(57)【要約】本発明は、炎症誘発性サイトカインによる小膠細胞の刺激が疾患病理の大きな要因であると合理的に予想される神経学的疾患の進行を遅らせるための連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の使用を含む。これに当てはまる疾患として、筋萎縮性側索硬化症(AlS)および同様の臨床症状を示す他の運動ニューロン疾患(MND)；パーキンソン病(PD)；アルツハイマー病(AD)；脊髄延髄萎縮(SBA)；ハンチントン舞踏病(HD)；重症筋無力症(MG)；多発性硬化症(MS)；HIV関連痴呆；前頭側頭骨痴呆(FTD)；脳卒中；脳脊髄炎；外傷性脳損傷；加齢性網膜変性；ならびに一因となる病理学的特徴が小膠細胞活性化である他の神経学的疾患が挙げられる。連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がレスベラトロール；ピセアタンノール；ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)、クルクミン、またはセサミンである特定の例が示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、対象における炎症性疾患を阻害する方法。
【請求項２】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が、以下の一般式
2005533042.tif 000022
（式中、R1は、長さが少なくとも2個、および10個未満の炭素単位のアルキル鎖であり、
R2-R5は、-H原子または1個もしくはそれ以上の炭素原子を含むアルキル鎖である）
を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
R1が、C=C結合；アルキン；アミドエステル、エーテル、もしくはスルフィド結合；介在環構造；ケトン部分；またはハロゲン化側鎖から選択される構造モチーフを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
R2-R5のアルキル鎖が、ハロゲン、カルボニル基、ボロナートエステル、および閉環構造より選択される基をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
OR4およびOR5の少なくとも1つならびにOR2およびOR3の少なくとも1つがヒドロキシル基またはアルコキシル基である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
連結R1が分枝鎖炭化水素である、請求項2記載の方法。
【請求項７】
OR2-OR5の少なくとも3つががヒドロキシル基またはアルコキシル基である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
疾患が神経学的疾患、癌、または過形成である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
神経学的疾患が、細胞の炎症誘発性サイトカイン刺激を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がピセアタンノールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がレスベラトロールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がクルクミンまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が還元クルクミンまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
還元クルクミンが、ジヒドロクルクミンもしくはテトラヒドロクルクミン、またはそのO-アルキル誘導体、またはそのプロドラッグである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がロオペロールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がローズマリー酸またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が、2つのフェノール環構造を含むチルホスチンまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がブテインまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がセサミンまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物がゴマ組成物またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ゴマ組成物がゴマ油もしくはゴマ種子抽出物、またはそのO-アルキル誘導体、またはそのプロドラッグである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
神経学的疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)(家族性または散発性)である、請求項8記載の方法。
【請求項２４】
神経学的疾患が、ALSと同様の臨床症状を示す運動ニューロン疾患(MND)である、請求項8記載の方法。
【請求項２５】
神経学的疾患がアルツハイマー病(AD)である、請求項8記載の方法。
【請求項２６】
神経学的疾患がパーキンソン病(PD)である、請求項8記載の方法。
【請求項２７】
神経学的疾患が多発性硬化症(MS)である、請求項8記載の方法。
【請求項２８】
神経学的疾患が重症筋無力症(MG)である、請求項8記載の方法。
【請求項２９】
神経学的疾患がハンチントン舞踏病(HD)である、請求項8記載の方法。
【請求項３０】
神経学的疾患が脊髄延髄萎縮(SBA)である、請求項8記載の方法。
【請求項３１】
神経学的疾患が前頭側頭骨痴呆(FTD)である、請求項8記載の方法。
【請求項３２】
神経学的疾患が脳卒中(脳の虚血再灌流障害)である、請求項8記載の方法。
【請求項３３】
神経学的疾患が脳脊髄炎または髄膜炎である、請求項8記載の方法。
【請求項３４】
神経学的疾患が外傷性脳損傷である、請求項8記載の方法。
【請求項３５】
神経学的疾患が網膜変性である、請求項8記載の方法。
【請求項３６】
神経学的疾患がHIV関連痴呆である、請求項8記載の方法。
【請求項３７】
細胞が小膠細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項３８】
細胞がニューロンである、請求項9記載の方法。
【請求項３９】
細胞がマクロファージ型細胞、クッパー細胞、ミュラー細胞、または他の骨髄性細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項４０】
マクロファージ様細胞に対する炎症誘発性サイトカインの作用を阻害するのに有効な量のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、対象における炎症性疾患または癌または過形成を治療する方法。
【請求項４１】
炎症性疾患が、眼、呼吸器系、筋骨格系、リンパ系、細網内皮系、肝臓系、前立腺(prostrate)、乳房、結腸、生殖管、尿路、または消化管の癌または過形成である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
炎症性疾患が慢性炎症性疾患またはリウマチ性疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
炎症性疾患またはリウマチ性疾患が、関節炎、眼の炎症性疾患もしくはリウマチ性疾患、または呼吸器系もしくは筋骨格系もしくは消化管の疾患である、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
小膠細胞活性化を阻害するのに有効な量のビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体を対象に投与する段階を含む、神経学的疾患、癌、または過形成を有する対象を治療する方法。
【請求項４５】
投与が、経口投与、皮下投与、くも膜下腔内投与、吸入による投与、注射による投与、微粒子銃による投与、静脈内投与、または局所投与である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤およびビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤の効力を高めるための方法。
【請求項４７】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤がリルゾールである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤がミノサイクリンである、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が1分を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が10分を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５１】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が30分を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５２】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が60分を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５３】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が120分を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５４】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が4時間を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５５】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が8時間を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５６】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が12時間を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５７】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体が24時間を超える期間にわたって徐々に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５８】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が複数回提供される、請求項46記載の方法。
【請求項５９】
非ビス(ポリヒドロキシフェニル)が複数回提供される、請求項46記載の方法。
【請求項６０】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が非ビス(ポリヒドロキシフェニル)の前に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項６１】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が非ビス(ポリヒドロキシフェニル)と同時に提供される、請求項46記載の方法。
【請求項６２】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が非ビス(ポリヒドロキシフェニル)の後に提供される、請求項46記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、2002年6月10日に出願された同時係属中の米国特許仮出願第60/387,374号に関して優先権を主張する。前記開示の全文が、特許権の一部放棄なく、参照として本明細書に詳細に組み入れられる。米国政府は、国立加齢研究所からの助成金番号R03-AG20783に基づいて本発明において権利を有する。
【０００２】
1.発明の分野
本発明は、一般的に、薬理学および免疫薬物療法の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、神経学的疾患(一因となる病理学的特徴が小膠細胞活性化である神経学的疾患を含むが、これに限定されない)を治療する方法に関する。本発明はまた、他の疾患(例えば、マクロファージ様細胞に炎症誘発性サイトカイン成分が作用する炎症性疾患および良性過形成または悪性過形成)を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
2.関連技術の説明
大部分のまたは全ての神経学的疾患には共通の病理学的特徴、すなわち、小膠細胞(中枢神経系(CNS)にある特殊化した骨髄性(マクロファージ様)細胞)の活性化がある。例えば、HLA-DR反応性小膠細胞は、アルツハイマー病(AD)の組織病理学的特徴を最も顕著に示すアルツハイマー病脳領域において増殖する(Wisniewskiら、1990；Hensleyら、1995)。同様の小膠細胞増殖が、ALS(筋萎縮性側索硬化症)患者の脊髄(Hallら、1998；Alexianuら、2001)；パーキンソン病患者の脳(Vilaら、2001)；HIV患者の脳(Kaulら、2001)；および外傷後または虚血後の脳組織(Floydら、2000)において観察されている。従って、小膠細胞反応性は、全てではないがほとんどの神経変性状態に共通して見られる。小膠細胞の機能の中には、例えば、アポトーシス細胞の除去および障害の解決に有益なものもある。他方で、悪化した小膠細胞活性化または慢性の小膠細胞活性化は、反応性酸素種および反応性窒素種(ROSおよびRNS)の過剰産生ならびに炎症性サイトカインカスケードの伝達を伴う直接的および間接的な作用によってニューロンを傷つけることがある。小膠細胞は活性化されると、反応性酸素種(ROS、酸素が中心のフリーラジカルを含むが、これに限定されない)；反応性窒素種(RNS、酸化窒素および誘導された窒素酸化物を含むが、これに限定されない)；ならびに炎症誘発性サイトカイン(インターロイキン1(IL1αおよびIL1β)、インターフェロンγ(IFNγ)、ならびに腫瘍壊死因子α(TNFα)を含むが、これらに限定されない)などの潜在的な神経毒を合成する(Coltonら、1994；Medaら、1995)。ほとんどの場合、小膠細胞がなぜ活性化されるのかは正確に分かっておらず、小膠細胞が無害で静止した表現型から活発で潜在的に神経毒性の表現型に変わるのを抑制する明確な手段を提供する戦略はごくわずかしか提供および試験されていない。このような手段の開発には、複数の刺激(炎症誘発性サイトカイン(特に、IL1βおよびTNFα)ならびに免疫グロブリン(特に、IgGおよび自己抗原複合体)への暴露を含む)により引き起こされる小膠細胞活性化を阻害することができる低分子の発見または発明および確認が必要であろう。このような分子は、生物活性に十分な濃度の活性化合物がCNSに蓄積できる程度まで血液脳関門を透過できなければならず、ニューロンおよび末梢組織に対して本質的に無毒でなければならない。
【０００４】
現在、アルツハイマー病(AD)、ハンチントン舞踏病(HD)、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む神経炎症性疾患の治療選択肢はほとんどない。現在の、ごくわずかな既存の治療法では、疾患の根本原因ではなく症状を治療するだけである。ADに限定して開発された現在処方されている数種類の薬物は、コリンエステラーゼ阻害剤または細胞骨格作用剤のいずれかである(Knopman、2001)。PDの唯一の標準治療はドーパミン補充/増強である(Damnis、2002)。現在認可されている唯一のALS薬リルゾールは、NMDA受容体に拮抗する抗興奮毒薬(anti-excitotoxicant)である(Miller、2001)。現在認可されているHD治療薬は無いが、時として神経弛緩剤が症状に用いられる(McMurray、2001)。従って、炎症性疾患および癌または過形成を含む神経学的疾患の治療のために新規のかつ自明でない小膠細胞抑制剤が必要とされる。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、神経学的疾患ならびに他の疾患(例えば、小膠細胞またはマクロファージ様細胞に対して炎症誘発性サイトカイン成分が作用する炎症性疾患および癌または過形成)を治療するためのビス(ポリドロキシフェニル)化合物(ジカテコール(dicathechol)としても知られる)およびそのO-アルキル誘導体を提供する。特に、本発明は、炎症誘発性サイトカインの生化学的作用を抑制する特異的な能力に関して、ただ結合(linked)しているだけの他のビス(ポリヒドロキシフェニル)より優れた連結(tethered)ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物を提供する。
【０００６】
従って、本発明では、有効量の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、対象における炎症性疾患を阻害する方法が提供される。本発明の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は以下の一般式を有する。
2005533042.tif 000002
【０００７】
特定の態様では、R1は、長さが少なくとも2個、および10個未満の炭素単位のアルキル鎖であり、R2-R5は、-H原子または1個もしくはそれ以上の炭素原子を含むアルキル鎖である。R1は、C=C結合；アルキン；アミドエステル、エーテル、もしくはスルフィド結合；介在環構造；ケトン部分；またはハロゲン化側鎖より選択される構造モチーフを含んでもよい。別の特定の態様では、R2-R5は、ハロゲン、カルボニル基、ボロナートエステル、および閉環構造より選択される基をさらに含んでもよい。さらに別の特定の態様では、OR4およびOR5の少なくとも1つならびにOR2およびOR3の少なくとも1つはヒドロキシル基またはアルコキシル基である。さらなる態様では、連結R1は分枝鎖炭化水素であり、OR2-OR5の少なくとも3つはヒドロキシル基またはアルコキシル基である。
【０００８】
本発明の特定の態様において、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；ピセアタンノールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；レスベラトロールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；ロオペロールまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；ローズマリー酸またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；2つのフェノール環構造を含むチルホスチンもしくはまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；ブテインまたはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；あるいはクルクミンまたは還元クルクミン(例えば、ジヒドロクルクミンもしくはテトラヒドロクルクミン)またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグ；あるいはセサミンまたはゴマ組成物(例えば、ゴマ油もしくはゴマ種子抽出物)またはそのO-アルキル誘導体またはそのプロドラッグである。
【０００９】
なおさらに別の態様において、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはそのO-アルキル誘導体は、神経学的疾患(例えば、炎症誘発性サイトカインによる小膠細胞、ニューロン、マクロファージ型細胞、クッパー細胞、ミュラー細胞、または他の骨髄性細胞の刺激を伴う神経学的疾患)を治療するのに用いられる。本発明のさらなる態様において、神経学的疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)(家族性または散発性)；ALSと同様の臨床症状を示す運動ニューロン疾患(MND)；アルツハイマー病(AD)；パーキンソン病(PD)；多発性硬化症(MS)；重症筋無力症(MG)；ハンチントン舞踏病(HD)；脊髄延髄萎縮(SBA)；前頭側頭骨痴呆(FTD)；脳卒中(脳の虚血再灌流障害)；外傷性脳損傷、脳脊髄炎、もしくは髄膜炎；HIV関連痴呆もしくはHIV関連炎症性疾患；または加齢性網膜変性である。
【００１０】
本発明はまた、マクロファージ様細胞に対する炎症誘発性サイトカインの作用を阻害するのに有効な量のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、対象における炎症性疾患または過形成を治療する方法を含む。本発明の他の態様において、炎症性疾患は、眼、呼吸器系、筋骨格系、リンパ系、細網内皮系、肝臓系、前立腺(prostrate)、乳房、結腸、生殖管、尿路、または消化管の癌または過形成である。別の態様において、炎症性疾患は、慢性炎症性疾患またはリウマチ性疾患(例えば、関節炎、眼の炎症性疾患もしくはリウマチ性疾患、または呼吸器系もしくは筋骨格系もしくは消化管の疾患)である。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、小膠細活性化を阻害するのに有効な量のビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体を対象に投与する段階を含む、神経学的疾患または過形成を有する対象を治療する方法を提供する。
【００１２】
本発明の化合物の投与は、経口投与、皮下投与、くも膜下腔内投与、吸入による投与、注射による投与、微粒子銃による投与、静脈内投与、または局所投与でもよい。
【００１３】
さらに、本発明は、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤(例えば、リルゾールまたはミノサイクリン)およびビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体を対象に提供する段階を含む、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)神経薬剤の効力を高めるための方法を含む。さらなる態様において、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体は1分を超える期間にわたって；10分を超える期間にわたって；30分を超える期間にわたって；60分を超える期間にわたって；120分を超える期間にわたって；4時間を超える期間にわたって；8時間を超える期間にわたって；12時間を超える期間にわたって； 24時間を超える期間にわたって徐々に提供される。なおさらなる態様において、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはビス(ポリヒドロキシフェニル)もしくはそのO-アルキル誘導体は複数回提供される。なおさらに別の態様において、ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体は、非ビス(ポリヒドロキシフェニル)の前に、または非ビス(ポリヒドロキシフェニル)と同時に、または非ビス(ポリヒドロキシフェニル)の後に提供される。他の態様において、ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体は非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)と共に提供されてもよい。
【００１４】
添付の図面は本明細書の一部をなし、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、これらの図面の1つまたはそれ以上と、本明細書に記載の特定の態様の詳細な説明とを参照することによってさらに理解することができる。
【００１５】
例示的な態様の説明
限られた数の研究によって、ある特定の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)が神経保護剤として関係付けられているが、小膠細胞に由来する神経炎症の重要性が考慮に入れられたことはない。現在、小膠細胞を阻害する作用を持つと機能を仮定してインビボで十分に試験されている唯一の化合物がミノサイクリンである。ミノサイクリンはテトラサイクリン誘導体であり、結合ビス(ポリヒドロキシ)フェニルまたは連結ビス(ポリヒドロキシ)フェニルとは構造的に関連しない(Yrjanheikkiら、1999；Tikkaら、2001；Chuら、2002；Chenら、2000；Walkerら、1995)。
【００１６】
連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)の個々もしくはグループとしての、サイトカイン受容体型チロシンキナーゼ(C-RTK)の直接阻害に関する作用または機能的に異なる優れた小膠細胞抑制剤クラスとしての作用は以前に考察されたことがない。本発明者らは、小膠細胞の阻害効力があると最もよく予想されるポリフェノールの構造的特徴の特定を目的とした詳細な研究を行った。その結果として、優れた小膠細胞阻害剤である有機分子の、これまで認められていなかった構造分類が特定された。
【００１７】
I.本発明
本発明は、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物(ジカテコールとも呼ばれる)と、ただ結合しているだけの(連結されていない)ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物との意味のある区別を提供する。本発明は、いままで関連性がないと考えられていた化合物間の機能的関連性をさらに提供する。例えば、クルクミン、NDGA、チルホスチンAG-575、およびピセアタンノールの間の機能的関連性は、これらの化合物が機能的に別の化学グループを占めると考えられていたので仮定されたことがなかった。重要なことに、本発明は、「連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)」のクラスから、結合しているが連結していない分子を排除する。結合しているが連結していない分子として、スチルベン誘導体レスベラトロールおよびピセアタンノールに似たものであると以前では考えられていたフラボノイドおよびイソフラボノイドが挙げられる(Chiら、2001)。特に、本発明は、炎症誘発性サイトカイン(最も有名なものはTNFα)の生化学作用を抑制する特異的な能力に関して、ただ結合しているだけの他のビス(ポリヒドロキシフェニル)より優れた連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)を提供する。さらに、本発明は、このような主張を正当化する証拠を提供する。本発明は、神経学的疾患における小膠細胞活性化を阻害するのに必要な最適な構造的特徴を詳細に考察し、これに関して、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が、ただ結合しているだけの化合物より優れていることを示す。連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、基準である小膠細胞不活化剤ミノサイクリンより概して優れているという証拠も提供される。これは意味があるが自明でない比較であり、比較の結果は、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)のクラスに固有の新規の有用性を直接意味する。
【００１８】
さらに、本発明は、神経学的疾患を治療する方法に関する。神経学的疾患として、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および類似の臨床症状を示す他の運動ニューロン疾患(MND)；パーキンソン病(PD)；アルツハイマー病(AD)；脊髄延髄萎縮；(SBA)；ハンチントン舞踏病(HD)；重症筋無力症(MG)；多発性硬化症(MS)；HIV関連痴呆；前頭側頭骨痴呆(FTD)；脳卒中；外傷性脳損傷；加齢性網膜変性；脳脊髄炎；ならびに一因となる病理学的特徴が小膠細胞活性化である他の神経学的疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、マクロファージ様細胞に炎症誘発性サイトカイン成分が作用する炎症性疾患および癌または過形成などの他の疾患を治療する方法を提供する。
【００１９】
II.ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物
植物天然産物のいくつかのファミリーは、結合基により結合された2個の芳香族環(両方とも天然ではフェノール環)からなる。これまで、この広範な有機化合物分類は、化学骨格の関連成分を説明するためにビス(ポリヒドロキシフェニル)またはジカテコールと呼ばれている。ビス(ポリヒドロキシフェニル)の例として、フラボン、フラバノン、イソフラボン、およびカルコン；2個のフェノール環構造を含む特定のチルホスチン；ヒドロキシル化スチルベン誘導体(例えば、レスベラトロールおよびピセアタンノール)；ならびに種々雑多な天然産物(ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)を含む)が挙げられる。2つのポリヒドロキシフェニル基が可撓性の炭素鎖(一般的に、他の構造モチーフ(例えば、C=C結合、アミド結合、スルフィド結合、エステル結合、もしくはエーテル結合、またはケトン部分。これらの全てがちょうど1回でそれぞれの環を結合する)を含む、または含まない、2つ以上の原子中心からなるアルキル鎖)によって結合された時、この構造は、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)またはジカテコールと間違いなく呼ぶことができる。従って、ピセアタンノール、レスベラトロール、およびNDGAは連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)であり、クルクミンは、このクラスのO-アルキル誘導体である。対照的に、環構造を拘束することによって結合されたフラボノイドなどは連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)でない。
【００２０】
（表１）ビス(ポリヒドロキシ)フェニル
2005533042.tif 000003
2005533042.tif 000004
【００２１】
研究者らは、結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)と連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)の区別を完全につけないことが多かった。例えば、Choら(2000)は、マクロファージモデルにおいてピナス-マリチマ(Pinus maritima)樹皮からの抽出物を研究した。これは、ピセアタンノールならびに結合しているが連結していない他のフラボノイドの供給源である。Choら(2000)は、連結化合物と、ただ結合しているだけで連結していない化合物との区別をつけることなく、「ビオフラボノイド」クラスとして、これらの全ての化合物を暗黙的に分類した。結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)と連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)を区別しないことで、以前の研究者らは、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)が天然産物の機能的サブグループである抗炎症剤として優れていることを評価しななかった。
【００２２】
III.ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の機能的局面
本発明者らにより「連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)」と定義されたビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物クラスの個々のメンバーは、様々な生物活性(通常、抗増殖(抗発癌)作用を含むが、時として末梢炎症状態を含む)について調べられている。連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)クラスの個々のメンバーが神経保護作用について調べられることはめったになかった。結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)を用いたShishidoら(2001)による研究を除けば、重要な病理学的成分として小膠細胞に由来する事象が関与することを予想できるモデルにおいて、これらの化合物をインビボで評価した公表された研究は実質的に無い。今まで、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)を定義する構造的特徴は、この化合物分類を小膠細胞活性化(またはマクロファージ活性化)の独特に強力な阻害剤として特定するように列挙および制約されたことがなかった。
【００２３】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物クラスの特定のメンバーは抗発癌活性を有すると記録に残されており(抗発癌活性は細胞増殖を遅らせる能力により証明された) (Birtら、2001；Miquelら、2002；Thakkarら、1993；Wolterら、2002；Wiederら、2001；Blumら、2000)、報告によると少数が弱い抗炎症作用を有する(Blumら、2000；Gazitetら、1989；Parkら、2000；Chiら、2001；Choら、2000；Kageuraら、2001)。主に、以前の関心は連結メンバーではなく結合メンバー(特に、フラボノイド)に集まり、これらの研究では主として抗発癌作用に的が絞られていた(Birtら、2001)。ほとんどの場合、この生物活性の機構は未知である。特定のビス(ポリヒドロキシフェニル)(例えば、特定のチルホスチン、レスベラトロール、およびピセアタンノール)は、無秩序な細胞増殖に関連する増殖因子受容体型チロシンキナーゼ(GF-RTK)を阻害すると考えられている(Thakkarら、1993；Wolterら、2002；Wiederら、2001；Blumら、2000；Gazitら、1989)。
【００２４】
炎症性疾患に対するビス(ポリヒドロキシフェニル)の作用に的を絞った研究は非常に少なく、小膠細胞の生物学的特性それ自体に的を絞った研究は実質的に無い。ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が末梢炎症モデルにおいて研究された時、連結サブクラスではなく結合サブクラスに関心が向けられていた。連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が神経疾患の小膠細胞由来炎症反応を阻害する能力について考察した研究はほとんどない。レスベラトロールおよびNDGAはマクロファージ細胞のペルオキシダーゼ酵素(特に、シクロオキシゲナーゼ(COX)およびリポキシゲナーゼ(LOX))を阻害する能力に関して研究されたことがあるが、現在、炎症誘発性サイトカインがサイトカイン受容体型チロシンキナーゼ(C-RTK)に結合することによって始まる小膠細胞シグナル伝達経路に拮抗するという記録はない。
【００２５】
1.レスベラトロール
トランス-レスベラトロールは、インビボで、神経毒カイニン酸投与後の興奮毒性脳損傷からげっ歯類を保護することにおいて役割を果たすことが分かっている(Virgiliら、2000)。しかしながら、インビトロでは同様の処置によってニューロンは保護されなかった。同様に、Guptaら(2002)は、ラットにおいてカイニン酸誘導性発作および酸化ストレスに対するレスベラトロールの保護作用を証明した。これらの作用は、主として、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)の抗酸化作用によるものであり、抗神経炎症作用によるものではなかった。レスベラトロールが、限局的な皮質虚血に供されたロングエバンス(Long-Evans)ラットの梗塞の大きさを小さくする能力もHuangら(2001)により証明された。これらの結果は「抗血小板凝集活性、血管拡張作用、抗酸化特性、または全ての機構」によるものであった(Huangら、2001)。レスベラトロールがマクロファージ細胞のペルオキシダーゼ酵素(特に、シクロオキシゲナーゼ(COX)およびリポキシゲナーゼ(LPOX)を阻害する能力も証明されている。さらに、ダイオウに由来する一部のスチルベン誘導体がマクロファージにおけるリポ多糖誘導性の酸化窒素産生を阻害する能力が証明されている(Kageuraら、2001)。
【００２６】
2.クルクミン
クルクミンまたはクルクミンを含む薬草抽出物は、炎症またはアレルゲンの阻害剤(米国特許第6,235,287号；米国特許第6,264,995号)およびNFκB活性化の阻害剤(米国特許第5,891,924号)として提案されている。クルクミン酸化防止剤は心血管疾患および末梢炎症(すなわち、乾癬、肝臓障害；Miquelら、2002)に有益であることが証明されている。ラットにおけるエタノール誘導性脳損傷に対するクルクミンの作用もまた脂質過酸化を逆転させることで有効であることが分かっている(Rajakrishnanら、1999)。これらの有益な作用は「酸化防止作用および低脂質作用」によるものであり、抗神経炎症作用ははっきりと考慮に入れられておらず、生物活性に必要な構造条件は定義されなかった。クルクミンがアルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおける斑関連異常を小さくする能力もまた、Limら(2001)により証明されている。この研究から、クルクミンはタンパク質酸化およびインターロイキン1βを低下させ、ニューロン層内の小膠細胞増殖を抑制するが、老人斑付近の小膠細胞増殖を抑制しないことが分かった。同様に、アミロイドペプチドの脳室内注入により引き起こされる加齢性損傷の低下にクルクミンが作用することも証明されている(Frautschyら、2001)。従って、これらの研究では、クルクミンにより阻害される神経炎症特性が他の推定作用機構と共に考慮に入れられていた。しかしながら、2つの研究とも1種類の化合物にだけ的を絞っており、従って、分子の活性を定義し、かつ連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物クラスを定義する、クルクミンの重要な構造的特徴を定義しなかった。
【００２７】
3.ノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)
NDGAは、脳卒中動物モデルにおける神経保護剤または虚血後脳損傷阻害剤として研究されており、保護剤であることが分かっている(Shishidoら、2001)。この研究におけるNDGAの推定作用機構はリポキシゲナーゼ活性作用および酸化防止作用の組み合わせであった。しかしながら、小膠細胞抑制作用は、明白には考慮に入れられていなかった(Kageuraら、2001)。NDGAがマクロファージ細胞のペルオキシダーゼ酵素(特に、シクロオキシゲナーゼ(COX)およびリポキシゲナーゼ(LPOX))を阻害する能力も証明されている。
【００２８】
ノルジヒドログアイアレチン酸誘導体はまた、インサイチュー適用を用いたHPV誘導性癌の治療にも提案されている(Huangら、2001)。リポキシゲナーゼ阻害剤は、一般的に、神経学的疾患において有用な可能性のある抗炎症剤または抗アレルギー剤として使用することが提案されている (米国特許第4,708,964号；米国特許第4,857,558号；米国特許第5,047,593号；米国特許第5,068,251号；米国特許第5,208,262号)。一部のビス(ポリヒドロキシフェニル)誘導体はリポキシゲナーゼ阻害作用を同時に有する。しかしながら、リポキシゲナーゼ阻害活性は、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の活性を最大限にするのに十分でないことが本発明により言及される。
【００２９】
4.ロオペロールおよびブテイン
ロオペロールは特定の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)であり、誘導体が、腸、結腸、気道、皮膚、および眼の特定の炎症性疾患の治療に用いられる(米国特許第5,569,649号)。
【００３０】
ブテインは別の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)であり、ある特定のタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤であることが分かっている。ブテインは、一部の細胞において、上皮細胞成長因子(EGF)で刺激されたEGF受容体自己ホスホチロシン濃度を阻害することも証明されている(Yangら、1998)。この化合物は癌細胞の増殖を著しく抑制し、癌細胞の細胞死を誘導することも示されている。
【００３１】
5.セサミン
セサミンはゴマ油に含まれる主要なリグナンであり、その生物学的作用は十分に記録に残されている。セサミンは、微生物および動物におけるΔ5不飽和化酵素(ジホモ-γ-リノレン酸からアラキドン酸への変換を触媒する)の特異的な阻害剤であることが分かっており(Shimizuら、1991)、コレステロールの吸収および合成を阻害することによって低コレステロール血活性を発揮する(Hiroseら、1991)。セサミンは、アルコールまたは四塩化炭素により引き起こされる肝臓損傷を防ぎ(Akimotoら、1993)、7,12-ジメチルベンズ[α]アントラセンにより誘導されるラット乳房発癌に対する抑制作用(Hiroseら、1992)および降圧作用(Matsumuraら、1995；Kitaら、1995；Matsumuraら、1998；Nakanoら、2002)を示すことも報告されているが、このリグナンの作用機構は依然として分かっていない。
【００３２】
ゴマ油に含まれるヒドロキシ基を有するリグナン、すなわち、セサミノール、エピセサミノール、およびセサモリノールは酸化防止活性を示す(Osawaら、1985；Fukudaら、1985)。しかしながら、セサミンは酸化防止剤としてはっきりと評価されていない。ラットへの経口投与後の肝臓におけるセサミンのジカテコール代謝産物は、観察された酸化防止特性を担っていることが示された(Nakaiら(2003))。これらのセサミンの抗酸化代謝産物は単離され、構造的に特定されているが(表1を参照のこと)、その抗炎症作用は評価されていない。
【００３３】
6.他のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物
結合メンバー(特に、フラボノイド)および連結メンバーのクルクミンを含む多数のビス(ポリヒドロキシフェニル)が評価されている(Solimanら、1998)。これらの化合物は、リポ多糖＋インターフェロンγに暴露されたC6星状膠細胞培養物における酸化窒素産生を阻害する能力に関して試験された。しかしながら、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が他の天然化合物クラスより優れていることは認められなかった。クエルセチン、モリン、および没食子酸エピカテキンは結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)であり連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)ではないが、LPSにより刺激されたC6星状膠細胞モデル系においてクルクミンより優れていることが見出された(Solimanら、1998)。例えば、クエルセチンのIC50値は62nM、モリンのIC50値は56μM、没食子酸エピカテキンのIC50値は10μMであったが、クルクミンのIC50値は72μMであった((Solimanら、1998)；本発明におけるTNFαにより刺激された小膠細胞活性化に対するクエルセチン対クルクミンの相対的な作用と比較のこと；表2)。従って、Solimanら(1998)の発見は本発明の有用性と反対のことを開示している。この研究において連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)の有益性を認めることができなかったのは刺激の種類に起因した可能性が高い。すなわち、LPSは、髄膜炎などの特別な場合を除けば中枢神経系における生理学的に関連する刺激ではなく、その結果、C-RTKを阻害する化合物は、LPSによって始まるシグナル伝達経路を阻害しない可能性が高い。同様に、星状膠細胞(特に、非初代星状膠細胞株)は発癌性で、シグナル処理経路が変化している可能性があり、神経炎症事象の状況で考慮すべき最も関連性のある細胞タイプではない。この研究では、「食物由来ポリフェノール化合物」という標題で、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物と、ただ結合しているだけで連結していない化合物が暗黙的に分類された。
【００３４】
IV.ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の抽出および精製
本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはジカテコールは、植物産物、香辛料、油、および薬草抽出物などの天然産物から単離することができる。例えば、NDGAはラレア-ディバリカタ(larrea divaricata)および関連する植物種から単離することができ、セサミンはゴマから単離することができる。一般的に、「単離された」は、他の様々な成分を除去するために分画にかけられており、組成物が、発現される生物学的活性を実質的に保持している有機分子または類似する分子のグループを意味する。本発明の「実質的に精製された」化合物は、組成物の主成分がビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物である(例えば、組成物に含まれる分子の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれ以上がビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物である)組成物を意味する。
【００３５】
抽出法および精製法は当業者に周知である。天然産物から本発明の化合物を抽出および分離した後に、部分的もしくは完全に精製するために(または均一になるまで精製するために)、本明細書に記載の精製法(例えば、クロマトグラフィー法)を使用することができる。
【００３６】
非常に多くのバリエーションが可能であるが、粗化合物を得るための現在の一般的な手順には、一般的に、メタノール、エタノール、水、またはアルコール水溶液を用いた抽出；抽出段階前に行われる、または抽出物それ自体に対して行われる、脱脂段階(一般的に石油エーテルを用いる)；抽出物の水への溶解または懸濁；水飽和n-ブタノールを用いた溶液または懸濁液の振盪または洗浄；およびジエチルエーテルまたはアセトンを用いた沈殿；が含まれる。さらに、小さな水溶性分子を除去するために、透析などの他の技法も含めることができる(Zhouら、1981；Massiotら、1988)。
【００３７】
当業者に周知であり、ビス(ポリヒドロキシルフェニル)化合物の分離に使用することができる様々な分離法が述べられている。このような分離法として、フラッシュクロマトグラフィー、低速液体クロマトグラフィー(low-pressure liquid chromatography：LPLC)、中速液体クロマトグラフィー(medium-pressure liquid chromatography：MPLC)、HPLC、および従来のオープンカラムクロマトグラフィー(Hostettmannら、1986；Marstonら、1991)が挙げられる。分離条件、溶媒系などは本発明の開示を考慮すれば当業者に周知であろう。通常、最良の結果は、方法の組み合わせを用いた戦略によって得られる。
【００３８】
同様に化合物の分離に使用することができる他の方法として、透析、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。蒸留または超臨界抽出法も使用することができる。場合によっては、本発明の化合物は、当業者に周知の有機溶媒または溶媒/水系を用いて効果的に分離することができる。
【００３９】
ビス(ポリヒドロキシルフェニル)化合物は他の成分から単離することができる。ここで、組成物は、天然で得られる状態と比較して任意の程度まで精製される。ある態様では、実質的に精製されていない本発明の産物が有用であることが意図される。従って、少数の精製段階を組み合わせて使用することによって、または同じ一般的な精製法の異なる形態を使用することによって、部分的な精製を行うことができる。例えば、HPLC装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低速クロマトグラフィー装置を用いる同じ技法より「何倍もの」精製をもたらすことが理解される。低度の精製比を示す方法は、産物の全回収またはビス(ポリヒドロキシルフェニル)化合物の生物学的活性の維持に有利な場合がある。
【００４０】
他の態様において、本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、当業者に周知の従来の技法を用いて化学合成することができる(StewartおよびYoung、1984；Tamら、1983；Merrifield、1986；ならびにBarnayおよびMerrifield、1979；それぞれが参照として本明細書に組み入れられる)。本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物はまた、当業者に周知の様々な対称合成法(例えば、ウィッティング(Witting)縮合またはシッフ塩基反応)を用いて化学合成することもできる。
【００４１】
V.ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の合理的薬物設計
本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、生物学的に活性な化合物の構造類似体を作成するために合理的薬物設計において使用することができる。このような類似体を作成することによって、天然分子より活性のある薬物もしくは安定な薬物、変化に対して様々な感受性を有する薬物、または他の様々な分子の機能に影響を及ぼす可能性のある薬物を作ることが可能である。1つのアプローチでは、本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物またはその断片の三次元構造が作成される。これは、X線結晶学、コンピュータモデリング、または両方法の組み合わせによって達成することができる。別のアプローチでは、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物全体にわたる官能基のランダム置換が行われ、結果として生じる、機能に対する作用が確かめられる。
【００４２】
機能アッセイにより選択されたビス(ポリヒドロキシフェニル)特異的抗体を単離し、次いで、その結晶構造を解析することも可能である。原則的に、このアプローチによって、後の薬剤設計の基礎となり得るファーマコア(pharmacore)が得られる。機能的で薬理学的に活性のある抗体に対する抗イディオタイプ抗体を作成することによって、タンパク質結晶学を省略することが可能である。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は元の抗原の類似体であると考えられる。次いで、抗イディオタイプを使用して、化学的または生物学的に生成されたペプチドの集まりからペプチドを特定および分離することができる。次いで、選択されたペプチドはファーマコアとして機能する。抗イディオタイプは、抗原として抗体を使用する本明細書に記載の抗体作成法を用いて作成することができる。
【００４３】
従って、出発ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物と比較して生物学的活性(例えば、抗炎症活性または抗発癌活性)が改善した薬物を設計することができる。この化学的単離法および本明細書での説明によって、結晶学研究を行うのに十分な量の本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物を作成することができる。さらに、これらの化合物の化学的特徴の知識があれば、コンピュータを用いて構造と機能の関連性を予想することができる。
【００４４】
VI.ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の薬学的製剤および送達
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された、有効量のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物および選択的にさらなる1種類または複数の種類の薬剤を含む。「薬学的な、または薬理学的に許容される」という語句は、動物(例えば、ヒト)に適切に投与された時に、有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物を意味する。薬学的組成物の調製は、参照として本明細書に組み入れられる「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版、Mack Printing Company、1990により例示されるように本発明の開示を考慮すれば当業者に周知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)投与の場合、調製は、FDA Office of Biological Standardsにより求められている滅菌性、発熱性、一般安全性、および純度の基準を満たしていなければならないと理解される。
【００４５】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」として、当業者に周知の任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、着香剤、染料、このような同様の材料およびその組み合わせが挙げられる(例えば、参照として本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences、1990を参照のこと)。従来の担体が、活性成分と適合しない場合を除いて、治療薬または薬学的組成物に用いられることが意図される。
【００４６】
薬学的組成物は、固体、液体、またはエアロゾルの形で投与されるかどうか、注射などの投与経路のために滅菌している必要があるかどうかに応じて様々なタイプの担体を含んでもよい。本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、胸膜内に、鼻腔内に、局所に、腫瘍内に、筋肉内に、皮下に、眼内に、経口で、脂質組成物(例えば、リポソーム)に溶解して、または当業者に周知の他の方法もしくは前記の方法の任意の組み合わせによって投与することができる(例えば、参照として本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990を参照のこと)。
【００４７】
対象に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、症状の重篤度、治療される疾患のタイプ、以前の治療介入または同時に行う治療介入、患者の特発性疾患、および投与経路などの身体的要因および生理学的要因によって決定することができる。投与を担当する医師は、どのような場合でも、組成物に含まれる活性成分の濃度および個々の対象に合った適切な用量を決定する。
【００４８】
組成物はまた、1種類またはそれ以上の種類の成分の酸化を遅らせるために様々な酸化防止剤を含んでもよい。さらに、様々な抗菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によって微生物が働かないようにすることができる。防腐剤として、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
組成物が液体の形をしている態様では、担体は溶媒または分散媒体でもよい。溶媒または分散媒体として、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって；例えば、液体ポリオールもしくは脂質などの担体に分散することにより、必要とされる粒径を維持することによって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を使用することによって；またはこのような方法の組み合わせによって；維持することができる。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはその組み合わせなどの等張剤を含めることが好ましい。
【００５０】
ある特定の態様では、薬学的組成物は経口摂取による投与のために調製される。これらの態様では、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル(例えば、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル)、徐放性製剤、頬用組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、またはその組み合わせを含んでもよい。経口組成物は食物と一緒に直接取り込まれてもよい。経口投与に好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可能な食用可能な担体、またはその組み合わせを含む。本発明の他の局面において、経口組成物はシロップまたはエリキシル剤として調製されてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも1種類の活性薬剤、甘味剤、防腐剤、着香剤、染料、防腐剤、またはその組み合わせを含んでもよい。投与単位形態がカプセルの場合、前記のタイプの材料に加えて、液体担体などの担体を含んでいてもよい。コーティングとして、または投与単位の物理的形態を改変するために、様々な他の材料が存在しうる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルはシェラック、糖、またはその両方でコーティングされてもよい。
【００５１】
滅菌注射液は、必要量の活性化合物を(必要に応じて、前記で列挙した様々な他の成分と共に)適切な溶媒に入れ、その後に、濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌した活性成分を、基本分散媒体および/または他の成分を含む滅菌媒質に入れることによって調製される。滅菌注射液、懸濁液、またはエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥法または凍結乾燥法であり、これにより、活性成分と任意のさらなる望ましい成分の粉末が予め濾過滅菌した液体媒体から得られる。液体媒体は必要に応じて適切に緩衝化され、液体希釈剤は、注射前に、まず最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされなければならない。直接注射するための高濃度組成物の調製物も意図される。この場合、極めて速やかに透過して、高濃度の活性薬剤を小さな部位に送達するために、溶媒としてDMSOを使用することが想定される。
【００５２】
組成物は製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および菌類などの微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン混入は安全なレベル(例えば、0.5ng/mgタンパク質未満)に最小限に保たれなければならないことが理解されるだろう。
【００５３】
VII.併用療法
本発明の化合物および方法は神経炎症疾患/状態の状況で使用することができる。神経炎症疾患/状態として癌または過形成が挙げられるが、これらに限定されない。ビス(ポリヒドロキシフェニル)およびそのO-アルキル誘導体などの本発明の組成物を用いた治療の有効性を高めるために、これらの組成物と、これらの疾患および状態の治療に有効な他の薬剤を併用することが望ましい場合がある。例えば、癌の治療は、本発明の治療化合物および他の抗癌療法(例えば、抗癌剤または外科手術)を用いて実施されてもよい。同様に、神経炎症疾患または状態の治療は、本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)およびそのO-アルキル誘導体と従来の神経学的薬剤または神経学的療法を伴ってもよい。本発明の他の態様では、神経学的疾患の治療において非ビス(ポリヒドロキシフェニル)とビス(ポリヒドロキシフェニル)およびそのO-アルキル誘導体を併用することができる。
【００５４】
または、本発明の組成物および方法と特定の神経学的疾患または状態の治療に一般的に用いられる治療剤を併用して、他の神経学的疾患または状態(例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)および同様の臨床症状を示す他の運動ニューロン疾患(MND)；パーキンソン病(PD)；アルツハイマー病(AD)；脊髄延髄萎縮；(SBA)；ハンチントン舞踏病(HD)；重症筋無力症(MG)；多発性硬化症(MS)；HIV関連痴呆；前頭側頭骨痴呆(FTD)；脳卒中；外傷性脳損傷；加齢性網膜変性；および脳脊髄炎)を治療することができる。
【００５５】
治療時間の様々な組み合わせを本発明において使用することができる。例えば、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物を伴う療法は、数分から数週間の間隔をあけて他の神経薬剤の前に行われてもよく、または他の神経薬剤の後に行われてもよい。他の神経薬剤およびビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が対象に別々に提供または投与される場合、他の神経薬剤およびビス(ポリヒドロキシフェニル)またはそのO-アルキル誘導体が対象に対して有利な併用効果を発揮できるように、一般的に、有効な期間がそれぞれの送達の間に確実に終わらないようにする。このような場合、2種類の薬剤を、どちらかを投与して約1〜6時間以内または約12〜24時間以内に、より好ましくは、どちらかを投与して約6〜12時間以内に対象に提供または投与できることが意図される。約12時間だけの遅延時間が最も好ましい。しかしながら、場合によっては、治療期間を大きく延ばすことが望ましいこともある。この場合、それぞれの投与の間に、数日(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)〜数週間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間)経過する。
【００５６】
ビス(ポリヒドロキシフェニル)および/もしくはそのO-アルキル誘導体ならびに/または二次的な薬剤の複数回の投与が望ましいことも考えられる。以下に示すように様々な組み合わせを使用することができる。「A」はビス(ポリヒドロキシフェニル)およびO-アルキル誘導体であり、「B」は二次的な薬剤である。
2005533042.tif 000005
【００５７】
本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)の対象への投与は、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物治療の毒性がもしあればそれを考慮に入れて、特定の二次的療法の一般的な投与プロトコールに従う。この治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。様々な標準療法ならびに外科的介入を、記載のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物と組み合わせて適用できることも意図される。
【００５８】
1.抗生物質
抗生物質ゲンタマイシンを使用すると、筋肉細胞は、産生プロセスにおける必要なタンパク質の産生を早く止めるように命令する異常な停止シグナル(時期尚早な停止コドン)を無視できるようになる。ゲンタマイシンは筋肉細胞膜の安定化に有効な可能性がある。本発明と共に使用することができる他の抗生物質として、アミカシン、他のアミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン)、アモキシシリン、アンホテリシンB、アンピシリン、アンチモン化合物、アトバクオン(atovaquone)、スチボグルコン酸ナトリウム、アジスロマイシン、カプレオマイシン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフトリアキソン、クロラムフェニコール、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、シクロセリン、ダプソン、ドキシサイクリン、エタンブトール、エチオナミド、フルコナゾール、フルオロキノロン、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、ミノサイクリン、オフロキサシン)、パラアミノサリチル酸、ペンタミジン、ポリミキシン、デフィンシン(definsin)、プロチオナミド、ピラジナミド、ピリメタミン、スルファジアジン、キノロン(例えば、シプロフロキサシン)、リファブチン、リファンピン、スパルフロキサシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、チアセタゾン、トリメタプリム-スルファメトキサゾール、バイオマイシン、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
2.抗癌剤
本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物はまた、神経炎症疾患、癌または過形成の治療にも使用することができる。従って、特定の態様では、本発明は、当業者に周知の生物学的薬剤(生物療法)、化学療法剤、および放射線療法剤を含む他の抗癌療法と併用することができる。抗癌剤は、対象の癌に負の影響を及ぼすことができる。本発明の状況では、ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、他のプロアポトーシス剤もしくは細胞周期調節剤または外科手術に加えて、化学療法介入、放射線療法介入、免疫療法介入、または他の生物学的介入と共に使用できることが意図される。従って、当業者に周知の1つまたはそれ以上の抗癌療法が本明細書に記載のビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物と共に使用できることが意図される。抗癌剤の一部の例として、5-フルオロウラシル；αおよびγインターフェロン；有糸分裂阻害剤(例えば、ドセタキセル、エトポシド(VP16)、テニポシド、パクリタキセル、メトトレキセート、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む)；ならびに本明細書に記載の療法の他の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
3.細胞死阻害剤/細胞生存促進剤
細胞死阻害剤も本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用することができる。これらの細胞死阻害剤として、細胞生存を促すBcl-2ファミリーのタンパク質(例えば、Bcl-2、Bag、Bclxl、Bclw、Bcls、Mcl-1、A1、およびBfl-1)；カスパーゼ活性および/またはカスパーゼ活性化を阻害することにより作用するように思われるNAIP(ニューロンアポトーシス阻害剤)およびIAP(アポトーシス阻害剤)；細胞生存促進剤(例えば、NFκB)；カスパーゼ阻害剤およびカルパイン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらは全て神経学的疾患の治療において本発明と併用して有効である可能性がある。
【００６１】
4.他の阻害剤
他の阻害剤も本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用することができる。これらの阻害剤として、CD4リンパ球のアポトーシスを阻害するインジナビルなどのプロテアーゼ阻害剤；カスパーゼ阻害剤；プロスタグランジン産生を阻害するシクロオキシゲナーゼ2(COX-2)阻害剤(プロスタグランジンは星状膠細胞のグルタミン酸放出を誘発し、フリーラジカル形成を誘導する)；β部位APP(アミロイド前駆体タンパク質)-BACE1およびBACE2阻害剤；マクロファージ遊走阻害因子(MIF)；ホスホジエステラーゼ阻害剤(PDEI)；酸化窒素阻害剤；ならびにマクロファージ遊走阻害因子(MIF)を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６２】
5.神経栄養因子/遺伝子
神経栄養因子は、神経細胞の成長、成熟、および生存に必須のものであり、神経学的疾患/状態の治療において本発明と併用することができる。これらの神経栄養因子として、CNTF-毛様体神経栄養因子；NT3-神経栄養因子3；BDNF-脳由来神経栄養因子；GNDF-膠細胞由来神経栄養因子；NGF-神経成長因子；および神経系の正常な発達に必須の他の神経栄養因子(例えば、インシュリン様成長因子1(IGF-1；Myotrophin(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、neotrofin(商標)(AIT-082、レテプリニムカリウム(leteprinim potassium))を含み、神経再生に関与する「遺伝子のオンまたはオフ」を選択的に制御するのに使用することができる薬物化合物クラスであるプリン誘導体も、本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用することができる。非ペプチドであるキサリプロデン(xaliproden)などのニューロトロフィン様活性を有する化合物も使用することができる。
【００６３】
6.非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)
非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)も併用できることが本発明により意図される。非ステロイド性抗炎症薬として、ナプロキセン、インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジクロフェナクナトリウムとミソプロストール、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、メクロフェナメートナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチンナトリウム；cox-2阻害剤：セレコキシブ、ロフェコキシブ、サリチル酸塩-アセチル化：アスピリン、非アセチル化：サリチル酸コリン、コリン、およびサリチル酸マグネシウム、サルサレート、ならびにサリチル酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
7.ステロイド
ステロイドも本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用できることが意図される。これらのステロイドとして、コルチコステロイド；メチルプレドニゾロン；バクロフェン(Lioresal(登録商標))、チザニジン(Zanaflex(登録商標))、およびベンゾジアゼピン(例えば、ジアゼパム(Valium(登録商標))；プレドニゾン、デキサメサゾン、ヒドロキシクロロキン(プラクエニル(Plaquenil))、アザチオプリン(イムラン(Imuran))、マイコフェノール酸モフェチル(セルセプト(Cell Cept))、メトトレキセート、またはシクロホスファミド(サイトザン(Cytoxan))が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
8.免疫系療法
一部の神経学的疾患の治療は、中枢神経系に対する免疫系の反応の調節または変化に向けることができる。このような治療法も本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用することができる。これらの治療法として、免疫系で自然に生じ、炎症を制限するのに役立つ可能性のあるインターフェロン(INF)が挙げられるが、これに限定されない。さらに、IFN-β1b(Betaseron(登録商標))；IFN-β1a(Avonex(登録商標))；およびIFN-β1-a(Rebif(登録商標))が挙げられる。さらに、ある特定の神経学的疾患の進行において役割を果たすと考えられている免疫系作用の一部を改変する酢酸グラチラマーも本発明と併用することができる。
【００６６】
9.グルタミン酸療法
グルタミン酸の濃度を減少、抑制、阻害、または調節する薬剤または療法が本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用できることも本発明により意図される。過剰なグルタミン酸はニューロンにとって毒性である。これらの薬剤または療法として、タモキシフェン(抗グルタミン作用をもたらし得るプロテインキナーゼC阻害剤)；Rilutek(登録商標)(ALS治療に用いられるグルタミン酸阻害薬)；NAALADase阻害(NAAG(N-アセチル-アスパラチル-グルタミン酸)はNAALADase(Nアセチル化α結合型酸性ジペプチダーゼ)によってグルタミン酸に変換される)；NMDAアンタゴニスト(例えば、メマンチンおよびニトログリセリン)が挙げられるが、これらに限定されない。複合薬ニトロメマンチンも使用することができる。
【００６７】
10.酸化防止剤
本発明では、酸化防止剤も本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)との併用療法として炎症性疾患の治療に使用することができる。酸化防止剤として、メチオニン、コリン、N-アセチルシステイン、ビタミン(例えば、B複合体-ビタミンB6またはビタミンB12；ビタミンK；ビタミンE-トコフェロール；ビタミンA；ビタミンC；およびその誘導体)、グルタチオン(gluthathione)、システイン、および2-メルカプトエタノール、イデベノン、補酵素Q10、ALA、カルノシン、トコトリエノール、フラボノイド、ALC、プロブコール、アスコルビン酸、ビンポセチン、リポ酸、カロテノイド、セレン、リコペン、クレアチン、アルギニン、タウリン、システイン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、レスベラトロール、イチョウ、オリゴマープロアントシアニジン、およびフェノール酸化防止剤を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
11.他の療法
本発明のビス(ポリヒドロキシフェニル)と併用することができる他の薬剤または療法として、胚細胞(例えば、胚ドーパミン細胞)の移植；葉酸治療；テロメラーゼ治療；およびクレアチンおよびアルブテロールなどの薬剤が挙げられる。
【００６９】
VIII.実施例
以下の実施例は本発明の好ましい態様を明示するために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において良好に機能する本発明者らにより発見された技法であり、従って、本発明の実施に好ましい態様を構成すると考えられることが当業者により理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができると理解するはずであり、なおかつ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができるはずである。
【００７０】
実施例I
小膠細胞活性化を示す神経炎症事象(特に、TNFαおよびTNF受容体Iの発現の増大)を伴うALS
G93A-SOD1変異マウス：CNSへの酸化的損傷に関連した運動ニューロン疾患モデル
ALSの全ての遺伝性症例のうち約20％は抗酸化酵素Cu、Zn-スーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)の変異によって引き起こされる。最も一般的な変異の1つは、酵素残基93のグリシンからアラニンへの置換(G93A-SOD1)である(Rosenら、1993；Dengら、1993)。標準的なALSモデルであるG93A-SOD1トランスジェニックマウスの集団が確立された(Rosenら、1993；Dengら、1993；Hallら、1998)。変異トランスジーンを有する動物は90〜100日齢から脊柱が変性する。横向きにして30秒以内に起き上がることができなくなった時に、動物を殺傷した。
【００７１】
G93A-SOD1マウスの脊髄変性と炎症性サイトカイン(特に、TNFαおよびTNFR-1)の発現との時間的な相関関係
病態生理学的ストレス間の炎症およびアポトーシスの指標を示すために、マルチプローブリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)が広範囲に用いられている(Gabbitaら、2000；Stewartら、1999)。RPAを用いると、ノーザンブロットより10倍以上の感度で複数のmRNA種を同時に定量することができる。RPAによって、生存の後期段階のG93A-SOD1マウス脊髄においてマクロファージ(モノカイン)特有のサイトカイン発現パターンが示された。(全てではないが)数種類のモノカインが120日齢G93A-SOD1マウスの脊髄において有意に上昇した。例えば、120日齢G93A-SOD1マウスのインターロイキン1α(IL1a)およびIL1βは、非トランスジェニック同腹仔または野生型ヒトSOD1発現マウスと比較して著しく増加した(表2)。発症前のG93A-SOD1マウスおよび発症したG93A-SOD1マウスの脊髄におけるTNFα上昇も、つい最近報告されている(Yoshiharaら、2002)。興味深いことに、IL1受容体アンタゴニスト(IL1RA)が同程度増加した(表2)。このことから、一部の抗炎症成分もG93A-SOD1マウス脊髄においてアップレギュレートされることが分かる。マクロファージまたはT細胞によって産生される強い抗炎症性を示すIL10は、120日で著しい影響を受けなかった(表2)。続いて、RPAを用いて、麻痺発生前の80日齢動物の脊髄における同じサイトカインmRNAを評価した。これらのデータから、G93A-SOD1マウスでは、(小膠細胞活性化を示す)モノカインアップレギュレーションは麻痺発生より前に起こり、麻痺発生と相関することが分かる(表2)。対照的に、Tリンパ球由来サイトカイン(リンホカイン)(例えば、IFNγ、IL2、IL3、IL4、IL5、およびIL15)は低レベルで発現し、これらはG93A-SOD1マウスではわずかにしか変化しなかった。
【００７２】
120日および80日(それぞれ、発症期間および後期発症前期間に相当する)でのアポトーシス関連遺伝子の発現を評価するために、別のRPAを行った(表2)。カスパーゼmRNAの全てが120日では増加したが、80日では有意に増加しなかった。同様に、FASなどの特定の「死受容体(death receptor)」は80日では変化しなかったか、またはわずかにしか増加しなかったが、120日齢では著しく上昇した(表2)。注目すべき例外はTNFR-p55(TNF-RI)であり、80日で有意に上昇し、120日でさらに増加した。従って、プロアポトーシス遺伝子のアップレギュレーションはサイトカイン変化の後に起こるが、全後肢麻痺の発生と時間的に相関する。これらのデータから、TNFα/TNF-RI系はALS発症にとって特に重要であることが分かる。
【００７３】
（表２）RPAデータの概要
2005533042.tif 000006
G93A-SOD1マウスから得られた値は、各日齢での非トランスジェニック(非Tg)マウスまたは野生型SOD1マウスから得られた平均値(±SEM)に対する相対パーセントとして表した。＊p＜0.05(個々のt検定による)。ND=検出限界未満。(M)モノカインプローブセットから得られた値を示す。；(L)リンホカインプローブセットから得られた値を示す。
【００７４】
実施例II
他の結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物および非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)と比較した連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の効力
以前に述べられたように、反応性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)はALSと強い関連性がある。炎症誘発剤(例えば、細菌リポ多糖(LPS))で刺激された小膠細胞およびマクロファージはO2・-および・NOを産生する(Coltonら、1994；Medaら、1995)。これらの研究のために、EOC-20マウス小膠細胞をモデル系として選択した。EOC-20細胞は、特徴付けられた、ウイルスにより形質転換されていないCSF-1依存性マウス小膠細胞株であり、IgG受容体FcγRIおよびII；Mac-1、Mac-2、Mac-3、CD45、CD80、およびMHC-Iを構成的に発現し、IFNγに反応してMHC-IIを発現する(Walkerら、1995)。従って、EOC-20細胞は、特徴付けられている範囲ではマクロファージおよび初代小膠細胞とよく似ている。
【００７５】
図1に示すように、TNFαで刺激されたEOC-20細胞は、培地中の亜硝酸イオン(NO2-)蓄積により証明されるように多量のRNSを産生する。亜硝酸イオンは・NOの自動酸化生成物であり(Shishidoら、2001；Yrjanheikkiら、1999)、便利な比色グリース(Griess)ジアゾ化アッセイを用いて測定することができる(Marzinzigら、1997；Archer、1993)。代表的な炎症剤で刺激されたマクロファージ型細胞では、NO2-は主にiNOSの発現を反映している(Coltonら、1994；Medaら、1995)。図1は、TNFαがEOC-20細胞における強力なRNS刺激であり、細菌リポ多糖(LPS)などの他の代表的な刺激より多くのNO2-を発生させることを示している。興味深いことに、EOC-20細胞がIL1β、EGF、またはH2O2に反応して亜硝酸イオンを産生しないので、TNFαの作用はある程度特異的である(図1)。熱凝集されたが遊離していないIgGもLPSとほぼ同じ程度で、これらの細胞を低めに刺激する。
【００７６】
インビトロでのTNFαに対する小膠細胞の反応を証明した後、小膠細胞培養物を、抗増殖作用または抗炎症作用について最近研究された天然成分の「ニュートリシューティカル(neutriceutical)」の存在下で、TNFαで刺激した。細胞をコンフルエントになるまで24ウェルプレートで培養し、次いで、ジメチルスルホキシド(DMSO)で100倍の最終濃度に溶解した試験薬剤で、または媒質のみで処理した。試験薬剤処理の30分後、細胞を10ng/mL組換えマウスTNFα(ファーミンゲン(Pharmingen)、San Diego CA USA)で処理した。24時間後、市販の試薬を用いてNO2-をアッセイするために、0.1mLのアリコートを培地から採取した(Marzingzigら、1997；Archer、1993)。結果として生じたジアゾ発色団の光学密度を、外部標準として本物の亜硝酸イオンを用いてマイクロプレート方式で560nmで測定した。TNFαの存在下で、各化合物を100μM、20μM、4μM、0.8μM、および0μMで試験した。各濃度の試験薬剤について、4つのウェルの細胞を使用した。
【００７７】
各試験化合物について、IC50値を補間法によって求めた。この値は、亜硝酸イオンの産生を50％阻害するのに必要な濃度に相当する。IC50値が低ければ効力が改善されたことが分かる。図2は、試験薬剤の例としてNDGAを用いた測定の原理を示す。生存率を求めるために、細胞培地を、20μL/mL MTT生存試薬(プロメガ(Promega))を含むフェノール不含DMEM(ギブコ(Gibco))と交換した。37℃で1時間インキュベーションした後、培地200μLを取り出し、ブランク(100％毒性)として(細胞を含まない)MTT生存試薬希釈液を用いて、光学密度をマイクロプレート方式で540nmで測定した。100％生存率を示すために対照細胞を測定し、MTT還元の中間値を対照のパーセントとして決定した。各化合物について、LD50値を、致死量以下の濃度によって補間法によって求めた。この値は、MTT生存率パラメータを50％下げる濃度に相当する。
【００７８】
表3は、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物および結合しているが連結していないビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の一部を含む、天然産物および合成産物の調査結果をまとめている。連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が、ただ結合しているだけで連結していないビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物より概して強力であることは、この比較から明らかである。効力が環Aおよび環Bのヒドロキシル基の数と概して相関することも明らかである。例えば、それぞれの環に2個のヒドロキシル基を有するピセアタンノールは、一方の環に1個のヒドロキシル基を、もう一方の環に2個のヒドロキシル基を有するレスベラトロールより強力である。NDGAがピセアタンノールより効果があるので、環Aと環Bの間の連結部分(tether)の長さを延長することによって、効力が高まるかもしれない。
【００７９】
NDGAよりほぼ10倍効果的にリポキシゲナーゼを阻害する標準的なリポキシゲナーゼ阻害剤カフェー酸フェネチルエステル(CAPE) (MirzoevaおよびCalder、1996)の、TNFα刺激小膠細胞活性化の阻害剤としての有効性は1/4であった。さらに、CAPEは、連結ビスフェニル化合物であるのでビス(ポリヒドロキシフェニル)と構造的に関連しているが、2つのフェニル環の必要とされるヒドロキシル化(またはアルコキシル化)が無いので連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)の定義を満たしていない(MirzoevaおよびCalder、1996)。従って、CAPEは、リポキシゲナーゼ阻害活性の他にC-RTK阻害剤としてある程度の活性を同時に示すのかもしれない。これらのデータから、非常に効果的なビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物の新規作用はリポキシゲナーゼ阻害作用のみによるものではないことが分かる。
【００８０】
特に、表3は、公表されたメチル化法(Hwuら、1998)を改良して本発明者らにより合成されたtetra-エチル(エチルオキシ)エーテルNDGA(Et4NDGA)も含む。Et4NDGAに関するデータは、ヒドロキシル基をエチルエーテル(アルコキシル基)に置換すると効力がさらに増大するが、この特定の例では細胞傷害性がいくらか犠牲となることを証明している(表3)。このデータから、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物のある特定のO-アルキル誘導体は優れた小膠細胞活性化阻害剤である可能性があることが分かる。さらに、ピセアタンノールおよびNDGAを含む表3に示した連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物クラスの大部分の試験メンバーは、同じ小膠細胞活性化アッセイで評価された時に、インドメタシンおよびイブブロフェンなどの標準的なNSAIDより効果的であることが明らかである(表3)。最後に、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物クラスの大部分の試験メンバーは、同じ小膠細胞活性化アッセイで評価された時に、標準的な小膠細胞阻害剤ミノサイクリン(Yrjanheikkiら、1999)より強力であることが明らかである(表3)。
【００８１】
最後に、表3は、多くの連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物が標準的な治療剤リルゾールおよびミノサイクリンと比較して優れていることを示している。一般的に、連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)誘導体は、リルゾールまたはミノサイクリンより低用量で小膠細胞活性化を阻害し、その細胞傷害性は低い。例えば、ロオペロールのIC50は25μMであり、無毒であった。リルゾールは、現在、米国のみで認可されているALS治療化合物であるのに対して(Physician's Desk Ref、2002)、ミノサイクリンはALS、HD、およびPDの治療について研究されている(Chenら、2000；Zhuら、2002；Wuら、2002)。従って、リルゾールは臨床標準薬とみなすことができる。NDGAなどの一部の連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)はインビボでリルゾールより毒性が非常に低い。例えば、リルゾール(経口経路)のLD50はマウスでは94mg/kgであり、ラットでは40mg/kgである(Physician's Desk Ref、2002)。それに対して、NDGAのLD50はマウスでは500mg/kg(腹腔内経路)より大きく、ラットでは2000mg/kg(経口経路)より大きい (Lehmanら、1951)。飼料の0.5％をNDGAとして長期間与えたマウスは副作用を示さない(Cranstonら、1947)。同様に、NDGAは、光感作(photsensitization)、肝臓障害、甲状腺および舌の変色、ならびに狼瘡様疾患の原因となることがあるミノサイクリンより毒性が低い可能性がある(Physician's Desk Ref、2002；Balestreroら、2001)。NDGAはまた、合成または精製にかかる費用がリルゾールおよびミノサイクリンより少ない。例えば、NDGAの商業的な調製には約46ドル/gかかるのに対して、リルゾールの調製には800ドル/g、ミノサイクリンの調製には180ドル/gかかる(シグマケミカル(Sigma Chemical)、St.Louis MOにより供給される)。
【００８２】
（表３）EOC-20細胞におけるTNFα刺激NO2-産生について試験された選択化合物の相対効力
2005533042.tif 000007
2005533042.tif 000008
【００８３】
実施例III
小膠細胞における炎症誘発性サイトカインの転写を抑制する連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物
マルチプローブリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)によって、TNFαはEOC-20小膠細胞における特定のサイトカインの発現を刺激することが分かった。ピセアタンノールは炎症誘発性サイトカインの転写を特異的に阻害したが、その阻害効力はRNS流動阻害について観察されたものより若干低かった(表3)。数レーンにわたる試料添加が等しく行われることを証明するために、RPAプローブセットにL32およびGAPDH「ハウスキーピング」遺伝子産物を含めた。IL1β、IL1RA、IFNγ、およびMIFは処理による影響を受けたが、IL18は影響を受けないことが認められた。
【００８４】
実施例IV
筋萎縮性側索硬化症(ALS)マウスモデルにおける運動機能低下の予後を改善する連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物NDGA
標準的なALSモデルであるG93A-SOD1トランスジェニックマウスの集団が確立された(Gurneyら、1996；Johnsonら、2000)。これらの動物には、家族性筋萎縮性側索硬化症症例の大部分の原因となるヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)酵素変異体が含まれる(Rosenら、1993)。変異トランスジーンを有する動物は90〜100日齢から脊柱が変性する。横向きにして30秒以内に起き上がることができなくなった時に、動物を殺傷した。この動物モデルの妥当性の前例として、G93A-SOD1マウスにリルゾール(現在認可されている唯一のALS治療薬、ヒトでは疾患の進行をわずかにしか遅らせない)が長期間投与された時、寿命を10日延ばす(Gurneyら、1996)。
【００８５】
潜在性の運動動作欠陥は回転棒装置を用いて測定される。動物を、最初1rpmで長軸を中心にして回転するように設定した水平の棒の上に置く。回転速度を10秒毎に1rpmの一定速度で上げ、動物が棒から落下するまで実験を続ける。変異SOD1トランスジーンを有するマウスとは対照的に、野生型ヒトSOD1トランスジーンを有する動物は健康な運動機能を示す。同様に、非トランスジェニック同腹仔も正常な機能を示す。
【００８６】
標準的な連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物であるノルジヒドログアイアレチン酸(NDGA)のインビボでの効力を試験するために、G93A-SOD1マウスを使用した。ある実験では、10匹のG93A-SOD1動物を85日齢で回転棒試験に供した。90日齢で、動物を2つの群(それぞれ5匹)に分けた。一方の群には、NDGA(10mg/kg、5日/週、95％生理食塩水/5％DMSO媒質に溶解した)を腹腔内に注射した。対照群には媒質のみを与えた。その後5日毎に、動物を回転棒装置で試験した。
【００８７】
当初、動物が装置に慣れるにつれて、全てのマウスにおいて回転棒動作特性は改善する。100日目に動物の動作はピークに達する(図3A)。100日より後の時点では、動物の運動動作は低下する。10匹の動物の中の初期体力の差を調整するために、100日の時点より後の全てのデータを、100日でのピーク動作と比較したパーセントとして表した(図3Bおよび3C)。NDGA処置によって、媒質のみを与えた動物と比較して運動機能低下率が減少した。図3Bのデータを反復測定分散分析(ANOVA)を用いて評価した時に、有意な日齢×処置効果が観察された(p＜0.005)。120日の時点のスチューデントt検定による統計評価から、薬物群と媒質群の間はp＜0.08であることが分かる(すなわち、保護薬物効果の確率は92％である)。100日〜120日の5つの時点による線形回帰によって、NDGA処置動物の運動機能の悪化速度は媒質処置動物と比較して38％遅くなることが分かった(媒質処置動物の傾き=4.71％減少/日；NDGA処置動物の傾き=2.96％減少/日；p＜0.05；図4)。先行技術の評価から、NDGAは、疾患発症段階のG93A-SOD1マウスに全身投与された時に効力を示す初めての化合物であることが分かる。
【００８８】
実施例V
LnCAP細胞のLnCAP PSA産生に対するビス(ポリヒドロキシフェニル)の作用
LnCAP前立腺癌細胞を確立された方法に従って培養した(Horoszewiczら、1983)。これらの細胞は前立腺特異的抗原(PSA)(転移の可能性を予測するセリンプロテアーゼ)を産生する(Thalmannら、2000)。細胞を0μM、4μM、20μM、または100μMの薬物(DMSO媒質に溶解)で24時間処理した。それぞれの薬物を、それぞれの濃度で3回繰り返して試験した。培地を取り出し、市販の酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いてPSA濃度について試験した。MTT法を用いて付着細胞の生存率を求めた。
【００８９】
（表４）LnCAPのPSA産生に対する薬物の作用：IC50値(ELISA)
2005533042.tif 000009
【００９０】
ピセアタンノール、レスベラトロール、およびNDGAなどの連結ビス(ポリヒドロキシフェニル)化合物は、LnCAPのPSA産生に対して、結合ビス(ポリヒドロキシフェニル)より効果的であった(それぞれ、IC50=42μM、43μM、および15μM)。
【００９１】
実施例VI
筋萎縮性側索硬化症(ALS)マウスモデルにおける機能を改善するセサミン処方物(ゴマ油)
ゴマ油に含まれるヒドロキシ基含有リグナン(例えば、セサミノール、エピセサミノール、およびセサモリノール)は酸化防止活性を示す(Osawaら、1985；Fukudaら、1985)。しかしながら、セサミンは酸化防止剤としてはっきりと評価されていない。さらに、ラット肝臓におけるセサミンのジカテコール代謝産物が証明されている(Nakaiら(2003))。しかしながら、セサミンのジカテコール代謝産物の抗炎症作用は分かっていない。
【００９２】
セサミン処方物が運動機能の改善に関与するかを確かめるために、G93A-SOD1マウスにゴマ油100μLを、90日齢から週に5日毎日、腹腔内に(I.P.)注射した。動物を90日で、その後5日間隔で回転棒試験した。動物を4回繰り返して試験し、各動物について回転棒動作時間を基準(90日)動作時間に対して標準化した。ゴマを注射したALS罹患動物は、未処置G93A-SOD1マウスで以前に観察されたものより有意に良好に運動した(図5)。実際に、ゴマ油を注射した動物では動作が約115日齢まで延びた(図5)。
【００９３】
実施例VII
TNFαシグナル伝達の強力なアンタゴニストであるアラキドン酸代謝阻害剤
アラキドン酸代謝阻害剤(特に、5LOX阻害剤)はTNFαシグナル伝達の強力なアンタゴニストである。EOC-20細胞には、薬物を小膠細胞抑制活性についてスクリーニングするためのバイオアッセイとして使用するのに好ましい、いくつかの魅力的な特徴がある。EOC-20細胞は培養が極めて容易であり、非常に急速に増殖する。EOC-20細胞は細胞ストレスに耐え抜き、かなり強靭である。EOC-20細胞は、TNFαなどの代表的な炎症誘発剤によって容易に刺激され、低分子NO2-を産生する。細胞培地中のNO2-は容易にアッセイすることができ、同時に、生存率が評価される。
【００９４】
EOC-20細胞をハイスループットスクリーニングの候補として評価し始めるために、細胞培養物を、抗増殖作用または抗炎症作用について最近研究された天然化合物または合成薬物の存在下でTNFαで刺激した。
【００９５】
この細胞培養系では、300個の構造的に異なる合理的に選択された化合物が試験された。NDGA、クルクミン、およびミノサイクリンの代表的な用量-阻害プロファイルを図2に示す。この分析からの最も注目すべき発見は、ある特定のアラキドン酸代謝阻害剤がTNFαアンタゴニストとして顕著な効力があることであった(表5)。特に、天然ジカテコールであるクルクミンおよびNDGAは両方とも非常に効果的な無毒の阻害剤であった(表5；図2)。両化合物は、ALS、ハンチントン舞踏病、およびパーキンソン病の動物モデルにおいて小膠細胞反応を抑制する標準的な小膠細胞阻害剤ミノサイクリンより有意に強力であった(Wuら、2002；Chenら、2000；Tikkaら、2001；Zhuら、2002；Balestreroら、2001)。特に、NDGAはミノサイクリンより約16倍強力であり、IC50は3〜5μMであり、100μMで毒性は無かった(図2)。相対的な効力の点から見れば、NDGAは、試験された無毒の化合物の上位2％に入っていた。800nM NDGAで有意なNO2-抑制が観察された。天然NDGAおよび合成NDGAならびにNDGAのアセチルエステルについて、同様の効力が観察された(表5)。興味深いことに、tetra-O-メチルNDGA(リポキシゲナーゼを阻害しない；Bensimonら、2002)が低めの生物活性を示したが、親化合物よりは強くなかった(表5)。臨床で認可された5LOX阻害剤ジレウトン(zileuton)(ザイフロー(Zyflo))はミノサイクリンとほぼ同じくらいの効果を示したが、NDGAまたはクルクミンよりは強くなかった(表5)。一般的なCOX阻害剤の中には活性が弱いまたはほとんどないものも観察されたが、COX-II選択的阻害剤NS-398は本質的に非活性であった(表5)。NDGAはシクロオキシゲナーゼ触媒能の比較的弱い阻害剤であるが、この結果から、ジカテコールは、サイトカインで刺激されたCOX-II発現を阻害することが示唆された。
【００９６】
NDGAは、μM以下の濃度で、TNFα刺激EOC-20細胞におけるプロスタグランジンE2(PGE2)放出の阻害剤として効果があることに注目した(図6)。プロスタグランジンE2は、膜リン脂質から放出されたアラキドン酸のシクロオキシゲネーション(cyclooxygenation)産物であり、脳損傷および炎症の調節に主な役割を果たしている。プロスタグランジンE2は脳損傷および変性の可能性のある誘導物質として考えられることが多いが、CNSにおいて有益な効果を発揮する可能性がある。実際に、炎症誘発分子としての古典的な役割にもかかわらず、最近のいくつかのインビトロ観察からプロスタグランジンE2は小膠細胞活性化を阻害できることが分かっている。
【００９７】
カフェー酸フェネチルエステル(CAPE)はクルクミンとほぼ同じくらいの効果を示したが、他の選択的5LOX阻害剤は生物活性はあったが、強くはなかった。興味深いことに、tetra-O-メチルNDGA(リポキシゲナーゼを阻害しない；Whitmanら、2002)はわずかな生物活性を示したが、親化合物よりは強くなかった(表5)。試験されたいくつかの代表的な非ステロイド性抗炎症薬の中で、様々な活性が観察された。インドメタシンおよびイブブロフェンは弱い活性を示した(表5)。多数の古典的なフリーラジカル消去酸化防止剤(モノカテコール、SOD、およびカタラーゼミメティックを含む)はTNFα刺激小膠細胞に対して活性を示さなかった。従って、NDGAのTNFα拮抗作用は、活性の組み合わせ(5LOX触媒作用の阻害を含むが、これに限定されない)による可能性が高い。
【００９８】
（表５）TNFα刺激によるEOC-20小膠細胞の亜硝酸イオン産生に対する様々なアラキドン酸代謝アンタゴニストの効力
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＊値は＜100μMの点からの直線外挿によって得られた
【００９９】
実施例VIII
EOC-20細胞におけるTNFαを介した亜硝酸イオン産生を刺激する5LOX産物ロイコトリエンB4
5LOX阻害剤はTNFαに拮抗する傾向があったので、TNFαの存在下または非存在下で5LOX代謝産物をEOC-20細胞に直接添加する逆の実験を行った。10μMのLTB4を小膠細胞に添加し、10分後に低用量(4ng/mL)のTNFαを添加した。24時間で亜硝酸イオンをアッセイした。LTA4もLTB4もそれだけではNO2-産生を刺激しなかった。しかしながら、LTB4は低用量のTNFαと協力作用して、サイトカイン単独よりかなり多くの亜硝酸イオン収量をもたらした(図7)。同様の例が、LTB4がIFNγと協力作用してマクロファージを活性化した文献に見られる(Talvaniら、2002)。5LOXがTNFαを調節することを確かめるために、(5LOXノックアウトマウスまたは他の遺伝子操作マウスから単離された)5LOXを発現しない膠細胞を用いて、さらなる研究を行うことができる。
【０１００】
データから、5LOXは小膠細胞でのTNFαシグナル伝達に密接に関与し、適切な5LOX阻害剤は神経炎症疾患からある程度保護する可能性があることが分かる。
【０１０１】
実施例IX
非トランスジェニック同腹仔由来膠細胞培養物よりもTNFα刺激に対して感受性であるG93A-SOD1マウス由来初代膠細胞培養物
本発明者らは、変異SOD1を発現する膠細胞では炎症シグナル伝達が混乱していると予想した。この予想を、G93A-SOD1マウスの仔または非トランスジェニック同腹仔から単離した初代混合膠細胞培養物を用いて試験した。このような膠細胞培養物は主に星状膠細胞(少なくとも90％)であり、残りは主に小膠細胞である(Robinsonら、1999；Gabbitaら、2002)。さらに高度に精製された小膠細胞を培養することができるが、これには多数のマウスの仔および大規模な培養操作が必要である。
【０１０２】
TNFαシグナル伝達に及ぼすSOD1変異の影響を評価するために、G93A-SOD1マウスまたは非トランスジェニックマウスに由来する混合初代膠細胞を漸増濃度のTNFαで処理した。30分後に、培地に含まれる亜硝酸イオンをアッセイした。図8に示すように、G93A-SOD1膠細胞は、TNFαに反応して非トランスジェニック細胞より有意に多いNO2-を産生した。この実験において試験した最低濃度のTNFαでは、G93A-SOD1膠細胞は非トランスジェニック細胞の2倍のNO2-を産生した(図8)。2つの遺伝子型間のNO2-産生量の相対的な差は高用量のTNFαで減少し始めた。これは、恐らく、高濃度サイトカインで細胞応答が頭打ちになったことを意味している(図8)。膠細胞応答の遺伝子型特異的な差をさらに徹底的に調べるために、トランスジーンに関連した差が容易に区別される可能性が高い低濃度TNFαで、将来的に実験を行うことができる。
【０１０３】
G93A-SOD1細胞の過敏性は、ALS発症とは関係のないトランスジェニックタンパク質の過剰産生から単に生じている可能性がある。将来の研究では、さらに正式に、G93A-SOD1膠細胞のサイトカイン感受性と同レベルの野生型ヒトSOD1トランスジーンを発現する細胞のサイトカイン感受性を比較することができる。図8のデータは、(前記の)G93A-SOD1マウスの脊髄では神経炎症性サイトカイン発現が増加するという本発明者らの発見をかなりはっきりと補足している。このデータは、SOD1変異が、TNFα受容体レベルと下流の核転写因子レベルの間でシグナル伝達要素を何らかの形で混乱させ、結果として、炎症誘発性シグナル伝達に対する過敏性をもたらすことを強く示唆している。
【０１０４】
実施例X
小膠細胞におけるTNFα-LOXシグナル伝達軸の提案されたモデル
リポキシゲナーゼ活性はマクロファージまたは小膠細胞において炎症シグナル伝達を調節できることが強く示唆された。次いで、本発明の予備研究において得られたデータを説明するために、およびさらに試験可能な仮説を立てるために、モデルを考案した(図9)。このモデルでは、TNFαシグナルは並行する経路によって核に伝達される。すなわち、ある分岐はp38-MAPキナーゼを介して5LOXを活性化し、別の分岐は、APIおよびPPARαを含む他の転写因子を活性化する(このモデルの後者の部分は、主として、Funkおよび他の研究者らの発見に基づいている(例えば、Funk、(2001)；Madamanchiら、(1998)；RizzoおよびCarlo-Stella、(1996)；Hallenbeck、(2002)))。図9の図はまた、LTB4がTNFα刺激線維芽細胞におけるROS産生の原因であることを示したWooら(2000)の発見も取り入れているが、LTB4感受性ROS産生の分子標的はまだ決定されていない。このモデルは、LTB4のみでは亜硝酸イオン産生の刺激に不十分であるが、ロイコトリエンがTNFα-MAPキナーゼ軸に沿って既存の刺激を増幅することができる理由を説明している。このモデルから、LOX阻害のみではTNFα刺激を完全に阻止しないが、LOXおよび上流の受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の二重阻害がTNFα刺激を良好に阻止する可能性があることも予測される。
【０１０５】
実施例XI
ALSのG93A-SOD1マウスモデルにおいて疾患進行を遅らせ、生存期間を延ばす、選択的5LOX阻害剤NDGA
NDGAはインビトロで効力があったので、インビボでさらに試験した。2つの異なる試験を行った。第1の実験では、10匹のG93A-SOD1マウスを無作為に選んで、90日齢から10mg/kg NDGA(腹腔内)を投与した群または媒質を投与した群に分けた。NDGAは、水での溶解度が限られていたので20％DMSO：80％生理食塩水に溶解して投与した。回転棒動作試験を5日間隔で行った。NDGA処置動物は、100日齢より後の運動機能の平均低下率が38％下がった(図4)。5匹のNDGA処置動物の寿命中央値は127日であったのに対して、対照群の寿命中央値は121日であった。これは、処置開始後の寿命が20％延びたことを意味する。
【０１０６】
第1の実験では、少数の動物において薬物効果が厳密に統計評価されなかった。動物は、媒質の反復腹腔内注射が不快であるように見え、試験は、観察者に盲検化された厳密な形で行われなかった。従って、これらの制限を克服するために、第2の大規模な試験を行った。NDGAを2500ppm(約40mg/kg摂取量/マウス/日)でAIN93G実験用マウス飼料に配合した。これは、アルツハイマーマウスモデルにおいて有効であると判明したクルクミンの最大濃度の半分に相当する(Limら、2001)。このNDGAを含む飼料または対照飼料を、G93A-SOD1マウスおよび非トランスジェニック同腹仔に90日齢から与えた。治療群が分かっていない観察者は、100日およびその後5日毎に動物を回転棒試験によって試験した。図10Aに示すように、経口NDGAによって回転棒動作が日齢依存的に有意に改善した(反復測定分散分析により、薬物効果についてはp＜0.03；薬物×日齢相互作用についてはp＜0.001)。生存期間もNDGAにより同様に延びた。図10B、(対照動物の死亡日齢中央値=127日；NDGA処置動物の死亡日齢中央値=140日；RR=0.27；ログランク(logrank)分析によりp＜0.01)。飼料に含まれるNDGAの関数として、非トランスジェニックマウスでもトランスジェニックマウスでも体重の変化は観察されなかった。薬物の病理学的作用は剖検で観察されなかった。この13日の寿命の延長は、50日からのリルゾール経口投与で観察される利益の大きさと同じである(Gurneyら、1996)。これは、90日でNDGA処置を開始した後の32％の寿命の延長に相当する。さらなる比較では、NDGAの利益はミノサイクリンで報告された利益(7週齢で投与を始めた時に、急速に進行するG93A-SOD1マウスの寿命を11日延ばす)に似ている(Zhuら、2002)。動物の体重は経口NDGA投与の影響を有意に受けなかった。
【０１０７】
G93A-SOD1マウスは90〜100日齢の間に測定可能な筋衰弱を示すのに対して、明らかな麻痺の徴候は、通常、約115日で認められる。この事象は、マウスの尾部を持って引き上げた時に肢が開く反応の変化を含む、多数の指標によって定義することができる(Gurneyら、1996)。NDGAは、肢の開きの基準により示されるように、明らかな麻痺の発生を有意に遅らせた(表6)。さらに、疾患の麻痺段階(麻痺発生から死亡までの期間)はNDGAの経口摂取によって約40％延び、この効果はわずかに有意であった(p＜0.06；表6)。この試験は、トランスジェニックマウスが非トランスジェニック同腹仔と比較して測定可能な障害を示す時期である90日齢からNDGA処置を開始した点で、G93A-SOD1マウスに行われた大部分の実験とは異なる。とりわけ、投与を遅い時期に始めた時に、ALSマウスにおいて効力を示した他の全身投与薬物は今までに無い。これは、ヒトALSの大部分の形態が散発性であり、予防的処置が現実的ではないので非常に重要な点である。NDGA試験では、薬物によって寿命中央値が13日延びた。これは、リルゾールがG93A-SOD1動物に50日齢から予防投与された時に観察された延長と実質的に同じである(Gurneyら、1996)。
【０１０８】
（表６）G93A-SOD1マウスにおける、明らかな麻痺の発生と疾患の麻痺段階の期間とに影響を及ぼす経口NDGA
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【０１０９】
別の実験では、NDGAを少数のG93A-SOD1マウス群に腹腔内投与した(対照5匹および薬物処置動物5匹；10mg/kg、90日から開始して5日/週)。このパラダイムでもNDGAは生存期間を延ばしたが、ログランク統計は正式に有意ではなかった(処置開始後の寿命中央値=対照動物では31日、NDGA処置動物では37日；ログランク検定によりp=0.074)。回転棒動作は薬物のみの腹腔内投与の影響を有意に受けなかったが、データを反復測定分散分析で分析した時に、薬物×時間相互作用の項は有意であった(p＜0.01)。NDGAの腹腔内投与は、DMSOを媒質に含めた影響を若干受けた。DMSOのみを与えたG93A-SOD1マウスは、これらの動物から通常予想されるものより約10日早く死亡した。ひとまとめにして考えると、このデータは、NDGAには、急速に進行するG93A-SOD1マウスの疾患の予後にプラスの効果があることを強く示している。
【０１１０】
実施例XII
G93A-SOD1マウスにおけるアストログリオーシスおよび小膠細胞増殖を抑制するNDGA
アストログリオーシスは神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)の発現増加を1つの特徴とし、様々なタイプの中枢神経系障害に対する星状膠細胞の同型反応(homotypic response)である(LittleおよびO'Callagha、2001)。アストログリオーシスは、G93A-SOD1トランスジーン発現に関連した主要な組織レベルの表現型である(Hallら、1998；Drachmanら、2002)。シクロオキシゲナーゼII阻害剤の最近の研究から、アストログリオーシスのNSAIDによる抑制がG93A-SOD1マウスモデルにおける予後の改善と相関することが分かっている(Drachmanら、2002)。従って、アストログリオーシスをNDGA投与の関数として免疫化学的に調べた。
【０１１１】
ペントバルビタールを用いてマウスに麻酔をかけ、リン酸緩衝液に溶解した4％パラホルムアルデヒド(peraformaldehyde)を心臓を介して灌流した。腰椎部分(L1-L5)をパラフィン包埋のために処理した。免疫化学を市販の抗体を用いて8mm切片上で行い、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで日常的に対比染色した。ポリクローナル抗SOD1 IgGはケミコン(Chemicon)(Temecula CA)から購入した。ポリクローナル抗5LOX IgGはカイマンケミカル(Cayman Chemical)(San Diego CA)から購入した。モノクローナル抗5LOXはトランスダクションラボラトリーズ(Transduction Laboratories)(Lexington KY)から入手した。神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)に対するポリクローナル抗体はリサーチダイアグノスティックインターナショナル(Research Diagnostics International)(Flanders、NJ)から購入した。小膠細胞表面抗原(Drachmanら、2002)を認識するFITC結合抗F4/80はセロテック(Serotec)(Raleigh NC)から購入した。5LOXウエスタンブロットの正の対照はSL-29線維芽細胞溶解産物(トランスダクションラボラトリーズ、抗体と共に入手した)であった。電気泳動を4〜20％勾配ポリアクリルアミドゲルで行い、バンドを化学発光検出試薬(アマシャム(Amersham))を用いて視覚化した。
【０１１２】
図11に示すように、対照飼料を与えたトランスジェニックマウスと比較して、経口NDGAによって、120日齢G93A-SOD1マウスの腰椎部分におけるアストログリオーシスが有意に減少した。
【０１１３】
小膠細胞増殖は、G93A-SOD1マウスにおける運動ニューロン疾患に固有の別の神経炎症特徴である(Drachmanら、2002)。G93A-SOD1マウス脊髄の小膠細胞を、マクロファージおよび小膠細胞表面抗原F4/80(Drachmanら、2002)に対するフルオロフォア結合抗体を用いて免疫化学的に標識した。120日齢で組織を評価した時に、NDGAの経口投与によって、G93A-SOD1マウス脊髄の腰椎部分におけるF4/80陽性小膠細胞の数が減少した。従って、有益であると推定されるNDGAの効果が、G93A-SOD1マウスにおいて組織レベルならびに行動レベルで観察することができる。
【０１１４】
実施例XIII
G93A-SOD1マウス脊髄において増加する5LOXタンパク質およびメッセージ
NDGAは、分子作用標的に関する演繹的な考え無しで、小膠細胞培養系においてTNFαに拮抗する能力に基づいてG93A-SOD1マウスに投与された。前記で議論したように、NDGAのTNFα拮抗作用は5LOXのみに位置づけられない可能性が高い。それにもかかわらず、5LOXは、NDGAの一般に認められている主な標的である。従って、本発明者らは、5LOX発現がG93A-SOD1トランスジーンの影響を受けるかどうかを調べることにした。ウエスタンブロット分析から、5LOXタンパク質はG93A-SOD1マウス脊髄において80日では5倍上昇、120日では2倍上昇することが分かった。80日と比較して120日で減少しているのは、5LOXを発現するニューロンが消失したことを反映しているかもしれない。同じ試料が12-LOXおよび15LOXに対する抗体でプローブされた時、反応性は本質的に観察されなかった。
【０１１５】
5LOX発現がG93A-SOD1マウスにおいて増加するさらなる確認として、反定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析を、5LOX特異的プライマー対を用いて行った。総RNAを、非トランスジェニック対照およびG93A+/-トランスジェニックマウスの上部脊髄から、TRI試薬(シグマ(Sigma)、St Louis、MO)を用いて、供給されたプロトコールに従って単離した。RNA試料5μgをオリゴ(dT)15を用いて逆転写して、製造業者のプロトコールに従ってAMV逆転写酵素(ロシュ(Roche)、Indianapolis、IN)の存在下で反応を促進した。それぞれの反応が完了したら、TE緩衝液(10mM tris、1mM EDTA、pH8.0)で最終体積50μlまで希釈した。前記のマウスcDNAから309bpの5LOX遺伝子産物を、Taq DNAポリメラーゼ(ロシュ、Indianapolis、IN)2.5単位/反応と、供給された緩衝液、および最終濃度1.5mMのMgCl2、各0.2mMのdNTP、各0.3μMのプライマーを用いてPCR増幅した。最終反応体積は50μlであった。マウス5LOXプライマーは、
2005533042.tif 000012
および
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であった。353bpのPCR産物をもたらすβアクチンプライマー
2005533042.tif 000014
を標準化対照として使用した。PCR増幅サイクルの数は、cDNA初期濃度に対してほぼ直線的な検出可能な産物のバンドが得られるように実験的に求めた。5LOXの場合、最適サイクル条件は94℃ 2分を1サイクル；94℃ 1分、56℃ 1分、および72℃ 1分を27サイクル；72℃ 7分を1サイクルであった。アクチンプライマーの条件は、54℃のアニーリング温度を使用し、24サイクルで行った以外は同じであった。各反応から25μlの試料を2％アガロース/TBEゲルにおいて1.5時間、電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、ヌクレオビジョン(NucleoVision)(ヌクレオテク(Nucleotech)、Westport、CT)画像化装置を用いて写真撮影した。
【０１１６】
図12が示すように、5LOX mRNAは、120日で、非トランスジェニックマウス脊髄と比較して少なくとも2倍増加している。ひとまとめにして考えると、このデータは、5LOXの拮抗が、このマウスモデルにおけるNDGAの有益な効果の一部の説明となっている可能性が高いことを示唆している。
【０１１７】
実施例XIV
インビトロおよびインビボで5LOXに結合するSOD1：SOD1変異によってTNFα-5LOX軸を破壊する機構
ALS研究において最も重要な解明されていない問題の1つが、なぜ、FALSにおけるSOD1変異が散発性ALSの表現型を忠実に再現するのか？ということである。かなりの努力にもかかわらず、散発性ALS患者のSOD1では(遺伝的または翻訳後の)欠陥は発見されていない。従って、変異SOD1は、SALSにおいて同時に機能不全になる1つまたは複数の経路を混乱させる可能性が高い。データは、TNFα-5LOX軸が、FALSおよびSALSでの機能が考慮する価値のあり得る経路である可能性があることを示唆している。変異SOD1の凝集によって引き起こされるタンパク質間相互作用の変化が、この炎症成分または類似の炎症成分に影響を及ぼす可能性があり、従って、SALSでは他の理由によって生じる欠陥を再現すると考えられる。推定されたSOD1-リポキシゲナーゼ相互作用を探求するために、120日齢のG93A-SOD1マウスまたは非トランスジェニック同腹仔からの脊髄溶解産物をポリクローナル抗SOD1 IgG(ケミコン)で免疫沈降した。免疫沈降物を、モノクローナル抗5LOX抗体(トランスダクションラボラトリーズ)でプローブした。非トランスジェニック動物からの溶解産物は、抗5LOXと免疫反応し、5LOX標準と正確に同時移動するタンパク質を含んでいた(図13)。G93A-SOD1マウスからの溶解産物は、このタンパク質を少ししか含まなかった(図13)。トランスジェニックマウス脊髄溶解産物において免疫認識される5LOXの相対的な不足は、トランスジェニック脊髄における高濃度遊離SOD1とLOX結合性SOD1が免疫沈降抗体に対して競合した人為的結果を反映しているのかもしれない。それにもかかわらず、図13のデータは、細胞または組織系におけるSOD1と5LOXとの相互作用の初めての証拠を提供する。今まで、抗5LOXを用いたSOD1の逆免疫沈降は、市販の5LOX抗体が脊髄溶解産物に適用された時に無効であったためにうまくいかなかった。
【０１１８】
インビトロでのタンパク質間結合相互作用の研究を可能にするいくつかの技法を用いて、SOD1と5LOXの相互作用を調べることができる。1つのアプローチでは、BIAcore装置(アマシャムファルマシア(Amersham-Pharmacia)、Upsala、Sweden)を使用する。BIA(生体分子相互作用分析(biomolecular interaction analysis))システムは、タンパク質(リガンド)を共有結合により固定することができる固相支持体からなる。この表面と、第2のタンパク質(分析物)を結合表面全体にわたって分配するマイクロ流体カートリッジを接触させる。分析物と固定リガンドとの接着は表面プラズモン共鳴(SPR)分光法によって測定される。固定化された化学種が液相中の結合パートナーと相互作用するので、表面プラズモン共鳴検出器はセンサー表面の近くでの屈折率変化に反応する。BIAcore装置からのデータ出力は「センサーグラム」(図14A)の形をとる。センサーグラムは、非特異的な結合事象が起こったかどうか評価するために定性的に解釈することができ、または結合親和性を測定するために定量的に解釈することができる。
【０１１９】
先行する実験では、(ヒト赤血球から均一に精製された)ヒト野生型SOD1を、標準的なカルボジイミド結合化学を用いて表面リジン残基を介してBIAcoreチップに共有結合により固定した。ヒト組換え5LOX(カイマンケミカル)をSOD1表面上に通過させた。対照実験では、ウシ血清アルブミン(BSA)を表面上に通過させた。SPR分析から、5LOXと固定SOD1の強い非特異的結合が示された(図14B〜14C)。結合親和性を定量する実験を行った。予備的なスキャッチャード分析からKdの上限値は2×10-5Mと示唆されたが、リガンド固定化は、多くの場合、結合表面への分析物の接近を立体的に妨害する傾向があるので、実際の親和性はさらに強い可能性が高い。代表的なセンサーグラムから、SOD1表面への5LOX結合の非常に遅い解離動態により示されるように、5LOX結合は非常に強いことが分かる(図14C)。実際に、結合5LOXの完全な解離は、解離促進試薬として3M KSCNを使用する標準的な再生条件下では不可能であることが判明した。
【０１２０】
逆の実験では、5LOXをBIAcoreチップに固定し、SOD1を液相分析物として使用した。この配置では、非常に弱い結合が観察された。これらのデータから、5LOXの表面リジンがSOD1の結合に関与しており、その結果、これらの残基がBIAcore表面に結合するとSOD1の接近が阻止されることが分かる。このような現象はBIAcore実験によくあることであり、この技法の1つの限界を示している。
【０１２１】
BIAcore法のこれらの限界を回避するために、固定化5LOXへのSOD1の結合を評価する概念的に異なる戦略を使用した。標準的な96ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートに5LOXを一晩インキュベーションによってコーティングした。これによって、5LOXが主にプレート表面との疎水性相互作用を介して吸着される。対照として、各マイクロプレートの半分にBSAをコーティングした。次いで、プレート全体をBSAでブロックし、その後に、生理食塩水に溶解した様々な濃度のSOD1と1時間インキュベートした。SOD1と5LOXコーティング(またはBSAコーティング)マイクロプレートウェルとの結合は、アルカリホスファターゼ結合抗SOD1ポリクローナルIgGおよび発色団としてp-ニトロフェノールを用いて定量した。図15は、この実験から得られた予備的な結合データを示す。SOD1は5LOXコーティングマイクロプレートに強く結合したが、BSAコーティング表面には結合しなかった。5LOX-SOD1結合親和性を見積もるために、さらなる実験を行うことができる。前のスキャッチャード分析からKd=1.4×10-6Mの推定値が得られた(すなわち、BIAcore推定値より10倍強い)。野生型SOD1に対する5LOXの結合と変異SOD1に対する5LOXの結合の違いを評価する実験も行うことができる。
【０１２２】
実施例XV
アルツハイマー病において調節不全になる5LOX：APP/PS1マウスおよびヒトからのデータ
本発明者らは、5LOXがアルツハイマー病マウスモデルにおいて調節不全になるかどうかを調べた。アミロイド前駆体タンパク質/プレセニリン1(APP/PS1)二重トランスジェニックマウスからの皮質組織を5LOXタンパク質のウエスタンブロットによって調べた。これらのマウスは、12〜16ヶ月齢でアミロイドパチー(amyloidpathy)および認知欠陥を発症する(Morganら、2000)。14〜15ヶ月齢で皮質5LOXは80％上昇するが、これは正式に有意でなかった(図16)。本発明者らはまた、迅速死後プロトコール(rapid postmortem protocol)の下で得られたヒトAD脳組織における5LOX調節不全を調べた。ウエスタンブロットから、AD脳皮質における5LOX発現には非常にばらつきがあったが、5LOXの平均レベルはADでは正常皮質より2.8倍高かったことが分かる(図17)。これらのデータから、5LOXの混乱は、アルツハイマー病を含む複数の加齢性神経変性状態に共通している可能性があることが示唆される。
【０１２３】
実施例XVI
Aβより誘導される神経毒をブロックするNDGA
アルツハイマー病の原因の1つはβアミロイドペプチド(A-βまたはAβ)の蓄積である。Frautschyら(2001)は、潜在的なアルツハイマー治療薬を評価するのに有用なアミロイド誘導性神経毒のラットモデルについて述べている。このモデルでは、アポリポタンパク質担体に吸着されたAβをラットの脳室内(ICV)に注入する。従って、ジカテコール(例えば、小膠細胞阻害剤ノルジヒドログアイアレチン酸)がAβ誘導性神経毒をブロックするかどうかを確かめるために、Frautschyのモデルを使用した。6〜8ヶ月齢の雄成体スプラーグドーリラット(ハルラン(Harlan)、Indianapolis)(体重250〜275グラム)を4つの群に分けた。それぞれの群は、対照飼料またはNDGA添加飼料を与えた6匹のラットからなった(表7)。
【０１２４】
（表７）アルツハイマー病関連アミロイド神経毒に対するジカテコールの効力を試験するための試験の設計
2005533042.tif 000015
【０１２５】
NDGAを2500ppm(飼料の0.25％、約40mg/kg摂取量/ラット/日)で実験用ラット飼料に配合した。前記で説明したように、ラットを八方向放射状迷路(radial eight-arm maze)において訓練した。エラーのレベルが0〜2に達した後に、ラットにカニューレおよび浸透圧ポンプを移植するために外科手術を施した。外科手術の24時間後、ラットの食餌処置を始めた。
【０１２６】
Aβ40およびAβ42ならびにApoE4で処置されたラットは動作の有意な低下を示した。28日目に処置が終了した後、エラーの数は減少していた。NDGAは処置の25日目および30日目にエラー基準値を抑えたが、動物が少数であったために、この違いは有意ではなかった。NDGAはまた25日目での作業記憶エラーの数および潜伏時間を有意に減少させた。(図18)。
【０１２７】
各実験群について6回の試験からの時間スコアおよびエラースコアを分散分析(ANOVA)にかけた。多重比較のためのタキー-クラマー(Tucky-Kramer)検定を事後検定として使用した。記憶作業中の動作を6回全ての試験に関して別々に分析した。
【０１２８】
この試験から、ApoE4担体中のApoE濃度の増加がAβの神経毒作用を増大させるという証拠が得られた。この試験はまた、ApoE-4により誘導されたAβ40＋42ペプチド神経毒性増大に神経炎症が関与していることも裏付けている。いくつかの試験から、アルツハイマー病発症における小膠細胞活性化の証拠ならびにIL1、IL6、およびTNFαの関与が報告されている。このデータは、5-リポキシゲナーゼがAβ(40＋42)＋ApoE-4注入に対する神経毒応答に密接に関与していることを強く示唆している。従って、適切な抗炎症剤(例えば、5LOX阻害剤)がAD患者に治療利益をもたらす可能性があることが提案される。
【０１２９】
実施例XVII
ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病に関連した線条体損傷からのNDGAによる保護
ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病には、脳の黒質および黒質線条体部分の損傷が伴う。これらの部位は、ラットおよびマウスに3-ニトロプロピオン酸(3NP；Bealら、1993)を腹腔内(I.P.)注射することによって選択的に傷つけることができる。これにより、ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病に対する神経保護利益について潜在的な薬物を試験する手段が得られる。従って、本発明者らは、小膠細胞阻害剤ノルジヒドログアイアレチン酸が、ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病に関連した線条体損傷の動物モデルを保護するかどうかを確かめた。
【０１３０】
C57/B6マウスに、特定されているAIN-93G飼料または2500ppmのクルクミンもしくはNDGAを含む同じ飼料を1ヶ月与えた。次いで、マウスに50mg/kg 3NPを、5日間、12時間毎に腹腔内注射した。運動動作を回転棒試験によって毎日評価し、平衡を平衡ワイヤ試験によって評価した。回転棒試験(Hensleyら 2002)では、動物を1rpmで回転する棒の上に置き、動物が棒から落下するまで、棒を1分につき10rpm加速した。平均台試験では、マウスを、尾部を持ってつり下げ、平均台に対して垂直にし、前肢の後に後肢を平均台に置くことによって2cmの平均台に置いた。75cm下の柔らかいクッションに落下するまで、または5分が経過するまで、マウスを平均台の上に置いた。それぞれ2回の試験の最長時間を統計解析に使用した。図19に示すように、経口NDGAは、両試験における機能を有意に改善したが、クルクミンは平衡試験に影響を及ぼさず、恐らく、回転棒試験に悪影響を及ぼした。
【０１３１】
実施例XVIII
TNFαまたは5LOX1いずれかの遺伝的除去によるALSのG93A-SOD1マウスモデルにおける予後の改善
TNFα遺伝子または5LOX遺伝子のいずれかが標的破壊された、十分に特徴付けられているトランスジェニックマウスが存在する。このような2種類のマウス系統とG93A-SOD1マウスを交配させ、子孫の表現型を、生存、運動動作、および麻痺疾患の発症に関して決定することができる(表8)。神経炎症の指標は、G93A-SOD1マウスにおける疾患の神経化学的評価のために以前に最適化されたマルチプローブリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)およびマルチプレックスサイトカインアレイを用いて評価することができる。いずれかの遺伝子の破壊に起因する疾患の発症または進行の任意の遅れが、ALS治療での薬理学的利益のために利用可能な新たな分子標的の確証の構成要素となる。
【０１３２】
（表８）5LOXおよびTNFαノックアウトマウスの遺伝型の概要
2005533042.tif 000016
【０１３３】
動物
表8は作成可能なマウスの遺伝子型の概要である。5LOX遺伝子またはTNFα遺伝子のいずれかが標的破壊された初代マウスを、ジャクソン研究所(Jackson Laboratories)(Bar Harbor、ME)から繁殖用つがいとして購入した。厳密な系統は、5LOXノックアウト動物についてはB6；129S2-ALOX5tm1Fum(Chenら、1994)およびTNFαノックアウト動物についてはB6；129S6-TNFtm1Gk1(Pasparakisら、1996)を含み得る。この2種類のノックアウト動物はホモ接合性の状態で入手することができる。さらに、対照系統として使用するためにB6129SF2/Jマウスを入手することができる。
【０１３４】
TNFtm1Gk1標的変異がホモのマウスは生存能力および受精能力があり、適用される炎症ストレスまたは発癌ストレスの非存在下では明らかな表現型異常を示さない。さらに、肥満のTNFαノックアウトマウスは肥満の野生型マウスと比較してインシュリン濃度が低く、グルコースクリアランス反応に欠陥がある。同様に、5LOX欠損がホモのマウスは生存能力および受精能力があり、明らかな表現型を示さないが、アラキドン酸により誘導される炎症に対して選択的に耐性である(だが、エンドトキシックショックに反応した致死率は野生型マウスの致死率と違いはない)。
【０１３５】
ジャクソン研究所(Bar Harbor ME)から入手し、C57B6/SJL系統においてヘミ接合体として維持したG93A-SOD1マウスを、ホモ5LOX破壊マウスまたはホモTNFα破壊マウスと交配することができる。F1子孫の遺伝子型を、変異SOD1トランスジーンに関して、および適宜、5LOXまたはTNFαに関して決定することができる。生存および麻痺発生パラメータをG93A-SOD1陽性F1マウスにおいて詳細にモニターすることができる。5LOXまたはTNFαに関してヘテロであり、変異SOD1トランスジーン陽性の同腹仔を、ホモTNFαマウスまたはホモ5LOXマウスと戻し交配することができる。結果として得られたG93A-SOD1陽性でホモTNFα欠損またはホモ5LOX欠損のF2世代メンバーを、運動機能、生存、および麻痺発生の基準について詳細に評価することができる。
【０１３６】
第3の交配プロトコールでは、G93A-SOD1マウスとB6129SF2/Jマウスを交配し、F1世代のG93A-SOD1陽性メンバーとB6129SF2/J親系統を戻し交配することができる。G93A-SOD1陽性であり、TNFαおよび5LOXに関して野生型のF2子孫を、対応するノックアウト動物の対照として使用することができる。
【０１３７】
適切な遺伝子型の全ての動物を40日齢で回転棒試験において訓練し、(前記で述べたように)死亡するまで、または試験を行うことができなくなるまで週間隔で評価することができる。回転棒試験は、市販の装置(コロンバスインスツルメンツ(Columbus Instruments))を用いて行うことができる。動物を、最初1rpmで長軸を中心にして回転するように設定した水平の棒の上に置いてもよい。回転速度を10秒毎に1rpmの一定速度で上げ、動物が棒から落下するまで実験を続けることができる。それぞれの動物を、それぞれの試験期間で3回の試験で評価することができる。それぞれの試験期間で、動物の体重も記録することができる。麻痺発生は、遺伝子型の分類について盲検化された観察者によって判断される、肢を開く反応の変化によって特定することができる(Gurneyら、1996)。回転棒試験を行うことができなくなった時に、または横向きにして10秒以内に起き上がることができなくなった時に、動物を殺傷することができる(Gurneyら、1996)。
【０１３８】
統計
最低20匹のF2動物をそれぞれの交配計画において使用することができる。生存パラメータは、古典的なログランク法(マンテル-ヘンゼル(Mantel-Haenszel)およびカプラン-マイヤーズ(Kaplan-Meiers)統計)を用いて統計的に評価することができる。回転棒動作の測定は反復測定分散分析を用いて比較することができる。麻痺発生データおよび麻痺段階期間(発生から死亡までの期間)は、標準的なt検定およびマン-ホイットニー(Mann-Whitney)検定(データが通常のガウス分布に従わない場合)を用いて統計的に比較することができる。全ての統計作業は、GraphPad Prism(商標)統計応用ソフトウェア(グラフパッド(GraphPad Inc.)、San Diego CA)を用いて行うことができる。
【０１３９】
アポトーシスおよび神経炎症についてのリボヌクレアーゼ保護アッセイ
前記で述べたように、G93A-SOD1マウスは神経変性の間に神経炎症の特徴を示す。本発明者らは、マルチプローブリボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)を用いて、このタイプのプロセスをmRNAレベルでモニターすることにかなりの成功を収めている。RPA法を用いると、12種類までのサイトカインまたはアポトーシスに関連したmRNA種のパネルを同時に定量することができる。サイトカインに関しては、以下のプローブ：IL1α、IL1β、IL1RA、IL2、IL4、IL10、IL18、MIF、IFNγ、TNF-RI、TNFαを含めることができる。マウス脊髄におけるアポトーシスを指標化することに関しては、カスパーゼおよび他のアポトーシス関連タンパク質(カスパーゼ1、2、3、6、7、8、11、および12；Fas、fas-リガンド、bcl、bax)の発現を確かめるためにRPAを使用することができる。脊髄組織(脊髄の下部1/2)を、ダンス型ホモジナイザーを用いてTRIzol(商標)mRNA単離試薬(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、Gaithersburg MD)中で溶解することができる。結果として生じた抽出物に含まれる総RNAを分光測定によって260nmで定量することができる。アポトーシス関連RNA種のパネルは市販のマルチプローブリボヌクレアーゼ保護アッセイシステム(Riboquant(商標)、ファーミンゲン(Pharmingen)、San Diego、CA)を用いて検出することができる。放射性標識プローブは、T7 RNAポリメラーゼプロモーター(ファーミンゲン、San Diego、CA)を含むDNAテンプレートから合成することができる。テンプレートを100μCi[γ-32P]UTPの存在下で転写して、各mRNAに対する特定のサイズの放射性プローブを得ることができる。プローブを5〜10μgの総RNAとハイブリダイズさせ、次いで、一本鎖RNAを消化するためにRNAseAおよびT1で処理することができる。無傷の二本鎖RNAハイブリッドを5％ポリアクリルアミド/8M尿素ゲルで分離することができる。乾燥したゲルを、ホスホルイメージャー(phosphorimager)(モレキュラーダイナミクス(Molecular Dynamics)、Sunnyvale CA)を用いて現像し、バンドを、装置に付属しているデンシトメトリーソフトウェア(ImageQuant(商標)、モレキュラーダイナミクス)を用いて定量することができる。各試料に含まれる各アポトーシス関連mRNAバンドの密度をL32＋GAPDHバンドの合計で割る。同じ組織を、8種類の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカイン(インターロイキン1α、1β、IL6、IL8、IL10、IL12、IFNγ、IL1受容体アンタゴニスト)の存在について別個に調べることができる。各RPAは、以下の各群から5匹の動物を比較することができる：基本飼料を与えたG93A-SOD1動物対添加飼料を与えたG93A-SOD1動物；および基本飼料を与えた非トランスジェニック動物対添加飼料を与えた非トランスジェニック動物。
【０１４０】
サイトカインタンパク質発現アレイ
新規のマイクロビーズおよび流れに基づくタンパク質検出システムを用いた同時マルチプレックス形式(Bio-Plex(商標)システム、バイオラドラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories Inc.))において、脊髄溶解産物を17種類のサイトカインおよびケモカインについて分析することができる。この定量アッセイシステムでは、マイクロキャリアビーズを、識別可能な黄色-緑色蛍光最大を有する3つ一組のフルオロフォアでコード化する。3つの標識の割合は正確に制御することができるので、計器による方法で分離可能な一連の17種類の異なるマイクロビーズ集団を作成することができる。17種類のマイクロビーズはそれぞれ、サイトカインまたはケモカイン標的に対する特異的抗体に結合される。試料のアリコートをマイクロビーズ混合物とインキュベートする。次いで、ビーズを遠心分離によって分離し、洗浄し、フィコエリトリン結合二次抗体で標識する。バイオプレックスシステムの使用には、個々のマイクロビーズの個々のスキャニングおよび識別が可能なように、流体工学、レーザー励起、蛍光検出、およびデジタル信号処理を取り入れている。それぞれのビーズは、その固有の蛍光サインに基づいて個々に識別され、ビーズと結合しているフィコエリトリンレポーターシグナルが定量される。17種類の標的のそれぞれにつき最低100個のマイクロビーズが各試料において分析される。脊髄溶解産物の全ての試料を3回繰り返してアッセイすることができる。それぞれの標的サイトカインおよびケモカインの観察された濃度は、適切な一組の組換えマウスサイトカインおよびケモカインの内部標準曲線に基づいて決定することができる。
【０１４１】
神経膠症の組織化学的評価
神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)に対する蛍光標識モノクローナル抗体を用いて神経膠症を組織化学的に評価するために、動物をペントバルビタール注射によって殺傷し、生理食塩水を灌流し、脊髄を取り出し、処理することができる。この手順はG93A-SOD1マウスにおける神経膠症を指標化するのに使用されており(Drachmanら、2002)、COXII阻害剤セレコキシブの経口投与に反応する(Drachmanら、2002)。従って、GFAPは、実験用抗炎症薬物に対するG93A-SOD1マウス神経系の反応を評価するための実証されたマーカーである。連続切片のGFAPを染色し、切片1枚当たりのGFAP陽性細胞の数を、試料が何であるのか分かっていない観察者によってスコア付けすることができる。
【０１４２】
タンパク質酸化アッセイ
脊髄、脳、および末梢組織の組織ホモジネートを、ビオチンヒドラジド法(40)を用いてタンパク質カルボニル含有量についてアッセイすることができる。ホモジネートは、0.1％tritonX-100および哺乳動物プロテアーゼインヒビターカクテル(シグマ)を含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)に溶解して作成する。ローリー法の後に、試料を2mg/mLタンパク質に調整し、20mM MES(pH5.5)と1：1で混合する。これらの試料に、DMSOに溶解した50mMビオチンヒドラジド(モレキュラープローブス(Molecular Probes)、Eugene OR)を1/10体積で添加する。試料を穏やかに攪拌しながら37℃で一晩(16時間)インキュベートする。次いで、試料を4〜20％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ(バイオラド(BioRad))を用いてブロットする。
【０１４３】
ロイコトリエン産物アッセイ
脊髄溶解産物に含まれるロイコトリエンA4、B4、C4、D4、およびE4は市販のELISA装置(カイマンケミカル、San Diego CA)を用いてアッセイすることができる。全脊髄溶解産物をアッセイ直前に調製する。標準的な溶解緩衝液は、10mM酢酸ナトリウム(pH7.4)、0.1％tritonX-100、およびアラキドン酸の人為的酸化を妨げる酸化防止剤として0.5mMブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)を含む。TNFαおよび5LOXの両方に関して野生型である120日齢G93A-SOD1動物からの溶解産物と、TNFαまたは5LOXが遺伝的に除去されているG93A-SOD1動物からの溶解産物を比較する。
【０１４４】
5LOXおよびTNFα欠損動物におけるSOD1コピー数の評価
前記で概説した交配計画によって、5LOXおよびTNFα欠損動物では変異G93A-SOD1トランスジーンの発現が減少する可能性があることが考えられるが、この可能性は低い。これは、遺伝子除去の保護利益についての平凡な説明であろう。このような人為的結果を調べるために、各遺伝子型の120日齢動物からの脊髄溶解産物を、ヒトSOD1に特異的なモノクローナルIgG(シグマケミカル(Sigma Chemical))を用いたウエスタンブロット法によって調べることができる。さらに、ヒトSOD1のmRNA転写物をノーザンブロット法によってモニターすることができる。
【０１４５】
実施例XIX
3種類の5LOX阻害剤(NDGA、クルクミン、およびジレウトン)によるG93A-SOD1マウスの予後の改善
以前のデータは投与を90日で始めた時のNDGAの利益を示したが、TNFαおよびその受容体TNF-RIは両方とも約80日齢から有意にアップレギュレートされる。さらに、5LOXは80日齢で増加する。従って、5LOXがALSの早期発症に関与していれば、5LOXアンタゴニストを疾患の初期に投与すれば利益が改善するはずである。従って、現在、臨床で使用することができないNDGAと、クルクミン(カレー香辛料ターメリックに由来する植物天然産物/代替医療/栄養剤(nutraceutical agent))およびジレウトン(ザイフロー、現在、喘息治療に用いられている臨床で使用可能な5LOXアンタゴニスト)とを比較する。
【０１４６】
飼料および運動動作の評価
標準的なAIN93Gげっ歯類用飼料は、4種類のやり方の1つで配合することができる(ダイエッツ(Dyets、Inc.)、Bethlehem PA)。配合1は薬物を含まない標準飼料である。配合2は0.25％NDGAを含む。配合3は0.25％クルクミンを含む。配合4は0.1％ジレウトンを含む。トランスジェニックマウスを50日齢で回転棒試験し、60日齢で4種類の飼料のうちの1つの上に置く。最低20匹の動物を、それぞれの飼料の上に置くことができる。回転棒試験は、処置群について盲検化された技術者によって週間隔で3回繰り返して行うことができる。それぞれの試験期間で動物の体重を記録する。回転棒試験を行うことができなくなった時に、または横向きにして10秒以内に起き上がることができなくなった時に、動物を殺傷する。薬物処置群間の統計的な差は、横断面時点での反復測定分散分析(ANOVA)とスチューデントt検定を用いた事後検定を用いて評価することができる。生存曲線は、ログランク法(マンテル-ヘンゼルおよびカプラン-マイヤーズ統計)によって分析することができる。全ての統計作業は、GraphPad Prism(商標)統計応用ソフトウェア(グラフパッド、San Diego CA)を用いて行うことができる。
【０１４７】
サイトカイン転写、タンパク質酸化、およびロイコトリエンのアッセイ
炎症性サイトカイン産生に及ぼす様々な飼料の影響を評価するために、前記のRPA法を使用することができる。腰仙脊髄組織をRPA分析に使用することができ、その一方で、対応する頚椎胸椎脊髄を、もう一度、前記の方法に従ってタンパク質酸化研究に使用することができる。それぞれのアッセイでは、120日齢の薬物処置G93A-SOD1動物と、薬物が添加されていない基本飼料を与えた対応するG93A-SOD1動物を比較する。生化学分析のために、最低5匹の動物をそれぞれの群に含めることができる。
【０１４８】
脊髄溶解産物に含まれるロイコトリエンA4、B4、C4、D4、およびE4は、市販のELISA装置(カイマンケミカル、San Diego CA)を用いてアッセイすることができる。全脊髄溶解産物をアッセイ直前に調製する。あるアッセイでは、ロイコトリエン産生に及ぼすG93A-SOD1トランスジーン発現の影響を評価するために、80日齢または120日齢の未処置G93A-SOD1動物と、同じ日齢の非トランスジェニック同腹仔とを比較する。別の実験では、中枢神経系内のロイコトリエン産生に対する数種類のリポキシゲナーゼ阻害剤の効力を試験するために、薬物処置G93A-SOD1動物と、薬物を含まない基本飼料を与えた動物とを比較する。
【０１４９】
さらに、同じロイコトリエンELISAアッセイを、前記と同じマウスに由来する皮質ホモジネートおよび血漿に適用することができる。これにより、それぞれの薬物がLOX活性をインビボで阻害するのに十分な濃度で中枢神経系に入ったかどうかを確かめることができる。
【０１５０】
ロイコトリエンの中には不安定なものもある場合があり、定常状態での濃度が、利用可能なELISAアッセイの検出限界より低い可能性がある。この場合、アラキドン酸および2mM CaCl2を脊髄溶解産物に添加することによって、LOX活性それ自体を測定することができる。結果として生じるLTA4、LTB4、およびLTC4の形成をELISAによって測定することができる。
【０１５１】
神経膠症の組織化学的評価
前記のように行うことができる。
【０１５２】
SOD1コピー数の評価
薬物処置によって、変異G93A-SOD1トランスジーンの発現が低下する可能性がある。これは、LOX阻害剤の保護利益についての平凡な説明かもしれない。このような人為的結果を調べるために、それぞれの薬物処置からの120日齢動物(未処置動物を含む)に由来する脊髄溶解産物を、ヒトSOD1特異的モノクローナルIgG(シグマケミカル)を用いたウエスタンブロット法で調べる。さらに、ヒトSOD1のmRNA転写物をノーザンブロット法によってモニターすることができる。
【０１５３】
実施例XX
TNFαシグナル伝達の5LOXによる調整の確認
本発明者らは、5LOXがTNFαシグナル伝達を調整するかどうか、およびTNFα経路を介したシグナル伝達がSOD1変異によって混乱しているかどうか確かめるために、野生型、G93A-SOD1、および5LOXノックアウトマウスに由来する初代小膠細胞培養物および初代星状膠細胞培養物を調べた。
【０１５４】
適切な遺伝子型の膠細胞をTNFαで処理し、活性化を、NO2-流出によって；p38 MAPおよびJNKキナーゼのリン酸活性化(phospho-activation)によって；ならびにサイトカインプロファイル分析によって評価する。これにより、TNFαに反応した5LOXのリン酸活性化をNDGA化合物が妨げるかどうかを確かめることによって、NDGAの作用機構をさらに調査することができる。
【０１５５】
初代小膠細胞培養物および初代星状膠細胞培養物
初代マウス小膠細胞は、以前に述べられた方法を改良することによって混合星状膠細胞-小膠細胞培養物から継代培養することができる(ColtonおよびGilbert、1987；Coltonら、1994；Chanら、2001；Chaら、2000；Chaoら、1992)。簡単に述べると、新皮質を4〜6日齢の仔から無菌条件下で取り出し、大きな血管を取り除く。次いで、組織をCa++/Mg+を含まない冷HBSS緩衝液ですすぎ、次いで、磨砕する。細胞を75cm2フラスコに入れ、50％ダルベッコ改変必須培地(DMEM)および50％F12培地(10％熱不活化胎仔ウシ血清、10％L929線維芽細胞条件培地(コロニー刺激因子の供給源)、1％グルタミン、ならびに1％ストレプトマイシンおよびペニシリンを含む)で106/mlに調節する。播種後に、培地を定期的に補充する。細胞を最初に播種した2〜4日後に、軌道振盪(orbital shaking)によって小膠細胞を星状膠細胞から精製する。軌道振盪の後、星状膠細胞はプレートに付着したままであるが、小膠細胞は分離して培地の中にあり、再播種される。このプロセスによって、本質的に純粋な小膠細胞培養物が樹立される(ColtonおよびGilbert、1987；Coltonら、1994；Chanら、2001；Chaら、2000；Chaoら、1992)。培養物の純度は、小膠細胞を同定するにはフルオレセイン結合抗OX-42抗体を用いた免疫細胞化学によって、星状膠細胞を同定するにはローダミン結合抗神経膠線維タンパク質(GFAP)抗体を用いた免疫細胞化学によって日常的に評価することができる。初代膠細胞培養物は、非トランスジェニックマウスから、または機能的なTNFα遺伝子および5LOX遺伝子を有するG93A-SOD1マウスもしくは機能的なTNFα遺伝子および5LOX遺伝子を欠くG93A-SOD1マウスから調製する。初代星状膠細胞は、前記のように軌道振盪して小膠細胞を取り出した後に付着星状膠細胞から調製する(Robinsonら、1999)。
【０１５６】
膠細胞培養物の刺激
細胞(星状膠細胞または小膠細胞)を、20ng/mLならびに段階1/2希釈(最終濃度20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、および0ng/mL；必要に応じて変更する)の組換えマウスTNFα(カルビオケム(Calbiochem))で刺激する。24時間で、培地に含まれる亜硝酸イオンを、標準的なグリースアッセイ(Physician's Desk Reference、2002；McGeerおよびMcgeer、2001)を用いて測定する。ROS産生は以下のように測定する。さらに、p38-MAPキナーゼおよびJNK経路の活性化を、2種類のMAPキナーゼに対するリン酸化状態特異的抗体(ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs))を用いたイムノブロット法によって評価する。
【０１５７】
用量反応曲線を、それぞれの終点について、細胞遺伝子型間(G93A-SOD1対非トランスジェニック、両方とも5LOX+/+対5LOX-/-の形)で比較する。用量反応曲線の各対の統計的な差を、TNFα投与量および細胞遺伝子型が独立した因子とみなされる2因子分散分析によって求める。5LOXを欠く細胞がTNFα刺激に反応しないことが判明すれば、除去された5LOX経路を迂回することによって反応性を回復させるために、外因性アラキドン酸または個々のロイコトリエンを適用する実験を行うことができる。
【０１５８】
RNSおよびROS産生の評価
培地を細胞から取り出し、NO2-濃度を、比色グリースジアゾ化アッセイ(Physician's Desk Reference、2002；McGeerおよびMcGeer、2001)によってアッセイする。3-NO2-Tyrおよび3,3'-diTyrについては、他の培地アリコートを、以前に最適化された方法を用いるHPLCと電気化学アレイ検出によって分析する(Hensleyら、1998a；Williamsonら、2002)。O2・-は、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)を青色ジホルマザン(比色分析によって660nmで検出される)に還元する能力として測定される(Hensleyら、1998b)。これらのアッセイのために、NBT還元を1000U/mLウシ赤血球SOD1の存在下および非存在下で測定し、SOD1で阻害されるNBT還元を用いて、O2・-を測定する。還元標的としてアセチル化チトクロムC(Ac-CytC)を用いて、同様のアッセイを行うことができる。この場合、還元されたAc-CytCは555nmでモニターされる。別の実験では、ROS産生は、蛍光原基質である二酢酸ジクロロジヒドロフルオレセイン(H2DCFDA；Woo、2000)の過酸化物依存性酸化による蛍光シグナルの変化として評価することができる。DCF分析は、96ウェルマイクロプレート形式ならびにFACSに基づく方法を用いて行うことができる。ラジカルの正体についての最終的な確認として、電子常磁性共鳴(EPR)スピントラッピング実験を、スピントラップとして5,5-ジメチル-ピロリン-N-オキシド(DMPO)を使用して行う。本物のスーパーオキシドは、キサンチン/キサンチンオキシダーゼ共役系を用いて産生することができる。さらに、付着した小膠細胞を溶解し、タンパク質を、3-NO2-Tyrに対する抗体を用いたウエスタンブロットにかける。別個に、同じ溶解産物をビオチンヒドラジドで誘導体化してタンパク質カルボニルを標識し、その後に、タンパク質カルボニルを、前記のようにストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する。全てのブロットを、強化化学ルミネセンス(ECL)を用いて発色させる。
【０１５９】
p38-MAPKおよびJNK経路の評価。TNFαシグナル伝達を示すさらなるパラメータとして、p38-MAPKおよびJNK経路のリン酸活性化を評価することができる。簡単に述べると、非トランスジェニックマウスおよびG93A-SOD1マウス(5LOX+/+または5LOX-/-条件)に由来する膠細胞培養物を組換えマウスTNFαで刺激する。細胞を24ウェル形式で刺激する。TNFαの濃度は段階1/2希釈で40ng/mL〜2.5ng/mLである(一濃度につき4個のウェル)。細胞を、刺激して5分後、10分後、20分後、30分後、および60分後に溶解する。標準的な溶解緩衝液は、10mM酢酸ナトリウム(pH7.4)、0.1mMオルトバナジン酸塩、およびβグリセロリン酸(ホスファターゼ活性およびキナーゼ活性を阻害するため)、ならびに哺乳動物プロテアーゼインヒビター(シグマケミカル)を含む。ウェスタンブロッティングは、リン酸化したp38およびJNKに特異的な抗体、またはリン酸化していないエピトープに対する抗体(ニューイングランドバイオラボ)を用いて行う。さらに、JNK活性は、プルダウンキナーゼアッセイ(ニューイングランドバイオラボ)を用いて評価する。遺伝子型の関数として刺激動態の差を評価することができる。
【０１６０】
それぞれの経路のTNFα刺激に最適な時間および投与量パラメータが求められると、別の実験において、G93A-SOD1膠細胞および非トランスジェニック膠細胞(両方とも5LOX+/+または5LOX-/-遺伝子型)を直接比較することができる。刺激感受性の差を求めるために、4種類の遺伝子型を横に並べて刺激し、溶解し、同じ膜上にブロットすることができる。この実験を繰り返し、データを、ペアワイズt検定を用いて統計的に評価することができる。G93A-SOD1細胞と非トランスジェニック細胞との間で有意な差が観察されれば、この後に、野生型SOD1を発現する膠細胞と、G93A-SOD1を発現する膠細胞とを比較する実験を行うことができる。これによって、SOD1過剰発現の非特異的な影響が調整され、SOD1変異それ自体が膠細胞のTNFα経路を破壊したかどうかはっきりと確かめることができる。
【０１６１】
リボヌクレアーゼ保護アッセイによるサイトカイン転写分析
リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)は、初代星状膠細胞および混合膠細胞培養物における酸化還元感受性サイトカイン発現をモニターするのに以前より用いられている(Gabbitaら、2000)。TNFαで刺激されたサイトカイン遺伝子発現の変化における変異SOD1および5LOXの役割を確かめるために、この同じ技法を使用することができる。非トランスジェニックマウスおよびG93A-SOD1マウス(5LOX+/+または5LOX-/-条件)に由来する混合星状膠細胞/小膠細胞培養物を組換えマウスTNFαで刺激する。リボヌクレアーゼ保護アッセイ(RPA)のために、細胞を刺激して2時間後、4時間後、および6時間後に溶解する。4種類全ての遺伝子型(G93A-SOD1および非トランスジェニック、5LOX+/+または5LOX-/-)を、同じRPAの中で、それぞれの時点で比較する。各処理につき最低4個のウェルを使用し、RNAをプールすることができる。サイトカイン濃度の差は、ホルホルイメージデンシトメトリーとANOVAおよび事後t検定によって評価することができる。
【０１６２】
5LOXのリン酸活性化に及ぼすNDGA、ジレウトン、およびクルクミンの影響
前述したように、NDGAは5LOXのリン酸活性化ならびにこの酵素の触媒活性を阻害する可能性がある。これが本当であるかどうかを確かめるために、および5LOXアンタゴニストであるジレウトンおよびクルクミンが同様に作用するかどうかを確かめるために、以下の実験を行うことができる。EOC-20細胞または初代混合膠細胞培養物を、最低IC100濃度のアンタゴニストの存在下(または非存在下)で、20ng/mLのTNFαで刺激する。5〜15分後、細胞を溶解し、抗ホスホチロシン抗体または抗ホスホセリン抗体(トランスダクションラボラトリーズ)で免疫沈降する。免疫沈降物を抗5LOXに対してブロットする。逆の実験では、溶解産物を抗5LOXで免疫沈降し、抗ホスホチロシン抗体または抗ホスホセリン抗体でプローブする。
【０１６３】
G93A-SOD1発現細胞の対照として非トランスジェニック細胞および野生型ヒトSOD1発現細胞を使用する場合には、トランスジェニックタンパク質の過剰発現によって、疾患病理と関係なくシグナル伝達が変化する可能性があると考えられる。幸運なことに、G93A-SOD1マウスと同等のレベルで野生型ヒトSOD1を発現するトランスジェニックマウスを使用することができる。これらの動物は、サイトカイン発現分析用の対照として以前に用いられており(Hensleyら、2002)、非トランスジェニック動物と野生型ヒトSOD1発現動物との間で意味のある差は見出されなかった。これに関して、ALSマウスの大部分の研究はかなり一致している。一般的に、非トランスジェニックマウスおよび野生型ヒトSOD1発現マウスは対照動物として区別なく用いられる。
【０１６４】
実施例XXI
ALS患者における疾患発症または進行と炎症性サイトカインまたはロイコトリエン濃度との相関関係
本発明者らは、ALS患者の血漿および脳脊髄液における炎症性サイトカインまたはロイコトリエン濃度が変化するかどうか、これらの変数が疾患の発症または進行と相関するかどうかを確かめた。17種類のサイトカインおよびケモカインの濃度を同時に測定するためにマルチプレックス抗体アレイを使用し(表9)、その一方で、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンをアッセイするために従来のイムノアッセイを使用する。他のバイオプレックスアレイもこの試験に取り入れることができる。この試験では、ヒト被検者における神経炎症仮説を実証し、潜在的なALS治療薬の臨床研究を早めるのに使用することができる神経炎症の特異的な代理生化学マーカーを特定する。
【０１６５】
（表９）G93A-SOD1マウス脊髄におけるサイトカインのタンパク質濃度変化
データは1群につき8匹(120〜130日齢)のマウスの平均±SDを示す；＊P＜0.05
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【０１６６】
5LOX-TNFα軸がSOD1変異マウスにおけるALS病因の意味のある成分として関与するかどうか、データをさらに裏付けるために、ALSに罹患したヒト被験者の評価を用いることができる。この評価を行う最も簡単な手段は、ヒトCNSおよび末梢組織におけるロイコトリエン濃度、5LOX、およびTNFαを測定することである。実際には、TNFαおよび可溶性TNF-RIは、ALSに罹患したヒトに由来する血清中であまり増加していないことが判明している(Poloniら、2000)。ロイコトリエン濃度は十分に測定されておらず、臨床パラメータと相関付けられてもいない。大部分の他のサイトカインおよびケモカインも同様であった。
【０１６７】
臨床ALS試料および臨床パラメータ
ALS患者から血漿および脳脊髄液(CSF)を集め、保管することができる。集められた試料は分析するまで-80℃で保存することができる。ALS患者は、疑い、確定、散発性ALS、または家族性ALSと臨床診断され、18歳より上でなければならない。対照被験者には、標準的な臨床徴候のために腰椎穿刺をしなければならない。対照被験者は、特にこの試験のために脊椎穿刺を受けない。全ての被験者から自発的に説明と同意が得られ、説明と同意を得ることができなければならない。過去の患者獲得の割合および現在の人口調査に基づいて、200人以上のALS患者を5年間にわたって分析しなければならないと概算された。患者の呼吸能力(努力肺活量、FVC)および生活水準指標(ALSFRS、以下に記載)を日常的に(2ヶ月間隔で)評価する。全ての患者の生存を追跡する。
【０１６８】
臨床評価のためのプロトコール/計器
各患者のベースラインでの包括的な評価およびそれぞれの追跡調査訪問を完全なものにすることができる。発症年齢、発症日、発症部位、性別、家族歴、実験薬およびビタミンを含む薬剤、ならびに過去の病歴が得られる。疾患進行の速度を評価するために、肺機能(努力肺活量、FVC)およびALS機能評価基準(ALSFRS)スコアの測定値を、それぞれの訪問で得ることができる。両方の測定値とも疾患重篤度および生存と非常に相関関係がある(Andresら、1987；Andresら、1988)。ALS機能評価基準(ALSFRS)は、広く認められている機能評価試験である。これは、10種類の機能活動の能力および非依存性の患者評価を決定するために用いられる、迅速に行われ(5分)、順位で表した評価基準(評価0〜4)である。10種類全ての活動がALSに関連している。Tufts Quantitative Neuromuscular Examination(Cedarbaum、1996；Cedarbaumら、1994)により測定されたように、ALS患者におけるALSFRSスコアの変化がある期間にわたる強さの変化と相関関係があることを記録することによって、初期の妥当性が証明された。
【０１６９】
対照試料：「正常」、「非神経学的疾患」、および「神経学的疾患」比較群
ALS血漿は、(1)ALS対象と年齢が一致した「正常」非罹患個体；(2)神経学的障害が認められない、または顕著な全身性炎症を引き起こす可能性の高い状態が認められない、実際に入院している(すなわち、病気の)患者；(3)アルツハイマー病またはALSとは異なる他の神経障害を有し、重篤な急性の末梢性疾患に罹患していない患者；から採取された3つのタイプの対照組織と比較することができる。さらに、敗血症または重篤なリウマチ障害などの明らかな炎症状態に罹患している患者から組織を集める取り組みを行うことができる。これらは、一種の正の対照集団に相当する。血漿分析のために、200人までのALS被験者および200人の対照被験者を標本抽出することができる。さらに、脳脊髄液については、150人までのALS被験者および150人の神経学的疾患(非ALS)被験者を標本抽出することができる。
【０１７０】
ELISAアッセイ
主要なロイコトリエン(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)(全てカイマンケミカル、San Diego CAにより製造されている)および主要なプロスタグランジン(比較用)PGE2(これもカイマンケミカルにより供給されている)の競合酵素結合免疫測定法(ELISA)は市販されている。このようなELISAは、正常血漿ならびに敗血症のヒトおよび動物に由来する血漿に含まれるエイコサノイドメディエーターについて評価されている。ELISAの感度は、正常ヒト血漿中のシステイニルロイコトリエンの基準濃度を測定するのに十分であり、敗血症の間に明らかな上昇が観察される(Quinnら、1996)。さらに、ELISAは、TNFαおよびC反応性タンパク質(CRP、古典的な炎症状態ではほとんど例外なく上昇する主要な急性期反応物)の定量に使用することができる。
【０１７１】
バイオプレックスアレイを用いたサイトカインプロファイル分析
バイオプレックス技術は本明細書で説明されている。このマイクロビーズに基づく抗体アレイシステムを用いると、0.2mLという少量の試料を用いて、17種類のサイトカインおよびケモカインを同時に定量することが可能になる。血漿およびCSFにおけるサイトカイン/ケモカインプロファイルのバイオプレックス分析をALS集団および比較集団に対して行うことができる。表9に列挙したマウス種と同一のまたは類似する炎症誘発性および抗炎症性サイトカインおよびケモカインに対応するヒト特異的抗体セットを使用することができる。アッセイされる特定の分析物は、TNFα、TNF-RI、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、IL7、IL10、IL12p70、IL13、IL17、GCSF、GM-CSF、IFNγ、MCP1、およびMIP1βである。この取り組みは古典的なELISAアッセイからのデータと組み合わせた時に、定義された神経学的疾患に罹患している調べが良くついた個体群における今日までで最も完璧な炎症生物マーカーの調査になる。
【０１７２】
統計解析：データ前処理および品質管理
それぞれのアッセイから得られたデータを、ALS集団と比較集団との統計的な差について分析する。この比較は、保存期間の関数として分析物の分解によって妨げられる可能性がある。この可能性を評価するために、いくつかの作戦を使用することができる。第1に、ロイコトリエン標準を新鮮な正常血漿(またはCSF)に加え、アリコートを-80℃で様々な期間(0日、1週間、2週間、1ヶ月、2ヶ月、4ヶ月、8ヶ月、1年、2年)保存することができる。これらの加えられた試料は保存安定性を確かめるために定期的にアッセイすることができる。分析物の分解が確認されれば、一般的な一次運動モデルおよび二次運動モデルにおいて劣化速度を評価することができる。次いで、臨床試料からのデータを収集日および保存期間の知識に基づいて補正することができ、この後に、群間の統計的な差を評価することができる。
【０１７３】
保存期間による人為的結果を補正する第2の作戦では、それぞれの群(正常およびALS)からの生ELISAデータを、個々の試料の保存期間に対して回帰分析することができる。いくつかの分析物の試料劣化の時間依存性がもしあれば、それを確かめるために、一般的な最小二乗曲線フィッティングを使用することができる。有意な保存期間相関関係を補正するために、データをそれに応じて再度変換することができる。最終的な品質保証のための測定として、ある1つの基準試料を臨床試料の各群と共に繰り返して分析することができる。これにより、アッセイ間のばらつきの測定が可能になる。
【０１７４】
群特異的な差の統計解析
いくつかの群(ALS、「正常」対照、神経学的疾患対照、および非神経学的疾患対照)の間の疾患特異的な差は、一般化された分散分析(ANOVA)法を行い、その後に、適切な事後分析(主に、ボンフェローニ(Bonferonni)法およびマン-ホイットニー検定)を行うことによって評価することができる。統計解析はGraphPad Prism(商標)統計解析ソフトウェア(グラフパッド、San Diego CA)および必要に応じて他の市販のプログラムを用いて行うことができる。
【０１７５】
生化学測定値と臨床パラメータの相関関係
疾患経過全体にわたってALS患者から試料が得られたので、生化学的変数と臨床パラメータ(例えば、試料収集時のFVCおよび病気の期間)との関係を調べることが可能である。これらの相関関係の統計的有意性を、スピアマン(Spearman)順位検定(ノンパラメトリック)およびピアソン(Pearson)相関分析(パラメトリック)を用いて評価することができる。これにより、臨床状態を最も予測する生化学的変数の特定が可能になる。ALS患者によるNSAIDまたは他の薬物の使用と関連した分析物濃度のどの変化も確認するように注意する。
【０１７６】
さらに、ロイコトリエンの末梢濃度からCNSにおける濃度が予測できるかどうか確かめるために、同じ患者から得られた血漿データおよびCSFデータの統計相関を評価することができる。これにより、ALS治療薬の将来の臨床試験における中間エンドポイントとして利用することができる神経損傷の代用マーカーを特定することが可能になる。全ての相関および回帰分析を、GraphPad Prism(商標)統計解析ソフトウェア(グラフパッド、San Diego CA)を用いて行うことができる。
【０１７７】
計量化学的分析および疾患判別関数の作成
この試験により、多数の異なる分析物(少なくとも21種類の炎症タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、エイコサノイド、およびプロスタグランジン)に関するデータの非常に効率的な収集が可能になる。ALS患者における神経学的疾患は任意の一種類の変数によってはっきりと指標化できない可能性がある。それにもかかわらず、いくつかの個々の分析物の間の微妙な関係を同時に考えることによって、疾患の重篤度を示すパラメータを全データマトリックスから抽出することができる。この試験の範囲は、分析物の独立変数の一次結合から構成される疾患判別関数を定義することを目的とした、神経疾患における炎症反応の高度な計量化学分析の他に例をみない機会を与える。
【０１７８】
ヒト生化学データの計量化学的探求に用いられる主なツールは主成分分析(PCA；(Otto、1999)に記載))である。PCAは、大きなデータマトリックスを2つの小さなマトリックス(スコアリングマトリックスおよびローディングマトリックス)に分解する数学的技法である。これらの成分マトリックスを操作することによって、元の変数の一次結合である一続きの「主成分」(PC)が得られる。従って、主成分は、2つの重要な特性を有する再構築された変数である。第1に、PCは互いに相関関係がない(すなわち、互いに独立している)。生物学的には、これは、PCが、単に自己相関するだけの互いに依存した実体である可能性は低いことを意味する。第2に、PCは、分散が最大限になるように再構築される。第1の主成分は、元のデータセットにおける分散の大部分を暗黙的に含む；第2のPCはそれより少ない分散を含む、など。これは、個体間のばらつきがほとんどない分析物が予後不良指標になる可能性が高いので重要である。
【０１７９】
従って、それぞれのデータ点(当初、任意の多くの数の分析物測定値を含む)は、1つ、2つ、または3つのPCを含む1つの座標に変換される。データセットにおける分散の大きな部分(多くの場合、大多数)が、1つ、2つ、または3つのPCによって表示することができるので、2次元空間または3次元空間において、それぞれの変換された点をプロットすれば、元の複雑なデータセットを都合よく視覚化することができる。成功したPCAでは、元のデータマトリックスの一因となる様々な部分母集団(例えば、正常群対ALS群)はPC変換において空間的に分解されるようになる。
【０１８０】
本明細書に開示および請求された組成物および方法の全てが、本開示を考慮すれば過度の実験なく作成および実施することができる。本発明の組成物および方法が好ましい態様に関して説明されたが、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および方法ならびに本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変更を加えることができることは当業者に明らかであろう。さらに詳細に述べると、本明細書に記載の薬剤の代わりに、化学的および生理学的に関連しているある特定の薬剤を使用することができ、同時に、同じ結果または類似した結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかな、このような全ての類似の代用および変更は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、および概念の範囲内と考えられる。
【０１８１】
参考文献
以下の参考文献は、例示的な手順または本明細書に記載のものを補足する他の詳細を提供する程度まで、参照として本明細書に詳細に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】TNFαはEOC-20小膠細胞培養物におけるRNS産生を刺激する。図1A：等濃度のTNFα、LPS、IL1β、EGF。図1B：様々な濃度のTNFα、LPS、IL1β、IL6、IFNγ、IL6＋IFNγ。
【図２】NDGA、ミノサイクリン、およびクルクミンを用いた、亜硝酸イオン流動により示されるTNFα刺激小膠細胞活性化の強力な阻害。エンドポイントは4個のウェルの平均である。
【図３】90日齢からNDGAまたは媒質を投与したG93A-SOD-1マウスの処理されていない回転棒動作時間 (図3A)。NDGA処置動物および媒質処置動物の回転棒運動機能の正味低下(図3B)。図3C：ヒトG93A-SOD1トランスジーンを有するマウスにおける運動機能低下(平均±SD；10/群)。
【図４】NGDAまたは媒質で処置されたG93A-SOD1マウスにおける運動機能低下の線形回帰分析。太い線はデータと最もフィットしたものを示す。細い線は95％信頼区間を示す。
【図５】ゴマ油は筋萎縮性側索硬化症(ALS)に罹患したG93A-SOD1マウスの動作を改善する。
【図６】μM以下の濃度のNGDAはTNFα刺激EOC-20細胞においてプロスタグランジンE2(PGE2)を効果的に阻害する。
【図７】LTB4によるTNFα刺激小膠細胞の亜硝酸イオン産生の増大。バーは平均±S.D.を示す。それぞれn=4ウェル。
【図８】G93A-SOD1初代膠細胞培養物は非トランスジェニック膠細胞培養物よりもTNFα刺激に対して感受性である。記号は平均±S.D.を示す。各点でn=4ウェル。＊トランスジーン効果については反復測定ANOVAによりP＜0.01。
【図９】小膠細胞における提案されたTNFα-5LOXシグナル伝達軸の説明モデル。
【図１０】90日から開始したNDGA経口投与によるG93A-SOD1マウスの予後の改善。薬物によって生存中央値が13日延びる。ログランク分析よりP＜0.01。N=16マウス/群。図10A：90日での回転棒時間。図1OB：生存の割合(％)。
【図１１】経口NDGAによるG93A-SOD1マウスにおけるアストログリオーシス低下。非トランスジェニック(非Tg)マウスまたはG93A-SOD1マウスからの腰髄切片を抗5LOX抗体で標識した。NDGAは、トランスジェニックマウスからのG93A-SOD1腰髄切片に存在するGFAP陽性星状膠細胞の数を有意に減少させた。棒グラフは細胞数の平均±S.D.を示す(40倍の倍率で切片1枚につき12の視野；1視野につき0.23mm2)。＊マン-ホイットニー検定によりP＜0.001。
【図１２】120日齢のG93A-SOD1マウスおよび非トランスジェニックマウスの脊髄における5LOX mRNAの半定量RT-PCR分析。5LOXゲル画像は、30回のPCRサイクル後に臭化エチジウム検出を用いて得られた。アクチンは24サイクルで得られた。各レーンは1匹の動物を示す。棒グラフは平均±S.D.を示す。N=7。＊マン-ホイットニー検定によりP=0.001。
【図１３】5LOX(80kDaタンパク質バンド)は非トランスジェニックマウス脊髄溶解産物においてSOD1と共に免疫共沈降される。左レーンおよび中央のレーンはそれぞれ、3匹のプールされたマウス脊髄に相当した。
【図１４】BIAcoreデータから5LOXが表面固定SOD1に結合することが分かる。図14A：BIAcore実験からの理想化されたセンサーグラム出力。図14B：5LOX(0.5mg/mL)と固定化SOD1との相互作用を示す実際のセンサーグラム。解離動態は非常に遅いことに留意のこと。図14C：5LOXは濃度依存的にSOD1に結合するが、アルブミンはほとんど結合を示さない。
【図１５】SOD1は、ヒト5LOXでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合するが、BSAでコーティングされた表面には結合しない。エンドポイントは、4個のウェルの平均±S.D.を示す。
【図１６】APP/PS1マウスおよび日齢が同じ非トランスジェニック動物からの皮質組織における5LOXタンパク質のウエスタンブロット分析。バーは平均値を示す。
【図１７】ヒトAD罹患脳からの皮質組織ならびに年齢および検死が同じ非痴呆症対象からの組織における5LOXタンパク質のウエスタンブロット分析。バーは、いくつかのデータポイントの平均値を示す。SMTG=組織が取り出された上側頭回および中側頭回。
【図１８】モリス(Morris)水迷路試験におけるアミロイドβ誘導性記憶障害に対するNGDAによる保護(待ち時間の測定値により示される)。
【図１９】経口NDGAは、3NPの全身注射により引き起こされる運動障害を強力に防ぐ。最後の3NP注射の12時間後に、平均台データを集めた。N=4〜5動物/群。回転棒試験におけるNDGAの効果については、反復測定ANOVAによりP＜0.05(図19A)。平均台試験におけるNDGAの効果については、スチューデントt検定によりP＜0.05(図19B)。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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