(57)【要約】本発明は、新生内膜過形成に起因する移植不全を治療するための方法および組成物を提供する。これら方法および組成物は、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物（例えばイマチニブメシレート）のような、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の生物活性を阻害するためのＰＤＧＦＲ阻害化合物の使用を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生内膜過形成に起因する移植不全の予防または治療の方法であって、式：
【化１】
2005533019.tif 000006
［式中、Ｒ1は、水素またはＣ1−Ｃ3アルキルであり；
Ｒ2は、水素またはＣ1−Ｃ3アルキルであり；
Ｒ3は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−メチル−３−ピリジル、４−メチル−３−ピリジル、２−フリル、５−メチル−２−フリル、２，５−ジメチル−３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、５−メチル−２−チエニル、２−フェノチアジニル、４−ピラジニル、２−ベンゾフリル、Ｎ−オキシド−２−ピリジル、Ｎ−オキシド−３−ピリジル、Ｎ−オキシド−４−ピリジル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−ピロル−２−イル、４−キノリニル、１−メチルピリジニウム−４−イルヨージド、ジメチルアミノフェニルまたはＮ−アセチル−Ｎ−メチルアミノフェニルであり；
Ｒ4は、水素、Ｃ1−Ｃ3アルキル、--ＣＯ--ＣＯ--Ｏ−Ｃ2Ｈ5またはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の少なくとも１つは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、フェニル、アミノ、モノ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）アミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）アミノ、Ｃ2−Ｃ4アルカノイル、プロペニルオキシ、カルボキシ、カルボキシメトキシ、エトキシカルボニルメトキシ、スルファニルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）スルファニルアミド、Ｎ−メチルピペラジニル、ピペリジニル、１Ｈ−イミダゾール−１−イル、１Ｈ−トリアゾール−１−イル、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル、１−ナフチル、シクロペンチル、３，４−ジメチルベンジル、または次の式：
--ＣＯ2Ｒ、--ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、--Ｎ（Ｒ）ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、
--Ｏ（ＣＨ2）nＮ（Ｒ）Ｒ、--ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮ（Ｒ）Ｒ、
--ＣＨ（ＣＨ3）ＮＨＣＨＯ、--ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ＝Ｎ−ＯＨ、
--ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ3、--ＣＨ（ＣＨ3）ＮＨ2、
--ＮＨＣＨ2ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）Ｒ、
【化２】
2005533019.tif 000007
--（ＣＨ2）mＲ10、--Ｘ−（ＣＨ2）mＲ10、若しくは
【化３】
2005533019.tif 000008
（式中、ＲはＣ1−Ｃ3アルキルであり、
Ｘは、酸素または硫黄であり、
ｍは、１、２または３であり、
ｎは、２または３であり；
Ｒ9は、水素、Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、クロロ、ブロモ、ヨードまたはトリフルオロメチルであり；
Ｒ10は、１Ｈ−イミダゾール−１−イルまたはモルホリニルであり；そして
Ｒ11は、Ｃ1−Ｃ3アルキルまたは未置換のフェニル、またはフェニルであって、Ｃ1−Ｃ3アルキル、ハロゲンまたはトリフルオロメチルで１置換されているものである）
の１つを有する基であり；そして
置換基Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の残りのものは水素である］
を有するＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物；または少なくとも１つの塩形成性基を含有する該Ｎ−フェニル−２−ピリミジン誘導体の薬学的に許容しうる塩の有効量を患者に投与することを含み、ここにおいて、該化合物は、ＰＤＧＦＲ生物活性を阻害し、そして該投与は、該移植不全を予防または治療するのに充分な用量である方法。
【請求項２】
前記化合物が、式：
【化４】
2005533019.tif 000009
を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物がイマチニブメシレートである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物がＰＤＧＦＲβ生物活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドによって刺激されるＰＤＧＦＲ生物活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記移植片を血液透析における血管アクセスに用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記移植片を末梢血管疾患を治療するのに用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記移植不全が内膜への平滑筋細胞の遊走を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記移植不全が血管平滑筋細胞の増殖を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記移植不全が細胞外マトリックスの沈着を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記移植不全が血管狭窄または血栓症の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
血液透析のための前記血管アクセスが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片の使用に関連している、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管アクセスが動静脈フィステルの使用に関連している、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記移植片が合成物質を含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記合成物質がダクロンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記移植片が、該移植片を受容するであろう患者からの静脈の一部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物を薬学的に許容しうる担体と組み合わせて与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記用量が血管狭窄または血栓症を予防または改善させるのに充分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記用量が新生内膜過形成を予防または改善させるのに充分である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１に記載の化合物、並びに
（ｉｉ）次の：
（ａ）血管新生阻害剤；
（ｂ）抗増殖化合物；
（ｃ）免疫抑制化合物；
（ｄ）抗遊走化合物；
（ｅ）抗血小板薬；および
（ｆ）抗線維症化合物、
から成る群より選択される少なくとも１つの追加の化合物
を含む医薬組成物。
【請求項２１】
前記追加の化合物が血管新生阻害剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記血管新生阻害剤が抗体である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記抗体がＶＥＧＦ−Ａを結合させる、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体がＶＥＧＦ受容体を結合し且つＶｅｇＦ結合をブロックする、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２５】
前記血管新生阻害剤がＡＶＡＳＴＩＮである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記血管新生阻害剤がエンドスタチンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記血管新生阻害剤がアンジオスタチンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記血管新生阻害剤がレスチンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記血管新生阻害剤がタムスタチンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記血管新生阻害剤がＴＮＰ−４７０である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記血管新生阻害剤が２−メトキシエストラジオールである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記血管新生阻害剤がサリドマイドである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記血管新生阻害剤が抗血管新生タンパク質のペプチド断片である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ペプチド断片がカンスタチンである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記ペプチド断片がアレスチンのものである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記血管新生阻害剤がＶＥＧＦキナーゼ阻害剤である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記血管新生阻害剤がＶＥＧＦキナーゼ阻害剤である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記血管新生阻害剤がＣＰＴＫ７８７である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記血管新生阻害剤がＳＦＨ−１である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記血管新生阻害剤が抗血管新生タンパク質である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記血管新生阻害剤がトロンボスポンジン−１である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記血管新生阻害剤が血小板第４因子である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記血管新生阻害剤がインターフェロンαである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記血管新生阻害剤が、ＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２のシグナル伝達をブロックする物質である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記血管新生阻害剤が、ＰＩＨ１２のシグナル伝達をブロックする物質である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記血管新生阻害剤が、細胞外血管内皮（ＶＥ）カドヘリンドメインをブロックする物質である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記血管新生阻害剤が、細胞外ＶＥカドヘリンドメインに結合する抗体である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記血管新生阻害剤がテトラサイクリンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記血管新生阻害剤がペニシラミンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記血管新生阻害剤がビンブラスチンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記血管新生阻害剤がシトキサンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記血管新生阻害剤がエデルフォシンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記血管新生阻害剤がテガフルまたはウラシルである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記血管新生阻害剤がクルクミンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記血管新生阻害剤が緑茶である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記血管新生阻害剤がゲニステインである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記血管新生阻害剤がレスベラトロールである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記血管新生阻害剤がＮ−アセチルシステインである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記血管新生阻害剤がカプトプリルである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記血管新生阻害剤がｃｏｘ−２阻害剤である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記血管新生阻害剤がセレブレックスである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記血管新生阻害剤がビオックスである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記追加の化合物が抗増殖化合物である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記抗増殖化合物がラパマイシンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記抗増殖化合物がタキソールである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記抗増殖化合物がトログリタゾンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記抗増殖化合物が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
前記抗増殖化合物が塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を阻害する物質である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記抗増殖化合物がｂＦＧＦを結合させる抗体である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記抗増殖化合物がｂＦＧＦ−サポリンを結合させる抗体である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記抗増殖化合物がスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記抗増殖化合物がＡＣＥ阻害剤である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記抗増殖化合物がスラミンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記抗増殖化合物が１７β−エストラジオールである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記抗増殖化合物がアトルバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記抗増殖化合物がフルバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記抗増殖化合物がロバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記抗増殖化合物がプラバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記抗増殖化合物がシンバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記抗増殖化合物がセリバスタチンである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記抗増殖化合物がペリンドプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
前記抗増殖化合物がキナプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記抗増殖化合物がカプトプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記抗増殖化合物がリシノプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記抗増殖化合物がエナラプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
前記抗増殖化合物がフォシノプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
前記抗増殖化合物がシラザプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
前記抗増殖化合物がラミプリルである、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
前記抗増殖化合物がキナーゼ阻害剤である、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
前記追加の化合物が免疫抑制化合物である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
前記免疫抑制化合物がプレドニゾンである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
前記免疫抑制化合物がＦＴＹ７２０である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
前記免疫抑制化合物がメチルプレドニゾロンである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記免疫抑制化合物がα−トコフェロールである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記免疫抑制化合物がアザチオプリンである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
前記免疫抑制化合物がシクロホスファミドである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
前記免疫抑制化合物がクロラムブシルである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
前記免疫抑制化合物がＩＬ−２受容体またはＣＴＬＡ４に結合する抗体である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
前記免疫抑制化合物がメトトレキサートである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
前記免疫抑制化合物がミコフェノレートモフェチルである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
前記免疫抑制化合物がシクロスポリンである、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
前記免疫抑制化合物がマクロファージ機能を妨げる物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
前記免疫抑制化合物がＰ−セレクチンの生物学的機能を阻害する物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
前記免疫抑制化合物がＰＳＧＬ−１の生物学的機能についての物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０５】
前記免疫抑制化合物がＶＬＡ−４の生物学的機能についての物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
前記免疫抑制化合物がＶＣＡＭ−１の生物学的機能についての物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】
前記免疫抑制化合物がＭａｃ−１の生物学的機能についての物質である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０８】
前記免疫抑制化合物がＦＴＹ７２０である、請求項９０に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
前記追加の化合物が抗遊走化合物である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項１１０】
前記抗遊走化合物がシプロヘプタジンである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１１】
前記抗遊走化合物がメチセルジドである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１２】
前記抗遊走化合物がボセンタンである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】
前記抗遊走化合物がＹＭ０８７である、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】
前記抗遊走化合物がシプロヘプタジンである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】
前記抗遊走化合物がケタンセリンである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
前記抗遊走化合物がアンプラーグである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１７】
前記抗遊走化合物がエンドセリン−１受容体アンタゴニストである、請求項１０９に記載の医薬組成物。
【請求項１１８】
前記抗遊走化合物がセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項１１９】
前記追加の化合物が抗血小板薬である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項１２０】
前記抗血小板薬がアスピリンである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２１】
前記抗血小板薬がチクロピジンである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２２】
前記抗血小板薬がシロスタゾールである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２３】
前記抗血小板薬がジピリダモールである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２４】
前記抗血小板薬がアブシキシマブである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２５】
前記抗血小板薬がクロピドグレルである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２６】
前記抗血小板薬がアデノシン再取り込み阻害剤である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２７】
前記抗血小板薬がジピリジモールである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２８】
前記抗血小板薬が糖タンパク質ｉｉｂ／ｉｉｉａ阻害剤である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１２９】
前記抗血小板薬がエプチフィバチドである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３０】
前記抗血小板薬がチロフィバンである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３１】
前記抗血小板薬がホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３２】
前記抗血小板薬がシロスタゾールである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３３】
前記抗血小板薬がＡＤＰ阻害剤である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３４】
前記抗血小板薬がチクロプジピンである、請求項１１９に記載の医薬組成物。
【請求項１３５】
前記追加の化合物が抗線維症化合物である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項１３６】
前記抗線維症化合物が、ＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックするかまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１のプロモーター活性の活性化を阻害する物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１３７】
前記抗線維症化合物が、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に結合する抗体である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１３８】
前記抗線維症化合物が、ＴＧＦ−β受容体Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに結合する抗体である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１３９】
前記抗線維症化合物がキナーゼ阻害剤である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４０】
前記抗線維症化合物が結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）シグナル伝達をブロックする物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４１】
前記抗線維症化合物がプロリルヒドロキシラーゼを阻害する物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４２】
前記抗線維症化合物がプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性を阻害する物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４３】
前記抗線維症化合物がピルフェニドンである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４４】
前記抗線維症化合物がシリマリンである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４５】
前記抗線維症化合物がペントキシフィリンである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４６】
前記抗線維症化合物がコルヒチンである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４７】
前記抗線維症化合物がエンブレルである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４８】
前記抗線維症化合物がレミケードである、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１４９】
前記抗線維症化合物がトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に拮抗する物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１５０】
前記抗線維症化合物が結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質である、請求項１３５に記載の医薬組成物。
【請求項１５１】
（ａ）血管新生阻害剤；
（ｂ）抗増殖化合物；
（ｃ）免疫抑制化合物；
（ｄ）抗遊走化合物；
（ｅ）抗血小板化合物；および
（ｆ）抗線維症化合物、
から成る群より選択される少なくとも１つの追加の化合物を患者に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５２】
前記追加の化合物が、抗体；ＶＥＧＦ−Ａを結合させる抗体；ＶＥＧＦ受容体を結合し且つＶｅｇＦ結合をブロックする抗体；アバスチン；エンドスタチン；アンジオスタチン；レスチン；タムスタチン；ＴＮＰ−４７０；２−メトキシエストラジオール；サリドマイド；抗血管新生タンパク質のペプチド断片；カンスタチン；アレスチン；ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤；ＣＰＴＫ７８７；ＳＦＨ−１；抗血管新生タンパク質；トロンボスポンジン−１；血小板第４因子；インターフェロンα；ＴＩＥ−１若しくはＴＩＥ−２シグナル伝達、またはＰＩＨ１２シグナル伝達をブロックする物質；細胞外血管内皮（ＶＥ）カドヘリンドメインをブロックする物質；細胞外ＶＥカドヘリンドメインに結合する抗体；テトラサイクリン；ペニシラミン；ビンブラスチン；シトキサン；エデルフォシン；テガフルまたはウラシル；クルクミン；緑茶；ゲニステイン；レスベラトロール；Ｎ−アセチルシステイン；カプトプリル；ｃｏｘ−２阻害剤；セレブレックス；およびビオックスから成る群より選択される血管新生阻害剤である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記追加の化合物が、ラパマイシン；タキソール；トログリタゾン；ｂＦＧＦを結合させる抗体；ｂＦＧＦ−サポリンを結合させる抗体；スタチン；ＡＣＥ阻害剤；スラミン；１７β−エストラジオール；アトルバスタチン；フルバスタチン；ロバスタチン；プラバスタチン；シンバスタチン；セリバスタチン；ペリンドプリル；キナプリル；カプトプリル；カプトプリル；リシノプリル；エナラプリル；フォシノプリル；シラザプリル；ラミプリル；およびキナーゼ阻害剤から成る群より選択される抗増殖化合物である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記追加の化合物が、プレドニゾン；ＦＴＹ７２０；メチルプレドニゾロン；α−トコフェロール；アザチオプリン；クロラムブシル；シクロホスファミド；ＩＬ−２受容体またはＣＴＬＡ４に結合する抗体；メトトレキサート；ミコフェノレートモフェチル；シクロスポリン；マクロファージ機能を妨げる物質；Ｐ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１を阻害するかまたはＭａｃ−１の生物学的機能をブロックする物質；およびＦＴＹ７２０から成る群より選択される免疫抑制化合物である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
前記追加の化合物が、シプロヘプタジン、メチセルジド、ボセンタン、ＹＭ０８７、シプロヘプタジン、ケタンセリンおよびアンプラーグから成る群より選択される抗遊走化合物である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記追加の化合物が、チクロピジン、シロスタゾール、ジピリダモール、アブシキシマブ、クロピドグレル、ジピリジモール、糖タンパク質ｉｉｂ／ｉｉｉａ阻害剤、エプチフィバチド、チロフィバン、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤およびチクロプジピンから成る群より選択される抗血小板化合物である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５７】
前記追加の化合物が、ＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックするかまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１のプロモーター活性の活性化を阻害する物質；ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に結合する抗体；ＴＧＦ−β受容体Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに結合する抗体；キナーゼ阻害剤；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）シグナル伝達をブロックする物質；プロリルヒドロキシラーゼを阻害する物質；プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼを阻害する物質；ピルフェニドン；シリマリン；ペントキシフィリン；コルヒチン；エンブレル；レミケード；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に拮抗する物質；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質；および結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質から成る群より選択される抗線維症化合物である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５８】
（ｉ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物、
（ｉｉ）次の：
（ａ）血管新生阻害剤；
（ｂ）抗増殖化合物；
（ｃ）免疫抑制化合物；
（ｄ）抗遊走化合物；
（ｅ）抗血小板化合物；及び
（ｆ）抗線維症化合物、
から成る群より選択される第２化合物；並びに
（ｉｉｉ）該Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および該第２化合物を、新生内膜過形成に起因する移植不全と診断されたかまたは移植不全を発症する危険性がある患者に投与するための使用説明書、
を含むキット。
【請求項１５９】
前記Ｎ−フェニル−２−ピリミジン誘導体がイマチニブメシレートである、請求項１５８に記載のキット。
【請求項１６０】
前記移植片を、血液透析における血管アクセスに、または末梢血管疾患を治療するのに用いる、請求項１５８に記載のキット。
【請求項１６１】
前記移植不全が、内膜への平滑筋細胞の遊走、血管平滑筋細胞の増殖、または細胞外マトリックスの沈着を特徴とする、請求項１５８に記載のキット。
【請求項１６２】
前記移植不全が血管狭窄または血栓症の結果である、請求項１５８に記載のキット。
【請求項１６３】
前記第２化合物が、
（ａ）血管新生阻害剤；
（ｂ）抗増殖化合物；
（ｃ）免疫抑制化合物；
（ｄ）抗遊走化合物；
（ｅ）抗血小板化合物；および
（ｆ）抗線維症化合物
から成る群より選択される、請求項１５８に記載のキット。
【請求項１６４】
前記第２化合物が、抗体；ＶＥＧＦ−Ａを結合させる抗体；ＶＥＧＦ受容体を結合し且つＶｅｇＦ結合をブロックする抗体；アバスチン；エンドスタチン；アンジオスタチン；レスチン；タムスタチン；ＴＮＰ−４７０；２−メトキシエストラジオール；サリドマイド；抗血管新生タンパク質のペプチド断片；カンスタチン；アレスチン；ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤；ＣＰＴＫ７８７；ＳＦＨ−１；抗血管新生タンパク質；トロンボスポンジン−１；血小板第４因子；インターフェロンα；ＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２シグナル伝達、ＰＩＨ１２シグナル伝達をブロックする物質；細胞外血管内皮（ＶＥ）カドヘリンドメインをブロックする物質；細胞外ＶＥカドヘリンドメインに結合する抗体；テトラサイクリン；ペニシラミン；ビンブラスチン；シトキサン；エデルフォシン；テガフルまたはウラシル；クルクミン；緑茶；ゲニステイン；レスベラトロール；Ｎ−アセチルシステイン；カプトプリル；ｃｏｘ−２阻害剤；セレブレックス；およびビオックスから成る群より選択される血管新生阻害剤である、請求項１６３に記載のキット。
【請求項１６５】
前記第２化合物が、ラパマイシン；タキソール；トログリタゾン；ｂＦＧＦを結合させる抗体；ｂＦＧＦ−サポリンを結合させる抗体；スタチン；ＡＣＥ阻害剤；スラミン；１７β−エストラジオール；アトルバスタチン；フルバスタチン；ロバスタチン；プラバスタチン；シンバスタチン；セリバスタチン；ペリンドプリル；キナプリル；カプトプリル；リシノプリル；エナラプリル；フォシノプリル；シラザプリル；ラミプリル；およびキナーゼ阻害剤から成る群より選択される抗増殖化合物である、請求項１６３に記載のキット。
【請求項１６６】
前記第２化合物が、プレドニゾン；ＦＴＹ７２０；メチルプレドニゾロン；α−トコフェロール；アザチオプリン；クロラムブシル；シクロホスファミド；ＩＬ−２受容体またはＣＴＬＡ４に結合する抗体；メトトレキサート；ミコフェノレートモフェチル；シクロスポリン；マクロファージ機能を妨げる物質；Ｐ−セレクチンの生物学的機能を阻害する物質；ＰＳＧＬ−１の生物学的機能についての物質；ＶＬＡ−４の生物学的機能についての物質；ＶＣＡＭ−１の生物学的機能についての物質；Ｍａｃ−１の生物学的機能についての物質；およびＦＴＹ７２０から成る群より選択される免疫抑制化合物である、請求項１６３に記載のキット。
【請求項１６７】
前記第２化合物が、シプロヘプタジン、メチセルジド、ボセンタン、ＹＭ０８７、シプロヘプタジン、ケタンセリンおよびアンプラーグから成る群より選択される抗遊走化合物である、請求項１５１に記載のキット。
【請求項１６８】
前記第２化合物が、チクロピジン、シロスタゾール、ジピリダモール、アブシキシマブ、クロピドグレル、ジピリジモール、糖タンパク質ｉｉｂ／ｉｉｉａ阻害剤、エプチフィバチド、チロフィバン、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤およびチクロプジピンから成る群より選択される抗血小板化合物である、請求項１５１に記載のキット。
【請求項１６９】
前記第２化合物が、ＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックするかまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１のプロモーター活性の活性化を阻害する物質；ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に結合する抗体；ＴＧＦ−β受容体Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに結合する抗体；キナーゼ阻害剤；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）シグナル伝達をブロックする物質；プロリルヒドロキシラーゼを阻害する物質；プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼを阻害する物質；ピルフェニドン；シリマリン；ペントキシフィリン；コルヒチン；エンブレル；レミケード；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に拮抗する物質；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質；および結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質から成る群より選択される抗線維症化合物である、請求項１５１に記載のキット。
【請求項１７０】
新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全の治療を必要とする患者の移植不全を治療するのに有用な化合物の組合せを同定する方法であって、
（ａ）ヒト大動脈血管平滑筋細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ｉ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および（ｉｉ）候補化合物と接触させ；そして
（ｂ）該Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および該候補化合物の組合せが、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の遊走を、細胞がＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物単独と接触している場合より大きく減少させるかどうか決定することを含み、該細胞遊走の減少は、新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全の治療を必要とする患者の移植不全を治療または予防するのに有用である組合せとして該組合せを同定する方法。
【請求項１７１】
ポリマー中に分散しているＮ−フェニル−２−ピリミジン誘導体を含むデリバリー製剤。
【請求項１７２】
（ａ）血管新生阻害剤；
（ｂ）抗増殖化合物；
（ｃ）免疫抑制化合物；
（ｄ）抗遊走化合物；
（ｅ）抗血小板化合物；および
（ｆ）抗線維症化合物
から成る群より選択される第２化合物を更に含む、請求項１７１に記載のデリバリー製剤。
【請求項１７３】
前記ポリマーがミクロスフェアの形である、請求項１７１または１７２に記載のデリバリー製剤。
【請求項１７４】
前記ポリマーがフィルムの形である、請求項１７１または１７２に記載のデリバリー製剤。
【請求項１７５】
前記ポリマーが縫合糸の形である、請求項１７１または１７２に記載のデリバリー製剤。
【請求項１７６】
前記ポリマーが、疎水性マトリックス中に埋め込まれたミクロスフェアを含む複合系の形である、請求項１７１または１７２に記載のデリバリー製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、移植不全を治療するための方法および組成物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者のような腎不全に苦しむ患者、および末期腎疾患に苦しむ患者は、血液透析を受けて、尿素などの老廃物を血液から除去している。血液透析には血管アクセスが必要である。最も一般的なアクセス方法は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製の合成移植片による。その移植片の一端は静脈に連結され、もう一端は動脈に連結されて、血液透析用針を連結する部位を生じている。残念ながら、ＰＴＦＥ移植片は、移植による血栓症を招きやすい。血管アクセス機能不全は、年１０億ドルの費用で、末期腎疾患集団の全入院の約２０％の原因となっている。これら症例の大部分において、根本的な病理は、静脈吻合部位または下流静脈における新生内膜過形成および狭窄である。
【０００３】
新生内膜過形成は、末梢血管疾患を治療するのに用いられる移植片にも関連している。米国だけで約８００万人がＰＶＤに冒されている。末梢血管疾患の場合、腕または脚に血液を運ぶ動脈は、狭まった状態または詰まった状態になっている。この狭窄は、アテローム性動脈硬化症のためであることが多く、コレステロールおよび瘢痕組織が増加して、血管を詰まらせる「プラーク」を形成する漸進的過程である。この状態は、動脈ブロック部位周辺の血液の循環を向け直すバイパス移植を用いて治療することができる。典型的には、合成移植片または別の体部からの静脈移植片を用いて、ブロックされた動脈の周辺に迂回路をつくる。或いは、動脈の閉塞部分を置き換えるのに静脈部分が用いられている静脈間置移植片を用いることができる。残念ながら、ＰＶＤを治療するのに用いられるバイパス移植も過形成を招きやすく、最終的には、移植不全をもたらすことがありうる。
【０００４】
血管アクセス機能不全またはＰＶＤに関連した移植不全をもたらす新生内膜過形成を予防または治療することが知られている有効な治療的処置は存在しない。明らかに、これら疾患の治療における移植不全の予防を目指した有効な療法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、新生内膜過形成に起因する移植不全を治療するための方法および組成物を提供する。これら方法および組成物は、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物（例えばイマチニブメシレート）のような、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の生物活性を阻害するＰＤＧＦＲ阻害剤化合物の使用を特徴とする。
【０００６】
第１の側面において、本発明は、概して、新生内膜過形成に起因する移植不全を予防または治療する方法を特徴とし、その方法は、式：
【０００７】
【化１】
2005533019.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｒ1は、水素またはＣ1−Ｃ3アルキルであり；
Ｒ2は、水素またはＣ1−Ｃ3アルキルであり；
Ｒ3は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−メチル−３−ピリジル、４−メチル−３−ピリジル、２−フリル、５−メチル−２−フリル、２，５−ジメチル−３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、５−メチル−２−チエニル、２−フェノチアジニル、４−ピラジニル、２−ベンゾフリル、Ｎ−オキシド−２−ピリジル、Ｎ−オキシド−３−ピリジル、Ｎ−オキシド−４−ピリジル、１Ｈ−インドール−２−イル、１Ｈ−インドール−３−イル、１−メチル−１Ｈ−ピロル−２−イル、４−キノリニル、１−メチルピリジニウム−４−イルヨージド、ジメチルアミノフェニルまたはＮ−アセチル−Ｎ−メチルアミノフェニルであり；
Ｒ4は、水素、Ｃ1−Ｃ3アルキル、--ＣＯ--ＣＯ--Ｏ−Ｃ2Ｈ5またはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の少なくとも１つは、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、フェニル、アミノ、モノ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）アミノ、ジ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）アミノ、Ｃ2−Ｃ4アルカノイル、プロペニルオキシ、カルボキシ、カルボキシメトキシ、エトキシカルボニルメトキシ、スルファニルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ1−Ｃ3アルキル）スルファニルアミド、Ｎ−メチルピペラジニル、ピペリジニル、１Ｈ−イミダゾール−１−イル、１Ｈ−トリアゾール−１−イル、１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル、１−ナフチル、シクロペンチル、３，４−ジメチルベンジル、または次の式：
--ＣＯ2Ｒ、--ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、--Ｎ（Ｒ）ＣＨ2Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、
--Ｏ（ＣＨ2）nＮ（Ｒ）Ｒ、--ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）nＮ（Ｒ）Ｒ、
--ＣＨ（ＣＨ3）ＮＨＣＨＯ、--ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ＝Ｎ−ＯＨ、
--ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ＝Ｎ−Ｏ−ＣＨ3、--ＣＨ（ＣＨ3）ＮＨ2、
--ＮＨＣＨ2ＣＨ2（Ｃ＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）Ｒ、
【０００９】
【化２】
2005533019.tif 000003
【００１０】
--（ＣＨ2）mＲ10、--Ｘ−（ＣＨ2）mＲ10、若しくは
【００１１】
【化３】
2005533019.tif 000004
【００１２】
（式中、ＲはＣ1−Ｃ3アルキルであり、
Ｘは、酸素または硫黄であり、
ｍは、１、２または３であり、
ｎは、２または３であり；
Ｒ9は、水素、Ｃ1−Ｃ3アルキル、Ｃ1−Ｃ3アルコキシ、クロロ、ブロモ、ヨードまたはトリフルオロメチルであり；
Ｒ10は、１Ｈ−イミダゾール−１−イルまたはモルホリニルであり；そして
Ｒ11は、Ｃ1−Ｃ3アルキルまたは未置換のフェニル、またはフェニルであって、Ｃ1−Ｃ3アルキル、ハロゲンまたはトリフルオロメチルで１置換されているものである）
の１つを有する基であり；そして
置換基Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の残りのものは水素である］
を有するＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物；または少なくとも１つの塩形成性基を含有するそのＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物の薬学的に許容しうる塩の有効量を患者に投与することを含む。この場合、その化合物は、ＰＤＧＦＲ生物活性を阻害し、そしてその投与は、移植不全を予防または治療するのに充分な用量である。
【００１３】
式Ｉの化合物およびそれらの製造は、本明細書中に援用されるＥＰ−Ａ−０２３３４６１号および米国特許第４，８７６，２５２号；第５，５１６，７７５号；第５，７０５，５０２号；および第５，５２１，１８４号に開示されている。
【００１４】
１つの好ましい態様において、化合物は、式：
【００１５】
【化４】
2005533019.tif 000005
【００１６】
を有するものである。
この化合物を、以後、イマチニブメシレート（グリベックTMとしても知られる）と称する。
【００１７】
他の好ましい態様において、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物はイマチニブメシレートである。好ましい態様において、その化合物は、ＰＤＧＦＲβ生物活性を阻害するかまたはＰＤＧＦ−ＢＢリガンドによって刺激されるＰＤＧＦＲ生物活性を阻害する。他の好ましい態様において、移植片は、血液透析における血管アクセスに用いられるかまたは末梢血管疾患を治療するのに用いられる。いろいろな態様において、移植不全は、内膜への平滑筋細胞の遊走、血管平滑筋細胞の増殖、または細胞外マトリックスの沈着を特徴とする。他の態様において、移植不全は、血管狭窄または血栓症の結果である。他の態様において、血液透析のための血管アクセスは、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片の使用に関連しているかまたは動静脈フィステルの使用に関連している。他の態様において、移植片は、合成物質（例えばダクロン）を含んで成る。１つの好ましい態様において、移植片は、その移植片を受容するであろう患者からの静脈の一部分を含有する。他の態様において、化合物は、薬学的に許容しうる担体と組み合わせて与えられる。他の態様において、用量は、血管狭窄または血栓症を予防または改善させるのに充分である。１つの好ましい態様において、用量は、新生内膜過形成を予防または改善させるのに充分である。
【００１８】
他の側面において、本発明は、（ｉ）上記の式を有する化合物、並びに（ｉｉ）血管新生阻害剤、抗増殖化合物、免疫抑制化合物、抗遊走化合物、抗血小板薬および抗線維症化合物から成る群より選択される少なくとも１つの追加の化合物を含有する医薬組成物を特徴とする。
【００１９】
第１の側面の好ましい態様において、その方法は、血管新生阻害剤、抗増殖化合物、免疫抑制化合物、抗遊走化合物、抗血小板化合物および抗線維症化合物から成る群より選択される少なくとも１つの追加の化合物を患者に投与することを更に含む。
【００２０】
他の側面において、本発明は、（ｉ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物、（ｉｉ）血管新生阻害剤、抗増殖化合物、免疫抑制化合物、抗遊走化合物、抗血小板化合物および抗線維症化合物から成る群より選択される第２化合物；並びに（ｉｉｉ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および第２化合物を、新生内膜過形成に起因する移植不全と診断されたかまたは移植不全を発症する危険性がある患者に投与するための使用説明書を含有するキットを特徴とする。１つの好ましい態様において、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物はイマチニブメシレートである。他の好ましい態様において、移植片は、血液透析における血管アクセスに、または末梢血管疾患を治療するのに用いられる。他の態様において、移植不全は、内膜への平滑筋細胞の遊走、血管平滑筋細胞の増殖、または細胞外マトリックスの沈着を特徴とする。他の態様において、移植不全は、血管狭窄または血栓症の結果である。好ましい態様において、第２化合物は、血管新生阻害剤、抗増殖化合物、免疫抑制化合物、抗遊走化合物、抗血小板化合物および抗線維症化合物から成る群より選択される。
【００２１】
他の側面において、本発明は、新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全の治療を必要とする患者の移植不全を治療するのに有用な化合物の組合せを同定する方法を特徴とし、その方法は、（ａ）ヒト大動脈血管平滑筋細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ｉ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および（ｉｉ）候補化合物と接触させる工程；並びに（ｂ）Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物および候補化合物のその組合せが、ヒト大動脈血管平滑筋細胞の遊走を、細胞がＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物単独と接触している場合より大きく減少させるかどうか決定する工程を含む。この場合、細胞遊走の減少は、新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全の治療を必要とする患者の移植不全を治療または予防するのに有用である組合せとしてその組合せを同定する。
【００２２】
他の側面において、本発明は、ポリマー中に分散しているＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物を含有するデリバリー製剤を特徴とする。他の好ましい態様において、デリバリー製剤は、血管新生阻害剤、抗増殖化合物、免疫抑制化合物、抗遊走化合物、抗血小板化合物および抗線維症化合物から成る群より選択される第２化合物を更に含有する。他の好ましい態様において、ポリマーはミクロスフェアの形である。他の好ましい態様において、ポリマーはフィルムの形である。他の好ましい態様において、ポリマーは縫合糸の形である。他の好ましい態様において、ポリマーは、疎水性マトリックス中に埋め込まれたミクロスフェアを含む複合系の形である。
【００２３】
先の側面の好ましい態様において、血管新生阻害剤は、次の：抗体；ＶＥＧＦ−Ａを結合させる抗体；ＶＥＧＦ受容体を結合し且つＶｅｇＦ結合をブロックする抗体；アバスチン；エンドスタチン；アンジオスタチン；レスチン；タムスタチン；ＴＮＰ−４７０；２−メトキシエストラジオール；サリドマイド；抗血管新生タンパク質のペプチド断片；カンスタチン；アレスチン；ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦキナーゼ阻害剤；ＣＰＴＫ７８７；ＳＦＨ−１；抗血管新生タンパク質；トロンボスポンジン−１；血小板第４因子；インターフェロンα；ＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２シグナル伝達、ＰＩＨ１２シグナル伝達をブロックする物質；細胞外血管内皮（ＶＥ）カドヘリンドメインをブロックする物質；細胞外ＶＥカドヘリンドメインに結合する抗体；テトラサイクリン；ペニシラミン；ビンブラスチン；シトキサン；エデルフォシン（edelfosine）；テガフルまたはウラシル；クルクミン；緑茶；ゲニステイン；レスベラトロール；Ｎ−アセチルシステイン；カプトプリル；ｃｏｘ−２阻害剤；セレブレックス；およびビオックスのいずれか１つ以上である。
【００２４】
先の側面の他の好ましい態様において、抗増殖化合物は、次の：ラパマイシン；タキソール；トログリタゾン；ｂＦＧＦを結合させる抗体；ｂＦＧＦ−サポリンを結合させる抗体；スタチン；ＡＣＥ阻害剤；スラミン；１７β−エストラジオール；アトルバスタチン；フルバスタチン；ロバスタチン；プラバスタチン；シンバスタチン；セリバスタチン；ペリンドプリル；キナプリル；カプトプリル；リシノプリル；エナラプリル；フォシノプリル；シラザプリル；ラミプリル；キナーゼ阻害剤のいずれか１つ以上である。
【００２５】
先の側面の更に他の好ましい態様において、免疫抑制化合物は、次の：プレドニゾン；ＦＴＹ７２０；メチルプレドニゾロン；α−トコフェロール；アザチオプリン；クロラムブシル；シクロホスファミド；ＩＬ−２受容体またはＣＴＬＡ４に結合する抗体；メトトレキサート；ミコフェノレートモフェチル；シクロスポリン；マクロファージ機能を妨げる物質；Ｐ−セレクチンの生物学的機能を阻害する物質；ＰＳＧＬ−１の生物学的機能についての物質；ＶＬＡ−４の生物学的機能についての物質；ＶＣＡＭ−１の生物学的機能についての物質；Ｍａｃ−１の生物学的機能についての物質；およびＦＴＹ７２０のいずれか１つ以上である。
【００２６】
先の側面の他の好ましい態様において、抗遊走化合物は、次の：シプロヘプタジン、メチセルジド、ボセンタン、ＹＭ０８７、シプロヘプタジン、ケタンセリンおよびアンプラーグのいずれか１つ以上である。
【００２７】
他の好ましい態様において、抗血小板化合物は、次の：チクロピジン、シロスタゾール、ジピリダモール、アブシキシマブ、クロピドグレル、ジピリジモール（dipyridimole）、糖タンパク質ｉｉｂ／ｉｉｉａ阻害剤、エプチフィバチド、チロフィバン、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤およびチクロプジピン（ticlopdipine）のいずれか１つ以上である。
【００２８】
他の好ましい態様において、抗線維症化合物は、次の：ＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックするかまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１のプロモーター活性の活性化を阻害する物質；ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に結合する抗体；ＴＧＦ−β受容体Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに結合する抗体；キナーゼ阻害剤；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）シグナル伝達をブロックする物質；プロリルヒドロキシラーゼを阻害する物質；プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼを阻害する物質；ピルフェニドン；シリマリン；ペントキシフィリン；コルヒチン；エンブレル（embrel）；レミケード；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に拮抗する物質；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質；および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質；および結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質のいずれか１つ以上である。
【００２９】
多くの化合物は、２種類以上の活性を有するということに注目すべきである。例えば、セロトニン受容体アンタゴニストは、抗遊走活性および抗増殖活性を有することがありうる。こうした分類は、それら化合物を限定するものではないが、各々の化合物の潜在的な活性について幅広い説明を与えるものである。
【００３０】
先の側面の他の好ましい態様において、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン誘導体（例えばイマチニブメシレート）には、代表的な化合物が本明細書中に援用される米国特許第４，８７６，２５２号；第５，５１６，７７５号；第５，７０５，５０２号；および第５，５２１，１８４号に開示されているいずれかのＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物、またはいずれか他のＰＤＧＦＲ阻害剤が含まれる。
【００３１】
本明細書中に用いられる「アルキル」という用語および「アルク（ａｌｋ−）」という接頭辞は、直鎖および分岐鎖の飽和または不飽和基、および環状基、すなわち、シクロアルキル基およびシクロアルケニル基を含む。特に断らない限り、非環式アルキル基は１〜６個の炭素である。環状基は単環式または多環式でありうるが、好ましくは、３〜８個の環炭素原子を有する。代表的な環状基には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびアダマンチル基が含まれる。
【００３２】
「アリール」とは、炭素環式芳香環または環系を意味する。特に断らない限り、アリール基は６〜１８個の炭素である。アリール基の例には、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、フルオレニル基およびインデニル基が含まれる。
【００３３】
「ヘテロアリール」とは、少なくとも１個の環ヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ）を含有する芳香環または環系を意味する。特に断らない限り、ヘテロアリール基は、１〜９個の炭素である。ヘテロアリール基には、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、トリアゾリル基、オキサジアゾリル基、オキサトリアゾリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基、トリアジル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドール基、インダゾリル基、インドリジニル基、ベンズイソオキサゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、フェナントロリニル基、プリニル基およびカルバゾリル基が含まれる。
【００３４】
「複素環」とは、少なくとも１個の環ヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ）を含有する非芳香環または環系を意味する。特に断らない限り、複素環式基は１〜９個の炭素である。複素環式基には、例えば、ジヒドロピロリル基、テトラヒドロピロリル基、ピペラジニル基、ピラニル基、ジヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、ジヒドロチオフェン基、テトラヒドロチオフェン基およびモルホリニル基が含まれる。
【００３５】
「ハライド」または「ハロゲン」または「ハロ」とは、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素を意味する。
アリール基、ヘテロアリール基または複素環式基は、未置換であってよいし、またはＣ1-6アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、トリフルオロメチル、Ｃ1-6アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、アリールアルキル（ここで、このアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する）およびヘテロアリールアルキル（ここで、このアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する）から成る群より選択される１つ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００３６】
「抗線維症薬」とは、フィブロネクチン、プロテオグリカン、コラーゲンおよびエラスチンが含まれるがこれらに限定されない細胞外マトリックス成分の産生を減少または阻害するいずれかの物質を意味する。抗線維症薬の例には、ＴＧＦ−βおよびＣＴＧＦのアンタゴニスト；更には、ＴＧＦ−βシグナル伝達をブロックするかまたはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１のプロモーター活性の活性化を阻害する物質；ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体（例えばＴＧＦ−β受容体Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ）に結合する抗体；キナーゼ阻害剤；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）シグナル伝達をブロックする物質；プロリルヒドロキシラーゼを阻害する物質；プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼを阻害する物質；ピルフェニドン；シリマリン；ペントキシフィリン；コルヒチン；エンブレル；レミケード；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）に拮抗する物質；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質；および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を阻害する物質；結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）に拮抗する物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
「抗遊走化合物」とは、平滑筋細胞の運動または遊走をブロックするいずれかの化合物を意味する。抗遊走化合物には、平滑筋細胞の遊走を引き起こすことが知られているいずれかの細胞内シグナル伝達タンパク質を阻害しうるいずれかの化合物も含まれる。抗遊走活性を有する化合物の例には、セロトニン受容体アンタゴニスト（例えばシプロヘプタジンまたはメチセルジド）；エンドセリン受容体ＥＴAおよびＥＴBのいずれかに拮抗する化合物（例えばボセンタン）；バソプレッシン受容体アンタゴニスト（例えばＹＭ０８７）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の抗遊走化合物には、シプロヘプタジン、メチセルジド、ボセンタン、ＹＭ０８７、シプロヘプタジン、ケタンセリンおよびアンプラーグが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
「抗血小板薬」とは、血小板活性化をもたらす１つ以上の段階（すなわち血小板形状変化、血小板顆粒内容物の分泌、および血小板の凝集）を阻害しうるいずれかの化合物を意味する。好ましくは、これら化合物は、ＰＤＧＦの産生を阻害するであろう。抗血小板薬の例には、チクロピジン、シロスタゾール、ジピリダモール、アブシキシマブ、クロピドグレル、ジピリジモール、糖タンパク質ｉｉｂ／ｉｉｉａ阻害剤、エプチフィバチド、チロフィバン、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
「抗増殖化合物」とは、血管平滑筋細胞または内皮細胞の増殖を減少または阻害することができるいずれかの化合物を意味する。抗増殖化合物には、平滑筋細胞の増殖を引き起こすことが知られているいずれかの細胞内シグナル伝達タンパク質を阻害しうるいずれの化合物も含まれる。血管平滑筋細胞の増殖を引き起こすことが知られている分裂促進因子の例には、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、エンドセリン−１、アンギオテンシンＩＩ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、バソプレッシン、トロンビン、セロトニンおよび多数の脂質メディエーターが含まれる。更に含まれるのは、いずれかのこれらタンパク質の分裂促進作用を阻害しうる抗増殖化合物である。抗増殖化合物の他の例には、ラパマイシン；タキソール；トログリタゾン；ｂＦＧＦを結合させる抗体；ｂＦＧＦ−サポリンを結合させる抗体；スタチン；ＡＣＥ阻害剤；スラミン；１７β−エストラジオール；アトルバスタチン；フルバスタチン；ロバスタチン；プラバスタチン；シンバスタチン；セリバスタチン；ペリンドプリル；キナプリル；カプトプリル；リシノプリル；エナラプリル；フォシノプリル；シラザプリル；ラミプリル；およびキナーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「血液透析」とは、急性または慢性の腎不全患者の血液から毒性老廃物を除去するのに用いられる処置を意味する。このような老廃物要素の除去は、血液が体外に循環されている間の、半透膜を介するそれらの拡散速度の差によって行われる。
【００４１】
「移植」とは、ブロックされているかまたは閉塞されている血管領域をバイパスするかまたは置き換えるのに用いられるいずれかのタイプの再連結を意味する。典型的には、移植片は、患者の身体の１つの領域からの動脈または静脈の部分が、別の領域にある閉塞の周辺に血液を新ルートで送るのに用いられる処置を介して挿入される。患者自身の血管を用いた移植の非限定例には、患者の長伏在静脈、内乳房動脈またはダクロン被覆臍帯静脈の使用が含まれる。合成移植片も、ブロックされた動脈の周辺に血液を新ルートで送るのに用いることができる。移植に用いられる合成物質の非限定例には、ＰＴＦＥ、ダクロン、または移植に一般的に用いられるいずれかのタイプの織布が含まれる。本明細書中で用いられる「移植」は、患者の動脈を静脈に取り付けることによって外科的に構築される動静脈フィステル、または患者の静脈の一部分が、ブロックまたは閉塞されている血管の領域を置き換えるのに実際に用いられている静脈間置移植を意味することもありうる。
【００４２】
「移植不全」とは、新生内膜過形成の結果としての、移植部位にわたる血流のいずれかの低下または減少を意味する。
「免疫抑制化合物」とは、化学的、生物学的または物理的な物質によって引き起こされる自然免疫応答を減少または阻害しうるいずれかの物質を意味する。好ましくは、免疫抑制化合物は、単球またはマクロファージの活性を、次の４種類の方法：（１）単球の産生を減少させるかまたは単球の除去を増加させることによる方法、（２）マクロファージへの単球の分化を妨げることによる方法、（３）過形成の領域中に単球が遊走するのを妨げることによる方法、および（４）マクロファージの活性化をブロックすることによる方法のいずれか１つで阻害することができる。
【００４３】
「マクロファージ活性」とは、抗原応答性リンパ球に外来抗原を提示する能力、および液性および細胞性の免疫応答を引き起こす能力を意味する。
好ましい免疫抑制化合物の非限定例には、ステロイド類（例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン）およびＦＴＹ７２０（例えばＳｈｕｕｒｍａｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７４：９５１−９６０、２００２；Ｄｒｏｏｇａｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５０：２２４−２２９、１９９８）が含まれる。更に別の代表的な免疫抑制化合物には、ｍａｃ−１の産生または機能化をブロックする抗体または化合物；遊出に重要であることが知られているマクロファージ上の抗原（例えばＥｓｌａｍｉら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３４：９２３−９２９、２００１；Ｓｈａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１９７０−１９７９、１９９８）；単球化学誘引性タンパク質（ＭＣＰ−１）の産生または機能化または双方をブロックするいずれかの化合物（Ｉｌｅｄａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２５：１４３−１４７、２００２）；α−トコフェロールなどの抗酸化物質（Ｄｅｖａｒａｊら、Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６０：８−１４、２００２；Ｔｅｒａｓａｗａら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  １１：２２１−２３３、２０００）；更には、Ｐ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＶＬＡ−４またはＶＣＡＭ−１活性をブロックする化合物（Ｈｕｏら、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１７３：３５−４３，２００１）が含まれる。
【００４４】
更に、免疫抑制化合物には、α−トコフェロール；アザチオプリン；クロラムブシル；シクロホスファミド；ＩＬ−２受容体またはＣＴＬＡ４に結合する抗体；メトトレキサート；ミコフェノレートモフェチル；シクロスポリン；マクロファージ機能を妨げる物質；Ｐ−セレクチンの生物活性を阻害する物質；ＰＳＧＬ−１、ＶＬＡ−４、ＶＣＡＭ−１またはＭａｃ−１の生物活性についての物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
「内膜」とは、血管の内部裏層または内層を意味する。
「遊走」とは、血管の中膜層から内膜へのｉｎ  ｖｉｖｏでの平滑筋細胞の運動を意味する。
【００４６】
「新生内膜過形成」とは、内膜への遊走後の平滑筋細胞の異常増殖を意味する。本明細書中で用いられる異常とは、正常に機能している同じタイプの細胞で典型的に生じるよりも速くまたは有意に多数で生じるがん細胞以外の細胞の分裂または増殖を意味する。新生内膜過形成の結果として、血流制限病変が、移植片中のいたるところに拡散的に、またはより一般的には、吻合付近の集中部位にまたは移植片の本体内に生じることがありうる。
【００４７】
「末梢血管疾患（ＰＶＤ）」とは、組織、臓器または筋肉が、それらが適切に機能するために必要な酸素および他の栄養素を受容しない障害を意味する。ＰＶＤは、通常は、動脈を狭くさせる動脈中のプラークの漸進的蓄積によって引き起こされるが、それは、身体中のいたるところの血流を制限する。
【００４８】
「薬学的に許容しうる担体」とは、一緒に投与される化合物の治療的性質を保持しながら、治療される哺乳動物に生理学的に許容しうる担体を意味する。１つの代表的な薬学的に許容しうる担体物質は、生理的食塩水である。他の生理学的に許容しうる担体およびそれら製剤は、当業者に公知であり、例えばレミントンのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルバニアに記載されている。
【００４９】
「血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の生物活性」とは、ＰＤＧＦＲのいずれかのおよび全ての機能を意味する。ＰＤＧＦＲは、細胞中の分裂促進性応答および走化性応答を引き起こすように機能する。その機能には：いずれか３種類の２量体のＰＤＧＦリガンド（ＡＡ、ＡＢまたはＢＢ）が含まれうるリガンド結合；受容体２量体化；チロシン残基上の自己リン酸化；チロシン残基上の基質ポリペプチドまたはタンパク質のトランスリン酸化；およびＳＨ２ドメイン含有タンパク質の補充が含まれうる。ＰＤＧＦＲの生物活性について、当該技術分野において公知の多数の標準的なアッセイがあるが、これらのいずれもが、ＰＤＧＦＲの生物活性を阻害する能力について可能性のある化合物をアッセイするのに用いることができる。例として、ＢｒｄＵ標識実験および細胞計数実験のような細胞増殖アッセイ；3Ｈ−チミジン取込みのような、ＤＮＡ合成の定量的アッセイ；リガンド結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析；受容体２量体化アッセイ；および細胞リン酸化アッセイが含まれる（例えばＢｉｏｕｋａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１４５７−６３、１９９９；Ｃｏｎｗａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３７：１７１−７、１９９９；Ｖｉｇｎａｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９：３７２７−３５、１９９９；Ｂａｘｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１７０５０−５、１９９８；ＤｅＭａｌｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：２０１４−２２；およびＤａｖｉｅｓら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：７７９−７８６、２０００を参照されたい）。ＰＤＧＦＲの生物活性に好ましい１つのアッセイは、抗リン酸化チロシン抗体（例えば４Ｇ１０、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いたリン酸化アッセイである。全細胞溶解物についてのイムノブロットはこの抗体を用いて行われ、細胞内チロシンリン酸化の全体の増加を検出することができる。Ｓｒｃまたはｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼなどの特異的基質のチロシンリン酸化は、基質タンパク質を免疫沈降後、抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロッティングによって解析することもできる。ＰＤＧＦＲ自体の自己リン酸化は、ＰＤＧＦＲを免疫沈降させ、抗リン酸化チロシン抗体でイムノブロッティングを行うことによって測定される。上述の各々のアッセイは、定量され、そしてＰＤＧＦＲの生物活性に影響を与えない対照化合物と比較してＰＤＧＦＲの生物活性に対する可能性のある阻害剤の効果を決定するのに用いられる。生物活性の阻害は用いられているアッセイに依存するが、概して、対照と比較して、アッセイされた活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくはアッセイされた活性の少なくとも７５％の減少を意味する。
【００５０】
「ポリテトラフルオロエチレン移植片（ＰＴＦＥ）」とは、繊維が、ゴアテックスと称されるメッシュに織られ、スリーブおよびフランジを作った後、移植片の一端で静脈におよび移植片の他端で動脈に取り付けられている合成移植片を意味する。次に、この合成移植片は、血液透析に必要な針用のアクセスを提供する。
【００５１】
「予防または改善させる」とは、血流が、特定の血管について正常であると考えられる値より下がらないように、血管腔直径の狭まりを減少させることを意味する。臨床医および当業者は、ある特定の血管についての血流の正常値を熟知しているであろう。血管腔直径の狭まりは、２０％以上、より好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上減少することが好適である。透析中の血流のサーベイランスは、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  ＨＤ０１フローメーター（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃｓ社、イサカ、ニューヨーク）を用いて行うことができる。
【００５２】
「予防または改善させる」とは、新生内膜過形成に関して用いることもでき、それには、血管平滑筋細胞の増殖速度の２０％以上（より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上）のいずれかの減少が含まれる。
【００５３】
「増殖」とは、すなわち、細胞の有糸分裂による細胞数の増加を意味する。本明細書中で用いられる増殖は、腫瘍性細胞増殖を意味するものではない。
「放射線療法」とは、正常に機能する細胞の能力を制限するようにまたは細胞全体を破壊するように細胞に充分な障害をもたらすための管理されたγ線またはＸ線の使用を意味する。線量および治療期間を決定するための当該技術分野に公知の多数の方法があるということは理解されるであろう。典型的な治療は１回投与として与えられ、典型的な線量は、１０〜２００単位（グレイ）／日である。
【００５４】
「平滑筋細胞」とは、血管の中膜層および外膜血管に由来する細胞を意味する。平滑筋細胞の特徴には、核小体が存在する細胞の中心に位置する楕円形核および筋形質中の筋原線維を有する紡錘形の組織学的形態（光学顕微鏡検査下）が含まれる。電子顕微鏡検査下において、平滑筋細胞は、核近傍筋形質中に長細いミトコンドリア、粗面小胞体のいくつかの管状要素、および遊離リボソームの多数のクラスターを有する。小ゴルジ複合体も、核の１つの極付近に位置することがありうる。筋形質の大部分は、筋細胞の長軸に大部分が配向していることがありうる細い平行な筋フィラメントによって占められている。これらアクチン含有筋原線維は、中に散在するミトコンドリアを含む束に整列していることがありうる。細胞の収縮性物質によって散乱しているのは、卵形稠密領域でもありうるが、類似の稠密領域は、原形質膜の内面に沿って間をおいて分布している。
【００５５】
「有効量」とは、新生内膜過形成、静脈狭窄または血管アクセス機能不全を予防または改善させるのに充分な量を意味する。ある用途に治療的な量を決定するために、当該技術分野において公知の多数の方法があるということは理解されるであろう。例えば、用量決定のための薬理学的方法は、療法の場合に用いることができる。
【００５６】
「血栓症」とは、閉塞しているかまたは管腔をふさぐことなく血管に付着していることがありうる、心臓血管系におけるクロットの形成または存在を意味する。
「チロシンキナーゼ活性」とは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）から基質ポリペプチドまたはタンパク質上のチロシン残基へのリン酸基の転移を触媒する能力を意味する。
【００５７】
「血管アクセス機能不全」とは、透析用移植またはＡＶフィステルの不全を意味する。透析用移植不全は、移植アクセス部位にわたる振戦の喪失によって診断される。振戦は心雑音に伴う触知可能な振動であり、振戦の喪失はしばしば血流の喪失を示すことがありうる。透析用移植不全は、ＴＲＡＮＳＯＮＩＣ  ＨＤ０１フローメーターを用いて測定されるようなアクセス血流の喪失によっても診断される。血管アクセス機能不全の原因には、新生内膜過形成、静脈狭窄および血栓症が含まれうる。
【００５８】
「血管狭窄」とは、血管の病理学的狭まりを意味する。
「静脈狭窄」とは、静脈の病理学的狭まりを意味する。
本発明の他の特徴および利点は、次の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
発明の説明
本発明は、概して、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物（例えばイマチニブメシレート）のような血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）阻害化合物が、ＰＤＧＦＲの生物活性を阻害し、ＡＶ移植不全の治療に有用であるという本発明者の発見を特徴とする。
【００６０】
移植不全をもたらすイベント
新生内膜過形成に起因する移植不全は、血液透析を受けている患者、更には、進行したＰＶＤの治療としてバイパス移植術を受けている患者にとって大きな健康問題である。移植不全をもたらす狭窄病変は、典型的に、３つの重要なイベント：血管平滑筋細胞の内膜への遊走；続いて起こるこれら血管平滑筋細胞の増殖；およびその結果の細胞外マトリックスの産生を特徴とする。
【００６１】
遊走、増殖および細胞外マトリックス産生のこの組合せは、新生内膜過形成および狭窄を引き起こす。更に、新生血管形成は、血管の内膜領域および外膜領域で生じ、マクロファージの存在も注目されている。
【００６２】
動脈と静脈との新生内膜過形成の差異
静脈新生内膜過形成について知られていることの多くは、冠動脈疾患および血管形成術のような実験用動脈モデルの研究に由来している。動脈新生内膜過形成と、血管アクセス機能不全に関連した静脈新生内膜過形成との間には、いくつかの重要な違いがある。例えば、血管アクセス機能不全に関連した静脈狭窄は、動脈モデルには存在しない尿毒症性環境で生じる。更に、動脈壁の場合、血管の内膜と中膜層との間に明白な境界があるが、それは静脈には存在しない。更に、ＰＴＦＥ移植病変に関連した新生内膜過形成は、事実上慢性的であり、血管平滑筋細胞および細胞外マトリックス沈着の連続的増殖を特徴とする。
【００６３】
内膜過形成の病原性機構
非ＡＶ移植新生内膜過形成病変の研究に基づき、ＡＶ移植における内膜過形成の発生について、多数の病原性機構が提唱されてきた。これら機構は、典型的には、血管壁への傷害を含めた上流イベント、免疫／炎症性イベント、および血流力学的イベントによって開始されるが、それらは全て、血管平滑筋細胞の遊走および増殖、細胞外マトリックス産生、そしておそらくは血管新生を含めた下流イベントへと集中する。更に、新生内膜中の血管平滑筋細胞の脱分化または分化の欠如は、病変の病原性にある役割を果たしているかもしれないと現在考えられている。血管平滑筋細胞以外の細胞タイプも、新生内膜病変の開始または維持に関与していると考えられる。これらには、血管壁へ遊走する単球；新生内膜および外膜内で新生血管形成を提供する内皮細胞；およびＰＤＧＦおよびセロトニンなどの増殖因子を放出する血小板が含まれる。
【００６４】
ＰＤＧＦ
ＰＤＧＦは、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢの３種類の形で見出されうるホモ／ヘテロ２量体リガンドである。ＰＤＧＦ受容体は、多数のシグナル伝達経路に関与するチロシンキナーゼであり、αおよびβの２つの形で見出されうる。各々の受容体タイプは各々のリガンドサブタイプに特異性を示し、ＰＤＧＦＲαは３種類全部のリガンドを結合させることができ、ＰＤＧＦＲβはＢＢサブタイプを結合させることができるにすぎない。
【００６５】
イマチニブメシレート
イマチニブメシレート（グリベックTM）は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ活性を、更にはｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＡｂｌおよびＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害することが示されているＮ−フェニル−２−ピリミジン誘導体である。イマチニブメシレートを用いて慢性骨髄性白血病の患者を治療する臨床試験は、多くの成功を示している。
【００６６】
イマチニブメシレートなどのＮ−フェニル−２−ピリミジン誘導体は、慢性骨髄性白血病などの疾患の治療にきわめて有効であると証明されたチロシンキナーゼ阻害剤として機能する。慢性骨髄性白血病の治療におけるイマチニブメシレートの成功は、血管アクセス機能不全とは無関係であると考えられるが、ＰＤＧＦＲの生物活性を阻害するイマチニブメシレートの能力は、新生内膜過形成による移植不全に苦しむ患者の治療において有用である。いずれの特定の理論にも拘束されなければ、ＰＤＧＦＲは、新生内膜過形成において分裂促進の役割を有するということがありうる。ＰＤＧＦＲからの分裂促進シグナル伝達を妨げることにより、血管平滑筋細胞の過増殖が阻害される。この阻害は新生内膜過形成の減少を引き起こし、それによって、血管アクセス機能不全またはＰＶＤのバイパス移植術処置に関連した移植不全を予防するまたは減少させる。
【００６７】
イマチニブメシレートは、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＡｂｌおよびＰＤＧＦＲを含めたいくつかのチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位を阻害することによって機能する。ＡＴＰ結合部位をブロックすることにより、この化合物は、ＡＴＰから基質タンパク質またはポリペプチド上のチロシン残基へのリン酸基の転移を妨げることができる。
【００６８】
ＰＤＧＦ経路は、不全ヒトＡＶ移植において活性化される。
不全ヒトＡＶ移植片を患者から取り出し、そして新生内膜過形成の免疫組織化学的証拠およびＰＤＧＦＲシグナル伝達経路に関連したタンパク質の発現について、次のように分析した。
【００６９】
ＡＶ移植検体を１０％ホルムアルデヒドで固定し、６μｍパラフィン包埋切片を作製し、キシレンで脱ロウし、アルコール中で再水和した。試料を、プロテイナーゼＫで１５分間処理して、抗原を暴露させた後、無水アルコールおよびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で２回洗浄した。次に、それらを無水メタノール中１％Ｈ2Ｏ2で１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、ＰＢＳで２回洗浄し、ブロック用溶液（２次抗体を作製したのと同じ種に由来する５％血清、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）で３０分間インキュベートして、２次抗体の非特異的結合を減少させた後、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００７０】
次に、それら切片を１次抗体とともに４℃で１６時間インキュベートした。１次抗体には、ＰＤＧＦ  Ａ鎖、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβの発現に対する抗体、およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路におけるシグナル伝達に関連のある部位でリン酸化されたＰＤＧＦＲβの形を認識する抗体が含まれた。ＰＢＳで洗浄後、それら切片を、ＰＢＳで１／２００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ２次抗体（ダコ  Ｐｏ４４８）で４５分間処理するか、またはＰＢＳで１／２００に希釈したウサギ抗ヤギ２次抗体（ダコ  Ｐｏ１６０）で処理した。ＰＢＳ洗浄後、色反応をジアミノベンジジン（ダコ）で顕出し、ヘマトキシリンで対比染色した。最後に、それら切片をアルコールで脱水し、プレマウント中にマウントした。負対照は１次抗体を省いて行った。
【００７１】
ＰＤＧＦ−Ｂ免疫組織化学については、上記の方法を、マイクロ波処理を用いて抗原を検索したことを除いて、次のように行った。５００ｍｌのｄＨ2Ｏ中に９ｍｌのクエン酸溶液（１リットルの蒸留脱イオン化Ｈ2Ｏ中に２１．０１ｇのクエン酸）および４１ｍｌのクエン酸Ｎａ溶液（１リットルの蒸留脱イオン化Ｈ2Ｏ中に２９．４１ｇのクエン酸Ｎａ）を含有した抗原検索用緩衝液を沸騰するまで加熱した。脱パラフィン処理した試料をその溶液中に入れ、マイクロ波で６分間加熱した。溶液を室温で１０分間冷却した。次に、それら試料をＰＢＳで２回洗浄した。
【００７２】
ＰＤＧＦ  Ａ鎖、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖（図１）、ＰＤＧＦＲβ（図２）およびＰＤＧＦＲα（図４）の顕著な発現を、不全ヒト移植片の内膜中に認め、ＰＤＧＦ経路が、このような移植片中で活性化される証拠を示した。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路におけるシグナル伝達に関連のある部位でリン酸化されたＰＤＧＦＲβの形を特異的に認識する抗体は、その部位におけるＰＤＧＦＲβの特異的リン酸化を示した（図３）。これら結果は、ＰＤＧＦＲおよびＰＩ３Ｋのシグナシル伝達経路が、不全ヒトＡＶ移植片中でアップレギュレーションされることを示している。本発明者らは、デスミン／α平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性に基づいて、その染色が筋線維芽細胞中であるかＶＳＭＣ中であるかをまだ評価していない。
【００７３】
ブタＡＶ移植病変は、ＰＤＧＦシグナシ伝達分子を発現する
ＡＶフィステル術
体重４０〜４５ｋｇのヨークシャーブタに、３２５ｍｇのアスピリンを経口で１日１回、手術前日に開始して、実験期間中継続して与えた。１５ｍｇ／ｋｇのケタミンで麻酔を誘発させ、気管内チューブを介して投与されるイソフルランで麻酔を維持した。単回用量のヘパリン（２５０Ｕ／ｋｇ）、ブプレネクス（buprenex）（０．０３ｍｇ／ｋｇ）およびセファゾリン（３５ｍｇ／ｋｇ）を手術前に与えた。両側の大腿の静脈および動脈を外科的に露出させた。ループ動静脈フィステルを、内径（ＩＤ）６ｍｍＰＴＦＥ移植片を用いて、大腿動脈と大腿静脈との間に６．５ｃｍ長さ（Ｉｍｐｒａ  Ｂａｒｄ  １０Ｓ０６）で、静脈側および動脈側にそれぞれ７−０および６−０ポリプロピレン縫合糸での端側吻合によって両側に作った。
【００７４】
次に、ベースライン血管造影を下記のように行った。筋膜および皮膚を、２−０バイクリルおよび４−０ポリグリコール酸  デキソンＳ  グリコール酸ホモポリマー（ＰＤＳ）縫合糸を用いて閉じ、それらブタを回復させた。
【００７５】
フェンタニールパッチ（２μｇ／ｋｇ）を術後痛覚脱失のために７２時間用いた。移植開存性を、手術直後、１週目、そして２８日目（移植片採取時）に聴診によって評価した。２８日目に開存している移植片は、ＩＶＵＳによって評価したところ、およそ７０〜９０％の最大管腔面積狭窄を示した（下記および図７を参照されたい）。
【００７６】
移植片採取
移植片配置後２８日目に、上記のようにブタに麻酔し、そして移植片採取前に移植片開存性および新生内膜の厚みを血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）および血管造影法を用いて（下記のように）評価した。移植片および周囲の大腿血管を、注意深く切開し、そして大腿血管に、吻合から近位および遠位に少なくとも２ｃｍ離れて連結し、切除した。ＡＶ移植片検体を、（全てのブタの）組織病理学的分析のために、１０％ホルマリンで加圧固定した。ブタは、高カリウム溶液の注射によって屠殺した。
【００７７】
ブタ病変組織学
６μｍパラフィン包埋切片を作製した。肉眼組織学的検査用の組織切片についてヘマトキシリンおよびエオシン染色を標準法を用いて行った。図６は、ブタ病変が、ヒト移植片中で認められる新生内膜過形成と区別がつかないことを示している。
【００７８】
血管造影法による評価
Ｘ線シネ血管造影法を、移植片配置直後と、移植片採取時に行った。血管造影手順は、次のように行った。２０ゲージのアンギオカテーテル（angiocath）をＡＶ移植片中に挿入し、そしてＡＶ移植管腔の定量的体型測定画像分析のために、高原子量造影剤であるＲＥＮＯＧＲＡＦＩＮ−７６をいろいろな入射方向で注入した（前後方向、右前斜め３０°および４５°、左前斜め３０°および４５°の画像を得た）。片側の血管造影の完了後、もう１つのアンギオカテーテルをもう一方の移植片に挿入し、血管造影を行った。図７Ａは、（２８日目の）典型的な移植片についての血管造影データを示し、明らかに、重症の狭窄と、静脈／移植片吻合のところで生じるその狭窄の両側に狭窄後拡張を示している。血液が移植片から大腿静脈へと流れ、そして大腿静脈中において両方向に、すなわち、心臓方向と、それから離れた方向に進むということに注目されたい。
【００７９】
血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）による評価
本発明者は、ＩＶＵＳを、２８日目の移植片採取時に次のように行った。血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）カテーテルは、患者の冠動脈に挿入された場合に、冠動脈内部からの画像を、取り付けられたコンソールへと映す小さい医療装置である。０．０１４”ガイドワイヤ（Ｃｈｏｉｃｅ  ＰＴ  ＥＸワイヤ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ）を、大腿静脈に、ＡＶ移植片接合部に約１０ｃｍ遠位に導入し、近位方向に進めた。３．２  Ｆｒｅｎｃｈ  ４０ＭＨｚ  ＩＶＵＳカテーテル（Ａｔｌａｎｔｉｓ  カテーテル、ＣＶＩＳ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、メープルグローブ、ミネソタ）を、ガイドワイヤを越えて送り、移植片・静脈接合部に近位の大腿静脈中に配置した。次に、自動プルバックを、０．５ｍｍ／秒の速度で、ＩＶＵＳ画像を記録しながら行った。実験室で使用中のＣＶＩＳシステムは、２００μの分解能を与えるが、これは、定量的血管造影法より有意に優れていて、我々が管腔および血管壁測定を行うことを可能にする。初めに示されたように、ＩＶＵＳの主な利点は、正確な横断面積評価と、内膜病変の面積および体積を測定する能力である。画像およびループをオフラインで分析した。これらは処理課題を知らない研究者によって分析されることが好ましい。ＩＶＵＳ画像を管腔横断面積および新生内膜の厚みについて分析した。画像を集めたが、典型的な例は、図７Ｂ〜Ｄに示されている。示された典型的な８０％最大狭窄領域に注目されたい。
【００８０】
ＰＤＧＦシグナル伝達分子をＡＶ移植病変中で発現させる
免疫組織化学は、ブタＡＶ移植片病変について、マイクロ波法を用いて抗原を回収したことを除き、ヒト試料について上に記載されたように実施した。試料を無水メタノール中３％Ｈ2Ｏ2で１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、それら試料を、シグナル対バックグラウンドブースター溶液であるＣｙｔｏＱバックグラウンドバスター（カタログ番号ＮＢ３０６、Ｉｎｎｏｖｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア）と一緒に３０分間インキュベートして、バックグラウンド染色を減少させた。Ｔｙｒ７５１リン酸化ＰＤＧＦ−β受容体に対する抗体は、ブタ組織においては、おそらくは、チロシン７５１残基周辺のブタ−ヒトβ受容体配列差のために、シグナルを検出しなかった。しかしながら、ホスホｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体は、ブタにおいて交差反応して、（ＰＤＧＦまたはＡｎｇ−ＩＩ、またはおそらくは、他のサイトカインによって駆動される）ｍＴＯＲ活性化の証拠を与えた。これらデータは、図８〜１０に示されており、ヒト免疫組織化学データと著しく近似している（図１〜５）。
【００８１】
これら結果は、ブタモデルがヒトＡＶ移植片で認められる典型的な新生内膜病原性を示すということを示した。更に、ＰＤＧＦシグナル伝達経路に関与する分子は、確かに、ブタＡＶ移植片病変で発現したので、ブタモデルがヒトの場合に平行し、ＰＤＧＦシグナル伝達をブロックする治療的方法を研究するのに有用であるということが、分子によって確かめられた。
【００８２】
ブタＡＶ移植片中でのサイトカイン発現
ｉｎ  ｓｉｔｕ方法は、本発明者らが、ＰＤＧＦ産生細胞を決定すること、そしてそれによって抗体研究を補完することを可能にする。ｉｎ  ｓｉｔｕ分析は、非放射性方法を用いて行う（Ｓｔ  Ｃｒｏｉｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９：１１９７−１２０２、２０００を参照されたい）。簡単にいうと、凍結組織切片を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ペプシンで透過性にし、そしてＲＮＡセンスおよびアンチセンスのプローブ（３００ｎｇ／ｍｌ）（ジゴキシゲニンＲＮＡ標識試薬を用いて予め生成される）と一緒に５５℃で一晩インキュベートする。シグナル増幅のために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）ウサギ抗ジゴキシゲニン抗体（ダコ、カーピンテリア、カリフォルニア）を用いて、ビオチン−チラミド（ＧｅｎＰｏｉｎｔキット、ダコ）の沈着を触媒する。更なる増幅は、ＨＲＰウサギ抗ビオチンを、次にアルカリ性ホスファターゼウサギ抗ビオチンを加えることによって行う。シグナルは、免疫化学におけるアルカリ性ホスファターゼ活性の検出のための沈降性基質であるＡＰ基質  ファーストレッド  ＴＲ／ナフトール  ＡＳ−ＭＸ（シグマ、セントルイス、ミズーリ）で検出するが、細胞は、ヘマトキシリンで対比染色した。このような染色は、胎盤において（図１１）、ＭＲＢ（マジックラウンダバウト（magic roundabout））と称される遺伝子用のプローブで行った。同様の方法が、ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ受容体のプローブで用いられるであろう。
【００８３】
グリベックおよびラパマイシンは、平滑筋細胞遊走を阻害する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を行って、ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ＨＡＳＯＭ細胞）遊走へのグリベックおよびラパマイシンの用量反応を、２４ウェルボイデンチャンバー（コーニング・コースター社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）を用いて次のように調べた。ＨＡＳＯＭ細胞を、７０％密集まで培養後、１％ウシ胎児血清と、グリベック単独、ラパマイシン単独、または組合せでのグリベックおよびラパマイシンとを含有する培地で処理した。用いられる各種化合物の濃度は、図１２に示されている。次に、それら細胞を、これら物質の存在下において、遊走アッセイ前の４８時間培養した。細胞を０．０５％トリプシンで採取し、Ｍ−１９９培地中に再懸濁させ、そしてグリベックおよび／またはラパマイシンを含むウェルに４０００個の細胞濃度で播種した。各々のウェルには、８μｍ細孔を有するポリカーボネートフィルターを含むインサートが入っていた。遊走アッセイ用の標品の場合、メンブランは、０．１％ゼラチンを８時間被覆し、吸引し、２時間乾燥させた。
【００８４】
０．５％ＢＳＡおよび２０ｎｇ／ｍｌのヒトＰＤＧＦ−Ｂ（ｈヒトＰＤＧＦ−ＢＢ）を含有するＭ−１９９培地を、ボイデンチャンバーの下部に入れた。細胞を、５％ＣＯ2において３７℃で１２時間インキュベートし、メンブランの上面にある細胞を掻き取り除いた。インサートメンブランを取り出し、そして各々のメンブランの下面上の細胞を、ヘマトキシリンで染色した。次に、メンブランの下面上のランダムな５個所の高倍率視野の細胞を計数することによって、細胞遊走を定量した。アッセイは全て３重反復試験で行った。このアッセイの結果は、図１２に示されている。
【００８５】
本発明者は、グリベック単独、ラパマイシン単独、そしてグリベックおよびラパマイシンの組合せが、ＰＤＧＦに誘発されるＨＡＳＯＭ細胞遊走を用量依存的に強力に阻害したことを発見した（図１２）。グリベックおよびラパマイシンの組合せは、相乗的ではないとしても、相加的作用を与えた（図１２）。ラパマイシンの有効な相乗作用濃度は、免疫抑制を典型的に引き起こす濃度より充分に低い（およそ５〜１５ｎｇ／ｍｌ）ということに注目されたい。認められる最大阻害は、７０〜８０％程度である。本発明者らは、アッセイにおける少量の血清の存在が、グリベックまたはラパマイシンによってシグナルがブロックされなかった因子を誘発したかもしれないと考えている。ＡＶ移植片の微環境を考えると、ラパマイシンおよびグリベックが、Ａｎｇ−ＩＩなどのサイトカインの作用をブロックするＡＣＥ阻害剤のような薬物と一緒に投与されたとしても、増加した阻害は認められるであろうと考えられる。グリベックおよびラパマイシンは、全身または局所に供給することができる。したがって、この遊走アッセイは、本発明の治療的組合せを同定するのに有用である。次に、有用な組合せを、下記のように動物モデルで試験した。
【００８６】
グリベックはブタ由来細胞のＰＤＧＦに誘発される遊走を阻害する
ラパマイシンは、ブタ細胞中でｍＴＯＲの活性化を阻害することが知られていたが、本発明者らは、ブタ細胞中のＰＤＧＦシグナル伝達へのラパマイシンの作用を試験した。本発明者らは、ブタ由来の細胞を、ブタ頸動脈の１次外植片から、標準法を用いて次のように単離した。
【００８７】
ブタ頸動脈試料は、対照動物から屠殺時に無菌技術を用いて得た。その試料をＰＢＳ中に入れ、氷上で放置した。動脈試料を、組織培養フード中において縦切開で開いた。内皮層を掻き取り除き、外膜を血管壁の外表面から剥離除去した。試料を、０．５×０．５ｃｍ片に切断し、そして内皮表面を下に向けて培地（１０％ＦＢＳ、アンピシリンおよびゲンタマイシン含有ＤＭＥＭ）に入れた。培地は２日毎に交換した。細胞は５日目以後に組織から遊走し始め、８日目までに密集した。培養された細胞を、トリプシン処理後に回収し、そして下記の実験を、第２継代細胞について行った。
【００８８】
単離されたブタ細胞を、上記の方法を用いて行われる遊走アッセイで試験した。これら細胞は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢを２０ｎｇ／ｍｌで用いた場合、ＰＤＧＦへの（バッグラウンドより２０倍高い）優れた用量反応を示した。重要なことに、本発明者らは、グリベックが、これらブタ細胞のＰＤＧＦ−Ｂに誘発される遊走を、用量依存的に阻害したことを発見した。ブタ用量反応曲線は、ヒトＶＳＭＣの場合に近似していた（図１３）。
【００８９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ平滑筋細胞系における化合物効力の測定
平滑筋細胞を、上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物にＰＤＧＦ−ＢＢを加えることによって遊走させた。グリベックを、その遊走している平滑筋細胞に加え、遊走を阻害した。ラパマイシンも、その遊走している平滑筋細胞に加え、やはり遊走を阻害した。重要なことに、グリベックおよびラパマイシンを組合せとして一緒に加えた場合、どちらかの薬物単独の添加と比較して、増加した増殖遊走阻害を検出した。
【００９０】
グリベックおよびペリンドプリルの効力
ＡＣＥ阻害剤は、血液透析中の患者に一般的に用いられている。ＡＣＥ阻害剤単独では、移植片開存性を維持するのに有効であることが判明していないが、上に詳述されたように、本発明者らは、本明細書中において、ＡＣＥ阻害剤が、新生内膜過形成を治療するのに有用であるということを報告している。したがって、グリベックをペリンドプリルと組み合わせて投与し、その作用を次のようにアッセイする。
【００９１】
５２頭のブタに、各４種類の治療を与える（例えばグリベック；ペリンドプリル；組合せでのグリベックおよびペリンドプリル、およびプラセボ）。薬物治療は、ＡＶ移植片配置の４日前（−４日）に投与する。通し薬物レベルは、外科手術当日（０日）、７日目および２８日目に得る。７日目に両ＡＶ移植の完全血栓症を有する被験動物は、手術不全とみなし、取り替える。移植片開存性は、聴診およびドップラーフローによって評価する。１つだけ生存可能な移植片を有する被験動物は、それらが血栓症による窮迫を示す場合は屠殺し、取り替えるが、そうでない限りそれらを保持する。
【００９２】
狭窄は、ＩＶＵＳを用いて２８日目にアッセイする。２８日目に両移植片に７５％以上の狭窄を有するブタを屠殺する。残りの被験動物は、狭窄が両移植片で７５％に達するまで狭窄について７日毎にアッセイするが、その到達時点で残りの被験動物を屠殺する。グループを、２８日目と、７５％狭窄に達した時点に比較する。これは、本発明者らが、狭窄の長期進行を研究することを可能にする。狭窄度を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％まで減少させる治療を、本発明において有用とする。
【００９３】
治療能力の差は、２８日目時点後に強調されることがありうる。これは、本発明者らが、狭窄度についての３種類の治療の間の、および被治療群と対照群との間の臨床的に重要な差異を同定することを可能にする。
【００９４】
移植片病変の免疫組織化学的分析を行って、細胞表現型についておよびサイトカインおよび細胞内シグナル伝達についてアッセイする。血液中のグリベックおよびペリンドプリルのレベル、更には、毒性のいずれか明らかな証拠（ＣＢＣ）、移植領域中の壊死（おそらくは薬物による）または移植部位における感染を評価する。
【００９５】
２８日目およびその後（上記）の最大面積移植片／静脈狭窄の程度を、上に詳述されたようにＩＶＵＳによって評価する。
ＩＶＵＳ
ＩＶＵＳ測定は、静脈について移植片／静脈接合部の両側の２〜３ｃｍの距離にわたって行うが、それは、この領域が新生内膜病変が起こるところであるからである。更に、血管造影法がそこに狭窄を示す場合、その移植片にＩＶＵＳを行う。狭窄度は、（ｉ）最小管腔面積を決定することによって、（ｉｉ）狭窄されている最大パーセント面積を測定することによって；（ｉｉｉ）病変の３次元再構成を作製後、移植片内の病変が占める体積を定量し、狭窄指数として全体積で割ることによって；または（ｉｖ）移植片中の全血流（ｃｃ／分）を決定することによって定量する。
【００９６】
ＩＶＵＳは、各群の２頭の被験動物において０日に行って、ベースラインを確かめる。これは、本発明者らが、ブタの静脈サイズにかなりの変動があるかどうか確認することを可能にするであろう。変動がある場合、それは、本発明者らに、２８日目時点における絶対孔面積よりもむしろ狭窄面積％を決定することを更に考慮させるであろう。血管造影法は０日および２８日目に行う。それは、本発明者らが、移植片および吻合部位の状態を速やかに評価することを可能にするであろう。
【００９７】
次のパラメーターＩＶＵＳ、すなわち、管腔直径、および静脈に沿った且つ移植片中の横断面積を、最大狭窄部位における％ＮＩＨ面積および全ＮＩＨ体積を得るように、ベースラインについて０日、２８日およびその後の測定時に記録する（３Ｄ再構成−図７Ｅの例を参照されたい）。
【００９８】
血中グリベックレベル、細胞表現型、サイトカインおよび細胞内シグナル伝達分析、および移植片および静脈の組織病理学は、屠殺時に次のように決定する。
グリベック血中レベル
質量分析法を用いて、標準法で約３０ｎｇ／ｍｌの検出レベルに下がった血中グリベックレベルを測定する（例えばＷｏｌｆｆら、Ｂｌｏｏｄ．２００３年２月２０日（印刷前のｅｐｕｂ）を参照されたい）。グリベックレベルは、本発明者らが、グリベックレベルと、グリベック治療で得られた狭窄減少の程度との間に何等かの相関があるかどうかを確認することを可能にするであろう。
【００９９】
細胞表現型分類
平滑筋細胞および筋線維芽細胞並びにマクロファージおよび内皮細胞の数および場所を、αＳＭＡ、デスミン、ビメンチン、マクロファージ表面抗原およびフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）に対する抗体を用いて、Ｋｅｌｌｙら（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ、６２：２２７２−２２８０、２００２）に記載のように決定する。
【０１００】
ＰＤＧＦ遮断は、細胞タイプの数、それらの相対比、または病変中のそれらの場所に変化を生じることがありうる。例えば、病変中のＶＳＭＣおよび筋線維芽細胞の数を評価することは興味深いと考えられるが、ＰＤＧＦシグナル伝達阻害剤は、前者に影響を与えることなく後者を減少させるので、より少ない新生内膜過形成に至ることがありうる。本発明者らの初期の知見によれば、本発明者らは、各々の細胞タイプにおける細胞増殖およびアポトーシスの度合いを、ＢｒｄＵおよび標準トンネルアッセイを用いて、Ｋｅｌｌｙら（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ、６２：２２７２−２２８０、２００２）に記載のように定量することができる。
【０１０１】
サイトカインおよび細胞内分析
サイトカインおよび細胞内シグナル伝達分析を、ブタβ受容体リン酸化を検出する抗体を用いて、またはβ受容体抗体と細胞抽出物の免疫沈降後、生じたリン酸化チロシン抗体を用いて行い、グリベックおよび／またはペリンドプリルが、シグナル伝達経路に作用したかどうかを確認する。
【０１０２】
標的に「ヒット」した場合、および有意のＮＩＨがなお存在する場合、細胞内経路を薬物療法後の活性化について評価する。本発明者らは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ経路およびＭＥＫ−ＥＲＫ１／２活性化に注目するが、それは、両者がＰＤＧＦおよび他のサイトカインシグナル伝達経路の下流にあり、ＶＳＭＣの遊走／増殖に重要であると知られているからである。具体的には、本発明者らは、ブタ組織の免疫組織化学またはウェスタンブロット分析に、ホスホＥＲＫ１／２抗体を用いるであろう。或いは、免疫沈降を行った後、生じたリン酸化チロシン抗体をＮＩＨ組織について利用したウェスタンブロット分析を行って活性化を確かめる。ホスホｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体も免疫組織化学またはウェスタン分析に用いられて、ｍＴＯＲ活性化を評価するであろう。例えば、グリベックによるＰＤＧＦ遮断が、ＥＲＫ１／２活性化の遮断を引き起こしたが、ｍＴＯＲ活性化の遮断を引き起こさなかった場合、ＰＤＧＦ以外のサイトカインがｍＴＯＲを活性化しているということ、およびラパマイシンによるｍＴＯＲ活性化標的指向が有用であるということが考えられる。更に、ペリンドプリルは、本発明の方法で用いられて、Ａｎｇ−ＩＩによるｍＴＯＲ活性化を減少させうると考えられるが、それは、Ａｎｇ−ＩＩのレベルがペリンドプリルによって減少するからである。
【０１０３】
これら細胞内シグナル伝達イベントに加えて、免疫組織化学、ｉｎ  ｓｉｔｕ方法およびウェスタン分析を用いて、次のサイトカインの病変中の発現を分析する：ｂＦＧＦ；ＰＤＧＦシグナル伝達がブロックされた場合に減少するはずであるＭＣＰ−１；ＶＥＧＦ；およびＥＴ−１。比較は、本発明者らの４つの実験群間について、半定量的スコア尺度で、例えば、０〜最強発現の５で行う。これらサイトカインは、ＶＳＭＣ、内皮細胞および単球について知られている分裂促進因子／細胞遊走促進因子である。更に、これらサイトカインのいくつか（例えばＥＴ−１およびＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト）または以前に注目された細胞内経路（ＭＥＫ−ＥＲＫ阻害剤）をブロックする薬物は利用可能であるし、そして少なくとも局所供給には、本発明の方法できわめて有用でありうる。
【０１０４】
ブタプライマー
適当なブタｃＤＮＡを、マウス、ヒト、ラットおよび下等生物からのｃＤＮＡを整列させることによって決定される保存領域（例えば少なくとも６０％、７５％、８０％、９０％または１００％の核酸配列類似性または同一性を有する領域）より選択されるＰＣＲプライマーを用いて同定する。ＰＣＲ産物は、ブタＶＳＭＣの細胞培養物に由来するかまたは、ブタ大動脈またはブタ新生内膜病変から得られるＲＮＡに由来するブタＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得る。これら供給源は、所望のクローンを提供するのに充分なはずである。当然ながら、クローンは全て配列決定されるが、ヒトおよび齧歯類動物のクローン配列に高度の相同性を示すはずである。
【０１０５】
統計学的考察
全１３頭／群の被験動物を、要求されるように取り替えられる手術不全で用いる。グリベックは、薬物療法を与えられない対照と比較して、狭窄への顕著な作用を有すると考えられるであろう。対照群において、本発明者らは、２８日時点での狭窄が評価される場合の本発明者らの実験に基づいて１０〜１５％の標準偏差で約８０％の狭窄を予想している。実験全体の試料サイズは、グリベックと、グリベック＋ペリンドプリルの組合せ群との間の差を検出する要求によって作動している。選択される試料サイズは、（２８日の内の一定の時点で）グリベックと組合せ群との間に２０％の狭窄の差異を検出する９０％の能力、または１７．５％の狭窄の差異を検出する８０％の能力を与えるであろう（０．０５の有意レベル、両側、ｔ検定を用いる、推定群内標準偏差（ＳＤ）として１５％を用いる）。これは、本発明者らが、臨床的に重要な差異を検出する充分な能力を有するであろうということを示すことを意図した、きわめて保守的な能力計算であるということに注目されたいが、それは、下記の分析が、２群間の差異を検出するはるかに高い能力を有すると考えられるからである。
【０１０６】
データ分析へのアプローチ
実験は、２×２要因分析であるが（グリベックにイエスかノー×ペリンドプリルにイエスかノー）、本発明者らは、グリベック単独群と、組合せのグリベック＋ペリンドプリル群との間の２群比較によって分析を記載しており、ここに記載のアプローチは、所望ならば、完全要因分析へと容易に拡大することができる。本発明者らは、各々の被験動物の範囲内の結果の図式的検査で始めて、ある被験動物の各々２つの移植片について別個に、狭窄を時間経過でプロットするであろう。これらプロフィールプロットは、（群内の）多数の被験動物によるプロット結果または全群についての時間経過での要約データ（例えばボックスプロット）へと拡大しうると考えられる。これは、データをある程度見通す不可欠な工程である。本発明者は、各々の時点を個々に、基本的な技法（例えば、２つの狭窄測定値の平均を用いるｔ検定またはウィルコクソン順位和検定、または結果が「イエスかノーの有意の狭窄」のような２値結果に分類される場合のフィッシャーの抽出検定）を用いて分析しうるが、本発明者らは、異なった被験動物において異なった測定計画で、２部位／動物の連続測定値を有するはずであるので、縦断的データ分析のための新しい技法を用いることは、統計学的にはるかに有効である。或いは、分散の混合模型分析（狭窄または変化（transform）が、正規の変数として分布していると考えられる）または一般化推定式を用いる。このような模型は、本発明者らが、ある被験動物内の連続測定値を時間経過で取り込むことを可能にするし、ある被験動物内の２つの移植片が相関していることを考慮することを可能にするし、そして測定間隔および異なった群についての潜在的に異なった測定計画を変更することを可能にする。本発明者らは、表示変数を用いることによって治療群を取り込むことができるし、グリベック×ペリンドプリル×時間相互作用項目を取り込むことによってその分析を完全要因分析へと拡大することができる。追加の潜在的な因子（例えばサイトカインレベル、またはｐ７０  Ｓ６キナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子のリン酸化度、血清グリベックレベル）は、この一般的な模型製作枠組みに取り込むのが容易である。このアプローチは、若干の測定値が、ある被験動物について欠けているかまたは不完全であるとしても、全ての被験動物からのデータを用いることを可能にする。したがって、実験計画を、被験動物の最初の２〜３回のブロック後に変更したとしても、これら被験動物からのデータは、実験分析全体に含まれる。
【０１０７】
グリベックおよびラパマイシンのドラッグデリバリーシステム
負荷用量
ＶＳＭＣ遊走をブロックするためのラパマイシンのＩＣ５０（１〜５ｎｇ／ｍｌ）に基づいて、本発明者らは、１〜２％の負荷用量を用いることを予想しているが、グリベックについては、グリベックのＩＣ５０が与えられると（グリベックについて２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）、３０〜５０％の負荷用量が必要である。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＩＣ５０を用いると、毎日の放出に必要な各々の薬物の量を推定することが可能である。例えば、ラパマイシン溶離用ステントは、約１８５μｇのラパマイシンを約３０日間にわたって溶離する（７４）。フィルムまたは縫合糸などの血管周囲装置は、静脈のほぼ４ｃｍ（移植片／静脈吻合の両側に２ｃｍ）および２００〜４００ｍｇの重量の移植片組織の１ｃｍを包んだが、本発明者らは、０．０５％〜０．１％の負荷用量が充分であると推定している。望ましくは、ラパマイシンについては、１〜２％（０．０５％〜０．１％よりかなり高い数値）の用量を用いる。
【０１０９】
グリベックについては、望ましくは３０％〜５０％の負荷用量を用いる。この用量は、ベラパミルなどの他の薬物の使用の常套法に基づいている。ベラパミルを血管周囲に用いて動脈モデル中の新生内膜過形成を阻害する場合、２％の負荷用量を用いて、１日当たり１０μｇの薬物をＥＶＡｃポリマー（Ｂｒａｕｎｅｒら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ、１１４：５３−６３、１９９７）から放出させた。
【０１１０】
デリバリー製剤
ドラッグデリバリーシステムを選択する場合、次の因子、すなわち、薬物の溶解度；その分子量；ポリマーから放出されるのに必要な薬物の１日当たりの量；および達せられる薬物放出の所望の時間および速度論を考慮すべきである。グリベックもラパマイシンもきわめて親水性であり、しかも１０００未満の分子量を有するので、それらは数時間〜数日間にわたってミクロスフェアから速やかに放出されると考えられ、したがって、本発明者らのブタモデルでは役立たないことがありうる。より長い放出期間を与えるために、本発明者らは、薬物を約１ヶ月間供給させるであろう３種類のデリバリーシステムを開発した。
【０１１１】
薬物負荷ミクロスフェア
薬物負荷ミクロスフェアからのラパマイシンまたはグリベックの予想供給時間は、（最初は若干高い放出で）約１〜２週間であると考えられる。この放出時間は、薬物が生体分解性コア中に分散していて、そしてこのコアが、生体分解性物質を含有する非薬物の外層によって包囲されている、すなわち、２重壁システムの場合に延長される。このシステムは、本発明者らが、比較的高い負荷量％に達しさせることが可能であろうから、グリベックについて特に充分に働くと考えられる。内部コアは、ポリラクチドコグリコリド（polylactide co gycolide）（ＰＬＧＡ）を含有するであろうし、外側は、ポリラクチド（ＰＬＡ）を含んで成る。ミクロスフェアの典型的な寸法は、５〜２０μの外層を含む約５０〜２００μである。生体分解性ポリマーから作られるミクロスフェアを、移植片配置時に、その移植片の周囲の領域に入れる。これらミクロスフェアの主な利点は、追加のミクロスフェアを後の段階で注入することができるということである。植込部位からのミクロスフェア分散を制限するために、ミクロスフェアをカルボキシメチルセルロースなどの接着性ペースト中に埋め込むことができる。これは、静脈および移植片にペーストの薄層を塗ることにより、外科医が、ミクロスフェアを移植片の周りに沈着させることを可能にするであろう。約２００〜４００ｍｇのミクロスフェアをペースト中に埋め込み、静脈吻合部位の周りの薄層中に塗るということが考えられる。ミクロスフェアペーストは、両側の移植片のヒールから約２ｃｍに広がる（exend）であろうし、移植片の周りの約１ｃｍまたはそのぐらいにも置く。
【０１１２】
薬物負荷フィルムおよび縫合糸
治療的化合物は、単独または組合せで、薬物をマトリックス内部に取り込んでいる非侵食性フィルム中で供給することもできる。このようなシステムからの薬物の放出時間は最初はより速い放出で、約３週間であると考えられる。好ましくは、ポリマーはエチルビニルアセテート（ＥＶＡｃ）である。ＥＶＡｃは、多数の局所デリバリー用途に、更には、血管周囲デリバリーに広く用いられてきている。そのフィルムを下に詳述されるように入手後、静脈吻合部位、更には、静脈と移植片の接合部の周りを包む。これは、製造するのが特に簡単なシステムである。本発明者らの初期の結果に基づき、特に、負荷量が５％未満であれば、かなり直線的な速度論を２〜３週間にわたって与えると考えられる。縫合糸は、フィルムを適所に保持するように移植片および静脈の周りに用いうると考えられる。
【０１１３】
或いは、薬物を、ポリマー縫合糸中に埋め込む。次に、その縫合糸を、移植片の静脈端の周りにおよび移植片の静脈との接合部の周りに巻き付ける。この移植片の周りに縫合糸を巻き付けることで、移植片を適所に保持する。移植片／静脈の長さ当たりの縫合糸の回転数を変更することにより、放出される薬物の量を増加または減少させることができる。
【０１１４】
複合システム
ラパマイシンおよびグリベックは、ＥＶＡｃなどの疎水性非侵食性マトリックス中に埋め込まれた侵食性ミクロスフェアを一緒にしている複合システムから供給することができる（図１４を参照されたい）。このシステムの主な利点は、（ｉ）ミクロスフェアをきわめて高密度に、例えば５０％まで負荷することができるということ；（ｉｉ）放出をフィルムの片側に制限することができるし（図を参照されたい）、移植片または静脈の側と接触しているミクロスフェアだけに制限することができるということ；および（ｉｉｉ）期待される薬物放出が、グリベックおよびラパマイシンなどの低分子量親水性薬物についても数ヶ月または数年のような長期間にわたって直線的であると考えられるということである。その複合システムはヒトの場合に最も適用可能である。本発明者らは、このような複合材料の厚みが約２〜３ｍｍであるということ、そしてその複合材料で移植片および静脈の周りを包むということを考えている。
【０１１５】
複合システムは、ミクロスフェアをフィルム中に取り込むのに有用であるポリウレタン、ＥＶＡｃ、または当該技術分野において知られている他の物質を含有するであろう。１つの態様において、溶液流延法を用いてミクロスフェアを埋め込む。この用途には、ミクロスフェアが不溶性である溶媒に可溶性のポリマーを同定する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ、３０：７４４−７５１、１９９９）。
【０１１６】
薬物抽出
グリベックは、薬物に加えて不活性物質を含有するカプセル剤中で入手可能である。このようなカプセル剤を破壊し、その薬物を親水性溶媒中に抽出して、不活性物質からそれを分離し、そして次に、抽出された物質を定量する。グリベックについて、不活性成分は、コロイドシリコーン、２酸化ケイ素（silicone dioxide）、クロスポビドンマグネシウムステアラートおよび微結晶性セルロースである。カプセル剤をいったん破壊したら、その内容物を、グリベックがきわめて可溶性である水性緩衝液（ｐＨ＜５）中に分散させる。凍結乾燥後、精製されたグリベックを得、適当なマトリックス中に取り込む。
【０１１７】
純ラパマイシンは、シグマ（Ｒ０３９５）から入手可能であるし、またはグリベックについて記載のカプセル剤から抽出することができる。次に、ラパマイシン抽出物を、標準的な質量分光分析法を用いて定量する。
【０１１８】
ポリマー製造方法。
ミクロスフェア製造
修飾溶媒蒸発法は、界面活性剤としての０．５％ポリビニルアルコール溶液と一緒に水を含有する非溶媒浴を構成する。それらポリマー溶液を塩化メチレンに溶解させるが、それは、４０℃の沸点を有するきわめて揮発性の溶媒であり、水と混和性であり、非溶媒である。撹拌機速度を５００〜８００ｒｐｍに設定する。撹拌機は、非溶媒中で形成される液体粒子のサイズと、塩化メチレンが蒸発する速度の双方を制御する。２０重量／容量（ｗ／ｖ）％の濃度において、ＰＬＬＡおよびＰＬＧＡの出発ポリマー溶液は混和性である。塩化メチレンが蒸発するにつれて、そのポリマー溶液は濃縮し、相分離が起こり、２重壁ミクロスフェアの形成を引き起こす。２００ｍｌの脱イオン水および５０ｍｌの２％ポリビニルアルコール溶液が入っている４００ｍｌビーカーを、ブランクミクロスフェアの成形加工に用いる。４００ｍｌの水および１００ｍｌの２％界面活性剤が入っている６００ｍｌビーカーを、タンパク質負荷ミクロスフェアの成形加工に用いる。
【０１１９】
ミクロスフェアは、２種類のポリマー、すなわち、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）およびポリ（Ｌ−ラクチドコグリコリド）５０：５０（ＰＬＧＡ５０：５０）の混合物から製造する。ＰＬＧＡの分子量は、放出速度を調節するために、２０，０００〜１００，０００に調整する。全部で０．６ｇのＰＬＧＡおよび０．２ｇのＰＬＬＡを各々、２ｍｌの塩化メチレン中に２０重量／容量（ｗ／ｖ）％の全ポリマー濃度で溶解させる。ＰＬＧＡ溶液を、ロトミキサー（Fisher Roto-Rack）上に４５分間置いて、塩化メチレンへの溶解性を助ける。１０ｗ／ｖ％ＰＬＬＡ溶液を、３０ｗ／ｖ％ＰＬＧＡ溶液に加え（１：３の比率）、そして１０ｃｃシリンジを用いて浴中に注入する。その浴を、２〜３時間運転させた後、球体を５００ｍｌの蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させる。薬物負荷ミクロスフェアのカプセル化には同様の手順を用いる。この場合、全部で０．６ｇのＰＬＧＡおよび０．２ｇのＰＬＬＡを用いる。薬物（負荷量に依って異なる量、すなわち、上記のように、ラパマイシンについては１〜２％およびグリベックについては３０〜５０％）を、１０ｍｌの塩化メチレン中において０．１ｇのＰＬＧＡと混合する。その混合物を、５分間浴音波処理した後、混合物を一晩冷凍する。翌日、塩化メチレンを蒸発させる。０．５ｇの残りのＰＬＧＡを２ｍｌの塩化メチレンに加え、その混合物をロトミキサー上に置いてポリマーを溶解させる。ＰＬＧＡ溶液を、ＰＬＧＡ−タンパク質バイアルに加え、３０秒間浴音波処理する。塩化メチレン中の別のＰＬＬＡ溶液を、２ｍｌ中の溶媒中に０．２ｇで作る。次に、２つのポリマー溶液を、第３のバイアル中で互いに混合し、数回手で振とうした後、４００ｍｌの蒸留水および１００ｍｌの２％ポリビニルアルコールから成る６００ｍｌのビーカー浴中に注入する。その浴を２〜３時間撹拌した後、球体を５００ｍｌの蒸留水で洗浄し、凍結乾燥させる。これらミクロスフェアは、上記のように直接的に用いることができるし、またはフィルム中に取り込むことができる。
【０１２０】
ＥＶＡｃのフィルムおよび縫合糸
ＥＶＡｃフィルム
フィルムは、超微粉薬物をＥＶＡｃと混合し、０．５〜１．０ｍｍの厚みを有するマトリックスをペトリ皿中で凝固させ、そして約０．５〜１．０ｍｍの厚みを有する約２ｃｍ×３ｃｍのサイズの長方形材を切断することによって製造する。或いは、薬物およびＥＶＡｃの混合物を、下記のように押出して、縫合糸を成形することができる。
【０１２１】
ＥＶＡｃ縫合糸製作
１０ｍｌのポリ（エチレンコビニルアセテート）（ＥＶＡｃ，ＭｅＣｌ2中１０ｗ／ｖ％）溶液を調製する。粉末薬物をこの溶液に加えて、製剤に依り、ラパマイシンについては１〜２％およびグリベックについては３０〜５０（重量／重量）％の負荷量に達しさせる。このような懸濁液を手動撹拌し、音波処理して薬物を分散させた後、ガラス上において２００μｍの高さに設定されたスクリムを用いて流延してフィルムにする。乾燥したら薬物負荷ＥＶＡｃフィルムを小片に切断する。それら小片を、受注押出装置中に供給し、２００〜８００μｍ直径のダイを介して５０〜５５℃の温度で熱押出する。本発明者らの以前の結果に基づき、本発明者らは縫合糸の直径が０．５〜１．０ｍｍであると予想している。
【０１２２】
複合デリバリーシステム
ミクロスフェア（ＰＬＬＡおよびＰＬＧＡから作られる）を上記のように製造する。次に、それらを温度調節付き自動油圧プレス（Ｃａｒｖｅｒ社、ウォバッシュ、インディアナ）を用いてプレスして、そのガラス転移温度を超えて維持されている薄い平フィルムにする。この手順は、ミクロスフェアをＥＶＡｃで被覆する。ＥＶＡｃの追加のコートを、エアブラシ（Ｂａｄｇｅｒ  Ａｉｒ−Ｂｒｕｓｈ社、フランクリンパーク、イリノイ）を用いてフィルムの片側に与える。これは、フィルムの片側から主に薬物を放出するシステムを生じる。或いは、そのミクロスフェアを製造し、そしてＰＬＧＡを溶解しない溶媒中に可溶性であるポリマー中に分散させる。次に、その溶媒を蒸発させて、外部ポリマー中に埋め込まれたミクロスフェアを残す。用いられる外部ポリマーは、ＥＶＡｃ、またはポリウレタンのようないずれか他の非侵食性相容性ポリマーである。
【０１２３】
走査型電子顕微鏡分析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析は、本発明者らが、生体侵食性（bioerodible）システムの分解を時間経過で確認することを可能にする。試料を、下記のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの分解前後に評価する。ＳＥＭ分析の目的は、各々のシステムの外部形態および横断面を評価することである。ＳＥＭ分析（日立  Ｓ−２７００）のための試料は、１％四酸化オスミウムで後固定し（ＥＭＳ、フォートワシントン、ペンシルバニア）、一連の分量を変えたエタノール中で脱水し、そしてヘキサメチジシラザン（シグマ）中に入れる。
【０１２４】
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
ＦＴＩＲ分析を用いて、複合デリバリー装置中のＰＬＧ対ＥＶＡｃの比率を決定する。ＦＴＩＲスペクトルを得、そしてパーキンエルマー  ＩＲデータマネジャーソフトウェアを用いて、１７２５型ＦＴＩＲ分光光度計（パーキンエルマー社、ノーウォーク、コネチカット）で分析する。ミクロスフェア試料は、２つの方法の内の一方で製造する。若干の試料は、１：９９ｗ／ｗの比率のミクロスフェアおよび臭化カリウム（ＫＢｒ、アルドリッチ・ケミカル社、ミルウォーキー、ウィスコンシン）を、乳鉢および乳棒で粉砕して微粉にすることによって調製する。次に、その混合物を、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｓｓ（パーキンエルマー社、ノーウォーク、コネチカット）を用いて圧縮してペレットにする、または試料をフィルム流延によって製造する。１．０（ｗ／ｖ）％ポリマー／塩化メチレン溶液を調製し、ＮａＣｌ結晶上に分配する。次に、その溶媒を完全に蒸発させた後、スペクトルを得る。
【０１２５】
２種類の薬物組合せについての考察
ドラッグデリバリーのための個々のシステムは、組み合わせることができる。例えば、ラパマイシンはミクロスフェア中で供給することができるし、グリベックは縫合糸中で供給することができる。組合せを供給するために、縫合糸を移植片の周りに巻き付けることができるが、ミクロスフェアはカルボキシメチルセルロースペーストとして移植片上に塗る。或いは、ミクロスフェア（各々の薬物を所望の濃度で負荷される）をフィルム中に埋め込み、上記のように移植片に供給する。
【０１２６】
放出速度論の評価
約５０％の薬物放出をほぼ直線的速度論で３０日間にわたって得ることが好ましい。放出速度論は、グリベックについての３０ｗ／ｗ％および５０ｗ／ｗ％ポリマーおよびラパマイシンについての１ｗ／ｗ％および２ｗ／ｗ％ポリマーのいろいろなポリマー系について決定する。これらポリマーを標準培地が入っている１０ｍｌ組織培養皿中に入れ、繰り返しのアリコートを４週間にわたって採取する。各々の試料採取後、新鮮培地を組織培養皿に加える。アリコートは、特に、本発明者らが初期の放出バーストを認めた場合は毎日、そしてその後、毎週数回採取する。これら試料を凍結させ、そして培地中へのグリベックおよびラパマイシン放出を質量分光分析によって定量する。４週間の最後に、マトリックスを適当な有機溶媒中に溶解させ、残っている薬物を測定する。
【０１２７】
これら方法は、種々のドラッグデリバリーシステムの放出速度論を与える。組織培養皿中の培地の容量について調整される試料採取アリコート中の量に、マトリックス中に残っている薬物を加えた合計は、本発明者が、マトリックス中の薬物の放出をこの４週間にわたって評価することを可能にするであろう。
【０１２８】
生物活性
更に、ポリマーから放出される薬物の生物活性をＶＳＭＣ遊走アッセイ（上記）を用いて評価する。ポリマーから放出される薬物の活性は、実験プロトコールの期間に週１回の間隔で集め、ポリマー中に埋め込まれていない薬物の相当量の活性と比較する。
【０１２９】
ドラッグデリバリーシステムを３頭のブタにおいて評価して、薬物の全身レベルが確実に許容されるようにするが、最初は、ドラッグデリバリーはグリベックについて５０ｎｇ／ｍｌおよびラパマイシンについて０．１ｎｇ／ｍｌを超えないであろう。血清薬物レベルを、各々のデリバリーシステムについて、植込後４日目、７日目および１４日目に測定する。各々の時点の平均レベルに約９５％の信頼限界を決定する。上方信頼限界がカットオフ未満である場合、本発明者らは、薬物の全身レベルが許容可能であり、下に概説される研究で進行すると考えるであろう。
【０１３０】
薬物の全身レベルがグリベックについて５０ｎｇ／ｍｌおよびラパマイシンについて０．１ｎｇ／ｍｌより低い場合、本発明者らは、ＶＳＭＣへの作用についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータに基づき、これら全身レベルがブタのもう一方の側の移植片に作用していないであろうと考えることができる。これは、本発明者らが、１頭のブタにつき２つの移植片であって、各々、局所用デリバリーに取り込まれた異なった薬物を有する移植片を評価することを可能にするであろう。したがって、本発明者らは、１頭の被験動物内の４種類の治療（グリベック；ラパマイシン；組合せ；またはデリバリー装置のみ）のうちの２つを評価することができる。全身レベルがこれらの日付のいずれかで示されるレベルより高い場合、同じ薬物／ポリマーを各々４群のブタ、すなわち、２つの同一薬物ポリマーを有する各々のブタの両側で試験する。
【０１３１】
次の評価を行うことが好ましい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物放出
研究の最後にポリマー中に残った薬物の量を決定する。これは、移植片の領域から非侵食性ポリマーを取り出し、これらを適当な有機溶媒中に溶解させ、そして薬物を水中に抽出してその濃度を決定することを含む。
【０１３２】
ポリマー装置を含む移植片の分析
上記のように、移植片および静脈吻合部位の組織学を評価する。この評価には、詳細な細胞表現型分類、サイトカインおよび細胞内シグナル伝達の研究が含まれる。更に、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、若干の生体分解性成分を双方とも含有するミクロスフェアおよび複合システムオプションに最も重要な、装置除去後（および配置前）の全てのデリバリーシステムの形態を評価することである。更に、その電子顕微鏡データは、本発明者らの細胞表現型分類研究（例えばＶＳＭＣを筋線維芽細胞と区別すること）によるデータを補完するであろう。
【０１３３】
ＴＥＭ用の検体を、１００％エタノールで脱水し、ＯｓＯ4でオスミウム染色し、ゼラチンカプセル剤中に基剤を埋め込むＬＲ  ＷＨＩＴＥ中に埋め込み、そして３０℃のオーブンで硬化させる。切片は、ＲＥＩＣＨＥＲＴ−ＪＵＮＧ  ＵＬＴＲＡＣＵＴ  Ｅ  ＭＩＣＲＯＴＯＭＥ上においてダイアモンドナイフで９５ｎｍの厚みに切断する。ＰＨＩＬＩＰＳ  ＥＭ４１０透過型電子顕微鏡を用いて切片を調べる。
【０１３４】
局所（および全身）毒性
血管吻合部位の局所壊死および分解を評価する。薬物負荷ポリマー側のみで毒性が認められる場合、ポリマーに加えられた薬物の量は減少している。当然ながら、負荷マトリックスから何等かの全身毒性があるかどうかの評価がある。これは、被験動物が充分に摂食しているかどうか、それらが敏捷且つ応答性に見えるかどうかを評価することによって確認する。更に、採血して、ＣＢＣ、ヘモグロビンおよび血小板計数をアッセイする。
【０１３５】
サイトカインおよび細胞内シグナル伝達を確認する本発明者らの方法を上記のように行う。ラパマイシンについては、ラパマイシンがその標的（ｍＴＯＲ）にヒットしたかどうかを、図５および図１０に示されるように、ラパマイシン感受性ホスホｐ７０  Ｓ６キナーゼ抗体を用いて確認する。本発明者らは、負の染色結果が認められると考え、ラパマイシンがｍＴＯＲ活性化をブロックしたということを示している。本発明者らが正の染色結果を認めた場合、１層多量のラパマイシンを用いて（例えば１０倍）ポリマーに薬物を負荷する。
【０１３６】
データ分析
上記のように、分散の混合模型分析または一般化推定式を用いてこの連続的なデータを分析する。これらアプローチは、時間経過での測定値間の関係、および同じ被験動物で試験された場合の治療間の関係を正しく考慮するであろうし、全ての被験動物からの測定値を分析に取り込むことを可能にする。
【０１３７】
最適な局所供給薬物製剤
ペリンドプリルまたはビヒクルを、薬物（グリベック、ラパマイシン、またはグリベックおよびラパマイシン）を含む１つの移植片と、デリバリーシステムのみを含む１つの移植片とを有する各々の被験動物に投与する。具体的には、局所用デリバリーシステム＋ペリンドプリル対デリバリーシステム単独の比較は、群間比較であることが必要であろう。予備分析を６組の被験動物を完成後に行って、ペリンドプリルとの組合せで投与された薬物がペリンドプリル非存在下の薬物治療よりも実質的に良いという何等かの証拠があるかどうを決定する。データ分析は、上記と同様の戦略および方法にしたがうが、本発明者らが被験動物内および間の比較を適切に考慮することを可能にする。
【０１３８】
ＡＶ移植モデルでの局所投与に有用な化合物
ラパマイシン、グリベックおよびペリンドプリルに加えて、ＶＳＭＣへの、前遊走性および／または前分裂促進シグナルを供給することが知られている受容体または細胞内経路をブロックする薬物（すなわち、ＰＤＧＦおよびＡｎｇ−ＩＩ受容体以外の受容体をブロックする薬物）も、本発明の方法において有用である。
【０１３９】
ＥＴ−１受容体遮断薬
例えば、Ｗｅｉｓｓら、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ、３７：９７０−９８０、２００１によって注目されたように、ＥＴ−１発現が新生内膜病変で認められた場合、ＥＴ−１受容体遮断薬を血管周囲に投与することができる。或いは、ラパマイシン以外の、ＥＲＫ−１／２またはＰＩ３Ｋの阻害剤のような細胞内阻害剤を投与してよい。ＰＩ３Ｋは、Ａｋｔおよび他の下流エフェクターを活性化する。このような化合物は、このような経路のリン酸化がグリベック、ラパマイシンおよび／またはペリンドプリルの存在下で認められる場合、特に有用である。このような阻害剤は、全身投与された場合副作用があるかもしれないが、本発明の方法を用いて局所供給された場合、より少ない有効量を投与することができるので副作用および全身毒性を低下させると考えられる。
【０１４０】
スラミン
スラミンは、ＡＶ移植片モデルでの局所投与に好ましい１つのサイトカイン阻害剤である。スラミンは、アフリカトリパノソーマ症およびオンコセルカ症（onchocercuiasis）に広く用いられてきた尿素のポリスルホン化ナフチルミン（naphtylmine）誘導体である。スラミンは、種々の新生物の治療にも有効である（Ｓｍａｌｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２０：３３６９−３３７５、２００２；Ｒｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５０：１−５、２００２）。最近、スラミンは、全身投与された場合のウサギモデルにおけるバルーン血管形成術後の内膜肥厚を阻害することが分かった（Ａｓａｄａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ、２８：１１６６−１１６９、１９９４；Ｕｒａｓａｗａら、Ｊｐｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、４２：２２１−２２３、２００１）。スラミンは、局所投与された場合のマウス静脈移植片の新生内膜過形成を阻害することにおいても有効であった。蓄積しつつある証拠は、スラミンが、ＰＤＧＦで活性化されたＭＡＰキナーゼ活性を無効にし、そのＰＤＧＦ受容体のリン酸化を阻害することによって；ＶＳＭＣにおいてＡｎｇ−ＩＩで誘発される有糸分裂誘発をブロックすることによって；および多数の増殖因子（酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＬ−１およびＴＧＦ−β）のリガンド結合を妨げ、フィブロネクチンおよびエラスチン沈着を阻害し、そして平滑筋細胞を細胞外マトリックスに固定するのに役立ちうるエラスチン結合タンパク質の発現を増加させることによって、ＶＳＭＣの増殖および遊走を阻害するということを示唆している。
【０１４１】
スラミン投与は、ラパマイシン、グリベックまたはペリンドプリルでブタを治療している場合に、新生内膜病変中にｂＦＧＦまたはＴＧＦ−βまたはＩＧＦ−Ｉの発現が存在する場合、必要とされる。スラミンの毒性プロフィールが、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）患者におけるＡＶ移植狭窄の治療のためのその長期全身性使用の前兆となりうると仮定するならば、新生内膜過形成の治療のために、本発明の方法にしたがって、スラミンを局所投与する。
【０１４２】
新生内膜病変についての転写プロフィール分析
最初に、ブタのＡＶ移植片をいろいろな時点に（例えば移植片配置後週１回）アスピリン以外のいずれの薬剤も不存在で評価する。これは、本発明者らが新生内膜病変における一時的サイトカイン発現を評価することを可能にする。この評価に続いて、ブタを本明細書中に記載の薬物で治療し、そして一時的サイトカイン発現を再度監視する。新生内膜過形成の減少が絶対的である場合、その病変からＲＮＡを入手しない。若干の新生内膜過形成組織が残っている場合、その残っている病変におけるサイトカイン発現を分析する。これは、有効なＰＤＧＦ遮断後の病変に、どんな補償的または余分なサイトカインが生じているかという不偏な見解を与える。同様の分析を、ペリンドプリルでおよび／またはラパマイシンで治療された被験動物について行う。このような評価を、ブタのミクロアレイについて（Ｍｏｏｄｙら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：２７、２００２）、またはマウスまたはヒトからのｃＤＮＡアレイについて行うが、それは、ブタＲＮＡがこのようなｃＤＮＡアレイとクロスハイブリッド形成すると考えられるからである。
【０１４３】
化合物スクリーニングアッセイ
上に論じられたように、本発明者の研究結果は、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン化合物（例えばイマチニブメシレート）が、新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全を治療するのに有用であるということを示した。この発見に基づき、本発明者らは、移植不全を予防または治療するのに用いることができる治療化合物の組合せを同定するスクリーニング手順も開発した。概して、その方法は、本明細書中に記載の血管平滑筋細胞遊走アッセイを用いることにより、治療活性物質について、いずれか多数の化合物をスクリーニングすることを含む。したがって、本発明の方法は、新生内膜過形成によって引き起こされる移植不全の治療のための薬物などの活性物質の評価、同定および開発を簡単にする。更に、同定された治療的組合せを、本明細書中に記載の動物モデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１４４】
概して、本発明の化学的スクリーニング法は、更に評価され且つ少数の活性で選択的な物質へと集約される大集団から、目的の天然物抽出物または化合物を選択する簡単な手段を提供する。次に、このプールの成分を、本発明の方法で精製し且つ評価して、移植不全または新生内膜過形成へのそれらの作用を決定する。
【０１４５】
試験抽出物および化合物
概して、新生内膜過形成の治療のためにＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物と組み合わせて用いられる化合物を、当該技術分野において公知の方法にしたがって、天然物または合成双方の（または半合成の）抽出物の大ライブラリーまたは化学物質ライブラリーから同定する。本発明のスクリーニング法は、血管平滑筋細胞遊走への可能性のある作用について、種々の供給源からの化合物を試験するのに適当且つ有用である。最初のスクリーニングは、化合物の異種ライブラリーを用いて行ってよいが、その方法は、種々の他の化合物および化合物ライブラリーに適している。このような化合物ライブラリーは、組合せライブラリー、天然物ライブラリーまたは他の低分子ライブラリーでありうる。更に、商業的源からの化合物、更には、同定された阻害剤の商業的に入手可能な類似体を試験することができる。
【０１４６】
例えば、薬物の発見および開発の分野の業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が、本発明の１つまたは複数のスクリーニング手順に臨界的でないということを理解するであろう。したがって、事実上、いずれか多数の化学抽出物または化合物を、本明細書中に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。このような抽出物または化合物の例には、植物、真菌、原核生物または動物に基づく抽出物、発酵ブイヨンおよび合成化合物、並びに既存の化合物の修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。サッカライド、脂質、ペプチドおよび核酸に基づく化合物が含まれるがこれらに限定されるものではないいずれか多数の化合物のランダムまたは直接的な合成（例えば半合成または全合成）を生じるためにも、多数の方法が利用可能である。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（メリマック、ニューハンプシャー）およびアルドリッチ・ケミカル（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から商業的に入手可能である。或いは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形での天然化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（サセックス、ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（スラウ、ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ、フロリダ）およびＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ）を含めた多数の源より商業的に入手可能である。更に、天然のおよび合成製造されたライブラリーを、所望ならば、当該技術分野において公知の方法にしたがって、例えば、標準的な抽出法および分別法によって製造する。更に、所望ならば、いずれかのライブラリーまたは化合物を、標準的な化学的、物理的または生化学的方法を用いて容易に修飾する。
【０１４７】
粗製抽出物が血管平滑筋細胞遊走への作用を有することが判明した場合、その認められた作用に関与している化学的成分を単離するために、正の指標抽出物の更なる分別が必要である。したがって、抽出、分別および精製の処理の目的は、血管平滑筋細胞遊走への作用を有する粗製抽出物中の化学物質の注意深い特性決定および同定である。このような不均一抽出物の分別および精製の方法は、当該技術分野において公知である。所望ならば、新生内膜過形成の治療に有用な物質であることが分かった化合物を、当該技術分野において公知の方法にしたがって化学的に修飾する。
【０１４８】
組合せライブラリーおよび天然物ライブラリーなどのライブラリー中の、更には、天然物標品中の化合物の多くは特性決定されていないので、本発明のスクリーニング法は、スクリーニングにおいて活性である既知の化合物を同定することに加えて、特定のスクリーニングにおいて阻害剤または誘導物質として活性である新規な化合物を提供する。したがって、本発明には、このような新規な化合物、更には、医薬組成物、治療的組合せ、および移植不全を有する患者を治療する方法における新規なおよび公知の双方の化合物の使用が含まれる。
【０１４９】
治療的使用
本発明は、新生内膜過形成に起因する移植不全を、イマチニブメシレートなどのＮ−フェニル−２−ピリミジン化合物を投与することによって治療する方法を特徴とする。移植片の好ましいタイプは、ＰＶＤを治療するのにまたは血液透析における血管アクセスを確立するのに用いられるものである。イマチニブメシレートは、単独で、または本発明の方法にしたがって同定されるものなどの別の治療的化合物と組み合わせて、薬学的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤中において単位剤形で投与することができる。投与は、非経口、静脈内、皮下、経口または移植片部位の局所であってよい。
【０１５０】
組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤または徐放性錠剤；または静脈内、皮下または非経口投与用の液剤；または局所投与用のポリマーまたは他の徐放性ビヒクルの形でありうる。
【０１５１】
製剤を製造するための当該技術分野において周知の方法は、例えば、「レミントン：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（上記）に見出される。非経口投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含有してよい。生体適合性、生体分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、化合物の放出を制御することができる。ナノ微粒子製剤（例えば生分解性ナノパーティクル、固体脂質ナノパーティクル、リポソーム）を用いて、化合物の生体分布を制御することができる。他の潜在的に有用な非経口デリバリーシステムには、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植込可能注入システムおよびリポソームが含まれる。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の用量、および投与経路を含めた多数の因子に依存して異なるであろう。
【０１５２】
化合物は、製薬産業において一般的に用いられる無毒性酸付加塩または金属錯体のような、薬学的に許容しうる塩として投与されてもよい。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸等のような有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロース等のような高分子酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等のような無機酸が含まれる。金属錯体には、亜鉛、鉄等が含まれる。
【０１５３】
治療的製剤
経口使用の製剤には、無毒性の薬学的に許容しうる賦形剤との混合物中に１つまたは複数の活性成分を含有する錠剤が含まれる。これら賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えばスクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、滑剤および付着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油またはタルク）であってよい。
【０１５４】
経口使用の製剤は、咀嚼錠として；または活性成分が不活性固体希釈剤と混合されているゼラチン硬カプセル剤として；または活性成分が水または油基剤と混合されているゼラチン軟カプセル剤として提供することもできる。
【０１５５】
イマチニブメシレートの経口使用に好ましい用量は、１日１回用量、１日２回用量、または１日４回までの用量で与えられる、５０ｍｇ〜５０００ｍｇ／日、より好ましくは１００ｍｇ〜８００ｍｇ／日、最も好ましくは１００ｍｇ〜４００ｍｇ／日である。
【０１５６】
全身投与も、血液透析治療に必要な静脈内アクセスを用いて行うことができる。この全身投与方法は、患者コンプライアンスの必要性を免れることができるし、しかも全身投与が望まれるが化合物を経口投与に利用できない場合に、代わりの機構を与えることができる。
【０１５７】
局所投与には、化合物を移植片または静脈吻合部位に直接的に注射することができる。更に、移植片の部位または静脈吻合部位に与えられるポリマーは、移植片部位で化合物を制御放出させるのに用いることができる。イマチニブメシレートのこの制御放出形は、ＰＴＦＥメンブラン壁の節空間を満たしおよび／またはそのメンブランの内面および／または外面を被覆する。このようなポリマーの例には、Ｇｅｌｆｏａｍ（ファルマシア＆アップジョン社）が含まれるが、それは、外科医によって長年用いられてきているので、ここでのその適用は当業者によって理解されるであろう。化合物の局所制御放出に用いることができるポリマーのもう１つの例は、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡ；デュポン・ケミカル社）である。徐放性デリバリーのためのＥＶＡ中への化合物の取込みも、当該技術分野において周知であり（例えばＢｒａｕｎｅｒら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１４：５３−６３、１９９７；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３７７３−３７７７、１９９０；Ｋｕｓａｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７４：１０７０−１０７６、１９９１；Ｓｉｇｎｏｒｅら、Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｉｎｔｅｒｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、１２：７９−８８、２００１を参照されたい）、標準的な手順をこの治療方法に用いる。概して、イマチニブメシレートの組成パーセントは、ポリマーマトリックスに対するイマチニブメシレートの重量について０．０５重量％〜１０重量％であろう。これら手順の１例を、実施例１に記載する。
【０１５８】
化合物の局所投与は、ステント、またはカテーテルのような血管を支持するのに用いられる機械的装置の他のタイプによって行うこともできる。それらステントまたはカテーテルは、治療的化合物のための容器を含有し、血管中に直接的に挿入することができるので、治療的化合物をその容器から血流として血管を介して放出する。種々の医薬化合物でステントを被覆する方法は当該技術分野において周知であり、実施例は、本明細書中に援用される米国特許第６，１５３，２５２号；第６，２５８，１２１号；および第５，８２４，０４８号に見出されうる。本出願に挙げられた各々の治療薬について、用いられる治療薬の量は、用いられる具体的な薬物に依存する。典型的には、薬物の量は、コーティングの約０．００１重量％〜約７０重量％、より典型的には約０．００１重量％〜約６０重量％、最も典型的には０．００１重量％〜約４５重量％である。
【０１５９】
好ましくは、治療薬は、本明細書中に記載のドラッグデリバリーシステム（例えばミクロスフェア、薬物負荷フィルム、縫合糸、複合システム、またはフィルム中ミクロスフェア）によって供給する。
【０１６０】
化合物を投与するタイミングは、患者の全身健康状態、移植不全の診断、およびアクセス血流速度を含めた種々の臨床的因子に依存するであろう。血液透析には、１回用量を、各々の血液透析治療時に与え、１〜１８０日、より好ましくは７〜１２０日、そして最も好ましくは７〜９０日の期間続けることができる。ＰＶＤバイパス移植については、１回用量を、移植片配置時に与えることができ、そして１〜１８０日、より好ましくは７〜１２０日、そして最も好ましくは７〜９０日の期間続けることができる。局所投与の反復適用は必要でありうるが、それには、反復注射、化合物の適用、または移植片の交換が含まれるであろう。経口投与かまたは静脈内投与による全身投与の反復適用は維持療法としても必要でありうる。
【０１６１】
治療的組合せ
上記のように、移植片の狭窄および閉塞を引き起こす新生内膜過形成を開始し且つ持続する細胞シグナル伝達経路は、きわめて多く且つさまざまである。上流刺激物質には、血小板、好中球またはマクロファージを含めた分裂促進因子およびサイトカインが含まれうる。古典的シグナル伝達経路および細胞遊走シグナル伝達経路並びに血管形成シグナル伝達経路、そして免疫応答経路もアップレギュレーションされる。更に、新生内膜過形成および移植不全に至る細胞性過程には、増加した細胞外マトリックス沈着、細胞遊走および細胞付着が含まれる。新生内膜過形成性病変のこれら側面を各々調節する細胞性タンパク質は様々である。したがって、新生内膜過形成および移植不全と戦う治療的アプローチを設計する場合、これら経路のいくつかを標的にすることが好都合である。追加の化合物の使用は、一層大きい治療的成功と、化合物の毒性および必要な用量の同時の減少をもたらすであろうと考えられる。
【０１６２】
したがって、本発明は、ＰＤＧＦＲ生物活性を阻害することができるＮ−フェニル−２−ピリミジン誘導体と、次の：（ｉ）血管新生阻害剤、（ｉｉ）抗増殖化合物、（ｉｉｉ）免疫抑制化合物、（ｉｖ）抗遊走化合物、（ｖ）抗血小板薬、および（ｖｉ）抗線維症化合物より選択される少なくとも１つの追加の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【０１６３】
血管新生阻害剤には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤であって、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体の１つに対する抗体、およびＶＥＧＦ受容体の１つのチロシンキナーゼ活性を阻害する低分子量化合物などが含まれるが、これらに限定されるものではない。血管新生阻害剤の更に別の例には、エンドスタチン、アンジオスタチン、レスチン、タムスタチン、更には、ＴＮＰ−４７０、２メトキシエストラジオールおよびサリドマイドなどの他の低分子量阻害剤が含まれる。
【０１６４】
血管新生阻害剤の用量は、ヒトまたは動物の体重および状態、および化合物の投与経路などの他の臨床的因子に依存するであろう。ヒトまたは動物を治療するには、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）の血管新生阻害剤を投与することができる。より好ましい範囲は、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、最も好ましい範囲は２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。特定の動物またはヒトにおける血管新生阻害剤の半減期に依って、血管新生阻害剤は１日数回〜週に１回投与することができる。本発明の方法は、同時にまたは長期間にわたって与えられる、単回投与並びに多数回投与を提供する。
【０１６５】
抗増殖化合物には、血管平滑筋細胞または内皮細胞の増殖を減少させるかまたは阻害することができるいずれかの化合物が含まれる。血管平滑筋細胞の増殖を引き起こすことが知られている分裂促進因子の例には、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、エンドセリン−１、アンギオテンシンＩＩ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、バソプレッシン、トロンビン、セロトニンおよび多数の脂質メディエーターが含まれる。抗増殖化合物の例には、これらのいずれかまたはいずれか他の増殖誘発性タンパク質の分裂促進作用を阻害しうるいずれかの化合物が含まれる。具体的な化合物の好ましい例には、ラパマイシン、ｂＦＧＦ阻害剤、パクリタクセル（タキソール）、１７β−エストラジオール、トログリタゾン、ＡＣＥ阻害剤、スタチンおよびスラミンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
抗増殖化合物の用量は、ヒトまたは動物の体重および状態、および化合物の供給経路などの他の臨床的因子に依存する。概して、ヒトまたは動物を治療するには約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）の抗増殖化合物を投与することができる。より好ましい範囲は０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、最も好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。特定の動物またはヒトにおける抗増殖化合物の半減期に依って、その化合物は１日数回〜週に１回またはそれ以外の週毎に１回投与することができる。本発明の方法は、同時にまたは長期間にわたって与えられる、単回投与並びに多数回投与を提供する。
【０１６７】
ラパマイシンについては、用量は０．００１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであるが、０．００５μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌが好ましい範囲であるラパマイシンの血中レベルを生じるように与える。タキソールは、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）である週１回の用量で静脈内投与する。より好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、最も好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜２．５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。トログリタゾンは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）である１日用量で経口によってまたは静脈内に与える。より好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、最も好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。
【０１６８】
スタチンは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ  ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤として正式に知られている薬物のクラスの俗名である。これら薬物は低密度リポタンパク質コレステロールのレベルを低下させる。平滑筋細胞増殖は、アテローム発症の特徴であり、したがって、スタチンのようなこの代謝経路に影響を与える薬物は、平滑筋細胞増殖を減少させることがありうる。現在、米国で市販されているスタチンには、アトルバスタチン（リピトール）、フルバスタチン（レスコール）、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラバコール）、シンバスタチン（ゾコール）、セリバスタチン（バイコール、２００１年８月に市場から除かれた）、および多数の他の製剤が含まれる。スタチンの用量は、各々の製剤について、医薬品製造者より入手することができる。提示用量は、用いられている具体的な製剤に依って、１日に０．２０〜１００ｍｇである。例えば、フルバスタチンの提示１日用量は、２０〜４０ｍｇである。
【０１６９】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤は、強力な血管収縮薬であるアンギオテンシンＩＩの作用をブロックする。その血管収縮性に加えて、アンギオテンシンは平滑筋細胞増殖も刺激する。ＡＣＥ阻害剤は、血管の反動および改造作用の防止によっても、炎症および細胞増殖の防止によっても、再狭窄を妨げることに有効でありうる。米国では、現在いくつかのＡＣＥ阻害剤が市販されている。例には、ペリンドプリル（Aceon）、キナプリル、カプトプリル（カポテン）、リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）、エナラプリル（バソテック）、フォシノプリル（モノプリル）、ベナゼプリル（ロテンシン）、シラザプリルおよびラミプリル（Altace）が含まれる。ＡＣＥ阻害剤の用量は、各々の製剤について、医薬品製造者より入手することができる。提示１日用量は、用いられている具体的な製剤に依って、０．１〜５００ｍｇである。例えば、ペリンドプリルの好ましい用量は１日に２ｍｇ〜２０ｍｇであるが、カポテンの好ましい用量は２５〜１５０ｍｇ／１日２回または１日３回であり、最大用量は４５０ｍｇ／日である。
【０１７０】
スラミンは、抗寄生虫性薬としての１０年間の使用後、平滑筋細胞の増殖に必要な自己分泌およびパラ分泌増殖因子をブロックするその能力について認識された多陰イオン化合物である。スラミンは、最近、新生物の治療についての動物研究で用いられてきている。スラミンは、ＡｎｔｒｙｐｏｌおよびＳｕｒｍｏｎｔｉｌを含めたいくつかの商標名で市販されている。スラミンの用量は、各々の製剤について、医薬品製造者より入手することができる。提示１日用量は、用いられている具体的な製剤に依って、５０〜２００ｍｇである。
【０１７１】
免疫抑制化合物には、動物の自然免疫応答を抑制することができるいずれかの化合物が含まれる。好ましい化合物は、慢性炎症性応答において中心の役割を果たしている単球および／またはマクロファージの活性を抑制するであろう。好ましくは、免疫抑制化合物は、単球またはマクロファージの活性を、次の４種類：（１）単球の産生を減少させるかまたは単球の除去を増加させることによる、（２）マクロファージへの単球の分化を妨げることによる、（３）過形成の領域中に単球が遊走するのを妨げることによる、および（４）マクロファージの活性化をブロックすることによる方法のいずれか１つで阻害することができる。好ましい免疫抑制化合物の非限定例には、ｍａｃ−１の産生または機能化をブロックする抗体または化合物；ＭＣＰ−１産生または機能または双方をブロックするいずれかの化合物；α−トコフェロールなどの酸化防止剤；およびＰ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＶＬＡ−４またはＶＣＡＭ−１をブロックする化合物が含まれる。ステロイド類は、マクロファージ活性を阻害する化合物のクラスのもう１つの例である。ステロイド類の非限定例には、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロンが含まれる。各々の化合物の用量は製造者より入手することができるが、患者の体重および状態、および化合物の投与経路に依って異なるであろう。免疫抑制化合物のもう１つの例は、ノバルティスによって現在開発中であるＦＴＹ７２０である。ＦＴＹ７２０の用量は、第２相および第３相臨床試験より得られる情報に基づいて決定する。予備研究に基づく現在の用量は２ｍｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１７２】
抗遊走化合物には、平滑筋細胞の運動または遊走を減少させるかまたは妨げるいずれかの化合物が含まれる。具体的な非限定例には、セロトニン（５−ＨＴ２）受容体アンタゴニスト、エンドセリン−１受容体アンタゴニストおよびバソプレッシン受容体アンタゴニストが含まれる。エンドセリン−１（ＥＴ−１）は、内皮細胞および平滑筋細胞によって分泌される強力な血管収縮薬である。それは、血管平滑筋細胞上にあるＥＴAと、内皮細胞および血管平滑筋細胞上にあるＥＴBという２つの受容体を有する。エンドセリン−１は、単独でおよび他のサイトカインとの組合せで、血管平滑筋細胞の増殖および遊走を刺激する。それは、細胞外マトリックス合成も刺激する。ＥＴ−１およびアンギオテンシンＩＩの双方が、血管平滑筋細胞に相乗的に作用することができるということを示唆する若干の証拠がある。ＥＴ−１受容体アンタゴニストおよびＥＴ変換酵素阻害剤が新生内膜過形成の予防に有用であるという、動物研究に基づく証拠もある。これらデータは、エンドセリン−１受容体アンタゴニストが平滑筋細胞の遊走の防止に有用でありうるということを示唆している。
【０１７３】
セロトニンは、主に、血小板によって分泌され、そして５−ＨＴ1および５−ＨＴ2受容体によって血管に作用する。過去１０年間にわたって、若干の研究者は、セロトニンが血管平滑筋細胞の増殖および遊走に関与しているかもしれないということを示唆してきた。５−ＨＴ2受容体アンタゴニスト  ケタンセリンおよびアンプラーグは、ウサギの頸動脈バルーン血管形成術および静脈移植片内膜過形成モデルにおいて、新生内膜過形成の予防に有効であることが示し、それらが平滑筋細胞の増殖および遊走の防止に有用でありうるということが示唆された。
【０１７４】
抗遊走化合物の具体的な例には、シプロヘプタジン、ボセンタン、ケタンセリン、アンプラーグおよびＹＭ０８７が含まれる。各々の化合物の用量は製造者より入手することができるが、患者の体重および状態、および化合物の投与経路に依って異なるであろう。
【０１７５】
抗血小板薬には、いずれかのシクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えばアスピリン）、ＡＤＰ阻害剤（例えばチクロピジン）、ホスホジエステラーゼＩＩＩ阻害剤（例えばシロスタゾールおよびジピリダモール）または糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩＡ阻害剤（例えばアブシキシマブ）が含まれうる。各々の化合物の用量は製造者より入手することができるが、患者の体重および状態、および化合物の投与経路に依って異なるであろう。
【０１７６】
抗線維症薬には、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）または結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）のアンタゴニストが含まれる。抗線維症薬の用量は、ヒトまたは動物の体重および状態、および化合物の投与経路などの他の臨床的因子に依存するであろう。ヒトまたは動物を治療するには、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）の抗線維症薬を投与することができる。より好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、最も好ましい範囲は１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。特定の動物またはヒトにおける抗線維症薬の半減期に依って、抗線維症薬は１日数回〜週に１回投与することができる。本発明の方法は、同時にまたは長期間にわたって与えられる、単回投与並びに多数回投与を提供する。
【０１７７】
挙げられた各々の化合物について、具体的な化合物を、ＰＤＧＦＲ阻害剤だけで、または挙げられたいずれか他の追加の化合物と組み合わせて与えることができる。１つの例において、ＰＤＧＦＲ阻害剤は、ラパマイシンと組み合わせて投与することができ、そして所望ならば、プレドニゾンなどのステロイドを投与することもできる。
【０１７８】
それら化合物は、個々の化合物各々について最も有効であり且つ最も毒性が少ないと確認されたいずれかの手段によって、個々にまたは同時に投与する。例えば、各々の化合物は、経口で、局所に、全身に、または経口、全身および局所投与のいずれかの組合せで与えることができる。挙げられた各々の化合物について、移植またはＡＶフィステルの部位に局所投与を用いることもできる。局所投与が望まれる場合、本明細書中に記載の方法を用いてポリマーマトリックス中の最適薬物化合物組成を決定する。概して、化合物の組成パーセントは、ポリマーマトリックスに対する化合物の重量について０．０５重量％〜１０重量％であろう。
【０１７９】
放射線療法と組み合わせた治療的化合物
本発明は、更に、放射線療法と組み合わせた、ＰＤＧＦＲ生物活性を阻害することができる化合物の治療的有効量の使用を提供する。線量および治療期間を決定するための当該技術分野において公知の多数の方法があるということは理解されるであろう。放射線療法には、γ線またはＸ線を、細胞に、正常に機能するその能力を制限するかまたは細胞全体を破壊するように充分な損傷をもたらす充分な量で用いる。典型的な線量は１０〜２００単位（グレイ）／日である。
【０１８０】
各々の化合物を具体的な種類の化合物として挙げているが、これら種類は範囲を限定するためのものではないということに留意すべきである。それら化合物の多くは２種類以上の活性を有するので、２つ以上の種類として含まれることがありうる。例えば、セロトニン受容体アンタゴニストは抗増殖性および抗遊走性双方の活性を有することがありうる。
【０１８１】
効力を決定する方法
本発明の治療的化合物または組合せで治療される患者は、典型的に、医師にしたがって、治療の成功を追求する。治療不全の適応症には、症状再発の患者愁訴、標準的なストレステストの不全、および疾患指示薬の応答が含まれる。更に、定量的血管造影法を、しばしば、被治療血管の管腔直径を決定するのに用いる。治療前の管腔直径と比較して、治療後の管腔直径の２５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の増加は、治療的効力を示すものである。被治療血管の直径は、基準の遠位および近位セグメントと比較して治療的効力を決定することもできる。治療的効力を測定する更に別の方法には、磁気共鳴血管造影法および血管内超音波検査（ＩＶＵＳ）が含まれるが、それは、新生内膜過形成、管腔直径、プラーク面積および体積の定量を可能にする。患者を短期（最初の治療後６ヶ月まで）および長期（最初の治療後６ヶ月以上）双方で監視して、本発明の化合物を用いた治療の完全効力を決定する。
【０１８２】
化合物の用量および毒性は、下記の動物モデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。更に、平滑筋細胞の培養物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを用いて、各々の化合物の有効量、更には、化合物安定性を決定することができる。例えば、一定数の細胞を、培養基中で培養し、増殖因子またはアンギオテンシンＩＩなどの公知の分裂促進因子で刺激し、そして増加する濃度の各々の薬物化合物で治療することができる。各々の期日に培養物中の細胞数を計数し、増殖を測定することができる（Ｐｏｗｅｌｌら、上記を参照されたい）。正の結果は、分裂促進因子単独で治療された細胞と比較して、少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％以上の増殖速度の減少であると考える。
【０１８３】
動物研究
本発明で与えられた治療方法には、ＰＤＧＦＲ生物活性を阻害することができるＮ−フェニル−２−ピリミジン誘導体の治療的量を、新生内膜過形成または血管狭窄に苦しむ温血動物に、新生内膜過形成および血管狭窄を予防または改善させるのに充分な用量で投与することも含まれる。このような動物は、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン誘導体と、次の：（ｉ）血管新生阻害剤、（ｉｉ）抗増殖化合物、（ｉｉｉ）免疫抑制化合物、（ｉｖ）抗遊走化合物、（ｖ）抗血小板薬、および（ｖｉ）抗線維症化合物の内の１つとの組合せで治療することもできる。
【０１８４】
本明細書中で用いられる温血動物には、マウス、イヌ、ブタ、ヒヒおよびサルが含まれるが、これらに限定されるものではない。更に含まれるのは、用量および治療効力を研究するのに用いることができる、新生内膜過形成または血管狭窄のいずれかの動物モデルである（例えばＳｕｋｈａｔｍｅ  Ｖ．Ｐ．、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．４９：１１６１−１１７４、１９９６；Ｋｅｌｌｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ、１２：Ａ１４９６、２００１；Ｋｅｌｌｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、５７：１８、２０００を参照されたい）。上記の使用例は、静脈新生内膜過形成または静脈狭窄の治療の研究用動物モデルの代表的な使用を特徴とする。
【０１８５】
他の態様
前述の説明から、本明細書中に記載の発明に変更および修飾を行って、種々の使用法および状態にそれを採用することができるということは明らかである。このような態様も、請求の範囲の範囲内である。
【０１８６】
本明細書中に述べられた公報は全て、各々独立した公報または特許出願が具体的に且つ個々に援用されると示されている範囲で本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ヒトＡＶ移植におけるＰＤＧＦ−Ｂ鎖染色を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／２００に希釈したウサギ抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖ポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−７８７８）である。下の挿入図は負対照である。
【図２】図２は、ヒトＡＶ移植におけるＰＤＧＦ受容体β鎖を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／５０に希釈したウサギ抗ヒトＰＤＧＦ受容体β抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−３３９）である。下の挿入図は負対照である。
【図３】図３は、ヒトＡＶ移植におけるリン酸化ＰＤＧＦ受容体β鎖染色を示す顕微鏡写真である。１次抗体は、ＰＢＳで１／５０に希釈したウサギ抗ヒトｐ−ＰＤＧＦ受容体β鎖（Ｔｙｒ７５１）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈ．＃２９７１）である。下の挿入図は負対照である。
【図４】図４は、ヒトＡＶ移植におけるＰＤＧＦ受容体Ａ鎖染色を示す顕微鏡写真である。マイクロ波法を用いて抗原を検索した。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／２００に希釈したウサギ抗ヒトＰＤＧＦ受容体ａポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−３３８）である。下の挿入図は負対照である。
【図５】図５は、ヒトＡＶ移植におけるホスホ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（ｐ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼ）染色を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／１００に希釈したヤギ抗ヒトｐ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−３３８）である。下の挿入図は負対照である。
【図６】図６は、ブタＡＶ移植付近の静脈のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示し、新生内膜過形成に続発する（Ａ）静脈壁の僅かな肥厚および（Ｂ）顕著に肥厚した静脈壁；（Ｃ）更に高倍率の新生内膜病変を示している。
【図７】図７Ａは、静脈狭窄の血管造影中に得られた静脈狭窄の血管造影図を示す。カテーテルを移植片に挿入し、静脈−移植片接合部へと進めた。この接合部における静脈狭窄領域を、その狭窄の両側（近位および遠位静脈）の狭窄後拡張の領域とともに示す。ＡＶ移植片から静脈への血流は、近位（心臓方向）および遠位に進む（データは示していない）。図７Ｂ〜７Ｄは、移植片採取時のＡＶ移植片の静脈側ＩＶＵＳ画像を示す。図７Ｂは、狭窄後静脈拡張の証拠を示し；図７Ｃは、１時の位置にある、移植片・静脈接合部での管腔狭まりの証拠を示し；そして図７Ｄは、下の左隅に示されるような８０．１％の狭窄を引き起こす、移植片・静脈接合部に僅かに遠位の最大管腔狭まり（直径３．１ｍｍ）の証拠を示す。図７Ｅは、（自動プルバックで）２Ｄ画像をスタッキングすることによって行われた動脈のＩＶＵＳ画像の３Ｄ再構成の１例を示す。これは、（標準的な直径および面積の測定に加えて）内膜体積の定量を可能にする。
【図８】図８は、ブタＡＶ移植病変におけるＰＤＧＦ−Ｂ鎖の免疫組織化学を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／２００に希釈したウサギ抗ヒトＰＤＧＦ−Ｂ鎖ポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−７８７８）である。
【図９】図９は、ＰＤＧＦ受容体Ｂ鎖の免疫組織化学を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／１００に希釈したウサギ抗ヒトＰＤＧＦ受容体Ｂポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−３３９）である。
【図１０】図１０は、ｐ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼの免疫組織化学を示す顕微鏡写真である。用いた１次抗体は、ＰＢＳで１／５０に希釈したヤギ抗ヒトｐ−ｐ７０  Ｓ６キナーゼポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、ｓｃ−３３８）である。図８および図１０の上の挿入図は負対照である。図９の上の挿入図は、１次抗体を用いた更に高倍率の写真であり；下の挿入図は負対照である。
【図１１】図１１は、胎盤のＭＲＢのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す。図１１Ａは、アンチセンスプローブでの結果を示し、図１１Ｂは、センスプローブでの結果を示す。
【図１２】図１２は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢ（２０ｎｇ／ｍｌ）で誘発されるＨＡＳＯＭ細胞遊走の、グリベック（Ｇ）単独、ラパマイシン（Ｒ）単独および組合せ（Ｇの薬物濃度はｎｇ／ｍｌであり、Ｒはｐｇ／ｍｌである）での用量反応阻害を示すグラフである。第１レーンはＰＤＧＦ不含であり；他は全てＰＤＧＦ含有である。最初の２レーンには薬物を加えていない。それら結果は、３重反復試験読みの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表されている。
【図１３】図１３は、ＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）で誘発されるブタ細胞遊走の、グリベックＧ（薬物濃度はｎｇ／ｍｌである）による用量反応阻害を示すグラフである。最後のレーンは、最高のグリベックデータ（レーン６）における濃度のＤＭＳＯを含有する。それら結果（遊走細胞数）は、ｙ軸上に３重反復試験読みの平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表されている。
【図１４】図１４は、概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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