(57)【要約】対象に対する化合物の投与を含む、微生物に基づく感染症を有する対象を治療する方法を開示する。この化合物は、同じ期間中に哺乳動物細胞を殺すことなく、インビトロ試験における２４時間後に対照と比べ少なくとも１０％、微生物中のＡＴＰレベルを減少させることが可能である。ＡＴＰレベルの減少は、（１）前記細胞を試験位置から除去し、それらを氷上に置くステップと、（２）前記細胞を４度Ｃで遠心分離によって採取し、それをＡＴＰ抽出バッファー中でビードビーティングにより破砕させるステップと、（３）細胞破片を４℃で遠心分離によって除去し、ＡＴＰ含有上清を放置するステップと、（４）前記上清中に存在するＡＴＰの量を４℃で生物発光アッセイによって測定するステップと、によって測定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象に対して有効量の化合物の投与を含む、微生物に基づく感染症を有する対象を治療する方法であって、前記化合物は、インビトロ試験における２４時間後に対照と比べ少なくとも１０％の微生物中のＡＴＰレベルを減少させ、かつ同じ時間中に哺乳動物細胞を殺さないことが可能であり、ＡＴＰレベルの減少が、
（１）前記細胞を試験位置から除去し、それらを氷上に置くステップと、
（２）前記細胞を４℃で遠心分離によって採取し、それをＡＴＰ抽出バッファー中でビーズビーティングにより破砕させるステップと、
（３）細胞破片を４℃で遠心分離によって除去し、ＡＴＰ含有上清を放置するステップと、
（４）前記上清中に存在するＡＴＰの量を４℃で生物発光アッセイによって測定するステップと、によって測定され、
前記化合物は、式Ｒ−ＳＯｎ−Ｚ−ＣＯ−Ｙ［式中、ｎが１または２であり、Ｒが炭素原子６〜２０個を有する炭化水素基であり、Ｚがヘテロ原子を含有しうる炭化水素連結部分であり、かつ、Ｙが−ＮＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−ＣＯ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、および−Ｏ−ＣＨ３から選択される］ではない、方法。
【請求項２】
前記対象は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象は、動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象は、ウマ、ウシ、ヤギおよびヒツジからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、
【化１】
2005533834.tif 000016
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、
【化２】
2005533834.tif 000017
である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、
【化３】
2005533834.tif 000018
である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物は、
【化４】
2005533834.tif 000019
である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物は、
【化５】
2005533834.tif 000020
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物は、
【化６】
2005533834.tif 000021
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、
【化７】
2005533834.tif 000022
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、
【化８】
2005533834.tif 000023
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物は、
【化９】
2005533834.tif 000024
である、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象は、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アヴィウム・イントラセルラーレ菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、ヨーネ菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択される微生物により感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
治療を必要とする対象に対して有効量の化合物の投与を含む、微生物に基づく感染症を有する対象を治療する方法であって、前記化合物は、ＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニットの過剰発現をひき起こし、さらに前記化合物は、式Ｒ−ＳＯｎ−Ｚ−ＣＯ−Ｙ［式中、ｎが１または２であり、
Ｒが炭素原子６〜２０個を有する炭化水素基であり、Ｚがヘテロ原子を含有しうる炭化水素連結部分であり、かつ、Ｙが−ＮＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ５、−ＣＯ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ３、および−Ｏ−ＣＨ３から選択される］ではない、方法。
【請求項１６】
前記対象は、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象は、動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象は、ウマ、ウシ、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物は、
【化１０】
2005533834.tif 000025
からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物は、
【化１１】
2005533834.tif 000026
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物は、
【化１２】
2005533834.tif 000027
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物は、
【化１３】
2005533834.tif 000028
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物は、
【化１４】
2005533834.tif 000029
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物は、
【化１５】
2005533834.tif 000030
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物は、
【化１６】
2005533834.tif 000031
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物は、
【化１７】
2005533834.tif 000032
である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物は、
【化１８】
2005533834.tif 000033
である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
微生物に基づく感染症は、依然として米国および世界中で主要な公衆衛生問題である。たとえば、結核は、依然として米国および全世界的に重要な保健問題である。結核（ＴＢ）は、世界における単一の病原菌による主要な死亡原因である。世界の人口の１８億６千万人または３２％はヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍ．ｔｂ．）に感染していると考えられている。毎年約８００万のＴＢの新しいケースおよび約２００万の死亡がある。これは、結果として、毎時２００人および毎日５０００人の死亡率となる。ＨＩＶ感染患者は、Ｍ．ｔｂ．に対する大幅に増大した感受性を示し、ＨＩＶを有さない患者に比べ約５０倍のリスク増大を示す（１２、４５）。同様に、初感染後に疾患を活性化する潜伏性ＴＢの進行速度は、ＨＩＶ非感染者における約５％に比べ４０％高い。ＨＩＶの全世界的、特にアジアおよびインド亜大陸における継続的拡大とともに、ＴＢの発生数および死亡率は増大することしか予想できない。
【０００２】
１つもしくはそれ以上の基準となる第一選択薬に対して耐性のＭ．ｔｂ．菌株の発生数の増大により、新規な標的の同定および医薬品開発の必要が増大する。ＭＤＲ−ＴＢ（多剤耐性結核菌）は、治療するのに困難かつ費用がかかるほか、薬物感受性のＴＢよりも大幅に高い死亡率に関係している。有効な予防および治療手段の非存在下に、ＭＤＲ−ＴＢは増大し、かつ、抑制できない問題となる。
【０００３】
軽減された毒性、ＭＤＲ−ＴＢに対する活性、代わりの作用機序、および潜伏性疾患に対する活性を有する改善された結核治療薬の顕著な需要が存在する。過去５０年にわたる結核の予防および治療における進歩にもかかわらず、この疾患の抑制が予期されうる前に依然として重要な障害がある。患者管理法の現行の標準は、特に効果的または包括的なＴＢ抑制プログラムを支援する財源またはインフラが不足している低所得、非工業化諸国において導入し、かつ、維持することが困難である。ＭＤＲ−ＴＢの発生は、ＴＢ抑制において今日までなされた進歩の多くを覆す恐れがある。
【０００４】
いくつかの有望な薬剤クラスが、長時間作用型リファマイシン、フルオロキノロン類、オキサゾリジノン類、およびニトロイミダゾール類を含めて開発中である。それにもかからわらず、新しい化合物の奏効率が臨床用途に近づく−約０．５％−と仮定すると、開発のための新しい独特のミコバクテリア標的の発見および同定の必要がある。新規な作用機序を有する新しい抗ミコバクテリア薬は、過去３０年において開発されていない。
【発明の開示】
【０００５】
発明の目的
本発明の目的は、微生物の主要なエネルギー代謝に干渉する化合物の投与によって、微生物に基づく感染症を治療する方法を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、微生物におけるＡＴＰ合成を阻害し、かつ、かかる微生物の細胞呼吸に干渉する化合物の投与を含む。
【０００７】
本発明の別の目的は、対照に対して少なくとも１０％のＡＴＰ［Ｍ］レベルの低下を誘発する化合物の投与を含む。
【０００８】
本発明の別の目的は、治療を必要とする対象に対する有効量の化合物の投与を含み、前記化合物がＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニットの過剰発現をひき起こす、微生物に基づく感染症を有する対象を治療する方法を含む。
【０００９】
本発明の別の目的は、微生物感染を有するヒトまたは動物に投与されると、上記の機序により感染症を治療しうる特定の化合物：
【化１】
2005533834.tif 000002
を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
図１は、ジムロート（Ｄｉｍｒｏｔｈ）ら、「ＡＴＰ合成酵素のＦ（０）モーターの操作（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆ（０）  ｍｏｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）」（２０００年）１４５８、ｐｐ．３７４〜３８６に由来するが、Ｆ１Ｆ０  ＡＴＰ合成酵素（ＡＴＰａｓｅ）の構造を概略的に示す。ＡＴＰａｓｅは、プロトン駆動力からのエネルギーを使用し、ＡＴＰを生成する。この酵素複合体は、膜貫通セクター（Ｆ０）および細胞質ゾルセクター（Ｆ１）で構成されている。Ｆ０成分を通じたプロトンの移動は、Ｆ１上の触媒部位のＡＴＰ合成または加水分解と可逆性に結合されていると考えられている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においては、Ｆ１およびＦ０は、それぞれ以下のサブユニット、α３β３γδε、およびａ１ｂ２ｃ１２で構成されている。一般に、相同サブユニットは、ミトコンドリアおよび葉緑体において見出されるが、原核系と真核系との間の差異が存在しうる。ＡＴＰ合成は、Ｆ０を通じたプロトン移動によって駆動される。しかし、結合の完全な構造および機序は完全には確立されていない。
【００１１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における別のＦ０膜成分（サブユニットｃ）とｂ−サブユニットの架橋結合は、ＡＴＰ加水分解とＡＴＰ駆動プロトンポンプの脱共役をもたらした。同様に、脱共役変異が、すべての酵素機能を廃した単一アミノ酸置換に関係するＦ０のｂ−サブユニットに影響を与える大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において見出されている。この表現型は、プロトントランスロケーションの触媒との結合におけるｂ−サブユニットの機能的役割を示す。ｂ−サブユニットのＦ１の成分との相互作用は、本質的に動的および構造的でありうる。最近になって、ストルグリックス（Ｓｔｒｕｇｌｉｃｓ）らは、可逆的にリン酸化されるミトコンドリアのｂ−サブユニットを示した。著者らは、かかるリン酸化の生理的役割が、Ｆ０−Ｆ１相互作用の安定性を制御し、それによってＦ０−Ｆ１モーターにおけるエネルギー結合を調節しうることを示している。そのようなものとして、Ｆ０のｂ−サブユニットは、ＡＴＰａｓｅの操作における構造的および機能的役割を果たすであろう。この粒状複合体の阻害は、ｂ−サブユニットまたはＦ０の膜関連成分との直接的相互作用により生じ、結果としてＡＴＰ生成の顕著な障害をもたらしうる。
【００１２】
この考えうる機序の重要な試験が、病原性ミコバクテリアに対する強力なインビトロ活性を有する□−スルホニルカルボキサミドクラスの化合物であるｎ−オクタンスルホニルアセトアミド（ＯＳＡ）で行われている。ＯＳＡは、本明細書中に参照によって含まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７８３０号において開示されている。
【００１３】
カルメット−ゲラン杆菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）におけるＯＳＡの酵素標的の同定は、２次元タンパク質ゲル電気泳動、および化合物の存在下に過剰発現されたタンパク質のその後の配列決定を用いて試みられた。ＢＣＧにおけるＯＳＡ処理により、２つの比較的小さなタンパク質（約１８ｋＤ）、すなわち、ａｔｐＦ遺伝子によってコード化されるＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニット（Ｆ１Ｆ０  ＡＴＰａｓｅ）および小さな熱ショックタンパク質、ｈｓｐ（Ｒｖ０２５１ｃ）がもたらされた。ＲＴ−ＰＣＲは、ｈｓｐ発現のレベルの著しい増大、およびＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニットの低い程度の増大を示し、これは２Ｄゲルで確認されたものと一致した。
【００１４】
これらの結果が、細胞傷害に対する一般化ストレス反応を示すかどうか評価するために、強力な抗ミコバクテリア化合物であるセルレニン、および別の強力な抗ＴＢ化合物であるイソニアジドの存在下に２次元タンパク質プロファイルが行われた。セルレニンとイソニアジドのいずれの処理によってもＢＣＧにおけるいずれのタンパク質の過剰発現も結果としてもたらされず、ＯＳＡがセルレニンまたはイソニアジドのいずれとも異なる機序によって作用することを示した。
【００１５】
ＢＣＧとＯＳＡ処理スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の２次元タンパク質プロファイルを比較することによって追加の情報が得られた。以前、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）は、溶解度の限界までの濃度（１００μｇ／ｍｌ）でＯＳＡに対して本質的に抵抗力があることが報告されていた。両方のＢＣＧタンパク質の相同体が、ゲノム研究所（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（メリーランド州（ＭＤ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）を通じて入手可能な速発育性抗酸（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ゲノム配列のＢＬＡＳＴサーチによって探求され、速発育性抗酸（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）に存在することが見出された。しかし、２つの間に非類似性の領域が存在する。ｂ−サブユニットは、これら２つのミコバクテリア種間で相当に類似しているようにみえる（６３％同一、７５％類似）が、しかし、ｈｓｐは類似性が低い（４２％同一、５４％類似）。ｂ−サブユニットおよびｈｓｐ相同体の推定分子量は、それぞれ１６および１８ｋＤである。しかし、これらの分子量またはｐＩと一致するタンパク質は、ＯＳＡ処理速発育性抗酸（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）において過剰発現されなかった。
【００１６】
ＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニットの過剰発現は、直接または間接にかかわらず、ＯＳＡの標的経路におけるＡＴＰ合成酵素の考えうる関与を示す。これらの所見に基づき、単一の時点およびタイムコースの実験が行われ、既知の非特異的ＡＴＰ合成酵素阻害剤であるＤＣＣＤと比較してＯＳＡ存在下のＡＴＰ［Ｍ］レベルを測定した。ＡＴＰ［Ｍ］レベルは、試験したすべての時点でＯＳＡおよびＤＣＣＤ処理後に大幅に減少した。この減少は両方の化合物で再現可能であったことはもちろん、きわめて迅速に曝露後わずか５分で生じた。
【００１７】
この効果が化合物特異的であったか、または一般化ストレス反応の結果であったかどうかを判定するために、対応する時点でのＡＴＰ［Ｍ］に影響を与えるその能力について、追加の抗ミコバクテリア薬および呼吸阻害剤を試験した。第一選択抗ミコバクテリア剤として含まれたのは、ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＳＴＲ、ＥＭＢ、およびセルレニンである。呼吸阻害剤として含まれたのは、ジクマロール（代替的デヒドロゲナーゼ阻害剤）、Ｒｏｔ（複合体Ｉ阻害剤）、およびＴＴＦＡ（複合体ＩＩ阻害剤）である。すべての第一選択薬がＯＳＡに匹敵するレベル（そのそれぞれのＢＣＧ中のＭＩＣの１６倍）で使用された。注目すべきは、試験された第１選択薬または呼吸阻害剤のいずれについても曝露後５分ではＡＴＰ［Ｍ］レベルの明らかな減少が検出されなかったことである。１つの例外は、複合体ＩＩの特異的阻害剤であるＴＴＦＡであったが、これは５分時点でＡＴＰ［Ｍ］レベルの中程度の減少を示した。これは、この阻害剤が、ＴＣＡサイクルの不可欠な部分であるコハク酸デヒドロゲナーゼ（複合体ＩＩ）を、特異的にターゲティングするので意外ではない。この酵素複合体なしには、ＴＣＡサイクルは大幅に阻害される。結果として、有酸素性呼吸が阻害されることになり、ＡＴＰの産生を遅くする。
【００１８】
したがって、ＯＳＡは、十分に立証された非特異的ＡＴＰ合成酵素阻害剤ＤＣＣＤの効果を模倣した。対照的に、他の抗ミコバクテリア剤は同様の効果をひき起こすことがなかった。同様の試験が以下の化合物で行われた。すなわち、
【化２】
2005533834.tif 000003
【００１９】
これらの化合物の試験は、ＯＳＡで示されたものと同様の結果を示し、すなわち、対照と比べ、対応する時点でのＡＴＰ［Ｍ］レベルを減少させる能力を示した。
【００２０】
ＯＳＡは、ＡＴＰレベルの減少を誘発し、これはｈｓｐ（Ｒｖ０２５１ｃ）の過剰発現に付随して生じた。発明の範囲を限定することなく、これは、熱ショック反応がマイコバクテリアにおけるエネルギー検出／調節と関係している可能性を示す。Ｈｓｐ（Ｒｖ０２５１ｃ）は、１５９アミノ酸の比較的小さなタンパク質をコード化し、小さな熱ショックタンパク質のＨｓｐ２０または□−結晶族のメンバーである。最近、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（２００２年）は、ｈｓｐ（同著者によってａｃｒ２と命名）がミコバクテリアゲノムにおける最も熱誘導性の遺伝子であることを示した。Ｈｓｐは、Ｒｖ０２５０ｃおよびＲｖ０２４９ｃと明らかなオペロンで配列もされている。ｈｓｐの調節は、熱ショック抑制因子、ＨｓｐＲ、およびＥＣＦシグマ因子σＥに伴って生じる。後者は、酸化または洗浄ストレス中にアップレギュレートもされ、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のα−結晶（ａｃｒ）（１４ｋＤａ抗原）との顕著な類似性を有する（９８アミノ酸にわたり４１％同一）。熱ショック反応は遍在的であり、正常および有害性の両方のストレス条件下に細胞を生存させる。この生存はしばしば遺伝子発現における完全な変化を必要とする。大部分の熱ショックタンパク質は、タンパク質折り畳み／分解に役立ち、かつタンパク質凝集を予防する分子シャペロンとみなされている。一般に、熱ショックタンパク質は比較的大きな基質特異性を有する。しかし、新しい証拠により、特定の酵素複合体の形成に不可欠である酵素特異的シャペロンの存在が確認された。酵素特異的シャペロンの例としては酵母ＡＴＰ１０、ＡＴＰ１１、およびＡＴＰ１２遺伝子が挙げられ、これらはＡＴＰ合成酵素構築に必要とされるタンパク質をコード化する。シトクロムオキシダーゼ、コハク酸還元酵素（複合体ＩＩ）、およびＮＡＤＨ−ユビキノン酸素還元酵素（複合体Ｉ）の形成に必要である追加の酵素特異的シャペロンが確認されている。これら酵素特異的シャペロンの多くは、分子シャペロンのＨｓｐ２０クラスに分類される。また、一部の分子シャペロンはレドックス調節の対象となる。ミコバクテリアｈｓｐの完全な機能的役割はほとんど未知である。しかし、この熱ショックタンパク質が呼吸鎖におけるＡＴＰ合成酵素または他の関連複合体の酵素特異的構築／調節において役割を果たしする可能性が存在する。Ｈｓｐは、レドックス調節熱ショックタンパク質のミコバクテリア変形をも表しうる。
【００２１】
主要なエネルギー代謝におけるＯＳＡ仲介干渉の推定は、エタノールとの活性の相乗作用によってさらに強化された。ミコバクテリアは、低濃度のエタノールおよび他の短鎖アルコールを炭素源として利用しうることが知られている。エタノールは、アルコールデヒドロゲナーゼによってＮＡＤの同時還元によりアセトアルデヒドに可逆的に酸化される呼吸基質である。アセトアルデヒドのその後の酸化により酢酸が得られ、これは次いでＡＴＰ依存反応においてアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡは主要な代謝における重要な分子である。ＴＣＡサイクルによるアセチル−ＣｏＡの酸化は、細胞エネルギーの産生を促進する。したがって、エタノール代謝と呼吸は相互接続されている。以前の研究者は、呼吸鎖を通じて陽子流の増大をもたらすＮＡＤＨ＋Ｈ＋の産生増大の結果として、エタノールが哺乳動物のミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成速度を増大させることを示した。ＡＴＰ／Ｏ比はエタノールの添加後に増大し、これは呼吸とＡＴＰ合成との間のエネルギー交換の増大を示す。この試験においては、エタノールとＯＤＡが同じ標的を共有することはありそうもない。しかし、エタノールはアセチル−ＣｏＡを上昇させ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋は、ＡＴＰ合成酵素または呼吸の他の成分が阻害された事象において細胞に対して有害となった。かかる場合には、ＯＳＡとエタノールの相乗作用が考えられうる。
【００２２】
ＡＴＰ合成の阻害および細胞呼吸障害は、複数の下流効果をもたらすこともありうる。これらにはミコール酸など他の高分子のエネルギー依存合成における減少が含まれる。以前、われわれは、ＯＳＡがＢＣＧにおけるミコール酸を減少させるが、この生合成経路における中間体に対する明らかな効果がないことを報告した。この所見は、既知の脂肪酸合成酵素阻害剤であるチオラクトマイシンおよびセルレニンで観察されたミコール酸阻害のパターンと著しく対照的であった。これらの所見は、ＯＳＡおよび他の□−スルホニルカルボキサミドによるミコール酸合成の阻害が、脂肪酸合成酵素阻害以外の別の機序に伴って生じうることを示す。
【００２３】
ＯＳＡおよび化合物Ｉ〜ＶＩＩＩのようにＡＴＰレベルを選択的に減少させうる化合物の使用は、ＴＢ（ＭＤＲ−ＴＢを含む）に現在罹患している患者、および免疫抑制または他の全身性疾患の結果として活性化しうる免疫休止疾患を抱く何百万人もの潜在的患者の両方の治療に役立つことになろう。
【００２４】
かかる化合物は、さまざまな他の微生物、たとえば、アヴィウム・イントラセルラーレ菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、ヨーネ菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、およびロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）などに対しても使用され、かつヒトと動物の両方、たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の反芻動物などにおいて使用されうる。
【００２５】
本発明による治療は、治療対象に対する微生物におけるＡＴＰレベルを選択的に減少させる化合物の投与を含む。かかる化合物を含有する医薬組成物は、化合物、医薬担体、または疾患によって必然的に生じるように、非経口（皮下、筋内、静脈内、腹腔内（ｉｎｔｒａｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、胸内、嚢内、または髄腔内）、局所、口、直腸、鼻、または吸入経路によって投与されうる。
【００２６】
これらの化合物は、好ましくは、化合物および薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物で製剤化されている。活性剤の濃度は、担体中のその溶解度によって決まり、かつ当業者によって容易に決定されうる。同様に、特定の製剤で使用される用量は、それに対して使用される特定の微生物によって決まる。医薬組成物は、それらが活性化合物の効果を無効にしない限り、他の成分を含んで成りうる。医薬担体は公知であり、かつ当業者であれば特定の投与経路によって的確なものを選択することができる。
【００２７】
用量および治療期間は、薬剤の治療指標、疾患の種類、患者の年齢、患者の体重、および毒性の耐性を含むさまざまな要因によって決まる。用量は通常、約１ｎｇ〜１００μｇ／ｍｌ、一般的には０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの血清濃度を達成するように選択される。好ましくは、初期用量レベルは、インビトロモデルとインビボモデルおよび臨床試験において有効であることが示された周囲濃度を達成するその能力に基づき選択される。特定の対象に対する特定の薬剤の用量および治療期間は、上記の要因を考慮して標準の薬学的方法を用いる熟練医師によって決定されうる。治療に対する反応は、活性化合物の血液レベルまたは体液レベルの分析、化合物の活性または関連組織中のそのレベルの測定、または対象の疾患状態をモニタリングすることによってモンタリングされうる。熟練医師は、これらの測定値によって示される治療に対する反応に基づき用量および治療期間を調節するであろう。
【００２８】
化合物は、もちろん、対象を殺すレベルより低いレベルで、かつ好ましくは、生体機能を回復不能に傷害するレベルより低いレベルで投与される。再生されうる患者の細胞の一部（例えば、子宮内膜細胞）を殺すレベルでの投与は排除されている。
【実施例】
【００２９】
実施例
以下の実施例は例示するために提示されているが、発明の範囲を限定しない。
【００３０】
ミコバクテリアと増殖条件。ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｈ３７Ｒｖ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（ＢＣＧ、パスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）菌株、ＡＴＣＣ３５７３４）、およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ｍｃ２６  １−２ｃ）が本試験において用いられた。菌株はローウェンスタインジャンセン（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ）斜面寒天培地またはミドルブルック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ１０寒天平板（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））上で維持された。すべてのアッセイのために、ＢＣＧ培養物を３７℃、回転式振盪培養機で中期対数増殖期（ＯＤ＝Ａ６０００．３−０．４）に増殖させた。
【００３１】
化合物。ｎ−オクタンスルホニルアセトアミド（ＯＳＡ、クレイグ・タウンゼント（Ｃｒａｉｇ  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）、ジョンホプキンス（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ）大学、メリーランド州、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ））、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ＡＴＰ合成酵素特異的阻害剤（ＤＣＣＤ、ＩＣＮ、カリフォルニア州、コスタメサ（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ））、テノイルトリフルオロアセトン、呼吸複合体ＩＩ阻害剤（ＴＴＦＡ、ＩＣＮ）、ロテノン、呼吸複合体Ｉ阻害剤（Ｒｏｔ、ＩＣＮ）、および脂肪酸合成酵素阻害剤であるセルレニン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））の原液および使用溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で構成した。イソ二アジド（ＩＮＨ）、ストレプトマイシン（ＳＴＲ）、およびエタンブトール（ＥＭＢ）（すべてシグマ（Ｓｉｇｍａ）製）の原液を滅菌水中で調製した。リファンピン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の初期原液をメタノール中で構成し、その後に滅菌水中で希釈した。
【００３２】
化合物Ｉ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、およびＶＩＩＩの調製
これら化合物のそれぞれの合成は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００年、４３（１７）、３３０４に記載されている手順に従って調製された３−スルホニルウンデカン酸（「ＩＸ」）を出発物質とした。
【００３３】
化合物Ｉ
【化３】
2005533834.tif 000004
【００３４】
乾燥塩化メチレン３ｍＬを含有するフレーム乾燥丸底フラスコに、３−スルホニルウンデカン酸ＩＸ、１５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、および１，１カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、（１０２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下に添加した。混合物を室温に２０分間攪拌した。次いで、２−クロロエチルアミンン塩酸塩（７３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに３時間攪拌した。水性ワークアップは粗アミドＸ（１４５ｍｇ、８８％）を十分な収量で提供する。アミドＸを加工せずにその後の化学反応ために使用した。１Ｈ（ＣＤＣ１３，３００ＭＨｚ）δ６．８６（ｂｓ，１Ｈ）、３．８７（ｓ，２Ｈ）、３．６７−３．６５（ｍ，４Ｈ）、３．１５（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．８９−１．８０（ｍ，２Ｈ）、１．４０−１．２６（ｍ，１４Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）。アミドＸ（１１０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をメタノール性水酸化カリウム１．５ｍＬ中に溶解した（５％ｗ／ｖ）。周囲温度に２時間攪拌後、混合物を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を塩水で２回洗浄し、真空で乾燥させて濃縮させた。粗オキサゾリンをフラッシュカラムクロマトグラフィー（１：１Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ）によって精製し、所望の生成物Ｉ、７０ｍｇ、収率７３％を得た。融点（ｍｐ）５３〜５５℃。１Ｈ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ４．３７（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．９５（ｓ，２Ｈ）、３．９５（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．２２（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）、１．９０−１．７９（ｍ，２Ｈ）、１．４６−１．４２（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．２３（ｍ，１２Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝６．０ＨＺ，３Ｈ）。
【００３５】
化合物ＩＩ
【化４】
2005533834.tif 000005
【００３６】
乾燥塩化メチレン３ｍＬを含有するフレーム乾燥丸底フラスコに、３−スルホニルウンデカン酸ＩＸ、１５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、およびＣＤＩ、（１０２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下に添加した。混合物を室温に２０分間攪拌した。次いで、イソニコチンヒドラジド（８６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに６．５時間攪拌した。反応混合物を真空で濃縮させ、粗ヒドラジドＩＩをフラッシュクロマトグラフィー（９８％ＥｔＯＡｃ／２％酢酸）によって精製し、白色固体、１２２ｍｇ、５６％を得た。１Ｈ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１０．９８（ｂｓ，１Ｈ）、１０．５７（ｂｓ，１Ｈ）、８．７７（ｂｓ，２Ｈ）、７．７８（ｄｘｄ，Ｊ１＝１．２Ｈｚ，Ｊ２＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．２１（ｓ，２Ｈ）、３．３０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ）、１．７６−１．６８（ｍ，２Ｈ）、１．４２−１．３４（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．２３（ｍ，１２Ｈ）、０．８４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【００３７】
化合物ＩＶ
【化５】
2005533834.tif 000006
【００３８】
乾燥塩化メチレン３ｍＬを含有するフレーム乾燥丸底フラスコに、３−スルホニルウンデカン酸、１５８．４ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）、および１，１カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１１５．７ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下に添加した。混合物を室温に２０分間攪拌した。次いで、２−フロイックヒドラジド、９０ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに３時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで２回、希釈ＨＣｌで３回、および飽和ＮａＣｌで１回洗浄した。有機物を減圧下に硫酸マグネシウムで乾燥させて濃縮させた。粗生成物ＩＶをＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（３：１）から再結晶させ、淡褐色の粉末（１４７ｍｇ、６６％）を得た。融点（ｍｐ）１３０〜１３１℃。１Ｈ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１０．５３（ｓ，１Ｈ）、１０．３８（ｓ，１Ｈ）、７．９０（ｄｘｄ，Ｊｌ＝０．４Ｈｚ，Ｊ２＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．２４（ｄｘｄ，Ｊ１＝０．６Ｈｚ，Ｊ２＝３．４Ｈｚ）、６．６５（ｄｘｄ，Ｊ１＝１．６Ｈｚ，Ｊ２＝３．６Ｈｚ）、４．１７（ｓ，１Ｈ）、３．２８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．７５−１．６７（ｍ，２Ｈ）、１．４２−１．３３（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．２３（ｍ，１２Ｈ）、０．８４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
【００３９】
化合物ＶＩ
【化６】
2005533834.tif 000007
【００４０】
乾燥塩化メチレン３ｍＬを含有するフレーム乾燥丸底フラスコに、３−スルホニルウンデカン酸（１６３ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＣＤＩ（１１３．９ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下に添加した。混合物を室温に２０分間攪拌した。次いで、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（８９μＬ、０．６３ｍｍｏｌ）、および４−塩酸クロロフェニルヒドラジン（１１５ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに２時間攪拌した。粗生成物ＶＩをフラッシュクロマトグラフィー（４０％ＥｔＯＡｃ／６０％Ｈｅｘ）によって精製した。（１１２ｍｇ、収率４６％）。１Ｈ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００ＭＨｚ）δ１０．１３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．１４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８−７．１４（ｍ，２Ｈ）、６．７８−６．７２（ｍ，２Ｈ）、４．１２（ｓ，２Ｈ）、３．２４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，３Ｈ）、１．７４−１．６６Ｈｚ（ｍ，２Ｈ）、１．４０−１．３２  （ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．２３（ｍ，１２Ｈ）、０．８４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）。
【００４１】
化合物ＶＩＩＩ
【化７】
2005533834.tif 000008
【００４２】
乾燥塩化メチレン３ｍＬを含有するフレーム乾燥丸底フラスコに、３−スルホニルウンデカン酸（３００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＣＤＩ（２１４ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下に添加した。混合物を室温に２０分間攪拌した。次いで、ＴＥＡ（１５４μＬ、１．１ｍｍｏｌ）、および塩酸グリシン酸メチル（１３８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をさらに４時間攪拌した。粗生成物ＶＩＩＩをフラッシュクロマトグラフィー（５０〜１００％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）によって精製し、白色固体（２０２ｍｇ、５６％）を得た。融点（ｍｐ）８２〜８４℃。１Ｈ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ７．１３（ｂｓ，１Ｈ）、４．０７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、３．９３（ｓ，２Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）、３．２３（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）、１．９０−１．８２（２Ｈ，ｍ）１．４６−１．４０（ｍ，２Ｈ）、１．３０−１．２５（ｍ，１２Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）。
【００４３】
化合物ＩＩＩの調製
この化合物は、最初に、（±）−α−メチレン−γ−ブチロラクトン−５−オクチル−４−カルボン酸（Ｃ７５）から化合物７を調製することによって、２ステップ合成で調製された。Ｃ７５は、米国特許第５，９８１，５７５号記載されているように調製されうる。
【化８】
2005533834.tif 000009
【００４４】
ＣＨ３ＣＮ（０．９ｍＬ）中Ｃ７５溶液（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）に、トリス（２−オキソ−３−オキサゾリニル）ホスフィンオキシド（９１．７ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、エタノールアミン（７．８μｌ、０．１３ｍｍｏｌ）、およびＮＥｔ３（０．０４ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温に３０分間攪拌させた。混合物をＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）／１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍｌ、３：１）の溶液中へ注ぎ、Ｅｔ２Ｏ（３×１５ｍＬ）で抽出した。複合有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過し、蒸発させてクロマトグラフ（３５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）にかけ、フラッシュクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン〜１００％ＥｔＯＡｃ／２％ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）後に化合物７（３２ｍｇ、９１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３  Ｈ）、１．２４（ｍ，１０Ｈ）、１．３５−１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．６４−１．７５（ｍ，２Ｈ）、３．４０−３．５７（ｍ，３Ｈ）、３．７４（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ）、４．７３−４．７９（ｄ，Ｊ＝５．７，７Ｈｚ，１Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、６．４２  （ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）。
【化９】
2005533834.tif 000010
【００４５】
ＣＨ２Ｃｌ２（０．７ｍＬ）中の７（４４．９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびイソシアン酸アリル（２０□Ｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温に１時間攪拌させた。混合物をＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ１０ｍＬ）中へ注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機物を複合させ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させて未精製物１５を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）により純粋物１５（１９ｍｇ、３３％）が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．３５−１．４８（ｍ，１Ｈ）、１．６２−１．７９（ｍ，２Ｈ）、３．３８−３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．５１−３．５２（ｍ，２Ｈ）、３．７８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、４．２０−４．２１（ｍ，２Ｈ）、４．７３−４．７９（ｍ，１Ｈ）、４．９６（ｂｔ，１Ｈ）、５．０９−５．２０（ｍ，２Ｈ）、５．７５−５．８６（ｍ，１Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．３８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【００４６】
化合物ＶおよびＶＩＩの調製
この化合物は、多くの中間体との合成で調製された。第１のステップにおいては、化合物２３が以下のように調製された。すなわち、
【化１０】
2005533834.tif 000011
−７８℃のＴＨＦ（９．７ｍＬ）中ＬｉＨＭＤＳ（６．２ｍＬ、６．２ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）の混合物に、ＴＨＦ（９．６０ｍＬ）中ＬｉＨＭＤＳ（±）−１（１．００ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）をカニューレ滴下によって添加し、結果として生じる溶液を−７８℃に３０分間攪拌した。次いで、−７８℃のＴＨＦ（４ｍＬ）中のオクチルトリフレート（１．６３ｇ、６．２０ｍｍｏｌ）をカニューレによって添加した。−７８℃に２時間撹拌後、１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）を添加し、溶液をＥｔ２Ｏ（３×１５ｍＬ）で抽出した。複合有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過して蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、分離可能なジアステレオマーの混合物２：１〜６：１として純粋物２３が得られた（１．３３ｇ、８１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）、０．９９（ｓ，９Ｈ）、１．２４−１．２６（ｍ，１２Ｈ）、１．５４（ｓ，３Ｈ）、１．７２−１．８４（ｍ，２Ｈ）、５．１３（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．９、２２．６、２４．９、２５．１、２５．９、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３５．２、４１．２、５５．３、８６．５、１７７．７。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４４３、２９２９、１８２９、１７６９ｃｍ−１；Ｃｌ６Ｈ３０Ｏ２Ｓの分析計算値：Ｃ、６７．０；Ｈ、１０．６；発見値：Ｃ、６６．３；Ｈ、１０．５。ＨＲＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ  Ｃ１６Ｈ３０Ｏ２Ｓ＋（Ｍ＋）の計算値２８６．１９６７  観測値２８６．１９６９。
【００４７】
次いで、化合物２６を調製した。すなわち、
【化１１】
2005533834.tif 000012
ＥｔＯＨ（１４．１ｍＬ）中の２３（６５０ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）に、ＮａＯＥｔ（２．１Ｍ）（２．１６ｍＬ、４．５４ｍｍｏｌ）（ＥｔＯＨ（４．０ｍＬ）中のＮａ金属（２００ｍｇ、８．３ｍｍｏｌ）から新しく調製）を添加し、溶液を室温に攪拌させた。２時間後、溶液をＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）／１Ｎ  ＨＣｌ（２５ｍＬ、３：１）中へ注ぎ、この混合物をＥＴ２Ｏ（３×２０ｍＬ）で抽出した。次いで、複合有機物をＨ２Ｏ（３ｘ２５ｍＬ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過して蒸発させ、未精製物２５を得た。０℃にＣＨ２Ｃｌ２（２６ｍＬ）中に溶解した２５にＮＥｔ３（０．５ｍＬ、３．４９ｍｍｏｌ）および塩化アルキニル（０．３ｍＬ、３．４９ｍｍｏｌ）を添加した。０℃に４０分後、ＮＨ４Ｃｌ（ｓａｔ）（３０ｍＬ）を添加し、溶液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。複合有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過して蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により純粋物２６（５４２ｍｇ、７９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、；１．２２−１．２７（ｍ，１５Ｈ）、１．６１（ｓ，３Ｈ）、１．７５−１．８４（ｍ，２Ｈ）、２．２６（ｓ，３Ｈ）、４．１８（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１３．９、１４．１、２２．６、２３．４、２４．４、２９．１、２９．２、２９．６、３０．３、３１．８、３８．３、５５．８、６１．５、１７３．１、１９５．８。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４３０、１８６８、１６９３、１６４４ｃｍ−１；Ｃ１５Ｈ２８Ｏ３Ｓの分析計算値：Ｃ、６２．５；Ｈ、９．７８；測定値：Ｃ、６２．６；Ｈ、９．８３。
【００４８】
化合物２６から化合物３２を調製した。すなわち、
【化１２】
2005533834.tif 000013
【００４９】
−７８℃のトルエン（２７ｍＬ）中の２６（５００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）に、ＬｉＨＭＤＳ（４．３ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を添加し、溶液をゆっくり−５℃に温めた。次いで、溶液を１Ｎ  ＨＣｌ（４０ｍＬ）中へ注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）で抽出した。複合有機物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、ろ過して蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／２％ＣＨ３ＣＯ２Ｈ／ヘキサン）により３２（３０８ｍｇ、７３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）（ケト互変異性体）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ）、１．１９−１．２４（ｍ，１０Ｈ）、１．４８−１．５３（ｍ，２Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）、１．７７−１．８５（ｍ，１Ｈ）、１．９４−２．０１（ｍ，１Ｈ）、３．３６（ｓ，２Ｈ）；１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）（エノール互変異性体）０．８７−０．８９（ｍ，３Ｈ）、１．２９（ｍ，１０Ｈ）、３．２９（ｓ，３Ｈ）、１．８１−１．８７（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）（エノール互変異性体）δ１４．７、２３．８、２６．４、２７．１、３０．５、３０．６、３０．８、３３．２、３９．８、６１．３、１０３．１（ｍ）、１８９．８、１９７．８。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４２２、１５９３ｃｍ−１；Ｃ１３Ｈ２２Ｏ２Ｓの分析計算値：Ｃ、６４．４；Ｈ、９．１５；測定値：Ｃ、６４．３；Ｈ、９．１０。
【００５０】
次いで、化合物５０を調製した。すなわち、
【化１３】
2005533834.tif 000014
一般手順Ｈに従い、３２（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブロモ酢酸ブチル（７３□Ｌ、０．４９ｍｍｏｌ）から、フラッシュクロマトグラフィー（１５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）後に５０（６２ｍｇ、７０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｓ，１２Ｈ）、１．４９（ｓ，９Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．８３−１．８６（ｍ，２Ｈ）、４．４３（ｓ，２Ｈ）、５．１９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）□１４．０、２２．６、２５．２、２６．３、２８．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．９、５９．７、６８．５、８３．４、１０２．１、１６５．２、１８５．５、１９３．４。Ｃ１９Ｈ３２Ｏ４Ｓの分析計算値：Ｃ、６４．０；Ｈ、９．０５；測定値：Ｃ、６４．１；Ｈ、９．０８。
【００５１】
次に、化合物５３は以下のように調製される。すなわち、
【化１４】
2005533834.tif 000015
【００５２】
ＣＨ２Ｃｌ２（１．４ｍＬ）中に溶解した５０（６５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．７ｍＬ）を添加し、室温に４時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、未精製物質をクロマトグラフにかけ（２０％ＥｔＯＡｃ／２％ＣＨ３ＣＯ２Ｈ／ヘキサン）、純粋物５３（４８ｍｇ、８９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｓ，１１Ｈ）、１．４７−１．４８（ｍ，１Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、１．８４−１．８８（ｍ，２Ｈ）、４．６２（ｓ，２Ｈ）、５．３１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１４．１、２２．６、２５．１、２６．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．９、６０．１、６７．７、１０２．４、１６９．８、１８５．８、１９５．４。ＩＲ（ＮａＣｌ）３４４２、１６４５ｃｍ−１；Ｃ１５Ｈ２４Ｏ４Ｓの分析計算値：Ｃ、５９．９；Ｈ、８．０５；測定値：Ｃ、６０．０；Ｈ、８．０９。
【００５３】
最後に、化合物５３から化合物Ｖを調製した。ＣＨ２Ｃｌ２（１．６１ｍＬ）中の５３（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−塩酸エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）（１２８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、および２−フロヒドラジド（５４ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃に３０分間攪拌し、次いで室温に温めて１２時間攪拌させた。溶液をＮＨ４Ｃｌ（１０ｍｌ、ｓａｔ）中へ注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（３×１０ｍＬ）で抽出した。複合有機物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過して蒸発させ、未精製化合物Ｖを得た。フラッシュクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）により未精製化合物Ｖ（９１ｍｇ、６８％）を得た。ｌＨ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２１（ｍ，１１Ｈ）、１．４３−１．４７（ｍ，１Ｈ）、１．６６（ｓ，３Ｈ）、１．８１−１．８６（ｍ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，２Ｈ）、５．４２（ｓ，１Ｈ）、６．４７（ｄｄ．Ｊ＝１．６，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．１６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，１Ｈ）、９．３２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、９．４４（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）δ１４．０、２２．６、２５．３、２６．０、２９．２、２９．３、２９．５、３１．７、３８．８、５９．７、６９．１、１０３．０、１１２．３、１１６．５、１４５．１、１４５．４、１５６．４、１６４．２、１８４．８、１９３．９。
【００５４】
化合物ＶＩＩも化合物５３から以下のように調製された。すなわち、５３（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）および４−塩酸クロロフェニルヒドラジン（７６．８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をフラッシュクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ）後の化合物Ｖ（７４ｍｇ、５３％）を調製するために使用された同じ一般手順に従った。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２４（ｍ，１１Ｈ）、１．４６−１．５４（ｍ，１Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）、１．８２−１．９０（ｍ，２Ｈ）、４．５７（ｓ，２Ｈ）、５．３９（ｓ，１Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．１８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）□１４．１、２２．６、２５．３、２６．１、２９．２、２９．３、２９．５、３１．８、３８．８、５９．７、６９．７、１０３．２、１１４．７、１２６．４、１４５．８、１２９．２、１６５．９、１８４．３、１９３．５。ＩＲ（ＮａＣｌ）２９５７、１６９５、１６５８、１６０９ｃｍ−１。
【００５５】
タンパク質アッセイ：ミコバクテリアおよび培養物。ＤＭＳＯ（希釈剤）、ＯＳＡ（６．２５および１００μｇ／ｍｌ）、セルレニン（２４μｇ／ｍｌ）、またはイソニアジド（１．０μｇ／ｍｌ）のいずれかを、対照および処理培養物２０ｍｌにそれぞれ添加した。同じ条件下に２４時間の追加のインキュベーション後、細胞の２ｍｌアリコートを遠心分離（３０秒間１３，０００ｘｇ）によって採取し、上清を除去し、工程を１回、１ＸＰＢＳを用いて繰り返した。各管の細胞内容物を２〜３個のエッペンドルフ（管当り約３〜５ＯＤ単位）に分け、３Ｍ尿素（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する溶菌液２５０μｌ、０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州、ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））５００ｍｇ、およびファルマライト（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）（ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州、ピスカッタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））５００μｌを添加した。その後、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））（１００μｇ／ｍｌ）およびロイペプチン（２μｇ／ｍｌ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））も添加した。細胞および溶菌液を含有する混合物を、２００〜３００μｍガラスビーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いるバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ）ミニ（Ｍｉｎｉ）−８ビーズビーターで６０秒間最大速度で破砕した。この工程を攪拌間、氷上で３０秒間隔によりサンプル当り２回繰り返した。各管の内容物を最小３０秒遠心分離し（１３，０００ｘｇ）、タンパク質含有上清を除去した。タンパク質濃度を標準化比色定量アッセイ（クマシープラス（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ）、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ））およびＢＳＡ標準（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて、島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＣ−１２０１分光光度計で測定した。定量サンプルを等分し、−７０℃下に凍結させた。
【００５６】
タンパク質アッセイ：タイムコース。原液ＢＣＧ（５００ｍｌ）を１５０ｍｌアリコートに分け、ＤＭＳＯまたはＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）のいずれかを、それぞれの対照および処理培養物に添加した後、インキュベートし、３７℃に１時間通気した。化合物の添加後最初の４時間には１時間の間隔で、さらに１６、２４、４８時間の時点でアリコート（２０ｍｌ）を各培養物から除去した。細胞を低速遠心分離によって採取し、滅菌蒸留水中で１回洗浄し、−７０℃に凍結させた。
【００５７】
タンパク質アッセイ：２−Ｄゲルおよび潜在的標的の配列決定。約２５０μｇの各タンパク質サンプルを８Ｍ尿素、０．５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ファルマライト３〜１０、ＤＴＴ、および数粒のブロモフェノールブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ））（２４０μｌ総量／サンプル）を含有する溶液と混合した。この混合物を用いて、メーカーの標準プロトコール（ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を用いることにより、室温に一夜、商業的に調製されたアクリルアミドｐＨストリップ（グラディエント４〜７）を再水和した。完全に再水和したストリップをその後に標準化プロトコール（ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））［１次元−２０℃に１６時間の後、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、尿素（８Ｍ）、グリセロール（３０％）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ＳＤＳ（１ｍｇ／ｍｌ））（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、およびＤＤＴまたはヨードアセトアミド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））のいずれかをそれぞれ含有する溶液中の個々のゲルストリップを平衡化］に従い２次元タンパク質ゲル系にかけた。平衡化後、ストリップを商業的に調製されたアクリルアミドゲル（２４５×１１０×０．５ｍｍ、グラディエント８〜１８％、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に塗布し、メーカーの標準プロトコール（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に従い、１５℃に２時間実行した。分子量標準（サイズ範囲：１４ｋＤ〜２００ｋＤ）をギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入し、ゲル当り１０μｌをロードした。ゲルの一夜クマシーブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ））染色によってタンパク質の視覚化を行った。過剰染料をメタノール：水：酢酸（９：９：２、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の２〜３回の洗浄で除去した。４つのゲルから問題のタンパク質をプールし、摘出ゲルフラグメントを２回５０％アセトニトリル中で洗浄した。その後のタンパク質配列決定は、ハーバードマイクロケミストリー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（マサチューセッツ州、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））によって行われた。
【００５８】
ＲＮＡ抽出。全ＲＮＡを、ＤＭＳＯ（希釈剤）またはＯＳＡのいずれかで一夜処理したＢＣＧの培養物１５ｍｌからトリゾル（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォリニア州、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））１ｍｌで抽出した。その後、細菌細胞を３０秒間（２回）ミニ−ビーズビーター中で均質化し、クロロホルムを細菌溶解物に添加した。全ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、蒸留水（ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅフリー、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に再懸濁した。全ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））で消化し、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））で精製した。ｃＤＮＡへの逆転写をＲＮＡおよびスーパースクリプトＩＩ、ＲＮＡｓｅＨ−逆転写酵素（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））２μｇを用いて行った。
【００５９】
ＰＣＲプロトコール。ＰＣＲ増幅をパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）２４００サーマルサイクラーで行った。各ＰＣＲ反応物は、ｃＤＮＡを２μｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含んだ。増幅パラメータは、９５℃で１分、６０℃で１．５分、および７２℃で２分で、３０サイクルを含んだ。延長は７２℃で１０分間行った。その後、温度を４℃に設定した。反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって評価した。
【００６０】
サザンハイブリダイゼーション。２０Ｘ  ＳＳＣによるサザンブロッティングによってナイロン膜（ロシュディアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、インディアナ州、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））上に、ＰＣＲ生成物を移した。その後、個々の膜を４２℃で一夜、遺伝子特異的ジゴキシゲニン１１−ｄＵＴＰ標識ＰＣＲフラグメントでハイブリダイゼーションを行った。次いで、プローブを除去し、膜を室温および６８℃で１５分間（２回）それぞれ、低い（２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）および高い（０．５％ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）厳密性のバッファー中で洗浄した。市販の化学発光法キット（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤｉｇ標識核酸を検出した。
【００６１】
ＡＴＰアッセイ。希釈剤またはＯＳＡのいずれかをＢＣＧ培養物１２０ｍｌに添加した（１００μｇ／ｍｌまたは計算ＭＩＣの１６倍）。追加の抗ミコバクテリア剤もＯＳＡに使用されたものに匹敵する濃度（そのそれぞれのＭＩＣの１６倍）で試験した。これらに含まれたのは、各化合物Ｉ〜ＶＩＩＩ、イソニアジド（ＩＮＨ、１．６μｇ／ｍｌ）、リファムピン（ＲＩＦ、３２μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（ＳＴＲ、３２μｇ／ｍｌ）、エタンブトール（ＥＭＢ、３２μｇ／ｍｌ）、および２つの濃度（１．５μｇ／ｍｌおよび２４μｇ／ｍｌ）でのセルレニンである。試験された既知の呼吸鎖阻害剤として含まれたのは、ＤＣＣＤ（１００μｇ／ｍｌ）、ＡＴＰ合成酵素特異的阻害剤、呼吸複合体ＩＩ特異的阻害剤であるＴＴＦＡ（１００μｇ／ｍｌ）、呼吸複合体Ｉ特異的阻害剤であるＲｏｔ（２５μｇ／ｍｌ）、および代替的デヒドロゲナーゼ阻害剤であるジクマロール（ＤＣ、７μｇ／ｍｌ）である。
【００６２】
初期単一および複数の時点アッセイは、培養物アリコート（各３０ｍｌ）を１、３、および２４時間の時点で除去し、直ちに氷上に配置することによって行われた。その後の操作はすべて４℃に行われた。追加のタイムコースを５、３０、１８０分で同じ手順を用いて行った。細胞を遠心分離によって採取し、計２分間最大力でＡＴＰ抽出バッファー（１００ｍＭトリス、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中２００〜３００μｍのガラスビーズで破砕することによって分配した。細胞破片を遠心分離（１５分間１３，０００ｘｇ）によって除去し、上清を含有するＡＴＰをきれいな管に移した。処理サンプル対、対照サンプルにおけるＡＴＰレベルの測定のために市販のＡＴＰ生物発光アッセイ（ロシュディアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を用いた。相対光単位をウォーレスビクター（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ）２（商標）照度計で測定した。コロニー計数（ＣＦＵ／ｍｌ）は、アリコートをＭ７Ｈ１０−ＡＤＣ寒天に平板培養し、３週間５％ＣＯ２中、３７℃にインキュベートすることによって各培養物について測定した。ＡＴＰレベル［Ｍ］は、処理群対未処理群のＣＦＵ当りで計算され、次いで相対［Ｍ］ＡＴＰは、処理値を対照に基準化することによって計算された。統計的有意性は、２−テイルドスチューデントｔ検定（２−ｔａｉｌｅｄ  ｓｔｕｄｅｎｔｓ’  ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて計算された。
【００６３】
エタノール存在下のＯＳＡの活性。呼吸基質であるエタノール存在下のＯＳＡのインビトロ活性を標準のＢＡＣＴＥＣ放射分析増殖法の変法を用いて測定した（４４）。手短に言えば、ガラスビーズおよび市販の希釈液（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、メリーランド州、スパークス（Ｓｐａｒｋｓ））を用いて、ローウェンスタイン−ジャンセン（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ）斜面寒天培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））上で維持されたヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）培養物から接種材料を調製した。ミコバクテリア懸濁液をガラスビーズでボルテックスし、３０分間安定させた。懸濁液を１．０マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）標準液に調節し、各ＢＡＣＴＥＣ１２Ｂ瓶中へ接種した（０．１ｍｌ）。ＯＳＡを個々の瓶に添加し、以下の最終濃度とした。すなわち、１．５μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、および２５．０μｇ／ｍｌ。組合せ試験に使用された最終エタノール濃度は０．０５％であった。ストレプトマイシン（０．０５μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、および２．０μｇ／ｍｌ）とエタノールの組合せも試験し、ＯＳＡについて観察された相乗効果が化合物特異的であるか、または代替的抗ミコバクテリア薬に一般化可能であるかどうか判定した。すべての瓶を３７℃にインキュベートし、各瓶の成長指標（ＧＩ）を毎日記録した。
【００６４】
ＯＳＡおよび他の呼吸鎖阻害剤によるＢＣＧの処理および１４Ｃ−酢酸液体パルス標識化。ＢＣＧ（各５０ｍｌ）をＭ７Ｈ９−ＡＤＣ−Ｔｗｅｅｎ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））中３７℃に早期対数増殖期（ＯＤ＝Ａ６０００．２）へ好気性に成長させた。この時点で、１μＣｉ／ｍｌの［１，２１４Ｃ］酢酸（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州、アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ））および希釈剤（ＤＭＳＯ）、ＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、ＤＣＣＤ（１００μｇ／ｍｌ）、またはＴＴＦＡ（１００μｇ／ｍｌ）のいずれかをそれぞれの培養物に添加し、同じ条件下に１０分間インキュベートした。培養物を直ちに氷上に配置し、３０００ｘｇで１５分間４℃の遠心分離によって細胞を採取した。
【００６５】
ミコール酸の調製と分析。たとえば、ドブソン（Ｄｏｂｓｏｎ）、Ｇ．ら著、「細菌体系学における化学的方法（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ）」における「複合ミコバクテリア脂質の体系的分析（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｉｄｓ）」（ｐｐ．２３７〜２６５）、Ｍ．グッドフェロー（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）とＤ．ミニキン（Ｍｉｎｉｋｉｎ）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８５年、ロンドン、およびミニキン（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ）、Ｄ．ら著「アルカリ性メタノール分解法によるミコバクテリアミコール酸および他の長鎖化合物の抽出（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８４年（２）、ｐｐ．２４３〜２４９などの刊行物で既述されているようにミコール酸の抽出を行った。手短に言えば、極性および非極性の抽出可能な脂質を上記文献の確立されたプロトコールに従い、同等量細胞（６０ｍｇ湿重量）から除去した。結合ミコール酸を含有する結果として生じる脱脂細胞をメタノール（１ｍｌ）、３０％ＫＯＨ（１ｍｌ）、およびトルエン（０．１ｍｌ）中で、７５℃で一夜、アルカリ性加水分解にかけ、その後に室温に冷却した。次いで、混合物を３．６％ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、ジエチルエーテルで３回抽出した。複合抽出物をＮ２下に乾燥させた。ジクロロメタン（１ｍｌ）、触媒溶液（１ｍｌ）（２６）、およびヨードメタン（２５ｍｌ）を３０分間混合し、遠心分離し、上相を廃棄することによって、ミコール酸の脂肪酸メチルエステルを調製した。下相をＮ２下に乾燥させた。１４Ｃ酢酸塩のミコール酸への取込みをシンチレーション計数（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ６５００多目的シンチレーションカウンター）によって測定し、未処理対照に占める割合で表した。ＢＣＧの早期対数増殖期における１０分曝露後のミコール酸合成に対するＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、ＤＣＣＤ（１００μｇ／ｍｌ）、およびＴＴＦＡ（１００μｇ／ｍｌ）の効果の比較が図７に示されている。
【００６６】
結果
最初に、ＯＳＡ特異的タンパク質標的の質的および量的確認を、ＢＣＧにおけるＯＳＡに対する２４時間曝露後の２次元ゲル電気泳動タンパク質プロファイルを検査することによって行った。以前の研究者は、同様の方法を有効に使用し、ムドルリ（Ｍｄｌｕｌｉ）Ｄ．ら著「イソニアジドによるヒト型結核菌β−ケトアシルＡＣＰ合成酵素の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  β−ｋｅｔｏａｃｙｌ  ＡＣＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｂｙ  ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年（２８０）、ｐｐ．１６０７〜１６１０に記載されているように、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるイソニアジドの酵素標的を同定した。図２（右）に示されているように、ＯＳＡによる処理は結果として、おおよその分子量が１７〜１８ｋＤの２つの比較的小さなタンパク質の顕著な過剰発現をもたらした。両方のタンパク質は、対応する未処理対照（図２、左）において検出不可能であった。過剰発現は、ＯＳＡのＭＩＣ（６．２５μｇ／ｍｌ）およびＭＩＣ（１００μｇ／ｍｌ）の１６倍（１６Ｘ）までの濃度の両方で用量依存的に生じた。３５Ｓ−メチオニンパルス標識化を用いた別のタイムコース実験は、両方のタンパク質がＯＳＡ曝露後わずか３．５時間で過剰発現したことを示した。対照的に、強力な抗ミコバクテリア阻害剤であるセルレニンまたはイソニアジドのいずれかによるＢＣＧの処理は、ＭＩＣの１６倍までの濃度でいずれのタンパク質の過剰発現も結果としてもたらさなかった。また、いずれのタンパク質もＯＳＡ処理スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）において過剰発現はしなかったが、この菌はこの化合物に対して本質的に耐性である。
【００６７】
２つのタンパク質のそれぞれを含有するプールされた２次元ゲルフラグメントの配列決定は、等電点（ｐＩ）が５．０である１７，７８６ダルトンの小さな熱ショックタンパク質（ｈｓｐ、Ｒｖ０２５１ｃ）であるより重要な種を示した。第２のタンパク質は、分子量が１８，３２５ダルトンであり、ｐＩが４．９である、ａｔｐＦ遺伝子（Ｒｖ１３０６）によってコード化されるＡＴＰ合成酵素のｂ−サブユニットとして同定された。両方の過剰発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図３）。
【００６８】
ｂ−サブユニットとの相互作用によるＡＴＰ合成酵素との考えうる関連を示したタンパク質データに基づき、２４時間にわたるタイムコース試験を行い、既知のＡＴＰ合成酵素阻害剤であるＤＣＣＤと比較してＢＣＧにおけるＡＴＰレベルに対するＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）の効果を検査した。図４に示されているように、ＡＴＰ［Ｍ］レベルは、曝露後１時間で未処理対照に対してＯＳＡ処理ＢＣＧにおいて大幅に（４６％）減少した。この傾向は３時間および２４時間の時点で継続し、ＡＴＰ［Ｍ］の減少はそれぞれ５４％および８５％であった。これらの差は各時点で統計的に有意であった（ｐ＜０．０２）。ＡＴＰ合成酵素の阻害剤であるＤＣＣＤもＡＴＰ［Ｍ］レベルの顕著な減少をひき起こし、すべての時点で９５％減少した（ｐ＝０．００３）。
【００６９】
同様の結果は、化合物Ｉ〜ＶＩＩＩのそれぞれについて観察された。
【００７０】
その後の実験を行い、ＡＴＰ［Ｍ］濃度に対するＯＳＡの効果がいかに迅速に起こるかを測定した。図５（パネルＡ）に示されているように、ＯＳＡはわずか５分で未処理ＢＣＧに対して処理ＢＣＧにおけるＡＴＰレベルを大幅に減少させた。この差は統計的に有意であった（ｐ＝０．００４）。統計的に有意な減少（ｐ＝０．００１）が、特異的ＡＴＰ合成酵素阻害剤であるＤＣＣＤでも確認された。呼吸複合体ＩＩ阻害剤であるＴＴＦＡによる処理は、結果として対応する時点でＡＴＰの中程度の減少のみをもたらした。
【００７１】
ＡＴＰレベルに対するＯＳＡの効果がＢＣＧにおける一般化ストレス反応の結果であるるかどうかを判定するために、ＩＮＨ、ＲＩＦ、ＥＭＢ、およびＳＴＲなど追加の抗ミコバクテリア剤をＯＳＡに使用されたものに匹敵する濃度（そのそれぞれのＭＩＣの１６倍、ＩＮＨ  １．６μｇ／ｍｌ、ＲＩＦ  ３２μｇ／ｍｌ、ＳＴＲ  ３２μｇ／ｍｌ、ＥＭＢ  ３２μｇ／ｍｌ、およびセルレニン２４μｇ／ｍｌ）で試験した。図５（パネルＢ）に示されているように、標準の抗ミコバクテリア薬（それぞれのＭＩＣの１６倍）によるＢＣＧの処理は結果として、曝露後５分の対応する時点で未処理対照に対してＡＴＰレベルの明らかな差をもたらさなかった。試験した追加の化合物として含まれたのは、代替的でヒドロゲナーゼ阻害剤であるジクマロール、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（呼吸複合体Ｉ）に対して特異的であるロテノン（Ｒｏｔ）、および脂肪酸合成酵素阻害剤、セルレニンである。ＡＴＰレベルの明らかな減少は、この化合物群では確認されなかった（図５、パネルＣ）。
【００７２】
ＡＴＰ合成酵素および呼吸鎖の他の成分の考えうる関与により、エタノール（０．０５％）存在下にＯＳＡでの試験を行った。エタノールは呼吸基質であり、たとえば、ボービックス（Ｂｅａｕｖｉｅｕｘ）、Ｍ．Ｐ．ら著「エタノール潅流は肥育ラットの分離肝における酸化的リン酸化の収率を増大させる（Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｏｆ  ｆｅｄ  ｒａｔｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、２００２年（５７０）、ｐｐ．１３５〜１４０において示されているように、細胞呼吸を試験するために多数の研究者によって使用されている。図６に示されているように、０．０５％エタノールは、ＯＳＡの成長阻害に対する効果を増強し、ＭＩＣをヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖにおける６．２５μｇ／ｍｌから１．５μｇ／ｍｌ未満に減少させた。エタノールとストレプトマイシンとの間に活性の相乗作用は観察されなかった。以前、われわれは、ＯＳＡによるＢＣＧの処理が結果としてミコール酸の減少をもたらしたが、この経路における中間体に対する明らかな効果はないことを報告した。ＡＴＰレベルにおける大幅な減少は、細胞壁にミコール酸を含めて、他の高分子に生合成に対する潜在的に直接または間接の有害な効果を有することが考えられる。ミコール酸産生におけるＡＴＰ合成および呼吸の役割を調査するために、ＡＴＰ合成酵素（ＤＣＣＤ）および呼吸複合体ＩＩ（ＴＴＦＡ）の阻害剤を評価し、ＢＣＧにおけるＯＳＡと未処理対照と比較した。曝露後１０分の短時間の間隔を選択し、ミコール酸合成における阻害が細胞死によるものではないことを確実にした。図６に示されているように、総ミコール酸レベルは、ＤＣＣＤ（１００μｇ／ｍｌ）では７９％、ＴＴＦＡ（１００μｇ／ｍｌ）では４６％、およびＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）では４３％、それぞれ未処理対照と比べ減少した。図６のパネルＡは、エタノールなしの標準のＢＡＣＴＥＣ放射計培地におけるＯＳＡの活性を示す（説明文で示されたμｇ／ｍｌでの濃度）が、パネルＢは、同じ濃度および０．５％エタノールを補充した培地を用いたＯＳＡの活性を示す。ＮＣは、未処理対照の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ＡＴＰ合成酵素の一般構造および機能を示す図である。
【図２】処理後４時間の対照対ＯＳＡ処理（１００μｇ／ｍｌ）ＢＣＧの２次元タンパク質ゲル電気泳動プロフィールを示す図である。
【図３Ａ】ＯＳＡの存在または非存在下に増殖したＢＣＧにおけるＡＴＰ合成酵素（Ｒｖ１３０６）およびｈｓｐ、（Ｒｖ０２５１ｃ）のｂ−サブユニットをコード化するａｔｐｆの発現比較を示す図である。
【図３Ｂ】ＯＳＡの存在または非存在下に増殖したＢＣＧにおけるＡＴＰ合成酵素（Ｒｖ１３０６）およびｈｓｐ、（Ｒｖ０２５１ｃ）のｂ−サブユニットをコード化するａｔｐｆの発現比較を示す図である。
【図４】未処理対照と比較してＯＳＡまたはジシクロヘキシルカルボジイミドで処理したＢＣＧ培養物におけるＡＴＰレベルを測定するタイムコース実験を示す図である。
【図５】ＯＳＡ、呼吸の既知の阻害剤、および抗ミコバクテリア薬への曝露５分後のＢＣＧにおけるＡＴＰ濃度／ＣＦＵを示す図である。
【図６】ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する低濃度のエタノール（０．０５％）でのＯＳＡの阻害活性の増強作用を示す図である。
【図７】ＢＣＧの早期対数増殖期における１０分曝露後のミコール酸合成に対するＯＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、ＤＣＣＤ（１００μｇ／ｍｌ）、およびＴＴＦＡ（１００μｇ／ｍｌ）の効果の比較を示す図である。
【図５】
2005533834.tif 000034
【図１】
2005533834.tif 000035
【図２】
2005533834.tif 000036
【図３Ａ】
2005533834.tif 000037
【図３Ｂ】
2005533834.tif 000038
【図４】
2005533834.tif 000039
【図６】
2005533834.tif 000040
【図７】
2005533834.tif 000041
【国際調査報告】
2005533834.tif 000042
2005533834.tif 000043