(57)【要約】【課題】  ヘテロジニアスアッセイ法における標識体の担体への非特異吸着量を低減し、低濃度測定における偽高値を回避した、再現性の良好な測定試薬を提供する。【解決手段】  測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分と、ウシ血清アルブミンの会合成分（分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入る分子量画分）を担持した不溶性担体をヘテロジニアスアッセイ法の測定試薬として使用することにより標識体の担体への非特異吸着量を低減して偽高値を回避し、測定の再現性を改善する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分と、分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入る分子量画分のウシ血清アルブミンの会合成分を担持した不溶性担体。
【請求項２】
前記反応特異的成分が抗体または抗原である、請求項１に記載の不溶性担体。
【請求項３】
前記不溶性担体が磁性粒子である、請求項１または２のいずれかに記載の不溶性担体。
【請求項４】
前記測定対象物が甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）である、請求項１から３のいずれかに記載の不溶性担体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の不溶性担体を希釈液で懸濁した懸濁液である測定試薬。
【請求項６】
前記懸濁液が凍結乾燥された請求項５に記載の測定試薬。
【請求項７】
請求項５または６のいずれかに記載の測定試薬を用いた測定方法であって、
前記測定試薬に試料を添加し、前記試料中の測定対象物を反応特異的成分に捕捉し、未反応物を除去後、標識体を添加し、さらに未反応物を除去後、前記反応特異的成分に捕捉した前記測定対象物を定量する前記測定方法。
【請求項８】
請求項５または６のいずれかに記載の測定試薬を用いた測定方法であって、
前記測定試薬に試料を添加し、前記試料中の測定対象物を反応特異的成分に捕捉し、標識体を添加し、未反応物を除去後、前記反応特異的成分に捕捉した測定対象物を定量する前記測定方法。
【請求項９】
ウシ血清アルブミンを５０〜６０℃において１０分〜２４時間加熱処理する工程と、
前記加熱処理したウシ血清アルブミンの分子量画分を、分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入るように分取する工程と、
前記ウシ血清アルブミンの分子量画分を０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）濃度に調整し、測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分を担持した不溶性担体を浸漬する工程と、
浸漬後の前記不溶性担体を希釈液にて希釈する工程と、
を含む測定試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘテロジニアスアッセイ法（不均一性測定法）に適し、標識体の担体への非特異吸着量を低減し、低濃度測定における偽高値の発生を回避した測定試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定法には生体試料中の測定対象物を高感度に測定する方法の一つとして、抗体、抗原等の測定対象物に特異的に結合する物質を担持した不溶性担体を用いるヘテロジニアスアッセイ法が知られている。この方法はＢ／Ｆ分離（担体に結合した標識体と未結合の標識体の分離）を必要とし、免疫反応が終了した担体を洗浄液にて洗浄し、担体上の免疫複合体に含まれる標識体の標識物から生じるシグナルに基づいて測定対象物を定量する。標識体が担体に非特異吸着すると測定対象物を高感度に測定できないため、通常は、測定対象物に特異的に結合する物質を担体に担持したのち、免疫反応に関与しないタンパク質で担体表面の非特異吸着部位を被覆（以下、この操作をブロッキングと表記することもある）する方法がとられている。
【０００３】
特許文献１は、加熱変性して高分子量化（分子量による分画は行っていない）したウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記することもある）を用いて免疫学的凝集反応用担体粒子（平均粒径３００ｎｍ）をブロッキングする方法により、非加熱変性（大部分が単量体）のＢＳＡで担持する従来法に比べて担体の被覆率が向上し、担体粒子間の非特異凝集反応が抑制される方法を開示している。
【０００４】
しかしながら、測定の高感度化を必要とするヘテロジニアスアッセイ法の場合は、前記標識体の担体への僅かな非特異吸着が測定性能を左右することが多く、特許文献１のブロッキング法を用いても標識体の担体への非特異吸着反応は完全には抑制できないため、低濃度検体の測定値が突発的に偽高値化する（陰性検体が陽性であると誤判定される危険性がある）という致命的な問題が解消されず、非特異吸着反応の抑制という点では不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１９７５３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヘテロジニアスアッセイ法に適し、標識体の担体への非特異吸着量を低減して低濃度測定における偽高値の発生を回避した、再現性の良好な測定試薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意検討を行った結果、担体のブロッキングに用いるウシ血清アルブミンを変性させて会合成分を得る際、会合しないで存在する成分（単量体を含む）や会合度の低い成分を除去した最適な分子量画分を用いることにより、へテロジニアスアッセイの低濃度測定における再現性が向上し、特に低濃度域の測定値が突発的に偽高値化するという測定試薬にとって致命的な問題が回避できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
前記課題を解決し、目的を達成するためになされた本発明は、以下の発明を包含する：
すなわち本発明の第一の態様は、
測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分と、ウシ血清アルブミンの会合成分（分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入る分子量画分）を担持した不溶性担体である。
【０００９】
次に、本発明の第二の態様は、
上述した不溶性担体を希釈液で懸濁した懸濁液である測定試薬及び前記懸濁液を凍結乾燥した測定試薬である。
【００１０】
次に、本発明の第三の態様は、
上述した測定試薬に試料を添加し、前記試料中の測定対象物を不溶性担体に担持した反応特異的成分に捕捉し、未反応物を除去後、標識体を添加し、さらに未反応物を除去後、前記反応特異的成分に捕捉した測定対象物を定量する測定方法である。
【００１１】
次に、本発明の第四の態様は、
上述した測定試薬に試料を添加し、前記試料中の測定対象物を不溶性担体に担持した反応特異的成分に捕捉し、標識体を添加し、未反応物を除去後、前記反応特異的成分に捕捉した測定対象物を定量する測定方法である。
【００１２】
次に、本発明の第五の態様は、
ウシ血清アルブミンを５０〜６０℃において１０分〜２４時間加熱処理する工程と、
前記加熱処理したウシ血清アルブミンの分子量画分を、分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入るように分取する工程と、
前記ウシ血清アルブミンの分子量画分を０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）濃度に調整し、測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分を担持した不溶性担体を浸漬する工程と、
浸漬後の前記不溶性担体を希釈液にて希釈する工程と、
を含む測定試薬の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分とウシ血清アルブミンの会合成分（分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入る分子量画分）を担持した不溶性担体をヘテロジニアスアッセイ法の測定試薬に用いることにより標識体の担体への非特異吸着量を低減して偽高値を回避し、測定の再現性を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の測定試薬に使用する加熱変性ＢＳＡの会合成分を分画した際のクロマトグラムを示す図である。
【図２】実施例１および比較例１の測定試薬（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用いてゼロ濃度の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）標準溶液を６０回測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１６】
本発明における反応特異的成分とは、抗体や抗原の他、レセプター、酵素、アビジン、ビオチン、ストレプトアビジン、核酸等が例示できる。
【００１７】
本発明におけるウシ血清アルブミンの会合成分とは、前記ウシ血清アルブミンを加熱、加圧、紫外線照射、超音波照射などの物理学的処理により、または酸、アルカリ、界面活性剤、有機溶媒、金属イオンなどを添加する化学的処理により変性させてウシ血清アルブミンが会合した成分、更には物理学的処理または化学的処理を行わずに未変性ウシ血清アルブミン（単量体を含む）を架橋剤により架橋し高分子量化した成分を指す。一般的に加熱により変性させた方が会合体を簡便に入手できる点において好ましく、通常、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）に濃度調整したウシ血清アルブミンを５０〜６０℃、好ましくは５０〜５６℃にて１０分〜２４時間、好ましくは１時間〜１２時間の範囲で加熱すると、目的とする分子量の会合成分の混合物が得られる。ウシ血清アルブミンのグレードにより差はあるが、会合体成分の混合物は通常、単量体（加熱しても会合しない成分）、または二量体〜三量体の会合度の低い成分を含み、分子量範囲が広いため、分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００、好ましくは分子量範囲４００，０００〜６００，０００、より好ましくは分子量範囲４００，０００〜５２０，０００の会合成分を得るためには、ゲル浸透クロマトグラフィー等による分画を行うことが望ましい。担体に担持する会合成分の分子量画分は狭くても広くても前記分子量範囲内であればよく、特に単量体を含めて会合度の低い成分（二量体〜三量体）を除去するように分画すれば好適に使用することができる。
【００１８】
本発明における不溶性担体の形状は、粒子状、チューブ状、カップ状、プレート状などが例示できるが、粒子状、特に球状粒子の担体が好ましい。不溶性担体の材質は、ガラス、シリカなどの無機物質、各種合成高分子化合物からなるプラスチック、セルロ−ス誘導体など、ヘテロジニアス測定に用いられる担体であれば特に制限はない。一例として、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ナイロン、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、ポリスチレン、スチレン−アクリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、またはこれらを主成分とする共重合体もしくは混合物といった熱可塑性樹脂製の担体、更にはこれらにカルボキシル基、スルホプロピル基、ジエチルアミノエチル基等のイオン交換基、トシル基、トレシル基、エポキシ基などの反応性官能基を導入したものがあげられる。担体の平均粒径についても特に制限はなく、例えば０．０１〜１０，０００μｍの粒径の担体を使用することができる。
【００１９】
本発明における不溶性担体は、磁気感応成分を含有しない担体でもよいが、磁気感応成分を含有した担体（磁性粒子）の方がその後の未反応成分の除去が容易となる点で好ましい。磁気感応性成分としては、例えばマンガン−亜鉛フェライトなどのソフトフェライト、四三酸化鉄を主成分とするマグネタイトなどがあげられる。磁気感応性成分は、前述した熱可塑性樹脂からなる担体の作製時に混合することで内部に一様に含有させてもよいし、多層構造からなる担体の１つの層に含有させてもよいし、吸着や熱融着などにより表面に担持させることで含有させてもよい。磁気感応性成分の担体への含有量（担持量）は、担体を流動させるために作用させる磁界の強度、担体の流動性の程度により適宜決定することができるが、通常は磁性粒子重量の１〜８０％（ｗ／ｖ）であり、５〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましい。なお、磁気感応性成分そのものを、担体そのもの、または担体の核として用いてもよい。
【００２０】
ウシ血清アルブミンの会合成分の担体への担持法は、測定対象物を特異的反応により捕捉する反応特異的成分を化学結合法または物理吸着法などの担持法により担体に担持したのち、前記ウシ血清アルブミンの会合成分を、担体表面に残存する非特異吸着部位に対し物理吸着法により担持する方法、または前記反応特異的成分を担体表面の官能基を用いて化学結合法により担持したのち、前記ウシ血清アルブミンの会合成分を担体表面に残存する官能基を利用して化学結合法にて直接、もしくは架橋剤を介して担持する方法などが例示されるが、担体の材質または担体表面の官能基等に合わせて適宜最適な方法で担持すればよい。不溶性担体に担持するための前記会合成分の添加濃度は、０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましく、より好ましくは０．５〜３％（ｗ／ｖ）である。
【００２１】
本発明の測定試薬の形態は、測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分およびウシ血清アルブミンの会合成分を担持した不溶性担体を希釈液にて懸濁した状態でそのまま使用してもよく、前記懸濁液を凍結乾燥して使用してもよい。
【００２２】
また、上述した希釈液は、哺乳動物の正常血清タンパク質、アルブミン、コラーゲン、ゲリゼート、スキムミルク、乳酸発酵物、ゼラチンもしくはその分解物などのタンパク質、またはＤ−マンニトール、シュークロース、ｍｙｏ―イノシトール、トレハロース、β―シクロデキストリン、グルコース、ラクトース、フルクトース、セルロース、ラフィノース、マルトース、ガラクトース、キシロースなどの糖を含有する。その濃度は特に限定されないが、タンパク質に関しては、好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１５％（ｗ／ｖ）、糖に関しては、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜５％（ｗ／ｖ）である。タンパク質または糖以外に、目的に応じてＢＳＡまたはカゼイン等の保護剤、アスコルビン酸、ビタミンＥ等の抗酸化剤、カルボキシメチルセルロース等の結合剤、セルロース、ポロエチレングリコール等の湿潤剤、ポリビニルピロリドン等の懸濁化剤、アルキルスルホン酸等の乳化剤、グリセリン等の溶解補助剤、リン酸塩、トリスヒドキシルアミン塩酸塩等の緩衝剤、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム等の等張化剤、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤などが添加されていても良い。
【００２３】
本発明の測定試薬を用いた測定方法とは、例えば、測定容器に前記測定試薬および試料を添加して攪拌し、前記試料中の測定対象物を不溶性担体に担持した第一の反応特異的成分に捕捉し、捕捉されなかった前記試料中の夾雑成分を除去（１回目のＢ／Ｆ分離）後、不溶性担体を洗浄液にて洗浄し、さらに測定対象物と特異的に反応する第二の反応特異的成分に標識物を結合した標識体を添加して撹拌し、不溶性担体に捕捉した前記測定対象物に対して前記標識体を反応させてサンドイッチ複合体（第一の反応特異的成分−測定対象物−標識体）を形成し、未反応物を除去（２回目のＢ／Ｆ分離）後、前記サンドイッチ複合体に含まれる前記標識体の標識物から生じるシグナルに基づいて前記測定対象物を定量する測定法があげられる。
【００２４】
また、測定容器に前記測定試薬および試料を添加して攪拌し、前記試料中の測定対象物を不溶性担体に担持した反応特異的成分に捕捉し、さらに測定対象物に標識物を結合した標識体を添加して撹拌し、未反応物を除去（Ｂ／Ｆ分離）後、不溶性担体に担持した反応特異的成分に捕捉した前記標識体の標識物から生じるシグナルに基づいて前記測定対象物を定量する測定法もあげられる。
【００２５】
本発明で用いる標識体とは、測定対象物と特異的に反応する反応特異的成分に標識物を標識したもの、あるいは前記測定対象物に標識物を標識したものがあげられ、前記標識物には、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウム誘導体やルミノール誘導体などの発光物質、フルオレセイン誘導体やローダミン誘導体などの蛍光物質などが例示でき、通常の酵素免疫測定法や発光または蛍光免疫測定法などに用いられるものであれば特に制限はない。標識体試薬の形態は、前記担体試薬と同様に溶液で使用してもよく、凍結乾燥して使用してもよい。さらには、前記標識体試薬は前記担体試薬と混合し、同じ容器内で凍結乾燥して使用してもよく、前記標識体試薬と前記担体試薬をそれぞれ別の容器に凍結乾燥して使用してもよい。
【００２６】
本発明の測定試薬の製造方法とは、例えば、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液などの緩衝液で０．１〜１０％（ｗ／ｖ）に濃度調整したウシ血清アルブミン溶液をポリプロピレン製等の容器に入れ、温浴にて５０〜６０℃において１０分〜２４時間加熱処理する工程と、加熱処理したウシ血清アルブミン溶液を室温に戻した後、ゲル浸透クロマトグラフィー用カラムをセットした高速液体クロマトグラフを用いてウシ血清アルブミンの会合成分の分子量画分を分子量範囲３００，０００〜１，０００，０００に入るように分取する工程と、反応特異的成分を不溶性担体に担持する際に用いた緩衝液と同じ組成の緩衝液にて前記会合成分の溶液を０．１〜５．０％（ｗ／ｖ）濃度に調整し、測定対象物を特異的反応により捕捉する一以上の反応特異的成分を担持した不溶性担体を２５〜３７℃において１〜１２時間程度、前記会合成分の溶液に浸漬して不溶性担体をブロッキングする工程と、ブロッキングが終了した前記不溶性担体を０．１〜５０％（ｗ／ｖ）のタンパク質または１〜１０％（ｗ／ｖ）の糖を含む緩衝液にて希釈する工程と、を含む製造方法があげられる
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００２８】
（実施例１）
１．０％のＢＳＡ（フラクションＶ、シグマ製）を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０℃、７時間温浴で加熱し、ＢＳＡの会合成分を含む溶液を得た。これを０．２２μｍフィルターで処理した後、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬゲル浸透クロマトグラフィー用カラムを用いて分離したのち紫外吸光検出器（検出波長２８０ｎｍ）にて検出し、平均分子量約４８０，０００（分子量４００，０００〜５２０，０００の画分）のＢＳＡの会合成分を含む画分（図１の破線枠の部分を分取）を得た。タンパク質濃度は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて測定した。
【００２９】
次に、不溶性担体として磁性微粒子（材質：磁性体含有ビニルポリマーコーティング微粒子、平均粒径２．１μｍ、磁性体の種類：マグネタイト、磁性体の量：３０〜５０％）を０．０１ｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で１％（ｗ／ｖ）スラリー濃度に調整し、抗甲状腺刺激ホルモン抗体（以下、抗ＴＳＨ抗体とする）を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加え、３７℃で１時間インキュベートして抗ＴＳＨ抗体を磁性微粒子に物理吸着した。磁性微粒子を洗浄後、上述したＢＳＡの１．０％会合成分溶液中にて３７℃、７時間インキュベートしてＢＳＡの会合成分を磁性微粒子にブロッキング（物理吸着）し、抗ＴＳＨ抗体固定化磁性微粒子とし、更に５％ウシ血清を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、希釈固相懸濁液を作製し、凍結乾燥して測定試薬とした。
【００３０】
（比較例１）
磁性微粒子のブロッキングを非会合のＢＳＡ（非加熱、単量体の他、一部二量体および三量体を含む）（分子量６６，０００（主画分）〜２００，０００の画分）の１．０％溶液中で行った以外は実施例１と同様の方法で希釈固相懸濁液を作製し、凍結乾燥して測定試薬とした。
【００３１】
（化学発光酵素免疫測定法による評価）
抗ＴＳＨ抗体とアルカリ性ホスファターゼの結合物を、５％ウシ血清を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものを凍結乾燥し、検出用標識抗体試薬（以下、標識抗体試薬とする）とし、５％ウシ血清となるように０．０３ｍｏｌ／Ｌ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈したものをＴＳＨ測定用のゼロ濃度標準溶液（以下、ＴＳＨ標準溶液とする）とした。
【００３２】
図２は実施例１で作製したと比較例１で作製した凍結乾燥品を用いてＴＳＨ標準溶液を化学発光酵素免疫測定法により６０回測定した結果を示す図である。
【００３３】
測定は以下の手順により行った。
測定試薬を、界面活性剤を含む純水およびゼロ濃度のＴＳＨ標準溶液で溶解した後、３７℃にて５分間免疫反応を行い、１回目のＢ／Ｆ分離を行った。次に界面活性剤を含む純水で溶解した標識抗体試薬を加えて３７℃にて３分間免疫反応を行い、２回目のＢ／Ｆ分離を行った。その後、アルカリ性ホスファターゼに対する化学発光基質（ＤＩＦＵＲＡＴ、３−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３，２，０］ヘプト−１−イル）フェニルリン酸エステル ジナトリウム塩）および化学発光補助試薬を加え、発光強度（ｃｏｕｎｔ（ｓ）／ｓｅｃｏｎｄ（ｃｐｓ））を測定した。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2018136179.tif 000003
全６０回測定の中で、比較例１の測定試薬では、３７回目（３６８ｃｐｓ）と４３回目（１，３７５ｃｐｓ）にバックグラウンド平均値（７４．９ｃｐｓ）のそれぞれ約５倍と約１８倍の非特異吸着量に相当するカウント数（偽高値）が得られた。それに比べて、実施例１の測定試薬では、バックグラウンド平均値は４０．６ｃｐｓと比較データに比べ５４％にまで低減して偽高値は検出されず、ＴＳＨ標準溶液における測定の同時再現性（ＣＶ％）は比較データの２３４．７％に比べて１０．７％と大幅に改善されることがわかった。
【図１】
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【図２】
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