(57)【要約】（ｉ）脳癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームおよび放射性核種キャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームを含む多重特異性抗体と、（ii）治療用放射性核種が結合する治療用放射性核種キャリヤーとを、患者に、投与することによって脳腫瘍を治療する方法であって、ここで、多重特異性抗体、放射性核種キャリヤーおよび治療用放射性核種を実質的に等モル比で投与する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に、医薬上有効な量の
（ｉ）脳癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームおよび放射性核種キャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームを含んでなる、多重特異性抗体と
（ii）治療用放射性核種が結合する治療用放射性核種キャリヤーと
を投与することを含んでなり、
多重特異性抗体、放射性核種キャリヤーおよび治療用放射性核種を実質的に等モル比で投与する、方法。
【請求項２】
（ａ）放射性核種キャリヤーの溶液を、治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キャリヤーは治療用放射性核種より過剰に存在して、それにより、治療用放射性核種キャリヤー複合体を形成し、
（ｂ）治療用放射性核種と複合体を形成しなかったか、または結合しなかったキャリヤーを、溶液から実質的に分離し、
（ｃ）多重特異性抗体を用意し、かつ
（ｄ）患者に、多重特異性抗体と放射性核種キャリヤーとを、逐次的にまたは同時に投与する
ことをさらに含んでなる方法であって、
放射性核種キャリヤーが多重特異性抗体と結合し、多重特異性抗体のターゲッティングアームまたはターゲッティングアーム群が標的細胞において抗原−抗体複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）の投与の前に、多重特異性抗体および治療用放射性核種複合体をおよそ１：１比で混合する
ことをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
治療用放射性核種複合体を投与する前に、
治療を必要とする患者に、医薬上有効な量の非放射性標識多重特異性抗体を、くも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、または腫瘍内に投与し、かつ
該多重特異性抗体を腫瘍と結合させ、循環からクリアリングし、
治療用放射性核種複合体を多重特異性抗体に対しておよそ１：１０〜１：１の間のモル比で投与する
ことをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）がイオン交換カラムによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
（ｂ）がサイズ排除カラムによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）が疎水性相互作用カラムによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）が治療用放射性核種キャリヤーの非複合体化学部分と反応し得る化学的に活性化されたカラムによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
治療用放射性標識キャリヤーが金属キレート剤を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
投与が、くも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、または腫瘍内である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）治療用放射性核種および治療用放射性核種キャリヤーの複合体に特異的であるように多重特異性抗体を開発し、ここで、多重特異性抗体は、治療用放射性核種キャリヤー複合体に対して、非放射性標識治療用放射性核種キャリヤー単独に対するその親和性よりも約１００倍以上高い親和性を有し、
（ｂ）治療用放射性核種キャリヤーの溶液を、治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キャリヤーは治療用放射性核種より過剰に存在して、それにより、治療用放射性核種キャリヤー複合体を形成し、
（ｃ）その溶液に多重特異性抗体を添加し、
（ｄ）必要に応じて、多重特異性抗体と結合しなかった、治療用放射性核種キャリヤーを溶液から分離し、かつ
（ｅ）患者に、カップリングした多重特異性抗体および治療用放射性核種キャリヤーを投与し、ここで、治療用放射性核種キャリヤーおよび多重特異性抗体はおよそ１：１比で投与される
ことをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ｄ）がイオン交換カラムにより行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｄ）がサイズ排除カラムにより行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）が疎水性相互作用カラムにより行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
（ｄ）が治療用放射性核種キャリヤーの非複合体化学部分と反応し得る化学的に活性化されたカラムにより行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
投与が、くも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、または腫瘍内である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）キレートを含む溶液を治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キレートおよび放射性核種はおよそ１：１比で混合され、それにより、治療用放射性核種キレート複合体を形成し、
（ｂ）その複合体と非放射性標識多重特異性抗体を結合し、
（ｃ）患者に、カップリングした多重特異性抗体および治療用放射性核種複合体を投与し、ここで、治療用放射性核種複合体および多重特異性抗体はおよそ１：１比で投与される
ことをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
投与がくも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、または腫瘍内である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）治療用放射性核種キャリヤーを用意し、ここで、治療用放射性核種キャリヤーはチオール基を有し、
（ｂ）治療用放射性核種キャリヤーのチオール基をチオール結合性放射性核種と結合させ、それによって、放射性核種−キャリヤー複合体を形成し、
（ｃ）結合した治療用放射性核種キャリヤーおよび結合していない治療用放射性核種キャリヤーの混合物を、チオール反応性化学部分で活性化した基質上を通過させ、それによって、放射性核種と結合していない状態にあるチオール基を有するキャリヤーが、基質と反応して、保持される一方で、放射性核種が結合したチオールを有する治療用放射性核種キャリヤーが溶出され、
（ｄ）治療を必要とする患者に、医薬上有効な量の多重特異性抗体および治療用放射性核種キャリヤー複合体を投与し、ここで、治療用放射性核種キャリヤー複合体が多重特異性抗体と結合する
ことをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
投与が、くも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、または腫瘍内である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｄ）の投与の前に、多重特異性抗体および治療用放射性核種キャリヤー複合体をおよそ１：１比で混合すること
をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
チオール反応性化学部分がハロアセテート基またはマレイミド基からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
治療用放射性核種キャリヤー複合体を投与する前に、
治療を必要とする患者に、医薬上有効な量の非放射性標識多重特異性抗体を、くも膜下、頭蓋内、静脈内、または腫瘍内に投与し、かつ
該多重特異性抗体を腫瘍と結合させ、循環からクリアリングし、
治療用放射性核種複合体を多重特異性抗体に対しておよそ１：１０〜１：１のの間のモル比で投与する
ことをさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
多重特異性抗体、治療用放射性核種キャリヤー、および放射性核種がおよそ１：１：１比で投与され、かつ、この組成物は放射性核種と結合しない治療用放射性核種キャリヤーを実質的に含まない
ことをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
投与が、くも膜下、頭蓋内、静脈内、動脈内、腫瘍内、または外科的に作られた切除腔内である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
多重特異性抗体を投与した後にクリアリング剤を投与すること
をさらに含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
多重特異性抗体が全身投与され、かつ、治療用放射性核種キャリヤーが頭蓋内投与される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
治療用放射性核種キャリヤーが、１以上のジエチレントリアミン五酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸、および／またはチオセミカルバゾニル−システイニルグリシンキレート剤を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
放射性核種が、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２、Ｉ−１２５、およびＩ−１３１からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標的腫瘍抗原が、癌胎児性抗原、テネイシン、上皮細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、繊維芽細胞増殖因子受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体、 ガングリオシドおよびＨＥＲ２ｎｅｕ受容体からなる群から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
治療用放射性標識キャリヤーが金属キレート剤を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
併用癌治療が使用されない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
使用されない併用癌治療が、化学療法または外部照射療法である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
医薬として使用する、医薬上有効な量の
（ｉ）脳癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、放射性核種キャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体、および／または
（ii）治療用放射性核種が結合する治療用放射性核種キャリヤー
を含んでなる、組成物。
【請求項３５】
脳腫瘍を治療するための医薬の製造のための、医薬上有効な量の
（ｉ）脳癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、放射性核種キャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体、および／または
（ii）治療用放射性核種が結合する治療用放射性核種キャリヤー
を含んでなる組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、脳癌および中枢神経系の他の癌の治療のための多重特異性抗体および治療薬の投与に関する。
【０００２】
背景技術
脳および中枢神経系（ＣＮＳ）の癌は、周知のとおり、治療が難しく、通常は死に至る。星状細胞腫は、周囲の脳組織へ早期かつ急速に浸潤する傾向が著しく、そのことがこれらの癌が制御不能であることの主な原因である。最も悪性度の高い星状細胞腫が、ほとんどの患者の生存期間が２年未満である多形性膠芽腫（ＧＢＭ）である。第２の極めて重要な脳癌患者群は、脳への転移病巣を発達させたＣＮＳ外から発生する原発腫瘍を有する患者群である。乳房、肺、腎臓、および前立腺の原発性癌、ならびに黒色腫を有する多数の患者がこれらに含まれ、このような患者の予後は見通しが極めて厳しい。実際に、転移性脳癌の発生率は原発性脳癌の発生率よりも１０倍高い。現在、脳転移は癌患者の２０〜４０％に起こると推定され、アメリカ合衆国だけで毎年１７０，０００を超える症例がある。
【０００３】
外科的切除による腫瘍容積の減少法(Surgical debulking)および外部照射療法(external beam radiation)は依然として治療プロトコールの柱であるが、化学療法は血液脳関門により腫瘍部位に全身系的に接近することが制限されることから特に難しくなっている。外部照射療法はＣＮＳ内の既知の腫瘍部位を定位的にターゲッティングすることができ、単発性または孤立性脳病変に対して使用されることが多い。しかしながら、このようなアプローチは腫瘍の急速な浸潤および浸潤後の腫瘍の再増殖に関する問題に対処するものではない。さらに、その方法は微小転移巣の治療には使用できない。外科アプローチでも同じ問題を抱えており、通常、正常組織をより大きな幅で取り去ることを必要とする。
【０００４】
術後の近接照射療法は残存病変の問題を克服しようとする共通の方法であり、ヨウ素−１２５およびイリジウム−１９２が放射性シードのインプランテーションに使用する最も一般的な核種である。治療薬を、治療計画に関連する副作用を減少させる方法で送達し得るならば、それは有効な前進であろう。治療の有効性を評価する１つの方法は治療指標の使用である。治療指標は、副作用を生む薬剤の投与量と所望の効果をもたらす投与量との比率として定義される。現行法に比べて治療指標が増えた脳癌を治療する方法が必要である。
【０００５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた放射免疫治療（ＲＡＩＴ）は種々のタイプの癌に対して特に将来有望な治療である。脳腫瘍で過剰発現する、テネイシンおよび上皮細胞増殖因子受容体などの抗原を標的とする放射標識抗体に基づき、いくつかの異なる治療方法が開発されている。標準的な治療様式に比べ、このようなＲＡＩＴ法を使用して目覚しい結果が得られた(Riva et al, Eur. J. Nucl.Med., 27: 601-609, 2000、およびAkabani et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 46: 947-958, 2000；など)。
【０００６】
しかしながら、標準的なＲＡＩＴ法は、放射性標識したｍＡｂを癌患者に注入する場合に放射性免疫複合体が腫瘍標的組織で最大となり、背景組織および循環からクリアリングされるのには限られた時間しかないという欠点がある。無傷の放射性標識免疫グロブリンＩｇＧに対してはかなり長く、放射性標識ＩｇＧフラグメントおよびサブ−Ｆａｂ’フラグメントに対しては幾分短いこの時間の間、患者は非疾患標的照射(non-disease-targeted radiation)に曝される。主として、ｍＡｂ局在化段階の間受けるこの非標的照射は、放射能毒性に直接変わる。このことから、投与できる放射性標識ｍＡｂ の全量が制限され、最適なＲＡＩＴを実現するための投与量の増加が抑えられる。
【０００７】
間接的ターゲッティングまたはプレターゲッティングと呼ばれるアプローチでは、二重特異性抗体（ｂｉｓＡｂ）は、従来、全身放射免疫治療に関して二段階アプローチで使用されている。第一に、腫瘍抗原および放射性核種ハプテン複合体に対して向けられた非放射性標識二重特異性抗体を投与し、腫瘍にて局在化させ、最大とし、その一方で、循環および正常組織からクリアリングする。その後、放射性標識二価ハプテンを施与すると、それは腫瘍に局在させたｂｉｓＡｂに集まるが、それ以外は尿を介して比較的完全にかつ極めて急速に系からクリアリングされる。直接標識した抗体の場合、生物系は１〜７日の長期間、放射性核種の減衰を受ける一方で、放射性標識抗体の腫瘍の取込みが最大となるため、ｂｉｓＡｂにより放射性核種が送達され、系が数分から数時間、非腫瘍標的核種に曝されるだけである。
【０００８】
さらに、腫瘍で認められた抗原部位数によって腫瘍に向ける照射線量が制限された範囲に抑えられる。この絶対制限に加えて、総て抗体分子が放射性核種分子と関連するというわけではないことから、実施上の制限もある。これは腫瘍抗原の大部分に放射能ペイロードを保有していないｍＡｂ分子が結合するということを意味する。内在化および／または再循環がない場合、１０に１つのｍＡｂ分子が放射性核種原子を保有するならば、１０に１つの抗原部位だけが放射性核種により標的化され得る。実際の問題として、１０に１つの放射性核種保有ｍＡｂ分子が、事実上、非常に有益なｍＡｂ対放射性核種比であり、その比が１００以上に１つであってよいことも多い。例えば、治療用放射性核種レニウム−１８８で、タンパク質１ｍｇ当たり１ｍＣｉにて標識したｍＡｂのサンプルを考えた場合、およそ２００に１つのｍＡｂ分子が放射性Ｒｅ−１８８原子と実際に結合する。必要な場合に、より多くの放射性核種が、それらの腫瘍の限られた数の抗原部位を不所望に遮断することなく、抗原部位に向けられるならば、ＲＡＩＴの改善があることは明らかであろう。
【０００９】
ＲＡＩＴプロトコールに関してなお残る別の大きな問題は、施与した投与量に対するｍＡｂの腫瘍の絶対的取込みが、ほとんどの場合、臨床条件で依然として非常に低いことであり、組織１ｇ当たり０．０１〜０．００００１％注入量であることが多い。そのため、実際には注入した放射性免疫複合体のごく一部だけしか標的組織に局在しないが、大部分が正常組織全体に分布し、そのため、組織損傷がもたらされる。さらに、正常組織と比べて、腫瘍関連抗原が腫瘍特異的抗原よりもアップレギュレートされることから、腫瘍において存在する利用可能なこのようなアップレギュレートされた部位も有限数である。正常組織では大量の抗原が存在するため、その同じ抗原もまた発現する癌に対して向けられた抗体の特異性が低下する。さらに、全身投与に伴う化学または放射線分解事象もしくは影響に関連した厳しい状況の負担が重いか、またはそれを受ける状態にある場合には、ｍＡｂは、それらの抗原性標的との結合能が容易に低下するデリケートな生体分子である。
【００１０】
当技術分野では、現在のところ、現行の方法と比べて改善された治療指標を有する、抗体を使用した脳癌治療法が必要である。また、抗体の分解および抗体活性の喪失を最小限に抑える、脳癌の治療に向けた治療抗体投与法も必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、脳癌抗原と結合するターゲッティングアームと認識部分と結合する捕捉アームとを含んでなる多重特異性抗体に関する。本発明はまた、中枢神経系、特に、脳の腫瘍および癌の治療に向けた多重特異性抗体の使用に関する。本発明により治療可能な腫瘍としては、脳をはじめとする中枢神経系（ＣＮＳ）由来の腫瘍、およびＣＮＳ外の身体部分または領域からの転移腫瘍が挙げられる。腫瘍は新生物増殖であり、良性である場合も悪性である場合もある。癌は悪性腫瘍または新生物である。
【００１２】
本発明の方法は、治療薬の標的への送達を最大限にすることによりＣＮＳ腫瘍の治療を最適にすることに関する。標的部位に対する治療薬の最適化は、標的抗原がわずかに発現される場合に特に有益である。標的部位への治療薬送達の最適化において、標的抗原と結合する抗体が１種以上の治療薬を送達し得るように、治療薬のキャリヤーに少なくとも１種の治療薬を保有させることが望ましい。このようなターゲッティングを実現するには、標的腫瘍に可能な限り接近して標的抗体、活性剤、またはその両方を投与することが望ましいことが多い。好ましい投与形式としては、頭蓋内および腫瘍内投与などの腔内投与、ならびにくも膜下投与が挙げられる。他の投与形式としては、血液脳関門が損なわれている場合には動脈内または静脈内投与が挙げられる。本願において治療薬とは、特に断りのない限り、放射性核種を包含することを意味する。治療薬の投与に加えて、造影剤、例えば、画像化用放射性核種などの診断薬も本発明で使用することができる。
【００１３】
本発明の１つの態様は、脳における腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に、医薬上有効な量の
（ｉ）脳腫瘍抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームおよび放射性核種キャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームを含んでなる、多重特異性抗体と、
（ii）治療用放射性核種が結合する治療用放射性核種キャリヤーと
を投与することを含んでなり、ここで、多重特異性抗体および放射性核種標識キャリヤーの量は、最大量の放射性核種を腫瘍へ送達するように最適化されてなる方法である。理想的には、また、特に、腫瘍抗原が強く発現されない場合には、抗原部位を多重特異性抗体で飽和させ、次いで、各抗体に少なくとも１つの放射性複合体分子を送達させることにより各抗原に少なくとも１つの放射性核種を送達させることが望ましい。
【００１４】
本発明の他の態様は、非放射性標識キャリヤーを実質的に含まないか、または多重特異性抗体の捕捉アームが優先的に結合するため、非標識キャリヤーを投与した場合でさえも選択的に結合する放射性複合体を提供することである。
【００１５】
多重特異性抗体は、放射性複合体前に投与することができ、またはこれら２つの成分を前もって混合し、免疫複合体として投与することができる。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、多重特異性抗体を用いる癌の治療または診断のための設計されたキットに関する。キットは、請求の範囲に記載されている発明、実施例または本明細書に挙げた態様を実施する材料を含んでなるいかなる形式のものであってよい。キットは、好ましくは、当業者が本発明を治療上または診断上の使用に向けて実施するために使用する材料を含んでなる。
【発明の具体的説明】
【００１７】
脳における腫瘍の治療のための抗体を介した治療法の治療指標を改善する方法の研究において、本発明者らは脳腫瘍抗原と結合するターゲッティングアームおよび認識部分と結合する捕捉アームを含む多重特異性抗体を開発した。多重特異性標的化薬剤は、少なくとも１つの組織標的化成分およびハプテンを認識する少なくとも１つの第２の標的化成分を有する薬剤である。簡略にするために、本明細書では多重特異性抗体をｂｉｓＭａｂと表記するが、当然のことながら、特に断りのない限り、多重特異性ｍＡｂならびに二重特異性ｍＡｂが意図される。
【００１８】
本発明者らはまた、脳腫瘍の抗体を介した治療の治療指標を改善するための方法を提供する。この方法では、脳癌を有する被験体の、脳腫瘍の最大取込みが達成される局部的にまたは局所的に、例えば、くも膜下、頭蓋内、または腫瘍内などの経路により標的化薬剤を投与することによる処置を伴う。全身投与などの他の経路を利用してもよい。例えば、特に、血液脳関門が損なわれている場合には、静脈内および動脈内経路が有用であると思われる。多重特異性抗体、例えば、脳癌抗原と結合するターゲッティングアームおよび認識部分と結合する捕捉アームを含むものを、多重特異性抗体の捕捉アームが結合する認識部分を含む治療薬に先立ち、投与することができる。あるいは、抗体および治療薬を免疫複合体として投与することもできる。
【００１９】
上記のように、存在する利用可能な抗原結合部位は有限数であり、周知のように、臨床条件で全身投与した放射標識抗体の腫瘍の取込みは腫瘍に局在する絶対量の点から見て非常に低い。より限局した投与によりこれらの経路を使用すると腫瘍の相対的取込みが高まるため、膀胱腔内、くも膜下、動脈内、または腫瘍内経路による投与は絶対的取込みを有利に増大させる。本発明のもう１つの態様は、これらの投与経路を、注入する多重特異性抗体の各分子がおよそ少なくとも１つの放射性核種原子をその目的とする標的へと運ぶ組成物と組み合わせることである。これは本明細書に記載のいくつかの方法により達成される。
【００２０】
本発明を実施する方法は、
（ａ）放射性核種キャリヤーの溶液を、治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キャリヤーは治療用放射性核種より過剰に存在し、それにより、治療用放射性核種キャリヤー複合体を形成し、
（ｂ）治療用放射性核種と複合体を形成しなかったか、または結合しなかったキャリヤーを、溶液から実質的に分離し、
（ｃ）多重特異性抗体を用意し、かつ
（ｄ）患者に、多重特異性抗体と放射性核種キャリヤーとを、逐次的にまたは同時に投与する
ことを含んでなることができ、ここで、放射性核種キャリヤーは多重特異性抗体と結合し、多重特異性抗体のターゲッティングアームまたはターゲッティングアーム群は標的細胞において抗原−抗体複合体を形成する。この方法はまた、（ｄ）の投与の前に、実質的に総ての多重特異性抗体が少なくとも１つの治療用放射性核種複合体とカップリングされるように、多重特異性抗体および治療用放射性核種複合体を混合することも含み得る。このことは、過剰の治療用放射性核種複合体を多重特異性抗体と混合することによって行うことができる。本発明は、投与後、多重特異性抗体を腫瘍と結合させ、循環からクリアリングすることをさらに含み得る。１つの好ましい様式では、治療用放射性核種複合体が標的腫瘍と結合する多重特異性抗体に対して少なくともおよそ１：１０〜１：１の間のモル比にある。
【００２１】
本発明はまた、
（ａ）治療用放射性核種および治療用放射性核種キャリヤーの複合体に特異的であるように多重特異性抗体を開発し、ここで、多重特異性抗体は、治療用放射性核種キャリヤー複合体に対して、非放射性標識治療用放射性核種キャリヤー単独に対するその親和性よりも約１００倍以上高い親和性を有し、
（ｂ）治療用放射性核種キャリヤーの溶液を、治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キャリヤーは治療用放射性核種より過剰に存在して、それにより、治療用放射性核種キャリヤー複合体を形成し、
（ｃ）その溶液に多重特異性抗体を添加し、
（ｄ）必要に応じて、多重特異性抗体と結合しなかった、治療用放射性核種キャリヤーを溶液から分離し、かつ
（ｅ）患者に、カップリングした多重特異性抗体および治療用放射性核種キャリヤーを投与し、ここで、治療用放射性核種キャリヤーおよび多重特異性抗体はおよそ１：１比でまたは患者に送達される放射性核種の量を最大にする方法で投与される
ことをさらに含んでなることができる。分離を行う（ｄ）は、イオン交換カラムまたはサイズ排除カラム、疎水性相互作用カラム、または治療用放射性核種キャリヤーの非複合体化学部分と反応し得る化学的に活性化されたカラムによって行うことができる。
【００２２】
本発明はまた、
（ａ）キレートを含む溶液を治療用放射性核種で放射性標識し、ここで、キレートおよび放射性核種は、各多重特異性抗体が実質的に少なくとも１つのキレート化された放射性核種を送達するように最適化され、それにより、治療用放射性核種キレート複合体を形成し、
（ｂ）その複合体と非放射性標識多重特異性抗体を結合し、かつ
（ｃ）患者に、カップリングした多重特異性抗体および治療用放射性核種複合体を投与し、ここで、治療用放射性核種複合体および多重特異性抗体は、各多重特異性抗体が実質的に少なくとも１つのキレート化された放射性核種を送達するように投与される
ことをさらに含んでなることができる。
【００２３】
本発明は、
（ａ）チオール基を有する治療用放射性核種キャリヤーを用意し、
（ｂ）治療用放射性核種キャリヤーのチオール基をチオール結合性放射性核種と結合させ、それによって、放射性核種−キャリヤー複合体を形成し、
（ｃ）結合した治療用放射性核種キャリヤーおよび結合していない治療用放射性核種キャリヤーの混合物を、チオール反応性化学部分で活性化した基質上を通過させ、それによって、放射性核種と結合していない状態にあるチオール基を有するキャリヤーが、基質と反応して、保持される一方で、放射性核種が結合したチオールを有する治療用放射性核種キャリヤーが溶出され、
（ｄ）治療を必要とする患者に、医薬上有効な量の多重特異性抗体および治療用放射性核種キャリヤー複合体を投与し、ここで、治療用放射性核種キャリヤー複合体が多重特異性抗体と結合する
ことをさらに含んでなることができる。チオール反応性化学部分はハロアセテート基またはマレイミド基を含み得る。
【００２４】
本発明は、およそ１：１：１比以上で投与される、多重特異性抗体、治療用放射性核種キャリヤー、および放射性核種（多重特異性抗体当たり少なくともほぼ同等以上の治療用放射性核種であり、ここで、組成物は放射性核種と結合しない治療用放射性核種キャリヤーを実質的に含まない）をさらに含んでなることができる。
【００２５】
投与経路
好ましい投与経路としては、くも膜下、頭蓋内、または腫瘍内などの腔内経路が挙げられる。ここでもまた、血液脳関門が損なわれている場合には動脈内または静脈内投与を挙げてもよいということが留意される。
【００２６】
本発明の方法では、注入前にｂｉｓＡｂおよびＲＡＩＴ薬を前もって混合することができるが、これは必ずしも必要ではなく、２薬剤を個別に施与することもできる。実際には、薬剤を個別に施与することが望ましいケースがある。１つの態様では、ｂｉｓＡｂを動脈内経路により、例えば、頚動脈を介して施与し、脳およびＣＮＳにあるその標的まで通過させる一方で、全身的に完全にクリアリングする。この段階において、ｂｉｓＡｂと結合する放射性核種は存在せず、その結果、神経組織に対する毒性は前もって混合した方法と比べて少ない。適切な時間が経過した時点で、放射性標識した二次認識ハプテンを、周囲の脳組織にすぐに拡散するように、例えば、くも膜下投与すると、それがプレターゲッティングｂｉｓＡｂによって認識され、結合される。特に好ましい態様では、ｂｉｓＡｂを公知の方法を使用してヨウ素−１３１またはテクネチウム−９９ｍなどのトレーサー核種で放射性標識して、腫瘍部位に存在するｂｉｓＡｂの量および循環に残存するｂｉｓＡｂの量を正確に測定し、次いで、投与する必要のある第二の認識ユニット／治療用核種の量およびその投与に最適な時間を測定することができる。
【００２７】
ハプテンの価数
以下の例では、簡単にし、理解しやすくするために、放射性標識ハプテンを一価で示す。一価性は、特に、高親和性、一般に、１０−９以上の放射性標識ハプテンに対して二次抗体を使用する場合に十分許容される。通常の試験により、二次ｍＡｂ認識アームと放射性標識ハプテンとの相互作用に必要な親和性のレベルを決定することができる。一般に、その結合対は結合速度（Ｋｏｎ）が速く、かつ解離速度（Ｋｏｆｆ）が遅いもの、すなわち、高速形成かつ遅速解離型である。
【００２８】
しかしながら、認識ハプテンは、ｂｉｓＡｂの認識アームに関する価数よりも高い価数を有してよい。二価認識ハプテンは、特に、当技術分野では周知であり、全身投与において、二価であることがプレターゲッティングｂｉｓＡｂを介して局在する放射性標識二次ハプテンの腫瘍保持に対して有利であることは周知である。さらに、二価ハプテン認識ユニット（例えば、１を超えるキレートを有するもの）は、放射性金属で標識された二価ハプテンへの変換が行われる場合には達成可能な比放射能を高めるのに有用であり得る。これは上記の、一価の種に関連する第３の態様下で行う有用な好ましい方法である。例えば、ＤＯＴＡ−Ｘ−ＤＯＴＡ（式中、Ｘ＝あらゆる種類の標準的な連結剤）などの薬剤が本発明において有用である。好適な−Ｘ−としては、ペプチド、アルキルまたはアリール基または糖骨格が挙げられる。
【００２９】
高分子ハプテン
同じ原理を、高分子主鎖を使用して、例えば、各々が１原子の放射性金属と結合することが可能な複数のキレート部分を保有するように、さらに大きな価数の認識ハプテンにまで拡大することができる。これらのタイプの薬剤と類似したより有効な構造が、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年７月３１日出願の米国仮出願番号６０／３０８，６０５で例示されている。２〜１０キレートだけを保有する小さめの高分子でも、一度、結合させる金属キレートおよび放射性核種を慎重に選択すれば、キャリヤーフリー放射性核種の溶液中の総ての利用可能な金属イオンと結合させるよう、ごく少量で添加する必要がある。
【００３０】
いずれかの二次認識ユニットがあれば、認識には必ずしも放射性金属を保有しているキレート剤を必要としない。これは、いくつかの態様において好ましいにすぎない。金属キレートの高分子キャリヤーの使用に関連した態様では、これは好ましくない。実際には、ｂｉｓＡｂが結合する認識ユニットは放射性核種保有部分とは別の存在（例えば、金属−キレート複合体）がよりよいために、その逆であることが好ましい。高分子１モル当たりに添加されるキレートの濃度の高さが、最終的に、各ｂｉｓＡｂが確実に少なくとも１つの放射性核種原子と結合できることに依存されている後者のケースでは、好ましい高分子キャリヤー種は複数の金属キレート基を有するが、１または２認識ユニットしか有していない。これは、あまり多くの認識ユニットが存在しないことを保証することであり、これが複数架橋されたｂｉｓＡｂ−高分子複合体の早期クリアランスおよび代謝を引き起こし得る。
【００３１】
抗体フラグメントおよび多重特異性抗体
多重特異性抗体は、１つのアームが腫瘍標的と結合し、１つのアームが二次認識ユニットと結合するＦａｂ’×Ｆａｂ’種またはＩｇＧ種であり得る。それらは、化学的架橋によりまたはクワッドローマ(quadromas)を使用した体細胞突然変異を介して作製できる。腫瘍抗原および／または認識ハプテンの価数よりも大きな価数の多重特異性抗体は本発明の範囲内である。例えば、２つの抗原ターゲッティングおよび２つの二次認識部位が存在する、ＩｇＧ−１×ＩｇＧ−２またはＩｇＧ×（ｓｃＦｖ）２などの種が作製できる。これらのタイプの薬剤は現在の標準的なクローニング技術を使用して作製できる。本発明の本質的な精神を逸脱することなく、最小分子認識ユニットに至るまで、より小さな腫瘍抗原および二次認識多重特異性を作製し、使用することができる。同様に、二価×一価である薬剤、例えば、Ｆ（ａｂ’）２が腫瘍抗原を標的とし、Ｆａｂ’が二次認識ユニットを標的とする、またはその逆であるＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’も本発明の範囲内である。Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’などの多価の種のケースでも、多重特異性が可能である。よって、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’の例では、腫瘍ターゲッティングアームがＦ（ａｂ’）２ユニットで表され、個々のアームをそれぞれ別の腫瘍抗原、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、またはテネイシンとＥＧＦＲに向けることができる。また、多重特異性の異なるアームを同じ抗原の異なるエピトープに向けることもできる。本明細書において「多重特異性」とは、二重特異性を包含することを意味する。
【００３２】
ｍｓＡｂとしては、抗体フラグメント、サブフラグメントおよびその組合せが挙げられる。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは無傷の抗体により認識される抗原と同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメントはＣＤ２２のエピトープと結合する。また、本発明のｍｓＡｂとしては、限定されるものではないが、ＩｇＧ×ＩｇＧ、ＩｇＧ×Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓｃＦｖ、ＩｇＧ×ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’×Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’×ｓＦｖ、（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２、ｓＦｖ×ｓＦｖ、およびｓｃＦｖ×ｓｃＦｖ二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｍＡｂ）も挙げられる。また、ｓｃＦｖ×ＩｇＧ×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ×Ｆ（ａｂ’）２×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’などの種も含まれる。最も好ましくは、ＩｇＧの部位特異的付着部位または一方または両方のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦ（ａｂ’）２、例えば、操作した炭水化物または操作したまたは解放された遊離チオール基を利用することができる。これらのｍＡｂは二量体であることから、それらは別の２モルのｍＡｂと結合することができる。例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するｍＡｂ、操作された軽鎖炭水化物を有する抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２を酸化し、ヒドラジド−マレイミド架橋剤を使用して、各軽鎖に少なくとも１つのペンダントマレイミド基を有する抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２誘導体へと変換することができる。この種は、少なくとも抗キレート−Ｆａｂ’×抗ＣＥＡ−Ｆ（ａｂ’）２−抗キレートＦａｂ’複合体が生成するように、抗キレートＦａｂ’−ＳＨと１：２モル比にて結合させる。得られたｍｓＡｂは標的組織および高分子複合体に対して二価である。それらの最も小さい状態で、ｍｓＡｂは各特異性に対して向けられたペプチド分子認識ユニットを用いて構築され、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、五重特異性抗体(quintabodies)などが挙げられる。さらに、本開示において「ｍｓＡｂ」とは、多重特異性抗体および多重特異性抗体フラグメントを包含するものと理解される。
【００３３】
また、「抗体フラグメント」とは、特異的な抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基または関連ペプチドからなる最小認識ユニットが挙げられる。
【００３４】
本発明のｍｓＡｂは、本質的にモノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、好ましくは、モノクローナルである。さらに、ｍｓＡｂのターゲッティングアームおよび捕捉アームは、本質的にモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。好ましくは、ターゲッティングアームまたは捕捉アームのいずれかがモノクローナルである。最も好ましくは、ターゲッティングアームおよび捕捉アームのいずれもがモノクローナルである。
【００３５】
本発明のｍｓＡｂは、標識を保有するように操作してもよい。ｍｓＡｂが保有し得る標識の例としては、限定されるものではないが、ビオチン−ストレプトアビジン複合体および放射性同位元素などの標識リガンドが挙げられる。局在化およびクリアランスの追跡を容易にするために、本発明のｍｓＡｂを放射性標識することが有利である。
【００３６】
また、本発明において有用なｍｓＡｂは、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’フラグメントなどの１を超えるターゲッティングアームを有するｍｓＡｂを包含するとも考えられる。従って、１つのアームを認識ハプテンにターゲッティングし、２つのアームを腫瘍関連抗原に向けることができ、またはその逆も可能である。さらに、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’フラグメントのＦ（ａｂ’）２部分（Ｆａｂ’部分が放射性標識ハプテンに向けられると仮定すると）は、同一抗原の２つの異なるエピトープ（例えば、ＣＥＡ）または２つの異なる抗原（例えば、ＣＥＡおよびＭＵＣ１）に対して向けることができる。よって、それ自体は、１つのＦａｂ’またはｓＦｖアームが１つの腫瘍抗原に対して向けられ、１つが標的組織の別の腫瘍抗原に対して向けられるというターゲッティング能力の点から見て多重特異性であり得る。さらに、このＦ（ａｂ’）２または（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２亜種の１つのターゲッティングアームは腫瘍抗原に対して向けることができるが、別のターゲッティングアームは別のタイプの抗原、例えば、脳腫瘍に存在する血管抗原エピトープに対して向けられる。
【００３７】
また、二重特異性抗体および三重特異性抗体も本発明で有用であり、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年１２月２１日出願の米国仮出願番号６０／３１４，８８１、２００１年１０月１５日出願の同６０／３２８，８３５、２００１年１２月２６日出願の同６０／３４２，１０３、２００２年１月８日出願の同６０／３４５，６４１でさらに記載されている。
【００３８】
全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年７月２５日出願の米国出願番号０９／９１１，６１０、１９９５年６月２２日出願の同０９／３３７，７５６、および２００１年４月３日出願の同０９／８２３，７４６で記載されている二重特異性融合タンパク質もまた、本発明で有用である。他の抗体ならびに本発明で有用な組成物および方法としては、Ｉ２５３Ａおよび２００２年３月１日出願の米国仮出願番号６０／３６１，０３７で開示されている対象物が挙げられる。
【００３９】
抗体および抗原性標的
脳癌のターゲッティングにおいて当技術分野では公知の種々の抗体を使用することができる。本発明は、好ましくは、原発性および二次性（転移性）脳腫瘍に向けられ、腫瘍のタイプに応じて、異なる抗体および抗体組合せが選択される。本発明の範囲内で有用な抗原性標的としては、治療する疾病サブセットで過剰発現されるもの、例えば、脳腫瘍で過剰発現される抗原が挙げられる。例えば、ＧＢＭの治療において有用な抗原性標的としては、限定されるものではないが、テネイシン、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、繊維芽細胞増殖因子受容体群（ＦＧＦＲｓ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、および種々のガングリオシドが挙げられる。上記の標的受容体に加えて、これらの受容体のリガンド、またはリガンド受容体複合体が好適な抗原性標的と考えられる。例えば、ＶＥＧＦＲの他、ＶＥＧＦリガンドおよびＶＧＲＦ：ＶＥＧＦＲ複合体が好適な抗原性標的であり得る。ＶＥＧＦ抗体については、Thorpe et al., 米国特許第６，３４２，２２１号、第５，９６５，１３２号および第６，００４，５５４号で記載されており、これらは全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。
【００４０】
また、本発明は、癌腫および黒色腫などの他の腫瘍の脳への転移を治療するのにも有用である。脳に転移する腫瘍に関連する抗原に対する抗体は癌腫関連抗体、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、上皮糖タンパク質（ＥＧＰ）、ＨＥＲ、ＰＳＭＡ、ＭＡＧＥ、Ｂ７２．３、ＣＤ４４、およびＳ１００に対する抗体である。本発明においては、米国特許第４，３４８，３７６号、第４，８１８，７０６号、第４，９００，６８４号、第５，８７４，５４０号、米国出願番号０９／２５３，７４４および２００２年３月１日出願の米国仮出願番号６０／３６０，２２９、および２００２年３月１日出願の同６０／３６０，２５９で開示されているように、ＥＧＰ−１（ＲＳ−７）、ＣＤ−７４（黒色腫に関するＬＬ１）およびＣＥＡに対する抗体が有用である。脳に転移する最も多く見られる腫瘍は、肺癌、前立腺癌、乳癌、および黒色腫である。さらに、実質的にリンパ腫および白血病をはじめとするいかなる癌も脳またはＣＮＳに広がり得るため、リンパ腫および白血病の場合などのさらなる抗原標的（ＣＤ２０、ＣＤ２２、および他のＢ細胞抗原参照）が本発明で有用である場合がある。ＣＤ２０に対する 抗体については、２００２年２月１４日出願の米国仮出願番号６０／３５６，１３２で挙げられており、ＣＤ２２に対して有用な抗体については、米国特許第６，１８３，７４４号、第６，３０６，３９３号で開示されている。原発性脳癌の場合のように、これらの転移性腫瘍を治療するのに好ましい方法は、１を超える抗原タイプに対する抗体の好適な組合せを使用することによるものである。しかしながら、脳への転移があるときには、身体の他の器官への転移もあることが通例であるため、転移した場合には、全身的、例えば、静脈内治療することが好ましいと思われる。抗体ターゲッティングに関する総説については、Goldenberg DM, Targeted therapy of cancer with radiolabeled antibodies, J Nucl Med 2002; 43 (5): 693-713を参照。さらなる抗体としては、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Epstein et al.による特許（米国特許第６，０７１，４９１号、第６，０１７，５１４号、第５，０１９，３６８号および第５，８８２，６２６号）で記載されているように、癌遺伝子産物、および腫瘍壊死物質に対する抗体が挙げられる。
【００４１】
抗体の調製
二次認識ハプテンに対する抗体を、免疫プライミングの後に目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを作製するという標準的な方法を使用して調製することができる。このようにして、種々の特異的抗体が作製され、大量生産されるが、これらのものとしては、金属−キレート複合体インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｉｎ−ＤＴＰＡ）、およびイットリウム−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（Ｙ−ＤＯＴＡ）に対する抗体、ならびにヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ビオチンおよびフルオレセインなどの他の多様な種に対する抗体が挙げられる。本発明は、その範囲に、高分子などの大きな構造体のエピトープと結合することができる多重特異性抗体をはじめとする二次認識ハプテンに対する抗体も包含する。腫瘍ターゲッティングｍＡｂおよび二次認識ｍＡｂの特異性および親和性を標準的なファージディスプレイ法を使用して前もって選択することができ、これにより、所望の特性のヒトｍｓＡｂを得ることができる。特異的な抗体は、親和性ならびに結合および解離速度を高めるために当技術分野で公知の技術により熟慮された親和性であり得る。
【００４２】
本発明のＭｓＡｂは、化学結合を使用する周知の方法、体細胞法、または好適な宿主生物でタンパク質を産生させる分子生物学に基づく発現系により製造される。ｍｓＡｂの起源または生産様式は本発明の中心ではないと考えられる。よって、本明細書においてｍｓＡｂとは、多価多重特異性ターゲッティング抗体またはフラグメント／サブフラグメントを包含するものであり、具体的に言えば、二価×二価および三価×一価および三価×二価種、多重特異性ミニ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、五重特異性抗体、およびｓｃＦｖ×ｓｃＦｖタンデムが挙げられる。
【００４３】
好ましい態様では、腫瘍組織で取り込まれた量を容易に定量するために、ターゲッティングｍｓＡｂを放射性標識することができる。これは簡単な減算により行うことができるし、または、いずれにしても、結合していない放射性標識ｍｓＡｂを除去した後に、周知の画像化技術を使用して行ってもよい。放射性核種認識ハプテン複合体の投与の前に、透過性放射性核種を使用して、コンピューター断層（ＣＴ）もしくは単光子放出コンピューター断層（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層（ＰＥＴ）撮影を実施することができる。いずれにしても、この定量の目的は、特定の患者に好適である放射性標識認識ハプテンの量をより適切に判定することである。本態様下で画像化するのに有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、１−１２３またはＩ−１３１が挙げられる。
【００４４】
本発明の認識ハプテンは、プレターゲッティングｍｓＡｂの少なくとも１つのアームによって認識される少なくとも１つのエピトープを有することだけが必要である。これは二価ハプテンの結合が極めて重要となる標準的なｍｓＡｂ  ＲＡＩＴプロトコールとは全く違っている。ｍｓＡｂ  ＲＡＩＴ治療を全身的に行う場合、本質的に、認識には二価である必要があることが分かっている。それが一価であると、腫瘍標的において長時間保持されるのに十分、プレターゲッティングｍｓＡｂと結合しない。それが三価以上であると、血清中で高分子量複合体が形成することによって、放射性標識認識ハプテンの、主として患者の肝臓および脾臓への早期クリアランスが起こるという危険性があり、腫瘍の取込みが不十分となり、非特異的な放射能毒性が生ずる。そのため、本発明は、不十分な保持および早期クリアランスという二重の問題とは関係なく、ｍｓＡｂに対して一価から上のあらゆる価数の認識ハプテンを包含する。
【００４５】
前段落で述べた問題を理由に、ｍｓＡｂプレターゲッティングＲＡＩＴで用いる認識ハプテンの設計には大幅な自由を適用することができる。単純な形では、一価結合が本発明の範囲内で有用であることから、認識ハプテンおよび放射性核種の複合体を使用することができる。この例は、キレートの金属複合体、例えば、ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡ、ビオチン−キレート複合体で使用する抗ビオチンｍＡｂ、およびＨＳＧ−キレート複合体で使用する抗ＨＳＧ  ｍＡｂとの反応性を有するアームを有するｍｓＡｂである。これらの例では、金属は放射性のものであり、キレート剤によって強力に結合する。低分子量キレートの金属複合体が、金属が適切に精製され、キレートが適切に選択されるならば、金属対キレートおよそ１：１比にて作製できることが知られている。本発明で有用な放射性金属としては、粒子放射、例えば、αおよびβ放射体、ならびに／または低エネルギーγ線放射（オージェ放射体）により崩壊するものが挙げられる。それらとしては、網羅するものではないが、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３およびＡｃ−２２５内のものが挙げられる。放射性標識では、これらの金属のうちいずれかのものを最初に過剰のキレート剤により複合体化し、その後、余剰キレート剤を金属−キレート複合体から除去することも留意すべきである。この分離は、金属カチオンとの結合後にキレートの複数の負電荷を中和することから、通常、イオン交換手順に基づく。このような精製を実施する方法については、科学文献で記載されている。
【００４６】
チオールまたはチオール−アミノ含有リガンドと結合する別の放射性金属も本発明の範囲内で使用できる。これらの放射性金属としては、限定されるものではないが、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３およびＰｂ−２１２が挙げられる。
【００４７】
ハプテン
非金属治療用放射性核種を保有するハプテンも本方法に使用することができる。例えば、認識ユニット、ε−ＨＳＧ−リシル−チロシンおよびＨＳＧ−チロシンをＩ−１２５またはＩ−１３１放射性核種で放射性標識することができ、放射性標識した認識ユニットをｍｓＡｂプレターゲッティング後に使用することができる。治療用α粒子放出核種が望まれる場合には、放射性アスタチンを使用して同様の薬剤を調製することができる。細胞内プロセシング後に細胞内に保持される非代謝形態の放射性ヨウ素を生成する新しい放射性ヨウ素化剤が設計されている。種々のこのような薬剤が科学文献で記載されており、それらを使用して認識ハプテンの残留放射性ハロゲンサブユニットとの複合体を形成させることができる。認識ハプテンと実際に放射性核種を保有する部分との複合体の形成には標準的な有機化学技術および方法を使用する。好適ないずれの化学結合も使用することができ、それらとしては、限定されるものではないが、アミド結合を形成するカルボキシルとアミノ、チオエーテル結合を形成するチオールとハロカーボン、イミン結合を形成し、所望により、第二級アミノ結合に還元可能であるアミノとアルデヒドなどが挙げられる。必要に応じて、短いリンカー（例えば、カルボキシル含有核種キャリヤー（例えば、金属−ＤＴＰＡ）およびカルボキシル含有認識ユニット（例えば、ヒスタミン−スクシニル−グリシン）の連結に使用されるジアミン）を使用することができる。これらの一般的原理は本発明での使用に向けて作製され得る総ての複合体に適用可能であると考えられる。
【００４８】
全身ｍｓＡｂ治療に使用される二価認識ハプテンはこの膀胱内アプローチでも有用である。基本的には、好適ないずれの化学結合によって２つの認識ハプテンを互いに結合させてもよい。例えば、２つの認識ハプテンは、下記に例示されるような短い直鎖または環状ペプチドにより連結される：
【化１】
2005532343.tif 000002
【００４９】
これらの例では、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡユニットは、上記の、同じ治療上有用な放射性金属の放射性核種で放射性標識することができる（酸素−窒素リガンドが好ましい）。同様に、キレートＴｓｃｇ−Ｃｙｓ−（チオセミカルバゾニルグリオキシル−システイン−）は、治療用放射性金属（チオール−窒素リガンドが好ましい）で放射性標識されるよう設計されている。ペプチドがＩ−１２５またはＩ−１３１により容易にヨウ素化され得るように、チロシル残基をすでに組み込んでそれらを設計することができる。放射性核種を受け入れ得る１を超えるキャリヤー部位を有するペプチドは、例えば、放射性ヨウ素および放射性金属で二重標識することができる。ペプチドがＤ−アミノ酸を含有し、Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端がアミド化されているように、それらを、酵素に耐性であるように選択することができる。上記の種は、必要に応じて、抗ＤＴＰＡ、抗ＤＯＴＡまたは抗ＨＳＧ二次認識アームを有するｍｓＡｂとともに使用することができる。同じ認識ユニットは、本質的に、ペプチドではない鋳型と容易に結合することもできる。例えば、単純なジアミンは、ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡ部分で二重置換することができる。同様に、適切に置換されたジアミノ糖鋳型をＤＯＴＡまたはＤＴＰＡで二重置換することもできる。
【００５０】
また、２を超える認識ユニットを本発明の実施において使用することもできる。最も好ましくは、認識ユニットが放射治療薬、例えば、イットリウム−９０−ＤＯＴＡキレート複合体の不可欠な部分でもある場合にこのように実施される。このような複合体は高分子キャリヤーへと多重置換することができる。イットリウム−９０−ＤＯＴＡなどの薬剤を保有し、本発明で使用される高分子キャリヤーは、非特異的組織の取込み、ならびに大量の放射性核種の肝臓および腎臓などの組織への代謝クリアランスについての懸念がずっと少なくてすむことから、好ましくは、膀胱腔内投与される。好ましい態様では、高分子タイプ［ＨＳＧ］ｍ−高分子主鎖−［ＤＯＴＡ−イットリウム−９０］ｎ（この場合、ＨＳＧが認識ハプテンを含む）が生成されるように、認識ユニットと放射性核種キャリヤーとが分離される。好ましくは、ｍ＝１、一方、ｎ＝１０〜１００。いずれにしても、認識ハプテンの置換レベルは、高分子ユニット当たり１〜２に維持され、一方、ＤＯＴＡの置換レベルは高分子ユニット当たり最大である。全身的な薬物動態学的問題が除かれたこのタイプの複合体には、Ｙ−９０を容易に過負荷することができる。腫瘍との結合および認識はＨＳＧ含有ｍｓＡｂを介するため、治療崩壊では腫瘍をプレターゲッティングする総てのｍｓＡｂが少なくとも１つのイットリウム−９０原子を送達することが確実になり得る。
【００５１】
投与前の余剰抗体の除去
投与の前に、溶液から遊離の余剰抗体を除去することができる。これはイオン交換カラムもしくはサイズ排除カラム、疎水性相互作用カラム、または治療用放射性核種キャリヤーの非複合体化学的部分と反応することが可能な化学的に活性化されたカラムを介して実施することができる。
【００５２】
放射性核種治療薬／診断薬
本発明の方法では、ターゲッティング可能な構築物は、罹患組織を治療するのに有用な１種以上の放射性同位元素を含み得る。特に有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、３２ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、９０Ｙ、および２２５Ａｃが挙げられる。治療用放射性核種は、好ましくは、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲（好ましくは、オージェ放射体の場合では６０〜２００ｋｅＶ、β放射体の場合では１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射体の場合では４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲）の崩壊エネルギーを有する。
【００５３】
また、診断用放射性核種も本発明によって投与することもできる。診断用放射性核種の例としては、ＭＲＩ用に使用することができる常磁性イオンが挙げられる。常磁性イオンの例がガドリニウムである。特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、好ましくは、２０〜４，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは、２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、よりさらに好ましくは、２０〜１，０００ｋｅＶの範囲、よりいっそう好ましくは、７０〜７００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、または他のγ放射体、β放射体、もしくは陽電子放射体が挙げられる。
【００５４】
多重特異性放射性標識抗体およびキャリヤーフリー放射性同位元素の調製および投与
本発明は、多重特異性抗体の投与後にクリアリング剤を投与することも必要とする。本発明はまた、多重特異性抗体が全身投与されることおよび治療用放射性核種キャリヤーが頭蓋内投与されることも意図する。治療用放射性核種キャリヤーは、次の１種以上のものを含み得る：ジエチレントリアミン五酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸、および／またはチオセミカルバゾニル−システイニルグリシンキレート剤。治療用放射性標識キャリヤーは、金属キレート剤を含み得る。また、本発明の総ての態様が排他的治療法である、言い換えれば、化学療法または体外照射療法などの併用癌治療は行わない。
【００５５】
Meares et al.（米国特許第５，９５８，３７４号）は、まず、イットリウム−９０、または他のＭ３＋カチオンとの金属キレート複合体を作製し、イオン交換手順により結合していないキレートからＭ３＋−キレート複合体を精製することによる、直接抗体放射性標識化方法を記載している。Mearesの方法では、キレートＭ３＋複合体が、Ｍ３＋と抗体標的化薬剤とのカップリングを可能にする活性化反応性化学基も保有している。Mearesにより記載された中間試薬と類似の組成物は、本発明に照らして、以下の通り作製することができる。カルボキシル基モノ活性化ＤＯＴＡと第１級アミン（例えば、Ｎ−ブチルアミン）との反応から作製されたＤＯＴＡ誘導体を使用する。このＤＯＴＡ誘導体は、ＤＯＴＡ−Ｒと呼ばれるイットリウム−９０で標識される種であり、そのイットリウム−９０−ＤＯＴＡ−Ｒは以下のように処理を受ける。
【００５６】
第１に、脳癌抗原性エピトープと反応する少なくとも１つのアームおよび抗キレート二次認識アームと反応する少なくとも１つの別のアームを含む多重特異性抗体を作製する。このような薬剤の例が、抗ＥＧＦＲ×抗イットリウム−ＤＯＴＡ抗体である。イットリウム−ＤＯＴＡはイットリウム−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸である。
【００５７】
第２に、キャリヤーフリーイットリウム−９０−ＤＯＴＡ−Ｒ複合体（式中、Ｒは四酸性ＤＯＴＡ環の４つのカルボキシル基のうちの１つを中和するために存在する置換部分である）のサンプルを調製する。放射性標識は、過剰のＤＯＴＡ−Ｒをイットリウム−９０放射性核種のバイアルに添加することに達成される。５分〜２時間標識した後、反応混合物をイオン交換カラム（酢酸塩様式でのＤＥＡＥ−セルロース陰イオン交換樹脂を代表とする）に通す。電気的に中性の複合体イットリウム−９０−ＤＯＴＡ−Ｒは、水で陰イオン交換樹脂から直接溶出させることができ、３〜ほぼ中性のｐＨにて電荷を帯びている非複合体ＤＯＴＡ−Ｒは樹脂に保持される。このようにして、キャリヤーフリーイットリウム−９０−ＤＯＴＡ−Ｒの溶液が得られる。
【００５８】
上記の態様におけるＲの性質は重大ではなく、金属複合体形成後に依然として残るＤＯＴＡ環の残留する負電荷が消えるように選択される。好ましい態様では、ＲはＮ−アルキル誘導体、例えば、Ｎ−プロピル−、Ｎ−ブチル−、Ｎ−ペンチル−などに該当する。Ｒ＝Ｈを有し、ＤＯＴＡ環に残留する１電荷を残することがまさに可能であるが、３種類の種からの０電荷種の分離は、３種類の種からの１電荷種の分離よりもはるかに容易であることから、これによりイオン交換による分離はより精緻なものとなる。通常、ＲはＤＯＴＡ環の１つのカルボキシル基と反応して電荷中性アミド結合を形成するアミノ基を含有する。
【００５９】
金属キレートに特異的な抗ハプテン抗体
本発明に関する治療用放射性標識キャリヤーは金属キレート剤であり得る。この場合、具体的に言えば、特定の金属−キレート複合体に対する特異性を有する抗ハプテン抗体を開発することができる。例えば、特定の金属−キレート複合体に対して、同じキレート単独よりも２〜４オーダー大きい親和性を有する抗体が本発明の範囲内で特に有用である。抗体パンニングおよび親和性の熟慮に関する標準的な方法を使用して、例えば、イットリウム−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）と、ＤＴＰＡ単独と比べてはるかに大きな親和性で反応する抗体を開発する。標識化では、本質的に総ての核種を結合するように十分に過剰なＤＴＰＡをイットリウム−９０治療用放射性核種に添加する、続いて添加する、抗イットリウム−ＤＴＰＡ抗体を含むｂｉｓＡｂは非複合体ＤＴＰＡよりもイットリウム−９０−ＤＴＰＡキレートと優先的に結合すると分かっている。レニウム−１８８、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、サマリウム−１４３、インジウム−１１１、および他のキャリヤーフリー核種に基づくものをはじめとする金属−キレート複合体でも同様の戦略を使用することができる。
【００６０】
放射性複合体に特異的な抗ハプテン抗体
二次ｍＡｂを作製し、使用する上記の戦略は、金属−キレート複合体に限定されるものではなく、共有結合種でも使用してよいと考えられる。例えば、ヨウ素には、ＲＡＩＴに有用であり得る数種類の核種がある。ヨウ素は最大の元素の１つであり、原子番号５３を有し、最外殻電子はほぼいっぱいであり、イオン半径＞２オングストロームを有する。抗体応答の優れた特異性を利用して、チロシンを含むエピトープとヨードチロシンを含むものとを区別することができる。よって、ヨードチロシンに対して惹起されたｂｉｓＡｂ二次認識アームが放射性ヨードチロシン誘導体とだけ反応し、類似しているが非置換のチロシン誘導体とは反応しないように、二次ｍＡｂをヨードチロシンに対して惹起することができる。したがって、放射性核種との結合後に非標識キャリヤーを除去する必要はない。ｂｉｓＡｂおよびそのα粒子放出核種を含む認識ユニットでのＲＡＩＴを行うため、同様の戦略を使用してアスタチン含有免疫原に対して抗体を惹起する。本発明で有用な複合体および二官能性リガンドとしては、その開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第５，６１２，０１６号で開示されているものが挙げられる。
【００６１】
有効なキレート剤
特定のキレート剤（例えば、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、および他のもの）は、１モル当量の添加ＤＴＰＡキレート剤が１モル当量の放射性核種金属と効率的に結合することができるように、高度希釈溶液中の特定の金属と結合することができる、このように有効な金属スカベンジャーであることが知られている。これらの金属としては、イットリウム−９０、サマリウム−１５３およびルテチウム−１７７が挙げられる。
【００６２】
米国特許第６，１２６，９１６号で開示されている結合リガンドおよび２００１年４月４日出願の米国出願番号０９／８２３，７４６で開示されているキレート剤は、本発明においても有用である。
【００６３】
化学反応性の違いの利用
放射性複合体を非標識キャリヤーと分離する別の方法は、放射性金属との反応後のキレートリガンドの化学反応性における違いを利用する。例えば、チオール含有リガンドを使用して放射性金属、例えば、レニウム−１８８、銅−６７、銅−６４および銀−１１１、放射免疫治療に有用な総ての放射性核種と結合する。チオールは特定の官能基（例えば、ハロゲノ酢酸およびマレイミド）と、各々、置換および付加反応により極めて容易に反応する。これらの反応特性を利用して、まず、チオール含有リガンドをこれらの核種のうちの１つと結合し、次いで、放射性金属と結合したチオール含有リガンドと放射性金属フリーチオール含有リガンドの混合物をヨード−、ブロモ−またはクロロ酢酸またはマレイミドで活性化した樹脂またはビーズ上を通過させる（その結果、放射性金属フリーチオール含有リガンドが反応し、放射性金属と結合したチオール含有リガンドが溶出される）ことにより、本質的にキャリヤーフリー試薬を調製することができる。このような薬剤は、一般構造、メルカプトアセチルグリシルグリシルグリシル−Ｑ（ＭＡＧ３−Ｑ）（式中、二次認識アームがＭＡＧ３または金属−ＭＡＧ３部分に対して惹起されない場合、Ｑは二次抗体認識アームによって認識される基である）で表される。
【００６４】
他の治療での使用
本発明は、化学療法または体外照射療法と併用することができるし、または併用せずに使用することができるという利点を有する。ある場合（例えば、急速に増殖する腫瘍の場合）において、頭蓋外疾患が存在するならば、本発明の方法を別の治療（例えば、化学療法）で使用し得、全身投与することができる。
【実施例】
【００６５】
例１：二重特異性抗体の調製
（ａ）抗テネイシンおよび６７９と呼ばれる抗ハプテン抗体（ネズミ；抗ヒスタミニル−グリシル−スクシンイミジル−（ＨＳＧ−）部分）を個々に、酢酸バッファー中２００μｇ／ｍＬのペプシン（ｐＨ３．７）で１時間インキュベートすることにより消化してＦ（ａｂ’）２フラグメントとする。各場合において、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィーにより、このＦ（ａｂ’）２フラグメントを試薬および副生成物から精製し、実質的に純粋な１００，０００ｋＤフラグメントの生成物を得る。
【００６６】
（ｂ）上記ペプシン消化から得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを個々に、０．１Ｍリン酸緩衝０．９％塩化ナトリウム（ＰＢＳ）バッファー（ｐＨ７．５）中、３７℃にて１時間、１０ｍＭの新しく調製したＬ−システインとともにインキュベートする。還元されたＦａｂ’−ＳＨフラグメントを個々に、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＧ−５０−８０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）を含むスピンカラム上での遠心分離により精製する。生成物であるＦａｂ’フラグメント抗体は、架橋反応まで４℃で維持する。
【００６７】
（ｃ）上記ｂ）から得られた６７９−Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、活性化反応物中のジメチルスルホキシドの最終濃度が１５％となるようにジメチルスルホキシドに溶解した２０倍過剰のチオール架橋剤オルト−フェニルジマレイミド（ＯＰＤ）と４℃で３０分間反応させる。生成物６７９−Ｆａｂ’−Ｓ−リンカー−マレイミドを、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＧ−５０−８０Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）を含むスピンカラム上での遠心分離により精製する。６７９−Ｆ（ａｂ’）２−Ｓ−リンカー−マレイミドを１モル当量の抗テネイシン−Ｆａｂ’−ＳＨと混合し、４℃で３０分間反応させる。目的生成物である抗テネイシン−Ｆａｂ’−リンカー−Ｆａｂ’−６７９（Ｆａｂ’１×Ｆａｂ’２二重特異性抗体）が、ＴＳＫ−３０００(Tosohaas, Montgomeryville, PA)上の分取サイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより低分子量の夾雑物および未反応のＦａｂ’種を除去すれば純粋な形で得られる。
【００６８】
例２：イットリウム−９０放射性標識二価ハプテンの調製
以下に示されるＩＭＰ２４１（ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２と呼ばれるモノ−ＤＯＴＡ、ジ−ＨＳＧ二価ハプテンペプチドを、６ｎｍｏｌのペプチドおよび〜１ｍＣｉの乾燥Ｙ−９０クロリドを用い、Ｙ−９０で放射性標識する。６μｌの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）、次いで２．７μＬ（５．９４ｎｍｏｌ）を０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）中、２．２ｍＭのＩＭＰ−２４１溶液へ加える。この溶液をアルミニウムブロックヒーターを用い、５５℃で３０〜４０分間加熱した後、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ（終濃度）でクエンチし、同じ温度でさらに１０分間加熱し、冷却する。溶液を４０μｌの水で希釈し、４．５μＬの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液と混合し、最終のｐＨを〜７．５まで引き上げる。酢酸イットリウム−９０の代わりに酢酸Ｉｎ−１１１で同様の標識を行う。
【化２】
2005532343.tif 000003
【００６９】
例３：キャリヤーフリーイットリウム−９０放射性標識二価ハプテンの調製
上記の例２で得られたＹ−９０−ＩＭＰ  ２４１を、下記のように、重力流を用いたＤｏｗｅｘ  ａｇ１−ｘ２陰イオン交換樹脂にて、非Ｕ−９０含有ＩＭＰ  ２４１から精製する。この放射性標識溶液を、二方向ストップコックを取り付けた（流れを止める）１ｍｌシリンジ中、０．５ｍｌの樹脂ベッド上に乗せる。１分後、この溶液を樹脂ベッドのちょうど最上部付近まで濾過する。樹脂が接触するまで何分か流れを止めた後、１０×０．１２５ｍｌの水画分を続ける。適用した放射活性の大部分は画分４〜１１に回収される。このアプローチを用いれば、最終生成物において非Ｙ−９０含有ペプチドのレベルに１００倍の減少が達成され、その結果、ペプチド１ｍｍｏｌ当たり２７，８８８ｃｉ  Ｙ−９０の比活性が得られる。Ｙ−９０自体の比活性は〜５００ｃｉ／ｍｇ（４５，０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）であることから、ペプチド各１ｍｍｏｌに０．６ｍｍｏｌのＹ−９０が会合ていること、すなわち、Ｙ−９０放射性核種１分子につきペプチド２分子未満に相当する。所望により、二回目に１−ｘ２樹脂を通すと、ペプチド：イットリウム−９０比は１：１に接近するまで低下する。次に、Ｙ−９０−ＩＭＰ  ２４１をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００７０】
例４：レニウム−１８８放射性標識二価ハプテンの調製
【化３】
2005532343.tif 000004
（ａ）上記に模式的に示したように、レニウム−１８８の溶出、溶出液の精製および濃縮のためにタングステン−１８８／レニウム−１８８ジェネレーターをセットアップする。この溶出液を、タンデムでセットアップした４本のカラム：アルミナＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジ１本（通り抜けたタングステンを吸着するため）、Ａｌｌｔｅｃｈ  ＩＣ−Ｈ陽イオン交換カラム２本（酢酸イオンを吸着するため）、およびＷａｔｅｒｓ  ＱＭＡライト陰イオン交換カラム（ペルレネート(perrhenate)イオンを吸着するため）にチューブを介して通す。この系をジェネレーターに接続する前に、シリンジを用いて２０ｍＬのミリポア脱イオン化水を通すことにより各カラムを湿らせる。カラムを予め湿られたところで、適当なコネクターと最短の配管を用いてそれらを上記のように接続する。ジェネレーターは０．３Ｍ酢酸アンモニウム溶液で、結合したイオン交換カラムから直接溶出し、ペルレネートはＱＭＡカラムに捕捉される。次に、この樹脂を、シリンジを介して２０ｍＬの水で洗浄し、１ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液でＲｅ−１８８を溶解させる。
【００７１】
（ｂ）次に続くレニウム−１８８標識のために下記のように二価ペプチドを調製する：以下に示されるペプチドＩＭＰ  １９２［Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２］がレニウム−１８８標識に用いられる。調製としては、９０ｍＬ部のグルコヘプトン酸溶液につき５４０ｍｇ（５１４μＬ）の氷酢酸を加えることで、グルコヘプトン酸ナトリウム中８００ｍＭ（１７．８５ｇ，１９８ｍｇ／ｍＬ）および１００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液９０ｍＬを調製する。次に、バッファー９０ｍＬにつき、抗酸化剤として１８０ｍｇのアスコルビン酸を加える。この混合物３０ｍＬに、１ｍｇ（６．３×１０−７モル）のＩＭＰ−１９２ペプチド、次いで６倍モル過剰の塩化インジウム（１．６ｍＬの２．３×１０−３モルのインジウム原液）を加える。このペプチドのターゲッティングに用いる二重特異性抗体はインジウム−ＤＴＰＡ複合体を認識するので、インジウムを加えて２つのＤＴＰＡ認識部分に結合させる。次に、この溶液に９０ｍｇの塩化スズ二水和物を加え、この混合物を０．２２ミクロンフィルターで迅速に濾過し、この混合物０．３ｍＬを２ｍＬ凍結乾燥バイアルに分注する。これらのバイアルおよび内容（各５０μｇのＩＭＰ  １９２ペプチドを含む）をドライアイス浴を用いて凍結させ、真空下で凍結乾燥する。
【００７２】
（ｃ）上記のジェネレーター溶出パート４ａ）から得られた濃縮Ｒｅ−１８８溶出液（１ｍＬ，５０ｍＣｉ）を、１ｍＬのシールドシリンジを用い、パート４ｂ）のＩＭＰ−１９２の凍結乾燥バイアルの１つに加える。このバイアルを軽く振盪して内容物を溶かし、バイアルを９０℃で１時間加熱する。冷却後、ＨＰＬＣおよびＩＴＬＣ（即時薄層クロマトグラフィー放射分析）では９０％を超えるＲｅ−１８８がＩＭＰ  １９２に、以下に示される還元型レニウム−ＴｓｃＣＧ複合体としてこれに結合して組み込まれていることを示す。
【化４】
2005532343.tif 000005
【００７３】
例５：キャリヤーフリーレニウム−１８８放射性標識二価ハプテンの調製
上記４ｃ）から得られたＲｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２ｍＬの脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で１：１希釈する。希釈したＲｅ−１８８−ＩＭＰ１９２を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で予め平衡化したＳｕｌｆｏＬｉｎｋ（商標）カップリングゲルカラム(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)上部に加える。Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２をこのカラムのゲルに流し、３０分間、ゲルと接触させておく。その後、Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を含むバッファーをカラムから排出し、このカラムを、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むさらに２ｍＬの脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で洗浄する。次に、Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００７４】
例６：アクチニウム−２２５放射性標識二価ハプテンの調製
ＩＭＰ  ２４１（ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２［図１］と呼ばれるモノ−ＤＯＴＡ、ジ−ＨＳＧ二価ハプテンペプチドを、〜６ｎｍｏｌのペプチドおよび〜１ｍＣｉの乾燥Ａｃ−２２５（ＡｃＣｌ３など）を用い、Ａｃ−２２５で放射性標識する。０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）中、ＩＭＰ−２４１の２．２ｍＭ溶液に、６μＬの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）、次いで２．７μＬ（５．９４ｎｍｏｌ）を加える。この溶液をアルミニウムブロックヒーターを用い、６０℃で１時間加熱した後、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ（終濃度）でクエンチし、同じ温度でさらに１０分間加熱し、冷却する。この溶液を４０μＬの水で希釈し、４．５μＬの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液で最終ｐＨを〜７．５まで引き上げる。
【００７５】
例７：キャリヤーフリーアクチニウム−２２５放射性標識二価ハプテンの調製
上記例６で得られたＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１を、上記例３）に記載のものと同様の手順を用い、重量流を用いるｄｏｗｅｘ  ａｇ  １−ｘ２陰イオン交換樹脂にて、非アクチニウム−２２５含有ＩＭＰ  ２４１から精製する。このアプローチを用いれば、最終生成物において非アクチニウム２２５含有ペプチドのレベルに１００倍の減少が達成され、その結果、ペプチド：アクチニウム−２５５比は３：１未満となる。所望により、二回目に１−ｘ２樹脂を通すと、ペプチド：イットリウム−９０比は１：１に接近するまで低下する。次に、Ａｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００７６】
例８：高比活性放射性標識ポリマーの調製
（ａ）２ｍＬのホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中、ポリ（Ｌ−リジン）１０ｍｇ（約５×１０−８モル；平均分子量約２００，０００と推定））攪拌溶液を、約１００倍モル過剰（〜１．８ｍｇ）のジエチレントリアミン五酢酸ジアンヒドリド（ＤＴＰＡＡ；Sigma Chem. Co., St Louis, MO）で処理する。さらに１５分間攪拌した後、２Ｎの臭化水素酸の滴下を用いてｐＨを４に調整する。室温でさらに１時間後、混合物を分子量カットオフ１０，０００ダルトンの膜中で水に対して透析して副生成物を除去する（なお、３〜１６時間の５回の透析の間で、４回透析物液を交換する）。この生成物の溶液を凍結乾燥により蒸発乾燥させて標題の化合物を回収し、次にこれをアミノ基置換レベルに関して標準的なＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイにより分析する。生成物をさらに、Ｉｎ−１１／非放射性インジウム標準液を過剰量で加えたサンプルを正確に秤量したものを放射性標識し、標識混合物中の非結合インジウムに対するインジウム取り込み量を求めることにより、ＤＴＰＡキレート含量に関して分析する。
【００７７】
（ｂ）上記８ａ）で調製したＤＴＰＡ−ポリ−（ｌ−リジン）を、１：５の比のＹ−９０：利用可能なＤＴＰＡ残基を用い（これらはインジウム結合アッセイから求める）、Ｙ−９０で放射性標識する。標識は、０．２５Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．４）中、室温で１５分間行う。次にこの標識混合物を１当量の（非放射性）インジウムクロリドで処理し、室温でさらに１５分間放置する。Ｙ−９０（インジウム−ＤＴＰＡ）−ポリ−（ｌ−リジン）はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して過剰量のインジウムイオンを除去してもよいし、あるいはさらなる精製を行わずに用いてもよい。このＹ−９０−（インジウム−ＤＴＰＡ）−ポリ−（ｌ−リジン）はそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００７８】
例９：β放出放射性核種を用いたプレミックス二重特異性抗体媒介放射免疫治療による脳癌患者の治療
左半球に病巣部に限定された多形性膠芽腫を有すると最近診断された６４歳の男性患者に全体的切除(gross total resection)を施し、外科的に作出した切除腔にＲｉｃｋｈａｍリザーバーとカテーテルを留置した。２４時間後、ＭＲＩでカテーテルの場所を確認した。Ｒｉｃｋｈａｍカテーテルの開通性および作出した切除腔の完全性は、例１の二重特異性抗体に結合させた５ｍｇのＩｎ−１１１を注射し、注射して４、２４および４８時間後にγカメラ画像を得ることにより確認した。Ｉｎ−１１１画像を調べたところ、γエネルギーがリザーバー中に局在していることを示した。外科術４日後、例１の二重特異性抗体と例３のＹ−９０−ＩＭＰ  ２４１二価ハプテンの１：１モル混合物で、予め混合した放射免疫治療薬をニードルでリザーバー中に投与することにより処置した（Ｙ−９０は抗体タンパク質量１０ｍｇ中１２ｍＣｉの量で投与）。抗体注入後、リザーバーとカテーテルをフラッシュした。この患者はこの放射免疫治療手順を十分許容し、２日後に排泄し、治療後、ＭＲＩスキャンを行った。患者を２ヶ月おきにＭＲＩスキャンで評価し、４ヶ月まで追跡したところ、腫瘍重量に推定３５％の減少が見られた。患者の腫瘍は、さらなる治療を必要とせず、９ヶ月の追跡期間中約６０％退縮した。
【００７９】
例１０：β放出放射性核種を用いたプレターゲッティングミックス二重特異
３ｃｍの側頭膠芽腫を有する５８歳の女性に腫瘍全摘出の外科処置を施した。腫瘍塊の摘出後、例９のように、腫瘍腔に直接薬剤を導入することにより、患者を抗テネイシン×抗インジウム−ＤＴＰＡヒト化二重特異性抗体で処置した。２日間、２０ｍＣｉ用量の９９ｍ−Ｔｃを結合させた二重特異性抗体を局在させ、４および２４時間の時点でγカメラ画像により腫瘍病巣に局在していることを確認した後、翌日、上記例５のＲｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２もその切除腔に直接注射した。患者はこの手順を十分許容し、２日後に治療後ＭＲＩスキャンを行った後に排泄し、その後、２ヶ月おきにＭＲＩスキャンおよび他の種々の毒性試験を行った。治療後、有害な結果はなく、４ヶ月経つと、３ｃｍの腫瘍が直径１ｃｍをやや超えるまでに退縮した。
【００８０】
例１１：α放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による脳癌患者の治療
脳橋に脳幹まで拡がる手術不能の脳腫瘍を示す４８歳の男性（血液脳関門は損なわれている）を３０ｍｇのヒト化抗テネイシン×抗ＨＳＧ二重特異性抗体の静脈注射で処置した。この製剤は、２４時間後にγカメラ画像により脳腫瘍へのターゲッティングを確認するため、Ｉｎ−１１１標識を含んでいた。さらに２日間、腫瘍に二重特異性抗体を十分局在させ、身体からクリアリングさせた後、上記例７のＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１も１ｍＣｉの用量で静脈注射した。８週間後、血液学的な毒性の証拠がなければ患者の顆粒球（ＡＮＣ）および血小板が正常範囲内であるので、この手順を繰り返した。追跡調査３ヶ月の時点で、患者は運動機能およびその他の神経学的な徴候に改善が見られ、全般的に改善した。この時点での脳のＭＲＩは腫瘍重量に約３０％の減少を示し、患者の水頭症も改善した（水頭症に関しては６０ｍｇ／日でプレドニソンを投与した）。その後、ＭＲＩにより確認されるように、水頭症が改善するとともにプレドニソンを徐々に減らした。３ヶ月後、患者にテモゾロミド治療を施したところ、腫瘍の改善およびさらに２５％の退縮が得られた。４ヶ月後、患者の症状は最小となり、機能的に適度な改善を示した。
【００８１】
例１２：α放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による脳癌患者の治療
左頭頂葉に２〜３ｃｍの多形性膠芽腫（過去外科術が施されたことがあり、現在、血液脳関門は損なわれている）を有する５４歳の男性を、３０ｍｇのヒト化抗テネイシン×抗ＨＳＧ二重特異性抗体の静脈注射で処置した。２日間、二重特異性抗体を局在させた後、上記例７のＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１を１ｍＣｉの用量で外科術腔内に注射した。患者はこの処置から何ら悪影響を受けず、翌日、排泄した。４週間後と１２週間後に、脳腫瘍の程度を評価するためにＭＲＩスキャンを繰り返したところ、進行は見られなかった。さらに４週間後、ＭＲＩで、脳の病巣において約２５％の減少が見られた。さらに２週間後、患者に対してトモゾロミドによる化学療法を行うことに決め、これは十分許容された。３ヶ月後、ＭＲＩで、もとの腫瘍が基準試験から約６０％の改善を示したことが示され、患者は放射免疫治療後３０週の最終の追跡調査まで改善を続けた。
【００８２】
例１３：α放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による脳癌患者の治療
別の処置において、例１２の患者に、二重特異性抗体を外科術腔内に注射する代わりにくも膜下注射を施した。結果は腔内投与で得られたものと同様であった。
【００８３】
当業者には、本発明の組成物および方法には種々の変形や変更をなし得ることが明らかであろう。よって、本発明は、このような変形や変更が付属の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にある限り、それらを包含するものとする。
【００８４】
発行された特許、特許出願（公開または非公開）および刊行文献を含め、上記に挙げられた総ての参照文献の開示は、各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされる場合と同じ程度で、それらの全開示内容が引用することにより明確に本明細書の一部とされる。
【国際調査報告】
2005532343.tif 000006
2005532343.tif 000007
2005532343.tif 000008
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