(57)【要約】本発明は、腸トレフォイルペプチドの局所または全身投与により気道上皮の病変を治療する方法を特徴とする。腸トレフォイルペプチドは単独で、または1つもしくは複数の治療剤と共に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に、治療有効量のトレフォイルペプチド、または生物学的に活性なその断片を含む組成物を投与する過程を含む、哺乳動物において呼吸上皮の病変を治療するための方法。
【請求項２】
トレフォイルペプチドが、腸トレフォイル因子(ITF)、鎮痙性ポリペプチド、またはpS2である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
生物学的に活性な断片が、ITF15-73、ITF21-73、ITF1-72、ITF15-72、またはITF21-72である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
病変がアレルギー反応の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
病変が、喘息の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
病変が、細菌、ウイルス、または真菌感染の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
病変が、化学物質、粒状物質、または煙を吸入した結果である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
病変が火傷の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
病変が、薬物に誘発された肺損傷、または抗腫瘍療法の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
病変が、外傷の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
外傷が、外科的処置または挿管の結果である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
病変が、慢性閉塞性肺疾患または喘息の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
病変が、高圧酸素療法の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
投与が吸入による、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、定量吸入器、または乾燥粉末吸入器を用いて投与される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、エアロゾルまたは乾燥粉末である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、または電子噴霧器において噴霧される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
組成物がさらに、第2の治療剤を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
トレフォイルペプチドおよび第2の治療剤が同じ製剤中で投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
トレフォイルペプチドおよび第2の治療剤が、異なる投与経路により投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
トレフォイルペプチドおよび第2の治療剤が、互いに24時間以内に投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
第2の治療剤がトブラマイシンである、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
第2の治療剤が、抗炎症剤、抗菌剤、抗ヒスタミン剤、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、充血除去剤、コリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、またはβ-アドレナリン気管支拡張剤である、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
抗炎症剤がグルココルチコイドである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
グルココルチコイドがベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニド、トリアムシノロン、プレドニソロン、デキサメタゾン、またフルチカゾンである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
抗炎症剤が、非ステロイド抗炎症剤である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
非ステロイド抗炎症剤が、イブプロフェン、タクロリムス、クロモリン、ネドクロミル、レフェコキシブ、またはセレコキシブである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
β-アドレナリン受容体アゴニストが、アルブテロール、ビトルテロール、エピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、ラセピネフリン、サルメテロール、またはテルブタリンである、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
抗菌剤が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、またはトブラマイシンである、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
抗ヒスタミン剤が、ジフェンヒドラミン、フェキソフェナジン、セチリジン、またはロラタジンである、請求項24記載の方法。
【請求項３２】
コリン受容体アンタゴニストが、臭化イプラトロピウムまたは臭化チオトロピウムである、請求項24記載の方法。
【請求項３３】
トレフォイルペプチドの生物学的に活性な断片が、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9の配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離核酸分子によりコードされる、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
トレフォイルペプチド、または生物学的に活性なその断片、および薬学的に許容される担体を含む、吸入投与に適した薬学的組成物。
【請求項３５】
トレフォイルペプチドが、腸トレフォイル因子(ITF)、鎮痙性ポリペプチド、またはpS2である、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
生物学的に活性な断片が、ITF15-73、ITF21-73、ITF1-72、ITF15-72、またはITF21-72である、請求項34記載の組成物。
【請求項３７】
組成物が、エアロゾルまたは乾燥粉末である、請求項34記載の組成物。
【請求項３８】
組成物がさらに、第2の治療剤を含む、請求項34記載の組成物。
【請求項３９】
第2の治療剤がトブラマイシンである、請求項38記載の組成物。
【請求項４０】
第2の治療剤が、抗炎症剤、抗菌剤、抗ヒスタミン剤、コリン受容体アンタゴニスト、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、充血除去剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、またはβ-アドレナリン受容体アゴニストである、請求項38記載の組成物。
【請求項４１】
抗炎症剤がグルココルチコイドである、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
グルココルチコイドがベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニド、トリアムシノロン、プレドニソロン、デキサメタゾン、またフルチカゾンである、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
抗炎症剤が、非ステロイド抗炎症剤である、請求項40記載の組成物。
【請求項４４】
非ステロイド抗炎症剤が、イブプロフェン、タクロリムス、クロモリン、ネドクロミル、レフェコキシブ、またはセレコキシブである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
β-アドレナリン受容体アゴニストが、アルブテロール、ビトルテロール、エピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、プルブテロール、プロカテロール、ラセピネフリン、サルメテロール、またはテルブタリンである、請求項40記載の組成物。
【請求項４６】
抗菌剤が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、またはトブラマイシンである、請求項40記載の組成物。
【請求項４７】
抗ヒスタミン剤が、ジフェンヒドラミン、フェキソフェナジン、セチリジン、またはロラタジンである、請求項40記載の組成物。
【請求項４８】
コリン受容体アンタゴニストが、臭化イプラトロピウムまたは臭化チオトロピウムである、請求項40記載の組成物。
【請求項４９】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9の配列とハイブリダイズする単離核酸配列によりコードされる、トレフォイルペプチドまたはその生物学的に活性な断片を含む、吸入投与に適した組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、例えば、ウイルス、細菌および真菌感染、炎症、アレルゲン、吸入した有機溶媒、微粒子、または刺激性ガスに起因する気道上皮の病変を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
外鼻孔から喉頭までの病変を含む上気道病変は、様々な局所刺激物、アレルゲンおよび感染物質により引き起こされる。典型的には、これらの刺激物は鼻炎または「鼻水」の症状を引き起こす。しかしながら、重篤な病変の場合、気道上皮粘膜の密着結合が崩壊し、アレルゲンまたは感染物質の侵入が容易になる。
【０００３】
気管支病変（呼吸細気管支のレベルまでの気管および誘導気管支）もまた通常、呼吸器感染物質、刺激物およびアレルゲンにより引き起こされる。気管支上皮および密着結合が破壊されると直ちに、感染物質、刺激物質またはアレルギー物質により肺が感作され、メディエイターの放出が引き起こされ、続いて気道狭窄および喘息が起こる。
【０００４】
呼吸細気管支より末梢の肺胞上皮は一般に、感染、刺激およびアレルギー曝露に対してうまく保護されている。しかしながら、肺構造深部に浸透する感染物質、免疫物質、または化学物質は肺炎を引き起こすことがある。乾癬物質が下気道内で体循環と接触することにより、さらに敗血症肺炎または呼吸促迫症候群となることがある。さらに、喘息などのある炎症状態では、粘膜の破壊により、アレルゲンおよび刺激物質のレベルが増大し、炎症および粘膜溶解の両方がさらに激化する。
【０００５】
そのため、気道組織において進行中の発病メカニズムまたはアレルギーメカニズムにより引き起こされる損傷を軽減し、関連する症状を緩和するには、正常な気道上皮バリアを迅速に修復することが重要である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、哺乳動物に治療有効量のトレフォイル（trefoil）ペプチド、または生物学的に活性なその断片を投与することによる、哺乳動物の気道上皮の病変を治療するための方法および組成物を特徴とする。本発明による病変の治療は、治癒を促進し、痛みを軽減し、病変の発症を遅らせるまたは阻止し、および病変の拡大、二次感染または他の合併症を阻止する。気道上皮の病変は、例えばアレルギー反応、喘息、感染、吸入した化学物質または粒子曝露、熱病変、煙の吸入、薬物により誘発された肺の損傷、損傷（例えば外科的手術または挿管による）、微生物感染（例えば、細菌、ウイルスまたは真菌）、慢性閉塞性肺疾患、抗腫瘍療法、嚢胞性線維症、鬱血性心不全などの心血管系副作用、または高圧酸素療法を含む任意の原因により生じることがある。
【０００７】
他の局面では、本発明は、吸入投与に適した薬学的に許容される担体中に溶解させたトレフォイルペプチドを含む組成物を提供する。そのようなものとして製剤化する場合、組成物は定量吸入器により投与されるエアロゾル（例えば、鼻スプレー、吸入スプレー、吸入溶液、吸入懸濁液）としてもよい。所望であれば、トレフォイルペプチドを含む製剤は(例えば、ジェット、超音波噴霧器または電子噴霧器により)噴霧してもよい。また、トレフォイルペプチド製剤は、例えば、定量吸入器または乾燥粉末吸入器を使用し乾燥粉末として投与してもよい。
【０００８】
本発明の前記全ての局面において、哺乳動物は好ましくはヒトであり、トレフォイルペプチドはヒト腸トレフォイル因子(ITF)、鎮痙性ペプチド(SP)、pS2または生物学的に活性なそれらの断片である。そのような断片としては、例えば、配列番号:1のITF15-73、ITF21-73、ITF1-72、ITF15-72またはITF21-72が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法および組成物では、第2の治療剤を含むことができる。そのような薬剤としてはグルココルチコイド(ベクロメタゾン、フルニソリド、ブデノシド、トリアムシノロン、プレドニソロン、デキサメタソンまたはフルチカソン)などの抗炎症剤または非ステロイド抗炎症剤(例えば、イブプロフェン、タクロリムス、クロモリン、ネドクロミル、レフェコキシブ、またはセレコキシブ)；抗菌剤(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロマイシン、ストレプトマイシン、またはトブラマイシン)；抗ヒスタミン剤(例えば、ジフェンヒドラミン、フェキソフェナジン、セチリジン、またはロラタジン)；コリン受容体アンタゴニスト(例えば、臭化イプラトロピウムまたはチオトロピウム)；ニューロキニン受容体アンタゴニスト；ロイコトリエン受容体アンタゴニスト；充血除去剤；ホスホジエステラーゼ阻害剤；またはβ-アドレナリン受容体アンタゴニスト(アルブテロール、ビトルテロール、エピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、ラセピネフリン、サルメテロール、またはテルブタリン)が挙げられる。第2の治療剤はトレフォイルペプチドの14日、7日、1日、12時間、1時間(前または後のいずれか)以内に、またはトレフォイルペプチドと同時に、投与してもよい。
【００１０】
第2の治療剤はトレフォイルペプチドと同じまたは異なる薬学的組成物中に存在させてもよい。第2の治療剤が異なる薬学的組成物中に存在する場合、異なる投与経路を使用してもよい。例えば、第2の治療剤は経口で、または静脈内、筋内、もしくは皮下注射により投与してもよい。このように、第2の治療剤は吸入により投与する必要はない。
【００１１】
当然、薬学的組成物は、2つ、3つ、もしくはそれ以上のトレフォイルペプチドまたは生物学的に活性なトレフォイルペプチド断片を含んでもよい。また、トレフォイルペプチドの吸入は、同じまたは異なるトレフォイルペプチドの全身性(例えば、経口または注射)投与により補ってもよい。
【００１２】
気道上皮では、予測される損傷(例えば、外科的手術、または抗腫瘍療法)の前に腸トレフォイルペプチド含有組成物を投与することにより、病変を防ぐまたは回復させる。好ましくは、損傷の少なくとも1日、3日、5日、7日、または10日前に予防治療を開始する。予測されない気道病変の治療は好ましくは、損傷後直ちに、または24時間以内に開始する。
【００１３】
好ましい態様では、トレフォイルペプチドまたは生物学的に活性な断片は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9の配列を有するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする単離核酸配列によりコードされる。
【００１４】
他の局面では、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9の配列を有するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする単離核酸配列によりコードされるトレフォイルペプチドまたは生物学的に活性な断片を含む吸入投与に適した薬学的組成物を特徴とする。
【００１５】
哺乳類トレフォイルペプチドは1982年に発見された。哺乳類トレフォイルペプチドの1つ、ヒト腸トレフォイル因子(ITF)は広く特徴付けされており、米国特許第6,063,755号および第6,221,840号において記述されている。これらの特許は参照により明細書に組み込まれる。他の2つの周知のヒトトレフォイルペプチドは鎮痙性ポリペプチド(SP)およびpS2である。文献(例えば、Sandsら、Annu. Rev. Physiol. 58:253-273(1996)、参照により本明細書に組み込まれる)において広く記述されているトレフォイルペプチドは、胃腸管で発現され、保存システイン残基間の鎖内ジスルフィド結合により形成される3ループ構造を有する。これらのペプチドは腸管が傷つけられないように保護し、消化性潰瘍および炎症性腸疾患などの腸管疾患を治療するのに使用することができる。これらのヒトペプチドの相同体が多くのヒト以外の動物種において見出されている。このタンパク質ファミリーの全てのメンバーは、ヒトおよびヒト以外のどちらでも、本明細書ではトレフォイルペプチドと呼ばれる。ヒトITFは本出願において最も広く言及されるが、ヒトITFの活性は哺乳類トレフォイルペプチドの各々に共通である。
【００１６】
「トレフォイルペプチド」という用語は、ヒト鎮痙性ポリペプチド、ヒトpS2およびヒトITFポリペプチドの哺乳類相同体全て、およびそれらの生物学的に活性な断片を含むことを意味する。トレフォイルペプチドの相同体は、好ましくはヒト配列に対し70%のアミノ酸の同一性、より好ましくは85%の同一性、最も好ましくは95%、さらには99%の配列同一性を有する。比較配列の長さは一般に少なくとも約8アミノ酸残基、通常、少なくとも20アミノ酸残基、さらに通常、少なくとも24アミノ酸残基、典型的には少なくとも28アミノ酸残基、好ましくは35以上のアミノ酸残基である。
【００１７】
「断片」という用語は、SP、pS2およびITFの切断または欠失ポリペプチドを含むことを意味する。好ましくは、断片はヒトポリペプチド配列の対応する領域に対し70%のアミノ酸同一性を有する。より好ましくは、断片は対応するヒトポリペプチド配列に対し85%同一、最も好ましくは95%、さらに99%同一である。比較配列の長さは一般に少なくとも約8アミノ酸残基、通常、少なくとも20アミノ酸残基、さらに通常、少なくとも24アミノ酸残基、典型的には少なくとも28アミノ酸残基、および好ましくは35以上のアミノ酸残基である。
【００１８】
好ましい断片は、ヒトITF(図1)の25、35、45、50、51、62または71位、またはヒトpS2(図2)の31、41、51、56、57、68および82位のシステインに対応する任意の位置の4つのシステイン残基を含む。より好ましくは、断片はこれらの位置の5つのシステイン残基を含む。より好ましくは、6または、7つ全てのシステインが存在する。
【００１９】
SP断片は、切断または欠失を含み、好ましくは対応するヒトSPポリペプチド配列(図3)に対し70%の配列同一性を有することを意味する。より好ましくは、断片はヒトポリペプチド配列に対し85%同一であり、最も好ましくは95%、さらには99%同一である。好ましくは、活性断片は、少なくとも4つのシステイン残基を含み、これらは、ヒトSPポリペプチドの6、8、19、29、34、35、46、58、68、78、83、84、95および104位に対応する。より好ましくは、断片はこれらの位置に対応する6つのシステインを含む。8システインを含む断片がさらに好ましい。10、12または14全ての位置のシステインを含む断片が最も好ましい。
【００２０】
同定したシステイン残基の1つの機能は、特徴的な3ループ(トレフォイル)構造を付与することであることは当技術分野で認識されている。したがって、ITFおよびpS2の好ましい断片は少なくとも1つのループ構造を有し、より好ましくは、断片は2つのループ構造を有し、最も好ましくは、3ループ構造を有する。天然SPポリペプチドが6ループ構造を有することは同様によく認識されている。好ましい断片はこれらのループ構造のうち、少なくとも2つを含み、より好ましくは、4つのループ構造が保存され、最も好ましくは、5または6のループ構造全てが存在する。
【００２１】
「エアロゾル」とは、本発明のトレフォイルペプチドの任意の組成物が、例えば、吸入噴霧、吸入溶液、吸入懸濁液、噴霧溶液、または鼻スプレーを含むエアロゾル製剤として投与されることを意味する。
【００２２】
「抗菌剤」とは、細菌もしくは真菌細胞、またはウイルスの増殖を変化させ、これにより増殖を予防し、安定化させ、もしくは阻止し、または細菌を殺害するいかなる化合物も意味する。言い換えると、抗菌剤は殺微生物薬(microbiosidal)または微生物静力学的薬(microbiostatic)とすることができる。
【００２３】
「抗腫瘍療法」とは、癌を治療するために使用されるいかなる治療療法も意味する。典型的な抗腫瘍療法としては化学療法および放射線療法が挙げられる。
【００２４】
トレフォイルペプチド、断片または相同体を示す場合、「生物学的に活性」は、その関連する天然のファミリーメンバーに共通の活性を示すいかなるポリペプチドも意味し、その活性は天然のトレフォイルペプチドのファミリーに共通である。トレフォイルペプチドのファミリーに共通の生物学的活性の例は、胃腸粘膜を元に戻す能力である(Traupinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.97(2):799-804)。
【００２５】
「単離DNA」という用語は、所定のDNAが由来する生物の天然ゲノム中で、そのDNAに隣接する遺伝子を含まないDNAを意味する。このように、「単離DNA」は、例えば、cDNA、クローンゲノムDNA、および合成DNAを含む。
【００２６】
「薬学的組成物」という用語は、少なくとも1つの治療上、または生物学的に活性な作用物質を含み、患者に投与するのに適したいかなる組成物も意味する。呼吸気道に治療を適用するのに適した薬学的組成物としては、エアロゾルおよび乾燥粉末が挙げられるが、これらに限定されない。これらの製剤のうちのいくつかは、当技術の周知の認められた方法により調製することができる。例えば、「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、(AR Gennaro編)、Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン、2000を参照のこと。
【００２７】
「高ストリンジェンシー条件」とは、高温および低イオン強度により特徴づけられ、65℃の温度の、0.5MのNaHPO4、pH7.2、7%SDS、1mMのEDTA、および1%のBSA(フラクションV)を含む緩衝液、または温度が42℃、48%のホルムアミド、4.8xSSC、0.2MのTris-Cl、pH7.6、1xデンハルト（Denhardt's）溶液、10%の硫酸デキストラン、および0.1%のSDSを含む緩衝液中で、長さが少なくとも40ヌクレオチドのDNAプローブを使用して得られるものと匹敵するハイブリダイゼーションが可能となる任意の条件の組を意味する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション、例えば、PCR、ノーザン、サザン、またはインサイチューハイブリダイゼーション、DNA配列決定などのための他の条件は、分子生物学の当業者には周知である。例えば、F.Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク、1998年(参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明、および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２８】
「実質的に同一」とは、基準アミノ酸または核酸配列に対し少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%、または99%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドに対しては、比較配列の長さは一般に少なくとも20アミノ酸、好ましくは少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも40アミノ酸、最も好ましくは50アミノ酸である。核酸では、比較配列の長さは一般に少なくとも60ヌクレオチド、好ましくは少なくとも90ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも120ヌクレオチドである。
【００２９】
「治療有効量」とは、医療効果が得られるのに十分な量を意味する。本明細書で記述した方法によりヒト患者にトレフォイルペプチドを投与する場合、有効量は治療すべき病変領域のサイズにより変動するが、治療有効量は通常1回の用量あたり約1〜2500mgのトレフォイルである。投与は典型的には1日あたり1〜4回実施される。患者はまた、一定期間にわたり連続してトレフォイルペプチドを投与されてもよい。
【００３０】
詳細な説明
本発明は、呼吸上皮に対する広範囲にわたる病変の治療、改善、および阻止に有益な方法および組成物を提供する。本発明により治療される呼吸上皮の病変は、例えば、物理的(例えば、外科的介入または挿管)、化学的(例えば、喫煙または揮発性溶媒への曝露)、もしくは熱的外傷；血管障害(compromise)(例えば、鬱血性心不全または慢性閉塞性肺疾患による)；感染もしくは炎症過程；抗腫瘍療法(例えば、放射線療法または化学療法)；または嚢胞性線維症もしくは喘息などの他の疾患過程により引き起こされることがある。さらに、呼吸上皮に対する他の普通の化学的損傷としては、長期間にわたる高濃度酸素への曝露(例えば、高圧酸素療法)が挙げられる。
【００３１】
本発明によるこれら病変の治療は、上皮治癒を促進し、気道上皮の破壊に関連する症状を緩和し、鼻炎、喘息、肺炎を悪化させる二次合併症、または気道上皮病変の他の合併症を軽減し、遅らせ、または阻止することができる。さらに、本発明は正常な上皮閉鎖を促進し、感染を軽減するので、二次感染および気道の進行中の感作の後期副次的効果(例えば、花粉症および喘息)の両方の機会を減少させるであろう。
【００３２】
アレルギー反応または身体的外傷によるものなどの呼吸上皮の病変は、エアロゾルまたは乾燥粉末として適用されたトレフォイルペプチド療法の影響を受けやすい。組成物は、周知の従来の製剤調製法により、製剤化(微粉化)され乾燥粉末吸入剤、またはエアロゾルとされる。気管気管支呼吸上皮を治療するために使用される場合、本発明の組成物の投与は好ましくは、症状が出たら直ちに実施され、3〜10日のオーダーで、または呼吸上皮の病変が消えるまで継続される。しかしながら、より軽い病変の場合、特に他の活性成分と組み合わせると、トレフォイルペプチド療法により病変はより短い期間で消散する。
【００３３】
本発明の組成物はまた、呼吸上皮を損傷する療法前に、予防的に使用することができる。例えば、組成物は抗腫瘍療法前、または外科的介入前に、上皮の完全性の損失を緩和するために投与することができる。鼻-咽頭気道上皮の破壊による症状の阻止または改善はまた、予測される損傷前にトレフォイルペプチドを投与することにより達成してもよい。例えば、患者は、「花粉症」の季節に木または草の花粉に曝露される前にトレフォイルペプチド療法を受けてもよく、患者が鼻-咽頭感染の危険にさらされている期間中、間隔を減らして予防治療を適用してもよい。
【００３４】
典型的には、定量吸入器または乾燥粉末吸入器は患者により自己管理される。通常医者の監督下での連続噴霧器からの換気呼吸により、トレフォイルペプチドおよび補助薬剤の用量を独立して調節することも可能となる。
【００３５】
製剤
エアロゾル
エアロゾル化した製剤は高濃度のトレフォイルペプチドを直接気道に送達し、全身吸収が低い。そのようなエアロゾル化製剤としては、例えば、鼻スプレー、吸入溶液、吸入懸濁液、および吸入スプレーが挙げられる。鼻スプレーは典型的には、一定用量のスプレーを送達する無加圧ディスペンサー内で、賦形剤の溶液または混合物(例えば、保存剤、粘度調整剤、乳化剤、または緩衝化剤)に溶解または懸濁させた治療上活性なトレフォイルペプチドを含む。吸入溶液および懸濁液は、トレフォイルペプチド、および必要であれば、追加の賦形剤を含む水溶液系製剤である。そのような製剤は、吸気により呼吸気道に送達されるように意図される。典型的には、定量エアロゾル吸入器は直径20〜30μmの滴を形成する。
【００３６】
肺送達の主な限界は、肺深部に到達することが困難なことである。上および下呼吸気道の両方で高濃度のトレフォイルペプチド溶液を達成するには、トレフォイルは好ましくはジェット噴霧器、超音波噴霧器、または電子噴霧器、特に一方向フローバルブを追加することにより改良したもの、例えば、バージニア州リッチモンドのPari Respiratory Equipment, Inc.から市販されているPari LC Plus(登録商標)噴霧器(他の改良されていない噴霧器よりも最高20%多く送達する)において噴霧される。
【００３７】
製剤のpHもまたエアロゾル送達には重要である。エアロゾルが酸性または塩基性であると、気管支痙攣および咳が生じることがある。安全なpH範囲は相対的なものであり患者の耐性による。弱酸性エアロゾルに対し耐性のある患者もあれば、気管支痙攣が起こる患者もある。典型的には、pHが4.5未満のエアロゾル溶液では気管支痙攣が誘発される。pHが4.5〜5.5のエアロゾル溶液では時折、この問題が生じる。pHが5.5〜7.0のエアロゾル溶液は通常安全と考えられる。pHが7.0を超えるエアロゾルはすべて避けるべきである。身体組織がアルカリ性エアロゾルを緩衝化することができず、炎症および気管支痙攣が起こるからである。そのため、気管支痙攣および咳などの二次的な望ましくない副作用を起こさずに、患者に良好な耐性が示されるトレフォイルペプチドエアロゾルを生成するためには、製剤のpHは好ましくは5.5〜7.0の間、最も好ましくは5.5〜6.5の間で維持される。製剤の浸透圧もまた、患者の耐性により、約250〜350mosm/Lの浸透圧に調節することができる。高張または低張溶液の投与は、ある一定の場合、特に露出粘膜に投与されると、耐え難い。HFA 134a、HFA 227などの推進薬、またはそれらの組み合わせもまた製剤中で使用してもよい。所望であれば、薬物の分散を促進し、またはバルブの潤滑性を増強させる賦形剤もまたトレフォイルペプチドと共に製剤化してもよい。
【００３８】
乾燥粉末製剤
エアロゾル送達の代わりの療法として、トレフォイルペプチドはまた、気管支内空間への効果的な送達のために乾燥粉末製剤として投与してもよい。そのような製剤は、製品および製剤が安定性である、パフあたりの薬物量送達が高い、および微生物増殖に対する感染性が低い等を含むいくつかの利点を有する。そのため、例えば、呼吸上皮の広い部分が病変の影響を受けている場合を含み、多量のトレフォイルペプチドを送達する必要がある場合は、乾燥粉末吸入および定量吸入が最も実用的である。乾燥粉末送達装置の効率に依存するが、効果的な乾燥粉末投与レベルは典型的には約20〜60mgの範囲内である。そのため、本発明は薬物粒子の乾燥粉末または定量投与形態で、トレフォイルペプチドの効能が十分な製剤を提供する。そのような製剤は、乾燥粉末を希釈するなど、さらに処理する必要がないので好都合である。さらに、十分小さく、完全に携帯可能で、有効期間が長い傾向のある装置が使用される。
【００３９】
本発明の乾燥粉末製剤において、トレフォイルペプチド組成物は、メディアミリング(media milling)、ジェットミリング(jet milling)、噴霧乾燥、超臨界流体エネルギー、または粒子沈澱技術によって粉砕し、空気動力学的中央粒子径が1〜10μmの範囲の粉末とする。
【００４０】
粒子サイズ決定は、多段階アンダーソン（Anderson）カスケードインパクタ法または他の適した方法を用いて実施してもよい。また、乾燥粉末製剤は、噴霧乾燥または溶液沈澱技術により調製してもよい。噴霧乾燥は、トレフォイルペプチドが分解する傾向が最も小さいという利点がある。溶液沈澱は、均一な薬物溶液に対する薬物の溶解度を減少させる共溶媒を添加することにより実施される。十分な共溶媒を添加すると、薬物の溶解度は、固体薬物粒子が形成される点まで落ち、この固体粒子は濾過または遠心分離により回収することができる。沈澱は再現性が高いという利点を有し、低温条件下で実施することができ、これにより分解が減少する。超臨界流体技術では、制御されたサイズ、密度および結晶性が粉末製剤に対し理想的な薬学的化合物の粒子が形成される。
【００４１】
本発明の乾燥粉末製剤は、定量または乾燥粉末吸入器において直接使用してもよい。現在、定量吸入器技術は、1μg〜5mgの治療量を送達するように最適化される。肺曝露を増強させ、患者の調整(coordination)を支援するために、エアロチャンバなどのスペーサー技術もまた使用してもよい。
【００４２】
乾燥粉末送達の他の経路は、乾燥粉末吸入器によるものである。乾燥粉末吸入器には2つの主な設計があり、薬物リザーバが装置内に保存され、患者がその装置の用量を吸入チャンバ内に「装填し」、患者の吸気流により粉末が装置から出て、口腔内に入るように促進される装置定量設計である。また、乾燥粉末吸入器はまた、空気源、ガス源または静電気を使用して、トレフォイルペプチドを送達してもよい。乾燥粉末吸入器のための現在の技術では、最大積載量限界が約10mgの粉末である。乾燥粉末製剤は温度安定であり、4.0〜7.5、好ましくは6.5〜7.0の生理学的に許容されるpHを有する。
【００４３】
治療剤
トレフォイルペプチドの他に、本発明の治療用製剤は、第2の治療剤、または処方計画を含んでいてもよい。第2の治療剤はトレフォイルと同時に、またはその1時間、12時間、1日、7日、14日以内(トレフォイルペプチドの投与の前、または後のいずれか)に投与してもよい。第2の治療剤はトレフォイルペプチドと同じまたは異なる薬学的組成物中に存在してもよい。このように、局所的に呼吸上皮を治療するための薬学的組成物は、トレフォイルペプチドの他に、例えば、抗炎症化合物、抗生物質、β-アドレナリン気管支拡張剤、コリン受容体アンタゴニスト、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、ステロイド、充血除去剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、鎮痛薬、または麻酔薬を含んでもよい。第2の治療剤が異なる薬学的組成物中に存在する場合、異なる投与経路を使用してもよい。例えば、第2の治療剤は経口、または静脈、筋内、もしくは皮下注射により、投与してもよい。このように、第2の治療剤は吸入により投与する必要はない。所望であれば、2つ以上の治療剤をトレフォイルペプチドと共に投与してもよい。もちろん、薬学的組成物は2つ、3つまたはそれ以上のトレフォイルペプチド、または生物学的に活性な断片も含んでもよい。
【００４４】
トレフォイルペプチド
治療用トレフォイルペプチドは典型的には、哺乳類トレフォイルペプチドまたはその断片であるが、哺乳類トレフォイルペプチドと実質的に同一な天然でない相同体もまた有益である。好ましくは、ヒトトレフォイルペプチドまたは断片を使用する；しかしながら、ラット、マウスおよびヒト以外の霊長類を含む他の種由来のトレフォイルペプチドを使用してもよい。典型的には、トレフォイルペプチドは腸トレフォイル因子(ITF)であるが、鎮痙性ポリペプチド(SP)、またはpS2もまた有益である。
【００４５】
特別なトレフォイルペプチド断片は生物学的活性を保持しており、トレフォイルペプチドが使用される任意の方法または組成物において代わりに使用してもよい。これらのトレフォイルペプチド断片を代わりに使用してもよい、トレフォイルペプチドを含む方法および組成物については、例えば、米国特許第6,063,755号および第6,221,840号、ならびに2002年4月24日に出願された米国特許出願第10/131,363号、2001年9月6日に出願された第60/317,657号、2002年10月5日に出願された第60/327,673号、2001年11月28日に出願された第60/333,836号、および2002年3月26日に出願された第60/367,574号(参照により本明細書に組み込まれる)において記述されている。
【００４６】
生物活性を保持する特に有益なITF断片は配列番号:1のアミノ酸残基15〜73(ITF15-73)および配列番号:1のアミノ酸残基21〜73(ITF21-73)に対応するポリペプチドが挙げられる。他の有益なITF断片はC末端フェニルアラニン残基の開裂後に形成される(すなわち、ITF1-72、ITF15-72、およびITF21-72)。
【００４７】
本発明の生物学的に活性なトレフォイルペプチド断片は任意の適した方法を用いて作製することができる。例えば、所望のITF断片をコードするcDNAを、組換えタンパク質を作製するための当技術分野で周知の任意の方法と共に使用することができる。例示的な方法を本明細書で示す。ITF断片、特にITF21-73は、長いITF種、例えば全長ITF(例えば、配列番号:4)またはITF15-73をコードするcDNAにより形質転換したピチア（Pichia）酵母発現系(例えば、米国特許第4,882,279号および同第5,122,465号を参照のこと)を用いて作製することができる。この場合、発酵培養物はpH〜5.0に維持される。
【００４８】
ITFを含むトレフォイルペプチドは可溶性であり、そのため、例えばエアロゾル化または噴霧化用の薬学的に許容される担体液に溶解することができる。トレフォイルペプチドを含むエアロゾルは、対象となる気道領域を標的とするように、空気力学的粒子サイズが最適化される。典型的には、1〜3μmのエアロゾルサイズは肺深部(肺胞)構造を標的とするが、5〜10μmの粒子サイズでは気管気管支に堆積する。さらに、ある一定の賦形剤を使用して、肺または鼻領域に送達されたトレフォイルペプチドの局所放出を延長させてもよく、または粘膜毛様体クリアランス速度を変更することにより肺の所望の局所領域でトレフォイルペプチド製剤を維持してもよい。
【００４９】
トレフォイルペプチド用量
典型的には、療法の用量、頻度および期間は、治療すべき病変の型および重篤度に合わせられる。例えば、小さな気道病変を治療するには間欠投与で十分な可能性がある。例えば、激しい煙の吸入または熱損傷に由来するより重篤な気道病変では、連続トレイフォイルペプチド投与が必要な可能性がある。または、呼吸上皮に対する病変を予測して、治療を予防的に適用してもよい。予防治療は、損傷の少なくとも1日、3日、5日、7日、または10日前に開始してもよい。予測されない気道病変の治療は好ましくは、損傷後直ちに、または24時間以内に開始する。好ましくは、トレフォイルペプチド療法は、少なくとも1日、5日、14日、または治療受ける患者の生涯において、1日あたり少なくとも1、2、3、4またはそれ以上の回数で投与される。また、トレフォイルペプチドは一定期間にわたり、例えば、1時間、2時間、6時間、1日、またはそれ以上の日数の間、患者に連続して投与されてもよい。このため、トレフォイルペプチドは、例えば噴霧器システムのマスクアダプタを使用して投与してもよい。
【００５０】
好ましくは、エアロゾル製剤は、5、10、20、40、60、80、100mg/mL、またはそれ以上の濃度のトレフォイルペプチドを含み、生理学的に許容される溶液、好ましくは4分の1強度の生理食塩水中で製剤化される。理想的には、患者には、少なくとも10、50、100、200、500、700、1000μgまたはそれ以上のトレフォイルペプチドがエアロゾルとして投与される。乾燥粉末吸入を使用すると、好ましくは、治療を受ける患者の気道に少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60mgまたはそれ以上のトレフォイルペプチドが送達される。そのような製剤中で、トレフォイルペプチドは、非結晶状態または結晶状態の、空気動力学的中央粒子径が1〜10μmの粒子サイズの粉末として送達される。その径は呼吸上皮の病変の治療、改善、および予防のために気管支内空間内にトレフォイルペプチドが効果的に送達されるのに必要とされる。末梢の肺を標的とするには2〜4μmの画分を使用してもよい。患者の吸息技術、例えば息止めによっても、トレフォイルペプチドの堆積が最適化される。
【００５１】
所望であれば、特にトレフォイルペプチドの制御または連続放出が目的である場合、トレフォイルペプチドは経口で、または静脈注射により投与してもよい。
【００５２】
トレフォイルペプチド成分を含む、本発明の組成物中で使用される治療剤は全て、これらの作用物質に対し現在周知の、使用されている用量範囲で使用することができる。患者の臨床状態、療法の目的(治療または予防)、予測される期間、病変部位、およびトレフォイルペプチドを投与する損傷の重篤度により、トレフォイルペプチドまたは他の作用物質のいずれかの濃度を異なるものとしてもよい。用量を選択する際にさらに考慮すべきものとしては、病因、患者の年齢(小児、成人、老人)、全身の健康および併存疾患が挙げられる。
【００５３】
抗炎症剤
任意の適した抗炎症剤をトレフォイルペプチドと共に製剤化することができ、本発明の方法を用いて使用することができる。適した抗炎症剤は全身投与することができ、または吸入により投与することができる。例示的な薬剤としては、非ステロイド抗炎症剤(例えば、イブプロフェン、タクロリムス、クロモリン、ネドクロミル)、シクロオキシゲナーゼ-2-特異阻害剤、例えばロフェコキシブ（Vioxx(登録商標)）およびセレコキシブ（Celebrex(登録商標)）、およびグルココルチコイドが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル化により使用してもよい特に有効なグルココルチコステロイド薬としては、例えばベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニドおよびトリアムシノロンが挙げられる。他の有益なグルココルチコステロイド薬としては、プレドニソロン、デキサメタゾンおよびフルチカゾンが挙げられる。喘息はコルチコステロイドが使用される主な肺状態であるが、そのような薬剤はまた、例えば慢性気管支炎および気腫など気道上皮がたばこの煙により損傷した場合にも有益である。コルチコステロイドはまた、サルコイドーシス、肺炎および慢性炎症状態などの他の肺疾患の治療にも有益である。これらの薬物は、経口、静脈注射(例えば、重篤な症例において)、または吸入により投与してもよい。好ましくは、コルチコステロイドは患者に吸入により投与される。必要な容量がずっと少なく、肺内の小さな気道に直接送達され、関連する副作用がより少ないからである。
【００５４】
吸入投与に従い有益であることがわかっている抗炎症濃度を使用することができる。例えば、イブプロフェンは、1日あたり25〜800mgを呼吸病変に送達するのに十分な濃度で組成物中に存在していてもよい。
【００５５】
気管支拡張剤
鼻-咽頭または気管気管支解剖学的構造への吸入適用のための通常の用量でトレフォイルペプチドと共に、任意の活性気管支拡張剤を製剤化してもよい。通常の気管支拡張剤としては、メチルキサンチン(例えば、テオフィリン、テオブロミンおよびカフェイン)、交感神経興奮薬(例えば、アドレナリン、エピネフリン、イソプロテレノールおよびβ-アドレナリンアゴニスト)、コリン受容体アンタゴニスト、例えば臭化イプラトロプリウムおよびチオトロピウム、ならびにニューロキニン受容体アンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
アドレナリン性気管支拡張剤は通常、吸入により投与され、肺の気管支(気道)が広げられる。アドレナリン性気管支拡張剤は典型的には、喘息、慢性気管支炎、気腫および他の肺疾患を治療し、改善し、または阻止するために使用される。そのような例示的な気管支拡張剤としては、アルブテロール、ビトルテロール、エピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、イソエタリン、イソプロテレノール、メタプロテレノール、ピルブテロール、プロカテロール、ラセピネフリン、サルメテロールおよびテルブタリンが挙げられる。
【００５７】
また、本発明のトレフォイルペプチドは、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト(例えば、モンテルカスト、またはザフィルカスト)、ニューロキニン受容体アンタゴニスト、抗ヒスタミン(例えば、ジフェニルヒドラミン、フェキソフェナジン、セチリジン、またはロラタジン)、またはコリン受容体アンタゴニストと共に投与してもよい。
【００５８】
抗菌剤
任意の適した抗菌剤は本発明の組成物中、これらの薬剤に対して一般的に使用される濃度で使用することができる。適した抗菌剤としては、抗細菌剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、および抗ウイルス剤が挙げられる。例示的な抗細菌剤(抗生物質)としてはペニシリン(例えば、ペニシリンG、アンピシリン、メチシリン、オキサシリンおよびアモキシリン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セフォラニド、セフォタキシムおよびセフトリアキソン)、テトラサイクリン(例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、およびトブラマイシン)、マクロライド(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、およびエリスロマイシン)、フルオロキノロン(例えば、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、およびノルフロキサシン)、ならびにクロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロセリン、イソニアジド、リファムピン、およびバンコマイシンを含む他の抗生物質が挙げられる。特に有益な製剤はアミノグリコシド、例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、ストレプトマイシンおよびトブラマイシンを含む。
【００５９】
抗ウイルス剤はウイルスの複製を破壊または抑制することができる物質である。抗ウイルス剤の例としては、1,-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミド、9->2-ヒドロキシ-エトキシメチルグアニン、アダマンタナミン、5-ヨード-2'-デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、プロテアーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、糖または糖タンパク質合成阻害剤、構造タンパク質合成阻害剤、付着および吸着阻害剤、およびヌクレオシド類似体、例えばアシクロビル、ペンシクロビル、バナシクロビル、およびガンシクロビルが挙げられる。
【００６０】
抗真菌剤は、殺菌剤および静真菌剤の両方を含み、例えば、安息香酸、ウンデシレンアルカノールアミド、シクロピロックスオーラミン、ポリエン、イミダゾール、アルキルアミン、チカルバメート、アムフォテリシンB、ブチルパラベン、クリンダマイシン、エコナキソール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ニスタチン、およびケトコナゾールが挙げられる。
【００６１】
ペンタミジンのような抗寄生虫剤などの他の抗菌剤は、呼吸性副作用を有することが知られている。そのため、トレフォイルペプチドおよびこの種の抗菌剤の同時投与により有害事象は減少するか、または阻止される。
【００６２】
呼吸器感染を治療するのに有益であることがわかっている抗菌濃度を使用することができる。
【００６３】
抗癌剤
小細胞癌および非小細胞癌を含む肺の癌は肺上皮を損傷する。しばしば、この損傷は抗癌療法により悪化する。というのは、多くの抗癌剤は上皮細胞に悪影響を与えるからである。そのため、呼吸上皮に対する損傷を阻止し、改善し、または治療するために抗腫瘍療法を予測して、それと同時に、またはその後にトレフォイルペプチド療法を適用することが好都合である。化学療法は通常、静脈注射により全身投与される。トレフォイルペプチドは、化学療法調製物と同時に、またはその添加剤として、または別個に、吸入により投与してもよい。放射線療法を受けている患者では、トレフォイルペプチドは好ましくは吸入により投与され、その投与は各療法期間の1〜3日前に始められ、療法の過程中継続され、最終放射線治療後1日〜3日間続けられる。
【００６４】
トレフォイルペプチドの製造
トレフォイルペプチドおよび断片は、組換えタンパク質の発現のための当技術分野で周知の任意の方法により製造することができる。トレフォイルペプチド(例えば、ヒト腸トレフォイル因子(図4および7)、ヒトpS2(図5および8)、およびヒト鎮痙性ポリペプチド(図6および9))、またはその断片をコードする核酸を様々な細胞系または細胞不含系に導入し、発現させ、これにより大規模製造、精製および、患者の治療が可能となる。
【００６５】
トレフォイルペプチド遺伝子配列をプラスミドまたは他のベクターに導入した真核および原核トレフォイルペプチド発現系を作製してもよく、これをその後使用して生細胞を形質転換する。トレフォイルペプチドcDNAが発現プラスミド内に正しい配向で挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含む構築物をタンパク質発現のために使用してもよい。原核および真核発現型では、トレフォイルペプチドが共有結合によりタグ分子に結合されたトレフォイルペプチド融合タンパク質の発現および回収が可能である。これにより同定および/または精製が容易になる。酵素または化学開裂部位はトレフォイルペプチドタグ分子との間で起こすことができ、そのためタグは精製後に除去できる。
【００６６】
典型的な発現ベクターは、プラスミド運搬細胞中の挿入トレフォイルペプチド核酸に対応する多量のmRNAの合成を指示するプロモーターを含む。このようなベクターにはまた、宿主生体内で自主複製を可能とする複製配列、他の毒性薬物の存在下でベクター含有細胞の選択を可能とする遺伝形質をコードする配列、合成mRNAの翻訳効率を増大させる配列といった、真核または原核細胞起源の配列が含まれていてもよい。安定性の長期ベクターは、例えばウイルスの調節要素(例えば、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr Virus）ゲノム由来のOriP配列)を使用することにより自由に複製される実体として維持されてもよい。ゲノムDNAに一体化されたベクターを有する細胞系統を作製してもよく、このように遺伝子産物が連続して生産される。
【００６７】
大腸菌などの細菌中で外来配列を発現させるには、トレフォイルペプチド核酸配列を細菌発現ベクターに挿入する必要がある。そのようなプラスミドベクターは細菌中でのプラスミドの増殖、およびプラスミドに挿入したDNAの発現に必要ないくつかの要素を含む。プラスミドを有する細菌のみを増殖させるには、他の毒性薬物の存在下でプラスミドを有する細菌の増殖を可能とする選択可能なマーカーコード配列をプラスミドに導入する。プラスミドまた、クローン遺伝子から多量のmRNAを生成することができる転写プロモータを含む。そのようなプロモーターは、誘導により転写を開始させる誘導性プロモーターであってもよいが、必ずしもそうである必要はない。プラスミドはまた、好ましくはポリリンカーを含み、遺伝子をベクター内に正しい配向で挿入することが簡素化される。哺乳動物細胞もまた、トレフォイルペプチドを発現させるのに使用することができる。可溶性(切断およびタグ付き)形態のトレフォイルペプチドを生成するために、安定性、または一過性の細胞系統クローンを、トレフォイルペプチド発現ベクターを使用して作製することができる。適した細胞系統としては、例えば、COS、HEK293T、CHO、またはNIH細胞系統が挙げられる。
【００６８】
適当な発現ベクターが構成されると直ちに、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソーム媒介トランスフェクションなど(これらに限定されない)の形質転換技術により適当な宿主細胞に導入される。本発明のベクターがトランスフェクトされる宿主細胞としては、大腸菌または他の細菌、酵母、真菌、昆虫細胞(例えば、SF9昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスを使用する)、またはマウス、ヒト、他の動物由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。クローンDNAによりコードされたトレフォイルペプチド、融合物、またはポリペプチド断片のインビトロ発現を使用してもよい。分子生物学の当業者であれば、広範囲の発現系および精製系を使用して組換えトレフォイルペプチドおよびその断片を製造してもよいことは理解されると思われる。これらの系のいくつかについては、例えばAusubelら(「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、ニューヨーク州ニューヨーク、2000、参照により本明細書に組み込まれる)において記述されている。
【００６９】
トランスジェニック植物、植物細胞および藻類もまた、特に、本発明の方法および組成物において使用するための組換えトレフォイルペプチドを生成するのに有益である。たとえば、トレフォイルペプチドを発現するトランスジェニックタバコ植物または培養トランスジェニックタバコ植物細胞は、当技術分野で周知の技術を用いて作製することができる(例えば、米国特許第5,202,422号および第6,140,075号を参照のこと)。組換えトレフォイルペプチドを製造するためにトランスジェニック藻類発現系もまた使用することができる(例えば、Chenら、Curr. Genet. 39:365-370、2001を参照のこと)。
【００７０】
組換えタンパク質が発現されると直ちに、アフィニティクロマトグラフィーなどのタンパク質精製技術を用いて細胞溶解物から単離することができる。単離されると直ちに、組換えタンパク質は、所望であれば、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC；例えば、Fisher、「Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology」、Work and Burdon編、Elsevier、1980)によりさらに精製することができる。
【００７１】
本発明のポリペプチド、特にトレフォイルペプチド断片はまた、例えば、メリフィールド（Merrifield）固相合成、溶液相合成、または両方の組み合わせを使用した化学合成により製造するができる(例えば、「the methods described in Solid Phase Peptide Synthesis」、第2版、1984、The Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォードを参照のこと)。選択的に、ペプチド断片はその後、標準ペプチドアセンブリ化学により縮合される。
【００７２】
以下の実施例は、本発明の原理およびトレフォイルペプチド療法の必要が示される状況を説明しようとするものである。以下の実施例は限定しようとするものではない。
【００７３】
実施例1：ライノウイルスに起因する鼻炎の治療
患者は、鼻風邪の発症後直ちにトレフォイルペプチド-含有調製物の投与を開始する。調製物は治療用量のITF15-73を含む。トレフォイルペプチドは鼻スプレーとして標準製剤化法を用いて投与することができ、50mg/mlのトレフォイルペプチドスプレー、100μlが送達される。患者はその後の5日間、12時間毎に鼻スプレーを自己投与することにより薬物治療を受ける。また、トレフォイルペプチド活性物質は、標準用量の充血除去剤鼻スプレー(例えば、0.05%オキシメタゾリンHCl)と共に適用してもよい。
【００７４】
実施例2：花粉に起因するアレルギー性鼻炎の治療
花粉症の季節中、アレルギー性鼻炎に影響される患者に、ジフェニルヒドラミン、フェキソフェナジン、セチリジン、またはロラタジンなどの抗ヒスタミン剤を投与する。また、同時に、治療用量のITF15-73を含む鼻スプレー調製物を患者に投与する。一例では、この構成要素は、標準製剤化法を使用する鼻スプレーであり、5mg/mlのITFスプレーが送達される。その後5日間連続して、患者は12時間毎に、または必要に応じて鼻スプレーを自己投与することにより薬物治療を受ける。重篤な症例では、ITF活性物質はさらに、標準用量の鼻グルココルチコイドスプレー(例えば、ベクロメタゾン、フルチカゾン、モメタゾン、またはトリアムシノロン)と共に適用してもよい。
【００７５】
実施例3：ウイルス感染後の長期気管支痙攣の治療
ウイルス感染後の気管気管支上皮破壊の治療において、トレフォイルペプチド含有物質を標準用量の吸入サルメテロール調製物と共に、乾燥粉末吸入器、エアロゾル定量吸入器中で、または超音波もしくは空気ジェット噴霧器内の溶液または懸濁として、製剤化してもよい。治療は、患者が少なくとも72時間の期間、12時間毎に、薬剤を自己投与することにより、続けられる。
【００７６】
実施例4：成人呼吸促迫症候群(ARDS)の治療
急性呼吸促迫症候群(ARDS)は、様々な損傷に対する反応における肺の特徴的な応答である。ARDSの治療は、肺にもたらされた損傷を最小に抑えるために可能な限り早く開始される。治療の目的は、呼吸器系(および他の系)の不全に対し十分なサポートを提供し、これらの系に治癒する時間を与えることである。ARDSにおける呼吸器系不全の主な対症治療は機械的換気(呼吸装置)であり、高量の酸素および、PEEP(呼吸終末陽圧)と呼ばれる圧力の連続レベルが損傷した肺に送達される。治癒を促進するために、既存のARDSまたは前ARDS症候群を患う患者に吸入によりトレフォイルペプチドを投与する。ITF21-73の量は24時間毎に1000mgのオーダーである。症例の重篤度および患者の臨床応答に応じて、治療を少なくとも72時間続ける。投薬計画を治癒するまで、または10日の治療期間の間、繰り返す。これらの患者には、より少ない頻度(例えば、12時間毎または24時間毎)、およびより高い濃度で、肺毛細血管上皮のペプチドへの曝露を増強させる製剤と共に、またはそのような製剤無しで、トレフォイルタンパク質を投与することがより好都合な可能性がある。トレフォイドペプチド療法と共に使用してもよい他の形態の治療としては、例えば、抗生物質、免疫抑制剤、血圧支持薬、経管栄養、および肺内の流体を減少させるために使用される利尿薬が挙げられる。ARDSの病状はまた過剰に産生した一酸化窒素と関連しているので、所望であれば、NO遮断薬を投与してもよい。
【００７７】
実施例5：ヒト呼吸器合胞体ウイルスの治療
ヒト呼吸器合胞体ウイルスは世界中の若い子供達のウイルス性気道疾患に対する入院の最も重要な原因である。初感染により通常、上気道症状が生じる。感染は上気道で始まるが、分泌物の吸引により、または呼吸上皮を介して、下気道まで広がることがあり、細気管支炎または肺炎が引き起こされる。感染中、RSVは上皮および細気管支線毛器官に広範な損傷を引き起こす。RSVの影響を受けた子供達に、ITF療法を適用して、呼吸上皮の回復を促進する。患者には、例えば、乾燥粉末吸入器、エアロゾル定量吸入器、超音波または空気ジェット噴霧器中の溶液または懸濁液を用いることにより、トレフォイルペプチドが投与される。トレフォイルペプチドは1日につき3回投与され、その用量は1mg/パフである。望ましくは、疾病の重篤度および期間を軽減することができるエアロゾル化薬であるリバビリンもまた投与される。
【００７８】
実施例6：インフルエンザ感染の治療
インフルエンザウイルスは気管および気管支の上皮細胞に感染する。感染による上皮の広汎な損傷により、重篤な咳ならびに胸の痛みが生じ、損傷を受けた細胞からサイトカインが放出されるとさらに、熱、悪寒、倦怠感、および筋肉痛が引き起こされる。また、上皮粘膜がひどく破壊されると、二次細菌感染および気管支炎に至ることがある。症状を緩和し回復速度を加速するために、感染症状が現れると直ちに患者にトレフォイルペプチド療法を適用する。ITF、または生物学的に活性なその断片を、乾燥粉末吸入器、吸入されるエアロゾル定量用量中で、超音波または空気ジェット噴霧器内の溶液または懸濁液として、投与される。また、鼻スプレーにより患者にトレフォイルペプチド療法を適用してもよい。この療法は、1日につき3または4回適用され、症状の消散後1週間続けてもよい。
【００７９】
実施例7：慢性気管支炎の治療
慢性気管支炎は典型的には、気道の慢性的な炎症により、または細菌感染により引き起こされる。そのため、しばしば喫煙と関連する状態であり、その発病は気腫としばしば関連する。患者は典型的には痰を伴う慢性咳を有する。気管支炎に由来する上皮への損傷により、肺炎球菌の侵入を受けやすくなり、肺炎などの他の合併症に至ることがある。そのため、呼吸上皮の修復または改善により、慢性気管支炎に関連する症状が軽減される。慢性気管支炎と診断された患者、または喫煙者は直ちに、乾燥粉末吸入器、吸入されたエアロゾル定量用量中で、または超音波もしくは空気ジェット噴霧器中の溶液または懸濁液としてトレフォイルペプチドを投与される。患者は、少なくとも7日間、または咳が止まるまで、1日に少なくとも3回、この投薬計画を自己適用することができる。所望であれば、トレフォイルペプチド療法は抗生物質の投与を含んでもよい。
【００８０】
実施例8：煙吸入により引き起こされた病変の治療
煙などの急激に作用する毒素により引き起こされた直接的な毒性影響は、瞬時に患者を再起不能とすることがある。そのため、気管支痙攣及び肺胞損傷を含む結果的な影響は、患者の急激な悪化および高い死亡率を引き起こすことがある。煙の吸入により患者の炎症応答が始まり、ヒスタミンおよび他の血管作用物質の放出が引き起こされ、呼吸上皮に損傷が起こる。治療は煙吸引により引き起こされる損傷の重篤度により変動する。治療の第一焦点は、気道を確保し、十分なレベルの酸素を供給することである。気道が安定に確保されれば、患者にはマスクによる高流速加湿100%酸素の供給を行ってもよい。気道組織の腫脹が気道を閉鎖している場合は、患者に気管内チューブを挿入し、人工的に気道を確保する必要がありうる。
【００８１】
患者には少なくとも5日間、ジェット噴霧器によりITF25-73が直ちに、および連続して投与され、煙により誘発された気道上皮への損傷および高圧酸素療法の悪影響が軽減される。
【００８２】
実施例9：喘息治療
喘息の管理は、呼吸上皮に損傷を引き起こす、根底にある炎症過程を治療して、症状を緩和および阻止することに主に関係する。さらに、治療しないと、慢性的な炎症により冷気、運動、チリダニ、空気中の汚染物質などの刺激物に対し気道が過剰応答し、上皮に対する損傷が悪化する。その結果、喘息患者には、抗炎症剤であるテオフィリン、および治療有効量のITF15-73を投与し、喘息関連症状を改善させ、呼吸気道に対する損傷を軽減させる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ヒト腸トレフォイル因子のアミノ酸配列である(ITF；アクセッション番号BAA95531)(配列番号:1)。
【図２】ヒトpS2タンパク質のアミノ酸配列である(アクセッション番号NP_003216)(配列番号:2)。
【図３】ヒト鎮痙性ポリペプチドのアミノ酸配列である(SP; アクセッション番号1909187A)(配列番号:3)。
【図４】ヒト腸トレフォイル因子をコードするcDNA配列である(配列番号:4)。
【図５】ヒトpS2タンパク質をコードするcDNA配列である(配列番号:5)。
【図６】ヒト鎮痙性ポリペプチドをコードするcDNA配列である(配列番号:6)。
【図７】ヒト腸トレフォイル因子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列である(座位10280533:52117-55412)(配列番号:7)。
【図８】ヒトpS2タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列である(座位10280533:16511-21132)(配列番号:8)。
【図９】ヒト鎮痙性ポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列である(座位10280533:957-5208)(配列番号:9)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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