(57)【要約】  本発明は、核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーおよび核酸増幅関連技術のあらゆる分野でのその用途に関する。本発明のプライマーは、(a)それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分；(b)予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分；および(c)前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体、を含んでおり、それによって調節部分がアニーリング温度によってそのプライマーのアニーリング部位を調節することができる。
2005511096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーであって、以下の(a)〜(c)：
(a) それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分；
(b) 予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分；および
(c) 前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分；
を含み、それによって調節部分がアニーリング温度によりそのプライマーのアニーリング部分を調節することができる、前記アニーリング調節プライマー。
【請求項２】
5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列が、前記鋳型核酸上のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３】
前記鋳型核酸が、gDNA、cDNAまたはmRNAであることを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項４】
前記gDNAまたはcDNAが、一本鎖または二本鎖DNAであることを特徴とする、請求項３に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項５】
前記核酸増幅が、第１のアニーリング温度および第２のアニーリング温度下で行うことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項６】
前記核酸増幅の第１のアニーリング温度が、前記第２のアニーリング温度と同一であるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項７】
前記3'末端部分が、前記第１のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、前記5'末端部分が、前記第２のアニーリング温度でのプライミング部位として機能することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項８】
前記調節部分が、前記第１のアニーリング温度でのプライマーのアニーリング部位を3'末端部分に制限することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項９】
前記第１のアニーリング温度が約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１０】
前記第２のアニーリング温度が約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１１】
次の一般式で表される、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
5'-Xp-Yq-Zr-3'
[式中、Xpは、鋳型核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分を表し；Yqは、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；Zrは、そのプライマーとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分を表し；ｐ、ｑおよびｒは、ヌクレオチドの数であり；X、YおよびZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。]
【請求項１２】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、天然のDNA/RNA塩基との間で識別されることなく天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１３】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2'-デオキシイノシン、2-アザ-2'-デオキシイノシン、2'-OMe イノシン、2'-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-F 3-ニトロピロール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2'-OMe 5-ニトロインドール、2'-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2'-F ネブラリン、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-0-メトキシエチルイノシン、2'-0-メトキシエチルネブラリン、2'-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2'-0-メトキシエチル 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-0-メトキシエチル3-ニトロピロールおよびこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１４】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１５】
前記調節部分が、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を有する連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１６】
前記デオキシリボヌクレオチドが、天然のdNMP、修飾ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１７】
前記pが、15〜60の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１８】
前記qが、少なくとも2であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１９】
前記qが、少なくとも3であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２０】
前記qが、2〜15の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２１】
前記rが、6〜50の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２２】
前記pが15〜60の整数であり、qが2〜15の整数であり、そしてrが6〜30の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２３】
前記Xpが、ユニバーサルプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２４】
前記Xpが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２５】
前記Xpが、検出または分離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２６】
前記Zrが、mRNAのポリアデノシン(ポリA)テイルとハイブリダイズするヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２７】
前記Zrが、少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２８】
前記Zrが、3'末端に3'-Vを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２９】
前記Zrが、3'末端に3'-NVを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれ、そしてそのNがデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３０】
前記Zrが、鋳型核酸中のターゲット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３１】
前記Zrが、ランダムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３２】
前記Zrが、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３３】
前記Zrが、予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の複数の組合せから選択される縮重ヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３４】
前記Zrが、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３５】
前記Zrが、アレル部位に相補的な少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３６】
前記Zrが、ターゲット核酸に対してミスマッチである、突然変異誘発のための少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマーセットを含むキット。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のアニーリング調節プライマーの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物から核酸配列を増幅する方法。
【請求項４０】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項３９に記載の方法：
(a) 核酸配列の第一段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４１】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４２】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４１に記載の方法：
(a) 第１のアニーリング温度でターゲット核酸配列の第１段階の増幅を行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅させる、前記工程。
【請求項４３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４４】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドdTプライマーと前記mRNAとを接触させる工程；
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のDNA鎖を生成させる工程；
(c) 工程(b)で得られる第１のDNA鎖からの前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(c)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４５】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二つまたはそれ以上の核酸試料中で示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出する方法。
【請求項４６】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４５に記載の方法：
(a) mRNA転写物の第１の集団である第１の核酸試料およびmRNA転写物の第２の集団である第２の核酸試料を提供する工程；
(b) 前記第１の核酸試料および第２の核酸試料の各々を請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと別々に接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記の示差的に発現されるmRNA中の第１の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、かつ、前記接触を、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う、前記工程；
(c) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記の示差的に発現されるmRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第１の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第１の集団、および前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第２の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第２の集団を生成する工程；
(d) 前記第１のcDNA鎖の第１および第２の集団の各々を精製し定量する工程；
(e) 工程(d)から得られた第１のDNA鎖の第１および第２の集団の各々の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、第１のcDNA鎖の第１および第２の集団における第２の部位に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の各々の集団における第２の部位にアニーリングする条件下で行って、それにより第２のcDNA鎖の第１および第２の集団を生成させる、前記工程；
(f) 工程(e)で生成された第２のcDNA鎖の各々の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第２のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記第２のcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(g) 工程(f)から得られた増幅産物の第１および第２の集団において、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。
【請求項４７】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項４８】
以下の工程(a)〜(e)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４７に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、そのプライマーの3'末端部分が、そのプライマーとハイブリダイズする前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 前記第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第１のcDNA鎖の一つにおける一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが前記第１のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的部位とアニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的な第２のcDNA鎖を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項４９】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項５０】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、cDNA合成プライマーとしてのオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、前記cDNA合成プライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNAの一領域に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを、逆転写酵素を用いて逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させ、それによってmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；
(f) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(e)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第２の完全長cDNA鎖の一つの一領域に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記第２の完全長cDNA鎖の一つにおける遺伝子特異的部位にアニーリングする条件で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程；および
(g) 前記遺伝子特異的cDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(f)-(i)および工程(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)-(i)および(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５１】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅する方法。
【請求項５２】
以下の工程(a)〜(f)を含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を用いて逆転写して、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；および
(f) 工程(e)で生成された前記第１の完全長cDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で各々使用したのと同一の第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅する方法。
【請求項５４】
以下の工程(a)〜(c)を含むことを特徴とする、請求項５３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 請求項５２に記載の工程(b)〜(e)を行い、それにより5'富化した第１のcDNAを伸長させる工程；および、
(c) 工程(b)で生成された前記5'富化した第１のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(b)で各々使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'富化した第１のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５５】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二組以上のプライマー対を用いて、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同一の反応で同時に増幅する方法。
【請求項５６】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５５に記載の方法：
(a) 二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記の各プライマー対の各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域と実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマー対の各々が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー対、または工程(a)で使用したプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各プライマー対の各々が工程(a)で生成された増幅産物の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅させる、前記工程。
【請求項５７】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAのDNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項５８】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５７に記載の方法：
(a) gDNAから、ゲノムに特徴的な独立したDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の部位に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングする条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された独立したDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対の各々が工程(a)で生成された前記の独立したDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の独立したDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項５９】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項６０】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、その第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖上の部位と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記mRNA試料にアニーリングする条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したcDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記のプライマーまたはプライマー対の各々が工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記独立したcDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項６１】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料から多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６２】
以下の(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、前記第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーは、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された3'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６３】
以下の工程(a)〜(c)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 請求項５２に記載の工程(a)〜(e)を行って、それにより完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第２の完全長cDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが第２の完全長cDNA鎖の前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記のコンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程；および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６４】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６５】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６４に記載の方法：
(a) 前記gDNAからの保存性ホモロジー断片の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対がgDNAの前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程；および
(b) 工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対の各々が工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の3'末端配列および5'末端配列の各々にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６６】
プライマーを用いた増幅反応を行う段階を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法。
【請求項６７】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第１のDNA鎖を生成させる第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置(interrogation position)を含み、それにより、前記疑問位置が、前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程：
(i) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第２の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第２の部位にアニーリングする条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相補的な第２のDNA鎖を生成させる工程；および
(ii) 工程(a)および工程(b)-(i)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)で生成された前記第２のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なもしくはそれに相当するハイブリダイズする配列を各々が有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、前記サイクルを、各々のプライマーが前記第２のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記ターゲット核酸の前記第１の部位および第２の部位を3'末端および5'末端に含む前記第２のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６８】
以下の工程(a)〜(c)を含む、第１の増幅および第２の増幅の二つの別個の増幅過程を用いて行い、前記第２の増幅を二段階増幅を用いて行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させる第１の増幅を行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、前記ターゲット核酸の一部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つが、3'末端部分に前記ハイブリダイズする配列を有する請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであり、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片を生成させる工程；
(b) 前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片に相補的な第１のDNA鎖を生成する第２の増幅における第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々が、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置が前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；および
(c) 工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２の増幅における第２段階の増幅を、第２のアニーリング温度で行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマー対の一方が、工程(a)で使用した請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーと同一のものであり、他方のプライマーが、工程(b)で使用した前記第１のプライマーと同一のものであるか、またはそのプライマー対の各々が、それとハイブリダイズする工程(b)で生成された前記第１のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたはそれに相当するハイブリダイズする配列を有しており、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより、前記第１のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６９】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸において突然変異誘発する方法。
【請求項７０】
以下の工程(a)および(b)を含む、前記突然変異誘発が位置指定突然変異誘発であり、二段階増幅を用いることを特徴とする、請求項６９に記載の方法：
(a) 前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記ハイブリダイズする配列が、位置指定突然変異を生じさせるための少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングされる条件で行って、それにより位置指定当然変異部位を含む増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより位置指定突然変異部位を含む増幅産物が再増幅される、前記工程。
【請求項７１】
前記第２段階の増幅が、少なくとも5回繰り返されることを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応により行うことを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸が二本鎖であり、その鎖は変性により分離することを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸が一本鎖であることを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のアニーリング温度が、約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２のアニーリング温度が、約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のアニーリング温度が、前記第２のアニーリング温度と同じであるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１段階の増幅を行う際、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマー対の3'末端部分が、前記第１のアニーリング温度でアニーリングに関与し、前記第２段階の増幅を行う際、前記プライマー対の5'末端部分が、プライミング部位として作用することを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマーの調節部分が、前記第１のアニーリング温度での前記プライマーのアニーリング部位を、3'末端部分に制限することができることを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２段階の増幅の後、増幅されたDNA産物を単離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４０〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
単離されたDNA産物をベクター中にクローニングする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１段階の増幅で使用した前記プライマー対が、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーから選択されるアニーリング調節プライマーと従来のプライマーとの組合せであることを特徴とする、請求項４０、４２、４４、４８、５０、５６、５８、６０、６２、６３または６５に記載の方法。
【請求項８３】
前記プライマーが、検出または単離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４５〜４６および５５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１の核酸試料が、第１の細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第２の核酸試料が、第２の細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１の核酸試料が、第１の発生段階の細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第２の核酸試料が、第２の発生段階の細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１の核酸試料が、腫瘍化細胞中で発現されたmRNAを含み、前記第２の核酸試料が、正常細胞中で発現されたmRNAを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項８７】
前記mRNAの前記第１の部位が、ポリAを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１のプライマーが次の一般式で表される、請求項４６に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつmRNAに実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；dTは、前記mRNAの第１の集団および第２の集団における前記第１の部位にアニーリングできる連続したデオキシチミジンを表す。]
【請求項８９】
前記第１のプライマーが次の一般式で表される、請求項４８、５２、６０または６２に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、mRNAに実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；dTは、前記mRNAのポリAテイルにアニーリングできる連続したデオキシチミジンを表す。]
【請求項９０】
前記dTが、その3'末端に3'-Vをさらに含み、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記dTが、その3'末端に3'-NVをさらに含み、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれて、前記Nは、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記第２のプライマーが次の一般式で表される、請求項４６に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dZ8-15-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、前記第１のcDNA鎖の第１の集団および第２の集団に実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；dZは、DNA鎖の前記の第１の集団および第２の集団における前記第２の部位にアニーリングできるハイブリダイズするアービトラリヌクレオチド配列を表す。]
【請求項９３】
前記第１のプライマーおよび第２のプライマーが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項９４】
工程(g)が、アガロースゲルでの電気泳動により増幅産物の第１の集団および第２の集団の各々を分離する工程、および特定の大きさのバンドの存在またはレベルを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項９５】
工程(g)が、変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により増幅産物の第１の集団および第２の集団の各々を分離する工程、および特定の大きさのバンドの存在またはレベルを比較する工程を含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項９６】
前記のシトシン残基をテイリングさせる工程を、マンガンイオンの存在下で行うことを特徴とする、請求項５０、５２、５４および６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記シトシンテイルとの塩基対を形成する前記オリゴヌクレオチドが、次の一般式で表される、請求項５０、５２、５４および６３のいずれか１項に記載の方法。
5'-dX15-30-dY2-10-dZ1-10-G3-5-3'
[式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、予め選択されたアービトラリ配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；dZは、デオキシリボヌクレオチドを表し、かつ、予め選択されたアービトラリ配列を含み；G3-5は、3〜5個のグアニンを表す。]
【請求項９８】
前記G3-5が、3〜5個のリボグアニンであることを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記G3-5が、3〜5個のデオキシリボグアニンであることを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記G3-5が、リボグアニンとデオキシリボグアニンとの組合せであることを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記増幅産物のサイズ分離によって増幅産物を比較する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記サイズ分離比較を、ポリアクリルアミドゲルマトリックスまたはアガロースゲルマトリックスでの電気泳動により行うことを特徴とする、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記サイズ分離比較を、自動DNAシーケンサーにより行うことを特徴とする、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の3'末端部分が、8〜15ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項１０５】
工程(c)で使用した前記第２のプライマーまたは第２のプライマー対の3'末端部分が、8〜15ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項６０に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ゲノムDNAまたはmRNA試料が、異なる別個の生物体に由来するものであることを特徴とする、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ゲノムDNAまたはmRNA試料の供給源が、植物、動物および微生物からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ゲノムDNAまたはmRNA試料の供給源が、ヒトであることを特徴とする、請求項５８または６０に記載の方法。
【請求項１０９】
請求項６２または６３で使用した前記第２のプライマー、または請求項６５の工程(a)で使用した前記のプライマーまたはプライマー対が、保存性配列のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチドから選択される縮重配列を各々含むプライマーのプールであることを特徴とする、請求項６２、６３または６５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ターゲット核酸が、ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ターゲット核酸が、ヌクレオチド変異を含む短いヌクレオチド断片であることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ターゲット核酸が、二つ以上の短いターゲットヌクレオチド断片を含み、前記ヌクレオチド断片の各々が、ヌクレオチド変異を含み、マルチプレックス核酸増幅にて製造されることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ヌクレオチド変異が、一塩基多型または点突然変異であることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ヌクレオチド変異が、ヒト核酸中に含まれることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ヌクレオチド変異が、感染性疾患を引き起こす生物の核酸中に含まれることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１６】
ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖が、1サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により生成されることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第１のプライマーの3'末端部分が、ヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドにより占められた疑問位置を含むことを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第１のプライマーの前記疑問位置が、その3'末端部分の中間に位置することを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１１９】
前記第１のプライマーの3'末端部分が、8〜20ヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記第１のプライマーの前記疑問位置が、前記第１のプライマーの3'末端ヌクレオチドから約10塩基以内にあることを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記第１のプライマーの疑問位置が、前記第１のプライマーの3'末端ヌクレオチドから約6塩基以内にあることを特徴とする、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記第１のプライマーの前記疑問位置が、前記第１のプライマーの3'末端ヌクレオチドから4〜6塩基以内に位置することを特徴とする、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記第１のプライマーの前記疑問位置が、前記第１のプライマーの3'末端ヌクレオチドから5塩基以内に位置することを特徴とする、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第１のプライマーが、その3'末端部分に、第１のプライマーの前記疑問位置に実質的に隣接した少なくとも一つの人為的ミスマッチヌクレオチドを有し、前記ミスマッチヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含むことを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１２５】
工程(b)-(i)におけるヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖が、1サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により生成されることを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項１２６】
工程(b)-(ii)におけるヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖を、少なくとも5サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により増幅することを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項１２７】
工程(c)におけるヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖を、少なくとも5サイクルのプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性により増幅することを特徴とする、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ヌクレオチド変異を含む短いターゲットヌクレオチド断片を、検出用標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含む前記第１のプライマーまたは第２のプライマーにより検出することを特徴とする、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項１２９】
請求項３９または４０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む核酸増幅用キット。
【請求項１３０】
請求項４１または４２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、DNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項１３１】
請求項４３または４４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項１３２】
請求項４５〜４６、８２、８７および８９〜９２のいずれか１項に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出するためのキット。
【請求項１３３】
請求項４７または４８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットcDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項１３４】
請求項４９または５０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項１３５】
請求項５１または５２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅するためのキット。
【請求項１３６】
請求項５３または５４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅するためのキット。
【請求項１３７】
請求項５５または５６に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅するためのキット。
【請求項１３８】
請求項５７または５８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いたDNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項１３９】
請求項５９または６０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いたRNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項１４０】
請求項６１、６２または６３に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いて多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項１４１】
前記キットは、請求項９８〜１０１のいずれか１項に記載の前記オリゴヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１３４、１３５または１４０に記載のキット。
【請求項１４２】
請求項６４または６５に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いた多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項１４３】
請求項６６、６７または６８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸におけるヌクレオチド変異を同定するためのキット。
【請求項１４４】
請求項６９または７０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸において突然変異誘発するためのキット。
【請求項１４５】
核酸増幅を含むプロセスのための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニーリング調節プライマーおよびその用途に関するものである。さらに詳細には、本発明は、核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するアニーリング調節プライマー、および、核酸増幅関連技術のあらゆる分野でのその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅は、分子生物学の多様な手法において極めて重要な工程であり、多様な増幅方法が提示されている。例えば、Miller, H. I.ら(WO89/06700)は、プロモーター/プライマー配列をターゲット一本鎖DNA(ssDNA)にハイブリダイズさせた後、前記配列のたくさんのRNAコピーを転写することに基づく核酸配列増幅を開示している。他の公知の核酸増幅方法としては、転写に基づく増幅システムが挙げられる(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989)；およびGingeras T.R. et al., WO 88/10315)。
【０００３】
得られた“ジ-オリゴヌクレオチド”配列を有する核酸の存在下で、二つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドのライゲーションを行うことにより、前記ジ-オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法も知られており(Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989))、この方法は「ライゲーション連鎖反応(ＬＣＲ)」と呼ばれている。
【０００４】
Davey, C.ら(ヨーロッパ特許出願公開番号第329822号)は、一本鎖RNA(ssRNA)、ssDNAおよび二本鎖DNA(dsDNA)を循環的に合成する核酸増幅方法を開示している。前記ssRNAは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドに対する第一の鋳型であり、これは逆転写酵素(RNA−依存DNAポリメラーゼ)により伸長される。次いで、前記RNAは、リボヌクレアーゼHの作用により、得られたDNA：RNA二重鎖から除去される。形成されたssDNAは、第２のプライマーに対する第２の鋳型となり、これはRNAポリメラーゼプロモーターの配列を含む。次いでDNAポリメラーゼにより前記プライマーが伸長され、それにより二本鎖DNA(dsDNA)分子が形成されるが、この分子は前記プライマー間の元のRNAと同一の配列を有し、かつ一方の末端にプロモーター配列を有する。このプロモーター配列は適合したRNAポリメラーゼによって利用され、前記DNAのたくさんのRNAコピーが生成されうる。続いて、これらのコピーは上述したサイクルに再び突入し、このことが非常に速い増幅を可能にする。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCR)として知られる最もよく利用される核酸増幅方法は、二本鎖DNAの変性、それに続くDNA鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングおよびDNAポリメラーゼによるプライマー伸長からなる反復サイクルに基づく(Mullisら、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号；Saiki et al. 1985)。PCRに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAの反対側の鎖にアニーリングするようにデザインされ、また、一方のプライマーのDNAポリメラーゼ触媒による伸長産物が他方のプライマーのための鋳型鎖として機能するように配置される。PCR増幅過程は、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーの5'末端によって定められる長さを有する個々のDNA断片の指数的増加をもたらす。
【０００６】
核酸増幅、特に、PCR増幅での成功は、プライマーが自分のターゲット配列にのみアニーリングする（そしてターゲットでない配列にはアニーリングしない）特異性に依存するため、この分子相互作用を最適化することが重要である。プライマーがその完全な相補体にのみアニーリングするか、または、一つもしくはそれ以上のミスマッチを有する配列にもアニーリングするかは、アニーリング温度により決定される。一般に、アニーリング温度が高いほど、完全に一致する鋳型に対するプライマーのアニーリングの特異性はより高くなり、これにより、ターゲット配列のみが増幅される可能性がさらに高まる。アニーリング温度が低いほど、鋳型とプライマーとの間で許容されるミスマッチが多くなり、それによりターゲットでない配列の増幅が増加する。アニーリング温度を調節することによって、鋳型とプライマーとの間の塩基対形成の特異性を変化させることができる。例えば、増幅産物が認められない場合、そのアニーリング温度が高過ぎる可能性があるので、それを下げればよい。一方のプライマーのみが存在する対照群で増幅産物が認められる場合には、このような結果は、前記の単独のプライマーが鋳型の二つ以上の部位にアニーリングすることを示唆する。このような場合、アニーリング温度を上昇させるべきである。プライマーのアニーリング特異性に対するアニーリング温度のそのような影響を考慮すると、アニーリング温度によりプライマーのアニーリングを調節して、プライマーデザインにかかわらずプライマーのアニーリング特異性を高めることができるアニーリング調節プライマーシステムに対する強い必要性がなおも存在している。
【０００７】
アニーリング温度だけではなく、プライマーの長さ、GC含量およびPCR産物の長さのようなプライマー検索パラメーターを、プライマーのアニーリング特異性のために考慮すべきである。それらのパラメーター全てを満足するプライマーを用いれば、プライマーのアニーリングは特異的になり、ターゲットDNA増幅の際のプライマーのアニーリング特異性が顕著に高められて、実験においてプライマーにより引き起こされるバックグラウンドや非特異的産物などの問題が解決される。良好にデザインされたプライマーは、例によって、非特異性アニーリングおよびバックグラウンドを回避するだけではなく、RNA−PCRでcDNAまたはゲノム鋳型を識別するのにも役立つ。
【０００８】
プライマーのアニーリング特異性を改善するために数多くの方法が開発され、それにより所望の産物の増幅が可能になった。例としては、タッチダウンPCR(Don et al., 1991)、ホットスタートPCR(D’Aquila et al., 1991)、ネスティッドPCR(Mullis and Faloona, 1987)およびブースターPCR(Ruano et al., 1989)がある。多様な「エンハンサー」化合物を用いてPCRの特異性を改善する他の代替的手法も報告されている。このエンハンサー化合物としては、前記反応の有効なアニーリング温度を増加させる化合物、DNA結合タンパク質および商業的に購入可能な試薬が挙げられる。しかし、全てのPCRで成功を保証する「特効薬」的な添加剤は存在しないが、アニーリング温度などについて異なる条件下で様々な添加剤を試験することはごく単調な作業である。これらのアプローチは、時にはプライマーのアニーリング特異性の改善に貢献してきたが、PCR増幅に用いられるプライマーから生じる非特異的産物や高いバックグラウンドなどの問題に対する根本的な解決策にはならない。
【０００９】
多くの場合、プライマー配列は、鋳型配列に対し完全な相補体である必要はない。鋳型と完全に一致すべきプライマー領域は3'末端であって、これはこの末端がDNAポリメラーゼにより伸長されるプライマー領域であり、このため、誤りのないターゲット配列に対するアニーリング特異性を保証する上で前記末端が最も重要であるからである。プライマーの5'末端は、ターゲット配列に対するアニーリングの特異性を決定する上ではそれほど重要ではなく、鋳型に対し相補的でない追加的な配列（例えば、制限部位やプロモーター配列）を担持するように改変することができる(McPherson and Moller 2000)。下記のように、この考え方は、本発明のアニーリング調節プライマーのデザインに適用される。
【００１０】
PCRに基づく技術は、ターゲットDNA配列の増幅だけではなく、生物学や医学の研究分野において科学的用途または方法に広く利用されており、例えば、逆転写酵素PCR(RT-PCR)、ディファレンシャル・ディスプレイ(Differential Display)PCR(DD-PCR)、公知または未知の遺伝子のPCRによるクローニング、cDNA末端の迅速増幅(RACE)およびPCRに基づくゲノム分析(McPherson and Moller, 2000)がある。以下は、PCRの用途の代表的な例である。
【００１１】
様々な生理学的条件または実験条件(例えば、分化、発癌、薬物処理)下で細胞により示差的に調節される遺伝子を同定するためにデザインされる技術は、最新生物学では非常に重要となっている。多様な細胞型の間、または細胞の異なる発生段階の間での遺伝子発現の差異をスクリーニングするためのそのような方法の一つは、ディファレンシャルディスプレイPCR(DD-PCR)として知られており、これはLiangとPardeeにより1992年に報告された。この方法は、10-merのアービトラリ(arbitrary)プライマーとアンカーcDNAプライマーとの組合せを用いて、主にポリ(A)テイルに由来し約50〜600ヌクレオチド上流まで伸長された断片を生成する。3'アンカーオリゴ(dT)プライマーと短い5アービトラリプライマーを組み合わせることによりトランスクリプトームのサブセットが増幅され、得られるcDNA断片は、一般に変性ポリアクリルアミドゲルで分離され、オートラジオグラフィーにより可視化される。
【００１２】
この方法は簡単且つ迅速で、全RNAを少量しか必要としない。しかし従来のDD-PCR法にはたくさんの短所がある。短いアービトラリ(arbitrary)プライマーを使用するため、その示差的なバンドパターンはしばしば再現性が不十分であり、多くの研究室では再現性のある結果を得るために苦労している。示差的に現れたバンドの40%以上が、よく訓練された実験者によってさえ実験間での再現性を示さない(Bauer el al., 1994)。さらに、示差的発現パターンは、ノーザンブロットで再現できないことが多く、その偽陽性のパーセンテージは、90％まで上る(Sompayrac et al., 1995)。代替的に用いられる変法として、より長い、例えば、20塩基長のランダムプライマーを使用しても、上述の再現性の問題を十分には解決できない(Ito et al., 1994)。DD-PCRでの比較的低い再現性の原因となる他の要因として、異なるバンドパターンを得るために使用される出発物質の不十分な量および非常に低い濃度のdNTP(2〜5μM)が挙げられる(Matz and Lukyanov, 1998)。また、前記方法では微量の転写物を検出することが難しい(Matz and Lukyanov, 1998)。DD-PCRで得られるcDNA断片は短く(通常は100〜500bp)、主に3'非翻訳領域となる当該遺伝子の3'末端に該当するため、そのcDNA断片は普通はコード領域の大部分を含まない。従って、かなりの配列相同性、遺伝子分類に関する情報および機能推定が得られない限り、労働集約的な完全長cDNAスクリーニングが必要とされる(Matz and Lukyanov, 1998)。
【００１３】
一般に、ディファレンシャルディスプレイ法では、変性ポリアクリルアミドゲルを用いる放射活性検出技術を利用する。反応生成物の放射活性検出では、ディファレンシャルディスプレイ技術の利用が、適切な設備を備えた実験室に制限される。比較的長い曝露時間およびポリアクリルアミドゲルから目的のバンドを単離する際に伴う問題は、ディファレンシャルディスプレイ技術のさらなる欠点である。最近提案された非放射性改変型ディファレンシャルディスプレイ法は、銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチド(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)およびエチジウムブロマイド染色アガロースゲル(Rompf and Kahl, 1997; Jefferies et al., 1998; Gromova et al., 1999)を含む。しかし、このような方法は、依然として成功に限界がある。もし、反応生成物をエチジウムブロマイド染色したアガロースゲルで簡単に検出できて、その結果が再現性があり信頼性があるものであれば、DD-PCR分析のスピードは大きく増加し、放射活性の利用も避けることができる
【００１４】
標的化ディファレンシャルディスプレイと通称される別のPCRベースの手法では、保存性タンパク質ドメインを有する多重遺伝子ファミリーメンバーの増幅をもたらすオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。遺伝子ファミリーとは、その遺伝子産物によって担われる細胞内での特定の種類の機能によりしばしば機能的に特徴付けられる、構造的に一つまたはそれ以上の保存領域(ドメイン)を共通して有する遺伝子群である。遺伝子ファミリーの例としては、MADS-ボックス、ホメオ遺伝子ファミリーおよび転写因子ファミリーが挙げられる。サイクリン、サイトカインおよびグロビン遺伝子ファミリーは、医学的関心の高い遺伝子ファミリーの例である。Prositeデータベースは、共通ドメインおよび配列モチーフを有するタンパク質のリストを提供している。PCRに利用されるオリゴヌクレオチドは、低いアニーリング温度で利用される特異的プライマーであるか、あるいは、より多くの場合には、より高いストリンジェンシーで用いられる縮重プライマー混合物である(Stone and Wharton, 1994)。しかし、縮重プライマーを用いた増幅は問題をはらんでおり、最適化を必要とする場合もある。過度な非特異的増幅を避けられるようにアニーリング温度をできるだけ高く維持することが重要であるため、好適な経験則では出発温度として55℃を用いる。前提条件として、縮重プライマーはアミノ酸配列または保存性ドメイン配列に基づいてデザインされるため、一般にこの経験則を保つのは難しい。縮重プライマーとアニーリング温度との間に満足のいく関係を作り出すために、プライマーデザインにかかわらず、アニーリング温度（特に、68℃のような高いアニーリング温度）の変更に耐えられるアニーリング調節プライマーを使用することが必要とされる。
【００１５】
また別のPCRベースの技術は、RNAフィンガープリンティングのためのアービトラリプライミングPCR(AP-PCR)である。AP-PCR法の１つの大きな長所は、その簡易性である(Welsh and McClelland, 1991; Williams et al., 1990)。AP-PCRは、10-merまたはより長い18-merの長さを有する単独のプライマーまたは一対のプライマーを用いる。この方法は、ハイブリッド細胞株のDNAフィンガープリントを提供するため(Ledbetter et al., 1990)、および特定のゲノム領域を提供するためにこれまで用いられてきた(Welsh and McClelland, 1990; Williams et al., 1990)。この方法は、細菌、真菌類および植物の同定および集団研究におけるゲノム解析のための非常に有用なツールを提供し、その場合に個々の分離株を迅速に比較することができる。例えば、それらは、病原体を同定したり、特定の株または病原型（pathotype）の発生を特定したりするツールとして利用できる。一般に、AP-PCRは、単独のプライマーを用いて、そのプライマーが不完全に一致する鋳型の部位からDNA合成を開始させる。これが機能するようにするために、初期サイクル、通常で最初の5回のサイクルは、プライマーがゲノム全体の不完全な部位にアニーリングされる低いストリンジェンシー条件(37〜50℃)で、実施しなければならない。次いで、前記ストリンジェンシーを、標準的なPCR増幅に用いる程度まで増加させて(55℃)、反応を追加的に30〜35サイクル行わせる。AP-PCRは、明確な結果が要求される父子鑑別のような用途で使用することは勧められない。というのも、これは親由来でない産物が時折生成されてしまうからである。ネスティッドAP-PCRを含む代替AP-PCR法が開発されてきてはいるが(McClelland et al., 1993; Ralph et al., 1993)、再現性の問題は依然として主たる懸念のままである。問題の一つは、そのパターンが、日ごとにあるいは実験室ごとに違う場合があることである(Meunier and Grimont, 1993)。
【００１６】
さらに別のPCRベースの用途は、RACE(cDNA末端迅速増幅；rapid amplification of cDNA end)技術である。RACEは、mRNAの5'末端または3'末端に該当するcDNA領域を増幅する方法であり(Frohman et al., 1988)、これは微量の転写物を成功裡に分離するのに使用されている。遺伝子特異的プライマーが、部分的なcDNA、ゲノムのエキソン、またはペプチドから得た配列データから作製される。3'RACEでは、mRNA分子のポリAテイルは、PCR増幅のためのプライミング部位として利用される。当技術分野で公知のようにオリゴdTプライマーおよび逆転写酵素を用いてmRNAがcDNAに変換される。次いで、遺伝子特異的プライマー、およびポリA部位にアニーリングするプライマーを用いて、生成したcDNAを直接的にPCR増幅する。
【００１７】
3'RACEと同じ原理が5'RACEにも適用されるが、ポリAテイルが存在しない。従って5'RACEは、他の方法を用いてcDNAの5'末端をタグ付けすることによって行う(Fromont-Racine et al., 1993; Schaefer, 1995; Franz et al., 1999)。ホモポリマー・テイリング(homopolymeric tailing)およびライゲーション・アンカー・テイリング(ligation anchored tailing)のような、5'RACEのための手法の多くは、第一鎖cDNA合成が完了した後に、一連の酵素反応を必要とする(Schaefer, 1995)。各々の酵素的工程には、失敗を招いてcDNAの完全性を破壊する可能性がある。最近、CapFinder法(Chenchik et al., 1998; Chenchik et al. 米国特許第5,962,271号および第5,962,272号)と通称される代替法が導入された。この技術は逆転写酵素の二重の機能を利用するものであり、すなわち、その機能の一つは、cDNAの3'末端に非鋳型ヌクレオチドを追加する末端転移酵素活性であり、もう一つの機能は、鋳型を第２の鋳型に切り替える鋳型切り替え活性である。このような特性は、レトロウイルスのライフサイクルの間に利用されるものである(Clark, 1988; Kulpa et al., 1997)。モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(RT)は、マンガンまたは高濃度のマグネシウムの存在下で、新しく合成されるcDNAの3'末端に３〜４個の非鋳型由来シトシン残基をしばしば付加する(Schmidt and Mueller, 1999)。この方法では、完全な(キャッピングされた)mRNAが鋳型として機能すれば、M-MLV RTがcDNAにC残基を優先的に付加するために、完全長cDNAの増幅が可能になる。
【００１８】
しかし、5'-RACE実験のためのCapFinder技術は、cDNA合成で利用されるCapFinderおよびオリゴdTプライマーの混入によって生じるDNAのスメアなどのバックグラウンド問題を克服できなかった(Chenchik et al., 1998)。概念的には、これらの両方ともが、反応混合物に存在する全てのcDNAにアニーリングできるため、残留量の前記のプライマーでさえ、高いバックグラウンドをもたらす。また、3'-RACEおよび完全長cDNA増幅も、cDNA合成で使用するプライマーの混入によりそれらプライマーがPCR反応で非特異的産物を生成するという、同じバックグラウンド問題を有している(Chenchik et al., 1998)。前記の問題を克服するための新しい手法が最近導入された。一つの手法は、望まないPCR産物の生成を抑制するステップアウトPCRである(Matz et al., 1999)。しかし、この手法は、単一DNAではないDNAのスメアの問題を依然として残していることが指摘された(Schramm et al., 2000)。さらに最近導入された別の手法は、固相cDNA合成、およびcDNA合成に利用した全ての混入物を除去する手順を用いるものである(Schramm et al., 2000)。しかし、この技術の主な短所は、固相cDNA合成およびその後の手順を必要とするため、高価で時間がたくさんかかるということである。従って、より効率よく、簡便で、迅速かつ安価な方法には、cDNA合成に利用されるオリゴdTまたはCapFinderプライマーのようなプライマーの混入から生じる問題を完璧に排除することが必要とされている。
【００１９】
RACE技術だけではなく、cDNAライブラリー構築のための現行の技術において、遺伝子の5'末端はcDNA集団で十分に示されない傾向があり、このような傾向は、第一鎖cDNAの合成の際、ポリ(dT)プライマーを利用し、かつ出発物質が限られている場合に特に示される。この問題を解決するためにたくさんの様々な手法が開発されてきたが、その大部分は共通した限界に悩み、たくさんの本来的な問題を有したままの完全長cDNAまたは5'富化した(enriched)cDNAを生成する。これらの手法は、複数の酵素的工程を必要とするために複雑であるかまたは高価で時間がかかり、そして／あるいは高い感度を示さない(Carninci et al., 1997; Suzuki et al., 1997; Guegler et al. 米国特許第6,083,727号および第6,326,175号; Hayashizaki. 米国特許第6,143,528号)。従って、完全長または5'富化したcDNAの製造方法、特に限られた量の出発物質を用いる製造方法の改良法を開発するための試みが続けられている。
【００２０】
マルチプレックスPCRは、PCRの別の変法であって、同一の反応で二つ以上のプライマー対を用いて二つ以上のターゲット配列を同時に増幅することができる。1988年に最初に紹介された後(Chamberlain et al., 1988)、この方法は、遺伝子欠失の分析(Anonymous, 1992; Henegariu, et al., 1994)、突然変異および多型分析(Shuber et al., 1993; Mutirangura et al., 1993)、定量分析(Zimmermann et al., 1996)およびRNA検出(Zou et al., 1998)を含むDNA試験の多様な分野に成功裡に利用されている。感染疾患の分野で、この技術は、ウイルス、細菌、真菌類および／または寄生虫の同定用の有益な方法であることが示されている。
【００２１】
しかし、マルチプレックスPCRから得られた結果は、増幅工程のアーティファクトのためにしばしば複雑になる。これらは、反応の失敗による“偽陰性”の結果や、プライマーが、真の認識配列と関連はしているが明らかに違う配列にアニーリングすることによって生じうる、偽の産物の増幅のような“偽陽性”の結果を含む。マルチプレックスPCRで使用する上では、プライマーは、その推定ハイブリダイゼーション動態が、同一のマルチプレックス反応サンプルに使用する別のプライマーのハイブリダイゼーション動態に類似するようにデザインされなければならない。アニーリング温度およびプライマー濃度はある程度計算できるが、一般的にその条件は、各々のマルチプレックス反応について経験的に決定されなければならない。非特異的プライミングの可能性は、追加的な各プライマー対を用いることによって増加するため、各々のプライマー対を追加するたびに条件を改変しなければならない。さらに、供給源に対する競合(例えば、プライマーの枯渇)から生じるアーティファクトは、マルチプレックスPCRで増加されるが、それは不均一に増幅された断片の収量の差異が各サイクルとともにさらに増強されるためである。従って、マルチプレックスPCRの反応条件を最適化することは、労働集約的で時間がたくさんかかりうる。互いに異なるマルチプレックスPCRは、ユニークな反応条件を有するため、新しい診断試験の開発には非常にコストがかかる。
【００２２】
従って、使用する様々なプライマーの潜在的に相異なる特性にかかわらず、念入りな最適化工程を行うことなく、マルチプレックスPCR反応をデザインし、かつ実施できるようにするプライマーが当業界で必要とされている。さらに、同一の反応条件で多数の増幅産物の各々を等量ずつ同時に生成するマルチプレックスPCR反応を可能にするプライマーが、当業界で必要とされている。
【００２３】
一塩基多型(SNP)は、ヒトゲノムで最も共通して認められる遺伝的変異であり、疾病関連座位を同定するため、および薬理遺伝学の研究のための重要なマーカーである(Landegren et al., 1998; Roses, 2000)。SNPは、ヒトゲノムで平均1000bp当たり一つの比率で出現し、合計で3百万個を超えて存在すると推定される。SNPを検出するために多様な手法が使用されている。しかし、重要なボトルネックの１つは、DNAの増幅である。最新のアッセイでは、各々のターゲットSNPを含む試料DNAの短いセグメントをたくさんのコピーで生成する工程を含む。通常の臨床試料から収集されうるDNAはごく少量であるため、この増幅は通常必要である。また、増幅は、アッセイのシグナル-対-ノイズ比率を改善し、それによって検出の信頼性を向上させる。大部分のゲノムタイピング技術では、このPCRを用いた増幅を行う。特に重要なことは、PCR増幅の特異性がSNPゲノムタイピングでのPCRの適用において決定的であることである。従って、PCRの特異性を改善する方法を利用し、それをSNPゲノムタイピングアッセイの開発に用いることは有益である。また、前記方法が単独のアッセイで複合的なアッセイを提供することができれば(マルチプレックスアッセイ)、これは非常に有益であろう。
【００２４】
上述のように、各方法に対する改良法は次々と導入されているが、核酸増幅、特にPCR増幅を伴うそのような方法および技術は全て、各方法で用いるプライマーの非特異性から引き起こされる限界や問題、例えば、偽陽性、低い再現性および高いバックグラウンドなどを完全に克服できなかった。従って、アニーリングの特異性を改善するための新規プライマー、および真の結果を出せる方法に対する必要性が依然として存在している。
【００２５】
本出願全体にわたって様々な特許および刊行物が参照されその出典が括弧内に記載されている。これらの特許および刊行物の開示内容は、本発明の属する技術分野の水準および本発明の内容をより十分に説明する目的で、その全体が本明細書に参照により組み入れられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
前記の従来のプライマー、および核酸増幅を伴う様々な方法の問題点を解決するために鋭意研究した結果、本発明者は、非常に高い特異性での核酸増幅を可能にすると共に、核酸増幅に基づく技術のあらゆる分野での制限的でない適用を可能にする、新規のアニーリング調節プライマーを開発した。
【００２７】
従って、本発明の目的は、核酸増幅でアニーリングの特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーを提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は、鋳型としてのDNAまたは核酸混合物から核酸配列を増幅する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、鋳型としてのDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の他の目的は、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供することにある。
【００３１】
本発明の他の目的は、二つまたはそれ以上の核酸試料中の示差的に発現されたmRNAに相補的なDNAを検出する方法を提供することにある。
【００３２】
本発明の他の目的は、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速な増幅方法を提供することにある。
【００３３】
本発明の他の目的は、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の増幅方法を提供することにある。
【００３４】
本発明の他の目的は、mRNAに相補的な完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法を提供することにある。
【００３５】
本発明の他の目的は、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅する方法を提供することにある。
【００３６】
本発明の他の目的は、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅する方法を提供することにある。
【００３７】
本発明の他の目的は、gDNAのDNAフィンガープリントを作製する方法を提供することにある。
【００３８】
本発明の他の目的は、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法を提供することにある。
【００３９】
本発明の他の目的は、多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジーセグメント(conserved homology segments)を同定する方法を提供することにある。
【００４０】
本発明の他の目的は、ターゲット核酸上のヌクレオチド変異を同定する方法を提供することにある。
【００４１】
本発明の他の目的は、ターゲット核酸において突然変異誘発する方法を提供することにある。
【００４２】
本発明の他の目的は、アニーリング調節プライマーを含むキットを提供することにある。
【００４３】
本発明の他の目的は、核酸増幅を伴う多様な方法に利用されるキットを提供することにある。
【００４４】
本発明の他の目的は、核酸増幅を伴う方法のためのアニーリング調節プライマーの用途を提供することにある。
【００４５】
本発明の他の目的および利点は、下記の詳細な説明、およびそれと併せて別添の特許請求の範囲および図面からさらに明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００４６】
本発明は、(a) 核酸増幅の特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーおよび(b) その用途に関するものである。本発明のアニーリング調節プライマー(annealing control primer；以下、ACP)は、アニーリング温度によりプライマーアニーリングを調節することができて、これにより核酸増幅(特に、PCR)の特異性を大きく改善することができる。ACPの原理は、少なくとも一つのユニバーサル塩基(universal base)または非識別性塩基類似体(non-discriminatory base analog)により隔てられた、明確に区別される3'末端部分および5'末端部分を有するオリゴヌクレオチドプライマーの構成に基づく。本発明者は、3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基または非識別性塩基残基群が、核酸増幅過程において、アニーリング温度により鋳型核酸にプライマーがアニーリングすることを調節する調節因子としての役割を果たすことを発見した。3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基または非識別性塩基群の存在は、特定アニーリング温度でのプライマーアニーリングを3'末端部分に限定するだけでなく、5'末端部分のアニーリングを妨害し、これはアニーリング特異性を大きく改善する結果をもたらす。ACPの3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基群は、各々の部分を規定するようにデザインされる。このような理由で、核酸増幅の際の特定のストリンジェンシー(stringency)条件下でプライマーアニーリング特異性を改善する機能の点で、本発明のACPは、従来のプライマーと根本的に異なっている。
【００４７】
本発明のACPは、核酸増幅に基づく用途において非常に効果的で、幅広く利用できる。また、従来のPCR技術におけるプライマーアニーリング特異性にかかわる多様な問題点を、ACPによって根本的に解決できる。核酸増幅(特に、PCR)の際に、ACPの利用により得られる主要な利点は、以下の通りである：
(a) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基残基群の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングする条件下で、プライマーアニーリング部分を3'末端部分に限定するため、プライマーのアニーリング配列は正確に調節され、これによって所望の長さのアニーリング配列を有するプライマーの設計が可能になる。このような特性は、プライマーのアニーリング部分が限定されなければならない場合(例えば、一塩基多型(SNP)の遺伝子型決定、DNAマイクロアレイスクリーニング、および示差的に発現される遺伝子の検出)、特に有用である。
(b) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置するユニバーサル塩基残基群の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングする条件下で5'末端部分が鋳型にアニーリングするのを妨害し、結局、アニーリングに関与しない5'末端部分は、3'末端部分にアニーリング特異性を提供する。
(c) プライマーアニーリングの特異性は、一塩基のミスマッチさえ検出できるほど非常に高感度である。従って、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異、例えば、一塩基多型および点突然変異を同定するのに非常に有用である。
(d) ACPは、プライマーデザインのための“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長、アニーリング温度、GC含量およびPCR産物の長さ)における高い許容性をプライマーに付与することができる。
(e) ACPシステムは、二段階PCR増幅(two-stage PCR amplifications)を提供し、提供する産物について非特異的増幅を排除する。
(f) PCR増幅の効率が増大し、微量のmRNAの検出を容易にする。
(g) PCR産物の再現性を増大させて、時間および費用を大きく節減する。
【００４８】
ACPの原理
本発明の一様態によると、本発明は、(a)それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分；(b)予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分；および(c)前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含み、アニーリング温度により前記プライマーのアニーリング部分を調節することができる調節部分を含む、核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーを提供する。
【００４９】
ACPの原理は、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分により隔てられた明確に区別される3'末端部分および5'末端部分を有するオリゴヌクレオチドプライマーの構成、そして該オリゴヌクレオチドプライマーにおける3'末端部分および5'末端部分に対する調節部分の作用に、基づく。ACPの3'末端部分と5'末端部分の間にある少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基を含む調節部分の存在は、プライマーアニーリング特異性の改善を担う主要素である。
【００５０】
用語“鋳型”は、核酸を意味する。用語“核酸”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体(特記しない限り、天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する)である。従って、本発明のACPは、一本鎖または二本鎖gDNA、cDNAまたはmRNAを鋳型として用いた核酸増幅に利用できる。本発明のプライマーと関連して使用される用語“部分”は、調節部分により隔てられたヌクレオチド配列を意味する。用語“3'末端部分”または“5'末端部分”は、調節部分により隔てられた、本発明のプライマーの3'末端または5'末端にあるヌクレオチド配列をそれぞれ意味する。
【００５１】
本明細書で使用される用語“プライマー”は、合成または天然のオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは、核酸鎖(鋳型)に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、即ち、ヌクレオチドとDNAポリメラーゼのような重合剤の存在下および適合した温度とpHの条件下で、合成の開始点として作用する。増幅の効率を最大にするために、プライマーは一本鎖であることが好ましい。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明のプライマーは、天然dNMP(即ち、dAMP、dGMP、dCMPおよび dTMP)、修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるくらい十分長くなければならない。プライマーの適切な長さは、多数の要因、例えば、温度、用途およびプライマーの供給源により決定される。用語“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並列に付加されることを意味し、それによってポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
【００５２】
ACPの3'末端部分は、鋳型核酸分子の一位置に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する。プライマーと関連して使用される用語“実質的に相補的な”は、所定のアニーリング条件下でプライマーが鋳型核酸配列に選択的にハイブリダイズするほど十分相補的であり、それによって、アニーリングしたプライマーがポリメラーゼにより伸長されて鋳型相補体を生成することを、意味する。従って、前記用語は、用語“完全に相補的な”またはこれに関連した用語とは違う意味を有する。ACPの3'末端部分は、ACPがプライマーとして機能できる範囲内で、鋳型に対する一つまたはそれ以上のミスマッチを有することができるということは当然である。最も好ましくは、ACPの3'末端部分は、鋳型の一位置に完全に相補的な、即ち、ミスマッチの無いヌクレオチド配列を有する。
【００５３】
ACPの3'末端部分を、鋳型配列および用途により多様なヌクレオチド配列を有することができる。例えば、ACPが逆転写過程を含む方法(例えば、ディファレンシャルディスプレイPCR、RACE、完全長cDNAの増幅、フィンガープリンティング、保存性ホモロジー断片の同定など)に適用する場合、その3'末端部分は、mRNAのポリアデノシン(ポリA)テイルにハイブリダイズするヌクレオチド配列を有してもよく、好ましくは、少なくとも8個のデオキシチミジンヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも10個のデオキシチミジンヌクレオチドおよび最も好ましくは、少なくとも10個の連続的なデオキシチミジンヌクレオチドを有する。本発明の一実施態様では、前述した逆転写を伴うプロセスにおいて、ACPの3'末端部分は、その3'末端に3'−Vを有する少なくとも10個の連続的なデオキシチミジンヌクレオチドを有し、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選択される。他の実施形態によると、前記3'末端部分は、その3'末端に3'−NVを有する少なくとも10個の連続的なデオキシチミジンヌクレオチドを有し、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選択され、前記Nは、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選択される。
【００５４】
また、ACPがターゲット核酸配列の増幅に利用される場合、その3'末端部分は、ターゲット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み；ディファレンシャルディスプレイがPCRに利用される場合、3'末端部分は、mRNAから形成されたcDNAの一部位に実質的に相補的なアービトラリ配列を含み；RACEに利用される場合、3'末端部分は、mRNAから形成されたcDNAの一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的配列を含み；5'富化した(5' enriched)cDNAの増幅に利用される場合、3'末端部分は、mRNA内の部位に実質的に相補的な少なくとも6個のヌクレオチドを含むランダム配列を含み；保存性ホモロジー断片の同定に利用される場合、3'末端部分は、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列または予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの複数の組合せから選択される縮重配列を含み；ターゲット核酸内のヌクレオチド変異(例えば、アレル座位)の同定に利用される場合、3'末端部分は、ヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み；さらに突然変異誘発に利用される場合、ヌクレオチド配列は、ターゲット核酸に少なくとも1個のミスマッチなヌクレオチドを含む。
【００５５】
用語“アービトラリ(arbitrary)”ヌクレオチド配列は、増幅されるターゲット核酸の配列に対する情報無しで選択されるヌクレオチド配列を意味する。用語アービトラリは、プライマーに関する用語“ランダム”と混同されるべきではなく、その“ランダム”プライマーは、それぞれが異なるランダムな配列を有するプライマーのランダム集団からなるプライマーを意味する。保存性ホモロジー断片の同定のためのACPと関連して用いられる用語“縮重”配列は、アミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列を意味し、この縮重配列は、遺伝子コドンの縮重により一つのアミノ酸配列からヌクレオチド配列のプールを形成することができる。
【００５６】
ACPの好ましい実施形態によれば、5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列は、鋳型核酸上のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態によると、本発明のアニーリング調節プライマーは、一般式(1) 5'-Xp-Yq-Zr-3'で表され、その式中の前記Xpは、鋳型核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分を示し；前記Yqは、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示し；前記Zrは、鋳型核酸の一部位に実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する3'末端部分を示し；前記ｐ、ｑおよびｒは、ヌクレオチドの数であり；前記X、YおよびZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。
【００５８】
少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む前記調節部分は、核酸増幅の際のアニーリング温度の変化と関連してACPの主たる機能を担う。用語“ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体”は、天然のDNA/RNA塩基との間でほとんど識別されることなく天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができるものを意味する。
【００５９】
縮重プライマーの設計にかかわる問題を解決するために、縮重プライマーのいくつかの不確実な位置のヌクレオチドを、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体、例えば、デオキシイノシン(Ohtsuka et al, 1985; Sakanari et al., 1989)、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール(Nichols et al., 1994)および5-ニトロインドール(Loakes and Brown, 1994)により置換することは広く知られている。これは、それらのユニバーサル塩基が、4種の従来の塩基全てと非特異的に塩基対を形成することができるためである。しかし、デオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールおよび5-ニトロインドールのようなユニバーサル塩基または非識別性類似体を用いてPCR過程でプライマーアニーリングの特異性を増加させることができるという報告は、いまだに無かった。
【００６０】
プライマー内にデオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールおよび5-ニトロインドールのようなユニバーサル塩基の存在は、塩基対での弱い水素結合の相互作用により低いアニーリング温度をもたらす。このような理論を拡張して、本発明者は、プライマーの3'末端と5'末端の間に位置する連続的なユニバーサル塩基の存在が低い融解温度を有する領域を生成させ、かつプライマーの3'末端部分および5'末端部分の各々に境界を形成させて、各部分のアニーリングに影響を及ぼすという推論をした。このような理論は、本発明のアニーリング調節プライマーの基礎を提供する。
【００６１】
好ましい実施形態では、ACPは、3'末端部分と5'末端部分の間に少なくとも2個、より好ましくは、少なくとも3個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体残基を含む。好ましくは、3'末端部分および5'末端部分の間のユニバーサル塩基は、最大15残基の長さを有する。本発明の一実施形態によると、ACPは、2〜15個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体残基を含む。最も好ましくは、3'末端部分と5'末端部分の間のユニバーサル塩基は、約5残基の長さを有する。
【００６２】
ユニバーサル塩基の最適数、即ち、5残基を考慮すると、特定のアニーリング温度で、核酸増幅過程で鋳型に5'末端部分がアニーリングされることを妨害するためには、ACPの3'末端部分および5'末端部分の間のユニバーサル塩基は最小限の数が好ましい。プライマー配列中のユニバーサル塩基の長さ(8〜10個の塩基)は、ACPでのユニバーサル塩基自身の機能に大きい差異をもたらさない。
【００６３】
3'末端部分配列と5'末端部分配列の間のユニバーサル塩基残基の使用は、本発明の主な特徴であり、前記ユニバーサル塩基残基は、各々の部位(3'末端および5'末端)に、核酸増幅、例えば、PCRの際のアニーリング温度と関連した明確なアニーリング特異性を提供する。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態によると、調節部分のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2'-デオキシイノシン、2-アザ-2'-デオキシイノシン、2'-OMe イノシン、2'-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-F 3-ニトロピロール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2'-OMe 5-ニトロインドール、2'-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2'-F ネブラリン、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-0-メトキシエチルイノシン、2'-0-メトキシエチルネブラリン、2'-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2'-0-メトキシエチル 4-ニトロ-ベンズイミダゾール、2'-0-メトキシエチル3-ニトロピロールおよび前記塩基の組合せを含むが、これに限定されるものではない。より好ましくは、前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体は、デオキシイノシン、イノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
【００６５】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの好ましい長さは、所望のアニーリング特異性、および鋳型にハイブリダイズするのに必要な所望の特異性を有するオリゴヌクレオチドの数により決定される。例えば、20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーは、10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーより特異性が高いが、これは、オリゴヌクレオチドにヌクレオチドを付加すればするほど鋳型に対するプライマーのアニーリング温度が増加するからである。
【００６６】
ACPの3'末端部分配列および5'末端部分配列の長さは様々であってよく、ACPを利用する各々の用途での目的に部分的には依存する。好ましい実施形態では、ACPの3'末端部分の長さは、プライマーアニーリングのための長さ要件として最小と判断される少なくとも6ヌクレオチド長である。より好ましくは、3'末端部分配列の長さは、10〜25ヌクレオチドであり、最大60ヌクレオチドまでである。他の実施形態では、ACPの3'末端部分は、デオキシリボヌクレオチドだけではなく、リボヌクレオチドも含むことができる。
【００６７】
本発明の他の好ましい実施形態で、ACPの5'末端部分の長さは、少なくとも15ヌクレオチドであり、前記長さは、高ストリンジェンシー条件下でアニーリングに必要な最小長さの要件として判断される。好ましくは、5'末端部分配列の長さは、最大60ヌクレオチドである。より好ましくは、5'末端部分配列の長さは、6〜50ヌクレオチドであり、最も好ましくは、20〜25ヌクレオチドである。全体ACPの長さは、35〜50ヌクレオチドであり、最大100ヌクレオチドである。
【００６８】
ACPの5'末端部分は、鋳型核酸上のいかなる位置に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有し、前記ヌクレオチド配列は、その後の増幅過程でプライミング部位として作用できる。用語“予め選択されたアービトラリ(pre-selected arbitrary)”ヌクレオチド配列は、天然または修飾ヌクレオチドの特定配列を含む、特定されたまたは予め選択されたデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは混合デオキシリボヌクレオチド配列を意味する。本発明の一実施形態では、5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列は、T3プロモーター配列、T7プロモーター配列、SP6プロモーター配列およびM13前方向または逆方向ユニバーサル配列のようなユニバーサルプライマー配列を含むことができる。ACPの5'末端部分に長いアービトラリ配列(約25〜60塩基)を利用すると、ACPの効率が減少され、短い配列(約15〜17塩基)を利用すると、高ストリンジェンシー条件でのアニーリング効率が減少する。ACPの5'末端部分に予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を、その後の増幅過程でプライミング部位として利用することは、本発明のまた他の主要な特徴である。
【００６９】
本発明の一実施形態によると、ACPの利点、即ち、アニーリング特異性の改善が損われない範囲内で、ACPの5'末端部分を改変することができる。例えば、5'末端部分は、制限酵素認識配列を含むことができ、前記配列により、増幅産物が適合するベクター中にクローニングすることが容易になる。また、5'末端部分は、増幅産物の検出または単離用標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことができる。適合した標識は、蛍光団、発色団、化学発光団、磁性粒子、放射能同位元素、マス標識、電子密集粒子、酵素、助因子、酵素に対する基質、そして抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニンとキレート基のような特定結合パートナーを有するハプテンを含むが、これに限定されるものではない。また、5'末端部分は、バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター部分を含むことができる。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態によると、ACPはPCRに適用される。より好ましくは、PCRは、第１のアニーリング温度および第２のアニーリング温度、即ち、相異なるストリンジェンシー条件下で行う。第１のアニーリング温度は、第２のアニーリング温度と同一であるかそれより低く、好ましくは、第２のアニーリング温度は第１のアニーリング温度より高い。相異なる二つのアニーリング温度で行うPCR過程、即ち二段階PCRで、ACPの3'末端は、第１のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、第１段階の増幅の生成物に挿入されたACPの5'末端は、第２のアニーリング温度でプライミング部位として作用する。このような場合において、ACPの利点は次のようである：
(1) ACPの調節部分は、少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含み、塩基対での弱い水素結合相互作用によりACPで他の部位より低いTmを有するため、第１のアニーリング温度で鋳型の一位置にACPの3'末端部分がアニーリングする条件下で、ACPの調節部分は、鋳型核酸にアニーリングされる傾向が低い。従って、ACPの3'末端部分と5'末端部分の間に少なくとも一つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分の存在は、第１のアニーリング温度でプライマーアニーリング部位を3'末端部分に限定し、
(2) 第１のアニーリング温度でアニーリングに関与しない5'末端部分は、3'末端部分が鋳型にアニーリングするのを妨害する作用をし、
(3) 従って、第１のアニーリング温度の条件下で、3'末端部分配列の特異的アニーリングが生じる強度は、非特異的アニーリングが生じる強度より強く、それにより3'末端部分でのプライマーアニーリング特異性が改善され、
(4) 5'末端部分配列が予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む場合、3'末端部分配列のアニーリングおよび伸長により生成された反応産物のその後の増幅で、前記5'末端部分が、第１のアニーリング温度より高い第２のアニーリング温度、即ち、高ストリンジェンシー条件で、プライミング部位として作用し；
(5) それにより、第２のアニーリング温度で各々のPCRサイクルについて、反応産物が2倍に増加する理論上の最適値に近接した水準で、3'末端部分配列のアニーリングおよび伸長により生成された反応産物だけが増幅される。
【００７１】
従って、ACPの3'末端部分は、第１のアニーリング温度でのみ鋳型に対するアニーリング部位として作用し、3'末端部分配列のアニーリングおよび伸長により生成された反応産物のその後の増幅のための第２のアニーリング温度で、5'末端部分はプライミング部位として作用する。
【００７２】
本発明のACPは、プライマーを用いる核酸増幅のための多様な方法、例えば、Miller, H. I. (WO 89/06700)とDavey, C.ら(EP 329,822)の方法、リガーゼ連鎖反応(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989))、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991))、Gap-LCR (WO 90/01069)、校正連鎖反応(EP 439,182)、3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989))およびNASBA(米国特許第5,130,238号)に非常に有用である。
【００７３】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述した本発明のプライマーまたはプライマーセットを含むキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、ACPの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対をさらに含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは本発明のキットは、ユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-トリフォスフェートを含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うに必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述した成分を含む。
【００７４】
本発明のACPは、多様な核酸増幅関連技術に適用できる。ACPの優れた効果が現れる代表的な例は、次のようである：
I.  核酸配列の増幅；
II.  ターゲット核酸配列の増幅；
III.  マルチプレックスDNAの増幅；
IV.  示差的発現される遺伝子の同定；
V.  cDNA末端の迅速増幅(RACE)；
VI.  完全長cDNAの増幅；
VII.  5'富化したcDNAの増幅；
VIII.  DNAまたはRNAフィンガープリンティング
IX.  多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片の同定；
X.  ヌクレオチド配列変異の同定；
XI.  突然変異誘発；および
XII.  他の用途
【００７５】
I.  (ターゲット)核酸配列の増幅への適用
本発明のまた他の様態によると、本発明は、DNAまたは核酸混合物の核酸配列を増幅する方法において、前記方法は、プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造によるプライマーの3'末端部分は、それとハイブリダイズする核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する。
【００７６】
本発明の特定実施形態によると、本発明は、以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行う、DNAまたは核酸混合物の核酸配列を増幅する方法を提供する：
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ本工程は、各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物が生成される、第１のアニーリング温度で前記核酸配列の第１段階の増幅を行う工程；および、
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する工程。
【００７７】
本発明の方法を、ターゲット(target)核酸配列を増幅するのに利用する場合、利用されるプライマー対の3'末端部分は、それとハイブリダイズするターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する。従って、本発明の他の様態によると、本発明は、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法において、前記方法は、プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、ACPから由来することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造によるプライマーの3'末端部分は、それとハイブリダイズするターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する。
【００７８】
本発明の特定の実施形態によると、本発明は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供する：
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物が生成される、第１のアニーリング温度で前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を行う工程；および、
(b) 前記工程(a)の増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物が再増幅される工程。
【００７９】
増幅される鋳型がmRNAである場合、cDNA作製が増幅の前に必要である。従って、本発明の他の実施形態によると、本発明は、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法において、前記方法は、mRNAの逆転写段階およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPから由来されることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造によるプライマーの3'末端部分は、ハイブリダイズされるターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する。
【００８０】
本発明の特定の実施形態によると、本発明は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行って、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法を提供する：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドdTプライマーに前記mRNAを接触させる工程；
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第１のDNA鎖を生成する工程；
(c) 工程(b)の第１のDNA鎖の前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、上述したACPのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる工程；および
(d) 工程(c)の増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(c)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する工程。
【００８１】
本発明の増幅方法は、本発明のACPを利用するため、過度な反復性をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【００８２】
ACPを利用する応用は、核酸増幅、好ましくは、PCRを実施して、核酸(DNAまたはmRNA)または核酸の混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する改善法を提供する。ACPの効果は、従来のプライマーに、プライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量および産物長)にかかわらず、プライマーアニーリング特異性を提供するため、ターゲット核酸断片を増幅するのに利用される従来のプライマーが前記パラメーターに敏感すぎて特異的核酸増幅産物を生成できない場合、ACPの利用が特に勧められる。
【００８３】
新規なACPシステムを用いて二本鎖DNAのターゲット核酸を選択的に増幅する代表的な方法は、図１Ａに示されている。図１Ｂは、新規なACPシステムを用いてmRNAのターゲット核酸を選択的に増幅する代表的な方法を示している。図１Ａおよび１Ｂを参照し、本発明の方法をさらに詳細に説明する。
【００８４】
核酸配列を増幅する本発明の方法は、当業界で公知の多様なプライマー関連核酸増幅方法により実施できる。好ましくは、本発明の方法は、本発明者により開発された二段階増幅により行って、より好ましくは、増幅は、当業界で公知のポリメラーゼ連鎖反応により行って、最も好ましくは、ホットスタートPCR法により行う。
【００８５】
核酸配列を増幅するための本発明の方法は、所望のいかなる核酸分子の増幅にも利用できる。このような核酸分子は、DNAまたはRNAである。前記核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよく、好ましくは二本鎖である。出発物質として核酸が二本鎖である場合、二つの鎖を一本鎖に、または部分的な一本鎖の形態にすることが好ましい。鎖を分離する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレアおよびグリコキサル（glycoxal）処理、酵素的方法(例えば、ヘリカーゼ作用)および結合タンパク質を含むが、これに限定されるものではない。例えば、鎖分離は、80〜105℃の温度で熱処理して達成できる。上述の処理の一般的な方法は、Joseph SambrookらによるMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)に開示されている。
【００８６】
mRNAが出発物質として利用される場合、逆転写段階が増幅の前に必要であり、逆転写工程の詳細な内容は、Joseph Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)およびNoonan,K. F. ら、Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)に開示されている。逆転写工程で、mRNAのポリAテイルにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドdTプライマーが利用される。オリゴヌクレオチドdTプライマーは、dTMPからなっており、dTプライマーがプライマーとして作用できる限度内でdTMPの一つまたはそれ以上は、他のdNMPに代替できる。逆転写工程は、RNase H活性を有する逆転写酵素により成されることができる。RNase H活性を有する酵素を利用する場合、反応条件を慎重に選択すると、個別的なRnase H切断過程を避けることができる。
【００８７】
本発明の方法は、増幅される分子が特定配列または長さを有することを必要としない。特に、増幅できる分子は、天然の原核細胞核酸、真核細胞(例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物および哺乳動物とヒトを含む高等動物)核酸、ウイルス(例えば、ヘルペスウイルス、HIV、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バー ウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど)核酸およびビロイド（viroid）核酸を含む。また、前記核酸分子は、化学的に合成された、または合成できる核酸分子を含む。従って、前記核酸配列は、天然から発見されるか、または発見されないものである。
【００８８】
本発明に利用されるACPは、鋳型の一部位にハイブリダイズまたはアニーリングされて、二本鎖構造を形成する。このような二本鎖構造を形成するのに適合した核酸ハイブリダイゼーションの条件は、Joseph Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)およびHaymes, B. D.ら、Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)に開示されている。ACPの3'末端部分の配列は、完全な相補性を示す必要はなく、安定した二本鎖構造が形成できる程度の実質的に相補的な配列を有すればよい。従って、二本鎖構造の形成のためのハイブリダイズを完全に排除しない限度内で、完全な相補性からの逸脱が許容される。鋳型核酸上の一部位にACPがハイブリダイズするのは、ポリメラーゼによる鋳型依存性重合反応の前提条件である。相補的な核酸にACPが塩基対を形成するのに影響を及ぼす因子(Joseph Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); およびHaymes, B.D.ら、Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985))は、プライミング効率に影響を与える。ACPのヌクレオチド組成は、最適のアニーリングのための温度に影響を及ぼし、これによりプライミング効率にも影響を与える。
【００８９】
多様なDNAポリメラーゼが本発明の増幅工程に利用でき、大腸菌（E. coli）DNAポリメラーゼIの‘クレノウ(Klenow)’断片、熱安定性DNAポリメラーゼおよびバクテリオファージT7 DNAポリメラーゼを含む。好ましくは、ポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得られる熱安定性DNAポリメラーゼであり、これは、Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalisおよび Pyrococcus furiosus (Pfu)を含む。前記ポリメラーゼの大部分は、バクテリアそれ自体から分離することができ、または商業的に購入できる。また、本発明に利用されるポリメラーゼは、ポリメラーゼをコードするクローン化遺伝子を高レベルで発現する細胞から得ることができる。重合反応を行う際、反応容器に反応に必要な成分を過剰量で提供することが好ましい。増幅反応に必要な成分の過剰量は、増幅反応が成分の濃度に実質的に制限されない程度の量を意味する。Mg2+のような助因子、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを、所望の増幅が達成できる程度に、混合物に提供することが好ましい。
【００９０】
増幅反応に利用される全ての酵素は、同一の反応条件で活性状態を有することができる。事実上、バッファーは全ての酵素にとって最適の反応条件に近づけるようにする。従って、本発明の増幅過程は、反応物の添加のような条件の変化無しに、単一反応物で実施できる。
【００９１】
第１段階の増幅過程に利用されるACPのセットの5'末端部分は、同一または異なる配列を含み、配列が同一である場合には、5'末端部分配列に相当する1種のプライマーが第２段階の増幅で利用でき、配列が異なる場合には、ACPの各々の5'末端部分の配列に相当する2種のプライマーが第２段階の増幅で利用できる。
【００９２】
本発明の他の変形例によると、本発明は、ACPを利用して核酸または核酸混合物からターゲット核酸断片を選択的に増幅する方法を提供する。この方法では、第１段階の増幅で、ACPのセットの代わりにACPと従来のプライマーとからなるプライマーセットが利用できる。本明細書で用語“従来のプライマー”は、ACPと異なる構造、特にユニバーサル塩基を含む調節部分の存在という面で、ACPと異なる構造を有するプライマーを意味する。従来のプライマーは、ただACPと共に第１段階の増幅過程に添加されて、第２段階の増幅過程では、ACPの5'末端部分の配列に相当する1種の予め選択されたアービトラリプライマーのみが添加される。好ましい実施形態では第１段階の増幅に利用されるACP対の各々の3'末端部分が異なる融解温度(Tm)を有する場合、本発明の変法が利用できる。“Tm”は、プライマーの半分がターゲット部位にアニーリングする時点での温度を意味する。
【００９３】
本発明の二段階増幅(mRNAを利用して増幅する場合、逆転写過程を包含する)は、ただ時間的にのみ分離されている。第１段階の増幅の後、第２段階の増幅が続く。第１段階の増幅反応混合物は、第２段階の増幅過程においてACPの5'末端部分の配列にアニーリングする5'末端部分に相当するプライマーを含むことができ、このような事実は、5'末端部分に相当するプライマーが第１段階の増幅過程時に、またはその後に反応混合物に添加できるということを意味する。
【００９４】
他の変法として、第２段階の増幅過程で、ACPの5'末端部分に相当するプライマーの代わりに、第１段階の増幅過程に利用されるACPの全体配列を、高ストリンジェンシー条件下で第１段階の増幅産物を再増幅するのにプライマーとして利用できる。この方法では、低ストリンジェンシー条件で鋳型核酸にACPセットの3'末端部分の配列がアニーリングおよび伸長されて生成された第１段階の増幅産物の3'末端および5'末端は、ACPの配列またはそれの相補的配列を含み、またACPセットに対する完全な対形成(pairing)位置として機能する。このような面で、第１段階の増幅過程でまたはその後に、反応混合物にACPの5'末端部分に相当するプライマーを追加的に添加する必要がないため、本発明の変法は好ましい。図１Ａは、上述の変形例によるターゲット核酸の選択的増幅過程を示している。
【００９５】
本発明において、アニーリングまたはハイブリダイズは、ヌクレオチド配列とACPとの間に特異的結合を可能にするストリンジェンシー条件下で行う。アニーリングのためのストリンジェンシー条件は、配列依存的であり、周辺環境パラメーターにより多様である。本発明では、第２段階の増幅過程は、一般に第１段階の増幅過程よりさらに高いストリンジェンシー条件下で行う。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態で、第１段階の増幅過程での第１のアニーリング温度は、約30〜68℃であり、より好ましくは、40〜65℃である。好ましくは、第２段階の増幅過程での第２のアニーリング温度は、約50〜72℃である。本発明のより好ましい実施形態によると、第１のアニーリング温度は、前記第２のアニーリング温度と同一であるか、それより低い。ACPの3'末端部分配列の長さまたは融解温度(Tm)は、第１段階の増幅過程のアニーリング温度を決定する。例えば、ACPが3'末端部分に10個のアービトラリヌクレオチドを含む場合、第１段階の増幅過程のアニーリング温度は、約45〜55℃が好ましい。
【００９７】
本発明の方法によると、低ストリンジェンシー条件下での第１段階の増幅過程は、第１段階の増幅でのプライマーアニーリングの特異性を改善するために、アニーリング、伸長および変性を少なくとも2サイクル実施して、その後、第２段階の増幅過程が高ストリンジェンシー条件下でより効果的に進められる。第１段階の増幅過程は、30サイクルまで実施できる。好ましい実施形態では、第１段階の増幅過程は、2サイクル行う。他の実施形態では、高ストリンジェンシー条件下での第２段階の増幅過程は、第１段階の産物を増幅するために、少なくとも1サイクル(好ましくは、少なくとも5サイクル)行うが、45サイクルまで実施できる。より好ましい実施形態では、第２段階の増幅過程は、25〜35サイクル行う。高ストリンジェンシーおよび低ストリンジェンシー条件は、当業界で知られている標準から容易に決定できる。用語“サイクル”は、ターゲット核酸を１コピー生成する過程を意味する。サイクルは、変性、アニーリングおよび伸長過程を含む。
【００９８】
本発明の最も好ましい実施形態では、増幅過程は、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号に開示されたPCRにより行う。
【００９９】
好ましい実施形態では、第１段階の増幅を行う際に、ACPプライマー対の3'末端部分が第１のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、第２段階の増幅を行う際に、プライマー対の5'末端部分がプライミング部位として作用する。このように、アニーリングに関与する部位が変化する理由は、主に、ACPそれ自体の特性、特に、ACPの調節部分のためである。本発明の方法において、ACPの調節部分は、第１のアニーリング温度でのACPのアニーリング部位をその3'末端部分に制限することができ、このような特性は、ターゲット配列に対するアニーリング特異性を大きく改善させる。
【０１００】
本発明の方法は、特定目的のための公知の他の過程と結合することができる。例えば、増幅産物の単離(または精製)を、第２段階の増幅過程の後に行ってもよい。前記過程は、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーまたはハイブリダイズにより実施できる。また、本発明の増幅産物は、クローニング用担体に挿入できる。また、本発明の増幅産物は、発現ベクターを有する適合した宿主から発現できる。増幅産物を発現させるために、プロモーターの調節下にあるかまたはプロモーターに作動的に連結された増幅産物を運搬する発現ベクターを製造する。プロモーターは、ベクター自体またはACPの5'末端部分に相当する増幅産物の末端部分に由来する。多様な宿主発現システムにおいてタンパク質またはペプチドを発現させるために、増幅産物および転写/翻訳/調節配列を含む発現ベクターを作製するための多くの標準技術が知られている。原核細胞宿主用プロモーターは、pLλプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーターおよびT7プロモーターを含むが、これに限定されるものではない。真核細胞宿主用プロモーターは、メタロチオネイン(metallothionein)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス 7.5K プロモーター、そしてポリオーマ、アデノウイルス 2、シミアンウイルス 40またはサイトメガロウイルスから由来したプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。原核細胞宿主の例は、E. coli、枯草菌(Bacillus subtilis)、そして、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、セラチア マルセセンス(Serratia marcescens)および多様なシュードモナス種のような腸内細菌を含む。微生物だけではなく、多細胞生物体に由来する細胞培養物も宿主として利用できる。脊椎動物または無脊椎動物に由来する細胞培養物が利用できる。哺乳動物の細胞だけではなく、再構築ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞システム；および再組合せウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス)により感染されるか、一つまたはそれ以上のコード配列を含む再構築プラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)により形質転換された植物も利用できる。増幅産物から発現されたポリペプチドは、当業界に公知の方法により精製できる。
【０１０１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む核酸増幅用キットを提供する。
【０１０２】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、DNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキットを提供する。
【０１０３】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキットを提供する。
【０１０４】
本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、ACPの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマーまたはプライマー対を追加的に含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-トリフォスフェートを含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うために必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述の成分を含む。
【０１０５】
II．マルチプレックスDNA増幅への応用
本発明のACPは、同一反応で2種以上のプライマー対を用いた2種以上のターゲット配列を増幅する、改良法を提供する。一般に、10種以上のターゲットを増幅するためのPCR条件を設定することは非常に難しいが、その理由は、非特異的副産物無しに一つの特定ターゲットを増幅するのに最適のPCR反応が必要となるからである。従って、マルチプレックスPCRを行う研究者らは、そのシステムの最適化のために非常に苦労する。完全なDNA-DNAマッチができるぐらいの十分高い温度でのアニーリングが要求されるが、本発明のACPは、増幅特異性を改善する能力を有しているため、マルチプレックスDNA増幅の最適化に非常に理想的である。用語“マルチプレックスPCR”は、単一のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)混合物内のマルチプレックスDNAターゲットを同時に増幅することを意味する。
【０１０６】
本発明の他の様態によると、本発明は、2対以上のプライマーを用いて2個以上のターゲットヌクレオチド配列を同一の反応で同時に増幅する方法において、前記方法は、プライマーを利用し増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造によるプライマーは、その3'末端部分にハイブリダイズされるターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有する。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態によると、本発明は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 第１のアニーリング温度で二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第１段階の増幅を行う工程であって、上述のACPのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲット核酸配列とアニーリングされる条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成する工程；および、
(b) 工程(a)の増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー対または工程(a)で利用されたプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記工程(a)の増幅産物の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅する工程。
【０１０８】
本発明のACPを用いた用途は、2種以上のターゲットヌクレオチド配列およびプライマー対を利用することを除いては、上述した核酸配列の増幅方法により行うため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【０１０９】
例えば、増幅に利用されるACPの構成および構造そして条件は、上述の核酸配列の増幅方法と本マルチプレックス増幅で共通する事項である。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態によると、ターゲットヌクレオチド配列の各々から生成される増幅産物は、その後の分析に適合するよう、大きさがお互い異なるものである。
【０１１１】
本発明の好ましい実施形態によると、マルチプレックスターゲットヌクレオチド配列の増幅産物は、サイズ分離過程を通じて分析できる。サイズ分離比較は、当業界に公知された多様な方法により行うが、そのような方法としては、例えば、ポリアクリルアミドゲルマトリックスまたはアガロースゲルマトリックスを通じた電気泳動やヌクレオチドシーケンシングがある。ヌクレオチドシーケンシングは、多様な会社から購入可能な自動化シーケンサーを利用し迅速に実施できる。
【０１１２】
下記の実施例に例示したように、本発明のACPは、当業界に公知のマルチプレックス核酸増幅方法に利用される従来のプライマーからもたらされる非特異性の問題だけではなく、最終増幅産物のバックグラウンド問題が克服されるようにする。
【０１１３】
マルチプレックス増幅の利点は、多数の疾患または特定のヌクレオチド配列変化(例えば、一塩基多型または点突然変異)が同一の反応物で分析できるということである。
【０１１４】
同時に実施できる分析物の数に制限はないが；しかし、上限は約20の分析物であり、分離に必要な大きさの差異および増幅産物の分離に有用な方法により決定される。
【０１１５】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、ACPの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマーまたはプライマー対を追加的に含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-トリフォスフェートを含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うために必要な試薬を含むことができる。特定反応に利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述の成分を含む。
【０１１６】
本発明の方法およびキットは、遺伝疾患および感染疾患の診断、性決定、遺伝的相関性の分析、そして法医学研究に適用できる。
【０１１７】
III．示差的発現遺伝子同定への用途
本発明のACPを用いた本用途は、二つまたはそれ以上の核酸試料中の示差的に発現されるmRNAに相補的なcDNAを検出してクローニングする、改良された方法を提供する。
【０１１８】
本発明の他の様態によると、本発明は、二つまたはそれ以上の核酸試料中の示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出する方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造によるプライマーは、逆転写過程から生成されたcDNA鎖の一部分に実質的に相補的なハイブリダイズ配列(より好ましくは、アービトラリ配列)を、その3'末端部分に有する。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態によると、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) mRNA転写物の第１の集団を代表する第１の核酸試料およびmRNA転写物の第２の集団を代表する第２の核酸試料を提供する工程；
(b) 前記第１の核酸試料および第２の核酸試料の各々を上述したACPの第１のプライマーに接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分は、前記示差的に発現されるmRNAの第１の位置に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記接触は、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う工程；
(c) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記示差的に発現されるmRNAを逆転写することによって、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第１の核酸試料中の前記示差的に発現されるmRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第１の集団を生成させ、前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記示差的に発現されるmRNAを逆転写して前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記示差的に発現されるmRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第２の集団を生成させる工程；
(d) 前記第１のcDNA鎖の第１および第２の集団の各々を精製して定量する工程；
(e) 第１のアニーリング温度で工程(d)の第１のDNA鎖の第１および第２の集団の各々の第１段階の増幅を行う工程であって、上述のACPの第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に第１のcDNA鎖の第１および第２の集団の第２の位置に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の各々の集団の第２の位置にアニーリングされる条件で行って、それにより第２のcDNA鎖の第１および第２の集団を生成させる工程；
(f) 工程(e)の第２のcDNA鎖の各々の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で利用された第１および第２のプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第２のcDNA鎖の3'−および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記第２のcDNA鎖の増幅産物を再増幅させる工程；および、
(g) 工程(f)から得た増幅産物の第１および第２の集団で、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。
【０１２０】
本発明のACPを用いた本用途は、上述した核酸配列の増幅方法により行うため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【０１２１】
本発明のACPを用いた示差的発現遺伝子を同定する過程の代表的な例は、図２Ａに示されている。
【０１２２】
本発明の方法において、mRNA転写物の集団を表す核酸試料は、多様な生物学的物質から得ることができる。一般に、前記第１の核酸試料は、第１の細胞から発現されるmRNAを含み、前記第２の核酸試料は、第２の細胞から発現されたmRNAを含む。特に、前記第１の核酸試料は、第１の発生段階の細胞から発現されたmRNAを含み、前記第２の核酸試料は、第２の発生段階の細胞から発現されたmRNAを含む。また、前記第１の核酸試料は、腫瘍化細胞から発現されたmRNAを含み、第２の核酸試料は、正常細胞から発現されたmRNAを含む。
【０１２３】
本発明の方法で工程(e)および(f)は、プライマーを除いては、同一反応混合物を利用して単一チューブ内で実施できるが、これは、工程(e)および(f)がただ時間的にのみ分離されていることを意味する。5'末端部分に相当するプライマーは、第２のcDNA鎖の合成時または合成後に反応混合物に添加できる。好ましい実施形態では、5'末端部分に相当するプライマーは、工程(e)が完了された直後に反応混合物に添加されて、次いで第２のcDNA鎖のPCR増幅が成される。
【０１２４】
工程(b)および(e)で各々利用される第１および第２のACPの5'末端部分の配列は、同一または相異なる配列を含むことができるが、配列が同一の場合には、5'末端部分配列に相当する1種のプライマーが工程(f)で利用でき、配列が相異なる場合には、ACPの各々の5'末端部分の配列に相当する2種のプライマーが工程(f)で利用できる。好ましくは、工程(b)および(e)で利用される第１および第２のACPの5'末端部分配列は相異なり、これにより、ACPの各々の5'末端部分配列に相当する2種のプライマーが工程(f)で利用される。
【０１２５】
本発明の他の変法によると、ACPの5'末端部分に相当するプライマーの代わりに、工程(b)および(e)で利用される第１および第２のACPの全体配列が、高ストリンジェンシー条件下で、工程(e))から得た第２のDNA鎖の各々を増幅する工程(f)でプライマーとして利用できる。この方法では、第２のACPを利用し最初に合成された第２のDNA鎖の3'末端および5'末端の各々は、第１のACPの配列および第２のACPの相補的配列を含み、第１および第２のACPに対する完璧な対形成位置としての作用をする。このような面で、第１段階の増幅過程でまたはその後に、反応混合物にACPの5'末端部分に相当するプライマーを追加的に添加する必要がないため、本発明の変法は好ましい。図２Ｂは、上述の変法による示差的発現遺伝子の同定過程を示している。
【０１２６】
遺伝子発現の差異を検出する本発明の方法は、多数のcDNA合成アンカープライマーを要求する従来のディファレンシャルディスプレイPCRとは違って、mRNAと反応する単一のcDNA合成プライマー(第１のACP)を利用する。LiangおよびPardee(1977)により提示されたディファレンシャルディスプレイ方法では、12個のアンカープライマーが利用された。例えば、T12MNの配列(Mは、A、CまたはGであり、Nは、A、C、GまたはTである)を有するアンカープライマーは、12種のcDNA集団を生成する。最近は、mRNAのポリAテイルの5'側にすぐ隣接した配列にハイブリダイズされる3'末端のヌクレオチドの数を、2から、1または3に変化させるか、またはオリゴ(dT)9-12 MNテイルを維持しながら少なくとも21個のヌクレオチドとなるように、5'末端に追加的なヌクレオチドを伸長させて変形されたアンカープライマーが提示された(Villeponteau et al., 1996, Combates et al., 2000)。
【０１２７】
本発明は、示差的発現される遺伝子の同定方法にACPを適用することに関するものであって、工程(b)に利用される第１のACPは、次の一般式(2)で表される：5'-dXp-dYq-dTr-3'（前記式中、dXは、4種のデオキシリボヌクレオチドのA、C、GまたはTの一つであり；dYは、PCRの間、アニーリング温度変化によるACPの主機能を決定するユニバーサル塩基を含む調節部分であり；dTは、Tデオキシリボヌクレオチドであり；p、qおよびrは、整数であって；dXpは、予め選択されたアービトラリ配列を含む5'末端部分を示し；dYqは、少なくとも2個のユニバーサル塩基を含み；dTr は、3'末端部分を示し；3'末端部分のヌクレオチド配列は、5'末端部分より低いTmを有する）。一般式(2)は、基本的に一般式(1)の原則に従う。一般式(2)の3'末端部分は、mRNAのポリAテイルにアニーリングする配列を含み、mRNAの逆転写のためのcDNA合成プライマーとして作用する。
【０１２８】
好ましい実施形態では、工程(b)に利用される第１のACPの3'末端部分は、少なくとも6個のTヌクレオチドを含み、前記長さは、プライマーアニーリングに対する最小の長さ要件として判断される。より好ましくは、3'末端部分配列の長さは、10〜20Tヌクレオチドであり、30Tヌクレオチドまで可能である。最も好ましくは、3'末端部分配列の長さは、約15Tヌクレオチドである。前記プライマーは、dT15アニーリング調節プライマー(dT15-ACP)と呼ばれる。好ましい実施形態で、第１のプライマーは、一般式5'-dX15-30-dY2-10-dT10-20-3'で表されて、前記式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを示し、前記mRNAの第１の集団および第２の集団に実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリ配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示して；dTは、mRNAの第１の集団および第２の集団の前記第１の位置にアニーリングできる連続的なデオキシチミジンを示す
【０１２９】
本発明の一実施形態で、工程(b)で利用される第１のACPの3'末端部分は、ポリAテイルのすぐ隣接した上流側のmRNA配列にハイブリダイズされる少なくとも一つの追加的なヌクレオチドをその3'末端に含むことができる。第１のACPの3'末端にある追加的なヌクレオチドの長さは、3ヌクレオチドまでである。例えば、dTは、その3'末端に3'−Vを追加的に含むことができて、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選択される。また、前記dTは、その3'末端に3'−NVを追加的に含むことができ、前記Vは、デオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれて、前記Nは、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選択される。最も好ましくは、工程(b)で利用される第１のACPの3'末端部分配列は、dT15である。
【０１３０】
好ましい実施形態で、第１のACPの全長は、約40〜45ヌクレオチドであり、その3'末端部分にdT15、5'末端部分にdX20-25、および3'末端と5'末端との間にdY5を含む。第１のACPの全長は、最大100ヌクレオチドである。第１のプライマーは、配列表の配列番号30、39、57および61〜63に例示されている。
【０１３１】
本明細書で第１のACPは、全てのmRNA(mRNAの微小な部分は除外)に存在するmRNAのポリAテイルにハイブリダイズされる。本発明で利用される第１のACPの利用は、ただ一つの反応だけを招来し、それにより、一つのcDNA集団のみを生成する。しかし、ディファレンシャルディスプレイ技術の従来アンカープライマーによっては、少なくとも3〜64個の別個のcDNA集団が生成される。本発明のACPは、各々の実験mRNA集団から一本鎖cDNAの実質的に標準的なプールを生成することにより、本発明の効率を大きく増加させる。
【０１３２】
工程(d)で、第１のACPにより合成されたcDNAの標準プールは精製され、分光測定法のような当業界に公知された技術により定量化される。本工程は、増幅段階に投入される反応物の量を正確に調節して、二つまたはそれ以上の試料の最終増幅産物を比較するのに必要である。好ましくは、この始点で生成されたcDNAの量を測定する。当業界に公知のあらゆるcDNA定量方法が利用できるが、より好ましくは、定量は、紫外線分光測定法を用いて行う。UV分光光度計を利用する場合、約260nmのUV光での吸収度が利用される。cDNA定量により、その後の増幅過程で試料間のcDNA量が標準化される。
【０１３３】
第１のACPを用いた第１鎖cDNAの合成後、低ストリンジェンシー条件下で変性、アニーリングおよびプライマー伸長の少なくとも1サイクルにより第２鎖DNAが合成されて、第１鎖DNAが鋳型として利用される。
【０１３４】
第２のACPは、基本的に一般式(1)の原則に従い、その3'末端部分は、短いアービトラリ配列を含み、好ましくは、5'末端部分より低いTmを有する。このプライマーは、アービトラリアニーリング調節プライマー(AR-ACP)と命名される。好ましい実施形態で、第２のACPの3'末端部分の長さは、8〜15ヌクレオチドである。最も好ましくは、第２のACPの3'末端部分の長さは、約10ヌクレオチドである。
【０１３５】
本発明の好ましい実施形態によると、前記第２のACPは、一般式5'-dX15-30-dY2-10-dZ8-15-3'で表されて、前記式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを示し、前記第１のcDNA鎖の第１の集団および第２の集団に実質的に非相補的な予め選択されたアービトラリ配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示して；dZは、前記DNA鎖の第１の集団および第２の集団の前記第２の位置にアニーリングできるハイブリダイズアービトラリヌクレオチド配列を示す。より好ましくは、第２のACPの全長は、約40〜45ヌクレオチドであり、その3'末端部分にdZ10、5'末端部分にdX20-25、そして3'末端部分と5'末端部分との間にdY5を含む。第２のACPの全長は、最大100ヌクレオチドである。第２のプライマーは、配列目録第1〜9、13〜18および20〜23に例示されている。
【０１３６】
本発明の第２のACPは、従来のディファレンシャルディスプレイ変形技術で利用する長いアービトラリプライマーとは違う。例えば、Villeponteau et al. (1996)とDiachenko et al. (1996)により提示された従来の長いアービトラリプライマーは、少なくとも21〜25ヌクレオチドの長さを有して、全配列は、アービトラリヌクレオチドのみで構成されている。このような従来の長いアービトラリプライマーは、初期PCRサイクルでアービトラリ・プライミングを可能にするために必要な低いアニーリング温度(約40℃)で予測性無くハイブリダイズするので、それによりプライマーの代表的セットを作製するのは理論的に不可能である。さらに、上述の低ストリンジェンシー条件下で利用される場合、長いプライマーの‘接着性(stickiness)’により、たくさんのバンドは同一のmRNAを表す。
【０１３７】
示差的発現遺伝子を検出する本発明の方法の利点は、主に第２のACPの利用に起因する。第２のACPで、第２のACPのアニーリングが、アニーリング温度により、5'末端部分ではなく、3'末端部分に限定されるように作製されているため、結果的なアニーリングは予測可能な方式で表わされ、それによりプライマーの代表的セットを作製するのが理論的に可能になる。また、従来のディファレンシャルディスプレイ技術で利用される低ストリンジェンシー条件下での従来の長いプライマーの‘接着性’からもたらされる偽陽性データの問題点が第２のACPの利用により克服される。
【０１３８】
工程(e)で、低ストリンジェンシー条件下での第２鎖DNAの合成に利用されるアニーリング温度は、好ましくは、約40〜65℃であり、より好ましくは、約45〜55℃であって、最も好ましくは、約50℃である。しかし、35℃〜45℃のアニーリング温度を利用するディファレンシャルディスプレイとは違って、本発明の方法で利用される低ストリンジェンシー条件のアニーリング温度は、アービトラリプライマーを利用する典型的なまたは改良されたディファレンシャルディスプレイでのアニーリング温度より高い。
【０１３９】
示差的発現遺伝子の検出に利用される本発明の他の独特な特徴は、その後の増幅により最初に合成された第２のDNA鎖のみを増幅することであり、第２のACPを利用し最初に合成された第２のDNA鎖の3'末端および5'末端は、第１のACPの相補的配列および第２のACPの配列を各々含み、よって、第１および第２のACPの全体配列、または第１および第２のACPの5'末端部分の配列は、第２のDNA鎖の増幅で3'および5'プライマー配列として利用される。
【０１４０】
本発明では、ACPは、特定の産物の増幅を引き起こすため、偽の産物および低い再現性のような重要な未解決の問題点の原因を根本的に除去することができる。前記問題点は、公知のディファレンシャルディスプレイ方法で、従来のアービトラリおよびdTプライマーが増幅産物だけではなく第１および第２のDNA鎖に非特異的にアニーリングするために生じるものである。
【０１４１】
好ましい実施形態では、工程(e)の第２のDNA鎖の合成を、アービトラリ・プライミングがなされるように低ストリンジェンシー条件下で少なくとも1サイクルの増幅により行い、その後のサイクルによって工程(f)で高ストリンジェンシー条件下で第２のDNA鎖の増幅がより効率的に進行する。最も好ましくは、工程(e)で第２のDNA鎖の合成は、低ストリンジェンシー条件下で１サイクルの増幅により行う。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態で、工程(e)で合成された第２のDNA鎖の増幅を高ストリンジェンシー条件で行って、工程(b)および(e)で利用された第１および第２のACPの全配列の各々をプライマー配列として利用すると、第２のDNA鎖の3'末端および5'末端は、第１および第２のACPに対する完璧な対形成位置を提供する。この際、第１および第２のACPは、高ストリンジェンシー条件下で第２のDNA鎖の3'末端および5'末端のアニーリングおよび伸長反応を除くと、鋳型核酸に対するいかなるアニーリングにも関与しない。これは、第１および第２のACPの3'末端部分が比較的低いアニーリング温度を必要としており、そして高ストリンジェンシー条件により、3'末端部分が第２のDNA鎖の3'末端および5'末端を除いた鋳型のいかなる位置にもアニーリングされないようになるためである。従って、アニーリング温度により鋳型に選択的にアニーリングすることを可能にするACPのこのような機能により、公知のディファレンシャルディスプレイ技術の主な問題点である、増幅産物の偽陽性データの発生およびマイナーなmRNA種が過小評価される問題点が解決される。このような側面から、高ストリンジェンシー条件と低ストリンジェンシー条件で同一のプライマーを利用する点では共通する技術的事項を有するが、本発明の方法と従来のディファレンシャルディスプレイ方法には大きく差がある。
【０１４３】
好ましい実施形態で、工程(f)の高ストリンジェンシー条件で増幅のためのアニーリング温度は、約55℃〜72℃である。最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件でのアニーリング温度は、約65〜68℃である。
【０１４４】
好ましい実施形態では、工程(f)の高ストリンジェンシー条件での増幅は、最小10サイクル〜最大50サイクルを実施し、工程(e)で合成された第２のDNA鎖がPCR過程を通じて増幅される。最も好ましくは、PCR増幅は、40〜45サイクル行う。
【０１４５】
好ましくは、第２のcDNAはPCR、より好ましくは、ホットスタートPCR法により合成される。前記ホットスタートPCR法によると、DNAポリメラーゼを含めずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃以上でインキュベートして最初の変性工程を行う。次いで、前記チューブを70℃以上に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量添加する。好ましい実施形態によると、第２のcDNA合成の完全な反応が成された後、第２段階の増幅用プライマーを反応混合物に90℃以上のような変性温度で添加する。反応チューブを約90℃に維持しながら、第２段階の増幅用プライマーを適量で反応物に添加する。
【０１４６】
第１および第２のACPの5'末端部分の予め選択されたアービトラリ配列を利用し、第２のDNA鎖を合成して増幅する具体的な実施例は、次のようである：第２のDNA鎖を低ストリンジェンシー条件下で、アニーリング、伸長および変性を含む第１段階の増幅の1サイクルにより合成し；第１のcDNA、PCR反応バッファー(例えば、Roche社から購入可能なもの)、dNTPおよび第２のACPを含む反応混合物を約94℃で予熱した後、前記反応混合物を含む反応チューブの温度を約94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(例えば、Roche社から購入可能なもの)を反応混合物に添加し；PCR反応を次の条件で行う：94℃で1分、50℃で3分および72℃で1分の１サイクル、次いで94℃で増幅産物を変性。工程(e)で第２のDNA鎖の合成が終了した後、5'予め選択されたアービトラリプライマーおよび3'予め選択されたアービトラリプライマーを反応混合物に添加した後、第２段階の増幅を次のように行う：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒を40サイクル、次いで72℃で5分間の最終伸長。
【０１４７】
第１および第２のACPの5'末端部分の予め選択されたアービトラリ配列を利用する代わりに、工程(b)および(e)の第１および第２のACPの全体配列を利用しながら、単一チューブで第２のDNA鎖を合成して増幅する変形例は、次のように行う：
第２のDNA鎖をストリンジェンシー条件下で、アニーリング、伸長および変性を含む第１段階の増幅の1サイクルにより合成し；第１のcDNA、PCR反応バッファー(例えば、Roche社から購入可能なもの)、dNTP、第１のACP(dT15−ACP)および第２のACP(AR−ACP)を含む反応混合物を約94℃で予熱した後、前記反応混合物を含む反応チューブの温度を約94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(例えば、Roche社から購入可能なもの)を反応混合物に添加し；PCR反応を次の条件で行う：94℃で1分、50℃で3分および72℃で1分の１サイクル、その後、アニーリング、伸長および変性を含む第２の段階のPCR増幅を次の条件で行う：94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒を40サイクル、次いで72℃で5分間の最終伸長。
【０１４８】
第１段階の増幅の１サイクルにより第２のcDNA鎖を合成する時、アービトラリACP(第２のACP)の適量が利用される。工程(e)で利用される第２のACPの量が少なすぎると、増幅産物の再現性がない。逆に、工程(e)で利用される第２のACPの量が多すぎると、PCRの際に、DNAスメアのようなバックグラウンド問題が発生する。好ましい実施形態で、工程(e)の第２のACPの濃度は、約0．1μM〜1.0μMである。最も好ましくは、第１のACPおよび第２のACPの濃度は、約0．2μMである。好ましい実施形態で、工程(f)で利用されるプライマーの濃度は、約0．1μM〜1μMであり、最も好ましくは、約0．4μMである。
【０１４９】
遺伝子発現の差異を明らかにする本発明の方法のまた別の重要な特徴は、高いアニーリング温度を利用することである。工程(f)で利用される高いアニーリング温度は、PCRの間、プライマーアニーリングの特異性を増加させて、これは、偽陽性生成物を完全に除去し再現性を増加させる。従来のディファレンシャルディスプレイ技術の主な問題点である偽陽性データの問題点を解決することは、ディファレンシャルディスプレイで同定されたcDNA断片を確認するスクリーニング工程で特に重要である。
【０１５０】
工程(f)から収得した増幅産物の存在またはレベルを比較する工程は、当業界に公知の多様な方法により実施できる。好ましい実施形態では、工程(f)の増幅産物の第１および第２の集団の各々は、電気泳動により分離されて示差的に発現されたmRNAを同定するようになる。より好ましくは、生成されたPCR cDNA断片は、エチジウムブロマイド染色アガロースゲルで検出される。本発明の他の主な特徴は、示差的発現mRNAを同定するためにエチジウムブロマイド染色アガロースゲルを利用することである。一般に、従来のディファレンシャルディスプレイ方法は、変性ポリアクリルアミドゲルを用いた放射性検出技術を利用する。しかし、本発明の方法によると、二段階増幅を通じて収得したcDNA断片の大きい量は、エチジウムブロマイド−染色アガロースゲルのみによっても増幅されたcDNAの検出を可能にして、これは結局、分析の速度を増加させて、放射能同位元素の利用を不要にする。
【０１５１】
選択的に、生成されたcDNA断片は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０１５２】
本発明の他の実施形態では、診断目的として利用される場合、増幅産物を検出または分析するための標識化、および自動化DNAシーケンサーのような自動化システムを利用することが好ましい(Bauer, et al., 1993)。
【０１５３】
本発明の方法でACPの特徴を考慮すると、示差的発現遺伝子を検出してクローニングする本発明の方法は、従来のディファレンシャルディスプレイ技術と根本的に相異なっている。
【０１５４】
結論的に、本発明の方法でACPは、第２のDNA鎖のみを増幅するようにして、高濃度のdNTPと十分な量の出発物質の使用を可能にして、次のような利点をもたらす：a)プライマーアニーリングの特異性の増加、b)真のポジティブ結果を確認するための難しい作業を必要とする偽陽性データの除去、c)信頼性および再現性の改善、d)微量のmRNAの検出、e)150bp〜2.0kb大きさの広範囲PCR産物の生成、g)分析速度の増加、h)特に、高熟練の技術者を要求する問題点の克服、およびi)代表的プライマーセットデザインの可能性提示。
【０１５５】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(第１および第２のプライマー)を含む、示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、ACPの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマーまたはプライマー対をさらに含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-三リン酸を含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うに必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述した成分を含む。
【０１５６】
IV.  cDNA末端の迅速増幅(RACE)への用途
本発明のACPを利用する本用途は、cDNA末端を迅速に増幅する方法、所謂RACE技術の改良された方法を提供する。より詳細には、本発明のACPは、3'末端および5'末端に対するRACE技術に適用され、従来のRACE技術で利用されたプライマーから招来されるバックグラウンド問題点を解決する。
【０１５７】
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAの3'末端部分に相当するcDNA部位を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写段階およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造による前記プライマーは、逆転写過程で生成されたcDNAの一位置に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列をその3'末端部分に有するか、またはmRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に有する。
【０１５８】
本発明の具体的な実施形態では、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に含む上述のACPのいずれか一つの第１のプライマーに前記mRNAを接触させる工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAを逆転写して前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成する工程；
(c) 前記第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つの第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第１のcDNA鎖の一つの一位置に実質的に相補的な遺伝子特異的ハイブリダイズヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが前記第１のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的位置とアニーリングされる条件で行って、それにより遺伝子特異的な第２のcDNA鎖を生成させる工程；および
(d) 前記工程(c)の遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)で利用された第１または第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが遺伝子特異的第２のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物が生成される工程。
【０１５９】
本発明のACPを用いた本適用は、上述した核酸配列の増幅方法により行うため、過度な反復性を招来する本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【０１６０】
新規なACPシステムを用いたmRNAの3'末端に相当する3'末端部分を含むターゲットcDNA断片を増幅する本発明の方法、所謂ACPベースの3'RACEは、図３に示されている。
【０１６１】
本発明の方法で工程(c)および(d)は、プライマーを除いては、同一反応混合物を利用し単一チューブ内で実施できて、これは、工程(c)および(d)がただ時間的にのみ分離されていることを意味する。5'末端部分に相当するプライマーは、第２のcDNA鎖の合成時または合成後に反応混合物に添加できる。好ましい実施形態で、5'末端部分に相当するプライマーは、工程(2)が完了された直後に反応混合物に添加されて、次いで第２のcDNA鎖のPCR増幅が成される。
【０１６２】
本発明の他の変形例によると、第１および第２のACPの5'末端部分に相当するプライマーの代わりに、第１および第２のACPの全体配列が、工程(c)で得た第２のcDNA鎖を増幅する工程(d)で3'プライマーおよび5'プライマーとして利用でき、この場合、第２のACPを利用して最初に合成された第２のcDNA鎖の3'末端および5'末端の各々は、第１のACPの相補的な配列および第２のACPの配列を含み、第１および第２のACPに対する完全な対形成位置としての作用をする。図３は、上述した変形例にmRNAの3'末端に相当する3'末端部分を含むターゲットcDNA断片を増幅する過程を例示する。
【０１６３】
3'−RACEに対する本発明の主な特徴の一つは、cDNA合成プライマーとして、mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む第１のプライマーを利用し、生成されたcDNAをその後の増幅過程で直接的に鋳型として利用するということであって、cDNA合成プライマーを除去する精製過程を経ない。
【０１６４】
上述のACPの原理に記載のように、比較的高ストリンジェンシー条件下でACPの3'−および5'末端部分に及ぼす調節部分の影響により、その後の増幅過程の際、鋳型の第１のACPへのアニーリングは妨害を受ける。そのため、3'−RACEへの本用途は、精製過程を除去することにより従来のRACE方法を単純化して、また、本発明に利用されるACPはバックグラウンド問題点を解決し、ACP内の3'末端部分および5'末端部分の間に位置した調節部分の存在により3'末端部分のアニーリングが特定化される。その反面、3'-RACE用オリゴdTプライマーのような従来のcDNA合成プライマーは、PCRの際、バックグラウンド、非特異的産物を生成させる。好ましい実施形態によると、cDNA合成用第１のACPの一般式は、一般式(2)と同一である。
【０１６５】
遺伝子特異的プライマーが5'プライマーとして利用される場合、3'末端配列を含む工程(c)のターゲットcDNA断片の第１段階の増幅は、従来のPCR法により行う。配列と関連し使用された用語“遺伝子特異的”は、当業者に公知の特定の遺伝子の部分配列またはその相補体を意味する。従って、遺伝子特異プライマーは、遺伝子特異的配列を含むプライマーを意味する。
【０１６６】
生成された第２のcDNA鎖は、上述した本発明のターゲット核酸配列増幅方法に利用される第２段階の増幅過程により増幅される。本発明のACPは、プライマー内に安定したTmを形成させて、またプライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量およびPCR産物の長さ)に対する許容性を付与する上で、遺伝子特異的プライマー配列が低いTmを有するか前記パラメーターに敏感すぎて特定産物を生成できない場合には、有用である。
【０１６７】
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAの5'末端部分に相当するcDNA部位を含むターゲットDNA断片の迅速増幅方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写段階およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造による前記プライマーは、逆転写過程で生成されたcDNAの一位置に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列をその3'末端部分に有する。
【０１６８】
本発明の具体的な実施形態では、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、mRNAの一部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むcDNA合成プライマーとしてオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーにmRNAを接触させる工程；
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を利用し逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズされる前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成する工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応を通じて前記mRNA−cDNA中間体の前記第１のcDNA鎖の3'末端にシトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分は、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズされる少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに工程(c)から形成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルを接触させて、前記オリゴヌクレオチドの3'末端部分を前記シトシンテイルにハイブリダイズさせる工程；
(e) 逆転写酵素を利用し前記第１のcDNA鎖の3'末端を伸長させることにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドは、伸長反応で鋳型として働き、それにより完全長の第１のcDNA鎖を伸長させる工程；
(f) 下記工程を含み、第１のアニーリング温度で工程(e)から得た前記完全長の第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、前記完全長の第１のcDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記サイクルは、前記第１のプライマーが前記完全長の第１のcDNA鎖の3'末端とアニーリングされる条件で行う第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 上述のACPのいずれか一つの第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第２の完全長のcDNA鎖の一つの一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的ハイブリダイズ配列を有し、前記サイクルは、前記第２のプライマーが前記第２の完全長cDNA鎖の一つの遺伝子特異的位置にアニーリングされる条件で行う遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程；および
(g) 工程(f)−(i)および(f)−(ii)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)−(i)および(f)−(ii)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物が生成される、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で前記遺伝子特異的cDNA鎖の第２段階の増幅を行う工程。
【０１６９】
新規なACPシステムを用いたmRNAの5'末端に相当する5'末端部分を含むターゲットcDNA断片を増幅する本発明の方法、所謂ACPベースの5'RACEは、図４Ａ(オリゴヌクレオチドdTプライマー利用)および図４Ｂ(ランダムプライマー利用)に例示されている。
【０１７０】
工程(a)で利用されるオリゴヌクレオチドdTプライマーについての詳細な説明は、mRNAからターゲット核酸配列を増幅する本発明の方法と同一である。選択的に、ターゲットmRNAのサイズが大きくて5'完全配列に到達する前に逆転写酵素が切れる場合、cDNA合成プライマーとしてランダムプライマーが利用される。
【０１７１】
好ましい実施形態によると、工程(c)、シトシン残基をテイリングする過程は、マンガンイオンの存在下で行う。
【０１７２】
本発明の方法で工程(f)および(g)は、プライマーを除いては、同一反応混合物を利用し単一チューブ内で実施できて、これは、工程(f)および(g)がただ時間的にのみ分離されていることを意味する。工程(f)および(g)に利用されるプライマーは、各々の工程でまたはその後に反応混合物に添加できる。好ましい実施形態では、各々の工程が終了した後、プライマーを反応混合物に添加して、次いで第２のcDNA鎖のPCR増幅を行う。
【０１７３】
遺伝子特異的プライマーを5'プライマーとして利用する場合、工程(f)で5'末端配列を含むターゲットcDNA断片の増幅は、当業者に公知の通常のPCR法により高ストリンジェンシー条件下で行う。
【０１７４】
好ましい実施形態で、工程(f)で5'末端配列を含むターゲットcDNA断片の増幅は、3'末端部分に遺伝子特異的配列を含む第２のACPを利用し、上述の本発明のターゲット核酸配列増幅方法に利用される二段階PCR増幅により行う。本発明のACPは、プライマー内に安定されたTmを形成させて、かつプライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量およびPCR産物の長さ)に対する許容性を持たせるため、遺伝子特異的プライマー配列が低いTmを有するか前記パラメーターに敏感すぎて特定産物を生成できない場合、有用である。第２のACPの一般式は、3'末端部分が遺伝子特異的配列を含む一般式(1)と同一である。
【０１７５】
3'末端に少なくとも3個のグアニン残基を含み、逆転写酵素による第１のcDNA鎖の3'末端伸長のための鋳型スイッチングプライマーとして利用されるという面から、工程(d)に利用されるオリゴヌクレオチドは、CapFinderプライマー(Chenchik et al., 1998; Chenchik et al. 米国特許第5,962,271号および第5,962,272号)に類似している。
【０１７６】
しかし、前記両方のプライマーは、PCR時、アニーリング温度により鋳型核酸に対するプライマーアニーリングを調節できるかどうかによって明白な差がある。CapFinderプライマーは、ACPでプライマーアニーリングを調節するのに関与するユニバーサル塩基残基群を含まないため、5'−RACE用CapFinder PCR法(Chenchik et al., 1998)は、PCRの際、cDNA合成に利用されるオリゴdTプライマーとCapFinderのようなプライマーの混入によってもたらされるDNAスメアのような高いバックグラウンドの問題を有する。逆に、第１のACPのユニバーサル塩基残基群は、プライマーアニーリングを調節するのに重要な役割をするため、本発明の方法は、PCR増幅でのバックグラウンド問題を引き起こさない。これは5'−RACEへのACPの用途の主な特徴である。
【０１７７】
また、本発明のACPが5'-RACE技術に利用される場合、固相cDNA合成のような物理的分離過程とcDNA合成で利用される全ての混入物を除去するための他の代替方法(Schramm et al., 2000)が必要なくなる。
【０１７８】
本発明の好ましい実施形態で、5'-RACEのためにシトシンテイルと塩基対を形成する前記オリゴヌクレオチドは、ACPに類似した構造を有し、次の一般式(3)で表される：5'-dX15-30-dY2-10-dZ1-10-G3-5-3'（前記式中、dXは、デオキシリボヌクレオチドを示し、予め選択されたアービトラリ配列を含み；dYは、2〜10個のユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を示して；dZは、デオキシリボヌクレオチドを示して、予め選択されたアービトラリ配列を含み；G3-5は、3〜5個のグアニンを示す）。
【０１７９】
最も好ましくは、前記3'末端部分配列dZの長さは、約2〜3ヌクレオチドである。本発明の一実施形態で、前記5'末端部分dXは、制限酵素に認識部位配列を含むことができる。
【０１８０】
前記G3-5は、3〜5個のリボグアニンまたはデオキシリボグアニンであるか、またはリボグアニンとデオキシリボグアニンとの組合せである。より好ましくは、G3-5は、2個のリボグアニンおよび1個のデオキシリボグアニン(r(G)2-d(G)-3')であり、最も好ましくは、3個のリボグアニンである。
【０１８１】
工程(f)で遺伝子特異的プライマーが5'−RACE用3'プライマーとして利用される場合、5'末端配列を含むターゲットcDNA断片の増幅は、当業界で公知の通常のPCR法により高ストリンジェンシー条件下で行う。
【０１８２】
好ましい実施形態で、5'末端配列を含むターゲットcDNA断片の増幅は、3'末端部分に遺伝子特異的配列を含む第２のACPを利用し、上述の本発明のターゲット核酸配列増幅方法に利用される二段階PCR増幅により行う。本発明のACPは、プライマー内に安定なTmを形成させて、かつプライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量およびPCR産物の長さ)に対する許容性を持たせるため、遺伝子特異的プライマー配列が低いTmを有するか前記パラメーターが敏感すぎて特定産物を生成できない場合、有用である。第２のACPの一般式は、3'末端部分が遺伝子特異的配列を含む一般式(1)と同一である。
【０１８３】
RACE技術でのACPは、上述のcDNA末端の増幅に記載されたように、従来のRACE技術を非常に単純化して改善させる。本発明の主要な特徴は、従来のRACE方法で利用されるプライマーによりもたらされるバックグラウンドの問題を克服するということである。それにより、本発明の方法は、従来のRACE方法に比べ、より効率的かつ便利で、労力を減らせると共に、再現性が高い。
【０１８４】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(第１および第２のプライマーを含む)を含む、mRNAの3'末端部分に相当するcDNA部位を含むターゲットcDNA断片を迅速に増幅するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、ACPの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマーまたはプライマー対をさらに含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-三リン酸を含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うに必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述した成分を含む。
【０１８５】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(cDNA合成のためのオリゴヌクレオチドdTプライマーおよびランダムプライマー、シトシンテイルと塩基対を形成するオリゴヌクレオチド、第１および第２のプライマーを含む)を含む、mRNAの5'末端部分に相当するcDNA部位を含むターゲットDNA断片を迅速に増幅するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、工程(f)-(i)および(f)-(ii)に利用される第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマーまたはプライマー対を追加的に含み；5'末端部分がユニバーサル配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットは、ユニバーサルプライマーを含む。
【０１８６】
V.  完全長cDNAの増幅への用途
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAに相補的な完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACPの構造を有するプライマーは、mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する。
【０１８７】
本発明の特定実施形態によると、本発明の方法は、次の工程を含む：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に含む前述のACPのいずれか一つの第１のプライマーに前記mRNAを接触させる工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を利用し逆転写することにより、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成する工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応によって前記mRNA−cDNA中間体の前記第１のcDNA鎖の3'末端にシトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分は、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分は、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドに工程(c)から形成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルを接触させて、前記オリゴヌクレオチドの3'末端部分を前記シトシンテイルにハイブリダイズさせる工程；
(e) 逆転写酵素を利用し前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより完全長の第１のcDNA鎖を伸長させる工程；および、
(f) 工程(e)で生成された前記完全長の第１のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドと同一のプライマーに相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記完全長の第１のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる工程。
【０１８８】
本発明のACPを用いた本用途は、上述した核酸配列の増幅方法により行うため、過度な反復性をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。また、ポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を3'末端部分に含む上述のACPは、本発明の3'−RACEに利用される第１のプライマーと原則的に同一である。また、工程(f)で利用される、シトシンテイルとの塩基対を形成するオリゴヌクレオチドおよびプライマー対は、上述した本発明の5'−RACEに利用されるものと原則的に同一である。
【０１８９】
完全長cDNA分子を増幅する本発明の方法は、図５に例示されている。
【０１９０】
完全長cDNAを増幅する方法でのACPは、従来のRACE技術を非常に単純化して改善させる。本発明の主要な特徴は、従来のRACE方法で利用されるプライマーからもたらされるバックグラウンドの問題を克服するということである。それにより、本発明の方法は、従来の方法に比べ、より効率的かつ便利で、労力を減らせると共に、再現性が高い。
【０１９１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(オリゴヌクレオチドdTプライマー、シトシンテイルと塩基対を形成するオリゴヌクレオチド、そして工程(f)で利用されるプライマーを包含する)を含む、mRNAに相補的な完全長二本鎖cDNAの集団を増幅するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、工程(a)および(d)で利用されるプライマーおよびオリゴヌクレオチド各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマー対を追加的に含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-三リン酸を含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うに必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述した成分を含む。
【０１９２】
VI.  5'富化したcDNAの増幅への応用
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNAの5'末端部分に相当するcDNA部分を含む5'富化した(5'−enriched)二本鎖cDNAの集団を増幅する方法であって、前記方法は、mRNAの逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、cDNA合成に利用されてACPの構造を有するプライマーは、その3'末端部分に少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する。
【０１９３】
本発明の特定実施形態によると、本発明の方法は、次の工程を含む：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、3'末端部分に少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する上述のACPのいずれか一つの第１のプライマーに前記mRNAを接触させる工程；
(b) 上述した完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法の工程(b)〜(e)を実施し、5'富化した第１のcDNAを伸長させる工程；および、
(c) 工程(a)および(b)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが前記5'富化した第１のcDNA鎖の3'−および5'末端配列に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物が生成される、工程(b)から生成された前記5'富化した第１のcDNA鎖の増幅を行う工程。
【０１９４】
本発明のACPを用いた本適用は、上述した核酸配列の増幅方法を利用するため、過度な反復性をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。また、工程(c)で利用される、シトシンテイルと塩基対を形成するオリゴヌクレオチドおよびプライマー対は、上述した本発明の5'−RACEに利用されるものと原則的に同一である。
【０１９５】
mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAの集団を増幅する本発明の方法は、図６に例示されている。
【０１９６】
用語“5'富化したcDNA”は、cDNAが生成されるmRNAの5'末端のヌクレオチド配列情報を含むcDNA分子を意味する。
【０１９７】
第１のプライマーの一般式は、3'末端部分がランダムヌクレオチド配列を含む一般式(1)と同一である。好ましい実施形態で、工程(a)で利用される第１のプライマーの3'末端部分は、少なくとも6個のランダムデオキシリボヌクレオチドを含む。好ましい実施形態で、工程(a)で利用される第１のプライマーの5'末端部分は、制限酵素認識配列を含むことができる。
【０１９８】
従来の方法は、プライマーアニーリングを調節できない従来のプライマーを利用するため、mRNA分子に相補的な5'富化したcDNA分子を増幅するのに、本発明の方法よりさらに多い工程を必要とする。逆に、本発明の方法は、ACP内のユニバーサル塩基残基群の影響によりもたらされるプライマーアニーリング調節のため、簡便かつ効率的である。
【０１９９】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(第１のプライマー、シトシンテイルと塩基対を形成するオリゴヌクレオチド)を含む、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅するためのキットを提供する。本発明の一実施形態によると、本発明のキットは、工程(a)および(b)で利用されるプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を有するプライマー対を追加的に含み；5'末端部分がユニバーサルプライマー配列を含む場合、より好ましくは、本発明のキットはユニバーサルプライマーを含む。選択的に、本発明のキットは、PCR反応に必要な試薬、例えば、バッファー、DNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ助因子およびデオキシリボヌクレオチド−5'-トリフォスフェートを含むことができる。選択的に、本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファーおよび試薬、DNAポリメラーゼの活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは、ポジティブおよびネガティブ対照群反応を行うに必要な試薬を含むことができる。特定反応で利用される試薬の最適量は、本明細書の内容を把握した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、分離されたパッケージまたは区画に上述した成分を含む。
【０２００】
VII.  DNAまたはRNAフィンガープリンティングへの応用
ACPを用いた本応用は、ゲノムDNA内の多型検出(DNAフィンガープリンティング)またはmRNA水準での示差的に発現される遺伝子の検出(RNAフィンガープリンティング)方法に対する改良を提供する。
【０２０１】
本発明の他の様態によると、本発明は、プライマーを利用し増幅反応を行う工程を含むgDNAのDNAフィンガープリントを生成する方法において、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造を有する前記プライマーは、その3'末端部分に、ハイブリダイズされるgDNA上の位置に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有する。
【０２０２】
本発明の特定実施形態で、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用し行う：
(a) ゲノムの特徴的な別個のDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第１段階の増幅を、gDNAから第１のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つのプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記gDNA上の位置に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、前記サイクルは、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングされる条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる別個のDNA断片のセットが生成される工程；および、
(b) 工程(a)で生成された別個のDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で利用されたプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ本工程を、各々のプライマーが工程(a)で生成された別個のDNA断片のセットの3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記別個のDNA断片のセットを再増幅する工程。
【０２０３】
本発明の他の実施形態によると、本発明は、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法において、前記方法は、逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造を有する前記プライマーは、逆転写過程により生成されたcDNA鎖上の位置と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有するか、またはmRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する。
【０２０４】
本発明の特定実施形態では、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、ハイブリダイズされる前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する上述のACPのいずれか一つの第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズされる前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、上述のACPのいずれか一つの第２のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、ハイブリダイズされる前記第１のcDNA鎖の位置と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ本工程を、各々のプライマーが前記mRNA試料にアニーリングされる条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる別個のcDNA断片のセットが生成される工程、および
(d) 工程(c)で生成された別個のcDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で利用されたプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが工程(c)で生成された別個のcDNA断片のセットの3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記別個のcDNA断片のセットを再増幅する工程。
【０２０５】
本発明のACPを用いた本用途は、上述の核酸配列の増幅方法を利用するため、過度な反復性をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容は、その記載を省略する。また、RNAフィンガープリンティングは、原則的に示差的発現mRNAに相補的なDNAを検出する本発明の方法に従う。
【０２０６】
用語“ゲノムDNA”は、一種の完全な遺伝物質を含むDNAの一集団を意味する。従って、ゲノムDNAは、特定の種に存在する遺伝子の完全なセットを含む。また、一種の完全な遺伝子セットは、ゲノムとも表現される。用語DNAまたはRNA“フィンガープリンティング”は、ゲノムの特徴とされる別個のDNA増幅産物の一セット、またはmRNA試料の特徴とされる別個のcDNA断片の一セットを意味する。
【０２０７】
アービトラリプライマーを利用する従来のPCRフィンガープリントでは、所謂AP-PCRにおいて、低いアニーリング温度がアービトラリプライミングの達成のために必要とされるため、PCR増幅の最初の2〜5サイクルの間、非ストリンジェンシー条件下で短いか長いアービトラリプライマーが利用される。このような特徴により、その後の増幅過程を高ストリンジェンシー条件下で行うとしても、分離された断片の相当な部分は、再現性がない。
【０２０８】
AP-PCRとは違って、フィンガープリンティングのためのACPベースのPCRは、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するユニバーサル塩基残基群の機能により、PCRの際、プライマーアニーリングの特異性を増加させて、前記ユニバーサル塩基残基群がアニーリング位置をACPの3'末端部分に限定させることにより、高いアニーリング温度で3'末端部分がアニーリングされるようにする。従って、フィンガープリンティングのためのACPベースのPCRは、偽陽性産物を完全に除去し、再現性を非常に増加させる。
【０２０９】
本発明の好ましい実施形態で、ACPは、その3'末端部分に少なくとも6ヌクレオチドのアービトラリ配列を含む。より好ましくは、3'末端部分の長さは、8〜15ヌクレオチドであり、最も好ましくは、約10ヌクレオチドである。
【０２１０】
単一ACPまたはACPの対は、DNAフィンガープリンティングで多型を検出するのに利用できる。好ましくは、ACPの対がDNAフィンガープリンティングのために利用されて、これは、単一アービトラリACPよりACPの対がさらに多い産物を生成するからである。
【０２１１】
ACPを利用するDNAフィンガープリンティングの例は、次の条件で二段階PCR増幅により行う：増幅反応は、低ストリンジェンシー条件下でアニーリング、伸長および変性反応を含む第１段階のPCRの2サイクルにより行って、ゲノムDNA、PCR反応バッファー、MgCl2、dNTPs(dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)とACPの対を含む反応混合物を予熱した後、Taqポリメラーゼを反応混合物に添加して；第１の段階のPCRが完了された後、ACPの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリプライマーJYC4を反応混合物に添加した後、第２の段階のPCR増幅を行う。
【０２１２】
DNAフィンガープリンティングを生成するために、ACPの適量を利用することが好ましい。ACPの量が少なすぎると、生成される増幅産物の再現性がない。逆に、ACPの量が多すぎると、PCRの際、DNAスメアのようなバックグラウンド問題が発生する。好ましい実施形態では、ACPの濃度は、約0．1μM〜2μMである。最も好ましくは、ACPの濃度は、約1.4μMである。
【０２１３】
好ましい実施形態では、ACPの5'末端部分に相当するプライマーの濃度は、約0.1μM〜2μMであり、最も好ましくは、約0.8μMである。
【０２１４】
ゲノムDNAおよびmRNA試料は、多様な生物学的材料および条件から得ることができる。例えば、前記試料は、植物、動物(ヒト)および微生物そして相異なる個体生物から得られる。
【０２１５】
増幅産物は、ゲル電気泳動により分析できる。本発明の一実施形態で、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０２１６】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAまたはmRNAを用いたDNAフィンガープリントを生成するためのキットを提供する。核酸配列増幅用キットおよび示差的発現mRNAに相補的なDNAの検出用キットに対する説明は、本発明のキットにも適用される。
【０２１７】
VIII.  多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片の同定への用途
ACPを用いた本応用は、多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片(conserved homology segments)を同定する方法に対する改良を提供する。
【０２１８】
本発明の他の様態によると、本発明は、mRNA試料から多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法において、前記方法は、逆転写工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造を有する前記プライマーは、その3'末端部分に逆転写過程から生成されたcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列および/またはmRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズヌクレオチド配列を有する。
【０２１９】
本発明の特定の実施形態で、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる工程；および、
(d) 工程(c)から生成された3'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する工程。
【０２２０】
前記本発明の特定実施形態は、原則的に、第２のプライマーを除いては、上述した本発明の3'-RACE方法に従う。
【０２２１】
本発明の他の具体的な実施形態によると、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 上述の完全長二本鎖cDNAの集団を増幅する方法の工程(a)〜(e)を実施し、完全長cDNA鎖を生成する工程；
(b) 次の工程を含み、第１のアニーリング温度で工程(a)から得た前記完全長の第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、前記完全長の第１のcDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、本工程を、前記第１のプライマーが前記完全長の第１のcDNA鎖の3'末端とアニーリングされる条件で行って、第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記第２のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第２の完全長cDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程；および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)−(i)および(b)−(ii)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)−(i)および(b)−(ii)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する工程。
【０２２２】
前記本発明の特定実施形態は、原則的に、第２のプライマーを除いては、上述した本発明の5'-RACE方法に従う。
【０２２３】
本発明の他の様態によると、本発明は、gDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジーセグメントを同定する方法において、プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を、提供する。好ましくは、ACP構造を有する前記プライマーは、その3'末端部分にgDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有する
【０２２４】
本発明の特定実施形態で、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用して行う：
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーが前記gDNAのコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングされる条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程；および
(b) 工程(a)から生成されたゲノムDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で利用されるプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが工程(a)から生成されたゲノムDNA断片の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する工程。
【０２２５】
前記本発明の方法は、原則的に、プライマーを除いては、上述した本発明のターゲット核酸配列の増幅方法に従う。
【０２２６】
本発明のACPを用いた本用途は、上述した核酸配列の増幅方法を利用するため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。また、mRNAを出発物質として利用する場合、本発明の3'−RACEまたは5'−RACE方法は、多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する本発明の方法に原則的に適用される。
【０２２７】
多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法に利用されるACPの一般式は、ACPの3'末端部分に、保存性ホモロジーのアミノ酸配列をコードする縮重配列または遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有する、一般式(1)と同一である。
【０２２８】
縮重プライマーを作製するには、二つの基本的な方法がある：(a)精製されたタンパク質から得たペプチド配列データを利用する方法；および(b)遺伝子ファミリーをアラインメントして得たコンセンサスタンパク質配列データを利用する方法。目的遺伝子のオーソログ体を異なる生物体からクローニングしたか、あるいは遺伝子が遺伝子ファミリーの一員である場合、タンパク質配列のアラインメントを作成することが可能である。
【０２２９】
前記のような方法では、例えば、高度に保存された部分のコンセンサス配列から縮重プライマーを作製するための適合した部分を見つけ出すことができる。縮重プライマーを用いた増幅は、たまに問題があり、最適化過程が必要になる。第１のパラメーターは、アニーリング温度である。過度な非特異的増幅を避けるためには、アニーリング温度をできるだけ高く維持することが重要であり、好ましくは、出発温度は、55℃である。一般に、前記原則に従うことは難しい。というのも、縮重プライマーはアミノ酸配列に基づいて作製されなければならないためである。しかし、本発明のACPは、上記満たすべき要件を排除する。これは、ACPが、プライマーデザインにかかわらず、第２段階のPCR増幅で65℃のような高いアニーリング温度の使用を可能にするからである。
【０２３０】
本発明の好ましい実施形態によると、第２のプライマーは、コンセンサス配列のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチドから選択される縮重配列を含むプライマーのプールである。
【０２３１】
用語“保存性領域”およびより特定的に“多重遺伝子ファミリーの一つの遺伝子の保存性領域”は、遺伝子ファミリーのメンバー間に相当な相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列の断片を意味する。相同性の程度は様々である。ある場合、保存性領域は、ファミリーメンバー間で同一である。他の場合、ファミリーメンバー間で保存されたアミノ酸断片をコードするが、ヌクレオチド配列は非常に異なる場合もある。用語“コンセンサス配列”は、多数の類似したヌクレオチド配列を比較する時、特定位置から最も頻繁に発見される塩基を意味する。
【０２３２】
保存性ホモロジー断片を同定する本発明の方法は、選択的に、示差的発現mRNAを検出する方法と結合できる。
【０２３３】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAまたはgDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキットを提供する。上述した核酸配列増幅用キット、3'−RACEおよび5'−RACEのためのキットに対する説明は、本発明のキットにも適用される。
【０２３４】
IX.  ヌクレオチド変異の同定への用途
ACPを用いた本応用は、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法に対する改良を提供する。
【０２３５】
本発明の他の様態によると、本発明は、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法において、前記方法は、プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造を有するプライマーは、(a) その3'末端部分にターゲット核酸の第１の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有して、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含む第１のプライマー、および/または(b) ターゲット核酸の第２の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する第２のプライマーである。
【０２３６】
本発明の特定実施形態で、本発明の方法は、次の工程を含み、二段階増幅を利用し行う：
(a) 上述のACPのいずれか一つの第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第１のアニーリング温度で前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第１のDNA鎖を生成させる第１段階の増幅を行う工程であって、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第１の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に対応する疑問位置を含み、それにより前記疑問位置が前記第１の部位のそれに相当するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；
(b) 次の工程を含み、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で工程(a)で得た前記第１のDNA鎖の第２段階の増幅を行う工程：
(i) 上述のACPのいずれか一つの第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第２の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第２の部位にアニーリングされる条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相補的な第２のDNA鎖を生成させる工程；および
(ii) 工程(a)および(b)−(i)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)−(i)から生成された前記第２のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたは相当するハイブリダイズ配列を有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記サイクルは、各々のプライマーが前記第２のDNA鎖の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記3'末端および5'末端に前記ターゲット核酸の前記第１の部位および第２の部位を含む前記第２のDNA鎖を増幅して、前記ヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【０２３７】
本発明のACPを用いた本用途は、上述した核酸配列の増幅方法を利用するため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容はその記載を省略する。
【０２３８】
新規ACPを用いて一塩基多型(SNP)ゲノムタイピングを行う本発明の具体的な実施形態は、図７Ａに例示されている。
【０２３９】
ヌクレオチド変異同定用ACPの一般式は、一般式(1)と同一であり、この場合、3'末端部分にヌクレオチド変異を含むターゲット核酸の一部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記ヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドおよびACPの相補的なヌクレオチドは、疑問位置を占める。本発明の方法は、ターゲットヌクレオチド変異を含む試料DNAの断片または患者血液のような試料から得たゲノムDNAを用いて二段階PCR増幅により行う。目的のヌクレオチド試料は、ヒト核酸および感染性疾患を引き起こす生物体から得られる。
【０２４０】
二段階PCR増幅による一塩基多型(SNP)ゲノムタイピングのための方法は、基本的に、ゲノムDNAを出発物質とするターゲット核酸配列の増幅方法に従う。また、本発明のマルチプレックスDNA増幅方法も本発明に適用できる。
【０２４１】
出発物質としてターゲットヌクレオチド変異を含む試料DNAの断片を利用するために、工程(a)の前に、ターゲット断片は、試料DNAに実質的に相補的なハイブリダイズ配列を含むプライマー対を用いて予め増幅することが好ましい。また、マルチプルSNPスクリーニングのための出発物質としてSNPを含む2種以上のターゲットヌクレオチド断片は、上述の応用IIのマルチプレックスDNA増幅により製造できる。
【０２４２】
多型塩基を検出するための工程(a)に利用される第１のACPは、その3'末端部分内に、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異に相当するヌクレオチドに相補的なヌクレオチドにより占められる、疑問位置を含むアレル特異的ACPである。好ましくは、第１のプライマーの疑問位置は、3'末端部分の中間に位置する。より好ましくは、アレル特異的ACPの疑問位置は、3'末端ヌクレオチドから約10塩基内にある。さらに好ましくは、アレル特異的ACPの疑問位置は、プライマーの3'末端ヌクレオチドから約6塩基内にある。他の好ましい実施形態で、アレル特異的ACPの疑問位置は、3'末端ヌクレオチドから4〜6塩基離れた位置にある。最も好ましくは、アレル特異的ACPの疑問位置は、3'末端ヌクレオチドから5塩基離れた位置にある。用語“3'末端ヌクレオチド”は、ACPの3'末端に位置するヌクレオチドを意味する。
【０２４３】
他の実施形態で、工程(a)で利用されるアレル特異的ACPの3'末端部分の長さは、最小6ヌクレオチドであり、これはプライマーアニーリングにおいて最小の長さ要件である。好ましくは、3'末端部分配列の長さは、約8〜20ヌクレオチドである。最も好ましくは、3'末端部分の配列は、疑問位置を含み、約10ヌクレオチドの長さを有する。
【０２４４】
本発明の一実施形態で、ACPは、自分の3'末端部分に少なくとも一つの人為的なミスマッチを有する。そのミスマッチは、DNA二重鎖の立体的構造を損わずに4種の塩基と最小限の水素結合をするユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体である。前記人為的ミスマッチの位置は、実験デザインにより多様であるが、第１のプライマーの疑問位置に隣接するのが好ましい。
【０２４５】
好ましい実施形態で、第１または第２のプライマーは、検出または分離用標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含む。
【０２４６】
本発明の好ましい実施形態によると、工程(a)でヌクレオチド変異を含む第１のDNA鎖は、プライマーアニーリング、伸長および変性の1サイクルにより生成される。工程(b)−(i)でヌクレオチド変異を含む第２のDNA鎖は、好ましくは、プライマーアニーリング、伸長および変性の1サイクルにより生成される。工程(b)−(ii)でヌクレオチド変異を含む第２のDNA鎖は、好ましくは、プライマーアニーリング、伸長および変性の少なくとも5サイクルにより増幅される。
【０２４７】
ヌクレオチド変異を含む、増幅されたDNA鎖断片を利用する本発明の特定実施形態によると、本発明の方法は、次の工程を含み、第１の増幅過程および第２の増幅過程の二つの個別的な増幅過程を利用して行い、かつ、前記第２の増幅過程は二段階増幅を利用して行う：
(a) プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含む、両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させるための第１の増幅過程を行う工程であって、前記プライマー対の各々は、前記ターゲット核酸の一部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つは、3'末端部分に前記ハイブリダイズ配列を有する上述のACPのいずれか一つのプライマーであって、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖の断片を生成させる工程；
(b) 上述のACPのいずれか一つの第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第１のアニーリング温度で前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖の断片に相補的な第１のDNA鎖を生成するための第２の増幅過程の第１段階の増幅を行う工程であって、前記プライマーは、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸の第１の位置の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の位置の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより前記疑問位置が前記第１の位置のそれに相当するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；および、
(c) プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、第２のアニーリング温度で工程(a)の前記第１のDNA鎖の第２段階の増幅を行う工程であって、前記プライマー対の一つのプライマーは、工程(a)で利用された上述のACPのいずれか一つのプライマーと同一であり、他のプライマーは、工程(b)で利用された前記第１のプライマーと同一であって、また前記プライマー対の各々のプライマーは、前記第１のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたは相当するハイブリダイズする配列を有し、前記サイクルは、各々のプライマーが前記第１のDNA鎖の3'末端および5'末端にアニーリングされる条件下で行って、それにより前記第１のDNA鎖が増幅されることにより、前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【０２４８】
新規ACPを用いた一塩基多型(SNP)ゲノムタイピングに対する他の特定実施形態は、図７Ｂに例示されている。本特定実施形態は、上述の実施形態と同様に行うため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために共通する内容は、その記載を省略する。
【０２４９】
本発明の方法は、一塩基多型および点突然変異(置換、欠失および付加)を含むヌクレオチド変異の多様な形態に適用できる。
【０２５０】
増幅産物は、ゲル電気泳動により分析できる。本発明の一実施形態で、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０２５１】
マルチプルSNPスクリーニングにおいて、マルチプレックスDNA増幅により生成された増幅産物は、サイズ分離により比較できる。前記サイズ分離比較は、アガロースゲルマトリックスまたはポリアクリルアミドゲルマトリックスでの電気泳動またはシーケンシングによっても実施できる。また、自動分析用蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅産物を検出することができる。
【０２５２】
用語“疑問位置”は、ターゲット核酸内にある、目的の特定ヌクレオチド塩基の位置を意味する。例えば、SNP分析において、ターゲット核酸内の“疑問位置”は、野生型と異なる塩基を有する位置を意味する。また、疑問位置は、ターゲット核酸の疑問位置に相補的なプライマーのヌクレオチド配列の位置を含む。ターゲット核酸の疑問位置は、プライマーがターゲット核酸にハイブリダイズされる際、プライマーの疑問位置に対し正反対側に位置している。
【０２５３】
用語“多型”は、異なるゲノムまたは個体での、二つまたはそれ以上の代替的なゲノム配列またはアレルの存在を意味する。用語“多型的”は、特定ゲノム配列の二つまたはそれ以上の変異が一集団内で発見される状態を意味する。“多型部位”は、変異が生じる座位を意味する。一塩基多型またはSNPは、単一塩基対変異であり、典型的に多型位置で一つのヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されることを意味する。単一ヌクレオチドの欠失または付加も一塩基多型を生じうる。典型的には、相異なるゲノムまたは相異なる個体の間で、多型位置は、二つの相異なるヌクレオチドにより占められる。用語“アレル(allele)”は、特定ゲノム座位またはマーカーから自然的に発生する配列変異(個体の集団から検出可能なもの)の集合の特定メンバーを意味する。
【０２５４】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセット(第１および第２のプライマー)を含む、ターゲット核酸でヌクレオチド変異を同定するためのキットを提供する。上述の核酸配列増幅用キットに対する説明は、本発明のキットにも適用される。
【０２５５】
X.  突然変異誘発への用途
ACPを用いた本応用は、突然変異誘発する方法に対する改良を提供する。ACPベースのPCRは、突然変異誘発に対する最上のツールを提供し、前記突然変異誘発は、配列の欠失または付加、一つまたは数個の特定ヌクレオチドの置換、そしてヌクレオチド配列のランダム変異を含む。
【０２５６】
本発明の他の様態によると、本発明は、プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含む、ターゲット核酸で突然変異誘発する方法であって、前記プライマーの少なくとも一つは、上述のACPのいずれか一つのプライマーであることを特徴とする方法を提供する。好ましくは、ACP構造を有するプライマーは、その3'末端部分にターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記ハイブリダイズ配列は、変異を発生させるためのヌクレオチド配列を含む。
【０２５７】
本発明の特定実施形態によると、本発明は、次の工程を含む二段階増幅を用いて行う：
(a) 上述のACPのいずれか一つのプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、前記ターゲット核酸配列の一部位と実質的に相補的なハイブリダイズ配列を有し、前記ハイブリダイズ配列は、位置指定変異を生じさせるために少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより位置指定変異位置を含む増幅産物が生成される、第１のアニーリング温度で前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を行う工程；および、
(b) 工程(a)の増幅産物の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマーまたは工程(a)で利用されたプライマーの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングされる条件下で行って、それにより位置指定変異位置を含む増幅産物を再増幅する工程。
【０２５８】
前記特定実施形態は、位置指定突然変異誘発方法に関するものである。
【０２５９】
本発明のACPを用いた本用途は、上述の核酸配列の増幅方法を利用するため、過度な反復をもたらす本明細書の複雑性を避けるために、共通する内容は、その記載を省略する。
【０２６０】
PCR突然変異誘発に利用されるACPの一般式は、3'末端部分が位置指定突然変異誘発またはランダム突然変異誘発のための配列を含む一般式(1)と同一である。
【０２６１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述したアニーリングプライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸で突然変異誘発をするためのキットを提供する。上述の核酸配列増幅用キットに対する説明は、本発明のキットにも適用される。
【０２６２】
XI.  他の用途
本発明のACPは、核酸増幅、特にPCRを含む多様な技術に有用である。例えば、cDNAの混合オリゴヌクレオチド−プライミング増幅、長範囲PCR、線形PCR、逆PCR、定量PCR、タッチダウンPCR、シーケンシング、in situ PCR、vectorette PCRおよび熱非対称交差PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）に有用である。上記の方法の一般的な過程は、Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) and M.J. McPherson, et al., PCR, Springer-Verlag New York Inc., N.Y.(2000)に開示されている。
【０２６３】
従って、本発明は、核酸増幅、特にPCRが関与する方法において、ACPのあらゆる用途を包括する。
【０２６４】
本発明のACPは、核酸増幅を伴う技術において、非常に効率的で幅広く適用できる。また、従来の核酸増幅技術に残っているプライマーアニーリング特異性にかかわる多様な問題点が、ACPおよび本発明の方法により根本的に解決される。核酸増幅の際、ACPの利用によって得られる主要な利点は、次の通りである：
(a) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置した調節部分の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングされる条件下で、プライマーアニーリング部位を3'末端部分に限定することから、プライマーのアニーリング配列が正確に調節されて、これにより所望の長さのアニーリング配列を有するプライマーの製作が可能になる(または、アニーリング部位を調節できるプライマーの製作が可能になる)。このような特性は、プライマーのアニーリング部位が制限的でなければならない場合(例えば、SNPゲノムタイピング、DNAマイクロアレイスクリーニング、および示差的に発現される遺伝子の検出)、特に有用である。
(b) 3'末端部分と5'末端部分の間に位置する調節部分の存在は、3'末端部分が鋳型とアニーリングされる条件下で、5'末端部分が鋳型にアニーリングされるのを妨害し、それによりアニーリングに関与しない5'末端部分が、3'末端部分にアニーリング特異性を提供する。
(c) プライマーアニーリングの特異性は、単一塩基ミスマッチが検出できるほど非常に高い。従って、一塩基多型(SNP)ゲノムタイピングに対し特に有用である。
(d) ACPは、プライマーデザインにおける“プライマー検索パラメーター”(例えば、プライマー長さ、アニーリング温度、GC量およびPCR産物の長さ)に対する高い許容性(tolerance)を付与する。
(e) ACPは、二段階核酸増幅を提供し、提供される産物における非特異性増幅を排除する。
(f) 核酸増幅の効率が増加し、微量のmRNAの検出を容易にする。
(g) 核酸増幅産物の再現性を増加させて、時間および費用を非常に節減する。
【０２６５】
PCRのような核酸増幅技術が生命工学分野に大きい影響を与えたように、ACPは、上述した通り無限の応用性を発揮し、現在の核酸増幅方法の原則を根本的に変えて、それらを一遍にアップグレードする。結論的に、核酸増幅技術が導入された以来、ACPおよび上述の応用は、新しい生命工学時代の幕を開ける転換点を提供する。
【０２６６】
下記の実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、当業界で通常の知識を有する者であれば分かるだろう。
【実施例】
【０２６７】
下記の実施例で、次の略語が使用される：M (モル濃度), mM (ミリモル濃度), μM (マイクロモル濃度), g (グラム), μg (マイクログラム), ng (ナノグラム), l (リットル), ml (ミリリットル), μl (マイクロリットル), ℃ (摂氏温度); Promega (Promega Co., Madison, USA); Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, USA); Roche (Roche Diagnostics, Mannheim,ドイツ); QIAGEN (QIAGEN GmbH, Hilden, ドイツ)。
【０２６８】
本発明で使用したプライマーは、表１に示した。
【０２６９】
実施例１：ACPでのユニバーサル塩基の影響の評価
ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するユニバーサル塩基残基の影響は、マウス受胎産物組織を利用しRT-PCRにより評価した。
【０２７０】
先に記載された方法(Chun et al., 1999; Hwang et al., 2000)と同様にして、妊娠中の4.5日目、11.5日目および18.5日目のマウス系統ICRの受胎産物全体から、Tri-試薬(Sigma)またはLiCl/ウレア方法(Hogan et al., 1994)を利用して、全RNAを単離した。ACPを用いたcDNA増幅を二つの個別の実験で実施し、ユニバーサル塩基、特にACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響を次のように調べた：A.  デオキシイノシン群を含まない従来のプライマーとACPを比較したときの、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響；B.  デオキシイノシンの数の変化と関連付けた、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響。
【０２７１】
これらの実験は、次の仮説に基づいて実施した：
(i) ユニバーサル塩基残基（塩基対におけるそれらのより弱い水素結合相互作用のため、ACPでは他の部分より低いTmを有する）の存在は、第１のアニーリング温度で鋳型の一位置にACPの3'末端部分がアニーリングする条件下で、鋳型核酸へのアニーリングに関与しない。
(ii) ACPの3'末端部分と5'末端部分との間の少なくとも一つのユニバーサル塩基残基の存在は、5'末端部分のアニーリングを妨害し、プライマーアニーリング部分を3'末端に制限している。
(iii) ACPの3'末端部分は、PCRの際、鋳型に対するアニーリング部分としてのみ機能する。
(iv) 10個のTヌクレオチドを含むdT10であるdT-ACPの3'末端部分は、鋳型核酸に結合するには低すぎるTmを有する。
(v) 結果として、dT10-ACPは、高いアニーリング温度でPCR産物を生成しない。
【０２７２】
A.  デオキシイノシン群を含まないプライマーとACPとを比較したときの、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響
(a)第一鎖cDNAの合成
dT10-JYC2 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGATTTTTTTTTT-3'(配列番号29)またはdT10-ACP1 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTT-3'(配列番号30)をcDNA合成プライマーとして用いた。
【０２７３】
全RNA 3μgおよび10μM dT10-JYC2または10μM dT10-ACP1 2μlを20μlの最終容量で混合した。溶液を65℃で10分間加熱した後、氷上で急冷して、微量遠心分離して下部に溶媒を集めた。氷上のアニーリングしたプライマー/鋳型に次の成分を順次添加した：RNasinリボヌクレアーゼインヒビター(Promega)0．5μl(40units/μl)、5×反応バッファー(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT; Promega)4μl、各2mMのデオキシヌクレオチド混合物(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)5μl、およびモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(200 units/μl; Promega)1μl。反応混合物20μlを37℃で90分間インキュベートした後、微量遠心分離して、氷上に2分間静置した。94℃で2分間インキュベートして反応を止めた。
【０２７４】
(b)ACPを用いたcDNA増幅
3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン群のPCRにおける影響を、dT10-ACP1を用いて調べた。デオキシイノシン群を含まないdT10-JYC2を、対照群として用いた。
【０２７５】
この実験では、ACP10 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号13)を5'プライマーとして用いた。
【０２７６】
第１鎖cDNA 50ng、10×PCRバッファー 5μl、10μM 5'プライマー(ACP10) 1μl、10μM 3'プライマー(dT10-JYC2またはdT10-ACP1) 1μl、25mM MgCl2 3μl、2mM dNTP 5μl、Taqポリメラーゼ(5 units/μl) 0.5μlを含む50μl容量でPCR増幅を実施した。PCR反応は、次の条件で実施した：94℃で5分、次いで94℃で1分、54℃で1分および72℃で1分を30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色をして分析した。
【０２７７】
その結果、図８から分かるように、デオキシイノシン群を含むdT10-ACP1は、産物をほとんど生成しないが(レーン4〜6)、その一方、デオキシイノシン群を含まないdT10-JYC2は、複数の増幅されたcDNA産物を生成した(レーン1〜3)。上述の本発明者の仮説と一致するように、本実験の結果は、3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン群が、高いアニーリング温度下での鋳型cDNAへのdT10-ACPの3'末端部分および5'末端部分のアニーリングに影響を及ぼして、結局上述の仮説に記載したように産物が生成されなくなることを明確に示した。
【０２７８】
B.デオキシイノシンの数の変化と関連した、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響
(a)第１鎖cDNAの合成
cDNA合成プライマーとしてdT10-JYC2を用い、マウス受胎産物の全RNAから第１鎖cDNAを上述の方法により合成した。
【０２７９】
(b)ACPを用いたcDNA増幅
デオキシイノシンの数の変化と関連した3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響を調べるために、それぞれ異なる数のデオキシイノシン残基を含む以下の4種のACPを用いて、特定のストリンジェンシー条件下で本実験を行った。
【０２８０】
ACP16  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIGCCATCGACC-3'(配列番号20)；
ACP17 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号21)；
ACP18 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号22)；
ACP19 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号23)；および
デオキシイノシン群を含まないCRP2I0 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATGCCATCGACC-3'(配列番号19)を対照群として用いた。
【０２８１】
5'末端にdT10-ACPの予め選択されたアービトラリ配列を含む、工程(A)で生成された第１鎖cDNAを鋳型として用い、dT10-ACPの5'末端部分に相当するプライマーJYC2  5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGA-3'(配列番号10)を3'プライマーとして用いた。
【０２８２】
PCR増幅は、第１鎖cDNA 50ng、10×PCRバッファー 5μl、10μM 5'プライマー(ACP16、17、18、19またはCRP2IO) 1μl、10μM  3'プライマー(JYC2) 1μl、25mM  MgCl2  3μl、2mM  dNTP  5μl、Taqポリメラーゼ(5 units/μl) 0.5μlを含む50μl容量で実施した。PCR反応は、次の条件で実施した：94℃で5分、次いで94℃で1分、57℃で1分および72℃で1分を30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により分析した。
【０２８３】
その結果、図９から分かるように、デオキシイノシン残基を全く含まないCRP2I0は、複数のcDNA増幅産物を生成したが、少なくとも二つのデオキシイノシン残基を含むACPでは、生成されるcDNA増幅産物が顕著に減少し、さらに、8個のデオキシイノシン残基を含むACPは、産物をほとんど生成しなかった。
【０２８４】
上述の本発明者の仮説と一致するように、連続的なデオキシイノシン残基の群は、塩基対におけるそのより弱い水素結合相互作用などのデオキシイノシンの特性のために、高ストリンジェンシー条件下で3'末端部分および5'末端部分のアニーリングを分離させてしまうため、ACPの3'末端部分の鋳型へのアニーリングを5'側部分から分離させることができることが、本実験の結果によって明確に示されている。
【０２８５】
実施例2：ACPを用いたターゲット核酸配列の増幅方法
マウス胎盤特異的ホメオボックス遺伝子Esx1 cDNAのターゲットヌクレオチド配列を増幅するために、本発明のACPを用いた。ACPを用いたEsx1 cDNAのターゲットヌクレオチド配列の増幅工程およびその結果は、次のようである。18.5日齢マウスの胎盤から得た全RNA(3μg)を出発物質として用いた。第１鎖cDNAを実施例１のcDNA合成と同一の条件下で調製したが、この際、オリゴdT15を第１鎖cDNA合成プライマーとして用いた。
【０２８６】
オリゴdT15 5'-TTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号54)
ACPを用いてEsx1のターゲットcDNA断片を増幅するために、生成された第１鎖cDNAを鋳型として用いた。これらの実験では、本発明のユニークな特徴の一つである二段階PCR増幅を実施した。
【０２８７】
本実施例で使用したEsx1の従来プライマーは次の通りである：
EsxN7    5'-GCCGGTTGCAGAAGCACC-3'(配列番号44)；
EsxC6    5'-GAACCATGTTTCTGAATGCC-3'(配列番号45)；
EsxN1    5'-GAATCTGAAACAACTTTCTA-3'(配列番号48)；
EsxC2    5'-GATGCATGGGACGAGGCACC-3'(配列番号49)；
EsxN3    5'-CGCCGCAACCCCTGCCCGCA-3'(配列番号51)；および
EsxC5    5'-GATGCATGGGACGAGGCA-3'(配列番号52)。
【０２８８】
当業界で公知の従来のPCR法において高いバックグラウンドおよび非特異的産物を生成させるプライマーセットとして知られている3種のプライマーセットのEsxN7とEsxC6、EsxN1とEsxC2、およびEsxN3とEsxC5を、本実施例で用いた。
【０２８９】
単一ターゲットのPCRシステムに従えば、類似した融解温度(Tm)を有するプライマーを選択することが好ましい。しかし、EsxN1(Tm 50.7℃)およびEsxC2(Tm 71.9℃)のプライマーセットでは相互に約20℃の融解温度差があるが、EsxN3(Tm 86.9℃)およびEsxC5(Tm 66.2℃)のプライマーセットは、二つとも高い融解温度を有する。また、ACPの効果を確認するために、比較的類似した融解温度を有するEsxN7(Tm 68.2℃)およびEsxC6(Tm 61.2℃)のプライマーセットを選択する。
【０２９０】
従来のプライマーセットから引き起こされる、バックグラウンドや非特異的産物のような主たる問題を、ACPシステムによって克服できるかどうかを確認するために、これら3種の従来のプライマーセットに本発明のACPを適用した。
【０２９１】
下記ACPは、3'末端部分に上記の従来のプライマーの配列を含んでおり、これを第１段階のPCR増幅においてEsx1遺伝子特異的プライマーとして使用した：
EsxN7-ACP  5'プライマー  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCGGTTGCAGAAGCACC-3'(配列番号46)；
EsxC6-ACP 3'プライマー  5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGAACCATGTTTCTGAATGCC-3'(配列番号47)；
EsxN1-ACP 5'プライマー  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGAATCTGAAACAACTTTCTA-3'(配列番号50)；
EsxC2-ACP 3'プライマー 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGAGGCACC-3'(配列番号55)；
EsxN3-ACP 5'プライマー 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGCCGCAACCCCTGCCCGCA-3'(配列番号53)；および
EsxC5-ACP 3'プライマー 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGATGCATGGGACGAGGCA-3'(配列番号56)。
【０２９２】
ACPの5'末端部分配列は、第２段階のPCR増幅のみのために予め選択されたアービトラリプライマー配列：JYC2およびJYC4 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3'(配列番号12)、として機能した。
【０２９３】
第１段階のPCR増幅の際に、EsxN7-ACPおよびEsxC6-ACPのプライマーセットを各々5'プライマーおよび3'プライマーとして用いて、Esx1 cDNAの520 bp断片を作製し、EsxN1-ACPおよびEsxC2-ACPのプライマーセットを各々5'プライマーおよび3'プライマーとして用いて、Esx1 cDNAの784 bp断片を作製し、さらにEsxN3-ACPおよびEsxC5-ACPのプライマーセットを各々5'プライマーおよび3'プライマーとして用いて、Esx1 cDNAの483 bp断片を作製した。
【０２９４】
第２段階のPCR増幅の際、JYC4およびJYC2を、予め選択されたアービトラリ5'プライマーおよび3'プライマーとして各々用いた(プロトコルA)。他の方法として、JYC4およびJYC2のような予め選択されたアービトラリプライマーを利用する代わりに、ACPの完全配列を高ストリンジェンシー条件下での第２段階のPCR増幅のための5'プライマーおよび3'プライマーとして用いることができる。この場合、第１段階のPCR反応のときまたはその後に、反応混合物に、予め選択されたアービトラリプライマーを添加する必要がない(プロトコルB)。
【０２９５】
プロトコルA：ワンストップ二段階PCR増幅
(A)第１段階のPCR増幅
第１段階のPCR増幅は、ホットスタートPCR法、すなわち、DNAポリメラーゼを加えないこと以外は完全な反応物を用意し、その反応チューブをサーマルサイクラー内でインキュベートして90℃を超える温度で最初の変性工程を完了させる方法により、実施した。次いで、前記チューブを70℃を超える温度に維持しながら、その反応物中にDNAポリメラーゼを適量ピペッティングで加える。
【０２９６】
アニーリング、伸長および変性反応からなるPCRのサイクルを2サイクル実施して、第１段階のPCR増幅を行った；第１鎖のcDNA 50ng、10×PCR反応バッファー(Promega) 5μl、25mM  MgCl2  5μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPを各々2mM) 5μl、5'ACP（1μM） 1.35μl、および3'ACP（1μM） 1.35μlを含む、最終容量49.5μlの反応混合物を94℃で予熱し、その反応混合物を入れたチューブを94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5 units/μl、Promega) 0.5μlを反応混合物に添加し；94℃で40秒、60℃で40秒および72℃で40秒を2サイクル行い、それに続いて94℃で増幅産物を変性させるPCR反応を行う。
【０２９７】
(B)第２段階のPCR増幅
Esx1遺伝子特異的ACPを用いて第１段階のPCR増幅により生成されたcDNA産物を、次いで、より高いアニーリング温度下で次の第２段階のPCR増幅により増幅した。第１段階のPCR増幅を完了させた後、10μMの予め選択されたアービトラリプライマーJYC4およびJYC2の各々1μlを、第１段階のPCR増幅から得た反応混合物に94℃のような変性温度下で添加した。第２段階のPCR反応は、次の通りに実施した：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを35サイクル、次いで72℃で5分間の最終伸長。
【０２９８】
増幅産物を2％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した。生成されたPCR産物はまた、変性ポリアクリルアミドゲルにて、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)などの非放射性検出方法により、検出できる。
【０２９９】
図１０Ａ〜Ｃから分かるように、EsxN7-ACPおよびEsxC6-ACP、EsxN1-ACPおよびEsxC2-ACPそしてEsxN3-ACPおよびEsxC5-ACPの各々のプライマーセットを用いて、Esx1についてワンストップ二段階PCR増幅を行ったところ、各々520 bp(図10A、レーン2)、784 bp(図10B、レーン4)および483 bp(図10C、レーン3)のEsx1 cDNA断の予測サイズに対応する単一バンドが生成された。続いて行うクローニングおよびクローンの配列解析によって、当該バンドがEsx1 cDNA断片であることを確認する。一方、ACPセットの各々の3'末端部分にのみ対応する配列を含む従来のプライマーセットは、非特異的産物や、DNAのスメアなどの高いバックグラウンドを引き起こした(図10A、レーン1；図10B、レーン3；図10C、レーン1と2)。ACPセットを用いて生成されるPCR産物は、その5'末端および3'末端に予め選択されたアービトラリ配列を含むことから、予め選択されたアービトラリ配列に対応する追加的な54 bp配列およびデオキシイノシン残基が観察される。
【０３００】
図１０Ａは、次のプライマーセットにより生成されたcDNA増幅産物を示す：EsxN7とEsxC6のセット(レーン1)、そしてEsxN7-ACPとEsxC6-ACPのセット(レーン2)。従来のプライマーセットであるEsxN7とEsxC6を用いたPCR反応は、次のように実施した：94℃で5分、次いで94℃で40秒、60℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
【０３０１】
図１０Ｂは、以下の単独プライマーまたはプライマー対を用いて生成されたcDNA増幅産物を示す。レーン１および２では、EsxN1およびEsxC2のプライマーを各々用いた。レーン３では、EsxN1−ACPと従来のプライマーEsxC2との組合せを使用した。レーン４では、EsxN1-ACPとEsxC2-ACPの二つのACPを用いた。従来のプライマーセットであるEsxN1およびEsxC2を60℃という高いアニーリング温度で用いた場合、ターゲット特異的産物は、生成されなかった。ACPであるEsxN1−ACPと従来のプライマーEsxC2とのプライマーセットを用いた場合には、従来のプライマーEsxC2の非特異的結合によりターゲット特異的産物と非特異的産物が増幅された(レーン３)。しかし、ACPセットを用いた場合、単一のターゲット特異的産物だけが増幅され(レーン４)、この結果は、本発明のACPが、単一ターゲットPCRシステムに必要とされる一般的なプライマーの融解温度と関連した“プライマーデザインパラメーター”に対する許容性を有するプライマーを提供することを示す。
【０３０２】
図１０Ｃは、以下のプライマーセットを用いて生成されたcDNA増幅産物を示す。EsxN3およびEsxC5のセットをレーン１および２で用い、EsxN3-ACPおよびEsxC5-ACPのセットをレーン３で用いた。従来のプライマーセットであるEsxN3およびEsxC5を用いたPCR反応は、次のように実施した：94℃で5分、次いで94℃で40秒、58℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長(レーン１)。また、従来のプライマーセットを用いて、ACPと同様の二段階PCR増幅をアニーリング温度を60℃から68℃に上昇させて行うことにより、ACPセットの場合と比較した(レーン２)。また、これらの結果は、高いTmを有するプライマーを含む従来のプライマーを用いて同じ二段階PCR増幅を行っても、非特異的産物およびバックグラウンドの問題は解決されなかったが、本発明のACPは、従来のプライマーによって引き起こされるそのような問題を解決する上で有用であることを示している。
【０３０３】
プロトコルB：ノンストップ二段階PCR増幅
別法として、JYC4とJYC2のような予め選択されたアービトラリプライマーを利用する代わりに、ACPの完全配列を、高ストリンジェンシー条件下の第２段階のPCR増幅でプライマーとして用いることができる。この場合、第１段階のPCR反応のときまたはその後に、反応混合物に予め選択されたアービトラリプライマーを添加する必要はない。
【０３０４】
ACPである5'ACP(10μM) 1μlおよび3'ACP(10μM) 1μlを第１段階のPCR増幅の際に添加すること、そして、予め選択されたアービトラリプライマーを添加する工程がないために、第１段階のPCR増幅の後に遅滞なく第２段階のPCR増幅が続くことを除いては、ノンストップ二段階PCR増幅方法は、プロトコルAと基本的に同じである。
【０３０５】
増幅産物を2％アガロースゲルで電気泳動することにより分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。生成されたPCR産物はまた、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)などの非放射性検出方法により、検出できる。
【０３０６】
図１０Ｄは、次の単独プライマーまたはプライマー対を用いて、ノンストップ二段階PCR増幅により生成されたcDNA増幅産物を示す。レーン１および２では、プライマーEsxN1およびEsxC2を各々用いた。レーン３では、EsxN1およびEsxC2のプライマー対を用いた。レーン４では、EsxN1-ACPとEsxC2-ACPの対を用いた。従来のプライマーセット、EsxN1およびEsxC2を用いた場合、ターゲット特異的産物は生成されなかった。ACPセットをノンストップ二段階PCR増幅おいて用いた場合、単一のターゲット特異的産物のみが増幅されたが(レーン４)、このような結果は、ワンストップ二段階PCR増幅の結果と一致するものである(図１０Ｂ)。
【０３０７】
本実施例を通じて、本発明のACPを用いれば、当業界で報告されているような、PCR法で使用される従来のプライマーから引き起こされる増幅産物のバックグラウンド問題および非特異性を解決できることが分かる。また、本発明のACPは、遺伝子特異的プライマーのデザインにかかわらず、特異的産物を生成することができるということも理解できるであろう。
【０３０８】
実施例３：ACPを用いた、マウス胚発生段階で示差的に発現されるmRNAの同定および特性解析
本発明のACPを利用し、胚発生段階で示差的に発現されるmRNAを検出した。具体的には、出発物質として異なる発生段階の受胎産物の全RNAを用いて、三つの異なる方法によって得た結果が、後述の通りである。本発明で使用したプライマーは、表１に記載されている。
【０３０９】
A1.  方法１
工程(1)：第１鎖cDNAの合成
cDNA合成プライマーとしてdT10-ACP1またはJYC5-T15-ACPを用いて、実施例１のcDNA合成で使用される条件と同一の条件下で第１鎖cDNAを製造した。製造されたcDNAをスピンカラム(PCR精製キット、QIAGEN)で精製し、プライマー、dNTPおよび前記試薬類を除去した。260nmの吸光度でUV分光光度計を用いてcDNA濃度を決定する前に、この精製工程を行うことが必要である。各々の試料から得られた同量のcDNAを、本発明のACPシステムを用いた増幅パターンとの比較に用いた。
【０３１０】
工程(2)：ACPを用いた第１段階のPCR増幅
第１のPCR増幅のために、次のACPをアービトラリACP(AR-ACP)として用いた：
ACP3   5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACS-3'(配列番号3)；
ACP5   5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCS-3'(配列番号5)；
ACP8   5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCS-3'(配列番号8)；
ACP10  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCCATCGACC-3'(配列番号13)；
ACP13  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAGGCGATGCG-3'(配列番号16)；および
ACP14  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCGATGCC-3'(配列番号17)。
【０３１１】
dT10-ACP1およびAR-ACPの5'末端部分の配列は、第２のPCR増幅のためだけの予め選択されたアービトラリプライマー配列として機能する。予め選択されたアービトラリプライマーは、JYC2およびJYC4である。
【０３１２】
5'および3'プライマーとして、AR-ACP (ACP3, ACP5, ACP8, ACP10, ACP13, またはACP14)のいずれか一つおよびdT10-ACP1を用いて、第１段階のPCR増幅過程により、工程(1)から生成された第１鎖cDNAを増幅した。第１鎖cDNA  50ng、10×PCR反応バッファー(Promega) 5μl、25mM  MgCl2  3μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各々0.2mM) 5μl、5'プライマー（1μM） 5μl、3'プライマー（1μM） 5μl、およびTaqポリメラーゼ(5 units/μl、Promega) 0.5μlを含む50μl容量で第１段階のPCR増幅を実施した。PCR反応は、次の条件で実施した：94℃で5分、次いで94℃で1分、50℃で1分および72℃で1分を20サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３１３】
第１段階のPCR増幅のサイクルは、試料の種類によって異なっていてよい。例えば、マウス受胎産物試料の場合、第１のPCR増幅を20サイクル用いた。
【０３１４】
工程(3)：ACPの5'末端部分の配列に相当する予め選択されたアービトラリプライマーを用いた第２段階のPCR増幅
AR-ACPおよびdT10-ACP1の5'末端部分の配列にそれぞれ相当する2つの予め選択されたアービトラリプライマーJYC4およびJYC2を用いて、続いての第２段階のPCR増幅により、工程(2)で生成されたcDNA増幅産物を再増幅した。第１のcDNA増幅産物(50μl)のうちの5μl、10×PCR反応バッファー(Promega) 5μl、25mM  MgCl2  3μl、2mM  dNTP  5μl、5'プライマー(10μM) 1μl、3'プライマー(10μM) 1μlおよびTaqポリメラーゼ(5 units/μl) 0.5μlを含む50μl容量で第２段階のPCR増幅を実施した。PCR反応は、次の条件で実施した：94℃で5分、次いで94℃で1分、65℃で1分および72℃で1分を30サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３１５】
A2.  方法２
別の本発明の方法は、次の工程を含む：
(a) mRNA転写物の第１の集団である第１の核酸試料およびmRNA転写物の第２の集団である第２の核酸試料を提供する工程；
(b) 前記第１の核酸試料および第２の核酸試料の各々を第１のACPに接触させる段階であって、前記第１のACPは、それとハイブリダイズするmRNA転写物の第１の集団および第２の集団の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、
(c) 前記第１のACPがハイブリダイズするmRNAを逆転写して、第１のACPがハイブリダイズする前記第１の核酸試料中のmRNAに相補的なDNA鎖の第１の集団、および第１のACPがハイブリダイズする前記第２の核酸試料中のmRNAに相補的なDNA鎖の第２の集団を、生成させる工程；
(d) 逆転写工程(c)の結果として生成された相補DNA鎖を精製し定量する工程；
(e) DNA鎖の第１および第２の集団に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有する第２のACPを用いて、変性、アニーリング、プライマー伸長を含む少なくとも一回のPCRサイクルにより、低ストリンジェンシー条件下で、DNA鎖の第１および第２の集団の各々に相補的な第２のDNA鎖を合成する工程；
(f) 第１および第２のアニーリング調節プライマーの各々の5'末端部分に相当する配列を各々が含む2種の予め選択されたアービトラリプライマーを用いて、高ストリンジェンシー条件下で、変性、アニーリング、およびプライマー伸長を含むPCRサイクルを少なくとも１回行うことにより、工程(e)で得られた第２のDNA鎖の各々を増幅し、増幅産物の第１の集団および第２の集団を生成させる工程；および、
(g) 増幅産物の第１および第２の集団に含まれる個々の増幅産物の量を比較する工程。
【０３１６】
JYC5-T15-ACP 5'-CTGTGAATGCTGC GACTACGATIIIIIITTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号61)を用いて第１鎖cDNAを合成した。
【０３１７】
JYC5-T15-ACPの5'末端部分配列は、第2の段階のPCR増幅でのみ、3'側の予め選択されたアービトラリプライマー配列として機能する：
JYC5    5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3'(配列番号60)。
【０３１８】
工程(1)：第１鎖cDNAの合成
１．滅菌された0.2ml微量遠心分離チューブ中に、全RNA  3μgおよび10μM JYC5-T15-ACP  2μlを混合する。
２．最終容量が9.5μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．チューブを80℃で3分間インキュベートするか、または同一目的でサーマルサイクラーを利用する。
４．チューブを氷上で2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機にかけて簡単に内容物を沈殿させる。
５．同一の反応チューブに次の試薬を添加する：5×第１鎖バッファー(Promega) 4μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP各々2mM) 5μl、RNasinインヒビター(40 units/μl, Promega) 0.5μlおよびM-MLV逆転写酵素(200 U/μl) 1μl。
６．内容物を混合して、チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
７．チューブを42℃で90分間インキュベートする。
８．チューブを94℃で2分間インキュベートして第１鎖の合成を終結させる。
９．チューブを氷上に2分間静置する。
１０．プライマー、dNTPおよび上述の試薬類を除去するために、スピンカラム(PCR精製キット、QIAGEN)によって、生成されたcDNAを精製する。
１１．次いで、260nmの吸光度でUV分光光度計を利用し、cDNAの濃度を測定する。
１２．工程２へ進む。
【０３１９】
工程(2)：ACPを用いた第２鎖cDNAの合成
本発明のACPを用いた増幅パターンを比較するために、各々の試料から得たcDNAを同量で使用した。第２鎖cDNAを、アービトラリACP10を用いて、ホットスタートPCR法により合成した。この方法では、DNAポリメラーゼを含まずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃を超える温度でインキュベートして最初の変性工程を完了させる。次いで、前記チューブを90℃を超える温度に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、その反応物中にピペットで加える。
【０３２０】
１．滅菌された0.2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する：工程１で調製された第１鎖cDNA(50ng/μl) 1μl、10×PCRバッファー(Roche) 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM アービトラリACP(5'プライマー) 1μl、および滅菌dH2O 37.5μlを含む総容量49.5μlの混合物。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
４．チューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl；Roche) 0.5μlを反応物に添加する。
５．次の条件下でPCR反応を行う：94℃で5分、50℃で3分および72℃で1分を1サイクル、その後、94℃での第１の増幅産物の変性。
【０３２１】
工程(3)：ACPの5'末端部分の配列に相当する予め選択されたアービトラリプライマーを用いた、第２鎖cDNAのPCR増幅
１．第１段階のPCR増幅が完了した後、チューブを94℃を上回る温度に維持しながら、5'および3'ACPの5'末端部分の配列に各々が相当する10μM JYC4 2μlおよび10μM JYC5 2μlを、工程(2)で用いた反応混合物中に添加する。
２．次の条件で第２段階のPCR反応を行う：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒を１サイクルとして40サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３２２】
A3.  方法３
本発明の変法として、方法２の工程(f)において、第１および第２のACPの5'末端部分の予め選択されたアービトラリ配列の代わりに、方法２の工程(b)および(e)で使用した第１および第２のACPの全体配列をそれぞれ3'および5'プライマーとして利用して、高ストリンジェンシー条件下で、方法２の工程(e)から得られた第２のDNA鎖の各々を増幅した。ここで、第２のACPを利用し最初に合成された第２のDNA鎖の3'末端および5'末端は、第１のACPの配列と第２のACPの相補配列を各々含み、第１および第２のACPに対して完璧に塩基対形成する部位として機能する。このような場合、第１段階のPCR反応の際またはその後に、予め選択されたアービトラリプライマーを反応混合物に添加する必要がない。
【０３２３】
工程(1)：第１鎖cDNAの合成
cDNA合成プライマーとしてJYC5-T15-ACPを利用し、方法２のcDNA合成で用いた条件と同一の条件下で第１鎖cDNAを調製した。
【０３２４】
工程(2)：ノンストップ二段階PCRを用いた第２鎖cDNAの合成および増幅
本発明のACPを用いた増幅パターンを比較するために、各々の試料から得たcDNAを同量ずつ使用した。第２鎖cDNAを、アービトラリACP10を用いて、ホットスタートPCR法により合成した。この方法では、DNAポリメラーゼを含めずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃を超える温度でインキュベートして最初の変性工程を完了させる。次いで、前記チューブを90℃を超える温度に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、反応物中にピペットで添加することができる。
【０３２５】
１．滅菌された0.2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する：工程１で調製された第１鎖cDNA(50ng/μl) 1μl、10×PCRバッファー(Roche) 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM アービトラリACP10 (5'プライマー) 1μl、10μM JYC5-T15-ACP(3'プライマー) 1μl、および滅菌dH2O  36.5μlを含む総量49.5μl。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
４．チューブを94℃の温度で維持しながらTaqポリメラーゼ(5 units/μl；Roche)  0.5μlを反応物に添加する。
５．次の条件でPCRを行う：94℃で1分、50℃で3分および72℃で1分を1サイクル；次いで、94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒のサイクルを40サイクル、続いて72℃で5分間の最終伸長。
【０３２６】
B.電気泳動分析によるPCR増幅産物の分離および示差的に示されたバンドの回収
増幅産物を2％アガロースゲルで電気泳動することにより分析して、エチジウムブロマイド染色により検出した。胚発生段階(E4.5、E11.5およびE18.5)で示差的に発現された数個の主なバンドを選択し、それを切り出し、GENECLEAN IIキット(BIO 101)を利用してゲルから抽出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの利用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３２７】
C.回収されたバンドの再増幅
方法１、２および３で使用した同一の予め選択されたアービトラリプライマーおよびPCR条件を用いて、工程Bで得られたバンドを再増幅した。
【０３２８】
D.再増幅断片のクローニングおよびシーケンシング
各々の増幅産物をpGEM-T Easyベクター(Promega)中にクローニングして、BigDye Terminatorサイクルシーケンシングキット(Perkin Elmer)を利用してABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer Biosystem)を使用してシーケンシングした。BLAST検索プログラム(Basic Local Alignment Search Tool)を用いてコンピューター支援配列解析を実施した。
【０３２９】
E.ノーザン分析
受胎産物組織から得た全RNA 20μgをホルムアルデヒドを含む変性1%アガロースゲルで分離して、ナイロン膜(Hybond-N, Amersham、アメリカ)に転写させた後、QuikHyb溶液(Stratagene、アメリカ)で32P-標識したサブクローン化PCR産物とともに58℃で一晩中ハイブリダイズさせた(Chun et al., 1999; Hwang et al., 2000)。ブロット(blots)を2×SSC、0．1%  SDSで20分間65℃で2回洗浄した後、1×SSC、0．1%  SDSで20分間2回洗浄して、0．1×SSC、0．1%  SDSで20分間2回洗浄した。膜を、Fuji増感紙とともにKodak X-Omat XK-1フィルムに−80℃で露出させた。
【０３３０】
図１１Ａ〜Ｄは、相異なる段階から得たマウス受胎産物試料を次のプライマーセットを用いて方法１により増幅したcDNA増幅産物を示す。図１１Ａのレーン１〜３は、ACP3およびdT10-ACP1；図１１Ｂのレーン１〜６は、ACP5および dT10-ACP1；図１１Ｂのレーン７〜１２は、ACP8およびdT10-ACP1。また、図１１Ｂは、他のACPセットを用いて生成されたcDNA増幅産物の追加的な結果である。図１１Ｃ〜Ｄは、ACP10とdT10-ACP1(図１１Ｃ)、およびACP14とdT10-ACP1(図１１Ｄ)の２種のプライマーセットを用いて生成された増幅産物を示す。特定の発生段階で示差的に発現されるたくさんのバンドを得て、これをpGEM-T Easyベクター(Promega)中にクローニングした後、シーケンシングした。配列解析により、二つの新規遺伝子を除いた全てのクローンが公知の遺伝子であることが分かった(表２)。発現パターンは、マウス受胎産物発生段階ブロット(Seegene, Inc., ソウル、大韓民国)を用いたノーザンブロット分析により確認した。
【０３３１】
図１２Ａは、相異なる段階から得たマウス受胎産物試料(E4.5:レーン1；E11.5:レーン2；E18.5:レーン3)をACP10とJYC5-T15-ACPを用いて方法２により増幅したcDNA増幅産物を示す。特定発生段階で示差的に発現されるたくさんのバンドを得て、これをpGEM-T Easyベクター(Promega)中にクローニングした後、シーケンシングした。配列解析により、一つのDEG 2を除いた全てのクローンが公知の遺伝子であることが分かった(表２)。発現パターンは、マウス受胎産物段階ブロット((Seegene, Inc., ソウル、大韓民国)を用いたノーザンブロット分析により確認した。
【０３３２】
図１２Ｂは、相異なる段階から得たマウス受胎産物試料(E4.5:レーン3；E11.5:レーン4；E18.5:レーン5)をACP10とJYC5-T15-ACPを利用し、上述の方法３のノンストップ二段階PCR法により増幅した、cDNA増幅産物を示す。ACP10とJYC5-T15-ACP(レーン3〜5)のセットを用いた場合、生成されたバンドは、ワンストップ二段階PCR法による方法２から得たものと同一であった。しかし、単一プライマーのACP10(レーン１)またはJYC5-T15-ACP(レーン２)を用いた場合、産物は生成されず、このような結果は、ACP10とJYC5-T15-ACPがセットとして利用される場合のみ、増幅産物が生成できるということを表すものである。
【０３３３】
図１３は、DEG1(A；図10A、図11および図12の矢印1)、DEG2(C)、DEG3(B；図10A、図11および図12の矢印2)、DEG5 (E)、DEG7 (F)、そしてDEG8 (D;図10A、図11および図12の矢印4)をプローブ(probe)として利用し、6種の相異なるクローンをノーザンブロットハイブリダイズした結果である。また、DEG1プローブを本発明により糾明されたトロポミオシン2(Tropomyosin2)の代替的なアイソフォーム(図11および図12の矢印１')とハイブリダイズさせた。アガロースゲル分析の結果と同様に、ノーザンブロット分析から、クローンの発現パターンは、アガロースゲルでの元のバンドと同一であることが明らかとなり、この結果は、全てのクローンが真のポジティブ産物であることを表す。従って、本発明のACPは、偽陽性データ無しに、専らポジティブ産物のみを生成することが分かり、これは、本発明のACPが偽陽性データの問題点を排除することを意味する。
【０３３４】
図１４は、マウス胚発生過程での、DEG5の発現に対するノーザンブロットハイブリダイズ結果を示す。配列分析を通じて新規遺伝子であることが明らかとなったDEG5は、興味深い発現パターンを表す：初期妊娠段階(E4.5)で強い発現が現れた後、中期段階で発現がだんだん減少して、後期発生段階(E17.5およびE18.5)では、再び徐々に増加した。
【０３３５】
本実験結果により、ACPを用いて示差的発現遺伝子を単離する本発明の方法は、専ら真のPCR産物のみを生成して、偽陽性産物を完全に除去するということが分かる。従来のディファレンシャルディスプレイ技術の主な問題点であった偽陽性データが除去できるということは、ディファレンシャルディスプレイにより同定されたcDNA断片の検証に必要とされる労力を避けることができるということを意味する。
【０３３６】
実施例5：ACPを用いたcDNAの3'末端の迅速増幅(3'−RACE)
cDNA合成で利用される従来のオリゴdTプライマーから引き起こされるバックグラウンド問題を、本発明のACPが排除することができることを証明するために、本実施例は、ACPベースの3'-RACEと従来の3'-RACEとを比較した。
【０３３７】
従来の3'-RACEでは、mRNA分子のポリ(A)テイルがPCR増幅のためのプライミング部位として利用され、オリゴdTプライマーは、従来の3'-RACEのための3'プライマーとして利用されている。一方、本発明のACPは、cDNA合成のためのプライミング部位としてのみmRNAのポリ(A)テイルを用いて、その後のPCR増幅では利用しない。
【０３３８】
cDNA合成プライマーとしてオリゴVdT15-ACP 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTTTTTTTV-3'(配列番号57)(Vは、A、CまたはGである)を利用し、実施例１のcDNA合成と同一の条件下でマウス第１鎖cDNAを製造した後、cDNA合成プライマーの除去のための精製を行うことなく、前記第１鎖cDNAをその後のPCR増幅の鋳型として直接用いた。
【０３３９】
従来の3'-RACEでは、第１鎖cDNAを、次のcDNA合成プライマーを用いて合成した：
CDS III/3'5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30-VN-3'(配列番号35)(Vは、A、CまたはGであり；Nは、A、C、TまたはGである)。
【０３４０】
前記cDNA合成プライマーCDS III/3'は、その後のPCR増幅で3'プライマーとして利用した。第１のcDNA増幅産物50ng、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、遺伝子特異的5'プライマー(10μM) 1μl、予め選択されたアービトラリ3'プライマーJYC2(10μM)またはCDS III/3'(10μM) 1μl、25mM  MgCl2  3μl、2mM  dNTP 5μlおよびTaqポリメラーゼ(5units/μl；Promega) 0.5μlを含む50μl容量で、PCR増幅を実施した。PCR反応は、次の条件下で実施した：94℃で5分、次いで94℃で1分、65℃で1分および72℃で1分の30サイクル、その後72℃で5分間最終伸長。増幅産物を2％アガロースゲルで電気泳動することにより分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルでオートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３４１】
図１５は、β−アクチン3'−RACEの結果である。従来の3'−RACE(レーン1)をACPベースの3'−RACE(レーン2)と比較した。従来の3'−RACEは、非特異的産物を生成するだけではなく、DNAスメアの問題を生じたが、ACPベースの3'−RACEは、専ら348-bpの大きさの単一バンドのみを生成した。このような実験結果は、ACPベースの3'−RACEがDNAスメアのようなバックグラウンド問題および非特異的産物を除去できるということを表す。
【０３４２】
実施例6：ACPを用いた5'末端の迅速増幅(5'−RACE)および完全長cDNAの増幅方法
本発明のACPは、cDNA断片の5'末端を増幅するのに利用できる。第１鎖cDNAは、次のオリゴVdT15-ACPまたはランダムdN6-ACPを用いて製造した。
オリゴVdT15-ACP  5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIITTTTTTTTTTTTTTTV-3'(配列番号57)、Vは、A、CまたはGである；
ランダムdN6-ACP  5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIINNNNNN-3'(配列番号58)、Nは、A、C、GまたはTである。
【０３４３】
mRNA−cDNA中間体の形態で存在する第１のcDNA配列の完全な合成の後、マンガンの存在下で、逆転写酵素の末端転移酵素反応により第１のcDNA配列の3'末端にシトシン残基をテイリングした。第１のcDNA 3'末端伸長ACP(rG3−ACP、rG2−ACPまたはdG3-ACP)を用いて第１のcDNA鎖の3'末端を伸長して、次いで、cDNA合成プライマーおよび第１のcDNA 3'末端伸長ACPを除去するための精製を行うことなく、その後のPCR増幅で第１のcDNA鎖を直接的に鋳型として用いた。
【０３４４】
第１のcDNA 3'末端伸長ACPの配列は、次のようである：
rG3-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GGG)-3'(配列番号36)；
rG2-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(GG)-dG-3'(配列番号37)；
rG1-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGr(G)-d(GG) -3'(配列番号59)；または
dG3-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGd(GGG) -3'(配列番号38)(rおよびdは、各々リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを示す)。
【０３４５】
A.第１の完全長cDNA鎖の製造
プロトコルA：ACPを用いた第１のcDNA鎖の製造
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:全RNA 3μgおよび10μM オリゴVdT15-ACPまたはランダムdN6-ACP 2μl。
２．最終容量が10μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．チューブを水浴で60℃、15分間インキュベートするか、または同一目的でサーマルサイクラーを利用する。
４．チューブを氷上で少なくとも2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンして内容物を沈殿させる。
５．同一の反応チューブに次の試薬を添加する：5×第１鎖バッファー(Invitrogen) 4μl、0．1M  DTT  1μl、BSA(1mg/ml) 2μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP  各々10mM)  2μl、100mM  MnCl2  0．4μlおよびRnasinインヒビター(40units/μl、Promega)。
６．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
７．チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、2分間インキュベートする。
８．SuperScript II逆転写酵素(200units/μl；Invitrogen) 1μlを添加する。
９．チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、1時間インキュベートする。
１０．10μMの第１のcDNA 3'末端伸長ACP(rG3-ACP、rG2-ACPまたはdG3-ACP) 1μlを添加する。
１１．SuperScript II逆転写酵素(200units/μl；Invitrogen) 0.3μlを添加する。
１２．チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで42℃、30分間インキュベートする。
１３．チューブをインキュベーターまたはサーマルサイクラーで70℃インキュベートして第１鎖の合成を終結させる。
１４．チューブを氷上で静置させるか、−20℃で保管する。
【０３４６】
プロトコルB：CapFinder方法による第１の完全長cDNA鎖の製造
CapFinder方法(Clontech)では、次のプライマーを用いた：
SMART IVTM オリゴヌクレオチド5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACG GCCr(GGG)-3'(配列番号33)；および
5'PCRプライマー5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'(配列番号34)、およびCDS III/3'PCRプライマー。
【０３４７】
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:全RNA 3μg、10μM CDS III/3'PCRプライマー(Clontech) 1μlおよびSMART IV オリゴヌクレオチド(Clontech) 1μl。
２．最終容量が5μlになるように滅菌H2Oを添加する。内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．チューブを水浴で72℃、2分間インキュベートする。
４．チューブを氷上で2分間冷却する。チューブを微量遠心分離機で簡単にスピンして内容物を沈殿させる。
５．同一の反応チューブに次の試薬を添加する：5×第１鎖バッファー(Clontech) 2μl、20mM DTT 1μl、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP  各々10mM)  1μlおよびPowerScript逆転写酵素(Clontech) 1μlを含む10μlの反応物。
６．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
７．チューブを42℃で1時間インキュベートする。
８．チューブを氷上で静置させるか、−20℃で保管する。
【０３４８】
B.PCR増幅
プロトコルC：ACPシステムまたは従来の5'−RACE方法を用いたターゲット5'末端cDNA断片の増幅
本実施例は、従来のCapFinder 5'−RACE技術およびACPベースの5'−RACE技術を比較する。従来のCapFinder 5'−RACE技術では、その過程におけるプライマーの残余量のため、高いバックグラウンドを除去することができない。cDNA合成に利用されるCapFinderプライマー、SMART  IV  オリゴヌクレオチド(Clontech)とcDNA合成プライマー、CDS III/3'PCRプライマー(Clontech)のようなプライマーから引き起こされるバックグラウンド問題点を本発明のACPが除去できるかどうかを確認するために、マウスJnuBおよびβ−アクチンcDNAのCapFinder 5'-RACEおよびACPベースの5'−RACEを同一条件で実施した。マウスJunB mRNAは、18.5日齢のマウス胎盤のRNA中では比較的微量の転写物であり、マウスβ−アクチンは、比較的豊富な転写物である。
【０３４９】
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:プロトコルAまたはBから製造された第１のcDNA 1μl、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、2mM  dNTP  5μl、10μM 遺伝子特異的5'−RACEプライマー 1μl、10μM  JYC2または5'PCRプライマー(Clontech) 1μl、Taqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0.5μlおよび滅菌dH2O  31．5μlを含む全容量50μl。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．次の条件でPCR反応を行う：94℃で5分、次いで94℃で40秒、58℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
４．増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、続いてエチジウムブロマイド染色して分析する。
【０３５０】
また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３５１】
図１６から分かるように、5'PCRプライマー(Clontech)および遺伝子特異的プライマーを用いてマウスJunBおよびβ−アクチン5'−RACEを行うCapFinder方法は、たくさんの研究者が言及したように(Chenchik et al., 1998; Matz et al., 1999; Schramm et al., 2000)、DNAスメアのような高いバックグラウンドを生成したが(レーン1および3)、本発明のACPベースの5'−RACEは、マウスJunB(レーン2)またはマウスβ−アクチン5'末端cDNA断片の155 bpまたは319 bpに対応する単一バンドのみを生成した。本実施例により、本発明のACPが、cDNA合成に利用されるプライマーの除去のための精製を行うことなく、cDNA合成の間にプライマー混入から引き起こされるバックグラウンド問題を根本的に除去できるということが分かる。
【０３５２】
図１７は、CapFinder方法により形成される非特異的産物(レーン1)が、本発明のACPによっては形成されないことを示している。CapFinder方法(レーン1)またはACP方法(レーン2、3および4)により第１鎖cDNAを製造して、マウスプロラクチン様タンパク質PLP-Cαの5'−RACEのためのその後のPCR増幅で、第１鎖cDNAを直接的に鋳型として用いた。PLP-Cα-特異5'−RACEプライマーは、次のようである：PLP-Cα5'-GAGAGGATAGTTTCAGGGAC-3'(配列番号40)。3'末端に三つのリボグアニン(rG3-ACP；レーン3)、三つのデオキシリボグアニン(dG3-ACP；レーン4)、または二つのリボグアニンと一つのデオキシリボグアニンとの組合せを含む第１鎖cDNA 3'末端伸長ACPは、5'末端cDNAを生成して、それによりマウスPLP-Cα5'末端cDNA断片の506 bpに該当する単一バンドが、PLP-Cαの5'−RACEのためのACPベースのPCRによって生成された。
【０３５３】
プロトコルD：ACPを用いた5'富化cDNA断片の増幅
プロトコルAのランダムdN6-ACPを用いて第１鎖cDNAを製造した。PCR増幅は、ホットスタートPCR法により実施した。この方法では、DNAポリメラーゼを含めずに完全な反応物を用意して、反応チューブをサーマルサイクラーで90℃以上でインキュベートして最初の変性工程を行う。次いで、前記チューブを70℃以上に維持しながら、DNAポリメラーゼを適量、反応物にピペットで添加すればよい。
【０３５４】
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:プロトコルAのランダムdN6-ACPを用いて製造された第１のcDNA鎖 1μl、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM JYC2(3'プライマー) 1μl、10μM JYC4(5'プライマー) 1μlおよび滅菌dH2O 31．5μlを含む全容量49．5μl。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
４．チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0．5μlを反応物に添加する。
５．次の条件でPCR反応を実施した：94℃で5分、次いで94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
６．増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動し、次いでエチジウムブロマイド染色して分析する。
【０３５５】
また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３５６】
プロトコルE：ACPを用いた完全長富化cDNAの増幅
プロトコルAのオリゴVdT15-ACPを用いて第１鎖cDNAを製造した。PCR増幅は、プロトコルDのように、ホットスタートPCR法により実施した。
【０３５７】
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:プロトコルAのオリゴVdT15-ACPを用いて製造された第１のcDNA鎖 1μl、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM JYC2(3'プライマー) 1μl、10μM JYC4(5'プライマー) 1μlおよび滅菌dH2O 31．5μlを含む全容量49．5μl。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
４．チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl；Promega) 0．5μlを反応物に添加する。
５．次の条件でPCR反応を実施した：94℃で5分、次いで94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の30サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
６．増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド染色して分析する。
【０３５８】
また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３５９】
ACPを用いた完全長cDNAの増幅方法の効率を確認するために、ACP方法またはCapFinder方法により増幅された完全長cDNAをHybond-N膜(Amersham/United States Biochemical)にブロットした。マウスグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)cDNAをランダム標識キット(Roche Diagnostics Co, Indianapolis、アメリカ)を用いて、[α-32P]dCTPで標識した後、プローブを用いた。
【０３６０】
図１８から分かるように、GAPDH cDNAプローブは、完全長GAPDH cDNAの1.3-kbに該当する単一バンドを検出した。予想した通り、前記ACP方法により生成されたPCR産物のシグナル(レーン2)は、CapFinder方法によるもの(レーン1)より数倍強く表れた。本実施例を通じて、本発明のACP方法がCapFinder方法より完全長cDNAを効率的に増幅するということが分かった。
【０３６１】
実施例７：ACPベースのアービトラリ・プライミングPCRを用いたゲノムフィンガープリンティング
マウスの多型を検出するのに本発明のACPを用いた。マウス系統C57BL/6J、CBA、BALB/cJ、NOR、SPRETUS、PANCEVO、および韓国野生マウスのゲノムDNAを出発物質として用いた。QIAamp組織キット(QIAGEN、Hilden、ドイツ)ゲノムDNAを用いて、マウスの肝臓からゲノムDNAを調製した。使用したアービトラリACPは、次のようである：
ACP101  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCGGAGGATC-3'(配列番号64)；
ACP109  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTGCAGGACG-3'(配列番号65)；および
ACP116  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICGGAGCATCC-3'(配列番号66)。
【０３６２】
アービトラリACPのセットである、ACP101とACP109(図１９Ａ)、またはACP101とACP116(図１９Ｂ)を、マウスゲノムフィンガープリンティングのためのプライマーとして用いた。PCR増幅は、前記実施例２に記載の方法により、ホットスタートPCR法により実施した。ACPを用いたゲノムフィンガープリンティングは、次の条件下でPCR二段階増幅により実施した：アニーリング、伸長および変性を含む第１段階PCRの2サイクルを低ストリンジェンシー条件下で実施し増幅反応を行った。ゲノムDNA 50ng、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各々2mM) 5μlおよびACP対(各々10μM) 各々7μlを含む最終容量49.5μlの反応混合物を94℃で予熱した後、反応混合物を含むチューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0．5μlを添加して、PCR反応を次のように実施した：94℃で40秒、52℃で3分および72℃で1分の2サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。第１段階のPCRが完了した後、ACPの5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリ・プライマーJYC4(10μM) 4μlを反応混合物に添加して、第２段階のPCRを次のように実施した：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒の40サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３６３】
増幅産物を2.0%アガロースゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド染色して分析し、写真撮影した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルでオートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの利用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３６４】
図１９は、多様なマウス系統のゲノムDNAの断片を、アービトラリACP対を用いて増幅した結果である。ゲノムフィンガープリンティングの再現性を確認するために、相異なる2種のACPセットを用いて各々のマウス系統の二つのフィンガープリンティングを得た。ACPベースのPCR増幅により、各々のプライマーセットから数個のDNA断片が得られ、その結果は再現性があった。マウス系統での多型は明白で、このような結果は、ACPベースのアービトラリ・プライミングPCRにより生成されたゲノムフィンガープリンティングでの多型を通じてマウス系統が明白に区別されることを表す。従って、本発明のACPは、多型を検出して遺伝子地図を構築するのに有用である。
【０３６５】
実施例８：ACPベースのPCRを用いたマルチプレックスPCR
ACPをマルチプレックスPCRに利用できるかどうかを確認するために、従来のプライマーまたはACPを用いて、ヒト白血球接着分子I(ELAM1)とヒトp53(TP53)遺伝子との一塩基多型を含む部位を増幅した。ACPを用いたマルチプレックスPCR増幅に対する方法および結果を下記に示した。DNA鋳型は、ヒト胎盤から得た。
【０３６６】
ELAM1のエキソン3(155bp)の増幅で使用した従来のプライマーは、次のものである：
ELAM1N1   5'-TTGCACACTGTTGATTCTAA-3'(配列番号67)；および
ELAM1C1   5'-TTATTGATGGTCTCTACACA-3'(配列番号68)。
【０３６７】
ELAM1のエキソン10(287bp)の増幅で使用した従来のプライマーは、次のものである：
ELAM1N2    5'-CCACTGAGTCCAACATTC-3'(配列番号69)；および
ELAM1C2    5'-CTGAAACACTTCCCACAC-3'(配列番号70)。
【０３６８】
TP53のエキソン4(349bp)の増幅で使用した従来のプライマーは、次のものである：
P53N1      5'-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号71)；および
P53C1      5'-ATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号72)。
【０３６９】
TP53のエキソン7−8(750bp)の増幅で使用した従来のプライマーは、次のものである：
P53N2      5'-TGCTTGCCACAGGTCTC-3'(配列番号73)；および
P53C2      5'-GCAGTGCTAGGAAAGAGG-3'(配列番号74)。
【０３７０】
本実施例で利用された上述の従来のプライマーは、公知のマルチプレックスPCR法で非特異的産物を生成することが知られたものである。
【０３７１】
マルチプレックスPCRで、従来のプライマーの利用によってもたらされる非特異的産物の生成のような問題点を、ACPが克服できるかどうかを確認するために、本発明のACPを前記4種の従来のプライマーセットに適用した。
【０３７２】
ACPの3'末端部分は、次のように従来のプライマーの配列を含み、ACPの大きさは、従来のプライマーより26bpまたは27bp程度大きい。
【０３７３】
ELAM1N1-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITTGCACACTGTTGATTCTAA-3'(配列番号75)；
ELAM1C1-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIITTATTGATGGTCTCTACACA-3'(配列番号76)；
ELAM1N2-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCACTGAGTCCAACATTC-3'(配列番号77)；
ELAM1C2-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICTGAAACACTTCCCACAC-3'(配列番号78)；
P53N1-ACP 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号79)；
P53C1-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号80)；
P53N2-ACP 5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITGCTTGCCACAGGTCTC-3'(配列番号81)；および
P53C2-ACP 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIGCAGTGCTAGGAAAGAGG-3'(配列番号82)。
【０３７４】
ACPの5'末端部分配列は、予め選択されたアービトラリプライマー配列を含み、第２段階のPCR増幅でのみ作用する：
JYC3  5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3'(配列番号11)および 
JYC4  5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3'(配列番号12)。
【０３７５】
マルチプレックスPCR増幅は、ワンストップまたはノンストップ二段階PCR増幅により実施するが、これは、本発明の独特の特徴である。PCR増幅は、実施例２と同様にホットスタートPCR法により実施した。
【０３７６】
プロトコルA:ワンストップ二段階PCR増幅
（A）第１段階のPCR増幅
アニーリング、伸長および変性を含む第１段階のPCRを2サイクル実施し、第１段階のPCR増幅を実施した。ヒトゲノムDNA 50ng、10×PCRバッファー(Promega) 8μl、25mM MgCl2 7μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各々2mM) 5μlおよび5'ACP(10μM)と3'ACP(10μM)の各々0.5μlを含む最終容量49.5μlの反応混合物を94℃で予熱した後、反応混合物を含むチューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl、Promega) 0．5μlを添加して、PCR反応を次のように実施した：94℃で40秒、60℃で40秒および72℃で40秒の2サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。
【０３７７】
(B)第２段階のPCR増幅
ACPのマルチプルセットを用いた第１段階のPCR増幅から生成された産物を、高いアニーリング温度で、次のように第２段階のPCR増幅により増幅した。第１段階のPCRが完了した後、10μMの予め選択されたアービトラリプライマーJYC3とJYC4の各々2μlを、94℃のような変性温度で第１段階の増幅の反応混合物に添加した。第２段階のPCRを次のように実施した：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で1分の40サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３７８】
増幅産物を2.0%アガロースゲルで電気泳動して分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの利用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３７９】
図２０および２１は、3種または4種のプライマーセットを利用し一つの反応でゲノムDNAのマルチプレックス断片を増幅した結果を示している。従来のプライマーセットの場合、3種(図20A)または4種(図21A)のプライマーセットは、ターゲット特異的産物だけではなく非特異的産物も生成した。一方、ACPの3種(図20B)または4種(図21B)のプライマーセットは、マルチプレックスターゲット産物のみを生成した。従って、本発明のACPは、マルチプレックスPCRに応用できる。
【０３８０】
プロトコルB：ノンストップ二段階PCR増幅
本発明の変形例として、JYC3とJYC4のような予め選択されたアービトラリプライマーを利用する代わりに、各々のACPセットの全体配列を、高ストリンジェンシー条件下の第２段階のPCR増幅でプライマーとして用いた。この方法では、第１段階のPCR反応の際またはその後に、反応混合物に予め選択されたアービトラリプライマーを添加する必要がない。
【０３８１】
各々のACPセットである、5'ACP(10μM) 1μlおよび3'ACP(10μM)の各々1μlを第１の段階のPCR増幅過程に添加することを除いては、プロトコルAと同様にノンストップ二段階PCR増幅を実施して、この際、予め選択されたアービトラリプライマーを添加する過程がないため、第１段階のPCR増幅過程に続いて遅滞なく第２段階のPCR増幅が行われる。
【０３８２】
増幅産物を2％アガロースゲルで電気泳動により分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)およびビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３８３】
ワンストップ二段階PCR増幅の結果と同様に(図21B)、ノンストップ二段階PCR増幅も専らターゲットマルチプレックス特異産物のみを生成した(図21C)。本実施例を用いて、当業界に公知のマルチプレックスPCR法に利用される従来のプライマーから引き起こされるバックグラウンド問題および非特異性問題を、本発明のACPが解決できるということが分かる。
【０３８４】
実施例９：ACPを用いた多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片の同定
多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を検出してクローニングするのに、本発明のACPを適用した。本実施例で、ホメオボックス配列を検出するために縮重プライマーをデザインした。ホメオボックス遺伝子は、60アミノ酸DNA結合ホメオドメインをコードする180 bpの保存性ホメオボックスにより特徴づけられる。マウス胚発生に関与するホメオボックス遺伝子を単離するために、受胎産物発生の三つの異なる段階、即ちマウス4.5、11.5および18.5日齢の受胎産物から得られた全RNAを出発物質として用いた。実施例３のcDNA合成と同一の条件で第１鎖cDNAを製造して、この場合、第１鎖cDNA合成プライマーとしてJYC5-T15-ACPを用いた。
【０３８５】
次のACPは、3'末端部分にホメオボックス配列に対する縮重配列を含み、第１の段階のPCR増幅での縮重ホメオボックス-特異プライマーとして利用された：
JYC2-HD1 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTGTGGTT-3'(配列番号83)；
JYC2-HD2 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTCTGGTT-3'(配列番号84)；および
JYC2-HD3 5'-GCTTGACTACGATACTGTGCGAIIIIIGTNCRRGTTTGGTT-3'(配列番号85)。
【０３８６】
実施例２と同様にホットスタートPCR法によりPCR増幅を実施して、ワンストップまたはノンストップ二段階PCR増幅を実施した。次は、ワンストップ二段階PCR増幅の例である。
【０３８７】
１．滅菌された0．2ml微量遠心分離チューブ中で次の試薬を混合する:第１のcDNA鎖(50ng/μl) 1μl、10×PCRバッファー(Roche) 5μl、2mM dNTP 5μl、10μM JYC2-HD1、JYC2-HD2およびJYC2-HD3(5'プライマー)のいずれか一つ 1μl、10μM JYC5-T15-ACP(3'プライマー) 1μlおよび滅菌dH2O 36．5μlを含む全容量49．5μl。
２．内容物を混合してチューブを微量遠心分離機で簡単にスピンする。
３．94℃に予熱されたサーマルサイクラーにチューブを置いておく。
４．チューブの温度を94℃に維持しながらTaqポリメラーゼ(5units/μl；Roche)  0．5μlを反応物に添加する。
５．次の条件でPCR反応を行う：94℃で1分、52℃で3分および72℃で1分の1サイクル、次いで、94℃で40秒、65℃で40秒および72℃で40秒の40サイクル、その後、72℃で5分間の最終伸長。
【０３８８】
増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動により分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルでオートラジオグラフィーまたは銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３８９】
特定段階で示差的に発現されたたくさんの遺伝子を得て、pGEM-T Easyベクター(Promega)にサブクローニングした後、シーケンシングした。配列解析により、幾つかのクローンがホメオボックス配列を含んでいることが分かった。ノーザンブロットまたはRT-PCR分析を通じて、電気泳動で観察された発現パターンの結果と前記クローンとが同一であることが分かった。本実施例を通じて、多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を分離するためのACPを用いた本発明の方法は、専ら真のPCR産物のみを生成することが分かる。多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を単離するための従来のPCRベースの技術の主な問題点である偽陽性データ問題点を除去したことは、cDNA増幅産物の検証に必要とされる労力を避けることができるようにする。
【０３９０】
実施例１０：ACPベースのPCRを用いた一塩基多型ゲノムタイピング
一塩基多型ゲノムタイピングにACPが適用できるかどうかを確認するために、従来のプライマーまたはACPを利用し、ヒトp53(TP53)遺伝子の一塩基多型(SNP)を含む部分を増幅した。ACPを用いたSNPゲノムタイピングに対する過程および結果は、下記に示した。TP53遺伝子のエキソン4にSNPを有するヒト血液試料からDNA鋳型を得た。前記多型は、GがCに置換され、アミノ酸位置72でArgがProに置換されたものである。次のプライマーセットを用いて各々の鋳型からヌクレオチド11991〜12339の349nt配列を増幅した：
P53N      5'-CCTCTGACTGCTCTTTTCAC-3'(配列番号86)および
P53C-ACP  5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIATTGAAGTCTCATGGAAGCC-3'(配列番号87)。
【０３９１】
末端の間にSNPを含む増幅産物を鋳型として用いて、アレル特異的ACPを用いてSNPを検出した：
P53N1A-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCGCGTGG-3'(配列番号88)、
P53N1B-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCCCCCGTGG-3'(配列番号89)、
P53N2A-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCGCGTG-3'(配列番号90)、
P53N2B-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCCCCCGTG-3'(配列番号91)、
P53N3A-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCGCGT-3'(配列番号92)、
P53N3B-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICTCCCCCCGT-3'(配列番号93)、
P53N4A-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCGCG-3'(配列番号94)、
P53N4B-ACP   5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCCCG-3'(配列番号95)、
P53N5A-ACP    5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCG-3'(配列番号96)、および
P53N5B-ACP    5'- GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGCTCCCCC-3'(配列番号97)。
【０３９２】
各々のアレル特異的ACPの3'末端部分に存在する多型塩基にはアンダーラインが引かれ、多型塩基位置は、疑問位置として見なされる。SNP検出においてアニーリング特異性に最も重要な位置を決定するために、アレル特異的ACPの3'末端から異なる位置に前記疑問位置を置いた。
【０３９３】
アレル特異的ACPを5'プライマーとして用いた。P53N1A-ACP、P53N2A-ACP、P53N3A-ACP、P53N4A-ACPおよびP53N5A-ACPのいずれか一つと、P53C-ACPとを野生型Aゲノムタイピングに用いた。P53N1B-ACP、P53N2B-ACP、P53N3B-ACP、P53N4B-ACおよび53N5B-ACPのいずれか一つと、P53C-ACPとを変異型Bゲノムタイピングに用いた。ACPの5'末端部分配列を第２の段階のPCR増幅で予め選択されたアービトラリプライマー配列として用いた：
JYC3    5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3'(配列番号11)、および
JYC4    5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3'(配列番号12)。
【０３９４】
(A)第１段階のPCR増幅
アニーリング、伸長および変性を含むPCRを1サイクル実施して、第１段階のPCR増幅を実施した。TP53遺伝子のエキソン4でSNPを含むターゲットゲノム増幅断片1μl、10×PCRバッファー(Promega) 5μl、25mM MgCl2 5μl、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各々2mM) 5μlおよびアレル特異的ACP(10μM) 1μlを含む最終濃度49.5μlの反応混合物を94℃で予熱した後、反応混合物を含むチューブの温度を94℃に維持しながら、Taqポリメラーゼ(5units/μl；Promega) 0．5μlを添加して、3'末端部分に10個のヌクレオチドを有するアレル特異的ACPに対し、次のようにPCR反応を実施した：94℃で40秒、55℃で40秒および72℃で40秒の1サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。
【０３９５】
3'末端部分に8個のヌクレオチドを有するアレル特異的ACPに対して、次のようにPCR反応を実施した：94℃で40秒、50℃で40秒および72℃で40秒の1サイクル、その後94℃で増幅産物を変性させる。生成された産物は、ターゲットゲノム断片に相補的な第１鎖DNAである。
【０３９６】
(B)第２の段階のPCR増幅
第１の段階のPCRにより生成された産物を、第１のアニーリング温度より高いアニーリング温度で、第２の段階のPCR増幅により増幅した。第１の段階のPCRが完了した後、10μM予め選択されたアービトラリプライマーJYC3 1μlを、94℃のような変性温度で第１段階の増幅過程の反応混合物に添加した。第２の段階のPCRを次のように実施した：94℃で40秒、68℃で40秒および72℃で40秒の30サイクル、その後72℃で5分間の最終伸長。
【０３９７】
増幅産物を2%アガロースゲルで電気泳動により分析し、エチジウムブロマイド染色により検出した。また、生成されたPCR産物は、変性ポリアクリルアミドゲルで、オートラジオグラフィー、または銀染色(Gottschlich et al. 1997; Kociok et al., 1998)、蛍光標識オリゴヌクレオチドの使用(Bauer et al. 1993; Ito et al. 1994; Luehrsen et al., 1997; Smith et al., 1997)、ビオチン化プライマーの使用(Korn et al., 1992; Tagle et al., 1993; Rosok et al., 1996)のような非放射性検出方法により検出できる。
【０３９８】
図２２は、ACPを用いたアレル特異的増幅の結果である。野生型A特異的ACP対(P53N2A-ACPおよびP53C-ACP)は、ホモ接合性野生型A(レーン1)またはヘテロ接合性ゲノムタイピング(レーン3)を有する試料からは特定のターゲット産物を生成したが、ホモ接合性変異型Bゲノムタイピングを有する試料からはそうではなかった(レーン5)。変異型B特異的ACP対(P53N2B-ACPおよびP53C-ACP)は、ホモ接合性変異型B(レーン6)またはヘテロ接合性ゲノムタイピング(レーン4)を有する試料からは特定ターゲット産物を生成したが、ホモ接合性野生型Aゲノムタイピングを有する試料からはそうではなかった(レーン2)。このような実験結果を通じて、本発明のACPが、SNPの遺伝型を検出するのに容易かつ経済的な方法を提供できるということが分かる。というのも、本発明では蛍光性DNAプローブまたはPCR後の過程が必要ないからである。3'末端部分に疑問位置を有するアレル特異的ACPは、アニーリング特異性を改善させる。さらに、アレル特異的ACPは、3'末端から5塩基離れた位置に疑問位置を有する場合(例えば、P53N2A-ACPおよびP53N2B-ACP)、アニーリング特異性が最も厳密に達成される。
【０３９９】
アレル特異的ACPの実際の3'末端から5塩基離れた位置が疑問位置として最も適合しているかを確認するために、追加的な６つの実験を図２２のように実施した。DNA鋳型は、SNPを有するヒト血液試料から得た。SNPを含む6個の短いゲノム断片は、次のプライマーセットを用いて増幅した：
β−2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)
703N     5'- ATTCTGATGGTGTGGATTGTG-3'(配列番号98)および
SM703C  5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIACCCTGGAGTAGACGAAGA-3'(配列番号99)
ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)
028N     5'- CCTTCTGTGCTTGATGCTTTT-3'(配列番号102)および
SM028C  5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIICAGGAAGGATGAGCATTTAG-3'(配列番号103)
インターロイキン13受容体
695N :    5'- AGAAAAACCAGAGGCAGCTT-3'(配列番号106)および
SM695C  5'- TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIIAGCACAAACCAAAGACACAGT-3'(配列番号107)
白血球接着分子-1(LAM-1)
679N     5'- CTAGCTGCAAGTGACATCTCT-3'(配列番号110)および
SM679C  5'- TCACAGAGTATCCAAGCGIIIIITCAGTAAGAAGCCAGGAGAG-3'(配列番号111)
タキキニン受容体3(TACR3)
832N    5'- TTTTGGGTGGAGGCTAACAT-3'(配列番号114)および
SM832C  5'- TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIAACGATGCAGACACCACCA-3'(配列番号115)
インターロイキン1、β(IL1B)
880N    5'- CTTCCACCAATACTCTTTTCC-3'(配列番号118)および
SM880C 5'- TCACAGAAGTATGCCAGCGAIIIIIGCATACACACAAGAGGCAGA-3'(配列番号119)。
【０４００】
両末端の間にSNPを含む増幅産物を鋳型として利用し、アレル特異的ACPを用いてSNPを検出した：
β-2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)
SM703-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACAGGGC-3'(配列番号100)および
SM703-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGGTACCGGGC-3'(配列番号101)
ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)
SM028-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAAACCAA-3'(配列番号104)および
SM028-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIITCCAACCCAA-3'(配列番号105)
インターロイキン13受容体
SM695-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII CCATTTTAGG-3'(配列番号108)および
SM695-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIII CCATTGTAGG-3'(配列番号109)
白血球接着分子-1(LAM-1)
SM679-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGAACTTT-3'(配列番号112)および
SM679-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIICCAGACCTTT-3'(配列番号113)
タキキニン受容体3(TACR3)
SM832-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGGTAAA-3'(配列番号116)および
SM832-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIGACTGATAAA-3'(配列番号117)
インターロイキン1、β(IL1B)
SM880-A 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCCATAA-3'(配列番号120)および
SM880-B 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCATIIIIIAAAGCTATAA-3'(配列番号121)。
【０４０１】
図２３は、β-2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)(A)、ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)(B)、インターロイキン13受容体(C)、白血球接着分子-1(LAM-1)(D)、タキキニン受容体3(TACR3)(E)およびインターロイキン1、β(IL1B)(F)のような遺伝子に存在するSNPに対するアレル特異的増幅結果である。図２２の結果のように、アレル特異的ACPが3'末端から5塩基離れた位置に疑問位置を有する場合、アニーリング特異性が大きく増加する。
【０４０２】
野生型A特異的ACP対は、ホモ接合性野生型A(レーン1)またはヘテロ接合性ゲノムタイピング(レーン3)を有する試料からは特定のターゲット産物を生成したが、ホモ接合性変異型Bゲノムタイピングを有する試料からはそうではなかった(レーン5)。変異型B特異的ACP対は、ホモ接合性変異型B(レーン6)またはヘテロ接合性ゲノムタイピング(レーン4)を有する試料からは特定ターゲット産物を生成したが、ホモ接合性野生型Aゲノムタイピングを有する試料からはそうではなかった(レーン2)。
【０４０３】
【表１】
2005511096.tif 000003
2005511096.tif 000004
2005511096.tif 000005
2005511096.tif 000006
2005511096.tif 000007
2005511096.tif 000008
S = GまたはC
W = AまたはT
V = A, G, またはC
N = A, G, C, またはT
Iは、デオキシイノシン
Rは、リボース
Dは、デオキシリボース
【０４０４】
【表２】
2005511096.tif 000009
【０４０５】
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【図面の簡単な説明】
【０４０６】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明のACPを用いて二本鎖DNAのターゲット核酸を選択的に増幅する方法を図示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明のACPを用いてmRNAのターゲット核酸を選択的に増幅する方法を図示している。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のACPを用いて示差的に発現される遺伝子を同定する方法を図示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のACPを用いて示差的に発現される遺伝子を同定する方法を図示している。
【図３】図３は、mRNAの3'末端に相当する3'末端領域を含むターゲットcDNA断片を、本発明のACPを用いて増幅する方法を図示している。
【図４Ａ】図４Ａは、mRNAの5'末端に相当する5'末端領域を含むターゲットcDNA断片を、本発明のACPを用いて増幅する方法を図示している。第一鎖cDNA合成プライマーとしてオリゴdTを利用する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、mRNAの5'末端に相当する5'末端領域を含むターゲットcDNA断片を、本発明のACPを用いて増幅する方法を示している。第一鎖cDNA合成プライマーとしてランダムプライマーを利用する。
【図５】図５は、本発明のACPを用いてmRNA分子に相補的な完全長cDNA分子を増幅する方法を図示している。
【図６】5'末端情報を含むmRNA分子に相補的な5'富化したcDNA分子を本発明のACPを用いて増幅する方法を図示している。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明のACPを用いて一塩基多型(SNP)を検出する方法を図示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明のACPを用いて一塩基多型(SNP)を検出する他の方法を図示している。
【図８】図８は、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン群の影響を示すアガロースゲルの写真である。E4.5(レーン1および4)、E11.5(レーン2および5)、そしてE18.5(レーン3および6)の受胎産物組織から単離された全RNAを用い、dT10-JYC2(配列番号29)とACP10(配列番号13)のセット(レーン1〜3)、およびdT10-ACP1(配列番号30)とACP10のセット(レーン4〜6)のそれぞれを用いて、cDNAを増幅した。
【図９】図９は、PCRの際のデオキシイノシンの数の変化と関連付けた、ACPの3'末端部分と5'末端部分との間に位置するデオキシイノシン残基の影響を示す、アガロースゲル写真である。レーン0、2、4、6および8は、各々デオキシイノシン残基の数を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、EsxN7プライマーとEsxC6プライマーとのセット(レーン1)およびEsxN7-ACPプライマーとEsxC6-ACPプライマーとのセット(レーン2)を用いてEsx1を二段階PCR増幅に供した結果を示すアガロースゲル写真である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、EsxN1(レーン1)、EsxC2(レーン2)、EsxN1-ACPとEsxC2のセット(レーン3)、そしてEsxN1-ACPとEsxC2-ACPのセット(レーン4)を用いてEsx1を二段階PCR増幅に供した結果を示すアガロースゲル写真である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、EsxN3とEsxC5のセット(レーン1および2)、そしてEsxN3-ACPとEsxC5-ACPのセット(レーン3)を用いてEsx1を二段階PCR増幅に供した結果を示すアガロースゲル写真である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、プライマーEsxN1(レーン1)、EsxC2(レーン2)、EsxN1とEsxC2の対(レーン3)、およびEsxN1-ACPとEsxC2-ACPの対(レーン4)用いてEsx1をノンストップ二段階PCR増幅に供した結果を示すアガロースゲル写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、相異なる段階のマウス受胎産物組織を用いて胚発生過程で示差的に発現されるmRNAを検出するために使用したACPの例を示すアガロースゲル写真である。E4.5(レーン1)、E11.5(レーン2)およびE18.5(レーン3)の受胎産物組織から単離された全RNAを用い、ACP3(配列番号3)およびdT10-ACP1のセットを用いて、cDNAを増幅した。矢印で示したバンドは、示差的に発現されたmRNAから増幅されたcDNA断片を示す。矢印の数は、図１３のノーザンブロット分析でプローブとして利用されたcDNA断片を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、相異なる段階のマウス受胎産物組織を用いて胚発生過程で示差的に発現されるmRNAを検出するために使用したACPの例を示すアガロースゲル写真である。E4.5(レーン1〜2および7〜8)、E11.5(レーン3〜4および9〜10)およびE18.5(レーン5〜6および11〜12)の受胎産物組織から単離された全RNAを用い、ACP5(配列番号5)とdT10-ACP1のセット(レーン1〜6)、およびACP8(配列番号8)とdT10-ACP1のセット(レーン7〜12)をそれぞれ使用して、cDNAを増幅した。矢印で示したバンドは、示差的に発現されたmRNAから増幅されたcDNA断片を示す。矢印の数は、図１３のノーザンブロット分析でプローブとして利用されたcDNA断片を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ACP10プライマーとdT10-ACPプライマーとのセットを用いて、相異なる段階のマウス受胎産物試料(E4.5:レーン1および2; E11.5:レーン3および4; E18.5:レーン5および6)から得たcDNA増幅産物を示すアガロースゲル写真である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ACP14とT10-ACPプライマーのセットを用いて相異なる段階のマウス受胎産物試料(E4.5:レーン1および2; E11.5:レーン3および4; E18.5:レーン5および6)から得たcDNA増幅産物を示すアガロースゲル写真である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ACP10プライマーとJYC5-T15-ACPプライマーとのセットを用いたワンストップ二段階PCR増幅により、相異なる段階のマウス受胎産物試料(E4.5:レーン1; E11.5:レーン2; およびE18.5:レーン3)から得た増幅cDNA産物を示す、アガロースゲル写真である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ACP10プライマーとJYC5-T15-ACPプライマーとのセットを用いたノンストップ二段階PCR増幅により、相異なる段階のマウス受胎産物試料(E4.5:レーン1; E11.5:レーン2; E18.5:レーン3)から得た増幅cDNA産物を示す、アガロースゲル写真である。
【図１３】図１３は、胚発生過程で示差的に発現されたmRNAから増幅された6個のcDNA断片に対するノーザンブロット分析結果を示している。図１１中、矢印で表された6個の32P標識断片を、ノーザンブロット分析のためのプローブとして用いた。矢印1、2、3、4、5および6は、各々DEG1(図13A)、DEG3(図13B)、DEG2(図13C)、DEG8(図13D)、DEG5(図13E)およびDEG7(図13F)であり、DEG配列解析の結果は表１に示している。DEG2(配列番号31)およびDEG5(配列番号32)は、最終的に新規遺伝子とされた(表2)。対照群パネル(各パネルの下部)は、プロッティング前のゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、それをUV光下で写真撮影したものであり、これらはローディング対照群としての18Sおよび28S rRNAが同程度のレベルであることを示す。
【図１４】図１４は、マウス受胎産物の全発生段階での新規遺伝子DEG5の発現パターンを示す。プローブとして放射性標識DEG5 cDNA断片を用いてノーザンブロット分析を実施した。指定の妊娠期間のマウス受胎産物から全RNA(20μg/レーン)を調製した。下部の対照群パネルは、ブロッティング前のゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、UV光下で写真撮影したものを示し、これらはローディング対照群としての18Sおよび28S rRNAが同程度のレベルであること示す
【図１５】図１５は、β−アクチン3'-RACEに関して、従来の3'-RACE(レーン1)とACPベースの3'-RACE(レーン2)との間で差異を示すアガロースゲル写真である。
【図１６】図１６は、マウスJunB(レーン1および2)およびβ−アクチン5'-RACE(レーン3および4)に対して従来のプライマーを用いたCapFinder方法(レーン1および3)と、ACPを用いたACPベースの方法(レーン2および4)との間の差異を示すアガロースゲル写真である。
【図１７】図１７は、マウスPLP-C α 5'-RACEについて従来のプライマーを用いたCapFinder方法(レーン１)とACPを用いたACPベースの方法(レーン2、3および4)との間の差異を示すアガロースゲル写真である。
【図１８】図１８は、マウス完全長GAPDH cDNAの増幅用のCapFinder方法またはACPベースの方法による、実際のノーザン解析の結果である。
【図１９】図１９は、アービトラリACPの2つの相異なるセットを用いて、7つのマウス系統のゲノムフィンガープリンティング結果を示すアガロースゲル写真である。
【図２０】図２０は、3種のターゲット核酸の増幅について従来の方法(A)またはACPベースの方法(B)を用いたマルチプレックスPCRの増幅産物を示すアガロースゲル写真である。
【図２１】図２２は、4種のターゲット核酸の増幅について従来の方法(A)またはACPベースの方法(BおよびC)を用いたマルチプレックスPCRの増幅産物を示すアガロースゲル写真である。ACPベースのマルチプレックスは、ワンストップ(B)またはノンストップ(C)二段階PCR増幅により実施した。
【図２２】図２２は、ヒトTP53遺伝子のエキソン4に存在するSNPを、ACPを用いてアレル特異的増幅した結果を示すアガロースゲル写真である。
【図２３】図２３は、β-2アドレナリン作動性受容体(ADRB2)(A)、ケモカイン(c-cモチーフ)受容体5(CCR5)(B)、インターロイキン13受容体(C)、白血球接着分子-1(LAM-1)(D)、タキキニン受容体3(TACR3)(E)およびインターロイキン1、β(IL1B)(F)のような様々な遺伝子に各々存在する6つの追加的なSNPについてのアレル特異的増幅結果を示すアガロースゲル写真である。
【図１Ａ】
2005511096.tif 000010
【図１Ｂ】
2005511096.tif 000011
【図２Ａ】
2005511096.tif 000012
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2005511096.tif 000017
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
2005511096.tif 000021
【図９】
2005511096.tif 000022
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005511096.tif 000035
【図１６】
2005511096.tif 000036
【図１７】
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【図１８】
2005511096.tif 000038
【図１９】
2005511096.tif 000039
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月4日(2004.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅においてアニーリング特異性を改善するためのアニーリング調節プライマーであって、以下の(a)〜(c)：
(a) それとハイブリダイズする鋳型核酸上の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分；
(b) 予め選択されたアービトラリ(arbitrary)ヌクレオチド配列を有する5'末端部分；および
(c) 前記3'末端部分と5'末端部分との間に位置し、少なくとも二つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分；
を含み、それによって調節部分がアニーリング温度によりそのプライマーのアニーリング部分を調節することができる、前記アニーリング調節プライマー。
【請求項２】
5'末端部分の予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列が、前記鋳型核酸上のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではないことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３】
前記鋳型核酸が、gDNA、cDNAまたはmRNAであることを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項４】
前記gDNAまたはcDNAが、一本鎖または二本鎖DNAであることを特徴とする、請求項３に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項５】
前記核酸増幅が、第１のアニーリング温度および第２のアニーリング温度下で行うことを特徴とする、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項６】
前記核酸増幅の第１のアニーリング温度が、前記第２のアニーリング温度と同一であるかまたはそれより低いことを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項７】
前記3'末端部分が、前記第１のアニーリング温度でのアニーリングに関与し、前記5'末端部分が、前記第２のアニーリング温度でのプライミング部位として機能することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項８】
前記調節部分が、前記第１のアニーリング温度でのプライマーのアニーリング部位を3'末端部分に制限することを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項９】
前記第１のアニーリング温度が約30℃〜68℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１０】
前記第２のアニーリング温度が約50℃〜72℃であることを特徴とする、請求項５に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１１】
次の一般式で表される、請求項１に記載のアニーリング調節プライマー。
5'-Xp-Yq-Zr-3'
[式中、Xpは、鋳型核酸のいかなる部位に対しても実質的に相補的ではない予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を有する5'末端部分を表し；Yqは、少なくとも二つのユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を含む調節部分を表し；Zrは、そのプライマーとハイブリダイズする鋳型核酸上の一の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する3'末端部分を表し；ｐ、ｑおよびｒは、ヌクレオチドの数であり；X、YおよびZは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。]
【請求項１２】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、天然のDNA/RNA塩基との間で識別されることなく天然のDNA/RNA塩基の各々と塩基対を形成することができることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１３】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、イノシン、7-デアザ-2'-デオキシイノシン、2-アザ-2'-デオキシイノシン、2'-OMe イノシン、2'-F イノシン、デオキシ 3-ニトロピロール、3-ニトロピロール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-F 3-ニトロピロール、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロール、デオキシ 5-ニトロインドール、5-ニトロインドール、2'-OMe 5-ニトロインドール、2'-F 5-ニトロインドール、デオキシ 4-ニトロベンズイミダゾール、4-ニトロベンズイミダゾール、デオキシ 4-アミノベンズイミダゾール、4-アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、2'-F ネブラリン、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-5-イントロインドール、PNA-ネブラリン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、モルフォリノ-5-ニトロインドール、モルフォリノ-ネブラリン、モルフォリノ-イノシン、モルフォリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ-3-ニトロピロール、ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホスホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-0-メトキシエチルイノシン、2'-0-メトキシエチルネブラリン、2'-0-メトキシエチル 5-ニトロインドール、2'-0-メトキシエチル 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-0-メトキシエチル3-ニトロピロールおよびこれらの組合せからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１４】
前記ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体が、デオキシイノシン、1-(2'-デオキシ-β-D-リボフラノシル)-3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１５】
前記調節部分が、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体を有する連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１６】
前記デオキシリボヌクレオチドが、天然のdNMP、修飾ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１７】
前記pが、15〜60の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１８】
前記qが、少なくとも3であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項１９】
前記qが、少なくとも4であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２０】
前記qが、2〜15の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２１】
前記rが、6〜50の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２２】
前記pが15〜60の整数であり、qが2〜15の整数であり、そしてrが6〜30の整数であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２３】
前記Xpが、ユニバーサルプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２４】
前記Xpが、制限酵素によって認識される配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２５】
前記Xpが、検出または分離のための標識を有する少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２６】
前記Zrが、mRNAのポリアデノシン(ポリA)テイルとハイブリダイズするヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２７】
前記Zrが、少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２８】
前記Zrが、3'末端に3'-Vを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項２９】
前記Zrが、3'末端に3'-NVを有する少なくとも10個連続したデオキシチミジンヌクレオチドを含み、かつ、そのVがデオキシアデノシン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれ、そしてそのNがデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジンおよびデオキシグアノシンからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２６に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３０】
前記Zrが、鋳型核酸中のターゲット配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３１】
前記Zrが、ランダムヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３２】
前記Zrが、遺伝子ファミリーのコンセンサス配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３３】
前記Zrが、予め決定されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の複数の組合せから選択される縮重ヌクレオチド配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３４】
前記Zrが、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３５】
前記Zrが、アレル部位に相補的な少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３６】
前記Zrが、ターゲット核酸に対してミスマッチである、突然変異誘発のための少なくとも一つのヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のアニーリング調節プライマー。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマーセットを含むキット。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載のアニーリング調節プライマーの5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を含むプライマーまたはプライマー対をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物から核酸配列を増幅する方法。
【請求項４０】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項３９に記載の方法：
(a) 核酸配列の第一段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を各々のプライマーが前記核酸配列の前記領域とアニーリングする条件で行って、それにより前記核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４１】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、DNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４２】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４１に記載の方法：
(a) 第１のアニーリング温度でターゲット核酸配列の第１段階の増幅を行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅させる、前記工程。
【請求項４３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅する方法。
【請求項４４】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、前記mRNAのポリAテイルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドdTプライマーと前記mRNAとを接触させる工程；
(b) 前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記オリゴヌクレオチドdTプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のDNA鎖を生成させる工程；
(c) 工程(b)で得られる第１のDNA鎖からの前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の領域と実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それにより前記ターゲット核酸配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したプライマーと同一のプライマー、または工程(c)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を再増幅する、前記工程。
【請求項４５】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二つまたはそれ以上の核酸試料中で示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出する方法。
【請求項４６】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４５に記載の方法：
(a) mRNA転写物の第１の集団である第１の核酸試料およびmRNA転写物の第２の集団である第２の核酸試料を提供する工程；
(b) 前記第１の核酸試料および第２の核酸試料の各々を請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと別々に接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記の示差的に発現されるmRNA中の第１の部位に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、かつ、前記接触を、鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で行う、前記工程；
(c) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記の示差的に発現されるmRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第１の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第１の集団、および前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記第２の核酸試料中で示差的に発現される前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の第２の集団を生成する工程；
(d) 前記第１のcDNA鎖の第１および第２の集団の各々を精製し定量する工程；
(e) 工程(d)から得られた第１のDNA鎖の第１および第２の集団の各々の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、第１のcDNA鎖の第１および第２の集団における第２の部位に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の各々の集団における第２の部位にアニーリングする条件下で行って、それにより第２のcDNA鎖の第１および第２の集団を生成させる、前記工程；
(f) 工程(e)で生成された第２のcDNA鎖の各々の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(b)および(e)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが第２のcDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記第２のcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(g) 工程(f)から得られた増幅産物の第１および第２の集団において、個々の増幅産物の存在またはレベルを比較する工程。
【請求項４７】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項４８】
以下の工程(a)〜(e)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４７に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、そのプライマーの3'末端部分が、そのプライマーとハイブリダイズする前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 前記第１のcDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第１のcDNA鎖の一つにおける一部位に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが前記第１のcDNA鎖の一つの遺伝子特異的部位とアニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的な第２のcDNA鎖を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(a)および(c)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的な第２のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的なcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項４９】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含むターゲットcDNA断片の迅速増幅方法。
【請求項５０】
以下の工程(a)〜(g)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項４９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、cDNA合成プライマーとしてのオリゴヌクレオチドdTプライマーまたはランダムプライマーとmRNAとを接触させる工程であって、前記cDNA合成プライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNAの一領域に実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAを、逆転写酵素を用いて逆転写して、前記cDNA合成プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させ、それによってmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；
(f) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(e)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第２の完全長cDNA鎖の一つの一領域に実質的に相補的な遺伝子特異的にハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記第２の完全長cDNA鎖の一つにおける遺伝子特異的部位にアニーリングする条件で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖を生成させる工程；および
(g) 前記遺伝子特異的cDNA鎖の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(f)-(i)および工程(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーと同一のプライマー、または工程(f)-(i)および(f)-(ii)で各々使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが遺伝子特異的cDNA鎖の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより遺伝子特異的cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５１】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅する方法。
【請求項５２】
以下の工程(a)〜(f)を含むことを特徴とする、請求項５１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、前記mRNAのポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNAを逆転写酵素を用いて逆転写して、前記プライマーがハイブリダイズする前記mRNAに相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させて、それによりmRNA−cDNA中間体を生成させる工程；
(c) 逆転写酵素の末端転移酵素反応により、前記mRNA−cDNA中間体の形態の前記第１のcDNA鎖の3'末端で、シトシン残基をテイリング(tailing)させる工程；
(d) 工程(c)で生成された前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルとオリゴヌクレオチドとを、そのオリゴヌクレオチドの3'末端部分が前記シトシンテイルにハイブリダイズする条件下で接触させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、ユニバーサル塩基または非識別性塩基類似体の群により隔てられた3'末端部分および5'末端部分を含み、前記3'末端部分が、前記第１のcDNA鎖の3'末端のシトシンテイルにハイブリダイズする少なくとも3個のグアニン残基をその3'末端に含み、前記5'末端部分が、予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を含む、前記工程；
(e) 逆転写酵素を用いて前記第１のcDNA鎖のテイリングされた3'末端を伸長することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的な追加配列を生成させる工程であって、前記オリゴヌクレオチドが伸長反応で鋳型として働き、それにより第１の完全長cDNA鎖を伸長させる工程；および
(f) 工程(e)で生成された前記第１の完全長cDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(d)で各々使用したのと同一の第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドに相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対、または工程(a)および(d)で使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記mRNAに相補的な完全長cDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５３】
mRNAを逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNAに相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅する方法。
【請求項５４】
以下の工程(a)〜(c)を含むことを特徴とする、請求項５３に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーと前記mRNAとを接触させる工程であって、前記第１のプライマーの3'末端部分が、少なくとも6個のランダムヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 請求項５２に記載の工程(b)〜(e)を行い、それにより5'富化した第１のcDNAを伸長させる工程；および、
(c) 工程(b)で生成された前記5'富化した第１のcDNA鎖の増幅を行う工程であって、工程(a)および(b)で各々使用した第１のプライマーおよびオリゴヌクレオチドの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'富化した第１のcDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより5'富化したcDNA鎖の増幅産物を生成させる、前記工程。
【請求項５５】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、二組以上のプライマー対を用いて、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同一の反応で同時に増幅する方法。
【請求項５６】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５５に記載の方法：
(a) 二つ以上のターゲットヌクレオチド配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記の各プライマー対の各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域と実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマー対の各々が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングする条件で行って、それによりターゲットヌクレオチド配列の増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー対、または工程(a)で使用したプライマー対の各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各プライマー対の各々が工程(a)で生成された増幅産物の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記増幅産物を同一反応で再増幅させる、前記工程。
【請求項５７】
プライマーを用いて増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAのDNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項５８】
以下の工程(a)および(b)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５７に記載の方法：
(a) gDNAから、ゲノムに特徴的な独立したDNA断片のセットであるDNAフィンガープリントの第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の部位に実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記gDNAにアニーリングする条件で行って、それによりDNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された独立したDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対の各々が工程(a)で生成された前記の独立したDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の独立したDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項５９】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料のRNAフィンガープリントを作製する方法。
【請求項６０】
以下の工程(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項５９に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、その第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーの各々は、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖上の部位と実質的に相補的なアービトラリヌクレオチド配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対が前記mRNA試料にアニーリングする条件で行って、それによりRNAフィンガープリントで特徴付けられる独立したcDNA断片のセットを生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(c)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(c)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記のプライマーまたはプライマー対の各々が工程(c)で生成された独立したcDNA断片のセットの3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記独立したcDNA断片のセットを再増幅させる、前記工程。
【請求項６１】
逆転写する工程およびプライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、mRNA試料から多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６２】
以下の(a)〜(d)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 鋳型誘導性酵素的デオキシリボ核酸合成を引き起こすのに十分な条件下で、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の第１のプライマーに前記mRNA試料を接触させる工程であって、前記第１のプライマーが、それとハイブリダイズする前記mRNA試料のポリAテイルに実質的に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する、前記工程；
(b) 前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料を逆転写して、前記第１のプライマーがハイブリダイズする前記mRNA試料に相補的な第１のcDNA鎖の集団を生成させる工程；
(c) 工程(b)で生成された第１のcDNA鎖の集団の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーは、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記第１のcDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記第２のプライマーが第１のcDNA鎖の前記コンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有する3'末端cDNA断片を生成させる、前記工程；および
(d) 工程(c)で生成された3'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)および(c)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(a)および(c)で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記3'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記3'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６３】
以下の工程(a)〜(c)を含む、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６１に記載の方法：
(a) 請求項５２に記載の工程(a)〜(e)を行って、それにより完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)から得られた前記第１の完全長cDNA鎖の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程：
(i) 第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ、前記サイクルを、前記第１のプライマーが前記第１の完全長cDNA鎖の3'末端とアニーリングする条件で行って、それにより第２の完全長cDNA鎖を生成させる工程；
(ii) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、前記第２の完全長cDNA鎖の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが第２の完全長cDNA鎖の前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記のコンセンサス配列または縮重配列を有する5'末端cDNA断片を生成させる工程；および
(c) 工程(b)で生成された5'末端cDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)および工程(b)-(ii)の各々で使用した第１および第２のプライマーの各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記5'末端cDNA断片の3'末端配列および5'末端配列にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の5'末端保存性ホモロジーcDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６４】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、gDNAから多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定する方法。
【請求項６５】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６４に記載の方法：
(a) 前記gDNAからの保存性ホモロジー断片の第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマーの各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記gDNA上の保存性ホモロジー断片のアミノ酸配列をコードする縮重配列またはコンセンサス配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、本工程を、前記プライマーまたは前記プライマー対がgDNAの前記のコンセンサス配列または縮重配列にアニーリングする条件で行って、それにより前記コンセンサス配列または縮重配列を有するゲノムDNA断片を生成させる工程；および
(b) 工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマーまたはプライマー対、または工程(a)で使用したプライマーまたはプライマー対の各々の5'末端部分に相当するヌクレオチド配列を各々が含むプライマーまたはプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、前記プライマーまたはプライマー対の各々が工程(a)で生成されたゲノムDNA断片の3'末端配列および5'末端配列の各々にアニーリングする条件下で行って、それにより前記の保存性ホモロジーゲノムDNA断片を増幅する、前記工程。
【請求項６６】
プライマーを用いた増幅反応を行う段階を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸内のヌクレオチド変異を同定する方法。
【請求項６７】
以下の工程(a)および(b)を含み、二段階増幅を利用して行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な第１のDNA鎖を生成させる第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位の予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々は、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置(interrogation position)を含み、それにより、前記疑問位置が、前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；
(b) 以下の工程(i)および(ii)を含み、工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程：
(i) 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第２のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第２のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第２の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、かつ、前記サイクルを、前記第２のプライマーが前記ターゲット核酸の前記第２の部位にアニーリングする条件で行って、それにより前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相補的な第２のDNA鎖を生成させる工程；および
(ii) 工程(a)および工程(b)-(i)で使用したのと同一の第１および第２のプライマー、または工程(b)-(i)で生成された前記第２のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なもしくはそれに相当するハイブリダイズする配列を各々が有するプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、前記サイクルを、各々のプライマーが前記第２のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより前記ターゲット核酸の前記第１の部位および第２の部位を3'末端および5'末端に含む前記第２のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第２のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６８】
以下の工程(a)〜(c)を含む、第１の増幅および第２の増幅の二つの別個の増幅過程を用いて行い、前記第２の増幅を二段階増幅を用いて行うことを特徴とする、請求項６６に記載の方法：
(a) 両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む短いDNA鎖断片を生成させる第１の増幅を行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、前記ターゲット核酸の一部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を含み、前記ヌクレオチド変異は、前記予め選択された配列の間に位置しており、前記プライマー対の少なくとも一つが、3'末端部分に前記ハイブリダイズする配列を有する請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであり、それにより両末端の間に前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片を生成させる工程；
(b) 前記ヌクレオチド変異を含む前記短いDNA鎖断片に相補的な第１のDNA鎖を生成する第２の増幅における第１段階の増幅を、第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の第１のプライマーを用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記第１のプライマーが、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸の第１の部位にある予め選択された配列に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記第１のプライマーおよび第１の部位の各々が、前記ヌクレオチド変異に該当する疑問位置を含み、それにより、前記疑問位置が前記第１の部位の対応するヌクレオチドに相補的な第１のプライマーの相補的ヌクレオチドにより占められる場合に、前記ヌクレオチド変異を含む前記ターゲット核酸に相補的な前記第１のDNA鎖を生成させる工程；および
(c) 工程(a)で生成された前記第１のDNA鎖の第２の増幅における第２段階の増幅を、第２のアニーリング温度で行う工程であって、プライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、前記プライマー対の一方が、工程(a)で使用した請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーと同一のものであり、他方のプライマーが、工程(b)で使用した前記第１のプライマーと同一のものであるか、またはそのプライマー対の各々が、それとハイブリダイズする工程(b)で生成された前記第１のDNA鎖の3'末端および5'末端に相補的なまたはそれに相当するハイブリダイズする配列を有しており、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記第１のDNA鎖の3'末端配列および5'末端配列に各々アニーリングする条件下で行って、それにより、前記第１のDNA鎖を増幅し、前記ヌクレオチド変異を含む前記第１のDNA鎖に相当する短いターゲットヌクレオチド断片を生成させる工程。
【請求項６９】
プライマーを用いた増幅反応を行う工程を含み、前記プライマーの少なくとも一つが、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーであることを特徴とする、ターゲット核酸において突然変異誘発する方法。
【請求項７０】
以下の工程(a)および(b)を含む、前記突然変異誘発が位置指定突然変異誘発であり、二段階増幅を用いることを特徴とする、請求項６９に記載の方法：
(a) 前記ターゲット核酸配列の第１段階の増幅を第１のアニーリング温度で行う工程であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも2サイクル含み、前記プライマー対の各々が、その3'末端部分に、それとハイブリダイズする前記ターゲット核酸配列の一領域に実質的に相補的なハイブリダイズする配列を有し、前記ハイブリダイズする配列が、位置指定突然変異を生じさせるための少なくとも一つのミスマッチヌクレオチドを有し、かつ、本工程を、プライマーまたはプライマー対が前記ターゲットヌクレオチド配列とアニーリングされる条件で行って、それにより位置指定当然変異部位を含む増幅産物を生成させる、前記工程；および
(b) 工程(a)で生成された増幅産物の第２段階の増幅を、高ストリンジェンシー条件の第２のアニーリング温度で行う工程であって、工程(a)で使用したのと同一のプライマー、または工程(a)で使用したプライマーの各々の5'末端部分に相当する予め選択されたアービトラリヌクレオチド配列を各々が含むプライマー対を用いたプライマーアニーリング、プライマー伸長および変性を少なくとも1サイクル含み、かつ、本工程を、各々のプライマーが前記増幅産物の3'末端および5'末端に各々アニーリングする条件下で行って、それにより位置指定突然変異部位を含む増幅産物が再増幅される、前記工程。
【請求項７１】
前記第１段階の増幅で使用した前記プライマー対が、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のプライマーから選択されるアニーリング調節プライマーと従来のプライマーとの組合せであることを特徴とする、請求項４０、４２、４４、４８、５０、５６、５８、６０、６２、６３または６５に記載の方法。
【請求項７２】
請求項３９または４０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む核酸増幅用キット。
【請求項７３】
請求項４１または４２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、DNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項７４】
請求項４３または４４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAからターゲット核酸配列を選択的に増幅するためのキット。
【請求項７５】
請求項４５または４６に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、示差的に発現されるmRNAに相補的なDNAを検出するためのキット。
【請求項７６】
請求項４７または４８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの3'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットcDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項７７】
請求項４９または５０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相当するcDNA領域を含む、ターゲットDNA断片を迅速に増幅するためのキット。
【請求項７８】
請求項５１または５２に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAに相補的な二本鎖完全長cDNAの集団を増幅するためのキット。
【請求項７９】
請求項５３または５４に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAの5'末端領域に相補的な5'富化した二本鎖cDNAを増幅するためのキット。
【請求項８０】
請求項５５または５６に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、二つ以上のターゲットヌクレオチド配列を同時に増幅するためのキット。
【請求項８１】
請求項５７または５８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いたDNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項８２】
請求項５９または６０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いたRNAフィンガープリントを作製するためのキット。
【請求項８３】
請求項６１、６２または６３に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、mRNAを用いて多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項８４】
請求項６４または６５に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、gDNAを用いた多重遺伝子ファミリーの保存性ホモロジー断片を同定するためのキット。
【請求項８５】
請求項６６、６７または６８に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸におけるヌクレオチド変異を同定するためのキット。
【請求項８６】
請求項６９または７０に記載のアニーリング調節プライマーまたはアニーリング調節プライマーのセットを含む、ターゲット核酸において突然変異誘発するためのキット。
【国際調査報告】
2005511096.tif 000044
2005511096.tif 000045