(57)【要約】本発明は、エピトープ特異的療法およびサイトカインまたは抗サイトカイン免疫療法の併用を用いる免疫療法の方法を提供する。本方法は、病原性免疫応答の調節を提供し、対象となる特定の疾患状態に関係する特異的エピトープを含む分子の同定、エピトープ特異的分子をサイトカインまたは抗サイトカインと共に投与すること、およびエピトープ特異的分子の投与に対するサイトカイン／抗サイトカイン投与の下流での調節が含まれる。
2005532981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）およびb）の投与が、被験者における免疫応答を調節する方法であって、以下を含む、免疫応答関連障害を有する被験者における免疫応答を調節する方法：
a）投与がエピトープ特異的T細胞免疫調節を提供する、抗原特異的エピトープの治療的有効量を投与する段階；および
b）サイトカインの治療的有効量またはサイトカイン活性もしくは発現に影響を及ぼす物質の調節有効量を投与する段階。
【請求項２】
投与が、粘膜、静脈内、皮下、または筋肉内投与によるサイトカインの直接投与によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
サイトカインの投与がサイトカインをコードする核酸の投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
サイトカイン活性に影響を及ぼす物質の投与が抗体の投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
抗体が可溶性または膜結合型サイトカイン受容体に結合する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
サイトカイン受容体が、天然に放出されたサイトカインの標的を妨害する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
抗体が可溶性または膜結合型サイトカインに結合する、請求項4記載の方法。
【請求項８】
抗体がヒト抗体、ヒト以外の抗体、またはキメラ抗体である、請求項4記載の方法。
【請求項９】
a）およびb）における投与が同時に起こる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
a）およびb）における投与が連続して起こる、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
投与が様々な比率で起こる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインが炎症性または寛容免疫応答に関連する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
炎症性または寛容免疫応答が免疫調節性サイトカインによって調節される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
免疫調節性サイトカインが、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、またはIFNγ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、IL-15、またはIL-23である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
抗原特異的エピトープが熱ショックタンパク質に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
障害が、関節炎、I型糖尿病、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、癌；結節性多発関節炎；多発筋炎および皮膚筋炎進行性全身硬化症（全身性強皮症）；糸球体腎炎；重症筋無力症；シェーグレン症候群；橋本病；グレーヴス病；副腎炎；副甲状腺機能低下症；悪性貧血；糖尿病；多発性硬化症および関連する脱髄性疾患；ブドウ膜炎；天疱瘡および類天疱瘡硬変；潰瘍性大腸炎；心筋炎；限局性腸炎；成人呼吸窮迫症候群；皮膚炎のような薬物反応の局所発現；皮膚の炎症関連パターンまたはアレルギー反応パターン；アトピー性皮膚炎および小児湿疹；接触性皮膚炎；乾癬；扁平苔癬；アレルギー性腸症；アレルギー性鼻炎；気管支喘息；移植片拒絶；感染物質に対する過敏症または破壊的反応；ならびに溶連菌感染後疾患からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
サイトカイン活性に影響を及ぼす物質の投与が、ペプチドまたはペプチド模倣体の投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
物質がサイトカイン受容体に結合する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
物質がサイトカインに結合する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
可溶性サイトカインによるT細胞またはB細胞のエキソビボ条件付けをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
エキソビボ条件付けが、同じ微小環境において行われる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
サイトカイン活性に影響を及ぼす物質の投与が、サイトカイン受容体を含む物質の投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
サイトカイン受容体が、天然に放出されたサイトカインの天然の標的を妨害する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
抗原特異的エピトープが表1のペプチドから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
投与が、免疫媒介疾患に対する免疫応答を誘導する方法であって、以下を含む、免疫プロセスおよび免疫媒介疾患の病因を調節する方法：
a）少なくとも一つの適したエピトープを同定する段階；
b）免疫媒介疾患に関連した少なくとも一つの細胞タイプを同定する段階；および
c）抗原特異的治療およびサイトカインまたは抗サイトカイン治療の併用を投与する段階。
【請求項２６】
免疫媒介疾患が自己免疫疾患である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患が関節炎である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
自己免疫疾患が免疫欠損または癌である、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
抗サイトカイン治療が抗TNFα治療を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
サイトカインが、炎症性または寛容免疫応答に関連する、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
炎症性または寛容免疫応答が免疫調節性サイトカインによって調節される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
免疫調節性サイトカインが、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβまたはIFNγ、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、IL-15、またはIL-23である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
抗原特異的エピトープが熱ショックタンパク質に由来する、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
抗原特異的エピトープが表1のペプチドから選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
a）およびb）の投与が、被験者における免疫応答を調節して、それによって被験者を治療する方法であって、以下を含む、免疫応答関連障害を有する被験者を治療する方法：
a）投与がエピトープ特異的T細胞免疫調節を提供する、抗原特異的エピトープの治療的有効量を投与する段階；および
b）サイトカインの治療的有効量、またはサイトカイン活性もしくは発現に影響を及ぼす物質の調節有効量を投与する段階。
【請求項３６】
抗原特異的エピトープが表1のペプチドから選択される、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利権
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた助成金番号第AR44850号の下で政府の支援を受けて行われた。したがって、米国政府は本発明において特定の権利を保有する可能性がある。
【０００２】
発明の分野
本発明は全般的に、免疫媒介疾患状態における免疫治療の方法論に関し、より詳しくは、インビボで免疫細胞を刺激して病原性反応の調節を引き起こすために併用療法を用いることに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫炎症は、所定の刺激に対する抗原特異的および非特異的免疫応答の組み合わせによって生じることは以前から認識されている。抗原特異的反応は、部分的に、可溶性の、抗体と複合体を形成した、もしくは抗原提示細胞によって免疫学的ペプチドにプロセシングされた、自己および／または外因性のタンパク質もしくはペプチド、または脂質、糖質、およびペプチドの混合物でさえも、TおよびB細胞が認識することを含む。抗原の認識は、特異的エフェクターBまたはT細胞による反応に至り、これは細胞増殖、可溶性メディエータ（すなわち、サイトカイン）および／またはエフェクター（すなわち、抗体）分泌、ならびに直接の細胞間接触または可溶性メディエータによって反応の強度および持続を支配する膜貫通タンパク質の発現からなる。生理的条件では、そのような抗原特異的反応は通常、自己限定性で、非特異的免疫メカニズムを制御するように思われる。抗原の認識はまた、アネルギー、または特定の細胞のクローン的の欠失を通して、下流の事象を直接妨害しうる。
【０００４】
免疫炎症が合併症となるリウマチ性関節炎および他の自己免疫疾患の治療のために、多くの治療レジメが開発されている。例えば、「生物学的治療」は、これらの疾患に対する治療アプローチに多くの進歩をもたらした。そのような治療にはしばしば、遺伝子操作されたタンパク質を用いることが含まれる。例えば、特定の基礎となる自己免疫プロセスを調節するように設計されたモノクローナル抗体および受容体-免疫グロブリン融合タンパク質を用いることができ、それによってしばしば全身性の免疫抑制のような特定の問題となる作用を回避することができる。そのような治療にはまた、主要組織適合抗原複合体II-抗原-T細胞受容体相互作用を含む「三分子複合体」を妨害する化合物を用いることが含まれる。
【０００５】
他の治療レジメは、抗原提示細胞およびサイトカインアゴニストと共にアンタゴニストを用いることによって、T細胞活性化およびT細胞相互作用の二次シグナルを遮断するように設計される。
【０００６】
なお他の治療には、炎症プロセスにおける重要なサイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFα）に影響を及ぼすように設計されたレジメが含まれる。例えば、一つのそのようなレジメでは、TNF経路を妨害して、短期的な臨床有効性および認容性を提供するために、抗TNF試薬が用いられる。そのような抗TNF試薬には、キメラモノクローナル抗TNFαであるインフリキシマブ、可溶性TNFα受容体、エタナセプト、およびタリドマイドが含まれる。そのような治療化合物はまた、例えば、インターロイキン-1（IL-1）にも影響を及ぼして、インビボでのIL-1の産生が遮断される。IL-1産生の遮断は、有用な作用を有する可能性があるが、そのような作用の性質はなおも決定しなければならない。
【０００７】
活動性リウマチ性関節炎（アメリカリウマチ学会（ACR）によって機能的クラスI〜IIIとして定義）を有し、これまでに一つより多いまたは一つの疾患修飾抗リウマチ薬（DMARD）による治療に対して反応しなかった患者を治療するために、TNFαの75 kD受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ヒトIgG1の定常部分とからなる融合タンパク質であるエタナセプトを、単独でまたはメソトレキセートと併用して用いたところ、全てのコアACR疾患活動性測定手段に改善を示した。
【０００８】
先に述べた様々な治療レジメは、自己免疫疾患の治療にある程度の成功を示しているが、そのような生物物質の長期投与に関連した問題はまだわかっていない。IL-1およびTNFαはいずれも、正常な宿主防御において重要な役割を果たしており、それらの産生または作用を遮断することによる合併症が患者に起こる可能性がある。最終的に、長期試験においてそのような治療を注意深く評価する必要がある。また、そのような治療によって、重篤な感染症の発生率が増加して、特に重度の疾患患者において新生物細胞に対する制御の程度が減少する可能性があることも懸念される。注射したモノクローナル抗体に対する抗グロブリン反応の発生および低分子量阻害剤の薬物動態が不良であることも、さらなる問題である。
【０００９】
自己免疫疾患の治療におけるその他の進歩には、併用治療の限られた使用が含まれる。例えば、実験的自己免疫性脳炎（EAE）の治療レジメは、サイトカイン治療と併用した抗原特異的免疫治療を用いて調べられている。この例において、インターロイキン-4（IL-4）遺伝子の局所遺伝子輸送を、寛容化DNAワクチン接種、すなわち自己ペプチドプロテオリピッドタンパク質をコードするワクチンのDNAと共に投与する。この治療は、異なる二つのDNAを同時輸送すると、EAEに対して保護免疫を提供し、輸送された裸のDNAからのIL-4を発現させ、これが分泌されて自己反応性T細胞上で局所的に作用し、細胞のサイトカインプロフィールをTh2方向にシフトさせることによって、確立されたEAEを逆転させることを示した。したがって、この戦略は、DNAワクチン接種の抗原特異的作用と局所遺伝子輸送の有用な作用とを組み合わせたものである。しかし、治療の方法論は、所望の免疫調節に対して定方向の制御を示さなかった。免疫応答の調節の制御能が証明されていないために、そのようなレジメの最終的な有効性は不明である。
【００１０】
このように、副作用を倍加させることなく免疫疾患の治療において免疫調節をより直接提供することができるさらなる併用治療が必要である。本発明は、この要求を満足して、エピトープ特異的およびサイトカインまたは抗サイトカイン免疫療法の併用を用いて、病原性免疫応答の制御された調節を可能にする免疫媒介疾患の免疫治療に対する広いアプローチを通してさらなる長所を提供する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
第一の態様において、本発明の方法は、免疫媒介疾患プロセスの有効な制御を得るために、エピトープ特異的およびサイトカイン／抗サイトカイン治療の併用を提供する。特に好ましい態様において、本発明の方法は、先天性および後天性免疫のアップまたはダウンレギュレーションを通して、免疫の持続的な調節および疾患の発現の制御を提供する。そのような方法が有効であると企図される疾患の例には、リウマチ性関節炎、I型糖尿病、多発性硬化症、および炎症性腸疾患が含まれるがこれらに限定されない。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明の方法は、エピトープ特異的免疫応答を同定して調節するメカニズムを、サイトカイン媒介反応をアップまたはダウンレギュレートするための戦略と組み合わせることを提供する。もう一つの態様において、本発明の方法によって、病原性免疫応答の特異的かつ制御された調節が得られ、最終的に疾患の制御が生理的で非毒性かつ費用効果の高いように得られる。本発明の態様は、TNFα、TNFβ、IFNα、IFNβ、またはIFNγ、またはIL-1、IL-4、IL-6、IL-10、IL-15、およびIL-23を含むがこれらに限定されない免疫調節性サイトカインに関連する炎症および／または寛容原反応に関連したサイトカイン媒介反応の調節を企図する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明の方法は、抗原特異的事象が支配的であって、疾患の転帰におそらく関連する免疫応答の時点まで反応が逆戻りするように、病原性免疫応答を調節することを提供する。抗原事象の「支配的」とは、そのような事象の影響が、疾患の発病および転帰を誘発する、永続させる、またはいずれにせよ影響を及ぼすために十分に関連することを意味する。「おそらく関連する」とは、影響が理論で示されるが証明されていないことを意味し、「関連する」とは、発病における役割を支持する証拠が存在することを意味する。関連する態様において、抗サイトカイン治療とエピトープ特異的治療とを併用すると、抗原特異的事象の介入は、所望の抗原特異的調節を永続的および特異的に誘導することができる。特に好ましい態様において、そのような調節によって臨床的に検出可能な疾患の改善が得られる。
【００１４】
さらに関連する態様において、本発明の方法は、現行の毒性で非特異的な、制御されない高価なサイトカイン／抗サイトカイン治療の必要性を減少させながら、疾患の改善を抗原特異的に提供する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、免疫応答関連障害を有する被験者における免疫応答を調節する方法を提供する。方法には、a）投与がエピトープ特異的なT細胞免疫調節を提供する、抗原特異的エピトープの治療的有効量を投与する段階、およびb）サイトカインの治療的有効量、またはサイトカインの活性もしくは発現に影響を及ぼす物質の調節有効量を投与する段階が含まれ、a）およびb）の投与は、被験者における免疫応答を調節する。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明には、免疫のプロセスおよび免疫媒介疾患の発病を調節する方法が含まれる。方法には、a）少なくとも一つの適したエピトープを同定すること；b）免疫媒介疾患に関連した少なくとも一つの細胞タイプを同定すること；およびc）投与が免疫媒介疾患に対する免疫応答を誘導する、抗原特異的およびサイトカインまたは抗サイトカイン治療の併用を投与する段階が含まれる。
【００１７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、免疫応答関連障害を有する被験者を治療する方法を提供する。方法には、a）投与がエピトープ特異的T細胞免疫調節を提供する、抗原特異的エピトープの治療的有効量を投与する段階；およびb）サイトカインの治療的有効量、またはサイトカイン活性もしくは発現に影響を及ぼす物質の調節有効量を投与する段階が含まれ、a）およびb）の投与は、被験者における免疫応答を調節して、それによって被験者を治療する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、非毒性で費用効果の高い方法で限定された長期作用を有する病原性反応の調節を引き起こすように免疫細胞を刺激する免疫療法の方法に向けられる。本発明の方法を用いることによって、病原性免疫応答は制御および／または調節される可能性がある。したがって、病原性反応が由来する自己免疫疾患も同様に制御または改善される可能性がある。
【００１９】
免疫療法は、それによって免疫系の細胞が疾患、感染症、または増殖と戦うために用いられるまたは刺激されるプロセスである。そのような療法は受動的でも能動的であってもよい。受動的免疫療法は、疾患と戦う物質（例えば、抗体）の直接投与を含む。逆に、能動的免疫療法は、疾患と戦う自身の天然の物質を産生するように免疫系の細胞を刺激する物質の投与を含む。
【００２０】
一つの態様において、本発明は、抗原特異的エピトープの治療的有効量と、サイトカインの病理生理学的役割を調節する化合物の治療的有効量とを投与することによって、免疫応答が調節される可能性がある方法を含む。
【００２１】
本発明の方法における化合物の投与は、当業者に既知の任意の方法によって行ってもよい。そのような方法には、粘膜、静脈内（iv）、皮下（sc）、または筋肉内（im）投与による直接投与が含まれるがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明の方法には、タンパク質がT細胞免疫応答の標的である、T細胞エピトープからのタンパク質の同定が含まれる。「T細胞エピトープ」とは、拘束するMHC分子の意味において、T細胞によって認識される連続したアミノ酸配列を意味する。一つの態様において、本発明は、コンピュータープログラミングによるタンパク質内のエピトープ組成予測と実際のエピトープマッピング法との組み合わせを含む。これらのコンピュータープログラムおよびマッピング技術は、当業者に十分に理解されている。関連する態様において、エピトープ特異的T細胞は、表現型によっておよび機能的に特徴が示されている。「表現型によって」とは、膜タンパク質を同定する表現型特徴を意味する。「機能的」とは、抗原に関連した細胞反応、例えば、細胞の増殖ならびに細胞間および細胞内メディエータの産生を同定する特徴付けを意味する。次に、そのような特徴を、疾患の活動性および重症度を含む臨床変数と相関させる。所定の病原性経路に関連したエピトープがそれによって同定される。
【００２３】
したがって、所定の病原性経路に関連することが判明したエピトープも同様に、それに対するエピトープが求められる任意の特定の疾患状態における炎症のアップまたはダウンレギュレーションのいずれかに関連する。自己反応性の制御が臨床の改善に至る可能性がある、自己免疫のような病的状態では、ダウンレギュレーションが望ましい。炎症の生成が防御の改善に至る可能性がある疾患ではアップレギュレーションが望ましい。そのような疾患の例には、外来の生物学的および化学物質によって引き起こされた感染症ならびに癌が含まれるがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明の一つの態様において、エピトープまたはエピトープ特異的T細胞は、以下によってしかしこれらに限定されずに同定され、特徴が調べられる：
i）免疫学的に関連するタンパク質上の推定のエピトープのコンピューターによる分析（例えば、米国特許第6,037,135号を参照されたい）；
ii）当業者に既知の手段による、インビボおよびインビトロ動物モデルにおける、ならびにインビトロまたはエキソビボでのヒト疾患における抗原性の評価；
iii）蛍光色素のタグをつけた人工抗原提示細胞による患者の試料からのエピトープ特異的T細胞の同定および単離（PCT/US/99/24666に記載のような）；ならびに
iv）当業者に既知の手段による単離されたエピトープ特異的T細胞の特徴付け。
【００２５】
抗原特異的エピトープの特定の例には、表1における以下の任意のペプチドにおけるエピトープがさらに含まれる。これらのペプチドには、熱ショック60（HSP60）タンパク質ならびにヒトおよび原核細胞（すなわち、マイコバクテリアまたは大腸菌（E. coli））起源のdnaJタンパク質の誘導体または変異体／類似体が含まれるがこれらに限定されない。
【００２６】
【表１】
2005532981.tif 000003
2005532981.tif 000004
【００２７】
さらにもう一つの態様において、免疫療法は、「誘導」および「休息」治療期間を含む少なくとも二つの異なる相において実施される。
【００２８】
「誘導期間」とは、調節的なエピトープ特異的T細胞反応を生成させるために非特異的炎症のダウンレギュレーションに用いられる期間を意味する。この期間において、被験者の患者を、対象となる特定の疾患状態において重要なサイトカインをアップまたはダウンレギュレートする化合物の投与と抗原特異的免疫調節との併用によって治療する。この治療期間の目的は、抗原特異的T細胞調節にとって適当な環境を作製することである。
【００２９】
作製された免疫学的環境は、アップまたはダウンギュレーションの必要性があるか否かに依存する。例えば、炎症のダウンレギュレーションを必要とする場合（例えば、自己免疫）、一つまたはそれ以上の前炎症性または活性化サイトカインの遮断、阻害、または破壊を行う。逆に、抗原特異的T細胞反応のアップレギュレーションが望ましい場合、防御免疫応答を強化するために、免疫刺激サイトカインが用いられる。アップレギュレーションは、例えば、感染疾患の治療、ワクチン接種、および癌レジメにおいて望ましい可能性がある。先に述べたアップまたはダウンレギュレーションにおいて用いることができる免疫調節性サイトカインには、所望の転帰に応じて、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TNFβ、TGFβ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、およびIL-23が含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
本明細書において用いられるように、「サイトカイン」という用語は、ケモカイン、インターロイキン、リンフォカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、および受容体関連タンパク質、ならびにその機能的断片を含む。本明細書において用いられるように、「機能的断片」という用語は、既定の機能的アッセイを通して同定される生物機能または活性を有するポリペプチドを意味する。
【００３１】
タンパク質様リガンド部分として有用なサイトカイン、コロニー刺激因子（CSF）、およびインターロイキン（IL）には、内皮単球活性化ポリペプチドII（EMAP-II）、顆粒球マクロファージ-CSF（GM-CSF）、顆粒球-CSF（G-CSF）、マクロファージ-CSF（M-CSF）、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、およびIL-13等が含まれ、これらはそれぞれ、EMAP-II、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13ファミリーのサイトカイン受容体等に結合して、細胞または細胞メカニズムにおける特定の生物学的、形態的、または表現型変化に関連する。
【００３２】
サイトカインの可溶性受容体も同様に、それらがサイトカインの天然の標的と競合するように投与されうるという点において、抗サイトカインとして作用することによって本発明の方法において利用してもよい。本発明に応用可能な可溶性受容体の例には、IL-1およびTNFαに対して特異的な可溶性受容体が含まれるがこれらに限定されない。そのような可溶性受容体の産生およびそのそれぞれの利用は、当業者に周知である。
【００３３】
サイトカイン拮抗剤はいくつかの形となりうる。それらはモノクローナル抗体であってもよい。それらはモノクローナル抗体断片であってもよい。それらは、そのサイトカインに対する可溶性の受容体の形であってもよい。可溶性受容体は体内を自由に循環する。それらがその標的サイトカインに遭遇すると、それに結合して、サイトカインを有効に不活化し、それ以降サイトカインは体内のその生物学的標的にもはや結合することができなくなる。このように、本発明のサイトカイン拮抗剤には、可溶性受容体またはその断片も含まれる。さらにより強力な拮抗剤は、免疫グロブリン分子の特異的な一部（Fc断片）と融合させた二つの可溶性受容体からなる。これは、標的に対する高い親和性およびより長い半減期を有する二つの可溶性受容体からなる二量体を生成する。この新しい分子は融合タンパク質と呼ばれる。融合タンパク質と呼ばれるこの新しいタイプの分子の例は、エタナセプト（エンブレル（登録商標））である。
【００３４】
天然に存在するサイトカインであるTNFは、炎症反応、免疫応答、および感染に対する反応において重要な役割を果たす。TNFは、前駆体である膜貫通タンパク質の切断によって形成され、インビボで凝集して三分子複合体を形成する可溶性の分子を形成する。次に、これらの複合体は、多様な細胞上に認められる受容体に結合する。結合は、IL-6、IL-8およびIL-1を含む他の免疫調節性サイトカインの放出；マトリクスメタロプロテナーゼの放出；および白血球を血管外組織に誘引することによって炎症および免疫カスケードをさらに増幅する、内皮接着分子の発現のアップレギュレーションを含む、一連の作用を生じる。
【００３５】
インターロイキン（IL-1）は、脳、脊髄、網膜、筋肉、および体内のあらゆるところで起こる炎症反応に関与しているサイトカインである。体内には、IL-1の天然の阻害剤が二つ存在する：IL-1受容体拮抗剤（IL-1 RA）およびII型IL-1受容体（II型IL-1 R）。本特許の目的に関するさらなるIL-1阻害剤は、可溶性IL-1受容体：ヒトIgG分子のFc部分に結合した二つのIL-1受容体からなる融合タンパク質（IL-1 R-FP）；およびIL-1に対する親和性が高いモノクローナル抗体。IL-6およびIL-8はいずれも、免疫調節性サイトカインである。
【００３６】
サイトカインの活性もしくは発現またはサイトカイン受容体を調節するために被験者に投与するために有用な物質にはまた、抗体もしくはその断片、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、有機低分子、またはサイトカインのシグナル伝達のアゴニストとして、もしくはサイトカインのシグナル伝達のアンタゴニストとして直接もしくは間接的に作用しうる如何なる他の物質も含まれる。もう一つの態様において、物質は、細胞によって発現されたサイトカインまたはサイトカイン受容体と特異的に相互作用することができる。例えば、ペプチド物質は、抗サイトカインもしくはサイトカイン受容体抗体、または抗サイトカインもしくはサイトカイン抗体の抗イディオタイプ抗体として表される。そのようなペプチド物質は、それがサイトカインまたはサイトカイン受容体と特異的に相互作用して、それによって受容体に関してサイトカインと競合できることに関して選択されうるのみならず、例えば、サイトカインシグナル伝達を活性化できないようにさらに選択されうるというさらなる長所を提供する。
【００３７】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、その最も広い意味においてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共に、そのような抗体の抗原結合断片を含めるように用いられる。本発明の方法において有用な抗体またはその抗原結合断片は、例えば、エピトープの特異的結合活性を有することを特徴とする。さらに上記のように、本発明の抗体は、ポリペプチドのペプチド部分に特異的に結合する抗体となりうる。
【００３８】
抗体に参照して用いる場合の「特異的に結合する」または「特異的結合活性」という用語は、抗体および特定のエピトープとの相互作用の解離定数が、少なくとも約1×10-6、一般的に少なくとも約1×10-7、通常少なくとも約1×10-8、および特に約1×10-9または1×10-10またはそれ未満であることを意味する。そのため、エピトープの特異的結合活性を保持する抗体のFab、F(ab')2、FdおよびFv断片が抗体の定義に含まれる。本発明の目的に関して、抗体は、サイトカインまたはサイトカイン受容体のエピトープに特異的に反応してもよく、例えば、抗体が、関連するサイトカインまたはサイトカイン受容体と比較して、サイトカインまたはサイトカイン受容体に関して少なくとも2倍大きい結合親和性、一般的に少なくとも5倍大きい結合親和性、特に少なくとも10倍大きい結合親和性を有すれば、もう一つのサイトカインまたはサイトカイン受容体と実質的に交叉反応しないと見なされる。
【００３９】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、例えば一本鎖抗体、キメラ、双機能、およびヒト化抗体と共にその抗原結合断片を含む、天然に存在する抗体と共に天然に存在しない抗体が含まれる。そのような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ、または例えば、可変重鎖と可変軽鎖からなる組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（Huseら、Science 246：1275〜1281（1989）を参照されたい）。例えば、キメラ、ヒト化、CDR移植、一本鎖、および双機能抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である（WinterおよびHarris、Immunol. Today 14：243〜246、1993；Wardら、Nature 341：544〜546、1989；HarlowおよびLane、「Antibodies：A laboratory manual」、（コールドスプリングハーバー研究所出版、1988）；Hilyardら、「Protein Engineering：A practical Approach」、（IRL出版、1992）；Borrabeck、「Antibody Engineering」、第二版（オックスフォード大学出版、1995））。
【００４０】
望ましければ、本発明の抗体において有用な抗体または他の物質を組み入れるキットを調製することができる。そのようなキットは、物質の他に、物質を被験者に投与するためにその中に溶解することができる薬学的組成物を含みうる。キットはまた、例えば、抗体を検出するための試薬、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体に対する抗体の特異的結合を検出するための試薬を含みうる。抗体を標識またはそうでなければ同定するために有用なそのような検出可能な試薬は、本明細書において記述され、当技術分野で既知である。
【００４１】
例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類においてポリクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera」、Immunochemical Protocols（Manson編、ヒュマナ出版、1992）、1〜5頁；Coliganら、「Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters」、Curr. Protocols. Imuunol.（1992）、2.4.1章）。さらに、モノクローナル抗体は、当技術分野で周知であって日常的である方法を用いて得ることができる（HarlowおよびLane、上記、1988）。例えば、サイトカインもしくはサイトカイン受容体、またはそのエピトープ断片によって免疫したマウスからの脾細胞を、SP/02骨髄腫細胞のような適当な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生することができる。クローニングしたハイブリドーマ細胞株を、標識抗原を用いてスクリーニングして、適当な特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定することができ、所望の特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離して、連続的な抗体源として利用することができる。抗体はさらに、サイトカインまたはサイトカイン受容体と特異的に結合できないことに関してさらにスクリーニングすることができる。そのような抗体は、例えば、臨床で用いるための標準的なキットを調製するために有用である。例えば、一本鎖抗サイトカインまたはサイトカイン受容体抗体を発現する組換え型ファージはまた、標準化キットを調製するために用いることができる抗体も提供する。
【００４２】
モノクローナル抗体を調製する方法は周知である（例えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256：495、1975；同様にColiganら、上記、1992、2.5.1〜2.6.7章；HarlowおよびLane、上記、1988を参照されたい）。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射すること、血清試料を採取することによって抗体産生の有無を確認すること、脾臓を採取してBリンパ球を得ること、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
【００４３】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテイン-Aセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー（Coliganら、上記、1992、2.7.1〜2.7.12章および2.9.1〜2.9.3章を参照されたい；同様にBarnesら、「Purification of Immunoglobulin G（IgG）」、Meth. Molec. Biol. 10：79〜104（ヒュマナ出版、1992）を参照されたい）を含む、十分に確立された多様な技術によってハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ複製法は、当業者に周知である。インビトロ複製は、選択的に仔ウシ胎児血清のような哺乳類血清または微量元素および正常マウス腹腔浸出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージのような増殖維持添加剤を添加したダルベッコ改変イーグル培地またはRPMI 1640培地のような適した培養培地において行うことができる。インビトロでの産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、所望の抗体の大量を生成するように規模を拡大することができる。大規模ハイブリドーマ培養は、エアリフト型リアクター、連続攪拌リアクター、または固定もしくは捕捉細胞培養における均一な浮遊培養によって行うことができる。インビボでの複製は、親細胞と組織適合性である哺乳類、例えば同系マウスに細胞クローンを注射して、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすことによって行うことができる。選択的に、動物は、炭化水素、特に注射前にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油によってプライミングする。1〜3週間後、所望のモノクローナル抗体を動物の体液から回収する。
【００４４】
本明細書に開示の抗体の治療応用も同様に、本発明の一部である。例えば、本発明の抗体はまた、ヒトより下位の霊長類抗体に由来しうる。ヒヒにおいて治療的に有用な抗体を産生する一般的技術は、例えば、Goldbergら、国際公開公報第91/11465号（1991）、およびLosmanら、Int. J. Cancer 46：310、1990に認めることができる。
【００４５】
治療的に有用な抗サイトカインまたはサイトカイン受容体抗体はまた、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来しうる。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変鎖からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移入して、次に、マウス相対物のフレームワーク領域におけるヒト残基を置換することによって産生される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を利用することによって、マウス定常領域の免疫原性に関連する可能性がある問題が回避される。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技術は既知である（例えば、Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：3833、1989）。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術も同様に既知である（例えば、Jonesら、Nature 321：522、1986；Riechmannら、Nature 332：323、1988；Verhoeyenら、Science 239：1534、1988；Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：4285、1992；Sandhu、Crit. Rev. Biotechnol. 12：437、1992；およびSingerら、J. Immunol. 150：2844、1993を参照されたい）。
【００４６】
本発明の抗体はまた、組み合わせ免疫グロブリンライブラリから単離したヒト抗体断片に由来しうる（例えば、Barbasら、「METHODS：A Companion to Methods in Immunology」2：119、1991；Winterら、Ann. Rev. Immunol. 12：433、1994を参照されたい）。ヒト免疫グロブリンファージライブラリを産生するために有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えばストラタジーンクローニングシステム（ラホヤ、カリフォルニア州）から得ることができる。
【００４７】
本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体に由来しうる。そのような抗体は、抗原チャレンジに反応して特異的ヒト抗体を産生するように「操作されている」トランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖座の要素を、内因性の重鎖および軽鎖座の標的化破壊を含む胚幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、Greenら、Nature Genet. 7：13、1994；Lonbergら、Nature 368：856、1994；およびTaylorら、Int. Immunol. 6：579、1994によって記述されている。
【００４８】
本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質分解加水分解によって、または断片をコードするDNAの大腸菌における発現によって調製することができる。抗体断片は、通常の方法によって抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生することができ、F(ab')2と呼ばれる5S断片を提供する。この断片は、チオール還元剤、および選択的に、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のブロッキング基を用いてさらに切断して、3.5S Fab'一価断片を生成することができる。または、ペプシンを用いる酵素的切断は、二つの一価Fab'断片とFc断片とを直接生成する（例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号、および米国特許第4,331,647号；およびそこに含まれる参考文献；Nisonhoffら、Arch. Biochem. Biophys. 89：230、1960；Porter、Biochem. J. 73：119、1959；Edelmanら、Meth. Enzymol. 1：422（アカデミック出版、1967）を参照されたい；同様にColiganら、上記、1992、の第2.8.1〜2.8.10章および第2.10.1〜2.10.4章を参照されたい）。
【００４９】
重鎖を分離して一価の軽鎖／重鎖断片を形成するような抗体を切断する他の方法、または断片をさらに切断する、または他の酵素、化学、もしくは遺伝子技術も同様に、断片が、無傷の抗体によって認識される抗原に特異的に結合する限り、用いることができる。例えば、Fv断片はVHおよびVL鎖の会合を含む。この会合は、非共有結合となりうる（Inbarら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：2659、1972）。または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって結合させることができ、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によってクロスリンクさせることができる（Sandhu、上記、1992）。好ましくは、Fv断片は、ペプチドリンカーによって接続したVHおよびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（sFv）は、オリゴヌクレオチドによって結合したVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入して、これをその後大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え型宿主細胞は、リンカーペプチドによって二つのVドメインを架橋した一本鎖ポリペプチドを合成する。sFvsを産生する方法は、例えば、Whitlowら、「Methods：A Companion to Methods in Enzymology」2：97、1991；Birdら、Science 242：423〜426、1988；Ladnerら、米国特許第4,946,778号；Packら、Bio/Technology 11：1271〜1277、1993に記述されており；同様にSandhu、上記、1992を参照されたい。
【００５０】
もう一つの形の抗体断片は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最少認識単位」）は、対象となる抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のRNAからの可変領域を合成するために、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製される（例えば、Larrickら、「Methods：A Companion to Methods in Enzymology」2：106、1991を参照されたい）。
【００５１】
抗体（免疫グロブリン）は、特定の外因性異物分子（抗原）に反応したリンパ球の一つのクラス（B細胞）によって産生されるタンパク質である。単一の抗原を認識する同一の免疫グロブリンコピーであるモノクローナル抗体（mAb）は、単一のB細胞のクローン（同一のコピー）に由来する。この技術によって、特異的標的を有する大量の免疫グロブリンを大量生産することができる。
【００５２】
特定のサイトカインに対して高い親和性を有するモノクローナル抗体は、サイトカインの生物活性を減少させる傾向がある。サイトカインの生物作用を減少させる物質は、以下の任意の方法で：サイトカイン遮断剤として；サイトカイン阻害剤として；またはサイトカインアンタゴニストとして、記述することができる。本特許出願において、遮断剤、阻害剤、およびアンタゴニストという用語は、サイトカインに関して互換的に用いられる。
【００５３】
バイオテクノロジーの進歩によって、モノクローナル抗体を単に用いた場合と比較して改善された分子が得られた。そのような一つの分子は抗体断片である。抗体構造の一部を除去することによって、この分子の機能を、それがヒト抗体において異なるように作用するように変化させる。モノクローナル抗体および可溶性受容体とは異なるもう一つの新しいタイプの分子は、融合タンパク質である。そのような分子は、ヒトの体内において単純な可溶性受容体または複数の受容体とは異なるように作用する異なる機能を有する。
【００５４】
本発明の方法において有用な物質はまた、ポリヌクレオチドとなりうる。一般的に、しかし必ずしもそうである必要はないが、ポリヌクレオチドは、それが直接または転写もしくは翻訳もしくはその両者の後に、その機能を発揮する細胞に導入される。例えば、ポリヌクレオチド物質は、細胞において発現され、サイトカインまたはサイトカイン受容体活性を調節するペプチドをコードしうる。発現されたそのようなペプチドは、例えば可溶性サイトカインもしくはサイトカイン受容体細胞外ドメイン；膜接着ドメインに機能的に会合したサイトカインもしくはサイトカイン受容体細胞外ドメイン；または活性を欠損する変異体サイトカインもしくはサイトカイン受容体のような、変異体サイトカインもしくはサイトカイン受容体となりうる。
【００５５】
本発明の方法を実行するために有用なポリヌクレオチド物質を含む本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞に直接接触させることができる。例えば、アンチセンス分子、リボザイム、または三重物質として有用なオリゴヌクレオチドを、それらが中に入ってその作用を発揮する標的細胞に直接接触させることができる。ポリヌクレオチド物質はまた、ポリペプチド、例えば受容体（またはサイトカイン自身）と特異的に相互作用して、それによってサイトカインの受容体との特異的相互作用能を変化させることができる。そのようなポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを作製および同定する方法と共に、本明細書に開示され、またはそうでなければ当技術分野において周知である（例えば、O'Connelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：5883〜5887、1996；TuerkおよびGold、Science 249：505〜510、1990；Goldら、Ann. Rev. Biochem. 64：763〜797、1995を参照されたい）。
【００５６】
発現ベクターは、例えば、コードするポリヌクレオチドの持続的な転写を得るために必要な発現要素を含みうる、または調節要素を、それがベクターにクローニングされる前にポリヌクレオチドに機能的に結合させることができる。発現ベクター（またはポリヌクレオチド）は、一般的に、コードするポリヌクレオチドの構成的発現、または望ましければ誘導型、もしくは組織特異的もしくは発達段階特異的発現を提供しうるプロモーター配列、ポリA認識配列、およびリボソーム認識部位または内部リボソーム流入部位、または組織特異的となりうるエンハンサーのような他の調節要素を含む、またはコードする。ベクターはまた、原核または真核宿主系または望ましければその双方において、複製にとって必要な要素を含みうる。バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターのようなプラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれるそのようなベクターは、周知であり、販売元（プロメガ（Promega）、マディソン、ウィスコンシン州；ストラタジーン（Stratagene）、ラホヤ、カリフォルニア州；ギブコ/BRL（GIBCO/BRL）、ガイサースバーグ、メリーランド州）から購入することができ、または当業者によって構築することができる（例えば、Meth. Enzymol. 第185巻、Goeddel編（アカデミック出版インク、1990）；Jolly、Canc. Gene Ther. 1：51〜64、1994；Flotte, J.、Bioenerg. Biomemb. 25：37〜42、1993；Kirshenbaumら、J. Clin. Invest. 92：381〜387、1993を参照されたい）。
【００５７】
本発明のサイトカイン／抗サイトカイン療法を投与するメカニズムには、i）粘膜、静脈内（iv）、皮下（sc）、または筋肉内（im）経路によるサイトカインの直接投与；ii）一つまたはそれ以上のサイトカインをコードするDNA構築物の注射；iii）同じ微小環境における可溶性サイトカインによる関連する細胞サブタイプ（例えば、TまたはB細胞）のエキソビボ条件付け；iv）可溶性または膜結合型サイトカイン受容体に結合するように設計された抗体（例えば、ヒト、ヒト以外、および／またはキメラ）の投与；v）可溶性または膜結合型サイトカインに結合するように設計された抗体（例えば、ヒト、ヒト以外、および／またはキメラ）の投与；およびvi）天然に放出されたサイトカインの生理的標的を妨害するように操作された可溶性サイトカイン受容体、が含まれるがこれらに限定されない。さらなる処置は当業者に既知である。
【００５８】
本発明に従うエピトープ特異的治療の誘導は、上記のように、適したエピトープをまず同定して、次に、免疫応答を調節することができるT細胞のインビボおよび／またはエキソビボでの生成を提供する。エピトープ特異的治療のアプローチの例には、以下を含むがこれらに限定されないエピトープ特異的反応の調節をインビボおよびエキソビボで誘導するための様々なアプローチが含まれる：
i）粘膜（すなわち、鼻腔または口腔）寛容による免疫調節ペプチドに対する寛容；
ii）タンパク質およびエピトープ、またはそのようなタンパク質もしくはエピトープをコードするDNAによるsc、iv、またはim免疫によるエピトープ特異的免疫応答の強化；
iii）インビボおよびエキソビボでのエピトープ特異的調節T細胞の増殖によるエピトープ特異的反応の調節；および
iv）条件環境を有する、または有しない人工的抗原提示細胞によるエピトープ特異的T細胞のエキソビボでの調節。「条件づけ環境」とは、培地に可溶性のメディエータ（例えば、サイトカイン）に加えることによって、および／または所定のT細胞反応を誘導することができる可溶性もしくは支持体結合分子（例えば、共刺激分子）によってT細胞反応が調節される可能性がある微小環境を意味する。
【００５９】
本発明の方法において、誘導期間は上記の双方の治療が作用するために必要な時間持続し、誘導期間は、サイトカイン／抗サイトカイン方向の治療が、アップまたはダウンレギュレーションを通して望ましいように免疫環境を変化させるための時間、およびエピトープ特異的T細胞が増殖するための時間を含む。一般的に、この期間は1ヶ月〜3ヶ月を要し、好ましくは、ヒトにおいて2ヶ月を要する。この期間は、個々の治療に従って変化する可能性がある。
【００６０】
エピトープ特異的T細胞の有効な誘導は、好ましくは、T細胞調節をモニターする手段によって、例えば、T細胞の捕捉によってPCT/US/99/24666に記載のメカニズムによって、モニターされる。そのようなモニタリングはまた、当業者に既知の他の手段によって行ってもよい。
【００６１】
対象となる所望の特異性の調節T細胞が、上記のエピトープ特異的反応の生成によって産生されている（すなわち、免疫応答を調節することができる機能的および表現型特徴を有するT細胞集団）ことが証明された後、休息期間を行う。T細胞集団の生成および特徴をモニターするメカニズムは、i）蛍光色素のタグをつけた人工抗原提示細胞によるT細胞捕捉；ii）四量体技術；iii）二量体技術；およびiv）フローサイトメトリーによるCD69+細胞のモニタリングを含むが、これらに限定されない。「T細胞捕捉」とは、PCT/US/99/24666に記載されるように、人工抗原提示細胞による抗原特異的細胞の同定、単離、および操作を意味する。「四量体技術」とは、所望の特異性の細胞を同定するために用いられる組換え型の多重（4×）MHC／ペプチド複合体を意味する。「二量体技術」とは、所望の特異性の細胞を同定するために用いられる組換え型多重（2×）MHC／ペプチド複合体を意味を意味する（例えば、米国特許第5,635,363号を参照されたい）。
【００６２】
エピトープ特異的ペプチドは、多様な方法で調製してもよい。都合のよいことに、それらは、自動シンセサイザーを用いる通常の技術によって合成することができ、または手動で合成してもよい。または、特定のペプチドをコードするDNA配列を調製して、これをクローニングおよび発現して、所望のペプチドを提供してもよい。この場合、メチオニンが最初のアミノ酸であってもよい。さらに、ペプチドは、特異的結合対の一つであるタンパク質との融合体として組換え法によって産生してもよく、アフィニティ試薬によって融合タンパク質を精製した後、通常、所望のペプチドを生成するように操作された部位でタンパク質分解による切断を行ってもよい（例えば、Driscollら（1993）、J. Mol. Bio. 232：342〜350を参照されたい）。ペプチドはまた、天然資源から単離して、例えば、イオン交換材料上でのクロマトグラフィー、大きさによる分離、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および電気泳動を含む既知の技術によって精製してもよい。hsp60に由来するペプチドならびにヒト、マイコバクテリア、および大腸菌からのdnaJは本発明において特に重要であり、有用である。
【００６３】
サイトカイン／抗サイトカイン治療を中止または劇的に減少させる休息期間のあいだ、エピトープ特異的免疫療法は継続する。したがって、非毒性で十分に集中的に制御された休息期間の利益が提供され、非特異的サイトカイン／抗サイトカイン治療の望ましくない作用が消失または減少する。下記の実施例1に提供するように、このアプローチは、誘導相後の抗サイトカイン治療を完全に中止しても、自己免疫疾患における制御可能な免疫療法による寛解の誘導および維持において持続的な抗サイトカイン治療として有効であることが示される。
【００６４】
この併用治療レジメの応用は、免疫調節に対して感受性がある多数の疾患状態において貴重である。任意の数のサイトカインおよびケモカインのアップまたはダウンレギュレーションを操作してもよい。例えば、下記の実施例1に記載するように、IL-10およびTGFβのみならず、本明細書に記載の他のサイトカインを制御的に調節できる。
【００６５】
二部治療レジメは、非特異的アプローチに当てはまる従来の方法よりむしろ、対象となる疾患に対して特異的なエピトープの同定を提供する。エピトープのこのような同定を、特定の疾患に直接関連する宿主病理生理学の特異的免疫調節と組み合わせる。そのようなペプチド特異的療法によって、ペプチド特異的T細胞の絶対数の変化を、それらが病理プロセスに関係しているためにT細胞反応の量と共に決定することができる。熱ショックペプチド180-188を用いてアプローチを適用する下記の実施例1は、この方法が、熱ショックタンパク質に由来するもののようなペプチドエピトープに応用可能であることを示している。特に、宿主の病理生理学の調節と組み合わせた場合に、実質的な利益を提供する微調整された／制御された免疫調節を、免疫治療レジメを用いて操作することができる。この新規の制御可能なアプローチによって最終的に、患者に投与される「従来の」治療物質の使用は有意に減少し、経済的および臨床利益の双方を提供する。
【００６６】
当業者は、本発明が免疫媒介疾患における病原性免疫応答を調節するために免疫治療において用いられるように十分に適合されることを容易に認識するであろう。
【００６７】
本発明は、エピトープ特異的免疫応答が同定されている、被験者における関節炎のような障害を改善する方法を提供する。そのような障害には、リウマチ性関節炎および変形性関節炎が含まれてもよいがこれらに限定されない。
【００６８】
本明細書において用いられるように、「改善」という用語は、同定された障害に関連する兆候または症状が弱められることを意味する。モニターすべき兆候または症状は、特定の障害の特徴であり、兆候および病態をモニターする方法と共に当業者に周知であろう。例えば、障害がリウマチ性関節炎の場合、臨床医は、被験者によって示される関節の運動度および器用さの増加、より低いサイトカインレベルもしくはより少ない炎症細胞によって示される炎症反応の減少、または撮像法によって証明される関節および／または軟骨破壊のレベルの減少もしくは割合の減少が、関節炎を改善する本発明の方法の指標であること知っているであろう。同様に、障害が変形性関節炎である場合、臨床医は、関節および／または軟骨の障害の減少が関節炎の改善を示すことを知っているであろう。非特異的サイトカイン／抗サイトカイン治療の望ましくない作用が消失または減少する、重点的および制御された強化されたアプローチが提供される。下記の実施例に提供するように、このアプローチは、誘導相の後に抗サイトカイン治療を完全に中止でき、制御可能な免疫療法による自己免疫疾患の寛解を誘導および維持するために持続的な抗サイトカイン治療として有効であることが示される。
【００６９】
T細胞特異的エピトープの検出は、T細胞活性化に関連した多様な病態に関連して重要である。そのような病態には、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、リウマチ性関節炎、I型糖尿病、移植片対宿主病、グレーヴス病等；様々な形の癌、例えば、癌、黒色腫、肉腫、リンパ腫および白血病が含まれる。ウイルス、例えば、HIV-1、肝炎、ヘルペスウイルス、腸ウイルス、呼吸器ウイルス、ラブドウイルス、風疹ウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、麻疹ウイルス等によって引き起こされる疾患のような様々な感染疾患が重要である。対象となる感染物質にはまた、肺炎双球菌（Pneumococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、バチルス（Bacillus）、連鎖球菌（Streptococcus）、髄膜炎菌（Meningococcus）、淋菌（Gonococcus）、大腸菌（Eschericia）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmonella）、赤痢菌（Shigella）、ヘモフィルス（Hemophilus）、エルシニア（Yersinia）、リステリア（Listeria）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ビブリオ（Vibrio）、クロストリジウム（Clostridia）、クラミジア（Chlamydia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ヘリコバクター（Helicobacter）、およびトレポネーマ（Treponema）のような細菌；原虫病原体等が含まれる。T細胞関連アレルギー反応、例えば遅延型過敏症またはT細胞を含む接触性過敏症も同様にモニターしてもよい。
【００７０】
特に重要なものは、特異的ペプチドまたはMHCハプロタイプとの関連を有する疾患であり、本発明の結合複合体を用いて、ハプロタイプおよび抗原に関してT細胞反応を追跡してもよい。疾患状態において、特異的MHCハプロタイプまたは特定のタンパク質抗原が疾患状態に関与していることを示唆する多数の関連がなされている。しかし、患者の試料における反応性T細胞の直接検出は可能ではなかった。本発明の結合複合体による検出および定量によって、そのような直接検出を行うことができる。例として、HIV感染CD4+ T細胞に対する細胞溶解性T細胞の活性を、本発明の方法によって決定してもよい。糖尿病とDQB1*0302（DQ3.2）対立遺伝子との関連は、対象となる様々なペプチドと併用して、このMHCタンパク質を認識するT細胞の検出および定量によって調べてもよい。多発性硬化症患者のMHCタンパク質と共にミエリン塩基性タンパク質のペプチドに対して特異的なT細胞の存在を決定してもよい。抗原特異性は、リウマチ性関節炎患者の滑液において認められる多数の活性化T細胞に関して決定してもよい。本発明の方法は、多数の疾患および免疫関連病態に応用可能であると認識されるであろう。
【００７１】
抗原特異的T細胞の単離は、広く多様な応用を有する。単離されたT細胞は、腫瘍浸潤リンパ球の場合と同様に、癌の治療において用いられる可能性がある。特異的T細胞を患者から単離して、サイトカイン、抗原刺激等によって培養において増殖させて、標的抗原に対する免疫の増加を提供するために、自家宿主において置換してもよい。患者の試料は、自己免疫反応を弱めるために、特異的抗原に反応する細胞を枯渇してもよい。
【００７２】
免疫機能の阻害は、特異的T細胞のアネルギーを誘導することによって、または反応性T細胞の除去によって得てもよい。本発明の結合複合体によって、非常に特異的なT細胞サブセットに治療をターゲティングすることができる。免疫系の機能を阻害できることは、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、自己免疫疾患、特定の悪性疾患、関節炎、炎症性腸疾患、移植の拒絶および再潅流損傷のような多様な疾患を治療するために治療的に有用であることがわかっている。対象となる特定の疾患には、全身性紅斑性狼瘡；リウマチ性関節炎；結節性多発動脈炎；多発筋炎、および皮膚筋炎進行性全身硬化症（全身性強皮症）；糸球体腎炎；重症筋無力症；シェーグレン症候群；橋本病；グレーヴス病；副腎炎；副甲状腺機能低下症；悪性貧血；糖尿病；多発性硬化症および関連する脱髄性疾患；ブドウ膜炎；天疱瘡および類天疱瘡硬変；潰瘍性大腸炎；心筋炎；限局性腸炎；成人呼吸窮迫症候群；皮膚炎等のような薬物反応の局所発現；皮膚の炎症関連またはアレルギー反応パターン；アトピー性皮膚炎および小児湿疹；接触性皮膚炎；乾癬；扁平苔癬；アレルギー性腸症；アレルギー性鼻炎；気管支喘息；移植の拒絶、例えば、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵島細胞等；感染物質に対する過敏症または破壊的反応；溶連菌感染後疾患、例えばリウマチ熱の心症状等が含まれる。
【００７３】
本明細書に記述した併用免疫療法の他にも、特異的T細胞を除去することが望ましい場合があり、本発明の結合複合体を毒素部分に結合させてもよい。様々な細胞障害剤が既知であり、特異的結合分子と共に用いられている。これらの化合物の例は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、メイタンシン類、シスプラチン等である。二つのサブユニットが存在する場合、細胞障害性サブユニットのみ、例えばリシンのα単位を用いてもよい。毒素は、一般的にクロスリンク剤またはジスルフィド結合が含まれる他の結合によって結合複合体に結合させる。毒素結合体は、米国特許第5,208,020号；第4,863,726号；第4,916,213号；および第5,165,923号に開示される。毒素結合体は、他の細胞に対して有意な毒性を発揮することなく標的T細胞を特異的に消失させるために投与される。
【００７４】
本発明の結合複合体は、特異的T細胞のアネルギーを誘導するために宿主に投与してもよい。結合複合体は、T細胞の活性化にとって必要な共刺激物質が存在しないことから、結合時にT細胞アネルギーを誘導するであろう。結合複合体は、結合複合体が標的T細胞に達してそれに結合する可能性を最大限にして、それによってアネルギーを誘導するように個体、好ましくは哺乳類に投与される。次に、これはそのT細胞によって媒介される免疫応答を阻害するであろう。
【００７５】
以下の実施例は本発明を説明するためであって、制限するためではない。
【００７６】
実施例1
本実施例において、現在用いられている従来の治療方法と本発明の方法との比較を行う。TNFαのために生じた炎症プロセスを弱めるためにヒトを治療する従来の方法の作業には、TNFαの存在量を減少させるために投与される、可溶性組換え型TNFα受容体／IgG1分子であるエタナセプト（エンブレルAE（イムネクス（Immunex）、シアトル、ワシントン州）として市販される）の投与が含まれる。本実施例は、ラットモデル（ヒト反応に直接相関すると認識されている）を用いるデータを提供し、本発明の併用療法が、臨床的に有意な利益と共に副作用の実質的な減少およびエタナセプトを投与する必要性の減少を提供することを示している。（典型的に、患者におけるエタナセプトの利用は、非常に高価であるのみならず、長期の副作用を予見できず、日和見感染症および悪性疾患のリスクの増加を示し、投与を中止すれば、疾患の再発が起こるであろう。）
【００７７】
本実施例の動物モデルにおいて、そのような免疫調節治療を、粘膜寛容の誘導と併用して用いた。次に、臨床転帰をモニターして、T細胞の免疫学的特徴付けを行った。アジュバント関節炎は、本発明のラットの尾基底部にエタナセプト0.1 mgを注射（0日目）することによって誘導した。8日目に、毎日の関節炎スコア（最大の読み16を有する）を測定して、ラットを1日おきに体重測定した。9日目にトレカトメント（Treqatment）を開始した。
【００７８】
本発明のラットを四つの治療群に分けた：エタナセプト3×sc、9、11、13日目；エタナセプト1×sc、9日目；エタナセプト1×sc、9日目および熱ショックペプチド180-188を10、13、16、および19日目に投与；ならびに非治療群。エタナセプトの用量は0.3 mg/kg体重であった。熱ショックペプチド180-188の用量は100 μgであった。（熱ショックペプチドは、マイコバクテリアタンパク質180-188のペプチドであり、アジュバント関節炎において病原性であるT細胞によって認識される主なエピトープであることがわかっている）。
【００７９】
上記の投与の結果を図1に示す。グラフから明らかであるように、粘膜に熱ショックペプチドを複数回曝露してエタナセプト1回注射を含む複合治療レジメにより、関節炎スコアは減少した。さらに、併用治療レジメの正の有効性に関する基礎となるメカニズムに、Th1からTh2反応への機能的スイッチが含まれることを確認するために、下顎および鼠径リンパ節を22〜35日目に被験ラットから採取して、細胞をインビトロで培養した。細胞の増殖は、[3H]TdR取り込みによって行った。細胞内サイトカイン産生および表面マーカー発現はFACSを用いて調べた。サイトカイン、TbetおよびGATA-3遺伝子転写は、タックマンによって行った。
【００８０】
図2において、上記レジメの結果は、22日および35日現在、35日エンブレル／180-188の棒グラフにおいて示されるように、MLNが実質的に刺激されることを示している。さらなるデータを図3〜7に示す。図3において、（ILN）の細胞内産生をFACS分析を用いて示す。示されるように、併用治療の試料細胞は、IL-10またはCTLA-4の発現によって示されるように、CD4+細胞の実質的な刺激を示す。同様に、図4において、IL-10の遺伝子転写は、エンブレル単独および無処置試料に対して併用治療試料では顕著に増加する。図5および6においてそれぞれ示されるように、同じことがTGFβ、およびGATA-3の遺伝子転写についても当てはまる。しかし、図7に示すように、Tbet発現は顕著に減少する。これらの遺伝子のそれぞれは、TbetおよびGATA-3が、Th-1またはTh-2サイトカインカスケードの発達を制御するゲートキーパー遺伝子であることから、併用レジメの有効性を証明するために重要である。
【００８１】
結果は、35日目までに熱ショックペプチド180-188に対して特異的な細胞の抗原特異的増殖の出現、MLNおよびILNにおけるIL-10およびTGFβの遺伝子転写の増加、IL-10の細胞内産生の増加、ならびにILNにおけるCTLA-4の発現を認めることを示している。したがって、機能的スイッチは、GATA-3の増加およびTbetの減少によってTh2方向となる。全体的な結果は、抗原特異的免疫療法と抗TNFα治療の併用治療によって、アジュバント関節炎における関節炎が有意に減少することである。さらに、当業者は、上記のマウスモデルの臨床応用性を認識するであろうことから、抗原の増殖、IL-10およびTGFβ産生、およびTh2表現型刺激によって示されるように、臨床有効性と調節T細胞の産生とのあいだに相関を認める。
【００８２】
本発明は、上記の実施例を参照して記述してきたが、改変および変更が本発明の趣旨および範囲に含まれると理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の請求の範囲に限って限定される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】アジュバント関節炎の誘導後4群に分けたラットについて計算した関節炎スコアの平均値に及ぼす影響を示すグラフである。四つの治療レジメは、以下の通りであった：（1）エタナセプト単独の3回注射；（2）エタナセプト単独の1回注射；3）エタナセプトの1回注射と共にマイコバクテリアの熱ショックタンパク質180-188の粘膜投与；および（4）治療を受けない動物。
【図２】図1に示す四つの試験群のそれぞれに関して下顎リンパ節細胞の刺激を示すグラフの組である。180-188、Mt、およびOVAと表示されたバーは、培養条件が刺激指数を評価するためにこれらを培地中の抗原として用いたことを表す。
【図３】FACS分析による鼠径リンパ節（ILN）における細胞内サイトカイン産生を示す棒グラフの組である。第一のグラフは、IL-10を発現することが判明したCD4+細胞の割合である。CTLA-4を発現して、IL-10を産生するCD4+細胞の同定は、T調節細胞の必須条件である。
【図４】リアルタイムPCR技術であるタックマン技術によってIL-10の遺伝子転写を示す棒グラフである。
【図５】下顎リンパ球（MLN）および（ILN）に関するタックマン技術によるTGFβの遺伝子転写を示す棒グラフである。
【図６】タックマン技術によるGATA-3の遺伝子転写を示す棒グラフである。
【図７】タックマン技術によるTbetの遺伝子転写を示す棒グラフである。
【図１】
2005532981.tif 000005
【図２】
2005532981.tif 000006
【図３】
2005532981.tif 000007
【図４】
2005532981.tif 000008
【図５】
2005532981.tif 000009
【図６】
2005532981.tif 000010
【図７】
2005532981.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月3日(2004.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
本発明は、上記の実施例を参照して記述してきたが、改変および変更が本発明の趣旨および範囲に含まれると理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の請求の範囲に限って限定される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA
<120>  COMBINATION THERAPIES FOR IMMUNE MEDIATED DISEASES
<130>  GR-A0408
<140>  JP   2003-530218
<141>  2002-09-25
<150>  US   60/339,284
<151>  2001-12-11
<150>  US   60/325,499
<151>  2001-09-25
<160>  59    
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  1
Val Leu Thr Asp Ser Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  2
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  2
Gln Asp Tyr Tyr Glu Ile Leu Gly Val Ser Lys Thr Ala Glu Glu 
1               5                   10                  15  
<210>  3
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  3
Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Leu Ala Met Lys Tyr His Pro Asp Arg 
1               5                   10                  15  
<210>  4
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  4
Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu Gln 
1               5                   10                  15      
<210>  5
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  5
Gln Gly Phe Phe Ala Val Gln Gln Thr Cys Pro His Cys Gln Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  6
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  6
Ser Lys Thr Leu Ser Val Lys Ile Pro Gly Ala Val Asp Thr Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  7
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  7
Gly Asp Leu Tyr Val Gln Val Gln Val Lys Gln His Pro Ile Phe 
1               5                   10                  15  
<210>  8
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  8
Tyr Cys Glu Val Pro Ile Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  9
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  9
Pro Ile Asn Phe Ala Met Ala Ala Leu Gly Gly Glu Ile Glu Val 
1               5                   10                  15  
<210>  10
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  10
Gln Lys Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu 
1               5                   10                  15  
<210>  11
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  E. Coli mutant sequence
<400>  11
Asp Glu Arg Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr Gly His Ala Ala Phe Glu 
1               5                   10                  15  
<210>  12
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  12
Ala Val Glu Leu Glu Ser Pro Phe Ile Leu Leu Ala Asp Lys Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  13
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  13
Pro Phe Ile Leu Leu Ala Asp Lys Lys Ile Ser Asn Ile Arg Glu 
1               5                   10                  15  
<210>  14
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  14
Gly Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Thr Met Arg Gly Ile 
1               5                   10                  15  
<210>  15
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Escherichia coli
<400>  15
Val Ala Gly Leu Met Ile Thr Thr Glu Cys Met Val Thr Asp Leu 
1               5                   10                  15  
<210>  16
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Gln Lys Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  17
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Lys Asp Leu Leu Glu Gln Lys Arg Ala Ala Val Asp Thr Tyr Cys 
1               5                   10                  15  
<210>  18
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Leu Asp Val Pro Arg Ser Ala Ser Ala 
1               5                   10                  15  
<210>  19
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Lys Asp Tyr Tyr Gln Thr Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asp 
1               5                   10                  15  
<210>  20
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Thr Thr Tyr Tyr Asp Val Leu Gly Val Lys Pro Asn Ala Thr Gln 
1               5                   10                  15  
<210>  21
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Lys Lys Ala Tyr Arg Arg Lys Ala Leu Gln Trp His Pro Asp Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  22
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Lys Arg Ala Tyr Arg Arg Gln Ala Leu Arg Tyr His Pro Asp Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  23
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  24
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Phe Arg Ser Val Ser Thr Ser Thr Thr Phe Val Gln Gly Arg Arg 
1               5                   10                  15  
<210>  25
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Pro Gly Met Val Gln Gln Ile Gln Ser Val Cys Met Glu Cys Gln 
1               5                   10                  15  
<210>  26
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Gly Arg Arg Ile Thr Thr Arg Arg Ile Met Glu Asn Gly Gln Glu 
1               5                   10                  15  
<210>  27
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Gln Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Glu Leu Tyr Asp 
1               5                   10                  15      
<210>  28
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Lys His Lys Arg Glu Ile Tyr Asp 
1               5                   10                  15      
<210>  29
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Ser Gly Pro Phe Phe Thr Phe Ser Ser Ser Phe Pro Gly His Ser 
1               5                   10                  15  
<210>  30
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Asp Gly Gln Leu Lys Ser Val Thr Ile Asn Gly Val Pro Asp Asp 
1               5                   10                  15  
<210>  31
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Asp Leu Gln Leu Ala Met Ala Tyr Ser Leu Ser Glu Met Glu Ala 
1               5                   10                  15  
<210>  32
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Glu Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala Leu 
1               5                   10                  15  
<210>  33
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Leu Cys Gly Phe Gln Lys Pro Ile Ser Thr Leu Asp Asn Arg Thr 
1               5                   10                  15  
<210>  34
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Arg Thr Ile Val Ile Thr Ser His Pro Gly Gln Ile Val Lys His 
1               5                   10                  15  
<210>  35
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Gly Arg Leu Ile Ile Glu Phe Lys Val Asn Phe Pro Glu Asn Gly 
1               5                   10                  15  
<210>  36
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 
1               5                   10                  15      
Arg Ser Ile Ala Lys Glu Gly 
20              
<210>  37
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Arg Lys Gly Val Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn Asp Glu 
1               5                   10                  15      
Leu Glu Ile Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Pro 
20                  25                  30          
<210>  38
<211>  33
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Gly Gln Lys Cys Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys 
1               5                   10                  15      
Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser Ile Val Pro Ala Leu Glu Ile Ala Asn 
20                  25                  30          
Ala 
<210>  39
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Lys Cys Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  40
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser 
1               5                   10                  15  
<210>  41
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Lys Pro Leu Val Ile Ile Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser 
1               5                   10                  15      
Thr Leu Val Leu Asn Arg Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val 
20                  25                  30          
Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp 
35                  
<210>  42
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Gly Glu Ala Leu Ser Thr Val Leu Val Leu Asn Arg Leu Lys Val Gly 
1               5                   10                  15      
<210>  43
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Ser Asp Val Glu Val Asn Glu Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu 
1               5                   10                  15      
Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly 
20                  25                  30          
Cys Ala Leu Leu 
35      
<210>  44
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala Lys Asn Ala Gly 
1               5                   10                  15      
Val Glu Gly Ser Leu Ile Val Glu Lys Ile Met Gln Ser Ser Ser Glu 
20                  25                  30          
<210>  45
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Lys Val Val Arg Thr Ala Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu 
1               5                   10                  15      
Leu Thr Thr Ala Glu Val Val Val Thr Glu Ile Pro 
20                  25              
<210>  46
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  46
Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Val Val Val Thr Glu Ile 
1               5                   10                  15  
<210>  47
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  47
Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala 
1               5                   10                  15      
Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly 
20              
<210>  48
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  48
Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln 
1               5                   10                  15      
Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly 
20                  25                  30          
<210>  49
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  49
Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr 
1               5                   
<210>  50
<211>  33
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  50
Arg Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser 
1               5                   10                  15      
Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile 
20                  25                  30          
Gly 
<210>  51
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  51
Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  52
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  52
Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp 
1               5                   10                  15  
<210>  53
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  53
Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser 
1               5                   10                  15      
Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala Val 
20                  25                  30          
Lys Ala Pro Gly Phe Asp 
35              
<210>  54
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  54
Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr 
1               5                   10                  15  
<210>  55
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  55
Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val 
1               5                   10                  15      
Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly 
20                  25                  30          
Val Thr Leu Leu 
35      
<210>  56
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  56
Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly 
1               5                   10                  15      
Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly 
20                  25                  30          
<210>  57
<211>  33
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  57
Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu 
1               5                   10                  15      
Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys 
20                  25                  30          
Ala 
<210>  58
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  58
Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys 
1               5                   10                  15  
<210>  59
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Mycobacterium
<400>  59
Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys 
1               5                   10                  15  
【国際調査報告】
2005532981.tif 000012
2005532981.tif 000013