(57)【要約】ストレス応答、生殖、および男性胎児の性的分化に必要とされる、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）、ミトコンドリアタンパク質は、マトリクス内のその最終的な休止位置中ではなく、ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）において、その活性を一時的に発揮し、そのＯＭＭ滞留時間および活性は、そのミトコンドリア輸送の速度によって調節されることが示されている。これは、ミトコンドリアタンパク質が、最終目的地以外の区画でその生物学的活性を発揮した最初の例である可能性がある。ステロイド産生細胞が高レベルのステロイド産生を数分以内に開始および停止させることを可能にする、この特有の系は、血清ステロイドホルモン濃度の迅速な調節を可能にし、したがって、ＳｔＡＲタンパク質のリーダー配列とＯＭＭ上のその受容体の結合を変化させることによって操作することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞プロセスの作用部位に対応する細胞における位置を同定するための方法であって、
前記細胞プロセスの推定作用部位であるオルガネラを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、前記細胞プロセスにおいて重要なタンパク質を発現させることを含む方法。
【請求項２】
ミトコンドリアタンパク質の生物学的活性部位に対応するミトコンドリア区画を同定するための方法であって、
宿主細胞を、（ａ）前記ミトコンドリアタンパク質をコードする第１の核酸、および前記ミトコンドリアタンパク質を、ミトコンドリア外膜、ミトコンドリア内膜、膜間腔、およびマトリクスからなる群から選択されるミトコンドリア区画に固定するための手段、および（ｂ）前記ミトコンドリアタンパク質の生物学的活性を評価するためのレポーター系をコードする第２の核酸で共トランスフェクトすることであって、第１、第２、第３および第４のトランスフェクト宿主細胞をそれぞれ生成させること、
前記第１および第２の核酸を発現させて、前記第２の核酸のみを発現する対照トランスフェクト宿主細胞と比較した場合の、それぞれのトランスフェクト宿主細胞によって生成される前記レポーター系の発現産物の量が、それぞれのミトコンドリア区画中の前記ミトコンドリアタンパク質の生物学的活性の指標を示すことを含む方法。
【請求項３】
さらに、
前記第１、第２、第３および第４のトランスフェクト宿主細胞の発現産物が輸送されているミトコンドリアを含む無細胞系において、前記生物学的活性を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＳｔＡＲミトコンドリアのリーダー配列および前記リーダー配列の受容体を含む、受容体−リガンド複合体を得るための方法であって、
前記リーダー配列と、ミトコンドリア外膜の細胞質側に前記タンパク質を固定する手段と結合した、完全長までの前記ＳｔＡＲタンパク質とを含む機能性ＳｔＡＲタンパク質を、前記受容体の供給源と組み合わせること；および前記受容体−リガンド複合体を回収することを含む方法。
【請求項５】
前記受容体がステロイド産生宿主細胞中に含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記機能性ＳｔＡＲタンパク質が無細胞系中で発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１のサブユニットとして電位依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）を含む、単離ミトコンドリアＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質。
【請求項８】
前記ＶＤＡＣがＶＤＡＣ１またはＶＤＡＣ３を含む、請求項７に記載の単離ミトコンドリアＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質。
【請求項９】
前記結合タンパク質が１つまたは複数の他のサブユニットとして、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰキャリヤータンパク質、およびグルコース調節タンパク質７８からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質を含む、請求項７に記載の単離ミトコンドリアＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質。
【請求項１０】
前記受容体／結合タンパク質が、ヒトステロイド産生細胞から得ることができる、請求項７に記載の単離ミトコンドリアＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質。
【請求項１１】
ＳｔＡＲリーダー配列、および請求項７乃至１０のいずれか１項に記載のＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質を含む、単離複合体。
【請求項１２】
ＳｔＡＲミトコンドリアのリーダー配列の受容体を含む、組換え非ステロイド産生宿主細胞。
【請求項１３】
ステロイド産生宿主細胞における増強されたステロイド生成のための方法であって、
前記ステロイド産生宿主細胞を、生物学的に活性があるＳｔＡＲタンパク質をコードする核酸、およびミトコンドリア外膜の細胞質側に前記ＳｔＡＲタンパク質を固定するための手段でトランスフェクトすること、および
前記宿主細胞を増殖させることであって、充分なステロイド産生を得ることを含む方法。
【請求項１４】
前記ステロイド産生宿主細胞が、ライジヒ細胞、卵巣濾胞細胞、および子宮内膜細胞からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
非ステロイド産生動物宿主細胞において、プレグネノロンを生成するための方法であって、
前記宿主細胞を、（ａ）生物学的に活性があるＳｔＡＲタンパク質、またはＳｔＡＲタンパク質のドメインとほぼ同一である機能性ドメインを有し、ＳｔＡＲ様ステロイド産生活性を有する第２のタンパク質、および前記ＳｔＡＲタンパク質をミトコンドリア外膜の細胞質側に固定するための手段、および（ｂ）コレステロール側鎖切断酵素系をコードする第２の核酸で共トランスフェクトすること、
前記細胞を増殖させて、プレグネノロンを生成させることを含む方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞がＣＯＳ−１細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のタンパク質がＭＬＮ６４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
末梢のステロイド産生を変える化合物をスクリーニングするための方法であって、
ステロイドホルモンまたはその前駆体を産生するＭＬＮ６４を含む非ステロイド産生細胞を、試験化合物を接触させることを含み、前記ホルモンの産生の速度または量の変化が、末梢のステロイド産生を変える試験化合物の指標である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、ＮＨＩの助成金ＤＫ３７９２２、ＤＫ０２７６２およびＮＳ３７３６５により支援されたものである。米国政府は、本発明における権利を有するものとする。
【０００２】
本発明の分野は、ステロイド産生細胞のミトコンドリアへのコレステロール輸送を調節する部位を同定し使用するための、組成物および方法に関する。具体的には本発明の方法は、ＳｔＡＲタンパク質の生物学的作用部位であるミトコンドリア外膜上の受容体を同定すること、ＳｔＡＲタンパク質の融合体を使用することである。ＳｔＡＲタンパク質の融合体の使用はミトコンドリア外膜上での滞留時間を変化させてＳｔＡＲタンパク質の活性を変化させ、それによってステロイド産生速度を変える。
【背景技術】
【０００３】
ステロイド産生細胞中での、ホルモンで誘導されｃＡＭＰが仲介するステロイドホルモン生産性の急性調節は、細胞の貯蔵所からミトコンドリアの外膜へコレステロールが移動し、コレステロールがミトコンドリアの内膜へ移送されそこでコレステロールのプレグネノロンへの転換が起こることが特徴である。このプロセスは、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）によって調節される。ＳｔＡＲ発現は、ミトコンドリアでのステロールヒドロキシル化反応を行う器官（ミトコンドリアでのステロールヒドロキシル化反応はｃＡＭＰの仲介によって作用する刺激ホルモンによる急性調節下にある）、たとえば副腎や性腺（これらの器官は、その各々の下垂体刺激ホルモンＡＣＴＨおよびＬＨに応答して、コレステロール側鎖の切断を促進する）、およびＰＴＨに応答してビタミンＤの１．α．ヒドロキシル化を増大させる腎臓などである。ステロイド産生組織における鉱質コルチコイド、糖質コルチコイド、および性ホルモンの生成は、ＳｔＡＲの発現に依存している。
【０００４】
輸送中、ミトコンドリアタンパク質は典型的には、ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）と結合したＴｏｍ（トランスロカーゼ、外膜）タンパク質、およびミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）と結合したＴｉｍ（トランスロカーゼ、内膜）タンパク質からなるタンパク質輸送機構によって加工処理され（Ｓｃｈａｔｚ、Ｇ．＆Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ、Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１、１５１９〜１５２６（１９９６）；Ｎｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、８６３〜９１７（１９９７）；Ｂａｕｅｒ、Ｍ．Ｆ．＆  Ｎｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ｊ  Ｉｎｈｅｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ  ２４、１６６〜１８０（２００１））、４つのミトコンドリア内の区画、ＯＭＭ（ミトコンドリア外膜）、ＩＭＭ（ミトコンドリア内膜）、ＩＭＳ（ミトコンドリア膜間腔）、およびマトリクスのどれか１つに振り向けられ、そこでタンパク質が機能する。大部分のミトコンドリアタンパク質と同様に、ＳｔＡＲは細胞質リボソーム上で合成され、ミトコンドリアに輸送され、そこでマトリクスに導入される。しかしながら、ＳｔＡＲ作用の機構および部位は議論の多いところで、その機構および作用部位を決定するための方法および組成物を開発することは意義がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでのステロイド産生の調節法およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステロイドホルモンの産生法も意義がある。
【非特許文献１】Ｓｃｈａｔｚ、Ｇ．＆Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ、Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１、１５１９〜１５２６（１９９６）
【非特許文献２】Ｎｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、８６３〜９１７（１９９７）
【非特許文献３】Ｂａｕｅｒ、Ｍ．Ｆ．＆  Ｎｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ｊ  Ｉｎｈｅｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ  ２４、１６６〜１８０（２００１）
【特許文献１】米国特許第５，９８９，９２１号
【特許文献２】米国特許第４，８０６，４８８号
【特許文献３】米国特許第４，３１８，７０７号
【特許文献４】米国特許第４，２５５，３２９号
【特許文献５】米国特許第４，２３３，４０２号
【特許文献６】米国特許第４，１９９，５５９号
【非特許文献４】ＰｅｒａｒａおよびＬｉｎｇａｐｐａ（１９８５）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：２２９２〜２３０１
【非特許文献５】Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（１９９９）１３：１５
【非特許文献６】Ｓｍｕｔｚｅｒ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（２００１）１５：２２
【非特許文献７】ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ
【非特許文献８】ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ
【非特許文献９】ｗｗｗ．ｂｉｏｃｂｅｍ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍ
【特許文献７】米国特許第５，９９８，１６３号
【特許文献８】米国特許第５，９９８，１３６号
【特許文献９】米国特許第５，９８９，８３３号
【非特許文献１０】Ｇｏｒｌｉｃｈ他、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７、４７〜５２
【非特許文献１１】ＧｏｒｌｉｃｈおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５、６１５〜６３０
【非特許文献１２】Ｈａｎｅｉｎ他、（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７、７２１〜７３２
【特許文献１０】米国特許第５，６３１，７３４号
【特許文献１１】米国特許第５，８５６，１０２号
【特許文献１２】米国特許第５，９１９，５２３号
【非特許文献１３】Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ．他、Ｉｎｃｏｒｒｅｃｔ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳｔＡＲ）ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｌｉｐｏｉｄ  ａｄｒｅｎａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７、９７６８〜９７７５（１９９８）
【非特許文献１４】Ｈｕｒｔ、Ｅ．Ｃ．他、Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｗｅｌｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｈａｌｆ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｏｆ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ．ＥＭＢＯ  Ｊ．４；２０６１〜２０６８（１９８５）
【非特許文献１５】Ｃｈｕｎｇ、Ｂ．，Ｍａｔｔｅｓｏｎ他、Ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｅｎｚｙｍｅ、Ｐ４５０ｓｃｃ：ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １５、ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、８９６２〜８９６６（１９８６）
【非特許文献１６】Ｓｔｏｃｃｏ、Ｄ．Ｍ．＆  Ｃｌａｒｋ、Ｂ．Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｉｎ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１７、２２１〜２４４（１９９６））
【非特許文献１７】Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ．他、Ｎ−２１８  ＭＬＮ６４、ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ＳｔＡＲ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｆｏｌｄｅｄ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｓｉｍｉｌａｒｌｙ  ｔｏ  ＳｔＡＲ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００）
【非特許文献１８】Ｃｈｕｃｋ  Ｓ．＆  Ｌｉｎｇａｐｐａ、Ｖ．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ３５６；１１５〜１１６．（１９９２）
【非特許文献１９】Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳｔＡＲ、ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｍｏｌｔｅｎ  ｇｌｏｂｕｌｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、７２５０〜７２５５（１９９９）
【非特許文献２０】Ａｒｔｅｍｅｎｋｏ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６５８３〜４６５９６（２００１）
【非特許文献２１】Ａｂｅ、Ｙ．他、Ｃｅｌｌ  １００、５５１〜５６０（２０００）
【非特許文献２２】Ｊ．Ａ．Ｈａｒｉｋｒｉｓｈｎａ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２、３７１（１９９３）
【非特許文献２３】Ｒａｐｏｐｏｒｔ、Ｄ．およびＮｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４６、３２１〜３３１（１９９９）
【非特許文献２４】Ｌｉ、Ｊ．Ｍ．およびＳｈｏｒｅ、Ｇ．Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６、１８１５〜１８１７（１９９２）
【非特許文献２５】Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ、Ｃ．他、ＭｏｌＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１、２３３７〜２３４８（２００１）
【非特許文献２６】Ｒｅｇａｎ  ＣＩ、他、Ｉｎ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ．Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｄａｒｌｙ−Ｕｓｍａｒ、Ｖ．Ｍ．、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ；Ｄ．＆Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ．Ｔ．）７９〜１１２（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ、１９８７）
【非特許文献２７】Ｌｕｃｉａｎｏ、Ｐ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０；４０９９〜４０１６（２００１）
【非特許文献２８】Ｔｓｕｊｉｓｈｉｔａ、Ｙ．、Ｈｕｒｌｅｙ、Ｊ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ７、４０８〜４１４（２０００）
【非特許文献２９】Ｃｏｌｏｍｂｉｎｉ他、（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９０５：２７９〜２８６
【非特許文献３０】Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  ＪＭｅｄ３３５、１８７０〜１８７８（１９９６）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
無細胞転写／翻訳系を使用して、ステロイド産生を調節するミトコンドリアタンパク質の生物学的作用部位を同定するための方法および組成物、このようにして同定した組成物、ならびに組成物の使用法を提供する。また、ステロイド産生を調整するため、ステロイドホルモンの生成を増大させるため、およびステロイド産生率を変化させる特異的因子を同定するための方法および組成物も提供する。ステロイド産生を調節するミトコンドリアタンパク質の生物学的作用部位を同定するための方法は、４つのミトコンドリア区画の１つにそのタンパク質を固定する手段によって、融合タンパク質としてそのミトコンドリアタンパク質を発現させる工程、およびそのそれぞれの固定タンパク質と関係があるステロイド生成物の量を無細胞系において測定する工程を含む。ＳｔＡＲなどのミトコンドリアタンパク質に対する受容体／結合タンパク質を使用して、アゴニストおよびアンタゴニストを始めとする受容体と相互作用するリガンドをスクリーニングすることができ、これらはステロイド産生の調節、およびミトコンドリアタンパク質と受容体／結合タンパク質の間の相互作用と関連がある他の活性の調節に用途が見出される。受容体／結合タンパク質の１つまたは複数のサブユニットの相互作用、および／またはミトコンドリアタンパク質との結合は、ステロイド産生経路の活性の指標として使用することができ、この経路の阻害を使用して、ステロイド産生を含めた活性化経路中の酵素を阻害または促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
単離オルガネラを加えた無細胞転写−翻訳系を使用して、オルガネラ中、例えばミトコンドリア、でのそのタンパク質の生物学的活性部位を解明するための方法および組成物を記載する。特に興味深いタンパク質として、合成または分解の生物学的経路、例えば卵巣、精巣および腎臓中のステロイド産生細胞におけるステロイド産生経路、の律速段階を触媒するタンパク質、および単離されたミトコンドリアＳｔＡＲの受容体／結合タンパク質がある。ミトコンドリアＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質は第１のサブユニットとして電位依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）のＶＤＡＣ１またはＶＤＡＣ３を含む。これは特にステロイド産生細胞、それも好ましくは霊長類細胞、より好ましくはヒト細胞から得ることができる。ＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質はほかに１つまたは複数のサブユニットを含むことができるが、それにはアデニンヌクレオチドトランスロケーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＴＰキャリヤータンパク質、およびグルコース調節タンパク質７８のうちの１つまたは複数のタンパク質が含まれる。また、受容体／結合タンパク質中のＶＤＡＣおよび／またはサブユニットの１つ又は複数と結合し、ステロイド産生活性を調節するＳｔＡＲリーダー配列、またはその断片を含む単離された複合体も興味深い。この１つまたは複数のサブユニットには、ＶＤＡＣが含まれることが好ましい。ＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質と結合し、ステロイド産生および／またはステロイド産生経路の他の活性を調節する、非ペプチドリガンドも興味深い。リガンドは、受容体／結合タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストであってよい。
【０００７】
この無細胞法は、特定のタンパク質の作用部位を突き止める手段として、既存の系よりもいくつかの点で優れている。特にその部位が、そのタンパク質が最終的に導かれる場所とは違う場合に優れている。この方法を使用して、任意の他の方法では現在検出不可能である中間体を検出し、それらを精製および／または単離することができる。「中間体（ｔｒａｎｓｍｅｄｉａｔｅｓ）」とは、生物学的活性のカスケードにおける一過的な中間体を意味する。ある生物学的経路において以前に知られていない中間複合体を同定することによって、その複合体を形成する受容体およびそのリガンドなどの特異的結合の１対は、例えば経路の活性を変化させる手段として、生物学的経路と関連がある疾患を治療するための推定薬剤の標的として、および疾患に付随する症状の潜在的な原因として、検討することができる。
【０００８】
多量の機能性タンパク質を生成し単離するには、これらのタンパク質を産生させるための組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換する。宿主細胞は、それらの細胞に天然に存在するそのタンパク質の遺伝子を実質的に欠失させた、遺伝子工学処理した細胞であってよい。無細胞系において有効な、その機能性タンパク質を生成させるための宿主細胞は、その組換えタンパク質を収容する能力を有する任意の細胞に由来するものでよい。しかしながら好ましい宿主細胞は、そのタンパク質を自然に産生する宿主細胞である。
【０００９】
したがってそのタンパク質がステロイド産生経路の酵素で、精巣のライジヒ細胞などのステロイド産生細胞のミトコンドリアへ送り込まれるものである場合、このような細胞は好ましい宿主細胞であろう。例えば、マウスＭＡ−１０細胞系などの培養ライジヒ細胞である。宿主細胞は、集合的にそのタンパク質が属する生物学的経路の最終産物の生産を行える１組の機能性タンパク質の１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のベクターで形質転換することができる。ベクターは、その経路の構成要素の本来または雑種の組合せ（そのタンパク質を、特定の細胞またはオルガネラ区画に固定する手段など）、および／またはそれらの突然変異体を含むことができる。
【００１０】
そのタンパク質をコードする核酸を含む組換えベクターは、当分野で知られている技法を使用して容易に作製することができる。例えば、ＳｔＡＲタンパク質やＳｔＡＲリーダー配列の受容体をコードする遺伝子は、この遺伝子を発現する細胞に由来するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニング、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を得るなどの組換え法を使用して、この遺伝子を発現する任意の細胞から得ることができる。次いで遺伝子を単離し、標準的な技法を使用して、他の望ましい核酸配列と組み合わせることができる。問題の遺伝子が適切な発現ベクター中に既に存在する場合、それをｉｎ  ｓｉｔｕで、例えば他の核酸配列と、望むように組み合わせることもできる。遺伝子はクローニングではなく、産生によってつくることもできる。ヌクレオチド配列は、望ましい特定のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計することができる。一般に、その中で配列が発現される宿主に合わせて好ましいコドンが選択される。完全な配列は、標準的方法により作製した重複部分のあるオリゴヌクレオチドから完全なコード配列に組み立てることができる。
【００１１】
本来の核酸配列に突然変異をおこさせて、このような突然変異体を本来の配列の代わりに、例えば生物学的活性に必要とされる領域を同定するために、使用することができる。このような突然変異は、従来の技法を使用して、例えば突然変異を含む合成オリゴヌクレオチドを作製し、制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化を使用して、突然変異配列を遺伝子に挿入することなどによって、本来の配列に導入できる。あるいは、本来のヌクレオチド配列（一般にＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）とハイブリダイズする、ミスマッチプライマー（一般に１０〜２０個のヌクレオチド長）を使用して、ミスマッチ二重鎖の融解温度未満の温度で、突然変異を起こすこともできる。プライマーは、プライマー長および塩基組成を比較的狭い範囲に保ち、突然変異した塩基が中央にくるようにすることにより、特異的なものとすることができる。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施され、生成物をクローニングし、プライマーの伸長鎖の乖離によって得られた突然変異ＤＮＡを含むクローンを選択する。選択は突然変異プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用して行うことができる。この技法は、多数の点突然変異を生み出すためにも適用可能である。ＰＣＲによる突然変異誘発は、所望の突然変異を起こすのにも使用できる。
【００１２】
本来のあるいは突然変異した遺伝子配列は、当業者に知られている方法を使用して、１つまたは複数の発現ベクター中に挿入することができる。発現ベクターには、所望のコード配列と動作可能に連結させたコントロール配列が含まれる。本発明と共に使用するための適切な発現系は、真核宿主細胞中で機能する系を含む。選択マーカーを組換え発現ベクター中に含めることもできる。形質転換細胞系の選択において有用なさまざまなマーカーが知られており、これらは一般に、適切な選択培地で細胞を増殖させた時に発現した遺伝子が形質転換細胞を選択できるような表現型を与えるような遺伝子を含む。このようなマーカーは、例えば抗生物質耐性または感受性をプラスミドに与える遺伝子を含む。あるいは、そのタンパク質がその要素の１つである生物学的経路によって生じる生成物が容易に検出することができるものである場合、この特徴を形質転換に成功した細胞を選択するための指標として使用することができる。
【００１３】
本発明の組換えベクターを適切な宿主に導入するための方法は当業者に知られており、典型的にはＣａＣｌ２、またはその他の物質例えば二価カチオンおよびＤＭＳＯなどの使用を含む。次に改変されてその機能性タンパク質の発現系を含む細胞を、そのタンパク質を発現させるのに適した条件下で培養する。無細胞系で使用するためのタンパク質が、上記のように組換えによって調製される場合、もし所望のタンパク質が細胞内で生成されるならば関連タンパク質を生成する細胞を集め破壊する。しかしながら、発現系がタンパク質を増殖培地に分泌する場合、タンパク質を培地から直接精製することができる。
【００１４】
タンパク質が分泌されない場合、タンパク質は細胞溶解物から単離することができる。これは一般に、まず細胞成分およびいくつかの外来タンパク質を含まない粗製抽出物を調製し、次いで所望のタンパク質を、例えばカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、免疫吸着技法、または当分野でよく知られている他の従来的方法によって、さらに精製することができる。適切な増殖条件の選択および回収法は、当分野の技術内にある。例えば、そのタンパク質を発現する細胞を増殖させて所定の数にする。次いで細胞を、超音波処理、凍結融解サイクル、または他の同様の技法により破壊して細胞膜を破壊し、粗製無細胞調製物を形成する。粗製無細胞調製物は、この段階ではそのタンパク質の源として使用することができ、あるいは遠心分離、濾過などによってさらに処理して、細胞上清を形成することができる。場合によっては核酸を、例えばポリエチレンイミンを用いた沈殿、またはそのタンパク質の生物学的活性を害さない他の同様の物質によって、細胞上清から除去することができる。調製物はこの段階で使用することができ、あるいは場合によっては、そのタンパク質を、当業者に知られている技法によってさらに精製することができる。単離した未変性タンパク質を使用することができる場合もある。以下に例示するように、精製されたタンパク質を使用して、無細胞系において所望の最終産物を触媒によって産生することができる。無細胞系は、適切な緩衝液中の精製タンパク質、および所望の最終産物の触媒による産生に必要とされる基質を含む。
【００１５】
特定細胞のオルガネラにターゲティングされるタンパク質は一般に、特異的結合の一方のメンバーであるシグナルまたはリーダー配列を有するタンパク質であり、そのもう一方のメンバーは、標的細胞のオルガネラの膜上の受容体である。シグナル配列は通常Ｎ−末端であるが、タンパク質内部またはＣ−末端であってよい。リーダー配列を有するタンパク質は、抗体、抗血清、または好ましくはモノクローナル抗体を生成させるために使用することができる。抗血清および抗体は、宿主（モノクローナル抗体の場合、通常はマウス）を、アジュバントありまたはなしで免疫処置し、次に２週間に１度またはさらに長い間隔で、タンパク質を追加的に注射し、抗血清のレベルを調べることによる、従来の方法で調製する。モノクローナル抗体に関しては、脾細胞を単離、不死化し、スクリーニングすることができる。タンパク質と細胞のオルガネラ膜の結合を阻害することができる抗血清をつくるハイブリドーマを増殖させる。ついでこれらの抗体を使用して、例えば親和性クロマトグラフィーにより、受容体タンパク質を単離することができる。
【００１６】
特異的結合対のメンバーに対する結合親和性は、均質または不均質なアッセイで決定することができる。多数のプロトコルが、複合体形成に関わるリガンドと受容体との結合を検出するために利用可能である。２つのタンパク質を蛍光剤およびエネルギー受容体で標識することができ、その２つのタンパク質が結合すると、蛍光剤の波長での発光のレベルを低下させ、エネルギー受容体のレベルで発光を増大させると思われる。あるいは、これらのタンパク質の１つを表面と結合させて、その結合タンパク質ともう一方のタンパク質との結合のレベルは、第２のタンパク質を標識することにより決定される。あるいは、それぞれのタンパク質を異なる粒子と結合させることができ、この場合１つの粒子がもう１つの粒子を活性化させる化合物を生成する。標識される物体が小さい、例えばオリゴマーまたは小さい有機分子などの場合、蛍光剤を標識として使用することができ、蛍光偏光を検出用に使用する。アッセイの例は、米国特許第５，９８９，９２１号、第４，８０６，４８８号、第４，３１８，７０７号、第４，２５５，３２９号、第４，２３３，４０２号および第４，１９９，５５９号中に記載されるアッセイである。
【００１７】
シグナル配列の結合位置も、その真正コード領域の５’端にこれらのシグナル配列をコードする切詰め型転写産物を無細胞系翻訳によって発現させ、架橋剤（リシンおよびシステイン特異的で開裂可能な架橋剤や開裂できない架橋剤などがあるがこれに限定されない）で化学的架橋したときに生じる架橋パターンを、ドデシル硫酸ナトリウムの免疫沈降およびポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後のオートラジオグラフィーにより分析することによって、決定することができる。
【００１８】
特定の細胞オルガネラとの結合、およびそのオルガネラ内の適切なコンパートメントを研究するために、オルガネラを適切な細胞から単離し、次いでその特定のオルガネラ中に固定されることができる構築体を、無細胞系を使用してオルガネラ中に輸送する。１例として、ＳｔＡＲをミトコンドリア内へ輸送するための無細胞系翻訳の条件は、以前に報告されたウサギ網状赤血球抽出系を使用するものである（ＰｅｒａｒａおよびＬｉｎｇａｐｐａ（１９８５）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：２２９２〜２３０１を参照のこと）。この系は、小麦麦芽の翻訳系、またはアフリカツメガエル卵母細胞の翻訳系などの、他の翻訳系に容易に適合させることができる。多数のこのような分画系の成分を混合し組み合わせることができると、そのタンパク質の生合成に関わる組織特異的な事象を研究することが可能になる。いくつかの無細胞系は、市販されている。総説に関しては、例えばＷｉｌｋｉｎｓｏｎ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（１９９９）１３：１５、およびＳｍｕｔｚｅｒ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（２００１）１５：２２を参照のこと。連結インビトロ転写／翻訳系用のキットに関しては、ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ、ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ、およびｗｗｗ．ｂｉｏｃｂｅｍ．ｒｏｃｈｅ．ｃｏｍも参照のこと。他の参照文献には、米国特許第５，９９８，１６３号、第５，９９８，１３６号、および第５，９８９，８３３号がある。ＥＲ、およびトランスロケーション産物のトランスロケーションに関わる補助タンパク質は、文献中に記載された方法によって、細胞溶解物から除去することができる（Ｇｏｒｌｉｃｈ他、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７、４７〜５２；ＧｏｒｌｉｃｈおよびＲａｐｏｐｏｒｔ、（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５、６１５〜６３０；およびＨａｎｅｉｎ他、（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８７、７２１〜７３２）。
【００１９】
ＳｔＡＲリーダー配列受容体／結合タンパク質と結合することができる、あるいはリーダー配列と受容体／結合タンパク質の結合を阻害する可能性がある非ペプチド小分子は、単離された受容体／結合タンパク質またはリーダー配列を結合させたマトリクス、および／または疾患と関連がある可能性があるこれらのタンパク質のいずれかの突然変異体を結合させたマトリクスを使用することによってスクリーニングすることができる。例えば、米国特許第５，６３１，７３４号、第５，８５６，１０２号、および第５，９１９，５２３号を参照のこと。これらのマトリクスは市販されており、個々の結合パターンに関して調製することができる、すなわち、マトリクス上のタンパク質はアドレス可能である。マトリクスおよび抗体を共に使用して、他のアッセイを確認し、コンホマーを単離し、同じアッセイで一緒に使用することができる。タンパク質は、検出可能な標識、例えば蛍光剤、発光剤、リン光剤、酵素、および放射性同位体などで標識することができる。オリゴペプチドは、その部位で競合する他のオリゴペプチド、また他の化合物、特に小さな有機化合物、天然または合成、５ｋＤａｌ未満、通常は約２．５ｋＤａｌ未満のものを同定するための競合アッセイにおいて使用することができる。次いでこれらの化合物を順次に使用して、受容体／結合タンパク質および／またはリーダー配列に関して高い親和性を有する、他の化合物を同定することができる。
【００２０】
ミトコンドリア外膜上のＳｔＡＲリーダー配列受容体／結合タンパク質に関するＤＮＡを得るための技法は、当業者によく知られている。要約すると、その遺伝子のＤＮＡは、アミノ酸配列がわかれば、縮重プローブを使用することによって単離される。当業者に知られている方法を使用して、受容体／結合タンパク質を単離した後受容体／結合タンパク質のアミノ酸配列を得ることができることは、すでに述べた。プローブと結合するＤＮＡ配列を、単離し配列決定して、望みのタンパク質をコードする配列を同定する。イントロンの存在を避けることを望む場合、ｍＲＮＡを単離し、逆転写し、ＰＣＲを使用して増幅することができる。ひとたび遺伝子ができれば、遺伝子を多数の市販のベクターの１つに導入し、クローニングし、かつ／あるいはセンス鎖の５‘に転写調節領域を有する発現ベクターを使用して、発現を与えることができる。上記したように哺乳動物細胞を使用すれば、受容体／結合タンパク質を産生させ、単離およびアッセイすることができる。このようにして、相当量の受容体／結合タンパク質を単離することができる。
【００２１】
以下の実施例を、本発明を制限するためではなく、例示するために示す。
実施例
方法
ベクターの構築
Ｔｏｍ２０、Ｔｉｍ９およびＴｉｍ４４の相補的ＤＮＡを、ＲＮＡの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）後のＰＣＲによりヒト副腎ＲＮＡから作製した。６３−２８５ＳｔＡＲと融合したエンテロキナーゼリンカーを含むＮ−６２ＳｔＡＲのｃＤＮＡは、細菌の発現ベクターから得た（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ．他、「先天性リポイド副腎皮質過形成におけるステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）の不正なフィールディング」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７、９７６８〜９７７５（１９９８））。Ｔｏｍ／ＳｔＡＲは、ＧＳＤＤＤＤＫを介して６３−２８５と融合したＴｏｍ２０であり、これはＢａｍＨＩおよびエンテロキナーゼ部位（Ｂａｍ／ＥＫリンカー）を含む。ＳｔＡＲ／Ｔｏｍは、ＥｃｏＲＩ／ＥＫリンカー（ＧＦＤＤＤＤＫ）を介してＴｏｍ２０と融合している１−２８５ＳｔＡＲである。Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲは、シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＩＶの２５アミノ酸のミトコンドリアリーダー配列（Ｈｕｒｔ、Ｅ．Ｃ．他、「ミトコンドリアに輸送されるンパク質の始めの１２アミノ酸（プレ配列の半分未満）はマウスの細胞質ジヒドロ葉酸レダクターゼを酵母ミトコンドリアマトリックスに送り込むことができる」ＥＭＢＯ  Ｊ．４；２０６１〜２０６８（１９８５））を含み、これはＢａｍ／ＥＫリンカーを介してＮ−３０ＳｔＡＲと連結したＴｉｍ９と融合している。Ｔｉｍ４４／ＳｔＡＲは、Ｂａｍ／ＥＫリンカーを介して６３−２８５ＳｔＡＲと融合したＴｉｍ４４である。ＳｔＡＲ／ＳｔＡＲは、Ｂａｍ／ＥＫリンカーを介して６３−２８５ＳｔＡＲと融合したＳｔＡＲである。Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲおよびＳｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲに関しては、ヒトＰ４５０ｓｃｃのアミノ酸１〜３９をコードするｃＤＮＡ（Ｃｈｕｎｇ、Ｂ．，Ｍａｔｔｅｓｏｎ他、「ヒトコレステロール側鎖開裂酵素、Ｐ４５０ｓｃｃ：ｃＤＮＡクローニング、遺伝子の第１５染色体への帰属、および胎盤での発現」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３、８９６２〜８９６６（１９８６））を、Ｎ−３０ＳｔＡＲまたはＮ−６２ＳｔＡＲと直接融合させた。Ｄｅｌ  ＳｔＡＲは、ＳｔＡＲ残基１〜３０を６３−２８５ＳｔＡＲと直接融合させたものである。配列決定、およびｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨｌ／ＥｃｏＲＩ部位中での発現により、構築体を確認した。
【００２２】
細胞培養
（Ｓｔｏｃｃｏ、Ｄ．Ｍ．＆  Ｃｌａｒｋ、Ｂ．Ｊ．「ステロイド産生細胞におけるステロイドの急性産生調節」Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１７、２２１〜２４４（１９９６））、（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ．他、「ＳｔＡＲ様ステロイド産生活性を有するタンパク質Ｎ−２１８ＭＬＮ６４はＳｔＡＲと同様に折りたたまれ切断される」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））に記載されたように、ＣＯＳ−１細胞を増殖させ、トランスフェクトし、プレグネノロン生成に関してアッセイした。３つの独立したトランスフェクションを各３連でそれぞれの構築体に関して行った。
【００２３】
タンパク質輸送アッセイ
Ｃｈｕｃｋ  Ｓ．＆  Ｌｉｎｇａｐｐａ、Ｖ．「アポリポプロテインＢ中間体」  Ｎａｔｕｒｅ  ３５６；１１５〜１１６．（１９９２）に記載されたのと同様に、ＳｔＡＲ構築体をｐＳＰ６のＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写し、［３５Ｓ］メチオニンの存在下で翻訳した。低浸透圧ショックおよびホモジナイズによって、５£１０６  ＭＡ−１０またはＣＯＳ−１細胞から単離したミトコンドリア（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、「ＳｔＡＲ様ステロイド産生活性を有するタンパク質Ｎ−２１８ＭＬＮ６４はＳｔＡＲと同様に折りたたまれ切断される」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））を、１２５ｍＭのスクロース、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０５ｍＭのＡＤＰ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのコハク酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭのＫＨ２Ｐ０４、および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４の１００ｍ１中に懸濁させた。ミトコンドリア（５０ｍｌ）および１ｍｌの転写／翻訳産物の混合物を、２６．８℃においてさまざまな時間インキュベートし、１ｍｌの１ｍＭ  ｍＣＣＣＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて輸送を停止させた。ミトコンドリアの一部を、４．８℃で１５分間、新鮮な１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．５を用いて抽出し、４．８℃において１５分間１５，０００ｇで遠心分離にかけて、膜をペレット状にした。膜の一部を、０．１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）と共に４．８℃において１５分間インキュベートして、４．８℃において１４４，０００ｇで遠心分離にかけて、ＯＭＭ断片をペレット状にした。マイトプラスト調製：ミトコンドリアを、１Ｕのトリプシンと共に４．８℃において１５分間インキュベートし、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０Ｕのダイズトリプシン阻害剤を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５で洗浄し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中で、４．８℃において３０分間浸透圧によるショックを与えた（ｒｅｆ．３０）。分析は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、およびphosphorimagerによる定量化（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｔｏｒｍ  ８６０）によって行った。
【００２４】
単離ミトコンドリアの活性
ＳｔＡＲ構築体を、ＭＡ−１０ミトコンドリアを用いてバイオアッセイした（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、「ＳｔＡＲ様ステロイド産生活性を有するタンパク質Ｎ−２１８ＭＬＮ６４はＳｔＡＲと同様に折りたたまれ切断される」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））。転写／翻訳共役系をミトコンドリアに直接加えたが、Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲを抗ＳｔＡＲ抗血清と共に免疫沈降させた場合（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、「ステロイド産生急性調節タンパク質ＳｔＡＲの活性型は溶融球のようにみえる」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、７２５０〜７２５５（１９９９））は、タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて回収し、洗浄し、ｐＨ３．０においてセファロース−抗体複合体から解離させ、中和し、ミトコンドリアに直接加えた。プレグネノロンのイムノアッセイを、３７．８℃で１時間のインキュベーション後に行い；免疫ブロッティングは、（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、「ＳｔＡＲ様ステロイド産生活性を有するタンパク質Ｎ−２１８ＭＬＮ６４はＳｔＡＲと同様に折りたたまれ切断される」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））に記載されたのと同様に行った。
【実施例１】
【００２５】
ＳｔＡＲのミトコンドリア外膜への固定によって、ステロイド産生活性が増大する
ミトコンドリアタンパク質ＳｔＡＲの生物学的活性の位置を決定するために、野生型ＳｔＡＲタンパク質、Ｎ末端が欠失したＳｔＡＲタンパク質、ならびにＳｔＡＲタンパク質を４つのミトコンドリア区画の１つに固定する働きがあると思われるタンパク質と融合させたＳｔＡＲタンパク質を、それらがステロイド産生を触媒する能力に関して評価した。（Ｓｔｏｃｃｏ、Ｄ．Ｍ．およびＣｌａｒｋ、Ｂ．Ｊ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ１７、２２１〜２４４．（１９９６）；Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３９、１１７２２−１１７３１（２０００））に記載されたのと同様に、非ステロイド産生性ＣＯＳ−１サル腎臓細胞を培養し、トランスフェクトし、プレグネノロン生成に関してアッセイした。各構築体について３回の独立したトランスフェクションを３連で行った。細胞は、完全長ＳｔＡＲを発現するベクター、またはＮ−６２ＳｔＡＲ、Ｔｏｍ−ＳｔＡＲ、ＳｔＡＲ−Ｔｏｍ、Ｔｉｍ４４−ＳｔＡＲ、またはＴｉｍ９−ＳｔＡＲを発現するベクターでトランスフェクトした。Ｔｏｍ２０、Ｔｉｍ９およびＴｉｍ４４のｃＤＮＡはＲＴ−ＰＣＲによりヒト副腎ＲＮＡから作製した。エンテロキナーゼリンカーを含み６３−２８５ＳｔＡＲと融合したＮ−６２ＳｔＡＲのｃＤＮＡは細菌の発現ベクターから得た（Ａｒｔｅｍｅｎｋｏ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４６５８３〜４６５９６（２００１）を参照のこと）。Ｔｏｍ／ＳｔＡＲは、Ｔｏｍ２０がＧＳＤＤＤＤＫによって６３−２８５ＳｔＡＲと融合したものであり、ＢａｍＨＩおよびエンテロキナーゼ部位（Ｂａｍ／ＥＫリンカー）を含む。ＳｔＡＲ／Ｔｏｍは、１−２８５ＳｔＡＲがＥｃｏＲＩ／ＥＫリンカー（ＧＦＤＤＤＤＫ）を介してＴｏｍ２０と融合したものである。Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲは、シトクロームｃオキシダーゼサブユニットＩＶの２５アミノ酸のミトコンドリアリーダー配列（Ｂｏｓｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：９７６８〜９７７５（１９９８））を含み、これはＴｉｍ９に融合しておりＴｉｍ９はＢａｍ／ＥＫリンカーを介してＮ−３０ＳｔＡＲと連結している。Ｔｉｍ４４／ＳｔＡＲは、Ｔｉｍ４４がＢａｍ／ＥＫリンカーによって６３−２８５ＳｔＡＲに融合したものである。Ｔｏｍ２０は、５０個のアミノ末端側残基がＯＭＭ中に埋まっており、細胞質中に９５個の残基を有する（Ａｂｅ、Ｙ．他、Ｃｅｌｌ  １００、５５１〜５６０（２０００））。Ｔｏｍ２０のカルボキシ末端に融合したＮ−６２ＳｔＡＲ（Ｔｏｍ／ＳｔＡＲ）の発現によって、ＳｔＡＲがＯＭＭの細胞質側に固定された。通常はＩＭＳに拘束されているＴｉｍ９（Ｂａｕｅｒ他、Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２４：１６６〜１８０（２００１））に融合したＮ−３０ＳｔＡＲ（Ｔｉｍ９／ＳＣＡＲ）の発現によって、ＳｔＡＲをＩＭＳに局在させた。ＩＭＭのマトリクス側に存在するＴｉｍ４４に融合させたＮ−６２ＳｔＡＲ（Ｔｉｍ４４／ＳｔＡＲ）の発現によって、ＳｔＡＲはマトリクスに送り込まれた。これらの細胞を、Ｆ２と呼ばれる融合タンパク質を発現するｐＥＣＥベクターで共トランスフェクトした。Ｆ２はヒトコレステロール側鎖切断系であるＨ２Ｎ−Ｐ４５０ｓｃｃ−アドレノドキシン還元酵素−アドレノドキシン−ＣＯＯＨからなる（Ｊ．Ａ．Ｈａｒｉｋｒｉｓｈｎａ他、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２、３７１（１９９３））。基質は内在性細胞のコレステロール、または加えた２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール（２２Ｒ−ＯＨ．）であった。４８時間のインキュベーションの後、培地を回収し、プレグネノロンに関してアッセイした。
【００２６】
ヒトＳｔＡＲに対する抗血清を用いたウエスタンブロットによって、それぞれのＳｔＡＲ構築体が等しいレベルで発現されたことが示された（データ示さず）。Ｆ２単独の発現によって、低レベルのＳｔＡＲ非依存性ステロイド産生が示された。ＳｔＡＲの作用を迂回する２２Ｒ−ＯＨ−コレステロールとインキュベーションすると、ＳｔＡＲ非依存性レベルのおよそ２０倍を超える、最大のステロイド産生能力が示された（図１ａ）。Ｆ２と完全長（１−２８５）ＳｔＡＲ、またはＮ−６２ＳｔＡＲの同時発現によって、Ｆ２単独で見られたＳｔＡＲ非依存性レベルの６倍または２２Ｒ−ＯＨ−コレステロールで見られた細胞の最大能力の約半分のステロイド産生がみられた。Ｔｏｍ／ＳｔＡＲをＦ２と同時発現させると、外から加えた２２Ｒ−ＯＨ−コレステロールで見られたものと等しい最大のステロイド産生が得られた。対照的にＳｔＡＲ／Ｔｏｍ、Ｔｉｍ４４／ＳｔＡＲ、およびＴｉｍ９／ＳｔＡＲが、ステロイド産生を増大させることはなかった。したがって、ＳｔＡＲをＯＭＭに局在させると活性を実質的に増大させたが、ＩＭＳまたはマトリクスに局在させたＳｔＡＲは不活性であった。これらの結果は、図１ａに示す。
【００２７】
ＳｔＡＲ構築体を、ＭＡ−１０ミトコンドリアを用いてバイオアッセイした（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ：３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））。転写／翻訳共役系はミトコンドリアに直接加えたが、Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲを抗ＳｔＡＲ抗血清と共に免疫沈降させた場合は（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、７２５０〜７２５５（１９９９））、タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて回収し、洗浄し、ｐＨ３．０においてセファロース−抗体複合体から解離させ、中和し、ミトコンドリアに直接加えた。プレグネノロンのイムノアッセイを、３７°で１時間のインキュベーション後に行い；免疫ブロッティングは、（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））に記載されたのと同様に行った。
【００２８】
Ｃｈｕｃｋ、Ｓ．およびＬｉｎｇａｐｐａ、Ｖ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６、１１５〜６（１９９２）に記載されたのと同様に、ＳｔＡＲ構築体をｐＳＰ６のＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲ１部位にクローニングし、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写し、３５Ｓメチオニンの存在下で翻訳した。低浸透圧ショックおよびホモジナイズによって、５×１０６個のＭＡ−１０またはＣＯＳ−１細胞から単離したミトコンドリア（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００））を、１２５ｍＭのスクロース、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０５ｍＭのＡＤＰ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのコハク酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４の１００□ｌ中に懸濁させた。ミトコンドリア（５０μｌ）および１μｌの転写／翻訳産物の混合物を、２６℃においてさまざまな時間インキュベートし、１μｌの１ｍＭ  ｍＣＣＣＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて輸送を停止させた。ミトコンドリアの一部を、４℃で１５分間、新鮮な１００ｍＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．５を用いて抽出し、４℃において１５分間１５，０００×ｇで遠心分離にかけて、膜をペレット状にした。膜の一部を、０．１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃において１５分間インキュベートして、４℃において１４４，０００×ｇで遠心分離にかけて、ＯＭＭ断片をペレット状にした。
【００２９】
ミトコンドリアの輸送アッセイ（Ｒａｐｏｐｏｒｔ、Ｄ．およびＮｅｕｐｅｒｔ、Ｗ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４６、３２１〜３３１（１９９９））は、Ｔｏｍ／ＳｔＡＲがＯＭＭと結合することを示す。共役転写／翻訳系によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでつくられた完全長３５Ｓ−ＳｔＡＲは、マウスのライジヒＭＡ−１０細胞のミトコンドリア中に輸送され、ミトコンドリアのペレットと結合している３０ｋＤａの形に切断された。タンパク質の相互作用を破壊するが脂質−タンパク質の相互作用は破壊しないＮａ２ＣＯ３を用いた抽出（Ｌｉ、Ｊ．Ｍ．およびＳｈｏｒｅ、Ｇ．Ｃ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６、１８１５〜１８１７（１９９２）；Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ、Ｃ．他、ＭｏｌＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１、２３３７〜２３４８（２００１））によって、輸送された３０ｋＤａのＳｔＡＲ形、およびいくつかの３７ｋＤａのタンパク質は、脂質膜に結合したことが示された（図１ｂ）。ミトコンドリア外３７ｋＤａのものは、プロテイナーゼＫに対して部分的に感受性があり、それがＯＭＭと固く結合していることを示唆している。ミトコンドリア内の３０ｋＤａのＳｔＡＲは、プロテイナーゼＫに対して全く感受性がない。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いた膜の可溶化によって、両方の形をプロテイナーゼ感受性にすることが示唆される（図１ｃ）。Ｎａ２ＣＯ３を用いて抽出しても３５ＳＴｏｍ／ＳｔＡＲがＯＭＭから解離することはなかったので、３５ＳＴｏｍ／ＳｔＡＲもミトコンドリアと結合した（図１ｄ）。炭酸（塩）処理後のペレットをジギトニンを用いて抽出すると、ＩＭＭは溶かすが、ＯＭＭは溶けない（Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ、Ｃ．他、ＭｏｌＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１、２３３７〜２３４８（２００１）；Ｒｅｇａｎ  ＣＩ、他、Ｉｎ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ．Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｄａｒｌｙ−Ｕｓｍａｒ、Ｖ．Ｍ．、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ；Ｄ．＆Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ．Ｔ．）７９〜１１２（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ、１９８７））（図１ｅ）、ジギトニンは、３５ＳＴｏｍ／ＳｔＡＲを溶かさなかった（図１ｄ）。したがって、Ｔｏｍ／ＳｔＡＲはミトコンドリア外膜には取り込まれたが、ミトコンドリア内膜には取り込まれず、そこで実質的に増大したＳｔＡＲ活性を示す。この取り込みには膜脂質との相互作用が必要である。
【実施例２】
【００３０】
ＳｔＡＲは膜内空間中では不活性である
マイトプラストは以下のように調製した。ミトコンドリアを、１Ｕのトリプシンと共に４℃において１５分間インキュベートし、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０Ｕのダイズトリプシン阻害剤を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ６．５で洗浄し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５中で、４℃において３０分間浸透圧によるショックを与えた（Ｌｕｃｉａｎｏ、Ｐ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０；４０９９〜４０１６（２００１））。分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびphosphoringerによる定量化（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｔｏｒｍ  ８６０）によって行った。
【００３１】
ミトコンドリアの輸送（前に記載したもの）を行った後ＯＭＭを剥ぎ取ってマイトプラストを生成させたところ、３７ｋＤａのＳｔＡＲは保持されなかったが、３０ｋＤａのＳｔＡＲは保持されたのでマイトプラストの調製が実証された。非切断型のＴｉｍ９／ＳｔＡＲ（４１ｋＤａ）はマイトプラストに結合していたが、プロテイナーゼＫに対して感受性があり、Ｎａ２ＣＯ３によって上清に遊離してくるので、ＩＭＳ中に存在することが示された（図２ａ）。ＩＭＳ中にＴｉｍ９／ＳｔＡＲが存在しても、ＯＭＭの完全性またはミトコンドリア機能が害されることはなかった。なぜなら、Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲが、完全長ＳｔＡＲの輸送（図２ｂ）または活性（データ示さず）を害することはなかったからである。ＯＭＭとマイトプラストを分離すると、それぞれの成分は、それがＳｔＡＲ構築体を含むか否かに関わらずステロイド産生に関しては不活性である。ミトコンドリアを再構成すると、再構成ミトコンドリアは、外からＳｔＡＲを加えるかＯＭＭ画分にＴｏｍ２０／ＳｔＡＲが存在すると活性を示した。マイトプラスト調製物中にＴｉｍ９／ＳｔＡＲが存在してもしなくても活性は変わらず、外から加えたＳｔＡＲはＯＭＭがないマイトプラストでは不活性である（図２ｃ）。Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲはＩＭＳ中では不活性であったが、ＯＭＭ上では活性があった。免疫沈降によって網状赤血球溶解物系から分離したＴｉｍ９／ＳｔＡＲはミトコンドリア内へ輸送されなかったが（図２ｄ）、単離ミトコンドリア上で活性を示した（図２ｅ）。したがってＴｉｍ９／ＳｔＡＲは、そのＩＭＳ局在化のために不活性であり、ミスフォールディングのために本質的に不活性になっている。
【００３２】
ＳｔＡＲ輸送後に単離ミトコンドリアのステロイド産生活性を測定することによって、この無細胞系が、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察されるＳｔＡＲの生成および活性の重要な特徴を忠実に再現することが示される（図２ｆ）。対照の無細胞転写／翻訳系と共にインキュベートしたミトコンドリア、あるいはＴｉｍ９／ＳｔＡＲを発現するミトコンドリアは、最少のステロイド産生をしたが、完全長ＳｔＡＲまたはＮ−６２ＳｔＡＲのいずれかの発現によって、６倍までステロイド産生が増大し、Ｔｏｍ／ＳｔＡＲの発現によって、活性が１５〜２０倍増大した。したがってＴｏｍ／ＳｔＡＲは、細胞中（図１ａ）および単離ミトコンドリア中の両方で、完全長ＳｔＡＲまたはＮ−６２ＳｔＡＲよりもかなり強力である。何人かの研究者は、ＳｔＡＲの活性形と非活性形を大きさ（３０ｋＤａと３７ｋＤａのタンパク質）に基づいて分類しているが、我々のデータは、ＳｔＡＲの活性は、その大きさではなくそのミトコンドリアでの位置によって決定されることを示す。このことは、新たに産生されたＳｔＡＲだけが活性があることを示す、最近のデータと一致する（Ａｒｔｅｍｅｎｋｏ、Ｉ．Ｐ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６；４６５８３〜４６５９６（２００１））。したがって図１は、ＳｔＡＲはＯＭＭ上で活性があることを示し、図２は、ＳｔＡＲがＩＭＳ中では作用することができないことを示す。
【実施例３】
【００３３】
ＳｔＡＲ活性とミトコンドリア輸送の関係
ＳｔＡＲ活性はＯＭＭに限られるので、輸送を遅らせることによって活性が増大するはずである。ＳｔＡＲ残基６３〜１８８はプロテアーゼ耐性であり、ＳｔＡＲの輸送を遅らせる可能性があり（Ｂｏｓｅ．Ｈ．Ｓ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６、７２５０〜７２５５（１９９９））。そこで６３〜１８８の第２のコピーを、６３〜２８５ＳｔＡＲの前に加えた（ＳｔＡＲ／ＳｔＡＲ）。逆に、ＳｔＡＲがミトコンドリアに入るのを加速するために、Ｐ４５０ｓｃｃの３９ＡＡリーダー配列でＳｔＡＲ残基１〜３０を置換した（Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲ）および残基１〜６２を置換した（Ｓｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲ）、残基３１〜６２を野生型ＳｔＡＲから欠失させた（ｄｅｌ−ＳｔＡＲ）。Ｆ２とともにＣＯＳ−１細胞をトランスフェクトすると、ＳｔＡＲ／ＳｔＡＲは、２２Ｒ−ＯＨ−コレステロールに関する活性と等しい活性を得て、Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲは、完全長ＳｔＡＲまたはＮ−６２ＳｔＡＲの約半分の活性を有しており、Ｓｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲおよびｄｅｌ  ＳｔＡＲは、対照と同等であった（図３ａ）。したがって、ミトコンドリア内への輸送を遅らせるよう設計した構築体は活性を増大させ、輸送を速めるよう設計した構築体は活性を低下させた。そこで、ミトコンドリア輸送の動態を評価するために、我々は翻訳／転写によってこれらの構築体それぞれを作製し、それらをＭＡ−１０細胞のミトコンドリアと共に２６℃でインキュベートした（図３ｂ）。この温度はミトコンドリアの輸送を遅らせ、構築体間の比較が容易になる（図３ｃ）。非切断型および切断型輸送タンパク質の、phosphorimagerによる定量化によって、Ｓｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲ＞＞Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲ＞完全長ＳｔＡＲという輸送速度が示された（図３ｄ）。Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲおよびＳｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲ構築体の両方が、完全長からプロテアーゼ耐性ミトコンドリア内３０ｋＤａ形に切断され、ミトコンドリア内に輸送されたことが実証された（図３ｅ）。したがって、活性を低下させたＳｔＡＲリーダー配列突然変異体は、構築体のミトコンドリア輸送を速める。
【実施例４】
【００３４】
完全長ＳｔＡＲとＮ−６２ＳｔＡＲは、同等に活性がある
Ｎ−６２ＳｔＡＲの活性が、トランスフェクト細胞中の過剰発現による人工産物であることが、示唆されてきている（Ｔｓｕｊｉｓｈｉｔａ、Ｙ．、Ｈｕｒｌｅｙ、Ｊ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ７、４０８〜４１４（２０００））。ＣＯＳ−１細胞を、完全長ＳｔＡＲまたはＮ−６２ＳｔＡＲ用の等モル量の発現ベクターでトランスフェクトすると、細胞に与えられるステロイド産生活性は、トランスフェクション後いつ測定しても等しい（図４ａ）。これが等量のタンパク質の活性を反映することを確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳によって生成される野生型、Ｎ−６２、Ｓｃｃ／Ｎ−３０およびＳｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲの量を免疫ブロッティングにより評価し、既知量の細菌に発現されるＮ−６２ＳｔＡＲ２０と比較した（図４ｂ）。
【００３５】
等量のそれぞれのタンパク質を、ＭＡ−１０細胞のミトコンドリアに加えると、完全長ＳｔＡＲとＮ−６２ＳｔＡＲは同等に活性があり、Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲは活性がわずかに低く、Ｓｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲは、野生型またはＮ−６２ＳｔＡＲの約半分の活性を有していた（図４ｃ）。したがって、トランスフェクトされたプラスミドから発現されるＮ−６２ＳｔＡＲの活性は、完全長ＳｔＡＲと等しく、薬剤によるアーティファクトではない。
【実施例５】
【００３６】
ミトコンドリア外膜の同定
ＳｔＡＲ受容体／結合タンパク質
３５Ｓ標識した完全長ＳｔＡＲ（野生型）およびＳＣＣ／Ｎ−６２ＳｔＡＲを、ホモ二官能性架橋剤、ＢＳ３と共に、前に記載したのと同様に得た単離ミトコンドリアの存在下または不在下において、２６℃および４℃でインキュベートした。約８０ｋＤａの新しいタンパク質架橋産物は、２６℃と４℃の両方で、完全長ＳｔＡＲに関してのみ存在する。ミトコンドリアが存在しない場合（左端のレーン）、あるいはＳｔＡＲシグナル配列およびアミノ酸１〜６２（推定ポーズ領域を含む）が、側鎖切断酵素（ＳＣＣ）のものに置換されている場合は、存在しない（図５の右側のパネルを参照のこと）。したがってこの実験はＳｔＡＲのＯＭＭ受容体らしいものを示すが、これは薬剤開発の有用な標的となりうる。この受容体のおよその分子量は４５ｋＤａである。
【００３７】
ＳｔＡＲと受容体／結合タンパク質の結合が、ＳｔＡＲシグナル配列−特異的であったことを確認するため、ミトコンドリア内へのタンパク質輸送の阻害を、ケーニッヒのポリアニオンであるＶＤＡＣ特異的阻害剤を使用して評価した。このポリアニオンは、メタクリレート、マレエートおよびスチレンが１：２：３の比であるコポリマーであり、１０，０００の平均分子量を有する。硫酸デキストランと同様の高い電位依存性に加えて、ポリアニオンは、膜電位がない状態でもＶＤＡＣと結合してＶＤＡＣの閉鎖を誘導する（Ｃｏｌｏｍｂｉｎｉ他、（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ９０５：２７９〜２８６）。５０μｌのＳｔＡＲまたはＳＣＣ−ＳｔＡＲ翻訳産物を、２５０μｇのミトコンドリア（１千万個の細胞のホモジェネートの１０，０００×ｇペレット画分を再懸濁して調製）と混合し、ＶＤＡＣ阻害剤であるケーニッヒのポリアニオンが存在しないまたは２０ｎＭ〜０．００２ｎＭの濃度で存在する状態で、１時間輸送を行わせた。１時間２６℃反応後、前に記載したのと同様に（方法の項を参照）、反応混合物を氷上に置き、シグナル切断およびタンパク質分解による輸送に関して、等分試料を分析した。図６に示すように、ＳｔＡＲの輸送はＶＤＡＣ特異的阻害剤によってブロックされたが成熟ＳｔＡＲ配列上のＳＣＣリーダーを含むキメラはブロックされず、ＶＤＡＣが、ＳｔＡＲおよび可能性のある他の基質によって使用される、もう一つのミトコンドリア輸送チャンネルであることが示された。ＳｔＡＲの輸送は、４ｐＭ未満のケーニッヒのポリアニオンによって５０％阻害された。ＳＣＣ／Ｎ−６２の５０％阻害には４ｎＭのケーニッヒのポリアニオンが必要であり、１０００倍を超える違いがあった。
【００３８】
ＳｔＡＲと受容体／結合タンパク質の間の関係をさらに特徴付けるために、グリセロール密度勾配による、ＳｔＡＲおよびＳＣＣ−ＳｔＡＲの移動を評価した。ＳｔＡＲおよびＳＣＣ−ＳｔＡＲの翻訳産物は、前に記載したのと同様にミトコンドリアに輸送させ、輸送した反応混合物の等分試料は、グリセロール密度勾配で分析した。翻訳および輸送は前に記載したのと同様に行い、２０μｌの等分試料を採取し、１％のラウリルマルトシドに溶かし、７５０ｍＭのアミノカプロン酸（ｐＨ７．４、界面活性剤）を含む、１０〜３０％グリセロール勾配にのせて、ＴＬＳ５５ローター中で２時間または６時間遠心分離した。１２５μｌづつ分取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。これらの結果は、図７中に示す。ＳｔＡＲは遠心分離の２時間後に勾配内、および遠心分離の６時間後にペレットへと移動する高分子量のタンパク質複合体に結合した物質の１フラクションを示すが、ＳＣＣ−ＳｔＡＲではみられなかった。
【００３９】
この高分子量の複合体と結合したタンパク質は、質量分光測定を使用して同定した。前に記載したのと同様に得た１００μｌの翻訳産物を１％マルトシドで溶かし、未変性ブルーゲル電気泳動により分析した。ＳｔＡＲと結合している（ＳＣＣ  ＳｔＡＲとは結合しない）バンドを切り出し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型分析装置（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）により分析した。ＳｔＡＲに関して以下の生成物：ＶＤＡＣ１およびＶＤＡＣ３、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＤＰ、ＡＴＰキャリヤータンパク質、およびグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ−７８）が同定されたが、ＳＣＣ  ＳｔＡＲに関しては同定されず、ＳｔＡＲシグナル配列の受容体／結合タンパク質は、ＶＤＡＣを含む複合体であることが示される。
【００４０】
前のデータによって以下のことが立証される：ｉ）ＳｔＡＲは、それが一時的に保持されるＯＭＭの上または中で機能する；ｉｉ）ＳｔＡＲの活性は、ＯＭＭの上または中の滞留時間に比例する；ｉｉｉ）ＳｔＡＲのミトコンドリア内への輸送によって、その活性が終了する；ｉｖ）ＳｔＡＲのはじめの６２のアミノ酸の中の配列は、Ｐ４５０ｓｃｃのリーダー配列と比較して、ＳｔＡＲのミトコンドリア内への輸送を特異的に遅らせる、およびｖ）可能性のあるＳｔＡＲのＯＭＭ受容体、である。ミトコンドリアの輸送は迅速なので、この普通でない系は、生理的必要性に応答したステロイド産生の迅速な調節を可能にし、ミトコンドリアタンパク質移動の速度が生理的調節のもう１つの部位であることを確立する。これらのデータにより、ＳｔＡＲの活性は、ミトコンドリア輸送のその速度によって調節されることが示される。ＳｔＡＲリーダー配列に対する受容体／結合タンパク質を同定することによって、薬剤開発の有用な標的が提供される。
【００４１】
本明細書中で述べたすべての刊行物および特許出願は、本発明と関係がある当業者の技術のレベルを示すものである。刊行物および特許出願はすべて、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれていることが詳細かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書中に組み込まれている。
【００４２】
本発明をここに十分に説明してきたが、添付の特許請求の精神または範囲から逸脱せずに、本発明に対する多くの変形および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＳｔＡＲをＯＭＭに固定することによって、ステロイド産生活性が増大することを示す図である。図１ａは、コレステロール側鎖切断系のＦ２融合体、および示した構築体を発現するベクターで共トランスフェクトした、ＣＯＳ−１細胞のステロイド産生活性（４８時間までに分泌されたプレグネノロンの合計）を示す図である。２２Ｒ−ＯＨ：２２Ｒ−ＯＨコレステロールと共にインキュベートした対照細胞のステロイド産生；それ以外のすべてのデータは、細胞の内因性コレステロールからのステロイド産生を示す。図１ｂは、３５Ｓ−ＳｔＡＲのＭＡ−１０ミトコンドリアへの輸送を示す図である。２時間後、３７ｋＤａの無細胞翻訳産物のいくらかは膜に取り込まれ、膜と結合した状態の３０ｋＤａのタンパク質に切断される。図１ｃは、ＳｔＡＲのＭＡ−１０ミトコンドリアへの輸送を示す図である。ミトコンドリア外の３７ｋＤａのＳｔＡＲは、プロテイナーゼＫに対して部分的に感受性であるが、ミトコンドリア内の３０ｋＤａのＳｔＡＲは時間と共に蓄積し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００がない状態ではプロテイナーゼから保護されている。図１ｄは、Ｔｏｍ／ＳｔＡＲの輸送を示す図である。４３ｋＤａのＴｏｍ／ＳｔＡＲはミトコンドリアと結合するが、輸送されず；炭酸（塩）およびジギトニン抽出物は、ＯＭＭとの結合を示す（ｃｙｔｏ、細胞質；ｍｉｔｏ、ミトコンドリア；ｓｕｐ、上清）。図１ｅは、ジギトニンがＩＭＭを選択的に溶かすことを示す図である。ＭＡ−１０ミトコンドリアを調製し、洗浄し、炭酸（塩）およびジギトニンを用いて一連で抽出した；示した分画はゲル電気泳動で分離し、ヒトＰ４５０ｓｃｃおよびヒトＴｏｍ２０それぞれに対する項血清の混合物を用いて免疫ブロッティングした。
【図２】ＳｔＡＲがＩＭＳにおいて不活性であることを示す図である。図２ａは、Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲの輸送を示す図である。４１ｋＤａのＴｉｍ９／ＳｔＡＲはミトコンドリアおよびマイトプラストと結合するが、Ｎａ２ＣＯ３を用いてマイトプラストを抽出する、あるいはプロテアーゼと共にこれらをインキュベートすることによって、Ｔｉｍ９／ＳｔＡＲはＩＭＭのＩＭＳ側に存在することが示される。図２ｂは、ＩＭＳ中のＴｉｍ９／ＳｔＡＲの存在によってＯＭＭ、または完全長ＳｔＡＲの輸送および切断が害されることはないことを示す図である。図２ｃは、ＯＭＭおよびマイトプラスト分画からのミトコンドリア活性の再構成を示す図である。ＳｔＡＲ構築体を含む分画はダッシュによって示し、別個の成分の混合物はプラス記号によって示す；この系は、ＯＭＭに固定されたＴｏｍ／ＳｔＡＲに関して、あるいは外部から加えられたＳｔＡＲに関してのみ活性がある。図２ｄは、転写／翻訳系中で発現されるＳｔＡＲは、ミトコンドリアに輸送され切断されてマイトプラスト中で３０ｋＤａの形になるが、ＳｔＡＲが転写／翻訳系から免疫沈降（ＩＰ）されれば、ＳｔＡＲはミトコンドリア中に取り込まれることはできないことを示す図である。図２ｅは、転写／翻訳系から免疫沈降させたＴｉｍ９／ＳｔＡＲは、ＭＡ−１０ミトコンドリアにｉｎ  ｖｉｔｒｏで加えると、それでも活性があることを示す図である。コントロールとしては、完全長ＳｔＡＲ、Ｎ−６２ＳｔＡＲを発現、あるいはＳｔＡＲ非発現、ｉｎ  ｖｉｖｏで不活性（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｎ  Ｅｎｇｌ  ＪＭｅｄ３３５、１８７０〜１８７８（１９９６））かつｉｎ  ｖｉｔｒｏで不活性（Ｂｏｓｅ、Ｈ．Ｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９、１１７２２〜１１７３１（２０００）なＳｔＡＲ突然変異Ｒ１８２Ｌを発現する転写／翻訳系の免疫沈降、緩衝液単独、熱処理したミトコンドリアの使用、およびプラスミドを加えない（擬似）無細胞転写／翻訳系の使用を含む。図２ｆは、並行実験で３５Ｓ−メチオニンの取り込みによりアッセイしたように、ＭＡ−１０ミトコンドリアを、ベクターを加えずに（対照）、および等量のＳｔＡＲ、Ｎ−６２ＳｔＡＲ、Ｔｏｍ／ＳｔＡＲおよびＴｉｍ９／ＳｔＡＲを加えて非放射活性無細胞転写／翻訳系と共に、さまざまな時間インキュベートした場合のステロイド産生を示す図である。
【図３】ＳｔＡＲ活性とミトコンドリア輸送の関係を示す図である。図３ａは、Ｆ２および示したベクターで共トランスフェクトした、ＣＯＳ−１細胞のステロイド産生を示す図である。１−１９３ＳｔＡＲと６３−２８５ＳｔＡＲの融合体（ＳｔＡＲ／ＳｔＡＲ）によって、最大の活性が生じ（２２Ｒ−ＯＨ−コレステロールと等しい）；Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲ、Ｓｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲ、およびｄｅｌ  ＳｔＡＲによっては、低い活性が生じる。ＳｔＡＲ／ＳｔＡＲは、Ｂａｍ／ＥＫリンカーによって、６３−２８５ＳｔＡＲと融合したＳｔＡＲである。図３ｂは、輸送および切断のタイムコースを示す図である（分または時間）。図３ｃは、インキュベーション温度が、完全長ＳｔＡＲのＭＡ−１０ミトコンドリア内への輸送動態（分単位）に及ぼす影響を示す図である。図３ｄは、図３ｂのデータの動態分析を示す図である。データは、３つの独立した実験からの平均値±ｓ．ｄ．である。図３ｅは、Ｓｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲおよびＳｃｃ／Ｎ−６２ＳｔＡＲが輸送され、ミトコンドリア内３０ｋＤａタンパク質へと切断されること、このタンパク質が界面活性剤の不在下ではプロテアーゼによる消化から保護されることを示す図である。
【図４】完全長ＳｔＡＲとＮ−６２ＳｔＡＲは、同等に活性があることを示す図である。図４ａは、等モル量の空ベクター（三角形）、完全長ＳｔＡＲを発現するベクター（黒丸）、およびＮ−６２ＳｔＡＲを発現するベクター（白丸）を、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトし、培養培地に蓄積したプレグネノロンを示す時間で測定したことを示す図である。図４ａおよび図４ｂは、等モル量の完全長、Ｎ−６２、Ｓｃｃ／Ｎ−６２およびＳｃｃ／Ｎ−３０ＳｔＡＲの、免疫ブロットを示す図である。図４ｃは、無細胞転写／翻訳により調製した、等量のそれぞれのタンパク質と共に１時間インキュベートした、ＭＡ−１０細胞のミトコンドリアの活性を示す図である。
【図５】ＯＭＭ上のＳｔＡＲシグナル配列特異的な受容体タンパク質に関する証拠を示す図である。３５Ｓ標識した完全長ＳｔＡＲ（ＷＴ）およびＳＣＣ／Ｎ−６２ＳｔＡＲを、ホモ二官能性架橋剤、ＢＳ３と共に、２６℃および４℃でミトコンドリアの存在下または不在下においてインキュベートした。約８０ｋＤａの大きさの新しいタンパク質架橋産物は、２６℃と４℃の両方で完全長ＳｔＡＲに関してのみ存在するが、ミトコンドリアの不在下（左端のレーン）、あるいはＳｔＡＲシグナル配列およびアミノ酸１〜６２（推定ポーズ領域を含む）が、側鎖切断酵素（ＳＣＣ）の配列に置換されている場合は、存在しない（右側のバンドのパネルを参照のこと）。
【図６】ＳｔＡＲシグナル配列−ミトコンドリア内へのタンパク質輸送の特異的阻害を示す図である。ＳｔＡＲの輸送はＶＤＡＣ特異的阻害剤によってブロックされたが成熟ＳｔＡＲ配列上にＳＣＣリーダーを含むキメラはブロックされず、ＶＤＡＣが、ＳｔＡＲおよび可能性のある他の基質によって使用される、もう一つのミトコンドリア輸送チャンネルであることが示された。１千万個の細胞のホモジェネートの１０，０００×ｇペレットを再懸濁により調製した２５０μｇのミトコンドリアと５０μｌのＳｔＡＲまたはＳＣＣ−ＳｔＡＲ翻訳産物を混合し、ＶＤＡＣ阻害剤であるケーニッヒのポリアニオンが存在しないまたは２０ｎＭ〜０．００２ｎＭの濃度で存在する状態で、１時間輸送を行わせた。１時間後、反応混合物を氷上に置き、シグナル切断およびタンパク質分解による輸送に関して、等分試料を分析した。輸送のケーニッヒのポリアニオンによる５０％阻害点は、ＳＣＣ／Ｎ−６２ＳｔＡＲでは約４ｎＭであるのに対し、ＳｔＡＲでは４ｐＭ未満ので得られる。
【図７】ＳｔＡＲとＳＣＣ−ＳｔＡＲは、グリセロール密度勾配により、異なるタンパク質−タンパク質相互作用を示すことを示す図である。翻訳、およびＳｔＡＲおよびＳＣＣ−ＳｔＡＲの翻訳産物のミトコンドリアへの輸送は、方法の項に記載したのと同様に行い、２０μｌの等分試料を採取し、１％のラウリルマルトシドに溶かし、７５０ｍＭのアミノカプロン酸（ｐＨ７．４界面活性剤）を含む、１０〜３０％グリセロール勾配にのせ、ＴＬＳ５５ローター中で２時間または６時間遠心分離し、１２５μｌづつ分画し、示すようにＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。
【図８】１００μｌの翻訳産物を１％マルトシドで溶かし、未変性ブルーゲル電気泳動（参照）により分析したことを示す図である。ＳｔＡＲと結合するがＳＣＣ  ＳｔＡＲとは結合しないことが観察されたバンドを切り出し、マトリクス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型分析装置（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）により分析した。以下の生成物：ＶＤＡＣ１およびＶＤＡＣ３、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＤＰ、ＡＴＰキャリヤータンパク質、およびグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ−７８）がＳｔＡＲに関して同定されたが、ＳＣＣ  ＳｔＡＲに関しては同定されなかった。
【図１】
2005526860.tif 000002
【図２】
2005526860.tif 000003
【図３】
2005526860.tif 000004
【図４】
2005526860.tif 000005
【図５】
2005526860.tif 000006
【図６】
2005526860.tif 000007
【図７】
2005526860.tif 000008
【図８】
2005526860.tif 000009
【国際調査報告】
2005526860.tif 000010