(57)【要約】インビトロでの部位特異的組換えを用いた組換えウイルスを製造するための方法を示す。本発明では、線状ウイルスゲノムDNAは２つのセグメントに分割され、部位特異的なリコンビナーゼ部位を両側に配した所望のゲノム材料と共に、インビトロで、部位特異的組換えを起こす。本発明によると、部位特異的組換え混合物は、組換えウイルスゲノムDNAを選抜するさらなる手順なしで、宿主細胞に適用されうるので、一度に多くの組換えウイルスをすばやく得ることができる。このように、本発明は、何百何千の組換えウイルスを生成する高生産性システムとして使用できる。
2005519603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ部位特異的組換えによって、所望のDNAが、ウイルスゲノムDNAに挿入される線状組換えウイルスベクターの作製方法であって、
i）ウイルスの複製とパッケージングとに不可欠である部位特異的組換え部位及び塩基配列を含むウイルスゲノムDNAセグメントを作製すること、
ii）少なくとも１つの所望のDNA及び部位特異的組換え部位を含むキャリアベクターを作製すること、及び
iii）インビトロで、i）のDNAセグメントとii）のキャリアベクターとを反応させることを含むことを特徴とする線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項２】
i）のウイルスゲノムDNAセグメントが、２つのDNAセグメントからなり、該２つのDNAセグメントは、それぞれがウイルス複製及びパッケージングに不可欠で、部位特異的組換え配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項３】
上記ウイルスゲノムDNAは、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、バクテリオファージ、コロナウイルス及び単純ヘルペスウイルス、CMV、EBV及びVZVからなるグループのうちのいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項４】
上記ウイルスゲノムDNAは、アデノウイルス由来であることを特徴とする請求項３に記載の線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項５】
上記アデノウイルスは、E1部位、E2部位、E3部位、及び／またはE4部位を取り除かれていることを特徴とする請求項４に記載の線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項６】
部位特異的組換え部位配列はatt部位であることを特徴とする請求項１に記載の線状組換えウイルスベクターの作製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって作製されることを特徴とする線状組換えウイルスベクター。
【請求項８】
i)ウイルス複製とパッケージングに不可欠な部位特異的組換え部位と塩基配列を含むウイルスゲノムDNAセグメントを作製する過程、
ii)少なくともひとつの所望のDNA及び部位特異的組換え配列を含むキャリアベクターを作製する過程、
iii)i)のゲノムDNAセグメントと、ii)のキャリアベクターとを、インビトロで、部位特異的リコンビナーゼを用いて反応させることで、発現線状組換えウイルスベクターを含む混合物を作製する過程、及び、
iv)宿主細胞に、iii)の混合物を感染させる過程を含むことを特徴とする線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスを作製する方法。
【請求項９】
i)のウイルスゲノムDNAが２つのDNAセグメントからなり、該DNAセグメントのそれぞれが、ウイルス複製及びパッケージングに不可欠で、部位特異的組換え配列を含むことを特徴とする請求項８に記載の線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスの作製方法。
【請求項１０】
上記ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、バクテリオファージ、コロナウイルス及び単純ヘルペスウイルス、CMV（サイトメガロウイルス）、EBV（エプスタインバーウイルス）及びVZV（水疱瘡ウイルス）からなるグループのうちのいずれかであることを特徴とする請求項８に記載の線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスの作製方法。
【請求項１１】
上記ウイルスは、アデノウイルスであることを特徴とする請求項１０に記載の線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスの作製方法。
【請求項１２】
上記アデノウイルスはE1部位、E2部位、E3部位、及び/または、E4部位を取り除かれていることを特徴とする請求項８に記載の線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスの作製方法。
【請求項１３】
部位特異的組換え部位配列はatt部位であることを特徴とする請求項８に記載の線状ゲノムDNAを持つ組換えウイルスの作製方法。
【請求項１４】
請求項８〜1３のいずれか１項に記載の方法によって作製される線状ゲノムDNAを持つことを特徴とする組換えウイルス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、組換えウイルス及び該組換えウイルス用のベクターの製造方法に関する。さらに、本発明は、上記方法に用いるDNA構造（DNA construct）、及び、上記方法により製造される組換えウイルスに関する。
【０００２】
（背景技術）
組換えウイルスベクターとは、遺伝子操作されたベクターを意味し、例えば、ワクチンの作製、遺伝子・遺伝子群・ゲノムドメインの機能分析、タンパク質の生成、及び遺伝子治療に使用される。ウイルスベクターに組込まれうるゲノム材料には、遺伝子、cDNA、ゲノムDNA、ペプチドまたはタンパク質をコードするDNA配列、RNA、アンチセンスRNA、siRNA、siRNA用DNA、プロモーター、エンハンサー等、どのゲノム材料も含まれる。ベクターを作製するのに使用されるウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus；AAV）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びベクシニア（Vacxnia）ウイルス等が含まれる。
【０００３】
レトロウイルスは遺伝子治療においてもっとも広く使用されているウイルスのひとつとして知られている[参照：Clive Patience 他、J Virol、72:2671-2676、1998年、Marshall、Science、269:1050-1055、1995年]。レトロウイルスゲノムは２つのLTR、キャプシド配列、3つのコーディング領域（gag、pol、及びenv）を持ち、その調整方法、並びに、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）での使用方法はすでに開示されている[ＷＯ9908692A1、EP453242]。しかしながら、レトロウイルスベクターの臨床応用には下記の不利点がある。それは、レトロウイルスベクターは複製適格レトロウイルス（RCR；replication-competent retrovirus）を形成すること（Sharon K. Powell 他、J.Virol.、73:8813-8816、1999年）、レトロウイルスベクターの遺伝子発現レベルは比較的低く、そのレベルはインビボで継続的に減少すること、そしてウイルスの力価（titer）が低いこと、である。さらに、レトロウイルスは、遺伝子を非分裂細胞に導入することができない[Jaffe、E.M. Cancer Res.、53:2221-2226、1993年;Bender、M.A.他、J. Virol.、61:1639-1646、1987年]。
【０００４】
アデノウイルスは線状ゲノム（サイズ約36kb）を持ち、左の逆方向末端領域（ITR）（103bp）の近くに複製起点とキャプシドシグナルを含む[Shenk、Adenoviridae:The Viruses and Their Replication. In: Fields BN、Knipe DM Howley PM、ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers、1996年: 2111-2148]。通常、アデノウイルスベクターはウイルスゲノム中のE1部位を取り除くことによって作られ、E1は、ウイルス複製には不可欠である。E1部位の代わりに外来ゲノム材料を含むウイルスは、E1タンパク質を生産するパッケージング細胞へ導入される。これにより、パッケージング細胞内でのみウイルス複製が起きる。代表的なパッケージング細胞（packaging cell）には、例えば、HEK293細胞、911細胞、そしてPER.C6細胞等が含まれる[Hitt MM 他、Advances in Pharmacology, vol. 40、137-206(1997年)、Wang Y. Huang S.、Drug]。アデノウイルスベクターは安全で、様々な細胞への親和性があり、分裂細胞に感染することができ、力価がより高い（1011pfu/ml）、といった利点がある。このように、アデノウイルスは外来（heterogeneous）の遺伝子を発現するベクターの作製に使用される。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（サイズ約4700bp）は各終端に複製起点としてITR（サイズ約145bp）を持つ。アデノ随伴ウイルスは様々なタイプの宿主細胞のゲノムDNAに、安全にかつ特異的に、組み込まれることができる。
【０００６】
組換えウイルスをベクターとして使うために、組換えウイルスは、感染した細胞内で自己複製しないように、修飾されなければならない。それゆえ、ウイルス複製のために不可欠なゲノム領域のいくつかが取り除かれた欠損ウイルスが、通常、組換えウイルスベクターを作製するのに使用される。レトロウイルスの場合、たとえばgag遺伝子、pol遺伝子、及び/またはenv遺伝子が取り除かれ、それらの領域は所望のゲノム材料に置き換えられる[Bender 他、J. Virol. 61 (1987年) 1639]。アデノウイルスに関しては、ウイルスベクターの作製のために、E1部位、E2部位、及び/またはE4部位が取り除かれる[Levrero他、Gene 101(1991年)195;Gosh-Choudhury他、Gene 50(1986年)161、Van der Vliet他、(1975年)]。対して、複製に不可欠な領域（ITRやキャプシド配列）のみからなる偽ウイルスベクター（pseudo-virus vector）も組換えウイルスを得るために使われてきた（参照：ＷＯ95/02697）。
【０００７】
さらに具体的には、アデノウイルスを作製するための従来の方法は、下記の３種類に分類することができる。第一のグループは、キャリアベクターとアデノウイルスゲノムDNAとの間の相同的組換えである。この場合は、ベクターが所望の外来ゲノム材料を運ぶ[Hitt MM 他、Advances in Pharmacology、vol. 40、137-206(1997年)]。この方法では、所望の外来ゲノム材料が、キャリアベクターへとクローニングされ、アデノウイルスベクターのゲノムDNAとともにパッケージング細胞に導入され、相同的組換えを引き起こす。キャリアベクターは、外来ゲノム材料の発現のために、プロモーター、遺伝子クローニングのための制限酵素認識部位、及びポリＡ付加シグナル等の、カセットを含む。さらに、キャリアベクターは相同的組換えを引き起こす核酸配列を持つ。一般的に、この方法では、ＬITR、パッケージングシグナル、またはE1部位が欠けた欠損アデノウイルスゲノムが使用される。これに対して、フランク・グラハム他は、プラスミド型ベクターを設計した。このプラスミドベクターは、大腸菌の中で複製することが出来るもので、ウイルスから欠損ウイルスゲノムを選抜する工程をさらに必要とするという上記方法の問題を解決するものである[Bett AJ 他、Proc. Natl. Acad. Sci USA、vol 91、8802-8806(1994年)]。しかしながら、グラハムの方法もまた、キャリアベクターと欠損アデノウイルスゲノムDNAとの間の相同的組換えを利用するものであり、この方法はパッケージング細胞内での相同的組換えの率が低く、非効率であった。
【０００８】
第二のグループは、制限酵素とリガーゼを使って、アデノウイルスゲノムの特定の領域への、所望の外来ゲノム材料のダイレクトクローニング(direct cloning)を含む方法である。この方法は、アデノウイルスゲノム（サイズ：約30kb）の構造が複雑であることによって引き起こされる問題を解決した。この方法では、所望の遺伝子のための発現カセットは、まず、キャリアベクターへとクローニングされ、次に、このキャリアベクターは、カセットとウイルスゲノム両方の中の特定の制限酵素部位を使ってウイルスゲノムへと再びクローニングされる。次に、クローニングされたカセットとウイルスゲノムが大腸菌に導入され、所望のクローンが選抜される。その後、選抜されたクローンはパッケージング細胞に導入される。そして、パッケージング細胞から組換えウイルスを得ることができる[Mizuguchi H. Kay MA.、Human Gene Therapy、vol. 10、2013-2017(1999年)]。このグループの他の方法では、ITR末端の領域にpTP(preterminal protein)を持つウイルスゲノムDNAは、大腸菌からではなく、ウイルスから抽出される。これは所望の組換えウイルスの生産力を向上させるためであり、組換えウイルスは所望のゲノム発現カセットに繋がれた後、株細胞へ導入される[Okada T.他、Nucleic Acids Research、vol. 26、1947-1950(1998年)]。
【０００９】
第三のグループは、パッケージング細胞では相同的組換え率が低いという問題点を改善するため、相同的組み替え率が比較的高い大腸菌を使用するものである[Chartier C.他、Journal of Virology、vol. 70、4805-4810(1996年)、He T.他、Proc. Natl. Acad. Sci USA、Vol 95、2509-2514(1998年)]。この方法によると、所望のゲノム材料はキャリアベクターへとクローニングされなければならないが、プラスミド型アデノウイルスゲノムと一緒に細胞に感染することによって、特定の大腸菌内で、比較的高い相同的組換え率を得ることができる。したがって、上記方法と比較して、より高い生産性で所望の組換えウイルスを得ることができた。しかしながら、この方法では、所望のゲノム材料はキャリアベクターへとクローニングされなければならなかった。また、特定の大腸菌株細胞（たとえば、ＢＪ５１８３）を使用しなければならなかった。さらに、大腸菌内で生産された組換えDNAはスクリーニングされ、スクリーニングされた組換えDNAは、組換えに使用される大腸菌のプラスミドが不安定であるために、他の大腸菌株細胞（例えば、DH5α）に導入されなければならなかった。このように、この方法は非常に複雑で、効率的ではないと考えられる。
【００１０】
上記のように、組換えウイルスを作製するための従来の方法は下記のような不利点がある。(i)所望のゲノム材料はキャリアベクターへとクローニングされなければならない。(ii)所望のゲノム材料の遺伝子クローニングは細胞内で行われなければならないので、複雑で非効率なクローニング手順を必要とする。(iii)大量生産の前に、所望の組換えウイルスは宿主細胞から選抜されなければならない。それゆえ、これらの方法によると、組換えウイルスを得るのに多くの時間がかかる一方、その生産性は比較的低い。特に(ii)と（iii）の不利点は、組換えウイルスの作製において、解決されるべき最も重要な問題であるとされている。よって、今まで、これらの問題を解決するための努力が、継続的になされている。これに対して、組換えウイルスの応用の発達によって、組換えウイルスを作製するためのより効率的で早い方法の必要性が強まってきている。
【００１１】
このように、我々は、所望の遺伝子を持つ組換えウイルスを製造するための研究をし、インビトロでの部位特異的組換えを使った組換えウイルスベクターを作製することによって、本発明を完成させた。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明に関する技術について充分に説明するために、ここで参照されるいかなる刊行物も、参考のためにこの明細書に添付する。
【００１３】
なお、ここで使用されるすべての技術用語・科学用語は、特に定義されていない限り、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を持つことを意図しており、本発明を理解するためには重要である。ここで使われる技術も、特に明記しない限り、当業者に知られているものである。
【００１４】
以下に述べられる特定の緩衝液、培養液、試薬、細胞、及び培養条件、または、それらの下位分類は、何ら限定されものでなく、本明細書において論じられる個々の状況において、興味深いまたは重要であると、当業者によって認識される関連物質のすべてを含むと理解されるべきである。例えば、ある緩衝系または培地を、他の緩衝系または培地で代用することは大抵可能である。よって、提示された方法、物質、または構成と同じ目的を達するために、異なるが周知の方法が使われる。
【００１５】
本発明の目的は、組換えウイルスを生成するための、より早く、より効率的な方法を提供することである。
【００１６】
本発明を完成させるために、本発明では、インビトロでの部位特異的組換えによって作製された、組換えウイルスベクターを使用する。より好ましくは、本発明で使用されるウイルスは線状ゲノムDNAを持つ。
【００１７】
それゆえ、本発明のもうひとつの目的は、インビトロでの部位特異的組換えを使った組換えウイルスベクターを提供することである。
【００１８】
本発明では、ウイルスゲノムDNAを含むベクターは、インビトロでの部位特異的組換えに使用される前に、２つ以上のセグメントに分割される。この両方のセグメントは、ウイルス複製に不可欠である。所望のゲノム材料を含むDNA断片は、この２つのゲノムDNAセグメントの間に特異的に挿入される。このように、非結合のウイルスゲノムDNAセグメントはそれ単独では発現され得ないので、所望のDNA断片を持つウイルスのみが発現される。それゆえ、中間の宿主細胞から所望の組換えウイルスを選抜するというようなさらなる手順なしで、宿主細胞から直接、所望の組換えウイルスを得ることができる。
【００１９】
部位特異的組換えは、さまざまな生物内で自然に起こる現象である。部位特異的組換えのための酵素には、エンドヌクレアーゼ活性だけでなく、リガーゼ活性も含まれているので、酵素はDNA配列の特定の部分を認識し、相当するほかのどのDNA配列とも置き換える[Yang W. Mizuuchi K.、Structure、1997年、Vol. 5、1401-1406(9)]。バクテリオλファージからのInt/attシステム、Ｐ１バクテリオファージからのCre/LoxPシステム、そしてイースト菌からのFLP-FRTシステムは、高度に発展した部位特異的組換えシステムである。
【００２０】
部位特異的組換えシステムは、(i)組換えウイルスへとクローニングされた所望のゲノム材料の発現制御、(ii)ヘルパーウイルス依存ウイルスを作製するときのヘルパーウイルスの摘出、(iii)パッケージング細胞内での相同的組換えの効率の向上、または、(iv)組換えウイルスを作製するための、パッケージング細胞内におけるキャリアベクターとウイルスゲノムの間の部位特異的組換えの誘起、のために使われている[Philip NG他、Biotechniques、vol. 29. 524-528(2000年)、Philip NG他、Human Gene Therapy、vol. 10.、2667-2672(1999年)、Hardy S他、Journal of Viology、vol. 71.、1842-1849(1997年)、Parks RJ他、Proc. Natl. Acad. Sci USA、vol 93.、13565-13570(1996年)]。しかしながら、従来技術で開示された部位特異的組換えのこれらの応用はインビトロではなく、生体内もしくは株細胞内での、間接的で補助的な使用にすぎない。
【００２１】
このように、組換えウイルスベクターを得る目的で、所望のゲノム材料を線状ウイルスゲノムDNAへ特異的に挿入するために、インビトロでの部位特異的組換えを応用することは、これまでになかった。特に、２つのセグメントに分割されたウイルスゲノムDNAを使った応用はなかった。
【００２２】
それゆえ、本発明は、組換えウイルスベクターの作製において、インビトロでの部位特異的組換えを使用することを特徴とする。本発明は従来技術と比較して、下記の予期しなかった利点を有する。(i)インビトロでの部位特異的組換えを使用することによって、より簡単により早く組換えウイルスベクターを得ることができる。(ii)本発明は、ウイルスゲノムDNAを部位特異的組換えに適用する前に、２つのセグメントに分割する。従って、プラーク検定のような、中間宿主細胞から所望の組換えウイルスを選抜するためのさらなる手順を必要としない。(iii)さらなる工程なしで、組換えウイルスベクターを含む反応混合物を宿主細胞に適用することができる。
【００２３】
さらに、本発明によると、パッケージング細胞内での相同的組換えは必要ではない。また、大腸菌内で相同的組換えを引き起こすための特別な株細胞も必要でない。図５は、アデノウイルス作製のための本発明の方法（AdHTシステム）と従来技術の方法（AdEasyシステム）との比較結果を、過程と時間の観点から示す図である。その結果から、本発明の方法を用いることによって所望の組換えウイルスをより早く得ることができることは明らかである。
【００２４】
さらに、本発明によると、多くの種類の所望のゲノム材料が、インビトロで正確に、ウイルスゲノムDNAの部位に組み込まれるので、さまざまなゲノム材料が、マルチウェル（例えば、96ウェルや384ウェル）の中の同じ種類のウイルスから同時に発現されうる。同様に、さまざまなタイプのウイルス[例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、バクテリオファージ、単純ヘルペスウイルス、CMV（サイトメガロウイルス）、EBV（エプスタインバーウイルス）またはVZV（水疱瘡ウイルス）等]のうちの、多くの種類のウイルスゲノムが使用されるので、所望のゲノム材料を含む一般共通ベクター（pMasterベクター）を使うことによって、同じ種類のゲノム材料がさまざまなタイプのウイルスから発現されうる。
【００２５】
その結果、本発明はまた、ゲノムプロジェクトの完了以来、非常に需要が高まってきている機能ゲノム学の研究にきわめて有用なツールも提供する[Wang Y. and Huang S.、Drug Discovery Today、vol. 5、10-16(2000年)]。
【００２６】
実施の形態中では、本発明はゲノムDNAが線状である組換えアデノウイルスを提供する。図２に示す通り、ウイルスのゲノムDNAはまず２つのセグメントに分割される。これらのセグメントは、それぞれウイルス複製とパッケージングに不可欠である。そして、分割されたセグメントを鋳型として用いて、部位特異的組換え部位を含む所望のゲノム材料を、部位特異的組換えによって組み込む。さらに具体的に言うと、E1部位を取り除かれたアデノウイルスは２つのセグメントに分割され、組換え部位はインビトロでの部位特異的組換えを引き起こすために各セグメントに導入される。他の相当する部位特異的組換え部位は所望のゲノム材料に導入される。
【００２７】
図２を参照すると、アデノウイルスゲノムの左セグメントにはITR及びパッケージングシグナルが含まれ、右セグメントにはウイルス複製に不可欠な他の遺伝子が含まれる。しかしながら、組換え及びウイルスパッケージングは、２つに分割されたセグメントのうちの、１つのみでは起こり得ない（なぜなら、右セグメントは粒子形成のためのシグナルが欠けており、左セグメントはウイルス粒子を形成するには短すぎるからである）。このように、部位特異的組換えによって組み込まれた、所望のゲノム材料を含むウイルスゲノムのみがパッケージング細胞内の複製のためのテンプレートとして使用されうる。
【００２８】
それに対して、下記の方法はウイルスゲノムDNAの２つのセグメントを得るのに使われうる。第一の方法では、ウイルスゲノムDNAは制限酵素によって２つのセグメントに裂かれる。各セグメントはウイルスパッケージングに不可欠であり、部位特異的組換え部位を持つ（図２参照）。さらに具体的に言うと、１つ以上の制限酵素認識部位がまずウイルスゲノムDNAへとクローニングされ（図１参照）、２つ以上のウイルスDNAセグメントが、制限酵素処理によって得られる。制限酵素認知部位を含むウイルスゲノムDNAは、大腸菌からプラスミドとして得られるか、または、ウイルスから直接得られる。得られたプラスミド（pAdHTS）は図１に示すような構造を持つ。次に、pAdHTS（SEQ. ID No: 1）が制限酵素処理によって３つのセグメントに分割される。部位特異的組換え及びウイルス複製に関係しないセグメント以外の、他の２つのセグメントが、組換えウイルスベクターの作製に使用される（図２参照）。
【００２９】
第二の方法では、親ウイルス形成を防ぐことができる。実施例３にあるように、ウイルスDNAの左セグメントと右セグメントはそれぞれプラスミドとして生成され、プラスミドは線形状になる。これら２つのセグメントは、互いに異なる部位特異的組換え部位を持つ。図３を参照すると、左セグメントはITRとパッケージングシグナルを持ち、右セグメントはウイルス複製に不可欠な核酸を持つ。各セグメントは、大腸菌のDNAの複製のための複製開始点（例えば、pBR322開始点やpUC開始点等）を持ち、検出及び/または選抜を可能にするための、少なくとも１つのセレクションマーカー（例えば、Ampr、Kanr、Cmr等）を持つ。これらのセグメントはそれぞれ他のプラスミドから提供されうる。
【００３０】
本発明におけるウイルスゲノムDNAセグメントは、線形状であってもよく、円形状であってもよいが、線形状であることが好ましい。例えば、制限酵素処理によって生成された線状DNAセグメントがインビトロでpMasterベクターに組み込まれたら、図4に示すように、線形状の組換えウイルスゲノムが得られる。従って、円形のプラスミドDNAの場合、まずは、制限酵素（例えば、Pacl）によって処理することで、線状DNAセグメントを形成し、線状ウイルスゲノムを得る（図４参照）。そして、この線状ウイルスゲノムは、ウイルス複製を引き起こすためにパッケージング細胞に導入される。
【００３１】
実施の形態中では、所望のゲノム材料の発現を引き起こすために、プロモーターは、ウイルスゲノムDNAの部位に挿入される（図１・２参照）。プロモーターは、分割されたDNAセグメント内では動作しないので、ゲノム材料が部位特異的組換えによって導入されるとき、これらゲノム材料の発現を引き起こす。図6において、部位特異的組換えが行われていない細胞のグループ内では緑色蛍光タンパク質（GFP）及びガス（GUS）遺伝子は発現されない。
【００３２】
本発明において使用されうるプロモーターとしては、継続的な遺伝子発現のためのCMVプロモーター、RSV［呼吸器合胞体ウイルス（Respiratory syncytial virus）］プロモーター、SV［シミアンウイルス（simian virus）］プロモーター、特定の環境でのみ遺伝子発現を引き起こすプロモーター系、対応するホルモンに応じて動作するEREを含むプロモーター系、エクジソン（ecdysone）に応じて動作するプロモーター系、及びテトラサイクリンに応じて動作するプロモーター系などがある。プロモーターは、一般的には、オペレーター配列によって、随意的に、発現を制御する。
【００３３】
他の実施の形態中では、２つのウイルスゲノムDNAセグメントのattR部位は外来ゲノム材料を含むキャリアベクターからのattL部位と反応し、attB部位とattP部位を形成する。さらに具体的に言うと、２つのウイルスゲノムDNAセグメントが、λインテグラーゼ、補因子としてのIHF及びXisの存在下で、所望のゲノム材料を持つキャリアベクターと共に処理されるとき、attB部位は主産物として生じる。attP部位を持つベクターDNAセグメントも副産物として反応混合物の中に生成される。様々な生物体由来の多くの組換えシステム（例えば、バクテリオファージλからのインテグラーゼ/attシステム、バクテリオファージP1からのCre/loxPシステム、及び、酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μ環状プラスミドからのFLP/FRTシステム）が使用できる。
【００３４】
もし混合物が、組換えウイルスを発現すると考えられるふさわしい宿主細胞に、直接導入されると、attB1-[所望のゲノム材料]-attB2を含むウイルスゲノムDNAのみが複製し、ウイルス粒子を形成することができる。お互いに反応しない、ウイルスDNAセグメント、ベクターDNA、及び、attP部位を持つベクターDNAセグメントは、ウイルス粒子を形成しない。
【００３５】
図６において、ウイルスゲノムDNAの左セグメントの消失は、attR部位を持つDNAセグメントが組換えられたことを意味する。図７ｌのPCR産物は、所望のゲノム材料がウイルスゲノムのふさわしい部位に正確に挿入されていることを示す。PCR反応は、ウイルスゲノムの特定の領域を増幅することができるプライマー（アデノFプライマー及びアデノRプライマー）を使って、組換え反応の前後に集められたサンプルの両方に対して行われた。
【００３６】
アデノFプライマー：5'-GGTCTATATA AGCAGAGCTG-3' (SEQ. ID No.:2)
アデノRプライマー：5'-GTATGGCTGA TTATGATCAG-3' (SEQ. ID No.:3)
DNA塩基配列決定法を使ったPCR産物の分析は、ウイルスゲノム及び所望のゲノム材料が、目的部位に組み込まれ、[ウイルスゲノムの左セグメント-attB1-所望のゲノム材料-attB2-ウイルスゲノムの右セグメント]が生成されていることを示す（図２参照）。
【００３７】
ウイルス複製とパッケージングは、パッケージング細胞（例えば293細胞）を部位特異的組換えウイルスベクターを含む反応混合物に入れた後に、観察される。これらの結果は、本発明のインビトロでの混合物を、直接宿主細胞に適用でき、さらなる選抜の工程なしで、組換えウイルスを生成することができる、ということを示している。すなわち、本発明によると、適したゲノムDNAを選抜するために大腸菌のような中間宿主細胞を使用することなしに、所望の組換えウイルスをすばやく生成することができる。
【００３８】
図８において、AdHTPベクター及びpMasterクローンの部位特異的組換えの結果が示されている。GFPの発現効率は、従来技術の方法（Ad-GPFコントロール）と比較して本発明の方法のほうがまだより高い。このGUSタンパク質の活性は、本発明の方法が、発現したタンパク質の活動に悪影響を及ぼさないことを示す。このように、本発明によって生成される組換えウイルスは、感染した宿主細胞由来の所望のゲノム材料の発現にふさわしい。
（図面の簡単な説明）
図１は、pAdHTSベクターの構成を示す。
図２は、pAdHTSベクターとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの過程を示す。
図３は、pAd-LeftとpAd-Rightの構成を示す。
図４は、pAd-Left/pAd-RightとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの過程を示す。
図５は、従来技術の方法と比較して、AdHTSを使った組換えアデノウイルス生成の過程と時間を示す。
図６は、pAdHTSベクターとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの結果を表すアガロースゲル電気泳動分析を示す。
図７は、pAdHTSベクターとpMasterクローンの部位特異的組換えを表す、PCRの結果を示す。
図８は、pAdHTSベクターとpMasterクローンの部位特異的組換えの結果を示す。pMasterクローン中の所望のゲノム材料は、所望のタンパク質を発現するために、アデノウイルスゲノムに導入される。
図９は、96ウェル内でのAdHTSとpMaster-GFPの部位特異的組換えを表すPCRの結果を示す。
図１０は、96ウェル中のAdHTSとpMaster-GPFの部位特異的組換えの結果を示す。pMasterに挿入されたGPF遺伝子は、GFPを発現するために、アデノウイルスゲノムに導入される。
【００３９】
本発明の実施の形態は下記の実施例に記載される。当業者にとっては、本クレームの範囲内の他の実施形態は、ここで開示されている明細書もしくは本発明の方法を検討することで、明らかとなるものである。実施例と共に、本明細書は、実施例に続くクレームによって示される本発明の範囲と精神において、単なる例としてのみ考えられることを目的とする。実施例は、発明を実施する様々な側面を例示するよう意図されており、決して本発明の範囲を限定することを目的としていない。実施例は、例えばゲノムDNA分離の動作、PCR、及び配列決定手順の、使用される従来の方法の詳細な説明を含んではいない。それらの方法は当業者には良く知られており多くの刊行物に記載されている。また、ここで参照されるすべての刊行物は参考としてここに含まれる。
【００４０】
（実施例）
＜実施例１：pAdHTSを用いた部位特異的組換え＞
両側にattL部位が配された所望のゲノム材料を持つpMasterベクターが作製された（図２参照）。そして、従来の組換え方法を使って、両側にattR部位が配されたウイルスゲノムDNAを持つpAdHTS（SEQ. ID No.: 1）が作製された。この研究に用いたpAdHTSベクターは、アデノウイルスゲノムDNAのE3部位を取り除き、E1部位を[CMV プロモーター]-attR1-[λ スタッファー（stuffer） DNA]-attR2-[ポリA付加シグナル]の発現カセットと置き換えることによって作製された（図１・２参照）。その発現カセットは、所望の組換えゲノム材料の発現を引き起こした。λ スタッファーDNAは、制限酵素認識部位を持つPCRプライマーを増幅し、対応する制限酵素認識部位にクローニングすることによって、制限酵素認識部位（例えば、SwaI、ClaI、またはPacI）を含むように作製された。そして、ウイルス複製及びパッケージングに不可欠な、２つのDNAセグメントを生成するために、DNAはSwaI及び/またはClaIで処理される。att部位はジェームス（James L.）らによって発明されたものと同じ核酸配列を持つ[参照：Hartley JL.他、Genome Research、vol. 10、1788-1795(2000年)]。変異attL部位（attL1とattL2）を両側に配されたpMasterベクターは、組換え手技を使って、それぞれGPF cDNA及びGus cDNAと、クローニングされた（図２参照、pMasterベクターのGene-X部位）。その結果、attL1-[所望のゲノム材料s]-attL2の発現カセットを含むプラスミドベクターが生成された。
【００４１】
SwaI及び/またはClaI酵素で処理した後、フェノール/クロロホルムを使ってpAdHTS（1μg）のDNAは精製された。GFP cDNAを含むpMaster-GFP(100ng)、Gus cDNAを含むpMaster-Gus(100ng)、インテグラーゼ(100ng)、IHF(10ng)、Xis(10ng)、を緩衝液(50mM Tris、pH7.8、16.5mM NaCl、35mM KCl、5mM スペルミジン、0.25mM EDTA、3% グリセロール)の中で、25度で1時間反応させた。インテグラーゼ、IHF、Xisは一般的な方法で大腸菌から取り除かれた[Kotewicz M他、Journal of Biological Chemistry、1980年、 vol. 255、2433-2439;Nash HA. Robertson CA. Journal of Biological Chemistry、vol. 256、9246-9253(1981年); Cho EH他、Journal of Bacteriology、vol. 182、5807-5812(2000年)]。アガロースゲル電気泳動分析の結果、PacIで処理されたpAdHTSは3つのDNAセグメントを生成した（32kb、4.5kb、1.8kb）（図７のレーン１）。部位特異的組換えが起こったところで、セグメント（サイズ：約1.8kb）が消滅したのが観測された（図７ レーン2・3）。これを確認するために、アデノFプライマーとアデノRプライマーを使ってPCRを行った。それによって所望のサイズのPCR産物（約32kbと約4.5kb）を、部位特異的組換えが引き起こされたところで、観測することができた（図６参照）。
【００４２】
PCR産物は、アガロースゲルから分離され、このPCR産物について、DNA塩基配列決定法が行われた。その結果、レーン2・3・4のPCR産物は、アデノウイルスゲノムの不適当な分割から生まれるλ DNAであると判断された。そして、レーン5のPCR産物は、attB1-GFP-attB2、レーン６のPCR産物は、attB1-Gus-attB2と判断された。つまり、２つのアデノウイルスゲノムセグメントとpMasterクローンとの間で、組換えが起こっていた。
＜実施例２：pAdHTSを使ったウイルスの作製＞
実施例１にて得られた反応混合物（DNA100ng）を2マイクロリッター、293パッケージング細胞に導入する。そして、この293細胞は、DMEM（牛胎児血清5％）と共に、24ウェル（5×10４細胞/ウェル）へに移される。24時間後、製造者の指示に従って、組換え誘起反応混合物（2マイクロリッター）及びリポフェクアミン2000（0.5マイクロリッター）（インビトロジェン社）が、細胞に加えられた。加えてから7日後、細胞内でのウイルス形成を示す、CPEが顕微鏡にて観測された。そのときに、細胞は回収され、遠心分離機にかけられた。結果として生じる沈殿物は100マイクロリッターのDMEM10％牛胎児血清の中に懸濁された。細胞は37度で5時間処理された後に、マイナス70度で１時間処理された。この冷凍と解凍は3回繰り返された。ウイルス混合物を生成するために、遠心分離機によって可溶化相は取り除かれた。その後、293細胞は、ウイルス混合物によって感染された。目的のウイルスの形成を検知するためにプラーク検定が行われた。
【００４３】
プラーク検定のために、2×105細胞が6ウェルプレートに移された。移されてから24時間後、400マイクロリッターのDMEM400と混合された10マイクロリッターのウイルス混合物はウイルス吸着を引き起こすために細胞内で1時間培養された。1％低融点アガロース[シープラーク（SeaPlaque）アガロース；FMC]が加えられたDMEMを3ミリリットルと、細胞とを凝固させた後に、ウイルスのプラークは2週間検査された。ウイルスの力価は、ウイルス混合物の1ミリリットルあたりのウイルスプラークの数として決定される。2週間後、所望の組換えウイルスの生成効率を検知するために、グルタミン酸タンパク質の下地としてのX-グルコース（5臭素4塩化3インドリルベータDグルクロニック酸）を500マイクログラム、凝固アガロースに加える。24時間後、青色プラークの数が算出された。ウイルスの力価は1ミリリットルあたり106〜107PFUだった。組換えウイルスの生成効率はGUS遺伝子を発現する組換えウイルスによって決定された。すべてのウイルスは青プラークとして観測された。それは、本発明で得られたウイルスは100％組換えウイルスであったことを示していた。すなわち、所望のゲノム材料を含むウイルスゲノムのみが複製され、ウイルス粒子を形成した。これは、部位特異的組換えの効率が100％でなかったとしても、分割されたDNAセグメント自体、及び、部位特異的組換えの副産物は、複製されなかったためである。
【００４４】
図８に示すように、GFPとGusを発現する組換えウイルスは、それぞれ上記の方法で作製された。293細胞は組換えウイルスによって感染された。そして、所望のタンパク質（GFPまたはGus）は、蛍光顕微鏡（GFP用）によって、またはX-グルコース下地を加えること（Gus用）によって、検知された。図８に示すように、部位特異的なリコンビナーゼが加えられたウイルスのグループのみが組換えウイルスを生成し、所望のタンパク質を発現した（図８のレーン4・5参照）。
＜実施例３：pAd-LeftとpAd-Rightを用いた組換えウイルスの作製＞
pAd-Left(SEQ. ID No.: 4)とpAd-Right(SEQ. ID No.: 5)が作製された（図３参照）。まず、pAdHTSベクターが、PacI及び/またはSwaIで処理された。そして、LITRとパッケージングシグナルを含む左断片は、pAd-Leftを形成するために、PCR増幅によって調整されたAmp-OriDNAと結合された。同様に、右断片（サイズ：約33kb）はpAd-Rightを形成するために、Amp-OriDNAと結合された。この研究中で、Amp-OriのためのPCRプライマーには、pBR322DNAのアンピシリン耐性遺伝子、複製開始点の増幅のための領域、及び、制限酵素認知部位のクローニングのためのPacI及び/またはSwalリンカー、が含まれる。pAd-LeftとpAd-Rightの得られたプラスミドDNAは、DH5α［ミディプレップキット（Midiprep kit）、キアゲン社］］によって生産され、DH5αはSwaIとPacIによって消化された。それぞれのプラスミドDNAを使って、組換えウイルスを生成するために、実施例１・２のように、部位特異的組換えを行った。手短に言えば、pAd-Left（DNA100ng）の線状DNAとpAd-Right（DNA800ng）の線状DNAを、緩衝液の中で1時間、GFP cDNA(100ng)、インテグラーゼ(100ng)、IHF(10 ng)、Xis (10ng)を持つpMaster-GFPの存在下で、反応させた。結果として生じる混合物は、実施例２にあるように、293パッケージング細胞に加えられた。7日後、細胞片からウイルスが得られ、プラーク検定が行われた。
＜実施例４：AdHTS終端タンパク質複合体（AdHTS-terminal protein complex）の分離と操作＞
AdHTSウイルスを得るために、PacIの制限酵素によってpAdHTSが消化され、ウイルスパッケージングを引き起こすために293パッケージング細胞へ加えられた。約5×105の293細胞がDMEM（牛胎児血清5％）と一緒に30細胞培養皿（直径150ミリメートル）に移されることによって、AdHTSウイルスの大量生産がなされた。24時間後、AdHTSウイルスが5MOIにまで感染した。ウイルス感染から48時間後、細胞スクレーパで皿から細胞を回収し、遠心分離機にかけた。その後、10ミリモルのトリスと1ミリモルのMgCl2の溶液に沈殿物を懸濁した。この検査液は、37度で5分処理された後、マイナス70度で1時間処理された。冷凍と解凍は3回繰り返された。細胞可溶化相は遠心分離機にかけられ、ウイルス混合物を得るために、沈殿物は取り除かれた。感染性ウイルス粒子を得るために、CsCl勾配超遠心分離機が使用された。1.4g/mlのCsCl溶液をチューブ（ベックマン社）に注ぎ、1.2g/mlのCsCl溶液を、さらに加えた。ここに、濃度勾配を保ちながら、20mlのウイルス混合物を溶液に加え、その後、2時間、25000rpmで、超遠心分離機にかけた。このようにして、1×1012個の感染性ウイルス粒子が欠損ウイルス粒子及び細胞片から分離された。
【００４５】
AdHTSウイルスからDNA終端タンパク質複合体を作製するために、２つの異なる方法を用いた。第一の方法では、6Mグアニジン塩酸を同量のAdHTSウイルス溶液に加え、臭化エチジウム、及び、飽和したCSCl/4MグアニジンHCl溶液1mgを加え、最終的な量を5mlとした。次に、その溶液を4時間で650000g、超遠心分離機にかけた。分離したウイルスDNA終端タンパク質複合体バンドは365nmの紫外線で検知され、そのバンドに相当するDNAを抽出した。抽出されたDNAは、以下の研究に使用するため、脱塩された。第二の方法では、6Mグアニジン塩酸と同量のAdHTSウイルス溶液を含むアデノウイルスの溶液が、スーパーデックス16/30HR S-200カラム (アマシャムファルマシア社)に供された。流速0.4ml/minで溶液を展開させる間に、継続的に得られる2mlフラクションについて、260nmと280nmにおける光学濃度を測定した。上記２つの方法で得られたAdHTS DNA終端タンパク質複合体は、ピークフラクションを回収したものを展開した1％アガロースゲル上で、検出された。
【００４６】
上記２つの方法で得られたAdHTS DNA終端タンパク質複合体はSwal（NEB）で消化され、他の研究で使用されるまでマイナス70度で保管された。
＜実施例５：pMaster-GFPとの部位特異的組換えの結果生じるウイルスのためのプラーク検定＞
実施例２において作製されたpAdHTSベクターのインビトロでの反応混合物10ulと、pMaster-GFPとは、実施例２にあるように、293パッケージング細胞に加えられた。7日後、細胞可溶液から抽出されたウイルスにプラーク検定が実施された。同様にして、実施例３のpAd-left/pAd-right、及び、実施例４のAdHTS-DNA-TPCに対して、プラーク検定が実施された。その結果を下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
＜実施例６：組換えアデノウイルスのマルチウェル生産＞
実施例4のSwal処理されたAdHTS-DNA終端タンパク質複合体は、45ng/ウェルとなるように、96ウェルPCRプレートの各ウェルへ加えられ、実施例１のように部位特異的組換えが行われた。手短に言うと、インテグラーゼ100ng、IHF10ng、Xis10ng、反応緩衝液（トリス50ミリモル、pH7.8、Nacl16.5ミリモル、KCl35ミリモル、スペルミジン5ミリモル、EDTA0.25ミリモル、3％グリセロール）そして、GFPのcDNAを含むpMaster-GFP5ngが、各ウェルに加えられる。コントロールとして、GusのcDNAを含むpMaster-Gusが４つのウェルそれぞれに加えられ、反応は1時間継続した。部位特異的組換えを確かめるために、アデノFプライマーとアデノRプライマーを用いたPCR反応を実施する。その結果、GPFに相当するPCR生成物質がコントロール以外の88ウェルで検知された（図９参照）。実施例２と同様、部位特異的な組換えを含むと確認された、10ul（DNA50ng）の反応混合物が、96ウェルプレートに加えられた。ここで、各ウェルは、ポリLリシンでコートされており、24時間培養された292パッケージング細胞を約5×103含んでいた。DNAを含む細胞は発光した。CPEは細胞に加えられてから4日から7日後に観測され、ウイルス形成を示した。上記した処理から10日目、96ウェルプレートは37度で5分処理された後、マイナス70度で1時間処理された。細胞可溶化液を得るために、冷凍と解凍は3回繰り返された。細胞可溶化相は、2500rpmで10分間、遠心分離機にかけられた。そして、96ウェルプレート内の293細胞に、GFPを発現するウイルスが確実に形成されるように、上澄み液を加えた（トランスフェクトした）（図１０参照）。同様に、組換えウイルスの発現効率は、96ウェル内の他のアデノウイルスベクター（例えば、pAdHTS及びpAd-Left/pAd-Right）についても、それぞれ判定された。組換えウイルスの平均発現効率は下の表２に示す。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
（産業上の利用可能性）
上記したように、本発明は組換えウイルスのためのベクターを作製するために、インビトロでの部位特異的組換えを利用する。本発明では、所望の外来ゲノム材料が、ウイルスゲノムDNAのふさわしい部位に挿入され、すばやく、そして部位特異的な方法で、２つ以上のセグメントに分割される。さらに、ウイルスゲノムDNAと所望のゲノム材料の反応混合物は、組換えウイルスゲノムDNAをさらに選択することなしに、直接、インビトロで宿主細胞に適用される。このように、本発明によると、一度に多くの組換えウイルスを得ることができる。さらに、ほぼ完全に自己複製を防ぐことができる。それゆえ、様々なゲノム研究のために、何百何千の組換えウイルスを生成する高生産性システムを、本発明は提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】pAdHTSベクターの構成を示す図である。
【図２】pAdHTSベクターとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの過程を示す図である。
【図３】pAd-LeftとpAd-Rightの構成を示す図である。
【図４】pAd-Left/pAd-RightとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの過程を示す図である。
【図５】従来技術の方法と比較して、AdHTSを使った組換えアデノウイルス生成の過程と時間を示す図である。
【図６】pAdHTSベクターとpMasterクローンのインビトロでの部位特異的組換えの結果を表すアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。
【図７】図７は、pAdHTSベクターとpMasterクローンの部位特異的組換えを表す、PCRの結果を示す。
【図８】pAdHTSベクターとpMasterクローンの部位特異的組換えの結果を示す。pMasterクローン中の所望のゲノム材料は、所望のタンパク質を発現するために、アデノウイルスゲノムに導入される。
【図９】96ウェル内でのAdHTSとpMaster-GFPの部位特異的組換えを表すPCRの結果を示す図である。
【図１０】96ウェル中のAdHTSとpMaster-GPFの部位特異的組換えの結果を示す図である。pMasterに挿入されたGPF遺伝子は、GFPを発現するために、アデノウイルスゲノムに導入される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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