(57)【要約】【課題】現在公知のタバコの煙成分では喫煙の破滅的有毒作用を説明できない。【解決手段】本発明は、タバコの煙に存在する比較的安定した主要な有毒オキシダント（ｃｓ−オキシダント）の単離、同定、及び構造、特性及びアッセイ判定の手順を述べるものであり、その含有量は、タバコ１本あたり約１９０±１０ｍｇである；ｃｓ−オキシダント単独でほぼ定量的に、タバコの煙すべてからの水抽出物により生じたタンパク質の酸化損傷を説明でき、これはまたＤＮＡの酸化損傷の原因ともなる；ｃｓ−オキシダントは比較的安定したものであるため、これさらに副流煙および間接喫煙の有害作用も説明できる；ビタミンＣを含む多くの化合物／化学物質が、生体外でのｃｓ−オキシダントによるタンパク質酸化を防止し得ることがわかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から主要な有害オキシダントである化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを単離する方法であり、前記方法は以下の工程を含む
【化１】
2005502857.tif 000012
（ａ）火のついた従来型のフィルター付きタバコからタール又はｃｓ（タバコの煙）を集め、
（ｂ）氷と塩の混合物に浸したガラスのフラスコ内で１本につきタール含有量２０〜３０ｍｇの従来型のフィルター付きタバコに火をつけることでタールを集め、且つタールをフラスコの底に凝縮・沈殿させ、
（ｃ）前記フラスコを室温に保ち、ｐＨが７．４〜７．８の範囲の３０〜６０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液で前記タールを抽出し、上記溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、ＮａＯＨ溶液の添加により濾過物のｐＨを調整して７．４〜７．６の範囲とし、所望のタール溶液を得、
（ｄ）等量の塩化メチレンを用いて前記タール溶液を三度抽出し、下側の塩化メチレン層を捨て、タバコの煙水抽出物と呼ばれる上側の黄色い水層を集め、
（ｅ）等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて前記タバコの煙水抽出物を二度抽出し、溜まった黄色のブタノール抽出物を減圧下で、−５０℃〜−６０℃の範囲の温度で凍結乾燥機において凍結乾燥し、ＨＰＬＣグレードのアセトンを用いて凍結乾燥した物質を二度抽出し、このアセトン溶液を減圧下で乾燥し、前記アセトン抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノールで溶解し、
（ｆ）前記メタノール溶液を非蛍光性シリカプレートを用いたバンドＴＬＣに供し、８０：２０の比のトルエンと酢酸エチルの混合物を用いて前記シリカプレートを展開し、前記プレートを取り出し、ドライヤを用いて約２５〜３０℃で乾燥し、プレートの両側から展開した物質を含む小さな短冊片を切り出してＲｆ０．２６に対応するバンドの位置を定めるためにこれらをヨウ素チェンバに保持し、バンドを削り落としＨＰＬＣグレードのアセトンを用いてバンド物質を抽出し、アセトン層を集め、それを減圧下で乾燥し、
（ｇ）等量の超純水を加えることで淡い黄色の針状物として現れる前記アセトン抽出物を溶解し、ＨＰＬＣグレードの等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて得られた水溶液を抽出し、減圧下の小さいガラス管内で上側のｎ−ブタノール層を乾燥し、純度９８〜９９％でタバコ１本あたりの歩留り約１８〜２２μｇの主要なタバコの煙（ｃｓ）オキシダントを得、
（ｈ）９０：１０の比（ｖ／ｖ）の塩化メチレンとメタノールの混合物からなる移動溶剤に溶解することで工程（ｇ）で得た上記ｃｓオキシダントを精製し、これを順相の２５ｃｍシリカカラムを有するＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器を２９４ｎｍ、流速０．５ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約２９ｋｇｆ／ｃｍ2で使用し、保持時間８．８０８分でただ一つのピークとして現れる、純度１００％で元のタール溶液に存在する総ｃｓオキシダントの８．４％の歩留りを有する流出液を集める。
【請求項２】
タンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から主要な有害オキシダントである化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを単離する方法であり、前記方法はさらに以下を含む
（ａ）１本につきタール含有量２０〜３０ｍｇの従来型のフィルター付きタバコから集めたタバコの煙をすべて、ｐＨが７．４〜７．８の３０〜６０ｍＭカリウム緩衝液に通し、上記溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、ＮａＯＨ溶液の添加により濾過物のｐＨを調整して７．４〜７．６の範囲とし、所望のタバコの煙溶液（ｃｓ溶液）を得、
（ｂ）等量の塩化メチレンを用いて前記ｃｓ溶液を三度抽出し、下側の塩化メチレン層を捨て、タバコの煙水抽出物と呼ばれる上側の黄色い水層を集め、
（ｃ）等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて前記タバコの煙水層を二度抽出し、溜まった黄色のブタノール抽出物を減圧下で、−５０℃〜−６０℃の範囲の温度でＬｙｏｌａｂ凍結乾燥機において凍結乾燥し、ＨＰＬＣグレードのアセトンを用いて凍結乾燥した物質を二度抽出し、このアセトン溶液を減圧下で乾燥し、前記アセトン抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノールで溶解し、
（ｄ）前記メタノール溶液を非蛍光性シリカプレートを用いたバンドＴＬＣに供し、８０：２０の比のトルエンと酢酸エチルの混合物を用いて前記シリカプレートを展開し、前記プレートを取り出し、ドライヤを用いて約２５〜３０℃で乾燥し、プレートの両側から展開した物質を含む小さな短冊片を切り出してＲｆ０．２６に対応するバンドの位置を定めるためにこれらをヨウ素チェンバに保持し、バンドを削り落としＨＰＬＣグレードのアセトンを用いてバンド物質を抽出し、アセトン層を集め、それを減圧下で乾燥し、
（ｅ）等量の超純水を加えることで淡い黄色の針状物として現れる前記アセトン抽出物を溶解し、ＨＰＬＣグレードの等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて水溶液を抽出し、減圧下の小さいガラス管内で上側のｎ−ブタノール層を乾燥し、純度９８〜９９％でタバコ１本あたりの歩留り１８〜２２μｇの主要なｃｓオキシダントを得、
（ｆ）９０：１０の比（ｖ／ｖ）の塩化メチレンとメタノールの混合物からなる移動溶剤に溶解することで工程ｅで得た上記ｃｓオキシダントを精製し、これを順相の２５ｃｍシリカカラムを有するＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器を２９４ｎｍ、流速０．５ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約２９ｋｇｆ／ｃｍ2で使用し、保持時間８．８０８分でただ一つのピークとして現れる、純度１００％で元のｃｓ溶液に存在する総ｃｓオキシダントの８．４％の歩留りを有する流出液を集める。
【請求項３】
単離された前記純粋なタバコの煙（ｃｓ）オキシダントは以下の特性
（ａ）アセトン溶液から結晶化したとき、腐った乳脂肪に似た鼻を突く臭いのする、小さな針状の、淡い黄色の結晶として現れる、
（ｂ）ＵＶ吸収極大は、メタノール溶液で２９３．４ｎｍと２２３．０ｎｍとに、水溶液で２８８ｎｍと２２１ｎｍとにそれぞれある、
（ｃ）メタノール溶液では、２９３ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５１．４ｎｍとに、２２４ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５２．６ｎｍとにそれぞれある、
（ｄ）放射を３３０ｎｍに保って励起スキャンを観測すると、観測された励起極大は２２８．２ｎｍと２９３．８ｎｍとに、放射を６５１ｎｍに保って励起スキャンを観測すると、観測された励起極大は２２９．２ｎｍと２９４．８ｎｍとにそれぞれある、
（ｅ）メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−ブタノールには非常に溶けやすく、水にはかなり溶けやすく、塩化メチレン、ジエチルエーテル、クロロフォルムにはやや溶けにくく、ベンゼン、石油エーテルには溶けない、
（ｆ）範囲４〜５の酸性のｐＨのとき、化合物は酸化能力を失い、範囲９〜１０のアルカリ性のｐＨに溶液を保つと、化合物は徐々に茶色く変色し、ｐＨが１０又はそれ以上の場合、瞬時に暗色化すると共にＵＶ分光法から分かるように活性と芳香族性の両方を失う、
（ｇ）暗所に２５℃〜３０℃の範囲の温度で固体状態で貯蔵された場合、オキシダントの半減期はその酸化能力から判断して約４８時間であり、ｐH７．４、２５℃〜３０℃、５０ｍMの燐酸カリウム緩衝溶液では、半減期は約１時間３０分である、
（ｈ）フェリチトクロムｃ、塩化第二鉄を還元する、
（ｉ）アスコルビン酸、タンパク質、ＤＮＡを酸化する、
（ｊ）融点が１６２℃である、
を有するものである請求項１及び２記載の方法。
【請求項４】
タンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から単離された主要な有害オキシダントである化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを定量する方法であり、前記方法は以下の工程を含む
（ａ）火のついた従来型のフィルター付きタバコからタール又はｃｓ（タバコの煙）を集め、
（ｂ）氷と塩の混合物に浸したガラスのフラスコ内で１本につきタール含有量２０〜３０ｍｇの従来型のフィルター付きタバコに火をつけることでタールを集め、且つタールをフラスコの底に凝縮・沈殿させ、
（ｃ）前記フラスコを室温に保ち、ｐＨが７．４〜７．８の範囲の３０〜６０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液で前記タールを抽出し、上記溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、ＮａＯＨ溶液の添加により濾過物のｐＨを調整して７．４〜７．６の範囲とし、所望のタール溶液を得、
（ｄ）等量の塩化メチレンを用いて前記タール溶液を三度抽出し、下側の塩化メチレン層を捨て、タバコの煙水抽出物と呼ばれる上側の黄色い水層を集め、
（ｅ）等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて前記タバコの煙水抽出物を二度抽出し、溜まった黄色のブタノール抽出物を減圧下で、−５０℃〜−６０℃の範囲の温度で凍結乾燥機において凍結乾燥し、ＨＰＬＣグレードのアセトンを用いて凍結乾燥した物質を二度抽出し、このアセトン溶液を減圧下で乾燥し、前記アセトン抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノールで溶解し、
（ｆ）前記メタノール溶液を非蛍光性シリカプレートを用いたバンドＴＬＣに供し、８０：２０の比のトルエンと酢酸エチルの混合物を用いて前記シリカプレートを展開し、前記プレートを取り出し、ドライヤを用いて約２５〜３０℃で乾燥し、プレートの両側から展開した物質を含む小さな短冊片を切り出してＲｆ０．２６に対応するバンドの位置を定めるためにこれらをヨウ素チェンバに保持し、バンドを削り落としＨＰＬＣグレードのアセトンを用いてバンド物質を抽出し、アセトン層を集め、それを減圧下で乾燥し、
（ｇ）等量の超純水を加えることで淡い黄色の針状物として現れる前記アセトン抽出物を溶解し、ＨＰＬＣグレードの等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて得られた水溶液を抽出し、減圧下の小さいガラス管内で上側のｎ−ブタノール層を乾燥し、純度９８〜９９％でタバコ１本あたりの歩留り約１８〜２２μｇの主要なタバコの煙（ｃｓ）オキシダントを得、
（ｈ）９０：１０の比（ｖ／ｖ）の塩化メチレンとメタノールの混合物からなる移動溶剤に溶解することで工程（ｇ）で得た上記ｃｓオキシダントを精製し、これを順相の２５ｃｍシリカカラムを有するＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器を２９４ｎｍ、流速０．５ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約２９ｋｇｆ／ｃｍ2で使用し、保持時間８．８０８分でただ一つのピークとして現れる、純度１００％で元のタール溶液に存在する総ｃｓオキシダントの８．４％の歩留りを有する流出液を集める。
【請求項５】
タンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から単離された主要な有害オキシダントである化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを定量する方法であり、前記方法はさらに以下を含む
（ａ）１本につきタール含有量２０〜３０ｍｇの従来型のフィルター付きタバコから集めたタバコの煙をすべて、ｐＨが７．４〜７．８の３０〜６０ｍＭカリウム緩衝液に通し、上記溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、ＮａＯＨ溶液の添加により濾過物のｐＨを調整して７．４〜７．６の範囲とし、所望のタバコの煙溶液（ｃｓ溶液）を得、
（ｂ）等量の塩化メチレンを用いて前記ｃｓ溶液を三度抽出し、下側の塩化メチレン層を捨て、タバコの煙水抽出物と呼ばれる上側の黄色い水層を集め、
（ｃ）等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて前記タバコの煙水層を二度抽出し、溜まった黄色のブタノール抽出物を減圧下で、−５０℃〜−６０℃の範囲の温度でＬｙｏｌａｂ凍結乾燥機において凍結乾燥し、ＨＰＬＣグレードのアセトンを用いて凍結乾燥した物質を二度抽出し、このアセトン溶液を減圧下で乾燥し、前記アセトン抽出物をＨＰＬＣグレードのメタノールで溶解し、
（ｄ）前記メタノール溶液を非蛍光性シリカプレートを用いたバンドＴＬＣに供し、８０：２０の比のトルエンと酢酸エチルの混合物を用いて前記シリカプレートを展開し、前記プレートを取り出し、ドライヤを用いて約２５〜３０℃で乾燥し、プレートの両側から展開した物質を含む小さな短冊片を切り出してＲｆ０．２６に対応するバンドの位置を定めるためにこれらをヨウ素チェンバに保持し、バンドを削り落としＨＰＬＣグレードのアセトンを用いてバンド物質を抽出し、アセトン層を集め、それを減圧下で乾燥し、
（ｅ）等量の超純水を加えることで淡い黄色の針状物として現れる前記アセトン抽出物を溶解し、ＨＰＬＣグレードの等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて水溶液を抽出し、減圧下の小さいガラス管内で上側のｎ−ブタノール層を乾燥し、純度９８〜９９％でタバコ１本あたりの歩留り１８〜２２μｇの主要なｃｓオキシダントを得、
（ｆ）９０：１０の比（ｖ／ｖ）の塩化メチレンとメタノールの混合物からなる移動溶剤に溶解すことで工程ｅで得た上記ｃｓオキシダントを精製し、これを順相の２５ｃｍシリカカラムを有するＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器を２９４ｎｍ、流速０．５ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約２９ｋｇｆ／ｃｍ2で使用し、保持時間８．８０８分でただ一つのピークとして現れる、純度１００％で元のｃｓ溶液に存在する総ｃｓオキシダントの８．４％の歩留りを有する流出液を集める。
【請求項６】
逆相の２５ｃｍＯＤＳカラムを用い、水とメタノール（９５：５  ｖ／ｖ）の混合物を移動相とし、波長２８８ｎｍ、流速０．８ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約１４７Ｋｇｆ／ｃｍ2において、保持時間１３．４６分で、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンがＵＶ検出器を用いたＨＰＬＣによって定量分析される請求項１〜４記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ−ベンゾセミキノンは、全ｃｓ溶液から単離された、タンパク質の酸化損傷の主な原因を引き起こすものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ｃｓオキシダントであるｐ−ベンゾセミキノンはＤＮＡの酸化損傷を引き起こすものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
タンパク質をｃｓ溶液から得られたｐ−ベンゾセミキノンと反応させることによるタンパク質カルボニル形成を測定し、さらに２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と反応させ、最後に３９０ｎｍの波長で吸光度を測定することで、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンにより生じるタンパク質の損傷を定量する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質をｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンと反応させることによるテンジクネズミの組織のミクロソームタンパク質の酸化的分解反応を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと比重走査にかけることで、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンにより生じるタンパク質の損傷を定量する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質の酸化損傷の分析に用いられるタンパク質が、ＢＳＡ及びテンジクネズミの肺のミクロソームタンパク質からなる群から選ばれるものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
全ｃｓ溶液によって生じたＢＳＡ酸化が、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンによってなされたものである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、全ｃｓ溶液によって生じた７．５３±０．３４と比較して、９．５６±０．１４である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、タバコの煙水抽出物によって生じた８．１６±０．２４と比較して、９．５６±０．１４である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、タバコの煙のＴＬＣ精製水抽出物によって生じた９．２３±０．１４と比較して、９．５６±０．１４である請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明されるｐ−ベンゾセミキノン溶液によって生じたテンジクネズミの組織のミクロソームタンパク質の酸化的分解反応が、全ｃｓ溶液によって生じたものに相当する請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、特定市販銘柄のタバコのタール含有量に基づき、タバコにおけるｃｓオキシダントｐ−ベンゾセミキノンの定量に使われる請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、特定市販銘柄のタバコの毒性基準に基づき、タバコにおけるｃｓオキシダントｐ−ベンゾセミキノンの定量に使われる請求項１記載の方法。
【請求項１９】
様々な市販銘柄の燃えているタバコの煙から単離されたｐ−ベンゾセミキノンの総量が、存在するｐ−ベンゾセミキノンの量に基づく特定銘柄のタバコの毒性指標の判定に用いられる請求項１記載の方法。
【請求項２０】
生体外でのタバコの煙によるタンパク質酸化を防止する方法であり、前記方法は、アスコルビン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、琥珀酸、ヒスチジン、リジン、チオ尿酸、グルタチオン、紅茶抽出物、緑茶抽出物、カテキン、エピガロカテキン、及びエピカテキンからなる群から選ばれる化合物又は化学物質を用いてＢＳＡ酸化を抑制することからなる。
【請求項２１】
約１００μＭの濃度で、アスコルビン酸がＢＳＡの酸化を最大７６％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
約２ｍＭの濃度で、亜ジチオン酸ナトリウムがＢＳＡの酸化を最大９７％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
５００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で、酒石酸がＢＳＡの酸化を最大７５％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
５００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で、クエン酸がＢＳＡの酸化を最大７５％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
約５００μＭの濃度で、シュウ酸がＢＳＡの酸化を最大５３％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
約１ｍＭの濃度で、琥珀酸がＢＳＡの酸化を最大６０％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
約１ｍＭの濃度で、ヒスチジンがＢＳＡの酸化を最大６７％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
約２．５ｍｇの濃度で、紅茶抽出物がＢＳＡの酸化を最大５０％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
約７５０μｇの濃度で、カテキンがＢＳＡの酸化を最大５４％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
約１４０μｇの濃度で、エピガロカテキンがＢＳＡの酸化を最大９５％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
約５０μｇの濃度で、エピカテキンがＢＳＡの酸化を最大５０％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
約２．５ｍｇの濃度で、緑茶抽出物がＢＳＡの酸化を最大５０％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
約１ｍＭの濃度で、リジンがＢＳＡの酸化を最大３５％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３４】
約１０ｍＭの濃度で、チオ尿酸がＢＳＡの酸化を最大５２％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３５】
約１ｍＭの濃度で、グルタチオンがＢＳＡの酸化を最大３７％抑制する請求項２０記載の方法。
【請求項３６】
アスコルビン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、琥珀酸、ヒスチジン、リジン、チオ尿酸、グルタチオン、紅茶抽出物、緑茶抽出物、カテキン、エピガロカテキン、及びエピカテキンからなる群から選ばれる化合物又は化学物質の、タバコの煙オキシダントにより生じる有害作用に対する解毒剤としての使用。
【請求項３７】
隔離したタンパク質、ＤＮＡ、培養細胞、すなわち実験室条件下での実験モデルに対して酸化損傷を生じるタバコの煙により引き起こされる酸化損傷による変性疾患及び癌のメカニズム研究のための化合物ｐ−ベンゾセミキノンの使用。
【請求項３８】
有害オキシダント、ｐ−ベンゾセミキノンの量的推計の方法であり、前記方法は、タバコ、葉巻、パイプ、及び他の従来の喫煙道具すべてで使用される喫煙物質の量及び性質を定式化するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタバコの煙から主要な有害オキシダント、化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを単離する方法に関する。より詳しくは、本発明はタンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から主要な有害オキシダント、ｐ−ベンゾセミキノンを単離する方法を提供するものである。
【０００２】
【化１】
2005502857.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
タバコの煙に晒されることが、気管支炎、気腫、その他の気道の疾患、冠状動脈性心臓病、肺癌、及びその他の悪性腫瘍などの命に係わる病気の主な原因である［１−５］。事実、タバコの煙は、世界的にみて今もっとも多い癌である肺癌の原因として圧倒的である。公共の健康キャンペーンや地方自治体によって制定された禁煙法による喫煙廃絶への取り組みはこれまで限られた成果しかあげられておらず、よってもっとも実際的な方策は、タバコの煙に起因する有害作用を防止することである。タバコの煙は約４０００の成分を含み、そのうち約３０００の成分が気相、約１０００の成分がタール相であることが知られている［６］。Ｏ−２、Ｈ２Ｏ２、ＮＯ、ペルオキシラジカルなどの気相のオキシダントは非常に不安定である［７］。この気相を燐酸緩衝液に通し、得られた溶液をアルブミン溶液へと与えても、タンパク質の酸化は起きない（７）。どうやら気相に起因する損傷は口腔及び上気道に限られているものと考えられる［８］。一方、タールに含まれるオキシダントは非常に安定しており、これらは明らかに、肺、心臓、その他の器官に酸化損傷を生じる原因となっている［７、９］。タール成分の約４８％は水溶性であり［１０］、タールの水抽出物は、タンパク質とＤＮＡを含む生物高分子の酸化損傷を生じることが知られている［７、１１、１２］。しかしながら、タールの水抽出物に存在する成分のうちいったいいくつが生物システムに酸化損傷を生ずる原因となるのかと想うと途方に暮れざるをえない。現在までのところ、タバコの煙に含まれる多くの成分のうち、３種類の成分、すなわち、（ｉ）多環式芳香族炭化水素、（ｉｉ）ニトロソアミン、（ｉｉｉ）フリーラジカルが癌や変性疾患発生の原因物質に関係があるとされている。
【０００４】
多環式炭化水素の中では、ベンゾ［ａ］ピレンがこれまでのところもっとも研究されてきたものである。しかしこれは発癌物質ではなく、究極発癌物質であるところのベンゾ［ａ］ピレンのジオールエポキシドとなるにはシトクロムＰ−４５０システムによる体謝活性化を必要とする。さらに、タバコの煙におけるベンゾ［ａ］ピレンの濃度は低く、タバコ１本につき約１０〜４０ｎｇであり［１３］、ベンゾ［ａ］ピレンではタバコの煙によるタンパク質の酸化損傷を説明できない。
【０００５】
タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の中でもっとも研究されてきたものは、N１−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）および４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）である。同じくＴＳＮＡも直接型発癌物質ではなく、またタバコの煙におけるその濃度も様々である。タバコ１本につき、ＮＮＮの実測範囲は０．００４μｇ〜１．３５μｇであり、ＮＮＫは＜０．００４μｇ〜１．７５μｇである。タバコの煙におけるＴＳＮＡは、タバコの煙の発癌可能性に関して、十分な指標ではないと結論できる［１４］。ＴＳＮＡも同じく、タンパク質の酸化損傷を説明できない。
【０００６】
タバコの煙の有害成分の他の面はフリーラジカルである。Ｐｒｙｏｒと彼の同僚はタバコの煙のフリーラジカル成分とその毒性の関係を詳細に研究した。これらの著者によると、タバコタールにおける主要且つ比較的安定したフリーラジカルは活性の酸化還元系であるキノン／ヒドロキノン錯体であり、この酸化還元系は分子酸素を還元してスーパーオキシドを生じることが可能であり、これは過酸化水素やヒドロキシルラジカルとなり［１５］、最終的には生物高分子の酸化損傷につながるとしているが、我々の研究では、安定したタールラジカルによって生じるタンパク質の酸化損傷はＳＯＤあるいは触媒では抑制できず、このことは酸化損傷を生じさせているのがスーパーオキシドラジカルでも過酸化水素でもないことを示している。出願人はさらに、タールラジカルが窒素雰囲気下で分子酸素なしでタンパク質を酸化することを観測したものであり、このことはタールラジカルと生物ミクロ分子との直接作用を示している。しかしながらこれらの著者は、彼らがタール中に同定した主要なラジカルが実際にはモノラジカルではなく、おそらくは単一種類でもないことを認めている（１６）。彼らはまた、タバコタールがおそろしく複雑な混合物であること、またタールラジカルが単離されはっきりと同定されていないため、タールラジカルの化学又は生化学に関する結論は暫定的なものと理解されるべきであることを認めている［１５］。
【０００７】
タバコタールが動物に癌を発生させることを１９６０年代までにタバコ産業が大概自社の実験室で証明していたことは注記に値する［１７］。もし有毒物質を同定できればこれらの物質を除去又は排除して「安全」なタバコを作り出せ、これにより有毒物質無しにニコチンを供給し得るとの確信のもと、１９６０年代を通して、これらの会社の研究者はタバコの煙に有毒物質を発見しようと努めた［１７］。しかし目標が達成不可能であると証明されたため、１９７０年代後半までにはタバコ産業はほとんど、この調査を取りやめた。これは技術的に解決困難な問題であり、御し難いことが証明された［１７］。
【０００８】
つい先日、我々はタバコの全煙／タールの水抽出物が主要な有害オキシダントを比較的多量、タバコ１本あたりおよそ１９０±１０μｇ含むことに気がついた。出願人はオキシダントを単離し、その構造を確定し、これがｐ−ベンゾセミキノンであることを発見した。このオキシダントはほぼ定量的に、タバコの全煙／タールの水抽出物により生じるタンパク質の酸化損傷を説明できる。このオキシダントはまた、ＤＮＡ酸化の原因ともなる。Ｎａｇａｔａ他（１８）はセミキノンラジカルがＤＮＡに結びつきこれに損傷を与えることを示している。ＤＮＡの酸化損傷は突然変異や癌にかかわりがあることもまた知られている。このオキシダントは比較的安定している。その室温における固体状態での半減期はおよそ４８時間である。タバコの煙に安定したオキシダントが存在することで、副流煙および間接喫煙の有害作用に説明が付く（７）。このオキシダントは非喫煙時のタバコには存在せず、タバコが燃えている間生じる（７）。出願人は、このオキシダントを非活性化する、そして解毒剤として使用し得る、多くの化合物／化学物質を同定したものである。
【０００９】
発明の目的
本発明の主な目的は、タンパク質とＤＮＡを含む生物高分子の酸化損傷の主な原因であるタバコの全煙／タールの水抽出物からの主要な有害オキシダントの単離及び位置付けに関するものである。
【００１０】
本発明の他の目的は、全タバコ溶液中に存在するタバコの煙（ｃｓ）オキシダントの定量分析の方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、オキシダントを非活性化し且つオキシダントの有害作用に対抗する解毒剤として作用し得る化合物／化学物質の同定に関する。
【００１２】
発明の要約
タバコの全煙／タールの水抽出物から比較的安定した主要な有害オキシダントを単離し、微分溶媒抽出、薄層クロマトグラフィ、及び分取ＨＰＬＣにより＞９９％まで精製した。タバコ１本あたりの歩留りは約１６μｇであり、これは１本のタバコの煙に存在する量（およそ１９０μｇ）の約８．４％である。類似の結果が異なる１２銘柄の市販タバコから得られた。精製したオキシダントはアセトン中の溶液から、細い針状の、非常に淡い黄色の結晶へと結晶化する。オキシダントの構造はｐ−ベンゾセミキノンであることが分かり、これは化学的性質からだけでなく、元素分析、質量スペクトル、ＵＶ、蛍光、ＩＲ、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−ＮＭＲ、ＥＳＲ分光法によっても証明された。オキシダントは、ＵＶ吸収分光法又はＨＰＬＣにより定量的に測定可能である。
【００１３】
ｐ−ベンゾセミキノンでは、不対電子がヘテロ原子を含む芳香族の骨格上で非局在化し、様々なメソメリー状態、すなわち、陰イオン、中性、陽イオン状態となる（図１、参考文献１９参照）。この共振によりセミキノンの安定性を説明できる。暗がりの中、空気中に室温で固体状態で置かれたオキシダントの半減期は約４８時間であり、これはアスコルビン酸の酸化能力で判定される。ｐＨ７．４の水溶液中では半減期は約１．５時間である。ＢＳＡの酸化又はテンジクネズミの肺のミクロソームタンパク質の酸化的分解反応をモデルシステムとして用いると、オキシダントは定量的に、タバコの全煙水抽出物によって生じる酸化損傷を説明できる。ｃｓ−オキシダントはまたＤＮＡ酸化の原因ともなる。
【００１４】
オキシダントを非活性化し且つ解毒剤として作用し得る化合物／化学物質を多数同定した。
【００１５】
発明の詳細な説明
よって本発明は、有害オキシダントである化学式１のｐ−ベンゾセミキノンを単離する方法、及びこのオキシダントによって生じる有毒作用を打ち消すものと認められた化合物を提供するものである。
【００１６】
【化２】
2005502857.tif 000003
【００１７】
本発明の一実施例では、タンパク質とＤＮＡの酸化損傷の原因であるタバコの煙から主要な有害オキシダントを単離する方法を提供するものであり、前記方法は、
ａ）氷と塩の混合物に浸したガラスのフラスコ内で火のついた従来型のフィルター付きタバコからタール溶液を得、
ｂ）このタールをフラスコの底に凝縮・沈殿させて全ｃｓ溶液を得、
ｃ）ｐＨが７．４〜７．８の範囲の３０〜６０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液で前記タールを抽出し、
ｄ）工程（ｃ）の溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、
ｅ）ＮａＯＨ水溶液により工程（ｄ）から得られた濾過物のｐＨを調整し、所望のタバコの煙水抽出物溶液を得、
ｆ）等量の塩化メチレンを用いて前記ｃｓ水溶液を三度抽出し、タバコの煙溶液のうち下側の塩化メチレン層を捨て、上側の半精製状態の黄色い抽出物を集め、
ｇ）等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて工程（ｆ）のタバコの煙水抽出物をさらに二度抽出し、黄色のｎ−ブタノール抽出物を溜め、且つ減圧下で、−５０℃〜−６０℃の範囲の温度で凍結乾燥し、
ｈ）ＨＰＬＣグレードのアセトンを用いて工程（ｇ）の凍結乾燥した物質を二度抽出し、アセトン可溶抽出物を得、
ｉ）工程（ｈ）のアセトン可溶抽出物を減圧下で乾燥し残留物を生じさせ、
ｊ）工程（ｉ）の残留物をＨＰＬＣグレードのメタノールに溶解し、
ｋ）工程（ｊ）のメタノール溶液を非蛍光性シリカプレートを用いた分取ＴＬＣに供し、トルエンと酢酸エチルを８０：２０の比で有する溶剤システム構成混合物を用いて前記シリカプレートを展開し、プレートを取り出し、ドライヤを用いて約２５〜３０℃で乾燥し、プレートの両側から展開した物質を含む小さな短冊片を切り出してＲｆ０．２６に対応するバンドの位置を定めるためにこれらをヨウ素チェンバに保持し、バンドを削り落としＨＰＬＣグレードのアセトンを用いてバンド物質を抽出し、アセトン溶液を濾過・収集し、減圧下で乾燥して淡い黄色の残留物を得、
ｌ）等量の超純水を加えることで工程（ｋ）の残留物を溶解し、ＨＰＬＣグレードの等量の水飽和状態のｎ−ブタノールを用いて水溶液を抽出し、最後に減圧下の小さいガラス管内で上側のｎ−ブタノール層を乾燥し、純度９８〜９９％でタバコ１本あたりの歩留り１８〜２２μｇの主要なタバコの煙（ｃｓ）オキシダントを得る、
工程を含むものである。
【００１８】
本発明の一実施例では、工程（ｌ）で得られた前記ｃｓオキシダントを、９０：１０の比（ｖ／ｖ）の塩化メチレンとメタノールの混合物からなる移動相に溶解した後ＨＰＬＣでさらに精製し、これを順相の２５ｃｍシリカカラムを有するＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器を２９４ｎｍ、流速０．５ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約２９ｋｇｆ／ｃｍ２で使用し、保持時間８．８０８分でただ一つのピークとして現れる、純度１００％で元のｃｓ溶液に存在する総ｃｓオキシダント（ｐ−ベンゾセミキノン）の約８．４％の歩留りを有する流出液を集めるものである。
【００１９】
本発明の他の実施例では、ｐＨが７．４〜７．８の３０〜６０ｍＭカリウム緩衝液にタバコの全煙を通すことで火のついた従来型のフィルター付きタバコから工程（ａ）の最初のｃｓ溶液を同じく得て、上記溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過し、ＮａＯＨ水溶液の添加により濾過物のｐＨを調整して７．４〜７．６とし、主要ｃｓオキシダントのｐ−ベンゾセミキノンを得るために工程（ｂ）〜（ｌ）を行うものである。
【００２０】
本発明の他の実施例では、単離された前記純粋なタバコの煙（ｃｓ）オキシダント、ｐ−ベンゾセミキノンは以下の特性
ａ）アセトンで結晶化したとき、腐った乳脂肪に似た鼻を突く臭いのする、小さな針状の、淡い黄色の結晶を形成する、
ｂ）ＵＶ吸収極大は、メタノール溶液で２９３．４ｎｍと２２３．０ｎｍとに、水溶液で２８８ｎｍと２２１ｎｍとにそれぞれある、
ｃ）メタノール溶液では、２９３ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５１．４ｎｍとに、２２４ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５２．６ｎｍとにそれぞれある、
ｄ）放射波長を３３０ｎｍに保って励起スキャンを観測すると、観測された励起極大は２２８．２ｎｍと２９３．８ｎｍとに、放射を６５１ｎｍに保って励起スキャンを観測すると、観測された励起極大は２２９．２ｎｍと２９４．８ｎｍとにそれぞれある、
ｅ）メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−ブタノールには非常に溶けやすく、水にはかなり溶けやすく、塩化メチレン、ジエチルエーテル、クロロフォルムにはやや溶けにくく、ベンゼン、石油エーテルには溶けない、
ｆ）範囲４〜５の酸性のｐＨのとき、化合物は酸化能力を失い、範囲９〜１０のアルカリ性のｐＨに溶液を保つと、化合物は徐々に茶色く変色し、ｐＨが１０又はそれ以上の場合、瞬時に暗色化すると共にＵＶ分光法から分かるように活性と芳香族性の両方を失う、
ｇ）暗所に２５℃〜３０℃の範囲の温度で固体状態で貯蔵された場合、オキシダントの半減期はその酸化能力から判断して約４８時間であり、ｐH７．４、２５℃〜３０℃、５０ｍMの燐酸カリウム緩衝溶液では、半減期は約９０分である、
ｈ）フェリチトクロムｃ、塩化第二鉄を還元する、
ｉ）アスコルビン酸、タンパク質、ＤＮＡを酸化する、
ｊ）融点が１６２℃である、
を有するものである。
【００２１】
本発明のさらに他の実施例では、逆相の２５ｃｍＯＤＳカラムを用い、水とメタノール（９５：５  ｖ／ｖ）の混合物を移動相とし、波長２８８ｎｍ、流速０．８ｍｌ／分、温度約２５℃、圧力約１４７Ｋｇｆ／ｃｍ２において、保持時間１３．４６分で、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンがＵＶ検出器を用いたＨＰＬＣによって定量分析されるものである。
【００２２】
本発明のさらに他の実施例では、全ｃｓ溶液から単離された前記ｐ−ベンゾセミキノンは、タンパク質の酸化損傷の主な原因を引き起こすものである。
【００２３】
本発明のさらに他の実施例では、前記ｃｓオキシダントであるｐ−ベンゾセミキノンはＤＮＡの酸化損傷を引き起こすものである。
【００２４】
本発明のさらに他の実施例では、タンパク質をｃｓ溶液から得られたｐ−ベンゾセミキノンと反応させることによるタンパク質カルボニル形成を測定し、さらに２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と反応させ、最後に３９０ｎｍの波長で吸光度を測定することで、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンにより生じるタンパク質の損傷を定量するものである。
【００２５】
本発明のさらに他の実施例では、タンパク質をｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンと反応させることによるテンジクネズミの組織のミクロソームタンパク質の酸化的分解反応を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと比重走査にかけることで、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンにより生じるタンパク質の損傷を定量するものである。
【００２６】
本発明のさらに他の実施例では、タンパク質の酸化損傷の分析に用いられるタンパク質が、ＢＳＡ及びテンジクネズミの肺のミクロソームタンパク質からなる群から選ばれるものである。
【００２７】
本発明のさらに他の実施例では、全ｃｓ溶液によって生じたＢＳＡ酸化が、ｃｓ溶液に存在するｐ−ベンゾセミキノンによってなされたものである。
【００２８】
本発明のさらに他の実施例では、ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、全ｃｓ溶液によって生じた７．５３±０．３４と比較して、９．５６±０．１４である。
【００２９】
本発明のさらに他の実施例では、ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、タバコの煙水抽出物によって生じた８．１６±０．２４と比較して、９．５６±０．１４である。
【００３０】
本発明のさらに他の実施例では、ＢＳＡ１ｍｇにつき形成されるカルボニルのナノモルにより証明されるｃｓオキシダントによって生じたＢＳＡ酸化が、タバコの煙のＴＬＣ精製水抽出物によって生じた９．２３±０．１４と比較して、９．５６±０．１４である。
【００３１】
本発明のさらに他の実施例では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明されるｐ−ベンゾセミキノン溶液によって生じたテンジクネズミの組織のミクロソームタンパク質の酸化的分解反応が、全ｃｓ溶液によって生じたものに相当するものである。
【００３２】
本発明のさらに他の実施例では、前記方法は、特定市販銘柄のタバコのタール含有量に基づき、タバコにおけるｃｓオキシダントｐ−ベンゾセミキノンの定量に使われるものである。
【００３３】
本発明のさらに他の実施例では、前記方法は、特定市販銘柄のタバコの毒性基準に基づき、タバコにおけるｃｓオキシダントｐ−ベンゾセミキノンの定量に使われるものである。
【００３４】
本発明のさらに他の実施例は、生体外でのタバコの煙によるタンパク質酸化を防止する方法に関連し、前記方法は、アスコルビン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、琥珀酸、ヒスチジン、リジン、チオ尿酸、グルタチオン、紅茶抽出物、緑茶抽出物、カテキン、エピガロカテキン、及びエピカテキンからなる群から選ばれる化合物又は化学物質を用いてＢＳＡ酸化を抑制することからなる。
【００３５】
本発明のさらに他の実施例では、約１００μＭの濃度で、アスコルビン酸がＢＳＡの酸化を最大７６％抑制するものである。
【００３６】
本発明のさらに他の実施例では、約２ｍＭの濃度で、亜ジチオン酸ナトリウムがＢＳＡの酸化を最大９７％抑制するものである。
【００３７】
本発明のさらに他の実施例では、５００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で、酒石酸がＢＳＡの酸化を最大７５％抑制するものである。
【００３８】
本発明のさらに他の実施例では、５００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で、クエン酸がＢＳＡの酸化を最大７５％抑制するものである。
【００３９】
本発明のさらに他の実施例では、約５００μＭの濃度で、シュウ酸がＢＳＡの酸化を最大５３％抑制するものである。
【００４０】
本発明のさらに他の実施例では、約１ｍＭの濃度で、琥珀酸がＢＳＡの酸化を最大６０％抑制するものである。
【００４１】
本発明のさらに他の実施例では、約１ｍＭの濃度で、ヒスチジンがＢＳＡの酸化を最大６７％抑制するものである。
【００４２】
本発明のさらに他の実施例では、約２．５ｍｇの濃度で、紅茶抽出物がＢＳＡの酸化を最大５０％抑制するものである。
【００４３】
本発明のさらに他の実施例では、約７５０μｇの濃度で、カテキンがＢＳＡの酸化を最大５４％抑制するものである。
【００４４】
本発明のさらに他の実施例では、約１４０μｇの濃度で、エピガロカテキンがＢＳＡの酸化を最大９５％抑制するものである。
【００４５】
本発明のさらに他の実施例では、約５０μｇの濃度で、エピカテキンがＢＳＡの酸化を最大５０％抑制するものである。
【００４６】
本発明のさらに他の実施例では、約２．５ｍｇの濃度で、緑茶抽出物がＢＳＡの酸化を最大５０％抑制するものである。
【００４７】
本発明のさらに他の実施例では、約１ｍＭの濃度で、リジンがＢＳＡの酸化を最大３５％抑制するものである。
【００４８】
本発明のさらに他の実施例では、約１０ｍＭの濃度で、チオ尿酸がＢＳＡの酸化を最大５２％抑制するものである。
【００４９】
本発明のさらに他の実施例では、約１ｍＭの濃度で、グルタチオンがＢＳＡの酸化を最大３７％抑制するものである。
【００５０】
本発明のさらに他の実施例は、タバコの煙オキシダントにより生じる有害作用に対する解毒剤に関するもので、これらはアスコルビン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、琥珀酸、ヒスチジン、リジン、チオ尿酸、グルタチオン、紅茶抽出物、緑茶抽出物、カテキン、エピガロカテキン、及びエピカテキンからなる群から選ばれるものである。
【００５１】
本発明のさらに他の実施例は、隔離したタンパク質、ＤＮＡ、培養細胞、すなわち実験室条件下での実験モデルに対して酸化損傷を生じるタバコの煙により引き起こされる酸化損傷による変性疾患及び癌のメカニズム研究のための化合物ｐ−ベンゾセミキノンの使用に関するものである。
【００５２】
本発明のさらに他の実施例は、有害オキシダント、ｐ−ベンゾセミキノンの量的推計の方法に関するもので、前記方法は、タバコ、葉巻、パイプ、及び他の従来の喫煙道具すべてで使用される喫煙物質の量及び性質を定式化するのに有用である。
【００５３】
本発明のさらに他の実施例は、生体外でのタバコの煙によるタンパク質酸化を防止する方法を提供し、前記方法は、アスコルビン酸、亜ジチオン酸ナトリウム、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、琥珀酸、ヒスチジン、リジン、チオ尿酸、グルタチオン、紅茶抽出物、緑茶抽出物、カテキン、エピガロカテキン、及びエピカテキンからなる群から選ばれる化合物又は化学物質を用いてＢＳＡ酸化を抑制することからなり、前記ＢＳＡ酸化の抑制は以下に管状に示す。
【００５４】
様々な化学物質によるｃｓ−オキシダントが引き起こすアルブミン酸化の予防
2005502857.tif 000004
【００５５】
さらに他の実施例では、化合物ｐ−ベンゾセミキノンは実験室条件下で隔離したタンパク質、ＤＮＡ、培養細胞に酸化損傷を与えるのに有用であり、タバコの煙により引き起こされる酸化損傷による変性疾患及び癌のメカニズム研究を可能ならしめるものである。
【００５６】
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これは説明のためだけのもので如何なる意味においても本発明の範囲を限定するものとは解釈さるべきではない。
【００５７】
表の詳細な説明
表１、ｃｓ−オキシダント精製の様々な段階における酸化能力の評価
表２、ＨＰＬＣ分析で測定したｃｓ−オキシダントにおるアスコルビン酸の酸化
表３、精製の様々な段階におけるｃｓ−溶液のフラクションによるＢＳＡの酸化
表４、様々な化学物質によるｃｓ−オキシダントが引き起こすアルブミン酸化の予防
表５、活性化したチャコールフィルターを用いた場合の主要な有毒ｃｓ−オキシダントの不活性化及びタバコの煙によって運ばれるニコチン
【００５８】
実施例
実施例１
タバコタール又はタバコの全煙溶液からの主要な有害成分（ｃｓ−オキシダント）の単離及び精製
（ｉ）タール含有量２５ｍｇのインド製市販フィルター付きタバコ（７４ｍｍ）を５銘柄、それぞれガラス管に入れたが、ガラス管はサイドアーム付き１リットル三角ガラスフラスコのガラス栓の穴に貫入し、フラスコの底から約２ｃｍ離れた位置まで延びるものであった。フラスコは氷と塩の混合物に浸し、サイドアームは送水ポンプにつないだ。タバコに火をつけ、タールをフラスコの底に凝縮・沈殿させた。全部で２０本のタバコからタールを集めた。瓶を取り出し室温とし、ｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液２０ｍｌで前記タールを抽出した。この溶液を０．４５μｍミリポアフィルタで濾過した。２０μｌの２Ｎ  ＮａＯＨ溶液を添加して濾過物のｐＨを７．４に調整した。溶液の色は茶色がかった黄色であった。この溶液をタール溶液と呼んだ。
【００５９】
タバコタールからｃｓ−オキシダントを単離する代わりに、タバコの全煙からこれを単離することも可能である。この場合、５バッチのタバコ２０本の煙を直接、ｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液２０ｍｌに送り込み、後の工程はタールの場合と同様とする。全ｃｓを緩衝液に送り込んだ後に得られる溶液を全ｃｓ溶液と呼んだ。
ｃｓ−オキシダントの歩留りは出発原料として用いられたのがタール溶液か全ｃｓ溶液かに係わらず、同様である。
【００６０】
（ｉｉ）工程１で得られた濾過タール溶液を１５ｍｌの塩化メチレンを用いて三度抽出した。下側の塩化メチレン層を捨て、上側の黄色い水層を集め、これをタバコの煙水抽出物と呼んだ。
【００６１】
（ｉｉｉ）水飽和状態のｎ−ブタノール１０ｍｌを用いて工程２の水層を二度抽出し、次に溜まった黄色のブタノール抽出物を減圧下、Ｌｙｏｌａｂ凍結乾燥機で−５５℃で凍結乾燥した。ＨＰＬＣグレードのアセトン１ｍｌを用いてこの凍結乾燥した物質を二度抽出し、このアセトン溶液をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ社、ＳＣ１００）で乾燥し、ＨＰＬＣグレードのメタノール１２０μｌに溶解した。
【００６２】
（ｉｖ）工程３で得られたメタノール溶液を次に、１０ｃｍ×１０ｃｍの非蛍光性０．２ｍｍ厚シリカプレート（ＴＬＣアルミニウムシート、シリカゲル６０、ＭＥＲＣＫ社、Ｎｏ．  １．０５５５３）を用いたバンドＴＬＣに供した。タバコ５本からの原料（およそ３０μｌメタノール溶液）を底部から約１．５ｃｍ上方の線に沿ってスポットした。このプレートをトルエンと酢酸エチル（８０：２０）を用いて１５分間展開した。展開した溶剤の先端が頂部から０．５ｃｍ離れたときプレートを取り出し、ドライヤを用いて室温で乾燥した。乾燥後、プレートの左右両側から０．５ｃｍの短冊片を切り出し、バンドの位置を定めるためヨウ素チェンバに３分間保持した。Ｒｆ０．２６に対応するバンド（図２）を各プレートから削り落とし、１．５ｍｌエッペンドルフ管に採取し、ＨＰＬＣグレードのアセトン６００μｌを用いて時折攪拌しながら３０分間抽出した。次に室温で１０分間、１２０００ｒｐｍで管を遠心分離した。上澄みのアセトン層を注意深く別のエッペンドルフ管に採取した。溜まったアセトン抽出物は最後に、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃでエッペンドルフ管内で乾燥した。
【００６３】
（ｖ）工程４で得られた淡い黄色の針状の乾燥材料に対して、２００μｌの超純水を加え、これに２００μｌの水飽和状態のｎ−ブタノールを加え、５分間攪拌し、室温で５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上側のｎ−ブタノール層を注意深く採取し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで小さなガラス管内で乾燥した。
歩留りはタバコ２０本あたりおよそ４００μｇ。この段階でｃｓ−オキシダントは純度９８．５％であり、これはＨＰＬＣ分析から分かる。
【００６４】
（ｖｉ）工程５の後に得られた全サンプルを４００μｌの移動溶剤に溶解し、この溶液の２０μｌ（およそ２０μｇのオキシダント）をＭｅｒｃｋ社製２５ｃｍ順相シリカカラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（商標登録）  Ｓｉ  ６０）を有する島津製作所製１０ＡＶＰ  ＨＰＬＣ装置に注入し、ＵＶ検出器及び付属のクロマトパックＣ−Ｒ６Ａを使用した。全部で２０の注入は異なったバッチでなされた。
その他の一定に保たれていた条件は以下の通りである。
吸光度：２９４ｎｍ（メタノール中のオキシダントのλｍａｘは２９３．４ｎｍで、これはＵＶ分光光度スキャニングから分かった。図９参照）
移動溶剤：塩化メチレン：メタノール（９０：１０）
流速：０．５ｍｌ／分
圧力：２９ｋｇｆ／ｃｍ２
温度：２５℃
オキシダント保持時間：８．８０８分
【００６５】
保持時間８．８０８分でオキシダントは主ピークとして溶出した（図３）。異なるバッチの注入から得られ溜まったＨＰＬＣ溶出液を２５ｍｌガラスビーカに採取し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃで乾燥した。オキシダントは小さな針状の、非常に淡い黄色の結晶として現れた。同一条件下で注入されると、ＨＰＬＣ精製オキシダントは保持時間８．８０８分でＨＰＬＣプロファイル中にただ一つのピークとして現れ（図４）、これは純度１００％を示す。
歩留りはタバコ２０本あたりおよそ３００μｇである。
【００６６】
（ｖｉｉ）使用したサンプル量及びＨＰＬＣ分析で得られたｃｓ−オキシダントの対応ピーク面積（任意）に基づき、全ｃｓ溶液からの活性オキシダントの復元率を以下のように算出した。
濾過した全ｃｓ溶液４μｌ（工程１参照）を移動溶剤で８０μｌに希釈し、２０μｌをＨＰＬＣカラムに注入した。
オキシダント２０μｌでの前記任意面積は、保持時間８．８０８分に対応し、３４０５８３であった。
したがって、８０μｌでの面積＝１３６２３３２＝全ｃｓ溶液４μｌ、である。
よって、全ｃｓ溶液１ｍｌでのオキシダントの任意面積＝３．４×１０８、である。
全ｃｓ溶液１ｍｌはタバコ１本に相当するため（工程１参照）、タバコ１本あたりのｃｓ−オキシダントの面積＝３．４×１０８、である。
タバコ２０本からのＨＰＬＣ精製後の純粋オキシダントの歩留り＝３００μｇ、である。
よって、タバコ１本からの歩留り＝１５μｇ＝１５０００ｎｇ、である。
標準曲線（図１４参照）から、純粋ｃｓ−オキシダント１００ｎｇのＨＰＬＣピーク面積＝１９００００、である。
したがって、タバコ１本に相当する１５０００ｎｇのピーク面積＝２．８５×１０７、である。
このように、全ｃｓ溶液からの純粋ｃｓ−オキシダントの復元率は、（２．８５×１０７×１００）／３．４×１０８＝８．４％、である。
【００６７】
（ｖｉｉｉ）精製の様々な段階におけるｃｓ−オキシダントの酸化能力は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の酸化を測定することで判定された。この結果は、ＢＳＡ１ｍｇあたりのタンパク質カルボニルのナノモルで表される（表１）。精製の様々な段階において、上記の「単離及び精製手順」で述べたように、タバコ１本の２０分の１に相当する量の材料（５０μｌ溶液）がタール溶液（工程１）、水抽出物（工程２）、ブタノール抽出物（工程３）に関して用いられた。ブタノール抽出物に関しては、５０μｌのブタノール溶液を取り出し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃでブタノールを蒸発させ、乾燥した残留物の重さを量り、ＢＳＡの酸化に直接使用した。工程４（ＴＬＣ）及び工程６（ＨＰＬＣ）で得られた材料はそれぞれ、１５μｇと１０μｇの量だけ用いられた。
【００６８】
（ｉｘ）ｃｓ−オキシダントの純度の判定基準
（ａ）ＴＬＣ：Ｒｆ０．２６、展開溶剤としてトルエン：酢酸エチル（８０：２０）を用いた（図５）ＴＬＣでスポットが一つだけ得られた。
（ｂ）ＨＰＬＣ：ＨＰＬＣ分析でピークが一つだけ得られた。保持時間は８．８０８分で、移動溶剤、塩化メチレン：メタノール（９０：１０）を使用した（図４）。
（ｃ）融点：化合物は１６２℃で急激に溶ける。
（ｄ）蛍光分光法：
ｃｓ−オキシダント（メタノール１ｍｌ中に５ｍｇ）のＵＶ分光光度スキャニングは、２９３．４ｎｍと２２３．０ｎｍとに２つの吸収極大を示した（図９参照）。ＵＶ分光光度スキャニングに関してと同様に、蛍光分光法がメタノール溶液について行われた。２９３ｎｍで励起したとき、放射スキャニングを３００ｎｍから８００ｎｍにかけてモニターし、２２４ｎｍで励起したとき、放射スキャニングを２２５ｎｍから８００ｎｍにかけてモニターした。２９３ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５１．４ｎｍにあった（図６ａ）。２２４ｎｍで励起したときに観測された放射極大は３２９．６ｎｍと６５２．６ｎｍにあった（図６ｂ）。放射を３３０ｎｍに保って励起スキャンをモニターすると、観測された励起極大は２２８．２ｎｍと２９３．８ｎｍにあった（図７ａ）。また、放射を６５１ｎｍに保って励起スキャンをモニターすると、観測された励起極大は２２９．２ｎｍと２９４．８ｎｍにあった（図７ｂ）。観測されたスペクトルプロファイルは、２つの吸収極大が同一の化合物からのもので、単離されたｃｓ−オキシダントの純度によるものであることを示している。
【００６９】
実施例２
カルボニル含有量の測定によるタンパク質損傷の定量分析
培養システムは、ＢＳＡ１ｍｇと、ｃｓ溶液５０μｌ、又はｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液最終量２００μｌでの精製の各段階において得られる相応量を含むものであった。培養は３７℃で１時間行われた。我々の実験室でこれまで行ってきた（Panda et al., Free Radic. Biol. & Med. 27: 1064-1079, 1999）ものと同様なＬｅｖｉｎｅ他の方法（Methods Enzymol. 186: 464-478, 1990）に従い、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と反応させタンパク質カルボニルを測定した。全相ｃｓ溶液、ｃｓの水抽出物、又はｃｓ−オキシダント（最終量２００μｌ）でＢＳＡを培養した後、タンパク質を２０％トリクロロ酢酸溶液２００μｌで沈殿させ、１０％トリクロロ酢酸溶液２００μｌで洗浄してｃｓ成分をペレットから取り除いた。この洗浄後のペレットに対して、１０ｍＭのＤＮＰＨ溶液５００μｌを２ＭのＨＣＬ内で加え、時折攪拌しながら３７℃で１時間培養した。その後、タンパク質を冷えた２０％トリクロロ酢酸溶液５００μｌで再び沈殿させ、ペレットをまず１０％トリクロロ酢酸溶液５００μｌで洗浄し、エタノール：酢酸エチル（１：１、ｖ／ｖ）の混合物１ｍｌで３回連続して洗浄した。最後に、洗浄後の沈殿物を１ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ２．３）に溶解し、吸光度を３９０ｎｍで、ダブルビーム分光光度計、日立Ｕ−３０２０を２ＭのＨＣＬの試薬ブランク液に対して用いて測定した。結果は、２２，０００のモル吸光係数を用い、タンパク質１ミリグラムあたりのフェニルヒドラゾンのナノモルとして表した。ｃｓ−オキシダントを用いたＢＳＡ培養後に得られた総フェニルヒドラゾン値から、未処理のＢＳＡで得られたフェニルヒドラゾン値を引き、形成されたタンパク質カルボニルの正味の値を得た。結果は表１に示した。
【００７０】
実施例３
ｃｓ−オキシダントの物理化学的性質
（ａ）外観：アセトン溶液から結晶化したとき、オキシダントは小さな針状の淡い黄色の結晶として現れた（図８）。乾燥状態又は溶液中において、明かりの下、空気中で、この化合物は徐々に茶色に変わる。
（ｂ）臭い：腐った乳脂肪に似た、鼻を突く臭い。
（ｃ）ＵＶ吸収：オキシダントはメタノール溶液で２つの吸収極大を有し、１つは２９３．４ｎｍ、もう１つは２２３．０ｎｍである（図９）。水溶液では、吸収極大が２８８ｎｍと２２１ｎｍにある。４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視領域で吸収はなかったが、これはオキシダントに発色団がないことを示している。
【００７１】
実施例４
ｃｓ−オキシダントの化学的性質
（ａ）溶解度：
メタノール、エタノール、アセトン、ｎ−ブタノールには非常に溶けやすく、水にはかなり溶けやすく、塩化メチレン、ジエチルエーテル、クロロフォルムにはやや溶けにくく、ベンゼン、石油エーテルには溶けない。
【００７２】
（ｂ）ｐＨの作用：
酸性のｐＨ（４〜５）のとき、化合物は茶色にならないが、その酸化能力を失う。アルカリ性のｐＨ（ｐＨ９）に溶液を保つと、化合物は徐々に茶色く変色する。ｐＨが１０近く又はそれ以上の場合、瞬時に暗色化すると共にＵＶ分光法から分かるように活性と芳香族性の両方を失う。
【００７３】
（ｃ）固体オキシダントの安定性：
固体状態で暗所に室温で貯蔵したときのオキシダントの半減期は、アスコルビン酸の酸化能力から判断して４８時間であることが分かった（図１０）。アスコルビン酸の酸化はＨＰＬＣ分析により測定された。様々な濃度のアスコルビン酸を用いて作成したアスコルビン酸の標準曲線を図１１に示す。
【００７４】
ｃｓ−オキシダントの安定性の測定のため、調製したてのオキシダントを５つの別々のサンプル管に分配した。各管は５μｇのｃｓ−オキシダントを収容していた。１本の管はすぐさま試験（０日目、図１０）してそのアスコルビン酸の酸化能力を測定した。残りの管はその後、それぞれ１日、２日、３日、５日目に試験した（図１０）。各管に対し、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液２００μｌに溶かしたアスコルビン酸塩５μｇが加えられ、室温で４５分間培養した。その後、分析用混合物１６μｌを様々な時間間隔で採取し、移動溶剤２４μｌに加え、最終量を４０μｌとした。当初はアスコルビン酸２００ｎｇに相当するこの希釈溶液２０μｌを注入した。平行する対照はオキシダント無しで保持し、アスコルビン酸塩の自動酸化を観察した。アスコルビン酸は２５４ｎｍで検出された。定められた条件下でのアスコルビン酸の保持時間は６．１分であった。その条件下でＨＰＬＣにより測定可能なアスコルビン酸塩の最小量は５００ｐｇであった。
ＨＰＬＣ分析の条件は、
装置：島津製作所製１０Ａ
カラム：Ｌｉｃｈｒｏ  ＣＡＲＴ  ２５０−４  ＮＨ２  カラム（Ｍｅｒｃｋ社製）
移動溶剤：アセトニトリル：５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（７５：２５）
流速：１．５ｍｌ／分
圧力：１３２ｋｇｆ／ｃｍ２
温度：２５℃
【００７５】
（ｄ）溶液中でのオキシダントの安定性
固体状態で貯蔵された場合の半減期４８時間とは大きく異なり、ｐH７．４、２５℃、５０ｍMの燐酸カリウム緩衝溶液に貯蔵した場合のオキシダントの半減期は約１時間３０分であった（図１２）。
分析条件は上記「固体オキシダントの安定性」で述べたものと同一であった。
【００７６】
（ｅ）塩化第二鉄溶液との反応
ｃｓ−オキシダント５００μｇを含むメタノール溶液２００μｌに塩化第二鉄（１ｍｇ）の水溶液２０μｌを加えた。その途端、緑色が一瞬だけ現れた。これはオキシダントがフェノール性−ＯＨ基を含むことを示している。
【００７７】
（ｆ）フェリチトクロムｃの還元
オキシダントはタンパク質とアスコルビン酸（後に示す）を酸化するだけでなく、経時的なフェロチトクロムｃの形成により測定されるように、フェリチトクロムｃを定量的に還元する（図１３）。
【００７８】
ｐH７．４の５０ｍM燐酸カリウム緩衝液８９０μｌに１ｍＭのフェリチトクロムｃ溶液を１００μｌ加え、終末濃度を１００μＭとした。これにｐH７．４の５０ｍM燐酸カリウム緩衝液１０μｌにｃｓ−オキシダントを４．５μｇ溶かした溶液を加え、吸光度を５５０ｎｍで３０秒間隔で記録した。結果（図１３）は、１ナノモルのオキシダント（後に示すように、Ｍ．Ｗ＝１１０とする）がフェリチトクロムｃを０．７１ナノモル還元することを示し、これはモル比１：１に近い。すなわち、オキシダントは分子毎に還元基を１つ含むようである。フェロチトクロムｃの５５０ｎｍでのモル吸光係数は２５×１０３ｃｍ−１とした。ヒドロキノンによるフェリチトクロムｃの還元がおよそモル比１：０７１であることも観測され、これはｃｓ−オキシダントの還元成分がヒドロキノンのものと類似していることを示している。
【００７９】
（ｇ）アスコルビン酸の酸化
調製したてのｃｓ−オキシダント溶液によるアスコルビン酸の酸化を、固体オキシダントの安定性（ｃｓ−オキシダントの化学的性質における項目ｃ）で先に述べたのと同様、アスコルビン酸のＨＰＬＣ分析で測定した。
【００８０】
アスコルビン酸塩の酸化は、ｐH７．４で最終量２００μｌの５０ｍMカリウム緩衝液に溶かした一定量のオキシダント（４５．４５ナノモル）に対し、限定量のアスコルビン酸塩（２８．４１ナノモル）と過剰なアスコルビン酸塩（８５．２３ナノモル）の両方で測定した。ｃｓ−オキシダントの化学的性質における項目ｃで述べたように様々な時間間隔で分取を行い、アスコルビン酸塩をＨＰＬＣ分析で分析した。用いたのが多量（８５．２３ナノモル）あるいは限定量（２８．４１ナノモル）のアスコルビン酸塩であったかどうかは関係なく、アスコルビン酸塩の酸化に関し同じような結果が得られた。
【００８１】
４５分の培養後、ｃｓ−オキシダントのナノモルに対する酸化したアスコルビン酸塩のナノモルの比は０．５５であった（表２）。アスコルビン酸塩の酸化とは電子が１つ移動する反応であるためこの比は事実上１：１であり、生成物のアスコルビン酸塩ラジカル（ＡＨ・）は化学的に不活性であり、以下に示すよう不均化反応により崩壊する。
2005502857.tif 000005
（ＡＨ２＝アスコルビン酸塩、Ａ＝デヒドロアスコルビン酸塩、ＯＸ＝オキシダント）
[(Bielski, B.H.Jr. and Richter, H.W. (1975), Some properties of the ascorbate free radical. Ann. N.Y. Acad. Sci, 258, pp.231-237)]
【００８２】
アスコルビン酸塩の酸化とフェリチトクロムｃの還元（上記の項目ｆ）に関して得られた結果は、ｃｓ−オキシダントが化学量論比において、分子に酸化基を１つと還元基を１つ含んでいることを示している。
【００８３】
実施例５
ｃｓ−オキシダントの定量的測定
オキシダントは（ａ）ＵＶ分光法、（ｂ）ＨＰＬＣ分析、（ｃ）フェリチトクロムｃの還元、により定量的に測定可能である。
【００８４】
（ａ）ＵＶ吸収
５μｇのオキシダントをＨＰＬＣグレードのメタノール１ｍｌに溶解し、この溶液の２００〜５００ｎｍでのメタノールに対するＵＶ吸収を日立製ダブルビーム分光光度計（Ｕ−３０２０）で記録した。
図９はオキシダントが２つの吸収極大（λｍａｘ）を有することを示す。
λｍａｘ                吸収
２９３．４ｎｍ          ０．３１９２
２２３．０ｎｍ          ０．６９９４
２９３．４ｎｍでの吸収はオキシダントの濃度に比例していた。２９３．４ｎｍでの吸収極大に基づくオキシダントのモル吸光係数は図９から算出され、ε２９３．４＝７０１８ｃｍ−１、であることがわかった。
【００８５】
（ｂ）ＨＰＬＣ分析
移動溶剤２０μｌに溶解した１０ｎｇ〜１００ｎｇにわたる様々な濃度のオキシダントをＨＰＬＣに注入し、２９４ｎｍでオキシダントを検出した。オキシダントのピーク面積（任意）に基づき標準曲線を作成した（図１４）。以下の条件のＨＰＬＣ分析で検出可能なオキシダントの最小量は５００ｐｇであった。
用いたパラメーターは：
装置：島津製作所製１０Ａ
カラム：２５ｃｍシリカカラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ（商標登録）  Ｓｉ  ６０、Ｍｅｒｃｋ社）
移動溶剤：塩化メチレン：メタノール（９０：１０、ｖ／ｖ）
流速：０．５ｍｌ／分
圧力：２９Ｋｇｆ／ｃｍ２
温度：２５℃
保持時間：８．８０８分
【００８６】
（ｃ）フェリチトクロムｃの還元
１μｇ〜５μｇにわたる様々な量のｃｓ−オキシダントを用いて、オキシダントの化学的性質の項目（ｆ）で述べた方法に基づき、フェリチトクロムｃを還元した。得られた結果に基づいて標準曲線を描いた（図１５）。
【００８７】
実施例６
ｃｓ−オキシダントの構造の特定
オキシダントの構造を以下のパラメーターによって特定した：
元素分析、質量スペクトル、融点測定、ＵＶ分光法、蛍光分光法、ＦＴＩＲ、Ｈ−ＮＭＲ、Ｃ−ＮＭＲ、ＥＳＲ、及びＸＲＦ分析。
【００８８】
（ａ）元素分析
１ｍｇのオキシダントを用いて、パーキンエルマー社製２４００シリーズＩＩのＣＨＮＳ／Ｏ分析装置で元素分析を行った。
結果
炭素％          水素％          窒素％
６４．０６      ５．３３        １．１６
この百分率分析からＣ、Ｈ、Ｏの比は：
炭素                  ５．３４
水素                  ５．３３
酸素（差による）      １．８４
よって実験式は、Ｃ６Ｈ６Ｏ２、である。
【００８９】
（ｂ）質量スペクトル
７０ｅＶでＥＩ法を用い、オキシダントの分子量をＶＧ７０７０Ｈ質量分析計によって測定した。
観測した分子量は１１０で、ｍ／ｅがそれぞれ８１、５３の２つの後続フラグメントを有していた（図１６）。
化合物の分子量は見たところヒドロキノン（Ｃ６Ｈ６Ｏ２）のものだが、実際には化合物は酸化性の強いオキシダントである。比較のＨ−ＮＭＲ分光調査（後に示す）は、ヒドロキノンよりもオキシダントの方がヘテロ原子結合プロトンが少量であることを示し、ＥＳＲ分光法（後に示す）から算出したｇ係数は、化合物がｐ−ベンゾセミキノン（ＭＷ１０９）であることを示す。観測した化合物の分子量１１０は、質量スペクトルが室温で７日間貯蔵したサンプルに対して行われたことで説明がつくであろう。室温で固体状態で貯蔵すると、ｐ−ベンゾセミキノンはそのカチオン形態に変化することがある。固体状態で５〜７日間貯蔵すると、この化合物は、オキシダントの活性の低下（後に示す）とともに、ヒドロキノン（ＭＷ１１０）のものと類似したＵＶ吸収スペクトルを示すことが観測された。
【００９０】
（ｃ）融点測定
ｃｓ−オキシダントの融点は１６２℃であることがわかった。顕微鏡下では最初、オキシダントは暗い、黒みがかったロッド状の結晶の束に見えた。およそ１４０℃から温度が上昇するにつれ、結晶端部の明るさが増し、結晶同士の分離が発生した。結晶端部からの黒みがかった陰が消え始め、温度が融点に近づくにつれ結晶の明瞭さ、輝きが増した。１６２℃で結晶の主要部の大半が融解した直後、融解池にいくつかの小さなロッド状結晶が現れ、これらはその後、ヒドロキノンの融点であることで知られる１７２℃で融解した。高い融解温度でオキシダントの一部がヒドロキノンに変化した可能性がある。同様の条件下で、ヒドロキノンの融点は１７２℃であることがわかった。上述したような融解前のオキシダントの結晶パターンの特徴的変化は、ヒドロキノンの場合ずっと不明瞭であった。
【００９１】
混融点の調査
等量のヒドロキノンとｃｓ−オキシダントをアセトンに溶解し、乾燥してその混晶を得た。混晶の融点は１６５℃であることがわかった。
この融点実験から、化合物がヒドロキノンではないことが証明された。
【００９２】
（ｃ）ＵＶ分光光度分析
メタノール１ｍｌにオキシダント５μｇを溶解し、ダブルビーム分光光度計、日立Ｕ−３０２０で、ブランク液としてのメタノールに対して５００ｎｍ〜２００ｎｍで波長スキャニングをモニターした。
図９に示すように吸収極大は以下の通り：
λｍａｘ            吸収
２９３．４ｎｍ      ０．３１９２
２２３．０ｎｍ      ０．６９９４
λｍａｘ２２３ｎｍ：λｍａｘ２９３．４ｎｍでの吸収比＝２．１９である。
同様の条件下でのヒドロキノンのＵＶ分光光度分析は１．９８の比（図１７）をもたらし、これはオキシダントのものとは異なっていた。
【００９３】
面白いことに、暗所において最大８日間室温で貯蔵したとき、貯蔵したオキシダントのＵＶスペクトルはヒドロキノンのものにより類似し、１．９９の比（図１８）をもたらした。これは、貯蔵時にｃｓ−オキシダントがゆっくりヒドロキノンに変わることを示すものと思われる。
【００９４】
貯蔵時にｐ−ベンゾキノンが生成された徴はない。等モル比でｐ−ベンゾキノンをヒドロキノンと混合すると、吸収スペクトルは２４２ｎｍ近傍に肩を生じる（図１９）。貯蔵したオキシダントにはこのような肩は全く見られない（図１８）。
【００９５】
（ｅ）蛍光分光法
２９４ｎｍの励起波長を用いたとき、オキシダントの蛍光発光パターンが同一条件下でのヒドロキノンと同じであることを図２０が示している（図６ａ参照）。
【００９６】
（ｆ）ＦＴＩＲ分光法
オキシダントのＦＴＩＲ分光分析を日本の島津製作所製の分光光度計ＦＴＩＲ−８３００で行った。乾燥オキシダント１ｍｇでＫＢｒペレットを作成し、ＦＴＩＲ分光法に用いた。図２１は、
・３２３４．４ｃｍ−１でのＯ−Ｈ延伸
・３０３０．０ｃｍ−１での芳香環のＣ−Ｈ延伸
・１５１４．０ｃｍ−１でのＣ−Ｃ−延伸
・１３５５．９ｃｍ−１でのＯ−Ｈ屈曲
・１１９３．９ｃｍ−１でのＣ−Ｏ延伸
・７５６．０ｃｍ−１でのＣ−Ｈ屈曲
に対応するピークを示す。
ヒドロキノンのＦＴＩＲスペクトルを同様の条件下で実施したが、これは微妙に異なるが類似したピークパターン（図２２）を示した。
【００９７】
（ｇ）ＮＭＲ分光法
Ｂｒｕｋｅｒ社製５００ＭＨｚ分光計を用いてＮＭＲ分光法を行った。
分析及び解説：
１Ｈ−ＮＭＲ：
オキシダント２００μｇを５００μｌのＣＤ３ＣＯＣＤ３に溶解し分析した。ＮＭＲプロファイルは、ヒドロキノン構造の４つの芳香族プロトンに対応する１つの鋭いピークを６．５６ｐｐｍに、ヒドロキノンの酸素原子に結合したプロトンであるヘテロ原子結合プロトンに対応する別のピークを７．５５ｐｐｍに示す（図２３）。ＣＤ３ＣＯＣＤ３中のヒドロキノンのＨ−ＮＭＲプロファイルは、（図２４）に示す。ヒドロキノンとオキシダントの間では２つのピークの化学シフトに違いはない。
ジューテロ化したアセトンでは、ヒドロキノンのヘテロ原子結合プロトンに対する芳香族プロトンの比が１：０．４１４３であることが分かった。この特定の比は、オキシダントでは１：０．２５８９であった。このことからオキシダントがヒドロキノンよりも少量のヘテロ原子結合プロトンしか含まないことが分かる。図２５は、７．５５ｐｐｍにおいて、オキシダントとヒドロキノンの間にピークの本質で明らかな違いがあることを示している。
ＣＤ３ＣＯＣＤ３のオキシダント溶液に亜ジチオン酸ナトリウムを少し加えると、ヘテロ原子結合プロトンに対する芳香族プロトンの比が１：０．３６となった。このことは、亜ジチオン酸塩によりオキシダントがヒドロキノンへと還元されたことを示している（図２６）。
【００９８】
Ｃ−ＮＭＲ：
オキシダントのＣ−ＮＭＲプロファイル（図２７）はこれがヒドロキノンのもの（図２８）と同一であることを示している。両者において、プロトンが完全に分離しＣＤ３ＣＯＣＤ３を溶剤として用いたとき、ピークが１１６．１０１ｐｐｍと１５０．６９５ｐｐｍとでそれぞれ得られた。１５０．６９５ｐｐｍでのピークはヘテロ原子（＞Ｃ＝Ｏ）結合炭素を表す。
【００９９】
（ｈ）ＸＲＦ分析
ここまで述べた分析は全て、ｃｓ−オキシダントの構造がヒドロキノンのものと類似しているが、ヘテロ原子結合プロトンの含有量は少ない、との意見に至るものである。さらにヒドロキノンとは対照的に、ｃｓ−オキシダントは酸化性の強いオキシダントである。ｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液を含む２００μｌ培養混合物にＢＳＡ１ｍｇを用いると、１０μｇのオキシダントが１時間で９ナノモルのカルボニルを生じた。同様の条件下で、１０μｇのヒドロキノンは極僅かな量のタンパク質カルボニルしか生じなかった。同じくヒドロキノンとは対照的に、オキシダントはアスコルビン酸塩を化学量論的に酸化する。よってｃｓ−オキシダントはヒドロキノンの遷移金属錯体であるか、あるいはフリーラジカル、すなわち不対電子を含むｐ−ベンゾセミキノンであると考えられる。もしあるならばだが、金属の存在を検知するため、化合物をＸ線蛍光分光法へと供した。
【０１００】
ホウ酸バックアップを有する粉にした試料と混合した後、圧縮ペレットの形態でオキシダントを分析した。ロジウムＸ線管を有するフィリップス社製ＰＷ２４０４型波長分散型Ｘ線蛍光分光器（ＷＤＸＲＦ）を用い、多量及び微量元素を測定した。操作条件は５０ＫＶ、４０ｍＡであった。
【０１０１】
化合物中のいかなる遷移金属の存在もＸＲＦ分析は示さなかった。よって化合物の強い酸化作用は、遷移金属の存在に由来するものではなかった。
【０１０２】
（ｉ）ＥＳＲ分析
ＸＲＦ分析で証明されたように化合物はいかなる遷移金属も含むものではないため、オキシダントがフリーラジカル、おそらくはｐ−ベンゾセミキノンであるとの他方の選択肢が残る。不対電子の存在を検知するため、オキシダントを異なる２つの手法を用いたＥＳＲスペクトル分析に供した。
【０１０３】
手法その１。貯蔵中にｃｓ−オキシダントの活性は減衰するため、ＥＳＲ分光法を調製したてのオキシダントに対して行った。１００本のタバコからタールを溜め、同日にオキシダントを精製しＥＳＲ分光法に供した。
使用装置はＪＥＳ−ＲＥＩＸ  ＥＳＲ分光計（日本、東京）であった。
用いたパラメーターは：
電場変調幅＝０．４ｍＴ
温度＝２５℃
電力＝２ｍＷ
走査範囲＝（３３５±１０）ｍＴ
掃引時間＝８分、すなわち２．５ｍＴ／分
時定数＝０．３秒
レシーバーゲイン＝３．２×１０００
【０１０４】
ＥＳＲプロファイル（図２９）は左右対称な単一のローレンツ曲線の存在を示している。これは、芳香族の骨格上で非局在化した不対電子からなる単一種類のラジカルを示している。スペクトル分岐因子、すなわちｇ係数は、標準の固体ＤＰＰＨ（ジフェニルピクリルヒドラジル）ラジカルを参照し算出した。ｃｓ−オキシダントとＤＰＰＨの正確な中心（ここで一次導関数信号がゼロを通る）の位置の違いは１３ｍｍで、１．８Ｇに相当する。
【０１０５】
両スペクトルは同じ固定周波数で記録されたため、共振が発生する（ｈｖ＝ｇＢＨ）ところの周波数（ｖ）は両スペクトルともに同じである：
ｈ．ｖＤＰＰＨ＝ｇＤＰＰＨ．Ｂ．ＨＤＰＰＨ、及び
ｈ．ｖｃｓ−オキシダント＝ｇｃｓ−オキシダント．Ｂ．Ｈｃｓ−オキシダント、
ｖＤＰＰＨとｖｃｓ−オキシダントが同じであるため、
ｇＤＰＰＨ．Ｂ．ＨＤＰＰＨ＝ｇｃｓ−オキシダント．Ｂ．Ｈｃｓ−オキシダント、
Ｂは一定であり、よって、
ｇＤＰＰＨ．ＨＤＰＰＨ＝ｇｃｓ−オキシダント．Ｈｃｓ−オキシダント、
ＨＤＰＰＨは約３３５３．１５Ｇであり、よってＨｃｓ−オキシダントは、
（３３５３．１５Ｇ−１．８Ｇ）＝３３５１．３５Ｇ。
整理すると：
ｇｃｓ−オキシダント＝２．００３６×３３５３．１５／３３５１．３５＝２．００４６８。
このｃｓ−オキシダントのｇ値は、既に報告されているｐ−ベンゾセミキノンのｇ値（２．００４６７９±０．０００００６）とほぼ同一である（Wertz, J.E. and Bolton, J. R. Electron spin resonance, theory and practical applications, McGraw-Hill Book Company, New York, 1972, p. 465）。
【０１０６】
ｃｓ−オキシダントのスピン密度は標準ピセインを基準として用い算出し、タバコ１００本につき１．８２×１０１３ｍｇ−１であること、すなわち、スピン密度＝１．８２×１０１１／タバコ１本、であると分かった。
【０１０７】
手法その２。毎日複数バッチで集めたタバコ４００本からのタールを、７日間かけて溜め、−７２℃で貯蔵した。溜めたタールからのｃｓ−オキシダントの精製を続く２日間で行った。精製したオキシダント（８ｍｇ）のＥＳＲ分光法を１０日目に行った。
図３０はタバコ４００本から集めて時間の経ったｃｓ−オキシダントのＥＳＲスペクトルを示す。
先と同様標準ピセインを用いて分子のスピン密度を算出し、１．０７１３×１０１３ｍｇ−１（タバコ４００本から）、すなわち、０．２６７８×１０１１／タバコ１本、であることが分かった。
【０１０８】
注目すべきは、手法その２で述べたように１０日間で精製された時間の経ったｃｓ−オキシダントのスピン密度（０．２６７８×１０１１／タバコ１本）が、調製したてのｃｓ−オキシダント（手法その１）のスピン密度（１．８２×１０１１／タバコ１本）の約１５％にすぎないことである。この常磁性のロスは、時間の経ったｃｓ−オキシダントのオキシダント活性の約８５％のロスを伴ったもので、これはアスコルビン酸の酸化能力により証明される。この結果はｃｓ−オキシダントの酸化活性を伴った常磁性が貯蔵時に減衰することの確証となる。
【０１０９】
ｃｓ−オキシダントの分子構造
ＨＰＬＣ分析ならびに化学及びスペクトル調査で得られた結果に基づき、ｃｓ−オキシダントの分子構造を以下のように導き出した。
【０１１０】
（ｉ）ｃｓ−オキシダントは不対電子を含み、そのｇ値はｐ−ベンゾセミキノンと同一である。
【０１１１】
（ｉｉ）Ｍ．Ｐ．が低く（１６２℃）且つヒドロキノンよりもヘテロ原子結合プロトンの含有量が少ないことを除き、構造はヒドロキノンと同一である。Ｎａ２Ｓ２Ｏ４による還元の際には、オキシダントはヒドロキノンへと変わる。
【０１１２】
（ｉｉｉ）ヒドロキノンとは対照的に、ｃｓ−オキシダントは強い酸化剤である。これはタンパク質ならびにアスコルビン酸を酸化する。
【０１１３】
（ｉｖ）オキシダントはまた、フェリチトクロムｃの還元から明らかなように、還元基を有する。
【０１１４】
（ｖ）フェリチトクロムｃの還元及びアスコルビン酸の酸化は化学量論的であり、すなわち、化学量論比において分子は還元基を１つと酸化基を１つ含む。フェノール性ＯＨが還元性をもたらし、不対電子を有する酸素が酸化性をもたらす。よってｃｓ−オキシダントの分子構造は以下に示すｐ−ベンゾセミキノンであろうと思われる。
【０１１５】
【化３】
2005502857.tif 000006
【０１１６】
図１に描いたように、ｐ−ベンゾセミキノンは様々なメソメリー状態、すなわち、陰イオン、中性、陽イオン状態で存在しており、これはヘテロ原子を含む芳香族の骨格上で不対電子が非局在化していることを示している。これがｐ−ベンゾセミキノンが比較的安定したフリーラジカルである理由で、タバコの煙溶液から固体の結晶状態で単離可能である。それでもなお貯蔵時には、単離した純粋なオキシダントは常磁性を失うもので、これにはＥＳＲ調査で上述したようにオキシダント活性のロスを伴う。暗所に室温で固体状態にて貯蔵した場合、オキシダントの半減期は４８時間、ｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝溶液に貯蔵した場合、およそ１．５時間である。
【０１１７】
実施例７
精製したｃｓ−オキシダント単独で、タバコの全煙溶液により生じるタンパク質酸化を量的に説明できる。
ＢＳＡの酸化をモデルシステムとして、上記申し立てを以下の観測により実証した。
（ｉ）カルボニル形成により証明される全ｃｓ溶液で生じたＢＳＡ酸化は、精製したｃｓオキシダント（安定したもの）で維持される。溶剤抽出法、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ等、オキシダントの単離及び精製の様々な工程で切り捨てられた全ｃｓ溶液の成分は、ＢＳＡ酸化を生じなかった。例えば溶剤抽出法の工程で、塩化メチレン抽出物によるＢＳＡの酸化は実際のところ皆無であった（単離及び精製の工程２）。
【０１１８】
（ｉｉ）凍結乾燥した物質のＴＬＣ（単離及び精製の工程４）は、図２に示すようにＲｆ＝０．２６のｃｓ−オキシダントのバンドを含んだ６つのバンドを生じた。先に述べたとおり、すべてのバンドの抽出物が別々に集められ、ＢＳＡの酸化に用いられた。ＢＳＡの酸化はｃｓ−オキシダントを含んだＲｆ＝０．２６に対応するバンドの抽出物のみにより生じた。Ｒｆ＝０．１２、０．１４、０．１６、０．３０、０．８０の他の全バンドの抽出物、ならびにベースラインからのものは、単独であろうが一緒であろうが、ＢＳＡの酸化を生じることはなかった。
【０１１９】
（ｉｉｉ）精製工程の最後から２番目の段階（単離及び精製の工程６）でのブタノール抽出物のＨＰＬＣ中、ｃｓ−オキシダントに対応する主ピーク（保持時間８．８０８分、図３ｂ）からの流出液のみがＢＳＡの酸化を生じた。保持時間が４．５５分〜７．２５分にわたる他の小ピークはＢＳＡの酸化を生じなかった。
【０１２０】
（ｉｖ）シリカカラムを用いての全ｃｓ溶液のＨＰＬＣ分析は、保持時間が８．８１３分のｃｓオキシダントの主ピークを含む、保持時間が５．７１７分〜１７．７８２分にかけての幾つかのピークの存在を示した（図３１）。全ｃｓ溶液に代えてｃｓの水抽出物を用いたとき、オキシダントは保持時間８．８０８分で溶出し（図３２）、これは純粋なｃｓ−オキシダントのＨＰＬＣ分析から分かった保持時間８．８０８分のｃｓ−オキシダントのピークと同一である（図４）。ｃｓ−オキシダントに対応するピーク（保持時間８．８１３分）からの流出液のみがＢＳＡの酸化を生じた。他のすべてのピークからの流出液は、単独であろうが一緒であろうが、ＢＳＡを酸化することはなかった。
【０１２１】
（ｖ）全ｃｓ溶液のＨＰＬＣ分析をＯＤＳカラムを用いて同様に行った。用いたパラメーターは：
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ（Ｍ）
移動溶剤：水：メタノール（９５：５）
流速：０．８ｍｌ／分
圧力：１４７ｋｇｆ／ｃｍ２
温度：２５℃
吸光度：２８８ｎｍ（水中でのｃｓ−オキシダントのλｍａｘ）
【０１２２】
ＯＤＳカラムを用いての全ｃｓ溶液のＨＰＬＣ分析は、純粋ｃｓ−オキシダントのＨＰＬＣ分析から分かるようにｃｓ−オキシダントのピーク（保持時間１３．４６分、図３４）である１３．４６７分での主ピークを含む約１３のピークを生じた（図３３）。この条件下ではまた、先に述べたようにシリカカラムを用いたときにも観測したように、ｃｓ−オキシダントに対応するピーク（保持時間１３．４６分）からの流出液のみがＢＳＡの酸化を生じた。他のピークからの流出液は、単独であろうが一緒であろうが、ＢＳＡを酸化することはなかった。
【０１２３】
なお、ＯＤＳカラムを用いて得られる分解能はシリカカラムよりも良いが、タバコの煙溶液又はｃｓ−オキシダントの分析にＯＤＳカラムを常に用いることはできない。全ｃｓ溶液、ｃｓの水抽出物、又はｃｓ−オキシダントに二三度使用すると、背圧の上昇や分解能のロスから分かるように、ＯＤＳカラムは変性を蒙る。
【０１２４】
上記結果はｃｓ−オキシダントのみがＢＳＡの酸化の原因であることを示している。全ｃｓ溶液の他の成分はどれもＢＳＡを酸化できない。これはさらに表３に示した結果からも確認できる。表は、全ｃｓ溶液を用いた場合ｃｓ−オキシダントに対応するピーク面積１７０３０×１０３（保持時間８．８１３分）が７．５３ナノモルのカルボニルを生じ、これは単位面積あたり４．４２×１０−７ナノモルのカルボニルに相当することを示す。この表（表３）はさらに、全ｃｓ溶液の代わりにＨＰＬＣ精製ｃｓ−オキシダントを用いた場合保持時間８．８０８分のピーク面積１９０１０×１０１３が９．５６ナノモルのカルボニルを生じ、これは単位面積あたり５．０３×１０−７ナノモルのカルボニルに相当することを示す。この結果は、全ｃｓ溶液により生じたＢＳＡの酸化が、それとは別に純粋なオキシダントのみによってもほぼ定量的に再現されることを示し、ここで後者は全ｃｓ溶液に存在するものに相当する量で用いられる。
【０１２５】
ｃｓ−オキシダントは、定量的に全ｃｓ溶液により生じるタンパク質の酸化損傷の原因となるだけでなく、その内容から明らかなようにタバコの煙の主要な有毒物質でもある。ＨＰＬＣ分析（８頁、ｃｓ−オキシダントの発見、において）から、全ｃｓ溶液１ｍｌ（タバコ１本に相当）に存在するｃｓ−オキシダントが任意面積３．４×１０８をもたらすことが分かる。標準ＨＰＬＣ曲線から、純粋ｃｓ−オキシダント１００ｎｇは面積１９００００をもたらすことが分かる。よって、タバコ１本からの全ｃｓ溶液中におけるｃｓ−オキシダントの含有量は約１９０±１０μｇである。フィルター付き又はフィルター無しの、市販の異なる１２銘柄のタバコから同程度の歩留りが得られた。なお、ｃｓ−オキシダントは非喫煙時のタバコには存在せず、タバコが燃えている間に生じる
【０１２６】
精製されたｃｓ−オキシダントが定量的に全ｃｓ溶液により生じるタンパク質の酸化損傷の原因となることはまた、全ｃｓ溶液ならびにｃｓ−オキシダントで処理したテンジクネズミの肺のミクロソームタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明される（図３５ａ）。この図は、未処理のミクロソーム（レーン１）と対比させて、ｃｓ溶液５０μｌ（レーン２）とｃｓ溶液１００μｌ（レーン３）により生じた実質的損傷をそれぞれ示している。ｃｓ溶液をｃｓ溶液中に存在する量の純粋ｃｓ−オキシダントで置き換えた場合、レーン４（ｃｓ−オキシダント１０μｇ）及びレーン５（ｃｓ−オキシダント２０μｇ）に表されるように、損傷はずっと大きい。図３５ｂは様々なレーン（レーン１〜５）のタンパク質バンドの比重走査を示し、ｃｓ溶液及びｃｓ溶液中に存在する量のｃｓ−オキシダントにより生じた損傷の程度を比較するグラフ図を表示している。
【０１２７】
実施例８
ｃｓ−オキシダントはＤＮＡの酸化損傷を引き起こした。
タバコの煙溶液がＤＮＡ損傷を引き起こすことはかねてより報告されており、これは一本鎖切断及び８−ヒドロキシグアノシンの形成により証明される。ＤＮＡ損傷が突然変異や癌にかかわりがあることもまた公知である。世界的にみて肺癌の約８０％はタバコの煙により引き起こされるものである。出願人はここでタバコの煙により引き起こされるＤＮＡの酸化損傷がｃｓ−オキシダントによるものであることを示すデータを提出する。
【０１２８】
ｐＨ７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液に１５μｇのｃｓ−オキシダントを溶かし、プラスミドＤＮＡ２ｍｇを３７℃で１時間培養し、最終量２００μｌとした。対照培養システムはｃｓ−オキシダント無しのままとした。培養後、５００μｌのエタノールでＤＮＡを沈殿させ、遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し塩を取り除き、凍結乾燥し、−７０℃で貯蔵し、続いて酸化損傷について分析を行った。ＧＣ−ｍａｓｓを用い、８−ヒドロキシグアノシン及び５−ヒドロキシ−６−メチルヒダントインの生成によりＤＮＡ損傷を測定した。結果は、ｃｓ−オキシダントが１０６ＤＮＡ塩基につき、２４ナノモルの８−ヒドロキシグアノシンと１２１ナノモルの５−ヒドロキシ−６−メチルヒダントインの生成を引き起こすことを示している。
【０１２９】
実施例９
ｃｓ−オキシダントが引き起こすタンパク質酸化の、様々な化合物／化学物質による防止。
３５〜９７％の範囲で生体外でのＢＳＡの酸化を防止する多数の化合物／化学物質が同定された。この化合物／化学物質はアスコルビン酸に加え、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、グルタチオン、茶の抽出物、そして茶の個々の成分を含むものである（表４）。
【０１３０】
【表１】
2005502857.tif 000007
【０１３１】
【表２】
2005502857.tif 000008
【０１３２】
【表３】
2005502857.tif 000009
【０１３３】
【表４】
2005502857.tif 000010
【０１３４】
【表５】
2005502857.tif 000011
【０１３５】
参考文献
1. Bartecchi, C.E.; Mackenzie, T.D. and Schier, R.W. The human costs of tobacco use. N. Engl. J. Med. 330:907-912; 1994
2. Frank, E. Benefits of stopping smoking. West J. Med. 159:83-87; 1993
3. U.S. Surgen General’s Report. Department of Health, Education and Welfare; Department of Health and Human Services, USA; 1985
4. Shah, P.K.; Helfant, R.H. Smoking and coronary artery disease. Chest 94:449-452; 1998
5. Sherman, C.B. Health effect of cigarette smoking. Clin. Chest Med. 12:643; 1991, J.N.; Green, C.R.; Best, F.W. and Newell, M.P. Smoke composition: an extensive investigation of the water-soluble portion of cigarette smoke. J. Agric. Food Chem. 25:310-320; 1977
6. Cross, C.E. Moderator. Oxygen radicals and human disease. Ann Intern. Med. 107:526-545; 1987
7. Panda, K.; Chattopadhyay, R.; Ghosh, M.K.; Chattopadhyay, D.J.; and Chatterjee, I.B. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced oxidative damage of proteins and increased proteolysis. Free Radic. Biol. Med. 27:1064-1079; 1999
8. Eiserich, J.P.; Vossen, V.; O’Neill, C.A.; Halliwel, B.; Cross, C.E.; and Van der Vliet. A molecular mechanism of damage by excess nitrogen oxides: nitration of tyrosine by gas phase cigarette smoke. FEBS Lett. 353:53-56; 1994
9. Panda, K.; Chattopadhyay, R.; Chattopadhyay, D.J.; and Chatterjee, I.B. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced oxidative damage in vivo. Free Radic. Biol. Med. 29:115-124; 2000
10. Schumacher Nakayama, T.; Kaneko, M,; Kodama, M. and Nagata, C. Cigarette smoke induces DNA single strand breaks in human cells. Nature 314:462-464; 1985
11. Nakayama, T.; Kaneko, M,; Kodama, M. and Nagata, C. Cigarette smoke induces DNA single strand breaks in human cells. Nature 314:462-464; 1985
12. Borish, E.T.; Cosgrove, J.P.; Chirch, D.F.; Deutesch, W.A. and Pryor, W.A. Cigarette tar causes single-strand breaks in DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 133:780-786; 1985
13. Denissoenko, M.F.; Pao, A.; Targ, M-S. and Pfeifer, G.P. Preferential formation of benzo [a] pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in P53. Science, 274:430-432, 1996
14. Fischer, S.; Spiegelhalder, B. and Preussmann, R. Tobacco specific nitrosamines in European and USA cigarettes. Arch. Geschwulstforsch, 60:169-177; 1990
15. Church, D.F. and Pryor, W.A. Free radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications. Environ. Health Perspect. 64:111-126; 1985
16. Pryor, W.A., Hales, B.J., Premovic, P.I. and Church, D.F. The radical in cigarette tar: Their nature and suggested physiological implication. Science 220:425-427, 1983
17. Glantz, S.A.; Slade, J.; Bero, L.A.; Hanauer, P. and Barnes, D.E. The cigarette papers. University of California Press, Berkely, USA, 1996.
18. Nagata, C.; Kodama, M. and Ioki, Y. In Polycyclic Hydrocarbons and Cancer, Gelboin, H.V. and P.O.P. Ts’o, Eds. (Academic Press, New York), 1:247; 1978
19. Werts, J.E. and Bolton, J.R. Electron spin resonance, elementary theory and practical applications. McGrow-Hill Book company, New York, 1972, p-213
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ｐ−ベンゾセミキノンのメソメリー状態を示し、ａ）は陰イオン、ｂ）及びｃ）は中性そしてｄ）は陽イオン、
【図２】凍結乾燥後のメタノール溶液のバンド薄層クロマトグラフィ−ｃｓオキシダントのバンドを指示、
【図３】ＴＬＣ後のブタノール抽出物のＨＰＬＣプロファイル、ｃｓ−オキシダント（工程６）は保持時間８．８０８分で主ピークとして溶出、ｃｓ−オキシダントの溶出量は約１２μｇ、
【図４】保持時間８．８０８分で溶出した純粋ｃｓ−オキシダントのＨＰＬＣプロファイル、
【図５】純粋ｃｓ−オキシダント（Ｒｆ＝０．２６）の薄層クロマトグラフィ、
【図６ａ】メタノールでのｃｓ−オキシダントの蛍光分光法プロファイル、励起は２９３ｎｍ、放射スキャニングは３００ｎｍ〜８００ｎｍで測定、放射極大は３２９．６ｎｍ、６５１．４ｎｍ、
【図６ｂ】メタノールでのｃｓ−オキシダントの蛍光分光法プロファイル、励起は２２４ｎｍ、放射スキャニングは２２５ｎｍ〜８００ｎｍで測定、放射極大は３２９．６ｎｍ、６５２．６ｎｍ、
【図７ａ】メタノールでのｃｓ−オキシダントの蛍光分光法プロファイル、放射は３３０ｎｍ、励起スキャニングは２２０ｎｍ〜３２５ｎｍで測定、励起極大は２２８．２ｎｍ、２９３．８ｎｍ、
【図７ｂ】メタノールでのｃｓ−オキシダントの蛍光分光法プロファイル、放射は６５１ｎｍ、励起スキャニングは２２０ｎｍ〜６５０ｎｍで測定、励起極大は２２９．２ｎｍ、２９４．８ｎｍ、
【図８】純粋ｃｓ−オキシダントの結晶構造、
【図９】メタノールでのｃｓ−オキシダントのＵＶ分光光度プロファイル、２つの吸収極大を有し、一方は２９３．４ｎｍ、他方は２２３．０ｎｍ、
【図１０】暗所に２５℃に保った固体のオキシダントの安定性、安定性はアスコルビン酸の酸化能力により判定、アスコルビン酸は２５４ｎｍでのＨＰＬＣ分析で測定、
【図１１】２５４ｎｍでのＨＰＬＣ分析に基づくアスコルビン酸の標準曲線、
【図１２】ＨＰＬＣ面積からわかるアスコルビン酸塩の酸化能力により測定された、２５℃の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中でのｃｓ−オキシダントの安定性、
【図１３】５５０ｎｍでのフェロチトクロムｃの経時的形成により測定されるオキシダントによるフェリチトクロムｃの量的還元、フェリチトクロムｃの終末濃度を１００μＭに保ち、ｐH７．４の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液中で反応、１ナノモルのオキシダントがフェリチトクロムｃを０．７１ナノモル還元、
【図１４】２９４ｎｍでのＨＰＬＣ面積に基づくオキシダントの標準曲線、２０μｌの移動溶剤に様々な量のｃｓ−オキシダントを１０ｎｇ〜１００ｎｇの範囲で使用、
【図１５】様々な量のオキシダントを１μｇ〜５μｇの範囲で用いたチトクロムｃの還元に基づくオキシダントの標準曲線、
【図１６】純粋ｃｓ−オキシダントの質量スペクトル、
【図１７】メタノールでのヒドロキノンのＵＶ分光光度プロファイル、２つの吸収極大を有し、一方は２９３．８ｎｍ、他方は２２４．２ｎｍ、
【図１８】暗所に８日間室温で貯蔵したときのｃｓ−オキシダントのＵＶ分光光度プロファイル、２つの吸収極大は２９３．６ｎｍと２２４．４ｎｍ、
【図１９】メタノールでのｐ−ベンゾキノンとヒドロキノンの等モル混合物のＵＶ分光光度プロファイル、２４２ｎｍ近傍に肩が生じる（ｐ−ベンゾキノンのλｍａｘ）、
【図２０】メタノールでのヒドロキノンの蛍光分光法プロファイル、励起は２９４ｎｍ、放射スキャニングは３００ｎｍ〜８００ｎｍで測定、放射極大は３２９．４ｎｍ、６５１．６ｎｍ、
【図２１】ｃｓ−オキシダントのＦＴＩＲ分光法プロファイル、
【図２２】ヒドロキノンのＦＴＩＲ分光法プロファイル、
【図２３】ＣＤ３ＣＯＣＤ３中のｃｓ−オキシダントのＨ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２４】ＣＤ３ＣＯＣＤ３中のヒドロキノンのＨ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２５】（ａ）ｃｓ−オキシダントと（ｂ）ヒドロキノンの比較のＨ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２６】亜ジチオン酸塩での還元後のｃｓ−オキシダントのＨ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２７】ＣＤ３ＣＯＣＤ３中のｃｓ−オキシダントのＣ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２８】ＣＤ３ＣＯＣＤ３中のヒドロキノンのＣ−ＮＭＲ分光法プロファイル、
【図２９】１００本のタバコから調製したてのｃｓ−オキシダントの室温ＥＳＲスペクトル、スペクトルはＪＥＳ−ＲＥＩＸ  ＥＳＲ分光計（日本、東京）に記録、スペクトルパラメータは以下の通り：マイクロ波振動数９．４３５６ＧＨｚ；電力２ｍＷ；電場変調幅０．４ｍＴ；変調周波数１００ｋＨｚ；時定数０．３秒；走査周波数２．５ｍＴ／秒、
【図３０】４００本のタバコから調製した時間の経った（１０日）ｃｓ−オキシダントの室温ＥＳＲスペクトル、
【図３１】シリカカラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒＲ  Ｓｉ  ６０、Ｍｅｒｃｋ社）で分析した全ｃｓ溶液のＨＰＬＣプロファイル−ｃｓオキシダントの保持時間、面積、濃度（１３．６６８２％）を指示、
【図３２】シリカカラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒＲ  Ｓｉ  ６０、Ｍｅｒｃｋ社）で分析したｃｓ溶液の水抽出物のＨＰＬＣプロファイル−ｃｓオキシダントの保持時間、面積、濃度（１３．６６８２％）を指示、
【図３３】ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ、島津製作所）で分析した全ｃｓ溶液のＨＰＬＣプロファイル、ｃｓ−オキシダントは１３．４６７分で溶出、
【図３４】ＣＬＣ−ＯＤＳカラム（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ、島津製作所）で分析した純粋ｃｓ−オキシダントのＨＰＬＣプロファイル、保持時間１３．４５８分で溶出、
【図３５ａ】全ｃｓ溶液及びｃｓ−オキシダントで処理したテンジクネズミの肺のミクロソームタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、レーン１、未処理のミクロソーム；レーン２、ｃｓ溶液５０μｌで処理したミクロソーム；レーン３、ｃｓ溶液１００μｌで処理したミクロソーム；レーン４、ｃｓ−オキシダント１０μｇで処理したミクロソーム；レーン５、ｃｓ−オキシダント２０μｇで処理したミクロソーム、
【図３５ｂ】図３５ａと同様な様々なレーンのタンパク質バンドの比重走査。
【図１】
2005502857.tif 000013
【図３】
2005502857.tif 000014
【図４】
2005502857.tif 000015
【図６ａ】
2005502857.tif 000016
【図６ｂ】
2005502857.tif 000017
【図７ａ】
2005502857.tif 000018
【図７ｂ】
2005502857.tif 000019
【図８】
2005502857.tif 000020
【図９】
2005502857.tif 000021
【図１０】
2005502857.tif 000022
【図１１】
2005502857.tif 000023
【図１２】
2005502857.tif 000024
【図１３】
2005502857.tif 000025
【図１４】
2005502857.tif 000026
【図１５】
2005502857.tif 000027
【図１６】
2005502857.tif 000028
【図１７】
2005502857.tif 000029
【図１８】
2005502857.tif 000030
【図１９】
2005502857.tif 000031
【図２０】
2005502857.tif 000032
【図２１】
2005502857.tif 000033
【図２２】
2005502857.tif 000034
【図２３】
2005502857.tif 000035
【図２４】
2005502857.tif 000036
【図２５】
2005502857.tif 000037
【図２６】
2005502857.tif 000038
【図２７】
2005502857.tif 000039
【図２８】
2005502857.tif 000040
【図２９】
2005502857.tif 000041
【図３０】
2005502857.tif 000042
【図３１】
2005502857.tif 000043
【図３２】
2005502857.tif 000044
【図３３】
2005502857.tif 000045
【図３４】
2005502857.tif 000046
【図２】
2005502857.tif 000047
【図５】
2005502857.tif 000048
【図３５ａ】
2005502857.tif 000049
【図３５ｂ】
2005502857.tif 000050
【国際公開パンフレット】
2005502857.tif 000051
2005502857.tif 000052
2005502857.tif 000053
2005502857.tif 000054
2005502857.tif 000055
2005502857.tif 000056
2005502857.tif 000057
2005502857.tif 000058
2005502857.tif 000059
2005502857.tif 000060
2005502857.tif 000061
2005502857.tif 000062
2005502857.tif 000063
2005502857.tif 000064
2005502857.tif 000065
2005502857.tif 000066
2005502857.tif 000067
2005502857.tif 000068
2005502857.tif 000069
2005502857.tif 000070
2005502857.tif 000071
2005502857.tif 000072
2005502857.tif 000073
2005502857.tif 000074
2005502857.tif 000075
2005502857.tif 000076
2005502857.tif 000077
2005502857.tif 000078
2005502857.tif 000079
2005502857.tif 000080
2005502857.tif 000081
2005502857.tif 000082
2005502857.tif 000083
2005502857.tif 000084
2005502857.tif 000085
2005502857.tif 000086
2005502857.tif 000087
2005502857.tif 000088
2005502857.tif 000089
2005502857.tif 000090
2005502857.tif 000091
2005502857.tif 000092
2005502857.tif 000093
2005502857.tif 000094
2005502857.tif 000095
2005502857.tif 000096
2005502857.tif 000097
2005502857.tif 000098
2005502857.tif 000099
2005502857.tif 000100
2005502857.tif 000101
2005502857.tif 000102
2005502857.tif 000103
2005502857.tif 000104
2005502857.tif 000105
2005502857.tif 000106
2005502857.tif 000107
2005502857.tif 000108
2005502857.tif 000109
2005502857.tif 000110
2005502857.tif 000111
2005502857.tif 000112
2005502857.tif 000113
2005502857.tif 000114
2005502857.tif 000115
2005502857.tif 000116
2005502857.tif 000117
2005502857.tif 000118
2005502857.tif 000119
2005502857.tif 000120
2005502857.tif 000121
2005502857.tif 000122
2005502857.tif 000123
2005502857.tif 000124
2005502857.tif 000125
2005502857.tif 000126
2005502857.tif 000127
2005502857.tif 000128
2005502857.tif 000129
2005502857.tif 000130
2005502857.tif 000131
2005502857.tif 000132
2005502857.tif 000133
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502857.tif 000134
【国際調査報告】
2005502857.tif 000135
2005502857.tif 000136