(57)【要約】生体組織シートのスタックに圧縮力を作用させ、これにより隣接層を相互に融合または接着させることによって、ヒトまたは動物組織を製造する方法。組織の表面に対して法線方向に力を作用させる。上記の方法により作製された多層構造の組織はまた、少なくとも２つの異なる種類のシートを有することができ、および／または本質的に２〜１２の生体組織シートからなるものとすることができる。この方法はまた、多層構造の組織構築物に組み込むことのできる平面的な組織を作製するためにも使用することができる。本明細書に記載の方法および組織は人工組織の作製に有用である。
2005532853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生体組織シートからヒトまたは動物組織を製造する方法であって、
（ａ）該少なくとも１つの生体組織シートを配置して生体組織の多層スタックを形成する工程、および
（ｂ）隣接する組織層を相互に融合または接着させるために、複数の組織層を一緒に圧縮するのに十分な圧力にて、かつ、十分な時間にわたって、加圧手段を用いて生体組織の多層スタックの表面に対して法線方向に圧縮力を作用させる工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記多層スタックが実質的に平坦な支持体上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における生体組織の前記多層スタックが、２つ以上の生体組織シートを重ね合わせることにより形成される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
生体組織の前記多層スタックが、生体組織シートを折りたたむことにより形成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
加圧する前記工程（ｂ）の前に、固定手段を用いて生体組織の前記多層スタックを固定する工程をさらに含んでなり、該固定手段が、生体組織の該多層スタックの全体にわたり、収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または繊維配向を促すために十分な張力を作用させるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定手段が、実質的に生体組織の前記多層スタックの辺縁部に配置される、離間された多数のウェイトまたはインゴットを含んでなるものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）における前記加圧手段が、生体組織の前記多層スタックに実質的に均等に分散された圧力を作用させるのに好適な、組織培養培地に対して少なくとも部分的に透過性を有する荷重装置を含んでなるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における生体組織の多層スタックが、生体組織シートを環状支持体に巻くことにより形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）における前記加圧手段が、組織培養培地透過性の弾性スリーブを含んでなるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの生体組織シートが生検材料である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの生体組織シートが、細胞をin vitroで培養することにより得られるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、胚幹細胞、生後幹細胞、成人幹細胞、間葉細胞、肝細胞、島細胞、実質細胞、骨芽細胞および骨もしくは軟骨を形成する他の細胞、ならびに神経細胞からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記間葉細胞が、繊維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、繊維筋芽細胞、および外胚葉細胞からなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生体組織シートが、皮膚組織、角膜組織、心臓弁組織、結合組織、および間葉組織からなる群から選択されるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に従って製造された多層構造の組織であって、少なくとも２つの異なる種類の生体組織シートを含んでなる、多層構造の組織。
【請求項１６】
本質的に２〜１２個の生体組織シートからなる、請求項１５に記載の多層構造の組織。
【請求項１７】
本質的に３〜９個の生体組織シートからなる、請求項１５に記載の多層構造の組織。
【請求項１８】
約０．０１ｍｍ〜約０．５ｍｍの厚さを有する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の多層構造の組織。
【請求項１９】
約０．０３ｍｍ〜約０．４５ｍｍの厚さを有する、請求項１８に記載の多層構造の組織。
【請求項２０】
少なくとも１つの生体組織シートから多層構造の組織構築物を製造するために好適な平面的なヒトまたは動物組織を製造する方法であって、
（ａ）該少なくとも１つの生体組織シートを実質的に平坦な支持体表面に配置する工程、および
（ｂ）多数の離間されたアンカーを含んでなる調節可能な固定手段を用いて、該少なくとも１つの生体組織シートを支持体表面に固定する工程
を含んでなり、前記アンカーが、（１）前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または細胞の配向を促すために十分な張力を生体組織シート全体に作用させ、かつ、（２）生体組織シート全体にわたって所定の張力閾値を一旦超えた場合に、前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を可能にするために好適なものである、方法。
【請求項２１】
前記アンカーが、個別に移動可能な複数のウェイトまたはインゴットである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの生体組織シートが、２つ以上の重ね合わされた生体組織シートを含んでなるものである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの生体組織シートが、折りたたまれたものである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの生体組織シートが、細胞をin vitroで培養することにより得られたものである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法に従って製造された、本質的に２〜１２個の生体組織シートからなる、多層構造の組織。
【発明の詳細な説明】
【他の出願の参照】
【０００１】
本願は２００２年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／３９６，００４号の利益を主張するものである。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、人工組織に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体組織シートから人工組織を作製する方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
組織工学は、患者へ移植するための組織および臓器を再生するために利用することができる。人工組織および臓器はまた、in vitroモデルとしても利用可能である。組織内植（tissue in-growth）、人工的な足場または生物分解可能な足場、およびコラーゲンゲルへの細胞の播種をはじめとする種々の組織工学技術が知られている。中でも、「自己組織化」法として知られる組織工学の新たな手法が生まれている(L'Heureux et al.; Michel et al.; Pouliot et al.)。自己組織化法では、細胞外マトリックスを分泌し、それを組織化し、その結果として生体組織シートを形成するように細胞を誘導する。自己組織化法は、繊維芽細胞が、アスコルビン酸の存在下で増殖させた場合に好適な細胞外マトリックスを産生し得るという事実を利用している。多層構造の組織構築物を作り出すには、生体組織シートを相互に積み重ねても、それら自体を折り重ねても、または環状支持体に巻いてもよい。
【０００４】
再生組織を産生するための組織工学手法の開発では、再生される組織の形態学的特性および組織学的特性の最適化に焦点が当てられている。ほとんどの組織工学的研究は、組織シートを増殖させる技術を最適化することを中心に行われている。しかしながら、多くの場合、数層の組織および／または２種以上の種類の組織の層からなる再生組織を作製することが望ましい。多層構造の組織構築物は厚くなるために強化されており、また、多層構造の組織構築物が２以上の生体組織シートを含んでなり得ることから、それらを置き換えようとする組織により一層類似するように設計することができる。しかしながら、有用な多層構造の組織構築物を作り出すには、隣接する細胞組織層が可能な限りしっかりと、かつ、確実に一緒に結合されるようにそれらの層を一緒に融合させ、分離に耐え得ることが必要である。組織のこれらの層がうまく一緒に融合されないと、それらはやがて、例えば、処理中に、または患者の体内で、分離または分解するかもしれない。
【０００５】
上記のことから、隣接する組織層間の融合が改善された多層構造の人工組織構築物を作製するための方法が望まれている。
【０００６】
背景技術の説明
Ye et al.は、機械的応力が、繊維芽細胞による主要な細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンの合成および分泌を促進し、その結果として、再生された組織の硬度の機械的強度が増強され得ることを教示している。Ye et al.は、繊維芽細胞のシートをフレームに取り付けて張力を作用させるといった、機械的応力を作用させる方法を開示している。しかしながら、この方法によって作製された再生組織は、生来の組織よりもコラーゲン含量が大幅に少なく、そのため、生来の組織のような機械的特性を有しているとは考えられない。
【０００７】
Kanda et al.は、機械的応力が、培養平滑筋細胞の細胞配向および表現型の変調を促すことを教示している。
【０００８】
L'Heureux et al.は、生体組織シートを環状支持体に巻きつけることにより組織工学的に作製された血管（tissue-engineered blood vessel）（ＴＥＢＶ）を作製する方法を開示している。
【０００９】
Lopez-Valle et al.は、多孔質ガラス超極細繊維材料で作製された連続（断続的または不連続とは対照的なものとして）アンカーの使用を開示しており、該アンカーの孔隙によってコラーゲン繊維が捕捉され、それにより細胞外マトリックスの組織化および細胞の配向が促されることを開示している。
【発明の概要】
【００１０】
本発明によれば、多層構造の人工組織構築物における隣接する生体組織層間の融合を改善するための方法が提供される。さらに、本発明によれば、多層構造の人工組織構築物の作製用に好適な生体組織シートを作製する方法が提供される。この方法により作製された多層構造の再生組織では組織層間の融合が改善されており、また、その後の取扱いにおいてそれらの組織層が分離する可能性は低い。
【００１１】
よって、本発明の一つの態様によれば、少なくとも１つの生体組織シートからヒトまたは動物組織を製造する方法であって、（ａ）少なくとも１つの生体組織シートを配置して生体組織の多層スタックを形成する工程、および（ｂ）隣接する組織層を相互に融合または接着させるために、複数の組織層を一緒に圧縮するのに十分な圧力にて、かつ、十分な時間にわたって、加圧手段を用いて生体組織の多層スタックの表面に対して法線方向に圧縮力を作用させる工程を含む方法が提供される。
【００１２】
特定の好ましい実施態様によれば、実質的に平坦な支持体上に配置された生体組織の多層スタックを形成することにより組織を製造する方法が提供される。より好ましくは、その多層スタックは、２つ以上の生体組織シートを重ね合わせることにより、および／または生体組織シートを折りたたむことにより形成される。
【００１３】
他の実施態様では、前記方法は、その多層スタックが、その後、ウェイトまたはインゴットを含んでなる移動可能なアンカーを用いて実質的に平坦な支持体表面に固定されるもう１つの工程を含んでなり、そのアンカーは、（１）前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または細胞の配向を促すために十分な張力を生体組織シート全体に作用させ、かつ、（２）生体組織シート全体にわたって所定の張力閾値を一旦超えた場合に、前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を可能にするために好適な重量を有するものとされる。次いで、隣接する組織層を相互に融合させるために、組織の多層スタックの表面に均等に分散された圧力を作用させるのに好適な、培養培地に対して少なくとも部分的に透過性がある荷重装置によって、組織層の表面に対して法線方向の力を作用させる。
【００１４】
好ましい実施態様によれば、前記方法の工程（ｂ）における前記加圧手段は、生体組織の前記多層スタックに実質的に均等に分散された圧力を作用させるのに好適な、組織培養培地に対して少なくとも部分的に透過性を有する荷重装置を含んでなる。
【００１５】
他の実施態様によれば、前記方法の工程（ａ）における前記多層スタックは、生体組織シートを環状支持体に巻くことにより形成され、より好ましくは、工程（ｂ）における前記加圧手段は、組織培養培地透過性の弾性スリーブを含んでなるものとされる。
【００１６】
本明細書に記載の方法に使用することができる生体組織シートには多くの種類がある。一つの実施態様によれば、該方法に生体組織シートとして生検材料を用いる。他の実施態様によれば、前記方法に生体組織シートとしてin vitroで培養した細胞を用いる。より好ましくは、該細胞は、胚幹細胞、生後幹細胞、成人幹細胞、間葉細胞、肝細胞、島細胞、実質細胞、骨芽細胞および骨もしくは軟骨を形成する他の細胞、ならびに神経細胞とされる。間葉細胞は、繊維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、繊維筋芽細胞、または外胚葉細胞のいずれかとすることができる。他の実施態様によれば、生体組織シートは、皮膚組織、角膜組織、心臓弁組織、結合組織および／または間葉組織とすることもできる。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、本明細書に記載の方法に従って製造された多層構造の組織が提供され、該多層構造の組織は、少なくとも２つの異なる種類の生体組織シートを含んでなる。好ましい実施態様によれば、その組織は、本質的に、２〜１２個のシートからなり、より好ましくは３〜９個のシートからなる。他の実施態様によれば、その組織は、約０．０１ｍｍ〜約０．５ｍｍの厚さを有し、より好ましくは約０．０３ｍｍ〜約０．４５ｍｍの厚さを有する。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、少なくとも１つの生体組織シートから多層構造の組織構築物を製造するために好適な平面的なヒトまたは動物組織を製造する方法が提供され、該方法は、（ａ）該少なくとも１つの生体組織シートを実質的に平坦な支持体表面に配置する工程、および（ｂ）多数の離間されたアンカーを含んでなる調節可能な固定手段を用いて、該少なくとも１つの生体組織シートを支持体表面に固定する工程を含んでなる。この方法において、前記アンカーは、（１）前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または細胞の配向を促すために十分な張力を生体組織シート全体に作用させ、かつ、（２）生体組織シート全体にわたって所定の張力閾値を一旦超えた場合に、前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を可能にするために好適なものとされる。
【００１９】
好ましくは、前記調節可能な固定手段は、複数のウェイトまたはインゴットなどの、個別に移動可能なアンカーを含んでなるものである。あるいは、前記調節可能な固定手段は、移動可能なフレームまたはフレームに取り付けられた多数の移動可能なアンカーを含んでなるものであってもよい。
【００２０】
特定の好ましい実施態様によれば、平面的な構築物を、２つ以上の生体組織シートを重ね合わせることによるか、または生体組織シートを折りたたむことにより、生体組織の多層スタックを形成することによって製造することができる。該多層スタックは、その後、ウェイトまたはインゴットを含んでなる移動可能なアンカーを用いて実質的に平坦な支持体表面に固定される。ここで、前記アンカーは、（１）前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または細胞の配向を促すために十分な張力を生体組織シート全体に作用させ、かつ、（２）生体組織シート全体にわたって所定の張力閾値を一旦超えた場合に、前記少なくとも１つの生体組織シートの収縮を可能にするために好適な重量を有するものである。次いで、隣接する組織層を相互に融合させるために、組織の多層スタックの表面に均等に分散された圧力を作用させるのに好適な、培養培地に対して少なくとも部分的に透過性を有する荷重装置によって、組織層の表面に対して法線方向の力を作用させる。
【００２１】
他の実施態様によれば、平面的な構築物の製造に使用される生体組織シートは、細胞をin vitroで培養することにより得られる。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、本明細書に記載の方法により得られる、本質的に２〜１２個の生体組織シートからなる平面的な多層構造の組織が提供される。
【００２３】
他の特定の実施態様によれば、生体組織シートを、例えば環状支持体を用いて、丸めることによって生体組織の多層スタックを形成することにより管状構築物を製造することができる。培養培地透過性の弾性スリーブは、隣接する組織層を相互に融合させるために、生体組織の多層スタックの組織の層を一緒に圧縮するのに使用することができる。
【００２４】
本発明の他の実施態様および利点は、以下の具体的説明、ならびに添付の図面から明らかになる。
【００２５】
本明細書に引用した全ての出版物、図面、特許および特許出願は、それぞれが個々に記載されたのと同程度に、あらゆる目的のために、それらの全開示内容が引用により明示的に本明細書の一部とされる。
【好ましい実施態様の詳細な説明】
【００２６】
本発明によれば、組織シートの面に対して法線方向の圧縮力を作用させることにより、組織シートの隣接層間の融合が強化されることが見出されている。圧縮により組織層の間の接触が改善され、複数の組織層の融合が促進される。例えば、荷重装置（例えば、離間されたウェイトをその上に置いたスポンジ）を２つ以上の重ね合わされた平面的な組織シートのスタックに適用し、これにより、組織シートの面に対して法線方向の力を作用させてもよい（図１Ｂを参照）。他の例では、適当な大きさの弾性スリーブを、少なくとも１つの組織シートを環状支持体に巻くことにより作製された組織の多層スタックに取り付けることができ、これにより、弾性スリーブが組織シートの二次元面に対して法線方向の圧力を作用させる（図２を参照）。
【００２７】
好ましくは、圧縮力または圧力を組織表面全体に均等に作用させる。そのため、融合を促すには組織の形に適合した装置を使用することが好ましい。組織スタックの表面に作用させる圧力の量は、人工組織の必要性に応じて調整することができる。この圧力は、組織層を完全に融合させるために十分な時間、好ましくは２４時間〜７日間作用させる。
【００２８】
また、組織の表面に圧力をもたらすために使用される装置は、生細胞の栄養摂取を可能にするために、培養培地に対して透過性を有することが好ましい。平坦な組織にこの圧力をもたらすための許容される方法は、組織スタックの上に半硬質スポンジを置く方法である。さらに、ウェイト（例えば、１個以上の固体インゴット）をスポンジの上に配置して、組織に所望の量の圧力を加えることができる（図１Ｂを参照）。当然ながら、この圧縮を行うために機械的圧力または水圧を利用する他のシステムを使用することができる。
【００２９】
管状または円筒状構築物の例では、圧縮装置は、構築物の外部表面に均等な圧力を作用させるものであることが好ましい。この場合、組織を圧縮するための良い方法は、構築物に弾性および透過性のスリーブを取り付ける方法である（図２を参照）。スリーブの大きさおよび弾性は、用いられる組織に好適な圧力を与えるように調整することができる。
【００３０】
組織を損傷させることなく、スリーブを組織に巻きつけ、それを取り外すために、取り付け装置を使用してもよい（図２を参照）。硬質中空管（８）にその管のテーパー端部（９）を利用して弾性スリーブ（７）を取り付ける。次いで、構築物より少し大きな内径を有する管をマンドレル（１１）に巻かれた管状組織（１０）に被せる。スリーブの端部をマンドレルに固定し、中空管を反対側から引いて慎重に取り除き、組織にそのスリーブを徐々に被着する。組織を損傷させることなくスリーブを取り外すには、例えば、それを慎重にカットしてもよいし、またはほどいてもよい。
【００３１】
培養平滑筋細胞の細胞配向および表現型の変調を促すために、機械的応力を利用し得ることが知られている（Kanda et al.; Germain et al.）。よって、繊維配向を促すために、成熟過程にある組織に好適な力を作用させてもよい。このような力はまた、収縮を防止し、所望の細胞分化も維持し得る。
【００３２】
一例として、細胞の配向を促すために、組織を縁取るかまたはこれを取り囲むガラス超極細繊維のフレームまたはリングなどの連続アンカーを使用し得ることが示されている（Ye et al.; Kanda et al.）。連続アンカーは、成熟過程にある培養組織の自然収縮を機械的に制限し、それにより、組織全体に細胞の配向を促す機械的応力または張力を生み出すため、細胞の配向の誘導が起こると考えられる。
【００３３】
配向応答のメカニズムは十分には解明されていない（Kanda et al.）。しかしながら、連続アンカーを使用する場合には、組織が成熟するにつれて組織全体にわたる張力が高まり続け、組織の細胞の健全性に悪影響を及ぼすレベルに達し、組織に含まれる細胞の生存能力が低下するために、質の悪い組織構築物が産生することがある。そのため、硬質フレームなどの連続アンカーは、いくつかの組織タイプ、すなわち、成熟するにつれて多くの張力を生み出し得る組織での使用には適さないことがある。
【００３４】
本発明によれば、成熟過程にある培養組織を固定する改善された方法が提供され、該方法は、好ましくは多数の離間されたアンカー（移動可能なウェイトまたはインゴットなど）を含む、調節可能な固定手段を含んでなる。ここで、前記アンカーは、（１）少なくとも１つの生体組織シートの収縮を防止し、および／または細胞分化を維持し、および／または細胞の配向を促すために十分な張力を生体組織シート全体に作用させ、かつ、（２）生体組織シート全体にわたって所定の張力閾値を一旦超えた場合に、少なくとも１つの生体組織シートの収縮を可能にするために好適なものである。具体例については図１Ａを参照されたい。
【００３５】
固定手段は、一旦組織がアンカー（すなわち、ウェイトまたはインゴット）により適用され得る最大張力より大きな張力を獲得すれば、その組織が自然に収縮することができ、収縮する組織に同調してアンカーが引き寄せられるという点において「調節可能」である。従って、このような調節可能な固定手段を使用する場合には、組織全体にわたる張力が高まり続けることはない。組織全体に作用する可能性がある最大張力は、好適なアンカー（例えば、特定の重量および数のウェイトまたはインゴット、または特定の張力もしくは力に応じて移動するように設計された調節可能なフレーム）を選択することにより制御することができる。このようにして、用いられる組織に対する張力の量を最適化し、例えば、組織の細胞の生存能力を高めることが可能である。
【００３６】
本発明によるアンカーは「不連続」または「規則的」であってよい。「不連続アンカー」または「規則的アンカー」は、実質的に間隔のあいた点で組織を固定する装置である。それとは対照的に、本発明に関して、「連続アンカー」とは、組織のその全辺縁部を固定するための装置を意味する（例えば、Lopez-Valle et al.により記載されている）。
【００３７】
本発明によるアンカーは、それらを容易に組織シートの上に置くことができるし、またはそこから取り外すことができるという点において「移動可能」であり得る。
【００３８】
多層構造の組織構築物を製造するための平面的な生体組織シートを作製するために、アンカーが、組織シートの縁部に近接して閉じた周界を形成するように配置されることが好ましい。この幾何学的構造により、組織シートの細胞と細胞外マトリックス繊維が組織シートの面の二次元に配向するように誘導される。細胞と細胞外マトリックスのこの配向は組織シートの隣接層の融合に有益であり、また、組織の特定の機能特性も向上させ得る。例えば、図１Ａでは、第一の生体組織シート（１）を平坦な表面上に配置し、インゴット（２）を用いて第一のシートを所定位置に維持する。第二の生体組織シート（３）を第一のシートの上に置く。インゴットを第一のシートから外し、第二のシートの上に配置してシートのスタックを固定する。インゴットは生体シートのスタックの辺縁部に沿って配置する。インゴットはまた、生体シートに不連続な機械力を与えて細胞分化および収縮をも可能にする。この工程を繰り返して多層構造の組織構築物を得る。
【００３９】
本発明によれば、組織に対し、機械力を生体組織シートの縁部に沿って断続的または不連続に（in a punctuated or discontinuous manner）作用させるためのアンカーとしての、多数の離間されたウェイトまたはインゴットの使用が提供される。ウェイトまたはインゴットが互いに近接して配置されるか、または互いに接触するように配置される場合には、組織が収縮する際にそれらが多少互いに押しのけ合う可能性がある。組織シートに作用させる機械力の量および方向は、ウェイトまたはインゴットの数、重量、および位置を変えることによって制御することができる。このようにして、特定の大きさまたは種類の組織に対する機械力の条件を最適化するか、または微調整することが可能である。
【００４０】
本発明は、Lopez-Valle et al.により開示された多孔質ガラス超極細繊維材料で作製された連続アンカーとは対照的なものである。Lopez-Valle et al.により開示されたもののような多孔質連続アンカーは、動かしたり、取り外したり、または調整したりすることが容易ではなく、結果として、このようなアンカーは組織への機械力の作用を微調整する能力を有さない。
【００４１】
本発明に従ってアンカーとして使用するウェイトまたはインゴットは、ステンレス鋼などの生体組織シートの細胞の発達または分化を妨げないいかなる材料から作製されたものであってもよい。テフロン（登録商標）または組織培養に適合する当技術分野で公知のいかなるポリマー材料でコーティングしたマグネットまたは金属インゴットも使用し得る。ある組織タイプでの使用に好適なウェイトまたはインゴットの重量値は実験的に決定することができる。好ましくは、細胞の配向および／または分化が促されるように重量が選択される。
【００４２】
調節可能／移動可能なアンカーを使用し、組織を一緒に融合するために圧縮する前述の技術は、三次元組織構築物の作製にも利用し得る。
【００４３】
生体組織シートの作製
本発明に従って多層構造の再生組織の作製に使用する生体組織シートは、生検材料から作製してもよいし、または公知の技術を利用して作製してもよい。間葉に由来する生体組織シートを組織工学技術を利用して作製する場合において、好ましい方法は、正常な細胞−細胞相互作用および細胞−細胞外マトリックス相互作用を可能にする自己組織化アプローチである。さらに、自己組織化アプローチは、重要な天然の増殖因子およびサイトカインの分泌、ならびに組織の機能性および組織中の細胞を代謝的に活性な状態に保ち、該細胞に正常な有糸分裂を行わせるのに必要な成熟結合組織の形成を可能とする。
【００４４】
以下のサブセクションでは、in vitroでのヒト人工組織の作製とその使用を記載する。しかしながら、本発明はヒト人工組織に限定されるものではなく、動物組織および形質転換された（ヒトおよび非ヒト）細胞を含む人工組織をも包含する。
【００４５】
細胞の供給源
本発明によるヒト人工組織には種々の細胞を使用することができる。好ましい細胞型としては、胚幹細胞、羊水細胞、生後幹細胞、成人幹細胞、間葉細胞（特に、繊維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、平滑筋細胞または骨格筋細胞、筋細胞（筋肉幹細胞）、軟骨細胞、含脂肪細胞、繊維筋芽細胞、ならびにダクティル細胞(ductile cell)およびスキル細胞(skill cell)などの外胚葉細胞）、肝細胞、島細胞、腸に存在する細胞および他の実質細胞、骨芽細胞および骨もしくは軟骨を形成する他の細胞、骨髄細胞、ならびに血液細胞が挙げられる。神経細胞を含むことが望ましい場合もある。
【００４６】
また、さらなる機能または正常な機能を付与するために細胞を遺伝子操作することもできる。レトロウイルスベクター、ポリエチレングリコールを用いて細胞を遺伝子操作する方法、および当業者に公知の他の方法を使用することができる。
【００４７】
細胞は、自己細胞、同種異系細胞または異種細胞であってよいが、自己細胞または同種異系細胞が好ましい。胚細胞または胎児細胞、幹細胞、および免疫抑制の必要がないように遺伝子操作されている細胞などの、免疫学的に不活性な細胞もまた使用してよい。免疫抑制に向けた方法および薬物は、移植技術分野の当業者には公知である。
【００４８】
いくつかの実施態様では、生検により細胞を得、コラゲナーゼ、トリプシンまたは他のプロテアーゼ溶液による消化などの標準的な技術を利用してそれを解離する。例えば、Germain and Augerの方法に従って皮膚生検材料の真皮層をコラゲナーゼにより消化することができる。真皮断片の消化後、間葉細胞を遠心分離により集め、細胞培養培地で増殖させる。全ての細胞培養物をそれらの第４〜第８継代間で使用し、３７℃にて、８％ＣＯ２でインキュベートしておく。細胞は、体内のいかなる場所の生検材料からでも容易に得ることができる。例えば、骨格筋生検材料は腕、前腕、または下肢から容易に得ることができるし、また、平滑筋は全身の皮下組織に隣接する部位から得ることができる。生検材料は生検針、手順が極めて単純で、ほとんど痛みのないラピッドアクションニードル(rapid action)針を使用して容易に得ることができる。細胞はまた、例えば、血管、臍帯血などの血液、弁ならびに整形外科(esthetic surgical)または美容整形(cosmetic surgical)手術中に得られる包皮および組織などの廃棄組織からも得ることができる。
【００４９】
繊維芽細胞、例えば真皮繊維芽細胞または外膜繊維芽細胞、を使用してもよい。繊維芽細胞は容易に入手できるものであり、結合組織中における主要なコラーゲン分泌細胞である。真皮繊維芽細胞は、通常、乳房縮小手術中に摘出された正常な成人皮膚試料から、または新生児包皮から採取される。１平方インチの包皮に含まれる細胞から大きな組織へと成長させることができるため、心血管適用に向けたヒト繊維芽細胞の可能性は、同種異系移植片および自己移植片のいずれに関しても大きい。
【００５０】
生体組織シートの作製
本発明による人工組織は少なくとも１つの生体組織シートから形成される。各生体組織シートは、細胞および内因性細胞外マトリックスを含んでなるものである。細胞外マトリックスは、２〜３例を挙げると、間葉細胞、胚幹細胞または成人幹細胞などの細胞により分泌される。真皮繊維芽細胞などの間葉細胞を平面的な培養床でＬ−アスコルビン酸またはＬ−アスコルビン酸のリン酸誘導体（例えば、Ａｓｃ ２−Ｐ）、血清、および増殖因子を使用して培養すると、それらは細胞外マトリックスタンパク質の十分な合成を示す。こうして、内因性細胞外マトリックスの基礎が築かれる。Ｌ−アスコルビン酸は、コラーゲンのプロリンおよびリジン残基のヒドロキシル化の補因子であり(Hata and Senoo)、また、プロコラーゲン遺伝子の転写速度およびプロコラーゲンｍＲＮＡの安定性のいずれもを高める(Tajima and Pinnell)ことから、それは重要な役割を果たす。細胞外物質は、異なるタンパク質、例えば、２〜３例を挙げると、Ｉ型コラーゲン、他のコラーゲンタイプ（繊維性および非繊維性）、エラスチン、フィブリリン、グリコサミノグリカン（デコリンなど）、増殖因子、および糖タンパク質を含んでなる。
【００５１】
本発明において、上記のように細胞と細胞外マトリックスから形成された生体組織を「生体組織シート」という。
【００５２】
このような生体組織シートを作製するための手順の典型的な実施態様については、Auger et al.による米国特許第５，６１８，７１８号明細書に記載されている。要約すれば、Auger et al.は次のようなことを記述している。真皮繊維芽細胞を、１０４細胞／ｃｍ２に相当する濃度にて、７５ｃｍ２滅菌ペトリ皿に播種する。細胞培地には３：１のＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２改変培地、ウシ胎児血清、ペニシリンおよびゲンタマイシン、ならびにアスコルビン酸溶液を補充する。例えば、５０〜１００μｇ／ｍｌの間の最終アスコルビン酸溶液を隔日で使用してもよい。培養条件は、十分な湿度にて９２％空気および８％ＣＯ２に維持される。培養時間は約３週間である。成熟期間が終わった時に、生体組織シートは床から自然に離れる。
【００５３】
当然のことながら、生体組織シートの作製には種々の方法（例えば、Auger et al.; Ye et al.; L'Heureux et al.; Michel et al.; Pouliot et al.）を利用できるが、生体組織シートの作製にある特定の形（すなわち、厚さおよび大きさ）、細胞型、起源、年齢、成熟期間、成分濃度、および培養条件を使用することにより、本発明の範囲は限定されるものではない。
【００５４】
人工組織の作製
本発明による人工組織は、複数の個々の生体組織シートを重ね合わせることにより形成される。一つの実施態様では、シートの数は２〜１２とされる。上記のように、生体組織シートは、間葉細胞などの細胞により分泌される細胞外マトリックスを含んでなる。細胞外マトリックスは、コラーゲンの超分子構築をはじめとする多くのin vivo様特性により産生される。コラーゲンはプロセシングを受けるだけでなく、効率的に架橋しており、コラーゲン微小繊維が束ねられて構成されている。そのシートを、例えば、折りたたむことにより、もしくは巻きつけることによりそれ自体で層形成させるか、または複数のシートを積み重ねるか、もしくは重ね合わせると、所望の構造特性を有する三次元構築物が培養によって形成される。
【００５５】
いくつかの実施態様では、生体組織シートを、直接重ね合わせるか、または部分的に重複させる(overlapping)ように、細胞培養皿内で積み重ねる。部分的に重複させることにより、種々の形の組織が形成され得る。例えば、長方形の生体組織シートを部分的に重複するように配置して、円形の層状組織構築物を作製し得る。あるいは、不規則な形をした細胞培養シートを規則的な形をした組織が形成される様に積み重ねてもよい。さらに、各シートを同じ方向に積み重ねてもよいし、またはシートの方向を、結果として生じる組織に特別な効果をもたらすように変えてもよい。
【００５６】
あるいは、またはこれに加えて、１以上の生体組織シートを折りたたんで多重層を形成してもよい。例えば、１つのシートを、それ自体をアコーディオン式に折りたたんでもよいし、またはそのシート自体の部分どうしが重なり合うように、半分折りを繰り返すことにより折りたたんでもよい。あるいは、２以上のシートを積み重ねて組織の多層スタックを形成してもよく、その際、その組織の多層スタック自体を折りたたんで、より多様な積層を作り出してもよい。
【００５７】
あるいは、またはこれに加えて、シート自体をシナモンロール式に丸めるなど、巻きつける技術を利用して組織の多層スタックを作り出してもよい。異なる／多くの技術を組み合わせることができ、例えば、まず（１）２以上の組織シートを層にすること、および／または（２）１つの組織シートまたは組織シートの多層スタックを折りたたむことにより、組織の多層スタックを作出し、次いで（１）または（２）の多層スタック自体を丸めることができる。
【００５８】
層にする場合、生体組織シートは、シート間の表面接着により結合される。いずれの数の生体組織シートを使用してもよいが、好ましくは５以上、より好ましくは７以上、より好ましくは９、１０または１１以上である。シートはピンセットで細心の注意を払って取り扱い、重ね合わせるか、あるいは組み立ててヒト人工組織構築物を形成する。この構築物を、Huynh et al.により記載されたものと同様の条件下でアスコルビン酸を補充した培養培地で維持することにより、生体組織シートが一緒に融合して対応する成熟組織に似たヒト人工組織を形成する（図３）。
【００５９】
いくつかの用途では、結果として得られる再生組織が２以上の種類の生体組織シートを含んでなることが好ましい。例えば、皮膚移植片としての使用に好適な再生組織は、真皮等価物および表皮等価物のシートを含んでなることができる。角膜移植片としての使用に好適な再生組織は、次の層：上皮等価物；間質等価物；および内皮等価物を含んでなる必要がある。
【００６０】
構築物の成熟期間は、組織の性質および所望の特定の機械的特性によって異なる。例えば、特定の組織構築物の機械的強度は、７週間の成熟後に安定水準に達するということが見出されている（L'Heureux et al.）。いかなる組織構築物に対しても、最適な機能性を獲得するのに必要な成熟期間は、日常的に使用する当技術分野で公知の方法を利用して容易に決定し得る。
【００６１】
一般に、人工組織は、代謝の必要性を維持するためにその表面を介した酸素供給を可能とする十分な薄さと、所望の機能性を付与するために十分な厚さを有するものである。本発明による人工組織の本実施態様は血管がなく、その組織は酸素を含む血液を組織に供給するための微小血管系を含んでいない。そのため、その組織は組織を維持するためにその表面からの酸素拡散に頼る。酸素拡散制限により、組織の厚さが目下重視すべき事柄となっている（Weind et al.）。人工組織の厚さは使用する生体組織シートの数を選択することにより制御してもよい。人工組織は約０．０１ｍｍ〜０．５ｍｍ、より好ましくは０．０３ｍｍ〜０．４５ｍｍの厚さを有するものであってよい。好ましい厚さは組織タイプ、人工組織の目的の機能、および使用する細胞の種類に応じて異なる。
【００６２】
必要に応じて、成熟組織構築物を、打抜きおよび型板切断(template cutting)などの好適な方法を用いて所望の形にカットしてもよい。
【００６３】
一つの実施態様では、数多くの異なる種由来の細胞および／または形質転換された細胞を使用することができる。人工組織の多くの目的がヒト患者の治療に関係するものであると考えられるため、ヒト人工組織が特に好ましい。
【００６４】
プレコンディショニング
必要に応じて、組織工学的に作製した構築物を、例えば、Lafrance et al.による米国出願に記載されたように、収縮を減らすようにプレコンディショニングしてもよい。
【００６５】
本発明の種々の実施態様が本明細書に開示されているが、多くの調節および改変が、当業者のよく用いられる一般知識によって、本発明の範囲内でなされ得る。このような改変は、実質的に同じ方法で同じ結果を得るための、本発明のあらゆる態様における既知の等価物への置換を含む。数値範囲はその範囲を定義している数値を含む。特許請求の範囲において、「含んでなる(comprising)」とは、「含むがこれ（ら）に限定されない(including, but not limited to)」と実質的に等しい、制約のない用語として用いられている。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、本明細書に開示される本発明の広い態様を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
繊維芽細胞と細胞外マトリックス構成成分を含む生体組織シートからの多層構造のヒト組織再生構築物の作製
以下の実施例では、本発明に従って繊維芽細胞と細胞外マトリックス構成成分を含む生体組織シートから多層構造のヒト組織再生構築物を作製する方法を記載する（方法の例示については図１を参照）。以下に記載する全ての手順は、無菌条件下で、好ましくは無菌フローフード(flow hood)を利用して行われる。当然のことながら、多層構造の組織構築物の作製には種々の方法が利用できるが、本実施例は重ね合わせる組織シートの数、多層構造のヒト組織構築物を作製するためのある特定の形（すなわち、厚さおよび大きさ）、細胞型、起源、年齢、成熟期間、成分濃度、および培養条件に対する本発明の範囲を限定するものではない。当業者であれば、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、該方法に対して種々の改変がなし得ることは容易に理解できる。
【００６７】
本実施例では、生体組織シートを作製するために、継代培養した生存能力のある７５０，０００個のヒト皮膚繊維芽細胞を、標準的な７５ｃｍ２滅菌ペトリ皿に最終播種密度１０４細胞／ｃｍ２にて播種する。細胞に培養培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＤＭＥ）を与え、４週間培養し、操作可能なシートを形成する。培養培地は１週間に３回交換する。培地交換のたびに新たに調製したアスコルビン酸溶液を添加して、最終濃度５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を得る。培養中は細胞を加湿雰囲気（９２％空気および８％ＣＯ２）中にて維持する。
【００６８】
組織シートが形成されたら、それらを皿から剥がし、以下の技術を利用して３つの別個の生体組織シートを重ね合わせる。第一の生体組織シートをペトリ皿に入れ、培養培地をそのシート上に添加してこれを湿潤状態に保ち、それが広がるのを促す。ステンレス鋼インゴット（約１ｍｍ×２ｍｍ×８ｍｍ）を組織シート辺縁部に置いて、その組織シートが固定され、ペトリ皿の表面上をその最大範囲まで伸びるようにしておく。次いで、もう１つの組織シートを第一の組織シートの上に置く。第一のシートからインゴットを１つずつ慎重に脇へ押しやり、他のインゴットを第二の層の組織シート辺縁部に置いて、それを第一の組織シート上で広げる。これらの工程を繰り返して３層の組織構築物を得る。
【００６９】
次いで、培養培地に対して透過性がある半硬質スポンジを、インゴット間の組織構築物の大きさに適合するようにカットし、その構築物の表面に当てる（図１Ｂを参照）。このスポンジは、インゴットによって定められる境界線に重なるもの、またはそれより大きいものではなく、それとぴったりと適合するものであるべきである。次いで、インゴットをスポンジ表面上に均等に配置して、その上に重量をかける（この場合、１１ｇ／４０ｃｍ２［０．２７５ｇ／ｃｍ２］）。積み重ねてから２４時間〜７日後に、スポンジならびにインゴットを取り除く。
【００７０】
組織シートを積み重ねた７日後、上記と同じ技術を利用して３つの３層組織構築物を重ね合わせて最終的に９層の組織構築物を形成した。その構築物を、最大８週間、さらにインキュベートし、培養培地を週に３回新しくした。この際の組織構築物は出荷処理可能な状態である。
【００７１】
実施例２
組織構築物の顕微鏡分析
実施例１に記載の手順に従って組織構築物を作製する。本実施例では、組織構築物は９つの生体組織シートから構成される。
【００７２】
まず、生体組織構築物の生検材料をブアン（商標）液で固定化する。固定化した組織の横断切片をパラフィンで包埋する。その横断切片をマッソントリクロームで染色する。Ｎｉｋｏｎ  ＴＳ１００（商標）顕微鏡により２０×倍率にて顕微鏡観察を行う。
【００７３】
図３は、繊維芽細胞と細胞外マトリックス構成成分を含有する９つの生体組織シートの積み重ねおよび成熟後に得られた組織構築物の横断切片の顕微鏡観察を示す。この光学顕微鏡検査により、組織構築物が濃密な細胞外マトリックスを含有する生来の組織のものに似ていることが実証されている。さらに、９つの重ね合わされた生体組織シートが一緒に融合して、単一組織構築物を形成している。
【００７４】
実施例３
組織構築物の生体力学的特性
組織の機械的特性は、簡易引張試験と繰り返し引張試験により決定される。これらの試験はＴｙｔｒｏｎ（商標）２５０  マイクロフォース試験システム(MTS Systems Corporation)を使用して行われる。この機械は、種々の速度率にて組織の荷重および除荷を可能にし、組織に作用させた応力とひずみのデータを収集する。いずれの試験も、７．９ｍｍ幅の組織薄片、１組織当たり合計３薄片で行われる。けん引速度は、引張試験および繰り返し試験の両方において１ｍｍ／ｓに設定する。
【００７５】
簡易引張試験は、荷重が組織を破壊するのに十分に高くなるまで、組織を引き伸ばす試験である。この試験により、組織の弾性率および最大引張強度の測定が可能である。これらの２つの値により組織の相対硬度および抵抗力が示される。
【００７６】
繰り返し引張試験は、引き伸ばした後の組織の塑性変形率を決定することができる試験である。塑性変形率は、組織に荷重をかけた後にその組織の最初の形を取り戻すその能力を評価するものである。繰り返し引張試験は、組織を、組織の最大引張強度の１０％に達するまで引き伸ばすことにより行う。その後、けん引を停止し、先に荷重をかけたのと同じ速度で組織から荷重を除去する。その結果は、組織が引き伸ばされている間に耐えなければならない組織の不可逆変形の量を示す。
【００７７】
図４は、実施例１に記載のように作製された成熟３層組織構築物における繰り返し応力−ひずみ試験のグラフである。この組織構築物は引張応力に抵抗を示す。この組織構築物はまた、１０％ひずみ後にその最初の形を取り戻す能力も有している。
【００７８】
本願の全体にわたって、本発明が属する技術分野の状況をより詳細に記述するために種々の参照文献が示されている。これらの参照文献の開示内容は、目的の如何にかかわらず、引用することにより本明細書の開示内容の一部とされる。
【００７９】
参照文献
・Auger et al., １９９７年４月８日に発行された米国特許第５，６１８，７１８号明細書
・Germain and Auger. "Tissue engineered biomaterials: biological and mechanical characteristics", In: Wise, Trantolo, et al. editors : "Encyclopedic handbook of biomaterials and bioengineering", NY, NY: Marcel Dekker Inc., 1995, pp. 699-734.
・Germain et al., ２００３年６月５日に公開された特許出願ＷＯ０３／０４５４５８号パンフレット
・Huynh et al., １９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，２８１号明細書
・Hata and Senoo. J Cell Physiol. (1989) 138,8-16.
・Kanda et al. ASAIO Journal (1993) 39, M686-90.
・Lafrance et al., ２００３年２月６日に公開された米国出願番号第２００３００２７３３２号
・L'Heureux et al. The FASEB Journal (1998) 12, 47-56.
・Lopez-Valle et al. British Journal of Dermatology (1992) 127, 365-371.
・Michel et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim (1999) 35, 318-26.
・Pouliot et al. Transplantation (2002) 73, 1751-7.
・Tajima and Pinnell. Biochem Biophys Res Commun. (1982) 106, 632-7.
・Weind et al. J Thorac Cardiovasc surg (2002) 123, 333-40.
・Ye et al. European Journal of Cardio-thoracic Surgery (2000) 17, 449-454.
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、平面的な組織を作製する好ましい方法を示す。（Ａ）第一の生体組織シート（１）を実質的に平坦な支持体表面上に配置し、ウェイトまたはインゴット（２）で辺縁部を固定する。第二の組織シート（３）を第一の組織シートの上に重ね合わせ、ウェイトまたはインゴット（２）を動かし、１つずつ、第二のシートの上に置いて、重ね合わさったシートを固定する。（Ｂ）インゴットの内側に収まるようにカットしたスポンジ（４）を上記のようにして形成した多層構造の組織構築物（５）の上に置き、離間されたウェイト（６）をスポンジ上に置く。
【図２】図２は、管状組織構築物を圧縮する好ましい方法を示す。中空管（８）にその管のテーパー端部（９）を利用して弾性スリーブ（７）を巻く。その中空管（８）は、マンドレル（１１）に巻かれた組織構築物（１０）より大きい。次いで、その中空管（８）を組織構築物（１０）に被せる。その管（８）を一方向に、組織構築物（１０）を反対方向に徐々に動かして、弾性スリーブ（７）を中空管（８）から組織構築物（１０）に移動させる。
【図３】図３は、本発明による方法に従って作製された組織の成熟後の顕微鏡画像である。この組織は、繊維芽細胞と細胞外マトリックス構成成分を含有する９つの生体組織シートから構成されたものである。倍率２０×、スケールバー５０μｍ。
【図４】図４は、実施例１に記載のように作製された３層組織構築物における繰り返し応力-ひずみ試験の結果を示すグラフである。
2005532853.tif 000003
【図２】
2005532853.tif 000004
【図３】
2005532853.tif 000005
【図４】
2005532853.tif 000006
【国際調査報告】
2005532853.tif 000007
2005532853.tif 000008
2005532853.tif 000009
2005532853.tif 000010
2005532853.tif 000011
2005532853.tif 000012