(57)【要約】本発明は、ＧＦＰ遺伝子が導入された複製豚、ＧＴ遺伝子が除去された複製豚及びこれらの生産方法に関する。このＧＦＰ遺伝子が導入された複製豚とＧＴ遺伝子が除去された複製豚を生産する方法は、体細胞株を設ける段階と、ＧＦＰ遺伝子が導入された供与細胞又はＧＴ遺伝子が除去された供与細胞を準備する段階と、供与細胞及び受核卵を用いて移植卵を生産する段階と、前記移植卵を代理母に移植する段階とを含む。本発明に係る、前記ＧＴ遺伝子が除去された複製豚の臓器は、超急性免疫拒否反応なしで異種移植のために使用することができる。
2005519633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ構造体と脂質成分又は非脂質カチオンポリマー媒介体を混合して脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を形成させた後、前記脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を前記核供与細胞培養液に添加した後培養し、前記ＧＦＰ遺伝子を前記核供与細胞に導入して発現させる段階と、
（ｃ）前記ＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｄ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含む、ＧＦＰ遺伝子が導入された豚を生産する方法。
【請求項２】
（ａ）段階の細胞が豚の胎児から分離した繊維牙細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）段階の豚ＧＦＰ遺伝子を含んだＤＮＡ構造体がｐＥＧＦＰ−Ｎ１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
（ｂ）段階の脂質成分がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）又はリポフェクトアミンプラス（LipofectAmine Plus）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ｂ）段階の非脂質カチオンポリマー成分がエクスジェン５００（ＥｘＧｅｎ５００）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１の（ａ）〜（ｃ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４５ＢＰ。
【請求項７】
請求項１の（ｄ）段階の方法を行い、請求項６のＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])から生産されたＧＦＰ遺伝子を発現する複製豚。
【請求項８】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）豚ゲノムＢＡＣライブラリからＧＴ遺伝子クローンを分離した後、前記ＧＴ遺伝子クローンを用いて、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分で相同組換えによってＧＴ蛋白質発現部位を標識遺伝子で代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにする遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する段階と、
（ｃ）前記の遺伝子ターゲティングベクターを脂質又は非脂質成分と混合して複合体を形成させた後、前記複合体を前記核供与細胞培養液に添加して前記組換えＧＴ遺伝子を核供与細胞内に導入してターゲティングさせる段階と、
（ｄ）前記組換えＧＴ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｅ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含むことを特徴とするＧＴ遺伝子が除去された豚を生産する方法。
【請求項９】
（ａ）段階の細胞が豚の胎児から分離した繊維牙細胞であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが外因性プロモータを持たないように、（ｂ）段階にプロモータトラップ方法がさらに含まれることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）段階の前記遺伝子ターゲティング用ベクターが、
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａＩＩＩ制限酵素及びＳａｃＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
（ｃ）段階の脂質媒介体がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１３】
請求項８の（ａ）〜（ｄ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４６ＢＰ。
【請求項１４】
請求項８の（ｅ）段階の方法を行い、請求項１３のＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])から生産されたＧＴ遺伝が除去された複製豚。
【請求項１５】
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａＩＩＩ制限酵素及びＳａｃＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されたベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豚において、所望する遺伝子の体細胞内導入(transfection)及びターゲティング(targeting)技術と遺伝子が導入された体細胞の核移植技術とを用いて、特定の遺伝形質を有する複製豚を生産する方法及びこの方法によって生産された豚に関する。
【０００２】
さらに詳しくは、本発明は、特定の遺伝子、すなわち特定の範囲の波長を有する光で緑色を発現する遺伝子、具体的にはＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)遺伝子が導入された複製豚及びその生産方法に関する。また、本発明は、免疫拒否反応関連遺伝子、具体的にＧＴ(α-１,３−galactrosyltransferase)遺伝子が除去された複製豚及びその生産方法に関する。
【０００３】
また、本発明は、ＧＦＰ遺伝子又は操作されたＧＴ遺伝子を細胞に効率よく導入してターゲッティングさせる方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、ＧＴ遺伝子を用いて効率よく除去することが可能なベクターに関する。
【０００５】
特に、本発明は、外来性遺伝子、すなわちＧＦＰ遺伝子の成功的導入によって疾患モデル動物の大量生産可能性を示唆し、ＧＴ遺伝子の除去された豚の生産が可能となることにより豚の臓器を超急性免疫拒否反応(hyperacute xeneograft rejection)なしで移植できるようにする。
【背景技術】
【０００６】
形質転換動物(transgenic animals)を生産する技術は、去る２０年間最も脚光を浴びている技術分野の一つである。 商業的有用性だけでなく、生体医学と生物学の研究においても、その重要性は圧倒的である。形質転換動物生産技術の産業的適用分野は、高品質の畜産食品の生産、高付加価値の薬理活性物質の生産、各種病原菌に対する生体抵抗力向上動物の生産、疾患モデル動物の生産及び遺伝子治療分野に至るまで非常に広範囲である。
【０００７】
形質転換動物を生産するための遺伝子導入技術の基本段階として、ＧＦＰ遺伝子のターゲティングは、染色体蛋白質の標識及び特定の染色体部位のタギング(tagging)の容易性、細胞質の多くの蛋白質との結合可能性、その無害性によって、生きている細胞で同一性質の細胞骨格糸(cognate cytoskeletal filaments)を発現させるに多く用いられている。１９９４年、Ｃｈａｌｆｉｅ等はオワンクラゲ(Aequorea victoria)から得たＧＦＰを蛍光性蛋白質認識指標として適用し、豚の胚芽を始めとした生きている細胞の様々な分子生物学的変化を観察した。その後、より機能が向上したＥＧＦＰ(enhanced GFP)が開発され、いろいろの動物でマーカー遺伝子(marker gene)として用いられている。
【０００８】
このような形質転換動物生産のための外来遺伝子導入方法としては、Ｇｏｒｄｏｎ等によって提示された前核内微細注入法(pronuclear microinjection)があるが、この方法は、外来遺伝子を受精卵の前核に直接注入する方法であって、マウスを始めとした実験動物で多く用いられているが、産業動物では極めて低い生産効率（牛０.５％、豚１.５％、羊２.５％）とモザイク現象(Mosaicism)が大部分の場合に現れるという欠点がある。これを克服するために、外来遺伝子が導入された形質転換体細胞を用いた動物複製技術が代案として提示されている。形質転換動物複製技術は、遺伝子が導入された細胞のみを核移植することにより、モザイク現象のない１００％形質転換複製受精卵を生産して代理母移植によって形質転換複製動物を効率よく生産することができる。また、この過程で体細胞の性を予め判別し、生まれる複製動物の性を人為的に調節することができるため、産業的有用性を極大化することができる。
【０００９】
体細胞複製技法による形質転換豚の生産のためには、まず、所望の遺伝子を分離し、遺伝子導入ベクターを製作し、遺伝子を体細胞に導入する分子生物学的技術と体細胞複製技術を融合しなければならない。遺伝子分離のために豚ゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングする方法が多く用いられている。遺伝子導入ベクターは、外因性プロモータの有無、遺伝子のサイズ及び陽性／陰性選択標識因子有無などを考慮し、目的に応じて異なる形のベクターが製作されている。遺伝子導入技術は、所望の遺伝子を核供与細胞内にトランスフェクション(transfection)することであり、生化学的方法(biochemical method)、物理的方法(physical method)、ウィルス媒介トランスフェクション方法(virus mediated transfection method)などがある。生化学的方法としては、カルシウムを媒介体とするカルシウム沈澱法、細胞膜成分のカチオン脂質を媒介体とするリポフェクション(lipofection)、又は非脂質カチオンポリマーを媒介体とする方法などがあるが、これは実験の容易性、効率性及び安定性の面で多く用いられている。物理的方法としてはエレクトロポレーション(electroporation)、遺伝子銃(gene gun)、細胞内直接微細注入法などがある。ウィルス−媒介方法としては、アデノウィルス(adenovirus)やレトロウィルス(retrovirus)のウィルスゲノム(virus genome)に所望のＤＮＡをクローニングして細胞に感染させる方法である。体細胞複製技術は、本出願人によって２０００年６月３０日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ００／００７０７の「体細胞複製動物及びその生産方法」が用いられるが、すなわち、まず脱核(enucleation)過程によって、遺伝物質(genetic material)を含んだ核が除去された未受精卵に他の細胞の核(nucleus)を注入することによりなされる。このように生産された受精卵を「複製受精卵(reconstructed embryo)というが、この複製受精卵を後活性化させ、体外培養を経て発育された核移植受精卵を代理母に移植して産子を生産する。
【００１０】
人間の臓器移植術は、人間臓器に関連した不治、難治疾患を治療する有用な手段であり、去る１０余年間、臓器移植手術例は漸次増加してきた。それにも拘わらず、同一期間の米国内手術待機者数は３倍が増加した。このような現象は需要と供給の不均衡によるもので、人間の臓器不足現象をもたらした。このように臓器移植手術で臓器供給源が絶対的に足りないが、これを解決する満足すべき方法は未だない実情である。このような臓器不足問題を解決する方案としては、医工学的接近法による人工臓器の開発と形質転換動物の生産などがある。この中でも、形質転換動物から供給を受けるためには、一般に、豚が臓器供与動物として選択される。その理由は生理学的類似性と臓器又は血管系の大きさ、ひいては赤血球の直径及び毛細血管の大きさが人間のそれと類似であって、倫理的に霊長類の利用より容易であることにある。
【００１１】
ところが、豚の臓器を人体に移植すると、超急性拒否反応が起こって、移植された患者に激しい副作用が発生して失敗するが、これは豚の細胞又は組織の主な異種抗原が人間の血漿内に存在するガルエピトープ(Gal epitope)という異種抗体に感作されるためである。このような免疫拒否反応を克服するために、いろいろの方案が提示されてきたが、人体内の補体活性を抑制させるための遺伝子操作技術、又は人体の免疫機序の活性を低下させるための持続的な薬物服用の方法などがあるが、その効果はあまり優れていない。すなわち、人体の免疫能力を低下させるので、微生物やウィルスなどの侵入によって感染し易いという問題が発生する。しかし、本願発明は、免疫拒否反応の根源的な解決策であって、問題となる異種抗原ＧＴ遺伝子ターゲティング技術によって前もって除去することにより、人間の免疫能力を低下させることなく、免疫拒否反応なしで臓器移植を受けることができる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、前述した先行技術に基づいて遺伝子ターゲティング及び導入技術と体細胞複製技術を用いて、ＧＦＰ遺伝子が発現される複製豚、及びＧＴ遺伝子が除去された複製豚を生産する方法及びこのような方法によって生産された豚を提供する。
【発明を実施するための最良の様態】
【００１３】
この発明の前記及び他の目的、特徴及びその他の利点は、添付図面を参照する次の説明によって明確に理解されるであろう。
図１は培養中のＧＦＰ発現体細胞の写真である。
図２はＧＦＰ発現体細胞を受核卵子に移植した核移植卵の写真である。
図３はＧＦＰが発現される豚胚盤胞核移植卵の写真である。
図４は形質転換された核移植卵を代理母の卵管内に移植する写真である。
図５は１次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの１次スクリーニング結果写真である。
図６は２次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの２次スクリーニング結果写真である。
図７は３次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの３次スクリーニング結果写真である。
図８はクローニングされたＧＴ遺伝子の制限酵素マッピング写真である。
図９はＧＴ遺伝子ターゲティングベクターの模式図である
以下、具体的に本発明を説明する。
【００１４】
本発明は、体細胞段階で、特定遺伝子の導入及びターゲティング技術と体細胞核移植技術を併合して、所望の遺伝子が発現又は除去される形質転換複製豚を提供する。
【００１５】
より具体的に、本発明は、遺伝子導入技術を用いてＧＦＰが導入された或いはＧＴ遺伝子が除去された体細胞を核移植する技術を用いて、ＧＦＰが発現され又はＧＴ遺伝子が除去された形質転換複製豚を提供する。
【００１６】
まず、ＧＦＰ発現複製豚を生産する方法は、（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、（ｂ）ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ構造体と脂質成分又は非脂質カチオンポリマー媒介体を混合して脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を形成させた後、前記脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を前記核供与細胞培養液に添加した後培養し、前記ＧＦＰ遺伝子を前記核供与細胞に導入して発現させる段階と、（ｃ）前記のＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、（ｄ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含む。
【００１７】
次に、前記のＧＦＰ遺伝子が発現される複製豚の生産方法を段階別に分けてより具体的に説明する。
【００１８】
〔第１段階：核供与細胞の準備、体外培養及び維持〕
体細胞核移植技術によるＧＦＰ遺伝子を発現する形質転換動物の生産には核供与細胞が必要である。核移植の際に用いられる供与細胞には体細胞由来及び受精卵由来の細胞などいろいろの種類があるが、豚の胎児から分離した繊維牙細胞を用いる。この細胞の特徴は、初期分離時に多数の細胞を得ることができ、細胞培養も比較的容易であり、体外における培養及び操作が容易であるという長所をもっている。
【００１９】
核供与細胞として主に用いられる胎児繊維牙細胞を分離するために、妊娠豚から採取した豚胎児の頭殿長(crown-rump length)を測定し、繁殖記録簿と対照して妊娠日齢を算定する。豚胎児を胎膜から分離し、臍帯も胎児に近接した部位で除去する。その後、分離された胎児を抗生剤と牛血清アルブミン(ＢＳＡ；bovine serum albumin)含有のリン酸緩衝生理食塩水(phosphate buffered saline；ＰＢＳ)で数回洗浄する。手術用器具で胎児の四肢、頭部及び内部臓器を除去し、さらにＰＢＳで洗浄する。組織からの細胞分離は残った組織を機械的に細かく粉砕した後、直ちにエクスプラント(explant)の培養によって細胞を分離し、或いは酵素(trypsin-EDTA)を用いて遊離された細胞を得る方法で胎児繊維牙細胞(fetal fibroblast)を分離する。核供与細胞の培養は３８℃及び９５％の湿度である恒温及び恒湿と５％ＣＯ２と９５％空気の条件で組成された培養器で行う。培養後、核供与細胞が培養容器に９０〜１００％増殖(confluent)すると、継代培養を行い、剰余分は凍結して保存する。
【００２０】
〔第２段階：ＧＦＰ遺伝子の体細胞導入及びターゲティング〕
ＧＦＰ遺伝子の導入及びターゲティングにおいて用いられたベクターは、商業的に市販されているｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech Labratories Inc., Palo Alto, CA)を用いた。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１は哺乳動物の細胞で明るい蛍光と高い発現のための野生型ＧＦＰ(wild-type GFP)の変形ＧＦＰである。生化学的導入媒介体としてヒュジン６(ＦｕＧＥＮＥ６、Roche Diagnostics Corp. IN, USA)、リポフェクトアミンプラス(LipofectAmine Plus、Life Technologies)及びエクスジン５００(ＥｘＧｅｎ５００、MBI Fermentas)を用いた。ヒュジン６は、多成分脂質系試薬(multi-component lipid based reagent)であって、様々な細胞タイプで高い導入効果効率を有し、細胞毒性がなく、血清添加有無に関係なく機能を発揮し、最小限の最適化作業が容易であるという長所を持つ。リポフェクトアミンプラスはカチオン脂質(cationic lipid)であり、エクスジン５００は非脂質カチオンポリマー(non lipid cationic polymer)であって、いろいろの細胞タイプで高い効率が報告された。
【００２１】
遺伝子の導入に用いられる細胞は、最適条件で成長させた後、酵素処理(trypsin-EDTA)によって単細胞に作って継代培養し、少なくとも実験一日前に新鮮な培養液で交替し、さらに実施４時間前に新鮮な培養液を供給する。生化学的媒介体に応じて最適の細胞密度になるまで細胞を培養して遺伝子を導入させる。
【００２２】
本発明では、ＧＦＰ遺伝子の導入及びターゲティングのために脂質及び非脂質系統の生化学的媒介体を用いた。ＧＦＰ遺伝子を脂質及び非脂質媒介体と混合して複合体(complex)を形成し、この複合体を核供与細胞内に導入させた。遺伝子の細胞内導入を効果的に行うために、媒介体に応じてＧＦＰ遺伝子の量、媒介体の体積、細胞密度、導入時間、血清使用有無などいろいろの変数を選定し、各変数(parameter)を選定し、各変数を最適化してＧＦＰ遺伝子の導入及び発現を極大化した。
【００２３】
〔第３段階：ＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞の選別、増殖及び凍結保存〕
ＧＦＰ遺伝子の細胞内導入後、細胞が完全増殖(confluency)するまで新しい培地で３〜５日間培養してＧＦＰ遺伝子の染色体内導入を誘導した後、酵素処理によって単細胞に作る。このような単細胞を顕微鏡上で紫外線フィルタを用いて観察し、緑色を呈する細胞のみを選別して核移植に用いる。また、ＧＦＰ遺伝子の導入された核供与細胞を抗生剤を用いて選別する。ＧＦＰ遺伝子ベクターに用いられたポジティブマーカー(positive marker)としてのネオマイシン(neomycin)抵抗遺伝子はＧＦＰ遺伝子と共に細胞内に導入されて発現されると、ネオマイシン抵抗性蛋白質を生産する。したがって、ターゲティングされた細胞を抗生剤含有の細胞培養液に培養すると、ＧＦＰ遺伝子ベクターの導入された細胞は生存し、その他の細胞は抗生剤の毒性によって死滅して、一定の時間後、培養容器には遺伝子がターゲティングされた細胞のみ増殖する（図１）。このような抗生剤による選別は、抗生剤の適正選別濃度を定めることにより、効果的に行われるようにする。ネオマイシン(neomycin)を２００μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌの濃度で４〜５日間添加して細胞を２〜３週間培養し、ターゲティングされた細胞を選別することができる。核供与細胞の種類によって差異があるが、ターゲティングされた細胞は一つの細胞から増殖を始めるので、次の段階の確認のためには一定数以上に増殖させなければならない。抗生剤による選別過程が行われると、正常培養に転換し、細胞の迅速な増殖と培養時に細胞死滅による不要な損失を減少させるために適切な成長因子と細胞死滅抑制剤などを添加する方法を適用する。増殖培養した細胞の効率的保存のために、最適条件を確立して各段階毎に凍結を行う。
【００２４】
〔第４段階：体細胞の核移植による複製受精卵の生産〕
本発明は、前記前段階で形質転換された核供与細胞の形質をそのまま有する動物を生産するために、体細胞核移植による複製技術を併合する。すなわち、複製受精卵を生産する。まず、受核卵子を選別しなければならないが、未成熟卵子を体外で成熟させて利用する。主に、屠畜場で豚の卵子を採取し、検卵して３回の洗浄を経て、牛血清アルブミンのない成熟用ＮＣＳＵ２３(North Carolina State University 23；ＮＣＳＵ２３−Ｍ、表１参照)に１０％豚卵胞液(porcine follicular fluid；ＰＦＦ)、性腺刺激ホルモン(gonadotropic hormone;ＧＴＨ、pregnant mare serum gonadotropin;ＰＭＳＧ、Intervet Folligon、hCG-Intervet、Chorulon)、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子(epidermal growth factor;ＥＧＦ)を添加した体外成熟培地で培養する。
【００２５】
このように培養された受核卵子及び核供与細胞を準備し、切開用、脱核及び注入用のピペットを準備する。培養液の準備過程で、全ての作業は洗浄用ＮＣＳＵ２３（ＮＣＳＵ２３−Ｗ、表２参照）を基礎培養液として用いる。受核卵子を０.１％ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)が添加されたＮＣＳＵ２３−Ｗ内に分注して卵丘細胞を剥す。完全に剥がされた卵子はＮＣＳＵ２３−Ｗ微小滴内で洗浄する。
【００２６】
洗浄済みの卵子を固定用ピペットで固定し、鋭いピペットで第１極体上部の透明帯に切開創を作る。固定用ピペットで受核卵子を固定させ、透明帯の切開創の製造に用いられたピペットで切開創と第１極体がよく見える位置でスキージング(squeezing)方法によって極体と細胞質の一部を除去して脱核させる。脱核後、卵子はＮＣＳＵ２３−Ｗで洗浄し、核移植前までＮＣＳＵ２３−Ｍ微小滴に静置させておく。核供与細胞を準備し、これを脱核された受核卵子の囲卵腔に注入する。この際、切開創を両ピペットと一直線上に置き、注入用ピペットで核供与細胞を吸入して切開創を介して核供与細胞を囲卵腔に注入することにより、核移植卵を作成する（図２）。
【００２７】
このようにして形成された核移植卵は、ＢＴＸ細胞操作機(BTX Electro cell manipulator、ＥＣＭ２００１、ＢＴＸ、ＵＳＡ)を用いて１.８ｋＶ／ｃｍの直流電圧、３０μｓの通電時間で単一通電で電気的細胞融合を試みる。融合が確認された受精卵はＮＣＳＵ２３−Ｗに移して洗浄する。その後、培養用ＮＣＳＵ２３（ＮＣＳＵ２３−Ｄ、表３参照）に移して培養する。培養４日目にＮＣＳＵ２３−Ｄに血清を１０％となるように添加して再培養した後、７日目に胚盤胞への発生及びＧＦＰ発現有無を確認する（図３）。
【００２８】
【表１】
2005519633.tif 000003
【００２９】
【表２】
2005519633.tif 000004
【００３０】
【表３】
2005519633.tif 000005
【００３１】
〔第５段階：複製受精卵の代理母移植及び産子生産〕
複製受精卵を移植して正常的に胎児に発生させることが可能な代理母を選抜する。経産豚の発情期を把握して移植適期を選定する。一般に、適当な受精時期は発情徴候を示し始めてから約３０〜４０時間経過した後なので、複製受精卵の代理母移植はこれから計算して複製受精卵の体外発育段階に合わせて定める。
【００３２】
複製受精卵の代理母移植は、開腹手術によって卵巣側の輸卵管２ｃｍ内に注入する（図４）。核移植卵の移植後４週目に超音波検査を行い、妊娠したか否かを確認する。その後にも、妊娠が持続されているか否か及び胎児の発育状態などを２週日間隔で超音波検査によって確認する。
【００３３】
胎児の出産は、分娩間隔が３０分以上経過したにも拘わらず、子豚が産まれなければ分娩を助けなければならず、分娩予定日が過ぎた母豚はホルモン製剤注射又は帝王切開術のような手術方法によって産子を生産する。
【００３４】
前記の方法で、豚胎児繊維牙細胞を核供与細胞としてＧＦＰ遺伝子の導入された体細胞を核の除去された受核卵子に核移植し、これを７日間体外培養して正常的に胚盤胞段階に発育され、ＧＦＰも発現された複製受精卵をＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽、SNU-P1[Porcine NT Embryo]）と命名し、これを２００１年１２月２７日付で国際寄託機関の韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）遺伝子銀行（ＫＣＴＣ、大韓民国大田広域市儒城区魚慇洞５２所在）に寄託番号「ＫＴＣＴ １０１４５ ＢＰ」で寄託し、前記寄託された核移植卵ＳＮＵ−Ｐ１を代理母に移植して正常産子を生産する。
【００３５】
一方、ＧＴ遺伝子の除去された複製豚を生産する方法は、（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、（ｂ）豚ゲノムＢＡＣライブラリからＧＴ遺伝子クローンを分離した後、前記ＧＴ遺伝子クローンを用いて、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分で相同組換えによってＧＴ蛋白質発現部位を標識遺伝子で代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにする遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する段階と、（ｃ）前記の遺伝子ターゲティングベクターを脂質又は非脂質成分と混合して複合体を形成させた後、前記複合体を前記核供与細胞培養液に添加して前記組換えＧＴ遺伝子を核供与細胞内に導入してターゲティングさせる段階と、（ｄ）前記組換えＧＴ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、（ｅ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含む。
【００３６】
以下、ＧＴ遺伝子が除去された複製豚の生産情報を段階別に分けてより具体的に説明する。
【００３７】
〔第１段階：核供与細胞の準備、体外培養及び維持〕
体細胞核移植技術による、ＧＴ遺伝子を除去させた形質転換動物の生産には核供与細胞が必要であるが、この過程は前記ＧＦＰ発現複製豚の生産のための第１段階と同一に行われる。
【００３８】
〔第２段階：ＧＴ遺伝子の分離〕
総３つのプール(pools)から構成されている豚ゲノムＢＡＣライブラリ(pig genomic BAC library)を英国ＨＧＭＰ(Human Genome Mapping Project)社から購入した後、これをスクリーニング(screening)してＧＴ遺伝子を分離する。ライブラリスクリーニング前段階として、豚ＧＴ ｃＤＮＡ(承認番号：ＡＦ２２１５１７)に基づいて作製したプライマー(primer)と豚ゲノムＤＮＡを用いた重合酵素連鎖反応を行ってポジティブ信号(positive signal)を得ることにより、プライマーの正確性及び重合酵素連鎖反応方法を検証する。検証された方法で３つの豚ＢＡＣゲノムライブラリプールをスクリーニングし、所望サイズの重合酵素連鎖反応産物が得られる単一クローンを得る。その後、通常的なサザンブロット(Southern blot)法を用いてＧＴ遺伝子クローンを検定する。
【００３９】
〔第３段階：ＧＴ遺伝子が除去されたベクター製作及び核供与細胞への導入〕
前記で分離されたＧＴ遺伝子クローンを用いて遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する。すなわち、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分を代置した標識遺伝子が相同組換え(homologous recombination)によってＧＴ蛋白質発現部位を代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにターゲティングベクターを作製する。ターゲティングされた細胞の選別効率を高めるために、ターゲティングベクターは外因性プロモータ(exogenous promoter)を持たないように、すなわちプロモータトラップ(promoter trap)方法を用いる。ターゲティングベクターは、ＧＴ遺伝子のうちイントロン(intron)８の一部分、蛋白質発現部位（エクソン９[Ｅｘｏｎ９]）、及びイントロン９の一部配列を含む相同切片と、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現のうちＡｖａＩとＤｒａＩＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列を代置するピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を含む。このようなターゲティングベクターは、相同切片では相同組換えが起こってピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列部位が正常的なエクソンに挿入されてＧＴ遺伝子を破壊する（図９）。前記ターゲティングベクターを核供与細胞としてＧＦＰ形質転換動物生産方法で言及されたヒュジン６を用いて導入する。ターゲティングベクターが導入された体細胞は、適切な抗生剤を含んだ培地で１〜２週日間培養して選別した後、ターゲティングしたか否かをサザンブロット又は重合酵素連鎖反応などの通常の方法で確認する。
【００４０】
〔第４段階：体細胞の核利殖による複製受精卵の生産〕
前記ＧＦＰ発現複製豚生産の第４段階と同一に行われる。
【００４１】
〔第５段階：複製受精卵の代理母移植及び産子生産〕
前記ＧＦＰ発現複製豚生産の第５段階と同一に行われる。
【００４２】
前述した方法で豚胎児繊維牙細胞を核供与細胞としてＧＴ遺伝子を除去させて核を移植した、胚盤胞段階の豚複製受精卵をＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Procine NT Embryol])と命名し、これを２００１年１２月２７日付で国際寄託機関の韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）遺伝子銀行（ＫＣＴＣ、大韓民国大田広域市儒城区魚慇洞５２所在）に寄託番号「ＫＴＣＴ １０１４６ＢＰ」で寄託し、前記寄託された核移植卵ＳＮＵ−Ｐ２を代理母に移植して正常産子を生産する。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者には自明のことである。
【００４４】
〔実施例１〕：核供与細胞の準備、核供与細胞の体外培養及び維持
妊娠した豚子宮を採取した後、無菌状態で実験室に移してくる。生後３０日齢、頭殿長２５ｍｍ程度の胎児を主に利用し、羊膜に包まれている胎児を無菌的に分離する。分離された胎児の頭、四肢及び腹腔内部臓器を除去した後、抗生剤と抗菌剤の添加されたリン酸緩衝液で数回洗浄する。０.２５％トリプシンＥＤＴＡ(trypsin-EDTA)入りのディッシュで外科用鋏を用いて胎児組織を分離する。分離された胎児組織を３８℃、５％ＣＯ２細胞培養器に３０分程度培養する。その後、数回遠心分離でトリプシンを洗浄し、牛胎児血清が１０％含有された細胞培養培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium：ＤＭＥＭ)で培養する。分離後、培養ディッシュに細胞が９０〜１００％増殖すると、一部は継代培養をし、剰余細胞は凍結する。細胞の凍結は体細胞核移植の核供与細胞として長期間用いるための目的であり、培養を行う場合、細胞の質を向上させるために成長因子と細胞死滅抑制剤を添加した培養液を用いる。
【００４５】
〔実施例２〕：ＧＴ遺伝子の分離
豚ゲノムライブラリ(Pig genome library)でＧＴのシグナルを検索する前に、陽性対照群として、ランドレース(Landrace)品種の６ヶ月齢豚子宮のうち約５ｇを細かく切って液体窒素入りの乳鉢で入れて組織を破壊させる。蛋白質融解剤Ｋ(proteinase K)を１１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した後、フェノール抽出によって豚ゲノムＤＮＡを準備する。  豚ＧＴスクリーニングのために、豚ＢＡＣゲノムライブラリを購入した。最終単一クローンを分離するために、段階別に総３つのプールから構成されているライブラリをスクリーニングしなければならず、それぞれのプールの構成は次の通りである。第１プールはＡからＲ（Ｋ除外）まで１７バイアル(vials)から構成されており、第２プールは各１５個のプールを有する９６ウェルマイクロプレート(microplate)から構成されており、第３プールは各３８４−ウェルマイクロプレートから構成されている。まず、豚ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を用いて所望のサイズの陽性ＧＴ信号を見つけるために豚ＧＴ ｃＤＮＡ（承認番号：ＡＦ２２１５１７）から由来のプライマーを製作し、重合酵素連鎖反応を行った。この際、用いられたプライマーは豚ＧＴ５（５−ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＧＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＧＣＡ Ａ ３）と豚ＧＴ３（５ ＴＣＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＣＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＣＡＣ Ｔ ３）であって、２つのプライマーを用いて増幅される産物の大きさは３４２ｂｐである。前記増幅産物を生成するために用いられる重合酵素連鎖反応は、１Ｕの耐熱性ＤＮＡ重合酵素、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８.８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、テンプレートとしての１００ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ及び２μｌプライマー（４０ｐｍｏｌ／μｌセンスプライマー、４０ｐｍｏｌ／μｌアンチセンスプライマー）から構成されており、総体積は２０μｌである。ＰＣＲ条件は初周期(cycle)では９５℃で５分間変性、２番目の周期(cycle)からは９５℃で１分間変性、５５℃で１分間アニーリング(annealing)、７２℃１分３０秒間重合化(polymerization)を行うサイクルを４０回繰り返し、最後のサイクルでは７２℃で１５分間増幅(extension)を行い、増幅された産物はゲル電気永動過程によって確認した。
【００４６】
豚ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）を用いて重合酵素連鎖反応を行った結果、３４２ｂｐの産物(product)を確認することができ、これを陽性対照群として第１次に豚ＢＡＣゲノムライブラリ第１プール（Ａ〜Ｒ、Ｋ除外、総１７個）を豚ＧＴ５と豚ＧＴ３プライマーを用いてゲノムＤＮＡと同一の条件でＰＣＲを行った結果、ゲノムＤＮＡと同様の３４２ｂｐサイズの産物をＦ、Ｇプールで得た（図５）。第１プールで陽性シグナルが現れたＦ、Ｇプールの第２プール(secondary pool)（Ｆ：７６〜９０、Ｇ：９１〜１０５から構成、各１５個）を前述と同一の条件で重合酵素連鎖反応を行った結果、Ｆ、Ｇそれぞれの第２プールでゲノムＤＮＡと同一の産物を得た。また、Ｆプールは８１、８８番で、Ｇプールは９１番で３４２ｂｐのＰＣＲ産物を確認することができた（図６）。この中のシグナル(signal)が最も強く現れた８８番プールの３８４個のそれぞれの単一クローンから構成された第３プール(tertiary pool)（384-well microplate、１Ａ〜２４Ｐ）を用いてＰＣＲを行った結果、８ＦでゲノムＤＮＡと同一のシグナルが強く現れることを確認することができた（図７）。
【００４７】
〔実施例３〕：ＧＴ遺伝子が除去されたベクター製作
豚ＧＴの大略的な切断マッピングは、豚ＧＴエクソン９遺伝子（承認番号：ＡＦ２２１５１７、３.９ｋｂ）をウェブカッタープログラム（Webcutter program；http://www.firstmarket.com/firstmarket/cutter/）とした。サザンハイブリダイゼーション(Southern hybridization)を行うためにプローブ(probe)に用いるＤＮＡは、重合酵素連鎖反応を用いて作った産物（３５１ｂｐ）を８％ページゲル(PAGE gel)で電気永動した後、ゲルエレクトロエルション(gel electro-elution)を用いて得た。これを無作為プライマー標識キット(Random primer labeling kit, Life Technologies, USA)を用いてプローブ（α−３２Ｐ［ｄＣＴＰ］）を作った。
【００４８】
ＧＴ ＢＡＣ ＤＮＡを準備するために、３番目のプールで１μｌのクローニングされた大腸菌を３ｍｌのＬＢブロス(broth)（ＣＭ＋）に接種して３７℃で３００ｒｐｍで１２時間培養し、５００ｍｌのＬＢブロス（ＣＭ＋）に再接種して同一の方法で１６時間培養した。キアゲン(QIAGEN)大型−構造キット(Large-construct kit；Qiagen, Germany)を用いて純粋なＢＡＣ ＤＮＡを得た。豚ＧＴ ＤＮＡ（５μｇ）を１０ユニットの制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ）で３時間切断した後、１％のアガロースゲルに５０Ｖで１２時間電気永動した。電気永動したゲルを変性化溶液(denaturation solution；０.５Ｍ ＮａＯＨ、１.５Ｍ ＮａＣｌ)に１５分間、中性化溶液（Neutralization solution；０.５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１.５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８）に同一の時間浸漬した後、バキュームトランスファー(vacuum transfer)を用いてＤＮＡをナイロン膜(nylon membrane)に移した。この膜を３時間プレハイブリダイゼーション(prehybridazaion)させた後、１６時間ハイブリダイゼーション(hybridization)させた。この膜をＸ線フィルムに露出させ、切断されたＢＡＣ断片を同定した。
【００４９】
サブクローン(subclone)を作るためにベクター（ｐＵＣ１９）を切断酵素（ＥｃｏＲＩ）で１時間半切断させた後、フェノール／クロロホルム(phenol/chloroform)で純粋化させて−２０℃に保管しながら使用した。切断されたＢＡＣ ＤＮＡとベクター（１００ｎｇ）、１０倍合成重合剤(ligation buffer)、２μｌのＴ４重合酵素（リガーゼ；１０ｕｎｉｔ／μｌ）をチューブに入れた後、１５〜１６℃で１６時間以上培養した。その後、Ｃ細胞(competent cell)２００μｌに重合混合液(ligation mixture)１０μｌを添加して３０分間氷上に置いた後、４２℃で９０秒間熱衝撃(heat shock)を加え、８００μｌのＬＢブロスを添加して４５分間３７℃の培養器で培養した。この混合液とＩＰＴＧとＸ−ｇａｌが塗抹されたＬＢプレート（Ａｍｐ＋）に塗布して３７℃の培養器で一晩中培養した。翌日、色選別(color selection)によって白色群(white colony)を選んで培養した後、重合酵素連鎖反応によって所望の断片が挿入されたかを確認した。
【００５０】
マッピング(Mapping)を行った結果、ＢａｍＨＩを除いた残りの酵素（ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ）部位が豚ＧＴエクソン９には存在しないことが分かった。そして、ＢＡＣ ＤＮＡをそれぞれの制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ）で切断して１％のアガロースゲルで電気永動した結果、様々なサイズのＤＮＡバンドが見られた（図８）。このゲルでサザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)を行った結果、ＧＴエクソン９を含んでいるＤＮＡ断片が、ＢａｍＨＩを除いた全ての制限酵素は単一バンドを示し、その断片は８〜１２ｋｂの間に位置した。ＥｃｏＲＩで切断したＤＮＡ切片は約８ｋｂの大きさを有し、ＧＴエクソン９及びイントロンの一部分を含む大きさであって、豚ＢＡＣ ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切った後、サブクローニングを行った。前記で分離されたＧＴ遺伝子クローンを用いて遺伝子ターゲティング用ベクターを作製した。ターゲティングされた細胞の選別効率を高めるために、ターゲティングベクターは外因性プロモータを有しないように、すなわちプロモータトラップ(promoter trap)方法を用いた。サブクローニングされたＧＴ遺伝子（１μｇ）を３ユニットのＡｖａＩとＤｒａＩＩＩ制限酵素で、ピューロカセット(puro cassette)を含むプラスミド(Clontech社)をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素で３７℃で２時間以上反応させて切断する。切断された遺伝子をｄＮＴＰとクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ(Klenow fragment DNA polymerase)を用いてブラントエンド(blunt end)を持つようにした。純粋化のために１％のアガロースゲル上で電気永動した後、ゲル内にある遺伝子をＤＮＡエルションキット(elution kit)(Qiagen, Germany)を用いて分離した。分離されたＧＴ遺伝子断片とピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）遺伝子切片を重合酵素を用いてライゲーション(ligation)してターゲティング用ベクターを作製した（図９）。
【００５１】
〔実施例４〕：ＧＦＰ遺伝子とＧＴ除去された遺伝子の導入及びターゲティング
細胞が完全増殖した６０ｍｍの培養ディッシュで細胞培養液を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。その後０.２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを適用し、１０％の牛胎児血清が添加された細胞培養培地２ｍｌに細胞を再浮遊させて３５ｍｍの培養ディッシュに胎児繊維牙細胞を塗布した。翌日５０〜９０％の細胞密度が確認されると、遺伝子を導入させた。
【００５２】
本発明でヒュジン６の場合、３５ｍｍのディッシュ当たりＤＮＡ量は１μｇ、遺伝子導入液用量を３.０μｌとして遺伝子を導入した。３５ｍｍのディッシュ一枚を基準としてエペンドルフチューブ(Ependorf tube)に９７μｌの血清を添加していない細胞培養培地を分注した。１μｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターを入れた後、ヒュジン６を３μｌ入れて３０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。遠心分離後、１５分間室温で放置した後、３５ｍｍの培養ディッシュに１００μｌずつ分注してよく揺らして均一に拡散させた後、細胞培養器で培養した。カチオン性リボソームを用いる方法であるリポフェクトアミンプラス(LipofectAmin plus, Life Technologies)は少量のＤＮＡでも高い遺伝子導入率を得ることができるという長所がある。まず、リン酸緩衝生理食塩水、牛胎児血清及び抗生剤が添加されていない培地を３０分前に３７℃の恒温水槽に浸漬しておき、クリーンベンチ内で滅菌エペンドルフチューブにＤＮＡを混合する。血清が添加されていない培地又はＯｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌとプラス試薬(Plus reagent)４μｌを混合してこれをＤＮＡとよく混合した（ピペット使用）後、１５分間室温に静置させた。静置する間、９０％の細胞密度を有する６ウェルプレート(well plate)をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。血清を添加しない培地をウェル当たり０.８ｍｌずつ加えた後、ＤＮＡ混合液を各ウェルに入れてディッシュを軽く揺らして均一に混ぜた後、ＣＯ２培養器で培養する。カチオンポリマー製剤であるエクスジェン５００（Ｅｘｇｅｎ５００、MBI Fermentas）は最適化作業によって１００μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌに２μｇのベクターＤＮＡを入れた後、６.６μｌのＥｘｇｅｎ５００を入れて１０秒間３０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、室温に１０分間静置し、６０％の細胞密度を有する３５ｍｍの培養ディッシュに分注した後、ＣＯ２培養器で培養した。
【００５３】
〔実施例５〕：ＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞の選別、増殖及び凍結保存
それぞれ異なる３つの方法で遺伝子を導入させた豚胎児繊維牙細胞を３〜５日間培養して完全増殖させた後、酵素処理で単細胞に分離した。このような単細胞のうち、顕微鏡の下で紫外線フィルタを用いてＧＦＰ蛋白質が発現される細胞のみを選択して核移植に適用する。また、抗生剤を用いた細胞選別のために遺伝子導入後、４〜５日間隔で３週間ネオマイシンを４００μｇ／ｍｌの用量で適用して選別する。選別後、細胞は一つのコロニー(colony)に成長するが、これをトリプシンで処理して９６−ウェル(96-well)の培養溶液に移して培養した後、これらが増殖すると、以後２４−ウェルに移して培養し、ひいては１２ウェルと６ウェルまで増殖培養を行った。一定の数以上培養された細胞のゲノムＤＮＡを分離して染色体上でＧＦＰ遺伝子が挿入されたかを確認するために、５’−ＧＣＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡ−３’、５’−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＡＴ−３’のプライマーを用いた重合酵素連鎖反応法とＧＦＰプローブを用いたサザンブロット(Southern blotting)によって、選別された細胞のＧＦＰ遺伝子が導入された否かを確認した。ＧＦＰ遺伝子導入と抗生剤選別が終わって増殖培養された細胞を１５％の牛胎児血清と１０％の細胞培養培地を用いて細胞を浮遊した後、４℃で２時間、−７０℃で１２時間以上静置させた後、−１５０℃で凍結保管した。その後、凍結した細胞を用いて体細胞核移植を行った。
【００５４】
〔実施例６〕：受核卵子の準備
屠畜場で採取した屠畜豚の卵巣から１８ゲージ注射針付き５ｍｌの注射器を用いて直径３〜６ｍｍ内外の卵胞を吸入した後、１ｃｍ間隔の格子目を描いた１００ｍｍのディッシュに吸入卵胞液を移し、卵丘細胞が十分付着されており且つ細胞質が均質な卵子を選別した。選別された卵子をＮＣＳＵ２３−Ｗが２ｍｌずつ分注された３５ｍｍのディッシュで３回にわたって洗浄し、ＮＣＳＵ２３−Ｍで最終的に洗浄する。その後、牛血清アルブミンが添加されていないＮＣＳＵ２３−Ｍに１０％の豚卵胞液、性腺刺激ホルモン、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子を添加して４−ウェルディッシュに４８０μｌずつ分注した。それぞれのウェルに未成熟卵子を５０〜６０個ずつ入れて５％ＣＯ２の条件下に２２時間培養した後、前記ホルモンが添加されていないＮＣＳＵ２３−Ｍで２０〜２２時間体外成熟させた。
【００５５】
〔実施例７〕：体細胞核移植
実施例４で準備された受核卵子をＮＣＳＵ２３−Ｗ培養液で１回洗浄し、０.１％ヒアルロニダーゼが添加されたＮＣＳＵ２３−Ｗ溶液内に移した後、卵丘細胞を除去した。次に、７.５ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ；dimethyl sulfoxide)にサイトカラシンＢ(cytochalasin B，Sigma chemical Co., USA)を溶解させた溶液１μｌと１０％の牛胎児血清が添加されたＮＣＳＵ２３−Ｗを１ｍｌ混合したサイトカラシンＢ溶液に卵子を移した。微細操作機(micromanipulator)で受核卵子を固定し、透明帯を貫通して固定用ピペットと摩擦を加えて切開創を形成させた後、卵子の上部で微細ピペットによって全量の１０〜１５％に該当する細胞質を圧迫圧力を加えて除去することにより、卵子から脱核させた（スキージング脱核、squeezing法）。
【００５６】
脱核後、微細操作機で脱核された受核卵子に、準備された核供与細胞を移植した。まず、５ｍｇのＰＨＡ−Ｐ(phytohemagglutinin)を１０ｍｌのＮＣＳＵ２３−Ｗに溶解させた溶液１００μｌと４００μｌのＮＣＳＵ２３−Ｗに混合した溶液で作業用ディッシュの上端中央に４μｌの移植用微小滴を作る。その後、０.５％の牛胎児血清が添加されたＰＢＳで移植用微小滴の上下にそれぞれ１つずつの４μｌの核供与細胞用微小滴を作る。これらの微小滴をミネラルオイルで塗布した後、作業用ディッシュを微細作業板に位置させる。ＮＣＳＵ−Ｍに静置された脱核卵子を洗浄用ＮＣＳＵ−Ｗで３回洗浄し、移植用微小滴に移動させた後、移植用ピペットを用いて供与細胞を移植用微小滴に移動させる。移植用ピペットにＧＦＰ発現が確認された細胞、又はＧＴ遺伝子が除去された細胞を注入し、この細胞を受核卵子の囲卵腔に注入した（図３）。このような過程を経て形成させた核移植卵をＮＣＳＵ−Ｗに移して３回洗浄した後、静置させた。
【００５７】
〔実施例８〕：細胞融合及び活性化
ＢＴＸ細胞操作機を用いて核移植卵の電気融合及び活性化を行った。マンニトール溶液（表４参照）１５μｌを洗浄用マウスピペットで核移植卵入りのＮＣＳＵ２３−Ｗに添加し、１分間静置させた。洗浄用マウスピペットを用いて核移植卵をＮＣＳＵ２３−Ｗ添加のマンニトール溶液に注入してさらに１分間静置させ、洗浄用マンニトール溶液に入れた。次に、ＢＴＸ細胞操作機に連結させたマンニトール入りの電極容器に核移植卵を入れ、供与細胞が（＋）電極を向かうように核移植卵を位置させた。核移植卵の細胞融合は１.８ｋＶ／ｃｍの直流電圧で３０μｓの時間で１回通電する条件を設定することにより誘導した。電気刺激後２０分以内に、細胞融合したか否かを顕微鏡の下で確認し、融合されていない核移植卵の融合を再び試みた。細胞融合が確認された核移植卵はＮＣＳＵ２３−Ｗに移した。
【００５８】
【表４】
2005519633.tif 000006
【００５９】
〔実施例９〕：核移植卵の培養
細胞融合過程済みの形質転換核移植卵は、ＮＣＳＵ２３−Ｗで活性化した後、ＮＣＳＵ２３−Ｄに移して培養した。その後、培養４日目にＮＣＳＵ２３−Ｄに牛胎児血清が１０％となるように添加した培地で培養した。このような過程によって発育されたそれぞれの形質転換核移植卵は、培養７日目に、胚盤胞に発育したか否かと、ＧＦＰ発現核移植卵の場合、発現したか否かを紫外線の下で確認した（図４）。
【００６０】
〔実施例１０〕：核供与細胞のＧＦＰ導入如何による核移植卵の発育成績比較
核供与細胞のＧＦＰ導入(GFP-transfection)如何による核移植卵発育成績の差異を比較するために、実施例４でＧＦＰを導入した核供与細胞とそうでない正常体細胞を実施例６、実施例７、実施例８及び実施例９の方法で体細胞核移植して分割率、胚盤胞への発育率及び胚盤胞細胞数を比較した（表５参照）。ＧＦＰ導入の如何は、核移植卵の発育成績に有意的な差異をもたらしていない。
【００６１】
【表５】
2005519633.tif 000007
【００６２】
〔実施例１１〕：供与核のＧＦＰ導入方法による核移植卵の発育成績比較
ＧＦＰ導入方法による核移植卵の発育率を比較するために、実施例４で３つの方法によってＧＦＰを核供与細胞に導入し、実施例６、実施例７、実施例８及び実施例９の方法で体細胞核移植して、これらの分割率、胚盤胞への発育率及び胚盤胞細胞数を比較した（表６）。ＧＦＰ導入方法によって核移植卵の発育成績に有意的な差異をもたらしていない。
【００６３】
【表６】
2005519633.tif 000008
【００６４】
〔実施例１２〕：核移植卵の代理母への移植
実施例１から実施例１１までの過程によって生産されたＧＦＰ遺伝子が導入され又はＧＴ遺伝子が除去された核移植卵の代理母移植のための受卵豚は、産科学的疾病に罹患せず正常的な発情周期が繰り返し行われる雌豚の中から子宮状態が正常な個体を対象として選抜した。
【００６５】
体外培養過程にある良質の形質転換核移植卵を選別し、２０％の牛胎児血清が添加されたリン酸緩衝生理食塩水と共に受卵豚の卵巣側の卵管２ｃｍ部位に注入した（図５）。その過程を略述すると、受卵豚の麻酔は全身麻酔剤として硫酸アトロピン(atropine)を１ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉注射した後、鎮静剤としてのアザペロン(Azaperone；Stresnil, P/M；Mallinckrodt)を２〜４ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内注射した。１０分後、２０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン(ketamine HCl)を筋肉注射して麻酔を誘導した。皮膚切開部の周囲に対する局所麻酔は、２％のリドカイン(lidocaine)で注射した。一般的な開腹手術法によって腹部の正中線に沿って７ｃｍ程度切開して切開創の血液が腹腔内に流入しないようにした。手で腹腔内で促進して卵巣、卵管及び子宮を切開創に牽引した。牽引された卵巣の卵巣間膜を用心深く取り扱って卵管の開口部を認知し、１.０ｍｌのツベルクリン(tuberculin)注射器(Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ07417)付きＴｏｍ ｃａｔ ｃａｔｈｅｔｅｒ(50cm, ５French, open ended catheter, Williams A Cook, MO 63103)を卵管内に２ｃｍ程度挿入した（図５）。挿入されたカテーテルの前方に十分な空間を確保し、核移植卵を注入した。核移植卵を完璧に注入したか否かは顕微鏡で検鏡し、抗生剤を混ぜた生理食塩水５００ｍｌを腹腔内注入した。腹部の縫合は吸水性縫合糸を用い、その後皮膚縫合を行った。手術後の感染を防止するために広範囲抗生剤を５日間投与した。
【００６６】
〔実施例１３〕：妊娠鑑定及びＧＦＰ遺伝子の導入とＧＴ遺伝子の除去が行われた産子の出産
核移植卵の代理母移植後４週目に、超音波検査方法で妊娠したか否かを確認した。
【００６７】
妊娠確認後にも２周間隔で超音波検査によって、妊娠が持続されているか否かを観察した。妊娠したＧＦＰ発現複製豚は核移植卵移植後１１４日目に７匹が、ＧＴ遺伝子が除去された複製豚は移植後１１４日に３匹がそれぞれ産まれた。
【００６８】
〔実施例１４〕：それぞれの形質転換複製豚の遺伝子確認
実施例１３で生産されたそれぞれの形質転換産子は、肉眼的方法及び分子生物学的方法で遺伝子分析を行った。ＧＦＰ発現複製豚は、外見観察及び組織を用いたサザンブロット、ウェスタンブロット及び細胞培養によってＧＦＰ発現及び遺伝子導入を分析した。ＧＦＰ発現の如何は、肉眼的に産子の皮膚組織、口腔組織、舌などを観察して緑色が現れるかを調査して評価した。分子生物学的検査では、サザンブロットで産子のゲノムＤＮＡを分析し、ウェスタンブロットで産子組織の蛋白質を分析してＧＦＰ発現複製豚であることを確認した。その後、産子の組織を実施例１の方法で培養して細胞株を確立した後、顕微鏡の紫外線フィルタを用いて、ＧＦＰ蛋白質が発現されることを確認した。ＧＴ遺伝子が除去された複製豚の遺伝子分析は、分子生物学的方法としてのサザンブロットで産子のＤＮＡを分析して、ＧＴ遺伝子が除去された複製豚であることを確認した。
【００６９】
【表７】
2005519633.tif 000009
【００７０】
【表８】
2005519633.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上説明したように、本発明は、体細胞でＧＦＰ遺伝子を導入し或いはＧＴ遺伝子を除去させた後、前記体細胞を核移植する複製技術を用いて、ＧＦＰ遺伝子が発現される豚又はＧＴ遺伝子が除去された豚を提供することにより、疾患モデル動物の生産可能性及び超急性免疫拒否反応なしで人体に利殖可能な臓器供給動物の生産可能性を提供する。
【００７２】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当該分野で通常の知識を有する者には、このような技術はただ好適な実施例に過ぎないものであり、本発明の実質的な範囲は請求の範囲とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】培養中のＧＦＰ発現体細胞の写真である。
【図２】ＧＦＰ発現体細胞を受核卵子に移植した核移植卵の写真である。
【図３】ＧＦＰが発現される豚胚盤胞核移植卵の写真である。
【図４】形質転換された核移植卵を代理母の卵管内に移植する写真である。
【図５】１次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの１次スクリーニング結果写真である。
【図６】２次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの２次スクリーニング結果写真である。
【図７】３次プール豚ＢＡＣゲノムライブラリの３次スクリーニング結果写真である。
【図８】クローニングされたＧＴ遺伝子の制限酵素マッピング写真である。
【図９】ＧＴ遺伝子ターゲティングベクターの模式図である。
【図１】
2005519633.tif 000011
【図２】
2005519633.tif 000012
【図３】
2005519633.tif 000013
【図４】
2005519633.tif 000014
【図５】
2005519633.tif 000015
【図６】
2005519633.tif 000016
【図７】
2005519633.tif 000017
【図８】
2005519633.tif 000018
【図９】
2005519633.tif 000019
【配列表】
2005519633000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月16日(2004.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）ｐＥＧＦＰ−Ｎ１と脂質成分又は非脂質カチオンポリマー媒介体を混合して脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を形成させた後、前記脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を前記核供与細胞培養液に添加した後培養し、前記ＧＦＰ遺伝子を前記核供与細胞に導入して発現させる段階と、
（ｃ）前記ＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｄ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含む、ＧＦＰ遺伝子が導入された豚を生産する方法。
【請求項２】
（ｂ）段階の脂質成分がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）又はリポフェクトアミンプラス（LipofectAmine Plus）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）段階の非脂質カチオンポリマー成分がエクスジェン５００（ＥｘＧｅｎ５００）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１の（ａ）〜（ｃ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４５ＢＰ。
【請求項５】
請求項１の（ｄ）段階の方法を行い、請求項６のＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])から生産されたＧＦＰ遺伝子を発現する複製豚。
【請求項６】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）豚ゲノムＢＡＣライブラリからＧＴ遺伝子クローンを分離した後、前記ＧＴ遺伝子クローンを用いて、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分で相同組換えによってＧＴ蛋白質発現部位を標識遺伝子で代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにする遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する段階と、
（ｃ）前記の遺伝子ターゲティングベクターを脂質又は非脂質成分と混合して複合体を形成させた後、前記複合体を前記核供与細胞培養液に添加して前記組換えＧＴ遺伝子を核供与細胞内に導入してターゲティングさせる段階と、
（ｄ）前記組換えＧＴ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｅ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含むことを特徴とするＧＴ遺伝子が除去された豚を生産する方法。
【請求項７】
（ａ）段階の細胞が豚の胎児から分離した繊維牙細胞であることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが外因性プロモータを持たないように、（ｂ）段階にプロモータトラップ方法がさらに含まれることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項９】
（ｂ）段階の前記遺伝子ターゲティング用ベクターが、
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａIII制限酵素及びＳａｃI制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項１０】
（ｃ）段階の脂質媒介体がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）であることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項１１】
請求項6の（ａ）〜（ｄ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４６ＢＰ。
【請求項１２】
請求項6の（ｅ）段階の方法を行い、請求項１1のＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])から生産されたＧＴ遺伝が除去された複製豚。
【請求項１３】
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａIII制限酵素及びＳａｃI制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されたベクター。
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月7日(2004.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）ｐＥＧＦＰ−Ｎ１と脂質成分又は非脂質カチオンポリマー媒介体を混合して脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を形成させた後、前記脂質（又はカチオンポリマー）−ＤＮＡ構造複合体を前記核供与細胞培養液に添加した後培養し、前記ＧＦＰ遺伝子を前記核供与細胞に導入して発現させる段階と、
（ｃ）前記ＧＦＰ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｄ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含む、ＧＦＰ遺伝子が導入された豚を生産する方法。
【請求項２】
（ｂ）段階の脂質成分がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）又はリポフェクトアミンプラス（LipofectAmine Plus）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ｂ）段階の非脂質カチオンポリマー成分がエクスジェン５００（ＥｘＧｅｎ５００）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１の（ａ）〜（ｃ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４５ＢＰ。
【請求項５】
請求項１の（ｄ）段階の方法を行い、請求項４のＳＮＵ−Ｐ１（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P1[Porcine NT embryo])から生産されたＧＦＰ遺伝子を発現する複製豚。
【請求項６】
（ａ）豚から採取して培養した細胞株を核供与細胞として準備する段階と、
（ｂ）豚ゲノムＢＡＣライブラリからＧＴ遺伝子クローンを分離した後、前記ＧＴ遺伝子クローンを用いて、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分で相同組換えによってＧＴ蛋白質発現部位を標識遺伝子で代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにする遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する段階と、
（ｃ）前記の遺伝子ターゲティングベクターを脂質又は非脂質成分と混合して複合体を形成させた後、前記複合体を前記核供与細胞培養液に添加して前記組換えＧＴ遺伝子を核供与細胞内に導入してターゲティングさせる段階と、
（ｄ）前記組換えＧＴ遺伝子が導入された核供与細胞を脱核された豚受核卵に移植して、形質転換された核移植卵を生産し、活性化させる段階と、
（ｅ）前記核移植卵を代理母に移植して産子を生産する段階とを含むことを特徴とするＧＴ遺伝子が除去された豚を生産する方法。
【請求項７】
（ａ）段階の細胞が豚の胎児から分離した繊維牙細胞であることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記（ｂ）段階で遺伝子ターゲティングベクターは外因性プロモータを持たないようにプロモータトラップ方法で製造されることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項９】
（ｂ）段階の前記遺伝子ターゲティング用ベクターが、
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａＩＩＩ制限酵素及びＡｖａＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項１０】
（ｃ）段階の脂質媒介体がヒュジン６（ＦｕＧＥＮＥ６）であることを特徴とする請求項6記載の方法。
【請求項１１】
請求項6の（ａ）〜（ｄ）段階の方法で製造された豚の核移植卵ＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])、ＫＣＴＣ １０１４６ＢＰ。
【請求項１２】
請求項6の（ｅ）段階の方法を行い、請求項１1のＳＮＵ−Ｐ２（豚ＮＴ胚芽）(SNU-P2[Porcine NT embryo])から生産されたＧＴ遺伝が除去された複製豚。
【請求項１３】
ＧＴ遺伝子のうちイントロン８の一部分、エクソン９（蛋白質発現部位）及びイントロン９の一部配列を含む相同切片を含み、前記ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位のうちＤｒａＩＩＩ制限酵素及びＡｖａＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列がピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列で代置されたベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
〔第３段階：ＧＴ遺伝子が除去されたベクター製作及び核供与細胞への導入〕
前記で分離されたＧＴ遺伝子クローンを用いて遺伝子ターゲティング用ベクターを作製する。すなわち、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現部位の一部分を代置した標識遺伝子が相同組換え(homologous recombination)によってＧＴ蛋白質発現部位を代置して正常的なＧＴ蛋白質が発現されないようにターゲティングベクターを作製する。ターゲティングされた細胞の選別効率を高めるために、ターゲティングベクターは外因性プロモータ(exogenous promoter)を持たないように、すなわちプロモータトラップ(promoter trap)方法を用いる。ターゲティングベクターは、ＧＴ遺伝子のうちイントロン(intron)８の一部分、蛋白質発現部位（エクソン９[Ｅｘｏｎ９]）、及びイントロン９の一部配列を含む相同切片と、ＧＴ遺伝子の蛋白質発現のうちＡｖａＩとＤｒａＩＩＩ制限酵素で切断された断片のアミノ酸配列に該当する遺伝子の塩基配列を代置するピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列を含む。このようなターゲティングベクターは、相同切片では相同組換えが起こってピューロマイシン抵抗遺伝子発現部位−ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列部位が正常的なエクソンに挿入されてＧＴ遺伝子を破壊する（図９）。前記ターゲティングベクターを核供与細胞としてＧＦＰ形質転換動物生産方法で言及されたヒュジン６を用いて導入する。ターゲティングベクターが導入された体細胞は、適切な抗生剤を含んだ培地で１〜２週日間培養して選別した後、ターゲティングしたか否かをサザンブロット又は重合酵素連鎖反応などの通常の方法で確認する。


【国際調査報告】
2005519633.tif 000020