(57)【要約】本発明は、インスリン指向性ペプチドエクセンジン−４の誘導体およびこれらから製造される医薬的に許容可能な塩に関連し、これらは、ＩＩ型糖尿病の処置に有用なものである。エクセンジン−４は、以下に示す化学構造を有する：【化５】2005502595.tif 000008ここで、ＸはＡｒｇ，ＬｅｕまたはＩｌｅを、ＹはＨｉｓ，ＡｒｇまたはＬｙｓを、ＺはＡｒｇ−ＯＨ，−ＯＨ，−ＮＨ2またはＬｙｓ−ＯＨを示す。本発明の誘導体は、合成の化学的手法により、およびより容易には、遺伝子組み換え技術により製造することができ、これは商業的生産を可能にするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の＜２１０＞１−＜２１０＞４に示されるアミノ酸配列を有する、インスリン指向性ペプチドの誘導体およびこれから製造される医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
固相合成による請求項１に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、固相担体としてＨＭＰ樹脂を用いること、アミノ酸のアルファアミンを９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護すること、インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従いペプチド合成装置で残基を合成すること、並びに分離、精製および凍結乾燥工程後に産物を得ること、を含む方法。
【請求項３】
遺伝子組み換え技術による請求項１に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、
ａ．インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い遺伝子フラグメントを合成すること、
ｂ．遺伝子フラグメントのライゲーション、組み換えプラスミドの構築、細菌細胞の培養、および組み換えプラスミドの形質転換の後に、クローニングされた細菌株を得ること、
ｃ．細菌株の発酵および細胞壁の破壊後に、封入体を抽出すること、
ｄ．封入対の溶解、粗産物の分離、ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥工程の後に、最終産物を得ること、
を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載のインスリン指向性ペプチド誘導体およびそれから製造される医薬的に許容可能な塩の、ＩＩ型糖尿病の処置への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＩ型糖尿病の処置に有用な活性なペプチド化合物に関する。特に、本発明は、インスリン指向性ペプチドエクセンジン−４の誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
同じ量のグルコースの経口投与が、注射よりもインスリンの分泌を刺激しうることが明らかにされてきた。その理由を探求する多くの研究により、インクレチンがこの現象に重要な役割を果たすことが確認された。
【０００３】
インクレチンはペプチド化合物群であり、これらの中で、強い阻害活性を有する胃抑制性ペプチド（ＧＩＰ）およびグルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）が１９８５年に開示された。ここで２種類のＧＬＰ−１が存在し、１つは３０アミノ酸残基から構成されるＧＬＰ−１（７−３６）アミドであり、もう１つは３１アミノ酸残基から構成されるＧＬＰ−１（７−３７）である。これら２つは、インスリンの分泌を刺激するという同様の活性を有している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて膵臓島細胞に作用するとき、１×１０-10〜１×１０-11ｍｏｌ／Ｌもの低い濃度のＧＬＰ−１でも、インスリンの分泌を刺激することができる。ＤＮＡおよびアミノ酸配列の分析により、これらのインスリン指向性ペプチドが、腸のタンパク質分解酵素の作用の下でグルカゴン前駆体「プログルカゴン」のタンパク質分解に由来することが明らかとなり、それゆえこれらはグルカゴン様ペプチドと呼ばれる。
【０００４】
ＧＬＰ−１の１つの特徴は、膵臓ベータ細胞を刺激してプロインスリンｍＲＮＡおよびプロインスリンを合成し、そしてインスリンを放出しうることである。膵臓ベータ細胞に対するＧＬＰ−１の作用は、グルコースの濃度に依存する。血液グルコース濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌより高い場合、ＧＬＰ−１は、インスリンの分泌を顕著に刺激し、その濃度が一旦正常濃度に回復すると、ＧＬＰ−１の刺激活性はもはや観察されなくなる。このような特徴は、ＩＩ型糖尿病の処置に非常に有用である。近年のＩＩ型糖尿病患者に対する臨床試験により、インスリンの分泌を刺激し、グルコース濃度を低下させるＧＬＰ−１の作用も確認された。
【０００５】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミドの化学構造は、以下に示される：
【化１】
2005502595.tif 000002
ここで、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ａｌａはアラニンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｇｌｙはグリシンを、Ｔｈｒはスレオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｓｅｒはセリンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｖａｌはバリンを、Ｔｙｒはチロシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、そしてＡｒｇはアルギニンを示す。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ９１／１１４５７は、ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７−３５、７−３６および７−３７の類似体を開示しており、これらはＩＩ型糖尿病の処置に有用であった。
【０００７】
メキシコドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍ）の毒液から分離されたペプチド化合物エクセンジン−４は、１９９６年のＲｅｇｕｌａｏｒｙ  ＰｅｐｔｉｄｅｓにＪｅａｎ−Ｐｉｅｒｒｅ  Ｒａｎｆｍａｎにより開示された。エクセンジン−４は、カルボキシル末端がアミド化された３９のアミノ酸残基から構成される。エクセンジン−４の化学構造は以下に示される：
【化２】
2005502595.tif 000003
ここで、Ｍｅｔはメチオニンを、Ａｓｎはアスパラギンを、そしてＰｒｏはプロリンを示す。
【０００８】
エクセンジン−４は、そのアミノ酸配列においてＧＬＰ−１と５３％の相同性を共有する。さらに、エクセンジン−４は、ＧＬＰ−１レセプターに結合して、インスリンの分泌を刺激する能力を有する。したがって、これは、インスリン指向性ペプチドと見なされる。
【０００９】
米国特許番号０５４２４２８６号は、インスリンの分泌の刺激作用について、エクセンジン−４とＧＬＰ−１との間で行ったいくつかの比較実験の結果を開示した。ＧＬＰ−１と比較すると、エクセンジン−４は、インスリンの分泌を刺激する強い能力を有し、このような刺激活性を示すために低い濃度しか必要としないことが示された。さらに、エクセンジン−４は、ＧＬＰ−１と比べｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長い半減期を有した。これらの特徴に照らして、エクセンジン−４は、ＩＩ型糖尿病を処置するための望ましい治療薬となりうる。
【００１０】
エクセンジン−４は、ペプチド合成装置により固相合成によるような、化学合成法により製造できるが、このような方法の高コストおよびそれによる販売価格により、エクセンジン−４は、市販に至っていない。それ故、市販のために、製造コストを削減するために遺伝子組み換え技術が試されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、インスリン指向性ペプチドエクセンジン−４のいくつかの誘導体を提供することに向けられる。このような誘導体は、インスリンの分泌を刺激し、血液グルコース濃度を低下させるのに役立つ。したがって、これらはＩＩ型糖尿病の処置に用いることができる。このような誘導体は、合成の化学手法により、およびより容易には、遺伝子組み換え技術により製造することができ、これは製造コストを削減することを可能とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、インスリン指向性ペプチドの誘導体およびこれらから製造される医薬的に許容可能な塩を提供する。前記インスリン指向性ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
2005502595.tif 000004
ここで、ＸはＡｒｇ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔを、ＹはＨｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓを、ＺはＡｒｇ−ＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2またはＬｙｓ−ＯＨを示し、そして、ＸがＭｅｔでＹがＡｒｇの時、ＺはＮＨ2ではない。
【００１３】
本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体は、特に配列表の＜２１０＞１−＜２１０＞４に表されるアミノ酸配列を有している。
【００１４】
本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体は、両性化合物であり、いずれかの多数の無機塩基、並びに無機および有機酸と反応して塩を形成するのに充分に酸性もしくは充分に塩基性でありうる。通常酸性付加塩を形成するために利用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等のような無機酸；ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−臭化フェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等のような有機酸である。このような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソブタン酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオン酸塩、ヘキシン−１，６−ジオン酸塩、安息香酸塩、塩化安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニルブタン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシブタン酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩、等が含まれる。好ましい酸付加塩は、塩酸および臭化水素酸、特に塩酸のような鉱酸と塩を形成するものである。
【００１５】
本発明の誘導体と反応させて塩を形成するために、アルカリを用いてもよい。このようなアルカリの代表例には、アンモニウム、アルカリ金属、アルカリ金属水酸化物、炭酸、および重炭酸が含まれる。典型的には、このようなアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウムおよび炭酸カルシウムが挙げられる。
【００１６】
本発明の１つの見地は、固相合成によるインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、固相担体としてＨＭＰ樹脂を用いること、アミノ酸のアルファアミンを９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護すること、インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従いペプチド合成装置で残基を合成すること、並びに分離、精製および凍結乾燥工程後に産物を得ること、を含む方法を提供する。
【００１７】
他の見地として、本発明は、遺伝子組み換え技術によるインスリン指向性ペプチド誘導体の製造方法であって、
ａ．インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い遺伝子フラグメントを合成すること、
ｂ．遺伝子フラグメントのライゲーション、組み換えプラスミドの構築、細菌細胞の培養、および組み換えプラスミドの形質転換の後に、クローニングされた細菌株を得ること、
ｃ．細菌株の発酵および細胞壁の破壊後に、封入体を抽出すること、
ｄ．封入対の溶解、粗産物の分離、ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥工程の後に、最終産物を得ること、
を含む、方法を提供する。
【００１８】
また他の見地として、本発明は、インスリン指向性ペプチド誘導体およびそれから製造される医薬的に許容可能な塩の、ＩＩ型糖尿病の処置への使用を提供する。
【００１９】
本発明は、ペプチド化合物エクセンジン−４の新規な誘導体を提供し、これは、エクセンジン−４誘導体の範囲を広げるものである。本発明の誘導体は、インスリンの分泌を刺激し、血液グルコース濃度を低下させる生物学的活性を有する。これらは、ＩＩ型真性糖尿病の処置に用いることができる。このような誘導体は、化学合成により、またより容易には、遺伝子組み換え技術により製造でき、これは製造コストを減少させることができる。さらに、このような誘導体の生物学的活性は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスによる薬力学研究により解明され、本発明の誘導体０．１μｇをマウスの腹部に注射した場合、インスリン指向性ペプチド誘導体は、インスリンの分泌を増加させ、また血液グルコース濃度を低下させる明らかな作用を示した。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例は、例示であり、いかなる手段においても本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１＞  ＸがＡｒｇ、ＹがＬｙｓ、Ｚが−ＯＨであるインスリン指向性ペプチド誘導体の、固相合成による製造
【００２１】
（１）アミノ酸モノマー：
【表１】
2005502595.tif 000005
ここで、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニルを、ＢＯＣはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを、Ｔｒｔはトリチルを、ＯｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルエステルを、ｔＢｕはｔｅｒｔ−ブチルを示す。
【００２２】
（２）装置および試薬：
装置：モデル４３３Ａペプチド合成装置（アプライドバイオシステム社、米国）
試薬：Ｎ−メチルケトピロリジン、塩化メチレン、ヘキサヒドロピリジン、メタノール、ジメチルアミノピリジン／ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／ＮＭＰ、１００ｍｍｏｌｅ  ＨＢＴＵ／ＤＭＦ中０．５Ｍ  ＨＯＢＴ、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド／ＮＭＰ
ここで、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、ＮＭＰはＮ−メチルピロリドンを、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−イル−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフロロホスフェート）を示す。
【００２３】
（３）工程
ａ．合成
例として０．２５スケールの合成を行い、以下に記載する合成工程とした。
０．２５ｇのＨＭＰ樹脂を秤量し、合成装置の反応容器に入れた。１ｍｍｏｌの種々の残基を、各々保護基を結合させて秤量し、カルボキシル末端からアミノ末端方向にインスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従い合成装置で配列させた。２５℃の室温で、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、残基を活性化させ、活性化した残基をＨＭＰ樹脂に結合させる反応を、コンピュータプログラムの制御下で自動的に行った。このような反応は、全ペプチドが合成されるまで繰り返された。合成の完了後、側鎖保護基が結合した各々の残基を有する残基結合樹脂を、ペプチド合成装置で空気乾燥させ、その後秤量した。
ｂ．保護基の除去および樹脂の分離
保護基が結合したインスリン指向性ペプチド誘導体の各々の残基を有する残基結合樹脂を、栓をしたエルレンマイヤーフラスコに入れ、その後以下に示す切断試薬を添加した。
【００２４】
【表２】
2005502595.tif 000006
３０℃の一定温度で６時間電磁石による撹拌反応を行った。ろ過工程の後、水溶性のろ液を採取した。樹脂を少量のトリフロロ酢酸で洗浄した。採取した水溶性のろ液および洗浄溶液を混合し、エーテルを加えて沈殿させた。混合物をろ過し、得られた沈殿を少量のエーテルで洗浄した。除湿装置による蒸発の後、粗産物を得た。
ｃ．ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥
粗産物の分離および精製を予備ＨＰＬＣを用いて行った。最終産物を、凍結および凍結乾燥工程の後に得た。産物の分子量をクロマトグラム−質量スペクトルの複合分析を用いて測定した。ペプチド誘導体は、理論分子量４３００．６に対して、４３１６．７の分子量を有することがわかった。
【００２５】
＜実施例２＞  ＸがＬｅｕ、ＹがＬｙｓ、ＺがＡｒｇ−ＯＨであるインスリン指向性ペプチド誘導体の、遺伝子組み換え技術による製造
【００２６】
Ａ．インスリン指向性ペプチド誘導体のアミノ酸配列に従った遺伝子フラグメントの合成
【化４】
2005502595.tif 000007
【００２７】
Ｂ．クローニング
ライゲーション：
２つの試験管を用意し、Ａ260nm＝０．１（２６０ｎｍにおける光学密度）のフラグメント（１）およびフラグメント（４）を１つの試験管に入れ、一方、同じ光学密度のフラグメント（２）およびフラグメント（３）をもう一方の試験管に入れた。そして、ポリヌクレオチドキナーゼバッファー、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを２つの試験管にそれぞれ添加した。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、遺伝子フラグメントの５’末端をリン酸化した。その後、２つの試験管を９５℃の水浴に置き、１０分間インキュベートした。加温のための水浴をやめて、室温にて自然に冷却し、その工程の間にアニーリング反応を行った。Ｔ４リガーゼおよびＴ４リガーゼバッファーを２つの試験管にそれぞれ添加し、遺伝子フラグメントのライゲーションのために、混合物を１６℃にて一晩インキュベートした。
プラスミド：
Ｌａｃ、ＰLまたはＴａｃのようなプロモーターを含むプラスミドを試験管に入れ、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。消化したプラスミドをヒドロキシベンゼン：クロロホルム溶媒により抽出し、遠心分離により採取した。水相を残し、クロロホルム溶媒により３回洗浄した。遠心分離を続け、得られた水相をイソプロパノール溶媒で沈殿させ、その後遠心分離および空気乾燥工程を行った。
消化したプラスミドおよびライゲートしたフラグメントを混合した。Ｔ４リガーゼおよびリガーゼバッファーを混合物に添加した。ライゲーション反応を室温で３〜４時間行った。
宿主細菌細胞の培養：
Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３の細菌細胞をＬＢ液体培地（１０ｇのペプトン、５ｇの酵母抽出物および５ｇの塩化ナトリウムを含む１０００ｍｌのＬＢ液体培地）中で３７℃で４時間振盪しながらインキュベートした。細菌培養物を遠心分離した後、採取した細菌細胞を塩化カルシウム溶液で処理し、さらなる使用に備えて−４℃で保存した。
形質転換：
クローニングしたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＩＭ１０３宿主細胞に形質転換した。形質転換された細菌細胞を、氷浴中で３０分間インキュベートし、その後４２℃で２分間インキュベートした。細菌細胞をアンピシリン抗生物質を含む寒天プレートに広げ、３７℃で一晩インキュベートした。その後コロニー選択を行い、組み換えプラスミドを含むコロニーを陽性コロニーとして保持した。
【００２８】
Ｃ．発酵：
誘導体遺伝子を保持した組み換えプラスミドを含む選択コロニーを、ＬＢ液体培地中で振盪しながらインキュベートした。０．５ｍＭのイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）をタンパク質誘導のために添加した。細菌細胞を一晩インキュベートし、遠心分離により採取した。発現したタンパク質を、１２％のドデカンスルホン酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により同定した。
【００２９】
Ｄ．封入体
各々３００ｍｌの細菌培養物を含む１０個のビンを、上述した条件下で振盪しながらインキュベートした。タンパク質誘導工程の後、溶解液（１％塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７．５）およびリゾチームを添加した。細菌培養物を３０℃で３０分間インキュベートし、その後遠心分離した。採取した沈殿を封入体の抽出のために６Ｍグアニジン塩酸塩（Ｇｕ・ＨＣｌ）で処理した。遠心分離を続け、得られた上清を透析し、グアニジン塩酸塩を除去した。透析物を２０ｍＭリン酸バッファー（１％塩化ナトリウムおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む、ｐＨ７．５）で３回洗浄し、そして封入体を得た。
【００３０】
Ｅ．溶解
封入体を８Ｍカルバミド溶液に溶解した。塩酸を添加して５０ｍＭの濃度とした。臭化シアンを添加後、溶液を光を避けて窒素保護下で撹拌した。溶解反応を２時間行い、その後ＨＰＬＣ分析を行った。
【００３１】
Ｆ．精製
溶解反応の完了後、粗産物をセファデックスＧ−２５による分画クロマトグラフィーにより得、最終産物をＨＰＬＣ精製により得た。固相合成の結果と同様に、測定されたペプチド誘導体の分子量は、理論分子量に一致することが、質量分析により示された。
【００３２】
＜実施例３＞  薬力学研究
２時間絶食させた体重１７±２ｇの非肥満糖尿病マウス（ＮＯＤマウス）を用いて実験を行った。対照群１のマウスは２μｇのインスリンの腹部注射を受け、対照群２のマウスは４μｇのインスリンの腹部注射を受け、一方、試験群のものは、実施例１に記載されたように得られたインスリン指向性ペプチド誘導体の０．１μｇの腹部注射を受けた。
【００３３】
血液サンプルを異なる時間において採取した。血漿グルコース濃度を、血漿グルコース試験キット（健康省生物学製品上海研究所）を用いて測定した。結果を図に示す。インスリン指向性ペプチド誘導体の血液グルコースに対する低下作用が、非常に明白であることが観察できる。
【００３４】
＜実施例４＞  ＮＯＤマウスにおける血液グルコースに対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ20）およびエクセンジン−４（Ｌｅｕ14，Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の低下作用
試料および方法：
ＮＯＤマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。０．９％塩化ナトリウム溶液、エクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）およびエクセンジン−４（Ｌｅｕ14，Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）ペプチドを、アッセイに用いた。血漿グルコース試験キットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【００３５】
一晩絶食させたＮＯＤマウスを３つの郡に分けた。第１群のマウスには、４０％グルコースおよび１μｇのエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を含む２００μｌの溶液を腹部に注射した。第２群のマウスには、４０％グルコースおよび２μｇのエクセンジン−４（Ｌｅｕ14，Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を含む２００μｌの溶液を腹部に注射した。一方、第３群では、対象群として、マウスにグルコース溶液を腹部に注射した。
【００３６】
３０μｌの血液サンプルを、あらかじめヘパリンで処理されたメモリ付きキャピラリーを用いて後方眼窩腔から直ちに採取した。サンプルを３００μｌの生理食塩水に入れ、塩水と混合した。３０００ｒｐｍで遠心分離して赤血球を除去し、血清をグルコース測定のために保持した。異なる血液サンプルを３０分後、６０分後および１２０分後においてそれぞれ上述のように採取し、血清を分離した。３つの血漿サンプルのグルコース濃度を試験キットに記載された方法にしたがって測定し、血液グルコース濃度に対するＧＬＰ−１（７−３６）の低下作用を検出した。
【００３７】
図１に示すように、急激な増加の後、対照群の血液グルコース濃度は、徐々に正常濃度に戻る一方、試験群のグルコース濃度は、顕著な増加を示さずにすべての時間において正常濃度を維持していた。その理由は、エクセンジン−４誘導体の投与がインスリンの分泌を刺激し、それによりグルコース濃度の急激な変動を防止したものである。したがって、エクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）およびエクセンジン−４（Ｌｅｕ14，Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の血液グルコースに対する低下作用は、この実験結果によって支持される。
【００３８】
＜実施例５＞  インスリン分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用
試料および方法：
ＮＯＤマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。４０％グルコース溶液、０．９％塩化ナトリウム溶液およびエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を、実験に用いた。インスリンラジオイムノアッセイキットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【００３９】
ＮＯＤマウスを２つの群に分けた。５０μｌの血液サンプルを、あらかじめ１ｍｇ／ｍＬヘパリンで内壁をすすいで空気乾燥させたメモリ付きキャピラリーを用いて、眼の静脈叢から採取した。２つの群のマウスに、５μｇのエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を含む２００μｌの生理食塩水をそれぞれ腹部に注射し、この時を０分として記録した。異なる血液サンプルを、５分後、１０分後、２０分後および３０分後にそれぞれ上述のように採取した。採取後、各々の血液サンプルを、５０μｌの生理食塩水を含む遠心管に直ちに入れ、塩水と混合した。３０００ｒｐｍでの遠心分離により赤血球を除去した。異なるサンプルのインスリン濃度をラジオイムノアッセイキットに記載された方法にしたがって測定し、インスリン分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用を検出した。
【００４０】
図２に示すように、エクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の腹部注射は、インスリンの分泌を顕著に刺激することができる。
【００４１】
＜実施例６＞  Ｃ−ペプチド分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用
試料および方法：
健康なＣ57／ＢＬマウスは、中国科学院動物センター上海研究所から提供された。４０％グルコース溶液、０．９％塩化ナトリウム溶液およびエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を、実験に用いた。インスリンラジオイムノアッセイキットおよびＣ−ペプチドラジオイムノアッセイキットを健康省生物学製品上海研究所から購入した。
【００４２】
健康なＣ57／ＢＬマウスを２つの群に分けた。５０μｌの血液サンプルをあらかじめ１ｍｇ／ｍＬヘパリンで内壁をすすいで空気乾燥させたメモリ付きキャピラリーを用いて、眼の静脈叢から採取した。２つの群のマウスに、５μｇのエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）を含む２００μｌの生理食塩水をそれぞれ腹部に注射し、この時を０分として記録した。異なる血液サンプルを、５分後、１０分後、２０分後および３０分後にそれぞれ上述のように採取した。採取後、各々の血液サンプルを、５０μｌの生理食塩水を含む遠心管に直ちに入れ、塩水と混合した。３０００ｒｐｍでの遠心分離により赤血球を除去した。異なるサンプルのＣ−ペプチド濃度をラジオイムノアッセイキットに記載された方法にしたがって測定し、Ｃ−ペプチド分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用を検出した。
【００４３】
図３に示すように、エクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の腹部注射は、Ｃ−ペプチドの分泌を顕著に刺激することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
本発明は、以下の図面および実施例を参照することにより、さらに例示されることとなる。
【図１】図１は、本発明のインスリン指向性ペプチド誘導体についての薬力学研究の結果を示す。
【図２】図２は、実施例１で製造された産物の質量分析結果を示し、理論的な分子量４３００．６および測定された分子量４３１６．７を示す。
【図３】図３は、エクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ20）およびエクセンジン−４（Ｌｅｕ14，Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の血液グルコース低下作用の実験結果を模式的に示す。
【図４】図４は、インスリン分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用の実験結果を模式的に示す。
【図５】図５は、Ｃ−ペプチド分泌に対するエクセンジン−４（Ｌｙｓ20，Ａｒｇ40）の刺激作用の実験結果を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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