(57)【要約】  ハイブリッドグリコシル化産物、例えばポリケチド及びペプチドは、宿主細胞を（ａ）活性型糖を合成するための遺伝子カセット及び（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）をコードする核酸で形質転換することによって産生される。前記細胞はまた、アグリコン鋳型を産生し、又はそれを供給される。前記構成要素（糖、アグリコン、ＧＴ、糖合成遺伝子、細胞）のうちの少なくともいくつかは相互に異種である。
2005511054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の糖部分をアグリコン鋳型に転移することによってハイブリッドグリコシル化産物を産生する方法であって、
（ａ）特定の活性型糖の合成を指示するのに十分な糖合成遺伝子コードする核酸を含むプラスミドベースの遺伝子カセットを構築し、ここで、前記カセット内の前記糖合成遺伝子のうちの少なくとも幾つかは制限部位に隣接している；
（ｂ）（ｉ）前記プラスミドベースの遺伝子カセット；及び（ｉｉ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）；により微生物宿主細胞を形質転換し；そして
（ｃ）ＧＴが、ハイブリッドグリコシル化産物を産生するために１又は複数の糖部分をアグリコン鋳型に転移するように、形質転換した微生物に対してアグリコン鋳型を提供し、又はその内因性の産生を可能にすること、
を含んで成り；
ここで、１又は複数の糖部分、アグリコン鋳型、グリコシルトランスフェラーゼ、糖部分を修飾することができる酵素をコードする遺伝子又は宿主細胞は、１又は複数の他の構成要素に対して異種である、方法。
【請求項２】
前記カセット内の前記糖合成遺伝子のそれぞれが制限部位に隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限部位が独特の制限部位である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子であって、存在するのであればそれらの制限部位を有する遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多数の糖合成遺伝子がＰＣＲによって生成され、そしてそれぞれの異なる宿主細胞の形質転換において使用される、多数の異なるカセットを生成するために組み合わせて会合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖合成遺伝子のうちの少なくとも幾つかが、それら自身のリボソーム結合部位を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記糖合成遺伝子のうちの全てが、それら自身のリボソーム結合部位を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アグリコン鋳型とＧＴが相互に異種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アグリコン鋳型が外因的に供給される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アグリコン鋳型がポリケチドを含んで成る、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アグリコン鋳型がペプチドを含んで成る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラスミドベースの遺伝子カセットが、１又は複数のオレアンドロース、デソサミン、マイカロース、マイカミノース、ロジノース、オリオース及びオリボースの合成に必要な遺伝子のうちの幾つか又は全てを含んで成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）同一のプロモーターのもと任意に作用可能に連結した、宿主細胞における特定の活性型糖の合成を指示するのに十分な遺伝子をコードする核酸含む遺伝子発現カセット、ここで、前記カセット内の前記糖合成遺伝子のうちの少なくとも幾つかは、制限部位に隣接している；及び（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）、ここで、ＧＴは当該宿主細胞と異種であり、且つ当該細胞内のアグリコン鋳型に対して１又は複数の糖部分を転移させてハイブリッドグリコシル化産物を産生することができる；
で前駆宿主細胞を形質転換することによって産生される宿主細胞。
【請求項１４】
前記プラスミドベースの遺伝子カセットが、１又は複数のオレアンドロース、デソサミン、マイカロース、マイカミノース、ロジノース、オリオース及びオリボースの合成に必要な遺伝子のうちの幾つか又は全てを含んで成る、請求項１３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
ハイブリッドグリコシル化産物を産生するための方法であって、請求項１３又は１４に記載の宿主細胞を培養し、そしてそのようにして産生した前記産物を単離することを含んで成る方法。
【請求項１６】
アグリコン鋳型を細胞に供給する追加の段階を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２、１５又は１６に記載の方法のいずれかによって得られるようなハイブリッドグリコシル化産物。
【請求項１８】
アグリコン鋳型を供給した場合に、特定のグリコシル化誘導体を生成する能力についてのクローン化した微生物グリコシルトランスフェラーゼのスクリーニングにおける、請求項１３又は１４に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドグリコシル化産物、及び、特に、天然産物、例えばポリケチド及びグリコペプチド、並びにそれらの調製法に関する。本発明は特に、例えばプラスミド上に収容されている、カセットフォーマットの特定の活性型デオキシ糖のためのクローン化した生合成遺伝子群を含む細胞に関する。当該カセットフォーマットは当該糖のカセット内の遺伝子の簡便な付加、除去又は置換を可能にして、その結果、活性型デオキシ糖のコンビナトリアルライブラリーを産生する。そのような細胞において、クローン化された微生物のグリコシルトランスフェラーゼは、基質としてポリケチド、ポリペプチド、又はポリケチド−ポリペプチドを供給した場合に、特定のグリコシル化誘導体を産生するその能力について簡便に試験されうる。
【背景技術】
【０００２】
グリコシル化は、抗菌化合物、例えばポリケチドであるエリスロマイシンＡ及びグリコペプチドであるバンコマイシン、並びに抗腫瘍化合物、例えば芳香族ポリケチドであるダウノルビシン及びグリコペプチド−ポリケチドであるブレオマイシンを含む、多くの天然産物の生物活性にとって重要である。ポリケチドは、巨大で且つ構造的に多様なクラスの天然産物であって、抗生物性又は他の薬理学的特性を有する多数の化合物、例えばエリスロマイシン、テトラサイクリン、ラパマイシン、アベルメクチン、モネンシン、エポシロン及びＦＫ５０６を含む。特に、ストレプトマイセス及び関連する属は、ポリケチドの素晴らしい産生株である。ポリケチドは、脂肪酸の生合成と類似の方法での繰り返しの段階的な縮合によって合成される(Rawlings, 1999 and 2001a&b)。天然のポリケチド間で見られるより大きな構造的多様性は、出発単位としてのアシルＣｏＡ、そして（通常）伸長単位としてのマロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ及びエチルマロニルＣｏＡから、そして各縮合後に観察されるβ−ケト基の処理の異なる程度から生じる。処理段階の例には、β−ヒドロキシアシルへの還元、還元に続く２−エノイル−への脱水、及び飽和アシルチオエステルへの完全な還元、が含まれる。これらの処理段階の立体化学的な結果も、鎖の伸長の各サイクルにつき明確にされる。ポリケチド鎖は、多くの場合、特定の経路で環化され、そして最終的なポリケチドを産生するための更なる酵素触媒型修飾にかけられる。非リボソームペプチド合成酵素によって産生される天然のペプチドは、同様に繰り返しの段階的な集合、この場合においては活性化アミノ酸の集合によって合成され、そして産生される鎖は、同様に、十分に生理活性の分枝を産生するために更なる修飾にかけられる(von Dohren et al., 1997)。ケチド及びアミノ酸単位の両方を組み込んでいるとして定義される、混合型ポリケチド−ペプチド化合物も知られており、そしてそれらの生理活性も、それらのグリコシル化及び他の修飾のパターンによって影響を受ける(Du et al., 2001)。これらの関連する経路によって産生される化合物が特に価値があるのは、それらが多数の既知の有用性のある化合物、例えば駆虫薬、殺虫剤、免疫抑制剤、抗真菌剤又は抗菌剤としてのものを含むためである。
【０００３】
多数の治療的に重要なポリケチドが同定されているが、増強された特性を有する、又は完全に新規の生理活性を持つ、新規のポリケチドを得る必要性が尚も存在している。抗生物質、例えば１４員マクロライド又はグリコペプチドに対する耐性を有する病原生物の発生の容赦のない増大は、ヒト及び動物の健康に対する多大なる脅威を象徴している。新規ポリケチド代謝物を得るための現時点での方法には、有用分子の直接的産生のための、又は増殖培地に添加される既知のポリケチドを特定の誘導体へと生物変換しうる酵素活性の存在についての、ストレプトマイセス及び他の生物の天然の種の大規模スクリーニングが含まれる。これらの手法は時間及びお金がかかり、そして、細胞全体を用いる生体内変換は、更に、副反応によって、又は生物変換に重要な、低濃度又は低活性の細胞内酵素によって制限されることがある。生理活性ポリケチドの複雑性を前提にすると、それらは大規模での全化学合成に容易に影響を受けない。既存のポリケチドの化学修飾は広く使用されているが、多数の所望の変化は、これらの手段によって容易に達成できるものではない。
【０００４】
それぞれポリケチド合成酵素及びポリペプチド合成酵素をコードする相当の遺伝子の操作による、変化したポリケチド及びリボソーム以外で合成されるポリペプチドの生合成のための方法が開発されてきた。ポリケチドの生合成は、ポリケチド合成酵素として知られている鎖形成酵素群によって開始される。３つのクラスのポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）が放線菌において説明されている。
【０００５】
第一のクラスは、Ｉ型ＰＫＳと命名され(Rawling, 2001a&b)、そしてマクロライドであるエリスロマイシン、オレアンドマイシン、アベルメクチン及びラパマイシンのためのＰＫＳによって代表され、各ポリケチド鎖伸長サイクルにつき、異なるセット又は「伸長モジュール」の酵素から成る(Cortes et al., 1990)。本明細書で使用する用語「伸長モジュール」は、１サイクルのポリケチド鎖伸長を達成する、β−ケトアシル−ＡＣＰ−合成酵素（「ＫＳ」）ドメインから次のアシルキャリアタンパク質（「ＡＣＰ」）ドメインへの連続ドメインのセットを意味する。
【０００６】
Ｉ型ＰＫＳのモジュールの変更は、モジュール５内のケトレダクターゼドメイン部分をコードするＤＮＡのインフレーム欠失を介する、エリスロマイシンＰＫＳ（６−デオキシエリスロノリドＢ合成酵素、ＤＥＢＳとしても知られている）の突然変異によって最初に確認された(Donadio et al., 1991)。これは、モジュール５の突然変異したＫＲドメインの、漸進的な生合成のこの段階で導入されたβケト基を還元することができないという能力に起因して、エリスロマイシン類似体、５，６−ジデオキシ−３−β−マイカロシル−５−オキソエリスロノリドＢ及び５，６−ジデオキシ−３−β−オキソエリスロノリドＢをもたらす。同様に、ＤＥＢＳにおけるモジュール４のエノイルレダクターゼドメイン内の活性部位残基の、相当するＰＫＳコードＤＮＡの遺伝子操作及びサッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora etythraea)内へのその導入による変化は、６，７−アンハイドロエリスロマイシンＣの産生をもたらす(Donadio et al., 1993)。ＷＯ９３／１３６６３は、変化したポリケチドを産生することができるＤＥＢＥＳ遺伝子の遺伝子操作の他の型を記載している。しかしながら、多くのそのような試みは、非生産的であったと報告されている(Huntchinson & Fujii, 1995)。
【０００７】
ＷＯ９８／０１５４６は、複数の天然のＰＫＳに由来するＰＫＳ遺伝子部分を利用するハイブリッドＩ型ＰＫＳ遺伝子の操作、及び変化したポリケチド代謝物の産生のためのそのような組換え遺伝子の使用を記載している。
【０００８】
ＩＩ型ＰＫＳと命名されている第二クラスのＰＫＳは、細菌によって産生される多くの芳香族化合物の合成酵素によって代表される。ＩＩ型ＰＫＳは、鎖の伸長について、わずかに一組の活性を含み、そしてこれらは連続的なサイクルで再使用される(Bibb et al., 1989; Sherman et al. , 1989; Fernandez-Moreno et al., 1992)。ＩＩ型ＰＫＳの伸長単位は、通常マロニルＣｏＡ単位であり、そして特定のシクラーゼの存在は、芳香族産物内への完全な鎖の環化にとって好ましい経路を決定する(Hutchinson & Fujii, 1995)。ハイブリッドポリケチドは、クローン化ＩＩ型ＰＫＳ遺伝子含有ＤＮＡを、異なるＩＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスターを含む別の菌株内に導入することによって、例えば、ストレプトマイセス・コエリコロー(Streptomyces coelicolor)由来の青色の色素性ポリケチドであるアクチノロージンの遺伝子クラスターに由来するＤＮＡを、ストレプトマイセス・ガリレウス(Streptomyces galileus)のアントラキノンポリケチド産生菌株内に導入することによって得られてきた(Bartel etal., 1990)。
【０００９】
ストレプトマイセス・コエリコロー(Streptomyces coelicolor)宿主細胞内で発現した場合に、ＩＩ型ＰＫＳ上でのポリケチド鎖の伸長に必要とされる最少のドメイン数（「最少ＰＫＳ」）は、act I遺伝子産物である以下の３つのポリペプチドを含むとして定義されいる（例えば、ＷＯ９５／０８５４８内）：第一にＫＳ；第二に、ＫＳに対して末端から末端までアミノ酸配列類似性を有するが、ＫＳの必須の活性部位残基、すなわちシステイン残基が、グルタミン残基か、又は胞子色素、例えばwhiE遺伝子産物のＰＫＳ(Chater & Davis, 1990)の場合にはグルタミン酸残基で置換されている、ＣＬＦと称されるポリペプチド；そして最後にＡＣＰである。ＣＬＦは、（例えば、ＷＯ９５／０８５４８において）最小ＰＫＳによって産生されるポリケチド鎖の鎖長を決定する因子であると述べられてきた。しかしながら、オクタケチドであるアクチノロージンのＣＬＦが、ストレプトマイセス・グラウセセンス(Streptomyces glaucescens)においてデカケチドであるテトラセノマイシン(tetracenomycin)を置換するために使用される場合、ポリケチド産物が、デカケチドからオクタケチドに変換されることが認められないことが明らかとなった(Shen et al., 1995)。ＫＳをＫＳαと表し、そしてＣＬＦをＫＳβと表す、ＣＬＦの機能の正確な割り当てにおける信用性の欠如を反映させるための別の命名法が提案されている(Meurer etal., 1997)。ＷＯ００／００６１８は、ＣＬＦ及びそのＩ型ＰＫＳ多酵素内の対応物、いわゆるＫＳＱドメインが、ポリケチド鎖の合成の開始に関与することを最近示した。ＷＯ９５／０８５４８は、例えば、ハイブリッドポリケチドを得るための、他のＩＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスター由来の異種ＤＮＡによるアクチノロージンＰＫＳ遺伝子の置換を記載している。
【００１０】
ＩＩＩ型ＰＫＳと命名されている、第三クラスのＰＫＳは、細菌内のほかの芳香族化合物、例えば、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のフラベオリン(flaveolin)の合成によって代表される(Funa et al., 1999)。ＩＩＩ型ＰＫＳは、鎖の伸長が生じるわずかに一組の活性部位を含む。ＩＩＩ型ＰＫＳの「伸長」単位は、通常酢酸塩単位であり、そして活性部位の形状及び大きさは、見かけ上、芳香族産物内への完全な鎖の環化にとって好ましい経路を決定する(Jez et al., 2000)。ＩＩＩ型ＰＫＳ産物は、典型的なカルコン合成酵素及びスチルベン合成酵素のＸ線結晶構造の知識に基づき、酵素構造の一部の特定の突然変位誘発によって変化することに成功してきた(Ferrer et al., 1999)。ＩＩＩ型ＰＫＳの芳香族産物は、しばしば酸化によって更に処理され、そしてデオキシ糖の結合も生じることがある(Cortes et al., 2002)。
【００１１】
全てのＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型起源のＰＫＳ遺伝子を操作するためのこの能力は、所望の生理活性についてスクリーニングされうる新規の天然産物の多様なライブラリーを産生する、ポリケチドのコンビナトリアル生合成の可能性を高める。しかしながら、組換えＰＫＳ遺伝子によって産生されるアグリコンは、グリコシルトランスフェラーゼ及び／又は他の修飾酵素によって、成熟ポリケチド類似体へと部分的に処理されることもあれば、されないこともある。従って、そのような新規アグリコンの、特定のグリコシル化産物への効率的な変換方法を提供することの更なる必要性が存在している。更に、グリコシル化の効率的方法の発明は、別のクローン化したグリコシルトランスフェラーゼ及び活性型糖の別の補完物を含む組換え細胞の利用により、コンビナトリアルポリケチドライブラリーの多様性を非常に有意に増大させる新規の手段を提供するであろう(Salas and Mendez, 2001; Rohr et al., 2002)。
【００１２】
生物学的活性に対するグリコシル化の周知の作用は、特定の糖単位の合成及び、ポリケチド及びポリペプチド代謝物に対する特定の糖単位の結合を支配する遺伝子及び酵素の集中的な研究を促進してきた（概要については、Trefzer et al., 1999を参照のこと）。そのような代謝物の調査は、非常に多数の異なるデオキシヘキソース及びデオキシアミノヘキソースを含む、明らかとなっているグリコシル置換の型の高度な多様性を明らかにした（概要については、Liu & Thorson, 1994を参照のこと）。多数のグリコシル化ポリケチド、ポリペプチド及び混合型ポリケチド／ペプチドに生合成遺伝子クラスターの配列決定は、そのような糖の生合成遺伝子の存在を明らかにした。更に、グリコシル基を、糖の活性型、例えばｄＴＤＰ−又はｄＵＴＰ−型から、アグリコン受容体に移動させるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子も同定されてきた。例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora etythraea)におけるエリスロマイシン生合成遺伝子クラスターのeryB遺伝子及びeryC遺伝子は、それぞれ、Ｌ−マイカロース及びＤ−デソサミンのエリスロマイシンＡのアグリコン前駆体の生合成及びそれに対する結合に関与するとして同定されてきた(Dhillon etal., 1989; Haydock et al., 1991; Salah-Bey et al., 1998;Gaisser et al., 1998;Gaisser et al., 1997; Summers et al., 1997)。ＷＯ９７／２３６３０及びＷＯ９９／０５２８３は共に、変化した糖がアグリコンに結合し始めるような、特定の糖の生合成遺伝子の欠失によって変化したエリスロマイシンの調製を記載している。このように、ＷＯ９９／０５２８３は、例えば、デソサミンがマイカミノース(mycaminose)によって置換されている(eryCIVノックアウト)、又はデスメチルマイカロシルエリスロマイシン(eryBIIIノックアウト) が産生される、低レベルであるが検出可能なレベルのエリスロマイシンを記載している。一方では、メチマイシン類似体が産生されており、これはデソサミンがＤ−キヌボース(quinuvose)で置換されているものであるか、又はマイクロモノスポラ・エチノスポラ(Micromonospora echinospora)由来のカリチェアマイシン遺伝子クラスターのcalH遺伝子の、メチマイシン産生菌株への取り込みを介するアミノ基の変化した置換パターンを示すものである(Zhao et al., 1999)。同様に、ハイブリッドグリコペプチドが、ＵＳ５，８７１，９８３(Solenberg et al., 1997も参照のこと)に従い、Ｄ−キシロース又はＤ−グルコースを密接に関連したグリコペプチドのアグリコンに付加するために、バンコマイシン産生アミコラトプシス・オリエンタリス(Amycolatopsis orientalis)由来のクローン化されたグリコシルトランスフェラーゼを用いることによって産生された。ハイブリッド芳香族ポリケチドはまた、類似の化学反応を実施するが、異なる立体特異性を有する生合成遺伝子の相同体を利用することによる、種間の相補性によって産生された。このように、天然のダウノサミンの代わりに、4'epi-ダウノサミンが組換え型ストレプトマイセス・ペウセチウス(Streptomyces peucetius)内で産生され、そしてダウノサミングリコシルトランスフェラーゼによって天然のアグリコンに結合し、その結果、ドキソルビシンの代わりに抗腫瘍誘導体エピルビシンが産生する(Madduri et al., 1998)。
【００１３】
これら全ての場合において、グリコシルトランスフェラーゼの広範な特異性が、別の活性型糖の置換を可能にしたが、アグリコン及びグリコシルトランスフェラーゼは互いに異種ではなかった。ストレプトマイセス・アンチビオチカス(Streptomyces antibioticus)のオレアンドマイシン生合成遺伝子クラスター由来のオレアンドロースグリコシルトランスフェラーゼOleG2が、エリスロマイシン産生菌株Ｓ．エリスラエア(S. erythraea)内にクローニングされる場合、他の産物に加え、Ｃ−３位にあるＬ−クラジノース部分がＬ−ラムノースに置換された新規エリスロマイシンが得られたことが明らかとなった(Doumith et al., 1999)。これは、活性型Ｌ−ラムノースが宿主細胞によって産生され、そして存在することが知られている活性型Ｌ−マイカロースと競合してOleG2によって補充されると考えられた。
【００１４】
糖であるＤ−デソサミンは、多くのマクロライドへの結合が明らかとなっており(Trefzer et al., 1999)、そして、この糖の活性型の生合成のための生合成遺伝子が、その結果そのようなマクロライドの各遺伝子クラスター内で見られることが明らかとなった。同様に、糖であるＬ−オレアンドロースは、例えば、Ｓ・アンチビオチカス(S. antibioticus)によって産生されるオレアンドマイシン内に見られるが、２つのそのようなオレアンドロシル部分は、ストレプトマイセス・アベルミチリス(Streptomyces avermitilis)によって産生されるアベルメクチン内に存在する。遺伝子配列の比較及び特定の遺伝子の破壊は、Ｓ．アベルミチリス(S. avermitilis)において、アベルメクチンクラスター由来の８つの遺伝子(avrBCDEFGHI)が、Ｌ−オレアンドロースの生合成及び結合に関与するという認識をもたらした（概要については、Wohlert et al., 2001を参照のこと）。ＡｖｒＤ及びＡｖｒＣ酵素はｄＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシグルコースの産生を制御し；続いて、ＡｖｒＧ及びＡｖｒＩによって触媒される、Ｃ−２脱酸素が生じ；これにＡｖｒＥによる５−エピマー化、ＡｖｒＨによって触媒されるＣ−３位でＯ−メチル化、そして最後にＡｖｒＥによる４−ケト還元が続き、ｄＴＤＰ−Ｌ−オレアンドロースが産生されることが提唱されている。同程度の事象が、オレアンドマイシン産生株において提唱されてきた(Aguirrezbalaga et al., 2000)が、更に最近では、この場合におけるメチル化は、正常な経路においてグリコシルトランスフェラーゼによって実際に転移する糖がＬ−オリボースであるように、中性糖がマクロライドアグリコンに結合するまで起こらないことが明らかとなってきた(Rodriguez et al., 2001)。
【００１５】
そのような解析の結果、異種の宿主においてデオキシ糖の生合成経路を発現するためのプラスミド系の使用は、当業界で周知である。Ｓ・アンチビオチカス(S. antibioticus)内のオレアンドマイシン生合成遺伝子クラスター由来の遺伝子を用いることで、ｄＴＤＰ−Ｌ−オリボースの生合成に必要であることが提唱されている一組の遺伝子を含むプラスミド（ｐＯＬＶ）及びｄＴＤＰ−Ｌ−オレアンドロースの生合成に必要であることが提唱されている一組の遺伝子を含む第二プラスミド（ｐＯＬＥ）が構築され、そしてこれらの糖又は任意のマクロライドポリケチドを合成することが知られておらず、且つゲノム内に組み込まれたoleG2遺伝子を含むストレプトマイセス・アルバス(Streptomyces albus)の菌株内に導入された。異種のマクロライドアグリコンであるエリスロノリドＢを供給した場合、３−Ｏ−Ｌ−オリボシルエリスロノリドＢが、ｐＯＬＶを収容している菌株から産生され、そして３−Ｏ−Ｌ−オレアンドロシルエリスロノリドＢが、ｐＯＬＥを収容している菌株から産生された。これらの結果は、各プラスミドが持つ遺伝子のセットが、異種の宿主菌株内でグリコシルトランスフェラーゼにとって適切な活性型糖の基質を産生するのに必要且つ十分であることを示唆している(Aguirrezbalaga et al., 2000)。これらのプラスミドにおいて、当該遺伝子は、多くがそれらの天然の遺伝子の順序通りであり、そしてそれらの天然のプロモーターから発現した。
【００１６】
更に最近では、Ｓ．アベルミチリス(S. avermitilis)のアベルメクチン生合成経路由来のこれらの同一の８つの遺伝子(avrBCDEFGHI)の等価物が、異種の宿主において、それら自身のプロモーターの制御下で同様に発現し得ることが明らかとなった(Wohlert et al., 2001)。それらはまた、異種のプロモーター、具体的には、Ｓ．エリスラエア(S. etythraea)由来のエリスロマイシン耐性遺伝子erm*Eのためのもの、からも発現することができる。更に、これらのオレアンドロース生合成遺伝子は、ストレプトマイセス・コエリコロー(Streptomyces coelicolor)由来の重複し、且つ分岐進化した異種のactI/actIIIプロモーターの制御下にあるプラスミド上の、２つの異なる人工オペロン、又は発現カセット、に分類することができること、そしてこのことが、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)におけるｄＴＤＰ−オレアンドロースの産生をもたらしたことが証明された。他の型の発現プラスミドは新たに合成され、ここで、個々のオレアンドロース生合成遺伝子は、インフレーム欠失によって１つのカセットから排除され、あるいは、構築の間に第二のプラスミドから削除された。アベルメクチンアグリコンは、そのように修飾された発現カセットを持つプラスミドを含むＳ．リビダンス(S. lividans)によって、グリコシル化されたアベルメクチン類似体に変換された。このように、５−エピメラーゼと推定される、遺伝子avrFの排除は、Ｄ糖である、Ｄ−オリボースのアグリコンに対する結合をもたらした。他の例においては、生成物の混合物が形成された：例えば、推定されているメチルトランスフェラーゼ遺伝子(avrH)の欠失は、オレアンドロースの代わりにＬ−オリボース又は、その代わりとして、Ｌ−ジギトキソース（Ｃ−３位で逆位の配置を有する点でＬ−オリボースと異なる）が結合した糖をもたらした。メチル化は、後者の菌株に３−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子eryBIIIを補うことによって低レベルで回復し、その結果、これまでのところ特徴のないアベルメクチンが生成された。eryBIIIは、Ｓ．エリスラエア(S. erythraea)のエリスロマイシン産生菌株において、密接に関連したデオキシヘキソースであるマイカロースの産生のための生合成経路内で働く；eryIIIは別のプラスミドでＳ．リビダンスの宿主内に導入された。
【００１７】
これらの洞察にも関わらず、多数の活性型デオキシ−及びジデオキシヘキソースの生合成における個々の遺伝子の同一性及び役割の多くが不確かなままである。更に、前記プラスミド系の構築には多大な労力が伴い、そして、特定の順序でクローニングした場合の遺伝子の特定の組み合わせが適切に発現するか否か、そしてそれらの天然の前後関係で機能するか否かについての多くが不確かである。更に、そのような糖の経路の遺伝子の更に迅速で且つ簡便なカセットベースの発現のための、特に、使用する遺伝子の組み合わせを試験し、そして最適化するためのカセット内での遺伝子の迅速で且つ自由な置換、除去、付加、又は再配列を可能にする方法での、新規方法論についての差し迫った必要性が存在する。当業界で報告されている実験の多くにおいては、生物変換の程度は極度に制限されており、そして、ポリケチド薬の調製にとって何ら有用な方法の基礎を形成しないであろう。この理由は不明であり、そして複雑であると思われるが、この問題の一つの本質は、種々の任意に構築されたカセットの十分でない性能に存するであろうことは明らかである。
【００１８】
本発明の要約
本発明は、プラスミドベースの遺伝子カセットであって、合理的に設計され、且つ容易な方法で異なるｄＴＤＰ糖の合成を指示し、それぞれ遺伝子交換を容易にする独特の制限部位が隣接している糖遺伝子を有する遺伝子カセットが構築され得ることを証明する。前記設計はまた、個々の遺伝子の自由で且つ容易な連結を可能にして、元の遺伝子カセットを発展させる。前記プラスミドはまた、元のプラスミドには存在しない機能を有する追加の遺伝子を一緒にクローニングするために使用されうる独特のXbaI部位も有する。そのような追加の遺伝子が、５’末端にはSpeI、AvrII又はNheIのいずれかを用いて、そして３’末端にはXbaIを用いて、カセットプラスミド内にクローニングされる場合、独特のXbaI制限部位が更なる使用のために保存される。
【００１９】
本発明の目的であるプラスミドベースの遺伝子カセットの創作においては、当該遺伝子は、それらの天然の前後関係から一緒に、例えば、後述するカセットプラスミドｐＬＮ２の例において１つのフラグメント上にクローニングされた、Ｌ−デオキシ糖生合成に共通する最初の３つの段階のための遺伝子（ｄＴＤＰ−グルコース合成酵素、oleS；４，６−グルコースデヒドラターゼ、oleE；３，５−エピメラーゼ、oleL）（図２）としてクローニングされうる。あるいは、そして好ましくは、それらはＰＣＲによって個別に生成されることがあり、そして前記ＰＣＲ過程によって導入される独特の制限部位によって隣接することがある。それぞれの増幅した遺伝子は、それ自身のリボゾーム結合部位を含む（表２）。独特の制限部位のうちの２つ（HindIII及びXbaI）は、糖遺伝子ライブラリーを生成するために、Ｅ．コリ(E. coli)ベクター（例えば、ｐＵＣ１８）内の各アンプリコンのサブクローニングを容易にするために使用される。他の２つの制限部位は、最初のプラスミドコンストラクトを産生するための、糖の遺伝子ライブラリーの逐次付加を容易にするために使用される。また、これらの制限部位は、機能を確認するためか、又は異なる酵素の基質の柔軟性をアッセイするために、類似の機能を有する遺伝子の交換を可能にする。これらの制限部位は、それらが放線菌に特有の高いＧ＋Ｃ含量のＤＮＡにおいてほとんどまったく切断しないために選択された。このように、例えば、４−ケトレダクターゼ遺伝子oleUは、多数の他の天然４−ケトレダクターゼ遺伝子のうちの１つによって置換されることがあり、このことは、その後に異なる産物の活性型糖の形成をもたらすことがある（図８）。本明細書に記載の実施例のうちの１つにおいて、遺伝子eryBIVの使用は、その後のアグリコンに対する結合と共に、好収率での異常な糖Ｌ−ジギトキソース（図９）の産生をもたらす。基本的なカセット、例えばプラスミドｐＬＮ２（図３Ａ、４、及び６）（これらの構築は後述する）が２，６−ジデオキシ糖の生合成を指示する場合、６−デオキシ糖のためのプラスミドを産生するために、糖の生合成における２−脱酸素過程に関与する２つの遺伝子（oleV及びoleW）は、容易に除去されうる。具体的には、例えば、この遺伝子対に隣接する２つの独特な制限部位(AvrII及びSpeI）を用いて（図６及び１１）、Ｌ−ラムノースの生合成に適したプラスミドｐＬＮ２Δが生成されうる。
【００２０】
そのようなプラスミドベースの遺伝子カセットを用いて、グリコシルトランスフェラーゼ酵素は、外因的に供給された、又は内因的に生成した、一連のアグリコン鋳型に対して一連の活性型糖が結合するそれらの能力について迅速にスクリーニングされうる。特許出願ＷＯ０１／７９５２０は、例えば、そのようなグリコシルトランスフェラーゼが、しばしば、アグリコン及び糖基質の両方に対する驚くべき柔軟性を示すこと、そしてこの過程が好収率での新規グリコシル化ポリケチドの産生を可能にすることを示している。このことは、遺伝子操作によって変化したポリケチドを含む個々のポリケチドに対する新規糖の結合を提供するという問題だけでなく、糖のコンビナトリアルな結合によるポリケチドライブラリーの多様性を増大させるという問題も克服する。特に驚くべきことは、新規グリコシル化産物が、アグリコン鋳型、１又は複数の糖部分、グリコシルトランスフェラーゼ、宿主細胞及び／又は、アグリコン鋳型に結合する前又は後に糖部分を修飾することができる酵素をコードする遺伝子、から選択される、１又は複数の構成要素が互いに異種である系において産生されうることである。好ましい態様において、前記構成要素のうち２、３、４、又は全てが互いに異種である。
【００２１】
本明細書に記載の方法が、他の天然糖の生合成経路由来の別の糖遺伝子を採用するために容易に拡張され得ることは当業者であれば容易に想到するであろう。詳細な情報が既に利用可能である、そのような経路の例は、糖であるデソサミン、マイカロース、マイカミノース、ロジノース(rhodinose)、オリオース(oliose)、オリボース(olivose)及びオレアンドロースを含む。Ｌ−又はＤ−型のいずれかとなりうる活性型糖の性質を選択する機会も存在する。これらの追加の糖の幾つかのカセットの配置を図１３及び１４に示す。
【００２２】
推定される活性型糖産物の存在についてのスクリーニングが提供したアグリコンに対するその転移を示さなかった場合であっても、このことが、糖カセット自身が機能していないというよりむしろ、グリコシルトランスフェラーゼにその特定の変換を触媒する機能がないことを単に反映し得るということは更に容易に理解されるであろう。従って、グリコシルトランスフェラーゼの語彙が拡張され、そしてそれらの基質特異性の範囲についての知識が増大するにつれ、本明細書に記載のように構築されるデオキシヘキソース（糖）鋳型の生合成をコードする、プラスミドベースの遺伝子カセットの有用な範囲はそれに応じて増大するであろう。
【００２３】
従って、第一の側面において、本発明は、１又は複数の糖部分をアグリコン鋳型に転移することによってハイブリッドグリコシル化産物の産生方法であって、
微生物宿主細胞を、それらの宿主細胞において特定の活性型糖の合成を指示するのに十分な遺伝子を含むプラスミドベースの遺伝子カセットをコードする遺伝子で形質転換し；そして更にグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）をコードする核酸で形質転換し；そして、
ハイブリッドグリコシル化産物を産生するために、ＧＴが１又は複数の糖部分をアグリコン鋳型に転移させるようアグリコン鋳型を形質転換した微生物に提供すること、
を含んで成り、
ここで、１又は複数の糖部分、アグリコン鋳型、グリコシルトランスフェラーゼ、糖部分を修飾することができる酵素をコードする遺伝子又は宿主細胞は、本発明の他の構成要素に対して異種である、方法、を提供する。
【００２４】
他の側面において、本発明は、同一のプロモーターのもと任意に作用可能に連結した、宿主細胞において特定の活性型糖の合成を指示するのに十分な遺伝子を含む遺伝子発現カセットをコードする核酸で形質転換し；そして更にグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）で形質転換した宿主細胞を提供し、ここで、ＧＴは当該宿主細胞と異種であり、そして当該細胞内のアグリコン鋳型に対して１又は複数の糖部分を転移させてハイブリッドグリコシル化産物を産生する。特定の活性型デオキシ糖の例には、以下のものに限定されないが、Ｌ−ＮＤＰ−オリボース、Ｌ−ＮＤＰ−オレアンドロース、Ｌ−ＮＤＰ−オリオース、Ｌ−ＮＤＰ−マイカロース、Ｌ−ＮＤＰ−クラジノース、Ｌ−ＮＤＰ−ジギトキソース、Ｌ−ＮＤＰ−３−Ｏ−メチルジギトキソース、Ｌ−ＮＤＰ−ラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−２−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−３−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−４−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−２，３−ジ−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−４−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−２，３−ジ−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−２，３，４−トリ−Ｏ−メチルラムノース、Ｌ−ＮＤＰ−ロジノースが含まれる。
【００２５】
他の側面において、本発明は、ハイブリッドグリコシル化産物の産生方法であって、上文で定義した宿主細胞を培養し、そしてそのようにして産生した産物を単離すること、を含んでなる方法を提供する。アグリコン鋳型が、宿主細胞によって産生されるのではなく、宿主細胞に供給される態様において、本方法は、当該細胞にアグリコン鋳型を供給する追加の段階を含んで成ることがある。
【００２６】
他の側面において、本発明は、本明細書に開示した方法のいずれかによって得ることができるようなハイブリッドグリコシル化産物を提供する。
【００２７】
本発明の態様は、実施例によって、そして、限定ではないが、添付図面を参照して、以下に説明する。
【００２８】
表１：遺伝子カセットプラスミドの構築において使用した遺伝子。
表２：経路発現遺伝子カセットの構築のための個々のデオキシ糖経路遺伝子のＰＣＲ増幅において使用した合成オリゴヌクレオチド。各オリゴヌクレオチドは、一般的な制限部位及び特異的な制限部位の両方を含み、そして上流プライマーは要求性のリボソーム結合部位モチーフ及び開始コドンを含む。
表３：異なる糖の生合成を指示するプラスミドコンストラクト及び糖の存在を証明するために使用されるグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）系。
【００２９】
方法と材料
微生物、培養条件及びベクター
ストレプトマイセス・アンチビオチカス(Streptomyces antibioticus)ＡＴＣＣ１１８９１（オレアンドマイシン産生株）、ストレプトマイセス・フラジアエ(Streptomyces fradiae)ＡＴＣＣ１９６０９（タイロシン産生株）、ストレプトマイセス・ポイセチウス(Streptomyces peucetius)ＡＴＣＣ２９０５０（ダウノルビシン産生株）、ストレプトマイセス・ノガラター(Streptomyces nogalater)ＮＲＲＬ３０３５（ノガラマイシン産生株）、及びサッカロポリスポラ・エリスラエア(Saccharopolyspora etythraea)ＮＲＲＬ２３３８（エリスロマイシン産生株）は、ＤＮＡ源として使用した。ストレプトマイセス・アルバス(Streptomyces albus)ＧＢ１６(Blanco et al., 2001)は、遺伝子発現及び生体内変換実験のための宿主として使用した。ストレプトマイセス・アルギラセウス(Streptomyces argillaceus)１６Ｆ４(Blanco et al., 2001)は、８−デメチル−テトラセノマイシンＣ（８ＤＭＴＣ）を得るために使用した。細菌の増殖は、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ；Ｏｘｏｉｄ）又はＲ５Ａ培地（Fernandez et al., 1998)上で実施された。胞子の増殖を達成するために、Ａ培地（Fernandez et al., 1998)を含むアガープレート上で、３０℃で７日間実施された。エスケリッチャ・コリ(Escherichia coli)ＸＬ１ブルー(Bullock etal., 1987)は、サブクローニングのための宿主として使用し、そして、ＴＳＢ培地中で３７℃で生育した。ｐＬＩＴＭＵＳ２９(Biolabs)及びｐＵＣ１８は、サブクローニング及びＤＮＡ配列決定のためのベクターとして使用した。ｐＷＨＭ３(Vara et al., 1989)及びｐＥＭ４(Quiros et al., 1998)は、ストレプトマイセス(Streptomyces)の実験に使用された。抗生物質の選択が必要だった場合、チオストレプトン(25μg/ml)、アパラマイシン(25μg/ml)又はアンピシリン(100μg/ml)を使用した。
【００３０】
ＤＮＡ操作及び配列決定
プラスミドＤＮＡの調製、制限エンドヌクレアーゼ消化、アルカリホスファターゼ処理、ライゲーション及び他のＤＮＡ操作は、Ｅ．コリ(E. coli)のための標準的な手順(Sambrook et al., 1989)及びストレプトマイセス(Streptomyces)のための標準的な手順(Kieser et al., 2000)に従い実施された。ＤＮＡの配列決定は、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止反応法(Sanger et al., 1977)及びＣｙ５オートサイクルシークエンシングキット(Pharmacia Biotech)を用いて実施した。両ＤＮＡ鎖は、キット内に提供されているプライマー又は内部オリゴプライマー（１７量体）により、ALF-express automatic DNA sequencer(Pharmacia)を用いて配列決定した。コンピューター支援データベースサーチ及び配列解析は、ウィスコンシン大学の遺伝子コンピューターグループのプログラムパッケージ(UWGCG; Devereux et al., 1984)及びＢＬＡＳＴＰプログラム(Altschul et al., 1990)を用いて実施された。
【００３１】
遺伝子のＰＣＲ増幅
個々の遺伝子は、表２に列記するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、サブクローニングを容易にするために、全ての遺伝子の各５’末端及び３’末端にHindIII及びXbaI部位を創り出すよう設計された。更に、２つの他の制限部位が、特定の遺伝子の交換を容易にするために、各遺伝子に特異的な各オリゴプライマー対に含められた。ＰＣＲの反応条件は以下のようにした：100ngの鋳型ＤＮＡを、2μMの各dNTP、10mMのKCI、10mM(NH4) 2SO4、20mM Tris-HCI (pH 8.8)、2mMMgSO4、0.1% Triton X-100及び10% DMSO(Merck)を含む50μlの全反応液量中で30pmolの各プライマー及び２ユニットのベントＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)と混合した。この反応混合物に50μlの鉱油(SIgma)を重層し、そして重合化反応をサーモサイクラー (MinyCycler, MJ Research)内で実施した。ＰＣＲ産物を精製し、そしてｐＵＣ１８内にサブクローニングした。
【００３２】
カセットプラスミドの構築
２つの遺伝子カセットプラスミドを最初に構築した：
プラスミドｐＬＮ１：このプラスミドの構築のために、オレアンドマイシンの糖遺伝子である、oleV, oleW, oleU及びoleYは、表１に記載のオリゴプライマー及び上記条件を用いて独立して増幅した。続いて、全ての遺伝子を連続的にｐＵＣ１８内にクローニングしてｐＵＣ１８ＶＷＵＹを生成させた。これを達成するために、各遺伝子は、５’特異的制限部位及びXbaI部位（各遺伝子の３’末端にある）を用いて、同一の制限酵素で消化された中間プラスミドコンストラクト内にクローニングされた。続いて、前記４つの遺伝子を含むAvrII-XbaIフラグメントを、ｐＥＭ４のエリスロマイシン耐性プロモーターの下流にクローニングし、ｐＬＮを生成させた。最後に、oleL、oleS及びoleEを含むSpeI-XbaIフラグメント（前記ポリリンカー由来のこれらの部位を用いる）を、ｐＬＲ２３４Δ７(Rodriguez et al., 2000)からｐＬＮのXbaI部位内にサブクローニングしてｐＬＮ１を生成させた。
【００３３】
プラスミドｐＬＮ２：最初に、oleVのＰＣＲフラグメントをAvrII-XbaIフラグメントとしてｐＬＩＴＭＵＳ２９の同一部位内にサブクローニングし、そしてエリスロマイシン耐性プロモーターの下流にある、ｐＥＭ４のXbaI部位内にサブクローニングするためのSpeI（ポリリンカー由来のこの部位を用いる）-XbaIフラグメントとして救出し、ｐＥＭ４Ｖを生成させた。続いて、ｐＬＮ１内のoleVをｐＥＭ４Ｖ由来のoleVと交換し、両コンストラクトをHindIII及びHpaIで消化することによってｐＬＮ１ｂを生成させた。最終的に、エリスロマイシン耐性プロモーターの支配下にある、Ｓ．アンチビオチカス(S. antibioticus)由来のオレアンドロース生合成遺伝子の全てを含むｐＬＮ１ｂのHindIII-XbaIフラグメントが、ｐＷＨＭ３の同一部位にサブクローニングされ、プラスミドｐＬＮ２が生成した。
【００３４】
プラスミドｐＬＮ２の種々の誘導体を以下のように作成した：
プラスミドｐＬＮ２ΔＶＷ：プラスミドｐＬＮ２をAvrII及びSpeIで消化し、そして生成した２つのＤＮＡフラグメントのより大きいほうを、ゲル電気泳動によって精製し、そして、所望のプラスミドｐＬＮ２ΔＶＷを得るために、それ自身とライゲーションした（AvrII及びSpeIが互換性末端を有する場合）。
【００３５】
プラスミドｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶ、ｐＬＮＳｎｏｇＣ、ｐＬＮＤｎｍＶ、ｐＬＮＴｙＩＤ：プラスミドｐＬＮ２をSpeI及びNheIで消化し、そして生成した２つのＤＮＡフラグメントのより大きいほうを単離した。eryBIV遺伝子は、表２に列記したオリゴヌクレオチドプライマー５’−Ｂ４Ｕ及び３’−Ｂ４Ｌを用いたＰＣＲによって増幅し、そしてｐＵＣ１８内にクローニングした。eryBIV遺伝子のインサートをこのクローンから切り出し、そしてSpeI-NheIで消化したｐＬＮ２主鎖とライゲーションし、プラスミドｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶを作り出した。同様に、Ｓ．ノガラター(S. nogaralaer)由来のsnogC遺伝子、Ｓ．ポイセチウス(S. peucetius)のdnmV遺伝子、及びＳ．フラジアエ(S. fradiae)のtylD遺伝子を、表２に列記した適切な上流及び下流オリゴヌクレオチドプライマーを用いてそれぞれ増幅し、そしてｐＵＣ１８内にクローニングした。各遺伝子インサートをこれらのクローンから切り出し、そしてｐＬＮ２のSpeI-NheIで消化した主鎖内にライゲーションしてｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶ、ｐＬＮＳｎｏｇＣ、ｐＬＮＤｎｍＶ及びｐＬＮＴｙＩＤをそれぞれ作り出した。
【００３６】
生体内変換宿主細胞の形質転換
前記プラスミドベースの遺伝子カセット及びグリコシルトランスフェラーゼを、標準的な手法によるプロトプラスト形質転換によって(Kieser et al., 2000)、２つの生体内変換宿主生物Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＴＫ２１及びＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６内に導入した。
【００３７】
生体内変換及びクロマトグラフィー技術
デオキシ糖の生合成のための関連するＧＴ及びプラスミドベース遺伝子カセットを有する適切なＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６又はＳ．リビダンス(S. lividans)ＴＫ２１組換え株の胞子を、８−デメチル−テトラセノマイシンＣ(Blanco et al., 2001)又はエリスロノリドＢ(Aguirrezabalaga et al., 2000)の存在下で、前述の条件に従い生育した。ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＬＣＭＳ解析は、既述の通りに実施した(Aguirrezabalaga et al., 2000; Fernandez-Lozano et al., 2000; Blanco et al., 2001)。
【００３８】
操作した生体内変換株から同定された産物の具体例
実施例１：グリコシル化レポーター系
エロラマイシン(elloramycin)経路のグリコシルトランスフェラーゼであるElmGTは、複数のＬ−６−デオキシ糖（Ｌ−オリボース、Ｌ−ラムノース、Ｌ−ロジノース）及びＤ−６−デオキシ糖（Ｄ−オリボース、Ｄ−ミコロース(mycorose)）に対する広範な基質特異性を有する。ElmGTは、そのような糖をアグリコンである８−デメチル−テトラセノマイシンＣ（８ＤＴＭＣ）上に転移させることができる（図７）。オレアンドマイシン経路のグリコシルトランスフェラーゼであるOleG2は、複数の６−デオキシ糖に対する広範な基質特異性を有する。OleG2は、そのような糖をアグリコンであるエリスロノリドＢ（ＥＢ）上に転移させることができる（図７）。エリスロマイシン経路のグリコシルトランスフェラーゼであるEryBVは、複数の６−デオキシ糖に対する広範な基質特異性を有する。EryBVは、そのような糖をアグリコンであるＥＢ上に転移させることができる（図７）。
【００３９】
ａ．Ｓ．アルバス(S. albus)における内因性８ＤＭＴＣの提供
８ＤＭＴＣの内因性の生合成を指示し、且つelmGTを含むコスミド１６Ｆ４を収容する組換え菌株であるＳ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４は、ｐＬＮ２誘導体で形質転換した場合に、８ＤＴＭＣへの転移によるＮＤＰ−６−デオキシ糖のプラスミド指示型合成の検出及びその後の相当するグリコシル化化合物の形成を可能にするレポーター菌株を提供する（図７）。
【００４０】
ｂ．Ｓ．リビダンス(S. lividans)における内因性８ＤＭＴＣの提供
８ＤＭＴＣの内因性の生合成を指示し、且つelmGTを含むコスミド１６Ｆ４を収容するＳ．リビダンス(S. lividans)ＴＫ２１の組換え誘導体株であるＳ．リビダンス(S. lividans)Ｌ１１６は、ｐＬＮ２誘導体で形質転換した場合に、８ＤＴＭＣへの転移によるＮＤＰ−６−デオキシ糖のプラスミド指示型合成の検出及びその後の相当するグリコシル化化合物の形成を可能にするレポーター菌株を提供する（図７）。
【００４１】
ｃ．８ＤＭＴＣのための生体内変換株、Ｓ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６
染色体内に組み込まれ、且つermE*（Ｓ．エリスラエア(S. etythraea)のエリスロマイシン耐性プロモーター）の支配下で発現する組換え菌株であるＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６は、ｐＬＮ２誘導体で形質転換し、且つアグリコンである８ＤＭＴＣを供給した場合に、８ＤＴＭＣへの転移によるＮＤＰ−６−デオキシ糖のプラスミド指示型合成の検出及びその後の相当するグリコシル化化合物の形成を可能にするレポーター菌株を提供する（図７）。
【００４２】
ｄ．８ＤＭＴＣ又はエリスロノリドＢのための生体内変換株、Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２
染色体内に組み込まれ、且つermE*（Ｓ．エリスラエア(S. etythraea)のエリスロマイシン耐性プロモーター）の支配下で発現する組換え菌株であるＳ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２は、ｐＬＮ２誘導体で形質転換し、且つアグリコンである８ＤＭＴＣ又はエリスロノリドＢ（ＥＢ）を供給した場合に、８ＤＴＭＣ又はＥＢへの転移によるＮＤＰ−６−デオキシ糖のプラスミド指示型合成の検出及びその後の相当するグリコシル化化合物の形成を可能にするレポーター菌株を提供する（図７）。
【００４３】
ｅ．８ＤＭＴＣ又はエリスロノリドＢのための生体内変換株、Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＢ５
染色体内に組み込まれ、且つermE*（Ｓ．エリスラエア(S. etythraea)のエリスロマイシン耐性プロモーター）の支配下で発現する組換え菌株であるＳ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＢ５は、ｐＬＮ２誘導体で形質転換し、且つアグリコンである８ＤＭＴＣ又はエリスロノリドＢ（ＥＢ）を供給した場合に、８ＤＴＭＣ又はＥＢへの転移によるＮＤＰ−６−デオキシ糖のプラスミド指示型合成の検出及びその後の相当するグリコシル化化合物の形成を可能にするレポーター菌株を提供する（図７）。
【００４４】
実施例２：ｐＬＮ２の機能性
Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４、Ｓ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６、及びＳ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２は、Ｌ−オリボース（上文の材料と方法を参照のこと）の産生のための生合成経路をコードするｐＬＮ２で形質転換された。Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４＋ｐＬＮ２は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合のＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、Ｌ−オリボシル−テトラセノマイシンＣ（ＬＯＬＶ−ＴＣＭＣ）と一致する化合物を産生することが明らかとなった（表３）。Ｓ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６＋ｐＬＮ２は、８ＤＭＴＣを供給した場合、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合のＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、ＬＯＬＶ−ＴＣＭＣと一致する化合物にアグリコンを変換させた（表３）。この化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、ＬＯＬＶ−ＴＣＭＣのナトリウム及びカリウム付加物につき、それぞれｍ／ｚ６１１．０８１５及び６２７．０７２８の分子ピークを示した（表３）。内因性８ＤＭＴＣ（Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４）を提供するレポーター系は、観察されたアグリコンの変換がわずかに１２％の生体内変換系（Ｓ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６）と比較して、ＬＯＬＶ−ＴＣＭＣに対するより高い変換効率（６４％）を示した。
【００４５】
Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２＋ｐＬＮ２は、供給されたＥＢのうち５０％を、純粋なスタンダードと比較した場合、Ｌ−オレアンドロシル−エリスロノリドＢ（ＬＯＬＥ−ＥＢ）と一致するＨＰＬＣ移動度、吸光スペクトル及びＬＣＭＳ解析の化合物に変換することが明らかとなった。
【００４６】
Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＢＶ＋ｐＬＮ２は、供給されたＥＢを、純粋なスタンダードと比較した場合、Ｌ−オレアンドロシル−エリスロノリドＢ（ＬＯＬＥ−ＥＢ）と一致するＨＰＬＣ移動度、吸光スペクトル及びＬＣＭＳ解析の化合物に変換することが明らかとなった。
【００４７】
実施例３：Ｌ−６−デオキシ糖中間体に対して作用する、ｐＬＮ２内の異種４−ケトレダクターゼのスクリーニング
oleUにコードされている４−ケトレダクターゼは、上文の材料と方法に記載したように、それぞれエリスロマイシン及びノガラマイシンクラスターの以下の異種４−ケトレダクターゼeryBIV又はsnogCの一方で置換された。これらのレダクターゼは、OleUと異なる糖中間体に作用するが、同一のＣ−４ケトレダクターゼの立体特異性を共有する。
【００４８】
eryBIVによるoleUの置換（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＢＩＶ）は、両レポーター系Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４及びＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６（実施例１に記載）において、それぞれ２０％及び３％のレベルでの８ＤＭＴＣの変換による新規のＨＰＬＣピークをもたらした。この新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点でＬＯＬＶ−ＴＣＭＣと一致した（表３）。この化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、ＬＯＬＶ−ＴＣＭＣのナトリウム及びカリウム付加物につき、それぞれｍ／ｚ６１１．０８１５及び６２７．０７２８の分子ピークを示した（図１０）。
【００４９】
８ＤＭＴＣのグリコシル化は、snogCによるoleUの置換（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＳ）の際に観察されなかった。snogCの予想産物であるＬ−オリボース又はＬ−ラムノースは、ＥｌｍＧＴによって８ＤＭＴＣに容易に転移し、グリコシル化が起こらなかったことは、snogC遺伝子産物の狭い糖基質特異性を示している。
【００５０】
eryBIVによるoleUの置換（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＢＩＶ）は、ＥＢを与えたレポーター系Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２において２つの新規ＨＰＬＣピークをもたらした。これらの新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点でＬＯＬＥ−ＥＢのマイナーなピーク及びＬ−ジギトキソシル(digitoxosyl)−ＥＢ（ＬＤＩＧ−ＥＢ）のメジャーなピークと一致した。ＬＤＩＧ−ＥＢのＬＣＭＳ解析は、ナトリウム及びカリウム付加物につき、それぞれｍ／ｚ５５５．０及び５７１．５の分子ピークを示した（図１０Ａ）。
【００５１】
eryBIVによるoleUの置換（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＢＩＶ）は、ＥＢを与えたレポーター系Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＢ５において３つの新規ＨＰＬＣピークをもたらした。これらの新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点でＬＯＬＥ−ＥＢ及びＬ−３−メチル−ジギトキソシル−ＥＢ（Ｌ３ＭＤＩＧ−ＥＢ）に相当するマイナーなピーク及びＬ−ジギトキソシル−ＥＢ（ＬＤＩＧ−ＥＢ）のメジャーなピークと一致した。
【００５２】
実施例４：Ｄ−６−デオキシ糖中間体に作用する、ｐＬＮ２における異種４−ケトレダクターゼのスクリーニング
４−ケトレダクターゼＴｙｌＤは、Ｄ−６−デオキシ糖に対して作用するが、OleUと同一のＣ−４位における立体特異性を有する（表１）。８ＤＭＴＣのグリコシル化は、Ｓ．アルバス(S. albus)又はＳ．リビダンス(S> lividans)宿主株レポーター系におけるtylDによるoleUの置換（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＴ）の際に観察されなかった。
【００５３】
実施例５：oleV及びoleWの２つの遺伝子欠失（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮ２Δ）によるＬ−ラムノースの生合成
Ｌ−ラムノースは、Ｃ−２位にヒドロキシル基を含む点でＬ−オリボースと異なる。ｐＬＮ２のカセットの設計は、脱酸素遺伝子oleV及びoleWの除去を可能にしてｐＬＮ２誘導体ｐＬＮ２Δを創り出す。遺伝子oleV及びoleWは、AvrII及びSpeI（互換性粘着末端を生成する）によるｐＬＮ２の消化及びその後の再ライゲーションによって除去された。生じたコンストラクトは、Ｌ−ラムノースの生合成を指示するはずである（図６及び１１）。本コンストラクトｐＬＮ２Δは、両レポーター系Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４及びＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６（実施例１に記載）において新規グリコシル化誘導体をもたらした。一旦ＥｌｍＧＴがＬ−ラムノースをアグリコン８ＤＭＴＣ上に転移させると、cos16F4に存在する３つのＯ−メチルトランスフェラーゼは、Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４におけるエロラマイシンの形成に伴い、Ｌ−ラムノースの３つの遊離ヒドロキシル基をメチル化した（図１２）。この新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、エロラマイシンと一致した。この化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、ネガティブモードにおいて、エロラマイシンに相当するｍ／ｚ６５９．０３８０の分子ピークを示した。
【００５４】
Ｓ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、それぞれＬ−ラムノース−テトラセナマイシンＣ（ＬＲＨＡ−ＴＣＭＣ）のナトリウム及びカリウム付加物に相当するｍ／ｚ６２７．０６４１及び６４３．０３８８の分子ピークを示した。
【００５５】
本コンストラクトｐＬＮ２Δは、レポーター系Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＧ２において、新規グリコシル化誘導体をもたらした。この新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、Ｌ−ラムノシル−ＥＢ（ＬＲＨＡ−ＥＢ）と一致した。この化合物のＬＣＭＳ解析は、ＬＲＨＡ−ＥＢのナトリウム及びカリウム付加物に相当するｍ／ｚ５７１．５及び５８８．０の分子ピークを示した（図１２Ａ）。
【００５６】
実施例６：oleV及びoleWの２つの遺伝子欠失（ｐＬＮＢＩＶ誘導体ｐＬＮＢＩＶΔ）によるＬ−ラムノースの生合成
Ｌ−ラムノースは、Ｃ−２位にヒドロキシル基を含む点でＬ−オリボースと異なる。ｐＬＮＢＩＶのカセットの設計は、脱酸素遺伝子oleV及びoleWの除去を可能にしてｐＬＮＢＩＶ誘導体ｐＬＮＢＩＶΔを創り出す。遺伝子oleV及びoleWは、AvrII及びSpeI（互換性粘着末端を生成する）によるｐＬＮ２の消化及びその後の再ライゲーションによって除去された。生じたコンストラクトは、Ｌ−ラムノースの生合成を指示するはずである（図６）。
【００５７】
グリコシル化産物は形成されず、これはEryBIVがＣ−２−デオキシ糖中間体を必要とし、一方、OleUが２，６−ジデオキシ及びＣ−２−デオキシ糖中間体に作用する、より広範な基質特異性を有することを示している（実施例３）。
【００５８】
実施例７：Ｌ−ロジノースの生合成（ｐＬＮ２誘導体ｐＬＮＲＨＯ）
Ｌ−オリボース（２，６−ジデオキシ糖）及びＬ−ロジノース（Ｃ−４位にエクアトリアルなヒドロキシル基を有する２，３，６−トリデオキシ糖）は、Ｃ−３及びＣ−４位にあるヒドロキシルが異なる６−デオキシヘキソースである。
【００５９】
ｐＬＮ２において、oleUは４−ケトレダクターゼurdZ3と置換され、ｐＬＮＺ３が創り出された。urdZ3は、ウルダマイシンＡの一部を形成する糖の１つであるＬ−ロジノースの生合成に参加する。同一のクラスター由来の、３，４−デヒドラターゼをコードする第二の遺伝子urdQは、ｐＬＮＺ３内に挿入され、これは誘導体ｐＬＮＲＨＯをもたらした。
【００６０】
本コンストラクトｐＬＮＲＨＯは、両レポーター系Ｓ．アルバス(S. albus)１６Ｆ４及びＳ．アルバス(S. albus)ＧＢ１６（実施例１に記載）において、新規ＨＰＬＣピークをもたらした。この新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、Ｌ−ロジノシル−テトラセノマイシンＣ（ＬＲＨＯ−ＴＣＭＣ）と一致した（表３）。この化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は、ネガティブモードにおいて、ＬＲＨＯ−ＴＣＭＣと一致するｍ／ｚ５７１．０７６０の分子ピークを示した。
【００６１】
コンストラクトｐＬＮＲＨＯは、ＥＢを与えたレポーター系Ｓ．リビダンス(S. lividans)ＮＡＢ５において新規ＨＰＬＣピークをもたらした。この新規化合物は、スタンダードとして使用した純粋な化合物と比較した場合に、ＨＰＬＣの移動度及び吸光スペクトルの観点で、Ｌ−ロジノシル−ＥＢ（ＬＲＨＯ−ＥＢ）に相当するピークと一致した。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】オレアンドマイシンの構造。
【図２】オレアンドマイシンの生合成を支配するストレプトマイセス・アンチビオチカス(Streptomyces antibioticus)の遺伝子クラスター由来の、ｄＴＤＰ−Ｌ−オレアンドロースの生合成に必要とされる遺伝子の構成。
【図３】糖遺伝子ライブラリーを作るための、デオキシ糖の生合成における段階を触媒する酵素をコードする個々の遺伝子のＰＣＲ増幅及びクローニング、並びに発現カセット内への段階的なそれらの組込みのためのスキーム。
【図４】プラスミドｐＬＮ１の構築のための詳細なスキーム。
【図５】活性型Ｌ−オリボースを産生し、続いてグリコシルトランスフェラーゼOleG2の存在下でエリスロノリドＢと結合する能力についての、ストレプトマイセス・アルバス(Streptomyces albus)内に収容されているプラスミドｐＬＮ１のＴＬＣベースのスクリーニングを示すスキーム。メチルトランスフェラーゼOleYも存在しているのは、結合した糖がその後メチル化されてオレアンドロシル−エリスロノリドＢを提供するためである。
【図６】XbaI部位が独特の発現カセットプラスミドｐＬＮ２の誘導を示すスキーム；及びｄＴＤＰ−Ｌ−ラムノースの合成を提供する発現カセットプラスミドｐＬＮ２ΔＶＷを作り出すためのoleV及びoleW遺伝子の押出しのためのスキーム。
【図７】活性型糖の細胞内産生について試験するために使用される方法であって、適当なグリコシルトランスフェラーゼの存在下で適当なアグリコンに対するそれらの結合の触媒を介する方法を示すスキーム。グリコシルトランスフェラーゼＥｌｍＧＴは、例えば、Ｌ−ラムノース、Ｌ−オリボース、Ｌ−ロジノース、Ｄ−オリボース及びＤ−マイカロースをアグリコン８−デメチルテトラセノマイシンＣに転移させることが知られている。
【図８】プラスミドｐＬＮ２内のoleU４−ケトレダクターゼ遺伝子の異種４−ケトレダクターゼ遺伝子との交換を示すスキーム。
【図９】４−ケトレダクターゼEryBIVの天然の基質及びこの酵素の別の基質を示すスキーム。
【図１０ａ】プラスミドｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶを含む菌株ＬＩ１６の発酵産物。
【図１０ｂ】菌株ＮＡＧ２（グリコシルトランスフェラーゼ、並びにプラスミドｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶを含み、そしてエリスロノリドＢを供給されている）におけるグリコシル化産物の産生のＨＰＬＣ解析。
【図１１】プラスミドｐＬＮ２由来の遺伝子oleV及びoleWの欠失を示すスキーム。
【図１２】プラスミドｐＬＮ２ΔＶＷを含む菌株の発行由来のＬ−ラムノース含有産物。
【図１２ａ】菌株Ｓ．アルバス(S. albus)ＮＡＧ２（グリコシルトランスフェラーゼOleG2、並びにプラスミドｐＬＮ２ＥｒｙＢＩＶを含み、そしてエリスロノリドＢを供給されている）におけるグリコシル化産物の産生。
【図１３】発現カセットプラスミドｐＤＥＳ内の遺伝子の配置を示すスキーム。
【図１４】ｄＴＤＰ−Ｌ−オリボース及びｄＴＤＰ−Ｌ−マイカロースの産生のための発現カセットプラスミドの構築。
【図１５】図１５は、発現プラスミドＰＫＳ内の遺伝子の配置を示す。
【図１６】図１６は、本特許に記載のプラスミドの構築を記載し、そして説明するのに使用するための図面である。
【図１７】図１７は、本特許に記載のプラスミドの構築を記載し、そして説明するのに使用するための図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２ａ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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