(57)【要約】ヒトＭＩＮＲ遺伝子はＩＮＲシグナル伝達のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥ＩＮＲシグナル伝達に関連する疾患の治療上の標的である。ＭＩＮＲの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ＭＩＮＲのモジュレーターを同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を提供し、
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させ、
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤として同定する、
工程を含んでなる、候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤を同定する方法。
【請求項２】
アッセイ系がＭＩＮＲポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ系が、ＭＩＮＲポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アッセイ系がＭＩＮＲ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アッセイ系が、ＭＩＮＲを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含み、
アッセイ系が、ＩＮＲシグナル伝達又はＩＮＲシグナル伝達の出力における試験剤の影響を受けた変化を検出するアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アッセイ系が培養細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アッセイが、インスリン応答性遺伝子の発現、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のリン酸化、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のキナーゼ活性、グリコーゲン合成、グルコース取り込み、ＧＬＵＴ４トランスロケーション、及びインスリン分泌からなる群から選択される事象を検出する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
非ヒト動物が糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイ系が、肝臓中の脂質の蓄積、血漿中の脂質の蓄積、脂肪中の脂質の蓄積、血漿中の糖レベル、血漿中のインスリンレベル、及びインスリン感受性からなる群から選択される事象を検出するアッセイを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｄ）ＭＩＮＲを発現する培養細胞又は非ヒト動物を含む第二のアッセイ系を提供し、
（ｅ）（ｂ）の試験剤又はそれから誘導された薬剤に第二のアッセイ系を、試験剤又はそれから誘導された薬剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、接触させ、
（ｆ）試験剤の影響を受けた第二のアッセイ系の活性を検出する、
更なる工程を含んでなり、
試験剤の影響を受けた活性と第二のアッセイ系の対照活性との差により試験剤又はそれから誘導された薬剤を候補ＩＮＲシグナル伝達調節剤として確認し、
第二のアッセイ系が、ＩＮＲシグナル伝達に関連した活性又はＩＮＲシグナル伝達の出力の試験剤の影響を受けた変化を検出する第二のアッセイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第二のアッセイ系が培養細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第二のアッセイが、インスリン応答性遺伝子の発現、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のリン酸化、ＩＮＲシグナル伝達経路成分のキナーゼ活性、グリコーゲン合成、グルコース取り込み、ＧＬＵＴ４トランスロケーション、及びインスリン分泌からなる群から選択される事象を検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第二のアッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト動物が、糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルを提供するマウスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第二のアッセイ系が、肝臓中の脂質の蓄積、血漿中の脂質の蓄積、脂肪中の脂質の蓄積、血漿中の糖レベル、血漿中のインスリンレベル、及びインスリン感受性からなる群から選択される事象を検出するアッセイを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞においてＩＮＲシグナル伝達を調節する方法であって、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸に特異的に結合する薬剤と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２１】
薬剤が、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に薬剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター又は抗体である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
この出願は、２００２年２月６日出願の米国特許仮出願第６０／３５４，８２４号、２００２年２月２０日出願の同第６０／３５８，２１７号、２００２年２月２０日出願の同第６０／３５８，１８９号、２００２年２月２０日出願の同第６０／３５８，１２６号、２００２年２月２１日出願の同第６０／３５８，９９５号、２００２年２月２１日出願の同第６０／３５８，７５６号、２００２年２月２１日出願の同第６０／３５８，７６５号、２００２年２月２５日出願の同第６０／３５９，５３１号、２００２年２月２６日出願の同第６０／３６０，２２２号、２００２年２月２６日出願の同第６０／３６０，２２４号、２００２年２月２６日出願の同第６０／３６０，１６７号、及び２００２年２月２６日出願の同第６０／３６０，１６６号の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
インスリンは脊椎動物における代謝を制御する中心的なホルモンである（Steiner等, 1989, Endocrinology, DeGroot編 Philadelphia, Saunders:1263-1289に総説あり）。ヒトにおいて、インスリンは上昇した血糖値に応答して膵臓のβ細胞によって分泌されるが、本来、食事のあとに起こる。インスリン分泌の即効性の効果は、筋肉、脂肪組織、及び肝臓によるグルコース摂取を誘導することである。インスリンの長期効果は、肝臓におけるグリコーゲン及び脂肪組織におけるトリグリセリドを合成する酵素活性を増強することである。インスリンは、筋肉中でのカリウム輸送の増大、脂肪細胞の細胞分化の促進、ナトリウムの腎臓貯留の増大、及び卵巣によるアンドロゲン産生の促進を含む、「古典的な」代謝活性の範囲を超えた他の活性を発揮することができる。インスリンの分泌及び／又はインスリンへの応答における欠陥は、糖尿病の要因になり、多大なる経済的重要性を有している。米国内において、糖尿病は、患者が医者を訪れる上で四番目によくある理由となっている；それは、労働年齢層の個々人において、腎臓疾患の最終段階、非外傷性の手足切断、及び失明の主な原因となっている（Warram等, 1995, In Joslin's Diabetes Mellitus, Kahn及びWeir, eds., Philadelphia, Lea & Febiger, pp201-215；Kahn等, 1996, Annu. Rev. Med. 47:509-531；Kahn, 1998, Cell 92:593-596）。糖尿病における役割を超えて、インスリン耐性の現象は、肥満症、卵巣アンドロゲン過剰症、高血圧症を含む他の病原性疾患と関連している。
【０００３】
医薬業界では、脂質欠損とインスリン耐性とを結びつける分子機構を理解することに興味が持たれている。高脂血症及び遊離脂肪酸レベルの上昇は、しばしば同一患者において発症し、２型糖尿病及び循環器疾患へと進行する主たる危険因子である肥満症及びインスリン耐性を含む、幾つかの疾患間の関連において定義される「代謝症候群」と相関する。現在の研究により、血糖値に加えて、脂質レベルのコントロールが２型糖尿病、心臓疾患、及び他の代謝症候群の症状を治療するのに必要とされることが示唆されている（Santomauro AT等, Diabetes (1999)48:1836-1841）。
ショウジョウバエや線虫のようなモデル生物のゲノムを操作しスクリーニングする能力は、遺伝子、経路及び細胞プロセスの有意な進化上の保存のため、より複雑な脊椎動物生物に直接的な関連を有している生化学プロセスを分析する強力な手段を提供する。そのようなモデル生物における特定の経路に関与する遺伝子の新規な機能の同定は哺乳動物における相関する経路とそれを調節する方法の理解に直接寄与し得る（Dulubova I等, J Neurochem 2001 Apr;77(1):229-38; Cai T等, Diabetologia 2001 Jan;44(1):81-8; Pasquinelli AE等, Nature. 2000 Nov 2;408(6808):37-8; Ivanov IP等, EMBO J 2000 Apr 17;19(8):1907-17; Vajo Z等, Mamm Genome 1999 Oct;10(10):1000-4; Miklos GL及びRubin GM, Cell 1996,86:521-529; Mechler BM等, 1985 EMBO J 4:1551-1557; Gateff E. 1982 adv. Cancer Res. 37:33-74; Watson KL.等, 1994 J Cell Sci. 18:19-33; Miklos GL, 及びRubin GM. 1996 Cell 86:521-529; Wassarman DA等, 1995 Curr Opin Gen Dev 5:44-50; 及びBooth DR. 1999 Cancer Metastasis Rev. 18:261-284）。ショウジョウバエと線虫はヒトの病気にかかることは少ないが、様々な実験的モデルで病理状態を模倣することが可能である。ショウジョウバエ又は線虫遺伝子の改変された発現と病理モデルの相関により、ヒトのオルソログのヒトの疾患との関連を特定することができる。
【０００４】
一例では、遺伝子スクリーニングは、既知の遺伝子のミスエクスプレッション−一般に低減した、亢進した又は異所的な発現−のために変異体（一般に可視可能又は選択可能）表現型を示す無脊椎動物モデル生物で実施される（「遺伝子エントリーポイント」）。更なる遺伝子を無作為に又は標的化した形で変異させる。更なる遺伝子突然変異が元の変異表現型を変化させる場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイント及びその関連経路と直接的に又は間接的に相互作用する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがヒトの病理に関係するヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の候補標的であるモディファイヤー遺伝子をスクリーニングにより同定することができる。
遺伝子スクリーニングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術を利用して、外来性の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを導入することにより相同的な配列を有する遺伝子の活性を乱し、特異的な機能低下表現型を誘発する（Fire等, 1998, Nature 391:806-811）。ｄｓＲＮＡを動物に導入するのに適した方法は、注入、摂食、及び水浴を含む（Tabara等, 1998, Science 282:430-431）。ＲＮＡｉはさらに、培養したショウジョウバエ及び哺乳動物細胞において、特異的な遺伝子破壊を生成することを示した（Paddison等, Proc Natl Acad Sci U S A 2002年1月29日公開の10.1073/pnas.032652399; Clemens等, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A 97:6499-503; Wojcik and DeMartino, J Biol Chem, 2001年12月5日公開の10.1074/jbc.M109996200; Goto等, 2001, Biochem J 360:167-72; Elbashir等, 2001, Nature 411:494-8）。
インスリンレセプター（ＩＮＲ）シグナル伝達経路は線虫において広く研究されている。線虫ＩＮＲオルソログであるｄａｆ-２によるシグナル伝達は、生殖成長及び正常な成人寿命を含む様々な事象を媒介する（例えば米国特許第６２２５１２０号；Tissenbaum HA及びRuvkun G, 1998, Genetics 148:703-17; Ogg S及びRuvkun G, 1998, Mol Cell 2:887-93; Lin K等, 2001, Nat Genet 28:139-45を参照のこと）。
【０００５】
ＮＯＴ２及び酵母（S. Cerevisiae）オルソログＣＤＣ３６はポリメラーゼＩＩホロ酵素と相互作用して遺伝子の発現を調節するタンパク質の複合体の一部である。複合体は、特にＣＣＲ４、ＣＡＦ及びＮＯＴファミリーのタンパク質を含む。ＮＯＴタンパク質は、非典型的ＴＡＴＡＡｓに対するＴＡＴＡボックスタンパク質のアクセスを制限する場合がある。ＮＯＴ２の欠損は、遺伝子の抑制解除に繋がる可能性がある（Benson等, 1998, EMBO 17:6714-6722; Collart等, 1994, Genes Dev. 8:525-537; Liu等, 2001, J. Biol. Chem. 276:7541-7548）。ショウジョウバエのＲｅｇｅｎａ（Ｒｇａ）遺伝子はＮＯＴ２のオルソログであり、白色眼遺伝子の発現を調節する遺伝子のためのショウジョウバエのスクリーニングで最初に同定されたものである。Ｒｅｇｅｎａは試験した７つの遺伝子のうち４つの発現に影響することが示された。これは、遺伝子発現の通常の調節に関与していることを示唆するものである。ＲＰ４９リボソーム遺伝子の発現は、Ｒｇａの変異に影響されなかった。配列類似性及び機能類似性に基づき、Ｒｇａは酵母遺伝子ＣＤＣ３６／ＮＯＴ２の相同体であることが示された（Frolov等, 1998, Genetics 148:317-329）。
【０００６】
ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎｓ（ＭＹＴ）は、ヒト、ショウジョウバエ、及び線虫を含む複数の生物から保存されたタンパク質のファミリーである（Laporte等, 1998, Hum. Molec. Genet. 7:1703-1712; Laporte等, 2001 Trends in Genetics 17:221-228）。ヒトのファミリーは少なくとも１０の遺伝子からなり、ショウジョウバエと線虫はそれぞれ６つのｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ関連遺伝子を有する。ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎは、タンパク質及び脂質ホスファターゼの活性両方と調和する活性部位残基を有し、生物化学的にこれら活性を有することが示されている（Laporte等, 1998, 2001）。加えて、酵母における実験証明に基づき、ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎがＰＩ−３−キナーゼ活性を下方制御できることが示されている。酵母において、ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎは基質としてＰｔｄＩｎｓ３Ｐを強く好む（Taylor等, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8915）。触媒ドメインに保存された残基は、モノホスホイノシチドホスファターゼとしてのその活性と調和するもので、これら残基の変異はインビトロの脂質ホスファターゼ活性を消滅させる（Taylor等, 2000; Laporte等, 2001）。加えて、ヒトｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎの変異形態は、酵母に導入されると、酵母ＰＩ−３キナーゼと共に免疫沈降した。これは、ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎが直接ＰＩ−３キナーゼ活性に作用し得ることを示している（Blondeau等、2000, Hum. Mol. Genet. 9:2223-2229）。ＧＩ１７７３７３９５のショウジョウバエｍｙｏｔｕｂｕｌａｒｉｎ遺伝子は、ヒトＭＴＭ１／ＭＴＭＲ２サブグループに含まれ、またこれはこのサブグループに含まれる唯一のショウジョウバエ遺伝子である。ＭＴＭ１変異は、疾病Ｘ連鎖筋小管ミオパシーに関連しており（Laporte等, 1996, Nat. Genet. 13:175-182）、これは筋肉繊維の破壊に繋がるものである。患者のＭＴＭ１に確認された変異は、多くの場合ヒトタンパクとショウジョウバエのタンパク質の間に保存された残基に作用するミスセンス変異である。ＭＴＭＲ２の変異はシャルコー・マリー・ツース病を引き起こし、運動ニューロンと感覚ニューロンの髄趙形成に作用する（Bolino等, 2000, Nat. Genet. 25:17-19）。
【０００７】
ＤＮＭＴ１は哺乳動物のＤＮＡメチル化を維持する酵素であり、また抑圧的転写性複合体の一構成要素である。ＤＮＭＴに関連するタンパク質（ＤＭＡＰ１）を、ＤＮＭＴ１と相互作用するタンパク質に関する酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングで同定した。ＤＭＡＰ１は内在的に転写性抑圧活性を有し、また腫瘍サプレッサー遺伝子ＴＳＧ１０１に結合する。ＴＳＧ１０１は核ホルモン誘発遺伝子のサイレンシングに関与する転写性コリプレッサーとして作用することが分かっており、また後期エンドソームトラフィッキングにおいて機能する（Roundtree等, 2000, Nature Genetics 25:269-277）。
【０００８】
ヒトの結節硬化症（ＴＣＳ）コンプレックスは、多くの組織に良性腫瘍の形成を生じる疾病である（Cheadle等, 2000, Hum. Genet. 107:97-114）。これら腫瘍は分化した細胞を含んでいるが、これらの細胞は正常細胞よりずっと大きい。この疾患は中央神経系に最も重症に現れ、癲癇、発達遅延及び自閉症を引き起こす可能性があり、ＴＳＣ１又はＴＳＣ２遺伝子の変異により発生する（Consortium T.E.C.T.S., 1993, Cell 75:1305-1315; van Slegtenhorst等, 1997, Science 277:805-808）。ＴＳＣ１はハマルチン（ｈａｍａｒｔｉｎ）を、ＴＳＣ２はツベリン（ｔｕｂｅｒｉｎ）をそれぞれコードしており、ヒトタンパク質がインビトロで相互作用することが証明されている（Plank等, 1998, Cancer Res. 58:4766-4770; van Slegtenhorst等, 1998, Hum. Mol. Genet. 7:1053-1057）。ＴＳＣ２タンパク質の産物であるツベリンは、コイルドコイルドメインに加えてＧＴＰ加水分解酵素活性化タンパク質（ＧＡＰ）ドメインを含み、インビトロにおいてＧＡＰ活性を有する（Wienecke等, 1995, J. Biol. Chem. 270:16409-16414）。インビトロでの核Ｒａｓ関連調節タンパク質Ｒａｐ１、Ｒｓｒ１及びＲａｎの活性を担うＧＴＰ加水分解酵素活性化タンパク質には、Ｒａｐ／ｒａｎ−ＧＡＰドメインも発見されており、これは細胞周期の進行に影響を与える。Ｇｉｇａｓ（ＧＩＧ）はＴＣＳ２のショウジョウバエオルソログである。ＧＩＧ機能低下変異誘発遺伝子は、変異誘発遺伝子の強度に応じて、幼生致死性や様々な神経解剖学的及び行動的欠陥を含む範囲の表現型を示す（Meinertzhagen, 1994, J. Neurogenet 9:157-176; Canal等, 1998, J. Neurosci 18:999-1008; Acebes及びFerrus 2001, J. Neurosci 21:6264-6273）。加えて、ＧＩＧ突然変異体細胞は正常に分化するが、その大きさは正常の２〜３倍である。ショウジョウバエＴＳＣ１及びＴＳＣ２（ＧＩＧ）遺伝子の過剰発現は細胞の大きさ、数及び器官の大きさに減少をもたらす（Potter等, 2001, Cell 105:357-368; Tapon等 2001）。ハエを用いた遺伝子の実験により、ＴＳＣ１及びＴＳＣ２ＧＩＧ遺伝子の組み合わせがインスリンレセプターシグナル伝達をアンタゴナイズすることが示された（Gaoら, 2001, Genes and Dev. 15: 1383-1392；Potterら, 2001； Taponら, 2001, Cell 105: 345-355）。遺伝子データによると、ＴＳＣ１及びＴＳＣ２（ＧＩＧ）は、これら遺伝子と同じ経路か、又はそれと平行な経路において、Ａｋｔの下流、Ｓ６キナーゼの上流で機能していると思われる。
【０００９】
ＲＡＢ５は、ベシクルのトラフィッキングに関わっているＧＴＰ加水分解酵素のＲａｓスーパーファミリーのメンバーである（Somsel Rodman及びWandinger-Ness, 2000, J. Cell Sci. 113:183-192）。エンドサイトーシスの経路は、栄養分の取り込み、細胞表面レセプターの制御、分泌経路に使用されるタンパク質の再循環に重要である。ＲＡＢ５はクラスリン被覆ベシクル及び早期エンドソームと関連しており、エンドサイトーシスの内面化及び早期エンドソーム融合を調節する機能を有する（Woodman, 2000, Traffic 9:695-701）。ＦＹＶＥドメインタンパク質Ｒａｂｅｎｏｓｙｎ−５は、Ｒａｂ５及びＲａｂ４のエフェクターであることが示されており、早期エンドソームとレセプター再循環を物理的に細胞表面に接続している（De Renzis等, 2002, Nat. Cell Biol. 4:124-133）。インスリン反応性組織は、Ｒａｂ３ｂ、Ｒａｂ４、Ｒａｂ５、及びＲａｂ８を含む複数のＲａｂアイソフォームを発現する。これらアイソフォームのうち、Ｒａｂ４だけが、インスリン刺激によるＧＬＵＴ４の細胞膜への転移を含め、細胞内におけるインスリン作用を媒介する役割を担うことが示されている（Knight等, 2000, Endocrinology 141:208-218）。Ｒａｂ５の膜関与はインスリンへの耐性を持つ２型糖尿病患者から単離された骨格筋中で変化するといういくつかの証拠がある（Bao等, 1998, Horm. Metab. Res. 30:656-662）。
【００１０】
ショウジョウバエＳＮＡＰはヒトα可溶性ＮＳＦ遺伝子（α−ＳＮＡＰ又はａＳＮＡＰ）のオルソログである。ショウジョウバエにおいて、ＳＮＡＰは、原形質膜との分泌ベシクル融合に必要な保存されたＳＮＡＲＥ複合体の一部として知られている（Ordway等, 1994, PNAS USA 91:5715-5719）。ショウジョウバエには機能低下突然変異が報告されていないが、ＮＳＦの突然変異は、主要タンパク質ＳＮＡＰがリクルーティングを行うため、運動行動及び表出麻痺に欠陥を有する（Littleton等, 1998, Neuron 21:401-413）。脊椎動物では、ＳＮＡＰは、ＳＮＡＲＥ複合体と関連してベシクルが結合する間のトランスに関与することが示されている（Xu等, 1999, EMBO J. 18:3293-3304）。ＳＮＡＰはＮＳＦのリクルーティングと刺激を行い、ＡＴＰアーゼはＳＮＡＲＥ複合体の分解及び再循環を行う（Sudlow等, 1996, FEBS Lett 393:185-188; Barnard等, 1997, J. Cell Biology 139:875-883; Cheatham 2000, Trends in Endocrinol. Metab. 11:356-361）。ＳＮＡＰとＮＳＦが組み合わさるとエキソサイトーシスの割合が飛躍的に増大する。脊椎動物のβＳＮＡＰはαＳＮＡＰと類似しているが、αＳＮＡＰはβＳＮＡＰよりもエキソサイトーシスを増大させることが示されている（Xu等, 2002, J. Neurosci 22:53-61）。αＳＮＡＰの変異性分析はロイシン２９４の要件を示す。αＳＮＡＰ（Ｌ２９４Ａ）は、ＳＮＡＲＥ複合体及びＮＳＦと正常に連携するが、外因性αＳＮＡＰによりエキソサイトーシスのＡＴＰアーゼ依存性刺激を阻害することで、優勢な突然変異として作用した（Barnard等, 1997,  上掲）。
【００１１】
ＣＡＦ−１（カタボライトリプレッサータンパク質（ＣＣＲ４）関連因子１）はＣＣＲ４−ＮＯＴ転写性複合体サブユニット７としても知られ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素と相互作用して遺伝子の発現を調節するタンパク質複合体の一構成要素である（Albert等, 2000, Nucleic Acids Res. 28:809-817）。複合体は特にＣＣＲ４及びＮＯＴタンパク質も含む。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を全体的に調節することに加え、ＣＡＦ−１は、早期リボソーム構築を調節することにより遺伝子の発現も調節する（Schaper等, 2001, Curr. Biol. 11:1885-1890）。ＣＣＲ４及びＣＡＦ−１はまた、酵母中の主要細胞質ｍＲＮＡ脱アデニル（deadenylase）の構成要素でもあり、ポリ（Ａ）テールの短縮を開始することによりｍＲＮＡ代謝回転の初期段階において機能することができる（Tucker等, Cell 104:377-386）。
【００１２】
ＶＡＭＰは、調節的及び本質的ベシクルトラフィッキングの両方において膜融合に重要なタンパク質であるＳＮＡＲＥタンパク質ファミリーのメンバーである。ＶＡＰ３３（３３ｋＤａのＶＡＭＰ関連タンパク質）タンパク質はＶＡＭＰとＳＮＡＲＥを結合する（Weir等, 2001, Biochem Biophys Res Commun 286:616-21）。哺乳動物のＶＡＰ３３（ＶＡＰ−Ａ）は複数の組織に広く発現し、ＥＲ及び微小管、並びにトラフィッキングベシクルに関連していると思われる（Weir等, 1998, Biochem. J. 333:247-251）。ＶＡＰ３３には３種類のヒトアイソフォームが知られている。ＶＡＰ−ＡとＶＡＰ−Ｂは個別の遺伝子によってコードされており、約６０％が同一である；ＶＡＰ−ＣはＶＡＰ−Ｂのスプライス変異体であり、Ｃ末端膜貫通ドメインが欠損している（Nishimura等, 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 254:21-26）。ＶＡＰ３３は、Ｌ６筋芽細胞及び３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるインスリン刺激を与えたＧＬＵＴ４の細胞表面への移動に中心的な役割を果たしていることが分かっている（Foster等, 2000, Traffic 6:512-521）。また、酵母相同体ＳＣＳ２がイノシトール代謝に必要とされていることも証明されている（Kagiwada等, 1998, J. Bacteriol. 180:1700-1708）。
【００１３】
ＰＰ２（ＰＰ２Ａとも呼ばれる）は、タンパク質Ａｋｔ及びＧｓｋ３βの脱リン酸化に関連したセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼである（Ivaska等, 2002, Mol Cell Biol 22:1352-1359）; Ｇｓｋの脱リン酸化によりグリコーゲン合成酵素活性が増大する。これに付随する報告によりセラミドが媒介するインスリン耐性はＰＰ２活性を誘起し、ＰＰ２インヒビターオカダ酸を用いた治療により軽減することができる（Teruel等, 2001, Diabetes 50:2563-2571）。最終的に、長鎖脂肪酸の生成を触媒し、インスリン分泌を調節することができる酵素であるアセチルコアカルボキシラーゼを刺激することが証明されている（Kowluru等, 2001, Diabetes 50:1580-1587）。ＰＰ２はまた、アシルコア：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）及びコレステロールエステル合成を抑制すると思われている（Hernandez等, 1997, Biochim Biophys Acta 1349:233-41）。ショウジョウバエのＭＴＳ（微細管スター）はＰＰ２のオルソログであり、スピンドル形成に必要不可欠な役割を担い、有糸分裂段階における微細管の動原体への付着に重要な意味を持っている（Snaith等, 1996, J. Cell Sci. 109:3001-3012）。また、マウスＰＰ２は減数分裂に必要である（Lu等, 2002, Biol Reprod. 66(1):29-37）。ＭＴＳ／ＰＰ２の必要性は、リン酸化過剰とτタンパク質の不活性化によるものと考えられており、微小管に関連し、その安定化を促進する（Brandt及びLee 1993, J Neurochem. 61:997-1005; Planel等 2001, J. Biol. Chem. 276(36):34298-34306）。
【００１４】
ＣＳＮＫ１はセリン／トレオニンタンパク質キナーゼであり、哺乳動物のカゼインキナーゼＩ遺伝子のファミリーに属し、多重アイソフォームを生成する。ファミリーメンバーには、可変Ｃ末端領域に結合する高度に保存された〜２９０残基Ｎ末端触媒ドメインが含まれる。Ｃ末端領域は個々のアイソフォームの差別的な細胞下の局在化を促進し、酵素の活性を調節するという役割を持つ（Mashhoon等, 2000 J Biol Chem 275:20052-20060）。ＣＳＮＫ１は、約２４時間周期のリズムの調節、細胞内トラフィッキング、ＤＮＡ補修、細胞形態学、及びタンパク質の安定化に寄与していると思われる（Liu等, 2001, Proc Natl Acad Sci 98:11062-11068）。ＣＳＮＫ１はまた、インスリンシグナル伝達反応の一部であるＧＳＫ３との協調において、ｅＩＦ２Ｂの調節に関与していることが分かっている（Wang等, 2001, EMBO 20:4349-4359）。ショウジョウバエＧＩＳＨ（ギルガメッシュ）はヒトＣＳＮＫ１のオルソログであり、グリアの移動及び眼の神経発達を調整する反発的シグナル伝達のメカニズムの一部であると特徴付けられている（Hummel等, 2002, Neuron 33:193-203）。
【００１５】
ＥＲＦ１（真核終結因子１）はタンパク質の生合成の終結を行う。タンパク質生合成の終結と未完成ポリペプチド鎖の解除は、リボソームのアミノアシル部位におけるフレーム内終止コドンの存在によりシグナル伝達される。ＥＲＦ１は終止コドンを識別し、ポリペプチド鎖をペプチジル部位ｔＲＮＡに繋ぐエステル結合の加水分解を促進させる（Frolova等, 1994, Nature 372: 701-703）。終結因子の結晶構造が決定され、ＥＲＦ１の全体的形状と寸法はｔＲＮＡ分子に類似しており、アンチコドンループ、アミノアシルアクセプターステム、及びｔＲＮＡ分子のＴステムにそれぞれ対応する専用ドメイン１、２、及び３を有することが分かった（Song等, 2000, Cell 100:311-321）。
【００１６】
特許、特許出願、刊行物及び参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号を含むここで引用したすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【００１７】
（発明の概要）
我々は、ショウジョウバエ細胞でＩＮＲ経路を調節する遺伝子を発見し、ここでインスリンレセプターシグナル伝達のモディファイヤー（ＭＩＮＲ）と称する、そのヒトのオルソログを同定した。本発明は、これらのＩＮＲモディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、欠陥又は損傷ＩＮＲ機能及び／又はＭＩＮＲ機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＭＩＮＲ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＭＩＮＲ調節剤は、ＭＩＮＲポリペプチドに特異的に結合してＩＮＲ機能を修復する。他の好ましいＭＩＮＲ調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、例えば各核酸（すなわちＤＮＡ又はｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによって、ＭＩＮＲ遺伝子の発現又は生成物の活性を抑制するＲＮＡｉである。
【００１８】
ＭＩＮＲ調節剤は、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸との分子相互作用のための任意の簡便なインビトロ又はインビボのアッセイによって評価することができる。一実施態様では、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＭＩＮＲ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ＩＮＲ調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＭＩＮＲ調節剤には、ＭＩＮＲ関連タンパク質（例えばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＭＩＮＲに特異的な抗体；ＭＩＮＲに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；並びにＭＩＮＲに特異的に結合又は相互作用する又はＭＩＮＲ結合対と（例えばＭＩＮＲ結合対に結合することによって）競合する化学剤が含まれる。特定の一実施態様では、結合アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施態様では、スクリーニングアッセイ系は、肝臓脂質蓄積アッセイ、血漿脂質蓄積アッセイ、脂肪細胞脂質蓄積アッセイ、血漿血糖値アッセイ、血漿インスリン値アッセイ、及びインスリン感度アッセイから選択される。
【００１９】
別の実施態様では、ＩＮＲシグナル伝達に関連した活性の変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ＩＮＲ経路調節剤を更に試験する。第２アッセイ系では、培養細胞又は非ヒト動物を使用することができる。特定の実施態様では、二次アッセイ系は、ＩＮＲ経路に関係づけられた疾病又は疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【００２０】
本発明は、さらに、哺乳動物細胞をＭＩＮＲポリペプチド又は核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＭＩＮＲ機能及び／又はＩＮＲ経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体であってよく、ＩＮＲ経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
細胞ＲＮＡｉスクリーニングを用いてＩＮＲ経路のモディファイヤー及びシグナル伝達活性を同定した。ＩＮＲ経路のモジュレーターが同定され、その後それらのオルソログが同定された。したがって、インスリンレセプターシグナル伝達のモディファイヤー（ＭＩＮＲ）遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する疾患の治療のための魅力的な薬剤標的である。一例では、治療法は、糖尿病及び／又は代謝症候群に関連する病理状態を治療するためにＩＮＲを通してシグナル伝達を増大させることを含む。
【００２２】
本発明は、ＭＩＮＲ機能を評価するインビトロ及びインビボの方法、及びＭＩＮＲ活性を調節（一般に阻害又はアゴナイズ）する方法を提供し、これらはＩＮＲシグナル伝達を更に解明し、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病理状態の診断及び治療様式を開発するために有用である。ここで使用されるところの、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病理状態は、ＩＮＲシグナル伝達が健康な状態を維持するのに寄与する病理状態、並びにその過程がＩＮＲシグナル伝達の調節によって改変されうる病理状態を包含する。
【００２３】
ＭＩＮＲ核酸及びポリペプチド
本発明で使用することができるＭＩＮＲ核酸及びポリペプチドに関連する配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されており（Ｇｅｎｂａｎｋの識別（ＧＩ）又は整理番号で参照できる）、また表１（実施例１）に示す。
【００２４】
「ＭＩＮＲポリペプチド」という用語は、完全長のＭＩＮＲタンパク質又はその「機能的に活性のある」断片又は誘導体を意味し、「機能的に活性のある」とは、ＭＩＮＲタンパク質断片又は誘導体が、完全長の野生型ＭＩＮＲタンパク質に関連する一又は複数の機能活性を示すことを意味する。一例として、断片又は誘導体は、更に以下に検討されるように、それがイムノアッセイ、免疫化、阻害抗体の産生に使用することができるように抗原性を有しうる。好ましくは、機能的に活性なＭＩＮＲ断片又は誘導体はＭＩＮＲタンパク質に関連する一又は複数の生物学的活性、例えば酵素活性、シグナル伝達活性、天然の細胞基質等々への結合能等々を示す。一実施態様では、機能的に活性なＭＩＮＲポリペプチドは、例えば、細胞ベース又は動物アッセイにおいて、欠陥のある内因性ＭＩＮＲ活性を救出することが可能なＭＩＮＲ誘導体であり；その救出誘導体は同種又は異なった種由来でありうる。ＭＩＮＲ断片が調節剤を同定するためにアッセイで使用される場合、断片は好ましくはＭＩＮＲドメイン、例えば特にＣ又はＮ末端又は触媒ドメインを有し、好ましくはＭＩＮＲタンパク質の少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２５、及び最も好ましくは少なくとも５０の近接アミノ酸を含む。好適なＭＩＮＲ断片は触媒ドメインを含む。機能性ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.等, 1999 Nucleic Acids Res 27:260-262;ウェブサイトpfam.wustl.edu）。
【００２５】
「ＭＩＮＲ核酸」という用語は、ＭＩＮＲポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＭＩＮＲと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、更に好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログ又はその誘導体でもよい。これらの遺伝子のヒトのオルソログを同定する方法は当該分野で知られている。通常、異なる種のオルソログは、一又は複数のタンパク質モチーフの存在及び／又は３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイト配列を使用し、ＢＬＡＳＴ分析のような配列相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴの結果のうち最も合致する配列が、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリ配列を取り出す場合に、配列を潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:5849-5856; Huynen MA等、Genome Research (2000) 10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD等, 1994, Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重配列比較のためのプログラムを使用して、オルソロガスなタンパク質の保存領域及び／又は残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同配列（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソロガスな配列は、それら２種のそれ以外の全配列に対し、系統樹中最も近いものとして現われる。構造のスレッディング、又はタンパク質の折り畳みのその他分析法（例えばProCeryon, Biosciences, Salzburg, Austriaのソフトウェアを使用するもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子複製が起こるとき、線虫など単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子（パラログ）に対応する場合がある。ここで使用される「オルソログ」という表現は、パラログも含む。特定された対象配列又は対象配列の一部分に関してここで使用される「パーセント（％）配列同一性」とは、検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２．０ａ１９（Altschul等, J.Mol.Biol.,(1997)215:403〜410;http://blast.wustl.edu/blast/README.html）によって得られるように、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップを導入した後に、対象配列（又はその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸のパーセントとして定義される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、特定の配列の組成と、目的配列が比較して検索されている特定のデータベースの組成とに応じて確定される。「％同一性値」は、一致する同一ヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が有意には影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有す��別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
【００２６】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所的相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2:482-489;Smith及びWaterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197; Nicholas等, 1998,「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(ウェブサイトwww.psc.edu)及びそこに引用されている参考文献；W.R.Pearson, 1991, Genomics, 11:635-650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff: Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第５補遺, 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA）、Gribskovによって正規化された（Gribskov 1986, Nucl.Acids Res. 14(6):6745-6763）スコア化マトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのにデフォルトパラメータを用いたSmith-Watermanアルゴリズムを使用することができる（例えば、ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸張ペナルティ２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００２７】
対象核酸分子の誘導核酸分子には、ＭＩＮＲの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、ｐＨ、並びにハイブリダイゼーション及び洗浄中にホルムアミドなどの変性剤を存在させることによって調節することができる。常套的に使用される条件は、直ぐに入手可能な手順書に記載されている（例えば、Current Protocol in Molecular Biology, 第１巻,  第２．１０章, John Wiley & Sons, Publishers (1994);Sambrook等, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)）。一部の実施態様では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ；ｐＨ７．０である）、５×デンハート液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間から終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと；６×ＳＳＣ、１×デンハート液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行うこと、及び；０．１×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＭＩＮＲのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。他の実施態様では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理すること；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／容量）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行うこと；ついで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２回、１時間５５℃で洗浄することを含む、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間から終夜、３７℃でインキュベートすること；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、及び；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間フィルターを洗浄することを含む、低ストリンジェント条件を使用することができる。
【００２８】
ＭＩＮＲ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＭＩＮＲ核酸及びポリペプチドは、ＭＩＮＲ機能を調節する薬剤の同定及び試験、並びにＩＮＲシグナル伝達におけるＭＩＮＲの関与に関連する他の用途に有用である。ＭＩＮＲ核酸は、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、対象のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列を単離する技術は当該分野で周知である。
【００２９】
非常に様々な方法がＭＩＮＲポリペプチドを取得するために利用可能である。一般に、ポリペプチドの意図された使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。例えば、調節剤をスクリーニングするために使用するポリペプチドを生成するには、これらのタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要である場合があり、抗体産生のためのポリペプチドを生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要である場合がある。スクリーニング又は抗体産生のために精製すべきポリペプチドを発現させるには、特異的タグの付加が必要である場合がある（例えば融合タンパク質の生成）。尿細管生成(tubulogenesis)への関与などＭＩＮＲ機能を評価するのに使用される細胞ベースアッセイのためのＭＩＮＲポリペプチドを過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞株中での発現が必要である場合がある。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当該分野で周知であり、そのための任意の適切な手段を使用することができる（例えば、Higgins SJ及びHames BD(編) Protein Expression: A Practical Approach、Oxford University Press Inc., New York 1999; Stanbury PF等, Principles of Fermentation Technology, 第２版, Elsevier Science, New York, 1995; Doonan S編, Protein Purification Protocols, Humana Press, New Jersey, 1996; Coligan JE等, Current Protocols in Protein Science編, 1999, John Wiley & Sons, New York；米国特許第６１６５９９２号）。
【００３０】
ＭＩＮＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入して、挿入されたタンパク質コード配列を発現させることができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含む必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、天然のＭＩＮＲ遺伝子及び／又はそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／又は特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【００３１】
ＭＩＮＲポリペプチドは、場合によっては、異種タンパク質配列とペプチド結合を介して連結された、融合体又はキメラ産物として発現されてもよい。一応用例では、異種配列は、転写レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなど）をコードする。キメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列を、適切なコード化フレーム内で標準的な方法を用いて互いに連結し、キメラ産物を発現することによって調製することができる。また、キメラ産物は、タンパク質合成技術、例えば、ペプチド合成装置（Hunkapiller等, Nature(1984) 310:105-111）の使用などにより調製することもできる。
【００３２】
ＭＩＮＲポリペプチドは、標準的方法（例えばイオン交換、アフィニティー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動）を使用して単離及び精製することができる。あるいは、標準的方法（例えば免疫親和性精製）によって、天然源から天然ＭＩＮＲタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、イムノアッセイ、バイオアッセイ、又は結晶学など他の物理的特性の測定などの適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
本発明の方法では、ＭＩＮＲ又はＩＮＲシグナル伝達に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作された細胞を使用することもできる。ここで使用されるミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（例えば遺伝子のノックアウト又は通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００３３】
遺伝子改変動物
この発明の方法はＭＩＮＲ及び／又はＩＮＲシグナル伝達に関与していることが知られている他の遺伝子の発現を改変するように遺伝子的に改変された非ヒト動物を使用しうる。好適な遺伝子改変動物は哺乳動物、特にマウス又はラットである。好適な非哺乳動物種には、ゼブラフィッシュ、線虫、及びショウジョウバエが含まれる。好ましくは、改変されたＭＩＮＲ又は他の遺伝子発現は、例えば改変遺伝子の正常な発現を有するコントロール動物と比較した場合に、ＩＮＲシグナル伝達の改変されたレベル、血漿グルコース又はインスリンの改変されたレベル、又は改変された脂質プロファイルのような、検出可能な表現型を生じる。遺伝子改変動物は、以下に記載されるように、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状の動物モデルにおけるＩＮＲシグナル伝達を更に解明するために、また候補治療剤のインビボ検査のために使用されうる。
好適な遺伝子改変動物はトランスジェニックで、その細胞の少なくとも一部分は、典型的にはモザイクである安定なゲノム挿入物か又は染色体外エレメントとして存在する非天然核酸を有する。好適なトランスジェニック動物は子孫動物の全細胞に安定に伝達される生殖系列挿入物を有する。
【００３４】
非天然核酸は任意の好都合な方法によって宿主動物中に導入される。トランスジェニック動物を作製する方法は当該分野で周知である（トランスジェニックマウスについては、Brinster等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:4438-4442 (1985), どちらもLeder等の米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner等の米国特許第４，８７３，１９１号、並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)を参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford等の米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling, Science, 1982, 218:348-53及び米国特許第４６７０３８８号を参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.等, A Universal Marker for Transgenic Insects (1999) Nature 402:370-371を参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S., Transgenic Zebrafish, Methods Mol Biol. (2000); 136:375-3830を参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションの手順については、Houdebine及びChourrout, Experientia (1991) 47:897-905を参照；トランスジェニックラットについては、Hammer等, Cell (1990) 63:1099-1112を参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製については、例えばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、(1987)を参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物のクローンを作製することができる（Wilmut,I等 (1997) Nature 385:810-813；ＰＣＴ国際公開公開番号ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号を参照）。
【００３５】
一実施形態では、トランスジェニック動物は、好ましくはＭＩＮＲ発現が検出不可能又は僅かとなるように、ＭＩＮＲ機能の低下をもたらす内因性ＭＩＮＲ遺伝子の配列中のヘテロ接合性又はホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は、通常、ノックアウトされる遺伝子の少なくとも一部を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、付加、又は置換を導入しておく。導入遺伝子はヒト遺伝子（例えばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。例えば、マウスゲノム中の内因性ＭＩＮＲ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するために、マウスＭＩＮＲ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi, Science (1989) 244:1288-1292;Joyner等, Nature (1989) 338:153-156を参照）。非げっ歯類トランスジェニック哺乳動物及び他の動物を作製する手順も利用可能である（上掲のHoudebine及びChourrout; Pursel等, Science (1989) 244:1281-1288; Simms等, Bio/Technology (1988) 6:179-183）。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH等, (1994) Scan J Immunol 40:257-264; Declerck PJ等, (1995) J Biol Chem. 270:8397-400）。
【００３６】
別の実施形態では、トランスジェニック動物は、例えばＭＩＮＲの追加のコピーを導入することによって、又はＭＩＮＲ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を作用可能に挿入することによって、ＭＩＮＲ遺伝子の発現の変化（例えば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。ノックインは、ホモ接合性又はヘテロ接合性でありうる。
【００３７】
導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトのトランスジェニック動物も作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso等, PNAS (1992) 89:6232-6236；米国特許第４９５９３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択タンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、一方が選択タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の作製によって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman等, (1991) Science 251:1351-1355；米国特許第５６５４１８２号）。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X等 (2000) Nat Genet 25:83-6）。
【００３８】
ＩＮＲ機能の欠陥に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を遺伝子研究に使用してＩＮＲ経路をさらに解明することができる。候補治療剤をＭＩＮＲ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／又は候補治療剤を与えたＭＩＮＲ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【００３９】
ＭＩＮＲ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ＩＮＲ機能（及びそれ以外は正常なＭＩＮＲ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。例えば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補ＩＮＲ調節剤の活性をインビボで評価するために、ＩＮＲノックアウトマウスを使用することができる。好ましくは、候補ＩＮＲ調節剤をＩＮＲ機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ＩＮＲ機能が修復されていることが示される。
【００４０】
ＭＩＮＲ調節剤
本発明は、ＭＩＮＲの機能及び／又はＩＮＲシグナル伝達と相互作用し及び／又はこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。このような作用剤は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する様々な診断及び治療用途、並びにＭＩＮＲタンパク質及びＩＮＲシグナル伝達に対するその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＭＩＮＲ相互作用剤又は調節剤を投与することによってＭＩＮＲ活性を特異的に調節する工程を含む、ＩＮＲシグナル伝達を調節する方法も提供する。
【００４１】
ここで使用される場合、「ＭＩＮＲ調節剤」は、ＭＩＮＲ機能を調節する任意の薬剤、例えばＭＩＮＲと相互作用してＭＩＮＲ活性を阻害又は増強させ、あるいはその他の方法によって正常なＭＩＮＲ機能に影響を与える薬剤である。ＭＩＮＲ機能は、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた任意のレベルで影響を受けうる。好ましい実施態様では、ＭＩＮＲ調節剤はＭＩＮＲの機能を特異的に調節する。「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などの語句は、本明細書中では、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸に直接結合し、好ましくはＭＩＮＲの機能を阻害、増強、又は他の形で変化させる調節剤を意味するために使用する。また、これらの語句は、（例えば、ＭＩＮＲの結合パートナーと、又はタンパク質／結合パートナー複合体と結合してＭＩＮＲ機能を改変することによって）ＭＩＮＲと結合パートナー又は基質、又はコファクターとの相互作用を変化させる調節剤をも包含する。更に好適な実施態様では、ＭＩＮＲ調節剤はＩＮＲ経路のモジュレーターであり（例えばＩＮＲ機能を回復し、及び／又はアップレギュレートする）、よってまたＩＮＲ調節剤である。
【００４２】
好ましいＭＩＮＲ調節剤には、小分子の化学薬剤；抗体及びその他生物治療剤を含めたＭＩＮＲ相互作用タンパク質；及びアンチセンスオリゴマーやＲＮＡを含む核酸モジュレーターが含まれる。調節剤を、例えば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／又は適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、医薬組成物中に配合してもよい。化合物を製剤又は投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA, １９版に見出される。
【００４３】
小分子モジュレーター
当該分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学薬剤は通常、分子量が１０，０００未満、好ましくは５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満である有機の非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリーからの化合物が含まれる。合成化合物は、ＭＩＮＲタンパク質の既知又は推定の特性に基づいて合理的に設計又は同定するか、あるいは化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリーをスクリーニングしてＭＩＮＲ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当該分野で周知である（Schreiber SL, Science (2000) 151:1964-1969; Radmann J及びGunther J, Science (2000) 151:1947-1948）。
【００４４】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ＩＮＲシグナル伝達に関連する病状を処置するのに有用でありうる。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する対話型の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。例えば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロ及びインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００４５】
タンパク質モジュレーター
特異的なＭＩＮＲ相互作用タンパク質は、ＩＮＲ経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、並びに他のＭＩＮＲ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施態様では、ＭＩＮＲ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた正常なＭＩＮＲ機能に影響を与える。別の実施態様では、ＭＩＮＲ相互作用タンパク質は、糖尿病などのＩＮＲに関連する疾患に関連しているので、ＭＩＮＲタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（例えば診断上の手段用）。
【００４６】
ＭＩＮＲ相互作用タンパク質は、ＭＩＮＲ発現、局在化、及び／又は活性を調節するＭＩＮＲ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＭＩＮＲと自然に遺伝学的又は生化学的に相互作用するものであってよい。ＭＩＮＲモジュレーターには、ＭＩＮＲ相互作用タンパク質及びＭＩＮＲタンパク質自体のドミナントネガティブ型が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＭＩＮＲ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供される（Finley, R.L.等 (1996) DNA Cloning-Expression Systems: A Practical Approach, Glover D.及びHames B.D編 (Oxford University Press, Oxford, England), pp.169-203; Fashema SF等, Gene (2000) 250:1-14; Drees BL Curr Opin Chem Biol (1999) 3:64-70; Vidal M及びLegrain P Nucleic Acids Res (1999) 27:919-29；米国特許第５，９２８，８６８号）。質量分析は、タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法である（例えば、Pandley A及びMann M, Nature (2000) 405:837-846; Yates JR 3rd, Trends Genet (2000) 16:5-8に総説あり）。
【００４７】
ＭＩＮＲ相互作用タンパク質は、ＭＩＮＲ特異的抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でありうる（例えば、Harlow及びLane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane (1999) Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Loboratory Pressを参照）。ＭＩＮＲ抗体については以下でさらに説明する。
好ましい実施態様では、ＭＩＮＲ相互作用タンパク質はＭＩＮＲタンパク質に特異的に結合する。好ましい他の実施態様では、ＭＩＮＲ調節剤はＭＩＮＲ基質、結合パートナー、又はコファクターと結合する。
【００４８】
抗体
別の実施態様では、タンパク質モジュレーターはＭＩＮＲ特異的抗体アゴニスト又はアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＭＩＮＲモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞性応答並びにＭＩＮＲの一般的なプロセッシング及び成熟を担当するＭＩＮＲ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【００４９】
周知の方法を使用してＭＩＮＲポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＭＩＮＲポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＭＩＮＲに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ')２断片、ＦＡｂ発現ライブラリーによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗-Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。例えば、抗原性を示すＭＩＮＲポリペプチドの常套的なスクリーニングによって、又はＭＩＮＲのアミノ酸配列に対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるＭＩＮＲのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood, (1981) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-28; Hopp及びWood, (1983) Mol. Immunol. 20:483-89; Sutcliffe等, (1983) Science 219:660-66）。記載された標準的手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、又はそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（上掲のHarlow及びLane; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第２版) Academic Press, New York;及び米国特許第４３８１２９２号；米国特許第４４５１５７０号；及び米国特許第４６１８５７７号）。ＭＩＮＲの粗細胞抽出物又は実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＭＩＮＲ断片を使用する場合、これらは、好ましくはＭＩＮＲタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施態様では、ＭＩＮＲ特異的抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。例えば、主題のポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化される。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００５０】
固定した対応するＭＩＮＲポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＭＩＮＲ特異的抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＭＩＮＲポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はマウス断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をマウスｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を併せてスプライスすることによってキメラ抗体を作製する（Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. (1984) 81:6851-6855; Neuberger等, Nature (1984) 312:604-608; Takeda等, Nature (1985) 31:452-454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM等, (1988) Nature 323:323-327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M., J.M.Harlan (1994) Blood 84:2068-2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のマウス配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下又は排除される（Co MS及びQueen C. 1991 Nature 351:501-501; Morrison SL. 1992 Ann. Rev. Immun. 10:239-265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００５１】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＭＩＮＲ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, Science (1988) 242:423-426; Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:5879-5883; Ward等, Nature (1989) 334:544-546）。
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、又は代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリーに曝すことを含む（Huse等, Science (1989) 246:1275-1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲に含まれる（上掲のHarlow及びLane, 1988）。
【００５２】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変して又は改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質又は標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合又は非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S等, Int J.Biol Markers (1989) 4:131-134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００５３】
患者に治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、又は静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるビヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（例えば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなビヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、又はリポソーム担体などの非水性ビヒクルを使用してもよい。ビヒクルには、等張性や化学的安定性を高める又は他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなビヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６号；国際公開ＷＯ００７３４６９号）。
【００５４】
核酸モジュレーター
他の好ましいＭＩＮＲ調節剤としては、一般的にＭＩＮＲ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましいアンチセンスオリゴマーは、ＤＮＡの複製、転写、ＭＩＮＲ ＲＮＡの転位、ＭＩＮＲ ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＮＡスプライシング、及びＭＩＮＲ ＲＮＡが関与する任意の触媒活性など、ＭＩＮＲ核酸の機能を妨げる。
一実施態様では、アンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＭＩＮＲ ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＭＩＮＲに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、又は２０ヌクレオチド長である。他の実施態様では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、又は３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはＤＮＡ及びＲＮＡのキメラ混合物、誘導体又はそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を修飾してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによって惹起される切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００５５】
別の実施態様では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルホリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）のうちの一つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから構築されている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な生成方法及び使用方法は、当分野で周知である（例えば、国際公開ＷＯ９９／１８１９３号；Summerton J及びWeller D., Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1997, 7:187-95; Probst JC, Methods 2000, 22:271-281;米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号を参照）。
【００５６】
好ましい代替のＭＩＮＲ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A等, 1998 Nature 391:806-811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999); Sharp, P.A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15,485-490 (2001); Hammond, S.M.等, Nature Rev.Genet. 2,110-1119(2001); Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001); Hamilton, A.等, Science 286, 950-952 (1999); Hammond, S.M.等, Nature 404, 293-296 (2000); Zamore, P.D.等, Cell 101, 25-33 (2000); Bernstein, E.等, Nature 409, 363-366 (2001); Elbashir, S.M.等, Genes Dev. 15, 188-200 (2001)；国際公開ＷＯ０１２９０５８号；国際公開ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM等, 2001 Nature 411:494-498）。
【００５７】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、及び治療薬として使用される。例えば、遺伝子の発現を特異的に阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（例えば、米国特許第６１６５７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、例えば生物学的経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。例えば、アンチセンスオリゴマーは、疾病状態の動物及びヒトの処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF等, 1993, J Med Chem 36:1923-1937; Tonkinson JL等, 1996, Cancer Invest 14:54-65）。したがって、本発明の一態様では、ＩＮＲシグナル伝達におけるＭＩＮＲの機能をさらに解明するためのアッセイで、ＭＩＮＲ特異的アンチセンスオリゴマーが使用される。ゼブラフィッシュはアンチセンスオリゴマーを使用するＩＮＲシグナル伝達の研究のための特に有用なモデルである。例えば、ＰＭＯはゼブラフィッシュの胚において一又は複数の遺伝子をインビボで選択的に不活性にするために使用される。１−１６細胞段階でゼブラフィッシュにＰＭＯを注射することによって、ショウジョウバエのスクリーニングから生じた候補標的の有効性がこの脊椎動物モデル系において確認される。本発明の別の態様では、ＩＮＲシグナル伝達の他の治療的モジュレーターの同定のためにゼブラフィッシュゲノムをスクリーニングするためにＰＭＯが使用される。本発明の更なる態様では、ＭＩＮＲ特異的アンチセンスオリゴマーは代謝病理状態の処置のための治療剤として使用される。
【００５８】
アッセイ系
本発明は、ＭＩＮＲ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、特定の事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＭＩＮＲ核酸又はタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果又は分子効果を同定又は確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＭＩＮＲ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がＩＮＲシグナル伝達に関連する形でＭＩＮＲに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＭＩＮＲモジュレーターを、「一次アッセイ」で同定したり確認せずに、直接「二次アッセイ」で試験する。
【００５９】
好ましい実施態様では、アッセイ系は、候補剤が存在しなければ、アッセイ系で検出される特定の分子事象に基づく対照活性が系によってもたらされる条件下で、ＭＩＮＲポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。該方法はさらに候補剤が存在する場合の同じタイプの活性（「作用剤によって影響を受ける系の活性」）を検出することを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との差により、この候補剤がＭＩＮＲ活性を、したがってＩＮＲシグナル伝達を調節することが示される。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＭＩＮＲ活性を、したがってＩＮＲシグナル伝達を調節することが示される。アッセイで使用されるＭＩＮＲポリペプチド又は核酸は上述した核酸又はポリペプチドの任意のものを含みうる。
【００６０】
一次アッセイ
一般的に、試験されるモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００６１】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質の関連する生化学的反応を再度引き起こさせる又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS等, Curr Opin Chem Biol (1997) 1:384-91及び添付の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、又は膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを指す。「無細胞」という用語は、実質的に精製されたタンパク質（内因性又は組換えによって生成された）、部分的に精製した細胞抽出物又は粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質-ＤＮＡ相互作用、タンパク質-タンパク質相互作用（例えば受容体-リガンド結合）、転写活性（例えばレポーター遺伝子）、酵素活性（例えば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する特定の分子事象の読出しを行うことができる。
【００６２】
好適な実施態様では、スクリーニングアッセイは、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質-タンパク質又はＤＮＡ-タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7:730-4; Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol (1998) 2:597-603; Hertzberg RP及びPope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4:445-451）。
ＭＩＮＲモジュレーターのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。
【００６３】
結合アッセイ。特異的な結合活性を有するタンパク質の活性を検出するために様々なアッセイが利用可能である。そのようなアッセイの例として、蛍光標識したタンパク質、ペプチド又はその他分子の結合を測定するために蛍光偏光を使用するもの、及びレーザー走査技術を使用するものがある（Lynch BA等, 1999, Anal Biochem 275:62-73; Li HY, 2001, J Cell Biochem 80:293-303; Zuck P等, Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:11122-11127）。別の実施例では、ストレプトアビジンでコーティングしたＳＰＡビーズに捕らえられたビオチン標識ペプチドプローブ、及び放射標識パートナー分子を用いるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用して結合活性を検出する。このアッセイは、ＳＰＡビーズに固定されたシンチラントにより、特にぺプチドプローブに結合した放射標識されたタンパク質を検出する（Sonatore LMら, 1996, Anal Biochem 240: 289-297）。
【００６４】
転写活性アッセイ。一実施例では、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して転写活性を検出する。別の実施例では、反応性遺伝子制御配列に作用可能にリンクする転写レポーター（例えばルシフェラーゼ、ＧＦＰ、βガラクトシダーゼ等）を使用する（例えばBerg M等, 2000, J Biomol Screen, 5:71-76）。転写複合体の一部であるタンパク質はまた、結合活性（つまり、複合体の他のメンバー）についてもアッセイできる。
【００６５】
ホスファターゼアッセイ。タンパク質ホスファターゼは、タンパク質基質においてセリンからのγリン酸、スレオニン又はチロシン残基の除去を触媒する。ホスファターゼはキナーゼとは反対に作用するので、適切なアッセイによりタンパク質基質からのリン酸の除去がモニターできる。一実施例では、蛍光標識したペプチド基質の脱リン酸化により基質のトリプシン切断が可能となり、次いで切断された基質の蛍光度が著しく上昇する（Nishikata M等, Biochem J (1999) 343:35-391）。別の実施例では、蛍光偏光によりホスファターゼと標的との直接的結合をモニターする；ホスファターゼの濃度を増大させると脱リン酸化速度が上昇し、偏光が変化する（Parker GJ等, 2000. J Biomol Screen 5:77-88）。別の適切なアッセイにより脂質ホスファターゼ活性をモニターすることができ、蛍光標識や放射標識などの標識をした基質を使用してホスファチジルイノシトール基質からのリン酸の除去を検出することができる。一実施例では、「ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ」技術（米国特許第５，９７２，５９５号）を使用するアッセイにおいて、放射標識した疎水性の基質をマルチウェルプレートの各ウェル内の固体支持体に固定化する。基質の脱リン酸化を、シンチラントの近似により検出できる結合放射性の低減により測定する。ホスホイノシチドホスファターゼ活性を検出するためのその他のアッセイは当技術分野において既知である（例えば米国特許第６，００１，３５４号及び同第６，２３８，９０３号を参照）。
【００６６】
ＧＡＰアッセイ。ＧＡＰタンパク質はＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を刺激する。例示的アッセイは、例えば標識したＧＴＰを使用するＧＴＰ加水分解アッセイにより、ＧＡＰ活性をモニターできる（例えばJones S等, Molec Biol Cell (1998) 9:2819-2837）。別のアッセイは、積み荷（ｃａｒｇｏ）の分子の動きをモニターすることによりエンドソームトラフィッキングにおけるＧＡＰ機能を検出することができる。このとき積み荷の分子を標識してもよい（Sonnichsen等, 2000, J Cell Biol 149:901-14）。
【００６７】
キナーゼアッセイ。いくつかの好適なアッセイでは、キナーゼ活性、タンパク質基質におけるアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）からセリン又はトレオニン残基へのγリン酸の転移を検出する。［γ−３２Ｐ又は−３３Ｐ］ＡＴＰからの転移をモニターするラジオアッセイを使用してキナーゼ活性をアッセイすることができる。残りの放射標識ＡＴＰからのリン酸標識産物の分離は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ガラスファイバーフィルターやペプチド又はタンパク質に結合するその他の基質を使用する濾過、及び固相基質へのペプチド又はタンパク質の吸収／結合により洗浄による残りの放射標識ＡＴＰの除去を可能にするなど、様々な方法により達成できる。一実施例では、シンチレーションアッセイにより、[γ−３３Ｐ］ＡＴＰからビオチン化したペプチド基質へのγリン酸の転移をモニターする。基質はシグナルを伝達するストレプトアビジン被覆ビーズに捕らえられる（Beveridge M等、J Biomol Screen、(2000) 5:205-212）。このアッセイはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用する。ＳＰＡにおいては、ＳＰＡビーズの表面に拘束されたレセプターに結合したラジオリガンドのみが、内部に固定化されたシンチラントによって検出され、それにより自由リガンドから結合体を分離することなく結合を測定することができる。プロテインキナーゼ活性のほかのアッセイでは、リン酸化した基質を特異的に認識する抗体を使用できる。例えば、キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、培養細胞中の無傷レセプターを刺激するリガンドによりレセプターチロシンキナーゼ活性を測定し、次いで特異的抗体で可溶化されたレセプターを培養し、ホスホチロシンＥＬＩＳＡによりリン酸化を定量化する（Sadick MD, Dev Biol Stand (1999) 97:121-133）。プロテインキナーゼ活性のための抗体に基づくアッセイの別の例は、ＴＲＦ（時間分解蛍光光度法）である。この方法では、ユーロピウムキレート標識した抗ホスホチロシン抗体を利用してマイクロタイタープレートウェル上にコーティングされた重合体基質へのリン酸の転移を検出する。次いで、時間分解、乖離増強蛍光を使用してリン酸化の量を検知する（Braunwalder AF, 等, Anal Biochem 1996 Jul 1;238(2):159-64）。ミエリン塩基タンパク質、カゼイン、ヒストン、又はポリグルタミン酸／チロシン及び放射標識ＡＴＰの合成ペプチドなど、基質のリン酸化に依存するタンパク質キナーゼのための一般的なアッセイを確立することができる。
【００６８】
終結因子活性アッセイ。適切なアッセイによりインビトロで終結因子活性を検出することができる（例えばSeit-Nebi等, 2001, Nucleic Acids Res 29:3982-7; Frolova等, 1994, Nature 372:701-3; Caskey等, 1974, Methods Enzymol 30:293-303）。
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＭＩＮＲの組換え発現系及び特定のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。無細胞アッセイでは、しばしば組換え生産され精製された又は実質的に精製されたタンパク質が用いられる。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母２ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質-タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、スクリーニングアッセイにＭＩＮＲ相互作用タンパク質を使用する場合、ＭＩＮＲタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、及び免疫原性を含む、様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００６９】
スクリーニングアッセイでは、ＭＩＮＲポリペプチド、その融合タンパク質、又はこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞又は膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＭＩＮＲポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＭＩＮＲ活性を保持しているその断片でもよい。ＭＩＮＲポリペプチドは、検出又は固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＭＩＮＲポリペプチドは、好ましくはヒトＭＩＮＲ、あるいは上記のようなそのオルソログ又は誘導体である。好ましい実施態様では、スクリーニングアッセイで、ＭＩＮＲと内因性タンパク質又は外因性タンパク質、又はＭＩＮＲに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＭＩＮＲ遺伝子機能を評価することができる。
ある種のスクリーニングアッセイをまた使用して抗体及び核酸モジュレーターを試験することができる；核酸モジュレーターに対して、適切なアッセイ系はＭＩＮＲ ｍＲＮＡの発現を含む。
【００７０】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ法は、ＭＩＮＲタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当該分野で周知である（上掲のHarlow及びLane, 1988, 1999）。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）がＭＩＮＲに特異的な抗体を検出する好ましい方法である；他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
【００７１】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＭＩＮＲ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーターの存在下及び非存在下での細胞の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＭＩＮＲを発現する２種の細胞プール）中のＭＩＮＲ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当該分野で周知である。例えば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ-ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、又はマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＭＩＮＲ ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology(1994) Ausubel FM等編, John Wiley & Sons, Inc., 第４章; Freeman WM等, Biotechniques (1999) 26:112-125; Kallioniemi OP, Ann Med 2001, 33:142-147; Blohm DH及びGuiseppi-Elie, A Curr Opin Biotechnol 2001, 12:41-47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＭＩＮＲタンパク質又は特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体又は抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又はｉｎ ｓｉｔｕ検出を含めた様々な手段が利用可能である（上掲のHarlow E及びLane D, 1988及び1999）。
【００７２】
二次アッセイ
調節剤がＩＮＲシグナル伝達に関連する形でＭＩＮＲに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＭＩＮＲ調節剤の活性を更に評価することができる。ここで使用されるところのＭＩＮＲ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物又は他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的又は生化学的経路に対する調節剤の活性を試験し、あるいはモジュレーターがＭＩＮＲと相互作用する特異性を試験することもできる。
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーターの存在下及び非存在下において、細胞や動物の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＭＩＮＲを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＭＩＮＲ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置又は偽薬処置した）細胞や動物と比較してＩＮＲシグナル伝達に変化がもたらされるかどうかを試験する。ＩＮＲシグナル伝達の変化はＩＮＲ経路成分の改変又はその発現もしくは活性の変化として検出することができる。アッセイは、また、グルコース取り込みのような即時の出力、又は長期にわたる効果、例えばグリコーゲン及びトリグリセリド代謝、脂肪細胞分化、又は糖尿病又は他のＩＮＲ関連病理の進行を包含するようにここで用いられる正常な又は欠陥のあるＩＮＲシグナル伝達の出力を検出しうる。ある種のアッセイでは、ＩＮＲ又は相互作用経路、又はＩＮＲシグナル伝達又はＩＮＲシグナル伝達の出力に関連する経路における遺伝子の発現が変化するように操作された細胞や動物を表すものとしてここで使用される、感作させた遺伝的バックグラウンドを使用する。
【００７３】
細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイは、種々のインスリン感受性哺乳動物細胞を使用し、内在性ＩＮＲシグナルを検出し、又はＩＮＲ及び／又は他のＩＮＲ経路の構成要素の組換え発現によるものである。例示的なインスリン感受性細胞には、脂肪細胞、肝細胞、及び膵臓β細胞が含まれる。適切な脂肪細胞には、インスリン感受性アッセイにおいて最も一般的に使用される３Ｔ３Ｌ１細胞、並びにマウス又はヒトのバイオプシーによる一次細胞が含まれる。適切な肝細胞には、ラット肝細胞腫Ｈ４−ＩＩ−Ｅ細胞株が含まれる。適切なβ細胞には、至適化されたグルコース感受性インスリン分泌を行うラットＩＮＳ−１細胞が含まれる(クローン８２３−１３等, Hohmeier等, 2000, Diabetes 49: 424)。他の適切な細胞には、筋細胞、例えばＩＮＲを過剰発現するように操作されたＬ６筋管、ＣＨＯ細胞が含まれる。あるアッセイ系に関して、インスリン耐性な状態を誘導するグルコサミン、遊離脂肪酸又はＴＮＦαなどの因子で細胞を処理することが有用である。候補モジュレーターは、典型的には、細胞培養液中に添加されるが、細胞に注入されるか又は他のいずれかの効果的な手段によって送達されてもよい。
細胞ベースのアッセイは、一般に、ＭＩＮＲ調節剤によるインスリン応答性細胞の処理がインスリン刺激に応答してＩＮＲシグナルを変更させるかどうか（「インスリン感受性」）を試験する；このようなアッセイは当該技術分野において周知である(例えば Sweeney等, 1999, J Biol Chem 274: 10071を参照)。好ましい実施態様において、アッセイはＭＩＮＲ機能がインスリン感受性の増加を阻害するか否か決定するために実施される。
【００７４】
一例において、ＩＮＲシグナル伝達はインスリン応答性遺伝子の発現を測定することにより評価される。肝細胞は、これらのアッセイに対して好ましいものである。多くのインスリン応答性遺伝子が知られている(例えば、ｐ８５ ＰＩ３キナーゼ、 ヘキソキナーゼＩＩ、グリコーゲン合成酵素、リポタンパク質リパーゼなど；ＰＥＰＣＫはＩＮＲシグナル伝達に応答して特異的に下方制御される)。既に記述されているような、発現解析に関する任意の有用な手段が使用される。典型的には、ｍＲＮＡ発現が検出される。好ましい適用において、Ｔａｑｍａｎ解析はｍＲＮＡ発現を直接測定するために使用される。あるいは、発現は、インスリン応答遺伝子の制御配列（例えば、エンハンサー／プロモーター領域）のコントロール下において、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ＧＦＰ又は他の蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼなど）をコードする配列を含む遺伝子組換えレポーターコンストラクトから間接的にモニターされる。レポーターコンストラクトの作製及び使用方法は周知である。
また、ＩＮＲシグナル伝達はＩＮＲシグナル伝達経路の構成要素の活性を測定することによっても測定され、当該技術分野において周知である(例えば、Kahn及びWeir編, Joslin's Diabetes Mellitus, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1994を参照)。適切なアッセイは、ＩＲＳ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＧＳＫ３などを含む経路のメンバーのリン酸化を、例えば、リン酸化されたタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて検出する。また、アッセイは経路構成要素の特異的なシグナル伝達活性における変化も検出する（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＧＳＫ３、Ａｋｔなどのキナーゼ活性）。キナーゼアッセイ、並びにリン酸化タンパク質基質の検出方法は、当該技術分野において周知である(例えば、Ueki K等, 2000, Mol Cell Biol ; 20: 8035-46を参照のこと)。
【００７５】
他の例において、アッセイでは、好ましくは肝細胞を用いて、インスリン刺激への応答におけるグリコーゲン合成が測定される。グリコーゲン合成は、グリコーゲン含有量の測定、及び放射標識などで標識されたグルコースを用いたグリコーゲン合成の定量を含む、種々の手段によってアッセイされる(例えば、Aiston S及びAgius L, 1999, Diabetes 48: 15-20；Rother KI等, 1998, J Biol Chem 273: 17491-7を参照)。
他の適切なアッセイでは、インスリン刺激に応答したグルコース（典型的には標識化グルコース）の細胞内取込みが測定される。脂肪細胞はこれらのアッセイに対して好ましい。また、アッセイにおいて、主として筋肉及び脂肪細胞中でのインスリン誘導性グルコースの取込みの主なメディエーターであり、インスリン刺激の後細胞表面へ特異的に移行する、グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）４の移行が測定される。このようなアッセイは、ＧＬＵＴ４−特異的抗体を使用して内在性ＧＬＵＴ４の移行を検出するか又は特定のエピトープに特異的な抗体を使用して外因的に導入されたエピトープタグ化ＧＬＵＴ４を検出する (例えば、Sweeney, 1999, 上掲；Quon MJ等, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 5587-91を参照)。
他の好ましいアッセイは、グルコースに応答したβ細胞からのインスリン分泌を検出する。このようなアッセイは典型的にはエライザ(例えば、Bergsten及びHellman, 1993, Diabetes 42: 670-4を参照)、又はラジオイムノアッセイを用いる (RIA；例えば、Hohmeier等, 2000, 上掲を参照)。
【００７６】
動物アッセイ
候補ＭＩＮＲモジュレーターを試験するために、代謝性疾患の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、そのようなモデルでは、脂質代謝、脂質生成、及び／又はＩＮＲシグナル伝達経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（例えば過剰発現又は発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。また、特定の摂食状態、及び／又は投与又はある種の生物学的に活性な化合物は、脂質及び／又は代謝疾患の動物モデルに貢献し又はこれを作成する。アッセイは、一般に、経口投与、注射（静脈内、皮下、腹腔内）、ボーラス投与などにより、候補モジュレーターの全身的な送達を必要とする。
一実施態様において、アッセイでは、糖尿病及び／又はインスリン耐性のモデルマウスが使用される。ｏｂ（レプチン）又はｄｂ（レプチンレセプター）などレプチン経路において、又はＩＮＲ又はインスリンレセプター基質（ＩＲＳ）などＩＮＲシグナル伝達経路において遺伝子がノックアウトされているマウスは、糖尿病の症状を示し、肝臓の脂質の蓄積（脂肪肝）、及び、しばしば、増大した血漿脂質レベルを示す(Nishina等, 1994, Metabolism 43: 549- 553；Michael等, 2000, Mol Cell 6: 87-97; Bruning JC等, 1998, Mol Cell 2: 559-569)。C57BL/6などのある種の感受性の高い野生型マウスは、高脂肪食餌を与えると類似の症状を呈する(Linton及びFazio, 2001, Current Opinion in Lipidology 12: 489-495)。従って、これらのモデルマウスを用いる適切なアッセイでは、候補モジュレーターの投与により肝臓における脂質の蓄積が変更され、好ましくは減少されるかどうかが試験される。血漿及び脂肪細胞中の脂質レベルも試験される。脂質含有量をアッセイする方法は、典型的にはＦＰＬＣ又は比色アッセイ(Shimano H等, 1996, J Clin Invest 98: 1575-1584；Hasty等, 2001, J Biol Chem 276: 37402-37408)、及び放射標識基質(Horton JD等, 1999, J Clin Invest 103: 1067-1076)の取り込みのシンチレーション測定などの脂質合成が当該技術分野において周知である。他の有用なアッセイでは、血糖値、インスリン値、及びインスリン感受性が試験される(例えば、Michael MD, 2000, Molecular Cell 6:87)。インスリン感受性はグルコース耐性試験又はインスリン耐性試験などによって常套的に試験される。
【００７７】
他の実施態様において、アッセイでは、リポタンパク質生物学及び心臓血管疾患のマウスモデルが使用される。例えば、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）のノックアウトマウスは、上昇した血漿コレステロール及び自発的な動脈障害を示す(Zhang SH, 1992, Science 258: 468-471)。また、コレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）を過剰発現するトランスジェニックマウスも、増大した血漿脂質レベル及び（特に、超低比重リポタンパク質［ＶＬＤＬ］及び低比重リポタンパク質［ＬＤＬ］コレステロールレベル）及び動脈におけるプラーク形成(Marotti KR等, 1993, Nature 364: 73-75)を示す。これらのモデルを使用するアッセイでは、候補モジュレーターの投与がアテローム誘発性(pro-atherogenic)ＬＤＬ及びＶＬＤＬのレベルを減少させ、ＨＤＬを増加させ、若しくは全脂質（トリグリセリドを含む）レベルを減少させることにより血漿脂質レベルを変更させるかどうか試験される。さらに、動脈の形態及び障害の形成の組織学的な解析（即ち、障害の数及び大きさ）により、候補モジュレーターがアテローム性動脈硬化の進行及び／又は重症度を減じることができるかどうかが示される。Ａｐｏ−Ａ１、ＰＰＡＲγ、及びＬＤＬＲ中のスカベンジャーレセプター(ＳＲ)−Ｂ１のノックアウト又はＡｐｏＥ−ｎｕｌｌバックグラウンドを含む、アテローム性動脈硬化に対する多くの他のマウスモデルが利用可能である(例えば、Glass CK及びWitztum JL, 2001, Cell 104: 503-516中に総説あり)。
他の実施態様において、血漿脂質レベル及びアテローム性動脈硬化の進行を変更させる候補モジュレーターの能力が、多重性脂質障害に関するマウスモデル中で試験される。例えば、レプチン及びＬＤＬレセプター遺伝子の両方がノックアウトされているマウスは、高コレステロール症、高トリグリセリド血症及び動脈障害を示し、障害を受けた燃料代謝、増大した血漿残余リポタンパク質、糖尿病、及びアテローム性動脈硬化同士の関連性のモデルを提供する(Hasty AH等, 2001, 上掲)。
【００７８】
診断方法
ＭＩＮＲがＩＮＲシグナル伝達に関係しているという発見により、ＩＮＲシグナル伝達に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、並びにこのような疾病及び疾患の素因を有する被験者の特定に使用可能な様々な方法が提供される。これまでに記載されているような、試料中のＭＩＮＲの発現を評価するための任意の方法を使用することができる。そのような方法は、（１）ＭＩＮＲ遺伝子変異の存在の検出、又は疾患でない状態と比較したＭＩＮＲ ｍＲＮＡの過剰発現又は過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＭＩＮＲ遺伝子産物の過剰存在量又は過少存在量のいずれかの検出、並びに（３）ＭＩＮＲに媒介された生物学的経路における摂動又は異常の検出のために、上に記載したように、試薬、例えばＭＩＮＲオリゴヌクレオチド及びＭＩＮＲに対する抗体を利用しうる。
したがって、特定の実施態様では、本発明は、ａ）患者から生体試料を得ること；ｂ）試料をＭＩＮＲ発現用のプローブと接触させること；ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較すること；及び（ｄ）工程（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＭＩＮＲの発現の改変に関連した患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。プローブは、ＤＮＡ又は抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【００７９】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【００８０】
Ｉ．ショウジョウバエ細胞ＲＮＡｉスクリーニング
細胞ＲＮＡｉスクリーニングを使用してＩＮＲ経路のモディファイヤーを同定した。簡潔には、本スクリーニングでは、Ｄｍｅｌ系由来の細胞、無血清の培地で成長するショウジョウバエＳ２細胞系の誘導体を、予想されるショウジョウバエ遺伝子に対応するｄｓＲＮＡで処理することにより、これら遺伝子の破壊に影響を与えた（Adams等, 2000, Science 287:2185-95）。マルチウェルプレート内の細胞の複写壁を、個々のショウジョウバエ遺伝子に対応するｄｓＲＮＡで処理した（Clemens等, 2000, 上掲に記載の方法に基本的に従った）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、本出願人により既にＩＮＲ経路活性との相関が示されている乳酸デヒドロゲナーゼ（"ＬＤＨ", GI1519714; Abu-Shumays及びFristrom, 1997, Dev Genet 20:11-22）遺伝子を測定した。具体的には、ＩＮＲシグナル伝達のネガティブエフェクター（例えばＰＴＥＮ、ＧＳＫ３β、及びＡＦＸ）のＲＮＡｉに基づくノックダウンによりＩＮＲ経路の活性を増大させたとき、インスリンの有無に関わらずＬＤＨの発現が増大した。ＬＤＨ発現は、ＩＮＲシグナル伝達のポジティブエフェクター（例えばＩＮＲ、ＩＲＳ、ＡＫＴ）のＲＮＡｉに基づくノックダウンによりＩＮＲ経路活性を低減させると減少した。よって、乳酸デヒドロゲナーゼの発現活性をＩＮＲ経路活性の代わりに使用した。このスクリーニングにより、ＲＮＡｉによるノックダウンがＬＤＨ発現に変化をもたらす遺伝子の「モディファイヤー」が同定された。ＲＮＡｉによる破壊がＬＤＨ発現の増加をもたらす遺伝子をＩＮＲ経路活性の候補ネガティブエフェクターとして同定し、一方、その破壊がＬＤＨ発現の減少をもたらす遺伝子を候補ポジティブエフェクターとして同定した。ＬＤＨＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた承認試験において、モディファイヤーである可能性があるものを３回再試験した。また、ＩＮＲのＲＮＡｉに基づく破壊後発現が減少したナトリウム／リン酸共輸送体（「ＣＧ４７２６」、ＧＩ１０７２７３９９；ＧＩ７２９６１１９のアミノ酸配列）も同様にした。承認試験に使用したｄｓＲＮＡは、最初の結果を産むために使用した候補モディファイヤー遺伝子とは異なるプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物から製造されたものである。表１にモディファイヤーとそのオルソログを示す。
表１
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【００８１】
ＩＩ．ハイスループットのインビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＭＩＮＲペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の選択した試験化合物と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ−２  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の、対照値に対する変化により、試験化合物がＭＩＮＲ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【００８２】
ＩＩＩ．ハイスループットのインビトロ結合アッセイ
３３Ｐ標識のＭＩＮＲペプチドを、対象の化合物と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ-４０、５０ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ-ａｖｉｄｉｎコーティングアッセイプレートのウェルに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。
【００８３】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、３×１０６個の適切な細胞を１０ｃｍの皿に蒔き、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのリン酸ｐ-ニトロフェニル、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ, Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ-４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５０００×ｇ、１５分間の２回の遠心分離によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【００８４】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、指示抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合させた西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のバンドを可視化させた。
【００８５】
ＶＩ．キナーゼアッセイ
精製したか、部分的に精製したＭＩＮＲを、適切な反応緩衝液（例えば、塩化マグネシウムまたは塩化マンガン（１−２０ｍＭ）、およびミエリン塩基性タンパク質またはカゼインなどのペプチドまたはポリペプチド基質（１−１０μｇ／ｍｌ）を含むｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ５０ｍＭ）に希釈する。キナーゼの最終的な濃度は１−２０ｎＭである。酵素反応をマイクロタイタープレートで行い、アッセイのスループットを増大させることにより反応条件の最適化を促進する。９６ウェルのマイクロタイタープレートを用い、最終容量を３０−１００μｌとする。３３ＰガンマＡＴＰ（０．５μＣｉ／ｍｌ）を加えて反応を開始させ、０．５から３時間室温でインキュベートする。ＥＤＴＡ付加によりネガティブコントロールを行い、それにより酵素活性に必要な二価カチオン（Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）をキレート化する。インキュベーション後、ＥＤＴＡを使用して酵素反応を消光させる。反応物の試料を９６ウェルのガラスファイバーフィルタリングプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。続いてフィルタをリン酸緩衝生理食塩水、希釈したリン酸（０．５％）、またはその他適切な媒体で洗浄し、過剰なラジオ標識ＡＴＰを除去する。シンチレーションカクテルをフィルタリングプレートに添加し、シンチレーションカウンティングにより取り込まれた放射能を定量化する（Wallac/Perkin Elmer）。活性は、ネガティブコントロール反応値（ＥＤＴＡクエンチ）の差引き後に検出される放射能の量と定義する。
【配列表】
2005532787000001.app
【国際調査報告】
2005532787.tif 000003
2005532787.tif 000004