(57)【要約】イヌ伝染性呼吸器疾患に罹患したイヌの気道に存在するイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）であって、イヌ腸性コロナウイルスとは低い程度の相同性であるが、ウシコロナウイルスのすべての系統（例えばQuebec及びLY138）及びヒトコロナウイルスOC43系統と高い相同性を持つもの。ＣＲＣＶのスパイク、ポリメラーゼ及び血球凝集素／エステラーゼのｃＤＮＡ及びタンパクの部分配列は図１から４、１３及び１４に示される。
2005533513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパクまたはその断片であって、図４に示されるアミノ酸配列のＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に示すイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）特異的なアミノ酸の少なくとも１を有する、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパクまたはその断片。
【請求項２】
図４に示すアミノ酸配列を有するコロナウイルスのＳタンパク、またはその変体であって図４に示す配列と少なくとも９７％のアミノ酸相同性を持つ変体。
【請求項３】
コロナウイルスのポリメラーゼ（ｐｏｌ）タンパクまたはその断片であって、ＢＣＶのｐｏｌタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有し、ＢＣＶゲノム（アクセス番号ＳＷＡＬＬ：Ｑ９１Ａ２９）の４９７５番に相当する位置にアミノ酸Ｅを有する、コロナウイルスのポリメラーゼ（ｐｏｌ）タンパクまたはその断片。
【請求項４】
図２に示すアミノ酸配列を有する、コロナウイルスのｐｏｌタンパク。
【請求項５】
コロナウイルスの血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）タンパクまたはその断片であって、ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持ち、ＢＣＶのＨＥタンパク（GenBankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）の２３５番のＦ、２４２番のＮ、２５３番のＬのうちの１以上を有する、コロナウイルスの血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）タンパクまたはその断片。
【請求項６】
図１４に示すアミノ酸配列を有するコロナウイルスのＨＥタンパク。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のタンパクをコードするポリヌクレオチド、またはその相補物。
【請求項８】
図３に示す核酸配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
図１に示す核酸配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
図１３に示す核酸配列を有する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７から１０の何れかに記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターによりコードされるタンパクを得る方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞で前記タンパクを発現させることと、前記タンパクを精製すること、を有する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって得ることのできるタンパク。
【請求項１５】
前記ベクターは前記ポリヌクレオチドに作用するように結合された真核生物のプロモーターを有する発現ベクターであり、前記宿主細胞は真核生物の宿主細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチドによりコードされるグリコシル化Ｓタンパクを得る方法であって、前記方法は請求項１５の宿主細胞を培養すること、前記宿主細胞において前記タンパクを発現させることと、前記タンパクを精製すること、を有する方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって得ることのできるグリコシル化Ｓタンパク。
【請求項１８】
抗ＣＲＣＶ抗体を作製する方法であって、（ｉ）動物において請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載のＳタンパクに対する免疫応答を起こさせて、前記動物または前記動物由来の不死細胞から抗体を調製すること、または（ｉｉ）請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載のＳタンパクを用いて抗体ディスプレイライブラリから抗体を選択すること、を有する方法。
【請求項１９】
前記抗体のアフィニティーがＢＣＶのＳタンパクよりもＣＲＣＶのＳタンパクに対して強いかどうかを判別することをさらに有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＲＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーよりも強い、請求項１８または１９記載の方法により得ることのできる抗ＣＲＣＶ抗体。
【請求項２１】
抗ＣＲＣＶ抗体を作製する方法であって、（ｉ）動物において請求項５または６に記載のＨＥタンパクに対する免疫応答を起こさせて、前記動物または前記動物由来の不死細胞から抗体を調製すること、または（ｉｉ）請求項５または６に記載のＨＥタンパクを用いて抗体ディスプレイライブラリから抗体を選択すること、を有する方法。
【請求項２２】
前記抗体のアフィニティーがＢＣＶのＨＥタンパクよりもＣＲＣＶのＨＥタンパクに対して強いかどうかを判別することをさらに有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＲＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーよりも強い、請求項２１または２２記載の方法により得ることのできる抗ＣＲＣＶ抗体。
【請求項２４】
イヌがＣＲＣＶに曝されたかどうかを判別する方法であって、
（ａ）前記イヌから好適な試料を得ることと、
（ｂ）前記試料中のＣＲＣＶまたは抗ＣＲＣＶ抗体を特定すること、
を有する方法。
【請求項２５】
前記抗ＣＲＣＶ抗体はＣＲＣＶ、ＢＣＶ、ヒトコロナウイルス（ＨＣＶ）または赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルスの抗原を用いて検出される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２６】
前記好適な試料は血清、唾液、気管洗液及び細気管支洗液などの抗体を含有する試料であり、抗ＣＲＣＶ抗体の特定することはＢＣＶのＳタンパク(AF058942)、ＨＣＶのＳタンパク(L14643)、またはＣＲＣＶのＳタンパク（図４）と少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクもしくはその断片を持つコロナウイルスに選択的に結合する抗体を特定することを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗ＣＲＣＶ抗体を特定することはＢＣＶのＨＥタンパク(AF058942)、ＨＣＶのＨＥタンパク(M76373)、またはＣＲＣＶのＨＥタンパク（図１４）と少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクもしくはその断片を持つコロナウイルスに選択的に結合する抗体を特定することを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記好適な試料は抗体を含有する試料であり、抗ＣＲＣＶ抗体を特定することは請求項１、２、１１及び１４のいずれかに記載のＳタンパクまたは請求項５もしくは６に記載のＨＥタンパクに選択的に結合する抗体を特定することを有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記好適な試料は、肺洗液、気管洗液、扁桃腺の綿棒採取標本またはイヌの気道から得た生検もしくは死後の試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＲＣＶを特定することはＣＲＣＶの核酸構成物を特定することを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＲＣＶの核酸構成物を特定することは前記ＢＣＶゲノム(AF058942)と非常にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを特定することを有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＲＣＶを特定することは請求項７から１０のいずれかに規定されるポリヌクレオチドを特定することを有する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＲＣＶを特定することはＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することは請求項１、２、５、６、１１及び１４のいずれかに記載のタンパクを特定することを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することはＣＲＣＶと反応する抗体を用いることを有する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＲＣＶに反応する抗体は抗ＢＣＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、または請求項２０または２３に記載の抗ＣＲＣＶ抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗ＣＲＣＶのＳ抗体を検出するための免疫吸着検定法であって、
請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載されるＳタンパクまたは抗原性のあるその断片でコートされた固相であって、前記固相に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＳ抗体は前記タンパクに結合する固相と、
前記固相に結合した前記抗ＣＲＣＶ抗体と結合する検出可能な標識複合体、
を有する検定法。
【請求項３８】
抗ＣＲＣＶのＨＥ抗体を検出するための免疫吸着法であって、
請求項５または６に記載されるＨＥタンパクまたは抗原性のあるその断片でコートされた固相であって、前記固相に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＨＥ抗体は前記タンパクに結合する固相と、
前記固相に結合した前記抗ＣＲＣＶ抗体と結合する検出可能な標識複合体
を有する検定法。
【請求項３９】
前記固相はマイクロタイターウェルである、請求項３７または３８に記載の免疫吸着検定法。
【請求項４０】
前記複合体は抗イヌ抗体を有する、請求項３７または３８に記載の免疫吸着検定法。
【請求項４１】
前記複合体は酵素を有する、請求項３７から４０のいずれかに記載の免疫吸着検定法。
【請求項４２】
前記酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼである、請求項４１に記載の免疫吸着検定法。
【請求項４３】
前記酵素の基質をさらに有する、請求項４１または４２に記載の免疫吸着検定法。
【請求項４４】
請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載のＳタンパクまたは抗原性のあるその断片を付着させた、液体試料から抗ＣＲＣＶのＳ抗体を捉えるための固体基質であって、前記固体基質に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＳ抗体は前記Ｓタンパクに結合する、固体基質。
【請求項４５】
請求項５または６に記載のＨＥタンパクまたは抗原性のあるその断片を付着させた、液体試料から抗ＣＲＣＶのＨＥ抗体を捉えるための固体基質であって、前記固体基質に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＨＥ抗体は前記ＨＥタンパクに結合する、固体基質。
【請求項４６】
前記固体基質はマイクロタイターウェルである、請求項４４または４５に記載の固体基質。
【請求項４７】
イヌに免疫するためのワクチン構成物であって、ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有するＳタンパクを持つコロナウイルス、またはＢＣＶタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または前記コロナウイルスタンパクをコードする核酸もしくは免疫原性のあるその断片を有する、ワクチン構成物。
【請求項４８】
前記コロナウイルスタンパクはＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶもしくはＣＲＣＶタンパク、またはその改変物である、請求項４７に記載のワクチン構成物。
【請求項４９】
前記コロナウイルスタンパクはＳタンパクである、請求項４７または４８に記載のワクチン構成物。
【請求項５０】
請求項４９に記載のワクチン構成物であって、請求項１、２、１４または１７のいずれかに記載のＳタンパク、またはＢＣＶのＳタンパク、またはＨＣＶのＳタンパク、またはＨＥＶのＳタンパク、または免疫原性のあるその断片を有する、ワクチン構成物。
【請求項５１】
前記コロナウイルスタンパクは血球凝集素−エステラーゼタンパク（ＨＥ）または膜内在タンパク（Ｍ）である、請求項４７または４８に記載のワクチン構成物。
【請求項５２】
請求項５１に記載のワクチン構成物であって、前記ＨＥタンパクは請求項５または６に規定されるＨＥタンパク、ＢＣＶのＨＥタンパク、ＨＣＶのＨＥタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片である、ワクチン構成物。
【請求項５３】
前記ウイルスはＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ及びＣＲＣＶ、またはそれらの改変物から選択される、請求項４７に記載のワクチン構成物。
【請求項５４】
医薬として使用可能なアジュバントをさらに有する、請求項４７から５３のいずれかに記載のワクチン構成物。
【請求項５５】
請求項４７から５５のいずれかに記載のワクチン構成物であって、
（ａ）イヌにおいてイヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）に対する免疫応答を起こすことのできる試薬、
（ｂ）イヌにおいてイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）に対する免疫応答を起こすことのできる試薬、
（ｃ）イヌにおいてイヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）に対する免疫応答を起こすことのできる試薬、
（ｄ）イヌにおいてBordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica)に対する免疫応答を起こすことのできる試薬、
のいずれか１以上をさらに有するワクチン構成物。
【請求項５６】
イヌにおけるＣＲＣＶに対す免疫応答を刺激するための薬剤の調製における使用であって、（ｉ）ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有するＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉ）ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有するＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉｉ）ＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｖ）ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｖ）ＣＲＣＶタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉ）ＢＣＶタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉｉ）前記コロナウイルスタンパクをコードする核酸もしくは免疫原性のあるその断片、の使用。
【請求項５７】
イヌにおける呼吸器疾患の予防のための薬剤の調製における使用であって、（ｉ）ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有するＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉ）ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を有するＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉｉ）ＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｖ）ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を有するＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｖ）ＣＲＣＶタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉ）ＢＣＶタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉｉ）前記コロナウイルスタンパクをコードする核酸もしくは免疫原性のあるその断片、の使用。
【請求項５８】
前記コロナウイルスタンパクはＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶもしくはＣＲＣＶタンパク、またはそれらの改変物である、請求項５６または５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記コロナウイルスタンパクはＳタンパクである、請求項５６から５８のいずれかに記載の使用。
【請求項６０】
前記Ｓタンパクは請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載のＳタンパク、ＢＣＶのＳタンパク、ＨＣＶのＳタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片である、請求項５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記コロナウイルスタンパクはＨＥまたはＭである、請求項５６から５８のいずれかに記載の使用。
【請求項６２】
前記ＨＥタンパクは請求項５または６に記載のＨＥタンパク、ＢＣＶのＨＥタンパク、ＨＣＶのＨＥタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
前記ウイルスはＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ及びＣＲＣＶまたはそれらの改変物から選択される、請求項５６に記載の使用。
【請求項６４】
医薬としての使用のための、請求項１、２、１４及び１７のいずれかに記載のＳタンパク。
【請求項６５】
医薬としての使用のための、請求項５または６に記載のＨＥタンパク。
【請求項６６】
ＣＲＣＶに対してイヌを免疫する方法であって、前記イヌに請求項４７から５４に記載のいずれかに記載のワクチン構成物を投与することを有する、方法。
【請求項６７】
イヌの間でのＣＲＣＶの蔓延と戦う方法であって、イヌがＣＲＣＶに感染しているかどうかを請求項２４から３６のいずれかに記載の方法によって判別することと、前記イヌがＣＲＣＶに感染しているのであれば前記イヌを隔離することを有する方法。
【請求項６８】
イヌの間でのＣＲＣＶの蔓延と戦う方法であって、イヌがＣＲＣＶに感染しているかどうかを請求項２４から３６のいずれかに記載の方法によって判別することと、前記イヌがＣＲＣＶに感染しているのであれば前記イヌと接していた、接している、または接しているかもしれない他のイヌに予防接種すること、を有する方法。
【請求項６９】
イヌにおいてイヌ伝染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）を予防することができる試験ワクチンを特定するための方法であって、
（ａ）請求項２４から３６のいずれかに記載の方法によってイヌがＣＲＣＶに曝されたかどうか判別することと、
（ｂ）前記イヌがＣＲＣＶに曝されていなかったのであれば前記イヌに前記テストワクチンを投与することと、
（ｃ）前記イヌにＣＲＣＶを接種することと、
（ｄ）前記イヌがＣＩＲＤを発症するかどうかを判別すること、
を有し、前記工程（ｄ）においてＣＩＲＤが確認されないことによって前記テストワクチンがＣＩＲＤを予防することができることを示唆される、方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法により特定されるワクチン。
【請求項７１】
挿入部分がＣＲＣＶのＳのｃＤＮＡの一部分を含むプラスミドを含有するSpike D-1 CRCV系統の大腸菌であって、２００２年７月２５日にザロイヤルヴェテリネリカレッジによりＮＣＩＭＢに寄託されたアクセス番号ＮＣＩＭＢ４１１４６の大腸菌。
【請求項７２】
２００２年７月２５日にザロイヤルヴェテリネリカレッジによりＮＣＩＭＢに寄託されたアクセス番号ＮＣＩＭＢ４１１４６であるSpike D-1 CRCV系統の大腸菌に含まれるプラスミド。
【請求項７３】
請求項３７から４３のいずれかに記載の免疫吸着検定法のためのキットであって、固相と、固相をコーティングするためのＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク及び／またはＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＨＥタンパクと、検出可能な標識複合体とを有するキット。
【請求項７４】
前記固相はマイクロタイタープレートを有する、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
前記検出可能な標識複合体は抗イヌ抗体を有する、請求項７３または７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記検出可能な標識複合体は酵素を有する、請求項７３または７４に記載のキット。
【請求項７７】
前記酵素に対する基質をさらに有する請求項７６に記載のキット。
【請求項７８】
抗ＣＲＣＶのＳタンパク抗体及び／または抗ＣＲＣＶのＨＥタンパク抗体を含有するポジティブコントロール試料をさらに有する、請求項７３から７７のいずれかに記載のキット。
【請求項７９】
イヌをＣＲＣＶに対して受動的に免疫する方法であって、ＣＲＣＶと反応する抗体を前記イヌに投与することを有する方法。
【請求項８０】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は抗ＢＣＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、または抗ＣＲＣＶ抗体を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は抗Ｓタンパク抗体または抗ＨＥタンパク抗体を有する、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は請求項２０から２３の何れかに記載の抗ＣＲＣＶ抗体を有する、請求項７９から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
イヌをＣＲＣＶに対して受動的に免疫する薬剤の調製における、ＣＲＣＶと反応する抗体の使用。
【請求項８４】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は抗ＢＣＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、または抗ＣＲＣＶ抗体である、請求項８３に記載の使用。
【請求項８５】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は抗Ｓタンパク抗体または抗ＨＥタンパク抗体である、請求項８３または８４に記載の使用。
【請求項８６】
前記ＣＲＣＶと反応する抗体は請求項２０から２３のいずれかに記載の抗ＣＲＣＶ抗体を有する、請求項８３から８５のいずれかに記載の使用。
【請求項８７】
ＣＩＲＤの診断方法であって、請求項２４から３６のいずれかに規定される方法によってイヌがＣＲＣＶに曝されたかどうかを判別することを有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物材料に関し、特にイヌ感染性呼吸器疾患のイヌが持つイヌ呼吸器コロナウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌ感染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）は、救助施設（re-homing center）や宿泊所または訓練施設などの過密な状況で飼育されるイヌによく見られる高い伝染性を有する病気である。多くのイヌは弱い咳のみを呈し短期間で回復するが、中には重い気管支炎に発展する場合もある（Appel and Binn, 1987）。
【０００３】
ＣＩＲＤの病因は多岐にわたると考えられており、数種のウイルスやバクテリアが含まれる。感染性のある、ＣＩＲＤの原因となる主な病原体としては、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）（Binn et al., 1967）、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）（Ditchfield et al., 1962）、及びバクテリアのBordetella bronchiseptica（Bemis et al., 1977, Keil et al., 1998）が考えられている。また、イヌヘルペスウイルス、ヒトレオウイルス及びマイコプラズマ類がＣＩＲＤの症状を示すイヌから単離されている（Karpas et al., 1968, Lou and Wenner 1963, Randolph et al., 1993）。ストレス等のその他の要素もまた重要となるかもしれない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＣＩＲＤが致命的となることは希であるが、ＣＩＲＤにより相当な治療費用がかかるだけでなく、イヌが救助施設から家に戻るのが遅くなったり、訓練施設でのスケジュールが乱れたりする。
【０００５】
この病気に関する病原体のいくつか、すなわちＣＰＩＶ及びＣＡＶ−２並びにBordetella bronchisepticaについては、ワクチンが利用可能である。しかしながら、こうしたワクチンの利用にもかかわらず、ＣＩＲＤは依然として世界規模で飼育施設において流行している。これは、おそらくワクチンがＣＩＲＤに含まれるすべての病原体に対する予防作用をもたらすものではないためと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
我々は、特有な呼吸器疾患の経歴がある大規模なイヌ飼育施設において新規なコロナウイルスを発見し、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）と命名した。そして、このウイルスがＣＩＲＤに関連することを示した。
【０００７】
コロナウイルス科のファミリーのいくつかは、ヒト、ウシ、ブタ及び家禽の呼吸器疾患の原因となることが知られている（Makela et al., 1998, Pensaert et al., 1986, Ignjatovic and Sapats 2000）。例えば、ウシ呼吸器コロナウイルスは多因性の呼吸器疾患であるウシの輸送熱に関連している（Storz et al., 2000）。
【０００８】
しかしながら、コロナウイルスはＣＩＲＤの病因の一因として疑われていなかった。実際、たったひとつの例外を除いて、イヌコロナウイルスは腸性ウイルスであり、主に若いイヌにおける急性の下痢の原因であると報告されている（例えばTennant et al., 1993）。大規模なイヌ呼吸器疾患に関連するウイルスの研究において、Binnら(1979)は一匹のイヌの肺からイヌコロナウイルスをしたが、そのイヌはＳＶ５及びイヌアデノウイルス２型にも感染しており、イヌコロナウイルスの他に２種のウイルスを伴っていた。
【０００９】
イギリスでは、神経、腸性、肝臓及び呼吸器等の疾患の原因となる種々の病原体に対する３０〜４０のイヌワクチンが市販されている。これらのワクチンのほとんどは、ジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、並びにLeptospira canicola及びL. icterohaemorrhagiaeなどの微生物試薬を含有している。これらのワクチンのいずれもイヌコロナウイルスを含有していない。
【００１０】
イヌ呼吸器疾患に用いられるイヌワクチンは、“ケンネルコフ”用のワクチンとして市販されている（下記参照）。そうしたワクチンはすべて“ケンネルコフ”に関連するバクテリアであるBordetella bronchisepticumを含有している。
【００１１】
Coyne M.J. 及び May S.W., (1995)は、著書"Considerations in using a canine coronavirus vaccine" (published as a Pfizer Technical Bulletin on the Internet at http://www.pfizer.com/ah/vet/tref/trbull/ ccv.html)の中で、イヌコロナウイルス単体あるいはイヌコロナウイルスとその他に対するワクチンとして市販される２０種以上のワクチンを列挙している。これらのワクチンはそれぞれイヌ腸性疾患に対するものであり、イヌコロナウイルスが呼吸器疾患に関連する可能性を示唆するものは無い。
【００１２】
Millerらによるファイザー社のUS Patents Nos. 6,057,436 and 6,372,224には、腸性コロナウイルスのスパイク遺伝子と、胃腸性炎のワクチンとしての使用などのその使用について記載されている。これら２つの特許のいずれもイヌコロナウイルスがＣＩＲＤに関連する可能性を示唆していない。
【００１３】
コロナウイルス科のファミリーは直径８０〜１６０ｎｍの被膜ウイルスで、直鎖状プラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。コロナウイルスの構造タンパクは、スパイク糖タンパク（Ｓ）、膜糖タンパク（Ｍ）、及びヌクレオカプシドタンパク（Ｎ）である。血球凝集素／エステラーゼ糖タンパク（ＨＥ）は２属のコロナウイルスの表面でのみ発見されている（例えばウシコロナウイルス及びネズミ肝炎ウイルス）（Spaan et al, 1988）。コロナウイルス類の詳細な構造については、the chapter by Cavanagh et al entitled "Coronviridae" p407-411, in "Virus Taxonomy, 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses", pub. Springer-Verlag Wein, New York, Eds. Murphy et alに記載されており、これは参照により組み入れられる。
【００１４】
本発明のイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）は、伝染性の呼吸器疾患をもつイヌの呼吸器系に存在するコロナウイルスとして特徴としてもよい。さらにＣＲＣＶの特徴として、我々はＣＲＣＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）ｃＤＮＡの２５０残基の塩基配列を決定した（図１及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）。これはｐｏｌタンパクにおける８３の部分アミノ酸配列に相当する（図２及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。また、我々はＣＲＣＶスパイク（Ｓ）ｃＤＮＡの４０９２残基の塩基配列をクローニング及び決定した（図３及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）。これは１３６３のアミノ酸に相当する（図４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。また、我々はＣＲＣＶ血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子の４９７残基の塩基配列を決定した（図１３及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）。これは１６５のアミノ酸に相当する（図１４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）。我々はＣＲＣＶが腸性性のイヌコロナウイルス（ＣＣＶ）と驚くべき低い相同性を持ち、一方でウシコロナウイルス（LY138またはQuebec系統）及びヒトコロナウイルス（OC43系統）と予期せぬ高い相同性を持つことを突き止めた。
【００１５】
ＣＲＣＶスパイクｃＤＮＡの一部を挿入したｐＴ７Ｂｌｕｅ２プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含むＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸性菌（ストラタジーン）である“ＳｐｉｋｅＤ−１ＣＲＣＶ”の培養菌は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１１４６としてブダペスト条約に基づき２００２年７月２５日にＮＣＩＭＢ社に寄託されている。ＮＣＩＭＢ４１１４６の寄託者はザロイヤルヴェテリネリカレッジ（Royal College Street, London NW1 OTU, UK）である。ＮＣＩＭＢ社の住所は23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK.である。
【００１６】
ＣＲＣＶｐｏｌ遺伝子と他のウイルスの対応する部分との比較に基づいて、ＣＲＣＶと１１の公知のコロナウイルスとの系統発生上の関係を決定した（図５）。ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ヒトコロナウイルス（ＨＣＶ）OC43系統及び血球凝集を起こさせる脳脊髄炎ウイルス（ＨＥＶ）が最もＣＲＣＶと相関していたが、一方で腸性ＣＣＶはＣＲＣＶと遠く関係しているにすぎないことが分かった。
【００１７】
図６及び７に示すように、配列が決定されたｐｏｌｃＤＮＡの２５０残基及び対応する８３のアミノ酸について、ＣＲＣＶは腸性ＣＣＶ（１−７１系統）ｐｏｌ遺伝子（Genbankアクセス番号ＡＦ１２４９８６）の同一の領域に対してヌクレオチド及びアミノ酸レベルでそれぞれ６８、５％及び７５．９％の相同性しかもたない。
【００１８】
配列が決定されたＣＲＣＶのＳ遺伝子の４０９２ヌクレオチド残基及び対応する１３６３のアミノ酸について、ＣＲＣＶは腸性ＣＣＶ（１−７１系統）Ｓ遺伝子の同一の領域に対してヌクレオチド及びアミノ酸レベルでそれぞれ４５％及び２１．２％の相同性しかもたない（図８）。
【００１９】
腸性ＣＣＶはＩＩ属のコロナウイルスではないため、ＨＥ遺伝子を持たない。従ってＣＲＣＶのこの遺伝子の腸性ＣＣＶに対する配列相同性を決定することは不可能である。
【００２０】
以下の場合を除き、２のヌクレオチドまたは２のアミノ酸配列間の相同性％はＦＡＳＴＡ  ｖｅｒｓｉｏｎ３４（Pearson WR. (1990) "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA". Methods Enzymol.;183:63-98）を用いて決定した。ＦＡＳＴＡの設定はGap open penaltyを-16及びGap extension penaltyを-4とした。
【００２１】
ＣＲＣＶと腸性ＣＣＶのスパイク配列の相同性％はＧＣＧｖｅｒｓｉｏｎ１０（Genetics Computer Group, (1991), Program Manual for the GCG Package, Version 7, April 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）を用いて決定した。使用したＧＣＧのパラメータは以下の通りである。ＤＮＡについてGap creation penalty 50、及びgap extension penalty 3、並びにタンパク質についてGap creation penalty 8、及びGap extension penalty 2。
【００２２】
配列解析はＣｌｕｓｔａｌ  Ｘにより行った（Thompson et al., 1997）。
【００２３】
対照的に、ｐｏｌｃＤＮＡの２５０残基の配列について、ＣＲＣＶはＢＣＶのQuebec系統のｐｏｌ遺伝子（Genbankアクセス番号ＡＦ２２０２９５）と９８．８％の配列相同性、ＢＣＶのLY138系統のｐｏｌ遺伝子（Genbankアクセス番号ＡＦ１２４９８５）と９８．４％の相同性、及びＨＣＶ OC43のｐｏｌ遺伝子（Genbankアクセス番号ＡＦ１２４９８９）と９８．４％の配列相同性を持っていた。
【００２４】
ＣＲＣＶｐｏｌタンパクの８３のアミノ酸配列とＢＣＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶｐｏｌタンパクとの間には、１のアミノ酸の違いしか無く、ＣＲＣＶにおいて、ＢＣＶゲノム（アクセス番号ＳＷＡＬＬ：Ｑ９１Ａ２９）における４９７５番に対応する部位がＤ（Ａｓｐ）ではなくＥ（Ｇｌｕ）であった。従って、ＣＲＣＶｐｏｌタンパクは、この領域においてＢＣＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶｐｏｌタンパクと９９％相同する。
【００２５】
ここではＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の１字及び３字のアミノ酸コードを用いる。
【００２６】
ＨＥ遺伝子の決定された４９７ヌクレオチド残基及び対応する１６５のアミノ酸において、ＣＲＣＶはＢＣＶのLY138系統（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）の同一の領域に対してヌクレオチド及びアミノ酸レベルでそれぞれ９８．９９４％及び９８．２％の配列相同性を持っていた。ＣＲＣＶは、ヒト腸性コロナウイルス（ＨＥＣＶ）のＨＥ遺伝子（Genbankアクセス番号Ｌ０７７４７）と９８．１８９％（ヌクレオチド）及び９８．２％（アミノ酸）；ＨＣＶ  OC43のＨＥ遺伝子（Genbankアクセス番号Ｍ７６３７３）と９７．４％（ヌクレオチド）及び９５．２％（アミノ酸）；及びＨＥＶ（Genbank アクセス番号ＡＦ４８１８６３）と９２．０％（ヌクレオチド）及び９３．９％（アミノ酸）の配列相同性をそれぞれ持っていた。
【００２７】
図１６及び表３に示すように、ＣＲＣＶのＨＥタンパクの１６５のアミノ酸において、ＣＲＣＶのＨＥタンパクとＢＣＶ、ＨＥＣＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶのＳタンパクとの間の３のアミノ酸配列の違いは、ＢＣＶ、ＨＥＣＶ、ＨＣＶ  OC43及びＨＥＶ  ＨＥ遺伝子の２３５、２４２及び２５３番に対応する部位において、それぞれにＬ（Ｌｅｕ）対しＦ（Ｐｈｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）に対しＮ（Ａｓｎ）、及びＶ（Ｖａｌ）に対しＬ（Ｌｅｕ）であった。従って２３５番のＦ、２４２番のＮ及び２５３番のＬがＣＲＣＶのＨＥタンパク特異的なアミノ酸と言うことができる。
【００２８】
ＣＲＣＶのＳ遺伝子の決定された４０９２ヌクレオチド残基及び対応する１３６３のアミノ酸において、ＣＲＣＶはＢＣＶのLY138系統（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）の同一の領域に対してヌクレオチド及びアミノ酸レベルでそれぞれ９７．３％及び９６％の配列相同性を持っていた。図９及び１０に示すように、ＣＲＣＶはOC43系統のＨＣＶ (Genbankアクセス番号 Ｚ３２７６８)と９６．９％（ヌクレオチド）及び９５．２％（アミノ酸）、及びＨＥＶ（Genbankアクセス番号ＡＦ４８１８６３（ｃＤＮＡ）及びＡＡＭ７７０００（タンパク）)と８３．８％（ヌクレオチド）及び８０．４％（アミノ酸）の配列相同性をそれぞれ持っていた。
【００２９】
ＣＲＣＶのＳタンパクにおける１３６３のアミノ酸について、ＣＲＣＶのＳタンパクとＢＣＶ、ＨＣＶ、及びＨＥＶ  Ｓタンパクのそれぞれとの間で異なるアミノ酸を以下の表１に列挙する。従って、表１に列挙されるアミノ酸がＣＲＣＶのＳタンパク特異的なアミノ酸であると言うことができる。アミノ酸はＣＲＣＶタンパクの最初のＭ残基を始点として、図４に示されるような番号が付されている。
【表１】
2005533513.tif 000003
【００３０】
本発明の第１の側面は、コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片であって、表４に示すアミノ酸配列のＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％の配列相同性を有し、少なくとも１０３番のＶ、１１８番のＶ、１６６番のＤ、１７１番のＭ、１７９番のＫ、１９２番のＰ、２１０番のＳ、２３５番のＨ、２６７番のＦ、３８８番のＦ、４０７番のＭ、４３６番のＳ、４４０番のＩ、４４７番のＩ、５０１番のＦ、５２５番のＹ、５２８番のＮ、５４０番のＬ、５８２番のＫ、６０８番のＧ、６９２番のＧ、６９５番のＳ、７５７番のＷ、７５８番のＧ、７６３番のＱ、７６９番のＴ、７８６番のＰ、７９２番のＨ、８１８番のＲ、８２７番のＰ、８２８番のＶ、８８７番のＦ、９３３番のＤ、９７７番のＦ、１０１１番のＴ、１０１８番のＳ、１０６３番のＫ、１２５６番のＬ、及び１２５７番のＭのうち少なくとも１を有するものである。アミノ酸は、表４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示されるようにＣＲＣＶのＳタンパクの最初のＭを始点として番号が付されている。
【００３１】
当然ながら、ＣＲＣＶのＳタンパクの部分ヌクレオチド配列は、Ｄ−１ＣＲＣＶ系統の大腸性菌に含まれるプラスミドの挿入配列をシークエンスすることにより、当業者であれば容易に決定することができる。この大腸性菌は、寄託番号ＮＣＩＭＢ４１１４６としてブダペスト条約に基づき２００２年７月２５日にＮＣＩＭＢ社に寄託されている。さらにこのＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブまたはプローブ設計の基礎として、イヌにおけるＣＲＣＶ核酸の単離に用いることができる。
【００３２】
念のためではるが、本発明は、コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片であって、表４に示すアミノ酸配列のＣＲＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と少なくとも７５％の配列相同性を有し、少なくとも表１に列挙する位置のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸のうち少なくとも１を有するものである。
【００３３】
“タンパク”には糖タンパクの意味も含まれる。糖タンパクのアミノ酸配列は、糖タンパクのポリペプチド主鎖の配列であり、そこに付属する糖の型、数、配列及び位置とは無関係である。
【００３４】
典型的には、本発明は単離されたタンパクまたは組み換えタンパクを含み、ＣＲＣＶ構成部分として存在する改変されていないＣＲＣＶタンパクを含まない。
【００３５】
本発明はコロナウイルスのＳタンパク及びその断片であって、ＣＲＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と少なくとも７６％のアミノ酸配列相同性を有し、またはＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に列挙する位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するものを包含する。
【００３６】
また、本発明は、コロナウイルスのＳタンパク及びその断片であって、ＣＲＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と少なくと７５％、少なくと８０％、少なくと８５％、少なくと９０％、または少なくと９５％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に列挙する位置に置いて少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、または少なくとも３８のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するものを包含する。
【００３７】
好ましくは、コロナウイルスＳタンパクまたはその断片は、表１に列挙する位置においてＣＲＣＶのＳタンパクに特異的な３９のアミノ酸残基のすべてを有する。
【００３８】
従って、本発明はＢＣＶ、ＨＣＶもしくはＨＥＶのＳタンパクまたはその断片であって、表１に列挙する位置の内すくなくとも１の位置においてＣＲＣＶのＳタンパクに近づくよう改変されているものを包含する。
【００３９】
好ましくは、本発明のコロナウイルスＳタンパクは図４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示す配列または前記配列と少なくとも９７％の相同性を持つその変体を有するまたはのみからなるＣＲＣＶのＳタンパクである。好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する。より好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸配列相同性を有する。
【００４０】
従って、本発明のコロナウイルスＳタンパクの変体は図４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示す配列を有するまたはのみからなるが、図４に示す配列と１から４０個のアミノ酸の違いがある。好ましくは、前記変体は図４に示す配列と４０未満のアミノ酸の違いを有する。より好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも３５、少なくとも３０、少なくとも２５、少なくとも２０、少なくとも１５、または少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、もしくは２のアミノ酸の違いを有し、または１のアミノ酸の違いを有する。
【００４１】
また、本発明は図４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示す配列の断片であり、表１に示す位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するＣＲＣＶのＳタンパクの断片を包含する。
【００４２】
本発明は、コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４、Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有し、少なくとも１０３番のＶ、１１８番のＶ、１６６番のＤ、１７１番のＭ、１７９番のＫ、１９２番のＰ、２１０番のＳ、２３５番のＨ、２６７番のＦ、３８８番のＦ、４０７番のＭ、４３６番のＳ、４４０番のＩ、４４７番のＩ、５０１番のＦ、５２５番のＹ、５２８番のＮ、５４０番のＬ、５８２番のＫ、６０８番のＧ、６９２番のＧ、６９５番のＳ、７５７番のＷ、７５８番のＧ、７６３番のＱ、７６９番のＴ、７８６番のＰ、７９２番のＨ、８１８番のＲ、８２７番のＰ、８２８番のＶ、８８７番のＦ、９３３番のＤ、９７７番のＦ、１０１１番のＴ、１０１８番のＳ、１０６３番のＫ、１２５６番のＬ、及び１２５７番のＭのうち少なくとも１を有するものを包含する。
【００４３】
念のためではあるが、本発明はLY138系統のＢＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）と少なくとも７５％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に示す位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するコロナウイルスのＳタンパクまたはその断片を包含する。
【００４４】
本発明は、コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７６％のアミノ酸配列相同性、または少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に示す位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するものを包含する。
【００４５】
本発明は、コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのＳタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）と少なくと７５％、少なくと８０％、少なくと８５％、少なくと９０％、または少なくと９５％のアミノ酸配列相同性を有し、表１に示す位置において少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、または少なくとも３８のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するものを包含する。
【００４６】
好ましくは、前記コロナウイルスのＳタンパクまたはその断片は表１に示す位置における３９のすべてのＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸残基を有する。
【００４７】
本発明の第２の側面は、コロナウイルスのｐｏｌタンパクまたはその断片であって、ＢＣＶのｐｏｌタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有し、ＢＣＶゲノム（アクセス番号ＳＷＡＬＬ：Ｑ９１Ａ２９）の４９７５番に相当する位置にアミノ酸Ｅを有するものである。
【００４８】
本発明は、コロナウイルスｐｏｌタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのｐｏｌタンパクと少なくとも９１％のアミノ酸配列相同性、またはLY138系統のＢＣＶのｐｏｌタンパクと少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、ＢＣＶゲノム（アクセス番号ＳＷＡＬＬ：Ｑ９１Ａ２９）の４９７５番に相当する位置にアミノ酸Ｅを有するものを包含する。
【００４９】
好ましくは、前記コロナウイルスのｐｏｌタンパクまたはその断片は、図２に示すアミノ酸配列を有するまたはのみからなるＣＲＣＶｐｏｌタンパクまたはその断片である。
【００５０】
従って、本発明はＢＣＶ、ＨＣＶまたはＨＥＶのｐｏｌタンパクまたはその断片であって、ＢＣＶゲノムの９４７５番に相当するアミノ酸がＣＲＣＶのｐｏｌタンパクに近づくよう改変されているものを包含する。
【００５１】
また、本発明は図２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）に示す配列の断片を有するＣＲＣＶのｐｏｌタンパクの断片であり、ＢＣＶゲノムの４９７５番に相当する位置にアミノ酸Ｅを有するものを包含する。
【００５２】
本発明の第３の側面は、コロナウイルスのＨＥタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのｐｏｌタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有し、２３５番のＦ、２４２番のＮ、及び２５３番のＬの少なくとも１を有するものである。アミノ酸はＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭ（１番となる）を始点として番号が付されている。
【００５３】
本発明は、コロナウイルスのＨＥタンパクまたはその断片であって、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９１％のアミノ酸配列相同性、またはLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、２３５番のＦ、２４２番のＮ、及び２５３番のＬの少なくとも１を有する。アミノ酸はＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭ（１番となる）を始点として番号が付されている。
【００５４】
本発明は、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性、またはLY138系統のＢＣＶのｐｏｌタンパクと少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、２３５番のＦ、２４２番のＮ、及び２５３番のＬのうちの２を有する。アミノ酸はＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭ（１番となる）を始点として番号が付されている。
【００５５】
本発明は、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９１％のアミノ酸配列相同性、またはLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有し、２３５番のＦ、２４２番のＮ、及び２５３番のＬのうちの３個すべてを有する。アミノ酸はＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭ（１番となる）を始点として番号が付されている。
【００５６】
好ましくは、前記コロナウイルスのＨＥタンパクまたはその断片は、図１４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）に示すアミノ酸配列を有するまたはのみからなるＣＲＣＶのＨＥタンパクまたはその断片である。
【００５７】
従って、本発明はＢＣＶ、ＨＣＶもしくはＨＥＶのＨＥタンパクまたはその断片であり、２３５番、２４２番または２５３番に相当するアミノ酸の１以上がＣＲＣＶのＨＥタンパクに近づくよう改変されているものを包含する。
【００５８】
また、本発明は図１４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）に示す配列の断片を有するＣＲＣＶのＨＥタンパクの断片であり、２３５番のＬ、２４２番のＮまたは２５３番のＬの１以上を有する。これらのアミノ酸の番号は、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と対応し、残基の番号１はLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭを始点とする。
【００５９】
ここでは、上記本発明の第１、第２及び第３の側面のコロナウイルスのＳ、ｐｏｌ及びＨＥタンパクを“ＣＲＣＶ”または“ＣＲＣＶ様”タンパクとする。
【００６０】
“ＣＲＣＶのＳタンパク”とは、図４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示す天然のＣＲＣＶのＳのアミノ酸配列、または表１に示す位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するその断片の配列を有する、Ｓタンパクまたはその断片である。
【００６１】
“ＣＲＣＶのｐｏｌタンパク”とは、図２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）に示す天然のＣＲＣＶのｐｏｌのアミノ酸配列またはＢＣＶゲノムの４９７５番に相当する位置にアミノ酸Ｅを有するその断片の配列を有する、ｐｏｌタンパクまたはその断片である。
【００６２】
“ＣＲＣＶのＨＥタンパク”とは、図１４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）に示す天然のＣＲＣＶのＨＥタンパクのアミノ酸配列または２３５番のＦ、２４２番のＮ及び２５３番のＬの少なくとも１を有するその断片の配列を有する、ＨＥタンパクまたはその断片である。これらのアミノ酸番号はLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と対応しており、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭを１番の残基としている。
【００６３】
“ＣＲＣＶ様Ｓタンパク”とは、天然のＣＲＣＶのＳアミノ酸配列（図４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と同一のアミノ酸配列ではないが、ＣＲＣＶまたはLY138系統のＢＣＶのＳタンパクに対応する領域と少なくとも７５％の配列相同性を持ち、表１に示す位置において少なくともも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するＳタンパクまたはその断片である。
【００６４】
また、“ＣＲＣＶ様Ｓタンパク”には、天然のＣＲＣＶのＳアミノ酸配列（図４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と同一のアミノ酸配列ではないが、表４に示す配列と少なくとも９７％の相同性を有する表４に示す配列の変体を有するあるいはのみからなるＳタンパクも含まれる。好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する。より好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸配列相同性を有する。
【００６５】
“ＣＲＣＶ様ｐｏｌタンパク”とは、天然のＣＲＣＶのｐｏｌアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列ではないが、ＣＲＣＶまたはLY138系統のＢＣＶのｐｏｌタンパクの対応する領域と少なくとも９０％の配列相同性を持ち、ＢＣＶゲノムの４９７５番に対応する位置にＥを有するｐｏｌタンパクまたはその断片である。
【００６６】
“ＣＲＣＶ様ＨＥタンパク”とは、天然のＣＲＣＶのＨＥアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列ではないが、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクの対応する領域と少なくとも９０％の配列相同性を持ち、２３５番のＦ、２４２番のＮ及び２５３番のＬのうちの１以上を有するＨＥタンパクまたはその断片である。これらの３のアミノ酸の番号はLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）において、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭを１番の残基とするアミノ酸番号に対応する。
【００６７】
好ましくは、ＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様タンパク、またはその断片は、少なくともアミノ酸１０個の長さである。より好ましくは、ＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様タンパク、またはその断片は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個のアミノ酸の長さである。
【００６８】
好ましくは、ＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様タンパク、またはその断片は、アミノ酸１３００個未満の長さである。より好ましくは、ＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様タンパク、またはその断片は、約１２００未満、約１１００未満、約１０００未満、約９００未満、約８００未満、約７００未満、約６００未満、約５００未満、約４００未満、約３００未満、約２００未満、約１００未満または約５０未満のアミノ酸の長さである。
【００６９】
ＣＲＣＶタンパクはＣＲＣＶから単離されてもよく、または例えば単離したタンパクの部分分解などのタンパク化学的な方法を用いて作製されてもよく（末端分解でも内分解でも良い）、または新たに合成されるものでもよい。あるいは、ＣＲＣＶ様タンパクだけでなくＣＲＣＶタンパクは、組み換えＤＮＡ技術により作製されてもよい。核酸のクローニング、取り扱い、修飾及び発現、並びに発現したタンパクの精製に好適は公知であり、例えば参照により組み込まれるSambrook et al (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3rd edition, Sambrook et al (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されている。
【００７０】
ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様タンパクのより短い断片、即ちペプチドは、一般的な方法によって合成して良い。ペプチドはLu et al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433及びそこでの参照において記載される固相ペプチド合成のＦｍｏｃポリアミド法により合成して良い。Ｎ−アミノ類は、９−フルオロレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）類により一時的に保護される。この塩不安定な保護基は２０％ピペリジンのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液の作用により反復的に開裂する。側鎖の官能性は、そのブチルエーテル（セリン、トレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアスパラギン酸の場合）、ブチロキシカルボニル誘導体（リシン及びヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、及び４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルフォニル誘導体（アルギニンの場合）として保護してもよい。ここで、グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端基である場合、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル基が側鎖アミノ官能性を保護するのに用いられる。固相支持体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖モノマー）、ビスアクロイルエチレンジアミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコジンメチルエステル（機能化剤）の３種のモノマーから構成されるポリジメチル−アクリルアミドポリマーを素材とする。ペプチド−樹脂間の開裂可能な結合剤としては、酸に不安定な４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体が用いられる。すべてのアミノ酸誘導体は、あらかじめ作られた対称形の無水物誘導体として添加される。但し、アスパラギン及びグルタミンは逆Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを介したカップリング法を用いて添加される。すべてのカップリング及び保護解除反応はニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸もしくはｉｓｏｔｉｎテスト法により測定される。合成が完了すると、５０％スカベンジャー混合物を含む９５％トリフルオロ酢酸で処理してペプチドを樹脂支持体より開裂させ、同時に側鎖保護基を取り除く。スカベンジャーは一般にはエタンジオール、フェノール、アニソール及び水が使われるが、合成されたペプチドを構成するアミノ酸に従って正確に選択される。減圧蒸発によりトリフルオロ酢酸を除去したのち、ジエチルエーテルと共に粉砕して粗ペプチドを得る。使用したあらゆるスカベンジャーは水相の凍結乾燥による簡便な抽出処理により取り除かれ、粗ペプチドはスカベンジャーフリーとなる。ペプチド合成のための試薬は、カルビオケム−ノバビオケム社（イギリス）、ノッティンガム  ＮＧ７  ２ＱＪ、イギリスにより市販されている。精製は限外クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び（主に）逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの単独使用もしくは組み合わせにより行われる。ペプチドの分析は薄層クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解によるアミノ酸分析、及び高速原子衝突（ＦＡＢ）質量分析法により行ってよい。
【００７１】
本発明の第４の側面はポリヌクレオチドであって、本発明の第１、第２及び第３の側面によるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳ、ｐｏｌまたはＨＥタンパクをコードするポリヌクレオチドまたはその相補ポリヌクレオチドである。
【００７２】
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは本発明の第１の側面のＣＲＣＶのＳタンパクをコードするポリヌクレオチドまたはその相補ポリヌクレオチドである。
【００７３】
より好ましくは、ＣＲＣＶのＳタンパクをコードする前記ポリヌクレオチドは図３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に記載の配列を有するあるいはのみからなる。
【００７４】
当然ながら、図３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に示す配列は３５３１番にＹを含み、これはＣもしくはＴを表す。どちらの場合も、対応するアミノ酸はＩｌｅである。従って、本発明は図３に示す配列を有するあるいはのみからなるＣＲＣＶのＳタンパクをコードするポリヌクレオチドであり、３５３１番にＣを有するものを包含する。また、本発明は図３に示す配列を有するあるいはのみからなるＣＲＣＶのＳタンパクをコードするポリヌクレオチドであり、３５３１番にＴを有するものも包含する。
【００７５】
また本発明は、図３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）に示す配列の断片を有し、表１に示す位置において少なくとも１のＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有するタンパクをコードするＣＲＣＶのＳのポリヌクレオチドも包含する。
【００７６】
好ましくは、ｐｏｌタンパクをコードする前記ポリヌクレオチドは図１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）に示す配列またはその相補的配列を有するもしくはのみからなる。
【００７７】
また、本発明はＢＣＶゲノムの４９７５番に相当する位置にＥを有するタンパクをコードする図１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）に示す配列の断片を有するＣＲＣＶポリヌクレオチドまたはその相補ヌクレオチドを包含する。
【００７８】
好ましくは、ＨＥタンパクをコードする前記ポリヌクレオチドは図１３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）に示す配列またはその相補配列を有するまたはのみからなる。
【００７９】
また、本発明は２３５番のＦ、２４２番のＮまたは２５３番のＬの１以上を有するタンパクをコードする図１３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）に示す配列の断片を有するＣＲＣＶのＨＥのポリヌクレオチドを包含する。これらの３のアミノ酸の番号はLY138系統のＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）において、LY138系統のＢＣＶのＨＥタンパクの最初のＭを１番の残基とするアミノ酸番号に対応する。
【００８０】
上記のポリヌクレオチドをここでは本発明のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドとする。
【００８１】
“ＣＲＣＶ様ポリヌクレオチド”とは、図１、３及び１３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、３及び２１）に列挙するような天然のＣＲＣＶｃＤＮＡ配列のすべてまたはその断片を有さないが、上記のＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様のＳｐｏｌまたはＨＥタンパクをコードするヌクレオチド、またはその相補的なヌクレオチドである。
【００８２】
ＣＲＣＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。ＲＮＡはプラス鎖またはマイナス鎖ＲＮＡであってよい。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖ＤＮＡであってよい。
【００８３】
ＣＲＣＶなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスからｃＤＮＡをクローニングし配列を決定するための好適な方法は公知であり、例えば本願に参照により取り込まれるSambrook et al 2001に記載されている。
【００８４】
本発明のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドはどのような大きさであってもよい。しかしながら、プローブ用または増幅用など特定の目的に対しては、核酸は３０００塩基対（核酸が２本鎖の場合）または塩基（核酸が一本鎖の場合）より少ないことが好ましく、より好ましくは１０００より少ない、さらには１０から１００、さらに好ましくは１５から３０である。以下により詳細に記載するが、１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用またはポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマーとしての使用に好適であり、特に好ましい。
【００８５】
オリゴヌクレオチドとしては、ＣＲＣＶのＳ、ｐｏｌまたはＨＥポリヌクレオチドを特異的に増幅またはこれらと特異的にハイブリダイズするが、ＢＣＶ、ＨＣＶまたは腸性ＣＣＶのＳ、ｐｏｌまたはＨＥポリヌクレオチドとは作用しないものが特に好ましい。当業者であれば、図６、８、９、及び１５のヌクレオチド配列の比較を参照することで好適なオリゴヌクレオチドを決定することができる。
【００８６】
当然ながら、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様オリゴヌクレオチドは、たとえ非常にストリンジェントな状況下であっても、ＣＲＣＶに加えてＨＣＶ、ＢＣＶ及びＨＥＶ由来のＲＮＡまたはＤＮＡのいずれの核酸ともハイブリダイズしてもよい。しかしながら、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様オリゴヌクレオチドはＣＲＣＶ由来の核酸とであれば、ＨＣＶ、ＢＣＶまたはＨＥＶ由来の核酸よりもよりストリンジェントな状況下でもハイブリダイズすることが好ましい。これは実験的に、あるいはオリゴヌクレオチド配列とＣＲＣＶ、ＨＣＶ、ＢＣＶまたはＨＥＶ配列のそれぞれとの比較により決定することができるが、これらは当業者によりよく知られている（Sambrook et al 2001）。
【００８７】
また、当然ながらＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様オリゴヌクレオチドはＣＲＣＶに加えて腸性ＣＣＶ由来のＲＮＡまたはＤＮＡのいずれの核酸ともハイブリダイズしてもよい。しかしながら、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様オリゴヌクレオチドはＣＲＣＶ由来の核酸とであれば、ＣＣＶ由来の核酸よりもよりストリンジェントな状況下でもハイブリダイズすることが好ましい。これは実験的に、あるいはオリゴヌクレオチドの配列とそれぞれの配列との比較により決定することができるが、これらは当業者によりよく知られている（Sambrook et al 2001）。好ましくは、オリゴヌクレオチドはどのようなストリンジェントな状況下でも腸性ＣＣＶ由来の核酸とはハイブリダイズしないことが好ましい（下記参照）。
【００８８】
簡便のためとして、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはさらに検出可能な標識を有する。
【００８９】
“検出可能な標識”には、公知の方法により核酸分子に容易に取り込ませることができる３２Ｐ、３３Ｐまたは３５Ｓなどのあらゆる簡便な放射性標識が含まれる。また、核酸分子に容易に取り込ませることができるあらゆる簡便な蛍光または化学ルミネッセンス標識も含まれる。さらに、“検出可能な標識”には、他の部分の結合することで検出できる一部分（ストレプトアビジンと結合することで検出できるビオチンなど）や、酵素などの一部分で無色の化合物を色の付いた化合物に転化する能力、またはその逆の能力を持つことから検出できるもの（例えばアルカリホスファターゼは、無色のｏ−リン酸ニトロフェニルを色の付いたｏ−ニトロフェノールに転化することができる）も含まれる。簡便のためとして、核酸プローブは固定されたアレイの特定の位置を占めるものであってよく、核酸がプローブにハイブリダイズしたかどうかをアレイにおけるハイブリダイゼーションの位置を参照することによって決定することができる。
【００９０】
［３２Ｐ］dCTPによる標識は、アマシャムのRediprime random primer labelling kitを用いて行ってよい。
【００９１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki et al (1988) Science 239, 487-491）に好適に用いられるプライマーが好ましい。好適なＰＣＲプライマーとしては以下の特性を持つものであってよい。
【００９２】
オリゴヌクレオチドの５’末端の配列が増幅される標的の配列と適合する必要が無いことはよく知られている。
【００９３】
通常ＰＣＲプライマーは特に３’末端において互いに２塩基以上の相互に相補的な構造を持たない。そうした場合、“プライマーダイマー”と呼ばれる副産物の形成が促進されるためである。２のプライマーの３’末端がハイブリダイズした場合、それらは“primed template”複合体を形成し、プライマーの伸長により“プライマーダイマー”と呼ばれる短い複製産物となる。
【００９４】
プライマーにおいては分子内二次構造を避けるべきである。対称ＰＣＲとしては、４０−６０％のＧ＋Ｃ含量で、１種の塩基が長く連続していないものが双方のプライマーに推奨される。ＤＮＡプローブハイブリダイゼーションの研究と古典的な解離温度の算出を組み合わせると、所定のプライマーは特定の温度でアニールすべきであり７２℃の伸長温度ではプライマー／テンプレートハイブリッドが解離してしまう、といったことがしばしば予想される。実際、ハイブリッドはＰＣＲにおいて単純なＴｍ計算により一般的に予想されるものよりも有効である。
【００９５】
最適なアニール温度は経験的に決定してよく、予想よりも高くても良い。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは３７〜５５℃の領域では活性を持っているので、プライマーの伸長はアニールステップの間に起こり、ハイブリッドは安定化される。プライマーの濃度は従来の（対称）ＰＣＲと同じであり、典型的には０．１〜１μＭの範囲である。
【００９６】
偏在的に発現している遺伝子に相補的なプライマーなど用いてコントロールの増幅反応を行えばより好ましい。コントロールの産物とＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様産物が異なるサイズとなり、例えばこれら２の産物は例えばアガロースゲル電気泳動での移動度など、検出手段により区別することができるなどの有益性がある。しかしながら、２の産物は例えば共に１００から１０００塩基長または１００から６００塩基長など、同様なサイズであることが望ましいかもしれない。これにより例えばゲル電気泳動による産物の同時分析に役立つかもしれない。また、例えば反応中の異なる段階における産物の相対的な生成速度といった点から見て、コントロールとＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様の増幅反応が同様な性能特性を持つことを意味するかもしれない。
【００９７】
ポリメラーゼ連鎖反応、ＱＢレプリカーゼ及びリガーゼ連鎖反応を含む本発明の方法では、あらゆる核酸増幅プロトコルを用いることができる。また、３ＳＲとも呼ばれるＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification:核酸配列を基礎とする増幅法）はCompton (1991) Nature 350, 91-92 及び AIDS (1993), Vol 7 (Suppl 2)に記載されるようにして、Ｓ１０８またはＳＤＡ（strand displacement amplification）はWalker et al (1992) Nucl. Acids Res. 20, 1691-1696に記載されるようにして用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応は、その平易さから特に好ましい。
【００９８】
本発明の好適な核酸の組がＰＣＲに用いられる場合、その産物はゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色によって検出するのが簡便である。その他、プローブとして増幅したＤＮＡとハイブリダイズできる標識したオリゴヌクレオチドを用いることも便利である。ＰＣＲにより増幅を行った場合、オリゴヌクレオチドプローブは２のプライマーにより定まるインタープライマー配列とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは１０から５０塩基長であり、より好ましくは１５から３０塩基長である。オリゴヌクレオチドプローブは増幅されたＤＮＡより長くてもよく、１のまたは両方のプライマーを含んでいてもよい。しかしこの場合、ハイブリダイズの条件として、プローブはプライマー単体とはハイブリダイズせず、プローブとハイブリダイズできるインタープライマー配列を含む増幅産物のみとハイブリダイズするべきである。
【００９９】
プローブは例えば３２Ｐ、３３Ｐ及び３５Ｓなどの放射活性ヌクレオチドにより標識してもよく、または蛍光色素により標識しても良い。オリゴヌクレオチドプローブを蛍光で標識した場合、増幅されたＤＮＡ産物は溶液中で検出される（例えばBalaguer et al (1991) "Quantification of DNA sequences obtained by ｐｏｌymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent" Anal. Biochem. 195, 105-110及びDilesare et al (1993) "A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation" BioTechniques 15, 152-157参照）。
【０１００】
また、ＰＣＲ産物は、蛍光体−消光剤の組み合わせを有するプローブを用いる、プローブを固体の支持体に固着させる、ビオチンタグを有するプローブを用いる、または捕獲プローブ及び検出プローブの組み合わせを用いて検出することによっても検出することができる。
【０１０１】
蛍光体−消光剤の組み合わせはＰＣＲ反応の量的な測定（例えばＲＴ−ＰＣＲ）に特に好適である。好適なプローブを用いた蛍光偏光もまた、ＰＣＲ産物の検出に用いても良い。
【０１０２】
また、本発明は、第４の側面のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドを有するベクターを包含する。
【０１０３】
原核生物ベクターのプラスミドとしては、Biorad研究所（リッチモンド、ＣＡ、アメリカ）より市販されるpUC18、 pUC19、pBR322及びpBR329；ファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ、アメリカ）より市販されるpTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及びpRIT5；ストラタジーンクローニングシステム（ラホーラ、ＣＡ９２３０７、アメリカ）より市販されるpBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、 pNH8A、pNH16A、pNH18A及びpNH46Aが典型的である。
【０１０４】
哺乳類細胞ベクターのプラスミドとしては、ファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ、アメリカ）より市販されるｐＳＶＬが典型的である。このベクターはクローニングされた遺伝子の発現にＳＶ４０後期プロモーターを用い、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原産生細胞において最も強い発現が見られる。誘導哺乳類発現ベクターの例としては、同様にファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ、アメリカ）より市販されるｐＭＳＧがある。このベクターは、マウス乳がんウイルスの長い末端反復の糖質コルチコイド誘導性のプロモーターをクローニングされる遺伝子の発現に用いる。
【０１０５】
酵母プラスミドのベクターとしては、一般にストラタジーンクローニングシステム（ラホーラ、ＣＡ９２３０７、アメリカ）より市販されるpRS403-406及びpRS413-416が有用である。pRS403、pRS404、pRS405及びpRS406プラスミドは酵母Integratingプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母に選択可能なマーカーであるHIS3、TRP1、LEU2及びURA3を取り込ませる。pRS413-416プラスミドは酵母動原体プラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【０１０６】
一般的に、本発明のＣＲＣＶ及びＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドは、プラスミドなどの発現ベクターに適当な向きと正しい読み枠で挿入される。所望のホストに認識される適切な転写及び翻訳調節を行う制御ヌクレオチド配列をベクターへの挿入に先立って結合させても良い。ただし、このような制御は一般的には発現ベクターにおいて行うことができる。従って本発明のポリヌクレオチドの挿入は、適切なプロモーターに効果的に結合するものであって良い。真核生物のプロモーターとしては、ＣＭＶimmediate earlyプロモーター、ＨＣＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター及びレトロウイルスのＬＴＲｓのプロモーターが挙げられる。当業者であれば、他の好適なプロモーターも知りうるであろう。発現の構築としては、望ましくは転写初期化及び終止のためのサイトも含み、転写される領域には、翻訳のためのリボゾーム結合サイトを含む（Hastings et al, International Patent No. WO 98/16643）。
【０１０７】
コード配列、及び例えば適切な転写及び翻訳制御部を含む発現ベクターの構築には当業者に公知の方法を用いることができる。そのような方法のひとつが、ホモポリマー末端を介した連結である。ポリｄＡ（またはポリｄＣ）ホモポリマー末端はＤＮＡ断片の露出した３’−ＯＨ基に付加され、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによりクローニングされる。次にその断片は、線状プラスミドベクターの末端に結合されたポリｄＴ（またはポリｄＧ）末端とアニールすることができる。アニールで残された隙間はＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼにより結合される自由末端により埋めることができる。
【０１０８】
他の方法としては、付着端を介した結合が挙げられる。適合する付着端は、好適な制限酵素の作用によりＤＮＡ断片及びベクター上で作製することができる。こうした末端は相補的な塩基の対合において即座にアニールし、残ったニックはＤＮＡリガーゼの作用により閉じられる。
【０１０９】
その他の方法では、リンカーまたはアダプターと呼ばれる合成分子を用いる。平滑末端を持つＤＮＡ断片は、３’突出末端を除去し、陥凹末端３’末端を挿入するバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸性菌ＤＮＡポリメラーゼＩにより作製することができる。認識配列を含む平滑末端の２本鎖ＤＮＡの断片である合成リンカーはＴ４ＤＮＡリガーゼにより平滑末端のＤＮＡ断片と結合することができる。続いてそれらは適切な制限酵素により切断されて付着端を形成し、適切な末端の発現ベクターと結合する。アダプターもまた結合に用いる１の平滑末端を含む化学的に合成されたＤＮＡであるが、あらかじめ形成された付着端も持つ。
【０１１０】
各種の制限エンドヌクレアーゼサイトを含む合成リンカーが、International Biotechnologies社、New Haven、CN、USAなど様々な企業等から市販されている。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドを修飾するのに望ましい方法のひとつが、Saiki et al (1988) Science 239, 487-491に開示されるポリメラーゼ連鎖反応を用いる方法である。この方法では、酵素反応で増幅されるＤＮＡは、２の特定のオリゴヌクレオチドプライマーと隣接し、このプライマー自身は増幅されたＤＮＡに取り込まれる。この特定のプライマーは、制限エンドヌクレアーゼ認識サイトを含んでいても良く、公知の方法で発現ベクターにクローニングするのに用いられる。
【０１１２】
また、本発明はＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドを有するベクターにより形質転換された宿主細胞を包含する。宿主細胞は真核生物と原核生物のいずれであってもよい。ベクター中のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドが糖タンパクとして発現する場合、前記宿主細胞は真核生物の宿主細胞であり、好ましくは哺乳類の宿主細胞である。
【０１１３】
原核生物の宿主細胞としては微生物細胞が好ましく、典型的には大腸性菌の系統である。例としては、Bethesda Research Laboratories社、Bethesda、MD、USAより市販されるＤＨ５系統、American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville、MD、USA(No ATCC 31343)より市販されるＲＲ１などである。好ましい真核生物の宿主細胞としては、酵母及び哺乳類の細胞が挙げられ、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞系などの脊椎動物の細胞が挙げられる。酵母の宿主細胞としては、ストラタジーンクローニングシステム（ラホーラ、ＣＡ９２３０７、アメリカ）より市販されるYPH499、YPH500及びYPH501 が挙げられる。好ましい哺乳類の宿主細胞としては、ATCCよりCCL61として市販されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ATCCよりCRL 1658として市販されるＮＩＨスイスマウス胚細胞のNIH/3T3、及びATCCよりCRL1650として市販されるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞としては、バキュロウイルス発現ベクターによりトランスフェクションすることができるＳｆ９細胞である。
【０１１４】
ベクターによる適切な宿主細胞の形質転換は、公知の方法により行うことができるが、典型的には用いるベクターの種類に依存する。原核生物の宿主細胞の形質転換に関しては、例えばCohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 and Sambrook et al (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。酵母細胞の形質転換については、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。Beggs (1978) Nature 275, 104-109の方法もまた、有用である。脊椎動物の細胞については、その導入に有用な試薬、例えばリン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストランまたはリポソーム製剤などが、ストラタジーンクローニングシステムまたはLife Technologies社（Gaithersburg, MD 20877, USA）より市販されている。
【０１１５】
エレクトロポレーションもまた細胞の形質転換に有用であり、酵母細胞、微生物細胞及び脊椎動物細胞の形質転換において公知である。
【０１１６】
例えば、参照により組み込まれるLuchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に記載される方法により種々の微生物を形質転換してもよい。２．５×ＰＥＢ溶液に懸濁させたＤＮＡ−細胞混合物に２５μＦＤで６２５０Ｖ／ｃｍのエレクトロポレーションを行うと、最大数の形質転換体が常に回収される。
【０１１７】
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換の方法はBecker & Guarente (1990) Methods Enzymol. 194, 182に記載される。
【０１１８】
ＤＮＡを動物または植物の細胞に導入するには物理的な方法を用いてもよい。ＤＮＡでコーティングした金またはタングステンの粒子を細胞に打ち込む方法がある。
【０１１９】
首尾良く形質転換された細胞、即ちＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ＤＮＡ構築物を含んだ細胞、は公知の方法により識別される。例えば、選別方法のひとつとしては、発現ベクターに形質転換細胞において選別可能な特徴をコードするＤＮＡ配列（マーカー）を組み込む方法がある。
これらのマーカーはとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素のＧ４１８、または真核生物の細胞培養においてはネオマイシン耐性、大腸性菌及びその他の微生物の培養においてはテトラサイクリン、カネマイシン及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。その他にも、選別可能な特徴を与える遺伝子を他のベクターに入れて、目的とする宿主細胞を協同的に形質転換するのに用いることもできる。
【０１２０】
マーカー遺伝子は形質転換体を特定するのに用いられるが、どの細胞が組み換えＤＮＡ分子を含み、自己結合ベクター分子を含むのかを決定できるものが望ましい。これは、ＤＮＡ断片の挿入により分子上に存在する遺伝子のひとつが完全性を失うようなクローニングベクターを用いることによって得られる。従って、形質転換体はそうした遺伝子の機能の欠損に基づいて特定することができる。
【０１２１】
他にも、首尾良く形質転換された細胞を特定する方法として、本発明の発現構築物を導入した結果としてＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳ、ｐｏｌまたはＨＥタンパクを産生している細胞を培養する方法がある。細胞を回収して溶解し、ＤＮＡ成分を分析して目的のＤＮＡの存在をSouthern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 or Berent et al (1985) Biotech. 3, 208などに記載される方法で確認することができる。他にも、後述するような抗体を用いて上清における目的のタンパクの存在を検出することもできる。
【０１２２】
組み換えＤＮＡの存在を直接的にアッセイする方法に加えて、組み換えＤＮＡが直接タンパクを発現するのであれば、形質転換が成功したかどうかは公知の免疫的な方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターによる形質転換が成功した細胞は適当な抗原性を示すタンパクを産生する。形質転換が疑われる細胞の試料を回収して、適切な抗体を用いてタンパクをアッセイを行う。
【０１２３】
従って、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明にはそれらの細胞の培養物も意図されている。好ましくは、栄養培地中のモノクローナルな（系統的に単一の）培養物またはモノクローナルな培養物から派生する培養物である。
【０１２４】
典型的には上記のベクターに挿入された組み換えＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドにより形質転換された宿主細胞は、続いてここに開示される技術を参考に公知の技術により適当な条件で十分な時間培養され、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドによりコードされるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様タンパクが発現させて回収する。
【０１２５】
ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様タンパクは組み換え細胞培養物より公知の方法により回収及び生成される。公知の方法としては、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、水酸アパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましいのは、高性能液体クロマトグラフィー“ＨＰＬＣ”を用いた精製である。
【０１２６】
例えば、バキュロウイルス系の発現において、ＣＲＣＶスパイク遺伝子をコードする組み換えＤＮＡはpMelBac (Invitrogen)などの好適な移転ベクターにクローニングしても良い。バキュロウイルスＤＮＡ（例えばBac-N-Blue/Invitrogen）と共に導入することで、スパイクタンパクをコードする組み換えバキュロウイルスとなる。好適な昆虫細胞系（例えばSf9、Sf21、High Five/Invitrogen）に適切な感染効率で感染させると、組み換えスパイクタンパクが発現する。タンパクの発現は、適当な試薬（例えば回復期のイヌ血清またはその他のウイルス特異的な抗体）を用いてウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡにより確認することができる。
【０１２７】
従って本発明は、本発明のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドによりコードされるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様タンパクを得る方法を包含する。前記方法は、典型的にはベクターであるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドを有する宿主細胞の培養することと、タンパク質を前記宿主細胞内で発現させることと、前記タンパク質を精製することを有する。本発明はさらに、この方法により得られるタンパク質を包含する。
【０１２８】
従って本発明は、典型的にはＳタンパクであり、本発明のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ポリヌクレオチドによりコードされるグリコシル化ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様タンパクも包含する。前記方法は、典型的にはベクターであるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ用のポリヌクレオチドを有する真核生物、より好ましくは哺乳類の宿主細胞の培養と、宿主細胞中のタンパクの発現と、前記グリコシル化タンパクの精製を有する。本発明はさらに、この方法によって得られるグリコシル化タンパクを包含する。
【０１２９】
第５の側面としての本発明は、抗ＣＲＣＶ抗体の作製方法であり、前記方法は動物において上記本発明の第１の側面のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様Ｓタンパクに対する免疫反応を起こさせることと、前記動物または前記動物由来の不死細胞から抗体を調製することを含む。前記方法は、その他に本発明の第１の側面に記載のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様Ｓタンパクを用いて抗体発現ライブラリから抗体を選択することを有していても良い。
【０１３０】
モノクローナル抗体を作製する方法及び技術は当業者に公知であり、例えば参照として組み込まれるMonoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)に開示される方法がある。
【０１３１】
また本発明は、さらに任意でこのようにして得られた抗体のＣＲＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーよりも高いかどうかを決定すること、及び好ましくは前記抗体のＣＲＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーがＨＣＶ及びＨＥＶのＳタンパクに対するアフィニティーよりも高いかどうかを決定すること、を有する。抗体の抗原に対する相対的なアフィニティーを決定する方法は公知である。
【０１３２】
また本発明は、本発明の第５の側面の方法により得られる、ＣＲＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーよりも高い抗ＣＲＣＶ抗体を包含する。好ましくは、前記抗体のＣＲＣＶのＳタンパクに対するアフィニティーは、さらにＨＣＶ及びＨＥＶのＳタンパクに対するアフィニティーよりも高い。
【０１３３】
また本発明は抗ＣＲＣＶ抗体の作製方法を包含し、前記方法は動物において上記本発明の第３の側面のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＨＥタンパクに対する免疫応答反応を起こさせることと、前記動物または前記動物由来の不死細胞から抗体を調製することを含む。前記方法は、その他に本発明の第３の側面に記載のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様ＨＥタンパクを用いて抗体発現ライブラリから抗体を選択することを有していても良い。
【０１３４】
また本発明は、さらに任意でこのようにして得られた抗体のＣＲＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーよりも高いかどうかを決定すること、及び好ましくは前記抗体のＣＲＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーがＨＣＶ及びＨＥＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーよりも高いかどうかを決定すること、を有する。抗体の抗原に対する相対的なアフィニティーを決定する方法は公知である。
【０１３５】
また本発明は、本発明の第５の側面の方法により得られる、ＣＲＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーがＢＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーよりも高い抗ＣＲＣＶ抗体を包含する。好ましくは、前記抗体のＣＲＣＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーは、さらにＨＣＶ及びＨＥＶのＨＥタンパクに対するアフィニティーよりも高い。
【０１３６】
好ましくは前記抗体はモノクローナル抗体である。しかしながら、本発明は単一特異的な抗ＣＲＣＶ抗体を包含する。前記抗体は、後述する抗体断片であって良い。
【０１３７】
前記モノクローナルまたは単一特異性の抗体は、Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)において論じられるようなキメラ抗体であってよい。前記モノクローナル抗体または単一特異的な抗体は“イヌ化された”抗体であってよく、例えばマウス抗体のＣＤＲ領域をイヌ抗体の骨格に挿入して作られる。
【０１３８】
また本発明は、抗ＣＲＣＶ抗体の断片を包含する。抗体の可変Ｈ（ＶＨ）及び可変Ｌ（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関係しており、この事実はプロテアーゼによる消化実験により最初に認められた。これはさらにげっ歯目の抗体の“ヒト化”により確認された。げっ歯目由来の可変領域をヒト由来の不変領域と融合させて作られた抗体は、母体となったげっ歯目抗体の抗原特異性を保持している（Morrisonら(1984)Proc.Acac.Sci.USA 81,6851-6855）。
【０１３９】
この抗原特異性は可変領域により付与されるものであり、不変領域からは独立していることが、１以上の可変領域のすべてを含む抗体断片をバクテリアで発現させた実験によって知られている。
【０１４０】
これらの分子にはＦａｂ様の分子(Better et al(1988)Science240、1041)、Ｆｖ分子 (Skerraet al (１９８８) Science 240, )、ＶＨとＶＬの組となるドメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合している一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子 (Bird et al (１９８８) Science 242, 423及び Huston et al (１９８８) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 85,５８７９ )及び孤立したＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）(Ward et al (１９８９) Nature 341, 544)を含まれる。抗体断片の合成に関する技術の一般的概要については、Winter & Milstein (1991)Nature 349 293-299に記載されている。
【０１４１】
“ＳｃＦＶ分子”とは、ＶＨとＶＬの組となるドメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合した分子を意味する。
【０１４２】
完全体の抗体に対して抗体断片の優位性は数倍にもなる。より小さなサイズの断片は例えば固体組織への浸透性などの薬理学的な特性を改善するかもしれない。また、補体結合などの抗体全体の効果または影響は取り除かれる。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片はすべて大腸性菌により発現及び分泌させることができるので、容易に大量生産することができる。
【０１４３】
完全体の抗体、及びＦ（ａｂ’）２断片は“２価”である。“２価”とは、抗体及びＦ（ａｂ’）２断片が２の抗原結合部位を持つことを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ及びｄＡｂ断片は１価であり、１の抗原結合部位を持つ。
【０１４４】
第６の側面としての本発明は、イヌがＣＲＣＶに曝されたかどうかを決定する方法である。前記方法は、イヌから好適な試料を得ることと、前記試料中のＣＲＣＶまたは抗ＣＲＣＶ抗体を特定すること、を有する。前記方法はイヌがＣＩＲＤに感染しているかどうかを診断する補助としても良い。
【０１４５】
本発明は、イヌから得た試料において、そのイヌが過去にＣＲＣＶに曝された経歴を検出する方法を包含し、前記方法はイヌから好適な試料を得ることと、前記試料中に抗ＣＲＣＶ抗体を特定することを、有する。
【０１４６】
好ましい実施例のひとつとして、前記好適な試料は血清、唾液、気管洗液または細気管支洗液などのあらゆる抗体含有試料であって良い。
【０１４７】
好ましくは、抗ＣＲＣＶ抗体はＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶまたはＣＲＣＶ抗原を用いて検出され、より好ましくはＢＣＶまたはＣＲＣＶ抗原を用いて検出される。
【０１４８】
より好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体の特定は、ＣＲＣＶのＳタンパクのアミノ酸配列（図４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と少なくとも７５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパク、ＢＣＶのＳタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）のアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパク、ＨＣＶのＳタンパク（Genbankアクセス番号Ｌ１４６４３）、ＢＣＶのＳタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と少なくとも７５％の相同性をもつＳタンパクを有するコロナウイルスままたはその断片、またはＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つＳタンパクを含むコロナウイルスもしくはその断片と選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１４９】
より好ましくは、ＢＣＶのＳタンパクのアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパクと選択的に結合する抗体を特定する、とは、ＢＣＶのＳタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパク、またはその断片と選択的に結合する抗体を特定すること、を有する。
【０１５０】
より好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定すること、とは、ＢＣＶのＳタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１５１】
より好ましくは、ＣＲＣＶのＳタンパクのアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパクと選択的に結合する抗体を特定する、とは、ＣＲＣＶのＳタンパクのアミノ酸配列（図４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の相同性をもつアミノ酸配列のＳタンパク、またはその断片と選択的に結合する抗体を特定すること、を有する。
【０１５２】
より好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定すること、とは、本発明の第１の側面のＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳタンパクと選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１５３】
最も好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定すること、とは、図４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）に示すＣＲＣＶのＳタンパクまたはその断片と選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１５４】
同様に、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定する、とは、ＣＲＣＶのＨＥタンパクの部分アミノ酸配列（図１４及びＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクと、ＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）の部分アミノ酸配列またはＨＥＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号Ｌ０７７４７）と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクと、ＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と少なくとも９０％の相同性を持つＳタンパクを含むコロナウイルスと、もしくはその断片と、またはＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％の相同性を持つＨＥタンパクを含むコロナウイルスまたはその断片と選択的に結合する抗体を特定すること、を有していても良い。
【０１５５】
より好ましくは、ＢＣＶのＨＥタンパクのアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクと選択的に結合する抗体を特定する、とは、ＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）のアミノ酸配列と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクまたはその断片と選択的に結合する抗体を特定すること、を有する。
【０１５６】
より好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体の特定とは、ＢＣＶのＨＥタンパク（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）と選択的に結合する抗体を特定すること、を有する。
【０１５７】
さらにより好ましくは、ＣＲＣＶのＨＥタンパクのアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクと選択的に結合する抗体を特定する、とは、ＣＲＣＶのＨＥタンパク（図１３）の部分アミノ酸配列と少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列のＨＥタンパクまたはその断片と選択的に結合する抗体を特定すること、を有する。
【０１５８】
さらにより好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定することが、本発明の第３の側面に規定されるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＨＥタンパクに選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１５９】
最も好ましくは、試料における抗ＣＲＣＶ抗体を特定することが、図１４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）に示す部分アミノ酸配列のＣＲＣＶのＨＥタンパクまたはその断片と選択的に結合する抗体を特定することを有する。
【０１６０】
本発明は、イヌから得た試料においてＣＲＣＶを検出する方法を包含し、前記方法はイヌから好適な試料を得ることと、前記試料中にＣＲＣＶを特定することを、有する。
【０１６１】
当然ながら、異なるＣＲＣＶの単離物の間にはある程度の自然発生した配列の変化があってよい。従って本発明は、ＣＲＣＶ単離物であり、そのＳ、ｐｏｌ、及びＨＥの遺伝子及びタンパクの配列が図１から４、１３及び１４に示す配列からある程度変化したＣＲＣＶ単離物を特定することを包含する。しかしながら、当然そうしたＣＲＣＶの変体単離物の検出には、図１から４、１３及び１４に示す配列を特徴とする単離物の検出と同じ方法が用いられる。
【０１６２】
好ましい実施例では、肺洗液、気管洗液、扁桃腺の綿棒採取標本またはイヌの気管から得た生検もしくは死後の試料が好適な試料である。
【０１６３】
本実施例において、ＣＲＣＶの特定は、好ましくはＣＲＣＶの核酸構成物を特定することを有する。
【０１６４】
これは、典型的には、例えば実施例１に記載されるようにＲＮＡを試料から抽出してｃＤＮＡを得ることにより行われる。次いで、例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション、特異的な増幅、及び核酸のシークエンスを使った、当業者によく知られる方法（Sambrook et al (2001) supra）を用いてＣＲＣＶの核酸構成物をｃＤＮＡにおいて特定する。
【０１６５】
好ましくは、ＣＲＣＶを特定することが、LY138系統のゲノム（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）やその一部分などのＢＣＶゲノムと高度にストリンジェントな条件ででハイブリダイズするポリヌクレオチドを特定することを有する。
【０１６６】
また好ましくは、ＣＲＣＶの特定は、ＣＲＣＶのＳ、ｐｏｌまたはＨＥポリヌクレオチド（図１、３及び１３）やその一部分と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを特定することを有する。
【０１６７】
“高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする”とは、ハイブリダイズするポリヌクレオチド及び核酸が、非常にストリンジェントな条件下でもハイブリダイズできるのに十分な塩基配列の類似性を持っていることを意味する。本技術分野で周知であるように、核酸のハイブリダイズの厳密性は、ハイブリダイズする核酸の長さ、ハイブリダイズする配列の相同性などや、温度、イオン強度、配列のＣＧまたはＡＴ含有量などの要素によって決まる。
【０１６８】
ＣＲＣＶのｃＤＮＡ分子と高い厳密性でハイブリダイズする核酸としては、ＣＲＣＶのｃＤＮＡの少なくとも一部分において＞９０％の配列相同性、このましくは＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％、より好ましくは＞９９％の配列相同性を持つ核酸が挙げられる。
【０１６９】
選択的なハイブリダイゼーションとなる高度にストリンジェントなハイブリダイズの条件は、典型例が公知であり、例えば参照として組み込まれるSambrook et al 2001 (supra)に記載の条件がある。
【０１７０】
以下は、核酸がナイロンメンブレン上に固定され、プローブ核酸が５００塩基以上の場合の典型的なハイブリダイズ溶液の例である。
６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）
０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
１００μｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡ
【０１７１】
ハイブリダイゼーションは６８℃で行う。核酸が固定されているナイロンメンブレンは６８℃の０．１×ＳＳＣで一度洗浄しても良い。
【０１７２】
２０×ＳＳＣは、以下のように調製しても良い。８００ｍｌのＨ２Ｏに１７５．３ｇのＮａＣｌと８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを溶解する。１０Ｎの水酸化ナトリウムの液滴でｐＨを７．０に調整する。Ｈ２Ｏで体積を１リットルに調整する。一定分量に分注する。オートクレーブにより滅菌する。
【０１７３】
以下は、核酸がナイロンメンブレン上に固定され、プローブ核酸が１５から５０塩基の場合の典型的なハイブリダイズ溶液の例である。
３．０Ｍ塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）
０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）
１ｍｍＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）
０．５％ＳＤＳ
１００μｇ／ｍｌの変性、断片化サケ精子ＤＮＡ
０．１％脱脂粉乳
【０１７４】
ハイブリダイズに最適な温度としては、所定の鎖長に対するＴｉより５℃低い温度が通常選択される。Ｔｉとは、プローブとその標的となる配列との間に形成されたハイブリッドの不可逆な解離温度である。Jacobs et al (1988) Nucl. Acids Res. 16, 4637では、Ｔｉの算定について議論されている。３ＭのＴＭＡＣｌにおける１７量体のハイブリダイズ温度としては、４８−５０℃が推奨される。１９量体では５５−５７℃、２０量体では５８−６６℃である。
【０１７５】
好ましくは、ＣＲＣＶを特定することが、ＢＣＶゲノム（Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２）の一部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つポリヌクレオチドを用いることを有する。
【０１７６】
より好ましくは、ＣＲＣＶを特定することが、ＣＲＣＶのＳポリヌクレオチド（図３）の一部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を持つポリヌクレオチド、またはＣＲＣＶのｐｏｌヌクレオチド（図１）の一部分と少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を持つポリヌクレオチド、またはＣＲＣＶのＨＥポリヌクレオチド（図１３）と少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を持つポリヌクレオチドを用いることを有する。
【０１７７】
より好ましくは、ＣＲＣＶを特定することは、上記の本発明の第４の側面で規定されるＣＲＣＶポリヌクレオチドを特定することを有する。
【０１７８】
最も好ましくは、ＣＲＣＶを特定することが、図１、図３もしくは図１３に示される配列、またはそれらの断片を有する、またはのみからなるＣＲＣＶポリヌクレオチドを特定することを有する。
【０１７９】
他の好ましい実施例としては、ＣＲＣＶを特定することが、ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することを有する。
【０１８０】
好ましくは、ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することが、上記本発明の第１、第２または第３の側面に規定されるＣＲＣＶタンパクを特定することを有する。
【０１８１】
最も好ましくは、ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することが、図２、図４もしくは図１４に示されるアミノ酸配列、またはそれらの断片を有する、またはのみからなるＣＲＣＶタンパクを特定すること有する。
【０１８２】
生物試料におけるＣＲＣＶのタンパク構成物のアッセイはあらゆる公知の方法により行うことができる。生物試料におけるＣＲＣＶタンパクレベルでのアッセイには、抗体を用いる技術が好適である。
【０１８３】
好ましくは、ＣＲＣＶのタンパク構成物を特定することは、ＣＲＣＶに反応する抗体を用いることを有する。
【０１８４】
より好ましくは、ＣＲＣＶに反応する抗体とは、本発明の第５の側面の方法により得られた、または得ることのできる抗ＢＣＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＥＶ抗体、または抗ＣＲＣＶ抗体である。
【０１８５】
例えば、ＣＲＣＶのタンパク発現は、古典的な免疫組織学的な方法により研究することができる。この方法において、一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）により特異的な認識が行われるが、二次の検出系には蛍光、抗体、またはその他の複合二次抗体を利用することができる。結果として、病理学的な検査を目的とした組織切片の免疫組織学的な染色が得られる。またウエスタンブロットまたはドット／スロットアッセイのために、組織を例えば尿素または中性界面活性などで抽出し、ＣＲＣＶタンパクを遊離させることができる（Jalkanen, M., et al, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)）。この方法は陽イオン性の固相を用いるものであるが、単離したＣＲＣＶタンパクを基準として用いることでＣＲＣＶタンパクを定量することができる。この方法は体液試料にも適用することができる。
【０１８６】
その他のＣＲＣＶタンパクの発現を検出するのに有用な抗体を用いた方法としては、酵素結合抗体吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫検定法（ＲＩＡ）などの免疫学的検定法が挙げられる。例えば、ＣＲＣＶに反応するモノクローナル抗体は、免疫吸着剤、及びＣＲＣＶタンパクを検出、定量する酵素標識プローブのどちらとしても用いることができる。試料中に存在するＣＲＣＶタンパクの量は、標準試料に存在する量を参照すればコンピューターアルゴリズムによる直線回帰を用いて計算することができる。腫瘍の抗原を検出するためなどのＥＬＩＳＡが、Iacobelli et al, Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988)に記載されている。その他のＥＬＩＳＡ法としては、２の異なる特異モノクローナル抗体を体液中のＣＲＣＶタンパクを検出するのに用いることができる。この方法では、抗体のひとつは免疫吸着剤として用いられ、他の抗体は酵素標識したプローブとして用いられる。
【０１８７】
上記の方法は“１段階”または“２段階”の方法として行って良い。“１段階”の方法には、ＣＲＣＶタンパクを固定した抗体に接触させることと、洗浄せずにそのまま標識した抗体に混合物に接触させることが含まれる。“２段階”の方法には、標識した抗体に混合物を接触させる前の洗浄することが含まれる。その他の従来の方法も適宜採用して良い。一般的には、アッセイ系の一構成要素を支持体上に固定して、そうして系の他の構成要素をその構成要素と接触させ、試料から除去できるようにすることが望ましい。
【０１８８】
好適な酵素標識としては、例えば基質と反応して水素ペルオキシダーゼの産出を触媒するオキシダーゼ類が挙げられる。グルコースオキシダーゼは、その安定性と基質（グルコース）が容易に入手できることから特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識された抗体と基質の反応により形成された水素ペルオキシダーゼの濃度を測定することによりアッセイしても良い。酵素の他にも、他の好適な標識としては、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）及びテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位体、フルオレセイン、ローダミンなどの蛍光標識、及びビオチンなどが挙げられる。
【０１８９】
第７の側面としての本発明は、抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥ抗体を検出するための抗体吸着法である。この方法は、本発明の第１もしくは第３の側面に規定されるか第４の側面方法に用いて得られるＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様のＳもしくはＨＥタンパク、またはＣＲＣＶもしくはＣＲＣＶ様のＳ及びＨＥタンパクの両方、あるいは抗原性のあるそれらの断片でコーティングされた固相を有し、当該固相に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥ抗体はタンパクに結合し、検出可能な標識複合体は固相に結合した抗ＣＲＣＶ抗体に結合する。
【０１９０】
固相をコーティングするＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳタンパクの抗原性の断片が、抗ＣＲＣＶのＳ抗体と結合するのに十分な大きさで、少なくとも１の表１に示すＣＲＣＶのＳタンパクに特異的なアミノ酸を有することが好ましい。
【０１９１】
また、固相をコーティングするＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＨＥタンパクの抗原性の断片が、抗ＣＲＣＶのＨＥ抗体と結合するのに十分な大きさで、上記で規定されるＣＲＣＶのＨＥタンパクに特異的な３のアミノ酸の少なくとも１を有することが好ましい。
【０１９２】
好ましくは、固相をコーティングするＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳもしくはＨＥタンパク、または抗原性のあるそれらの断片は、少なくとも１０のアミノ酸長である。より好ましくは、ＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク、または抗原性のあるそれらの断片は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、または少なくとも４００のアミノ酸長である。ＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ用のＳタンパクは少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、または少なくとも１０００のアミノ酸長である。
【０１９３】
好ましくは、固相をコーティングするＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク、または抗原性のあるそれらの断片は１２００未満のアミノ酸長である。より好ましくは、ＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク、または抗原性のあるそれらの断片は、１１００未満、１０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、または５００未満のアミノ酸長である。ＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳもしくはＨＥタンパク、または抗原性のあるそれらの断片は、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、または５０未満のアミノ酸長であってよい。
【０１９４】
好ましくは、固相はマイクロタイターウェルである。
【０１９５】
また、好ましくは複合体は抗イヌ抗体を有する。
【０１９６】
好ましくは複合体は例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼである酵素を有する。また、好ましくは免疫吸着法は酵素の基質も有する。
【０１９７】
好適な免疫吸着法及びＥＬＩＳＡ法の詳細は上述のとおりである。
【０１９８】
本発明には免疫吸着法の構成物を含むようなキットも含まれる。キットには、マイクロタイタープレートなどの固相、固相をコーティングするＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳもしくはＨＥタンパクまたはその両方、及び固相に結合した抗ＣＲＣＶ抗体に結合する検出可能な抗イヌ抗体などの標識複合物が含まれていても良い。検出可能な標識複合物が酵素の場合、キットには当該酵素の基質も含まれる。またキットには、本発明の第５の側面において記載されるような抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥタンパク抗体を含有するポジティブコントロール試料、及びネガティブコントロール試料が含まれていても良い。
【０１９９】
従って本発明には、抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥ抗体またはその両方を補足するためであって、本発明の第１もしくは第３の側面に規定されるか第４の側面の方法を用いて得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳもしくはＨＥタンパク、または抗原性のあるそれらの断片が固着された固体基質が含まれ、当該固相に曝された試料中の抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥ抗体はＳまたはＨＥタンパクに結合する。
【０２００】
典型的には、タンパクは抗原の安定性により４℃から３７℃で一晩マイクロタイタープレート上にコーティングされる。結合しなかったタンパクをリン酸緩衝生理食塩水やトリス緩衝生理食塩水などの緩衝液で洗浄する。血清またはその他の試料を、典型的には３７℃で１〜数時間プレート上でインキュベートする。結合しなかった材料を洗浄し、プレートを酵素標識した（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ）抗体（例えば血清試料に対しては抗イヌＩｇＧ、ＩｇＭまたは肺洗液に対しては抗イヌＩｇＡ）で３７℃で１〜数時間インキュベートする。結合しなかった抗体を洗浄し、プレートをＯＰＤなどの基質で訳１０分インキュベートし、光学的な濃度を光度計で測定する。
【０２０１】
好ましくは、固体基質はマイクロタイターウェルである。
【０２０２】
本発明としての第８の側面は、イヌの予防接種用のワクチン構成物であって、（ｉ）ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉ）ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉｉ）ＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｖ）ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｖ）ＣＲＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉ）ＢＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉｉ）前記コロナウイルスタンパクまたは免疫原性のあるその断片をコードする核酸、を有する。
【０２０３】
好ましくは、ワクチンはイヌ用として作られ、供される。
【０２０４】
ワクチンがコロナウイルスタンパクまたは免疫原性のあるその断片を有する場合、前記タンパクはＢＣＶまたはＣＲＣＶタンパクの対応する部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つ。
【０２０５】
好ましくは、コロナウイルスタンパクはＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＣもしくはＣＲＣＶタンパク、またはそれらの改変物である。
【０２０６】
改変物としては、典型的にはワクチンの抗原性を改善するようなアミノ酸置換が挙げられる。ＢＣＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶタンパクは、よりＣＲＣＶに近くなるよう改変しても良い。例えば、ＢＣＶ、ＨＣＶまたはＨＥＶのスパイクタンパクは図１０において比較されるまたは表１に示される相違部分がＣＲＣＶのアミノ酸となるように改変されていても良い。さらに、または代わりとして、ＢＣＶ、ＨＣＶまたはＨＥＶのＨＥタンパクは上記の３のＣＲＣＶ特異的な残基がＣＲＣＶのアミノ酸となるように改変されていても良い。
【０２０７】
１以上のアミノ酸残基が化学的に修飾されたタンパクは、そのタンパクの機能、すなわち生体内において特異抗体を産生させること、が実施的に変化せずに保持されているのであれば、用いても良い。合成タンパクは、合成前または合成後に適宜修飾されていることが好ましい。そのような修飾としては、酸または塩基（特に生理学的に許容できる有機または無機の酸または塩基）との塩の形成、末端カルボキシ基のエステルまたはアミドの形成、及びＮ−ｔ−ブトキシカルボニルなどのアミノ酸保護基の付加などが挙げられる。そのような修飾は、生体内での代謝からポリペプチドを保護するものであって良い。
【０２０８】
前記タンパクは単一コピーまたはタンデム反復などの複数体として存在してよい。タンデムや複数の反復は、それ自体が十分に抗原性であり、キャリア使用しなくても良いかもしれない。タンパクは、Ｎ末端とＣ末端が互いに結合して環状となっていたり、抗原性が増したりジスルフィド結合が形成できるように末端に１以上のＣｙｓ残基が付加されていれば有利である。タンパクがキャリアと共有結合（好ましくはポリペプチド）していれば、本発明のタンパクが環状に形成されるような配列が好ましい。
【０２０９】
現在の免疫学的理論によれば、あらゆる免疫原形成において、キャリアには免疫系を刺激したり刺激を増幅したりするキャリアの機能が存在するはずである。Ｔ細胞エピトープが組み込まれた（または抗原と共にＴ細胞エピトープをつくる）キャリアが最も良いと考えられている。ペプチドは、例えば架橋により、血清アルブミン、ミオグロビン、微生物変性毒素及びキーホールリンペットヘモシアニンといったキャリアと結合している。免疫応答におけるＴ細胞ヘルプを含む最近開発されたキャリアには、Ｂ型肝炎コア抗原（ヌクレオカプシド抗原とも呼ばれる）、Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr- Asn-Cys (SEQ ID NO. 52)などのＴ細胞推定エピトープ、ベータガラクトシダーゼ、及びインターロイキン−１のペプチド１６３−１７１が含まれる。後者の物質は、キャリアもしくはアジュバント、またはその両方として様々に解釈されて良い。もしくは、同一のまたは異なる種類の本発明のタンパクを数コピー分互いに架橋したものであって良い。この場合、独立したキャリアは存在しないが、架橋によってキャリアの機能を果たされる。好適な架橋剤としては、シグマやピアスのカタログに記載されるようなものが挙げられ、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド、コハク酸イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩であり、後者の試薬はＣ末端のシステイン残基（あれば）の−ＳＨ基を利用する。
【０２１０】
タンパクが好適な塩基配列を好適な宿主において発現させることにより調製する場合、キャリアとして作用するペプチド配列との融合体として発現させるのが有利である。Kabigenの“Ecosec”システムがそのような取り合わせの例である。
【０２１１】
ワクチンのコロナウイルスの構成物が他の抗原と結合して二重の効果を奏するものであっても良い。
【０２１２】
好ましくは、ワクチン構成物におけるコロナウイルスタンパクはＳタンパクである。より好ましくは前記Ｓタンパクは、上記本発明の第１の側面に規定されるか第４の側面の方法を用いて得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク、ＢＣＶのＳタンパク、ＨＣＶのＳタンパク、ＨＥＶのＳタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片である。
【０２１３】
最も好ましくは、ワクチン構成物は図４に示すアミノ酸配列を含むまたはのみからなるＣＲＣＶのＳタンパク、または図４に示すアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を持ち、免疫原性のあるその断片を含む。好ましくは、前記変体は図４に記載の配列と少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸相同性を持つ。より好ましくは、前記変体は図４に記載の配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸相同性を持つ。
【０２１４】
さらに、またはもしくは、前記ワクチン構成物は、血球凝集素−エステラーゼタンパク（ＨＥ）、膜内在タンパク（Ｍ）、または小膜タンパク（Ｅ）（Lai MMC & Cavanagh D, (1997) "The molecular biology of coronaviruses" Adv.Vir.Res, 48: 1-100）を有していても良い。
【０２１５】
実施例のひとつとして、ＨＥ、ＥまたはＭタンパクはＢＣＶ、ＨＣＶまたはＨＥＶタンパクである。他の実施例として、ＨＥ、ＥまたはＭタンパクはＣＲＣＶタンパクである。
【０２１６】
好ましくは、前記ＨＥタンパクは上記本発明の第３の実施例で定義されるか、第４の側面の方法によって得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＨＥタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片である。
【０２１７】
より好ましくは、前記ワクチン構成物は図１４に示す部分アミノ酸配列を有する、もしくはのみからなるＣＲＣＶのＨＥタンパク、または免疫原性のあるその断片で図１４に示す配列と少なくと９７％の相同性を持つものを含む。好ましくは、前記変体は図１４に示す配列と少なくと９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸相同性を持つ。より好ましくは、前記変体は図１４に示す配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸相同性を持つ。
【０２１８】
ワクチンがコロナウイルスを有する場合、好ましくはコロナウイルスはＢＣＶのＳタンパクと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを有する。より好ましくは、前記コロナウイルスは、ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを有する。
【０２１９】
さらに、またはもしくは、ワクチンがコロナウイルスを含む場合、好ましくはコロナウイルスはＢＣＶのＨＥタンパクと、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つ。より好ましくは、前記コロナウイルスはＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを有する。
【０２２０】
その他の好ましい実施例では、ワクチン構成物はＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶ及びＣＲＣＶ、またはその改変物を有する。
【０２２１】
イヌウイルスに対して効果のあるイヌワクチンは非イヌウイルス由来であることが好ましい。例えば、US Patent No. 5,750,112（Gillが発明しSolvay Animal Health社に譲渡、）は、不活化したネコ科腸性コロナウイルスを含むイヌ腸性コロナウイルスに対するワクチンを開示している。US 5,750,112の開示内容は本願に参照により組み込まれる。
【０２２２】
好ましい実施例のひとつとして、前記ウイルスは不活化したウイルスである。ワクチンとしての使用するためのウイルスの不活化の方法は周知である。好適な方法としては、例えばベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）などを使用する化学的な方法が挙げられる。好適な不活化したウシコロナウイルスのワクチンは、不活化したＢＣＶを含んでもよく、例えば"Rotovec Corona"  (シェーリングプラウ、 http://www.ukvet.co.uk/rotovec/scour.htm)、 "Lactovac" （Hoechst Roussel Vet社, (Veterinary Formulary 5th Edition of the Veterinary Data Sheet Compendium)、"First Defense" （Immuncell社、アメリカ）; "Scour Bos 4"（Grand Laboraotries）及び"Scour Guard 3K"（ファイザー）が挙げられる。
【０２２３】
その他の実施例として、前記ウイルスは弱毒化したウイルスである。ワクチンとしての使用するためのウイルスの弱毒化の方法は周知である。
【０２２４】
好ましくは、ワクチン構成物は医薬として可能なアジュバントも有する。
【０２２５】
好ましくは、ワクチンが核酸を含む場合、ワクチンとして用いられるコロナウイルスタンパクや免疫原性のあるその断片をコードする核酸は、ＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳポリヌクレオチド、またはＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＨＥポリヌクレオチド、またはＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳ及びＨＥポリヌクレオチドの両方である。より好ましくは、前記核酸は図３もしくは図１３に記載の塩基配列、またはその断片を有する、またはのみからなる。
【０２２６】
ワクチンとしての使用のため、ＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳまたはＨＥ核酸は、様々な複製（例えば組み換えアデノウイルスワクチン）または非複製（ＤＮＡワクチン）ベクターにより運ばれるものであってよい。
【０２２７】
好ましい実施例としては、ワクチンはＨＥタンパクなどの他の免疫原性のコロナウイルスの他にも組み換えＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパクを含んでいて良い。
【０２２８】
上述したように、数種のウイルス及び細菌がイヌの呼吸器疾患に関わっていることが知られており、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩＶ）、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）及びBordetella bronchiseptica(B. bronchiseptica)が知られている。
【０２２９】
その他の好ましい実施例として、ワクチンにはイヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス２型、Bordetella bronchiseptica(B. bronchiseptica)、イヌヘルペスウイルス、ヒトレオウイルス及びマイコプラズマ類、または免疫原性のあるこれら由来のタンパクの他にも、組み換えＣＲＶ、ＣＲＣＶ様のＳまたはＨＥタンパクを含んでいても良い。従って、ワクチンは免疫応答、例えばＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２、B.bronchiseptica及びＣＨＶなどの呼吸器疾患に関係する病原体と同様にＣＲＣＶに対する抗体の産生を起こさせることのできる試薬を含むものであって良い。
【０２３０】
実施例として、ワクチン構成物はＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳまたはＨＥタンパクなどのＣＲＣＶに対する抗体の産生を刺激することのできる試薬を含むことに加えて、以下のいずれか１以上をさらに有するものであって良い。
（ａ）イヌにおいてＣＰＩＶに対する免疫応答を起こすことのできる試薬。
（ｂ）イヌにおいてＣＡＶ−２に対する免疫応答を起こすことのできる試薬。
（ｃ）イヌにおいてＣＨＶに対する免疫応答を起こすことのできる試薬。
（ｄ）イヌにおいてB. bronchisepticaに対する免疫応答を起こすことのできる試薬。
【０２３１】
従って、ワクチン構成物はこれらの追加試薬（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれか２、３または４種すべてを適宜有することができる。
【０２３２】
典型的には、イヌにおいてＣＰＩＶに対する免疫応答を起こすことのできる試薬は、不活化、弱毒化したＣＰＩＶ、免疫原性のあるその断片、または前記免疫原性のある部分をコードする核酸を有する。
【０２３３】
典型的には、イヌにおいてＣＡＶ−２に対する免疫応答を起こすことのできる試薬は、不活化、弱毒化したＣＡＶ−２、免疫原性のあるその断片、または前記免疫原性のある部分をコードする核酸を有する。
【０２３４】
イヌアデノウイルス１型は感染性肝炎を引き起こし、イヌアデノウイルス２型は呼吸器疾患を引き起こす。ＣＡＶ−１はＣＡＶ−２に対して相互に交差防御されることが示されている。従って、イヌにおいてＣＡＶ−２に対して免疫応答を起こす試薬は、ＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２のどちらか、または免疫原性のあるその断片を含んでも良い。以下に示すワクチンはEURICAN DHPPiを除いてＣＡＶ−２を含んでおり、使用されるウイルス型を特定しない。
【０２３５】
イヌにおいてＣＰＩＶ及びＣＡＶ−２に対して免疫応答を起こすのに好適な試薬は、当業者に公知である。例えば、以下のイヌワクチンがイギリスにおいて認可されている。
【０２３６】
Fort Dodge Animal HealthのKAVAK DA2PiP69は、組織培養より得たイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパラインフルエンザ２型、及びイヌパルボウイルスの弱毒系統を含む、生凍結乾燥ワクチンである。
【０２３７】
Fort Dodge Animal HealthのKAVAKパラインフルエンザは、同一の樹立細胞株を培養して得たイヌパラインフルエンザ２型の弱毒系統由来の生凍結乾燥ワクチンである。
【０２３８】
Intervet UK社のNOBIVAK DHPPiは、組織培養下細胞株より得たイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス及びイヌパラインフルエンザウイルスを含む、弱毒化生凍結乾燥ワクチンである。
【０２３９】
Intervet UK社のNOBIVAC KCは、Bordetella bronchiseptica系統B-C2及びイヌパラインフルエンザウイルス系統Cornellを含む改変された生ワクチンである（これは鼻腔内ワクチンである）。管理許可番号Vm06376/4026。
【０２４０】
Merial Animal Health社のEURICAN DHPPiは、イヌジステンパー、イヌ感染性肺炎、イヌパルボウイルス及びイヌパラインフルエンザウイルス２型に対する複合生凍結乾燥ワクチンである。
【０２４１】
ファイザー社のVANGUARD7は、樹立細胞株で増殖させた弱毒化した生のイヌジステンパーウイルス（SnyderHill系統）、アデノウイルス（CAV-2 Manhatta系統）、パラインフルエンザウイルス（NL-CPI-5系統）、イヌパラボウイルス（NL-35-D）、並びにLeptospira canicola及びLeptospira icterohaemorrhagiaeの不活化培養物を含む。
【０２４２】
シェーリングプラウAnimal HealthのQUANTUM DOG7は、イヌジステンパー、アデノウイルス２型、パラボウイルス、パラインフルエンザウイルス２型のワクチン（生）及び不活化したLeptospira canicola及びLeptospira icterohaemorrhagiaeのワクチンを含む。
【０２４３】
Virbac社のCANIGEN DHPPiは、組織培養した細胞株より得たイヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス（ＣＡＶ２）、イヌパラボウイルス及びイヌパラインフルエンザウイルスを含む弱毒化生凍結乾燥ワクチンである。
【０２４４】
Virbac社のCANIGEN Ppiは、細胞株を組織培養して得られたイヌパルボウイルス及びイヌパラインフルエンザウイルスを含む弱毒化生凍結乾燥ワクチンである。
【０２４５】
典型的には、イヌにおいてＣＨＶに対する免疫応答を起こさせることのできる試薬は、不活化、弱毒化したＣＨＶ、または免疫原性のあるその断片、または前記免疫原性のある部分をコードする核酸を有する。
【０２４６】
イヌにおいてＣＨＶに対する免疫応答を起こさせることのできる試薬は当業者に公知である。例えば、MerialのEURICAN Herpes205は、イヌヘルペスウイルスに対する精製サブユニットワクチンであり、妊娠したメスの能動免疫に用いられて、子犬が生後１日目からイヌヘルペスウイルスに感染することで死んだり、臨床的な症状や傷害を示したりするのを防ぐものである。しかし、成犬の呼吸器疾患に対しての免疫には許可されていない。
【０２４７】
典型的には、イヌにおけるB. bronchisepticaに対する免疫応答を起こさせることできる試薬は、不活化、弱毒化したB. bronchiseptica、または免疫原性のあるその断片、または前記免疫原性のある部分をコードする核酸を有する。
【０２４８】
イヌにおいてB. bronchisepticaに対する免疫応答を起こさせることのできる試薬は当業者に公知である。例えば、以下のイヌワクチンが使用許可されている。
【０２４９】
ファイザーAnimal HealthのCOUGHGUARD-B（登録商標）(U.S.Vet.Lic.No.:189)は、B. bronchisepticaの不活化した培養物を含む。これは、B. bronchisepticaにより引き起こされる病気、特にケンネルコフの予防として健康なイヌの免疫に用いられる。COUGHGUARD-B（登録商標）は、B. bronchisepticaの不活化された抗原性の高い系統から調製され、イヌに投薬する際に無毒化される。B. bronchisepticaの免疫原特性を完全なまま残す製造方法が報告されている。
【０２５０】
ファイザーAnimal HealthのVANGUARD（登録商標） 5/B (U.S.Vet.Lic.No.:189)は、イヌの樹立細胞株で増殖させたイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、ＣＡＶ−２、ＣＰＩＶ及びイヌパラボウイルス（ＣＰＶ）の弱毒系統を含む。ＣＰＶ抗原はイヌ細胞株の低い継代(low passage)によって弱毒化されるが、移行抗体に勝ることのできる免疫原特性を持つ継代レベルとする。ワクチンは凍結乾燥され不活性ガスで充填された状態で包装される。不活化したB. bronchisepticaの全培養物を含む細菌ワクチンの構成物であり、希釈液として供される。VANGUARD（登録商標） 5/BのB. bronchiseptica成分は、不活化された免疫原性の高い系統をイヌに投薬する際に無毒化して調製される。
【０２５１】
ファイザーAnimal HealthのNASAGUARD-B（商標）(U.S. Vet. Lic. No.: 112)は、B. bronchisepticaの無毒性の生培養物からなる。
【０２５２】
IntervetのPROGARD（登録商標）-KCは、弱毒イヌパラインフルエンザウイルス及びB. bronchisepticaの無毒性の生培養物を含む鼻腔投与型の改変生ワクチンである。PROGARD（登録商標）-KCは、最溶解用の滅菌希釈液と共に乾燥粉末の状態で供される。PROGARD（登録商標）-KCは、イヌパラインフルエンザウイルス及びB. bronchisepticaによるイヌの感染性気管気管支炎（“ケンネルコフ”）の予防として、健康な感染しやすい子イヌおよびイヌの免疫に用いられる。
【０２５３】
IntervetのPROGARD（登録商標）-KC PLUSは、B. bronchisepticaの無毒系統、弱毒イヌアデノウイルス２型及びパラインフルエンザウイルスを含み、鼻腔投与用である。PROGARD（登録商標）-KC Plusを投与すると、気管において即応性の局所的な免疫が活性化し、臨床的症状を予防するだけでなく、初期の感染が抑制される。局所的な免疫に加えて、鼻腔投与から３週間以内に全身の免疫も活性化する。PROGARD（登録商標）-KC Plusの少量（０．４ｍｌ）で１回の鼻孔投与であるため、特に少ない血統や若い子犬に対して、容易に予防接種することができる。PROGARD（登録商標）-KC Plusは、最溶解用の滅菌希釈液と共に乾燥粉末の状態で供される。PROGARD（登録商標）-KC Plusは、イヌアデノウイルス２型、パラインフルエンザウイルス及びB. bronchisepticaによるイヌ感染性気管気管支炎（“ケンネルコフ”）の予防として、健康なイヌ及び３週齡以上子犬の免疫に用いられる。
【０２５４】
IntervetのIntracは、B. bronchisepticaのＳ５５系統を含む凍結乾燥した改変生ワクチンであり、鼻孔投与用である。製品許可番号はＰＬ０２０１／４０１１である。
【０２５５】
上記のNovivacKCもまた、B. bronchisepticaを含んでいる。
【０２５６】
予防接種は特に犬舎に入れる前のイヌ、または繁殖施設のイヌの予防接種として特に有用であるが、それだけに限られるものではない。
【０２５７】
組み換えタンパクからなるワクチンの典型的な投与量は５〜１０μｇである。不活化ウイルスからなるワクチンの典型的な投与用は１〜１０ｍｇである。
【０２５８】
第９の側面としての本発明は、イヌのＣＲＣＶに対する免疫応答を刺激するための薬剤の調製における、（ｉ）ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉ）ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉｉ）ＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｖ）ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｖ）ＣＲＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉ）ＢＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉｉ）前記コロナウイルスタンパクまたは免疫原性のあるその断片をコードする核酸、の使用である。
【０２５９】
本発明は、イヌにおける呼吸器疾患、典型的にはＣＩＲＤの予防のための薬剤の調製における、（ｉ）ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉ）ＢＣＶのＳタンパクと少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｉｉ）ＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｉｖ）ＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを持つコロナウイルス、または（ｖ）ＣＲＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉ）ＢＣＶタンパクと少なくとも７５％の相同性を持つコロナウイルスタンパクもしくは免疫原性のあるその断片、または（ｖｉｉ）前記コロナウイルスタンパクまたは免疫原性のあるその断片をコードする核酸、の使用である。
【０２６０】
コロナウイルスタンパクまたは免疫原性のあるその断片が薬剤の調製に用いられる場合、前記タンパクはＢＣＶタンパクの対応する部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つ。好ましくは、前記タンパクはＣＲＣＶタンパクの対応する部分と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つ。
【０２６１】
好ましくは、薬剤の調製に使用されるコロナウイルスタンパクは上述の第８の側面におけるＢＣＶ、ＨＣＶ、ＨＥＶもしくはＣＲＣＶタンパク、またはその改変物である。
【０２６２】
より好ましくは、薬剤の調製に用いられるコロナウイルスタンパクはＳタンパクである。また好ましくは、前記Ｓタンパクは、上記本発明の第１の側面に規定されるか第４の側面の方法を用いて得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＳタンパク、ＢＣＶのＳタンパク、ＨＣＶのＳタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片を有する。
【０２６３】
最も好ましくは、薬剤の調製に用いられるコロナウイルスタンパクは、図４に示すアミノ酸配列、または図４に示すアミノ酸配列と少なくとも９７％の同一性を持ち、免疫原性のあるその断片を有するまたはのみからなる。好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する。より好ましくは、前記変体は図４に示す配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸配列相同性を有する。
【０２６４】
さらに、またはもしくは、薬剤の調製に使用される前記コロナウイルスタンパクはＨＥ、Ｅ、ＭまたはＮコロナウイルスタンパクを有していても良い。実施例のひとつとして、ＨＥ、Ｍ、またはＮタンパクはＢＣＶ、ＨＣＶまたはＨＥＶタンパクである。他の実施例として、ＨＥ、Ｅ、Ｍ、またはＮタンパクはＣＲＣＶタンパクである。
【０２６５】
典型的には、前記ＨＥタンパクは上記本発明の第３の実施例で定義されるか、第４の側面の方法によって得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＨＥタンパク、ＢＣＶのＨＥタンパク、ＨＣＶのＨＥタンパク、または免疫原性のあるそれらの断片を有する。
【０２６６】
好ましくは、薬剤の調製に用いられるＨＥタンパクは、図１４に示す部分アミノ酸配列、または免疫原性のあるその断片で図１４に示す配列と少なくと９８％の相同性を持つものを有する、またはのみからなる。好ましくは、前記変体は図１４に示す配列と少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する。より好ましくは、前記変体は図１４に示す配列と少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％のアミノ酸相同性を持つ。
【０２６７】
コロナウイルスを薬剤の調製に用いる場合、好ましくはコロナウイルスはＢＣＶのＳタンパクと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つ。より好ましくは、前記コロナウイルスは、ＣＲＣＶのＳタンパクと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つＳタンパクを有していてもよい。
【０２６８】
さらに、またはもしくは、コロナウイルスはＢＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを有していても良い。より好ましくは、前記コロナウイルスはＣＲＣＶのＨＥタンパクと少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸相同性を持つＨＥタンパクを有する。
【０２６９】
第１０の側面としての本発明は、本発明の第１の側面に規定されるか、第４の側面の方法により得られるＣＲＣＶまたはＣＲＣＶ様のＳタンパクで、薬として使用されるものである。典型的には、前記Ｓタンパクは家畜用医薬として使用される。
【０２７０】
本発明は、薬として使用される、上記本発明の第３の実施例で定義されるか、第４の側面の方法によって得られるＣＲＣＶ、ＣＲＣＶ様のＨＥタンパクを包含する。典型的には、前記ＨＥタンパクは家畜用医薬として使用される。
【０２７１】
第１１の側面としての本発明は、ＣＲＣＶの予防としてイヌに免疫する方法であって、本発明の第９の側面のワクチン構成物をイヌに投与することを有する。
【０２７２】
典型的には、前記ワクチンは、筋肉、皮下または鼻腔道に投与される。
【０２７３】
その他の実施例として、ＣＲＣＶと反応する抗体を投与することで、イヌにＣＲＣＶに対する免疫性を受動的に持たせることもできる。ＣＲＣＶと反応する抗体は抗ＢＣＶ抗体、抗ＨＣＶ抗体であって良いが、好ましくは抗ＣＲＣＶ抗体である。好ましくは、ＣＲＣＶと反応する抗体は抗Ｓタンパク抗体、抗ＨＥタンパク抗体である。最も好ましくは、ＣＲＣＶと反応する抗体は、本発明の第５の側面に記載される抗ＣＲＣＶのＳまたはＨＥタンパク抗体である。
【０２７４】
第１２の側面としての本発明は、イヌの間におけるＣＲＣＶの蔓延と戦う方法であり、上記本発明の第６の側面に記載される方法、または上記本発明の第７の側面に記載される免疫吸着法または固体基質を用いることによってイヌがＣＲＣＶに感染しているかどうかを判断すること、及びイヌがＣＲＣＶに感染しているのであればそのイヌを隔離すること、を有する。
【０２７５】
イヌを“隔離する”とは、そのイヌを他のすべてのイヌから引き離した状態にすることを意味を含む。また、そのイヌをＣＲＣＶに対する予防接種をしていない他のすべてのイヌから引き離した状態にするという意味も含んでおり、これは上述するように実施することができる。そのイヌをＣＲＣＶに感染していない他のすべてのイヌから引き離した状態にするという意味も含んでおり、感染については上記のように判断することができる。
【０２７６】
第１３の側面としての本発明は、イヌの間におけるＣＲＣＶの蔓延と戦う方法であり、上記本発明の第６の側面に記載される方法、または上記本発明の第７の側面に記載される免疫吸着法または固体基質を用いることによってイヌがＣＲＣＶに感染しているかどうかを判断すること、及びイヌがＣＲＣＶに感染しているのであれば、そのイヌと接していた、接している、または接しているかもしれない他のイヌに予防接種すること、を有する。
【０２７７】
第１４の側面としての本発明は、イヌにおけるイヌ感染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）の発生を予防したり減少させたりすることのできるテストワクチンを検定する方法である。前記方法は、（ａ）典型的には上記本発明の第６の側面の方法、または上記本発明の第７の側面の免疫吸着法か固体基質を用いることによって、イヌがＣＲＣＶに曝されていたかどうかを決定することと、（ｂ）イヌがＣＲＣＶに曝されていなかったのであれば、テストワクチンをイヌに投与することと、（ｃ）イヌにＣＲＣＶを接種することと、（ｄ）イヌがＣＩＲＤを発症したかどうかを判断すること、を有する。（ｄ）段階においてＣＩＲＤが確認されなければ、テストワクチンがＣＩＲＤを予防することができることが示される。
【０２７８】
典型的には、この方法は一揃いのイヌに対して実施される。
【０２７９】
好ましくは、前記方法は、（ｂ）段階においてテストワクチンを投与されないコントロールのイヌを一揃い使用することを含む。テストワクチンを投与したイヌの組におけるＣＩＲＤの発症が、コントロールの組よりも有意に低ければ、テストワクチンがＣＩＲＤの発症を予防または減少させることができることが示される。
【０２８０】
本発明は、この方法により検定されるワクチンを含む。
【０２８１】
本願で引用される文献は、すべてここに参照により完全に取り込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２８２】
以下、本発明を以下の図及び実施例を参照しながら詳細に説明する。
【実施例１】
【０２８３】
イヌ伝染性呼吸器疾患に関わる新規なコロナウイルスの検出
【０２８４】
概要
イヌ伝染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）の原因についての調査を大規模なイヌの救助施設（re-homing kennel)にて行った。罹患したイヌの気管から採取した組織試料について、ポリメラーゼ遺伝子の保存プライマー（conserved primer）によるＲＴ−ＰＣＲ法を用いて試験した。４つの陽性試料について配列解析したところ新規なコロナウイルスの存在が示され、それらはウシ及びヒトコロナウイルス（OC43系統）の両方について、そのポリメラーゼとスパイクタンパクが高い類似性を示したが、一方でイヌ腸性コロナウイルスの対応する遺伝子とは低い類似性しか持たなかった。このイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）は、３２／１１９の気管試料及び２０／１１９の肺試料よりＲＴ−ＰＣＲにより検出されたが、軽い臨床的症状を示すイヌが最も高い罹患率で検出された。犬舎に入った日にＣＲＣＶに対する抗体が存在していた場合、呼吸器疾患を発症する危険が減少することが血清学的な分析により示された。
【０２８５】
試料と方法
【０２８６】
研究個体群
本研究では、地域的な呼吸器疾患が発生した経歴のある、大手のイヌ救助施設(re-homing kennel)を調査した。すべてのイヌについて、犬舎に入る際にKAVAK DA2PiP69(Fort Dodge)（ジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパラインフルエンザウイルス及びイヌパラボウイルスに対する弱毒生ワクチン）を予防接種した。また、レプトスピラ症死菌ワクチンも用いた(Fort Dodge)。各イヌの健康状態について、獣医学臨床医により１日に２度評価して呼吸器の症状を以下のように評定した。１：呼吸器の症状無し、２：弱い咳、３：咳と鼻水、４：咳と鼻水と食欲不振、５：気管支肺炎。イヌの全身的な健康状態、は以下のように評定した。１：健康、２：健康でない、３：非常に健康でない。イヌの年齢、血統及び性別を記録した。
【０２８７】
１１９匹のイヌに対して、全身の死体解剖を行った。組織試料は、使用に供するまで−７０℃で保存した。
【０２８８】
１１１匹のイヌについて、イヌ救助施設に入った日に血清試料を採取した。８１匹のイヌについては入舎後７日、及び１１１匹のイヌについては入舎後２１日の追跡試料の血清を入手することができた。
【０２８９】
最初の血清採取から最後の採取までの２１日間において、１１１匹のイヌのうち３０匹が健康であったが、８１匹のイヌが呼吸器疾患を発症した。
【０２９０】
他の場所で飼育されていた３５匹のイヌの血清を、Royal Veterinary Collegeの診療施設から得た。これらの血清は、種々の理由から生化学的な調査に供されたものである。これらの血清のうちの５つは、呼吸器疾患の経歴のない１８月齢のビーグル犬より得たものである。血清は常法に基づき−２０℃で保存した。
【０２９１】
ＲＮＡの抽出とＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡはTriReagent（シグマ）を用いて１１９匹のイヌの気管及び肺組織から抽出した。約２５−５０ｍｇのホモジナイズした試料を用い、取扱説明書の推奨にならってＲＮＡを抽出した。
【０２９２】
ｃＤＮＡの合成は、Random Hexamers（ロシュ）及びImpromII逆転写酵素(Promega)を用いて行った。
【０２９３】
コロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子は高度に保存されていることが知られており、このウイルスファミリーの系統解析に用いられている（Stephensen et al., 1999）。コロナウイルスの検出のため、Stephensen et al. (1999)に記載されるポリメラーゼ遺伝子に対する２Ｂｐ及び４Ｂｍプライマーの改変物を用いた（Conscoro5: 5' -ACT-CAR-ATG-AAT-TTG-AAA-TAT-GC (SEQ ID NO. 31)、及びConscoro6: 5' -TCA-CAC-TTA-GGA-TAR-TCC-CA (SEQ ID NO. 32)）。
【０２９４】
ＰＣＲは、終濃度が２．５ｍＭのＭｇＣｌ２と０．５μＭのプライマーを含む所定の反応バッファー中でＴａｑポリメラーゼ(Promega)を用いて行った。Conscoro5及びConscoro6プライマーを用いたＰＣＲでは、以下の温度制御とした。９５℃５分の変性後、９５℃１分、３７℃１分でアニール、及び７２℃１分で伸長のサイクルを１０回行った。続いて、アニール温度４５℃で１０サイクル、アニール温度５０℃で１０サイクル、及びアニール温度５３℃で１０サイクル行い、最後の伸長を７２℃で１０分行った。
【０２９５】
ＰＣＲ産品の２０μｌ画分を１．５％アガロースゲルで分析し、電気泳動の後ナイロンメンブレン（ロシュ）上にブロットした。ナイロンメンブレンはＰＣＲ産品に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと３７℃で一晩ハイブリダイズさせた(Probe Conscoro: AAG-TTT-TAT-GGY-GGY-TGG-GA (SEQ ID NO. 33))。ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを伴う３’Ａ−末端のプローブを用い、抗ジゴキシゲニン複合体及びＣＳＰＤ化学蛍光基質（ロシュ）を用いて検出した。
【０２９６】
スパイク遺伝子に特異的なプライマー配列は、ウシコロナウイルスＬＹ−１３８系統(AF058942)及びヒトコロナウイルスOC43系統のスパイク領域の配列(L14643)由来のものである。
【０２９７】
ＰＣＲはSpike1及びSpike2プライマーを用いて行い、続いてSpike3及びSpike4プライマー並びに２μｌの最初の増幅産物を用いてネステッドＰＣＲを行った。
【０２９８】
括弧書きの数字は、ウシコロナウイルスゲノムにおけるヌクレオチドの位置を示す。
Spike1: 5'-CTT-ATA-AGT-GCC-CCC-AAA-CTA-AAT (25291-25314)
Spike2: 5'-CCT-ACT-GTG-AGA-TCA-CAT-GTT-TG (25912-25890)
Spike3: 5'-GTT-GGC-ATA-GGT-GAG-CAC-CTG (25320-25339)
Spike4: 5'-GCA-ATG-CTG-GTT-CGG-AAG-AG (25762-25742)
【０２９９】
オリゴヌクレオチドのSpike1はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４、Spike2はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５、Spike3はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６、Spike4はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７である。
【０３００】
温度制御は、９５℃５分の変性後、９５℃１分、５５℃１分でアニール、及び７２℃４０秒で伸長のサイクルを３５回行った。７２℃１０分で最後の伸長を行った。ネステッドＰＣＲにより４４２ｂｐの断片を産した。
【０３０１】
ＰＣＲ産物はpGEM-T-easyベクター(Promega)にクローニングされ、Ｃｙ５標識プライマーを用いたThermo sequenase 蛍光標識プライマーサイクルシークエンスキット及び7-deaza-dGTP（アマシャムファルマシア）を用いてシークエンスした。
【０３０２】
系統解析
ポリメラーゼ遺伝子由来の２５０ｂｐのｃＤＮＡ配列と、１１のコロナウイルスの対応する配列との配列解析は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘを用いて行った（Thompson et al., 1997）。
【０３０３】
公知のコロナウイルスとの系統学的な関係は、Phylip 3.6 package(Felsenstein, 1989)を用いて解析した（Felsenstein, 1989）。配列はSeqbootプログラムを用いてブートストラップ解析を行った。得られたデータはDNAparsプログラムを用いた最節約法に供し、またコンセンサスツリーはConsenseを用いて算出した。こうして得られた系統図をTreeviewプログラムを用いて描画した（Page, 1996)。
【０３０４】
ＥＬＩＳＡ
ウシコロナウイルス、イヌ腸性コロナウイルス（ＣＥＣＶ）のＥＬＩＳＡ抗原（ウイルスに感染した細胞培養物から調製したもの。 Churchill Applied Biosciences, Huntingdon, UKより購入）を推奨される濃度にてＰＢＳに再懸濁させ、９６穴プレート（ファルコン）で３７℃で一晩インキュベートした。
【０３０５】
プレートをＰＢＳで洗浄し、５％スキムミルクを含むＰＢＳで３０分ブロッキングした。血清はブロッキングバッファーで１：１００に希釈し、プレートで１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Tween20（シグマ）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗イヌＩｇＧコンジュゲート(Sigma)（ＰＢＳ／０．０５％Tween20で１：５０００希釈）を加えて１時間した。プレート発色基質（ＯＰＤ、シグマ）で１０分インキュベートし、２ＭのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。４９２ｎｍにおける吸収をＥＬＩＳＡ分光計で決定した。
【０３０６】
ウイルス培養
イヌ成犬の肺線維芽細胞（継代３から７）、ＭＤＣＫ及びＡ７２細胞においてウイルスの単離を行った（ウイルスの単離は初代細胞、またはＭＤＣＫなどの細胞株、またはＡ７２（イヌ）、ＭＤＢＫ（ウシ）、ＨＲＴ−１８（ヒト直腸性腫瘍細胞株）及びＶｅｒｏ（アフリカミドリザル）を用いて行われるのが好ましい）。肺線維芽細胞は２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＥＭで培養し、ＭＤＣＫ及びＡ７２細胞は５％ＦＣＳを含むＭＥＭで培養する。気管組織試料（おおよそ２５ｍｇ）はメスでホモジナイズし、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（２．５μｇ／ｍｌ）及びトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌのＭＥＭ中で強く撹拌する。試料を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を細胞培養物の接種に用いた。３７℃３０分経過後、上清を除去し、維持培地を培養物に加える。培養物を細胞変性の効果がない状態で３代継代する。次いで、ＲＮＡを細胞から抽出し、ＣＲＣＶの存在を検出するためのＲＴ−ＰＣＲを行う。
【０３０７】
統計分析
データはカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定により分析し、ｐ値が０．０５未満であれば統計的に有意とした。
【０３０８】
結果
【０３０９】
コロナウイルスＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に対するコンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ
Conscoro5及びConscoro6プライマーを用い、４０の気管試料から得たｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【０３１０】
ＰＣＲ及びそれに続くハイブリダイゼーションにより、これらのうち７の試料が陽性であることが判明した（１７．５％）。
【０３１１】
ＰＣＲ産物をクローニング及び配列決定し（図１及び図２）、配列データをＦＡＳＴＡ検索プログラムを用いて利用可能なウイルスの配列と比較した(Pearson, 1990)。
【０３１２】
４のイヌ気管試料から得たコロナウイルスｃＤＮＡポリメラーゼ配列を他のコロナウイルス配列と比較した結果、それらはQuebec及びLY138系統のＢＣＶの配列（GenBankアクセス番号はそれぞれＡＦ２２０２９５及びＡＦ０５８９４２）及びヒトコロナウイルスOC43系統(GenBankアクセス番号ＡＦ１２４９８９）の配列と最も似ていることが明らかとなった。解析した２５０ｂｐの配列の相同性は、ＢＣＶ Quebecとは９８．８％、ＢＣＶ LY138及びＨＣＶ ｐｏｌ遺伝子とは９８．４％であったが、一方でＣＣＶ 1-71系統のｐｏｌ遺伝子とは６８．５３％にすぎなかった（図６及び図７）。
【０３１３】
この新規な配列と１１のコロナウイルスの対応する配列との配列比較、及び最節約法を用いた解析により得られたコンセンサスツリーを図５に示す。気管試料（Ｔ１０１）より得られたｃＤＮＡ配列は、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルス-OC43、及び赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルスと共通する分岐に位置することがわかった。
【０３１４】
このウイルスをイヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣＶ）と呼ぶ。
【０３１５】
スパイク遺伝子に対するプライマーを用いたＰＣＲ
ＣＲＣＶのＲＮＡ配列を更に解析するために、ウシコロナウイルスLY138系統（AF058942）及びヒトコロナウイルスOC43系統（L14643）とのＲＮＡの配列比較をClustal Xを用いて行った（Thompson et al., 1997）。コンセンサス領域に基づいてネステッドプライマーのセットSpike 1-2及びSpike3-4の選択した（図１１）。１１９の気管及び肺試料からネステッドプライマーを用いて得られたｃＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った。
【０３１６】
ネステッドＰＣＲにより、総計で３２の気管試料（２６．９％）及び２０の肺試料（１６．８％）が陽性であることがわかった。８匹のイヌについては、気管及び肺の両方においてＰＣＲ結果が陽性であった。
【０３１７】
６匹の異なるイヌの組織から得たＰＣＲ産物の配列分析により、これらのｃＤＮＡからこれらが同一のＤＮＡ配列であることが示された（図３及び４）。ＦＡＳＴＡプログラムを用いて公知のコロナウイルスのスパイク配列と比較したところ、ウシコロナウイルスとは９８．１％の相同性、ヒトコロナウイルスOC43系統とは９７．８％の相同性があることが明らかとなった（図９及び図１０）。
【０３１８】
ＨＥ遺伝子に対するプライマーを用いたＰＣＲ
ウシコロナウイルス及び他のグループＩＩのコロナウイルスは、さらに構造タンパクである血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）を含有している。ＣＲＣＶがＢＣＶと高い相同性を示したことから、我々はＣＲＣＶにおけるＨＥ遺伝子の存在について分析した。
【０３１９】
ＢＣＶ及びOC43系統ＨＣＶのＨＥ遺伝子配列の配列比較をHE1及びHE2プライマーの設計に用いた（表２）。Ｓ遺伝子に対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより陽性と確認された４の気管試料をＨＥ遺伝子に対するプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより試験した。アガロースゲル電気泳動の結果、４の試料のすべてが予想されたサイズのＰＣＲバンドを示した（図１７）。
【表２】
2005533513.tif 000004
【０３２０】
ＨＥ１プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８であり、ＨＥ２プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９である。ＨＥ１及びＨＥ２プライマーを用いたＣＲＣＶのＰＣＲ産物の配列を図１３に（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）、その予想されるアミノ酸配列を図１４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）に示す。これらのヌクレオチド及びアミノ酸配列と、他のコロナウイルスの対応する断片との比較を図１５及び図１６に示す。表３に示すように３のアミノ酸配列がＣＲＣＶに特有であった。
【表３】
2005533513.tif 000005
【０３２１】
ＢＣＶ、ＨＥＣＶ、ＨＣＶ、及びＨＥＶにおけるアミノ酸の位置については、ＢＣＶ及びOC43系統のＨＣＶのＨＥタンパク（それぞれGenBankアクセス番号Ｍ８４４８６及びＭ７６３７３）の最初のＭ（これを１番とする）から番号を付した。
【０３２２】
ＰＣＲ陽性の試料と呼吸器症状の関連
スパイク遺伝子に対するプライマーを用いて、１１９匹のイヌから得た気管及び肺試料をＣＲＣＶに対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。このうち、４２匹のイヌは呼吸器症状が無く（１度）、１８匹のイヌは軽症の呼吸器症状を示し（２度）、４６匹は中程度の（３度）そして１３匹は重症の呼吸器症状（４度及び５度）を示した。４度と５度については、本グループでは症例が少ないため併合した。
【０３２３】
表４は異なる程度の呼吸器疾患を持つイヌにおけるコロナウイルスに対するＰＣＲの結果を示したものである。特に、表４はコロナウイルスのＳタンパクに対するネステッドＰＣＲを用いた、異なる呼吸器症状（無しからひどいものまで）を持つ１１９匹のイヌの気管及び肺試料から得られたＲＴ−ＰＣＲの結果を試料総数に対する陽性試料の数とその割合（かっこ内）と共に示したものである。
【表４】
2005533513.tif 000006
【０３２４】
ＣＲＣＶの血清によるアッセイ法の確立
ＣＲＣＶのスパイクｃＤＮＡとウシコロナウイルスのスパイク領域との相同性から、ＢＣＶに対するＥＬＩＳＡ抗原をＣＲＣＶの血清による分析に用いた。
【０３２５】
調査した犬舎にて飼育されたことが無く、伝染性の呼吸器疾患に罹患した経歴のない５匹のイヌの血清を試験した。ＯＤ値は−０．０１３から０．３９であり、平均値は０．１５４であった。また、様々な理由から動物病院に来た３０匹のイヌの血清について、コロナウイルスの抗体に対する試験を行った。そのうち、２０の試料は＜０．４（−０．４６から０．３９６）のＯＤ値を示し、１０の試料は＞１．０のＯＤ値（１．０１２から１．９４９）を示した。ＯＤ値が０．６以上の試料は、実質上陽性と考えられる。
【０３２６】
呼吸器疾患を持つ及び持たないイヌのＣＲＣＶに対する免疫応答の比較
調査した犬舎の１１１匹のイヌの血清の組について、ＢＣＶ抗原ＥＬＩＳＡを行った。このうち、８１匹のイヌは２１日間期間中に呼吸器疾患の症状を示しており、３０匹は健康であった。
【０３２７】
呼吸器疾患のイヌのグループについて、犬舎に来た日において１７匹はＣＲＣＶに対する抗体が陽性であり、６４匹は陰性であった。
【０３２８】
１日目にＢＣＶに対する抗体が検出されなかった６４匹のイヌについて、２１日目には６３匹が陽性であった。６３匹中７日目の試料が利用可能な４６匹のすべてにおいて、７日目の結果は陰性であった。従って、６３匹のイヌが試験期間中に血清変換を起こし、陰性のままだったのはたった１匹だった。
【０３２９】
健康なままだった３１匹のイヌの内、１７匹のイヌは犬舎に来た日においてＣＲＣＶに対する抗体を持っていた。１日目に陰性だった１３匹のイヌは、７日目においてもすべて陰性であったが、２１日目までに血清変換を起こした。
【０３３０】
従って、犬舎に到着した日にＣＲＣＶに対する抗体が陽性だった３４のイヌのうち、１７匹が呼吸器疾患に罹患したが（５０％）、一方で到着時に陰性だった７７のイヌは試験期間中に６４匹（８３．１％）が呼吸器疾患の症状を示した（図１２）。
【０３３１】
従って、犬舎に来た日にＣＲＣＶに対する抗体を持たないイヌは呼吸器疾患に罹患する可能性が高かった（ｐ＜０．００１）。
【０３３２】
犬舎に来た日に陰性だった７７匹のイヌのうちたった１匹が２１日の試験期間において陰性のままであり、７６匹は血清転換を起こした。
【０３３３】
イヌ腸性コロナウイルス（ＣＥＣＶ）抗原を用いた血清学
ＣＲＣＶがイヌ腸性コロナウイルスと血清学的な交差反応を起こすかどうかを調べるために、イヌコロナウイルス抗原を用いたＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＢＣＶ抗原を用いてＣＲＣＶに対する抗体の試験を行った２７匹のイヌの血清を選出した。
【０３３４】
そして、８匹のイヌが犬舎に来た日にＣＥＣＶに対する抗体を持っており、そのうちの４匹はＣＲＣＶに対する抗体も持っていた。１９匹のイヌは１日目にはＣＥＣＶに対して陰性でり、そのうち１７匹はＣＲＣＶに対しても陰性であった。この１９匹のイヌのうち、５匹は２１日の試験期間中にＣＥＣＶに対する血清変換を起こし、１７匹はＣＲＣＶに対する血清変換を起こした。
【０３３５】
このグループにおける呼吸器疾患の罹患率を分析した結果、１日目にＣＥＣＶに対する抗体が陽性であった８匹のうち６匹（７５％）が呼吸器疾患に罹患した。１日目にＣＥＣＶに対する抗体が検出されなかった１９匹のイヌのグループについては、１５匹が呼吸器疾患の症状を示した（７８．９％）（ｐ＝０．５９４）。
【０３３６】
ウイルスの単離
ＲＴ−ＰＣＲによりＣＲＣＶのＲＮＡが陽性と確認されたイヌの気管組織試料を、イヌ成熟線維芽細胞及びＭＤＣＫ細胞の培養細胞に植え付ける。いくつかの試料については、Ａ７２細胞においてウイルスの単離も行う。培養物は３世代の継代において細胞病理学的な徴候を示さない。数回の継代後、培養組織からＲＮＡを抽出し、ＰＴ−ＰＣＲによりＣＲＣＶのＲＮＡの有無を試験した。
【０３３７】
考察
【０３３８】
本研究は、犬舎に飼育される呼吸器疾患を持つイヌにおける新規なコロナウイルスであるＣＲＣＶについて報告するものである。
【０３３９】
コロナウイルスはヒト、ネコ、ブタ、家禽類の呼吸器疾患を引き起こすことが報告されているが、イヌの気管における存在及びイヌの伝染性呼吸器疾患（ＣＩＲＤ）との関係は確認されていなかった。
【０３４０】
ＣＩＲＤが流行しており、ＣＩＲＤに対して推奨されるワクチンの使用によっても流行を抑制することができなかった犬舎のイヌについて調査した。これらのイヌの気管から採取した試料を、コロナウイルスの保存ポリメラーゼ遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いて試験した(Stephensen et al., 1999)。
【０３４１】
まず、７の気管試料が陽性であることがわかった。ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列を決定し、すべての利用可能なコロナウイルスポリメラーゼ遺伝子の配列と比較した。この解析により、イヌ試料から得たｃＤＮＡ配列が、ウシコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子（９８．８％）及びヒトコロナウイルスのOC43系統（９８．４％）と最も高い相同性を持つが、腸性イヌコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子とは低い相同性しか持たない（1-71系統、６８．５３％）ことが明らかとなった。
【０３４２】
１１のコロナウイルスのポリメラーゼ配列を用いて、系統学的な解析を行った。イヌの気管から検出したコロナウイルス（ＣＲＣＶ）は、第２グループに属する３のウイルス（ＢＣＶ、OC43系統のＨＣＶ、及びＨＥＶ）と同じ分岐に位置していた。しかしながら、グループ１のコロナウイルスである、イヌ腸性コロナウイルスは、遠く関係しているにすぎなかった。
【０３４３】
従って、イヌ呼吸器コロナウイルスは新規なイヌのウイルスであり、共に呼吸器疾患の原因となることで知られるＢＣＶ及びＨＣＶ−OC43と密接に関係するウイルスである。
【０３４４】
より多くの配列情報を得るため、またより変化しやすい遺伝子を用いて他のコロナウイルスとの関係を決定するために、スパイク遺伝子の一部を解析した。ＣＲＣＶはＢＣＶ及びＨＣＶ−OC43と最も類似していることが示されたことから、これらのスパイク遺伝子の配列をネステッドプライマーのセットを設計するのに用いた。より感度の良いアッセイが達成されるように、ネステッドプライマーが選択された。
【０３４５】
このＲＴ−ＰＣＲの産物のシークエンスにより、ＣＲＣＶがＢＣＶ及びＨＣＶ−OC43と高い相同性を持つことが確認された。
【０３４６】
ＢＣＶとＣＲＣＶのスパイクｃＤＮＡは高い相同性を持つことから、ＢＣＶ抗原に基づくＥＬＩＳＡを用いてＣＲＣＶに対する抗体の有無を分析した。ＥＬＩＳＡの結果により、調査個体群におけるＢＣＶに類似するウイルスの存在が確認された。
【０３４７】
犬舎に来た時は３０％だった抗体の保有率は、２１日後には９９％となった。
【０３４８】
興味深いことに、また予期しなかったことに、血清の分析から犬舎に来た日にＣＲＣＶに対する抗体を持っていたイヌは抗体を持たなかったイヌに比べて呼吸器疾患に罹患する確率が低かった（ｐ＜０．００１）。従って、今回の個体群ＣＲＣＶに対する抗体の存在によって、において呼吸器疾患に対する防護的な効果があった。
【０３４９】
犬舎に来た日に陰性だったイヌのほとんどが３週間の間にＣＲＣＶに対する血清変換を起こしたことから、このウイルスが非常に伝染性であることが示唆される。イヌ腸性コロナウイルス（ＣＥＣＶ）に対する抗原の血清としての使用により、２１日目におけるＣＥＣＶに対する抗体の保有率はがずっと低いことが示された。従って、ＢＣＶ−ＥＬＩＳＡの結果はイヌ腸性コロナウイルスへの感染を反映しておらず、これら２種の抗原間での交差反応は低いことが示された。
【０３５０】
ＣＲＣＶに対する血清抗体は、飼い犬や救助施設に来たイヌなどを含む様々なイヌのうちの３０％に見られた。従って、ＣＲＣＶの存在は調査した犬舎に限ったものではなく、ウイルスはイヌ全体に定着しているようである。
【０３５１】
ＰＣＲによって、気管組織及び肺組織に検出されたことから、ＣＲＣＶは上気道及び下気道に感染しているようであった。犬舎の個体群において、ＣＲＣＶ−ＲＮＡはあらゆる程度の呼吸器疾患を持つイヌの２７．３％で検出され、安楽死の時点では一見すると健康であるイヌの２６．２％で検出された。
【０３５２】
ＣＲＣＶ−ＲＮＡは軽症の咳をするイヌの気管から最も高い割合で発見された（５５％）。229-E系統のヒトコロナウイルスを用いた研究により、コロナウイルスは気管上皮の破壊及び繊毛の運動異常を引き起こすことが知られている（Chilvers et al.,2001）。理論に束縛されないのであれば、ＣＲＣＶの感染は同様な効果を持ち、ウイルスはＣＩＲＤの病因のうちの初期段階において重要な役割を持つことを我々は確信している。ＣＲＣＶが気管上皮を傷つけ、繊毛の運動を妨げることで、他のウイルスや病原菌の侵入が容易になる。したがって、ＣＲＣＶの感染自体は軽症の呼吸器症状しか引き起こさないが、他の病原体と共同して重症な呼吸器疾患を引き起こすのであろう。
【０３５３】
Bordetella bronchiseptica、イヌアデノウイルス２型及びイヌパラインフルエンザがＣＩＲＤの主要な原因であると決定されたため、１９７０年代以降ＣＩＲＤの病因については詳細に調査されていなかった。しかしながら、すべてのイヌにＣＰＩＶ、ＣＡＶ−２及びジステンパーウイルスに対する予防接種を行い、大多数のイヌが２１日以内にワクチンに応答したことが示されたにもかかわらず、この予防接種は今回の犬舎における病気の抑制を手助けするものとはならなかった（データ示さず）。
【０３５４】
この研究より、ＣＩＲＤには新規なイヌ呼吸器コロナウイルスが関係していることが示された。従って、ＣＩＲＤの病因を再評価し、新規な微生物や以前はこの病気に関係しないとされた微生物の役割を立証しなければならないであろう。
【０３５５】
参照文献
【０３５６】
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【０３５７】
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【実施例２】
【０３５８】
ＣＲＣＶスパイクのクローニング及び発現
ＣＲＣＶのスパイク遺伝子は表５に示すプライマー及び以下のクローニング法を用いてクローニングした。これらは図１８に図示される。
【０３５９】
１．スパイク遺伝子を４の重複断片で増幅した。
２．ＰＣＲ産物であるSp5-Sp2(B)は重複部分におけるPvuIIサイトを用いてSp1-Sp8(C)に結合させた。
３．この断片を制限サイトNcoI及びBstXIを用いてpT7blue2ベクター（Novagen）にクローニングした。
４．ＰＣＲ断片SpFXho-Sp6(A)を、重複部分のBstXI及びSpF-Xhoプライマーに取り込ませたXhoIサイトを用いてBCに結合させた。
５．断片ABCを制限サイトXhoI及びNcoIを用いてバキュロウイルス輸送ベクターpMelBacB (Invirogen)に移送した。
６．ＰＣＲ断片Sp7-SpR-HisTag-Eco(D)を、重複部分のNcoI及びプライマーSpR-Eco-HisTagに取り込まれたEcoRIの制限サイトを用いてABCに結合させ、pMelBacB中の完全なスパイク遺伝子(Spike MelBac)を得た。これには、発現タンパクのＣ末端にHisTag (6xHis)が含まれる。
７．哺乳類における発現のため、完全遺伝子をpMelBacBのBamHIサイト及びABCDの末端のEcoRIサイトを用いてpSecTagA (Invitrogen)に移送してプラスミドSpikeSecTagとした。
【０３６０】
組み換えバキュロウイルスの構築
Bac-N-BlueバキュロウイルスＤＮＡ(Invitrogen)及びSpike MelBacを用いてSf9細胞に同時導入を行った。得られたバキュロウイルス（AcSpCRCV 1-11）には、組み換え部位の上流及び下流に位置するプライマー（Invitrogen）を用いたＰＣＲにより、全長が挿入されていることが示された。
【０３６１】
哺乳動物細胞における発現
Spike SecTagプラスミドは、リポフェクタミン（Invitrogen）を用いてBHK-21細胞に導入した。ＥＬＩＳＡ（Churchillより得たＢＣＶ抗原）によってＣＲＣＶに対する抗体が陽性であることが示されたイヌの血清試料及びChurchillより得たＢＣＶに対するポジティブコントロール血清（トリ抗ＢＣＶ）を用いて、スパイクタンパクの発現を分析した。導入が行われた細胞はイヌまたはトリ血清及びＦＩＴＣ標識複合体（ＦＩＴＣ抗イヌＩｇＧまたはＦＩＴＣ抗トリＩｇＧ）を用いた免疫蛍光アッセイにおいてポジティブな標識を示す。
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０３６２】
【図１】ＣＲＣＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列（２５０残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）。
【図２】図１の塩基配列由来のＣＲＣＶのｐｏｌタンパクの部分アミノ酸配列（８３残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。
【図３】ＣＲＣＶのスパイク（Ｓ）ｃＤＮＡの塩基配列（４０９２残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）  ３５３１番目のＹはＣもしくはＴの何れかである。
【図４】図３の塩基配列由来のＣＲＣＶのＳタンパクのアミノ酸配列（１３６３残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）。
【図５】１２種のコロナウイルスにおけるポリメラーゼ遺伝子の２５０塩基領域についてのｃＤＮＡ配列のコンセンサスツリー。イヌ呼吸器コロナウイルスから得られた配列をＴ１０１で示す。数字は１００種のデータセットを解析して得られたブートストラップ値を示す。ＢＣＶ：ウシコロナウイルス、ＣＣＶ：イヌコロナウイルス、ＦＩＰＶ：ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ＨＥＶ：ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ＩＢＶ：伝染性気管支炎ウイルス、ＭＨＶ：マウス肝炎ウイルス、OC43：ヒトコロナウイルスOC43系統、ＳＤＡＶ：シアロ涙腺炎ウイルス、ＴＣＶ：七面鳥コロナウイルス、ＴＧＥＶ：伝染性胃腸性炎ウイルス、２２９Ｅ：ヒトコロナウイルス、２２９Ｅ系統、Ｔ１０１：イヌ呼吸器コロナウイルス（気管試料Ｔ１０１のＰＣＲ産物）。
【図６】ＣＲＣＶ（サンプルＴ１０１  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、ＢＣＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、ＨＣＶのOC43系統（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）、ＨＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）およびＣＣＶ（腸性ＣＣＶ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）のｐｏｌのｃＤＮＡの２５０塩基部分配列におけるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析。
【図７】ＣＲＣＶ（ｐｒｏｔＣＲＣＶｐｏｌ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）のｐｏｌタンパクと、ＨＣＶ（ｐｒｏｔＨＣＶｐｏｌｙ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）、ＨＥＶ（ｐｒｏｔＨＥＶｐｏｌｙにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）、ＢＣＶ（ｐｒｏｔＢＣＶｐｏｌｙにＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）およびＣＥＣＶ（腸性ＣＣＶ、ｐｒｏｔＣＥＣＶｐｏｌ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）のｐｏｌタンパクとにおける８３塩基部分配列のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析。
【図８】ＣＲＣＶスパイクｃＤＮＡ（ＣＲＣＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）と腸性ＣＣＶスパイクｃＤＮＡ（ＣＥＣＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）の塩基配列におけるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析。
【図９】ＣＲＣＶのスパイクｃＤＮＡ（ＣＲＣＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）配列と、ＢＣＶ（ＢＣＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）、ＨＣＶ（ＨＣＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）及びＨＥＶ（ＨＥＶｓｐｉｋｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）スパイクｃＤＮＡ配列とにおける４０９２塩基のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析ＣＲＣＶの３５３１番目のＹは、ＣまたはＴのいずれかである。
【図１０】ＣＲＣＶのスパイクタンパク（ＣＲＣＶｓｐｉｋｅｐｒ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）とＢＣＶ(ＢＣＶｓｐｉｋｅｐｒｏ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７、ＨＣＶ（ＨＣＶｓｐｉｋｅｐｒｏ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）、ＨＥＶ（ＨＥＶｓｐｉｋｅｐｒｏ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）及び腸性ＣＣＶ（ＣＥＣＶｓｐｉｋｅｐｒ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）のスパイクタンパクとにおける１３６３アミノ酸のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析。
【図１１】入れ子状態の組となったプライマー（Ｓｐｉｋｅ１及び２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．３４及び３５）とそれに続くＳｐｉｋｅ３及び４（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．３６及び３７））を使ったＲＴ−ＰＣＲ。ＢＣＶ：ウシコロナウイルスのポジティブコントロール試料、Ａ７２：コロナウイルスに感染していないＡ７２細胞；Ｈ２Ｏ：ＤＮＡを含まないＰＣＲ混合物；Ｔ５−Ｔ２１：研究対称の犬の気管試料。アガロースゲル電気泳動により、ポジティブコントロール並びに試料Ｔ１２及びＴ２１のＰＣＲ産物の推定サイズは４４２ｂｐであることが示された。
【図１２】２のイヌのグループにおける呼吸器疾患の罹患率の比較。グループ１のイヌは犬舎に入る日において呼吸器コロナウイルスに対して血清抗体が陽性であり、グループ２は陰性であった。グラフはグループ２と比較したグループ１においてイヌが呼吸器疾患を発症した割合を示すものである。ｎは、各グループのイヌの総数である。
【図１３】ＣＲＣＶ血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子の部分ヌクレオチド配列（４９７残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）。配列はＢＣＶのＨＥ遺伝子（GenbankＭ８４４８６）とＨＣＶ  OC43（Genbankアクセス番号Ｍ７６３７３）のヌクレオチド４１８から９１４に対応する。
【図１４】図１３のヌクレオチド配列由来のＣＲＣＶのＨＥタンパク（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）の部分アミノ酸配列（１６５残基）。配列ははＢＣＶのＨＥ遺伝子（GenbankＭ８４４８６）とＨＣＶOC43（Genbankアクセス番号Ｍ７６３７３）のヌクレオチド１４０から３０４に対応する。
【図１５】ＣＲＣＶ（イヌ呼吸器コロナウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）の血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子と、ＢＣＶ（ウシコロナウイルスLY138系統、（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３、Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２より取得）、OC43（ヒトコロナウイルスOC43系統、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４、Genbankアクセス番号Ｍ７６３７３より取得）、ＨＥＣＶ（ヒト腸性コロナウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５、Genbankアクセス番号L07747より取得）、及びＨＥＶ（赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６、Genbankアクセス番号ＡＦ４８１８６３より取得）の血球凝集素／エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子との４９７ヌクレオチド部分配列のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析
【図１６】ＣＲＣＶ（イヌ呼吸器コロナウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）のＨＥタンパクと、ＢＣＶ（ウシコロナウイルスLY138系統、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７、Genbankアクセス番号ＡＦ０５８９４２より取得）、OC43（ヒトコロナウイルスOC43系統、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８、Genbankアクセス番号Ｍ７６３７３より取得）、ＨＥＣＶ（ヒト腸性コロナウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９、Genbankアクセス番号Ｌ０７７４７より取得）、及びＨＥＶ（赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０、Genbankアクセス番号ＡＦ４８１８６３より取得）のＨＥタンパクとの１６５アミノ酸部分配列のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ（１．８）多重配列解析  ＣＲＣＶ特異的な３のアミノ酸であるＦ、Ｎ、及びＬを太字及び下線で示す。
【図１７】ＢＣＶ及びＨＣＶ（OC43系統）のＨＥ遺伝子を対称とするコンセンサスプライマーＨＥ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８）及びＨＥ２（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９）を用いたＲＴ−ＰＣＲアガロースゲル電気泳動により推測されるＰＣＲ産物のサイズはＢＣＶポジティブコントロール及び研究対象のイヌのうちの４つの気管試料（Ｔ９０、Ｔ９１、Ｔ１０１及びＴ１０５）については４９７ｂｐ示したが、コロナウイルス陰性のＡ７２細胞またはＤＮＡを含まないＰＣＲ混合物（Ｈ２Ｏ）は示さなかった。１ｋｂとは分子サイズ標準を示す（プロメガ）。
【図１８】ＣＲＣＶスパイクタンパクのクローニングの方策。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図８】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2005533513.tif 000051
2005533513.tif 000052
2005533513.tif 000053
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