(57)【要約】生体分子の高スループット電気泳動分離及び検出用マルチキャピラリーシステムについて開示する。本発明の一実施形態では、生体分子のマルチチャネル電気泳動分離用篩いマトリックスとしてガラクトマンナンを用いる。サンプルとして同一チャネル中の対照及び標準の同時分析用の多色検出、並びに内在性蛍光検出についても開示する。本発明の別の実施形態は、複雑な試料を分離するための二次元システムであり、２段階分離工程をつなぐ画分回収工程を有する多重キャピラリー電気泳動システムを二次元目として用いる。このシステムによって、高度並列式又は二次元方式で分離を行うことができる。
2005526969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及びペプチドの分離及び検出用多重キャピラリー電気泳動システムであって、
（ａ）同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管のアレイであって、各キャピラリー電気泳動管が第一の端部と第二の端部を有し、第一の端部がマイクロタイタープレートのウェル配列の間隔に対応した間隔を有する二次元アレイに配置されている、キャピラリー電気泳動管のアレイ、
（ｂ）篩いマトリックス及び複数の液体から選択された１種類の液体をキャピラリー管の第二の端部へ選択的に供給するように構成された装置、及び
（ｃ）キャピラリー管アレイを励起して、キャピラリー管アレイからの放射光を検出する走査手段
を備えるシステム。
【請求項２】
前記篩いマトリックスがサイズ分離型篩いマトリックスである、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記篩いマトリックスがデキストランを含む、請求項２記載のシステム。
【請求項４】
前記篩いマトリックスがガラクトマンナンを含む、請求項２記載のシステム。
【請求項５】
生体分子の分離及び検出用多重キャピラリー電気泳動システムであって、
（ａ）同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管のアレイであって、各キャピラリー電気泳動管が第一の端部と第二の端部を有し、第一の端部がマイクロタイタープレートのウェル配列の間隔に対応した間隔を有する二次元アレイに配置されている、キャピラリー電気泳動管のアレイ、
（ｂ）篩いマトリックス及び複数の液体から選択された１種類の液体をキャピラリー管の第二の端部へ選択的に供給するように構成された装置、及び
（ｃ）キャピラリー管アレイの生体分子を励起して、キャピラリー管アレイからの生体分子の内在性蛍光放射を検出する走査手段
を備えるシステム。
【請求項６】
前記走査手段が紫外線波長の放射光を発振できるレーザーを備える、請求項５記載のシステム。
【請求項７】
前記レーザーが増倍型チタンサファイアレーザーである、請求項６記載のシステム。
【請求項８】
前記篩いマトリックスがサイズ分離型篩いマトリックスである、請求項５記載のシステム。
【請求項９】
前記篩いマトリックスがデキストランを含む、請求項８記載のシステム。
【請求項１０】
前記篩いマトリックスがガラクトマンナンを含む、請求項８記載のシステム。
【請求項１１】
同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管アレイが１６本以上のキャピラリーを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項１２】
同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管アレイが９６本以上のキャピラリーを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項１３】
同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管アレイが３８４本以上のキャピラリーを含む、請求項１記載のシステム。
【請求項１４】
二次元分離によって複雑な生物試料中の成分を分離及び検出する方法であって、
（ａ）試料を第一の分離検出手段に付して複数の画分に分画する工程、
（ｂ）上記複数の画分を画分回収手段に回収する工程、及び
（ｃ）上記複数の画分の２以上の画分を同時に第二の分離検出手段に付す工程であって、第二の分離検出手段が第一の分離検出手段とは被分離成分の異なる性質に基づく工程
を含んでなる方法。
【請求項１５】
試料を第一の分離検出手段に付す前に、前記複雑な生物試料を染色標識する工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
複数の画分を画分回収手段に回収した後で、前記複雑な生物試料の複数の画分を染色標識する工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記回収工程後の画分に、移動度の一致した染料で標識した対照を加える工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
第一の分離検出手段がＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動、等速電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション、固相抽出、液相抽出又は他の標準分離手段からなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
第二の分離検出手段が高度並列キャピラリーゲル電気泳動管システムである、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
第二の分離検出手段の篩いマトリックスとしてガラクトマンナンが用いられる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第二の分離検出手段の篩いマトリックスとしてデキストランが用いられる、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記画分回収手段がマイクロタイタープレートからなる、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動とその関連技術によってタンパク質、ペプチド及び生体分子を多重分離・検出する装置及びその付属装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動は生物科学で最も広く用いられている分離技術の一つである。電気泳動は、スラブゲル電気泳動、濾紙電気泳動及びキャピラリー電気泳動を始めとする幾つかの方式のいずれでも実施できる。これらの方式の中ではスラブゲル電気泳動が最も利用されているが、キャピラリー電気泳動は１９８１年にＢｕｓｈｅｙとＪｏｒｇｅｎｓｏｎによって発表（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５５，１１９８−１３０２）されて以来次第に評判が高まりつつある。その理由は、スラブゲル電気泳動は時間がかかり、ゲル間での再現性がないためである。これに対して、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は迅速で、自動化に適しており、概して実験室間での再現性に優れている。核酸分子の多重ＣＥ分離はルーチン化しつつあるが、タンパク質その他の生体分子の場合には、さらに多くの化学的課題が種々残っており、分離が難しいため、未だルーチン化されていない。
【０００３】
幾つかの電気泳動の方式があることに加え、フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動を始めとする様々な形態も存在する。従来のスラブゲル電気泳動では、これによって同一ゲルで２通りの異なる分離法を行うことができ、分解できる成分数（ピーク能力）が増加する。これは等電点電気泳動を用いて成分をその等電点に基づいて分離した後、ゲルを９０度回転してゲル電気泳動を用いて成分をそのサイズに基づいて分離することによって行われる。米国特許第５４９６４６０号及び同第５１３１９９８号明細書、国際公開第０２／４０９８３号及び同第００／５７１７０号パンフレットに記載されているように、二次元分離のその他の実施法も考案されている。
【０００４】
キャピラリー電気泳動で分離した生体分子の検出は、考慮すべき重要な事項である。典型的には、検出は、検体に共有結合させておいた検出用蛍光体（タグ又は標識と呼ばれる。）の紫外線（ＵＶ）吸収又はレーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）のいずれかによって光学的に実施される。同一キャピラリーで同時に分析するため、試料に内標準又は対照を加えると都合がよいことが多い。これによって、キャピラリー間及びラン間での注入及び泳動の微妙な差を制御できる。ただし、これには波長の異なる標識を数種類用いることが必要とされる。標識を用いると移動度がシフトしかねず、使用したすべての標識についてこうしたシフトが一致しない限り、試料を内標準又は対照と直接対比することができなくなる。検体の移動度がシフトするだけでなく、同じ種類の分子間で標識の数分布が異なるおそれもある。そのため、標識を用いると分離時にバンドが広がりかねず、ひいては解像度が低下してしまう。さらに、検体分子の数に対する標識数が不確実であるため、標識を用いると対象検体の定量化能力が落ちる。
【特許文献１】米国特許第５４９６４６０号明細書
【特許文献２】米国特許第５１３１９９８号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／４０９８３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／５７１７０号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｕｓｈｅｙ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５５，１１９８−１３０２（１９８１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質、ペプチドその他の生体分子の分離のための多重キャピラリーゲル電気泳動のような使い易い高度並列技術に対するニーズが存在する。複雑な検体に含まれる上述のような分子のための先進二次元分離システムに対するニーズも存在する。高度並列電気泳動分離の検出感度を高めるため、検体の内在性（固有の）蛍光を検出するニーズも存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、殊に、各種材料を平行して分離・検出するのに用いることができる方法及びシステムについて開示する。当該方法及びシステムは、複雑な生物試料の高分解能、高感度、高スループットな検出法を提供する。
【０００７】
本発明の第一の態様では、試料中の成分の分離及び検出を実施するためのシステム及び方法を提供する。当該システムは、同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管のアレイであって、各キャピラリー電気泳動管が第一の端部と第二の端部を有し、第一の端部がマイクロタイタープレートのウェル配列の間隔に対応した間隔を有する二次元アレイに配置されているキャピラリー電気泳動管のアレイと、篩いマトリックス及び複数の液体から選択された１種類の液体をキャピラリー管の第二の端部へ選択的に供給するように構成された装置と、キャピラリー管アレイを励起してキャピラリー管アレイからの放射光を検出する走査手段とを備える。
【０００８】
本システムの好ましい実施形態では、ＬＰＡ、デキストラン又はガラクトマンナンのようなサイズ分離型の篩いマトリックスを利用する。
【０００９】
本発明の別の態様では、生体分子を分離及び検出する多重キャピラリー電気泳動システム及び方法を提供する。当該システムは、
同一平面上の平行なキャピラリー電気泳動管のアレイであって、各キャピラリー電気泳動管が第一の端部と第二の端部を有し、第一の端部がマイクロタイタープレートのウェル配列の間隔に対応した間隔を有する二次元アレイに配置されているキャピラリー電気泳動管のアレイと、篩いマトリックス及び複数の液体から選択された１種類の液体をキャピラリー管の第二の端部へ選択的に供給するように構成された装置と、キャピラリー管アレイの生体分子を励起してキャピラリー管アレイからの生体分子の内在性蛍光放射を検出する走査手段とを備える。
【００１０】
本システムの好ましい実施形態では、ＬＰＡ、デキストラン又はガラクトマンナンのようなサイズ分離型の篩いマトリックスを利用する。好ましい走査手段としては、増倍型チタンサファイアレーザーと高調波発生器のような紫外線波長光を発振できるレーザーが挙げられる。
【００１１】
本発明の別の態様では、二次元分離によって複雑な生物試料中の成分を分離及び検出する方法であって、試料を第一の分離検出手段に付して複数の画分に分画する工程と、上記複数の画分を画分回収手段に回収する工程と、上記複数の画分の２以上の画分を同時に第二の分離検出手段に付す工程であって、第二の分離検出手段が第一の分離検出手段とは被分離成分の異なる性質に基づく工程とを含んでなる方法を提供する。
【００１２】
当該方法は、試料を第一の分離検出手段に付す前に複雑な生物試料を染色標識する工程、又は上記複数の画分を画分回収手段に回収した後で複雑な生物試料の複数の画分を染色標識する工程をさらに含んでいてもよい。当該方法は、上記回収工程後の画分に、移動度の一致した染料で標識した対照を加える工程をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
第一の分離検出手段は、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、等電点電気泳動、等速電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、電気クロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション、固相抽出、液相抽出又は他の標準分離手段からなる。好ましくは、上記画分回収手段はマイクロタイタープレートからなる。第二の分離検出手段は高度並列キャピラリーゲル電気泳動管システムである。第二の分離検出手段における好ましい篩いマトリックスは、ガラクトマンナン又はデキストランである。
【００１４】
本発明の別の態様では、試料として同一チャネル中の対照及び標準を同時分析するための多色検出法を提供する。
【００１５】
本発明の上記その他の目的について、図面及び以下の明細書で詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、タンパク質、ペプチド、生体分子及びそれらの複合体、小分子及びそれらの複合体及び重合体を、電気泳動及びその関連技術によって多重分離・検出するための装置及びシステムである。当該システムは、ガラスやプラスチックのような適当な材料で作られた複数のキャピラリー又はチャネルを有する。電気泳動分離は、キャピラリー又はチャネル内で実施され、レーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）（１又は２フォトンプロセス）を用いて検出される。ＬＩＦは蛍光標識分子によるものでも、分子の内在性蛍光によるものでもよい。
【００１７】
ガラクトマンナンでの多重分離
本発明の一実施形態は、タンパク質その他の生体分子のサイズ分離型の多重電気泳動分離に関する。分離はフリーゾーン電気泳動でも、或いは線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）のような篩いマトリックスを用いた電気泳動でも実施できる。
【００１８】
一実施形態では、９６本のキャピラリー装置でタンパク質の分離及び標識蛍光検出が行われる。マルチキャピラリー電気泳動システムのＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州サニーベイル）を改造せずに用いる。この装置は、各々１６本のキャピラリーからなるアレイ６列を有しており、アレイの片側は高圧セルに結合していて、各キャピラリーに粘性マトリックスを充填できるようになっている。キャピラリーに新たなマトリックスを充填した後、動電手段によって試料をローディングし、試料のアレイを緩衝液で置換し、高電圧を印加して分離場を形成する。この電圧は典型的には８〜２０ｋＶであるが、どのような電圧を用いてもよい。試料がキャピラリーを降って行くと、検出領域を通過し、そこでレーザー誘起蛍光検出が行われる。ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）のＬＩＦ検出システムは、米国特許第５２７４２４０号に記載されているような走査型共焦点蛍光検出器を有する。この蛍光検出器は、データ収集サイクル当たり最大４つの異なるデータスペクトルチャネルを収集でき、分離チャネル当たり４種類の異なる化学的性質を同時解析することができる。
【００１９】
米国特許出願番号第０９／９４６３９６号（その開示内容はすべて援用によって本明細書の内容の一部をなす）には、本発明で用いられるガラクトマンナンの精製方法が開示されている。用いるガラクトマンナンの重量平均分子量は１０5〜３×１０6の範囲である。分子量３０００００以上のガラクトマンナンを篩いマトリックスとして選択するのが好ましい。ガラクトマンナンの粘度及び重量平均分子量は、超音波処理、オートクレーブ処理、酸加水分解及び塩基加水分解で下げることができる。タンパク質分析用の好ましいキャピラリーカラムは、分子量７．７×１０5のガラクトマンナン１０ｇ／Ｌ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び４ｍＭ  ＳＤＳからなるゲルを充填した内部キャビティーを有する。分離は、試料のアリコートをキャピラリーカラムに導入し、キャピラリーカラムに電界を印加することによって実施される。
【００２０】
この方法を用いて、蛍光標識タンパク質の９６並列サイズ分離が機械的に達成される。典型的には、ピーク能力は各キャピラリーについて約５０であり、問題となる成分すべてが十分に分離される。すべてのキャピラリーで同じ分離を実施した場合、９６チャネルのすべてで同様の結果が得られる。そこで、この方法では、高スループットで再現性のあるタンパク質及びペプチドの分離が得られる。
【００２１】
二次元目としてＣＧＥを用いる二次元分離
極めて複雑な試料の分離には、高いピーク能力が必要とされる。生物活性分子の分離には、生物起源の混合物又は合成混合物中に存在する多数の成分を分析するため二次元分離の使用が必要とされることが多い。その典型例は、一次元目が等電点電気泳動で、二次元目がサイズ分離である周知の２Ｄスラブゲル電気泳動である。ただし、どのような分離技術の組み合わせであれ、分離メカニズムが異なっていれば、分離性を向上させることができる可能性がある。
【００２２】
以下、２Ｄ  ＣＧＥ装置と呼ぶ本発明の別の実施形態では、生物試料中に含まれるタンパク質その他の成分を、高いスループットで、高い分解能で分離し高感度で検出する装置及び方法を提供する。
【００２３】
好ましくは電気泳動又はクロマトグラフ手段で実施される一次元目分離を提供する。サイズ分離前の分離法の具体例としては、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション、固相抽出、液相抽出などが挙げられる。この一次元目分離手法で試料は多数の画分に分けられるが、各画分は１以上の成分を含んでいてもよい。
【００２４】
本発明では、各画分をマイクロタイタープレートのようなインターフェース装置に回収する。インターフェース装置は、所望に応じて試料画分を貯蔵する手段を備える。各画分のアリコートは、二次元目分離その他の後段での分析に用いることができる。全画分を二次元目分離に用いる場合には、試料の所要の修飾をインターフェース装置内で実施することができる。かかる修飾としては、溶媒中での調整（所望に応じて）、一次元目分離の前に標識していないときの試料の標識などが挙げられる。別法として、各画分のアリコートを同様の装置に移して二次元目の分析に用い、残りのアリコートを別の分析や保管に用いてもよい。また、各画分に対照及び／又は標準を加えてもよい。対照及び／又は標準は、試料の標識に用いた染料とは蛍光発光波長が異なるが移動度が同じ染料を用いて標識される。これによって試料と対照とを直接対比でき、また各キャピラリーについての泳動時間を標準化することができる。かかる染料は容易に入手でき、図２に、各々異なる３種類の染料で標識した４種類のタンパク質の分離を示す。染料の移動度は非常によく一致しており、その結果、各タンパク質のピークがよく一致している。
【００２５】
インターフェース装置から１以上の画分（又は画分のアリコート、上記参照）が二次元目分離装置に同時に装填され、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって各画分内の成分をさらに分離する。この二次元目分離は、分析試料のすべての画分又はかなりの数の画分について同時に実施される。好ましい実施形態では、分離はＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムで実施される。
【００２６】
現行のシステムを用いて二次元分離を行う利点は、統合２Ｄ装置と同様に、一次元目の分析の時間フレームに比べて二次元目の分析の時間フレームを極端に短くする必要がないことである。これによって各次元の選択の幅が広がるが、さもなければ、二次元目の分離時間を妥当なものとするため一次元目を非常に遅くするか、或いは二次元目を極端に速くする必要があるが、これらは常に可能なわけではない。さらに、全分析時間が大幅に短縮され、試料劣化のおそれが低減しスループットが増大するので、一次元目分離から画分を回収しそれらを順次分析する技術に比べて明らかな利点を有する。
【００２７】
ＵＶ−ＬＩＦ検出による多重分離
マルチキャピラリー電気泳動システムのための蛍光検出技術は、可視光スペクトル域に蛍光発光する分子については、例えば米国特許第５２７４２４０号、同第５４９８３２４号及び同第５５８２７０５号にみられるように、既に十分に確立されている。しかし、現在利用可能なマルチキャピラリー蛍光検出システムはすべて蛍光「タグ」の使用を前提としており、問題とする分子の誘導体化が必要とされる。本発明ではある種の分子の内在性（固有の）蛍光を活用し、そのため分子を誘導体化せずに検出することが可能となり、検出技術の格段と改善となる。誘導体化は分離に重大な悪影響を与えることが多いからである。この検出システムをＵＶ−ＬＩＦシステムと呼ぶ。
【００２８】
ＵＶ−ＬＩＦシステムは、走査型共焦点蛍光検出器と共に、同一平面上に配置された複数のキャピラリーからなる。本発明では、ＵＶ及び２フォトン法を始めとする幾つかの方法のいずれかを用いて、マルチキャピラリーでの内在性蛍光を検出することができる。かかる実施形態の一つについて説明すると、紫外線域の波長を発振できるチタンサファイアレーザーと高調波発生器、及びレーザー光を小さなスポットに導いて蛍光発光を効率的に集める専用光学素子を用いる。別法として、周波数増倍型ガスレーザー、周波数増倍型固体レーザー又は光励起固体レーザーなどの単一波長レーザー、或いは水銀キセノンランプや（利用可能であれば）ダイオードなどの多波長代替光源を用いることができる。
【００２９】
図６は、本発明、すなわち、分離時に生体活性分子の内在性蛍光を検出するための装置構成を示す。用いる電気泳動装置は、ＤＮＡのゲル電気泳動を行うために設計されたＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムに基づく。このシステムの電気泳動部品はキャピラリーのアレイからなるが、キャピラリーアレイは束ねられて陽極端側で試薬チューブに連結され、陰極端側でマイクロタイタープレートに割り当てられ結合される。ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムの検出システムは米国特許第５２７４２４０号に基づくもので、本発明はこの米国特許と同様の光学配置によるが、ＵＶ励起、反射及び蛍光発光が可能となるように適合される。図６Ａは、本発明の検出システムで改造した９６本キャピラリーのＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムを示す。この実施形態では、市販ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）検出システムで用いられているアルゴンイオンレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）に代えて、チタンサファイアレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社製）が励起用に用いられる。レーザー誘起蛍光検出器の光学系の構成を図６Ｂに示す。ＵＶ伝送系及び励起エネルギーの２フォトン源の実装は、強化（保護）アルミニウムミラー１０、２０、３０及び４０、キャピラリーの位置合わせの際の正反射検出用のＵＶ反応型ダイオード５０、人工溶融石英及びサファイアレンズ６０、特殊パターニング処理反射ビームスプリッタ７０、８０及び９０、複数の波長でレーザーをブロックする特注運動フィルターホルダー１００を備える。これらに関しては以下の４段落で説明する。
【００３０】
図６Ｂは、本発明の光学系を示す。実線は入射レーザー光を表し、点線は蛍光発光を表す。レーザーは１０６４ｎｍ赤外ダイオードレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ社）であり、２倍周波数の５３２ｎｍにされる。このビームを用いて、広範な波長を発振できるチタンサファイア（Ｔｉ：サファイア）レーザーでの蛍光過程を光励起する。この実施形態では、Ｔｉ：サファイアを８４０ｎｍに同調させ、（３倍高調波発生結晶を用いて）３倍周波数の２８０ｎｍにする。このビームは次いでミラー１（強化アルミニウム）（１０）で反射されてシステムのミラー２（強化アルミニウム）（２０）に向けられる。ミラー２は可動であり、各ランの前に隣接パワーモニターでレーザー出力をモニターできる。フォトダイオードに入射する反射レーザー光の大きさはキャピラリーの中心で最も大きくなるので、各キャピラリーの中心位置を求めるためＵＶ強化ダイオードが用いられる。
【００３１】
ミラー３（３０）も、ＵＶ域で最適反射率となる強化アルミニウムミラーである。走査台の手前の第一ビームスプリッタ（８０）は、パターニングされたＵＶ強化アルミニウムである。これはアルミニウムミラー内に無反射孔を有していて、ビームが走査ヘッドに到達することができる。戻りビームの直径は入射ビームの直径よりも大きく、ビームスプリッタの反射領域を通過してレーザーブロックフィルター（１００）に達し、最終的に検出用光電子増倍管（１５０、１６０）に達する。
【００３２】
一次ビームスプリッタを通過した後、ビームは軽量走査ヘッドに至り、そこでミラー４（強化アルミニウム）によって反射され、人工溶融石英の単一レンズ（６０）に到達する。このビームは、キャピラリー内の分離すべき試料の蛍光を誘起する。キャピラリー中の試料からの蛍光は同じレンズで集められ、一次ビームスプリッタに戻され、そこで光学台の検出領域へと反射される。
【００３３】
図６Ｃは、軽量対物レンズ及びミラー取付台及び走査領域を示す。分離すべき試料にレーザー光を導くには、反射鏡及びＵＶ強化レンズが必要である。この図には、キャピラリーウィンドーホルダー及びキャピラリーが示されている。
【００３４】
以下の実施例は、本発明を遺漏なく示したものではなく、上記で説明した装置及び化学検査を利用することのできる幾つかの分離形式を例示したものにすぎない。
【００３５】
実施例１：多重ＣＧＥによるタンパク質分離
この分離では、未改造ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）装置を用いた。長さ６０ｃｍのキャピラリーを線状ポリアクリルアミドでコートし、次いで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び４ｍＭ  ＳＤＳ中の１％グアラン篩いマトリックスの分離剤を充填した。蛍光標識タンパク質標準（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｆ３４０１）。標識タンパク質を、１０ｋＶで注入時間３秒の条件で電気泳動注入によりキャピラリーカラムにローディングした。タンパク質標準は、１２ｋＶで２０分間の電気泳動で分離した。図１は代表的な分離結果を示す。
【００３６】
実施例２：ＨＰＬＣ−ＣＧＥによるラット肝臓タンパク質の二次元分離
この分離では、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムを用いて二次元目分離としてＣＧＥを行い、ＡＫＴＡ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて一次元目分離としてＨＰＬＣを行った。タンパク質試料は、８Ｍ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１０ｍｇ／ｍＬジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び１７．４ｍｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液中ポリトロンでホモジナイズしたラット肝臓組織から調製した。試料を１時間インキュベートし、次いで遠心分離して不溶物を除去した。
【００３７】
分離用に、緩衝液Ａ：１０ｍＭリン酸塩緩衝液と、緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸塩緩衝液中７５％アセトニトリル、ｐＨ６．５との２種類の緩衝液を調製した。Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｃ４、５μｍ  ＳＴ４．６／１００ｍｍカラムで分離した。用いた勾配は以下の通りである。最初に、４ｍｌの１００％緩衝液Ａを導入し、次に３４ｍｌの１００％緩衝液Ｂの勾配にして、最後に１２ｍｌの１００％緩衝液Ｂとした。流出液を、マイクロタイタープレートのウェルに各２００μｌずつ１８０画分回収した。これらの画分を次いで減圧下で乾燥させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５の緩衝液中に再懸濁し、暗所で４時間ＴＭＲのスクシンイミジルエステルで標識した。二次元目ＣＧＥ分離は、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムで並列に実施した。画分を２ｋＶで４０秒間注入し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液及び０．１％ＳＤＳ中の１％グアラン篩いマトリックスで１０ｋＶにて分離した。図３Ａ〜図３Ｄは、ラット肝臓タンパク質の二次元分離を示す。一画分のＣＧＥ分離を、図３Ｃ及び図３Ｄに示す。
【００３８】
実施例３：ＩＥＦ−ＣＧＥによるラット肝臓タンパク質の二次元分離
先の実施例と同様に、ラット肝臓組織からタンパク質試料を調製した。この分離では、等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、従来法に従いドライストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、部品番号１７−６００２−４４、２４ｃｍ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ、ｐＨ３〜１０）上で行った。次いでストリップを小片に切り分け、粉砕して、各切片中のタンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＳＤＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で抽出した。切片を次いでＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システム（注入電圧２ｋＶ、注入時間４０秒、ラン電圧１０ｋＶ）を用いてサイズ篩いによって並列に分析し、長さ６０ｃｍのキャピラリーで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＳＤＳ緩衝液（ｐＨ８．５）と１５％デキストランマトリックス内で分離した。図４は、ＩＥＦの一画分で得られたＣＧＥ分離プロファイルを示す。
【００３９】
実施例４：ＨＰＬＣ−ＣＧＥによる大腸菌タンパク質の二色二次元分離
この分離では、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）を用いて二次元目分離としてＣＧＥを行い、ＡＫＴＡ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて一次元目分離としてＨＰＬＣを行った。タンパク質は、大腸菌から遠心分離でペレットを形成して得た。ペレットを、８Ｍ尿素、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ中で再懸濁した。菌体懸濁液は透明になるまで氷浴中で超音波破砕した。１００ｍｇのＤＴＴを１０ｍＬ溶液に加え、溶液を１５分間インキュベートした後遠心分離した。
【００４０】
分離用に、緩衝液Ａ：１０ｍＭリン酸塩緩衝液と、緩衝液Ｂ：１０ｍＭリン酸塩緩衝液中７５％アセトニトリル、ｐＨ６．５との２種類の緩衝液を調製した。Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｃ４、５μｍ  ＳＴ４．６／１００ｍｍカラムで分離を行った。用いた勾配は以下の通りである。最初に、４ｍｌの１００％緩衝液Ａを導入し、次に３４ｍｌの１００％緩衝液Ｂの勾配にして、最後に１２ｍｌの１００％緩衝液Ｂにした。
【００４１】
流出液を、マイクロタイタープレートのウェルに各２００μｌずつ１８０画分回収した。これらの画分を次いで減圧下で乾燥させ、１０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５の緩衝液中に再懸濁し、暗所でＤＭＳＯ中に溶解したＲＯＸの０．１ｍｇ／ｍＬスクシンイミジルエステルの１μＬ溶液で４時間標識した。４時間後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ、１％ＳＤＳ緩衝液で容積を１００μＬに増加させた。分子量サイズ標準は、ラクトアルブミン、トリプシン抑制剤、アルコール脱水素酵素及びウシ血清アルブミンを暗所でＤＭＳＯ中に溶解したローダミングリーンのスクシンイミジルエステルの過剰量で４時間標識することによって調製した。これらの標準をセファデックスＧ−２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で脱塩し、１００倍に希釈し、サイズ標準３μＬを試料の各画分に加えた。
【００４２】
二次元目ＣＧＥ分離は、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムで並列に実施した。試料は２ｋＶで４０秒間注入し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液及び０．１％ＳＤＳ中の１％グアラン篩いマトリックスで１０ｋＶで分離した。
【００４３】
図５は、大腸菌抽出物からのタンパク質の二次元分離を示す。図面の下側のトレースはＵＶ吸収検出によるＨＰＬＣ分離を示す。ＵＶ吸収検出はＬＩＦ検出よりも感度に劣るので、存在するすべてのタンパク質がこのトレースで観察できるわけではない。この図面の左側の二重トレースは、これらの画分の一画分の分離で得られた生データを示す。４つのスペクトルチャネルのうちの２つを、このトレースに示す（残りの２つは明瞭化のため除いた）。大きな四角の図は全二次元分離を示す。横軸はＨＰＬＣ分離を表し、回収された各画分は異なる垂直レーンとしてみられる。各々の並列ＣＧＥ分離は、図の下方から上方に向かって進む。時間は走査番号で表される。各走査は約１／１００分を表すので、図に示す領域はＣＥＧ分離の１４分目から３０分目、つまり１６分間に相当するデータを示している。この図から、本発明の二次元分離方法を用いると分離力が格段に向上することが分かる。また、マルチスペクトルチャネルで収集したデータによって、（標準を用いての）試料の泳動時間の標準化及び（対照を用いての）各成分の量の標準化が可能となることも明らかである。
【００４４】
実施例５：トリプトファンの検出に関する検出限界プロット
ＵＶ−ＬＩＦシステムの検出限界（ＬＯＤ）を試験するため、次の実験を行った。図６及び上記で説明した通り、内在性蛍光検出に対応させたＵＶ−ＬＩＦ改良型ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムにキャピラリーを装着した。キャピラリーにトリプトファンの希釈溶液を充填し、２８０ｎｍ励起光で走査した。シグナルからバックグラウンドを引いた値をバックグラウンドの標準偏差で除した値（Ｓ−Ｂ／ＳＤＢ）を算出し、このプロットにおける濃度を比較した。検出限界は、信号対雑音比（Ｓ−Ｂ／ＳＤＢ）が３の値に達する点で定義される。このプロットでは、ＬＯＤは６×１０-9モルとなった（図７）。
【００４５】
実施例６：内在性蛍光検出によるＣＥＧを用いたタンパク質の分離
６種類のタンパク質を含むタンパク質混合物をＵＶ−ＬＩＦシステムで分析する。この混合物を調製するため、各タンパク質を５ｇ／Ｌずつ含む溶液１００μＬを、１０μＬの２０％ＳＤＳ，１０μＬ（１００ｇ／Ｌ）のＤＴＴ及び４８０μＬのＨ2Ｏで希釈して、最終体積を６００μＬにした。各タンパク質の希釈後の最終濃度は、インシュリン１．７×１０-6Ｍ、α−ラクトアルブミン７．１×１０-7Ｍ、β−ラクトアルブミン５．６×１０-7Ｍ、炭酸脱水酵素３．４×１０-7Ｍ、オボアルブミン２．２×１０-7Ｍ、ウシ血清アルブミン１．５×１０-7Ｍであった。この混合物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの１６個のウェルに１ウェル当たり１０μＬ分取した（ウェル当たりの全タンパク質は５０μｇ）。この試料を１０ｋＶで１０秒間注入し、図６に示す上述のＵＶ−ＬＩＦ改良型ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムを用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び０．１％ＳＤＳの運転緩衝液とともに１０ｋＶで２５分間動作させた。信号対雑音比（シグナルからバックグラウンドを引いた値をバックグラウンドの標準偏差で除した値）はβ−ラクトアルブミンで４０５であった。図８に上記タンパク質の分離を示す。分析時間が十分でないため、ウシ血清アルブミンは観察されない。
【００４６】
ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システム及びＵＶ−ＬＩＦ改良型ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムを、タンパク質、ペプチドその他の生体活性分子の１Ｄ及び２Ｄ分離に用いると、分析時間が短縮されるだけでなく、非並列化ピーク能力も提供する。これによって、一致染料を用いて、試料、対照標準／対照及び標準を同時に分析することができる。こうして、サンプルの投薬及び非投薬履歴を見分けることができ、医薬品の開発、毒物学、環境効果などでの比較が可能となる。
【００４７】
本発明の要旨及び技術的範囲において、上述の本発明の様々な変形や変更を行うことができる。以上説明してきた具体的な実施形態は専ら例示を目的としたものであり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ガラクトマンナン篩いマトリックス及びＬＩＦ検出による多重キャピラリー電気泳動を用いたサイズ分離型タンパク質分離の例である。
【図２】移動度の一致した染料セットを用いたタンパク質分離の例を示す。
【図３Ａ】ラット肝臓タンパク質の二次元分離の第一段階としてのＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図３Ｂ】図３Ａに示すクロマトグラムの四角で囲まれた領域の拡大図である。
【図３Ｃ】図３Ｂに示すクロマトグラムの四角で囲まれた部分のキャピラリー電気泳動分離である。
【図３Ｄ】図３Ｃに示す電気泳動図の四角で囲まれた領域の拡大図である。
【図４】ＩＥＦ−ＣＥ分離法によりＩＥＦの一画分をＣＥで分離した結果を示す。
【図５】ガラクトマンナン篩いマトリックスを用いたＨＰＬＣ及びＣＧＥで分離した大腸菌タンパク質抽出物の２色二次元分離を示す。
【図６Ａ】チタンサファイアレーザーを装備した改良型ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムを示す。
【図６Ｂ】生体活性分子の分離検出のため、内在性蛍光発生用の励起法を用いたＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムの改良を示す。
【図６Ｃ】改良型ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００（登録商標）システムの検出部分の詳細図である。
【図７】図６に示す内在性蛍光検出の検出限界（ＬＯＤ）プロットである。
【図８】図６に示す９６キャピラリー装置を用いたタンパク質分離及び内在性蛍光検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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