(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役型レセプターＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）及びその相同配列、該レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞、及び天然リガンドＡＤＰの同定、並びに新薬の開発と種々の疾病診断の改良に有用なアゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の同定のためのスクリーニングアッセイに用いられる等価分子に関する。本発明は、さらにＧＰＲ８６活性のモジュレーターとしてＡＴＰ，２ＭｅＳＡＴＰ，２ＭｅＳＡＤＰ，ＡＤＰβＳ，Ａｐ３Ａ，ＲＢ−２，スラミン及びＰＰＡＤＳに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＧＰＲ８６活性を検出する方法であって、
ａ）ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で、ＧＰＲ８６とＡＤＰを含むサンプルを培養する工程；及び
ｂ）セカンドメッセンジャーを検出する工程
を含む検出方法。
【請求項２】
さらに、ａ）ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で、ＡＤＰの不在下で、ＧＰＲ８６を含む第２のサンプルを培養する工程；及び
ｂ）セカンドメッセンジャーを検出する工程
を含む請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記サンプルがＧＰＲ８６を発現する細胞を含んでいる請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４】
前記サンプルがＧＰＲ８６を有している細胞膜を含んでいる請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
ウィルス誘導により出芽しているＧＰＲ８６ポリペプチドを含む膜内又は膜上で、前記培養工程が行われる請求項１又は２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
ａ）工程は、更にＧα６ポリペプチドの存在下で行われる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＧＰＲ８６を発現する細胞を用いて、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターをスクリーニングする方法であって、
ａ）候補モジュレーターが存在する前記細胞の第１のサンプルと、候補モジュレーターが不在の前記細胞の第２のサンプルとの双方のサンプルを、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；
ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及び
ｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程
を含むスクリーニング方法。
【請求項８】
ＧＰＲ８６を有する細胞膜を用いてＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターをスクリーニングする方法であって、
ａ）前記候補モジュレーターが存在する前記細胞膜の第１のサンプルと、候補モジュレーターが不在の前記細胞膜の第２のサンプルとの双方のサンプルを、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；
ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及び
ｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程
を含むスクリーニング方法。
【請求項９】
ＧＰＲ８６を発現する細胞を用いて、候補モジュレーターがＧＰＲ８６活性を増大又は低減させているかを決定する方法であって、
ａ）前記候補モジュレーターが存在する前記細胞の第１のサンプルと、候補モジュレーターが不在の前記細胞の第２のサンプルとの双方のサンプルを、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；
ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及び
ｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程
を含む決定方法。
【請求項１０】
ＧＰＲ８６を有する細胞膜を用いて、候補モジュレーターがＧＰＲ８６活性を増大又は低減させているかを決定する方法であって、
ａ）前記候補モジュレーターが存在する前記細胞膜の第１のサンプルと、候補モジュレーターが不在の前記細胞膜の第２のサンプルとの双方のサンプルを、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；
ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及び
ｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程
を含む決定方法。
【請求項１１】
サンプル内の、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質の存在を検出する方法であって、
ａ）ＧＰＲ８６ポリペプチドと前記サンプルを接触させる工程；
ｂ）前記サンプルの存在下で前記ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を測定する工程；
ｃ）前記サンプルの存在下で測定されたシグナリング活性と、ＥＣ５０で存在するＡＤＰと前記ＧＰＲ８６ポリペプチドが接触させている反応系で測定されたシグナリング活性とを比較し、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質が、前記サンプルの存在下で測定される前記活性の量がＥＣ５０で存在する前記ＡＤＰによって誘導される量の少なくとも５０％であるかどうかを検出する工程
を含む検出方法。
【請求項１２】
ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質の同定方法であって、
ａ）候補モジュレーターの存在及び不在下で、前記ＧＰＲ８６ポリペプチドと前記ＡＤＰが結合することを許容する条件下で、前記ＧＰＲ８６ポリペプチドを前記ＡＤＰと接触させる工程；及び
ｂ）前記ＧＰＲ８６ポリペプチドと前記候補モジュレーターとの結合を、前記候補モジュレーターの不在下での結合に対して測定し、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質として前記候補モジュレーターを同定する工程
を含む同定方法。
【請求項１３】
前記ＧＰＲ８６は細胞によって発現される請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＰＲ８６が細胞膜に存在する請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＲ８６は、ウィルス誘導された出芽している膜内又は膜上に存在している請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞、及び１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞及び他の細胞系列からなる群から選ばれる請求項１，２，３，６，７，９，又は１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｇα１６ポリペプチドの存在下でさらに実行される請求項７〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記測定工程又は前記検出工程は、ラベル変位、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギートランスファー、蛍光消光、及び蛍光分極から選ばれる方法を用いて行われる請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記物質は又は前記候補モジュレーターは、天然又は合成ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子からなる群より選ばれる請求項７〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記検出又は前記ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性の測定工程は、セカンドメッセンジャーのレベルにおける変化を検出する請求項７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
シグナリング活性の検出工程又はシグナリング活性の測定工程は、グアニンヌクレオチド結合又は変化、アデニレートシクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、フォスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール３リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、レポータ遺伝子発現の測定を含む請求項７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記シグナリング活性の測定工程は、エクオリンベースアッセイを用いる工程を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内のポリペプチドのＧＰＲ８６活性をモジュレートする方法であって、
ＧＰＲ８６活性がモジュレートされるように、ポリペプチドのＧＰＲ８６活性をモジュレートする物質を、前記細胞に配送する（ｄｅｌｉｖｅｒ）工程を含む方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドの相同組換えノックアウトを含む非ヒトほ乳類又は前記ポリヌクレオチドの天然レベルを超えて過剰に発現するトランスジェニック非ヒトほ乳類のような、ヒトポリヌクレオチドのオルソローグ配列（配列ＩＤ  ＮＯ．１）の部分的又は全体の欠失を含む非ヒトほ乳類。
【請求項２５】
ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項２６】
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
ａ）ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；
ｂ）前記組織サンプルと前記抗体の結合を検出する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で検出された結合と標準を比較し、前記標準に対して結合に差異があれば、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程
を含む診断方法。
【請求項２７】
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
ａ）ＧＰＲ８６特異的リガンドに特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；
ｂ）前記組織サンプルと前記抗体の結合を検出する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で検出された結合と標準を比較し、前記標準に対して当該結合に差異があれば、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病であるとする工程
を含む診断方法。
【請求項２８】
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
ａ）ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的抗体及びＧＰＲ８６特異的リガンドに特異的な抗体と、組織サンプルを接触させる工程；
ｂ）前記組織サンプルと前記抗体の結合を検出する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で検出された結合と標準を比較し、前記標準に対して抗体のいずれか一方又は双方の結合に差異があれば、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程
を含む診断方法。
【請求項２９】
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程
ｂ）鋳型として前記核酸を用いてＧＰＲ８６ポリヌクレオチドを増幅する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＧＰＲ８６ポリヌクレオチドの量と標準とを比較し、前記標準に対して増幅されたＧＰＲ８６ポリヌクレオチド量に差異があれば、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程
を含む診断方法。
【請求項３０】
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法であって、
ａ）組織サンプルから核酸を単離する工程
ｂ）鋳型として前記核酸を用いてＧＰＲ８６特異的リガンドポリヌクレオチドを増幅する工程；及び
ｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＧＰＲ８６特異的リガンドポリヌクレオチドの配列と標準とを比較し、前記標準に対して配列に差異があれば、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であるとする工程
を含む診断方法。
【請求項３１】
前記標準は、配列ＩＤ  ＮＯ：１である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記比較工程は、マイクロアレイ上で行われる請求項２６〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＰＲ８６又はＧＰＲ８６モジュレーターに結合する検出キットであって、
ＧＰＲ８６及びＡＤＰ、及びそれらのためのパッケージング材料を含み、前記ＧＰＲ８６とＡＤＰが別々にパーケージされているキット。
【請求項３４】
ＧＰＲ８６は細胞内に存在する請求項３３のキット。
【請求項３５】
前記細胞は、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞及び１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞及びその他の細胞系列からなる群より選ばれる請求項３４のキット。
【請求項３６】
ＧＰＲ８６が細胞膜に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）している請求項３３のキット。
【請求項３７】
さらに、前記キットはセカンドメッセンジャー解析の構成要素を含む、請求項３３〜３６のいずれかに記載のキット  。
【請求項３８】
前記モジュレーターは、ＧＰＲ８６特異的抗体又はＧＰＲ８６特異的核酸プローブを用いて検出される請求項３３〜３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
さらにＧα１６ポリペプチドを含む請求項３３〜３８のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
ＧＰＲ８６のシグナリング活性をモジュレートする物質のスクリーニングキットであって、
ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド及びＧＰＲ８６シグナリング検出手段及びこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項４１】
さらにＡＤＰのようなリガンドを含む請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
ＧＰＲ８６のシグナリング活性をモジュレートする物質のスクリーニングキットであって、
ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフォームされた細胞、及びＧＰＲ８６シグナリング検出手段、及びこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項４３】
前記物質が、ＧＰＲ８６に特異的な抗体又はＧＰＲ８６特異的核酸プローブを用いて検出される請求項４０〜４２のいずれかに記載のキット。
【請求項４４】
ＧＰＲ８６シグナリング活性の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断キットであって、
単離されたＧＰＲ８６ポリペプチド、及びＧＰＲ８６シグナリング検出手段、及びこれらのパッケージング材料を含むキット。
【請求項４５】
前記疾患又は疾病は、ＧＰＲ８６に特異的な抗体又はＧＰＲ８６特異的核酸プローブを用いて検出される請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
ＡＤＰ不在下でＧＰＲ８６を発現する細胞系列において測定されるＧＰＲ８６活性の標準をさらに含む請求項３３〜４５のいずれか記載のキット。
【請求項４７】
請求項７〜１５のいずれかの方法を用いて得られるＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター。
【請求項４８】
前記候補モジュレーターが、ＡＴＰ，２ＭｅＳＡＴＰ，２ＭｅＳＡＤＰ，ＡＤＰβＳ，Ａｐ３Ａ，ＲＢ−２，スラミン又はＰＰＡＤＳである請求項４７に記載のＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター。
【請求項４９】
請求項４７若しくは４８のＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター；又はＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の予防、治療及び／若しくは軽減するための薬剤組成物としての使用のための請求項２５の抗体の候補モジュレーター。
【請求項５０】
請求項４７若しくは４８のＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター；又はＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の予防、治療及び／若しくは軽減するための薬剤組成物の製造のための請求項２５の抗体の候補モジュレーターの使用。
【請求項５１】
請求項５０のＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター、又はＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患若しくは疾病の予防、治療及び／若しくは軽減するための薬剤組成物の製造のため請求項２５の抗体の候補モジュレーターの使用であって、
前記疾患又は疾病は、例えば、前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；恐怖、鬱病、精神分裂症、激しいうつ病、譫妄、痴呆、およびいくつかの精神的遅滞を含む精神的及び神経的疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経消耗性疾患；ハンチントン病、ギルトドラトゥレット症候群及びトロンボシス及び他の心血管作動病を含む他の関連する疾患のようなジスキネシア（ｄｙｓｋｉｎａｓｉａｓ）；自己免疫疾患；炎症性疾患；生殖能力機能不良；胎児成長不良、；バクテリア、カビ、原生動物の感染、及びＨＩＶ１及びＨＩＶ２によって引き起こされる感染等のウィルス感染；痛み；癌；食欲不振；大食症；喘息；急性心不全；高血圧；尿閉；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；前立腺肥大、及び脳卒中からなる群より選ばれる使用。
【請求項５２】
請求項４７乃至４９のいずれかに記載の候補モジュレーター、又は請求項２５に記載の抗体を、薬剤のキャリアに添加混合する工程を含む薬剤組成物の製造方法。
【請求項５３】
請求項４７乃至４９のいずれかに記載の候補モジュレーター、又は請求項２５に記載の抗体を含む薬剤組成物。
【請求項５４】
ＡＤＰが、ＡＴＰ，２ＭｅＳＡＴＰ，２ＭｅＳＡＤＰ，ＡＤＰαＳ、又はＡｐ３Ａと置き換えられる請求項１〜２３，３３〜３９，４１又は４６のいずれかに記載の方法又はキット
【請求項５５】
ＡＤＰがＲＢ−２，スラミン又はＰＰＡＤＳによって置き換えられる請求項７〜２３，３３〜３９，４１又は４６のいずれかに記載の方法又はキット。
【請求項５６】
候補モジュレーターがＧＰＲ８６の活性を増大又は低減するかどうかを決定する方法であって、
ａ）候補モジュレーターの存在又は不在下で、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で、ＧＰＲ８６を発現する細胞をその表面で培養する工程；
ｂ）セカンドメッセンジャー解析によって前記ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出し、前記候補モジュレーターの不在下でのセカンドメッセンジャー製造に対して、前記候補モジュレーターの存在下でのセカンドメッセンジャー生産に変化があれば、ＧＰＲ８６の活性の増大又は減少として前記モジュレーターを同定する工程
を含む決定方法。
【請求項５７】
候補モジュレーターがＧＰＲ８６の活性を増大又は低減するかどうかを決定する方法であって、
ａ）候補モジュレーターの存在又は不在下で、ＧＰＲ８６を有している細胞膜を、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で、培養する工程；
ｂ）セカンドメッセンジャー解析によって前記ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出し、前記候補モジュレーターの不在下でのセカンドメッセンジャーに対して、前記候補モジュレーターの存在下でのセカンドメッセンジャー生産に変化があれば、ＧＰＲ８６の活性の増大又は減少として前記モジュレーターを同定する工程
を含む決定方法。
【請求項５８】
ＧＰＲ８６ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）候補モジュレーターの存在又は不在下で、ＧＰＲ８６ポリペプチドとＡＤＰが結合することを許容する条件下で、ＧＰＲ８６ポリペプチドとＡＤＰを接触させる工程；及び
ｂ）前記候補モジュレーターの存在下でＧＰＲ８６ポリペプチドとＡＤＰの結合を測定し、前記候補モジュレーターの不在下でのその結合に対して、前記候補モジュレーターの存在下での結合が減少していれば、ＧＰＲ８６ポリペプチドに結合する化合物を前記候補モジュレーターとして同定する工程
を含む同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーファンＧタンパク質共役型レセプターＧＰＲ８６の天然リガンドと使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデニンヌクレオチドとウリジンヌクレオチドは、いくつかのＧタンパク質共役型レセプター（Ｐ２Ｙ）とリガンドゲート型カチオンチャネル（Ｐ２Ｘ）（非特許文献１，２）を通して薬学的及び生理学的応答を誘導する。Ｐ２Ｙファミリーは、２つの選択的プリンレセプター（purinoceptor）であるヒトＰ２Ｙ１とＰ２Ｙ１１レセプターに拡大する：ヒトＰ２Ｙ１とＰ２Ｙ１１レセプターは、ＡＤＰ及びＡＴＰによってそれぞれ優先的に活性化される（非特許文献３−５）。アデニンヌクレオチド及びウラシルヌクレオチド双方に応答するヌクレオチドレセプターは、Ｐ２Ｙ２レセプターで、ＡＴＰ及びＵＴＰによって等位に活性化され（非特許文献６、７）、またＸｅｎｏｐｕｓＰ２Ｙ８レセプター（非特許文献８）と七面鳥ｔｐ２ｙレセプター（非特許文献９）がすべてのヌクレオチド３リン酸によって等しく活性化される。また、ピリミジンレセプター（pyrimidinoceptor）もある：トリＰ２Ｙ３レセプター（非特許文献１０）とヒトＰ２Ｙ６レセプター（非特許文献１１−１３）はＵＤＰによって優先的に活性化され、ヒトＰ２Ｙ４レセプター（非特許文献１３−１５）はＵＴＰによって優先的に活性化される。これらＰ２Ｙサブタイプの全てはホスホイノシトールリン酸（phosphoinositide）経路と共役する。Ｐ２Ｙ１１レセプター及びｔｐ２ｙレセプターはそれぞれ付加的に共役され、アデニルシクラーゼの刺激及び阻害となる。他のレセプター（Ｐ２Ｙ５（非特許文献１６），Ｐ２Ｙ７（非特許文献１７），Ｐ２Ｙ９及びＰ２Ｙ１０）は、Ｐ２Ｙファミリーに間違って包含された（非特許文献１８−２０）。最近、Ｐ２Ｙ１２サブタイプがクローン化され、これは以前はＰ２Ｔと呼ばれていた血小板レセプターに該当する（非特許文献２１，２２）。Ｐ２Ｔはアデニルシクラーゼの阻害に共役され、血小板と脳内で、特異的に発現される。その一次構造は他のＰ２Ｙレセプターに関係しないが、ＵＤＰ−グルコースレセプターの一次構造に関係する（非特許文献２３）。
【０００３】
３００以上のＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲｓ）が、今までにクローン化され、このようなレセプターは、１０００以上存在すると一般に考えられている。機構上、臨床的に関連する全薬剤の約３０−５０％は、種々のＧＰＣＲｓの機能をモジュレートすることによって作用する（非特許文献３４）。
【０００４】
既知の及び未知のＧＰＣＲは、今や薬物作用の主なターゲットとなり、開発されている。
ＧＰＲ８６は、ロドプシン様レセプターファミリーのメンバーであり、１９９７年にクローン化されたＧＰＲ８６（非特許文献２４）は、最近同定された血小板ＡＤＰレセプターであるＰ２Ｔと４９％ホモロジーを示す。
【０００５】
ＧＰＲ８６の１００２ｂｐの同定されたＯＲＦは、１８ｂｐ上流の停止コドンによって先行され、推定上のポリＡシグナルＡＡＴＡＡＡが、コード配列の１６７２ｂｐ下流に存在する。ｈＧＰＲ８６は、染色体３ｑ２４上のｈＧＰＲ８７と同じゲノム位置を有しているが、ｈＧＰＲ８７とは反対に、そのコード配列にはイントロンがない。ｈＧＰＲ８６の推論された３３３アミノ酸残基配列は、ＧＰＣＲの典型的な７回膜貫通（７ＴＭ）構造を示し、シグナルペプチドを有しない。ＧＰＲ８７とＫＩＡＡ０００１で説明されたようなモチーフと同じモチーフを本質的に示すことから、ファミリー１ＧＰＣＲｓのメンバーでもある。ＤＲＹモチーフの代わりに、プリン作動性（purinergic）レセプター、Ｃ５Ａレセプター、Ｂｏｎｚｏレセプター、トロンビンレセプター前駆体の配列にもみられるＤＲＦモチーフが存在する。
【０００６】
【非特許文献１】
Ａｂｂａｒａｃｈｉｏ，Ｍ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ，Ｇ．（１９９４年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６４，４４５−４７５頁
【非特許文献２】
Ｆｒｅｄｈｏｌｍ，Ｂ．Ｂ．ら（１９９７年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８，７９−８２頁
【非特許文献３】
Ｗｅｂｂ，Ｔ．Ｅ．ら（１９９３年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３２４，２１９−２２５頁
【非特許文献４】
Ｌｅｏｎ，Ｃ．ら（１９９７年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０３，２６−３０頁
【非特許文献５】
Ｃｏｍｍｕｎｉ，Ｄ．ら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３１９６９−３１９７３頁
【非特許文献６】
Ｌｕｓｔｉｇ，Ｋ．Ｄ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，５１１３−５１１７頁
【非特許文献７】
Ｐａｒｒ，Ｃ．Ｅ．ら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，３２７５−３２７９頁
【非特許文献８】
Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｙ．ら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１２５８３−１２５９０頁
【非特許文献９】
Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（２０００年）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，８０５−８１０頁
【非特許文献１０】
Ｗｅｂｂ，Ｔ．Ｅ．ら（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０，２５８−２６５頁
【非特許文献１１】
Ｃｈａｎｇ，Ｋ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２６１５２−２６１５８頁
【非特許文献１２】
Ｃｏｍｍｕｎｉ，Ｄ．ら（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２２，３０３−３０８頁
【非特許文献１３】
Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６年）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０，２２４−２２９頁
【非特許文献１４】
Ｃｏｍｍｕｎｉ，Ｄ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０８４９−３０８５２頁
【非特許文献１５】
Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０８４５−３０８４８頁
【非特許文献１６】
Ｗｅｂｂ，Ｔ．Ｅ．ら（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１９，１０５−１１０頁
【非特許文献１７】
Ａｋｂａｒ，Ｇ．Ｋ．Ｍ．ら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１８３６３−１８３６７頁
【非特許文献１８】
Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４頁
【非特許文献１９】
Ｌｉ，Ｑ．ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３６，４５５−４６０頁
【非特許文献２０】
Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ｒ．ら （１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６，１０６−１１２頁
【非特許文献２１】
Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｌら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（１１），８６０８−８６１５頁
【非特許文献２２】
Ｈｏｌｌｏｐｅｔｅｒ，Ｇ．ら（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，２０２−２０７頁
【非特許文献２３】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ｋ．ら（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１５），１０７６７−１０７７１頁
【非特許文献２４】
Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．ら（２００１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７，７９９−８１３頁
【非特許文献２５】
Ｃｏｍｍｕｉ，Ｄ．ら（１９９５年）．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７６，１９１−１９８頁
【非特許文献２６】
Ｂｒｏｏｋｅｒ，Ｇ．ら（１９７９年）Ａｄｖ．Ｃｙｃｌｉｃ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．１０，１−３３頁
【非特許文献２７】
Ｍｉｎａｍｉｄｅ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ  Ｂａｍｂｕｒｇ，Ｊ．Ｒ．（１９９０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９０，６６−７０頁
【非特許文献２８】
Ｅｒｂ，Ｌ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，４１８５−４１８８頁
【非特許文献２９】
Ｂａｌｔｅｎｓｐｅｒｇｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐｏｒｚｉｇ，Ｈ．（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０１５１−１０１５９頁
【非特許文献３０】
Ｅａｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．ら（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２２），１５７９５−１５８０１頁
【非特許文献３１】
Ｃｈａｂｒｅ，Ｏ．ら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（８），５７３０−５７３４頁
【非特許文献３２】
Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９９３年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２６７，１１４０−１１４６頁
【非特許文献３３】
Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．ら（２００１年）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２，１７３−１８２頁
【非特許文献３４】
Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ  ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３，５１−６３頁
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプター（ここでは配列ＩＤ  ＮＯ１で同定されている）（又はいずれかの相同配列）と、当該レセプターをコードするヌクレオチド配列を含む組換え細胞（好適なベクターによってトランスフォームされた）に関し、また、本発明は新たな薬剤の開発や種々の病気診断の改良に有用なアゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の同定のためのスクリーニングアッセイの中で用いられている天然リガンド（ＡＤＰや、米国特許５７００７８６に公開されているいずれのＡＤＰ類似物も含むＡＤＰβＳ，２ＭｅＳＡＤＰのような等価分子）にも関する。
【０００８】
相同配列（他の哺乳類又はヒト集団の特異的グループに存在しえる）は、相同性が配列アイデンティティを示しているところでは、完全なヒトヌクレオチドまたはここで述べられているアミノ酸配列を有する高い配列アイデンティティ（７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上又は９８％配列アイデンティティ）を示す配列を意味する。また好ましくは同じ薬理学によって特徴付けられ、特に好ましくはＡＤＰ＞＞ＩＤＰ＞ＵＤＰで結合する（ＧＰＲ８６に対するＡＤＰの親和性は、ＩＤＰやＵＤＰの親和性よりも約１０００倍大きい（ＡＤＰ＞＞ＩＤＰ＞ＵＤＰ））。
【０００９】
本発明の組換え細胞は、プラスミド又はバキュロウィルスやアデノウィルスやセムリキ（semliki）フォレストウィルスのようなウィルスベクターによってトランスフォームされた組換え細胞で、その細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞からなる群より選択してもよい。
【００１０】
本発明の他の態様によれば、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ−５６２細胞、又は１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞からなる群より選ばれるが、他のトランスフェクト可能な細胞系列からも選ばれえる。そのベクターは、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチド配列が発現するのに実施可能に連結される全ての調節要素を含み得る。
本発明の他の実施態様によれば、当業者に明らかなように、ＧＰＲ８６は、細胞膜内に存在しえる。
【００１１】
本発明の他の見地では、その配列の特異的活性部分の使用に関する。ここで用いられるように、「活性部分」はノーマル又はノーマルに近い薬理学を示すのに（例えば、レセプター活性（ここで述べられている）、活性化剤若しくは阻害剤に対する応答、又はリガンド結合は、野生型レセプターによって示される活性、応答又は結合の少なくも９０％である。）十分な長さの配列部分をいう。レセプターをコードする配列をいうように、「部分」は、その配列の１００％未満をいう（すなわち、９９、９０、８０、７０、６０、５０％など）。その活性部分は、その完全なヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の部分的除去を含み、活性部位と、ＡＤＰのような特異的リガンドとの結合及び相互作用に必要なタンパク質ドメインとを尚も保持している。
【００１２】
ここで述べられているいずれかの方法の他の態様において、接触工程は合成リポゾーム中若しくは合成リポソーム上で（Tajib Mirzabekov，Harry Kontos，Michael Farzan，Wayne Marasco，Joseph Sodroski（2000年）「純粋で天然の７回膜貫通を指向しているセグメントタンパク質ＣＣＲ５を含む常磁性プロテオリゾーム」、Nature  Biotechnology  18，649−654頁参照、これは参考として本明細書に組み入れられる）、あるいはＧＰＲ８６ポリペプチドを含み、ウィルス誘導された出芽している膜内若しくは膜上で達成される（国際公開０１０２５５１の特許出願、「好ましくは薬剤スクリーニング及び機能的ゲノミクスにおけるウィルス用粒子、その調製及びその使用（２００１年）参照、これは参考として本明細書に組み入れられる）。
【００１３】
従って、本発明の他の見地によれば、ＧＰＲ８６は上記細胞のような細胞内に存在していてもよいし、会合していてもよく、また細胞膜内に存在又は細胞膜と会合していてもよく、あるいはウィルス誘導された出芽膜内若しくは出芽膜上に存在してもよい。
【００１４】
ここで用いられている「リガンド」は、レセプターに会合または結合できる部分（moiety）をいう。本発明の方法によれば、リガンドとレセプターは、レセプターに結合するリガンドの検出に好適な解析方法によってその結合を検出するのに十分強い結合定数を有している（例えば、レセプターに結合しているリガンドに対する応答におけるセカンドメッセンジャーの産生の増加又は減少を検出するセカンドメッセンジャーアッセイ、タンパク質−リガンド結合を測定する結合アッセイ、又は抗原−抗体相互作用を測定するイムノアッセイ）。本発明によれば、リガンドは、レセプターに結合する実際の分子を含み（例えば、ＡＤＰはＧＰＲ８６のリガンドである）、あるいはリガンドはレセプターに結合できるヌクレオチド、抗体、抗原、酵素、ペプチド、ポリペプチド、又は核酸でありえる。リガンドは、ヌクレオチドであって、ポリペプチド、ペプチド、又は核酸配列も含んでもよい。本発明の方法によれば、リガンドとレセプターは、互いに特異的に結合する（例えば、共有結合又は水素結合を介して、あるいは例えばタンパク質とリガンド間の相互作用、あるいは抗体と抗原又はタンパク質サブユニット間の相互作用を介して）。
【００１５】
ここで用いられる「ＡＤＰ」とは、ＡＴＰのリン酸末端の加水分解によって生成されるヌクレオチドをいい、アデニン、リボース及び２リン酸を含んだ構造である（図７）。ＡＤＰアナローグ（analog）はＡＤＰ等価物と考えられるであろうことが意図される。本発明のＡＤＰアナローグとしては、２ＭｅＳＡＤＰ、ＡＤＰβＳが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によれば、ＡＤＰアナローグは上記で説明され、図７で表されるようなＡＤＰと同じ塩基構造を示すだけでなく、１つ以上の異なる置換基の構造であってもよく、米国特許５７００７８６に表示されているＡＤＰ類似物のいずれかを含むが、これらに限定されない。本発明によればＡＤＰアナローグは、ＡＤＰと同程度にＧＰＲ８６への結合を示すだろう。
【００１６】
ここで用いられている「ＧＰＲ活性」は、図１に表されている配列を含むレセプター、又は図１に示す配列と少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、９０％、９５％など）アイデンティティを示す配列を含むレセプターの活性をいう。「ＧＰＲ活性」を有するレセプターは、ＩＤＰやＵＤＰの親和性よりも少なくとも１００倍、５００倍、さらには１０００倍大きい親和性でＡＤＰに結合する（ＡＤＰ＞ＩＤＰ＞ＵＤＰ）。
【００１７】
本発明によれば、ある配列の相同的（homologous）配列は、他の哺乳類、例えば他の動物種（ラット、マウス、猫、犬など）又は特異的なヒト集団に存在するが、同じ生化学経路にかかわっている類似レセプターをコードするアミノ酸又はヌクレオチド配列を含みえる。同様に、本発明は、オルソローグ（ortholog）を意図する。ここでオルソローグとは、古代の共通する祖先における１つの単一遺伝子から進化した２つの異なる種において画定する遺伝子である。オルソローグは、その２つの異なる種の双方において同じ機能を有しているらしい。
【００１８】
そのような相同的配列は、1つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を含み、そのレセプターへのリガンド結合のような、本発明にしたがったレセプターの機能的特徴を実質的には変更しない。
【００１９】
そのような相同的配列は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下（ＳＡＭＢＲＯＯＫら、１９８９年、「分子クローニング実験マニュアル」、コールドスプリング、ハーバーラボラトリープレス社、ニューヨークによって説明されたもののように）で、完全なヒト配列にハイブリダイズできる４００、６００、８００又は１０００以上のヌクレオチドでもあることができる。
【００２０】
本発明の他の見地では、本発明のレセプターの候補モジュレーターのスクリーニング方法、検出方法及び可能な取り出し（recovery）方法に関し、その方法は、候補モジュレータの存在下で、ＡＤＰがＧＰＲ８６に結合するのを許容する条件下でＧＰＲ８６を発現する細胞をＡＤＰと接触させる工程；セカンドメッセンジャー解析を行う工程；及び候補モジュレータの存在下で得られるセカンドメッセンジャーの解析結果を、候補モジュレータの不在下で得られる解析結果と比較する工程を含む。
【００２１】
本発明の別の見地は、本発明のレセプターの候補モジュレータのスクリーニング方法、検出方法、及び可能な取り出し方法に関し、その方法は、セカンドメッセンジャー解析を行っているＧＰＲ８６へＡＤＰが結合するのを許容する条件下で、ＧＰＲ８６を発現している細胞膜をＡＤＰと接触させる工程、及び候補モジュレーターの存在下で得られたセカンドメッセンジャー解析の結果を、候補モジュレータの不在下で得られた解析結果と比較する工程を含む。
【００２２】
本発明の別の見地では、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質を同定する方法に関し、その同定方法は、ａ）ＡＤＰをＧＰＲ８６ポリペプチドに結合するのを許容する条件下で候補モジュレーターの存在及び不在下でＧＰＲ８６ポリペプチドをＡＤＰと接触させる工程；及びｂ）候補モジュレーターの不在下での結合に対して候補モジュレーターへのＧＰＲ８６の結合を測定し、その候補モジュレーターをＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質として同定する工程を含む。
【００２３】
他の態様において、候補モジュレーター、候補物質、候補化合物は、天然又は合成のペプチド、ポリペプチド、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸、及び有機低分子からなる群より選ばれる。
【００２４】
他の態様において、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナル活性の検出工程又は測定工程は、セカンドメッセンジャーのレベル変化を検出する工程を含む。
【００２５】
本発明のさらなる見地は、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーター、本発明の方法によって同定及び／又は取り出された取得可能な未知のアゴニスト及び／又はアンタゴニスト化合物に関する。また、適切な薬剤のキャリア及び十分量の前記（未知）化合物を含む前記（未知）化合物又は薬剤組成物（ワクチンを含む）を含む診断キットに関する。
【００２６】
ＧＰＲ８６の候補モジュレーターは、ＡＴＰ、２ＭｅＳＡＤＰ、ＡＤＰβＳ、２ＭｅＳＡＴＰ、Ａｐ３Ａ、ＲＢ−２、スラミン（Ｓｕｒａｍｉｎｅ）又はＰＰＡＤＳを含むが、これらに限定されないことがわかるだろう。
【００２７】
本発明によれば、アンタゴニスト化合物は、本発明のレセプターに結合できる分子若しくは分子グループ、ＡＤＰ、又は等価分子、例えば２ＭｅＳＡＤＰ、ＡＤＰβＳ、ＡＴＰ、２ＭｅＳＡＴＰ、又はＡｐ３Ａのような天然化合物の結合をブロック又は低減できる分子若しくは分子グループを意味し、米国特許５７００７８６に表示されたいずれのＡＤＰアナローグも含むが、これらに限定されない。本発明のアンタゴニスト化合物は、ＲＢ−２、スラミン、又はＰＰＡＤＳを含むが、これらに限定されない。
【００２８】
さらに本発明は、サンプル中の、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質の存在を検出する方法に拡張される。その方法とは、ａ）サンプルとＧＰＲ８６ポリペプチドを接触させる工程；ｂ）該サンプルの存在下においてＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及びｃ）当該サンプルの存在下で測定された活性と、ＥＣ５０におけるＧＰＲ８６ポリペプチドとＡＤＰとの反応において測定された活性とを比較し、当該サンプル存在下で測定されたＧＰＲ８６特異的活性の量が少なくともそのＥＣ５０でＡＤＰによって誘導された量の活性の１０％、２０％，３０％、４０％、５０％又はそれ以上であれば、ＧＰＲ８６の機能をモジュレートする物質が検出されたとする工程を含む。
【００２９】
本発明は、さらに、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不能によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法に拡張される。その方法は、ａ）ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；ｂ）その組織サンプルと該抗体との結合を検出する工程；及びｃ）工程（ｂ）で検出された前記結合を標準と比較し、該標準に対して結合に差異があればＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の兆候であるとする工程を含む。
【００３０】
さらに本発明は、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられた疾患又は疾病の診断方法に拡張される。その方法とは、ａ)ＧＰＲ８６リガンドに特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；ｂ）その組織サンプルと当該抗体の結合を検出する工程；及びｃ）工程（ｂ）で検出された結合と標準とを比較し、該標準に対して結合に差異があれば、ＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の兆候とする工程を含む。
【００３１】
本発明は、さらにＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられた疾患又は疾病の診断方法に拡張される。その方法とは、ａ)ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的な抗体及びＧＰＲ８６リガンドに特異的な抗体と組織サンプルを接触させる工程；ｂ）その組織サンプルと前記抗体の結合を検出する工程；及びｃ）工程（ｂ）で検出された結合と標準とを比較し、該標準に対していずれか一方の抗体又は双方の抗体の結合に差異があれば、ＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の兆候とする工程を含む。
【００３２】
本発明は、さらに、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられた疾患又は疾病の診断方法に拡張される。その方法とは、ａ)組織サンプルから核酸を単離する方法；ｂ）鋳型として当該核酸を用いて、ＧＰＲ８６ポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＧＰＲ８６ポリヌクレオチドの量又は配列と標準を比較し、標準に対して増幅されたＧＰＲ８６ポリヌクレオチドの量又は配列に差異があれば、ＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の兆候であるとする工程を含む。
【００３３】
本発明は、さらに、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断方法に拡張される。その方法は、ａ)組織サンプルから核酸を単離する方法；ｂ）鋳型として当該核酸を用いて、ＧＰＲ８６特異的ポリペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチドを増幅する工程；及びｃ）工程（ｂ）で製造された増幅されたＧＰＲ８６特異的リガンドポリヌクレオチドの量又は配列と標準を比較し、該標準に対して増幅されたＧＰＲ８６特異的リガンドポリヌクレオチドの量又は配列に差異があれば、ＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の兆候であるとする工程を含む。
【００３４】
他の態様において、増幅工程は、ＲＴ／ＰＣＲを含む。他の態様において、標準は配列ＩＤ  ＮＯ：１である。他の態様において、その配列の比較工程は、ミニ配列決定（minisequencing）を含む。他の態様において、配列又は量の比較工程は、マイクロアレイ上で達成される。
【００３５】
本発明のさらなる見地は、トランスジェニック非ヒト哺乳類に関し、本発明のＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターをコードするポリヌクレオチドの相同的組換え（ノックアウト）又は発現の天然レベルを超えてポリペプチドを過剰に発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類に関する。ここで用いられている「発現の天然レベルを超える」とは、内在性レセプターの発現レベルと比べて、少なくとも２倍、５倍、又は１０倍、又はほぼ１００倍以上のレベル（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１００００倍など）をいう。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、当業者によく知られた方法によって得られる。例えば、ＥＳ細胞のトランスフェクションに基づく古典的方法を用いてＷＯ９８／２０１１２で説明されているように、好ましくはＣａｒｍｅｌｉｅｔらによって説明されている方法によって得られる（Nature，Vol.380，p435−439，1996年）。
【００３６】
「ジーンターゲテイング」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳類細胞の中へ導入され、そのフラグメントが位置し、米国特許Ｎｏ．５４６４７６４および米国特許Ｎｏ．５７７７１９５（これらの内容全てが本明細書に参考として組み入れられる）に例示されているような内在性相同的配列で組替えるときに起こる相同的組換えの１つのタイプである。ここで用いられている用語「トランスジェニック動物」は、動物細胞の１つ以上、実質的に全てが、当該分野で知られているトランスジェニック技術によってのような、ヒトの仲介を通じて導入されたトランスジーンを含む非ヒト動物をいう。トランスジーンは、細胞の前駆体の中への導入によってマイクロインジェクションによってのような意図的な遺伝的巧みな操作を通じて、又は組換えウィルスでの感染によって、直接又は非直接的に、細胞の中に導入されることができる。
【００３７】
本発明によれば、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターをコードするポリヌクレオチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物は、レセプターの過剰発現を許す導入可能なプロモータでＤＮＡ構築に組み入れられるポリヌクレオチド、並びに組織及び細胞特異的調節（regulatory）要素も含むかもしれない。
【００３８】
従って、本発明の他の見地は、ヒトポリヌクレオチド（配列ＩＤ  ＮＯ１）の相同組替え体ノックアウト又は当該ポリヌクレオチドの天然レベルを超えて過剰発現をするトランスジェニックの非ヒト哺乳類のように、前記ヒトポリヌクレオチド（配列ＩＤ  ＮＯ１）のオルソローグ配列の部分的又は全削除を含む非ヒト哺乳類に関する。
【００３９】
本発明の他の見地は、ＧＰＲ８６ポリペプチドに特異的な抗体及びその種々の使用に関し、また、ＧＰＲ８６活性のモジュレータに特異的な抗体及びその使用についても同様に関する。
【００４０】
本発明の診断キットは、少なくともＧＰＲ８６レセプターと、別々にパッケージされたＡＤＰを含み、また、本発明のＧＰＲ８６レセプターへの特異的結合（例えばＡＤＰ）の検出を達成し、本明細書で説明されている疾患の１つ以上の兆候のモニタ方法に特異的結合の検出に関係するかもしれない手段及び媒体で必要らしいものはすべて含むだろう。さらに、本発明のキットは、セカンドメッセンジャー解析の要素を含む。
【００４１】
多分、そのキットは、特異的診断又は当業者によく知られた（特にＷＯ００／０２０４５に開示されたもの）ハイスループットスクリーニング技術を通じてそのように結合された化合物の投薬のための要素を含む。このハイスループットスクリーニング診断投与及びモニタリングは、当業者によって選択されたマイクロタイタプレート又はバイオチップのような種々の固体支持体を用いて達成されることができる。
【００４２】
他の見地では、本発明は、本明細書で説明されるように、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターに関し、あるいはＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴付けられた疾患または疾病を阻止、治療及び／又は軽減のための薬剤組成物又は薬剤としての使用のために本明細書で説明されているような抗体に関する。また本発明は、ここで説明されているように、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターの使用に関する、又はＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴付けられた疾患または疾病を阻止、治療及び／又は軽減のための薬剤組成物又は薬剤の製造のために、本明細書で説明されているような抗体に関する。
【００４３】
本発明の薬剤組成物において、適切な薬剤キャリアは、固体、液体又は気体状をしていて、本発明の化合物の考えられる部位効果及び投与のタイプに従って、当業者によって選択され得る。薬剤キャリアと特異的化合物との間の比率は、治療される患者、投与量、化合物の潜在的部位効果に従って当業者によって選択されることができる。治療又は特異的阻止を甘受させられる疾患又は疾病のタイプもまた同様に、当業者によって選択されることができる。
【００４４】
１．薬剤組成物は、治療及び／又は種々の疾患又は疾病の予防分野で、有用な応用を見出す。前記疾患又は疾病は、前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；恐怖、精神分裂症、激しいうつ病、うつ病、譫妄、痴呆、およびいくつかの精神的遅滞を含む精神的及び神経的疾患；消耗性疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経消耗性疾患；ハンチントン病、ギルトドラトゥレット症候群のようなジスキネシア；及びトロンボシス及び他の心血管作動病を含む他の関連疾患；自己免疫疾患及び炎症性疾患からなる群より選ばれる。
【００４５】
２．上記疾病のうち、薬への応用は、例えば、機能不全又は疾病の予防、改善又は治癒について機能を果たすことができる７回膜貫通型レセプターをターゲットとする治療剤に関する。対象となる機能不全又は疾病には、生殖能力不全；胎児成長不全；バクテリア、カビ、原生動物及び、ＨＩＶ１及びＨＩＶ２によって引き起こされるウィルス感染を含む感染；痛み、癌、食欲不振；大食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；高血圧；尿閉；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；前立腺肥大；恐怖、うつ病、片頭痛、嘔吐、脳卒中；精神分裂症、狂乱うつ病、譫妄、痴呆、いくつかの精神的遅滞及び、ハンチントン病又はトロンボシス及び他の心血管病等のギルトドラトゥレット症候群のようなジスキネシアを含む精神的疾患；自己免疫疾患；炎症性疾患が含まれるが、これらに限定しない。
【００４６】
本発明の他の見地では、本発明の候補化合物又は本発明の抗体を薬剤キャリアに添加する工程を含む薬剤組成物の製造方法に関する。
【００４７】
従って、本発明は、本明細書で述べられているような候補モジュレーター例えばＡＴＰ、２ＭｅＳＡＴＰ、２ＭｅＳＡＤＰ、ＡＤＰβＳ、Ａｐ３Ａ、ＲＢ−２、スラミン、又は本明細書で説明されているような抗体を含む組成物に関する。
【００４８】
本明細書で用いられている「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位でレセプターに競合的に結合するが、レセプターの活性型によって開始される細胞内応答を活性化せずに、これにより、アゴニスト例えばＡＤＰによって誘導される細胞内応答を、アゴニストの存在下及びアンタゴニストの不在下での細胞内応答に比べて、少なくとも１０％、又は１５〜２５％、又は２５〜５０％、又は５０〜１００％阻害する。
【００４９】
本明細書で用いられている「アゴニスト」は、それが細胞内応答を誘導するＡＤＰ濃度と等しい濃度又は低い濃度で、レセプターに結合するとき、細胞内応答を活性化するリガンドをいう。本発明によれば、アゴニストは、レセプターによって仲介される細胞内応答が、アゴニストの不在下での細胞内応答と比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、又は１００倍以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１００００倍など）だけ増大し得る。本発明によれば、アゴニストはレセプターの細胞表面発現がアゴニスト不在下で細胞表面に存在する細胞表面レセプターの数と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、又は１００倍以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１００００倍など）増大させられるように、細胞表面のレセプターの内在化を減少させることができる。本発明の他の態様において、アゴニストは、細胞表面レセプターを安定化させ、レセプターの細胞表面発現を、アゴニストの不在下での細胞表面に存在する細胞表面レセプターの数と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、又は１００倍以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１００００倍など）増大する。
【００５０】
ここで用いられている「逆アゴニスト」は、それがレセプターに結合する細胞表面レセプターの構成（constitutive）の活性を減少させるリガンドに関する。本発明の逆アゴニストは、レセプターによって仲介された構造性の細胞内応答を、逆アゴニストの不在下での細胞内応答と比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、又は１００倍以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１００００倍など）減少させることができる。
【００５１】
本発明によれば、「阻害剤」化合物とは、ＡＤＰ存在下で且つ阻害剤の不在下でのレセプターとリガンドの結合と比べて、ＡＤＰ存在下で少なくとも１０％又はほぼ１５〜２５％又はほぼ２５〜５０％及びほぼ５０〜１００％減少させるレセプター又はレセプターのための天然リガンドに対して向けられる分子である。本発明の「阻害剤」は、本発明の阻害剤化合物をコードするヌクレオチド配列をもいう。
【００５２】
本明細書に用いられている「天然リガンド」とは、天然に生じていて、自然界で見出され、ＡＤＰと等価であるという方式（すなわち、リガンドに対する親和性がＩＤＰやＵＤＰよりも大きい状態（ＡＤＰ＞ＩＤＰ＞＞ＵＤＰ））でレセプターに結合するリガンドをいう。もはや天然に生じることがない「非天然」で、天然に生じている分子から誘導されるように設計されたものとは量又は種類のいずれかにおいて異なるように、ある方式においてリガンドがかつてはレセプターに結合しなかった場合には、「天然リガンド」は、レセプターに結合するように設計され、天然に見出されないように設計されたリガンドをいわない。
【００５３】
本明細書で用いられている「モジュレーター」及び「モジュレートする物質」は、本明細書で互いに交換できるように用いられる用語で、「モジュレートする」、すなわち本発明のレセプターの細胞表面発現を増大又は減少するいずれかの化合物、あるいはアゴニストの存在又は不在下のいずれかで、及びレセプターのリガンドの存在下で、本発明のレセプターの活性型によって開始される細胞内応答を増大又は減少させるいずれかの化合物、例えばＡＤＰをいう。モジュレーターは、本明細書で定義されるように、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、または逆アゴニストを含む。モジュレーターは、タンパク質、核酸、抗体、又はこれらの断片で例えば、抗原結合断片、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、無機低分子、有機低分子などであり得る。候補モジュレーターは、天然又は合成化合物で、例えば、低分子化合物、そのような細胞からのならし培地と同様に、動物、植物、バクテリア細胞又はカビ細胞の抽出物に含まれる化合物を含み得る。
【００５４】
ここで用いられている用語「低分子」とは、３０００ダルトン以下、又はほぼ２０００又は１５００又は１０００以下及び６００ダルトン以下の分子量を有する化合物をいう。「有機低分子」は、炭素を含む低分子をいう。
【００５５】
ここで用いられている用語「結合における変化」又は「活性における変化」及びその等価的用語「結合の相違」又は「活性の相違」または「増幅された」ＰＣＲ産物の量における相違は、結合において標準に対して少なくとも１０％増大又は減少すること、あるいは与えられた解析において標準に対してシグナリング活性又はｍＲＮＡレベルにおいて１０％増大又は減少することをいう。
【００５６】
本明細書で用いられている用語「調節不良」は、サンプル内でのＧＰＲ８６のシグナリング活性をいう。ここで、
ａ）ＧＰＲ８６の量、又はＧＰＲ８６ポリペプチドリガンドｍＲＮＡ若しくはポリペプチドレベルにおける１０％の増加又は減少は、本明細書で定義されたように与えられた解析の標準に対して測定される、あるいは
ｂ）ＧＰＲ８６又はＧＰＲ８６ポリペプチドリガンドをコードする配列における少なくとも単一の塩基対変化は、本明細書で定義されるように、与えられた解析及び結果の標準に対して検出され、パラグラフａ），ｃ），またはｄ）において定義されるようにＧＰＲシグナリング活性の変更となる、あるいは；
ｃ）ＧＰＲ８６リガンド結合活性の量における１０％の増加又は減少は、本明細書で定義されるような、与えられた解析の標準に対して測定される、あるいは；
ｄ）セカンドメッセンジャー解析における１０％の増加又は減少は、ここで定義されるように、与えられた解析において、ここで述べられているように、標準に対して測定される。
【００５７】
本明細書で用いられている用語「ＡＤＰのＧＰＲ８６への結合を許容する条件」とは、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ及びＡＤＰがＧＰＲ８６に結合するタンパク質条件をいう。抽出結合条件は、解析の特性、例えば、その解析が生きている細胞又は細胞の膜フラクションだけを用いるかどうかに依存して変わる。しかしながら、ＧＰＲ８６は細胞表面タンパク質なので、好適な条件は、一般に生理学的塩（９０ｍＭ）及びｐＨ（約７．０から８．０まで）を含む。結合のための温度は１５〜３７℃で変化し、一般に室温と約３０℃の間である。結合反応におけるＡＤＰ及びＧＰＲ８６ポリペプチドの濃度も変わるが、好ましくは約０．１ｎＭ（例えば放射性物質でラベルされたトレーサーＡＤＰとの反応において、濃度は一般にＫｄ未満）から１μＭ（例えば競合者としてのＡＤＰであり得る）だろう。
【００５８】
本明細書で用いられている用語「サンプル」は、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナル活性又はＧＰＲ８６ポリペプチドへの結合をモジュレートする物質又はモジュレーター化合物の存在についてテストされる分子源をいう。サンプルは、環境サンプル；動物、植物、酵母、又はバクテリア細胞又は組織からの天然抽出物；臨床サンプル；合成サンプル；又は組換え細胞又は発酵プロセス由来のならし培地であってもよい。用語「組織サンプル」は、ＧＰＲ８６ポリペプチドの存在、多数（abundance）、量若しくは活性；ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードする核酸；又はＧＰＲ８６ポリペプチドの活性若しくはＧＰＲ８６ポリペプチドへのリガンドの結合をモディファイ若しくはモジュレートする物質若しくは化合物のためにテストされる組織をいう。
【００５９】
本明細書で用いられている「組織」は、生体内で特定機能を果たす細胞の塊をいう。本明細書で用いられている用語「組織」は、特定の生理学上の領域からの細胞材料をいう。特定組織の細胞は、いくつかの異なる細胞タイプを含むことが出来る。この限定のない例は、脳組織であり、さらにニューロン、グリア細胞を含み、また毛細管内皮（endothelial）細胞、血球も同様に含み、与えられた組織切片又はサンプル内に含まれるあらゆるものを含む。固体組織に加えて、用語「組織」は、また血液のような非固体組織にまで拡張されることを意図する。
【００６０】
本明細書で用いられている用語「膜フラクション」及び「細胞膜」は、ＧＰＲ８６ポリペプチドを含む細胞脂質膜の調製物をいう。この言葉はここで用いられているように、「膜フラクション」又は「細胞膜」は、膜関連でない細胞の構成要素の少なくとも一部（すなわち少なくとも１０％以上）が除去されるところにおいて、細胞ホモゲネートから区別される。「膜が有している（bearing）」及び「細胞膜に存在」のような類似の用語と同様の用語「膜結合した」は、脂質膜の中へ集積される、あるいは脂質膜内へ集積される成分と物理的に結合されている、いずれかである細胞構成要素の用語をいう。
【００６１】
本明細書で使用されているように、シグナリング活性の検出又は測定は、「セカンドメッセンジャー解析」を通じて行われることができる。前記セカンドメッセンジャー解析には、グアニンヌクレオチド結合又は交換の測定、アデニレートシクラーゼ活性、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼ活性又はチロシンキナーゼ活性、プロテインキナーゼＣ活性、細胞内カルシウム、ジアシルグリセロール、ホスファチジルイノシトール分解、又は当該分野で知られ且つ本明細書で定義された方法のレポータ遺伝子発現又はエオクオリンベース解析が含まれる。
【００６２】
本明細書で用いられている用語「セカンドメッセンジャー」は、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の活性化によって濃度が変化するように生成され又は濃度を変化させる分子をいい、そのＧＰＣＲからのシグナル伝達に参加する。セカンドメッセンジャーの限定ない例としては、ｃＡＭＰ、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸解離（ｒｅｌｅａｓｅ）、イノシトール三燐酸、及び細胞内カルシウムが挙げられる。用語「セカンドメッセンジャーにおけるレベル変化」とは、与えられたセカンドメッセジャーの検出レベルにおいて、候補モジュレーター不在下で行われる解析で検出された量に対して、少なくとも１０％の増加又は減少をいう。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「エクオリンベース解析」は、活性化されたＧＰＣＲによって誘導される細胞内カルシウムフラックスを測定するＧＰＣＲ活性のための解析をいい、カルシウムフラックスは、細胞内で発現されたエクオリン発光によって測定される。本発明は、このレセプターの発現の結果生じるエクオリン発光のアゴニスト又はアンタゴニストを同定するスクリーニングツールとしての、ヒトＧタンパク共役型レセプターであるＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）の使用に関する。
【００６４】
本明細書で用いられている用語「結合」は、レセプター（例えばＧＰＲ８６）とリガンド（例えばＡＤＰ又は抗体）との物理的結合をいう。ここで用いられている用語として、もし、結合がＥＣ５０でおこれば、あるいはＫｄが１００ｎＭ以下（一般的には１００ｎＭ乃至１０ｐＭ）でおこれば、その結合は特異的である。例えば、もし、ＥＣ５０又はＫｄが１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、９５０ｐＭ、９００ｐＭ、８５０ｐＭ、８００ｐＭ、７５０ｐＭ、７００ｐＭ、６５０ｐＭ、６００ｐＭ、５５０ｐＭ、５００ｐＭ、４５０ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、７５ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、又は１０ｐM以下であれば、特異的である。
【００６５】
本明細書で用いられるように、用語「ＥＣ５０」は、ＡＤＰ又は他のリガンドの結合及びＧＰＲ８６ポリペプチドの機能的活性を包含する与えられた活性での化合物の濃度が、化合物不在下で同じ解析法を用いて測定できるＧＰＲ８６活性について最大の５０％という。換言すると、「ＥＣ５０」は、１００％活性がさらなるアゴニストの添加に伴って増加しない活性量でセットされるときに５０％活性を与える化合物の濃度である。「ＡＤＰのＥＣ５０」は、解析で用いられたＡＤＰアナローグの同定により変化するだろう。例えば、ＡＤＰアナローグは、ＡＤＰよりも高い、又は低い又は同じＥＣ５０を有することができる。従って、ＡＤＰアナローグはＡＤＰと異なり、当業者が従来方法によりそのアナローグに対するＥＣ５０を決めることができる。与えられたＡＤＰのＥＣ５０は、少なくともＧＰＲ８６応答が飽和又は最大となるまで増加するＡＤＰ投与量の存在下で、ＧＰＲ８６ポリペプチドの固定量の活性に対する解析を行い、次いでＡＤＰ濃度に対するＧＰＲ８６活性の測定値をプロットすることによって測定される。
【００６６】
本明細書で用いられている「飽和」は、リガンド濃度の更なる増大がＡＤＰリガンドの結合又はＧＰＲ８６特異的シグナル活性の増大を損なう、ＡＤＰ又は他のリガンドの濃度をいう。
【００６７】
本明細書で用いられている用語「ＩＣ５０」は、ＧＰＲ８６レセプターの最大活性が５０％減じるアンタゴニスト又は逆アゴニストの濃度をいう。
【００６８】
本明細書で用いられている用語「結合における減少」は、既知又は疑いあるモジュレーターが不足する解析で検出される結合に対して、既知又は疑いあるＧＰＲ８６モジュレーターを伴って解析で検出される結合量の少なくとも１０％の減少をいう。
【００６９】
本明細書で用いられている用語「配送（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」は、薬物（ｄｒｕｇ）又は薬剤（ａｇｅｎｔ）に関連して用いられるとき、培地中の解析混合物又は細胞へ、薬物（ｄｒｕｇ）又は薬剤（ａｇｅｎｔ）を投与することを意味する。この用語は、また動物への薬物又は薬剤の投与をいう。このような投与としては、例えば、注射（好ましいキャリアは例えば滅菌生理食塩水又は滅菌水）、インハレーション、経口、経皮、直腸、膣、又は薬剤投与の他の共通ルートがあり得る。
【００７０】
本明細書で用いられている用語「標準」は、ＧＰＲ８６の調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病によって影響されない個体から入手したサンプルをいう。そのサンプルは、ＧＰＲ８６ｍＲＮＡレベル及び質（すなわち突然変異体ｖｓ野生型）の比較のための参照として用いられる。ＧＰＲ８６活性の比較についても参照として用いられる。例えば「標準」は、配列ＩＤ  ＮＯ１によって特徴づけられる配列である。
【００７１】
本明細書で用いられている「増幅」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列の１つ以上のコピーは、鋳型核酸から生成されるようなプロセスをいう。「増幅」の好適な方法は、ＰＣＲ又はＲＴ／ＰＣＲである。
【００７２】
本明細書で用いられている用語「Ｇタンパク質共役型レセプター」すなわち「ＧＰＣＲ」は、７個のアルファヘリカルの膜貫通型ドメインと、膜結合型ポリペプチドをいう。機能的ＧＰＣＲは、リガンド又はアゴニストと結合し、また活性Ｇタンパク質と結合する。ＧＰＲ８６はＧＰＣＲである。
【００７３】
本明細書で用いられている用語「抗体」は、従来の免疫グロブリン分子のほか、免疫グロブリン分子の断片で、支配下にあるポリペプチド又はモジュレーターの一つとも特異的に反応するものも含む。抗体は、従来の技術を用いてフラグメント化されることができ、本明細書で下記に抗体全体に対して説明されているのと同様の方法で、実用のためにスクリーンニングされる断片であってもよい。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、ペプシンで抗体を処理することによって生成されることができる。結果として生じるＦ（ａｂ）２フラグメントはジスルフィド結合を減じさせるように処理して、Ｆａｂフラグメントを製造した。本発明の抗体は、さらに、二重特異的、単一鎖、及びキメラ、及び抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって授けられたポリペプチドに対する親和性を有するヒト化した分子を包含することが意図される。他の態様において、抗体は、その抗体に付けられ且つ検出され得るラベルをさらに含む（例えば、ラベルには、放射性アイソトープ、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、又は酵素コファクターであり得る）。抗体、モノクローナル、又はポリクローナル、及びその過度の可変（hypervariable）部分（ＦＡＢ、ＦＡＢ”など）は、抗体を産生するハイブリドーマ細胞と同様に、特異的疾患を診断又はモニターする分野の特異的産業上応用、好ましくは後述するものは、本発明のさらなる見地である。
【００７４】
本発明によれば、阻害剤は、標識されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又は抗体の過度の可変（hypervariable）部分を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
ここで用いられている用語「トランスジェニック動物」は、１つ以上の細胞が、当該分野でよく知られているトランスジェニック技術によってのようなヒトの仲介によって誘導される異種の核酸を含んでいる非ヒト哺乳類、鳥類、魚類、両生類のような動物をいう。その核酸は、細胞の前駆体の中への直接的又は間接的導入によって、マイクロインジェクションまたは組換えウィルスを用いた感染などの意図的な遺伝的操作によって、細胞内に導入される。用語の遺伝的操作は、古典的異種交配又はインビトロの受精を含むが、むしろ組替えＤＮＡ分子の導入を指向する。この分子は、染色体内に集積されてもよいし、染色体外でのＤＮＡ複製であってもよい。ここで述べられている典型的なトランスジェニック動物において、トランスジーンは、支配下にあるポリペプチドの一つの組換え型、例えばアゴニスト型又はアンタゴニスト型を、細胞に発現させる。しかしながら、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物は、例えば、下記に述べられている構成要素依存性のＦＬＰ又はＣＲＥリコンビナーゼとして予期される。さらに、「トランスジェニック動物」は、また、１つ以上の遺伝子のうちの遺伝子崩壊が、組換え又はアンチセンス技術双方を含むヒト仲介によってもたらされるこれらの組換え動物も含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
図１は、本発明のヒトＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターのヌクレオチド及び推定されるアミノ酸配列を示す。
【００７７】
図２は、他のＰ２ＹサブタイプとＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターの構造的関係を示す樹状図である。
【００７８】
図３は、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターの組織分布を示す。
【００７９】
図４Ａ〜図４Ｃは、夫々次のものを示す：
ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現する１３２１Ｎ１−Ｇα１６細胞内でのＩＰ３の蓄積に対するＡＤＰ、２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰβＳの濃度作動曲線；
ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現する１３２１Ｎ１細胞におけるＧα１６とともにＩＰ３の蓄積に対するＡＤＰ、ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＤＰのアゴニストの効果；及び
ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現する１３２１Ｎ１細胞に対して、Ｇα１６とともに、ＡＤＰによって誘導されるＩＰ３の蓄積に対する百日咳毒素の影響。
【００８０】
図５Ａは、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄積に対するＡＤＰの濃度作動曲線を示し、図５Ｂは、本発明のＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞においてＡＤＰによって誘導されるｃＡＭＰ蓄積に対する百日咳毒素の影響を示す。
【００８１】
図６は、本発明のＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）ヒトレセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、リン酸化されたＥｒｋ１及びＥｒｋ２タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。
【００８２】
図７は、ＡＤＰの構造を示す。
【００８３】
図８は、ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＴＰによるＧＰＲ８６の濃度応答曲線を示す。
【００８４】
図９は、異なるジアデノシンポリリン酸によるＧＰＲ８６の活性化を示す。
【００８５】
図１０は、ポリ〔Ａ〕とポリ〔Ａ〕．〔Ｇ〕によってＧＰＲ８６活性化の濃度応答曲線を示す。
【００８６】
図１１は、レセプターアンタゴニストＲＢ−２、スラミン、ＰＰＡＤＳ、ＭＲＳ−２１７９の存在下でのＡＤＰによるＧＰＲ８６の活性化の濃度応答曲線を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＤＰオーファンＧタンパク質共役型レセプターＧＰＲ８６に対する天然リガンドであるという発見に関し、また薬剤スクリーニング方法におけるレセプターに対するこのリガンドの結合の使用方法に関する。この既知のリガンド及びレセプターＧＰＲ８６との相互作用は、調節不良となったレセプター活性を含む条件の診断方法を提供する。本発明は、またＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）と相同配列、該配列に相当するポリヌクレオチド、及び／又はそのポリヌクレオチドを発現する組換え細胞を含むキットに関し、レセプター及び／又はその相当するポリヌクレオチドのアゴニスト化合物、アンタゴニスト化合物及び逆アゴニスト化合物を同定する。このようなキットは、種々の疾患又は疾病の診断、予防、及び／又は治療に有用である。
【００８８】
本発明は、また、レセプターポリペプチドの新規なアゴニスト化合物、アンタゴニスト化合物、逆アゴニスト化合物、及びその相当するポリヌクレオチドで、本発明の方法によって同定されたものに関する。
【００８９】
下記及び上記に参照された全ての参考文献は、全体的に参考として、本明細書に組み入れられる。
【００９０】
配列
本発明は、ＧＰＲ８６をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する（図１に示す）。本発明は、またＧＰＲ８６をコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列に相同であるオルソローグ（ortholog）及び配列に関する。
【００９１】
配列相同性の計算
本明細書で示されている配列のいずれかに関する配列同定は、他の配列とのいずれか１つ以上の配列の単純な「眼球」による比較（すなわち厳密な比較）をして、他の配列が例えばその配列の少なくとも７０％アイデンティティを有するかどうかをみることによって決めることができる。
【００９２】
相対配列の同定は、同定決定に最適なアルゴリズムを用いて、例えばデフォールトパラメータを用いて、２つ以上の配列の間でのアイデンティティ％を算出できる商業上入手できるコンピュータプログラムによって決めることもできる。このようなコンピュータプログラムの典型例は、ＣＬＵＳＴＡＬである。２つの配列間のアイデンティティ及び類似性を決める他コンピュータプログラム方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Deveruexら、1984年、Nucleic  Acids  Research  12：387）及びＦＡＳＴＡ（Altschulら、1990年、J  Molec  Biol  403−410頁）である。
【００９３】
ホモロジー％は、隣接配列を超えて計算され得る、すなわち１つの配列は他の配列と並んでいて、１つの配列における各アミノ酸が他の配列の該当アミノ酸あるときは1残基と直接比べられる。これは、「アンギャップド（ungapped）」アライメントとよばれる。典型的には、そのようなアライメントは、比較的短い数の残基を超えてだけ行われる。
【００９４】
これはとても簡単で両立する方法であるけれども、例えば、他の点では全く同一の配列ペアにおいて、１つの挿入又は欠失が続くアミノ酸残基をアラインメントから外に置かれる原因となることを考慮することを欠いていて、その結果、全体的なアラインメントが行われるときに、潜在的にホモロジー％の大きな減少となる。結果的に、ほとんどの配列比較方法は、デザインされて、ホモロジースコア全体を過度に不利にすることなく、起こりえる挿入と欠失を考慮している好適なアラインメントを作り出す。これは、特定の相同性を最大化しようとする配列アラインメント中に、「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【００９５】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、そのアラインメント中でおこる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てて、同数の一致するアミノ酸にとって、出来る限り少ないギャップを伴う配列アラインメントは、２つの比較される配列間のより高い関係を反映して、たくさんのギャップを伴う配列よりも高いスコアを達成するだろう。「密接な関係にあるギャップコスト」は、ギャップの存在のための比較的高いコストと、ギャップ内で各々続いている残基にとって小さいほうの不利益を課すことに、典型的に用いられる。これは、最も共通に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、わずかのギャップを伴う好適化されたアラインメントを、もちろん生産するだろう。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティがモデファイされるのを許容する。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを用いるときデフォールト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージを用いるとき、アミノ酸配列のためのデフォールトギャップペナルティは、ギャップに対する−１２と各伸長に対する−４である。
【００９６】
従ってホモロジー％の最大値の計算は、ギャップペナルティを考慮すると、最初に、最適アラインメントの製造を要求する。そのようなアラインメントを実行するための好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（ウィスコンシン大学、米国；Deveruexら、1984年、Nucleic  Acids  Research  12：387）である。配列比較できる他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubelら、1995年、Short  Protocols  in  Molecular  Biology，3rd  Edition，John  Wiley  ＆  Sons）、ＦＡＳＴＡ（Altshulら、1990年、Ｊ．Mol．Biol．403−410頁）及びひと揃いの比較ツールであるＧＥＮＥＷＯＲＫＳを含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは双方とも、オフライン及びオンラインサーチングに有効である（Ausbelら、1999年、上記、7−58乃至7−60頁）。
【００９７】
最終的ホモロジー％は、アイデンティティに関して測定されることができるけれども、そのアラインメントプロセス自体が、典型的には、全か無かのペア比較に基づいている。そのかわりに、スケール化された類似性のスコアマトリックスは、化学的類似性と進化の距離に基づく各ペアの分別ある比較にスコアをわりあてるように、一般に、用いられる。共通に用いられているそのようなマトリックスの例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴひと揃いプログラムに対するデフォールトマトリックス。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、もし供給されるならば、公共のデフォールト値又は慣習的シンボル比較表のいずれかを、一般に用いる。ＧＣＧパッケージのために、公共のデフォールト値を用いることは好ましく、他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォールトマトリックスを用いることが好ましい。
【００９８】
有利には、デフォールト値をセットするパラメータとともに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが採用される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで詳細に説明されていて、これは、参考として本明細書に組み入れられる。このサーチパラメータは、下記のように定義され、定義されたデフォールトパラメータに有利にセットされることができる。
【００９９】
有利には、ＢＬＡＳＴによって評価されるときの「実質的アイデンティティ」は、ＥＸＰＥＣＴ値が少なくとも７、好ましくは少なくとも９、最も好ましくは１０以上に合う配列に相等しいとみなす。ＢＬＡＳＴサーチングにおけるＥＸＰＥＣＴに対するデフォールト閾値は、通常１０である。
【０１００】
ＢＬＡＳＴ（Basic  Local  Alignment  Search  Tool）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって採用される発見に役立つサーチアルゴリズムである；これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｕｌの統計学的方法（KarlinとAltschul、1990年、Proc．Natl．Acad．Sci．USA87：2264−68；KarlinとAltschul、1993年、Proc．Natl．Acad．Sci．USA90：5873−7；http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html）をいくつかの強化を伴って用いた彼らの発見に基づいている。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列類似性のサーチング用に適合させられ、照会配列との相同性を同定する実施例用に適合させられる。配列データベースの類似サーチにおける基礎的な問題点についての議論は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４年）Nature  Genetics  6：119−129頁参照。
【０１０１】
http://www.ncbi.nih.govで入手可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを実行している：ｂｌａｓｔｐ−タンパク質配列のデータベースに対してアミノ酸の問題配列を比較；ｂｌａｓｔｎ−ヌクレオチド配列データベースに対して問題のヌクレオチド配列を比較；ｂｌａｓｔｘ−タンパク質配列のデータベースに対して問題のヌクレオチド（双方のストランド）配列の６つのフレームの概念の翻訳産物を比較；ｔｂｌａｓｔｎ−６つのリーディングフレーム（双方のストランド）すべてにおいて、動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対する問題のタンパク質配列を比較；ｔｂｌａｓｔｘ−ヌクレオチド配列データベースの６つのフレーム翻訳に対する問題ヌクレオチド配列の６つのフレームの翻訳の比較。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴは下記サーチパラメータを使用する：
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−各サーチのためのスコアのヒストグラムの表示；デフォールトはｙｅｓ（ＢＬＡＳＴマニュアルでのパラメータＨ）。
【０１０３】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−特異化された番号に報告されたマッチング配列の短い銘柄の番号の制限；デフォールトリミットは１００の銘柄（description）（マニュアルページのパラメータＶ参照）。
【０１０４】
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列にマッチする報告のための統計学的に重大な閾値；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｕｌ（１９９０年）の確率的モデルによれば、１０マッチが単なるチャンスによって見出されると期待されるように、デフォールト値が１０である。もし、マッチにありとされる統計学上の重大性が、ＥＸＰＥＣＴ閾値よりも大きいならば、そのマッチは、報告されないだろう。ＥＸＰＥＣＴ閾値が低いほど、よりストリンジェントになり、より少ないチャンスマッチが報告されるように導く。分数値は受け入れられる（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＥを参照）。
【０１０５】
ＣＵＴＯＦＦ−高いスコアリングのセグメントペアの報告に対するカットオフスコア。デフォールト値はＥＸＰＥＣＴ値から算出される（上記参照）。ＨＳＰｓは、これらのせいにする統計学的重要性が、ＣＵＴＯＦＦ値に等価のスコアを有するたった一つのＨＳＰにありとするほど少なくとも高いかどうかだけを、データベース配列のために報告される。ＣＵＴＯＦＦ値が高い程、よりストリンジェントになり、報告されるチャンスマッチがより少なくなるように導く（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＳを参照）。典型的には、重要な閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いてより直感的に支配されることができる。
【０１０６】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−ハイスコアリングセグメントペア（ＨＳＰｓ）が報告されることに対して特異的な数へのデータベース配列の制限；デフォールトリミットは５０である。もし、これよりも大きいデータベースが、報告のための統計学的に重要な閾値をたまたま満足させるならば（下記ＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦ参照）、もっとも大きい統計学的重要性がありとするマッチだけが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルにおけるパラメータＢを参照）。
【０１０７】
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＸ，ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸの代替のスコアリングマトリックスを特異化する。デフォールトマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である（Henikoff＆Henikoff，1992年）。価値ある代替可能な選択としては、ＰＡＭ４０，ＰＡＭ１２０，ＰＡＭ２５０及びＩＤＥＮＴＩＴＹがある。ＢＬＡＳＴＮの代替のスコアリングマトリックスは入手可能でない。ＢＬＡＳＴＮにおいて指示的なＭＡＴＲＩＸの特異化は、エラー応答のリターンを要求する。
【０１０８】
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮサーチはデータベース配列のちょうどトップ又はボトムのストランドに制限する；あるいはＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ又はＴＢＬＡＴＸサーチを、問題配列のトップ又はボトムのストランド上のちょうどリーディングフレームに限定する。
【０１０９】
ＦＩＬＴＥＲ−Wooton＆Federhen（１９９３年）Computers  and  Chemistry  17：149−163のＳＥＧプログラムによって決定されるように、低い文法的複雑さを有する問題配列のセグメントのおおいをはがす、あるいはClaverie＆States（1993年）Computers  and  Chemistry  17：191−201のＸＮＵプログラムによって決定されるように、あるいはＢＬＡＳＴＮにかえて、ＴａｔｕｓｏｖとＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラム（http://www.ncbi.nih.govを参照）によって決定されるように、短周期の内部繰り返しからなるセグメントのおおいをはがす。フィルタリングは、ｂｌａｓｔ出力から、統計学的に重要であるが生物学的には興味がない報告（例えば共通の酸性領域、塩基性領域またはプロリンリッチ領域についてのヒット）を除去することができ、データベース配列に対して特異的マッチングに入手可能な問題配列のより生物学的に興味ある領域を残しておく。
【０１１０】
フィルタープログラムによって見出される複雑性の低い配列は、ヌクレオチド配列において文字「Ｎ」を用いて置換される（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）とタンパク質配列では文字「Ｘ」で置換される（例えば「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）。
【０１１１】
フィルタリングは、問題配列（又はその翻訳産物）に適用されるだけで、データベース配列には適用されない。デフォールトフィルタリングには、ＢＬＡＳＴＮのためのＤＵＳＴ、他のプログラムのためのＳＥＧがある。
【０１１２】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおける配列に適用されるとき、ＳＥＧ，ＸＮＵ又は双方によって全く何もマスクされないことは異常ではない。フィルタリングが常に効果を生み出すことを期待すべきでない。
【０１１３】
さらに、いくつかのケースでは、配列はその全体でマスクされ、フィルタリングされていない問題の配列に対して報告されたどのマッチも統計学的重要性が疑われていることを示す。
【０１１４】
ＮＣＢＩ−ｇｉ  ＮＣＢＩ  ｇｉ同定物（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）を、アクセス及び／又は座の名前に加えて、出力として示されるようにする。
【０１１５】
最も好ましくは、配列比較は、http://www.ncbi.nih.gov/BLASTで提供されている単純なＢＬＡＳＴサーチアルゴリズムを用いて実行される。本発明のいくつかの態様では、配列アイデンティティを決定するときにギャップペナルティは用いられない。
【０１１６】
ハイブリダイゼーション
本発明は、本明細書で示されている配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、または配列の断片又は誘導体、又は上記いずれかの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にも拡張する。
【０１１７】
ハイブリダイゼーションは、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＣＷとＧＳ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（1995年，ＰＣＲプライマー，実験マニュアル、コールドスプリングハーバープレス社，ニューヨーク州プレインビュー）で説明されているポリメラーゼ鎖反応技術において実行されるような増幅プロセスと同様に、「塩基ペアを通じて、核酸の鎖が相補鎖と結合することによるプロセス」を意味する（Coombs  Ｊ(1994年)、バイオテクノロジー事典、Stockton  Press社，ニューヨーク州ニューヨーク）。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒとＫｉｍｍｅｌ（1987年，分子クローニング技術のガイド，Methods  in  Enzymology，Vol．152，アカデミックプレス社，カリフォルニア州サンディエゴ）に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、下記に説明するように、定義された「ストリンジェンシー」を授ける。
【０１１９】
本明細書で表されているヌクレオチド配列又はそれらの相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に選択的にハイブリダイズできる本発明のヌクレオチド配列は、少なくも２０又は少なくとも２５又は３０、例えば４０、６０又は１００以上の隣接しているヌクレオチド領域を超えて、本明細書で表示されている該当ヌクレオチド配列に、一般に少なくとも７０％、又は７５％、又は少なくとも８５％又は９０％およびほぼ少なくとも９５％又は９８％相同であるだろう。
【０１２０】
用語「選択的にハイブリダイズできる」は、本発明の標的ヌクレオチド配列は、上記バックグラウンドに重要なレベルでそのプローブにハイブリダイズすることを見出される条件下で、プローブが用いられるように、使用されるヌクレオチド配列をいう。そのバックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡにおいて存在する他のヌクレオチド配列のために起こりえる。この場合、バックグラウンドは、１０倍又はほぼ１００倍激しく標的ＤＮＡとともに観察される特異的相互作用よりも１０倍以下又はほぼ１００倍以下であるライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとプローブの間での相互作用によって生み出されたシグナルレベルを暗示する。相互作用の激しさは、例えば、プローブを放射性ラベル、例えば３２Ｐを用いて測定されることができる。
【０１２１】
最大ストリンジェンシ−に対する中間的条件下、本明細書に表示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列も、本発明の範囲内に含まれる。Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（1987年、分子クローニング技術へのガイド、Methods  in  Enzymology，Vol．52，アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ）で教示されたように、ハイブリダイゼーション条件は、複合体に結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づき、下記で説明されるように定義された「ストリンジェンシー」を授ける。
【０１２２】
最大のストリンジェンシ−は、典型的には、約Ｔｍ−５℃で起こる（プローブのＴｍ未満５℃）；約５〜Ｔｍ未満である１０℃でのハイストリンジェンシィ；約１０〜Ｔｍ未満である２０℃での中間ストリンジェンシィ；そしてＴｍ未満である約２０〜２５℃での低いハイストリンジェンシィ。当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシィハイブリダイゼーションは、中間の（又は低い）ストリンジェンシィハイブリダイゼーションは、類似の又は関係するヌクレオチド配列を同定又は検出に用いられることができる間に、ヌクレオチド配列の同定又は検出に用いられることができる。
【０１２３】
他の態様では、本発明はストリンジェントな条件下で本発明のＧＰＣＲヌクレオチド配列の１つ以上にハイブリダイズできるヌクレオチド配列をカバーできる（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ{１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０}。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖のところでは、双方の鎖が二重で、各々独立的に又は組合せのいずれかは、本発明によって拡張される。ヌクレオチド配列が単一鎖のところでは、そのヌクレオチド配列の相補配列は、また本発明の範囲内に含まれる。
【０１２４】
本発明は、本明細書で表示されている配列に相補的である配列又はその断片のいずれか又は誘導体にハイブリダイズできるヌクレオチド配列にも拡張する。さらに、本発明は、本発明の配列にハイブリダイズできる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも拡張する。これらのタイプのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の変形例である。この点において、用語「変形（ｖａｒｉａｎｔ）」は、本明細書で表示されているヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補的な配列に拡張する。しかしながら、用語「変形」は、ストリンジェントな条件下で本明細書に表示されているヌクレオチド配列にハイブリダイズできる配列に相補的である配列にも拡張する（例えば、６５℃で０．１×ＳＳＣ{１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０}）。
【０１２５】
細胞
本発明によれば有用な細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞からなる群より選択されることができる。
【０１２６】
本発明によれば有用な細胞は、本発明によればレセプターをコードする核酸配列が誘導されることができる、又は本明細書で定義されるように、レセプターが天然のレベル又は天然のレベル以上で表現されるように存在している中へのいずれかの細胞であることができる。細胞内で発現される本発明のレセプターは、本明細書で定義される正常又はほぼ正常な薬理学を示しえる。細胞内で発現される本発明のレセプターは、図１に表示されたヌクレオチド又はアミノ酸配列あるいは図１に表示されたアミノ酸配列に少なくとも７０％一致するヌクレオチド又はアミノ酸配列を含み得る。細胞内で発現される本発明のレセプターは、ＩＤＰ及びＵＤＰに対する親和性よりも少なくとも１００倍、５００倍、又はほぼ１０００倍の親和性をもってＡＤＰに結合できる。
【０１２７】
本発明の他の態様によれば、細胞は、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＬＭ（ＴＫ）細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｋ５６２細胞又は１３２１Ｎ１アストロサイト−マ細胞からなる群より選択されるが、他のトランスフェクトできる細胞系列も選ばれる。本発明の細胞膜がこれらの細胞由来であり得ることは明らかである。
【０１２８】
Ｉ  ＧＰＲ８６の活性をモジュレートする物質の同定のための解析
ＧＰＲ８６の活性をモジュレートする物質は、ＡＤＰ又は他のリガンドとレセプターの相互作用を利用するたくさんの方式で同定されることができる。例えば、培養された細胞におけるインビトロ又はインビボで、ＧＰＲ８６／ＡＤＰ結合を再構築する可能性は、その結合を引き裂く物質の同定のための標的を提供する。結合の開裂に基づく解析は、そのような分子のライブラリ又はコレクションからの有機低分子のような物質を同定できる。その代わりに、そのような解析は、天然源、例えば植物、カビ又はバクテリアの抽出物またはヒト組織サンプル（例えば腫瘍組織）からの抽出物又はサンプルにおいて物質を同定することができる。ある見地では、その抽出物は、核酸変形、ペプチド、又はポリペプチドのライブラリを発現する細胞から作られることができる。そして、ＧＰＲ８６／ＡＤＰ結合のモジュレーターは、結合解析又はレセプターを通じての下流のシグナリングを測定する機能的解析を用いてスクリーニングされることができる。
【０１２９】
ＧＰＲ８６機能をモジュレートする物質をもっと直接的に同定するＧＰＲ８６／ＡＤＰ相互作用を用いる他のアプローチは、候補物質又は候補モジュレーターによって誘導されるＧＰＲ８６の下流シグナリングにおける変化を測定する。これらの機能解析は、単離された細胞膜フラクション内、又は細胞表面のレセプターを発現する細胞上で行われることができる。
【０１３０】
ＡＤＰが、ＧＰＲ８６レセプターのリガンドであることが発見されて、スクリーニング解析によりアゴニスト、アンタゴニスト、及びレセプター活性の逆アゴニストを同定できるようにする。このスクリーニング解析には、２つの一般的なアプローチがあるであろう。
【０１３１】
１）リガンド結合解析
ＧＰＲ８６を発現する細胞、そのような細胞からの膜抽出物、ＧＰＲ８６ポリペプチドを含むウィルス誘導された出芽膜、又はＧＰＲ８６を含む固定化した脂質膜が標識されたＡＤＰ及び候補化合物に曝されるところで行われる。培養に続いて、反応混合物は、ＧＰＲ８６レセプターに対する標識ＡＤＰの特異的結合のために測定される。結合を阻止又は標識ＡＤＰにとってかわる化合物は、ＧＰＲ８６活性のアゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストであることができる。そして、次の機能的解析は、これらのカテゴリーのうちのいずれかに、これらが属するのかを決定する陽性化合物上で行われることができる。
【０１３２】
２）機能解析は、ＧＰＲ８６のシグナリング活性が測定される。
ａ）アゴニストスクリーニングにとって、ＧＰＲ８６発現細胞又はこれらから調製された膜が、候補化合物とともに培養され、ＧＰＲ８６のシグナリング活性が測定される。レセプター活性をモジュレートする化合物によって誘導される活性は、ＡＤＰによって誘導される活性と比較される。アゴニスト又は部分的アゴニストは、アゴニスト又は部分的アゴニストが１０ｎＭ以下で存在するとき、ＡＤＰの最大活性の少なくとも１０％に該当する最大の生物活性を有するだろう、また、少なくともＡＤＰと同じ程度の強さの効能を有するだろう。
【０１３３】
ｂ）アンタゴニスト又は逆アゴニストスクリーニングのために、ＧＰＲ８６発現細胞又はこれらから単離された膜が、候補化合物とともに又は伴わずに、ＡＤＰ存在下でのシグナリング活性について解析される。アンタゴニストは、ＡＤＰ存在下で、アンタゴニストを不足する反応に対して、少なくとも１０％ＡＤＰ刺激されたレセプター活性のレベルを減じるだろう。逆アゴニストは、逆アゴニストを不足している反応に対して、少なくとも１０％そのレセプターの構成要素活性を減じるだろう。
【０１３４】
ｃ）逆アゴニストスクリーニングのために、構成要素ＧＰＲ８６活性を発現する細胞又はこれらから単離された膜は、候補化合物の存在下でのレセプター活性を測定する機能的解析の中で用いられる。逆アゴニストは、少なくとも１０％レセプターの構成要素活性を減少させるこれらの化合物である。ＧＰＲ８６は、強い構成要素プロモータ、例えばＣＭＶ初期（ｅａｒｌｙ）プロモータのコントロール下に、それを配置することによって、過剰発現されることができる。あるいは、保存されたＧＰＣＲアミノ酸又はアミノ酸ドメインのある突然変異は、構成要素活性を導く傾向がある。例えば、Kjelsbergら，1992年，J．Biol．Chem．267：1430；McWhinneyら，2000年，J．Biol．Chem．275：2087；Renら，1993年，J．Biol．Chem．268：16483；Samamaら，1993年，J．Biol．Chem．268：4625；Parmaら，1993年，Nature365：649；Parmaら，1998年，J．Pharmacol．Exp．Ther．286：85；及びParentら，1996年，J．Biol．Chem．271：7949参照。
【０１３５】
リガンド結合と変位解析
ある者は、細胞上、又はレセプターポリペプチドを含む単離された膜上で発現されるＧＰＲ８６ポリペプチドを、ＡＤＰがＧＰＲ８６へ結合するのを阻害する化合物のスクリーニングのために、ＡＤＰとともに、使用することができる。結合又はＡＤＰ変位だけを測定する解析の中で同定されるとき、化合物は、それらがアゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストとして作用するかどうかを決定する機能的テストを受けさせなければならないだろう。
【０１３６】
変位実験にとって、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞（一般に解析あたり２５×１０３細胞又は１乃至１００μｇの膜抽出物）は、候補モジュレーターの増大濃度の存在又は不在下で標識されたＡＤＰで結合したバッファ内で培養される。その解析を有効にし、修正するために、非標識ＡＤＰの濃度を増大させながら、コントロール競合反応が行われることができる。培養後、細胞は、広範囲に洗浄され、結合した標識ＡＤＰは与えられた標識にふさわしいように測定される（例えば、シンチレーションカウント、蛍光など）。候補モジュレーターの存在下で結合された標識ＡＤＰの量における少なくとも１０％の減少は、候補モジュレーターによって結合の変位を示す。１０ｎＭ以下の濃度で標識ＡＤＰ（サブ飽和しているＡＤＰ投与量）の５０％変位すれば、本明細書で説明されているこの又は他の解析において、候補モジュレーターは特異的に結合すると考えられる。
【０１３７】
あるいは、結合又は結合の変位は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニタされることができる。表面プラズモン共鳴解析は、定量的方法として用いられることができ、水相からセンサ上の膜内に固定化されたＧＰＲ８６ポリペプチドまでＡＤＰが結合又は結合を喪失することによって引き起こされる固定化したセンサ付近での質量変化によって２つの分子間結合を測定する。質量におけるこの変化は、ＡＤＰ又は候補モジュレーターの注入又は除去後の時間に対する共鳴ユニットとして測定される、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（バイアコアＡＢ）を用いて測定される。ＧＰＲ８６は、Ｓａｌａｍｏｎらによって説明された方法によれば薄層脂質膜において、センサチップ上に固定化される（例えばリサーチグレードＣＭ５チップ；バイアコアＡＢ）（Salamonら，1996年，Biophys  J．71：283−294；Salamonら，2001年，Biophys．J．80：1557−1567；Salamonら，1999年，Trends  Biochem．Sci．24：213−219、これらはそれぞれ参考として本明細書に組み入れられる）。Ｓａｒｒｉｏら、ＳＰＲがチップ上での脂質層内に固定化されたＧＰＣＲ  Ａ（１）アデノシンレセプターに結合しているリガンドを検出するのに用いられることができる（Sarrioら，2000年，Mol．Cell．Biol．20：5164−5174，参考として本明細書に組み入れられる）。ＳＰＲ解析において、ＧＰＲ８６にＡＤＰが結合するための条件は、開始点として、Ｓａｒｒｉｏらによって報告された条件を用いて、当業者によって微調整されることができる。
【０１３８】
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で結合のモジュレーターについて解析できる。第１の方法は、固定化されたＧＰＲ８６ポリペプチドにＡＤＰをプレ結合し、続いて０．１ｎＭから１μＭまでの領域の濃度で候補モジュレーターをインジェクションすることができる。結合されたＡＤＰの変位を定量して、モジュレーター結合を検出する。あるいは膜結合されたＧＰＲ８６ポリペプチドを、候補モジュレーターとともにプレインキュベートして、ＡＤＰとともにチャレンジされることができる。モジュレーターに予めさらされていないチップ上でのＡＤＰ結合に対して、モジュレーターにさらされたＧＰＲ８６とＡＤＰの結合に差異があれば、モジュレーターが存在するときのＡＤＰの結合又は変位を立証するだろう。いずれかの解析において、候補モジュレーターの不在下でのＡＤＰ結合量に対して、候補モジュレーター存在下でＡＤＰ結合の量が１０％以上減少していると、候補モジュレーターがＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用を阻害することを示している。
【０１３９】
ＡＤＰのＧＰＲ８６への結合阻止を検出する方法は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を使用する。ＦＲＥＴは、蛍光ドナー（Ｄ）の放射スペクトルが蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルとオーバラップしているならば、蛍光ドナー（Ｄ）と蛍光アクセプター（Ａ）の間で互いに接近しているとき（通常、分離の＜１００Å）に起こる量子機構的現象である。テストされる分子、例えばＡＤＰとＧＰＲ８６ポリペプチドは、ドナーとアクセプター蛍光団の相補的ペアで標識される。ＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用によって両者が密接に結合される一方、ＡＤＰとＧＰＲ８６ポリペプチドが結合されていないとき、ドナー蛍光団の励起で放射される蛍光は励起波長に応答して放射される波長と異なる波長を有し、各波長での放射強度の測定によって、結合されていない分子ｖｓ結合された分子を定量するだろう。ＧＰＲ８６ポリペプチドを標識するドナー蛍光団は、当該分野でよく知られている。ＣｙａｎＦＰ（ＣＦＰ，ドナー（Ｄ））とイエローＦＰ（ＹＦＰ，アクセプター（Ａ））として知られているＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰの変異体は、興味あるものである。実施例として、ＹＦＰ変異体は、ＧＰＲ８６との融合タンパク質として作られることができる。蛍光団で標識したＡＤＰ化合物（モレキュラープローブス社）と同様に融合としてのＧＦＰ変異体の発現のためのベクター（クローンテック社）が当該分野で知られている。標識されたＡＤＰとＹＦＰ−ＧＰＲ８６タンパク質の混合物への候補モジュレーターの添加は、例えば、候補モジュレーターを伴わないサンプルに対して、ＹＦＰ蛍光の減少によって、実証されたエネルギートランスファーの阻害をもたらす。ＧＰＲ８６：ＡＤＰの検出のためにＦＲＥＴを用いる解析において、候補モジュレーターを含まないサンプルに対して、候補モジュレーターを含むサンプルにおけるアクセプター波長で蛍光放射強度が１０％以上減少すると、候補モジュレーターはＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用を阻止することを示す。
【０１４０】
ＦＲＥＴにおけるバリエーションは、蛍光消光を用いて、分子の相互作用をモニターする。相互作用しているペアにおける一方の分子は蛍光団で標識され、他方は、それを伴う密接な並列をもたらすとき、蛍光団の蛍光を消光する分子で標識される。励起に基づく蛍光の変化は、蛍光団：消光剤ペアでタグ付けされた分子の会合における変化の指標である。一般に、標識ＧＰＲ８６ポリペプチドの蛍光の増加は、消光剤を有するＡＤＰ分子が置き換えられた指標となる。消光解析にとって、候補モジュレーターなしのサンプルに対して、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光放出の強度における１０％以上の増大は、候補モジュレーターがＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用を阻害することを示す。
【０１４１】
表面プラズモン共鳴とＦＲＥＴ方法に加えて、蛍光分極測定は、結合の定量に有用である。蛍光的にタグづけされた分子に対する蛍光分極値は、回転の相互関係時または宙返り速度に依存している。蛍光標識ＡＤＰと会合するＧＰＲ８６によって形成される複合体のような複合体は、複合化されていない、標識ＡＤＰよりも高い分極値を有する。候補阻害剤が解離、又はＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用を阻止するならば、ＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用の候補阻害剤の包含は、候補阻害剤なしの混合物に対して、蛍光分極の減少を結果としてもたらす。蛍光分極は、レセプター：リガンド複合体の形成を解離する低分子の同定によく適している。候補モジュレーターが不足しているサンプルにおける蛍光分極に対して、候補モジュレーターを含むサンプルにおける蛍光分極の１０％以上の減少は、候補モジュレーターはＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用を阻止することを示す。
【０１４２】
ＧＰＲ８６：ＡＤＰ相互作用をモニタする他の代用は、バイオセンサ解析を使用する。ＩＣＳバイオセンサは、当該分野で説明された（オーストラリアのメンブレンバイオテクノロジーリサーチインステイテュート；http //www.ambri.com.au/；Cornell・Ｂ，Braach-Maksvytis・V，King・L，Osman・P，Raguse・B，Wieczorek・L及びPace・R．「イオンチャンネルスイッチを用いたバイオセンサ」Nature，1997年，387，580）。この技術は、ＧＰＲ８６とそのリガンドの会合が、疑いある２層膜の中のグラマシジン−促進（gramacidin-facilitated）イオンチャネルの接近と共役し、このようにしてバイオセンサのアドミッタンス（インピーダンスと類似）が測定可能に変化する。このアプローチは、アドミッタンス変化の大きさが６オーダーを超える線形で、小さな分子の組換えライブラリーの大規模なハイスループットスクリーニングに理想的に適している。候補モジュレーターに不足しているサンプルのアドミッタンスに対して、候補モジュレーターを含むサンプルにおけるアドミッタンスの１０％以上の変化（増加又は減少）は、候補モジュレーターがＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用を阻害していることを示す。ＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用をテストする解析において、相互作用のモジュレーターが必ずしも、ＡＤＰと物理的に相互作用するタンパク質のドメインと直接相互作用する必要がないであろうことに留意することが重要である。モジュレーターが相互作用の部位から除去された位置で相互作用するであろうこと、そして例えばＧＰＲ８６ポリペプチド内での構造的変化を引き起こすであろうこともあり得る。この方式で作動するモジュレーター（阻害剤又はアゴニスト）は、それにもかかわらず、ＧＰＲ８６活性をモジュレートする物質として興味深い。
【０１４３】
従って、ＧＰＲ８６発現細胞を用いるＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターのスクリーニング方法は、ａ）候補モジュレーター存在下での細胞の第１のサンプル及び候補モジュレーターの不在下での細胞の第２のサンプルを、これらの双方サンプルがＡＤＰがＧＰＲ８６に結合するのを許容する条件下で培養する工程；ｂ）これらの第１及び第２のサンプルの中で、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程、及び；ｃ）第１と第２のサンプルについてのセカンドメッセンジャーの解析結果を比較する工程を含む。また、ＧＰＲ８６を有する細胞膜を用いるＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターのためのスクリーニング方法は、ａ）前記候補モジュレーターの存在下での前記細胞膜の第１のサンプルと、候補モジュレーターの不在下での前記細胞膜の第２のサンプルとを、双方のサンプルがＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；ｂ）これらの第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及びｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャー解析の結果を比較する工程を含む。さらにＧＰＲ８６を発現する細胞を用いて候補モジュレーターがＧＰＲ８６活性を増大又は低減させているかを決定する方法は、ａ）前記候補モジュレーターの存在下で前記細胞の第１のサンプルと、候補モジュレーターの不在下で前記細胞の第２のサンプルとを、双方のサンプルがＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及びｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程を含む。次に、ＧＰＲ８６を有する細胞膜を用いて、候補モジュレーターがＧＰＲ８６活性を増大又は低減させているかを決定する方法は、ａ）前記候補モジュレーターの存在下で前記細胞膜の第１のサンプルと、候補モジュレーターの不在下で前記細胞膜の第２のサンプルとの双方のサンプルを、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下で培養する工程；ｂ）前記第１のサンプルと第２のサンプルにおいて、ＧＰＲ８６ポリペプチドのシグナリング活性を検出する工程；及びｃ）前記第１のサンプルと第２のサンプルについて、前記セカンドメッセンジャーの結果を比較する工程を含む。
【０１４４】
他のリガンド
ここで説明されている方法又は結合解析のいずれも、ＧＰＲ８６の非ＡＤＰリガンド（例えばアゴニスト、アンタゴニストなど）を用いて実行されることができると理解されるべきである。例えば、ここで説明されているように同定された小さな分子又はＡＤＰアナローグ類似物は、米国特許Ｎｏ．５７００７８６に表示されるＡＤＰアナローグ、天然又は合成ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合部位、脂質、炭水化物、及び小さな有機分子のいずれも含むが、これらに限定されない。
【０１４５】
説明された方法又は結合解析のいずれも、ＧＰＲ８６レセプター分子に結合する又はＧＰＲ８６レセプターへのＡＤＰの結合に影響を与えるサンプル、例えば組織サンプル中での物質の存在を決定するのに用いられることができる。そうすると、ＧＰＲ８６ポリペプチドは、ＡＤＰと又はサンプルの存在又は不在下での他のリガンドと反応し、ＡＤＰ又はリガンド結合が、使用される結合解析にふさわしいとして測定される。ＡＤＰ又は他のリガンドの結合における１０％以上の減少は、当該サンプルがレセプターポリペプチドへのＡＤＰ又はリガンドの結合をモジュレートする物質を含むことを示す。
【０１４６】
さらに、本発明は、本明細書で説明されているような方法に関する。その方法とは、ＡＤＰが、ここで述べられているようなモジュレーター、例えばＡＴＰ，２ＭｅＳＡＴＰ，２ＭｅＳＡＤＰ，ＡＤＰβＳ，Ａｐ３Ａ，ＲＢ−２，スラミン又はＰＰＡＤＳのようなモジュレーターに置き換えられる方法である。
【０１４７】
さらに、本発明によって同定又は特徴付けられた物質又はモジュレーターは、細胞の中のポリペプチドのＧＰＲ８６活性をモジュレートする方法であって、ＧＰＲ８６活性がモジュレートするように、ポリペプチドのＧＰＲ８６活性をモジュレートする物質を前記細胞に配送する工程を含む方法の中で用いられることができる。
【０１４８】
レセプター活性の機能的解析
ｉ．ＧＴＰアーゼ／ＧＴＰ結合解析
ＧＰＲ８６のようなＧＰＣＲにとって、レセプター活性の測定は、レセプターを含む細胞膜によるＧＴＰの結合として測定される。ＴｒａｙｎｏｒとＮａｈｏｒｓｋｉによって、1995年，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４７：８４８−８５４頁（これは参考として本明細書に組み入れられる）で説明された方法において、標識ＧＴＰの結合を検出することによって膜に共役するＧタンパク質を本質的に測定する。ＧＴＰ結合解析にとって、レセプターを発現する細胞から単離された膜は、ＨＥＰＥＳを２０ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ１００ｍＭ，ＭｇＣｌ２を１０ｍＭ，３５Ｓ−ＧＴＰγＳを８０ｐＭ及びＧＤＰを３μＭ含むバッファーの中で培養される。この解析混合物は、結合されていない標識ＧＴＰがＧＦ／Ｂフィルター上での濾過によって除去される後、３０℃で６０分間培養される。結合した、標識ＧＴＰは、液体シンチレーションカウンターによって測定される。ＡＤＰ誘導ＧＰＲ８６活性のモジュレーションの解析のために、ＧＰＲ８６ポリペプチド発現細胞から調製さた膜が、ＡＤＰと混合され、ＧＴＰ結合解析は、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターの存在及び不在下で実行される。候補モジュレーターを含むこの種の解析においてシンチレーションカウントされることによって測定されるように、候補モジュレーターなしでの解析に対して標識ＧＴＰ結合が１０％以上減少すると、候補モジュレーターがＧＰＲ８６活性を阻害することを示す。類似のＧＴＰ結合解析は、ＡＤＰを用いることなく実行されて、アゴニストとして作動する化合物を同定することができる。この場合、ＡＤＰ刺激ＧＴＰ結合は、標準として用いられる。もしその化合物が１μＭ以下で存在するときにＡＤＰによって誘導されるＧＴＰ結合を少なくとも５０％のレベルで誘導すれば、またはＡＤＰによって誘導されるレベルと同じ若しくはそれよりも高いレベルで誘導すれば、その化合物はアゴニストと考えられる。ＧＴＰアーゼ活性は、ＧＰＲ８６を含む膜を、γ３２Ｐ−ＧＴＰとともに培養することによって、測定される。活性ＧＴＰアーゼが無機リン酸としてラベルを解離するであろう。そして、無機リン酸は、２０ｍＭのＨ３ＰＯ４中の活性炭の５％懸濁液の中のフリー無機リン酸の分離によって検出され、続いてシンチレーションカウントされる。コントロールは、候補化合物の潜在的な非特異的影響を排除するために、ＧＰＲ８６を発現しない細胞（ｍｏｃｋ−トランスフェクト）から単離された膜を用いる解析を含む。
【０１４９】
ＧＰＲ８６調節されたＧＴＰアーゼ活性上での候補モジュレーターの影響について解析するために、膜サンプルは、ＡＤＰとともに、モジュレーターを伴い又は伴わずに培養され、続いてＧＴＰアーゼ解析を行う。モジュレーターなしのサンプルに対して、ＧＴＰ結合又はＧＴＰ活性のレベルの１０％以上の変化（増加又は減少）は、候補モジュレーターによるＧＰＲ８６モジュレーションの指標となる。
【０１５０】
ｉｉ．ダウンストリーム経路活性化解析：
ａ．カルシウムフラックス−エクオリンベース解析：
エクオリン解析は、ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウムの放出に対するミトコンドリアのアポエクオリンの応答を利用する（Stableら，1997年，Anal．Biochem．252：115−126；Detheuxら，2000年，Ｊ．Exp．Med．，192：1501−1508；これらは双方とも本明細書に参考として組み入れられる）。要するに、ＧＰＲ８６発現クローンは、トランスフェクトされて、ミトコンドリアのアポエクオリンとＧα１６を共発現する。細胞は、５μＭのＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ  Ｈ（モレキュラープローブス社）とともに室温で４時間培養され、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地内で洗浄され、再び０．５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で再懸濁される。そして、細胞はテストアゴニスト分子と混合され、エクオリンによる発光がルミノメータを用いて３０秒間記録される。結果は、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）として発現される。コントロールは、候補化合物の潜在的非特異的効果を排除するために、ＧＰＲ８６を発現しない細胞（ｍｏｃｋトランスフェクトされた）から単離された膜を用いた解析を含む。
【０１５１】
もし、光強度が、候補モジュレーターで処理されたＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞のサンプル内で、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現するが候補モジュレーターで処理されない細胞のサンプルに対して、又はＧＰＲ８６ポリペプチドを発現しないが（ｍｏｃｋトランスフェクトされた）候補モジュレーターで処理された細胞に対して、１０％以上の増加又は減少していれば、エクオリン活性又は細胞内カルシウムレベルは、「変化した」とする。
【０１５２】
ＡＤＰの不在下で行うとき、その解析は、ＧＰＲ８６活性のアゴニストを同定するのに用いられることができる。その解析がＡＤＰの存在下で行われるならば、それはアンタゴニストについての解析に用いられることができる。
【０１５３】
ｂ．アデニレートシクラーゼ解析：
アデニレートシクラーゼ活性の解析は、Ｋｅｎｉｍｅｒ＆Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇによって、1981年，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０：５８５−５９１（これは参考として本明細書に組み入れられる）で説明されている。この解析は、Ｓｏｌｏｍｏｎらによって、１９７４年，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５４１−５４８によって教示される解析のモディフィケーションである（これは参考として本明細書に組み入れられる）。要するに、１００μｌの反応系には、５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５），５ｍＭのＭｇＣｌ２，２０ｍＭのクレアチンリン酸（ナトリウム塩），１０ユニット（７１μｇのタンパク質）のクレアチンホスホキナーゼ，１ｍＭのα−３２Ｐ−ＡＴＰ（テトラナトリウム塩，２μＣｉ），０．５ｍＭのサイクリックＡＭＰ，Ｇ−３Ｈ−標識サイクリックＡＭＰ（約１００００ｃｐｍ）０．５ｍＭのＲｏ２０−１７２４，０．２５％エタノール，及び５０−２００μｇのタンパク質ホモゲネートを含んでテストされる（すなわち、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞又は発現せず、候補モジュレーターともに又は伴わずにＡＤＰで処理又は処理されない細胞からのホモゲネート）。反応混合物は、一般に、３７℃で６分間培養される。培養につづいて、反応混合物は、コールドの６％トリクロロ酢酸０．９ｍｌの追加によって脱タンパクされる。試験管は、１８００×ｇで２０分間遠心分離され、各上澄み液は、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ４カラムに添加される。このカラムからのｃＡＭＰフラクションは、０．１ｍＭイミダゾール塩酸（ｐＨ７．５）４ｍｌでカウンティングバイアルに溶出される。解析は３回行われるべきである。コントロール反応は、また、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現しない細胞からのホモゲネートタンパク質を用いて行われるべきである。
【０１５４】
本発明によれば、ＧＰＲ８６活性の候補モジュレーターで処理された細胞からのサンプルにおいて、候補モジュレーターで処理されない細胞の同様のサンプルに対して又は候補モジュレーターで処理されたがＧＰＲ８６を発現しない細胞のサンプル（ｍｏｃｋトランスフェクト細胞）に対して、アデニレートシクラーゼ活性が１０％増加又は減少すれば、アデニレートシクラーゼ活性が「変化した」とする。
【０１５５】
ｃ．ｃＡＭＰ解析：
細胞内又は細胞外ｃＡＭＰは、当該分野で広範に知られている方法によれば、ｃＡＭＰラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定される。例えば、Horton＆Baxendale，1995年，Methods  Mol．Biol．41：91−105（これは参考として本明細書に組み入れられる）に、ｃＡＭＰ用のＲＩＡを説明している。
【０１５６】
ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社によって上市されている高効率蛍光分極ベースホモジーナスアッセイのように、たくさんのｃＡＭＰの測定キットが商業上入手できる。コントロール反応は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞の抽出物を用いていくつかの候補モジュレーターの潜在的な非特異的影響を排除するために行われるべきである。
【０１５７】
ＧＰＲ８６活性（又はそのような細胞の抽出物内）の候補モジュレーターで処理され、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞内で検出されるｃＡＭＰのレベルが、上記のＨｏｒｔｏｎ＆Ｂａｘｅｎｄａｌｅ，１９９５年に開示されたＲＩＡベースアッセイを用いて、候補モジュレーターで処理されない類似の細胞のｃＡＭＰレベルに対して、少なくとも１０％以上増加又は減少していれば、ｃＡＭＰレベルは「変化した」とする。
【０１５８】
ｄ．リン脂質分解、ＤＡＧ産生とイノシトール３リン酸のレベル
リン脂質の分解を活性化するレセプターは、リン脂質をモニタすることによって、既知の又は疑いあるＧＰＲ８６のモジュレーターの活性のために、変化としてモニタされることができ、その結果産物はセカンドメッセンジャーＤＡＧ及び／又はイノシトール３リン酸（ＩＰ３）である。これらの各検出方法は、Ｉａｎ  Ｍ．Ｂｉｒｄ  Ｔｏｔｏｗａ，ニュージャージ州、Ｈｕｍａｎａプレス社，１９９８年に編集された「リン脂質シグナリングプロトコル」（これは参考として本明細書に組み入れられる）に説明されている。Rudolphら，1999年，J．Biol．Chem．274：11824−11831も参照（これは参考として本明細書に組み入れられる）。これには、ホスファチジルイノシトール分解についての解析も説明されている。解析は、ＡＤＰで処理された又は処理されないで候補モジュレーターを伴って又は伴わずに、ＧＰＲ８６を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて行われるべきである。コントロール反応は、候補モジュレーターの潜在的非特異的効果を排除するために、ｍｏｃｋトランスフェクトされた細胞又はこれらからの抽出物を用いて、行われるべきである。
【０１５９】
本発明によればもし、候補モジュレーターで処理されたＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞からのサンプル内でのホスファチジルイノシトール分解、及びジアシルグリセロール及び／又はイノシトール３リン酸レベルが、候補モジュレーターで処理されないＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞のサンプル内で観察されるレベルに対して、少なくとも１０％の増加又は減少していれば、ホスファチジルイノシトール分解、及びジアシルグリセロール及び／又はイノシトール３リン酸レベルが「変化した」とする。
【０１６０】
ｅ．ＰＫＣ活性解析：
成長因子レセプターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を含む経路を経由してシグナルをだす。プロテインキナーゼＣは、リン脂質活性化及びカルシウム活性化されたプロテインキナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化は、最終的に、ｃ−ｆｏｓ，ｃ−ｍｙｃ，及びｃ−ｊｕｎを含むガン原遺伝子転写因子コード遺伝子；プロテアーゼ；コラゲナーゼＩやプラスミノーゲン活性化阻害剤を含む細胞内接着分子Ｉ（ＣＡＭ  Ｉ）を含む接着分子のアレイの転写をもたらす。ＰＫＣによって誘導される遺伝子産物における増加を検出するように設計されたアッセイは、ＰＫＣ活性化及びこれによるレセプター活性化をモニタするのに用いられることができる。さらにＰＫＣ経由でシグナルを出すレセプターの活性化は、ＰＫＣ活性化によって活性される遺伝子のコントロール配列により駆動されるレポータ遺伝子構成要素は、レポータ遺伝子の使用を通じてモニタされることができる。このタイプのレポータ遺伝子ベース解析は、以下に詳細に述べられる。
【０１６１】
ＰＫＣ活性のより直接的な測定にとって、Ｋｉｋｋａｗａらの方法、１９８２年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３３４１（これは参考として本明細書に組み入れられる）が用いられることができる。この解析は、ホスホセルロース紙に結合することによって実質的に分離されるＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定する。このＰＫＣアッセイシステムは、精製されたキナーゼの活性又は粗細胞抽出物における活性を測定するのに用いられることができる。プロテインキナーゼＣサンプルは、解析に先だって迅速に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／２ｍＭのＤＤＴ内で希釈されることができる。
【０１６２】
この解析の基質は、ミリストイル化アラニンリッチのプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）由来のペプチドＡｃ−ＦＫＫＳＦＫＬ−ＮＨ２である。このペプチドの酵素のＫｍは、約５０μＭである。当該分野で知られている他の基本的なプロテインキナーゼＣ選択的ペプチドも、これらのＫｍの少なくとも２〜３倍の濃度で用いられることができる。この解析に要求されるコファクターとしては、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリン及びジアシルグリセロールなどがある。ユーザの意図に依存して、このアッセイは、ＰＫＣ存在量（活性化条件）又は活性化ＰＫＣの存在量（非活性化条件）を決定するのに用いられることができる。本発明のほとんどの目的のためには、活性化されることができるＰＫＣを測定するよりも、むしろこれが単離されるときサンプルの中で活性であるＰＫＣが測定されるように、非活性化状態が用いられるだろう。非活性化状態にとって、カルシウムは、ＥＧＴＡのための解析から省かれる。
【０１６３】
この解析は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１−２ｍＭのＤＤＴ，５ｍＭのＭｇＣｌ２，１μＣｉのγ−３２Ｐ−ＡＴＰ，１００μｇ／ｍｌのペプチド基質（〜１００μＭ），１４０μＭ／３．８μＭのホスファチジルセリン／ジアシルグリセロール膜，及び１００μＭカルシウム（又は５００μＭのＥＤＴＡ）を含む混合物内で行われる。２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＤＤＴで希釈したサンプル４８μｌが、８０μｌの最終反応容器の中で用いられる。反応は、３０℃で５−１０分間行われ、続いて２５μｌの１００ｍＭのＡＴＰ，１００ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を添加して反応を停止した。
【０１６４】
反応終了後、各反応部分（８５μｌ）が、ワッツマンｐ８１セルロースホスフェートフィルター上にスポットされ、続いて、０．４％リン酸５００ｍｌで４回（１回洗浄あたり５〜１０分）洗浄し、最後の洗浄は９５％エタノール５００ｍｌで２〜５分行った。結合された放射活性は、シンチレーションカウントによって測定される。標識ＡＴＰの特異活性（ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）は、ｐ８１紙上に反応のサンプルをスポットし、洗浄せずにカウントすることによって決められる。ＰＫＣ活性ユニットは、分あたりにトランスファーされたｎｍｏｌフォスフェートで定義され、下式で計算される。
【０１６５】
【数１】2005500053.tif 000002
【０１６６】
代替アッセイは、ＰａｎＶｅｒａ（Ｃａｔ．＃Ｐ２７４７）によって販売されているプロテインキナーゼＣ解析キットを用いて行われる。
【０１６７】
候補モジュレーターと共に又は伴わずにＡＤＰで処理又は処理せずに、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞からの抽出物上で解析は行われる。コントロール反応は、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞又はこれらからの抽出物を用いて、いくつかの候補モジュレーターの可能性ある非特異的影響を排除するために行われるべきである。
【０１６８】
本発明によれば、上記アッセイのいずれかによって測定されるＰＫＣのユニットが、候補モジュレーターで処理されない細胞からの類似サンプル上で行われた反応に対して、候補モジュレーターで処理されたＧＰＲ８６発現細胞からの抽出物内で、少なくとも１０％増加又は減少するとき、ＰＫＣ活性は、候補モジュレーターによって「変化」させられる。
【０１６９】
ｆ．キナーゼ解析
ＭＡＰキナーゼ活性は、商業上入手可能ないくつかのキットのいずれを用いても解析することができる。当該キットとしては、例えば、ニューイングランドバイオラボ社（Ｃａｔ＃９８２０）から販売されているｐ３８ＭＡＰキナーゼ解析キット又はパーキン−エルマーライフサイエンス社から販売されているＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）ＭＡＰキナーゼ解析が挙げられる。
【０１７０】
候補モジュレーターで処理され、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞からのサンプルにおいて、候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞からのサンプルにおけるＭＡＰキナーゼ活性に対して、活性レベルが１０％以上増加又は減少していれば、ＭＡＰキナーゼ活性は「変化した」という。
【０１７１】
既知の合成又は天然チロシンキナーゼ基質及び標識リン酸塩を用いたチロシンキナーゼ活性の直接的解析が、他のタイプのキナーゼについての類似の解析のように（例えばＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ）、よく知られている。キナーゼ活性解析は、ＡＤＰを用いて又は用いることなく処理され、候補モジュレーターと共に又は伴わずに、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞から調製される粗抽出物と精製されたキナーゼとの双方で、行われることができる。いくつかの候補モジュレーターの可能な非特異的効果を排除するために、ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞又はこれらからの抽出物を用いて、コントロール反応が行われるべきである。基質は、全長タンパク質又は基質となる合成ペプチドのいずれでもよい。Ｐｉｎｎａ＆Ｒｕｚｚｅｎｅ（1996年，Biochem．Biophys．Acta  1314：191−225、これは参考として本明細書に組み入れられる）、キナーゼ活性を検出するのに有用なたくさんのリン酸化基質部位をリストに挙げている。たくさんのキナーゼ基質ペプチドが商業上入手可能である。特に有用なものは、「Ｓｃｒ−関連ペプチド」ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（シグマ社から＃Ａ７４３３として入手可能）であり、これは、たくさんのレセプター及びノンレセプターチロシンキナーゼに対する基質である。以下に述べる解析は、ペプチド基質のフィルターへの結合を要求し、ペプチド基質は正味陽性に荷電して結合を引きつける。一般に、ペプチド基質は、少なくとも２塩基残基とフリーのアミノ末端を有するべきである。反応は一般に０．７−１．５ｍＭのペプチド濃度を使用する。
【０１７２】
一般に、５μｌの５Ｘキナーゼバッファー（ＢＳＡが５ｍｇ／ｍｌ，Ｔｒｉｓ塩酸１５０ｍＭ（ｐＨ７．５），ＭｇＣｌ２が１００ｍＭ；解析された正確なキナーゼに依存する、ＭｎＣｌ２がＭｇＣｌ２に加えて又は代えて用いられる），１．０ｍＭのＡＴＰを５μｌ（最終濃度０．２ｍＭ），γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（１００−５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ），１０ｍＭペプチド基質を３μｌ（最終濃度１．２ｍＭ）、テストされるキナーゼを含む細胞抽出物（キナーゼ解析に用いられる細胞抽出物がホスファターゼ酸阻害剤（例えば０．１−１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム）を含むべきである）と、Ｈ２Ｏを含んで容量２５μｌとしたものの中で解析が行われる。
【０１７３】
キナーゼ反応が、３０秒間から約３０分間行われる、続いて氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を４５μｌ添加した。サンプルは、マイクロ遠心の中で２分間回転させられ、上清３５μｌがワッツマンｐ８１セルロースリン酸塩フィルターサークル上にスポットされた。このフィルターを５００ｍｌのコールド０．５％リン酸を用いて３回洗浄し、５分間、室温で２００ｍｌのアセトンを用いて１回洗浄した。フィルターが乾燥され、取り込まれた３２Ｐがシンチレーションカウントによって測定される。キナーゼ反応の特異的ＡＴＰ活性（例えばｃｐｍ／ｐｍｏｌ）が、ｐ８１フィルターサークル上での反応の小さなサンプル（２−５μｌ）をスポットすることによって、洗浄することなしに直接カウントされる。キナーゼ反応（マイナスブランク）で得られた分あたりのカウントは、そして、特異的活性によって分割され、反応中にトランスファーされたリン酸塩のモル数を決定する。
【０１７４】
候補モジュレーターで処理されていない同様の細胞からのサンプルにおけるキナーゼ活性に対して、候補モジュレーターで処理され、ＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞からのサンプルにおいて、キナーゼ活性のレベルが１０％以上増加又は減少したとき、チロシンキナーゼ活性は「変化した」とする。
【０１７５】
ｇ．ダウンストリーム経路活性化についての転写レポータ
レセプター、例えばＧＰＲ８６にアゴニストを結合することによって開始された細胞内シグナルは、細胞内イベントのカスケード運動に向かい、その究極の結果は、１つ以上の遺伝子の転写又は翻訳における迅速で検出可能な変化となる。従ってレセプターの活性は、ＧＰＲ８６活性化に反応するコントロール配列によって駆動されるレポータ遺伝子の発現を検出することによってモニタされることができる。
【０１７６】
ここで用いられている「プロモータ」は、遺伝子発現のレセプター仲介調節に必要な転写コントロール要素をいい、基礎プロモータだけでなく、レセプター調節発現に必要な転写因子結合部位又はいずれかの促進剤も含まれる。アゴニスト結合から生じる細胞内シグナルに反応するプロモータを選択し、転写、翻訳又は最終段階の活性がたやすく検出可能で測定可能なレポータ遺伝子に選択されたプロモータを実施可能に連結することによって、レポータ解析に基づく転写は、与えられたレセプターが活性化されたかどうかの迅速な指標を提供する。
【０１７７】
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼ又はβ−ガラクトシダーゼのようなレポータ遺伝子は、これらの産物の検出用解析として、当該分野でよく知られている。
【０１７８】
レセプター活性のモニタに特に好適な遺伝子は、「早急（immediate early）」遺伝子である。これは、レセプターとエフェクタータンパク質又はリガンドとの間で接触する一般的には分内で迅速に誘導される遺伝子である。早急遺伝子転写の誘導は、新しい調節タンパク質の合成を要求しない。リガンド結合の迅速な応答に加えて、レポータ構成要素をつくるのに有用な好ましい遺伝子の特徴は、次のものを含む：静止の細胞における低い又は検出できない発現；一過的で、新規タンパク質合成に独立している誘導；転写の実質的シャットオフは、新規タンパク質合成を要求する；そしてこれらの遺伝子から翻訳されたｍＲＮＡは、短い半減期を有している。転写コントロール要素がそれにとって有用であるこれらの全ての特性を有することは好ましいが、必要ではない。
【０１７９】
たくさんの異なる刺激に応答する遺伝子の例は、ｃ−ｆｏｓプロトオンコジーンである。ｃ−ｆｏｓ遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化特異剤、ストレス、及び細胞表面タンパク質の既知の誘導剤によってタンパク合成独立方式で活性化される。ｃ−ｆｏｓ発現の誘導は、特に迅速で、しばしば、レセプター刺激から数分内で起る。この特徴は、レセプター活性化のレセプターとしての使用について特に引きつけられるｃ−ｆｏｓ調節領域を作る。
【０１８０】
ｃ−ｆｏｓ調節要素は、転写開始に要求されるＴＡＴＡボックス；基礎的転写に必要な２つの上流要素と、２個一組でシメトリーとなっている（dyad symmetory）要素を含み且つＴＰＡ，血清，ＥＧＦ，及びＰＭＡによる誘導のために要求される促進剤を含む（Vermaら，1987年，Cell  51：513-514）。
【０１８１】
ｃ−ｆｏｓｍＲＮＡキャップ部位から上流の−３１７ｂｐと−２９８ｂｐとの間に位置する２０ｂｐのｃ−ｆｏｓ転写促進要素が、血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞内で血清誘導に本質的である。２つの上流要素のうち１つは、−６３乃至−５７に位置し、ｃＡＭＰ制御のための一致配列に似ている。
【０１８２】
転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答要素結合タンパク質）は、名前が意味するように、細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。従って、ｃＡＭＰレベルのモジュレーション経由でシグナルを送るレセプターの活性化は、転写因子の結合又はＣＲＥＢ結合要素（ｃＡＭＰ応答要素のことでＣＲＥと記載される）のいずれかを検出することによってモニタされることができる。ＣＲＥのＤＮＡ配列は、ＴＧＡＣＧＴＣＡである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポータ構成要素は、米国特許Ｎｏ．５９１９６４９に説明されている。
【０１８３】
他のプロモータと転写コントロール要素は、ｃ−ｆｏｓ要素とＣＲＥＢ応答構成要素に加えて、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Finkら，1988年，Proc．Natl．Acad．Sci．85：6662−6666）；ソマトスタチン遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Montminyら，1986年，Proc．Natl．Acad．Sci．83：6682−6686）；プロエンケファリンプロモータ（ｃＡＭＰ応答，ニコチンアゴニスト，及びホルボールエステル；Combら，1986年，Nature，323：353−356）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）遺伝子プロモータ（ｃＡＭＰ応答；Shortら，1986年，Ｊ．Biol．Chem．261：9721−9726）を含む。
【０１８４】
ＧＰＣＲ活性における変化に応答する転写コントロール配列の付加的例えばｍＡＰ−１転写因子およびＮＦ−κＢ活性に応答するものを含むが、これらに限定されない。共通ＡＰ−1結合部位は、パリンドロームＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡである（Leeら，1987年，Nature  325:368-372；Leeら，1987年，Cell  49：741−752）。ＡＰ−１部位は、また、ホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルボニルホルボール−β−アセテート（ＴＰＡ）のような腫瘍プロモータの誘導を仲介に対して応答し、したがって時々、ＴＰＡ応答要素についてはＴＲＥということもある。ＡＰ−１は、成長刺激に対する細胞の初期の応答に関係するたくさんの遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答遺伝子の例は、ＦｏｓとＪｕｎ（これらはタンパク質自身がＡＰ−１活性をつくりあげる），Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｒａ）１と２，ＩκＢα，アルニチンデカルボキシラーゼ及びアネキンスＩ及びＩＩを含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
ＮＦ−κＢ結合要素は、共通配列ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣをもっている。膨大な数の遺伝子は、ＮＦ−κＢ応答として同定されることができ、これらのコントロール要素は、レポータ遺伝子に連結されて、ＧＰＣＲ活性をモニタすることができる。ＮＦ−κＢの応答遺伝子の小さなサンプルは、ＩＬ−１βをコードするもの（Hiscottら，1993年，Mol．Cell．Biol．13：6231-6240），ＴＮＦ−α（Shakhovら，1990年，Ｊ．Exp．Med．171：35-47），ＣＣＲ５（Liuら，1998年，AIDS Res．Hum．Retroviruses．14：1509-1519），Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（Pan＆McEver，1995年，Ｊ．Biol．Chem．270：23077-23083）,Ｆａｓリガンド（Matsuiら，1998年，Ｊ．Immunol．161：3469-3473），ＧＭ−ＣＳＦ（Schreck＆Baeuerle，1990年，Mol．Cell．Biol．10：1281-1286）及びＩκＢα（Haskillら，1991年，Cell  65：1281-1289）を含む。これらの各参考文献はそれぞれ参考として本明細書に組み入れられる。ＮＦ−κＢ応答レポータをコードするベクターは当該分野でもよく知られており、例えば、合成ＮＦ−κＢ応答要素と最小プロモータを用いて、あるいはＮＦ−κＢ制御を受けると知られている遺伝子のＮＦ−κＢ配列を用いて、当業者が容易く作ることができる。さらに、ＮＦ−κＢ応答レポータ構成要素は、例えばＣＬＯＮＴＥＣＨ社から商業上入手可能である。
【０１８６】
与えられたプロモータ構成要素は、構成要素でトランスフェクトされたＧＰＲ８６発現細胞を、ＡＤＰにさらすことによってテストされるべきである。ＡＤＰに応答してレポータの発現が少なくとも２倍増加することは、レポータがＧＰＲ８６の指示薬となることを示している。
【０１８７】
ＡＤＰ応答転写レポータ構成要素を用いてＧＰＲ８６活性を解析するために、安定にＧＰＲ８６ポリペプチドを発現する細胞が、安定にレポータ構成要素でトランスフェクトされる。アゴニストをスクリーニングするために、細胞は未処理のままおかれて、候補モジュレーターにさらされるか、ＡＤＰにさらされて、レポータの発現が測定される。ＡＤＰ処理された培養は既知のアゴニストによって転写誘導されたレベルの標準として役立つ。候補モジュレーターの存在下でのレポータ発現における少なくとも５０％の増加は、その候補がＧＰＲ８６活性のモジュレーターであることを示す。アゴニストは、少なくとも、ＡＤＰ単独よりも等量又はそれ以上の量のレポータ発現を誘導する。このアプローチは、ＡＤＰ又は他のアゴニストの不在下で、レポータの基礎活性を上昇するようなレベルで、細胞がＧＰＲ８６ポリペプチドを発現するところでは、逆アゴニストのためのスクリーニングに用いられることもできる。候補モジュレーターの存在下、その不在下に対して、１０％以上レポータ活性が減少していると、その化合物が逆アゴニストであることを示す。
【０１８８】
アンタゴニストをスクリーニングするために、ＧＰＲ８６発現細胞及びレポータ構成要素の運搬が、候補モジュレーターの存在及び不在下でＡＤＰ（又は他のアゴニスト）にさらされる。候補モジュレーターの不在下に対して、候補モジュレーターの存在下でのレポータ発現が１０％以上減少していると、その候補がＧＰＲ８６活性のモジュレーターであることを示す。
【０１８９】
転写解析のためのコントロールは、ＧＰＲ８６を発現しないがレポータ構成要素を運ぶ細胞を含み、またプロモータのないレポータ構成要素を有する細胞を含む。ＧＰＲ８６調節型転写のモジュレーターとして同定された化合物が解析され、またこれらの化合物の活性の特異性とスペクトルを決定するために、これらの化合物が他の制御配列及び他のレセプターによって駆動される転写に影響を与えるかどうかを決定すべきである。
【０１９０】
転写レポータ解析及び殆どの細胞ベース解析は、ＧＰＲ８６活性をモジュレートするもののためのタンパク質のための発現ライブラリーをスクリーニングするのに好適である。このライブラリーは、例えば植物、動物、バクテリアなどの天然源からのｃＤＮＡライブラリーであることができ、あるいはこれらが１つ以上のポリペプチドをランダムに又は系統的に突然変異させた変異体を発現するライブラリーであることもできる。ウィルスベクターのゲノムライブラリーは、また、ＧＰＲ８６のスクリーニングのために用いられた異なるライブラリーの中で、１細胞又は組織のｍＲＮＡ内容物を発現するのに用いられることができる。
【０１９１】
ｈ）イノシトールリン酸（ＩＰ）測定：
本発明の細胞、例えば１３２１Ｎ１細胞は、５％ＦＣＳ，抗生物質，アンフォテリシン，ピルビン酸ナトリウム及びＧ４１８を含む４００μｇ／ｍｌイノシトールフリーのＤＭＥＭの中で、１０μＣｉ／ｍｌ〔３Ｈ〕イノシトールで、２４時間標識した。細胞は、２時間、下記組成のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー（ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１，２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及び８ｍＭグルコース）中で培養された。そして、この細胞は、種々のヌクレオチドを用いて、３０秒間チャレンジされた。培養は、氷冷３％過塩素酸溶液の添加によって停止させられる。ＩＰは抽出され、上述（非特許文献２５）のＤｏｗｅｘカラム上で分離される。２ＭｅＳＡＴＰとＡＴＰ溶液（１ｍＭ）は、室温で、２０ユニット／ｍｌＣＰＫ及び１０ｍＭのＣＰを用いて９０分間処理され、汚染とヌクレオチド３リン酸の分解から問題がおこることを回避した。
【０１９２】
ＩＩ  ＧＰＲ８６解析
本発明は、サンプル中の本発明のレセプターの活性を検出するための解析を提供する。例えば、ＧＰＲ８６活性は、ＧＰＲ８６を発現する細胞又は細胞膜を含むサンプル中で測定される。この解析は、ＡＤＰの存在又は不在下でサンプルを培養することによって達成され、上記のようにセカンドメッセンジャー解析を実行している。ＡＤＰ存在又は不在下で行われたセカンドメッセンジャー解析の結果が比較されて、ＧＰＲ８６レセプターが活性であるかどうかを決める。本明細書で定義するように、ＡＤＰ不在下で行われた解析で検出された量に対して、ＡＤＰ存在下での与えられたセカンドメッセンジャーの検出レベルが１０％以上増加していることが、ＧＰＲ８６活性の指標となる。
【０１９３】
レセプター活性の解析のいずれも、ＧＰＲ８６レセプター分子の活性に影響を与えるサンプル（例えば組織サンプル）内での物質の存在を決めるために用いられる。ここで、レセプター活性の解析には、ＧＴＰ結合，ＧＴＰａｓｅ，アデニレート、シクラーゼ，ｃＡＭＰ，リン脂質分解，ジアシルグリセロール，イノシトール３リン酸，アラキドン酸放出（下記参照），ＰＫＣ，キナーゼ，及び翻訳レポータ解析を含むが、これらに限定されない。レセプター活性の解析を用いると、ＧＰＲ８６ポリペプチドは、サンプルの存在及び不在下で、又はサンプル抽出物における活性について、解析される。サンプルの不在下に対して、サンプル又は抽出物の存在下におけるＧＰＲ８６活性が増加していることは、サンプルがレセプター活性のアゴニストを含むことを意味している。ＡＤＰの存在下または他のアゴニストと当該サンプルの存在下でのレセプターの活性が、ＡＤＰだけの存在下におけるレセプターの活性に対して減少していれば、サンプルがＧＰＲ８６活性のアゴニストを含むことを示す。所望であれば、次いでサンプルは分画され、さらにテストされて、アゴニスト又はアンタゴニストを単離又は精製する。モジュレーターを含むといわれているサンプルに必要な測定された活性における増加量又は減少量は、用いられる解析のタイプに依存する。一般にサンプルの不在下で行われた解析に対して１０％以上の大きい変化（増加又は減少）は、サンプル中にモジュレーターが存在することを示す。１つの例外は、モジュレーターが含まれているといわれているサンプルではシグナルの少なくとも２倍の増大又は１０％減少が必要であるような転写のレポータ解析である。
【０１９４】
他の機能的解析は、例えばマイクロフィジオメータ又はバイオセンサー解析（Hafner，2000年，Biosens．Bioelectron．１５：149−158参照、これは参考文献として組み入れられる）。アラキドン酸の細胞内レベルは、Ｇｉｊｉｏｎら、2000年，Ｊ．Biol．Chem.，275：20146−20156で説明されるように決定されることもできる。
【０１９５】
従って、サンプルにおけるＧＰＲ８６活性の検出方法は、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下でＧＰＲ８６及びＡＤＰを含むサンプルを培養する工程、及びセカンドメッセンジャーを検出する工程を含むことができる。あるいは、この方法は、ＧＰＲ８６とＡＤＰが結合することを許容する条件下でＡＤＰの不在下でＧＰＲ８６を含む第２のサンプルを培養する工程、及びセカンドメッセンジャーを検出する工程を、さらに含む。このサンプルは、ＧＰＲ８６を発現する細胞又はＧＰＲ８６を有している細胞膜を含んでもよい。あるいは、その培養工程は、ＧＰＲ８６ポリペプチドを含む、ウィルス誘導により出芽している膜内又は膜上で行われてもよい。
【０１９６】
ＩＩＩ  ＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用に基づく診断解析
ＧＰＣＲを通じてのシグナリングは、大量の疾患又は疾病の病理に役立つ。ＧＰＲ８６は、白血球細胞と同様にリンパ球系列の細胞、血小板、脾臓内で発現され、免疫プロセス、癌、血栓症、及びこれらの関連疾患又は疾病における役割がある。ＧＰＲ８６発現パターンは、また、脳に含まれ、さらにＡＤＰニューロトランスミッターとしての潜在的役割を提案している。
【０１９７】
ＧＰＲ８６の発現パターン及びＧＰＣＲによって一般に仲介される疾患に関する知識は、細胞移住障害、癌、腫瘍及び腫瘍転移の発達、炎症プロセス、腫瘍性プロセス、損傷治癒、骨治癒、調節性成長機能の調節不良、糖尿病、肥満、食欲不振；大食症、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；レステノシス（ｒｅｓｅｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム硬化、血栓症、及び他の心血管病；自己免疫疾患；炎症疾患；過剰な平滑筋細胞増殖により特徴づけられる疾患；動脈瘤；平滑筋細胞の損失又は平滑筋細胞増殖の減少により特徴づけられる疾患；脳卒中；虚血；潰瘍；アレルギー；前立腺肥大；片頭痛；嘔吐；恐怖、精神分裂症、激しい鬱病、鬱病、譫妄、痴呆、いくつかの精神的遅滞等の精神病、神経病；消耗性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病のような精神性消耗疾患、ハンチントン病又はギルトドラトゥレット症候群のようなジスキネシア；血栓症及び他の心血管病；自己免疫病及び炎症疾患を含む他の関連病に、ＧＰＲ８６が関連し得ることを提案している。
【０１９８】
ＧＰＲ８６とＡＤＰの相互作用は、ＧＰＲ８６シグナリングを含む疾病、疾患又はプロセスを診断又はモニタする解析の基礎として用いられることができる。ＧＰＲ８６関連疾患又は疾病の診断解析には、いくつかの異なる型を有することができる。第１の型では、診断解析は、組織サンプル中のＧＰＲ８６、遺伝子、ｍＲＮＡ量を測定することができる。ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を測定する解析は、また、このカテゴリーにあてはまる。第２の型では、解析は、そのレセプター又はリガンドの量を評価することができる。例えば、ＧＰＲ８６又はポリペプチドの突然変異体型又は変異体（variant）型を個体が発現するかどうかを決める解析は、診断的に用いられることができる。第３に、ＧＰＲ８６ポリペプチドの１つ以上の活性を測定する解析が、診断的に用いられることができる。
【０１９９】
Ａ．  ＧＰＲ８６量を測定する解析
異常レベルのレセプター又はそのリガンドが、サンプル中に存在するかどうか、そのいずれかがＧＰＲ８６シグナリングの可能性ある調節不良を示しているかどうかを決めるために、ＧＰＲ８６レベルが測定され、標準と比較される。ポリペプチドレベルが測定され、例えば、ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学によって測定される。
ＧＰＲ８６活性によって特徴付けられた疾患又は疾病で煩っていると疑いのある個体から単離されたサンプルが、ＧＰＲ８６の抗体と接触させられ、その抗体の結合はその分野で既知であるとして測定される（例えば、二次抗体に結合した（conjugated）酵素の活性を測定することによって）。
【０２００】
ＧＰＲ８６レベルの測定に対する他のアプローチは、影響された組織からの細胞のフローサイトメトリー解析を用いる。フローサイトメトリー方法は、ＧＰＲ８６に特異的な抗体の蛍光標識を含めて、この分野でよく知られている。他のアプローチは、放射性免疫測定又はＥＬＩＺＡを含む。これらの各方法は、その分野でよく知られている。
【０２０１】
検出された結合量は、健康な個体又はそんなに影響されていない影響された個体の部位からの類似組織のサンプル中での結合と比較される。標準に対して１０％以上増加していると、ＧＰＲ８６調節不良によって特徴付けられた疾患又は疾病の徴候であるとする。
【０２０２】
ＧＰＲ８６発現は、また、組織サンプル中でポリペプチドをコードするｍＲＮＡ量を決定することによって測定されることができる。ｍＲＮＡレベルは、定量的又は半定量ＰＣＲによって測定される。「定量的」増幅の方法は、当業者によく知られていて、両ＧＰＲ８６の増幅のためのプライマー配列が、本明細書に開示されている。定量ＰＣＲの共通の方法は、同じプライマーを用いてコントロール配列の既知量を、同時に共増幅する工程を含む。これは、ＰＣＲ反応を計算するのに用いられることができる内部標準を提供する。定量ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、「ＰＣＲプロトコル、方法と応用のためのガイド」Innisら、アカデミックプレス社，ニューヨーク（１９９０年）の中で提供され、これは参考として本明細書に組み入れられる。健康な個体からの類似の組織サンプル又は影響された個体の影響されない位置からの組織サンプルにおいて発現される量に対して、サンプルの中でＧＰＲ８６をコードするｍＲＮＡの量における１０％以上の増加は、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられた疾患又は疾病の徴候である。
【０２０３】
Ｂ．  定量解析
ＧＰＲ８６ポリペプチド又はこれをコードするｍＲＮＡが野生型であるかどうかを評価する解析は、診断的に用いられることができる。この様式でＧＰＲ８６調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病を診断するために、サンプルから単離されたＲＮＡが、ＧＰＲ８６のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いられる。そして、増幅された配列は、標準的方法を用いて直接的に配列化されるか、又は最初にベクターの中にクローン化され、続いて配列決定されるかのいずれかである。野生型ＧＰＲ８６の配列に関して１つ以上コードされたアミノ酸を変化させる配列の差異は、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候であり得る。コード配列における変化がサンプル内で同定されるとき、変異レセプター又はリガンドを発現させ、その活性を、野生型ＧＰＲ８６の活性と比較するのに有用である。他の利益の中で、このアプローチは、構造的に活性でヌルな突然変異体を含む新規突然変異体を提供できる。
【０２０４】
標準的な配列決定方法に加えて、増幅された配列は、例えば、野生型と変異配列の間を区別する分子的目印のハイブリダイゼーションを用いて、特異的な突然変異の存在について解析されることができる。１ヌクレオチド程度の小さな変化に基づいて区別するハイブリダイゼーション解析は、当該分野でよく知られている。あるいは多数の「ミニシークエンシング」解析のいずれも行うことができ、例えば米国特許５８８８８１９，６００４７４４，６０１３４３１（これらは参考として組み入れられる）で説明されているような解析方法も含むことができる。これらの解析及び当該分野で知られた他の方法は、与えられたサンプルにおいて、既知の多型性を伴う核酸の存在を決定することができる。
【０２０５】
所望であれば、アレイ又はマイクロアレイベースの方法は、ＧＰＲ８６配列において、突然変異の発現又は存在を解析するのに用いられることができる。ミニシークエンシング及び核酸発現の定量のためのアレイベースの方法は、当該分野でよく知られている。
【０２０６】
Ｃ．  機能的解析
ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の診断は、機能的解析を用いて解析されることもできる。そうすると、細胞膜は又は組織サンプルから調製された細胞抽出物が、本明細書で説明されているように、ＧＰＲ８６の解析に用いられることができる（例えば、リガンド結合解析、ＧＴＰ結合解析、ＧＴＰａｓｅ解析、アデニレートシクラーゼ解析、ｃＡＭＰ解析、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、又はイノシトール３リン酸解析、ＰＫＣ活性解析、又はキナーゼ解析）。検出された活性は、健康な個体又は影響された個体の影響されていない部位から採取した標準的サンプル内の活性と比較される。代替品として、サンプル又はサンプル抽出物が、ＧＰＲ８６を発現する細胞に適用され、続いて標準サンプルに対してＧＰＲ８６シグナリング活性が測定される。これらの解析のいずれかで測定された１０％以上の差異は、ＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴づけられる疾患又は疾病の徴候である。
【０２０７】
本発明による細胞のＧＰＲ８６活性のモジュレーション
ＧＰＲ８６のリガンドとしてのＡＤＰの発見は、細胞内のＧＰＲ８６の活性をモジュレートする方法を提供する。ＧＰＲ８６活性は、ＧＰＲ８６ポリペプチドの機能をモジュレートする物質をその細胞に配送することによって、細胞内でモジュレートされる。このモジュレーションは、付加的なモジュレーティング物質の同定のための解析の部分としての培養細胞の中、又は例えばヒトを含む動物の中で、行われることができる。物質には、ＡＤＰ及びここで定義されるようなＡＤＰアナローグが含まれ、また本明細書で説明されるようなスクリーニング方法を用いて同定された付加的モジュレーターも同様に含み、米国特許５７００７８６に表示されたＡＤＰアナローグのいずれも含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
物質を培養培地に添加することによって、細胞にその物質を供与することができる。供与量は、物質のアイデンティティ及びそれが供与される目的とともに変わるだろう。例えば、ＧＰＲ８６活性のアンタゴニストを同定する培養解析において、一般に、レセプターを最大の半分を活性化するＡＤＰ量（例えば約ＥＣ５０）で、例えばレセプター飽和に要求される投与量を超えることない量を添加するだろう。この投与量は、ＡＤＰの付加量が、ＧＰＲ８６活性に付加的効果をさらに有しない点を決定するＡＤＰ量を滴定することによって決定されることができる。
【０２０９】
ＧＰＲ８６活性のモジュレーターが疾患又は疾病の治療のための動物に投与されるとき、投与される量は、所望の出力に基づいて、当業者によって調節されることができる。病理学の１つ以上の測定できる様子（例えば、腫瘍細胞の成長、炎症性細胞の蓄積）が、治療前のその様子についての値に対して少なくとも１０％変化すれば、治療は成功したことになる。
【０２１０】
本発明に有用な候補モジュレーター
本発明は、本発明のレセプターのモジュレーターである化合物を提供する。
【０２１１】
候補モジュレーターは、ヌクレオチド又は糖に結合したヌクレオチド（ＡＤＰグルコース、又はＡＤＰガラクトースを含むがこれらに限定されない）であり得る。候補モジュレーターは、また、ＵＤＰグルコースレセプターに結合するどのリガンドとも同様に、当該分野で既知のＡＤＰアナローグのいずれであってもよい。
【０２１２】
候補化合物は、合成化合物であってもよいし、化合物の混合物であってもよいし、天然産物（例えば、植物抽出物又は培養上清）であってもよい。本発明によれば、候補化合物は、合成されることができる小さな分子、天然抽出物、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質などを含む。
【０２１３】
候補モジュレーターは、例えば、ＡＴＰ，２ＭｅＳＡＴＰ，２ＭｅＳＡＤＰ，ＡＤＰβＳ，Ａｐ３Ａ，ＲＢ−２，スラミン，又はＰＰＡＤＳであってもよい。
【０２１４】
合成又は天然化合物の大きなライブラリーから、候補モジュレーター化合物はスクリーニングされることができる。サッカライド、ペプチド、及び核酸ベース化合物のランダムかつ直接的合成のために、多くの手段が、現在用いられている。合成化合物ライブラリーは、メイブリッジケミカル社（トレビレット、コーンウォール、イギリス）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ニュージャージー州プリンストン）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ニューハンプシャー州メリマック）及びマイクロソース（コネチカット州ニューミルフォード）などのたくさんの会社からに入手可能である。稀少な化学ライブラリーは、アルドリッチ社（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から入手可能である。コンビナトリアルライブラリーは、入手可能で調製可能である。その代わりに、バクテリア、カビ類、植物、及び動物抽出物の形での天然化合物のライブラリーが、例えば、パンラボラトリー（ワシントン州ボスウェル）又はＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ノースカロナイナ州）から入手可能で、あるいは当該分野で知られている方法によって容易く製造されることができる。さらに、天然及び合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通じて容易くモディファイされる。
【０２１５】
有用な化合物は、たくさんの化学的クラス内で見出されることができる。有用な化合物は、有機化合物であってもよいし、有機低分子化合物であってもよい。有機低分子化合物は、分子量が５０以上であるが、約２５００ダルトン未満又は約７５０ダルトン未満又は約３５０ダルトン未満である。実施例のクラスは、ヘテロサイクル、ペプチド、サッカライド、ステロイドなどを含む。その化合物は、モデファイされ、効用、安定性、薬剤上の適合性などを促進することができる。物質の構造的同定は、付加的物質を同定し、生成し、スクリーニングするのに用いられることができる。例えば、ペプチド物質が、同定されるところでは、これらは、Ｄ−アミノ酸、特にＤ−アラニンのような天然でないアミノ酸を用いるような安定性を促進する種々の方法において、アミノ末端又はカルボキシ末端を機能化することによって、例えばアミノ基についてであればアシル化又はアセチル化、カルボキシル基についてであればエステル化又はアミド化などによって、モデファイされることができる。
【０２１６】
第１次スクリーニングにとって、本発明の候補化合物の有用な濃度は、約１μＭから約６０μＭ以上（すなわち１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、１Ｍなど）である。二次的スクリーニングのために又は濃度曲線を作り出すために、ハーフログ間隔（例えば、９以上の濃度）で第１次スクリーニング濃度を減じることによって添加濃度が決められるところでは、９つの添加濃度にそって、第１次スクリーニング濃度が上限として用いられるだろう。
【０２１７】
Ｇα１６タンパク質
本発明は、ＧＰＲ８６及びＡＤＰのようなリガンドの培養がＧα１６タンパク質の存在下で行われる解析及び方法を提供する。Ｇα１６タンパク質は、ホスホリパーゼＣへのＧＰＲ８６レセプターと共役できる。
【０２１８】
本発明に有用な抗体
本発明は、ＧＰＲ８６に対する抗体を提供する。抗体は、当該分野で知られた標準プロトコルを用いて作られることができる（例えば、抗体：実験マニュアル、編集Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（コールドスプリングハーバープレス社：1988年）。マウス、ハムスター、又はウサギのようなほ乳類が、ペプチドの免疫原型（例えばＧＰＲ８６ポリペプチド又は抗体応答を引出すことができる抗原的フラグメント、又は上記で説明されるような融合タンパク質）で免疫感作されることができる。抗体を生み出す免疫原は、ポリペプチド（例えば単離された組換えペプチド又は合成ペプチド）とアジュバントを混合することによって調製される。あるいは、ＧＰＲ８６ポリペプチド又はペプチドは、より大きな免疫原タンパク質に対する融合タンパク質として作られることができる。ポリペプチドは、また、笠貝ヘモシアニンの鍵穴のような、他のより大きな免疫原タンパク質に共有結合されることができる。あるいは、ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードするプラスミド又はウィルスベクター、又はこれらのタンパク質の断片が、Costagliolaら，2000年，J．Clin．Invest．105：803−811（参考として本明細書に組み入れられる）の中で説明されているように、ポリペプチドを発現するのに用いられ、動物体内で免疫応答を生み出す。抗体を生み出すために、免疫原は、典型的には、ウサギ、ヒツジ、マウスのような実験動物に皮内注射、皮下注射、又は筋肉内注射される。上記で論じた抗体に加えて、遺伝学的に設計された抗体誘導体は、単一鎖抗体のように作られることができる。
【０２１９】
血漿又は血清における抗体滴定の検出によって、免疫感作の発達がモニタされることができる。標準的なＥＬＩＺＡ、フローサイトメトリー又は他の免疫解析は、抗原として免疫原とともに用いられて抗体のレベルを評価することができる。抗体の調製としては、免疫感作された動物からの単なる血清であってもよく、あるいは所望であれば、例えば、固定化された免疫原を用いたアフィニティクロマトグラフィによって血清から単離されるポリクローナル抗体であってもよい。
【０２２０】
モノクローナル抗体を生産するために、抗体産生脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）が免疫感作された動物から獲得され、ミエローマ細胞のような不死化細胞を用いてハイブリドーマ細胞を生じさせる標準的な体細胞融合処理によって融合される。このような技術は、当該分野でよく知られており、例えばハイブリドーマ技術（KohlerとMilstein，1975年，Nature，256：495-497）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbarら，1983年，Immunology  Today，4：72）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術でヒトモノクローナル抗体を産生する（Coleら，1985年，モノクローナル抗体とガン治療，Alan  Ｒ．Liss，Inc．77-96頁）を含む。ハイブリドーマ細胞は、ＧＰＲ８６ポリペプチドと特異的に反応する抗体及びそのようなハイブリドーマ細胞を含む培養培地から単離されたモノクローナル抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングされることができる
【０２２１】
ハイスループットスクリーニングキット
本発明のハイスループットスクリーニングキットは、ＡＤＰ存在下、例えば１ｎＭ乃至１０μＭの範囲の濃度でのＡＤＰ存在下で、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、又は本発明のレセプターの阻害剤等のモジュレーター化合物の検出を実行するための必要な手段及び培地のすべてを含む。このキットは、下記の連続的工程を含む。本発明の組換え細胞は、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターをコードするヌクレオチド配列を含み且つ発現し、ＷＯ００／０２０４５（参考として本明細書に特異的に組み入れられる）に説明されるような当業者によく知られた方法によれば、マイクロタイタープレート、例えば９６ウェルマイクロタイタープレートのような固体支持体の上で成長させられる。本発明のモジュレーター化合物は、約１ｎＭから１０μＭ以上までの濃度で、好適な濃度のＡＤＰ（例えば１ｎＭ乃至１μＭの範囲で）が存在する決められたウェルの培地に添加される。
【０２２２】
セカンドメッセンジャー解析は、ハイスループットスクリーニング解析に修正可能で、ｃＡＭＰ，細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度又はＭＡＰキナーゼ又はチロシンキナーゼ活性（上記のように）などの測定を含むが、これらに限定されない。例えば、ＧＰＲ８６活性は、サイクリックＡＭＰ解析で測定されるように、先に述べられた（非特許文献２６）ように、放射性免疫解析によって定量される。結果は、ＡＤＰは存在するが添加されたモジュレーター化合物は不在のときには、本発明の組換え細胞から得られたＧＰＲ８６活性の基底レベルと比較される。モジュレーターの不在下での活性レベルと比べて、ＧＰＲ８６活性が少なくとも２倍、５倍又は１０倍、ほぼ１００倍以上の増大又は減少を示すウェルが選ばれて、さらに解析される。
【０２２３】
本発明の他の有用なキット
本発明は、ＧＰＲ８６活性、ＧＰＲ８６への結合を検出するキット、さらにはＧＰＲ８６シグナリングの調節不良によって特徴付けられる疾患又は疾病の診断に有用なキットをモジュレートする物質などのモジュレーターの検出又はスクリーニングに有用なキットを提供する。本発明の有用なキットは、単離されたＧＰＲ８６ポリペプチド（膜関連又は細胞関連ＧＰＲ８６ポリペプチド、例えば単離膜上、又はＧＰＲ８６を発現する細胞、又はＳＰＲチップ上）を含むことができる。本発明のキットは、ＡＤＰのようなリガンドを含み得る。さらに、キットは、Ｇα１６ポリペプチドを含む。キットは、ＧＰＲ８６に特異的な抗体も含む。あるいは、又はさらに、キットはＧＰＲ８６ポリペプチドを発現するようにトランスフォームされた細胞を含むことができる。さらなる態様においては、本発明のキットは、ＧＰＲ８６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。なおも更なる態様において、本発明のキットは、下記で説明されるようにＧＰＲ８６の増幅に有用な特異的プライマーを含むことができる。あるいは、本発明のキットは、ＧＰＲ８６シグナリングを検出するための手段を含む。物質，モジュレーター，特性、又は不調の検出は、ＧＰＲ８６又はＧＰＲ８６特異的核酸プローブに特異的な抗体を用いて達成されることができる。更なる態様において、本発明のキットは、ＧＰＲ８６活性の標準、例えばＡＤＰのようなリガンドの存在下でＧＰＲ８６を発現する細胞系列で測定されるような標準を含むことができる。従って、本発明のキットは全て、述べられた品目又は品目の組合わせ、及びパッケージ材料を含み得る。キットは、また、使用のための指南書も含み得る。
【０２２４】
トランスジェニック動物
トランスジェニックマウスは、遺伝的及び発生生物学の研究のための有用なツール、及び新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。従来のトランスジーン過程（transgenesis）の方法によれば、正常又はモデファイされた遺伝子の付加的コピーが、接合体の雄前核の中へインジェクトされ、レシピエントマウスのゲノムＤＮＡの中へ集積されるようになる。トランスジーンは、樹立されたトランスジェニック株において、メンデルの法則にしたがって伝えられる。トランスジェニック動物を作り出すのに有用な構成要素は、正常プロモータ又は誘導プロモータのいずれか一方；組織発現及び調節のパターンに関して解析されるプロモータのコントロール下でのレポータ遺伝子；及びドミナント突然変異、突然変異プロモータ及び人工的融合遺伝子を含む構成要素を含み、特異的な発生の結果に関して研究される。典型的には、１０ｋｂ以下のオーダーのＤＮＡフラグメントが用いられて、トランスジェニック動物を構成する（Reeves，1998年，New．Anat．，253：19）。トランスジェニック動物は、本発明の１つ以上の多型性を含む候補遺伝子を含む構成要素とともに作り出されることができる。あるいは、単一の多型性を含む候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物が、異なる多型性を含む候補遺伝子を発現する第２のトランスジェニック動物と交差されることができ、２つの多型性の組合わされた影響は子孫の動物の中で研究される。
【０２２５】
他のトランスジェニック動物
本発明は、トランスジェニックマウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギなどのトランスジェニック動物を含むが、これらに限定されない。トランスジェニックブタも生産のためのプロトコルは、WhiteとYannoutsos，Current  Topics  in  Complement  Research：６４回免疫学フォーラム，88-94頁；米国特許Ｎｏ．５５２３２２６；米国特許Ｎｏ．５５７３９３３：ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５０７１；及びＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４７４４の中で見いだせる。トランスジェニックマウス作製のプロトコルは、米国特許Ｎｏ．５５３０１７７の中で見つけ出すことができる。トランスジェニックラットの作製プロトコルは、BaderとGanten，Clinical  and  Experimental  Pharmacology  and  Physiology，追補3：S81−S87，1996年の中で見いだすことができる。トランスジェニックウシの生産プロトコルは、トランスジェニック動物技術，ハンドブック，1994年編集，Carl  Ａ.Pinkert，アカデミックプレス社の中で見いだすことができる。トランスジェニックウサギの作製プロトコルは、Hammerら，Nature315：680−683，1985年及びTaylor及びFan，Frontiers  in  Bioscience２：d298−308，1997年の中で見いだされる。
【０２２６】
ノックアウト動物
ｉ  標準
ノックアウト動物は、相同組換えで遺伝子欠失を作り出す方法によって製造される。この技術は、胎児由来で培養の中で維持され、宿主胚盤胞の中へ導入されるときマウス内のあらゆる組織の分化に参加する能力を有している胚性幹（ＥＳ）細胞の発展に基づいている。ノックアウト動物は、ＥＳ細胞の特異的標的遺伝子に相同組換えを指向することによって生産され、これによりヌル対立遺伝子を生み出す。このヌル対立遺伝子の考えられる表現型の結果（ヘテロ接合体又はホモ接合体子孫のいずれか）を解析することができる（Reeves，上記）。
【０２２７】
ｉｉ  Ｃｒｅ−ｌｏｘを用いたマウスにおけるインビボ組織特異的ノックアウト
標的とされた相同組換えの方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的リコンビナーゼＣｒｅに基づく部位特異的組換えシステムの発達によって、改良されてきた。バクテリオファージＰ１部位からのＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼが、限定された組織又は分化のステージに制限される遺伝子ノックアウトを作り出すために、トランスジェニックマウス解析で用いられる。領域的に限定された遺伝子の欠失、グローバル遺伝子ノックアウトとは反対に、表現型は部分的細胞／組織に寄与されることができる（Marth，1996年，Clin．Invest．97：1999）。あるトランスジェニックマウス株のＣｒｅ−ｌｏｘＰ部位において、ｌｏｘＰ部位が興味ある遺伝子の１つ以上のエキソンを側面に配置するように、設計される。「ｆｌｏｘｅｄ遺伝子」と呼ばれるこのホモ接合体は、細胞／組織タイプ転写プロモータのコントロール下でＣｒｅ遺伝子を発現する第２のトランスジェニックマウスと交差される。そして、Ｃｒｅタンパク質は、ｌｏｘＰ認識配列の間のＤＮＡを切り取り、有効に標的遺伝子機能を除去する（Sauer，1998年，Methods，14：381）。今では、この方法のインビボ実施例は、ほ乳類の組織特異的遺伝子の誘導可能な不活性化を含めてたくさんある（Wagnerら，1997年，Nucleic  Acids  Res．，25：4323）。
【０２２８】
ｉｉｉ  ノックアウト表現型のＢａｃＲｅｓｃｕｅ
特定の遺伝的多型性／突然変異は、インビボで機能を変更されたタンパク質の原因となることを明らかにするために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することによって変更されたタンパク質機能を「救い出す」ことができる。トランスジェニックマウスの中で発現されたバクテリアの人工的染色体（ＢＡＣ）クローンを用いたインビボ相補性が、これらの目的のために用いられることができる。この方法は、マウスのサーカデイアンクロック遺伝子の同定に用いられてきた（Antochら，1997年，Cell  89：655）。
【０２２９】
材料
トリプシンはフローラボラトリーズ（スイス、ビジョー）から得た。培養培地，Ｇ４１８，ウシ胎児血清（ＦＢＳ），制限酵素，プラチナＰｆｘ，及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ライフテクノロジー社（ベルギー，メレルベーク）から購入した。放射性産物ｍｙｏ−Ｄ−〔２−３Ｈ〕イノシトール（１７．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はアメルシャム（ベルギー，ゲント）から得た。Ｄｏｗｅｘ  ＡＧＩＸ８（ギ酸型）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリー（カリフォルニア州，リッチモンド）から得た。ＡＴＰ，ＡＤＰ，アデノシン，ＡＤＰβＳ（アデノシン５’−Ｏ−（２−チオジホスフェート）），Ａ２Ｐ５Ｐ（アデノシン２’,５’−ジリン酸），Ａ３Ｐ５Ｐ（アデノシン３’，５’−ジリン酸），Ａ３Ｐ５ＰＳ（アデノシン３’−リン酸５’−ホスホサルフェート），ＵＴＰ，ＵＤＰ，ＩＴＰ，ＩＤＰ，ＵＤＰ−グルコース及び３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）がシグマケミカル社（ミズーリ州，セントルイス）から入手された。２−メチルチオ−ＡＤＰ（２ＭｅＳＡＤＰ）と２−メチルチオ−ＡＴＰ（２ＭｅＳＡＴＰ）が、リサーチバイオケミカルインターナショナル（マサチューセッツ州，ナティック）から得た。フォルスコリンは、カルバイオケム社（ベルギー，ベルージュ）から購入した。ロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）は、ラボラトリーズ・ジャックス・ロジェア（フランス，トラッペス）から授けられた。Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２（２０２Ｔｈｙと２０４Ｔｈｙ）の二重リン酸化型に特異的なモノクローナル抗体は、ニューイングランドバイオラボ（マサチューセッツ州，ベベリー）から入手した。
【０２３０】
投与の量とモード
実施例を経由して、患者は、ＧＰＲ８６のモジュレーター（例えば、本発明のアゴニスト、アンタゴニスト、ＧＰＲ８６阻害剤）の投与によって下記のように治療されることができる。本発明のＧＰＲ８６のモジュレーターは、患者に投与され、例えば生物学的に適合する溶液又は薬学的に受け入れられるデリバリー担体、消化により、インジェクション、インハレーション、又は他のいくつかの方法のいずれかによって、投与され得る。投与量は患者ごとに変わり；「治療学的に有効な投与量」は、例えば、機能の促進レベルによって（例えば、本明細書で述べられているセカンドメッセンジャー解析において決められるように）決められることができるが、これには限定されない。ＡＤＰ結合のモニタは、当業者に投与される量を選択し、調節させるようにすることができるだろう。本発明のＧＰＲ８６のモジュレーターの投与量は、毎日、毎週、毎月、毎年又は患者治療によって適当と考えられるように、繰り返されるだろう。
【０２３１】
薬剤組成物
本発明は、生理学上適合できるキャリアと添加混合された、本発明のＧＰＲ８６モジュレーターを含む組成物を提供する。本明細書で用いられるように、「生理学上、適合できるキャリア」は、生理学上受け入れられる希釈剤をいい、水、リン酸緩衝化生理食塩水、又は生理食塩水などがあり、さらにアジュバントを含んでもよい。不完全なフロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はミョウバンのようなアジュバントが、当該分野でよく知られている材料である。
【０２３２】
本発明は、薬剤組成物も提供する。活性成分に加えて、これらの薬剤組成物は、薬剤上用いられることが薬剤的に好適に受け入れられるキャリア調製物を含み得る。
【０２３３】
経口投与用の薬剤組成物は、経口投与に適切な投与量で当業者によく知られている薬剤的に受け入れられるキャリアを用いて調製されることができる。そのようなキャリアは、患者による摂取のために、この薬剤組成物を、タブレット、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして調製することができる。
【０２３４】
経口使用のための薬剤調製は、固体賦形剤、好適な補助剤の添加後、ときには破砕した結果生じる混合物、及び処理による顆粒混合物と活性化合物との組合わせを通じて、得られることができ、所望であれば、タブレット又は糖衣錠のコアを得ることができる。好適な賦形剤は、ラクトース、シュクロース、マンニトール、またはソルビトール等の糖類；コーンスターチ、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム；ゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質のような炭水化物又はタンパク質フィラーである。所望であれば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩のような分解剤又は溶解剤が添加されてもよい。
【０２３５】
糖衣錠のコアは、濃縮した糖溶液のような好適なコーティングとともに提供され、この糖溶液には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は酸化チタン、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒、または溶媒混合物を含んでもよい。染料又は顔料を、タブレット又は産物同定の糖衣錠コーティングに添加してもよく、活性化合物の量、すなわち投与量を特徴づけてもよい。
【０２３６】
経口的に用いられることができる薬剤調製物は、ゼラチンから作られるプッシュフィットカプセルだけでなく、ゼラチンから作られる柔軟でシールされたカプセル及びグリセロール又はソルビトールのようなコーティングも含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はスターチのようなフィラー又はバインダー、タルク又はステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、及びときには安定化剤と混合された活性成分を含むことができる。柔らかいカプセルでは、活性な化合物は、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールのような好適な液体の中で、安定化剤と共に又は伴わずに、溶解され又は懸濁されてもよい。
【０２３７】
非経口的投与の薬剤組成は、活性化合物の水溶液を含む。注射薬のためには、本発明の薬剤組成物は、水溶液の中で調製され、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液又は生理学的に緩衝化された生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液の中で調製されることができる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランのような懸濁液の粘度を上昇させる物質を含む。さらに、活性溶媒又は担体の懸濁液は、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポゾームを含む。任意には、懸濁液は、好適な安定化剤又はその化合物の溶解度を増加させて高濃度溶液の調製を許容させる物質を含んでもよい。
【０２３８】
鼻への投与のためには、透過される特定バリアにふさわしい浸透剤が組成に用いられる。そのような浸透剤は、一般に当該分野でよく知られている。
【０２３９】
本発明の薬剤組成物は、当該分野で知られた方式例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、空中浮遊化、エマルジョン化、カプセル化、捕捉、又は親油化プロセスによって作製されることができる。
【０２４０】
塩として提供されることができる薬剤組成物は、多くの酸とともに形成されることができる。当該酸としては、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されない。塩は、フリーの塩基型に該当する他のプロトン溶媒又は水中でより溶解される傾向にある。他の場合には、その調製は、使用前にバッファーと組合わされる４．５乃至５．５のｐＨ領域で、１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトール中の親油化された粉末であり得る。
【０２４１】
受け入れられるキャリアにおいて組成された本発明の化合物を含む薬剤組成物が調製された後、これらは、ふさわしい容器に入れられ、投与量、投与回数、及び投与方法などの情報とともに指示された状態の治療のために標識されることができる。
【０２４２】
本発明は、下記材料及び方法が採用される実施例に限定されることなく、説明される。本明細書で以下に引用される各参考文献の開示全体は、本明細書に参考として組み入れられる。
【実施例】
【０２４３】
実施例１  クローニングとシークエンシング
ヒトＰ２Ｙ１２に強く関係する新規レセプターをコードするイントロンのないコード配列が、３ｑ２４領域に位置し、下記特許：ＷＯ００／３１２５８ＡＲＥＮＡ配列番号１８のゲノムクローンＲＰ１１−２５Ｋ２４（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＣ０２４８８６）上に同定された。
【０２４４】
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが、ＧＰＲ８６ヒトレセプターの配列：センスプライマー５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＣ−３’とアンチセンスプライマー５’−ＣＴＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＣＣＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＴＧＴＣ−３’に基づいて合成された。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が、プラチナＰｆｘＤＮＡポリメラーゼを用いて３つの異なる脾臓ｃＤＮＡ上で達成された。増幅条件は、次の通りである：９４℃，１５秒；５０℃，３０秒；６８℃，２分で３５サイクル。増幅は、結局、ＧＰＲ８６遺伝子のコード配列全体を含む１キロベースの断片となった。コード配列は、次いでサブクローン化され、ＢｉｇＤｙｅターミネータサイクルシークエンシングキットを用いて、３つのｃＤＮＡの各々のための両方の鎖上に配列された（アプライドバイオシステムズ社、ウェーリントン、イギリス）。
【０２４５】
この１００２塩基対（ｂｐ）−オープンリーディングフレームも、Ｗｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒらによって最近同定され（ＧｅｎＢａｎｋ承認番号ＡＦ２９５３６８）、彼らがＧＰＲ８６（非特許文献２４）と呼ぶオーファンＧタンパク共役型レセプターをコードすると報告された。開始コドンは、停止コドンより１８塩基上流にある。オリゴヌクレオチドプライマーは、このコード配列に基づいて合成された。これらは、脾臓ｃＤＮＡから開始するＰＣＲの中で用いられた。ＧＰＲ８６コード配列とサイズ競合しているＰＣＲ産物は、発現ベクターの中へ挿入され、双方の鎖上で配列された（図１）。推定上の膜上に広がるドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）は、アンダーラインされ、ＩからＶＩＩの番号が付けられている。プロテインキナーゼＡ又はプロテインキナーゼＣによる推定上のリン酸化部位が、黒丸（●）又は黒三角（▲）によってそれぞれ示されている。ポテンシャルＮ−グリコシル化部位は、黒四角（■）によって示されている。
【０２４６】
得られた配列は、胎児の脳及び胎盤からのヒトｃＤＮＡライブラリーから増幅されたＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒの配列に完全にマッチした。１００２塩基対オープンリーディングフレームは、Ｋｏｚａｋコンセンサス中のＡＴＧコドンから開始され、３３３アミノ酸のプロテインをコードする。ペプチド配列は、Ｎ連結グリコシル化のための３つのポテンシャル部位（細胞外のＮ末端部分の２つ（Ｎ２とＮ１０）と３番目の細胞外ループ（Ｎ２６４）の一つで、プロテインキナーゼＣによるリン酸化のための２つのポテンシャル部位（３番目の細胞内ループ（Ｓ２１７）とカルボキシ末端部分（Ｔ３０４）内の１つ）と、プロテインキナーゼＡによる１つの部位（カルボキシル末端部分（Ｔ３１６）（図１））を含む。新規なレセプターは、ヒトＰ２Ｙ１２及びＵＤＰグルコースレセプターと顕著なホモロジーを表わしていて（図２）、それぞれ４８％及び４５％アミノ酸アイデンティティを示す。他のＰ２Ｙレセプターとの類似性は、もっと低く（図２）、例えばヒトＰ２Ｙ１及びＰ２Ｙ２レセプターとそれぞれ２５％、２６％アミノ酸アイデンティティを示す。プリン作動性レセプター（Ｐ２Ｙ１，−２，−4，−11，−12）、ＵＤＰグルコースレセプター及び他のプリン作動性関連配列（ＧＰＲ１７，ＧＰＲ８７，Ｈ９６３）とＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）のアミノ酸配列が一列になっていることは、ＣｌｕｓｔａｌＸアルゴリズムを用いて行われた。そして、ＴｒｅｅＶｉｅｗアルゴリズムを用いて、樹状図が構築された（図２）。
【０２４７】
実施例２  ＧＰＲ８６ヒトレセプターの組織分布
ＧＰＲ８６ｍＲＮＡがいくつかのヒト組織中のＲＴ−ＰＣＲによって増幅された（図３Ａ）。
逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）実験は、ポリＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）のパネルを用いて実施された。ＧＰＲ８６プライマーは、次の通りである：ＧＰＲ８６センスプライマー（５’−ＴＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧ−３’）とＧＰＲ８６アンチセンスプライマー（５’−ＣＴＧＣＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧ−３’）。増幅されたＤＮＡバンドの予期されたサイズは、５７５ｂｐである。配列をコードするアルドラーゼに基づいて合成された２つのプライマーが、コントロールとして用いられ、４４３ｂｐの予期されたサイズを伴う産物を生産する：アルドラーゼセンスプライマー（５’−ＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ−３’とアルドラーゼアンチセンス逆５’−ＴＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＴＴ−３’）。約７５ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡが、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ライフテクノロジー社、メレルベーケ，ベルギー）を用いて逆転写されて、ＰＣＲのために用いられた。ＰＣＲは、下記条件下でＴａｑポリメラーゼを用いて行われた：９４℃で３分間９４℃で１分間３８サイクル、５８℃で２分間及び７２℃で２分間変性。ＰＣＲ反応のアリコート（１０μｌ）が、１％アガロースゲル電気泳動によって解析された。
【０２４８】
ＲＴ−ＰＣＲ実験は、ポリＡ＋ＲＮＡ（クロンテック社）のパネル及びＧＰＲ８６配列の特異的プライマーを用いて実施された。増幅されたＧＰＲ８６とアルドラーゼバンドの予期されたサイズは、それぞれ５７５ｂｐ及び４４３ｂｐであった。ｃＤＮＡ（−）は、ｃＤＮＡ鋳型なしのＰＣＲ反応のネガティブコントロールを示す。ＰＣＲ反応のアリコート（１０μｌ）は、１％アガロースゲル電気泳動によって解析された。予期されたサイズ（５７５ｂｐ）の強いバンドは、脾臓及び脳（大人）の中で検出され、胎盤、肺、肝臓、骨髄、胸腺、小腸、子宮、胃、精巣、胎児脳及び副腎では、より強度が低いところで検出されたが、膵臓、心臓、腎臓、骨格筋、卵巣、大動脈、またはｃＤＮＡなしのネガティブコントロール（図３Ａ）では検出されなかった。５７５ｂｐバンドも、リンパ節及び骨髄で明確に検出され、末梢血単球（ＰＢＭＣ）で弱く検出された（図３Ａ）。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と多形核細胞（ＰＭＮ）の中では、シグナルは検出されなかった（図３Ａ）。ＧＰＲ８６メッセンジャーは、異なる脳領域（視床、尾状核、黒色物質（substantial  nigra）、海馬、小脳、脳梁、及びアミグダラ（図３Ｂ）で検出された。配列をコードするアルドラーゼの断片増幅はコントロールとして用いられた。
【０２４９】
ｈＧＰＲ８６を用いるノザンブロット解析では、脾臓中で強い２．９ｋｂ転写物を示し、肝臓、胎盤、白血球、及び脳中に弱い転写物を示した。異なる脳領域におけるｈＧＰＲ８６の発現の評価は、黒色物質（substantial  nigra）、視床、及び骨髄の中では強いシグナルとして、前頭葉及び側頭葉、硬膜、アミグダラ（ａｍｙｇｄａｌａ）、尾状核、海馬、骨髄、脳梁では少し強いシグナルとして、小脳及び後頭葉では弱いシグナルとして、２．９ｋｂ転写物を示した。この転写物は、大脳皮質の中では検出されなかった。ノザンブロット解析で示されるｈＧＰＲ８６の広範にひろがった発現は、生殖細胞腫瘍、胎児肝臓、胎児脾臓、結腸、妊娠中の子宮、及び多種の硬化症障害として異なった組織由来の、公共のデータベース中でこのＧＰＣＲのために見出された１６ＥＳＴ配列のオリジンによって、もたらされる。脳及び胎盤ｃＤＮＡからのｈＧＰＲ８６のＰＣＲ増幅は、またこれらの結果（非特許文献２４）と調和している。
【０２５０】
実施例３  １３２１Ｎ１アストロサイトーマにおける新規レセプターの安定した発現
新規レセプターの完全な配列は、１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞系列をトランスフェクトするために、発現ベクターの中に導入された。予め、いくつかのＰ２Ｙサブタイプ（５，１３，１４）を特徴づけるのに用いた。Ｇα１６タンパクを発現する１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞は、ＧＰＲ８６プラスミド組換え体又はプラスミド単体を用いてトランスフェクトされた。
【０２５１】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び１３２１Ｎ１細胞は、ＧＰＲ８６プラスミド組換え体又はプラスミドのみで、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ社）を用いて、トランスフェクトされた。Ｇα１６（ユーロスクリーンより提供）をコードするｐＥＲＡＥＱ２プラスミドで予めトランスフェクトされた１３２１Ｎ１細胞に相当するＡＧ３２とよばれるクローンがトランスフェクトされた。ＣＨＯ−Ｋ１及び１３２１Ｎ１トランスフェクト細胞は、完全培地（ＨａｍのＦ１２培地又はＤＭＥＭ（ダルベッコの修飾イーグル培地）のそれぞれにおいて、１０％ＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ）の中で、トランスフェクション２日後、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選ばれ、同じ培地で保持された。ＡＧ３２細胞が５００μｇ／ｍｌゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）を添加した同じＤＭＥＭ完全培地の中で、保持された。
【０２５２】
Ｇ−４１８抵抗クローンのプールは、上記で説明した方法にしたがって、いくつかのヌクレオチドに応答して機能的ＩＰ３応答のためにテストされた。この細胞は、種々のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰ、ＴＤＰ）１００μＭ濃度で３０秒間刺激された。ＧＰＲ８６レセプターだけを発現する１３２１Ｎ１細胞では、応答は得られなかったが、これらの細胞内でヒスタミンに対する強いＩＰ３応答が観察されたが、ＧＰＲ８６レセプター及びＧα１６タンパク質の双方を発現する１３２１Ｎ１細胞内では、ＡＤＰ、ＵＤＰ及びＩＤＰがＩＰ３応答を誘導した。他のヌクレオチドに対しては、ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＴＰを除いてＩＰ３応答は観察されなかったが、このケースにおけるＨＰＬＣ精製後にこれらの応答は失われた（データは示さず；しかしながら、実施例７を参照）。野生型発現ベクターを用いてトランスフェクトされた１３２１Ｎ１又は１３２１Ｎ１−Ｇα１６細胞内ではいずれのヌクレオチドに対してもＩＰ３応答は観察されず、ネガティブコントロールとして用いられた。
【０２５３】
ＧＰＲ８６レセプター及びＧα１６の双方を発現する１３２１Ｎ１細胞内では、濃度作動カーブがＡＤＰ、ＩＤＰ、ＵＤＰについて作成され、ＡＤＰに対してＧＰＲ８６の強い親和性を示した。次のような効力範囲が観察された：ＡＤＰ＞＞＞ＩＤＰ＞ＵＤＰ。ＡＤＰに対するＧＰＲ８６の親和性は、ＩＤＰ及びＵＤＰの親和性よりも約１０００倍以上大きかった。ＡＤＰ、２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰβＳに対して、濃度作動はカーブしている。ＡＤＰ、２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰβＳについては、それぞれ次の様なＥＣ５０値が観察された：１１．４±２．２ｎＭ、１４．２±３．０ｎＭ及び４８．４±０．４ｎＭ（３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．）（図４Ａ）。１３２１Ｎ１トランスフェクト細胞は、ＡＤＰ、２ＭｅＳＡＤＰ及びＡＤＰβＳの種々の濃度存在下で３０秒間培養された。データは、３回の各回の実験の中で観察された３つの実験値の平均値±Ｓ．Ｄ．を示している。Ａ２Ｐ５Ｐ（ＡＤＰ２’，５’−ジホスフェート）、Ａ３Ｐ５Ｐ（アデノシン３’，５’−ジホスフェート）及びＡ３Ｐ５ＰＳ（アデノシン３’−ホスフェート５’−ホスホサルフェート）については、ＩＰ３応答は観察されなかった。
【０２５４】
２ＭｅＳＡＴＰ及びＡＴＰの効果は、それぞれのジホスフェートヌクレオチド（図４Ｂ）についてよりも高濃度で得られた（図４Ｂ）。１３２１Ｎ１トランスフェクト細胞は、１００ｎｇ／ｍｌの百日咳トキシンと共に又は伴わずに、１８時間プレインキュベートされ、次いで、ＡＤＰ（３００ｎＭ）又は水（ＣＯＮＴ）の存在下で、３０秒間インキュベートされた。そのデータは、２回のうちの１つの代表的実験で観察された３つの実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０２５５】
先に論じたように、市販のヌクレオチド粉末は、分解産物によって、しばしば汚染される（非特許文献４，１３，２８）。汚染は、通常ＡＴＰについて１％、２ＭｅＳＡＴＰについて１０％である（非特許文献２８）。２ＭｅＳＡＴＰとＡＴＰ溶液（１ｍＭ）は、室温で、２０ユニット／ｍｌＣＰＫ及び１０ｍＭのＣＰとともに、９０分間、処理された。このＡＴＰ再生システムは、ヌクレオチド３リン酸溶液の汚染及び分解からおこる問題を阻止する（非特許文献２８）。これらの条件では、ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＴＰに対する応答は、廃止された（図４Ｂ）。
【０２５６】
１００ｎｇ／ｍｌの百日咳トキシン（ＰＴｘ）でトランスフェクトされた細胞の１８時間プレ処理後のＡＤＰ応答（３００ｎＭ）の８６±８％（２つの独立した実験の平均値±範囲）の阻害が、観察された（図４Ｃ）。１３２１Ｎ１トランスフェクト細胞は、１８時間１００ｎｇ／ｍｌの百日咳トキシン（ＰＴｘ）と共に又は伴わずにプレインキュベートされ、ＡＤＰ（３００ｎＭ）の存在下で、又はコントロール培地（ＣＯＮＴ）で３０秒間、インキュベートされた。そのデータは、２回のうち、各実験で観察された３つの実験値の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。
【０２５７】
実施例４  ＣＨＯ−Ｋ１細胞の新規レセプターの安定な発現
ヌクレオチドの潜在的効果は、ヒトＧＰＲ８６レセプターを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｃＡＭＰ経路上でテストされた。ｃＡＭＰレベルの顕著な阻害は、フォルスコリンの存在下（４μＭ）で、低濃度のＡＤＰ（図５Ａ）及び２ＭｅＳＡＤＰで観察された。ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト細胞は、種々のＡＤＰ濃度及び４μＭフォルスコリンの存在下で、１０分間、インキュベートされた。そのデータは、３回のうちの１つの代表的実験で得られる３つの実験値の平均±Ｓ．Ｄ．で表される。ＡＤＰのＩＣ５０は、１．５±０．６ｎＭ（３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．）は、３０ｎＭで最大阻害率５２±７％（３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．）である。第２フェーズは、３０ｎＭよりも高い濃度で観察される：減少又は小さく増加したアデニルシクラーゼの阻害は、１０μＭで観察された（図５Ａ）。１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の１８時間−前処理後、ＡＤＰ（１０ｎＭ及び１００μＭ）がｃＡＭＰレベルの顕著な増加を誘導した（図５Ｂ）。ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト細胞は、種々の濃度のＡＤＰと４μＭのフォルスコリンの存在下、１０分間でインキュベートされた。そのデータは、３回のうちの１回の代表的実験で得られた３つの実験値の平均値±Ｓ．Ｄ．を表している。ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト細胞は、１００ｎｇ／ｍｌ百日咳毒素と共に又は伴わずに１８時間プレインキュベートされ、次いでＡＤＰ（１００ｎＭ及び１００μＭ）又は水（ＣＯＮＴ）と４μＭフォルスコリンの存在下で１０分間インキュベートされた。そのデータは、２回の実験のうち１回の代表的実験で得られた３つ実験値の平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。アデニルシクラーゼ上でのＡＤＰの２局面的（ｂｉｐｈａｓｉｃ）効果は、ヒトＧＰＲ８６レセプターでトランスフェクトされた１３２１Ｎ１細胞内で再生産された。
【０２５８】
ヒトＧＰＲ８６レセプターの刺激におけるＭＡＰキナーゼＥｒｋ１及びＥｒｋ２の活性化状態で変化をみるために、ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト細胞全体の抽出物が、Ｅｒｋの活性型である二重にリン酸化されたキナーゼ（Ｔｙｒ２０２及びＴｙｒ２０４）用の特異的抗体を用いて、ウエスタンブロッティング法によって解析された。リン酸化されたＥｒｋ１及びＥｒｋ２タンパク質のウエスタンブロット解析。
【０２５９】
ＧＰＲ８６トランフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１．５×１０６個／ディシュで植え付けられた。２４時間後、細胞は、ＫＲＨバッファー内で、２時間、血清飢餓状態とされた。アゴニストによる刺激後、細胞は、１ｍｌのＰＢＳ  ｐＨ７．３（１３７ｍＭのＮａＣｌ，２．７ｍＭのＫＣｌ，４．３ｍＭのＮａＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）内で、かき集められた。細胞は、遠心分離によって回収され、１５０μｌのＬａｅｍｍｌｉバッファー（１０％ｗ／ｖ）グリセロール、５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、２．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６２．５ｍＭのＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ６．８）内で消化された。タンパク濃度は、Ｍｉｎａｍｉｄｅ及びＢａｍｂｕｒｇの方法を用いて決定された（非特許文献２７）。各条件について同量のタンパク質は、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル内で、電気泳動された。タンパク質は、６０Ｖ、４℃で、一晩、ニトロセルロース膜上で、２０ｍＭＴｒｉｓ、１５４ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノールをトランスファーバッファとして用いて、トランスファーされた。免疫検出が、高められた化学発光ウエスタンブロッテイング検出システム（ＥＣＬ，アメルシャム・ファルマシア・バイオテック社）を用いて、ビオチン標識二次マウス抗体を用いて（１／２５０００）達成された。Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２の二重リン酸化型（Ｔｙｒ２０２及びＴｙｒ２０４））に特異的なモノクローナル抗体が、１／１０００希釈で用いられた。
【０２６０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、リン酸化されたＥｒｋ１とＥｒｋ２は、それぞれ、分子量４４ｋＤａと４２ｋＤａと予測された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で１μＭのＡＤＰ又は２−ＭｅＳＡＤＰを用いて、ヒトＧＰＲ８６レセプターの刺激が安定的に発現されて、Ｅｒｋ２の強いリン酸化に導いた（図６Ａ）。ＧＰＲ８６トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞は、異なる時間の間中、種々の濃度のＡＤＰと２ＭｅＳＡＤＰ又は水（ＣＯＮＴ）で刺激された。１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴｘ）の効果は、１μＭのＡＤＰ又は２−ＭｅＳＡＤＰの存在下で５分および３０分でテストされた。ブロテッィング及び免疫検出は、高められたウエスタンブロッティング検出システムを用いて説明されたように達成された（ＥＣＬ，アメルシャム・ファルマシア・バイオテック社）。
【０２６１】
Ｅｒｋ１も弱くリン酸化された。Ｅｒｋリン酸化は、刺激の１分後検出され、時間とともに増大した（図６Ａ）。最大応答は、ＡＤＰ又は２ＭｅＳＡＤＰを用いた刺激の５分後に得られた。そして最大応答後、Ｅｒｋ活性は、１時間後の基礎レベルまでゆっくり減少した。内在レセプターが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で、ＡＤＰ又は２−ＭｅＳＡＤＰ依存性Ｅｒｋ活性の原因となるかどうかをきめるために、これらのヌクレオチドが、空のベクターでトランスフェクトされた細胞上でテストされた：Ｅｒｋ１又はＥｒｋ２リン酸化は、ＣＨＯ−Ｋ１コントロール細胞が５分、２０分又は１時間、１μＭのは２−ＭｅＳＡＤＰ又はＡＤＰとともにインキュベートされるときには観察されなかった。ＡＤＰによって誘導された濃度依存性のＥｒｋリン酸化は、一過性応答（５分）のピークで決められた。ＡＤＰ又は２−ＭｅＳＡＤＰ（１ｎＭ乃至１０μＭ）によるヒトＧＰＲ８６レセプターの刺激は、Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２の濃度依存性リン酸化に導いた（図６Ｂ）。最大効果は、１μＭで得られるが、顕著な効果は、すでに１０ｎＭで双方のアゴニストに対して観察された。これらの効果におけるＧｉタンパク質の影響を評価するために、我々は、ＡＤＰ（１μＭ）又は２−ＭｅＳＡＤＰ（１μＭ）刺激に先立って、百日咳毒素（１００ｎｇ／ｍｌで１８時間）とともに、ＧＰＲ８６−ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト細胞をプレインキュベートした。ＡＤＰ又は２−ＭｅＳＡＤＰ（１μＭ）処理の５分又は３０分によって通常誘導されるＥｒｋリン酸化は、強く阻害された（図６Ｂ）。
【０２６２】
Ｐ２Ｙファミリー、仮にＰ２Ｙ１３と呼ばれるファミリーの新規なヒトＧタンパク共役型レセプターのクローニングと薬理学的特徴付けは、先に説明されたＧＰＲ８６オーファンレセプターに該当する（非特許文献２４）。その配列に関連して、Ｐ２Ｙ１乃至Ｐ２Ｙ１１サブタイプとのホモロジーは、約２５％に制限される。逆に、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターは、ヒト（Ｐ２Ｙ１２）及びＵＤＰ−グルコースレセプターとの顕著なホモロジーを示す。最も近いＧ共役型レセプターは、ヒトＰ２Ｙ１２レセプター（４８％アミノ酸アイデンティティ）であり、ＡＤＰに応答するレセプターでもある。Ｐ２Ｙ２レセプターを用いた変異誘発実験は、６回目及び７回目の膜貫通ドメインで正に荷電された３つのアミノ酸（Ｈｉｓ２６２，Ａｒｇ２６５，及びＡｒｇ２９２）を同定した。これらは（多分、リン酸基の陰性荷電を中和することによって）、ヌクレオチド結合の中できわめて重大な役目を果たす（非特許文献２８）。はじめの２残基は、２５１位及び２５４位のそれぞれで、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターの中で保存されている。これらの２残基は、また、Ｐ２Ｙ１２レセプター及びＵＤＰ−グルコースレセプターの中でも保存されている。Ｐ２Ｙ２レセプターのＡｒｇ２９２残基は、Ｐ２Ｙ１２，ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）及びＵＤＰグルコースレセプターの中で陰性荷電されたグルタミン酸残基によって置換されていて、レセプターの薬理学に非常に重要である。
【０２６３】
Ｐ２Ｙ１２レセプター及びＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターは、このようにしてＰ２Ｙレセプターのサブグループを形成し、構造上、他のＰ２Ｙレセプターと異なり、それらのリガンドＡＤＰに対する高い親和性を分配する。ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターに対するＡＤＰのＥＣ５０の値は、比較できるトランスフェクト細胞系列における他のＰ２ＹレセプターのそれぞれのリガンドのＥＣ５０の値よりも２０倍〜１０００倍低い。薬学的見地から、ＡＤＰと２−ＭｅＳＡＤＰの相対的親和性は、Ｐ２Ｙ１２とＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）サブタイプの間で区別することを許容する。類似の親和性は、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）について観察される一方、２−ＭｅＳＡＤＰは、発現系に依存して、Ｐ２Ｙ１２レセプターに対するＡＤＰよりも１０倍〜１００倍高い効能を示す（非特許文献２１，２２）。
【０２６４】
Ｇα１６のタンパク質の存在は、１３２１Ｎ１細胞におけるホスホリパーゼＣに対するＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターと共役するのに必要である。１３２１Ｎ１−Ｇα１６トランスフェクト細胞におけるＡＤＰによって誘導されたＩＰ３蓄積における百日咳毒素の強い阻害効果は、Ｇα１６タンパク質とＧｉタンパク質との間の共同作用を提案する。そのような現象は、ＨＥＬ細胞内で予め説明され、Ｐ２Ｙ２アゴニストによるＣａ２＋可動性が、Ｇα１６アンチセンスによって完全に阻害され、百日咳毒素によって部分的に阻害される（非特許文献２９）。
【０２６５】
アデニルシクラーゼの阻害とＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ−１及び２）の刺激は、ＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターに関連するとともに双方のＧｉタンパク質に関連する伝達メカニズムである。アデニルシクラーゼにおけるＡＤＰの二局面（biphasic）の効果は、α２アドレナリンレセプターのような他のレセプターのために観察されたものを思い出させる（非特許文献３０，３１）。低濃度のアゴニストで、アデニルシクラーゼの阻害がある一方、より高濃度で増加が観察され、反対の効果を伴う２つのＧタンパクに同時におこる共役を提案する。この同時におこる共役（coupling）は、過剰発現（surexpression）の人造物であり得る。
【０２６６】
ヒトＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターの組織分布に関して、よい関係が、現在のＲＴ−ＰＣＲデータとＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（非特許文献２４）によって得られるノザンブロッティングデータとの間で得られた。ヒトＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターは、特にヒト脾臓及び脳で発現され、脳では、異なる脳領域の大きな発現を表す。Ｐ２Ｙ１２レセプターは、ヒト脳内でも検出され、グリア発現パターンを示す。ＡＤＰによるｃＡＭＰ形成の阻害は、ラットＣ６グリオーマ細胞（非特許文献３２）及びラット脳の毛細管内皮細胞（非特許文献３３）の中で説明された。双方のモデルにおいて、２−ＭｅＳＡＤＰは、ＡＤＰよりももっと効力があり、２−ＭｅＳＡＴＰは２−ＭｅＳＡＤＰと類似の効力を有した。これらの特徴はＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターよりはむしろＰ２Ｙ１３に含まれることを意味する。脾臓、リンパ節及び骨髄におけるＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）レセプターの発現は、造血及び免疫系において役割を果たすだろうことを提案している。
【０２６７】
実施例５  トランスジェニック動物の生産
非ヒトトランスジェニック動物の製造方法は、ここで説明される。ＤＮＡ構成要素は、ほ乳類の生殖系列に導入され、トランスジェニック動物を作り出すことができる。例えば、構成要素の１つ又はいくつかのコピーは、標準的なトランスジェニック技術によってほ乳類の胚のゲノムの中に組み入れられる。
【０２６８】
実験的態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物の生殖系列の中にトランスジーンを導入することによって製造される。トランスジーンは、種々の進化的段階で胚の標的細胞の中に導入される。異なった方法が胚性標的細胞の発達段階に依存して用いられる。用いられる動物の特異的系列は、可能であれば、一般的に健康優良でよい胚を生み出すことができ、胚の中でよい前核を可視化でき、よい再生産的適合のために選択される。
【０２６９】
胚の中へのＰ２Ｙ１３レセプタータンパク質トランスジーンの導入は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、又はリポフェクションのようなその業界で既知の種々の手段のいずれかによって行われる。例えば、Ｐ２Ｙ１３レセプタータンパク質トランスジーンは、受精したほ乳類の卵の前核の中へのマイクロインジェクションによって構成要素をほ乳類の中へ導入し、その構成要素の１つ以上のコピーが発達したほ乳類の細胞の中に保持されるようになる。トランスジーンの下記導入は、受精卵を構成し、その受精卵は、時間の総計を変えるためにインビトロで培養され、または代理宿主または双方の中へ再び移植される。一つの共通の方法は、約１〜７日間、インビトロで胚を培養し、そして、その胚を代理宿主の中へ再移植する方法である。
【０２７０】
トランスジェニック的に操作された胚の子孫は、組織のセグメントのサザンブロット解析によってその構成要素の存在についてテストされる。ゲノム内に安定的に集積された外因性クローン化された構成要素の１つ以上のコピーを有する胚が、トランスジェニック的に導入された構成要素を運ぶ永久的なトランスジェニックほ乳類系列の樹立に用いられる。
【０２７１】
子孫のゲノムの中へその構成要素を組み入れるための誕生後、トランスジェニック的に変更されたほ乳類のリッターが解析される。このことは、子孫からの染色体的材料上で融合タンパク質又はそのセグメントをコードするＤＮＡ配列に該当するプローブをハイブリダイズすることによってなされる。これらのゲノム内での構成要素の少なくとも１つのコピーを含むと見出されたこれらのほ乳類の子孫は、成熟するまで育てられる。トランスジェニックほ乳類は、他のトランスジェニック子孫を生産するまで育てられる。
【０２７２】
トランスジェニックの雌は、既知の解析技術、例えばウエスタンブロットまたは酵素的解析を用いたタンパク質発現についてテストされる。
【０２７３】
実施例６  ＧＰＲ８６活性
ＧＰＲ８６の活性は、次の方法で検出又は測定されることができる：組換えほ乳類細胞、例えば好適なＧＰＲ８６（Ｐ２Ｙ１３）発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた１３２１Ｎ１アルトロサイトーマ又はＣＨＯ−Ｋ１細胞は、実施例３及び４で説明されるように、組織培養プレート上にプレートアウトされる。適当な細胞密度、通常５０〜７５％の集密性で、培養培地は、ＡＤＰリガンド（例えば、１ｎＭ乃至１μＭの範囲）を含むＫＲＨバッファー溶液（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ：ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１，２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及び８ｍＭグルコース）と取り替えられ、細胞は３７℃でさらに３０秒間培養される。培養後、細胞は洗浄され、溶解された。ＡＤＰリガンドの存在又は不在下でのこの細胞内抽出物中でのＧＰＲ８６活性は、実施例３及び４で説明されるように、ｃＡＭＰ，ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫリン酸化及びＩＰ３のような下流のセカンドメッセンジャーの関連する活性を検出することにより決定される。ＧＰＲ８６活性は、ＡＤＰの不在下対存在下での、ＥＲＫリン酸化における２倍以上の増加またはｃＡＭＰレベルの２倍以上の減少として定義される。活性は、またリガンドＡＤＰの至適濃度の存在対不在で、セカンドメッセンジャーレベルにおける２倍以上の変化によっても定義される。
【０２７４】
実施例７  ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＴＰの部分的アゴニスト効果
本発明は、一部分、ＡＤＰによるＧＰＲ８６の活性化、あるいは２ＭｅＳＡＤＰ、ＡＤＰβＳ又は米国特許Ｎｏ．５７００７８６で教示されたＡＤＰアナローグのいずれかのようなアナローグ又は等価分子に関する。従って、２つのＡＤＰアナローグ、ＡＴＰ及び２ＭｅＳＡＴＰは、上述のように、ヒトＰ２Ｙ１３レセプターでトランスフェクトされたＡＧ３２細胞でテストされた。ＡＧ３２細胞は、Ｇα１６タンパク質でトランスフェクトされた１３２１Ｎ１細胞である。
【０２７５】
ＡＧ３２細胞が、３５ｍｍ（直径）ペトリ皿上に播かれ（２×１０５個／ディッシュ）、５％ウシ胎児血清，抗生物質，アンホテリシン，ピルビン酸ナトリウム及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むイノシトールフリーのＤＭＥＭで、５μＣｉ／ｍｌ〔３Ｈ〕−ｍｙｏイノシトールで、２４時間標識された。細胞は、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー（ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１，２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及びＤ−グルコース８ｍＭ）内で２時間培養された。そして、細胞は、ＡＤＰ、ＡＴＰ又は２ＭｅＳＡＴＰ存在下で３０秒間培養された。培養は、１ｍｌの氷冷３％過塩素酸溶液の添加によって停止させた。刺激に先立って、ＡＴＰと２ＭｅＳＡＴＰ（１ｍＭ溶液）が、９０分室温で、２０ユニット／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）及び１０ｍＭクレアチンリン酸（ＣＰ）とともに培養された。反応は、１０ｍＭヨードアセトアミドの添加によって停止した。
【０２７６】
クレアチンリン酸及びクレアチンホスホキナーゼでの処理後、ＡＴＰと２ＭｅＳＡＴＰが、ヒトＰ２Ｙ１３レセプターの部分的アゴニストであることが明らかにされた。図８は、ＡＤＰアナローグ、ＡＴＰと２ＭｅＳＡＴＰによって刺激されたＧＰＲ８６活性の濃度応答曲線を示す。データは、分あたりの〔３Ｈ〕ＩＰ３カウントに対してプロットされたアゴニスト濃度として示される。ＡＴＰと２ＭｅＳＡＴＰは、ＧＰＲ８６レセプター活性を４．２±０．８μＭ及び１．５±０．２μＭのＥＣ５０でそれぞれ刺激した。このデータは、３回のうち１つの代表的実験において得られる３つの実験値の平均値±標準偏差を示す。
【０２７７】
実施例８  ジアデノシンポリリン酸活性
ＡＤＰアナローグであるＡｐ３Ａ，Ａｐ４Ａ，Ａｐ５Ａ，及びＡｐ６Ａが、上記のヒトＰ２Ｙ１３レセプターでトランスフェクトされたＡＧ３２細胞でテストされた。
【０２７８】
ＡＧ３２細胞が、３５ｍｍ（直径）ペトリ皿上に播かれ（２×１０５個／ディッシュ）、５％ウシ胎児血清，抗生物質，アンホテリシン，ピルビン酸ナトリウム及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むイノシトールフリーのＤＭＥＭ内で、５μＣｉ／ｍｌ〔３Ｈ〕−ｍｙｏイノシトールで、２４時間標識された。細胞は、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー（ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１．２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及びＤ−グルコース８ｍＭ）内で２時間培養された。そして細胞は、２つの異なる濃度（１００ｎＭと１０μＭ）のＡＤＰ又はＡｐｎＡ（ｎ＝３〜６）の存在下で、それぞれ３０秒間培養された。この培養は、１ｍｌの氷冷３％過塩素酸溶液の添加によって停止させた。
【０２７９】
培養の３０秒後、ＩＰ３蓄積におけるＡｐ３Ａの影響が、〔３Ｈ〕ＩＰ３の生産によって測定されるように、ＡＤＰの影響（図９）とほぼ等しい。反対に、Ａｐ４Ａ，Ａｐ５ＡとＡｐ６Ａが不活性である。このデータは、３回のうち代表的な１回の実験において得られる３つの実験値の平均値±標準偏差を示す。
【０２８０】
実施例９  ポリ〔Ａ〕活性
ポリ〔Ａ〕とポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕が、上記のようにヒトＰ２Ｙ１３レセプターでトランスフェクトされたＡＧ３２細胞についてテストされた。本発明者は、これらの化合物は、ヒトＰ２Ｙ１３レセプターのターゲットとしてデンドライト細胞のワクチン治療に用いられるだろうと考えた。
【０２８１】
ＡＧ３２細胞が、３５ｍｍ（直径）ペトリ皿上に播かれ（２×１０５個／ディッシュ）、５％ウシ胎児血清，抗生物質，アンホテリシン，ピルビン酸ナトリウム及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むイノシトールフリーのＤＭＥＭ内で、５μＣｉ／ｍｌ〔３Ｈ〕−ｍｙｏイノシトールで、２４時間標識された。細胞は、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー（ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１，２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及びＤ−グルコース８ｍＭ）内で２時間培養された。そして、細胞は、ＡＤＰ（至適刺激の指示薬として），ポリ〔Ａ〕又はポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕の存在下で、それぞれ３０秒間、培養された。培養は、１ｍｌの氷冷３％過塩素酸溶液の添加によって停止させた。比較の目的のために、細胞培養前に、ポリ〔Ａ〕とポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕（１ｍＭ溶液）は、室温で９０分間、２０ユニット／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）及び１０ｍＭクレアチンリン酸（ＣＰ）とともに培養し、その後、反応を１０ｍＭヨードアセトアミドの添加によって反応を停止した。図１０は、ポリ〔Ａ〕及びポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕を用いたヒトＧＰＲ８６の活性化についての濃度応答曲線を示す。
【０２８２】
クレアチンリン酸及びクレアチンホスホキナーゼでの処理後、ポリ〔Ａ〕は、なおも、とはいえ、より低いＥＣ５０（２０５±６０μＭ）で、ＧＰＲ８６を活性化することができる。しかしながら、ポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕は、ヒトＧＰＲ８６（図１０に示されたデータ）上で、もはや、活性化しない。ポリ〔Ａ〕とポリ〔Ａ〕〔Ｇ〕の濃度は、ＡＭＰ等価物内で発現された。データは、３回のうち代表的な１回の実験において得られる３つの実験値の平均値±標準偏差を示す。
【０２８３】
実施例１０  リアクティブブルー２，スラミン，ＰＰＡＤＳ及びＭＲＳ−２１７９のアンタゴニスト活性
アンタゴニストは、ヒトＧＰＲ８６でトランスフェクトされたＡＧ３２細胞についてテストされた。ＡＧ３２細胞が、３５ｍｍ（直径）ペトリ皿上に播かれ（２×１０５細胞／ディッシュ）、５％ウシ胎児血清，抗生物質，アンホテリシン，ピルビン酸ナトリウム及び４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むイノシトールフリーのＤＭＥＭで、５μＣｉ／ｍｌ〔３Ｈ〕−ｍｙｏイノシトールで、２４時間標識された。細胞は、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）バッファー（ＮａＣｌが１２４ｍＭ，ＫＣｌが５ｍＭ，ＭｇＳＯ４が１．２５ｍＭ，ＣａＣｌ２が１．４５ｍＭ，ＫＨ２ＰＯ４が１，２５ｍＭ，Ｈｅｐｅｓが２５ｍＭ（ｐＨ７．４）及びＤ−グルコース８ｍＭ）内で２時間培養された。刺激に先立って、細胞は、リアクティブブルー２（ＲＢ２），スラミン，ＰＰＡＤＳ又はＭＲＳ−２１７９の存在下で１０分間、プレ培養された。そして、この細胞は、ＡＤＰ１００ｎＭの存在下で、３０秒間培養された。培養は、１ｍｌの氷冷３％過塩素酸溶液の添加によって停止させた。図１１は、アンタゴニスト化合物の存在下でＡＤＰによってＧＰＲ８６活性についての濃度応答曲線を示す。このデータは、３回のうちの代表的な１回の実験において得られる３つの実験値の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０２８４】
下記表は、各化合物についてのＩＣ５０を示している。
ヒトＰ２Ｙ１３−ＡＧ３２細胞におけるアンタゴニストの効力
値は、３つの独立した実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表す。
【０２８５】
【表１】2005500053.tif 000003
【０２８６】
実施例１１  ＧＰＲ８６活性のモジュレーターのスクリーニング
ＧＰＲ８６の候補モジュレーターは、次のように同定されることができる：実施例６で説明される解析は、ＧＰＲ８６の「モジュレーティング」用の異なる候補化合物のスクリーニングに前提を提供する。このシナリオによれば、ＧＰＲ８６が安定にトランスフェクトされた細胞は、ＡＤＰリガンドの好適濃度（例えば１ｎＭ乃至１μＭの範囲）及びアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、又は他の候補モジュレーター化合物の異なる濃度で（例えば１ｎＭ乃至１μＭ以上の範囲）で共培養される。室温での培養後、細胞は洗浄され、溶解された。そして細胞抽出物のアリコートが、（実施例３，４，及び６で先に説明したように）セカンドメッセンジャー解析でテストされる。この方式で、ＧＰＲ８６活性上に対するモジュレーター化合物の影響が、ＡＤＰリガンド濃度、バッファー組成物、培養時間及び温度の至適テスト条件下で、候補モジュレーター化合物の存在又は不在下で、下流のセカンドメッセンジャーの活性を決めることによって、測定されることができる。この解析は、また、ハイスループットフォーマット（キットの欄で説明されたように）でも行って、種々の濃度でたくさんの候補モジュレーターを同時にテストすることができる。ＧＰＲ８６活性は、至適濃度のＡＤＰ存在下で、定義された濃度で候補モジュレーター化合物の存在下ｖｓ不在下でのセカンドメッセンジャーレベルのいかなる変化も検出することによって決定される。
【０２８７】
他の態様
他の態様は、当業者に明らかであろう。前述の詳細な説明は、単なる明瞭化や単なる好例を提供することは理解されよう。本発明の特質及び範囲は、上記実施例に限定されず、クレームによって拡張される。
【図１Ａ】
2005500053.tif 000004
【図１Ｂ】
2005500053.tif 000005
【図１Ｃ】
2005500053.tif 000006
【図２】
2005500053.tif 000007
【図３Ａ】
2005500053.tif 000008
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2005500053.tif 000010
【図４Ｂ】
2005500053.tif 000011
【図４Ｃ】
2005500053.tif 000012
【図５Ａ】
2005500053.tif 000013
【図５Ｂ】
2005500053.tif 000014
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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