(57)【要約】本発明は、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２の効力に匹敵するＨＩＶ−１中和効力を有する、中和抗ＨＩＶ−１抗体、特にｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１に関する。４Ｅ１０−ＩｇＧ１は、ｍＡｂ  ２Ｆ５により認識されるＥＬＤＫＷＡエピトープのＣ末端側の新規に保存されたエピトープ（ＮＷＦＤＩＴ）と結合する。両エピトープは、ウイルス−細胞融合中間状態にのみ到達可能な領域内にあるクリプティックエピトープであると考えられる。４Ｅ１０−ＩｇＧ１は、２Ｆ５に対して耐性であることが見出されたウイルスを含む、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを含む異なるクレードの、組織培養馴化株のみならず、初代単離物も強力に中和する。テストされた単離物の中に、両方の抗ｇｐ４１抗体に対して耐性のものは存在しなかった。従って、本発明は、４Ｅ１０エピトープを含有しているペプチド、それから作成された組成物、４Ｅ１０−ＩｇＧ１のパラトープと反応性の抗イディオタイプ抗体、４Ｅ１０エピトープを含有しているペプチドと場合により組み合わせられた、抗イディオタイプ抗体を含有している組成物、並びに２Ｆ５及び／又は２Ｇ１２のような他の中和抗体と場合により組み合わせられた、４Ｅ１０−ＩｇＧ１を含む抗ＨＩＶ−１組成物にも関する。
2005502708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７（ＮＷＦＤＩＴ）と同一であるか又はそれに相当するアミノ酸配列と結合し、かつｍＡｂ  ２Ｆ５（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０４）及び／又はｍＡｂ  ２Ｇ１２（ＥＣＡＣＣ登録番号９３０９１５１７）による中和に対して非感受性のＨＩＶ−１変異体を中和することができる、ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０３）以外のＨＩＶ−１中和モノクローナル抗体。
【請求項２】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１（ＥＣＡＣＣ登録番号０１１１０６６５）であることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
少なくとも１個の他の中和抗ＨＩＶ−１モノクローナル抗体と場合により組み合わせられた、好ましくはｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２のうちの少なくとも１個と組み合わせられた、請求項１又は２記載の抗体を含むことを特徴とする、哺乳動物細胞のＨＩＶ−１感染の阻害又は防止のための薬学的組成物。
【請求項４】
ＨＩＶ−１感染に対する薬学的組成物の製造のためのｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１（ＥＣＡＣＣ登録番号０１１１０６６５）の使用。
【請求項５】
ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２の一方又は両方による中和に対して非感受性のＨＩＶ−１株による哺乳動物細胞の感染の阻害又は防止のための、請求項４記載の使用。
【請求項６】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１の４Ｅ１０結合パラトープと反応性であり、好ましくはＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７（ＮＷＦＤＩＴ）と同一であるか又はそれに相当するアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片を模倣するペプチド、特に抗イディオタイプ抗体の誘発又はスクリーニングのための、ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１（ＥＣＡＣＣ登録番号０１１１０６６５）の使用。
【請求項７】
好ましくはＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７（ＮＷＦＤＩＴ）と同一であるか又はそれに相当するアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片を模倣する、ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１の結合パラトープと反応性の抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
前記断片が、前記アミノ酸配列の片側又は両側に、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に見られるものと同一の組成及び同一の順序で存在する１個以上の隣接アミノ酸を含む、請求項７記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項９】
哺乳動物レシピエントにおいてＨＩＶ−１中和免疫応答を誘導する、請求項７又は８記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の抗イディオタイプ抗体少なくとも１個と適当な担体とを含むことを特徴とする、ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物レシピエントの能動免疫のためのワクチン。
【請求項１１】
好ましくは、ｍＡｂ  ２Ｆ５（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０４）及びｍＡｂ  ２Ｇ１２（ＥＣＡＣＣ登録番号９３０９１５１７）からなる群より選択される他のＨＩＶ−１中和抗体少なくとも１個と組み合わせられた、請求項１又は２に定義されたＨＩＶ−１中和抗体少なくとも１個を含むことを特徴とする、ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物レシピエントの受動免疫のための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、応用微生物学及びワクチン開発の領域にあり、ＨＩＶ−１のｇｐ４１上のクリプティックエピトープ（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ）、及びこのクリプティックエピトープ又はその必須部分を模倣する合成ペプチド、及び哺乳動物宿主においてＨＩＶ−１中和抗体を誘発するためのこれらのペプチドの適用に関する。本発明は、さらに、これらのペプチドのいずれかにより誘発されたＨＩＶ−１中和抗体、及び前記ＨＩＶ−１中和抗体の作用の阻害又は防止に有効な抗イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的抗体の存在は、多数のヒトウイルス性疾患に対する防護において重要な役割を果たしていることが示されている。しかしながら、ＨＩＶ感染における体液性免疫応答の役割には、未だ議論の余地がある。
【０００３】
中和抗体力価がしばしば低い、急速に疾患が進行している者とは対照的に、長期にわたり進行しない者において見出されるような広い中和免疫応答の発達は、疾患進行を遅延させることが示されている。他の研究は、高い中和抗体力価を有する母親は、新生児にウイルスを伝達する可能性が低いことを示唆している。中和抗体の存在と疾患の顕在化との間には一般的に相関が観察される。さらに、ＨＩＶ特異的抗体応答の減衰は、しばしば不幸な診断を予測する。
【０００４】
ＨＩＶ−１感染における抗体の役割を研究するため、多数の動物及びヒトにおける試験が実施された。チンパンジー及びマカーク（ｍａｃａｑｕｅｓ）にＨＩＶ−１特異的中和抗体を注入した後、ＨＩＶ又はキメラサル／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）を静脈内又は粘膜へチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）することにより、感染又は疾患進行が防止された。ＨＩＶ−１に対するモノクローナル又はポリクローナルの抗体調製物による受動免疫の陽性効果も、ヒト有志者における多くの試験において観察された。
【０００５】
例えば、２個のヒトモノクローナル抗体２Ｆ５（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０４）及び２Ｇ１２（ＥＣＡＣＣ登録番号９３０９１５１７）は、第一相臨床試験において有益な効果を示した。ＨＩＶ陽性患者への両抗体の反復注入は、ウイルス負荷及び感染末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）の減少をもたらし、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の増加及び補体活性化をもたらした。
【０００６】
現在のところ、保存されたエピトープを認識する、高い治療的可能性を有していることが既知のモノクローナル抗体の数は少ない（スザ（Ｄ’Ｓｏｕｚａ）ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９７；１７５：１０５６−１０６２）。３個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）２Ｆ５、２Ｇ１２（ブチャチャー（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ）ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９４；１０：３５９−３６９）及びＩｇＧ１ｂ１２（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：１０２４−１０２７）のみが、有意なクロスクレード（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）抗ウイルス活性を示すことが報告されている。
【０００７】
ＨＩＶ−１エンベロープ上の保存された中和Ｂ細胞エピトープに対するモノクローナル抗体の同定は、受動免疫戦略（ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）にとって価値があり得るだけでなく、広い体液性免疫応答の誘導に基づくワクチン設計のための重要な情報も与える。Ｔ細胞エピトープに排他的に基づくワクチンは、ＨＩＶ−１感染に対する防御にとっておそらく充分ではないであろうことが示されている（パレン（Ｐａｒｒｅｎ）ら、ＡＩＤＳ  １９９９；１３（ｓｕｐｐｌ  Ａ）：Ｓ１３７−Ｓ１６２）。
【０００８】
数年前、本発明者らは、ＨＩＶ−１陽性ドナーに由来するヒト末梢血リンパ球の不死化により、３３個のＨＩＶ−１に対するヒトモノクローナル抗体のパネル（ｐａｎｅｌ）を確立した。このパネルのうち、２個のモノクローナル抗体（２Ｆ５、２Ｇ１２）が、ＨＩＶ−１の実験用単離物及び初代（ｐｒｉｍａｒｙ）単離物の強力な阻害剤であることが同定された。ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２は、さらに開発され、間もなく、最も強力な中和抗体のうちの二つであることが認識された。
【０００９】
当初はＩｇＧ３抗体であったモノクローナル抗体４Ｅ１０（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０３）は、抗体血清学プロジェクト（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＡＳＰ）の評価プログラムに含まれ、いくつかの実験用株を中和することが示された（スザ（Ｄ’Ｓｏｕｚａ）ら、ＡＩＤＳ  １９９４；８：１６９−１８１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０は、本発明において、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎｓ）の定常領域が組換えｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２のものと同一であるＩｇＧ１クラス抗体として、連続ＣＨＯ細胞系においてクローニングされた。驚くべきことに、ＩｇＧ３からＩｇＧ１へのこのクラススイッチの後、ｍＡｂ  ４Ｅ１０は、増加した中和効力を示した。さらに、予想に反して、ＩｇＧ３バージョンではなくＩｇＧ１バージョンのｍＡｂ  ４Ｅ１０は、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２による第一相臨床試験に参加したＨＩＶ−１陽性個体に由来する初代単離物全てを中和した唯一の抗体であった。また、それは、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２の一方又は両方による中和に対して非感受性であった初代ＨＩＶ−１単離物を中和した。
【００１１】
従って、従来既知であったクラスＩｇＧ３のｍＡｂ  ４Ｅ１０（ＥＣＡＣＣ登録番号９００９１７０３）と比較して有意に増加したＨＩＶ−１中和活性を有し、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２の一方又は両方による中和に対して非感受性の初代ＨＩＶ−１単離物を中和する、改良されたクラスＩｇＧ１の４Ｅ１０抗体を提供することが、本発明の目的である。診断及び治療の目的のための、そしてＩｇＧ１クラスのｍＡｂ  ４Ｅ１０のＨＩＶ−１中和作用を阻害又は防止することができる抗イディオタイプ抗体の誘発又はスクリーニングのための、改良されたＩｇＧ１クラスｍＡｂ  ４Ｅ１０（以後、４Ｅ１０−ＩｇＧ１と呼ぶ）の使用の方法を提供することが、本発明のもう一つの目的である。ｇｐ４１上の４Ｅ１０エピトープの必須部分を少なくとも模倣するそのような抗イディオタイプ抗体を提供すること、そしてこれらの抗イディオタイプ抗体のうちの１個又は複数個を含有している産物（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、特に抗ＨＩＶ−１ワクチン、及びにそれらの使用を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１２】
「４Ｅ１０」という用語は、本明細書において以下使用されるように、特記しない限り、ヒトモノクローナル抗体４Ｅ１０のＩｇＧ３バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）及びＩｇＧ１バリアントの両方をさす。しかしながら、実施例及び対応する図面においては、そこに開示された実験は４Ｅ１０のＩｇＧ１バリアントを使用して実施されたため、「４Ｅ１０」という用語は、典型的にはＩｇＧ１バリアントをさす。「４Ｅ１０−ＩｇＧ３」という用語は既知の４Ｅ１０のＩｇＧ３バリアントを、「４Ｅ１０−ＩｇＧ１」という用語は４Ｅ１０のＩｇＧ１バリアントを排他的にさすものとする。ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３は、登録番号９００９１７０３の下でＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生され、４Ｅ１０−ＩｇＧ１は、（ＥＣＡＣＣ登録番号０１１１０６６５としてブダペスト条約に基づき寄託された）ＣＨＯ細胞系により発現される。両バリアントは、ＨＩＶ−１のｇｐ４１上の同一エピトープを認識する。しかしながら、それらはＨＩＶ−１中和能が著しく異なっている。
【００１３】
さらに、ｍＡｂ  ４Ｅ１０が、２Ｆ５エピトープのＣ末端側の位置にあるｇｐ４１上のこれまで未知であったエピトープを認識することが、本明細書に開示される。異なるクレードのＴ細胞系馴化（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｄａｐｔｅｄ）（ＴＣＬＡ）ＨＩＶ−１単離物及び初代ＨＩＶ−１単離物に対するｍＡｂ  ４Ｅ１０のスクリーニングは、この抗体の中和能が、少なくとも２Ｆ５及び２Ｇ１２と同程度に強力であり得ることを示している。他のよく特徴付けられた中和モノクローナル抗体と比較された、４Ｅ１０−ＩｇＧ１のインヴィトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）中和特性が、本明細書に記載される。
【００１４】
従って、ｍＡｂ  ４Ｅ１０により認識されるＨＩＶ−１のｇｐ４１上に位置する結合エピトープの必須部分を少なくとも模倣する合成ペプチドを提供することが、本発明のもう一つの目的である。ウイルス又はウイルスの一部、例えばウイルスタンパク質のような適当な免疫原性担体と組み合わせられた、又はそれらに共有結合的に連結された、そのような合成ペプチドを提供することが、本発明のさらなる目的である。また、前記合成ペプチドのうちの少なくとも１個、又は適当な免疫原性担体と組み合わせられた、もしくはそれらと連結された前記合成ペプチドのうちの少なくとも１個、又は４Ｅ１０に対して有効な少なくとも１個の抗イディオタイプ抗体、又は前記ペプチド及び／もしくは抗イディオタイプ抗体の任意の組み合わせを含有しているワクチンを提供することも、本発明の目的である。
【００１５】
また、場合によって、好ましくは２Ｆ５及び２Ｇ１２からなる群より選択される少なくとも１個の他の抗体との混合物として、適当な担体と組み合わせられたｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１を含む、薬学的組成物を提供することも、本発明の目的である。
【００１６】
ＨＩＶ−１のリスクが高い人々、又はＨＩＶ−１に感染した人々の予防的又は治療的な処置における、特に、エイズの防止又は治療のための、そのような薬学的組成物及びワクチンの使用を提供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
エイズ臨床試験グループ抗体選択ワーキンググループ（ＡＩＤＳ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）の評価プログラムにおいては、ｍＡｂ  ２Ｆ５、２Ｇ１２及びＩｇＧ１ｂ１２のみが、抗ＨＩＶ−１受動免疫療法のための有力な候補であることが同定された。本明細書に提示された本発明者らの最近の所見は、４Ｅ１０−ＩｇＧ１が、匹敵する抗ウイルス能を有する付加的な抗体であることを示している。
【００１８】
エピトープマッピング研究は、４Ｅ１０がｇｐ４１の外部ドメイン上のエピトープを認識することを明らかにした。４Ｅ１０は、ｇｐ１６０MNペプチド２０３０（ＱＴＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬ）とも、ＧＧＧＬＥＬＤＫＷＡＳＬペプチドとも結合しないため、アミノ酸ＬＤＫＷＡからなる２Ｆ５コアエピトープが、４Ｅ１０のｇｐ１６０MNペプチド２０３１（ＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ）との結合に本質的に寄与している可能性は低い。この領域に後続するアミノ酸が４Ｅ１０による認識を担っているという結論が、マッピング用のペプチドライブラリーを利用した付加的なエピトープマッピング研究により確認された。
【００１９】
その結果は、４Ｅ１０コアエピトープが、実際２Ｆ５エピトープのＣ末端側に位置しており、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＬＶ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７（ＮＷＦＤＩＴ）と同一であるか又はそれに相当する６アミノ酸（ａａ）の配列を少なくとも含むことを示した。
【００２０】
本文中、「相当する」という用語は、４Ｅ１０エピトープのアミノ酸配列が、明示されたＨＩＶ−１単離物のｇｐ４１のアミノ酸配列と同一であってもよいし、又は遺伝暗号の縮重により、もしくは異なるＨＩＶ−１単離物間のバリエーションにより、それらから逸脱していてもよいことを意味する。しかしながら、逸脱している配列は、ｍＡｂ  ４Ｅ１０により認識される結合モチーフ又はエピトープを依然として提示していなければならず、例えば、それらは、スクリーニングの道具として４Ｅ１０を使用することにより、ｇｐ４１断片を含有しているライブラリーから検出可能でなければならない。例えば、ＨＴＬＶ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７にある配列ＮＷＦＤＩＴは、単離物ＨＸＢ２のｇｐ４１の同一の位置に見られる配列ＮＷＦＮＩＴと等価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）又は相同（ｈｏｍｏｌｏｇ）である。等価又は相同な配列のさらなる例には、以下に制限はされないが、ＳＷＦＧＩＴ、ＴＷＦＧＩＴ、ＮＷＦＳＩＴが含まれる。
【００２１】
自然感染中にｇｐ４１により誘導される抗体の大多数が、ａａ５９８から６０４及び６４４から６６３（ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２による番号付け；スー（Ｘｕ）ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９１；６５：４８３２−４８３８）の近傍の残基に対するものである。これらの抗体は、ウイルスの複製を阻害せず、補体により媒介されるメカニズムによりウイルスの感染性を増強するものすらある。現在のところ、ｍＡｂ  ２Ｆ５が、強力なクロスクレード中和特性を示す唯一記載されている抗ｇｐ４１抗体であった。興味深いことに、２Ｆ５様の特異的抗体は、ＨＩＶ−１感染個体の血清中に稀にしか見出されない。ＨＩＶＩＧ（７０人を超えるＨＩＶ−１陽性供血者の血清をプールしたもの）は、有意なｇｐ１６０及び／又はｇｐ４１との２Ｆ５様の特異的結合を示さない。２Ｆ５が結合するｇｐ４１上の領域は、自然感染中、明らかにヒト免疫系に対してクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）である。
【００２２】
ｇｐ４１上のこの領域に対するもう１個の広域中和抗体ｍＡｂ  ４Ｅ１０（２Ｆ５コアエピトープのＣ末端側にマッピングされているエピトープ）に関する本明細書に記載された結果は、この領域が、ウイルスの感染性及び複製にとって不可欠であることを確証している。いずれの抗体も、感染細胞及び遊離ウイルスとは微弱にしか結合しないが、強力な中和活性を示すため、本発明者らは、ウイルス複製の阻害のための２Ｆ５及び４Ｅ１０の類似したメカニズムを提案する。さらに、ウイルスを２個のモノクローナル抗体のいずれかと共にプレインキュベートしても、４Ｅ１０又は２Ｆ５の抗ウイルス効率が改良されなかった、シンシチウム阻害アッセイ（ｓｙｎｃｉｔｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）から得られた結果は、この仮説を補強し得る。
【００２３】
従って、両ｍＡｂが、ＨＩＶ−１の高活性侵入阻止剤（中和剤）であるが、遊離ウイルス及びＨＩＶ−１感染細胞とは極微弱にしか結合しないという所見を考慮すると、ｇｐ４１上のこの融合性領域は、ＨＩＶ−１の宿主細胞との融合のイベントの間にのみ露出されるとの結論が下される。それは、一方では、自然感染におけるこれらの中和２Ｆ５エピトープ及び４Ｅ１０エピトープのクリプティック性の付加的な説明を与える。
【００２４】
他方で、これらの抗体の両方の組み合わせによる中和に対して非感受性のＨＩＶ−１単離物は、現在のところ全く見出されていない。これは、ｇｐ４１の外部ドメインのこの特定の領域が、適当な免疫原性担体上に適切に提示されれば、又は抗イディオタイプ抗体により模倣された場合、高度に有効な抗ＨＩＶ−１療法の可能性を保持していることの重要な指標であり、この領域は、ＨＩＶ−１に対する能動免疫のためのワクチンの製造のための有望な候補となる。
【００２５】
従って、一つの実施形態において、本発明は、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片であり、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列を含む、ＨＩＶ−１の標的細胞への侵入を妨害し、好ましくはＨＩＶ−１中和免疫応答を誘導するペプチド少なくとも１個を含む、ＨＩＶ−１感染に対する能動免疫のためのワクチンに関する。もう一つの実施形態において、本発明は、前記のペプチドのうちの少なくとも１個、及び／又はＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片を模倣する、ｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合パラトープと反応性の少なくとも１個の抗イディオタイプ抗体を含有しているワクチンに関する。ワクチンは、適当な、即ち薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【００２６】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０は、２Ｆ５又は２Ｇ１２を使用した場合に適用可能な濃度に匹敵する極めて低い濃度でも、ＨＩＶ−１のＴＣＬＡ株及び初代株のウイルス複製を阻害する。それは、その他のテストされたｍＡｂと比較した場合、類似したクロスクレード抗ウイルス活性を発揮する。２Ｆ５及び４Ｅ１０は近接したエピトープを認識するが、組み合わせてテストした場合、それらは相互に拮抗しない。４Ｅ１０は、最近実施されたｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２を利用した第一相臨床試験に参加した無症候性ＨＩＶ患者から得られたＨＩＶ−１単離物に対して、２Ｆ５及び２Ｇ１２の各々よりさらに有効であることが判明した。他方で、４Ｅ１０は、オーストリアの末期エイズ患者から過去に得られた単離物６個のうち１個のみを中和した。４Ｅ１０に対して比較的耐性の単離物（９２ＵＧ０２９）が、現在の初代単離物のパネルの中に、もう１個だけ存在した。これらの６個の耐性単離物（即ち、５個の過去に得られた耐性単離物及び１個の現在の単離物）が、宿主細胞侵入のための唯一の補助受容体としてＣＸＣＲ４を使用していることは、注目に値する。マクロファージ向性又は二重向性（ｄｕａｌｔｒｏｐｉｃ）の表現型を示した他の単離物は、全て、ｍＡｂ  ４Ｅ１０により容易に阻害された。対照的に、侵入のためにＣＸＣＲ４を使用する全てのＴＣＬＡウイルスが、低い４Ｅ１０濃度で阻害された。しかしながら、細胞系に基づくシンシチウムアッセイにおいて中和非感受性ＴＣＬＡ株により得られた結果は、初代ウイルスを用いたＰＢＭＣに基づくアッセイとは比較可能でないのかもしれない。
【００２７】
ＨＩＶ−１感染のための高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の開発は、少なくとも先進諸国においては、ＨＩＶ−１陽性個体の状況を劇的に改良した（カーペンター（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）ら、ＪＡＭＡ  ２０００；２８３：３８１−３９０）。にもかかわらず、重篤な副作用及びＨＡＡＲＴ耐性ウイルスの発生のため、付加的な標的部位に作用する新たな療法アプローチが緊急に必要とされている。現在は、モノクローナル抗体、抗体様分子及びペプチドを含む侵入阻害剤に焦点が当てられている。ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２は、既に、特に組み合わせ使用された場合、ＨＩＶ−１陽性有志者において顕著な抗ウイルス効率を示している。従って、本発明者らは、ｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合特徴を有する付加的なＨＩＶ−１中和抗体を提供する。
【００２８】
従って、本発明の一つの実施形態において、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７（ａａＮＷＦＤＩＴ）に相当するアミノ酸配列と結合する、公開されているヒトｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３以外のＨＩＶ−１中和モノクローナル抗体が提供される。好ましい実施形態において、この抗体は、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び／又はｍＡｂ  ２Ｇ１２による中和に対して非感受性のＨＩＶ−１変異体すら中和する。この型の中和抗体の一つの代表は、ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１、即ち既知のｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３のＩｇＧ１バリアントである。
【００２９】
ここで、ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３に関するいくつかの先行技術情報が、明らかに誤っていたことが指摘される。ブチャチャー（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ）ら（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０（４），１９９４，３５９−３６９）は、ｍＡｂ  ４Ｅ１０が、ｇｐ４１アミノ酸ａａ８２４から８３０位（ＨＩＶ−１株ＢＨ１０に関する番号付け）にあるＣ末端エピトープと結合することを証明する結果を公開した。
【００３０】
それらの実験を繰り返したところ、そのような所見は確認され得なかった。
【００３１】
また、そこに報告されたＭＨＣクラスＩＩタンパク質との交差反応も観察されなかった。アミノ酸ＥＧＴＤＲＶＩを含有している関連ペプチド２０４７及び２０４８との相互作用は、見出されなかった。
【００３２】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３を、有望な抗ＨＩＶ特性を有しない多くのさほど興味深くない抗体のうちの１個にすぎないとしている、そのような誤解を招きやすい先行技術の情報にも関わらず、本発明者らは、ＣＨＯ細胞における組換え発現によりＩｇＧ３からＩｇＧ１へ表現型を変化させた後、再度その抗体を比較阻害アッセイに供した。前述のように、ＩｇＧ１バリアントを用いた中和実験から得られた結果は、予想外に良好であり、有望であり、そして本発明者らの予想をはるかに越えていた。
【００３３】
ｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１は、２Ｆ５抗体及び２Ｇ１２抗体の一方又は両方の中和を回避したウイルスも中和することが示されたため、さらに、２Ｆ５と４Ｅ１０−ＩｇＧ１との組み合わせによる中和に対して非感受性のＨＩＶ−１単離物は見出され得なかったため、４Ｅ１０−ＩｇＧ１は、例えば受動免疫のための強大な道具になると考えられる。
【００３４】
従って、一つの実施形態において、本発明は、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列と結合するＨＩＶ−１中和モノクローナル抗体（最も好ましい抗体はｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１である）少なくとも１個を含む、哺乳動物細胞のＨＩＶ−１感染の阻害又は防止のための薬学的組成物に関する。もう一つの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１個の他の中和抗ＨＩＶ−１抗体と組み合わせられた、好ましくはｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２のうちの少なくとも１個と組み合わせられたｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１を含む。
【００３５】
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、ｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合パラトープと反応性であり、かつ４Ｅ１０エピトープ又はその必須部分（ｅｓｓｅｎｔｉｏａｌ  ｐａｒｔ）を模倣する、即ちＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片を模倣する抗イディオタイプ抗体の誘発又はスクリーニングのための、ｍＡｂ  ４Ｅ１０、場合によってはそのＩｇＧ１バリアントの使用に関する。
【００３６】
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列を含むＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片を模倣する、ｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合パラトープと反応性の抗イディオタイプ抗体に関する。有利には、抗イディオタイプ抗体は、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当する前記アミノ酸配列の片側又は両側に、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に見られるものと同一の組成及び同一の順序で存在する１個以上の隣接アミノ酸を含む断片を模倣する。
【００３７】
４Ｅ１０−ＩｇＧ１により免疫された哺乳動物宿主の血清をスクリーニングすることにより例えば入手され得る抗イディオタイプ抗体は、ＨＩＶ−１の標的細胞への侵入を、特にウイルス−細胞融合の段階で妨害することが好ましい。抗イディオタイプ抗体は、インヴィトロのみならず、哺乳動物レシピエントにおいてインヴィヴォ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも、ＨＩＶ−１中和免疫応答を誘導することも好ましい。
【００３８】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、従属クレームに記載されている。
【００３９】
本明細書に記載された本発明がより完全に理解され得るよう、以下に実施例が示される。この実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかなる点においても本発明を制限するものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００４０】
以下の材料及び方法が、後述の実施例１から７において使用された。
【００４１】
ａ）モノクローナル抗体
ヒトモノクローナル抗体４Ｅ１０、２Ｆ５、２Ｇ１２及び３Ｄ６の作製、産生、及び特徴決定は、以前に記載されている（スザ（Ｄ’Ｓｏｕｚａ）ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９７；１７５：１０５６−１０６２；クナート（Ｋｕｎｅｒｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０００；６７：９７−１０３）。簡単に説明すると、抗体産生ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）が、組み合わせポリエチレングリコール／電気融合法により作製された。無症候性ＨＩＶ−１陽性ドナーに由来するＰＢＭＣが、マウスヒトヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞系ＣＢ−Ｆ７と融合させられた。ハイブリドーマ上清が、ＨＩＶ特異的抗体産生に関してスクリーニングされ、陽性クローンが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット及び免疫蛍光アッセイによりさらに分析された。安全な大量製造を可能にするため、そして２Ｆ５及び４Ｅ１０のアイソタイプをＩｇＧ３からＩｇＧ１へ変化させるため、抗体は、ＩｇＧ１（κ）としてチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において組換え発現させられた。後述の実施例１から７に記載された当研究には、２Ｆ５抗体及び４Ｅ１０抗体の組換えＣＨＯ  ＩｇＧ１バージョンが使用された。
【００４２】
４Ｅ１０、２Ｆ５及び２Ｇ１２は、同一の定常領域を含有しており、当初のハイブリドーマクローンに由来する可変部分のみが異なっている。
【００４３】
２Ｇ１２はｇｐ１２０上のコンフォメーション感受性エピトープを認識し、ｍＡｂ  ２Ｆ５はｇｐ４１の外部ドメイン上のＥＬＤＫＷＡモチーフを認識し、そして４Ｅ１０はｇｐ４１上の異なるエピトープを認識する。３Ｄ６は、ｇｐ４１イムノドミナントループ内のエピトープ（アミノ酸ＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳ）を認識し、全てのシンシチウム阻害アッセイにおいて非中和対照として機能した。
【００４４】
ヒトｍＡｂ  ＩｇＧ１ｂ１２は、デニス・バートン博士（Ｄｒ．Ｄｅｎｎｉｓ  Ｂｕｒｔｏｎ）（Ｔｈｅ  Ｓｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から好意により提供された。その作製は、バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：１０２４−１０２７に記載されている。ＩｇＧ１ｂ１２は、ＣＤ４結合ドメインとオーバーラップしているエピトープを認識し、ＣＤ４／ｇｐ１２０相互作用を阻害することが示された。
【００４５】
ＨＩＶＩＧは、ＮＡＢＩ（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ）により調製され、複数のＨＩＶ−１陽性患者に由来する精製されたポリクローナルＨＩＶ−１特異的免疫グロブリンを含有していた。９８％の単量体ＩｇＧを含有している調製物が、ジョン・マスコラ博士（Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｍａｓｃｏｌａ）から好意により提供された。
【００４６】
ｂ）細胞
シンシチウム阻害アッセイ用のＡＡ−２細胞系は、ＮＩＨエイズ・リージェント・リファレンス・プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）から入手された（Ｍ．ハーシュフィールド（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ）により提供された）。細胞は、１０％熱不活化ＦＣＳ及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補足されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有している細胞培養培地（ＣＣＭ）において週１回２回継代された。
【００４７】
ウイルス中和アッセイ用のＰＢＭＣは、ＨＩＶ陰性有志者に由来する血液の４００*ｇでのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配遠心分離により得られた。
【００４８】
細胞は、使用前に２日間、２０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が補足されたＣＣＭにおいてフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）された。
【００４９】
ｃ）ウイルス
ＨＩＶ−１初代単離物９２ＢＲ０２１／０３０、９２ＲＷ００９／０２１、９２ＴＨ１４／２１／２４及び９２ＵＧ００１／０２９／０３７は、ＨＩＶの単離及び特徴決定のためのＷＨＯネットワーク（ＷＨＯ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）から得られ、ＭＲＣエイズ・リージェント・プロジェクト（ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）により提供された。
【００５０】
ウイルスＷＹＧ、ＷＲＦ、ＷＨＭ、ＷＲＢ及びＷＳＣは、オーストリアの末期エイズ患者より過去に単離された。Ｓ２／０２、Ｓ２／０３、Ｓ２／０４、Ｓ２／０５、Ｓ２／０６、Ｓ２／０８、Ｓ２／０９及びＰ６／７１と名付けられた単離物は、無症候性ＨＩＶ−１陽性有志者から、２Ｆ５及び２Ｇ１２による１９９９／２０００年の第一相臨床試験の間に単離された。ウイルスは、刺激されたＰＢＭＣ上で増殖させられ、無細胞上清としてテストされた。
【００５１】
ＴＣＬＡウイルスＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮ及びＨＴＬＶ−ＩＩＩＲＦは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）及びＮＩＨエイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リージェント・プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）により提供された感染Ｈ９細胞に由来し；ｃｌ８２はＥ．Ｍ．フェンヨー博士（Ｄｒ．Ｅ．Ｍ．Ｆｅｎｙo）より提供された。ストックは、ＡＡ−２細胞上で増殖させられ力価測定された。５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ５０）は、リード（Ｒｅｅｄ）及びミュンチ（Ｍｕｅｎｃｈ）（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ  Ｈ；ＡＭ  Ｊ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  １９３８；２７：４９３−４９７）の方法に従い計算された。
【００５２】
＜実施例１＞
ＥＬＩＳＡによるエピトープマッピング
４Ｅ１０エピトープのマッピングのため、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）により製造されたＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮの３４個のオーバーラップしているｇｐ４１ペプチド（ａａ５０１から８５６、表１）を、エイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リージェント・プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）より得た（番号２０１５から２０４９）。これらのペプチドの大部分が２０アミノ酸長であり、連続ペプチド間には１０アミノ酸のオーバーラップがあった。ペプチドＧＧＧＬＥＬＤＫＷＡＳＬは研究室内（ｉｎ−ｈａｕｓｅ）で合成された。
【００５３】
短縮型大腸菌組換えｇｐ４１ＭＮペプチドは、ＮＩＢＳＣセントラライズド・ファシリティ・フォー・エイズ・リージェント（Ｃｅｎｔｒａｌｉｓｅｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）を通してＪ．レイナ博士（Ｄｒ．Ｊ．Ｒａｉｎａ）より提供された。ワクシニア組換えｇｐ１６０ＩＩＩＢは、イムノ（Ｉｍｍｕｎｏ）−ＡＧ（Ａｕｓｔｒｉａ）からの寄贈であった。
【００５４】
マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の１μｇ／ｍＬという一定濃度又は１０μｇ／ｍＬから出発した段階希釈の合成ペプチドｇｐ４１ＭＮ又はｇｐ１６０ＩＩＩＢにより＋４℃で一夜コーティングした。プレートを、０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有しているＰＢＳで洗浄し、３７℃で２時間２％スキムミルクでブロッキング（ｂｌｏｃｋ）した。洗浄後、４Ｅ１０又は２Ｆ５の段階希釈物（５００ｎｇ／ｍＬから出発）又は一定濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）を、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＲＴで１時間西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇ）と共にインキュベートした。プレートを洗浄し、０．０３％Ｈ２０２を含有している１，２−ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）染色溶液により現像した。
【００５５】
２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた後、光学密度（ＯＤ）を４９２／６２０ｎｍで測定した。
【００５６】
競合研究については、オーバーラップしているｇｐ４１ＭＮペプチド全て、ＧＧＧＬＥＬＤＫＷＡＳＬ及びｇｐ４１ＭＮをテストした。一定濃度の４Ｅ１０（２５０ｎｇ／ｍＬ）を、３７℃で２時間、ペプチドの段階希釈物（合成ペプチドについては５０μｇ／ｍＬ、ｇｐ４１については５μｇ／ｍＬから出発）と共にプレインキュベートした後、ペプチド２０３１又はｇｐ４１（１μｇ／ｍＬ）でコーティングされたプレートへ添加した。
【００５７】
共焦点顕微鏡検査及びフローサイトメトリーによる免疫蛍光分析
共焦点顕微鏡検査については、初代ＨＩＶ−１ウイルス（Ｓ２／０２、Ｓ２／０４、Ｓ２／０８）を感染させたＰＢＭＣを、３７℃で１時間、スライド（Ｂｉｏｒａｄ、Ｍuｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に付着させた。同一ドナーの未刺激の未感染ＰＢＭＣ及び分裂促進因子により刺激された未感染ＰＢＭＣを、陰性対照とした。スライドをＰＢＳで洗浄し、２０分間ＰＢＳ中の５％スキムミルクによりブロッキングした。抗体４Ｅ１０、２Ｆ５、２Ｇ１２及びＨＩＶＩＧを、１００μｇ／ｍＬの濃度で適用し、＋４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／スキムミルクで洗浄し、ＦＩＴＣ標識ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳによる徹底的な洗浄の後、細胞を２０分間パラホルムアルデヒド（３％）で固定し、続いてＰＢＳで洗浄した。蛍光シグナルを、バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）ＭＲＣ６００共焦点顕微鏡で可視化した。
【００５８】
別法として、ＰＢＭＣの染色の前にパラホルムアルデヒド固定を行い、インキュベーション工程を３７℃で行う、同一の実験を実施した。
【００５９】
フローサイトメトリー分析については、ＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣ（単離物Ｓ２／０２、Ｓ２／０４）、ＰＨＡ−Ｐにより刺激された未感染細胞及び未刺激の未感染細胞を、洗浄し、＋４℃で３０分間１０％ＦＣＳを含有しているＰＢＳによりブロッキングした。ＰＢＭＣを、氷上で１時間、４Ｅ１０、２Ｆ５及びＨＩＶＩＧ（１００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＰＢＳ／ＦＣＳによる洗浄の後、細胞を、再び氷上で１時間、ポリクローナルＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇ）と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で１時間３％パラホルムアルデヒドで固定した後、ファックス・バンテージ（ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。
【００６０】
シンシチウム阻害アッセイ
シンシチウム阻害は、以前に記載されたように（パーチャー（Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ）ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９４；１０：１６５１−１６５８）、読み取りとしてシンシチウム形成を用いて、指標細胞系としてＡＡ−２細胞を使用して査定した。簡単に説明すると、ＣＣＭ（５μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有しているポリブレン中の抗体の段階希釈物を、３７℃で１時間１０２から１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬのウイルスと共にプレインキュベートした後、ＡＡ−２細胞を添加した。細胞を５日間インキュベートした後、シンシチウム形成を評価した。実験は、１希釈段階につき４から８個のレプリケート（ｒｅｐｌｏｃａｔｅｓ）を用いて実施した。１ウェル当たり少なくとも１個のシンシチウムの存在を、ＨＩＶ−１感染の指標と見なした。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、リード（Ｒｅｅｄ）及びミュンチ（Ｍｕｅｎｃｈ）、ＡＭ  Ｊ  Ｈｙｇｉｅｎｅ  １９３８；２７：４９３−４９７の方法に従い計算した。実験は、２Ｆ５、２Ｇ１２及び４Ｅ１０を用いて実施した。
【００６１】
全てのアッセイに、感染力価を確認するための接種物のウイルス力価決定を含めた。別の実験においては、抗体及びウイルスのプレインキュベーション工程を省略した。
【００６２】
中和アッセイ
ｈｕ−ｍＡｂ  ４Ｅ１０（＝４Ｅ１０−ＩｇＧ１）、２Ｆ５（２Ｆ５−ＩｇＧ１）、２Ｇ１２及びＩｇＧ１ｂ１２の中和活性を、以前に記載されたようにして（パーチャー（Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ）ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９４；１０：１６５１−１６５８）、ＰＢＭＣに基づく中和アッセイにおいて決定した。抗体の段階希釈物を、３７℃で１時間ウイルスと共にプレインキュベートした後、ＰＢＭＣを添加し、さらに７日間インキュベートした。実験は１希釈段階につき４個のレプリケートを用いて実施した。アッセイ終了時に、高感度ｐ２４−ＥＬＩＳＡ（ステインドル（Ｓｔｅｉｎｄｌ）ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９８；２１７：１４３−１５１）により、ウイルス増殖を測定した。対照培養物におけるｐ２４抗原産生に対するｍＡｂ含有培養物におけるｐ２４抗原産生の比率を、インプットｐ２４を考慮に入れて計算し、５０％の阻害を引き起こすｍＡｂ濃度（μｇ／ｍＬ）を線形回帰分析により決定した。各アッセイには、実際のＴＣＩＤ５０を決定するためのウイルス力価決定を含めた。ウイルス力価が１０２から１０３ＴＣＩＤ５０の間にある場合にテストを妥当と見なし、最大の複製はインプットｐ２４より少なくとも５倍高いｐ２４濃度をもたらした。
【００６３】
ｍＡｂ組み合わせの相乗作用の決定
組み合わせられたｍＡｂの相乗中和効果の計算は、チョウ−タラレイ（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ）（チョウ（Ｃｈｏｕ）ＴＣ及びタラレイ（Ｔａｌａｌａｙ）、Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ  １９８４：２２：２７−５５）の方法に従って決定した。簡単に説明すると、５０％の阻害を達成するために必要な単一ｍＡｂの量を、ｍＡｂの組み合わせを使用した場合に必要とされる濃度と比較した。組み合わせ指数（ＣＩ）を、方程式ＣＩ＝（Ｄ１）／（Ｄｘ）１＋（Ｄ２）／（Ｄｘ）２に基づき計算した。（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、５０％の中和を達成するために必要とされた単独のｍＡｂ１及びｍＡｂ２の濃度であり、（Ｄ１）及び（Ｄ２）は組み合わせて使用した場合のｍＡｂ１又はｍＡｂ２の用量である。ＣＩ＜１は相乗作用を示し、ＣＩ＝１は相加効果（ａｄｄｉｔｉｖｅ）を示し、ＣＩ＞１は拮抗（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ）を示す。
【００６４】
結果：
４Ｅ１０の結合領域を決定するため、ＥＬＩＳＡにより、三十四（３４）個のオーバーラップしているｇｐ４１ＭＮペプチドを、４Ｅ１０との反応性に関してテストした。最小２Ｆ５  ｇｐ４１−エピトープを含むペプチドＧＧＧＬＥＬＤＫＷＡＳＬを陰性対照として使用し、ｇｐ４１ＭＮ及びｇｐ１６０ＩＩＩＢを陽性対照とした。
【００６５】
両抗体が同一のエピトープを認識する可能性を探求するため、２Ｆ５を平行してテストした。４Ｅ１０は、ペプチド２０３１、ｇｐ１６０（図１及び表１）及びｇｐ４１と用量依存的に結合した。他のペプチドは、４Ｅ１０との有意な反応性を示さなかった。２Ｆ５は同一のペプチドと結合し、さらにペプチド２０３０（図１及び表１）及びＧＧＧＬＥＬＤＫＷＡＳＬペプチドと結合した（全部、ＥＬＤＫＷＡ配列を含有している）。
【００６６】
【表１】
2005502708.tif 000003
【００６７】
全ての合成ｇｐ４１ＭＮペプチド及びｇｐ４１を用いて実施された競合研究により、ペプチド２０３１及びｇｐ４１のみが４Ｅ１０と反応することが確認された（ｇｐ１６０はテストしていない）。一定量の４Ｅ１０のペプチド２０３１及びｇｐ４１の段階希釈物とのプレインキュベーションのみが、ｍＡｂ  ４Ｅ１０のｇｐ４１（図３（Ａ））又はペプチド２０３１（図３（Ｂ））との結合の用量依存的な阻害をもたらした。他のペプチドは、４Ｅ１０の結合を阻害することができなかった。
【００６８】
上記の結果より、本発明者らは、４Ｅ１０の最小結合エピトープ（コアエピトープ）が、ペプチド２０３１上に完全に存在し、２Ｆ５のＥＬＤＫＷＡＳエピトープの後に位置しており、ａａ配列ＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ（ｇｐ４１のａａ６７０から６８０位；ＴＣＬＡ単離物ＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮによる番号付け）内に存在するとの結論を下した。より小さなペプチドを使用したより詳細なマッピングによって、ａａ配列ＮＷＦＤＩＴ（ＨＴＬＶ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７）を含む６アミノ酸のコアエピトープが明らかとなった。しかしながら、このコアエピトープを合成ペプチドの形態で、好ましくは適当な免疫原性担体と組み合わせて、又はそれと連結させて免疫感作目的のために使用する場合には、この六量体アミノ酸配列の片側又は両側に隣接しているアミノ酸が、最良の中和効率を達成するのに有利であるかもしれない。
【００６９】
従って、ＨＩＶ−１のｇｐ４１の断片であり、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６７２から６７７に相当するアミノ酸配列を含む、ＨＩＶ−１の標的細胞への侵入を妨害し、好ましくはインヴィトロ及び哺乳動物宿主のインヴィヴォにおいてＨＩＶ−１中和免疫応答も誘導する、そのような合成ペプチドを提供することが、本発明の目的である。
【００７０】
一つの実施形態において、本発明の合成ペプチドは、そのアミノ酸配列の片側又は両側に、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に見られるものと同一の組成及び同一の順序で存在する１個以上の隣接アミノ酸を含む。本発明の合成ペプチドは、２３個以下のアミノ酸から構成されることが好ましい。また、１個以上の隣接アミノ酸が、ＴＣＬＡ単離物ＨＴＶＬ  ＩＩＩＭＮのｇｐ４１のａａ６５８から６８０（ＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ）に相当する位置においてＨＩＶ−１のｇｐ４１に見られるものと同一の組成及び同一の順序で存在することも好ましい。
【００７１】
４Ｅ１０のコアエピトープ及び拡張コアエピトープ、即ち、ＮＷＦＤＩＴ、ＳＷＦＧＩＴ、ＴＷＦＧＩＴ、ＮＷＦＳＩＴ、ＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ、ＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬ、ＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬからなる群より選択されるアミノ酸配列と同一であるか又は（相同性により）それらに相当するアミノ酸配列を含む合成ペプチドの両方のみならず、コアエピトープと拡張コアエピトープとの間のａａ配列を有する任意のペプチドも、抗ＨＩＶ−１ワクチンの製造のため、そしてｍＡｂ  ４Ｅ１０に対する抗イディオタイプ抗体の誘発及びスクリーニングのため、使用され得る。しかしながら、遺伝暗号の縮重による、又は異なるＨＩＶ−１単離物間のバリエーションによるこれらのａａ配列の小規模な改変も、前記のｍＡｂ  ４Ｅ１０のコアエピトープ及び拡張コアエピトープのペプチドの範囲内に包含されることが強調される。
【００７２】
さらに、もう一つの好ましい実施形態によると、本発明の合成ペプチドは、適当な免疫原性担体と組み合わせられる。それらは、例えばインフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルス赤血球凝集素のような、ウイルス又はウイルスタンパク質に共有結合的に連結されることが、特に好ましい。その他の担体、特にウイルスエンベロープタンパク質も、適当であり得る。
【００７３】
＜実施例２＞
４Ｅ１０結合特徴の免疫蛍光分析
以前に報告された（ブチャチャー（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ）ら、前記参照）、４Ｅ１０の、感染ＰＢＭＣの表面上に存在するＨＩＶ−１抗原との相互作用、及び可能性のあるＭＨＣクラスＩＩとの交差反応性を研究するため、本発明者らは、４Ｅ１０の、未刺激ＨＩＶ−１陰性ＰＢＭＣ、ＰＨＡ−Ｐにより刺激されたＨＩＶ−１陰性ＰＢＭＣ、及びＨＩＶ−１感染ＰＢＭＣとの結合研究を実施した。共焦点顕微鏡検査及びフローサイトメトリーを使用した間接免疫蛍光により、４Ｅ１０の結合を、２Ｆ５、２Ｇ１２及びＨＩＶＩＧの結合と比較した。
【００７４】
有意な結合は、感染細胞にのみ検出され、２Ｇ１２及びＨＩＶＩＧは強く結合し、４Ｅ１０及び２Ｆ５は弱い反応性のみを示した（示されないデータ）。また、４Ｅ１０が、２Ｆ５、２Ｇ１２及びＨＩＶＩＧより強く未感染ＰＢＭＣと結合することはなかった。３７℃で染色された予め固定された細胞と比較して、＋４℃で染色された未固定細胞に関して得られた結果には差が観察されなかった。
【００７５】
＜実施例３＞
Ｔ細胞系馴化（ＴＣＬＡ）ＨＩＶ−１株によるシンシチウム阻害アッセイ
ＡＡ−２細胞におけるＴＣＬＡ単離物ＨＴＬＶＩＩＩＢ、ＨＴＬＶＩＩＩＲＦ、ＨＴＬＶＩＩＩＭＮ及びｃｌ８２によるシンシチウム形成を阻害するヒトモノクローナル抗体４Ｅ１０（＝４Ｅ１０−ＩｇＧ１）の能力を、ｍＡｂ  ２Ｆ５及び２Ｇ１２の対応する能力と比較した。ＭＡｂ  ２Ｇ１２は、Ｖ１ループ、Ｖ２ループ及びＶ３ループ又はＣＤ４結合部位に無関係なｇｐ１２０上のコンフォメーション感受性グリコシル化依存性のエピトープを認識する（トルコラ（Ｔｒｋｏｌａ）ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９６；７０：１１００−１１０８）。４Ｅ１０及び２Ｆ５は、４個のウイルス全てのシンシチウム形成を阻害したが、２Ｇ１２はＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮを中和しなかった（表２）。
【００７６】
【表２】
2005502708.tif 000004
【００７７】
ｇｐ４１のイムノドミナントループ内のエピトープを認識するｍＡｂである３Ｄ６（ブチャチャー（Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ）ら、前記参照）は、非中和対照として機能し、シンシチウム形成を阻害することができなかった。４Ｅ１０の５０％阻害濃度は、ＭＮ株に対する０．３μｇ／ｍＬからＲＦ株に対する１２．５μｇ／ｍＬまでの範囲であった。２Ｆ５及び２Ｇ１２は、２Ｇ１２がＨＴＬＶ−ＩＩＩＭＮウイルスを中和しなかったことを除き、ほぼ同等に低い濃度でＴＣＬＡ株を中和した。
【００７８】
４Ｅ１０は、ＨＴＬＶＩＩＩＭＮに対する最も強力なｍＡｂであり、２Ｆ５はＨＴＬＶＩＩＩＢ及びｃｌ８２に対する最も強力なｍＡｂであり（０．３μｇ／ｍＬ）、２Ｇ１２は他の２個のｍＡｂより低い濃度（２．４μｇ／ｍＬ）でＨＴＬＶＩＩＩＲＦを中和した。
【００７９】
＜実施例４＞
ウイルスとｍＡｂとのプレインキュベーションのシンシチウム阻害に対する影響
標的細胞へ添加する前にウイルスを抗体と共にプレインキュベートした場合の影響を決定するため、別法としてプレインキュベーション工程なしのアッセイを実施した。ウイルス（ＨＴＬＶＩＩＩＲＦ）及びｍＡｂ（４Ｅ１０、２Ｆ５、２Ｇ１２）を、同時にＡＡ−２細胞に添加した。４Ｅ１０（−ＩｇＧ１）及び２Ｆ５（−ＩｇＧ１）については、プレインキュベーションを行った場合と行わなかった場合とで結果は異ならなかったが、２Ｇ１２については、１時間のプレインキュベーション工程の後に３００％という劇的な増加が観察された。
【００８０】
＜実施例５＞
初代ＨＩＶ−１単離物の中和
次に、ＰＢＭＣに基づく中和アッセイにおいて、異なるクレードの初代単離物のパネルに対するｍＡｂ  ４Ｅ１０（−ＩｇＧ１）の中和活性を、２Ｆ５、２Ｇ１２、ＩｇＧ１ｂ１２の対応する活性と比較した。
【００８１】
ＩｇＧ１ｂ１２は、ｇｐ１２０上のＣＤ４結合ドメインとオーバーラップしている不連続のエピトープと結合する（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：１０２４−１０２７を参照のこと）。５０％の中和が達成されたｍＡｂ濃度が、表３に示される（２回の独立の実験から得られた値）。
【００８２】
【表３】
2005502708.tif 000005
【００８３】
４Ｅ１０は、５０μｇ／ｍＬ未満の濃度で、テストされた単離物２２個中１８個を中和し、２Ｆ５は２２個中２０個、２Ｇ１２は２２個中１３個、ＩｇＧ１ｂ１２は６個中５個を中和した。例えば、４Ｅ１０は、単離物Ｓ２／０５に対して２Ｇ１２と同等の活性を有し、２Ｆ５及びＩｇＧ１ｂ１２より高活性であった（図２）。中和されたウイルスに関してウイルスの複製の５０％の阻害を達成するのに必要な平均濃度は、５．７μｇ／ｍＬ（４Ｅ１０）、２．６μｇ／ｍＬ（２Ｆ５）、０．７μｇ／ｍＬ（２Ｇ１２）及び１２．４μｇ／ｍＬ（ＩｇＧ１ｂ１２）であった。４個の抗体全てに耐性のウイルスは存在しなかった。さらに、各ウイルスは、抗ｇｐ４１抗体４Ｅ１０又は２Ｆ５のうちの少なくとも１個により中和され、２２個中１６個の単離物が両方のｍＡｂにより中和され、２２個中２個が４Ｅ１０のみにより、２２個中４個が２Ｆ５のみにより中和された。
【００８４】
＜実施例６＞
ハイブリドーマｍＡｂ  ４Ｅ１０−ｌｇＧ３及びＣＨＯ組換えｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ１の中和活性の比較
ＰＢＭＣに基づく中和アッセイを、初代ＨＩＶ−１単離物を用いて実施した（実施例５を参照のこと）。
【００８５】
【表４】
2005502708.tif 000006
【００８６】
結果は、印象的に、既知のｍＡｂ  ４Ｅ１０−ＩｇＧ３と比べたｍＡｂ  ４Ｅ１０−ｌｇＧ１の中和効率の顕著な増加を証明している。
【００８７】
＜実施例７＞
ｍＡｂ  ４Ｅ１０及び２Ｆ５の組み合わせ適用
４Ｅ１０及び２Ｆ５は近接したエピトープを認識するため、初代ウイルスの中和における２Ｆ５及び４Ｅ１０の可能性のある阻害性相互作用を、２Ｆ５抗体又は４Ｅ１０抗体のいずれかを含有している調製物を、２個の抗体の組み合わせ（１：１比率）を含有している調製物と比較することにより、５個の異なる初代ウイルス（Ｓ２／０２、Ｓ２／０３、Ｓ２／０４、Ｓ２／０６及びＳ２／０８）に関して研究した。２Ｆ５（−ＩｇＧ１）と４Ｅ１０（−ＩｇＧ１）との組み合わせは、全ての実験において、わずかに相乗的又は相加的な効果（ＣＩ≦１）をもたらし；いずれの実験においても、拮抗的な効果は検出されなかった。２Ｇ１２及びＩｇＧ１ｂ１２も含めた、初代単離物Ｐ６／７１を用いた付加的な実験の結果が、図４（Ａ）、図４（Ｂ）及び図４（Ｃ）に示されている。この実験に関する組み合わせ指数（ＣＩ５０）は、４Ｅ１０と２Ｆ５との組み合わせで０．６４、４Ｅ１０と２Ｇ１２との組み合わせで０．２３、４Ｅ１０とＩｇＧ１ｂ１２との組み合わせで０．８７であり、２Ｇ１２及びＩｇＧ１ｂ１２も、４Ｅ１０と拮抗せず、相乗的ではないにしても相加的な効果を示すことを示している。
【００８８】
【表５】
2005502708.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】２Ｆ５及び４Ｅ１０のペプチド２０３０、２０３１及びｇｐ１６０IIIBとの結合。ペプチドの二倍段階希釈物を、ＥＬＩＳＡプレートに一夜コーティングした後、一定量の４Ｅ１０又は２Ｆ５（１００ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）により検出した。
【図２】２Ｆ５、２Ｇ１２、４Ｅ１０及びＩｇＧ１ｂ１２による初代単離物Ｓ２／０５の中和。アッセイは、複製マーカーとしてｐ２４産生を使用してＰＢＭＣで実施した。ｍＡｂを含まない培養物におけるｐ２４の量は、１９５ｎｇ／ｍＬであった。
【図３】ｍＡｂ  ４Ｅ１０をｇｐ４１又はペプチド２０３１と共にプレインキュベートした後の、（図３（Ａ））ｇｐ４１又は（図３（Ｂ））ペプチド２０３１が予めコーティングされたＥＬＩＳＡプレートとのｍＡｂ  ４Ｅ１０の結合の阻害。ペプチドｇｐ４１又は２０３１の二倍段階希釈物を、一定量の４Ｅ１０（２５０ｎｇ／ｍＬ）と共にプレインキュベートした後、ｇｐ４１又はペプチド２０３１がコーティングされたプレートへ添加した。抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）により検出した。
【図４】４Ｅ１０、２Ｆ５（図４（Ａ））、２Ｇ１２（図４（Ｂ））、ＩｇＧ１ｂ１２（図４（Ｃ））及び二重組み合わせ（１：１）による初代単離物Ｐ６／７１の中和。５０％中和における組み合わせ指数（ＣＩ50）が示されている。アッセイは、複製マーカーとしてｐ２４産生を使用してＰＢＭＣで実施された。ｍＡｂを含まない培養物におけるｐ２４の量は、９６ｎｇ／ｍＬであった。相乗作用は、ＣＩ＜１を相乗作用の指標とするチョウ−タラレイ（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ）の方法により決定した。
【図１】
2005502708.tif 000008
【図２】
2005502708.tif 000009
【図３】
2005502708.tif 000010
【図４】
2005502708.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2005502708.tif 000012
2005502708.tif 000013
2005502708.tif 000014
2005502708.tif 000015
2005502708.tif 000016
2005502708.tif 000017
2005502708.tif 000018
2005502708.tif 000019
2005502708.tif 000020
2005502708.tif 000021
2005502708.tif 000022
2005502708.tif 000023
2005502708.tif 000024
2005502708.tif 000025
2005502708.tif 000026
2005502708.tif 000027
2005502708.tif 000028
2005502708.tif 000029
2005502708.tif 000030
2005502708.tif 000031
2005502708.tif 000032
2005502708.tif 000033
2005502708.tif 000034
2005502708.tif 000035
2005502708.tif 000036
2005502708.tif 000037
2005502708.tif 000038
2005502708.tif 000039
2005502708.tif 000040
2005502708.tif 000041
2005502708.tif 000042
2005502708.tif 000043
2005502708.tif 000044
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502708.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502708.tif 000046
2005502708.tif 000047
【国際調査報告】
2005502708.tif 000048
2005502708.tif 000049
2005502708.tif 000050
2005502708.tif 000051