(57)【要約】本発明は、多分化能性及び全能性幹細胞の指令した分化を誘導する能力について、増殖因子、接着分子、免疫刺激分子、細胞外マトリックス成分及びそのほかの物質を、単独でまたは組み合わせて、同時にまたは適当な時間に、スクリーニングする検定に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団を、開放または密閉した一つまたは複数の分離したウエル、そのウエルは同じまたは異なる装置内にある、に分配する：
(b)該分離したウエルの細胞を1またはそれ以上の候補分化誘導条件に同時にまたは連続して暴露する：そして
(c)該個別の細胞または細胞の集団の分化のマーカーを検出するために該個別の細胞または細胞の集団をスクリーニングする：
を含む、1またはそれ以上の化学的または生物学的物質または物理的条件に応答する全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞の分化を評価する方法。
【請求項２】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞が内部細胞塊（ICM）細胞、胚性幹（ES）細胞、胚性生殖（EG）細胞、1から400細胞からなる胚、胎児様体細胞、桑実胚由来細胞、胚性多分化能細胞及びそれらに由来する細胞からなる群から選択されている請求項1に記載の方法。
【請求項３】
該ほぼ全能性または多分化能の幹細胞がヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、イヌ及びネコ細胞からなる群から選択されている請求項1に記載の方法。
【請求項４】
該1またはそれ以上の候補分化誘導条件が増殖因子、サイトカイン、組織抽出物、核酸、細胞間相互作用に関係する因子、接着分子及び細胞外マトリックス成分、組織の細胞外成分抽出物、培地成分、環境条件、及び細胞間相互作用により分化を誘導する生きた細胞からなる群から選択されている請求項1に記載の方法。
【請求項５】
該増殖因子、ケモカイン,及びサイトカインが限定せずに塩基性FGF（146aa）、塩基性FGF（157AA）、酸性FGFを含む繊維芽細胞増殖因子ファミリータンパク（FGF1-23）、限定せずにTGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータsRII、潜在性TGF-ベータを含むTGFベータファミリータンパク、限定せずにTNFSF1-18、TNF-アルファ、TNF-ベータを含む腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリー（TNFSF）、限定せずにIGF-1を含むインスリン様増殖因子ファミリー及び限定せずにIGFBP-1、II-1 R rp2、IGFBP-5、IGFBP-6を含むその結合タンパク、限定せずにMMP-1, CF, MMP-2, CF, MMP-2 (NSA発現)、CF, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-9, TIMP-1, CF, TIMP-2を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ、及び限定せずにPDGF, Flt-3リガンド、Fasリガンド、B7-1(CD80), B7-2(CD86), DR6, IL-13Rアルファ、IL-15Rアルファ、GROベータ/CXCL2（aa 39-107）、IL 1-18, II-8/CXCL8, GDNF, G-CSF, GM-CSF, M-GSF, PDGF-BB, PDGF-AA, PDGF-AB, IL-2 sRアルファ、IL-2 sRベータ、可溶性TNF RII、IL-6 sR,可溶性gp130、PD-ECGF, IL-4 sR, ベータ-ECGF、TGF-アルファ、TGF-ベータsRII、TGF-ベータ5、LAP(TGF-ベータ1)、BDNF, LIF sRアルファ、LIF, KGF/FGF-7,プレイオトロフィン、ENA-78/CXCL5, SCF, ベータ-NGF, CNTF, ミドカイン、HB-EGF, SLPI, ベータセルリン、アンフィレグリン、PIGF, アンギオゲニン、IP-10/CXCL10, NT-3, NT-4, MIP-1アルファ/CCL3, MIP-1ベータ/CCL4、I-309/CCL1，GROアルファ/CXCL1、GROベータ/CXCL2、GROガンマ/CXCL3、ランテス/CCL5、MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, IFN-ガンマ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、MIF, IGF-I, IGF-II, VEGF, HGF,オンコスタチンM、HRG-アルファ（EGFドメイン）、TGF-ベータ2、CNTF Rアルファ、Tie-2/Fcキメラ、BMP-4, BMPR-IA,エオタキシン/CCL11、VEGF R1(Fit-1), PDGF sRアルファ、HCC-1/CCL14, CTLA-4, MCP-4/CCL13, GCP-2/CXCL6, TECK/CCL25, MDC/CCL22, アクチビンA、エオタキシン-2/MPIF-2/CCL24, エオタキシン-3/CCL26（aa 24-94）、TRAIL R1 (DR4), VEGF R3 (Fit-4)/SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12、MSP, BMP-2, HVEM/VEGF R2 (KDR), エフリン-A3、MIP-3アルファ/CCL20、MIP-3ベータ/CCL19、フラクタルキン/CX3CL1（ケモカインドメイン）、TARC/CCL17, 6Ckine/CCL21、p75ニューロトロフィンR（NGF R）、SMDF, ニューロチューリン、レプチンR/Fcキメラ、MIG/CXCL9, NAP-2/CXCL7, PARC/CCL18, カルジオトロフィン-1（CT-1）、GFRアルファ-2、BMP-5, IL-8/CXCL8（内皮細胞由来）、Tie-1, ウイルスCMV UL146, VEGF-D, アンギオポエチン-2、インヒビンA、TRANCE/RANK L, CD6/Fcキメラ、CF, dMIP-1デルタ/LKN-1/CCL15 (68 aa), TRAIL R3/Fcキメラ、可溶性TNF RI、アクチビンRIA、EphA1, E-カドヘリン、ENA-70, ENA-74,エオタキシン-3/CCL26、ALCAM, FGFR1アルファ（IIIc）、アクチビンB、FGFT1ベータ（IIIc）、LIGHT,  FGFR2ベータ（IIIb）、DNAM-1,フォリスタチン、GFRアルファ-3、gp130, I-TAC/CXCL11, IFN-ガンマRI, IGFBP-2, IGFBP-3,インヒビンB、プロラクチンCF, RANK, FGFR2ベータ（IIIc）、FGFR4, TrkB, GITR, MSP R, GITRリガンド、リンホタクチン/XCL1, FGFR2アルファ（IIIc）、アクチビンAB、ICAM-3(CD50), ICAM-1(CD54), TNF RII, L-セレクチン（CD62L）, BLC/BCA-1/CXCL13, HCC-4/CCL16, ICAM-2(CD102), IGFBP-4,オステオプロテゲリン（OPG)、uPAR,アクチビンRIB, VCAM-1(CD106), CF, BMPR-II, IL-18R, IL-12Rベータ1、Dtk, LBP, SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12(合成)、E-セレクチン（CD62E）,L-セレクチン（CD62L）, P-セレクチン（CD62P）、ICAM-1(CD54), VCAM-1(CD106), CD31(PECAM-1),ヘッジホッグファミリータンパク、インターロイキン-10、上皮増殖因子、ヘレグリン、HER4,ヘパリン結合上皮増殖因子、bFGF, MIP-18, MIP-2, MCP-1, MCP-5, NGF, NGF-B, レプチン、インターフェロンA、インタ���フェロンA/D、インターフェロンB、インターフェロン誘導タンパク-10、インスリン様増殖因子II、IGBFBP/IGF-1複合体、C10, サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2B、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質1、サイトカイン責任遺伝子2、を含むそのほかの増殖因子及びサイトカイン及びそれらのフラグメント及びそれらの中和抗体からなる群から選択されている請求項4に記載の方法。
【請求項６】
細胞間相互作用に関係する該因子がADAM 1，2，3A，3B, 4-31及びTS1-9を含むADAM(ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ)ファミリーのタンパク、ADAMTS（トロンボスポンジンモチーフを持つADAM）、レプロリシン、メチンシン、チンシン、及び亜鉛メタロプテイナーゼ及びそれらの中和抗体からなる群から選択されている請求項4に記載の方法。
【請求項７】
該接着分子がIgスパーファミリーCAM、インテグリン、カドヘリン及びセレクチン及びそれらの中和抗体からなる群から選択されている請求項4に記載の方法。
【請求項８】
試験される該核酸が限定せずにリボザイム活性、または分化の間の遺伝子発現の調節に関係する転写因とのRNA干渉、増殖因子、サイトカイン、及び細胞外マトリックス成分、またはそのほかの分化を調節する活性に対する遺伝子をコードしまたはアンチセンスにより阻害されるものを含む請求項4に記載の方法。
【請求項９】
該細胞間相互作用が検定する細胞を他の細胞型の細胞と細胞間接触させることまたは他の分化細胞型の細胞の順化培地を存在させることを含む請求項4に記載の方法。
【請求項１０】
該組織抽出物が試験される早期段階の胚、胎児、または成熟組織に由来する物質を限定することなく含み胎児様体、原始内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の組織、及び分化しつつある器官及び組織の原基または問題細胞と共培養したときに分化誘導を生じる生きた細胞または組織の界面活性剤抽出によって調製された無細胞細胞外マトリックスを限定することなく含む請求項4に記載の方法。
【請求項１１】
該環境条件が酸素分圧、二酸化炭素分圧、酸化窒素分圧、温度、pH、機械的刺激、二次元対三次元基質のような基質の変更、ビーズ上、シリンダー内、または多孔性基質での増殖を限定することなく含む請求項4に記載の方法。
【請求項１２】
該細胞外マトリックス成分が限定することなくケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、コンドロイチン硫酸A、SPARC、ベータアミロイド前駆タンパク、ベータアミロイド、プレセニリン1，2、アポリポプロテインE、トロンボスポンジン-1，2、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、マトリゲル、アグレガン、ビグリカン、ポリ-L-オルニチン、コラーゲンI-IVに限定せずに含むコラーゲンファミリー、ポリ-D-リシン、エクシスタチン（毒蛇毒液）、フラボリジン（毒蛇毒液）、キストリン（毒蛇毒液）、ビトロネクチン、スーパーフィブロネクチン、フィブロネクチン接着促進ペプチド、フィブロネクチンフラグメントIII-C、フィブロネクチンフラグメント-30KDA、フィブロネクチン様重合体、フィブロネクチンフラグメント45KDA、フィブロネクチンフラグメント70KDA、アシアロガングリオシド-GM、ジシアロガングリオシド-GOLA、モノシアロガングリオシド-GM1、モノシアロガングリオシド-GM2、モノシアロガングリオシド-GM3、メチルセルロース、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン及びコンドロイチン硫酸Aを含む群から選択されている請求項4に記載の方法。
【請求項１３】
該個別細胞または細胞の個別集団を1またはそれ以上の多ウエルプレートの分離したウエルの中に分配する請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
対照組織の一次及び/または前駆細胞を単離しそして該一次及び/または前駆細胞をマイクロアレイの分離した容器中に入れそれにより対照ライブラリーを形成する；そして
該分離した容器の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞を該一つまたはそれ以上の候補分化誘導化合物に同時にまたは連続して暴露した後；
該個別の細胞または細胞の集団の分化を評価するために該個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞または細胞の集団を該対照ライブラリーと比較する：
をさらに含む請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
該一次細胞の対照ライブラリーが1またはそれ以上の多ウエルプレートに作られる請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
該対照ライブラリーの該一次及び/または前駆細胞が1またはそれ以上の脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、及び腎臓細胞を含む請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
該全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞及び該対照ライブラリー細胞を対照ライブラリー中の特定一次細胞に特異的な機能検定を使用して比較する請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
該機能的検定が該対照一次及び/または前駆細胞により作られる酵素または代謝物の生産を測定する請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
該全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞及び該対照ライブラリー細胞を特異的細胞表面マーカーまたは受容体の存在を試験することにより比較する請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
該細胞表面マーカーの存在を該細胞表面マーカーまたは受容体に特異的な標識抗体またはリガンドを使用して検出する請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
(a) 個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団を、開放または密閉した一つまたは複数の分離した容器、その容器は同じまたは異なる装置内にある、に分配する：
(b) 該分離した容器の細胞を種々の候補分化誘導化合物またはそれらの組み合わせのパネルに同時にまたは連続して暴露する：そして
(c)該個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団の分化を評価するために該個別細胞または細胞の集団を分化したまたは部分的に分化した細胞の対照パネルと比較する：
を含む、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団の分化を評価する方法。
【請求項２２】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞が内部細胞塊（ICM）細胞、胚性幹（ES）細胞、胚性生殖（EG）細胞、1から400細胞からなる胚、胎児様体細胞、桑実胚由来細胞、胚性多分化能細胞及びそれらに由来する細胞からなる群から選択されている請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
該個別全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞またはそれらに由来する細胞がヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ウサギ細胞からなる群から選択されている請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
該1またはそれ以上の候補分化誘導条件が増殖因子、サイトカイン、細胞間相互作用に関係する因子、接着分子及び細胞外マトリックス成分からなる群から選択されている請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
該増殖因子及びサイトカインがTGF-ベータ-2、PDGF, Fasリガンド、酸性FGF、B7-1(CD80), B7-2(CD86), DR6, IL-13Rアルファ、IL-15Rアルファ、GROベータ/CXCL2(aa 39-107), IL 1-18, II-8/CXCL8, TNF-アルファ、TNF-ベータ、GDNF, G-CSF, GM-CSF, M-GSF, PDGF-BB, PDGF-AA, PDGF-AB,IL-2 sRアルファ、IL-2 sRベータ、可溶性TNF RII, IL-6 sR, 可溶性gp130, PD-ECGF, IL-4 sR, ベータ-ECGF, 塩基性FGF(146 aa),塩基性FGF(157 AA), FGF1-21, TGF-アルファ、TGF-ベータ1、TGF-ベータsRII, TGF-ベータ5、LAP(TGF-ベータ1)、BDNF, LIF sRアルファ、LIF, KGF/FGF-7, プレイオトロフィン、ENA-78/CXCL5, SCF, ベータ-NGF, CNTF, ミドカイン、HB-EGF, SLPI, ベータセルリン、アンフィレグリン、PIGF, アンギオゲニン、IP-10/CXCL10, NT-3, NT-4, MIP-1アルファ/CCL3, MIP-1ベータ/CCL4, I-309/CCL1, GROアルファ/CXCL1, GROベータ/CXCL2, GROガンマ/CXCL3, ランテス/CCL5, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, IFN-ガンマ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、MIF, IGF-I, IGF-II, VEGF, HGF, オンコスタチンM, HRG-アルファ（EGFドメイン）、潜在性TGF-ベータ、TGF-ベータ2、CNTF Rアルファ、Tie-2/Fcキメラ、BMP-4, BMPR-IA,エオタキシン/CCL11, VEGF R1(Fit-1), PDGF sRアルファ、HCC-1/CCL14, CTLA-4, MCP-4/CCL13, GCP-2/CXCL6, TECK/CCL25, MDC/CCL22, アクチビンA, TGF-ベータsRII, エオタキシン-2/MPIF-2/CCL24, エオタキシン-3/CCL-26(aa 24-94), TRAIL R1(DR4), VEGF R3(Fit-4)/SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12, MSP, BMP-2, HVEM/VEGF R2(KDR),エフリン-A3, MIP-3アルファ/CCL20, MIP-3ベータ/CCL19, フラクタルキン/CX3CL1 (ケモカインドメイン)、TARC/CCL17, 6Ckine/CCL21, p75ニュートロフィンR (NGF R), SMDF, ニューロチューリン、レプチンR/Fcキメラ、MIG/CXCL9, NAP-2/CXCL7, PARC/CCL18, カルジオトロフィン-1（CT-1）, GFRアルファ-2、BMP-5, IL-8/CXCL8（内皮細胞由来）、Tie-1, ウイルスCMV UL146, VEGF-D, アンギオポエチン-2、インヒビンA, TRANCE/RANK L, CD6/Fcキメラ、CF, dMIP-1デルタ/LKN-1/CCL15(68 aa), TRAIL R3/Fcキメラ、可溶性TNF RI, アクチビンRIA, EphA1, E-カドヘリン、ENA-70, ENA-74, エオタキシン-3/CCL26, ALCAM, FGFR1アルファ（IIIc）、アクチビンB、FGFT1ベータ（IIIc）、LIGHT, FGFR2ベータ（IIIb）、DNAM-1,フォリスタチン、GFRアルファ-3、gp 130, I-TAC/CXCL11, IFN-ガンマRI, IGFBP-2, IGFBP-3, インヒビンB,  プロラクチンCF, RANK, FGFR2ベータ（IIIc）、FGFR4, TrkB, GITR, MSP R, GITRリガンド、リンホタクチン/XCL1, FGFR2アルファ（IIIc）、アクチビンAB, ICAM-3(CD50), ICAM-1(CD54), TNF RII, L-セレクチン（CD62L）, BLC/BCA-1/CXCL13, HCC-4/CCL16, ICAM-2(CD102), IGFBP-4, オステオプロテゲリン（OPG),  uPAR,アクチビンRIB, VCAM-1(CD106), CF, BMPR-II, IL-18R, IL-12Rベータ1、Dtk, LBP, IGFBP-1 ，II-1 R rp2，IGFBP-5, IGFBP-6, MMP-1, CF, MMP-2, CF, MMP-2 (NSA発現)、CF, MMP-7, MMP-8, MMP-10, CF, MMP-9＜CF, TIMP-1, CF, TIMP-2, CF, SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12（合成）、E-セレクチン（CD62E）, L-セレクチン（CD62L）,  P-セレクチン（CD62P）, ICAM-1(CD54), VCAM-1(CD106), CD31(PECAM-1)からなる群から選択されている請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
細胞間相互作用に関係する該因子がADAM 1，2，3A, 3B, 4-31, TS1-9からなる群から選択されている請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
該接着分子がIgスパーファミリーCAM、インテグリン、カドヘリン及びからなる群から選択されている請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
該細胞外マトリックス成分がケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、コンドロイチン硫酸A、トロンボスポンジン-1、ヘパラン硫酸、アグレガン、ビグリカン、ポリ-L-オルニチン、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIV、ポリ-D-リシン、エクシスタチン（毒蛇毒液）、フラボリジン（毒蛇毒液）、キストリン（毒蛇毒液）、ビトロネクチン、スーパーフィブロネクチン、フィブロネクチン接着促進ペプチド、フィブロネクチンフラグメントIII-C、フィブロネクチンフラグメント-30KDA、フィブロネクチン様重合体、フィブロネクチンフラグメント45KDA、フィブロネクチンフラグメント70KDA、プロスタグランジンF2,ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン、L-チロキシン、3,3,5-トリヨード-L-チロニン、L-アスコルビン酸、アシアロガングリオシド-GM、ジシアロガングリオシド-GOLA、モノシアロガングリオシド-GM1、モノシアロガングリオシド-GM2、モノシアロガングリオシド-GM3、脂質、トランスフェリン、B-シクロデキストリン、アスコルビン酸塩、フェチュイン、ヘパリン、2-メルカプトエタノール、ウマ血清、DMSO、ニワトリ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ヒト血清、MIP-18, MIP-2, MCP-1, MCP-5, NGF, NGF-B,脳下垂体抽出物、ストローマ細胞因子、順化培地、ハイブリドーマ培地、d-アルドステロン、デキサメタゾン、DHT, B-エストラジオール、グルカゴン、インスリン、プロゲステロン、プロスタグランジン-D2、プロスタグランジン-E1、プロスタグランジン-E2、プロスタグランジン-F2、無血清培地、遺伝子治療培地、MDBK-GM培地、QBSF-S1, 内皮細胞培地、ケラチノサイト培地、メラノサイト培地、インターロイキン-10、上皮増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子、bFGF, Gly-His-Lys, インスリン様増殖因子-II、IGBFBP/IGF-1複合体、C10、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2B、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質1、サイトカイン責任遺伝子-2、内皮細胞増殖添加物、インターフェロンA、インターフェロンA/D、インターフェロンB、インターフェロン誘導性タンパク-10、レプチン、メチルセルロース、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン及びコンドロイチン硫酸Aからなる群から選択されている請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
該個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の個別集団を一つまたはそれ以上の多ウエルプレートの分離したウエルに分配する請求項21に記載の方法。
【請求項３０】
該対照の分化したまたは部分的に分化した細胞が脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、及び腎臓細胞から選択された一時細胞または前駆細胞である請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
該暴露された全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、及び該対照細胞を対照細胞に特異的な機能検定を使用して比較する請求項21に記載の方法。
【請求項３２】
該機能検定が該対照細胞により作られる一つまたはそれ以上の酵素または代謝物の生産を測定する請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
該暴露された全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、及び該対照細胞を特異的細胞表面マーカーまたは受容体の存在を試験することにより比較する請求項21に記載の方法。
【請求項３４】
該細胞表面マーカーの存在を該細胞表面マーカーまたは受容体に特異的な標識抗体またはリガンドを使用して検出する請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
該暴露された全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、及び該対照細胞をRNA発現プロフィールを比較することにより比較する請求項21に記載の方法。
【請求項３６】
(a)遺伝子を導入した全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、該細胞は少なくとも一つのレポーター遺伝子を導入されており、その発現は細胞が分化または部分的分化を誘導されたときに活性化するプロモーターに作動的に連動している、を単離する；
(b)該遺伝子導入細胞を培養して増殖する；
(c)個別の遺伝子導入細胞、または個別の細胞集団を、開放または密閉した一つまたは複数の分離した容器、その容器は同じまたは異なる装置内にある、に分配する：
(d)該分離容器の遺伝子導入細胞を同時にまたは連続的に種々の分化誘導化合物またはその組み合わせのパネルに規則的に暴露する；そして
(e)該少なくとも一つのレポーター遺伝子の発現を検出するために該個別の遺伝子導入細胞または細胞集団を分析する；
を含む種々の化合物または化合物の組み合わせに応答する全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団の分化を評価する方法。
【請求項３７】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞が内部細胞塊（ICM）細胞、胚性幹（ES）細胞、胚性生殖（EG）細胞、1から400細胞からなる胚、胎児様体細胞、桑実胚由来細胞、胚性多分化能細胞及びそれらに由来する細胞からなる群から選択されている請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞またはそれらに由来する細胞がヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、からなる群から選択されている請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
該1またはそれ以上の候補分化誘導条件が増殖因子、サイトカイン、細胞間相互作用に関係する因子、接着分子及び細胞外マトリックス成分からなる群から選択されている請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
該増殖因子およびサイトカインがTGF-ベータ-2、PDGF, Fasリガンド、酸性FGF、B7-1(CD80), B7-2(CD86), DR6, IL-13Rアルファ、IL-15Rアルファ、GROベータ/CXCL2(aa 39-107), IL 1-18, II-8/CXCL8. TNF-アルファ、TNF-ベータ、GDNF, G-CSF, GM-CSF, M-GSF, PDGF-BB, PDGF-AA, PDGF-AB,IL-2 sRアルファ、IL-2 sRベータ、可溶性TNF RII, IL-6 sR, 可溶性gp130, PD-ECGF, IL-4sR, ベータ-ECGF, 塩基性FGF(146 aa),塩基性FGF(157 AA), FGF1-21, TGF-アルファ、TGF-ベータ1、TGF-ベータsRII, TGF-ベータ5、LAP(TGF-ベータ1)、BDNF, LIF sRアルファ、LIF, KGF/FGF-7, プレイオトロフィン、ENA-78/CXCL5, SCF, ベータ-NGF, CNTF, ミドカイン、HB-EGF, SLPI, ベータセルリン、アンフィレグリン、PIGF, アンギオゲニン、IP-10/CXCL10, NT-3, NT-4, MIP-1アルファ/CCL3, MIP-1ベータ/CCL4, I-309/CCL1, GROアルファ/CXCL1, GROベータ/CXCL2, GROガンマ/CXCL3, ランテス/CCL5, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, IFN-ガンマ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、MIF, IGF-I, IGF-II, VEGF, HGF, オンコスタチンM, HRG-アルファ（EGFドメイン）、潜在性TGF-ベータ、TGF-ベータ2、CNTF Rアルファ、Tie-2/Fcキメラ、BMP-4, BMPR-IA,エオタキシン/CCL11, VEGF R1(Fit-1), PDGF sRアルファ、HCC-1/CCL14, CTLA-4, MCP-4/CCL13, GCP-2/CXCL6, TECK/CCL25, MDC/CCL22, アクチビンA, TGF-ベータsRII, エオタキシン-2/MPIF-2/CCL24, エオタキシン-3/CCL-26(aa 24-94), TRAIL R1(DR4), VEGF R3(Fit-4)/SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12, MSP, BMP-2, HVEM/VEGF R2(KDR),エフリン-A3, MIP-3アルファ/CCL20, MIP-3ベータ/CCL19, フラクタルキン/CX3CL1 (ケモカインドメイン)、TARC/CCL17, 6Ckine/CCL21, p75ニュートロフィンR (NGF R), SMDF, ニューロチューリン、レプチンR/Fcキメラ、MIG/CXCL9, NAP-2/CXCL7, PARC/CCL18, カルジオトロフィン-1（CT-1）, GFRアルファ-2、BMP-5, IL-8/CXCL8（内皮細胞由来）、Tie-1, ウイルスCMV UL146, VEGF-D, アンギオポエチン-2、インヒビンA, TRANCE/RANK L, CD6/Fcキメラ、CF, dMIP-1デルタ/LKN-1/CCL15(68 aa), TRAIL R3/Fcキメラ、可溶性TNF RI, アクチビンRIA, EphA1, E-カドヘリン、ENA-70, ENA-74, エオタキシン-3/CCL26, ALCAM, FGFR1アルファ（IIIc）、アクチビンB、FGFT1ベータ（IIIc）、LIGHT, FGFR2ベータ（IIIb）、DNAM-1,フォリスタチン、GFRアルファ-3、gp130, I-TAC/CXCL11, IFN-ガンマRI, IGFBP-2, IGFBP-3, インヒビンB,  プロラクチンCF, RANK, FGFR2ベータ（IIIc）、FGFR4, TrkB, GITR, MSP R, GITRリガンド、リンホタクチン/XCL1, FGFR2アルファ（IIIc）、アクチビンAB, ICAM-3(CD50), ICAM-1(CD54), TNF RII, L-セレクチン（CD62L）, BLC/BCA-1/CXCL13, HCC-4/CCL16, ICAM-2(CD102), IGFBP-4, オステオプロテゲリン（OPG),  uPAR,アクチビンRIB, VCAM-1(CD106), CF, BMPR-II, IL-18R, IL-12Rベータ1、Dtk, LBP, IGFBP-1 ，II-1 R rp2，IGFBP-5, IGFBP-6, MMP-1, CF, MMP-2, CF, MMP-2 (NSA発現)、CF, MMP-7, MMP-8, MMP-10, CF, MMP-9＜CF, TIMP-1, CF, TIMP-2, CF, SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12（合成）、E-セレクチン（CD62E）, L-セレクチン（CD62L）,  P-セレクチン（CD62P）, ICAM-1(CD54), VCAM-1(CD106), CD31(PECAM-1)からなる群から選択されている請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
細胞間相互作用に関係する該因子がADAM 1, 2, 3A, 3B, 4-31, TS 1-9からなる群から選択されている請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
該接着分子がIgスーパーファミリーCAM,インテグリン、カドヘリン及びセレクチンからなる群から選択されている請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
該細胞外マトリックス成分がケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、コンドロイチン硫酸A、トロンボスポンジン-1、ヘパラン硫酸、アグレガン、ビグリカン、ポリ-L-オルニチン、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIV、ポリ-D-リシン、エクシスタチン（毒蛇毒液）、フラボリジン（毒蛇毒液）、キストリン（毒蛇毒液）、ビトロネクチン、スーパーフィブロネクチン、フィブロネクチン接着促進ペプチド、フィブロネクチンフラグメントIII-C、フィブロネクチンフラグメント-30KDA、フィブロネクチン様重合体、フィブロネクチンフラグメント45KDA、フィブロネクチンフラグメント70KDA、プロスタグランジンF2,ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン、L-チロキシン、3,3,5-トリヨード-L-チロニン、L-アスコルビン酸、アシアロガングリオシド-GM、ジシアロガングリオシド-GOLA、モノシアロガングリオシド-GM1、モノシアロガングリオシド-GM2、モノシアロガングリオシド-GM3、脂質、トランスフェリン、B-シクロデキストリン、アスコルビン酸塩、フェチュイン、ヘパリン、2-メルカプトエタノール、ウマ血清、DMSO、ニワトリ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ヒト血清、MIP-18, MIP-2, MCP-1, MCP-5, NGF, NGF-B,脳下垂体抽出物、ストローマ細胞因子、順化培地、ハイブリドーマ培地、d-アルドステロン、デキサメタゾン、DHT, B-エストラジオール、グルカゴン、インスリン、プロゲステロン、プロスタグランジン-D2、プロスタグランジン-E1、プロスタグランジン-E2、プロスタグランジン-F2、無血清培地、遺伝子治療培地、MDBK-GM培地、QBSF-S1, 内皮細胞培地、ケラチノサイト培地、メラノサイト培地、インターロイキン-10、上皮増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子、bFGF, Gly-His-Lys, インスリン様増殖因子-II、IGBFBP/IGF-1複合体、C10、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2B、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質1、サイトカイン責任遺伝子-2、内皮細胞増殖添加物、インターフェロンA、インターフェロンA/D、インターフェロンB、インターフェロン誘導性タンパク-10、レプチン、メチルセルロース、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン及びコンドロイチン硫酸Aからなる群から選択されている請求項39に記載の方法。
【請求項４４】
該個別の遺伝子導入胚性細胞または胚性細胞の個別集団を1またはそれ以上の多ウエルプレートの分離したウエルに分配する請求項35に記載の方法。
【請求項４５】
該プロモーターが内胚葉細胞、中胚葉細胞、外胚葉細胞、脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、及び腎臓細胞からなる群から選択された一次細胞または前駆細胞に特異的に発現する請求項35に記載の方法。
【請求項４６】
該レポーター遺伝子が検出しうる信号を作ることができるポリペプチドをコードし、該信号が該プロモーターの転写と共役している請求項35に記載の方法。
【請求項４７】
(f)検出しうる信号を定量的に測定する；そして
(g)該検出しうる信号の量を試験化合物の非存在下に該遺伝子導入胚性細胞の同数の細胞によって作られる信号の量と比較する；
をさらに含む請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
該検出しうる信号を肉眼または顕微鏡、写真または放射線画像分析により、発色原性基質、色素、糖、抗体、リガンド及びプライマーからなる群から選択された試薬に該暴露細胞を接触させた後に検出する請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
該ポリペプチドが強化緑色蛍光タンパク（EGFP）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グアニンキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ及びβ-ラクタマーゼからなる群から選択されている請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
(a) それぞれは少なくとも一つのレポーター遺伝子を導入され、その発現は細胞が分化または部分的な分化を誘導されたときに活性化するプロモーターと連動している遺伝子を導入した全能性、ほぼ全能性、または多分化能の肝細胞、またはそれらに由来する細胞のライブラリーを得る；
(b)該ライブラリーの個別メンバーを、開放または密閉した一つまたは複数の分離した容器、その容器は同じまたは異なる装置内にある、に分配する：
(c)該分離した容器の遺伝子導入細胞を同じ1またはそれ以上の候補分化誘導化合物に同時にまたは連続して暴露する；そして
(d)該少なくとも一つのレポーター遺伝子の発現を検出するために該ライブラリーの該個別メンバーを分析する；
を含む1またはそれ以上の化合物に応答する全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、またはその細胞の集団の分化を評価する方法。
【請求項５１】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞が内部細胞塊（ICM）細胞、胚性幹（ES）細胞、胚性生殖（EG）細胞、1から400細胞からなる胚、胎児様体細胞、桑実胚由来細胞、胚性多分化能細胞及びそれらに由来する細胞からなる群から選択されている請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
該全能性、ほぼ全能性または多分化能の幹細胞またはそれらに由来する細胞がヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ウサギ細胞からなる群から選択されている請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
該1またはそれ以上の候補分化誘導条件が増殖因子、サイトカイン、細胞間相互作用に関係する因子、接着分子及び細胞外マトリックス成分からなる群から選択されている請求項50に記載の方法。
【請求項５４】
該増殖因子およびサイトカインがTGF-ベータ-2、PDGF, Fasリガンド、酸性FGF、B7-1(CD80), B7-2(CD86), DR6, IL-13Rアルファ、IL-15Rアルファ、GROベータ/CXCL2(aa 39-107), IL 1-18, II-8/CXCL8, TNF-アルファ、TNF-ベータ、GDNF, G-CSF, GM-CSF, M-GSF, PDGF-BB, PDGF-AA, PDGF-AB,IL-2 sRアルファ、IL-2 sRベータ、可溶性TNF RII, IL-6 sR, 可溶性gp130, PD-ECGF, IL-4 sR, ベータ-ECGF, 塩基性FGF(146aa),塩基性FGF(157AA), FGF1-21, TGF-アルファ、TGF-ベータ1、TGF-ベータsRII, TGF-ベータ5、LAP(TGF-ベータ1)、BDNF, LIF sRアルファ、LIF, KGF/FGF-7, プレイオトロフィン、ENA-78/CXCL5, SCF, ベータ-NGF, CNTF, ミドカイン、HB-EGF, SLPI, ベータセルリン、アンフィレグリン、PIGF, アンギオゲニン、IP-10/CXCL10, NT-3, NT-4, MIP-1アルファ/CCL3, IP-1ベータ/CCL4, I-309/CCL1, GROアルファ/CXCL1, GROベータ/CXCL2, GROガンマ/CXCL3, ランテス/CCL5, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, IFN-ガンマ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、MIF, IGF-I, IGF-II, VEGF, HGF, オンコスタチンM, HRG-アルファ（EGFドメイン）、潜在性TGF-ベータ、TGF-ベータ2、CNTF Rアルファ、Tie-2/Fcキメラ、BMP-4, BMPR-IA,エオタキシン/CCL11, VEGF R1(Fit-1), PDGF sRアルファ、HCC-1/CCL14, CTLA-4, MCP-4/CCL13, GCP-2/CXCL6, TECK/CCL25, MDC/CCL22, アクチビンA, TGF-ベータsRII, エオタキシン-2/MPIF-2/CCL24, エオタキシン-3/CCL-26(aa24-94), TRAIL R1(DR4), VEGF R3(Fit-4)/SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12, MSP, BMP-2, HVEM/VEGF R2(KDR),エフリン-A3, MIP-3アルファ/CCL20, MIP-3ベータ/CCL19, フラクタルキン/CX3CL1 (ケモカインドメイン)、TARC/CCL17, 6Ckine/CCL21, p75ニュートロフィンR (NGF R), SMDF, ニューロチューリン、レプチンR/Fcキメラ、MIG/CXCL9, NAP-2/CXCL7, PARC/CCL18, カルジオトロフィン-1（CT-1）, GFRアルファ-2、BMP-5, IL-8/CXCL8（内皮細胞由来）、Tie-1, ウイルスCMV UL146, VEGF-D, アンギオポエチン-2、インヒビンA, TRANCE/RANK L, CD6/Fcキメラ、CF, dMIP-1デルタ/LKN-1/CCL15(68 aa), TRAIL R3/Fcキメラ、可溶性TNF RI, アクチビンRIA, EphA1, E-カドヘリン、ENA-70, ENA-74, エオタキシン-3/CCL26, ALCAM, FGFR1アルファ（IIIc）、アクチビンB、FGFT1ベータ（IIIc）、LIGHT, FGFR2ベータ（IIIb）、DNAM-1,フォリスタチン、GFRアルファ-3、gp130, I-TAC/CXCL11, IFN-ガンマRI, IGFBP-2, IGFBP-3, インヒビンB,  プロラクチンCF, RANK, FGFR2ベータ（IIIc）、FGFR4, TrkB, GITR, MSP R, GITRリガンド、リンホタクチン/XCL1, FGFR2アルファ（IIIc）、アクチビンAB, ICAM-3(CD50), ICAM-1(CD54), TNF RII, L-セレクチン（CD62L）, BLC/BCA-1/CXCL13, HCC-4/CCL16, ICAM-2(CD102), IGFBP-4, オステオプロテゲリン（OPG),  uPAR,アクチビンRIB, VCAM-1(CD106), CF, BMPR-II, IL-18 R, IL-12 Rベータ1、Dtk, LBP, IGFBP-1 ，II-1 R rp2，IGFBP-5, IGFBP-6, MMP-1, CF, MMP-2, CF, MMP-2 (NSA発現)、CF, MMP-7, MMP-8, MMP-10, CF, MMP-9＜CF, TIMP-1, CF, TIMP-2, CF, SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12（合成）、E-セレクチン（CD62E）, L-セレクチン（CD62L）,  P-セレクチン（CD62P）, ICAM-1(CD54), VCAM-1(CD106), CD31(PECAM-1)からなる群から選択されている請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
細胞間相互作用に関係する該因子がADAM 1, 2, 3A, 3B, 4-31, TS 1-9からなる群から選択されている請求項53に記載の方法。
【請求項５６】
該接着分子がIgスーパーファミリーCAM,インテグリン、カドヘリン及びセレクチンからなる群から選択されている請求項53に記載の方法。
【請求項５７】
該細胞外マトリックス成分がケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、コンドロイチン硫酸A、トロンボスポンジン-1、ヘパラン硫酸、アグレガン、ビグリカン、ポリ-L-オルニチン、コラーゲンI、コラーゲンII、コラーゲンIV、ポリ-D-リシン、エクシスタチン（毒蛇毒液）、フラボリジン（毒蛇毒液）、キストリン（毒蛇毒液）、ビトロネクチン、スーパーフィブロネクチン、フィブロネクチン接着促進ペプチド、フィブロネクチンフラグメントIII-C、フィブロネクチンフラグメント-30KDA、フィブロネクチン様重合体、フィブロネクチンフラグメント45KDA、フィブロネクチンフラグメント70KDA、プロスタグランジンF2,ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン、L-チロキシン、3,3,5-トリヨード-L-チロニン、L-アスコルビン酸、アシアロガングリオシド-GM、ジシアロガングリオシド-GOLA、モノシアロガングリオシド-GM1、モノシアロガングリオシド-GM2、モノシアロガングリオシド-GM3、脂質、トランスフェリン、B-シクロデキストリン、アスコルビン酸塩、フェチュイン、ヘパリン、2-メルカプトエタノール、ウマ血清、DMSO、ニワトリ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ヒト血清、MIP-18, MIP-2, MCP-1, MCP-5, NGF, NGF-B,脳下垂体抽出物、ストローマ細胞因子、順化培地、ハイブリドーマ培地、d-アルドステロン、デキサメタゾン、DHT, B-エストラジオール、グルカゴン、インスリン、プロゲステロン、プロスタグランジン-D2、プロスタグランジン-E1、プロスタグランジン-E2、プロスタグランジン-F2、無血清培地、遺伝子治療培地、MDBK-GM培地、QBSF-S1, 内皮細胞培地、ケラチノサイト培地、メラノサイト培地、インターロイキン-10、上皮増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子、bFGF, Gly-His-Lys, インスリン様増殖因子-II、IGBFBP/IGF-1複合体、C10、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2B、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質1、サイトカイン責任遺伝子-2、内皮細胞増殖添加物、インターフェロンA、インターフェロンA/D、インターフェロンB、インターフェロン誘導性タンパク-10、レプチン、メチルセルロース、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン及びコンドロイチン硫酸Aからなる群から選択されている請求項53に記載の方法。
【請求項５８】
該遺伝子導入細胞のライブラリーの該個別メンバーを1またはそれ以上の多ウエルプレートの分離したウエルに分配する請求項50に記載の方法。
【請求項５９】
該プロモーターが内胚葉細胞、中胚葉細胞、外胚葉細胞、脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、及び腎臓細胞からなる群から選択された一次細胞または前駆細胞に特異的に発現する請求項50に記載の方法。
【請求項６０】
該全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、が霊長類胚性幹細胞である請求項50に記載の方法。
【請求項６１】
該霊長類胚性幹細胞がCyno-1細胞である請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
該全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、がマウス胚性幹細胞である請求項50に記載の方法。
【請求項６３】
該マウス胚性幹細胞のそれぞれが遺伝子トラップベクター挿入を含んでいる請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
該マウス胚性幹細胞がOmniBankTM及び/または遺伝子トラップ配列タグ（GTST）参照ライブラリーに対応するES細胞突然変異のメンバーを含む請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
参照組織から一次及び/または前駆細胞を単離しそして該一次及び/または前駆細胞をマイクロアレイの分離した容器内に分配してそれにより対照参照ライブラリーを形成する；そして
該分離した容器の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、を該1またはそれ以上の候補分化誘導化合物に同時にまたは連続して暴露した後；
該個別細胞または細胞集団の分化を評価するために該個別全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、または細胞集団を該参照ライブラリーと比較する；
をさらに含む請求項50に記載の方法。
【請求項６６】
一次細胞の該参照ライブラリーが1またはそれ以上の多ウエルプレートの中に構築される請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
該参照ライブラリーの一次及び/または前駆細胞が1またはそれ以上の脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、及び腎臓細胞を含む請求項65に記載の方法。
【請求項６８】
該個別全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、及び該参照ライブラリー細胞を参照ライブラリー中の特定の一次細胞に特異的な機能検定を使用して比較する請求項65に記載の方法。
【請求項６９】
該機能検定が該一次及び/または前駆細胞により作られる酵素または代謝物の生産を測定する請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
該個別全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、及び該参照ライブラリー細胞を特異的な細胞表面マーカーまたは受容体の存在を試験することにより比較する請求項65に記載の方法。
【請求項７１】
該細胞表面マーカーを該細胞表面マーカーまたは受容体に対する標識抗体またはリガンドを使用して検出する請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
検定期間の間に細胞の生存を増加させる薬物または条件を同定するためにスクリーニング段階に経時的に多数回測定を行うことを含む請求項1に記載の方法。
【請求項７３】
検定期間の間に細胞数を増加させる薬物または条件を同定するためにスクリーニング段階に経時的に多数回測定を行うことを含む請求項1に記載の方法。
【請求項７４】
幹細胞の分化、生存、または増殖に影響する薬物または条件を検出するためにスクリーニングに同時に使用される2以上の遺伝子トラップ幹細胞のライブラリー。
【請求項７５】
一またはそれ以上の該遺伝子トラップ幹細胞系が一分節性である；すなわち、幹細胞の分化または部分的分化に際して一つの細胞型においてのみ活性化されるレポーター遺伝子を含んでいる請求項74に記載のライブラリー。
【請求項７６】
一またはそれ以上の該遺伝子トラップ幹細胞系が多分節性である；すなわち、幹細胞の分化または部分的分化に際して2以上の異なる細胞型において活性化されるレポーター遺伝子を含んでいる請求項74に記載のライブラリー。
【請求項７７】
幹細胞をFlt-3に暴露することを含む幹細胞を中胚葉系統の細胞形成に誘導する方法。
【請求項７８】
該中胚葉系統の細胞が血管内皮細胞である請求項76に記載の方法。
【請求項７９】
幹細胞をTGF-ベータ-1に暴露することを含む幹細胞を中胚葉及び神経系統の細胞を形成する分化に誘導する方法。
【請求項８０】
幹細胞をテナシンに暴露することを含む幹細胞を内皮細胞系統の細胞及び内胚葉系統または外観の細胞からなる群から選択された細胞を形成する分化に誘導する方法。
【請求項８１】
幹細胞をTie-1に暴露することを含む幹細胞の分化を誘導する方法。
【請求項８２】
幹細胞をFc分子に暴露することをさらに含む請求項80に記載の方法。
【請求項８３】
幹細胞をBMP-2に暴露することを含む幹細胞を繊維芽細胞及び/または結合組織のそのほかの細胞形成に分化を誘導する方法。
【請求項８４】
幹細胞を内皮誘導細胞に暴露することを含む幹細胞を心筋細胞形成に分化を誘導する方法。
【請求項８５】
幹細胞を繊維芽細胞誘導細胞に暴露することを含む中胚葉系統の細胞形成に分化を誘導する方法。
【請求項８６】
幹細胞をFGF-4及びTGF-ベータ-1に暴露することをさらに含む請求項85の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全能性細胞、ほぼ全能性細胞、及び多分化能細胞、及びそれらに由来する細胞のインビトロ培養及び分化の方法に関するものである。そのような細胞の例は、胚性細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎児様体、内部細胞塊細胞、桑実胚由来細胞由来細胞、胚、胎児、及び成熟動物の非胚性幹細胞、例えば、間充織、造血、及び神経幹細胞、及びこれらのいずれかに由来する細胞である。
【０００２】
一態様において、本発明は、全能性細胞、ほぼ全能性細胞、及び多分化能細胞、及びそれらに由来しそして特別な発生系統に属する細胞の分化を誘導及び指令するために使用することができる化学的及び生物学的薬物及び物理的条件をスクリーニングしそして同定するための効率のよい、ハイスループット検定を提供する。そのような分化誘導薬物及び条件は、増殖因子、サイトカイン及び細胞外マトリックス成分、細胞‐細胞相互作用、環境条件（温度、酸素分圧、など）、及びそのほかの細胞外因子または成分、及び分化を誘導及び指令するために同時にまたは連続して標的幹細胞が暴露されるそれらの組み合わせである。
【０００３】
そのほかの態様において、本発明は、遺伝子修飾した幹細胞系、例えば、細胞治療のための分化細胞型の作製、単離及び治療への使用を容易にする遺伝子トラップ幹細胞系、を作製する方法を提供する。
【０００４】
そのほかの態様において、本発明は、動物試験及び細胞治療のための特別な型の細胞を作製し単離する方法を提供する。
【０００５】
そのほかの態様において、本発明は、治療、移植治療、及び新規の癌標的及び治療の探索を含む薬物探索に使用するために、ここに記述する方法により同定されそして全能性細胞、ほぼ全能性細胞、及び多分化能細胞、及びそれらに由来する細胞から特徴的細胞集団及び組織の発生を指令するために使用される増殖因子、サイトカイン、及び/またはそのほかの化学的及び生物学的分化誘導薬物、の単独または組み合わせた、組成物を包含する。
【背景技術】
【０００６】
発明の背景
過去10年間はクローニングの科学の著しい進歩により特徴付けられており、クローンヒツジ、すなわち“Dolly”（Roslin Bio-Med）、“Mira”と命名された3匹のクローンヤギ（Genzyme Transgenics）及び1ダース以上のクローンウシ（Advanced Cell Technology or ACT）の誕生を見てきた。極く最近ではクローン一族にブタ（PPL Therapeutics）及びマウス（ハワイ医科大学）が加わった。また、ACTの科学者たちは、レシピエントウシ卵母細胞を使用して作製したクローングアルの誕生により種間交差核再プログラミングに成功したことを示している。例えば、米国特許出願09/685,062参照、その全体を引用してここに取り入れた。さらに、クローニング技術は成熟し分化した細胞の核を使用して哺乳動物をクローニングできるまでに進歩し、科学者たちは脱核卵母細胞中に導入すると「再プログラミング」されることを今では知っている。米国特許5,945,577参照、その全体を引用してここに取り入れた。
【０００７】
成熟分化細胞の核を使用して胚及び胚性幹細胞を作りうることが示されたことは、器官、細胞及び組織移植の分野にとって興奮するような意味合いがある。現在適当な臓器提供者を待ち望んでいる患者は数千人もおり、彼らは移植を待つ間に使用可能性と不適合性の両方の問題に直面している。胚性幹細胞を作製するために移植を必要とする患者の分化細胞を使用して、移植に必要な細胞型の特徴的集団に分化を誘導することにより、移植拒否及び免疫抑制薬の危険性を排除することができるであろう。この前途は「生殖的クローニング」と区別するために「治療的クローニング」または「成熟細胞再プログラミング」として多くの人に知られており、クローニングの範囲が人類の領域に拡大する倫理的境界を提供する。Lanza et al., Sept. 1999, Human therapeutic cloning, Nat. Med. 5(9):975-7.
【０００８】
治療的クローニングの約束を意識して、科学者は全能性細胞及び多分化能細胞の特別な細胞型及び組織への分化を効率よく指令し、他方同時に望ましくない細胞及び組織への分化を阻止する方法を理解しようと努めている。調節された、特異的な細胞分化の指令は、胚発生を調節する因子及び信号の解読により行われるであろう。そうでなければ、例えば、胚性細胞の無秩序な分化及びその結果必要な組織の切り取りを生じ、これはいずれも実用的でないし、またヒトの治療には倫理的に受け入れられない。
【０００９】
ここに使用した「幹細胞」は、培養において永久に分裂することができ、そして1またはそれ以上の特異細胞型の娘細胞を生ずる細胞である。
【００１０】
ここに使用した「胚性幹細胞」（ES細胞）は、桑実胚または胚盤胞内部細胞塊から単離されたマウス胚性幹細胞の特徴を持つ細胞系である（Martin, G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 7634-7638; 及びEvans, M. and  Kaufman, M., Nature (1981) 292: 154-156に報告されているように）すなわち、ES細胞は不死であり、3胚葉、全ての体細胞系統、及び生殖系を含む生物体の全ての特化した細胞型に分化することができる。
【００１１】
ここに使用した「胚性幹様細胞」（ES様細胞）は動物内部細胞塊または平坦な形状、明瞭な核小体を持つ胚盤葉上層から単離された細胞系の細胞であり、不死であり、全ての体細胞系統に分化することができるが、他の胚盤胞に移された場合には生殖系になることはできない。霊長類「ES細胞」の例はThomson et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1995) 92: 7844-7848)により報告されている。
【００１２】
ここに使用した「内部細胞塊由来細胞」（ICM由来細胞）は、持続的にESまたはES様細胞系を確立するにいたる以前の単離ICMまたは桑実胚に由来する細胞である。
【００１３】
ここに使用した「胚性生殖細胞」（EG細胞）は、始原生殖細胞を増殖させそして胚性幹細胞と同じではないが類似の分化の状態に達するような条件で培養することにより得られる細胞系の細胞である。マウスEG細胞の例はMatsui, et al, 1992, Cell 70: 841-847及びResnick et al, Nature, 359: 550-551により報告されている。EG細胞はインビトロで胎児様体に分化することができ、そしてインビボでは奇形癌腫を形成する（Labosky et al., Development (1994) 120: 3197-3204）。免疫組織学的解析によりEG細胞により作られた胎児様体は3胚葉全てに由来する分化細胞を含むことが示された（Shamblott et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 95: 13726-13731）。
【００１４】
ここに使用した「全能性」細胞は、発生において通常存在する刺激に暴露されることにより、生殖系を含む体内のいずれの細胞型にも分化する「全能力」を持つ幹細胞である。そのような細胞の例は、ES細胞、EG細胞、ICM由来細胞、または遅い段階の胚盤胞の胚盤葉上層の培養細胞である。
【００１５】
ここに使用した「ほぼ全能性細胞」は、発生において通常存在する刺激に暴露されることにより、体内のほとんどまたはほぼいずれの細胞型にも分化する能力を持つ幹細胞である。そのような細胞の例はES様細胞である。
【００１６】
ここに使用した「多分化能細胞」は複数の細胞型に分化することができるが、ほとんどまたは全ての細胞型には分化できない幹細胞である。例としてあげるならば、これに限定はしないが、骨、軟骨及び筋肉に分化することができる間充織幹細胞；血液、内皮、及び心筋に分化することができる造血幹細胞；ニューロン及びグリアに分化することができる神経幹細胞；など。
【００１７】
ここに使用した「分化」とは、それにより細胞が特化した機能を発揮するのに必要な生化学的及び形態的性質を獲得する進行性の形質転換過程のことである。
【００１８】
ここに使用した「マーカー」は特別な細胞の状態を示す細胞の性質または特徴である。典型的に、マーカーは、細胞が特別な状態に入るまたは出るときに検出可能な様式で状態を変える生化学的な実体である。例えば、マーカーは検出しうる産物（例えば、特異的mRNA、または蛍光または抗原性タンパク）かまたは検出しうる活性（例えば抗生物質耐性を付与するタンパクまたはlacZのような色素原性酵素）をコードするDNA配列でありうる。マーカーDNA配列のコピーが細胞のゲノムDNA中に無作為に挿入された場合に、あるコピーはプロモーターの近位に正しい方向でインフレームに挿入されることがあり、するとプロモーターの活性化によりマーカーDNA配列の転写及びそれがコードする検出可能な産物を合成することになる。次いで、マーカーを検出することにより、転写活性遺伝子座にマーカー遺伝子を含む細胞として細胞を同定する。ここに使用した用語「マーカー」はマーカー遺伝子、またはマーカーRNAまたはその遺伝子によりコードされるタンパクであるといえる。
【００１９】
幹細胞の指令された分化
全能性及びほぼ全能性胚由来幹細胞は、幅広い細胞型に分化を誘導することができ、その一部は細胞治療に必要である。例えば、Andersonらは、ウシの内部細胞塊（ICM）及び胚盤及びブタ胚盤胞は、胸腺切除マウスの腎臓内に移植した場合に、外胚葉、中胚葉及び内胚葉起源の分化細胞型を含む奇形腫になることを示した。Animal Repro. Sci. 45: 231-240 (1996).Thomsonらは、霊長類ES細胞は栄養芽層及び3胚葉の誘導体に分化し得ることを報告し、そして霊長類ES細胞を免疫不全マウスの筋肉内に移植して、神経管、胚性ガングリオ、ニューロン、及びアストロサイトに類似した組織を含む、3胚葉の細胞からなる奇形腫を作製したことを記述している（APMIS（1998）106（1）:149-156）。マウス（Lee et al., Nature Biotech. (2000) 18: 675-679）カニクイザル（Macaca fascicularis）（Cibelli et al., Science (2002) 295: 819）及びヒト（Zhang et al., Nature Biotech. (2001) 19: 1129-1133）のES細胞はインビトロで培養することができ、ネスチン（中枢神経系の発生の過程で作られる中間径フィラメントタンパクであり、神経系における神経前駆細胞の増殖のマーカーとして広く使用されている）試験陽性の神経前駆細胞を含む3胚葉からなる胎児様体を作製した。多分化能幹細胞はES及びEG細胞由来奇形腫及び胎児様体から単離することができ、誘導する条件に暴露することにより細胞治療に有用な特別な細胞型に分化させることができる。例えば、ヒト胚から単離したネスチン陽性神経幹細胞は中枢神経系の3つの大きな細胞型に分化を誘導する条件下に培養することができる（Zhang et al. (2001)p.1130参照）。
【００２０】
前記報告は、全能性ES及びEG細胞から作製した胎児様体及び奇形腫中に無秩序にまたは自然に生じたと思われる前駆または分化細胞の誘導を記述している。したがってこれらの方法により分化した細胞の特徴的集団を作製するには、目的の分化した細胞、またはその前駆細胞を胎児様態または奇形腫中のほかの型の細胞から単離する必要がある。現在では、細胞治療に有用な分化細胞の特徴的集団を作る効率的な方法を開発するために、ES及びEG細胞のような全能性細胞またはほぼ全能性細胞を直接目的の分化細胞に分化させるよう誘導する化学的、生物学的、及び物理的な薬物または条件の同定に強い関心がもたれている。
【００２１】
米国特許番号5,733,727の中で、Field はコートしていないペトリ皿上にマウスES細胞を接種し、白血病阻害因子（LIF）、分化阻害薬、を含まない培地で培養して、自発収縮活性を示す心筋細胞のパッチを作製したことを記述した（col. 12,lines 63-67）。また、Fieldは、培養中に存在するほかの型の細胞から特別な細胞に分化を誘導する細胞精製の有用な方法を記述している：親ES細胞にpGK-HYG（ヒグロマイシン）プラスミド及びMHC-neor融合遺伝子−ネオマイシン耐性を付与するneor遺伝子に作動的に連結したα-心筋ミオシン重鎖（MHC）プロモーターを含むプラスミドを共導入する。pGK-HYGプラスミドは形質転換細胞の選別に使用され、他方MHC-neor遺伝子は分化細胞の第二回目の選別を可能にする−G418の存在下にインキュベートすることによりMHCプロモーターが不活性になっている非心筋細胞を除去する（col.12, line63-67参照）。米国特許番号5,733,727の開示の全体を引用してここに取り入れた。
【００２２】
Schuldiner らは、種々の増殖因子に応答したES由来細胞の分化を分析する系統的方法を記述した。彼らは、ヒトES細胞を培養して胎児様体を作り、胎児様体を解離し、そして8種の異なる増殖因子の一つの存在下に単層としてその細胞を培養した。増殖因子により誘導された分化を、細胞の形態的変化を調べることにより、そして親ES細胞、胎児様体細胞、及び8種の増殖因子の一つの存在下及び非存在下に培養した解離胎児様体細胞における24細胞−特定遺伝子のパネルの発現のRT-PCR（逆転写‐ポリメラーゼ連鎖反応）分析により検討した。Schuldinerらは、増殖因子のそれぞれは分析した24マーカー遺伝子の異なる組み合わせの発現を誘導するようであると報告した；そして増殖因子で処理した培養は比較的均一であり、唯一または2種の細胞型を含むことが多かったが、他方増殖因子が存在しない解離胎児様体細胞培養では自発的に多くの異なる型のコロニーへ分化した。増殖因子は特定の細胞型の分化を誘導するよりもより抑制的に作用するように思われ、試験した増殖因子のいずれも完全に均一なそして単一な細胞分化を指令せず、特定の細胞型の形成を指令するには望まない経路を阻害するものと特定の細胞型の分化を誘導するものを含む因子の組み合わせが必要であることを示している。（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2000）97（21）：11307−12参照）。 Paquin らは、細胞の集合体を形成する条件下においてマウスP19 ES細胞を培養し、そしてその一部は拍動する心筋細胞に分化することを記述した（Proc. Nat. Acad. Sci. (2002) 99(14): 9550-9555）。Reubinoffらは、ヒトES細胞を培養する条件を操作して神経前駆細胞に直接分化を誘導し、次いで3神経系統の誘導体、ニューロン性細胞、グリア細胞、及びアストロサイトへの分化を誘導できたと記述した（Nature Biotechnology (2001) 19: 1134-1139）。Kellyらは、レチノイン酸に応答したES細胞における遺伝子発現の変化は非常に再現性がよく（Mol. Reprod. Dev. (2000) 56(2): 113-23）、増殖因子の指令による胚性細胞の分化を意味する結果は信頼性があり、再現性が良い。
【００２３】
他のグループは、ES細胞を特定の細胞型に分化させるのに必要な因子を同定するために、否定的方法を使用して成功した。例えば、Henkel と共同研究者は、PU.1遺伝子のホモ接合性ノックアウトを含むES細胞はマクロファージに分化できないことを示すことにより、転写因子PU.1 は胚性幹細胞からマクロファージの発生に必須であることを報告した（Henkel et al., Blood (1996) 88(8): 2917-26参照）。同様に、Dunn と共同研究者は、ホスファチジルイノシトールグリカンクラスA（Pig-a）遺伝子の標的破壊を含むノックアウト胎児様体は第二次造血コロニーを発生することができず、肉眼的に異常な形態を示すことを認めている（Dunn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93(15): 7938-43参照）。
【００２４】
指令された分化は、多分化能成熟幹細胞においても成功することが示されている。例えば、Bruder らに対する米国特許5,942,225には、エクスビボまたはインビボのいずれにおいても分化を有効に誘導する生物活性因子または因子の組み合わせにその幹細胞を暴露することによるヒト間充織幹細胞の系統指定分化が記述されている。間充織幹細胞は胚性幹細胞より分化が進行しており、分化するのは骨形成、軟骨形成、腱形成、靭帯形成、筋原性、骨髄ストローマ性、脂肪組織性及び皮膚形成の系統のみである。同様に、Weissらに対する米国特許番号5,851,832には、種々の増殖因子に細胞を暴露した後の神経幹細胞のインビトロ増殖及び分化が記述されている。このような幹細胞はその分化能力が限定されており、アストロサイト及びオリゴデンドロサイトを含むニューロン及びグリア細胞のみを作る（Brannen et al., Neuroreport (2000) 11(5): 1123-8; Lillien et al., Dev. (2000) 127: 4993-5005参照）。
【００２５】
上記の研究は、全能性、ほぼ全能性及び多分化能の幹細胞は、それが培養されている培地の増殖因子及びサイトカインの濃度を操作することにより特定の細胞型への分化を誘導できることを示している。そのほかの増殖因子誘導分化の例は、IL-3によるマクロファージ、マスト細胞または好中球になる幹細胞の誘導（Wiles et al., Development (1991) 111: 259-267）；IL-6による赤芽球系統の細胞の指令（Biesecker et al., Exp. Hematol. (1993) 21: 774-778）；レチノイン酸による神経性分化の誘導（Slager et al., Dev. Genet. (1993) 14: 212-224; Bain et al., Dev. Biol. (1995) 168: 342-357）；及びトランスフォーミング増殖因子による筋形成の誘導（Rohwedel et al., Dev. Biol. (1994) 164:87−101）。最後の例では、誘導薬物を直接ES細胞または胚から直接由来した細胞に適用したのではなく、ES細胞の集合体または胎児様体に適用した。
【００２６】
増殖因子及びサイトカインの濃度の操作に加えて、全能性及び多分化能幹細胞は異なる型の細胞と共培養することにより特定の細胞型に分化を誘導することができる。例えば、Kaufmanらは（米国特許番号6,280,718）、ヒトES細胞は哺乳動物ストローマ細胞の支持細胞層上で培養した場合造血前駆細胞に分化することを示した（col.5, line 7,からcol. 6, line26 参照）。米国特許番号6,280,718の開示の全体を引用してここに取り入れた。同様に、Kawasakiらは、マウスストローマ細胞の支持細胞層上で培養することによりカニクイザルES細胞をドパミン作動性神経及び色素沈着上皮細胞に分化を誘導した（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99(3): 1580-85参照）。
【００２７】
上記の報告により示されているように、全能性細胞及び多分化能幹細胞の特定の細胞型への分化を誘導する薬物または条件を同定しようとする研究グループの試みは、一般的に比較的少数の増殖因子またはサイトカインを含む一つまたは二つの溶液に細胞を暴露し、そしてその幹細胞が分化して特定の細胞型に特徴的な形態をとる及び/またはマーカー遺伝子を発現するか否か監視することである。
【００２８】
現在では、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞を多数の異なる特定細胞型に分化を誘導するために、同時にまたは連続して作用する生物学的、生化学的、そして物理的な薬物または条件を効率よく同定するための系統的な、大規模な、スクリーニング検定に対するニーズがある。
【００２９】
重要な特定細胞型のそれぞれにその幹細胞の分化を誘導することに関係する重要な調節段階を特異的に示すマーカー遺伝子及び遺伝子産物を効率よく同定し、分析しそして分類する手段も求められている。
【００３０】
細胞治療のために、そして動物モデルで試験するために適しそして有用な分化細胞の特徴的集団の作製と精製の効率の良い方法に対するニーズもある。
【００３１】
本発明は、それらに限定されずに、その目的を達成するものである。
【００３２】
発癌における分化経路
発癌における多くの分子事象は分化において正常に生じる事象の繰り返しまたは突然変異である。この点で、多くの場合に発癌は、少なくとも一部は、正常な発生に使用された経路を利用する最終分化の逆行を反映している。細胞外信号による細胞増殖及び分化の調節は受容体チロシンキナーゼ（RTK）のような高親和性膜貫通受容体への増殖因子の結合を必要とする。例えば、最近Sakamoto  et al., 2001,（Oncol. Rep. 8: 973-80）は、乳癌における神経増殖因子及びその低親和性受容体p75NGFRの役割を報告しており、Gmyrek et al., 2001（Am. J. Pathol. 159: 579-90）は、Met受容体に結合して前立腺、腎臓、及び肝細胞癌腫における上皮細胞の分化を促進する肝細胞増殖因子/散乱因子（HGF/SF）の役割を記述している、同様に、Ret受容体における突然変異は多発性分泌腺新生物に関係しており、kit受容体はマスト細胞腫及び消化器癌に、造血分化の役割をするFlt-3リガンドは神経冠由来腫瘍に関係づけられてきた（Timeus et al, 2001, Lab. Invest. 81: 1025-1037）、膵臓悪性腫瘍におけるFGF-1及び-2（El−Hariry et al, 2001, Br. J. Cancer, 84: 1656-63）、結腸癌におけるHB-EGF（Ito et al, 2001, Anticancer Res. 21: 1391-4）、乳癌におけるオンコスタチンM、乳癌におけるグリピカン（Matsuda et al, 2001, Cancer Res. 61: 5562-9)、そしてYiu et al,2001（Am. J. Pathol. 159: 609-22）は、卵巣癌のアポトーシス経路における細胞外マトリックス成分SPARCの役割を記述した。これらは、特定の細胞型の分化に重要であり、また癌において役割を演じている多数の細胞外成分のわずかな例に過ぎない。驚くことに、分化経路の早期に影響する因子を同定することに基づいた抗癌剤の検定または癌治療の新規標的を検定する方法はない。本発明は、癌細胞を分化するように誘導し、その増殖を阻止することができる処置を同定するために生物的、生化学的、及び物理的な薬物または条件の多数の組み合わせを効率よくスクリーニングする手段も提供する。
【発明の開示】
【００３３】
発明の説明
本発明の目的は、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞及びそれらに由来する細胞を細胞治療に有用な細胞型を含む多数の異なる特定の細胞型に分化させる化学的、物理的、そして生物学的な薬物及び/または条件、及びそのような薬物及び/または条件の組み合わせを効率よく同定するためのハイスループットスクリーニング検定を提供することである。
【００３４】
本発明のそのほかの目的は、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞及びそれらに由来する細胞を細胞治療に有用な細胞型を含む多数の異なる特定の細胞型に分化する分岐経路において連続する調節段階または「分節」と関係する細胞内の生化学的マーカーを同定しそして解析する効率の良い方法を提供することである。
【００３５】
本発明のそのほかの目的は、細胞治療のための分化細胞型の作製、単離、及び治療への使用を容易にするために遺伝的に修飾した全能性、または多分化能幹細胞を作製するための効率の良い方法を提供することにある。
【００３６】
一態様において、本発明は特別な発生系統に沿って全能性、ほぼ全能性、及び多分化能細胞、及びそれらから由来した細胞の分化を指令するために使用することができる化学的及び生物学的薬物及び物理的条件を同定するための検定を含んでいる。そのような分化誘導性の化学的及び生物学的薬物及び物理的条件の例は、増殖因子、サイトカイン及び細胞外マトリックス成分、細胞-細胞相互作用、環境条件（温度、酸素分圧、など）及びそのほかの細胞外因子または成分、及び標的細胞が同時にまたは連続して暴露されるそれらの組み合わせである。候補分化誘導薬物として使用できる生物学的薬物の例としては、全ての型の生きた細胞または死んだ細胞、並びに細胞小器官、内部及び外部細胞膜、膜結合タンパク、可溶性タンパク、タンパク複合体、タンパク及び他の脂質、糖類及び核酸などを含む分子種の複合体、を含む細胞の部分またはフラクションが含まれる。候補分化誘導薬物である生物学的薬物として使用することができるフラクションを調製するために細胞を分画する方法は良く知られている。分化誘導薬物として有用なそのほかの生物学的薬物は細胞培養順化培地、及び天然または人工的組織の抽出物またはフラクションである。
【００３７】
そのほかの態様において、本発明は、細胞が分化したときに活性化される遺伝子座にマーカー遺伝子として挿入された検出しうるマーカーをコードするDNAを持つ遺伝子トラップ幹細胞の作成方法を提供する。遺伝子トラップマーカーをコードするDNAは、挿入されている遺伝子座が活性化されたときにそれが発現しそしてマーカーが生産されるような部位に正しい方向でインフレームに挿入することができる。次いで、挿入されたコード配列は幹細胞の分化の検出ができるマーカーとして働く。ベータ-ガラクトシダーゼをコードするDNAは本発明に適した一般的に使用される遺伝子トラップマーカーの例である。
【００３８】
本発明のそのほかの態様は、細胞治療のための分化細胞型の作製、単離及び治療への使用を容易にするために遺伝子修飾した全能性、または多分化能幹細胞を作成する効率的方法を提供する。
【００３９】
そのほかの態様において、本発明は動物試験及び細胞治療のための特定の細胞型を単離する方法を提供する。
【００４０】
そのほかの態様において、本発明は、増殖因子、サイトカイン、及び/またはそのほかのここに記述した方法により同定された分化誘導薬物の、単独または組み合わせた、組成物、及び治療、移植治療、及び新規の癌標的及び治療の探索を含む薬物探索へのその使用を包含する。
【００４１】
核移植は、幹細胞分化を誘導及び指令する薬物及び条件をスクリーニングするために本発明の方法に使用することができる全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞を作製するための有用な方法である。本発明のスクリーニング方法のための幹細胞を作製するための有用な核移植方法は、細胞治療に有用な細胞に分化する全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞を作製するための方法と同じである。そのような方法はともに出願中のAdvanced Cell Technologyに付与された米国仮出願番号60/305,904に基づく国際出願、2002年7月18日出願、に記述されており、その全体をここに取り入れたが、核移植を幹細胞の作製に使用することもできる：
【００４２】
本発明の検定は、適当な全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞及びそれらに由来する細胞のいずれかを使用して実施することができる。それらの細胞には、内部細胞塊（ICM）細胞、胚性幹（ES）細胞、胚性生殖（EG）細胞、1またはそれ以上の細胞からなる胚、胎児様体（胎児様）細胞、桑実胚由来細胞、並びに、これに限定はしないが、ネスチン陽性神経幹細胞、間充織幹細胞、造血幹細胞、膵臓幹細胞、骨髄ストローマ性幹細胞、内皮前駆細胞（EPC）、骨髄幹細胞、上皮幹細胞、肝臓幹細胞及びそのほかの系統拘束成熟前駆細胞を含む胚発生過程の後期から得た多分化能の部分分化胚性幹細胞が含まれる。
【００４３】
本発明に使用するための全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、及びそれらに由来する細胞はいずれかの資源から得ることができる。本発明に使用するための全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、及びそれらに由来する細胞を作製するための一つの方法は、米国出願番号09/655,815、その開示の全体を引用してここに取り入れた、に記述されているように、適当なレシピエント細胞に核移植することによる。核ドナーとして成熟分化細胞を使用する核移植は、本発明の出発物質として形質転換されそして遺伝子修飾された幹細胞の回収を容易にする、なぜなら成熟細胞は胚性細胞より形質転換されやすいからである。
【００４４】
本発明の方法は、限定はしないが、ヒト及び非ヒト霊長類細胞、有蹄類細胞、げっ歯類細胞、lagomorph細胞を含むいずれかの動物種の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、及びそれらに由来する細胞を使用して実施することができる。本発明を実施することができる霊長類細胞には、これに限定しないが、ヒト、チンパンジー、バブーン、カニクイザル、及び新世界及び旧世界のサルが含まれる。本発明を実施することができる有蹄類細胞には、これに限定しないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファロー及びバイソンの細胞が含まれる。本発明を実施することができるげっ歯類細胞には、限定はしないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びジャービルの細胞が含まれる。ウサギは本発明を実施することができるlagomorph種の例である。
【００４５】
例えば、本発明の方法はマウスES細胞系、または霊長類ESまたはEG細胞系を使用して実施することができる。本発明を実施することができる霊長類幹細胞系の例は全能性非ヒト霊長類幹細胞系Cyno-1であり、これは単為発生カニクイサル胚の内部細胞塊から単離され、身体の全ての細胞型に分化することができる。(Cibelli et al. (2000) Science  295: 819)。
【００４６】
幹細胞の遺伝子修飾：
本発明の一部の態様は、遺伝子を修飾した幹細胞またはその幹細胞のライブラリーを使用する。例えば、幹細胞を多数の異なる特定の細胞型へ分化誘導する薬物または条件を同定するためのスクリーニングは、以下に検討するような遺伝子トラップ幹細胞ライブラリーを使用するハイスループット様式において効率的に実施することができる。
【００４７】
幹細胞を求める細胞型、例えば、細胞治療に有用な細胞、へ分化誘導する薬物または条件を同定するための本発明のスクリーニング検定を行った後、細胞治療用に分化した細胞型を作製、単離、及び治療への使用を容易にするために幹細胞（あるいは遺伝子トラップ細胞または同じ型の非修飾ES細胞）を遺伝子修飾することが本発明の一態様である。
【００４８】
例えば、細胞治療用の分化細胞を生じる幹細胞は、先天的な突然変異を矯正することにより、または細胞移植（遺伝子治療）を受ける患者に治療効果を与える1またはそれ以上のDNA配列を導入、変更または欠失することにより遺伝子修飾することができる。
【００４９】
核ドナーとして成熟分化細胞を使用する核移植は、本発明の出発物質として形質転換されそして遺伝子修飾された幹細胞の回収を容易にする、なぜなら成熟細胞は胚性細胞より形質転換されやすいからである。
【００５０】
ある例において、これらの細胞は選別マーカーを発現するように遺伝子修飾することができるし、あるいはその細胞系に欠陥をもたらすように遺伝子修飾をすることができる。例えば、選別マーカーはここに報告した方法を使用して誘導した分化細胞の検体から特定の細胞をさらに精製するために利用することができる。その方法は、例えば、選別マーカーがネオマイシンまたはヒグロマイシン耐性遺伝子であるような陽性選別を使用することを含んでいる。ネオマイシン耐性の場合には、目的とする細胞型に分化しなかった細胞をG418により殺すことができる。そのほかには、特別なプロモーターは、例えば、ブローサイトメトリーを使用して目的の細胞を単離することができる細胞表面抗原のようなほかの選別システムを作動させることができる。そのほかに、細胞を組織特異的または系統特異的なプロモーターにより作動的に発現する自殺遺伝子で修飾することができる、すなわち、求める細胞及び組織の回収を容易にするために、ここに開示した方法を使用して同定した化合物及び組み合わせの補足として。
【００５１】
無血清培地における培養：
胚性細胞はLIF（白血病阻害因子）の除去により無秩序にそして急速に分化する傾向を有し、そして胚性細胞を維持するために通常使用される支持細胞は増殖因子または結果を複雑にするそのほかの化合物を作ることがある（Reubinoff et al., Nature Biotech. (2000) 18(4): 399-404参照）。このように、スクリーニング検定の態様は無血清培地に細胞を適応させることを含んでおり、また一部の胚由来細胞の場合には、増殖に必ずしも必要でない繊維芽細胞支持層を存在させずに、しかし細胞が生存し適用した試験化合物に対する応答を維持する条件で増殖するように適応させることを含んでいる。種々の無血清培地は当業者に既知であり、そしてここに開示された方法に示されたいずれの細胞系も試験及び使用することができる。例えば、多分化能幹細胞のインビトロ増殖及び分化の評価において、米国特許5,851,832（ここに引用して取り入れた）は、グルコース（0.6％）、グルタミン（2μM）、重炭酸ナトリウム（3 mM）、及びHEPESを含むDMEM/F-12 (1:1)からなる無血清培地の使用を記述している。指定ホルモン及び塩混合物を血清の代わりに使用した。Wilesらは、ES細胞の分化を検討するための無血清既知組成培地（CDM）を記述しており、これはES細胞の自発的分化を支持することはできないが、外来性因子に応答する分化を評価することができた（Wiles et al., Exp. Cell Res. (1999) 247(1): 241-8参照）。このグループによると、LIF及び支持細胞がない場合には、ES細胞は典型的に急速に分化し、主として外胚葉、中胚葉及び造血細胞を形成する。しかし、CDM中では、細胞はES細胞表現型を失うが中胚葉を形成することができない。むしろ、細胞は、外来性分化信号のないときに生じる「デフォルト」経路の型と考えられる限定された点に拘束された神経外胚葉に入る。
【００５２】
Nichols 及び共同研究者はIL-6プラス可溶性IL-6受容体組み合わせを伴う支持層のない状態でのES細胞の維持を報告した。Nichols et al., 1994, インターロイキン-6及び可溶性インターロイキン6受容体の組み合わせによる生殖系適合胚性幹細胞の誘導、Exp. Cell Res. 215(1): 237-9。しかし、この組み合わせはLIFと同じシグナリング過程を活性化するので、この培地は候補分化誘導因子を研究するには適していないであろう。しかし、ES細胞はLIFの存在下に分化することが報告されている（Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 8240-44参照）。さらに、インビボにおいてLIFは発生の胚盤胞段階に存在する（Murray et al., Mol. Cell. Biol.（1990）10:4953-56）。したがって、LIFに対するICM細胞の応答は発生を進行させるために時間的そして/または空間的に調節されているのであろう。
【００５３】
他のグループは支持細胞に依存せずそしてLIFにも依存しないES細胞系を単離したが、それでも発育する胚の環境においた場合には全ての胚生殖層に貢献する（Berger et al., Growth Factors (1997) 14(2-3): 145-159）。しかし、細胞は継代を通しての選別により単離されるので、自己更新能力に寄与する突然変異はわからない。しかし、特異的維持培地を開発する代替として本発明に使用するためのES細胞類似の系を単離することはできる。
【００５４】
そのほかの選択は、検定の時まで幹細胞をLIFの存在下に支持層上で胚性細胞を維持することである。ES細胞に対する8個の異なる増殖因子の影響の評価において、Schuldiner及び共同研究者は、集団として分化を開始することができるように5日間ゼラチンコート皿にES細胞を移した、次いで再度細胞をプレートして単層とし細胞を試験増殖因子に曝露した。Schuldiner et al., 2000 ,前出参照。同様な方法はマウスES細胞に、神経細胞または筋肉細胞のような特定の細胞型になるよう指令するために一般的に使用されている（Slager et al., 1993,前記；Bain et al., 1995,前記；及びRohwedel et al., 1994, 前出）。しかし、Schuldiner はまた、細胞はいずれの試験増殖因子がない状態で全ての異なる細胞型に自然に分化し、特異的増殖因子で処理した検体は非処理対照よりも均一であったと報告している。したがって、いずれの個別の検定についても、試験した化合物の組み合わせにより、分化を阻止するための特別の培地成分を存在させずに、目的の分化を指令することは可能である。実際に、研究者たちは、指定した分化の過程は、誘導薬物を単独または併用して、ある発生経路を阻害する化合物を含むことができることを発見している。
【００５５】
分化誘導物：
本発明の方法は、幹細胞の分化に対する影響を測定するための非常に広範な化合物及び培養条件をスクリーニングするために使用することができる。例えば、その方法は、増殖因子、サイトカイン、細胞間相互作用に関係する因子、接着分子、細胞外マトリックス成分、培地成分、環境条件などからなる群から選択された1またはそれ以上の候補分化誘導化合物を使用して実施することができる。使用に適した培地成分には同定されたもの及び未同定の培地成分のいずれも含まれる；例えば、細胞培養により順化培地に含まれる未同定成分を分化誘導試薬として使用することができる。本発明は分化を誘導する1またはそれ以上の未同定の物質を含む生物学的組成物を同定するためのスクリーニング及び既知フラクションの使用及び活性物質を単離するための検定方法を含んでいる。
【００５６】
本発明の方法及び検定は、早期段階の胎児またはそれに由来する因子またはホモジネートまたは単離分化細胞から単離した物質に応答する細胞の分化を分析するために使用することもできる。一次細胞及び組織または単離細胞系を含むそのほかの細胞も、開示した方法及び検定に従って、細胞分化を誘導する能力についてスクリーニングすることができる。
【００５７】
開示した検定において試験することができる増殖因子、ケモカイン、及びサイトカインの例は、限定はしないが、塩基性FGF（146aa）及びその変異体、酸性FGF、これに限定せず、を含むタンパク（FGF1-23）の繊維芽細胞増殖因子のファミリー、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータsRII、潜在型TGF-ベータ、これに限定せず、を含むタンパクのTGF-ベータファミリー、TNF-アルファ、TNF-ベータを含むTNFSF1-18、これに限定せず、を含む腫瘍壊死因子（TNF）スーパーファミリー（TNFSF）、これに限定せずIGF-1を含むインスリン様増殖因子ファミリー及びIGFBP-1, Il-1 R rp2, IGFBP-5, IGFBP-6,これに限定せず、を含むその結合タンパク、MMP-1, CF, MMP-2, CF, MMP-2 (NSA発現),CF, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-9, TIMP-1, CF, TIMP-2,これに限定せずに、を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ及びそのほかの増殖因子、及びPDGF, Flt-3リガンド、Fasリガンド、B7-1(CD80),  B7-2(CD86),  DR6, IL-13 Rアルファ、IL-15 Rアルファ、GROベータ/CXCL2（aa39-107），IL 1-18, Il-8/CXCL8,  GDNF, G-CSF, GM-CSF, M-GSF, PDGF-BB, PDGF-AA, PDGF-AB, IL-2 sRアルファ、IL-2 sR ベータ、可溶性TNF RII, IL-6 sR, 可溶性gp130, PD-ECGF, IL-4 sR, ベータ-ECGF, TGF-アルファ、TGF-ベータ sRII, TGF-ベータ5、LAP(TGF-ベータ1)、BDNF, LIF sRアルファ、LIF, KGF/FGF-7, プレイオトロフィン、ENA-78/CXCL5，SCF, ベータ-NGF, CNTF,ミドカイン、HB-EGF, SLPI,ベータセルリン、アンフィレグリン、PIGF, アンジオゲニン、IP-10/CXCL10, NT-3, NT-4, MIP-1アルファ/CCL3, MIP-1ベータ/CCL4，I-309/CCL1, CROアルファ/CXCL1, GROベータ/CXCL2, GROガンマ/CXCL3, Rantes/CCL5, MCP-1/CCL2, MCP-2/CCL8, MCP-3/CCL7, IFN-ガンマ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、MIF, IGF-I, IGF-II, VEGF, HGF, オンコスタチンM,  HRG-アルファ（EGFドメイン）、TGF-ベータ2、CNTF Rアルファ、Tie-2/Fcキメラ、BMP-4, BMPR-IA, エオタキシン/CCL11，VEGF R1(Flt-1), PDGF sRアルファ、HCC-1/CCL14, CTLA-4, MCP-4/CCL13, GCP-2/CXCL6, TECK/CCL25, MDC/CCL22, アクチビンＡ，エオタキシン-2/MPIF-2/CCL24, エオタキシン-3/CCL-26（aa24-94）, TRAIL R1(DR4), VEGF R3(Fit-4)/SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12, MSP, BMP-2, HVEM/VEGF R2(KDR),エフリン-A3，MIP-3アルファ/CCL20, MIP-3ベータ/CCL19, フラクタルキン/CX3CL1（ケモカインドメイン）、TARC/CCL17, 6Ckine/CCL21, p75ニューロトロフィンR (NGFR)，SMDF,ニューロチューリン、レプチンR/Fcキメラ、MIG/CXCL9, NAP-2/CXCL7, PARC/CCL18,カルジオトロフィン-1（CT-1）, GFRアルファ-2、BMP-5, IL-8/CXCL8 (内皮細胞由来)、Tie-1, ウイルスCMV UL146, VEGF-D,アンギオポエチン-2、インヒビンA,  TRANCE/RANK L, CD6/Fcキメラ、CF, dMIP-1デルタ/LKN-1/CCL15 (68 aa)，TRAIL R3/Fcキメラ、可溶性TNF RI, アクチビンRIA, EphA1, ENA-70, ENA-74, エオタキシン-3/CCL26, ALCAM, FGFR1アルファ（IIIc）、アクチビンB,  FGFT1ベータ（IIIc），LIGHT, FGFR2ベータ（IIIb）、DNAM-1, フォリスタチン、GFRアルファ-3、gp130, I-TAC/CXCL11, IFN-ガンマRI, IGFBP-2. IGFBP-3, インヒビンB,  プロラクチンCF, RANK, FGFR2ベータ（IIIc）、FGFR4, TrkB, GITR, MSP R, GITRリガンド、リンフォタクチン/XCL1, FGFR2アルファ（IIIc）、アクチビンAB, ICAM-3(CD50), ICAM-1(CD54), TNF RII, L-セレクチン（CD62L）, BLC/BCA-1/CXCL13, HCC-4/CCL16,  ICAM-2(CD102), IGFBP-4,オステオプロテグリン（OPG）, uPAR, アクチビンRIB, VCAM-1(CD106), CF, BMPR-II, IL-18 R, IL-12 Rベータ1、Dtk, LBP, SDF-1アルファ（PBSF）/CXCL12（合成）、E-セレクチン（CD62E）、L-セレクチン（CD62L）、P-セレクチン（CD62P）、ICAM-1(CD54), VCAM-1(CD106), CD31(PECAM-1),タンパクのヘッジホッグファミリー、インターロイキン-10、上皮増殖因子、ヘレ��リン、HER4, ヘパリン結合上皮増殖因子、bFGF, MIP-18, MIP-2, MCP-1, MCP-5 NGF, NGF-B, レプチン、インターフェロンA, インターフェロンA/D,インターフェロンB, インターフェロン誘導性タンパク10、インスリン様増殖因子-II、IGBFBP/IGF-1複合体、C10, サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質2B、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質1、サイトカイン応答遺伝子2、及びそれらのフラグメント及びその中和抗体である。用量は確立された有効濃度の範囲でよい；例えば、用量は、基準と最大の反応の中間の反応を生じる濃度であるEC50 の最大値の0.1から5倍の範囲でよい。
【００５８】
試験することができる細胞間相互作用に関係する因子は、限定はしないが、ADAM  1，2，3A, 3B, 4-31を含むタンパクのADAM（ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ）ファミリー、TS 1-9, ADAMTS（トロンボスポンジンモチーフを持つADAM）、レプロリシン、メチンシン、チンシン、及び亜鉛メタロプロテイナーゼ及びその中和抗体を含む。
【００５９】
試験することができる接着分子は、限定はしないが、IgスーパーファミリーCAM,インテグリン、E-，P-,及びN-カドヘリンを含むカドヘリン、及びセレクチン、及びそれらの中和抗体を含む。
【００６０】
試験することができる核酸は、限定はしないが、リボザイム活性、または分化の間に発現する調節遺伝子に関係するRNA干渉転写因子、増殖因子、サイトカイン、及び細胞外マトリックス成分またはそのほかの分化を調節する分子活性の遺伝子をコードまたはアンチセンスにより阻害するものを含む。
【００６１】
細胞外マトリックス成分も幹細胞の分化を誘導及び指令することができる。テナシンファミリーのメンバーは細胞分化を指令するのに有用な細胞外マトリックス成分の例である。現在このファミリーには5つのメンバーがある、テナシン-C（以下の例では単純にテナシンと呼ばれる）、及びテナシン-R, -X, -Y 及び-W。テナシン-Rは中枢神経系の細胞を誘導する薬物をスクリーニングするのに特に有用であり、他方テナシン-X及び-Yは筋肉細胞に関係するスクリーニングに有用である。テナシン-Cは神経系及び外胚葉性細胞を含む広い範囲の細胞型の分化に有用である。中和抗体のようなテナシンの作用を阻害する薬物及びテナシンのタンパク分解サブユニットも分化の指令に有用である。テナシンまたはそのサブユニットは目的の細胞の培養に先立って培地に添加することができ、培養細胞の培地に加えることができ、目的の細胞と共培養する細胞により発現することができ、あるいは細胞と接触させて導入することができる。
【００６２】
試験することができる細胞外マトリックス成分は、これに限定しないが、テナシン、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン、メロシン（ラミニンa2-鎖）、コンドロイチン硫酸A，SPARC,ベータアミロイド前駆タンパク、ベータアミロイド、プレセニリン1，2、アポリポプロテインE,  トロンボスポンジン-1，2、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、マトリゲル、アグレガン、ビグリカン、ポリ-L-オルニチン、限定せずにコラーゲンI-IVを含むコラーゲンファミリー、ポリ-D-リシン、エキスタチン（毒ヘビ毒液）、フラボリジン（毒ヘビ毒液）、キストリン（毒ヘビ毒液）、ビトロネクチン、プーパーフィブロネクチン、フィブロネクチン接着促進ペプチド、フィブロネクチンフラグメントIII-C,フィブロネクチンフラグメント-30KDA、フィブロネクチン様重合体、フィブロネクチンフラグメント45KDA、フィブロネクチンフラグメント70KDA、アシアロガングリオシド-GM、ジシアロガングリオシド-GOLA、モノシアロガングリオシド-GM1, モノシアロガングリオシド-GM2, モノシアロガングリオシド-GM3、メチルセルロース、ケラチン硫酸プロテオグリカン、ラミニン及びコンドロイチン硫酸Aを含む。細胞外マトリックス成分は細胞を加える前にまたは後に培養ウエルに適用することができる。ウエル表面にコーティングする場合には、これらの成分の濃度は、１から10 mg/mlまたは 0.2から50mg/mlの範囲が良い。
【００６３】
試験することができる培地成分は、限定はしないが、グルコース濃度、脂質、トランスフェリン、B-シクロデキストリン、プロスタグランジンF2、ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン、L-チロキシン、3,3,5-トリヨード-L-チロニン、L-アスコルビン酸、フェチュイン、ヘパリン、2-メルカプトエタノール、ウマ血清、DMSO、ニワトリ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ヒト血清、脳下垂体抽出物、ストローマ細胞因子、順化培地、ハイブリドーマ培地、d-アルドステロン、デキサメタゾン、DHT, B-エストラジオール、グルカゴン、インスリン、プロゲステロン、プロスタグランジン-D2、プロスタグランジン-E1、プロスタグランジン-E2、プロスタグランジン-F2、無血清培地、内皮細胞増殖添加物、遺伝子治療培地、MDBK-GM培地、QBSF-S1、内皮培地、角質細胞培地、メラノサイト培地、Gly-His-Lys、細胞内酵素を阻害または妨害する可溶性因子、または限定しないが、ブチレートまたはトリコスタチンAのようなヒストンデアセチラーゼのようなクロマチン修飾酵素に影響する化合物、cAMPを変化させる化合物、プロテインキナーゼ阻害薬、細胞内カルシウム濃度を変える化合物、ホスファチジルイノシトールを変える化合物を含むそのほかの分子を含む。
【００６４】
試験することができる環境条件は、限定はしないが、酸素分圧、二酸化炭素分圧、酸化窒素分圧、温度、pH、機械的刺激、二次元と三次元のような培養基質の変更、ビーズ゛上、シリンダー内、または多孔性基質での増殖、を含む。
【００６５】
試験することができる早期段階胚、胎児、または成熟組織由来の物質は、限定はしないが、胎児様体、原始内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の組織、及び分化しつつある器官及び組織の原基または生きた細胞または問題の細胞と共培養したときに分化を誘導する組織の界面活性剤抽出により調製された無細胞細胞外マトリックスを含む。
【００６６】
増殖因子、接着因子、細胞外マトリックス成分、などは個々にまたは種々に組み合わせて試験することができる。加えて、これらの因子は種々の培養条件、例えば、幹細胞の分化に影響することがあるビタミン及びミネラルと組み合わせることができる。例えば、酸素分圧は胎児様体における遺伝子発現及び発生に影響することが示されている。Bichet et al, 1999, FASEB J., 13: 285-95, 酸素分圧は胎児様体におけるβ-グロブリン切り替えを変化させる。種々の異なる組み合わせに試験細胞を暴露する検定様式において、結果を試験条件に相関できるように各検体に適用した条件を記録するように注意すべきである。
【００６７】
増殖因子及びそのほかの化合物はその有効濃度の約0.1から約10倍で幹細胞に適用することができる；例えば、その有効濃度の約2倍で、種々の時間、例えば、問題の細胞の正常な発生における分化のタイミングによって1時間から2ヶ月間。増殖因子及びそのほかの化合物を反復して、または同時でなく、他の化合物と数時間、数日または数週間の投与間隔を置く特別な時系列で適用することもできる。
【００６８】
スクリーニング検定：
本発明の態様は、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれから由来する細胞；例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎児様体、ICM細胞、桑実胚由来細胞、非ES幹細胞、の分化を誘導する薬物または条件を同定するために、及び試験した薬物または条件に応答して生じる分化の型及び程度を分析するためにスクリーニング検定を使用する。例えば、本発明のスクリーニング検定は下記を含むことができる：
(a)個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、または個別の細胞の集団を、開放または密閉の一つまたは複数の容器、その容器は同一または異なる装置内にある、に分配する；
(b)対照組織から一次及び/または前駆細胞を単離し、該一次及び/または前駆細胞を個別のマイクロアレイ容器に入れて対照参照ライブラリーとする；
(c)該個別容器の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、を同一の一つまたはそれ以上の候補分化誘導化合物に、同時にまたは連続して暴露し；そして
(d)該個別細胞または細胞の集団の分化を評価するために、個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、または個別の細胞の集団を、該対照ライブラリーと比較する。
【００６９】
ハイスループットスクリーニング
本発明の有用な態様は、非常に多数の異なる型の幹細胞；例えば、動物の部分的にまたは完全に分化した細胞型になることができる分化経路の複雑な、分枝した木の多数の異なる段階または「分節」に幹細胞が分化誘導されたときに遺伝子トラップマーカーを持つように選別された遺伝子トラップ幹細胞のライブラリー、をスクリーニングする方法を提供することである。さらに、本発明は、目的の細胞型に部分的にまたは完全に幹細胞を分化誘導する薬物及び条件のセットを同定するために、1またはそれ以上の異なる型の幹細胞を非常に多数の型の化学的及び生物学的物質及び物理的条件に、単独または組み合わせて、同時にまたは種々の時間間隔で、暴露するスクリーニング方法も提供する。
【００７０】
ここに開示した本発明の検定を実施するには、個別の細胞または個別の細胞の集団に規則的に試験化合物を適用しそして分化を評価するために便利な配列容器またはコンパートメントの集合のいずれかの型の中に分配することができる。例えば、細胞は10から100,000の容器またはコンパートメント、または一部の態様では100から100,000容器、そのほかでは1000から10,000容器、または1またはそれ以上の多ウエルプレートの分離したウエルに細胞を分配することができる。使用される多ウエルプレートはどのような数のウエルも有することができる；例えば、本発明のスクリーニング検定は24または96ウエルのプレートを使用して実施することができる。この態様において、一次細胞の対照ライブラリーは新規に単離して、同じ配列容器に配分することができ、あるいは凍結保存細胞を使用することもできる。コンパートメント、例えば、1または24または96ウエルプレートのウエル、に細胞を配分する際には、表面のcm2当り1から106個の幹細胞を加えることができる。例えば、本発明のスクリーニング検定は表面のcm2当り10から105個の細胞を加えることにより実施することができる。一部のES細胞は生存するために最小限の細胞数を必要とするので、そのような細胞に対しては表面のcm2当り3から106個の幹細胞を加えるべきである。所与の条件のセットによる分化の誘導は統計的確率で生じる；したがって、ウエル当たりの細胞数が多いほど、その中の細胞が分化誘導される可能性は高まる。
【００７１】
対照ライブラリー細胞及び細胞型関連マーカー
対照ライブラリーに使用される一次細胞及び/または前駆細胞は関心の細胞のいずれかを含むことができる、すなわち、限定はしないが、脳細胞、心臓細胞、肝細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、血液細胞、生殖細胞、神経細胞、感覚細胞、血管細胞、骨格細胞、免疫細胞、肺細胞、筋肉細胞、腎細胞、などを含む、分化誘導化合物または組成物を同定する際に実験者が関心を持ついずれかの細胞。この対照ライブラリー細胞は次いで、暴露された幹細胞が対照ライブラリー中の特定の一次細胞に分化したことを調べる際の実験対照として使用される。対照ライブラリー中の各細胞を検出するように特別に調整された機能的検定は処理または暴露された幹細胞について実施され、対照ライブラリーの特定の細胞と分化を関係づける。
【００７２】
例えば、一次及び二次抗体及び入手可能なリガンド試薬及び特別な細胞型に特異的な分子マーカーに関する知識に基づいて、免疫細胞化学をライブラリー内の特別な細胞に関係付けるタンパクの発現について試験幹細胞を調べるために使用することができる。そのほかに、RT-PCRを特別な遺伝子転写について検体を調べるために使用することができる。例えば、特異的抗体またはRT-PCRによって検出しうる細胞型の分化の既知分子マーカーは多く存在する；例えば、E-，P-,及びN-カドヘリン、ケラチン、chAT, チロシン水酸化酵素、ガンマエノラーゼ、PDX、アミラーゼ、CD34, VEGFR，心筋ミオシン、コラーゲンII,性決定領域Y、frizzled-3, GATA6, brachyury, PU.1(Spi-1),肝細胞核因子-3、アルファ-2タイプXIコラーゲン、肝リパーゼ、神経増殖因子、ソニックヘッジホッグ、造血的に発現したホメオボックス、エノラーゼ-2、ケラチン19、骨芽細胞-特異的因子2、グロビン転写因子1、筋原性因子3、ミオシンヘビーポリペプチド2、ドパミントランスポーター、CD34、ヒト血清アルブミン、パンクレアチンアミラーゼ、インスリンプロモーター因子、ベータ-グロビン、Oct4、心筋アルファ-ミオシン重鎖、心筋ミオシン軽鎖1、繊維芽細胞増殖因子5（FGF-5）、SOX-1、アルファ-フェトプロテイン（AFP）、EMX-2、engrailed-2 (En2)、Hesx-1, Hox B1 , Krox-20 , Mush-1, Nkx-1, Nkx-2, Pax-3, Pax-6,ネスチン、及びGAPDH（ハウスキーピング遺伝子、対照マーカーとして有用）が含まれる。
【００７３】
特別なタンパクまたは転写物が存在しないことよりもむしろ陰性の結果が検定自身の欠陥でないことを確証するために、対照ライブラリー中の細胞は陽性対照として同時に試験すべきである。機能的検定では特定の対照一次または前駆細胞によって生産される酵素または代謝物の生産を測定することもできる、例えば、固相酵素免疫検定（ELISA）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ウエスタンブロット、放射免疫検定、などにより。例えば、ドパミン作動性ニューロンはKCl誘発ドパミン放出について試験することができ、β-細胞はグルコース依存インスリン放出を、心筋細胞は同調収縮を、肝細胞はトリアシルグリセロール生産を、例として示した。
【００７４】
本発明の第二の態様は、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞の、種々の化合物または化合物の組み合わせに応答する分化を評価する方法に関係する；それは以下を含む：
(a)個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、または個別細胞の集団を、解放または密閉した一つまたは複数の分離した容器、その容器は同じまたは異なる装置中にある、の中に分注する；
(b)個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞が入った該分離した容器を種々の候補分化誘導化合物またはそれらの組み合わせのパネルに同時にまたは連続的に規則的に暴露し、そして
(c)該個別細胞または細胞の集団の分化を評価するために、該個別の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞、または細胞の集団を、対照の分化したまたは部分的に分化した細胞と比較する。
【００７５】
この態様は、細胞は種々の化合物及び化合物の組み合わせのパネルで処置され、そしてその細胞型に分化を指令することになる特別な条件を同定するために結果は単一の比較対照と比較される点で、前記の第一の態様と異なる。
【００７６】
上記の機能的検定はいずれも結果を分析するために使用することができるが、第二の態様はRNA発現プロフィールの使用が最もしやすい。例えば、発現プロフィールはいつでもどこでも作ることができ、どの因子が特異的プロフィールを作るかにしたがってRNA発現プロフィールを分類するライブラリーを作るために使用することができる。次いで、それぞれの胚分化プロフィールを一次細胞と照合するために、プロフィールはいつでも種々の比較一次細胞の発現プロフィールと比較することができる。そのライブラリーは電子方式で提供することができ、それによりライブラリー構成員と特別な一次細胞または前駆細胞の間のようなRNA発現プロフィールの照合は肉眼よりも電子的に実施することができる。
【００７７】
第三の態様は、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞の、種々の化合物または化合物の組み合わせに応答する分化を評価する方法に関係し、以下を含む：
(a)該細胞が少なくとも一つのレポーター遺伝子を導入され、その発現がプロモーター及び/または目的の遺伝子に作動的に連結している遺伝子導入した全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞を単離し；
(b)該遺伝子導入細胞を培養で増殖し；
(c)個別の遺伝子導入細胞または個別の遺伝子導入細胞の集団を、解放または密閉の、同じかまたは異なる装置内の1または複数の容器に分配し；
(d)該容器を種々の候補分化誘導化合物またはそれらの組み合わせのパネルに同時にまたは連続して暴露し；そして
(e)該少なくとも一つのレポーター遺伝子の発現を検出するために、個別遺伝子導入細胞または細胞の集団を分析する。
【００７８】
そのほかに、この態様は遺伝子トラップ幹細胞を使用して実施することができる、その幹細胞はマーカーDNAを、特定の細胞型に幹細胞が部分的にまたは完全に分化することに伴って遺伝子座が活性化されることにより発現するような部位にランダムに挿入されている。マーカーが挿入された遺伝子座が同定されなくても、その細胞は分化の機能的マーカーとなる。
【００７９】
この態様において、特定のレポーター遺伝子構築の発現を生じる組み合わせを同定するために、全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞を種々の化合物または化合物の組み合わせのパネルに暴露する。
【００８０】
関連レポーター遺伝子構築を含む幹細胞は既に検討したように当業者既知であり、それ以外には、既知方法にしたがって作製することができる。例えば、レポーター遺伝子を目的の遺伝子、すなわち、目的とする細胞型または組織型に特異的に発現する遺伝子の座に、相同組換えにより導入することができる。インターナルリボソームエントリー配列（IRES）を含みそして内在性ストップコドンの下流に挿入が生じるように設計することにより、標的遺伝子座からの転写は2シストロン性のメッセージとなり、内在性タンパク及びレポーター遺伝子によりコードされたタンパクの両者を作る。このようにして、標的遺伝子は機能的に破壊されないであろう。そのほかには、標的構築を融合転写及び/または融合タンパクを生じるように設計することもできる。
【００８１】
第二の方法は、細胞型特異的遺伝子に対する単離プロモーター配列を使用してレポーター導入遺伝子を構築することであろう。この方法は、相同組換えを使用しないので精巧なものではなく、そのため導入遺伝子発現において位置の変動を生じるのが欠点である。しかし、構築は容易に作ることができ、良い5’及び3’フランキング配列、及びインシュレータ配列の使用により変動の一部は改善することができるであろう。
【００８２】
レポーター遺伝子法によりハイスループット及び非破壊スクリーニングを可能にする。具体的には、細胞は連続的に監視することができ、したがって検定時点は分化過程の中の特定の時期に限定されないであろう。スクリーニングは遺伝子導入幹細胞を96ウエルプレートに接種することにより実施することができ、そして例えば、レポーター遺伝子の発現が検出されるまで、各ウエルに種々の条件を与える。この方法は迅速に適用しそして評価するために種々のスタイルの実験デザインが可能であろう。さらに、この方法は同じ細胞集団の他の機能的及び形態的マーカーと連結することが可能であろう。
【００８３】
レポーター遺伝子法を使用して、ある細胞型に特異的な遺伝子発現の活性化を集団内の細胞の純度に関して定量化することができる。例えば、本発明の方法はさらに以下の段階を含むことができるであろう：
(f)検出しうる信号を定量的に測定する；そして
(g)該検出しうる信号の量を、試験化合物の非存在下の該遺伝子導入細胞の同数により作られる信号の量と比較する。
【００８４】
この態様は、より純粋な細胞集団を作る化合物組み合わせの開発を容易にするであろう。さらに、緑色蛍光タンパク（GFP）のようなレポーター遺伝子を発現する細胞を蛍光細胞分類により同じ検体中の他の細胞または未分化細胞から分離することができる。Odorico et al., 2001, ヒト胚性幹細胞系からの多系統分化、Stem Cells 19(3): 193-204.
【００８５】
臨床的応用のための標的となる可能性のある遺伝子座は：β-細胞のインスリン、ドーパ作動性ニューロンのDOPAデカルボキシラーゼ、心筋細胞の心筋α-アクチン、及び肝細胞のアルブミンである。これらのタンパクの発現は対応する細胞型に完全に限定されているので、作製された細胞の型に対する信頼性のある指標または裏づけを提供する。
【００８６】
マーカーとして有用なレポーター遺伝子
本発明にとって有用なレポーター遺伝子はいずれかの方法により検出されるタンパクをコードしている、すなわち、肉眼または顕微鏡により、写真または放射線画像解析、または該暴露細胞を色素原基質、色素、糖、抗体、リガンド、プライマー、などからなる群から選択された試薬と接触させることにより検出しうるものである。適するレポーター遺伝子は、限定はしないが、緑色蛍光タンパク（GFP）、強化緑色蛍光タンパク（EGFP）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グアニンキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ、またはβ-ラクタマーゼを含むポリペプチドをコードすることができる。例えば、米国特許5,928,88、引用してここに取り入れた、参照。GFPのような蛍光タンパクをコードするマーカー遺伝子を使用することにより、細胞を傷つけることなくマーカー遺伝子の発現を検出することができる。蛍光原基質としては、限定はしないが、フルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド、レゾルフィンβ-D-ガラクトピラノシド、DDAOガラクトシド、メチルウンベリフェリルガラクトシドまたはそのジ-フッ素化同属体、カルボキシウンベリフェリルガラクトシド、蛍光グリコリピド、Amplex Redガラクトース、PFBアミノフルオレセイン、DiFMUGのクロロメチル及び親油性誘導体、4-メチルウンベリフェリルβ-D-グルクロニド、フロレセインジβ-D-グルクロニド、5-（ペンタフルオロベンゾイルアミノ）フルオレセインジβ-D-グルクロニド、DDAOβ-D-グルクロニド、などが含まれる。当業者はグリコシダーゼ活性を検出する多数の試薬を熟知している。
【００８７】
第四の態様は全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞の、一つまたはそれ以上の化合物に応答した、分化を評価する方法に関係しており、以下を含む：
(a)遺伝子導入した全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞、またはそれらに由来する細胞のライブラリーを得、予め特徴付けたプロモーター及び/または目的の遺伝子に作動的に連結して発現する少なくとも一つのレポーター遺伝子をそれぞれに導入し；
(b)該ライブラリーの個別の構成員を解放または密閉した一つまたは複数の分離した容器、その容器は同じまたは異なる装置中にある、の中に分注する；
(c)該遺伝子導入した細胞の分離した容器を同じ一つまたはそれ以上の候補分化誘導化合物に同時にまたは連続して暴露し；そして
(d)該少なくとも一つのレポーター遺伝子の発現を検出するために該ライブラリーの該個別の構成員を分析する。
【００８８】
この態様は、種々の遺伝子導入細胞のライブラリー、それぞれは異なるレポーター構築を含む、は一つの試験化合物または試験組み合わせ（一つのレポーター構築を示す一つの幹細胞型に適用する化合物のパネルでなく）に暴露される点で、上記の第三の態様とは異なる。
【００８９】
前記態様と同様に、この態様は、遺伝子トラップ幹細胞を使用して実施することができ、その幹細胞においてマーカーDNAは、挿入された遺伝子座が同定されなくとも遺伝子トラップ細胞が分化のマーカーとして働くように、特定の細胞型に幹細胞が部分的にまたは完全に分化することに関連した遺伝子座の活性化により発現するような遺伝子座にランダムに挿入される。
【００９０】
本発明はまた幹細胞分化を誘導する物質及び/または条件を同定し、次いで分化した細胞の特徴的集団の単離を容易にするために幹細胞の遺伝子を修飾することを含む；例えば、動物実験モデルにおける治療試験に使用するために、これをどうのように行うかの限定的でない例は、幹細胞に、単離する分化細胞に特異的に発現する遺伝子座に挿入される非免疫原細胞表面抗原をコードするマーカーDNAを導入することである。既知方法、例えば、相同的組換えを使用する方法、は目的の遺伝子座にマーカーDNAを指向させるために使用することができる。遺伝子変更された幹細胞が目的とする細胞型に分化すると、マーカー遺伝子が発現し、そして細胞は表面抗原で標識される。表面抗原のようなマーカータンパクの発現に基づく遺伝子修飾幹細胞の単離方法はGay（米国特許番号5,639,618）により記述されており、その内容を引用してここに取り入れた。本発明のこの態様の一つの態様において、単離マーカーは、細胞が目的の数種の特定の細胞型の前駆体に分化した時に、発現するように幹細胞に挿入される。追加の単離マーカーを、前駆細胞が特定の細胞型に最終的に分化した時に発現するように同じ細胞に挿入することができる。これにより前駆細胞または最終分化細胞型のいずれかを単離することができる。例えば、神経前駆細胞の単離ができるように、単離マーカーをネスチン遺伝子、神経前駆細胞のマーカー、の遺伝子座に挿入することができるであろう；そして神経前駆細胞からの分化誘導の後にこれらの細胞の単離を効率よく行えるように、追加の単離マーカーを神経細胞、グリア細胞、及びアストロサイト、に特異的に発現する遺伝子座に挿入することができる。
【００９１】
本発明はさらに、幹細胞分化を誘導する薬物及び/または条件を同定し、次いで幹細胞を遺伝子修飾して、動物に投与した後に遺伝子修飾した幹細胞に由来する分化細胞の検出を可能にするマーカー遺伝子を構成的に発現させることを含む。
【００９２】
したがって、本発明の態様は、マーカー遺伝子が目的の分化細胞を同定するために使用され、そして緑色蛍光タンパク（GFP）のような構成的に発現されるマーカーをこれらの細胞に導入できる、動物種の細胞を利用することである。これらの胚性細胞から生じる分化細胞は動物またはヒトモデルにおける細胞治療の有効性と安全性を試験する際に有用である。細胞型関連マーカーの発現は、実験者に目的の標的組織中に目的の細胞型が存在することを明示し、そして試験する細胞が投与された動物の宿主細胞の背景の中で投与した細胞を構成的に発現するマーカーにより識別する。
【００９３】
この態様は、上記に検討した技術にしたがってレポーター構築の特別なセットを含む幹細胞の特製パネルを特別に調製しそして分析することにより実施することができる。真核細胞においてレポーター遺伝子構築を作製し、分析するための方法及び材料は一般的に遺伝子トラップベクターと呼ばれており、当業者に既知であり、そして一度適当なベクターが同定された後は、目的の特定の幹細胞に対して調整することができる。例えば、米国特許5,922,601、その全体を引用してここに取り入れた、参照；またSalminen et al., 1998, Dev. Dyn. 212(2): 326-33及びStanford et al., 1998, Blood 92(12): 4622-31,それぞれその全体を引用して取り入れた、も参照。
【００９４】
特別設計のパネルの構成員は予め分析され、あるいは特別な細胞型または系統の代表となるように特別に設計することができる。特別な遺伝子トラップ系を予め選別し、予め分析する方法は当業者に既知である。Baker et al., 1997, Dev. Biol. 185(2); Thorey et al., 1998, Mol. Cell. Biol. 18(5): 3081-88;及びBonaldo et al., 1998, Exp. Cell Res. 244: 125-36,これらのそれぞれの全体をここに取り入れた、参照。そのほかに、ランダム挿入を持つ遺伝子トラップ幹細胞のパネルは累積することができ、所与の化合物または化合物の組み合わせに応答する挿入は、暴露及び同定の後に分析することができる。例えば、挿入の位置は隣接する内在性遺伝子物質のPCRの後分子クローニングにより、そして十分に確立されている技術を使用して挿入構築から外側へ配列分析することにより同定することができる。例えば、Gossler et al., 1989, Science 244(4903): 463-5,その全体をここに取り入れた、参照。
【００９５】
そのようなパネルを設計するのに使用することが特に望ましい多分化能細胞はCyno-1細胞系、カニクイサルの卵母細胞を単為生殖的に活性化して単離した多分化能霊長類幹細胞系、である。
【００９６】
既存のES細胞遺伝子トラップライブラリーを使用するスクリーニング
特定の細胞型に幹細胞の分化を誘導する薬物及び条件を決定する幹細胞スクリーニングにおいて、細胞が分化を誘導されたときに通常活性化し、そして挿入された遺伝子座の内在性プロモーターの転写調節を受けている遺伝子座にマーカー遺伝子が挿入されている幹細胞を含む遺伝子トラップ幹細胞ライブラリーを使用することは有用である。これにより、挿入された遺伝子座の内在性プロモーターと同一の調節信号（例えば、転写因子及びクロマチン構造を変える因子）によりマーカー遺伝子の発現が調節されることを確実にする。
【００９７】
完全に新規の遺伝子トラップライブラリーを調製する代わりとして、本発明の一態様は、既知でありそして当業者が入手可能なマウスES細胞遺伝子トップライブラリーのいずれかを使用する。例えば、Cecconi & Meyer, 2000, FEBS Letts 480: 63-71参照；Durick et al., 1999, Genome Res. 9(11): 1019-25も参照。例えば、ドイツ遺伝子トラップコンソーシアム（GGTC）はドイツにおいて遺伝子トラップ配列タグ（GTST）の参照ライブラリーの提供を確立した。Wiles et al., 2000, Nature Genetics 24(1),その全体を引用して取り入れた、参照。GTSTライブラリーの配列情報はGGTCのインターネットサイトで入手することができ、突然変異ES細胞は科学団体に申請することにより自由に入手することができる。そのほかの遺伝子トラップマウスES細胞のライブラリー、OmniBankTMと呼ばれる、はLexicon Genetics, Inc.(The Woodlands, TX)から入手することができ、それは20,000以上の配列タグ付き突然変異が特徴であると言われている。OmniBankTMデータベースはキーワードまたはヌクレオチドまたはタンパクの配列を使用してLexicon Genetics, Inc.のインターネットサイトを介して検索することができる。Zambrowicz & Friedrich, 1998, Int. J. Dev. Biol. 42(7): 1025-36; Zambrowicz et al., 1998, Nature 392: 609-11参照;米国特許6,080,576、6,207,371及び6,136,566も参照、それぞれその全体を引用してここに取り入れた。別のグループは5’RACE技術を使用して153細胞系から115配列の回収に成功したと報告した。Townley et al., 1997, Genome Res. 7: 293-298,その全体を引用して取り入れた。これらのマウスES細胞クローンの一部の配列情報はカリホルニア大学バークレー校Skarnes  Labのウエブサイトで入手できる。さらに、最近非常に多数の学術的マウスES細胞タグ付け研究の詳細が報告された。Chowdhury et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 1531-1536; Hicks et al., 1997, Nat. Genet. 16: 338-344; Couldrey et al., 1998, Dev. Dyn. 212: 284-292; 及びVoss et al., 1998, Dev. Dyn. 212: 171-180,これらのそれぞれの全体を引用してここに取り入れた。
【００９８】
遺伝子トラップES細胞は遺伝子分析のために多数の突然変異生物を作るために使用されてきた。遺伝子トラップES細胞からの遺伝子導入マウスの回収は分析されるトラップ遺伝子について可能であり、組織発現プロフィール、または細胞内発現特性に基づいて分離される。遺伝子発見及び発現プロフィールを総合したゲノム全体の遺伝子トラップ方法を薬物探索のための生体検定をする平行フォーマットに応用することができると予想する人もある。Durick et al., 1999,前出。他方では、インビトロ試験における遺伝子トラップクローンの使用は限られている。
【００９９】
Zambrowicz に対する米国特許6,080,576は、アポトーシスまたは造血細胞分化を誘導する分泌型分子のスクリーニングに遺伝子トラップES細胞の使用を示唆している。しかし、この方法は内在性遺伝子の過剰発現を生じる挿入を同定するように特化されており、幹細胞分化について多数の化合物を規則的にスクリーニングする方式を提供していない。同様に、Russと共同研究者は、遺伝子トラップ突然変異誘起を使用してアポトーシスをする造血細胞における因子廃除により誘導される遺伝子の同定を開示した。Russ et al., 1996, 遺伝子トラップ突然変異誘起及び位置指定組換えを使用してアポトーシスをする造血細胞における因子廃除により誘導される遺伝子の同定、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15279-84.しかし、この方法はプログラムされた細胞死の間に活性化する遺伝子を探すものであり、胚性または幹細胞の分化の間に活性化する遺伝子を探すものではない。
【０１００】
Era及び共同研究者は、インビトロ分化誘導システムにおいてES細胞による造血系統特異的遺伝子発現を分析するために、遺伝子トラップ法において使用したものに類似するLacZレポーター遺伝子を使用している。Era et al., 2000，Blood 95(3): 870-78。しかし、この方法は、関心の特別のプロモーターを分析し、分化誘導発現に必要なプロモーターのセクションを決定することに特化されている。特別な細胞系統の分化経路に関係する増殖因子またはそのほかの化合物をスクリーニングするためのプロモーターの使用についてはなんらの示唆もない。
【０１０１】
Bonaldo 及び共同研究者は、特異的な一つの増殖因子に応答した胚発生の間に発現する融合を同定するために、単離細胞系の遺伝子トラップ及び選別前分析を使用した。しかし、彼らは、これらの細胞の発生を指令する因子の組み合わせをスクリーニングするために、同定した細胞を使用していない。事実、スクリーニング操作に使用した低血清培地は約24時間の間の短時間スクリーニングにのみ適した。Bonaldo et al., 1998,前出。このように、Bonaldoらは発生早期胚における融合を含む細胞を予め選別し、予め分析する方法を提供したが、特定の細胞及び組織への分化を指令する因子のスクリーニングにそのような細胞を使用することは開示しなかった。
【０１０２】
同様に、Forrester 及び共同研究者は、胚形成の間にレチノイン酸に応答して特異的に発現する遺伝子を同定するために、遺伝子トラップ技術を使用した。Forrester et al., 1996,胚性幹細胞における誘導遺伝子トラップスクリーニング:インビトロでレチノイン酸に応答する遺伝子の同定、Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 1677-82。しかし、彼らは、やはり、特定の細胞及び組織への発生を指令する増殖因子組み合わせをスクリーニングするために、その細胞を使用しなかった。
【０１０３】
したがって、これは、幹細胞の指定された分化を仲介する化合物及び組み合わせを探索するために増殖因子、接着因子、細胞外マトリックス成分などをスクリーニングする道具として遺伝子トラップES細胞ライブラリーを使用することを提案する最初の開示であると、本発明者らは認識している。増殖因子の特別な組み合わせに対応すると同定されたES細胞は、インビボにおける時間的及び空間的遺伝子発現と本開示の方法において得られたインビトロデータと相関させるために、遺伝子導入胚または動物を作るために使用することができる。
【０１０４】
以上の説明により示されたように、全能性マウス及び非ヒト遺伝子トラップ幹細胞のライブラリーは既存の細胞系から作ることができ、あるいは新規のライブラリーは既知技術を使用して作ることができる。遺伝子トラップマーカーDNAがランダムに挿入されたならば、本発明のスクリーニング検定に使用するために、遺伝子トラップES細胞からクローニングされた発育または成熟動物を屠殺しそして組織学的に分析して、特定の細胞型において活性化するマーカーを含む遺伝子トラップ幹細胞系を同定することができる。
【０１０５】
そのほかに、遺伝子トラップマーカーDNAはESまたはEG細胞中に直接にまたは遺伝子修飾核ドナー細胞を使用して作製した核移植胚の遺伝子修飾ESまたはEG細胞から誘導することにより挿入することができる。例えば、全能性ヒト遺伝子トラップ幹細胞のライブラリーは遺伝子修飾核ドナー細胞を使用して作製した核移植胚の遺伝子修飾ヒトESまたはEG細胞のセットを誘導することにより作製することができる。この遺伝子トラップESまたはEG細胞を次いで増殖し、そして多様な型の分化細胞を含む胎児様体を作るために使用される。本発明のスクリーニング検定に使用するための特定細胞型において活性化するマーカーを含む遺伝子トラップ幹細胞系を同定するために組織学的分析を実施する。そのほかには、分化細胞の多様な型を含む奇形腫を作るために全能性細胞を動物に注入することができ、そして分化の有用なマーカーを含む遺伝子トラップ幹細胞系を同定するために組織学的分析を実施する。
【０１０６】
本発明は広範囲に応用される。例えば、分化を誘導及び指令する薬物及び条件を同定することに加えて、本出願のスクリーニング方法は細胞の生存を延長する薬物及び条件（生存因子）の同定、及び分裂誘発を促進する薬物及び条件（分裂促進因子）の同定を可能にする。例えば、細胞を候補生存因子及び/または分裂促進因子である種々の薬物及び条件のパネルに暴露しつつ1-14日間の間培養する、そして種々の処置の細胞生存及び/または細胞増殖に及ぼす影響について検定期間の間測定する。特定の細胞型の減少または死を少なくする薬物及び条件はこのような検定により検出することができる、そして生存因子とみなすことができる。同様に、検定の期間中に細胞増殖を増加させる薬物及び条件は分裂促進因子である。分化、生存及び分裂因子に関する情報の組み合わせは、医療上有用な細胞型の必要量を作るために有用な条件を同定しそして最適化するのに有用である。
【０１０７】
そのほかの態様において、本発明は、開示した方法を使用して同定した化合物及び組成物を含む組成物及び製剤、及び全能性、ほぼ全能性、及び多分化能幹細胞、及びそれらに由来する細胞から細胞及び組織を発生させるためにそれを使用すること、治療及び移植治療に使用するための細胞及び組織の単離、を包含する。特に、同定した因子の組み合わせは重合体マトリックス上の細胞の分化を誘導するために使用することができる、すなわち、米国特許番号6,214,369、6,197,575、及び6,123,727、それぞれの全体を引用してここに取り入れた、に開示されているように。
【０１０８】
開示した方法で同定した組み合わせは、種々の細胞型で構成される組織及び/または人工器官を設計しそして回収するために、細胞の種々の型の生産を誘導するためにも使用することができる。
【０１０９】
そのほかの態様、ここに開示した検定及び方法の変更及び修飾は本開示を読んだ当業者には想像できるであろう、そしてそれも本発明の部分として含まれるべきである。
【０１１０】
例1
支持細胞を存在させずに増殖しそして分化しない状態を維持するための全能性幹細胞の順化：
単為発生カニクイサル胚の内部細胞塊に由来するES様細胞、Cyno-1を最初D12胎児（株129）に由来する分裂不活化したマウス胚性繊維芽細胞上で培養した。
【０１１１】
培地は：
DMEM（高グルコース）（Gibco#11960-044）        425 ml
ウシ胎児血清（Hyclone）                         75 ml
MEM 非必須AA  ｘ  100（Gibco#11140-050）         5 ml
L-グルタミン                                     4 mM
2-メルカプトエタノール（Gibco#21985-023）        1.4 ml
【０１１２】
細胞を機械的に4から5日ごとに継代した。
【０１１３】
スクリーニング検定を改良するために支持細胞を存在させずに増殖するように細胞を順化させるために、細胞を非コートポリスチレン細胞培養プレート（Corning）中で機械的に継代した。
【０１１４】
最初の2日間、細胞を最初の培養（上記）から順化培地に換えて培養した。
【０１１５】
3日目に順化培地を交換した：
【０１１６】
ヒト上皮SFM基本増殖培地（Gibco#11111-044）  500 ml
【０１１７】
EGF-ヒト組換え（Gibco#10458-016）  10 μg
【０１１８】
bFGF (Gibco#13256-029)   10μg
【０１１９】
ヒト血漿フィブロネクチン（Gibco#33016-023） 1 mg
【０１２０】
コロニーは多分化能表現型（形態及びAP染色）を1週間は維持した。培養は未分化状態を維持して、支持繊維芽細胞なしで増殖を示した。このCyno-1FFと命名した新しい系は、小さな細胞質対核比、明瞭な核小体を持つ未分化のES様細胞の形態を示し、アルカリホスファターゼ陽性であった（図1）。
【０１２１】
例2
霊長類ES様細胞を使用するスクリーニング及び顕微鏡及びRT-PCRによる分析
単為発生サル胚から得たES様幹細胞（Cyno-1FF細胞系、例1参照）の約105個をマウス胚性繊維芽細胞-順化培地の存在下に2枚の24ウエルプレートに2日間プレートした。次いで、培地を吸引し、15％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、5ｘ10-5Mβ-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地に交換した。次いで、細胞の分化を指令するために、細胞を増殖因子またはサイトカインの存在下に培養した。サイトカインの作業用保存溶液を0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）添加リン酸緩衝食塩液（PBS）中に調製した。希釈したサイトカインを0日目に適用した。各ウエルに作業用保存溶液から7.5μlの希釈因子を加え、下記の最終濃度にした：
VEGF-A(165 kDa)(R&D Biosystem cat#293VE)を20 ng/mLで使用した。
LAP(R&D #246-LP)  50 ng/mL
Flt-3/Flk-2 リガンド（R&D #308-FK）  5 ng/mL
TGFベータ-1（R&D #240-B）  0.1  ng/mL
IGF-1（R&D #291-G1）  10 ng/mL
PIGF（R&D #264-PG）  20 ng/mL
Tie-1/Fcキメラ（R&D #619-TI）  100 ng/mL
BMP-2（R&D #355-BM）  500 ng/mL
BMP-4（R&D #314-BP）  250 ng/mL
BMP-5（R&D #615-BM）  2  μg/mL
FGF-17 (R&D #319-FG)  50 ng/mL
TGF-アルファ（R&D #239-A）  0.5 ng/mL
フィブロネクチン（ヒト120キモトリプシンフラグメント、Gibco#12159-018）  50 ng/mL
メロシン（Gibco#12162-012）  50 ng/mL
テナシン（Gibco#12175-014）  50 ng/mL
IL-1-アルファ（R&D #200-LA）  10pg/mL
FGF-4（R&D #235-F4）      0.25 ng/mL
SCF（R&D #255-SC）        10 ng/mL
bFGF (R&D #233-FB)        1.0 ng/mL
PDGF (R&D #120-HD)        5.0 ng/mL
PECAM-1 (R&D #ADP6)        1.0μg/mL
抗-FGF-4抗体（R&D #AF235）  0.5μg/mL
抗-Cripto-1抗体（R&D #AF145）  0.5μg/mL
及び対照は同容量の0.1％BSA/PBS
【０１２２】
ウエルをECM成分でコートするために、PBSに10μg/mLの濃度にECM成分を溶解した溶液をコートするウエルに加え、少なくとも1時間インキュベートし、次いで吸引により除去した。
【０１２３】
プレートを37℃で空気中の酸素と5％ CO2 中において、一つは3日間、一つは10日間培養した。図2の表1に2枚の24ウエルプレートの各ウエルに加えた因子を示す。一つのプレートは3日目に回収し、もう一つのプレートは10日目に回収した。以下に検討するように、位相差顕微鏡及びRT-PCRによる分析は多数の特徴的分化細胞型を示した。
【０１２４】
位相差顕微鏡による細胞形態の分析
Flt-3リガンドに暴露した後、Cyno-1FF  ES様細胞は血管内皮細胞（中胚葉分化由来）に見える細胞に分化した。血管内皮細胞の外観を示す細胞はFlt-3リガンドを加えたウエルに5日で観察され、そして11日目により明瞭になった。図3はFlt-3リガンドに暴露した霊長類Cyno-1FF細胞の写真である。
【０１２５】
TGFベータ-1への暴露はCyno-1FF細胞を中胚葉性で神経幹細胞に見える形態を持つものに誘導した。図4は、TGFベータ-1の存在下にCyno-1FF細胞を培養して得られたネスチン陽性神経幹細胞の形態を持つ中胚葉及び細胞を示す。
【０１２６】
細胞外マトリックスタンパクテナシンの存在下に培養されたCyno-1FF細胞は内胚葉前駆細胞の外観を持つ特徴的細胞集団の形成を誘導した。テナシンの存在下の細胞の外観は対照ウエルの細胞の外観と著しく異なっていた。この結果は、この特別な細胞外マトリックス成分の種々の濃度及び/またはその除去または不活化は全能性及び多分化能の幹細胞の分化を指令するために使用できることを示している。図5は、細胞外マトリックス成分テナシンの存在下にCyno-1FF細胞を培養して得られた内胚葉前駆細胞の外観を持つ細胞を示す。
【０１２７】
検定プレートのほかのウエル中で他の候補分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞は分化が誘導され特徴的形態を持ちそして細胞型関連遺伝子を発現した。例えば、図6は、Tie-1受容体/Fcキメラの存在下に培養した細胞の外観を示す。BMP-2 の存在下に培養し、結合組織繊維芽様細胞の形態及び外観を有する細胞を図7に示す。
【０１２８】
細胞型関連遺伝子発現のRT-PCR分析
図2に示した候補分化誘導薬物のパネルに暴露されたCyno-1FFによる細胞型関連遺伝子の発現を以下の標準的プロトコールを使用してRT-PCRにより分析した。
(a)RNAはキット：Ultraspec-II RNA, Item No. BL-12050（Bioflex Labs, Inc）及びプロトコールを使用して細胞から回収した。
(b)単離したRNAを列挙されたプライマー及びキット：Enhanced Avian RT First Strand Synthesis kit, Item No. STR-1 (Sigma-Aldrich, Inc)を使用して増幅した。
(c)増幅したRNAを細胞から回収し、-70℃でエタノール中保存した。
(d)逆転写反応：
-  RNAを30μlに再懸濁し、以下の試薬を加えた：
2μl  dNTP 混合物
2μl  ランダムノナマー
-  混合物を80℃に12分間加熱し、次いで氷浴に5分間移す
-  以下の試薬を加える：
4μl  10ｘRT緩衝液
1μl  RNアーゼ阻害薬
2μl  逆転写酵素
-  次いで反応を以下の条件で加熱サイクルにかける：
24℃‐15分
42℃‐50分
95℃‐30秒
4℃  -維持
-  次いで混合物を3μl/検体に分割し、-70℃で使用するまで保存した。
(e)ポリメラーゼ連鎖反応：
-  各検体に以下の試薬を加えた：
2μl  プライマー対混合物（50 pmol/μl）
5μl  MgCl2
PCR反応混合物（各検体ごとに）
5μl  10ｘ緩衝液（Mg除去）
4μl  dNTP混合物（10 mM）
0.5μl Taq(Sigma)
0.055μl HotStart Taq (Qiagen)
30.5μl H2O
-  以下の条件を使用して反応を35サイクルの加熱サイクルにかける：
94℃‐2分
94℃‐30秒
45℃‐1分
72℃‐2分
72℃‐10分
4℃‐維持
【０１２９】
RT-PCRにより細胞型関連遺伝子の発現を検出するために使用されるプライマー及び産物の予期されるサイズを図8の表2に示す。PCR産物はポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロミド染色、そしてUV光線照射により可視化される。バンドを予想サイズにより同定し、相対強度はGAPDH強度と比較して測定した。
【０１３０】
ウエル内で内胚葉、中胚葉及び外胚葉の経路に特異的に分化したことを示すRT-PCRによる検出結果の例を図9に示す。
【０１３１】
図9は、Cyno-1FF細胞が種々の分化誘導薬物により分化を誘導され、異なる、しかし時には重複する細胞型関連遺伝子を発現することを示す。例えば、VEGF-Aに暴露された細胞はChAT,ケラチン-19、及びネスチンを発現し、テナシンに暴露された細胞はChAT,ネスチン、及びGATA-4 を発現した。最も強くChAT（コリンアセチルトランスフェラーゼ）の誘導及びしたがって神経性分化が認められたのは、細胞外マトリックス成分テナシンが存在するウエル10-14、及びBMP-5が存在するウエル10-15であった。ChATはTGF-ベータ-1、IGF-1,  FGF-4，bFGF,テナシン、及び抗-Cripto-1抗体によっても誘導された。観察された最も良い内皮/造血条件はFlt-3リガンドの存在下であった。これは図3に示した位相差顕微鏡により観察された内皮形態と良く相関した。興味あることは、内皮分化誘導が観察された最も良い条件は細胞外マトリックス成分テナシンの存在下でもあった。
【０１３２】
上記のように分化誘導薬物を含むウエル中で培養された細胞で得られた結果とは反対に、候補分化誘導薬物を加えない培地で培養された対照Cyno-1FF細胞による細胞型関連遺伝子の発現はRT-PCR検定により何も検出されなかった。この結果は、上記検定が真実の分化誘導効果を検出していることの証拠である。
【０１３３】
例3
霊長類ES様細胞を使用するスクリーニング及び免疫細胞化学による分析
例2に従って調製された24ウエルプレートの一つにおいて候補分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞における細胞型関連遺伝子の発現の産物の存在を免疫細胞化学（ICC）により検出した。
免疫細胞化学用の溶液：
固定液：4％パラホルムアルデヒド
透過性増進溶液：DPBS＋1％ TritonX-100
ブロッキング溶液：DPBS＋150 mMグリシン＋3 mg/ml BSA
リンス溶液：DPBS＋0.1% TritonX-100
抗体希釈液：DPBS＋0.1% TritonX-100＋3 mg/ml BSA
免疫細胞化学用の一般的プロトコール：
-  DPBS（細胞が分離しないようにCa/Mgを含む）で3X  細胞をリンスする。
-  4％パラアルデヒドを加えて、室温で20-30分間インキュベートする。
-  固定液をパスツールピペットで除去し、PBSで3X洗う。この時点で、パラフィルムで包めば細胞を4℃で長期間保存することができる。
-  ブロッキング溶液を加えて室温で少なくとも1時間インキュベートする（これは終夜に延長することができる）。
-  ブロッキング溶液を除去し、一次抗体（希釈．．．一般的に1:10から1:100の希釈で十分機能）と置換する。
-  室温で少なくとも1時間インキュベートする。
-  一次抗体を除去して、PBSで45分間3X洗う。
-  二次抗体を加える（希釈．．．一般的に1:50から１:500の希釈で十分機能）。
-  PBSで45分間3Xリンスする。5μg/ml  Hoechst またはDAPIを最初のリンスに加える。
-  検体は画像解析の用意ができた。
【０１３４】
使用した抗体：
GATA-4: Item #sc-1237 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)
ヤギIgG  1:75の希釈で使用
【０１３５】
ネスチン：Item #611659 (BD Transduction Laboratories, Inc.)
マウスIgG1  1:75の希釈で使用
【０１３６】
デスミン：Item #D-1033 (Sigma-Aldrich, Inc.)
マウスIgG1  1:20に希釈して使用
【０１３７】
ヤギ抗-マウスIgG-FITCコンジュゲート：Item #F-0257 (Sigma-Aldrich, Inc)
1:50 の希釈で使用
【０１３８】
マウス抗-ヤギIgG-FITCコンジュゲート：Item #sc-2356 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)
1:50の希釈で使用
【０１３９】
ICC検定により三胚葉のそれぞれに関連する遺伝子発現産物を検出することができた。図10は、デスミン、中胚葉のマーカー、のICCによる検出を示し、そして図11は、分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞において主として外胚葉のマーカー、しかし時には内胚葉のマーカーとなる、ネスチンの検出を示す。内胚葉のマーカー、GATA-4の発現は分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞においてICCによっても検出される（結果は示さず）。
【０１４０】
例4
霊長類ES細胞を使用する物理的条件による分化の誘導のスクリーニング
Cyno-1FF  ES様細胞を例2に記述したように24ウエルプレートのウエルに接種し、低酸素分圧（5％）でインキュベートした。対照プレートは大気酸素中でインキュベートした。細胞形態の分析から、低酸素分圧（5％）でインキュベートした細胞は分化して、大気酸素中でインキュベートした対照細胞とは異なる形態となった。この例は、幹細胞を目的とする細胞型に分化を誘導する条件または因子を同定するために、化学的因子と同様に種々の物理的因子をスクリーニングすることの重要性を示している。
【０１４１】
例5
マウスES細胞の心筋細胞への分化を誘導する薬物のスクリーニング
約20,000個のマウスES細胞（J1 株）を、支持細胞またはLIFなしで、24 ウエル組織培養プレート上で15％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、5ｘ10-5 M2-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地1.5 mL中に接種した。細胞を、例2に記述したのと同じ因子の存在下及び同じ方法でインキュベートし、分化させた。分化の10日後、心筋分化の証拠として周期的収縮をする細胞を検出するために、細胞の形態を位相差顕微鏡で調べた。一つのウエルのみ、IL-1-アルファを含む＃16ウエル、周期的に収縮する心筋細胞を含んでいた。興味あることに、これらの細胞は潜在的内皮細胞を伴って増殖していることが、矛盾なく認められた。図12A及び12Bはウエル＃16の細胞の位相差顕微鏡写真である。左図（図12A）の矢印の先端は拍動する心筋細胞を指している。右図（図12B）の矢印の先端は心筋細胞に隣接する内皮細胞誘導体を指している。
【０１４２】
例6
マウスES細胞の分化を誘導する薬物のスクリーニング：ICCによる検出
約5,000個のマウスES細胞（J1株）を24ウエル組織培養プレート上でLIFなしで15％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、5ｘ10-5 M2-メルカプトエタノール、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地1.5 mL中に接種した。細胞を、FGF-4及び/またはTGF-ベータ-1（例2と同じ濃度）の存在下に、誘導物質繊維芽細胞の存在下または非存在下に、あるいはタイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブロネクチンの存在下または非存在下に（ウエルは10μg/mLのECMタンパクと1時間インキュベートすることによりプレコートし、ついで除去して、PBSでリンスした）分化させた。各ウエル中の候補分化誘導薬物の組み合わせは図13の表3に示す。
【０１４３】
細胞を5日間候補分化誘導薬物の存在下にインキュベートした後、ICCにより細胞型関連遺伝子の発現についてウエル中の細胞を検定した。デスミン、ネスチン、及びGATA-4に対する一次抗体を細胞に適用し、そして上記例3に記述したように蛍光顕微鏡により可視化した。図14はタイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブリノーゲン上で5日間TGF-ベータ-1及びFGF4と培養したマウスES細胞における、デスミン、中胚葉細胞系統のマーカー、に結合した抗デスミン抗体の免疫蛍光を示す。
【０１４４】
分化が誘導されたウエル中のマウスES細胞によるGATA-4及びネスチンのような細胞型関連遺伝子の発現は、例2に記述されているようにRT-PCR検定によっても検出された（データは示さず）。
【０１４５】
例7
遺伝子トラップマウスES細胞系を使用するスクリーニング；X-gal染色及びICCによる検出
マウス遺伝子トラップES細胞系K18E2及びM7H7それぞれは、細胞が分化した時に活性化される遺伝子座にマーカー遺伝子として挿入されたベータ-ガラクトシダーゼをコードするDNAを有している。ベータ-ガラクトシダーゼをコードするDNAは、それが挿入された遺伝子座が活性化されたときにそれが発現しそしてベータ-ガラクトシダーゼが作られるような部位に正しい方向を持ってインフレームに挿入されている。したがって、ベータ-ガラクトシダーゼをコードする配列はK18E2及びM7H7  ES細胞の分化を検出することができるマーカーとして機能する。ベータ-ガラクトシダーゼマーカーDNAがK18E2及びM7H7  ES細胞の異なる遺伝子座に挿入され、そしてこのマーカー遺伝子の活性化を生じる条件のセットはこの二つの細胞系に対するものとは同じでない。K18E2  ES細胞系におけるベータ-ガラクトシダーゼマーカーは多数の早期分化細胞系統に発現する；M7H7細胞におけるベータ-ガラクトシダーゼマーカーは早期中胚葉に発現し、内皮及び造血経路に保持される。
【０１４６】
マウス遺伝子トラップ細胞系K18E2の細胞を上記例6の記述のように処理し、次いでマーカーベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を検出するためにX-galで染色した。X-gal染色は広く当業者に熟知されている。要するに、細胞を0.1 Mリン酸緩衝液で1度洗い、0.1 Mリン酸緩衝液中25％グルタルアルデヒドで室温において固定し、リン酸緩衝液で5回洗い、そして37℃で終夜X-gal染色を行う。緩衝液のpHは使用する細胞により7.0−8.0の範囲である。
【０１４７】
図15は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブリノーゲン上で5日間TGF-ベータ-1及びFGF-4と培養したK18E2  ES細胞のX-gal染色の検出を示す。K18E2  ES細胞由来の細胞においてベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現が検出されたことは、この細胞が分化誘導されたことを示す。
【０１４８】
分化誘導薬物の存在下に培養したK18E2及びM7H7  ES細胞におけるベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現はICCによっても検出される。図16は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブリノーゲン上で5日間TGF-ベータ-1及びFGF-4の存在下に培養したM7H7  ES細胞における（ベータ-ガラクトシダーゼに対する抗体を使用する）ICCによるベータ-ガラクトシダーゼの検出を示す。細胞核はDAPI染色により同時に視覚化されている。図17は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブリノーゲン上で5日間FGF-4の存在下に培養したK18E2  ES細胞におけるICCによるベータ-ガラクトシダーゼの検出を示す。
【０１４９】
発現を検出するためにRT-PCRを使用して、マウス遺伝子トラップES細胞においてベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子が、他の細胞によりその細胞が分化を誘導されたときに活性化することが示された（データは示さず）。
【０１５０】
例8
細胞間相互作用による分化の誘導のスクリーニング：
マウス遺伝子トラップK18E2及びM7H7  ES細胞を24ウエル組織培養プレートのウエルに接種し（5,000から20,000細胞/ウエル）、そして一部のウエルでは繊維芽細胞間充織誘導細胞層上に接種したこと以外は一般的に上記例6に記述したように、FGF-4及びTGF-ベータ-1の存在下に分化させた。5日間のインキュベーション後、細胞を全て誘導細胞のないFGF-4及びTGF-ベータ-1を含むウエルに移し、さらに5日間培養した。この処理の後、ベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の発現を、例3に記述したICCプロトコールにより検出した。図18-21の画像は、モノクロナール抗-β-ガラクトシダーゼ（G-6282 Sigma-Aldrich, Inc.）一次抗体及び抗-マウスIgM  FITCコンジュゲート（F9259   Sigma-Aldrich, Inc.）二次抗体を使用して標識されている。
【０１５１】
結果：
図18は、5日間誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と培養し、次いでさらに5日間 FGF-4及びTGF-β1のみで再培養したK18E2細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。図19は、5日間誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と培養し、次いでさらに5日間 FGF-4及びTGF-β1のみで再培養したM7H7細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。図20は、5日間誘導繊維芽細胞なしでFGF-4及びTGF-β1と培養し、次いでさらに5日間同条件で再培養したK18E2細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。図21は、5日間誘導繊維芽細胞なしでFGF-4及びTGF-β1と培養し、次いでさらに5日間同条件で再培養したM7H7細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。
【０１５２】
ベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と培養した遺伝子トラップ幹細胞の両系により、そしてFGF-4及びTGF-β1のみで培養した同じ幹細胞により発現された。しかし、ベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と培養したM7H7細胞によるほうがFGF-4及びTGF-β1のみで培養したM7H7細胞によるよりも強く発現した。M7H7のベータ-ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、細胞が中胚葉系統の細胞に分化が誘導されたときに活性化されるので、幹細胞を造血細胞に分化を誘導する条件を同定するのに有用である。この例は、幹細胞と、幹細胞を中胚葉系統の、例えば造血細胞を作るための、細胞に分化を誘導する作用をする、誘導繊維芽細胞の間の細胞間相互作用を同定するために本発明を使用することを示したものである。
【０１５３】
例9
多分節マーカーを使用する分化の指令
この例は、どのように多分節マーカーを分化細胞型の同定に使用できるかを示す。
【０１５４】
細胞系Aは、細胞がそれぞれ心臓、肺及び腎臓に分化を指令する3種の異なる条件のセットに暴露されたときに発現する遺伝子トラップマーカーを持つ全能性遺伝子トラップ幹細胞系である。
【０１５５】
細胞系Bは、細胞がそれぞれ目、肺及び脳に分化を指令する3種の異なる条件のセットに暴露されたときに発現する遺伝子トラップマーカーを持つ全能性遺伝子トラップ幹細胞系である。
2005500847.tif 000002
【０１５６】
両細胞系においてマーカーを活性化する条件のセットを同定するためにスクリーニングを実施する；この条件のセットは肺への分化を指令することが期待される。
【０１５７】
例10
卵におけるスクリーニング：
トリの卵の行列を分化のスクリーニングを実施するコンパートメントのセットとして使用する。102から105個の全能性、ほぼ全能性、または多分化能の幹細胞；例えば、マウスまたは霊長類ES細胞、を各卵に導入する。次いで、一つまたはそれ以上の候補分化誘導薬物；例えば、増殖因子、サイトカイン、ECM成分、及び/または誘導細胞、を種々の組み合わせ及び時系列で各卵の中の細胞に加える。その卵をインキュベートし、細胞中の細胞型関連遺伝子の活性化をRT-PCRにより検出する。
【０１５８】
この検定は、幹細胞が特定の細胞型に分化した時に活性化される遺伝子トラップマーカーを持つ遺伝子トラップES細胞を使用して実施することができる。そのような細胞を使用することにより二つのタイプのスクリーニングを実施することが可能である。一つは、各卵が同じ型の遺伝子トラップ幹細胞及び異なる候補分化誘導薬物の組み合わせを含む卵の行列を作る。もう一つは、細胞が分化を誘導されたときに活性化される異なる遺伝子トラップマーカーを持つ幹細胞、及び候補分化誘導薬物の同一の組み合わせを含む卵の行列を作る。最初の検定は特定の細胞型へ分化を指令する薬物または条件を同定するスクリーニングである。第二の検定は候補分化誘導薬物の特定のセットにより活性化される細胞型関連マーカーを同定する。
【０１５９】
例11
部位特異的組換えにより導入された系統トレーサーを使用するスクリーニング：
求める特定の細胞型に分化する分岐経路にある段階または「分節」において一過性にのみ活性化される遺伝子座の活性化を効率よく検出するために、幹細胞のゲノム中に二つのコード配列を挿入することにより遺伝子トラップ幹細胞を作ることができる：
(i) 挿入された遺伝子座が活性化されたときにそれが発現しそして組換え酵素が作られるような部位に正しい方向を持ってインフレームに遺伝子座に挿入されている組換え酵素をコードする配列；及び
(ii)破壊されていないマーカー遺伝子を作るために組換え酵素により切り出される隣接組換え酵素部位を持つヌクレオチド配列により破壊されているマーカータンパクをコードする配列。この配列は構成的に活性である遺伝子座に、または組換え酵素DNAと同じ遺伝子座に挿入することができる。
【０１６０】
組換え酵素DNAが挿入された遺伝子座が活性化されたときには、組換え酵素が合成されそしてマーカーDNA配列から破壊配列の切り出しが触媒され、分化細胞においてマーカーの検出をすることができる。マーカーDNAの転写が構成的に活性であるプロモーターの調節下にある場合には、マーカーは、組換え酵素DNAが挿入されている遺伝子座が一過性に活性化される座であり次いで不活性になる場合であっても検出することができる。（Zinyk et al., Curr. Biol. (1998) 8: 665- 668; Dymecki et al., Dev. Biol. (1998) 201: 57-65,それぞれその全体を引用して取り入れた、参照）。例えば、λインテグラーゼファミリーのような組換え酵素システムはこの方法を実施するために使用することができる。cre-loxP及びFLO-FRTシステムは、発生のある点を通過した細胞のゲノム中に永続的マーカーとして機能する標的配列の活性化または不活化をすることができる。動物発生の予定運命図にこのシステムを使用することは当業者は熟知している；しかし、組換え酵素仲介細胞運命マーキングを幹細胞分化のインビトロスクリーニングに使用することはこれまで記述されていない。現在の予定運命図技術は二つの成分を利用する：1）遺伝子特異的に組換え酵素（CreまたはFLP）を発現する組換え酵素動物、及び2）例えば、分化の段階に関係なくその細胞に由来する全ての細胞にβ-galが発現するような、永続的な様式で組換え酵素の存在下に活性化される導入遺伝子を持つ指標動物。この組換え酵素は上記のように遺伝子トラップベクターでES細胞に導入することができ、そして組換えES細胞を、多数の遺伝子トラップ組み換え酵素遺伝子を包含する配偶子のランダムな詰め合わせを提供する組換えマウスの集合を作るために使用することができる。次いで、これらの配偶子（精子または卵）は、発生樹の所与の点を経過したことを示す永続的マーカーを残す胚、胎児様体、または幹細胞を作るために指標動物の相手配偶子とともに使用することができる。そのような系統トレース幹細胞は、目的の遺伝子が一過性にのみ発現し検出するのが困難である場合に特別な有用性がある。そのような組換え酵素に基づくマーカーがランダムに挿入された幹細胞ライブラリーを作ることができ、そして細胞型関連遺伝子トラップマーカーを同定するためにスクリーニングされる。そのほかに、その組換え酵素に基づくマーカーが特定の遺伝子座を標的にしている幹細胞ライブラリーは、幹細胞が細胞型関連遺伝子を発現し、そして特定の細胞型に分化するように誘導する条件を決定するための本発明のスクリーニング検定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】図１Aは、支持繊維芽細胞なしで組織培養皿上において増殖するよう順化した霊長類Cyno-1FF ES様細胞を示す写真である（10×）。
【図１Ｂ】図１Bは、典型的ES様細胞の形態を示すCyno-1FF細胞を強拡大で示す（40×）。
【図２】図2：表1は、例2の二枚の24ウエルプレートの各ウエルに加えた因子を示す。
【図３】図3はFlt-3リガンドに暴露したCyno-1FF細胞を示す写真である。
【図４】図4は、TGFベータ-1の存在下にCyno-1FF細胞を培養することにより得られたネスチン陽性神経幹細胞の形態を持つ中胚葉及び細胞を示す。
【図５】図5は、細胞外マトリックスタンパクテナシンの存在下にCyno-1FFを培養して得られた外胚葉前駆細胞の概観を持つ細胞を示す。
【図６】図6は、Tie-1の受容体及び免疫グロブリンFc領域から作製したキメラタンパクに暴露したCyno-１FFを示す。
【図７】図7は、BMP-2の存在下にCyno-1FF細胞を培養することにより作製した繊維芽細胞様結合組織細胞を示す。
【図８】図8：表2にRT-PCRにより細胞型関連遺伝子の発現を検出するために使用されるプライマー、及びRT-PCR反応により作製されるDNAの予想サイズを示す。
【図９】図9は、それぞれ異なる誘導薬物を含む4つの異なるウエルの細胞のRT-PCR分析結果の例を示す（例2参照）。図は、RT-PCRにより作られたDNA分子が分離され、エチジュームブロミド染色され、そしてUV光線で照射された電気泳動ゲルのレーンの写真を示す。
【図１０】図10は、分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞中のデスミンのICCによる検出を示す（例3参照）。
【図１１】図11は、分化誘導薬物に暴露されたCyno-1FF細胞中のネスチンのICCによる検出を示す（例3参照）。
【図１２Ａ】図12A及び12Bは、IL-1-アルファに暴露された例5のウエル＃16の細胞の位相差顕微鏡写真である。図12A（左）：矢印の先端は拍動する心筋細胞を指す。
【図１２Ｂ】図12B（右）：矢印の先端は心筋細胞に隣接する上皮細胞を指す。
【図１３】図13：表3は、例6に記述したようにマウスES細胞を培養した24ウエルプレートのウエルに加えた候補分化誘導薬の組み合わせを示す。
【図１４】図14は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブロネクチン上でTGF-ベータ-1及びFGF-4と5日間培養したマウスES細胞中のデスミンのICCによる検出を示す（例６参照）。
【図１５】図15は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブロネクチン上でTGF-ベータ-1及びFGF-4の存在下に5日間培養したマウス遺伝子トラップES細胞系K18E2の細胞のX-gal染色の検出を示す（例7参照）。遺伝子トラップES細胞におけるマーカーベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の検出は、細胞が分化誘導されたことを示す。
【図１６】図16は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブロネクチン上でTGF-ベータ-1及びFGF-4の存在下に5日間培養したマウス遺伝子トラップES細胞系M7H7の細胞におけるベータ-ガラクトシダーゼのICC（ベータ-ガラクトシダーゼに対する抗体を使用した）検出を示す。核もDAPI染色により可視化されている。
【図１７】図17は、タイプIコラーゲン及びヒト血漿フィブロネクチン上でFGF-4の存在下に5日間培養したマウス遺伝子トラップES細胞系K18E2の細胞中のベータ-ガラクトシダーゼのICCによる検出を示す。
【図１８】図18は、誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と5日間培養し、次いでFGF-4及びTGF-β1のみとさらに５日間再培養したK18E2細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。
【図１９】図19は、誘導繊維芽細胞上でFGF-4及びTGF-β1と5日間培養し、次いでFGF-4及びTGF-β1のみとさらに５日間再培養したM7H7細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。
【図２０】図20は、誘導繊維芽細胞がない状態でFGF-4及びTGF-β1と5日間培養し、次いで同じ条件でさらに5日間再培養したK18E2細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。
【図２１】図21は、誘導繊維芽細胞がない状態でFGF-4及びTGF-β1と5日間培養し、次いで同じ条件でさらに5日間再培養したM7H7細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの存在を示す。
【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005500847.tif 000109