(57)【要約】本発明は、ブタ内因性レトロウイルス（PERV）およびポリヌクレオチド配列を介する同定、単離およびスクリーニングの新規な方法に関する。また、本発明は、ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを供するにおける該方法の使用に関する。該ブタの器官、組織および細胞は異種間移植で用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1、2、3、4、5、6、7および配列番号8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドおよびその断片。
【請求項２】
請求項1記載の群から選択されたポリヌクレオチドに対して相同な単離されたポリヌクレオチドであって、パーセント配列同一性が該選択されたポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80％相同である該単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1または2記載の少なくとも一つの単離されたポリヌクレオチドよりなるベクター。
【請求項４】
（i）請求項1または2記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドによってブタ内因性レトロウイルスを検出し、
（ii）ブタ内因性レトロウイルスを有するブタを同定する；
ことを特徴とするブタ内因性レトロウイルスの存在につきブタをスクリーニングする方法。
【請求項５】
特定の染色体位置におけるブタ内因性レトロウイルスの存在につきブタをスクリーニングするにおける請求項1または2記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドの使用。
【請求項６】
（i）請求項1または2記載の少なくとも一つのポリヌクレオチド配列によってブタ内因性レトロウイルスを同定し、
（ii）該ブタ内因性レトロウイルスの相同組換えによってノックアウトし、または不活化し、
（iii）該ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを選択する；
ことを特徴とする選択されたブタ内因性レトロウイルスを発現しないように修飾されたブタを供する方法。
【請求項７】
（i）請求項1または2記載の少なくとも一つのポリヌクレオチド配列によってブタ内因性レトロウイルスを同定し、
（ii）該ブタ内因性レトロウイルスの相同組換えによってノックアウトし、または不活化し、
（iii）該ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを選択する；
ことを特徴とするブタ内因性レトロウイルスを発現しないように修飾されたブタを供するにおける請求項1または2記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
請求項6記載の方法によって生産されたブタ。
【請求項９】
その器官、組織および細胞が異種間移植で用いられる請求項8記載のブタ。
【請求項１０】
（i）単離されたポリヌクレオチド配列を用いてブタ内因性レトロウイルスを検出し、ここに、該配列は請求項1または2記載の群から選択され、
（ii）ブタ内因性レトロウイルスを同定する；
ことを特徴とするブタ内因性レトロウイルスの検出用の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はブタ内因性レトロウイルス（PERV）およびポリヌクレオチドフランキング配列を介する同定、単離およびスクリーニングの新規な方法に関する。また、本発明は、ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを供する方法における該ポリヌクレオチドフランキング配列の使用に関する。該ブタの器官、組織および細胞は異種間移植で用いることができる。
【０００２】
発明の背景
移植用のヒト器官の欠点は、移植用のブタのごとき代替非−ヒト種を用いる異種間移植における興味に導いた。今日まで、生きたブタ組織で処理したヒトの研究はPERV感染のいずれの証拠も見出されていない（Herringら2001およびCunninghamら2001でレビューされているParadisら1999，Heneineら1998，Patienceら1998，PitkinおよびMullon1999，Schumakerら2000，Levyら2000）。これらの研究は、皮膚移植片、ブタ膵臓島での移植、および体外肝臓および脾臓灌流を含めた、ブタ組織へのある範囲の暴露経路を持つ患者を含むものであった。また、多数の組織型の分析にもかかわらず（Martigら1999）、それがイン・ビトロで非−ヒト霊長類細胞を感染できるかにかかわらず（Bluschら2000）、ブタ内皮細胞を移植した霊長類の調査はPERVでの感染の不存在を示してきた。
【０００３】
ヒトにおけるPERV感染の証拠の欠如にもかかわらず、最低の可能な動物原性感染の危険を与える器官源ブタを用いるのが望ましいであろう。Boschら（2000）は、発現されたPERVプロウイルスのほとんどが、ヒト、マウスおよびネコのごとき他の種における内因性レトロウイルスと共通して欠陥があることを見出した（Tonjesら1999）。プロウイルス分布におけるある程度のブタ間変動が見出されているにもかかわらず（Jinら2000、Boschら2000）、いくつかのプロウイルスは全てのブタに共通しているようである。いずれのプロウイルスが無傷であるか、および無傷のPERVプロウイルスがどの程度のブタ間変動を有するかを決定するための、系統的な研究はいまだ公表されていない。プロウイルス発現パターンは異なる細胞型の間で変動し（Langfordら2001）、あるいは器官拒絶の間の隠れた刺激体のため変化するであろう。核導入によるブタのクローニングは、異種間移植のための遺伝子的に修飾されたブタを創製する方法として活発に開発されつつある（Polejaevaら2000）。
【０００４】
特異的または適格な病原体フリー条件下での育種ブタは、一般に、異種間移植によって外因性ウイルス、細菌、真菌および寄生虫剤を伝達する危険性を低下させると推定される。しかしながら、ブタ内因性レトロウイルスのごとき微生物は生殖系において安定に伝達でき、したがって、容易には排除できない。レトロウイルスのユニークな特性の多くは、逆転写酵素を介するRNA鋳型からの相補的DNAコピーの合成およびこのDNAの宿主細胞ゲノムへの組込みによるものである。内因性コピーまたは「プロウイルス」という組み込まれたレトロウイルスコピーは生殖系を介して伝達され得る。多くのプロウイルスは欠陥があり、複製できないが、もしプロウイルスが無傷であると、それはある種の刺激体によって活性化され、次いで、宿主細胞の細胞メカニズムを用いてウイルス複製を開始しかねない。ウイルスの複製の結果、ウイルス血症、（例えば、レトロウイルスオンコジーンの挿入を介する）悪性トランスフォーメーション、変性または他の挿入効果（例えば、遺伝子不活化）がもたらされるであろう。
【０００５】
ブタ内因性レトロウイルスのごときレトロウイルスを同定、単離およびスクリーニングする方法に対する明らかな要望がある。さらに、そのような方法は迅速かつ有効に用いて動物の群れをスクリーニングできるべきである。
【０００６】
発明の記載
本発明はブタ内因性レトロウイルス（PERV）およびポリヌクレオチドフランキング配列を介する同定、単離およびスクリーニングの新規な方法に関する。また、本発明は、ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを供する方法における該ポリヌクレオチドフランキング配列の使用に関する。該ブタの器官、組織および細胞は異種間移植で用いることができる。
【０００７】
本発明は「フランキング配列」として知られたブタ内因性レトロウイルスポリヌクレオチド配列に関する。フランキング配列は、PERV組込み部位を特徴付け、PERVを同定するのに用いることができるユニークな分子シグニチャーを表すブタ内因性レトロウイルスを囲うDNA配列である。本発明のフランキング配列は、例えば、本明細書中に記載した配列番号1ないし8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドおよびその断片である。
【０００８】
本発明はレトロウイルスのPERVファミリーに関し、その三つの主なクラスは今日までに同定されており：PERV  A、BおよびC（Patienceら1997，Akiyoshiら1998）、そのgagおよびpol遺伝子は高度に相同であり、それらは主としてLTRおよびenv超可変領域が異なる。PERV  AおよびBは家畜ブタで普遍的であるが、PERV  Cを有しない大きな白色ブタが同定されている（Boschら2000，Jinら2000）。家畜ブタは、サザーンブロットでプローブを用いて測定して50コピーまでのPERVを有する（Patienceら1997）。感染の分析および偽タイピング実験は、PERV  A、BおよびCはおそらくは異なる受容体を用いることを示しているが（Takeuchiら1998，Wilsonら2000）、これらは未だクローン化されていない。PERV  AおよびBはヒトおよび他の哺乳動物双方からの広い範囲の細胞型に生産的に感染するが、PERV  Cは、HT1080細胞系だけに非生産的に感染するという、調べられたヒト細胞の中ではより制限された向性を有する（Takeuchiら2000）。PBMC、内皮細胞および膵臓島のごときブタ組織から放出されたPERVは、293および内皮細胞を含めたヒト細胞系に感染することが示されている（Martinら2000、Takeuchiら1998、Wilsonら2001）。
【０００９】
PERVの同定
PERVの同定は技術的に挑戦しつつある。というのはPERVの同定は、ブタ内因性レトロウイルス、事実、すべてのレトロウイルスプロウイルスの5’および3’両末端における長い（約700bp）同一LTR配列の存在によって妨げられるからである。これは、例えば、プロウイルスを保有するコスミドまたはラムダクローンからの直接的上流または下流プライマー配列決定を妨げる。
【００１０】
本明細書中に記載した発明の一つの態様は、ポリヌクレオチドフランキング配列を用いてブタ内因性レトロウイルスを同定する新規のより迅速な方法である。PERV−特異的フランキング配列は好ましくはリンカー−媒介PCRによって同定される。リンカー−媒介PCRを用い、ブタ内因性レトロウイルス−陽性コスミドおよびラムダライブラリーDNAクローンからのユニークなプロウイルス遺伝子座が同定される。そのようなブタ内因性レトロウイルスフランキングDNA配列情報は、宿主哺乳動物内でPERVの罹患率を確立するのに必須である。
【００１１】
PERVについてのスクリーニング
本明細書中に記載した本発明による迅速かつ効果的な技術は、多数のDNAライブラリークローンを平行してスクリーニングするのに価値がある。簡単に述べれば、プロウイルスを含有するゲノムライブラリークローンを平滑切断制限酵素で消化し、二本鎖DNAリンカー分子を連結し、混合物を希釈し、PCRのための鋳型として用いる。
【００１２】
PCR産物のサイズは、プロウイルスを近接に挟む制限酵素部位の位置によった規定され、次いで、これはライブラリー中の複製ブタ内因性レトロウイルス−陽性クローンの早期の同定で用いることができる。このアプローチは、超感染またはレトロトランスポジションに由来する新規な組込みがサブクローニング要件なしで検出できるような、ゲノムDNAにおけるプロウイルスのフィンガープリントの確立をもたらす。また、それは大きな断片の広範な配列決定を可能とする。リンカー−媒介PCRは本発明によるPERVをマッピングする好ましい方法である。
【００１３】
本発明の哺乳動物のスクリーニングは、公知のプロウイルスを持つドナーの排除および不活化を提供する。本発明は、特にブタからのレトロウイルス配列、特にブタ内因性レトロウイルスの同定を提供する。
【００１４】
本発明の一つの具体例はブタ内因性レトロウイルスの存在につきブタをクリーニングする方法に関し、ここに、該方法は（i）少なくとも一つのポリヌクレオチドによってブタ内因性レトロウイルスを検出し、ここに、該ポリヌクレオチドは配列番号1ないし8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドであり、次いで、（ii）ブタ内因性レトロウイルスを有するブタを同定することを含む。
【００１５】
本発明のもう一つの具体例はブタ内因性レトロウイルスの存在につきブタをスクリーニングする方法に関し、ここに、該方法は（i）少なくとも一つのポリヌクレオチドによってブタ内因性レトロウイルスを検出し、ここに、該ポリヌクレオチドは配列番号1ないし8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドの断片であり、次いで、（ii）ブタ内因性レトロウイルスを有するブタを同定することを含む。好ましい断片は長さが少なくとも15ヌクレオチドであり、長さが2000ヌクレオチドまで拡大される。それらは参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一な機能を有する。
【００１６】
本発明のさらなる具体例はブタ内因性レトロウイルスの存在につきブタをスクリーニングする方法に関し、ここに、該方法は（i）少なくとも一つのポリヌクレオチドによってブタ内因性レトロウイルスを検出し、ここに、該ポリヌクレオチドは配列番号1ないし8よりなる群のホモログであり、次いで、（ii）ブタ内因性レトロウイルスを有するブタを同定することを含む。好ましくは、該ホモログは参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一な構造および機能を有するポリペプチドであり、例えば、ポリペプチドの機能に影響しないアミノ酸のみに変化が起こる場合である。好ましくは、相同ヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをコードする。相同ヌクレオチド配列および参照ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージは好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、なおより好ましくは少なくとも99％である。
【００１７】
本発明のもう一つの具体例は、特定の染色体位置におけるブタ内因性レトロウイルスの存在または不存在につきブタをスクリーニングするにおける配列番号1ないし8よりなる群の少なくともひとつのポリヌクレオチドの使用に関する。
【００１８】
選択されたPERVを発現しないように修飾されたブタの提供
本発明で開示されたポリヌクレオチド配列（配列番号1ないし8）を用いて、相同組換えにより、遺伝子座を「ノックアウト」するためのブタ内因性レトロウイルス−特異的遺伝子−標的化構築体を設計することができる。イン・ビトロで操作された体細胞からの核導入を用いて動物をクローン化する能力はこのノックアウトアプローチの実施可能性に対して鍵となる（Wolfら（1998），McCreathら（2000））。
【００１９】
本発明の一つの具体例は、（i）配列番号1ないし8よりなる群から選択される少なくとも一つのポリヌクレオチド配列によってブタ内因性レトロウイルスを同定し、（ii）該ブタ内因性レトロウイルスの相同組換えによってノックアウトし、または不活化し、次いで、（iii）該ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを選択することを特徴とする選択されたブタ内因性レトロウイルスを発現しないように修飾されたブタを供する方法に関する。
【００２０】
本発明のもう一つの具体例は、（i）少なくとも一つのポリヌクレオチド配列断片によってブタ内因性レトロウイルスを同定し、ここに、該ポリヌクレオチドは配列番号1ないし8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドの断片であり、（ii）該ブタ内因性レトロウイルスの相同組換えによってノックアウトし、または、不活化し、次いで、（iii）該ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを選択することを特徴とする選択されたブタ内因性レトロウイルスを発現しないように修飾されたブタを供する方法に関する。
【００２１】
本発明のさらなる具体例は（i）配列番号1ないし8よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに相同な少なくとも一つのポリヌクレオチド配列によってブタ内因性レトロウイルスを同定し、（ii）該ブタ内因性レトロウイルスの相同組換えによってノックアウトし、または不活化し、次いで、（iii）該ブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを選択することを特徴とする選択されたブタ内因性レトロウイルスを発現しないように修飾されたブタを供する方法に関する。相同ヌクレオチド配列および参照ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージは好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、なおより好ましくは少なくとも99％である。
【００２２】
本発明のもう一つの態様において、配列番号1ないし8よりなる群から選択される少なくとも一つの単離されたポリヌクレオチドよりなるベクターが提供される。本発明のさらなる態様において、配列番号1ないし8よりなる群から選択されるポリヌクレオチドの断片よりなるベクターが提供される。最後に、本発明により、配列番号1ないし8よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対するホモログよりなるベクターが提供される。
【００２３】
選択されたブタ内因性レトロウイルスを発現しないブタを、本発明の方法によって提供することができる。さらに、該ブタから採取された細胞、組織または器官試料は異種間移植で用いることかできる。
【００２４】
本発明のもう一つの具体例において、（i）単離されたポリヌクレオチド配列を用いてブタ内因性レトロウイルスを検出し、ここに、該配列は群配列番号1ないし8および該配列の断片およびホモログから選択されることを特徴とするブタ内因性レトロウイルスの検出用の検出キットが提供される。
【００２５】
本発明を実施するにおいて、分子生物学、微生物学および組換えDNAにおける多くの慣用的な技術を用いる。これらの技術はよく知られており、例えば、Current Protocols in molecular Biology，Volumes Ｉ，ＩＩ and ＩＩＩ，1997（F．M．Ausubel ed．）；Sambrook et al．，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Lavoratory Press，Cold Spring Harbor，N．Y．；DNA  Cloning：A Practical Approach，Volumes I and ＩＩ，1985（D．N．Glover ed．）；Oligonucleotide Synthesis，1984（M．L．Gait ed．）；Nucleic Acid Hybridization，1985，（Hames and Higgins）；Transciption and translation，1984（Hames and Higgins eds．）；Animal Cell Culture，1986（R．I．Freshney ed．）；Immobilized Cells and Enzymes，1986（IRL Press）；Perbal，1984，A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Methoeds in Enzymology（Academic Press，Inc．）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，1987（J．H．Miller and M．P．Calos eds．，Cold Spring Harbor Laboratory）；and Methods in Enzymology Vol．154 and Vol．155（Wu and Grossman，and Wu，eds．，各々）に説明されている。
【００２６】
その最も広い意味では、用語「相同」は、ヌクレオチド配列に関してここで用いる場合、参照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、ここに、対応する配列は参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一の構造および機能を有するポリペプチドをコードし、例えば、ポリペプチド機能に影響しないアミノ酸のみい変化が起こる場合である。望ましくは、相同ヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをコードする。相同ヌクレオチド配列および参照ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージは望ましくは少なくとも80％、より望ましくは少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、なおより好ましくは少なくとも99％である。配列の比較はSmith−Waterman配列アラインメントアルゴリズムを用いて行なう（例えば、Waterman，M．S．，Introduction to Computatinal Biology：Maps，sequences and genomes．Chapman ＆ Hall．London：1995．ISBN 0−412−99391−0，またはhttp://www-hto.usc.edu/software/segaln/index.html）。localSプログラム、バージョン1.16は以下のパラメータで用いる：マッチ：1、ミスマッチペナルティ：0.33，オープンギャップペナルティ：2，拡大した−ギャップペナルティ：2。参照ヌクレオチド配列に「相同な」ヌクレオチド配列は50℃の2×SSC、0.1％SDS中で洗浄しつつ50℃の7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M  NaPO4、1mM  EDTA中、より望ましくは50℃の1×SSC、0.1％SDS中で洗浄しつつ50℃の7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M  NaPO4、1mM  EDTA中、より望ましくは50℃の0.5×SSC、0.1％SDS中で洗浄しつつ50℃の7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M  NaPO4、1mM  EDTA中、好ましくは50℃の0.1×SSC、0.1％SDS中で洗浄しつつ50℃の7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M  NaPO4、1mM  EDTA中、より好ましくは65℃の0.1×SSC、0.1％SDS中で洗浄しつつ50℃の7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M  NaPO4、1mM  EDTA中で参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、なお機能的に同等な遺伝子産物をコードする。
【００２７】
本明細書中で用いるごとく、「宿主細胞」とは、いずれかの手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染によって細胞に導入された異種DNAを含有する原核生物または真核生物細胞をいう。
【００２８】
本明細書中で用いるごとく、「異種」とは「異なる天然源の」を意味するか、あるいは非―天然状態を表す。例えば、もし宿主細胞がもう1つの生物に、特にもう1つの種に由来するDNAまたは遺伝子で形質転換されれば、その遺伝子はその宿主細胞に対して、また、その遺伝子を保有している宿主細胞の子孫に関して異種である。同様に、異種とは、動物の天然の元々の細胞型に由来し、それに挿入されたが、非−天然状態で、例えば、異なるコピー数で、または異なる調節エレメントの制御下で存在するヌクレオチド配列をいう。
【００２９】
「ベクター」分子は、それに異種核酸を挿入することができ、それは、次いで適当な宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは、好ましくは、1以上の複製起点、および組換えDNAを挿入することができる1以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを持つ細胞をそれなしでそれから選択することができる便宜な手段を有し、例えば、それらは薬物抵抗性遺伝子をコードする。通常のベクターはプラスミド、ウイルスゲノム、および（一義的には、酵母および細菌における）「人工染色体」を含む。
【００３０】
「プラスミド」は、一般に、当業者になじみのある標準的な命名約束に従い、ここでは、小文字pが先行し、および／または続いて大文字および／または数字によって示される。本明細書中で開示する出発プラスミドは商業的に入手可能であり、非制限的ベースで公に入手でき、あるいはよく知られた公表手法のルーチン的適用によって入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明で用いることができる多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターはよく知られており、当業者に容易に入手できる。さらに、当業者は本発明で用いるのに適した多数の他のプラスミドを容易に構築することができるであろう。本発明におけるそのようなプラスミドならびに他のベクターの構築および使用は本開示から当業者に容易に明らかであろう。
【００３１】
用語「単離された」とは、物質がその元来の環境（例えば、もしそれが天然に生じるならば天然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系における共存する物質のいくつかまたは全てから分離された同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえ引き続いて天然系に再度導入されたとしても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得、そのようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部でない点で依然として単離されている。
【００３２】
本明細書中で用いるごとく、用語「転写制御配列」とは、それらが作動可能に連結した蛋白質をコードする核酸配列の転写を誘導し、抑制し、または制御するイニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列のごときDNA配列をいう。
【００３３】
本発明は本明細書中に開示する核酸配列のいずれの「断片」も含む。断片は、充分な長さの遺伝子を単離するために、および高い配列類似性または同様な生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。このタイプのプローブは、好ましくは、少なくとも約30塩基を有し、例えば、約30ないし約50塩基、約50ないし約100塩基、約100ないし約200塩基、または200以上の塩基を含むことができる。また、プローブを用いて、全長転写体に対応するcDNAクローン、およびゲノミッククローン、または調節およびプロモーター領域、エクソンおよびイントロンを含めた完全なPERV遺伝子を含むクローンを同定することができる。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための公知のDNA配列を用いることによってPERV遺伝子のコーディング領域を単離することを含む。本発明の遺伝子のそれと相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのいずれのメンバーがプローブにハイブリダイズするかを判断する。ブタをスクリーニングするためのPCRプライマーを設計するにおいて、例えば、最小15程度のヌクレオチドがPERVを同定するのに用いられるであろう。PERVノックアウト構築体を創製するにおいて、最小500ヌクレオチドを用いるであろう。
【００３４】
前記した遺伝子配列に加え、例えば、他の種に存在することができるごとく、そのような配列の「ホモログ」を同定することができ、当該分野でよく知られた分子生物学技術によって過度の実験なくして容易に単離することができる。さらに、そのような遺伝子産物の1以上のドメインに対して大きな相同性を有する蛋白質をコードするゲノム内の他の遺伝子座に遺伝子が存在できる。これらの遺伝子も同様な技術を介して同定することができる。例えば、単離された異なって発現された遺伝子配列を標識することができ、これを用いて、注目する生物から得られたmRNAから構築されたcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション条件は、標識された配列がそれに由来する生物の型とは異なる生物にcDNAライブラリーが由来する場合、より低いストリンジェンシーであろう。あるいは、標識された断片を用いて、再度、適切にストリンジェントな条件を用いて注目する生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような低いストリンジェンシー条件は当業者によく知られており、ライブラリーおよび標識された配列が由来する特異的生物に依存して予測可能に変化するであろう。そのような条件に関するガイダンスについては、例えば、前記で引用したSambrookを参照されたし。
【００３５】
さらに、注目する遺伝子内のアミノ酸配列をベースにして設計された2つの変性オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてPCRを行なうことによって、以前は知られていない異なって発現された遺伝子型の配列を単離することができる。反応のための鋳型は、異なって発現された遺伝子対立遺伝子を発現することが知られているまたはそれを疑われるヒトまたは非−ヒト細胞系または組織から調製されたmRNAの逆転写によって得られたcDNAであり得る。
【００３６】
PCR産物をサブクローンし、配列決定して、増幅された配列が、異なって発現された遺伝子−様核酸配列の配列を表すことを保証する。次いで、PCR断片を用いて、種々の方法によって、全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅された断片を標識し、それを用いて、バクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。別法として、標識された断片を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００３７】
また、PCR技術を用いて、全長cDNA配列を単離することができる。例えば、標準的な手法に従い、適当な細胞または組織源からRNAを単離することができる。最初の鎖合成のプライミングのための増幅された断片の最も5’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、逆転写反応をRNAで行なうことができる。次いで、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を用い、得られたRNA／DNAハイブリッドをグアニンで「テール」することができ、ハイブリッドをRNAase  Hで消化することができ、次いで、第2の鎖合成をポリ−Cプライマーを用いて開始することができる。かくして、増幅された断片の上流のcDNA配列を用意に単離することができる。用いることができるクローニング戦略のレビューについては、例えば、Sambrookら，1989，前掲参照。
【００３８】
異なって発現された同定された遺伝子が正常なまたは野生型遺伝子である場合、この遺伝子を用いて、遺伝子の突然変異体対立遺伝子を単離することができる。そのような単離は、遺伝的根拠を有することが知られているまたはそれが疑われるプロセスおよび障害において好ましい。突然変異体対立遺伝子は、PERV病気兆候に寄与する遺伝子型を有することが知られているまたはそれが疑われる個体から単離することができる。突然変異体対立遺伝子および突然変異体対立遺伝子産物を、次いで、後記する診断アッセイ系で利用することができる。
【００３９】
例えば、当業者によく知られた技術であるPCRを用いることによって、突然変異体遺伝子のcDNAを単離することができる。この場合、突然変異体対立遺伝子を保有していると推定される個体で発現されることが知られているまたはそれが疑われる組織から単離されたmRNAにオリゴ−dTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることによって、および新しいストランドを逆転写構想で延長することによって、第1のcDNAストランドを合成することができる。次いで、正常な遺伝子の5’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用い、cDNAの第2のストランドを合成する。これらの2つのプライマーを用い、次いで、産物をPCRを介して増幅し、適当なベクターにクローン化し、当業者によく知られた方法を介してDNA配列分析に付す。突然変異体遺伝子のDNA配列を正常な遺伝子のそれと比較することによって、突然変位体遺伝子産物の機能の喪失または改変の原因となる突然変異（複数突然変異）を確認することができる。
【００４０】
あるいは、「ゲノムまたはcDNAライブラリー」を構築し、突然変異体対立遺伝子を保有していると疑われるまたはそうであることが知られた個体において注目する遺伝子を発現することが知られているまたは疑われる組織から、各々、DNAまたはRNAを用いてスクリーニングすることができる。次いで、正常な遺伝子またはそのいずれかの適当な断片を標識し、それを、ライブラリー中の対応する突然変異体対立遺伝子を同定するためのプローブとして用いることができる。次いで、この遺伝子を含むクローンを、当該分野でルーチン的に実施される方法を介して精製することができ、前記したごとく配列分析に付すことが出来る。
【００４１】
加えて、突然変異体対立遺伝子を保有していると疑われるまたは保有していることが知られた個体において注目する遺伝子を発現することが知られたまたは疑われる組織から単離されたDNAまたは該組織から合成されたcDNAを利用して、「発現ライブラリー」を構築することができる。このようにして、後記するとごく、正常な遺伝産物に対して生起した抗体と組み合わせて標準抗体スクリーニング技術を用い、推定突然変異体組織によって作られた遺伝子産物を発現させ、スクリーニングすることができる。（スクリーニング技術については、例えば、Harlow，E．およびLane編，1988，「Antibodies：A  Labratory Mannual」，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor参照）。（例えば、ミスセンス突然変異の結果として）突然変異の結果、改変された機能を持つ発現された遺伝子産物がもたらされる場合、抗体のポリクローナル組は、突然変異体遺伝子産物と交差反応するようである。そのような標識された抗体とのそれらの反応を介して検出されたライブラリークローンを精製し、前記したごとく配列分析に付すことができる。
【００４２】
また、「機能的同等体」とは、内因性の異なって発現された遺伝子産物の対応する部分と実質的に同様な方法で、他の細胞または細胞外分子と相互作用することができる蛋白質またはポリペプチドをいうことができる。例えば、「機能的同等体」ペプチドは、免疫アッセイにおいて、内因性蛋白質の対応するペプチド（すなわち、そのアミノ酸配列が「機能的同等な」ペプチドを達成するよう修飾されたペプチド）への、または内因性蛋白質の対応するペプチドに対して抗体が生起された場合、内因性蛋白質それ自体への抗体の結合を減少させることができるであろう。等モル濃度の機能的同等ペプチドは、少なくとも約5％、好ましくは約5％および10％の間、より好ましくは約10％および25％の間、尚より好ましくは、約25％および50％の間、最も好ましくは約40％および50％の間だけ、対応するペプチドの前記結合を減少させるであろう。
【００４３】
異なって発現された遺伝子産物は、当該分野でよく知られた技術を用い、組換えDNA技術によって産生することができる。かくして、異なって発現された遺伝子配列をコードする核酸を発現させることによって本発明の異なって発現された遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを製造する方法を本明細書中で記載する。当業者によく知られた方法を用いて、異なって発現された遺伝子蛋白質をコードする配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの技術は、例えば、イン・ビトロ組換えDNA技術、合成技術およびイン・ビボ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrookら，1989，前掲，およびAusubelら，1989，前掲に記載された技術を参照されたし。別法として、異なって発現された遺伝子蛋白質配列をコードできるRNAを、例えば、シンセサイザーを用いて化学的に合成することができる。例えば、ここに引用してその全体を一体化させる「Oligonucleotide Synthesis」，1984，Gait，M．J．編，IRL Press，Oxfordに記載された技術を参照されたし。
【００４４】
種々の宿主―発現ベクター系を用いて、本発明の異なって発現された遺伝子コーディング配列を発現させることができる。そのような宿主―発現系は、それにより、注目するコーディング配列を作ることができ、引き続き、精製することができるビヒクルを表し、また、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクトした場合に、イン・サイチュにて本発明の異なって発現された遺伝子蛋白質を呈することができる細胞も表す。これらは、限定されるものではないが、異なって発現された遺伝子蛋白質コーディング配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、E．Coli，B．subtilis）；異なって発現された遺伝子蛋白質コーディング配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Saccharomyces，Pichia）；異なって発現された遺伝子蛋白質コーディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させた、または異なって発現された遺伝子蛋白質コーディング配列を含む組換えプラスミド形質転換ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノムに、または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築体を保有する哺乳動物細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3）を含む。
【００４５】
宿主細胞での発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択はよく知られた手法であり、発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入および宿主での発現それ自体のための必要な技術は当該分野においてルーチン的技量である。一般に、組換え発現ベクターは複製起点、下流構造配列の転写を指令する高度に発現された遺伝子に由来するプロモーター、およびベクターへの暴露の後に細胞を含むベクターの単離を行なうための選択マーカーを含むであろう。
【００４６】
加えて、挿入された配列の発現を変調し、または特定の所望の様式にて遺伝子産物を修飾し処理する宿主細胞系を選択することができる。蛋白質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は蛋白質の機能に重要であろう。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセッシングおよび蛋白質の修飾のための特徴的かつ特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系は、発現された外来性蛋白質の正しい修飾およびプロセッシングを保証するように選択することができる。この目的では、一次転写体の適切なプロセッシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞性機構を保有している真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などを含む。
【００４７】
組換え蛋白質の長期の高収率生産には、安定した発現が好ましい。例えば、異なって発現された遺伝子蛋白質を安定に発現する細胞系を作成することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりはむしろ、宿主細胞を適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択マーカーによって制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来性DNAの導入に続き、作成した細胞を富化培地中で1ないし2日間増殖することができ、次いで、選択培地にスイッチする。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込むのを可能とし、増殖させてフォーカスを形成させることができ、これをクローン化し、細胞系に拡大することができる。この方法は、有利には、異なって発現された遺伝子蛋白質を発現する細胞系を作成するのに用いることができる。そのような作成された細胞系は、異なって発現された遺伝子蛋白質の内因性活性に影響する化合物をスクリーニングし、それを評価するのに特に有用であろう。
【００４８】
「遺伝子標的化」とは、本発明の選択されたPERV遺伝子のヌクレオチド配列に所望の変化を導入するプロセスである。哺乳動物細胞は、非−相同または相同組換えのいずれかのプロセスによって外来性DNAを組み込む。相同DNA配列の間の組換えを媒介する哺乳動物細胞の能力は、遺伝子標的化技術のための基礎である。イントロン配列または遺伝子プロモーターもしくはエンハンサーがエクソン配列として等しく効果的かつ有用な標的であるように、全ゲノムを潜在的に操作することができる。
【００４９】
「遺伝子治療」とは、核酸の対象への投与によって行なわれる治療をいう。当該分野で利用できる遺伝子治療のための方法のいずれも、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を後記する。対象への核酸の送達は直接的とすることができ、その場合、対象を直接的に核酸または核酸を保有しているベクターに暴露させるか、あるいは間接的とすることができ、その場合には、細胞をまずイン・ビトロで核酸で形質転換し、次いで、患者に移植する。これらの2つのアプローチは、各々、イン・ビボまたはエクス・ビボ遺伝子治療として知られている。
【００５０】
特別な具体例において、核酸は直接的にイン・ビボで投与され、そこで、それは発現されて、コードされた産物を生産する。これは、当該分野で知られた多数の方法のうちいずれかによって、例えば、それを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠陥のあるまたは減弱されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いる感染によって（例えば、米国特許第4,980,286号および言及されたその他参照）、または裸のDNAの直接的注入によって、またはミクロ粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Biolistic，Dupont）、または脂質または細胞―表面受容体またはトランスフェクティング剤での被覆、リポソーム、ミクロ粒子、またはマイクロカプセルへの封入の使用によって、それが細胞内となるようにそれを投与することによって、あるいは核に侵入することが知られているペプチドに連結してそれを投与することによって、それを受容体―媒介エンドサイトーシスに従うようにリガンドに結合させてそれを投与することによって（例えば、ここに引用して、その全体を全て一体化させる米国特許第5,166,320号；第5,728,399号；第5,874,297号；および第6,030,954号参照）（これは、特異的に受容体を発現する細胞型を標的化するのに用いることができる）達成することができる。もう1つの具体例において、核酸―リガンド複合体を形成することができ、ここに、リガンドはエンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソームの分解を回避するのを可能とする。さらにもう1つの具体例において、特異的受容体を標的化することによって、核酸を、細胞特異的取込みおよび発現のためにイン・ビボで標的化することができる（例えば、PCT公開WO  92／06180；WO  92／22635；WO  92／20316；WO  93／14188；およびWO  93／20221参照）。別法として、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる（例えば、米国特許第5，413，923号；第5,416,260号；および第5,574,205号；およびZijlstraら，1989，Nature  342：435−438参照）。
【００５１】
特別な具体例において、ウイルスベクターを用いる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる（例えば、米国特許第5,219,740号；第5,604,090号；および第5,835,182号参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組込みに必要でないレトロウイルス配列を欠失するように修飾されている。遺伝子治療で用いるべき核酸をベクターにクローン化し、これは、遺伝子の患者への送達を容易とする。
【００５２】
アデノウイルスは、遺伝子治療で用いることができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器系上皮に送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは天然で呼吸器系上皮に感染し、そこで、それは温和な病気を引き起こす。アデノウイルス−ベースの送達系のための他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非−分裂細胞を感染させることができる利点を有する。アデノウイルス−ベースの遺伝子治療を行なうための方法は、例えば、ここに引用してその全体を全て一体化させる。米国特許第5,824,544号；第5,868,040号；第5,871,722号；第5,880,102号；第5,882,877号；第5,885,808号；第5,932,210号；第5,981,225号；第5,994,106号；第5,994,132号；第5,994,134号；第6,001,557号；および第6,033,8843号に記載されている。
【００５３】
また、アデノ随伴ウイルス（AAV）が遺伝子治療で用いるのに提案されている。AAVを生産し、それを利用する方法は、例えば、ここに引用してその全体を全て一体化させる、米国特許第5,173,414号；第5,252,479号；第5,552,311号；第5,658,785号；第5,763,416号；第5,773,289号；第5,843,742号；第5,869,040号；第5,942,496号；および第5,948,675号に記載されている。
【００５４】
遺伝子治療に対するもう1つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のごとき方法によって遺伝子を組織培養中の細胞に導入することを含む。通常、導入の方法は選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで、導入された遺伝子を取り込み、それを発現しつつある細胞を単離する選択下に細胞を置く。次いで、それらの対象に送達する。
【００５５】
この具体例において、得られた組換え細胞のイン・ビボでの投与に先立って、核酸を細胞に導入する。そのような導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体−媒介遺伝子導入、マイクロセル−媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含めた当該分野で知られたいずれの方法によって行なうこともできる。外来性遺伝子の細胞への導入については、多数の技術が当該分野で知られており、本発明に従って用いることができ、但し、受容体細胞の必要な発生的および生理学的機能は破壊されないものとする。該技術は、核酸が細胞によって発現でき、好ましくは、その細胞の子孫によって受け継ぐことができ、発現することができるように、核酸の細胞への安定な導入を供するべきである。
【００５６】
得られた組換え細胞は、当該分野で知られた種々の方法によって患者に送達することが出来る。好ましい具体例において、上皮細胞を、例えば、皮下注射する。もう1つの具体例において、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として対象に適用することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹または先祖細胞）は好ましくは静脈内投与される。用いることが考えられる細胞の量は所望の効果、対象の状態等に依存し、当業者によって決定することが出来る。
【００５７】
核酸を遺伝子治療の目的で導入することができる細胞はいずれかの所望の利用できる細胞方を含み、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝臓細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨大核細胞、顆粒球のごとき血液細胞；種々の幹または先祖細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血液、末梢血液、胎児肝臓等から得られる造血幹または先祖細胞を含む。
【００５８】
好ましい具体例において、遺伝子治療で用いる細胞は対象にとってオートロガスである。
【００５９】
組換え細胞を遺伝子治療で用いる具体例において、核酸は、それが細胞またはその組織によって発現できるように細胞に導入され、次いで、組換え細胞は治療効果のためにイン・ビボに投与される。特別な具体例において、幹または先祖細胞が用いられる。単離し、イン・ビトロで維持することができるいずれの幹および／または先祖細胞も本発明のこの具体例により潜在的に用いることができる。そのような幹細胞は、限定されるものではないが、造血幹細胞（HSC）、皮膚および腸のライニングのごとき上皮組織の幹細胞、胚心筋細胞、肝臓幹細胞（例えば、WO  94／08598）、および神経幹細胞（Stemple and Anderson，1992，Cell 71：973−985参照）を含む。
【００６０】
上皮幹細胞（ESC）またはケラチノサイトは、公知の手法によって皮膚および腸のライニングの組織から得ることができる（Rheinwald，1980，Meth．Cell Bio．21A：229）。皮膚のごとき層化上皮組織において、発芽層内の幹細胞の有糸分裂によって再生が起こり、該層は基部ラミナに最も近い。腸のライニング内の幹細胞は、この組織の迅速な再生速度を供する。対象またはドナーの皮膚または腸のライニングから得られたESCまたはケラチノサイトは組織培養で増殖させることができる（PittelkowおよびScott，1986，Mayo Clinic Proc．61：771）。もしESCがドナーによって提供されれば、宿主−対−移植片反応性を抑制する方法（例えば、照射、中程度の免疫抑制を促進するための薬物または抗体投与）を用いることもできる。
【００６１】
造血幹細胞（HSC）に関しては、HSCの単離、増殖、および維持を供するいずれの技術も本発明のこの具体例で用いることができる。これが達成できる技術は（a）将来の宿主またはドナーから単離された骨髄細胞からのHSC培養の単離および確立、または（b）同種異系または異種間であり得る従前に確立された長期HSC培養の使用を含む。好ましくは、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と組み合わせて非−オートロガスHSCを用いる。本発明の特別な具体例において、ヒト骨髄細胞は、針吸入によって後腸骨凌から得ることができる（例えば、Kodoら，1984，J．Clin．Invest．73：1377−1384参照）。本発明の好ましい具体例において、HSCは高度に富化でき、または実質的に純粋な形態にできる。この富化は長期培養の前、間または後に達成することができ、当該分野で知られたいずれかの技術においてなすことが出来る。骨髄細胞の長期培養は、例えば、改良されたDexter細胞培養技術（Dexterら，1977，J．Cell Physiol．91：335）またはWitlock−Witte培養技術（WitlockおよびWitte，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79：3608−3612）を用いることによって確立し、維持することができる。
【００６２】
特別な具体例において、遺伝子治療の目的で導入すべき核酸は、核酸の発現が転写の適当なインデューサーの存在または不存在を制御することによって制御できるように、コーディング領域に作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む。
【００６３】
また、本発明は、診断キットで用いるべき診断試薬としての本発明の単離されたポリヌクレオチド（配列番号1ないし8）およびその断片およびホモログの使用に関する。
【００６４】
本発明の1つの具体例は、（i）配列番号1ないし8よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド配列を用いてブタ内因性レトロウイルスを検出し、および（ii）ブタ内因性レトロウイルスを同定することを特徴とするブタ内因性レトロウイルスの検出用の検出キットを提供する。
【００６５】
機能不全に関連する検出は、遺伝子の過小発現、過剰発現または変化した空間または時間的発現に由来する病気の診断、または該病気に対する罹患性に付け加える。または規定することが出来る診断ツールを提供する。遺伝子中に突然変異を保有している個体は、種々の技術によってDNAレベルで検出することができる。
【００６６】
診断用の核酸は血液、尿、唾液、組織バイオプシーまたはオートプシー物質からのごとく、対象の細胞から得ることができる。ゲノムDNAを検出のために直接的に用いることができるか、あるいは分析に先立って、PCRまたは他の増幅技術を用いることによって酵素により増幅することができる。RNAまたはcDNAも同様に用いることができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅されたDNAを標識されたヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によって、または融点の変化によって、ミスマッチした二本鎖から区別することができる。また，DNA配列の差は、変性剤を含むまたは含まないゲルにおけるDNA断片の電気移動移動度の変化によって、または直接的DNA配列決定によって検出することもできる（例えば、Myersら，Science（1985）230：1242）。特異的位置における配列の変化は、RNaseおよびS1ほぼまたは化学的切断方法のごときヌクレアーゼ保護アッセイによって明らかにすることもできる（Cottonら，Proc Natl Acad Scis USA（1985）85：4397−4401）。もう1つの具体例において、ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプロ−ブのアレイを構築して、例えば、遺伝子突然変異の効果的なスクリーニングを行なうことができる。アレイ技術方法はよく知られており、一般的な適用可能性を有し、それを用いて、遺伝子発現、遺伝的連鎖、および遺伝子変動性を含めた分子遺伝学における種々の問題に取り組むことができる（例えば、M．Cheeら，Science，Vol  274，頁610−613（1996）参照）。
【００６７】
本発明の態様の具体例を、ここに、実施例によって記載するが、該実施例は断じて限定的であることを意図しない。
【００６８】
実施例
実施例1  DNAおよびリンカー分子の調製
リンパ球DNAから創製したブタコスミドゲノムDNAライブラリーをLarge  Whiteメスブタから抽出し、各々、Gnebank  PERV−C（AF038599）およびPERV−A（AJ133817）ゲノムのヌクレオチド位置580ないし2147および6681ないし7040の間の領域に対応するgagおよびenv‐特異的プローブを用い、ブタ内因性レトロウィルスプロウィルスにつきスクリーニングした。二重―陽性PERV含有コスミドクローンを複数ラウンドのスクリーニングを介して単離する。Large−Construct  Kit（登録商標）（Qiagen）を用いてコスミドDNAを精製し、蛋白質切形テスト（PTT）を用いてgagおよびenv  ORFの完全性につきアッセイする（Roestら，（1993））。製造業者によって推奨される標準的な条件下で、20μl反応中の20単位Pvu  II（Roche Biochemicals）で2μgのコスミドDNAを消化して、平滑末端制限断片を得る。上方ストランドオリゴヌクレオチド：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT−3’およびより短い下方ストランドオリゴヌクレオチド：5’ACCAGCCC−N2H−3’よりなるリンカー分子。混合物を5分間で95℃まで加熱し、ゆっくりと20℃まで冷却し、この温度に12時間維持することによって、2μモルの各オリゴヌクレオチドを100μlの10mMトリスHCl（pH8）、50mMのNaCl中でアニールする。短いオリゴヌクレオチドは、リンカー−連結ゲノム断片の3’末端の延長をブロックするアミン基を含み、未増幅連結断片上のPERV−特異的プライマー結合部位についての要件なくして、リンカープライマー（LP）結合部位および、従って、PCR増幅のための標的の形成を妨げる。下方オリゴヌクレオチドの3’末端が延長し、LP結合部位を生じる場合、分子内結合は、プライマーアニーリングに好都合なストランドの対向末端の間に安定で延長できないパンハンドル構造を生じる。この効果は、さらに、非−特異的PCR産物を生じる危険性を低下させ、これは、抑制PCRとして知られている（Siebertら，（1995））。
【００６９】
リンカー連結
二本鎖リンカー分子を平滑末端制限断片に連結するために、前記からの5μlのPvu  II−消化コスミドDNAを3μlのアニールしたリンカー溶液、1μlの5×リガーゼ緩衝液（Life  Technologies）および1μlの高濃度DNAリガーゼ（Life  Technologies）に添加する。連結は15℃において16時間行なう。
【００７０】
フランキングDNAのリンカー−分子媒介PCR増幅
連結混合物をPCR−グレードの水（Sigma）で1：100希釈し、1μlを、製造業者のガイドラインに従ってAmplitaq  Gold（Perkin Elmer）および5pMのセンスおよびアンチセンスプライマー（表1）を用いるPCR反応で用いる。反応は以下のごとくサイクルする：94℃、9分；94℃、30秒；58℃、30秒；72℃、4分；PEバイオシステムズ2400サーマルサイクラーで35サイクル。これらのサイクリング条件は、産物をサイズ7kbまで増幅することが知られている。
【００７１】
DNA配列決定
QIAquick  Gel  Exstractionキット（Qiagen）を用いてPCR産物をゲル精製し、LPプライマーを用いて直接的に配列決定する。より大きな断片をpCR2.1−TOPO（Invitrogen）にクローン化し（任意）、しかる後、M13順方向および逆方向プライマーで配列決定する。DNA配列決定反応は、ABI  PRISM  Dye  terminator  Cycle  Sequencing  Ready Reactionキット（Applied  Biosystems）を用いて行い、ABI  373（Applied  Biosystems）自動シーケンサーで分析する。
【００７２】
前記した戦略をサイズが30および45kbの間の種々のユニークなコスミドクローンに適用し、各々は、ブタゲノムDNAのユニークな領域によって近接挟まれた、Please  Descriveプローブenv−Aおよびgag  DNAプローブでのサザーングロットならびにRFLP分析によって測定して、PERVプロウィルスの単一コピーを含む。2つのPCR産物を、LPとカップリングした各LTRプライマーにつき予測でき−1つは全く内部PERV  DNAよりなり、もう1つはフランキング配列／LTR  DNAを含む。フランキングDNA配列では、PCR産物のサイズは、プロウィルスLTRの上流または下流の選択された制限酵素部位の近接性によって規定される。ある範囲の平滑−切断制限酵素を用いて、PERVフランキングDNA配列を含むPCR産物を得る尤度を増加させる。それにもかかわらず、Sma  IおよびPvu  II制限酵素は、分析したほとんど全てのコスミドクローンにつきフランキング配列を得るのに充分である。
【００７３】
この技術を3つのユニークなPERV−陽性コスミドクローンに適用した結果。コスミドDNAをPvu  IIで消化し、U5逆方向プライマーを用いてリンカー−媒介PCRを行なう。1つのバンドは3’LTRの上流の内部PERV  DAN断片を表し、他のバンドは5’フランキングDANを含む。これは配列分析によって確認される。Pvu  II消化およびU5順方向プライマーを用いるリンカー−媒介PCRから得られたPCR産物が証拠である。この場合、高分子量バンド（3kb）は、配列分析によって確認されるごとく、2.8kbのユニークな3’フランキングDNAを含む。高分子量標的は、その低分子量カウンターパートよりも増幅する効率は低い。反応内のPCR産物のサイズの境界はより小さく、増幅効率は同様である。Sma  IまたはPvu  IIいずれかを用い、複数クローンを平行して分析する場合、特定のプライマー対（LP＋U5順方向またはLP＋U5逆方向）についてのサイズだけに基づき、内部および外部（フランキング）PCR産物を区別することが可能である。さらに、PERVプロウィルスはフランキングDNAに関して高度に保存されているので、内部バンドサイズは予測することができ、クローニングおよび配列決定の必要なくしてPCR産物のサイズに基づいて同定することができる。
【００７４】
実施例2：非‐トランスジェニックLargeWhiteブタにおけるPERVのマッピング
ライブラリーの調製およびスクリーニング
DNAをブタ末梢血液単核細胞から抽出し、ベクター製造業者のプロトコルに従ってSau3Alで部分的に消化する。製造業者の指示に従い（Stratagene）、ライブラリーをBamHI消化Lambda  Fix  IIまたはpSuperCos  1ベクター中で構築する。コスミドライブラリーをPERV  Aにつきスクリーニングし、他方、ラムダーライブラリーは後記するごとくPERV  Bにつきスクリーニングする。
【００７５】
コスミドライブラリーでは、クローンの3ないし4倍ゲノムカバレージを、50μg／mlアンピシリンを補足したLB寒天プレート上に置く。コロニーを30℃にて一晩増殖させ、Hybond  N＋フィルター（Amersham）にリフトしてマスターフィルターを得る。次いで、マスターフィルターを3つの他のフィルター（セットA、BおよびC）に複製し、これを、Sambroolkら（1989）に記載されているごとく処理し、Stratalinkerクロスリンカー（120000μJ，Stratagene）でUV架橋する。
【００７６】
以下のごとく、Megaprimeランダムプライムド標識キット（Amersham  Pharmacia  Biotech）を用い、三連レプリカフィルターセット（セットA、BおよびC）を、α32P‐dCTPで標識したプローブでスクリーニングする：フィルターセットAはPERV  gagに対するプローブ（配列AF038600，塩基585‐2159）でスクリーニングし、他方、セットBおよびCはPERV  A  envに対するプローブ（配列Y12238塩基745−1101）でスクリーニングする。一体化されていないヌクレオチドは、Sephadex  G50カラムでのスパンカラムクロマトグラフィーによって除去する。6×SSC、20mM  NaH2PO4、5×デンハルト溶液、0.4％SDSおよび500μg／ml変性サケ精子DNAを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中、フィルターを65℃にて3時間プレハイブリダイズさせる。プローブを添加し、フィルターを一晩ハイブリダイズさせる。フィルターを2×SSC、0.1％SDS中で室温にて1回、0.5×SSC、0.1％SDS中で65℃にて30分間2回、ついで、0.1×SSC、0.1％SDS中で30分間2回洗浄する。フィルターを、増感スクリーンを用いて、−70℃にてX−線フィルムに24ないし48時間、または貯蔵ホスフォルスクリーンに1ないし5時間暴露し、続いて、Molecular  Dynamics  Stormホスフォルイメージャーでホスフォルイメージングを行なう。ホスフォルイメージしたブロットをアセテートフィルター上にプリントし、しかる後、他の関連フィルターと共に光ボックス上に整列させる。
【００７７】
ラムダFix  IIライブラリーでは、製造業者の指示（Stratagene）に従い、合計1.5×106pfuをNZY寒天プレート上で平板培養する。Hybond  NX（Amersham）を用いて二連フィルターをリフトし、Sambrookら（1988）に記載されているごとく変性し、中和する。フィルターを前記したごとくUV架橋し、Quickhyb溶液（Stratagene）中で30分間プレハイブリダイズさせる。Prime−it  II（Stratagene）を用いて、プローブをα32P‐dCTPで標識する。gagプローブ（AF038600、塩基585ないし2159）を1つのフィルターに加え、envプローブ（Y12239塩基1387ないし1735）を二連フィルターに加える。フィルターを一晩ハイブリダイズさせ、次いで、コスミドフィルターにつき前記したごとく洗浄する。フィルターを−70℃にて1週間までX−線フィルムに暴露し、Compact×4自動フィルムプロセッサー（X−ograph  Imaging  Systems）を用いて現像する。
【００７８】
次いで、gagおよびenvの双方のフィルター上で複製したクローンを、前記したごとく、複数ラウンドの再スクリーニングを介して均一となるまで精製する。この戦略は、全長プロフィルスのみをピックアップするように設計される。全gag遺伝子、またはenvのVRAおよびVRB部分いずれかを失ったかなり欠失したプロウィルスは、かくして、さらなる分析のために排除しておく。より小さな欠失または再配置を持つクローンは、後記するごとく、後の段階において排除する。コスミドDNAはQiagen  QIAwellシステム（Qiagen）を用いて調製する。ラムダDNAは、Ausubelら（1987）に記載されているごとく液体溶解物から調製する。
【００７９】
1．一次分析
コスミドおよびラムダクローンは後記するごとく異なって分析し、これは、コスミドDNAに対するラムダDNAのより低い収率を反映する。
【００８０】
SmaIおよびPvu  II消化物を用いる制限断片分析によって、コスミドクローンの一次分析を行なって、同一の制限断片フィンガープリントを持つクローンを同定する。各RFLPクラスの代表的なクローンは、後記するごとく、オープンリーディグフレーム（ORF）のPCRによってさらに分析する。
【００８１】
ラムダクローンは、NotI、EcoRI、MslI、SmaI／NotIまたはAvrII／MslIでの制限消化、続いてのHybondNXへのサザーンブロッティング（Sambrookら（1989））、および前記した32P標識gagおよびPERV  B  envプローブいずれかでのハイブリダイゼーションによって分析する。サザーンブロットは前記したごとくハイブリダイズさせる。フィルターは1×SSC、0.1％SDS中で65℃にて2×30分、次いで、0.1×SSC、0.1％SDS中で65℃にて30分間2回洗浄し、X−線フィルムに一晩暴露させる。
【００８２】
2．二次分析
ラムダおよびコスミド単離体における無傷ウイルス遺伝子の存在は、polオープンリーディングプレーム（ORF）を横切るPCRによって、またはORFのPCR、続いての、gagおよびenv  ORFをコードする可能性を分析するための蛋白質切形テスト（PTT）によって調べる。プライマーは、公表された配列データに基づき、各ORFの出発および最後における保存された配列に対して設計される。PCR条件は、充分に配列決定されてPERV  C  gag、およびPERV  A、BおよびC  envの実験室で作られたプラスミドクローンおよび公表されたプロトタイプ配列に対して＞98％相同性を持つコードされた全長ORFについて最適化される。pol  PCRはPK15細胞由来のDNAについて最適化される。
【００８３】
gagでは、以下のプライマーを用いる：gag  F（5’−GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGGACAGACAGTGACTACC−3’）およびgag  R（5’−CCCTCCACCTTCAAAGTTAC−3’）。50μlの反応はほぼ1ngのコスミドまたはラムダ鋳型と共に50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH8.3）、1.5mMのMgCl2、150nMの各プライマー、200nMの各dNTPおよび2.5UのAmplitaq（PE  Biosystems）を含んだ。次いで、反応を以下のごとくサイクルする：95℃3分、30サイクルの（94℃1分、60℃1分、72℃1分50秒）、続いての72℃における10分。PCRはABI2400またはABI9600サーモサイクラー（PE  Biosystems）で行なう。
【００８４】
polでは、以下のプライマーを用いる：pol  F（5’−GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGGTGCCACAGGGCAAC−3’）およびpol  R（5’−GACCATTGTCTGACCCGATTA−3’）。50μlの反応はほぼ1ngのコスミドまたはラムダ鋳型と共に50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH8.3）、1.5mMのMgCl2、150nMの各プライマー、200nMの各dNTPおよび2.5UのAmplitaq（PE  Biosystems）を含んだ。次いで、反応は以下のごとくサイクルする：95℃3分、続いての30サイクルの（95℃40秒、58℃30秒、72℃3分）、および最終の72℃10分の浸漬。
【００８５】
envでは、以下のプライマーを用いた：env  F（5’−GGATCCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGCATCCCACGTTAAGCCG−3’）およびenv  R（5’−CGCTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGAACTGGGAAGGGTAGAGGTCAGT−3’）50μlの反応はgag（前記）につき記載したのと同一条件下で行い、次いで、以下のごとくサイクルする：90℃3分、30サイクルの（94℃1分、62℃1分、72℃2分10秒）、続いての72℃における10分。
【００８６】
gag、polおよびenvにつき示した順方向プライマー配列は、それらがT7  RNAポリメラーゼプロモーター配列を含み、従って、gagおよびenvにつきほぼ予測される産物サイズを与えるクローンからのPCR産物をPTTによってさらに分析することができるように、修飾した。加えて、env逆方向プライマーは停止コドンを除去し、イン‐フレームHAエピートープタグを挿入し、HAタグに対するウェスタンブロッティングによる全長産物の検出を可能とする。
【００８７】
オープンリーディングプレームについての蛋白質切形テストは、ビオチニル化‐リシンtRNAを用いる非−放射能検出と共に、ウサギ網赤血球溶解物（PCR用のTNT  T7  Rapid，Promega）におけるカップルド転写−翻訳を用いて行なう。各25μl反応は：2.5μlの未精製PCR産物、1μlを超えるtRNA（Promega）、20μlのTNT  T7  PCR  Quick  マスターミックス（Promaga）を含み、20μMのメチオニンを補足したものであった。反応を30℃にて90分間インキュベートし、2μlを4ないし12％のNuPAGE  Bis−Trisゲル上のSDS−PAGE（Novex／Invitrogen）に付す。ゲルをHybond  ECL膜（Amersham  Pharmacia  Biotech）に半乾燥ブロットする。ストレプトアジビン／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（1／3750希釈，  Roche）でブロットし、続いてECL検出（Amersham  Pharmacia  Biotech）を行なうことによって、ビオチニル化翻訳産物を検出する。公知の配列の翻訳されたgagまたはenvプラスミドクローン、およびビオチニル化蛋白質分子量マーカー（Roche）を参照することによって、産物のサイズを評価する。高親和性ラット抗−HA抗血清（1／500，  Roche）、および二次ヒツジ抗―ラットHRPコンジュゲート（1／10000、Sigma）でブロットし、続いてECL検出することによって、HAエピトープタグド産物を検出する。
【００８８】
コスミドおよびラムダクローンの配列決定分析
次いで、方法の組合せによって、全長gagおよびenv翻訳産物と共に、全長gag、polおよびenv遺伝子を有するものとして同定されたクローンを配列決定する。コスミドDNAおよびPCR産物は、ABI373（Applied  Biosystems）でのABI  PRISM  Dyeターミネーターサイクル配列決定を用いて直接的に配列決定し、配列決定に先立って、いくつかのPCR産物をpCR2.1（Invitrogen）にサブクローン化する。LICOR  4000  DNAシーケンサー（MWG  Biotech）を用いて以下のごとくラムダクローンを直接的に配列決定する：製造業者の指示に従い、Thermoセクエナーゼ蛍光標識配列決定キット（Amersham）を用い、800ngのラムダDNAを調製する。ラムダDNAを配列決定するのに用いるプライマーは以下の表に記載する。
【００８９】
陰性コスミドクローンの分析
加えて、SmaI消化したコスミドDNAのサザーンブロットを、プライマー結合部位（PBS）5’−ビオチンGCCTTTCATTTGGTGCGTTGGCCGGGAAATCCTCGCGACCACCCCTTACAC−3’（nt661−711，  受託番号AJ133817）の周りの領域およびenv5’−ビオチン−ACTGACCTCTAGCCTTCCCAGTTCTAAGATTAGAACTATTAACAAGACAA−3’（nt8121−8171，  受託番号AJ133817）の3’−末端に相同なビオチン標識オリゴヌクレオチドでプローブする。これらのプローブは初期ライブラリースクリーニングで用いるプローブ配列に対して、およびgagおよびenv  PCRプライマーセットに対して外部である。サザーンブロットしたDNAを40℃にて6時間プレハイブリダイズさせ、次いで、40℃にて緩衝液中の27nMのビオチン標識プローブオリゴと一晩ハイブリダイズさせた。次いで、ブロットを42℃にて1×SSC、0.1％SDS中で3回の30分間洗浄し、次いで、ストレプトアジビン‐西洋ワワビペルオキシダーゼコンジュゲートで現像し、前記PTTについて記載したごとくECL検出した。全ての公知のPERVにおけるこれらの領域について観察された配列保存のため、これらのオリゴに結合しない変種は欠失したプロウイルスを示すであろうと推定される。
【００９０】
プロウイルスフランキング配列分析
プロウイルスフランキング配列は、PERV  LTR中のプライマーおよび平滑末端切断DNAに連結されたリンカー中のプライマーの間のリンカー媒介PCRによって生じる。この戦略には、二重にアダプター連結された断片の望ましくない増幅を減少させる抑制効果が取り込まれる（Siebertら，1995）。7μlの反応中の10UのT4  DNAリガーゼ（Life  Technologies）を用い、0.5μgのPvuII消化コスミドまたはラムダDNAを60pmolのdsアダプターを、15℃にて16ないし48時間で連結させる。アダプターは、アニールされた上方ストランドオリゴ（5’−GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT−3’）および3’−アミンブロックした下方ストランドオリゴ（5’−ACCAGCCC−NH2−3’）よりなる。この反応の1マイクロリットルの1：100希釈を、50mMのKCl、10mMのトリス‐HCl（pH  8.3）、1.5mMのMgCl2、50nMのLTR特異的プライマー、50nMのアダプタープライマー（5’−GTAATACGACTCACTATAGGGC−3’）、200nMの各dNPTおよび2.5UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する25μlのPCR反応で鋳型として用いる。反応を以下の通りサイクルする：94℃9分、続いての30サイクルの（94℃、30秒；58℃30秒；72℃4分）；および10分間の72℃。LTR特異的プライマーを、全ての公知のPERV変種の間で保存されたU5領域で用い；プライマーLTR−5’（5’−GTGAACCCCATAAAAGCTGTC−3’）を用いて5’−フランキング配列を単離し、他方、プライマーLTR−3’（5’−GACAGCTTTTATGGGGTTCAC−3’）を用いて3’−フランキング配列を単離する。
【００９１】
2つのPCR産物は、通常、各反応のために製造され、LTR−内部プロウイルス配列、およびLTR−フランキングDNA配列を表す。双方の産物を直接的に配列決定するか、またはQiaquick  Gel  Extractionキット（Qiagen）を用いてゲル精製し、pCR2.1−TOPO（Invitrogen）にクローン化し、次いで、配列決定する。
【００９２】
実施例3：  Large  WHite  hDAFブタ群れ内のPERV罹患率についてのスクリーニング
テストブタがそれから選択される群れは近い遺伝的群れであった。30匹の動物を選択して同胞および密接に関連する動物を排除し、できる限り多くの先祖（異なる親および祖父母）を含める。家系についての動物のこの選択は、血統による共通の属性を最小化するにつれ、動物のランダムな選択と比較して、テストした可変遺伝子型の数を増加させる。標準的なプロテイナーゼK／フェノール／クロロホルム方法（Sambrookら1989）または製造業者のプロトコルに従ってQiagen  Genomicチップ（Qiagen）を用いるかのいずれかにより、DNAをブタから単離する。前記したフランキングPCRから生じた配列に基づき、PERV  LTRおよび隣接フランキングDNAの間で増幅し、ユニークに各プロウイルスを同定するPCR産物を生じるプライマー対を設計する。プロウイルスが元来それから同定されるラムダまたはコスミドクローンでの陽性対照PCRを用いてプライマーの特異性を確認する。陽性としてスコアを取るために、ブタゲノムDNAに由来するPCR産物は陽性対照産物と同一のサイズを有しなければならない。各試料につきβ―グロビンPCRを行なって、各々150nMのプライマーβ‐グロビンF1（5’−GCAGATTCCCAAACCTTCGCAGAG−3’）およびβ―グロビンR1（5’−TCTGCCCAAGTCCTAAATGTGCGT−3’）、50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH8.3）、1.5mMのMgCl2、200nMの各dNTPおよび1.25UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する50μlの反応中の約35ngの鋳型DNAを用い、該DNAが増幅に適していることを確認する。反応は以下の通りにサイクルする：95℃9分、30サイクルの95℃30秒、58℃30秒、72℃30秒、続いて72℃における7分。
【００９３】
コスミド78プロウイルスでは、各反応は、各300nMのプライマー78ltrs（5’−GAA  CCC  CAT  AAA  AGC  TGT  CC−3’）および78ltras（5’−GAT  CCC  ATG  TTG  GGT  GCA  TTT−3’）、50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH  8.3）、1.5mMのMgCl2、200nMの各dNTP、および2UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する50μlの反応中で約60ngの鋳型DNAを用いた。反応は以下の通りにサイクルする：94℃9分、続いての35サイクルの94℃30秒、54℃30秒、72℃30秒、および最終の72℃における10分（予測された産物のサイズは配列分析に基づいて323bpである。
【００９４】
後記する全ての残りのプライマーセットについての反応条件は以下の通りである：50mMのKCl、10mMのTris−HCl（pH  8.3）、1.5mMのMgCl2、150nMの各プライマー、200nMの各dNTPおよび1.25UのAmplitaq  Gold（PE  Biosystems）を含有する50μlの反応中の約20ngの鋳型DNA。
【００９５】
用いたプライマーセットおよびサイクルパラメーターは以下の通りである：
以下のサイクルパラメーター：95℃9分、35サイクルの94℃1分、58℃の1分、72℃2分、続いての72℃における10分下の、プロウイルス35121i：プライマーFLPR3（5’−CATGACGGCAACTCCTGAAG−3’およびrevltr1（5’−GTG  AAC  CCC  ATA  AAA  GCT  GTC−3’）。予測された産物のサイズは配列分析に基づき455bpである。
【００９６】
以下のサイクルパラメーター：95℃9分、35サイクルの94℃1分、58℃1分、72℃2分、続いての72℃における10分下の、プロウイルス21321：プライマー21f2（5’−GGTCTGTGACCTACTCCATA−3’）およびlpr1（5’−GAC  AGC  TTT  TAT  GGG  GTT  CAC−3’）。予測される産物のサイズは配列分析に基づき518bpである。
【００９７】
以下のサイクルパラメーター：95℃9分、40サイクルの94℃1分、56℃1分、72℃2分、続いての72℃における10分下の、プロウイルス73414i：プライマー73−4r−3（5’−GTCATGCCGTTCATTTGGGA−3’）およびrevltr1。予測される産物のサイズは配列分析に基づいて388bpである。
【００９８】
72414iと同一のサイクルパラメータ下の、プロウイルス73414ii：プライマー73−3f−3（5’−AGCAACAGAATTGAAGTCAG−3’）およびrevltr1。予測される産物のサイズは配列分析に基づき438bpである。
【００９９】
以下のサイクルパラメーター：95℃9分、35℃サイクルの94℃1分、56℃1分、72℃2分、続いての72℃における10分下の、プロウイルス310518−5’：プライマー31f8（5’−GGATGGAGACTATGCTCAGC−3’）およびltr1。予測される産物のサイズは配列分析に基づき1641bpである。
【０１００】
310518−5’と同一サイクルパラメーター下の、プロウイルス310518−3’：プライマー31f2（5’−AACTCATGATAAATGAAACACC−3’）およびrevltr1。予測される産物のサイズは配列分析に基づき815bpである。
【０１０１】
gagおよびenv配列双方を含むプロウイルスの単離
コスミドライブラリーを、PERV  A  envについて、ならびにラムダライブラリーを前記のようにPERV  B  envおよびPERV  gagについてスクリーニングする。双方のライブラリーはenv陽性体よりも多くのgag陽性コロニーを生じ、これは、部分的には、gagプローブ、およびコスミドライブラリーの場合には、より大きなサイズの用いるgagプローブの非−PERVサブタイプの選択性を反映する。84のクローンが、共にgagおよびevn  A陽性であるとしてコスミドライブラリーから同定され、その内78が回収される。これらの78のクローンのうち4つは配列分析でインサートを有さず、合計74のgagおよびenv陽性クローンを与え、これはさらなるラウンドのスクリーニングを介して均一に精製される。ラムダライブラリーより、40のプラークが最初に単離され、その内4つは第2ラウンドのスクリーニングでgagおよびenv  B陽性ではなく、これを捨てる。残りの36の陽性プラークを均一に精製する。各初期プラークに由来する複数クローンを分析して、インサートのいずれの不安定性も結果に影響しないことを確実とする。
【０１０２】
次いで、制限断片消化によって二重に陽性なコスミドクローンを分析して、それらの同一制限断片パターンによって複製クローンを同定する。制限断片パターン分析により54はユニークであり、24は他のクローンの複製である。ユニークなクローンについての結果のみを後に記載する。ラムダ調製物からのDNAの収率がコスミドクローンについてよりもかなり低くなるに従い、ラムダクローンを前記したgagおよびenvプローブを用いるサザーンブロット分析にも付す。というのは、数は相対的に小さく、全てのラムダクローンがさらに分析されるからである。サザーンブロッティングは、PERV  bクローンの大部分が公表されたPERV  B配列に関してEcoRI  RFLPを有したことを示す。配列決定は、これがgag遺伝子における単一のサイレントな塩基変化であることを示し、新規なEcoRI部位を導入する。
【０１０３】
次いで、各ユニークなクローンをさらなる分析に付す。同一RFLPパターンを持つ2以上のコスミドクローンがある場合、各々の2以上の代表を分析して結果を確認する。もしクローンが、公表されたPERV配列に基づいて無傷ORFで予測される概ねのサイズのPCR産物を与えたならば、PCRの結果は陽性であるとみなされる。
【０１０４】
gag  PCRは、PERV  AでスクリーニングしたコスミドライブラリーおよびPERV  Bでスクリーニングしたラムダライブラリーとの間の主な差を示す。32／34のラムダクローンがgag  PCR産物を与えたのに対し、13／54コスミドクローンのみがgag  PCR産物を与えた。コスミドMCSからの配列決定は、これが、いくつかの場合におけるenv遺伝子でのクローニング欠失によって引き起こされたことを示す。しかしながら、gag  PCR産物を与えないクローンの大部分については、MCSに隣接する配列はPERV配列ではなく、これはクローニング欠失が起こっていないことを示す。内部欠失を持つプロウイルスを表す予測されたよりも大きいgag産物がいずれのライブラリーからも検出される。コスミドクローンについての見掛け上全長のgag遺伝子の蛋白質切形テストは、8／13クローンが無傷gagオープンリーディングフレームを有し、1／15が切形ORFを有することを示し、他方、4／13クローンは、それらが切形env遺伝子に基づく分析からすでに排除されていたのでテストしない。対照的に11／32ラムダクローンのみが無傷gagORFを有し、20／34は切形gagORFを有する。1／32は、それが以前に欠陥があることが判明しているのでPTTによって分析しない。
【０１０５】
プロトタイプPERV配列AF038600との配列アラインメントに基づき、pol  PCRプライマーは約2.7kb産物を増幅するように設計される。16／54コスミドクローンはpol  PCR産物を与える。より小さな約720bp産物はいくつかのコスミドから増幅され、これは、コスミド5からの唯一の産物である。この産物の配列決定は、2つの内部欠失を持つAF038600（PERV  Cクローン）のPERV  pol遺伝子に対して3つの領域にわたり＞96％相同性を示す。塩基2496、次いで欠失に対するAF038600の塩基2307におけるpol開始ATGコドンからの相同性、塩基3721−4051、次いで欠失からの相同性、および塩基5070におけるPCR産物の末端に対する塩基4872からの相同性があり、これは、718bpの配列決定された産物サイズを与える。この小さな産物は機能的pol蛋白質をコードせず、そのようなPCR産物を与えるクローンは欠陥があるとみなされる。また、いくつかのクローンは予測される3.8kb産物よりも大きなものを与える。該3.8kb産物は機能的pol蛋白質を潜在的にコードするが、これはさらには調べない。というのは、gagおよびenvについての結果は、この産物が少なくとも1つの他の遺伝子において欠陥があることを示したからである。示すごとく、数個のコスミドは予測された全長産物、および718bpの欠失された産物双方を与える。これらの場合、2以上のプロウイルスまたはプロウイルス断片があるという約40kbコスミドインサートについての可能性のため、より大きな断片は、コスミドクローンに対するもう1つのプロウイルスよりはむしろ実験中のプロウイルスに関連すると推定される。Pol  PCRに付された18のラムダクローンの内、1つのみが予測された2.7kb産物を与えなかった。クローンの残りは、以前、gagまたはenvにおいて欠けていると同定され、テストしなかった。これらのより大きな産物においてORFを探すための蛋白質切形テストを用いる試みは、ウサギ網赤血球溶解物または小麦胚芽溶解物双方を用いるある範囲の実験下で翻訳産物を生じなかった。かくして、PTTはpol遺伝子では行なわない。
【０１０６】
env  PCRでは、18／54コスミドクローンは約2kbにおいてORFの予測されたサイズのPCR産物を与え、35／54はPCR産物を与えず、1つをテストした。ラムダライブラリーから、31／34は全長産物を与え、3／34は産物を与えない。env内部欠失を表すより小さな産物は同定されない。PTTをPCR産物で行なう。2／18コスミドクローンのみが翻訳産物を与え、これは前記したごとくカルボキシ末端エピトープタギングPTTによって確認される。16／18は切形された非機能的env翻訳産物を与える。全長gag産物も与える唯一のクローンの配列分析により、これは、事実、PERV  bクローンであることが明らかにされた。多数の他のクローンの配列分析は、それらが予測されたごとくPERV  Aであることを示す。対照的に、PERV  Bクローンの13／31がPTTにつき全長env翻訳産物を与え、10／31は切形された産物を与え、他方、8つは既にgag欠陥であることが観察されているので分析しない。
【０１０７】
クローンはプライマーの1以上のセットによって増幅可能であるが、他のORFの1以上についての産物を与えない場合、残りのプロウイルス配列は欠陥があると推測され、分析はさらには継続しない。これらの基準によって、コスミドライブラリーから無傷PERVaクローンは同定されず：54のユニークなクローンのうち、1つのみが、適当なサイズのpol  PCR産物と一緒に、gagおよびenvについての全長PTT産物を与える。このクローン、コスミド78の配列分析は、それがPERV  Bであることを示す。ラムダライブラリーから、6つのPERV  Bクローンが潜在的に全長クローン21321、2441、35121、310518、65321および73414であると同定される。これらの7つのクローンの分析は後記するごとくさらに継続する。
【０１０８】
単離された多数のgagおよびenv陽性コスミドクローンはgag、porまたはenvプライマーセットで増幅されない。これらが公表されたPERVプロウイルスについての主な配列変種を表し、よって、用いられるPCRプライマーによって増幅されない可能性を排除するために、これらを2つの方法でさらに分析する。クローニング部位からインサートへと配列決定して、プロウイルスがクローニングプロセスの間に切形されているかを検出する。さらに、Smalで消化されたコスミドDNAのサザーンブロットを、プライマー結合部位（PBS）およびenv  LTR接合のまわりの領域に相同なビオチン標識オリゴヌクレオチドでプローブする。全ての公知のPERV変種におけるこれらの領域について見られる配列保存性により、これらのオリゴに結合しないことは大きく欠失されたプロウイルスを示すであろうと推測される。これらのクローンのほとんどはこれらのプローブのいずれによってもシグナルを示さず、それらは両末端で欠失されていることを示す。残りは一方の末端または他方の末端いずれかで欠失されている。コスミドクローン74は、プライマー結合部位およびenv−LTR双方についてのシグナルを示す。
【０１０９】
フランキング配列およびプロウイルス罹患率の分析
配列データは、前記したリンカー−媒介PCR方法を用い、前記した各ユニークなクローン無傷クローン用のLTR−フランキングDNA接合について得られる。ほとんどのクローンでは、3’−フランク配列が得られ（コスミド78およびラムダクローン65321、2441、73414および35121）、ラムダクローン21321では、5’−フランク配列が得られ、310518では、3’および5’−フランキング配列が得られる。
【０１１０】
ラムダクローン75321、2441および310518は共通のフランキング配列を与え、それらが単一プロウイルスを表したことが確認される。ラムダクローン73414および35121は共に2つの異なるLTR−3’−フランク配列（73414iおよび73414ii、35121iおよび35121iiと呼ばれる）を与え、73414iiおよび35121iiは同一であり、他方、他の配列は類似性を示さず、ラムダクローンが連続しており、3つの縦列配列したプロウイルス／プロウイルスの残りを含むことが示される。コスミド78の3’−フランク配列はこれらのいずれとも同一ではない。
【０１１１】
得られた5’−フランク配列から、クローン21321および310518は異なるが、5’−フランク配列は他のクローンにつき得られないので、21321が73414／35121グループ、またはコスミド78と同一のプロウイルスであると判断することは不可能である。しかしながら、以下に得られるブタにおける罹患率のパターンは35121および21321で同一であるが、それらが異なるプロウイルスを表すことを確認するEnvにおける多数のヌクレオチドおよびアミノ酸に差がある。
【０１１２】
これらのユニークなLTR−フランキングDNA接合配列の各々につきプライマー対を設計して、プロウイルスの各々の存在につき30の無関係ブタを分析する。全ての試料が広く同等な産物収率を与えた場合、PCR増幅についてのDNAの適当性を、ブタβ−グロビンプライマーを用いて確認する。PERV−コスミド78プロウイルスは6／30ブタで存在し、24／30ブタはこのプロウイルスに対して陰性であった。3／30ブタ（G579，H744，H440）は強力に陽性であり、他方、3／30はより低い産物収率を与える（H522，G768，H338）。プロウイルス73414iは3／30ブタに存在し、他方、プロウイルス73414iiは30／30ブタに存在する。プロウイルス35121iは24／30ブタに存在する。より小さな約200bp断片はラムダクローン35121から生じ、これは、ブタPCR反応のいくつかにおいても目に見える陽性対照である。これはアッセイに干渉しなかったので、それは無視され、配列決定してその起源を決定しない。プロウイルス310518では、独立したPCRを5’−および3’−フランクについて行なう。これらは29／30ブタで合致した結果を与え、23／30ブタはプロウイルスで陽性であり、6／30は陰性である。ブタH539は3’−LTR−フランク接合につき陽性であり、5’−LTR−フランク接合につき陰性であり、かくして、曖昧な結果を与える。プロウイルス21321は24／30ブタに存在する。
【０１１３】
配列分析およびトランスフェクション分析
Env
全てのプロウイルスのenv遺伝子の配列決定により、全長Env  ORFの存在が確認され、これは、PTTの結果を確認する。プロウイルスenvと公表されたPERV配列の比較は、ヌクレオチドおよびアミノ酸双方のレベルにおいて、公表されたPERV  B配列Y12239との高度な相同性（＞99％）を示す。単一配列標識2441はクローン65321、2441および310518env配列から得られたコンセンサス配列である。ラムダクローン73414および310518からのenvの配列決定は、これらのクローンに存在する2つの異なる3’−LTRにかかわらず、各々単一のenvコンセンサス配列のみを与える。
【０１１４】
蛋白質の中央にある受容体相互作用VRAおよびVRB領域はプロトタイプ配列からの変動を示さないが、env遺伝子の間には少数の多形があり、これによりそれらが異なるプロウイルスを表すことを確認された。
【０１１５】
PTTおよび配列決定によって確認されるごとく、全てのクローンは全ての3つのオープンリーディングフレームにおいて無傷である。公表されたPERV変種との相同性の配列分析は、それらの間で予測された高いレベルの相同性を示した。
【０１１６】
コスミドクローンの要約
gagおよびenvに対して陽性のコスミドクローンについての全ての結果を以下に表にまとめる。クローンは最初のピッキングに応じて順次番号付けする。以下に示すクローンは、RFLPパターンの欄中の「U」によって示されるごとくユニークである。複製クローンが同一である場合、そのような複製物の数はこの欄に記載する。表にはないクローンの番号は第1ラウンドのスクリーニングから回収されなかったか、あるいは他のクローンの複製であった。正しいサイズの産物が得られた場合は、PCRの結果は＋として報告し、産物が得られなかった場合には、−として報告する。CDは、gag配列がクローニング欠失の結果としてベクター配列に隣接する、べクターアームからの配列決定に際して、もし陰性結果がenv遺伝子で得られた場合のみ、そのようなクローンを欠陥があるとして記録することを示す。クローン56の場合、該クローンは切形されているが、陰性PCR結果がpolおよびenvで得られており、これは、さらに分析しなかったのでクローニング欠失として記録する。加えて、polでは、＋単独は、予測されたサイズの産物が得られたことを意味し、1またはs付の＋は、各々、予測された産物の不存在下でより大きなまたはより小さな産物が観察されたことを意味する。PTT結果については、FLは、全長蛋白質が翻訳されたことを意味し、TPは、対照と比べて切形された蛋白質が産生されたことを意味する。env  HA  PTTでは、＋はシグナルが観察されたことを意味し（全長蛋白質の確認）、−はシグナルが観察されなかったことを意味する（切形された蛋白質の確認）。
【０１１７】
「欠陥？」の欄においては、欠陥クローンは「yes」、続いてのそれらが欠陥である理由によって示す。産物がgag、polまたはenvいずれかにつき得られた場合、該クローンはいずれかの遺伝子において欠陥があると記載され、切形されたPTT産物、またはPCR産物を与えない遺伝子を生じる。gag、polまたはenvにつき産物が観察されない場合、PBSまたはenv−LTRプローブを用いるサザーンブロットからの結果を用いて、クローンが欠陥であることを確認した。
【０１１８】
【表１】
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【表２】
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【０１１９】
PERV  Bスクリーニングしたlarge  whiteブタラムダライブラリーから得られたgagおよびenv二重陽性クローンの分析のまとめ
欄および略語は、サザーンブロットデータの欄を除き、前記表と同一である。PERV  Bは、得られた制限パターンが公表されたPERV  BプロウイルスY17013と同一であることを示し、他方、PERV  B  Varは、観察された変種RFLPパターンがあることを示し、これは、プロウイルスの配列が公表されたデータからの変種であるか、プロウイルス配列のどこかが欠失されていることを示す。元のプラークからピックアップした複数プラークのそれぞれを分析し、示したクローンIDは、最も詳細に分析し、最も欠陥が少ないクローンの番号である。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
gagおよびenv陽性であって、gag、polまたはenvについてのPCR産物を与えなかったコスミドクローンの分析
コスミドDNAをSmaIで消化し、電気泳動に付し、サザーンブロッティングに付した。ブロットをPBS−gagまたはenv−LTRいずれかに対するビオチン標識プローブでプローブし、続いて、ストレプトアビジン−HRPコンジュゲートでプローブを検出し、前記したごとくECL検出を行った。＞6.0kbは、産物が用いた最大マーカーよりも大きく、よって、サイズは正確に決定できなかったことを意味する。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
記載したリンカー−媒介PCR方法によって、フランキング配列は全てのクローンにつき得られる。ほとんどのクローンでは、3’−フランク配列が得られ（コスミド78およびラムダクローン65321、2441、73414および35121）、ラムダクローン21321では、5’−フランク配列が得られ、310518では、3’および5’−フランキング配列双方が得られる。
【０１２４】
ラムダクローン65321、2441および310518は共通のフランキング配列を与え、それらは単一のプロウイルスを表したことが確認される。ラムダクローン73414および35121は共に2つの異なるLTR−3’−フランク配列（73414iおよび734141ii、35121iおよび35121iiと呼ぶ）を与え、73414iiおよび35121iiは同一であり、他方、他の配列は類似性を示さず、ラムダクローンが連続しており、3つの縦列配置されたプロウイルス／プロウイルスの残りを含むことを示す。コスミド78の3’−フランク配列はこれらのいずれとも同一ではない。
【０１２５】
得られた5’−フランク配列より、クローン21321および310518は異なる。env配列の差により、プロウイルス21321は他のクローンとは異なることが確認される。
【０１２６】
5つの無傷プロウイルスについての翻訳されたenv遺伝子の配列アラインメント
env遺伝子は記載したごとく配列決定し、翻訳された。配列アラインメントを行った。
【表５】
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【０１２７】
実施例4：PERVにおける遺伝子標的化
標的化戦略における最初の工程は、所望の遺伝子突然変異および選択されたポリヌクレオチドフランキング配列を含む標的化ベクターを創製することによって始まる。エレクトロポレーションによってこれを胚性幹細胞に導入する。ほとんどの細胞では、標的化ベクターはランダムに標的細胞ゲノムに挿入される。しかしながら、少数の細胞においては、標的化ベクター中の相同DNA配列は、標的細胞染色体DNA中の相同配列と対をなし、組換えられ、突然変異をゲノムに導入する。もしそのような遺伝子操作が標的化遺伝子の発現を妨げるように設計すれば、それは無効突然変異または完全ノックアウトと呼ばれる。点突然変異または欠失のごとき他の修飾を導入して、イン・サイチュにて遺伝子産物の異なるドメインおよびサブドメインを研究することができる。
【０１２８】
好ましくは、他方側に少なくとも2ないし3kbを持つ1kbの一方側の最小標的化アーム長さを用いる。2つの標的化アームがほぼ同一の長さになり得ない理由はない。より好ましくは、双方の標的化アームはサイズが約2kbである。実質的により長い標的化アームを用いるのにかなりの利点があろう；しかしながら、大きな構築体は操作するのがより困難である。各側の約2kbの標的化アームは1ないし2％の相同組換え効率を生じ、これはほとんどの目的に適する。
【０１２９】
源動物から、またはクローン化ゲノムDNAから由来するゲノムDNAを用いて標的化アームをPCRするのは可能である。少数のPCRのエラーは、効率的な相同組換えに対して（もしあっても）ほとんど問題を引き起こさない。PCRは、断片の末端が、Neoを含むベクターへの挿入用の操作を確実に容易とする。
【０１３０】
2つの選択マーカーが通常は標的化ベクターに導入されて、首尾良い相同組換えを受けた胚性幹細胞クローンの同定を可能とする。陽性選択マーカーは、相同または非相同組換えいずれかによって標的化ベクターを取り込んだ細胞の生存を促進する。陰性選択マーカーを用いて、相同組換えにより標的化ベクターを取り込んだ細胞を富化し、非相同的に標的化ベクターを取り込んだ細胞を排除する。陽性選択マーカー、典型的には、ネオマイシン−抵抗性遺伝子は、標的化すべき遺伝子のDNA配列に近接する。陰性選択マーカー、通常はチミジンキナーゼ遺伝子カセットを標的化ベクターの末端にクローン化する。相同組換えが起こると、ネオマイシンカセットと共に標的化遺伝子配列を含む領域が、染色体中の対応するヌクレオチド配列を置き換える。チミジンキナーゼ遺伝子は相同領域の外部にあるので、それは染色体に組み込まれず、最終的に分解される。しかしながら、もし標的化ベクター配列が非−相同組換えによって染色体に非特異的に組み込まれれば、チミジンキナーゼ遺伝子を含めた全ベクターを挿入することができる。
【０１３１】
ネオマイシンで処理した標的細胞は標的化べクターを取り込まないものを殺し、ガンシクロビルでの処理はチミジンキナーゼ遺伝子を保持したものを殺す。このように、相同組換えによって染色体に挿入された標的化配列を保有している細胞を選択することができる。標的化配列の適切な組み込みはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、またはゲノミックサザーンブロッティングによって確認される。遺伝子標的化では、選択された胚性幹細胞を拡大培養し、プレ−移植胚の胚盤胞腔に注入し、次いで、胚盤胞を偽妊娠母親の子宮に移す。得られた動物はキメラであり、標的化ドナー胚性幹細胞および宿主胚盤胞に由来する細胞よりなる。
【０１３２】
ブタにおける遺伝子標的化では、キメラ子孫を産生するためのブタ胚性幹細胞および胚盤胞注入の効果的な操作は困難である。核導入は遺伝子−標的化ブタ、例えば、PERV−陰性ブタを創製するための好ましい方法である。核導入ブタは完全に単一遺伝子的修飾細胞から由来するので、得られたブタは、胚細胞を含めた全ての細胞においてこの遺伝子修飾を保有しており、従って、キメラではないであろう。
【０１３３】
過去におけるほとんどの標的化構築体は＋／−選択を行なうのにNeoおよびHSV−TK双方を用いてきた。しかしながら、ES細胞のガンシクロビル処理はかなり毒性であり、ES細胞の場合には、それは、ES細胞が生殖系を作る能力に不利に影響しかねない。よって、相同組換えのより低い率を、しばしば、生殖系伝達の良好な率で交換する。いくつかの異なる種類のNeoカセットが入手可能である。PGK−Neo選択マーカーカセットが、CRE−レコンビナーゼによって除去して、PGK−Neoカセットの「隣接効果」に関する潜在的問題を回避できるように、Lox−P部位（後記参照）によって近接挟まれたNeoが好ましい。最近の成果は、この隣接効果がマルチジーンクラスターで非常に問題であることを示唆した（Phamら，PNAS 93：13090，1996；Hugら，MCB 16：2906，1996）。もし標的遺伝子がマルチジーンクラスター中にあることが知られていれば、保持されたNeoカセットの潜在的隣接効果を予測する必要があるであろう。
【０１３４】
相同組換え事象の検出
PCRを用いて相同組換え体を検出することができるが、それは推奨されない。標的化配列それ自体に対して外部にあるユニークなプローブを開発し、それを用いて、サザン分析を用いてスクリーニングするのが好ましい。このプローブが標的構築体から上流にあるかまたは下流にあるかは重要ではなく、それが完全に外部にあり、それが反復DNAエレメントを含まないことのみが重要である。このプローブを各細胞クローンのサザン分析と組み合わせて用いて、標的化事象が起こるか否かを判断すべきである。相同組換えバンドを規定するに加え、サザン分析により、PCRによって行なうのは困難な突然変異体バンドのモル濃度を評価することができる。基本的には、もし野生型および突然変異体のバンドが強度が等しくなければ、標的化クローンは野生型細胞で汚染されていることが疑われる。もし標的化バンドがサザーンで正しく見えるが、モル濃度が疑われれば、細胞をG−418において再度選択し、注目する細胞をサブクローン化する限界希釈によって再度平板培養さえするのが強く推奨される。
【０１３５】
以下の図は、1つのベクターアーム中の3’または5’ユニークPERVフランキングDNA配列を含むPERV遺伝子−標的化構築体および他のベクターアームを含むユニークでないPERVゲノム配列の例を示す。これらの構築体において、env遺伝子は5’−特異的構築体において破壊し、gag遺伝子は3’−特異的構築体で破壊する。しかしながら、これは設計を拘束するものではなく、かくして、PERVゲノムのいずれの領域を破壊してもよく、あるいは、適当な標的化構築体で欠失してもよい。
【０１３６】
5’または3’ユニークフランキングDNA配列いずれかの利用可能性に基づく挿入突然変異誘発によるPERVの「ノッキング−アウト」特異的コピーについての標的化構築体
【表６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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