(57)【要約】分解時に光エネルギを生成することのできる化学ルミネセンスヘテロアリール置換ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタン化合物を提供する。これらの化学ルミネセンス化合物は一般式（Ｉ）：【化１】2005502688.tif 000008により表される。ヘテロアリール置換基Ｙは例えばピリジル基又はベンゾチアゾリル基であることができる。ヘテロアリール置換ベンゾチアゾール化合物は室温において実質的に安定である。ヘテロアリール置換ジオキセタン化合物を含むキット並びに試料中の１種以上の分析対象の存在を検出するためのこれらの化合物の使用方法も提供される。
2005502688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2005502688.tif 000007
（式中、Ｒは独立してジオキセタンのための安定化をもたらすいずれかの分枝鎖アルキル又はシクロアルキル基であるか、又は、両方のＲ基が一緒になってジオキセタン環にスピロ結合しているシクロアルキル又はポリシクロアルキル部分を形成し；各Ｒ基又はスピロ結合部分は未置換であるか、又は１個以上の電子吸引性基又は電子供与性基で置換されていてよく；Ｒ1は任意により１個以上のハロゲン原子で置換されていてよい炭素原子数１〜２０のアリール基又はアルキル基であり；Ｙはヘテロアリール基であり；Ｘは非酵素的化学又は酵素手段により除去することができる保護基である）で表される、
分解時に光エネルギを発生することができる１，２−ジオキセタン化合物。
【請求項２】
Ｘがホスフェート基であり、Ｒ1がメチル基であり、両方のＲ基が一緒になってスピロ結合アダマンチル基を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ヘテロアリール基Ｙが、ピリジル、ベンゾチオゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、チアゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、キノリニル及びピリミジニルからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ヘテロアリール基Ｙが、２−ピリジル、３−ピリジル及び４−ピリジルからなる群より選択されるピリジルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ヘテロアリール基Ｙが２−ベンゾチアゾリルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
ヘテロアリール基Ｙが、２−チアゾリル、４−チアゾリル及び５−チアゾリルからなる群より選択されるチアゾリルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ヘテロアリール基Ｙが、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル及び５−イソキサゾリルからなる群より選択されるイソキサゾリルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
ヘテロアリール基Ｙが、３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル及び５−イソチアゾリルからなる群より選択されるイソチアゾリルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
ヘテロアリール基が、１個以上の電子活性基で置換される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１に記載の１，２−ジオキセタン化合物と、
ジオキセタンの存在下にジオキセタンに分解を起こさせて化学ルミネセンス発光を発生させる物質とを含む、
試料中の分析対象の存在を検出するためのキット。
【請求項１１】
物質が酵素を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
ジオキセタンの分解により発生する化学ルミネセンス発光を増強する化学ルミネセンス増強剤を更に含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
化学ルミネセンス増強剤が第４オニウム重合体である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ジオキセタンの分解により発生する化学ルミネセンス発光を更に増強する増強添加剤を更に含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
請求項２に記載の１，２−ジオキセタン化合物と、
前記ジオキセタンの存在下に前記ジオキセタンに分解を起こさせて化学ルミネセンス発光を発生させる物質とを含む、
試料中の分析対象の存在を検出するためのキット。
【請求項１６】
請求項１に記載のジオキセタン化合物を試料に添加する工程であって、分析対象はジオキセタン化合物に分解を起こさせて光を発生させる、工程と、
試料をインキュベートする工程と、
光の存在について試料を検査する工程とを包含し、
光の存在が試料中の分析対象の存在を示し、光量が試料中の分析対象の量を示す、
試料中の分析対象の存在を検出するための方法。
【請求項１７】
発生した光を増強するために、試料に化学ルミネセンス増強剤を添加する工程を更に包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増強剤がオニウム第４重合体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
発生した光を更に増強するために試料に増強添加剤を添加する工程を更に包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
試料を検査する工程が、ＣＣＤカメラを用いて光を検出することを包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
分析対象が酵素を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
酵素が生物学的部分と複合体化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも２種の異なる化学ルミネセンス化合物を試料に添加する工程であって、その内少なくとも１種が請求項１に記載のジオキセタン化合物であり、化学ルミネセンス化合物の各々は分解により異なる波長の光を発するように構成され、分析対象の各々が相当する化学ルミネセンス化合物に分解を起こさせて特定の波長の光を発生させる、工程と、
試料をインキュベートする工程と、
光の存在について試料を検査する工程とを包含し、
特定の波長の光の存在が試料中の相当する分析対象の存在を示し、特定の波長の光の量が試料中の相当する分析対象の量を示す、
試料中の２種以上の分析対象の存在を検出するための方法。
【請求項２４】
試料に添加する少なくとも１種の化学ルミネセンス化合物が、置換基Ｙが３−ピリジルである請求項１に記載のジオキセタン化合物である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
試料に添加する第２化学ルミネセンス化合物が、可視スペクトルの青色部分の光を発する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
第２化学ルミネセンス化合物が約４７０ｎｍのλmaxを有する光を発する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヘテロアリール基Ｙが２−ベンゾオキサゾリルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項２８】
ヘテロアリール基Ｙが２−ベンゾフラニルである、請求項３に記載の化合物。
【請求項２９】
ヘテロアリール基Ｙが２−ベンゾチエニルである、請求項３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９８年７月２８日に出願された仮出願第６０／０９４，３３６号からの優先権を主張する、現在許可されている１９９９年７月２８日出願の米国特許出願第０９／３６２，０４７号の一部係属出願である。各出願の全体は参照により本発明に組み込まれる。
【０００２】
本発明は改善された化学ルミネセンス１，２−ジオキセタン化合物に関する。より詳しくは、本発明は酵素的に除去可能な不安定な基を含む改善された酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタン化合物に関する。このような不安定な基は、適切な酵素を添加して不安定な基が除去されるまで、分子が分解して光、即ち可視光又は適切な装置により検出可能な光を生成することを防止する。
【０００３】
１酵素分子は、数千個の酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタン分子から付随する不安定な基を、触媒周期を介して除去する過程に影響することができる。これは、化学切断剤の１分子が各ジオキセタン分子から付随する不安定な基を除去するために必要とされる化学的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタンの状況とは明らかに対照的である。
【０００４】
酵素的に切断可能な光生成１，２−ジオキセタン化合物は、通常、酵素的に切断される不安定な基が分子の残余部分に連結されるために使用されている結合が意図的に切断される前に、室温（約２５℃）においてジオキセタン化合物が自発的に分解するのを防止するのに寄与するジオキセタン環の３−炭素原子にスピロ結合しているアダマンチリデン基等の安定化基も含んでいる。Ｗｉｅｒｙｎｇａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１６９（１９７２）及びＭｃＣａｐｒａら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，９４４（１９７７）。即ちこれらの安定化基により、このようなジオキセタンは、使用時まで例外的に長時間に渡り、例えば約１２ヶ月から約１２年もに渡り、実質的に分解することなく約４℃〜約３０℃の温度範囲で保存できるようになる。
【０００５】
本発明は更に、当該分野で知られた免疫検定法、化学試験及び核酸プローブ試験におけるそのジオキセタン分子の組込み、及び、存在、量又は構造を決定すべき分析対象や化学的又は物理的物質が同定又は定量できるようにするための種々の微小分子、合成重合体、蛋白、核酸、触媒抗体等の分子構造又は微細構造を研究するための直接の化学的・物理的プローブとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００６】
１，２−ジオキセタンの化学ルミネセンス化合物としての使用は十分確立されている。これらの化合物は例えば種々の生物学的物質を検出するための超高感度の試験においてレポーター又は標識として使用されている。１，２−ジオキセタンを使用することにより、これらの試験は、迅速に、そして特異な条件や複雑な装置を用いることなく実施することができる。例えば米国特許第４，９３１，２２３号、４，９３１，５６９号、４，９５２，７０７号、４，９５６，４７７号、４，９７８，６１４号、５，０３２，３８１号、５，１４５，７７２号、５，２２０，００５号、５，２２５，５８４号、５，３２６，８８２号、５，３３０，９００号、５，３３６，５９６号、及び５，８７１，９３８号を参照することができる。上記した全ての参考文献は本明細書に組み込まれる。本出願と共通して譲渡されている他の特許も発行されており、そして他の出願も係争中である。これらと共に、特許文献の要件はジオキセタン環の炭素の１つにスピロ結合しているアダマンチル基等の典型的な多環基、及びジオキセタン環の残余の炭素に結合している他の部分（例えばアリール基）により安定化されている１，２−ジオキセタンに関する。この部分は典型的には電子感受性である。電子感受性の部分を脱保護することによりアニオン、一般的にはオキシアニオンが形成され、これは不安定で分解する。分解により、ジオキセタン中のＯ−Ｏ結合が破壊され、光子が発生する。この電子感受性の部分が結合しているものと同じ炭素原子はアルコキシ又は他の電子活性基を有してもよい。
【０００７】
市販されているこの種のジオキセタンの最初のものは３−（４−メトキシ−スピロ（１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ（３．３．１．１3,7）デカン）−４−イル）フェニルホスフェート、特に２ナトリウム塩、一般的にＡＭＰＰＤ（登録商標）として知られているものである。この化合物は本出願の譲渡先であるＴｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ並びにＬｕｍｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩにより市販されている。上記した化合物の卓越した性能はスピロ結合アダマンタン環上の選択的置換により得られる。例えば、いずれかの架橋部の炭素における電子活性種、例えば塩素による置換は、反応速度及びＳ/Ｎ比（signal to noise ratio）を改善することがわかっている。ＣＳＰＤ（登録商標）として市販されているＡＭＰＰＤ（登録商標）の塩素置換体はＴｒｏｐｉｘによっても広範に市販されている。アリール部分が電子活性置換基、例えば塩素を有する同様の構造の「第３世代」のジオキセタン化合物は更に改善された性能を示すことが判っている。ホスフェート部分を有するアリール基を有する１，２−ジオキセタンはＣＤＰ（登録商標）及びＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）として市販されており、共にＴｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃの商標である。
【０００８】
種々の物質が１，２−ジオキセタンの化学ルミネセンス発光を増強するために使用されている。これらの物質は一般的に化学ルミネセンス増強剤と称され、ポリ［ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）］（ＢＤＭＱ）及び他のヘテロ極性重合体等の重合性アンモニウム、ホスホニウム又はスルホニウム塩を包含する。
【０００９】
しかしながら、水溶液中及び化学ルミネセンス増強剤の存在下のＡＭＰＰＤ（登録商標）等の化学ルミネセンスジオキセタンは一定の発光特性に達するまで、最適時間よりも長くかかる。活性化学ルミネセンス種の半減期、即ち「ｔ1/2」は一定の安定した発光水準において最大化学ルミネセンス強度の半分を得るために必要な時間として定義される。この発光半減期は種々の環境におけるジオキセタンオキシアニオンの安定性の関数として変化する。例えば、ＢＤＭＱの存在下のｐＨ９．５の水溶液中２Ｘ１０-5Ｍを超える濃度におけるＡＭＰＰＤ（登録商標）の半減期は約７．５分であることがわかっている。ＢＤＭＱ非存在下の４Ｘ１０-3Ｍにおいては、ＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2は約３０〜６０分であることがわかっており、水溶液中２Ｘ１０-5ＭではＡＭＰＰＤ（登録商標）のｔ1/2は約２．５分であることがわかっている。
【００１０】
化学ルミネセンス強度は典型的には定常状態の発光速度を達成した後に測定される。統計学的には、約７ｔ1/2時間が定常状態の発光速度を達成するために必要である。化学ルミネセンス強度は定常状態速度達成前にも測定できるが、定常状態発光速度を達成する前に正確なデータを得ようとすれば精密に制御できる光計測装置を使用しなければならない。従って、酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタンをレポーター分子として使用する生物検定等の試験においては、可能な限り迅速に定常状態の発光速度を達成することが望ましい。
【００１１】
更にＢＤＭＱ等の化学ルミネセンス増強剤の存在下及び非存在下の両方における水性緩衝液中のＡＭＰＰＤ（登録商標）は望ましい程度を超えた熱的及び非酵素的に活性化された発光、即ち「ノイズ」を示す。このようなノイズは励起状態のアダマンタノン及びＡＭＰＰＤ（登録商標）分子の芳香族部分から誘導されたメチルｍ−オキシベンゾエートによる発光に起因している可能性がある。ＡＭＰＰＤ（登録商標）の測定ノイズ値は標準的な光計測器における暗電流より２桁高くなる場合がある。従ってこのノイズが検出水準を制約し、化学ルミネセンス試験において究極的な感度を実現する妨げとなっている。
【００１２】
更にまた、ＣＣＤ(charge coupled device)カメラのような化学ルミネセンス発光を検出するための種々の装置は緑及び赤の波長においてより高い検出感度を有する。ＡＭＰＰＤ（登録商標）及び関連のジオキセタンは典型的にはより短い波長（例えば青の波長）の可視スペクトルにおいて発光する。これまで重合体増強剤は可視スペクトルの緑又は赤側に発光の波長を「シフト」させるために使用されてきた。従って、検出感度を上げるためには可視スペクトルの緑部分に近い、又は赤側の波長で発光するジオキセタンを得ることが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って本発明の目的は、酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタンをレポーター分子として使用する試験、特に生物試験を実施するために必要な時間を低減することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、試験、特に生物試験においてレポーター分子として使用された場合に試験を終了するために必要な時間を低減する新規で改善された酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタンを提供することである。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、シグナルｖｓバックグラウンドの特性が改善されており、これにより改善された検出水準を与える、酵素系試験、特に生物試験のための基質として使用するための新規で改善された酵素的に切断可能な化学ルミネセンス１，２−ジオキセタンを提供することである。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、発光波長が緑及び赤側の波長にシフトしているジオキセタンを提供することである。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、これらの改善された酵素的に切断可能な１，２−ジオキセタンを合成する際に有用な新規な中間体を提供することである。
【００１８】
本発明の更に他の目的は、これらの酵素的に切断可能な１，２−ジオキセタン及びその中間体の調製方法を提供することである。
【００１９】
本発明の上記及び他の目的、並びに性質、範囲及び利用法は、以下の詳細な説明及び請求項から当業者が容易に知り得るものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の第１の局面によれば下記一般式の化学ルミネセンス化合物が提供される。
【００２１】
【化１】
2005502688.tif 000003
【００２２】
上記式における置換基Ｒの各々は独立してジオキセタンのための安定化をもたらす分枝鎖アルキル又はシクロアルキル基である。或いは、両方のＲが一緒になってジオキセタン環にスピロ結合しているシクロアルキル又はポリシクロアルキル部分を形成する。Ｒ基の各々又はスピロ結合した環状部分は未置換であるか、又はハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性有機基で置換されていてもよい。置換基Ｒ1は任意により１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１〜２０のアリール基又はアルキル基である。置換基Ｘは化学的又は酵素的手段により除去することができるいずれかの保護基である。本発明の好ましい実施形態によれば、Ｙが複素環芳香族部分（即ちヘテロアリール基）である。本発明の他の好ましい実施形態によれば、複素環芳香族部分Ｙは２−、３−又は４−ピリジル；２−ベンゾチアゾリル：２−ベンゾオキサゾリル；２−ベンゾフラニル；２−ベンゾチエニル；２−、４−又は５−チアゾリル；３−、４−、５−、６−又は７−キノリニル；３−、４−又は５−イソキサゾリル；３−、４−又は５−イソチアゾリル；又は２−、４−、５−又は６−ピリミジニルである。
【００２３】
本発明の第２の局面によれば、試料中の分析対象の存在を検出するためのキットが提供される。キットには上記した１，２−ジオキセタン化合物が含まれる。本発明のキットは更に、ジオキセタン化合物存在下にジオキセタン化合物に分解を起こさせて光を発生させる酵素等の物質を含むことができる。
【００２４】
本発明の第３の局面によれば、試料中の分析対象の存在を検出するための方法が提供される。方法は部分Ｘが分析対象により除去され得る試料に上記したジオキセタン化合物を添加する工程を包含する。方法は更に試料をインキュベートする工程、及び試料が発光したかどうかを調べる工程を包含する。発光の存在は物質の存在を示す。検出された光の量は試料中に存在する物質の量を決定するために使用できる。試料中の２種以上の分析対象の存在を同時に検出するための方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者等は本発明の好ましい実施形態の構造、合成及び使用を以下に記載する。
【００２６】
本発明によれば、下記式（I)：
【００２７】
【化２】
2005502688.tif 000004
【００２８】
を有する化学ルミネセンス化合物が提供される。
【００２９】
上記一般式（I）において、Ｒの各々は独立してジオキセタンのための安定化をもたらす分枝鎖アルキル又はシクロアルキル基である。或いは、両方のＲが一緒になってジオキセタン環にスピロ結合しているシクロアルキル又はポリシクロアルキル部分を形成する。Ｒ基の各々は置換又は未置換であってもよい。さらに、Ｒ基がスピロ結合環状部分を形成する場合は、スピロ結合環状部分は置換されているか、未置換であってよい。Ｒ基又はスピロ結合した環状部分は、例えばハロゲン原子、アルコキシ基又は電子吸引性有機基で置換されていてよい。置換基Ｒ1は任意により１個以上のハロゲン原子で置換されてもよい炭素原子数１〜２０のアリール基又はアルキル基である。本発明によればベンゾチアゾール部分の２−炭素上の置換基Ｙはヘテロアリール基である。ヘテロアリール基は電子活性基又は可溶化基で置換される。置換基Ｘは化学的又は酵素的手段により除去することができるいずれかの保護基である。
【００３０】
本発明の第２の局面によれば、下記式（II)：
【００３１】
【化３】
2005502688.tif 000005
【００３２】
を有する化学ルミネセンス化合物が提供される。
【００３３】
上記式（II)における置換基Ｘ及びＹは式（I)に関して上記定義した通りである。上記式（II)における置換基Ｒ2〜Ｒ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであることができる。更に、置換基Ｒ3及びＲ4はスピロ縮合シクロアルキル基として一緒になってもよい。
【００３４】
本発明の式（II)のジオキセタンを合成するために、相当するベンゾチアゾールアルデヒド又はトルエン誘導体から、過マンガン酸塩酸化を用いてカルボン酸を形成する。このカルボン酸のエステルを次に使用して上記化合物のためのジオキセタン前駆体を調製する。この種の方法は米国特許第５，７３１，４４５号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
式（I)及び（II)の置換基の各々に関る代表的な名称は、本明細書に記載される新規な化学式及び参照により本明細書に組み込まれるＴｒｏｐｉｘの以前の特許に基づき、当業者が容易に知り得るものである。Ｒに関する好ましい名称は炭素原子数２〜１２の直鎖又は分枝鎖のアルキルを包含する。分枝鎖のアルキル基が好ましい。更に、各アルキル基は１個以上の電子吸引性又は電子供与性基で置換されていてもよく、且つ／若しくは各アルキル部分Ｒは一般的には極めて疎水性であるジオキセタン全体の溶解度を増大させる１個以上の基で置換されていてもよい。好ましい可溶化基はカルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸部分、アンモニウム部分等を含む。
【００３６】
好ましい実施形態においては、両方のＲ基が一緒になってスピロ結合アダマンチル基を形成してもよく、これは未置換であるか、又は架橋部の炭素のいずれか又は両方において電子活性（即ち電子吸引性又は電子供与性）の基で置換されていてもよい。適当な電子活性基には炭素原子数１〜７のアルコキシ基、ハロ基、アルキル基等が包含される。例示されるアダマンチル基上の置換基は米国特許第５，１１２，９６０号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。更にまた、各基Ｒの名称は早期の分解を防止するためにジオキセタンの立体的安定化をもたらすように選択することができる。
【００３７】
置換基Ｒ2〜Ｒ6は、Ｒ3及びＲ4は一緒になって式（I)のＲ基に関して上記定義した通りスピロ縮合シクロアルキル基を形成してよい以外は、相互に独立して選択できる。それ以外としては、Ｒ2〜Ｒ6は独立して水素、炭素原子数１〜６のアルキル基であって、未置換であるか又は置換されている１個以上のハロゲン基（例えばトリフルオロアルキル）、ヒドロキシ、フェニル、ナフチル等で置換されているものから選択される。部分Ｒ2〜Ｒ6のいずれも、単独又は組み合わせにおいて、更に上記したジオキセタンの水溶性を増強するために計算された１個以上の基で置換されていてもよい。さらにまた、部分Ｒ2〜Ｒ6の各々は、１個又は２個の水溶性増強基を有していてよい。アルキル以外に、各々及び／又は全てのＲ2〜Ｒ6はアリール基、好ましくはフェニルであってもよい。
【００３８】
ヘテロアリール基Ｙは電子活性基で置換されていることができる。Ｙ上の好ましい電子活性置換基には、クロロ、アラルケニル、アルコキシ（−ＯＲ）、アリールオキシ（−ＯＡｒ）、トリアルキルアンモニウム（−ＮＲ3＋）、アルキルアミド（−ＮＨＣＯＲ、ＮＲＣＯＲ’）、アリールアミド（−ＮＨＣＯＡｒ、−ＮＲＣＯＡｒ、−ＮａｒＣＯＡｒ）、アリールカルバモイル（−ＮＨＣＯＯＡｒ、−ＮＲＣＯＯＡｒ）、アルキルカルバモイル（−ＮＨＣＯＯＲ、−ＮＲＣＯＯＲ’）、シアノ（−ＣＮ）、ニトロ（−ＮＯ2）、エステル（−ＣＯＯＲ、−ＣＯＯＡｒ）、アルキル−又はアリールスルホンアミド（−ＮＨＳＯ2Ｒ、−ＮＨＳＯ2Ａｒ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ3）、アリール（−Ａｒ）、アルキル（−Ｒ）、トリアルキル−、トリアリール−、又は、アルキルアリールシリル（−ＳｉＲ3、−ＳｉＡｒ3、−ＳｉＡｒＲ2）、アルキル−又はアリールアミドスルホニル（−ＳＯ2ＮＨＣＯＲ、−ＳＯ2ＮＨＣＯＡｒ）、アルキル−又はアリールスルホニル（−ＳＯ2Ａｒ、−ＳＯ2Ｒ）、アルキル−又はアリールチオエーテル（−ＳＲ、−ＳＡｒ）が包含される。Ｚ置換基の大きさは一般的には溶解度の観点によってのみ限定される。アルキル又はＲ、Ｒ’等について述べる場合は、アルキル部分は、好ましくは炭素原子数１〜１２である。適当なアリール部分はフェニル及びナフチルを包含する。特に好ましい電子活性置換基はクロロ及びアルコキシを包含する。
【００３９】
ヘテロアリール基Ｙはカルボン酸、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、及びアンモニウム基等の水可溶化基で置換されることができる。Ｙの水溶性はまた第４化されたヘテロアリール基を生成するＹにおける１個のヘテロ原子のアルキル化により増大させることもできる。
【００４０】
上記した米国特許第５，５３８，８４７号に記載されている通り、電子供与基、例えばメトキシ基はアニオン分解過程を増強し、電子吸引基、例えば塩素は同じ分解反応を遅延させる。意外にもアリール基上の置換基の影響はアダマンチル基又は他の立体的安定化基上の置換基に対するものと反対の作用を有する。
【００４１】
本発明によれば、Ｙは芳香族複素環（例えばヘテロアリール）基である。特に好ましいヘテロアリール基には２−、３−又は４−ピリジル；２−ベンゾチアゾリル；２−ベンゾオキサゾリル；２−ベンゾフラニル；２−ベンゾチエニル；２−、４−又は５−チアゾリル；３−、４−又は５−イソキサゾリル；３−、４−又は５−イソチアゾリル；３−、４−、５−、６−又は７−キノリニル；又は、２−、４−、５−又は６−ピリミジニルが包含される。本発明のヘテロアリール基Ｙは未置換であっても置換されていることもできる。ヘテロアリール基のための好ましい置換基は１個以上の電子活性基を包含する。
【００４２】
典型的には、上記した式（I)及び（II)におけるＸ置換基は酵素不安定な基である。好ましい酵素不安定基にはホスフェート部分及びガラクトシド部分が包含されるが、切断時にオキシアニオンを発生する実質的に如何なる酵素切断可能な基も本発明において使用するのに適している。広範な種類の酵素切断可能な基が米国特許第５，６０５，７９５号に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、ホスフェートエステルに加えて、部分Ｘは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０５，７９５号における基Ｚに関して指定されている部分のいかなるものであってもよく、例えばエステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼ、α又はβ−キシロシダーゼ、フコシダーゼ、グルコシダーゼ及びチオグルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンオシダーゼ、フルクトフラノシダーゼ、グルコシドウロナーゼ、トリプシン等に対する基質が挙げられる。更にまた、部分−ＯＸは蛋白分解酵素、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９１，５９１号に記載されているもの等の広範な種類のペプチドのいずれかにより置き換えられることができる。
【００４３】
前述した通り、酵素的誘発とは反対に非酵素的な化学的誘発が望まれるような状況が存在している。このような場合、Ｘ置換基は例えば、Ｈ、トリアルキルシリル等であることができる。化学的誘発並びに置換基Ｘの種々の名称は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６５２，３４５号に記載されている。
【００４４】
化学ルミネセンスのモニタリング及び測定（例えば定量）においては、広範な種類の装置が開発されている。最も高感度で特にハイスループットのスクリーニング用途に適するものはＣＣＤカメラである。ジオキセタンからの典型的なルミネセンス発光は可視スペクトルの青波長にある。しかしながらＣＣＤカメラは青の発光に限定する際に困難を伴う場合がある。したがって青色発光の長波長側の「エッジ」のみが典型的にはカメラにより観察される。本発明によりジオキセタン上のベンゾチアゾール共鳴部分を用いることにより、発光された光は緑色側にシフトすることができる。即ち、発光は可視光スペクトルの緑色部分（即ち赤色側末端）に向かってシフトさせることができる。
【００４５】
従来技術のジオキセタンは典型的には疎水性領域にジオキセタンを封鎖する、即ち、水の存在下に観察され得る化学ルミネセンスクエンチングを低減する作用を有する増強剤とともに用いられる。これらの増強剤分子は、好ましくはオニウム第４重合体、例えばホスホニウム、スルホニウム及びアンモニウム重合体である。代表的な重合体及びその作用は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３３０，９００号に記載されている。これらの重合体は単独で、又は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５４７，８３６号に記載されているもの等の増強力を更に改善するための界面活性剤とともに使用してもよい。
【００４６】
本発明においては、ジオキセタン発光の緑側シフト及びベンゾチアゾールの存在によるジオキセタンの増強された疎水性の結果として、増強剤及び他の添加剤を低濃度で使用することができる。
【００４７】
特に図を参照すれば、図１はベンゾチアゾールジオキセタンホスフェートの化学構造に関する一般式を示す。この分子は本明細書ではＢＺＰＤと称する。図１に示すＢＺＰＤ分子はベンゾチアゾール基の２位においてフェニル置換基を有する。しかしながら本発明によれば、他の置換基はベンゾチアゾール上で使用することができる。本発明の好ましい置換基は芳香族複素環（例えばヘテロアリール）基、例えばピリジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル等である。本発明の好ましい実施形態によれば、複素環芳香族部分は２−、３−又は４−ピリジル；２−ベンゾチアゾリル：２−ベンゾオキサゾリル；２−ベンゾフラニル；２−ベンゾチエニル；２−、４−又は５−チアゾリル；３−、４−又は５−イソキサゾリル；３−、４−又は５−イソチアゾリル；３−、４−、５−、６−又は７−キノリニル；又は２−、４−、５−又は６−ピリミジニルである。
【００４８】
図２〜図６及び以下で説明する合成方法はフェニル又は置換フェニルの置換基を有するＢＺＰＤジオキセタンに関する。しかしながら、これらの方法は本発明のベンゾチアゾール基上のヘテロアリール置換基を有する同様のジオキセタン分子の合成にも適用できる。図２〜図６に説明した方法の適用は当業者の知るとおりである。
【００４９】
図１のＢＺＰＤジオキセタンの合成は図２Ａ、図２Ｂ及び図３に説明するとおりである。図２Ａはフェニル置換基を有するベンゾチアゾール化合物の合成を含む図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための工程の第１セットを示す。図２Ｂは相当するベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートの合成を含む図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための工程の第２セットを示す。図３は相当するベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートの光酸素化の工程を含む図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための最終工程を示す。
【００５０】
従来の出発物質を用いて本発明のジオキセタンを合成してもよいが、新規なイソチオシアネートが本発明の局面として記載されており、そしてアリール置換基を有するベンゾチアゾール化合物の合成を説明する図４において説明する。
【００５１】
図５は本発明の生物学的部分又はエネルギ転移蛍光団を結合するための部位を有するジオキセタンを合成するために用いることができるベンジルオキシベンゾチアゾールエノールエーテル誘導体の合成を説明するものである。
【００５２】
図６はベンゾチアゾール−ＤＲＯＸエネルギ転移酵素基質を示す。
【００５３】
図７及び図８はＢＺＰＤに関する波長の関数としての発光の強度を示す。図７は増強剤非存在下における５５０ｎｍより大きいピーク波長を示すＢＺＰＤの波長発光の「緑シフト」を示している。図８は増強剤（即ちＳａｐｐｈｉｅｒ−ＩＩ（商標））の存在下では化学ルミネセンス発光の波長強度が更に増強できることを示している。
【００５４】
図９〜図１２においてＢＺＰＤの相対的化学ルミネセンス性能を他の市販のジオキセタンと比較する。図９ＡはＣＳＰＤ（登録商標）（アダマンチル基上に塩素置換基を有するフェニルジオキセタン）及びＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（アダマンチル基とフェニル部分の両方に塩素置換基を有するフェニルジオキセタン）と比較した場合のＢＺＰＤに関するｐＨ８．５及び時間４分におけるルミネセンス（ＲＬＵ）を示す。図９Ａから明らかなとおり、ＢＺＰＤの半減期（Ｔ1/2）はＣＳＰＤ（登録商標）及びＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）の相当する半減期よりも短い。図９Ｂに示すとおり、本発明のジオキセタンはまたこれらの条件下で優れたＳ／Ｎ比(signal to noise ratio)を有している。Ｓ／Ｎ比(signal to noise ratio)の値が重要である理由は、バックグラウンドノイズが高すぎる（即ちＳ／Ｎ比が低すぎる）場合には以下に迅速にピーク強度が生じても試験は相対的に感度の低いものとなる場合があるためである。
【００５５】
図１０Ａ及び図１０ＢはｐＨ８．５及び時間２４分の後のルミネセンス値及びＳ／Ｎ比を示す。これらの図より明らかなとおり、ＢＺＰＤはこの条件下で有意に高値のルミネセンス及び有意に高値の感度（Ｓ／Ｎ）を示している。
【００５６】
感度はジオキセタン検出剤の重要な特性である。図１１Ａ及び図１２Ａにおいて、４分後及び２４分後の化学ルミネセンスを、それぞれ、ＢＺＰＤに関して種々の濃度のアルカリホスファターゼにおいて示している。明らかに分かるとおり、ＢＺＰＤは極めて低濃度の酵素（１０-17モル以下）であっても優れた検出感度（即ちより高値のシグナル）を与えている。図１１Ｂ及び図１２Ｂより分かるとおり、アルカリホスファターゼ低濃度におけるＢＺＰＤのＳ／Ｎ比は以前に開発されているジオキセタンと同等であったが、高いアルカリホスファターゼ濃度においては、ＢＺＰＤのＳ／Ｎ比が優れている。この向上したＢＺＰＤの感度を用いて極めて少量の物質を検出することができる。
【００５７】
図１３及び図１４は本発明の２種のヘテロアリール置換ベンゾチアゾールジオキセタンを示している。図１３は本発明の好ましい実施形態による３−ピリジル置換ベンゾチアゾールジオキセタンの一般的構造を示している。図１４は本発明の好ましい実施形態による２−ベンゾチアゾリル置換ベンゾチアゾールジオキセタンの一般的構造である。図１３及び図１４における置換基Ｘは化学的又は酵素的手段により除去することができる保護基である。
【００５８】
３−ピリジル−ＢＺＰＤの発光スペクトルを測定した。３−ピリジル−ＢＺＰＤの半減期（ｔ1/2）は約２秒であることが判った。３−ピリジル−ＢＺＰＤの最大発光波長（λmax）は５７４ｎｍであることが判った。この波長は約５５０ｎｍであるＢＺＰＤの最大発光波長から約２４ｎｍ赤色側にシフトする。
【００５９】
３−ピリジル−ＢＺＰＤについて観察されるこの赤色側シフトを用いて、種々の用途に利用することができる。例えば検出のためにＣＣＤカメラを用いる用途においては、赤色側シフトはＣＣＤによる検出を増強することができる。更にまた２波長用途においては、３−ピリジル−ＢＺＰＤの赤色側シフトを用いて感度を増大させることができる。例えば、青色光発光（例えばλmax＝約４７０ｎｍ）を１事象に対して用い、３−ピリジル−ＢＺＰＤの分解による黄橙色光（例えばλmax＝約５７４ｎｍ）を他の事象に用いる２波長用途においては、２つの発光スペクトルの間により大きい分離が得られる。発光スペクトルの間の分離が大きいことはより高度な検出感度を与える。２波長試験は参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９３１，２２３号に記載されている。
【００６０】
図１５は本発明によるヘテロアリール置換ベンゾチアゾールジオキセタンの第２実施形態の一般的構造を示す。
【００６１】
図１６及び図１７は図１３に示した３−ピリジル置換ベンゾチアゾールジオキセタンの合成経路を説明するものである。
【００６２】
本発明の１、２−ジオキセタンは試料中の分析対象の存在及び量を検出するための方法において使用することができる。典型的には、分析対象はジオキセタンから置換基Ｘ（上記式（I)及び（II)において説明したもの）を切断することによりジオキセタンに分解を起こさせ、光を発させる。本発明の方法によれば、本発明の１，２−ジオキセタンと共に試料をインキュベートし、次に光の発光について検査する。光が検出された場合は、Ｘを除去する分析対象の存在が示される。更にまた、検出される光の量を用いて試料中に存在する分析対象の量を検出することができる。典型的には、分析対象はジオキセタン上の置換基Ｘを切断するように選択される酵素である。Ｘの切断により、ジオキセタンは分解し、光を発することができる。本発明によれば、酵素は意図する生物学的部分に複合体化させることができる。
【００６３】
方法は増強分子、好ましくは上記した、そして米国特許第５，３３０，９００号及び５，５４７，８３６号に記載されているオニウム第４重合体及び添加剤と共に用いてよい。好ましい実施形態においては、本発明の１，２−ジオキセタンの分解により発された光はＣＣＤカメラにより検出される。
【００６４】
本発明の化学ルミネセンス基質は単独で、又は、酵素又はＸを除去することによりジオキセタンに分解を起こさせる別の物質と共に、本発明の１，２−ジオキセタンを含むキットにおいて提供することができる。化学ルミネセンス増強剤及び増強剤の性能を進歩させる添加剤もまたキットに含めることができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例はベンゾチアゾールジオキセタン基質及びその前駆体の代表的な合成法であり、本発明の請求範囲を限定するものではない。第１に４，６−ジブロモ−ｏ−アニシジンを文献Ｆｕｃｈｓ，Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆｕｒ  Ｃｈｅｍｉｅ，３６，１３０，１９１５に従って得た。Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ３００  ＮＭＲスペクトル分析器を使用した。全てのＮＭＲデータはプロトン（1Ｈ）ＮＭＲである。
【００６６】
［実施例１］２−ベンズアミド−３，５−ジブロモアニソール
４，５−ジブロモ−ｏ−アニシジン（１１．３ｇ；４０．２ミリモル）をジクロロメタン７５ｍｌ及びピリジン６．７ｍｌに溶解した。混合物をアルゴン下室温で攪拌した。ベンゾイルクロリド（４．８ｍｌ；１．０３等量）をシリンジで滴下した。混合物を８時間攪拌し、橙茶色の懸濁液を得た。次に反応混合物をロータリーエバポレータ上で１／３の容量になるまで濃縮した。濃厚なスラリーをブフナー漏斗上で濾過し、５０：５０ジクロロメタン／ヘキサンでフラスコ及び固体を洗浄した。得られた白色固体を次に水で十分洗浄し、残存する塩酸ピリジンを全て除去した。次に固体生成物を真空下に乾燥し、上記標題の生成物１３．５６グラムを得た。２相の濾液を漏斗中、水で洗浄し、有機層を分離し、次にこれをロータリーエバポレータに付して紫茶色の固体を得た。５０：５０ジクロロメタン／ヘキサンで磨砕し、最少量の酢酸エチルから再結晶させ、第２収量として１．４３グラムを得た。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）データはδ３．８１（ｓ，３Ｈ）、７．３６（１Ｈ）、７．４４−７．７１（ｍ，４Ｈ）、７．８８−８．１１（ｍ，２Ｈ）、９．８８（ｓ，１Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは３４２０、２９８０、２９４０、１６９１、１５８５、１４８７、１４００、１０４１、８７５、８３７であった。
【００６７】
［実施例２］Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）フェニルチオベンズアミド
前述の実施例の生成物（１４．４ｇ；３７．４ミリモル）を僅かに加温しながら乾燥ピリジン３５ｍｌに溶解した。五硫化リン（１１ｇ；４９．５ミリモル）をアルゴン下に１回で添加した。濃厚で淡黄色の複合体が発熱を伴って形成された。この混合物をオイルバス中に９０℃で２時間攪拌し、より希薄な暗黄色懸濁液を得た。その後、混合物を１５分間還流し、室温に冷却した。混合物を酢酸エチル１２５ｍｌで処理し、ガム状物が沈殿した。水１ｍｌを攪拌しながら添加し、ガム状物を凝集させた後、上澄をデカンテーションした。その後、ガム状物を酢酸エチル２Ｘ２５ｍｌで磨砕した。合わせた有機物をロータリーエバポレータに付し、得られた橙色油状物はピリジンを含有していた。水中の水酸化ナトリウム７％溶液を２０分間激しく攪拌しながら油状物に添加した。溶液を濾過し、不溶物を除去し、最少量の水酸化溶液で洗浄した。その後濾液を３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ１に酸性化し、沈殿した羊毛状の淡黄色固体を最少量のジクロロメタンに溶解した。有機層を分離し、ロータリーエバポレータに付し、レモン黄色固体として上記標題生成物１２．６グラムを得た。エタノールから再結晶化することにより得られた分析用試料はＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−ジクロロメタン；Ｒｆ＝０．５６）上で１スポットの物質であった。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）データはδ３．８１（ｓ，３Ｈ）、７．４０−７．５９（ｍ，６Ｈ）、７．９０−７．９３（ｍ，２Ｈ）、１１．３６（ｓ，１Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨＣｌ3／ｃｍ-1）データは３３８０、２９９０、１５８４、１４９０、１４００、１３４５、１０４０、８７８、８３８、６９５であった。
【００６８】
［実施例３］２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
前述の実施例のチオアミド（１２．６ｇ；３１．４ミリモル）をメタノール３０ｍｌ中に加温した。懸濁液をメタノール中の４．３Ｍナトリウムメトキシド７．３５ｍｌ（３１．６ミリモル）を添加しながら攪拌した。添加しながら固体が溶解し、黄色が淡琥珀色に変化した。溶媒をロータリーエバポレータで真空下に吸引し、得られた琥珀色のガラス状固体がガラスにコーティングされた。このチオアミド塩を、Ｎ−メチルピロリドン２０ｍｌを添加しながらアルゴン下に保持した。フラスコをセプタムで蓋をし、オイルバス中に１１０〜１２０℃で設置されたバブラーに接続した。３０分間攪拌後、緑茶色の固体が形成した。その後フラスコを室温に冷却し、水１００ｍｌを添加し、オフホワイトの固体を得た。混合物を濾過し、固体を十分水で洗浄した。真空下に乾燥後、固体を酢酸エチル：ヘキサン５０：５０から再結晶化し、白色の毛髪状針状物７．０５グラムを得た。ＴＬＣはＲｆ＝０．４７で青蛍光色生成物スポットを示した。痕跡量のＵＶ吸収不純物がより高いＲｆ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−ジクロロメタン）に存在した。不純物をシリカゲルクロマトグラフィーにより除去し、分析用試料を得た。ＮＭＲ及びＩＲデータは上記標題生成物と合致していた。特にＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）データは、δ４．１０（ｓ，３Ｈ）、７．０７（ｄ，１Ｈ）、７．４９−７．５２（ｍ，３Ｈ）、７．６６（ｄ，１Ｈ）、８．１１−８．１４（ｍ，２Ｈ）であり、ＩＲ（ＣＨＣｌ3／ｃｍ-1）データは３００３、２９４０、１５９０、１５６２、１５１７、１４４０、１４００、１３８７、１３２２、１２６０、１０５５、９７８、８３０、６９０であった。
【００６９】
［実施例４］２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
前述の実施例からのクロマトグラフィーに付した生成物（３ｇ；９．３７ミリモル）をアルゴン下に乾燥ＴＨＦ７０ｍｌに溶解した。別のフラスコ中に乾燥ＴＨＦ６０ｍｌを冷却し、アルゴン下に−７８℃で攪拌した。このフラスコに２．５Ｍｎ−ブチルリチウム５．６ｍｌ（１４．１ミリモル）をシリンジにより添加した。その後、ブロモベンゾチアゾール出発物質の溶液をアルゴン下に滴下漏斗から２５分間かけて滴下した。添加終了時、ＴＨＦ７ｍｌを使用して漏斗を洗浄した。赤茶色溶液をさらに１０分間低温で攪拌した。その後、乾燥ＤＭＦ１．８ｍｌをシリンジにより滴下した。１０分後、溶液を１時間かけてゆっくり室温に加温した。反応は１Ｍ塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌを急速に添加することによりクエンチングした。ロータリーエバポレータ上にＴＨＦを除去し、生成物を酢酸エチルと残存する水との間に分配した。酢酸エチル層を水で４回洗浄し、全てのＤＭＦを除去した。有機物を硫酸ナトリウム上に乾燥し、溶媒を除去し、半固体状ペーストを得た。これをヘキサン中の２０％ジクロロメタン２０ｍｌで磨砕し、デカンテーション及び真空下に吸引し、乾燥固体を得た。得られた重量１．８１ｇの桃色生成物はＴＬＣで本質的にＲｆ値０．６２（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−１０％酢酸エチル／ヘキサン）の１スポットであることが示された。同様にして得られた生成物のスペクトルデータは上記標題化合物で想定されるものと同一かつ合致していた。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）データは、δ４．１８（ｓ，３Ｈ）、７．４８−７．５６（ｍ，４Ｈ）、８．０４（ｄ，１Ｈ）、８．１７−８．２０（ｍ，２Ｈ）、１０．０８（ｓ，１Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨＣｌ3／ｃｍ-1）データは、３０１０、２８４０、２７４０、１６９５、１５９５、１５７２、１４８０、１４７０、１３９５、１２９０、１２７０、１１４５、１０５７、９８３、８５０、６９０であった。
【００７０】
［実施例５］２−フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
アルゴン下に、前述の実施例からのアルデヒド１．８グラム（６．７ミリモル）をジクロロメタン１１ｍｌ、トリメチルオルソホルメート０．９ｍｌ、及び無水メタノール０．７ｍｌで処理した。トルエンスルホン酸１水和物１０５ｍｇを全量１回で添加しながら、懸濁液を攪拌した。アルゴンでパージ後、フラスコをセプタムで閉鎖した。すぐに固体を溶解し、黄橙色溶液を得た。室温で１夜攪拌を続行した。反応混合物を、シリンジを使用し、過剰のトリエチルアミン（０．１５ｍｌ）で中和した。混合物から全ての揮発物を除去し、最少量のジクロロメタンに溶解し、アルミナ２ｃｍＸ１．５インチカラム上のプラグ−クロマトグラフィに付した。溶出液をロータリーエバポレータに付し、油状物を吸引してゆっくり固化した。試料を直ちにＩＲ分析にかけると、カルボニル吸収の存在を示した。これはアセタール形成が完了したことを示しており、粗生成物を直ちに次反応に使用した。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは、２９４０、２８４０、１６０２、１５８０、１４６８、１４１０、１３５５、１１９８、１１５５、１０６０、９９６、８３７であった。
【００７１】
［実施例６］ジエチル−１−メトキシ−１−（２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル）メタンホスホネート
前工程で得られた粗生成物をアルゴン下にシーブ乾燥ジクロロメタン１１ｍｌ及び亜リン酸トリエチル１．５ｍｌに溶解した。フラスコをセプタムで密封し、攪拌溶液を乾燥氷／アセトンバス中に−７８℃で冷却した。この温度で圧力をアルゴンバルーンで平衡化した。その後、懸濁液になった混合物を三フッ化ホウ素エーテレート１．０ｍｌで滴下処理した。内容物をゆっくり約−２０℃に加温しながら懸濁した固体を溶解した。溶液を冷蔵庫中に１時間格納し、その後１夜攪拌しながらゆっくり室温に戻した。翌朝固体重炭酸ナトリウム０．７グラム、次いで飽和重炭酸ナトリウム水溶液１５ｍｌを添加した。２相を激しく攪拌し、二酸化炭素を放出した。必要に応じて３時間かけて水を添加し、全ての無機物を溶解した。ジクロロメタン層を分離し、水層を同様の溶媒１５ｍｌで逆抽出した。合わせた有機物をＴＬＣに付し、原点までテーリングした（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−酢酸エチル）１つのＵＶ／青蛍光色スポットが約Ｒｆ＝０．１５であることを示した。溶液を蒸発させ、４０℃で真空吸引した。その後、粘稠な黄色油状物を最少量のジクロロメタン／酢酸エチル５０／５０に溶解し、極めて短いシリカゲル充填物を通した。溶離剤を除去し、ジクロロメタン／ヘキサン混合物で数回反復した。油状の生成物の重量は２．７グラムであった。ＮＭＲ及びＩＲ分光光度分析は水分の存在を示したが、実質的に純粋な物質を示した。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）データはδ１．２１−１．３６（ｍ，６Ｈ）、３．４６（ｓ，３Ｈ）、３．９３−４．２１（ｍ，７Ｈ）、４．５９−４．６４（ｄ，１Ｈ）、７．０７（ｓ，１Ｈ）、７．４７−７．５２（ｍ，３Ｈ）、７．５７（ｓ，１Ｈ）、８．１１−８．１４（ｍ，２Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは、３３６０＆３４６０（Ｈ2Ｏ）、２９８０、２９３５、２８６０、１５９７、１５７０、１５１０、１４８０、１４６０、１４４５、１４０８、１３４２、１２４５−１２８５（ｂｒ）、１１００、１０４０（ｂｒ）、９６５（ｂｒ）、８６５、８４０、６１０であった。
【００７２】
［実施例７］６−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
前工程からの吸引されたホスホネートエステル（２．７ｇ；６．４ミリモル）をアルゴン下に乾燥ＴＨＦ２５ｍｌに溶解した。溶液をアルゴンバルーンとセプタムで密封したフラスコ中に攪拌しながら−７８℃に冷却した。溶液を十分なヘキサン中の２．５Ｍｎ−ＢｕＬｉで滴下処理し、長時間持続する赤紫色を得た。この方法において、全ての水分及びプロトン性の不純物を滴定した。続いて、同様のｎ−ＢｕＬｉ溶液２．７ｍｌ（６．７５ミリモル）を滴下し、暗赤紫色溶液を得た。低温で１０分間攪拌後、強アルゴン気流下に水分を排他しながら２−アダマンタノン（０．９５グラム、６．３３ミリモル）を添加した。固体を１０分間かけて溶解した。その後溶液をゆっくり室温に戻した。アルゴン雰囲気を維持しながら還流コンデンサを連結した。混合物を１．５時間還流し、淡橙色溶液を得た。その後、ＴＨＦを、泡沫形成を回避するように慎重にロータリーエバポレータ上に除去した。生成物を酢酸エチル２５ｍｌと飽和重炭酸ナトリウム／水１：１  ５０ｍｌの間に分配した。その後、有機層を水２５ｍｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上に乾燥し、蒸発させ、淡黄色ガム状物を得た。ガム状物を、ジクロロメタンを溶離剤とするシリカゲルの短カラム上のプラグ−クロマトグラフィーに付し、痕跡量の極性夾雑物を除去した。適当な画分を吸引し、ジクロロメタン−ヘキサンで反復した。吸引した生成物、重量２．１４グラムを冷凍庫中に格納し半固体にした。ＩＲ分光光度分析により、次工程で取り除く少量の夾雑物を示す小さい２−アダマンタノンカルボニルバンドが判明した。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは、２９２０、２８５０、１５９７、１５６７、１４５０、１４０２、１３３０、１３２０、１３１０、１２５２、１１６５、１１００、１０５７、９７８、８６５、６４０、６２０であった。１７２０及び１７１０で痕跡量のＡＤ＝０。
【００７３】
［実施例８］６−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカ−２−イリデンメチル）−２−フェニル−４−ヒドロキシベンゾチアゾール
ＤＭＦ中のナトリウムエタンチオレート溶液を６０％水素化ナトリウム及びエタンチオールから作成した。６０％水素化ナトリウム２４０ｍｇ（６ミリモル）はアルゴン雰囲気下にヘキサンで３回洗浄し、鉱物油を除去した。ＤＭＦ１１ｍｌを添加した。得られた懸濁液をエタンチオール（０．４５ｍｌ、６ミリモル）を滴下し攪拌しながら０℃に冷却した。水素発生が停止後、溶液を室温に加温し、分離フラスコ中のメトキシ［２−フェニル−４−メトキシ（ベンゾチアゾール−６−イル）メチリデンアダマンタン１．６４グラム（３．９ミリモル）にアルゴン下にピペットにより供給した。得られた溶液をオイルバス中に１３０℃で攪拌した。１時間後、溶液は暗橙色になり、懸濁した固体を含有していた。反応混合物を冷却し、１Ｍ塩化アンモニウムと７５％酢酸エチル／ヘキサン各々５０ｍｌの間に分配した。有機層を水２５ｍｌで３回洗浄した。合わせた水層を同様の溶媒混合物で逆抽出し、その後水で数回洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上に乾燥した。ＴＬＣ（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−ジクロロメタン）はＲｆ＝０．２３で生成物を、またＲｆ＝０．３９で出発物質を示した。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル：５０％ジクロロメタン−ヘキサンから純粋なジクロロメタン）により低Ｒｆ生成物の１つの純粋な画分が単離された。混合した画分のクロマトグラフィーを反復し、追加の生成物が単離された。溶媒を除去後、上記標題生成物総量２４５ｍｇを得た。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤ2Ｃｌ2）データは、δ１．７４−２．０７（ｍ，１４Ｈ）、２．７１（ｓ，１Ｈ）、３．２６（ｓ，１Ｈ）、３．３２（ｓ，３Ｈ）、６．７６（ｓ，１Ｈ）、６．９４（ｄ，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．４４−７５９（ｍ，３Ｈ）、７．９９−８．１６（ｍ，２Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは、３５２０、２９１０、２８５０、１６１２、１５７５、１４８０、１４４５、１３０２、１２８４、１１７５、１０８０、９８０、８６０であった。
【００７４】
［実施例９］６−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカ−２−イリデンメチル）−２−フェニルベンゾチアゾリル−４−リン酸二ナトリウム
モレキュラーシーブ乾燥したピリジン４．０ｍｌをアルゴン下フラスコに投入した。フラスコには磁気攪拌子を装着し、アイスバス内に設置した。蒸留したオキシ塩化リン０．１１２ｍｌ（１．２ミリモル）をシリンジで滴下した。別のフラスコにおいて、前述の実施例のヒドロキシベンゾチアゾール誘導体２４５ｍｇをアルゴン下無水ＴＨＦ１５ｍｌ中に溶解した。次にＴＨＦ溶液をゆっくり滴下しながらホスホリル化試薬の攪拌溶液に添加した。添加中、沈殿が形成した。添加終了時にフラスコ及びシリンジをＴＨＦ２ｍｌで洗浄し、これもゆっくり反応フラスコに添加した。次に反応混合物を室温に加温し、３時間攪拌した。２０ｍｌシリンジの綿花先端部付きの針を用いて上澄みを吸引し、塩酸ピリジンは残存させた。この上澄みを、０．５Ｍ水酸化ナトリウム１５ｍｌの溶液を予め水で７５ｍｌの容量まで希釈しておいたものに滴下し、その間アイスバス温度で攪拌した。僅かに白濁した溶液は室温に加温すると透明化した。溶液を慎重にポンピングしてＴＨＦを除去し、容量を５．０ｍｌのアセトニトリル及び水を用いて１１０ｍｌに調節した。この溶液をＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの２インチのポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２回に分けて注入した。５％〜１０％アセトニトリルの勾配を用いて２７０ｎｍの主要な吸光度ピークを分離した。この勾配は特定の装置に対して最適化しなければならない。適切な画分を合わせ、凍結乾燥し、淡黄色固体２９４ｍｇを得た。スペクトルデータは上記標題の構造と合致していた。０．１％重炭酸ナトリウム水溶液に対して勾配としたアセトニトリルを用いた同様の支持体上の分析用ＨＰＬＣクロマトグラムは、１３．２分で溶出する単一の生成物を示していた（約５０％アセトニトリル）。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／Ｄ2Ｏ）データはδ１．３８−２．０２（ｍ，１４Ｈ）、２．５１（ｓ，１Ｈ）、３．００（ｓ，１Ｈ）、３．２４（ｓ，３Ｈ）、７．２６−７．５３（ｍ，５Ｈ）、７．７５−８．０４（ｍ，２Ｈ）であった。
【００７５】
［実施例１０］６−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］−４−イル）２−フェニルベンゾチアゾリル−４−リン酸二ナトリウム
試験管に前述の工程のエノールエーテルホスフェート２８５ｍｇを投入した。固体をメタノール１．０ｍｌで湿潤させ、ジクロロメタン２５ｍｌを添加して溶解した。次に溶液を５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンの溶液（ＣＨＣｌ3中２ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌで処理した。試験管の内容物を０℃に冷却し、その間、溶液を酸素ガスで散布した。５分後、溶液に酸素をバブリングしつづけながら、試験管に冷却した４００ワットのナトリウム蒸気ランプから光を照射し、その間温度を５℃に維持した。Ｋａｐｔｏｎポリイミドフィルムの厚み５ｍｉｌの小片をランプと試験管の間に設置することにより、望ましくないＵＶ照射をフィルター除去した。照射は１７分間継続した。分析用ＨＰＬＣ［０．１％ＮａＨＣＯ3（Ｈ2Ｏ）−アセトニトリル勾配］によれば１３．２分に溶出する出発物質から１２．９４分に溶出する１，２−ジオキセタンへの変換は実質的に完了していた。反応混合物から溶媒を蒸発させ赤色ガム状物を得た。アセトニトリル５ｍｌ及び０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを攪拌しながら、そして度々冷却しながら添加し、ガム状物を溶解した。次にＤＩ水を添加し全容量を７０ｍｌとした。この溶液を高保持能濾紙で濾過し、少しづつの水で慎重に洗浄し、１１０ｍｌ容量の濾液を得た。この溶液をＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの１インチのポリスチレン逆相ＨＰＬＣカラムに２回に分けて注入した。５％〜１００％アセトニトリルの勾配（水に対して）を用いて２７０ｎｍの主要な吸光度ピークを分離した。この勾配は特定の装置に対して最適化しなければならない。０．１％重炭酸ナトリウム水溶液に対して勾配としたアセトニトリルを用いた同様の支持体上の合わせた生成物画分の分析用ＨＰＬＣクロマトグラムは、１２．９６分で溶出する単一の生成物を示していた（約５０％アセトニトリル）。適切な画分を合わせ、凍結乾燥し、淡黄色の固体２８７ｍｇを得た。生成物１，２−ジオキセタンはｐＨ８．５の水性緩衝液中のアルカリホスファターゼで誘発した場合５５８ｎｍの緑色光を発生した。ＵＶ：５０／５０ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ中２１３、２６０．５及び３０４ｎｍ。
【００７６】
［実施例１１］２−メトキシ−４，６−ジブロモフェニルイソチオシアネート
アルゴン下のフラスコに４，６−ジブロモ−ｏ−アニシジン１９．７５グラム（７０ミリモル）及び固体の重炭酸塩２０グラムを投入した。大型の強力磁気攪拌子をいれ、その後アセトニトリル１２０ｍｌ及びジクロロメタン５０ｍｌを添加した。チオホスゲン６．０ｍｌをシリンジで急速に添加しながら懸濁液を０℃で攪拌した。濃厚な沈殿が急速に形成した。これを激しく攪拌しながらフラスコの内容物をゆっくり室温に加温した。発生した二酸化炭素を、針状排気口を有するバブラーに導入した。混合物は加温に従って僅かに低粘度化し、より容易に攪拌できるようになった。２時間激しく攪拌し続けた。次に懸濁液を０℃に再度冷却した。固体をブフナー漏斗で濾過し、冷却したアセトニトリル３０ｍｌを用いてフラスコを洗浄し、残存する固体を全て移した。濾液をロータリーエバポレータに付し、橙色の変色部を有する固体を得た。この固体をヘキサンで磨砕し、ポンプ乾燥し、白色の元のフィルターケーキの入ったブフナー漏斗に移した。この固体をＮａＨ2ＰＯ4の０．５Ｍ水溶液５Ｘ各１００ｍｌで洗浄することにより存在する無機の重炭酸塩を中和した（二酸化炭素を放出した）。各洗浄時に固体を崩壊させた。次に白色の固体を水で十分に洗浄し、真空下に乾燥した。乾燥した生成物は２１．８グラムであった。同様に合成した生成物から得た分析データは上記標題の構造と合致していた。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）データはδ３．９２（ｓ，３Ｈ）、６．９８（ｄ，１Ｈ）、７．３１（ｄ，１Ｈ）であった。ＩＲ（ＣＨ2Ｃｌ2／ｃｍ-1）データは３０２０、２９７０、２９４０、２０３０（ｂｒ）、１５７５、１５５５、１４７０、１４００、１０４０、９３５、８７０、８４０であった。
【００７７】
［実施例１２］２−フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール［ワンポット法］
前述の実施例のイソチオシアネート約１５．５グラム（４８ミリモル）をアルゴン下乾燥ＴＨＦ５０ｍｌに溶解した。溶液をアイスバス中で攪拌しながら０℃に冷却した。臭化フェニルマグネシウムの溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）５０ｍｌ（５０ミリモル）を少しづつシリンジで添加した。１０分間冷却しながら攪拌した後、溶液をゆっくり室温に加温した。この時点で弱い発熱を伴いながら沈殿が形成し始めた。淡橙茶色の懸濁液は２時間かけて粘稠化した。３０℃でロータリーエバポレータにより溶媒を除去し、ガラスにコーティングされた湿潤した桃色の固体を得た。この物質はシーブ乾燥したＤＭＦ５０ｍｌを添加することにより空気から保護した。固体は僅かに発熱しながら溶解した。フラスコを１２５℃のオイルバスに入れた。４５分間かけて、残存する全てのＴＨＦを、ショートパスの蒸留ヘッドを用いながらフラスコから留去した。その間混合物は暗色化し、フラスコの内容物は固化した。水性の１Ｍ  ＨＣｌを１００ｍｌ添加し、固体を崩壊させた。その後水１００ｍｌを添加した。混合物を湿潤させて配位結合したマグネシウムイオンを全て除去した。次に混合物を濾過し、水で十分洗浄した。湿潤した固体を温酢酸エチル２Ｘ２５０ｍｌ中に溶解し、不溶性の塊から上澄みを分離した。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上に乾燥し、蒸発させて淡茶色の固体１３．２７ｇを得た。ＴＬＣはＲｆ＝０．４７に主要な青蛍光色の生成物のスポットを示し、痕跡量のＵＶ吸収不純物がより高いＲｆに存在した（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０−ジクロロメタン）。小型の着色した原点のスポットはシリカゲル上のプラグクロマトグラフィーにより除去した（ジクロロメタン）。適切な画分を合わせて得られた生成物１２．２９グラムは実施例３の物質と本質的に同一であったが、ただし、痕跡量の高Ｒｆ不純物をなお含有していた。本実施例の反応は、酸性化し、臭化フェニルマグネシウムがイソチオシアネートと反応し終わった後に後処理することにより実施例２のチオアミド生成物を得てもよい。
【００７８】
以下の物質は上記した一般的な合成方法に従って合成した。当業者は必要に応じて多少の変更を容易に行ない得る。ベンゾチアゾール系への他の経路を使用してもよい。
【００７９】
［実施例１３］２−（ｐ−ベンジルオキシベンズアミド）−３，５−ジブロモアニソール
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．７９（ｓ，３Ｈ）、５．２１（２Ｈ）、７．１１−７．１４（ｄ，２Ｈ）、７．３４−７．５２（ｍ，７Ｈ）、７．９３−７．９６（ｄ，２Ｈ）、９．７０（ｓ，１Ｈ）。
【００８０】
［実施例１４］Ｎ−（２，４−ジブロモ−６−メトキシ）−ｐ−ベンジルオキシフェニルチオベンズアミド
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．８０（ｓ，３Ｈ）、５．２２（２Ｈ）、７．０８−７．１１（ｄ，２Ｈ）、７．３２−７．５５（ｍ，７Ｈ）、７．９５−７．９８（ｄ，２Ｈ）、１１．１２（ｓ，１Ｈ）。
【００８１】
［実施例１５］２−（ｐ−ベンジルオキシ）フェニル−４−メトキシ−６−ブロモベンゾチアゾール
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ４．００（ｓ，３Ｈ）、５．２１（２Ｈ）、７．１７−７．２２（ｍ，３Ｈ）、７．３４−７．５０（ｍ，５Ｈ）、７．９３−８．０１（ｍ，３Ｈ）。
【００８２】
［実施例１６］２−（ｐ−ベンジルオキシ）フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾール
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ４．０５（ｓ，３Ｈ）、５．２３（２Ｈ）、７．２０−７．２３（ｄ，２Ｈ）、７．３３−７．５０（ｍ，６Ｈ）、８．０５−８．０８（ｄ，２Ｈ）、８．３１−８．３２（ｄ，１Ｈ）、１０．０４（ｓ，１Ｈ）。
【００８３】
［実施例１７］２−（ｐ−ベンジルオキシ）フェニル−４−メトキシ−６−ホルミルベンゾチアゾールジメチルアセタール
ＩＲ（ＣＨＣｌ３／ｃｍ-1）：３０００、２９４０、２８４０、１６１１、１５８０、１５３０、１４９０、１４７０、１３５５、１１８０、１１５５、１０６０、１０２０、９８０、８３８、７００。
【００８４】
［実施例１８］ジエチル−１−メトキシ−１−［２−（ｐ−ベンジルオキシ）フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール−６−イル］メタンホスホネート
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）：δ１．１９−１．３７（ｍ，６Ｈ）、３．４３（ｓ，３Ｈ）、３．８６−４．１８（ｍ，７Ｈ）、４．５１−４．７５（ｍ，１Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、７．０２−７．０３（ｍ，２Ｈ）、７．３０−７．５２（ｍ，７Ｈ）、８．０２−８．０６（ｍ，２Ｈ）。
【００８５】
［実施例１９］６−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカ−２−イリデンメチル）−２−（ｐ−ベンジルオキシ）フェニル−４−メトキシベンゾチアゾール
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ／ＣＤＣｌ3）：δ１．７８−２．１（ｍ，１４Ｈ）、２．７４（ｓ，１Ｈ）、３．３０（ｓ，１Ｈ）、３．３５（ｓ，３Ｈ）、４．０６（ｓ，３Ｈ）、５．１２（２，２Ｈ）、６．８５−６．９６（ｍ，１Ｈ）、６．９９−７．１２（ｍ，２Ｈ）、７．２９−７．５０（ｍ，６Ｈ）、７．９９−８．１４（ｍ，２Ｈ）。
【００８６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）の化学構造を示す図である。
【図２Ａ】フェニル置換基を有するベンゾチアゾール化合物の合成を含む、図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための工程の第１セットを示す図である。
【図２Ｂ】相当するベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートの合成を含む、図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための工程の第２セットを示す図である。
【図３】相当するベンゾチアゾールエノールエーテルホスフェートの光酸素化の工程を含む、図１の縮合ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンホスフェート（ＢＺＰＤ）を合成するための最終工程を示す図である。
【図４】アリール置換基を有するベンゾチアゾール化合物の合成を説明する図である。
【図５】生物学的部分又はエネルギ転移蛍光団を結合するためのベンジルオキシリンカーを有するベンゾチアゾールエノールエーテル誘導体の合成を説明する図である。
【図６】ベンゾチアゾール−ＤＲＯＸエネルギ転移酵素基質を示す図である。
【図７】ｐＨ１０におけるアルカリホスファターゼ存在下の図１のジオキセタンの発光スペクトルを示す図である。
【図８】ｐＨ１０におけるアルカリホスファターゼ存在下の図１のジオキセタンの発光スペクトルを示す図である。
【図９Ａ】ｐＨ８．５及び時間４分におけるＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ及びＢＺＰＤに関するルミネセンス（ＲＬＵ）値を示す図である。
【図９Ｂ】ｐＨ８．５及び時間４分におけるＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ及びＢＺＰＤのルミネセンスに関するＳ／Ｎ比(signal to noise ratio)を示す図である。
【図１０Ａ】ｐＨ８．５及び時間２４分におけるＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ及びＢＺＰＤに関するルミネセンス（ＲＬＵ）を示す図である。
【図１０Ｂ】ｐＨ８．５及び時間２４分におけるＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ及びＢＺＰＤのルミネセンスに関するＳ／Ｎ比(signal to noise ratio)を示す図である。
【図１１Ａ】ｐＨ８．５及び時間４分におけるＣＤＰ及びＣＤＰ−Ｓｔａｒと比較した場合のＢＺＰＤのアルカリホスファターゼ濃度の関数としてのルミネセンス（ＲＬＵ）を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ｐＨ８．５及び時間４分におけるＣＤＰ及びＣＤＰ−Ｓｔａｒと比較した場合のＢＺＰＤのルミネセンスに関するアルカリホスファターゼ濃度の関数としてのＳ／Ｎ比(signal to noise ratio)を示すグラフである。
【図１２Ａ】ｐＨ８．５及び時間２４分におけるＣＤＰ及びＣＤＰ−Ｓｔａｒと比較した場合のＢＺＰＤのアルカリホスファターゼ濃度の関数としてのルミネセンス（ＲＬＵ）を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ｐＨ８．５及び時間２４分におけるＣＤＰ及びＣＤＰ−Ｓｔａｒと比較した場合のＢＺＰＤのルミネセンスに関するアルカリホスファターゼ濃度の関数としてのＳ／Ｎ比(signal to noise ratio)を示すグラフである。
【図１３】本発明による３−ピリジル置換ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンの化学構造を示す図である。
【図１４】本発明の好ましい実施形態による２−ベンゾチアゾリル置換ベンゾチアゾールジオキセタンの一般的構造を示す図である。
【図１５】本発明によるヘテロアリール置換ベンゾチアゾールジオキセタン化合物の第２実施形態の一般的構造を示す図である。
【図１６】３−ピリジル置換ベンゾチアゾール１，２−ジオキセタンを合成するための第１経路を示す図である。
【図１７】３−ピリジル置換ベンゾチアゾール１、２−ジオキセタンを合成するための第２経路を示す図である。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005502688.tif 000092
2005502688.tif 000093