(57)【要約】  一局面では、本発明は、変異性PCR又は他の方法を用いて完全染色体用のランダムに変異したオーバーラップセグメントを生成する工程を含む染色体飽和変異誘発(CSM)法、及びこれらの方法で作製される核酸のライブラリーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、核酸配列を変異させる方法：
（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；
（ｂ）前記セグメントの１以上に、１つ以上の変異を導入する工程；及び
（ｃ）無マーカー遺伝子置換法で、相同染色体中に前記変異したセグメントを再挿入する工程。
【請求項２】
工程（ａ）の前記染色体が全ゲノムを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の前記染色体が染色体全体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
染色体が細菌染色体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細菌染色体が大腸菌染色体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
染色体が酵母、植物、昆虫又は哺乳動物染色体である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物染色体がヒト染色体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
セグメントがオーバーラップしている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
セグメントが、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50又は55塩基対オーバーラップしている、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
セグメントがオーバーラップしていない、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
セグメントが、約５、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150又は200塩基対の長さである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
セグメントが、約200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000塩基対の長さである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
セグメントが、約10〜500,000塩基対、又は約50〜250,000塩基対の長さである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
変異がランダムに導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
変異が非ランダムに導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
変異がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって導入される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が、変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
変異したセグメントが、１つ以上のセグメントでGSSMライブラリー又はTGR（調律可能遺伝子再構成(Tunable Gene Reassembly)）ライブラリーを含むことができる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
変異が、ポリペプチドのオープンリーディングフレーム中に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
変異が、非コーティング配列中に導入される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
１％、５％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％又は100％のゲノム又は染色体が変異誘発される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
変異した核酸セグメントが、相同染色体にインビトロ導入される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
変異した核酸セグメントが、相同染色体にインビボ導入される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
さらに、変異した核酸セグメントを、相同染色体を含む宿主細胞中に挿入する工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
変異した核酸セグメントが、選択可能マーカーを有する宿主細胞中に導入される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
選択可能マーカーが抗生物質選択マーカーである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
抗生物質選択マーカーが、アンピシリン、βラクタム抗生物質、半合成ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メチシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、エリスロマイシン、アミノグリコシド、ストレプトマイシン、ナリジキシン酸、キノリン、リファマイシン、スルホンアミド、ガントリシン又はトリメトプリムである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
さらに、変化した遺伝子型を含む宿主細胞を選択する工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
さらに、変化した表現型を含む宿主細胞を選択する工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
さらに、宿主細胞内で内因性RecA活性を誘導する工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
さらに、宿主細胞内で相同組換えを誘導し、又は増やす工程を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
ミス対合DNAを宿主細胞中に導入することによって、前記宿主細胞内で相同組換えを増やす、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ベクターだけの存在下でクローン化変異セグメントを変性させ、かつ宿主細胞中に導入する前にその２つを一緒に再アニールすることによって、前記宿主細胞内で相同組換えを増やす、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞内で三重構造を導入し、又は三重構造の形成を誘導することによって、前記宿主細胞内で相同組換えを増やす、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
変異したセグメントを、宿主細胞中に挿入する前にベクター中でクローン化する、請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
変異したセグメントを、エレクトロポレーションによって宿主細胞中に挿入する、請求項２４記載の方法。
【請求項３７】
変異したセグメントを、感染又はトランスフェクションによって宿主細胞中に挿入する、請求項２４記載の方法。
【請求項３８】
変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が、Taqに基づいた変異性PCRである、請求項２４記載の方法。
【請求項３９】
以下の工程を含む方法で作製される変異した核酸配列のライブラリー：
（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；
（ｂ）前記セグメントの１以上に、１つ以上の変異を導入する工程；及び
（ｃ）無マーカー遺伝子置換法で、相同染色体中に前記変異したセグメントを再挿入する工程。
【請求項４０】
以下の工程を含む方法で作製される変異した核酸配列のライブラリーを含む細胞：
（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；
（ｂ）前記セグメントの１以上に、１つ以上の変異を導入する工程；及び
（ｃ）無マーカー遺伝子置換法で、相同染色体中に前記変異したセグメントを再挿入する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
この発明は、一般的には、分子遺伝学に関する。一局面では、本発明は、染色体飽和変異誘発（CSM）法及びこの方法で作製される核酸のライブラリーを提供する。本方法は、変異性(error-prone)PCR又は他の技法を用いて、完全染色体、又は完全ゲノムの一部のためのランダム又は非ランダムに変異したオーバーラップするセグメントを生成する工程を含むことができる。一局面では、これらセグメントが、外因性配列の付加のない無マーカー遺伝子置換法を用いて相同染色体座中に正確に挿入される。
【背景技術】
【０００２】
研究者らは、点変異を染色体のランダムな位置に導入して所望の表現型を有する宿主を創造するためにＵＶ又は化学的方法を用いてきた。所望の表現型の変化を果たすために配列又は機能情報は必要ないが、表現型を変えることになる変異を同定することは困難なので、これらアプローチのランダム性は利点でもありかつ欠点でもあることがわかった。このことは、これらアプローチから抽出し得る情報の量を制限する。さらに重要なことに、このかなり粗末な方法は、その表現型効果がいつもよく定義されるわけではなく、或いは必ずしも望ましくない多くの変異を同時に生じさせる。
【０００３】
変異誘発物質への曝露中に生じる有害な副変異の可能性を最小にするため、変異誘発された株から生じた所望の変異を非変異バックグラウンドの株に伝達するためにP1形質導入が用いられてきた。しかし、P1形質導入による伝達及び組換え率は低いので、該変異は、それ自体選択可能でなければならず、或いは所望の変異を含む細胞を選択するために選択可能マーカーが該遺伝子といっしょに形質導入されなければならない。
【０００４】
より制御された染色体変異誘発は、転移要素によって可能である。トランスポゾン変異誘発は、所望の表現型発見後、最小の努力でトランスポゾンの挿入部位を正確にマッピングすることができる。遺伝子型と表現型データをつなげることができるということは生体の機能ゲノミックの理解に重大な意味を持つので、この点は重要である。結果として、トランスポゾン変異誘発は、細菌染色体を進化させ、かつ特有の用途に特に適する宿主の操作を許容するやり方で構造と機能情報をつなげる手段を提供する。
【０００５】
トランスポゾンは、ランダムなＵＶ又は化学的変異誘発を超えた利点を提供し得るが、トランスポゾン挿入によって染色体の領域を単に破壊することによって達成できることについて限界がある。しばしば、所望の表現型変化を達成するために単一又は複数の点変異の導入が要求される。タンパク質進化論の研究では、特定遺伝子のランダムな変異誘発が、多くの酵素の活性を改善し、安定性を高め、或いは基質特異性を変えることが分かっている。クローン化遺伝子内で変異の多様な集団を生成するための技法を利用できる。
【０００６】
相同組換え又はミス対合修復システムを用いて特有の点変異を宿主の染色体の特定の領域内に導入することができる。これらアプローチは有効であるが、不十分で遅く、かつ労が多いことが分かっている。さらに、研究者らは、生存クローンをスクリーニングして該クローンが所望の変異を持っているかを決定しなければならない。Posfai(1999)Nucl. Acids Res. 13:4409-4415は、無マーカー様式で大腸菌染色体の定義領域内に特有の変異を効率的に導入し、かつ組み換えなかった領域に対して選択する方法について議論している。この方法を用いて、特有の点変異、小さい挿入、又は欠失を組み込むことができる。
【発明の開示】
【０００７】
（概要）
本発明は、染色体飽和変異誘発（CSM）の方法を提供する。CSMは、例えば、変異性PCR又は他の技法を用いて、全染色体、又は全ゲノムの一部のための、セグメント、例えばオーバーラップセグメントを変異させ、例えば、ランダムに変異させ、或いはその定方向変異を起こす工程を含むことができる。一局面では、これらセグメントが、相同染色体座中に正確に挿入される。一局面では、これは、外因性配列の付加のない無マーカー遺伝子置換法を用いて為される。
【０００８】
一局面では、染色体飽和変異誘発（CSM）法は、以下の工程：ａ）ゲノム又は染色体をセグメントに分割する工程；及びｂ）変異を１つ以上のセグメント中に導入する工程を含む。すべてのセグメント、染色体又は全ゲノムのすべとを変異させることができる。別の局面では、セグメントは、約10〜500,000塩基対(bp)以上、又は約50〜250,000塩基対(bp)、又は約100〜100,000塩基対(bp)、又は約200〜5,000塩基対(bp)である。別の局面では、セグメントは、約５、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000以上の塩基対(bp)である。
【０００９】
別の局面では、セグメントがオーバーラップしていても、していなくてよい。別の局面では、重なりは、約２〜50塩基対、又は２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55以上の塩基対でよい。
別の局面では、各セグメントに対する変異の数は、１残基〜セグメントのすべての残基でよい。各セグメントに対する変異の数は、セグメント上の残基の１％〜100％のどれでもよい。例えば、各セグメントに対する変異の数は、セグメント上の残基の１％、５％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％又は100％でよい。
【００１０】
別の局面では、変異は、ランダムに導入され、或いは非ランダムに導入され、或いは両者の組合せである。一局面では、変異は、変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって導入される。
一局面では、変異したセグメントは、１つ以上のセグメントで、GSSMライブラリー、SLRライブラリー、又はTGR（調律可能遺伝子再構成(Tunable Gene Reassembly)）ライブラリーを含むことができる。従って、異なる局面では、変異の濃度は変動し得るもＯＮであり、例えば、GSSMでは、３塩基の長さで64の可能性である。
別の局面では、変異は、オープンリーディングフレーム(ORF)又は非ORF、コーディング領域又は非コーディング領域内、及びその混合である。
別の局面では、変異誘発される生体又は変異誘発される核酸セグメントの起源は、細菌、例えば大腸菌又は他のいずれの微生物或いは原核生物、又は真核生物でもよい。変異誘発される生体は、いずれの宿主、例えば、ストレプトミセス、シュードモナス、アラビドプシスでよく、組換え発現に使用されるいずれの宿主をも包含する。
【００１１】
一局面では、染色体またはゲノムの全体又は一部が変異誘発され得る。例えば、１％、５％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％又は100％のゲノム又は染色体に変異誘発することができ、或いは変異誘発される１つ以上のセグメントを含むことができる。別の局面では、変異誘発されるゲノム（又は染色体）の一部は、少なくとも約100bp、500bp、1000bp、103bp、104bp、105bp、106bp、107bp、染色体又はゲノム全体までであり；例えば大腸菌ゲノムは約3,600kbであり、他のゲノムはずっと大きい。
【００１２】
一局面では、変異した核酸セグメントが相同染色体にインビトロ（in vitro）で導入される。一局面では、変異した核酸セグメントが、相同染色体にインビボ（in vivo）で導入される。一局面では、変異した核酸セグメントが、選択マーカー、例えば抗生物質選択マーカーと共に導入される。別の局面では、抗生物質選択マーカーは、アンピシリン耐性である。一局面では、選択マーカーは、該細胞がプレート上でなく懸濁液内で成長したならば、該マーカーなしで他の細胞を保護できる分泌産物を含む。一局面では、分泌選択マーカー（例えば、耐性マーカー）は、アンピシリン選択マーカーのような抗生物質選択マーカーである。本発明の方法で使用される典型的な選択マーカーとしては、βラクタム抗生物質、例えば、アモキシシリン、アンピシリン、メチシリン、カルベニシリンのような半合成ペニシリンが挙げられる。本発明の方法で使用される典型的な選択マーカーとしては、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド（例えば、エリスロマイシン）及びアミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン）も挙げられる。本発明の方法で使用される典型的な選択マーカーとしては、ナリジキシン酸、キノリン、リファマイシン、スルホンアミド（例えば、ガントリシン）及びトリメトプリムも挙げられる。
【００１３】
別の局面では、細胞は、37℃、30℃、25℃又は20℃未満の温度で成長させる。異なる局面では、細胞は、懸濁液又はプレート上で成長させることができる。
別の局面では、変異したセグメント（例えば、染色体、又は全ゲノム）の宿主中への挿入後、変化した遺伝子型及び／又は表現型が選択される。別の局面では、その選択基準は、ａ）小分子又はタンパク質のような生体分子の発現の増加又は減少（これは、外因性又は内因性であり得る）；ｂ）プロテアーゼの不活性化又は阻害（それによってあるプロテアーゼによる分解に感受性なタンパク質が、より高レベルで発現する）；ｃ）細胞内の「フィードバック阻害メカニズム」の阻害又は変化；ｄ）遺伝子又は遺伝子産物の組の変化；ｅ）代謝経路の変化（これは、代謝物を異なる方向に再び向けることができる）；ｆ）栄養要求体からそうでない細胞への変化、及び逆もまた同様（変異性変化の結果としてその成長と代謝に必要な特定物質を合成する能力を失った細菌の株のような生体）；ｇ）原栄養株からそうでない細胞への変化、及び逆もまた同様（前後して）(野生型親株、例えば、原栄養菌と同一の代謝能力と栄養要求を有する)。
【００１４】
本発明は、核酸配列を変異させる方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；（ｂ）１つ以上の前記セグメント中に１つ以上の変異を導入する工程；及び（ｃ）変異したセグメントを、無マーカー遺伝子置換法によって相同染色体中に再挿入する工程。
一局面では、工程（ａ）の染色体は、全染色体全体又はゲノム全体を含む。
一局面では、染色体は、大腸菌染色体のような細菌染色体である。染色体は、酵母、植物、昆虫又はヒト染色体のような哺乳動物染色体であり得る。
【００１５】
一局面では、セグメントはオーバーラップする。セグメントは２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55塩基対によって重なり得る。一局面では、セグメントはオーバーラップしない。セグメントは約５、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150又は200塩基対の長さであり得る。セグメントは約250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000塩基対の長さであり得る。セグメントは、約10〜500,000塩基対、又は約50〜250,000塩基対の長さであり得る。
【００１６】
一局面では、変異はランダムに導入される。一局面では、変異は非ランダムに導入される。変異は、変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって導入することができる。変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、Taqベースの変異性PCRであり得る。
一局面では、変異したセグメントは、１つ以上のセグメントでGSSMライブラリー、SLRライブラリー、又はTGR（調律可能遺伝子再構成(Tunable Gene Reassembly)）ライブラリーを含み得る。
一局面では、変異はポリペプチドのオープンリーディングフレーム中に導入される。変異は非コーディング領域中に導入され得る。
別の局面では、ゲノム又は染色体の１％、５％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％又は100％が変異誘発される。
【００１７】
一局面では、変異した核酸セグメントが相同染色体にin vitro導入される。一局面では、変異した核酸セグメントが相同染色体にin vivo導入される。
一局面では、本方法は、さらに、変異したセグメントを、相同染色体を含む宿主細胞中に挿入する工程を含む。変異した核酸セグメントは、選択可能マーカーを有する宿主細胞中に導入され得る。選択可能マーカーは、アンピシリン、βラクタム抗生物質、半合成ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メチシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、エリスロマイシン、アミノグリコシド、ストレプトマイシン、ナリジキシン酸、キノリン、リファマイシン、スルホンアミド、ガントリシン又はトリメトプリムのような抗生物質選択マーカーである。
【００１８】
一局面では、本方法は、さらに、改変した遺伝子型を含む宿主細胞を選抜する工程を含む。一局面では、本方法は、さらに、改変した表現型を含む宿主細胞を選抜する工程を含む。
一局面では、変異したセグメントは、宿主細胞中への挿入前にベクターへクローン化される。変異したセグメントは、いずれの手段によっても、例えば、エレクトロポレーション、感染、形質転換又はトランスフェクションによっても宿主細胞中に挿入することができる。
【００１９】
本発明は、本発明の方法、例えば、以下の工程を含む方法で作製される変異した核酸配列のライブラリーを提供する：（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；（ｂ）１つ以上のセグメント中に１つ以上の変異を導入する工程；及び（ｃ）変異したセグメントを、無マーカー遺伝子置換法によって、相同染色体中に再挿入する工程。
本発明は、変異した核酸配列のライブラリーを含む細胞を提供し、このライブラリーは、本発明の方法、例えば、以下の工程を含む方法で作製される：（ａ）染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程；（ｂ）１つ以上のセグメント中に１つ以上の変異を導入する工程；及び（ｃ）変異したセグメントを、無マーカー遺伝子置換法によって、相同染色体中に再挿入する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付図面及び以下の説明で示される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明と図面、及び特許請求の範囲から明らかだろう。
いろいろな図中の同様の参照記号は、同様の要素を示す。
（詳細な説明）
本発明は、染色体飽和変異誘発（CSM）法を提供する。CSMを用いて、変異対立遺伝子のプールを生成し、多様かつ整然としたゲノムライブラリーを生成することができる。CSMは大規模ゲノム展開のために使用することができる。
CSMは、変異性PCR又は他の技法を用いて全染色体のオーバーラップセグメントにわたって変異を引き起こす工程を含む。誤りは、ランダムな変異又は定方向変異によって引き起こすことができる。一局面では、これらセグメントが、相同染色体座中に正確に挿入される。挿入は、外因性配列の付加のない無マーカー遺伝子置換法によって行うことができる。本方法は、染色体のセグメント又は全染色体にわたって変異を引き起こすことができる。
本方法は、いずれの起源の染色体、例えば哺乳動物染色体、例えばマウス又はヒト染色体、酵母染色体、昆虫染色体、植物染色体、細菌染色体、例えば、大腸菌染色体のすべて又は一部にわったって変異を引き起こすことができる。
【００２１】
一局面では、本発明は、染色体全体の系統的変異誘発によって生じた点変異を含む多様かつ整然としたゲノムライブラリーを生成するためのCSM法を提供する。一局面では、本発明は、大腸菌染色体全体の系統的変異誘発による点変異を含む多様かつ整然とした大腸菌ライブラリーの生成方法を提供する。点変異は、正確に定義されたオーバーラップセグメント内にあり得る。変異は、特異的かつ定方向的、又はランダム的、又は両者でよい。これら整然としたライブラリーをスクリーニングすることができ、かつ種々の特性に対して選択することができる。例えば、ライブラリーを用いて宿主を「進化させる」(改変)することができる。これらライブラリー−改変宿主を用いて宿主又は異種タンパク質の発現を高め、アッセイ開発を促進し、生体分子の生産を増やし、又は他の可能性のある望ましい表現型を表示することなどができる。
【００２２】
本発明のCSMは、種々の技法を用いて、全染色体のセグメントにわたってランダム又は定方向変異を引き起こす工程を含むことができる。例えば、変異性PCRを用いて、ランダムに変異したオーバーラップセグメントを生成することができる。変異性PCRは、ゲノム配列の定義されたオーバーラップセグメント内の変異のランダムなプールを生成し得る。染色体、例えば、大腸菌若しくはヒト染色体、又は所定間隔で完全若しくは部分的に配列決定されている他の染色体の全領域を表す変異体プールを生成するようにPCRプライマーを設計することができる。変異したDNAセグメントのプールは、各プライマーセットから生成される。
これらのセグメントは、相同染色体座中に正確に挿入することができる。それらを別々に処理することができる。一局面では、無マーカー遺伝子置換法を使用する。この方法は、外因性配列を付加せずに変異したオーバーラップセグメントを加えることができる。
【００２３】
本発明の変異したゲノムセグメント、変異した染色体及び／又はライブラリーを宿主細胞中に挿入（例えば、感染、トランスフェクション、形質転換）し、かつ発現させることができる。望ましい表現型を表示するいずれの進化宿主も、例えば、表現型の変化をもたらす変異を決定するための対応するプライマーセットによるシークエンシングによって特徴づけできる。各反復ステップが引き続く組換えを妨げるかもしれない配列又はマーカーを残さないので、この機能情報とゲノム情報との連関により単一生体内において有利な変異の組合せによってさらに宿主を操作することが可能となる。
【００２４】
本発明のCSM法は、遺伝子破壊又は染色体構造の改変に限定されない。本方法は、タンパク質コーディング領域又は転写中心領域中への点変異の導入をも包含する。従って、本発明のCSM法は、タンパク質機能及び／又は遺伝子発現を変える可能性のあるランダム又は定方向点変異を導入することができる。本発明のCSM法は、宿主適応度の損失又は望ましくない表現型の導入をもたらすことなく、染色体の他の領域に悪影響を与えずに染色体の定義された領域内にランダムな点変異を組み込むことができる。本発明のCSM法は、所望の表現型を生成する当該変異を同定する能力を維持できる。
【００２５】
本発明のCSM法は、さらに、本発明の変異したゲノムセグメント、変異した染色体及び／又はライブラリーを挿入できる宿主細胞のスクリーニングを含むことができる。これら変異宿主は、特定用途に最適化される宿主の多様性を作りだすことができる。変異宿主を用いて宿主細胞、例えば大腸菌又はヒト細胞の機能的ゲノミックの知識を増やすことができる。本発明のCSM法を用いて全規模進化からの情報を照らし合わせることができる。この情報は、他の生体の相同座のターゲティングに使用できる。例えば、大腸菌の全規模進化からの情報は、他の細菌で使用できる。これは、バチルス属、他の細菌、酵母、植物細胞、ヒト細胞などのような高組換え性生体のような他の種内における全規模進化を含むいろいろな用途の最適化宿主の生成を容易にし得る。
【００２６】
一局面では、本発明の方法は、染色体、例えば、大腸菌染色体の特定の領域を表す変異体プールを生成し、かつその変異した対立遺伝子を、無マーカーで高処理能力の様式で宿主の染色体中に導入する。本発明の方法は、さらに、全染色体、例えば、大腸菌染色体への変異誘発、及び所望表現型の同定用変異体プールの生成とアーカイビングを含むことができる。一局面では、本発明のCSM法は、図１に示されるように、以下の工程で行われる。
１）ルーチンスクリーニングによって、ランダムな点変異を含む多様な変異体プールを生成する種々の変異性PCR方法論の能力を評価する工程；
２）ルーチンスクリーニングによって、変異対立遺伝子から染色体への遺伝的物質の効率的な交換を生じさせる無マーカー置換法を最適化する工程；
３）上述したようなルーチンスクリーニングで最適化された方法を用いて、染色体、例えば大腸菌染色体の特定領域の大きい変異体プールを生成する工程。
【００２７】
（PCRによる変異の生成）
一局面では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、染色体、ゲノムセグメント又は遺伝子全体に分散したランダムな点変異を含む集団、例えばゲノムセグメントのライブラリー、を生成する。GSSM又はSLRのような他の変異誘発法を系統的に用いて１個以上のアミノ酸、一局面では、タンパク質中のあらゆるアミノ酸のコード配列を変えることができる。一局面では、各アミノ酸があらゆる他の天然アミノ酸に変えられるように、ポリペプチドのコード配列が変えられる。
【００２８】
一局面では、Taq DNAポリメラーゼを用いて本発明を実施する。一局面では、Taq DNAポリメラーゼが高頻度で変異を取り込めるように偏向したヌクレオチド濃度及び／又はマンガンの存在を利用する。PCR変異誘発を実施するための典型的な方法は、Leung(1989)Technique 1(1):11-15；Cadewll(1922) PCR Meth. and Appl. 2:28-33；Vartanian(1996) Nucl. Acids. Res.,24(14):2627-2631に記載されている。一局面では、これら手順を利用して、PCR増幅中に変異体プール（例えば、ゲノム／染色体セグメントのライブラリー）を生成する。これら典型的な方法は、タンパク質進化研究に使用することができる。本発明の方法を適用して、宿主遺伝子の変異体プールを生成することができる。本発明の別のPCRに基づいた変異誘発戦略は、増幅中、緩和した忠実度で作用するように操作されたDNAポリメラーゼを使用することを含む。例えばCline(2000)Strategies 13(4):157-161を参照せよ。
【００２９】
（無マーカー組換えによる染色体中への変異の導入）
例えば、PCRによる染色体／遺伝子セグメントの変異体プール、又はライブラリーの生成後、無マーカー置換法を用いてこれら変異体プール、又は「変異対立遺伝子」を染色体、例えば大腸菌染色体、例えばMG1655染色体中に組み入れる。例えばPosfai(1999)Nucl. Acids Res.,27(22):4409-4415に記載されているようないずれの無マーカー置換法も使用できる。
【００３０】
一局面では、このアプローチは、共組込み(cointegration)、次いで分離という２工程から成る。典型的な無マーカー置換手順は、以下のとおりである。
１）PCR産物を、複製について温度感受性であり、抗生物質耐性遺伝子（kpt）を保持し、メガヌクレアーゼI-SceIの認識部位と、そのコード遺伝子の両者を含むベクター（pST98-KS）中へクローン化する。組換え分子を大腸菌宿主中にエレクトロポレーションで導入し、非許容温度での増殖後、変異体と野生型(wt)対立遺伝子との間のゲノム中への相同組換えから生じる共組込み体(cointegrant)を抗生物質選択によって選択する。
２）対立遺伝子対の分子内組換えによる共組込み体の分離は、ベクターにコードされ、その発現が誘発物質の添加によって調節されるI-SceIメガヌクレアーゼ遺伝子によるI-SceI認識部位における染色体中への唯一の二本鎖切断の導入によって引き起こされる。細胞が二本鎖切断の導入に対して生き残るためには、対立遺伝子間の組換えが必要である。
典型的な無マーカー置換法の概要は、図３に示される。
【００３１】
（共組込み体の分離と無マーカー置換の生成）
一局面では、変異したセグメントの染色体中への共組込み後、次工程は、宿主ゲノム中への変異の共組込みと交換の効率的な分離である。一局面では、ベクターは、イントロンにコードされるメガヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼI-SceIに対する制限酵素切断部位を含有する（後述する実施例２参照）。共組込み体内におけるこの酵素の誘導発現は、宿主染色体内に単一の二本鎖切断の生成をもたらし得る。この認識部位は、天然には大腸菌ゲノム中に存在しない。この二本鎖切断を修復するため、共組込みゲノム中に存在する重複配列を組換え用基質として使用できる。この結果、抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドベクター配列の排除と、共組込みおよび分離交差がどこで起こったかによって、変異したセグメントのある部分の染色体中への無マーカー交換となる。
【００３２】
（染色体全体の変異誘発）
本発明の一局面では、全染色体を、ランダムに、又は定方向様式で、或いはその両方で、本発明のCSM法によって変異させる。一局面では、完全な4,632kbの大腸菌ゲノムを表す変異体プールを生成するという要求に応じるため、構築及びスクリーニング工程を通じて高処理能力戦略を利用する。ロボットコロニーピッカーと液体レプリケート(replicates)を用いて、例えば、384ウェル又は1536ウェルプレートから高処理能力様式で多様なプールを生成することができる。一局面では、GigaMatrixTMシステムを適合させて多様なライブラリーを生成する。GigaMatrixTMは、典型的なプレートフットプリント内に収容された約100,000個のウェルを含むことができる。GigaMatrixTMは、構築工程に適合させることができる。この局面では、多様なライブラリーを生成するために必要なプレートは、より少ない。一局面では、ライブラリー構築手順の無マーカー置換部分に従って個々の変異宿主が組換えられ、大腸菌の当該特定セグメントを表す１つの変異体ライブラリーとして保管される。
【００３３】
（所望の表現型に関する変異体ライブラリーのスクリーニング）
別の局面では、結果の変異した核酸セグメント（例えば、ライブラリー又はゲノム／染色体セグメント）のプール、例えば、大腸菌プールのライブラリーは、いくつかの方法でスクリーニングされる。第１に、低減されたアッセイバックグラウンドを示す宿主株が望ましい場合、ライブラリーを384、1536又はGigaMatrixTMプレート中に配列して、所望の変異株についてアッセイすることができる。内因性遺伝子（例えば、大腸菌遺伝子）の活性の増加が望ましい場合、感受性蛍光アッセイを用いて、同一手順を適用できる。特定の場合、選抜アッセイも利用でき、変異宿主クローンを配列する必要がなくなるだろう。
【００３４】
一局面では、外因的に宿主細胞（例えば、大腸菌）に付加される遺伝子の活性の増加が望ましい場合、ライブラリー（プール）は、所望表現型の変異株のスクリーニング又は選択前に、所望の遺伝子を含有するプラスミドクローンをトランスフェクションし、或いはエレクトロポレートする。特定の変異と変化した表現型との間の連関を発見する能力を保存するため、各セグメント用の変異体プールを個々に形質転換又はトランスフェクションさせることができる。一局面では、384ウェル電極と共にエレクトロポレーションを用い、２kbのセグメントサイズ及びセグメントの50％の重なりと仮定して、検定されるすべての外因性遺伝子の染色体の各セグメントを表す12,384ウェルプレートの変異体プール（ライブラリー）を形質転換させる。
【００３５】
本明細書で与えられる一般的な生成物及び方法の議論は、説明の目的だけを意図している。本技術の当業者には、この開示をレビューすれば他の代替的な生成物、方法及び実施形態が明白だろう。
用語「核酸」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はこれらいずれかの断片、一本鎖若しくは二本鎖でよく、センス若しくはアンチセンス鎖でよいゲノム若しくは合成起源のDNA若しくはRNA（例えば、mRNA、rRNA、tRNA）、ペプチド核酸（PNA）、又は例えば、iRNA、リボヌクレオタンパク質（例えば、iRNPs）を含む元来天然若しくは合成的ないずれのDNA様若しくはRNA様物質を包含し得る。この用語は、核酸、すなわち天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。この用語は合成バックボーンを有する核酸様構造をも包含する。（例えば、Mata(1997)Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197；Strauss-Soukup(1997) Biochemistry 36:8692-8698；Samstag(1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156参照）。
【００３６】
用語「飽和変異誘発」又は「GSSM」は、以下に詳述するように、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて点変異をポリヌクレオチド中に導入する方法を含む。用語「最適化定方向進化システム」又は「最適化定方向進化」は、関連核酸配列、例えば、関連遺伝子の断片を再構成する方法を含み、以下に詳細に説明する。用語「合成連結再構成」又は「SLR」は、オリゴヌクレオチド断片を非確率的様式で連結する方法を含み、以下に詳細に説明する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」及び「発現カセット」は、相互に交換して使用でき、かつ核酸、例えば本発明の変異した核酸の発現に影響を与えることのできるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、ポリペプチドコード配列と動作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含むことができ、場合により、他の配列、例えば転写終結シグナルを含むことができる。発現を達成するのに必要又は役立つさらなる因子、例えばエンハンサーを用いてもよい。本明細書で使用する場合、「動作可能に連結された」とは、プロモーターがDNA配列の転写を媒介するようにDNA配列の上流にプロモーターを連結すること意味する。従って、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、いずれの型の「裸のDNA」組換え体ベクター等をも包含する。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクション、一過性又は永久的に形質導入できる核酸を含む。ベクターが、裸の核酸、又はタンパク質若しくは脂質と複合した核酸であり得ることは分かるだろう。ベクターは、任意に、ウイルス若しくは細菌核酸及び／又はタンパク質、及び／又は膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープ等）を含む。ベクターとしては、限定するものではないが、DNAの断片を結合し得る複製可能なレプリコン（例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージ）が挙げられる。従って、ベクターとしては、限定するものではないが、RNA、自律性自己複製環状若しくは線状DNA又はRNA（例えば、プラスミド、ウイルス等、米国特許第5,217,879号参照）が挙げられ、発現と非発現プラスミドの両者を包含する。
【００３８】
（核酸の生成及び操作）
本発明の方法は、ゲノム全体を含む、染色体の全部又は一部を含む核酸を改変する。本発明は、本発明の改変された核酸を用いて新しいポリペプチド及び表現型を作製する方法をも包含する。本発明の実施では、核酸は、いずれの方法によっても、例えばポリメラーゼ連鎖反応（例えば、誤りに基づいたPCR）、合成連結再構成、最適化定方向進化システム及び／又は飽和変異誘発によって改変することができ、すなわち変異させることができる。
【００３９】
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローン化と発現、PCRによるメッセージ若しくはゲノムDNAの増幅などによって作製、単離及び／又は操作することができる。本発明の実施では、本明細書で述べるように、鋳型核酸を操作することによって、相同遺伝子を改変することができる。本発明は、科学及び特許文献に十分に記載されている技術的に公知のいずれの方法又は手順又は装置とも関連して実施することができる。
【００４０】
（一般的な技法）
この発明を実施するために用いられる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、クローン化（組換え）若しくは単離核酸、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又はそのハイブリッドであれ、種々のソースから単離し、一般的に操作、増幅、及び／又は発現／組換え的に生成させることができる。これら核酸から生成された組換えポリペプチドを個々に単離又はクローン化して所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含め、いずれの組換え発現系も使用し得る。
【００４１】
これとは別に、これらの核酸を周知の、例えば、Adams(1983) J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res. 25：3440-3444；Frenkel(1995) Free Radic. Biol. Med. 19：373-380；Blommers(1994) Biochemistry 33:7886-7896；Narang(1979) Meth. Enzymol. 68:90；Brown(1979) Meth. Enzymol. 68:109；Beaucage(1981) Tetra. Lett. 22:1859；米国特許第4,458,066号に記載されているような化学合成法で in vitro合成することができる。
【００４２】
例えば、サブクローン化、プローブの標識化（例えば、クレノウポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅によるランダムなプライマー標識化）、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等のような核酸の操作法は、科学及び特許文献に十分に記載されている。例えばSambrook,ed.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(2ND ED.),Vols. 1-3,Cold Spring Harabor Laboratory,(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel,ed. Jhon Wily & Sons, Inc., New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen,ed. Elsevier,N.Y.(1993)を参照せよ。
【００４３】
本発明の方法を実施するために用いられる核酸を得、かつ操作する別の有用な手段は、ゲノム試料からクローン化し、かつ、所望により、例えばゲノムクローン又はcDNAクローンから単離又は増幅された挿入断片をスクリーニングかつ再クローン化することである。本発明の方法で用いられる核酸のソースとしては、例えば、哺乳動物の人工染色体（MACs）（例えば、米国特許第5,721,118号；第6,025,155号参照）、ヒトの人工染色体（例えば、Rosenfeld(1997) Nat. Genet. 15:333-335参照）；酵母の人工染色体（YAC）；細菌の人工染色体（BAC）；P1人工染色体（例えば、Woon(1998) Genomics 50:306-316参照）；P1誘導ベクター（PACs）（例えば、Kern(1997) Biotechniques 23:120-124参照）；コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミド中に含まれるゲノム又はcDNAライブラリーが挙げられる。
【００４４】
（ベクター及びクローニングビヒクル）
本発明の方法の実施では、変異した核酸セグメントは、宿主細胞中への導入を含む、相同染色体中への導入前にベクター又はクローニングビヒクルに挿入することができる。代わりに、変異したセグメントと共に或いは独立的に挿入される選択マーカーをベクター又はクローニングビヒクル中へクローン化し、変異したセグメントを有する宿主細胞中に挿入することができる。ベクター及びクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウィルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌の人工染色体、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びSV40の誘導体）、P1ベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母の人工染色体、及び昆虫の特有の宿主に特異的な（バシラス、アスペルギルス及び酵母のような）他のいずれのベクターをも含み得る。ベクターは、染色体、非染色体及び合成DNA配列を包含し得る。本技術の当業者には、大量の適切なベクターが知られており、商業的に入手可能である。典型的なベクターとしては、細菌：pQEベクター(Qiagen)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター、ラムダ-ZAPベクター(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核生物：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)が挙げられる。しかし、宿主内で複製でき、かつ生存できる限り、いずれの他のプラスミド又は他のベクターも使用できる。本発明では、低コピー数又は高コピー数ベクターを利用することができる。
【００４５】
ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位及び転写終結因子を含み得る。ベクターは、発現を増幅するための適切な配列をも含み得る。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、及び5'フランキング非転写配列を含み得る。いくつかの局面では、必要な非転写遺伝要素を与えるためにSV40スプライシング及びポリアデニル化部位由来のDNA配列を用いることができる。
【００４６】
一局面では、ベクターは、該ベクターを含む宿主細胞の選抜を可能にする１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含有する（変異した遺伝子セグメントを含み或いは宿主細胞中に一緒に挿入されている）。このような選択可能マーカーとしては、真核生物細胞培養に対してジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子又はネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌においてはテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を与える遺伝子、及びS.セレビジエTRP1遺伝子が挙げられる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクター又は選択可能マーカーを有する他のベクターを用いていずれの所望遺伝子からも選び出すことができる。
【００４７】
真核生物細胞内でポリペプチド又はその断片を発現させるためのベクターは、発現レベルを高めるためのエンハンサーを含むこともできる。エンハンサーは、DNAのシス作用要素で、長さが通常約10〜約300bpであり、プロモーター上で作用してその転写を増やす。例としては、複製起点の後期側bp100〜270上のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００４８】
核酸配列は、種々の手順でベクター中に挿入することができる。一般に、挿入断片とベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼによって消化した後、DNA配列はベクター中の所望の位置に連結される。あるいは、挿入断片とベクターの両者の平滑末端を連結することができる。Ausubel及びSambrookに記載されているように、種々のクローン化法が技術的に知られている。このような手順及び他の手順は、本技術の当業者の範囲内であると考えられる。
【００４９】
ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態でよい。他のベクターとしては、染色体、非染色体及び合成DNA配列、SV40の誘導体；細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合せから誘導されるベクター、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、及び仮性狂犬病ウイルスのようなウイルスDNAが挙げられる。原核生物及び真核生物宿主で使用するための種々のクローン化及び発現ベクターは、例えばSambrookによって記述されている。
【００５０】
使用可能な特定の細菌ベクターとしては、周知のクローン化ベクターpBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison,WI,USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、DR540、pRIT5(Pharmacia)、pKK232-8及びpCM7の遺伝要素を含む商業的に入手可能なプラスミドが挙げられる。特定の真核生物ベクターとしては、pSVCAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMDG、及びpSVL(Pharmacia)が挙げられる。しかし、宿主細胞内で複製でき、かつ生存できる限り、いずれの他のベクターも使用できる。
【００５１】
（宿主細胞及び形質転換細胞）
本発明の方法は、本発明の方法で改変された（「変異した「）核酸（例えば、染色体又はゲノム）を宿主細胞中に挿入する工程を含むことができる。本方法は、変化した遺伝子型又は表現型について宿主細胞をスクリーニングする工程を含むことができる。宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞のような原核生物細胞、真核生物細胞を含め、本技術の当業者が精通しているいずれの宿主細胞でもよい。典型的な細菌細胞としては、大腸菌、ストレプトマイセス、バチルス・サブチリス、サルモネラ・チフィムリウム及びシュードモナス属、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属内の種々の種が挙げられる。典型的な昆虫細胞としては、Drosophila S2及びSpodoptera Sf9が挙げられる。典型的な動物細胞としては、CHO、COS又はBowesメラノーマ又はいずれかのマウス若しくはヒト細胞系統が挙げられる。適切な宿主の選択は、本技術の当業者の能力内である。種々多様な高等植物種を形質転換させる技法は周知であり、かつ技術及び科学文献に記載されている。例えば、Weising(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477、米国特許第5,750,870号を参照せよ。
【００５２】
変異した核酸セグメント及び／又はベクターは、形質転換、トランスフェクション、ｄトランスダクション、ウイルス感染、遺伝子銃、又はTi媒介遺伝子伝達を含む種々のいずれの技法を用いて宿主細胞中に導入してもよい。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが挙げられる（例えば、Davisら,Basic Methods in Molecular Biology(1986)参照）。
【００５３】
適切な場合、操作した宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、或いは遺伝子を増幅し、或いは相同組換えを増やすために適するように改変した通常の栄養培地内で培養することができる。適切な宿主株の形質転換及びその宿主株の適切な細胞濃度への成長後、選択したプロモーターを適宜の手段（例えば、温度シフト又は化学的誘発）によって誘発し、細胞をさらなる期間培養して細胞に所望ポリペプチド又はその断片を産生させることができる。
【００５４】
一局面では、本発明の方法で作られた核酸又はベクターをスクリーニング用の細胞中に導入すると、核酸は、該核酸のその後の発現に好適な様式で細胞に入る。導入方法は、主として標的細胞型によって決定される。典型的な方法としては、CaPO4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えば、LIPOFECTIONTM）、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。候補核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定して組み込まれ（例えば、レトロウイルス導入による）或いは細胞質内に一過性に又は安定して存在し得る（すなわち、伝統的なプラスミドの使用を通じて、標準的な調節配列、選択マーカーなどを用いて）。多くの製薬的に重要なスクリーンは、ヒト又はモデル哺乳動物細胞標的を必要とするので、該標的をトランスフェクションできるレトロウイルスベクターが好ましい。
【００５５】
細胞を遠心分離で収集し、物理的若しくは化学的手段で破壊し、結果の粗抽出物をさらなる精製用に保持することができる。タンパク質の発現用に用いられる微生物細胞は、凍解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む、いずれの便利な方法によても破壊することができる。このような方法は本技術の当業者には周知である。発現したポリペプチド又はその断片は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法で組換え細胞培養から回収かつ精製することができる。いずれの便利な方法によっても破壊することができる。必要に応じ、ポリペプチドのコンフィギュレーションを完成するのにタンパク質のリフォールディング工程を利用することができる。所望により、最終精製工程で高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を利用することができる。
【００５６】
種々の哺乳動物細胞培養系を利用して組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例としては、サル腎線維芽細胞のCOS-7系統及びC127、3T3、CHO、Hela、BHK細胞系統のような適合性ベクターからタンパク質を発現可能な他の細胞系統が挙げられる。
【００５７】
従来のやり方で宿主細胞中の構築物を用い、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生成することができる。組換え体生産法に使用する宿主細胞に依存して、ベクターを含有する宿主細胞に依存して、産生されるポリペプチドはグリコシル化され、或いはグリコシル化されない。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を含むことも含まないこともある。
【００５８】
無細胞翻訳系も利用できる。無細胞翻訳系は、ポリペプチド又はその断片をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを使用し得る。いくつかの局面では、インビトロ転写反応を行う前にDNA構築物を線状にしてもよい。そして、転写されたmRNAをウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物と共にインキュベートして所望のポリペプチド又はその断片を生成する。
【００５９】
発現ベクターは、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、又は大腸菌内においてはテトラサイクリン耐性若しくはアンピシリン耐性のような、形質転換宿主細胞の選抜のための表現型形質を与えるために１つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。
【００６０】
（核酸の増幅）
本発明の一局面では、１つ以上の変異が１つ以上の核酸（例えば、染色体又はゲノム）セグメント中に、増幅、例えば変異性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって導入される。増幅反応を用いて試料内の核酸の量（試料細胞内のメッセージ量のような）を数量化し、核酸を標識し（例えば、それをアレイ若しくはブロットに適用するため）、核酸を検出し、或いは試料内の特定の核酸の量を数量化することができる。当業者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択かつ設計することができる。増幅法は技術的にも周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)（例えば、PCR PROTOCOLS,A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS,ed.Innis,Academic Press,N.Y.(1990)及びPCR STRATEGIES(1995),ed.Innis, Academic Press,N.Y.,リガーゼ連鎖反応(LCR)（例えば、Wu(1995) Genomics 4:560；Landegren(1988) Science 241:1077；Barringer(1990) Gene 89:117）；転写増幅（例えば、Kwoh(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173）；及び自立配列複製（例えば、Guatelli(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874）；Q ベータレプリカーゼ増幅（例えば、Smith(1997) J.Clin.Microbiol. 35:1477-1491）、自動化Q-ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Burg(1996) Mol.Cell.Probes 10:257-271）及び他のRNAポリメラーゼ媒介法（例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）；Berger(1987) Methods Enzymol. 152:307-316；Sambrook；Ausubel；米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号；Sooknanan(1995) Biotechnology 13:563-564も参照せよ。
【００６１】
（核酸の改変）
本発明は、核酸配列を変異させる方法であって、染色体又は染色体の一部のセグメントを供給する工程と、１つ以上のセグメント中に１つ以上の変異を導入する工程を含む方法を提供する。ランダムに、非ランダムに、又は両方で変異を誘発するため、いずれの方法も使用することができる。これらの方法を繰り返し、或いはいろいろ組み合わせて用い、１つ以上の変異を１つ以上のセグメント中に生成することができる。これらの方法を繰り返し、或いはいろいろ組み合わせて使用することもできる。別の局面では、例えば、本発明の方法による相同遺伝子のex vivo改変後、その細胞中への再挿入によって、細胞の遺伝子構成が変えられる。
【００６２】
ランダムに、非ランダムに、又は両者で変異を導入するため、いずれの方法も使用できる。例えば、ランダム又は確率的方法、又は非確率的、又は「定方向進化」法は、例えば、米国特許第6,361,974号を参照せよ。遺伝子のランダムな変異は、技術的に周知であり、例えば、米国特許第5,830,696号を参照せよ。例えば、変異原を用いてランダムに遺伝子を変異させることができる。変異原としては、例えば、紫外線若しくはガンマ線、又は化学的変異原、例えば、マイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、これらを単独で又は組合せて、組換えによって修復を受けやすいDNA損傷を誘発する。他の化学的変異原としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が挙げられる。他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似体、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、又はアクリジンである。これら物質をヌクレオチド前駆体の代わりにPCR反応に加えることによって、配列を変異させることができる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン等のようなインターカレティング剤も使用できる。
【００６３】
分子生物学のいずれの技術も、例えばランダムPCR変異誘発、例えば、Rice(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5467-5471参照；又は組合せ複数カセット変異誘発、例えば、Gramer(1995) Biotechniques 18:194-196参照；を使用できる。あるいは、核酸、例えば遺伝子をランダム又は「確率的」断片化後再構成することができ、例えば米国特許第6,291,242；6,287,862；6,287,861;5,955,358；5,830,721；5,824,514；5,811,238；5,605,793号を参照せよ。別の局面では、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド-特異的変異誘発、構築PCR、セクシュアルPCR(sexual PCR)変異誘発、in vivo変異誘発、カセット変異誘発、再帰的アンサンブル変異誘発、指数アンサンブル変異誘発、部位特異的変異誘発、遺伝子再構成、遺伝子部位飽和変異誘発（GSSM）、合成連結変異誘発（SLR）、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート改変DNA変異誘発、ウラシル含有鋳型変異誘発、ギャップド二重鎖変異誘発、点ミス対合修復変異誘発、修復欠損宿主株変異誘発、化学的変異誘発、放射線変異誘発、欠失変異誘発、制限-選択変異誘発、制限-精製変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル変異誘発、キメラ核酸マルチマー作製、及び／又はこれら及び他の方法の組合せによって、改変、付加又は欠失が導入される。
【００６４】
以下の出版物は、本発明の方法に取り込むことのできる種々の再帰的組換え手順及び／又は方法について記述している：Stemmer(1999)「ターゲティング及び他の臨床特性のためのウイルスの分子育種」Tumor Targeting 4:1-4；Ness(1999)Nature Biotechnology 17:893-896；Chang(1999)「DNAファミリーシャッフリングによるサイトカインの進化」Nature Biotechnology 7:793-797；Minshul(1999)「分子育種によるタンパク質の進化」Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290；Christians(1999)「DNAファミリーシャッフリングによるAZTリン酸化用チミジンキナーゼの定方向進化」Nature Biotechnology 17:259-264；Crameri(1998)「多様な種由来の遺伝子ファミリーのDNAシャッフリングは定方向進化を加速する」Nature 391:288-291；Crameri(1997) 「DNAシャッフリングによるヒ酸塩解毒経路の分子進化」Nature Biotechnology 15:436-438；Zhang(1997)「DNAシャッフリング及びスクリーニングによるガラクトシダーゼからの効率的なフコシダーゼの定方向進化」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509；Pattenら(1997)「DNAシャッフリングの医薬品及びワクチンへの適用」Current Opinion in Biotechnology 8:724-733；Crameriら(1996)「DNAシャッフリングによる抗体-ファージライブラリーの構築と進化」Nature Medicine 2:100-103；Gatesら(1996)「lacリプレッサー‘ヘッドピースダイマー’上の提示によるペプチドライブラリーからのリガンドのアフィニティー選択的単離」Journal of Molecular Biology 255:373-386；Stemmer(1996)「セクシュアルPCR及びアッセンブリPCR」In:The Encyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers,New York.pp.447-457；Crameri及びStemmer(1995)「コンビナトリアルマルチカセット変異誘発は変異体と野生型カセットのすべての順序の交換を引き起こす」Bio Techniques 18:194-195；Stemmerら(1995)「遺伝子と完全染色体の一段階アッセンブリは多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドを形成する」Gene, 64:49-53；Stemmer(1995)「分子計算の発展」Science 270:1510；Stemmer(1995)「検査シーケンススペース」Bio/Technology 13:549-553；Stemmer(1994)「DNAシャッフリングによるタンパク質の急速なインビトロ進化」Nature 370:389-391；及びStemmer(1994)「ランダムな断片化と再構成によるDNAシャッフリング：分子進化のためのインビトロ組換え」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751。
【００６５】
多様性を生じさせる変異誘法としては、例えば、部位-特異的変異誘発（Lingら(1997)「DNA変異誘発へのアプローチ：概観」Anal.Biochem. 254(2):157-178；Daleら(1996)「ホスホロチオエート法によるオリゴヌクレオチド-特異的変異誘発」Methods Mol. Biol.57:369-374；Smith(1985)「in vitro変異誘発」Ann. Rev. Grent. 19:423-462；Botstein & Shortle(1985)「in vitro変異誘発の戦略と応用」Science 229:1193-1201；Carter(1986)「部位-特異的変異誘発」Biochem. J. 237:1-7；及びKunkel(1987)「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の効率」in Nucleic Acids & Molecular Biology（Eckstein, F及びLilley,D.M.J.eds.,Springer Verlag,Berlin））；ウラシル含有鋳型による変異誘発（Kunkel(1985)「表現型選択を伴わない迅速かつ効率的な部位特異的変異誘発」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel(1987)「表現型選択を伴わない迅速かつ効率的な部位特異的変異誘発」Methods in Enzymol. 154,367-382；及びBassら(1988)「新規なDNA結合特異性を有する変異体Trpリプレッサー」Science 242:240-245）；オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Methods in Enzymol. 100:468-500(1983)；Methods in Enzymol. 154:329-350(1987)；Zoller & Smith(1982)「M13由来ベクターによるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発：点変異の生成のためのいずれのDNA断片内でも有効かつ一般的な手順」Nucleic Acids Res. 10:6487-6500；Zoller & Smith(1983)「M13ベクター中でクローン化したDNA断片のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発」Methods in Enzymol. 100:468-500；及びZoller & Smith(1987)「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発：２つのオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖DNA鋳型を用いる簡単な方法」Methods in Enzymol. 154:329-350）；ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発（Taylorら(1985)「ニックの入ったDNAを調製するための制限酵素反応におけるホスホロチオエート修飾DNAの使用」Nucl. Acids Res. 13:8749-8764；Taylorら(1985)「ホスホロチオエート修飾DNAを用いる高頻度のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発の迅速な生成」Nucl. Acids Res. 13:8765-8787(1985)；Nakamaye(1986)「ホスホロチオエート基による制限エンドヌクレアーゼNci I切断の阻害及びそのオリゴヌクレオチド特異的変異誘発への適用」Nucl. Acids Res. 14:9679-9698；Sayersら(1988)「ホスホロチオエートに基づいたオリゴヌクレオチド特異的変異誘発におけるY-Tエクソヌクレアーゼ」Nucl. Acids Res. 16:791-802；及びSayersら(1988)「臭化エチジウムの存在下における制限エンドヌクレアーゼとの反応によるホスホロチオエート含有DNAの鎖特異的切断」Nucl. Acids Res. 16:803-814）；ギャップド二重鎖DNAによる変異誘発（Kramerら(1984)「オリゴヌクレオチド特異的変異構築へのギャップド二重鎖DNAアプローチ」Nucl. Acids Res. 12:9441-9456；Kramer & Fritz(1987)Methods in Enzymol.「ギャップド二重鎖DNAによる変異のオリゴヌクレオチド特異的構築」154:350-367；Kramerら(1988)「変異のオリゴヌクレオチド特異的構築へのギャップド二重鎖DNAアプローチにおける改良された酵素的インビトロ反応」Nucl. Acids Res. 16:7207；及びFritzら(1988)「変異のオリゴヌクレオチド特異的構築：酵素的in vitro反応のないギャップド二重鎖DNA手順」Nucl. Acids Res. 16:6987-6999）。
【００６６】
本発明の方法で用いられるさらなる手順としては、点ミス対合修復（Kramer(1984)「点ミス対合修復」Cell 38:879-887）、修復不完全な宿主株による変異誘発（Carterら(1985)「M13ベクターを用いる改良されたオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発」Nucl. Acids Res. 13:4431-4443；及びCarter(1987)「M13ベクターを用いる改良されたオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発」Methods in Enzymol. 154:382-403）、欠失変異誘発（Eghtedarzadeh(1986)「大きい欠失を生成するためのオリゴヌクレオチドの使用」Nucl. Acids Res. 14:5115）、制限−選択及び制限−選択と制限−精製（Wellsら(1986)「サブチリシンの遷移状態の安定化における水素結合形成の重要性」Phil. Trans. R. Soc. Load. A 317:415-423）、全体的な遺伝子合成による変異誘発（Nambiarら(1984)「リボヌクレアーゼSタンパク質をコードする遺伝子の全合成とクローン化」Science 223:1299-1301；Sakamer及びKhorana(1988)「ウシロッド外側セグメントグアニンヌクレオチド結合性タンパク質(トランスデューシン)のサブユニット用遺伝子の全合成と発現」Nucl. Acids Res. 14:6361-6372；Wellsら(1985)「カセット変異誘発：定義した部位での複数変異の生成の効率的方法」Gene 34:315-323；及びGrundstromら(1985)「微小規模‘ショットガン’遺伝子合成によるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発」Nucl. Acids Res. 13:3305-3316）、二本鎖破損修復（Mandecki(1986)；Arnold(1993)「異常環境のためのタンパク質操作」Current Opinion in Biotechnology 4:450-455「大腸菌のプラスミド内におけるオリゴヌクレオチド特異的二本鎖破損修復：部位特異的変異誘発の方法」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7177-7181）が挙げられる。上記多くの方法のさらなる詳細は、Enzymology Volume 154で見られ、種々の変異誘発法でトラブルシューティング問題に有用なコントロールについて記載されている。
【００６７】
本発明の方法で用いられるさらなる手順としては、Stemmerらに対する米国特許第5,605,793号(1997年2月25日)「in vitro組換えのための方法」；Stemmerらに対する米国特許第5,811,238号(1998年9月22日)「反復性選択と組換えによる所望特性を有するポリヌクレオチドの製造方法」；Stemmerらに対する米国特許第5,830,721号(1998年11月3日)「ランダムな断片化と再構成によるDNA変異誘発」；Stemmerらに対する米国特許第5,834,252号(1998年11月10日)「末端相補的なポリメラーゼ連鎖反応」；Minshullらに対する米国特許第5,837,458号(1998年11月17日)「細胞及び代謝操作のための方法と組成物」；WO95/2625,Stemmer及びCrameri,「ランダムな断片化と再構成による変異誘発」；Stemmer及びLipschutzによるWO96/33207「末端相補的なポリメラーゼ連鎖反応」；Stemmer及びLipschutzによるWO97/20078「反復性選択と組換えによる所望特性を有するポリヌクレオチドの製造方法」；Minshull及びStemmerによるWO97/35966「細胞及び代謝操作のための方法と組成物」；PunnonenらによるWO99/41402「遺伝子ワクチンベクターのターゲティング」；PunnonenらによるWO99/41383「抗原ライブラリー免疫化」；PunnonenらによるWO99/41369「遺伝子ワクチンベクター操作」；PunnonenらによるWO99/41368「遺伝子ワクチンの免疫調節特性の最適化」；Stemmer及びCrameriによるEP752008「ランダムな断片化と再構成によるDNA変異誘発」；StemmerによるEP0932670「再帰的配列組換えによって進化する細胞DNA摂取」；StemmerらによるWO99/23107「ウイルスゲノムシャッフリングによるウイルス親和性及び宿主範囲の改変」；AptらによるWO99/21979「ヒト乳頭腫ウイルスベクター」；del CardayreらによるWO98/31837「再帰的配列組換えによる全細胞及び生体の進化」；Patten及びStemmerによるWO98/27230「ポリペプチド操作のための方法及び組成物」；StemmerらによるWO98/27230「再帰的配列シャッフリング及び選択による遺伝的治療の最適化法」、WO00/00632「高多様性ライブラリーの生成方法」、WO00/09679「インビトロ組換えポリヌクレオチド配列バンク内で得る方法及びその結果の配列」；ArnoldらによるWO98/42832「ランダム又は定義されたプライマーを用いるポリヌクレオチド配列の組換え」、ArnoldらによるWO99/29902「ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の生成方法」、VindによるWO98/41653「DNAライブラリー構築のインビトロ方法」、BorchertらによるWO98/41622「DNAシャッフリングを用いるライブラリーの構築方法」、Pati及びZarlingによるWO98/42727「相同組換えを用いる配列変更」が挙げられる。
【００６８】
本発明の実施に使用できる手順（種々多様な製造方法に関する詳細を与える）は、例えば、Pattenらによって1999年9月28日に提出された米国特許出願番号(USSN)09/407,800，「コドン変更遺伝子のシャッフリング」；del Cardayreらによる米国特許第6,379,964号「再帰的配列組換えによる全細胞及び生物の進化」；Crameriらによる米国特許第6,319,714；6,368,861；6,376,246；6,423,542；6,426,224号及びPCT/US00/01203「オリゴヌクレオチド媒介核酸組換え」；Welchらによる米国特許第6,436,675号「合成シャッフリングのためのコドン変化オリゴヌクレオチド合成の使用」；Selifonovらによって2000年1月18日に提出された（PCT/US00/01202）「所望特性を有する形質ストリング、ポリヌクレオチ及びポリペプチドの製造方法」及び例えば、Selifonovらによって2000年1月18日に提出された（米国特許出願番号09/618,579）「所望特性を有する形質ストリング、ポリヌクレオチ及びポリペプチドの製造方法」；Selifonov及びStemmerによって2000年1月18日に提出された（PCT/US00/01138）「進化シミュレーション用のデータ構造の配置方法」；及びAffholterによって2000年9月6日に提出された（米国特許出願番号09/656,549）「一本鎖核酸鋳型媒介組換え及び核酸断片単離」；及び米国特許第6,177,263；6,153,410号に記載されている。
【００６９】
非確率的、又は「定方向進化」方法としては、例えば、飽和変異誘発（GSSM）、合成連結再構成（SLR）、又はその組合せが挙げられ、本発明の核酸を改変して核酸セグメントに変異を起こすために使用される。これら改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、タンパク質分解性又は他の活性について試験する前に活性をスクリーニングすることができる。いずれの試験の様相又は手順を使用してもよく、例えば、キャピラリーアレイプラットフォームを用いることができる。例えば、米国特許第6,361,974；6,280,926；5,939,250号を参照せよ。
【００７０】
（飽和変異誘発、又はGSSM）
本発明の一局面では、非確率的な遺伝子改変、「定方向進化法」を用いて配列に変異を起こす。この方法の変形は、「遺伝子部位飽和変異誘発」「部位飽和変異誘発」「飽和変異誘発」、又は単に「GSSM」と呼ばれている。この方法は、他の変異誘発法と組み合わせて使用することができる。例えば、米国特許第6,171,820；6,238,884号を参照せよ。一局面では、GSSMは、鋳型ポリヌクレオチドと複数のオリゴヌクレオチドを供給することを含む。ここで、各オリゴヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列（それによって鋳型ポリヌクレオチドの特異的配列を標的化する）、および、相同的な遺伝子の変異体を含む；該オリゴヌクレオチドで鋳型ポリヌクレオチドを複製することによって非確率的な配列変化を含む子孫ポリヌクレオチドを生成し、それによって相同的な遺伝子配列変化を含むポリヌクレオチドを生成する工程を含む。
【００７１】
一局面では、各アミノ酸位置、例えば改変すべき標的とされる酵素活性部位又はリガンド結合部位内のアミノ酸残基で単一のアミノ酸置換の全範囲が表現される１セットの子孫ポリペプチドが生成するように、縮重したＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列を含有するコドンプライマーを用いてポリヌクレオチド中に点変異を誘導する。これらオリゴヌクレオチドは、隣接した第１の相同配列と、縮重したＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列を含むことができ、場合により、第２の相同配列を含むことができる。このようなオリゴヌクレオチドの使用による下流の子孫翻訳産物は、Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列の縮重が20個のアミノ酸すべてのコドンを含むので、ポリペプチドに沿った各アミノ酸部位ですべての可能なアミノ酸変化を含む。一局面では、このような縮重オリゴヌクレオチドの１つ（例えば、１つの縮重Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔカセットを含む）を用いて、親ポリヌクレオチド鋳型内の元の各コドンを全範囲のコドン置換させる。一局面では、同一又はそうでないオリゴヌクレオチド中にある少なくとも２つの縮重カセットを用いて親ポリヌクレオチド鋳型内の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換させる。例えば、１つより多くのＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列が１つのオリゴヌクレオチド内に含まれ、１つより多くの部位でアミノ酸変異が導入され得る。この複数のＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列は、直接隣接することができ、或いは１つ以上の付加ヌクレオチド配列によって分離され得る。一局面では、付加及び欠失を導入するのに役立つオリゴヌクレオチドを単独又はＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列を含有するコドンと組み合わせて使用し、アミノ酸の付加、欠失、及び／又は置換のいずれの組合せ又は順序の交換をも導入することができる。
【００７２】
一局面では、隣接したＮ,Ｎ,Ｇ/Ｔトリプレット、すなわち、縮重(Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔ)ｎ配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて、２つ以上の隣接したアミノ酸位置の同時変異誘発を行う。一局面では、Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔ配列より低縮重の縮重カセットを用いる。例えば、ある場合には、１つのＮだけから成る（ここで、前記Ｎは該トリプレットの第１第２又は第３位にあり得る）縮重トリプレットを使用することが望ましい（例えば、オリゴヌクレオチド内で）。いかなる組合せ及びその順序の交換をも含むいずれの他の塩基も該トリプレットの残っている２つの位置で使用することができる。代わりに、縮重Ｎ,Ｎ,Ｎトリプレット配列を使用することが望ましい場合もある（例えば、オリゴ内で）。
【００７３】
一局面では、縮重トリプレット（例えば、Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔトリプレット）の使用は、ポリヌクレオチド内の１つ１つのアミノ酸位置中に全範囲の可能な天然アミノ酸（20種のアミノ酸全部）の系統的かつ容易な生成を可能にする（別の局面では、本方法は、アミノ酸残基、又はコドンの位置ごとに可能なすべての置換より少ない生成をも包含する）。例えば、100アミノ酸ポリペプチドでは、2000の別個の種（すなわち、位置毎に20種の可能なアミノ酸x100個のアミノ酸位置）が生成され得る。縮重Ｎ,Ｎ,Ｇ/Ｔトリプレットを含有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのセットの使用により、32の個々の配列が20種の可能な天然アミノ酸すべてをコードし得る。従って、少なくとも１つのこのようなオリゴヌクレオチドを用いて親ポリヌクレオチド配列を飽和変異誘発にかける反応容器内には、20の別個のポリペプチドをコードする32の別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異誘発で非縮重オリゴヌクレオチドを用いると、反応容器当たり１つだけ子孫ポリペプチド産物が生じる。任意に、開示した縮重プライマーと組み合わせて非縮重オリゴヌクレオチドを使用することができ；例えば、非縮重オリゴヌクレオチドを用いて作用ポリヌクレオチド内に特有の点変異を生成することができる。これは、特異的サイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす変異、及び終止コドンの生成とポリペプチド断片の対応する発現を引き起こす点変異を生成する一手段を与える。
【００７４】
一局面では、各飽和変異誘発反応容器は、すべての20種の天然アミノ酸が、親ポリヌクレオチド内で変異誘発されるコドン位置に対応する１つの特異的なアミノ酸位置に相当するように、少なくとも20個の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の局面は、全20種より少ない天然の組合せを使用する）。各飽和変異誘発反応容器から生成される32倍縮重した子孫ポリペプチドをクローン増幅（例えば、適切な宿主、例えば、大腸菌宿主中に、例えば発現ベクターを用いてクローン化される）に供し、かつ発現スクリーニングに供することができる。スクリーニングによって（親ポリペプチドと比較したとき、アルカリ性又は酸性条件下でタンパク質分解活性が上昇したというような）特性の好ましい変化を提示する個々の子孫ポリペプチドが同定された場合は、配列決定をして、そこに含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
【００７５】
一局面では、ここで開示するような飽和変異誘発を用いて親ポリペプチド内の１つ１つのアミノ酸位置を変異誘発すると、１つ以上のアミノ酸位置で好ましいアミノ酸変化が同定されることがある。これら好ましいアミノ酸置換のすべて又は一部の組合せを含む１つ以上の新しい子孫分子を生成し得る。例えば、ポリペプチド内の３つのアミノ酸位置のそれぞれで２つの特有の好ましいアミノ酸変化が同定された場合、順序の交換は、各位置で３つの可能性（元のアミノ酸から変化せず、かつそれぞれ２つの好ましい変化）及び３つの位置を含む。従って、以前に調べられた７つ、すなわち６つの単一の点変異（すなわち、３つの位置のそれぞれで２）といずれかの位置の無変化を含め、３x３x３、つまり全部で27の可能性がある。
【００７６】
一局面では、部位飽和変異誘発は、配列を変える別の確率的又は非確率的手段、例えば、合成連結再構成（後述する）、シャッフリング、キメラ化、組換え及び他の変異を誘発する方法及び変異誘発物質と共に使用することができる。この発明は、反復様式の飽和変異誘発を含むいずれの変異誘発法の使用も提供する。
【００７７】
（合成連結再構成（SLR））
本発明の方法は、本発明の変異配列を生成するための、「合成連結再構成」、又は単に「SLR」、「定方向進化法」と呼ばれる非確率的遺伝子改変システムの使用を包含する。SLRは、オリゴヌクレオチド断片を一緒に非確率的に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロック(nucleic acid building block)がシャッフルされず、ランダムに鎖状につながれ或いはキメラ化されるのではなく、非確率的に構築されるという点で、確率的なオリゴヌクレオチドシャッフリングと異なる。例えば1999年6月14日に提出され、表題「定方向進化における合成連結再構成」の米国特許出願番号(USSN)09/332,835（「USSN 09/332,835」）を参照せよ。一局面では、SLRは、以下の工程を含む：（ａ）相同遺伝子をコードする配列を含む鋳型ポリヌクレオチドを供給する工程；（ｂ）複数の構築ブロックポリヌクレオチド（該構築ブロックは、所定配列で前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成するように設計されており、かつ１つの構築ブロックは、前記相同遺伝子の変異体である配列と、該変異体配列に隣接している前記鋳型ポリヌクレオチドに相同的な配列とを含む）を供給する工程；（ｃ）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成して、相同遺伝子配列変異体を含むポリヌクレオチドを生成するように、前記構築ブロックポリヌクレオチドを前記鋳型ポリヌクレオチドと結合させる工程。
【００７８】
SLRは、再配列されるポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しない。従って、この方法を用いて、10100を超える異なるキメラを含む子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率的に生成することができる。SLRを用いて、101000を超える異なる子孫キメラを含むライブラリーを生成することができる。従って、本発明の局面は、設計によって選択される全体的な構築順序を減らす１セットの最終キメラ核酸分子の非確率的な製造方法を包含する。この方法は、設計によって、相互に適合できる連結可能末端を有する複数の特有の核酸構築ブロックを生成する工程と、設計された全体的な構築順序が達成されるように、これら核酸構築ブロックを構築する工程を含む。
【００７９】
核酸構築ブロックの相互に適合性の連結可能末端は、それらが構築ブロックを所定順序で結合できる場合、このタイプの順序づけられた構築に「役立つ」とみなされる。従って、核酸構築ブロックが結合され得る全体的な構築順序は、連結可能末端の設計によって特定される。１つより多くの構築工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合され得る全体的な構築順序も構築工程の逐次的な順序によって特定される。一局面では、アニールされる構築断片は、リガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ）のような酵素で処理されて該構築断片の共有結合を達成する。
【００８０】
一局面では、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、１セットの子孫最終キメラポリヌクレオチドを生成するための基礎として働く１セットの前駆核酸鋳型を解析することによって得られる。このようにして、これら親オリゴヌクレオチド鋳型は、変異誘発される、例えば、キメラ化又はシャッフルされる核酸構築ブロックの設計を助ける配列情報のソースとして働く。この方法の一局面では、１つ以上の境界点を選択するため、複数の親核酸鋳型の配列がアラインメントされる。境界点は相同性の領域に位置し、かつ１つ以上のヌクレオチドを含む。これら境界点は、好ましくは少なくとも２つの前駆鋳型によって共有される。それによって、境界点を用いて、親ポリヌクレオチドを再配列するために生成すべきオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界を線引きすることができる。前駆分子内で同定かつ選択された境界点が、最終キメラ子孫分子の構築で可能性のあるキメラ化点として働く。境界点は、少なくとも２つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同性の領域（少なくとも１つの相同ヌクレオチド塩基を含む）であり得る。あるいは、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同性の領域であり得、或いは親ポリヌクレオチド配列の少なくとも３分の２によって共有される相同性の領域であり得る。さらに好ましくは、役に立つ境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも４分の３によって共有される相同性の領域であり、或いは、親ポリヌクレオチド配列のほとんどすべてによって共有され得る。一局面では、境界点は、すべての親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同性の領域である。
【００８１】
一局面では、子孫キメラポリヌクレオチドの徹底的なライブラリーを生成するため、連結再構成プロセスは徹底的に行われる。言い換えれば、核酸構築ブロックのすべての可能な順序組合せが、最終キメラ核酸分子のセット内に表される。同時に、別の局面では、各組合せ内の構築順序（すなわち、各最終キメラ核酸の５'->３'配列内の各構築ブロックの構築順序）は、上述したように意図的（又は非確率的）である。この発明の非確率的性質のため、望ましくない副産物の可能性は大いに減少する。
【００８２】
別の局面では、連結再構成法は系統的に実施される。例えば、系統的に、例えば１つずつスクリーニングし得る区画を有する子孫分子の系統的に区画化されたライブラリーを系統的に生成するために本方法が実施される。言い換えれば、本発明により、連続的な段階的構築反応の選択的かつ思慮分別のある使用と組み合わせて、特有の核酸構築ブロックの選択的かつ思慮分別のある使用により、数反応容器内のそれぞれにおいて特有セットの子孫産物が作られるという設計を行うことができる。これは、系統的な調査及びスクリーニング手順の実施を可能にする。従って、これらの方法は、可能性のある非常に多数の子孫分子をより小さいグループ中で系統的に調査することを可能にする。この方法は高度にフレキシブルでさらに徹底的かつ系統的でもある様式でキメラ化を行うことができるため、特に前駆分子間の相同性が低レベルである場合、この方法は、多数の子孫分子が含まれるライブラリー（又はセット）の生成に役立つ。本連結再構成発明の非確率的性質のため、生成される子孫分子は、好ましくは設計によって選択される全体的な構築順序を有する最終キメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異誘発及び最適化定方向進化法を使用しても異なる子孫分子種を生成することができる。本発明が境界点、核酸構築ブロックの大きさと数、及び結合の大きさと設計の選択についての選択と制御の自由を与えることは明白である。実際、境界点は、ほとんど又は全く分子間の相同性がない領域内に選択することさえできる。例えば、コドンゆらぎ、すなわちコドンの縮重のため、ヌクレオチド置換は、対応する前駆鋳型内に最初にコードされているアミノ酸を変えずに、核酸構築ブロック中に導入することができる。あるいは、元のアミノ酸のコーディングが変わるようにコドンを変えることができる。この発明は、このような置換を核酸構築ブロック中に導入して、分子間の相同境界点の発生率を高め、ひいては構築ブロック間で達成されるカップリングの数を増やし、次には、より多数の子孫キメラ分子を生成するのを可能にする。
【００８３】
別の局面では、構築ブロックが生成される工程の合成的性質が、後で任意に、インビトロプロセス（例えば、変異誘発によって）或いはin vivoプロセス（例えば、宿主生物の遺伝子スプライシング能力を利用して）で除去できるヌクレオチド（例えば、１つ以上のヌクレオチド、例えば、コドン又はイントロン又は調節配列でよい）の設計と導入を可能にする。多くの場合、これらヌクレオチドの導入は、役に立つ境界点を作るという潜在的な利益に加え、多くの他の理由でも望ましいことは明白である。
一局面では、核酸構築ブロックを用いてイントロンを導入する。従って、本発明で述べる方法により製造された人工の遺伝子中に機能性イントロンが導入される。人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能的に働く様に、遺伝子スプライシング用の宿主細胞内で機能的であり得る。
【００８４】
（最適化定方向進化システム）
本発明の方法は、本発明の変異配列を生成するために「最適化定方向進化システム」と呼ばれる非確率的遺伝子改変システムをも使用する。最適化定方向進化システムは、組換えを通じて核酸の定方向分子進化を与える還元的再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用に向けられる。最適化定方向進化は、大集団の進化したキメラ配列の生成を可能にし、この生成された集団は、所定数の交差事象を有する配列が有意に富んでいる。
【００８５】
交差事象は、ある親変異体から別の親変異体へ配列中でシフトが起こる、キメラ配列内の点である。このような点は、通常２つの親由来のオリゴヌクレオチドが一緒に連結して単一の配列を形成する接合点にある。この方法は、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度計算を与えるので、配列の最終キメラ集団は、選択した数の交差事象に富む。これが、所定数の交差事象を有するキメラ変異体の選択の高いコントロールを与える。
【００８６】
さらに、この方法は、他のシステムに比べて莫大な量の可能なタンパク質変異体スペースを探る便利な手段を与える。以前は、例えば、反応中に1013個のキメラ分子を生成する場合、特定の活性についてこのような多数のキメラ変異体を試験することは非常に困難だろう。さらに、子孫集団の有意な部分は、結果として特定の活性のレベルをあまり高めないタンパク質を生じさせる非常に多数の交差事象を有しているだろう。これらの方法を用いることで、キメラ分子の集団を、特定数の交差事象を有する当該変異体について富ませることができる。従って、反応中に1013個のキメラ分子を生成することができるが、さらなる解析のために選択される各分子は、おそらく例えば３つの交差事象しか有していないだろう。得られる子孫集団は所定数の交差事象を有するように偏向させることができるので、キメラ分子間の機能多様性に関する境界が減少する。これは、元の親ポリヌクレオチド由来のどのオリゴヌクレオチドが特定の形質に作用する原因かを計算する場合に、より管理できる数の変数を与える。
【００８７】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作る１つの方法は、各親配列の断片又は部分に相当するオリゴヌクレオチドを作ることである。各オリゴヌクレオチドは、好ましくは、該オリゴヌクレオチドを一緒に混合すると、正確な順序で構築された各オリゴヌクレオチド断片を有する新しい変異体をもたらすような唯一の重なり領域を含む。さらなる情報は、例えば、USSN09/332,835；米国特許第6,361,974号で述べられている。各親変異体のために生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作られるキメラ分子内に生じる交差の総数に対して関連性をもつ。例えば、高温で大きい活性を有するキメラ変異体を見つけるためには、３つの親ヌクレオチド配列変異体が供給されて連結反応を受けるかもしれない。一例として、各親変異体の各部分に対応して50個のオリゴヌクレオチド配列が１セット生成され得る。従って、連結再構成プロセスの間に、各キメラ配列内に50個までの交差事象があるだろう。生成された各キメラポリヌクレオチドが交互の順序で各親変異体由来のオリゴヌクレオチドを含む確率は非常に低い。各オリゴヌクレオチド断片が同一分子量の連結反応に存在する場合、いくつかの位置で、同じ親ポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドが相互に隣に連結し、その結果交差事象とならないことがありそうである。この例のいずれの連結段階でも各親由来の各オリゴヌクレオチドの濃度が一定に保たれれば、同じ親変異体由来のオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結し、かつ交差を生じない機会は1/3（３つの親と仮定すると）である。
【００８８】
従って、確率密度関数（PDF）を決定して、与えられる連結反応の各工程で起こるであろう交差事象の集団、該連結反応の各工程中における親変異体のセット数、各変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び各変異体の濃度を予測することができる。PDFの決定の背後にある統計学と数学については後述する。これらの方法を利用することで、このような確率密度関数を計算して、特定の連結反応から生じる所定数の交差事象についてキメラ子孫集団を濃厚にすることができる。さらに、目標数の交差事象を予め決定して、連結反応の各工程中の各親オリゴヌクレオチドの開始量を計算し、前記予め決定した数の交差事象に集中する確率密度関数に帰着するようにシステムをプログラムすることができる。これらの方法は、組換えによるポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を考慮する還元的な再組合せ、組換え及び選択の反復サイクルの使用に向けられている。このシステムは、進化したキメラ配列の大きな集団の生成を可能にし、生成した集団は所定数の交差事象を有する配列が有意に富んでいる。交差事象は、ある親変異体から別の親変異体に配列のシフトが起こるキメラ配列の一点である。このような点は、通常２つの親由来のオリゴヌクレオチドが一緒に連結されて単一の配列を形成する接合点にある。本方法は、配列の最終キメラ集団が選択数の交差事象に富むようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度を計算することができる。これは、所定数の交差事象を有するキメラ変異体の選択に関する多くのコントロールを与える。
【００８９】
さらに、この方法は、他のシステムに比べて莫大な量の可能なタンパク質変異体スペースを探る便利な手段を与える。ここで述べる方法を用いることによって、特定数の交差事象を有する当該変異体についてキメラ分子集団を濃縮することができる。従って、反応中に1013個のキメラ分子を生成することができるが、さらなる解析のために選択される各分子は、おそらく、例えば３つの交差事象しか持っていないだろう。得られる子孫集団は所定数の交差事象を有するように偏向させることができるので、キメラ分子間の機能多様性に関する境界が減少する。これは、元の親ポリヌクレオチド由来のどのオリゴヌクレオチドが特定の形質に作用する原因かを計算するとき、より管理できる数の変量を与える。
【００９０】
一局面では、本方法は、各親配列の断片又は部分に相当するオリゴヌクレオチドを作ることによって、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作る。各オリゴヌクレオチドは、好ましくは、該オリゴヌクレオチドを一緒に混合すると、正確な順序で構築された各オリゴヌクレオチド断片を有する新しい変異体をもたらすような唯一の重なり領域を含む。USSN09/332,835も参照せよ。
【００９１】
各親変異体のために生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作られるキメラ分子内に生じる交差の総数に対して関連性をもつ。例えば、高温で大きい活性を有するキメラ変異体を見つけるために、３つの親ヌクレオチド配列変異体が供給されて連結反応を受けるかもしれない。一例として、各親変異体の各部分に対応して50個のオリゴヌクレオチド配列が１セット生成され得る。従って、連結再構成プロセスの間に、各キメラ配列内に50個までの交差事象があるだろう。生成された各キメラポリヌクレオチドが交互の順序で各親変異体由来のオリゴヌクレオチドを含む確率は非常に低い。各オリゴヌクレオチド断片が同一分子量の連結反応に存在する場合、いくつかの位置で、同じ親ポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドが相互に隣に連結し、その結果交差事象とならないことがありそうである。この例のいずれの連結段階でも各親由来の各オリゴヌクレオチドの濃度が一定に保たれれば、同じ親変異体由来のオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結し、かつ交差を生じない機会は1/3（３つの親と仮定すると）である。
【００９２】
従って、確率密度関数（PDF）を決定して、与えられる連結反応の各工程で起こるであろう交差事象の集団、該連結反応の各工程中における親変異体のセット数、各変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、及び各変異体の濃度を予測することができる。PDFの決定の背景にある統計学と数学については後述する。このような確率密度関数を計算して、特定の連結反応から生じる所定数の交差事象についてキメラ子孫集団を濃縮することができる。さらに、目標数の交差事象を予め決定して、連結反応の各工程中の各親オリゴヌクレオチドの開始量を計算し、前記予め決定した数の交差事象に集中する確率密度関数に帰着するようにシステムをプログラムすることができる。
【００９３】
（反復プロセス）
本発明の実施では、これらの方法を反復的に繰り返すことができる。例えば、ある表現型の原因である核酸を同定し、再単離し、再び改変し、活性について再試験する。所望の表現型を操作するまでこのプロセスを反復的に繰り返すことができる。例えば、完全な生化学的なタンパク同化又は異化経路を、タンパク質分解活性を含めて細胞中に操作することができる。
【００９４】
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが、所望の形質についてまったく影響を及ぼさないと決定された場合、除去すべき配列を含む、より大きい親オリゴヌクレオチドを合成することによって変量としてそれを除去することができる。より大きい配列内に該配列を組み込むと、いずれの交差事象をも妨げるので、子孫ポリヌクレオチド内ではもはやこの配列のいずれの変化もないだろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の形質に最も関連するか、またどれが関連しないかを決定するこの反復実施によって、特定の形質又は活性を与えるかもしれない、可能なタンパク質変異体のすべてをより効率的に探索することができる。
【００９５】
（In vivoシャッフリング）
本発明の方法で、分子のin vivoシャッフリングを使用できる。細胞の天然の性質を利用して多量体を組換えることで、in vivoシャッフリングを行うことができる。in vivoの組換えは、分子の多様性に対する主要な天然経路を与えるが、遺伝子組換えは、以下を含むかなり複雑なプロセスを残している：１）相同性の認識；２）組換えキアズマの生成につながる鎖切断、鎖侵入、及び代謝工程；及び最後に３）キアズマの個々の組換え分子への分離；キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
【００９６】
一局面では、本発明は、少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチド由来のハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供する。部分的な配列相同性の少なくとも１つの領域を共有する少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞中に導入することによって、本発明を用いてハイブリッドポリヌクレオチドを生成することができる。部分的な配列相同性の領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する配列再編成をもたらすプロセスを促進する。本明細書で使用する場合、用語「ハイブリッドポリヌクレオチド」は、本発明の方法から生じ、かつ少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列由来の配列を含むいずれのヌクレオチド配列でもある。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列相互作用を促進する分子間組換え事象から生じ得る。さらに、このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、繰り返し配列を利用してDNA分子内のヌクレオチド配列を変える分子間の還元的再編成プロセスから生じ得る。
【００９７】
（配列変異体の生成）
本発明の方法は、１つ以上の変異を１つ以上の核酸セグメント中に導入する。核酸は、例えば、ランダム若しくは確率的方法、又は上述したような非確率的、つまり「定方向進化」法を含むいずれの手段によっても変えることができる。
変異は、部位特異的変異誘発、ランダムな化学的変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失方法及び標準的なクローン化技術のような遺伝子操作技術を用いて引き起こすことができる。あるいは、このような変異体、断片、類似体、又は誘導体は、化学合成又は改変手順を用いて作ることができる。また、当業者は、変異体を作る他の方法に精通している。これらの方法は、天然単離物から得た核酸配列を改変して、産業又は研究用途でそれらの価値を高める特徴を有するポリペプチドをコードする核酸を生成する手順を包含する。このような手順では、天然単離物から得た配列に対して１つ以上のヌクレオチドの相異を有する多数の変異体配列が生成され、特徴づけられる。これらのヌクレオチドの相異の結果、天然単離物由来の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化を生じさせる。
【００９８】
例えば、変異性PCRを用いて変異を起こすことができる。変異性PCRでは、DNAポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でPCRが行われるので、PCR産物の全長に沿って高率の点変異が得られる。変異性PCRは、例えば、Leung,D.W.ら,Technique, 1:11-15,1989）及びCadwell,R.C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33,1992に記述されている。簡単には、該手順では、変異誘発される核酸をPCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ及びPCR産物の全長に沿って高率の点変異を達成するための適切な濃度のdNTPsと混合する。例えば、反応は、変異誘発される核酸20fmolesと、各PCRプライマー30pmoleと、50mM KCl、10mM Tris HCl(pH8.3)及び0.01％ゼラチンを含む反応緩衝液と、7mM MgCl2と、0.5mM MnCl2と、５単位のTaqポリメラーゼと、0.2mM dGTPと、0.2mM dATPと、1mM dCTPと、１mM dTTPとを用いて行うことができる。PCRは、94℃で１分、45℃で１分、72℃で１分の30サイクルを行うことができる。しかし、これらパラメーターを適宜変更できることは明らかである。変異誘発された核酸を適切なベクターへクローン化し、変異誘発された核酸によってコードされるポリペプチドの活性を評価する。
【００９９】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて変異を引き起こし、関心のあるいずれのクローン化DNAにおいても部位特異的変異を起こすことができる。オリゴヌクレオチド変異誘発は、例えば、Reidhaar-Olson(1988) Science 241:53-57に記述されている。簡単には、該手順では、クローン化DNA中に導入する予定の１つ以上の変異を有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、変異誘発されるクローン化DNA中に挿入する。その変異原誘発されたDNAを含有するクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１００】
変異を引き起こす別の方法は、アッセンブリPCRである。アッセンブリPCRは、小さいDNA断片の混合物由来のPCR産物の構築を含む。多数の異なるPCR反応は平行して同一のビン内で起こり、ある反応の産物が別の反応の産物をプライムする。アッセンブリPCRは、例えば、米国特許第5,965,408号に記述されている。
【０１０１】
変異を引き起こすさらに別の方法は、セクシュアルPCR変異誘発(sexual PCR mutagenesis)である。セクシュアルPCR変異誘発では、配列相同性に基づいたDNA分子のランダムな断片化、次いでPCR反応のプライマー伸長による交差の固定化の結果として、異なるが高度に関連したDNA配列のDNA分子間にin vitro相同組換えを強制的に起こす。セクシュアルPCR変異誘発は、例えば、Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751に記述されている。簡単には、該手順では、組換える予定の複数の核酸をDNaseで消化させて平均サイズ50〜200ヌクレオチドの断片を生成する。所望の平均サイズの断片を精製し、PCR混合物中に再懸濁させる。核酸断片間の組換えを促進する条件下でPCRを行う。例えば、反応混合物100:l当たり0.2mMの各dNTP、2.2mM MgCl2、50mM KCl、10mM Tris HCl、pH9.0、及び0.1％Triton X-100、2.5単位のTaqポリメラーゼの溶液中10-30ng/:lの濃度で精製断片を再懸濁させてPCRを行うことができ、かつ以下の方式で行う：94℃で60秒間、94℃で30秒間、55-55℃で30秒間、72℃で30秒間（30〜45回）及び72℃で５分間。しかし、これらパラメーターを適宜変更できることは明らかである。他の局面では、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を最初のセットのPCR反応で用い、Taqポリメラーゼを次のセットのPCR反応で用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１０２】
in vivo変異誘発によっても変異を引き起こすことができる。ある局面では、１つ以上のDNA修復経路内に変異を有する（大腸菌株のような）細菌株内で、関心のある配列を増殖させることによって、関心のある配列内にランダムな変異を生成させる。このような「ミューテーター」株は、野生型親より高いランダム変異率を有する。これらの株の１つでDNAを増殖させると、最後には該DNA内にランダムな変異が生じる。in vivo変異誘発用に好適なミューテーター株は、PCT公開番号WO91/16427に記述されている。
【０１０３】
カセット変異誘発を用いても変異を引き起こすことができる。カセット変異誘発では、二本鎖DNA分子の小さい領域を、天然の配列と異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換する。オリゴヌクレオチドは、しばしば完全及び／又は部分的にランダム化された天然の配列を含む。
【０１０４】
再帰的アンサンブル変異誘発を用いても変異を引き起こすことができる。再帰的アンサンブル変異誘発は、アミノ酸配列内でそのメンバーが異なる表現型的に関連する変異体の多様な集団を生成するために開発されたタンパク質操作（タンパク質変異誘発）のアルゴリズムである。この方法は、組換えカセット変異誘発の連続ラウンドを制御するためのフィードバックメカニズムを利用する。再帰的アンサンブル変異誘発は、例えば、Arkin(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811-7815に記述されている。
【０１０５】
ある局面では、指数アンサンブル変異誘発を用いて変異を引き起こす。指数アンサンブル変異誘発は、高率の独特かつ機能的な変異体を有する組換えライブラリーを生成する方法であり、小グループの残基を並行してランダム化し、それぞれの改変位置で、機能性タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する。指数アンサンブル変異誘発は、例えばDelegrave(1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552に記述されている。ランダムかつ部位特異的変異誘発は、例えば、Arnold(1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455に記述されている。
ある局面では、米国特許第5,965,408；5,939,250号に記述されているように、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が一緒に融合されてキメラ核酸配列を作るシャッフリング手順を用いて変異を引き起こす。
【０１０６】
（キャピラリーアレイ）
一局面では、本発明の方法は、キャピラリーアレイのような反応チャンバー内で実施することができる。本発明の方法は、全体的又は部分的にキャピラリーアレイ内で実施することもできる。本発明の製造産物及び方法は、GIGAMATRIXTM, Diversa Corporation, San Diego, CAのようなキャピラリーアレイを含むことができる。例えば、WO0138583を参照せよ。本発明の産物及び方法の実施では、試薬又はポリペプチド、例えば、PCRポリメラーゼ等のような酵素を、キャピラリーアレイを含むアレイに固定化或いは適用することができる。キャピラリーアレイは、試薬、酵素、及び反応の産物を保持かつスクリーニングする別のシステムを提供する。この装置は、さらにアレイ内の隣接キャピラリー間に配置される介在物質と、この介在物質の中に形成される１つ以上の参照表示を含むことができる。高処理能力スクリーニング装置も本発明の方法に適合させ、かつそれを用いて本発明の方法を実施することができる。例えば、米国特許出願番号20020001809を参照せよ。
【０１０７】
（全細胞ベースの方法）
本発明のCSM法は、全体的又は部分的に全細胞環境内で実施することができる。本発明は、新しい遺伝子型又は表現型を有する新しい細胞株を開発するための細胞の全細胞進化、又は全細胞操作をも提供する。これは、本発明の方法で該細胞の遺伝子構成を改変することによって行うことができ、この遺伝子構成は、本発明の方法で作られる改変核酸セグメント又は染色体又はゲノムの細胞に対する付加によって改変される。例えばWO0229032；WO0196551を参照せよ。
「全細胞法」のための宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞のような原核生物、真核生物を含め、本技術の当業者に公知のいずれの細胞でもよい。
【０１０８】
本発明の方法の中間体若しくは産物、又は新表現型の生産を検出するため、細胞（又は遺伝子的に改変した細胞）の少なくとも１つの代謝パラメーターを、細胞内で代謝フラックス解析(Metabolic Flux Analysis(MFA))によって「リアルタイム」又は「オンライン」時間枠内で監視する。一局面では、細胞培養物のような複数の細胞を「リアルタイム」又は「オンライン」で監視する。一局面では、複数の代謝パラメーターを「リアルタイム」又は「オンライン」で監視する。
【０１０９】
代謝フラックス解析（MFA）は、公知の生化学的枠組みに基づいている。質量保存の法則及び細胞内代謝についての擬似定常状態仮説に基づいて線形独立な代謝マトリックスを構築する。本発明の方法の実施では、以下を含む代謝ネットワークを確立する。
・すべての経路基質、産物及び中間代謝物の同定、
・経路代謝物を相互変換するすべての化学反応、経路反応の化学量論の同定、
・反応を触媒するすべての酵素、酵素反応キネティクス、
・経路成分間の制御相互作用、例えば、アロステリック相互作用、酵素−酵素相互作用など、
・酵素の分子内区画化又は酵素の他の超分子構成
・代謝物、酵素若しくはエフェクター分子の濃度勾配又はそれらの動きに対する障壁の存在。
【０１１０】
一端特定株の代謝ネットワークが組み立てられると、オンライン代謝データが利用可能ならば、マトリックス概念による数学的提示を導入して、分子内代謝フラックスを評価することができる。代謝表現型は、細胞内の全体的な代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、発達状態及び遺伝子型などに関する経路利用の変化に依存する。本発明の方法の一局面では、オンラインMFA計算後、経路利用を調査することで細胞の動的挙動、その表現型及び他の特性を解析する。
【０１１１】
経路解析後に、細胞培養の生理的状態のコントロールが可能になる。本発明の方法は、基質供給、温度、誘発物質の使用などを変えて、所望の方向に沿って細胞の生理的状態が動くようにコントロールする方法を決定することによって、醗酵の操作法の決定を助けることができる。本発明の方法の実施では、MFAの結果をトランスクリプトーム(transcriptome)及びプロテオーム(proteome)データと比較して代謝的操作又は遺伝子シャッフリングの実験と手順を設計することもできる。
【０１１２】
（ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸の発現のモニタリング）
本発明の一局面では、改変した核酸の導入後に細胞における新しい表現型をモニターする。本発明の一局面では、操作した表現型は、ポリペプチドの発現を増減し、或いは細胞内に新しいポリペプチドを生成することを含む。ペプチドの生産及び新規又は変化したポリペプチドの発現の増減は、蛍光ポリペプチド、例えば、本発明の方法で使用する酵素を含むキメラタンパク質を用いて追跡することができる。
【０１１３】
ポリペプチド、試薬及び最終産物は、例えば、核磁気共鳴（NMR）、分光光度法、Ｘ線撮影法（タンパク質放射能標識法）、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、超拡散クロマトグラフィー(hyperdiffusion chromatography)、種々の免疫学的方法、例えば、免疫沈降法、免疫拡散法、免疫-電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（RIAs）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISAs）、イムノ-蛍光アッセイ、ゲル電気泳動法（例えば、SDS-PAGE）、抗体による染色法、蛍光細胞分析分離装置（fluorescent activated cell sorter(FASC)）、フーリエ変換分光法、ラマン分光法、GC-MS、及びLC-エレクトロスプレー及びキャップ-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分光法などを含む技術的に公知のいずれの方法によっても検出かつ定量することができる。米国特許第6,057,103号に記述されている方法、又はその変形を利用して新規な生物活性もスクリーニングできる。細胞のポリペプチドは、タンパク質アレイを用いて測定することができる。
【０１１４】
実施例１：PCR変異の頻度と分布の評価
以下の実施例は、本発明の例示的方法を示す。
変異性Taq PCR法又は頻繁に変異を導入するように操作されたポリメラーゼを用いて３つの標的遺伝子（b1625、rcsB及びlamB）を大腸菌MG1655ゲノムDNAから増幅した。PCR産物をクローン化し、各標的由来のいくつかのクローンと頻度レベルを順番に配列して、種々の方法で導入した変異の型と数を決定した。図２は、本発明の方法で使用する典型的なPCRに基づいた変異誘発法を比較する表を示す。
【０１１５】
一局面では、多様な変異体プールを生成する最良の方法を決定するため、大腸菌遺伝子標的を選択し、少なくとも２つの別個のPCR変異誘発戦略を用いて増幅した。バイアスのかかったヌクレオチド濃度及び／又はマンガンの存在のような特定の反応条件下で、Taq DNAポリメラーゼは高頻度で変異を組み込むことができる。PCR変異誘発を実施するための典型的な方法は、Leung(1989)Technique 1(1):11-15；Cadwell(1992) PCR Meth. and Appl.2:28-33；Vartanian(1996)Nucl. Acids Res., 24(14):2627-2631によって記述されている。選択した各標的は、各システムで異なる変異頻度を生じる条件を用いて増幅することができる。Taqに基づいた変異性PCRでは、例えば、マンガン及びヌクレオチド濃度を含む反応条件を変えることによって、異なる頻度で変異を導入することができる。操作したポリメラーゼを使用する場合、全体的な変異頻度は、ポリメラーゼ誤り率と増幅工程の数の関数なので、開始鋳型の量を変えることによって変異頻度を変えることができる。
【０１１６】
一局面では、PCR増幅から生じた産物をクローン化する。代表的な試料を順番に配列決定して導入された変異の型、位置、及び頻度を決定する。統計解析を適用して、各アプローチを用いて生成されたプールの多様性と、統計的に相応するデータを生成するのに必要な数の両者を決定した。各システムからのデータを比較して宿主遺伝子の多様な変異体プールを生成するのに最良の方法を決定することができる。kb当たり平均５〜７個のヌクレオチド変化を目標とすることができる。この範囲内の変異頻度を有する適度な大きさのライブラリーから所望の表現型の変化を表示する酵素を単離することができる。本発明の方法に取り込まれる典型的な手順については、例えば、Daugherty(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:2029-2034；Christians(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:6124-6128；Martinez(1996) EMBO J. 15:1203-1210を参照せよ。
【０１１７】
一局面では、いくつかの理由のため最初に約２kbの大きさのPCR産物が生成される。第１に、２kb断片は、ポリメラーゼが非効率的に働く条件を与えるように設計される変異性PCR手順により一貫して生成させるために十分小さい。第２に、２kb断片は、迅速に配列決定をして所望の表現型の変異体を生成する変異を特徴づけるために十分小さい。第３に、大腸菌染色体全体をカバーするため4,300個の断片（PCR断片間に50％の重なりを有する）しか必要ない。従って、２kbの大きさは、染色体をカバーするのに必要なセグメントプールの数と、遺伝子型及び表現型の情報を迅速に一線に並べる能力を保つこととの間の妥協案である。
【０１１８】
変異性Taq法は、操作したポリメラーゼよりさらに変異の偏向を示し、占めるアデニン又はチミン置換が導入される変異の約80％を占める。これは、以前に公表されている結果と一致する。操作したポリメラーゼは、ほとんど変異の偏りを示さず、グアニン又はシトシン置換が、他の置換よりほんのわずかに優勢である（55％）。どちらの方法も、期待どおりに変えることのできる頻度で一貫して変異を導入できるが、変異頻度及びプール多様性のさらに正確な測定を得るためには、より多くのクローンを配列決定しなければならない。シークエンシング用に選択したクローンはいずれも増幅産物中の同じ位置内には同一の変異を含まなかった。
【０１１９】
実施例２：染色体中への変異の共組込み
以下の実施例は、染色体中へに変異を共組込みするための本発明の典型的な方法を示す。
一局面では、染色体中へのPCR生成変異の共組込みとその後の分離に最適な条件を決定するため、大腸菌lamB遺伝子を含有する約２kbサイズの単一の変異した断片を使用する。この断片は、上述したようなPCR変異誘発の比較の際にクローン化かつ配列決定した断片から、相対的に多数の一様に分布した変異を有するように（200ヌクレオチド(nt)当たり平均１置換でｎ＞10）選択することができるので、組換え間隔の位置を容易にマッピングできる。究極的に無マーカー組換え後の染色体中に存在する点変異の分布は、PCR生成断片中に染色体のすべての部分が点変異を確実に含むために必要な重なりの量を左右するので、これを決定することは重要である。
【０１２０】
一局面では、選択したlamB変異対立遺伝子を組換えベクター、pST98-KS中にサブクローン化し、大腸菌MG1655に形質転換させる。この形質転換体を寒天プレート上、プラスミドの成長に許容的な条件下（30℃）で一晩中成長させることができる。温度選抜後に成長するウェルの数に基づいた組換え効率のラフな測定値を得るため、自動コロニーピッカーでコロニーを384-ウェル微量定量プレート（適切な成長培地を含む）中に配置し、一晩中30℃でインキュベートして、許容的条件下で細胞数を増やすことができる。384個の培養物のアリコートを増殖培地と抗生物質を含有する新しい微量定量プレートに連続して移し、自律プラスミド複製に非許容的温度である42℃でインキュベートすることができる。
【０１２１】
共組込みを媒介するための相同的な染色体配列を含まないベクターだけで形質転換させたコロニーを用いて負対照による並行実験を行うことができる。一局面では、クローン化変異対立遺伝子を含有するウェル内の成長を観察しながら、負対照の成長が観察されなくなるまで連続的な移動を行う。一局面では、42℃の連続ラウンド後に成長するクローン化変異対立遺伝子を含有するウェルの数を決定する。より多くの接種物を用いればウェル毎の組換え事象の数は増えるので、いくつかの異なる接種量を試験し、比較して確実にプレート毎にプールの多様性が損なわれないように移動するのに最適な量を決定した。
【０１２２】
一局面では、組換えが大腸菌染色体中の相同的な座で起こっていることと、共組込み事象のタイミングを決定するため、染色体のlamB座の外部にあるプライマーを用いて許容的温度〜非許容的温度の移動の間、種々の時間点で採取した細胞由来のDNAについてPCRを行う。一局面では、組換えが染色体内の適切な相同的位置で起こることを確実にするため、逆PCR又はベクトレット(vectorette)PCRを用いて異所部位の組込みを同定する。一局面では、ベクター配列の内側のオーバーラッププライマーと、鋳型として制限酵素で消化され自己連結させた染色体DNAの円環状断片とを用いて逆PCRを利用する。ベクトレットPCRは、PCR前に染色体DNAの制限消化から生成されたDNA末端に連結しておいたプライミング部位に相補的な第２プライマーと共にベクター特異的プライマーを用いてベクターに隣接しているDNAをマッピングする手段も与えることができる。典型的な手順は、Allen(1994) PCR Methods Appl. 4(2):71-75に記述されている。
【０１２３】
（液体培養における組換え効率と温度選抜のPCRによる評価）
lamBの1.7kb変異体バージョンを含有するpST98-KSベクターで形質転換したコロニー(＃変異＝12)を、抗生物質を有するLB内で18時間30℃で培養した。同じ培地内で、10μlの培養を用いて新しい液体培養を開始した。この新培養を一晩中42℃で成長させた。この様式でさらに３ラウンド培養を通した。毎日各培養からゲノム及びプラスミドDNAを精製した。PCR増幅を行い、種々の温度段階で染色体中に存在する野生型と組換えlamBの相対量を決定した。染色体のlamB配列だけを増幅するようにPCRプライマーを設計し、この座に対して外側に配置した。それぞれ５μlのPCR反応物を１％アガロース、1xTAEゲル上で泳動した。この実験の結果は図４に示す。
【０１２４】
野生型lamB座が存在する場合、2.3kbのバンドが増幅される筈である。プラスミドがlamB座で染色体中に組込まれた場合、8.65kbのバンドが増幅される筈である。結果(図４)は、培養中の細胞におけるこの遺伝子座の野生型バージョン存在は、温度が42℃に上昇するにつれて減少することを示している。しかし、野生型lamBの量を有意に減らし、同時に染色体の適切な座中へ組換えを起こすプラスミドの量を増やすには、数サイクルの42℃における増殖を要する。結果は、42℃で３ラウンド後には非常にわずかしか天然のゲノムDNAバンドが残っていないので、高い割合の細胞がプラスミドと組換えを起こしたことも示している。
【０１２５】
（共組込み体の分離と無マーカー置換の生成）
一局面では、変異セグメント（pST98-KS内でクローン化）の染色体中への共組込み後、第２工程は、共組込み体の効率的な分離と宿主ゲノム中への変異の交換である。pST98-KSは、イントロンによってコードされるメガヌクレアーゼI-SecIの制限酵素切断部位、共組込みにおけるこの酵素の誘導発現を含む。これは、宿主染色体内で単一の二本鎖切断をもたらすことができる（この認識部位は大腸菌ゲノム内には天然に存在しない）。この二本鎖切断を修復するため、大腸菌は共組込みゲノム内に組換え用基質として存在する重複配列を使用できる。この結果、プラスミドベクター配列（抗生物質耐性遺伝子を含む）の脱離と、共組込みと分離交差が起こる場所に依存して、変異セグメントのある部分の染色体中への無マーカー交換が生じる。得られた集団の一部は、野生型配列を再生し得る。
【０１２６】
培養物を増殖させ、42℃での適切な数のサイクルを通過させた後、カナマイシンを含まない増殖培地及びメガヌクレアーゼ発現（tetプロモーターから）の誘導物質、クロルテトラサイクリンを含有する新鮮な384ウェルプレート中にアリコートをレプリカする。種々の時間にアリコートを取り出し、LB又はLB/Kanプレート上に塗布して抗生物質耐性の（対立遺伝子対の分離とベクター配列の損失の結果としての）損失の進行をモニターする。これは、すべての細胞内の対立遺伝子対の完全な切断と分離を達成するのに必要な誘導物質の存在下での成長に要する時間の長さを確立する。誘導物質中で適量の時間後、多数のウェルからの一定分量をLBアガー上に塗布し、一晩中インキュベートしてさらなる分析用の個々のクローンを選抜した。各遺伝子の外側に位置づけられるプライマーを用いて各プレートから50コロニーについて高忠実度PCR増幅を行い、シークエンシング用の鋳型を生成する。シークエンシングを用い、導入された変異の分布を決定する。
【０１２７】
（メガヌクレアーゼ誘導後の対立遺伝子対の分離）
pST98-KS中でクローン化された、変異した大腸菌lamB遺伝子断片（上述した）で大腸菌MG1655細胞を形質転換させた。コロニーを接種し、30℃で培養して組換え中間体を形成させた。培養物を４ラウンドの42℃での増殖（上述したように決定した）を通過させ、20ug/mlの熱不活性化クロルテトラサイクリンを有するLB培地に培養物を移すことによりメガヌクレアーゼ発現を誘導した。培養物を30℃で一晩増殖させ、アリコートをLB及びLB/Kanプレート上に塗布した。カナマイシンを含有するプレート上ではコロニーは成長しないが、LBだけのプレート上では数千のコロニーが生じた。これらコロニーの25個をPCR用の鋳型として用い、産物を配列決定して組換え部位をマッピングした。コロニーの大体の組換え部位を図５に示す（全体の組換え部位マッピングの説明図）。23個のコロニーは、変異対立遺伝子内にもともと存在していた変異を含んでいたが、コロニーの２個だけは、野生型lamB配列を保持していることが分かった。
【０１２８】
（メガヌクレアーゼ誘導後の対立遺伝子対の分離）
図５では、lamB変異対立遺伝子内の12個の置換が境界となっている領域は区別して着色されている。シークエンシングは、12個の変異体の位置ごとに天然又は変異体の配列を検出する。無マーカー置換後、宿主染色体内で配列が変異体から天然に或いは天然から変異体に切り替わるとき、その前のセグメント内で交差が起こったにちがいない。25個の配列決定したコロニー内で交差が起こった領域が示されている。マッピングした領域外（*）で組換えが起こったときは、12個すべての変異が存在する。
【０１２９】
（特有の染色体セグメント全体に分散した点変異を含む宿主細胞の変異体プールの作製）
一局面では、特有の変異対立遺伝子を用いて関連パラメーターを決定したら、大腸菌染色体の定義した領域について飽和変異誘発を行う。特定の２kb間隔の妥当な完全変異誘発を確実にするため、少なくとも100,000個のクローン化断片を得ることが本発明のCSM手順を通じて必要であると推定される。所望の表現型を有する酵素は、100,000メンバー以下のライブラリー内で見られる。個々の変異誘発された断片が全CSM手順を通じて分離したままである場合、これら実験を行うために高処理操作手順が必要かもしれない。例えば、構築時に別個の断片を配列すべき場合、約250枚の384ウェルプレートを用いて特定セグメントの100,000メンバーライブラリーを生成することができる。共組込みと分離工程前に特定セグメントの（複数の）クローン化断片を一緒に組み合わせると、必要な材料と労力の大きさを減らすことができるが、これは、例えば、共組込み中にいくつかの組換え事象が他より早く起こり、かつこれら早い事象へ集団が偏向する場合、最終的な変異体集団中で見られる多様性を制限するかもしれない。
【０１３０】
多様性を損なわずに個々のクローンを組合わせることがどの程度まで可能であるかを決定するため、以下の実験を行うことができる。変異誘発されたlamB含有断片をPCRによって生成し、pST98-KS組換えベクター中へクローン化することができる。個々のコロニーを選択し、断片を配列決定してそれぞれに存在する変異を同定することができる。変異の構成が各断片に対して固有であるという判定基準で、複数のコロニー、例えば約50個のコロニーを選択することができる。例えば約２、５、10、25及び50メンバーを含むように増加する複雑さの５つの混合物を作ることができる。各プールを384ウェルプレートへ三つ組で接種し、最適化CSM手順を行い、カナマイシンを含まないLB寒天上に塗布することができる。一局面では、得られたライブラリーの多様性を特徴づけるため、各ウェルから50個のコロニーを増殖させ、シークエンシング用の鋳型を調製する（全部で750の配列）。
【０１３１】
変異体の最終構成に対する親の寄与の分布を決定することによって（各変異は単一の親に起因しうるので）、最初の変異に存在する多様性を最も効率的に維持する最大プールサイズを決定することができる。例えば、約50のプールサイズが妥当なレベルの多様性を維持すると決定されるなら、これは、染色体の特定セグメントについて必要な384-ウェルプレートの数を250から５に減らすだろう。プールサイズを50より大きく増やすこともできるが、事象の多様性の解析が漸次的に困難になるだろう。
【０１３２】
上述した実験が、複数の対立遺伝子を一緒に併せてCSMに供するときに対立遺伝子間の競合が実際に多様性を制限することを示す場合、相同組換えを刺激することは、この問題を取り扱うためのメカニズムを与え得る。相同組換えをさらに効率的に生じさせると、初期増殖段階で起こる組換え事象の数を増やし、かつ過-競合の影響を最少にすることができる。従って、一局面では、本発明の方法は、組換えプラスミド上にrecAをクローン化し発現させて、相同組換えを増やすことを含む。しかし、大腸菌recA遺伝子は別の染色体の組換え部位として働くことができる。大腸菌バージョンとの相同性がより少ないが、大腸菌内で発現されると相同組換えを増加させ、かつSOS応答を誘導しないことが分かっている非大腸菌バージョンのrecAをクローン化することにって、該染色体バージョンがプラスミドによる代替組換えスポットとして作用する可能性を減らすことができる。従って、一局面では、本発明は、非大腸菌バージョンのrecAをクローン化すること及び発現させることを含む。
【０１３３】
一局面では、組換えプラスミド由来のrecA発現は、クローン化及び発現実験のために通常使用されるような大腸菌のRecA-株による無マーカー置換法を併用して行われる。
内因性RecA活性の誘導も相同組換えを増加させることができる。従って、一局面では、本発明の方法は、内因性RecA活性を誘導することを含む。別の局面では、この戦略はいくつかの方法で達成される。一局面では、線状断片が、組換えベクター中に連結されたその線状断片と共にMG1655を形質転換させる。線状DNAの存在が相同組換えを誘導することが示されている。
【０１３４】
相同組換えは、クローン化に先立って変異体プールを変性し、再アニールした場合に生成し得るようなミス対合DNAの細胞中への導入によっても刺激されることが分かった。従って、本発明の方法は、ミス対合DNAの細胞中への導入を含む。
内因性RecA活性は、三重構造を形成するために過剰の線状PCR産物の存在下で、変異した挿入断片を含むプラスミドを変性させ、かつそれらを再アニールすることによって、誘導することもできる。三重構造が相同組換えを増やすことが知られている。従って、一局面では、本発明の方法は、三重構造を導入すること、又は三重構造の形成を誘導することを含む。
【０１３５】
相同組換えは、RecAフィラメントがより効率的に結合できる一本鎖の領域を生成することによっても増加させることができる。これは、ベクターのみの存在下でクローン化変異セグメント（「変異対立遺伝子」）を変性させてからその２つを一緒に再アニールすることによって行うことができる。このことにより、エレクトロポレーションに先立って、相同変異した対立遺伝子からのループアウトを生成することができ、それによって細胞内により効率的な組換え基質が与えられる。従って、本発明の方法は、RecAフィラメントがより効率的に結合できる一本鎖の領域を生成することを含む。
【０１３６】
本発明の多数の実施態様について述べてきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変形を為し得ることが理解されるだろう。他の実施態様は、添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】本発明の典型的なCSM法を概略的に示す。
【図２】実施例１で詳述されるような、本発明の方法で用いられる典型的なPCRに基づいた変異誘発法を比較する表を示す。
【図３】本発明の方法で用いられる典型的な無マーカー置換法を概略的に示す。
【図４】実施例２で詳述されるような、本発明の典型的な方法を用いる、lamBの変異バージョンの染色体中への組換えを示すデータと共に、１％アガロース、１xTAEゲルを図示したものである。
【図５】実施例２で詳述されるような、全体的な組換え部位マッピングの説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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