(57)【要約】本発明は、新規なタンパク質（LBDG1およびLBDG4と称され、本明細書では核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインと同定された）、並びに疾患の診断、予防および治療における前記タンパク質およびコード遺伝子由来の核酸配列の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチド：
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、前記のフラグメントであるポリペプチド；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物であるポリペプチド。
【請求項２】
ＬＢＤＧ１ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含む、請求項１の（ｉｉ）に記載のフラグメントであるポリペプチドであって、前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が配列番号：２に記載のアミノ酸配列の残基822から1020を含むと定義され、前記フラグメントが“ＬＢＤモチーフ”残基LEU878、ASP885、GLN886、Leu889およびLEU890、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有する前記ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１の（ｉｉｉ）に記載の機能的等価物であり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と相同であり、触媒性残基ＬEU878、ASP885、GLN886、Leu889およびLEU890、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有するポリペプチド。
【請求項４】
以下のポリペプチド：
（ｉ）配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列から成るポリペプチド；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、そのフラグメントであるポリペプチド；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物であるポリペプチド。
【請求項５】
ＬＢＤＧ４ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含む、請求項４の（ｉｉ）に記載のフラグメントであるポリペプチドであって、前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が配列番号：４に記載のアミノ酸配列の残基805から1005を含むと定義され、前記フラグメントが“ＬＢＤモチーフ”残基ＩLE863、ASP870、GLN871およびLEU875、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有する前記ポリペプチド。
【請求項６】
請求項４の（ｉｉｉ）に記載の機能的等価物であり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と相同であり、触媒性残基ILE863、ASP870、GLN871およびLEU875、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有するポリペプチド。
【請求項７】
前記機能的等価物が、ＬＢＤＧ１ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と相同である請求項３または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって同定されたデフォルトパラメーター｛Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス；ギャップ開放ペナルティー＝１１およびギャップ伸長ペナルティー＝１｝を用いて決定したとき、配列番号：２もしくは配列番号：４に記載のアミノ酸配列、または核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するそのフラグメントと８０％を超える配列同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を越える配列同一性を有する、請求項１−７のいずれか1項に記載のフラグメントまたは機能的等価物。
【請求項９】
配列番号：２もしくは配列番号：４のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するそのフラグメントと顕著な構造相同性を示す請求項１−８のいずれか1項に記載の機能的等価物。
【請求項１０】
配列番号：２または配列番号：４の配列に由来する７つもしくはそれより多い（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれより多い）アミノ酸残基からなる、請求項１の（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する請求項１、２、４または５に記載のフラグメント。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子。
【請求項１２】
配列番号：１もしくは配列番号：３に記載の核酸配列を有するか、または重複等価物もしくはそのフラグメントである請求項１１に記載の精製核酸分子。
【請求項１３】
配列番号：１のヌクレオチド2732から3328または配列番号：3のヌクレオチド2913から3515を含むか、またはその重複等価物である請求項11または請求項12に記載の精製核酸分子のフラグメント。
【請求項１４】
高いストリンジェンシー条件下で請求項１１−１３のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子。
【請求項１５】
請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドと特異的に結合し、さらに好ましくは前記ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を抑制するリガンド。
【請求項１８】
抗体である請求項１７に記載のリガンド。
【請求項１９】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現レベルまたは活性レベルを増加または低下させる化合物。
【請求項２０】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合し、前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれをも誘発することがない請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
天然または改変された基質、リガンド、酵素、レセプターまたは構造的もしくは機能的摸倣体である請求項１９または２０に記載の化合物。
【請求項２２】
疾患の治療または診断で使用することを目的とする請求項１−１０のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項１１−１４のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１７または１８に記載のリガンド、または請求項１９−２１のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項２３】
患者の疾患を診断する方法であって、前記患者の組織で請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを評価するか、または請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を評価し、さらに前記発現または活性レベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと異なるレベルが疾患を示唆する前記疾患の診断方法。
【請求項２４】
in vitroで実施される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１７または請求項１８に記載のリガンドをリガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させ；さらに（ｂ）前記複合体を検出する工程を含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）患者由来の組織サンプルを、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体を形成し得るストリンジェントな条件下で核酸プローブと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルと前記プローブを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；さらに
ｃ）前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含み、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることが疾患を示唆する、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）患者の組織由来の核酸サンプルを、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体を形成し得るストリンジェントな条件下で核酸プライマーと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルと前記プライマーを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；
ｃ）前記サンプル化された核酸を増幅する工程；および、
ｄ）患者サンプルおよびコントロールサンプルの両方の増幅された核酸レベルを検出する工程；
を含み、コントロールサンプル中の増幅核酸レベルと顕著に異なる増幅核酸レベルが患者サンプルで検出されることは疾患を示唆する、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む請求項２３または請求項２４に記載の方法：
ａ）疾患について検査しようとする患者から組織サンプルを得る工程；
ｂ）請求項１１−１４のいずれかの項に記載の核酸分子を前記組織サンプルから単離する工程；および、
ｃ）疾核酸分子中で患に関連する変異の存在を疾患の徴候として検出することによって患者を疾患について診断する工程。
【請求項２９】
核酸分子を増幅して増幅生成物を形成し、前記増幅生成物中で変異の有無を検出することをさらに含む請求項２８の方法。
【請求項３０】
核酸分子をストリンジェントな条件下で前記核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二本鎖分子を形成させ、前記ハイブリッド二本鎖分子は疾患に関連する変異に対応するいずれかの部分でハイブリダイズしない核酸プローブ鎖部分を有するハイブリッドであり、および、疾患関連変異の有無を表示するものとして前記プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の有無を検出することによって患者で変異の有無を検出する請求項２８または２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
疾患が以下から選択される請求項２３−３０のいずれか1項に記載の方法：
細胞増殖性疾患（新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵、頭部および頸部の腫瘍並びに他の固形腫瘍を含む）、骨髄増殖性疾患（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫を含む）、白血球減少症、血小板減少症、血管形成疾患、カポジ肉腫、自己免疫／炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬および気道の炎症、喘息および器官の移植拒絶を含む）、心脈管系疾患（高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流障害、心不整脈および虚血を含む）、神経学的疾患（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、不安、抑うつおよび痛みを含む）、発達障害、代謝性障害（真性糖尿病、骨粗しょう症、脂質代謝障害、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症および肥満を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（アクネ、湿疹および創傷治癒を含む）、加齢の負の作用、エイズ、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染および寄生虫感染を含む）、並びに他の病的状態（特に核内ホルモンレセプターが関与するもの）。
【請求項３２】
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３３】
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するタンパク質の発現を目的とする請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項３４】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを利用する細胞−細胞接着を行わせる方法。
【請求項３５】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１７または１８に記載のリガンド、または請求項１９−２１のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むワクチン組成物。
【請求項３７】
以下の疾患の治療用医薬の製造で使用される請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１７または１８に記載のリガンド、請求項１９−２１のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３５記載の医薬組成物：
細胞増殖性疾患（新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵、頭部および頸部の腫瘍並びに他の固形腫瘍を含む）、骨髄増殖性疾患（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫を含む）、白血球減少症、血小板減少症、血管形成疾患、カポジ肉腫、自己免疫／炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬および気道の炎症、喘息および器官の移植拒絶を含む）、心脈管系疾患（高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流障害、心不整脈および虚血を含む）、神経学的疾患（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、不安、抑うつおよび痛みを含む）、発達障害、代謝性障害（真性糖尿病、骨粗しょう症、脂質代謝障害、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症および肥満を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（アクネ、湿疹および創傷治癒を含む）、加齢の負の作用、エイズ、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染および寄生虫感染を含む）、並びに他の病的状態（特に核内ホルモンレセプターが関与するもの）。
【請求項３８】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１５に記載のベクター、請求項１７または１８に記載のリガンド、請求項１９−２１のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３５に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者において疾患を治療する方法。
【請求項３９】
天然の遺伝子の発現またはポリペプチドの活性が、健常な対象者における発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患に対して、前記対象者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物、または組成物がアゴニストである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
天然の遺伝子の発現またはポリペプチドの活性が、健常な対象者における発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患に対して、前記対象者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物または組成物がアンタゴニストである請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
患者の疾患の治療的処置をモニターする方法であって、一定期間にわたって請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現もしくは活性レベル、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子の発現レベルを前記患者由来の組織でモニターすることを含み、前記期間にわたってコントロールレベルに向かって前記発現または活性レベルが変化することが前記疾患の軽減の徴候である、前記患者の疾患の治療的処置をモニターする方法。
【請求項４２】
疾患の治療および／または診断で有効な化合物の同定方法であって、前記方法が、請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１６に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドまたは核酸に対する結合親和性を保有すると思われる１つまたは２つ以上の化合物と接触させ、さらに前記核酸分子またはポリペプチドと特異的に結合する化合物を選択することを含む前記有効な化合物の同定方法。
【請求項４３】
ストリンジェントな条件下で請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；前記核酸分子の増幅に有用なプライマーを含む第二の容器；および疾患の診断を容易にすることを目的とする前記プローブおよびプライマーの使用のための指示書を含む疾患の診断に有用なキット。
【請求項４４】
ハイブリダイズしていないＲＮＡを消化するための薬剤を保持する第三の容器をさらに含む請求項４３のキット。
【請求項４５】
核酸分子のアレイを含むキットであって、前記核酸分子の少なくとも一つが請求項１１−１４のいずれか１項に記載の核酸分子である前記キット。
【請求項４６】
請求項１−１０のいずれかの項に記載のポリペプチドと結合する１つまたは２つ以上の抗体；および前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むキット。
【請求項４７】
請求項１−１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをより高レベルまたはより低レベルで発現するように、または前記ポリペプチドを発現しないように形質転換したトランスジェニックまたはノックアウト非ヒト動物。
【請求項４８】
請求項４７に記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させ、さらに前記動物の疾患に対する前記化合物の影響を決定することによって、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本明細書において核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインとして同定された、O75385およびBAA31598.1と称される、新規なタンパク質並びに疾患の診断、予防および治療における前記タンパク質およびそのコード遺伝子に由来する核酸配列の使用に関する。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、引用により完全に本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
（背景技術）
薬剤の発見プロセスにおいて、機能ゲノム学（functional genomics）の時代の到来につれて根幹的な革命が現在進行している。“機能ゲノム学”という用語は、対象のタンパク質配列に機能を帰属させるためにバイオインフォマティクスツールを利用するアプローチに適用される。そのようなツールは、配列データの生成速度が、これらタンパク質配列に機能を割り当てる研究室の能力をはるかに越えるために、ますます必要性を増している。
バイオインフォマティクスツールの潜在能力および精度が高まっているために、前記ツールは通常の生化学的特徴付け技術と急速に置き換えられつつある。実際、本発明の同定に用いた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や、高い信頼性をもつ結果を産出する能力を有する。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の研究機関および企業の組織がそれらを調査し、重要な発見が絶え間なく達成され続けている。しかしながら、研究および薬剤の発見のための標的として更に新たな遺伝子およびそれらがコードするポリペプチドを同定し特徴付ける必要性は引き続き存在している。
最近、未知の機能をもつ配列を評価するための注目すべきツールが本発明の出願人によって開発された。このツールは、同時係属国際特許出願第PCT/GB01/01105号の主題であるデータベースシステム（バイオペンジウム（Biopendium）検索データベースと称される）である。このデータベースシステムは、独占的技術を用いて作製され、利用可能な全てのタンパク質または核酸配列の完全な比較から作製された情報を含む集積データリソースから成る。
【０００３】
別個のデータリソースからこれら配列データを一体化させたその背後の目的は、可能なかぎり多くのデータを、配列それ自体と各配列に関連する情報の両方に関して１つの完全なリソースにまとめることである。各配列と関係を有する全ての利用可能なデータ（入手可能な場合はコードするタンパク質の三次元構造に関するデータを含む）を一緒に統合し、各配列について知られている情報の最大限の利用を可能にし、したがって最も多くの知見を含む予測がこれら配列の比較から入手することができる。前記データベースで作製され、各配列のエントリーに付随する注釈は、生物学的に関連がある事柄を前記配列情報に付与する。
このデータリソースは、配列のみをベースにしてタンパク質の正確な機能を予測することを可能にした。通常の技術を用いた場合、このような予測は、同じ機能ファミリーに属する他のタンパク質に対して高度な配列同一性（約２０％−３０％の同一性）を示すタンパク質についてのみ可能である。既知の機能を有する他の近縁なタンパク質と低度な配列相同性を示すタンパク質に対しては、正確な予測が不可能である。
本件では、その配列が公的に利用可能なデータベースにO75385として記録されているタンパク質（NCBI GenBankヌクレオチドアクセッション番号ＡＦ０４５４５８および GenBankタンパク質アクセッション番号O75385）が、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインファミリーの新規なメンバーとして意味付けられる。
【０００４】
Ｉ．核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインに関する導入部
核内ホルモンレセプター遺伝子スーパーファミリー（表１参照）は、標的遺伝子の転写を調節する構造的に関連するタンパク質をコードする。前記タンパク質には、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン、ビタミン並びにリガンドが未だ発見されていない他のタンパク質に対するレセプターが含まれる。核内レセプターは２つの主要なドメイン、DNA結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から構成されている。ＤＢＤは、前記レセプターがモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして特異的なDNA配列と結合するように指令する。ＤＢＤは、核内レセプターでのみ見出される特殊なタイプのジンクフィンガーである。ＤＢＤを有する核内レセプターは、ＰＲＯＳＩＴＥコンセンサス配列（ＰＳ０００３１）とのマッチングについて検索することによって容易に配列レベルで同定することができる。
リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は同系のホルモンと結合しこれに応答する。ＬＢＤと結合したリガンドは、すでに結合していた“核内レセプターコリプレッサー”を排斥する構造的変化をひき起こす。続いて前記コリプレッサーによって以前に占有されていた部位は空席になり、“核内レセプターコアクチベーター”で補充される。このリガンドによってひき起こされるコアクチベーターによるコリプレッサーの交換が、リガンド結合が標的遺伝子の転写活性化をもたらすメカニズムである。全てのリガンド結合ドメインはコンセンサス配列、“ＬＢＤモチーフ”（表２参照）を含み、前記モチーフは、コリプレッサー結合およびコアクチベーター結合を仲介する。ＬＢＤは、今日まで全ての核内ホルモンレセプター標的薬剤のための結合部位であり、したがって新規なリガンド結合ドメインは魅力的な薬剤標的であるので、それらの同定が所望される。リガンド結合ドメインは低い配列同一性（約１５％）しか共有しないが、非常に類似する構造を有し、したがって、ゲノムスレッダー(Genome Threader)のような構造に基づく関係付けツール(structure−based relationship tool)のための理想的なターゲットである。
ＰＲＯＳＩＴＥのような基本的な検索ツールを用いて、ＤＢＤが存在することによって、さらにそれをもとに推測されたＬＢＤによって、多くのタンパク質配列が核内ホルモンレセプターとしてパブリックドメインですでに注釈付けされている。このために、ゲノムスレッダーによって同定される、核内レセプターとして注釈されてないどの新規ＬＢＤも完全にＤＢＤを欠くであろうということが予期される。ＬＢＤを有するがＤＢＤを欠くタンパク質の先例は、ＤＡＸ１によって提供される。したがって、我々は、これらＤＢＤのないヒットを“核内ホルモンレセプター”ではなく“核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン”を含むものと注釈付けする。
【０００５】
【表１】
2005500012.tif 000002
【０００６】
下表２：“ＬＢＤモチーフ”。最上段の数字はモチーフ内の残基の位置を示す。文字は１文字コードによるアミノ酸を示す。１つの縦の欄内の文字は全てモチーフ内のその位置について許容される。例えば、Ｌ、Ｉ、Ａ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＹまたはＷは“ＬＢＤモチーフ”の最初の位置を占めることができる。位置４と８の間、および位置９と１２の間で見出される残基の数には変動が観察されることを述べる。“ＬＢＤモチーフ”は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの681の配列を整列化し、残基の保存パターンを同定することによって構築された。
【０００７】
【表２】
2005500012.tif 000003
【０００８】
ＩＩ．核内ホルモンレセプターおよび疾患
核内ホルモンレセプターは、多様な生理学的機能において役割を果たすことが示されている。それらの多くは疾患プロセスにおいて役割を果たし得る（表３参照）
【０００９】
表３：核内ホルモンレセプターと疾患
【表３】
2005500012.tif 000004
【００１０】
したがって、核内ホルモンレセプターのLBDと結合するリガンドによる核内ホルモンレセプターの変化は、疾患の表現型を変化させる手段を提供する。したがって、新規核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインの同定は、それらタンパク質が上記で同定した疾患や他の症状において役割を果たし得るために強く希求される。したがって新規核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインの同定は、疾患（特に表３で同定したような疾患）の治療および診断と密接な関連を有する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、O75385タンパク質およびBAA31598.1タンパク質が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとして機能するという発見を基にしている。
O75385タンパク質の場合、前記タンパク質配列の残基822−1020を含む領域は、ヒトエストロゲンレセプターα（ＰＤＢコード１ＥＲＲ：Ａ）の残基１(ALA307)から残基201(MET517)と等価なフォールドを採用することが見出された。ヒトエストロゲンレセプターαは、核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインとして機能することが知られている。さらにヒトエストロゲンレセプターαの“ＬＢＤモチーフ”残基、PHE367、ASP374、GLN375、LEU378およびLEU379は、O75385ではそれぞれLEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890として保存されている。前記の関係は単にヒトエストロゲンレセプターαとの関係ではなく、むしろ全体として核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインファミリー全体との関係である。したがって、ヒトエストロゲンレセプターα（１ＥＲＲ：Ａ）とO75385とのゲノムスレッダー（Genome Threader）（商標）アラインメントの参照によって、O75385のLEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890は“ＬＢＤモチーフ”残基を形成すると予測される。
等価なフォールドおよび“ＬＢＤモチーフ”残基保存が組み合わされて、O75385の前記領域の機能的注釈付けを可能とし、したがってこの領域を含むタンパク質が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を有するという機能的注釈付けを可能とする。
【００１２】
本発明の第一の特徴の態様ではポリペプチドが提供され、前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、配列番号：２のフラグメントである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物である。
好ましくは、前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列から成る；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するそのフラグメントである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物である。
配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドは、以下では“LBDG1ポリペプチド”と称する。
本発明の前記特徴にしたがえば、上記（ｉｉ）に記載の好ましいポリペプチドフラグメントは、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を担うと予測される、LBDG1ポリペプチドの領域（以下では“LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域”と称する）を含むか、またはその変種であって“ＬＢＤモチーフ”（LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890、または等価な残基）を保有する。本明細書で明確にされるように、LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG1ポリペプチド配列の残基822と残基1020の間に広がっていると考えられる。
本発明の前記特徴はまた、ポリペプチドのフラグメントおよび上記で定義したこれらポリペプチドフラグメントの変種を取り込んだ融合タンパク質も含むが、ただし前記融合タンパク質は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保有することを条件とする。
【００１３】
O75385（LBDG1）のホモサピエンスパラログもまた同定され、本明細書ではLBDG4と称される。このポリペプチドはアクセッションコードBAA31598.1を有する。BAA31598.1は、O75385（LBDG1）と５１％の配列同一性を示し、さらにO75385のリガンド結合ドメインフォールドにおいて主要な役割を果たすと予測される残基がBAA31598.1（LBDG4、図２２参照）で保存されている。O75385（LBDG1）に対する高い相同性および予測される主要な残基の保存に基づいて、BAA31598.1（LBDG4）もまた核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けされる。
等価なフォールドおよび“ＬＢＤモチーフ”残基保存の組み合わせにより、BAA31598.1の前記領域の注釈付けを可能にし、したがって前記領域を含むタンパク質が核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメイン活性を有するという機能的注釈付けを可能にする。
【００１４】
したがって、本発明の第一の特徴による第二の態様では、ポリペプチドが提供され、そのポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するそのフラグメントである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物である。
好ましくは前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列から成る；
（ｉｉ）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するそのフラグメントである；または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）の機能的等価物である。
配列番号：４に記載の配列を有するポリペプチドは以下では“LBDG4ポリペプチド”と称する。
本発明の前記特徴にしたがえば、上記（ｉｉ）に記載の好ましいポリペプチドフラグメントは、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性に必要なものと予測される、LBDG4ポリペプチドの領域（以下では“LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域”）を含むか、またはその変種であって“ＬＢＤモチーフ”（ILE863、ASP870、GLN871およびLEU875、または等価な残基）を保有する。本明細書で明確にされるように、LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG4ポリペプチド配列の残基805と残基1005の間に広がっていると考えられる。
本発明の前記特徴はまた、ポリペプチドのフラグメントおよび上記で定義したこれらポリペプチドフラグメントの変種を取り込んだ融合タンパク質を含むが、ただし前記融合タンパク質は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保有することを条件とする。
【００１５】
第二の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。好ましくは前記精製核酸分子は、配列番号：１（LBDG1ポリペプチドをコードする）または配列番号：３（LBDG4ポリペプチドをコードする）に記載の核酸配列を有するか、または前記配列の重複等価物またはフラグメントである。好ましい核酸フラグメントは、上記（ｉｉ）に記載のポリペプチドフラグメント、好ましくはLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むポリペプチドフラグメントをコードするものであるか、上記に定義したこれらフラグメントの変種をコードするものである。
第三の特徴では、本発明は、本発明の第二の特徴の核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする精製核酸分子を提供する。
第四の特徴では、本発明は、発現ベクターのように本発明の第二または第三の特徴の核酸分子を含むベクターを提供する。
第五の特徴では、本発明は、本発明の第四の特徴のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第六の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドと特異的に結合し、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を阻害するリガンドを提供する。
第七の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるか、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
本発明の第七の特徴の化合物は、前記ポリペプチドの遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを増加（作働）させるか、または低下（拮抗）させる。重要なことには、それぞれLBDG1またはLBDG4ポリペプチドのLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域として本明細書で明確にされる領域の機能を同定することによって、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインが関与する疾患の治療および／または診断に有効な化合物を同定することが可能なスクリーニング方法をデザインすることができる。
【００１６】
第八の特徴では、本発明は、診断または治療で使用するための本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第五の特徴のリガンド、または本発明の第六の特徴の化合物を提供する。前記分子はまた以下を含む疾患の治療を目的とする医薬品の製造においても用いることができる：細胞増殖性疾患（新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵、頭部および頸部の腫瘍並びに他の固形腫瘍を含む）、骨髄増殖性疾患（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管形成疾患、カポジ肉腫）、自己免疫／炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬および気道の炎症、喘息および器官の移植拒絶を含む）、心脈管系疾患（高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流障害、心不整脈および虚血を含む）、神経学的疾患（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、不安、抑うつおよび痛みを含む）、発達障害、代謝性障害（真性糖尿病、骨粗しょう症、脂質代謝障害、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症および肥満を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（アクネ、湿疹および創傷治癒を含む）、加齢の負の作用、エイズ、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染および寄生虫感染を含む）、並びに他の病的状態（特に核内ホルモンレセプターが関与するもの）。
【００１７】
第九番目の特徴では、本発明は患者で疾患を診断する以下の工程を含む方法を提供する：本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベル、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性レベルを前記患者由来の組織で評価し、さらに前記発現または活性レベルをコントロールレベルと比較する工程であって、この場合前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆する。前記の方法は好ましくはin vitroで実施されるであろう。同様な方法は患者での疾患治療のモニタリングに使用することができる。この場合、時間の経過にしたがってポリペプチドまたは核酸分子の発現もしくは活性レベルがコントロールレベルに向かって変化するのは疾患の緩解の指標となる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドを検出する好ましい方法は以下の工程を含む：（ａ）本発明の第六の特徴のリガンド（例えば抗体）を生物学的サンプルとリガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；および、（ｂ）前記複合体を検出する工程。
本発明の第九番目の特徴に記載の方法には、例えば短いプローブによる核酸ハイブリダイゼーション法、点変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、および異常なタンパク質レベルを検出する抗体を用いる方法といった種々の異なる方法が存在することは、当業者には明らかであろう。同様な方法を短期または長期ベースで用いて、モニターされる疾患の治療を可能にすることができる。本発明はまた前記疾患診断方法で有用なキットも提供する。
【００１８】
第十番目の特徴では、本発明は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての本発明の第一の特徴のポリペプチドの使用を提供する。本発明はまた、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性をもつタンパク質の発現のために本発明の第二または第三の特徴に記載の核酸分子の使用を提供する。本発明はまた核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を作用させる方法を提供し、前記方法は本発明の第一の特徴のポリペプチドを利用する。
第十一番目の特徴では本発明は医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を医薬的に許容できる担体と組合わせて含有する。
第十二番目の特徴では、本発明は、疾患の診断または治療を目的とする医薬品の製造で使用するために、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二のもしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を提供する。前記診断または治療される疾患は、例えば、細胞増殖性疾患（新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵、頭部および頸部の腫瘍並びに他の固形腫瘍、骨髄増殖性疾患（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管形成疾患、カポジ肉腫）、自己免疫／炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬および気道の炎症、喘息および器官の移植拒絶を含む）、心脈管系疾患（高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流障害、心不整脈および虚血を含む）、神経学的疾患（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、不安、抑うつおよび痛みを含む）、発達障害、代謝性障害（真性糖尿病、骨粗しょう症、脂質代謝障害、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症および肥満を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（アクネ、湿疹および創傷治癒を含む）、加齢の負の作用、エイズ、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染および寄生虫感染を含む）、並びに他の病的状態（特に核内ホルモンレセプターが関与するもの）である。
【００１９】
第十三番目の特徴では、本発明は患者の疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を患者に投与することを含む。
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患の場合、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物はアゴニストであろう。逆に、前記天然の遺伝子の発現、または前記ポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患の場合、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物はアンタゴニストであろう。前記アンタゴニストの例にはアンチセンス核酸分子、リボザイムおよびリガンド（例えば抗体）が含まれる。
第十四番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドを高レベルで、または低レベルで発現させるために、または全く発現させないために形質転換したトランスジェニックまたは遺伝子ノックアウト非ヒト動物を提供する。前記トランスジェニック動物は、疾患の研究用モデルとして非常に有用であり、さらに前記疾患の治療または診断に有効な化合物の同定を目的とするスクリーニング方法で用いることができる。
【００２０】
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術および方法の要旨は下記で提供される。本発明は、記載した同定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に限定されないことは理解されよう。本明細書で用いられる専門用語は単に個々の態様を説明するためのものであり、前記用語によって本発明の範囲を限定しようとするものではないこともまた理解されよう。本発明の範囲は添付の請求の範囲の用語によってのみ限定される。
本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が用いられる。
本発明の実施では別に指示がなければ、分子生物学、微生物学、リコンビナントDNA技術および免疫学の通常の技術が用いられるであろう。前記技術は当業者の技術範囲内である。
前記のような技術は文献で完全に説明されている。特に適切な解説書の例には以下が含まれる：Sambrook Molecular Cloning； A Laboratory Manual, Second Edition (1989)； DNA Cloning, Vol. I and II ( D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.)特にVol. 154 & 155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London)；Scopes, (1987) Protein Purification： Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, NY)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I−IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986)。
【００２１】
本明細書において用いる“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合した２つまたは３つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質（すなわちペプチドイソスター）が含まれる。この用語は、短鎖（ペプチドおよびオリゴペプチド）および長鎖（タンパク質）の両方を指す。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質の形態を有するものでもよく、またプレ−、プロ−またはプレプロ−タンパク質であってプレ−、プロ−またはプレプロ−部分の切断によって活性化され、活性成熟ポリペプチドを生じるタンパク質でもよい。そのようなポリペプチドでは、プレ−、プロ−またはプレプロ−配列はリーダー配列もしくは分泌配列であっても、または成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列であってもよい。
本発明の第一の特徴のポリペプチドは融合タンパク質の一部分を形成することができる。例えば、１つまたは２つ以上の付加アミノ酸配列を含むことがしばしば有利である。前記付加アミノ酸配列は、例えばリコンビナント形成時に、分泌もしくはリーダー配列、プロ−配列、精製を促進する配列、またはより高いタンパク質安定性を付与する配列を含んでもよい。あるいは、または前記に加えて、前記成熟ポリペプチドを別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させるような化合物（例えばポリエチレングリコール）を融合させることができる。
【００２２】
ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によって、または当業者に周知の化学的改変技術によって改変された、２０の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドに一般的に存在する公知の改変にはグリコシル化、脂質付加、硫化、γ−カルボキシル化（例えばグルタミン酸残基の）、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化がある。他の可能な改変には、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ＧＰＩアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質へのトランスファーRNA媒介性アミノ酸付加（例えばアルギニル化）およびユビキチン結合が含まれる。
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチド内のいずれの場所に生じてもよい。実際、共有結合改変によるポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端またはその両端の妨害(blockage)は、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドにも存在し得る。
【００２３】
ポリペプチド内に生じる改変は多くの場合ポリペプチドが生成される方法の機能であろう。組換えによって生成されるポリペプチドの場合、大部分の改変の性質および程度は、個々の宿主細胞の改変能力および問題のポリペプチドのアミノ酸配列に存在する改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは異なる種類の宿主細胞間で変動するであろう。
本発明のポリペプチドは任意の適切な様式で調製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド（例えば細胞培養から精製）、組換えにより生成されたポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成により生成されたポリペプチド、または前記方法を併用して生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドと相同なポリペプチドであり得る。２つのポリペプチドは、前記ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列に対して充分な同一性または類似性を有する場合、本明細書で用いられる用語のように“相同である”と称される。“同一性”とは、整列化した配列のどの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”は、整列化した配列のいずれの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で類似の種類であることを示す。同一性および類似性の度合いは容易に計算できる（Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991）。
【００２４】
したがって、相同なポリペプチドには、LBDG1ポリペプチドまたはLBDG4ポリペプチドの天然の生物学的変種（例えば前記ポリペプチドが由来した種における対立形質変種または地理的変種）および変異体（例えばアミノ酸置換、挿入または欠失を含む変異体）が含まれる。前記変異体は、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されているポリペプチドを含んでもよく、さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされたものでもそうでなくてもよい。典型的な前記の置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間で；SerとThr間で；酸性残基AspとGlu間で；AsnとGln間で、塩基性残基LysとArg間で；または芳香族残基PheとTyr間で生じる。特に好ましいものは、いくつか（すなわち５から１０、１から５、１から３、１から２、または単に１つ）のアミノ酸が任意の組合せで置換されたまたは欠失または付加された変種である。特に好ましいものは、タンパク質の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。さらにこれに関して特に好ましいものは保存的置換である。
前記変異体にはまた、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドが含まれる。
【００２５】
典型的には、２つのポリペプチド間で８０％を越える同一性（好ましくは特定の領域で）が機能的等価物を示すと考えられる。好ましくは、本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、LBDG1ポリペプチドもしくはLBDG4ポリペプチドに関して、またはその活性なフラグメントに関して８０％を越える配列同一性を有する。より好ましいポリペプチドは、LBDG1もしくはLBDG4ポリペプチドまたはその活性なフラグメントに関してそれぞれ８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を越える同一性を有する。
本明細書で言及される同一性のパーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメーター｛Blosum62マトリックス；ギャップ開放(open)ペナルティー＝１１およびギャップ伸長(extension)ペナルティー＝１｝を用いて決定されるとおりである。
本件では、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの好ましい活性フラグメントは、LBDG1またはLBDG4の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むもの、および残基LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890、または等価な残基を有する“ＬＢＤモチーフ”を保有するものである。“等価な残基”とは、“ＬＢＤモチーフ”残基と等価である残基を意味するが、ただし核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持していることを条件とする。例えば、LEU878はILE、ALA、VAL、MET、PHE、TYRまたはTRPによって置換することができる。例えば、ASP885はGLUと置換することができる。例えば、GLN886は、ASN、LYS、HIS、ARG、SERまたはTHRと置換できる。例えば、LEU889は、ILE、ALA、VAL、MET、PHE、TYRまたはTRPと置換することができる。例えば、LEU890は、ILE、ALA、VAL、MET、PHE、TYRまたはTRPと置換することができる。LBDG4(活性な残基はILE863、ASP870、GLN871およびLEU875)についても、同様な態様で残基を置換することができる。したがって本発明のこの特徴は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関して８０％を越える同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を越える同一性をそれぞれ有するポリペプチド、および、LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890、または等価な残基（LBDG4ポリペプチドではILE863、ASP870、GLN871およびLEU875）をもつ“ＬＢＤモチーフ”を保有するものを含む。上記で考察したように、LBDG1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG1ポリペプチド配列の残基822と残基1020の間に広がっていると考えられ、一方、LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG4ポリペプチド配列の残基805と残基1005の間に広がっていると考えられる。
【００２６】
本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドはまた、１つまたは２つ以上の構造的アラインメント技術を用いて同定されたポリペプチドであろう。例えば、バイオペンジウム検索データベースを作製するために用いられた検索ツールの１つの特徴を形成するインファーマチカゲノムスレッダー（商標）（Inpharmatica Genome Treader）技術を用いて（同時係属国際特許出願PCT/GB01/01105を参照されたい）、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドと比較したとき、低い配列同一性を有するが、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列と顕著な構造的相同性を共有するがゆえに、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性をもつと予測される、現在は未知の機能を有するポリペプチドを同定することができる。
“顕著な構造的相同性”とは、インファーマチカゲノムスレッダー（商標）が、２つのタンパク質またはタンパク質領域が、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および前記を越える確実性で構造的相同性を共有することを予測することを意味する。前記インファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）の前記確実性の値は以下のように計算される。既知の構造を有する配列をもっぱら使用して、初めに一組の比較をインファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）を用いて行った。いくつかの比較は（構造を基準にして）関連することが判明しているタンパク質間で行った。続いてニューラルネットワークを、ＣＡＴＨ構造分類（www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath）から得られる既知の関係と既知の非関係とを最も良く識別することを必要とすることに基づいて調整(train)した。これによって０と１の間のニューラルネットワークスコアが得られた。しかしながら、一方で関連するタンパク質の数および無関係のタンパク質の数は既知であるので、前記ニューラルネットワークの結果を小群に分配し、正確な結果のパーセンテージを経験的に計算することが可能であった。このようにして、バイオペンジウム検索データベースにおける全ての真正の予測はニューラルネットワークスコアが付随しており、信頼百分率は、インファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）がいかに良好なトレーニング／テストセットであるかを反映したものである。
【００２７】
LBDG1の構造的相同体は、LBDG1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と構造的相同性を共有し、“ＬＢＤモチーフ” 残基LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890、または等価な残基を保有するはずである。そのような構造的相同体は、前記ポリペプチド配列と顕著な構造的相同性を共有し、さらに“ＬＢＤモチーフ”残基を保有するがゆえに、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を有すると予測される。
LBDG4の構造的相同体は、LBDG4の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と構造的相同性を共有し、“ＬＢＤモチーフ” 残基ＩLE863、ASP870、GLN871およびLEU875、または等価な残基を保有するはずである。そのような構造的相同体は、前記ポリペプチド配列と顕著な構造的相同性を共有し、さらに“ＬＢＤモチーフ”残基を保有するがゆえに、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を有すると予想される。
本発明の第一の特徴のポリペプチドにはまた、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのフラグメント、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのフラグメントの機能的等価物、およびLBDG1またはLBDG4ポリペプチドの機能的等価物のフラグメントが含まれるが、ただし前記機能的等価物およびフラグメントは核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保持するか、またはLBDG1またはLBDG4ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
【００２８】
本明細書において用いる、“フラグメント”という用語は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド、またはその機能的等価物のアミノ酸配列の一部分（全部ではなく）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。フラグメントは、前記配列に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきである。さらに、個々の配列に応じて、ｎは７またはそれより大きい（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０またはそれより大きい）。小さなフラグメントは抗原決定基を構成することができる。
本発明のこの特徴の好ましいポリペプチドフラグメントは、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのそれぞれLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と本明細書で明確にされる領域を含むフラグメントである。これらの領域は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインと注釈付けされた領域である。
LBDG1ポリペプチドの場合、前記領域は残基822と残基1020の間に広がっていると考えられる。LBDG4ポリペプチドの場合、この領域は残基805と残基1005の間に広がっていると考えられる。
前記フラグメントの変種は、本発明のこの特徴の態様として含まれるが、ただしこれら変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保有することを条件とする。
ある観点では、“変種”という用語は前記ポリペプチドフラグメントの伸長型または短縮型を含むことが意図される。
【００２９】
伸長型変種の場合、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列内のこれら境界のＣ末端および／またはＮ末端にさらに付加された残基が前記ポリペプチドフラグメントに含まれるとき、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が正確に折り畳まれ、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を示すであろうということは想像に難くない。例えば、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列、または相同な配列に由来する５、１０、２０、３０、４０または５０またはそれより多い付加アミノ酸残基は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域の境界のＣ末端および／またはＮ末端のいずれか一方または両方に含まれ、前記ポリペプチドフラグメントは、正確に折り畳まれる能力を損なうことなく核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を示し得る。
LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの短縮型変種の場合、１つまたは２つ以上のアミノ酸残基をLBDG1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域のＣ末端またはＮ末端の一方または両方で欠失させることができるが、ただし“ＬＢＤモチーフ”残基（LBDG1の場合、LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890；LBDG4の場合、前記残基はILE863、ASP870、GLN871およびLEU875）または等価な残基は無傷のままで維持され、欠失は、前記残基のいずれかが欠失するほど前記ポリペプチド配列内に深く伸長することはない。
【００３０】
第二の観点では、“変種”という用語は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と顕著な配列相同性を保有し、かつ“ＬＢＤモチーフ”残基（LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890；LBDG4の場合、前記残基はILE863、ASP870、GLN871およびLEU875）または等価な残基を保有する上記で述べたポリペプチドフラグメントの相同体を含むが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。
相同体には、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのうち、それぞれLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と８０％を越える同一性を保有するポリペプチド分子が含まれる。同一性パーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されるデフォルトパラメーター｛Blosum62マトリックス；ギャップ開放ペナルティー＝１１およびギャップ伸長ペナルティー＝１｝を用いて決定されるとおりである。好ましくは、本発明のこの特徴のポリペプチドフラグメントの変種相同体は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関してそれぞれ８０％を越える同一性を有する。より好ましくは、変種ポリペプチドは、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドのLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関してそれぞれ８５％、９０％、９５％、９８％または９９％を越える同一性をそれぞれ有するが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。変種ポリペプチドはまた、上記で考察したポリペプチドフラグメントの短縮型相同体も含むが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。
【００３１】
本発明の第一の特徴のポリペプチドフラグメントは、例えばインファーマチカゲノムスレッダー（商標）によって同定される、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列のLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって規定されるポリペプチドフラグメントの構造と顕著な構造的相同性を示すポリペプチドフラグメントであり得る。したがって、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列のLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって規定されるポリペプチドフラグメントの構造的相同体であるポリペプチドフラグメントは、上記で定義されたフォールドのような、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドフラグメントによって採用されるフォールドと同じフォールドを採用するはずである。
LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって規定されるポリペプチドフラグメントの構造的相同体はまた、“ＬＢＤモチーフ” 残基LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890、または等価な残基も保持するはずである。LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって規定されるポリペプチドフラグメントの構造的相同体もまた、“ＬＢＤモチーフ” 残基ILE863、ASP870、GLN871およびLEU875、または等価な残基を保持するはずである。
【００３２】
そのようなフラグメントは、“独立的存在(free−standing)”すなわち、他のアミノ酸もしくはポリペプチドの部分でなくてもよく、他のアミノ酸もしくはポリペプチドに融合されていなくてもよく、それらフラグメントがその部分または領域を構成するより大きなポリペプチドの内部に含まれていてもよい。より大きなポリペプチドの内部に含まれている場合は、本発明のフラグメントは最も好ましくは連続するただ１つの領域を形成する。例えばある種の好ましい態様は、前記フラグメントのアミノ末端に融合したプレ−および／またはプロ−ポリペプチド領域、および／または前記フラグメントのカルボキシ末端に融合した付加的領域を有するフラグメントに関する。しかしながら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペプチドの内部に含まれてもよい。
本発明のポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント（少なくとも１つの抗原決定基を含む）を用いて、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体といった、前記ポリペプチドに免疫特異的なリガンドを作製することができる。そのような抗体は、本発明のポリペプチドを発現しているクローンを単離することもしくは同定すること、またはアフィニティークロマトグラフィーによって前記ポリペプチドを精製することに用いることができる。前記抗体はまた、当業者には明らかなように他の利用の中で特に診断的または治療的補助としても用いられ得る。
【００３３】
“免疫特異的”という用語は、前記抗体が、従来技術において他の関連ポリペプチドに対する親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に強い親和性を有することを意味する。本明細書で用いる“抗体”という用語は、完全な分子だけでなく問題の抗原決定基と結合することができるそのフラグメント、例えばFab、F(ab’)2およびFvも意味する。したがって、そのような抗体は本発明の第一の特徴のポリペプチドと結合する。
ポリクローナル抗体が所望される場合は、選択される哺乳類（例えばマウス、ウサギ、ヤギまたはウマ）は、本発明の第一の特徴のポリペプチドで免疫することができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドは、リコンビナントDNA技術によって誘導するか、または化学的に合成することができる。所望する場合には、前記ポリペプチドは担体タンパク質と結合させることができる。前記ポリペプチドと化学的に結合させることができる一般的に用いられる担体には、ウシ血清アルブミン、サイログロブリンおよびキーホールリンペットヘモシアニンが含まれる。続いて前記担体結合ポリペプチドを用いて動物を免疫することができる。血清は免疫した動物から採集され、既知の方法（例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー）にしたがって処理される。
【００３４】
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も、当業者は容易に生成できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は周知である（例えば以下を参照されたい：G. Kohler & C. Milstein, Nature 256：495−497(1975)； Kozbor et al., Immunology Today 4：72(1983)； Cole et al., 77−96 “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. (1985)）。
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体のパネル(panel)を種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、それらを作らせた個々のポリペプチドの精製に特に有用である。あるいは、対象のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、例えば当技術分野で知られるＰＣＲ技術によってハイブリドーマから単離し、さらにクローニングし適切なベクターで発現させることができる。
非ヒト可変領域がヒト定常領域と結合または融合されているキメラ抗体（例えば以下を参照されたい：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84：3439(1987)）もまた有用であろう。
【００３５】
抗体は、例えばヒト化によって改変して各個体での免疫原性を減少させることができる（例えば以下を参照されたい：Jones et al., Nature,321：522(1986)； Verhoeyen et al., Science, 239：1534(1988)； Kabat et al., J. Immunol., 147：1709(1991)； Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：10029(1989)； Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：34181(1991)； Hodgson et al., Bio/Technology 9：421(1991)）。本明細書で用いられる“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン中のＣＤＲアミノ酸および選択した他のアミノ酸がヒト抗体の等価なアミノ酸に代えて置換されている抗体分子を指す。したがって、ヒト化抗体はヒトの抗体と密接に類似するがドナー抗体の結合能力を有する。
また別の選択肢では、前記抗体は、２つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインは異なるエピトープに向けられている“二重特異性”抗体であってもよい。
ファージディスプレー技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する結合活性をもつ抗体をコードする遺伝子を、関連抗体の保有についてスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅Ｖ−遺伝子のレパートリー、または未感作ライブラリーのいずれかから選択することができる（J. McCafferty et al., (1990) Nature 348：552−554； J. Marks et al., (1992) Biotechnology 10：779−783）。前記抗体の親和性は、鎖のシャッフリングによって改善することもできる（T. Clackson et al., (1991) Nature 352：624−628）。
上記の技術によって作製された抗体は（ポリクローナルであれモノクローナルであれ）、免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＺＡ）で試薬として用いることができるというさらに別の有用性を有する。前記の利用では、これら抗体は分析的に検出可能な試薬（例えば放射性同位元素、蛍光分子または酵素）で標識することができる。
【００３６】
本発明の第二および第三の特徴の好ましい核酸分子は、配列番号：２または配列番号：４に記載のポリペプチド配列および機能的に等価なポリペプチドをコードするものである。前記機能的に等価なポリペプチドには、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの活性なフラグメント、例えばLBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列のLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメントフラグメント、またはその相同体が含まれる。
これら配列の一続きを包含する核酸分子は本発明のこの特徴の好ましい態様を形成する。
これらの核酸分子は、本明細書に記載する方法および応用で用いることができる。好ましくは本発明の核酸分子は、本明細書に開示する配列に由来する少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含む。ｎは、個々の配列に応じて１０またはそれより大きい（例えば１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０またはそれより大きい）。
本発明の核酸分子は、上記で述べた核酸分子に相補的な配列も含む（例えばアンチセンスまたはプローブとしての目的のために）。
本発明の核酸分子は、RNA（例えばmRNA）、またはDNA（例えばcDNA、合成DNAまたはゲノムDNAを含む）の形態をとることができる。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学合成によって、またはそれらを併用して得ることができる。前記核酸分子は、固相ホスホルアミダイト化学合成のような技術を用いるゲノムまたはcDNAライブラリーからの化学合成によって、または生物体から分離することによって調製することができる。RNA分子は一般的にはDNA配列のin vitroまたはin vivo転写によって作製することができる。
【００３７】
核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAはコード鎖（センス鎖としても知られる）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）でもよい。
“核酸分子”という用語には、DNAおよびRNAのアナログ（例えば改変骨格を含むもの）、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）も含まれる。本明細書で用いられる“ＰＮＡ”という用語はアンチセンス分子または抗遺伝子(anti−gene)作用因子を指し、長さが少なくとも５ヌクレオチドであってアミノ酸残基のペプチド骨格と結合したオリゴヌクレオチドを含む。前記ペプチド骨格は好ましくはリジンで終わり、前記末端リジンは当該組成物に可溶性を付与する。ＰＮＡはＰＥＧ化（pegylated）されて細胞内での寿命が延長されてもよい｛細胞内では、ＰＮＡは優先的に相補性一本鎖DNAおよびRNAと結合して転写物伸長を停止させる（P.E. Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8：53−63）｝。
配列番号：２のポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸分子は、配列番号：１に示した核酸分子のコード配列と同一でもよい。これらの分子は、遺伝コードの縮退の結果として、配列番号：２のポリペプチドまたはLBDG1ポリペプチドの活性フラグメント（例えばLBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント）、またはその相同体をコードする多様な配列を有することもできる。LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG1ポリペプチド配列の残基822と残基1020の間に広がっていると考えられる。したがって配列番号：１では、LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、ヌクレオチド2732から3328を含む核酸分子によってコードされる。前記配列の一続きを包含する核酸分子、および前記配列の相同体は、本発明のこの特徴の好ましい態様を形成する。
【００３８】
配列番号：４またはその活性フラグメントをコードする核酸分子は、配列番号：３に示した核酸分子のコード配列と同一であろう。これらの分子はまた、遺伝コードの縮退の結果として、配列番号：４またはLBDG4ポリペプチドの活性フラグメント（例えばLBDG4の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント）、またはその相同体をコードする多様な配列を有することができる。LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDG4ポリペプチド配列の残基805と残基1005の間に広がっていると考えられる。配列番号：３では、LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、したがってヌクレオチド2913から3515を含む核酸分子によってコードされる。前記配列の一続きを包含する核酸分子、および前記配列の相同体は、本発明のこの特徴の好ましい態様を形成する。
配列番号：２または配列番号：４のポリペプチドをコードする前記核酸分子には、それ自体で成熟なポリペプチドのコード配列；成熟ポリペプチドおよび付加コード配列（例えばリーダー配列または分泌配列、例えばプロ−、プリ−またはプレプロ−ポリペプチド配列をコードするもの）のためのコード配列；前述の付加的コード配列を伴なう、または伴なわないが、さらに付加的な非コード配列（非コード5’および3’配列を含む）を伴なう成熟ポリペプチドのコード配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記の非コード5’および3’配列は、例えば転写される非翻訳配列で、転写（終止シグナルを含む）、リボソーム結合およびmRNA安定性で役割を果たすものである。前記核酸分子は、更なる官能性を提供するアミノ酸のような付加アミノ酸をコードする付加配列を含むこともできる。
【００３９】
本発明の第二および第三の特徴の核酸分子は、本発明の第一の特徴のポリペプチドのフラグメントまたは機能的等価物およびそのフラグメントもコードし得る。
上記で考察したように、LBDG1ポリペプチドの好ましいフラグメントは、LBDG1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント、またはその相同体である。前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、配列番号：１のヌクレオチド2732から3328を含む核酸分子によってコードされる。
LBDG4ポリペプチドの好ましいフラグメントは、LBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント、またはその相同体である。前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、配列番号：３のヌクレオチド2913から3515を含む核酸分子によってコードされる。
本発明の機能的に等価な核酸分子は、天然に存在する変種（例えば天然に存在する対立形質変種）であっても、または前記分子は天然に存在することが知られていない変種であってもよい。前記のような天然に存在しない核酸分子の変種は、突然変異誘発技術（核酸分子、細胞または生物に対して適用される技術が含まれる）によって達成できる。
このような変種の中では、特にヌクレオチドの置換、欠失または挿入によって前述の核酸分子と異なる変種が挙げられる。置換、欠失または挿入は１つまたは２つ以上のヌクレオチドを含むことができる。変種はコード領域または非コード領域またはその両方が変化していてもよい。コード領域における変化は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入をもたらし得る。
【００４０】
本発明の核酸分子はまた、多様な理由で、遺伝子生成物（ポリペプチド）のクローニング、プロセッシングおよび／または発現の改変を含む当技術分野で一般的に知られている方法を用いて操作され得る。ランダムフラグメント化によるDNAシャッフリングおよび遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲリアッセンブリーは、ヌクレオチド配列の操作に用いられ得る技術に含まれる。位置特異的突然変異誘発を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライシング変種の生成、変異の導入など、その他を行うことができる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする核酸分子は異種配列に連結され、それによって結合核酸分子が融合タンパク質をコードすることができるようにしてもよい。前記のような結合核酸分子は本発明の第二または第三の特徴に包含される。例えば、本発明のポリペプチドの阻害物質のためのペプチドライブラリーをスクリーニングするために、前記のような結合核酸分子を用いて、市販の抗体によって認識される融合タンパク質を発現させることは有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作し、それによって前記ポリペプチドを異種タンパク質から切り離して精製することができるようにしてもよい。
【００４１】
本発明の核酸分子にはまた本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、したがってコード核酸分子とハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子が含まれる。そのようなアンチセンス分子（例えばオリゴヌクレオチド）は、当業者にはよく知られるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、その標的核酸と特異的に結合してその転写を妨げるようにデザインすることができる（例えば以下の文献を参照されたい：J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci., 10：435(1989)； J. Okano, Neurochem. 56：560(1991)； J. O’ Connor, Neurochem. 56：560(1991)； Lee et al., Nucleic Acids Res. 6：3073(1979)； Cooney et al., Science 241：456(1988)； Dervan et al., Science 251：1360(1991)）。
本明細書で用いられる“ハイブリダイゼーション”という用語は、２つの核酸分子が水素結合によって互いに結合することを指す。典型的には、１つの分子が固相支持体に固定され、他方は溶液中で遊離しているであろう。続いて２つの分子を水素結合に適した条件下で互いに接触させる。前記結合に影響する因子には以下が含まれる：溶媒の種類および体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；攪拌；液相分子の固相支持体への非特異的結合を妨害する薬剤（デンハルト試薬、またはＢＬＯＴＴＯ）；分子の濃度；分子の結合速度を増加させる化合物の使用（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）；およびハイブリダイゼーションに続く洗浄条件のストリンジェンシー（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。
【００４２】
完全に相補的な分子と標的分子とのハイブリダイゼーションの阻害は、当業者に知られるハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる（例えばSambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。したがって、実質的に相同な分子は、文献（G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152：399−407； A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152：507−511）に開示されたように完全に相同な分子と標的分子との結合を種々のストリンジェンシー条件下で競合させ阻害するであろう。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の結合よりも非常に類似した分子の結合に適したハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液（50％のホルムアミド、５倍のＳＳＣ（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５倍のデンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および20μｇ／ｍＬの変性せん断サケ精子DNA）中で42℃で一晩インキュベーションし、続いてフィルターを0.1倍のＳＳＣで約65℃で洗浄すると定義される。低ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション反応が35℃で実施されることを含む（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイゼーションに用いられる条件は高ストリンジェンシーを構成するものである。
【００４３】
本発明のこの特徴の好ましい態様は、LBDG1ポリペプチド（配列番号：２）またはLBDG4ポリペプチド（配列番号：４）をコードする核酸分子の全長にわたって少なくとも８０％同一である核酸分子、および前記のような核酸分子に対して実質的に相補的な核酸分子である。好ましい活性フラグメントは、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列のそれぞれLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメントである。したがって、好ましい核酸分子は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチド配列の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域をコードする核酸分子の全長にわたって少なくとも８０％同一であるものを含む。
本明細書で言及される同一性パーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI（the National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメーターを用いて決定されるとおりである。
好ましくは、本発明のこの特徴の核酸分子は、配列番号：１に示された配列を有する核酸分子、この配列のヌクレオチド2732−3328を含む領域の全長にわたって少なくとも８０％同一の領域を含む。本発明のこの特徴の他の好ましい核酸分子は、配列番号：３に示された配列を有する核酸分子、この配列のヌクレオチド2913−3515を含む領域の全長にわたって少なくとも８０％同一の領域を含むか、またはこれら核酸領域のいずれかと相補的である核酸分子を含む。この場合、前記の全長にわたって少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％または９９％同一の核酸分子が特に好ましい。これに関して、好ましい態様は、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００４４】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出する方法を提供する：（ａ）二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸プローブを生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）形成された前記の全ての二重鎖を検出する工程。
本発明にしたがって利用することができるアッセイに関連して下記でさらに考察するように、上記で述べた核酸分子をRNA、cDNAまたはゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして用い、LBDG1またはLBDG4ポリペプチドをコードする完全長のcDNAおよびゲノムクローンを単離し、さらに前記ポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子またはオーソログ遺伝子のcDNAまたはゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当技術分野で公知の他の技術の中で特に以下の技術を利用することができる。これらの技術は例示として下記で考察される。DNAのシークエンシングおよび解析のための方法は周知で、当技術分野では一般的に利用可能であり、本明細書で考察される本発明の態様の多くを実施するために実際に用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメント、シークエナーゼ（US Biochemical Corp., Cleaveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Prekin Elmer）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、またはポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せ（例えば市販（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）のELONGASE増幅キットで見出されるようなもの）のような酵素を利用することができる。好ましくは、シークエンシングプロセスは、例えばハミルトンマイクロラブ（Hamilton Micro Lab）2200（Hamilton, Reno, NV）、ペルティエサーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler）PTC200（MJ Research, Watertown, MA）、ＡＢＩカタリスト並びに373および377DNAシークエンサー（Perkin Elmer）のような機器を用いて自動化することができる。
【００４５】
LBDG1またはLBDG4ポリペプチドの機能と等価な機能を有するポリペプチド、特にLBDG1またはLBDG4ポリペプチドのLBDG1またはLBDG4核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と同等の機能をもつポリペプチドをコードする核酸分子を単離する方法の１つは、当技術分野で知られている標準的な方法を用いる、天然のプローブまたは人工的にデザインしたプローブによるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーの探索である（例えば以下の文献を参照されたい：“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。特に有用なプローブは、適切なコード遺伝子（配列番号：１または配列番号：３）、特に配列番号：１のヌクレオチド2732−3328または配列番号：３のヌクレオチド2913−3515の領域に由来する核酸配列に対応する、または前記配列と相補的である、少なくとも１５、好ましくは少なくとも３０、さらに好ましくは少なくとも５０の連続塩基を含むプローブである。
前記のようなプローブは分析的な検出が可能な試薬で標識して前記プローブの識別を容易にすることができる。有用な試薬には、放射性同位元素、蛍光色素、および検出可能な生成物の形成を触媒し得る酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらのプローブを用いて、当業者は、ヒト、哺乳類または他の動物供給源から対象のタンパク質をコードするゲノムDNA、cDNAまたはRNAポリヌクレオチドの相補的なコピーを単離し、近縁配列、例えば前記のファミリー、タイプおよび／またはサブタイプに属するまた別のメンバーについて、前記の供給源をスクリーニングすることができるであろう。
【００４６】
多くの場合、単離されるcDNA配列は不完全で、ポリペプチドをコードする領域は短く（通常は５’末端で）切断されているであろう。完全長cDNAを得るために、または短いcDNAを伸長させるために、いくつかの方法が利用可能である。そのような配列は、部分的なヌクレオチド配列を用い、上流の配列（例えばプロモーターおよび調節エレメント）を検出するための当技術分野で公知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、使用され得るある方法は、cDNA末端迅速増幅法（ＲＡＣＥ；例えば以下を参照されたい：Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85：8998−9002）に基づく。前記技術の最近の改変（例えばマラソン（Marathon）（商標）技術（Clontech Laboratories Inc.）により例示される）は、より長いcDNAの検索を顕著に単純化した。わずかに異なる技術（“制限部位”ＰＣＲと称される）では、普遍的プライマーを用いて既知の遺伝子座に近接する未知の核酸配列が検索される（G. Sarkar (1993) PCR Methods Applic. 2：318−322）。逆ＰＣＲもまた、既知の領域に基づく多様なプライマーを用いた配列の増幅または伸長に用いることができる（T. Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16：8186）。使用できる別の方法は捕捉ＰＣＲで、前記は、ヒトおよび酵母の人工染色体DNAで既知配列に近接するDNAフラグメントのＰＣＲ増幅を含む（M. Lagerstrom et al. (1991) PCR Methods Applic. 1：111−119）。未知の配列を検索するために利用可能な別の方法はパーカーの方法である（J.D. Parker et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19：3055−3060）。さらに、ゲノムDNAを歩行させるためにＰＣＲ、入れ子（nested）プライマーおよびプロモーターファインダー（PromoterFinder）（商標）ライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA）を用いてもよい。この方法ではライブラリーのスクリーニングが不要で、イントロン／エクソン結合部を見出すことに有用である。
【００４７】
完全長cDNAをスクリーニングする場合、より大きなcDNAを包含するためにサイズ選択を実施したライブラリーを用いることが好ましい。さらにまた、遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含むという点でランダムプライミングした(random−primed)ライブラリーが好ましい。ランダムプライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長cDNAを生成できない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、５’非転写調節領域に配列を伸長させるために有用であろう。
本発明のある態様では、染色体局在化のために本発明の核酸分子を用いることができる。この技術では、核酸分子は個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定の位置にハイブリダイズさせることができる。本発明の関連配列の染色体上へのマッピングは、遺伝子関連疾患に関する配列の相関性確認において重要な工程である。いったん染色体の正確な位置に配列がマッピングされたら、前記配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出すことができる：V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズホプキンス大学、ウェルチ医学図書館を通じてオンラインで入手可能である）。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を、次に連鎖解析（物理的に近接する遺伝子の同時遺伝(coinheritance)）によって同定する。これにより、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報が提供される。いったん疾患または症候群の位置が遺伝連鎖によって特定のゲノム領域で大まかに限局されたら、前記領域にマッピングされるいずれの配列も、更なる解析のための関連または調節遺伝子となることができる。前記核酸分子はまた、正常な個体、キャリア個体または罹患個体間で転座、逆位などによる染色体位置上の相違を検出するために用いることができる。
【００４８】
本発明の核酸分子はまた組織分布同定(tissue localisation)のために貴重である。そのような技術は、ポリペプチドをコードするmRNAの検出によって組織中の前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術にはin situハイブリダイゼーション技術およびヌクレオチド増幅技術（例えばＰＣＲ）が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物内での前記ポリペプチドの正常な機能を示唆する。さらに、変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンと正常mRNA発現パターンとの比較研究によって、変異ポリペプチドの疾患における役割に対する貴重な洞察が提供される。そのような不適切な発現は時間的、位置的または量的性質を有する場合もある。
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。本発明のベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入され得る本発明の宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中の前記ポリペプチドをコードする核酸分子の発現によってリコンビナント形態で調製することができる。前記のような発現方法は当業者によく知られており、以下の文献により詳細に記述され得る：Sambrook et al.（上掲書）およびFernandez & Hoeffler（1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto）。
【００４９】
一般的には、要求される宿主でポリペプチドを生成させるために核酸分子の維持、増殖または発現に適したいずれの系またはベクターも用いることができる。周知であり日常的である種々の技術のいずれによっても（例えば前掲書（Sambrook et al.）に記載されたようなもの）、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。一般的には、コード遺伝子は制御エレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、および場合によってオペレーター）の制御下に置かれ、それによって所望のポリペプチドをコードするDNA配列を形質転換宿主細胞でRNAに転写させることができる。
適切な発現系の例には、例えば染色体系、エピソーム系およびウイルス由来系、例えば以下に由来するベクターが含まれる：細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス、または上記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するもの（例えばコスミドおよびファージミドを含む）。ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドに包含させ発現させるには大きいDNAフラグメントを搬送するために用いることができる。
【００５０】
特に適切な発現系には、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物（例えば細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの生成に用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)および上掲書（Sambrook et al.））に記載された方法によって達成できる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、擦過ローディング（scrape loading）、弾道導入または感染が含まれる（以下を参照されたい：Sambrook et al.（1989）上掲書；Ausbel et al.（1991）上掲書；Spector, Goldman & Leinward,（1998））。
【００５１】
コード核酸分子は、所望であれば、例えばシグナルペプチドまたはリーダー配列のような制御配列をコードする配列を（例えば翻訳ポリペプチドの小胞体内、細胞周辺腔または細胞外環境への分泌のために）含んでいても含んでいなくてもよい。このシグナルは前記ポリペプチドにとって内因性であっても異種シグナルであってもよい。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングで細菌宿主によって取り除くことができる。
コントロール配列の他に、宿主細胞の増殖に関連して前記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合がある。調節配列の例は、化学的または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）または多様な温度もしくは代謝条件に応答して遺伝子の発現を増加させたり低下させたりする配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに５’および３’非翻訳領域である。これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を実行する。そのような調節配列は、その強さおよび特異性を変化させることができる。用いられるベクター系および宿主に依存して、多くの適切な転写および翻訳エレメント（構成性および誘発性プロモーターを含む）を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘発性プロモーター、例えばBluescriptファージミド（Stratagene, La Jolla, CA）またはpSportl（商標）プラスミド（Gibco BRL）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン(polyhedrin)プロモーターは昆虫細胞で用いることができる。植物細胞ゲノムに由来するプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、RUBISCOおよび貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルスに由来するプロモーターまたはエンハンサー（例えばウイルスプロモーターまたはリーダー配列）は、ベクターへクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。配列の多数コピーを含む細胞株の作製が必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを適切な選択マーカーとともに用いることができる。
【００５２】
発現ベクターは、特定の核酸コード配列を適切な調節配列とともにベクター内に配置させることができるように構築される。前記コード配列の調節配列に関する位置および向きは、前記コード配列が調節配列の“制御下”で転写されるような位置および向きである（すなわちコントロール配列にてDNA分子と結合するRNAポリメラーゼは前記コード配列を転写する）。いくつかの事例では、前記配列を適切な向きで制御配列に付属させることができるように（すなわちリーディングフレームを維持するために）、前記配列を改変する必要があるであろう。
コントロール配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に核酸コード配列に連結させることができる。あるいは、コード配列は、コントロール配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクターへ直接クローニングすることができる。
長期的なリコンビナントポリペプチドの高収量の生成のためには、安定な発現が好ましい。例えば、対象のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメント並びに選択マーカー（同じベクターまたは別個のベクターに存在する）を含む発現ベクターを用いて形質転換させることができる。ベクターの導入に続き、選択培地に切り替える前に細胞を栄養(enriched)培地で１−２日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することで、選択マーカーの存在によって、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞の種類に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００５３】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は当技術分野で公知であり、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection, ATCC）から入手可能な多くの不朽化細胞株が含まれる。前記には、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HeLa、ベイビーハムスター腎（BHK）、サル腎（COS）、C127、3T3、BHK、HEK293、ボウズ（Bowes）メラノーマおよびヒト肝細胞癌（例えばHepG2）細胞および多数の細胞株が含まれるが、これだけに限られない。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料は、特にインビトロジェン（Invitrogen, San Diego, CA）からキットの形態で（“MaxBac”キット）商業的に入手可能である。前記の技術は一般的に当業者に知られており、文献には完全に記載されている（Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)）。この系での使用に特に適切な宿主細胞には昆虫細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞が含まれる。
当技術分野で公知である多くの植物細胞培養および植物体(whole plant)遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例には米国特許第5,693,506号、5,659,122号および5,608,143号に記載されたものが含まれる。植物細胞培養における遺伝子発現の別の例は、文献に記載されている（Zenk (1991) Phytochemistry 30：3861−3863）。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を形成することが可能な植物は全て利用することができ、それによって移入遺伝子を含む完全な植物が回収される。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実および他の樹木、マメ類および野菜の主要な種の全てを含む（ただしこれらに限定されない）全ての植物は、培養細胞または組織から再生させることができる。
【００５４】
特に好ましい細菌宿主細胞の例には連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセスおよびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）細胞が含まれる。
真菌での発現に特に適切な宿主細胞の例には酵母細胞（例えばS.セレビシエ(cerevisiae)）およびアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞株の回収に用いることができる多くの選択系は、当技術分野で公知である。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（M. Wigler et al.(1977) Cell 11：223−32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（I. Lowy et al.(1980) Cell 22：817−23）の遺伝子が含まれ、前記はそれぞれtk−またはaprt±細胞で用いることができる。
さらにまた、抗代謝物質耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性を選択基準として用いてもよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）はメトトレキセートに対する耐性を付与し（M. Wigler et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77：3567−70）、nptはアミノグリコシド系ネオマイシンおよびG−418に耐性を付与し（F. Colbere−Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150：1−14）、さらにalsまたはpatはそれぞれクロロスルフロン(chlorsulfuron)およびホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選択可能な遺伝子が報告されており、当業者にはそれらの例は明白であろう。
【００５５】
マーカー遺伝子の発現の有無は対象の遺伝子も存在することを示唆するが、対象の遺伝子の存在および発現を確認する必要があり得る。例えば、関連する配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、適切な配列を含む形質転換細胞はマーカー遺伝子機能が存在しないことによって識別することができる。あるいは、マーカー遺伝子は、ただ１つのプロモーターの制御下で本発明のポリペプチドをコードする配列とともに直列に配置することができる。通常、誘発または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、直列遺伝子の発現も示している。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られている多様な方法で同定することができる。前記方法には、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）またはイムノアッセイ技術（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および放射性イムノアッセイ（RIA））が含まれ（ただしこれらに限定されない）、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のためのメンブレン、溶液またはチップをベースとする技術が含まれる（例えば以下を参照されたい：R. Hampton et al.(1990) Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN；およびD.E. Maddox et al.(1983) J. Exp. Med. 158：1211−1216）。
【００５６】
多様な標識および結合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブの作製手段には、標識したポリヌクレオチドを用いるオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする配列をベクターにクローニングしてmRNAプローブを作製することができる。そのようなベクターは当技術分野で公知で、商業的に入手可能であり、適切なRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3またはSP6）および標識ヌクレオチドを添加することによりin vitroでRNAプローブを合成することに用いることができる。これらの方法は、種々の市販キット（Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI)； Promega (Madison, WI)； U.S. Biochemical Corp., (Cleaveland, OH)）を用いて実施することができる。
適切なレポーター分子または標識（前記は検出を容易にするために用いることができる）には、放射性核種、酵素および蛍光、化学発光または色素生産性物質の他に基質、コファクター、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。
【００５７】
本発明の核酸分子はまたトランスジェニック動物（特にげっ歯類動物）の作製に用いることができる。そのようなトランスジェニック動物は本発明の別の特徴を構成する。これは、体細胞の改変によって局部的に、または遺伝性改変を導入する生殖細胞系療法によって実施することができる。前記のようなトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドのモジュレーターとして有効な薬剤分子のための動物モデルを作製するために特に有用であろう。
ポリペプチドは、周知の方法によってリコンビナント細胞培養物から回収し精製することができる。前記周知の方法には、硫安またはエタノール沈澱、酸性抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸化セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。高性能液体クロマトグラフィーは、精製に特に有用である。単離および精製の間にポリペプチドが変性した場合には、タンパク質のリフォールディングのためによく知られている技術を用いて活性な構造を再生することができる。
【００５８】
所望の場合には、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に本発明のポリペプチドをコードする配列を連結させることにより特殊化したベクター構築物も、タンパク質の精製を容易にするために用いることができる。そのような精製促進ドメインの例には、金属キレートペプチド（例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle, WA）で用いられるドメイン）が含まれる。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に特異的なもの）を精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に包含させて、精製を容易にすることに用いてもよい。そのような発現ベクターの1つは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行するいくつかのヒスチジン残基と融合させた本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ（固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；J. Porath et al.(1992) Prot. Exp. Purif. 3：263−281）により精製を容易にし、一方、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察は以下で提供される：D.J. Kroll et al.(1993) DNA Cell Biol. 12：441−453）。
【００５９】
スクリーニングアッセイで使用するためにポリペプチドを発現させる場合は、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の表面で前記ポリペプチドを生成させることが一般には好ましい。この場合、宿主細胞はスクリーニングアッセイで使用する前に、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）またはイムノアフィニティー技術のような技術を用いて収穫することができる。ポリペプチドが培養液中に分泌される場合は、前記培養液を回収して発現されたポリペプチドを回収および精製することができる。ポリペプチドが細胞内で生成される場合、ポリペプチドを回収する前に、先ず初めに細胞を溶解させねばならない。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような化合物は、本発明のポリペプチドの遺伝子発現レベルまたは活性レベルを活性化（作働）させ、または阻害（拮抗）することができる。それらは本発明のさらなる特徴を形成する。好ましい化合物は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させることに有効であるか、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節することに有効である。
アゴニスト化合物またはアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーまたは天然生成物の混合物から単離することができる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは天然または改変された基質、リガンド、酵素、レセプターまたは構造的もしくは機能的模倣物質であってよい。前記のスクリーニング技術の適切な概論のためには以下を参照されたい：Coligan et al.(1991) Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5。
【００６０】
おそらく良好なアンタゴニストと考えられる化合物は、本発明のポリペプチドと結合し、結合したときに前記ポリペプチドの生物学的作用を誘発しない分子である。潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによって本発明のポリペプチドの活性を阻害または消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。そのようなやり方で、前記ポリペプチドと正常な細胞の結合分子との結合が阻害され、その結果前記ポリペプチドの正常な生物学的活性が阻害され得る。
このようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは溶液中で遊離していても、固相支持体に固定されていても、細胞表面に保持されていても、または細胞内に位置していてもよい。一般に、このようなスクリーニングの方法は、前記のポリペプチドを発現している適切な細胞または細胞膜を用いることを含み、前記細胞または細胞膜をテスト化合物と接触させて、結合または機能的な応答の刺激もしくは阻害を観察する。続いて前記テスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、前記テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。前記のようなアッセイによって、テスト化合物が前記ポリペプチドの活性化によって発生するシグナルをもたらすか否かを、適切な検出系を用いて評価する。活性化の阻害剤は、一般的には既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、テスト化合物の存在下でアゴニストによる活性化の影響が観察される。
【００６１】
或いは、単純な結合アッセイを用いてもよい。この場合、テスト化合物のポリペプチド保持表面への付着が直接または間接的にテスト化合物と結合させた標識手段によって検出されるか、または標識競合物質を用いた競合を含むアッセイで検出される。別の態様では、競合薬剤のスクリーニングアッセイを用いることができる。この場合、ポリペプチドと特異的に結合することができる中和抗体がテスト化合物と結合について競合する。このようにして、前記抗体を用いて前記ポリペプチドに対して特異的な結合親和性を保有する一切のテスト化合物の存在を検出することができる。
前記ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内の生成に対する添加テスト化合物の影響を検出するアッセイをデザインすることもできる。例えば、当技術分野で公知の標準的な方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するＥＬＩＳＡを構築することができ、それを用いて適切に操作した細胞または組織からのポリペプチド生成を阻害または増強し得る化合物について検索することができる。続いて、前記ポリペプチドとテストされる化合物との結合複合体の生成を測定することができる。
【００６２】
使用され得る薬剤スクリーニングのための別の技術は、対象のポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物の高速大量処理スクリーニングを提供する（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。前記方法では、多数の異なる小型のテスト化合物が固相基質上で合成され、次に本発明のポリペプチドと反応させられ洗浄され得る。ポリペプチドを固定する方法の１つは非中和抗体を使用することである。続いて、当技術分野で周知の方法を用いて結合ポリペプチドを検出することができる。精製ポリペプチドはまた、前述の薬剤スクリーニング技術で使用するためにプレートに直接被覆させることができる。
本発明のポリペプチドを用いて、膜結合レセプターまたは可溶性レセプターを当技術分野で公知の標準的なレセプター結合技術により同定することができる。前記標準的な技術は、例えばリガンド結合アッセイおよび架橋アッセイであり、そのようなアッセイでは、ポリペプチドは放射性同位体で標識されているか、化学的に改変されているか、またはその検出もしくは精製を容易にするペプチド配列と融合されており、推定上のレセプター供給源（例えば細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物または体液）とインキュベートされる。結合有効性は、生物物理的技術、例えば表面プラズモン共鳴および分光法を用いて測定することができる。結合アッセイは、レセプターの精製およびクローニングのために用いることができるが、ポリペプチドとそのレセプターとの結合に競合する前記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためにも用いることができる。スクリーニングアッセイを実施する標準的方法は当技術分野ではよく理解されている。
【００６３】
本発明はまた、上記で述べたアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質、酵素を同定する方法で有用なスクリーニングキットを含む。
本発明は、上記アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質および酵素、並びに上記で述べた方法によって発見される、本発明のポリペプチドの活性または抗原性を調節する他の化合物を含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、リガンドまたは化合物とともに適切な医薬担体を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、下記で詳細に説明するように、治療用もしくは診断用試薬として、ワクチンとして、または他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で用いられる専門用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンドまたは化合物｛Ｘ｝を含む組成物は、組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも８５質量％がＸである場合は不純物（本明細書中ではＹ）を“実質的に含まない”。好ましくはＸは、組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも約９０質量％を、より好ましくは少なくとも約９５質量％、９８質量％または９９質量％を構成する。
【００６４】
医薬組成物は、好ましくは治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物を含むべきである。本明細書で用いられる“治療的に有効な量”という用語は、標的疾患または症状を治療、緩和もしくは予防するために、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すために必要な治療薬剤の量を指す。いずれの化合物についても、治療的に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ（例えば新生物細胞培養アッセイ）または動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかで見積もることができる。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路の決定にも用いることができる。次にそのような情報を用いて、ヒトで有用な投与量および投与経路を決定することができる。
ヒト対象者に対する正確な有効量は、疾患状態の重篤度、対象者の全身の健康状態、対象者の年齢、体重および性別、食事、投与時間および投与回数、併用薬剤、反応感受性および治療に対する許容性／応答性に依存するであろう。前記の量は日常的検査により決定でき、それは臨床医の判断の範囲内であろう。一般には有効用量は0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。本組成物は個別にまたは他の薬剤、医薬品またはホルモンと一緒に患者に投与することができる。
【００６５】
医薬組成物はまた、治療薬の投与のために医薬的に許容できる担体を含むことができる。そのような担体には、抗体および他のポリペプチド、遺伝子並びに他の治療薬剤（例えばリポソーム）が含まれるが、ただし担体はそれ自体で前記組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘発せず、さらに不都合な毒性をもたらすことなく投与されることを条件とする。適切な担体は大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であり得る。
それらの中には医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような）；および有機酸の塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような）を用いることができる。医薬的に許容できる担体についての綿密な考察は以下のテキストで入手可能である：Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体は、さらに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールを含むことができる。さらに、助剤（例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が前記組成物中に存在していてもよい。そのような担体は、患者が摂取できるように前記医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
【００６６】
いったん製剤化されたら、本発明の組成物は直接対象者に投与することができる。治療される対象者は動物で、特にヒト対象者が治療され得る。
本発明で用いられる医薬組成物は、多数の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜下腔内、心室内、経皮適用（例えばWO98/20734を参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸的手段が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によって投与できる。遺伝子銃またはハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、本治療用組成物は、注射用物質（液体溶液または懸濁剤のいずれか）として調製できる。注射前に液体賦形剤中で溶液または懸濁剤とするために適した固体を調製することもできる。
本組成物の直接的デリバリーは一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内に注射によって達成されるか、または組織の間隙腔に搬送されるであろう。前記組成物はまた、病巣に投与してもよい。投薬治療は単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の疾患状態で過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、医薬的に許容できる担体とともに上記のような阻害化合物（アンタゴニスト）を、前記ポリペプチドの機能阻害に有効な量で対象者に投与することを含む（前記化合物による前記機能阻害は、例えばリガンド、基質、酵素、レセプターの結合を遮断するか、または第二のシグナルを阻害し、それによって異常な症状を緩和することによって達成される）。好ましくは、前記アンタゴニストは抗体である。最も好ましくは、そのような抗体は、先に記載したようなその免疫原性を最少にするキメラ抗体および／またはヒト化抗体である。
【００６７】
別のアプローチでは、問題のリガンド、基質、酵素、レセプターに対する結合親和性を保持するポリペプチドの可溶形を投与することができる。典型的には、前記ポリペプチドは、関連部分を保持するフラグメントの形態で投与することができる。
また別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、発現遮断技術を用いて、例えば内部で生成されるかまたは別々に投与されるアンチセンス核酸分子を使用して（上記で述べたように）阻害することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、5’領域または調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサーおよびイントロン）に対して相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）をデザインすることによって達成できる。同様に、阻害は“三重らせん”塩基対方法論を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために二重らせんが充分に開く能力を阻害することから有用である。三重DNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（J.E. Gee et al.(1994) In：B.E. Huber & B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。相補的配列またはアンチセンス分子をデザインし、リボソームに対する結合を妨げて転写を妨害することによってmRNAの翻訳を遮断することもできる。そのようなオリゴヌクレオチドは投与されてもよいし、またin vivoでの発現によりin situで生成させてもよい。
【００６８】
さらに、本発明のポリペプチドの発現は、そのコードmRNA配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げることができる。リボザイムは、天然または合成であり得る触媒的活性型のRNAである（例えば以下を参照されたい：N. Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol.(1996) 6(4)：527−533）。合成リボザイムをデザインして、選択した位置でmRNAを特異的に切断し、それによってmRNAの機能的ポリペプチドへの翻訳を妨げることができる。リボザイムは、通常RNA分子で見出されるような天然のリン酸リボース骨格および天然の塩基から合成することができる。或いは、リボザイムは、非天然の骨格（例えば2’−O−メチルRNA）を用いて合成して、リボヌクレアーゼ分解から保護することができる。これらは改変塩基を含んでいてもよい。
RNA分子は細胞内安定性および半減期を増加させるために改変することができる。可能な改変には、RNA分子の5’および／または3’末端へのフランキング配列の付加、または分子の骨格内でホスホジエステル結合に代わるホスホロチオエートまたは2’−O−メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この概念はPNAの生成にも受け継がれ、さらに非慣用塩基（例えばイノシン、ケオシン(gueosine)およびブトシン(butosine)（アセチル−、メチル−、チオ−も同様に）、および同様に改変された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンで、これらは内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないようなものである）の包含によってPNA分子の全てに前記概念を広げることができる。
【００６９】
本発明のポリペプチドおよびその活性の過小発現に関連する異常な状態を治療するためには、いくつかのアプローチも利用可能である。あるアプローチは、前記ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち上記で述べたアゴニスト）の治療的に有効な量を対象者に投与し、異常な状態を緩和することを含む。あるいは、本ポリペプチドの治療量を適切な医薬担体と組合せて投与し、ポリペプチドの相対的な生理学的バランスを回復させてもよい。
遺伝子治療を用い、対象者の関連する細胞による本ポリペプチドの内因性生成を行わせることができる。遺伝子治療は、不完全な遺伝子を修正した治療用遺伝子と置き換えることによって、前記ポリペプチドの不適切な生成を永久的に治療するために用いられる。
本発明の遺伝子治療はin vivoまたはex vivoで実施できる。Ex vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離および精製、治療用遺伝子の導入、および遺伝的に改変した細胞を患者に戻して導入することを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離および精製を必要としない。
治療用遺伝子は患者に投与するために典型的には“封入されて”いる。遺伝子デリバリー賦形剤はリポソームのような非ウイルス、または、例えばK.L. Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158：39−66に記載されたアデノウイルスのような複製欠損ウイルスまたはN. Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158：97−129および米国特許第5.252,479号に記載されたアデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠損レトロウイルスベクターで発現させるために操作を施すことができる。次にこの発現構築物を単離し、前記ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージ細胞に導入することができる。その結果、前記パッケージ細胞は対象の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生することができるようになる。これらのプロデューサー細胞はin vivoで細胞を操作するために、さらにin vivoでポリペプチドを発現させるために対象者に投与することができる（以下を参照されたい：Gene Therapy and Other Molecular Genetic−based Therapeutic Approaches, Chapter 20（およびその中に引用された文献）, “Human Molecular Genetics” (1996) T. Strachan & A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.）。
【００７０】
別のアプローチは“裸のDNA”の投与で、この場合、治療用遺伝子は血流または筋肉組織に直接注射される。
本発明のポリペプチドまたは核酸分子が疾患をひき起こす原因物質である場合には、本発明は、前記疾患をひき起こす原因物質に対する抗体を生成するワクチンとして用いることができる。
本発明のワクチンは予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染後の疾患を治療する）であろう。そのようなワクチンは、免疫性を付与する抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常は上記で述べた医薬的に許容できる担体と組合せて含む。前記担体には、それ自体で組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生を誘発しない担体のいずれもが含まれる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（“アジュバント”）として機能してもよい。さらにまた、前記抗原または免疫原は、細菌の類毒素（例えばジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ピロリ菌（pyroli））および他の病原体と結合させることができる。
ポリペプチドは胃で分解されるので、ポリペプチドを含むワクチンは好ましくは非経口的に（例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）投与される。非経口投与に適した製剤には、水性および非水性滅菌注射溶液（前記は抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤および製剤を受容者の血液に対し等張にする溶質を含むことができる）、並びに水性および非水性滅菌懸濁剤（前記は分散剤または粘稠剤を含むことができる）が含まれる。
【００７１】
本発明のワクチン製剤は単位用量または複数単位用量容器で提供されてもよい。例えば封入したアンプルおよびバイアルは、使用直前に滅菌された液状担体を添加することだけを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。投与量はワクチンの比活性に依存し、日常的な検査で容易に決定することができる。
本発明はまた、診断薬としての本発明の核酸分子の使用に関する。本発明の核酸分子により特徴付けられ、機能不全に付随する遺伝子の変異型の検出は、前記遺伝子の過小発現、過剰発現または位置的もしくは時間的発現の変化から生じる疾患の診断、または疾患に対する感受性の診断に付け加えることができるか、またはそれらを明確にすることができる診断ツールを提供する。前記遺伝子に変異を保有する個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。
診断のための核酸分子は対象者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から入手できる。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）または他の増幅技術を分析前に用いることによって、ゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい（以下の文献を参照されたい：Saiki et al., Nature 324：163−166(1986)； Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26：301−334(1991)； Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35：117−126(1991)； Van Brunt, J., Bio/Technology, 8：291−294(1990)）。
【００７２】
ある態様では、本発明のこの特徴は、本発明のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを評価し、さらに前記発現レベルをコントロールのレベルと比較することを含む、患者における疾患を診断する方法を提供する（ここで前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆する）。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明の核酸分子と核酸プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェント条件下で、患者由来の組織サンプルを前記核酸プローブと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で前記プローブと接触させる工程；および、
ｃ）前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
この場合、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることは、疾患を示唆する。
本発明のさらなる特徴は、以下の工程を含む診断方法を含む：
ａ）疾患について検査される患者から組織サンプルを入手する工程；
ｂ）前記組織サンプルから本発明の核酸分子を単離する工程；および、
ｃ）前記核酸分子内の疾患に付随する変異の存在を検出することによって患者を疾患について診断する工程。
【００７３】
上記に記載した方法における核酸分子の検出を補助するために、増幅工程、例えばＰＣＲの使用を含むことができる。
正常な遺伝子型と比較すると、増幅生成物におけるサイズの変化によって、欠失および挿入が検出される。点変異は、増幅DNAを本発明の標識RNAとハイブリダイズさせるか、あるいは本発明の標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によって、または溶融温度における差異を評価することによって、ミスマッチを有する二重鎖と区別することができる。DNAをストリンジェントな条件下で前記DNAとハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二重鎖分子を形成させ（前記ハイブリッド二重鎖は、疾患に付随する変異に対応するいずれかの部分で前記核酸プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分を有する）、DNA鎖の対応する部分における疾患付随変異の有無を示すものとして、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を検出することによって、患者における変異の有無を検出することができる。
前記のような診断は特に出生前検査で有用であり、新生児検査においてすら有用である。
【００７４】
点変異、および参照遺伝子と“変異”遺伝子間で異なる他の配列は、他の周知の技術、例えば直接DNAシークエンシングまたは一本鎖構造多型性（Orita et al., Genomics, 5：874−879(1989)）によって同定できる。例えば、シークエンシングプライマーは、二本鎖ＰＣＲ生成物または改変ＰＣＲによって作製された一本鎖テンプレート分子とともに用いることができる。配列決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いる通常の方法によって、または蛍光タグを用いる自動シークエンシング法によって実施される。クローン化DNAセグメントを、特異的DNAセグメントを検出するためのプローブとして用いることもできる。この方法の感受性は、ＰＣＲと併用したとき極めて増強される。さらに、点変異および他の配列の変動（例えば多型性）は、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをただ１つのヌクレオチドが異なる配列のＰＣＲ増幅に用いることによって、上記のように検出することができる。
DNA配列の相違はまた、変性剤の存在下または非存在下でのゲル内のDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化によって、または直接DNAシークエンシング（例えば、Myers et al., Science (1985) 230：1242）によって検出することができる。特定の位置における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えばRNaseおよびＳ１保護）または化学切断法（Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85：4397−4401を参照）によって明らかにすることができる。
【００７５】
通常のゲル電気泳動およびDNAシークエンシングの他に、ミクロ欠損、異数性、転座、逆位のような変異は、in situ分析によっても検出できる（例えば以下を参照されたい：Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA(1993)）。すなわち、細胞内のDNAまたはRNA配列は、それらを単離および／またはメンブレン上に固定する必要なしに変異について分析することができる。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、現在のところ最も一般的に用いられている方法で、ＦＩＳＨに関する多数の概論が存在する（例えば以下を参照されたい：Trachuck et al., Science, 250：559−562(1990)；およびTrask et al., Trends Genet. 7：149−154(1991)）。
本発明の別の態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、遺伝的変種、変異および多型性の効率的スクリーニングを実施することができる。アレイ技術方法はよく知られており汎用的に応用することができ、遺伝子発現、遺伝連鎖および遺伝的多様性を含む分子遺伝学における種々の疑問に取り組むために用いることができる（例えば以下を参照されたい：M. Chee et al., Science (1996) 274：610−613）。
【００７６】
ある態様では、前記アレイは以下の文献に記載された方法にしたがって調製され使用される（PCT出願WO95/11995（Chee et al.）；D.J. Lockhart et al.(1996) Nat. Biotech. 14：1675−1680；M. Schena et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93：10614−10619）。オリゴヌクレオチド対は２つから１００万個を越える範囲で変動し得る。前記オリゴマーは、光誘導化学方法を用いて基板上の指定領域で合成される。基板は紙、ナイロンまたは他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、ガラススライドもしくは他の適切な任意の固相支持体でよい。別の特徴では、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ特許出願（WO95/251116, Baldeschweiler et al.）に記載されたように化学的結合方法およびインクジェット適用装置を用いて基板表面で合成することができる。別の特徴では、ドット（またはスロット）ブロットに類似する“格子化（gridded）”アレイを用い、真空系、熱結合方法、ＵＶ結合方法、機械的または化学的結合方法を用いて基質表面にcDNAフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを配置し、連結させることができる。アレイ（例えば上記で述べたようなもの）は手動で、または利用可能な装置（スロットブロットまたはドットブロット装置）、材料（適切な固相支持体すべて）および機械（ロボット機器を含む））を用いて作製することができ、８、２４、９６、３８４、１５３６または６１４４個のオリゴヌクレオチド、または２つから１００万個を越える範囲の他のいずれの数をも含むことができる（このことはアレイ自体を商業的に入手可能な計測器の有効利用に向くものとしている）。
【００７７】
上記で考察した方法の他に、対象者に由来するサンプルから、ポリペプチドまたはmRNAの異常な増加または低下レベルを決定することを含む方法によって、疾患を診断することができる。発現低下または発現増加は、ポリヌクレオチドの定量のために当技術分野で周知の方法のいずれか、例えば核酸増幅（例を挙げるとＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、RNase保護、ノザンブロット法）および他のハイブリダイゼーション方法を用いてRNAレベルで測定することができる。
宿主に由来するサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定することに用いることができるアッセイ技術は当業者によく知られており、さらに上記でいくらか詳細に考察されている（ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む）。本発明のこの特徴では以下の工程を含む診断方法が提供される：（ａ）上記に記載したリガンドを、リガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）前記複合体を検出する工程。
例えばELISA、RIAおよびFACSのようなポリペプチドレベルを測定するためのプロトコルは、さらにポリペプチド発現の変化レベルまたは異常レベルを診断するための基礎を提供することができる。ポリペプチド発現の正常値または標準値は、正常な哺乳類対象体（好ましくはヒト）から得られた体液または細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で前記ポリペプチドに対する抗体と混合することによって確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法、例えば分光測定方法によって定量することができる。
【００７８】
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、前記ポリペプチドの発現によって特徴付けられる症状または疾患の診断のために、または本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンドおよび他の化合物を用いて治療されている患者をモニターするアッセイにおいて、用いることができる。診断目的に有用な抗体は、治療薬として上記で述べたのと同じ様式で調製することができる。前記ポリペプチドについての診断アッセイは、前記抗体および標識を用いてヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のポリペプチドを検出する方法を含む。前記抗体は改変して、または改変せずに用いることができ、さらにそれらをレポーター分子と共有結合または非共有結合によって結合させることによって標識することができる。当技術分野で公知の多様なレポーター分子を用いることができる（それらのいくつかは上記に記載されている）。
生検組織由来の対象者、コントロールおよび疾患サンプルで発現されたポリペプチドの量は、標準値と比較される。標準値と対象者の値との間の偏差は疾患診断のためのパラメータを確立する。診断アッセイを用いて、ポリペプチド発現の有無および過剰を識別し、治療的処置の間のポリペプチドレベルの調節をモニターすることができる。そのようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験または個々の患者の治療モニタリングにおける個々の治療的処置方法の有効性を評価することに用いることができる。
【００７９】
本発明の診断キットは以下を含むことができる：
（ａ）本発明の核酸分子；
（ｂ）本発明のポリペプチド；または
（ｃ）本発明のリガンド。
本発明のある特徴では、診断キットは、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器；および疾患の診断を容易にするために前記プローブおよびプライマーの使用についての指示書を含むことができる。前記キットはさらに、ハイブリダイズしていないRNAを消化するための試薬を保持する第三の容器を含むことができる。
本発明の別の特徴では、診断キットは核酸分子のアレイを含み、前記核酸分子の１つが本発明の核酸分子であってもよい。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは以下を含むことができる：本発明のポリペプチドと結合する１つまたは２つ以上の抗体；および前記抗体とポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬。
【００８０】
そのようなキットは、以下のような疾患または疾患に対する感受性を診断することに有用であろう：特に細胞増殖疾患（新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、乳房、膵、頭部および頸部の腫瘍並びに他の固形腫瘍を含む）、骨髄増殖性疾患（例えば白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管形成疾患、カポジ肉腫）、自己免疫／炎症性疾患（アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬および気道の炎症、喘息および器官の移植拒絶を含む）、心脈管系疾患（高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化症、血栓症、敗血症、ショック、再灌流障害、心不整脈および虚血を含む）、神経学的疾患（中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症、不安、抑うつおよび痛みを含む）、発達障害、代謝性障害（真性糖尿病、骨粗しょう症、脂質代謝障害、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症および肥満を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（アクネ、湿疹および創傷治癒を含む）、加齢の負の作用、エイズ、感染（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染および寄生虫感染を含む）、並びに他の病的状態（特に核内ホルモンレセプターが関与するもの）。
本発明の種々の特徴および態様は、特にLBDG1ポリペプチドへの言及を有する実施例を介してこれからより詳細に説明されるであろう。
細部の改変は本発明の範囲を逸脱することなく実施できることは理解されよう。
【００８１】
実施例
実施例１
遠縁の新規な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの検索を開始するために、原型となるファミリーメンバー、ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインを選択する。より具体的には、前記検索は、タンパク質データバンク（PDB）（Research Collaboratory for Structural Bioinfomaticsによって運用されている）から得られた構造を用いて開始する。
選択した構造は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインである（PDBコード1ERR：A；図１参照）。1ERR：Aの類縁体についてバイオペンジウムの検索を実施し（ターゲットマイニングインターフェース(Target Mining Interface)を用いる）、3614のゲノムスレッダーの結果が返される。この3614のゲノムスレッダーの結果には、典型的な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン（例えばホモサピエンスエストロゲンレセプターの残基307−547の間で見出されるもの）（図２Ａの矢印参照）の例が含まれる。
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことが判明しているタンパク質の中で、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けされていないタンパク質、O75385（LBDG1；図２Ｂの矢印参照）が現れる。インファーマチカゲノムスレッダーは、配列O75385（LBDG1）の領域（残基822−1020の間）をホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと類似の構造を有すると同定した。ホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと類似する構造を保有することは、O75385（LBDG1）の残基822−1020は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとして機能することを示唆する。ゲノムスレッダーはこれを８４％の信頼度で同定する。
【００８２】
1ERR：Aの類縁体についてのバイオペンジウムの検索（ターゲットマイニングインターフェースを用いる）によって、841のフォワード(forward)PSI−BLASTの結果も返される。フォワードPSI−BLAST（図２Ｃを参照されたい）は前記関係を同定できず、インファーマチカゲノムスレッダーだけがO75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと同定できる。
O75385（LBDG1）についてパブリックドメインデータベースで何が判明しているかを評価するために、重複配列ディスプレーページ（図３）を調査する。O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと同定するPROSITEヒットもPRINTSヒットも得られない。PROSITEおよびPRINTSは、類似ファミリーのタンパク質を記述することに役立つデータベースである。両データベースから核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインのヒットが返ってこないことは、PROSITEまたはPRINTSを用いた場合、O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むものとして同定できないことを意味する。
【００８３】
他のいずれかのパブリックドメイン注釈付け手段が、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けすることができるか否かを確認するために、O75385（LBDG1）タンパク質配列をインタープロ（InterPro）ウェブサイトでPFAMデータベース（アラインメントおよび隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース）に対して検索する（図４Ａ矢印１参照）。１つのPFAM−AマッチングがPF00069/IPR000719に対して見出され、それは真核細胞タンパク質キナーゼに特徴的である。このタンパク質キナーゼドメインは、O75385（LBDG1）の残基16−278の間に位置すると注釈付けされる。O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けするPFAM−Aマッチングは存在しない。したがってPFAMでは、O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことを同定しない。
興味深いことには、PROSITEのPFスキャン（図４Ａ矢印２参照）によって、O75385（LBDG1）の残基501−688でプロリンに富む領域が同定される。プロリンに富む領域はDNA結合ドメインとして機能することができる（図４Ｂ参照）。DNA結合ドメインの位置を予測核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン（残基822−1020）のＮ−末端に位置づけることは、原型の核内ホルモンレセプターのドメイン機構を想起させる（原型核内ホルモンレセプターはＮ−末端ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよびＣ−末端リガンド結合ドメインを有する）。
【００８４】
続いてスイスバイオインフォマティクス研究所、SIB（Swiss Institute of Bioinformatics）のSWISS−PROTタンパク質データベースを、O75385（LBDG1）配列に関連するパブリックドメインでさらなる既知情報があるか否かを調べた。これは、タンパク質および遺伝子配列寄託に関するスイスのパブリックドメインデータベースである（図５）。O75385（LBDG1）はホモサピエンスの配列で、そのSWISS−PROTタンパク質ＩＤはO75385であり、長さは１０５０アミノ酸である。O75385はULK1(UNC51様キナーゼ１)と呼ばれる。ULK1はKuroyanagiら（東京都老人医学研究所、分子遺伝学部門；東京都板橋区栄町２−３５（１７３−００１５））によってクローン化された。この遺伝子について前記パブリックドメインの情報は、前記遺伝子を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けしていない。
したがって、全てのパブリックドメインの注釈付けツールを用いて、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けされないであろうと結論することができる。インファーマチカゲノムスレッダーのみが前記タンパク質を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けすることができる。
【００８５】
ここで逆検索を実施する。O75385（LBDG1）を今度はクエリー配列としてバイオペンジウムで用いる（図６Ａ参照）。インファーマチカゲノムスレッダーは、O75385（LBDG1）の残基822−1020はホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインと同じ構造を有すると信頼度８４％で同定する（図６Ｂの矢印参照）。ホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイン（1ERR：A）は、元々のクエリー配列であった。PSI−BLASTの正の繰返しはこの結果を返さない（図６Ｃ）。この関係を同定することができるのはインファーマチカゲノムスレッダーだけである。
ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインの配列は、O75385（LBDG1）の配列アラインメントを観察するために前記に対して選択される。類似の構造を有すると確認されたタンパク質に対するクエリータンパク質のAlEyeアラインメント（図７）を観察することは、相同領域の可視化に役立つ。
ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインは“ＬＢＤモチーフ”を含み、前記モチーフは、今日まで注釈付けされた全ての核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインで見出されている。“ＬＢＤモチーフ”は核内ホルモンレセプターのコアクチベーターおよびコリプレッサーを補充することに関与する。６つの残基；PHE367、LEU370、ASP374、GLN375、LEU378およびLEU379は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインにおいてこのモチーフを構成する（図７の四角枠を参照）。O75385（LBDG1）中の４残基（ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890）は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン中の６つの“ＬＢＤモチーフ”残基のうちの４つ（ASP374、GLN375、LEU378およびLEU379）と正確にマッチする。O75385（LBDG1）の５番目の残基（LEU878）は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインの“ＬＢＤモチーフ”ではPHE367に保存的置換されている。このことは、O75385（LBDG1）はホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインと類似する核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことを示している。
【００８６】
同定されたタンパク質が実際にクエリータンパク質と関連することを保証するために、可視化プログラム“LigEye”（図８Ａ）および“iRasmol”（図８Ｂ）を用いる。これらの可視化ツールは、既知の小型阻害分子が既知タンパク質構造の活性部位で相互作用するアミノ酸を表示することによって、前記既知タンパク質構造の活性部位を同定する。これらの相互作用は、直接水素結合を介するか、または疎水性相互作用を介する。このようにして、活性部位のフォールド／構造が、同定された相同体と選択した既知構造のタンパク質との間で保存されているか否かを理解することができる。ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインのLigEyeによる調査は、ラロキシフェン（Raloxifene）と結合する１５残基（図７の丸付き文字）を明らかにする。しかしながら、これら１５残基のうちの１１残基のみ（THR347、ALA350、LEU354、TRP383、LEU387、MET388、LEU391、ARG394、PHE404、MET421およびLEU428）が、ゲノムスレッダーアラインメントの範囲内に存在する。したがって、これら１１残基のみが、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むというO75385（LBDG1）のゲノムスレッダーの注釈付けを強固にするために用いることができる。これら１１残基の中に９個の疎水性残基が存在し、これらはホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインのポケットの輪郭を形成する；ALA350、LEU354、TRP383、LEU387、MET388、LEU391、PHE404、MET421およびLEU428。これら９つのホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインの疎水性残基のうちの５つは、O75385（LBDG1）で完全に保存されている：ALA861、LEU863、TRP894、LEU900およびLEU904（図７の丸付き文字）。残りの４つのホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインの疎水性残基のうち３つは、O75385（LBDG1）では別の疎水性残基に保存的に置換されている：VAL901、LEU910およびVAL932（図７の穴あき丸付き文字）。結合ポケットの輪郭を形成する９つの疎水性残基のうち（ゲノムスレッダーアラインメント領域内で）８つで疎水性が保存されていることは、O75385（LBDG1）は疎水性ステロイド様リガンドと結合するであろうことを示している。
【００８７】
このことは、実際インファーマチカゲノムスレッダーによって予測されたように、O75385（LBDG1）はホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインと類似の様式で折り畳まれることを示し、したがって核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと同定される。
O75385（LBDG1）の逆最大化PSI−BLASTによってO75385（LBDG1）の１つのホモサピエンス相同体および２つのマス・マスキュラス（Mus musculus）相同体が同定される。O70405（マス・マスキュラスのULK1、図６Ｃ矢印１参照）はO75385（LBDG1）に最も近縁な配列で、８８％の配列同一性を共有する。したがってO70405（マス・マスキュラスのULK1）は、O75385（LBDG1；ホモサピエンスULK1）のマス・マスキュラスオーソログ（orthologue）を表す。
BAA31598.1（ホモサピエンスULK2、図６Ｃ矢印２参照）はO75385（LBDG1；ホモサピエンスULK1）と５１％の配列同一性を共有する。したがってBAA31598.1（ホモサピエンスULK2）は、O75385（LBDG1；ホモサピエンスULK1）のオーソログを表す。
【００８８】
BAA77341.1（マス・マスキュラスＵＬＫ２、図６Ｃ矢印３参照）はO75385（LBDG1；ホモサピエンスULK1）と50％の配列同一性を共有する。しかしながら、BAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）はBAA31598.1（ホモサピエンスＵＬＫ２）とはるかに近縁であって９１％の配列同一性を共有し、これはそれらが図６Ｃでクラスターを形成する理由である。BAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）はしたがってO70405（LBDG1；ホモサピエンスULK2）のマス・マスキュラスオーソログを表す。
O75385（LBDG1；ホモサピエンスULK1）、O70405（マス・マスキュラスＵＬＫ１）、BAA31598.1（ホモサピエンスULK2）およびBAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）で整列化し、AlEyeで調査する（図９）。AlEyeは、前記リガンド結合ポケットの輪郭を形成すると予測されるO75385（LBDG1）の８つの疎水性残基（ゲノムスレッダーアラインメント範囲内；ALA861、LEU863、TRP894、LEU900、VAL901、LEU904、LEU910およびVAL932)は全てO70405（マス・マスキュラスULK1；図９を参照）で正確に保存されていることを明らかにしている。さらにまた、O75385（LBDG1）の５つの予測される“ＬＢＤモチーフ”残基のうちの４つ（LEU878、ASP885、GLN886およびLEU890)は正確にO70405（マス・マスキュラスULK1）で保存されている。
【００８９】
Ａ１Ｅｙｅはまた、リガンド結合ポケットの輪郭を形成すると予測されるO75385（LBDG1）の（ゲノムスレッダーアラインメント範囲内の）８つの疎水性残基のうち５つ（TRP894、LEU900、VAL901、LEU910およびVAL932）は全て、BAA31598.1（ホモサピエンスULK2）およびBAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）で正確に保存されていることを明らかにする。さらにまた、O75385（LBDG1）の５つの予測される“ＬＢＤモチーフ”残基のうちの３つ（ASP885、GLN886、LEU890）は、BAA31598.1（ホモサピエンスULK2)およびBAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）で正確に保存されている。
タンパク質の機能にとって必須の残基は前記タンパク質の相同体において保存されるであろう。したがって、相同体O70405（マス・マスキュラスULK1）、BAA31598.1（ホモサピエンスULK2）およびBAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）における予測されるO75385（LBDG1）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの機能に必須であろう残基の保存は、O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むとの注釈付けを強く支持する。
【００９０】
図１０はＮＣＢＩのユニジーン（UniGene）データベースから作製されたレポートである。このデータベースは、種々のヒトの組織由来の発現配列タグ（EST）の収集であり、タンパク質に対しての一般的な組織分布を与えることに用いることができる（ただし前記タンパク質配列が前記データベースに存在することを条件とする）。O75385（LBDG1）は前記データベースに存在し、血液、脳、乳房、ＣＮＳ、結腸、生殖細胞、心臓、腎臓、肺臓、リンパ、筋肉、卵巣、膵臓、上皮小体、プールされたもの(pooled)、前立腺、精巣、扁桃腺、子宮、全胚、副腎、脳、脳＿正常、子宮頸部、結腸、結腸＿ｅｓｔ、結腸＿ｉｎｓ、頭部＿頸部、腎臓、平滑筋、肺臓、神経＿正常、卵巣、胎盤、前立腺＿正常、前立腺＿腫瘍および子宮として参照されている組織で発現することが示された。O75385（LBDG1）のmRNAもまたライブラリー3761NN1112（成人神経組織ライブラリー）で高度に（３．６％）提示されている（図１１参照）。
ユニジーンデータベースは組織分布について大まかな見解を提供するが、かずさcDNAプロジェクトにより解析されたヒト未同定遺伝子によってコードされる巨大タンパク質；Human Unidentified Gene−Encoded Large Proteins Analyzed by Kazusa cDNA Project（ＨＵＧＥ）データベースは、RT−PCR ELISAによるcDNAレベルの直接的な実験測定値を提供する（図１２を参照）。O75385（LBDG1）は識別記号KIAA0722の下で前記データベースに存在し、脳、心臓および卵巣で高度に発現されている。
【００９１】
O75385（LBDG1）に関連する論文が存在する；Kuroyanagi et al., Genomics (1998) 51：76−85（図１３参照）。この論文は、O75385（LBDG1）をコードする遺伝子が、細胞遺伝子座12q24.3の遠位にマッピングされることを実証している。前記の位置は、II型遠位遺伝性運動神経障害（遠位性HMNII）の原因遺伝子、および肩甲骨棘筋萎縮（SPSMA）の原因遺伝子の近傍である。O75385（LBDG1）をコードする遺伝子はこれら遺伝子座の遠位にマッピングされるが、それにもかかわらずO75385（LBDG1）が前記疾患の一方または両方の原因遺伝子である可能性が存在する。したがって、O75385（LBDG1）の遺伝子はこれらの症状に関与すると推論できる。前記症状の診断および／または治療のためにO75385（LBDG1）の遺伝子またはそのコードタンパク質を標的とする薬剤の開発のための道を作ることは重用であろう。特に、前記遺伝子が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという同定は、（例えば核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインアゴニストまたはアンタゴニストの使用を通じて）O75385（LBDG1）タンパク質に特異的な薬剤の開発を容易にする。
【００９２】
実施例２
ホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメインは“ＬＢＤモチーフ”を含み、前記モチーフは、今日までに注釈された全ての核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインで見出されている。“ＬＢＤモチーフ”は核内ホルモンレセプターのコアクチベーターおよびコリプレッサーを補充することに関与する。６つの残基PHE367、LEU370、ASP374、GLN375、LEU378およびLEU379は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメインにおいて前記モチーフを構成する（図７：1ERR：A参照）。上記で考察したように、これら“ＬＢＤモチーフ”残基のうちの４つはO75385（LBDG1）で正確に保存されている。1ERR：AのASP374はO75385（LBDG1）ではASP885として保存されている。1ERR：AのGLN375はO75385（LBDG1）ではGLN886として保存されている。1ERR：AのLEU378はO75385（LBDG1）ではLEU889として保存されている。1ERR：AのLEU379はO75385（LBDG1）ではLEU890として保存されている。1ERR：A“ＬＢＤモチーフ”の５番目の残基、PHE367はO75385（LBDG1）ではLEU878によって保存的に置換されている。
【００９３】
“ＬＢＤモチーフ”残基の他に、既知の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインで良く保存されている他の残基がある。O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むとの注釈付けについての更なるテストは、“ＬＢＤモチーフ”の外側の重要な残基がO75385（LBDG1）および５つのO75385（LBDG1）相同体で保存されているか否かを解析することである。
リガンド結合およびコアクチベーター／コリプレッサーの補充の他に、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインのもう１つの固有性は、他の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとのダイマー化能力である。例えば、エストロゲンレセプターα（ＥＲα）リガンド結合ドメインはそれ自体でホモダイマーを形成することができる。
また別の例はペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（ＰＰＡＲγ）リガンド結合ドメインはレチノイドＸレセプターα（ＲＸＲα）リガンド結合ドメインとヘテロダイマーを形成することができるということである。リガンド結合ドメインがホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成するか否かにかかわらず、同じ普遍的な相互作用の様式が結合の根底にある。結晶学的実験および突然変異誘発実験によって、ヘリックス“α１０”のＮ−末端側の半分が２つのダイマー化リガンド結合ドメイン間の主要な相互作用部位と同定された（R.T. Gampe, V.G. Montana, M.H. Lambert, A.B. Miller, R.K. Bledsoe, M.V. Milburn, S.A. Kliewer, T.M. Willson, H.E. Xu, Mol. Cell.(2000) 5(3)：545−55； A.M. Brzozowski, A.C. Pike, Z. Dauter, R.E. Hubbard, T. Bonn, O. Engstrom, L. Ohman, G.L. Greene, J.A. Gustafsson, M. Carlquist, Nature (1997) 389(6652)：753−8）。ヘリックス“α１０”のＮ−末端側半分の機能的重要性はこの領域の特定の残基の強い保存性に反映されている。図１４は、ホモサピエンスERα、AR、RARγ、RXRα、PPARγおよびRORβに対して、ヘリックス“α１０”配列のＮ−末端側半分で整列化したO75385（LBDG1）およびその３つの相同体を示している。ダイマーを形成するために、各モノマーの“α１０”ヘリックスは捩り合わされて堅い骨格を形成し、これは極性反応および疎水性相互作用の組み合わせによって駆動される。ヘリックス“α１０”上にはダイマー化相互作用の極性成分において重要な役割を果たす２つの残基の位置がある（これらは図１４で枠“ｂ”および枠“ｇ”として示されている）。ヘリックス“α１０”上の位置“ｂ”は通常、極性残基（例えばERαではGLN506）が占有するか、または正荷電残基（例えばRXRαではLYS417）が占有する（これらは適切な側鎖特性を有し、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じる）。O75385（LBDG1）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのゲノムスレッダーアラインメントによれば、O75385（LBDG1）のLYS1009は、ヘリックス“α１０”上の位置“ｂ”を占有するであろう。明らかにLYS1009は、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈を支持する。ヘリックス“α１０”の位置“ｂ”を占有するO75385（LBDG1）のLYS1009の重要性は、LYS1009は、３つのO75385（LBDG1）相同体（O70405、BAA31598.1およびBAA77341.1；図１４枠“ｂ”参照）で保存されているという知見によって強化される。
【００９４】
ヘリックス“α１０”上の位置“ｇ”は通常は正荷電残基（例えばERαのARG516）または極性残基（例えばARのGLN867）によって占有されている（これらは適切な側鎖特性を有し、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じる）。O75385（LBDG1）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのゲノムスレッダーアラインメントによれば、O75385（LBDG1）のGLN1018は、ヘリックス“α１０”上の位置“ｇ”を占有するであろう。明らかにGLN1018は、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。ヘリックス“α１０”上の位置“ｇ”を占有するO75385（LBDG1）のGLN1018の重要性は、GLN1018がO75385（LBDG1）のマス・マスキュラス オーソログO70405で保存されているという知見（図１４枠“ｇ”参照）によって強化される。他の２つのO75385（LBDG1）相同体（BAA31598.1およびBAA77341.1）は、位置“ｇ”にSERを有すると予測される。明らかにSERもまたダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。
【００９５】
リガンド結合ドメインのダイマー化はまた、多数の疎水性相互作用によって駆動される。例えば、ヘリックス“α１０”上の位置“ａ”は通常は芳香族残基（例えばPPARγのPHE432）または大型の疎水性残基（例えばERαのLEU504）によって占有され、これらはダイマー化パートナーと疎水性相互作用を生じるのに適切な側鎖を有する。O75385（LBDG1）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのゲノムスレッダーアラインメントによれば、O75385（LBDG1）のTYR1008はヘリックス“α１０”上の位置“ａ”を占有しているであろう。明らかにTYR1008は、ダイマー化パートナーと疎水性相互反応を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。ヘリックス“α１０”上の位置“ａ”を占有するO75385（LBDG1）のTYR1008の重要性は、TYR1008が3つのO75385(LBDG1)相同体で保存されているという知見(O70405、BAA31598.1およびBAA77341.1、図１４枠“ａ”参照)によって強化される。
【００９６】
ヘリックス“α１０”のＮ−末端側の半分はまた、既知のリガンド結合ドメインで保存された疎水性残基によって占有されている多数の他の位置（図１４の枠ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈ）を含む。これら疎水性残基は、溶媒露出してダイマー化パートナーとの疎水性相互作用に寄与するか、または埋め込まれてリガンド結合ドメインの本体に対してヘリックス“α１０”のフォールディングに関与する（例えばERαのLEU507およびLEU514）。O75385（LBDG1）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのゲノムスレッダーアラインメントによれば、疎水性残基は、O75385（LBDG1）でこれらの位置の全てを占有するであろう（位置“ｃ”にALA1010、位置“ｄ”にLEU1011、位置“ｅ”にLEU1014、位置“ｆ”にLEU1017、位置“ｈ”にMET1020、図１４参照）。このことは、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。O75385（LBDG1）の位置ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈを占有する疎水性残基の重要性は、疎水性残基が、３つのO75385（LBDG1）相同体でもこれらの位置を占有するという知見によってさらに強化される（O70405、BAA31598.1およびBAA77341.1、図１４参照）。
まとめると、前記残基解析は、O75385（LBDG1）は核内ホルモンリガンド結合ドメインとホモダイマー化またはヘテロダイマー化するのに適切な補完残基を（ヘリックス“α１０”のＮ−末端に）保有していることを示している。このことは、O75385（LBDG1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。
【００９７】
O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むというゲノムスレッダーの注釈付けの更なるテストは、ＬＢＤフォールドを採用したO75385（LBDG1）の相同モデルの構築を試みることである。O75385（LBDG1）の相同モデルは、O75385（LBDG1）とホモサピエンスレチノイン酸レセプターγ構造１ＦＣＸとのゲノムスレッダーアラインメントをモデラー(Modeller)バージョン５（A. Sali & T.L. Blundell, “Comparative protein modeling by satisfaction of spatial restraints”, J.Mol. Biol. 234：779−815,1993）にかけることによって構築した。
前記相同モデルの全体図は図１６に提示されている。 O75385（LBDG1）は１ＦＣＸ構造に合わせてうまくモデリングされ、ＬＢＤフォールドを形成する交差格子αへリックスの典型的な機構を示す。図１７は、２つの主要αへリックス “α３”および“α５” （これらは既知の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン構造のα３およびα５に対応する）に焦点を合わせている。図１８は予測されるコアクチベーター結合部位で拡大している。既知のＬＢＤ構造では、コアクチベーター結合部位はリガンド結合ドメインの表面でα３とα５との間に形成された溝である。図１９は同じ図を示しているが、溝に結合しているコアクチベーターの予測される形式(mode)を説明するために相互作用しているコアクチベーターのアニメーションが加えられている。O75385（LBDG1）の予測される“ＬＢＤモチーフ”の５つの残基、LEU878、ASP885、GLN886、LEU889およびLEU890は灰色で示されており、これらは全て適切な向きで存在し、どのような衝突または立体障害も無しにそれらの役割を果たしている。例えば、GLN886は、コアクチベーターヘリックスのＣ−末端と相互作用するのに適切な位置に有り、このことは、ちょうどエストロゲンレセプターαがＳＲＣ−１のコアクチベーターヘリックスと結合したとき、エストロゲンレセプターαの等価な残基GLN375について観察されるとおりである（A.K. Shiau, D.Barstad, P.M. Loria, Lin Cheng, P.J. Kushner, D.A. Agard & G.L. Greene, “The Structural Basis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This Interaction by Tamoxifen”, Cell 1998, 95：927）。同様に、LEU890は前記溝の中に突出し、LXXLLコアクチベーターヘリックスに存在するロイシンのいくつかと疎水的に接触することができよう。それは、ちょうどエストロゲンレセプターαがＳＲＣ−１のコアクチベーターヘリックスと結合したときに、エストロゲンレセプターαの等価な残基LEU379について観察されるとおりである（A.K. Shiau, D.Barstad, P.M. Loria, Lin Cheng, P.J. Kushner, D.A. Agard & G.L. Greene, “The Structural Basis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This Interaction by Tamoxifen”, Cell 1989, 95：927）。
【００９８】
“ＬＢＤモチーフ”の外側の残基もまた適切な向きで配置され、それらの役割を果たす。例えば、“ダイマー化”ヘリックス“α１０”のＮ−末端に配置されると予測される残基は、ダイマー化パートナーとの相互作用に加わることができるように適切な向きで存在する。図２０は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターαホモダイマーの構造の全体図を示している。前記ホモダイマーの境界の主要な特徴は、各モノマのが捩じりあわされた、ヘリックス“α１０”である。図２１は、エストロゲンレセプターαモノマー（図２１Ａ）とＬＢＤフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデル（図２１Ｂ）とを比較している。ヘリックス“α１０”に配置されるとゲノムスレッダーによって予測されるO75385（LBDG1）の領域は、どのような衝突または立体障害も無しに長い連続したαへリックスとしてうまくモデリングされていることは明白である。このことは、O75385（LBDG1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むというゲノムスレッダーの注釈付けを支持する。さらにまた、主要な電荷／極性相互作用を生じると予測される残基は、ダイマー化パートナーとの相互作用に適切な向きで存在する。例えば、O75385（LBDG1）のLYS1009はリガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、これは、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基GLN506について観察されるとおりである。例えば、O75385（LBDG1）のGLN1018は、リガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基ARG515について観察されるとおりである。さらにまた、主要な疎水性相互作用を生じると予想される残基はダイマー化パートナーとの相互作用に適した向きで存在する。例えば、O75385（LBDG1）のTYR1007はリガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基LEU504について観察されるとおりである。図２１は、ERα(図21A)およびLBDフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデル（図２１Ｂ）の両方についての、ヘリックス“α１０”のクローズアップを示している。図２１はまた、リガンド結合ドメインの本体に対してヘリックス“α１０”フォールディングにおいて機能するとゲノムスレッダーにより予測される残基は、どのような衝突または立体障害も無しにその役割を果たすのに適切な向きで存在することを明らかにしている。例えば、O75385（LBDG1）のALA1010はリガンド結合ドメインの本体に突出し、その位置で前記構造のコアと疎水的に接触することができ、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基LEU507について観察されるとおりである。例えば、O75385（LBDG1）のLEU1017はリガンド結合ドメインの本体に突出し、その位置で前記構造のコアと疎水的に接触することができ、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基ILE514について観察されるとおりである。
リガンド結合ドメインとしてのO75385（LBDG1）の相同モデリングは、O75385（LBDG1）がリガンド結合ドメインを含むというゲノムスレッダーの注釈付けを支持する。
【００９９】
実施例３
本実施例は、本明細書中で核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとして同定された、BAA31598.1と称される新規なタンパク質、並びに前記タンパク質およびコード遺伝子に由来する核酸配列の疾患の診断、予防および治療における使用に関する。
本タンパク質はO75385（LBDG1）のホモサピエンスパラログであり、本明細書においてLBDG4（BAA31598.1）と称される。前記タンパク質はO75385（LBDG1）と５１％の配列同一性を有し、さらにO75385（LBDG1）のリガンド結合ドメインフォールドで主要な役割を果たすと予測される残基は、BAA31598.1で保存されている（LBDG4、図２２参照）。O75385（LBDG1）に対する高い相同性および予測される主要な残基の保存に基づいて、我々は、BAA31598.1（LDG4）もまた核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付ける。
ホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメインは、今日まで注釈付けされている核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの全てで見出されている“ＬＢＤモチーフ”を含む。“ＬＢＤモチーフ”は、核内ホルモンレセプターのコアクチベーターおよびコリプレッサーを補充することに関与する。６つの残基PHE367、LEU370、ASP374、GLN375、LEU378およびLEU379は、ホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメインで前記モチーフを構成する（図２２：1ERR：A参照）。これら“ＬＢＤモチーフ”残基のうちの３つはBAA31598.1（LBDG4）で正確に保存されている。1ERR：AのASP374はBAA31598.1（LBDG4）ではASP870として保存されている。1ERR：AのGLN375はBAA31598.1（LBDG4）ではGLN871として保存されている。1ERR：AのLEU379はBAA31598.1(LBDG4)ではLEU875として保存されている。1ERR：A“ＬＢＤモチーフ”の４番目の残基、PHE367はBAA31598.1（LBDG4）ではILE863として保存的に置換されている。このことは、BAA31598.1（LBDG4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むとの注釈付けを支持する。
【０１００】
“ＬＢＤモチーフ”の他に、既知の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインで良く保存されている他の残基が存在する。BAA31598.1（LBDG4）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けの更なるテストは、“ＬＢＤモチーフ”の外側の重要な残基がBAA31598.1（LBDG4）で保存されているか否かを解析することである。
リガンド結合およびおよびコアクチベーター／コリプレッサーの補充の他に、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインのもう１つの固有性は他の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとのダイマー化能力である。例えば、エストロゲンレセプターα（ERα）リガンド結合ドメインはそれ自身とホモダイマーを形成することができる。
別の例は、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（PPARγ）リガンド結合ドメインはレチノイドＸレセプターα（RXRα）リガンド結合ドメインとヘテロダイマー化することができるということである。リガンド結合ドメインがホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成するか否かにかかわらず、同じ普遍的な相互作用の様式が結合の根底にある。結晶学的実験および突然変異誘発実験によって、ヘリックス“α１０”のＮ−末端側の半分が２つのダイマー化リガンド結合ドメイン間の主要な相互作用部位として同定された（R.T. Gampe, V.G. Montana, M.H. Lambert, A.B. Miller, R.K. Bledsoe, M.V. Milburn, S.A. Kliewer, T.M. Willson, H.E. Xu, Mol. Cell.(2000) 5(3)：545−55； A.M. Brzozowski, A.C. Pike, Z. Dauter, R.E. Hubbard, T. Bonn, O. Engstrom, L. Ohman, G.L. Greene, J.A. Gustafsson, M. Carlquist, Nature (1997) 389(6652)：753−8）。ヘリックス“α１０”のＮ−末端側半分の機能的重要性はこの領域に存在する特定の残基の強い保存性に反映されている。図１４は、ホモサピエンスERα、AR、RARγ、RXRα、PPARγおよびRORβのヘリックス“α１０”配列のＮ−末端側半分で整列化したBAA31598.1（LBDG4）およびその３つの相同体を示している。ダイマーを形成するために、各モノマーの“α１０”ヘリックスは捩り合わされて堅い骨格を形成し、これは極性相互作用および疎水性相互作用の組み合わせによって駆動される。ヘリックス“α１０”上には２つの残基の位置があり、それら残基はダイマー化相互作用の極性成分で重要な役割を果たす（これらは図１４で枠“ｂ”および枠“ｇ”として示されている）。ヘリックス“α１０”上の位置“ｂ”は通常は、極性残基（例えばERαのGLN506）により占有されるか、または正荷電残基（例えばRXRαのLYS417）により占有される（これらは適切な側鎖特性を有し、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じる）。BAA31598.1（LBDG4）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのアラインメントによれば、BAA31598.1（LBDG4）のLYS994はヘリックス“α１０”上の位置“ｂ”を占有するであろう。明らかにLYS994は、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、BAA31598.1（LBDG4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。
【０１０１】
ヘリックス“α１０”上の位置“ｇ”は通常は正荷電残基（例えばERαのARG516）または極性残基（例えばRORβのTHR417）によって占有されている（これらは適切な側鎖の特性を有し、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じる）。BAA31598.1（LBDG4）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのアラインメントによれば、BAA31598.1（LBDG4）のSER1003はヘリックス“α１０”上の位置“ｇ”を占有するであろう。明らかにSER1003は、ダイマー化パートナーと極性／電荷相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、BAA31598.1（LBDG4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。
リガンド結合ドメインのダイマー化はまた、多数の疎水性相互作用によって駆動される。例えば、ヘリックス“α１０”上の位置“ａ”は通常は芳香族残基（例えばPPARγのPHE432）または大型の疎水性残基（例えばERαのLEU504）によって占有され、これらはダイマー化パートナーと疎水性相互作用を生じるのに適切な側鎖を有する。BAA31598.1（LBDG4）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのアラインメントによれば、BAA31598.1（LBDG4）のTYR992は、ヘリックス“α１０”上の位置“ａ”を占有しているであろう。明らかにTYR992は、ダイマー化パートナーと疎水性相互作用を生じるのに適切な側鎖特性を有する。このことは、BAA31598.1（LBDG4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。
【０１０２】
ヘリックス“α１０”のＮ−末端側の半分はまた、既知のリガンド結合ドメインで保存された疎水性残基によって占有されている多数の他の位置（図１４の枠ｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｈ）を含む。これら疎水性残基は、溶媒露出してダイマー化パートナーとの疎水性相互作用に寄与するか、または埋め込まれてリガンド結合ドメインの本体に対してヘリックス“α１０”のフォールディングに関与する（例えばERαのLEU507およびLEU514）。BAA31598.1（LBDG4）とホモサピエンスエストロゲンレセプターαリガンド結合ドメイン（1ERR：A）とのアラインメントによれば、疎水性残基は、BAA31598.1（LBDG4）で前記の位置の全てを占有するであろう（位置“ｃ”にALA995、位置“ｄ”にALA996、位置“ｅ”にLEU999、位置“ｆ”にLEU1002、位置“ｈ”にILE1005、図１４参照）。このことは、BAA31598.1（LBD4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。まとめると、前記残基解析は、BAA31598.1（LBDG4）は（ヘリックス“α１０”のＮ−末端で）核ホルモンリガンド結合ドメインとホモダイマー化またはヘテロダイマー化するための適切な補完残基を保有することを示している。このことは、BAA31598.1（LBDG4）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けを支持する。
【０１０３】
BAA31598.1（LBDG4）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという注釈付けの更なるテストは、ＬＢＤフォールドを採用するBAA31598.1（LBDG4）の相同モデルの構築を試みることである。BAA31598.1（LBDG4）の相同モデルは、図２２に示したアラインメントを基にして構築した。相同モデリングはモデラーバージョン５（A. Sali & T.L. Blundell, “Comparative protein modeling by satisfaction of spatial restraints”, J.Mol. Biol. 234：779−815,1993）を用いて実施した。
前記相同モデルの全体図は図２３に提示されている。 BAA31598.1（LBDG4）はＬＢＤフォールドに合わせてうまくモデリングされ、ＬＢＤフォールドを形成する交差格子αへリックスの典型的な機構を示す。BAA31598.1（LBDG4）の予測される“ＬＢＤモチーフ”の４つの残基、ILE863、ASP870、GLN871およびLEU875は黒色で示されており、全て適切な向きで存在し、どのような衝突または立体障害も無しにそれらの役割を果たす。
【０１０４】
“ＬＢＤモチーフ”の外側の残基もまた適切な向きで配置され、それらの役割を果たす。例えば、“ダイマー化”ヘリックス“α１０”のＮ−末端に配置されると予測される残基は、ダイマー化パートナーとの相互作用に加わることができるように適切な向きで存在する（図２４）。ヘリックス“α１０”のＮ−末端に配置されると予測されるBAA31598.1（LBDG4）の領域は、どのような衝突または立体障害も無しにαへリックスとしてうまくモデリングされていることは明白である。このことは、BAA31598.1（LBDG4）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むという前記ゲノム注釈付けを支持する。さらにまた、主要な電荷／極性相互作用を生じると予測される残基は、ダイマー化パートナーとの相互作用に適切な向きで存在する。例えば、BAA31598.1（LBDG4）のLYS994はリガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、これは、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基GLN506について観察されるとおりである。例えば、BAA31598.1（LBDG4）のSER1003は、リガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基ARG515について観察されるとおりである。さらにまた、主要な疎水性相互作用を生じると予測される残基はダイマー化パートナーとの相互作用に適切な向きで存在する。例えば、BAA31598.1（LBDG4）のTYR992はリガンド結合ドメインの本体からダイマー化パートナーが位置すると思われる方向に向かって突出し、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基LEU504について観察されるとおりである。図２４Ｂおよび２４Ｃは、ＬＢＤフォールドを採用するBAA31598.1（LBDG4）の相同モデルについての、ヘリックス“α１０”のクローズアップを示している。図２４Ｂおよび２４Ｃはまた、リガンド結合ドメインの本体に対してヘリックス“α１０”のフォールディングにおいて機能すると予想される残基は、どのような衝突または立体障害も無しにその役割を果たすのに適切な向きで存在することを明らかにしている。例えば、BAA31598.1（LBDG4）のALA995はリガンド結合ドメインの本体に突出し、その位置で前記構造のコアと疎水的に接触することができ、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基LEU507について観察されるとおりである。例えば、BAA31598.1（LBDG4）のLEU1002はリガンド結合ドメインの本体に突出し、その位置で前記構造のコアと疎水的に接触することができ、ちょうどエストロゲンレセプターαの等価な残基ILE514について観察されるとおりである。
リガンド結合ドメインとしてのBAA31598.1（LBDG4）の相同モデリングは、BAA31598.1（LBDG4）がリガンド結合ドメインを含むというゲノムスレッダーの注釈付けを支持する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】バイオペンジウムのターゲットマイニングインターフェースのフロントエンドを示す。データベースの検索はＰＤＢコード“１ＥＲＲ：Ａ”を用いて開始する。
【図２Ａ】１ＥＲＲ：Ａを用いた検索に対するインファーマチカゲノムスレッダーの結果の抜粋が示されている。矢印は、ホモサピエンスエストロゲンレセプター（典型的な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを有する）を示している。
【図２Ｂ】１ＥＲＲ：Ａを用いた検索に対するインファーマチカゲノムスレッダーの結果の抜粋が示されている。矢印は、O75385（LBDG1）を示している。
【図２Ｃ】１ＥＲＲ：Ａを用いた検索に対するフォワードＰＳＩ−ＢＬＡＳＴの結果の完全なリストが示されている。O75385（LBDG1）は同定されない。
【図３】O75385（LBDG1）に対する重複配列表示の結果のページである。
【図４Ａ】O75385（LBDG1）に対するインタープロＰＦＡＭ検索結果を示す。矢印１を参照されたい。
【図４Ｂ】インタープロによるプロリンに富む領域についてのレポートで、前記領域がDNA結合ドメインとして機能し得ることを示している。
【図５】O75385（LBDG1）に対するSWISS−PROTのエントリーである。
【図６Ａ】バイオペンジウムデータベースのフロントエンドである。データベースの検索はクエリー配列としてO75385（LBDG1）を用いて開始する。
【図６Ｂ】クエリー配列としてO75385（LBDG1）を用いた検索のインファーマチカゲノムスレッダーの結果の抜粋である。矢印は１ＥＲＲ：Ａを指している。
【図６Ｃ】クエリー配列としてO75385（LBDG1）を用いて得られた逆最大化PSI−BLASTの結果の抜粋である。１、２、３の番号を付与された矢印はO75385（LBDG1）の相同体を指している。
【図７】O75385（LBDG1）および1ERR：AのAlEye配列アラインメントである。
【図８Ａ】1ERR：Aに関するLigEyeで、ラロキシフェン（Ral600(A)）とホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイン、1ERR：Aとの相互作用部位を図示している。
【図８Ｂ】1ERR：A、ホモサピエンスエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインのiRasMol図である。
【図９】O75385（LBDG1；ホモサピエンスＵＬＫ１）と相同体O70405（マス・マスキュラスULK1）、BAA31598.1（ホモサピエンスULK2）およびBAA77341.1（マス・マスキュラスULK2）とのAlEye配列アラインメントである。
【図１０】O75385（LBDG1）に対応するcDNAおよびＥＳＴの供給源を要約するＮＣＢＩユニジーンのレポートである。
【図１１】NN1112は成人神経組織ライブラリーである。
【図１２】KIAA0722（O75385（LBDG1）についてのHUGE識別記号）に対するHUGEデータベースのレポートである。
【図１３】Kuroyanagiらの論文（Genomics (1998) 51：76−85）の８４ページである。O75385（LBDG1）の遺伝子および近傍の疾患に関する遺伝子座の細胞遺伝学的マップ位置を詳述する。
【図１４】O75385（LBDG1）とホモサピエンスエストロゲンレセプターα（１ＥＲＲ：Ａ）とのゲノムスレッダーアラインメントである。ダイマー化ヘリックス“α１０”のＮ−末端側の半分のみを示している。３つのO75385（LBDG1）相同体が（O75385（LBDG1）配列の参照によって）アラインメントに含まれている。他の５つのヒトリガンド結合ドメイン配列もまた、1ERR：A配列の参照によりアラインメントに含まれている。前記は、アンドロゲンレセプター（AR）、レチノイン酸レセプターγ（RARγ）、レチノイドＸレセプターα（RXRα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターγ（PPARγ）およびレチノイドオーファンレセプターβ（RORβ）に由来するLBDである。保存残基は、ａからｈの標識を付した枠によって示されている。極性／荷電残基は灰色の枠内に、疎水性残基は黒色の枠内に示されている。
【図１５】リガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデルの全体図である。特に注目される残基は黒色で示されている。
【図１６】リガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデルの図で、予測されるヘリックス“α３”および“α５”を包含する領域のみが示されている。灰色の矢印はＮ−末端からＣ−末端へ向かうポリペプチド鎖の方向を示している。
【図１７】リガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデルの予測されるコアクチベーター結合部位のクローズアップである。特に注目される残基は黒色で示されている。
【図１８】リガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1）の相同モデルの予測されるコアクチベーター結合部位のクローズアップである。特に注目される残基は黒色で示されている。相同モデルへの予測される結合様式を図示するため、コアクチベーターヘリックスのアニメーションが付け加えられている。
【図１９】ホモサピエンスエストロゲンレセプターαホモダイマー（1ERR：Aおよび1ERR：B）の構造の概観である。黒い線は２つのモノマーを分割している。ダイマー化ヘリックスは標識されている。
【図２０】特にダイマー化ヘリックス“α１０”に関連する、ＥＲα構造（1ERR：A、図20A）とリガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1、図20B）の相同モデルとの比較である。ダイマー相互作用に重要な残基は黒色で示されている。
【図２１】ＥＲα構造（1ERR：A、図21A）とリガンド結合ドメインフォールドを採用するO75385（LBDG1、図21B）の相同モデルとの比較である。ダイマー化ヘリックス“α１０”のみを示してある。図21AおよびBは各々ダイマー化ヘリックス“α１０”の２つの垂直図である。ヘリックスの端を前に見た図では、ポリペプチド鎖はＣ−末端に向かって進み、ページから出て観察者の方に向かう。重要な残基は黒色で示されている。
【図２２】BAA31598.1（LBDG4）とホモサピエンスエストロゲンレセプターα（1ERR：A）とのゲノムスレッダーアラインメントである（BAA31598.1（LBDG4）のヒトパラログを含む）。
【図２３】リガンド結合ドメインフォールドを採用するBAA31598.1（LBDG4）の相同モデルの全体図である。特に注目される残基は黒色で示されている。
【図２４】特にダイマー化ヘリックス“α１０”に関連する、リガンド結合ドメインフォールドを採用するBAA31598.1（LBDG4）の相同モデルの図である。ダイマー相互作用に重要な残基は黒色で示されている。図２４のＢおよびＣはダイマー化ヘリックス“α１０”の２つの垂直図を示す。ヘリックスの端を前に見た図では、ポリペプチド鎖はＣ−末端に向かって進み、ページから出て観察者の方に向かう。重要な残基は黒色で示されている。
【図７−１】
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【図７−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１９】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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