(57)【要約】  本発明は、感染性病原体並びに正常および異常遺伝子の迅速で自動的な検出アッセイを実施するための前記アッセイおよびキットに関する。本発明はさらに、本明細書に開示した増幅方法を用いた、ゲノムDNAおよび全ｍRNAの一般的な増幅方法並びに弁別的ｍRNA発現の分析方法に関する。
2005511030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むサンプル中の標的核酸を検出する方法：
（ａ）前記核酸と環状オリゴヌクレオチドプローブとを、前記標的核酸および前記環状オリゴヌクレオチドプローブ中の相補性配列間でハイブリダイゼーションが許容される条件下で接触させ；
（ｂ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対を添加し、ここで
（i）前記プライマー対の第一のプライマーは（Ａ）前記環状プローブと相補的な第一の配列、（Ｂ）前記プライマー対の第二のプライマーと相補的な第二の配列、および（Ｃ）シグナル発生部分を含み；
（ii）前記プライマー対の第二のプライマーは（Ａ）前記第一のプライマーと相補的な配列および（Ｂ）前記シグナル発生部分と隣接または接近して存在するとき前記シグナル発生部分の活性を停止、隠蔽または抑制することができる部分を含み；さらに
（iii）前記第一のプライマーおよび第二のプライマーが互いに結合するとき前記シグナルが抑制され；
（ｃ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに
（ｄ）前記環状プローブを増幅し、さらに前記シグナル発生部分および前記停止、隠蔽または抑制部分を分離してそれによってシグナルを発生させ、ここでシグナルの検出が、サンプル中に前記標的核酸が存在することを示す。
【請求項２】
前記環状オリゴヌクレオチドプローブが、直鎖状オリゴヌクレオチドプローブの３’および５’末端が連結されることによって形成され、前記標的核酸および前記直鎖状オリゴヌクレオチドプローブ内の相補性配列間のハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的核酸内の隣接配列と相補的な３’および５’領域を含む請求項１の方法。
【請求項３】
前記シグナル発生部分が蛍光物質である請求項１の方法。
【請求項４】
前記シグナル発生部分が化学発光物質である請求項１の方法。
【請求項５】
前記シグナル発生部分が酵素または酵素基質である請求項１の方法。
【請求項６】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAMおよびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項１の方法。
【請求項７】
前記増幅方法がRAMである請求項６の方法。
【請求項８】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸の存在を検出する方法：
（ａ）前記核酸とハイブリダイゼーションプローブ／環状プローブ複合体とを接触させ、ここで前記複合体は以下を含み：
（i）前記標的核酸と相補的な領域およびリガンドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ；
（ii）リガンドを含む環状プローブ；および
（iii）リガンド結合部分、ここで前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブおよび前記環状プローブは互いに結合し；
（ｂ）DNAポリメラーゼおよび前記環状プローブと結合するプライマーを添加し；
（ｃ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが修飾され、標識され、または変更される請求項８の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが前記一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの５’または３’末端に結合される請求項８の方法。
【請求項１１】
前記リガンドが前記一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに組み込まれる請求項８の方法。
【請求項１２】
前記リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項８の方法。
【請求項１３】
前記リガンド結合部分が、ストレプトアビジン、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項８の方法。
【請求項１４】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項８の方法。
【請求項１５】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項14の方法。
【請求項１６】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項８の方法。
【請求項１７】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項８の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが標識される請求項９の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸の存在を検出する方法：
（ａ）前記核酸とハイブリダイゼーションプローブ−プライマー／環状プローブ複合体とを接触させ、ここで前記複合体は、（i）リガンドおよび前記ハイブリダイゼーションプローブ−プライマー相補性領域を含む環状プローブ、（ii）前記標的核酸に相補的な領域および前記環状プローブに相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ−プライマー、および（iii）リガンド結合部分を含み、ここで前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ−プライマーおよび環状プローブは互いに結合し；
（ｂ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに
（ｃ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中の標的核酸が存在することを示す。
【請求項２０】
前記リガンドが一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに組み込まれる請求項19の方法。
【請求項２１】
前記リガンドが前記一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの５’または３’末端と結合される請求項19の方法。
【請求項２２】
前記リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項19の方法。
【請求項２３】
前記リガンド結合部分が、ストレプトアビジン、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項19の方法。
【請求項２４】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項19の方法。
【請求項２５】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項24の方法。
【請求項２６】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項19の方法。
【請求項２７】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項19の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸をin situで検出する方法：
（ａ）リガンド結合部分および前記標的核酸内の配列に相補的な領域を含む環状オリゴヌクレオチドプローブをリガンド含有マトリックスに添加し、それによって前記リガンドとリガンド結合部分との間で複合体を前記マトリックス内に形成し；
（ｂ）工程（ａ）の複合体に前記標的核酸を添加し、それによって前記標的核酸と前記環状オリゴヌクレオチドプローブとの間で複合体を形成し；
（ｃ）DNAポリメラーゼおよび前記環状プローブと結合するプライマーを添加し；さらに、
（ｄ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【請求項２９】
前記環状オリゴヌクレオチドプローブが、直鎖状オリゴヌクレオチドプローブの３’および５’末端を連結することによって形成され、前記標的核酸および前記直鎖状オリゴヌクレオチドプローブ内の相補性配列間でハイブリダイゼーションが許容される条件下で標的核酸内の隣接配列と相補的な３’および５’領域を含む請求項28の方法。
【請求項３０】
前記リガンドが、ビオチン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項28の方法。
【請求項３１】
前記リガンド結合部分が、ストレプトアビジン、アビジン、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項28の方法。
【請求項３２】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項28の方法。
【請求項３３】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項32の方法。
【請求項３４】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項28の方法。
【請求項３５】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項28の方法。
【請求項３６】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸をin situで検出する方法：
（ａ）ハイブリダイゼーションプローブを固体担体に付着させ；
（ｂ）前記固体担体にマトリックスを添加し；
（ｃ）環状オリゴヌクレオチドプローブを前記マトリックスに添加し、ここで前記環状オリゴヌクレオチドプローブは、（i）前記ハイブリダイゼーションプローブと相補的な配列および（ii）前記標的核酸内の配列と相補的な領域を含み、それによって前記ハイブリダイゼーションプローブと前記環状オリゴヌクレオチドプローブ間で複合体を前記マトリックス内に形成し；
（ｄ）前記標的核酸を前記マトリックスに添加し、それによって前記標的核酸と前記環状オリゴヌクレオチドプローブ間で複合体を形成し；
（ｅ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに、
（ｆ）前記環状プローブを増幅し、ここで環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【請求項３７】
前記環状オリゴヌクレオチドプローブが、直鎖状オリゴヌクレオチドプローブの３’および５’末端を連結することによって形成され、前記標的核酸および前記直鎖状オリゴヌクレオチドプローブ内の相補性配列間でハイブリダイゼーションが許容される条件下で標的核酸中の隣接配列と相補的な３’および５’領域を含む請求項36の方法。
【請求項３８】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項37の方法。
【請求項３９】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項38の方法。
【請求項４０】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項37の方法。
【請求項４１】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項37の方法。
【請求項４２】
以下の工程を含むサンプル中の標的ポリペプチドをin situで検出する方法：
（ａ）前記ポリペプチドをマトリックス内に包埋し；
（ｂ）核酸分子を含む結合パートナーを前記マトリックスに添加し、ここで前記結合パートナーは前記ポリペプチドに対して親和性を有し；
（ｃ）DNAポリメラーゼおよび前記核酸と結合するプライマーを添加し；さらに、
（ｄ）前記核酸を増幅し、ここで前記核酸分子の増幅の検出が、サンプル中に標的ポリペプチドが存在することを示す。
【請求項４３】
前記核酸が環状プローブである請求項42の方法。
【請求項４４】
前記核酸が、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項42の方法。
【請求項４５】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはプライマー伸長である請求項44の方法。
【請求項４６】
前記核酸が標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項42の方法。
【請求項４７】
前記核酸がHSAMを介して直接検出される請求項42の方法。
【請求項４８】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸を検出する方法：
（ａ）前記核酸とハイブリダイゼーションプローブとを接触させ、ここで前記ハイブリダイゼーションプローブは、（i）前記標的核酸と相補的な領域および（ii）環状プローブと相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含み；
（ｂ）工程（ａ）で形成された複合体を前記環状プローブと接触させ、ここで前記環状プローブは、（i）前記標的核酸と相補的な領域および（ii）前記ハイブリダイゼーションプローブと相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、前記ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸の存在下で前記環状プローブの増幅のためのプライマーとして機能し；
（ｃ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに、
（ｄ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【請求項４９】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項48の方法。
【請求項５０】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項49の方法。
【請求項５１】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項48の方法。
【請求項５２】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項48の方法。
【請求項５３】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸を検出する方法：
（ａ）前記標的核酸と固体担体に連結された第一のハイブリダイゼーションプローブとを接触させ、ここで前記ハイブリダイゼーションプローブは、前記標的核酸と相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含み；
（ｂ）前記標的核酸と第二のハイブリダイゼーションプローブとを接触させ、ここで前記第二のハイブリダイゼーションプローブは、そのうちの１つが前記標的核酸と相補的であり、他の１つが環状プローブと相補的である２つの領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、前記環状プローブは第二のハイブリダイゼーションプローブと相補的な領域を有し；
（ｃ）前記環状プローブを添加し、ここで前記標的核酸の存在下で前記第一のハイブリダイゼーションプローブおよび第二のハイブリダイゼーションプローブは互いに隣接し；
（ｄ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに、
（ｅ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【請求項５４】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項53の方法。
【請求項５５】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項54の方法。
【請求項５６】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項53の方法。
【請求項５７】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項53の方法。
【請求項５８】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）前記標的核酸と配列が相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブ；
（ｂ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対、ここで
（i）前記第一のプライマーは（Ａ）前記オリゴヌクレオチドプローブと相補的な第一の配列、（Ｂ）前記プライマー対の第二のプライマーと相補的な第二の配列、および（Ｃ）シグナル発生部分を含み；
（ii）前記プライマー対の第二のプライマーは（Ａ）前記第一のプライマーと相補的な配列および（Ｂ）前記シグナル発生部分と隣接または接近して存在するとき前記シグナル発生部分の活性を停止、隠蔽または抑制することができる部分を含み；さらに
（iii）前記第一のプライマーおよび第二のプライマーが互いに結合するとき前記シグナルが抑制される。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸と配列が相補的な領域を含む環状オリゴヌクレオチドプローブを含む請求項58のキット。
【請求項６０】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸の隣接する配列と相補的な３’および５’領域を含む直鎖状オリゴヌクレオチドプローブを含み、さらに連結物質で前記３’および５’領域が連結されたとき前記環状オリゴヌクレオチドプローブが形成される請求項58のキット。
【請求項６１】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）前記標的核酸と相補的な領域およびリガンドを含む一本鎖のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ；
（ｂ）リガンドを含む環状プローブ；
（ｃ）リガンド結合部分；および
（ｄ）前記環状プローブと結合するプライマー。
【請求項６２】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）リガンドおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ−プライマーと相補的な領域を含む環状プローブ；
（ｂ）前記標的核酸と相補的な領域および前記環状プローブと相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ−プライマー；および
（ｃ）リガンド結合部分；
ここで前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ−プライマーおよび環状プローブは互いに結合される。
【請求項６３】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）リガンド結合部分および前記標的核酸内の配列と相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブ；
（ｂ）リガンドを含むマトリックス；および
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドプローブと結合するプライマー。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸と配列が相補的な領域を含む環状オリゴヌクレオチドプローブを含む請求項63のキット。
【請求項６５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸中の隣接する配列と相補的な３’および５’領域を含む直鎖状オリゴヌクレオチドプローブを含み、さらに連結物質で前記３’および５’領域が連結されたとき前記環状オリゴヌクレオチドプローブが形成される請求項63のキット。
【請求項６６】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）固体担体に付着させたハイブリダイゼーションプローブ；
（ｂ）マトリックス；
（ｃ）オリゴヌクレオチドプローブ、ここで前記プローブは（i）前記ハイブリダイゼーションプローブと相補的な配列、および（ii）前記標的核酸内の配列と相補的な領域を含む。
【請求項６７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが環状オリゴヌクレオチドプローブを含む請求項66のキット。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸内の隣接する配列と相補的な３’および５’領域を含む直鎖状オリゴヌクレオチドプローブを含み、さらに連結物質で前記３’および５’領域が連結されたとき前記環状オリゴヌクレオチドプローブが形成される請求項66のキット。
【請求項６９】
以下を含む標的核酸検出用キット：
（ａ）前記標的核酸と相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、固体担体に連結された第一のハイブリダイゼーションプローブ；
（ｂ）そのうちの１つが前記標的核酸と相補的であり、他の１つが環状プローブと相補的である２つの領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む第二のハイブリダイゼーションプローブ；
（ｃ）前記第二のハイブリダイゼーションプローブと相補的な領域を有する前記環状プローブ。
【請求項７０】
以下の工程を含むサンプル中の標的タンパク質の存在を検出する方法：
（ａ）前記タンパク質と抗体／アンカーオリゴヌクレオチド複合体とを接触させ、ここで前記複合体は（i）前記標的タンパク質と特異的に結合する抗体、および（ii）リガンドを含む一本鎖のアンカーオリゴヌクレオチドを含み；
（ｂ）リガンドを含む環状プローブを添加し；
（ｃ）リガンド結合部分を添加し、ここで前記アンカーオリゴヌクレオチドおよび前記環状プローブは互いに結合し；
（ｄ）DNAポリメラーゼおよび前記環状プローブと結合するプライマーを添加し；
（ｅ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的タンパク質が存在することを示す。
【請求項７１】
前記アンカーオリゴヌクレオチドが修飾、標識または改変される請求項70の方法。
【請求項７２】
前記リガンドが前記一本鎖アンカーオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合される請求項70の方法。
【請求項７３】
前記リガンドが前記一本鎖アンカーオリゴヌクレオチドに組み込まれる請求項70の方法。
【請求項７４】
前記リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項70の方法。
【請求項７５】
前記リガンド結合部分が、ストレプトアビジン、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項70の方法。
【請求項７６】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項70の方法。
【請求項７７】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項76の方法。
【請求項７８】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項70の方法。
【請求項７９】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項70の方法。
【請求項８０】
前記アンカーオリゴヌクレオチドが標識される請求項71の方法。
【請求項８１】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸タンパク質の存在を検出する方法：
（ａ）前記タンパク質と抗体／アンカーオリゴヌクレオチド複合体とを接触させ、ここで前記複合体は、（i）前記標的タンパク質と特異的に結合する抗体、および（ii）環状プローブに相補的な領域およびリガンドを含む一本鎖アンカーオリゴヌクレオチドを含み；
（ｂ）リガンドおよびアンカーオリゴヌクレオチドと相補的な領域を含む環状プローブを添加し；
（ｃ）リガンド結合部分を添加し、ここで前記アンカーオリゴヌクレオチドおよび前記環状プローブは互いに結合し；
（ｄ）DNAポリメラーゼを添加し；
（ｅ）前記環状プローブを増幅し、ここで前記環状プローブの増幅の検出が、サンプル中に標的タンパク質が存在することを示す。
【請求項８２】
前記リガンドが前記一本鎖アンカーオリゴヌクレオチドに組み込まれる請求項81の方法。
【請求項８３】
前記リガンドが前記一本鎖アンカーオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合される請求項81の方法。
【請求項８４】
前記リガンドが、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項81の方法。
【請求項８５】
前記リガンド結合部分が、ストレプトアビジン、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドから成る群から選択される請求項81の方法。
【請求項８６】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAM、ローリングサークル増幅およびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項81の方法。
【請求項８７】
前記増幅方法がローリングサークル増幅またはRAMである請求項86の方法。
【請求項８８】
前記環状プローブが標識ヌクレオチドの存在下で増幅される請求項81の方法。
【請求項８９】
前記環状プローブがHSAMを介して直接検出される請求項81の方法。
【請求項９０】
以下の工程を含むサンプル中の標的核酸を検出する方法：
（ａ）前記標的核酸およびオリゴヌクレオチドプライマー対中の相補的な配列間でハイブリダイゼーションが許容される条件下で、前記核酸と前記オリゴヌクレオチドプライマー対とを接触させ；
（ｂ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマー対を添加し、ここで
（i）前記プライマー対の第一のプライマーは、（Ａ）前記標的核酸と相補的である第一の配列、（Ｂ）前記プライマー対の第二のプライマーと相補的である第二の配列、および（Ｃ）シグナル発生部分を含み；
（ii）前記プライマー対の第二のプライマーは、（Ａ）前記第一のプライマーと相補的な配列および（Ｂ）前記シグナル発生部分と隣接または接近して存在するとき前記シグナル発生部分の活性を停止、隠蔽または抑制することができる部分を含み；さらに
（iii）前記第一のプライマーおよび第二のプライマーが互いに結合するとき前記シグナルが抑制され；
（ｃ）前記標的核酸と相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーを添加し；
（ｄ）DNAポリメラーゼを添加し；さらに
（ｅ）前記標的核酸を増幅し、さらに前記シグナル発生部分および前記停止、隠蔽または抑制部分を分離してそれによってシグナルを発生させ、ここでシグナルの検出が、サンプル中に前記標的核酸が存在することを示す。
【請求項９１】
前記シグナル発生部分が蛍光物質である請求項90の方法。
【請求項９２】
前記シグナル発生部分が化学発光物質である請求項90の方法。
【請求項９６】
前記シグナル発生部分が酵素または酵素基質である請求項90の方法。
【請求項９７】
前記環状プローブが、ポリメラーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、転写仲介増幅、RAMおよびプライマー伸長から成る群から選択される増幅方法を用いて増幅される請求項90の方法。
【請求項９８】
前記増幅方法がポリメラーゼ連鎖反応である請求項97の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、感染性病原体並びに正常および異常遺伝子の迅速な自動検出のためのアッセイを実施するアッセイおよびキットに関する。本発明はさらに、本明細書に開示した方法を用いて、ゲノムDNAおよび全ｍRNAの一般的増幅方法および種々のｍRNAの発現を分析する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
感染性病原体（例えばウイルス、細菌およびカビ）の迅速で正確な検出並びに正常および異常な遺伝子の検出の要求に応えるために、多くの技術が最近開発された。そのような技術（一般的にはテストサンプル中に存在する微量の標的核酸（DNAまたはRNA）の増幅を必要とする）にはとりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiki et al., Science 230:1350, 1985; Saiki et al., Science 239:487, 1988; PCR Technology, Henry A. Erlich, ed., Stockton Press, 1989; Patterson et al., Science 260:976, 1993）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189, 1991）、鎖置換増幅（SDA）（Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691, 1992）、Qβレプリカーゼ増幅（QβRA）（Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11769, 1992; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826, 1989）および自己維持複製（3SR）（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878, 1990）が含まれる。これらの技術はいずれもサンプル中に存在する微量の標的核酸を検出および特定する強力なツールであるが、前記技術はいずれも種々の問題を抱え、日常的な診断技術として使用される臨床検査室設定でのそれら技術の普遍的な応用の妨げとなっている。
【０００３】
もっとも困難な問題の１つは、標的核酸の増幅および検出を実施する前の標的核酸の調製である。標的核酸調製プロセスは多大な時間と労力を要し、したがって迅速で正確な結果が要求される臨床検査では一般的に不向きである。また別の問題（特にPCRおよびSDAについて）は、その後の検出および場合によって定量のための標的核酸の増幅条件が各検査で変動すること、すなわち検査の標準化を容易にする一定の条件が存在しないということである。後者の問題は、競合PCRによる標的核酸の定量の場合、および多種の標的核酸の同時検出に際して特に重大である。
上述の問題を回避するために、前記の種々の技術を利用した迅速な標準化アッセイの開発が検討されるであろう。前記標準化アッセイは、患者サンプル中の病原性微生物およびウイルスを検出する臨床検査室設定だけでなく疫学的研究の実施に特に有用であろう。そのような微生物はヒトの健康の主要な脅威となる感染性疾患をひき起こす。したがって、伝染病の病原体に特異的な標的核酸の迅速で鋭敏な特定を基本とする標準化された自動分析技術およびキットの開発は、細菌およびウイルスの免疫学的検出または培養による検出を必要とする技術よりも利点を提供するであろう。
試薬は特定の生物または一連の関連生物に特異的であるようにデザインすることができる。これらの試薬を用いて、種々の抗生物質に対する耐性および疾患をひき起こす毒性因子を付与する微生物の遺伝子を直接アッセイすることができる。迅速で標準化された分析技術の開発は適切な処置の選択を促進するであろう。
【０００４】
いくつかの事例、例えば初期スクリーニングでは、中等度の感度（ただし高い特異性）をもつアッセイで十分であろう。他の事例では高い感度（同様に高い特異性）が要求される。例えば感染血におけるHIVゲノムの検出では、10から100,000個のヒトゲノム同等物につき１個の割合でサンプルに存在するウイルス核酸配列の検出が要求される（Harper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:772,1986）。
血液の汚染（とりわけHIV、HTLV-I、B型肝炎およびC型肝炎を含む）は輸血患者にとって重大な脅威であり、そのような病原体の迅速で鋭敏な検出のためにこれら病原体の核酸が中心的に関与するルーチンな診断検査の開発は臨床診断検査室で大きな利点を有するであろう。例えば、HIVゲノムは、遊離ウイルス粒子を示すRNA分子として、または組み込まれたプロウイルスを示すDNA分子としてPCR技術を用いて血液サンプルで検出することができる（Ou et al., Science 239:295, 1988; Murakawa et al., DNA 7:287, 1988）。
さらにまた、古典的培養技術を用いる疫学的研究によって、播種性鳥型喀痰型結核菌（Mycobacterium aviun-intracellulaire; MAI）感染は小児および成人の後天的免疫不全症候群（AIDS）の後期合併症であることが示された。しかしながら結核菌検出のための従来の培養方法は面倒で時間がかかり、さらに感度に問題があるので、上記の問題の正確な程度は明らかではない。したがって、MAI検出のための迅速で鋭敏な特異性を有する技術を考案することは、HIV感染個体および他の免疫抑制個体での中心的関与像を明らかにするために望ましく、かつ極めて有益であろう。そのような研究には、標的核酸の検出が基本である分子生物学的な方法が必要とされるであろう（分子生物学的方法は標準的な培養系よりも感度が高いことはこれまで日常的に示されてきた（Boddinghaus et al., J. Clin. Med. 28:1751, 1990））。
【０００５】
そのような技術の他の応用には、ただ１つの遺伝子による個体または集団の遺伝疾患の検出および性状決定が含まれる（例えば以下を参照されたい：Landergren et al., Science 241:1077, 1988：前記文献は点変異を含むただ１つの遺伝子欠損を検出する連結技術を開示する）。そのような技術は、疾患をもたらすただ１つのヌクレオチドの相違（点変異）（例えば鎌状血球貧血）の他に、欠損を有するかまたは二重に複製されている遺伝配列（例えばサラセミア）を明瞭に識別することができるはずである。
上記で述べた方法は、記載したように、ルーチンな診断並びに感染性疾患および遺伝的異常の疫学的研究のためにそれらを臨床検査室で使用することを困難にする欠点をもつ比較的複雑な方法である。これまでに述べた方法のいずれも検出されるべき標的核酸の増幅を必要とする。増幅鋳型（例えばその検出が測定される特異的標的核酸）および条件の可変性と同様に標的核酸の調製のために要求される多大な時間および労力のために、そのような方法は臨床検査室設定で要求される標準化および自動化に不適切である。
本発明は、病原生物の検出およびモニタリング並びに個体の異常な遺伝子の検出に有用な迅速で鋭敏なアッセイを目的とする。さらにまた、本発明の方法は臨床検査室設定で使用するために容易に標準化および自動化することができる。
【０００６】
発明の要旨
感染性疾患を有する患者のサンプル中の病原微生物に由来する核酸の迅速で鋭敏な標準化された検出および定量を可能にする改善された方法がここに開発された。本改善方法はまた、遺伝性疾患または腫瘍形成をもつ患者のサンプル中の核酸に存在する遺伝的変種の迅速で鋭敏な検出および定量を可能にする。
本方法は従来の方法よりいくつかの利点を提供する。本方法は標的核酸の単離方法を単純化し、前記方法は所望の場合マイクロ試験管、マイクロチップまたはマイクロウェルプレートで実施することができる。本方法は、問題の標的核酸配列に対応する核酸配列を同じサンプル容器（例えば試験管またはマイクロウェルプレート）で単離、増幅および検出することを可能にする。
本発明のまた別の特徴では、本明細書に記載する技術は、ゲルマトリックスまたはスライド様式を用いて単一細胞レベルで特異的な遺伝子またはマーカーの検出に用いることができる。単一細胞での核酸配列のin situ増幅および検出は、半固形ゲルマトリックスに包埋した細胞を用いて実施することができる。そのような方法を用いて単一細胞（例えば腫瘍細胞）内の変異を検出するか、または単一細胞（例えば胚細胞）内の染色体異常を検出することができ。
【０００７】
本方法はまた条件の標準化を可能にする。なぜならば多様な標的核酸を検出するために、本方法では包括的な一対の増幅プローブのみを使用し、したがって効率的な多重増幅を可能にするからである。本方法はまた、DNA鋳型の製造を必要としないプローブ増幅によってRNAの直接検出を可能にする。本増幅プローブ（本方法では末端と末端を共有結合によって連結することができる）は、連続して連結された増幅配列を形成する。増幅可能なDNAの連結によるアッセンブリーによって特異性が高まり、標的内のただ１つの変異の検出が可能になる。標的核酸ではなくこの連結増幅配列が直接検出されるか、または増幅され、種々の異なる感染性病原体について実質的に同じ増幅条件を使用することを可能にし、したがってより管理された一定の結果が得られる。さらにまた、開示した本発明の多重増幅方法を用いて単一サンプル中の多種の感染性病原体を検出することができる。
本発明のさらに別の利点には、開示した本方法のプロトコルは自動化することができること（これは特に臨床検査室でのルチーンアッセイで重要である）、および多様な核酸増幅系（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）および自己維持複製（３SR））を利用することができることが含まれる。
本発明の方法は常磁性粒子またはビーズを用いる磁性分離技術を含み、それら粒子またはビーズは、潜在する病原体の検出を促進するために、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ上のリガンドを認識しこれと結合して、例えば疑いをもたれている微生物または遺伝子異常を含む臨床標本サンプルから標的核酸（DNAまたはRNA）を単離するリガンド結合部分で被覆されている。
【０００８】
本発明のある特徴では、標的核酸は１対の非オーバーラップオリゴヌクレオチド増幅プローブとリガンド結合部分（例えばストレプトアビジン）で被覆された常磁性ビーズの存在下でハイブリダイズされ、複合体を形成する。これらのプローブはそれぞれ捕捉／増幅プローブと称される。捕捉／増幅プローブはリガンド（例えばビオチン）を含み、前記は常磁性ビーズ上のリガンド結合部分を認識しこれと結合する。前記プローブは、各々が包括的配列（すなわち標的核酸特異的ではない）および標的核酸中のヌクレオチド配列と相補的な特異的配列を含むようにデザインされる。前記プローブの特異的配列は標的核酸の隣接領域と相補的で、したがって互いにオーバーラップしない。続いて、連結剤を用いて前記２つのプローブを結合させ、連続して連結された増幅配列を形成する。前記連結剤は酵素（例えばDNAリガーゼ）または化学物質であろう。サンプル中の未結合反応物質および他の物質を洗浄して除去した後、最初のサンプルに存在する標的核酸の検出は前記連結増幅配列の検出によって決定される。連結増幅配列は、十分な量（例えば106−197分子）の標的核酸が最初のサンプルに存在する場合は直接検出することができる。十分な量の標的核酸がサンプル中に存在しない場合（＜106分子）、前記連結増幅配列（標的核酸ではない）は、検出のために適切な増幅技術（例えばPCR）を用いて増幅することができる。また別には、捕捉および増幅機能を分離した別個のプローブによって実施してもよい。例えば、２つの増幅プローブを連結して増幅されるべき連続配列を形成してもよい。この技術では連結されていないプローブは標的核酸と同様に増幅されない。また別の選択肢は、その３’および５’末端が並列するように標的とハイブリダイズする単一増幅プローブである。続いて前記末端はDNAリガーゼによって連結され、共有結合によって連結された環状プローブが形成される。前記プローブは増幅によって特定することができる。
【０００９】
本発明はさらに、細胞内で発現されるゲノムDNAまたはｍRNAの全てを普遍的に増幅する方法を提供する。そのような方法を使用することによって、少数の細胞に由来するDNAおよび／またはｍRNAの量を増加させる手段が提供される。続いて、感染性病原体の検出並びに正常および異常遺伝子検出のために開発された技術でそのような増幅DNAおよび／またはｍRNAを用いることができる。
さらにまた、本発明は、種々の細胞タイプ内で弁別的に発現されるｍRNAを特定する、新規な弁別ディスプレー連結依存RAM法を提供する。
さらに本発明は、捕捉／増幅プローブが抗体と結合するようにデザインすることができる方法を提供する。例えば、一方の抗体を捕捉／増幅プローブと結合させ、他方の抗体を標的配列に結合させることができる。この事例では、両抗体が同じ抗原に結合した場合にのみ連結が生じるであろう。この技術は液相RAM反応で、またはin situ固相RAM反応でELISAのために用いることができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、テストサンプル中の病原性微生物の検出およびモニターの他に、個体の異常な遺伝子を検出するために臨床アッセイで使用する単純化されたサンプル調製および包括的増幅系を目的とする。サンプル中の核酸を検出および測定するために磁性分離技術と連結／増幅技術とを組み合せた包括的増幅系が臨床で使用するために開示される。前記分離技術はほとんどの増幅系（とりわけPCR、LCRおよびSDA増幅技術）と組み合わせることができる。本発明はさらに、分枝伸長増幅方法（ramification-extension amplification method; RAM）およびハイブリダイゼーションシグナル増幅（HSAM）と称される、また別の本発明の方法で有用な増幅系を提供する。本発明の利点には、（１）臨床検査室設定に適している、（２）管理された一定の（標準化が可能な）結果を得ることができる、（３）個々のサンプルで核酸を定量できる、（４）テストサンプルで多種多様の標的核酸を同時に検出および定量できる、（５）血清サンプル中およびin situで核酸を鋭敏に効果的に検出することができる、および（６）標的内の単変異を検出できることが含まれる。さらにまた、本発明で開示する方法の完全なプロトコルは容易に自動化することができ、臨床検査室設定でルーチンな診断検査として本方法を有用なものにする。RAMおよびHSAMを用いることにより、等温増幅を実施することができる。
【００１１】
本発明は磁性分離を取り入れ、前記分離は、リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子、ビーズまたは球体を利用する。前記リガンド結合部分は、下記で述べるオリゴヌクレオチド捕捉プローブ上に存在するリガンドを認識しこれと結合して、臨床サンプルから標的核酸（DNAまたはRNA）を単離し、標的核酸の検出を容易にする。
磁性分離は、サンプルから標的核酸（RNAまたはDNA）を単離するためにリガンド結合部分で被覆された常磁性粒子またはビーズを用いるシステムである（Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826,1989）。この方法の重要な基本は、リガンドを含む捕捉プローブと標的核酸との間で前記プローブと標的間に存在する特異的な相補性配列によりハイブリッドが形成されることである。ハイブリダイゼーションは適切なカオトロピズム誘発物質（例えばチオシアン酸グアニジン、GnSCN）の存在下で実施される（前記物質は標的核酸内の相補性配列とプローブとの特異的な結合を促進する）。続いて、前記捕捉プローブ上のリガンドと前記ビーズ上のリガンド結合部分との特異的な結合により上記のようにして形成されたハイブリッドを前記常磁性ビーズ上で捕捉する。
本明細書で用いられる“リガンド”という用語は、本明細書で“リガンド結合部分”と称されるもう１つの成分に対して親和性を有する任意の成分を指す。リガンドとリガンド結合部分との結合によって前記２つの成分間でアフィニティーペアが形成される。例えばそのようなアフィニティーペアにはとりわけ、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン、抗体と抗原またはハプテン、チオ基と重金属誘導体、ポリｄCと種々のポリヌクレオチド（たとえばホモポリヌクレオチド）、ポリｄTとポリｄAおよびポリｄUとポリｄAが含まれる。互いに強い親和性を有する任意の成分対をアフィニティーペア、リガンド−リガンド結合部分として用いることができる。適切なアフィニティーペアはまた免疫学的方法で用いられるリガンドおよび共役物で見出される。本発明で使用される好ましいリガンド−リガンド結合部分はビオチン／ストレプトアビジンのアフィニティーペアである。
【００１２】
ある特徴では、本発明は図１に示したように標的核酸の捕捉および検出を提供する（図１は標的核酸の捕捉および検出の模式図を提供する）。リガンド結合部分（ｂ）で被覆された磁性ビーズまたは粒子（ａ）の存在下で、標的核酸は、１対のオリゴヌクレオチド増幅プローブ（すなわち第一のヌクレオチドプローブ（捕捉／増幅プローブとも称される）および第二のヌクレオチドプローブ（増幅プローブとも称される））と同時にハイブリダイズされる。前記オリゴヌクレオチド対は、図１でそれぞれ捕捉／Amp-プローブ１（ｄおよびｅ）およびAmp-プローブ２（ｆおよびｇ）として示されている。前記プローブはオリゴデオキシリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド分子のいずれかで、その後の増幅方法に応じて分子タイプが選択される。本明細書で“プローブ”とは一般に多種プローブコピーを指す。
捕捉／増幅プローブは包括的３’ヌクレオチド配列（ｄ）（すなわち分析される特定の標的核酸に対して特異的ではない）をもつようにデザインされ、したがって多様な標的について用いることができる。換言すれば、第一のプローブの３’配列は標的核酸のヌクレオチド配列と相補的でもなく、ハイブリダイズすることもできない。前記捕捉／増幅プローブの５’部分（ｅ）は、特定の標的核酸のヌクレオチド配列部分と相補的で前記とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、病原微生物およびウイルスに関して使用する場合、前記捕捉／増幅プローブは、その３’包括的配列（ｄ）が全ての系について同じで、その５’特異的配列（ｅ）が微生物の個々の種もしくは亜種または異常遺伝子（例えば嚢胞性線維症または鎌状赤血球貧血の原因遺伝子）の標的核酸と特異的に相補性を示すように合成される。ある種の事例では、前記捕捉／増幅プローブの５’特異的部分は、個々の微生物株の標的核酸のヌクレオチド配列に特異的に相補性を示す。捕捉／増幅プローブ１はさらにリガンド（ｃ）をプローブ（ｄ）の３’末端に含み、前記リガンドは、前記常磁性ビーズ（ａ）上に被覆された前記リガンド結合部分（ｂ）によって認識され前記と結合する。
【００１３】
第二のプローブまたは増幅プローブ（すなわち図１のAmp-プローブ２）は、捕捉／Amp-プローブ１の５’末端とハイブリダイズする標的配列のすぐ隣の（ただしオーバーラップしない）標的核酸のヌクレオチド配列の１つの部分と相補的であり、これとハイブリダイズする３’配列（ｆ）を含む。Amp-プローブ２はまた５’包括的配列（ｇ）を含み、前記配列は標的核酸と相補的ではなくハイブリダイズもしない。場合によって前記５’包括的配列に標識またはシグナル発生部分（＊＊＊）がその５’末端に結合される。そのようなシグナル発生部分には、とりわけ放射性同位元素（例えば32Ｐまたは3Ｈ）、蛍光分子（例えばフルオレセイン）および発色分子または酵素（例えばペルオキシダーゼ）が含まれる。そのような標識は標的核酸の直接検出のために用いられ、検出工程で標的核酸に結合したAmp-プローブ２の存在を検出する。32Ｐは放射性同位元素計測または電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーによる検出分析の場合に好ましい。発色物質は、例えば酵素結合発色アッセイによる検出分析の場合に好ましい。
常磁性ビーズ上のリガンド結合部分の捕捉／増幅プローブ上のリガンドに対する親和性の結果として、標的核酸は、プローブの特定の５’部分とハイブリダイズした標的核酸は常磁性ビーズによって捕捉される。さらにまた、Amp-プローブ２（前記もまた標的核酸とハイブリダイズする）はまた前記常磁性ビーズによって捕捉される。
【００１４】
標的核酸および２つのハイブリダイズしたプローブが常磁性ビーズ上に捕捉された後、連結物質を用いて前記プローブを（図１で垂直な矢印で示した部位で）一つに連結して連続した一本鎖オリゴヌクレオチド分子（ここでは連結増幅配列と呼ぶ）を形成する。前記連結物質は酵素（例えばDNAまたはRNAリガーゼ）、または化学結合物質（例えば臭化シアンまたはカルボジイミド）であろう（Sokolova et al., FEBS Lett. 232:153-155, 1988）。前記連結増幅配列は、標的核酸と相補的な連結増幅配列のこの領域（例えば図１の（ｅ）および（ｆ））で標的核酸（RNAまたはDNA）とハイブリダイズする。
標的核酸が十分な量（例えば106から107分子）でサンプル中に存在する場合は、標的核酸の検出は、前記連結増幅配列をさらに増幅させることなく、例えばAmp-プローブ２の５’末端に存在するオプションのシグナル発生部分の存在を検出することによって実施することができる。
サンプル中の標的核酸の量が上記のような直接検出には不十分（例えば106分子）である場合は、捕捉／Amp-プローブ１およびAmp-プローブ２の連結によって上記のように形成された連結増幅配列を下記に述べるように検出のために増幅させることができる。
【００１５】
また別には、１つのリガンドが５’末端に位置し、他は５’末端から約50ヌクレオチド下流に位置する２つのリガンド部分を含むように、捕捉／増幅プローブ（好ましくは長さが70から90ヌクレオチド）を合成してもよい。第二の環状プローブ（Amp-プローブ２と呼ぶ）もまた合成される。Amp-プローブ２のリンカー領域はヌクレオチド１から50の間で捕捉／プライマーと相補的である。このアッセイ系では、捕捉／増幅プローブは、リガンド／リガンド結合反応により、支持マトリックスに結合させたリガンド結合部分と結合することができる。リガンドにはビオチン、抗原、抗体、重金属誘導体およびポリヌクレオチドが含まれる。リガンド結合部分には、ストレプトアビジン、アビジン、抗体、抗原、チオ基およびポリヌクレオチドが含まれる。指示マトリックスには例えば磁性ビーズが含まれるが、他のタイプの支持体（スライドまたはマイクロタイタープレートを含むがただしこれらに限定されない）も用いることができる。Amp-プローブ２は相補的領域を介して捕捉／増幅プローブと結合するであろう。捕捉／増幅プローブの３’末端はループバックするようにデザインされ、Amp-プローブ２のリンカー領域の５’末端と結合し、伸長のためのプライマーとして機能する。最後に、標的は、例えば図28に示すように、相補性領域を介して前記Amp-プローブ２と結合し、それによってマトリックス（例えば磁性ビーズ）への捕捉が可能になる。連結によってAmp-プローブ２の３’および５’末端がつなぎ合わされ、共有結合によって連結された環状プローブが形成される。結合したプローブは大量のストリンジェントな洗浄を可能にし、それによって非特異的捕捉から生じるバックグラウンドが減少する。捕捉／増幅プローブからC-プローブに沿って伸長が進み、マルチユニットのssDNAが生じ、続いてこのssDNAは、プライマー伸長によるか、または上記のようにRAMプライマーの添加によってRAMによって増幅させることができる。アッセイの特異性をさらに高めるために、二重連結を実施してもよい。この場合２つのプローブ（各々は半分のAmp-プローブ２から成る）が用いられる。
さらに、捕捉／増幅プローブは抗体と結合するようにデザインしてもよい。上記に述べたAmp-プローブ２は捕捉／増幅プローブの捕捉領域に誘導されるであろう（図29）。連結させた後、プライマー伸長またはRAM反応を上記のように実施する。また別には、１つの抗体を捕捉／増幅プローブに付着させ、他方を標的配列に付着させることができる。この事例では、両抗体が同じ抗原に結合した場合にのみ連結が生じるであろう。この技術を液相RAM反応またはin situ固相RAM反応でELISAに用いてもよい。検出を目的とする場合は、FITC-標識dUTPまたはdig-標識dUTPを用いてRAM生成物を検出することができる。
【００１６】
また別には、連結増幅配列は、前記連結された配列の核酸を増幅することなくハイブリダイゼーションシグナル増幅方法（HSAM）を使用することにより検出することができる。HSAMは図10に示されている。HSAMの場合、標的特異的核酸プローブ（例えばAmp-プローブ２）はリガンドで内部標識されている。前記リガンドは、核酸プローブと結合し、さらにリガンド結合分子（少なくとも二価）に対して結合パートナーを提供することができる分子である。好ましい実施態様では、前記リガンドはビオチンまたは抗原、例えばジゴキシゲニンである。前記核酸プローブは当業界で公知の方法によってリガンドで標識することができる。好ましい実施態様では、前記プローブは約３から約10分子のリガンド（好ましくはビオチンまたはジゴキシゲニン）で標識される。捕捉プローブおよびリガンド標識した標的特異的プローブをサンプルに添加した後、得られた複合体を上記で述べたように洗浄し、連結物質を添加して上記のようにプローブを連結する。標的特異的プローブの捕捉プローブへの連結によって、ビーズ上に前記標的特異的プローブが保持されることになる。それと同時にまたはその後で過剰なリガンド結合部分を前記反応に添加する。リガンド結合部分はリガンドと結合し、前記とともにアフィニティーペアを形成する部分である。前記リガンド結合部分はリガンドに対して少なくとも二価である。好ましい実施態様では、前記リガンドはビオチンで、前記リガンド結合部分はストレプトアビジンである。別の好ましい実施態様では、リガンドは抗原で、リガンド結合部分は前記抗原に対する抗体である。連結物質およびリガンド結合分子の添加によって、捕捉プローブに共有結合した標的特異的プローブを含む、リガンド結合リガンド結合分子を有するリガンド標識−標的特異的プローブとの複合体が得られる。
【００１７】
続いてシグナルプローブを前記反応混合物に添加する。前記シグナルプローブは、リガンド結合分子と結合するリガンドで内部標識された包括的核酸である。好ましい実施態様では、前記リガンドは、前記標的特異的増幅プローブの標識に用いられたリガンドと同じものである。前記シグナルプローブは、標的核酸または他のプローブに対して相補的でなくこれらとハイブリダイズしない包括的配列を有する。好ましい実施態様では、前記シグナルプローブは約30から約100ヌクレオチドを含み、さらに約３から約10分子のリガンドを含む。
過剰なリガンド結合分子の存在下で前記複合体にシグナルプローブを添加することによって容易に検出できる大きな複合体が生成される。前記複合体のサイズは多価リガンド結合分子の結果により生じる。例えば、標的特異的増幅プローブのリガンドがビオチンであるとき、プローブ内のビオチン１分子につき１分子のストレプトアビジンが結合する。この結合ストレプトアビジンはさらに３つのビオチン分子と結合することができる。シグナルプローブが添加されると、シグナルプローブ上のビオチン分子は、増幅プローブに結合したストレプトアビジンの利用可能な結合部位に結合する。図10に模式的に示したようにクモの巣状の複合体が形成される。
上記で述べたように洗浄し、未結合のシグナルプローブおよびリガンド結合分子を除去した後、続いて複合体を検出する。複合体の検出は標的核酸の存在を示す。したがってHSAM法は核酸を増幅せずに標的核酸を検出することを可能にする。
【００１８】
前記複合体は当業界で公知であり、選択したリガンドとリガンド結合部分に適した方法によって検出することができる。例えば、リガンド結合部分がストレプトアビジンであるときは、前記複合体はストレプトアビジンの抗体を用い免疫アッセイによって検出できる。また別には、リガンド結合分子は、容易に検出できる共役結合物として本方法で利用することができる。例えば、リガンドを蛍光発光団または酵素（酵素結合発色アッセイで検出できる、例えばアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼ）と共役させることができる。例えば、リガンド結合分子はアルカリホスファターゼ共役結合ストレプトアビジンであってもよい。前記は発色性アルカリホスファターゼ基質（例えばニトロブルーテトラゾリウムクロリド）の添加によって検出することができる。
HSAM法はまた下記で述べる環状化することができる増幅プローブとともに用いることができる。この環状化可能増幅プローブは、標的核酸内の隣接する（ただし連続しない）配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができる３’および５’領域、並びに前記標的核酸と相補的でなくこれとハイブリダイズすることもできないリンカー領域を含む。前記環状化可能プローブが標的核酸と結合したとき、その３’および５’領域が並列状態で存在する。連結物質を添加することによる３’および５’領域の連結によって、前記標的核酸に結合した閉環状分子が生成される。続いてこの標的／プローブ複合体を十分に洗浄して未結合プローブを除去する。
【００１９】
HSAMの場合、リガンド分子は、環状化可能プローブのリンカー領域に例えばプローブ合成時に組み込まれる。続いて上記で述べさらに図15で示したようにリガンド結合分子およびシグナルプローブを添加して大きな複合体を形成し、洗浄しさらに複合体を検出することによってHSAMアッセイを実施する。核酸の検出方法は当業者には公知であり、それら方法には、例えば文献（Essers et al., (1980), J. Clin. Microbiol. 12:641）に記載されたようにラテックス凝集が含まれる。環状化可能プローブとHSAMとの併用は特にin situハイブリダイゼーションで有用である。
HSAMはまた抗体または抗原の検出に有用である。リガンド含有抗原または抗体は、それぞれ対応する抗体または抗原の結合に用いられる。洗浄した後、続いて過剰なリガンド結合分子をリガンド標識包括的核酸プローブとともに添加する。大きな複合体が生成され、上記で述べたように検出することができる。好ましい実施態様では、前記リガンドはビオチンであり、リガンド結合分子はストレプトアビジンである。ビオチン付加抗体およびビオチン付加シグナルプローブを用いHSAMを使用する抗原検出は図11に示されている。
【００２０】
本方法は、検査目的で採取したルーチンな臨床サンプルを用い臨床検査室で使用することができる。本方法で用いることができる臨床サンプルには、とりわけ全血、分離白血球、喀痰、尿、生検組織、喉頭ぬぐい液など（すなわち分析のために臨床検査室に通常送られる任意の患者サンプル）が含まれる。
本発明の連結依存増幅方法は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）標本で標的配列を検出するために特に有用であり、FFPE標本の標的RNAを検出するために実施される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）の従来の方法の欠点を解決する。RT-PCRは検出感度が変動し易く、おそらくホルマリン固定中に生じるRNA−RNAおよびRNA−タンパク質架橋形成によって逆転写酵素のプライマー伸長が妨げられるためであろう。本方法では、プローブは架橋にもかかわらず標的とハイブリダイズすることができ、逆転写は要求されず、標的配列ではなくプローブが増幅される。したがって、本発明の感度は架橋の存在によって減弱されない。RT-PCRと比較して本発明の利点は図12に模式的に示されている。
磁性分離およびサンプル中の標的核酸の標的依存検出についての一般的な略図を示す図２を参照すれば、この場合の本発明の特徴は以下の工程を含む：
（ａ）第一の工程は分析されるサンプル（例えば血清）中に存在する標的核酸の捕捉または単離である。マイクロウェルプレートで良好に実施できる分析に適したサンプルサイズは約100μLである。本発明によるサンプル分析にマイクロウェルプレートを使用することによって本方法の自動化が容易になる。疑われる病原微生物またはウイルスまたは異常遺伝子を含むサンプルを等容積の溶解緩衝液とともにインキュベートする。前記溶解緩衝液は、カオトロピズム誘発物質（すなわち化合物内の水素結合を破壊する物質）、安定化剤および洗剤を含み、サンプル中に存在する一切の核酸およびタンパク質を遊離させる。例えば、本発明で使用される適切な溶解緩衝液は、2.5から５Mのチオシアン酸グアニジン（GnSCN）、10％の硫酸デキストラン、100ｍMのEDTA、200ｍMのトリス-塩酸（pH8.0）および0.5％NP-40（ノニデットP-40、非イオン性洗剤、N-ラウロイルサルコシン、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。緩衝液中のGnSCN（カオトロピズム誘発物質）の濃度はまた前記微生物またはウイルスの病原性に必要なタンパク質および他の分子を変性させる効果を有する。このことは、病原体を含むサンプルのその後の操作の間に発生する可能性がある一切の不測の感染を予防するために有用である。
【００２１】
溶解緩衝液の処理と同時にまたは処理の前に、リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子またはビーズをサンプルに添加する。本方法で用いられる常磁性ビーズまたは粒子は酸化第二鉄粒子（一般的に直径が＜１μｍ）を含み、水素化ケイ素で被覆され高度に入り組んだ表面を有する。リガンド結合部分は前記水素化ケイ素と共有結合により連結される。常磁性粒子またはビーズはそれ自体磁性をもたず、一緒に凝集することはない。しかしながら磁場に置かれたときには、それらは磁気源に引き付けられる。したがって、磁性分離装置によって提供される強力な磁場の存在下に反応容器を置くことによって、常磁性粒子またはビーズは、それらに結合した一切のものとともに混合物の他の成分から分離することができる。そのような装置は、例えばプロメガ社（Promega Corporation）またはストラタジーン社（Stratagene, Inc.）から市販されている。
本発明の方法で使用できる適切な磁性ビーズは、ストレプトアビジン（ビオチンと結合する）で被覆されたものである。そのようなビーズはいくつかの供給元から市販されている。例えばストレプトアビジン＝マグネスフィア（Streptavidin MagneSphere（登録商標））はプロメガ社から、ストレプトアビジン＝マグネティックビーズ（Streptavidin-Magnetic Beads、 カタログ番号＃MBOO2）はアメリカンクォレックス（American Qualex, La Mirada, CA）から入手できる。
【００２２】
続いて、上記で述べたように一対のオリゴヌクレオチド増幅プローブを前記溶解サンプルおよび磁性ビーズに添加する。変型例として、プローブおよび磁性ビーズは同時に添加することができる。上記に述べたように、２つのオリゴヌクレオチドは、その３’末端にリガンドを含む第一のプローブまたは捕捉／増幅プローブ（図1では捕捉／Amp-プローブ1と称される）、および第二のプローブまたは増幅プローブ（図1ではAmp-プローブ２と称される）である。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズとともに使用する場合、第一のプローブは好ましくは３’ビオチン付加捕捉／増幅プローブである。
前記プローブは、公知の自動オリゴヌクレオチド合成技術によって、例えば核酸合成装置を用いる標準的リンアミダイト技術によりヌクレオシド三リン酸から合成することができる。そのような合成装置は例えばアプライドバイオシステムズ社（Applied Biosysytems, Inc., Foster City, CA）から入手できる。
各オリゴヌクレオチドプローブは長さが約40から200ヌクレオチド、好ましくは約50から100ヌクレオチドであり、プローブの連結後に、長さが約80から400ヌクレオチド、好ましくは100から200ヌクレオチドの連結増幅配列（PCR、QβレプリカーゼまたはSDA反応による増幅に適している）を提供する。
【００２３】
前記プローブの標的核酸特異的部分（すなわち標的核酸のヌクレオチドと相補的な第一の捕捉／増幅プローブの５’末端および第二の増幅プローブの３’末端）は各々、長さが約15から60ヌクレオチド、好ましくは約18から35ヌクレオチドであり、プローブと標的核酸との適切なハイブリダイゼーションに十分な長さを提供する。
プローブの包括的部分（すなわち捕捉／増幅プローブの３’末端および増幅プローブの５’末端、前記は標的核酸と相補的ではない）に関しては、とりわけ以下の考慮が適用される：
（１）オリゴデオキシヌクレオチド捕捉／増幅プローブの包括的ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、好ましくは２つから４つの長さが約６ヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む。前記配列は、下記で考察するように、所望の場合は特異的な制限エンドヌクレアーゼによって連結増幅配列を常磁性ビーズから切断するために用いることができる。好ましい制限部位にはとりわけEcoRI（GAATTC）、SmaI（CCCGGG）およびHindff1（AAGCTT）が含まれる。
（２）包括的ヌクレオチド配列はGCに富む領域を含み、前記はプライマーとのハイブリダイゼーション時に、下記で考察するようにより安定なデュープレックス分子（例えば変性により高温を必要とする）を提供する。捕捉／増幅プローブおよび増幅プローブのG−C富裕包括的部分を有する連結増幅配列は二温度PCR反応を用いて増幅できる。前記反応では、下記で考察されるように、プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長は両方とも約60−65℃の温度で（通常PCR増幅で用いられる37℃でのハイブリダイゼーションとは対照的である）、変性は約92℃の温度で実施される。二温度反応を使用することによって各PCR増幅サイクルの長さが短縮され、アッセイ時間の短縮が得られる。
【００２４】
プローブ、磁性ビーズおよび標的核酸を溶解緩衝液中で約37℃の温度で約30から60分インキュベーションした後、標的核酸およびハイブリダイズしたプローブを含む三重複合体が形成される。前記複合体は、前記捕捉／増幅プローブ上のリガンド（例えばビオチン）と前記常磁性ビーズ上のリガンド結合部分（例えばストレプトアビジン）との結合を介して常磁性ビーズに結合される。
本方法は以下のように実施される：
（ａ）続いて、標的核酸−プローブ−ビーズを含む複合体を、磁力装置によって生じた磁場（前記ビーズを引き付ける）の手段によって前記溶解緩衝液から分離する。磁場を用いて、反応容器（例えばマイクロウェルプレートまたはマイクロチューブ）の壁に複合体を保持し、それによって溶解緩衝液および一切の未結合反応物を例えばデカンテーションによって除去することを可能にし、標的核酸またはハイブリダイズしたプローブの大きな損失が生じない。続いて、前記複合体を磁場の存在下で２から３回緩衝液（複合体を解離させない量のカオトロピズム誘発物質および洗剤を含む）で洗浄する。本発明で使用される適切な洗浄緩衝液は以下を含む：約1.0から1.5MのGnSCN、10ｍMのEDTA、100ｍMトリス-塩酸（pH8.0）および0.5％NP-40（ノニデットP-40、非イオン性洗剤、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。他の非イオン性洗剤（例えばトリトンX-100）もまた用いることができる。緩衝液による洗浄によって、その後の工程の妨げとなる可能性がある未結合タンパク質、核酸およびプローブを除去する。続いて洗浄複合体をKCｌの溶液で洗浄し、GnSCNおよび洗剤を除去して保存することができる。KCｌの適切な濃度は約100から500ｍMである。また別には、KCｌの洗浄工程を省略してリガーゼ緩衝液で２回洗浄してもよい。
（ｂ）前記プローブを一つに連結しようとする場合、本方法の次の工程は、前記２つのプローブを結合させる連結物質で工程（ａ）の複合体を処理することを必要とする。前記連結物質は酵素（例えばDNAまたはRNAリガーゼ）または化学物質（例えば臭化シアンまたはカルボジイミド）であろう。前記を用いて、第一のオリゴヌクレオチドプローブの５’末端を第二のオリゴヌクレオチドプローブの３’末端（それぞれ捕捉／増幅プローブおよび増幅プローブ）に結合させ、連続した機能的な一本鎖オリゴヌクレオチド分子（本明細書では連結増幅配列と称する）を形成する。（Amp-プローブ２の５’末端のシグナル発生部分を介して）検出された連結増幅配列の存在は、サンプル中に標的核酸が存在することが間接的に示される。また別には、連結増幅配列は種々の増幅系（例えばPCRまたはSDA）のいずれかの鋳型として用いられる。処理の後で未連結のままである一切の第一および第二のプローブは本方法のその後の工程で増幅されない。
捕捉／増幅および増幅オリゴデオキシヌクレオチドプローブは適切な連結物質（例えばDNAまたはRNAリガーゼ）を用いて連結することができる。また別には、前記連結物質は化学物質（例えば臭化シアンまたはカルボジイミド）でもよい（Sokolova et al., FEBES Lett. 232:153-155,1988）。好ましいDNAリガーゼにはT4DNAリガーゼおよび耐熱性TaqDNAリガーゼが含まれるが、PCR技術をもちいて増幅を実施するプローブの場合は後者がもっとも好ましい。TaqDNAリガーゼを用いる利点は、このリガーゼは高温（65から72℃）で活性を有するということである。そのような高温でオリゴヌクレオチドプローブを結合させることによって非特異的な連結が減少する。好ましくは、この連結工程は高温（65から72℃）で30から60分実施される。その後、場合によって未連結の第二の増幅プローブ（図1のAmp-プローブ２）は全て変性条件下で除去される。
変性は、連結工程の後で前記混合物へTE緩衝液（10ｍMトリス-塩酸（pH7.5）、0.1ｍMのEDTA）を添加することによって実施される。続いて混合物の温度を約92から95℃に約１から５分上昇させ、ハイブリダイズした核酸を変性させる。この処理は、常磁性ビーズに結合したままのハイブリダイズした連結増幅配列から標的核酸（および未連結Amp-プローブ２）を分離させる。上記のように磁場の存在下で、結合状態の連結増幅配列を高温でTE緩衝液を用いて洗浄し、変性した標的核酸および一切の未連結Amp-プローブ２を除去し、以降の分析のために再度TE緩衝液に懸濁させる。
【００２５】
（ｃ）本プロセスの第三の工程は前記連結増幅配列の検出であり、検出によって最初のテストサンプル中に標的核酸が存在することが示される。この工程は、十分な標的核酸がサンプル中に存在する場合（約106から107分子）は直接実施するか、または種々の増幅技術の１つ（例えばPCRまたはSDA）を用いて前記連結増幅配列の増幅後に実施することができる。例えば直接検出は、急性感染エイズ患者の血清サンプルでHIV-1のRNAを検出するために用いることができる。そのような血清サンプルは血清１ｍL中に約106コピーのウイルスRNAを含むと考えられる。
直接検出する場合、長さが約10から15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド検出プローブを常磁性ビーズに結合させた連結増幅配列に添加することができる（前記プローブは、連結増幅配列のAmp-プローブ２部分の５’末端と相補的であるように上記に記載した自動合成によって調製される）。連結増幅配列と前記検出プローブとをハイブリダイズさせるために十分な条件下で、前記検出プローブ［シグナル発生部分（例えば放射性同位元素、発色物質または蛍光物質）で標識されている］を前記複合体と一定の時間インキュベートする。前記インキュベーション時間は約１分から60分の範囲で、約４から60℃の温度で実施できる。好ましくは、標識が蛍光物質であるときは、インキュベーション温度は約４℃であり、発色物質の場合は約37℃、放射性同位元素の場合は約37℃から60℃である。好ましいシグナル発生部分には、とりわけ32P（放射性同位元素）、ペルオキシダーゼ（発色物質）およびフルオレセイン、アクリジンまたはエチジウム（蛍光物質）が含まれる。
【００２６】
また別には、上記で述べたように直接検出の場合、Amp-プローブ２自体を場合によってその５’末端でシグナル発生部分（例えば32P）で標識してもよい。続いて捕捉／Amp-プローブ１およびAmp-プローブ２の連結の結果、このシグナル発生部分は連結増幅配列に組み込まれる。したがって、連結増幅配列の直接検出は、連結および洗浄後直ちに実施して標的核酸が存在することを示すことができる。
連結増幅プローブ上で直接シグナル発生部分を検出するために適した技術または検出プライマーを介して連結増幅プローブにハイブリダイズされたシグナル発生部分を検出する技術はいずれも利用することができる。そのような技術には、当業界で公知のシンチレーション計測（32P）および発色検出または蛍光検出の方法が含まれる。例えば適切な検出方法はとりわけ以下の文献で見出すことができる：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; in Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press (1987); Wu et al., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989)。
標的核酸が最初のサンプルに不十分な量で存在する場合（＜106分子）は、増幅系を用いて前記連結増幅配列を検出のために増幅する。
【００２７】
例えば、本発明の方法で用いられるプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチド分子である場合、PCR法を用いて公知の技術により前記連結増幅配列を増幅することができる（例えば以下を参照されたい：PCR Technology, H.A. Erlich, ed., Stockton Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）。増幅にPCRを用いるときは、２つのプライマーが利用される。第一のプライマーは連結増幅配列の捕捉／Amp-プローブ１領域の包括的３’末端に相補的で、第二のプライマーは連結増幅配列のAmp-プローブ２部分の包括的５’末端と配列が対応する。これらのプライマーは、それらが結合するプローブの配列と同様に包括的であるようにデザインされ、標的核酸の配列とは無関係に全てのアッセイで用いることができる。第一のプライマーは連結増幅配列の３’末端の包括的配列とアニールし、第二のプライマーは連結増幅配列の５’末端の包括的配列と配列が対応するようにデザインされているので、包括的プライマーを用いて任意の連結増幅配列を増幅することができる。
また別には、連結増幅配列の捕捉／Amp-プローブ１領域の包括的３’末端に相補的で、連結増幅配列のAmp-プローブ２部分の包括的５’末端に相補的であるようにデザインした多種プライマーを用いて、連結増幅配列を両末端の間の配列と一緒に増幅することができる。本明細書に記載する作業例で示すように、プライマーの数を増加させることによって、増幅効率が顕著に増加し、それによってDNA検出感度が高まることが示された。
【００２８】
本方法で用いる包括的なPCRオリゴヌクレオチドプライマー対を、上記でオリゴヌクレオチドプローブの合成について上記で述べたように公知の自動化合成技術によってヌクレオシド三リン酸から合成することができる。プライマーは長さが10から60ヌクレオチドであろう。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは長さが約18から35ヌクレオチドで、もっとも好ましくは長さが12から21ヌクレオチドである。プライマー対は、第一の捕捉／増幅プローブおよび第二の増幅配列の包括部分とそれぞれ相補的であるようにデザインされ、したがって高いG−C含量を有する。さらにまた、プライマーはいずれの二次構造ももたないように（すなわち各プライマーはそれ自体の内部でセルフアニーリングを生じる可能性がある相補的領域を含まない）デザインするのが好ましい。
前記包括的PCRプライマーおよび連結増幅配列の前記包括的部分の高いG−C含量は、通常の三温度法ではなく二温度PCR反応の実施を可能にする。連結増幅配列へのプライマーのアニーリングは約37から50℃で実施され、ヌクレオシド三リン酸の存在下でのTaqポリメラーゼによるプライマー配列の伸長は約70から75℃で実施され、さらに伸長プライマーを遊離させる変性工程は約90から95℃で実施される。二温PCR技術では、アニーリングおよび伸長工程はともに約60から65℃で実施することができ、したがって各増幅サイクルを短くしてアッセイ時間を短縮することができる。
【００２９】
例えば、適切な三温PCR増幅は以下のように実施できる（前記は以下の文献で提供されるとおりである：Saiki et al., Science 239:487-491, 1988）。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を以下を含む約25から50μLのサンプル中で実施する：0.01から1.0ngの連結増幅配列鋳型、10から100pmolの各包括的プライマー、1.5単位のTaqDNAポリメラーゼ（Promega Corp.）、0.2ｍMのｄATP、0.2ｍMのｄCTP、0.2ｍMのｄGTP、0.2ｍMのｄTTP、15ｍMのMgCl２、10ｍMトリス塩酸（pH9.0）、50ｍMのKCl、１μg/ｍLのゼラチンおよび10μL/ｍLトリトンX-100（Saiki,1988）。反応物を94℃で１時間、約37から55℃で２分間（プライマーによって左右される）、さらに約72℃で３分インキュベートし、前記を30から40サイクル（好ましくは35サイクル）繰り返す。各反応から４μLの部分標本を２％アガロースゲルの電気泳動によって分析し、サンプル中のDNA生成物はゲルを臭化エチジウムで染色することによって可視化される。
上記で述べたように二温PCR技術は、アニーリング／伸長工程を２つの温度ではなく単一温度（例えば約60から65℃）で約５分実施することだけが異なる。
【００３０】
さらに図２を参照すれば、競合PCRアッセイを用いて標的核酸の定量的検出もまた実施できる。そのような定量的検出の場合、オリゴデオキシリボヌクレオチド遊離プライマー（上記のように一般的に合成される）を常磁性ビーズに結合した連結増幅配列に添加する。遊離プライマーは上記で述べた第一のPCRプライマーと同じであってもなくてもよいが、好ましくは同じであろう。前記遊離プライマーは、連結増幅配列の捕捉／Amp-プローブ１部分の包括的３’末端とハイブリダイズするようにデザインされ、前記は、上記で述べたように、少なくとも１つ（好ましくは２つから４つ）の制限エンドヌクレアーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つ（好ましくは２つから４つ）の二本鎖制限酵素切断部位、例えばEcoRI、SmaIおよび／またはHindIII部位を形成する。
これに関しては上記に記載したように、定量的PCR増幅および検出系で使用するために、捕捉／Amp-プローブ１は、その３’末端に位置する少なくとも１つ（好ましくは２つから４つ）の制限酵素認識ヌクレオチド配列もつように合成されることが重要である。これによって、遊離プライマーが結合して二本鎖制限酵素切断部位を形成するヌクレオチドが提供される。
【００３１】
第一および第二のプローブを連結し連結増幅配列を形成した後、遊離プライマーを前記連結増幅配列にハイブリダイズさせる。少なくとも１つの制限酵素（例えばEcoRI、SmaIおよび／またはHindIIIを続いて前記ハイブリダイズしたプライマーおよび連結増幅配列に添加する。前記連結増幅配列を制限酵素部位（例えばEcoRI部位）で切断してビーズから遊離させる。
ビーズから遊離させた後、前記連結増幅配列を連続的に希釈し、続いて適切なPCR増幅技術を用いて上記で述べたようにTaqDNAポリメラーゼにより定量的に増幅する。
サンプル中に存在する最初の標的核酸の定量は、連結増幅配列を定量的に増幅する競合的PCR方法によって実施することができる。前記の方法は例えば以下の文献で提供される：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989。
一般的には、本方法は、連結増幅配列および一連の増幅反応物に既知量で添加されるコントロールの２つの鋳型の同時増幅を必要とする。前記コントロールは、例えば連結増幅配列の包括的部分または標的核酸配列とは無関係のヌクレオチド配列の介在する包括的部分である。コントロールおよび連結増幅配列は同じ包括的PCRプライマー対で増幅されるが、コントロールの鋳型は連結増幅配列とは例えばサイズが異なることによって識別される。コントロールおよび連結増幅配列は同じ増幅反応中に存在し同じプライマーを利用するので、増幅反応効率に影響する多数の変数の影響は本質的にゼロにすることができる。そのような変数にはとりわけ以下が含まれる：（１）試薬（TaqDNAポリメラーゼ、プライマー、鋳型、ｄNTP）の品質および濃度、（２）変性、アニーリングおよびプライマー伸長で用いられる条件、（３）反応温度の変化速度および（４）オリゴヌクレオチドプライマーのプライミング効率。２つの増幅生成物（すなわち連結増幅配列およびコントロール鋳型）の相対量は出発の鋳型の相対濃度を反映する。
【００３２】
定量的PCR法は一般的には以下のように実施することができる：
コントロール鋳型［例えばナノバリアントRNA（天然に存在するQβレプリカーゼの鋳型（Schafiher et al., J. Mol. Biol. 117:877-907,1977））］を自動オリゴヌクレオチド合成によって合成し、その濃度を例えば分光光度法または臭化エチジウム仲介蛍光によって決定する。
10ng/mLから１fg/mLのコントロール鋳型を含む10倍段階希釈を作製し使用まで-70℃で保存する。
遊離状態の連結増幅配列を含む一連のPCR増幅反応物を作製する。通常のPCR成分の他に、前記反応物はまた、反応物当たり10μLの10倍段階希釈のコントロール鋳型および約10μCiの［α-32P］ｄCTP（比活性3000Ci/mmole）を含む。
PCR増幅反応は所望のサイクル数（例えば30から40）で実施される。
続いて、反応生成物をアガロースゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーに付して２つの増幅生成物（サイズが異なる）を分離する。コントロールおよび連結増幅配列の増幅バンドを適切な技術を用いてゲルから回収し、各バンドに存在する放射能をシンチレーションカウンターで計測して決定する。前記２つの生成物の相対量を各バンドの放射能の量を基準に計算する。２つのサンプル中に存在する放射能の量は２つの生成物の分子量の相違について修正する必要がある。
前記の反応は狭い範囲のコントロール鋳型濃度を用いて繰返し、連結増幅配列濃度のより正確な概算を得る。
【００３３】
本発明の別の特徴では、前記２つのプローブ（すなわち１つの捕捉／増幅プローブおよび１つの増幅プローブ）より多いプローブを用いてもよい。例えば、１つまたは２つ以上の捕捉／増幅プローブおよび１つまたは２つ以上の増幅プローブを、図４および５に模式的に示すように標的核酸の検出および捕捉で、さらには場合によって標的配列の増幅で用いてもよい。本発明のこの特徴にしたがえば、捕捉／増幅プローブは標的核酸と相補的な３’配列を有し、さらにストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと相互反応することができるビオチン部分をその５’末端に有することができる。また別には、捕捉／増幅プローブは標的核酸と相補的な５’配列およびビオチン部分をその３’末端に有することもできる。
さらにまた、本発明のこの特徴にしたがえば、各プローブが標的核酸と特異的な相補性を有しこれとハイブリダイズすることができる配列を含む１つまたは２つ以上の増幅プローブが用いられる。例えば、１つの増幅配列（例えば図４のAmp-プローブ２（HCV A））の５’末端は標的核酸のまた別個の部分と相補的な配列を含む。第二の増幅プローブ（例えば図４のAmp-プローブ2A（HCV A））の３’末端は、第一の増幅プローブとハイブリダイズすることができる標的の部分の直そばに存在する標的核酸領域と相補的な特定の配列を含む。捕捉／増幅プローブおよび増幅プローブ対は、上記で述べたようにGnSCNの存在下で標的核酸とハイブリダイズする。このようにして形成された複合体は、捕捉／増幅プローブ上のビオチン部分を介してストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと結合し、前記複合体は上記のように磁力分離の手段によって未反応成分と分離される。次に、増幅プローブを例えばリガーゼ酵素によって連結することができる。これによって連結増幅配列が生成され、PCRによる増幅反応時にTaqDNAポリメラーゼのための鋳型として機能する。
【００３４】
本発明のある特徴では、２つまたは３つ以上の捕捉／増幅プローブおよび２対の増幅プローブが標的核酸の検出に用いられる。
多種の捕捉／増幅プローブを使用することによってより良好な捕捉効率を得ることができ、包括的捕捉プローブで多種の標的を補足することが可能になる。このことは、ただ１つの反応物中で多種標的を検出することができる多重PCR反応で特に所望される。
例えば、本発明で使用される捕捉／増幅プローブは細胞ｍRNAのポリ-Aテールに結合するようにデザインすることができる。それによって単一捕捉洗浄工程によって前記のようなｍRNAを全て単離することができる。続いてPCR増幅をデザインして特定の標的病原体または疾患遺伝子配列を前記のようなｍRNAプールから検出および増幅することができる。前記のような遺伝子にはとりわけ嚢胞性線維症トランスメンブレン調節タンパク質（CFTR）もしくはヘモグロビンまたは遺伝性疾患に関与する他のタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
本発明のさらに別の特徴では、多種の捕捉／増幅プローブは、例えば特定の病原体（例えばC型肝炎（HCV）の全ての株を標的とし、増幅プローブは前記病原体（例えばHCV）の個々のHCV遺伝型を検出し、さらに特定できるように調製することができる。
さらに別の実施態様では、２つの捕捉／増幅プローブが例えば図４に示したように用いられる。この場合、標的核酸と相補的でこれとハイブリダイズすることができる、捕捉／増幅プローブの完全な特異的配列が提供され、前記は単一の捕捉／増幅プローブの長さの２倍であり、それによってより高い捕捉効率を達成できる。
【００３５】
例えば図４に示したような捕捉／増幅プローブ対は、各々標的核酸と相補的な３’配列およびストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと相互反応できるビオチン部分をその５’末端に有することができる。また別には、捕捉／増幅プローブ対は、各々標的核酸と相補的な５’配列およびストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと相互反応できるビオチン部分をその３’末端に有することができる。
さらに、連結された標的プローブがPCRによって増幅される本方法は、図13に示すように単一反応で多種標的を検出することを可能にし、多重LD-PCRと称される。従来の標的核酸のPCR増幅方法では、単一反応容器で多種プライマーを用いて多種標的核酸を検出する試みは、プライマー対間に存在する種々のプライマーの効率および競合によって制限されてきた。対照的に本発明では、各捕捉／増幅プローブは標的特異的領域および包括的領域を有する。本発明の多重LD-PCRでは、PCRプライマーが結合する包括的領域は全ての捕捉／増幅プローブで共通であることが可能である。したがって、多種標的に対して特異性を有する多種の捕捉／増幅プローブ対を用いることができるが、連結された捕捉／増幅プローブの増幅にはただ１対の包括的PCRプライマーが要求されるだけである。捕捉／増幅プローブの標的特異的領域の長さを変えることによって、個々の標的に一致する増幅PCR生成物をサイズによって特定することができる。
PCR生成物はまた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって特定してもよい。PCR生成物は増幅中に抗原（例えばジゴキシゲニン）で標識することができる。続いて増幅プローブの標的特異的領域とハイブリダイズする核酸プローブをその上に有するマイクロタイタープレートで前記標識PCR生成物を捕捉する（前記領域は増幅生成物中に存在する）。続いて、前記抗原標識に対する酵素結合抗体（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗ジゴキシゲニン抗体）および着色インジケーターをマイクロタイタープレートの各ウェルに添加することによって、捕捉された標識生成物を検出することができる。各ウェルの光学的濃度によってPCR生成物の測定値が提供され、前記測定値は続いて最初のサンプル中に標的核酸が存在することを示す。
【００３６】
さらに別の実施態様では、本発明は、図６に示すようにただ１つの増幅することができる“完全長プローブ”および１つまたは２つ以上の捕捉／増幅プローブを利用することができる。ハイブリダイズした核酸デュープレックス［標的核酸（例えばHCV RNA）、捕捉／増幅プローブおよび完全長増幅プローブ（増幅配列とも称される）を含む］は、RNAase Hで前記ハイブリダイズしたデュープレックス分子を処理することによって磁性ビーズから遊離させることができる。また別には、ハイブリダイズしたデュープレックス［標的核酸（例えばDNA）、捕捉／増幅プローブおよび完全長増幅プローブを含む］は、上記のように適切な制限酵素で前記ハイブリダイズしたデュープレックス分子を処理することによって磁性ビーズから遊離させることができる。
完全長増幅プローブを用いて標的核酸配列を検出するときは、前記プローブは、上記で述べた連結工程を実施する必要がなく増幅反応（例えばPCR）で用いることができる。特にこの後者のアプローチはアッセイを簡素化し、少なくとも104の標的核酸分子が検査サンプルで利用可能である場合に特に有用である。その結果、連結不要検出反応では非特異的結合の機会が減少する。臨床でもっとも用いられるアッセイでは、標的核酸（例えば病原体）はサンプル中に＞105分子／ｍLで存在し、したがって本方法による検出および増幅に馴染みやすいであろう。
【００３７】
本発明のさらに別の特徴では、図７に示すように、１つまたは２つ以上の捕捉／増幅プローブ（その各々はビオチン部分を含む）およびただ１つの増幅プローブ（増幅配列とも称される、前記標的核酸とハイブリダイズし、その遊離末端が連結されたとき環状化する）が用いられる。前記増幅プローブは、標的核酸配列とハイブリダイズすることができるプローブの相補性領域（例えば図７で太く示された領域）がプローブの各末端に位置するようにデザインすることができる（Nilssonら（Science 265:2085-2088, 1994）が記載したとおり）。プローブが標的とハイブリダイズするとき、その末端は互いに隣接して配置され、連結物質（例えばリガーゼ酵素）で連結されたとき閉環分子が生成される。続いてこの環状分子は、図７に示したようなプライマーを用いた増幅工程（例えばPCR）で鋳型として機能することができる。前記環状分子はまた下記で述べるようにRAMによって増幅してもよいし、または下記で述べるように改変HSAMアッセイで検出してもよい。
例えば、上記で述べたように前記プローブはある病原体の種々の遺伝子型（例えば血清標本に由来するHCVの種々の遺伝子型）の検出に用いることができる。遺伝子型特異的プローブは、発表されているHCV配列（Stuyver et al., 1993, J. Gen. Virol. 74:1093-1102）を基にして標的核酸内の変異が検出できるようにデザインすることができる。なぜならば、そのような変異は、（１）標的核酸とプローブとの適切なハイブリダイゼーションおよび（２）環状分子へのプローブのその後の連結を妨げるからである。下記で述べるように環状化プローブの性質のために、非連結プローブはストリンジェントな洗浄条件下で除去することができる。
【００３８】
本方法で用いられるただ１つの完全長の連結依存環状化プローブは、標的核酸配列の検出および増幅にはるかに高い効率を有する。二本鎖核酸分子のらせん特性のために、環状化プローブは標的核酸の周りに巻きつく。連結工程の結果として、プローブはカテネーションにより標的分子に共有結合することができる。これによってプローブが標的分子に固定され、ストリンジェントな洗浄条件に実質的に耐性を示すハイブリッド分子が形成される。これは、アッセイ時の非特異的シグナルの顕著な減少、バックグラウンドのノイズの低下およびアッセイの特異性の増加をもたらす。
本発明の別の実施態様では、環状プローブを利用する増幅方法で持ち越し夾雑およびバックグラウンドを減少させる方法が提供される。本発明の連結依存増幅方法は通常の増幅方法と異なり、標的核酸ではなく連結されたプローブの増幅を必要とする。連結プローブが環状分子であるときは、前記分子はエキソヌクレアーゼ消化に対して感受性を示す遊離末端をもたない。プローブを連結した後（すなわち環状化した後）、反応混合物をエキソヌクレアーゼで処理することによって“浄化”工程が提供され、したがって非連結プローブまたは環状DNAフラグメントが消化されるが、閉環状分子は消化されずバックグラウンドおよび持ち越し夾雑が減少する。共有結合によって連結された環状分子はその後の増幅および検出のために無傷で残存する。通常のPCRでは、一本鎖プライマーまたは持ち越しDNAフラグメントを除去するためにエキソヌクレアーゼを使用することは、標的核酸もまた分解されるというリスクをおかす。
【００３９】
本発明は前記のリスクをもたない。なぜならば標的核酸は増幅されないからである。好ましい実施態様では、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、マングビーン（mung bean）ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼBAL-31である。エキソヌクレアーゼは連結後および増幅前に反応に添加され、例えば37℃で30分インキュベートされる。
さらにまた、連結されて共有結合により閉じられた単一環状プローブを形成することができる多種のプローブを用いることも意図される。例えば、第一のプローブは標的の１つの領域とハイブリダイズするように選択される。第二のプローブは、その３’および５’末端が、隣接するが第一のプローブの５’および３’末端と連続しない標的の領域とハイブリダイズするように選択される。続いて、共有結合により閉じられた環状プローブを提供するために２つの連結事象が要求される。共有結合でプローブを閉じるために２つのリガーゼ（例えば酵素性リガーゼおよび化学物質性リガーゼ）を用いることによって、連結の順序を管理することができる。この実施態様は、単一標的内の２つの隣接する変異を特定するために特に有用である。
環状化プローブはまた、大きなポリマーを生成することによって増幅および検出することができる。前記ポリマーは、環状化プローブに沿ったプライマー１のローリングサークル伸長および下流の配列の置換によって生成される。この工程は、図９および16に示すように、その後のPCRのための鋳型として機能するマルチユニットを含む一本鎖DNAを産出する。前記の図に示したように、プライマー２は一本鎖DNAポリマーと結合し、さらに同時に伸長し上流のプライマーによって下流のプライマーの置換を生じる。プライマーの伸長／置換およびPCRの両方を用いることによって、同じサイクル数でより多くの検出可能な生成物が生じる。
【００４０】
環状化プローブはまた改変HSAMアッセイによって検出することができる。図14に示すこの方法では、環状化可能増幅プローブは、上記で述べたように標的核酸の隣接する領域と相補的な３’領域および５’領域を含む。環状化プローブはさらに、非相補的（または包括的）リンカー領域を含む。本シグナル増幅方法では、環状化可能プローブのこのリンカー領域は、第一の包括的環状化可能シグナルプローブ（CS-プローブ）の３’および５’領域と相補的な少なくとも一対の隣接領域を含む。前記第一のCS-プローブは、環状化可能増幅プローブのリンカー領域の隣接領域と相補的な配列をその３’および５’領域に含む。環状化可能増幅プローブと標的核酸との結合およびそれに続く連結によって、共有結合で連結された環状プローブを生じ、前記環状プローブは第一のCS-プローブの３’および５’末端との結合に利用できるリンカー内領域を有する。第一のCS-プローブの添加により、環状増幅プローブのリンカーの相補的領域とCS-プローブの３’および５’領域との結合が生じる。CS-プローブの３’および５’領域は連結物質によって結合され、前記閉環状増幅プローブに結合した閉環状CS-プローブを形成する。第一のCS-プローブはさらに、第二のCS-プローブの３’および５’領域と相補的であるようにデザインされた少なくとも一対の隣接する連続領域を含むリンカー領域を含む。
前記第二のCS-プローブは、第一のCS-プローブのリンカー領域の隣接する領域と相補的な配列をその３’および５’領域に含む。第二のCS-プローブの添加により、第一のCS-プローブのリンカーの相補的領域と第二のCS-プローブの３’および５’領域との結合が生じる。第二のCS-プローブの３’および５’領域は連結物質によって結合され閉環状CS-プローブを形成し、これは続いて閉環状増幅プローブに結合される。
【００４１】
多種の相補領域対を有する多種CS-プローブを用いて上記の方法を実施することによって、大きな連鎖分子クラスターが標的核酸上に形成される。好ましい実施態様では、３種のCS-プローブが用いられる。３’および５’領域の他に、各CS-プローブは、一対の相補性領域（第二のCS-プローブの３’および５’領域と相補的である）およびもう一対の相補性領域（第三のCS-プローブの３’および５’領域と相補的である）を有する。これら“三価”のCS-プローブを本発明の方法で用いることによって、連鎖分子クラスターが図14に示すように形成される。
十分に洗浄して標的と結合していない非特異的連鎖反応物を除去した後、続いて連鎖分子クラスターを検出することによって標的核酸を検出する。前記連鎖分子は複合体を制限エンドヌクレアーゼ（その認識配列が各CS-プローブのリンカー領域に固有に組み込まれている）で消化することによって容易に検出することができる。制限エンドヌクレアーゼ消化によって、ポリアクリルアミドゲル上で可視化できる直鎖状モノマーが生じる。CS-プローブに検出可能な分子、例えばジゴキシニン、ビオチンまたは蛍光分子を組み込み、抗ジゴキシニン、ストレプトアビジンまたは蛍光検出により検出することによって、他の検出方法を実施することもできる。例えばEssersら（J. Clin. Microbiol. 12:641, 1980）が記載したラテックス凝集もまた用いることができる。そのような核酸検出方法は当業者には公知である。
【００４２】
さらにまた特別な利用では、in situのLD-PCRアッセイのために上記で述べた増幅プローブおよび／または増幅配列を用いることができる。in situのPCRは、標的ウイルス核酸のそのままの位置を決定し可視化するために用いることができ、さらにウイルス感染と組織病変の相関性を決定するために有用である。
これまでの標的ウイルスRNA配列をアッセイする方法はRT-PCR技術を利用してきた（Nuovo et al., 1993, Am. J. Surg. Pathol. 17(7):683-690）。本方法では、in situでの逆転写により標的ウイルスRNAから得られたｃDNAはPCRによって増幅される。続いて、標識プローブによる増幅ｃDNAのin situハイブリダイゼーションによって、または増幅反応時に標識ヌクレオチドをDNAに取り込ませることによって増幅ｃDNAの細胞内の位置を決定することができる。
しかしながらRT-PCR法には欠点があり、この欠点は本発明によって解決された。例えば、サンプル組織の処理に用いられる種々の組織固定剤は細胞内核酸およびタンパク質を架橋させ（例えばタンパク質−RNAおよびRNA−RNA複合体）、RT-PCRの重要な工程である逆転写を妨げる。さらにまた、標的RNAの二次構造もまた逆転写を妨害するであろう。さらに、単一細胞内の多種多様な標的配列を検出するために多重PCRをRT-PCRに応用することは、各プライマー対の種々の効率のために重大な問題を生じるであろう。
【００４３】
本発明の方法は、上記で述べたように１つまたは２つ以上の増幅プローブおよび／または増幅配列、並びにLD-PCR技術を用いてin situで標的核酸の位置を決定しこれを検出する。本方法はRT-PCR法よりも明らかな利点を提供する。第一に、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションおよびその後のプローブ配列の増幅によってRT-PCR法の逆転写工程が省かれるので、標的RNAの二次構造はアッセイの結果に影響を与えない。さらにまた、RT-PCR法の場合のような標的RNAのプライマー伸長は存在しないので、上記で述べた組織固定剤による標的核酸と細胞性タンパク質の架橋はプローブ配列の増幅を妨害しない。
特に、本発明の増幅プローブは、標的病原体の種々の遺伝子型変種を検出するプローブ内に共通のプライマー結合配列が存在するようにデザインすることができる。これによって、単一サンプル内の多種標的を検出するアッセイが可能になる。例えば非制限的な例を挙げれば、本アッセイは２つまたは３つ以上の本発明の増幅プローブを用いてHCV-RNAおよびβアクチンRNAを検出することができる。この場合、βアクチンプローブはアッセイの内部コントロールとして機能する。
さらにまた、プローブ内のプライマー結合配列は、（１）非特異的なプライマーのオリゴマー化を最小限にし、さらに（２）優れたプライマー結合を達成しさらにPCR生成物の収量を高めるようにデザインし、それによってアッセイの感度を高めることができる。
本発明の増幅プローブは標的核酸に結合した後で環状化し環状分子を形成するので、重合反応中にマルチマー生成物を形成することができ、その結果、図９および16に示しさらに上記で述べたように増幅生成物を容易に検出することができる。
【００４４】
組織標本中の標的核酸を検出する本発明のin situLD-PCRアッセイは、連結依存完全長増幅プローブを用い、さらに以下の工程を必要とする。
サンプル組織（例えば肝臓、凍結されているかまたはホルマリン固定されパラフィンに包埋されている）の切片を作製し、シラン被覆スライド上に置く。切片をキシレンおよびエタノールで洗浄しパラフィンを除去する。続いて前記切片をタンパク分解酵素（例えばトリプシン）で処理し、膜透過性を高めることができる。さらに切片をRNAase非含有DNAaseで処理して細胞性DNAを除去することができる。
増幅プローブは適切な緩衝液に懸濁し、スライド上のサンプル切片に添加し、標的配列とハイブリダイズさせることができる。好ましくは、前記プローブは20％のホルムアミドを含む２ｘのSSCに溶解してスライドに添加し、混合物を37℃で２時間インキュベートしハイブリダイゼーションを惹起する。スライドを２ｘのSSCで１回、１ｘのリガーゼ緩衝液で２回洗浄した後、DNAリガーゼをサンプルに適用することができる。好ましくは、１U／20μLのリガーゼ酵素を各スライドに添加し、混合物を37℃で２時間インキュベートしてプローブを環状化させる。スライドを0.2ｘのSSC（高ストリンジェンシー）および１ｘのPCR緩衝液で洗浄し、次ぎのPCRによる増幅工程前に非連結プローブを除去する。ここでPCR反応混合物（増幅プライマーおよび１つまたは２つ以上の標識ヌクレオチドを含む）をスライド上のサンプルに添加し標的配列を増幅させる。ヌクレオチドの標識はいずれのシグナル発生部分でもよい。上記で述べたように、前記にはとりわけ放射性同位元素（例えば32Pまたは3H）、蛍光分子（例えばフルオレセイン）および発色分子または酵素（例えばペルオキシダーゼ）が含まれる。発色物質は、例えば酵素結合発色アッセイによる検出分析用の物質が好ましい。
【００４５】
さらに好ましい特徴では、ジゴキシニン標識ヌクレオチドが用いられる。そのような事例では、PCR生成物（ジゴキシニン標識ヌクレオチドでタグが付されている）は、抗ジゴキシニン抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合物とともにインキュベートしたときに検出できる。アルカリ性ホスファターゼ系比色検出はニトロブルーテトラゾリウムを利用し、前記物質は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートの存在下で青紫色の沈殿物をプローブの増幅部位に生じる。
本発明のある特徴では、in situ LD-PCR検出法の連結およびPCR増幅工程は、増幅プローブの環状化に耐熱性リガーゼ酵素を用いることによって同時におよび高温で実施することができる。
本発明にしたがえば、in situLD-PCRのまた別の実施態様では、ある病原体（例えばHCV）の種々の遺伝子型変種を検出するためにデザインされた増幅プローブを用いることができる（前記プローブはこれら変種の公知のHCV配列を基にしている（Stuyver et al., 1993, J. Gen. Vir. 74:1093-1102））。例えば種々の型特異的プローブを一緒にサンプルに添加し、HCV配列の検出およびプローブ配列の増幅を上記で述べたin situLD-PCRで実施できる。次に、検出を容易にするために標識された型特異的内部プローブを用いin situハイブリダイゼーションによって増幅プローブ配列を個々の変種遺伝子型の存在についてアッセイする。
本発明のある特徴では、標的核酸配列は、上記に記載した種々の増幅プローブおよび／または増幅配列を用いこれら配列を増幅させることなく直接検出することができる。そのような特徴では、増幅プローブおよび／または増幅配列は検出可能なように標識される。
【００４６】
本発明のある実施態様では、本明細書に記載したRAM増幅法が、蛍光プライマーとともにゲルマトリックス様式またはスライド様式で用いられ、単一細胞内の染色体異常または遺伝子変異をin situで検出することができる。単一細胞をゲルマトリックス内に包埋することによって、ゲノム物質を失うことなく細胞の酵素による操作、すなわちDNA遊離のためのタンパク分解酵素による消化が可能になる。ゲルマトリックスはまたせん断損傷からDNAを保護し、細胞の本来の三次元構造の維持を可能にする。
本発明のさらに別の実施態様では、標的分子のin situ検出のためにマトリックス内に核酸分子またはタンパク質が包埋される方法が提供される。本発明の方法は特定の位置にシグナルを維持する手段を提供し、本明細書に記載された増幅方法（すなわちRAMおよびHSAM）と併用しDNAおよびタンパク質アレー技術で用いることができる。
本発明の特別な実施態様では、リガンド部分はゲルマトリックス材に結合される。そのような結合はリガンド部分とマトリックス内の化学基またはタンパク質との相互作用によって提供されるであろう。続いて、リガンド結合部分に連結されたC-プローブがゲルマトリックスに添加され、リガンドとリガンド結合部分との間の相互作用によりC-プローブとマトリックスとの結合が生じる。標的核酸分子の存在下で、C-プローブは相補性配列を介して標的核酸と結合するであろう。リガーゼの添加により閉鎖C-プローブが生成され、これはローリングサークル増幅またはRAMによって増幅される。また別には、C-プローブは、ゲルマトリックスとの直接結合またはゲルマトリックスに以前に結合されてあったリガンドとの結合によってゲルマトリックスと結合させることができる。続いて、標的核酸分子はプライマーとハイブリダイズされ、プライマー伸長が実施され、標的核酸分子が増幅および検出される。
【００４７】
リガンド／リガンド結合部分対の例には、ビオチンとアビジン／ストレプトアビジン、抗原またはハプテンと抗体、重金属誘導体とチオ基、種々のポリヌクレオチド、例えばポリｄGのようなホモポリペプチドとポリｄC、ポリｄAとポリｄTおよびポリｄAとポリｄUが含まれる。互いに強い親和性を有する任意の成分対をアフィニティー対、リガンド−リガンド結合部分として用いることができる。適切なアフィニティー対はまた免疫学的方法で用いられるリガンドおよび共役物間で見出される。本発明で使用される好ましいリガンド−リガンド結合部分はビオチン／ストレプトアビジンのアフィニティー対である。
本発明のさらに別の実施態様では、標識ヌクレオチドを増幅時に用いて増幅生成物を検出することができる。そのような標識には化学発光標識または放射能標識が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のさらに別の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは固体担体、例えばガラスまたはニトロセルロース膜に固定し、続いてゲルマトリックス材を重層することができる。C-プローブをゲルマトリックスに添加した後、標的核酸分子をマトリックスに添加して増幅反応を実施し、それによってシグナルをin situで保持させる。
本発明のさらに別の実施態様では、マトリックス材は、リガンド／リガンド結合部分が包埋されたビーズ形として調製することができる（すなわちセファロース、セルロースまたはナノ粒子）。
【００４８】
本発明のまた別の実施態様では、タンパク質、抗体または抗原はゲルマトリックス内に包埋することができる。続いてそのようなタンパク質、抗体または抗原は、前記分子に親和性を有する“結合パートナー”の添加によって検出される。前記結合パートナーは核酸分子に結合され、続いて前記核酸分子は本明細書に記載された増幅方法（すなわちHSAMおよびRAMおよびローリングサークル増幅）を用いて検出することができる。
プローブハイブリダイゼーション、連結および増幅はゲルマトリックス（例えばポリアクリルアミドまたはアガロース）中で実施できる（例えば以下を参照されたい：S. Dubiley et al., 1999, Nucleic Acids Research 27:i-iv）。プライマー伸長増幅および／またはそれに続く分枝増幅によって生成される大きなマルチマーアンプリコンは蛍光顕微鏡で可視化することができる。ゲルマトリックスは拡散を防止するので、いずれの陽性シグナルも“点”として出現するであろう。また別には、結合RAMプローブはハイブリダイゼーションシグナル増幅法（HSAM）を用いて検出できる。
連結依存環状化可能プローブを用いる本発明の実施態様では、生じた環状分子は、図19に示すように分枝伸長増幅法（RAM）によって簡単に増幅させることができる。環状化プローブのRAMによる増幅によって、本発明の方法は、等温条件下で環状化プローブの増幅を百万倍まで可能にするというさらに別の利点が付加される。RAMは図19に示されている。
RAMに有用な単一完全長の連結依存環状化可能プローブは、標的分子の隣接するが連続していない領域とハイブリダイズする領域を３’および５’末端に含む。前記環状化可能プローブは、標的核酸の１つの部分と相補的でこれとハイブリダイズできる５’領域、およびプローブの５’領域と相補的な標的の部分に隣接する標的核酸の１つの部分と相補的でこれとハイブリダイズする３’領域を含むようにデザインされる。環状化可能プローブの５’および３’領域は各々長さが約20から約35ヌクレオチドであろう。好ましい実施態様では、環状化可能プローブの５’および３’領域は長さが約25ヌクレオチドである。環状化可能プローブはさらにリンカー領域と称される領域を含む。好ましい実施態様では、リンカー領域は長さが約30から約60ヌクレオチドである。前記リンカー領域は、標的核酸と相補的でもなくハイブリダイズもできない包括的配列で構成される。
【００４９】
RAMによる増幅に適した環状化可能プローブは、上記で述べた１つまたは２つ以上の捕捉／増幅プローブとともに本方法で用いられる。環状化可能プローブが標的核酸とハイブリダイズするとき、その５’および３’末端は並列するようになる。連結物質による結合によって閉環状分子が形成される。閉環状分子の増幅は第一の伸長プライマー（Ext-プライマー１）を前記反応に添加することによって実施される。Ext-プライマー１は環状化可能プローブのリンカー領域の１つの部分と相補的でこれとハイブリダイズすることができ、好ましくは長さが約15から約30ヌクレオチドである。Ext-プライマー１は、閉環状分子の周囲にプライマーを伸長させるために十分な濃度のｄNTPおよびDNAポリメラーゼを添加することによって伸長される。１回転後に（すなわちDNAポリメラーゼがExt-プライマー１結合部位に到達するとき）、ポリメラーゼはプライマーおよびその伸長された配列を分離させる。したがってポリメラーゼは閉環状プローブ上を連続的に“回転”して長い一本鎖DNAを図19に示すように生成する。
環状化プローブのRAMによる増幅に有用なポリメラーゼは、３’から５’方向のエキソヌクレアーゼ活性をもたず、鎖置換活性を有し、さらに少なくとも1000塩基のプライマー伸長能力を有するいずれのポリメラーゼでもよい。DNAポリメラーゼの（Bxo-）クレノーフラグメント、テルモコックス＝リトラリス（Thermococcus litoralis）DNAポリメラーゼ（Vent（exo）DNAポリメラーゼ、New England Biolabs）およびphi29ポリメラーゼ（Blanco et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12198）が好ましいポリメラーゼである。テルムス＝アグアティクス（Thermus aguaticus）（Taq）DNAポリメラーゼもまた本発明で有用である。文献での報告とは反対に、本発明ではTaqDNAポリメラーゼは鎖置換活性を有することが見出された。
【００５０】
ポリメラーゼによるExt-プライマー１の伸長は、環状化可能プローブの配列と相補的な配列を有する繰返し単位をもつ長い一本鎖DNAを生じる。前記一本鎖DNAは10Kbにに達し、例えば約20から約100の繰り返し単位を含み、各単位の長さは環状化可能プローブ（例えば約100塩基）の長さと等しい。RAMの代替として、標的が豊富であるかまたは一本鎖DNAが長い場合は検出をこの工程で実施してもよい。例えば、長い一本鎖DNAは、ポリアクリルアミドゲル上に大きな分子として生じた生成物を可視化することによってこの段階で検出してもよい。
RAMによる増幅の次ぎの工程で、第二の伸長プライマー（Ext-プライマー２）が添加される。Ext-プライマー２は長さが好ましくは約15から約30ヌクレオチドである。Ext-プライマー２は、Ext-プライマー１が相補的であるリンカー領域の部分にオーバーラップしないリンカー領域の１つの部分と同一である。したがって、長い一本鎖DNAの各繰返し単位は、Ext-プライマー２がハイブリダイズする結合部位を含む。Ext-プライマー２の多種コピーはしたがって図19に示したように長い一本鎖DNAと結合し、DNAポリメラーゼによって伸長される。プライマー伸長生成物は下流のプライマーをその対応する伸長生成物で置換し、図19に示すように置換された多種一本鎖DNA分子を生成する。この置換された一本鎖はExt-プライマー１の結合部位を含み、したがって更なるプライマー伸長反応の鋳型として機能し、図19に示す多様な分枝した分子を生じる。この反応は全てのDNAが二本鎖になったとき終了する。
【００５１】
続いてRAMによって増幅されたDNAをDNA検出について当業界で公知の方法によって検出する。RAMは指数関数的増幅をもたらすので、生じた大量のDNAは簡便に、例えばゲル電気泳動によって検出され、さらに例えば臭化エチジウムによって可視化することができる。RAM伸長生成物は、閉環状DNAから伸長された単位の数にしたがってサイズが異なるので、RAM生成物は電気泳動を実施したときしみ状またははしご状のものとして出現する。別の実施態様では、環状化可能プローブは固有の制限部位を含むようにデザインされ、さらにRAM生成物は対応する制限エンドヌクレアーゼで消化されて、１単位の長さ（すなわち環状化可能プローブの長さ）を有する大量の単一サイズフラグメントを提供する。前記フラグメントは容易にゲル電気泳動により単一バンドとして検出される。また別には、リガンド（例えばビオチンまたはジゴキシゲニン）をプライマー伸長時に取り込ませ、上記に記載したようにリガンド標識一本鎖生成物を検出することができる。
RAM伸長生成物は、PCR生成物について上記で述べたように当業界で公知の他の方法（例えばELISAを含む）によって検出することができる。
本発明の他の実施態様では、増幅を高めるためにRAMアッセイは改変される。ある実施態様では、Ext-プライマー２の添加に続いて、反応温度を周期的に約95℃に上昇させる。温度の上昇は二本鎖DNAの変性をもたらし、Ext-プライマー１および２の更なる結合を可能にし、更なる伸長生成物の製造を可能にする。したがってPCRはRAMと効果的に併用され、図16に示すように増幅を高める。
【００５２】
また別の実施態様では、Ext-2プライマー（したがって環状化可能プローブのリンカー領域の同一部分）は、DNA依存RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含むようにデザインされる。RNAポリメラーゼおよび対応するプロモーター配列は当業界で公知であり、例えば以下の文献に開示されている：Milligan et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15:8783。好ましい実施態様では、RNAポリメラーゼはバクテリオファージT3、T7またはSP6のRNAポリメラーゼである。プロモーター配列を含むExt-プライマー２、対応するRNAポリメラーゼおよびｒNTPの添加は、成長する一本鎖DNAにExt-プライマー２をハイブリダイズさせて機能的プロモーターを形成し、下流の配列を多種RNAコピーに転写させる。本発明のこの実施態様は図17に示されている。この実施態様では、RAMおよび転写の両者がプローブの顕著な増幅を生じるために機能する。RNAは当業者に公知の方法、例えばポリアシルアミドゲル電気泳動、放射能もしくは非放射能標識と検出法（Boehringer Manheim）またはシャープディテクションアッセイ（Digene, Md）によって検出できる。RNAの検出は、標的核酸の存在を示す。
また別の実施態様では、Ext-プライマー１および環状プローブのリンカー領域の対応する部分が、DNA依存RNAポリメラーゼプロモーター配列がそれらの中に取り込まれてあるようにデザインされる。したがって、Ext-プライマー１が前記環状プローブと結合するとき、機能的なプロモーターが形成され、環状プローブは、RNAポリメラーゼおよびｒNTPの添加に際してRNA転写の鋳型として機能する。下流のプライマーおよびそのRNA配列はRNAポリメラーゼによって置換され、大きなRNAポリマーが生成される。前記RNAポリマーは上記で述べたように検出できる。また別には、前記環状プローブは、制限酵素（例えばEcoRI）を添加することによって一本鎖DNAに切断してもよい。制限部位は、図20に示されているように伸長プライマー１の５’末端に組み込まれている。
【００５３】
本発明のまた別の実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマー対は、環状プローブ特異的RAM増幅の存在下でシグナルを提供するようにデザインされる。前記プライマー対の第一のプライマーは、環状プローブと相補的であり、RAM仲介増幅のためのプライマーとして機能する第一の配列、および第二のプライマーと相補的な第二の配列を含む。さらに、第一のプライマーはシグナル発生部分で標識され、前記シグナル発生部分は、プライマーの伸長によって環状プローブから生じる第一の配列の存在下で検出することができる。好ましくは、前記プライマーはシグナル発生部分でその５’末端を標識される。そのようなシグナル発生部分には蛍光物質、化学発光物質または酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。例を挙げればルシフェラーゼおよびフルオレセインおよび量子ドットが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
前記プライマー対の第二のプライマーは、第一のプライマーと互いにハイブリダイズするとき“ジッパー領域”が形成されるように相補的な配列を含む。さらに、前記第二のプライマーは好ましくは３’末端で１つの部分で標識されるが、前記１つの部分はシグナル発生部分と隣接（adjacent）するか、または接近（close proximity）して配置されるとき、前記シグナル発生部分の活性を停止（quenching）、隠蔽（masking）または抑制（inhibiting）することができる（例えば図20を参照）。そのような抑制分子には蛍光もしくは化学発光のクェンチャーまたは酵素活性の阻害物質が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の別の実施態様では、前記プライマー対の第一のプライマーは第一の配列および第二の配列を含み、前記第一の配列は標的核酸と相補的であり、さらに種々の増幅方法［RAM、ポリメラーゼ連鎖反応、転写仲介アッセイ（C. Sarrazin et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39:2850-5）および鎖置換増幅アッセイ（Nadeau et al., 1999, 276:177-87）を含むがただしこれらに限定されない］を用いる標的核酸分子の増幅のプライマーとして機能し、第二の配列は第二のプライマーと相補的である。さらに、第一のプライマーはシグナル発生部分で標識される。
互いに結合したときに、シグナル発生部分および前記抑制部分が隣接するか、または互いに近接して存在するように前記プライマーはデザインされ、それによって検出可能なシグナルの発生が抑制される。しかしながら、環状プローブとの結合時にプライマー伸長に続いて、前記プライマーは“ジッパーが開放され”または空間的に互いに分離され、それによってシグナルの検出を可能にする。さらに、シグナル発生部分および抑制部分に結合されたプライマーを用い、多様な増幅方法［RAM、ポリメラーゼ連鎖反応、転写仲介アッセイ（C. Sarrazin et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39:2850-5）および鎖置換増幅アッセイ（Nadeau et al., 1999, 276:177-87）を含むがただしこれらに限定されない］により標的核酸分子を検出することができる。ただ１つ必要なことは、前記の増幅方法によって、シグナル生成部分と抑制部分が空間的に分離されねばならないということである。そのような増幅方法は当業者には周知である。
【００５５】
本発明のさらに別の実施態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ（Cap-Ampプローブ）、PNAプローブ（V.V. Demidov et al., 2001, Methods 23:123-31）またはLNAプローブ（A.A. Koshkin et al., 1998, Tetrahedron 54:3607-3630）（これらは標的核酸と特異的に結合する）は、その末端に結合させたリガンド部分（例えばビオチン）とともに合成される。プローブの長さは多様であってもよいが、そのようなプローブのサイズは長さが15から40ヌクレオチドの範囲である。さらにまた、環状プローブはまた、そのリンカー領域内にリガンド部分を含むようにデザインされる。いったん環状プローブが連結され環を形成したら、前記環状プローブをリガンド結合部分（例えばストレプトアビジン）の存在下でハイブリダイゼーションプローブとともにインキュベートし、ハイブリダイゼーションプローブ／リガンド結合部分／環状プローブ複合体を形成させる。標的配列が存在する場合、ハイブリダイゼーションプローブは標的核酸と結合し、それによってC-プローブを標的上に固定するであろう。検査では、Cap-Ampプローブをテストサンプルとともにインキュベートし、続いてリガンド結合部分およびリガンド標識環状プローブを添加する。続いて、上記で述べたようにプライマーおよびDNAポリメラーゼを添加して環状プローブを増幅する。また別に、Cap-Ampプローブは、標的と相補的な領域、C-プローブと相補的な３’領域およびその間に配置される内部リガンド部分を含むようにデザインされる。このようにして、内部でC-プローブと結合したとき、Cap-Ampプローブの３’末端（C-プローブとハイブリダイズする）は、最初のプライマー伸長および分枝増幅のためのプライマーとして機能することができる（図21A−B）。
さらにまた、本発明は、標的核酸をハイブリダイゼーションプローブと接触させることを含むサンプル中の標的核酸を検出する方法を提供する。前記ハイブリダイゼーションプローブは、（i）標的核酸と相補的な領域、および（ii）環状プローブと相補的な領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。さらに、標的核酸を（i）標的核酸と相補的な領域および（ii）ハイブリダイゼーションプローブと相補的な領域を含む環状プローブと接触させる。ここで前記ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の存在下で環状プローブの増幅のためにプライマーとして機能する。続いてこのハイブリダイゼーションプローブはDNAポリメラーゼの添加によって伸長され、続いて環状プローブが増幅される。ここで環状プローブの増幅の検出は、標的核酸が存在することを示す（図21C）。
【００５６】
本発明のさらに別の実施態様では、サンプル中の標的核酸を検出する方法が提供される。本方法は、前記標的核酸と、固体担体に連結させた第一のハイブリダイゼーションプローブ（前記プローブは（i）標的核酸と相補的な領域および（ii）前記第二のハイブリダイゼーションプローブと相補的な配列によって結合された環状プローブを有する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む）とを接触させることを含む。標的核酸分子の存在下で、前記第一のハイブリダイゼーションプローブおよび第二のハイブリダイゼーションプローブは互いに隣接し、それによって第一のハイブリダイゼーションプローブと第二のハイブリダイゼーションプローブとの連結が可能になり、続いてリガーゼが添加される。続いて環状プローブが増幅され、ここで環状プローブの増幅の検出は、標的核酸分子が存在することを示す（図21D）。
本発明のさらに別の実施態様では、サンプル中の標的抗原または抗体を検出する方法が提供される。前記標的抗原または標的抗体を前記標的と特異的に結合する抗体と接触させる。前記抗体を、その末端に結合させたリガンド部分（例えばビオチン）を含むアンカーオリゴヌクレオチドと結合させる。リガンド部分を含む環状プローブをリガンド結合部分（例えばストレプトアビジン）の存在下で添加し、抗体固定オリゴヌクレオチド／リガンド結合部分／環状プローブ複合体を形成させる。続いて、上記で述べたようにプライマーおよびDNAポリメラーゼを添加して前記環状プローブを増幅する。また別には、環状プローブと相補的な領域および内部リガンド部分を含むようにアンカーオリゴヌクレオチドをデザインしてもよい。このようにして、前記環状プローブが内部に結合したとき、環状プローブとハイブリダイズした前記末端が最初のプライマー伸長および分枝増幅のためのプライマーとして機能することができる（図31）。
【００５７】
上記で述べた方法ではRAM増幅を用いてプローブを増幅することができる。しかしながら、Amp-プローブ２のデザインを改変して標的配列を増幅してもよい。そのような事例では、Amp-プローブ２の３’および５’末端は増幅しようとする標的配列によって分離される（図27）。前記配列のサイズは数ヌクレオチドから数千ヌクレオチドの範囲であろう。プローブの３’末端および５’末端の間のギャップは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性および鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼを用いて充填されるであろう。前記のようなポリメラーゼは当業者には周知で、T4DNAポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性欠如改変ポリメラーゼが含まれるがただしこれらに限定されない。標的核酸がRNAである場合は、プローブの３’末端および５’末端の間のギャップは逆転写を用いて充填されるであろう。伸長の後、前記ギャップをリガーゼで閉じ、DNA増幅はext-プライマー１を用いて実施し、長い一本鎖DNAを生成する。第二のプライマー、ext-プライマー２を添加し、上記で述べたようにRAMによって一本鎖DNAを増幅させる。
【００５８】
上記で述べたように、本発明の方法は、特に感染性病原体並びに正常および異常遺伝子を検出するアッセイで用いることができる。本発明はさらに、全ゲノムDNAまたは細胞内で発現されるｍRNAの普遍的増幅方法を提供する。そのような方法を用いることによって、少数の細胞から得られるDNAおよび／またはｍRNAの量を増加させる手段が提供される。続いてそのようにして増幅されたDNAおよび／またはｍRNAを、感染性病原体の検出並びに正常および異常な遺伝子の検出のために開発された技術で用いることができる。
ゲノムDNAを増幅するために、当業界で周知の多様な方法のいずれかを用いて細胞からゲノムDNAサンプルを調製する。いったん単離したら、前記ゲノムDNAを選択した制限エンドヌクレアーゼで消化する。ゲノムDNAの消化に用いることができる制限エンドヌクレアーゼには例えば市販されている種々の酵素のいずれかが含まれる。ゲノムDNAを消化した後、二本鎖amp-プローブを反応物に添加する。前記amp-プローブは約70から130ヌクレオチドの二本鎖DNAフラグメントで、消化したゲノムDNAの制限エンドヌクレアーゼ部位と相補的な突出配列を含む。前記amp-プローブは、ゲノムDNAのRAM増幅に用いられる多種プライマー部位を含むようにデザインされる。多種の制限エンドヌクレアーゼがDNA消化に用いられる事例では、種々の制限部位に相補的な突出部位をもつamp-プローブが添加されるであろう。前記amp-プローブをアニールさせた後、反応物にリガーゼを添加してamp-プローブ配列をフラグメント化したゲノムDNAに連結する。この過程を何回も繰返し、ゲノムDNAの完全な消化を担保する。
【００５９】
本発明のある実施態様では、アダプターの自己連結の可能性を減少させるために、消化したゲノムDNAを含む反応物に第一鎖のamp-プローブを添加し、続いて第一鎖のamp-プローブをゲノムDNAと連結する。未連結の第一鎖amp-プローブを除去する洗浄工程の後、第二鎖のamp-プローブ（これは第一鎖amp-プローブの相補性配列とハイブリダイズする）を添加する。次にリガーゼを反応物に添加し、各末端に連結された二本鎖amp-プローブを含むゲノムDNAフラグメントを生成する。
amp-プローブ配列の長さは、選択した制限エンドヌクレアーゼによるDNAフラグメントの反復消化、並びに反復ハイブリダイゼーション、洗浄および連結工程によって大きくすることができる。amp-プローブの反対側の末端は制限エンドヌクレアーゼ部位を含むようにデザインされるので、制限エンドヌクレアーゼによる消化によって第一のamp-プローブが結合するための新規な部位が創出されるであろう。この過程を何度も繰り返すことができ、それによってamp-プローブの長さが増し、したがってRAMプライマー結合部位の数を増加させることができる。
amp-プローブの添加に続いて、ゲノムDNAを変性させ、さらにamp-プローブ内の配列と結合するようにデザインしたRAMプライマーを添加する。DNAポリメラーゼおよびｄNTPを反応物に添加し、RAM仲介増幅が開始される。前記増幅反応に用いることができるDNAポリメラーゼは好ましくは強い置換活性および高いプロセッシビティーをもつもので、例えばφ29またはBstDNAポリメラーゼである。
【００６０】
本発明のある実施態様では、消化したゲノムDNAの末端へのamp-プローブの添加は、DNAフラグメントの完全性および全ての末端がamp-プローブ配列を含むことを担保するために先ず初めにゲルマトリックスで実施することができる。増幅工程の効率は、amp-プローブ配列において利用可能なプライマー結合部位の数に左右される。したがって、効率的な増幅のために、多数のプライマー結合部位がamp-プローブ配列内で利用できなければならない。DNAフラグメントをゲルマトリックスから取り出し、その後の増幅は反応容器内で実施される。他のPCR系の方法を凌駕するこの普遍的ゲノム増幅方法の利点は、マルチサイクリングが要求されないこと、および全てのDNAフラグメントの増幅が担保されることである。
全ｍRNAもまた本発明のRAM技術を用いて増幅することができる。細胞性ｍRNAは、RNAの単離について周知の方法を用いて精製することができる。前記方法には、オリゴ（ｄT）捕捉／Amp-プローブ１プローブを用いた支持マトリックス（例えば磁性ビーズまたはニトロセルロース膜）への捕捉が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記捕捉／Amp-プローブ１は、20個のＴヌクレオチドのストレッチが続くアンカー配列（この配列の後にRAMプライマー結合配列が続く）を含むようにデザインされる。逆転写酵素とのインキュベーションによる逆転写によって一本鎖のｃDNAが生成される。続いて、当業者に周知の方法を用いて前記一本鎖ｃDNAをdsDNAに変換する。第二のdsDNA AMP-プローブ２を前記ｃDNAの５’末端に連結する。続いてゲノムDNAについて上記で述べたように得られた全ｃDNAを増幅する。
【００６１】
本発明はまた、細胞間での弁別的なｍRNA発現パターンを分析する新規な方法（本明細書では弁別表示RAM（differential display RAM; DD-RAM）と称される）を提供する。前記方法は以下の工程を必要とする：（i）プライマーとして５’捕捉／Amp-プローブ１配列を用いるｍRNAの逆転写；（ii）伸長配列の３’末端とｍRNAにアニールさせた不定／／Amp-プローブ２との連結；（iii）RAMプライマーセット（前進プライマーおよび逆方向プライマー）を用いるRAM増幅；および（iv）生成フラグメントの電気泳動分離。種々のタイプの細胞から得られたフラグメントを比較して、弁別的に発現されるｍRNAを特定する。本発明の方法はさらに、得られたｃDNAをプライマー内の部位を認識する制限エンドヌクレアーゼで消化する工程を含むことができる。
３’相補的領域の他に各５’捕捉／Amp-プローブは、その５’末端にRAMプライマーが結合する包括的配列および例えばビオチン部分を含む。前記５’捕捉／Amp-プローブ１はｍRNAの３’末端に結合するようにデザインされ、ｍRNA単離のための捕捉プローブおよび逆転写のためのプライマーの両者として機能するであろう。３’不定（Arbitrary）／Amp-プローブ２は、ｍRNAの５’末端に結合するための５’縮退配列およびRAMプライマーが結合するための包括的配列を含むようにデザインされる。
【００６２】
本発明の特別な実施態様では、プローブをmRNAでハイブリダイズした後、前記プローブ／ｍRNA複合体は支持マトリックス、例えばビオチンによる磁性ストレプトアビジンビーズに、または５’アンカープローブによりオリゴ（dT）ニトロセルロースに捕捉することによって単離される。十分な洗浄を実施して一切の未結合プローブおよび細胞性DNAを除去する。逆転写酵素を添加することによって、不定／Amp-プローブ２の５’末端で終了する第一鎖ｃDNAを生成する。連結によって２つのフラグメント、すなわち不定／／Amp-プローブ２および伸長配列を連結する（前記はその後のRAM増幅のための鋳型として機能する）。
アッセイ感度を高めるために、逆転写を実施する前にサブトラクション工程を実施することができる。サブトラクションのために、長さが12から15ヌクレオチドの、公知のハウスキーピング遺伝子配列および／または構造遺伝子配列と相補的なプライマーを前記ハイブリダイゼーションミックスに添加する。前記プライマーはハウスキーピングおよび／または構造ｍRNAの３’領域と、アンカープローブと数ヌクレオチドがオーバーラップする状態で結合し、それによって捕捉／Amp-プローブ１と競合しながらｍRNAと結合するようにデザインされてある。例えば、ハウスキーピングおよび／または構造ｍRNAの３’末端を補完するように合成された12−15ヌクレオチドの長さを有するプライマーが前記ハイブリダイゼーションミックスに添加されるであろう。前記ハウスキーピングおよび／または構造ｍRNAは例えば、ケラチン、ラミニン、チューブリン、アセチル補酵素、アデノシンデアミナーゼおよびアルドラーゼAである。逆転写酵素を添加する前に、RNA−DNAデュープレックスのRNA鎖を特異的に切断するRNA特異的酵素とともに反応物をインキュベートする。そのような酵素には、例えばRNase（例えばRNaseH）が含まれる。RNase処理は高度に過剰なハウスキーピングｍRNAの大多数を排除し、それによってアッセイの感度を高めるように考案されている。
【００６３】
さらにまた、単一プローブを５’アンカー配列および５’不定配列を含むようにデザインしてもよい。前記プローブは結合分子（例えばビオチン）で標識し、反応混合物からハイブリッド分子の単離を容易にすることができる（例えばストレプトアビジンビーズを用いて）。逆転写酵素反応を実施してプライマーの両末端間の領域を伸長し、続いて連結して閉環状分子を形成する。前記分子はその後RAMによって増幅される。制限エンドヌクレアーゼで消化した後得られた生成物をシークェンシングゲルで調べることができる。
本発明は他のタイプの弁別表示法に対し次の点で利点を有する：（i）各mRNAはただ１つの対応するRAM生成物を有する、なぜならば第一の利用可能な３’不定／Amp-プローブだけが唯一伸長配列に連結され、したがって同じｍRNAの重複提示が減少するからである；（ii）すべたの連結プローブが同じプライマー対によって増幅され、したがってプライマー増幅効率の多様性を最小限にする；さらに（iii）サブトラクション工程を付け加えることで、ハウスキーピングおよび／または構造ｍRNAが反応物から排除され、したがってアッセイ感度および特異性が高まる。
本明細書で述べたDD-RAM技術を用いて、種々の細胞タイプ内で弁別的に発現されるｍRNAを特定することができる。例えば、前記技術は、腫瘍発生で種々のステージにある極めて多くの腫瘍細胞の迅速なスクリーニングを可能にし、それによって腫瘍発生に密接に関連する重要な遺伝子を特定する方法を提供する。
【００６４】
本発明の実施に使用される試薬は個々に提供してもよいし、またキットの形態で包装されてあってもよい。例えば、１つもしくは２つ以上の第一の（例えば捕捉／増幅プローブ１）プローブおよび１つもしくは２つ以上の第二の（例えば増幅プローブ２）プローブを含み、さらに好ましくは適切な包括的プライマーを組み合わせたパッケージも含むキットを製造することができる。１つもしくは２つ以上の第一の（例えば捕捉／増幅プローブ１）プローブおよび１つもしくは２つ以上の第二の完全長で連結不要プローブ（例えば増幅プローブ２）を含むキットもまた製造することができる。さらにまた、１つもしくは２つ以上の第一の（例えば捕捉／増幅プローブ１）プローブおよび１つもしくは２つ以上の第二の完全長で連結依存環状プローブ（例えば増幅プローブ２）を含む他のキットも製造することができる。そのようなキットはまた、好ましくは適切な包括的プライマーを組み合わせたパッケージを含むことができる。場合によって、連結に必要な他の試薬（例えばDNAリガーゼ）および可能であれば増幅のための試薬を含むことができる。増幅させた連結増幅配列［例えばコントロール鋳型（例えばナノバリアントRNAに対応するオリゴデオキシリボヌクレオチド）］の定量的検出に使用されるさらに別の試薬もまた含むことができる。さらにまた、キットは、例えば組織サンプルでin situで標的核酸配列を検出するための試薬を含むことができる。環状プローブを含むキットはまた持ち越し防止のためのエキソヌクレアーゼを含むことができる。
キット容器内で試薬をどのようにアレンジするかは必要とされる個々の試薬によって左右されるであろう。各試薬は個々の容器に詰めてもよいが、種々にまとめることもまた可能である。
本発明を以下の実施例により例示するが、これら実施例は本発明の範囲を制限しようとするものではない。
【００６５】
実施例１：サンプル中のHIV-1 RNAの検出
オリゴヌクレオチドプローブの調製：
HIV-1RNAのgag領域を検出するために、一対のオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ（それぞれ捕捉／Amp-プローブ１(HIV)およびAmp-プローブ２(HIV)と称される）を、公知のオリゴヌクレオチド合成技術を用い自動DNA合成装置（Applied Biosystems, Inc.）で自動合成によって調製した。捕捉／Amp-プローブ１(HIV)は59ヌクレオチドおよび３’ビオチン部分を含む（前記ビオチン部分は最後の合成工程で３’ビオチン化ヌクレオシド三リン酸を用いることにより付加される）。本実施例で用いた捕捉／Amp-プローブ１(HIV)は以下のヌクレオチド配列を有する（さらにまた配列番号１として下記に列挙されている）：
1          11         21         31         41         51
5'-CCATCTTCCT GCTAATTTTA AGACCTGGTA ACAGGATTTC CCCGGGAATT CAAGCTTGG-3'
【００６６】
24位から59位のヌクレオチドはプローブの包括的３’末端を含む。この領域内にSmaI（CCCGGG）、EcoRI（GAATTC）およびHindIII（AAGCTT）のための認識配列がそれぞれヌクレオチド41−46、46−51および52−57に存在する。ヌクレオチド1−23を含む配列の５’部分は、HIV-1RNAのgag領域の一部分と相補的であり、前記とハイブリダイズする。
Amp-プローブ２(HIV)は、以下の配列（さらにまた配列番号２として下記に列挙されている）を有する92ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CTGTATGTAC TGTTTTTACT GG-3'
前記ヌクレオチドの71−92位はこのプローブの３’特異的部分を含み、前記部分は、捕捉／Amp-プローブ１(HIV)のヌクレオチド1−23と相補的なgag領域部分と直接隣接するHIV-1RNAのgag領域の１つの部分と相補的でこれとハイブリダイズすることができる。ヌクレオチド1−70はAmp-プローブ２(HIV)の包括的５’部分を含む。
【００６７】
T4DNAリガーゼによる捕捉／Amp-プローブ１(HIV)の５’末端とAmp-プローブ２(HIV)の３’末端との連結によって、以下の配列（配列番号３として下記にまた列挙されている）を有する連結増幅配列(HIV)が生成される：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CTGTATGTAC TGTTTTTACT GGCCATCTTC 
101        111        121        131        141        151
CTGCTAATTT TAAGACCTGG TAACAGGATT TCCCCGGGAA TTCAAGCTTG G-3'
この連結増幅配列は151ヌクレオチドの長さを有し、理想的なサイズのPCR用鋳型を提供する。
ヌクレオチド116−135（捕捉／Amp-プローブ１(HIV)のヌクレオチド24−43に由来）およびヌクレオチド１−70（Amp-プローブ２(HIV)のヌクレオチド１−70に由来）を含む前記連結増幅配列(HIV)の包括的ヌクレオチド配列は、Schaffnerら（J. Molec. Biol. 117:877-907(1977)）が記載したWSIナノバリアントRNAの（−）鎖のヌクレオチド１−90と配列が一致する。WSIは３つの６SRNA近縁種群（WSI、WSIIおよびWSIII）の１つであり、Qβレプリカーゼ反応で鋳型を付加することなく生成される。Schaffnerらは前記３つの分子を“ナノバリアント”と命名した。
【００６８】
WSI（−）鎖のヌクレオチド１−90に対応する長さが90ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドは以下の配列を有する（また配列番号４として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81                 
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CCTGGTAACA GGATTTCCCC-3'
２つの包括的オリゴデオキシヌクレオチドプライマーもまた連結増幅配列のPCR増幅で使用するために合成した。プライマー１（長さが21ヌクレオチドである）は捕捉／Amp-プローブ１(HIV)の３’配列（ヌクレオチド38−58）と相補的であり、以下の配列を有する（また配列番号５として下記に列挙される）：
1          11         
5'-CAAGCTTGAA TTCCCGGGGA A-3'
プライマー２（長さが20ヌクレオチドである）はAmp-プローブ２(HIV)の５’配列（ヌクレオチド１−20）と配列が一致し、以下の配列を有する（配列番号６として下記にまた列挙される）：
1          11
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC-3'
【００６９】
HIV-1RNAの捕捉と検出：
標的HIV-1RNA（100μL）を1.5ｍLのミクロフュージ管で等容積の溶解緩衝液に溶解させる。前記緩衝液は以下を含む：SM GnSCN、100ｍMのEDTA、200ｍMトリス塩酸（pH8.0）、0.5％NP-40（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）および0.5％BSA。次に、３’ビオチン化捕捉／Amp-プローブ１(HW)（配列番号１）およびAmp-プローブ２(HIV)（配列番号２）を、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Promega Corp.から入手）とともに前記溶解緩衝液中の溶解サンプルに添加した。標的RNA／捕捉／Amp-プローブ１(HIV)／Amp-プローブ２(HIV)／常磁性ビーズを含む複合体が形成され、ビーズ上に保持された。ミクロフュージ管ホルダーラック（Promega Corp.から入手）内の磁石によって生じた磁場を複合体に適用し、前記複合体を磁石に隣接する反応管の側部に保持し、未結合物質をサイフォンで除去することを可能にした。続いて複合体を２回1.5MのGnSCN緩衝液で洗浄し、一切の未結合タンパク質、核酸および複合体に閉じ込められる可能性があるプローブを除去した。前記磁場技術はこの洗浄工程を容易にした。続いて300ｍMのKCｌ緩衝液（300ｍMのKCｌ、50ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％ノニデットP-40、１ｍMのEDTA）で複合体を洗浄することによってGnSCNを除去した。
続いてT4DNAリガーゼ（Boehringer Manheim）を用いて前記２つのプローブを共有結合させて機能的な連結増幅配列(HIV)（配列番号３）を生成した（前記はPCR増幅のための鋳型として機能できる）。連結反応は、10ｘのT4DNAリガーゼ緩衝液（Boehringer Manheimから入手；660ｍMトリス塩酸、50ｍMのMgCl2、10ｍMジチオエリリトール、10ｍMのATP：20℃でpH7.5）の1:10希釈を含む１ｘの連結緩衝液の存在下で実施した。
【００７０】
複合体に結合した連結増幅配列(HIV)を含む常磁性ビーズを１ｘのT4DNAリガーゼ連結緩衝液で洗浄し、１ｘのT4DNAリガーゼ連結緩衝液100μLに再懸濁した。20μLのビーズ懸濁液を連結反応のために取り出した。２μLのT4DNAリガーゼを反応混合物に添加し、前記を37℃で60分インキュベートした。
前記結合した連結増幅配列(HIV)のPCR増幅のために、TaqDNAポリメラーゼを含むPCR反応混合物80μL、２つの包括的PCRプライマー（配列番号５および６）、デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物および32P-ｄCTPを前記連結反応に添加した。以下のように二温PCR反応を30サイクル実施した：ハイブリッド形成およびプライマー伸長を65℃で60秒実施し、変性は92℃で30秒実施した。
30サイクル後に、10ピコリットルの反応混合物を10％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付し、オートラジオグラフィーで検出した（図３、レーンA）。コントロールとして、ナノバリアントDNA（配列番号４）をまた前記連結増幅配列(HIV)の場合と同じ条件下で30サイクルの二温PCRに付し、電気泳動してオートラジオグラフィーを実施した（図３、レーンB）。図３に示したように、増幅された前記連結増幅配列(HIV)は単一バンド（151ヌクレオチド）として増幅ナノバリアントDNA（90ヌクレオチド）よりも遅い速度で泳動した。連結されなかった第一および第二のプローブはいずれも増幅も検出もされないことがまた前記結果で示された。
【００７１】
実施例２：サンプル中のHIV-1RNAの直接検出
サンプル中のHIV-1RNAの存在を直接検出する本発明の能力もまた決定された。本実施例で用いたプローブは実施例１と同じである（配列番号１および２）。直接検出の場合、Amp-プローブ２(HIV)（配列番号２）は、32P-γ-ATPを用いたT4ホスホキナーゼ反応によって32Pで前記プローブの５’末端で標識された。種々の反応混合物は以下のとおりであった：
１．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、３’ビオチン化捕捉／Amp-プローブ１(HIV)（配列番号１）、Amp-プローブ２(HIV)（配列番号２）５’（32P）、HIV-1RNA転写物。
２．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、３’ビオチン化捕捉／Amp-プローブ１(HIV)、Amp-プローブ２(HIV)５’（32P）。
３．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、Amp-プローブ２(HIV)５’（32P）、HIV-1RNA転写物。
上記３つの反応混合物の各々を用いて、ハイブリダイゼーションを20μLの１MのGnSCN緩衝液（１MのGnSCN、0.5％NP-40（ノニデットP-40、N-ラウリルサーコシン、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％ウシ血清アルブミンを含む）中で実施した。
反応混合物を37℃で60分インキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物を実施例１で述べたように磁場に置き、さらに１MのGnSCN緩衝液で２回（200p.L／洗浄）および300ｍMのKCｌ緩衝液（300ｍMのKCｌ、50ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％NP-40および1mMのBDTAを含む）で３回洗浄した。洗浄後常磁性ビーズに保持された32P標識Amp-プローブ２(HIV)の量をカウント／分（CPM）として表1に示す。前記の結果は、標的HIVRNAおよび捕捉／Amp-プローブ１(HIV)の両者が存在しているときのみ、顕著な量のAmp-プローブ２がビーズ上に保持され、β-シンチレーション計測装置で検出できることを示している。
表１：標的HIVRNAの捕捉／Amp-プローブ１(HIV)による捕捉
2005511030.tif 000003
【００７２】
実施例３：患者サンプル中の鳥型喀痰型結核菌（MAI）の検出
最近の報告（Boddinghaus et al., J. Clin. Microbiol. 28:175i, 1990）では、16SリボソームRNA（ｒRNA）の増幅による結核菌種の特定および種間識別の成功が記載された。増幅および特定のための標的として細菌の16SｒRNAを使用する利点は、Rogallら（J. Gen. Microbiol., 136:1915,1990）によって以下のように示された：１）ｒRNAは細菌のリボソームの必須の構成成分である；２）ｒRNA配列の比較分析はいくつかの高度に保存された配列ストレッチおよび顕著な変動性を有する他のストレッチを明らかにした；３）ｒRNAは大量のコピー数で存在し（すなわち103から104分子／細胞）、したがって感度の高い検出アッセイの開発を容易にする；４）16SｒRNAのヌクレオチド配列はクローニングを全く実施することなく容易に決定でき、ほとんどのマイコバクテリウム16SｒRNAの配列が公知である。
捕捉／Amp-プローブ１およびAmp-プローブ２の３対のプローブ対を、BoddinghausらおよびRogallらが報告した16SｒRNAの配列を基にして自動オリゴヌクレオチド合成（上記のとおり）によって調製する。第一のプローブ（MYC）対は、第一および第二のプローブの固有部分が全ての種のマイコバクテリアの16SRNAとハイブリダイズするという点で包括的であり、前記を用いて標本中の一切のマイコバクテリアの存在を検出する。第二のプローブ対（MAV）は鳥型結核菌の16SｒRNAに特異的であり、さらに第三のプローブ対（MIN）は喀痰型結核菌（M. intracellulaire）の16SｒRNAに特異的である。本方法の極めて特異的な連結反応によって、これら２つの種をただ１つのヌクレオチドレベルで識別することができる。
【００７３】
Ａ．全ての種のマイコバクテリウムの包括的検出に用いることができるプローブは実施例１のように第一および第二のプローブを含む。第一のプローブは３’ビオチン化捕捉／Amp-プローブ１（MYC）であり、以下の配列（また配列番号７として下記に列挙される）を有する長さが54ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである：
1          11         21         31         41        
5'-CAGGCTTATC CCGAAGTGCC TGGTAACAGG ATTTCCCCGG GAATTCAAGC 
51
TTGG-3'
前記プローブの５’末端のヌクレオチド１−18はマイコバクテリアの16SｒRNAの共通部分（すなわち全ての種のマイコバクテリウムに存在する16SrRNA配列）と相補的である。前記プローブの３’部分（ヌクレオチド19−54を含む）は、実施例１の捕捉／Amp-プローブ１(HIV)の包括的部分を含む36ヌクレオチドと配列が一致する。
第二のプローブはAmp-プローブ２（MYC）であり、以下の配列（また配列番号８として下記に列挙される）を有する長さが91ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG 
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CCGGTATTAG ACCCAGTTTC C-3'
前記プローブの３’末端のヌクレオチド71−91は、16SrRNAの共通部分と相補的であり、ヌクレオチド１−18または上記に開示した捕捉／Amp-プローブ１（MYC）と相補的な領域に隣接し、全ての種のマイコバクテリアに共通である。前記プローブの５’末端のヌクレオチド１−70は実施例１でAmp-プローブ２(HIV)について説明したものと同じ包括的配列を含む。
実施例1のように、２つのプローブの末端と末端との連結によって、長さが145ヌクレオチドの連結増幅配列（MYC）が全ての種のマイコバクテリアの検出のために提供され、以下の配列を有する（また配列番号９として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CCGGTATTAG ACCCAGTTTC CCAGGCTTAT
101        111        121        131        141
CCCGAAGTGC CTGGTAACAG GATTTCCCCG GGAATTCAAG CTTGG-3'
【００７４】
Ｂ．鳥型結核菌の特異的検出のためのプローブ対は以下のとおりである：
第一のプローブは３’ビオチン化−捕捉／Amp-プローブ１(MAV)であり、以下の配列（また配列番号10として下記に列挙される）を有する長さが56ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである：
1          11         21         31         41        
5'-GAAGACATGC ATCCCGTGGT CCTGGTAACA GGATTTCCCC GGGAATTCAA 
51       
GCTTGG-3'
５’末端のヌクレオチド１−20は鳥型結核菌に対して特異的な16SrRNAの１つの部分と相補的である。ヌクレオチド21−56は上記に述べた同じ包括的配列を含む。
第二のプローブはAmp-プローブ２（MAV）であり、以下の配列（また配列番号11として下記に列挙される）を有する長さが90ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CGCTAAAGCG CTTTCCACCA-3'
前記プローブの３’末端のヌクレオチド71−90は、鳥型結核菌に特異的な16SrRNAの領域と相補的な特異的ヌクレオチド配列を含み、捕捉／Amp-プローブ１（MAV）によって認識される特異的配列に隣接する。ヌクレオチド１−70は上記と同じ包括的配列を含む。
２つのプローブの末端と末端との連結によって長さが146ヌクレオチドの連結増幅配列（MAV）が鳥型結核菌の検出のために提供され、前記は以下の配列を有する（また配列番号12として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CGCTAAAGCG CTTTCCACCA GAAGACATGC
101        111        121        131        141       
ATCCCGTGGT CCTGGTAACA GGATTTCCCC GGGAATTCAA GCTTGG-3'
【００７５】
Ｃ．喀痰型結核菌（M. intracellulaire）の特異的検出用プローブ対は以下のとおりである：
第一のプローブは３’ビオチン化捕捉／Amp-プローブ１（MIN）であり、長さが56ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで以下の配列を有する（また配列番号13として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-AAAGACATGC ATCCCGTGGT CCTGGTAACA GGATTTCCCC GGGAATTCAA 
51        
GCTTGG-3'
前記５’末端のヌクレオチド１−20は、喀痰型結核菌に特異的な16SrRNAの１つの部分と相補的である。ヌクレオチド21−56は上記と同じ包括的配列を含む。
第二のプローブはAmp-プローブ２（MIN）で、オリゴデオキシリボヌクレオチドまたは長さが90ヌクレオチドで以下の配列を有する（また配列番号14として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CGCTAAAGCG CTTTCCACCT-3'
前記プローブの３’末端のヌクレオチド71−90は、喀痰型結核菌の16SrRNAの領域と相補的な特異的ヌクレオチド配列を含み、前記は捕捉／Amp-プローブ１（MIN）によって認識される特異的配列と隣接する。
前記２つのプローブの末端と末端との連結によって、長さが146ヌクレオチドの連結増幅配列（MIN）が喀痰型結核菌（M. intracellulaire）の検出のために提供され、以下の配列を有する（また配列番号15として下記に列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG 
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CGCTAAAGCG CTTTCCACCT AAAGACATGC 
101        111        121        131        141       
ATCCCGTGGT CCTGGTAACA GGATTTCCCC GGGAATTCAA GCTTGG-3'
【００７６】
Ｄ．上記のマイコバクテリアの菌種の存在を検出するために、患者の血液標本を小児科用アイソレーターチューブ（Wampole Laboratories, NJ）に採取した。前記アイソレーターによる溶解遠心技術によって血液成分を分離し、続いて白血球を溶解し、細胞内微生物の回収を容易にした（Shanson et al., J. Clin. Pathol. 41:687, 1988）。白血球溶解後に約120pLの濃縮材料を実施例１のGnSCN緩衝液（５M）の等容積中に溶解した。前記混合物を30分煮沸する。前記処理はマイコバクテリウムの細胞壁の性質のためにマイコバクテリアの菌種の溶解に要求される。その後の方法（すなわち捕捉、連結、PCRおよび検出）は実施例１で用いられものと同じである。
PCR増幅の前に、磁性ビーズに捕捉された32P-５’AMPプローブ２を表す放射能を測定することによって直接検出を実施する。未結合の放射能標識Amp-プローブ２を十分な洗浄で除去した後、106／反応を超える濃度で存在する標的16SrRNA分子を検出することができる。直接検出できない標的16SrRNAは、実施例１のように連結増幅配列のPCR増幅に付される。増幅で使用されるプライマーは実施例１の２つの包括プライマーと同じである（配列番号５および６）。
【００７７】
実施例４：サンプル中のHCVRNAの検出
C型肝炎ウイルス（HCV）（RINAウイルス）は、輸血後肝炎の原因因子である。HCVはフラビウイルスおよびペスチウイルスとは関係が薄いことが判明しており、したがってそのゲノムは５’および３’非翻訳領域（UTR）を有し、ただ１つの大きな開放読み枠をコードする（Lee et al., J. Clin. Microbiol. 30:1602-1604, 1992）。本発明の方法は、サンプル中のHCVの存在を検出するために有用である。
HCVRNAの５’UTRを標的とする一対のオリゴデオキシヌクレオチドプローブ（捕捉／Amp-プローブ１(HCV)およびAmp-プローブ２(HCV)とそれぞれ称される）が実施例１のように調製される。
その３’末端がビオチン化された捕捉／Amp-プローブ１(HCV)は55ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドで、以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号16として下記にもまた列挙される）：
1          11         21         31         41        
5'-GCAGACCACT ATGGCTCTCC CTGGTAACAG GATTTCCCCG GGAATTCAAG
51       
CTTGG-3'
捕捉／Amp-プローブ１(HCV)の５’末端のヌクレオチド１−19はHCVゲノムの５’UTRの１つの部分と相補的な特異的配列を含む。前記プローブの３’末端のヌクレオチド20−５は、実施例1の捕捉／Amp-プローブ１(HIV)と同じ36ヌクレオチドの包括的配列を含む。
Amp-プローブ２(HCV)は90ヌクレオチドの長さのオリゴデオキシリボヌクレオチドで、以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号17として下記にもまた列挙されている）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG 
51         61         71         81         
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CCGGTGTACT CACCGGTTCC-3'
ヌクレオチド71−90は前記プローブの３’特異的部分を含み、前記はHCVの５’UTRの１つの部分と相補的でこれとハイブリダイズすることができ、前記部分は捕捉／Amp-プローブ２(HCV)のヌクレオチド１−19とハイブリダイズすることができるHCVゲノムの部分に直接隣接する。ヌクレオチド１−70は実施例１のAmp-プローブ２(HIV)の場合と同じ包括的配列を含む。
実施例１のように、前記２つのプローブの末端と末端との連結によって145ヌクレオチドの長さの連結増幅配列(HCV)がサンプル中のHCV検出のために提供され、前記は以下の配列を有する（配列番号18として下記にまた列挙されている）：
1          11         21         31         41        
5'-GGGTTGACCC GGCTAGATCC GGGTGTGTCC TCTCTAACTT TCGAGTAGAG
51         61         71         81         91        
AGGTGAGAAA ACCCCGTTAT CCGGTGTACT CACCGGTTCC GCAGACCACT 
101        111        121        131        141     
ATGGCTCTCC CTGGTAACAG GATTTCCCCG GGAATTCAAG CTTGG-3'
前記連結増幅配列(HCV)は実施例１のように二温PCR反応を用いて増幅される。増幅に用いられるPCRプライマーは実施例１と同じ２つの包括的プライマー（配列番号５および６）である。
【００７８】
実施例５：サンプル中のHCVRNAを検出するために多種の捕捉および増幅プローブを使用する
サンプル中のHCVRNAをアッセイし検出するために一対の増幅プローブおよび２つの捕捉／増幅プローブを用い、それによってアッセイの捕捉効率を高めた。
前記捕捉増幅プローブの捕捉／増幅プローブ１(HCV-A)（実施例４のプローブ“（HCV）”と区別するために、本実施例に示す全てのオリゴマーは“（HCV-A）”と呼ぶ）は配列番号22を有し、捕捉／増幅プローブ１A(HCV-A)は配列番号23を有し、これらは、それらの５’末端がビオチン化され、さらにプローブの３’領域がHCVRNAの５’UTR内の配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができる配列を含むようにデザインされ合成される（図４）。標的核酸配列とハイブリダイズすることができないプローブの５’領域の包括的ヌクレオチド配列は、ランダム配列および少なくとも60％のGC含量をもつように、さらに二次元構造（例えばヘアピン構造またはホールドバック構造）が最小限になるようにデザインされ合成される。
捕捉／増幅プローブ１A(HCV-A)（前記は５’末端がビオチン化される）は45ヌクレオチドのDNAオリゴマーである。その３’領域のヌクレオチド４−45は標的HCVRNAの５’UTR内の配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができる。前記オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号22として下記にまた列挙されている）：
5'-AAGAGCGTGA AGACAGTAGT TCCTCACAGG GGAGTGATTC ATGGT-3'
捕捉／増幅プローブ1A(HCV-A)（前記はまたその５’末端がビオチン化される）もまた45ヌクレオチドのDNAオリゴマーであり、その３’領域のヌクレオチド４−45はHCVRNAの５’UTR内の配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができる（前記配列は捕捉／増幅プローブ１(HCV-A)とハイブリダイズすることができるHCVRNAの５’UTRの前記領域と直接隣接する）。前記オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号23として下記にまた列挙されている）：
5'-AAGACCCAAC ACTACTCGGC TAGCAGTCTT GCGGGGGCAC GCCCA-3'
２つの増幅プローブ、Amp-プローブ２(HCV-A)およびAmp-プローブ2A(HCV-A)は、各々HCVRNAの保存的５’UTRと相補的でこれとハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含む。
Amp-プローブ２(HCV-A)は51ヌクレオチドのオリゴマーであり、その５’領域のヌクレオチド１−30はHCVRNAの５’UTR内の配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができ、その３’末端のヌクレオチド34−51はPCRプライマー３と結合しこれとハイブリダイズする。前記オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号24として下記にまた列挙されている）：
5'-ACTCACCGGT TCCGCAGACC ACTATGGCTC GTTGTCTGTG TATCTGCTAA-3'
【００７９】
Amp-プローブ2A(HCV-A)は69ヌクレオチドのオリゴマーであり、その３’領域のヌクレオチド40−69はHCVRNAゲノムの５’UTR内の配列（前記配列はAmp-プローブ２(HCV-A)のヌクレオチド１−30とハイブリダイズすることができるHCVRNAゲノムの部分と直接隣接する）と相補的でありこれとハイブリダイズすることができ、さらに５’末端のヌクレオチド１−18はPCRプライマー４と結合しハイブリダイズし、さらに５’末端のヌクレオチド19−36はPCRプライマー５と結合しハイブリダイズし、さらにこのオリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号25として下記にまた列挙されている）：
5'-CAAGAGCAAC TACACGAATT CTCGATTAGG TTACTGCAGA GGACCCGGTC GTCCTGGCAA TTCCGGTGT-3'
２つのプローブの末端と末端との連結によって120ヌクレオチドの連結生成物、増幅反応のための鋳型としてさらにHCVのための検出可能な配列として機能する連結増幅配列(HCV-A)が提供され、前記は以下の配列を有する（配列番号26として下記にまた列挙されている）：
5'-CAAGAGCAAC TACACGAATT CTCGATTAGG TTACTGCAGA GGACCCGGTC GTCCTGGCAA TTCCGGTGTA CTCACCGGTT CCGCAGACCA CTATGGCTCG TTGTCTGTGT ATCTGCTAAC-3'
プライマー３（前記は、連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））の第一のPCR増幅シリーズのために使用され、さらに18ヌクレオチドの長さを有する）は、Amp-プローブ２(HCV-A)の３’末端のヌクレオチド34−51を含む配列と相補的であり、したがって連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））のヌクレオチド103−120を含む配列ともまた相補的であり、以下の配列を有する（配列番号27として下記にまた列挙されている）：
5'-GTTAGCAGAT ACACAGAC-3'
プライマー４（前記は、連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））の第一のPCR増幅シリーズのために使用され、さらに18ヌクレオチドの長さを有する）は、Amp-プローブ2A(HCV-A)の５’末端のヌクレオチド１−18を含む配列と相補的であり、したがって連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））のヌクレオチド１−18を含む配列ともまた相補的であり、以下の配列を有する（配列番号28として下記にまた列挙されている）：
5'-CAAGAGCAAC TACACGAA-3'
プライマー５（18ヌクレをチドのDNAオリゴマー）は、連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））の第二のPCR増幅シリーズのために使用され、Amp-プローブ2A(HCV-A)のヌクレオチド19−36を含む配列と相補的であり、したがって連結増幅配列（配列番号26（HCV-A））のヌクレオチド19−36を含む配列ともまたハイブリダイズすることができ、以下の配列を有する（配列番号29として下記にまた列挙されている）：
5'-TTCTCGATTA GGTTACTG-3'
【００８０】
上記のプローブおよびプライマーを利用するアッセイを用いて、24のヒト血清サンプル（使用まで-70℃で保存）中のHCVRNAを検出した。アッセイのために、180μLの血清を濃縮溶解緩衝液［溶解緩衝液（５MのGnSCN、0.5％ウシ血清アルブミン、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％ノニデットP-40を含む）を、GnSCNの最終濃度が５Mとなるように250μLの緩衝液を濃縮することによって調製した］に添加し、よく混合して37℃で１時間インキュベートし、HCV粒子から標的RNAを遊離させた。続いて前記溶解混合物の80μLを120μLのハイブリダイゼーション緩衝液［0.5％ウシ血清アルブミン、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％ノニデットP-40を含む］に移し、さらに、各々1010分子の増幅プローブ、Amp-プローブ２(HCV-A)およびAmp-プローブ2A(HCV-A)オリゴマー、並びに各々1011分子の捕捉／増幅プローブ、捕捉／Amp-プローブ１A(HCV-A)および捕捉／Amp-プローブ1A(HCV-A)を添加した。前記ハイブリダイゼーション緩衝液の添加によってグアニジンイソチオシアネート（GnSCN）の濃度は５Mから２Mに低下し、ハイブリダイゼーションを惹起させた。前記混合物を37℃で１時間インキュベートし、種々のプローブを標的RNAとハイブリダイズさせ、このとき30μLのストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Promega）を前記ハイブリダイゼーション混合物に添加し、その後37℃で20分インキュベーとしてリガンドを結合させた。次に、ビーズを150μLのGnSCN（２M）で洗浄し、一切の遊離プローブ、タンパク質、無関係の核酸および潜在的なPCR阻害物質をハイブリダイゼーション混合物から排除した。この後、150μLのリガーゼ緩衝液［66mMトリス塩酸（pH7.5）、１ｍMのDTT、１ｍMのATP、0.5％ノニデットP-40および１ｍMのMnCl2］で２回洗浄することによってGnSCNを除去した。各洗浄工程で、結合複合体の上清からの磁力による分離は実施例１で述べたように磁場技術によって実施した。
【００８１】
増幅プローブのAmp-プローブ２(HCV-A)およびAmp-プローブ2A(HCV-A)（前記は標的RNAに結合している）を続いて共有結合により結合させて連結増幅配列(HCV-A)を生成し、これをPCR増幅のための鋳型として利用した。前記ハイブリッド複合体を５単位のT4DNAリガーゼ（Boehringer）を含む20μLのリガーゼ緩衝液に再懸濁し、連結反応のために37℃で１時間インキュベートした。以下で“第一のPCR反応”と呼ぶこの後のPCR反応のために、10μLの連結混合物（ビーズを含む）を20μLのPCR混合物［各々0.06μMのプライマー３およびプライマー４、1.5単位のTaqDNAポリメラーゼ、各々0.2ｍMのｄATP、ｄCTP、ｄGTPおよびｄTTP、1.5ｍMのMgCl2、10ｍMトリス塩酸（pH8.3）、50ｍMのKCｌ］に添加し、前記混合物を95℃で30秒、55℃で30秒および72℃で１分の35サイクルによりインキュベートした。第一のPCR反応の後で、５μLの生成物を第二のPCR混合物［第一のPCR混合物と同じ成分であるが、ただしプライマー4はプライマー５で代替される］に移し、第一のPCR反応と同じ条件下で“第二のPCR反応”（アッセイの感度を高める半ネスト（semi-nested）PCR法）を実施した。第二の反応の生成物10μLを６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色し、紫外光の下で可視化した。
本方法の感度および特異性を確認するために、HCVRNAの濃度が10から107分子／反応となるように、HCV陰性血清中で10倍連続希釈した合成HCVRNAを上記のプロトコルにしたがってアッセイした。連結および増幅後、PCR生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色し、紫外光の下で可視化した。図８に示したように結果は本方法の特異性を明確に示した。HCVRNAの非存在下ではシグナルは存在せず、PCR生成物を生じるためにはプローブは標的RNAを捕捉する必要があることが示された。サンプル当たりわずかに100分子のHCVRNAをこの半ネストPCR法(図８)により検出することが可能で、本方法の感度は通常のRT-PCR（Clementi et al., 1993, PCR 2:191-196）の感度に少なくとも匹敵することが示された。
さらにまた、図８で可視化されているように、バンドの濃度によって示されるPCR生成物の相対量は標的RNA（HCVRNA転写物）の量と比例していた。したがって、本アッセイは少なくとも102から105の標的分子の範囲で定量的である。
２つの捕捉プローブによって達成される捕捉効率の増加を決定するために32Pで標識した標的HCVRNAを、捕捉／Amp-プローブ１(HCV-A)または捕捉／Amp-プローブ1A(HCV-A)またはその両者を用いて常磁性ビーズ上での捕捉および保持についてアッセイした。前記捕捉は、２MのGnSCN緩衝液およびリガーゼ緩衝液による徹底的な洗浄後に常磁性ビーズに保持された放射能の量によって概算した。その結果によれば、捕捉／Amp-プローブ１(HCV-A)単独により捕捉したときは標識HCVRNAの25.7％がビーズ上に保持され、捕捉／Amp-プローブ１A(HCV-A)単独により捕捉したときは35.8％が保持され、両捕捉プローブを用いたときは標的RNAの41.5％が保持されることが示された。したがって、本二重捕捉法はただ１つの捕捉プローブを使用するよりも効率が高い。
【００８２】
実施例６：サンプル中のHIV-1RNAを検出するために多種の捕捉および増幅プローブを使用する
実施例１で説明したアプローチとはまた別のアプローチでは、補足／増幅プローブおよび一対の増幅プローブを使用しHIV-1RNAの存在が検出される。捕捉／Amp-プローブ１(HIV)（配列番号１）および一対の増幅プローブであるAmp-プローブ２(HIV-A)（実施例１のプローブ“（HIV）”と区別するために本実施例で述べる全てのオリゴマーは“（HIV-A）”と呼ぶ）（配列番号19）およびAmp-プローブ2A(HIV-A)（配列番号20）が利用され、前記は、連結増幅配列(HIV-A)（配列番号21）の包括的ヌクレオチド配列［Amp-プローブ２(HIV-A)のヌクレオチド１−26に由来するヌクレオチド１−26およびAmp-プローブ2A(HIV-A)のヌクレオチド40−65に由来するヌクレオチド86−112を含む］がランダム配列および少なくとも60％のGC含量をもつようにデザインされ合成され、さらにそれらは、二次構造（例えばヘアピン構造またはホールドバック構造）が最小限となるようなものである。
増幅プローブのAmp-プローブ２(HIV-A)は47ヌクレオチドのDNAオリゴマーで、その３’領域のヌクレオチド27−47が標的HIV-1RNAのgag領域内の配列と相補的でこれとハイブリダイズできるものであり、さらに前記オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号19として下記にまた列挙されている）：
5'-GGTGAAATTG CTGCCATTGT CTGTATGTTG TCTGTGTATC TGCTAAC-3'
増幅プローブのAmp-プローブ2A(HIV-A)は65ヌクレオチドのオリゴマーで、その５’領域のヌクレオチド１−39が標的HP/-1RNAのgag領域内の配列と相補的でこれとハイブリダイズでき、前記はAmp-プローブ２(HIV-A)のヌクレオチド27−47とハイブリダイズできるHP/-1RNAゲノムの部分と直接隣接し、さらに前記オリゴマーは以下のヌクレオチド配列を有する（配列番号20として下記にまた列挙されている）：
5'-CAAGAGCAAC TACACGAATT CTCGATTAGG TTACTGCAGC AACAGGCGGC CTTAACTGTA GTACT-3'
前記２つの増幅プローブの末端と末端との連結によって、112ヌクレオチドの連結増幅配列(HIV-A)が提供される。前記配列は、HP/-1RNAのための検出可能な配列として機能するとともに増幅反応のための鋳型としても機能し、さらに以下の配列を有する（配列番号21として下記にまた列挙されている）：
5'-GGTGAAATTG CTGCCATTGT CTGTATGTTG TCTGTGTATC TGCTAACCAA GAGCAACTAC ACGAATTCTC GATTAGGTTA CTGCAGCAAC AGGCGGCCTT AACTGTAGTA CT-3'
さらにまた、HIVRNAをアッセイするために、捕捉された連結生成物の捕捉、検出および場合によって増幅を実施例５に記載したように実施する。増幅に用いたPCRプライマーは実施例５のプライマー３、４および５（配列番号27、28および29）と同じである。
【００８３】
実施例７：サンプル中のHCVRNAを検出するために切り離された捕捉／増幅プローブおよび連結不要のただ１つの増幅プローブを使用する
本アッセイは、サンプル中のHCVRNAを検出するためにただ１つの連結不要増幅プローブおよび２つの捕捉／増幅プローブを使用する。
本方法で用いられる捕捉／増幅プローブ［捕捉／Amp-プローブ１(HCV-A)および捕捉／Amp-プローブ1A(HCV-A)］は実施例５で述べたものと同じである。
増幅プローブであるAmp-プローブ２(HCV-B)（配列番号30）（実施例４のプローブ“（HCV）”と区別するために本実施例に記載する全てのオリゴマーは“（HCV-B）”と呼ぶ）は100ヌクレオチドのDNA分子で、このオリゴマーの中央領域のヌクレオチド39−79によって表される配列はHCVRNAの５’UTR内の領域と相補的でこれとハイブリダイズでき、さらに５’末端内のヌクレオチド１−38および３’末端のヌクレオチド80−100に広がる配列は、それらがランダムな配列および少なくとも60％のGC含量をもつように、さらにそれらが最少の二次構造（例えばヘアピン構造およびホールドバック構造）を示すようにデザインされ合成される。Amp-プローブ２(HCV-B)（また増幅配列とも称される）は以下の配列を有する（配列番号30として下記にまた列挙されている）：
5'-CAAGAGCAAC TACACGAATT CTCGATTAGG TTACTGCAGC GTCCTGGCAA TTCCGGTGTA CTCACCGGTT CCGCAGACCG TTGTCTGTGT ATCTGCTAAC-3'
前記プローブ配列の捕捉、検出および場合によって増幅は実施例５に記載したように実施したが、ただしプライマー３および４はただ1回のPCR増幅工程で用い、第二のPCR工程は省略し、さらに連結工程も省いた。
【００８４】
実施例８：サンプル中のHCVRNAを検出するために分離されてある捕捉／増幅プローブおよびただ１つの増幅可能な連結依存プローブを使用する
本実施例の方法は、２つの捕捉／増幅プローブとして実施例５で述べた捕捉／Amp-プローブ１(HCV-A)および捕捉／Amp-プローブ1A(HCV-A)、並びにただ１つの増幅プローブであるAmp-プローブ２(HCV-C)（実施例４のプローブ“（HCV）”と区別するために本実施例に記載する全てのオリゴマーは“（HCV-C）”と呼ぶ）（前記は標的核酸とハイブリダイズし、さらに図７に示すようにその遊離末端の連結に際して環状化する）を利用する。
Amp-プローブ２(HCV-C)は108ヌクレオチドの増幅プローブであり（また増幅配列とも称される）、このオリゴマーの５’末端のヌクレオチド１−26は標的HCVRNAの５’UTRの配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができ（図7の（a）で示されている）、さらにこのオリゴマーの３’末端のヌクレオチド83−108は標的HCVRNAの５’UTR内の配列と相補的でこれとハイブリダイズすることができるようなものである。さらにまた、前記プローブが標的HCVRNAとハイブリダイズするとき、前記プローブの３’および５’末端は互いに直接隣接するように配置され（図7）、連結物質（例えばDNAリガーゼ）による連結に際して閉環状分子が生成される。Amp-プローブ２(HCV-C)の配列は以下のとおりである（また配列番号31として列挙されている）：
5'-CCTTTCGCGA CCCAACACTA CTCGGCTGTC TGTGTATCTG CTAACCAAGA GCAACTACAC GAATTCTCGA TTAGGTTACT GCGCACCCTA TCAGGCAGTA CCACAAGG-3'
【００８５】
プライマー３（配列番号27）（連結して環状化されたAmp-プローブ２(HCV-C)の第一のPCR増幅シリーズで用いられる）は、Amp-プローブ２(HCV-C)のヌクレオチド27−45を含む配列と相補的な18ヌクレオチドの長さのオリゴマーである。
プライマー４（配列番号28）（前記もまた連結して環状化されたAmp-プローブ２の第一のPCR増幅シリーズで用いられる）は、Amp-プローブ２(HCV-C)のヌクレオチド46−63を含む配列と相補的な18ヌクレオチドの長さのオリゴマーである。
標的HCVRNAと前記２つの捕捉／増幅プローブおよび増幅プローブのハイブリダイゼーション、前記増幅プローブ末端の連結時における前記増幅プローブの環状化、および前記プローブ配列の増幅は実施例５に記載したように実施したが、ただしプライマー３および４はただ1回のPCR増幅工程で用い、第二のPCR工程は省略し、さらにAmp-プローブ２(HCV-C)（配列番号31）を実施例５で用いた増幅プローブ対のAmp-プローブ２(HCV-A)（配列番号24）およびAmp-プローブ2A(HCV-A)（配列番号25）の代わりに用いた。
本方法の感度および特異性を確認する目的で、103から107分子／サンプルの範囲のHCVRNA標準濃度を提供するためにHCV陰性血清中で10倍連続希釈した合成HCVRNAを本方法にしたがってアッセイした。連結および増幅後、PCR生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色し、紫外光の下で可視化した。
その結果（図９、（−）：コントロール、サンプル無し）本方法の特異性が示された。本アッセイは高度に特異的である。すなわち、HCVRNAの非存在下では目に見えるシグナルは存在せず、PCR生成物を生じるためにはプローブは標的RNAを捕捉する必要があることが示された。図９に示されているように、サンプル当たり104分子のHCVRNAが明瞭に検出できる。
さらにまた、バンドの濃度（図９）によって示されるPCR生成物の相対量は標的RNA（HCVRNA転写物）の量と比例していた。したがって、本アッセイは少なくとも104から107の標的分子の範囲で極めて定量的である。
【００８６】
実施例９：LD-PCRアッセイによる組織サンプル中のHCV標的配列の検出
本実施例は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）肝臓サンプル中のHCV配列の検出について、本発明の連結依存PCR（LD−PCR）と逆転写酵素PCR（RT-PCR）との比較を提供する。Mount Sinai Medical Center（New York, NY）で1992年の1月から1995年の3月までに肝切除または正常位肝移植を受けた患者の肝細胞性癌腫（HCC）の21例の保存肝標本を本実験に選択した。第二世代の酵素結合免疫アッセイ（ELA-II）（Abbott Diagnostics, Chicago, IL）によって決定したとき、前記患者のうち13人は抗HCV陽性であり、8人は陰性であった。胆管閉鎖による二次性肝硬変を有する抗HCV陰性患者の対外移植肝組織をコントロールとして用いた。手術後、肝標本は4℃に保存し、12時間以内に切片を作製した。標本は10％緩衝ホルマリンで８から12時間固定し、通常のとおりパラフィン包埋を実施した。FFPE標本は室温で3ヶ月から3年まで保存した。さらにまた、22人のうち13人の患者から得た瞬間凍結肝組織（-70℃で保存）を用いてLD-PCRとRT-PCRの結果の不一致を分析した。
使い捨て替え刃を用いてFFPE標本（約2−4cm2）を10μmの厚さにミクロトームで切り出し、各切片を1.5ｍLの微量遠心管に入れた。相互汚染を防止するために、各サンプル間で刃を交換し、ホルダーは10％のクロロックス（Chlorox）溶液で洗浄した。前記切片を１ｍLのキシレン（Sigma）の存在下で60℃で10分インキュベートしてパラフィンを除去した。無水アルコールで2回洗浄してキシレンを除去した。続いて標本を真空遠心によってまたはホットブロック（65℃、30分）上に静置することによって乾燥させた。
LD-PCRの場合、脱パラフィン組織は、250μLの溶解緩衝液［5Mチオシアン酸グアニジウム（GnSCN）（Fluka）、0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma）、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム（Sigma）を含む］に100℃で30分、続いて65℃で30分インキュベートして溶解した。前記溶解標本を-20℃で使用まで保存した。全ての標本のHCVの血清学的状態は、先入観を避けるために実験者らには隠されていた。
RT-PCRの場合は、脱パラフィン組織は200μLの溶解緩衝液［10ｍMトリス塩酸（pH8.0）、0.1ｍMのEDTA（pH8.0）、２％ドデシル硫酸ナトリウムおよび500μg/ｍLプロテイナーゼKを含む］中で60℃で５時間インキュベートして溶解した。RNAをフェノールおよびクロロホルム抽出し、続いて0.1容積の酢酸ナトリウム（3M）の存在下で等容積のイソプロパノールで沈殿させることによって精製した。RNAペレットを70％エタノールで1回洗浄し、乾燥させて30μLの滅菌ジエチルピロカーボネート処理水に再懸濁した。RNAはまた、文献（Chomczynski et al., 1987, Anal. Biochem. 162:156）に記載された単工程RNA抽出法を用いて対応する患者から得られた凍結肝組織切片（10nmの厚さ）からも抽出した。
【００８７】
LD-PCRは以下のように実施した。簡単に記せば、80μLの溶解混合物を120μLのハイブリダイゼーション緩衝液［0.5％ウシ血清アルブミン、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム］に添加した。前記緩衝液は1010分子のリン酸化Amp-プローブ２、1010分子のAmp-プローブ2A、並びに1011分子の捕捉Amp-プローブ１および捕捉Amp-プローブ1Aを含んでいた（プローブは実施例５に記載されたとおりである）。ハイブリダイゼーション緩衝液の添加によってGnSCN濃度は５Mから２Mに低下し、ハイブリダイゼーションが惹起される。この混合物を１時間インキュベートしてハイブリッドを形成させる。前記ハイブリッドはそれらの標的HCVRNAと結合した２つのDNA捕捉プローブおよび２つのDNAヘミプローブから成る。30μLのストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Promega）を前記混合物に添加し、37℃で20分インキュベートしてビーズの表面に前記ハイブリッドを結合させた。続いてビーズを150μLの洗浄緩衝液［10ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％ノニデットP-40および1.5ｍMのMgCl2および50ｍMのKCｌ］で２回洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブとともにGnSCN、タンパク質、核酸および一切の潜在的なPCR阻害物質を除去した。各洗浄の間、アッセイ管を磁力分離スタンド（Promega）に静置することによってビーズをアッセイ管壁に引き寄せ、吸引による上清の除去を可能にした。続いて前記ハイブリッドを20μLのリガーゼ溶液［66ｍMトリス塩酸（pH7.5）、１ｍMジチオスレイトール、１ｍMのATP、1ｍMのMnCl2、５ｍMのMgCl2および５単位のT4DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim）］に再懸濁し、37℃で1時間インキュベートし、前記RNA標的上の隣接する位置にハイブリダイズしたプローブを共有結合で連結させ、したがって実施例５に記載された連結増幅プローブが生成される。続いて、10μLの連結反応混合物（ビーズを含む）を20μLのPCR混合物に移した。前記PCR混合物は以下を含む：0．66μMのPCRプライマー３および0.66μMのPCRプライマー４（前記は実施例で述べたとおり）、1.5単位のTaqDNAポリメラーゼ、0.2ｍMのdATP、0.2ｍMのdCTP、0.2ｍMのdGTP、0.2ｍMのdTTP、1.5ｍMのMgCl2、10ｍMトリス塩酸（pH8.3）および50ｍMのKCｌ。第一のPCR反応物は90℃で30秒、55℃で30秒および72℃で1分の35サイクルによりジーンアンプPCRシステム9600サーモサイクラー（Perkin-Elmaer, Norwalk, CT）でインキュベートした。第一のPCRの後で、各反応混合物の５μLを30μLの第二のPCR混合物に移した。前記第二のPCR混合物は同じ成分を含むが、ただし0.66μMのPCRプライマー３および0.66μMのPCRプライマー５をセミネストPCRのために用いた。第二のPCR反応は第一のPCR反応と同じプロトコルで実施した。10μLの第二のPCR反応を６％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分析し、臭化エチジウムで染色した後紫外蛍光によって可視化した。第二のPCR生成物について102塩基対バンドの存在を陽性結果と考えた。全ての検査を二重に実施し、サンプルの血清学的状態を知らせないで実施した。
【００８８】
RT-PCRはAbeら（International Hepatology Communication, 1994, 2:352）の方法にしたがって実施した。簡単に記せば、各標本のRNA懸濁物15μLを鋳型として用いてHCVRNAおよびβアクチンRNAを検出した。βアクチンRNAは細胞RNAの陽性内部コントロールとして使用した。RT-PCRのために用いたアウタープライマーの配列は、HCVRNAについては、5'-GCGACACTCCACCATAGAT-3'（センス）（配列番号32）および5'-GCTCATGGTGCACGGTCTA-3'（アンチセンス）（配列番号33）並びにβアクチンRNAについては、5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCT-3'（センス）（配列番号34）および5'-CGCTCATTGCCAATGGTGATGACCT-3'（アンチセンス）（配列番号35）である。インナープライマーの配列は、HCVRNAについては、5'-CTGTGAGGAACTACTGTCT-3'（センス）（配列番号36）および5'-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3'（アンチセンス）（配列番号37）並びにβアクチンRNAについては、5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT-3'（センス）（配列番号38）および5'-TCACGCACGATTTCCCGC-3'（アンチセンス）（配列番号39）である。第一のPCR反応では逆転写工程を同じ反応管で一緒に実施した。前記反応管は以下のように調製した反応緩衝液50μLを含む：20単位のRnase阻害剤（Promega）、100単位のモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Gibco BRL）、各々100ngのアウタープライマー、各々200μMの4種のデオキシヌクレオチド、１単位のTaqDNAポリメラーゼ（Boehringer Manheim）および１ｘのTaq緩衝液（1.5ｍMのMgCl2を含む）。サーモサイクラーのためのプログラムは以下のとおりであった：最初の逆転写工程のために先ず初めにサンプルを37℃で50分インキュベートし、続いて94℃1分、55℃1分および72℃2分から成る35サイクルを実施する。第二のPCRのために、前記第一のPCR生成物の5μLを反応管に添加した。前記反応管は、第一のPCR反応のように各インナープライマー、デオキシヌクレオチド、TaqDNAポリメラーゼおよびTaq緩衝液を含むが逆転写酵素とRnase阻害剤は含まない第二のセットを含んでいた。第二のPCR反応は第一のPCR反応と同じプロトコルで同じであったが、最初の37℃50分のインキュベーションは実施しなかった。このPCR生成物20μLを２％アガロースゲルによる電気泳動で調べた。HCVRNAおよびβアクチンRNAの陽性結果は、それぞれ268塩基対および307塩基対として第二のPCR生成物の存在によって示された。
【００８９】
LD-PCRおよびRT-PCRの結果は下記の表２に示す。
表２：LD-PCRとRT-PCRの比較
2005511030.tif 000004
a：FFPE，ホルマリン固定パラフィン包埋肝組織
b：未固定、対応するFFPE標本の瞬間凍結肝組織
c：連結依存PCRにより陽性（＋）または陰性（−）と判定されたFFPE標本の数
d：逆転写PCRにより陽性（＋）または陰性（−）と判定されたFFPE標本の数
e：未固定凍結組織を用いたRT-PCRによって確認された標本の数
f：７つの未固定標本のみが確認RT-PCR検査に利用可能であった
g：７つの未固定標本のみが確認RT-PCR検査に利用可能であった
【００９０】
22のFFPE標本のうちで、13がEIAアッセイでHCV陽性の患者から得られ、９例がHCV陰性であった（表２）。HCVRNAは、LD-PCRでは１３例の全ての血清陽性FFPE標本で検出されたが、一方、RT-PCRでは５例のみが陽性であった。確認のために、７例から入手できた未固定凍結肝標本をRT-PCRで調べた。これら７例のうち、同じ標本のFFPE組織を用いたとき、LD-PCRによってHCV-RNAが全７例で検出できたが、RT-PCRでは１例のみで陽性であった。しかしながら、凍結組織でのRT-PCRによって全ての事例でHCV-RNAの存在が確認された。βアクチンｍRNAは全ての対応する標本で検出され、RNA分解が極めて少ないことが示された。これらの結果によって、ホルマリン固定中、パラフィン包埋工程中、および３年までの保存中にHCVRNAが保存されることが確認された。FFPE標本に対するRT-PCRの全体的な感度は本実験では23.8％（5／21）であったが、一方、El-Batononyら（J. Med. Virol. 43:380(1994)）およびAbeらの以前の実験ではそれぞれ58.6％および84％と決定された。これらの値における大きな相違はこれら実験での標本の選択における相違のためであった（本実験については8例のRT-PCR陰性および5例の陽性組織が選択された）。８つのHCV血清陰性肝標本の中で、原発性胆管性肝硬変の2人の患者、アルコール性肝硬変を有する2人、B型肝炎ウイルス（HBV）性肝硬変を有する2人、原因不明の肝硬変を有する1人の患者からHCCを有する7例、および胆管閉鎖を有する小児からHCCをもたない1例を取り出した（表3）。これら７例のHCC肝標本の中で、LD-PCRによって5例はHCV陽性と判定されたが、RT-PCRではいずれも陽性と判定されなかった。胆管閉鎖を有する標本は両PCR検査で陰性のままであった。この矛盾を解析するために、RT-PCRを7例の未固定凍結組織標本で実施した。結果は下記の表3で説明する。
【００９１】
表３：HCV血清陰性事例で検出されるHCVRNA
2005511030.tif 000005
a：種々の診断を受けた患者の肝臓標本：PBC−原発性胆管性肝硬変、アルコール性−アルコール性肝硬変、HBV−B型肝炎抗原陽性、原因不明−原因不明肝硬変
b：FFPE−ホルマリン固定パラフィン包埋肝組織
c：未固定−対応するFFPE標本の瞬間凍結未固定肝組織
d：LD-PCRまたはRT-PCRによってHCVRNA陽性と判定されたFFPE標本の数
e：未固定凍結組織を用いてRT-PCRによって確認された標本の数
g：確認RT-PCR検査のための未固定標本は2例のみ入手可能であった。
N/D：実施せず、新鮮な凍結標本は入手できなかった。
未固定組織でのRT-PCRの結果によってLD-PCRの結果が確認され、血清検査による偽陰性結果を示唆した。さらにまた、FFPE標本においてLD-PCRおよびRT-PCRの両検査で陰性と判定されたPBC標本の１つは、未固定凍結標本でRT-PCRによって陽性であり、FFPE標本での両PCRによる偽陰性結果が示唆された。これらの結果は、HCV血清陰性HCCでHCVRNAの高い検出率が認められること（6／8、75％）（表3）、およびHCV血清陽性および血清陰性の両HCC標本における全体的陽性率は86％（18／21）であることを示している。FFPEおよび未固定標本の切片作製並びにPCRアッセイは２つの別々の実験室で実施されたので、夾雑があったとは考えにくい。さらに、標本調製および適切な陰性コントロールによるPCR検査で細心の注意が払われた。FFPE標本のLD-PCRおよび新鮮な凍結標本でのRT-PCRとの間における全体的一致は極めて高く、LD-PCRの感度は95％（18／19）である。
前述の結果は、ホルマリン固定によって生じる架橋は新生DNA鎖の逆転写酵素による鎖の伸長を破壊し、FFPE組織におけるRT-PCRの感度の低下をもたらすことを示している。対照的に、LD-PCRは架橋鋳型のプライマー伸長工程を迂回してプローブ配列を増幅させる。さらにまた、増幅プローブは30ヌクレオチドの長さの相補性領域をもつだけで、したがって架橋されていない領域にアクセスし易い。LD-PCRはしたがってFFPE標本でのHCVRNAの検出でより高い感度を達成できる。高い感度をもつ本アッセイの価値は前述の結果から確認され、これは、血清陰性標本においてさえHCVRNAの検出率が高いことによって証明された。
【００９２】
実施例10：環状増幅配列上でのプライマーの伸長−置換
本実施例は、DNAポリメラーゼのクレノーフラグメントが下流の鎖を置換してポリマーを生成する能力を有することを示す。
合成DNA標的は以下のようにして検出された：1012分子の配列番号31を有するリン酸化された環状化可能プローブと1013分子の合成HCVDNA標的を１ｘの連結緩衝液10μL中で混合し、65℃で２分加熱し、さらに室温で10分間冷却する。1μLのリガーゼを前記混合物に添加し、37℃で１時間インキュベートし、続いて配列番号27を有する32P標識Ext-プライマー1013分子を添加した。前記混合物を100℃で５分加熱し、続いて室温で20分冷却した。40μLのクレノーミックスおよびｄNTPを前記反応に添加し、37℃でインキュベートした。10μLの部分標本を0、1、2および3時間で取り出し、８％ポリアクリルアミドゲルで調べた。結果は図18に示されている。左のレーンはリガーゼ非存在下の結果を表している。右のレーンは連結後の伸長を表している。105から600塩基の範囲のバンドを右のレーンで観察することができる。前記結果は、クレノーフラグメントがExt-プライマーから伸長し、下流の鎖を置換してポリマーを生成する能力を有することを示している。
【００９３】
実施例11：連結依存PCRによる耳下腺多形腺腫内のEBV初期RNA（EBER-1）の検出
環状化プローブを用いるLD-PCRを実施し、エプスタイン＝バーウイルスの初期RNA（EBER-1）を唾液腺の良性混合腫瘍（BMT）内で検出した。BMTおよび隣接する耳下腺組織の６つの標本、および正常な耳下腺組織の３つの標本（２つは嚢胞から１つは過形成リンパ節から採取した）を凍結組織切片用の包埋媒体（OCT, Miles, Inc., Elkhart, In.）および液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保存した。対応するホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを入手し、前記新鮮組織と平行して調べた。全ての組織の切片をミクロトームで作製し、各事例間で刃を10％クロロックスで清浄にし相互汚染を回避した。各標本の２から３切片を1.5ｍLの微量遠心管に入れた。FFPE組織は１ｍLのキシレン（Sigma）とともに60℃で10分インキュベートすることによってパラフィンを除去し、続いてキシレンを無水アルコールで２回洗浄して除去した。これらの標本を65℃のホットブロック上に30分静置して乾燥させた。脱パラフィン組織を100℃で30分、続いて65℃で30分、250μLの溶解緩衝液中でインキュベートすることによって溶解させた。前記溶解緩衝液は以下を含む：５Mのチオシアン酸グアニジウム（GTC）（Fluka）、0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma）、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム（Sigma）。新鮮凍結組織は37℃で60分同じ溶解緩衝液でインキュベートして溶解させた。前記溶解標本を-20℃で使用まで保存した。
EBER-1の領域と側面を接するようにデザインした２つの捕捉／増幅プローブを用いて標的RNAを捕捉した。捕捉プローブ１（配列番号40）および捕捉／増幅プローブ２（配列番号41）のための配列は表４に示されている。環状増幅プローブ（配列番号42）は、選択した標的配列と相補的な３’および５’領域をもつようにデザインした（表４）。非相補性リンカー配列が前記２つの領域の間に介在する。標的のハイブリダイゼーションに際して、その５’および３’末端が並列するような態様でこの環状増幅プローブは環状化した。このリンカー配列（また表４に示されている）に誘導されるプライマー対を用いてセミネストPCRを実施した。
【００９４】
表4：捕捉プローブ、増幅可能環状標的プローブおよびPCRプライマーの配列
EBER-Cap/Amp-1
5'ビオチン-AAGAgtctcctccctagcaaaacctctagggcagcgtaggtcctg-3'（配列番号40）
EBER-Cap/Amp-2
5'ビオチン-AAGAggatcaaaacatgcggaccaccagctggtacttgaccgaag-3'（配列番号41）
環状増幅プローブ
5'tcaccacccgggacttgtacccgggacTGTCTGTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGAATTCTCGATTAGGTTACTGCgggaagacaaccacagacaccgttcc-3'（配列番号42）
第一のPCRのプライマー対
GTTAGCAGATACACAGAC           （センス配列番号27）
CAAGAGCAACTACACGAA           （アンチセンス配列番号28）
第二のPCRのプライマー対
GTTAGCAGATACACAGAC           （センス配列番号27）
TTCTCGATTAGGTTACTG           （アンチセンス配列番号29）
（小文字：EBER-1と相補性、大文字：包括的にデザインされてある）
【００９５】
簡単に記せば、80μLの溶解混合物を120μLのハイブリダイゼーション緩衝液［0.5％ウシ血清アルブミン、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム（Sigma）］に添加した。前記緩衝液は1010分子のリン酸化標的プローブ並びに1011分子の捕捉プローブ１および捕捉プローブ２を含んでいた。ハイブリダイゼーション緩衝液の添加によってGnSCN濃度は５Mから２Mに低下し、ハイブリダイゼーションが惹起される。この混合物を１時間インキュベートしてハイブリッドを形成させる。前記ハイブリッドはその標的RNAとハイブリダイズした２つのDNA捕捉／増幅プローブおよび１つのDNA環状増幅プローブから成る。30μLのストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Promega）を前記混合物に添加し、37℃で20分インキュベートしてビーズの表面に前記ハイブリッドを結合させた。ビーズを150μLの洗浄緩衝液［10ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％ノニデットP-40および1.5ｍMのMgCl2および50ｍMのKCｌ］で２回洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブとともに潜在的なPCR阻害物質（GTC、タンパク質）および非特異的PCR生成物の潜在的供給源（細胞の核酸）を除去した。各洗浄の間、反応管を磁気分離スタンド（Promega）に静置することによってビーズをアッセイ管壁に引き寄せ、吸引による上清の除去を可能にした。前記RNA標的上で互いに直接隣接してハイブリダイズした環状増幅プローブの３’および５’末端を共有結合で連結させ、上述のように20μLのリガーゼ溶液中で37℃で１時間インキュベートすることによって環状化させた。前記リガーゼ溶液は以下を含む：66ｍMトリス塩酸（pH7.5）、１ｍMジチオスレイトール、１ｍMのATP、１ｍMのMgCl2および５単位のT4DNAリガーゼ（Boerhinger）。10μLの連結反応混合物（常磁性ビーズを含む）を20μLのPCR混合物に移した。前記PCR混合物は以下を含む：0．66μMのPCRプライマー、0.5単位のTaqDNAポリメラーゼ、0.2ｍMのdATP、0.2ｍMのdCTP、0.2ｍMのdGTP、0.2ｍMのdTTP、1.5ｍMのMgCl2、10ｍMトリス塩酸（pH8.3）および50ｍMのKCｌ。第一のPCR反応は94℃で30秒、55℃で30秒および72℃で1分の35サイクルでジーンアンプPCRシステム9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer, CT）でインキュベートした。第一のPCRの後で、各反応混合物の５μLを25μLの第二のPCR混合物に移した。前記第二のPCR混合物は同じ成分を含むが、ただし0.66μMのPCRプライマー１および0.66μMのPCRプライマー３をセミネストPCRのために用いた（セミネストPCRは増幅特異性を損なうことなくシグナル検出感度を高める）。実際、モノマー単位に消化することなく、PCRポリマー生成物はポリアクリルアミドゲル中に泳動することはできない。10μLの第二のPCR反応物を制限エンドヌクレアーゼEcoRIで、50ｍMのNaCl、100ｍMトリス塩酸（pH7.5）、10ｍMのMgCl2、0.025％のトリトンX-100の存在下で消化し、さらに６％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分析し、臭化エチジウムで染色した後紫外蛍光によって可視化した。90塩基対バンド（第二のPCR生成物）および108塩基対生成物（第一のPCR）の存在を陽性結果と考えた。結果の要旨は表５に示されている。
表５：LD-PCRによって検出されるEBV初期RNA（EBER-1）
2005511030.tif 000006
注記：事例１および2は、多形腺腫以外の理由で摘出された耳下腺組織から得られた。
事例3から8は多形腺腫を含んでいた。
FFPE：ホルマリン固定パラフィン包埋組織
（凍結）：液体窒素で瞬間凍結した組織
ND：組織が入手できなかったので実施されなかった。
【００９６】
要約すれば、EBER-1配列は８つの耳下腺サンプルのうち６つで検出された。調べた６つの多形腺腫のうち、４つはEBER-1が陽性であった。EBERが腫瘍で検出されなかった前記２例について、配列は周囲の耳下腺組織内に存在していた。対応するホルマリン固定パラフィン包埋組織内のEBER-1配列の検出は極めて感度が低く、８つの標本のうち２つのみが陽性であった。
要約すれば、環状プローブを用いる連結依存PCRを用いた本発明の結果は、調べた大半の多形腺腫内にEBV関連配列が存在することを示した。本発明の方法は、Tairaら（J. Otorhinolaryngol. Soc. Jap. 95:860(1992)）が実施したEBVDNA検出のための標準的なPCRと比較して極めて高い検出率を示した。本発明の方法では、環状化可能プローブの３’および５’末端が標的配列とハイブリダイズして並列的配置がもたらされる。続いて、前記並列した配列は連結され、共有結合によって連結された環状プローブが生成され、前記環状プローブは標的配列に固定されてストリンジェントな洗浄に耐える。環状プローブによるPCRはローリングサークルポリマーを生じた。前記ポリマーをモノマー単位に消化してゲル上で可視化した。環状プローブによる連結依存PCRを使用し、続いてローリングサークルモデルによってプローブを増幅することにより検出を実施して、新鮮凍結組織で極めて感度の高い標的検出が達成される。
【００９７】
実施例12：弁別的ディスプレーRAM
５’捕捉／Amp-プローブおよび３’任意／Amp-プローブが以下のようにデザインされる。24種の10量体３’任意／Amp-プローブを組み合わせて用いることによって得られる12の可能な５’捕捉／Amp-プローブオリゴ（dT）は、哺乳類細胞に存在する10,000種類のｍRNAを表示するために十分な数である（Liang et al., 1992, Science 257:967-971）。５’捕捉オリゴ（dT）プローブの末端の３’塩基は選択性の大半を提供するので、捕捉オリゴ（dT）プローブの数を12から３に減少させることができる（Liang et al., 1992, Science 257:967-971;Liang et al., 1994, Nucleic Acid Res. 22:5763-5764）。
先ず初めに、３つの別個の５’捕捉／Amp-プローブを合成する（各々はその３’末端にヌクレオチドG、AまたはCを含む）。末端のヌクレオチドに隣接するのはオリゴ（dT）11であり、これは捕捉配列およびアンカー配列の両方として機能するであろう。捕捉／Amp-プローブの５’領域は、その５’末端にビオチン成分を有する多種の（すなわち５−20）包括的プライマー結合配列を含む。これら多種のプライマー結合部位はRAM増幅のためにデザインされ、感度が担保される。３つの捕捉／アンカープローブによる最初のテストによって良好な弁別的ディスプレーが得られない場合、４−12の別々の捕捉／アンカープローブを最後の２つのヌクレオチドの組み合わせを基に合成することができる（T12MN、M＝縮退A、GまたはC；N＝A、C、GおよびT）。
３’任意／Amp-プローブ（長さが10ヌクレオチド）はｍRNAとハイブリダイズし、シークェンシングゲルによって分析するために十分な表示バンドを生じる。しかしながら、長さが10ヌクレオチドのプローブは全てが適切であるというわけではない。したがって、プローブは実験でテストする必要がある（Bauer, 1993, Nucl. Acid Res. 21:4272-4280）。ほとんどのｍRNA種を表示するために要求される３’任意／Amp-プローブの実際の数は24から26の異なるプローブである。したがって先ず初めに、24の３’任意／Amp-プローブを別々に合成する。各３’任意／Amp-プローブは、５’任意配列（例えば長さが10ヌクレオチド）および３’RAMプライマー結合配列（長さは70−130ヌクレオチドであろう）を含む。各３’任意／Amp-プローブの５’末端は、連結を惹起させるためにT4DNAキナーゼとともにインキュベートすることによってリン酸化する。３’任意／Amp-プローブは等モル比で最終濃度1011分子／μLで混合する。各３’任意／Amp-プローブの濃度は最良の弁別的ディスプレーを達成するために変更することができる。
【００９８】
DD-RAMアッセイは、小さな改変を加えながら以前に報告されたように実施する（Zhang et al., 1998, Gene 211:277-285; Park, 1996, Amer. J. Path. 149:1485-1491）。組織切片（厚さ5−10μm）または細胞懸濁物（1ｘ106細胞／ｍL）は、250μLの溶解緩衝液中で37℃で60分インキュベートして溶解させた。前記溶解緩衝液は以下を含む：5Mのチオシアン酸グアニジウム（GTC）（Fluka）、0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、80ｍMのEDTA、400ｍMのトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム（Sigma）。80μLの溶解混合物を120μLのハイブリダイゼーション緩衝液［0.5％ウシ血清アルブミン、80nMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）および0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム］に添加する。前記ハイブリダイゼーション緩衝液は、1012分子の各捕捉／被アンカープローブおよび1011分子のリン酸化された任意配列プローブ混合物を含んでいる。ハイブリダイゼーション緩衝液の添加によって、GTC濃度は5Mから2Mに低下し、それによりハイブリダイゼーションが惹起される。前記ハイブリダイゼーション混合物を37℃で1時間インキュベートしてハイブリッドを形成させる。前記ハイブリッドはそれらのｍRNA標的と結合した５’捕捉／Amp-プローブおよび３’任意／Amp-プローブから成る。30μLのストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（1mg/mL, Promega, Madison, WI）を前記混合物に添加し、さらに37℃で20分インキュベートして前記ハイブリッドをビーズ表面に結合させる。続いて、ビーズを180μLの洗浄緩衝液［10ｍMトリス塩酸（pH7.5）、50ｍMのKCｌ、1.5ｍMのMgCl2および0.5％ノニデットP-40（Sigma）］で2回洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブとともにGTC、タンパク質、核酸および一切の潜在的な連結およびRAM阻害物質を除去した。
【００９９】
続いて、前記ハイブリッドを20μLのRT／リガーゼ溶液に再懸濁して37℃で1時間インキュベートし、５’捕捉／Amp-プローブから下流の３’任意配列プローブへ向けて伸長させる。前記RT／リガーゼ溶液は以下を含む：66ｍMトリス塩酸（pH7.5）、１mMジチオスレイトール、１nMのATP、0.2ｍMのdATP、0.2ｍMのdCTP、0.2ｍMのdGTP、0.2ｍMのdTTP、1ｍMのMnCl2、5mMのMgCl2および200単位のモロニ−ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Boehringer Mannheim）および5単位のT4DNAリガーゼ（Boehringer Mannheim）。前記任意プローブと伸長された配列との間のギャップは連結されて、共有結合で連結された環状プローブを形成し、これは上記のようにRAMアッセイによって増幅させることができる。続いて、10μLのRT／連結反応混合物（ビーズを含む）を40μLのRAM混合物に移す。前記混合物は以下を含む：0.66μMのRAM前進プライマーおよび0.66μMのRAM逆方向プライマー、90ngのφ29DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）、80μMの32P-dATP、80μMのdCTP、80μMのdGTP、80μMのdTTP、5mMのMgCl2および66ｍMトリス塩酸（pH7.5）。前記RAM反応物を35℃で2時間インキュベートする。希少のｍRMAの表示のためには感度が十分でない場合、第一のRAM反応混合物の5μLを25μLの第二のRAM混合物（第二のRAM反応のために同じ成分を含む）に移す。前記のRAM反応物の15μLを6％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動して分析し、オートラジオグラフィーによって可視化する。
【０１００】
実施例13：多種プライマーによるRAMアッセイ
多種RAMプライマーの添加によってRAM反応効率を高めることができるか否かを調べるために、１つのEBER Amp-プローブ２および３つのRAMプライマーによる反応を実施した。1011分子の合成EBER DNA標的を1011分子の合成EBER Amp-プローブ２とハイブリダイズさせた。連結の後、１つのRAM前進プライマー、２つのRAM逆方向プライマー（前進方向１つおよび逆方向１つ）、または３つのRAMプライマー（前進方向１つおよび逆方向２つ）をφ29DNAポリメラーゼと一緒に各反応に添加した。
前記反応生成物を８％ポリアクリルアミドゲルで調べた。プライマーが1つの場合、マルチマーのssDNAが生成され、生成物サブセットは非常に大きいのでゲル内に入らないことが判明した。使用プライマーの数が増えれば生成物の量は増加するが（図29参照：２つのプライマー、レーンB；３つのプライマー、レーンC）、指数関数的増幅は観察されなかった。標的が存在しないとき生成物は観察されず（レーンD）、この反応は特異的であることが示された。
反応効率を高めるために、プライマーの数を３から６に増やし、プライマーの長さを18ヌクレオチドから12ヌクレオチドに縮めた。プライマーの長さの短縮はプライマーの鋳型へのアクセス能力を増加させ、一方、プライマーの数の増加は反応平衡をハイブリダイゼーションの方へ移動させた。
6mMの（NH4）2SO4、10％DMSOおよび0.5μgのジーン32タンパク質をRAM反応に添加することによって条件をさらに最適化させた。前記のような条件下では、104分子のEBER標的を検出することができる（図27）。
生成DNAの量で判定したとき（最初の104分子のAmp-プローブ２から1013分子のDNAが生成される）、1000,000,000倍の増幅が達成された。プライマーの長さを減じることによって非特異的なバックグラウンドが増加しなかったことは注目すべきである。
さらに別の２つのAmp-プローブ２をデザインし、６つのプライマーの存在下で反応効率を調べた。１つのAmp-プローブ２は、３つの前進プライマーの結合部位および３つの逆方向プライマー結合部位を含み、各プライマーは対向するプライマーと隙間を空けて配置されるように合成された。第二のAmp-プローブ２は、６つのプライマー結合部位を含むようにデザインされたが、２つのプライマー配列（前進方向が１つおよび逆方向が１つ）のみが包含された。この特別なプライマーのデザインは、ハイブリダイゼーション速度を増加させるがAmp-プローブ２に結合したプライマー間の緩衝を最小限にするという利点を有する。
【０１０１】
実施例14：アンカーRAM
リンカー領域に４つのビオチン分子を含む1013分子のC-プローブを1014分子の合成DNA標的と１Xの連結緩衝液中で75℃で5分間インキュベートし、続いて室温で10分インキュベートしてC-プローブを前記標的とハイブリダイズさせた。リガーゼを前記混合物に添加し、37℃で1時間インキュベートし、C-プローブの２つの末端を連結して閉環状プローブを生成した。0.1μLのアビジン（Boehringer Mannheim）を前記反応に添加してアビジン／C-プローブ複合体を生成した。３つのビオチン分子とともに40ヌクレオチドを含むビオチン化シグナルプローブを前記反応に添加した。ローリングサークル反応を増幅プライマーおよびDNAポリメラーゼの添加により開始した。前記反応は、BstDNAポリメラーゼを用いたときは抑制されない。対照的に、前記反応はφ29DNAを用いたときは抑制される。この結果は、RAMプライマーは、大きなアビジン分子が存在している場合でさえもC-プローブに結合することができ、さらにBstDNAポリメラーゼはビオチン−アビジン複合体を迂回し、C-プローブの全長に沿って伸長できることを示している（図23）。
【０１０２】
実施例15：分子ジッパーによる即時分枝増幅
ジッパーは異なる長さを有する２つのプローブで構成される。長いほうのプローブは短いほうのプローブとハイブリダイズして長いほうのプローブの３’末端に一本鎖のテールを残す。この一本鎖配列により前記ジッパーは環状プローブのループ領域内の相補性領域と結合する。前記テール３’末端はまたRAM反応で前記２つのプライマーの１つとして機能する。長いプローブの５’末端はフルオレセイン分子で標識される。短いほうのプローブの３’末端には、DABCYL（クェンチャー分子）が取り込まれている。前記２つのプローブが一緒にハイブリダイズし、したがって互いに近接するとき、蛍光シグナルが前記クェンチャーに吸収され光は放射されない。増幅反応がいったん惹起されたら、長プローブ（プライマーとして使用される）はRAM生成物に取り込まれ、前記２つのプローブはもはや互いに近接しない。したがってDABCYLのクェンチング作用は阻害され、前記フルオレセイン分子から光が放射される。
分子ジッパープローブは以下のように調製された：２つのプローブは製造業者（Integrated DNA Technologist, Inc, Coralville, IA）によって合成され、これをゲル電気泳動で精製して1:1の分子比で混合した。ジッパープローブ１は38ヌクレオチドのオリゴマー（また下記に配列番号43として列挙される）で、前記はプローブ対の短い方に相当し、その３’末端がDABCYL分子で標識されている。ジッパープローブ２は61ヌクレオチドのオリゴマー（また下記に配列番号44として列挙される）で、前記はプローブ対の長い方に相当し、その５’末端がフルオレセイン分子で標識されている。
【０１０３】
ジッパープローブ１（配列番号43）：
5'-TCGGCATCCG CATCCGCATT CGCATCCGGG TCCTCAGC-DABCTL-3'
ジッパープローブ２（配列番号44）：
5'-フルオレセイン-GCTGAGGACC CGGATGCGAA TGCGGATGCG GATGCCGAAC CAAGAGCAAC TACACGAATT C-3'
前記混合物を95℃で5−10分加熱し、ゆっくりと室温に冷却した。ジッパープローブの濃度を水または１ｘのTE緩衝液で50μMに調節した。
RAMアッセイはいくつかの工程から成り、オリゴヌクレオチドプローブ（また下記に配列番号45として列挙される）および捕捉プローブ（また下記に配列番号46として列挙される）の標的核酸（また下記に配列番号47として列挙される）へのハイブリダイゼーションを含む。前記オリゴヌクレオチドプローブは124ヌクレオチドの長さで、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）の基本小体、標的核酸と相補的な配列を含む。捕捉プローブは43ヌクレオチドのオリゴマーでその５’末端にビオチン分子を含む。標的核酸分子はトラコーマクラミジアの基本小体に由来し、96ヌクレオチドの長さを有する。
オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号45）：
5'-GGTTTTGTCT TCGTAACTCG CTCCGGATGT CTGTGTATCT GCTAACCAAG AGCAACTACA CGAATTCTCG ATTAGGTTAC TGCGATTAGC ACAAGCTCTA CAAGAGTACA TCGGTCAACG AAGA-3'
捕捉プローブ（配列番号46）：
5'-ビオチン-AAGAGCTTAA GAACCGTCAG ACAGAAAAGA GGATTATTAT ACC-3'
標的核酸分子（配列番号47）：
5-'TCCGGAGCGA GTTACGAAGA CAAAACCTCT TCGTTGACCG ATGTACTCTT GTAGAAAGTT ATAATAATCC TCTTTTCTGT CTGACGGTTC TTAAGC-3'
【０１０４】
続いて、オリゴヌクレオチドプローブ／捕捉プローブ／標的核酸ハイブリッドを磁性ビーズに捕捉し、洗浄して未結合プローブおよび細胞成分を除去した。オリゴヌクレオチドプローブの３’および５’末端を連結して閉環状プローブを生成する。続いて、プライマー伸長、鎖の置換および分枝化によって増幅を実施した。
オリゴヌクレオチドプローブ、捕捉プローブおよび標的核酸のハイブリダイゼーションは以下を含む80μLの反応物中で実施した：2MのGTC、0.5％ウシ血清アルブミン（Sigma）、80ｍMのEDTA、400ｍMトリス塩酸（pH7.5）、0.5％N-ラウリルサルコシンナトリウム（Sigma）、50nMリン酸化オリゴヌクレオチドプローブ、2μM捕捉プローブおよび種々の量の標的（10から105分子）。前記反応物を55℃で2時間インキュベートしてハイブリッドを形成させた。3μLのストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（10mg/mL、Dynal, Lake  Success, NY）、80μLの10ｍMトリス塩酸（pH7.5）（1mMのEDTAを含む）および2MのNaClをハイブリダイゼーション混合物に添加して室温で20分インキュベートし、ビーズ上に被覆されたストレプトアビジンとともに捕捉プローブ上のビオチンとの結合によりハイブリッドをビーズに補足させる。
続いて、結合複合体を含むビーズを400μLのTE緩衝液（10ｍMトリス塩酸（pH8.0）および1mMのEDTA）で2回室温で洗浄し、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドプローブを除去する。20μLのリガーゼ混合物を前記ビーズペレットに添加し、60℃で20分インキュベートした。前記リガーゼ混合物は以下を含む：20ｍMトリス塩酸（pH7.6）、25ｍM酢酸カリウム、10ｍM酢酸マグネシウム、10ｍMのDTT、１ｍMのNAD、0.1％のトリトンX-100および12単位のTaqDNAリガーゼ（New England Biolabs, MA）。標的核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの３’および５’末端の連結によって、標的核酸上に固定された閉環状プローブを形成させた。
【０１０５】
連結後、前記RAM反応溶液を吸引し、ビーズを50μLのRAM反応混合物に懸濁させた。前記RAM反応混合物は以下を含んでいた：300μMのｄNTP（USB Biochemicals）、20ｍMトリス塩酸（pH8.8）、10ｍMのKCｌ、10ｍMの（NH4）2SO4、2mMのMgSO4、0.1％トリトンX-100、1.2μMの前進プライマー（また配列番号48として列挙される）、1.25μMの二本鎖ジッパープローブ、6.4単位のBstDNAポリメラーゼの大フラグメント（New England Biolab）、1μgのT4遺伝子32タンパク質（USB Biochemicals）、および6％ジメチルスルホキシド（DMSO）。この混合物を63℃で1時間、リアルタイムサーモサイクラーのスマートサイクラー（Cepheid）でインキュベートした。
前進プライマー（配列番号48）：
5'-CTTGTGCTAA TCGCAGTAAC CTAAT-3'
分枝中にジッパーの短いほうのプローブを置換することによって生じた蛍光をスマートサイクラーチャンネル１でモニターした（励起波長：450−495nmおよび放出波長：505−537nm）。結果は図22に示されている。これらの結果は、標的の数は蛍光単位の増加に依存することを示している。わずかに10分子の標的を検出することができる。これらの結果はまた分子ジッパープライマー対は前記反応条件下では“開放”されず、それらがRAM生成物に取り込まれたときにのみ分離されることを示している。
種々の文献が本明細書に引用されているが、前記文献の内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】標的核酸の捕捉、連結依存増幅および検出のために本発明の方法で用いられる種々の成分を示す包括的な模式図である。
【図２】本発明の種々の工程を一般的に示す模式的工程図である。
【図３】HIV-1RNAを検出するPCR増幅プローブの検出を示すオートラジオグラフである。レーンAは本発明の連結増幅配列であり、レーンB（コントロール）はPCRで増幅されたナノバリアントDNAである（ナノバリアントDNAはHIV-1特異的配列を含まない）。
【図４】標的核酸（例えばHCVRNA）の捕捉および連結依存検出、それに続く前記配列の増幅のために用いられる種々の成分を示す本発明の実施態様の模式図である。前記実施態様では、ビオチン部分を結合させた２つの捕捉／増幅プローブおよび２つの連結依存増幅プローブが用いられる。
【図５】ただ１つの捕捉／増幅プローブおよび２つの増幅プローブを用いるHCVRNA検出のための磁性分離、標的核酸の連結およびPCR増幅を模式的に示す工程図である。
【図６】標的核酸（例えばHCVRNA）の増幅および検出に用いられる種々の成分を示す模式図である。前記ではその各々にビオチン部分が結合されている２つの捕捉／増幅プローブおよびただ１つの増幅プローブが用いられる。
【図７】標的核酸（例えばHCVRNA）の検出に用いられる種々の成分を示す模式図である。ここではその各々にビオチン部分が結合されている２つの捕捉／増幅プローブおよびただ１つの増幅プローブが用いられる。前記増幅プローブは、標的核酸とのハイブリダイゼーションおよびプローブの遊離末端の連結に際して環状化される。
【図８】サンプル中のHCVRNAの検出に用いられた、PCRで増幅されたプローブを示す臭化エチジウム染色DNAの写真である。サンプル中のHCVRNAの量は、サンプルのバンド濃度を連続希釈標準HCV転写物のバンド濃度と比較することによって決定される。
【図９】サンプル中のHCVRNAの検出に用いられた、PCRで増幅されたただ１つの完全長連結依存プローブおよび環状化可能プローブを示す臭化エチジウム染色DNAの写真である。サンプル中のHCVRNAの量は、サンプルのバンド濃度を連続希釈標準HCV転写物のバンド濃度と比較することによって決定される。
【図１０】ハイブリダイゼーションシグナル増幅法（HSAM）による標的核酸の捕捉および検出を示す模式図である。
【図１１】ビオチン化抗体およびビオチン化シグナルプローブを用いて抗原を検出するHSAMの使用を示す模式図である。
【図１２】12AおよびBは、ホルマリン固定中に形成されるRNA−タンパク質架橋を示す模式図である。図12Aは、本方法の逆転写PCR（RT-PCR）の方法では架橋のためにプライマーの伸長が妨げられることを示している。図12Bは、本発明のプローブのハイブリダイゼーションおよび連結はタンパク質−RNA架橋によって妨げられないことを示している。
【図１３】多重PCRの模式図である。2組の捕捉／増幅プローブ（HIV-1およびHCVにそれぞれ特異性を有する）を標的の捕捉に用いたが、連結プローブの増幅にはただ1対の包括的PCRプライマーが用いられる。各標的の存在は増幅生成物のサイズまたは酵素結合免疫吸着アッセイによって決定することができる。
【図１４】１つの環状標的プローブおよび３つの環状シグナルプローブを用いるHSAMの模式図である。AB、CDおよびEFは、環状シグナルプローブの３’および５’ヌクレオチド配列と相補的なリンカー領域内のヌクレオチド配列を示す。AB'、CD'およびEF'は、もう一方の環状シグナルプローブのリンカー領域の相補的配列と結合することによって並列するようになったシグナルプローブの３’および５’ヌクレオチド配列を示す。
【図１５】環状標的プローブおよび直鎖状シグナルプローブを用いるHSAMの模式図である。
【図１６】プライマー伸長／置換およびPCRによる環状化プローブの増幅を示す模式図である。
【図１７】T3プロモーターがExt-プライマー２に取り込まれ、転写によって環状化プローブの増幅が可能になるRAMの実施態様の模式図である。
【図１８】Ext-プライマー１の伸長による環状プローブの増幅を示すポリアクリルアミドゲルが提供されている。
【図１９】分枝−伸長増幅法（RAM）による環状化プローブの増幅を示す模式図である。
【図２０】シグナル発生部分と結合させた分子ジッパーを用いた分枝伸長増幅法による環状化プローブの増幅を示す図である。
【図２１】図21A−Bは、リガンド結合部分を有するハイブリダイゼーションプローブを用いるアンカープライマー伸長増幅法の模式図である。図21C−Dはハイブリダイゼーションプローブを用いるプライマー伸長増幅法の模式図である。
【図２２】RAM反応と連係して分子ジッパーを用いたEBV標的（100,000、1,000および10コピー／反応）の即時検出を示すグラフである。反応に存在する標的分子の数が多ければ多いほど、シグナルが迅速に検出されることを図22の結果は示している。
【図２３】アンカーRAM反応を示すグラフである。C-プローブ（C-P）およびビオチン化C-プローブ（ビオチン化C-P）を標的とともにインキュベートし連結する。RAM反応はアビジンまたはアビジンとシグナルヌクレオチドの存在下で実施した。複合体（アビジン−シグナルヌクレオチド）はBstDNAポリメラーゼを抑制しないが、φ29DNAポリメラーゼを抑制する。
【図２４】RNAポリメラーゼプロモーター配列がプライマーに組み入れられるRAMアッセイの模式図である。
【図２５】プライマーが１つ、２つおよび３つ存在するRAMアッセイを示す。
【図２６】標的DNAを連続希釈したRAMアッセイの模式図である。
【図２７】長さを増加させた標的配列が増幅されるRAMアッセイを示す。
【図２８】環状プローブを利用した固体担体への標的核酸の捕捉を示す。
【図２９】抗体または抗原に特異的に結合する捕捉／プライマーを用いた抗体または抗原の検出を示す模式図である。
【図３０】アダプター分子を用いたゲノムDNAの遺伝子増幅を示す。
【図３１】アンカーオリゴヌクレオチドと結合させた抗体を用いた抗原の検出を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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