(57)【要約】  ＰＣＲを使用して、複数の核酸を分析するための組成物および方法が開示される。１つの実施形態において、サンプル中に存在する標的核酸分子の相対的なコピー数を決定する方法であって、１）ＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを実行する工程であり、この混合物は、標的核酸分子の群および第１のＰＣＲプライマー対のセットを含み、各プライマー対は、標的核酸分子の群における１つの標的核酸分子の領域を増幅するように設計される工程、２）ＰＣＲ混合物中で第２のＰＣＲを実行する工程であり、この混合物は、ＰＣＲ産物の第１群の一部分および標的核酸産物の１つを増幅するように設計される第２のＰＣＲプライマー対を含み、第２のＰＣＲは、標的核酸分子の１つに関連する第２の標的核酸ＰＣＲ産物を産生する工程、３）標的核酸分子を含むサンプル中に存在する第２の標的核酸産物のコピー数を定量する工程、を包含する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する標的核酸分子の相対的なコピー数を決定する方法であって、１）ＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この混合物は、標的核酸分子の群および第１のＰＣＲプライマー対のセットを含み、ここで、各プライマー対は、標的核酸分子の群における１つの標的核酸分子の領域を増幅するように設計され、ここで、第１のＰＣＲは、標的核酸産物の第１のセットを産生する工程、２）ＰＣＲ混合物中で第２のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この混合物は、ＰＣＲ産物の第１群の一部分および標的核酸産物の１つを増幅するように設計される第２のＰＣＲプライマー対を含み、ここで、第２のＰＣＲは、標的核酸分子の１つに関連する第２の標的核酸ＰＣＲ産物を産生する工程、３）標的核酸分子を含むサンプル中に存在する第２の標的核酸産物のコピー数を定量する工程、を包含する方法。
【請求項２】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、１）第１のＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、このＰＣＲは、少なくとも２つの異なるプライマー対で実行され、ここで、各プライマー対は、異なる標的遺伝子の発現転写に特異的である工程、２）各標的核酸に対して第２のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この第２のＰＣＲは、第２のプライマー対を含み、ここで、この第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲ混合物の一部分を含む工程、３）各標的核酸についてそれぞれ第２のＰＣＲの開始物質の量を比較する工程、を包含する方法。
【請求項３】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、１）第１のＰＣＲ産物のセットを産生する第１のＰＣＲプライマー対のセットを含む第１のＰＣＲを実行する工程、２）第２のＰＣＲ産物を産生する標的核酸の１つおよび第１のＰＣＲ産物のセットの一部分に特異的な第２のプライマー対を含む第２のＰＣＲを実行する工程、３）第２のＰＣＲ中に存在する各標的核酸のコピー数を比較する工程、を包含する方法。
【請求項４】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、第１のＰＣＲ産物のセットを産生する第１のＰＣＲプライマー対のセットを含む第１のＰＣＲを実行する工程、２）第２のＰＣＲ産物を産生する第２のプライマー対および第１のＰＣＲ産物のセットの一部分を含む第２のＰＣＲを実行する工程、３）標準曲線に対する第２のＰＣＲの閾値サイクルを比較する工程であって、ここで、この標準曲線は、閾値サイクル  対  ＤＮＡのコピー数をプロットする工程、を包含する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対は、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、このフォワードプライマーおよびリバースプライマーがおよそ等モルである、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対のセットにおけるそれぞれの他の第１のＰＣＲプライマー対と大よそ等モルである、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対が、約５０％のＧＣ含量を有する、方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲがホットスタートによって開始される、方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲが１５サイクル未満またはそれと同等なサイクルの間実行される、方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、１００〜１０００ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１２】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、２０〜１５００ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、１７７〜２３７ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１の標的核酸産物が２５０ヌクレオチド未満の長さである、方法。
【請求項１５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１の標的核酸産物が２５０ヌクレオチド未満の長さである、方法。
【請求項１６】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲが少なくとも１９ＰＣＲプライマー対で実行される、方法。
【請求項１７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲが１つのＰＣＲプライマー対で実行される、方法。
【請求項１８】
請求項４に記載の方法であって、ここで、ステップ２におけるプライマー対が、ステップ１における任意のプライマー対とは異なる、方法。
【請求項１９】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対のセットにおいて存在するプライマー対である、方法。
【請求項２０】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対と同じ領域の標的核酸を増幅する、方法。
【請求項２１】
請求項４に記載の方法であって、ここで、ステップ２におけるプライマー対が普遍プライマー配列を含む、方法。
【請求項２２】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１のＰＣＲ産物のセットが、少なくとも５個の異なる標的核酸分子に由来する、方法。
【請求項２３】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１のＰＣＲ産物のセットが、少なくとも１５個の異なる標的核酸分子に由来する、方法。
【請求項２４】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対に由来するプライマーの１つが蛍光検出と関連する配列を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、この蛍光検出が、ＳＹＢＲグリーン、Ｔａｑｍａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、およびＥｃｌｉｓｐｅ  Ｐｒｏｂｅからなる群から選択される蛍光レポータープローブの使用を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、蛍光レポータープローブがクエンチャーと結合する、方法。
【請求項２７】
請求項４に記載の方法であって、さらに第１のＰＣＲを実行する以前の標的核酸分子と関連するｃＤＮＡを産生する工程を包含する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、さらにｃＤＮＡを産生する前にＲＮＡを産生する工程を包含する方法。
【請求項２９】
被験体がアルツハイマー病になるおそれがあるか否かを決定する方法であって、被験体からのサンプルに関して請求項１、２６、または２８に記載の方法を実行し、そして被験体における標的核酸の群のコピー数と、コントロールにおける標的核酸の群を比較する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも４つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも５つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも６つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項３８】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される２対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される３対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４０】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第の１プライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される４対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される２対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４２】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される６対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「マルチプレックスリアルタイム定量的ＰＣＲ」と題された、２００１年１１月３０日に提出された米国仮出願番号第６０／３３６，０９５号および「マルチプレックスリアルタイム定量的ＰＣＲ」と題された、２００２年７月１９日に提出された米国仮出願番号第６０／３９７，４７５号に対して優先権を主張し、これらの出願はどちらもその全体として本明細書中で参考文献として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（Ｉ．背景）
ｃＤＮＡおよび大きなオリゴヌクレオチドアレイハイブリダイゼーションのような技術の発達は、単一の実験において、数千の遺伝子を転写物レベルで分析することを可能にする。これらのアプローチは、ゲノム機能解析の基幹を形成する。それにもかかわらず、その技術の限界または適当なコントロールを設定することの困難さのために、そのようなアプローチで得られた結果の確実性は疑われてきた。従って、代替方法でｃＤＮＡおよびオリゴアレイ分析を確認することが必要である。差次的遺伝子発現パターンを分析することによって、疾患、例えばアルツハイマー病のような神経変性性疾患の初期診断を定義および確認する必要も存在する。アルツハイマー病に関して、唯一の信頼できる診断は、死後である。初期、前臨床および比較的非侵襲的な診断は、現在利用可能な治療の有効性を改善し、そのような疾患に関連する破壊的な臨床的症状を遅らせ、そして予防さえし得る。存在する方法は、そのうち４つのみが同定された、異なるフルオロフォアを使用することに焦点を合わせ、そして従ってこれが分析し得る遺伝子の数を制限するので、ＤＮＡ増幅手順は、典型的には遺伝子のクラスターまたは細胞の集団を定量的に分析するために使用されない。従って、多くの遺伝子、例えば５０、１００、またはそれ以上を単一の分析において分析し得るＰＣＲアプローチが必要である。これらの必要性に取り組むマルチプレックスリアルタイム定量的ＰＣＲ試薬および方法が開示される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（ＩＩ．要旨）
所定のサンプルにおいて１つより多くの遺伝子転写物を分析する組成物および方法が開示される。
【０００４】
さらなる利点および実施形態を、以下の説明において部分的に述べる。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、例示および説明のためのみであり、そして制限しないことが理解される。
【０００５】
（詳細な説明）
本化合物、組成物、物品、装置、および／または方法を開示および記載する前に、もちろんそのようなものは変化し得るので、それらは他に明記しなければ、特定の合成方法または特定の組換え生物工学方法に、または他に明記しなければ特定の試薬に制限されないことが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、そして制限することを意図しないことも理解される。
【０００６】
（Ａ．組成物および方法）
アレイ技術を使用する有効なアプローチは、ヒト疾患の分子的基礎を理解するために重要である。基礎となる病理の分子的メカニズムの同定がきわめて重要である、アルツハイマー病のコンテクストにおいて、微小量の開始材料からコピー数レベルで多数の遺伝子の発現を同時に定量し得る、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに基づいたハイスループットアプローチであるアッセイが開示される。ヒト脳においてこのアプローチを使用して、１度に１９個の遺伝子を１つの型の蛍光プローブのみで定量した。含まれる遺伝子の数は、かなり増加させ得る。これら１９個の候補遺伝子中、ＡＤにおける一致した変化の例は、樹状突起およびシナプス装置に関連する標的における減少を含んでいた。同じ脳領域および同じ被験体からのマイクロアレイ分析との比較データも開示される。これらの技術を、診断的目的および基礎研究のために、広く使用し得る。
【０００７】
規定された組織サンプルから抽出された多くの転写物の同時定量は、分子神経生物学に関する基礎的な情報を提供する。同定された疾患の状態において、そのような情報は、基礎となる病理の分子カスケードの理解を助ける。一致した発現プロファイリング、およびコピー数レベルでの、および微小量の開始材料からの多数の遺伝子の分析を可能にする方法が開示される。シングルチャネル定量的マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ（ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ）が開示される。１つの蛍光レポータープローブのみを使用して行ない得る方法が開示され、それは伝統的なマルチチャネルマルチプレックス定量的ＰＣＲ方法において直面する高いバックグラウンドを防止するのを助ける。開示された方法の均一性、感受性および特異性は、単一転写物リアルタイムＰＣＲと同等である（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９９）。
【０００８】
開示された方法および組成物は、多くの異なる遺伝子の発現を同時に分析することを可能にするために設計される。開示された方法は、標的遺伝子の相対的量および絶対的量を定量し得る。現在利用可能な方法は、マイクロアレイにおけるように、間接的な指標として蛍光強度を用いることによって、半定量的または定性的遺伝子発現レベルしか提供しないか、またはその方法は、広く入手可能な異なる蛍光チャネルの数によって制限されるため、典型的には１度に５遺伝子より少ない分析に制限される（Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２５、１６９−１９３）。開示された方法は、１つより多くのレポーターと共に使用し得るが、１つのレポーターシグナルのみで機能し得る。開示された方法を１つより多くのレポーターと共に使用する場合、分析し得る遺伝子の数はそれによって増加する。１つの蛍光レポーターしか必要としないことは、１度に１つより多くの遺伝子を見るための他のシステムにおいて直面する、高いバックグラウンドを防止する。
【０００９】
複数の遺伝子の発現を同時に分析するための、ＰＣＲに基づくハイスループット方法が、本明細書中で開示される。その方法は、微小量の開始材料を使用し得、そして単一コピーレベルの効率に達し得、例えばここで単一標的細胞由来の単一コピーの転写物のような、単一の標的核酸のみが利用可能である。例えば、４人の被験体に関する３連の、２０個の転写物の分析のために、被験体あたり１μｇより少ない全ＲＮＡが必要である。開示された方法は、複数の遺伝子を同時に分析し得る。開示された方法は、特定の方法で遺伝子特異的プライマーを使用する。開示された方法は、蛍光プローブのような、単一のシグナル試薬の使用によって、複数の遺伝子を定量し得る。
【００１０】
一般的に、その方法は、単一細胞程度の少量を含み得るサンプルにおいて、多くの異なる遺伝子の発現について定量的情報を得るために有用である。開示された方法は定量的であるので、様々な異なる細胞状態または細胞型間の、定量的レベルにおける発現パターンの比較を達成し得る。一般的に、全ＲＮＡを、あらゆる単離手順を使用して標的サンプルから単離し得る。このＲＮＡを次いで、あらゆる手順を使用して、例えばランダムプライマーまたはオリゴｄｔプライマー、またはランダムオリゴｄｔプライマー（全ての可能な組み合せをカバーする特異的配列の短いストレッチに３’末端で結合したオリゴｄｔプライマーであり、プライマーがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合するポリＡ区域（ｔｒａｃｔ）および非ポリＡ区域間の連結部にプライム（ｐｒｉｍｅ）する）を使用して、第１鎖コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を産生するために使用し得る。そのｃＤＮＡを次いで、ＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用する。このＰＣＲ反応を、追跡される発現遺伝子に特異的な、プライマー対、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて行なう。この反応は、望ましいだけ多くの異なるプライマー対を含み得るが、典型的にはそれぞれ単一遺伝子または単一アイソフォームに特異的な、５から１００の間の異なるプライマーのセットを含む（５から１００の間のあらゆる特定の数を含む）。典型的には、全てのプライマーは約等モル濃度である。ＤＮＡがまだ約８０％または８５％または９０％または９５％より高い倍加速度で増幅しているように、多くのＰＣＲサイクル、例えば１５サイクルを行なった後に、ＰＣＲを停止する。典型的には、初回のＰＣＲにおいて、もし定量的ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行なったなら、増幅の閾値サイクルには到達しない。しかし、ある実施形態における開示された方法は、もし増幅が約９または８または７または６または５または４または３または２または１サイクルより少なく閾値サイクルを超えて進んでも、まだ有効であり得る。初回のサイクル数は、開始材料の量に依存する。例えば、単一細胞実験のために２０サイクルを使用し得る。ＰＣＲ反応を次いで、（新しい）２回目のＰＣＲのために、新しい反応チューブに分割する。そのチューブはそれぞれ、最初のＰＣＲ混合物に存在する全ての特異的プライマーから産生された全ての産物を含む、前のＰＣＲ反応混合物の画分を含む。最初のＰＣＲ混合物の画分を含む２番目のＰＣＲ混合物において、典型的には分子ビーコンを結合したユニバーサルプライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ）に加えて、１つのみの特異的なプライマー対または新規のプライマー対を加え、そしてＰＣＲを行なう。典型的には、この２回目のＰＣＲは、定量的リアルタイムＰＣＲプロトコールを用いて行ない、それは例えばユニプライマー（ｕｎｉｐｒｉｍｅｒ）（ユニバーサルプライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ））がＤＮＡ配列と結合する間に、クエンチャー配列からの蛍光の放出による（例えば、増幅プローブの１つの一部にハイブリダイズするプローブ）、ＰＣＲの各サイクルにおける蛍光の増加に依存する。リアルタイム定量的ＰＣＲで使用する蛍光アプローチは、典型的にはＳＹ��Ｒグリーン、ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ等のような蛍光レポーター色素、およびＤＡＢＳＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ等のようなクエンチャーに基づく。ＰＣＲの伸長期にクエンチャーがプローブから分離すると、レポーターの蛍光を測定し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ、Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ＰｒｉｍｅｒｓまたはＳｕｎｒｉｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒおよび他のようなシステムは、このアプローチを使用してリアルタイム定量的ＰＣＲを行なう。リアルタイムプローブに関連する方法および試薬の例は、米国特許第５，９２５，５１７号；同第６，１０３，４７６号；同第６，１５０，０９７号；および同第６，０３７，１３０号において見出し得、それらは少なくとも核酸の検出方法およびＰＣＲ方法に関連する材料に関して、本明細書中で参考として援用される。２回目のＰＣＲから得られたデータを、例えば標的細胞を含む標的サンプル中の、もとの開始材料の絶対的なコピー数と正確に関連付け得るように、上記の工程を行なうことに加えて、プライマー対に関して、そして典型的には個々のプライマー対それぞれに関して、標準曲線を作製しなければならない。一般的な方法のこれらの工程それぞれ、および試薬およびその方法のバリエーションが、本明細書中で詳しく議論される。開示された方法を理解するための重要な局面は、全ての標的遺伝子産物または遺伝子産物の断片が増幅される、バッチＰＣＲ混合物中に複数の異なるプライマー対を含む最初のＰＣＲと、バッチＰＣＲ混合物の一部が特異的プライマー対で増幅され、特異的増幅反応が起こる２番目のＰＣＲパネルとの組み合せである。定量は、典型的には完全なプライマー対または個々のプライマー対それぞれに関して産生された標準曲線を参照することによって達成される。
【００１１】
１μｇの全ＲＮＡを使用する方法が開示され、それは並行して分析する転写物の数を、以下の事実に基づいて増加させることを可能にする：まず分析を行なうために５％の逆転写材料のみを使用した；２番目に、２回目のＰＣＲ反応それぞれのために、１％の初回産物のみを使用した。従って、少なくとも５００まで、またはそれ以上の標的を、１μｇの全ＲＮＡから並行して分析し得る。あるいは、開始材料の量を、単一細胞転写物増幅のレベルまで高度に抑制し得る。ａＲＮＡ増幅（Ｍｉｙａｓｈｉｒｏら、１９９４）のような他の単一細胞技術と組み合せて使用し得る方法が開示される。異なる技術と開示された方法との組み合せは、単一細胞技術の正確さを増加させ得る。
【００１２】
開示された方法を、あらゆる型の検出システムとともに使用し得る。例えば、その５’末端にユニバーサル配列を含む「サンライズ（ｓｕｎｒｉｓｅ）」プライマー（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、１９９７）、および大きな修飾無しで「分子ビーコン」アプローチ（Ｔａｑｍａｎ）（Ｂｕｓｔｉｎ、２０００）を使用し得る。核酸を同定するために多くの方法が存在し、そしてこれらの方法は全て、各技術の範囲内で、開示された方法と共に有効である。
【００１３】
また、開示された方法において標準曲線を使用し得るが、Ｃ（ｔ）を使用する分析のような、標的の絶対的コピー数を得るための他の方法も使用し得る。
【００１４】
正常な加齢と神経変性性疾患との間の遺伝子発現の比較は、多くの場合、しばしば参照値として使用されるＧＡＰＤＨおよびβアクチンのような「ハウスキーピング」遺伝子が、疾患の進行の間に変化するという事実によって妨げられる。ＡＤにおけるこれら遺伝子の変化した発現は、ＡＤにおいて起こることが知られている代謝および構造的変化と一致する（Ｂｒａａｋら、１９９９；Ｄｉｃｋｓｏｎ、２００１；Ｐｅｒｌ、２０００）。参照標準として「ハウスキーピング」遺伝子を使用することによって誘発される問題は、開示された方法によって産生される、絶対的コピー数の定量によって抑制される。従って、各標的に関するコピー数レベルでの定量および多くの標的の並行した定量をあわせることによって、ＡＤにおいて一致して変化するデータを生成する、ほとんど樹状突起およびシナプスに関連する遺伝子のセットが開示される。これは、樹状突起およびシナプス機構は、ＡＤにおいて確実に影響されるという発見による（Ｓｍａｌｌら、２００１）。
【００１５】
開示された方法を使用して、遺伝子のグループの発現パターンを分析して異なる疾患サブタイプを分離し得、それは臨床的診断のために有望なアプローチであった（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、２００１；Ｐｏｍｅｒｏｙら、２００２；ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、２００２）。しかし、現在の出版物は、主にマイクロアレイ研究から得られ、それは多くの理由（時間、コスト等）のために実用的な適用から制限される。開示された方法は、候補遺伝子の選択においてより柔軟性を提供し、そして有意により少数の遺伝子を有するグループの確固とした分離を可能にする。実際、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲとＰＣＡのような多変量統計分析との組み合せを、神経変性性疾患に限らず、あらゆる疾患の初期同定のために使用し得る。樹状突起およびシナプス装置に関連する７つの転写物による開示された結果に基づいて、ＰＣＡと組み合せたｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの使用によって示された、分子的および統計学的ツールの開示された組み合せを、年齢を一致させたコントロールおよび中間段階ＡＤ症例の間を区別するために使用し得る。例として、ＡＤの臨床基準を満たさないが生検においてＡＤの神経病理学的基準を満たす中間段階症例が、その遺伝子発現に基づいてコントロールから分離されたことが本明細書中で開示される。実際、この種の試験は、関心のある異なる集団を分子レベルで迅速に分離し得るという意味で、あらゆる大規模分析の必要条件であり得る。
【００１６】
ＡＤは、複雑な、二分する（ｄｉｃｈｏｔｏｍｏｕｓ）、および不均一な疾患である（ＴａｎｚｉおよびＢｅｒｔｒａｍ、２００１）。病理生物学的および遺伝的連鎖アプローチの両方に基づいて、「強力なＡＤ候補」の探索は、今や大規模マイクロアレイの使用に非常に依存している。明らかに必要不可欠であるが、アレイアプローチは、一致、不一致またはありそうな擬陽性／陰性発見の間を区別する、独立した確認が必要であることも、広く認識される。ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲは、マイクロアレイの確認を可能にする、そのような独立した実験技術のパラメーターに従う。マイクロアレイデータに基づいてＡＤにおいて豊富にある、または減少することが予測される転写物の評価は、約半分の候補においてのみ確認されたことが、本明細書中で開示される。倍数変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅｓ）は重要ではないという事実にもかかわらず、ほとんどの候補は、アレイにおいて一致した変化を示したことを指摘すべきである。言い換えると、これらの変化はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術を用いて研究したサンプル中で確固としており、そして再現できたが、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲで試験した場合に確認されなかった。これらの転写物を、ＰＣＡを用いて全体として分析した場合、両方の技術がＡＤ症例からコントロールを分離できたが、アレイは「移行する」症例を区別するために必要な正確さのレベルを欠いていた。言い換えると、アレイ分析は正確な説明を生じ、そしてｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲはこれに、以前のアプローチには無かった、試験における予測のレベルを加えた。これらの予測は、この場合、死後の診断によって確認される。
【００１７】
従って、アルツハイマー病のような疾患の分子的診断を行なう際に正確さの増加を可能にする方法が開示される。開示された方法は、多くの異なる遺伝子の定量を可能にする。
【００１８】
（１．方法）
（ａ）一般的な方法）
一般的な方法は、単一の分析的事象における、複数の遺伝子の遺伝子発現パターンの定量的分析に引かれる（ｉｓ  ｄｒａｗｎ  ｔｏ）。この型の方法に関する必要性は大きい。存在する方法は、増幅方法を用いて１回で複数の遺伝子を正確に追跡できないために、定性的分析にのみ依存する。さらに、ハイブリダイゼーションに依存する半定量的手段、例えばチップ技術およびマイクロアレイは、その複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）能力を確認する方法を必要とする。従って、開示された方法は、核酸増幅技術に依存する定量的手段を提供する。
【００１９】
一般的に、その方法は、ｃＤＮＡを生成するための逆転写工程、異なる標的遺伝子発現転写物に対して特異的な複数の異なる特異的プライマー対を用いて行なう第１のＰＣＲ反応工程（ここで第１のＰＣＲは同時に全ての標的産物を産生し、第２のＰＣＲ混合物のアリコートに対する特異的プライマー対のうちの１つのみを用いて行なわれる）、第２のＰＣＲ工程（これは、典型的には他の個々の特異的プライマー対の全ての第２のＰＣＲと平行して行なわれる）、および第２のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の量を、特異的プライマー対に関して作製された標準曲線、または独特のプライマー対から作製された代表的な標準曲線と比較する工程、を使用し得る。
【００２０】
サンプル中の標的核酸を定量する方法が開示され、この方法は、以下の工程を包含する：１）第１のＰＣＲ産物のセットを生成する、ＰＣＲプライマー対の第１のセットを含む、第１のＰＣＲを行なう工程、２）第２のＰＣＲ産物を生成する、第２のプライマー対および第１のＰＣＲ産物のセットのアリコートを含む、第２のＰＣＲを行なう工程、３）第１のＰＣＲ産物のセットのアリコートから生成された各ＰＣＲ産物についての標準曲線を作製する工程、および４）第２のＰＣＲ産物を標準曲線と比較する工程を含む。ここでこの混合物は標的核酸分子のグループおよび第１のＰＣＲプライマー対のグループを含み、ここで各プライマー対は標的核酸分子のグループにおいて標的核酸分子の１つの領域を増幅するよう設計され、ここでＰＣＲは標的核酸分子に関連するＰＣＲ産物の第１のグループを生成する、工程、２）ＰＣＲ混合物において第２のＰＣＲを行なう工程であって、ここでその混合物はＰＣＲ産物の第１のグループのアリコートおよび標的核酸産物のうちの１つを増幅するよう設計される単一のプライマー対を含み、ここで第２のＰＣＲは、標的核酸分子のうちの１つに関連する第２の標的核酸ＰＣＲ産物を生成する、工程、ならびに３）標的核酸分子を含むサンプル中に存在する、第２の標的核酸産物のコピー数を定量する、工程。
【００２１】
標的核酸分子を含むサンプル中に存在する標的核酸分子のグループの、相対的コピー数を決定する方法が開示され、この方法は、以下の工程を包含する：１）ＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを行なう工程であって、ここでその混合物は標的核酸分子のグループおよび第１のＰＣＲプライマー対のグループを含み、ここで各プライマー対は標的核酸分子のグループにおいて標的核酸分子のうちの１つの領域を増幅するように設計され、ここでＰＣＲは標的核酸分子に関連するＰＣＲ産物の第１のグループを生成する、工程、２）ＰＣＲ混合物中で第２のＰＣＲを行なう工程であって、ここでこの混合物は、第１のＰＣＲ産物のグループのアリコートおよび標的核酸産物のうちの１つを増幅するよう設計された単一のプライマー対を含み、ここで第２のＰＣＲは、標的核酸分子の１つに関連する第２の標的核酸ＰＣＲ産物を生成する、工程、ならびに３）標的核酸分子を含むサンプル中に存在する第２の標的核酸産物のコピー数を定量する、工程。
【００２２】
第１のＰＣＲプライマー対それぞれが、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーを含み、順方向および逆方向プライマーが約等モルであり、第１のプライマーＰＣＲセットの各々が、第１のＰＣＲプライマー対のグループにおける他の第１のＰＣＲプライマー対の各々とほぼ等モルであり、そして／または第１のＰＣＲプライマーの各々が約５０％のＧＣ含量を有する方法も開示される。
【００２３】
第１のＰＣＲをホットスタートで開始する方法も開示される。
【００２４】
第１の標的核酸産物が、５００ヌクレオチド長よりも短いか、または第１の標的核酸産物それぞれが、５００ヌクレオチド長よりも短い方法も開示される。
【００２５】
第１のＰＣＲを少なくとも２セットの遺伝子特異的プライマーを用いて行なうか、または第２のＰＣＲを１セットの遺伝子特異的プライマーを用いて行なう方法も開示される。
【００２６】
第１のＰＣＲにおいてプライマー対が等モルであるか、またはプライマー対のグループにおいて、各プライマー対が互いに等モルである方法も開示される。
【００２７】
第２のＰＣＲにおけるプライマー対が、第１のＰＣＲにおけるいかなるプライマー対とも異なり、第２のＰＣＲにおけるプライマー対がユニバーサルプライマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ）配列を含む方法も開示される。
【００２８】
ＰＣＲ産物の第１のグループが、少なくとも５つの異なる標的核酸分子から誘導された方法も開示される。
【００２９】
標的核酸分子から生成された産物が、全て１７７ヌクレオチド長と２３７ヌクレオチド長の間であるが、２０〜１５００塩基対の範囲であり得る方法も開示される。
【００３０】
単一のプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対のグループに存在しないプライマー対であり、単一のプライマー対が第１のＰＣＲプライマー対のグループに存在するプライマー対であるか、または第２のＰＣＲが、少なくとも１つの異なる単一プライマー対および少なくとも１つの第１のプライマー対と同じ単一プライマー対を有する方法も開示される。
【００３１】
第２のＰＣＲにおける単一プライマー対由来のプライマーの１つが、蛍光レポーターと相互作用するか、または蛍光レポーターから誘導される方法も開示される。
【００３２】
蛍光レポーターが、ＳＹＢＲグリーン、Ｔａｑｍａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｕｎｒｉｓｅ  ＰｒｉｍｅｒおよびＥｃｌｉｓｐｅ  Ｐｒｏｂｅからなるグループから選択される方法も開示される。
【００３３】
蛍光レポータープローブを、クエンチャーと結合させる方法も開示される。
【００３４】
標的核酸分子を含むサンプル中に存在する、第２のＰＣＲ産物に関連する標的核酸分子のコピー数を定量する工程が、第２のＰＣＲ産物の量を標準曲線と比較することを含む方法も開示される。
【００３５】
標準曲線が、第２のＰＣＲ産物に特異的である方法も開示される。
【００３６】
第１のＰＣＲを行なう前に、標的核酸分子と関連するｃＤＮＡを生成する工程をさらに包含する方法も開示される。
【００３７】
ｃＤＮＡを産生する前に、ＲＮＡを生成する工程をさらに包含する方法も開示される。
【００３８】
（１）ＲＮＡの調製
開示された方法は、典型的には、あるレベルのＲＮＡ調製を含む。ＲＮＡ調製工程は、連続的な方法の一部として行なわれる必要はないが、その方法はＰＣＲ反応のためにテンプレートを必要とする。ＰＣＲ反応のテンプレートは、典型的にはＤＮＡであり、かつ典型的には分析される標的材料は発現されたｍＲＮＡであるので、典型的には第１のＰＣＲ反応のための開始テンプレート材料は、ｍＲＮＡを含む精製ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡである。理論的には、ＲＮＡ調製工程は、実際の増幅および定量工程から遠く離れて、例えば別の実験室で、またはより早い時期に行なわれ得るが、多くの実施形態において、ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの調製は、本方法の増幅および定量工程と同時に起こるが、このことは必要ではない。しかし、本方法を、例えば、存在するｃＤＮＡライブラリー、および他の存在するＤＮＡライブラリーに対して行ない得ることが、理解される。
【００３９】
ＲＮＡ調製工程が開示された方法に含まれる場合、ＲＮＡ調製の方法は、酵素的に操作可能なｍＲＮＡを生成する、任意のＲＮＡ調製方法であり得る。例えば、ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート−超遠心方法、グアニジニウムおよびフェノール−クロロホルム方法、塩化リチウム−ＳＤＳ−尿素方法またはオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いる組織溶解物由来のポリＡ＋／ｍＲＮＡ方法によって単離し得る（例えば、Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ，Ｃ．Ｌ．ら、（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４、４３０−４３３；Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ、Ｎ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６（１９８７）；ＡｕｆｆｒａｙおよびＦ．Ｒｏｕｇｅｏｎ（１９８０）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：３０３−３１４；Ａｖｉｖ  Ｈ、Ｌｅｄｅｒ  Ｐ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、１４０８−１４１２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第１巻、７．２６−７．２９におけるポリＡ＋ＲＮＡの選択を参照のこと。これらは全て、少なくともＲＮＡ精製および単離に関連する材料に関して、本明細書中で参考として援用される）。
【００４０】
ＲＮＡを単離する場合に、十分なＲＮＡを単離することが重要である。さらに、典型的には得られたＲＮＡの量を決定し得る。例えば、典型的には少なくとも０．０１ｎｇまたは０．５ｎｇまたは１ｎｇまたは１０ｎｇまたは１００ｎｇまたは１，０００ｎｇまたは１０，０００ｎｇまたは１００，０００ｎｇのＲＮＡを単離し得る。本明細書中で議論されるように、増幅ＰＣＲの間に、増幅を停止した場合、残りの各標的産物の増幅が、少なくとも約８０％または８５％または９０％または９５％の倍加速度であることが重要である。およそ倍加速度のままでありつづけるように行なわれるＰＣＲのサイクル数は、ｃＤＮＡ生成工程に使用された総ＲＮＡの量に関連する。
【００４１】
ＲＮＡを、任意の所望の細胞または細胞型から、ならびにマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトのような哺乳動物、ならびに魚類または両生類のような他の非哺乳類動物、ならびに植物および細菌のような前核細胞さえも含む、任意の生物から単離し得る。従って、本方法で使用するＤＮＡも、ＲＮＡに関して開示されたもののようなあらゆる生物由来であり得る。
【００４２】
（２）ｃＤＮＡの生成
開示された方法は、典型的にはあるレベルのｃＤＮＡ調製を含む。ｃＤＮＡ調製工程は、連続的な方法の一部として行なわれる必要はないが、その方法はＰＣＲ反応のためにテンプレートを必要とする。ＰＣＲ反応のテンプレートは、典型的にはＤＮＡであり、そして典型的には分析される標的材料は、発現されたｍＲＮＡであるので、典型的には第１のＰＣＲ反応のための開始テンプレート材料は、ｍＲＮＡを含む精製ＲＮＡから産生されたｃＤＮＡである。理論的には、ｃＤＮＡ調製工程を実際の増幅および定量工程から遠く離れて、例えば別の研究室において、またはより早い時期に行なわれ得るが、多くの実施形態において、ｃＤＮＡの調製は、その方法の増幅および定量工程と同時に起こるが、このことは必要ではない。
【００４３】
ｃＤＮＡ調製工程が開示された方法に含まれる場合、ｃＤＮＡの調製方法は、酵素的に操作可能なｃＤＮＡを生成するあらゆるｃＤＮＡ調製方法であり得る。例えば、ｃＤＮＡを、例えばランダムプライマー、ポリ−ｄ（Ｔ）オリゴ、またはＮＶｄ（Ｔ）オリゴを使用することによって調製し得る。データの標準化の目的のために、典型的には等量の全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために使用する。ＰＣＲにおいて使用するためのｃＤＮＡを生成するために逆転写を行う多くの例が存在し、これらの例としては、以下が挙げられる：Ｇｌｉｓｉｎ  Ｖ．、Ｒ．ＣｒｋｖｅｎｊａｋｏｖおよびＣ．Ｂｙｕｓ（１９７４）塩化セシウム遠心分離によって単離されたリボ核酸  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２６３３−７；Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．、Ｊ．Ｓｈｉｎｅ、Ｊ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｒ．Ｐｉｃｔｅｔ、Ｅ．Ｔｉｓｃｈｅｒ、Ｗ．Ｊ．ＲｕｔｔｅｒおよびＨ．Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ（１９７７）ラットインスリン遺伝子：コード配列を含むプラスミドの構築  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１３１３；Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  Ｊ．Ｍ．、Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｙｂｙｌａ、Ｒ．Ｊ．ＭａｃＤｏｎａｌｄおよびＷ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ（１９７９）リボヌクレアーゼが豊富な供給源からの生物学的に活性なリボ核酸の単離、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−９；Ｆａｕｌｋｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  Ｂ．Ｅ．、Ｄ．Ｓ．Ｃｒａｍ、Ｊ．ＫｕｎおよびＬ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ（１９９３）マウスおよびラットの膵臓ｂ細胞および他の末梢組織における２つのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の発現の局在および定量  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３３：２９６２−２９７２；およびＧｏｎｄａ  Ｔ．Ｊ．、Ｄ．Ｋ．ＳｈｅｉｎｅｓｓおよびＪ．Ｍ．Ｂｉｓｈｏｐ（１９８２）レトロウイルス癌遺伝子の細胞ホモログ由来の転写物：ニワトリ組織間の分布  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：６１７−６２４、これらは少なくともＤＡＮ増幅に関連する材料に関して、本明細書中で参考として援用される。
【００４４】
（３）第１のＰＣＲ
開示された方法は、第１のＰＣＲを行なう工程を包含する。第１のＰＣＲは、典型的には潜在的に標的核酸分子を含む分子に対して行なわれる。従って、例えば、第１のＰＣＲは、ＰＣＲによって操作可能な標的核酸分子または標的核酸分子のコピー、例えばＤＮＡ、例えば市販のｃＤＮＡライブラリーまたは開示された方法で使用するために新規に作製されたｃＤＮＡライブラリーのようなｃＤＮＡテンプレートを含む。開示された方法は、典型的には第１のＰＣＲ反応の間にプライマー対のグループが同時に使用されることを必要とする。プライマー対は少なくとも特異的標的テンプレートに関する順方向および逆方向プライマーを含む。プライマー対のグループは、少なくとも２つの異なるプライマー対を含む。プライマー対のグループは、典型的には少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００以上のプライマー対を含み得る。プライマー対のグループはまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００以上未満のプライマー対を含み得る。
【００４５】
プライマー対は、異なる標的遺伝子に関して特異的である。プライマーを実験的に使用する条件下で、プライマーの特異性を同定するためのアッセイにおいて、適当なサイクル数、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０サイクル後に、アガロースゲルにおいて意図する産物に対応するバンドのみが見える場合、プライマー対は特異的である。
【００４６】
プライマー対のグループが適合性であることは重要である。これは、プライマー対の所定のグループを構成するプライマー対は、お互いに、またはその同起源の遺伝子以外の標的遺伝子と相互作用すべきでないことを意味する。プライマー対の適合性は、当業者に利用可能な任意の方法を用いて決定され得る。例えば、核酸配列の所定のセットが、お互いに相互作用するかどうかを予測するためにアルゴリズムを使用するコンピュータープログラムが存在する（例えば、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ  ＴＭ）。グループで使用されるプライマー対が適合性かどうかを決定する別の方法は、経験的にプライマー対をお互いに対して試験し、そして必要に応じて修飾することである。例えば、設計された全てのプライマーで定性的マルチプレックスＰＣＲを行い、そしてＰＣＲ産物をアガロースゲルに流すことによって、情報を得ることができる。各ＰＣＲ産物に対応するバンドのみが作成されるなら、プライマー対は適合性であると考えられる。グループで使用されるプライマー対が適合性であるかどうかを、経験的にプライマー対をお互いに対して試験し、そして必要に応じて修飾することによって決定し得る。プライマー対は、典型的にはおよそ同じ溶解温度を有する。プライマー対はまた、典型的には約５０％のＧＣ含量を有する。プライマー対のグループ内の各プライマー対が、お互いのプライマー対とおよそ同じ溶解温度を有することも典型的である。同様に、プライマー対のグループ内の各プライマー対が、約５０％のＧＣ含量を有することは典型的である。プライマーの長さは、典型的には約１０ヌクレオチドと約３０ヌクレオチドの間であるが、ＤＮＡを増幅するために機能するあらゆる長さであり得る。プライマーは、典型的には約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、または１０ヌクレオチド長未満である。
【００４７】
第１のＰＣＲは、典型的には遺伝子の全長ではなく目的の標的遺伝子転写物の領域である産物を生成する。例えば、典型的には第１のＰＣＲから生成される産物は、約１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２２５、２００、１７５または１５０ヌクレオチド長未満である。
【００４８】
その産物はまた、例えば、約１００ヌクレオチド長と約２０００ヌクレオチド長、または約２００ヌクレオチド長と約１５００ヌクレオチド長、または約１００ヌクレオチドと約３００ヌクレオチドの間の範囲であり得る。最も長いメンバーのヌクレオチド数が、約３０００ヌクレオチド長までである、全ての他の可能な順列も、本明細書中で開示される。例として、典型的には分子ビーコン系と適合性であるために、ＰＣＲ産物は１８０−２５０ｂｐヌクレオチド長の間であるべきである。
【００４９】
ある実施形態において、第１のＰＣＲをホットスタートで開始する。ホットスタートを行なう多くの方法が存在するが、一般的に、ホットスタートは、単にプライマーの初回の伸長を行なう前に、ＰＣＲ混合物を９５℃のような高温で一定の時間加熱することを意味する。時間は変化し得るが、一般的にその時間は混合物に存在し得るあらゆる残留熱不安定性（ｎｏｎ−ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｌｅ）ポリメラーゼを破壊するのに十分長く、例えば９５℃で少なくとも５分または１０分または１５分である。
【００５０】
第１のＰＣＲを、使用されるプライマー対およびテンプレートに適切なあらゆる任意の条件を使用して行ない得る。例えば、ｄＮＴＰまたはプライマーまたは酵素または緩衝液の濃度条件は、ＰＣＲが起こることを可能にするあらゆる濃度であり得る。典型的には、ｄＮＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭと１０ｍＭの間であり得る。典型的には、プライマーの濃度はそれぞれ０．１μＭと０．５μＭの間であり得るが、典型的にはプライマー対はおよそ同じ濃度、すなわち等モルである。典型的には、酵素の濃度は、反応あたり１ユニットと３ユニットの間であり得る。典型的には、緩衝液の濃度および組成は、例えば熱安定性ポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の製造会社によって示唆されるように、１０×ストック溶液から１×最終濃度である。しかし、これらの以外の条件も有効であり得ること、そしてある場合においては経験的試験の後に決定し得ることが理解される。
【００５１】
あらゆる型の熱安定性ポリメラーゼを使用し得る。ホットスタートを行なうならば、熱安定性ポリメラーゼが、９０℃より高いような高温において長期間インキュベートするまで機能的でない型であることが好ましい。
【００５２】
第１のＰＣＲで行なうサイクル数は、第１のＰＣＲの開始時に存在する開始材料の量に関連する。本明細書中で議論されるように、各プライマー対およびそのプライマー対から生成された産物は、増幅が起こっている条件に関連するある倍加速度を有する。任意の所定のＰＣＲにおいて、産物の生成に関する倍加速度が存在し、そしてＰＣＲサイクルが続くにつれて、各ＰＣＲサイクルで生成されるＤＮＡの量が、その反応の倍加速度より下に減少し始める点が来る。この現象は、例えば反応混合物中のフリープライマーの損失に関連する。ＰＣＲの第１のサイクルにおいて、テンプレートに対して有意に過剰なプライマーが存在するが、テンプレートが増幅され、そしてＰＣＲの各サイクルがより多くの残りのプライマーを使用するので、フリーのテンプレートに対するプライマーのハイブリダイズが制限される点が来て、そしてこれがそのＰＣＲサイクルの間に起こる増幅の量を減少させ得る。
【００５３】
開示された方法は、典型的には第１のＰＣＲを増幅速度の有意な減少が起こる前に停止する、すなわちＰＣＲサイクルがそれ以上行なわれないように行なわれる。従って、典型的には第１のＰＣＲを、増幅が倍加速度の約９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％以下になる前に停止する。ある実施形態において、ＰＣＲを、増幅速度が倍加速度の約９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、または６５％以上であるときに停止する。
【００５４】
所定のサンプルの倍加速度を、経験的に決定し得ることが理解されるが、１．９９、１．９８、１．９７、１．９６、１．９５、１．９４、１．９３、１．９２、１．９１、１．９０、１．８９、１．８８、１．８７、１．８６、１．８５、１．８４、１．８３、１．８２、１．８１、１．８０、１．７９、１．７８、１．７７、１．７６、１．７５、１．７４、１．７３、１．７２、１．７１、１．７０、１．６５、１．６０、１．５５、１．５０、１．４０、および１．３０の倍加速度を見ることができる。およそこれらの数字およびより高いもしくはより低い、またはそれ以上もしくはそれ以下の倍加速度も開示されることが理解される。
【００５５】
典型的には、第１のＰＣＲのサイクル数は、使用される開始材料の量に関連し、そしてある状況においては、開始材料は細胞サンプルから調製された全ＲＮＡから産生されたｃＤＮＡである。開始材料はまた、開始ＤＮＡの混合物であり得る。例えば、最初のｃＤＮＡ鎖を産生するために単離および使用されたＲＮＡの量が約１μｇである場合、ＰＣＲの１５サイクルの後、倍加速度の約９５％にとどまることを、経験的に決定し得る。典型的には、１００ｎｇから３μｇの全ＲＮＡを使用する場合、１０−１５サイクルが、９５％より高い倍加速度を維持する。典型的には、全ＲＮＡの開始量は、約２０μｇまたは１５μｇまたは１０μｇまたは９μｇまたは８μｇまたは７μｇまたは６μｇまたは５μｇまたは４μｇまたは３μｇまたは２μｇまたは１μｇまたは単一細胞に存在し得るＲＮＡ量以下である。開示された方法を、単一転写物のデータを産生するために典型的には少なくとも１０μｇの全ＲＮＡを必要とする、ノーザンブロット分析のような他の方法よりも少ないＲＮＡを用いて使用し得る。開示された方法は、全ＲＮＡサンプルに含まれる単一コピー数程度の少ない転写物を使用し得る。ＲＮＡ量の下方制限に関する唯一の制限因子は、単離されたＲＮＡの全量が減少するにつれて、低いコピー数で存在するあらゆる所定の転写物を失う可能性が増加することである。例えば、使用するＲＮＡ量が減少すると、最終的には、確率が原因で、もともと低いコピー数であった転写物の単一コピーを含まない量に達する。これが全ての状況で起こるＲＮＡの絶対量は存在しないが、約３０ｎｇまたは３５ｎｇまたは４０ｎｇまたは４５ｎｇまたは５０ｎｇまたは５５ｎｇまたは６０ｎｇまたは６５ｎｇまたは７０ｎｇまたは７５ｎｇまたは８０ｎｇより高いＤＮＡ量は、典型的には低いコピー数の転写物を失う問題に直面しない。しかし、これより少ないＲＮＡが使用される場合、単一コピー転写物の潜在的な損失のために、分析の反復を調整し得る。
【００５６】
第１のＰＣＲの条件を最適化することはまた、必要ではないが筋が通っている。これは、典型的には、例えば使用されるべき最善の温度、時間、プライマー濃度、およびＰＣＲサイクル数を同定するために典型的には平行して行なわれる、異なる条件下で行なわれる一連のＰＣＲを伴う。
【００５７】
第１のＰＣＲが完了した後、使用された標的特異的プライマー対によって決定されるように、ＰＣＲ中に開始標的核酸分子に関連する産物の混合物が存在する。ＰＣＲの終わりのＤＮＡ量は、部分的には、混合物に存在する開始鋳型の量によって決定されるので、そして標的核酸に関する開始材料の量は、典型的には異なるので、各標的核酸に関する産物材料の量は、典型的には異なる。開示された方法において、典型的には定量はこの時点で起こらない。産物の量の違いの定性的評価を、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または通常のＰＣＲおよびアガロースゲルを用いて産物を分析することによって得ることができる。定性的マルチプレックスＰＣＲを行なう例が存在し、それらのいくつかは以下の参考文献において述べられる：
【００５８】
【数１】
2005511055.tif 000002
2005511055.tif 000003
これらは少なくとも核酸増幅に関連する方法に関連する材料に関して、本明細書中で参考として援用される。本方法によって提供される定量の正確さは、この第１のＰＣＲと第２のＰＣＲとの組み合せ、および第２のＰＣＲにおける産物の反応混合物またはプライマー対に関する標準曲線との比較と共に起こる。
【００５９】
（４）第２のＰＣＲ
一般的に、典型的には第２のＰＣＲで利用される第２のＰＣＲ混合物の数は、第１のＰＣＲプライマー対のグループにおける異なる第１のＰＣＲプライマー対の数と同じである。第１のＰＣＲは１つの反応混合物にプライマー対のグループを有していたが、第２のＰＣＲは、典型的には単一の反応混合物中に存在する単一のまたは減少した数のプライマー対を有し、そして典型的にはそれぞれ異なるプライマー対のグループまたは異なる個々のプライマー対を有する複数の第２のＰＣＲ反応混合物が存在する。例えば、もし第１のＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲプライマー対のグループ中に３０個の異なる第１のＰＣＲプライマー対が存在したなら、典型的にはそれぞれ第１のＰＣＲプライマー対の１つから産生された主な産物を増幅するよう設計された３０個の別々の第２のＰＣＲが存在する。別の例において、もし第１のＰＣＲにおいて、第１のＰＣＲプライマー対のグループ中に５０個の異なる第１のＰＣＲプライマー対が存在したなら、典型的にはそれぞれ第１のＰＣＲプライマー対の１つから産生された主な産物を増幅するよう設計された、５０個の別々の第２のＰＣＲが存在する。全ての特異的な第１のＰＣＲ産物が、本明細書中で議論されたように、最終的に第２のＰＣＲにおいて増幅される必要はない。１を超える第２のＰＣＲプライマー対が第２のＰＣＲに存在し得、そして第２のＰＣＲにおいて産生される各産物を定量する方法がある場合は、定量され得ることが理解される。例えば、もし４つの別々のフルオロフォアを使用するなら、４つの別々の第２のＰＣＲプライマー対を第２のＰＣＲにおいて使用し得る。しかし、特定の第１のＰＣＲ産物に関連する標的核酸分子のコピー数を定量する能力は、典型的には第２のＰＣＲおよび続く分析によって起こる。確実性を加えるため、および再現性を試験するために、第２のＰＣＲそれぞれが、三連で行なわれ得る。
【００６０】
開示された方法は従って、典型的には第２のＰＣＲを含む。第２のＰＣＲは、第２のＰＣＲのための開始鋳型は、第１のＰＣＲ反応において産生されたＰＣＲ産物から少なくとも生じるという点で、第１のＰＣＲに関連する。典型的には、これは第１のＰＣＲ混合物が少なくとも１サイクルのＰＣＲ反応を受けた後に、第１のＰＣＲ混合物からアリコートを取ることによって達成される。このアリコートは、第１のＰＣＲ混合物の１／１００または１／５０または１／２５または１／１０のような、典型的には少なくとも１サイクルのＰＣＲを受けた、第１のＰＣＲ混合物の画分である。一般的に、第１のＰＣＲ混合物のアリコートは、（１／（プライマー対の数））以下である。典型的には、第２のＰＣＲに使用される第１のＰＣＲ由来のアリコートは、各プライマー対に関しておよそ同じ大きさである。しかし、例えば各プライマー対に使用される第１のＰＣＲの相対的量が既知であり、そして初回ＰＣＲからの繰越が２回目のＰＣＲに干渉しない限り、アリコートは異なる大きさであり得る。もし各アリコートに関して（１／（プライマー対の数））より少ない量を使用するなら、複数の第２のＰＣＲを行ない得る。例えば、もし（０．５／（プライマー対の数））以下の量を使用するなら、少なくとも２つの第２のＰＣＲを各プライマー対に関して行ない得、そしてもし（０．３３／（プライマー対の数））以下の量を使用するなら、少なくとも３つの第２のＰＣＲを各プライマー対に関して行ない得、そしてもし（０．２５／（プライマー対の数））以下の量を使用するなら、少なくとも４つの第２のＰＣＲを各プライマー対に関して行ない得る、等である。アリコートをまた、本明細書中で議論されるように、サブクローニングおよび標準曲線の作成を行なうために使用し得る。
【００６１】
第１のＰＣＲと第２のＰＣＲとの間の典型的な違いは、第２のＰＣＲが、典型的には第１のＰＣＲで使用される特異的プライマー対の同じグループではなく、唯一の特異的プライマー対または特異的プライマー対のサブセットを用いて行なわれることである。第１のＰＣＲ混合物は依然として例えば倍加速度の約９５％で増幅しているので、第１のＰＣＲのアリコートを取る場合に、少量のもともとのプライマー対のグループが、依然として混合物中に存在し、それは部分的には依然として産物の量に対して過剰のプライマーが混合物中に存在することを意味することが理解される。第２のＰＣＲは、典型的には、追加量（典型的には鋳型より過剰の量）のプライマー対の１つが加えられるか、または関連するが異なるプライマー対が第２のＰＣＲに加えられるので、これらの残ったプライマーは、第２のＰＣＲに干渉しない。従って、典型的に第２のＰＣＲに必要とされるものは、ａ）より多くの１つまたはそれ以上のプライマー対を第２のＰＣＲに加えることによる、第１のＰＣＲに存在する最初のプライマー対のグループ中の他のプライマー対と比較して、少なくとも１つのプライマー対の相対的濃度の変化、またはｂ）最初のプライマー対のグループには存在しないが、第１のＰＣＲにおいて産生された核酸標的産物の１つに関連しており、そして典型的には特異的な、新規プライマー対の追加、のいずれかである。第２のＰＣＲはまた、ａ）およびｂ）の組み合せであり得ることが理解される。
【００６２】
典型的には、第２のＰＣＲを、特異的標的核酸分子に関する同じ特異的プライマー対、または標的核酸分子に関するわずかに異なる特異的プライマー対のいずれかを用いて行なう。典型的には、もし第２のＰＣＲプライマー対が、関連する第１のＰＣＲプライマー対とわずかに異なるとしても、第２のＰＣＲプライマー対は依然として同じまたは同様のハイブリダイゼーション領域を有し、このことは、第２のＰＣＲが、典型的には標的分子および標的分子産物の同じ領域にハイブリダイズすることを意味する。典型的に異なるのは、標的核酸にハイブリダイズした場合に、プライマーの検出を可能にする配列または修飾の存在である。例えば、リアルタイムＰＣＲ中の蛍光検出は、あらゆる機能的技術とともに起こり得る。
【００６３】
２回目のＰＣＲをまた、ネステッドＰＣＲ戦略によって行ない得、ここで定量のために使用される２番目のセットのプライマーを、初回のＰＣＲにおいて産生されたアンプリコン内の領域を増幅するために使用する。この型のシステムは、１つの遺伝子に関する全てのプライマー対が適合性である必要がある。
【００６４】
増幅された産物をモニターするために他の方法、例えばブロットアッセイ、ＲＮａｓｅ保護アッセイも行ない得るが、これらのアプローチは、鋳型の絶対的なコピー数を産生しないので、半定量的なアプローチでしかない。
【００６５】
第２のＰＣＲを、使用されるプライマー対および鋳型に適当なあらゆる条件を用いて行ない得る。例えば、ｄＮＴＰまたはプライマーまたは酵素の濃度または緩衝液条件は、ＰＣＲが起こることを可能にするあらゆる濃度であり得る。典型的には、ｄＮＴＰの濃度はそれぞれ２．５〜１０ｍＭの間であり得る。典型的には、プライマーの濃度はそれぞれ０．１〜０．５μＭの間であり得る。典型的には、酵素の濃度は１回の反応あたり１〜３ユニットの間であり得る。典型的には、緩衝液の濃度および組成は、例えば熱安定性ポリメラーゼの製造会社が推奨する混合物の１０×ストック溶液から１×最終濃度である。しかし、これら以外の条件も有効であり得、そしてある場合には経験的試験の後に決定され得ることが理解される。
【００６６】
あらゆる型の熱安定性ポリメラーゼを使用し得る。もしホットスタートを行なうなら、熱安定性ポリメラーゼは９０℃より高いような高温で長期間インキュベートするまで機能的でない型であることが好ましい。
【００６７】
一般的な原理において、リアルタイムＰＣＲは蛍光検出を用い、ここで蛍光レポーター（例えばフルオレセイン、ＦＡＭ等）はクエンチャー、例えばＤＡＢＳＹＬまたはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅと結合する。ＰＣＲの伸長の間に、クエンチャーが蛍光レポーターから分離し、蛍光を生ずる。例えば、プライマー配列中の小さなヌクレオチド配列が、蛍光レポーターおよび蛍光が放出されないくらい十分レポーターの近くにあるクエンチャーを含み得る。レポーター／クエンチャーを含む配列がＰＣＲ産物に一旦組み込まれると、クエンチャーはレポーターから放出され、そしてレポーターが蛍光を発する。代わりのアプローチにおいて、本明細書中でＺ配列と呼ばれる短いヌクレオチド配列が、蛍光レポーターおよびクエンチャーを含む。ユニプライマー（ｕｎｉｐｒｉｍｅｒ）が伸長する場合に、それはクエンチャーを放出する様式でＺ配列を認識し、これと相互作用し、蛍光を生ずる。
【００６８】
（５）標準曲線の作成および第２のＰＣＲ産物の分析
開示された方法は、標的核酸分子の発現、例えば所定のサンプル中の標的遺伝子の定量的分析を可能にするよう設計される。ＰＣＲに関する倍加速度および増幅活性についての正確な情報を提供するＰＣＲ方法、例えばリアルタイム蛍光ＰＣＲが存在するが、これらの型の方法から得られる情報は、第１のＰＣＲまたはサンプル中の標的核酸開始材料の正確な量に関する情報を提供しない。開示された方法は、そのような情報を提供し得る。この情報を得るために、倍加速度およびＤＮＡの量について第２のＰＣＲで得られた情報を、第１のＰＣＲで使用された開始材料と関連付けなければならない。典型的には、これは、例えば第１のＰＣＲにおいて産生された産物のグループに関して代表的な標準曲線を作成することによって、または第１のＰＣＲ由来の標的産物のグループにおける個々の産物それぞれに関して標準曲線を産生することによって達成される。この標準曲線は、典型的にはＤＮＡの絶対的な量をＰＣＲ増幅の特定のサイクルに関連付ける。次いで、第２のＰＣＲから得られたデータ、例えばＤＮＡ産物がある量に達した特定のサイクルを、標準曲線に置いて、そしてＤＮＡの絶対的な量を決定し得る。標準曲線を、様々な方法で、例えば第１のＰＣＲのアリコートを取り、ＰＣＲ産物をサブクローニングし、サブクローニングした産物を増幅し、ＵＶ吸収のような伝統的な手段を用いてサブクローニングした産物を定量し、そして次いで様々な希釈の開始材料で一連のＰＣＲを産生しそしてＰＣＲを行なうことによって、作成し得る。これらの行為から得られたデータは、例えば、第１のＰＣＲ産物のＰＣＲサイクルをプロットする標準曲線の作成を可能する。
【００６９】
また、標準曲線を開示された方法で使用し得るが、Ｃ（ｔ）を用いた分析のような、標的の絶対的なコピー数を得る他の方法も使用し得る。
【００７０】
標準曲線の考えを理解するために、ＰＣＲおよび特にリアルタイムＰＣＲの基礎を理解しなければならない。これらの概念は当業者によって理解されるが、簡単な、制限しない議論が本明細書中で提供される。本明細書中で議論されるように、ＰＣＲは、極少量のＤＮＡ、多くの場合検出不可能な量のＤＮＡを、検出し得るまたはより容易に検出し得るレベルまで増幅する手段である。ＰＣＲ混合物において標的核酸産物を検出する多くの手段が存在する。例えば産物を、その産物を大きさによって分離するアガロースゲルにおいて検出し得、そしてＵＶ吸収によって、またはＰＣＲが例えば放射性標識されたデオキシヌクレオチドを用いて行なわれるなら放射活性によって、またはもしＰＣＲがフルオロフォアで標識されたｄＮＴＰまたはプライマーを用いて行なわれるなら蛍光によって検出する。これらの型のプロトコールを、ＰＣＲの各サイクルにおいて行ない得るが、情報を得るために行なわなければならないサンプルの操作が存在するので、それは時間がかかり得る。操作を伴わないＰＣＲの各サイクルにおける分析のために、他のプロトコールが存在する。この型のプロトコールは、一般的にリアルタイムＰＣＲと呼ばれ、そして典型的にはサーマルサイクラーにおいて行なわれ、それは反応過程の間に、例えば産物中のフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅ）のようなシグナル産生物質を直接モニターすることによって、ＰＣＲ混合物を直接分析し得る。（例えば、以下を参照のこと：
【００７１】
【数２】
2005511055.tif 000004
2005511055.tif 000005
これらは全て少なくともＰＣＲの実行に関する方法および試薬に関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される。）「リアルタイム」という用語は、一般的に例えばＰＣＲの各サイクルにおいて、産物が産生されるときに標的ＰＣＲ産物の変化する量をモニターする能力を指す。このモニタリングがどのように起こるかにかかわらず、典型的にはリアルタイムＰＣＲにおいてＰＣＲ産物がバックグラウンド検出の上にちょうど見える点が存在する。言い換えると、典型的には特定のＰＣＲサイクルとして示される、産物をやっと観察するのに十分な開始鋳型が増幅された時点が存在する。この点は、典型的には閾値ポイントまたは閾値サイクルと呼ばれる。リアルタイムＰＣＲを行なうために既知の量のＤＮＡが使用され、そして既知の開始材料の所定の希釈に関する閾値サイクルが回収される場合、開示された標準曲線の型が産生され得る。この型のデータは、開始材料に存在したＤＮＡの量（例えばＤＮＡのコピー数）対その量のＤＮＡに関する閾値サイクルのプロットから作成される曲線を生じる（図２および７を参照のこと）。この型の標準曲線作成およびそれがどのようにアルツハイマー病に関連する標的核酸の特異的セットに関連するかを示す例を、実施例で示す。その方法をどのように行ない得るかに関する多くの異なる説明も、本明細書中で開示される。
【００７２】
特定のＰＣＲの量を関連付け得る曲線を作成するあらゆる条件のセットを用いて、標準曲線を作成し得る。例えば、標準曲線は、典型的にはＰＣＲの閾値サイクル対開始量、コピー数の対数をプロットする曲線である。例えば、標準曲線を以下のように作成し得る。標的核酸を含むプラスミドの等モル濃度の連続希釈を行い、その核酸を増幅および定量する。これは、典型的には特徴付けされる標的核酸それぞれに関して起こる。例えば、もし１０または２０または５０または１００個の遺伝子を１度に分析するなら、これは典型的にはそれぞれに関して行なわれる。希釈は、あらゆる様式で設定し得る。例えば、１０８から１０１または１０１１から１０１または２１０から２１または４１５から４１コピーの連続的希釈またはあらゆる希釈を有し得る。これらの希釈を、ＰＣＲの開始鋳型として使用し得る。このＰＣＲを行ない得、産物を定量し、そして開始材料の量が既知でありそして連続的に希釈されるので、特定のプライマー対が標的核酸配列をどのように増幅するかについての情報を提供する曲線を作成し得、そして例えば閾値サイクル対開始材料のコピー数（または量等）をプロットする曲線を作成し得る。この型の標準曲線作成を、曲線の正確さを増加させるために二連、または三連等で行ない得ることが理解される。これらの反応を、多くの異なる方法で行ない得ること、および多くの異なる技術を用いて曲線を作成し得ることが理解される。
【００７３】
その技術が、サンプル中のＤＮＡ量を既知のＤＮＡ量と関連付けるために使用し得る曲線の作成を可能にする限り、あらゆる技術が十分である。例えば、非合成内部標準および最初のｍＲＮＡコピー数と同時増幅される、野生型または変異ｃＤＮＡのような、合成内部標準を産生するためにＲＮＡまたはＤＮＡを産生し、従って終点の野生型および内部標準ＰＣＲ産物の比からｍＲＮＡコピー数を予測することによって。（Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、９７１７−９７２１；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ，Ｍ．およびＨａｈｌｂｒｏｃｋ，Ｋ．（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、９４３７−９４４６；Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｇ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７、２６２５−２７２９、これらは全て少なくとも核酸のモニタリングに関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される。）代替の技術は、ＰＣＲ産物の蓄積を蛍光測定でモニタリングすること、および内部標準に対して定量して、例えば２重標識したプローブのエキソヌクレアーゼ切断後にローダミンによるフルオレセインの消光における相対的な減少を、または例えば隣接するプローブ間のフルオレセインからＣｙ５への共鳴エネルギー転移によって（ＦＲＥＴの原理）、または他のシアニン色素のファミリーを用いることによって、評価することである（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８、７２７６−７２８０；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６、９９５−１００１；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ら（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．４、３５７−３６２、これらは全て少なくとも核酸のモニタリングに関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される）。別の技術は、各サイクル中に別々の産物特異的溶解温度で二本鎖特異的色素の蛍光をモニターすることによって、構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子に対して定量することである（Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．Ｔ．ら（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２、１３０−１３１、１３４−１３８、少なくとも核酸のモニタリングに関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される）。あるいは、お互いに内部標準として同じサンプル中に存在する２つの密接に関連するｍＲＮＡを使用し得る（Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ，Ｌ．ら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６、３９２−４０３、少なくとも核酸のモニタリングに関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される）。
【００７４】
別の例は、標準曲線を、Ｔａｑポリメラーゼ酵素がＰＣＲの伸長期の間に内部標識非伸長プローブを切断する技術と組み合せて用いる場合である。このアプローチにおいて、プローブは、プローブの一方の末端において、レポーター色素、例えばＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で、および他方末端においてクエンチング色素、例えばＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）で２重標識される。このアプローチにおいて、プローブが完全である場合、蛍光エネルギーの転移が起こり、それによってレポーター色素の蛍光発生が、クエンチング色素によって吸収される。ＰＣＲ中のプローブのヌクレアーゼ分解時に、レポーターおよびクエンチング色素が分離し、そしてレポーター色素の発光はもはやクエンチング色素に転移されず、レポーター蛍光発光の増加を引き起こす（例えばＦＡＭに関しては５１８ｎｍにおいて）（Ｃ．Ａ．Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（１９９６）９８６−９９４、少なくとも核酸のモニタリングに関連する材料に関して本明細書中で参考として援用される）。内部または外部標準を使用するあらゆる技術を、開始材料中に存在するあらゆるｍＲＮＡのコピー数を評価するために使用し得る。
【００７５】
標準曲線のデータを分析する一つの方法は、異なるデータセットの間で、閾値サイクル変動を比較することである。例えば、２つの異なる曲線の間で、閾値サイクルが、約２、２．５、２．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１８、０．１６、０．１４、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４または０．０２サイクル以下で異なる場合、曲線は、与えられたサンプルに対して出発物質を決定するために使用され得る。標準曲線の質を判断する別の方法は、理解されている相関係数を見ることである。例えば、相関係数は、０．９９９、０．９８０、０．９７０、０．９６０、０．９５０、０．９４０、０．９３０、０．９２０、０．９１０、０．９００、０．８５０、０．８００または０．７５０以上であり得る。この相関の水準は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２オーダーの大きさにわたって生じ得る。標準曲線の質を評価するための別の方法は、式  ｙ＝（１０−１／傾き）−１（ここで、ｙは効率であり、例えば、−３．３２に等しい傾きは１００％効率を表し、−３．４０に等しい傾きは９７％効率を表し、−３．５９に等しい傾きは９０％効率を表し、−４．０４に等しい傾きは７７％効率を表す）を用いてＰＣＲ反応の効率を判断することである。一旦、標準曲線が、特定のプライマー対および標的核酸に対して作成されると、それは、多数のサンプル（すなわち、それは、デノボで各時間に、試験されるべきサンプルを作成される必要はない）を分析するために使用され得る、ということもまた理解される。
【００７６】
（ｂ）一般的な方法を用いる特定の説明図）
（（１）一般的な実施例）
本明細書中で検討されるように、開示される方法および足されたりまたは引かれ得るバリエーションを実施するための多くの異なる方法が存在する。以下の説明図のセットは、開示される方法を実施するための包括的な方法のセットを表していない。これらの説明図の間での統一的な因子は、第１プライマー対群を用いる第１ＰＣＲの実施、全部ではないプライマー対群を用いる第２ＰＣＲの実施、または異なるプライマー対群（代表的には、１プライマー対のみ）を用いる第２ＰＣＲの実施、および第２ＰＣＲで得られたデータと標準との比較である。
【００７７】
（（ａ）説明図１）
肺癌細胞の標的集団が得られる。２５の遺伝子が、標的遺伝子として決定され、そして２つの異なるプライマー対は、各標的遺伝子、第１ＰＣＲプライマー対および第２ＰＣＲプライマー対に対して得られる。このプライマー対は、各プライマーが標的遺伝子を増幅することを示すマルチプレックスＰＣＲ分析を実施することにより、適合性が決定される。全ＲＮＡは、任意の方法を用いて肺癌細胞集団から単離され、０．１μｇのＲＮＡが得られる。ＲＮＡは、任意の方法を用いて、ｃＤＮＡの第１鎖を生成するために使用される。ｃＤＮＡのこの第１鎖は、第１ＰＣＲ（２５の標的遺伝子に対して特異的な、２５の第１ＰＣＲプライマー対群を含む）で使用される。第１ＰＣＲは、１８サイクルのＰＣＲで実施される。次いで、第１ＰＣＲは、４セットの２５のアリコートに分割される。第１セットのアリコートは、標準曲線を生成するために使用され、そして選択プラスミドへサブクローン化される。サブクローン化プラスミドは、増幅され、回収され、そして定量化される。次いで、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７または１０８コピー数のサブクローン化プラスミドを含むＰＣＲ混合物が作成されるように、回収されたプラスミドは、連続的に希釈される。次いで、リアルタイムＰＣＲは、これらの連続的に希釈されたプラスミドＰＣＲ混合物で実施され、そして、各々に対する閾値サイクルが決定される。次いで、閾値サイクルは、起点ＤＮＡのコピー数に対して、プロットされ、各プライマー対に対して標準曲線を作成する。他の３セットの２５のアリコートは、第２ＰＣＲで使用される。従って、３セットの２５の異なるＰＣＲ混合物は、２５のアリコートの一つに各々相当し、作成される。２５の第２ＰＣＲ混合物の各々は、第２ＰＣＲプライマー対（２５の標的遺伝子の一つに対して特異的であり、それに付加される）の一つを有し、そして、リアルタイムＰＣＲが実施される。２５の反応の各々に対して閾値サイクルが決定され、そして、３セットの２５の反応があるため、これは３連で実施される。次いで、この閾値サイクルは、対応する標的遺伝子プラスミドに対して生成された標準曲線に相関され、第２ＰＣＲにおける出発物質のコピー数が得られる。次いで、この数は、例えば、他の２５の標的遺伝子のコピー数と比較され得、そして、サンプル中の標的物質の相対数の定量的評価が得られ得る。なぜなら、出発標的サンプルにおける物質量は、第２ＰＣＲでの出発物質量に相関するからである。次いで、このデータは、例えば、同じ標的サンプルからの同じ２５の標的遺伝子のＤＮＡアレイ分析から得られたデータと比較され得る。
【００７８】
（（ｂ）説明図２）
説明図２は、この方法が、同じ２５の標的遺伝子第１プライマー対群および同じ２５の第２プライマー対を用いて実施されているという点で、説明図１に関連する。標準曲線はすでに作成されている。しかし、肺癌細胞集団を用いるのではなく、前立腺癌細胞集団が標的化される。従って、前述のように、ＲＮＡは単離され、ｃＤＮＡは作成され、第１ＰＣＲが実施され、第２ＰＣＲが実施され、そして、次いで、このデータは、前立腺癌細胞サンプルにおいて、標的遺伝子の発現の相対量の定量的評価を生成するために、標準曲線と比較される。しかしながら、この方法の実施は、デノボでの標準曲線の作成を必要としなかったか、あるいはプライマー対の適合性の新たな決定を必要とはしなかった。
【００７９】
（（ｃ）説明図３）
説明図３は、説明図１および説明図２の両方に類似している。説明図３において、標的細胞集団はなお、前立腺癌細胞集団であるが、この説明図では、デノボでのｃＤＮＡライブラリーを作製するのではなく、市販される前立腺ｃＤＮＡライブラリーが購入された。従って、この方法のバリエーションは、第１ＰＣＲの実施、第２ＰＣＲの実施、およびすでに作成された標準曲線とデータとの比較のみを必要とする。ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの作製、ならびに標準曲線の作成ならびにプライマー対決定は、必要とされない。
【００８０】
標的細胞集団中の遺伝子発現を定量化する方法が開示され、この方法は以下の工程を包含する１）ｃＤＮＡを生成する標的細胞集団において核酸の逆転写を実施する工程、２）ｃＤＮＡを用いて第１ＰＣＲを実施し、第１ＰＣＲ産物を生成する工程、３）第１ＰＣＲ産物を用いて第２ＰＣＲを実施し、第２ＰＣＲ産物を生成する工程、４）第２ＰＣＲ産物量と標準曲線とを比較する工程、および５）第２ＰＣＲ産物量を決定する工程。
【００８１】
標的細胞集団における遺伝子発現を定量化する方法が開示され、この方法は以下の工程を包含する１）ｃＤＮＡを生成する標的細胞集団において、核酸の逆転写を実施する工程、２）ｃＤＮＡを用いて第１ＰＣＲを実施し、第１ＰＣＲ産物を生成する工程（ここで、第１ＰＣＲは少なくとも２セットの遺伝子特異的なプライマーを用いて実施される）、３）第１ＰＣＲ産物を用いて第２ＰＣＲを実施し、第２ＰＣＲ産物を生成する工程（ここで、第２ＰＣＲは１セットの遺伝子特異的なプライマーを用いて実施される）、４）第２ＰＣＲ産物量と標準曲線とを比較する工程、および５）第２ＰＣＲ産物量を決定する工程、および６）第２ＰＣＲ産物量と標的細胞集団中の遺伝子に対応する遺伝子の発現量とを相連させる工程。
【００８２】
標的細胞集団における遺伝子発現を定量化する方法が開示され、この方法は以下の工程を包含する１）ｃＤＮＡを生成する標的細胞集団において、核酸の逆転写を実施する工程、２）ｃＤＮＡを用いて第１ＰＣＲを実施し、第１ＰＣＲ産物を生成する工程、３）第１ＰＣＲ産物を用いて、第２ＰＣＲを実施し、並行して分析された各目的遺伝子に対して、特異的な第２ＰＣＲ産物を生成する工程、４）第２ＰＣＲ産物量と標準曲線とを比較する工程、および５）第２ＰＣＲ産物量を決定する工程（ここで、この量は、テンプレートの絶対的なコピー数に対して決定され得る）。
【００８３】
開示された方法は、単一標的物質から生成された複数の産物に対して定量的である。定量的によって、この方法が実施される場合、二つの転写物の間での差異は、少なくとも１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１倍、０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍または少なくとも０．０５倍の差異まで統計的に決定され得ることを意味する。従って、本方法は、統計的な有意性（一つの標的転写物の１０コピーのテンプレートの間での差異、および３０コピーの転写物の間での差異は、３倍の差異である）とともに決定し得た。
【００８４】
標的細胞集団における遺伝子発現を定量化する方法が開示され、この方法は以下の工程を包含する１）ｃＤＮＡを生成する標的細胞集団において、核酸の逆転写を実施する工程、２）ｃＤＮＡを用いて第１ＰＣＲを実施し、少なくとも５つの異なるＰＣＲ産物を生成する工程、３）５分画のＰＣＲ混合物において、５つの第１ＰＣＲ産物を用いて第２ＰＣＲを実施し、少なくとも５つの第２ＰＣＲ産物を生成する工程、４）５つの第２ＰＣＲ産物量と標準曲線とを比較する工程、および５）５つの第２ＰＣＲ産物量を決定する工程。
【００８５】
（（２）特定の疾患標的（診断））
開示された方法は、特定の表現型または特定の表現型を有する傾向に対して、特定の細胞型または細胞集団を評価するために使用され得る。例えば、開示された方法は、前立腺癌細胞と正常前立腺細胞との間、または肺癌細胞と正常肺細胞との間、あるいは冠状心疾患に罹患した被験体の動脈からの動脈細胞と冠状心疾患を有さないヒトの動脈からの動脈細胞との間での差異を評価するために、使用され得る。この様式において、開示された方法の使用は、特定の表現型に関連する予測を可能にし得る。標的細胞またはサンプルの異なる型は、異なるプライマー対群を有し得る。開示された方法で有用であり得る特定のプライマー対の例は、本明細書中で開示される。
【００８６】
（（ａ）プライマー対セット）
本明細書に記載されるように機能するプライマー対の任意の組合せは、所望される任意の転写物セットを分析するために生成され得ると理解される。例えば、種々の遺伝子は、癌遺伝子性事象に関与し、そして、多数の異なる遺伝子の異常発現は、多数の異なる癌で生じ得ると理解される。開示された方法は、これらの差異（例えば、異なる癌細胞型の間、または癌細胞と非癌細胞との間）をアッセイするために使用され得る。癌遺伝子性事象に関与すると考えられる、多様な遺伝子の発現を標的化するための例示的なプライマー対が、図６に示される（配列番号「５８−１０９」（図６））。他のプライマー対は生成され得ると理解される。
【００８７】
プライマー対は生成され得て、そして開示された方法は、種々の状況および種々の細胞条件に対して使用され得た。例えば、プライマー対は、発生結果、種々の疾患状態、幹細胞および細胞系列分析を分析するために生成され得る。
【００８８】
（（ｃ）研究ツールとして組成物を用いる方法）
開示された組成物および方法は、研究ツールとして種々の方法で使用され得る。例えば、開示された組成物（例えば、配列番号１−１０９）は、ニューロンでの発現パターンを研究するために使用され得る。
【００８９】
開示された組成物および方法はまた、アルツハイマーおよび癌のような疾患に関連する診断ツールに使用され得る。
【００９０】
開示された組成物は、本明細書で検討されているように、マイクロアレイ中のいずれかの試薬として、またはプローブするための試薬もしくは現存するマイクロアレイを分析するための試薬として、使用され得る。開示された組成物は、単一ヌクレオチド多型を単離するかまたは同定するために、任意の公知の方法で使用され得る。この組成物はまた、対立遺伝子分析を決定するために、任意の方法で使用され得る。この組成物はまた、スクリーニングアッセイ（チップアレイ／マイクロアレイに関連する）の任意の公知の方法で使用され得る。この組成物はまた、例えば、相関を研究したりまたは開示された組成物に関連する分子モデル分析を実施するために、開示された組成物のコンピュータ読み取り可能な実施形態を用いて、任意の公知の方法で使用され得る。
【００９１】
開示された組成物および方法は、オリゴアレイおよびｃＤＮＡアレイあるいは任意の他の型のＤＮＡ診断を有効にするために使用され得る。開示された組成物および方法はまた、遺伝子発現の単一細胞定量的分析を実施するために使用され得る。
【００９２】
開示された方法は、種々の疾患の診断に対して使用され得る。一つ以上の遺伝子の差次的発現もしくは蓄積、または一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡの分解に関連する任意の疾患は、開示される方法を用いてアッセイされた得たり、または診断され得る。例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動失調、脳性麻痺、自律神経障害、てんかん、ハンティングトン病、水頭症、レヴィー小体病、髄膜炎、オリーブ橋小脳萎縮、パーキンソン病、レット症候群およびツレット症候群、または自律神経系、染色体障害、慢性疲労症候群、慢性疼痛症候群、先天性異常、脳神経病、痴呆、脱髄疾患、頭痛、感染、運動障害、筋疾患、新生物、神経皮膚症候群、神経学的発現、神経毒性症候群、眼球運動障害、末梢神経系、下垂体障害、脳空洞症、睡眠障害、脊髄、発作、外傷および損傷から生じる細胞変性のような神経変性疾患は開示される方法を用いて診断され得る。癌はまた、開示される方法を用いて診断され得る。差次的発現の蓄積または一つ以上の遺伝子のｍＲＮＡの変性に関連する任意の癌が、診断され得る。例えば、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、子宮癌、ホジキン病癌、腎癌、成人急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人慢性骨髄性白血病、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、黒色腫、および精巣癌の癌が診断され得る。
【００９３】
この方法は、差次的発現もしくは蓄積、またはｍＲＮＡの分解が生じる、任意の細胞型での遺伝子発現のパターンを分析するために使用され得る。例えば、開示された方法は、細胞周期の異なる段階の細胞、習得（ｌｅａｒｎｉｎｇ）の異なる段階の細胞、異なる表現型のドナーからの細胞などにおけるｍＲＮＡの差異を見るために使用され得る。例えば、神経生物学（遺伝子の差次的発現、蓄積または分解）の背景において、細胞の不均質性は、脳の老化および／または退化での範囲内で認められ得た。
【００９４】
開示される定量的マルチプレックスＰＣＲ法は免疫細胞学といっしょにされる、という方法がまた開示される。例えば、二つの異なる細胞の間または細胞型の間で、ｍＲＮＡの差次的発現、蓄積または分解が決定され得る（ここで、異なる細胞または細胞型はまた、免疫細胞学によって異なって決定され得る）。例えば、疾患性ニューロンは、例えば、神経細線維もつれマーカーに対するスクリーニングによって、およびこのマーカーに対してポジティブかまたはネガティブのニューロンにおいて発現されたｍＲＮＡを比較することによって、単一細胞型の水準で分析され得た。
【００９５】
疾患の早期分子診断の背景において、この技術は、診断を導く統計学的分析の根拠として役立ち得る。この技術は、現在、血液検査で使用されるａＲＮＡ増幅技術に対する、確認および／または代替アプローチとして使用され得る。なお、診断の背景において、現在、単一の生体マーカーは、疾患の状態を早く明確にするために、試験的に使用される。これらのアプローチは、矛盾する結果が生じるので、毎日は使用されない（この話題の概説について、Ｍｕｌｄｅｒ  Ｃ、Ｓｃｈｅｌｔｅｎｓ  Ｐ、Ｖｉｓｓｅｒ  ＪＪ、ｖａｎ  Ｋａｍｐ  ＧＪ、Ｓｃｈｕｔｇｅｎｓ  ＲＢ（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３７：５９３−６０７、Ｃｏｗａｎ  ＬＤ、Ｌｅｖｉｔｏｎ  Ａ、Ｄａｍｍａｎｎ  Ｏ（２０００）Ｎｅｗ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２２：１８−２３を参照）。多数の転写物が、技術（例えば、ａＲＮＡ、単一細胞ｍＲＮＡ表現型決定、マルチプレックス分析、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ方法、ＰｏｌｙＡＰＣＲおよびＴＰＥＡ）を補償する感受性方法および再現性方法において並行して分析され得るので、開示された方法（標準的な分析または主成分の分析に対する根拠を提供する）は、これらの欠点を避ける。最後に、機能的なゲノムの背景において、定量化マルチプレックスＰＣＲは、大きなｃＤＮＡおよびオリゴアレイの確認に関して絶対に必要な物となり得る。実際は、後の方法において、感受性の制限および再現性の制限は、さらに認識される。これらの制限は、開示される方法を用いて着手される。
【００９６】
（２．組成物）
開示される組成物およびそれらの組成物を調製するために使用される構成要素ならびに本明細書で開示される方法内で使用される構成要素が開示される。これらの物質および他の物質は本明細書で開示され、そして、これらの物質の組合せ、サブセット、相互作用、群などが、開示される場合（これらの化合物の種々の個々および集合的な組合せもしくは置換の各々の特定の参照が、明瞭に開示され得ないが）、各々は具体的に企図されており、そして本明細書中に記載されることが理解される。例えば、特定のプライマー対が開示されそして検討される場合、およびプライマー対を含む多数の分子を作成し得る多数の改変が検討される場合、具体的に反対に表されない限り可能性である、プライマー対および改変の各組み合わせおよび各置換ならびに全ての組み合わせならびに全ての置換が、具体的に企図される。従って、分子Ａ、分子Ｂならびに分子Ｃのクラスが開示され、そして分子Ｄ、分子Ｅならびに分子Ｆのクラス、および組み合わせ分子Ａ−Ｄの例が開示される場合、次いで、かりに各々が個々に列挙されないとしても、各々は個々に考察され、そして、開示されると考えられるＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆの意味のある組合せについて集合的に企図される。同様に、任意のサブセットまたは任意のこれらの組み合わせもまた、開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅの亜群は、開示されると考えられる。この概念はこの適用の全ての局面に適用し、この適用としては、開示される組成物を作成する方法および使用する方法における工程が挙げられるが、これらに限定されていない。従って、実施され得る多様なさななる工程がある場合、各々のこれらのさらなる工程は、任意の特定の実施形態または開示される方法の実施形態の組み合わせを用いて実施され得る、と理解される。
【００９７】
（ａ）プライマー）
開示されるプライマーは、特定のＤＮＡ産物の伸長および増幅のためのプライマーに依存する。開示される方法の第１ＰＣＲにおいて、第１ＰＣＲプライマー対群を構成するプライマーは、混合物に添加される。代表的に、この混合物は、プライマー対の等モル混合物に関する。開示される方法の第１ＰＣＲで使用される、プライマーの混合物を含む組成物が開示される。これらの組成物は、異なるプライマー対の混合物である。例えば、配列番号１−１０９に記載する核酸を含む組成物が開示される（図６、７および８）。また、配列番号１−１０９に記載する核酸（ここで、核酸は互いに対してほぼ等モルである）を含む組成物が開示される。図６、７および８に記載されるようにプライマーセットにハイブリダイズするプライマーの混合物を含む組成物もまた開示される。
【００９８】
（ｂ）配列類似性）
本明細書で検討される場合、相同性という用語および同一性という用語の使用は、類似性と同じものを意味することが理解される。従って、例えば、相同性という単語の使用が、二つの非天然配列の間で使用される場合、これは、これらの二つの配列の間で進化的な関連を表している必要はないが、むしろ、これらの核酸配列間の類似性または相関性を見ている、と理解される。二つの進化関連性分子の間で相同性を決定する方法の多くは、これらが進化に関連するかまたはしないかにかかわらず、配列類似性を計測する目的のために、任意の二つ以上の核酸またはタンパク質に対して慣用的に適用される。
【００９９】
一般的に、本明細書で開示される遺伝子およびタンパク質の、任意の公知の改変体および誘導体、または発生じ得たこれらを規定する一つの方法は、特定の公知配列に対する相同性によって、改変体および誘導体を規定するこによることが理解される。本明細書に開示される特定の配列のこの同一性はまた、本明細書中の他の箇所で検討される。一般的に、本明細書で開示される改変遺伝子および改変タンパク質は、代表的に、一定配列または天然配列に対して、少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの相同性を有する。当業者は、二つのタンパク質の相同性または核酸（例えば、遺伝子）の相同性をどのように決定するかを容易に理解する。例えば、相同性が最高の水準であるように、この相同性は、二つの配列を整列した後に計算され得る。
【０１００】
相同性を計算する別な方法は、公開されるアルゴリズムによって実施され得る。比較のための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって実施され得、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって実施され得、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性法に対する検索によって実施され得、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のコンピューター化実行によって、または検査によって実施され得る。
【０１０１】
相同性の同じ型は、例えば、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０、１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９（少なくとも核酸アライメントに関する物質に対して、本明細書中で参考として援用する）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について、得られ得る。任意の方法が、代表的に使用され得、そして、特定の例においてこれらの種々の方法の結果は異なり得ることが理解されるが、同一性がこれらの方法の少なくとも一つで見つけられる場合、配列は一定の同一性を有すると言われ、そして本明細書で開示されることを当業者は理解する。
【０１０２】
例えば、本明細書で使用されるように、上記に記載される任意の一つ以上の計算方法によって計算されるので、別の配列に対して特定のパーセント相同性を有するように列挙される配列は、列挙される相同性を有する配列といわれる。例えば、Ｚｕｋｅｒ計算方法を用いて、第１配列が、第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、たとえ、任意の他の計算方法によって計算される場合、第１配列が、第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列は、本明細書に規定される場合、第２配列に対して８０パーセント相同性を有する。別な例の場合、Ｚｕｋｅｒ計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ計算方法の両方を用いて、第１配列が、第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、たとえ、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ計算方法、Ｊａｅｇｅｒ計算方法または任意の他の計算方法によって計算される場合、第１配列が第２配列に対して８０％の相同性を有さないとしても、第１配列は、本明細書に規定される場合、第２配列に対して８０パーセント相同性を有する。さらに、別な例の場合、各計算方法（ただし、実際上、異なる計算方法は、しばしば相同性パーセントが差次的に計算されるという結果になる）を用いて、第１配列が、第２配列に対して８０パーセント相同性を有すると計算される場合、第１配列が、本明細書に規定される場合、第２配列に対して８０パーセント相同性を有する。
【０１０３】
（ｃ）ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションという用語は、代表的に、少なくとも二つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子）の間での配列駆動性（ｄｒｉｖｅｎ）相互作用を意味する。配列駆動性相互作用は、ヌクレオチドに特異的な様式において、二つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログもしくはヌクレオチド誘導体の間で生じる相互作用を意味する。例えば，ＧとＣとの相互作用またはＡとＴとの相互作用は、配列駆動性相互作用である。代表的に、配列駆動性相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で生じる。二つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知である多くの条件および多くのパラメーターにより影響を及される。例えば、塩濃度、ｐＨおよび反応温度全ては、二つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を及ぼす。
【０１０４】
二つの核酸分子の間での選択的なハイブリダイゼーションに対する指標は、当業者に周知である。例えば、ある実施形態において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として規定され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のいずれかまたはその両方においての、温度および塩濃度の双方によって、制御される。例えば、選択的なハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（半分の分子が、分子のハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）より約１２〜２５℃低い温度で、高いイオン強度溶液（６×  ＳＳＣまたは６×  ＳＳＰＥ）でのハイブリダイゼーションを含み得、その後、洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低いように選ばれた温度および塩濃度の組み合わせで洗浄される。フィルターに固定される参照ＤＮＡのサンプルが、目的の標識化核酸にハイブリダイズされ、そして次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、という予備実験で、この温度および塩濃度が、容易に実験に基づいて決定される。ハイブリダイゼーション温度は、代表的に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに対して高い。この条件は、ストリンジェンシーを達成するため、上記に記載されるように使用され得、または当該分野で公知である場合に使用され得る。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９８７：１５４：３６７、１９８７、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する題材に対して、本明細書中において参考として援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対して好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、６×  ＳＳＣまたは６×  ＳＳＰＥで約６８℃（水溶液中）であり得、その後６８℃で洗浄される。所望の相補性の程度が減少される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、適宜に減少され得、さらに、変異性が検索される任意の領域のＧ−ＣリッチまたはＡ−Ｔリッチに依存している。同様に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、所望されるホモロジーが増加される場合に適宜に増加され得、さらに、高いホモロジーが所望される任意の領域のＧ−ＣリッチまたはＡ−Ｔリッチに依存している。全て、当該分野で公知の通りである。
【０１０５】
選択的なハイブリダイゼーションを規定するための別な方法は、他の核酸に結合される一つの核酸量（パーセント）で見ることである。例えば、ある実施形態において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、制限核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、非制限核酸に結合される場合である。代表的に、非制限プライマーは、例えば、１０倍または１００倍または１０００倍過剰である。このアッセイ型は、制限プライマーおよび非制限プライマーの双方が、例えば、それらのＫｄ未満で１０倍または１００倍または１０００倍であり、または、核酸分子の一つだけが１０倍または１００倍または１０００倍であり、あるいは核酸分子の一つもしくは双方がそれらのＫｄより上である、という条件下で実施され得る。
【０１０６】
選択的なハイブリダイゼーションを規定する別な方法は、ハイブリダイゼーションが、所望される酵素的操作を促進するのに必要とされる条件下で、酵素学的に操作されるプライマーのパーセントで見ることである。例えば、ある実施形態において、選択的なハイブリダイゼーションの条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、酵素的操作を促進する条件下で、酵素学的に操作される場合である（例えば、酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的なハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長される場合である）。好ましい条件はまた、操作を実施する酵素に対して適切であると、製造業者により提示されることまたは当該分野で表示されることを含む。  
【０１０７】
単にホモロジーを用いる場合、二つの核酸分子の間でハイブリダイゼーションの水準を決定するために、明細書に開示される多様な方法があると理解される。これらの方法およびこれらの条件は、二つの核酸分子の間で、異なるパーセントのハイブリダイゼーションを与え得るが、別なことを表さない場合、任意の方法の指標を合わせることで十分であることが理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが要求された場合、およびハイブリダイゼーションがこれらの方法の任意の一つにおいて要求される指標内で生じる限り、それは明細書で開示されると考えられる。
【０１０８】
組成物または方法が、集合的または単独的のいずれかでハイブリダイゼーションを決定するために、これらの基準の任意の一つに合致する場合、当業者は、それは明細書で開示される組成物または方法であると理解する、と理解される。
【０１０９】
（ｄ）核酸）
核酸ベースで、明細書で開示される多様な分子があり、例えば、核酸プライマー（例えば、配列番号１−１０９）が挙げられる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換から構成される。これらの他の分子の非制限例は、本明細書で検討される。例えば、ベクターが細胞で発現される場合、発現されたｍＲＮＡは、代表的にＡ、Ｃ、ＧおよびＵから構成されるということが理解される。  
【０１１０】
（（１）ヌクレオチドおよび関連分子）
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間連結を作製するそれらのリン酸部分および糖部分を通じて共に連結され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、５価のリン酸である。ヌクレオチドの非制限例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０１１１】
ヌクレオチドアナログは、塩基、糖またはリン酸部分のいずれかに対して、何らかの型の改変を含むヌクレオチドである。塩基部分に対する改変は、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ／Ｕ天然改変および合成改変、ならびに異なるプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、ウラシル−５−イル（．ｐｓｉ．）、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、および２−アミノアデニン−９イル）を含む。修飾塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルアデニンおよびグアニンならびに他のアルキル化アデニン誘導体およびグアニン誘導体、２−プロピルアデニンおよびグアニンならびに他のアルキル化アデニン誘導体およびグアニン誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）アデニンおよびグアニン、４−チオウラシルアデニンおよびグアニン、８−ハロアデニンおよびグアニン、８−アミノアデニンおよびグアニン、８−チオールアデニンおよびグアニン、８−チオアルキルアデニンおよびグアニン、８−ヒドロキシアデニンおよびグアニンおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモウラシルおよびシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシンならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる塩基改変は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３、およびＳａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３で見つけられ得る。あるヌクレオチドアナログは、例えば、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリンであり、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシンは、二重鎖形成の安定性を増大し得る。しばしば、塩基改変は、例えば二重鎖安定性を増加させる独特な特性を達成するために、例えば、糖改変（例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル）と組み合わせられ得る。多数の米国特許、例えば、米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５���５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号（これらは、ある範囲の塩基改変を詳述し、そして記述する）がある。各々のこれらの特許は、本明細書中において参考として援用される。
【０１１２】
ヌクレオチドアナログはまた、糖部分の改変を含み得る。糖部分に対する改変は、リボースおよびデオキシリボースの天然改変ならびに合成改変を含む。糖改変は、以下の２’位置での改変を含むが、これらに限定されない：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、このアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、あるいは置換または非置換のＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る）。２’糖改変はまた、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（ｎおよびｍは、１〜約１０である）を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
２’位置での他の改変は、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、置換低級アルカリール、置換低級アラルキル、置換低級Ｏ−アルカリールまたは置換低級Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル（ｓｉｌｙｌ）、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入因子、オリゴヌクレオチドの薬物動態的な特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬力学的な特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基、を含むが、これらに限定されない。類似の改変はまた、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドでの糖の３’位置または２’−５’連結オリゴヌクレオチドでの糖の３’位置、および５’末端ヌクレオチドの５’位置で、作製され得る。改変糖としてはまた、架橋環酸素（例えば、ＣＨ２およびＳ）での改変を含む糖が挙げられ得る。ヌクレオチド糖アナログはまた、例えば、ペントフラノシル糖に代わってシクロブチル部分のような糖様模倣物を有し得る。このような改変糖構造の調製を教示する多数の米国特許があり、例えば、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号であり、各々は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【０１１４】
ヌクレオチドアナログはまた、リン酸部分で改変され得る。改変されるリン酸部分は、二つのヌクレオチドの間での連結が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネートを含み、（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートが挙げられる）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートが挙げられる）、チオキソホスホロアミデート、チオキソアルキルホスホネート、チオキソアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートを含むように、改変され得るリン酸部分が挙げられるが、これらに限定されない。二つのヌクレオチドの間で上記のリン酸連結または改変されるリン酸連結は、３’−５’連結または２’−５’連結を通じてであり得、この連結は、例えば、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２の反転した極性を含み得ることがことが理解される。各種の塩、混合塩および遊離酸形態もまた含まれる。改変リン酸を含むヌクレオチドをどのように作製しそして使用するかを教示する、多数の米国特許があり、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を含むが、これらに限定されない（各々は、本明細書中において参考として援用される）。
【０１１５】
ヌクレオチドアナログは、単一の改変を含むことのみを必要とするが、一つの部分内または異なる部分の間で、複数の改変もまた含み得る、と理解される。
【０１１６】
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに対して類似の機能的特性を有する分子であるが、それは、リン酸部分（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））を含まない。ヌクレオチド置換体は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ方法またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ方法において核酸を認識する分子であるが、それは、リン酸部分以外の部分を通じて連結される。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸との相互作用の場合、二重らせん型構造に適合し得る。
【０１１７】
ヌクレオチドの置換体は、置換されたリン酸部分および／または置換された糖部分を有しているヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。ヌクレオチドの置換体は、標準のリン原子を含まない。リン酸に対する置換は、例えば、短鎖アルキルヌクレオシド間連結またはシクロアルキルヌクレオシド間連結、へテロ原子、アルキルまたはシクロアルキルとの混合ヌクレオシド間連結、あるいは一つ以上の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環式ヌクレオシド間連結であり得る。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的には形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合されるＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分の一部を有する他の骨格、を含む。多数の米国特許は、これらの型のリン酸置換をどのように作製し、そして使用するかを開示し、そして米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を含むが、これに限定されない（各々は、本明細書中において参考として援用される）。
【０１１８】
また、ヌクレオチドの置換において、ヌクレオチドの糖部分およびリン酸部分の双方が、例えば、アミド型連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換され得る、と理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号：および同第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子をどのように作製し、そして使用するかを教示し、各々は、本明細書中において参考として援用される。（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００もまた参照）。
【０１１９】
例えば、細胞取り込みを増強するために、他の分子（結合体）の型とヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログとを連結することもまた可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログと化学的に連結され得る。このような結合体としては、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６）、胆汁酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９１、１０、１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３−９３７、の脂質部分を含むが、これらに限定されない。多数の米国特許は、このような結合体の調製を教示し、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を含むが、これらに限定されない（各々は、本明細書中において参考として援用される）。
【０１２０】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドの置換体のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも一つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドの置換体のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドの置換体のＣ２位置、Ｎ１位置ならびにＣ６位置、およびピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドの置換体のＣ２位置、Ｎ３位置、Ｃ４位置を含む。
【０１２１】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの相互作用は、二重鎖ＤＮＡの大きい溝に見られる、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で起こる相互作用である。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、Ｎ７位置を含み、プリンヌクレオチドのＣ６位置に反応性基（ＮＨ２またはＯ）を有する。
【０１２２】
（（２）プライマーおよびプローブ）
プライマーおよびプローブ（それらは、多様な核酸分子（例えば、本明細書で開示されるような遺伝子転写物および遺伝子）と相互作用し得る）を含む組成物が、開示される。特定の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支持するために使用される。代表的に、このプライマーは、配列特異的な方法で伸長され得る。配列特異的な方法でのプライマーの伸長は、任意の方法を包含する（ここで、プライマーとハイブリダイズされ、または他の方法で会合される核酸分子の配列および／または組成は、プライマー伸長により産生される産物の組成または配列を指向するかあるいは影響を及ぼす）。従って、配列特異的な方法でのプライマー伸長は、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合作用、ＲＮＡ転写、または逆転写を含むが、これらに限定されない。配列特異的方法において、プライマーを増幅する技術および条件が好ましい。特定の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応（例えば、ＰＣＲまたは直接配列決定法）に対して使用される。特定の実施形態において、プライマーはまた、非酵素学的技術（例えば、それらは、配列特異的な方法において、プライマーを伸長するために化学的に反応するように、プライマーを伸長させるために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、修飾される）を用いて伸長され得ることが理解される。
【０１２３】
特定の実施形態において、標的核酸との相互作用のためのプライマーサイズまたはプローブのサイズは、プライマーの所望される酵素学的操作（例えば、ＤＮＡ増幅またはプローブもしくはプライマーの簡単なハイブリダイゼーション）を支持する任意のサイズであり得る。代表的なプライマーまたはプローブは、少なくとも、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３２５，３５０，３７５，４００，４２５，４５０，４７５，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３５００または４０００ヌクレオチド長である。
【０１２４】
他の実施形態において、標的核酸プライマーまたはプローブは、６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３２５，３５０，３７５，４００，４２５，４５０，４７５，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３５００または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
【０１２５】
代表的に、標的核酸に対するプライマーは、１００ヌクレオチド長と３５０ヌクレオチド長の間である標的核酸の領域を含む増幅ＤＮＡ産物を生成するために使用される。一般的に、代表的な産物のサイズは、このサイズが、３ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドまたは１ヌクレオチド内で正確に決定され得るようなサイズである。
【０１２６】
特定の実施形態において、この産物は、少なくとも２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３２５，３５０，３７５，４００，４２５，４５０，４７５，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３５００または４０００ヌクレオチド長である。
【０１２７】
他の実施形態において、産物は、２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１２５，１５０，１７５，２００，２２５，２５０，２７５，３００，３２５，３５０，３７５，４００，４２５，４５０，４７５，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１２５０，１５００，１７５０，２０００，２２５０，２５００，２７５０，３０００，３５００または４０００ヌクレオチド長以下である。
【０１２８】
（ｅ）チップおよびマイクロアレイ）
少なくとも一つのアドレスが、本明細書で開示される任意の核酸配列で記載する配列または配列の一部である、というチップが開示される。少なくとも一つのアドレスが、本明細書で開示される任意のペプチド配列で記載する配列または配列の一部である、というチップもまた開示される。
【０１２９】
少なくとも一つのアドレスが、本明細書で開示される任意の核酸配列で記載する配列の改変体または配列の一部の改変体である、というチップもまた開示される。少なくとも一つのアドレスが、本明細書で開示される任意のペプチド配列で記載される配列の改変体または配列の一部の改変体である、というチップもまた開示される。
【０１３０】
（ｆ）コンピューター読取り可能媒体）
開示される核酸およびタンパク質は、ヌクレオチドまたはアミノ酸からなる配列として表され得る、と理解される。これらの配列を表すための多様な方法（例えば、ヌクレオチドグアノシンは、Ｇまたはｇで表され得る）がある。同様に、アミノ酸バリンは、ＶａｌまたはＶで表され得る。当業者は、存在する任意の多様な方法（各々は、本明細書で開示されると考慮される）において、任意の核酸配列またはタンパク質配列を、どのように表しそして表現するのかを理解する。本明細書中で具体的に考察されることは、コンピューター読取り可能媒体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、または他のコンピューター読取り可能媒体）でのこれらの配列のディスプレーである。開示される配列の二元性コード表出もまた開示される。当業者は、コンピューター読取り可能媒体を理解する。従って、コンピューター読取り可能媒体に核酸配列またはタンパク質配列が記録され保管されもしくは保存される。
【０１３１】
特定のプライマー対の群についての、本明細書中に開示されるように使用されるための標準曲線が、特定のデータを分析するために保管されまたは検索される、というコンピューター読取り可能媒体もまた開示される。
【０１３２】
本明細書中で示されるプライマーおよびこのプライマーに関する情報を含むコンピューターで読み取り可能な媒体が開示される。
【０１３３】
ｇ）キット
本明細書中で開示される方法を実施するうえで使用され得る試薬について示されるキットが、本明細書中で記載される。このキットは、本明細書中で考察されるか、あるいは開示された方法の実施において必要または有益であると理解される任意の試薬または試薬の組み合わせを含み得る。例えば、このキットは、方法の特定の実施形態において考察される増幅反応を実行するためのプライマー、および意図されるプライマーを使用するために必要な緩衝液ならびに酵素を含み得る。
【０１３４】
キットは、第１ＰＣＲおよび第２ＰＣＲの両方についてのプライマー対の群を含み得る。キットはまた、例えば、含まれるプライマー対の群（キット内に含まれる）に特異的な標準曲線に関する情報を含み得る。キットは、本明細書中で開示される種々の形態の方法を実行するために必要とされる任意の試薬を含み得る。
【０１３５】
例えば、キットは、配列番号１〜１０９で示されるプライマーおよび配列番号１〜１０９に結合する普遍的な標識配列を有するプライマーならびにそれぞれに対して作られる標準曲線に関する情報を含み得る。キットは、これらが他の方法で得られ得る場合、いずれの試薬も含む必要はない。この型のキットの特定のバリエーションにおいて、第１のＰＣＲプライマー対の群は、単一のチューブで、すぐにＰＣＲ混合物に添加される状態にあり得る。
【０１３６】
ｈ）類似の機能を有する組成物
本明細書中で開示される組成物および方法が、ＰＣＲを使用して核酸配列の複合解析を可能にするような特定の機能を有することが理解される。開示された機能を実行するための特定の構造的な必要性または開示された方法を実行するためのステップが本明細書中で開示され、そして、開示された構造およびステップに関連する同じ機能を実行し得る種々の構造またはステップがあること、そして、これらの構造が、最終的に同じ結果（例えば、ＰＣＲを使用した核酸配列の複合解析を可能にする刺激または阻害）に到達することが理解される。
【０１３７】
（３．組成物の作製方法）
本明細書中で開示される組成物および開示された方法を実行するために必要な組成物は、特に他に記載されない限り、特定の試薬または化合物について、当業者に公知の任意の方法を作られ得る。
【０１３８】
ａ）核酸合成
例えば、核酸（例えば、プライマーとして使用され得るオリゴヌクレオチド）は、標準的な化学合成方法を使用して作られ得るか、あるいは酵素方法または任意の他の公知の方法を使用して産生され得る。そのような方法は、標準的な酵素消化、それに引き続くヌクレオチドフラグメント分離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）第５、６章を参照のこと）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成器（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成器またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホラミダイト方法による純粋な合成方法までの範囲にあり得る。オリゴヌクレオチドを作るために有用な合成方法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３〜３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよび亜リン酸塩トリエステル方法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５：６１０〜６２０（１９８０）（ホスホトリエステル方法）によって記載される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３〜７（１９９４）によって記載されるような公知の方法を使用して作られ得る。
【０１３９】
（Ｂ．用語）
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単一の形態「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「薬学的キャリア」に対する参照は、２つ以上のそのようなキャリアなどの混合物を含む。
【０１４０】
範囲は、「おおよそ」１つの特定値から、および／または「おおよそ」別の特定値として、本明細書中で表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、この１つの特定値から、および／または他方の特定値を含む。同様に、値が近似値として表される場合、推定的な「おおよそ」の使用によって、この特定値が別の実施形態を形成することが推測される。それぞれの範囲の終点は、他の終点と関連し、そして他の終点から独立しているという両点で重要であることがさらに理解される。本明細書中で開示される多数の値があり、そしてそれぞれの値はまた、「おおよそ」（値自体に追加される特定の値）として本明細書中で開示されることもまた、理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「おおよそ１０」もまた開示される。値（この値「未満または等価な値」）が開示される場合、当業者によって適切に理解されるように、「この値より大きいまたは等価な値」および値間の可能な範囲もまた開示されることがまた、理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満または１０と等価な値」および「１０より大きいまたは１０と等価な値」もまた開示される。
【０１４１】
「任意の」または「必要に応じて」は、引き続き記載される事象または状況が生じ得るかまたは生じ得ないこと、およびこの記載が、前記事象または状況が生じる例ならびに生じない例を含むことを意味する。
【０１４２】
「プライマー」は、いくつかの型の酵素操作を支持し得、そして酵素操作が生じ得るように標的核酸とハイブリダイズし得るプローブのサブセットである。プライマーは、酵素操作を妨げない、当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体あるいはアナログの任意の組み合わせから作られ得る。
【０１４３】
「プローブ」は、代表的には配列特異的な方法（例えば、ハイブリダイゼーションを介する）で標的核酸と相互作用し得る分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野で十分に理解され、そして本明細書中で考察される。代表的に、プローブは、当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体あるいはアナログの任意の組み合わせから作られ得る。
【０１４４】
「倍化速度」は、所定のセットの条件下で所定のプライマー対によって産生される所定の産物がＰＣＲ反応において増幅される速度をいうために、ＰＣＲの文脈において本明細書中で使用される用語である。理論的には、ＰＣＲ反応（溶融、アニーリング、および伸長）において生じる増幅の各サイクルは、正確に２倍のテンプレートＤＮＡを産生する（すなわち、それは、テンプレートＤＮＡを２倍にする）。しかし、実際は、増幅は「完全」ではなく、実際上の増幅は、わずかに「１サイクルあたり２倍」未満の速度で生じる。所定のセット条件下で所定のＰＣＲ産物を生じる増幅の最高速度は、反応の「倍化速度」と呼ばれ、そしてこの最高速度は、例えば１．９２または１．８３のような「２倍」未満であり得ることが理解される。従って、この倍化速度は、所定のセットの試薬および条件のためのおよそ上のレベルの増幅を示す。
【０１４５】
「最適なＰＣＲ増幅」とは、ＰＣＲの各サイクルが特定のＰＣＲ産物のためのおおよその倍化速度でなお増幅している場合に存在する条件をいう。ＰＣＲ産物がＰＣＲ混合物中で増加し、そしてＰＣＲプライマーがＰＣＲ反応混合物中で減少する場合、増幅効率は、特定の産物および条件のためのおおよその倍化速度未満に低下することが理解される。これが生じる場合、反応はもはや最適なＰＣＲ増幅を受けているとは言われない。
【０１４６】
本出願の全体を通じて、種々の公開公報が参照される。これらの公開公報全体の開示が、当該分野の技術の状態をより十分に記載するために本願で参考として援用される。開示された参考文献はまた、これらの参考文献が信頼される文章中で考察される参考文献に含まれる物質に関して本明細書中で参考として独立して、そして特異的に援用される。
【０１４７】
プライマー対は、本明細書中で、特定の標的核酸を増幅するように設計されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを称するために使用される。プライマー対はまた、プライマーセットと称され得、そしてプライマーセットはプライマー対と称され得る。
【０１４８】
プライマー対のセットとは、少なくとも２つのプライマー対をいい、このプライマー対は２つの異なる標的核酸のために設計される。代表的に、これは、例えば２つの異なる遺伝子に由来する２つの異なる核酸標的を意味するが、これはまた、例えば、同じ発現遺伝子産物の２つの異なるアイリフォーム（同一形態）を増幅するように設計された２つの異なるプライマー対でもあり得る。
【０１４９】
コピー数とは、何らかのコピーの数をいう。例えば、特定の核酸のコピー数とは、例えば、サンプル、またはチューブ、あるいは状況において存在するその特定の核酸のコピーの数をいう。コピー数は、本明細書中で開示されるように決定され得、そしてまた、例えば本明細書で開示され、そして理解されるような特定の組成物のグラム数または特定の組成物のモル数に書き換えられ得る。
【０１５０】
（Ｃ．実施例）
数（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための努力がなされるが、いくつかの誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は重量部であり、温度は、°Ｃにおけるかまたは周辺温度であり、そして圧力は、大気圧かまたは大気圧周辺である。
【０１５１】
（１．実施例  １  多数の遺伝子産物のための単一チャネル定量マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲの検証およびそのアルツハイマー病研究の分野における使用）
ａ）設計の一般的な概観
開示される方法の実施例の全体的な概説は、図１において略述される。代表的に、組織の均質化後、上前頭回由来の総ＲＮＡを、ドライアイスまたはイソペンタンで凍結された組織からＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。これらのホモジネートから抽出されたＲＮＡあるいはアセトンで固定され、そしてヘマトキシリンで対比染色された新鮮な凍結切片から削られた組織を、最終容量２０μｌ中でＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、適切な濃度のｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＮＶｄ（Ｔ）および１μｇの総ＲＮＡを含む製造者の緩衝液中で逆転写した。この反応は、−２０°Ｃで保存する前に３７°Ｃで１２時間で起こった。β−アクチン、ＦＫＨＲ、インテグリン、Ｏｃｔ３、ＨＯＸＢ２、ＰＫＤ１、ＰＥＣＡＭ、ＥＧＲ１、ＴｅｌｅｎＣ、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＴＩＡ１、Ｃｕｌ２、ＰＰ２ＣＢ、ＰＡＲＧ、ＩＴＧＢ、ＫＩＦ５Ｂ、ＡＰ１８０、ＳｙｎｔａｘｉｎおよびＤｙｎａｍｉｎ  ｍＲＮＡに関するマルチプレックスリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ）分析を，ｉＣｙｃｌｅｒ機器およびソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して実行した。３つのプライマーセット（２個のフォワードおよび１個のリバース）を、目的の遺伝子に関する１７７および２３７塩基対との間を特異的に増幅するように設計し、そしてＧｉｂｃｏによって合成した（このプライマーは、図７および図８において示される）。フォワードプライマー対の１つは、第２巡の増幅において使用されるべき「普遍配列」を含んだ（以下参照のこと）。各遺伝子のために使用したＰＣＲプライマーの配列および普遍配列を、図７および図８中に示す。第２巡のＰＣＲのために使用される蛍光プローブを、（ＦＡＭ＝６−カルボキシ−フルオレセイン）のようなレポーターおよびクエンチャー色素（ＤＡＢＳＹＬ＝４−（ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸）で標識した。マルチプレックスリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲの原理は本明細書中で記載され、そして代表的に、２巡のＰＣＲからなる。この開示された方法は、目的の各遺伝子についての特異的のレポーターは必要としない。逆転写後、第１巡目のＰＣＲをＲＴから１μｌをもって実行する。この巡において、目的の全プライマーを、代表的には等モル濃度および最終容量１００μｌで、ｄＮＴＰおよび２０μｌのＲＴを含む製造者の緩衝液中で適切な濃度のＨｏｔＳｔａｒＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）とともに混合する。９５°Ｃでの１５分後、次の１５サイクルはそれぞれ、９５°Ｃで２０秒の変性、６０°Ｃで２０秒のアニーリングおよび７２°Ｃで２０秒の伸長から構成された。７２°Ｃで１０分間の最終伸長ステップを実行した。リアルタイムで定量的な第２巡の増幅のために、代表的には第１巡からの１μｌのアリコートを、氷上で総容量２５μｌで毎回普遍配列を含むフォワード特異プライマーおよび目的の遺伝子ごとに特異的なリバースプライマーと共に、適切の濃度のＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、普遍プライマー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、およびｄＮＴＰと混合した。次いで、標準曲線を、目的の各遺伝子���ついてそれぞれ構築する。これを行う前に、各アンプリコンを、ｐＧＥＭ（商標登録）−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクローンニングした。この生成したプラスミドを分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して定量し、そして標準曲線をプロットするための公知の出発物質として使用するために、続いて希釈する。次いで、これらの曲線を使用して、その特異的な閾値サイクルに基づいて、それぞれ未知のテンプレートについての遺伝子コピーの開始時の量を分析し得る。
【０１５２】
ｂ）結果
（１）ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの実験デザイン
平行して多数の転写を分析するために使用されるストラテジーの概観を、図１において略述する。第１ステップは、同じＰＣＲ条件を共有するプライマーのセットを設計し、そして有効にすることであった（Ｒｕａｎｏら，１９９５）。共通のパラメーターは、アニーリング温度（６０＋／−０．５°Ｃ）、ＧＣ含量（５０＋／−５％）および１８０〜２００塩基対を有するアンプリコンを含んだ。代表的には、ＰＣＲ産物が長ければ長いほど、バックグラウンドはより増大する。これらの特徴は、全ＰＣＲマルチプレックス反応が最大効率で生じるのを可能にするために必須であった。一連の標準曲線の構築は、プライマー設計後に起こった。このステップを達成するために、それ（各候補）を、プラスミドベクターでサブクローニングした。それを行うために、通常の定量マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲを実行した（データは示されない）。このステップは、目的の候補のサブクローニングを可能にしただけでなく、プライマー対についての品質試験を提供した。換言すれば、相補性間または自己相補性のようなプライマー間の任意の不適合性を、この点で検出し得、そして関連プライマーを再設計し得た。また、各プライマー対の特異性を、この工程を通して試験した。この「実験に基づく」品質制御は、時間消費が少ないことおよびプライマー設計ソフトウェアを使用して他のコントロールよりも信頼性のあることが見出されたが、これもまた実行し得る。一旦本発明人の標的をサブクローニングしたのち、目的の各遺伝子についての標準曲線を構築した。
【０１５３】
第３のステップ（図１におけるステップ３）は、サンプル調製と関連した。総ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｎｅａｓｙ（商標登録）Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を、製造者の指示書に従ってサンプルから抽出し、そして第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。一旦、第１鎖ｃＤＮＡを合成して、第１巡のＰＣＲを実行した。この第１巡のＰＣＲを、１μｌのＲＴ（ステップ４）で実行した。この巡において、目的の全プライマーを、等モル濃度および最終容量が１００μｌで、適切な濃度のｄＮＴＰ、酵素および適切な混合物とともに混合した（物質および方法を参照のこと）。この実施例において、第１巡は、１μｇの総ＲＮＡで開始した場合、β−アクチンのような最も豊富なメッセージでさえ、なお増幅の直線範囲内にあるということを保証するために１５サイクルに限定した。この第１巡のＰＣＲ条件は、サブクローニングおよび品質制御について、以前の「標準的」なマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ（ステップ２）と同じであった。次のステップ（ステップ５）は、一連の単一チャネルリアルタイムＰＣＲ反応から構成した。このステップを達成するために、第１巡のＰＣＲのアリコート（１μｌ）を、氷上にて総容量５０μｌで、５’を普遍配列でタグ化した特異的フォワードプライマー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）および目的の遺伝子ごとに特異的なリバースプライマーとともに混合した（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら，１９９７；Ｎｕｏｖｏら，１９９９；Ｗｉｎｎ−Ｄｅｅｎ，１９９８）。反応に必要な適切な濃度の酵素および試薬をこの溶液に添加した。目的の全遺伝子についての反応を、平行して実行した。この第２巡のＰＣＲを、リアルタイム定量サーモサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ）において実行し、そして蛍光放出の定量をＰＣＲの各サイクルの間で記録した。次いで、目的の各遺伝子に関するコピー数を、対応する標準曲線を使用する閾値サイクルに基づいて計測した。従って、１９個の定量を、初めの第１鎖ｃＤＮＡから平行して実行した（ステップ３）。次のステップ（ステップ６）は、データ分析から構成された。いくつかの解析を、異なるゴールを達成するために実行し得る。実施例を、次のセクションで示す。
【０１５４】
ｃ）ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの検証
ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの検証のための第１のステップとして、１９個の候補標的（図８）をクローニングベクター（ｐＧＥＭ（商標登録）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングしたが、任意のサブクローニングベクターを使用し得る。
【０１５５】
プライマーの特異性を、さらに、目的のそれぞれ挿入されたクローンを配列決定することによって検証した。次いで、それぞれ標的遺伝子を含むプラスミドをもって、図１中の手順を実行した（ステップ２〜５）。１０８〜１０１コピーの範囲にある１９個のプラスミドの等モル濃度の８段階希釈を、第１巡の増幅のためのテンプレートとして使用した。これは、異なる濃度でのこれらの１９個の挿入物の平行プロセッシングを可能にし、そして同じアリコートからの１９個の異なる標準曲線（それぞれ３連でコピー数を有する）の構築を可能にした。増幅の均一性の実例を図２Ａにおいて示す。３連の繰り返しの分析は、０．０５〜０．１８サイクル（代表的には、おおよそ、．１サイクル）の範囲にある閾値サイクル数の標準偏差を、使用した希釈段階内で導いた（他の実験において、サイクル数は、．４サイクルを超えなかった。図２Ｅを参照のこと）。この実験中に集められた全データを使用し、そしてこれらのデータと、ベースラインサイクルおよび閾値のための適切な選択を組み合わせることによって、２４ウェルについての最終的な結果（すなわち、８希釈×３（３連））は、平均閾値サイクル２９．６および標準偏差０．２１（平均ＳＤ＝０．７％）であった。１９個のバックグラウンド修正データのそれぞれを、図２Ｂにおいて例証されるような標準曲線を形成するために、ＰＣＲベースラインまで落とし、これは、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲで達成し得た増幅直線の典型的な例を示す。標準曲線相関係数は、８オーダーの大きさにわたって、０．９９９と０．９８０との間の範囲であった。この範囲の相関係数は、標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して得られたものと関連する。それぞれ第２巡のＰＣＲ後、増幅の特異性について調べるために１％アガロースゲルを泳動した（図２Ｃ）。このステップは、別のプライマーセットから生じる非特異増幅または混入が生じる機会を最小にしたい場合に、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲにおいて重要である。ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの感度は、１０〜１００コピーの転写物（図２Ｂにおいて示されるような１０コピー）を含む出発物質の再現可能な増幅を可能にする。いくつかの例において、閾値サイクルは、単一コピーテンプレートで到達した（データは示されない）。この出発物質の量は、１ｐｇ未満の核酸と等価であり、これは、単一細胞転写分析を必要とする感度と同等である。このレベルの感受性は、手順を広範囲に適合させ、そして数オーダーで、アレイまたはノーザンブロットに必要な量を超える定量化のために必要な量の出発物質を減少する。さらに、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲを検証するために、得た結果を、以下の通常の定量ＲＴ−ＰＣＲおよびいくつかの標的を使用したｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲと比較した。図２Ｄは、得た結果を示す。ここで、１つの希釈を、サーモサイクラー設定において「未知」の濃度としてセットした（提供される実施例において、１０４コピー）。第１の観察は、標準曲線を構築した場合、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲを使用して閾値サイクルの絶対値が有意に減少した（ｐ＜０．００１）ということであった。前増幅が直線範囲において維持され、従って、閾値サイクルとコピー数の対数との間の本来の相関を変化させないので、このことは���出発物質の正確なコピー数の計測に影響を及ぼさない。通常の定量ＲＴ−ＰＣＲのための別個の標準曲線を構築したことが注記されるべきである。しかし、両方のアプローチを使用することで、同じコピー数の出発物質を得た。それゆえ、本発明者らの技術は、より従来的なアプローチと比較した場合、プラスミドに関して絶対的定量化の点では同じ結果を与える。
【０１５６】
ｄ）アルツハイマー病の状況におけるｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの適用
これらの検証ステップ後、このアプローチが、生物学的状況において適用され得ることを証明することが重要であった。これを行うために、ＡＤにおける１９個の標的の発現（図７および図８を参照のこと）を調査した。比較目的のために、以下で考察されるオリゴアレイで得た結果に基づいてこれらの標的を選択した。十分なプロテアーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）およびＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）消化後、総ＲＮＡを製造者の指示書に従って抽出した。総ＲＮＡ  対  ｍＲＮＡから得た結果の比較は、データの再現性における違いが無いことを示した（データは示されない）。結果として、続く調製は、総ＲＮＡを使用した。５つのＡＤ症例（３症例が年齢がマッチしたコントロール（本文中では「コントロール」として記載される）およびその剖検報告がＲｅａｇｅｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡＤの神経病理学的診断基準（Ｇｅａｒｉｎｇら，１９９５；Ｍｉｒｒａら，１９９４）を満たすが、痴呆の臨床的徴候を有さなかった（追想性臨床的痴呆評価：０）２症例）を使用した。これらの２症例は、本文中で「中間」として記載される。このＡＤ症例は、ＡＤについての臨床および神経病理学的診断基準の両方を満たした（Ｇｅａｒｉｎｇら，１９９５）。図３は、研究した１０症例から得た１９個の遺伝子の１μｇの総ＲＮＡあたりのコピー数を要約する。それぞれの測定は、３連であった（ＳＤをプロットしたが、あまりに小さく可視化できない）。ヒト被験体間の固有の変動性に起因して、「コントロールの平均またはＡＤの平均」として結果を一まとめにするよりむしろ、別個に記載された各個体についてのデータを示すことがより有益であると見出した。個体のデータの提示は、他では不明確にされ得る情報を提供する。このデータは、多数の候補メッセージについて、コントロールとＡＤ症例との間の明らかな隔たりを示す（図３Ａ）。コントロール（２つの「中間」症例を含まない）は、常に、研究した７つの候補遺伝子（ＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、ＩＣＡＭ５（図３Ａ））について、１μｇの総ＲＮＡあたりより多いｍＲＮＡコピー数を有した。これらの標的の大部分は、樹状突起器およびシナプス器に関連し、これは、ＡＤにおいて初期に影響されることが提唱されている（Ｍａｃｃｉｏｎｉら，２００１；Ｍｉｎｇｅｒら，２００１；Ｓｃｈｅｆｆら，２００１）。そのうえ、２つの中間症例の発現パターンは、コントロール群と比較してＡＤ群とより類似した（図３Ａ）。上の７つのメッセージ内で、ＡＤ集団（臨床的および形態学的の両方で、「後期」ＡＤステージを示す）は、コピー数の点でコントロールおよび中間症例と比較するよりもより相同であり、以前の研究（Ｃｈｏｗら，１９９８）において観察されたものと類似することもまた観察した。しかし、偶然ＡＤ値の中に入る中間症例に起因して、コントロールおよび中間を示す症例におけるよりおおきな異質性はほとんど全体的である。従って、神経病理学的ＡＤ以外の臨床的コントロールである症例をより厳密に規定されたコントロール集団から除外した場合、このコントロール症例は、ＡＤ症例ほど異質性ではなかった。コントロールがより異質性であり、ＡＤ値と部分的に重なっているので、Ｅｇｒ−１は、これらの解説に対する例外を示す（図３Ａ）。別の遺伝子セット（ＨＯＸＢ７、ＰＫＤ１、β−アクチン、Ｏｃｔ−３、ＫＩＦ５Ｂ、ＦＫＨＲ、インテグリン−β５およびＩＴＧＢを含む）は、コピー数の不均質な分配および両群の広範囲な重複を示す（図３Ｂ）。内因性のエンドヌクレアーゼＴＩＡＬ１（Ｋａｗａｋａｍｉら，１９９２）および急性炎症反応タンパク質ＰＥＣＡＭ１（Ｎｅｗｍａｎら、１９９０）の場合、コントロール集団および中間症例は、ＡＤ群より相同であった。ｍＲＮＡレギュレーターＣＵＬ２を誘導された低酸素症（Ｐａｕｓｅら，１９９８；Ｐａｕｓｅら，１９９７）は、コントロール集団（コントロール症例５）における１つの注目に値する例外を有するこの群に属するように思われた。図３Ｃは、年齢がマッチしたコントロールとＡＤ症例との間の絶対値における遺伝子発現の比較を示す。標準偏差は、ＡＤ症例で比較して年齢がマッチしたコントロール群内でより高く、年齢がマッチしたコントロール群のより高度な異質性を明らかにした（図３Ｃ）。β−アクチンを、この２つの群の間のデータの正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した（図３Ｄ）。比較発現における首尾一貫した変化を観察した。年齢がマッチしたコントロールにおけるβ−アクチンとＡＤとの間で９倍の変化を見出した。
【０１５７】
ｅ）主成分分析の適用
主成分分析（ＰＣＡ）を、本発明者のデータセットの次元を減少させ、そしてさらに意義のある生物学的情報を抜粋するために使用した。第１に、ＰＣＡを実行するために遺伝子の全セットを使用し、そして第１の２つの主成分の２次元プロットを構築した（図４Ａ）。この分析は、疾患状態による症状のクラスター化を示した。特に、中間症状を、コントロールのクラスターよりＡＤのクラスターに対してより近く位置付けた。この最初の２つの成分は、本発明者らの候補間の７５．５％の変化を説明するために、この分析において十分であった（図４Ｃ）。成分１に対してより重い重みを与えるメッセージは、Ｄｙｎａｍｉｎ、ＡＰ１８０、ＩＣＡＭ５、ＰＰ２ＣＢ、ＳｙｎｔａｘｉｎおよびＡｃｔｉｎであった。成分２に対してより重い重みを与えるメッセージは、ＰＫＤ１、ＫＩＦ５Ｂ、ＨＯＸＢ７、インテグリン５、ＩＴＧＢおよびＦＫＨＲであった。樹状器およびシナプス器（図３Ａを参照のこと）に関連するこの７つの遺伝子を選択し、そしてこの候補セットに関してＰＣＡを実行した。この回収遺伝子を使用して、より明白なＡＤ症例のクラスター化およびここでもコントロールよりＡＤ症例により近しい中間症例（図４Ｂ）を観察した。ここで、第１の成分は、本発明者らの候補間の７８．５％の変化の原因であった（図４Ｄ）。第２の成分の添加は、９２．３％に対する原因となった変化を増加した。このメッセージのセットがＡＤとコントロールの間の明らかな分離を可能にした事実は、このメッセージがＡＤと低確率の誤差を有するコントロールから分離するために使用され得ることを示唆する。そのうえ、これらのメッセージをＡＤの最終診断が困難である任意の死後状態において使用し得た（Ｇｅａｒｉｎｇら，１９９５）。さらに、この結果のセットは、これらの遺伝子とこの疾患の細胞生物学との関係についての調査を導き得る。全体的にみて、図３および４に存在するデータは、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲが転写集団が目的の集団である生物学的パラダイムにおいて使用され得ることを証明する。
【０１５８】
ｆ）アフィメトリックス（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）サンプルとｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲとの比較
ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの別の使用は、オリゴアレイまたはｃＤＮＡアレイを有効にすることである。コントロールとＡＤ症例の間で異なって発現するｍＲＮＡの全般的な同定を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｕ９５オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して達成した。この研究の残りのために使用した同じ症例から抽出した総ＲＮＡをハイブリダイズし、そして公開された手順（Ｇｏｌｕｂら，１９９９）に従って分析した。次いで、年齢がマッチしたコントロールとＡＤ症例の間の各標的についての倍数変化（図５Ａ）を比較した。シナプス小胞エンドサイトーシスＡＰ１８０（Ｍａｏら，２００１）遺伝子はオリゴヌクレオチドアレイ上で示されないので、シナプス小胞エンドサイトーシスＡＰ１８０を除外した。１７個の標的のうちの７個（４１％）において、傾きの点から１倍の変化より大きい２つの技術との間の不一致が認められた。これらの７個の標的は、ＦＫＨＲ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２００１）、インテグリン５（Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，２００２）、Ｏｃｔ３（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，１９９３）、ＰＫＤ１（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，１９９４）、ＰＥＣＡＭ  １、ＥＧＲ  １（Ｈｕａｎｇら，１９９７）およびＫＩＦ  ５Ｂ（Ｋａｍａｌら，２００１；Ｎｉｃｌａｓら，１９９４）であった。これらの７個の転写物内で、これらのうちの４つは、反対方向であった（ＦＫＨＲ、インテグリン−５、Ｏｃｔ−３およびＰＥＣＡＭ）。アレイ確認におけるこれらの不一致は、他（Ｒａｊｅｅｖａｎら，２００１；Ｔｓｅｎｇら，２００１；Ｗａｎｇら，２００１）によってされているが、多くの研究において目立たなかった。製造者によって提唱される新規の統計学的アルゴリズム（ＭＡＳ  ５．０）の使用は、この状況を変化させなかった。興味深いことに、ＰＣＡをこのアレイデータ上で使用し、そしてｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲでプロセスした同じ標的に関してＰＣＡと比較した場合（図５Ｂ）、この２つの集団が、予想通りに分離しされた。しかし、アレイデータに関して実行したＰＣＡ分析において、この２つの中間症例は、コントロールと分離されそこねた（図５Ｃ）。このデータは、ここでも機能的ゲノムアプローチに続く検証ステップの重要性を強調した。
【０１５９】
（２．実験手順）
ａ）ヒト脳組織
上前頭回由来の死後ヒト脳組織をローチェスター大学の脳バンクから得た。全症例を、表１において示された臨床および神経病理学的基準に基づいて特徴付けた。
【０１６０】
【表１】
2005511055.tif 000006
2005511055.tif 000007
ｂ）ＲＮＡ抽出
２００ｍｇヒト脳組織ホモジネートから総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。各ＲＮＡ調製は、製造者の指示書によるＤＮａｓｅ  Ｉおよびプロテイーゼ  Ｋ（Ｑｉａｇｅｎ）処理も包含した。総ＲＮＡの収量を、２６０ｎＭでの吸光度によって決定した。ＲＮＡの完全性を、２６０／２８０ｎＭ比（１．９８〜２．０２の範囲にある）およびアガロースゲル電気泳動の両方によって評価した。
【０１６１】
ｃ）逆転写
各サンプルからの１μｇの総ＲＮＡを、製造者の緩衝液における４単位のＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０単位のＲＮａｓｅインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および１μＭのＮＶｄ（Ｔ）（５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ３’）を含む最終容量２０μｌにおいて、ｃＤＮＡに逆転写した。この反応は、３７°Ｃで１２時間で起こり、そしてさらなる使用まで−２０°Ｃで保存した。
【０１６２】
ｄ）単一チャネルマルチプレックス定量ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲ反応を、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）およびｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して実行した。同じＰＣＲ条件において目的の遺伝子についての１７７塩基対と２３７塩基対の間を特異的に増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌで利用可能）を使用してＰＣＲプライマーを設計し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって合成した。目的の各遺伝子について、「Ｚ−配列」（ＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＡＣＡ）またはＵｎｉｐｒｉｍｅｒアニーリングを必要とする５’末端でＺ配列のように機能する任意の他の配列を含むさらなるフォワードプライマーを注文した。ＰＣＲプライマーの配列を、図７および図８において示す。Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍキットは、サンライズ（ｓｕｎｒｉｓｅ）プライマーストラテジーに基づく。ＵｎｉＰｒｉｍｅｒは、Ｚ配列の５’末端をレポーター色素（ＦＡＭ＝６−カルボキシ−フルオレセイン）で、および３’末端をクエンチャー色素（ＤＡＢＳＹＬ＝４−（ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸）で標識された同じ「Ｚ−配列」を含む。
【０１６３】
マルチプレックス定量ＰＣＲの第１巡について、それぞれ１００μｌのＰＣＲ反応は、１μｌのｃＤＮＡまたはプラスミド、製造者の緩衝液における５単位のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２μｌのプライマー混合物を含んだ。このプライマー混合物を、目的の全遺伝子のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーから、それぞれ１０μＭの最終濃度で作った。ここで使用したフォワードプライマーは、Ｚ−配列を含まなかった。ＰＣＲプログラムを、ポリメラーゼを活性化するための９５°Ｃでの１５分、引き続く９５°Ｃでの２０秒の変性、６０°Ｃでの２０秒のアニーリングおよび７２°Ｃでの３５秒の伸長からなる１５サイクルから構成した。７２°Ｃでの１０分間の伸長の最終ステップを実行した。この巡のＰＣＲは、前増幅のみであり、そしてリアルタイムＰＣＲを伴わなかった。
【０１６４】
マルチプレックス定量ＰＣＲの第２巡について、それぞれ５０μｌのリアルタイムＰＣＲ反応は、１μｌの第１巡マルチプレックス定量ＰＣＲ反応物、製造者の緩衝液における２．５単位のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１つの遺伝子について０．０２μＭのフォワードプライマーおよび０．２μＭのリバースプライマー、および０．２μＭのＵｎｉＰｒｉｍｅｒを含んだ。ＰＣＲプログラムを、ポリメラーゼを活性化するための９５°Ｃでの１５分、引き続く９５°Ｃでの２０秒の変性、６０°Ｃでの２０秒のアニーリングおよび７２°Ｃでの３５秒の伸長からなる５０サイクルから構成した。７２°Ｃでの１０分間の伸長の最終ステップを実行した。蛍光強度を各サイクルのアニーリングステップの間に測定し、そのため、取り込まれなかったＵｎｉＰｒｉｍｅｒは、失活したヘアピン構造において優位であった。各反応についての閾値サイクル（ＣＴ）を、ｉＣｙｃｌｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析した。
【０１６５】
全リアルタイムＰＣＲ実験を３連で実行し、そしてこの３連についての平均ＣＴを、続く分析全てにおいて使用した。酵素またはテンプレートを省略した反応を、ネガティブコントロールとして使用した。全反応物は、このＰＣＲ特異性を確認するために、１％アガロースゲルで分離した。転写物の量を、それぞれの標準曲線に対する参考によって計算した。
【０１６６】
ｅ）標準定量ＰＣＲ
反応混合物および条件は、ＰＣＲテンプレートが１μｌのプラスミドであることを除いて、第２巡のマルチプレックス定量ＰＣＲと同じであった。
【０１６７】
ｆ）クローニングおよび標準曲線の構築
標準ＰＣＲを、テンプレートとしてｃＤＮＡおよび目的の各遺伝子について同じセットのプライマーを使用して実行した。使用したフォワードプライマーは、Ｚ−配列を含まなかった。各ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。プラスミドを２６０ｎＭでの吸光度によって定量した。目的の各遺伝子に関するプラスミドの８つの１０倍段階希釈を、マルチプレックス定量ＰＣＲを３連で独立して実行するためのテンプレートとして使用した。従って、標準曲線を目的の各遺伝子について構築した。投入プラスミドＤＮＡコピー数の閾値サイクルと対数値の間の直線相関を、１０１〜１０８コピーの範囲にわたって観察した。
【０１６８】
ｇ）マイクロアレイ
二本鎖ＤＮＡを、ポリ（ｄＴ）を含む１つのプライマーおよびＴ７ポリメラーゼプロモーター配列を含む他のプライマーを使用して１５μｇの総ＲＮＡから合成した。ビオチン化ＵＴＰおよびＣＴＰの存在下でテンプレートとして二本鎖ＤＮＡを用いたインビトロ転写を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されたプロトコルを使用して実行した。ビオチン化ｃＲＮＡを精製し、フラグメント化し、そして製造者の手引きに従ってＨｕＧｅｎｅＦＬアレイとハイブリダイズした。次いで、このハイブリダイズアレイを洗浄し、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、そしてＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンした。データ分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン３．１および５．０）を使用して実行した。ハウスキーピング遺伝子の内部制御および試験チップを、サンプルを試験する前に流した。
【０１６９】
ｈ）主成分分析
第１に、マルチプレックス定量ＰＣＲおよびマイクロアレイからのデータをＥｘｃｅｌファイルに変換し、そしてデータファイルとしてＳ−Ｐｌｕｓ統計ソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ）に移した。主成分分析を、Ｓ−Ｐｌｕｓにおけるデフォルト設定を使用して全変数または選択された変数のいずれかで実行した。第１の２つの主成分を、散布図を作るために使用した。スクリーンプロットおよび導かれる棒グラフもまた、ソフトウェアによる各分析において生成した。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、開示される方法を実施する一般的なスキーム、シングルチャネル定量的マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ（ＳｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ）の全体像を示す。それは典型的には６つの可能な工程からなる。工程１−５（プライマー設計およびサブクローニング；標準曲線の構築；ＲＮＡの抽出および逆転写；初回ＰＣＲ；および２回目のリアルタイム定量的ＰＣＲ）が典型的に実施され、そして工程６は（それは、例えば主な構成成分の分析；規範的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）分析；アレイ比較からなる）、典型的にはどの型の分析が必要かによって適応させ得る。
【図２Ａ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｂ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｃ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｄ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｅ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｆ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｇ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図２Ｈ】図２は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの確証工程を示す。図２Ａ、１９個の標的を同じ量の開始材料から並行して処理し、そしてＰＣＲの定量回中に得られた閾値サイクルの代表的な例を示す。図２Ｂ、１９個の標的転写物に関連する標準曲線を、閾値サイクルから構築した。図２Ｃ、アンプリコンの特異性の標示として、定量後１％アガロースゲルに流したもの。そのようなゲルを、典型的には各実験の後に流す。図２Ｄ、「通常の」定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較。上の傾向線は、通常の定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールに従って得られたものであり、ここで１０４コピーの開始材料が、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）の設定において未知のコピー数として考えられた。下の標準曲線は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲプロトコールを用いて行なった同じ実験を示す。同じ開始ｍＲＮＡコピー数が、両方の技術を用いて得られた。図２Ｅ−Ｆは、２回目のＰＣＲ中に行なわれた標準曲線の２つの代表的な例を示す。図２Ｅは、ホメオボックスＨＯＸＢ７転写物を示し、そして図２Ｆは、オクタマー結合転写物Ｏｃｔ−３の標準曲線を示す。ＨＯＸＢ７で得られた感受性（１０プラスミドコピー）およびＯｃｔ−３で得られた相関係数（０．９９９）に注意すること。
【図３Ａ】図３は、コントロール、中間段階、およびＡＤ症例由来の、全ＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡコピー数の比較を示す。図３Ａ、７つの転写物が、コントロール（黒）およびＡＤ症例（中灰色）の間で、一致した変化を示した。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤグループにより近くマッチしたことに注意する。ＡＰ１８０、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５およびＣａｍＫ２Ｇは、樹状突起、およびシナプス装置に関連する。ＥＧＲ１は、コントロールグループ内でより大きな不均一性を示した。図３Ｂ、８つの転写物が、３つのグループ内でそのｍＲＮＡコピー数に不均一性を示した。図３Ｃ、ＡＤ症例と比較して、コントロールおよび中間症例内でより高い均一性を示した３つの転写物。図３Ｄは、２回目のＰＣＲ（実際の定量回）後に行なった代表的なアガロースゲルを示す。各レーンは、異なる候補を示す（例えば、レーン１は、ベータアクチンに対応する）。ＰＣＲ産物は、事実上あらゆるプライマーダイマーを含まず、そして非特異的増幅は存在しない。
【図３Ｂ】図３は、コントロール、中間段階、およびＡＤ症例由来の、全ＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡコピー数の比較を示す。図３Ａ、７つの転写物が、コントロール（黒）およびＡＤ症例（中灰色）の間で、一致した変化を示した。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤグループにより近くマッチしたことに注意する。ＡＰ１８０、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５およびＣａｍＫ２Ｇは、樹状突起、およびシナプス装置に関連する。ＥＧＲ１は、コントロールグループ内でより大きな不均一性を示した。図３Ｂ、８つの転写物が、３つのグループ内でそのｍＲＮＡコピー数に不均一性を示した。図３Ｃ、ＡＤ症例と比較して、コントロールおよび中間症例内でより高い均一性を示した３つの転写物。図３Ｄは、２回目のＰＣＲ（実際の定量回）後に行なった代表的なアガロースゲルを示す。各レーンは、異なる候補を示す（例えば、レーン１は、ベータアクチンに対応する）。ＰＣＲ産物は、事実上あらゆるプライマーダイマーを含まず、そして非特異的増幅は存在しない。
【図３Ｃ】図３は、コントロール、中間段階、およびＡＤ症例由来の、全ＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡコピー数の比較を示す。図３Ａ、７つの転写物が、コントロール（黒）およびＡＤ症例（中灰色）の間で、一致した変化を示した。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤグループにより近くマッチしたことに注意する。ＡＰ１８０、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５およびＣａｍＫ２Ｇは、樹状突起、およびシナプス装置に関連する。ＥＧＲ１は、コントロールグループ内でより大きな不均一性を示した。図３Ｂ、８つの転写物が、３つのグループ内でそのｍＲＮＡコピー数に不均一性を示した。図３Ｃ、ＡＤ症例と比較して、コントロールおよび中間症例内でより高い均一性を示した３つの転写物。図３Ｄは、２回目のＰＣＲ（実際の定量回）後に行なった代表的なアガロースゲルを示す。各レーンは、異なる候補を示す（例えば、レーン１は、ベータアクチンに対応する）。ＰＣＲ産物は、事実上あらゆるプライマーダイマーを含まず、そして非特異的増幅は存在しない。
【図３Ｄ】図３は、コントロール、中間段階、およびＡＤ症例由来の、全ＲＮＡ１μｇあたりのｍＲＮＡコピー数の比較を示す。図３Ａ、７つの転写物が、コントロール（黒）およびＡＤ症例（中灰色）の間で、一致した変化を示した。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤグループにより近くマッチしたことに注意する。ＡＰ１８０、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５およびＣａｍＫ２Ｇは、樹状突起、およびシナプス装置に関連する。ＥＧＲ１は、コントロールグループ内でより大きな不均一性を示した。図３Ｂ、８つの転写物が、３つのグループ内でそのｍＲＮＡコピー数に不均一性を示した。図３Ｃ、ＡＤ症例と比較して、コントロールおよび中間症例内でより高い均一性を示した３つの転写物。図３Ｄは、２回目のＰＣＲ（実際の定量回）後に行なった代表的なアガロースゲルを示す。各レーンは、異なる候補を示す（例えば、レーン１は、ベータアクチンに対応する）。ＰＣＲ産物は、事実上あらゆるプライマーダイマーを含まず、そして非特異的増幅は存在しない。
【図４Ａ】図４は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ結果に対して行なった、主な構成成分の分析を示す。図４Ａ、遺伝子のセット全体に基づいて構築した２次元プロット（Ｍａｏ，Ｙら、（２００１）、Ｃｅｌｌ  １０４、４３３−４４０）。症例はその疾患状態によってクラスター化し、そして中間段階の症例（薄灰色）は、コントロール症例（黒）よりも、ＡＤ症例（中灰色）により近く位置した。図４Ｂ、同じ分析をＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇで行なった。この転写物のセットは、コントロール症例をＡＤ症例から分離するのに十分であり、そして中間段階の症例はＡＤグループに近くクラスター化した。図４Ｃ、１９個の候補遺伝子に関する主な構成成分の相対的重要性。最初の２つの構成成分が、症例間の変動の７５．５％を説明することに注意する。図４Ｄ、ＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇを含む７つの候補遺伝子に関する、主な構成成分の相対的重要性。ここで最初の２つの構成成分が、症例間の変動の９２．１％を説明する。
【図４Ｂ】図４は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ結果に対して行なった、主な構成成分の分析を示す。図４Ａ、遺伝子のセット全体に基づいて構築した２次元プロット（Ｍａｏ，Ｙら、（２００１）、Ｃｅｌｌ  １０４、４３３−４４０）。症例はその疾患状態によってクラスター化し、そして中間段階の症例（薄灰色）は、コントロール症例（黒）よりも、ＡＤ症例（中灰色）により近く位置した。図４Ｂ、同じ分析をＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇで行なった。この転写物のセットは、コントロール症例をＡＤ症例から分離するのに十分であり、そして中間段階の症例はＡＤグループに近くクラスター化した。図４Ｃ、１９個の候補遺伝子に関する主な構成成分の相対的重要性。最初の２つの構成成分が、症例間の変動の７５．５％を説明することに注意する。図４Ｄ、ＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇを含む７つの候補遺伝子に関する、主な構成成分の相対的重要性。ここで最初の２つの構成成分が、症例間の変動の９２．１％を説明する。
【図４Ｃ】図４は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ結果に対して行なった、主な構成成分の分析を示す。図４Ａ、遺伝子のセット全体に基づいて構築した２次元プロット（Ｍａｏ，Ｙら、（２００１）、Ｃｅｌｌ  １０４、４３３−４４０）。症例はその疾患状態によってクラスター化し、そして中間段階の症例（薄灰色）は、コントロール症例（黒）よりも、ＡＤ症例（中灰色）により近く位置した。図４Ｂ、同じ分析をＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇで行なった。この転写物のセットは、コントロール症例をＡＤ症例から分離するのに十分であり、そして中間段階の症例はＡＤグループに近くクラスター化した。図４Ｃ、１９個の候補遺伝子に関する主な構成成分の相対的重要性。最初の２つの構成成分が、症例間の変動の７５．５％を説明することに注意する。図４Ｄ、ＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇを含む７つの候補遺伝子に関する、主な構成成分の相対的重要性。ここで最初の２つの構成成分が、症例間の変動の９２．１％を説明する。
【図４Ｄ】図４は、ｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ結果に対して行なった、主な構成成分の分析を示す。図４Ａ、遺伝子のセット全体に基づいて構築した２次元プロット（Ｍａｏ，Ｙら、（２００１）、Ｃｅｌｌ  １０４、４３３−４４０）。症例はその疾患状態によってクラスター化し、そして中間段階の症例（薄灰色）は、コントロール症例（黒）よりも、ＡＤ症例（中灰色）により近く位置した。図４Ｂ、同じ分析をＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇで行なった。この転写物のセットは、コントロール症例をＡＤ症例から分離するのに十分であり、そして中間段階の症例はＡＤグループに近くクラスター化した。図４Ｃ、１９個の候補遺伝子に関する主な構成成分の相対的重要性。最初の２つの構成成分が、症例間の変動の７５．５％を説明することに注意する。図４Ｄ、ＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＩＣＡＭ５、ＰＡＲＧおよびＣａｍＫ２Ｇを含む７つの候補遺伝子に関する、主な構成成分の相対的重要性。ここで最初の２つの構成成分が、症例間の変動の９２．１％を説明する。
【図５Ａ】図５は、マイクロアレイおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較を示す。図５Ａ、マイクロアレイデータまたはｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲのいずれかで測定されたコントロールおよびＡＤ症例間の倍数変化は、ＦＫＨＲ、インテグリン５、Ｏｃｔ３およびＰＥＣＡＭ１を含むいくつかの候補に関して不一致を示した。図５Ｂ、マイクロアレイにも存在する１８個の遺伝子で構築された、主な構成成分のｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ２次元プロット。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤ症例（中灰色）でクラスター化したことに注意する。図５Ｃ、Ｂと同じ分析であるが、マイクロアレイ間接的蛍光インデックスに基づく。ここで、２つの中間段階の症例は、そのＡＤ組織学的病理にもかかわらず、コントロールから識別できなかった。
【図５Ｂ】図５は、マイクロアレイおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較を示す。図５Ａ、マイクロアレイデータまたはｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲのいずれかで測定されたコントロールおよびＡＤ症例間の倍数変化は、ＦＫＨＲ、インテグリン５、Ｏｃｔ３およびＰＥＣＡＭ１を含むいくつかの候補に関して不一致を示した。図５Ｂ、マイクロアレイにも存在する１８個の遺伝子で構築された、主な構成成分のｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ２次元プロット。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤ症例（中灰色）でクラスター化したことに注意する。図５Ｃ、Ｂと同じ分析であるが、マイクロアレイ間接的蛍光インデックスに基づく。ここで、２つの中間段階の症例は、そのＡＤ組織学的病理にもかかわらず、コントロールから識別できなかった。
【図５Ｃ】図５は、マイクロアレイおよびｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲの比較を示す。図５Ａ、マイクロアレイデータまたはｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲのいずれかで測定されたコントロールおよびＡＤ症例間の倍数変化は、ＦＫＨＲ、インテグリン５、Ｏｃｔ３およびＰＥＣＡＭ１を含むいくつかの候補に関して不一致を示した。図５Ｂ、マイクロアレイにも存在する１８個の遺伝子で構築された、主な構成成分のｓｃｑｍＲＴ−ＰＣＲ２次元プロット。中間段階の症例（薄灰色）は、ＡＤ症例（中灰色）でクラスター化したことに注意する。図５Ｃ、Ｂと同じ分析であるが、マイクロアレイ間接的蛍光インデックスに基づく。ここで、２つの中間段階の症例は、そのＡＤ組織学的病理にもかかわらず、コントロールから識別できなかった。
【図６】図６は、癌細胞のような、異常な増殖を有する細胞において転写物情報を分析するために使用し得る、プライマーの代表的なセットに関連する情報を示す。
【図７】図７は、アルツハイマー病および実施例１で議論する他の神経学的疾患に関して転写物を分析するために使用する２番目のＰＣＲのためのプライマー配列に関連する情報を示す。
【図８】図８は、アルツハイマー病および実施例１で議論する他の神経学的疾患に関して転写物を分析するために使用する最初のＰＣＲのためのプライマー配列に関連する情報を示す。
【配列表】
2005511055.tif 000008
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2005511055.tif 000029
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【図１】
2005511055.tif 000031
【図２Ａ】
2005511055.tif 000032
【図２Ｂ】
2005511055.tif 000033
【図２Ｃ】
2005511055.tif 000034
【図２Ｄ】
2005511055.tif 000035
【図２Ｅ】
2005511055.tif 000036
【図２Ｆ】
2005511055.tif 000037
【図２Ｇ】
2005511055.tif 000038
【図２Ｈ】
2005511055.tif 000039
【図３Ａ】
2005511055.tif 000040
【図３Ｂ】
2005511055.tif 000041
【図３Ｃ】
2005511055.tif 000042
【図３Ｄ】
2005511055.tif 000043
【図４Ａ】
2005511055.tif 000044
【図４Ｂ】
2005511055.tif 000045
【図４Ｃ】
2005511055.tif 000046
【図４Ｄ】
2005511055.tif 000047
【図５Ａ】
2005511055.tif 000048
【図５Ｂ】
2005511055.tif 000049
【図５Ｃ】
2005511055.tif 000050
【図６】
2005511055.tif 000051
【図７】
2005511055.tif 000052
【図８】
2005511055.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月29日(2004.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する標的核酸分子の相対的なコピー数を決定する方法であって、１）ＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この混合物は、標的核酸分子の群および第１のＰＣＲプライマー対のセットを含み、ここで、各プライマー対は、標的核酸分子の群における１つの標的核酸分子の領域を増幅するように設計され、ここで、第１のＰＣＲは、標的核酸産物の第１のセットを産生する工程、２）ＰＣＲ混合物中で第２のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この混合物は、ＰＣＲ産物の第１群の一部分および標的核酸産物の１つを増幅するように設計される第２のＰＣＲプライマー対を含み、ここで、第２のＰＣＲは、標的核酸分子の１つに関連する第２の標的核酸ＰＣＲ産物を産生する工程、３）標的核酸分子を含むサンプル中に存在する第２の標的核酸産物のコピー数を定量する工程、を包含する方法。
【請求項２】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、１）第１のＰＣＲ混合物中で第１のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、このＰＣＲは、少なくとも２つの異なるプライマー対で実行され、ここで、各プライマー対は、異なる標的遺伝子の発現転写に特異的である工程、２）各標的核酸に対して第２のＰＣＲを実行する工程であり、ここで、この第２のＰＣＲは、第２のプライマー対を含み、ここで、この第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲ混合物の一部分を含む工程、３）各標的核酸についてそれぞれ第２のＰＣＲの開始物質の量を比較する工程、を包含する方法。
【請求項３】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、１）第１のＰＣＲ産物のセットを産生する第１のＰＣＲプライマー対のセットを含む第１のＰＣＲを実行する工程、２）第２のＰＣＲ産物を産生する標的核酸の１つおよび第１のＰＣＲ産物のセットの一部分に特異的な第２のプライマー対を含む第２のＰＣＲを実行する工程、３）第２のＰＣＲ中に存在する各標的核酸のコピー数を比較する工程、を包含する方法。
【請求項４】
サンプル中の標的核酸の群のコピー数を定量する方法であって、第１のＰＣＲ産物のセットを産生する第１のＰＣＲプライマー対のセットを含む第１のＰＣＲを実行する工程、２）第２のＰＣＲ産物を産生する第２のプライマー対および第１のＰＣＲ産物のセットの一部分を含む第２のＰＣＲを実行する工程、３）標準曲線に対する第２のＰＣＲの閾値サイクルを比較する工程であって、ここで、この標準曲線は、閾値サイクル  対  ＤＮＡのコピー数をプロットする工程、を包含する方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対は、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーを含む、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、このフォワードプライマーおよびリバースプライマーがおよそ等モルである、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対のセットにおけるそれぞれの他の第１のＰＣＲプライマー対と大よそ等モルである、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１のＰＣＲプライマー対が、約５０％のＧＣ含量を有する、方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲがホットスタートによって開始される、方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲが１５サイクル未満またはそれと同等なサイクルの間実行される、方法。
【請求項１１】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、１００〜１０００ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１２】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、２０〜１５００ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の方法であって、ここで、標的核酸分子から産生される産物は、１７７〜２３７ヌクレオチドの間の長さである、方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１の標的核酸産物が２５０ヌクレオチド未満の長さである、方法。
【請求項１５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、それぞれの第１の標的核酸産物が２５０ヌクレオチド未満の長さである、方法。
【請求項１６】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記第１のＰＣＲが少なくとも１９ＰＣＲプライマー対で実行される、方法。
【請求項１７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲが１つのＰＣＲプライマー対で実行される、方法。
【請求項１８】
請求項４に記載の方法であって、ここで、ステップ２におけるプライマー対が、ステップ１における任意のプライマー対とは異なる、方法。
【請求項１９】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対のセットにおいて存在するプライマー対である、方法。
【請求項２０】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対が、第１のＰＣＲプライマー対と同じ領域の標的核酸を増幅する、方法。
【請求項２１】
請求項４に記載の方法であって、ここで、ステップ２におけるプライマー対が普遍プライマー配列を含む、方法。
【請求項２２】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１のＰＣＲ産物のセットが、少なくとも５個の異なる標的核酸分子に由来する、方法。
【請求項２３】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第１のＰＣＲ産物のセットが、少なくとも１５個の異なる標的核酸分子に由来する、方法。
【請求項２４】
請求項４に記載の方法であって、ここで、第２のＰＣＲプライマー対に由来するプライマーの１つが蛍光検出と関連する配列を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、この蛍光検出が、ＳＹＢＲグリーン、Ｔａｑｍａｎプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ、およびＥｃｌｉｓｐｅ  Ｐｒｏｂｅからなる群から選択される蛍光レポータープローブの使用を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、蛍光レポータープローブがクエンチャーと結合する、方法。
【請求項２７】
請求項４に記載の方法であって、さらに第１のＰＣＲを実行する以前の標的核酸分子と関連するｃＤＮＡを産生する工程を包含する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、さらにｃＤＮＡを産生する前にＲＮＡを産生する工程を包含する方法。
【請求項２９】
被験体がアルツハイマー病になるおそれがあるか否かを決定するための指標を提供する方法であって、被験体からのサンプルに関して請求項１、２６、または２８に記載の方法を実行し、そして被験体における標的核酸の群のコピー数と、コントロールにおける標的核酸の群を比較する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも４つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも５つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５からなる群から選択される少なくとも６つの遺伝子に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットがＡＰ１８０、ＰＰ２ＣＢ、Ｄｙｎａｍｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ、ＰＡＲＧ、ＣＡＭＫＧ、およびＩＣＡＭ５に特異的な対を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項３８】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される２対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される３対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４０】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第の１プライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される４対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される２対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４２】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７からなる群から選択される６対を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【請求項４３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記第１のプライマー対のセットが対１、対２、対３、対４、対５、対６、および対７を含み、そして、ここで、対１が配列番号１７および３６であり、ここで、対２が配列番号１３および３２であり、ここで、対３が配列番号１９および３８であり、ここで、対４が配列番号１８および３７であり、ここで、対５が配列番号１４および３３であり、ここで、対６が配列番号１０および２９であり、そして、ここで、対７が配列番号３および２２である、方法。
【国際調査報告】
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