(57)【要約】    本発明は、冠動脈性心疾患、特に安定及び不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞の予防、突然心臓死、心不全ならびに高血圧、末梢循環障害及びアテローム性動脈硬化症の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
冠動脈性心疾患の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用。
【請求項２】
高血圧の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用。
【請求項３】
末梢血管閉塞性疾患の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化症の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用。
【請求項５】
冠動脈性心疾患が安定及び不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、突然心臓死及び心不全である請求項１の使用。
【請求項６】
ＰＤＥ９Ａ阻害剤が１μＭ未満のＩＣ５０を有する請求項１〜４に従う使用。
【請求項７】
ＰＤＥ９Ａ阻害剤が１００ｎＭ未満のＩＣ５０を有する請求項１〜４に従う使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈性心疾患、特に安定及び不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、突然心臓死、心不全、高血圧及びアテローム性動脈硬化症の後遺症の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
絶えず働いている洞筋として、心臓はそのエネルギー要求を満たすために特に強力な酸素の供給を必要とする。従って供給の妨害は主に、血流の適応性が低下すると不十分になり得る酸素輸送に関連する。酸素消費量の増加は、心臓への血流の増加によってのみ補償され得る。
【０００３】
安定及び不安定狭心症、心不全、心筋梗塞、突然心臓死及びアテローム性動脈硬化症の後遺症のような冠動脈性心疾患においては、心組織の部分への十分な血流はもはや保証されず、組織虚血が起こり、冒された領域における壊死及びアポトーシスを生ずる。これは心筋機能不全を生じ、それは心不全にまで進展し得る。
【０００４】
冠動脈血流及びかくして酸素供給を増加させる治療法及び活性成分、しかしまた酸素消費量を減少させるものが上記の障害の症状の処置に適している。
【０００５】
これらには比較的大きい冠動脈血管の拡張、冠動脈抵抗の血管外成分の減少、心筋内壁張力の低下及び体循環における小動脈抵抗血管の拡張が含まれる。
【０００６】
心臓における冠動脈流を増加させる及び／又は血圧を低下させる物質及び方法を治療的に利用することができる（非特許文献１）。
【０００７】
上記の効果をいわゆる二次メッセンジャー、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）及びサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の細胞内濃度を介して調節することができる。ｃＧＭＰの細胞内濃度は可溶性及び膜−結合グアニレートシクラーゼの刺激により増加する。ｃＡＭＰの細胞内濃度は、いわゆるＧタンパク質共役型受容体の活性化により調節され得る。これらのレセプターの活性化は、Ｇタンパク質の活性化及びかくしてアデニレートシクラーゼの活性化又は阻害に導く。
【０００８】
いわゆるホスホジエステラーゼは、細胞内ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの分解に関与する。ホスホジエステラーゼは、それらの生化学的及び薬理学的性質に従って１１の異なる種類に分けられる（非特許文献２，非特許文献３）。
【０００９】
ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ９Ａ）はｃＧＭＰ−特異的ホスホジエステラーゼである。該酵素は７０ｎＭのＫｍ（ミカエリス−メンテン定数）を有し（非特許文献４）、それはすべての既知のホスホジエステラーゼのｃＧＭＰに関する既知の最小のＫｍである。従ってＰＤＥ９Ａは基礎的細胞内ｃＧＭＰレベルの保持及び調節に関与している。
【００１０】
ホスホジエステラーゼ９Ａに関するＤＮＡ及びタンパク質配列は、マウス（非特許文献４）及びヒト（非特許文献５，非特許文献６）に関して既知である。今日までに、ＰＤＥ９Ａの４つのスプライスバリアントが同定されている（非特許文献６）。
【００１１】
ＰＤＥ９Ａ発現はマウスにおいて、特に腎臓において、しかし又もっと弱く肺及び肝臓において検出可能であった（非特許文献４）。ヒトにおいては、特に脾臓、腎臓、腸、前立腺及び脳で強い発現が示されたが、肺、肝臓、心臓及び膵臓のような他の器官においてももっと弱い発現が検出された（非特許文献５，非特許文献６）。
【非特許文献１】Ｆｏｒｔｈ，Ｈｅｎｓｃｈｌｅｒ，Ｒｕｍｍｅｌ著，Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  ｕｎｄ  ｓｐｅｚｉｅｌｌｅ  Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｔｏｘｉｋｏｌｏｇｉｅ；２００１年，Ｕｒｂａｎ  ＆  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｍｕｎｉｃｈ
【非特許文献２】Ｓｏｌｄｅｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅａｖｏ著，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００年，１７４−１７９
【非特許文献３】Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，１−５２
【非特許文献４】Ｓｏｌｄｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年，１５５５３−１５５５８
【非特許文献５】Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年，１５５５９−１５５６４
【非特許文献６】Ｇｕｉｐｐｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．１９９８年，３８６−３９２
【発明の開示】
【００１２】
驚くべきことに今回、ヒトにおけるＰＤＥ９Ａ  ｍＲＮＡ発現の定量的分析において、ヒト冠動脈でＰＤＥ９Ａの顕著な発現があることが見出された（図１及び２）。
【００１３】
ヒト冠動脈におけるＰＤＥ９Ａ発現はさらに驚くべきことに、この組織におけるホスホジエステラーゼ５Ａの発現より実際に約２．７倍高い（図２）。
【００１４】
ホスホジエステラーゼ５Ａは文献から、心臓への血液供給に含まれることが既知である。ＰＤＥ５Ａ阻害剤の投与は冠動脈血管の弛緩に導くことが示されている（Ｔｒａｖｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０００年，２９９７−３００２）。
【００１５】
ＰＤＥ５Ａと比較しても高いヒト冠動脈におけるＰＤＥ９Ａの発現及びｃＧＭＰに関するＰＤＥ９Ａの極度に高い親和性（Ｋｍ  ７０ｎＭ）は今回、ホスホジエステラーゼ９Ａが冠動脈の収縮及び弛緩において、ならびにかくして心臓への血液供給の調節において非常に有意な役割を有することを示している。
【００１６】
かくして血管におけるＰＤＥ９Ａ発現は、血圧の調節及び末梢血流の調節におけるＰＤＥ９Ａの役割も示している。
【００１７】
単離された灌流されたＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓において、冠動脈流へのＰＤＥ９Ａ阻害剤の効果を調べることができる。ＰＤＥ９Ａ阻害剤はＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆラット心臓において灌流圧を低下させる。
【００１８】
冠動脈におけるヒトホスホジエステラーゼ９Ａの発現は、冠動脈性心疾患を有する患者におけるＰＤＥ９Ａを阻害する活性成分の使用のための条件なので、この結果は新規な治療法のための基礎を作る。
【００１９】
この新規な結果に基づき、我々は、ホスホジエステラーゼ９Ａを阻害する物質が、それから生ずる細胞内ｃＧＭＰ濃度の増加及びそれに伴う血管、特に冠動脈の拡張（ならびにそれに伴う冠動脈流の増加）の理由で、ヒトにおける安定及び不安定狭心症、急性心筋梗塞、心筋梗塞予防、心不全、突然心臓死ならびに高血圧、末梢血流障害及びアテローム性動脈硬化症の後遺症の処置及び／又は予防のために用いられる得るという結論に達した。
【００２０】
従って本発明は、上記の疾患の処置及び／又は予防用の薬剤の製造のためのホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤の使用に関する。
【００２１】
本発明の目的のための阻害剤は、酵素の活性化又は生物学的活性を妨げる（阻害する）すべての物質である。例えば下記に記載するｃＧＭＰアッセイにおいて阻害を測定することができる。特に好ましい阻害剤は低分子量物質である。
【００２２】
阻害は、ホスホジエステラーゼ９Ａに関し、活性の少なくとも１０％の低下又はホスホジエステラーゼ９Ａを含有する細胞における細胞内ｃＧＭＰ濃度の少なくとも１０％の増加を意味する。適した組織から精製された、又は組換え的に発現して精製されたＰＤＥ９Ａについて阻害剤を試験することができる。さらに、ホスホジエステラーゼ９Ａを含有する細胞において細胞内ｃＧＭＰ濃度を決定することが可能である。これらの細胞は好ましくは血管の平滑筋からの細胞又は組み換え的にＰＤＥ９Ａを発現する細胞系からの細胞である。
【００２３】
さらに、好ましいＰＤＥ９Ａ阻害剤は、下記に示す活性アッセイにおいて１μＭ、好ましくは０．１μＭ未満のＩＣ５０を以って阻害するものである。
【００２４】
本発明のＰＤＥ９Ａ阻害剤は好ましくは血液／脳関門を横切ることができず、且つ中枢的ではなくて全身的に作用する。
【実施例】
【００２５】
ｃＧＭＰ−特異的ＰＤＥ９Ａの阻害
単離された酵素についてＰＤＥ９Ａ阻害剤の効果を試験した。この目的のために、例えばＡｍｅｒｓｈａｍからのホスホジエステラーゼ［３Ｈ］ｃＧＭＰ  ＳＰＡ酵素アッセイキットを用いることができる。試験は製造者の指示に従って行なわれる。
【００２６】
試験物質を特性化するために、適した希釈の酵素、種々の濃度の阻害剤（典型的には１０−９〜１０−５Ｍの連続希釈）及び［３Ｈ］ｃＧＭＰ（混合物あたりに０．０５μＣｉ）を９６穴マイクロタイタープレート中で３０℃において１５分間インキュベーションする。反応が停止した後に「ＳＰＡビーズ」を加え、マイクロタイタープレートを３０秒間振る。６０分後、マイクロタイタープレートに適したシンチレーションカウンター（例えば１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ，Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定を行なう。
【００２７】
ＰＤＥ９Ａ阻害剤の効果のＩＣ５０は、ＰＤＥ９ＡによるｃＧＭＰ分解の５０％が阻害される値である。
ヒト組織におけるＰＤＥ９Ａ及びＰＤＥ５Ａ  ｍＲＮＡ発現の定量
実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（いわゆるＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ，Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６（１０），１９９６年，９８６−９９４）のｍＲＮＡ値を定量することにより、ヒト組織におけるＰＤＥ９Ａの相対的発現を測定する。通常のＰＣＲと比べ、実時間ＰＣＲは、追加の蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入を介するもっと正確な定量の利点を有する。このいわゆるプローブは、５’末端に蛍光色素ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）及び３’末端に蛍光クエンチャー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）を含有する。ポリメラーゼ連鎖反応の間に、蛍光色素ＦＡＭはＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにおけるＴａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によりプローブから切断され、かくして前にはクエンチングされていた蛍光シグナルが得られる。
【００２８】
ＰＣＲのために用いられる鋳型は、商業的に得られるトータルＲＮＡである（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）。冠動脈の場合、体外移植された心臓の小片（約０．５ｇ）をベルリンのＧｅｒｍａｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｅｎｔｒｅから得、均質化の後にフェノール／クロロホルム抽出によりそれからトータルＲＮＡを単離する。トータルＲＮＡの１μｇ分を１単位のＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏから）と一緒に室温で１５分間インキュベーションし、ゲノムＤＮＡの混入を除去する。１μｌのＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を加え、次いで６５℃で加熱（１０分間）することにより、ＤＮａｓｅ  Ｉを不活性化する。続いて「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ−ＩＩ  ＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット」（Ｇｉｂｃｏから）の指示に従い、同じ反応混合物中でｃＤＮＡ合成を行い、蒸留水を用いて反応体積を２００μｌとする。
【００２９】
ＰＣＲのために、希釈されたｃＤＮＡ溶液のそれぞれ５μｌ分に７．５μｌのプライマー／プローブ混合物及び１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を加える。いずれの場合もプライマーの最終的濃度は３００ｎＭであり、プローブのそれは１５０ｎＭである。ＰＤＥ９Ａのためのフォワード及びリバースプライマーの配列は：５’−ＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴ−３’及び５’−ＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＧＣＧＧＡＣＣＧ−３’であり、蛍光標識プローブの配列は５’−６ＦＡＭ−ＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴ−ＴＡＭＲＡ−３’である。アンプリコンの位置は、ＰＤＥ９Ａ  ｍＲＭＡの記載されている４つのスプライスバリアントのすべて（ＰＤＥ９Ａ１−４）が検出されるように選ばれる。ＰＤＥ５Ａの場合、フォワードプライマーの配列は：５’−ＴＧＧＣＡＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＴＴＴＣＡＡ−３’であり、リバースプライマーのそれは：５’−ＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣ−３’であり、プローブの配列は５’−ＦＡＭ−ＡＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴ−ＴＡＭＲＡ−３’である。この場合も、ｍＲＮＡ上のアンプリコンの位置は、両方のスプライスバリアント（ＰＤＥ５Ａ１−２）が検出されるように選ばれる。
【００３０】
ＰＣＲはＡＢＩプリズムＳＤＳ−７７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）上で、製造者の指示に従って行なわれる。この目的のための標準として４０サイクルが行なわれる。各組織及び各プローブに関していわゆる閾サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（Ｃｔ）を得る。Ｃｔは、放出されるプローブの蛍光強度が背景シグナルの１０倍に達するサイクルに相当する。かくしてより低いＣｔは増幅のより早い開始、すなわち最初の試料中に存在するより多いｍＲＮＡを意味する。ｃＤＮＡ合成における変動を補償するために、調べられるすべての組織においていわゆるハウスキーピング遺伝子の発現も分析される。この遺伝子の発現の強度はすべての組織において大体同じはずである。この目的のために、β−アクチンを用いてＰＤＥ９Ａ及びＰＤＥ５Ａ発現を標準化する。ヒト細胞質ゾルβ−アクチンのためのフォワード及びリバースプライマーの配列はそれぞれ：
５’−ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＴＧ−３’及び５’−ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣ−３’であり、プローブの配列は５’−６ＦＡＭ−ＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＧＡＣＧＡＧＴＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ−３’である。いわゆるｄｄＣｔ法により、ＡＢＩプリズムＳＤＳ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）のための指示に従ってデータを分析する。ＰＤＥ９Ａ  ｍＲＮＡの組織分布のグラフによる提示のために、最高のＣｔ（＝最低の発現）を有する組織の発現のレベルを任意に１に等しく設定し、すべての他の組織をそれに標準化する。
Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆラット心臓
麻酔されたラットの胸腔の開放の後に心臓を迅速に取り出し、通常のＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置に導入する。冠動脈を定量（１０ｍｌ／分）灌流に供し、それにより上昇する灌流圧を適した圧力変換器を介して記録する。この配置における灌流圧の低下は冠動脈の弛緩に対応する。同時に、各収縮の間に心臓により発せられる圧力（ＬＶＰ）を、左心室中に導入されたバルーン及びさらに圧力変換器を介して測定する。単位時間当たりの収縮の数からの計算により、単離された心臓が拍動する速度を見出す。試験物質は一系列の増加する濃度において（通常は１０−９Ｍ〜１０−６Ｍ）、灌流器（ｐｅｒｆｕｓｏｒ）を用いて加えられる。
ＰＤＥ９Ａ阻害剤調剤
不活性、無毒性の製薬学的に適した担体又は溶媒を用いて、ＰＤＥ９Ａ阻害剤を既知の方法で通常の調剤、例えば錠剤、コーティング錠、丸薬、顆粒剤、エアゾール、シロップ、乳剤、懸濁剤及び溶液に転換することができる。治療的に活性な化合物はこれらのそれぞれ中に、完全な混合物の０．５〜９０重量％の濃度で、例えば指示される投薬量範囲を達成するのに十分な量で存在しなければならない。
【００３１】
調剤は、例えば溶媒及び／又は担体を用い、適宜乳化剤及び／又は分散剤を用いて活性成分を伸展することにより調製され、例えば希釈剤として水が用いられる場合、適宜有機溶媒を補助溶媒として用いることができる。
【００３２】
投与は通常の方法で、好ましくは経口的、経皮的、静脈内又は非経口的に、特に経口的又は静脈内に行なわれる。しかしながら、例えばスプレーを用いて口又は鼻を介する吸入により、あるいは皮膚を介して局所的に投与を行なうこともできる。
【００３３】
有効な結果を達成するために、一般に体重のｋｇ当たりに約０．００１〜１０ｍｇ、経口的投与の場合には好ましくは約０．００５〜３ｍｇの量を投与するのが有利であることが証明された。
【００３４】
それにもかかわらず適宜、特定的には体重又は投与経路の性質、薬剤に対する患者の反応、その調剤の性質及び投与が行なわれる時間又は間隔の関数として、上記の量から変動させることが必要であり得る。かくしていくつかの場合には上記の最少量未満で間に合わせるのが十分であり得るが、他の場合には上記の上限を超えなければならない。比較的多量を投与する場合、これらを１日に及ぶ複数の単投薬量に分配するのが良いかも知れない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト組織におけるヒトホスホジエステラーゼ９Ａの相対的発現（データに関しては表１を参照されたい）。
【図２】ヒト冠動脈におけるヒトＰＤＥ９Ａの相対的発現のＰＤＥ５Ａとの比較。
【配列表】
2005511619.tif 000002
2005511619.tif 000003
2005511619.tif 000004
【図１ａ】
2005511619.tif 000005
【図１ｂ】
2005511619.tif 000006
【図２】
2005511619.tif 000007
【国際調査報告】
2005511619.tif 000008
2005511619.tif 000009
2005511619.tif 000010
2005511619.tif 000011
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