて、飽和結合曲線を描くために、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合から、バックグラウンドとなる偽−トランスフェクト細胞との結合をサブトラクトした（差し引いた）。従って、図8におけるY軸の吸光度は（KDRから偽−トランスフェクトを引いた）比較吸光度（differential absorbance）であり、絶対吸光度ではない。図8の飽和結合データを、Graph Pad Prismソフトウェア（バージョン3.0）を使って分析すると、得られるKd値は、四量体P6-XBペプチド複合体では10.00nM（±2.36）、四量体P5-XBペプチド複合体では14.87nM（±5.07）、四量体P12-XBペプチド複合体では4.03nM（±0.86）、四量体P13-XBペプチド複合体では1.81nM（±0.27）であった。予想した通り、これらの結合定数は、相関するmonodentateペプチドP6（69nM）およびP5（280nM）（フルオレセイン標識）についてのKDRFc構成物に対するFPにより測定される結合定数よりも低い値であったが、monodentateペプチドP12（3nM）については同様の値であった。予想した通り、対照のP1-X-Bペプチド／neutravidin HRP複合体に対する非飽和結合が観察された。図9に示されるように、KDR結合ペプチド（P6-XB、P5-XBおよびP12-XB）と非結合ペプチド（P1-XB）とを識別する目的で単一濃度の実験を利用することが可能であることを示すため、単一濃度（5.55nM）におけるペプチド／neutravidin HRP複合体の結合をプロットした。
【０３３９】
実験B
実験BはKDR結合配列（P6およびP5）とビオチンの間のスペーサー（X）の影響を調べるためにデザインされた。この実験では、ビオチン化P6およびP5（スペーサーXを含むもの、およびスペーサーXを含まないもの）を試験に供し、陰性対照にはP1（スペーサーXを含むもの、およびスペーサーXを含まないもの、先の記載に従い調製）が使用された。
【０３４０】
本実験は、2.78nMの単一濃度のみであったことを除き、先の実験Aの記載に従って実施された。図10に示されるように、スペーサー（X）がP6およびP5の効果的な結合に必要であることが、結果から明白であった。結合配列とビオチンとの間のスペーサー（X）は、多角的なメカニズムにより、標的細胞への結合の促進に利用することが可能である。第一に、4個のビオチン化ペプチドが1個のビオチンに結合した後、これら4ペプチド間の立体障害の減少に役立つ可能性がある。第二に、一個の細胞の複数の結合部位に到達するために必要な予備配列を提供している可能性がある。
【０３４１】
実験C
実験Cでは、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBの結合に対する血清の影響を検討した。この実験では、P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XBのビオチン化ペプチド／アビジンHRP複合体は、40％ラット血清含有または非含有のM199培養液（上記実験Aに記載）中において試験に供された。本実験は、P6-XBおよびP5-XBでは6.66nM、P12-XBでは3.33nM、およびP13-XBでは2.22nMの単一濃度とした以外は実験Aの記載に従って実施された。
【０３４２】
図11に示されるように、40％ラット血清は、P6-XB、P5-XBおよびP13-XBの結合に対して著しい影響を与えることはなかったものの、50％を超える40％ラット血清の存在によってP12-XBの結合が減少することが、結果から示された。先の実施例5に記載の方法で調製されたTcで標識したP12-C（Tc-キレートを含むP12）の結合では、40％ラット血清の存在により80％を超える減少が観察された（データを図25に記載）。Tcで標識したP12-Cの結合における血清の影響は、本明細書に記載のアビジンHRP分析にて模倣される（mimick）ため、（単数または複数の）ペプチドとKDRとの結合に対する血清の影響を迅速に評価するために、本分析を使用することが可能である。
【０３４３】
実験D
実験Dは、KDRの四量体複合体およびポリペプチドP6-XBおよびP5-XBに結合したVEGF／KDR複合体、とりわけ、少なくとも2個のKDR結合ペプチドを含む構成物、の結合を評価するためにデザインされた。KDR結合ペプチドおよび対照の結合ペプチド（P1-XB）は先に記載の方法により調製された。以下に説明する本実験独自の手順を除き、実験Aに記載のプロトコルを用いてこの実験を実施した。
【０３４４】
ペプチド／neutravidin HRP複合体溶液の調製
50％DMSO中で250μMのビオチン化ペプチドP-1-X-B、P6-XBおよびP5-XB原液を調製し、2mgのneutravidin HRP（Pierce社、カタログ番号31001）を1mlのddH2Oに溶解して33μMのneutravidin HRP原液を調製した。ペプチド原液は−20℃で保存し、一方、neutravidin HRP原液は−80℃で保存した。ペプチド／neutravidin HRP複合体を調製するために、総量で5.36μlの250μMビオチン化ペプチド原液（あるいはぺプチド分子がアビジンHRP分子数の4倍とした、ペプチド溶液の混合物）および10μlの33μM neutravidin HRP原液を、1mlのM199培養液に加えた。この混合物を4℃にて60分間ローテーターで培養して、次に50μlのsoft releaseアビジンセファロース（50％スラリーを含むddH2O）を加えて余剰のペプチドを除去し、再び4℃にて30分間ローテーターで培養を行なった。最後に、室温にて5分間、12,000rpmで遠心分離を行ない、soft releaseアビジンセファロースを沈殿させて、得られた上澄み液を分析に使用した。各実験のために、新鮮なペプチド／neutravidin HRP複合体を調製した。
【０３４５】
ペプチド／neutravidin HRPの結合を検出するための分析
ペプチド／neutravidin HRPの結合を検出するためには、先に記載した手順を用いた。P6-XBおよびP5-XBは多量体の状態（multimeric fashion）でKDRに結合し、293Hトランスフェクト細胞内でKDRに結合するために互いに連携していることが、本実験の結果により立証された。
【０３４６】
P1-XBはP1のビオチン化誘導体であり、KDRと結合することのない対照ペプチドである。推測した通り、P1-XBとアビジン-HRPの四量体複合体が、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞に対する結合の増大を示すことはなかった。図12に示されるように、P6-XBまたはP5-XBの四量体複合体は、偽−トランスフェクト細胞への結合に比べ、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合が極めて良好であった。しかしながらP6-XB四量体は、P5-X四量体に比べてはるかに良好に結合した。四量体複合体の形成に使用されるペプチド混合物にP1-XBを添加した場合、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合が低下した。四量体から単量体、二量体、三量体への特異的結合は、四量体、三量体および二量体の特異的結合（ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合から偽−トランスフェクト細胞への結合を差し引いて得られる）を、単量体の特異的結合で分割（dividing）することにより算出された。この結果は、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に関してP5-XB、P6-XBおよびP13-XBの多量体形成による協調的な効果（co-operative effect）が存在することを示唆している。
【０３４７】
表２
2005519980.tif 000030
*：3.33nMにおける単量体ペプチド結合を0としており、従って5.55nMにおける結合を用いて比率を計算した。
【０３４８】
バックグラウンドのＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に対して、25％P1-XBと75％P5-XBの混合物が顕著に結合することはなかったため、分析を通じてP5-XB／アビジン-HRP複合体がKDRへの結合を維持するためには、多価結合が必須であることが示された。この現象はP6-XBについても当てはまるものであり、四量体複合体中のペプチドの50％をP1-XBで置換すると、トランスフェクト細胞のKDRへの結合のほぼすべてが喪失した。
【０３４９】
50％P1-XB、25％P6-XBおよび25％P5-XBで構成されるペプチド混合物は、偽−トランスフェクト細胞に比べて、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞に対してかなり良好に結合し、これは、ひとつの標的細胞上に2つの結合部位が標的となることが大きな利点であることを示している。さらに、異なる割合のP6-XBおよびP5-XB（3：1、2：2、および1：3）を含む四量体複合体はすべて、いずれかのペプチドの非混成四量体に比べ、非常に良好にＫＤＲ−トランスフェクト細胞と結合したことが注目され、ひとつの標的細胞上の2つの異なる結合部位を標的とすることは、ひとつの結合部位への多量体の結合よりも優れているという考えに賛同するものである。これは、多重結合の本質は2またはそれ以上の異なる標的分子に及ぶものであり、そのため該標的分子は同時に結合するために十分に密接していることが、ひとつの結合部位への多重結合には要求されるが、一方、ひとつの標的細胞上の2またはそれ以上の異なる部位に結合し得る多量体結合剤は、多重結合を完成するために、結合剤が到達する範囲内において別の標的細胞を探すことを必要としないからであろう。単量体と比較したヘテロ四量体、ヘテロ三量体、ヘテロ二量体の特異的結合の比率は、四量体、三量体、二量体の特異的結合（ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合から偽−トランスフェクト細胞への結合を差し引いて得られる）を単量体の結合で分割する（dividing）ことにより算出された。比率の算出に用いられた、各へテロ量体（heteromer）用の単量体は、表中の各へテロ量体のリストの最後に記録し、これを比率1とした。
【０３５０】
表3   単量体と比較した、ヘテロ多量体構成物の結合の増大
2005519980.tif 000031
ホモ二量体の結合の増大率は、表2に示すように約1〜4倍の範囲であったが、一方、ヘテロ二両体の結合は2〜110倍の範囲であり、完全長配列の結合強度に対する相乗効果を示している（表3）。
【０３５１】
実験E
実験Eは、P6-XBおよびP5-XBがKDRの異なる結合部位に結合していることを確認するためにデザインされた。ペプチドがKDRの同一部位に結合するのであれば、これらはKDRへの結合に関して互いに競合するであろう。一方、ペプチドが異なる部位に結合するのであれば、KDRへの結合に関してペプチド間の競合は起こらないであろう。本実験は、単一濃度のP5-XB／アビジンHRP（3.33nM）溶液を各ウェル中で使用し、さまざまな濃度（0〜2.5μM）のP1-XB、P5-XBおよびP6-XBを加えたが、いずれもアビジンとの複合体を形成しなかった。
【０３５２】
図13に示すように、P5-XBは、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に関してP5-XB／アビジン溶液と競合するが、P1-XBおよびP6-XBは、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に関してP5-XB／アビジン溶液と競合しないことは、この結果から明白である。したがって、P5-XBおよびP6-XBは、KDR上の異なる相補的部位に結合する。
【０３５３】
［実施例7］
ヘテロ二量体構成物の調製
KDR受容体に対する高親和性のペプチド結合剤を得るために、2種の線形ペプチド（P9、P10）を結合し、ヘテロ二量体を形成した。VEGF競合分析において特定された通り、これらの2つのペプチドはKDR上の異なる部位に結合した。従って、ヘテロ二量体中の両ペプチドは同時にひとつのタンパク質分子に結合することが可能であり、結果として総合的な親和性がより高い状態で結合する。ヘテロ二量体の2つの形状は、この二座の結合イベント（bidentate binding event）に対する最良の方向性を特定することを目指して合成される。ペプチドは、C末端のリジン残基を介してtail-to-tailの方向性で結合するか、あるいはN末端のアミノ基を介してhead-to-headの方向性で結合する。
【０３５４】
ペプチドは標準Fmoc固相ペプチド合成プロトコルを用いて合成された。二量体中の二つのペプチドの間にスペーサーを設けるためにそれぞれのペプチド単量体をC末端リジン（tail-to-tail二量体）またはN末端アミノ基（head-to-head二量体）を、単分散したPEGを基材とするアミノ酸リンカー（Fmoc-NH-PEG4-CO2H）で修飾した。各PEGリンカーのFmoc基の脱保護の後、P9ペプチドをレブリン酸（CH3(C=O)(CH2)2CO2H）で標識し、P10ペプチドをBoc-アミノ-オキシ酢酸で標識した。脱保護、切断および精製の後、変性緩衝液ー中（8Mの尿素、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH＝4.6）にて1：1の割合で2つのペプチドを結合（ライゲート）して、2種のペプチドの間にオキシムリンケージ（oxime linkage）（-CH=N-O-）を形成した。2種の異なる単量体のセットを用いて、溶液中でtail-to-tailとhead-to-headのヘテロ二量体を形成し、標準的な逆相プロトコル（standard reverse phase protocols）によって均質となるように精製した。この連結（リンケージ）化学（linkage chemistry）に関する、より詳細な記述はK.Roseら、JACS, 121:7034-7038（1999）に記載されており、その全文は参照により本明細書に援用される。
【０３５５】
ヘテロ二量体構成物の結合親和性に関する分析
いずれか一方の単量体ペプチドに対する改善された結合親和性に関する分析を行なう目的で、表面プラズモン共鳴（Biacore 3000）を用いて、結合に関する各へテロ二量体の分析を行った。標準的なアミンカップリングの手順により、可溶性のKDR受容体はCM5センサーのチップのデキストラン表面に交差結合（cross-link）した。0.5mg／mlの溶液を、50mMの酢酸塩（pH＝6.0）で1：40に希釈して、総KL値が12721となるように固定化した。PBST緩衝液ー（5.5mMのリン酸、pH＝7.65、0.15MのNaCl、0.1％のTween-20 (v/v)）中で実験を行なった。減衰係数によって定量したペプチド溶液を希釈して1000、500、250、125、62.5および31.3nMの溶液を作製した。（ペプチドの）会合を行なうために、kinjectプログラムを用い、ペプチドを20μl／分で2分間注入した。3分間の解離の後、quickinject（50mMのNaOH、1MのNaCl、15秒間、75μl／分）により、残存するすべてのペプチドをKDR表面から剥離した。単量体P9およびP10を基準品とした。センサーグラムはBIA評価ソフトウェア3.1を使用した国際的な分析技術によって分析された。
【０３５６】
この試験でBLAcore分析による調査が行なわれたペプチド二量体は、いずれかの構成物単量体に比べて非常に高い親和性によってKDRに結合している。意図的に、KDRに結合した二量体のペプチドの相互作用は2つの運動段階を経て進行すると予想される。より詳細な分析により、これらの段階の各比率の定数（individual rate constant）を正確に分析することが可能となるかもしれない。しかしながら、二量体の相互作用に関し、見掛け上のKD値はinitial encounter（ka,1）およびpredominant off-rate（kd,2）を示す比率を用いて算出された。この分析からは、head-to-head二量体の見掛け上のKD値は2.2nMであり、tail-to-tail二量体の見掛け上のKD値は11nMであった（表4）。P9とT-T二量体とのKD値の比較（732nM／1.1nM）に関し、個々の単量体に比べて60倍を超える親和性の増加、そして、P10とH-H二量体とのKD値の比較（1260nM／2.24nM）に関し、個々の単量体に比べて560倍を超える親和性の増加が、これらの推定値により示されている。
【０３５７】
表4   動的パラメータの要約
2005519980.tif 000032
［実施例8］
実施例（8〜12）に記載の個々のペプチドおよび二量体のペプチド構成物の調製には、以下の方法が使用された。
【０３５８】
自動ペプチド合成
ペプチド合成はABI-433Aシンセサイザー（Biosystems Inc.社製を利用、カリフォルニア州フォスターシティー）で、0.25mmolのスケールにてFastMocプロトコルを使用して行なわれた。乾燥条件のNα-Fmoc側鎖保護アミノ酸（requiste dry Nα-Fmoc side-chain protected amino acid）1mmolを、カートリッジ内で0.9mmolのHBTU、2mmolのDIEAおよび0.9mmolのHOBtを含むDMF-NMP混合液を用いて希釈することにより、このプロトコルの各サイクルにおける予備活性化を行なった。NovaSyn TGR（Rink amide）樹脂（0.2mmol／gの置換レベル）によりペプチドを構築した。カップリングを21分間行なった。Fmocの脱保護は、20％のピペリジンを含むNMP中で行なった。最終サイクルにおいて、N末端のFmoc基を除去し、無水酢酸／DIEA／HOBt／NMPを用いて、完全に保護された樹脂結合ペプチドのアセチル化を行なった。
【０３５９】
切断、側鎖の脱保護、および粗製ペプチドの単離
常温にて4.5時間、試薬B（Reagent B）を用ることにより、樹脂からのペプチドの切断、および側鎖の脱保護を行なった。切断された溶液を回収し、追加分の試薬Bアリコートを用いて樹脂を洗浄した。集めた溶液を乾燥するまで濃縮した。円を描くように混ぜながら、あるいは攪拌しながらジエチルエーテルを残渣に加え、ペプチドを沈殿させた。液層をデカントしてから固形物を回収した。この手順を2〜3回繰り返して不純物および切断混合成分の残留物を除去した。
【０３６０】
ジシステインペプチドの環化
エーテルで沈殿した直鎖ジシステインを含む粗製ペプチドを、水、アセトニトリル水溶液混合物（0.1％TFA）、DMSO水溶液、または100％のDMSO中で再溶解させ、ならびに、アンモニア水溶液、炭酸アンモニウム水溶液、重炭酸アンモニウム水溶液またはDIEAを添加して溶液のpHを7.5〜8.5に調整することによって環化した。混合液を空気で16〜48時間攪拌して、トリフルオロ酢酸水溶液でpH＝2になるように酸性化し、その後、アセトニトリルの水への勾配を用いた調製用逆相HPLCで精製した。所望の物質を含む画分をプールし、凍結乾燥により精製ペプチドを単離した。
【０３６１】
リンカーを含むペプチドの調製
標準的な実験において、ivDdeで保護されたリジンを有する樹脂結合ペプチド400mgを、10％ヒドラジンを含むDMF（1×20ml）で処理した。この樹脂をDMF（2×20ml）およびDCM（1×20ml）で洗浄した。DMF（10ml）中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（0.4mmol）、HOBt（0.4mmol）、DIC（0.4mmol）、およびDIEA（0.8mmol）で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF（2×20ml）およびDCM（1×20ml）で洗浄した。次に、この樹脂は20％ピペリジンを含むDMF（2×15ml）により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
【０３６２】
こうして得られた、遊離アミノ基を持つ樹脂結合ペプチドを洗浄し、乾燥した後、試薬B（20ml）で4時間処理した。混合物をろ過し、ろ過液を濃縮乾燥した。残渣をエーテルで攪拌して固形物とし、エーテルで洗浄してから乾燥させた。固形物を無水DMSO中で溶解しDIEAでpH＝7.5となるように調整した。混合物を16時間攪拌してジスルフィドによる環化（disulufide cyclization）を引き起こすと共に、この反応を分析HPLCにより観察した。環化が完了した後、反応混合物を25％のアセトニトリルを含む水で希釈し、逆相C-18カラムに直接投入した。アセトニトリルの水への勾配（いずれも0.1％のTFAを含む）を用いて精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含むものを集めて凍結乾燥し、目的のペプチドを調製した。
【０３６３】
リンカーを含むビオチン化ペプチドの調製
標準的な実験において、ivDdeで保護されたリジンを有する樹脂結合ペプチド400mgを、10％ヒドラジンを含むDMF（2×20ml）で処理した。この樹脂をDMF（2×20ml）およびDCM（1×20ml）で洗浄した。DMF（10ml）中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（0.4mmol）、HOBt（0.4mmol）、DIC（0.4mmol）、およびDIEA（0.8mmol）で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF（2×20ml）およびDCM（1×20ml）で洗浄した。次に、この樹脂は20％ピペリジンを含むDMF（2×15ml）により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。
【０３６４】
こうして得られた、遊離アミノ基を持つ樹脂結合ペプチドをビオチン-NHSエステル溶液（0.4mmol、5当量）およびDIEA（0.4mmol、5当量）を含むDMFで、2時間処理した。先に記載したようにこの樹脂を洗浄し、乾燥した後、試薬B（20ml）で4時間処理した。混合物をろ過し、ろ過液を濃縮乾燥した。残渣をエーテルで攪拌して固形物とし、これを集めてエーテルで洗浄してから乾燥させた。この固形物を無水DMSO中で溶解しDIEAでpH＝7.5となるように調整した。混合物を4〜6時間攪拌し、分析HPLCにより観察しながらジスルフィドによる環化（disulufide cyclization）を行なった。環化が完了した後、反応混合物を25％のアセトニトリルを含む水で希釈し、逆相C-18カラムに直接投入した。アセトニトリルの水への勾配（いずれも0.1％のTFAを含む）を用いて精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含むものを集めて凍結乾燥し、目的のビオチン化ペプチドを調製した。
【０３６５】
選択されたガドリニウムまたはインジウム同位体で標識するための、DOTA-結合（conjugated）ペプチドの調製
標準的な実験において、Nε-ivDdeで保護されたリジン部分を有する樹脂結合ペプチド400mgを、10％ヒドラジンを含むDMF（2×20ml）で処理した。この樹脂をDMF（2×20ml）およびDCM（1×20ml）で洗浄した。DMF（10ml）中で樹脂を再懸濁し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（0.4mmol）、HOBt（0.4mmol）、DIC（0.4mmol）、およびDIEA（0.8mmol）で4時間混合しながら処理した。反応後、この樹脂をDMF（2×10ml）およびDCM（1×10ml）で洗浄した。次に、この樹脂は20％ピペリジンを含むDMF（2×15ml）により、毎回10分間処理された。樹脂を洗浄し、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸によるカップリングおよびFmoc保護基の除去をもう一度繰り返した。こうして得られた、遊離アミノ基を持つ樹脂結合ペプチドをDMF（10ml）中に再懸濁し、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸-1,4,7-トリ-t-ブチルエステル（DOTA-トリ-t-ブチルエステル、0.4mmol、5当量）、HOBt（0.4mmol）、DIC（0.4mmol）およびDIEA（0.8mmol）を含むDMF（10ml）の溶液で4時間混合しながら処理した。反応が完了した後、この樹脂をDMF（2×10ml）およびDCM（1×10ml）で洗浄し、試薬B（20ml）で4時間処理した。混合物をろ過し、ろ過液を濃縮乾燥した。残渣をエーテルで攪拌して固形物とし、これを集めてエーテルで洗浄してから乾燥させた。この固形物を無水DMSO中で溶解しDIEAでpH＝7.5となるように調整した。混合物を16時間攪拌し、分析HPLCにより観察しながらジスルフィド環化（disulufide cyclization）を行なった。環化が完了した後、反応混合物を25％のアセトニトリルを含む水で希釈し、逆相C-18カラムに直接投入した。アセトニトリルの水への勾配（いずれも0.1％のTFAを含む）を用いて精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含むものを集めて凍結乾燥し、目的のビオチン化ペプチドを調製した。
【０３６６】
以下に示す表5の単量体ペプチドは、上述の方法により調整されたものである。
【０３６７】
表5   単量体ペプチドおよびペプチド誘導体の配列または構造
2005519980.tif 000033
2005519980.tif 000034
先の表5およびその他の本明細書の記載において、記号表記「C*」は、ジスルフィド結合に関与するシスティン残基を指す。通常、本明細書に記載の単量体ペプチドは、環状ジスルフィドペプチドとして調製された後、共に連結することにより二量体を形成する。その結果、システィン残基が「C*」の表記を欠く場合であっても、単量体中の最も近いシスティンに結合したジスルフィド結合が存在することが概して推測される。二量体中の単量体成分もまた、システィン残基が「C*」の表記を含むか否かにかかわらず、概してこのようなジスルフィド結合を含むであろう。しかしながら、単量体を結合させて二量体を形成しし、その後ジ-システィンペプチドの環化を行なうことにより、本願発明の二量体およびその他のヘテロ多量体を代替として調製することができるであろうこと、ならびに、本願発明は、このようなジスルフィド結合が存在するか否かに関して何ら限定することを意図するものではないことを、当業者であれば理解するであろう。
【０３６８】
［実施例9］
種々のホモ二量体およびヘテロ二量体構成物の調製において、先に実施例8において言及した精製ペプチドの単量体を使用した。
【０３６９】
ホモ二量体を含有する構成物の調製
ホモ二量体成分を調製するために、二量体を調製するために必要なペプチドの半量をDMFに溶解し、10当量のグルタル酸  ビス-N-ヒドロキシルスクシンイミジル  エステルで処理した。HPLC分析および質量分析により、反応の進捗状況を観察した。反応終了後、真空内で揮発性物質を除去し、残渣を酢酸エチルで洗浄して、未反応のビス-NHSエステルを除去した。残渣を乾燥させて、無水DMF中に再溶解し、2当量のDIEAの存在下、残りの半量のペプチドによる処理を行なった。24時間、この反応を進行させた。混合物を直接YMC逆相HPLCカラムに投入し、アセトニトリルの水への直線勾配（いずれも0.1％のTFAを含む）による溶出により、精製を行なった。
【０３７０】
ヘテロ二量体を含有する構成物の調製
ヘテロ二量体の場合、第一の単量体（「A」）は、グルタル酸のビス-NHSエステルと反応し、余剰分のビス-NHSエステルを洗い流した後（ホモ二量体に関する記載のように）、DIEAの存在下、第二の単量体（「B」）を加えた。反応混合液を調製用逆相HPLCで精製した。通常、グルタル酸  ビス-N-ヒドロキシルスクシンイミジル  エステル（0.02mmol、10当量）を含むDMF（0.3ml）をペプチドAおよびDIEA（2当量）を含むDMF（0.5ml）に加えて、この混合物を2時間攪拌した。HPLC分析および質量分析により、反応の進捗状況を観察した。反応終了後、真空内で揮発性物質を除去し、残渣を酢酸エチル（3×1.0ml）で洗浄して、未反応のビス-NHSエステルを除去した。残渣を乾燥させて、無水DMF（0.5ml）中に再溶解し、ペプチドBおよびDIEA（2当量）を含むDMF（0.5ml）で24時間の処理を行なった。混合物を水で希釈（1：1、v／v）してからYMC  C-18逆相HPLCカラムに直接投入し、アセトニトリルの水への直線勾配（いずれも0.1％のTFAを含む）による溶出により、精製を行なった。画分をHPLCにより分析し、これらのうち純生成物を含む画分を集めて凍結乾燥し、目的の二量体を得た。以下の二量体はこの方法により調整された（構造、名称、化合物の整理番号）：
2005519980.tif 000035
2005519980.tif 000036
2005519980.tif 000037
2005519980.tif 000038
2005519980.tif 000039
2005519980.tif 000040
2005519980.tif 000041
2005519980.tif 000042
2005519980.tif 000043
2005519980.tif 000044
2005519980.tif 000045
2005519980.tif 000046
2005519980.tif 000047
2005519980.tif 000048
2005519980.tif 000049
2005519980.tif 000050
2005519980.tif 000051
2005519980.tif 000052
2005519980.tif 000053
2005519980.tif 000054
2005519980.tif 000055
2005519980.tif 000056
2005519980.tif 000057
二量体Ｄ５を調製するために、個々のペプチドのカップリング反応後、５０μｌのヒドラジンが反応混合物に加えられ（リジンＮε−アミノ酸を晒すため）、溶液は、２分間攪拌された。反応混合物は、水（１．０ｍＬ）で希釈され、ｐＨは、ＴＦＲで２に調整された。その後、これを上述の方法で精製した。
【０３７１】
Ｄ２７の合成
2005519980.tif 000058
2005519980.tif 000059
１および３の合成
単量体の合成は、２５ｍｍｏｌ規模で、方法５に記述したやり方で、開始樹脂としてＦｍｏｃ−ＧＧＧＫ（ｉＶ−Ｄｄｅ）ＮＨ−ＰＡＬ−ＰＳ樹脂を使用して実行された。ペプチド樹脂は、切断またはさらなる誘導体化を行う前に、自動または手動で洗浄され、乾燥された。
【０３７２】
２および４の合成手順
１および３への、ビオチン−ｊｊ、リシル、グリチルおよびＳｅｒｉｎｙｌ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄ部の付加は、方法６および８に記述したように、手動ＳＰＰＳにより実行された。アミノ酸のカップリングは、ＨＯＢｔ／ＤＩＣを活性剤に用いて（Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄの場合を除く）、ＤＭＦ内で行われた。Ｆｍｏｃの除去は、ＤＭＦ内の２０％のピペリジンで行われた。すべてのカップリングは、５〜１６時間継続された。各々のカップリングの後、Ｋａｉｓｅｒ試験で、カップリングの完了を確認した。Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄの場合は、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡをカップリング試薬に用いて、ＤＭＦ内でカップリングを行った。Ｋａｉｓｅｒ試験により、未反応のアミノ酸基が発見された場合は、カップリング処置が繰り返された。Ｎ−端末Ｆｍｏｃ基の除去および樹脂からの切断が実行された。粗製ペプチドを、エーテル内に沈殿させ、エーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥させた。直鎖粗製ペプチドは、ＤＭＳＯ（４０ｍｇ／ｍＬ）内に溶解され、これにより直接的に環化された。溶液のｐＨは、水性Ｎ−メチルグルカンを加えることにより、８に調整され、溶液は、大気中で、室温で４８時間攪拌された。その後ペプチドは、方法１に記述したように、Ｗａｔｅｒｓ−ＹＭＣ  Ｃ−１８  ＯＤＳ調製用カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ内径）を使用して、勾配ＨＰＬＣにより精製された。純粋な生産物を含む留分を集めて冷凍乾燥し、所望のペプチドを得た。
【０３７３】
2005519980.tif 000060
Ｄ２７−化合物６の合成手順
無水ＤＭＦにグルタル酸ｂｉｓ−ＮＨＳエステル（０．１２２ｍｍｏｌ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．）を加えた溶液に、ＤＭＦに４を加えた溶液（４０ｍｇ、０．０１２２ｍｍｏｌ）を、一滴ずつ垂らすように加えた。ペプチドと結合したトリフルオロ酢酸、および反応の間に形成されたＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅを中和するため、ＤＩＥＡを加えた。この０．７ｍＬの溶液は、４時間攪拌された。反応は、ＨＰＬＣおよび質量分析によってモニターされた。ＤＭＦは、真空下で除去された。過剰なジエステルを、酢酸エチルを加えることにより除去し、グルタル酸ｂｉｓ−ＮＨＳエステルを溶解する間に、ペプチド−モノエステル５を沈殿させた。混合物は、遠心分離機で分離され、液体部分は、別の容器に移された。これを、２回繰り返した。残留物は、真空下に１０分間保たれた。残留物は、ＤＭＦに溶解され、ＤＭＦ（ｐＨ７）に２を加えた溶液（３７ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）と混合された。混合液は、常温で１６時間攪拌された。揮発性物質は、高真空で除去され、酢酸官能基は、残留物を１ｍＬのヒドラジン／ＭｅＯＨ（１５／８５、ｖ／ｖ）溶液で処理し、常温で２．５時間攪拌することにより、除去された。過剰なヒドラジンを抑えるために、アセトンが加えられ、発揮性物質は、真空で除去された。こうして得られた残留物は、ＤＭＳＯに溶解され、前述したように、調製用ＨＰＬＣによって精製され、９ｍｇの純粋な物質を提供した。
【０３７４】
分析的データ
上記に同定した二量体ペプチドＤ−１〜５、Ｄ−８〜３０、および二量体Ｄ−２７のペプチド構成要素に関する、ＨＰＬＣ分析データおよび質量分析データを、下記の表６に示す。
【０３７５】
表６  ホモ二量体およびヘテロ二量体ペプチド構成物の分析データ
2005519980.tif 000061
2005519980.tif 000062
ＨＰＬＣ解析システム
システムＡ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２５％Ｂ，直線的勾配２５〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３７６】
システムＢ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２５％Ｂ，２０分は直線的勾配２５〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３７７】
システムＣ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，３０％Ｂ，直線的勾配３０〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３７８】
システムＤ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−４（４．６×２５０ｍｍ）；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２０％Ｂ，直線的勾配２０〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３７９】
システムＥ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１０％Ｂ，直線的勾配１０〜６０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８０】
システムＦ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，３０％Ｂ，直線的勾配３０〜７０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８１】
システムＧ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，３０％Ｂ，直線的勾配３０〜７５％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８２】
システムＨ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２０％Ｂ，直線的勾配２０〜５２％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８３】
システムＩ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１０％Ｂ，直線的勾配１０〜６５％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８４】
システムＪ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２０％Ｂ，直線的勾配２０〜６０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８５】
システムＫ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，５％Ｂ，直線的勾配５〜６０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８６】
システムＬ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，５％Ｂ，直線的勾配５〜６５％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８７】
システムＭ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１５％Ｂ，直線的勾配１５〜５０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８８】
システムＮ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１０％Ｂ，直線的勾配２０〜８０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３８９】
システムＯ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−１８，４．６×２５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，３０％Ｂ，直線的勾配３０〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９０】
システムＰ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−１８，４．６×２５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２０％Ｂ，２０分は直線的勾配２０〜８０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９１】
システムＱ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−１８，４．６×２５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２０％Ｂ，６分は直線的勾配２０〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９２】
システムＲ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−１８，４．６×２５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，２５％Ｂ，直線的勾配２５〜６０％Ｂで１０分；流量：２．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９３】
システムＳ：カラム：ＹＭＣ  Ｃ−１８，４．６×２５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１０％Ｂ，直線的勾配１０〜６０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９４】
システムＴ：カラム：Waters XTerra,４．６×５０ｍｍ；溶出剤：Ａ：水（０．１％ＴＦＡ），Ｂ：アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）；溶出：初期状態，１５％Ｂ，８分は直線的勾配１５〜５０％Ｂで１０分；流量：３．０ｍｌ／分；検出：紫外線で２２０ｎｍ。
【０３９５】
［実施例１０］
ＨＵＶＥＣおよびＫＤＲ−トランスフェクト細胞上のＫＤＲと結合するための125  Ｉ−ＶＥＧＦとの競合
以下の実験は、トランスフェクト２９３Ｈ細胞に発現したKDRと結合するために、本発明のKDR-結合ペプチド、ホモ二量体およびヘテロ二量体が、125  Ｉ−標識ＶＥＧＦ  と競合する能力を判定したものである。
【０３９６】
プロトコル：
２９３Ｈ細胞は、ＫＤＲｃＤＮＡでトランスフェクトされるか、前述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。細胞は、競合する化合物（１０μＭ、０．３μＭおよび０．０３μＭ）の存在下または不在下、125  Ｉ−ＶＥＧＦで培養された。細胞を洗浄した後、結合放射活性が、ガンマカウンターで計量された。ＶＥＧＦ結合の阻害率は、式  ［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ１］を用いて計算された。ここで、Ｙ１は、ペプチド不在下における、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合であり、Ｙ２は、ペプチド競合物の存在下における、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から、偽−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合を引くことにより計算される。
【０３９７】
結果：
図１４に示されるように、判定されたすべてのＫＤＲ−結合化合物は、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に関して、125  Ｉ−ＶＥＧＦと競い合うことができた。ヘテロ二量体（Ｄ１）は、明らかに、125  Ｉ−ＶＥＧＦと最も効果的に競合した。これは、２つのホモ二量体（Ｄ２およびＤ３）を上回るものであり、Ｄ１の優れた結合力を裏づけた。
【０３９８】
［実施例１１］
受容体活性化分析
ヘテロ多量体をはじめとする、本発明のＫＤＲ−結合多量体構成物の、ＶＥＧＦが誘発するＫＤＲの活性化（リン酸化）を阻害する能力は、以下の分析を用いて判定された（上記の実施例４も参照）。
【０３９９】
プロトコル：
ほぼ融合性のＨＵＶＥＣを入れた皿が、血清も増殖因子も含まない基礎媒体の中に、一晩置かれた。翌日、下記の（ｃ）グループの皿を、ＫＤＲ−結合ペプチドを含んだ基礎媒体で前処理し、その後、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のグループの皿の中の細胞は、
（ａ）添加物無し（負の制御）
（ｂ）５ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ（正の制御）
（ｃ）５ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦおよび競合的／阻害的と見なされるペプチド
を含んだ新しい媒体の中に置かれた。５分間処理した後、各皿からの溶解物が準備された。溶解物から免疫沈降したＫＤＲは、連続して免疫ブロット法により分析された。抗−ホスホチロシン抗体で、リン酸化を分析し、抗−ＫＤＲ抗体で、総ＫＤＲ量を分析（サンプルの負荷量を照合するため）した。
【０４００】
結果：
図１５に示されるように、Ｄ１は、１０ｎMで、ＨＵＶＥＣ内におけるＶＥＧＦが誘発するＫＤＲのリン酸化を、完全にブロックした。ホモ二量体Ｄ２およびＤ３（Ｄ１に含まれる別個の結合部分を、それぞれ、単独で２個有している）は、１００ｎＭまで、リン酸化に何の影響も与えなかった。このことは、適切なヘテロ二量体を使用することが、受容体−リガンドの相互作用をブロックするには、有益であるということを示している。多くの実験において、Ｄ１の本分析におけるＩＣ５０は、０．５〜１ｎＭの間で変化した。無関係な結合配列を有するヘ別のテロ二量体Ｄ３１（下記に構造を示す）は、その高い結合親和力（ＫＤＲに対して１１ｎＭ、Biacoreで測定）にもかかわらず、１００ｎＭでは、リン酸化に何の影響も及ぼさなかった。このことは、ＫＤＲへの結合を、ＶＥＧＦと競い合う多量体を構築する場合、ＫＤＲ結合部分の選択が、重要であるということを示唆してる。Ｄ１のＫＤＲへの親和力は、Ｄ２のそれよりも１０倍高い（ＳＰＲ分析による）が、活性化分析におけるＤ１のＩＣ５０は、少なくとも１００倍低い。このことは、１つの結合分子でＫＤＲ上の２つの別個のエピトープを標的とすると、ＫＤＲ上の単一のエピトープとしか結合しない同じ親和力を有する分子と比して、より大きな立体障害を生み出すことができる、ということを示唆している。同様に、Ｄ１内の２つのＫＤＲ−結合部分を、受容体活性化分析において、単量体の遊離ペプチド（Ｐ１２−ＸＢおよびＰ６−Ｄ）として試験したところ、それぞれ、０．１、１マイクロモルのＩＣ５０を有していた。これは、この分析におけるＤ１のＩＣ５０よりも１００〜１０００倍高く、単量体ペプチドのフルオレセイン標識された誘導体のKDよりも１４〜３０倍高い。このように、ＶＥＧＦのブロック機能が弱いペプチドであっても、これら２つを含めて二量体を作ると、非常に強力なＶＥＧＦ−ブロック機能を有する分子とすることができ、これはＤ１の結合親和力の向上を優に上回るものである。
【０４０１】
2005519980.tif 000063
［実施例１２］
移動分析
以下の実験は、培養中にＶＥＧＦが誘発するＨＵＶＥＣの移動を、本発明のヘテロ多量体がブロックする能力ついて判定した。
【０４０２】
プロトコル：
血清を欠いたＨＵＶＥＣが、１つのウェルにつき１００，０００細胞、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ−ｃｏａｔｅｄ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋの２４−ウェル・インサートプレート（＃３５４１４１）の、上部チェンバーに置かれた。添加物無しの、または異なる誘因剤、たとえばＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、血清（５％）（ＶＥＧＦをブロック／阻害する可能性のある化合物を含むまたは含まない）を含む基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。２２時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略／移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動／侵略が計量された。
【０４０３】
ＶＥＧＦの誘発による移動は、ウェルの下部チェンバーに基礎媒体のみをおいた場合の移動を、差し引くことにより計算された。
【０４０４】
結果：
本分析において、ＶＥＧＦは、内皮細胞の移動を大幅に増加させたが、これは、Ｄ１によって強力にブロックされた。５ｎＭのＤ１で、ＶＥＧＦの刺激による内皮細胞の移動は、８４％ブロックされた（図１６参照）。２５ｎＭのＤ１では、移動はほぼ完全にブロックされた。他の実験において、ＫＤＲの阻害剤として知られるＳＵ−１４９８（（Ｅ）−３−（３，５−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−［（３−ｐｈｅｎｙｌ−ｎ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ］が、本分析で試験された。３ミリモルのＳＵ１４９８は、ＶＥＧＦの誘発による移動を、Ｄ１ほどにはブロックしなかった（３ミリモルで４７％をブロックした）。Ｄ７（下記に構造を示す）は、５０ｎＭで、ＶＥＧＦの刺激による移動を、本質的に完全に阻害した。本分析において、ＶＥＧＦの代わりに血清を用いると、非常に強力な誘引剤となる。しかし、血清による効果は、Ｄ１ではあまり減少しなかった。このことは、Ｄ１は、ＶＥＧＦの誘発による内皮細胞の移動を、特異的に阻害するということを示している。
【０４０５】
2005519980.tif 000064
［実施例１３］
以下、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｌｕ、およびＩで標識された化合物を調製するために用いられる方法について、記述する。
【０４０６】
９９ｍＴｃ−Ｐ１２−Ｐの調製
ＳｎＣｌ２・Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を、１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解し、この溶液１０μＬを、１ｍＬの水に１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）に溶解することにより調製した、１ｍＬのＤＴＰＡ溶液に加えた。錫ＤＴＰＡ溶液の ｐＨは、１Ｎ水酸化ナトリウムを使用してｐＨ６〜８に調整された。５０μｇのＰ１２−Ｐ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴＧＧＧＫ（ＰｎＡＯ６−ＮＨ−（Ｏ＝）Ｃ（ＣＨ２）３Ｃ（＝Ｏ）−ＪＪ）−ＮＨ２）の入った５０μＬの１０％ＤＭＦを、２０μＬの９９ｍＴｃＯ４−（２．４〜４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）に混合し、続いて１００μＬの錫Ｓｎ−ＤＴＰＡ溶液を加えた。室温で３０分後、放射線化学的純度（ＲＣＰ）は、９３％であった。生成物は、Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＣ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、５μｍの孔サイズ）の上で、（Ａ）１ｇ／Ｌ酢酸アンモニウムを入れた水、（Ｂ）アセトニトリルの水性／有機の勾配を使用して流量０．５ｍＬ／分で溶出されて、精製された。以下の勾配が使用された：３０．５％Ｂ〜３５％Ｂに３０分、７０％Ｂに至るまで１０分。２１．２分の保持時間で溶出した化合物が、１％のアスコルビン酸および０．１％ＨＳＡを含む５００μＬの５０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．２）の中に集められ、アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。精製後、化合物は＞９８％のＲＣＰを有していた。
【０４０７】
１１１Ｉｎ−Ｐ１２−ＸＤＴの調製
５０μｇのＰ１２−ＸＤＴ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣＥＤＤＷＹＹＣＷＬＦＧＴＪＫ（ＪＪ−ＤＯＴＡ）−ＮＨ２）が入った５０μＬの１０％ＤＭＦを、１１１ＩｎＣｌ３（５０μＬ、４００μＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）および１００μＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウムまたはｐＨ５．３のクエン酸緩衝液に混合した。８５℃で４５分加熱された後、ＨＰＬＣを使用して測定された放射線化学的純度（ＲＣＰ）は、４４％〜５２．２％の範囲にあった。１１１Ｉｎで標識された化合物は、ＶｙｄａｃＣ１８カラム（４．６×２５ｃｍ、５ミクロンの孔サイズ）を使用して、以下の条件で、標識されなかったリガンドから分離された。：水相、１ｇ／Ｌの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）；有機相、アセトニトリル。勾配：有機２３％〜２５％まで３０分、有機３０％まで２分、１０分間の維持。化合物は、維持時間２０．８分で溶出し、１％のアスコルビン酸および０．１％のＨＳＡを含む２００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の中に集められ、アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。精製後、化合物は＞９３％のＲＣＰを有していた。
【０４０８】
１１１Ｉｎ−Ｄ４の調製
ヒスチジン緩衝液は、濃縮水酸化アンモニウムでヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）の０．１Ｍ溶液をｐＨ６．２５に調整することにより調製された。酢酸アンモニウム緩衝液は、濃縮塩酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｕｉｔｒａ  Ｐｕｒｅ）を使用して、酢酸アンモニウム（９９．９９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．２Ｍ溶液をｐＨ５．５に調整することにより調製された。高純度１１１ＩｎＣｌ３（１００μＬ、１．２ｍＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）が、Ｄ４（５０％ＤＭＦ、１０％ＤＭＳＯ、２０％アセトニトリルおよび２０％水の２００につき２００μｇ）に加えられ、続いて３００μＬのヒスチジン緩衝液が追加された。最終的なｐＨは５．５であった。８５℃で４５分間、反応混合物を培養した後、ＲＣＰは２０％であった。
【０４０９】
代替的に、市販されているＯｃｔｒｅｏＳｃａｎ（商標）キット（１３４μＬ、０．６ｍＣｉ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）により提供された１１１ＩｎＣｌ３が、１６２μＬの０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液に入ったＤ４（１３５μｇ）に加えられた。最終的なｐＨは５．５であった。８５℃で４５分間、反応混合物を培養した後、ＲＣＰは２０％であった。
【０４１０】
１２５Ｉ−Ｄ５の調製
ジイソプロピルアミンを使用して予めｐＨ８．５〜９．０に調整された３０μＬのＤＭＦに入ったＤ５（２００μｇ）を、蒸発されて乾燥された１ｍＣｉのモノ−ヨウ化１２５ＩＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（ＮＥＸ−１２０、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に加えた。ガラスビンはシェイクされ、氷の上で３０分間、時々揺らしながら培養された。３０分経過後、ＲＣＰは２３％であった。１２５Ｉ−Ｄ５（以下に示す）は、ＨＰＬＣにより、ＶｙｄａｃＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５ミクロンの孔サイズ）を使用して、流量１ｍＬ／分で、以下の条件で精製された。水相：０．１％ＴＦＡの水；有機相：０．０８５％ＴＦＡのアセトニトリル。勾配：有機３０％〜３６％まで３０分、有機６０％まで５分、５分間維持。化合物は、１％のアスコルビン酸および０．１％のＨＳＡを含む、２００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の中に集められた。アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。結果として得られた化合物は、９７％のＲＣＰを有していた。
【０４１１】
2005519980.tif 000065
１７７Ｌｕ−Ｄ１１の調製
Ｄ１１（０．０５ＮのＮＨ４ＯＨ／１０％ＥｔＯＨに入った５μＬの〜１μｇ／μＬ溶液）を、８０μＬの０．２ＭのＮａＯＡｃ緩衝液ｐＨ５．６が入れられたガラス挿入マイクロガラスビンに加えた。十分な１７７Ｌｕが、リガンドを運ぶために加えられた。Ｌｕ割合は２：１（１−５ｍＣｉ）まで。ガラスビンは、クリンプ封止され、１００℃で１５〜２０分間加熱され、５分間冷却され、３μＬの１％Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏが入った水で処理された。全ての反応混合物は、Supelco Discovery RPアミドＣ１６カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ）の上に注入された。以下のＨＰＬＣ条件が使用された：カラム温度＝５０℃。溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏｗ／０．１％ＴＦＡ。溶媒Ｂ＝ＡＣＮｗ／０．０８５％ＴＦＡ。勾配は、０．６／０．２５ｍＬ／分Ａ／Ｂ＝０分〜０．５／０．４ｍＬ／分Ａ／Ｂ＝６０分。Ｄ１１のための維持時間は〜４０分；１７７Ｌｕ−Ｄ１１  １３３４のための維持時間は〜４２分であった。放射能ピークは、ｐＨ５．３で、０．１％のヒト血清アルブミン断片Ｖおよび１．０％アスコルビン酸を含む０．７ｍＬの０．０５クエン酸緩衝液内に集められ、混合物は、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで遠心沈降され、有機溶媒が除去された。８０％を超える放射化学的純度が得られた。
【０４１２】
９９ｍＴｃ−Ｄ１２の調製
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を、１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解し、この溶液１０μＬを、１ｍＬの水に１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）に溶解することにより調製した、１ｍＬのＤＴＰＡ溶液に加えた。Ｄ１２（１００μＬの５０％ＤＭＦに入れられた１００μｇ）を、７５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９のリン酸塩緩衝液および６０μＬの９９ｍＴｃＯ４−（２．４から４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）に混合し、続いて１００μＬの錫のＳｎ−ＤＴＰＡ溶液を加えた。４０℃で１０分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は１６％であった。生成物は、Supelco DiscoveryＣ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、５μｍの孔サイズ）の上で、（Ａ）０．１％ＴＦＡの入った水および、（Ｂ）０．０８５％ＴＦＡの入ったアセトニトリルの水性／有機の勾配を使用して、流量０．７ｍＬ／分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された：３０％Ｂ〜４２％Ｂが１０分、７０％Ｂに至るまで１０分。３７．１分の維持時間で溶出した化合物は、０．２％ＨＳＡを含む５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の中に集められ、アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。精製後、化合物は、＞９０％のＲＣＰであった。
【０４１３】
９９ｍＴｃ−Ｄ１４の調製
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を、１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解し、この溶液１０μＬを、１ｍＬの水に１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）に溶解することにより調製した、１ｍＬのＤＴＰＡ溶液に加えた。Ｄ１４（１００μＬの５０％ＤＭＦに入れられた１００μｇ）を、５０μＬの９９ｍＴｃＯ４−（６ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）、および１２５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９のリン酸塩緩衝液に混合し、続いて１００μＬの錫のＳｎ−ＤＴＰＡ溶液を加えた。４０℃で１０分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は２１％であった。生成物は、ＶｙｄａｃペプチドＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ）の上で、（Ａ）０．１％ＴＦＡの入った水および、（Ｂ）０．０８５％ＴＦＡの入ったアセトニトリルによる水性／有機の勾配を使用して、流量１ｍＬ／分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された：３０％Ｂ〜４５％Ｂが４０分。３４．９分の維持時間で溶出した化合物は、０．２％ＨＳＡを含む５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）の中に集められ、アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。精製後、化合物は、９２．５％のＲＣＰであった。
【０４１４】
［実施例１４］
本発明の125I−標識ヘテロ多量体とＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合
125I−標識Ｄ５が、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と結合する能力を試験するために、実験が行われた。この実験では、様々な量の125I−標識Ｄ５（１〜４Ｃｉ／ｍｌ、125I−Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識、ＨＰＬＣで精製）が、９６ウェルのプレート内で、室温で１時間、偽−トランスフェクトおよびＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞に培養された。ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への結合に、血清が及ぼす効果を評価するため、
結合は、４０％のマウス血清を伴う場合と、伴わない場合とで実行された。未結合の化合物を洗浄した後、各ウェル内の細胞を０．５ＮのＮａＯＨで溶解し、溶解物をガンマカウンターで計側した。
【０４１５】
この実験の結果を、図１７および図１８にまとめた。これらの結果から、次のことが明らかである。すなわち、125I−標識Ｄ５は、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞と特異的に結合することができ、その結合は、４０％のマウス血清の存在によって、何らの影響も受けないということである。確かに、４０％のマウス血清がある場合に比べると、血清がない場合の方が、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞と、幾分多く結合した。しかしながら、125I−Ｄ５の偽−トランスフェクト細胞への結合もまた、分析において血清を省略した場合に、およそ同じ程度増加しており、このことは、血清がない場合における結合の増加は、特異的ではないということを示している（図１７）。ＫＤＲ−トランスフェクト細胞への特異的結合（偽−トランスフェクト細胞への結合を差し引いたもの）は、マウス血清を伴う場合も伴わない場合も、ほぼ同一（図１８に示されるように）であった。この実験において、１０〜１４％の総ＣＰＭを加えると、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞と、特異的に結合した（データは示さず）。
【０４１６】
［実施例１５］
ペプチドヘテロ二量体（Ｄ６、以下に示す）は、実施例９において前述したように、グルタル酸ｂｉｓ−ＮＨＳエステルを用いて調製された。このヘテロ二量体は、Ｂｉａｃｏｒｅを用いてＫＤＲ−Ｆｃとの結合を試験され、親和定数は、以下のように測定された。
【０４１７】
2005519980.tif 000066
３つの密度のＫＤＲ−Ｆｃは、標準的なアミンカップリング処置（０．５ｍｇ／ｍＬ溶液、１：１００または１：５０希釈、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０）Ｃ５センサーチップのデキストラン表面に、交差結合した。フローセル１は、参考引き算に用いるため、活性化され、次にブロックされた。最終的な不動化レベルが、得られた：
ＲＬＦｃ２ＫＤＲ−Ｆｃ＝１６０７
ＲＬＦｃ３ＫＤＲ−Ｆｃ＝３００１
ＲＬＦｃ４ＫＤＲ−Ｆｃ＝６３１９
実験は、ＰＢＳ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５Ｍの塩化ナトリウム＋０．００５％のＰ−２０（ｖ／ｖ））内で実施された。Ｄ６は、ＰＢＳ内で２５０ｎＭに希釈され、また、１２５、６２．５、３１．３、１５．６、７．８および３．９ｎＭの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、Ｋｉｎｊｅｃｔプログラムを使用して、ペプチドを１２．５分間、２０μＬ／mimで注入した。１０分間の解離を行った後、残ったペプチドは、５０ｍＭのＮａＯＨ＋１ＭのＮａＣＬを、７５μＬ／mimで１２秒間急速に注入することより、ＫＤＲ表面から引き剥がされた。センサ質量は、ＢＬＡ評価ソフトウェア３．１、およびシグマプロット６．０の双曲線二重矩形回帰方程式使用して、分析された。ヘテロ二量体の定常状態結合親和力（ＫＤ）が、３つすべてのＫＤＲ不動化濃度において、測定された（表７）。
【０４１８】
表７．パラメーターの概略
2005519980.tif 000067
このデータが示すところによれば、高い不動化濃度において、ヘテロ二量体は、サブ−ナノモルの親和力（〜０．６ｎＭ））でＫＤＲと結合する。
【０４１９】
生体内おける、ペプチドヘテロ二量体の除去を判定するために、標準的なプロトコルに従い、少量の素材がヨード剤およびＮａ125Iを用いてヨード処理された。放射性ヨード化は、放射性安全ラボにおいて、指定のフード内で行われた。ヨード試薬でコーティングされた１つの管は、２５ｍＬの２５ｍM  Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ  ＮａＣＬ、ｐＨ７．５で予め湿らされた。この液は捨てられ、１００μｌの同じ緩衝液が加えられた。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、１１μＬの125I−ＮａＩが反応管に移された。１４３．５５５ｍＣｉ／ｍｌの濃度のＮａ125Iの最初の見積もりに基づくと、１１μＬはおよそ１．５ｍＣｉを含んでいるはずであった。室内には、放射線量キャビレーターがなかった。添加後、サンプルは、旋回され、リードピッグにセットされ、３０秒ごとに旋回されて６分間培養された。６分後、サンプル全体を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管の中のペプチドへと移した。８分後、チロシン（１０ｍｇ／ｍＬ、飽和溶液）で反応を終了させ、５分間放置し、その後２μＬが基準用に取り出された。
【０４２０】
精製のために、Ｄ−塩ポリアクリルアミド１８００の１０ｍＬカラムを使用して、標識されたチロシンから、標識されたペプチドを分離した。カラムは、まず最初に、１０ｍＬの塩水で洗浄され、次に、非特異的な部位をブロックするため、２．５％のＨＳＡを含んだ５ｍＬの２５ｍM  Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ  ＮａＣＬ、ｐＨ７．５で洗浄された。ＨＳＡ緩衝液での洗浄後、カラムは、６０ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ  ＮａＣＬ、ｐＨ７．５の緩衝液で溶出され、一晩４℃で保管された。放射線量キャビレーターで測定すると、標識されたサンプルは、１．３３５ｍＣｉ含んでいた。基準用に取り出しておいた２μｌのサンプルは、８．８μＣｉ含んでいた。サンプルは、Ｄ−塩１８００カラムに適用され、Ｔｒｉｓ／ＮａＣＬ緩衝液、ｐＨ７．５で溶出された。♯１〜１４のそれぞれには０．５ｍｌの単一のアリコートを適用し、２５〜４３については、１．０ｍＬ適用することで、流れを制御した。♯９、１０および１１における活動のピークは、ペプチドであると推定された。２４〜４０における放射活性は、標識されたチロシンのようであった。この精製から、♯９〜１２が、一緒にプールされ、後の除去研究に用いられた（プールの125Ｉ−Ｄ６の濃度は、７．０２３μｇ／ｍＬ；１００μＬ＝０．７０２μｇ、８．６μＣｉである）。
【０４２１】
全部で１５匹のマウスが、１００μＬの125I−Ｄ６を注射され、０分、７分、１５分、３０分、９０分の時点で、犠牲になった（１セット３匹）。注射された実際の放射能量は、およそ６μＣｉであった。６μＣｉの注射に対応するペプチドの投与量は、一匹ごとに〜０．５μｇであった。犠牲になったそれぞれのマウスから、５０μＬの血漿が採られ、計測された。各時点の、３匹１セットの各々について、計測値が平均され、注射量／ｍｌ血漿（ＩＤ％／ｍＬ）のパーセンテージに変換され、除去率を判定するためにプロットされた（図１９）。その後、このデータは、分子の二相半減期を特定するため、パラメーター方程式４または５のいずれかに適用された。４のパラメーターに当てはめた結果は、Ｔ１／２α２．５５分、およびＴ１／２β６４．６６分であった。５のパラメーターに当てはめた結果は、Ｔ１／２α２．１３分、およびＴ１／２β２３．６分であった。
【０４２２】
血漿サンプルの計測の他に、０分、３０分および９０分の時点で犠牲になったマウスからは、より多くの量の血漿サンプルが採取された。これらのサンプルは、放射活性探知器と連結したＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入され、血清タンパク質との結合を判定された（図２９）。図に示されるように、標識されたペプチドは、高ＭＷタンパク質と結合した。このことは、ペプチドの二相半減期除去行動の説明となり得る。
【０４２３】
ペプチドの抗−血管新生阻害剤としての能力を判定する手助けとして、ＨＵＶＥＣおよびＢｒｄＵ検出を用いた内皮細胞増殖分析において、Ｄ６を試験した。簡潔に説明すると、新鮮に単離されたＨＵＶＥＣ（ｐ３〜６の間）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％ｌ−グルタミン＋０．４％ＢＢＥ（ウシの脳から抽出）で培養し、ウェル毎に５０００〜１００００／ウェル、１００μＬ接種した。細胞は、使用前の２４時間、回復を許された。その後、細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、抗−ＶＥＧＦ抗体（正の制御）、またはＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン内のペプチドＡ、ＢおよびＣ（０．１および１０ｕｇ／ｍＬ）で、４８時間処理された。以下の６つの変更が、２シリーズで試験された。
【０４２４】
シリーズ１：  ｗ／ｏＶＥＧＦ
シリーズ２：  ｗ／ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）
１．標準的な媒体：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋１％抗生物質＋１％ｌ−グルタミン＋０．      ４％ＢＢＥ
２．負の制御１：ＲＰＭＩ（真性飢餓）
３．負の制御２：ＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン
４．正の制御：抗−ＶＥＧＦ１０μｇ／ｍｌの入ったＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン
５．０．１μｇ／ｍｌＫＤＲペプチドの入ったＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン
６．１０μｇ／ｍｌＫＤＲペプチドの入ったＲＰＭＩ＋０．１％ＢＳＡ＋１％ｌ−グルタミン
プロトコル
１）細胞を、４８時間、様々な条件で培養する。
２）１０μＬのＢｒｄＵ希釈液（ＥＢＭに１：１００）を、２４時間で、各ウェルに加える。
３）さらに２４時間、培養する。
４）培養媒体を、吸い出す。
５）１００μＬのFixDenatを、各ウェルに加え、室温で３０分間、培養する。
６）FixDenat溶液を捨てる。
７）１００μＬの抗体−溶液（ＰＢＳ１％ＢＳＡおよび抗−ＢｒｄＵ  ＰＯ）を、各ウェルに加える。
８）室温で９０分間、培養する。
９）ＰＢＳにより、２００μＬ／ウェル、５分で、３回、洗浄する。
１０）基質溶液（ＴＭＢ）を加え、１０〜３０分間、培養する。
１１）全てをフレキシブルプレートに移す。
１２）２ＭのＨ2ＳＯ4、２５μＬ／ウェルを、加えることにより、反応を止める。
１３）反応終了後、５分以内に、４５０ｎｍで吸光度を読む。
注：  バックグラウンド結合は、制御細胞（完全な媒体で培養された；ＥＢＭ＋ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）の４つのウェル内から抗−ＢｒｄＵ抗体を除外し、ＢｒｄＵに晒されていない細胞を完全に標識することにより、測定された。
【０４２５】
試験された２つのＫＤＲ結合構成のうち（Ｄ６およびＰ１２−Ｇ（Ａｃ−ＡＧＰＴＷＣ＊ＥＤＤＷＹＹＣ＊ＷＬＦＧＴ−ＧＧＧＫ−ＮＨ２））、図２１に示されるように、Ｄ６は、抗−ＶＥＧＦ抗体（正の制御）と同様に、１０μｇ／ｍＬで、完全にＨＵＶＥＣの増殖を阻害した。ＰＮＣ−１（Ａｃ−ＡＥＧＴＧＤＬＨＣＹＦＰＷＶＣＳＬＤＰＧＰＥＧＧＧＫ−ＯＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）が、負の制御として使用された。一方、Ｐ１２−Ｇ（ヘテロ二量体を構成するペプチドの１つ）は、本分析で試験された最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）において、増殖を阻害することはできなかった。この結果は、Ｐ１２−Ｇ単独の場合と比較して、ヘテロ二量体は、明らかに卓越したＶＥＧＦとの競合能力を有することを示している。
【０４２６】
［実施例１６］
ＢＩＡｃｏｒｅ分析−ペプチド二量体Ｄ１およびＤ７のネズミＫＤＲ−Ｆｃとの結合
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、ペプチド二量体Ｄ１（Ｐ１２−ＧおよびＰ６−Ｄの切形によるヘテロ二量体）およびＤ７（Ｐ５−ＤおよびＰ６−Ｄによるヘテロ二量体）の、ネズミＫＤＲ−Ｆｃに対する結合定数を測定した。
【０４２７】
手順
３つの密度の遺伝子組み換え型のネズミＫＤＲ−Ｆｃが、標準的なアミンカップリング処置（０．５ｍｇ／ｍＬ溶液、１：１００または１：４０希釈、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ６．０）によって、Ｃ５センサーチップのデキストラン表面に、交差結合した。フローセル１は、参考引き算に用いるため、活性化され、次にブロックされた。最終的な不動化レベルが、得られた：
ＲＬＦｃ２ＫＤＲ−Ｆｃ＝２７７０
ＲＬＦｃ３ＫＤＲ−Ｆｃ＝５０８５
ＲＬＦｃ４ＫＤＲ−Ｆｃ＝９２６５
実験は、ＰＢＳ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５Ｍの塩化ナトリウム）＋０．００５％のＰ−２０（ｖ／ｖ））内で実施された。Ｐ１２−Ｇ（制御用）は、ＰＢＳ内で１２５ｎＭに希釈され、また、６２．５、３１．３、１５．６、７．８および３．９ｎＭの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。Ｄ１およびＤ７は、ＰＢＳ内で５０ｎＭに希釈され、また、２５、１２．５、６．２５、３．１３、１．５６、０．７８および０．３９ｎＭの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、ｋｉｎｊｅｃｔプログラムを使用して、ペプチドを３分間、３０μＬ／mimで注入した。１０分間の解離を行った後、残ったペプチドは、５０ｍＭのＮａＯＨ＋１ＭのＮａＣＬを、７５μＬ／mimで１２秒間急速に注入することより、ＫＤＲ表面から引き剥がされた。
【０４２８】
センサ質量は、ＢＬＡ評価ソフトウェア３．１における、同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して、分析された。結果は、表８および図２２〜２４に示される。センサーチップ上の受容体の密度が半分に減っても、ほぼ同じＫＤ２定数が、両ヘテロ二量体につき達成されたという事実は、受容体の間を結合する交差結合タイプというよりは、むしろヘテロ二量体と個々の受容体との多量体結合と矛盾がない。
【０４２９】
表８．Ｋｉｎｅｔｉｃパラメーターの概要
2005519980.tif 000068
＃ＫＤ１は、ｋｄ1／ｋａ1に基づいて計算された解離定数である。
【０４３０】
＋ＫD２は、ｋｄ2／ｋａ1（すなわち、アビジティー因子）に基づいて計算された解離定数である。
【０４３１】
＊ｃｈｉ２（χ2 ）の値は、適合度の近似の標準的統計測定である。理想的なデータに適合するために、ｃｈｉ２は、ＲＵでの機器ノイズと同じオーダーの大きさとなる（典型的には＜２）。
【０４３２】
［実施例１７］
結合親和力と生物学的能力の相違  生体外分析による検証
以下の実験は、ヘテロ多量体が、同じ標的に対して同様の結合親和力を有する単量体のペプチドよりも、遙かに大きな生物学的能力を発揮するということを示した。
【０４３３】
プロトコル  実験１：
２９３Ｈ細胞は、ＫＤＲｃＤＮＡでトランスフェクトされるか、実施例６に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。細胞は、ＰＧ−１（Ａｃ−ＥＲＶＴＴＣＷＰＧＥＹＧＧＶＥＣＹＳＶＡＹ−ＮＨ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）またはＤ１（３００、３０、３および０．３ｎＭで）の存在下、または不在下、125I−ＶＥＧＦで培養された。細胞を洗浄した後、結合放射活性をガンマカウンターで計量した。ＶＥＧＦの結合阻害率が、式［（Ｙ１−Ｙ２）×１００／Ｙ］を用いて計算された。ここで、Ｙ１は、ペプチド不在下のKDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合であり、Ｙ２は、ペプチドという競合者の存在下におけるKDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合である。KDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への特異的結合は、偽-トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合を、KDRトランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合から差し引くことにより算出した。
【０４３４】
プロトコル  実験２：
血清を欠いたＨＵＶＥＣが、１つのウェルにつき１００，０００細胞、ＢＤ  Ｆｉｂｒｏｎｅｃｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋの２４−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。濃度増加を伴うＰＧ−１またはＤ１の存在下または不在下におけるＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。２２時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略／移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動／侵略が計量された。ＶＥＧＦの刺激による移動は、ＶＥＧＦの不在下で測定された基礎的移動を差し引くことにより得られた。
【０４３５】
結果  実験１：
図２６に示されるように、ＰＧ−１およびＤ１は、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞への結合に関し、ほぼ同じくらい優秀に、125I−ＶＥＧＦと競い合った。このことは、ＰＧ−１およびＤ１は、同等の結合親和力、およびＶＥＧＦがＫＤＲへ結合するのを阻害する同等の能力を有するということを示している。
【０４３６】
結果  実験２：
ＰＧ−１およびＤ１が、共に、125I−ＶＥＧＦの結合ブロックする同程度の能力を有している（図２６）という事実にもかかわらず、内皮細胞移動分析で検証されたように（図２７）、ヘテロ二量体のＤ１は、単量体のＰＧ−１よりも、遙かによくＶＥＧＦの生物学的効力をブロックすることができた。６２．５ｎＭまで、ＰＧ−１が、ＶＥＧＦの刺激による移動に何の効力も有さなかったのに対し、Ｄ１は、５０ｎＭで、ＶＥＧＦの刺激による移動を、完全にブロックした。これらのデータは、リガンドがその受容体に結合するのを阻害する能力を、単量体が同等に有している場合であっても、ヘテロ多量体の方が、より有効にリガンドの生物学的活性をブロックする、ということを示している。
【０４３７】
［実施例１８］
本発明のＴｃ−標識ヘテロ二量体のＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞との結合
本実施例においては、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて、Ｔｃ−標識Ｄ１０がＫＤＲと結合する能力が判定された。結果は、Ｔｃ−標識Ｄ１０が、偽−トランスフェクト２９３Ｈ細胞よりも、遙かによくＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と結合し、この結合力は、４０％のマウス血清の存在下においても維持される、ということを示した。さらに、Ｔｃ−標識Ｄ１０の誘導体であり、そのアミノ酸配列をスクランブルしたＤ１８は、ＫＤＲ−発現細胞に対して、何の親和力も有さないことがわかった。このことは、Ｄ１０がＫＤＲ−発現細胞に対して特異性を有するということを示している。
【０４３８】
９９ｍＴｃ−標識されたペプチドの合成
９９ｍＴｃ−Ｄ１０の調製：
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を、１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解し、この溶液１０μＬを、１ｍＬの水に１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）に溶解することにより調製した、１ｍＬのＤＴＰＡ溶液に加えた。Ｄ１０（１００μＬの５０％ＤＭＦに入れられた１００μｇ）を、７５μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９のリン酸塩緩衝液、および５０μＬの９９ｍＴｃＯ４−（２．４から５ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）に混合し、続いて１００μＬの錫のＳｎ−ＤＴＰＡ溶液を加えた。室温で１５分後、放射化学的純度（ＲＣＰ）は７２％であった。生成物は、Supelco DiscoveryＣ１６アミドカラム（４×２５０ｍｍ、５μｍの孔サイズ）の上で、（Ａ）０．１％ＴＦＡの入った水および、（Ｂ）０．０８５％ＴＦＡの入ったアセトニトリルによる水性／有機の勾配を使用して、流量０．７ｍＬ／分で溶出され、精製された。以下の勾配が使用された：３０％Ｂ〜４２％Ｂが３６分、７０％Ｂに至るまで１０分。３２分の維持時間で溶出した化合物は、０．２％ＨＳＡを含む５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の中に集められ、アセトニトリルは、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を使用して除去された。精製後、化合物は、＞９０％のＲＣＰであった。
【０４３９】
９９ｍＴｃ−Ｄ１８の調製：
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（２０ｍｇ）を、１ｍＬの１Ｎ塩酸に溶解し、この溶液１０μＬを、１ｍＬの水に１０ｍｇのＣａＮａ２ＤＴＰＡ・２．５Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ）に溶解することにより調製した、１ｍＬのＤＴＰＡ溶液に加えた。Ｄ１８（１００μＬの５０％ＤＭＦに入れられた１００μｇ）を、５０μＬの０．１Ｍ、ｐＨ９のリン酸塩緩衝液、および９０μＬの９９ｍＴｃＯ４−（１４ｍＣｉ、Ｓｙｎｃｏｒ）に混合し、続いて１００μＬの錫のＳｎ−ＤＴＰＡ溶液を加えた。反応は、３７℃で２０分間、温められた。全ての反応混合物は、Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍシリカ）の上に注入され、（Ａ）０．１％ＴＦＡの入った水および、（Ｂ）０．０８５％ＴＦＡの入ったアセトニトリルによる水性／有機の勾配を使用して、流量１．５ｍＬ／分で溶出された。以下の勾配が使用された：３２％〜３９％Ｂが３０分、８０％Ｂに至るまで２分。遊離リガンドが、１９分の維持時間で溶出した。２４分で溶出した複合体は、０．１％ＨＳＡおよび１％アスコルビン酸を含む５００μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．３）の中に集められた。アセトニトリルおよび過剰のＴＦＡは、ＳｐｅｅｄＶａｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）を４０分間使用して除去された。精製後、化合物は、９３％のＲＣＰであった。
【０４４０】
２９３Ｈ細胞のトランスフェクト
２９３Ｈ細胞は、実施例６に記述したプロトコルを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒／透明９６-ウェルプレート（Becton Dikinson #354640）内で実施された。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は、偽-トランスフェクト（DNA無しで）され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に８０〜９０％が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでない場合は、分析は中止された。
【０４４１】
０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの調製
ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｃａｔ．♯１１０５８−０２１）から得られ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ（ｃａｔ．♯Ａ−３７８２）から得られた。０．１％のＨＳＡを伴うｏｐｔｉ−ＭＥＭＩを調製するために、０．１％ｗ／ｖのＨＳＡをｏｐｔｉ−ＭＥＭＩに加え、室温で２０分間かき混ぜ、０．２μＭのフィルターを使用して濾過殺菌した。
【０４４２】
分析用Ｔｃ−標識ペプチド希釈液の調製
Ｔｃ−標識Ｄ１０およびＤ１８のストック溶液を、０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの中で希釈し、Ｔｃ−標識のヘテロ二量体の最終濃度が、それぞれ、１．２５、２．５、５．０および１０．０μＣｉ／ｍＬである溶液を得た。希釈液の第２のセットは、希釈剤として、４０％のマウス血清／０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの混合液を用いて調製された。
【０４４３】
Ｔｃ−標識ヘテロ二量体の結合を探知するための分析
細胞は、トランスフェクトの２４時間後、分析で使用する細胞を準備するため、０．１％のＨＳＡを伴った室温の１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭＩで、１回洗浄された。洗浄後、０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩをプレートから取り除き、代わりに、１．２５、２．５、５．０および１０μＣｉ／ｍＬのＴｃ−標識Ｄ１０またはＤ１８（上述の２つの希釈溶液を用いて調製した）を７０μＬ加えた。各希釈液が、偽−トランスフェクトおよびＫＤＲ−トランスフェクト細胞の３つの別個のウェルに加えられた。室温で１時間培養した後、１００μＬの冷たい結合緩衝液（０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ）で、プレートを５回洗浄した。１００μＬの溶解補助溶液（０．５ＮのＮａＯＨ）を、各々のウェルに加え、７℃で１０分間、プレートを培養した。ピペットを上下に動かすことにより、各ウェル内の溶解補助溶液を混ぜ合わせ、１．２ｍＬ管に移した。１００μＬの溶解補助溶液で、各ウェルを１回洗浄し、この洗液を、対応する１．２mL管に加えた。その後、各１．２mL管は、１５．７ｍｍ×１０ｃｍ管に移され、ＬＫＢ Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒで計数された。
【０４４４】
Ｔｃ−標識ヘテロ二量体のＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞との結合
ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて、Ｔｃ−標識Ｄ１０およびＤ１８がＫＤＲと特異的に結合する能力が判定された。図２８Ａに示されるように、Ｔｃ−標識Ｄ１０は、偽−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と比較して、遙かによくＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と結合した。マウス血清の存在下では、幾分かは結合が阻害されたものの、４０％のマウス血清の存在下および不在下において、ほぼ同様の結合を見せた。このＴｃ−標識ヘテロ二量体のＫＤＲ発現細胞に対する特異的結合の総数は、Ｔｃ−標識単量体ペプチド（実施例５）の特異的結合総数を、遙かに上回った。一方、Ｄ１８は、偽−トランスフェクト細胞に対しても、ＫＤＲ−発現細胞に対しても、何の親和力も示さなかった。このことは、Ｄ１がＫＤＲ−発現細胞に対して特異性を有するということを示している。
【０４４５】
［実施例１９］
Ｌｕ−標識ヘテロ二量体のＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞との結合
本実施例においては、ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて、Ｌｕ−標識Ｄ１３がＫＤＲと結合する能力が判定された。結果は、Ｌｕ−標識Ｄ１３が、偽−トランスフェクト２９３Ｈ細胞よりも、遙かによくＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と結合し、この結合力は、４０％のマウス血清の存在下においても維持される、ということを示した。
【０４４６】
１７７Ｌｕ−標識されたペプチドの合成
１７７Ｌｕ−Ｄ１３の調製：
Ｄ１３（３０６μｇ）を、〜４５０μＬの円錐挿入部を伴った２ｍＬのオートサンプラーガラスビンに加え、０．０１Ｎ  ＮＨ４ＯＨ（５０μＬ）に溶解した。ここに、安定剤を含む３００μＬの０．５Ｍ酢酸アンモニウムを加えた。１７７ＬｕＣｌ３のアリコートが６．８μＬ入った０．０５Ｎの塩酸（３９．３ｍＣｉ）を加え、ガラスビンをクリンプ封止し、３７℃で１５分間温め、〜５分冷やし、１％Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏの入った１０μＬの水を加えた。反応混合物の３５０μＬのアリコートを、Supelco Discovery RFアミドＣ１６カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ×５μｍ）の上に注入した。以下のＨＰＬＣ条件が使用された：カラム温度＝３７℃。試薬Ａ＝２ｇ／ＬのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液を含むｐＨ７．０のＨ２Ｏ。試薬Ｂ＝８０％ＡＣＮ／２０％のＨ２Ｏ。勾配は、０．５６／０．２４ｍＬ／分Ａ／Ｂ＝０分〜０．４７／０．３３ｍＬ／分Ａ／Ｂ＝３０分。Ｄ１３のための維持時間は〜２８分で、１７７Ｌｕ−Ｄ１３のための維持時間は〜２９分であった。放射能ピークは、安定剤を含む１ｍＬの緩衝液に集められ、最終のｐＨ＝７．６が、水酸化ナトリウムで調整された。これを、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃｃｕｕｍ（Ｓａｖａｎｔ）で〜４０分間、遠心沈降してＡＣＮを除去した。単離された生成物のＲＣＰは８６％であった。
【０４４７】
２９３Ｈ細胞のトランスフェクト
２９３Ｈ細胞は、実施例６に記述したプロトコルを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクトは、黒／透明９６-ウェルプレート（Becton Dikinson #354640）内で実施された。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は、偽-トランスフェクト（DNA無しで）され、プレートの残り半分は、KDR cDNAでトランスフェクトされた。細胞は、トランスフェクトと同時に８０〜９０％が融合し、翌日の分析時には、完全に融合した。そうでな
された。プレートの半分（４８ウェル）の細胞は、偽-トランスフェクト（DNA無しで）され、
い場合は、分析は中止された。
【０４４８】
０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの調製
０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩは、実施例１８と同様に、調製された。
【０４４９】
分析用Ｔｃ−標識ペプチド希釈液の調製
Ｌｕ−標識Ｄ１３ストック溶液を、０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの中で希釈し、標識されたヘテロ二量体の最終濃度が、それぞれ、１．２５、２．５、５．０および１０．０μＣｉ／ｍＬである溶液を得た。希釈液の第２のセットは、希釈剤として、４０％のマウス血清／０．１％のＨＳＡを伴ったｏｐｔｉ−ＭＥＭＩの混合液を用いて調製された。
【０４５０】
Ｌｕ−標識ヘテロ二量体の結合を探知するための分析
本分析は、Ｔｃ−標識ヘテロ二量体の代わりに、Ｌｕ−標識Ｄ１３を用いたことを除いて、実施例１８に詳細したのと同様に行われた。
【０４５１】
Ｌｕ−標識ヘテロ二量体のＫＤＲ−トランスフェクト２９３細胞との結合
一時的にトランスフェクトされた２９３Ｈ細胞を用いて、Ｌｕ−標識Ｄ１３がＫＤＲと特異的に結合する能力が判定された。図２９に示されるように、Ｌｕ−標識Ｄ１３は、偽−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と比較して、遙かによくＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞と結合した。マウス血清の存在下では、幾分かは結合が阻害されたものの、４０％のマウス血清の存在下および不在下において、ほぼ同様の結合を見せた。
【０４５２】
［実施例２０］
腫瘍マウスにおけるＬｕ−標識ヘテロ二量体による放射線治療
本実施例においては、腫瘍を植え付けたＰＣ３細胞のヌードマウス内における増殖を、Ｌｕ−標識Ｄ１３が阻害する能力について検証する。
【０４５３】
177Ｌｕ−標識Ｄ１３の合成
177Ｌｕ−標識Ｄ１３は、実施例１９と同様に調製された。
【０４５４】
動物モデル
供給者の指示通りに増殖させた、ＡＴＣＣからのＰＣ３細胞が、ヌードマウスの肩甲骨の間の皮下に注射された。腫瘍が１００〜４００ｍｍ3に達したとき、１２匹のマウスに５００マイクロキュリーのＬｕ−標識Ｄ１３を静脈注射し、その成長をその後１８日間モニターした。２０％以上の体重を失った場合、または腫瘍が２０００ｍｍ3を超えた場合に、マウスは犠牲にされた。処置を施したマウスにおける腫瘍の増加を、未処置のヌードマウス（ＰＣ３腫瘍を移植）３７匹における腫瘍増加の平均と比較された。
【０４５５】
結果
本実験において処置された１２匹のマウスのうちの６匹において、処置をしていない腫瘍マウスと比較して、著しいまたは完全な腫瘍増殖の遅延が見られた（図３０）。このことは、実験が行われた条件下において、Ｄ１３は、ＰＣ１３腫瘍の増加を遅延させる効果を有することを示している。
【０４５６】
［実施例２１］
ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体バインダーとの結合のための細胞に基づく分析
本実験においては、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体−結合ペプチドが、選択的にＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体と結合する能力を検証する。
【０４５７】
試薬の調製
本分析に使用する試薬は、指摘された場合を除き、実施例５と同様に調製された。
【０４５８】
ペプチド−125I−ストレプトアビジン複合体溶液の調製
ビオチニル化ペプチドＰ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢおよびビオチニル化非結合制御ペプチドが、５０％のＤＭＳＯ内で１．２５μＭのストック溶液を調製するために使用された。３３．３３ｎＭの125I−ストレプトアビジンのストック溶液は、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した。１３．３３ｎMのI−１２５ストレプトアビジン／１００ｎＭのＶＥＧＦのストック溶液は、８５０ｍｌのＩ−１２５ストレプトアビジンを、１０μＭのＶＥＧＦ２２μｌおよびＭ１９９媒体１２７５μｌと混ぜ合わせることにより調製した。同じ方法で、もう１つのストック溶液を用意したが、こちらには、ＶＥＧＦを加えなかった。１３．３３ｎMのペプチド−125I−ストレプトアビジン複合体溶液±ＶＥＧＦを調製するために、５００μｌの125I−ストレプトアビジン（ＶＥＧＦを伴う、または伴わない）ストック溶液（最後のステップで調製された）が、１．２５μＭのペプチド溶液（Ｐ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ、または制御ペプチド）２４μｌと混合された。混合液を、回転装置上で、４℃で６０分間培養し、続いて、５０μｌのソフトリリース・アビジン−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｄｄＨ2Ｏ内の５０％のスラリー）を加えて過剰なペプチドを除去し、さらに３０分間の培養を、４℃で回転装置上で行った。最後に、１２，０００ｒｐｍの遠心分離を室温で５分間行うことにより、ソフトリリース・アビジン−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを沈殿させ、得られた上澄みを、分析に使用した。
【０４５９】
表９．ビオチニル化ペプチド
2005519980.tif 000069
ペプチド／中性アビジンＨＲＰのＫＤＲ−トランスフェクト細胞との結合
本分析では、制御ペプチドおよび被験ペプチド（Ｐ３０−ＸＢ、Ｐ３１−ＸＢ、Ｐ３２−ＸＢ）と、125I−ストレプトアビジンとの複合体（上述のように調製）が、ＶＥＧＦの存在下または不在下において、一時的にＫＤＲをトランスフェクトした２９３Ｈ細胞と結合する能力を試験した。Ｐ３０−ＸＢと125I−ストレプトアビジンとの複合体は、ＶＥＧＦの存在下、偽−トランスフェクト細胞と比較して、ＫＤＲ−トランスフェクト細胞と特異的に結合した（図３１Ａ）が、ＶＥＧＦを省略した場合はそうではなかった（図３１Ｂ）。またＰ３０−ＸＢは、蛍光偏光およびＳＰＲ（ＢｉａＣｏｒｅ）分析で試験したペプチドの中で、最良のＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体バインダーであった。表９、U.S.S.N.第60／360,851号、U.S.S.N.第60／440,441号、および、本明細書に参照としてその全内容が組み込まれる同時係属中の「KDR and VEGF／KDR Binding Peptides and Their Use in Diagnosis and Therapy」と題する本願と同日出願のU.S.S.N.第      号を、参照されたい。この実施例は、ペプチド（Ｐ３０−ＸＢ）が、細胞表面に発現したＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体と特異的に結合できるということを示している。したがって、診断または治療のために、生体外および生体内で、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体を標的とするために、このペプチドを使用できる可能性がある。ＫＤＲ／ＶＥＧＦ結合ペプチドは、細胞表面に発現したすべてのＫＤＲを探知するわけではなく、機能的で活動的なＫＤＲ受容体のみを探知するので、腫瘍、転移腫瘍、糖尿病性網膜症、乾癬および関節疾患などにおける活発な血管新生を探知し、かつ／または治療するのに有益である。さらに、これらのペプチドは、ＫＤＲ／ＶＥＧＦ複合体と結合するその他のペプチドと同様に、本発明のヘテロ多量体に、有益に含めることができる。
【０４６０】
［実施例２２］
以下の実験は、ＶＥＧＦの誘発による培養ＨＵＶＥＣの移動を、ヘテロ二量体Ｄ２４およびＤ２６がブロックする能力を判定した。そして、Ｄ２６に用いらる糖鎖付加および／または独自のスペーサー構造が、その能力を高めることを実証した。
【０４６１】
プロトコル：
血清を欠いたＨＵＶＥＣが、１つのウェルにつき１００，０００細胞、ＢＤ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋの２４−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。Ｄ２４またはＤ２６の存在下または不在下におけるＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。２２時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略／移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動／侵略が計量された。ＶＥＧＦの誘発による移動は、すべての実験条件につき、ウェルの下部チェンバーに基礎媒体のみをおいた場合の移動を、差し引くことにより計算された。
【０４６２】
結果：
ＶＥＧＦは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させたが、これは、Ｄ２４およびＤ２６の両者によって、強力にブロックされた（図３２）。Ｄ２６は、２４よりも１０倍強力であった（ＩＣ５０それぞれ０．５ｎＭおよび５ｎＭ）。このことは、Ｄ２６における糖鎖付加および／または独自のスペーサー特性が、Ｄ２６のＫＤＲへの結合能力、およびＶＥＧＦの効力をブロックする能力を高めた、ということを示している。
【０４６３】
［実施例２３］
以下の実験は、ペプチドＴＫＰＰＲ（ＫＤＲを介して、ＶＥＧＦの効力を高めるＶＥＧＦ受容体であるＮＰ−１と結合する）の多量体構造であるＴＫ−１（構造を以下に示す）が、ＶＥＧＦの誘発による培養ＨＵＶＥＣの移動の阻害（Ｄ６によってもたらされる））を、高める能力について判定した。
【０４６４】
2005519980.tif 000070
プロトコル：
血清を欠いたＨＵＶＥＣが、１つのウェルにつき１００，０００細胞、ＢＤ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋの２４−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。様々な濃度のＤ６、または１００ｎＭ（不変）のＴＫ−１（ＷＯ０１／９１８０５Ａ２の記述に従い合成）と組み合わせた様々な濃度のＤ６の存在下または不在下におけるＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。２２時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略／移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動／侵略が計量された。ＶＥＧＦの誘発による移動は、すべての実験条件につき、ＶＥＧＦの不在下において観察された移動を、差し引くことにより計算された。
【０４６５】
結果：
ＶＥＧＦは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させた。これはＤ６（ＩＣ５０およそ１２．５ｎＭ）によって強力にブロックされたが、１００ｎＭのＴＫ−１単独ではブロックできなかった（図３３）。しかしながら、驚くべきことに、ＴＫ−１は、Ｄ６（ＩＣ５０およそ２．５ｎＭ）と同時に本分析に使用すると、Ｄ６の能力をおよそ１０倍高めることができた。このことは、ＴＫ−１に見られるＴＫＰＰＲ配列（または類似形）を含む化合物は、たとえばＤ６のような、ＫＤＲとの結合においてＶＥＧＦと競合する化合物の能力を、高めるために使用できるということを示している。さらに、ＴＫＰＰＲ
配列（または類似形）同様、Ｄ６に見られるペプチド配列（または類似形）を、１度以上繰り返して有するヘテロ多量体は、本分析において、より高い活動性を有する可能性がある。（ＴＫＰＰＲ構造の調製については、本願に参照としてその内容を組み込むＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／８７１，９７４を参照）。
【０４６６】
［実施例２４］
ＫＤＲへの結合機能を有するＰ１３−ＸＢ断片の同定
以下の実験は、Ｐ１３−ＸＢの断片が、ＫＤＲへの結合機能を維持することができるということを示す。
【０４６７】
プロトコル：
２９３Ｈ細胞は、ＫＤＲｃＤＮＡでトランスフェクトされるか、実施例６に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。Ｐ１２−ＸＢを含むストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体は、実施例６と同様に調製された。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体と細胞の結合は、実施例６と同様に、０〜２５０ｎＭ、または０〜１００ｎＭの競合ペプチド、すなわちＰ１３−ＸＢ、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の存在下、５．５ｎＭの複合体濃度で行われた。各実験条件において、特異的結合を測定した後、それぞれのペプチドにつきＩＣ５０を測定した。
【０４６８】
結果：
表９に示されるように、Ｆ１は、非標的Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ配列（ファージ提示法データに基づいて合成されるほとんどの単量体ペプチドに付加される）、およびＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒの結合モチーフ（Ｐ１２−ＸＢとも共通する）だけで構成されているが、これは、１マイクロモル以下で、Ｐ１２−ＸＢストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の結合をＩＣ５０阻害できる最も小さな断片であった。驚くべきことに、Ｐ１３−ＸＢ由来のより大きな断片Ｆ２は、１マイクロモルでは、充分に複合体の結合を阻害できなかった。しかしながら、可溶化モチーフ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）３を後者のペプチドに加えてＦ３とすると、１７５ｎＭでＩＣ５０複合体の結合に対抗することができた。このことは、Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒモチーフを含むＰ１３−ＸＢの断片は、ＫＤＲへの結合機能を維持するということを実証している。したがって、標的と結合する能力を維持するこれらの断片（または、本願に開示されたその他の結合ポリペプチドの断片）を、ペプチド全体の代わりに、本発明のヘテロ多量体に使用することが可能である。
【０４６９】
表９．置き換え分析において、Ｐ１２−ＸＢおよびストレプトアビジン−ＨＲＰで構成される複合体と、ＫＤＲ−発現細胞との結合を競う、Ｐ１３−ＸＢの断片。
【０４７０】
2005519980.tif 000071
［実施例２５］
単一の標的分子上の２つのエピトープを標的とするヘテロ二量体は、標的分子上の２つのエピトープの１つとしか結合しないホモ二量体よりも、優れた結合力を有する。
以下の実験は、ペプチド増殖因子またはシトキンの生物学的効力をブロックする能力において、ヘテロ二量体構成は、ホモ二量体に優るということを実証するものである。
【０４７１】
プロトコル：
血清を欠いたＨＵＶＥＣが、１つのウェルにつき１００，０００細胞、ＢＤ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋの２４−ウェル・インサートプレートの、上部チェンバーに置かれた。増加する濃度のホモ二量体Ｄ８またはヘテロ二量体Ｄ１７の存在下または不在下におけるＶＥＧＦを、含むまたは含まない基礎媒体を、ウェルの下部チェンバーに加えた。２２時間後、インサートプレート内の細胞を、蛍光塗料で事後的に標識し、侵略／移動細胞の蛍光発光を蛍光プレートリーダーで測定することにより、細胞の移動／侵略が計量された。
【０４７２】
結果：
ＶＥＧＦは、本分析において、内皮細胞の移動を大幅に増加させた。これはＤ１７によって強力にブロックされたが、Ｄ８ではブロックできなかった（図３４）。Ｄ１７は、ＶＥＧＦの誘発による移動を、およそ２５０ｎＭでＩＣ５０ブロックしたのに対し、Ｄ８は、８００ｎＭでも、移動に対し充分な効力を発揮できなかった。Ｄ８は、Ｐ１３−ＸＢにおける標的配列をすべて有しており、一方Ｄ１７は、ＫＤＲに対する親和性の低い（実施例２４で検証されたように）Ｐ１３−ＸＢ配列の断端型（図３に示されるように）しか有していないという事実にもかかわらず、である。したがって、同じ標的分子上の２つの異なるエピトープと結合する能力を有するヘテロ二量体は、同じ、またはより強力な標的配列を有するホモ二量体よりも、効果的にリガンドが標的分子に結合するのをブロックすることができる。
【０４７３】
［実施例２６］
ジスルフィド結合をアミド結合に置き換えた環状ペプチドの調製
ポジション６および１３におけるＣｙｓ残基を、一方はカルボキシル基側鎖（ＧｌｕまたはＡｓｐ）、もう一方はアミノ基側鎖［ＬｙｓまたはＤｐｒ（２，３−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ酸）］からなる一対のアミノ酸で置換して、Ｐ１２−Ｇ（非−標的ＧＧＧＫ配列を伴うＰ１２）のジスルフィド結合置換類似型を調製した。Ｐ１２−Ｇ（ジスルフィド結合形成）に含まれるのと同じ配列ポジションを包含するこの環は、側鎖アミノ部および側鎖酸部の縮合によって形成され、Ｐ１２−Ｇのジスルフィド結合のように残基６と１３とをブリッジする、ラクタム環として得られた。
【０４７４】
表１０．Ｐ１２−ＧのＣｙｓ6およびＣｙｓ13のための、ラクタム類似型における置換例
2005519980.tif 000072
環状ラクタムペプチド−Ｐ３３−Ｌの代表的な合成例
2005519980.tif 000073
樹脂結合ペプチド１の合成
１の合成は、方法５を用いて、０．２５ｍｍｏｌ規模で行われた。ペプチド樹脂１は、洗浄され、手作業によるさらなる誘導体化のために、乾燥された。
【０４７５】
４（Ｐ３３−Ｌ）の合成
１（２４０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）にＮＭＭ（Ｎ−メチル・モルホリン）／ＨＯＡｃ／ＤＭＦ１／２／１０（ｖ／ｖ／ｖ）（６５ｍＬ）が加えられた。パラジウムｔｒｉｓ−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、５５４．４ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ］が加えられ、光を遮蔽して２０時間シェイクされた。樹脂は、濾過され、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（０．５ｇ）／ＤＩＥＡ（０．５ｍｌ）／ＤＭＦ（１００ｍＬ）で洗浄され、最後にＤＭＦ（３×７０ｍＬ）で洗浄された。この処置は、ラクタム形成反応を必要とするＧｌｕ６およびＬｙｓ１３のカルボキシル基およびアミノ基だけを、反応に晒すために行われた。樹脂上における２の環状化は、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（６６μＬ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１０ｍＬ）を用いて、３時間で行われた。Ｋａｉｓｅｒ試験によって、環状化の完了がモニターされた。試薬Ｂを４時間用いて、ペプチド樹脂３からペプチドを切断した。樹脂は濾過され、濾過物は、ペースト状になるまで乾燥させた。粗製ペプチドをエーテルに沈殿させ、エーテルで２回洗浄した。環状ペプチドは、調製用逆相線状勾配ＨＰＬＣによって、Ｗａｔｅｒ−ＹＭＣ  Ｃ−１８カラム（２５０ｍｍ×３０ｍｍ内径）を使用し、溶出液としてＨ2Ｏ内のＣＨ3ＣＮ（共に０．１％のＴＦＡを伴う）を用いて、精製された。生成物を含んだ留分の冷凍乾燥物は、８ｍｇのＰ３３−Ｌを産出した。Ｐ３４−Ｌ、Ｐ３５−Ｌ、Ｐ−３６−ＬおよびＰ３７−Ｌも、同様に調製された。
【０４７６】
ＫＤＲ−結合機能を保持しつつのＰ１２−Ｇのジスルフィド・ブリッジの置換
以下の実験は、Ｐ１２−Ｇの化学的に反応するジスルフィド・ブリッジの代わりに用いられた、ラクタムＰ３４−Ｌは、ＫＤＲ結合機能を充分に維持するということを、実証した。
【０４７７】
プロトコル：
２９３Ｈ細胞は、ＫＤＲｃＤＮＡでトランスフェクトされるか、実施例６に記述した標準的技術を用いて偽−トランスフェクトされた。Ｐ１２−ＸＢを含むストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体は、実施例６と同様に調製された。ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体と細胞の結合は、実施例６と同様に、０〜２５０ｎＭのＰ１２−ＧまたはＰ３４−Ｌの存在下、５．５ｎＭの複合体濃度で行われた。各実験条件において、特異的結合を測定した後、それぞれのペプチドにつきＩＣ５０を測定した。
【０４７８】
結果：
表１１に示されるように、ジスルフィド・ブリッジの代わりにラクタムを含むＰ３４−Ｌは、幾分かの親和性を失いはしたものの（ＩＣ５０につき１０８ｎＭ、これに対しＰ１２−Ｌは１３ｎＭ）、ＫＤＲへの結合に関し、依然としてＰ１２−ＸＢストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体と対抗することができた。これらのラクタムペプチド（または、本願に開示された結合ポリペプチドの、同じように調製されたラクタム類似型）は、ジスルフィド・ブリッジを含むペプチドの代わりとして、本発明のヘテロ多量体に用いることができる。
【０４７９】
表１１．置き換え分析において、Ｐ１２−ＸＢおよびストレプトアビジン−ＨＲＰで構成される複合体と、ＫＤＲ−発現細胞との結合を競う、Ｐ１２−ＧおよびＰ３４−Ｌ（ジスルフィド・ブリッジ置換類似型）。
【０４８０】
2005519980.tif 000074
［実施例２７］
ｃＭｅｔへのペプチド二量体の結合の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ測定器を用いて、不動化ｃＭｅｔ−Ｆｃへの二量体Ｄ２８の結合定数が測定された。
【０４８１】
プロトコル：
３つの密度のｃＭｅｔ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、標準的なアミンカップリング処置（３μＭ溶液、１：１００，１：５０または１：２０希釈、５０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．５）によって、Ｃ５センサーチップのデキストラン表面に、交差結合した。フローセル１は、参考引き算に用いるため、活性化され、次にブロックされた。最終的な不動化レベルが、得られた：
ＲＬＦｃ２ＫＤＲ−Ｆｃ＝２５８２
ＲＬＦｃ３ＫＤＲ−Ｆｃ＝５０４８
ＲＬＦｃ４ＫＤＲ−Ｆｃ＝９７２１
実験は、ＰＢＳ緩衝液（５．５ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．６５、０．１５Ｍの塩化ナトリウム）＋０．００５％のＰ−２０（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）内で実施された。ペプチド二量体を、イオンを除いたＨ2Ｏに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの溶液とした。二量体は、ＰＢＳ内で５０ｎＭに希釈され、また、２５、１２．５、６．２５、および３．１２５ｎＭの溶液を得るため、一連の希釈が実施された。すべてのサンプルは、二重に注入された。会合のため、ｋｉｎｊｅｃｔプログラムを使用して、二量体を３分間、３０μＬ／mimで注入した。１０分間の解離を行った後、残ったペプチドは、４ＭのＭｇＣｌ2を、５０μＬ／ｍｉｍで２分間、急速に２回注入することより、ｃＭｅｔ表面から引き剥がされた。センサ質量は、ＢＬＡ評価ソフトウェア３．１を使用して分析された。
【０４８２】
０．７９というKD値が、Ｄ２８（Ｐ２６−ＡおよびＰ２７−Ｘのヘテロ二量体）について得られた。この数値は、いずれのヘテロ二量体単独のKD値（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６９は８８０Ｍ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７０は２２０Ｍ）よりも、遙かに優れたものであった。なお、これについては、”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ＨＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃＭｅｔ）ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ”と題され、本願に参照としてその全内容が組み込まれる、本願の同日出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．
号の、表８に示されている。
【０４８３】
［実施例２８］
生体外における細胞増殖分析
Ｄ６および関連する類似型が、ＶＥＧＦの刺激による増殖を阻害する能力について、生体外での効力を判定するために、微小血管の内皮細胞（ＭＶＥＣｓ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて、実験を行った。ＭＶＥＣｓ（継代培養２）を、９０％の細胞密度まで発育させ、トリプシン化し、ゼラチンをコーティングした９６−ウェルのマイクロタイター・プレート内で、４〜８×１０３細胞／ウェルの密度で培養した。培養から１６〜２４時間後、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むがウシ胎仔血清を欠いた媒体で、細胞を１回洗浄した。ＢＳＡを含む新鮮な媒体が、各ウェルに加えられ、細胞はさらに２４時間培養された。その後、ＢＳＡを含む新たな媒体（Ｄ６またはその他の試験物質を伴う、または伴わない）が加えられ、細胞は、さらに４８時間３７℃で培養された。媒体を取り除き、ＢＳＡを含む新たな媒体（ＢｒｄＵを伴う、または伴わない）を加え、さらに２４時間培養し、その後、製造者（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｃａｔ♯ＱＩＡ５８）の指示に正確に従って、結合レベルを測定した。この結果は、図３５に示されている。
【０４８４】
［実施例２９］
生体内における腫瘍増殖の阻害
ＳＷ−４８０ヒト結腸癌細胞に対して、抗−血管新生機能を有すると考えられる試験化合物（二量体Ｄ６）の効力を、３つの濃度において、移植腫瘍モデルを用いて測定する方法を提供しつつ、実験状況を記述する。
【０４８５】
胸腺欠損ヌードマウスが、同種異系および異種異系細胞の宿主として、容認される。「生物学的製剤を製造するための細胞株の特徴付けにおける留意事項」（ＦＤＡ１９９３）において、ヌードマウスの使用が要求されている。
【０４８６】
Ｄ６は、抗−血管新生機能を有すると考えられる合成ヘテロ二量体ペプチドである。このペプチドは、ヒトＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）と高い親和性で結合し、ＶＥＧＦの結合に対抗する。以下の実験は、その抗−血管新生機能を確認するものである。
【０４８７】
ＳＷ−４８０ヒト癌細胞
結腸癌細胞ＳＷ−４８０（ＡＴＣＣ）は、４ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２５０ｍｇ／ｍＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅおよび熱処理により不活性化したウシ胎仔血清１０％を追加した、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）内で、９５％の空気と５％の二酸化炭素下、３７℃で培養された。
【０４８８】
急激に成長する細胞を取り出し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄して、トリプシンまたは血清を、すべてきれいに取り除いた。細胞は、注入のため、Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）に懸濁された。
【０４８９】
殺菌したリン酸緩衝食塩水（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）が、ｃＧＭＰの規制に従って製造され、適合性（ｐＨ７．３〜７．７、オスモル濃度２７１〜２８７ｍＯｓｍ／ｋｇ）を確認するため細胞培養試験を行った。ＰＢＳは、試験物質を再構成するために用いられる媒体であると同時に、媒介物制御のためにも注入される。
【０４９０】
シスプラチン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ；  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）は、製造者の明細書に従って準備された。シスプラチンは、ＢＬ２  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍの防御フードを用いて、無菌状態で調製された。
【０４９１】
試験システム
種／血統：  ハツカネズミ、Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲマウス（ヌードマウス）
性別：  メス
年齢：  処置開始時において６〜８週間
体重範囲：  体重条件なし
出生地：  Ｇｎｏｔｔｏｂｉｏｔｉｃ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ａｔ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ．
数：  本研究のため総数１１５匹の動物を入手し、注射し、そのうち９０匹を研究に使用した。
【０４９２】
同定方法：
耳タグ方式を用いて、マウスに一匹ずつ番号を付けた。さらに、檻にも、檻カードを付し、グループ番号、動物番号、研究番号およびＩＡＣＵＣプロトコル番号を記した。
【０４９３】
任意性：
動物は、Ｍｉｄｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ９７ＳＲ−１プログラムを用いて、任意に処置グループに割り当てられた。
【０４９４】
動物の管理
マウスは、ガンマ線を照射した齧歯類用の食料を、好きなだけ与えて飼育た。また、水道水を殺菌し、ボトルとシッパー管で、好きなだけ与えた。
【０４９５】
動物環境：
マウスは、半剛体のアイソレーターに、グループ毎に収容された。マウスは、５〜１０匹用のそこの平らな檻に収容された。かごは、ガンマ線を照射した接触寝具を備えていた。それぞれの檻のマウスの数は、マウスの行動の如何により変更され、変更はアイソレーターの一覧表に記載された。収容檻は、「実験用動物の飼育および使用ガイド」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，１９９６）およびその後の改訂版に定められた要件を満たした。
【０４９６】
環境制御を行い、温度を１６〜２６℃（７０±８°Ｆ）、相対湿度を３０〜７０に維持した。１２：１２時間の明暗サイクルが維持された。
【０４９７】
マウスは、入手されると、研究開始の２４時間前に、実験環境に順応させられた。マウスは、疾病の兆候、食料および／水摂取量の異常、またはその他の一般的な健康不良の兆候を、観察された。入手の時点で、マウスの健康状態は診断されており、健康ということであった。
【０４９８】
実験計画：
メスの胸腺欠損ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ／ＮＵ−ｎｕＢＲ）、年齢６〜８週間が、本研究に使用された。総数１１５匹のマウスが、右側面胸部の皮下に、５×１０6のＳＷ−４８０ヒト結腸癌細胞を注射された。腫瘍が、およそ１５０±７５ｍｇの目的のウィンドウサイズに達したとき、９０匹のマウスが任意に選ばれ、９つのグループに分配された。化合物と媒介物は、腹腔内注射（ＩＰ）により、シスプラチンは、皮下注射（ＩＶ）により投与された。腫瘍の測定は、手持ち側径器を用いて、週に２回記録された。マウスは、毒性度、病的状態を毎日モニターされた。研究の最終段階において、二酸化炭素の過剰投与によりマウスを安楽死させ、細胞の収集のため検視した。
【０４９９】
全部で９つのグループが、研究に使用された。各グループは、１０匹の腫瘍マウスで構成された。グループ１のマウスには、何の処置も施さず、グループ２のマウスには、媒介物を投与した。グループ３、４および５のマウスには、異なる濃度のヘテロ二量体Ｄ６を投与した。グループ６、７および８のマウスには、異なる濃度の別の抗−血管新生ペプチドを投与した。グループ９のマウスには、正の制御として、標準的な化学療法化合物であるシスプラチンを投与した。
【０５００】
各グループについての投与レベルは、表１２に示される。投与は、マウスを任意のグループに分配したその日に、開始された。各投与剤は、それぞれのマウス毎に、無菌法を用いてガラス瓶から取り出され、注射箇所は、投与前にアルコール消毒綿で拭かれた。投与は、１．０ｍＬシリンジと２７−ゲージ×１／２の針を用いて行われた。
【０５０１】
表１２．研究処置グループ
2005519980.tif 000075
試験化合物を投与されたマウス、および媒介物を投与されたマウスには、腹腔内注射（ＩＰ）を毎日、１５日間行った。シスプラチンは、１日おきに計５回、皮下注射で投与した。
【０５０２】
各マウスは、少なくとも１日に１回、毒性度、病的状態および死亡の可能性を診断された。ここで、病的状態には、たとえば、衰弱、脱水症、不活発、猫背の姿勢、だらしのない姿態、呼吸困難、尿または糞便の汚染性といった病気の兆候が含まれるが、これに限定されない。
【０５０３】
腫瘍の測定：
プロトコルに従い、目盛り付きの側径器で腫瘍の長さと幅を、週に２回研究期間を通じて測定した。測定は、少なくとも３〜４日の間隔を開けて行った。ただし、マウスを安楽死させ、測定を行う場合は、２日以内に測定を行うこともあった。腫瘍の重さは、次の式を用いて計算された：ｍｇ＝（Ｌ×Ｗ２）／２。マウスは、グループの腫瘍の平均重量が２回続けて＞１０００ｍｇになった場合か、腫瘍が潰瘍化し、マウスの移動能力や、食料や水を摂取する能力を損なった場合に、安楽死させた。
【０５０４】
予定外の安楽死および予期せぬ死亡：
１．  予定外の安楽死：  
研究中に、予定外の安楽死は、実施されなかった。
【０５０５】
２．  予期せぬ死亡
研究中に、マウスが死亡することはなかった。
【０５０６】
検視：
１．  安楽死および検視の指示
グループ１、２、３、４および５（総数５０）のマウスは、すべて、グループにおける腫瘍の平均サイズが、２回の測定で続けて＞１０００ｍｇとなったとき、検視に服した。マウスの検視は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＨＭ），  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡに委ねた。すべてのマウスを、２８日という試験物質の投与期間前の、研究日２２日目に安楽死させた。試験物質で処置されたグループ３〜８において、腫瘍の平均サイズが、＞１０００ｍｇに達したためである。すべてのマウスは、人道的に、二酸化炭素の吸入により安楽死させた。
【０５０７】
組織の採集：
周囲の組織および覆っている皮膚を取り除いて、腫瘍を取り出した。さらに、腎臓も収集した。腎臓部表面の異常は、すべて記載された。
【０５０８】
各マウスの腫瘍および腎臓につき、冷凍ブロックを作成した。組織（腫瘍、腎臓）の代表的断片が、採取された。腎臓片は、皮膚および髄質を含んだ。組織片は、ラベルを付したプラスチックの冷凍型の底部に入れられた。組織は、ＯＣＴ媒体と共に挿入された。ブロックは、ドライアイスで冷やしたイソペンタンの中に、凍るまで沈められた。ブロックは、素早く特性を検査され、ドライアイス上に保存された。
【０５０９】
ブロックは、動物番号および組織に対応する文字コード（Ａ＝左の腎臓；Ｂ＝右の腎臓；Ｃ＝腫瘍塊）を付された。ブロックはマウス毎に、ラベルを付したバッグに収められた。
【０５１０】
結果：
Ａ．  生存中の測定および観察：
１．  診断的観察、病的状態および死亡についての概要：
すべてのマウスは、外見は健康そうであり、研究期間中、正常の限界内にあった。また、試験化合物（Ｄ６）は、本研究におけるそれぞれの投与量において、毒性の兆候を示さなかった。
【０５１１】
マウスは、研究日２２日目に安楽死させた。グループ９を除き、グループ１〜８において、腫瘍の平均サイズが＞１０００ｍｇに達したため、すべてのマウスを試験化合物の投与期間の完了前に安楽死させた。シスプラチンで処置したグループ９のマウスは、研究日２２日目、平均サイズ９９５ｍｇのときに安楽死させた。
【０５１２】
塊の触診
研究期間を通じて、すべてのマウスの触診可能な塊を触診し、腫瘍が成長していくのを確認した。予想通り、未処置のマウスおよび媒介物のみで処置したマウス（グループ１および２）において、腫瘍の成長は最も速く、研究日２０日目前に、腫瘍の平均サイズが１０００ｍｇに達した。また、シスプラチンで処置マウス（グループ９）の腫瘍は、最も成長が遅く、研究終了日（２２日目）の時点で、腫瘍の平均サイズは９９５ｍｇであった。
【０５１３】
一般的に、試験化合物で処理したマウスは、グループ３を除いて、腫瘍の成長が遅かった。Ｄ６の投与量が少なかった（０．０５ｍｇ／ｋｇ）グループ３のマウスにおいて、腫瘍の成長率は、未処理のマウスおよび媒介物のみで処置したマウスと、ほぼ同じであった。より多くのＤ６を投与したマウス（グループ４および５）における腫瘍の成長は、より緩慢で、腫瘍サイズは、研究日２１日目に１０００ｍｇに達した。グループ１および２のマウスと比較して、試験化合物で処理したマウスの腫瘍の成長は、およそ１日遅かった。
【０５１４】
結論
本研究のデータは、使用されたモデルの正当性を証明するものであった。すなわち、負の制御であるグループ１および２、正の制御である９は、予想通りの結果を示した。
【０５１５】
研究期間を通じて、触診可能な塊が、すべてのマウスに観察された。さらに、研究期間を通じて、すべてのマウスは、健康であり、正常の範囲内にあった。また、試験化合物（Ｄ６）は、マウスに副作用を及ぼさなかった。したがって、これらのデータは、Ｄ６で処理すると、腫瘍の成長が遅くれるということを示唆している（２２日の研究期間において、およそ１日遅い）。また、試験化合物は、これといった副作用を示さなかったことから、より高い濃度の試験化合物を使用すれば、腫瘍の成長をより強力に抑制できる可能性がある。
【０５１６】
［実施例３０］
以下の実施例は、本発明のＫＤＲ−結合ヘテロ二量体と共役する超音波造影剤、および造影剤と共役したヘテロ二量体が、生体外においてＫＤＲ−発現細胞に、生体内において血管新生組織に、集中する能力について記述する。
【０５１７】
ペプチドとの共役のための被覆マイクロバブルの調製
２００ｍｇのＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、２７５ｍｇのＤＰＰＧ．Ｎａ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌナトリウムで塩）を、５０ｍｌのＨｅｘａｎ／イソプロパノール（４２／８）の中で６０℃で可溶化した。溶液を、真空で蒸発させ、ＰＥＧ−４０００（３５．０４６ｇ）を脂質に加え、混合物を６０℃の１０６．９２ｇのブチルアルコールの中で、水浴で可溶化した。溶液を、１．５ｍｌのガラスビンに詰めた。サンプルを素早く−４５℃で凍らせ、冷凍乾燥させた。上部にできた空間の空気を、C４Ｆ１０／空気（５０／５０）の混合物で置き換えてから、ガラスビンにキャップをし、クリンプした。冷凍乾燥させたサンプルを、ガラスビン毎に１０ｍｌの食塩水（０．９％−ＮａＣｌ）で戻し、リン脂質安定マイクロバブル懸濁液を得た。
【０５１８】
ペプチド共役
Ｄ２３（Ｐ６の二量体構造およびＰ１２派生の配列）を、上記のように調製したマイクロバブルと、以下の手順に従って共役させた。チオアセチル化ペプチド（２００μｇ）を、２０μｌのＤＭＳＯに溶解し、その後１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中で希釈した。この溶液を、１８ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）内に分散したＮ−ＭＰＢ−機能化マイクロバブルと混ぜ合わせ、２ｍｌの脱アセチル化溶液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５Ｍのヒドロキシルアミン塩酸、ｐＨ７．５）を加えた。容器の上部にできた空間を、C４Ｆ１０／空気（５０／５０）で満たし、混合物を、暗闇の中室温で２．５時間、緩やかに揺さぶりながら（回転ホイール）培養した。共役したバブルは、遠心分離器で洗浄された。同様に、Ｄ２３を構成する単量体ペプチドも、別々に、上記の手順で調製された２つの異なるマイクロバブルと共役させた。
【０５１９】
トランスフェクト細胞における生体外分析
ＫＤＲ−トランスフェクト２９３Ｈ細胞を用いて、本発明のヘテロ多量体構成物と共役させたリン脂質安定マイクロバブルが、ＫＤＲ−発現細胞に結合する能力を判定した。
【０５２０】
Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップ上における２９３Ｈ細胞のトランスフェクト
２９３Ｈ細胞は、実施例６に定めたように、ＫＤＲ ＤＮＡでトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞を、上述のように調製したペプチド−共役マイクロバブルの懸濁液で培養した。トランスフェクト細胞を培養するために、小さなプラスチックのキャップを、１〜３．１０８のペプチド−共役マイクロバブルを含む懸濁液で満たし、キャップを裏返したＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップで覆い、トランスフェクト細胞が共役マイクロバブルと接触するようにした。室温でおよそ２０分後、ピンセットでカバースリップを持ち上げ、ＰＢＳ内で３回濯ぎ、顕微鏡で共役マイクロバブルとの結合を調べた。
【０５２１】
マイクロ気泡に覆われた表面のパーセンテージの測定
デジタルカメラＤＣ３００Ｆ（Ｌｅｉｃａ）を用いて映像を得て、映像化されたエリアにおける結合マイクロバブルに覆われた表面のパーセンテージを、ソフトウェアＱＷｉｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。表１３は、本発明の標的マイクロ気泡とＫＤＲトランスフェクト細胞との結合親和力（映像化された表面のカバー率として表される）を、同じマイクロ気泡と偽−トランスフェクト細胞との結合と比較した結果を示している。
【０５２２】
表１３．
2005519980.tif 000076
Ｐ６派生の配列、およびＰ１２派生の配列が、単量体として別々にリン脂質安定マイクロバブルに付加された場合、この結果物が、生体外において、ＫＤＲトランスフェクト細胞とバブルを結合させる程度は、それぞれ異なる（３．５％および１６．８％）ものであった。それぞれのペプチド単量体を、同じ量ずつ加えて（ただし総ペプチド負荷は同じ）リン酸化安定型マイクロバブルを調製し、同じシステムで試験した場合、１２．９％の結合が達成された。この結合は、２つの平均を少し上回るものであった。しかしながら、二量体Ｄ２３において、結合は２２．９％（同じペプチド負荷で）にまで増加した。これらの結果は、本発明のヘテロ多量体が、結合を増加させ、競合における対抗力を増加させるということを示している。
【０５２３】
生体内における動物モデル
本発明のヘテロ多量体に共役させたリン脂質安定マイクロバブルが、血管新生組織に集中し、その映像を提供する能力を、周知の血管新生組織モデル（ラットＭａｔIIIモデル）を用いて検証した。
【０５２４】
動物：  メスのＦｉｓｈｅｒ３４４ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、体重１２０〜１６０ｇが、ＭＡＴＢIII腫瘍移植に用いられた。オスのＯＦＡラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、体重１００〜１５０ｇが、Ｍａｔｒｉｇｅｌの注入に用いられた。
【０５２５】
麻酔
ラットは、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＭａｔIII細胞の移植前に、Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ（登録商標）／ｘｙｌａｚｉｎｅ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  ＡＧ／Ｓｉｇｍａ）（５０／１０ｍｇ／ｍｌ）の混合物を筋肉注射して麻酔した。映像化実験においては、同じ混合物、および５０％のウレタン（１ｇ／ｋｇ）を皮下注射することにより麻酔した。
【０５２６】
ラットＭＡＴＢIII腫瘍モデル
１３７６２ＭａｔＢIIIに指定されたラット乳腺癌を、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６６６）から入手し、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ媒体＋１０％ＦＣＳ．１％グルタミンおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ♯１５２９０−０１８）の中で成長させた。懸濁液の中の細胞を、収集し、成長媒体の中で洗浄し、計量し、遠心分離し、再びＰＢＳまたは成長媒体の中に、ｍｌにつき１．１０７細胞懸濁した。腫瘍の誘発のため、０．１ｍｌ内の１×１０66細胞が、麻酔をしたメスのＦｉｓｈｅｒ３４４ラットの乳房の脂肪体に、注射された。腫瘍は、通常、８日以内に５〜８ｍｍの直径に成長する。
【０５２７】
生体内における超音波画像化
線状プローブを備えた超音波画像化システムＡＴＬ  ＨＤＩ５０００装置を用いて、腫瘍の画像化を行った。低い音響出力（Ｍ１＝０．０５）のＢ−モードのパルス反転を用いて、血管の内皮細胞内に発現したＫＤＲ受容体上に、マイクロバブルを共役したペプチドを蓄積させた。制御実験例として、非共役マイクロバブル、または非特異的ペプチドに共役させたマイクロバブルが、静脈内ボーラスで注入された。線状プローブが、腫瘍を移植したライン上の皮膚に直接取り付けられ、その後３０分間、標的バブルの蓄積を続けた。
【０５２８】
Ｓｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）の潅流が、試験バブル懸濁液の注射の前に投与された。これにより、血管新生の状態を評価することが可能となり、Ｓｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）の注射後に得られる映像の強度が、内部基準となる。
【０５２９】
基線フレームが記録され、マイクロバブルの注入の間、インソネーションは中断された。注入後の様々な時点で（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０分）、インソネーションを再開し、１秒間に２フレームがビデオテープに記録された。
【０５３０】
腫瘍画像化実験で得た映像フレームは、ビデオキャプチャーに記録され、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ２．０ソフトウェアで分析された。腫瘍部分の全領域を含んだ、同じ長方形の関心領域（ＡＯＩ）が、異なる時点（１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０分）で、画像に選択された。各時点において、ＡＯＩベースラインのサブトラクション後、ＡＯＩ内部の映像画素総数が計算された。結果は、Ｓｏｎｏ Ｖｕｅ（登録商標）から得られた信号を１００％として、パーセンテージで表された。同様に、腫瘍の外側に位置し、自由に循環する造影剤を表す、第２のＡＯＩについても分析が行われた。
【０５３１】
図３７は、上記のように調製された、本発明のヘテロ多量体構成物（Ｄ２３）と共役させたリン脂質安定マイクロバブルの懸濁液を、注射して30分後までの、腫瘍内のバブル造影剤の取り込みおよび貯留を示している。腫瘍部位の外側に位置するＡＯＩにおいては、同じバブルが、一過性の視覚化／バブル造影（１０分以内）しか示さなかった。
【０５３２】
その他の実施例
ここまで本発明を、好ましい実施例を参照に述べてきたが、当業者であれば、本発明の本質的特徴を理解することが容易であり、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明に様々な変更および修正を加えて、様々な用途および条件に適合させ得るであろう。また、当業者であれば、通常の創作の範囲内で、本明細書に記載した特定の実施例の等価物を、数多く認識し、実現し得るであろう。こうした等価物は、すべて、本発明の範囲内に包含される。
【０５３３】
本明細書に記載した、すべての刊行物および特許は、参照として本願に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０５３４】
【図１】KDRをトランスフェクトした細胞、および偽-トランスフェクト細胞と、蛍光ビーズとの結合を示す。Neutravidinでコーティングしたビーズと、図示のビオチン化リガンドを結合させ、KDRを発現している293H細胞、および発現していない293H細胞との結合を試験した。P5（親水性スペーサー）およびP6の両方で、KDRとの特異的な結合が検出された。さらなる詳細は実施例2に示す。
【図２】実施例3に記載の125I標識VEGFとKDRをトランスフェクトした293H細胞との結合の2種類の濃度（30μMおよび0.3μM）のペプチド（P6、P4、P5-X-BおよびP12-X-B）による阻害率を示す。P6、P4およびP5-X-Bの結果は3回の実験の平均値±SDであるが、P12-X-Bの結果は1回の実験に基づくものである。
【図３】SDS-PAGEで分離し、転写した後、抗ホスホチロシン（「Phospho KDR」）および抗KDR（「総KDR」）抗体で検証した、未刺激（-V）HUVECおよびVEGF刺激    （+V）HUVECのKDR免疫沈降物の免疫ブロットを表したものである。活性化（リン酸化）KDRは未刺激（-V）HUVECで検出されなかったが、VEGF刺激（+V）HUVECの免疫沈降物には豊富に存在した。抗KDRによるブロットを、再検証したところ、両方の免疫沈降物に存在するKDRの総量は同等であることが明らかになった。この図は、同じプロトコールに従って実施した12回の実験結果を示したものである。
【図４】実施例4に記載の中和抗KDR抗体によるKDRリン酸化（活性化）の阻害を示した免疫ブロットである。未刺激（-V）、VEGF刺激（+V）およびVEGF／抗KDR（1μg／mL）で同時に処理した（+V+α-KDR）HUVECの免疫沈降物を、SDS-PAGEで分離し、転写した後、抗ホスホチロシン（「Phospho KDR」）および抗KDR（「総KDR」）抗体で測定した。実施例4に記載の通り、中和抗体はVEGFが誘発するKDRの活性化を部分的にブロックすることができた。
【図５】KDR結合ペプチドによるKDRリン酸化（活性化）の阻害を示した免疫ブロットである（反復実験）。未刺激（-V）、VEGF刺激（+V）およびKDR結合ペプチド（10μM）で処理した（+V+P10）HUVECを、SDS-PAGEで分離し、転写した後、抗ホスホチロシン（「Phospho KDR」）および抗KDR（「総KDR」）抗体で測定した。実施例4に記載の通り、KDR結合ペプチドP10は明らかに10μM濃度でVEGFが誘発するKDRの活性化を部分的にブロックすることができた。
【図６】実施例5に記載の、Tcで標識したP12-Cと、KDRをトランスフェクトまたは偽-トランスフェクトした293H細胞との結合を示す。
【図７】実施例5に記載の、Tcで標識したP12-Cと、KDRをトランスフェクトした293H細胞との特異的結合を示す。
【図８】実施例6に記載の、ペプチド／Neutravidin HRP複合体の飽和結合を示す。図8Aは、P6-XBおよびP5-XBを用いて得られた結果を示す。図8Bは、P12-XBおよびP13-XBを用いて得られた結果を示す。算出されたKd値は、10.00nM（P6-XB）、14.87nM（P5-XB）、4.03nM（P12-XB）および1.81nM（P13-XB）であった。
【図９】実施例6に記載の、単一濃度（5.5nM）における、ペプチド／Neutravidin HRP複合体（P1-X-B、P5-X-B、P6-XB、P12-XBおよびP13-XB）と、KDRをトランスフェクトまたは偽-トランスフェクトした293H細胞との結合を示す。
【図１０】実施例6の実験Bに記載の、単一濃度（2.78nM）における、ペプチド／Neutravidin HRP複合体（P1-XB、P1-B、P5-XB、P5-B、P6-XBおよびP6-B）と、KDRをトランスフェクトまたは偽-トランスフェクトした293H細胞との結合を示す。
【図１１】実施例6の実験Cに記載の、40%ラット血清を用いた場合および用いなかった場合の、ペプチド／Neutravidin HRP複合体（P6-XB、P5-XB、P12-XBおよびP13-XB）の特異的結合（KDRトランスフェクト細胞との結合から、偽-トランスフェクト細胞との結合を引いたもの）を示す。ペプチド／アビジンHRP溶液の濃度は、P6-XBおよびP5-XBで6.66nM、P12-XBで3.33nM、およびP13-XBで2.22nMであった。
【図１２】ペプチド／アビジンHRPと、KDRをトランスフェクトまたは偽-トランスフェクトした細胞との結合を、吸光度450nmでプロットしたものである。各々の四量体複合体を形成するために用いた、対照ペプチドおよびKDR結合ペプチドの比率は、被験多量体ごとに凡例に示す。
【図１３】P5-XB／アビジン-HRP複合体と、KDRトランスフェクト細胞との特異的結合（偽-トランスフェクト細胞への結合を差し引いた）を、吸光度450nmでプロットしたものである。凡例に示す通り、本分析には、未結合ペプチドの濃度の上昇（X軸に示す）が付け加えられた。遊離P5-XBのみが、P5-XB／アビジン複合体と、KDRトランスフェクト細胞との結合を、低減させることができた。
【図１４】3つの異なる濃度（10μM、0.3μMおよび0.03μM）における、125I標識VEGFとKDRトランスフェクト293H細胞との結合の、ペプチド（P12-XB、D2、D1、D3およびP13-D）による阻害率を示すグラフである。結果は3連±SDで実施された1回の実験によるものである。
【図１５】VEGFが誘発するKDRのリン酸化を、10nMのHUVECにおいては完全に、1nMにおいてはその大半を、ブロックするD1の能力を示す写真である。総KDRのブロット（下図）を再測定すると、被験化合物の作用は、サンプル負荷量の減少によるものではないことが明らかになった。D1に含まれる2つの結合配列からなるホモ二量体は、100nMまでこのリン酸化に干渉することはなかった。
【図１６】VEGFが誘発する内皮細胞の遊走／侵入を、D1が強力にブロックすることを示す。遊走細胞は、蛍光染色剤で染色した後、蛍光測定法で定量化された。
【図１７】40%マウス血清がある場合とない場合の、125I標識D5と偽-トランスフェクトおよびKDRトランスフェクト293H細胞との結合を示すグラフである。
【図１８】40%マウス血清がある場合とない場合の、125I標識D5とKDRトランスフェクト293H細胞との特異的結合（KDR-MOCK）を示すグラフである。
【図１９】は、注射量%／mLを投与した場合の血液中からの除去を、時間と対比して示したグラフである。
【図２０】Superdexペプチドカラムの血漿のSE-HPLC特性を示す。上図では試料は0分後、30分後および90分後に注射した。各図の間の挿入部分は、時点、動物数およびHPLC分析のための注射量を示す。
【図２１】HUVEC増殖分析におけるKDRペプチドの試験結果を示すグラフである。AはD6；BはP12-G；CはPNC-1（陰性対照）；FはPNC-1（陰性対照）。
【図２２】マウスのKDR-Fcに結合させたD1（P6-DおよびP12-Gの切断型ヘテロ二量体）の動態学的分析を示す。すべてのSensogramは二価分析モデルに適合した。
【図２３】マウスのKDR-Fcに結合させたD7（P5-DおよびP6-Dのヘテロ二量体）の動態学的分析を示す。すべてのSensogramは二価分析モデルに適合した。
【図２４】マウスのKDR-Fcに結合させたフルオレセインで標識したP12-Gの動態学的分析を示す。すべてのSensogramは1：1Langmuirモデルに適合した。
【図２５】実施例6の実験Cに記載の、40%マウス血清がある場合とない場合の、99mTcで標識したP12Cの特異的結合（KDRトランスフェクト細胞との結合から、偽-トランスフェクト細胞との結合を引いたもの）を示す。結果は、特異的CPM結合±sdとしてプロットされる。
【図２６】PG-1（四角）D1（菱形）におる125I -VEGFとKDRトランスフェクト細胞との特異的結合の阻害率%±sdのグラフである。
【図２７】図示された濃度のPG-1（菱形）およびD1（四角）の存在下における、HUVEC細胞のVEGFの刺激による最大遊走率±s.d.のグラフである。
【図２８】図２８Ａは、実施例18に記載の、Tcで標識したD10とKDRトランスフェクト293H細胞との結合を示したグラフである。図２８Ｂは、実施例18に記載の、Tcで標識したD18とKDRトランスフェクト293H細胞との非結合を示したグラフである。Mockは偽-トランスフェクト、TransはKDRトランスフェクト、MSはマウス血清を示す。
【図２９】実施例19に記載の、Luで標識したD13とKDRトランスフェクト293H細胞との結合を示すグラフである。Mockは偽-トランスフェクト、TransはKDRトランスフェクト、MSはマウス血清を示す。
【図３０】実施例20に記載の、PC3腫瘍を植え込まれたヌードマウスを対象に実施したD13による放射線療法試験の結果を要約したグラフである。各プロット線は、治療マウスにおける個々の腫瘍の経時的増殖を示す。ただし、破線は未治療マウス群の腫瘍増殖の平均値を示す。
【図３１】対照ペプチドおよび被験ペプチド（P30-XB、P31-XB、P32-XB）と125Iストレプトアビジンとの複合体（VEGFの存在下で）と、偽-トランスフェクトおよびKDRトランスフェクト細胞との結合合計を示すグラフである。P30XBを含有する複合体のみが特異的結合を示した（KDR偽-トランスフェクト）。
【図３２】糖化し、修飾スペーサーを備えたD26（四角）は、こうした化学的修飾をしていないD24（菱形）よりも強力にVEGFの刺激による遊走を阻害することができることを示すグラフである。
【図３３】培養HUVECを対象にした遊走分析において、VEGFの生物学的作用を阻害するD6の力を、TK-1が促進することを示すグラフである。菱形は図示の濃度におけるD6単独を示す。四角は、図示の濃度100nM以上のTK-1におけるD6を示す（定数）。
【図３４】実施例25に記載の通り実施した遊走分析における、VEGFの作用を阻害する能力に関して、D8（四角）はヘテロ二量体D17（菱形）よりも低いことを示すグラフである。
【図３５】実施例31に記載の、D6の細胞増殖データを示すグラフである。
【図３６】（A）C末端-C末端結合二量体、（B）N末端-C末端結合二量体および（C）N末端-N末端結合二量体の例を示す。
【図３７】ヘテロ多量体構成物と抱合させたリン脂質安定マイクロバブルの懸濁液を注射して30分後までの腫瘍内のバブル造影剤の取り込みおよび貯留を示すグラフである。
【図１】
2005519980.tif 000094
【図２】
2005519980.tif 000095
【図３】
2005519980.tif 000096
【図４】
2005519980.tif 000097
【図５】
2005519980.tif 000098
【図６】
2005519980.tif 000099
【図７】
2005519980.tif 000100
【図８】
2005519980.tif 000101
【図９】
2005519980.tif 000102
【図１０】
2005519980.tif 000103
【図１１】
2005519980.tif 000104
【図１２】
2005519980.tif 000105
【図１３】
2005519980.tif 000106
【図１４】
2005519980.tif 000107
【図１５】
2005519980.tif 000108
【図１６】
2005519980.tif 000109
【図１７】
2005519980.tif 000110
【図１８】
2005519980.tif 000111
【図１９】
2005519980.tif 000112
【図２０】
2005519980.tif 000113
【図２１】
2005519980.tif 000114
【図２２】
2005519980.tif 000115
【図２３】
2005519980.tif 000116
【図２４】
2005519980.tif 000117
【図２５】
2005519980.tif 000118
【図２６】
2005519980.tif 000119
【図２７】
2005519980.tif 000120
【図２８】
2005519980.tif 000121
【図２９】
2005519980.tif 000122
【図３０】
2005519980.tif 000123
【図３１】
2005519980.tif 000124
【図３２】
2005519980.tif 000125
【図３３】
2005519980.tif 000126
【図３４】
2005519980.tif 000127
【図３５】
2005519980.tif 000128
【図３６】
2005519980.tif 000129
【図３７】
2005519980.tif 000130
【国際調査報告】
2005519980.tif 000131
2005519980.tif 000132
2005519980.tif 000133