(57)【要約】本発明の第一の態様は、ＣＤＫ阻害剤及び５−ＦＵ又はそのプロドラッグからなる組合せに関する。本発明の第二の態様は、ＣＤＫ阻害剤及び５−ＦＵ又はそのプロドラッグからなり、治療において同時に、連続して、又は個別に使用する複合製剤である医薬品に関する。本発明の第三の態様は、増殖性疾患の治療方法であって、前記の方法はＣＤＫ阻害剤及び５−ＦＵ、又はそのプロドラッグを同時に、連続して、又は個別に投与対象に投与することからなる増殖性疾患の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを含む組合せ。
【請求項２】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項１記載の組合せ。
【請求項３】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項１又は２記載の組合せ。
【請求項４】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組合せ。
【請求項５】
５−ＦＵのプロドラッグがカペシタビンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の組合せ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の組合せ、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における、クレーム１〜５のいずれか記載の組合せの使用。
【請求項８】
増殖性疾患が癌であることを特徴とする請求項７記載の使用。
【請求項９】
癌が乳癌であることを特徴とする請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを含み、治療において同時に、連続して、又は個別に使用する複合製剤である医薬品。
【請求項１１】
５−ＦＵ又はそのプロドラッグとＣＤＫ阻害剤とを連続して投与することを特徴とする、治療において、個別に又は連続して使用する請求項１０記載の医薬品。
【請求項１２】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の医薬品。
【請求項１３】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか記載の医薬品。
【請求項１４】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか記載の医薬品。
【請求項１５】
５−ＦＵのプロドラッグがカペシタビンであることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか記載の医薬品。
【請求項１６】
薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の形である請求項１０〜１５のいずれか記載の医薬品。
【請求項１７】
増殖性疾患の治療に使用する請求項１０〜１６のいずれか記載の医薬品。
【請求項１８】
増殖性疾患が癌であることを特徴とする請求項１７記載の医薬品。
【請求項１９】
増殖性疾患が乳癌であることを特徴とする請求項１８記載の医薬品。
【請求項２０】
増殖性疾患の治療方法であって、前記の方法が５−ＦＵ又はそのプロドラッグとＣＤＫ阻害剤とを投与対象に同時に、連続して、又は個別に投与することからなる治療方法。
【請求項２１】
５−ＦＵ又はそのプロドラッグを投与対象に連続して又は個別に投与する前に、前記ＣＤＫ阻害剤を投与対象に投与することからなる請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤＫ阻害剤を投与対象に連続して又は個別に投与する前に、５-ＦＵ又はそのプロドラッグを投与対象に投与することからなる請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項２０〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンであることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
５−ＦＵのプロドラッグがカペシタビンであることを特徴とする請求項２０〜２５のいずれか記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの、個々の成分について、それぞれ治療上有効な量を投与することを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの、個々の成分について、それぞれ治療量以下の量を投与することを特徴とする請求項２０〜２６のいずれか記載の方法。
【請求項２９】
増殖性疾患が癌であることを特徴とする請求項２０〜２８のいずれか記載の方法。
【請求項３０】
増殖性疾患が乳癌であることを特徴とする請求項２０〜２９のいずれか記載の方法。
【請求項３１】
増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記治療が５−ＦＵ又はそのプロドラッグ、及びＣＤＫ阻害剤を同時に、連続して、又は個別に投与対象に投与することからなるＣＤＫ阻害剤の使用。
【請求項３２】
増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの使用。
【請求項３３】
増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記薬剤を５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの併用療法において使用することを特徴とするＣＤＫ阻害剤の使用。
【請求項３４】
増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における５−ＦＵ又はそのプロドラッグの使用であって、前記薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法において使用することを特徴とする５−ＦＵまたはそのプロドラッグの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及びその他の増殖性疾患の治療に適した薬剤の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の細胞サイクルの開始、進行及び完成は、細胞の成長のために重要である、様々なサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）複合体によって制御されている。これらの複合体には、少なくとも触媒サブユニット（ＣＤＫそのもの）、及び制御サブユニット（サイクリン）が含まれる。細胞サイクルの制御にとってより重要である複合体には、サイクリンＡ（ＣＤＫ１−ｃｄｃ２及びＣＤＫ２としても知られる）、サイクリンＢ１〜Ｂ３（ＣＤＫ１）、サイクリンＣ（ＣＤＫ８）、サイクリンＤ１〜Ｄ３（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６）、サイクリンＥ（ＣＤＫ２）、サイクリンＫ及びサイクリンＴ（ＣＤＫ９）、及びサイクリンＨ（ＣＤＫ７）が含まれる。これらの複合体のそれぞれが、細胞サイクルの特定の相に関与している。
【０００３】
ＣＤＫの活性は、他のタンパク質との一時的な関連性や細胞内での局在性の変化により、翻訳後に制御される。腫瘍の形成は、ＣＤＫ及びその制御因子の遺伝子の変化や制御解除と密接に関係しており、ＣＤＫの阻害剤が抗癌治療に有効である可能性を示唆している。実際、形質転換した細胞と正常な細胞とでは、例えばサイクリンＡ／ＣＤＫ２の要求性の点で相違しており、従来の細胞毒性薬剤や細胞増殖抑制剤に見られる一般的な宿主に対する毒性がない新規の抗腫瘍薬を開発できる可能性が、初期の結果から示唆されている。
【０００４】
ＣＤＫの機能は、例えば網膜芽細胞腫タンパク質、ラミン、ヒストンＨ１及び紡錘体の構成成分を含む特定のタンパク質をリン酸化し、活性化若しくは不活性化することである。ＣＤＫが媒介する触媒のステップには、ＡＴＰから巨大分子酵素基質へのリン酸転移反応が含まれる。化合物群の中には、ＣＤＫ特異的ＡＴＰ拮抗作用によって抗増殖性特性を有するものがあることがわかっている（総説としてN. Gray, L. Detivaud, C.  Doerig, L. Meijer, Curr. Med. Chem. 6, 859, 1999参照）。
【０００５】
ロスコビチン(roscovitine)は６−ベンジルアミノ−２−［（Ｒ）−１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ］−９−イソプロピルプリン化合物である。ロスコビチンはサイクリン依存性キナーゼ酵素、特にＣＤＫ２の強力な阻害剤であることが実証されている。本化合物は、現在抗癌剤として開発中である。ＣＤＫ阻害剤は、細胞サイクルのＧ１／Ｓ期及びＧ２／Ｍ期の細胞の通過をブロックするものとして理解されている。ロスコビチンはまた、網膜芽細胞腫リン酸化反応の阻害剤であるということが示されており、したがってＲｂ陽性腫瘍に対してより強力に作用するとされている。
【０００６】
治療法の効果を最適化するため、多くの場合に活性薬剤を併用して投与することが可能であることは、当技術分野で十分に確立されている。したがって本発明は、増殖性疾患、特に癌の治療に特に適した公知の薬剤の新たな組合せを提供することを目指すものである。より具体的には、本発明は特定の薬剤を組合せて使用することに関連する驚くべき効果や予期せぬ効果に焦点を当てるものである。
【発明の開示】
【０００７】
第一の態様として、本発明はＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを含む組合せを提供する。
【０００８】
第二の態様は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合した本発明による組合せからなる医薬組成物を提供する。
第三の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調製における、本発明による組合せの使用に関する。
【０００９】
第四の態様は、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを含み、治療において同時に、連続して、又は個別に使用する複合製剤である医薬品に関する。
【００１０】
第五の態様は、増殖性疾患の治療方法であって、かかる方法は同時に、連続して、又は個別にＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを投与対象に投与することからなる増殖性疾患の治療方法に関する。
【００１１】
第六の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記治療がＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグを同時に、連続して、又は個別に投与対象に投与することからなるＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００１２】
第七の態様は、増殖性疾患の治療のための薬剤の調製における、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの使用に関する。
【００１３】
第八の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる薬剤を５−ＦＵ又はそのプロドラッグと組み合わせて治療に使用することを特徴とするＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００１４】
第九の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における５−ＦＵ又はそのプロドラッグの使用であって、かかる薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法において使用することを特徴とする５−ＦＵ又はそのプロドラッグの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に記載された好適な実施態様を、上述の本発明の態様の全てに応用することができる。
【００１６】
上述のように、本発明は、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを含む組合せに関する。
【００１７】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は抗腫瘍代謝拮抗剤であり、固形腫瘍、特に胃や結腸で発生する固形腫瘍に対する化学療法レジームにおいて広く使用される。５−フルオロウラシルは、腫瘍細胞は腸粘膜の正常な細胞よりも、効率的にＤＮＡ合成を行うために、塩基対ウラシルを利用するという観察に基づいて、１９５７年に開発された。５−ＦＵはその活性型であるフルオロデオキシウリジン−リン酸（ＦｄＵＭＰ）に細胞内で代謝されるフッ化ピリミジンである。該活性型はチミジンの正常な生産を抑制することによってＤＮＡ合成を阻害する。５−ＦＵは細胞周期特異性（Ｓ期）であり、すなわち細胞サイクルのＳ期からの細胞の進行をブロックする。
【００１８】
薬の併用効果は、本質的に予測不能であり、１つの薬剤が他の薬剤の効果を部分的に又は完全に阻害するということが頻繁におこる。本発明は５−ＦＵとＣＤＫ阻害剤（例えば、ロスコビチン）を、同時に又は個別に又は連続して併用投与しても、２つの薬剤の間で悪い相互作用は起こらないという驚くべき観察に基づいている。かかる拮抗する相互反応がないことは予測しなかった事ではあるが、臨床応用のために重要なことである。
【００１９】
好ましくは、前記の組合せに相乗効果がある、すなわち前記の組合せは相乗的である。
【００２０】
上記のとおり、本発明の１つの態様は、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグからなり、治療において同時に連続して、又は個別に使用する複合製剤である医薬品に関する。
ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグは、同時に、併用して、連続して、若しくは個別に投与することが可能である（投薬レジーム一部として）。
【００２１】
ここに用いる「同時に（simultaneously）」という用語は２つの薬剤を同時に一斉に投与するということを意味するために使用され、一方、「併用して（in combination）」という用語は、同時でない場合にはこれら２つの薬剤が治療効果を有する同じ期間内にこれらを「連続して（sequentially）」投与するいうことを意味するために使用されている。したがって、最初に投与した薬剤の循環の半減期が、治療に有効な量で両薬剤が一斉に存在するようなものであるならば、「連続して」投与することによって、一方の薬剤を投与してから５分以内、１０分以内又は数時間以内に、他方の薬剤を投与することが可能となる。成分投与の間の時間遅延は、成分の実質の性質や成分間の相互作用、および個々の成分の半減期により異なる。
【００２２】
「併用して」または「連続して」とは対照的に、ここに記載されている「個別に」というのは１つの薬剤と別の薬剤の投与の間のギャップが著しいこと、すなわち、２番目の薬剤が投与されるときに、最初に投与された薬剤が治療上有効な量で血流の中にもはや存在しない可能性があるということを意味する。
【００２３】
本発明の１つの態様は増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる治療は同時に、連続して、又は個別に５−ＦＵ又はそのプロドラッグ、及びＣＤＫ阻害剤を投与対象に投与することからなるＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００２４】
好ましくは、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグを同時に又は連続して投与する。
【００２５】
好適な実施態様の１つにおいて、５−ＦＵ又はそのプロドラッグ、及びＣＤＫ阻害剤を同時に投与する。
【００２６】
特に好適な実施態様の１つにおいて、５−ＦＵ又はそのプロドラッグを連続して、又は個別に投与対象に投与する前に、ＣＤＫ阻害剤を該投与対象に投与する。
【００２７】
本発明の別の態様は、治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤を投与し、その後に治療上有効な量の５−ＦＵの投与が続く、連続した投与からなる増殖性疾患の治療方法に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤を投与し、その後に治療上有効な量の５−ＦＵの投与が続く、連続した投与からなる増殖性疾患の治療において使用する薬剤の製造おけるロスコビチンの使用に関する。
【００２９】
選択的な好適な実施態様において、ＣＤＫ阻害剤を連続して、又は個別に投与対象に投与する前に、５−ＦＵ又はそのプロドラッグを該投与対象に投与する。
【００３０】
特に好適な実施態様の１つにおいて、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを連続して投与する。
【００３１】
本発明の好適な実施態様の１つにおいて、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを、個々の成分に対し、治療上有効な量でそれぞれ投与する。
【００３２】
本発明の別の好適な実施態様において、ＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとを、個々の成分に対し、治療量以下の量においてそれぞれ投与する。
【００３３】
本発明の別の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの使用に関する。
【００３４】
なお本発明の別の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる薬剤を５−ＦＵ又はそのプロドラッグとの併用療法に使用することを特徴とするＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００３５】
本発明の更に別の態様は、増殖性疾患の治療用の薬剤の調製における５−ＦＵ又はそのプロドラッグの使用であって、かかる薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法に使用することを特徴とする５−ＦＵ又はそのプロドラッグの使用に関する。
【００３６】
ここに用いる「併用治療」なる用語は、５−ＦＵ又はそのプロドラッグ、及びＣＤＫ阻害剤を同時でなければ、同じ時間枠内で両方の薬剤の治療作用が得られる時間枠内で、連続して投与する療法に関する。
【００３７】
ここに用いる「薬剤の調製」なる語句には、本発明の成分の薬剤のあらゆる調製段階における使用に加え、薬剤としての直接的な使用が含まれる。
【００３８】
ここにおいて「増殖性疾患」なる用語は、細胞サイクルの制御が必要とされる疾患を全て含むべく広義に使用され、再狭窄及び心筋症等の心臓血管疾患、糸球体腎炎及び関節リューマチ等の自己免疫疾患、乾癬等の皮膚病、抗炎症性疾患、抗真菌性疾患、マラリア等の抗寄生虫性疾患、気腫、並びに脱毛症が列挙される。これらの疾患において、本発明の成分は、所望細胞内で必要に応じてアポトーシスを誘導し、或いは静止状態を維持する。
【００３９】
好ましくは、増殖性疾患は癌又は白血病であり、最も好ましくは癌である。
【００４０】
より好適な実施態様においては、増殖性疾患が軟部組織癌、例えば乳癌である。
【００４１】
別の好適な実施態様においては、増殖性疾患が結腸直腸癌、頭部又は頸部癌、子宮頸癌又は膵臓癌である。
【００４２】
特に好適な実施態様の１つにおいては、本発明は、ＣＤＫ依存性又は感受性疾患の治療に、ここに記載された組合せを使用することに関する。ＣＤＫ依存性疾患では、１若しくは２以上のＣＤＫ酵素の活性が正常レベルを上回ることに関連する。かかる疾患は、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４活性の異常レベルを伴うものであることが好ましい。ＣＤＫ感受性疾患は、ＣＤＫレベルの異常が一次的原因ではなく、一次代謝異常のダウンストリームでＣＤＫレベル異常が生じる疾患である。このような筋書きにたてば、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４は、感受性代謝経路の一部であるということができ、よって上記疾患の治療にＣＤＫ阻害剤が活性を示す可能性がある。疾患は、癌又は白血病であることが好ましい。
【００４３】
好ましくは、ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４の阻害剤である。ＷＯ９７／２０８４２、ＷＯ９８／０５３３５（CV Therapeutics）、ＷＯ９９／０７７０５（Regents of the University of California）に記載されているように、より好ましくは、ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン (roscovitine)、プルバラノールＡ(purvalanol A)、 プルバラノールＢ (purvalanol B) 、オロモウシン(olomoucine)、及び他の２，６，９−三置換プリン誘導体から選択する。
【００４４】
更により好ましくは、ＣＤＫ阻害剤をロスコビチン及びプルバラノールＡから選択する。
【００４５】
特に好適な実施態様の１つにおいて、ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである。
【００４６】
ロスコビチンは２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリン、又は２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンと記載される化合物である。ここで用いられるように、「ロスコビチン」なる語には、分解したＲ体及びＳ体の鏡像異性体、それらの混合物、及びそれらのラセミ体が含まれる。
【００４７】
多くの抗癌剤が治療レジーム（治療法）を最適化するために併用して投与される。５−ＦＵは、シクロホスファミド、メトトレキサートと組み合わせて（Int J Cancer (1981) 28, 91-96）、及びシスプラチンを伴う投薬レジームにおいて、ロイコボリンと一緒に使用されてきた（Jpn J Clin Onc (2001) 31, 605-609）。後者の開示は進行性胃癌の治療を改善することを目的とする、５−ＦＵとの組合せの試みの要約について記載している。Bible KC and Kaufmann SH, Cancer Res. (1997) 57: 3375-3380は、フラボプリノール（flavopurinol）と５−ＦＵの連続投与について記載している。しかし現在まで、５−ＦＵ又はそのプロドラッグをロスコビチンと併用投与することについて示唆しているものはない。
【００４８】
更により好ましくは、組合せがロスコビチンと５−ＦＵ又はそのプロドラッグからなる相乗作用のある組合せである。
【００４９】
好適な実施態様において、５−ＦＵ又はそのプロドラッグとロスコビチンの併用は、それぞれの薬剤を単独で投与する場合と比較して効果が増進する。本観察の驚くべき性質は、先行技術に基づく予想とは対照的である。
【００５０】
本発明の特に好適な実施態様の１つにおいて、プロドラッグがカペシタビン(capecitabine)である。したがって好ましくは、ロスコビチンとカペシタビンからなる組合せである。
【００５１】
医薬組成物
ヒトの治療において本発明の成分（その薬学的に許容される塩、エステル、及び薬学的に許容される溶媒和物）は単独投与することが可能であっても、通常ヒトの治療には、それらを医薬担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与する。
【００５２】
したがって、本発明の好適な実施形態は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と混合されたＣＤＫ阻害剤と５−ＦＵ又はそのプロドラッグからなる医薬組成物に関する。
【００５３】
本明細書に記載する多種多様な形態の医薬組成物に用いるこのような適切な賦形剤の例が、「医薬賦形剤ハンドブック  第二版（"Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition"）（1994, A Wade and PJ Weller編）に記載されている。
【００５４】
許容可能な担体又は希釈剤を治療的に使用することは、製薬業界では周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) に記載されている。適切な担体の例としては、乳糖、デンプン、ブドウ糖、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、及びソルビトール等が含まれる。好適な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。
【００５５】
薬理学的な担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、予定される投与経路や標準的な薬理学的実務を考慮して行われる。医薬組成物は担体、賦形剤、希釈剤として、−又は更に−いずれの適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含有していてもよい。
【００５６】
適切な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖等の天然の糖分、無水ラクトース、フリー・フローラクトース(free-flow lactose)、ベータ・ラクトース、とうもろこし甘味料、アカシア、トラガカント、又はアルギン酸ナトリウム等の天然ゴム及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００５７】
適切な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウム等が挙げられる。
【００５８】
かかる医薬組成物は、保存料、安定剤、及び染料を含んでいてもよく、着香料さえも含んでいてもよい。保存料の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤や懸濁化剤が使用されてもよい。
【００５９】
塩／エステル
本発明の薬剤は、塩若しくはエステル、特に薬学上許容される塩若しくはエステルとして存在することができる。
【００６０】
本発明の薬剤の薬学上許容される塩には、その適切な酸付加塩又は塩基性塩が含まれる。適切な薬理学的な塩に関する記載が、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977) にある。塩は、例えば鉱酸（例；硫酸、リン酸、又はハロゲン化水素酸）等の強無機酸、非置換若しくは置換（例えばハロゲンによって）の炭素原子数１〜４のアルカンカルボン酸（例；酢酸）等の強有機カルボン酸、飽和若しくは不飽和のジカルボン酸（例；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テトラフタル酸）、ヒドロキシカルボン酸（例；アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸）、アミノ酸（例；アスパラギン酸又はグルタミン酸）、安息香酸、或いは非置換若しくは置換（例えばハロゲンによって）の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル−又はアリール−スルホン酸（例；メタン−、又はｐ−トルエンスルホン酸）等の有機スルホン酸を用いて形成される。
【００６１】
エステルは、エステル化する官能基に基づいて有機酸若しくはアルコール／水酸化物を使用して形成する。有機酸には、非置換若しくは置換（例えばハロゲンによって）の炭素原子数１〜１２のアルカンカルボン酸（例；酢酸）等のカルボン酸、飽和若しくは不飽和のジカルボン酸（例；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、テトラフタル酸）、ヒドロキシカルボン酸（例；アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、又はクエン酸）、アミノ酸（例；アスパラギン酸又はグルタミン酸）、安息香酸、或いは非置換若しくは置換（例えばハロゲンによって）の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル−又はアリール−スルホン酸（例；メタン−、又はｐ−トルエンスルホン酸）等の有機スルホン酸が含まれる。好適な水酸化物には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム等の無機水酸化物が含まれる。アルコールには、非置換若しくは置換（例えばハロゲンによって）の炭素原子数１−１２のアルカンアルコールが含まれる。
【００６２】
光学異性体／互変異性体
本発明には、薬剤の全ての光学異性体及び互変異性体が適宜に含まれる。当業者であれば、光学特性（１若しくは２以上の不斉炭素原子）又は互変性の特徴を有する化合物を認識するであろう。対応する光学異性体及び／又は互変異性体は、当技術分野で公知の手法により単離・調製される。
【００６３】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の薬剤は立体異性体及び／又は幾何異性体として存在してもよく、例えば、これらは１つ以上の不斉中心及び／又は幾何学的中心を有していてもよい。つまり、２つ以上の立体異性体及び／又は幾何異性体の形で存在していてもよい。本発明は、かかる薬剤の個々の立体異性体と幾何異性体の全て、及びその混合物の使用を意図するものである。請求項で使用される用語には、適切な機能活性を保持する形態を提供するこれらの形態が包含される（しかし同程度である必要はない）。
【００６４】
本発明にはまた、かかる薬剤又はその薬理学的に許容可能な塩の、あらゆる適切な同位体変異体が含まれる。本発明による薬剤又はその薬理学的に許容可能な塩の同位体変異体は、同じ原子番号を有するが、通常自然界で見い出される原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって、少なくとも１原子を置換される塩であると定義される。かかる薬剤及びその薬理学的に許容可能な塩に組み込むことができる同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、及び３６Ｃｌである水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素が挙げられる。かかる化合物及びその薬理学的に許容可能な塩の特定の同位体変異体、例えば３Ｈ、や１４Ｃのような放射性同位元素が組み込まれた同位体変異体は、薬剤及び／又は基質組織の分布の研究において有益である。トリチウム化した、すなわち３Ｈ、及び炭素１４、すなわち１４Ｃ同位体は、調製の容易さと検出能の点から特に好ましい。更に、重水素、すなわち２Ｈ等の同位体との置換によって、例えばインビボで半減期が増加したり、必要とされる投薬量が減少するといった、高い代謝安定性から生じる治療的な利点が生じる場合があり、それ故、重水素すなわち２Ｈ等の同位体との置換は好ましい場合がある。本発明による薬剤及びその薬理学的に許容可能な塩の同位体変異体を、適切な試薬の適切な同位体変異体を用いた従来の手法によって、一般に調製することが可能である。
【００６５】
溶媒和物
本発明にはまた、本発明による薬剤の溶媒和物の形態が含まれる。請求項で使用される用語には、これらの形態が包含される。
【００６６】
多形体
更に本発明は、種々の結晶型、多形型、（無）水和物としての本発明の薬剤に関する。化合物は、その合成に用いられる溶媒から精製及び／又は単離する方法に若干の変更を加えることにより、上記いずれの形態としてでも単離することができることは医薬業界では十分に確立している。
【００６７】
化学的誘導体
本発明は、また薬剤の誘導体からなる組合せに関する。ここで用いられるように、「誘導体」なる用語は、薬剤の化学的修飾を含む。かかる化学修飾の例は、水素がハロゲン、アルキル基、アシル基、又はアミノ基により置換される。
【００６８】
プロドラッグ
本発明は更に、プロドラッグ形態としての本発明の薬剤に関する。通常かかるプロドラッグは、１若しくは２以上の適当な基が、ヒト又は哺乳類投与対象に投与したときに修飾が元に戻るような形態で修飾されている化合物である。インビボで元に戻すために第２剤を上記プロドラッグと共投与することも可能だが、このような戻りは通常、上記投与対象に元来備わる酵素によって生じる。かかる修飾の例にはエステル（例えば上述のエステルのいずれか）が含まれ、その場合エステラーゼ等により元に戻る。当業者にはこのようなシステムが他にも広く知られている。
【００６９】
特に好適な実施態様の１つにおいては、５−ＦＵはプロドラッグの形態、好ましくは、カペシタビンである。カペシタビンは、経口投与に特に適した５−ＦＵのプロドラッグである。
【００７０】
投与
本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、経膣、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、クモ膜下内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、経鼻、口腔内、又は舌下の各経路から投与できる。
【００７１】
経口投与用としては、圧縮錠剤、ピル、錠剤、ゲル剤（gellule）、ドロップ剤、及びカプセル剤が特に使用される。これらの組成物に活性成分が一投与量あたり、１〜２０００ｍｇ含有されていることが好ましく、５０〜１０００ｍｇ含有されていることがより好ましい。
【００７２】
他の投与剤型としては溶液又は乳剤があり、これらは静脈内、動脈内、クモ膜下内、皮下、皮内、腹腔内、又は筋肉内に注入され、無菌溶液又は無菌化が可能な溶液から調製される。本発明の医薬組成物はまた、座剤、ペッサリー、懸濁剤、乳剤、ローション、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー、溶液、又は粉剤の剤型であってもよい。
【００７３】
経皮投与の別の方法としては、スキンパッチを用いる方法がある。例えば、ポリエチレングリコール水性乳剤又は液体パラフィンからなるクリームに活性成分を含有させることができる。また、白ワックス又は白色軟パラフィン基剤からなる軟膏に活性成分を１〜１０重量％の濃度範囲で、必要に応じて安定剤や保存料と共に含有させることもできる。
【００７４】
注入用剤型には、一投与量あたり活性成分を１０〜１０００ｍｇ含有させることができ、１０〜５００ｍｇ含有させることが好ましい。
【００７５】
組成物は単位投与量形態、すなわち一単位投与量を含有する、又は一単位投与量を複数若しくはサブユニットに分けて含有する別々のポーションの形態に処方する。
【００７６】
特に好適な実施態様においては、本発明の組合せ又は医薬組成物は静脈内に投与される。
【００７７】
投薬量
一般的な当業者であれば過度の実験を行うことなく、本発明組成物のいずれか１つについて投与対象に投与する適切投与量を容易に決定できる。一般的に、医師が個々の患者に最適と思われる実際の投与量を決定し、これは使用する特定の薬剤の活性、かかる薬剤の代謝安定性及び作用時間の長さ、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食習慣、投与の様態と時間、排泄率、他の薬との併用、特定の状態の重症度、及び個々の患者が受けている治療等の因子の多様性による。ここに開示する投与量は、平均的なケースを挙げたものである。個々の症例に応じて当然、平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、それもまた本発明の範囲に該当する。
【００７８】
必要に応じて、薬剤を０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、又は２〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与してもよい。
【００７９】
上記の通り、各活性成分であるＣＤＫ阻害剤及び５−ＦＵ又はそのプロドラッグを治療上有効な量において好ましくは薬学上許容できる成分の形態で投与する。これらの量は当業者には周知である。指針として、５−ＦＵは一般的には、静脈内に、経口で、若しくは局所的に投与される。静脈内及び経口の投与量は、一般的には、２５０ｍｇ又は５００ｍｇの５−ＦＵからなり、総投与量は医師の裁量に従い、患者の体重により、例えば経口では週に１５ｍｇ／ｋｇ、最大投与量は１ｇ／日、又は静脈内に４時間かけて１２ｍｇ／ｋｇ、又は１日に２４時間かけて２４〜４９ｍｇ／ｋｇを５日間投与する。経口による投与は一般的にカプセルで投与するのに対し、静脈内投与は通常数時間かけて、一般的には４時間かけて投与する。
【００８０】
好ましくは、ロスコビチンを１〜５ｇ／日の投与量で、経口で又は静脈内に投与する。その後５−ＦＵを、上記の通り、適切な投与量で最も適していると考えられる方法で投与する。好ましくは、５−ＦＵをロスコビチンの投与後、少なくとも２４時間で投与する。
【００８１】
ロスコビチンを、一般的には経口で、又は静脈内に、約０．０５〜約５ｇ／日、好ましくは約０．５〜約５ｇ／日、又は１〜約５ｇ／日、さらにより好ましくは約１〜約３ｇ／日の投薬量で投与する。（訳注：ここの１〜約５ｇの１の前に約が抜けていると思います。）或いは、好ましくは約０．４〜約３ｇ／日の投与量でロスコビチンを投与する。好ましくは、ロスコビチンを錠剤又はカプセルで経口で投与する。ロスコビチンの一日の総投与量を、１回に投与してもよいし、一日に２、３、４回に分けて投与してもよい。
【実施例】
【００８２】
材料と方法
ＨＴ２９ヒト結腸直腸癌細胞をロスコビチン及び／又は５−ＦＵを使って処理した。化合物を個別に、併用して、及び連続して投与した。ロスコビチンと５−ＦＵの連続投与の効果を、フローサイトメトリー法によって、及びカスパーゼ−３レベル（アポトーシスの誘導の早期マーカー）のアッセイによって分析した。
【００８３】
細胞の培養
ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＴ２９は、European Collection of Animal Cell Culturesから入手した。１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清（Perbio社製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したダルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s medium）で細胞を生育させた。細胞を３７℃、５％ｖ／ｖＣＯ２で加湿雰囲気下で生育させ、０．０５％ｗ／ｖトリプシン、０．０２％ｗ／ｖＥＤＴＡを使って回収した。自生又は分析の前に、トリプシンを不活化するために、細胞を培地で洗浄した。
【００８４】
薬物治療
薬物治療の濃度を、細胞毒性アッセイにより計算したＩＣ５０値に基づき選択した。ロスコビチンを、ＩＣ５０（２０μＭ）又は２×ＩＣ５０（４０μＭ）のいずれか、及び５−ＦＵをＩＣ５０（１μＭ）又は０．５×ＩＣ５０（０．５μＭ）のいずれかで投薬した。併用した及び連続した治療のために、薬剤と濃度の全ての可能な組合せを評価した。
【００８５】
細胞サイクル分布の分析
ＨＴ２９細胞を直径９０ｍｍのプレートに、１プレートにつき１×１０６細胞数で蒔き、２４時間インキュベートした。連続した薬剤治療を適用する箇所を除いては、適切な濃度で４８時間、ロスコビチン、５−ＦＵ、又はロスコビチン＋５−ＦＵのいずれかを用いて細胞を処理した。薬剤の連続適用を評価する試料においては、最初の薬剤に２４時間曝した後、培地をプレートからチューブに移して、適切な２番目の薬剤を加えた。混合後、さらに２４時間インキュベートした該当するプレートに培地を戻した。その後、分離細胞と付着細胞の両方を回収した。ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を氷冷７０％ｖ／ｖエタノール水溶液内に固定し、−２０℃で保存した。細胞は，固定剤を取り除くためにＰＢＳ＋１％ｗ／ｖＢＳＡで２回洗浄し、０．１％ｖ／ｖトリトン−Ｘ、５０μｇ／ｍｌプロピジウムアイオダイド及び５０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳで再懸濁した。室温で２０分間インキュベートした後、フローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。
【００８６】
活性化カスパーゼ−３アッセイ
細胞サイクル分布を決定をするのと同様に、ＨＴ２９細胞を蒔き、薬剤で処理し、回収した。分析の前に、細胞を１％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドに３７℃で３０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、氷冷７０％ｖ／ｖエタノールで再縣濁し、−２０℃で保存した。細胞をＰＢＳ＋１％ｗ／ｖＢＳＡで２回洗浄し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：５に薄められた抗活性化カスパーゼ−３抗体（Pharmingen社製）と共役する１２０μｌのＦＩＴＣで再縣濁し、室温で３０分間遮光してインキュベートした。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１回洗浄後、０．１％ｖ／ｖトリトン−Ｘ、５０μｇ／ｍｌプロピジウムアイオダイド及び５０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した。室温で遮光して２０分間インキュベートした後、フローサイトメトリーにより試料を分析した。
【００８７】
ＢｒｄＵの取込みによる細胞増殖の評価
細胞サイクルの分布を決定するのと同様に、ＨＴ２９細胞を蒔き、薬剤で処理した。２４時間後、培地を１０μＭ  ＢｒｄＵを含む培地と交換し、３０分間インキュベートした。分離細胞を回収し、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、付着細胞をtrypsinisationにより回収した。付着及び分離細胞をプールし、ＰＢＳで洗浄し、氷冷７０％ｖ／ｖエタノールで固定し、４℃で保存した。細胞をＰＢＳ＋１％ＢＳＡで２回洗浄し、２Ｍ  ＨＣ１を使って２０分間処理し、その後ＰＢＳで更に３回洗浄した。細胞をペレット状にして、２μｌの抗ＢｒｄＵ抗体（Pharmingen社製）をペレットに加えた。細胞を室温で３０分間放置し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１回洗浄した。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１：１０に薄められた抗マウスＦ（ａｂ‘）２（Dako社製）と共役する５０μｌのＦＩＴＣをペレット状細胞に加え、試料を室温で遮光して３０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１回洗浄した後、０．１％ｖ／ｖトリトン−Ｘ、５０μｇ／ｍｌプロピジウムアイオダイド及び５０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳで細胞を再懸濁した。室温で遮光して２０分間インキュベートした後、フローサイトメトリーにより試料を分析した。
【００８８】
フローサイトメトリー
製造業者の推薦に従い、ベクトン  ディッキンソンＬＳＲ（Becton Dickinson LSR） フローサイトメトリーをこれらの研究に使用した。４８８ｎｍに設定したアルゴンイオンレーザーを励振源として使用した。使用する場所には、活性化カスパーゼ−３とＢｒｄＵ陽性細胞を、対数スケールで得た緑色蛍光（５３０±２８ｎｍ）に基づき表した。赤色蛍光（５７５±２６ｎｍ）を均等目盛(linear scale)で得て、分析から細胞のダブレット及び会合体を排除するためにパルス幅分析を使用した。赤色蛍光のレベルにより定義されるように、ＤＮＡコンテントが２ｎと４ｎである細胞を、細胞サイクルのＧ１、Ｓ又はＧ２／Ｍ期に入るように表した。２ｎＤＮＡコンテント未満を示す細胞をサブ−Ｇ１細胞(sub-G1 cells)と表した。各細胞サイクルの区画（compartment）の細胞数を、存在する細胞の総数のパーセントで表した。
【００８９】
結果
細胞サイクルの分析
ＨＴ２９細胞の細胞サイクル分布に対するロスコビチン、５−ＦＵ、及びロスコビチン＋５−ＦＵを使った治療効果を図１に示す。
【００９０】
両方とも投与量依存の方法において、２０μＭ及び４０μＭの両方のロスコビチンを使った治療は、Ｇ２／Ｍにおける細胞の蓄積を惹起し、０．５μMと１μMの５−ＦＵを使った治療は、Ｓ期における細胞の蓄積を惹起する。細胞を２０μMロスコビチンと０．５μM又は１μMの５−ＦＵのいずれかを用いて同時に処理したときには、Ｓ期で蓄積が見られ、それは両方の濃度で、５−ＦＵが２０μMロスコビチンのＧ２／Ｍのブロックを妨げていることを示唆している。しかし、ロスコビチンのレベルを４０μMまで増やすと、Ｇ２／Ｍにおける蓄積が０．５μMと１μMの両方の５−ＦＵで見られ、ロスコビチンのレベルを上げることにより５−ＦＵの効果を克服可能であるということを示唆している。
ＨＴ２９細胞の細胞サイクル分布に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った連続治療の効果を図２に示す。
【００９１】
ロスコビチンを５−ＦＵの前に投与すると、細胞サイクル分布は、ロスコビチン単独で得られるものとほとんど同様である。５−ＦＵの濃度を０．５μMから１μMに高めても、細胞サイクル分布への明らかな影響はなかった。５−ＦＵをロスコビチンの前に投与した場合、通常ロスコビチンの治療に見られるＧ２／Ｍにおける蓄積は、特に４０μMのロスコビチンで処理した試料において、目立つものではなかった。１μMの５−ＦＵの後で４０μMのロスコビチンで処理した試料においては、Ｓ期の細胞が著しく増加した。この結果は５−ＦＵがロスコビチンの細胞サイクルへの効果をブロック可能であることを示している。
【００９２】
カスパーゼ活性化
図３は、ＨＴ２９細胞のカスパーゼ活性化に対する、ロスコビチン、５−ＦＵ、及び（ロスコビチン＋５−ＦＵ）を使った治療効果を示している。
【００９３】
ロスコビチンは低い程度にもかかわらず、５−ＦＵの投与と同様に、投与量依存の方法で、カスパーゼ−３の活性化（アポトーシスによる細胞死の早期マーカー）を誘導する。併用投与した場合、結果はロスコビチン単独の場合と類似しており、テストしたレベルでの２つの薬剤の同時治療により、細胞死が増加しないことを示唆している（すなわち、本特定のアッセイに基づくと、追加的又は相乗効果を示す証拠はない）。
【００９４】
ＨＴ２９細胞のカスパーゼ−３の活性化に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った連続治療の効果を、図４に示す。
【００９５】
５−ＦＵの前にロスコビチンを使って治療することは、すべての薬剤濃度を組み合わせたときに見られるのと同様のレベルの、高レベルのカスパーゼ−３活性化（細胞死）を示した。より具体的には、５−ＦＵの前にロスコビチンを投与することで、結果としてカスパーゼ−３の活性化が改善され、この活性化は５−ＦＵ又はロスコビチン単独で達成されるよりももっと大きいものであった。したがって、本アッセイに基づき、ロスコビチン等のＣＤＫ阻害剤に続き５−ＦＵを連続投与することにより、各薬剤を単独で投与したときに比較して、アポトーシスの誘導に対し最大の効果を生む。理論に縛られることなく、ロスコビチンの後に５−ＦＵを使って連続治療することで、Ｓ期における５−ＦＵに誘導されるブロックを防いでいると思われる。
【００９６】
ロスコビチンの前に５−ＦＵを投与する場合、細胞死のレベルは大幅に減少し、本特定アッセイで測定した場合、５−ＦＵがロスコビチンによる細胞死の誘導をブロックする可能性を示唆している。
【００９７】
ＢｒｄＵの分析
４０μMのロスコビチンを使った治療により、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の数の減少（３．８％）により示されるように、結果として増殖が減少する。１μMの５−ＦＵを使った治療により、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞数は６４．３％まで増加したが、ＢｒｄＵ標識の強度は、コントロールにおいてみられるより低く、Ｓ期での停止を惹起する薬剤であることを示している。４０μMのロスコビチンと１μMの５−ＦＵを同時に投与すると、結果としてロスコビチン単独の場合より多くの細胞がＢｒｄＵを取り込むことになる。これは細胞サイクル分布の結果で示唆しているように、５−ＦＵの存在がロスコビチンの効果をブロックしていることを示している。１μMの５−ＦＵの前に４０μMのロスコビチンを使う連続治療の結果は、４０μMのロスコビチン単独の結果と同様であった。１μMの５−ＦＵの後で４０μMのロスコビチンを使う連続治療は、５−ＦＵ単独の場合に比べて増殖の減少を示し、ロスコビチン単独の場合に比べて増加を示した。これはロスコビチンの前に５−ＦＵを投与することでロスコビチンの効果を阻害する可能性があることを示している。
【００９８】
ＢｒｄＵの取込みにより決定される、ＨＴ２９細胞の増殖に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った併用治療の効果を図５に示す。
ＭＣＦ７細胞へのロスコビチンと５−ＦＵによる治療
ＭＣＦ７細胞を３０００／ウエルになるように９６ウエルプレートに蒔いた。細胞を一晩かけて定着させ、翌日培地を薬剤を含む培地と取り替えた。各プレートに３種類で、９種の異なる薬剤治療をテストした。ＭＣＦ７細胞に関する２つの薬剤のＩＣ５０値は、８μM（５−ＦＵ）及び１０μM（ロスコビチン）であった。実験モデルは、５−ＦＵの１００％のＩＣ５０を用いた細胞の処理（治療１）から、ロスコビチンの１００％のＩＣ５０を用いた細胞の処理（治療７）までの範囲であった。治療２〜６は以下の表１に示すように、ロスコビチンに対する５−ＦＵの異なった比率の範囲を用いて細胞を処理することを含んでいた。薬剤を使用しない（治療８）又は両方の薬剤の１００％のＩＣ５０を用いた治療（治療９）を含む、２つの追加的なコントロールも行われた。
【００９９】
【表１】
2005526086.tif 000002
以下の３つの異なる併用戦略がテストされた。
【０１００】
（Ａ）細胞を５−ＦＵを使って２４時間処理し、その後培地をロスコビチンを含む培地と４８時間取り替えた、５−ＦＵのプレトリートメント。
【０１０１】
（Ｂ）細胞をロスコビチンを使って２４時間処理し、その後５−ＦＵを使って４８時間処理したロスコビチンのプレトリートメント。
【０１０２】
（Ｃ）５−ＦＵとロスコビチンを同時に７２時間使って処理した細胞。
【０１０３】
３つの全併用戦略において、７２時間の実験期間後、各ウエルの細胞数を、ＷＳＴ１アッセイ（Roche Applied Science Assay Catalogue No.1644807）を使って評価した。各プレート内で、各治療用の細胞数を、コントロールウエルでの細胞のパーセントとして表した（薬剤無し）。
【０１０４】
併用研究の統計分析
併用曲線（combination curve）を解釈するために、各テストの組合せ（７５：２５  ロスコビチン／５−ＦＵ）と評価項目（１００：０  ロスコビチン、及び０：１００  ５−ＦＵを統計上比較した。統計上の重要な観察は、併用（ロスコビチンと５−ＦＵ）吸収値と両方の評価項目値（ロスコビチンと５−ＦＵ単独）の間に差異が存在することを要求する［Greco et al, The serch for synergy; A critical review from a response surface perspective.  Pharmacol; Review 47:331-385, 1995; Laska et al, Simple designs and model-free tests for synergy; Biometrics 50:834-841, 1994］。（>３  ｏｆ  ５）の値の大部分が統計上、ライン（評価項目）の上又は下にある場合には、それぞれ拮抗作用又は相乗作用があると言われている。そうでない場合には、パターンは追加の相互作用とより整合性がある。
【０１０５】
結果
併用戦略（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の結果を以下の表２、３、４及び図６、７、８に示す。
【０１０６】
【表２】
2005526086.tif 000003
【表３】
2005526086.tif 000004
【表４】
2005526086.tif 000005
【表５】
2005526086.tif 000006
【０１０７】
併用戦略（Ａ）
５−ＦＵを使ったプレトリートメントの結果（表２と５、図６に示す）は、５−ＦＵとロスコビチンの間の相乗作用を示す。
【０１０８】
併用戦略（Ｂ）
ロスコビチンを使ったプレトリートメントの結果（表３と５、図７に示す）は、５−ＦＵとロスコビチンの間の追加的作用を示す。
【０１０９】
併用戦略（Ｃ）
５−ＦＵとロスコビチンを使った同時治療の結果（表３と５、図８に示す）は、５−ＦＵとロスコビチンの間の相乗作用を示す。
【０１１０】
クローン原性アッセイ
ヒト腫瘍異種移植片由来の一種類の細胞懸濁液の調製
胸腺形成不全ヌードマウスにおいて連続継代で皮下で育成している充実性ヒト腫瘍（NMRI, Naval Medical Research Institute, USA, nu/nu strain, obtained from breeding facility）を、無菌条件下で取り除き、機械的に分解し、その後コラゲナーゼ（４１Ｕ／ｍｌ、Sigma社製）、ＤＮＡｓｅI（１２５Ｕ／ｍｌ、Roche社製）、ヒアルロニダーゼ（１００  Ｕ／ｍｌ、Sigma社製）及びディスパーゼII（１．０Ｕ／ｍｌ、Roche社製）からなる酵素カクテルを用いて、ＰＰＭＩ１６４０−培地（Life Technologies社製）において３７℃で４０分間インキュベートした。細胞を２００μM及び５０μMのメッシュサイズのふるいに通し、無菌のＰＢＳ緩衝液（Life Technologies社製）で２回洗浄した。生菌細胞のパーセンテージを、トリパンブルー排除試験を使ってNeubauer-hemocytometerで決定した。
【０１１１】
培養方法
クローン原性アッセイを、Hamburger et al［Hamburger, A.W. & S.E. Salmon. 1977; Primary bioassay of human tumor stem cell.  Science 197: 461-463］によって導入された、改良された２層の軟寒天アッセイに従い、２４ウエルフォーマットで行った。底層は０．２ｍｌ／ウエルのイスコフ改変ダルベッコ培地（２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清及び０．０１％（ｖ／ｖ）ゲンタマイシンで補足）から構成され、０．７５％（ｗ／ｖ）寒天５・１０４細胞を、０．４％（ｗ／ｖ）寒天で補足された０．２ｍｌの同じ培養培地に加え、底層の上に２４マルチウエルディッシュで平板培養した。継続して曝すこと（ドラッグオーバーレイ）により０．２ｍｌの培養培地で、蒔いた後２４時間で細胞内に細胞増殖抑制剤を適用した。各ディッシュには６のコントロールウエルと６の濃度で三通りに薬剤処理したグループが含まれた。併用の研究においては、ロスコビチンと標準的な細胞増殖抑制剤を同時に適用し、アッセイ層を通じて拡散することにより達する各テスト濃度になるように３倍に濃縮した。細胞増殖抑制剤を６の希釈液中でテストし、ロスコビチンを各希釈液に２つの一定の濃度で加えた。培養物を３７℃と７．５％ＣＯ２で加湿雰囲気下で８〜２０日間インキュベートし、倒立顕微鏡を使ってコロニーの生育を詳しく観察した。その期間中に、インビトロ腫瘍の生育は、直径>５０μｍのコロニーを形成することとなった。最大コロニーの形成時に、自動イメージ分析システム（OMNICON FAS IV, Biosys GmbH社製）を使ってカウントした。評価の前の２４時間バイタルコロニーを２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロライド（１ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウエル）の無菌水溶液で染色した（Alley, M.C., Uhi, C.B. & M.M. Lieber, 1982.  Improved detection of drug cytotoxicity in the soft agar colony formation assay through use of a metabolizable tetrazolium salt.  Life Sci. 31:3071-3078）。
【０１１２】
以下の品質管理基準が満たされた場合に、アッセイは完全に評価可能であるとみなされた。
・  ２４マルチウエルプレートのコントロールグループウエルのコロニー平均数  >コロニーの直径が>５０μｍである２０コロニー
・  コントロールグループの変動係数  <５０％
・  ポジティブリファレンス化合物（positive reference compound）である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（１０００μｇ／ｍｌの中毒量で）はコントロールの<２０％のコロニー生存に効果がなければならない。又は
・  ０日目又は２日目の最初のプレートのカウント<最終コントロールグループのカウントの２０％
【０１１３】
データ評価
薬剤の効果を、処理したプレートのコロニーの平均数と処理していないコントロールの平均コロニーカウントを比較して得た、生存のパーセンテージの点から表す（テスト対コントロールグループ値で表す相対的コロニーカウント、Ｔ／Ｃ−値[％]）
Ｔ／Ｃ＝コロニカウント処理したグループ／コロニーカウントコントロールグループ・１００[％]
併用の研究においては、各薬剤の投与量で組み合わせるために得られたＴ／Ｃ−値を、それぞれの濃度でのロスコビチン又は標準的な薬剤単独で得られたＴ／Ｃ−値と比較した。組み合わせたもののＴ／Ｃ−値が各単一療法のＴ／Ｃ−値よりかなり低い場合に、組み合わせる利点が得られた。コロニー形成をそれぞれ５０％（Ｔ／Ｃ＝５０％）及び７０％（Ｔ／Ｃ＝３０％）阻害するために必要な薬剤の濃度であるＩＣ５０とＩＣ７０値を、化合物の濃度対相対的なコロニーカウントを線に表すことによって決定した。
【０１１４】
結果を図９に示す。ヒト乳癌異種移植片ＭＡＸＦ８５７を１０μＭのロスコビチン単独で処理した場合には、相対的コロニーカウントは７７％であった。この細胞株をロスコビチンと５ＦＵを組み合わせて処理した場合には、相対的コロニーカウントは、５ＦＵ単独で処理した場合の細胞の生育に効果を与えない５ＦＵの濃度で、約４５％であった。したがって、７７％から４５％への減少は、本同時治療においてかなりの相乗作用があることを示唆している。
【０１１５】
まとめとして、ロスコビチンと５−ＦＵを使った併用治療の効果は、細胞サイクル分析、細胞増殖の研究、及びアポトーシス誘導についての研究を含む各種の実験方法を使って実証された。ＭＣＦ７細胞を使った研究結果が、５−ＦＵとロスコビチンを同時に投与した場合、及び５−ＦＵでプレトリートメントした場合に相乗効果があることを示していることは注目に値する。活性化カスパーゼ−３アッセイにより測定されたアポトーシス誘導についての研究は、ロスコビチンを使ったプレトリートメントに相乗効果があることを示している。
【０１１６】
したがって、上で概説した実験結果により、５−ＦＵとロスコビチンを同時に投与した場合、又はいずれの順番においても連続投与した場合（すなわちロスコビチンの前に５−ＦＵを投与しても５−ＦＵの前にロスコビチンを投与してもよい）に相乗作用があることの証拠が提供される。
【０１１７】
本発明の様々な改良や変形は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明は、特定の好ましい実施態様に関して説明されてきたが、本発明が請求するように、このような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるであろう。実際、関連のある分野の当業者には明らかである、前述の実施のための形態に関する様々な改良は、本発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
実施例を挙げながら、また以下の図を参照しながら、本発明をさらに説明する。
【０１１９】
【図１】図１は、ＨＴ２９細胞の細胞サイクル分布に対する、ロスコビチン（ここでは「ＣＹＣ２０２」又は「２０２」という）、５−ＦＵ、及び[ロスコビチン＋５−ＦＵ]を使った治療の効果を示す。
【図２】図２は、ＨＴ２９細胞の細胞サイクル分布に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った連続治療の効果を示す。
【図３】図３は、ＨＴ２９細胞内のカスパーゼ−３の活性化に対するロスコビチン、５−ＦＵ、及び[ロスコビチン＋５−ＦＵ]を使った治療の効果を示す。
【図４】図４は、ＨＴ２９細胞内のカスパーゼ−３の活性化に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った連続治療の効果を示す。
【図５】図５は、ＢｒｄＵの取込みによって決定される、ＨＴ２９細胞の増殖に対するロスコビチンと５−ＦＵを使った併用治療の効果を示す。
【図６】図６は、ＭＣＦ７細胞に対する５−ＦＵによるプレトリートメントの効果を示す。細胞数（コントロールの％として）対投薬量（ＩＣ５０の％として）。
【図７】図７は、ＭＣＦ７細胞に対するロスコビチンによるプレトリートメントの効果を示す。細胞数（コントロールの％として）対投薬量（ＩＣ５０の％として）。
【図８】図８は、ＭＣＦ７細胞に対するロスコビチン／５−ＦＵの同時治療の効果を示す。細胞数（コントロールの％として）対投薬量（ＩＣ５０の％として）。
【図９】図９は、ヒト乳癌異種移植片ＭＡＸＦ８５７において、ロスコビチンを５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）と組み合わせた場合のインビトロの制癌効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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