(57)【要約】本発明の組織工学心臓弁は、自立型人間工学組織から形成される要素（例えば、リーフレット）で構成される。このような自立型組織は、生きた生物学的細胞および細胞外マトリクスで構成され、非生存足場構造が存在しない。従って、本発明の組織工学心臓弁は、全体が、生きたヒト組織からなり、理論的に、増殖、修復、およびリモデリングする能力を有するネイティブの生物学的構造のように機能し得る。このような自立型人間工学組織の産生は、「自己アセンブリ」アプローチによって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人間工学組織型心臓弁であって、心臓弁を形成するよう組み立てられる複数のリーフレットを備え、各々のリーフレットは、自立型人間工学組織を形成するよう融着された、少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層で構成される、心臓弁。
【請求項２】
前記少なくとも１つの生組織シートが、間葉細胞により分泌される細胞外マトリクスから形成される、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項３】
前記間葉細胞が、同種異系、自系、遺伝子改変型、またはこれらの組み合わせである、請求項２に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項４】
前記間葉細胞が、皮膚線維芽細胞および外膜線維芽細胞を含む、請求項２に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項５】
前記間葉細胞が、筋線維芽細胞を含む、請求項２に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項６】
前記間葉細胞が、間質弁細胞、内皮細胞、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項７】
前記少なくとも１つの生組織シートが、胚性幹細胞、出産後幹細胞、または成体幹細胞により分泌される細胞外マトリクスから形成される、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項８】
前記幹細胞が、同種異系、自系、遺伝子改変型、またはこれらの組み合わせである、請求項７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項９】
各々のリーフレットが、少なくとも７つの層で構成される、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１０】
各々のリーフレットが、少なくとも９つの層で構成される、請求項９に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層が、互いの上面に重ねられた、少なくとも５つの生組織シートを含む、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層が、５つの層を形成するよう折り畳まれた１つの生組織シートを含む、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１３】
前記人間工学組織が、約０．１ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有する、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１４】
前記人間工学組織が、約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有する、請求項１３に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの生組織シートが、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、エラスチン、グリコサミノグリカン、増殖因子、糖タンパク質、および水を含む、請求項１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１６】
人間工学組織型心臓弁であって、心臓弁を形成するよう組み立てられる複数のリーフレットを備え、各々のリーフレットは、少なくとも約０．１６ｍｍの厚みを有する自立型人間工学組織を形成するよう融着された、少なくとも１つの生組織シートの層で構成される、心臓弁。
【請求項１７】
人間工学組織型心臓弁であって、心臓弁を形成するよう配置された複数のリーフレットを備え、各々のリーフレットは、自立型人間工学組織を形成するよう融着された、少なくとも１つの同種異系生組織シートの層で構成され、該自立型人間工学組織は、患者に移植した際に生細胞の置換を起こし、その結果、該同種異系細胞の少なくともいくつかが患者の生細胞と置き換わる、心臓弁。
【請求項１８】
前記同種異系細胞の大部分が、前記患者の生細胞と置き換えられる、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項１９】
前記同種異系細胞のほぼ全てが、前記患者の生細胞と置き換えられる、請求項１８に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２０】
前記自立型人間工学組織が、前記患者に移植された際に、リモデリングを起こす、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２１】
前記同種異系細胞が、間葉細胞を含む、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２２】
前記間葉細胞が、皮膚線維芽細胞および外膜線維芽細胞を含む、請求項２１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２３】
前記間葉細胞が、間質弁細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞、またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項２１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２４】
前記同種異系細胞が、胚性幹細胞、出産後幹細胞、または成体幹細胞を含む、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２５】
各々のリーフレットが、少なくとも５つの層で構成される、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２６】
各々のリーフレットが、約０．１ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有する、請求項１７に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２７】
各々のリーフレットが、約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有する、請求項２６に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項２８】
人間工学心臓弁を作製する方法であって、該方法は、以下：
細胞から細胞外マトリクスを分泌することにより少なくとも１つの生組織シートを作製する工程；
該少なくとも１つの生組織シートを重ねて、少なくとも７つの層を有する層状構築物を形成する工程；および
該層を融着させて人間工学組織を形成するよう、該層状構築物を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの生組織シートを重ねる工程が、互いの上面に複数の個々のシートを重ねる工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの生組織シートを重ねる工程が、単一のシートをそれ自体に折り畳む工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの生組織シートを重ねる工程が、前記人間工学組織が約０．１ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有するのに十分な層を作製する工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの生組織シートを重ねる工程が、前記人間工学組織が約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚みを有するのに十分な層を作製する工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
培養工程が、前記層状構築物を、Ｌ−アスコルビン酸またはＬ−アスコルビン酸血清のリン酸誘導体に曝す工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
培養工程が、前記層状構築物を係留して収縮を減少させる工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記人間工学組織から前記複数のリーフレットを形成する工程が、該人間工学組織から各リーフレット形状を切り出す工程を包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が間葉細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、胚性幹細胞、出産後幹細胞、または成体幹細胞を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
心臓弁の製造に使用するための人間工学心臓弁を調製する方法であって、該方法は、以下：
細胞から細胞外マトリクスを分泌することにより少なくとも１つの生組織シートを作製する工程；
該少なくとも１つの生組織シートを重ねて、層状構築物を形成する工程；
該層を融着させて人間工学組織を形成するよう、該層状構築物を培養する工程；および
該人間工学組織の収縮を調節する工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
収縮を調節する工程が、前記人間工学組織を係留する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
係留工程が、前記人間工学組織上に複数のアンカーを配置する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンカーが、ほぼ矩形の形状で配置される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
アンカーが、ほぼ円形または楕円形の形状で配置される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
収縮を調節する工程が、前記人間工学組織を湿条件で維持する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
湿条件が、ＨＥＰＥＳ、高グルコース、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍによる湿り気を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
収縮を調節する工程が、前記人間工学組織において表面接着を形成し、収縮を減少する工程を包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
心臓弁の製造に使用するための人間工学心臓弁を調製する方法であって、該方法は、以下：
細胞から細胞外マトリクスを分泌することにより少なくとも１つの生組織シートを作製する工程；
該少なくとも１つの生組織シートを重ねて、層状構築物を形成する工程；
該層を融着させて人間工学組織を形成するよう、該層状構築物を培養する工程；および
収縮を考慮して所望のリーフレット形状よりも寸法の大きなリーフレット形状を、該人間工学組織から切り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
各々のリーフレット形状を切り出す工程が、該リーフレット形状を有する型を用いて打ち抜きにより切り出す工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
各々のリーフレット形状を切り出す工程が、該リーフレット形状を有する鋳型周囲を切り出す工程を包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記より大きな寸法とは、約５０％大きいことである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記リーフレット形状を用いて心臓弁を構築する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
人間工学組織型心臓弁であって、心臓弁を形成するようワイヤフォームで結ばれた組織のリーフレットサブアセンブリを備え、各々のリーフレットは、自立型人間工学組織を形成するよう融着された、少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層で構成され、そして該ワイヤフォームの少なくとも一部は、組織で覆われている、心臓弁。
【請求項５２】
前記心臓弁がさらに、前記ワイヤフォームで結ばれた支持ステントを備える、請求項５１に記載の人間工学組織型心臓弁。
【請求項５３】
前記支持ステントの少なくとも一部が、前記組織で覆われている、請求項５２に記載の人間工学組織型心臓弁
【請求項５４】
前記心臓弁がさらに、前記支持ステントに取り付けられた適合可能な構造表面を備える、請求項５２に記載の人間工学組織型心臓弁
【請求項５５】
前記適合可能な構造表面の少なくとも一部が、前記組織で覆われている、請求項５４に記載の人間工学組織型心臓弁。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００１年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／３０６０５８号（代理人明細書番号２０５５３Ｄ−００４３００ＵＳ）（この完全な開示は、本明細書中に参考として援用される）の優先権を主張する。本願はまた、本願と同日の２００２年７月１６日に出願され、すべての目的のために参考として援用される「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ」と題される出願番号 （代理人明細書番号８６１９４−２２）に関する。
【０００２】
（連邦政府が補助金を出す研究または開発のもとでの発明に対する権利についての陳述）
適用せず
（コンパクトディスクで提出される「配列表」、表、またはコンピュータープログラムリスト付属書の言及）
適用せず
（発明の分野）
本発明は、工学ヒト組織に関する。特に、本発明は、心臓組織の置換に関する。本発明はまた、心臓弁の修復および置換に関する。より詳しくは、本発明は、組織工学生ヒト心臓弁およびこのような弁の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
損傷した心臓弁または罹患した心臓弁を置換するために世界中で毎年１５０，０００より多くの外科的手順が実施されている。脊椎動物において、心臓は、４つのポンピングチャンバー：左心房および右心房ならびに左心室および右心室（各々は、それ自身の一方向弁（ｏｎｅ−ｗａｙ  ｖａｌｖｅ）を備える）を有する中空の筋肉器官である。天然の心臓弁は、大動脈弁、僧帽弁（または二尖弁）、三尖弁および肺動脈弁として同定される。人工の心臓弁は、これらの天然に存在する弁のいずれかを置換するために使用され得る。現在、置換手順の多くは、機械的弁プロテーゼを使用する。機械的弁としては、ケージドボール（ｃａｇｅｄ  ｂａｌｌ）弁（例えば、Ｓｔａｒｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ弁）、二リーフレット（ｂｉ−ｌｅａｆｌｅｔ）弁（例えば、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ弁）および傾斜ディスク弁（例えば、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ−Ｈａｌｌ弁またはＯｍｎｉｓｃｉｅｎｃｅ弁）が挙げられる。硬い機械的逆止弁に酷似して作動するので、機械的心臓弁は、丈夫かつ長寿命である。故に、機械的弁の主な利点は、その長期の耐久性である。しかし、現在利用可能な機械的弁は、それが血栓形成性であり、故に患者は生涯の抗凝固療法を必要とする不利益を受ける。弁において血栓が形成する場合、血栓は、弁が正常に開閉することを妨げるか、あるいはより重大には血栓は弁からはずれ得、そして脳に塞栓を形成して脳卒中を引き起こすか、または冠状動脈を閉塞して心筋に恒久的な損傷を引き起こす。血栓形成の危険性を減らすために、抗凝固剤が投与され得るが、このような薬剤は高価かつ潜在的に危険（異常な出血を引き起こし得、脳内で出血が起こった場合、それ自体が脳卒中を引き起こし得る）である。さらに、心臓の各拍動において、関連した弁構造に機械的な閉鎖物（ｃｌｏｓｕｒｅ）が填まる際、閉鎖物は、カチッという（ｃｌｉｃｋｉｎｇ）雑音を産生する。
【０００４】
機械的弁に対する一つの代替物は、組織型弁または「バイオプロテーゼ（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）」弁である。バイオプロテーゼ弁は、一般にグルタルアルデヒドを基本とするプロセスで固定された天然由来の異種組織から作製される。現在利用可能なバイオプロテーゼ弁は、ブタの大動脈弁をステントに縫い付けて、適切な位置でリーフレットに保持することによってか、またはウシ由来の心膜のような心膜の袋を使用して弁リーフレットを構築し、そしてそのリーフレットをステントに縫い付けることによって構築される。このステントは、硬いかまたは僅かに柔軟であり得、そして布（通常ＤａｃｒｏｎＴＭの商標のもとで販売される合成材料）で覆われる。このステントは、通常患者のネイティブの組織へ固定するために縫い付けリング（ｓｅｗｉｎｇ  ｒｉｎｇ）に接着される。このようなバイオプロテーゼは、柔軟な天然の心臓弁リーフレットの動作を模倣し、隣接の組織で自由端（ｆｒｅｅ  ｅｄｇｅ）として公知の連結部の間を接着する。故に天然組織から構築される人工弁は、優れた血流力学的特性を有する。さらに、組織型弁リーフレットは、柔軟で、静かであり、そして全身性の抗凝固の使用を必要としない。なぜなら、機械的弁のように容易には血栓を形成させないからである。しかし、バイオプロテーゼ弁の主な不利点は、バイオプロテーゼ弁が機械的弁の長期の耐久性を欠いていることである。ヒトの体の中で天然に起こるプロセスが、時間が経つと弁の組織リーフレット（特に、弁リーフレット間の交連（ｃｏｍｍｉｓｓｕｒｅ）の連結部のような弁の高応力領域および周辺のリーフレット接着点または各リーフレットの外縁における「心臓弁膜尖」において）を攻撃および硬化または「石灰化」し得る。さらに、弁は、体内の一定の機械的な働きからの応力を受ける。従って、弁は時間が経つと摩耗し、置換される必要がある。従って、現在利用可能な組織弁は、機械的弁よりも短い寿命しか有さず、通常ブタ由来の弁について約２１年およびウシ心膜弁について約１７年で置換を必要とする。その結果、バイオプロテーゼ弁は、６５歳より若い患者には通常薦められないか、または薦められる場合は、別の心臓切開手術の検討を必要とする。
【０００５】
従って、長期の耐久性を有し、そして宿主（特に６５歳より若い患者に関して）と生体適合性である組織弁置換に対する必要性がある。これらの目的を達成するために、組織工学方法が発展している。心臓弁療法において組織工学は、ヒト細胞から機能的な心臓弁を作製するための新たなアプローチである。歴史的には、組織工学アプローチは、骨格を設ける（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）効果および機械的強度を提供するために、脱細胞化（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）した組織、合成ポリマーまたは生体再吸収可能（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）な人工ポリマーを頼みにしている。弁を作製するために、一つの基本的な考案は、心臓弁のように形成された生体適合性かつ生分解性の骨格の自己の細胞の播種を含み得る。一旦、細胞が骨格に接着されると、細胞は、自身の細胞外マトリックスを形成し、一方ポリマー骨格は、分解し始める。この方法で、細胞を採取した同じ患者に移植され得る自己の組織工学心臓弁を作製することが理論的には可能である。このような移植可能な組織工学構造は、現在の心臓弁置換物（例えば、グルタルアルデヒド固定化異種移植片、機械的弁および同種移植片）より優れた特定の潜在的な利点を有する。
【０００６】
現在の組織工学弁の主な不利点は、組織工学弁が外来の身体材料（ｂｏｄｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ）からなり、生育不能であることである。代表的な骨格材料は、ポリグリコール酸、ポリ−４−ヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシアルカノエートのような化学物質から構成されるいずれかのポリマーおよびコラーゲンまたはフィブリンのような細胞外マトリックスからのゲルである。不運にも、これらの材料はまだ理想的なものから遠い。これらは、高価であり、潜在的に免疫原性であり、そしてさらにこれらは、毒性の分解および炎症反応を示す。さらに、これらは再吸収能が乏しいかもしれない。結果として、成長の欠如および血栓塞栓性の合併症、変性および感染の危険性が存在する。
【０００７】
従って、医療従事者の業務の進展と一貫して、天然の心臓内の種々の位置および循環器系における代替の配置での使用のための改良された置換弁についての必要性がある。このような置換弁は、臨床経験から学ばれた教訓（特にリーフレットにおける応力の低減の必要性および望ましい構造および機能的特徴の維持）を組み入れるべきである。特にこのような置換弁は、弁の機械的機能および生物学的機能の両方を回復、維持および改善すべきである一方、現在の組織工学の脱細胞化組織または生体再吸収可能な組織の協同作用の問題（例えば、とりわけ免疫原性、強い炎症反応、抗血栓形成性、機械的安定性、および毒性の問題）を回避すべきである。さらには、このような置換弁は、一貫した様式で製造されることが比較的単純かつ容易であるべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
前述の目的の達成に指向され、そして従来の心臓弁置換物の問題を改善するために、新規の工学ヒト心臓弁組織、新規の組織心臓弁構造物、およびそれらの構成要素の調製および使用ならびにそれらを製造する単純化された方法が、本明細書中に開示される。
【０００９】
本発明の組織工学の心臓弁は、自立型人間工学組織から形成される要素（例えば、リーフレット）からなる。このような自立型人間工学組織は、生育不能な外来の骨格構造が存在せずに、生きている生物学的細胞および細胞外マトリックスからなる。このことは、いくつかの理論上の利点を提供する。第１に、生きている弁は、内在の治癒潜在力を有する応答性かつ自己再生性の組織を意味する。第２に、その生物学的マトリックスは、環境の必要性に従って身体によって再構築され得る。第３に、合成骨格組織の非存在は、外来の身体反応を除外し、完全な弁の統合を可能にし、そして弁の感染を制限する。故に、本発明の組織工学心臓弁は、成長、修復、および再構築する潜在性を有するネイティブの生物学的構造のように理論的に機能し得る、完全に生きているヒト組織からなる。この弁は、ヒトの生きている弁の中へ再構築し、そしてその新しい環境に適応する（例えば、幼児から成人へのヒトの体の成長に対応する）。
【００１０】
このような自立型人間工学組織の産生は、「自己アセンブリ」アプローチによって達成される。この革新的な自己アセンブリアプローチは、アスコルビン酸の存在下で培養される場合の細胞（例えば、間葉細胞）による細胞外マトリックスの豊富な内在性合成をうまく利用する。得られた組織構造は、天然の組織で観察される組織学的な組織化、細胞外マトリックス組成、細胞分化マーカー、および細胞の機能を表す。従来の組織工学アプローチよりも有利なことに、自己アセンブリアプローチの使用は、正常なヒト細胞−細胞相互作用および細胞−細胞外マトリックス相互作用を可能にする。さらに、自己アセンブリアプローチの使用は、重要な天然の増殖因子およびサイトカインの分泌、ならびに心臓弁に所望される成熟結合組織の形成を可能にする。故に、本発明の組織工学心臓弁は、代謝的に活性なままであり、そして有糸分裂を行う細胞を含む。
【００１１】
弁の天然の生物学的機能を回復させるこのストラテジーは、心臓弁療法の範例の移行（ｐａｒａｄｉｇｍ  ｓｈｉｆｔ）：レシピエント自身の生きている弁の中に再構築する新しい組織型弁、である。より長い耐久性を提供するために、弁置換物は、弁の機械的機能および生物学的機能の両方を回復、維持および改善すべきである。このことを達成するために、この弁は、移植して長年にわたり、自己修復可能であるべきである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態において、人間工学組織型心臓弁は、心臓弁を形成するために集められた複数のリーフレットを含み、各リーフレットは、自立の人間工学組織を形成するために共に融合された少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層からなる。各リーフレットは、５つより多い層（例えば、少なくとも７層、少なくとも９層、またはより多い層）からなり得ることが理解され得る。代表的には、生組織シートは、間葉細胞によって分泌される細胞外マトリックスから形成される。この間葉細胞は、例えば、異質遺伝子型間葉細胞、自家間葉細胞、遺伝的に改変された間葉細胞またはこれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、間葉細胞は、真皮の線維芽細胞および外膜線維芽細胞を含む。他の実施形態において、この間葉細胞は、筋線維芽細胞を含む。そして、さらに他の実施形態において、この間葉細胞は、腸の弁細胞、内皮細胞またはこれらの組合せを含む。生きている組織シートは、代替的に胎児性幹細胞、出生後の幹細胞または成人の幹細胞により分泌される細胞外マトリックスから形成され得る。同様に、幹細胞は、異質遺伝子型幹細胞、自家幹細胞、遺伝的に改変された幹細胞かまたはこれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの生きている組織シートは、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、エラスチン、グリコサミノグリカン、増殖因子、糖タンパク質および水を含む。
【００１３】
述べたように、この層は、単一の生組織シートの部分、いくつかの生組織シートの部分、または両方であり得る。例えば、少なくとも１つの生きている組織シートの少なくとも５つの層は、互いの上部において積み重ねられた少なくとも５つの生組織シートを含み得る。あるいは、少なくとも１つの生組織シートの少なくとも５つの層は、５層を作製するために折り曲げられた１つの生きている組織シートを含み得る。得られた人間工学組織は、一般的に約０．１６ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲、好ましくは約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲の厚さを有する。従って、いくつかの実施形態において、本発明の人間工学組織型心臓弁は、心臓弁を形成するために集められた複数のリーフレットを含み、各リーフレットは、少なくとも約０．１６ｍｍの厚さを有する自立の人間工学組織を形成するために共に融合された少なくとも１つの生組織シートの層からなる。
【００１４】
他の実施形態において、本発明の人間工学組織型心臓弁は、心臓弁を形成するために配置された複数のリーフレットを含み、各リーフレットは、患者への移植の際に生細胞の置換を行う自立型人間工学組織を形成するために共に融合された少なくとも１つの異質遺伝子型の生組織シートの層からなり、その結果、異質遺伝子型細胞の少なくともいくらかは、患者の生細胞で置換される。いくつかの例において、異質遺伝子型細胞の大多数が、患者の生細胞で置換される。他の例において、異質遺伝子型細胞のおおよそ全てが、患者の生細胞で置換される。さらに、自立型人間工学組織は、代表的には患者への移植の際に再構築を受ける。
【００１５】
この異質遺伝子型細胞は、間葉細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、この間葉細胞は、真皮の線維芽細胞および外膜線維芽細胞を含み、そして他の実施形態において、この間葉細胞は、腸の弁細胞、筋線維芽細胞、内皮細胞またはこれらのいずれかの組合せを含む。この異質遺伝子型細胞は、胎児性幹細胞、出生後の幹細胞または成人の幹細胞を含み得る。
【００１６】
以前に記載された実施形態におけるように、各リーフレットは、少なくとも５層からなり得る。そして、各リーフレットは、約０．１５ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内、好ましくは約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内の厚さを有し得る。
【００１７】
本発明は、人間工学心臓弁を作製する方法をさらに示す。一つの実施形態において、この方法は、細胞から細胞外マトリックスを分泌すること、少なくとも７層を有する層化構築物を形成するために少なくとも１つの生きている組織シートを層化すること、および人間工学組織を形成するために層を融合するために層状構築物を培養することによって少なくとも１つの生きている組織シートを産生する工程を含む。
【００１８】
少なくとも１つの生組織シートを層化する工程は、複数の個々のシートを、互いの上部において積み重ねる工程を含み得る。あるいはまたはさらには、層化する工程は、単一のシートをそれ自体の上に折りたたむ工程を含み得る。少なくとも１つの生きている組織シートのこのような層化工程は、人間工学組織が約０．１６ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内、好ましくは約０．３ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内の厚さを有する十分な層を作製することを含み得る。
【００１９】
培養工程は、層化構築物をＬ−アスコルビン酸血清またはＬ−アスコルビン酸のリン酸誘導体血清に曝露する工程を含み得る。必要に応じて、この培養工程はまた、収縮を低減するために層状構築物をアンカーする工程を含み得る。さらに、この形成工程は、人間工学組織から各リーフレット形状を切り出す工程を含み得る。
【００２０】
さらに、この細胞は、間葉細胞を含み得、あるいはこの細胞は胎児性幹細胞、出生後の幹細胞または成人の幹細胞を含み得る。
【００２１】
本発明は、心臓弁の作製における使用のための人間工学組織を調製する方法をさらに示す。一つの実施形態において、この方法は、細胞から細胞外マトリックスを分泌すること、層化構築物を形成するために少なくとも１つの生組織シートを層化すること、人間工学組織を形成するために層を融合するために層状構築物を培養すること、および人間工学組織の収縮を制御することによって少なくとも１つの生きている組織シートを産生する工程を含む。いくつかの実施形態において、収縮を制御する工程は、人間工学組織をアンカーする工程を含む。係留する工程は、ヒト人工組織において複数のアンカーを設置する工程を含み得る。アンカーは、２〜３例を挙げると、ほぼ矩形あるいはほぼ円形または卵円形で配置され得る。他の実施形態において、収縮を制御する工程は、人間工学組織を湿性条件に維持する工程を含む。このような湿性条件は、ＨＥＰＥＳ、高グルコースおよびダルベッコ改変イーグル培地での湿性を含む。なお他の実施形態において、収縮を制御する工程は、収縮を低減するために、人間工学組織において表面接着を産生する工程を含む。
【００２２】
別の実施形態において、この方法は、細胞から細胞外マトリックスを分泌させることによって、少なくとも１つの生存組織のシートを作製する工程、少なくとも１つの生存組織のシートを層状にして、層状構築物を形成する工程、層状にした構築物を培養してこれらの層を融合させ、人間工学組織を形成する工程、および人間工学組織からリーフレット形状を切り出す工程であって、このリーフレット形状は、収縮を考慮して、所望のリーフレット形状より寸法が大きい、工程を包含する。例えば、各リーフレット形状を切断する工程は、リーフレット形状を有するダイを使用して、パンチ切断（ｐｕｎｃｈ  ｃｕｔｔｉｎｇ）する工程を包含し得る。または、各リーフレット形状を切断する工程は、リーフレット形状を有するテンプレートの周りで切断する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、より寸法が大きいとは、約５０％大きい。このような方法は、リーフレット形状を使用して、心臓弁を構築する工程をさらに包含し得る。
【００２３】
本発明は、心臓弁の調製における１つの特定の技術順序を使用することによって、その範囲が限定されない。異なる順序を使用して、組織工学生存ヒト弁の機能性を果すために、広範な種々の弁の大きさおよび形状を形成し得ることが、言外に表される。さらに、弁の各部分は、異なる技術によって作製されたかまたは異なる特徴を有する、組織−工学組織から作製され得る。例えば、１つのリーフレットは、単一工程の折り畳み技術を使用して形成された平坦な組織から切り取られ得、そして別のリーフレットは、ローリング技術を使用して作製された管状組織から切り取られ得る。次いで、これらのリーフレットは、単一の弁のアセンブリに組み合わせられ得る。
【００２４】
全体として、例示的な組織−工学生存ヒト弁は、成熟したヒト組織−工学組織から切り出された、複数の組織リーフレットを備える。これらのリーフレットは、一緒に付着されて、生理学的圧力に供される場合に、寸法的に安定でありかつ一貫して癒合するリーフレットサブアセンブリを形成する。次いで、このサブアセンブリのリーフレットの各々は、ワイヤフォームと整列され、そして代表的に、１つのワイヤフォーム交連の先端から、リーフレットの心臓弁膜尖周囲の周りで均一に、隣接するワイヤフォーム交連の先端へと、このワイヤフォームに個々に縫い付けられる。このワイヤフォームは、通常、ヒト組織−工学組織で覆われるが、代替的に、布で覆われ得る。縫い付けられた縫合は、類似して整列されたステープルのように働き、これらの全てが、予備整列されたリーフレットの各々の心臓弁膜尖全体に沿って作用するトー（ｔｏｅ）負荷力を等しく使用する。このように形成された、得られる組織−ワイヤフォーム構造アセンブリは、応力をリーフレットの心臓弁膜尖全体にわたって、交連から交連へと均等に分配することによって、リーフレット構造体の界面における応力および潜在的な疲労を低減する。
【００２５】
従って、本発明は、人間工学組織型の心臓弁を提供し、これは、心臓弁を形成するようにワイヤフォームと嵌合した組織リーフレットサブアセンブリを備え、ここで、各リーフレットは、少なくとも５層の、一緒に融合した少なくとも１つの生組織シートからなり、自己支持型の人間工学組織を形成し、そしてここで、ワイヤフォームの少なくとも一部は、この組織で覆われている。いくつかの実施形態において、この心臓弁は、ワイヤフォームと嵌合した支持ステントをさらに備え、そしてこの支持ステントの少なくとも一部は、組織で覆われ得る。そしていくつかの実施形態において、この心臓弁は、支持ステントに付着した、適合可能な構造界面をさらに備え、そしてこの適合可能な構造界面の少なくとも一部は、組織で覆われ得る。
【００２６】
本発明の他の目的および利点は、添付の図面と一緒に、以下の詳細な説明から明らかになる。本明細書中に引用される全ての刊行物、図、特許および特許出願は、各々が個々に表示されると同じ程度まで、全ての目的で、明白に本明細書中に参考として援用される。
【００２７】
（詳細な説明）
本発明は、インビトロでの機械的な弁機能および生物学的な弁機能の両方を複製する、人間工学組織心臓弁を提供する。重要なのは、人間工学心臓弁は、形態学的および組織学的に成熟した弁の構成成分を形成し、維持し、そして改善するために使用する組織細胞から構成される。
【００２８】
（細胞供給源）
本発明の人間工学組織において、多様な細胞が用いられ得る。好ましい細胞としては、胚の幹細胞、出生後の幹細胞、成体の幹細胞、間充織細胞（特に、線維芽細胞）、間質細胞、内皮細胞、平滑筋および骨格筋の細胞、ミオサイト（筋肉幹細胞）、クロンドサイト（ｃｈｒｏｎｄｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞、線維芽筋細胞ならびに外胚葉細胞（可塑性およびスキル細胞、肝細胞、ランゲルハンス島細胞、腸に存在する細胞および他の柔組織細胞、骨芽細胞、他の骨または軟骨を形成する細胞を含む）が挙げられる。あるケースでは、神経細胞を含むことが好ましくあり得る。
【００２９】
細胞は、一般的または遺伝的に操作され得、さらなる機能または正常な機能を提供する。レトロウイルスベクター、ポリエチレングリコールを用いた遺伝的な細胞の操作方法、および当業者に公知の他の方法が用いられ得る。
【００３０】
細胞は、自系、同種異系または異種であり得るが、自系または同種異系野細胞が好ましい。免疫学的に不活性な細胞（例えば、胚または胎児の細胞、幹細胞、および免疫抑制の必要性を避けるために遺伝的に操作された細胞）がまた、用いられ得る。免疫抑制の方法および薬剤が、移植の当業者に公知である。
【００３１】
ある実施形態において、細胞は、標準的な技術（例えば、コラゲナーゼ、トリプシンまたは他のプロテアーゼ溶液を用いた消化）を用いるバイオプシーおよび分離により、得られる。図１は患者Ｐから１０００の細胞が得られることを例示する。ある実施形態において、皮膚バイオプシーの真皮層が収集され、そして、ＧｅｒｍａｉｎおよびＡｕｇｅｒ、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」，Ｉｎ：Ｗｉｓｅ，Ｔｒａｎｔｏｌｏら，編者：「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，ＮＹ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９９５，ｐｐ．６９９〜７３４の方法に従って、コラゲナーゼで消化した。簡単に言うと、細胞を、消化皮膚フラグメントの遠心の後に収集し、そして細胞培養培地中で拡大する。全ての細胞培養物は、４継代と８継代との間で使用され、８％ＣＯ２下で、３７℃でインキュベートし続ける。細胞は、体内の任意の場所でバイオプシーを通して容易に収集し得る（例えば、骨格筋バイオプシーは、腕、前腕または下肢から容易に収集し得、そして平滑筋は、体の全体に渡って、皮下組織に隣接する領域から収集し得る）。このバイオプシーは、バイオプシーニードル（ｂｉｏｐｓｙ  ｎｅｅｄｌｅ）（非常に簡単な手順でなされ、そしてほとんど痛みを伴わないラピッドアクションニードル（ｒａｐｉｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｎｅｅｄｌｅ））を用いることで、難なく収集し得る。細胞はまた、例えば、血管、弁および廃棄組織（例えば、包皮）からも入手し得る。
【００３２】
好ましい実施形態においては、間充織細胞が用いられる。ネイティブの心臓弁は、間充織細胞（例えば、内皮細胞および間質細胞）で占められる。これらの集団の中に、考え得る表現型の異系遺伝子性が存在する。例えば、Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ（「Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｗａｌｌ」，Ｉｎ：ＺｉｌｌａおよびＧｒｅｉｓｌｅｒ，編者：「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｇｒａｆｔｓ」，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ：ＲＧ  Ｌａｎｄｅｓ，１９９９，ｐｐ．４０３〜１６）によって、出生後の弁の発達の間、胚の内皮細胞が、細胞外マトリックスにおいて、弁の間質細胞にｔｒａｎｓ分化することが示されている。さらに重要なことに、間充織細胞の表現型は、環境刺激（例えば、ＳｃｈｏｅｎおよびＬｅｖｙによって記載されるように（「Ｔｉｓｓｕｅ  ｈｅａｒｔ  ｖａｌｖｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４７，１９９９，ｐｐ．４３９〜４６５））、開閉する場合、弁の複雑な機械的影響を通して改変される。
【００３３】
特に、線維芽細胞（例えば、真皮の線維芽細胞または外膜の線維芽細胞）が用いられ得る。線維芽細胞は容易に使用でき、それらの細胞は、主にコラーゲンを分泌する結合組織内の細胞である。真皮の線維芽細胞は、代表的に、還元性の胸部手術の間に除去された正常な成人の皮膚試料から収集されるか、または新生児の包皮から収集される。１インチ四方の包皮に含まれる細胞は、数フィートの肢の組織を増殖し得るので、心臓血管への適用に対するヒト線維芽細胞の潜在性は、自家移植片および同種異系移植片の両方にとって膨大である。
【００３４】
（ヒト生組織シートの調製）
本発明の心臓弁の作製に用いられる人間工学組織は、少なくとも１つの生組織シートから形成される。図２に例示されるように、細胞１０００を、各々のペトリ皿１２００において、生組織シート１４００が形成されるように滅菌ペトリ皿１２００にプレートする。各々の生組織シート１４００は、さらなる細胞が接着する、内生の細胞外マトリックスから構成される。細胞外マトリックスは細胞１０００（例えば、少し挙げると間充織細胞、胚の幹細胞、または成人の幹細胞）によって分泌される。間充織細胞（例えば、真皮線維芽組織）を、Ｌ−アスコルビン酸、またはＬ−アスコルビン酸のリン酸誘導体（例えば、Ａｓｃ  ２−Ｐ）、血清、および増殖因子を用いて、平坦培養基質において培養する場合、間充織細胞は、細胞外マトリクスタンパク質の大量合成を示す。これは内生細胞外マトリクスの基礎を作製するＬ−アスコルビン酸は、Ｈａｔａ，Ｒｙｕ−Ｉｃｈｉｒｏら，「Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  Ａｃｉｄ  ２−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  Ｓｋｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１３８：８〜１６（１９８９）に記載されるように、コラーゲン中のプロリン残基およびリジン残基のコファクターであり、そしてまた、プロコラーゲン遺伝子の転写速度とプロコラーゲンｍＲＮＡの安定性の両方を上昇させるので、重要な役割を担う。細胞外材料は、異なるタンパク質（例えば、少し挙げると本質的にＩ型コラーゲン、他の型のコラーゲン型、エラスチン、グリコサミノグリカン、増殖因子、および糖タンパク質）から構成される。細胞外マトリクスから形成される合成生組織を、「生組織シート」という。
【００３５】
生組織シート１４００のような、得られる方法の模範的な実施形態は、全ての目的について、参考として本明細書中に援用した、Ａｕｇｅｒらの米国特許第５，６１８，７１８号に記載されている。要約すると、Ａｕｇｅｒらは、真皮線維芽細胞を、１０４細胞／ｃｍ２の濃度当量で、７５ｃｍ２の滅菌ペトリ皿にプレートすると記載している。細胞培養物を、ＤＭＥＭおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２改変培地（３：１）、胎仔ウシ血清、ペニシリンおよびゲンタマイシンを補充し、そしてアスコルビン酸溶液（５０〜１００μｇ／ｍｌ）を毎日補充する。培養地条件は、完全な湿度下で、９２％空気および８％ＣＯ２に維持する。培養時間は、約３週間である。成熟時間の終りに、生組織シート１４００が自然に基層から剥離する。図３は、シート１４００がピンセット２０００により支持されながら、生組織シート１４００の、皿１２００からの剥離を例示する。
【００３６】
多様な方法を生組織シートの調製に用い得る（例えば、米国特許第５，６１８，７１８（Ａｕｇｅｒら）；Ｙｅ，Ｑｉｎｇら，「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ：ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ」，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏ−Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１７（２０００）４４９−４５４；Ｌ，Ｈｅｕｒｅｕｘ，Ｎｉｃｏｌａｓら，「Ａ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ」，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ  １２，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９８，ｐｐ．４７〜５６；Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈａｉｒ．」Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．１９９９  Ｊｕｎ；３５（６）：３１８〜２６；Ｐｏｕｌｉｏｔ  Ｒ．ら，「Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｏｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｍｉｃｅ」，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００２  Ｊｕｎ  １５；７３（１１）：１７５１〜７であり、これらは全て、全ての目的について、参考により本明細書中に援用される）ことが理解され得る。
【００３７】
さらに、本発明は、生組織シート１４００を生成する細胞の特定の型、起源、年齢、成熟時間、成分濃度、および培地条件により、範囲を限定されない。さらに、本発明は、生組織１４００の任意の特定の形状（すなわち、厚さおよびサイズ）することによって、範囲を限定されない。
【００３８】
（工学弁組織の調製）
本発明の人間工学弁組織は、複数の個々の生組織シート１４００の重ね合わせから形成される。上記に記載されるように、生組織シート１４００は、細胞１０００（例えば、間充織細胞）によって分泌される細胞外マトリックスから構成される。この細胞外マトリックスは、コラーゲンの超分子構成を含む、多くのインビボ様性質により生成される。コラーゲンは、実質的に完成に達するだけでなく、効率的にクロスリンクし、そしてこのコラーゲン原繊維は束状構造を構築する。シート１４００そのものが、例えば、折りたたみまたはラッピング、で層を成す場合、または複数のシート１４００が束ねられるか、または重ね合わせられる場合、所望の構造的特徴を有する３次元構造が、培地内で形成される。
【００３９】
ある実施形態において、この生組織シートは細胞培養皿内で、直接重ね合わせるようにまたは重複形式で、束ねられる。図４は、束の形成において、直接重ね合わせられる個々の５つ生組織シート１４００を例示する。あるいは、重複組織によって、多様な形状が形成され得る。例えば、図１５に概略的に例示されるように、長方形の生組織シートは、ペトリ皿１２００中で、重複形式で配置され得、環状の層状組織構築物４０００を生成する。または、図６に例示されるように、不規則な形状の生組織シート１４００’は、規則的な形状の組織４２００を形成する方法で束ねられる。さらに、個々のシートは、同じ向きで束ねられるか、またはシートの向きを変えられて、その結果生成する組織に特定の効力が生じ得る。図７は、矢印により指定される方向を有するシート１４００の重なりを示す。本明細書では、第１のシート５０００が、第１の向き５２００を有することを示す。第２のシート５４００は、第２の向き５６００を有することを示す。これらのシート５０００、５４００は、向き５２００、５６００が、互いに垂直であるように束ねられる。このことは、これらのシートが、向き５２００、５６００が各々のシートと平行であるように、または他のあらゆる関連において束ねられた場合と異なる効力を提供し得る。
【００４０】
あるいはまたはさらに、１つ以上の生組織シートが折りたたまれて、複数の層を形成し得る。例えば、図８に例示されるように、シート１４００は、アコーディオン型様式でシート自体が折りたたまれ、複数の層を形成し得る。または、図９に例示されるように、シート１４００は、繰り返し半分に折りたたまれ、シートの一部が重ね合わされ得る。同様に、２つ以上のシート１４００が束ねられ、次いでそれ自体が折りたたまれて、さらにより多様な層が生じ得る。あるいはまたはさらに、層形成技術はまた、ラッピング技術の使用（例えば、図９Ａに例示されるような、シナモンロール様式でのシート１４００周囲のラッピング）にも広げ得る。また、１つ以上のシートは、束ねられ、次いでラップされるが、または層化技術の任意の組み合わせである。
【００４１】
層を形成する場合、生組織シートは、シート間の接着または表面接着により、共に支持する。多数の生組織シートが使用され得、好ましくは５以上、より好ましくは７以上、そしてより好ましくは９、１０または１１以上である。これらのシートを、ピンセットで繊細に操作し、そして重ね合わせるかまたはそれ以外で組み立て、人間工学組織構造を形成する。全ての目的について参考として援用した、米国特許第５，９２８，２８１号の記載と同様の条件下で、アスコルビン酸を補充した培養培地中でこの構築物を維持することにより、生組織シートは、共に融合し、図１０に例示されるように成熟様の人間工学組織を形成する。図１０は、線維芽細胞および細胞外マトリックス成分を含む、９つの生組織シートの、成熟後の組織の実施形態の顕微鏡図である。この光学顕微鏡観察は、高密度細胞外マトリックスのネイティブの組織構造と似ている組織構造を実証する。さらに、９つ重ね合わせられた生組織シートは、共に融合しており、１つの単体構造を形成する。この構造の成熟時間は、特定の所望の機械的性質により決定される。ある実施形態において、特に、組織構造が９層の生組織シートから構成される場合、成熟時間は７週間である。７週間の成熟後、そのような組織プラトーの機械的強度が見出されている。
【００４２】
一般的に、工学組織は、その表面を通して酸素を送達させるのに十分薄く、代謝的に必要な十分な厚さが維持され、心臓弁における使用に対して適切な強度および耐久性を提供する。本発明の工学弁組織の最新の実施形態は、無血管であり、ここで、組織は、酸性化された血液を組織に送達するための微小血管を含まない。したがって、この組織は、その表面からの酸素拡散で酸素に頼り、組織を維持する。酸素拡散限界のため、組織の厚さは、現在重要な注意点である。本発明のある実施形態において、工学組織は、約０．１ｍｍ、好ましくは０．３ｍｍ（標準サイズの弁向け）から約０．６ｍｍ（大きな弁向け）の範囲の厚さを有する。この組織調製は、最小弁サイズ（サイズ１９ｍｍとして公知）ならびにより大きなサイズ（サイズ３３ｍｍとして公知）の弁に適切である。
【００４３】
言及されたように、後ほど形成される本発明の心臓弁は、この人間工学組織由来である。この工学組織は、複雑な機械的構造および生物学的構造を提供する心臓弁における使用に対して、十分に強くそして柔軟であることが望ましい。また、工学組織が、最適な繊維性の微細構造を含み、前出の生理学的な血圧に供する場合、ストレッチングに耐えることが望ましい。この工学組織で作られる心臓弁先端は、弁が開いている間中、低い圧力勾配を可能にするのに十分な柔軟性を示し、閉じている間の、大動脈の高い生理学的圧力に耐え得る。この組織はまた、内生増殖（長期の構造的保全性における自己修復）、および創傷組織または疾患組織の修復を促進し得ることが望ましい。
【００４４】
このシートを、ピンセットで繊細に操作して重ね合わせるか、またはそれ以外の組み立てにし、上述のような人間工学組織構造を形成する。この構造を、生組織シートが互いに融合し、成熟様人間工学組織を形成するように、アスコルビン酸を補充した培養培地に維持する。この組織を培養培地中に完全に浸して維持するために、そして成熟の間、この組織の収縮を減少させるために、成熟組織に対してアンカーが適用され得る。アンカーとしては、例えば、組織の表面上に置く重し、インゴット（ｉｎｇｏｔ）またはバーが挙げられる。このようなアンカーは、生組織シート中の細胞の成長および分化を妨げない任意の材料（例えば、ステンレススチール）から作られ得る。当該分野で組織培養物と適合性であることが公知のテフロン（登録商標）材または任意のポリマー材で覆われた磁石インゴットまたは金属インゴットがまた、用いられ得る。組織型での使用に適切なアンカーの重量値は、経験的に決定し得る。好ましくは、重しは、細胞の配向および／または分化は誘導されるが、細胞アポトーシスは実質的に回避されるように選択される。このようなアンカーを使用せずに、細胞牽引力に、組織的な収縮を誘導する新しい組織の微細構造および瘢痕組織の不規則な塊の生成を再構築させる場合、組織は自由に浮遊する。周辺のアンカーによって提供される張力は、このような組織収縮を克服し、そして防ぐ。
【００４５】
さらに、組織構造面に対して垂直な圧縮力の適用は、隣接する組織層間の融合を促進する。圧縮は、組織層間の細胞−細胞接触を改善し、そして組織層を横断する細胞の融合を促進し得る。そのような圧縮は、組織または重ね合わされた組織シート平面に適用される荷重デバイスの使用することで適用され得、それにより、組織の平面に対して垂直の力を加える。例えば、図１１に例示されるように、この荷重デバイスは、スポンジ１５００を含み、重し１５０２から離して間を空けて配置される。このスポンジ１５００は、実質的にその平面の表面を多い、そして規定の力を加えるように組織構築物７０００上に位置する。必要に応じて、組織構築物７０００はまた、示されるように、アンカー６０００でその周囲が固着され得る。
【００４６】
好ましくは、圧縮力または圧力は、組織表面全体に均一に加えられる。従って、組織の形状に合わせたデバイスを使用して融合を誘導することが好ましい。組織の束の表面に加える圧力の強さは、工学組織の要求に従って、調整し得る。従って、この実施例において、アンカー６０００は、重量および配置によって変わり得、組織に対する望ましい強さの圧力が得られる。当然のことながら、機械的圧力または液圧を用いる他のあらゆる系が用いられ得、この圧縮を提供する。この圧力を加える時間は、組織層を完全に融合させるのに、十分に長くあるべきである（好ましくは、２４時間〜７２時間）。
【００４７】
また、生存細胞に栄養を取らせるために、組織の表面に圧力を加えるために用いるデバイスは、培養培地に対して浸透性であることが好ましい。従って、図１１に示されるスポンジ１５００は、受容可能な経路であり、培養培地に対して多孔性および浸透性であるような圧力を生じる。
【００４８】
融合プロセスの間、機械的ストレスは細胞の配向および組織内の細胞の表現型の改変を誘導するのに用いられ得る。従って、繊維の配向を誘導するために、適切な力を成熟中の組織に対して加え得る。このような力はまた、収縮を妨げ、所望の細胞分化を維持しうる。アンカーは、このような所望の細胞分化および繊維の配向を維持するか、または生成するために用いられ得る。本発明は、成熟中の培養細胞を固着する方法を提供する。１つの実施形態において、その方法は、調節可能な固着手段を包含し、好ましくは、多重のアンカーとの間隔を含み（例えば、動かすことのできる重しまたはインゴット）、ここで、アンカーは、（１）生組織シートを横断して十分な張力を加え、少なくとも１つの生組織シートにおいて、収縮を妨げ、そして／または細胞分化の維持し、そして／または細胞の配向を誘導するのに適しており、そして（２）一旦、生組織シートを横断して、所定の張力の閾値を超えると、少なくとも１つの生組織シートを収縮させるのに適している。
【００４９】
この実施形態において、固着手段は時間厳守であり、ここで、各々の固着手段は、実質的に空間中の一点で組織を保持する。固着手段はまた、一旦、組織がアンカー（すなわち、重しまたはインゴート）によって支持され得る最大張力より高い張力を増強すると、組織は、自然に収縮収縮し得、そしてアンカーは、収縮した組織に沿って引きつけられるという点で、「調整可能」である。従って、組織を横断する張力は、上記の調整可能な固着手段が用いられる場合、増強し続けるのは不可能である。組織を横断して増強し得る最大張力は、適切なアンカー（例えば、特定の重量および数の重しまたはインゴット、もしくは特定の張力または力に応答して移動するように設計されている調整フレーム）の選択により制御され得る。これらのアンカーは移動可能であるので、それらを容易に組織シート上に配置することも、そこから取り外すことも可能である。従って、任意の得られた組織に対する張力の強さを最適にする（例えば、組織内の細胞の生存度を増強する）ことが可能である。
【００５０】
図１１Ａに例示される実例のように、組織構造７０００上の２つのアンカー６０００の配置は、細胞およびこれら２つのアンカー６０００の間のマトリックスの、（ライン６２００によって示される）コードのような配向を誘導し得る。アンカー６０００が群化され、組織構造７０００に沿って、アンカー６０００の２つのラインを形成する場合、図１１Ｂに例示されるように、繊維は、アンカー６０００によって誘導される機械的な力と平行に（ライン６４００によって示される）整列する。
【００５１】
さらに、アンカー６０００が、長方形の組織構造７０００の周囲に沿って位置する場合、図１２に例示されるように、繊維および細胞は、アンカー６０００によって作られる平面の２次元に方向付けられる。この細胞および細胞外マトリックスの配向は、融合プロセスに利益をもたらし得、そしてまた、組織の特定の機能的性質を改善し得る。例示されるように、多様な離れたアンカーを、中断するまたは不連続な方法において、生組織シートの縁に沿って、組織に対して機械的な力を加えるために用い得る。アンカーを、互いに非常に接近させて配列するか、または互いに接触するように配置する場合、それらのアンカーは、組織が収縮する際に、幾分か互いに置換し得る。組織に加えられる機械的な力の強さおよび向きは、アンカーの数、重量および位置の変化によって制御され得る。それ故、任意の特定の型の組織に対して、機械的な力の条件の最適化または微調整が可能である。
【００５２】
連続アンカー（例えば、組織を囲むまたは取り巻くガラス微小繊維のフレームまたは環）が二者択一的に用いられ、細胞の配向が誘導され得ることが理解され得る。細胞の配向の誘導が引き起こされ得る。なぜならば、連続アンカーが、成熟した培養組織の自然な収縮を機械的に制限し、それにより、細胞の配向が誘導される組織を横断する機械的なストレスまたは張力を生じるからである。しかし、連続アンカーの使用は、成熟する間、高レベルの張力を生じない特定の組織型に対してのみ適切であり得る。
【００５３】
特定の構造ジオメトリを有する合わせた細胞牽引力は、後に作製する弁（例えば、少し挙げれば、リーフレットの癒合、整復した弁閉鎖不全、有効な開口部、および低圧力勾配など）のより良い補助弁機能に対して、特定のコラーゲン繊維を提供すし得る。例えば、図１３に例示されるように、アンカー６０００をその周囲に有するディスク型構造８０００は、組織構造８０００の成熟の間、放射状の８１００コラーゲン繊維および周囲の８２００コラーゲン繊維の配向に効力をもたらす。図１３Ａは、ディスク型構造８０００から切り出される楔型部分８３００を例示し、ここで部分８３００のいくつかの端は、コラーゲン繊維方向のラインに沿って置かれる。これは、ネイティブの弁に非常にそっくりに模倣し得、ここで、主なコラーゲン繊維の同じ周囲の配向は、リーフレットに帰される、より大きな張力の力を支持する。あるいは、図１４および図１４Ａに例示されるように、長方形構造８６００から切り出される楔型部分８４００は、短い８８００軸方向および長い９０００軸方向を提供し、異なるロード条件を支持する。
【００５４】
（送達条件）
成熟組織を輸送することを所望する場合、組織は、以下のような送達に対して調製し得る。図１５Ａに例示されるように、個々の培養皿１２００に含まれる各々の組織構造は、固体寒天ベースの栄養培地１００００（好ましくは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）中の１％寒天）、生理学的に安定なｐＨを維持する緩衝液で覆われる。固体ゲルのような寒天ベースの栄養培地１００００での組織構造の被覆はまた、重みつきアンカーを適所に維持する利点を有し、組織の移動および／または送達の間の組織の折りたたみが妨げられる。さらに、細胞は、ゲルからの栄養の拡散により生存度が維持される。図１５Ｂは、送達のための、カバー１０２００での皿１２の被覆を例示する。好ましくは、これらの皿１２００は、凍結すべきでなく、送達前に約３７℃に予め温めておく。絶縁パッケージ（例えば、標準的な冷却機）と合わせた、予め温めておいた「ホットパック（ｈｏｔ  ｐａｃｋ）」（好ましくは約３７℃）は、送達に用いられ得る。この送達系は、少なくとも２４時間、組織の保全性および生存度を維持する。
【００５５】
（前条件付け）
一旦組織が成熟し、コントロール範囲（例えば、層状流体フード）において、滅菌したピンセットを用いて固着補助（例えば、ステンレススチールバー、またはストリング）から遊離すると、残渣の収縮が起こりうる。そのような収縮を減らすために、多様な前条件付け方法が、必要に応じて実施され得る。初めに、組織構造は、その培養培地から放出し得うるが、水分は維持され、そして約１５分間、層状流体フード下で別の培養皿の底で平らにする。この期間の間に、この構築物の収縮は落ち着く。
【００５６】
あるいはまたはさらに、弁を構成する前または移植前に、ヒト組織工学組織の弾性を調整するために、他の前条件付け方法が用いられ得る。このような前条件付けは、組織がもともと形成された寸法よりも大きい寸法にストレッチするか、破裂することを含み得る。構造の前条件付け方法の１つは、ストレッチングまたは生理学的頻度（例えば、１Ｈｅｒｔｚの頻度で１０回のロードの適用）で繰り返し付与されるロードの適用による。このような前条件付けは、減少傾向のロードコンディション構造を生成する。あるいは、この構造は、全ての次元に対して前条件付けされ得、破裂（ｂｕｒｓｔｉｎｇ）圧力技術または循環流体流動により達成され得る。
【００５７】
（リーフレットの切り取り）
弁のリーフレットおよび他の部分を、任意の適切な方法によって、組織工学組織から切り取る。好ましい方法としては、テンプレートカッティングおよびダイカッティングが挙げられる。テンプレートカッティングにおいて、テンプレートは、弁の各部分について作製され、ここで各テンプレートは、所定の部分に適切な形状およびサイズを有する。このテンプレートは、組織上に配置され、そしてカッティングブレードが、このテンプレートの縁部にそって動かされ、下にある組織をこのテンプレートと同じ形状に切り取る。図１６は、リーフレット６８が、意図される弁の用途に所望の形状およびサイズに、テンプレート６９を使用して切り取られ、対向する端部７１、７２を有するほぼまっすぐかまたは直線状の接着嵌合縁部７０およびその間を延びるほぼ弓形の周辺カスプ７３を規定することを示す。このリーフレット６８は、カッティングボード７４上に配置され、次いで、選択されたテンプレート６９が、このリーフレット６８の上に配置される。次いで、このテンプレート６９の境界を越えて延びる組織７５は、シャープラゾーブレード７６または類似のカッティングツールを使用して、切り取られる。同様に、このような部分は、組織からダイカッティングまたは穿孔カッティングされ得る。周囲に沿って切り取り縁部を有するダイが、所望のサイズおよび形状で形成される。次いで、このダイは、組織上に配置され、そしてこの切り取り縁部がこの組織を貫くまで、押しつけられる。図１７は、組織７４を示し、この組織７４は、アンカー６０００により支持され、そして切り抜き部６００２を有し、ここで、組織７４は、ダイカッティングまたはテンプレートカッティングされ、そして取り出される。図１７の組織から切り取られたリーフレット６８は、ペトリ皿１２００に並べて図１７Ａに示される。
【００５８】
テンプレートまたはダイは、弁において最終的に所望されるサイズよりも大きいリーフレットまたは弁部分を切り取るために、必要以上に大きなサイズであり得る。このような必要以上に大きいことは、組織の残余収縮を補償し得る。いくつかの実施形態において、リーフレットまたは弁部分は、弁において所望される最終的なサイズの１５０％である。または、言い換えると、リーフレットまたは弁部分は、約５０％だけ寸法が大きい。
【００５９】
（弁の製造条件）
有利には、組織または弁の最終アセンブリに使用される任意のテンプレートリーフレットと滑らかな不活性表面との間の表面張力は、弁の構築の間の収縮を制御するのに役立つ。好ましい開示において、代表的な生きた三リーフレット型人間工学心臓弁５０は、ＨＥＰＥＳおよびグルコースを含有する適切な細胞培養培地でこの構築物を濡らしたまま製造され得る。
【００６０】
（弁の製造）
本発明は、心臓弁の調製において１つの技術順序を使用することにより、その範囲を限定しない。異なる順序を使用して、生きたヒトの組織工学弁の機能を満たす種々の弁のサイズおよび形状を形成し得ることが暗に示される。さらに、弁の各部分が、異なる技術により生成されるかまたは異なる特徴を有する組織工学組織から製造され得る。例えば、１つのリーフレットは、一工程の折り畳み技術を使用して形成される平らな組織から切り取られ得、そして別のリーフレットは、ローリング技術を使用して生成される管状組織から切り取られ得る。次いで、これらのリーフレットは、単一の弁の構築において組み合わされ得る。
【００６１】
全体的に、例示的な生きたヒトの組織工学弁は、成人組織工学組織から切り取られる複数の組織リーフレットを含む。これらのリーフレットは、物理化学的圧力に供される場合、一緒に結合されて、寸法安定性で一貫した連結リーフレットサブアセンブリを形成する。次いで、このサブアセンブリのリーフレットの各々が、整列され、そして代表的には、１つのワイヤフォームの連結部の頂部から、リーフレットカスプの周囲の周りを均一に、隣接するワイヤフォームの連結部の頂部まで、個別にワイヤフォームに縫いつけられる。このワイヤフォームは、通常、ヒトの組織工学組織で覆われるが、代わりに布で覆われ得る。この縫いつけられた構造体は、同様に整列されたステープルのように作用し、これら全ては、予め整列されたリーフレットの各々のカスプ全体に沿って作用する先端負荷力を均等に受ける。このように形成されて生じる組織−ワイヤフォーム構造アセンブリは、連結部ごとに、フィーフレットカスプ全体に均一に応力を分散することによって、リーフレット縫合界面の応力および起こり得る疲労を軽減する。
【００６２】
必要に応じて、この改善された構造安定性の減少した応力アセンブリは、以前に調製されたステントの先端部に作動可能に取り付けられ得る。このステントはまた、代表的に、ヒト組織工学組織で覆われるが、代わりに布で覆われ得る。組織リーフレットカスプをリーフレットを歪めることも、それらの相対的な整列およびそれらの嵌合縁部の生じた連結を妨げることもなく、負荷分配組織または被覆ステントの先端部により形成される布シート上に、組織リーフレットカスプを留めることもまた所望される。
【００６３】
図１８は、本発明の生きた組織工学ヒト心臓弁５０の実施形態の上面図である。同様に、図１９は、図１８に例示される実施形態の斜視図である。図２０は、アセンブリの分解図であり、本発明の生きた組織工学ヒト心臓弁５０の数個の例示的な実施形態を示す。弁５０の個々の構成要素および本発明の教示に従って製造される代替の構成が示される。本開示において、例示的な弁５０は、三リーフレット弁または三尖弁として例示される。しかし、弁５０は、意図される用途に依存して２つのリーフレットまたは任意の他の所望のリーフレット構成を有するように構成され得ることが当業者に理解される。
【００６４】
弁５０は、上記のような組織加工型組織から作製される予め整列されて規格化されたリーフレットサブアセンブリ５２、組織または布被覆ワイヤフォーム５４、および支持ステント５６を含む。以下で詳細に考察されるように、弁５０の構築の間、予め整列されたリーフレットサブアセンブリ５２およびワイヤフォーム５４は、初めに、本発明に従って構築され、組織−ワイヤフォーム構造アセンブリ５８を形成する。次いで、この構造アセンブリ５８は、必要に応じて、ステント５６に取り付けられ、構築された弁５０を形成する。
【００６５】
図２０に例示されるように、弁５０は、種々の最終用途に有用ないくつかの代替の弁の製造を可能にするように、独自に構成される。例えば、所望の用途が、元の心臓弁との交換である場合、弁５０は、心臓内の場所（図示せず）に後に縫いつけるために、比較的柔らかい縫合リング６０に取り付けられ得る。あるいは、所望の場合、弁５０は、流入コンジット６４および／または流出コンジット６６のいずれかに取り付けられ得る。
【００６６】
（リーフレットの互いの取付け）
組織弁５０の構築における第１の工程は、組織リーフレット６８を互いに取り付けて、一貫して寸法決めされた、規格化されたリーフレットサブアセンブリを形成することである。本発明の教示に従って予め整列することおよび縫い合わせることは、弁５０の製造を簡単にするだけでなく、即座に弁の嵌合表面または被覆表面全体を整列するように機能する。このことは、リーフレットの整列および寸法関係におけるばらつきを排除し、かつリーフレットの嵌合縁部における適切な連結を保証するために、弁の最終的な構築の後に組織リーフレットを調整する必要性を有意に最小限にする。
【００６７】
１つの表面が対向する表面よりも滑らかである場合、この滑らかではない方の表面は、隣接するリーフレット縁部７０を有する縁部７０で、嵌合表面として役立つことが同定されることが所望される。リーフレット６８が切り取られ、そして嵌合表面が同定された後、２つのリーフレット６８ａ、６８ｂは、図２１に示されるように、テンプレート６９と共に予め整列または嵌合される。次いで、この２つのリーフレット６８ａ、６８ｂは、一端７１で一緒に取り付けられるかまたは縫い合わされ、第１の整列された嵌合リーフレット端部の複数の対を規定する。例えば、「二重に糸を通した」針、すなわち、糸８０のループ状（または「畳んだ」）セグメントを通された針７８は、テンプレート６９の一端でガイドスロット８２により示される場所で、リーフレット６８ａ、６８ｂに挿入されるかまたはリーフレット６８ａ、６８ｂを通過する。次いで、テンプレート６９が外され得、針７８は、リーフレット６８ａ，６８ｂの先端部の上を通り、そしてループを再び通過して、強く引っ張られる。本来、代替の取付け方法または縫い合わせが使用され得る。代表的な三リーフレット弁の初めの２つのリーフレット６８ａ、６８ｂの対向する端部７２は、この時点では一緒に縫い合わせられない。
【００６８】
ここで図２２を参照すると、第３のリーフレット６８ｃは、予め整列され、そして再びテンプレート６９を使用して、三尖様式で、他の２つのリーフレット６８ａ、６８ｂに取り付けられる。特に、第３のリーフレット６８ｃは、テンプレート６９と嵌合され、そして初めの２つのリーフレット６８ａ、６８ｂのそれぞれの縫い合わされていない端部７２が、展開され、次いで、第３のテンプレートリーフレット６８ｃの対向する端部７１、７２のそれぞれと整列される。再びテンプレート６９のガイドスロット８２をガイドとして使用して、糸８０で二重に糸を通した針が、３つのリーフレット６８ａ、６８ｂ、６８ｃの縫い合わされていない対の各々を通して挿入され、示されるように、リーフレットの端部を一緒に対にして固定する。次いで、テンプレートが外され、そして各々の縫い合わせのために、針７８がリーフレット６８ａ、６８ｂ、６８ｃの先端部の上に通され、そして再びループに通され、そして強く引っ張られて、３つのリーフレット嵌合端部を有するリーフレットサブアセンブリ５２を生成する。
【００６９】
ヒト組織工学心臓弁の作製の間、構築物の形状を持続する適切な力（例えば、この構築物の自由端におけるさらなる縫い合わせ、または表面張力）が、収縮現象を回避するために使用され得る。例えば、構築物の収縮は、この構築物を柔軟または剛性のソイング助剤に浸すことにより、表面張力を使用して制御され得る。あるいは、カスプの自由端は、収縮を防止するために縫い合わされ得る。
【００７０】
（ワイヤフォームへのリーフレットの取付け）
ここで図２３〜２４を参照すると、リーフレットサブアセンブリ５２をワイヤフォーム５４の裏面または底部８３に取り付けることが好ましい。例示的なワイヤフォーム５４は、組織縁部８４を有する組織工学組織で覆われたワイヤであり、リーフレットサブアセンブリ構造５２の形状に実質的に適合する様式で、成形される。ワイヤフォーム５４は、代わりに、適切な布で覆われてもよいことが理解され得る。示される実施形態において、ワイヤフォーム５４は、ほぼ円形の形状であり、リーフレット嵌合端部の対に対応する複数の連結先端部８６を規定する正弦形の波形を有する。ワイヤフォーム５４の被覆部は、周辺組織縁部８４を含み、この周辺組織縁部８４は、リーフレットサブアセンブリ５２のための縫い付け表面または取付け表面として働く。例示的なワイヤフォーム５４は、３つの高くなった連結先端部８６を含み、これらは、予め整列されたリーフレットサブアセンブリ５２のリーフレット６８ａ、６８ｂ、６８ｃの取り付けられた嵌合端部の３つのそれぞれの対を収容する。
【００７１】
リーフレットアセンブリ５２の端部にあるリーフレットの対を、ワイヤフォーム５４の連結先端部８６の１つに取り付けるための例示的な技術は、図２３に示される。ループ状の糸８０を有する針７８（図示せず）（これはリーフレットの端部を一緒に縫い合わせるために使用された）は、リーフレット６８から上に挿入され（破線で示されるように）、８７で示されるように、組織縁部８４の内縁部を通り、その結果、嵌合リーフレット６８の上面は、ワイヤフォーム５４と接触して固定される。次いで、この針は、８８’で示されるように、下の組織縁部８４の外面に、この組織縁部の外面から再び挿入され、そして第１のロック８９、好ましくはシングルロック縫合部が、糸８０を用いて作製される。このロッキングプロセスは、８８’’で示されるように、第２のロック、好ましくは二重ロックステッチを用いて繰り返され得る。最後に、この針は、９１で示される用に、下の組織端部８４の中央に、この組織縁部８４から挿入され得、そして糸が引っ張られ、その結果、第１および第２のロック８９、９０は、下の組織縁部８４を引張り、それにより残りの製造プロセスの間、隠され保護される。次いで、過剰な糸が切り取られ、そして捨てられる。取り付けられ、サブアセンブリ５２の嵌合リーフレット６８ａ、６８ｂ、６８ｃの取り付けられて整列された嵌合リーフレットの端部のそれぞれの部位の各々を、ワイヤフォーム５４のそれぞれの連結先端部８６に固定するために、この方法が繰り返される。従って、ワイヤフォーム５４は、リーフレット連結部を互いに対して最終的な位置に位置決めするためのさらなる永久テンプレートとして機能する。本発明のさらなる利点として、この製造技術は、ワイヤフォームへのリーフレットカプスの取付けの前に、連結弁リーフレットの互いに対する位置をさらに安定化する。従って、リーフレット縁部に沿って一貫した取付け応力を生成するために、１つの連結部から隣の連結部まで均一に周辺リーフレットカスプ全体を取り付けることが可能である。
【００７２】
ここで図２４〜２５を参照すると、例示的なリーフレットサブアセンブリ５２をワイヤフォーム５４に固定するための次の例示的な工程は、リーフレット６８の各々の周辺カスプ９２を組織縁部８４に取り付けることである。この連結において、スリップノット９４（すなわち、外され得ないノット）が、ワイヤフォーム５４の周囲に沿って間隔をあけて配置されて、ワイヤフォーム５４上の位置で、リーフレットカスプ９２を一時的に取り付ける。３つのスリップノット９４が、各リーフレットカスプ９２ごとに作製され得、この１つは、カプスの中央にあり、そして２つは、および縫い合わせ部を有する湾曲部の点にある。なぜなら、これは、ワイヤフォーム５４への取付けの間、カスプをある位置に一様に安定化するのを助けるからである。
【００７３】
図２５〜２６に示されるように、一時的に固定されたリーフレットカスプ９２は、次いで、好ましくは、各リーフレットカスプ９２の中央位置９８から始まり、各連結部８６の先端部まで走る、二重に糸を通した「イン−アンド−アウト（ｉｎ−ａｎｄ−ｏｕｔ）」縫合糸９６を使用して、ワイヤフォーム組織縁部８４に取り付けられる。連結先端部８６から約１ミリメートルで、この糸を縛り、好ましくは、以前に記載されるようにして、埋め込みそして切り取る。従って、リーフレットが個別に取り付けられ、連結部の先端部の前でカスプの周辺の縫い付け（潜在的な応力点を生成する）が終了しているいくつかの組織弁とは異なり、この生成された弁アセンブリは、連結先端部から連結先端部まで均一な縫い付けを有し、そして一貫して整列された連結リーフレット嵌合縁部を有する。
【００７４】
（支持ステントへのリーフレット−ワイヤフォームアセンブリの任意の取付け）
一端、構築された組織−ワイヤフォーム構造アセンブリ（これは参照番号５８により識別される）が、上記のように生成されると、このアセンブリ５８は、次いで、必要に応じて支持体またはステント５６に取り付けられる。図２７〜２９を参照すると、この組織ワイヤフォーム構造アセンブリ５８は、初めに、ステント５６の上側表面９９（図２０を参照のこと）とワイヤフォーム５４の下側表面との間にリーフレットの周辺カスプ縁部を均一に留める様式で、対応して構成されたステント５６に取り付けられる。この構築技術は、さらに、リーフレット６８の応力および負荷を分配し、そしてその機能寿命に寄与する。さらに、リーフレット６８の予備整列およびワイヤフォーム５４への取付けは、弁５０全体の寸法を一度に整列させ得、そして別個の連結ポストの使用に起因して、他の技術を用いた場合に生じ得る寸法のばらつきを排除する。特に、ステント５６は、アセンブリ５８の構成と嵌合するかまたはこれを収容するような寸法にされ、そしてアセンブリ５８は、ステント５６に嵌合され、その結果、ワイヤフォーム５４の各連結先端部８６の下側表面は、対応する相補的なステント連結先端部１００の上部表面と嵌合する。嵌合リーフレット６８を連結することにより形成される中央開口部１０２が、組織−ワイヤフォーム構造アセンブリ５８をステントに嵌合したまま、歪められないことを保証することに注意する。同様に、リーフレット６８が均一に留められ、そしてこのプロセス全体にわたって一様な張力を維持することを保証することに注意する。
【００７５】
一旦ワイヤフォームアセンブリ５８がステント５６に嵌合されると、ワイヤフォームアセンブリ５８ヲステント５６に一時的に固定するために、一時的なピン１０４が、各リーフレットカスプ９２の下側湾曲部に挿入され得る。次いで、ステント５６およびアセンブリ５８は、図２８〜２９に示されるように、一緒に縫い合わされる。ステント５６へのアセンブリ５８の縫い合わせは、連結先端部８６の上部で始まる。特に、二重に糸を通した針（図示せず）は、１０５’で示されるように、リーフレット６８の隣接する対のタブの自由端１０６、１０８の間のステント連結先端部１００に挿入され、そして１０９’’で示されるように、ワイヤフォームアセンブリ５８の組織縁部８４に通される。次いで、この針は、ループ状の糸を通されて、シングルロック１１０を形成する。次いで、二重ロック１１２が形成され、ここで針は、二重ロック１１２が下の組織縁部８４を引張り得るように、実質的に前に議論されたよう様式で、１０５’’のステント連結先端部および１０９’’の組織縁部８４に挿入される。次いで、１１３で示されるように、組織縁部８４から出ている過剰な糸が、切り取られ、そして捨てられ得る。ワイヤフォームアセンブリ５８の残りの連結先端部について、同じ手順が実施され得る。結果として、ワイヤフォーム連結先端部８６は、ステント連結先端部１００に均一に嵌合する。
【００７６】
図２７、３０〜３２を参照すると、前記のような二重に糸を通して針を、１１４’で示されるように、ステント連結先端部１００の上部付近のステント５６に挿入し、組織リーフレット６８に通し、そして１１５’で示されるように、ワイヤフォーム５４の組織縁部８４に通すことにより、例示的な取付け手順が完了され得る。次いで、針は、逆の様式で、１１５’’の組織縁部に再び挿入され、１１４’’のステント連結先端部１１０を通され、そして二重の糸のループ１１５を通される。図３２を参照すると、次いで、縫合糸は、ループ１１５がステント連結先端部１００に対してしっかりと固く配置される用に、締められる。次いで、イン−アンド−アウト縫合１１６（図３３〜３４もまた参照のこと）が、ステント５６およびワイヤフォームアセンブリ５８の嵌合縁部に沿って、隣のワイヤフォームアセンブリおよびステント連結先端部８６、１００まで行われる。図３１を参照すると、連結先端部８６の上部付近の位置で、シングルロック１１８および二重ロック１２０が形成され、そして糸は、前記のように、ワイヤフォームアセンブリ５８の組織縁部８４の下に埋めこまれ得る。ちょうど記載された縫合がステント連結先端部１００のいずれかで開始され得ること、およびイン−アンド−アウト縫合１１６が、ステント５６の周辺の周りで時計回り様式または反時計回り様式のいずれかで実施され得ることが理解される。
【００７７】
ステント５６の周辺の周りのイン−アンド−アウト縫合１１６が完了すると、組織リーフレット６８の各対のタブの自由端１０６、１０８は、それぞれのステント連結先端部１００に固定される必要がある。図３３〜３４を参照すると、２つの例示的な代替が、この課題を実施するために提供される。
【００７８】
図３３を参照すると、第１の例示的な代替は、タブ端部１０６、１０８を、突合わせ継手１２２に適合させることである。特に、タブ端部１０６、１０８は切り取られ、その結果、互いに折り畳まれた場合、各タブ端部１０６、１０８の各々の縁部が一様に嵌合し、好ましくは、連結先端部１００の上部から垂直に下りるまっすぐな中心線を形成する。２つのリーフレットタブ端部１０６、１０８は、次いで、縫合部１２４と共に縫い合わされる。
【００７９】
図３４を参照すると、リーフレットタブ端部１０６、１０８を固定するための第２の例示的な代替は、タブ端部１０６、１０８が嵌合し、連結先端部１００のいずれかの側面上で、ワイヤフォーム５４の組織縁部８４とフラッシュ接合部１２６を一様に形成するように構成することである。特に、リーフレットタブ端部１０６、１０８は、各タブ１０、１０８の端縁部がワイヤフォームの組織縁部８４とぴったり一致する大きさになるように、切り取られ得る。次いで、リーフレットタブ端部１０６、１０８は、示されるように、縫合部１２８を用いて、ワイヤフォーム５４の組織縁部８４に縫い付けられる。このように形成された代替のフラッシュ接合部１２６は、第１の代替の突き合わせ接合部１２２よりも幾分平らな連結部を提供し、従って、フラッシュ接合部１２６は、より小型の弁がひるようである場合に、より望ましくあり得る。しかし、両方の例示的な方法は、連結部において組織リーフレット上の負荷の均一かつ正確な分配を可能にする。
【００８０】
（ステントの構築）
上記の記載から、ステント５６がワイヤフォームアセンブリ５８を嵌合および支持するために適切な構造を有するように構成されることが理解される。この点について、ここでステント５６の例示的な構造を、図３５を参照して記載する。当業者は、本明細書中に記載される例示的なステントが、多部品構成であることを理解する。しかし、単部品ステントを提供することが、本発明の範囲内であることが意図される。しかし、例示される多部品ステントアセンブリは、連結ポストの所望の軸方向可撓性を維持しつつ、ステントの半径方向安定性を設計または微調整することを容易にし得る。例示的なステント５６の構築における第１の工程は、内側支持部材１３０および外部支持部材１３２を製造することであり、これらは、一緒に嵌合された場合、一般にワイヤフォームアセンブリ５８の構成に最終的に適合するステント５６の形状を形成する。例示的な実施形態において、内側支持部材１３０は、ステント連結先端部１００のための支持構造体として働く３つの直立ポスト１３４を有して構成される。外側支持部材１３２はまた、内側支持部材１３０のポスト１３４に対応するポスト１３６を含み得る。しかし、ポスト１３６は切り取られ得、従って、内側部材１３０上のポスト１３４の高さと一致しない。内側支持部材１３０および外側１３２は、弁５０の所望の特性に依存して、金属材料またはプラスチック材料から製造され得る。
【００８１】
内側支持部材１３０の上には、複数のソイングホール１３８が、複数の縁部１３０に沿って、ポスト１３４の上に配置されている。外側支持部材１３２は、その切り取られたポスト１３６（これは内側部材１３０の各ポスト１３４上のソイングホール１３８のそれぞれ１つに対応する）の各々の上に少なくとも１つのソイングホール１３９を備える。外側支持部材１３２の内径は、内側支持部材１３０の外径とスリップ係合を形成するような大きさである。
【００８２】
内側支持部材１３０は、外側支持部材１３２内に配置され、その結果、外側支持部材１３２のソイングホール１３９は、内側部材１３０のそれぞれのポスト１３４上のソイングホール１３８と整列する。ついで、これら２つの部材は、前記のように、二重に糸を通した針を整列されたホール１３８、１３９に挿入することによって、一緒に縫い合わされる。図３６に示されるように、次いで、整列されたホール１３８、１３９の各々に挿入された糸１４０は、末端ループ１４０を通過し、そして締められる。次いで、この糸は、例えば、スリップノット（図示せず）（これは、糸に沿ってスライドして、支持部材に接合し得るノットである）を使用して、ロックされ得る。従って、内側支持部材１３０のポスト１３４は、その基部からその上部までより大きな程度まで曲がり、そして外側支持部材１３２は、内側支持部材１３０の半径方向安定性を増強し、切り取られたポスト１３６は、内側支持部材１３０のポスト１３４の基部に対する剛性を提供する。
【００８３】
ここで図３７を参照すると、一旦、内側支持部材１３０および外側支持部材１３２が一緒に縫い合わされると、被覆材料１４４（好ましくは、人間工学組織、組織または織布ポリエステルから作製される）は、切り取られ、そしてこの合わせられた支持部材１３０、１３２を覆うための円柱状チューブに形成される。当業者は、この被覆材料が、単部品ステントアセンブリにも同様に適用可能であることを理解する。被覆材料１４４は、２本の折り目線１４６、１４８を含み、そのうち第１の線１４６は、材料１４４の縁部を折り畳むことにより形成され、内側支持部材１３０のポスト１３４を収容するひだを形成する。例示的な実施形態において、第１の折り目線１４６と各ポスト１３４の上縁部との間は、約１ｍｍ〜１．５ｍｍである（図３５〜３６を参照のこと）。第２の折り目線１４８は、合わせられた支持部材１３０、１３２の下縁部１５０に対応するように位置する（図３６を参照のこと）。
【００８４】
ここで図３８を参照すると、被覆材料１４４を支持部材１３０、１３２に固定するために、糸を通された針が、材料１４４、内側部材ポート１３４の１つのホール１５１、材料１４４の第２層に通され、次いで、材料１４４を通して同じホール１５１および材料１４４に戻される。次いで、この針は、ループを通過して、第１のロック１５２を形成し得る。この糸を通す工程は、２回より多くまで行われる。次いで、余分な糸が、切り取られ、そして捨てられる。内側支持部材１３０上の３つのポスト１３４の各々について、同じ手順が続く。
【００８５】
次いで、図３９に示されるように、次の例示的な工程は、被覆材料１４４を内側支持部材１３０および外側支持部材１３２に、内側支持部材１３０の上縁部に沿って縫い付ける工程を包含する。この被覆材料１４４は、任意の適切な材料（いくつか挙げると、人間工学組織、組織または布が挙げられる）を含み得ることが理解され得る。第１の、材料１４４の下縁部１５４は、折り目線１４８に沿って、支持部材１３０、１３２の内側に折り畳まれ得、その結果、第２の折り目線１４８は、支持部材構造の下端部または底部を規定する。この折り畳みは、支持材料１３０、１３２を覆う二層材料１４４（外側材料層１５６および内側材料層１５８を含む）を生じる。次いで、一本の糸を通した針を使用して、この層状材料を、支持部材１３０、１３２の上縁部１５３の湾曲に沿って、１５５で一緒に縫い付ける。この縫合部１５５は、好ましくは返し縫い部であり、これは、針を、例えば、右まで縫合長さだけ挿入し、そしてこの針を左まで等しい距離だけ上げることによって、達成される。しかし、縫合部１５５は、ポスト１３４の上部１４９まで延びず、ポスト１３４の上部１４９と縫合部１５５との間に約１ｍｍの空間を残す。支持部材１３０、１３２の上縁部１５３を縫い合わせた後、次いで、材料１４４は、支持部材１３０、１３２の下縁部１５０に沿って、類似の様式で、１５６において縫い合わせられ得る。次いで、最後の縫合が、スリップノットを結ぶことによりロックされ、これはこの縫合部を適所に固定してロックするために、三回まで実施され得る。
【００８６】
ここで図３９〜４４を参照すると、ここで支持部材１３０、１３２に取り付けられている材料１４４は、支持部材１３０、１３２の形状に適合するように切り取られ、所望の場合、ガスケット様のソイング縁部を提供する。これを達成するために、外側材料層１５７は、内側支持部材１３０の上縁部１５３の上約５ｍｍ〜６ｍｍの距離まで、この外側材料層１５７の上縁部から下向きにスライスされ得る。類似の様式において、内側材料層１５８は、外側材料層１５７内のスライスの底部の上約２ｍｍ〜３ｍｍの距離まで、この内側材料層１５８の上縁部から下向きにスライスされ得る。これらのスライスは、内側部材１３０の隣接するポスト１３４の間の中間位置に作製され、そして１６０で示されるように、下向きの方向で互いに整列することが意図される。
【００８７】
次に、外側材料層１５７は、外側材料層１５７に形成されたスライスの底部から始めて、内側支持部材１３０の上縁部１５３に沿って切り取られる。本発明のこの例示的な実施形態において、切り取りは、支持部材１３０の上縁部１５３の下湾曲部の上約４ｍｍ〜５ｍｍの距離、支持部材１３０のポスト１３４の基部におけるまたは基部付近の領域内の、支持部材１３０の部分の上約２ｍｍ〜３ｍｍの距離、および支持部材１３０のポスト１３４の上部１４９の上約０．５ｍｍ〜２ｍｍの距離まで、材料１４４の輪郭が及ぶような様式で行われる。
【００８８】
図４０に示されるように、次いで、内側材料層１５８は、内側部材１３０のポスト１３４の上部１４９の上で折り畳まれて、ポスト１３４に固定され、ここで糸を通された針は、材料１４４の上部折り畳み部分について上記された様式で、ポスト１３４内のソイングホール１５１を通して縫い合わせる。しかし、これらのロッキング縫合が完了した後、針は、ポスト１３４の上部から出るように、材料の下を通過する。
【００８９】
次に、一連の切り取り操作が、行われ得る。図４０〜４１を参照すると、内側材料層１５８の折り畳み部分１６２は、材料の周辺全体の周りで切り取られ、その結果、折り畳み部分１６２の下縁部１６４は、ポスト１３４のホール１５１内の縫合部から約１ｍｍ〜１．５ｍｍになる。外側材料層１５７の折り畳み部分１６８は、内側支持部材１３０のポスト１３４の上部１４９の上で折り畳まれる。内側材料層１５８の折り畳み部分１６２は、さらに切り取られ、その結果、その残りの縁部は、前に切り取られた内側材料層１５８の縁部と揃う。内側材料層１５８の折り畳まれていない部分に関して、この層は、その縁部が、前に切り取られた外側材料層１５７の縁部を越えて約２ｍｍ延びるような様式で、切り取られる。外側材料１５７を越えた内側材料層１５８の２ｍｍの伸長部は、ステント状に装填表面および取付け表面またはソイング表面を形成するために望ましい材料を提供する。
【００９０】
各々の切り取り操作は、内部支持部材１３０のポスト１３４の間の中心領域から初めてポスト１３４の上部１４９まで実施される。内部材料層１５８、外部材料の織り返し１６８、外部材料層１５７、および内部材料の織り返し１６２の配置は、図４１の拡大断面図に示される。
【００９１】
ステント５６の組み立てを完了するための残りの例示的な工程は、材料層を折り畳んで縫合し、ステント５６の周囲に裁縫縁１６９を形成することである。図４２を参照すると、内部材料層１５８は、ポスト１３４の周囲で折り畳まれ、そしてポスト１３４を包むよう縫い付けられている。より詳細には、縫合穴１５１を通して折り畳まれた外部材料層１５７を連結する場合にポスト１３４の上部を通して先に挿入された糸（ｔｈｒｅａｄ）は、ここで使用され、ポスト１３４の上部に内部材料層１５８を保持するようポスト１３４の上部に第１および第２ロック１７２が作製される。次いで、かがり縫い（ｗｈｉｐｓｔｉｔｃｈ）１７４が、例示の内部材料層１５８をポスト１３４の周囲下方向に、ポスト１３４の上部から約８ｍｍのところでさらに固定するために使用され得る。ポスト１３４の底部に到達する場合、第１および第２のロックが形成され、そして糸が切り取りおよび廃棄される。
【００９２】
上記の縫合操作は、３つのポスト１３４の各々について実施される。しかし、縫合されるポスト１３４の最後については、第１および第２ロック１７２を形成した後に糸を切り取る代わりに、切り取られない糸１７６が、ポスト１３４の間の支持部材１３０、１３２の残りの縁に沿って材料の縫合を実施するために使用され得る。
【００９３】
この点において、図４３〜４４を参照すると、内部材料層１５８は、外部材料層１５７上に折り畳まれ、そして代替の縫合が、折り畳まれた層を、支持部材に保持するため、およびそれによって、ステント上に裁縫縁１６９を形成するために適用される。支持部材１３０、１３２の残りの部分の周囲の縫合が完了した後、第１および第２ロックの縫合は、糸と共に形成され得、そして余剰の糸が切り取りおよび廃棄されて、組み立てられたステント５６が完成する。
【００９４】
（縫合リングの構築）
弁５０が、ネイティブの心臓弁の代わりに使用されることが意図される場合、軟らかい縫合リング６０が、弁の構造を完了するのに使用され得る。例えば、図４５を参照すると、例示されるリング座金または「レメイ（ｒｅｍｅｙ）」１８０が提供され、これは、好ましくは、非網目ポリエステルで作製される。レメイ１８０と対にするために、シリコーンスポンジワッフル環１８２もまた提供される。この点において、環１８２は、レメイ１８０の内部境界面１８５に沿って配置されるよう構成された、壁で囲まれたリップ１８４を有するよう構成される。リップ１８４は、弁５０における各々の合わせ目（ｃｏｍｍｉｓｓｕｒｅ）の間の低い方の湾曲表面と対応する３つの窪み１８６を含むような外形である。レメイ１８０は、ワッフル環１８２上に取り付けられ、その結果、レメイ１８０は、壁に囲まれたリップ１８４を取り囲む。これにより、軟らかく、比較的可撓性であるが、以前として安定な縫合リングの内部構造が生成され、この内部構造は、以下に議論されるような材料で覆われる場合、心臓の天然組織とプロテーゼ組織弁５０との間の適合性の、縫合可能な表面として機能する。
【００９５】
図４６に示されるように、ワッフル環１８２上にレメイ１８０を取り付ける前に、材料１８８が、内部境界面１８５から外部境界面１８９へと伸びるようレメイ１８０の周囲に配置される。次いで、レメイ１８０は、ワッフル環１８２上に取り付けられ、その結果、材料１８８は、ワッフル環１８２とレメイ１８０との間でサンドイッチされる。材料１８８は、図４６に示されるように、レメイ１８０の外部境界面の縁１８９を超えて約３ｍｍ〜５ｍｍの距離１９０だけ伸びるよう配置される。次いで、レメイ１８０、材料１８８、およびワッフル環１８２は、例えば、レメイ１８０の境界面の周囲で、イン−アンド−アウト縫合（ｉｎ−ａｎｄ−ｏｕｔ  ｓｕｔｕｒｉｎｇ）１９２を用いて一緒に裁縫される。例示される縫合は、好ましくは、レメイ１８０の外部境界面の縁１８９から約１ｍｍの距離１９４に配置される。所望の場合、第２縫合線（示されず）が、第１縫合線と同じ位置に追加され得、第２縫合線の各々の縫合が、第１縫合線の縫合の間に配置される。次いで、得られる縫合１９２は、縫合の連続線として見られる。さらに、図４７に示されるように、さらに、材料１８８およびワッフル環１８２を一緒に固定するために、裏縫合（ｂａｃｋ  ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）１９５が、環１８２の壁に取り囲まれたリップ１８４とレメイ１８０との間の空間（この空間は、図４６の１９６に示される）に適用され得る。
【００９６】
ここで、図４８を参照すると、材料１８８は、例えば、一本の糸を通された針を窪み１８６の１つの角１９８に（材料１８８および環１８２を通して）挿入し、次いで、二重スリップノットを、角１９８で糸に固定することにより、レメイ１８０およびワッフル環１８２の構造アセンブリの窪み１８６に取り付けられ得る。次いで、イン−アンド−アウト縫合２００は、材料１８８を、窪み１８６の輪郭に固定するために使用され得る。各々の窪み１８６について、同じ方法が、続けられ得る。次いで、余剰の材料は、２０１で示されるように、レメイ１８０の外部縁まで切り取られる。
【００９７】
図４９をさらに参照すると、次いで、材料１８８の外部部分２０２が、レメイ１８０の外部表面で折り畳まれ得、そしてレメイ１８０とワッフル環１８２との間で、レメイ１８０の下に押し込まれる。環１８２は曲げやすいので、環１８２は変形し、そして材料１８８の外部部分２０２を収容する。一本の糸を通された針を用いることで、代替の縫合２０４が、レメイ１８０の底で折り畳まれた材料１８８を固定するために使用され得る。レメイ１８０の境界面全体の縫合が完了した後、二重ノットが、縫合を固定するために形成され得、完成した縫合リングが作製される。
【００９８】
（縫合リングへの弁の任意の取り付け）
図５０〜５１を参照すると、縫合リングまたは代替の構造物（例えば、フランジ６２（図２０を参照のこと））を弁５０に取り付けるために、縫合リング６０の窪み１８６は、弁５０の傾斜した周辺カスプ２０６と整列され、次いで、一緒に対を形成される。より詳細には、弁５０は、縫合リング６０に配置され、その結果、弁５０上の各カスプの最も低い部分にあるワイヤフォーム５８の組織縁８４は、対応する窪み１８６で、縫合リング６０の上表面と実質的に水平である。組織リーフレット６８のもつれまたはしわが回避されるような配置に注意が払われる。弁５０は、この手順を容易にするために、針２０８によって、縫合リング６０に一時的にピン留めされる。
【００９９】
図５２に示されるように、ピン留めされた弁５０および縫合リング６０のアセンブリは、反転され、そして縫合リング６０は、リング６０と弁５０との嵌合形成縁２０９に沿って弁５０に縫合され得る。より詳細には、例示の実施例において、一本の糸を通された針は、ステント構造の材料に縫合リング６０を裁縫するために使用され得る。縫合工程を容易にするために、構成要素は、一時的に、しかしさらなる針２０８によってしっかりと保持される。リング６０および弁５０の反対側は、同様の様式で一緒に裁縫され得る。
【０１００】
（流出コンジットへの弁の任意の取り付け）
ここで図５３〜５５を参照すると、特定の適用において、６６に示されるような流出コンジットに弁５０を取り付けることが望ましくあり得る。例えば、大動脈弁の置換を必要とする何人かの患者において、動脈自体の一部は、損傷するかまたは疾患を引き起こし得、その結果、置換を必要とする。従って、本発明の教示と一致して、適合可能な組織弁構造は、損傷した大動脈を置換する働きをする流出コンジット６６を含むよう改変され得る。あるいは、いくつかの意図的な機械的なポンピングの適用において、本発明の適合可能な組織弁には、機械的ポンピング構造との接続を容易する流出コンジットが設けられ得る。いずれかの代替物において、このことは、図５３〜５４に示されるようにして達成され得る。流出コンジット６６は、組織リーフレット６８が固定される時点でワイヤフォーム５４に取り付けられ得る。特に、図５４を参照すると、コンジット６６は、例えば、縫合によって、組織リーフレット６８の反対側のワイヤフォーム５４の側面に固定され得る。あるいは、図５５に示されるように、コンジット６６は、組織リーフレット６８と同じ側で、ワイヤフォーム５４に縫合および固定され得るか、またはそれらの間にサンドイッチされ得る。第３の選択肢は、その後の裁縫工程として、単に、完成した弁（示さず）の周囲にコンジット６６を固定することである。弁５０は、洞を有してまたは有さずのいずれかで、流出コンジットに取り付けられ得る。
【０１０１】
（弁の流入側への弁の任意の取り付け）
図５６は、弁５０の改変および取り付けに利用可能なさらなる例示の代替の選択肢を示す。例えば、上述のように、コンジット弁として弁５０を使用することが望ましい場合、縫合リング６０は、先に記載されたように弁５０に取り付けられ得る。あるいは、人工心臓または左心室補助デバイス（ＬＶＡＤ）のような適用において、縫合リング６０は、必ずしも必要ではなく；従って、ステント５６の低い方の端は、人工心臓またはＬＶＡＤにおいて弁を取り付けるのに使用するために、フランジ６２に取り付けられ得る。
【０１０２】
なおさらなる代替の適合は、流入コンジット６４が所望される適用を含む。このような適用において、流入コンジット６４は、弁５０のステント５６に直接取り付けられ得る。より詳細には、流入コンジット６４は、ステント５６の外部外縁（あるいは、内部外縁）とぴったりと嵌合し、そしてそれに裁縫され得る段階的境界２１０を有するよう構成され得る。例えば、この構成において、人工心臓またはＬＶＡＤ適用において、縫合リング６０は、弁５０ではなく流入コンジット６４に取り付けられ得る。
【０１０３】
（さらなる実施形態）
種々の弁および関連するデバイスが、本明細書中に記載される人間工学組織の使用により構築され得ることが理解され得る。例えば、上記および説明された弁に加えて、図５７に示される弁５０もまた構築され得る。ここで、弁５０は、より可撓性の弁の設計を有し、そしてこれは、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０１８５５（全ての目的で、本明細書中に参考として援用される）により詳細に記載される。同様に、本発明の人間工学組織はまた、一般的に使用されているワイヤ状布地の代わりとして使用され得る。従って、図５８に示されるように、人間工学組織１１０１０は、移植部位で、自然な生きた接触面を形成するようワイヤフォーム１１０１２を覆っていることが示される。他の類似の使用もまた、本発明の範囲内にある。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１：線維芽細胞および細胞外マトリクス構成成分を含む生組織のシートからの再構築多層ヒト組織構築物の調製）
以下の実施例は、本発明に従う線維芽細胞および細胞外マトリクス構成成分を含む生組織のシートから再構築多層ヒト組織構築物を調製するための１つの方法を記載する。以下に記載される手順は全て、滅菌条件下で（好ましくは、滅菌流フードを用いて）実施される。種々の方法が、多層組織構築物を調製するために使用され得、そしてこの実施例は、多層ヒト組織構築物を作製するための、重ねられた組織のシートの数、１つの特定の形状（すなわち、厚みおよび大きさ）、細胞型、起源、年齢、成熟時間、成分濃度、および培養条件に、本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解され得る。当業者は、種々の改変が、本発明の範囲および意図から逸脱することなくこの方法に対してなされ得ることを容易に理解する。
【０１０５】
代表的に、７５０，０００の生存準培養ヒト皮膚線維芽細胞を、最終接種密度１０４細胞／ｃｍ２で、標準的な７５ｃｍ２の滅菌ペトリ皿に接種する。細胞を、培養培地（１０％胎仔ウシ血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＤＭＥ）と共に供給し、そして４週間培養して操作され得るシートを形成する。培養培地を、週に３回変更する。新たに調製されたアスコルビン酸の溶液を、培地を交換するごとに添加し、アスコルビン酸の終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。細胞を、培養の間、加湿環境（９２％空気および８％ＣＯ２）で維持する。組織のシートを、皿から剥がした後、生存組織の３つの別々のシートを重ねる。ステンレス鋼の塊（約１ｍｍ×２ｍｍ×８ｍｍ）を使用し、組織シート境界線周辺に配置して、組織構築物の係留を維持し、そしてペトリ皿の表面上の最大領域まで拡大する。次いで、別の組織シートを、第１組織シートの上面に配置する。１つずつ、塊を注意深く第１シートから除くよう押し込み、そして他の塊を、第２層の組織シート境界線周辺に配置し、それを、組織の第１シート上に広げる。これらの工程を反復して、３層組織構築物を得る。
【０１０６】
次いで、培養培地に対して透過性の半硬質スポンジを、塊の間の組織構築物の大きさに適合するよう切り取り、そしてこの構築物の表面に適用する。このスポンジは、塊により定められる境界線に緊密に適合させるべきであるが、重複または超過するべきでない。次いで、塊を、スポンジ表面上に均一に分散させて、それに対していくらか加重する。スポンジおよび塊を、積み重ねた２４〜７２時間後に取り除く。組織シートの積み重ねの７日後、上記と同じ技術を用いて、３つの３層組織構築物を重ねて、最終的な９層組織構築物を形成する。この構築物をさらに、６週間インキュベートし、そして培養培地を週に３回交換する。次いで、組織構築物を、出荷処理のために準備する。
【０１０７】
前述の発明は、より明確に理解させる目的で詳細に記載されているが、特定の改変が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかである。本明細書中で引用された全ての刊行物および特許書類は、全ての目的のために、各々が個々に示されるのと同程度に、それらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、患者から細胞を得る工程の概略図である。
【図２】図２は、生存組織シートが各ディッシュにおいて形成されるように、ペトリ皿中に細胞をプレーティングする工程を図示する。
【図３】図３は、鉗子を使用しての、ディッシュからの生存組織シートの取り外しを図示する。
【図４】図４は、シートが直接重なるように重ねられた、生存組織シートの斜視図である。
【図５】図５は、円形の層状の組織構築物を作製するために、生存組織シートを重ねる工程を概略的に示す。
【図６】図６は、規則的な形状の組織構築物を形成するための、不規則に形成された生存組織シートの積み重ねを図示する。
【図７】図７は、交互の配向でのシートの積み重ねを図示する。
【図８】図８は、アコーディオン型の様式でのシートの折り畳みを図示する斜視図である。
【図９】図９は、反復した半体へのシートの折り畳みを図示する斜視図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ラッピング技術を図示する斜視図である。
【図１０】図１０は、本発明の成熟様の人間工学組織の組織学的図である。
【図１１】図１１は、重み付きデバイスが組織の平面に対して垂直に圧力を付与している、組織の斜視図である。図１１Ａ〜１１Ｂは、別の配置に関する繊維の配向を図示する。
【図１２】図１２は、組織構築物の周囲全体に沿った、アンカー配置を図示する。
【図１３】図１３および１３Ａは、構築物の形状と調和するような、特定のコラーゲン繊維配向の作製を図示する。
【図１４】図１４および１４Ａは、構築物の形状と調和するような、特定のコラーゲン繊維配向の作製を図示する。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、組織構築物の送達のための任意の調製を図示する。
【図１６】図１６は、本発明の組織心臓弁を作製する際に使用される例示的なリーフレットを、テンプレーティングおよびトリミングする工程を図示する斜視図である。
【図１７】図１７は、組織がダイカットまたはテンプレート切断されて除去された切抜きを有する、組織の上面図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、図１７の組織から切り取られたリーフレットを図示する。
【図１８】図１８は、本発明の生存組織−工学ヒト心臓弁の実施形態の上面図である。
【図１９】図１９は、図１８に図示される実施形態の斜視図である。
【図２０】図２０は、本発明の例示的な心臓弁の分解斜視図であり、標準化された構成要素と、代替弁装着適用構造体との組み立ての関係を図示する。
【図２１】図２１は、弁サブアセンブリのリーフレットをテンプレーティングおよび予備整列する、最初の工程を図示する。
【図２２】図２２は、弁リーフレットサブアセンブリの予備整列におけるさらなる工程を示す。
【図２３】図２３は、ワイヤフォーム交連先端への予備整列されたリーフレットの例示的な装着工程を図示する拡大図である。
【図２４】図２４は、図２３のワイヤフォームの例示的なリーフレット心臓弁膜尖の、引き続く予備的な装着を図示する斜視図である。
【図２５】図２５は、リーフレットの周囲の心臓弁膜尖の、布、または人間工学心臓弁組織で覆われたワイヤフォームへの均一な付着を図示する、斜視図である。
【図２６】図２６は、図２５の付着されたリーフレットタブの対の一方の拡大図であり、ワイヤフォーム交連先端の心臓弁膜尖の均一な付着を図示する。
【図２７】図２７は、本発明の例示的な組織リーフレット−ワイヤフォーム構造サブアセンブリの、例示的なステントへの付着を図示する、斜視図である。
【図２８】図２８は、図２７のリーフレットタブの対の一方の拡大図であり、ステントと交連先端との間にリーフレット心臓弁膜尖をクランプして、交連先端においてステントをワイヤフォームに付着させるさらなる工程を図示する。
【図２９】図２９は、図２８の組織−ワイヤフォーム構造アセンブリの交連先端の１つの拡大図であり、ステントによるリーフレットのクランピングを図示する。
【図３０】図３０は、例示的な組織−ワイヤフォーム構造アセンブリをステントに付着させる最終工程を図示する斜視図である。
【図３１】図３１は、図３０の円１３における拡大図であり、さらなる例示的な付着技術を図示する。
【図３２】図３２は、図３０の円１４における拡大図であり、さらなる例示的な付着技術を図示する。
【図３３】図３３は、交連先端における、組織リーフレットタブの例示的な付着工程を図示する斜視図である。
【図３４】図３４は、図３３と類似の図であり、代替の付着工程を図示する。
【図３５】図３５は、可撓性支持体および付随する補強材から形成される、本発明の例示的な複数片ステントを図示する分解斜視図である。
【図３６】図３６は、図１７の補強材への支持体の付着を図示する斜視図である。
【図３７】図３７は、図３６のステント構成要素を、布、または人間工学心臓弁組織で覆う際の最初の工程を図示する斜視図である。
【図３８】図３８は、図３７の上部の拡大図であり、布、または人間工学心臓弁組織の、ステント構成要素への付着におけるさらなる工程を図示する。
【図３９】図３９は、布、または人間工学心臓弁組織を、ステント構成要素に付着させるための縫い付けタブを作製するさらなる工程を図示する斜視図である。
【図４０】図４０は、図３８の一部の拡大図であり、引き続く製造工程を図示する。
【図４１】図４１は、図４０の線２３−−２３における拡大断面図である。
【図４２】図４２は、さらなる組み立て工程を例示する、図４０と同様の図である。
【図４３】図４３は、布または組織シートリップを図示する図３６の布カバーするステントまたは人間工学心臓弁組織カバーステント、斜視図である。
【図４４】図４４は、例示のステントアセンブリの組み立てのさらなる局面を例示する、図４３のライン２６−２６での拡大断面図である。
【図４５】図４５は、本発明の例示の縫合リングの初期成分を例示する、斜視図である。
【図４６】図４６は、例示の縫合リングの組み立ての側面を例示する、拡大断面図である。
【図４７】図４７は、例示の縫合リングアセンブリのさらなる特徴を例示する、横断面図である。
【図４８】図４８は、縫合リングアセンブリの組み立てのさらなる局面を例示する、図４７の一部分の拡大断面図である。
【図４９】図４９は、完成した例示の縫合リングアセンブリのさらなる側面を例示する、拡大断面図である。
【図５０】図５０は、縫合リングの配置およびアセンブリ、ならびにリーフレットサブアセンブリ立体配置を例示する、拡大斜視図である。
【図５１】図５１は、縫合リングリーフレットサブアセンブリ装着工程を例示する、上面斜視図である。
【図５２】図５２は、さらなる例示の縫合リング装着工程を例示する、底面斜視図である。
【図５３】図５３は、アウトフロー導管の本発明の例示の弁への、例示の装着を例示する、断面斜視図である。
【図５４】図５４は、導管装着のさらなる局面を例示する、拡大断面図である。
【図５５】図５５は、代替的な導管接続の特徴を例示する、図５４と同様の横断面図である。
【図５６】図５６は、本発明の弁装着代替物を例示する、分解斜視図である。
【図５７】図５７は、本発明の生組織工学ヒト心臓弁のさらなる実施形態の、斜視図である。
【図５８】図５８は、ワイヤーフォーム（ｗｉｒｅｆｏｒｍ）を覆うための人間工学組織の使用を例示する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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