(57)【要約】乾燥させるコラーゲンフォームを得るために、コラーゲンゲルに空気を混合する段階を含む、コラーゲンスポンジの調製方法について開示する。それによって得られた乾燥産物から、小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるスポンジの一部または小室の平均対角線寸法が3mmである一部を単離することによって、コラーゲンスポンジが得られる。コラーゲンスポンジは、おそらくフィブリノーゲン、トロンビン、およびアプロチニンの組み合わせのようなフィブリン膠を含むコーティングによって、創傷を密閉するための材料として用いてもよい。コラーゲンフォームの一部を抽出するための、そしてコラーゲンフォームの別の部分をコラーゲンゲルに変性させるための装置を開示する。貫通した穴または穿孔と柔軟な壁とを有する伸長したコラーゲンスポンジは、哺乳類の胃腸管または気管において壁を再確立するために用いてもよい。
2005502733.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、コラーゲンスポンジを調製する方法：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るために、コラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるスポンジの一部、または小室の平均対角線寸法が3mmである一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。
【請求項２】
スポンジの単離された部分のコラーゲン含有量が50〜100％である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
コラーゲンゲルが以下の起源：哺乳類、トランスジェニック、および組換え型起源の少なくとも一つからの異なるタイプのコラーゲン材料を含む、請求項2または3に記載の方法。
【請求項４】
コラーゲンが、ウマ腱、ウシ腱、およびヒト腱からなる群より選択される腱からの材料を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンゲルを調製する段階が以下の段階を含む、請求項3または4記載の方法：
−  腱を−10℃〜−30℃の温度で保存して；腱を剥離する段階、
−  腱から異種タンパク質を除去する段階、
−  腱における胚含有量を減少させる段階、
−  腱を膨張させる段階、
−  膨張した腱をホモジナイズする段階。
【請求項６】
胚含有量を減少させる段階が、腱に酸および有機溶媒を加える段階を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
酸が乳酸のような有機酸である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒がエタノールのようなアルコールである、請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
腱を膨張させる段階が腱に乳酸を加える段階を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
酸のpH値が、1.5〜3.5、2.5〜3.0といったような1〜4の範囲である、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
乳酸が0.45％乳酸である、請求項5〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
腱を膨張させる段階が、4℃〜25℃の温度で48〜200時間腱を保存する段階を含む、請求項5〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
腱が100〜120時間保存される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
膨張した腱をホモジナイズする段階が、粒子の長さまたは直径が0.8〜1.2 cmである腱の粒子を含む物質を得る段階を含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
膨張した腱をホモジナイズする段階が、粘度2〜20 Ncmを有する物質を得る段階を含む、請求項5〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
膨張した腱をホモジナイズする段階が、歯のついた円板ミルまたは同等の機器によって行われる、請求項5〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
コラーゲンゲルの動的粘度が2〜20 Ncmである、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
コラーゲンゲルに空気を混合する段階が以下の段階を含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法：
−  コラーゲンフォームを作製するために、ミキサーによってゲルに周囲の空気を混合する段階、
−  混合したゲルフォームを分画チャンネルに送る段階、
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階。
【請求項１９】
分画チャンネルにおいてコラーゲンフォームから分離したコラーゲンゲルの少なくとも一部がミキサーに戻される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
分画チャンネルからミキサーに戻されるコラーゲンゲルの量と、ミキサーに送られる新鮮なコラーゲンゲルの量との比が0.1〜0.5である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
コラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階が以下の段階を含む、請求項18〜20のいずれか一項記載の方法：
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンフォームの選択された部分を分離する段階、
−  分画チャンネルから得たコラーゲンフォームの選択された部分をそれを乾燥させるために送る段階。
【請求項２２】
分画チャンネルにおいて温度を15℃〜40℃の間に維持する段階をさらに含む、請求項18〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
コラーゲンゲルに空気を混合した後に、コラーゲンフォームを2〜4分間ホモジナイズする段階をさらに含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
コラーゲンフォームを乾燥させる段階の前でコラーゲンゲルに空気を混合する段階の後に、コラーゲンフォームのpH値が6.5〜8.5となるように、コラーゲンフォームに中和剤を加えて、コラーゲンフォームを中和する段階をさらに含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
中和剤がアンモニア溶液を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
コラーゲンフォームが5〜30時間中和される、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２７】
コラーゲンフォームが20〜30時間中和される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
乾燥させる段階が、乾燥コラーゲンスポンジを得るために、15℃〜60℃の温度で48〜200時間乾燥させることを含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
乾燥させる段階が、700〜900 mbarの圧力下で行われる、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
乾燥させる段階が、15℃〜40℃の温度で100〜200時間乾燥させることを含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
コラーゲンスポンジが以下の基準の少なくとも一つを満たす、先行請求項のいずれか一項記載の方法：
−  pH値が5.0〜6.0の間である、
−  乳酸含有量が多くとも5％である、
−  アンモニア含有量が多くとも0.5％である、
−  アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも0.5％である、
−  硫酸塩の灰含有量が多くとも1.0％である、
−  重金属含有量が多くとも20 ppmである、
−  微生物純度が多くとも103 CFU/gである、
−  コラーゲン含有量が75〜100％である、
−  密度が1〜10 mg/cm3である、
−  弾性係数が5〜100 N/cmの範囲である。
【請求項３２】
コラーゲンスポンジの水分含有量が20％以下である、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
コラーゲンスポンジの一部を単離する段階が、切断によって多数の部分にコラーゲンスポンジを分割する段階を含む、先行請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
以下の段階を含む、コラーゲンスポンジを調製する方法：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るために、コラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  以下の特性を有するスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階：
−  弾性係数が5〜100 N/cmの範囲である、
−  密度が1〜10 mg/cm3の範囲である、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満である、または小室の平均直径が多くとも3mmである。
【請求項３５】
請求項1〜33のいずれか一項記載の段階を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
以下を含む、コラーゲンフォームの一部を抽出してコラーゲンフォームの別の部分をコラーゲンゲルに変性させるための装置：
−  コラーゲンフォームの流れを受けるための入り口、コラーゲンフォームの流れの一部のための出口、およびコラーゲンフォームの流れの方向に下方に傾斜している底の部分を含む分画チャンネル、
−  出口の位置が分画チャンネルの末端部で垂直方向に移動可能である、分画チャンネルの底の部分におけるコラーゲンゲルの少なくとも一つの出口。
【請求項３７】
貫通した穴または穿孔および柔軟な壁を有する伸長したコラーゲンスポンジ。
【請求項３８】
請求項37記載の、および円形または楕円形の断面を有する伸長したコラーゲンスポンジ。
【請求項３９】
請求項37または38に記載の、および哺乳類の消化管もしくは気管系において創傷を閉鎖するためまたは壁を再確立するためにスポンジを使用可能にするような外部寸法を有する、伸長したコラーゲンスポンジ。
【請求項４０】
穿孔または穴が、哺乳類の消化管または気管の内部または外部断面積に対応する対角線寸法を有する、請求項37〜39のいずれか一項記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
【請求項４１】
直腸壁における創傷を閉鎖するためまたは直腸壁を再確立するために適したスポンジを作製するために、ヒト直腸の内部寸法に対応する外部寸法を有する請求項39または40に記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、コラーゲンスポンジを調製する方法に関する。本発明に従って作製したコラーゲンスポンジは、主に毛細管出血を停止させるために外科において特に有用である。コラーゲンスポンジはまた、フィブリン膠調製物によってコーティングされる担体として用いてもよい。本発明はまた、コラーゲンフォームの一部を抽出する装置にも関する。本発明はさらに、主に消化管で用いられる伸長したコラーゲンスポンジに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
コラーゲンは60年代後半以降、止血剤として用いられている。コラーゲンは、全ての哺乳類において最も頻繁に認められる構造タンパク質である。約300 kDaの単量体タンパク質（トロポコラーゲン）は、特異的部位で共有結合している。したがって成熟タンパク質は不溶性であり、高い張力を有する特徴的な原線維を形成する。多数のコラーゲンサブクラスが記述されており、最も一般的なものは、皮膚、腱、骨、および角膜における主なコラーゲンタイプであるI型コラーゲンである。コラーゲンは、長さが約290 nmの三重らせんから実質的に成る線維様タンパク質である。これらの三重らせん（トロポコラーゲン分子）5個が交互して直径約3.6 nmの微小線維を形成する。これらの微小線維は、原線維間および原線維内相互作用のために容易に近づくことができる極性および非極性セグメントを有する。微小線維は、四面体格子に充填されて、直径約30 nmの小原線維を形成する。次に、これらの小原線維が集合して、結合組織の基本単位であるコラーゲン原線維となり、これは直径が数百nmであり、したがって光学顕微鏡では薄い線のように見える（参考文献1参照）。製造過程の間に生成されるコラーゲンゲルおよびコラーゲンスポンジは、顕微鏡で証明されるように、最小の単位としてこれらの原線維を含む。
【０００３】
コラーゲンは、おそらくフィブリン膠を含むコーティングによって、創傷を密封する材料として用いてもよい。フィブリン膠、すなわち、フィブリノーゲン、トロンビン、およびアプロチニンの組み合わせは、組織および神経を接着するため、ならびに出血が軽度の場合に表面を密封するために、何年もの間治療的に用いられて成功している。フィブリン膠の一つの欠点は、出血が大量である場合、フィブリンの十分な重合化が起こる前に、たいていの場合膠が流れてしまうことであった。この問題に対処するために、外科医は、液体フィブリン膠をコラーゲンフリースのような吸収性の担体に手で適用していた。
【０００４】
このように組み合わせて適用することが印象的な成功を収めたにもかかわらず、この方法は、いくつかの短所のために広い規模で適用されていない。調製は比較的やっかいであり、方法は経験と熟練した人を必要とし、調製時間が10〜15分の範囲であるために、緊急の場合には調製物は容易に利用できない。これらの要因によって、改善された製品の開発が刺激され、その結果欧州特許第0 059 265号に開示されるように、固体フィブリノーゲン、固体トロンビン、および固体アプロチニンのコーティングによって覆われたコラーゲン担体の固定配合剤が開発されるに至った。商標TachoComb（登録商標）として販売されている欧州特許第0 059 265号に開示された製品は、創傷に直接適用することができる。コーティングが、血液、他の体液、または生理食塩液のような水性の液体に接触すると、成分は溶解して、フィブリンが形成される。製品は、わずかに圧をかけて創傷に適用し、損傷表面にコラーゲンを堅固に結合（接着）させる。止血が得られ、創傷は密閉される。
【０００５】
いくつかの血液凝固刺激活性の他に、TachoComb（登録商標）におけるコラーゲンの機能は主に、それが吸着して、コーティングされる凝固調製物に対して機械的安定性を付与する担体の機能である。特にコラーゲンスポンジの形のコラーゲンの他の長所は、その生体分解性、湿潤状態においてもその比較的高い張力、液体および空気の浸透に対するその高い抵抗性、および湿潤状態でのその高い柔軟性である。
【０００６】
本発明は、フィブリノーゲン、トロンビン、および／またはアプロチニンのための担体、例えばTachoComb（登録商標）として用いてもよいコラーゲンスポンジの作製に主に関する。コラーゲンスポンジはまた、局所損傷に対して包帯として直接、すなわちコーティングせずに、再出血を予防するため、実質臓器からの弱い散在性の出血のため、火傷、皮膚移植片、床ずれ、もしくは皮膚欠損に適用するため、または局所損傷に対する包帯としてのような止血を支持するために用いてもよい。
【０００７】
先行技術において、コラーゲン担体を調製する多くの方法が示唆されている。国際公開公報第86/05811号は、高度にクロスリンクしたコラーゲンマトリクスを含む、動力バイオリアクターシステムにおいて生物活性材料を固定するための加重マイクロスポンジを開示する。高度クロスリンクコラーゲンマトリクスは、I型、II型、またはIII型コラーゲン原料を粉砕して、直径1〜50 μmの次数で長さが200 μm以下である線維を生じることによって調製される。粉砕したコラーゲンは、溶媒に溶解した可溶性コラーゲンに形成されるか、または酢酸、乳酸、プロピオン酸、もしくは酪酸のような溶媒と混合することによって溶媒中に分散した不溶性コラーゲンに形成される。コラーゲン分散液の場合、混合は、コラーゲンの微小線維を作製するために、ブレンダーを用いて高レベルの攪拌によって行う。次に、加重添加剤をコラーゲン液体混合物と混合して、複合混合物を小滴に形成して、凍結によって固化する。小さい粒子を作製する多くの技術が開示されている。凍結した組成物は真空凍結乾燥して、凍結と乾燥との組み合わせは凍結乾燥と呼ばれる。コラーゲンをクロスリンクするために、凍結乾燥したコラーゲンマトリクス組成物を処置する。コラーゲンは、化学クロスリンク剤、上昇した温度での強度の脱水、または組み合わせのいずれかを用いてクロスリンクさせることができる。コラーゲンマトリクスはコラゲナーゼおよび他の酵素的分解に対して抵抗性となることを目的としており、それによってこれらの材料は生物を培養するために特に適するようになる。クロスリンクしたコラーゲンマトリクスを洗浄した後、マイクロスポンジは滅菌して無菌的に包装してもよい。加重マイクロスポンジの場合、コラーゲンマトリクスは、平均的な孔の大きさが約1〜約150 μmの範囲の表面孔構造の開口部を有し、マトリクスの孔は、マイクロスポンジの容積の約70〜約98％を占める。マイクロスポンジはさらに、平均粒子径が約100〜約1000μmであって、比重は約1.05以上である。加重材料は、金属または金属合金、金属酸化物、およびセラミクスであってもよい。
【０００８】
米国特許第5,660,857号は、不溶性のタンパク質マトリクスと油性の材料とを含む複合体を調製するプロセスを開示し、これは外科用包帯および生物医学インプラントのための材料として、ならびに皮膚に適用するための化粧品材料として有用である。米国特許第5,660,857号のプロセスは、タンパク質、油性材料および水を混合してタンパク質の水性分散液中に油性材料の乳剤を形成する段階、ならびに乳剤をその後乾燥または凍結乾燥して被膜またはスポンジを形成する段階を含む。不溶性の線維様タンパク質は主に、不溶性のコラーゲンを含み、これはウシの皮膚から得ることが適当であるかも知れない。一つの態様において、コラーゲンは、使用前に乳酸中で膨張させてもよい。
【０００９】
国際公開公報第99/13902号は、活性なウイルスおよびプリオンを実質的に含まない生理学的に適合性のコラーゲンを調製する段階を含む、髄膜組織の増殖マトリクスを作製する方法を開示する。コラーゲンは、被膜、スポンジ、非織コラーゲンまたはフェルトに形成される。コラーゲンは、皮膚、腱、靱帯、または脂肪の骨を洗浄する段階を含むプロセスによって得られる。次に、材料に酵素処理を行い、それによってコラーゲン材料を膨張させる。次に、コラーゲン材料をさらに酸溶液によって膨張させる。次に、コラーゲン混合物をホモジナイズする。得られた産物は、コラーゲンスポンジ、非織マトリクス、フェルト、もしくは被膜の形で提供されるマトリクスであってもよく、または前述の形の二つもしくはそれ以上の複合体であってもよい。コラーゲンスポンジは、米国特許第5,019,087号に開示されるコラーゲンスポンジを形成する方法の改変によって提供することができる。スポンジは、国際公開公報第99/13902号に従って調製したコラーゲン分散液の凍結乾燥によって調製することができる。得られたスポンジ密度は、約0.1 mg/cm3〜約120 mg/cm3であると記載されている。国際公開公報第99/13902号の開示によれば、孔サイズは約10 μm〜約500 μmの範囲である。層状のコラーゲンスポンジおよびコラーゲン被膜について言及されている。
【００１０】
米国特許第5,618,551号は、クロスリンクしていないおよびおそらくクロスリンク可能なペプシン処理コラーゲンまたは水溶液中での酸化的切断によって改変されたゼラチン粉末に関し、これは酸性pHで可溶性であり、温度0℃未満で少なくとも1ヶ月間保存しても安定である。本特許はさらに、ペプシン処置コラーゲンの酸性溶液を調製する段階、室温で酸性水溶液に制御された酸化を行う段階、酸性pHで、酸化されたがクロスリンクしていないペプシン処理コラーゲンを沈殿させる段階、反応性の酸性粉末の形でそれを得るためにクロスリンクしていないペプシン処理コラーゲンを単離、濃縮、および脱水する段階、ならびに得られた反応性酸性粉末を温度0℃未満で保存する段階を含む、粉末を調製するプロセスに関する。
【００１１】
英国特許第1 292 326号は、コラーゲン線維の懸濁液を調製して、これをその後攪拌手段を有する処置用小室に導入する、その適用のためにコラーゲン分散液を調製する方法および装置を開示する。処置室には大気圧より低い気圧が存在し、この中で懸濁液は、攪拌によって分散液に変換され、無機または有機酸によって酸性化が制御される。英国特許第1 292 326号の開示に従って、スポンジ様のコラーゲン製品は、コラーゲン分散液またはゲルから調製することができる。この意味において、文書は、凍結乾燥および気泡に非常に富む分散液またはゲルに言及している。英国特許第1 292 326号はさらに、気泡の導入または消失を満足のゆくように制御する問題について言及している。文書は二つの例において、コラーゲン含有量が2.5％で気泡を含まないコラーゲン分散液、およびコラーゲン濃度が2.5％のコラーゲン気泡分散液を開示する。
【００１２】
1983年6月13日のChemical Abstracts、オハイオ州コロンブス、第98巻第24号は、酸処置を行った皮膚または腱骨のような動物組織から得たコラーゲンについて言及している。コラーゲンは、透析によって再度凝集して、そのプロセスの間に、最終的な非常に複屈折の結晶線維が形成される。コラーゲンは、0.5mm〜2 cmのシートに形成する、空気と混合してスポンジを形成する、またはクリームとして分散させることができる。
【発明の開示】
【００１３】
発明の説明
フィブリン膠調製物によるコラーゲンスポンジのコーティングの成否は、コラーゲンスポンジのきめに依存することが判明した。このように、本発明の目的は、特に、創傷を治癒および密閉する材料を得るために、フィブリン膠調製物によるコーティングに適したコラーゲンスポンジを作製する目的で、特定のきめを有するコラーゲンスポンジを作製する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、湿度、弾性、密度、および弾性係数が改善されたという意味において、先行技術のスポンジに関して改善された物理的特徴を有するコラーゲンスポンジを作製する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、コラーゲンスポンジが創傷に一度適用されると、それが空気または液体をコラーゲンスポンジの中に浸透させないという意味において、空気および液体を通さないコラーゲンスポンジを調製する方法を提供することである。本発明のなおさらなる目的は、消化管または気管において用いることができる創傷密閉材料を提供することである。
【００１４】
このように、第一の局面において、本発明は、以下の段階を含む、コラーゲンスポンジを調製する方法を提供する：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有する担体の乾燥ブロックを得るために、コラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるスポンジの一部、または小室の平均対角線寸法が多くて3mmであるスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。
【００１５】
本発明の文脈において、「小室の直径」という用語は、小室における最大直線壁間距離、すなわち小室の最大対角線直線距離として理解すべきである。小室は、八角形のような多角形であってもよい。
【００１６】
小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満、または小室の平均直径が多くとも3mmであれば、コラーゲンスポンジはフィブリン膠調製物によってコーティングされるために特に有用となることが判明した。好ましくは、コラーゲンゲルは乾燥重量がゲル1 gあたり4〜18 mgのような、5〜13 mgのような、6〜11 mgのような2〜20 mgの範囲である。コラーゲンゲルの動的粘度は好ましくは、4〜10 Ncmのような、6〜8 Ncmのような2〜20 Ncmである。コラーゲンスポンジは好ましくは、水分含有量が10〜15％のような、約18％のような、多くて20％である。コラーゲンスポンジの弾性係数は好ましくは、10〜50 N/cmのような、5〜100 N/cmの範囲であり、スポンジの密度は好ましくは2〜7 mg/cm3のような1〜10 mg/cm3である。
【００１７】
本発明の方法によって調製したコラーゲンスポンジは、コラーゲンスポンジを創傷に適用すると、空気または液体がコラーゲンスポンジの中を浸透できないという点において空気および液体を通さないことが判明した。液体はスポンジに吸収される。この作用は主に、線維構造を有する既知のコラーゲンスポンジとは対照的に、コラーゲンゲルに空気を混合する段階によって、重なり合う小室がコラーゲン材料の壁によって隔てられ、実質的に完全に封入されている三次元構造を有するコラーゲンスポンジが得られるという事実によって得られる。
【００１８】
コラーゲンゲルは、哺乳類、トランスジェニック、または組換え型起源のI型、II型、またはIII型のような異なるタイプの材料を含んでもよいが、他の全てのタイプのコラーゲンも全て用いることができる。コラーゲンは、ウマ腱、ヒト腱、およびウシ腱からなる群より選択される腱からの材料を含んでもよい。コラーゲンは、さらにもしくはまたは、組換え型コラーゲン材料を含んでもよい。
【００１９】
スポンジの単離された部分のコラーゲン含有量は好ましくは、スポンジの乾燥重量に関連して75〜100％のような、80％〜100％のような、85％〜100％のような、90％〜100％のような、92％〜100％のような、92％〜98％のような、93％〜97％のような、94％〜96％のような、50％〜100％である。
【００２０】
コラーゲンゲルを調製する段階は、好ましくは以下の段階を含む：
−  腱を−10℃〜−30℃の温度で保存して、腱を剥離する、
−  腱から異種タンパク質を除去する、
−  腱における胚含有量を減少させる、
−  腱を膨張させる、
−  膨張した腱をホモジナイズする。
【００２１】
保存、剥離、タンパク質の除去、胚含有量の減少、および膨張段階は、原料を精製することを目的としており、一方ホモジナイズする段階は、ゲルの形でコラーゲンを得ることを目的としている。
【００２２】
胚含有量を減少させる段階は好ましくは、乳酸のような有機酸のような酸を腱に加えることを含む。さらに、エタノールのようなアルコールのような有機溶媒を好ましくは腱に加える。さらに、腱を膨張させる段階は、好ましくは腱に乳酸を加える段階を含む。用いる乳酸は、0.45％乳酸のような0.40〜0.50％乳酸であってもよい。
【００２３】
腱を膨張させる段階は、温度10℃〜20℃のような4℃〜25℃で、100〜200時間のような48〜200時間の間腱を保存することを含んでもよい。
【００２４】
膨張した腱をホモジナイズする段階は、好ましくは、直径約1 cmのような0.8〜1.2 cmの粒子サイズのコラーゲンゲル断片、すなわち線維球が得られるように行われる。さらに、コラーゲンゲルの物理的特徴は好ましくは先に記述したとおりである。例えば、鋸歯のある円板ミルまたは適当なホモジナイゼーション装置によって膨張した腱をホモジナイズする段階を行うことによって、適当な特徴を得てもよい。
【００２５】
コラーゲンゲルに空気を混合する段階は、好ましくは以下の段階を含む：
−  コラーゲンフォームを作製するためにミキサーを用いて周囲の空気をゲルに混合する段階、
−  混合したゲルフォームを分画チャンネルに送る段階、
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階。
【００２６】
分画チャンネルにおいてコラーゲンフォームから分離したコラーゲンゲルの少なくとも一部を、ミキサーに戻してもよい。その場合、分画チャンネルからミキサーに戻すコラーゲンゲルの量と、ミキサーに加える新鮮なコラーゲンゲルの量との比率は好ましくは0.1〜0.5である。コラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階は、好ましくは以下の段階を含む：
−  分画チャンネルに含まれるコラーゲンフォームの選択した部分を分離する段階、
−  コラーゲンフォームの選択した部分を乾燥させるために分画チャンネルから送る。
【００２７】
方法の好ましい態様において、分画チャンネルにおいて、温度を20℃〜25℃のような15℃〜40℃に維持する。
【００２８】
コラーゲンゲルに空気を混合した後、コラーゲンフォームを2〜4分間ホモジナイズしてもよい。
【００２９】
コラーゲンフォームを乾燥させる段階の前で空気をコラーゲンゲルに混合する段階の後に、中和剤をコラーゲンフォームに加えてもよく、コラーゲンフォームを好ましくは、pH値が通常、2.5〜3.5からコラーゲンフォームにおけるpH値6.5〜8.5に達するように中和する。アンモニア溶液を含む中和剤を用いてもよく、コラーゲンフォームは好ましくは、10〜20時間のような、約24時間のような5〜30時間中和する。
【００３０】
コラーゲンフォームを乾燥させる段階の前に、コラーゲンフォームは、好ましくは、充填の際にフォームの中に実質的に空気が入らないように乾燥容器に入れる。
【００３１】
乾燥段階は好ましくは、乾燥コラーゲンスポンジを得るために、温度20℃〜40℃のような15℃〜60℃で、100〜150時間のような50〜200時間の間の乾燥を含む。乾燥段階は、700〜900 mbarのような、約800 mbarのような大気圧よりわずかに低い圧力で行ってもよい。
【００３２】
本発明の方法によって作製されたコラーゲンスポンジは、好ましくは以下の基準の少なくとも一つを満たす：
−  pH値が5.0〜6.0、
−  乳酸含有量が多くとも5％
−  アンモニア含有量が多くとも0.5％
−  アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも0.5％
−  硫酸塩の灰含有量が多くとも1.0％
−  重金属含有量が多くとも20 ppm
−  微生物純度が多くとも103 CFU/g
−  コラーゲン含有量が75％〜100％
−  密度が2〜7 mg/cm3のような1〜10 mg/m3、
−  弾性係数が10〜50 N/cmのような5〜100 N/cm。
【００３３】
コラーゲンスポンジの一部を単離する段階は、切断によってコラーゲンスポンジを多数の部分に分割する段階を含んでもよい。得られた部分は、円錐形、断面が円形の円柱を含む円柱形、直角形、多角形、立方体、および平坦なシートのような如何なる所望の形状に成形してもよく、または適当な造粒法によって顆粒に成型してもよい。
【００３４】
第二の局面において、本発明は、以下の段階を含むコラーゲンスポンジを調製する方法に関する：
−  コラーゲンゲルを調製する段階、
−  コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
−  その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
−  以下の特性を有するスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階、
−  弾性係数が5〜100 N/cmの範囲である、
−  密度が1〜10 mg/cm3の範囲である、
−  小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または小室の平均直径が多くとも3mmである。
【００３５】
本発明の第一の局面に従う方法の如何なる段階および全ての段階はまた、本発明の第二の局面に従う方法において行ってもよいと理解すべきである。さらに、本発明の第一の局面に従う方法によって作製されたコラーゲンスポンジの如何なるおよび全ての特徴および特色は、本発明の第二の局面に従う方法によって得てもよい。
【００３６】
第三の局面において、本発明は、以下を含む、コラーゲンフォームの一部を抽出して、コラーゲンフォームのもう一つの部分をコラーゲンゲルに変性させるための装置を提供する：
−  コラーゲンフォームの流れを受けるための入り口、コラーゲンフォームの流れの一部のための出口、およびコラーゲンフォームの流れの方向に対して下方に傾斜した底の部分を含む、分画チャンネル、
−  出口の部分が分画チャンネルの末端で垂直方向に移動可能である、分画チャンネルの底の部分でコラーゲンゲルのための少なくとも一つの出口。
【００３７】
第四の局面において、本発明は、貫通した穴または穿孔と柔軟な壁とを有する伸長したコラーゲンスポンジを提供する。好ましい態様において、そのようなコラーゲンスポンジは、哺乳類における創傷を閉鎖するため、または消化管および気管壁を再度確立するために用いてもよい。このように、コラーゲンスポンジは、円形または楕円形の断面を有してもよい。コラーゲンスポンジは、充填剤としてもしくは消化管の中に適用してもよく、または消化管の外表面に適用する外側のスリーブとして適用してもよい。
【００３８】
様々なヒト消化管および気管に適用するための貫通した穴または穿孔の内径は、例えば以下の通りである：
腸：    0.5〜6 cm
直腸：  1〜4 cm
大腸：  2〜6 cm
小腸：  0.5〜3 cm
食道：  0.5〜2 cm
気管：  1〜4 cm
【００３９】
コラーゲンスポンジは、例えば、直腸手術後のような、痔疾の外科的切除後のような、消化管の壁に対する外嚢の外科的除去後の創傷を閉鎖するために用いてもよい。本発明に従うコラーゲンスポンジによって可能な適応の例は：
−  創傷の包帯、
−  以下のような止血の支持体、
−  実質臓器からの弱い散在性出血、
−  コラーゲンスポンジを適用する前に、ectrosurgeryまたは結紮が行われている場所での外科技法、
−  再出血の予防（縫合の確保）、
−  火傷に対する適用
−  局所損傷に対する包帯、
−  抗生物質の輸送のような薬物輸送。
【００４０】
図面の説明
好ましい態様において、本発明は、図1および図2に示すように以下の段階を含む：
【００４１】
段階1  超低温凍結ウマ腱の輸送
ウマ腱は−18℃〜−25℃で輸送して凍結する。
【００４２】
段階2  ウマ腱の剥離
半分凍結した状態で、腱の薄い皮膚を手またはナイフによって機械的に除去する。次に、腱を−18℃〜−25℃で再度超低温凍結する。
【００４３】
段階3  剥離したウマ腱の機械的切片作製
任意選択的に、剥離した凍結腱を70％エタノール中で30分間消毒して、エタノール下で製造室に移した。次に、腱を洗浄して、洗浄後、腱をブロックに圧縮して、−18℃〜−25℃で超低温凍結する。次に、凍結した腱のブロックを切断機によって切片にして、回転するナイフによって厚さ約1mmの切片に切断する。
【００４４】
段階4  腱の切片の洗浄および消毒
可溶性のタンパク質を除去するために、腱切片をまず、注射用水に3〜6時間浸漬した後、注射用水によって洗浄するか、または上清がヘモグロビン不含となるまで、脱塩水、または1〜10 mMの範囲内のCa2+および／またはMg2+イオンを含む塩溶液によって洗浄する。次に、腱切片を70％エタノール中で15分間消毒して、0.45％乳酸の飲料水溶液（濾過滅菌して発熱物質を除去する）によって2回洗浄して、エタノールを除去する。
【００４５】
段階5  コラーゲンゲルの作製
洗浄した腱切片を0.45％乳酸に2〜5日間、好ましくは4日間浸漬した後、コラーゲンゲルにホモジナイズする。0.45％乳酸に曝露することは、主なウイルス不活化段階の一つであると考えられる。
【００４６】
段階6  フォーム形成
溶解攪拌子によって、濾過滅菌した空気をコラーゲンゲルに入れて泡立てる。生じた泡を分画して、泡の大きさが1〜3mmの分画を採取する。泡をスチール製の容器から樽に注ぎ、これを約3分間回転させて均一な泡を得る。泡を乾燥容器に充填する。容器の基部は、泡を排水することができるように液体が浸透可能な薄い織物からなる。5〜24時間後、好ましくは18〜24時間後、排水したフォームをアンモニアガス、例えばDAB品質の26％アンモニア溶液から生成されたガスに曝露する。このプロセスにおいて、過剰なアンモニアのために、フォームのpHはアルカリ領域にシフトする。その後の乾燥プロセスの際にアンモニアを除去すると、中性の産物が得られる。
【００４７】
段階7  フォームの乾燥
フォームは、高級スチール製乾燥室において暖かい空気中で48〜150時間、好ましくは120〜150時間乾燥させる。その結果、ブロックで形成されたコラーゲンスポンジが得られる。
【００４８】
段階8  コラーゲンブロックの切断
コラーゲンのシートとも呼ばれるブロックは、例えば、コーティングのための担体として用いてもよい。切断は、垂直切断機によって行う。最初に、ブロックの側面を切断して、側部の長さが50 cmの垂直面を有するブロックを生じる。次に、このブロックを垂直に、幅11 cmの棒４本に切断する。棒を、その上下の面で形を整えて、寸法50×11×0.4〜0.7 cmの小片に切断する。コラーゲンスポンジの重量は好ましくは、TachoComb（登録商標）H、TachoComb（登録商標）、およびTachoTop（登録商標）のように、得られた最終製品におけるコラーゲンの如何なる仕様も考慮に入れる。
【００４９】
段階9  コラーゲンスポンジ片のソーティング
次に、コラーゲンスポンジ片に肉眼による検査を行う。以下の欠陥を一つまたはそれ以上を有する小片を廃棄する：
−  小室の平均直径が1mm未満または3mm以上である小片
−  不均一な小室構造を有する小片
−  穴を有する小片（スポンジの厚み以上の深さを有する単一の小室）
【００５０】
保存された小片は、消毒した軽金属容器において15〜25℃で最大で1年間保存される。
【００５１】
図3は、本発明に従う方法によって作成されたコラーゲンスポンジの表面の写真であり、写真は、約20,000倍で撮影した（ドイツ、エルランゲン大学病院外科のRoman Carbon教授の好意による）。図3の写真に示した表面は、本発明に従う方法によって調製したコラーゲンスポンジの横断面である。写真中の暗い領域は小室を表し、写真中の明るい領域は、小室によって隔てられたコラーゲン材料の壁を含むコラーゲン材料を表す。
【００５２】
図4は、液体が入るように適合させた容器と上記の液体を攪拌するための手段とを含む、液体の粘度の測定値を得るための攪拌装置を示す。攪拌手段は、フォーク状の要素に結合した棒を含む。容器中の液体は、棒にねじれを加えることによって攪拌し、その結果、フォーク状の要素の回転運動が起こる。フォーク状の要素は、それに対して棒が結合する主要な部分41と第一および第二の部分42とを含む。第二の部分は、主要な部分の末端に結合している。フォーク状の要素が回転すると、表面は液体を移動させ、このように液体を攪拌する。
【００５３】
一つの態様において、装置は以下の寸法を有する。容器は高さが110mmで幅が146mmである。棒は、高さが220mmで直径が10mmである。フォークの主要な部分41は、長さが90mmで高さが30mmである。第二の部分42は、高さが90mmで幅が30mmである。第二の部分42の外側の端部から容器の内表面までの距離は28mmである。
【００５４】
実施例I
表1は、本発明に従う方法の三つの異なるサイクルのパラメータ値を示す。
【００５５】
【表１】
2005502733.tif 000003
【００５６】
表2は本発明の方法に従って得られた三つの異なるコラーゲンスポンジのパラメータ値を示す。
【００５７】
【表２】
2005502733.tif 000004
【００５８】
実施例II
本実施例は、トルク測定によるコラーゲンゲルの粘度の間接的測定に関する。
【００５９】
トルク測定に用いた装置は以下の通りである：
−  攪拌機：EUROSTAR POWERコントロールビスク
−  ウィンドウズソフトウェア：IKASOFT dc
−  データロガーDC2
−  既定の寸法の特殊な攪拌構築物（「フォーク」）、図4を参照のこと
−  内径14.6 cmおよび高さ20.5 cmの漏斗
−  温度計
−  秤
【００６０】
コラーゲンゲル1500 gを漏斗に充填する。試料の温度は23℃である。「フォーク」状の攪拌子を漏斗の中心に固定する。次に、測定を開始する。トルク表示装置は、攪拌子の抵抗を動的ゲル粘度を表す値（Ncm）に変換する。
【００６１】
トルクの測定を確認するために、59％ポリエチレングリコール標準溶液を調製する。この溶液の粘度は、Haake粘度計RV 20 Rotoviskoによって測定する。この溶液の動的粘度ηは、23℃でη＝925±25 mPasの範囲である。この溶液の粘度は、上記のゲル測定装置によって測定し、それによって測定したトルク値は、23℃で3.66 Ncm±5％の範囲でなければならない。
【００６２】
参考文献
2005502733.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６３】
（図１および図２）本発明に係る方法の好ましい態様に含まれる段階を説明する流れ図を含む。
（図３）本発明に係る方法によって作製されたコラーゲンスポンジの表面の写真である（ドイツ、エルランゲン大学病院外科のRoman Carbon教授の好意による）。
（図４）コラーゲンゲルの粘度の測定値を得るための攪拌装置を開示する。
【図１】
2005502733.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2005502733.tif 000011
2005502733.tif 000012
2005502733.tif 000013
2005502733.tif 000014
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2005502733.tif 000035
2005502733.tif 000036
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502733.tif 000037
2005502733.tif 000038
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502733.tif 000039
2005502733.tif 000040
【国際調査報告】
2005502733.tif 000041
2005502733.tif 000042
2005502733.tif 000043
2005502733.tif 000044
2005502733.tif 000045