(57)【要約】直接基板（１１５）上において生化学反応を実行する装置および方法が提供される。基板アセンブリ（１１０）は、着脱可能に固定位置に基板（１１５）を支持するカートリッジ（１３０）、および、着脱可能に基板上面に配置される反応封入部材（１２０）を備える。反応封入部材（１２０）は、基板表面における１個以上の標的部位の直上にチャンバーを形成する１個以上の凹部を備える。これらのチャンバーは、基板（１１５）の直上で生化学反応を実行するのに使用されると共に、チャンバーに含まれる物質のサーマルサイクルを、基板に直接配される加熱要素を用いて実行するのにも使用される。基板アセンブリ（１１０）は、好ましくは、物質をチャンバーに滴下し、チャンバーに含まれる物質の生化学反応を実行しながらも、その処理の間、基板アセンブリの、ある位置から別の位置への移動を要しない処理機と組み合わせて使用される。
2005532043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル物質を含むのに好適な少なくとも１個の標的部位を有する基板を保持するアセンブリであって、該アセンブリは、
該基板を固定位置に支持することが可能な少なくとも１個の取付部位を有するカートリッジ基盤と、
該基板の上部に着脱可能に配置される反応封入部材であって、該反応封入部材の底面は、該基板の上面と接触配置するようになっている該反応封入部材とを備え、該反応封入部材が該基板の上面に接触配置されると、該反応封入部材と該基板は共同して、該基板上の少なくとも１個の標的部位の上に位置する少なくとも１個のチャンバーを形成し、それによって該チャンバー内で化学反応が起こるのを可能にする、アセンブリ。
【請求項２】
カートリッジカバーをさらに備える、請求項１に記載のアセンブリであって、前記カートリッジ基盤に着脱可能に嵌合して、該カートリッジ基盤と該カートリッジカバーの間の固定位置に基板を固定し、かつ、該基板上面の固定位置に該反応封入部材を固定する、アセンブリ。
【請求項３】
前記取付部位は、前記基板の下面を該基板の一辺に沿って支持する棚を備える、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項４】
前記棚は、前記基板の表面領域の１０％以下と接触するような大きさになっている、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項５】
前記カートリッジ基盤は、該カートリッジ基盤を貫いて延びる開口部を有し、そのために、前記基板が固定位置にある場合、該基板は該開口部の上に配置され、該基板の底面が、該開口部を通じて少なくとも一部露出する、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項６】
前記反応封入部材は、該反応封入部材の底面に少なくとも１本のチャネルを含み、該チャネルと前記基板の上面が共同して前記チャンバーを形成する、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項７】
前記チャネルは細長く、前記反応封入部材が前記基板上面に接触配置された場合、該基板上面の、１列の標的部位の上に位置する、請求項６に記載のアセンブリ。
【請求項８】
前記反応封入部材は、前記細長いチャネルの第１末端と連絡する流入口、および、該細長いチャネルの第２末端と連絡する流出口を備える、請求項７に記載のアセンブリ。
【請求項９】
前記反応封入部材は複数の細長いチャネルを備え、該反応封入部材が、前記基板の上面に接触配置された場合、該チャネルの各々は、該基板上面の１列の標的部位の上に位置する、請求項７に記載のアセンブリ。
【請求項１０】
前記チャンバーは、前記反応封入部材中のウェルによって形成され、該ウェルは、該反応封入部材の上面に開口を形成し、かつ、該反応封入部材の底面に開口を形成する、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項１１】
前記反応封入部材は複数のウェルを備え、請求項１０に記載のアセンブリ。
【請求項１２】
前記反応封入部材を取り付けることができる反応封入部材背面プレートをさらに備え、かつ、該反応封入部材背面プレートは前記カートリッジカバーに取り付けることができる、請求項２に記載のアセンブリ。
【請求項１３】
前記反応封入部材が前記カートリッジカバーに取り付けられた場合、前記反応封入部材背面プレートは、該カートリッジカバーに対して可動である、請求項１２に記載のアセンブリ。
【請求項１４】
前記カートリッジ基盤が前記カートリッジカバーと嵌合した場合、該カートリッジ基盤と該カートリッジカバーの間に配される、少なくとも１本の整列ピンをさらに備え、該整列ピンは、前記基板が固定位置にある場合、前記チャンバーが該基板の標的部位の上に位置するように、該カートリッジ基盤を該カートリッジカバーに対して位置づける、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項１５】
前記チャンバーは、前記基板が固定位置にある場合、該基板の上面の複数の標的部位の上に位置する、前記反応封入部材中の細長いフローチャネルによって形成され、該反応封入部材は、該フローチャネルに対する入口と、該フローチャネルに対する出口をさらに備える、請求項１に記載のアセンブリ。
【請求項１６】
サンプル物質を含むのに好適な少なくとも１個の標的部位を有する基板を保持するアセンブリであって、該アセンブリは、
該基板を固定位置に配置することが可能な、少なくとも１個の取付部位を有するカートリッジ；
該基板が固定位置にある場合、該基板と接触関係となるよう整列が可能な反応封入部材であって、該基板が、該基板に対して接触関係となるよう適正に整列された場合、該反応封入部材は、該基板上の少なくとも１個の標的部位の上にチャンバーを形成するチャネルを備える、反応封入部材；
該反応封入部材が取付けられる反応封入部材背面プレートであって、該反応封入部材背面プレートは該カートリッジに装着されると、該反応封入部材と該基板との接触関係を維持することが可能であり、かつ、該反応封入部材背面プレートは、該カートリッジに装着された場合、該カートリッジに対して移動が可能であり、それによって、該反応封入部材背面プレートが該カートリッジに装着された場合、該反応封入部材も移動して、該基板に対して整列されることを可能とする、反応封入部材背面プレート、
を備える、アセンブリ。
【請求項１７】
前記カートリッジは、カートリッジ基盤と、該カートリッジ基盤に着脱可能に嵌合するカートリッジカバーを備え、かつ、前記取付部位は、該カートリッジ基盤上にある、請求項１６に記載のアセンブリ。
【請求項１８】
前記反応封入部材背面プレートは前記カートリッジカバーに取付けられる、請求項１７に記載のアセンブリ。
【請求項１９】
前記チャネルは細長く、前記反応封入部材が前記基板上面に接触配置された場合、該基板上面の、１列の標的部位の上に位置する、請求項１６に記載のアセンブリ。
【請求項２０】
前記反応封入部材は、前記細長いチャネルの第１末端と連絡する流入口、および、該細長いチャネルの第２末端と連絡する流出口を備える、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２１】
前記反応封入部材は複数の細長いチャネルを含み、該反応封入部材が、前記基板の上面に接触配置された場合、該チャネルの各々は、該基板上面の１列の標的部位の上に位置する、請求項１９に記載のアセンブリ。
【請求項２２】
前記チャンバーを形成するチャネルは、前記反応封入部材の上面における開口と、該反応封入部材の底面における開口を形成するウェルを備える、請求項１６に記載のアセンブリ。
【請求項２３】
化学反応を実行する装置であって、
サンプル物質を受容するのに好適な底面と平坦な上面を有する基板であって、半導体材料から形成され、かつ該材料は、ガラスの熱伝導率よりも高い熱伝導率を持つ、基板；
該基板の平坦な上面に配される反応封入部材であって、該反応封入部材と該基板とは共同して、該平坦な上面に少なくとも１個のチャンバーを形成し、かつ、該反応封入部材は熱可塑性プラスチックから製造される、反応封入部材；
該基板底面のコーティングであって、電気的抵抗性材料で製造される、コーティング、
を備える、装置。
【請求項２４】
前記チャンバーは、前記反応封入部材中の細長いフローチャネルによって形成され、かつ、該反応封入部材は、該フローチャネルに対する入口と該フローチャネルに対する出口とをさらに備える、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記チャンバーは、前記反応封入部材において、該反応封入部材の上面における開口と、該反応封入部材の底面における開口を形成するウェルにより形成される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板材料が、約０．５Ｗ／ｍＫから４５０Ｗ／ｍＫの熱伝導率を有する、請求項２３に記載の装置。
【請求項２７】
基板の上に少なくとも１個のウェルを形成する反応封入部材であって、
上側と底側を持つ本体であって、該本体は、
該本体底側に少なくとも１本の細長いフローチャネルを形成する、少なくとも一つの内面であって、該細長いフローチャネルは、本体の底側にそって開放している、フローチャネル；
該本体の上側に上方開口、および、該本体の内面に下方開口を定める流入ポート；
該本体の上側に上方開口、および、該本体の内面に下方開口を定める流出ポート；
該本体内に配される、少なくとも１個の圧解除腔であって、該腔は、該細長いフローチャネルを形成する内面の一つにそって肉薄領域を定めるように内面に対して配置される、圧解除腔；を備え
該本体は、該基板の上に、該細長いチャネルが該基板上面の１列の標的部位の上に整列されるように置かれ、そのため、該基板の表面と該本体の内面とが共同して、該細長いフローチャネル内の該１列の標的部位を封鎖することを可能とする、
、反応封入部材。
【請求項２８】
前記本体は、それぞれが対応する流入ポートと対応する流出ポートを有する、複数のフローチャネルを含み、かつ、該本体は、該フローチャネルの各々が、前記基板上の、対応する１列の標的部位に整列されるように該基板上に配置が可能である、請求項２７に記載の反応封入部材。
【請求項２９】
前記本体は熱可塑性プラスチックから製造される、請求項２７に記載の反応封入部材。
【請求項３０】
生物学的物質のサンプルを含む少なくとも１個の標的部位を有する基板の上で化学反応を実行する方法であって、
（ａ）該基板の上面に反応封入部材を、該反応封入部材と該基板とが、該少なくとも１個の標的部位の直上に、共同してチャンバーを形成するように配置する工程；
（ｂ）流体を該チャンバーに投与して、該少なくとも１個の標的部位を該流体に露出する工程；
（ｃ）該流体を用いて該チャンバー内で化学反応を実行する工程；
（ｄ）該基板を加熱して、該チャンバー内の温度を上げる工程
を包含し、工程（ｂ）〜（ｃ）は、該基板が静止位置に留まる間に実行される、方法。
【請求項３１】
前記基板を、該基板を固定位置に保持するカートリッジに取付ける工程をさらに包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記基板の加熱は、
該基板上の抵抗性コーティングと、２個以上の電気的導体の間に第１組の接点を形成する工程であって、第１組の電気的導体の少なくとも１個は、第１抵抗器に対し直列に結合する、工程；
該基板上の抵抗性コーティングと、２個以上の電気的導体の間に第２組の接点を形成する工程であって、第２組の電気的導体の少なくとも１個は、第２抵抗器に対し直列に結合する、工程；
該第１組の電気的導体に第１電流を印加する工程であって、該電流が、第１組の電気接点から第２組の電気接点へ抵抗性コーティングを介して流れるようにする、工程；
を包含し、ここで、
該第１と第２抵抗器の抵抗値は相互に異なり、そのために、ある接点での電流は、別の電気接点に対して変動する、
請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記チャンバーは、前記反応封入部材内の前記フローチャネルによって形成され、該フローチャネルは入口と出口を持ち、かつ、入口と出口を、その入口と出口に中空ピンを挿入することによって封鎖する工程をさらに包含する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
標的生体分子の反応を実行する装置であって、
該標的生体分子を含む前記基板を取付けることが可能なワークステーション；
該ワークステーションに移動可能に結合された少なくとも１個の分注器であって、該基板が該ワークステーションに取付けられた場合、該分注器から材料が該標的生体分子に対して分注が可能な位置に移動される分注ピン；
該ワークステーションに結合されるサーマルサイクラーであって、該基板が該ワークステーションに取付けられた場合、該基板を加熱することが可能な少なくとも１個の加熱接点を備える、サーマルサイクラー；
を備える、装置。
【請求項３５】
前記基板は、基板アセンブリの一部として前記ワークステーションに取付けられ、該基板アセンブリは
該基板を固定位置に支持することが可能な少なくとも１個の取付部位を有するカートリッジ基盤；
該基板の上部に着脱可能に配置される前記反応封入部材を含み、該反応封入部材の底面は、該基板の上面と接触配置され、該反応封入部材が該基板上面に接触配置されると、該反応封入部材と該基板は共同して、該基板上の前記標的生体分子の上に配される少なくとも１個のチャンバーを形成し、それによって該チャンバー内で反応が起こるのを可能とする、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記分注器は、前記基板が前記ワークステーションに取付けられた場合、該基板に対して、３本の別々の軸に沿って移動することが可能である、請求項３４に記載の装置。
【請求項３７】
前記サーマルサイクラーは、前記基板が前記ワークステーションに取付けられた場合、該基板を冷却することが可能なクーラーをさらに備える、請求項３４に記載の装置。
【請求項３８】
前記クーラーは、前記基板が前記ワークステーションに取付けられた場合、該基板の底面に空気を吹き付けるファンを備える、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記サーマルサイクラーは、前記基板が前記ワークステーションに取付けられた場合、該基板の温度を感受する温度センサーをさらに備える、請求項３４に記載の装置。
【請求項４０】
標的生体分子の反応を実行する方法であって、
（ａ）基板表面の存在下に該標的生体分子について１種以上の反応を実行する工程であって、該反応は、実質的に溶液中で実行され、該基板は該溶液と接触する１個以上の標的検出部位を備える、工程；
（ｂ）該基板表面の標的検出部位において１種以上の反応生成物を捕捉する工程であって、該捕捉は、反応生成物と、該基板表面、または、該基板表面に付着する官能基との間の非共有的相互作用を介して達成される、工程；および
（ｃ）該標的検出部位において該反応生成物を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
標的核酸分子の中の一つのヌクレオチドの本体を確定する方法であって、
該標的核酸分子の１本鎖部分を、標的核酸の該１本鎖部分のある領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドに対し、前記基板上の不連続な検出部位において、溶液中で、かつ、捕捉官能基の存在下でハイブリダイズさせる工程；
前記ハイブリダイズした核酸とオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの伸長を可能とする条件に暴露する工程；
伸長反応の生成物を、該基板表面の該不連続な標的検出部位で捕捉する工程であって、該捕捉は、該反応生成物と、該基板表面、または、該基板表面に付着する官能基との間の非共有的相互作用を介して達成される、工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
捕捉が、イオン相互作用、ファンデルワールス力、または、水素結合を介して達成される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
捕捉が、反応生成物と、基板表面に付着した捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して達成される、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記捕捉された反応生成物を検出する工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記反応生成物は、質量分析によって検出される、請求項４０または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記基板の表面はチャンバーの内面を形成する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記生体分子は核酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸の少なくとも１種の反応は、核酸分子の少なくとも一部の増幅を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および、鎖変位増幅（ＳＤＡ）から成る群から選択される増幅手順によって増幅される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸の少なくとも１種の反応は、該核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記伸長プライマーは、前記基板表面に捕捉される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記伸長プライマーは、該伸長プライマーの、前記基板表面に固定化されたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを介して捕捉される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
ハイブリダイゼーションは、前記伸長プライマーのプライマー部分の付加領域のヌクレオチドと、固定化オリゴヌクレオチドの相補配列の間に起こり、該伸長プライマーのプライマー部分の該付加領域のヌクレオチドは、標的生体分子の中には見られない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プライマーは、選択的に切断可能な部位を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ｃ）に先立って、マトリックスが標的検出部位に堆積され、かつ、検出はＭＡＬＤＩ質量分析によって実行される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
検出に先立って、マトリックスが標的検出部位に堆積され、かつ、検出はＭＡＬＤＩ質量分析によって実行される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
少なくとも１種の反応は、加熱と冷却を含む、少なくとも１回のサーマルサイクル処理を経過する、請求項４８または５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記加熱の速度は、約３℃／秒から最大約１００℃／秒の範囲から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記加熱の速度は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および、少なくとも約１００℃／秒の加熱速度からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記加熱は、熱伝導性または電導性を用いて達成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記冷却の速度は、約３℃／秒から最大１００℃／秒の範囲から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記冷却の速度は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および、少なくとも約１００℃／秒の冷却速度からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記冷却は、水、空気、または、冷ブロックを用いて達成される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴヌクレオチドの伸長を可能とする条件は、加熱と冷却を含む、少なくとも１回のサーマルサイクル処理を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６５】
前記加熱の速度は、約３℃／秒から最大約１００℃／秒の範囲から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記加熱の速度は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および、少なくとも約１００℃／秒の加熱速度からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記加熱は、熱伝導性または電導性を用いて達成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記冷却の速度は、約３℃／秒から最大１００℃／秒の範囲から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記冷却の速度は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および、少なくとも約１００℃／秒の冷却速度からなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記冷却は、水、空気、または、冷ブロックを用いて達成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記基板の表面は、取り外し可能な反応封入部材内の１個以上の反応チャンバーによって封鎖されている、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項７２】
単一の反応チャンバー内の温度差は、≦２．０℃、１．５℃、１．０℃、０．５℃、および、≦０．３℃から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
個々の反応チャンバー間の温度差は、≦１．０℃、０．５℃、０．４℃、０．３℃、０．２℃および、≦０．１℃から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
標的生体分子の反応を実行する方法であって、
（ａ）基板表面の存在下に該標的生体分子について１種以上の反応を実行する工程であって、該反応は、実質的に溶液中で実行され、該基板は該溶液と接触する１個以上の標的検出部位を備える、工程；
（ｂ）該基板表面の該標的検出部位において１種以上の反応生成物を捕捉する工程、および
（ｃ）該標的検出部位において反応生成物を検出する工程
を包含する方法。
【請求項７５】
標的核酸分子の中の一つのヌクレオチドの本体を確定する方法であって、
該標的核酸分子の１本鎖部分を、標的核酸の該１本鎖部分のある領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドに対し、基板上の不連続な検出部位において、溶液中で、かつ、捕捉官能基の存在下でハイブリダイズさせる工程；
該ハイブリダイズした核酸とオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの伸長を可能とする条件に暴露する工程；
伸長反応の生成物を、該基板表面の該不連続な標的検出部位で捕捉する工程
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記捕捉は、前記反応生成物と、前記基板表面、または、該基板表面に結合する官能基との間の非共有的相互作用を介して達成される、請求項７４または７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
２００２年４月１１日出願、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ」の米国仮出願第６０／３７２，７１１号、代理人管理番号２４７３６−Ｐ２０６４、および、２００３年３月２４日出願、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ」の米国仮出願、代理人管理番号２４７３６−Ｐ２０６４Ｂに対して優先権が主張されている。本出願は、本願と同日に出願された、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ」なる米国出願番号（代理人管理番号２４７３６−２０６４）と関連する。認められる場合、前記仮出願および米国出願それぞれの主題全体を、参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は生化学処理システムに関する。より具体的には基板上における生化学的処理の実行に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的物質の処理においては、試験・分析のために、サンプル物質を反応地点に自動移送することがよくある。大規模なバッチの遺伝学的サンプルに対して試験を行い、表現型の関連性を作製するため、および、そのような試験から得られた大量のデータセットの解釈を向上させるために、マイクロアレイが用いられてきた。サンプルは通常マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）と呼ばれるトレイで調製される。このＭＴＰは、それぞれが生物学的物質のサンプルを保持するウェルのアレイを含む。様々な液体試薬物質がウェル中で組み合わされ、各種処理、たとえば、分析のためのＤＮＡ増幅法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に供される。
【０００４】
ＰＣＲ過程に従って、ＤＮＡサンプルを各種薬剤と混合し、このサンプルを一連の交互の加熱および冷却サイクルに供する熱サイクリング処理に供することによって、少量のＤＮＡを複製する。典型的な熱的サイクル操作の場合、サンプルを取付したＭＴＰを加熱サイクルブースに設置し、ここで、ＭＴＰを希望に応じて加熱・冷却し、これによってＭＴＰウェルの内容物に作用を及ぼす。プレートを加熱・冷却する一つのやり方は、そのプレートを、ＭＴＰの下面に適合する金属プレート上面に設置することである。この金属プレートを加熱・冷却すれば、それによってまた、ＭＴＰも加熱・冷却されることになる。
【０００５】
熱的サイクル過程の前に、ＰＣＲ用サンプルの調製は、代表的には、空のＭＴＰをプレート処理ステーションに搬送することで始まる。次に、各種試薬および生物学的物質をＭＴＰウェルに添加するが、これはロボットシステムによって実行される。ロボットシステムは、プレート処理ステーションからＭＴＰを摘み上げ、生物学的試料サンプルに試薬を加え、それからそのＭＴＰを次のステーションに移してその後の処理を実行する。別法として、人間のオペレータが手動で試薬を生物学的物質に加え、そして混合する。従って、ＰＣＲ用のサンプル物質を調製する場合、ＭＴＰのウェルは、しばしば、いくつかの操作（通常、各ウェル中での溶液の混合および他の処理が含まれる）の結果そのもののサンプル物質が含まれる。このような操作の間、ＭＴＰは、いくつかの異なるステーションに、例えば、ＭＴＰをリンスするステーション、サンプルをあるＭＴＰのウェルから別のＭＴＰのウェルに移動させるステーションに移動させられることがある。
【０００６】
ＰＣＲ過程が所定のサンプルのセットについて完了した後、得られたサンプル物質に、一つ以上の追加過程を実施することがあり得、そのような追加過程では、しばしば、先行する過程で用いられた装置の洗浄およびリンスが必要とされる。しばしば、最終サンプルは、基板上のスポットのアレイ中に置かれ、次に、一つ以上の分析、例えば、当業者には公知のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）にかけられる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法によれば、標的プレート上のスポット中に含まれるサンプルは、ある一定波長の光を強く吸収するマトッリクス物質中に分散される。次に、真空チャンバー内において、短いパルスのレーザー光線をこのサンプルに収束して、サンプルおよびマトリックスを揮発させてイオンを形成させる。この形成されたイオンを高圧電源により加速し、次に飛行管の中を押し流す。科学者は、イオンが飛行管の末端に到着するまでに要した時間量に基づいて、サンプルの成分の分子量について情報を集めることが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記の過程に関連して様々の負担が生じる。その負担の一つに、前記過程の実行に比較的長時間を要することが挙げられる。これはサンプル分析処理量を低下させる。前記過程を実行するのに要する時間には各種要因が関わる。例えば、熱的サイクル過程では、ＭＴＰの加熱および冷却が、例えば、数時間のオーダーの長時間を費やし得る。各種ステーション間で、例えば、サンプルを調製する混合ステーションから、サーマルサイクリングを実行するサーマルサイクリングステーションへＭＴＰを移動させることにも時間がかかる。時間の浪費は、その他にも、ＰＣＲおよびその後のその他の反応の後、サンプルをＭＴＰから取り出しＭＡＬＤＩ−ＭＳ用の基板に載せる場合にも生ずる。
【０００８】
さらに別の負担として、過程を実行するのに要するスペースの量に関する負担がある。現在、過程の実施中に、数個のステーションの使用が必要とされ、ここで、各ステーションが他の目的のために使用し得るスペースを取ってしまう。様々なステーションは、それらステーション間でサンプルを移送させるために何らかの機構、例えば、ロボットシステムまたは人間オペレータの形態の機構を必要とするが、これらは、諸過程の金銭コストを増大させる。さらに別の負担は、過程を実行するのに必要な補給物資の容量に関する。例えば、ＰＣＲの間に使用される試薬は非常に高価である。
【０００９】
前記に鑑みて、このような分析に関連する各種負担を低減する生物学的サンプル処理の改良装置および改良法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
直接基板の上で生化学過程を実行するための装置および方法が提供される。基板アセンブリは、着脱可能に固定位置に基板を支持するカートリッジベース、および、着脱可能に基板上面に配置される反応封入部材を含む。反応封入部材および基板は共同して、基板表面の１個以上の標的位置の直上にチャンバーを形成する。これらのチャンバーは、基板の上での標的位置の定位置での生化学反応を実行するのに使用され得、ならびに、基板に直接配置される加熱エレメントを用いる、チャンバー内に含まれる物質のサーマルサイクリングを実行するのにも使用され得る。
【００１１】
基板アセンブリは、処理機であって、物質をチャンバーに滴下し、チャンバーに含まれる物質の生化学反応を実行しながらも、その処理中、基板アセンブリの、ある位置から別の位置への移動を要しない処理機と組み合わせて使用することが可能である。このようにして、例えば、試薬や生化学物質のＰＣＲ調製を含む各種化学過程を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の準備を実行する孤立処理ステーションを含む処理機で実行が可能である。
【００１２】
本開示のその他の特徴および利点は、実施例に基づいて示される下記の例示の実施態様の記載から自ずから明らかとなろう。
【００１３】
（詳細な説明）
（Ａ．定義）
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明（単数または複数）の属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における全開示を通じて引用された全ての特許、特許出願、公刊された出願および公報、ジーンバンクの塩基配列、ウェブサイトおよびその他の公刊資料は、別様に注記しない限り、その全体が本明細書において参考として援用される。本明細書の用語について複数の定義がある場合には、本節で紹介されるものが優先する。参照が、ＵＲＬや、その他の特定符号またはアドレスについて行われる場合、そのような特定符号は変更の可能性があり、そして、インターネット上の特定の情報は変動する可能性があるが、等価な情報がインターネットを検索することによって発見が可能であることが理解される。情報に対する参照は、その情報の入手可能性および一般的普及を裏付けるものである。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「生体分子」または「標的生体分子」とは、生きている生物に生じる全ての有機分子、特に、巨大分子をいう。生体分子としては、核酸、生体高分子、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、小有機分子、脂質および炭水化物、それら化合物グループの誘導体、および、それら分子の結合体が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。
【００１５】
本明細書で使用する場合、「基板表面の存在下において標的生体分子の１つ以上の反応を実行する」という言句は、少なくとも基板表面ともまた接触する反応混合液中において、何らかの生化学反応（例えば、増幅またはプライマー伸長反応、または、タンパク質間の結合反応）を実行することをいう。
【００１６】
本明細書で使用する場合、「反応（単数または複数）は、実質的に溶液内で実行される」という言句は、大多数の反応物質間の相互作用が溶液中で生じ、その結果、大多数の反応物質および任意の中間物質が溶液中に存在する反応をいう。特定の実施態様では、反応生成物（単数または複数）は、１個以上の、別々の標的検出部位（単数または複数）において、基板表面において捕捉される。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「基板は、溶液と接触する１個以上の標的検出部位（単数または複数）を含む」という言句は、反応混合液に接触する基板の表面に、不連続な標的検出部位（単数または複数）が、各検出標的部位も、反応中、その混合物に接触するような形で存在することを指す。反応期間中、反応混合液に接触する標的検出部位が存在するということは、反応生成物を、標的検出部位を持たない一つの反応チャンバーから、標的検出部位を有する別の反応チャンバーに物理的に移送しなければならないという要求を回避させる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「標的検出部位」または「標的部位」またはその文法的な変種は、分析される、または、検出される標的分子の置かれる基板上の位置を指す。この標的分子は、通常、捕捉用官能基、例えば、核酸（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて）によって、または、タンパク質または抗体によって、イオン相互作用ファンデルワールス力または水素結合を介して、捕捉される。
【００１９】
本明細書で使用する場合、「反応（単数または複数）は、・・・の存在下で行われる」という言句は、個別の標的検出部位において不連続に配される固相捕捉官能基の内の一つ、または、それらの全てのサブセットという文脈で用いられる場合、その標的検出部位の周囲、上方、下方、または、近傍において反応が、生体分子反応物質を含む反応混合物が、少なくとも１個の標的検出部位に接触するような形で起こることを指す。典型的には、反応は、基板上の標的検出部位の上方にて起こる。例えば、本明細書で提供される方法の特別の利点として、捕捉標的生体分子の検出を、捕捉前溶液相反応が実行された、その同じ部位にて行うことが挙げられる。従って、捕捉前溶液相反応の部位と、標的検出部位とは同じである。この特別の利点により、経費や時間が低減・短縮されるばかりでなく、高い処理能力方式で反応を自動的に実行しようとした場合必要とされる装置の規模や複雑性も低減される。この特長は、その内部において溶液相反応が起こる１個以上の反応チャンバーまたはチャネルを形成する反応封入部材を、標的検出部位における標的捕捉工程の終了後、基板から外すことによって達成される。従って、本明細書で提供される方法では、液相反応生成物を、標的生体分子の捕捉前に、その中に捕捉官能基を備える、新たな標的検出部位および／または新たな溶液への物理的移送が要求されない。例えば、基板がチップである場合、このチップは、溶液相反応期間中、少なくとも反応生成物（単数または複数）が捕捉されるまで、好都合にも静止を持続することが可能である。一旦反応生成物（単数または複数）が捕捉されたならば、チップは、取り外す、および／または、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のような検出分析のために調製することが可能である。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「非共有的相互作用」という言句は、２、４または６個の電子の共有によって特徴付けられる原子間結合を含まない、全ての相互作用を指す。
【００２１】
本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチドの延長を許す条件」という語句は、鋳型にハイブリダイズさせる際プライマーを延長するのに使用される周知の反応条件のいずれか、例えば、本明細書の実施例の節に記載される条件を指す。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「多型」とは、ある特定の核酸、例えば、遺伝子またはその一部の、一つより多い形態または対立遺伝子の共存を指す。例えば遺伝子のような核酸分節の一部または座位であって、少なくとも２種類の異なる形態、すなわち、２種類の異なるヌクレオチド遺伝子座がある部分または座位は、「多型領域」と呼ばれる。多型領域は、その特定内容が、異なる対立遺伝子では別になる、単一ヌクレオチドであってもよい。多型領域はまた幾らかのヌクレオチド長であってもよい。多型は、ヌクレオチドの置換、挿入、重複、および、欠失を含む。多型は、ある特定の多型部位に見られる特定のヌクレオチド（単数または複数）、または、ヌクレオチド配列を指してもよい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「多型遺伝子」とは、少なくとも１個の多型領域を持つ遺伝子を指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「対立遺伝子」は、本明細書では「対立的変種」と相互交換的に使用されるものであり、ある核酸、例えば、遺伝子またはその一部の別形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体において同一座位または位置を占める。被験体が、ある遺伝子について二つの同一の対立遺伝子を有する場合、その被験体は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であると言われる。被験体が、ある遺伝子について異なる二つの対立遺伝子を有する場合、その被験体は、その遺伝子についてヘテロ接合体であると言われる。ある特定の遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドにおいて互いに異なることもあるし、いくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なることもあり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含むこともある。また、一つの遺伝子の対立遺伝子は、一つの突然変異を含む、一形態の遺伝子であることもある。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「被験体」という用語は、生体分子分析の対象となり得る全ての生物を指す。この被験体という用語は、真核生物（例えば、酵母、植物、動物、特に哺乳類、および、特にヒト）、および、原核生物を含む。例えば、原核生物は、突然変異分析の対象となることがある。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「配列番号第ｘ番に記載されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列」とは、配列番号第ｘ番を有する核酸鎖の相補鎖の核酸配列を指す。「相補鎖」という用語は、本明細書では、「相補体」という用語と相互交換的に使用される。ある核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体であっても、非コード鎖の相補体であってもよい。２本鎖核酸に言及している際、配列番号第ｘ番を持つ核酸の相補体とは、本明細書に配列番号第ｘ番として列挙されているヌクレオチド配列を有する鎖の相補鎖、または、前記配列番号第ｘ番の相補鎖のヌクレオチド配列を有する全ての核酸を指す。ヌクレオチド配列、配列番号第ｘ番を持つ１本鎖核酸に言及している際、この核酸の相補体は、前記配列番号第ｘ番のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸である。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「コード配列」という用語は、あるタンパク質のあるアミノ酸配列をコードする遺伝子部分を指す。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「センス鎖」という用語は、その２本鎖核酸分子によってコードされるアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ配列を有する、２本鎖核酸分子の鎖を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「アンチセンス鎖」という用語は、その２本鎖核酸分子によってコードされるアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ配列の相補体である２本鎖核酸分子の鎖を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、ストリンジェンシー条件とは、非特異的プローブを除去するための洗浄条件、および、下記の高度、中度、および、低度のストリンジェンシーに相当する条件を指す。すなわち、
１）高ストリンジェンシー−０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
２）中ストリンジェンシー−０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
３）低ストリンジェンシー−１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
別のバッファー、塩類、および、温度を用いることによって等価なストリンジェンシーを実現してもよいことが理解されよう。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「標的分子」とは、分析の対象とされる分子、例えば、生体分子を指す。標的分子の例としては、核酸、例えば、目的の遺伝子の多型領域の全てまたは一部を含む核酸、ペプチドまたはタンパク質、有機低分子または炭水化物が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「チャンバー」は、流体、例えば、反応混合物を含むことが可能な内部空間を定める、および／または、一つの区域を別の区域から隔てることを可能とする、少なくとも一つの底面と１個以上の壁で形成される囲い込みを指す。例えば、チャンバーは、基板、例えば、シリコンチップの表面における窪みとして形成されてもよい。別の例として、チャンバーは、中空円筒の開放端を基板表面に置くことによって形成してもよい。別の実施態様として、チャンバーは、円筒の半分を用いて形成することが可能である。さらに別の例として、チャンバーは、少なくとも２枚の壁を互いに平行に基板表面に置いてチャネルを創設することによって形成することも可能である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「アレイ」は、要素、例えば、核酸のアセンブリを指す。典型的には、アレイは３個以上のメンバーを含む。対処可能なアレイは、代表的には、アレイのメンバーが固相支持体上の位置によって特定が可能なものである。従って、一般に、アレイのメンバーは、固相表面の、不連続な、特定可能な位置に固定化される。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」とは、あるプローブまたはプライマーが、非標的配列に比べて、ある標的配列に優先的にハイブリダイズすることを指す。当業者であれば、ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータ、例えば、温度、プローブまたはプライマーの長さや組成、バッファー組成および塩濃度には精通しており、標的配列に対してある核酸の特異的ハイブリダイゼーションを実現するためにこれらのパラメータを簡単に調節することが可能であろう。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレトチドを指す。この用語は、その等価物として、ヌクレオチド類縁体、１本鎖（センスまたはアンチセンス）ポリヌクレオチド、および、２本鎖ポリヌクレオチドから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変種、および、類縁体を含むものと理解しなければならない。デオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、および、デオキシチミジンを含む。ＲＮＡでは、ウラシル塩基はウリジンである。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「質量分析」は、当業者には周知の適当な質量分析方式を全て含む。そのような方式としては、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法、飛行時間法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、電子スプレー法（ＥＳ）、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ（例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５７３１８号、および、米国特許第５，１１８，９３７号の公報参照）、イオンサイクロトロン共鳴法（ＩＣＲ）、フーリエ変換法、および、それらの併用法が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。ＭＡＬＤＩ、特にＵＶおよびＩＲは、例示の方式として特記される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「プライマー」および「プローブ」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類縁体、また、タンパク質核酸（ＰＮＡ）およびそれらの混合物を含む核酸分子を指す。そのような分子は、典型的には、目的のゲノムにおいて統計的には一意（すなわち、ただ一度しか起こらない）となるような長さを有する。一般に、あるプローブまたはプライマーがヒトゲノムにおいて一意となるためには、目的の遺伝子に対して相補的な、または、同一の配列の、少なくとも１４個、１６個、または、連続したヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００個以上の核酸長であってもよい。典型的には、プローブまたはプライマーは、１本鎖核酸分子である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「隣接」とは、一塩基多型（ＳＮＰ、スニップ）部位に対する５’位置であって、その位置とＳＮＰ部位の間に対合しないヌクレオチドペアが存在する可能性のある位置を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、支持体（またマトリックス支持体、マトリックス、不溶性支持体、または、固相支持体とも呼ばれる）とは、目的の分子、典型的には、生物分子、有機分子または生物特異的リガンドが結合する、または、接触する、固相もしくは半固体もしくは不溶の支持体全てを指す。このような物質としては、化学的・生物学的分子合成・分析に好適な親和性マトリックスまたは支持体として使用される全ての材料、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ナイロン、ガラス、デキストラン、キチン、砂、軽石、アガロース、多糖類、デンドリマー、バッキーボール、ポリアクリルアミド、シリコーン、ゴム、および、固相合成、親和性分離・精製、ハイブリダイゼーション反応、免疫定量法、その他の用途において支持体として使用される、他の材料が挙げられるが、ただし上記に限定されない。本明細書におけるマトリックスは粒状であっても、または、連続面の形を取っても、例えば、微量定量皿またはウェル、ガラススライド、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または、その他の材料のような形を取ってもよい。粒状の場合、典型的には、粒子は、５〜１００μｍ範囲以下の少なくとも一形態を持つ。このような粒子は、本明細書ではまとめて「ビーズ」という。これは、球形であることが多いが必ずしもそうでなくともよい。しかしながら、このように言及したからと言って、それはマトリックスの形状を限定するものではなく、マトリックスは、どのような形態であってもよく、例えば、ランダムな形状、針状、繊維状、および、細長状であってもよい。概して、球形「ビーズ」が、特に、脂質相において使用が可能な微小球がまた考えられる。ビーズは、追加成分を、例えば、磁性粒子または常磁性粒子（例えば、「ダイナビーズ」（登録商標）（Ｄｙｎａｌ、オスロ、ノルウェー）参照）を、マグネットによって分離するために含んでもよい。ただし、その追加成分が、本明細書の方法や分析に干渉しない限りにおいてではあるが。
【００４０】
本明細書で使用する場合、マトリックスまたは支持粒子とは、不連続粒子の形態を取るマトリックス材料を指す。この粒子はどのような形、大きさのものであってもよいが、典型的には、１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、１ｍｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、および、１０ｎｍ以下である、少なくとも一つの大きさを有する。粒子は典型的には、１００ｍｍ３以下、５０ｍｍ３以下、１０ｍｍ３以下、および、５ｍｍ３以下、４ｍｍ３以下、３ｍｍ３以下、２ｍｍ３以下、および、１ｍｍ３以下、９００μｍ３以下、８００μｍ３以下、７００μｍ３以下、６００μｍ３以下、５００μｍ３以下、４００μｍ３以下、３００μｍ３以下、２００μｍ３以下、１００μｍ３以下、５０μｍ３以下、４０μｍ３以下、３０μｍ３以下、２０μｍ３以下、１０μｍ３以下、５μｍ３以下、４μｍ３以下、３μｍ３以下、２μｍ３以下、１μｍ３以下、９００ｎｍ３以下、８００ｎｍ３以下、７００ｎｍ３以下、６００ｎｍ３以下、５００ｎｍ３以下、４００ｎｍ３以下、３００ｎｍ３以下、２００ｎｍ３以下、１００ｎｍ３以下、５０ｎｍ３以下、４０ｎｍ３以下、３０ｎｍ３以下、２０ｎｍ３以下、１０ｎｍ３以下または５ｎｍ３以下のサイズを持ち、そして立方ナノメートルのオーダーである。典型的には、粒子は、約１．５ミクロンで１５ミクロン未満、例えば、約４−６ミクロンの直径を持つ。このような粒子をまとめて「ビーズ」と呼ぶ。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「基板」とは、その上で反応の実行が可能である、および／または、反応生成物を特定可能な遺伝子座に保持が可能である表面を提供できる不溶の支持体を指す。支持体は、ほとんどどのような不溶の、または、固相の物質からでも製造が可能である。例えば、シリコーン、シリカゲル、ガラス（例えば、孔調節ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、ワン樹脂、メリフィールド樹脂、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、セルロース、金属面（例えば、スチール、金、銀、アルミニウム、および、銅）、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））がある。例示的な基板としては、例えば、ガラス繊維フィルター、シリコーン表面、ガラス面、金属面（スチール、金、銀、アルミニウム、および、銅）、および、プラスチック材料のような平坦支持体が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。固相支持体は、カートリッジ基盤に取り付けるのに適当ないずれの所望の形を取ってもよく、そのようなものとして、プレート、膜、ウェーファ（ｗａｆｅｒ）、小孔印刻ウェーファ（ｗａｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ｐｉｔ）、および、当業者には周知のその他の大きさ・形態が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。例示的な支持体は、不連続遺伝子座、例えば、サンプルを受容するか、含有するか、または、サンプルに結合するための親水性遺伝子座を取り囲む疎水性領域を備えた平面において、サンプルを受容する、または、サンプルに結合するように設計された平面である。
【００４２】
（Ｂ．例示的な基板アセンブリ）
図１は、基板アセンブリ１１０の分解斜視図を示し、同基板アセンブリは、基板１１５、反応封入部材１２０、反応封入部材背面プレート１２５、カートリッジ基盤１３０、および、カートリッジカバー１３５を含む。図２に示すように、カートリッジカバー１３５は着脱可能にカートリッジ基盤１３０に組み合わさり、まとまって、下記にさらに十分に説明するように、基板１１５、反応封入部材１２０、および、反応封入部材背面プレート１２５を着脱可能にしっかりと保持するカートリッジ２１０を形成する。カートリッジカバー１３５はカートリッジ基盤１３０から外すことが可能であり、それにより、基板１１５を、処理後、カートリッジから取り出すことが可能となる。
【００４３】
（Ｃ．基板）
図３に示すように、基板１１５は、生物サンプルが堆積されてその上に複数の標的部位３１０を作る上側平面を形成する。一つの実施態様では、基板はチップの形を取る。基板は、急速熱応答や、基板全体に渡る熱均一性を実現するために熱伝導性の高い材料から形成される。この点で、基板は、約０．５Ｗ／ｍｋのガラスの熱伝導率よりも大きい熱伝導性を有する材料から形成することも可能である。一つの実施態様では、基板１１５は、約０．５Ｗ／Ｍｋから４５０Ｗ／Ｍｋの範囲の熱伝導率を持つ材料から製造される。基板１１５は、シリコーンや当業者には公知のその他の材料のような半導体材料から製造されてもよい。
【００４４】
図３では例示が分かり易いように、図３に例示される基板１１５は、１２×８の格子に配置された、９６個の標的部位を含んでいるが、その標的部位の内の僅か二つだけを参照番号３１０で表示している。従って、基板１１５は、１２列の標的部位および８行の標的部位を持つ。基板１１５は、その他様々の構成において配置される、他の数量の標的部位を持つことも可能であることを理解しなければならない。基板１１５のサイズも変更が可能である。ただし、一つの実施態様では、基板１１５は、約３ｃｍの長さと約２ｃｍの幅を持つ長方形を有する。標的部位３１０は、様々の容量の生物材料を含むことが可能である。一つの実施態様では、標的部位３１０は、０．００２５ｍｍ２または１．０ｍｍ２の面積を占め、オリゴヌクレオチド量は１０ａｍｏｌと１０ｐｍｏｌの範囲にある。ただし、この量は変更が可能である。
【００４５】
図４は基板１１５の側面図を示す。電気抵抗性コーティング４１０から成る加熱要素が、基板１１５の一つの面、例えば、標的部位を含む面と対向する面に配される。抵抗性コーティング４１０は、基板１１５に対して熱的に接触し、熱がコーティング４１０から基板１１５に向けて伝播可能となるようにする。抵抗性コーティング４１０は、加熱・冷却され、そのために基板１１５の加熱・冷却が可能となるような材料から成る薄膜またはコーティングを含む。抵抗性コーティング４１０は、電流が印加されると熱せられる材料、例えば、白金またはチタンタングステンから作製が可能である。抵抗性コーティング４１０は、基板１１５の全底面に渡って均一な厚みを持ち、基板１１５の表面上に均一な温度特性を実現するようにしてもよい。しかしながら、抵抗性コーティングの形態、例えば、その厚みは変更が可能である。例えば、抵抗性コーティング４１０は、その抵抗性コーティング４１０が基板１１５のある領域のみに配されるようにパターン化され、基板における加熱の均一性を変化させるようにすることも可能である。さらに、抵抗性コーティング４１０は、生物サンプルが静置される基板１１５の上面に配することも可能である。図４は原寸大ではなく、基板１１５と抵抗性コーティング４１０の相対的サイズは、図示の明瞭と簡便のために誇張されていることを理解しなければならない。
【００４６】
別の実施態様では、基板４１０は、抵抗性材料であって、電流が材料に印加されると加熱される抵抗材料から製造される。この抵抗性材料は、上面における標的部位の形成を可能とするよう、上面に塗布された絶縁性薄膜を有していてもよい。
【００４７】
（カートリッジ基盤およびカバー）
図２に示すように、基板１１５はカートリッジ基盤１３０に取付され、それによってカートリッジ基盤１３０が固定位置において着脱可能に基板１１５を支持することが可能となる。カートリッジ基盤１３０は、後述するように、カートリッジ基盤１３０と基板１１５の間に生じる熱の流れを最小とするやり方で基板１１５を支持する。図５は、カートリッジ基盤１３０の拡大斜視図を示す。開口部５１０は、カートリッジ基盤１３０の上面５１２から下面５１４までカートリッジ基板１３０を貫いて延びる。開口部５１０は、基板１１５がカートリッジ基盤１３０に取付される基板取付領域を定める。
【００４８】
カートリッジ基盤１３０には、１種以上の取付部位５１５、例えば、開口部５１０辺縁が配されている。取付部位５１５とは、基板１１５をカートリッジ基盤１３０に取付したときに基板１１５に接触するカートリッジ基盤１３０の領域である。一つの実施態様では、基板１１５とカートリッジ基盤１３０の間の接触面積量は極力小さくされる。これは、基板１１５をカートリッジ１３０に取付した場合に、カートリッジ基盤１３０が、基板１１５の熱質量に対してほとんど、または、全く寄与することがないようにするためである。この点で、カートリッジ基盤１３０と基板１１５の間における熱流の可能性を最小にするためには、カートリッジ基盤１３０は、基板１１５の一辺の表面積の１０％未満に接触可能とし、基板１１５の一辺の表面積の５％未満に接触可能とし、基板１１５の一辺の表面積の３％未満に接触可能とする。
【００４９】
取付部位５１５は、段差のある棚を含むことが可能である。これらの棚は集まって、基板１１５のカートリッジ基盤１３０への取付を可能とする座位を形成する。この状況は、図６の、カートリッジ基盤１３０の、一部断面図においてさらに詳細に示される。各取付部位５１５において、段付き棚形態が、基板１１５が据えられる水平壁６１０と、基板１１５が動かないようにするために、基板１１５の辺縁と隣接する垂直壁６１５を定める。壁６１０、６１５のサイズは、基板１１５に対する十分な支持を確保し、また一方で、基板１１５とカートリッジ基盤１３０の間の熱接触量を最小にするように選ばれる。
【００５０】
再び図５を参照すると、カートリッジ基盤１３０は、基板１１５がカートリッジ基盤１３０の取付部位５１５に取付された際に、基板１１５を固定位置に確保する、少なくとも１個の確保部材５２０を含む。確保部材５２０は、基板１１５が、取付部位５１５の段付き棚に据えつけられた際に、基板１１５の末端に対し第一方向に向けて力を及ぼすように付勢されたフィンガーを含んでいてもよい。この力は、基板１１５を１個以上の垂直壁６１５（図６に示す）に対して押し付けるので、基板１１５は、カートリッジ基盤１３０にしっかりと取付される。
【００５１】
一つの実施態様では、カートリッジ基盤１３０はまた第２固定確保手段５２２を含む。これは、基板１１５が取付部位５１５の段付き棚に据えられた際に、基板１１５に対して第二の力を及ぼすものである。この第２確保部材５２２は、第１確保部材５２０によって施される力の方向に対して横断的に第二の力を及ぼすので、基板１１５に対して施される実際の合計力は、基板１１５の隅角の一つに向けられることになる。従って、第１確保部材５２０と第２確保部材５２２は共同して、基板１１５を、カートリッジ基盤の開口部５１０の隅角の一つに対してぴったりと据えられるように付勢する実際の合計力を与えることになる。これは、基板１１５が、取付部位において、常に同じ場所同じ方向に設置される確率を高めることになるから、カートリッジ基盤１３０における基板１１５の位置を登録することがより易しくなる。
【００５２】
図２は、カートリッジ基盤１３０に取付された基板１１５を示す。カートリッジ基盤１３０に取付されると、基板１１５は、開口部５１０の上に宙吊りされることになる。このため基板１１５の底面は、少なくとも部分的には、開口部５１０を通して露出されることになる。このため基板の上面（すなわち、生物サンプルが静置される面）は、基板１１５がカートリッジ基盤１３０に取付されると、上に向かって露出されることになる。確保部材５２０、５２２は、基板１１５に対して、基板を取付部位５１５に確実に設置するように力を及ぼす。
【００５３】
前述したように、カートリッジ基盤１３０はカートリッジカバー１３５と嵌合する。この点で、カートリッジ基盤は、１個以上の嵌合部材５２５（図２と図５の両方に示す）を含む。この部材は、下記にさらに詳述するように、カートリッジカバー１３５の対応嵌合部材と嵌合する。図５を参照すると、各嵌合部材５２５は、段付き面を持つ上方に延びる舌を含んでもよい。この舌は、カートリッジカバー１３５の対応開口部と嵌合・閉鎖して、カートリッジ基盤１３０とカートリッジカバー１３５の間に、カートリッジ基盤１３０とカートリッジカバー１３５を互いにしっかりと結合する力を及ぼすことを可能にする。カートリッジ基盤１３０とカートリッジカバー１３５を互いにしっかりと結合させるのに他の手段を用いてもよいことを理解しなければならない。
【００５４】
一つの実施態様では、各嵌合部材５２５は、少なくとも２個の、段付き面のようなストッパーを含む。これは、カートリッジカバー１３５を、カートリッジ基盤１３０に対して二つの異なる固定位置において確保するためのものである。この段付き面はそれぞれ、カートリッジカバー１３５の対応開口部と嵌合する。第一固定位置では、カートリッジカバー１３５は、基板１１５に対して、基板がカートリッジ１３０の取付部位から外れることがないよう確保するのに十分な力で圧迫するように設置される。第一固定位置では、カートリッジカバーが基板１１５に対して及ぼす圧力は、カートリッジ基盤およびカバーの製造に使用された材料に変形クリープを全く生じさせることがない程度に十分に低いものである。カートリッジカバー１３５は、基板アセンブリ１１０の長期の保存や輸送の際には第一固定位置に設置される。これは、その保存や輸送の際カートリッジの成分にクリープの生ずる可能性を低減するためである。第二固定位置では、カートリッジカバー１３５は、第一設置位置におけるカートリッジカバー１３５よりも、より高度の力を、カートリッジ基盤１３０（および取付された基板１１５）に対して及ぼす。これは、基板と反応封入部材との間により高度の密閉度を実現するためである。カートリッジカバー１３５は、基板アセンブリが生物反応を実行するのに使用される際には、第二固定位置にある。
【００５５】
さらに図５を参照すると、カートリッジ基盤１３０は、カートリッジ基盤１３０から上方に延びる１本以上の整列ピン５３０を含む。整列ピン５３０は、カートリッジカバー１３５（または、反応封入部材背面プレート１２５）の対応する整列穴と嵌合が可能である。これらは、下記に詳述するように、嵌合中、カートリッジ基盤１３０のカートリッジカバー１３５に対する軸を揃える。
【００５６】
図７は、カートリッジカバー１３５の拡大斜視図である。開口部７１０はカートリッジカバー１３５を貫いて延びる。カートリッジカバー１３５の開口部７１０は、カートリッジカバー１３５とカートリッジ基盤１３０が嵌合された場合、カートリッジ基盤１３０の開口部５１０の上に配される。従って、開口部７１０は、基板１１５がカートリッジ基盤１３０に取付され、カートリッジカバー１３５がそれらと嵌合された場合、基板１１５の直上に配されることになる。カートリッジカバー１３５は、スロットから成る嵌合部材７１５を含む。スロットは、カートリッジ基盤１３０の対応する嵌合部材５２５（図５に示す）と雌雄関係で嵌合する。雄部材をカートリッジカバー１３５に設置し、雌部材をカートリッジ基盤１３０に配することも可能であることを理解しなければならない。
【００５７】
図７を参照すると、１本以上の整列穴７２５がカートリッジカバー１３５を貫いて延びている。各整列穴７２５は、カートリッジ基盤１３０の対応整列ピン５３０と軸が揃い、嵌合する。整列穴７２５と整列ピン５３０の軸が互いに揃えられると、嵌合部材５２５と７１５のみならず開口部５１５と７１０の軸も揃い、そのために、図２でもっとも良く見て取れるように、カートリッジ基盤１３０のカートリッジカバー１３５への結合が促進される。カートリッジカバー１３５はまた、開口部７１０の辺縁周囲に設置される、１個以上の背面プレート取付用スロットまたは穴７３０を含む。この取付用穴７３０は、下記にさらに詳述するように、カートリッジカバー１３５に対して背面プレート１２５（図１に示す）を取付するのに使用される。
【００５８】
（反応封入部材）
図８は、反応封入部材１２０の第一実施態様の斜視図を示す。図８に示す反応封入部材１２０は、下記にさらに詳述するように、基板１１５に近接し、カートリッジ２１０に取付されて、基板１１５上面の上に１個以上のチャンバーを形成する。この点で、反応封入部材１２０は、反応封入部材１２０の辺縁に沿って延びる、一列の流入ポート８１０、および、流入ポート８１０の列と向かい合って、反応封入部材１２０の辺縁に沿って延びる、対応する一列の流出ポート８１５を含む。各流入ポート８１０は対応する流出ポート８１５を持つ。このために、各流入ポート８１０と流出ポート８１５はペアとして配置されることになる。フローチャネル８２０は、任意の流入／流出ポートペアについて、流入ポート８１０の下端を流出ポート８１５の下端に接続する。例えば、図８において、流入ポート８１０ａと流出ポート８１５ａから成るペアは、この流入ポート８１０ａを流出ポート８１５ａに接続するフローチャネル８２０ａを含む。フローチャネル８２０は、下記にさらに詳述するように、反応封入部材１２０の内面によって形成される。図面の明瞭のために、図８は、流入ポート、流出ポート、および、フローチャネルの内のいくつかに対してのみ参照数字表示を含める。
【００５９】
流入ポート８１０、流出ポート８１５、および、フローチャネル８２０の配置を、図９Ａを参照しながらさらに詳細に説明する。同図は、フローチャネル８２０の内の一つについて、その長さに沿って得られた反応封入部材１２０の断面図を示す。各ポート８１０、８１５は同一サイズ・形態を持つ。流入ポート８１０および流出ポート８１５はそれぞれ、反応封入部材１２０の上面から下面へと延長する内壁によって形成される貫通孔を含む。このため、ポート８１０，８１５は、反応封入部材１２０の上面と下面に開口を形成する。反応封入部材１２０の上面の開口部は様々の形態を取ることが可能である。一つの実施態様では、開口部は円形であり、約１０ミクロンから５ミリメートルの範囲の直径を有する。一つの実施態様では、各開口部の直径は１ミリメートルである。
【００６０】
ポート８１０，８１５は、ウェルを下方に移動するに従ってそのサイズが漸次減少する断面を有するように図示されている。しかしながら、サイズは一定であることも可能である。図９Ｂの拡大図においてもっとも良く見て取れるように、各流出ポート８１５の下端は、ステップ１０１０を形成する。この目的は下記にさらに詳述する。流入ポート８１５も、図９Ｂには示されていないけれども、ステップを持つ。ポート８１５の下端は、それぞれのフローチャネル８２０に開放する。
【００６１】
図１０は、フローチャネル８２０の内の一つの、一部切り取り断面図を示す。フローチェンネル８２０は、反応封入部材１２０内の一組の内面１０１５によって形成される。内面１０１５は、両側面と上面においてフローチャネル１２０を囲むが、フローチャネル１２０の底部は開放したままに放置する。図１０では、内面１０１５が平坦であり、そのために、フローチャネルは長方形断面を持つように描かれているが、内面１０１５は丸くなっていたり、または、その他の輪郭を持ち、そのためにフローチャネル８２０が別の断面形を持つことになることも可能であることを理解しなければならない。
【００６２】
再び図９Ａを参照すると、フローチャネル８２０は、流入ポート８１０の下端から流出ポート８１５の下端まで水平に延びる。このためポート８１０，８１５はフローチャネル８２０に開放することになる。ポート８１０、８１５の間では、フローチャネル８２０は、その上縁を、反応封入部材１２０の下面によって区切られることになる。フローチェンネル８２０はその底部が開放されており、そのため、反応封入部材１２０が図９Ａに示すように平面９５０に設置された場合、フローチャネル８２０は、流入ポート８１０の下端を流出ポート８１５の下端に接続する、トンネルの形をした細長いチャンバーを形成する。チャンバーは、底部は平面９５０によって、上面は反応封入部材１２０の内面によって囲われる。
【００６３】
フローチャネル８２０は、約１０ミクロン（μｍ）から１ｍｍの範囲の高さＨ（図９Ｂに示す）を持つ。一つの実施態様では、高さＨは約２００μｍである。単一フローチャネル８２０は、約１０ナノリットルから１００マイクロリットルの容量を含み得るが、別の実施態様では、５０ナノリットルから１０マイクロリットルである。
【００６４】
図９Ａに図示するように、反応封入部材１２０には１個以上の圧解除腔９５５が設けられる。圧解除腔９５５は、反応封入部材１２０のばらばらの位置に設置される。各圧解除腔９５５は、フローチャネル８２０の一部に沿って見られる壁厚の薄い領域９６０を形成するように配置される。このために、もしもフローチャネル８２０によって形成されるトンネルが加圧されたとしても、領域９６０の壁厚の薄さにより、フローチャネル８２０が膨張し、トンネルの圧を解除することが可能になる。これは、反応封入部材１２０のサーマルサイクル中に起こる可能性がある。
【００６５】
図１１は反応封入部材１２０の上面図である。反応封入部材は、上から見下ろした場合、対応する基板１１５の形・サイズに実質的に一致する形・サイズを持つ。例えば、図１１に示す反応封入部材１２０は、図３に示す基板１１５に対し、対応するサイズのみならず、その長方形に一致する長方形を有する。反応封入部材１２０の流入ポート８１０と流出ポート８１５は、反応封入部材１２０が基板１１５の上面と軸が揃えられ得、そのために各フローチャネル８２０が、基板１１５の対応列の標的部位の上に揃えられるように、空間的に配置されている。このように整列されていると、標的部位の各列について、流入ポート８１０は、列の標的部位の一つの直上に揃えられ、流出ポート８１５は、列の標的部位の一つの直上に揃えられる。一つの実施態様では、流入ポート８１０がある列の最外側標的部位に揃えられ、流出ポート８１５が、同じ列の対向する最外側標的部位に揃えられる。この一つの例が図１１に示される。同図において、反応封入部材１２０の下に設置される基板１１５上に、例示の、一列の標的部位３１０の位置が示される。この標的部位の列は、対応するフローチャネル８２０ａの下に整列されており、そのフローチャネルの流入ポート８１０ａは、その列の最外側の標的部位に整列され、かつ、流出ポート８１５ａは同じ列の反対の最外側標的部位に整列されている。図の簡明のために、基板１１５上の他の列の標的部位は示されていないが、各列は、対応的に整列されるフローチャネル８２０を有することを理解しなければならない。
【００６６】
図１１を参照すると、反応封入部材１２０は、１個以上の整列穴１１１０を含んでもよい。この穴は、反応封入部材１２０の基板１１５に対する適正な整列を促進する。整列穴１１１０は背面プレート１２５の対応する整列ピンと嵌合し、それによって、反応封入部材１２０を背面プレート１２５に整列させることが可能である。反応封入部材１２０の基板１１５に対する適切な整列の実現をさらに支援するために、下記に詳述するように、反応封入部材１２０は、反応封入部材背面プレート１２５と結合することによって適切な整列を支援することも可能である。
【００６７】
図８に示す反応封入部材１２０は、約５ｍｍの厚みＴＦを持つ。ただしこの厚みは変更が可能である。反応封入部材１２０は、熱可塑性材料のような柔らかい材料、または、シリコーンで製造してもよい。
【００６８】
図１２Ａは、反応封入部材１２１５を含む、反応封入部材の別の実施態様の上面図を示す。この反応封入部材１２１５は、アレイ状に配される複数のウェル１２１７を含む。各ウェル１２１７は、反応封入部材１２１５の全長を貫通し、反応封入部材１２１５の上面に開口を形成し、底面に開口を形成する貫通孔を含む。ウェル１２１７によって形成されるこれらの貫通孔は、図１３の反応封入部材１２１５の側面図において想像線で示される。
【００６９】
ウェル１２１７は、各ウェル１２１７が、基板１１５の１個以上の標的部位３１０の上に整列され得るように空間的に配されている。従って、反応封入部材１２１５は、基板１１５の上に、各ウェル１２１７が、基板１１５上の、少なくとも１個の対応する標的位置３１０の上に整列され、それによってその標的部位の上にチャンバーを形成するように配置することが可能である。チャンバーは、基板の上面とウェル１２１７の壁によって定められる。反応封入部材１２１５は全くフローチャネルを必要としない。なぜなら、各ウェル１２１７は、基板の上に１個以上の対応標的部位を持つからである。
【００７０】
図１２Ａに示す反応封入部材１２１５は、６×４の格子に配置された２４個のウェル１２１７を持つ。従って、反応封入部材１２１５は、６×４の格子に配置され、反応封入部材１２１５上のウェル１２１７と同じ間隔を持つ２４個の標的部位を持つ基板１１５と共に使用することが可能である。流入ポート８１０の量および空間的配置は、いずれの基板に対してもそれに合致するよう変更が可能であることが理解されるべきである。例えば、反応封入部材１２１５は、図３に示したような基板１１５と使用できるように、１２×８の格子に配置された９６個の標的部位を持つことも可能である。反応封入部材１２１５は、対応する基板の形・サイズに一致する形・サイズを持つ。反応封入部材１２１５はまた、反応封入部材１２１５を取り扱う際に掴むことが可能なタブ区画１２２０を持つ。
【００７１】
図１３は、図８に示す反応封入部材１２０の厚みより小さくあり得る厚みＴＦを持つ反応封入部材１２１５の側面図を示す。一つの実施態様では、反応封入部材１２１５は約１ｍｍの厚みＴＦを持つ。反応封入部材１２１５は、シリコーンや、ゴムのような熱可塑性材料を含む様々な材料で製造されてよい。
【００７２】
図１２の反応封入部材１２１５は、反応封入部材１２１５が、図１２Ｂに示す様式の反応封入部材となるように、流入ポート８１０、流出ポート８１５、および、フローチャネル８２０を構成することも可能であることが理解されるべきである。さらに、反応封入部材１２０（図８に示す）の実施態様も、図１２Ａおよび１３の反応封入部材１２１５において示される配置に従って多数のウェル１２１７を有することが可能である。
【００７３】
使用時、反応封入部材１２０（または反応封入部材１２１５）は、基板１１５のごく近傍に設置され、そのために、反応封入部材１２０の底面は、図１４に示すように、基板１１５の上面に近接する。図８に示す実施態様を使用する際には、下記で詳述するように、反応封入部材１２０は基板１１５に整列され、そのために、反応封入部材１２０の各フローチャネル８２０が、基板の対応する標的部位列の直上に配されて、その標的部位列の上に細長いチャンバーを形成する。反応封入部材１２１５の実施態様が使用される場合は、反応封入部材１２１５は基板１１５と整列され、そのために、反応封入部材１２１５の各ウェル１２１７が、基板１１５の対応する少なくとも１個の標的部位３１０の上に配されて、その標的部位の上にチャンバーを形成する。これについては下記にさらに詳述する。
【００７４】
（反応封入部材背面プレート）
反応封入部材１２０は、図１４に示すように、基板１１５に対して、さまざまなやり方で、例えば、反応封入部材１２０の底面と基板１１５の上面の間に配置された接着剤を使用することによって、固定確保することが可能である。一つの実施態様では、反応封入部材背面プレート１２５が、反応封入部材１２０が基板１１５に対して適切に整列されるように、反応封入部材１２０を基板１１５の上に確保するために使用される。図１５は、反応封入部材背面バックプレート１２５の斜視図であるが、これが、図１６に関連して下記に詳述するように、反応封入部材１２０が設置・固定され得る座位１５１０を定める。
【００７５】
反応封入部材背面プレート１２５は、反応封入部材が座位１５１０に設置された場合、反応封入部材１２０の流入ポート８１０と整列される複数の流入ポート１５１５を持つ。反応封入部材背面プレート１２５はまた、反応封入部材が座位１５１０に設置された場合、反応封入部材１２０の流出ポート８１５に整列される複数の流出ポート１５２０を持つ。反応封入部材背面プレート１２５はまた、カートリッジカバー１３５と嵌合して、反応封入部材背面プレート１２５を同カバーに固定するための、上方突出フィンガーのような、１本以上の嵌合部材１５３０を含む。図２に、反応封入部材背面プレート１２５の、カートリッジカバー１３５に固定されているところが示される。
【００７６】
図１６は、反応封入部材背面プレート１２５の断面図を示す。背面プレート１２５は、座位１５１０を形成する下面凹部を定める形を取る。この座位は、図１６では、背面プレート１２５の直下にあるものとして描かれている反応封入部材１２０をその中に受容するような大きさに作られている。反応封入部材１２０は、座位１５１０内にぴったりと適合し、かつ、接着剤を使用してまたはプレスばめを介して座位１５１０内に固定することが可能である。背面プレート１２５の流入ポート１５１５と流出ポート１５２０は、反応封入部材１２０が座位１５１０内に適切に設置されると、反応封入部材１２０上の、それぞれ対応する流入ポート８１０と流出ポート８１５に整列する。次に、基板を、標的３１０が流入ポートと流出ポートの下で適切に整列されるよう、反応封入部材の下に設置することが可能となる。
【００７７】
（カートリッジの組み立て）
再び図１と２を参照すると、基板アセンブリ１１０は、図５と６に関連して前述したように、先ず基板１１５をカートリッジ基盤１３０に取付することによって組み立てる。図２はカートリッジ基盤１３０に取付された基板１１５を示すが、その際、基板１１５は、基板１１５の底面は開口部５１０越しに下方に向け、基板１１５の上面（すなわち、生物サンプルが静置される面）は上に向けて、開口部５１０の上に設置される。
【００７８】
次に、反応封入部材１２０が、流入ポート８１０、流出ポート８１５、および、フローチャネル８２０が、前述のように基板１１５の標的部位と整列されるように、基板１１５の上面に設置される。反応封入部材１２１５を使用する場合は、その反応封入部材を、基板の上に、各ウェル１２１７が、基板１１５の少なくとも１個の対応する標的部位の上に配されるように設置する。前述のように、反応封入部材１２０は、接着剤を用いて基板１１５の上に設置されてもよい。
【００７９】
別の実施態様では、反応封入部材１２０は、図１６に示すやり方で反応封入部材１２０を背面プレートの座位１５１０に挿入することによって、先ず反応封入部材背面プレート１２５に結合される。一旦反応封入部材１２０が背面プレート１２５に結合されたならば、次に、図２に示すように、背面プレート１２５を、その背面プレートの嵌合部材１５３０をカートリッジカバー１３５の対応するスロットに挿入することによって、カートリッジカバー１３５に装着することが可能である。一つの実施態様では、背面プレート１２５とカートリッジカバー１３５の間の嵌合配置により、背面プレート１２５は、カートリッジカバー１３５に対してある程度の動きを持つことが可能となり、そのために、パックプレート１２５は、カートリッジカバー１３５に対して「浮く」ことになる。背面プレート１２５は、カートリッジカバー１３５に対して、３軸に沿って少なくとも約２ミリメートルの範囲の動きを持つことが可能である。これによって、後述するように、背面プレート１２５／封入部材１２０および基板１１５間の適切な位置合わせが促進される。背面プレート１２５はまた、カートリッジカバー１３５に対してある程度の回転運動を持つようになっていてもよい。
【００８０】
背面プレート１２５と反応封入部材１２０がカートリッジカバー１３５に装着された後、カートリッジカバー１３５はカートリッジ基盤１３０に固定される。前述のように、カートリッジ基盤１３０は整列ピン５３０を含む。このピンは、カートリッジカバー・基盤間の適正な整列と位置合わせばかりでなく、反応封入部材１２０と基板１１５の適切な整列と位置合わせを促進するために、カートリッジカバー１３５の対応する整列穴７２５と嵌合する。整列ピン５３０は、背面プレート１２５の対応する整列穴と嵌合する特別整列ピン５３０ａ（図２に示す）を含む。カートリッジカバー１３５が下降し、カートリッジ基盤１３０と嵌合するにつれて、整列ピン５３０ａは、背面プレート１２５の穴に滑り込んで嵌合する。前述のように、背面プレート１２５は、カートリッジカバー１３５およびカートリッジ基盤１３０に対して移動が可能であり、そのために、カートリッジカバー１３５がカートリッジ基盤１３０と嵌合した際に、背面プレート１２５（および付属の反応封入部材１２０）を動かして、基板１１５に対して適正な位置合わせ位置に置くことが可能となる。基板１１５はまた、プレスばめ方式によって背面プレート１２５と嵌合し、それによって適正な整列を確保することも可能である。この場合も、背面プレート１２５は、カートリッジカバー１３５が基盤１３０と結合した場合に、基板と適正な整列を実現する位置に移動する。
【００８１】
図１７は、組み立てられた基板アセンブリ１１０の断面模式図である。基板アセンブリ１１０の成分の構造的詳細のいくつかは省略した。また、各種成分の相対的大きさは、図１７の簡明と描画の簡便のために誇張されている。基板１１５はカートリッジ基盤１３０に取付され、その際、反応封入部材１２０は基板１１５の上に配され、カートリッジカバー１３５によって所定の位置に確保される（図１７では、反応封入部材背面プレート１２５は、その使用は可能であるけれども、示されていない）。反応封入部材１２０のフローチャネル８２０は一列の標的部位３１０の上に配される。標的部位は、図１７では、フローチャネル８２０内の四角で表される。従って、フローチャネル８２０は、この一列の標的部位３１０を囲み、かつ、流入ポート８１０を通じて入口を、流出ポート８１５を通じて出口を持つ細長いチャンバーを形成する。流体は、図１７の矢印で示されるように、流入ポート８１０を通じて注入し、流出ポート８１５を通じてフローチャネル８２０から流出させることによってフローチャネル８２０の中を流通され得る。
【００８２】
図１８は、図１２Ａ・１２Ｂに示した反応封入部材１２１５の実施態様を使用して組み立てられた基板アセンブリ１１０の断面模式図である。反応封入部材１２１５は多数のウェル１２１７を含み、これらのウェルはそれぞれ対応する標的部位に整列する。各ウェル１２１７は、対応する標的部位３１０を含むチャンバーを形成する。
【００８３】
（基板アセンブリによるサンプルの処理）
基板アセンブリ１１０は、基板１１５の標的部位に生物サンプルを静置したり、また、標的部位を試薬のような各種物質に浸し、それによって、基板の上に形成されるチャンバー内でそれら物質を用いる化学反応を実行するのに使用が可能である。これは、図１９に示す装置１９１０のような基板処理システムの上に基板アセンブリ１１０を設置することによって達成が可能である。装置１９１０は、ワークステーションを形成する、実質的に水平な平面１９１５を定めるテーブルのような構造を含む。この平面には、基板１１５を含む基板アセンブリ１１０を載置することが可能である、ワークステーションが形成される。基板アセンブリ１１０は、表面１９１５上で、基板アセンブリ１１０の上面または天辺が上を向くように、それによって、流入ポート８１０および流出ポート８１５も上を向くように、または、ウェル１２１７の開口部が上を向くように設置することが可能である。
【００８４】
装置１９１０はまた、ナノ分注器１９２０やマイクロ分注器１９２２のような１個以上の可動性分注器を含む。分注器は、反応封入部材１２０の流入ポート８１０、または、ウェル１２１７の中に、周知のやり方で挿入が可能な１個以上の投薬ノズルを含む。一つの実施態様では、ナノ分注器１９２０は、約１ナノリットルという最低容量下限まで流体を投入することが可能であり、また、マイクロ分注器は、約０．５マイクリリットルμＬという最低容量下限まで流体を投入することが可能である。ただし、投入容量は変更が可能であることを理解しなければならない。
【００８５】
分注器１９２０、１９２２は、支持構造１９３０に移動可能に取り付けられる単一の投薬ヘッド１９２５に装着される。支持構造は表面１９１５から上方に延び、投薬ヘッド１９２５を表面１９１５の上に宙吊りする。別態様として、分注器１９２０、１９２２は、別々の投薬ヘッドに装着することも可能である。支持構造１９３０は、テーブル１９０２に可動的に装着され、それによって、支持構造を、基板アセンブリ１１０に関して第１水平軸１９３５によって定められる方向にそって移動可能となるようにしてもよい。投薬ヘッド１９２５は、支持構造１９３０の上に可動的に装着され、それによって、投薬ヘッドを、基質アセンブリに対して、垂直に延びる第２軸１９３６によって定められる方向に沿って移動可能となるようにしてもよい。投薬ヘッド１９２５はまた、基質アセンブリに対して第３軸にそって移動可能とし、それによって、分注器１９２０、１９２２が、基板アセンブリ１１０に対して、異なる三つの軸にそって移動可能となるようにしてもよい。従って、分注器１９２０、１９２２は、表面１９１５のワークステーションに設置された場合、移動して、基板アセンブリ１１０の流入／流出ポートまたはウェルと嵌合することが可能となる。分注器１９２０、１９２２はまた、作業表面１９１５上の様々な部位に移動して、作業表面１９１５のその他の品目と交渉することも可能である。一つの実施態様では、投薬ヘッド１９２５と支持構造１９３０の移動は、周知の方法で、ロボット的に、かつ、遠隔的に制御することが可能である。
【００８６】
表面１９１５は、基板アセンブリ１１０に加えて他の品目を支持するスペースを提供できるほどに十分に大きい。例えば、表面１９１５は、流体、例えば、試薬やその他の物質を含むための複数のウェルを含む微小定量プレート１９３７を置くのに十分なスペースを持つことも可能である。分注器１９２０、１９２２は、分注器の先端が、微小定量プレート１９３７のウェルの中に進入し、ウェルから物質を吸引できるような位置に移動することが可能である。次に、分注器１９２０、１９２２は嵌合位置に移動し、そこで、分注器の先端を基板アセンブリ１１０のウェルまたは流入ポートに挿入し、試料をそのウェルまたはポートに注入することも可能である。表面１９１５または、装置１９１０の別のどれかの部分が、例えば、分注器１９２０、１９２２を水洗するための水のような追加の材料を含む、その他のウェルまたは容器を含むことも可能である。
【００８７】
装置１９１０はまたサーマルサイクラーを含んでもよい。このサーマルサイクラーは、表面１９１５のワークステーションに設置される基板アセンブリ１１０に配される基板の温度を周期変化させるのに使用が可能である。このサーマルサイクラーのある特定の実施態様をさらに下記に説明する。
【００８８】
好都合なことに、ＰＣＲおよび他の化学過程を含む様々な過程が、装置１９１０を用い、基板の標的部位に含まれる生物材料に対して、基板を装置１９１０のワークステーションから移動させることなく、実行が可能である。試薬のような物質を、分注器から投与して流入ポート８１０に流し込み、物質が流入ポート８１０の対応標的部位の上を流れるようにしてもよい。フローチャネル８２０を有する反応封入部材１２０を使用する場合は、図１７に示すように、単一流入ポート８１０を用いて、試薬を、全体列の標的部位の上に流すことが可能である。別態様として、反応封入部材１２１５を用いてもよいし、また、複数の標的部位について、各標的部位専用の流入ポート８１０を用いて、個別に曝露させてもよい。
【００８９】
ある状況では、フローチャネルの流入および／または流出ポートを密閉することが必要となることがある。ポートの密閉は様々なやり方で実行が可能である。一つの実施態様では、図２０に示すように、各流入ポートおよび／または流出ポートを、ポートの中に、そのポートに対する栓として挿入される密閉ピン２０１０によって密閉する。密閉ピン２０１０は、下端が開放されていて、それを通じて、密閉ピン２０１０がポートに挿入される際に、余分な空気の漏出が可能とされる内部軸２０１５を含むことも可能である。密閉の際、密閉ピン２０１０はポートに向かって押し下げられ、それによって、ピン２０１０は、過度のサイズによる押し込み適合によって、または、ステップ１０１０（図９Ｂに示す）を押し下げることによってポートを塞ぎ、ポートを底部において閉鎖する。反応封入部材の微小定量基板実施態様におけるウェルを密閉するには、一組の固相密閉ピンの使用も可能である。
【００９０】
図２１は、ポートを密閉する別の方法を示す。この場合、水平力２１１０が、反応封入部材１２０の両側面に印加されて、流入ポート８１０および／または流出ポート８１５を捻って閉鎖する。この密閉法を用いた場合、反応封入部材１２０は、力２１１０の印加によってウェルの捻転閉鎖を可能とするほど十分に柔らかい材料から製造される。
【００９１】
図２２は、反応封入部材１２１５におけるウェル１２１７を密閉するためのさらに別の方法を示す。この方法では、平面２２１０が反応封入部材１２０の上に設置される。この平面はウェルの上部開口部を被い、それによってウェルの開口部を密閉する。一つの実施態様では、この平面はプラスチックであってもよい。このプラスチックは圧縮を避けるために加熱してもよい。
【００９２】
（サーマルサイクラー）
図２３は、基板を、ＰＣＲ工程の際のように、サーマルサイクルにかけることを可能とするサーマルサイクラー２３１０の模式図を示す。このサーマルサイクラーは、下記にさらに詳述するように、図１９に示す装置１９１０に、例えば、表面１９１５の作業部位に組み込まれる。基板１１５は、このサーマルサイクラー２３１０の支持面に設置される。その際、基板１１５は基板アセンブリ１１０の内部に配される。ただし、図２３は、カートリッジ基盤１３０、カートリッジカバー１３５および反応封入部材１２０を示していない。サーマルサイクラー２３１０は、基板１１５を加熱するのに用いられる、１個以上の加熱接点２３１５を含み、かつ、基板を冷却するのに使用される冷却システム２３２０、および、基板１１５の温度を測定するのに用いられる温度プローブ２３３０も含むことが可能である。制御器２３３３は、サーマルサイクラー２３１０を制御するのに使用される。
【００９３】
加熱接点２３１５は、例えば、金属の細長いロッドのような伝導性ロッドを含んでもよい。加熱接点２３１５の一部、例えば、加熱接点２３１５の上端は、基板の抵抗性コーティング４１０に接触する。加熱接点２３１５を通じてこの抵抗性コーティングに電流を印加すると、これは抵抗性コーティングを発熱させるので、基板１１５と抵抗性コーティング４１０の間の熱的接続を通じて基板１１５も加熱される。加熱接点２３１５は、抵抗性コーティング４１０全体に渡って均一な電流シートを形成する。加熱接点２３１５と抵抗性コーティングの間の接触面積が大きければ大きいほど、抵抗性コーティング４１０の上により均一な熱の分布が得られることが従来から判明している。しかしながら、こうするとそれはまた、基板と電気接点の間により高い熱流を生じる結果を招き、それは、接触点が基板１１５の温度に影響を及ぼす可能性があるということで望ましいことではない。従って、一般に、加熱接点２３１５と基板１１５の間の接触面積量と、加熱接点２３１５と基板１１５の間の熱流量との間にはバランス点が存在する。
【００９４】
図２４に示す加熱接点２３１５の一つの実施態様では、各加熱接点は、スプリング２４２０に上に取り付けられたポゴピン２４１０を含む。基板１１５とポゴピン２４１０の相対的大きさは、図２４では図示の簡明のために誇張されている。スプリング２４２０は、基板１１５がポゴピン２４１０の先端に設置されると、ポゴピン２４１０に対して負荷を与えるので、ピン２４１０の上端は基板１１５の底面の抵抗性コーティング４１０を圧迫する。スプリング２４２０とポゴピン２４１０から構成される加熱接点２３１５は、図１９に示すように、装置１９１０の平面１９１５上に設置されてもよい。
【００９５】
一つの実施態様では、二つの加熱接点２３１５が、基板の対向縁に沿って設置され、基板１１５の長さに沿って約１／３間隔で隔てられる。加熱接点２３１５についてはその他の間隔・設定配置の使用も可能であることを理解しなければならない。加熱接点２３１５は、基板１１５の接触面積を最小にするが、それでも加熱接点２３１５と基板１１５間の接続は確保するために、一般に球形の先端を持つ。前述のように、接触面積を最小にすることは、ピンと基板１１５の間の熱流を最小にすることとなり、ピンは基板１１５の温度にはほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【００９６】
図２３に示すように、温度プローブ２３３０は基板１１５と接触して基板の温度を測定する。温度プローブ２３３０は、一般に、プローブ先端と基板との間の熱伝導をきわめて低いものとするような形態を取る。このため、プローブ２３３０は基板１１５の温度に影響を与えない。この点で、温度プローブ２３３０は一般に熱質量は低い。図２５Ａは、温度感知要素としてサーミスタを含む温度プローブ２３３０の第一実施態様を示す。サーミスタは、基板１１５に接触する平面を持つ、小さな金属製接触要素２５１０に埋め込まれる。接触要素は、金属（例えば、アルミニウムまたは黄銅）から作られる。接触要素２５１０は、針２５１５によって、針を軸として回転し、それによって、接触要素２５１０の平面と基板１１５の間の接触を維持可能とするように保持される。接触要素２５１０は、埋め込まれたサーミスタを介して基板１１５の温度を測定し、その温度を示す信号を、針２５１５に付属する、または、埋め込まれるワイヤを通じて周知の様式で伝送する。温度読み取り器２５３０は、この温度を周知の様式で監視し、記録する。
【００９７】
図２５Ｂに示す温度プローブの別の実施態様では、針２５１５の先端は、接触要素２５１０内の球形空洞中に収められたボール２５４０に付着する。このボールは、球形空洞と、接触要素２５１０を回転可能に維持し、それによって基板１１５との接触を維持可能とするやり方で相互作用を持つ。さらに別の実施態様では、基板１１５の温度は基板上に一体化された温度センサーを用いて測定される。前述したように、サーマルサイクル時には、環境が基板１１５に及ぼす熱寄与を最小にすることが望ましい。この点で、温度プローブ２３３０のある部分は、接触の結果として、プローブが、基板１１５に対して熱を伝播する、または、基板から熱を引き込む可能性を低下させる温度に加熱してもよい。例えば、針２５１５は、針２５１５と基板の間の熱交換を最小にするように加熱し、それによって、針２５１５が、基板１１５の温度に対してほとんどまたは全く影響を持たないようにすることも可能である。針２５１５は、針２５１５と基板間に熱交換の生じないよう基板と同じ温度に加熱することも可能である。このようにすると、接触要素の温度は基板１１５の温度を正確に反映することになる。
【００９８】
再び図１９を参照すると、温度プローブ２３３０は、一般に、装置１９１０の平面１９１５の上に、例えば、表面１９１５から上方に延びる、いくつかのタイプの支持構造を用いて取り付けられる。支持構造は、基板アセンブリ１１０の上位位置に温度プローブ２３３０を支持し、プローブが基板１１５の温度を測定することが可能である。
【００９９】
再び図２３を参照すると、冷却システム２３２０は、所望の温度サイクルによって要求された場合に基板を冷却するように機能する。冷却システム２３２０は、基板１１５から熱を取り去る。一つの実施態様では、冷却システム２３２０は、冷却のために基板上に空気を吹き付けるファンを含む。ファンは加熱中は切ることも可能である。別態様として、ファンは常にオンのまま放置して、ヒーター電力を調節して加熱を変えてもよい。基板１１５を冷却するには他にも方法がある。例えば、（１）流体、例えば、水またはアルコールの霧を、基板底面に吹き付けること、（２）冷塊を基板に接触させて基板から熱を吸収すること、（３）ノズル（ファンではなく）を用いて圧縮空気を基板上に吹き付けること、（４）圧縮空気渦巻きクーラーの使用、が挙げられる。冷却システム２３２０は、装置１９１０の、例えば、表面１９１５の下に取り付け、基板アセンブリ１１０には、表面１９１５の穴を通じて接触することも可能である。
【０１００】
サーマルサイクラー２３１０の各種成分は、基板の上面または底面への接触を要求することがある。例えば、温度プローブ２３３０、加熱接点２３１５、および、冷却システム２３２０は、基板の表面との接触を要求する成分を持つことがある。好都合なことに、基板アセンブリ１１０は、基板１１５がカートリッジに取り付けられた場合でも基板表面への接触を用意する。カートリッジ基盤１３０は開放口５１０（図５に示す）を持つが、これによって、基板をカートリッジに取り付けた場合、基板１１５の底面に対する接触が可能となる。同様に、カートリッジカバー１３５は開放口７１０（図２に示す）を持つが、これによって基板１１５の上面への接触が実現される。開放口５１０および７１０によって、基板１１５がカートリッジ内に包み込まれた場合でも、複数の電気接点、複数の温度プローブ、および、冷却システムに対し基板表面の接触は実現される。
【０１０１】
図２６は、サーマルサイクラー２３１０の各種成分の斜視図を示す。ワークステーション２６１０は、基板アセンブリ１１０の取付可能な平面を含む。ワークステーションは、装置１９１０（図１９に示す）の表面１９１５に、サーマルサイクラー２３１０のワークステーション２６１０も、装置１９１０のワークステーションとなるようなやり方で組み込まれる。ワークステーション２６１０の平面は、装置１９１０の表面１９１５と一体的に形成されてもよいし、または、別の平面であってもよい。基板アセンブリ１１０は装置１９１０の平面１９１５の上に設置されるが、基板アセンブリ１１０が静止位置を維持している間、マイクロおよびナノ分注器１９２０、１９２２を通じて物質投与を可能にしながら、サーマルサイクルの実行を可能とするやり方で設置される。作業領域２６１０は、基板アセンブリ１１０と接触できるように、作業領域上に上向きに配された複数の接点２３１５を含む。図２６に示す冷却システム２３２０は、空気を、上方、基板アセンブリ１１０の基板に向かって吹き付けるファン２３３５を含む。前述のように、冷却システム２３２０は、装置１９１０の中に取り付けることも可能である。
【０１０２】
前述したように、サーマルサイクラー２３１０は、基板１１５の面を横切る均等な熱分布を実現する。図２７は電気接点界面の模式図を示す。この中間体は、各接点２３１５を通じて電流を「整形」する能力を持ち、基板１１５の全面を横切る均等な熱パターンを実現する。第１組の接点２３１５ａは基板１１５の一端に沿って配置され、第２組の接点２３１５ｂは基板１１５の対向端に沿って配置される。抵抗器Ｒが、接点２３１５ａ，２３１５ｂの少なくとも一つと直列に設置され、また、一つの実施態様では、接点２３１５ａ、２３１５ｂの全てと直列に設置される。電流センサー２７１０も、趣致の様式で各接点２３１５と、各接点２３１５に対する電流を感知・監視するために、直列に設置される。電流センサー２７１０を用いて、電流調節のために、測定した電流を制御器にフィードバックすることも可能である。
【０１０３】
次に、電流を第１組接点２３１５ａに与え、基板１１５の第１辺縁から、抵抗性コーティングを通じて、対向辺縁の第２組接点２３１５ｂに向けて電流を流す。当業者であれば、第１組接点２３１５ａにおける正味電流は、第２組接点２３１５ｂにおける正味電流と等しいことが了解される。一定電圧を維持しながら、抵抗器Ｒの内の１個以上の値を他の抵抗器Ｒに対して変え、それによって、電気接点２３１５ａ，２３１５ｂを流れる電流を個別に調節することも可能である。例えば、抵抗器Ｒ１は、抵抗器Ｒ１０に対して、二つの間では同じ電圧を維持しながら、より高い抵抗を持ってもよい。これによって、抵抗器Ｒ１に付着する接点２３１５に対する電流はより低くなる。従って、複数の接点２３１５を通じて流れる相対的電流は、一方の接点に対する他方の接点の抵抗レベルを調節することによって調節することが可能である。すなわち、各接点２３１５を流れる電流は、他の接点に対して増減させることが可能であり、そのために、基板１１５表面を横切る温度プロフィールを調節することも可能である。温度プロフィールはまた、基板１１５の抵抗性熱コーティングをパターン化することによって調節することも可能であるけれども、図２７に示したセットアップを、抵抗性コーティングをパターン化することに関連する困難や出費を避けるために使用することも可能である。図２７は、基板１１５の対向辺縁に沿って設置される５個の接点２３１５を示す。しかしながら、接点２３１５の量・位置は、他の加熱プロフィールを実現するよう変更することも可能であることが理解される。
【０１０４】
基板アセンブリ１１０と処理装置１９１０は、生物材料のサンプルを基板１１５に静置し、その材料に対して多種多様な処理・分析を実行するのに使用が可能である。例えば、基板アセンブリは、標的部位に含まれる生物サンプルに対して、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出処理、または、多種多様な生化学的処理の内のいずれかを実行するのに使用が可能である。このような過程の内の第一工程では、生物材料、例えば、捕捉オリゴの１個以上のサンプルが周知の様式で採取され、次に、基板１１５に静置されて複数の標的部位を形成する。次に、基板１１５はカートリッジに取付されて基板アセンブリを形成する。
【０１０５】
次に、この標的部位は、反応封入部材１２０によって基板１１５の上に形成されるチャンバーに物質を投入することによって、様々な物質の内のどれかに曝露することが可能である。好都合なことに、図１９に示す装置１９１０は、物質をチャンバーに投与するのに使用が可能である。反応封入部材１２０を使用する場合は、分注器１９２０または１９２２が、図２８に示すように、試薬のような物質を流入ポート８１０に注入する。試薬は、図２８の矢印の示すように、流入ポート８１０を流下して、フローチャネル８２０によって形成されるチャンバーを流れる。このようにして、試薬は、このチャネル内に配置される標的部位の全てに曝露される。試薬は、出口ウェル８１５を通じてチャネル８２０から流出する。別態様として、各標的部位を、反応封入部材１２１５を用いて、個別に物質に曝露することも可能である。この場合、分注器は、図２９に示すように、反応チャンバーの各ウェル１２１７に対して１個の投薬ピンを備えた、一連の投薬ピンアレイを含むことになる。標的部位に対し、流入ポート・流出ポートを用いて、試薬以外の物質を曝露させることも可能であることを理解しなければならない。
【０１０６】
チャンバー内に含まれる物質のサーマルサイクル処理は、基板１１５をカートリッジから取り外すことなく、かつ、基板を装置１９１０の同じ位置に静置したままで、図２３に示す温度サイクル装置２３１０を用いて実行が可能である。電流を基板１１５に与えて、所望の温度サイクルに従って基板１１５を加熱する。基板１１５は、サーマルサイクラーの冷却システム２３２０を用いて冷却する。次に、基板１１５は、カートリッジ基盤１３０からカートリッジカバー１３５を取り外すことによって、カートリッジから外すことが可能である。次に、基板１１５を当業者には公知の適当な装置に移動することによって、基板１１５にＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施してもよい。
【０１０７】
（Ｄ．反応実行法および反応分析法）
本明細書では、基板表面において、生物分子を含む１種以上の反応を実行し、かつ、得られた１つ以上の反応生成物を分析するというその両方のための方法が提供される。本発明の特定の実施形態では、少なくとも２種以上の反応が実行される。別の実施形態では、少なくとも３種以上の反応が実行される。一つの実施形態では、たった一つの反応が実施される場合、その反応は、ハイブリダイゼーション反応ではない。ある特定の実施形態では、反応（単数または複数）は実質的に溶液中で実行される。実質的に溶液中で実行される反応とは、大多数の反応物質間の相互作用が溶液の中で行われ、大多数の反応物質および任意の中間体が、溶液中に存在する反応である。ある特定の実施形態では、反応生成物（単数または複数）は基板の表面に捕捉される。
【０１０８】
上記方法のうちの一つの実施形態では、反応（単数または複数）および少なくとも検出プロセスの開始は、それぞれ、同じ単一の標的検出位置の存在下で実行される。上記方法のうちの別の実施形態では、反応（単数または複数）および少なくとも検出プロセスの開始は、それぞれ、同じ２個以上の標的検出位置の存在下で実行される。ある特定の実施例では、標的生物分子（例えば、核酸）は、基板上の、標的捕捉部分を付着させた不連続部位（標的検出位置と呼ばれる）に適用される。この標的検出位置の存在下で、標的分子を含む１種以上の反応が実行され、得られた生成物は固相によって固定化される。標的検出位置にて反応生成物（単数または複数）を捕捉したならば、反応生成物（単数または複数）の分析または検出が、その標的検出位置で進行する。例えば、ＭＡＬＤＩ質量分析によって分析する場合、捕捉された反応生成物は、マトリックス物質に接触させてＭＡＬＤＩ−ＭＳをやり易いようにされ得、そしてレーザーに暴露されて、標的検出位置における反応生成物（単数または複数）のイオン化を開始される。この標的検出位置は、一つのチャンバーまたはチャネルの中に含まれてもよい。
【０１０９】
本明細書において提供される方法の特定の利点は、捕捉した標的生物分子を、捕捉前溶液相反応が実行されたのと同じ位置で検出することである。従って、捕捉前溶液相反応の位置と、標的検出位置とは同じである。この特定の特徴は、コストおよび時間を低減し、高処理能形式でその反応を自動的に実行しようとした場合必要とされる装置の量および複雑性を低減する。この特徴は、その内部において液相反応が生じる１個以上の反応チャンバーまたはチャネルを形成する反応封入部材を、標的検出位置における標的捕捉工程の終了後に、基板から除去することによって実現される。従って、本明細書で提供される方法では、液相反応生成物を、標的生体分子の捕捉前に、その中に捕捉部分を備える新たな標的検出位置および／または新たな溶液へと物理的に移送することが要求されない。例えば、基板がチップである場合、このチップは、溶液相反応期間中、少なくとも反応生成物（単数または複数）が捕捉されるまで、好都合にも静止を持続することが可能である。一旦反応生成物（単数または複数）が捕捉されたならば、チップは、取り出され得、そして／または、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のような検出分析のために調製することが可能である。
【０１１０】
この方法は、生物分子の正体、構造的特性および／または機能的特性に関する情報、または、あるサンプル中における特定の生物分子の存在または不在に関する情報を得るために生物分子の分析が実行される、様々の用途で使用が可能である。そのような用途としては、生物科学、生物医学および製薬科学における、重要な診断法、スクリーニング法、発見および検出法が挙げられる。例えば、ある核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける特定の多型または変異の正確な決定は、遺伝子障害の診断に用いられることがよくある。レセプターまたは他の細胞成分、および／または、その機能的結果に対する分子（例えば、ペプチドまたは有機低分子）の結合の正確な検出は、疾患処置用治療剤をスクリーニングする方法において、しばしば用いられる。病原因子（例えば、細菌およびウイルス）の特徴的要素の検出は、しばしば感染症の診断に用いられる。生体高分子（例えば、核酸およびタンパク質）の配列の決定、または、多型ヌクレオチドの正体の決定は、診断法、遺伝子型決定法、および、多型性同定法においてよく用いられる。
【０１１１】
本明細書で提供される、生体分子を含む反応を実行および分析するための方法の特定の実施形態では、反応（単数または複数）は、実質的に溶液中で実行される。溶液相反応は、反応が固相支持体の上で実行される場合に課される不利、制限および限界を免れる。例えば、溶液相反応は３次元で起こるが、一方、固相支持体上での反応は２次元に制限され、立体阻害、十分な攪拌の不足、または、反応物質の吸着によって、重大な影響を被り得る。さらに、ある種の反応（例えば、特定の分子形状の認識、立体配置の認識、または、活性部位の認識を必要とする反応）は、固相支持体の上で実行すると抑制され得る。なぜなら、表面の上に固定化された分子は、溶液相にある時とは異なる形態または立体配置を有し得るからである。これらの制限は、特に、本明細書で用いられる反応にとって不可欠であり、かつ、分析の標的生体分子であり得る、酵素およびタンパク質のような高度に機能的な高分子に対して大きな影響を及ぼす。
【０１１２】
本明細書に提供される、生体分子を含む反応を実行および分析するための特定の方法では、反応の生成物は、基板（例えば、反応が実行されるチャンバー中にあり得る基板）上に捕捉される。これによって、その生成物は、定められた位置（例えば、標的検出位置）に、分析または検出のために保持される。典型的には、反応生成物（単数または複数）はチャンバーの内側底部で捕捉され、この底部は、例えば、基板であり、この基板は、反応生成物を、他の分子をチャンバーから除去するかまたは洗浄するのに用いられるプロセスの間、基板に付着させることによってその反応生成物を保持する様式で反応生成物（単数または複数）と特異的相互作用可能である。これらの方法で分析される生成物が捕捉されることは、いくつかの利点を提供する。例えば、基板（例えば、チャンバー中）の生体分子に対して実行される反応は、溶液中で実行が可能であり、反応生成物の反応後処理および分析前調製は全て、反応が、固相支持体に固定化された生体分子に関して実行される場合に課され得る制限を伴うことなく、実行が可能である。さらに、分析される反応生成物を捕捉することは、分析前の生成物の単離および精製をやり易くすることにより、分析をあいまいにし得る試薬、化学物質、ならびに、その他の分子および汚染物質を低減または除去する。さらに、捕捉された反応生成物（単数または複数）は、基板の特定領域に配置され、この領域は、別の領域に固定化された他の反応生成物を付着させてもよい。従って、多数の異なる反応を、別々のチャンバーまたは単一のチャンバー内で実行するが、基板における反応生成物の別個の位置にあることを利用して個別に分析し得る。
【０１１３】
本明細書に提供される方法は、基板表面で（例えば、単一チャンバー内で）、僅かな容量で実行することによって、試薬の量、試薬および生成物の移送、ならびに生体分子の実行および分析に必要とされる処理時間が低減され得る。この方法は小型化にきわめて好適である。この方法は、多数反応の平行処理用のマルチチャンバー方式で実行され得、そしてまた、多数の異なる生体分子を、単一チャンバー内において反応および分析するように実行することも可能である。従って、本明細書に提供される方法は、多数の異なる生体分子の、高速、高感度、および、正確な分析（例えば、高処理能力スクリーニングプロセスにおいてなされ得るような分析）に対して特に好適である。本明細書において特定の実施形態において記載されるように、２種以上の個別の別個の反応が、基板（例えば、チップ）の上の、２個以上のそれぞれの不連続な位置で並列して起こる。基板の反応封入部材内部で反応（単数または複数）を実行するのに用いられる反応チャンバーまたはチャネルの総数は、基板の大きさ、および／または反応封入部材成形上の制限に応じて、所望される程度に多さであり得る。一つの実施形態では、単一反応封入部材の中に、最大５，０００個以上の反応チャンバーが、本明細書における使用について企図される。例えば、反応封入部材における反応チャンバーまたはチャネルの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、最大５０００以上の範囲であり得る。
【０１１４】
同様に、基板上、および／または、特定の反応チャンバーまたはチャネル内の標的検出位置の総数は、所望される化学反応を実行するのに十分なサンプルサイズが存在することが保証される限り、望むだけ多くの別個のサンプル検出位置であり得る。一つの実施形態では、反応封入部材内部の各単一反応チャンバーは、一つの基板の上に、最大５，０００個以上の別個の標的検出部位を含み得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９６、１００、２００、３００、３８４、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、１５３６、２０００、３０００、４０００、最大５０００以上の、不連続な標的検出位置が、一つの基板上の、１個以上の反応チャンバーまたはチャネルの中に限定され得る。
【０１１５】
本明細書の一つの実施形態において記述するように、上記反応は、捕捉生体分子を載せた基板表面の存在下で、溶液中で行われる。一つの実施形態では、その反応（例えば、ＰＣＲおよび／またはプライマー伸長）は、捕捉生体分子を載せた基板表面において行われ、その基板表面はまた、反応封入部材のチャンバーまたはチャネルによって囲まれ、そのために、上記プロセスを通じて、反応は、単一標的検出位置に限定される（図１２Ａおよび１３）。例えば、８個の標的検出位置１２列を持つ９６標的位置チップを利用する一つの実施形態では、９６種の不連続溶液相反応混合物が、例えば、並列して用いられ、この結果、溶液中の各反応混合物は、その上に捕捉生体分子を載せた対応する９６個の不連続標的部位を持つ基板表面により限定される（図１２Ａおよび図１３参照）。チャンバーの周囲の壁は、例えば、チャネル、チャンバーを形成するかまたはマイクロタイタープレートのウェルを模倣するために、円形、正方形、長方形等どのような形であってもよい。
【０１１６】
別の実施形態では、上記一種以上の反応は、反応封入部材のチャンバーまたはチャネルによって囲まれる、捕捉生体分子を載せた基板表面で起こり、この反応封入部材は、反応を、上記プロセスを通じて２個以上の標的検出位置に限定する。ある特定の実施形態では、反応（単数または複数）は、基板表面（チップ）全体に含まれる全標的検出位置のうちのサブセットのみに限定される。例えば、８個の標的検出位置１２列を持つ９６標的検出位置チップを用いる実施形態では、１２種の不連続溶液相反応混合物が、並列して使用され、これにより、溶液中の各反応混合物は、その上に捕捉生体分子を載せた８個の不連続な標的検出位置を持つ基板表面により限定される（図１２Ｂ参照）。この実施形態では、上記１２種の不連続溶液相反応混合物は、反応封入部材において、各反応混合液を分け隔てるチャネルによって限定される。他の実施形態では、一つの反応封入部材の中に収められた２０個の反応チャンバーまたはチャネルが、各反応チャネルまたはチャンバー内に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の不連続検出位置を有する基板の上に重ねることが、企図される。
【０１１７】
（サーマルサイクル処理）
本明細書で提供される方法および装置を使用する利点のうちの一つは、高速サーマルサイクル処理能である。従来利用可能なサーマルサイクラーは、標準的マイクロタイタープレートを加熱するための大きな熱ブロックを含む。これら従来のシステムでは、ブロックの大きな熱質量のために、熱上昇（ｔｈｅｒｍａｌ  ｒａｍｐｉｎｇ）（例えば、ブロックまたはシステムの加熱速度）は、約１〜２℃／秒である。さらに、試薬容量が比較的大きい（例えば、５〜２５μｌ）ために、流体の温度上昇ならびに冷却速度は、さらに低減させられる。コンピュータシミュレーションでも示されているこれらの従来のシステムに関する別の不利は、金属ヒーターそのものの温度分布は均一であるが、およそ数℃の不均一なサンプル温度分布が存在することである。これらの不利点は、マイクロタイタープレートそのものの許容度と関連する技術的困難と折り合いを付けられる。例えば、製造業者によるマイクロタイタープレート設計の変動に起因して、熱ブロックに対するマイクロタイターウェルの堅固な直接接触は、必ずしも常には実現されない。標準的マイクロタイタープレートの使用時に、空気ギャップが、ウェルと熱ブロック壁との間に存在し、これがさらに、不均一な加熱および温度分布を招く。さらに、加熱速度は、さらに多くの電力を用いることによって増大され得るが、冷却は、しばしば、ヒーターブロックの高い熱質量に起因して、より困難である。
【０１１８】
本明細書に提供される方法および装置は、有利なことに、大きな熱質量の使用、およびサンプル容量を加熱するための二次プラットフォームの使用を避ける。さらに、サーマルサイクル処理のために熱ブロックの中に安置される容器を用いることをせず、本明細書に提供される方法および装置は、サーマルサイクル処理するのに反応容器（すなわち、基板）そのものを用いる。本明細書に記載する通り、基板（例えばチップ）が、サーマルサイクラーそのものとして振舞う。例えば、一つの実施形態では、個々のウェルは、シリコンギャスケット（すなわち反応封入部材）によって、例えば、標準の９６ウェル、３８４ウェル、または、それ以上の個数のウェルの形式（例えば、図１１参照）と適合する形式で形成される。
【０１１９】
本明細書で提供される方法および装置の基板内部においてサーマルサイクル機能を一体化したことは、従来のサーマルサイクラーのヒーターブロックに見出される空気ギャップを排除する。本明細書で提供される方法および装置の特定の実施形態では、基板（例えば、シリコンチップ）およびサンプル量は、マイクロタイタープレートにおける従来のサンプル容量よりも数桁小さいので、反応混合物のより速い加熱（例えば熱上昇）および冷却が、実現される。
【０１２０】
標的生体分子が核酸であり、反応の一つが核酸増幅反応および／またはプライマー伸長反応である、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、有利なことに、本明細書に記載する通りに調製された、高速サーマルサイクルチップを利用する（例えば、図１〜２９参照）。この実施形態では、取り外し可能な反応封入部材を含むチップは、高速サーマルサイクル温度変化を経過して増幅反応（単数または複数）を促進する。高速サーマルサイクルは、チップを直接加熱および冷却することによって実現される。冷却および加熱に要求される時間が、サーマルサイクル反応の持続時間に関する主要な寄与因子である。冷却および加熱の速度を増すことによって、本明細書で提供する方法は、好都合にも、このような反応のための総合処理時間を短縮する。
【０１２１】
一つの実施形態では、直接加熱は、チップの背面の抵抗性コーティング（例えば、金属の薄層、図４参照）に調節可能な電流を通ずることによって媒介され得る。加熱は、基板（例えばシリコンチップ）の背面に堆積させた金属に対する電気ピン接触を介して実現される。多数の接触が、最適な温度均一性のために基板の様々な点にてなされる。加熱速度（例えば、熱上昇）を上げるには、この金属化された基板に、さらに大きな電力を容易に適用し得る。
【０１２２】
特定の実施形態では、約１〜２℃／秒を利用する従来のサーマルサイクラーの熱上昇速度に対して、約３℃／秒から約１００℃／秒の範囲の加熱上昇速度が、使用され得る。一つの実施形態では、少なくとも約３℃／秒、４℃／秒、５℃／秒、６℃／秒、７℃／秒、８℃／秒または９℃／秒の加熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約１０℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約１５℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約２０℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約２５℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約３０℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約３５℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約４０℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約４５℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約５０℃／秒の熱上昇速度が使用される。別の実施形態では、少なくとも約６０℃／秒、７０℃／秒、８０℃／秒、９０℃／秒、最大１００℃／秒またはそれ以上の熱上昇速度が使用される。従って、本明細書で提供される方法では、加熱速度は、少なくとも約３℃／秒、４℃／秒、５℃／秒、６℃／秒、７℃／秒、８℃／秒、９℃／秒、１０℃／秒、１５℃／秒、２０℃／秒、２５℃／秒、３０℃／秒、３５℃／秒、４０℃／秒、４５℃／秒、５０℃／秒、６０℃／秒、６５℃／秒、７０℃／秒、７５℃／秒、８０℃／秒、８５℃／秒、９０℃／秒、９５℃／秒、および、少なくとも約１００℃／秒の加熱速度からなる群より選択され得る。
【０１２３】
本明細書で提供される方法・装置によって達成されるもう一つの利点は、サーマルサイクラーの冷却において実現される冷却速度の上昇である。一つの実施態様では、ナノ基板（例えば、ナノチップ）の冷却は、基板の下面を、冷却ファンを用い、空気の強制対流に暴露することによって実現が可能である。さらに高い冷却速度を実現する他の実施態様では、水使用冷却法をナノ定量基板設計に対して採用することが可能である。この実施態様では、各サイクルの間において、水ジェット噴霧が、基板（例えば、シリコンチップ）の背面を均等に冷却する。別の実施態様では、定常な冷却温度に維持された冷却ブロックで、増幅反応の冷却相において基板の背面と定期的に可逆的に接触される冷却ブロックの採用が可能である。
【０１２４】
冷却速度は、従来のサーマルサイクラーの１〜２℃／秒の冷却速度に比べて、本明細書で提供されるサーマルサイクル基板の場合、約３℃／秒から約１００℃／秒の使用が可能である。一つの実施態様では、少なくとも約３、４、５、６、７、８、または、９℃／病の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約１０℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約１５℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約２０℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約２５℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約３０℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約３５℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約４０℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約４５℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約５０℃／秒の冷却速度が使用される。別の実施態様では、少なくとも約６０、７０、８０、９０、最大１００℃／秒またはそれ以上の冷却速度が使用される。従って、本明細書で提供される方法では、冷却速度は、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および、少なくとも約１００℃／秒の冷却速度から成るグループから選択することが可能である。
【０１２５】
本明細書に提供される方法では、反応封入部材を含めたチップは小さい熱質量を持つが、これによって、微小定量プレートや微小定量チューブを反応容器として利用する従来のサーマルサイクラーと比べて、極めて高い冷却・加熱速度が可能となる。熱勾配率の上昇を冷却速度の上昇と組み合わせたこと、これが、この有利な、サーマルサイクル処理速度の全体的上昇をもたらしたのである。例えば、本明細書で提供される方法を用いた一つの実施態様において、４０〜５５回サーマルサイクルＰＣＲ反応は、従来法では典型的には１００から１５０分が必要とされるのに対して、約２０分内で実行することが可能である。このＰＣＲ反応速度は、サーマルサイクル当たり約２２から３０秒の範囲に相当する。本明細書で示される他の実施態様では、本明細書で示される反応（例えば、プライマー伸長反応、および／または、増幅反応）におけるサーマルサイクル速度は、サイクル当たり約５秒から最大約１５０秒の範囲にあることが可能である。例えば、一つの実施態様では、プライマー伸長反応または増幅反応の１サイクルは、≦約１５０秒、約１４０秒、１３０秒、１２０秒、１１０秒、１００秒、９０秒、８０秒、７０秒、６０秒、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、１５秒、１０秒、９秒、８秒、７秒、６秒、≦約５秒から選ばれる時間内で実行される。
【０１２６】
従って、ある実施態様では、４０−５５回サーマルサイクル（例えば、４０、４５、５０または５５サイクル）反応（例えばプライマー延長または増幅）は、≦約１５分で実行される。別の実施態様では、４０−５５回サーマルサイクル反応は、≦約１０、約９、約８、約７、または、≦約６分から選ばれる時間内に実行される。別の実施態様では、４０〜５５サーマルサイクル反応は≦約５分で実行される。従って、本明細書で使用される時間当たりのサーマルサイクル率は、約２０サーマルサイクルから最大約５００サーマルサイクル／時（例えば、約０．３〜８．３ＰＣＲサーマルサイクル／分）の範囲になる。少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の、１分当たりサーマルサイクル率も本発明では想定が可能である。従って、本明細書で提供される方法は、サーマルサイクル処理、例えば、核酸プライマー伸長反応、および／または、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を利用する反応を実行するのに必要とされる負担と時間の、目だった低下をもたらす。
【０１２７】
ナノウェルを横切る、また、一つのウェルから隣のウェルを横切る温度分布の均一化も、本明細書で提供される基板の重要な機能である。ＣＦＣＲＣソフトウェアと実験結果を使用したコンピュータシミュレーションにより、本明細書で提供されるナノ定量チップシステムは、均一な温度分布の下に同時に９６通りのＰＣＲを実行可能であることが示された。例えば、ナノ定量チップ３相熱加温シミュレーションを９５℃（３６８Ｋ）で実行した。チップの半分は、チップの対称性によるように設計した。典型的には、高温での、この場合は９５℃であるが、熱均一性は、低温に比べて難しい。比較として、チップ辺縁近くに位置する２個のナノウェルと、チップ中央近くの別ペアの温度プロットを作成した。その結果、ウェル内には約０．８℃の温度差が観測され、ウェル間では約０．１℃の温度差が観測されることが示された。この温度差は、数度の桁の温度差が簡単に観測される標準的微小定量プレートに比べると目覚しい改善である。従って、特定の実施態様では、単一反応チャンバー内の温度差は、≦（以下）２．０℃、１．５℃、１．０℃、０．５℃、または、≦０．３℃から選ぶことが可能である。このことは、単一反応チャンバーにおいて、温度は、反応混合液内の任意の２点間において、これらの量だけしか変化しないということを意味する。
【０１２８】
これら、および、その他の実施態様では、ウェル間の温度差は、≦１．０℃、０．５℃、０．４℃、０．３℃、０．２℃、または、≦０．１℃である。このことは、同じ基板（例えば、チップ）上の、二つの別々の反応チャンバー間では、温度は、任意の二つの隣接反応チャンバーにおいて、これらの量を越えては変化しないことを意味する。別の実施態様では、同じ基板上の任意の二つの反応チャンバー間の温度は、これらの量を越えては変化しない。
【０１２９】
特定の実施態様では、核酸反応生成物は、反応チャンバーまたはチャネル内の不連続な標的検出部位（単数または複数）で捕捉されるので、その存在下に、サーマルサイクル反応（単数または複数）は、その反応生成物を捕捉に先立って別の場所に物理的に移送する必要を生ずることなく実行される。一つの実施態様では、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に続いて、かつ、捕捉工程の前に、反応チャンバーまたはチェンネル内の増幅された標的核酸にプライマー伸長反応を施す。好都合にも、本明細書で提供される方法は、標的核酸の増幅、増幅生成物のプライマー伸長、および、それに続く、固相捕捉官能基（例えば、捕捉オリゴヌクレオチド）による反応生成物（単数または複数）の捕捉が単一の反応チャンバーまたはチャネルにおいて実行されるのを可能とする。
【０１３０】
従って、本明細書で提供されるものは、標的核酸分子のヌクレオチドを特定するための方法であって、同方法は、標的核酸分子の１本鎖部分を、前記標的核酸分子の１本鎖部分のある領域と相補的なオリゴヌクレオチドに対して、溶液中で、不連続な標的検出部位にある捕捉官能基の存在下にハイブリダイズすること、このハイブリダイズした核酸とオリゴヌクレオチドを、同オリゴヌクレオチドの伸長を可能とする条件に暴露すること、この伸長反応の生成物（単数または複数）を、基板表面の不連続標的検出部位に捕捉することを含み、前記捕捉は、反応生成物（単数または複数）と基板表面、または、基板表面に付着する官能基間における非共有相互作用によって実現されることを特徴とする。
【０１３１】
さらに、本明細書で提供される方法は小型化には特に好適である。反応封入部材の設計、高速サーマルサイクル処理、および、基板そのものを、分析台としてばかりでなく、精製計画の中心部分として使用する方法は、従来の周知のシステムに比べて、１０倍以上の著明な容量低下をもたらす選択肢となる。このような容量低下は、好都合なことに、酵素のような高価な成分や試薬負担を下げるという点で負担低下をもたらす。同時に、基板や反応封入部材の周囲に、従来の器具（例えば、液体処理やサーマルサイクル処理用）よりも小型の器具の設置が許されるので、スペース面での負担低下も実現される。典型的には、本明細書に記述される生化学反応は、反応容器として、５〜５０マイクロリットルの全反応量を持つ、比較的大きな微小定量プレートまたは微量リットル管において実施される。本明細書で提供される方法に要する全反応量は、主に、反応封入部材と基板の設計に依存する。反応封入部材および基板によって形成されるチャネルまたはウェルは、マイクロリットルで表して、約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２以下、または、約１マイクロリットル以下の容量を持つ、または、ナノリットルで表して、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００以下、または、約１０００ナノリットル以下の容量を持つが、ただしそれらに限定されない。典型的に用いられる全反応量は、約４、３、２、１．５、または１マイクロリットル以下、または、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、または、５０ナノリットル以下である。
【０１３２】
（１．生体分子）
興味のある全ての生体分子が、本明細書で提供される方法で反応・分析が可能である。そのような生体分子としては、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、および、その他の小型有機分子、および、このような分子の複合体が挙げられるが、ただしそれらに限定されない。生体分子はいくつかの供給源から入手が可能である。例えば、生体分子は、被験体からのサンプル、例えば、細胞サンプル、組織サンプル、および、血液、唾液、尿、生検試料、および、細胞培養液のような流体サンプルから入手が可能である。
【０１３３】
（ａ．ヌクレオチドおよび核酸）
ヌクレオチドおよび核酸は、本明細書に記載される方法、および、当業者に周知の標準法を用いて入手が可能である。このような技術は、例えば、血液、唾液、皮膚、および、生体組織からＤＮＡを単離し、スクリーニング法で使用が可能な核酸を合成するのに用いられる。
【０１３４】
分析される核酸の一般的供給源は、血液銀行および診断検査所から入手が可能な血液である。血液からのＤＮＡの単離は、例えば、下記のように実施される。各種バッファー・洗浄剤を用いた一連の遠心を通じて、白血球ペレットが血液サンプルから単離される。次に、この細胞溶解液からタンパク質を沈殿させ、遠心によって核酸から分離する。この核酸を、等量の１００％イソプラノールの添加と遠心によって上清から回収する。核酸合成の方法も従来技術において周知である。
【０１３５】
（ｂ．アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質）
アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質は、本明細書に記載する方法、および、当業者に周知の標準法を用いて入手が可能である。このような技術は、例えば、タンパク質を、細胞、血液、唾液、皮膚および生体組織から単離し、スクリーニング法で使用が可能なペプチドおよびタンパク質を合成するのに用いられる。
【０１３６】
ペプチド・タンパク質の単離・合成法は従来技術で周知である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｔｏｔｏｗａ発行、ニュージャージー州、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｃ１９９８）。さらに、ファージディスプレー法によるタンパク質の生成は、ファージディスプレー法同様、従来技術においてよく知られている（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｃ．Ｋ．ら「Ｂａｃｔｅｒｉｐｈａｇｅ  Ｔ４」、アメリカ微生物学会発行、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｃ１９８３、Ｃａｎｔｏｎ，Ｃ．ら、「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、ニューヨーク州、ｃ１９９９、Ｐａｒｋ，ＪＨら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００２，２３，１７９７−１８０８。
【０１３７】
（ｃ．有機分子）
有機分子は、周知の供給源から抽出が可能であり、市販の化合物ライブラリーから入手が可能であり、または、化学的組み合わせ法を含む、従来技術で周知の様々な方法を用いて合成が可能である。
【０１３８】
（ｄ．炭水化物）
炭水化物は、細胞サンプルおよび組織サンプルのような供給源から単離が可能である。炭水化物はまた、従来技術で周知の様々な方法を用いて合成が可能である（例えば、Ｈａａｓｅ，Ｗ．Ｃら、２００１、「Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、１−１３、Ｋａｄｏｔａ  Ｋ．ら、２００１，４２，８６６１−８６６４参照）。
【０１３９】
（２．生体分子の反応）
本明細書で提供される方法において分析される生体分子は、その分析の前に、および／または、分析時に、１種以上の反応を経過する。生体分子は、基板に印加される、例えば、一枚以上の壁、および／または、内部底として基板を持つ、本明細書に記述されるチャンバーに導入され、その基板において反応（単数または複数）が起こり、また、そこから反応生成物が分析される。本法の特定の実施態様では、多数の反応が、例えば、２種以上、または、３種以上の反応が、基板上の単一部位にて、または、単一チャンバーにて実行される。
【０１４０】
導入された生体分子（単数または複数）を巻き込むチャンバー内で実行される反応（単数または複数）は、実質的にまたは完全に溶液内で、かつ、チャンバー内の低容量において実行が可能であり、また、いずれのタイプの化学的、酵素的、または、生化学的反応であってもよい。本明細書で提供される方法の特定の実施態様では、反応の少なくとも一つは、反応混合物の温度の変更を含む。一般に、反応は、導入された生体分子に関する情報、例えば、その本体、構造、機能的特徴、または、モノマー単位の配列（例えば、その生体分子が核酸またはペプチドのような生体高分子の場合）に関する情報を与える生成物を最終的に生成するように設計される。本明細書で提供される方法で実行が可能な反応のタイプの実際例としては下記のものが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１４１】
（ａ．核酸を含む反応）
多様な反応およびその変種が、一般に、核酸分析において実行される。このような反応に共通する原理は、核酸が増幅されて、分析用標的核酸の量を増大させる酵素反応である。その他の反応としては、例えば、プライマー伸長反応、配列決定反応、断片化反応（例えば、特異的エンドヌクレアーゼによる）、核酸のミスマッチヘテロ二重鎖の切断反応、オリゴヌクレオチドの連結反応、および、１本鎖立体構成反応が挙げられる。
【０１４２】
（（１）核酸増幅反応）
いくつかの核酸増幅反応が従来技術で周知であり、本明細書でも記述される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる一般的増幅反応は、従来技術で周知のいずれの方法によっても実行が可能である。例えば、一つのＰＣＲプロトコルでは、細胞のゲノムＤＮＡは、２本のＰＣＲプライマーに暴露され、必要な量の増幅ＤＮＡを産生するのに十分なサイクル数増幅を実施される。プライマーは、例えば、約５０と３５０、５００、または、１０００塩基対も離れて配置される。多重ＰＣＲ増幅を実行しなければならない場合は、最初に、核酸分子の１分節を越える大領域を、その領域外のプライマーを用いて増幅し、次に、各部位に特異的なプライマーを用いて、サブ領域または分節を増幅することが可能である。多重ＰＣＲの限界をいくつか挙げるならば、標的部位以外に、ＰＣＲプライマー間で、ＰＣＲプライマーと、他のプライマーまたはゲノムＤＮＡの他の領域の間で部分的に結合が生じ、これが副生成物の生成や、所望のＰＣＲ生成物の減収を招くことが挙げられる。従来技術に通常の熟練度を持つ当業者であれば、多重ＰＣＲの設計・限界には精通しているであろう。
【０１４３】
核酸を増幅するその他の方法としては、ミニＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｉｅｄｍａｎｎら、（１９９４）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５７−６４；  Ｂａｒｎａｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−９３）、鎖変位増幅（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２６７０−７７）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉら、（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０２６−１０３０）、ローリングサークル増幅、自己触媒法、例えば、ＱＪレプリカーゼ、ＴＡＳ、３ＳＲを用いるもの、および、その他全ての好適な、当業者に周知の方法が挙げられる。
【０１４４】
別の増幅法としては、自己維持配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または、その他の全ての核酸増幅法で、その後に、当業者には周知で、かつ、本明細書で記述される技法による増幅核酸の検出が挙げられる。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合、核酸分子の検出のための特に有用である。
【０１４５】
別法として、選択的ＰＣＲ増幅法に依存する、対立遺伝子特異的増幅技法を用いてもよい。特異的増幅用プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、その分子の中央に興味の対立遺伝子変異を担持しても（従って、増幅は差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または、一方のプライマーの３’末端に興味の対立遺伝子変異を担持してもよい。後者の場合、適当な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を阻害するか、低下させる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８；Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５０３）。さらに、変異領域に制限部位を導入し、切断依存性検出法を実現することが好ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。
【０１４６】
（（２）プライマー伸長反応）
プライマー伸長反応は、鎖伸長停止因子、例えば、ジデオキシヌクレオチドを伸長反応に組み込むことによって、ポリメラーゼ介在性核酸鎖伸長を特異的に停止させることを含む。いくつかのプライマー伸長依存法が従来技術において公知であり、核酸配列の中の特定ヌクレオチドの同定に従来から使用されている（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１（ＷＯ９６／２９４３１）、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４４（ＷＯ９８／２０１６６）、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９４（ＷＯ９８／２００１９）、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０００４６（ＷＯ９１／１３０７５）号、および、米国特許第５，５４７，８３５号、同第５，６０５，７９８号、同第５，６２２，８２４号、同第５，６９１，１４１号、同第５，８７２，００３号、同第５，８５１，７６５号、同第５，８６５，０９２号、同第５，９００，４８１号、同第６，０４３，０３１号、同第６，１３３，４３６号、および、同第６，１９７，４８９号を参照）。一般に、ある特定の核酸分子の中の興味の部位、例えば、多型部位の近くに特異的にハイブリダイズするプライマーが調製される。次に、このプライマーを、１種以上のジデオキシヌクレオチドの存在下に、典型的には、その部位の多型であるヌクレオチドの相補体であるジデオキシヌクレオチドの内の少なくとも一つの存在下に、伸長させる。プライマー伸長および／または伸長したヌクレオチド（単数または複数）の特定はいくつかのやり方で決定が可能である。特定的方法では、伸長は質量分析法によって決定される（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１（ＷＯ９６／２９４３１）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４４（ＷＯ９８／２０１６６）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９４（ＷＯ９８／２００１９）、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０００４６（ＷＯ９１／１３０７５）、および、米国特許第５，６０５，７９８、５，６２２，８２４、５，８５６，０９２号参照）。
【０１４７】
プライマー伸長反応の一変法では、ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの両方が用いられる。例えば、このような反応を、二つの対立遺伝子の内の一方にハイブリダイズするプライマーを伸長するのに用いた場合、一つの多型部位に対して可能な伸長生成物は、この場合、一方の遺伝子型に対しては通常１塩基伸長生成物であり、他方の可能な遺伝子型に対しては２（またはそれ以上）塩基伸長生成物である。この反応設計と関連させて伸長を決定するには質量分析が特に好適である。なぜなら、この可能な生成物は、事実上、分子量が異なるからである。２本鎖核酸分子（例えば、ＰＣＲ生成物）が鋳型として用いられる場合、プライマー伸長反応はサーマルサイクル処理し、検出可能となるほど十分に高い反応生成物を実現するべきである。周期的温度プログラムでは、２本鎖構造を一時的に変性させて、未伸長のプライマーを、相補的ＰＣＲ鎖と競合させながら、興味の部位の近傍にアニールさせる。これは、標準的サーマルサイクラー装置設定を用いると、約９０分以上を要する手間隙を要する過程であることがある。本明細書で提供される装置（すなわち、小型のチップ基板と、チップ表面を直接内部底とするチャンバーに含まれる低容量の反応混合液を加熱する高速サーマルサイクラー）を用いると、このサーマルサイクル過程の持続時間は約１５分に短縮することが可能である。
【０１４８】
（（３）断片化反応）
ＰＣＲ生成物またはその他の増幅生成物を含む特定の核酸の中に、１種以上の変異、例えば、多型現象が存在するか否かは、その核酸の断片に基づいて決定することが可能である。断片は、様々な化学的および／または酵素的反応によって産生が可能である。これらの断片化反応のいずれに対しても、反応後に得られた核酸断片（単数または複数）の分子量は、質量分析によって決定が可能である（例えば、米国特許第５，６０５，７９８号、同第６，０４３，０３１号、同第６，１９７，４９８号、同第６，２２１，６０１号、同第６，２２１，６０５号、同第６，２３５，４７８号、同第６，２５８，５３８号、同第６，２６８，１４４号、同第６，２７７，５７３号および同第６，３００，０７６号、および、国際出願公報ＷＯ９６／２９４３１を参照）。
【０１４９】
標的核酸は、その断片化全体パターンを通じて、完全配列を明らかにすることによって、または、断片化パターンから選ばれた一部を通じて、その特徴が明らかにされる。核酸のある断片は、例えば、基板上のハイブリダイゼーションによる捕捉を通じて、または、その他の特異的相互作用を通じて、例えば、１種以上の断片のビオチン／ストレプトアビジン親和性を通じて、選択的に単離および精製することが可能である。生成された断片の全てまたは大部分を単離および精製するための方法としては、例えば、基板上でのハイブリダイゼーションによる特異的および非特異的（例えば、ポリイノシンの使用による）捕捉、および、イオン結合、水素結合または疎水性相互作用、キレート性リガンド、アフィニティー相互作用、または、当業者には公知のその他の手段で、断片を結合させる基板が挙げられる。
【０１５０】
核酸（好ましくは、増幅生成物由来）の断片を作製するための１つの方法は、１つ以上の制限酵素の使用である。反応生成物の数、サイズおよび／または組成を分析することは、１つまたは複数の位置における核酸およびその改変体についての情報を提供する。例えば、増幅生成物内の特異的なヌクレオチド多型は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得、これは、別の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列において存在しない。これは、２つの大きく異なる生成物を作製し、これは、選択的に分離および分析され得る。他のアッセイ設計において、制限酵素は、１つ以上の多型部位の周りに特徴的な断片を作製し得る。
【０１５１】
この方法と同様にして、ＲＮＡＳＥによる切断を用いて、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡキメラを断片化することも可能である。核酸は、ＰＣＲ、および／または、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写のような周知の増幅法によって生成することが可能である（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｈａｐ．１０．２７−１０．３３）。これらの生成物は、基板の上に捕捉して、質量分析による分析の前にＲＮＡＳＥによって精製および処理することが可能である。表面での断片化に対する別法として、この工程を溶液の中で実施し、いくつかの断片を、その相補体に対するハイブリダイゼーションを通じて、または、断片特異的修飾、例えば、ビオチン化を通じて特異的に抽出することが可能である。
【０１５２】
核酸のウラシル特異的切断は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを核酸と反応させることによって実行が可能である（例えば、国際ＰＣＴ出願公報ＷＯ９８／５４５７１を参照）。グリコシラーゼで処理した核酸は、ウラシル塩基を用いて増幅反応に生成させ、増幅生成物中に組み込むことが可能である。核酸の切断を招く全ての反応において、反応後に得られたＤＮＡ断片（単数または複数）の分子量は、質量分析によって決定され、核酸中における変異の有無の検出に使用が可能である（例えば、米国特許第５，６０５，７９８号、同第６，０４３，０３１号、同第６，１９７，４９８号、同第６，２２１，６０１号、同第６，２２１，６０５号、同第６，２３５，４７８号、同第６，２５８，５３８号、同第６，２６８，１４４号、同第６，２７７，５７３号、および同第６，３００，０７６号、および、国際ＰＣＴ出願公報ＷＯ９６／２９４３１を参照）。再び、完全な断片化パターン、または、個々の断片は、前述のようにして分離および分析が可能である。
【０１５３】
（（４）配列決定反応）
様々な核酸配列決定反応が当該分野で公知であり、また、特定の核酸を特定するのにも使用が可能である。例示の配列決定反応としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）、または、Ｓａｎｇｅｒら（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３）によって開発された技法に基づくものが挙げられる。当業者であれば、ある種の実施態様では、核酸塩基の内、ただ一つ、二つ、または、三つの出現を、配列決定反応で決定する必要のある場合があることは明白であろう。例えば、Ａ−トラック配列決定法、または、それの等価な、例えば、ただ一つのヌクレオチドのみ検出される決定法も実行可能である。他の配列決定法も公知である（例えば、名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｍｉｘｅｄ  ＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｐｒｏｂｅ」なる米国特許第５，５８０，７３２号、および、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」なる米国特許第５，５７１，６７６号を参照）。
【０１５４】
特定の方法では、配列決定反応の生成物は質量分析で分析してもよい（例えば、米国特許第５，５４７，８３５、５，６９１，１４１号、および、Ｈ．Ｋｏｅｓｔｅｒによる、名称「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」なる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１９３（ＷＯ９４／１６１０１）、米国特許第５，５４７，８３５、５，６２２，８２４、５，８５１，７６５、５，８７２，００３、６，０７４，８２３、６，１４０，０５３、および、Ｈ．Ｋｏｅｓｔｅｒによる名称「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｖｉａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」なる国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９３８（ＷＯ９４／２１８２２）参照）。本明細書で提供される方法の特定の例では、配列決定すべき標的核酸を、サンガー型配列決定反応を実行するのに必要な試薬全てと共に、プライマーも含めて、基板に与える。反応で得られた配列決定用断片を、全配列決定用プライマーの一部の相補体である配列を含む、基質結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって基質表面に捕捉する。基質表面の脱塩および基板表面に対するマトリックスの添加に次いで、各配列決定断片について、基板表面に捕捉された断片位置において、すなわち、標的検出部位において開始するＭＡＬＤＩ質量分析によって検出および分析が可能である。
【０１５５】
（（５）ミスマッチ切断反応）
ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムのような切断剤からの、および、ピペリジンを用いる保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、または、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出することが可能である（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、”ミスマッチ切断”法は、ＲＮＡまたはＤＮＡのような標的核酸分子に対するオリゴヌクレオチド相補鎖を、サンプルから入手したＲＮＡまたはＤＮＡのような核酸とハイブリダイズさせることによって形成される、ヘテロ二重鎖を設けることによって始まる。この２本鎖二重鎖は、二重鎖の１本鎖領域、例えば、上記オリゴヌクレオチドとサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチによって形成される二重鎖を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮＡアーゼで処理することが可能であるし、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することも可能である。従って、ミスマッチ（変異の存在を示し得る）は、標的核酸の切断を生じる。特定の方法において、切断生成物は、質量分析法によって検出され得る（例えば、米国特許第５，６０５，７９８号、同第６，０４３，０３１号、同第６，１９７，４９８号、同第６，２２１，６０１号、同第６，２２１，６０５号、同第６，２３５，４７８号、同第６，２５８，５３８号、同第６，２６８，１４４号、同第６，２７７，５７３号、および同第６，３００，０７６号、および、国際ＰＣＴ出願公報ＷＯ９６／２９４３１を参照）。
【０１５６】
他の実施態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、かつ、ピペリジンで処理し、ミスマッチ領域を消化することが可能である。ミスマッチ領域の消化後、得られた材料を、例えば質量分析で分析し、任意の核酸断片の有無および分子量を決定することが可能である。本明細書で提供される方法の特定の例では、ミスマッチ切断反応で生成された断片は全て、その断片の全てまたは一部に対して相補的な配列を有する、固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることによって基質表面に捕捉される。基質表面の脱塩および基板表面に対するマトリックスの添加に次いで、各断片について、基板表面に捕捉された断片位置において、すなわち、標的検出部位において開始するＭＡＬＤＩ質量分析によって検出および分析が可能である。
【０１５７】
ミスマッチ切断反応に関連する例示の実施態様では、ＤＮＡ標的のＳＮＰ領域に対して相補的なリボ−オリゴヌクレオチドを、固相支持面に付着させることも可能である。このＤＮＡ標的を、表面上において、ＰＣＲその他の方法によって増幅する。増幅生成物の１本鎖を除去する、または、増幅を、標的ＤＮＡが過剰に生産される方向に向ける。このＤＮＡ標的鎖を、表面付着の、相補的リボ−オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズさせることによって捕捉する。単一塩基ミスマッチがＳＮＰ部位で起こっている場合には、形成された二重鎖は縮んで（ｐｕｃｋｅｒｅｄ）おり、従って部分的に１本鎖状となっている。次に、１本鎖を切断する切断試薬（例えば、ＲＮＡＳＥ）を用いて、この部位でリボ−オリゴヌクレオチドを切断する。この切断により、リボ−オリゴヌクレオチドの短い遊離部分が生成されるが、これは、表面にマトリックス化合物を添加して後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析が可能である。サンプル中にミスマッチが存在する場合にのみ、切断されたリボ−オリゴヌクレオチド断片に相当するピークが見られるが、一方、完全なマッチに対してはＭＡＬＤＩ−ＭＳ信号は現れない。一つの実施態様では、このシステムは、質量分析ではなく、表面付着のリボ−オリゴヌクレオチドの末端に蛍光タグを付けることによって、蛍光で分析することも可能である。リボ−オリゴヌクレオチドとＰＣＲ生成物の間にミスマッチが生じた場合、切断は、リボ−オリゴヌクレオチドの短い遊離部分をもたらし、これが表面に蛍光信号を生ずる。しかしながら、完全なマッチの場合、表面に蛍光信号をもたらす切断は起こらない。
【０１５８】
別の実施態様では、ＤＮＡ標的増幅のためのＰＣＲやその他の方法は、表面上で実施することも可能である。増幅生成物の１本鎖を除去する、または、増幅を、標的ＤＮＡが過剰に生産される方向に向ける。次いで、ＰＣＲ生成物のＳＮＰ型対立遺伝子の内の一つに対して相補的なリボ−オリゴヌクレオチド配列を添加する。次に、リボ−オリゴヌクレオチド配列とＰＣＲ生成物の間に生じたミスマッチした、および／または、マッチしたハイブリッドが溶液中に形成される。次いで、ＲＮＡＳＥＡが溶液に添加される。上記実施態様の場合と同様、リボ−オリゴヌクレオチド配列とＰＣＲ生成物の間にミスマッチが生じた場合、リボ−オリゴヌクレオチド配列の切断が起こる。完全なマッチが起こった場合、切断は明白にはならない。切断されるかされないかによらず、リボ−オリゴヌクレオチドは、そのリボ−オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的な表面付着オリゴにハイブリダイズすることによって表面に捕捉される。マトリックス添加後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて、この切断および未切断生成物を特定する。ある特定の実施態様では、このシステムは、質量分析ではなく、リボ−オリゴヌクレオチド配列の５’または３’末端に蛍光タグを設けることによって蛍光によって分析することが可能である。表面付着オリゴヌクレオチドは、蛍光タグに対向する標的配列の末端において、かつ、潜在的な切断部位の上流でもっぱら捕捉されるように設計が可能である。切断が起こった場合は、蛍光信号は検出されず、一方、切断が起こらない場合は、蛍光信号が検出される。
【０１５９】
（（６）オリゴヌクレオチド連結反応）
オリゴヌクレオチド連結反応と呼ばれる、別の核酸反応設計では、１本鎖標的核酸の配列末端に隣接するようにハイブリダイズできるように設計された２個のオリゴヌクレオチドを、サンプル核酸と混ぜる。厳密な相補配列がサンプル核酸の中に見られると、そのオリゴヌクレオチドは末端が隣接するようにハイブリダイズし、連結基質を形成する。従って、サンプル中の核酸は、オリゴヌクレオチド連結定量法（ＯＬＡ）を、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号、および、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）に記載されるやり方で用いて検出が可能である。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎらは、ＰＣＲとＯＬＡと特性を組み合わせた核酸検出定量法を記述している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３−８９２７）。この方法では、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡの指数関数的増幅を実行し、次にこのＤＮＡをＯＬＡを用いて検出する。
【０１６０】
このＯＬＡ法に基づく技法がいくつか開発されており、遺伝子の多型領域の、特異的対立遺伝子改変体の検出に使用され得る。例えば、米国特許第５，５９３，８２６号は、３’−アミノ基と５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いてホスホラミダート結合を有する結合体を形成するＯＬＡを開示する。
【０１６１】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づく他のプロトコルにおいて、標的核酸を、一組の連結エダクト（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｅｄｕｃｔ）および熱安定性ＤＮＡリガーゼとハイブリダイズさせ、リガーゼエダクト（ｌｉｇａｓｅ  ｅｄｕｃｔ）同士を互いに共有結合させて連結生成物を形成する。特定の方法において、この連結生成物を、質量分析によって検出し、周知の値と比較し得る（例えば、米国特許第５，６０５，７９８号、第６，０４３，０３１号、第６，１９７，４９８号、第６，２２１，６０１号、第６，２２１，６０５号、第６，２３５，４７８号、第６，２５８，５３８号、第６，２６８，１４４号、第６，２７７，５７３号、および、第６，３００，０７６号、ならびにＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２９４３１を参照）。反応を周期的に実施する場合、得られた連結生成物を増幅して、小容量の標的核酸の検出をさらに促進し得る。連結点での野生型プライマーと変異プライマーとの選択によって、点変異の検出が得られ得る。
【０１６２】
本明細書中で提供される方法の特定の実施形態において、リガーゼ連鎖反応は、溶液中で固相支持体の表面上で実質的に実施され得、例えば、一ヌクレオチド多型を決定し得る。例えば、連結生成物の一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合させ得る。この固相支持体固定化オリゴヌクレオチドの上で、およびその存在下で、先ずＰＣＲを実施し、次いで連結反応を実施する。この連結反応のために、３本の連結プライマーが溶液に添加される。１本は、表面に結合したオリゴヌクレオチドに対して相補的であり、１本のプライマーは野生型ＳＮＰを含み、別の１本のプライマーは変異型ＳＮＰを含む。次に、野生型、および／または、変異型配列に相当する連結生成物は、表面上に捕捉され、質量分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、その分子量に基づいて特定される。蛍光による分析のための別の実施形態において、野生型および変異型ＳＮＰを含む連結プライマーは、それぞれ、別々の蛍光タグによって標識される。例えば、野生型プライマーをｃｙ５で標識し、一方、変異型プライマーをｃｙ３で標識し得る。このようにして、変異型および／または野生型配列の存在が同定され得る。特定の実施形態において、多重ＰＣＲおよび連結反応が実施される。
【０１６３】
別の実施形態において、表面固定化オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションを通じてＰＣＲ生成物を捕捉し得る。次に、この連結生成物を、表面に捕捉されたＰＣＲ生成物にハイブリダイズさせる。
【０１６４】
（ｂ．核酸反応に使用され得る試薬）
核酸を含む反応の型から明らかなように、このような反応には多くの試薬が使用され得る。試薬としては、酵素（例えば、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、リガーゼ）、プライマー、オリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、および、ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が挙げられる。
【０１６５】
（（１）プライマー）
プライマーとは、目的の領域、例えば、多型領域の近傍位置において核酸配列（しばしばテンプレートと呼ばれる）に対して特異的にハイブリダイズ可能な核酸をいう。プライマーは、そのプライマー近傍のテンプレートに対して相補的なヌクレオチドまたはそのアナログが、伸長するヌクレオチド鎖に対して添加される過程において、酵素（例えば、ポリメラーゼ）の作用を通じて伸長され得る。例えば、ＲＮＡテンプレートが使用される場合、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーは逆転写酵素の作用によって伸長し、そのＲＮＡテンプレートに対して相補的なｃＤＮＡを生成する。ＤＮＡテンプレートが使用される場合は、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長するされ得る。
【０１６６】
プライマーは、例えば、標的核酸の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、および／または存在に関する情報を提供するように設計されたプライマー伸長反応において単独で使用され得るか、あるいは、プライマーは、例えば、増幅反応の場合のように、少なくとも１本の他のプライマーまたはプローブと共に使用され得る。核酸の少なくとも一部を増幅するために、順プライマー（すなわち、５’プライマー）と逆プライマー（すなわち、３’プライマー）を用いるのが好ましい。順プライマーおよび逆プライマーは、２本鎖核酸の相補鎖にハイブリダイズし、それによって、各プライマーの伸長により、２本鎖核酸が増幅される。
【０１６７】
本明細書中でに記載されるプライマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ（１本鎖または２本鎖）、ＰＮＡおよびそのアナログ）は、その目的の本質を変えることなく、例えば、制限部位または他の有用な配列を組み込むように設計されたヌクレオチドを末端添加することによって改変され得る。
【０１６８】
プライマーは、当該分野で周知の方法に従って調製され得、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される。例えば、不連続なＤＮＡ断片を、制限酵素を用いて、調製およびクローン化し得る。あるいは、プライマーは、適当な配列を有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製され得るか、または、合成され得る。
【０１６９】
プライマー、特に、対立遺伝子改変体検出法において実行される反応に用いられるプライマーは、多型部位で対立遺伝子の一部に特異的にハイブリダイズために十分な長さである。代表的には、その長さは、供給源生物ゲノムの複雑性に依存する。ヒトでは、その長さは少なくとも１４〜１６個のヌクレオチド、代表的には、２０個、３０個、５０個、１００個以上のヌクレオチドであってもよい。
【０１７０】
（（２）ヌクレオシド／ヌクレオチド）
核酸を含む多くの反応は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を構築用ブロックとして含む。このブロックは、例えば、伸長反応、増幅反応および配列決定反応においてプライマーを伸長するために使用され得る。特定の反応において、反応生成物の同定および／または検出を容易にするために、または、異なる反応生成物を区別するために、改変ｄＮＴＰを用いることが所望され得る。例えば、異なる反応の核酸生成物間の分子量の相違は、核酸配列自体（組成または長さ）、またはこの生成物に質量修飾性官能基（ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の導入のどちらかによって達成され得る。例えば、質量修飾は、核酸増幅過程の際に組み込まれ得る。
【０１７１】
質量修飾性部分（ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）は、例えば、核酸生成物の５’末端、核酸塩基、リン酸骨格に、およびヌクレオシドの２’位置、ならびに／または末端３’位置に、結合され得る。質量修飾性官能基の例としては、例えば、ハロゲン、アジド、またはＸＲ型（ここで、Ｘは結合基であり、そしてＲは質量修飾性官能基である）が挙げられる。従って、質量修飾官能基は、核酸生成物分子の中に、規定された質量増加を導入するために使用され得る。
【０１７２】
プライマーの合成の間の核酸配列の５’末端を修飾は、２個以上の核酸生成物の質量に違いを導入する一つの方法である。５’末端修飾の多くは、例えば、捕捉配列と核酸生成物との間に形成されるハイブリッドの安定性または、３’末端に起こるプライマー伸長反応の効率を妨げない。この修飾は、合成の間にも、例えば、ホスホラミダイト化学によって、ならびにこのクラスの広範な種々の市販の化合物（ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、デオキシリボース−３’−リン酸、デオキシリボース−５’−リン酸、および他の有機−３’−リン酸基）と共に、導入され得る。
【０１７３】
質量修飾官能基は、ヌクレオチド官能基内の様々な位置に配置され得る（例えば、米国特許第５，５４７，８３５号および国際ＰＣＴ出願ＷＯ９４／２１８２２を参照）。例えば、質量修飾官能基Ｍは、核酸塩基（ｃ７−デアザヌクレオシドの場合はＣ−７にも）、アルファリン酸の三リン酸基、または、ヌクレオシド三リン酸の糖環の２’位置のいずれかに結合され得る。例えば、アルファ−チオヌクレオシド三リン酸塩の場合のように、フォスフォジエステル結合に導入された修飾は、これらの修飾が、正確なワトソン・クリック型の塩基対に干渉せず、さらに、完全な核酸分子について、（例えばアルキル化反応によって）１工程合成後部位特異的修飾を可能とするという利点を有する（例えば、Ｎａｋａｍａｙｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：９９４７−５９を参照）。ホウ素修飾核酸もまた、ポリメラーゼによって核酸の中によりよく組み込まれるという点で有用な質量修飾官能基である（例えば、Ｐｏｒｔｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１９６３−１１９６９；Ｈａｓａｎら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２１５０−２１５７；Ｌｉら（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：４４９５−４５０１を参照）。
【０１７４】
さらに、質量修飾官能基は、鎖停止に影響を及ぼすように（例えば、それをヌクレオシド三リン酸における糖環の３’位置に結合させることにより）添加され得る。当業者には、本明細書で提供される方法において多くの組み合わせが使用され得ることは明白である。同様にして、当業者は、鎖伸長性ヌクレオシド三リン酸もまた、同じ様式で、官能基および結合位置に数多くのバリエーションおよび組み合わせを用いて質量修飾され得ることを認識する。
【０１７５】
例えば、特定のいかなる理論にも縛られることなく、質量修飾は、オリゴヌクレオチドのポリエチレングリコール誘導体を用いて、ＸＲのＸおよびＲの代わりに導入され得る。この場合の質量修飾増加分（ｍ）は４４であり、すなわち、５通りの質量修飾分子種を、ただｍを０から４に変えるだけで（従って核酸分子（例えば、ヌクレオシド三リン酸）に、４５（ｍ＝０）、８９（ｍ＝１）、１３３（ｍ＝２）、１７７（ｍ＝３）、および、２２１（ｍ＝４）の質量単位を加えるだけで）、生成し得る。オリゴヌクレオチドのポリエチレングリコール誘導体も、低級アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルおよびｔ−ブチルが上げられるが、それらに限定されない）によって、モノアルキル化され得る。質量修飾化合物において、他の化学を使用し得る（例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１に記載される化学を参照）。
【０１７６】
オリゴヌクレオチドのポリエチレングリコール誘導体以外にも、様々の質量修飾性官能基Ｒを、適当な結合化学薬品Ｘを介して選択および結合させ得る。単純な質量修飾は、例えば、Ｈを、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒおよび／もしくはＩ）または擬ハロゲン（例えば、ＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＳ）と置換することによって、あるいは種々のアルキル、アリルまたはアラルキル官能基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル、フェニル、置換フェニル、ベンジル）を用いることによって、あるいは、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、Ｓｉ（ＣＨ３）３、Ｓｉ（ＣＨ３）２（Ｃ２Ｈ５）、Ｓｉ（ＣＨ３）（Ｃ２Ｈ５）２、Ｓｉ（Ｃ２Ｈ５）３のような官能基を用いることによって、達成され得る。さらに別の質量修飾は、核酸分子（例えば、またはヌクレオシド三リン酸）を介してホモペプチドまたはヘテロペプチドの結合により得られ得る。質量増加５７を伴う質量修飾分子種の生成において有用な一つの例は、核酸分子（ｒ）へのオリゴグリシン（ｍ）の結合であり、例えば、７４（ｒ＝１、ｍ＝０）、１３１（ｒ＝１、ｍ＝１）、１８８（ｒ＝１、ｍ＝２）、２４５（ｒ＝１、ｍ＝３）の質量修飾が達成される。単純なオリゴアミド類も使用され得る。例えば、７４（ｒ＝１、ｍ＝０）、８８（ｒ＝２、ｍ＝０）、１０２（ｒ＝３、ｍ＝０）、１１６（ｒ＝４、ｍ＝０）の質量修飾が得られ得る。本明細書中にに記載される例に加わるバリエーションは、当業者にとって明白である。
【０１７７】
（ｃ．核酸反応に用いられる条件）
核酸を含む反応は、代表的には、２種以上の核酸分子をハイブリダイズする工程を包含する。ハイブリダイゼーションの程度および特異性は、反応条件（特に、温度および塩濃度）によって変動する。ハイブリダイゼーション反応条件は、代表的には、ストリンジェンシーに換算して（例えば、低、中、および、高ストリンジェンシーとして）言及される。これらのストリンジェンシーは、当業者に公知であり、本明細書中に例示されている様々な温度および塩濃度の下で達成される。従って、例えば、ハイブリダイズする核酸間の不完全なマッチの量を減らすために、より高いストリンジェンシー条件（例えば、より高温およびより低い塩濃度）を採用し得る。
【０１７８】
さらに、核酸を含む反応はまた、二本鎖核酸を変性して１本鎖分子を生成する工程を包含し得る。変性は、例えば、反応混合物の温度が特定の二本鎖核酸の融解温度を越える条件下で、達成され得る。
【０１７９】
多くの核酸反応（例えば、増幅反応）が、温度の上昇と低下から成る反復周期を包含し、核酸ハイブリッドの鎖の変性およびアニーリングを提供する。本明細書中で提供される装置は、比較的質量が小さく、熱伝導性の高いチャンバーの基板底を、直接、迅速かつ効率的に、加熱および冷却すること、ならびに反応物質を別のサーマルサイクル装置へ移送するいかなる工程も回避することによって、チャンバーにおける反応混合物の温度の変動を促進する。
【０１８０】
（ｄ．タンパク質またはペプチドを含む反応）
本明細書で提供される方法において使用が企図される、タンパク質またはペプチドを含むいくつかの異なるタイプの反応が存在する。例えば、タンパク質およびポリペプチドは、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡマイクロアレイの上に捕捉され得る（Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｊ．ら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２１：８０４４−８０５１）。エピトープタグ化タンパク質は、Ｎｉ２＋キレート化表面、または、抗体結合表面に対する親和性を介して捕捉され得る（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：２８５８−２８６５）。タンパク質もまた、表面結合酵素への表面に捕捉される（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４３６９−４３７４；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１−７；Ｎｅｄｅｌｋｏｖ，Ｄ．ら（２０００）Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４２３：１−７）。他の実施形態において、タンパク質固定化表面に対するタンパク質の相互作用を用いて、液相の標的タンパク質またはペプチドを、固相基板上に捕捉し得る（ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６２；Ｌｉｎ，Ｓ．ら（２０００）７２：２６３５−２６４０）。
【０１８１】
（（１）タンパク質の、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ固定化表面への捕捉）
特定のタンパク質の機能は、特異的オリゴヌクレオチド配列を認識することである。それらのタンパク質における、例えば一塩基多型に起因する立体構造的変化は、そのようなタンパク質の機能を阻害し得る。本明細書中で提供される技術的基盤と方法において、タンパク質／オリゴヌクレオチド相互作用を研究するために、目的の捕捉オリゴヌクレオチドを表面に固定し得る。先ず、目的のタンパク質を、ｃＤＮＡファージライブラリーから発現させる。次に、これらのタンパク質を表面に導入し、そしてタンパク質は、表面固定化オリゴに対する親和性を介して捕捉される。洗浄および表面へのマトリックス化合物の添加に次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による生成物の分析が行われ得る。表面上に捕捉されたタンパク質の同一性、および存在するタンパク質の量が、測定され得る。別の実施形態において、表面上に捕捉されたタンパク質は、そのタンパク質に、フルオレセインまたはｃｙ５のような蛍光タグを標識することによって蛍光により分析され得る。種々のタンパク質が使用される場合、各タンパク質は異なる蛍光タグで標識される。このようにして、表面上のタンパク質の同一性および相対量を決定し得る。
【０１８２】
（（２）Ｎｉ２＋キレート化、抗体または抗体固定化表面へのタンパク質親和性捕捉）
他の実施形態において、表面に固定化された酵素、抗体、および、Ｎｉ２＋キレートに対するタンパク質およびペプチドの独特の親和性を通じて、タンパク質およびペプチドが単離され得、特徴付けられ得る。これらの実施形態において、新規のタンパク質が特徴付けられ得る。一つの実施形態において、タンパク質は、一般に、そのタンパク質を生体分子でタグ標識することによって捕捉され得る。このようにして、タンパク質は、対応する表面結合生体分子に対するタグの親和性を通じて表面上に捕捉される。タグは、ＤＮＡタグを、クローニングベクター、または、ＣＤ−タギングのような挿入ビヒクルを用いて遺伝子に挿入することによって、タンパク質に導入され得る（Ｊａｒｖｉｋ，Ｊ．Ｗ．ら（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：８９６−９０４）。タグ含有タンパク質はまた、タンパク質発現後に得られる。トリプシンによる消化後、タグ含有ペプチドフラグメントを、タグの表面結合生体分子に対する親和性を介して捕捉し得る。タグは、Ｎｉ２＋キレート表面に対して高度の親和性を有するヒスチジン富裕ポリペプチドであり得る。Ｎｉ２＋キレート表面は、ニトリロ三酢酸誘導体化表面上にＮｉ２＋緩衝液を流すことによって形成される。捕捉されたタンパク質およびポリペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳマトリックスを表面に適用後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定され得る。
【０１８３】
別の実施態様では、タンパク質を、表面固定化酵素および／または抗体に対する親和性を通じて表面に捕捉することが可能である。例えば、酵素または抗体の一級アミンが、表面に共有結合され得、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、アミノプロピルカルボジイミドを用いて活性化され得る。捕捉されたタンパク質の質量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定することが可能である。同様に、これらの捕捉されたタンパク質を、それらのタンパク質に蛍光タグを結合させることによる蛍光によって分析することも可能である。各タンパク質に異なる蛍光タグが用いられ得る。このようにして、表面のタンパク質の同一性や相対量を計測することが可能である。
【０１８４】
（（３）タンパク質結合表面へのタンパク質の捕捉）
本明細書で提供される方法の他の実施態様では、タンパク質−タンパク質相互作用が、目的のタンパク質を表面に固定化することによって分析され得る。一つの実施態様では、タンパク質のリジン残基を、例えば、シッフの塩基形成によるアルデヒド表面に共有結合させることが可能である。従って、次いで、タンパク質をこの表面上に捕捉することが可能である。洗浄、および、表面に対するＭＡＬＤＩ−ＭＳマトリックス塗布後、タンパク質の質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって得ることができる。同様に、これらのタンパク質が蛍光マーカでタグ化される場合、タンパク質と、それらタンパク質の相対量は、蛍光を介して測定され得る。
【０１８５】
（ｅ．小型有機分子に関する反応）
タンパク質／小型有機分子相互作用の研究は、タンパク質の機能を明らかにすること、ならびに、小型有機分子の可能性のある治療関連性の情報を得ることが重要である。小型有機分子を表面に捕捉するのいくつかの周知の反応がある。例えば、一つの実施態様では、小型有機分子をタンパク質固定化表面に捕捉することが可能である。目的のタンパク質のリシン残基は、例えば、シッフの塩基形成によるアルデヒド表面に共有結合することが可能である。次に、目的の小型有機分子を、そのタンパク質構造への特異的結合または非特異的結合のために上面に導入することが可能である。捕捉された有機分子は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定され得る。別の実施態様では、有機分子はまた、蛍光を使用して、同定され得る。この方法では、使用される各有機分子は、異なる蛍光タグを有する。有機分子の同一性ならびに相対量も測定される。
【０１８６】
（ｆ．炭水化物に関する反応）
いくつかの抗原の宿主レセプターは、炭水化物から構成される。さらに、宿主レセプターもまた、細胞表面に位置される複雑な炭水化物であり得る。宿主のレセプター／抗原／抗体相互作用に関してさらに理解を深めることによって、感染症の経路についてさらに多くの情報が得られ得る。さらに、このような情報に基づいて、これらの疾患を予防する薬物を設計することが可能になる。炭水化物マイクロアレイは、当該分野で公知である（Ｗａｎｇ，Ｄら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ２０，２７５−２８１）。一つの実施態様では、炭水化物含有抗原を、ニトロセルロースまたはナイロン由来表面に固定化する。次に、蛍光タグ化抗体を表面に導入する。様々な表面固定化抗原に対する特異的抗体の親和性は、蛍光によって、または、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって同定され得る。
【０１８７】
（３．反応生成物の捕捉）
（ａ．反応生成物を捕捉するための基板）
反応生成物は、その上で反応が実行される基板表面（例えば、チャンバーの内部底面）に捕捉される。特定の実施態様では、反応（単数または複数）は、基板を含むチャンバー内で実行されるか、またはチャンバーの底部が基板となり、基板は、反応生成物（単数または複数）と特異的に相互作用し得、そのために、他の分子をチャンバーから除去するか、または、洗い流すために使用される過程の間、反応生成物が基板に結合されたままである。この相互作用は、反応生成物と、基板そのものの実際の化学的成分の間に起こるものでも、または、反応生成物と、基板材料の中に組み込まれた成分、例えば、誘導体化、または、官能基化された基板との間に起こるものであってもよい。反応生成物（単数または複数）の特異的捕捉を実現できるものであれば、いずれのタイプの基板も使用が可能である。
【０１８８】
例えば、基板は、平坦な２次元表面であっても、または、３次元表面であってもよいし、ビーズであってもよい。平坦基板の場合、チャンバーは、基板表面から突出する壁によって、例えば、本明細書で提供される装置の一実施態様において記述される「マスク」によって提供されても、あるいは、不連続で隔離されたチャンバーを設けるために、基板表面にウェル、柱、または、チャネルをエッチングすることによって作製されてもよい。基板が作製され得る可能な材料としては、シリコーン、上面酸化物層を有するシリコーン、ガラス、白金、金、ポリマー、および、プラスチックが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施態様では、基板はシリコンチップ、すなわち、ウェーハである。
【０１８９】
平坦基板は、チャンバー内の反応混合物の温度調節を容易にするために、熱伝導性材料を含むように修飾されてもよい。ある特定の実施態様では、基板は、金属材料でコーティングされた平坦なシリコンチップである。例示的な基板は、本明細書中に記載され、そして本明細書中に記載され、そして提供されるデバイスと共に使用され得る。
【０１９０】
（ｂ．核酸反応生成物の捕捉）
核酸反応生成物は、様々な方法でチャンバー内に捕捉され得る。例えば、ある反応生成物と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、その生成物の特異的捕捉のために基板に結合され得る。
【０１９１】
（（１）表面結合オリゴヌクレオチド）
（１．合成）
オリゴヌクレオチドは別々に合成し、次に基板に結合させてもよいし、または、合成を基板表面でインシリコで実行してもよい。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ），Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｇ，ＭＤ），Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ），ＭＷＧ，Ｏｐｅｒｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）およびＭｅｔａＢＩＯｎ（Ｐｌａｎｅｇｇ−Ｍａｒｔｉｎｒｅｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などを含めた多数の企業から購入することが可能である。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体は、当該分やで公知の標準法（例えば、ＤＮＡ自動合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などから市販されているものと同様のもの）の使用）を、孔調節多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレンやその他の樹脂のような固相支持体、ホスホラミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、または、ホスホトリエステル法のような化学的方法と組み合わせて合成が可能である。オリゴヌクレオチドはまた溶液中で、または、可溶性支持体の上で合成することが可能である。例として、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）によって合成が可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、例えば、孔調節多孔性ガラスポリマー支持体の使用によって調製が可能である（Ｓａｒｉｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）。
【０１９３】
表面結合オリゴヌクレオチドは、アッセイ生成物の目的の領域、例えば、伸長プライマーに対して、または、その近傍にハイブリダイズする核酸である。捕捉性オリゴヌクレオチドは、一般に、チャンバー内で起こる反応のどれにも実質的には関与しない。好ましいオリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な数のヌクレオチドを有する。表面結合オリゴヌクレオチドは、典型的には、６〜３０塩基長であり、そして配列は、特定の標的核酸（下記のオリゴヌクレオチドのタイプを参照のこと）の配列に対して相補的であるように選ばれる。オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは、相補配列に対してハイブリダイズする特異性を改変するため、あるいは、形成されたハイブリッドの安定性を改変するためのヌクレオチド模倣物から作製することが可能である。
【０１９４】
特異性の変更は、捕捉配列の中に、または、標的核酸の前駆体の中に普遍的塩基または部位を組み込むことによって達成され得る。配列内部の一つの塩基をイノシンで置換することによって、例えば、標的核酸生成物の多型部位に対する普遍的ハイブリダイゼーションが実現される（例えば、Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５；Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：１９３１を参照のこと）。ハイブリッドの安定性は、例えば、ＲＮＡ（ＤＮＡ標的に指向される場合）、ロック核酸（ＬＮＡ）（Ｂｒａａｓｃｈら（２００１）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１−７）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ａｒｍｉｔａｇｅら（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２３２０−１２３２５）、または、他の修飾された核酸誘導体を、捕捉または標的核酸の配列内に、完全にまたは部分的に使用することによって有意に増加させることが可能である。この安定性はまた、１個または数個の無塩基部位、非ハイブリダイズ性塩基誘導体、または、ホスホロチオエートのような融解温度の低下をもたらす核酸修飾を組み込むことによって低下させることもできる。両方のアプローチが、ほとんど全ての配列や長さのものの融解温度を所望の融解温度を調節するのに使用され得る。
【０１９５】
（オリゴヌクレオチド合成）
溶液中の、または固相支持体上でのオリゴヌクレオチド合成法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２；Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｔ−１９７２，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；Ｓｅｌｉｇｅｒら（１９９０）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：６９１−６９６を参照のこｔ）。
【０１９６】
（オリゴヌクレオチドのインサイチュ合成）
光指向合成法を使用するガラスおよびシリコーン表面でのインサイチュオリゴヌクレオチド合成は、当該分野で周知である（例えば、ＭｃＧａｌｌら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：５０８１−５０９０；Ｗａｌｌｒａｆｆら（１９９７）Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  ２７：２２−３２；ＭｃＧａｌｌら（１９９６）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３５５５−１３５６０；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．４：３７６−３８０；および、Ｐｅａｓｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５０２２−５０２６を参照のこと）。
【０１９７】
（２．基板への結合）
オリゴヌクレオチドは、化学的に誘導される基板、または、官能基を有するポリマーまたはプラスチックのような基質に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、写真平板、共有結合、または、イオン相互作用、ファンデルワール結合および水素結合のような非共有的相互作用による受動的結合を含む、様々な過程を通じて固相支持体に結合させることが可能である。オリゴヌクレオチドは、５’または３’末端修飾を通じて表面に共有結合され得る。オリゴヌクレオチドを表面から遠ざけるために、典型的にはリンカーが用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドが、５’末端を介して結合される場合、リンカーは、その５’修飾の直前の５’末端に存在することになる。使用される典型的リンカーとしては、ヘキシルエチレングリコール（１つ以上の単位）、および、オリゴデソキシチミジンｄＴｎ（ｎ＝５〜２０を有する）が挙げられる。
【０１９８】
（化学的誘導体化）
種々の方法が、反応性官能基を備えるように化学的に誘導体化された表面にオリゴヌクレオチドを結合させるのに使用され得る。例えば、アミノ修飾オリゴは、エポキシド活性化表面と反応して共有結合を形成する（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅら（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５を参照のこと）。同様に、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの共有結合は、カルボン酸修飾表面（Ｓｔｏｔｈｅｒら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１２０５−１２０９）、イソチオシアネート、アミン、チオール（Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙら（２０００）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ９８−１−６；Ｌｅｎｉｇｋら（２００１）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １７：２４９７−２５０１）、イソシアネート（Ｌｉｎｄｒｏｏｓら（２００１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：ｅ６９  １−７）、および、アルデヒド修飾表面（Ｚａｍｍａｔｔｅｏら（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８０：１４３−１５０）で達成され得る。
【０１９９】
典型的には、シリコーン表面は、化学的に誘導体化されて、次に、本明細書に記載されるようにオリゴヌクレオチドが固定化される（Ｂｅｎｔｅｒｓら（２００２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ１０  １−７をも参照のこと）。例えば、表面の洗浄後、表面をアミノプロピルトリメトキシシランで処理して表面上にアミノシロキサン層を形成する。この表面を、二官能性クロスリンカー１，４−フェニレンジイソチオシアネートで活性化する。クロスリンカーの一方のイソチオシアネート基は、表面のアミノ官能基と反応して安定なチオウレア結合を形成する。ここで、第二の表面結合されたイソチオシアネート基は、他の、アミノ基を有する分子と共有結合をするために待機する。次の工程で、デンドリマーポリアミン、例えば、スターバースト（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、世代４、６４個の末端アミノ基を有する（例えば、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が活性化表面と反応して、高密度の共有結合したアミノ基を有する基板の上に均一な中間層を形成する。表面のこれらの官能基は、１，４−フェニレンジイソチオシアネートを用いて再び活性化される。未反応のアミンは、４−ニトロ−フェニレン・イソチオシアネートを用いてブロックされる。ここで、アミノ修飾オリゴヌクレオチドは、活性化デンドリマー中間層に対して、同じタイプの反応を通じて架橋結合される。最終工程では、未反応イソチオシアネートは、ヘキシルアミンのような小型の一級アミンを用いてブロックされる。
【０２００】
（３．基板上の配置）
オリゴヌクレオチドは、基板上に、周知の不連続の位置に結合される。各位置は、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドの複数コピーからなる。あるいは、各位置は、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドの複数コピーを有し得る。これは、多重反応のためのオリゴヌクレオチドの好ましい配置である。同一位置にある異なる配列のオリゴヌクレオチドは、同様配列を有するグループと一緒に混合されるか、または、同様配列を有するグループに分離することが可能である。多重化のためには、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または、それ以上の異なるオリゴヌクレオチドが利用され得る。利用される異なるオリゴヌクレオチドの数は、一つの位置において各異なる配列に結合する生成物を分解する能力によってのみ制限される。例えば、米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２号は、１００種以上の異なるオリゴヌクレオチドを分解し得るナノ結晶検出手段を提供する。
【０２０１】
基板の上の異なる位置は、典型的には、異なる配列のオリゴヌクレオチドを含む。ある一つの位置のオリゴヌクレオチドは、典型的には、０．００２５ｍｍ２から２．０ｍｍ２（例えば、１．４ｍｍ２）の面積を占め、オリゴヌクレオチド量は１０ａｍｏｌと１０ｐｍｏｌの範囲にある。典型的な形式は、１枚の基板について、大きさ２０×３０ｍｍ、８×１２、１６×２４または３２×４８のパターンと間隔を有する９６、３８４または１５３６位置であり、これらは、標準的反応プレートと等価である（中心間距離が、２．２５ｍｍ、１．１２５ｍｍ、または、０．５６２５ｍｍ）。一つの実施態様では、位置は、質量分析で用いられるレーザーの直径よりも大きくはない。基板のサイズ、位置の総数、および、位置の配置されるパターンは、基板の上にアレイを作製するため、液体処理のため、および／または、分析のために使用されるデザイン面および装置に一致され得る。例えば、間隔やスポットサイズは、アレイを形成する装置の正確度および／または滴下サイズに適合するものであってもよい。基板の１列または１行に置かれる、オリゴヌクレオチドの位置の数は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のレーザーが同時に一つ以上の位置を含まないようにされ得る。
【０２０２】
オリゴヌクレオチドのグループは、基板表面において、どのような配置で設置されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、基板の中に形成された個々のウェルの中に設置されてもよい。基板の上にあるウェルの数は、基板のサイズに応じて変動してよいが、９６ウェルまたは３８４ウェルがもっとも頻繁に使われている。唯一の制限は、ウェルがそれぞれ別々に分離されたままで維持されなければならないことである。オリゴヌクレオチドは、基板において、それぞれ、共通の上段試薬チャネルを共有する、列または行の、周知の不連続位置に設置されてもよい。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドはまた、全体として平坦な平面で、周知の不連続位置に、任意の配置で設置されてもよい。位置はまた、さらに、個々のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの混合物を含む、より小なる面積の小区画に分割されてもよい。試薬用のチャネルまたはウェルは、基板の上層に設置されるのと同じ材料、または、異なる材料から成るマスクで形成されてもよい。さらに、基板上のウェルおよびチャネルは、ビーズを局在させる、または、それらを、例えば、サイズによって分離および仕分けするように設計されてもよい。この設計では、ビーズは、反応生成物の核酸および誘導体を捕捉するために使用されるオリゴヌクレオチドのキャリアである。
【０２０３】
（４．オリゴヌクレオチドの型）
オリゴヌクレオチドの配列、長さおよび組成は、捕捉される核酸の性質に依存して変動する。オリゴヌクレオチドは、各アッセイ生成物に対して特異的であってもよく、または、ある多型部位に関して２種以上の対立遺伝子改変体の共通領域に対して、相補的であってもよい。例えば、プライマー伸長反応アッセイでは、表面固定化相補性オリゴヌクレオチドは、多型部位の両方の対立遺伝子に由来する伸長生成物に対してハイブリダイズすることが可能である。これは、多型領域とハイブリッドを形成していないためである。オリゴヌクレオチドは、多型領域に対して５’の伸長生成物とハイブリダイズする。しかし、各オリゴヌクレオチドは、単一多型領域の対立遺伝子とのみハイブリダイズする。
【０２０４】
あるいは、一般的オリゴヌクレオチド（「ジップコード」オリゴヌクレオチド）を基板上に固定化することも可能である。ジップコードオリゴヌクレオチドはどのような長さであってもよいが、代表的には６から２５ヌクレオチド長である。捕捉されたアッセイ生成物は、表面結合オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするようジップコード相補配列を有する。ジップコードは、一つの部位で各種多型を捕捉および検出するために使用されるアッセイ生成物によって共用されてもよい。種々の組のジップコードおよび相補的ジップコード配列を用いて、種々の部位における種々の多型部位のアッセイ生成物を、単一アッセイ生成物として、ならびに異なるアッセイ生成物の小グループにおけるアッセイ生成物として分離するために使用し得る。遺伝子ジップコード配列の使用は、基板の製造および品質管理を単純化する。上述の戦略は、多重化サンプルの処理および分析を容易にする。
【０２０５】
ジップコード法の可能な改変は、伸長プライマーに切断部位を組み込むことである。例えば、ジップコード配列は、アッセイ生成物から切断されて、質量分析のような分析法に、より適切なアッセイ生成物を作製することが可能である。切断可能部位は、酵素的にまたは塩基的に切断可能な部位である。例えば、デオキシリボヌクレオチドの配列中の単一リボヌクレオチドは、リボヌクレアーゼまたは塩基によって切断され得る。オリゴヌクレオチドの合成の間に無塩基部位を組み込むことも可能であるし、酵素や化学物質で誘導することも、塩基性条件下で、または、酵素によって切断することも可能である。反応生成物の分析にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いる場合は、切断用の酵素または試薬は、マトリックスと一緒に捕捉核酸に添加し得る。他の方法としては、酸切断部位（例えば、質量分析用のマトリックスによって、または、マトリックス添加物によって切断可能な部位）が挙げられ、ホスホラミデート結合（例えば、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ  ら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３８６４−３８７２を参照のこと）または光切断部位の場合、レーザー使用質量分析法においてレーザーで切断され得る。ジスルフィド結合も使用され得、ジチオスレイトールのような還元剤の存在下で、切断され得る。
【０２０６】
別の実施形態では、表面結合オリゴヌクレオチドは、活性化基板またはチップに付着するようになった増幅生成物である。基板は、本明細書に、すなわち、実施例２に記載されるように、オリゴヌクレオチド添加の点まで活性化される。表面に対するＰＣＲ生成物の付着は、ＰＣＲの間およびＰＣＲ後に起こる。ＰＣＲ生成物の化学的付着は、ＰＣＲプライマー（単数または複数）の５’−改変を介して達成される。また、表面に対するＰＣＲ生成物の受動的付着は、例えば、静電的相互作用、ファンデルワールス力および水素結合によって生じ得る。アッセイ生成物、例えば、プライマー伸長生成物は、表面固定化増幅生成物に対するハイブリダイゼーションによって捕捉される。
【０２０７】
あるいは、前述したように、一般的オリゴヌクレオチド（「ジップコード」オリゴヌクレオチド）を基板上に固定化し得る。増幅生成物は、結合オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを可能にするようにジップコード相補配列を付着させている。増幅生成物は同時にアッセイ生成物を捕捉する。ジップコードオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ＰＮＡ）、または、その他の改変核酸誘導体を、全体として、または、部分的に、その配列内で用いることによって形成されたハイブリッドの安定性が、顕著に改善され得るように修飾され得る。ジップコードとおよび増幅生成物の対応領域も、形成されたハイブリッドの反応基を介して、互いに恒久的に架橋結合され得る。別の実施形態では、一般ジップコードオリゴヌクレオチドが基板上に固定化される。増幅生成物の１本鎖は、一端で、１本鎖突出配列を有するように設計されている。ＰＣＲまたは他の任意の増幅法の後、ハイブリダイゼーションによる捕捉は、一部は、表面のジップコードに対して相補的であり、他の一部では、増幅生成物の標的鎖のさらなる突出配列に対して相補的な配列を有する第３のオリゴヌクレオチドによって仲介される。従って、表面では、増幅生成物とジップコード配列との間の接触を仲介することにより形成されたハイブリッドはさらに、標的鎖を、例えば、リガーゼ反応を使用することによって表面に恒久的に結合するのに使用され得る。共有結合付着は、適切な緩衝液条件下で、第２鎖および仲介オリゴヌクレオチドを洗い流すことによって、単一鎖増幅生成物の単離を可能にする。基板における１本鎖単離は、例えば、固定化標的ＤＮＡ内部に、プライマー伸長反応によってＳＮＰ部位を同定する反応をその後に実行され得る。アッセイ生成物は最終的には捕捉され、固定化標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることによって分析に適切な状態にする。
【０２０８】
（ｃ．タンパク質およびペプチドの捕捉）
タンパク質またはペプチドがアッセイされる実施形態では、タンパク質およびペプチドは、例えば、表面付着オリゴヌクレオチド、タンパク質、および、表面固定化酵素に対するハイブリダイゼーションまたは他の相互作用機構を介して捕捉され得る。表面付着オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡマイクロアレイに対するタンパク質相互作用の研究は、遺伝子発現、複製、および、組換えの制御および調節について知るために重要である（Ｂｒｏｃｋｍａｎ，Ｊ．ら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２１：８０４４−８０５１）。さらに、タンパク質がどのようにしてある種のオリゴヌクレオチド配列を認識するのかを理解することは、治療タンパク質の発現を調整するために使用され得る薬剤を設計するに当たって有用である。Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９９，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：２８５８−２８６５）は、エピトープ標識タンパク質の一つの方法を記載している。この方法では、エピトープタグはヒスチジンであり、次いで、この標識タンパク質を表面固定化Ｎｉ２＋キレートに捕捉する。この技術では、Ｎｉ２＋キレート化表面に結合することによって捕捉されたのはヒスチジンタグである。このＮｉ２＋キレート化表面は、Ｎｉ２＋緩衝液を、ニトリロ三酢酸誘導化表面に流すことによって形成される。別の実施形態では、タンパク質は、表面固定化酵素に対するその結合親和性によって表面に捕捉され得る（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：４３６９−４３７４；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．ら（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１−７；Ｎｅｄｅｌｋｏｖ，Ｄ．ら（２０００）Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ４２３：１−７）。酵素上の一次アミンは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドアミノプロピルカルボジイミドによって活性化された表面に共有的に付着し得る。ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．ら（２０００，Ｓｉｃｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６２）は、本発明で使用するのに適した別のプロセスを記述している。その方法では、タンパク質は表面に固定化され、タンパク質チップを形成し得る。この実施形態では、タンパク質上のリシン残基は、例えば、シッフの塩基形成によるアルデヒド面に対して共有的に付着し得る。この表面固定化タンパク質に対する他のタンパク質および小型分子の捕捉による相互作用は、タンパク質機能に関する重要な情報ならびに小型分子の可能な治療性に関する情報をももたらし得る（Ｌｉｎ，Ｓ．ら，（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：２６３５−２６４０）。
【０２０９】
（ｄ．小型有機分子の捕捉）
小型有機分子とタンパク質間の相互作用は、タンパク質機能を明らかにするばかりでなく、小型分子が、良好な薬剤候補となり得る可能性を発見する点でも重要な場合がある（ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．ら（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６２；Ｌｉｎ，Ｓ．ら（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：２６３５−２６４０）。小型有機分子とタンパク質の相互作用は、目的のタンパク質を表面に固定化することによって研究され得る。この実施形態では、タンパク質上のリジン残基を例えば、シッフの塩基形成を介してアルデヒド面に、または、チオウレア結合形成を介してイソチオシアネート表面に共有的に付着させることが可能である。
【０２１０】
（ｅ．炭水化物の捕捉）
複雑な炭水化物（例えば、糖タンパク質、糖脂質およびプロテオグリカン）は、細胞表面上に位置する。多くの場合、これらの炭水化物は、抗原に対する宿主の受容体である。宿主の受容体／抗原相互作用を明らかにすることは、感染症メカニズムのより良い理解をもたらすだけでなく、そのような病気を予防し得る薬物製造の機会を作り出すことにもなる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｄら（Ｗａｎｇ，Ｄ  ら２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ２０，２７５−２８１）は、表面固定化炭水化物含有抗原に対する抗体反応を研究するために、炭水化物マイクロアレイ製造の本発明の使用に適切な方法を記述する。これらのマイクロアレイは、ニトロセルロース被覆ガラススライド上に炭水化物抗原を点状滴下することによって形成される。炭水化物抗原は、非共有的相互作用を介してこのニトロセルローススライド上に固定化される。
【０２１１】
（４．増幅）
核酸標的を検出、同定または特徴付けするように設計された反応を実施する前に、その拡散標的の少なくとも一部をまず増幅する必要がある場合もある。増幅は、例えば、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲ等により、当該分野で公知の方法に従って実施され得る。
【０２１２】
（５．多型の検出）
対立遺伝子改変体の有無を確定する方法は、センス鎖、または、アンチセンス鎖の同じ位置を利用し得る。一般に、これらの方法は、配列特異的ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プローブおよびプライマーに基づく。当業者には周知の、ある核酸配列内の一つの特定のヌクレオチドを特定する任意の方法、または、ある核酸配列内の一つの特定のヌクレオチドの本体を確定する任意の方法が適用可能である。いくつかのそのような一般的核酸検出アッセイが知られている（例えば、米国特許第６，０３０，７７８号を参照のこと）。
【０２１３】
一ヌクレオチド多型を検出する方法も提供される。一ヌクレオチド多型は、不変配列領域によって隣接される変動部位を構成するので、その分析は、変動部位に存在する単一ヌクレオチドの特定しか必要とせず、従って、各患者について全遺伝子配列を決定する必要はない。このような一ヌクレオチド多型の分析を促進するためにいくつかの方法が開発されてきた。
【０２１４】
（６．反応生成物の分析）
（ａ．質量分析）
核酸はまた、検出法およびプロトコル、特に、質量分析に依存するものによっても分析され得る（例えば、米国特許第５，６０５，７９８号、同第６，０４３，０３１号、同第６，１９７，４９８号および国際特許出願番号ＷＯ９６／２９４３１、同時係属米国出願番号０８／６１７，２５６、同時係属米国出願番号０８／７４４，４８１、米国出願番号０８／９９０，８５１、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２００１９を参照のこと）。これらの方法は自動化され得る（例えば、同時係属米国出願番号０９／２８５，４８１を参照のこと、これは自動化プロセスラインを記述する）。本発明において分析法の中で特有なものは、検出に質量分析法を備えたプライマーオリゴヌクレオチド塩基伸長反応（ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標））を含むもの（例えば、米国特許第６，０４３，０３１号および同６，１９７，４９８号、特許出願番号０９／２８７，６８１、同０９／２８７，６８２、および、同０９／２８７，６７９、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０４４４（ＷＯ９８／２０１６６）を参照のこと）であって、米国特許第５，９００，４８１号、同６，０２４，９２５号、同６，０７４，８２３号、出願番号０８／７４６，０５５号、同０８／７８６，９８８号、同０８／９３３，７９２号、同０８／７４６，０５５号および同０８／７８６，９８８号に基づく；米国出願番号０９／０７４，９３６号および公開国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９５（ＷＯ９８／２００２０）を参照も参照のこと）。
【０２１５】
分析を質量分析、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて行う場合、ナノリットル容量のサンプルを、得られるスポットが、レーザースポットのサイズとほぼ同じか、それよりも小さくなるようにロードする。このことが達成された場合、質量分析の結果は定量的になることが判明している。得られた質量スペクトルのピーク下面積は濃度に比例する（正規化され、かつ、背景に対して補正された場合）。このようなチップの調製および使用法が米国特許第６，０２４，９２５号、同時係属米国出願番号０８／７８６，９８８号、同０９／３６４，７７４号、同０９／３７１，１５０号および同０９／２９７，５７５号に記述されている；また、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０１９５（ＷＯ９８／２００２０）を参照のこと。これらの分析を実行するためのチップおよびキットは、ＳＥＱＵＥＮＯＭ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）として市販されている。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）は、酵素性プライマー伸長反応の忠実性を、小型化アレイおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型）質量分析法と組み合わせて、結果を急速に送達するようにしている。この装置は、標識なしに、遺伝子改変体に関連するＤＮＡフラグメントサイズにおける一塩基変化を正確に識別する。
【０２１６】
（１．反応サンプルの調整）
例えば、ハイブリダイズした核酸のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するには、サンプルを脱塩し、最終的に、生体分子の分析に干渉する恐れのある他の成分を全て除去することが必要である。このような調整は、塩類、緩衝成分および試薬や、固相支持体に結合していない生成物を全て洗い去ることによって実施され得る。
【０２１７】
（２．マトリックス）
一旦表面への生体分子の捕捉が起こり、脱塩および調整が完了した場合、マトリックスを表面に加え、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による分析を可能とする。代表的には、１ｎＬから１００ｎＬのマトリックスを表面に添加する。オリゴヌクレオチドには、３−ヒドロキシピコリン酸マトリックスが使用され得る。マトリックス組成物は、例えば、１０％アセトニトリル：水中の３００ｍＭ  ３−ヒドロキシピコリン酸、３５ｍＭクエン酸ジアンモニウムである。タンパク質、ペプチドおよび小型分子には、シナピン酸（５０ｍＭシナピン酸、１：２アセトニトリル／水に１．５％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖを添加したもの）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ジヒドロキシ安息香酸＋１０％５’−メトキシサルチル酸）、および、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（約５０ｍＭ、１：２アセトニトリル／水に１．５％トリフルオロ酢酸ｖ／ｖを添加したものに溶解）、のようなマトリックスが使用され得る。このマトリックスを、例えば、ＧｅＳｉｍナノ分注器、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ分注器、微小滴下ナノ分注器およびＲｏｂｏｄｅｓｉｇｎピンツールを用いてナノ投与し得る。
【０２１８】
（３．多重化）
多重化法は、ある特定の遺伝子または数種の遺伝子における１個を越える多型領域について同時検出を可能とする。基板上の単一部位における多重化は、各組の特異的アッセイ反応の生成物として、異なる固定化捕捉オリゴヌクレオチドを使用することによって達成され得る。
【０２１９】
別の実施形態では、多重化は、それぞれが固定化された１つ以上の捕捉オリゴヌクレオチドを有し、かつ、一つの共通の試薬チャネルを共有する、いくつかの部位を用いて実行が可能である。この捕捉オリゴヌクレオチドの組は各部位について異なる。ある特定の部位では同一の捕捉オリゴヌクレオチドが使用されてもよいし、あるいは、アッセイ生成物が共通の配列を共有しているか否かに依存して異なる捕捉ヌクレオチドがあってもよい。多数の種々のアッセイ反応が試薬チャネル内で実行が可能であり、かつ、その生成物は、捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有しているので、基板上の特定の位置に仕分けされる。この多重化用配置の利点は、アッセイ生成物を検出するのに限られた数の質量値を使用することが可能であること、および、それらの値が、種々の部位のそれぞれに結合される生成物に対して同一であってもよいことである。
【０２２０】
（ｂ．蛍光依存分析法）
生体分子の蛍光依存検出のための多くのシステムが知られている。このようなシステムを、本明細書に提供される方法における反応生成物の分析・検出のために用いてもよい。
【０２２１】
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ含まれており、本発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書で提供される方法の実施・生成物の展開は、別様に表示しない限り、従来技術の範囲にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および、免疫学に関する従来の技法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩおよびＩＩ巻、Ｄ．Ｎ．Ｃｌｏｖｅｒ編、１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」、（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４；「Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１５４と１５５巻、Ｗｕら編；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）編、１９８６）；「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ」、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照。
【実施例】
【０２２２】
（実施例１）
（血液サンプルからのＤＮＡ単離）
血液からＤＮＡを単離するための例示の方法を、必要に応じて採用してよい工程を含めて下記に詳述する。
【０２２３】
（細胞溶解）
ＥＤＴＡ全血１０ｍｌを、２０００×ｇで１５分以下遠心した。１−２ｍｌの軟膜を１５ｍｌチューブに移送した。９ｍｌの溶解赤血球（ＲＣＬ）をチューブに加え、チューブを、赤血球塊が無くなるまで激しくボルテックスし、室温で１０分インキュベートした。インキュベーション中チューブを一度反転し、その後、２０００×ｇで１０分遠心した。上清を、バイオハザード容器に注入した。目に見える白血球ペレットと１００−２００μｌの残留液が後に残された。チューブを試験管ラックに並べ、白血球をこの残留上清に再懸濁した。５ｍｌのＲＣＬ洗浄体を白血球に加え、チューブを反転し白血球を再懸濁した。チューブを２０００×ｇで１０分遠心し、上清をバイオハザード容器に注入した。目に見える白血球ペレットと１００−２００μｌの残留液が後に残された。チューブを試験管ラックに並べ、白血球をこの残留上清に再懸濁した。４．５ｍｌの溶解白血球（ＷＣＬ）をチューブに加え、完全に混合するまで上下にピペッティングした（移送ピペットにて）。典型的にはインキュベーションは必要ではなかった。
【０２２４】
（タンパク質沈殿）
タンパク質を沈殿させるには、タンパク質沈殿溶液２ｍｌを細胞溶解物に加え、高速で２０秒間激しくボルテックスし、タンパク質沈殿溶液と細胞溶解物とを均等に混合した。この混合液を３０００×ｇで１０分遠心した。沈殿したタンパク質は、締まった、暗褐色のペレットを形成する。ＤＮＡを含む上清は透明でなければならない。
【０２２５】
（ＤＮＡ沈殿）
ＤＮＡを含む上清を、１００％イソプロパノール６ｍｌを含む、清潔な１５ｍｌチューブに注入した。このサンプルを、ＤＮＡの白い糸が見えるようになるまで、穏やかに反転して混合した。各サンプルを、ＤＮＡの有無に関して視覚的にチェックし、サンプルのサイズを推定した。比較的小さい場合には、ＤＮＡ水添加の工程１においてＴＥバッファーをあまり要しなかった。サンプルを、２０００×ｇで３分遠心した。ＤＮＡは、小さな白いペレットとして見えた。上清は、アルコール廃棄物容器に注ぎ、チューブはペーパータオルの上でたたいて余分のアルコールを除去した。７０％エタノール：水５ｍｌを加え、チューブを数回反転してＤＮＡペレットを洗浄した。チューブを２０００×ｇで１分遠心した。エタノールを注意深くアルコール廃棄物容器に注いで除いた。ペレットはこの段階ではゆるくなっているかも知れないので、ゆっくりと注ぎ、ペレットを見守る。チューブの液体を清潔な吸収紙で吸収し、ＤＮＡを、チューブを１０分間反転させて乾燥させた。
【０２２６】
（ＤＮＡ水和）
ＤＮＡを再度水和させるために、１×ＴＥ  １０００μｌを加え、室温で一晩放置して再度水和させた。次に、ＤＮＡを、サンプルグループ毎に適正な蓋のついたラベル付きチューブにピペットで移した。水和したＤＮＡに凝固塊が見られる場合には、下記の精製工程を実施した。ＤＮＡサンプルは、２−８℃の冷蔵庫に、民族集団、性別、および、年齢で分けて保存した。
【０２２７】
（水和ＤＮＡの精製）
水和ＤＮＡの中に凝固塊がある場合には、再水和工程の後で、ＤＮＡを再度単離した。新たなＷＣＬ  ５ｍｌを加え、６５℃で３０分から１時間インキュベートした。このサンプルを室温に冷却し、タンパク質沈殿液１ｍｌを、この溶解細胞に加えた。タンパク質沈殿プロトコルを繰り返した。
【０２２８】
（実施例２）
（表面の化学的誘導体化）
チップを下洗いするために、シリコーン面を、クロム酸溶液に１２時間浸し、その後ＤＩ水で３度洗浄した。
【０２２９】
（チップのケイ素化）
１％ＡＰＴＭＳ／９５％アセトン：水ｖ／ｖを調製するために、アミノプロピルトリメトキシシラン１．６ｍＬを、９５％アセトン：水１５８．４ｍＬと混ぜ、チップに加え、室温（ＲＴ）で攪拌しながら５分間反応させた。次に、この表面をメタノール（５×）で濯ぎ、その後アセトン（５×）で濯いだ。次に、表面を１１０℃で２５分間真空オーブンに置いた。
【０２３０】
（５７ｍＭ  １，４フェニレンジイソチオシアネートによる第１回活性化）
１，４フェニレンジイソチオシアネート１．７６ｇを、１０％ピリジン：ＤＭＦ１６０ｍＬに溶解し、その溶液を表面に与え、軌道回転攪拌しながらＲＴで２時間反応させた。表面を、手動で攪拌しながらＲＴで、メタノール（３×）で、次にアセトン（３×）で洗浄した。
【０２３１】
（アミンデンドリマー工程）
１０％ピリジン：ＤＭＦに溶解させた１．２５％ｖ／ｖスターバーストデンドリマー世代４．０（６４アミノ基）を、２ｍＬのデンドリマーを１０％ピリジン：ＤＭＦ１５８ｍＬと結合させて生成した。この溶液をチップに加え、ＲＴで軌道回転攪拌しながら一晩（例えば、＞５時間）反応させた。表面をエタノール（３×）と水（３×）で洗浄した。
【０２３２】
（１００ｍＭ  １，４フェニレンジイソチオシアネートによる第２回活性化）
１，４フェニレンジイソチオシアネート３．２ｇを１０％ピリジン：ＤＭＦ１６０ｍＬに溶解し、チップに加え、攪拌しながらＲＴで３時間反応させた。表面をメタノール（３×）で、次にアセトン（３×）で洗浄した。
【０２３３】
（０．１Ｍ４−ニトロフェニルイソチオシアネートによるアミンキャッピング）
４．８ｇの４−ニトロフェニルイソチオシアネートを、１０％ピリジン：ＤＭＦ１６０ｍＬに溶解し、この溶液をチップに加え、軌道回転攪拌しながらＲＴで１時間反応させた。次に、表面をメタノール（３×）とアセトン（３×）で洗浄した。
【０２３４】
（オリゴヌクレオチドスポット形成）
５’−アミノ修飾オリゴヌクレオチドの２５μＭホルムアミド溶液を、ピンツールスポット形成具を用いて表面上にスポット形成した。点綴した容量は約５０−１００ｎＬであった。９６オリゴヌクレオチドアレイから成るパターンが形成された。表面を二日間放置した。次に、未結合のオリゴヌクレオチドは、５×ＳＳＣ／５０％ホルムアミドバッファー液で３０分６０℃で洗い流し、脱イオン水で６０℃で３０分で容器へ、次いでＲＴでアセトンにより洗浄した。
【０２３５】
（２％ヘキシラミンによるイソチオシアネートキャッピング）
未反応イソチオシアネートをブロックするために、３．２ｍＬヘキシラミンを１０％ピリジン：ＤＭＦ１５６．８ｍＬと混合し、チップに加え、６０℃で１時間反応させた。次に、表面をＲＴで５ｘＳＳＣ／５０％ホルムアミドで洗浄し（２×）、その後ＲＴでＤＩ水洗浄と２回、アセトンによる１回の短い濯ぎを行った。次に、チップを、その後使用するまで真空デシケータ中で真空下に保存した。
【０２３６】
（実施例３）
（４重ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）アッセイ）
（Ａ．ハイブリダイゼーションチップ）
図４に関連して記述した方法により、背面金属箔シリコンチップ、２０×３０ｍｍで厚さ７００μｍを用意した。この基板に、４種の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを付着させた。すなわち、嚢胞性線維症に関連するヒト遺伝子内多型部位の４種の伸長プライマーに対して相補的なオリゴヌクレオチドである。各チップは、１２レーンで、それぞれに８個の別々の標的部位のあるパターンを持つ。４種の捕捉ヌクレオチドのそれぞれが、各レーンに２回重複として存在する。４種の捕捉オリゴヌクレオチドの配列は下記の通り。ＣＦ３６５９−３−ｃｏｍ：５’−ｃａａ  ｇｔｃ  ａａｃ  ｃａａ  ａｃｃ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号１）、ＣＦ５０８ｄｅｌＦ−ｃｏｍ：５’−ｇｇｔ  ｇｔｔ  ｔｃｃ  ｔａｔ  ｇａｔ  ｇ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号２）、ＣＦ７１１＋１−ｃｏｍ：５’−ｔｃａ  ｔｃａ  ａａｔ  ｔｔｇ  ｔｔｃ  ａｇ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号３）、および、ＣＦ６２１−２−ｃｏｍ：５’−ｔｔａ  ｔａａ  ａｔｃ  ａａａ  ｃｔａ  ａａｃ  ａ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号４）。各配列は、３’アミノ末端修飾（ＮＨ２＝３’−アミノ−Ｃ７修飾因子、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）を介して、かつ、１個のヘキサエチレングリコール単位（Ｘ）を隔てて、シリコーン表面に付着される。チップ表面の各部位は、６００−８００μｍの直径と、１５から１００ｆｍｏｌｅ／ｍｍ２のオリゴヌクレオチドの表面密度を持つ。
【０２３７】
（Ｂ．多重化ＰＣＲと脱リン酸化）
４重ＰＣＲを、実施例１に従って調製したゲノムＤＮＡと下記の組のプライマーを用いて、標準サーマルサイクラーの上で標準プロトコルに従って実行した。エキソン５の１３２ｂｐのアンプリコンに対してＣＦＸ４−Ｆ３  ｃｃａ  ａａｇ  ｃａｇ  ｔａｃ  ａｇｃ  ｃｔｃ  ｔ（配列番号５）とＣＦＸ４−Ｒ  ｃｇａ  ｔａｃ  ａｇａ  ａｔａ  ｔａｔ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｔｇ（配列番号６）、ＣＦＸ５−Ｆ５  ｇｃｔ  ｇｔｃ  ａａｇ  ｃｃｇ  ｔｇｔ  ｔｃｔ  ａ（配列番号７）とＣＦＸ５−Ｒ５  ｇｔａ  ｔａａ  ｔｔｔ  ａｔａ  ａｃａ  ａｔａ  ｇｔｇ  ｃｃ（配列番号８）；エキソン１０の２２５ｂｐのアンプリコンに対してＣＦＸ１０−Ｆ７  ｇａｔ  ｔａｔ  ｇｇｇ  ａｇａ  ａｃｔ  ｇｇａ  ｇ（配列番号９）とＣＦＸ１０−Ｒ  ｇｔｇ  ｔｇａ  ａｇｇ  ｇｔｔ  ｃａｔ  ａｔｇ  ｃ（配列番号１０）；および、エキソン１９の２４０ｂｐのアンプリコンに対してＣＦＸ１９−Ｆ２  ｃｃａ  ａｇｔ  ｇａｃ  ａａａ  ｔａｇ  ｃａａ  ｇｔｇ  ｔ（配列番号１１）とＣＦＸ１９−Ｒ２  ａｃｇ  ｔｇｔ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ａｔａ  ａｔｃ  ａｔａ（配列番号１２）のプライマー。ＰＣＲ反応は、全体容量５μｌの１×ＰＣＲバッファー（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に対して、各ＰＣＲプライマー５０ｎＭ、各ｄＮＴＰ５００μＭの濃度で、５ｍＭのＭｇＣｌ２と０．１単位のＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼで行った。ＰＣＲ反応の後、２μｌのテルモセケナーゼバッファー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）溶解液中で、エビアルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）０．３単位で処理し、３７℃で２０分、次いで８５℃で５分インキュベートした。
【０２３８】
（Ｃ．ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ反応およびチップ基板上でのハイブリダイゼーション）
４重ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ混合液を、下記のプライマーの組み合わせを用い標準プロトコルに従って調製した。すなわち、ＣＦ３６５９−３  ｇｇｔ  ｔｔｇ  ｇｔｔ  ｇａｃ  ｔｔｇ（配列番号１３）、ＣＦ５０８ｄｅｌＦ  ｃａｔ  ｃａｔ  ａｇｇ  ａａａ  ｃａｃ  ｃａ（配列番号１４）、ＣＦ７１１＋１  ｃｔｇ  ａａｃ  ａａａ  ｔｔｔ  ｇａｔ  ｇａａ（配列番号１５）、および、ＣＦ６２１−２  ｔｇｔ  ｔｔａ  ｇｔｔ  ｔｇａ  ｔｔｔ  ａｔａ  ａｇａ  ａｇ（配列番号１６）である。最終濃度は、１×テルモセケナーゼバッファー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において、ｄｄＮＴＰおよびｄＮＴＰに対して５０μＭ、各ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーに対して６００ｎＭ、および、テルモセケナーゼ０．０６３Ｕ／μｌであった。ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ混合液を、実施例３Ｂで得られたＰＣＲ／ＳＡＰ反応液と２：７の比で混合した。次に、この反応混合液をハイブリダイゼーションチップに塗布した。二つの方法のサーマルサイクル処理を実行した。一つの実施態様では、チップ全体を、全体容量１２５μｌのＦｒａｍｅＳｅａｌ（商標）セル（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で被い、長いサイクル時間（５５サイクル当たり約１５０分、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を持つ標準的なインサイチュサーマルサイクルブロックを用いた。別の実施態様では、チップをポリジメチルシロキサンマスク（ＰＤＭＳ）で被い、カートリッジ（図１に描かれるものと同様の）に設置し、チップ表面の上に６個の４μｌおよび６個の２μｌチャネルを形成した。チャネルは入口と出口を備える。チップに反応混合液を満たした後、チャネルを封印し、本明細書に記載した高速サーマルサイクラーを用いてサーマルサイクル処理した。典型的サイクル条件は、最初９５℃で２０秒、次に９５℃で５秒間、５６℃で５秒間、および、７２℃で５秒間から成る４０−５５サイクルである。冷却・加熱速度は、市販のサーマルサイクラーに比べると極端に高く、４５サイクルに対して合計処理時間１５分となった。両方のセットアップにおいて、チップは室温または４℃に冷却し、マスクから外し、直接、室温で５×ＳＳＣバッファー浴中に入れた。軌道回転攪拌器の上で５分間穏やかに振とうした後、２回目の５×ＳＳＣバッファー洗浄、その後、７０ｍＭクエン酸アンモニウムによる２回の洗浄とナノ純粋水による短い１回の洗浄を実行した。
【０２３９】
（Ｄ．マトリックス塗布およびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ分析）
下準備の後、マトリックス液を、チップ上の、ハイブリダイズした標的核酸を備える９６部位に塗布した。水または水／アセトニトリル９：１ｖ／ｖに溶解させた３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシピコリン酸）の３００ｍＭ溶液で、３２ｍＭのクエン酸ジアンモニウムを添加させた溶液２×７ｎｌを、ミクロドロップ圧電ナノ分注器（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  ＧｍｂＨ，Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ、ドイツ）によって投与した。結晶化の後、チップを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ標的ホルダーに固定した。手動分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で実行した。一方、自動化操作は、Ｂｉｆｌｅｘ  ＭＳ装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）でＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲ−ＲＴソフトウェア（ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。
【０２４０】
（実施例４）
（Ａ．高速サーマルサイクルプロトコルを用いた９６ウェルチップ基板におけるＰＣＲ）
ＰＣＲ増幅反応を、本明細書で提供される高速サーマルサイクル処理チップおよび方法を用いて実行した。図４に関連して記述した方法に従って、背面金属化シリコンチップ（２０×３０ｍｍで厚さ７００μｍ）を調製した。チップの一つを、ジメチルジクロロシランを用いてシラン処理した。次に、チップおよびガスケットを、Ｔｒｉｓ緩衝液中の市販のブロッキング剤カゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手）で、室温で１時間処理した。ガスケットはシリコーンゴム製であり、チップ表面に接着され、基板上に、最大３μｌ容量の、９６個の反応ウェルを形成した。このチップをカートリッジに配置し、本明細書に記述される通りに高速サーマルサイクラーに接続した。ＰＣＲ混合液を、下の表１に示される通りに調製した。
【０２４１】
（表１）
【０２４２】
【表１】
2005532043.tif 000003
【０２４３】
次に、ＰＣＲ混合液０．５から１．５μｌを、チップの各反応ウェル中にロードした。チップを密閉し、８０〜９５℃に加熱した蓋を装着し、以下のようにサイクル処理した。
【０２４４】
１）ゲノムＤＮＡ溶解（１×）：９５℃、２分間
２）配列増幅（４０×）：９５℃、２秒間
５６℃、５秒間
７２℃、５秒間
高速サイクルＰＣＲに使用した酵素は、ＨｏｔＭａｓｔｅｒ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。使用したＰＣＲ緩衝液は、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）であった。結果は、ＰＣＲ反応が、所望の増幅生成物を生成したことを示した。
【０２４５】
（Ｂ．高速サーマルサイクル処理による１２チャネルチップ基板上のＰＣＲ）
別の実施形態では、ＰＣＲ増幅反応を、本明細書に記述される高速サーマルサイクル処理多数チャネルチップを用いて、実施例４Ａに記述される通りに行った。図４に関連して記述した方法を用いて、背面金属化シリコンチップ（２０×３０ｍｍで厚さ７００μｍ）を調製した。チップの一つを、ジメチルジクロロシランを用いてシラン処理した。次に、チップおよびガスケットを、Ｔｒｉｓ緩衝液中の市販のブロッキング剤カゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手）で、室温で１時間処理した。ＰＣＲ反応を、チップのチャネルにロードし、４５回のサーマルサイクルを下記のように運転した。
【０２４６】
１）ゲノムＤＮＡ溶解（１×）：９５℃、２分間
２）配列増幅（４５×）：９５℃、５秒間
５６℃、５秒間
７２℃、５秒間
９５℃保持の終了時に、あらかじめ準備した空気（Ｐｅｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｊａｎｅｖｉｌｌｅ，ＷＩから入手したＶａｒｉＡｉｒ）のパルスを手動でチップの下面に噴霧した。冷却が、９５℃から５６℃まで約１から２秒で起こることが観察された。これは、１秒当たり１８．５℃と３９℃の範囲の冷却速度に相当する。結果から、ＰＣＲ反応は、所望の増幅生成物を生成したことが示された。
【０２４７】
（実施例５）
（リボ切断部位を有するジップコードオリゴヌクレオチドのチップに基づいた切断）
本明細書に記述した通り、一般的捕捉配列、すなわち、ジップコードオリゴヌクレオチドの使用は、基本概念の有利な改変であり得る。本実施例は、さらなるジップコード配列を基板上に用いて伸長プライマーを効果的に精製し、かつ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の前に表面上にＲＮａｓｅ誘発切断を実行する方法を記述する。
【０２４８】
（ハイブリダイゼーションチップの調製）
背面金属化シリコンチップ（２０×３０ｍｍで厚さ７００ｍｍ）を、実施例２に記述した方法を用いて調製した。４種類の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを基板に付着させた。配列は、４種類のアドレスまたはジップコード配列に対する相補体であった。各チップは、１２レーンで、それぞれ８部位、合計９６スポットに相当するパターンを有する。４種の捕捉オリゴヌクレオチドはそれぞれ、各レーンにおいて、２個の反復配列として存在した。４種の捕捉オリゴヌクレオチドの配列は下記の通りである：
Ｓｅｑ＃６ＮＨ２：５’−ｔｔａ  ｇｃｔ  ｇｇｔ  ｇｔｇ  ｔｇ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号１７）；
Ｓｅｑ＃１４ＮＨ２：５’−ｔｇｃ  ａｇｃ  ａｇｃ  ｃａｔ  ｔｃ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号１８）；
Ｓｅｑ＃１５ＮＨ２：５’−ｃｔｃ  ｇｃｔ  ａｇｔ  ｇｇａ  ｔｔ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号Ｎｏ．１９）；および
Ｓｅｑ＃１９ＮＨ２：５’−ｃｇｇ  ａｇａ  ｃｇｃ  ａｔａ  ｔａ−３’−Ｘ−ＮＨ２（配列番号Ｎｏ．２０）。
【０２４９】
各配列は、３’−末端アミノ修飾によってシリコーン表面に付着させ（ＮＨ２＝３’−アミノ−Ｃ７修飾因子、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、１個のヘキサエチレングリコール単位（Ｘ）のスペースを挿入した。チップ表面の各部位は、直径が６００〜８００μｍ、オリゴヌクレオチドの表面密度が１５〜１００ｆｍｏｌｅ／ｍｍ２であった。
【０２５０】
（ジップコードオリゴヌクレオチドの設計）
以下の３種の配列を、標準的オリゴヌクレトチド合成法を用いて合成し、また、二つの異なる製造元（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤまたは、ＩＤＴ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から購入した。
【０２５１】
１）ｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵ：５’−ｃａｃ  ａｃａ  ｃｃａ  ｇｃｔ  ａａａ  （ｒＵ）ｃｃ  ｃａａ  ｔａｇ  ｇｃｔ  ｔａｔ  ｃｃａ  ａｇ（分子量＝１０６２４Ｄａ、配列番号２１）；
２）Ｈｙｂ１５：５’−ａａｔ  ｃｃａ  ｃｔａ  ｇｃｇ  ａｇ（分子量＝４２５７Ｄａ、配列番号２２）、および
３）ＣＦ６２１（ｓｅｑ１９）ｒＵ：５’−ｔａｔ  ａｔｇ  ｃｇｔ  ｃｔｃ  ｃｇｔ  ｇｔｔ  ｔａｇ  （ｒＵ）ｔｔ  ｔｇａ  ｔｔｔ  ａｔａ  ａｇａ  ａｇ（分子量＝１１７２１Ｄａ、配列番号２３）。
配列Ｈｙｂ１５は、１４マーのデソキシリボオリゴヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、基板の捕捉配列Ｓｅｑ＃１５ＮＨ２にハイブリダイズするように設計されている。その他の２種のオリゴヌクレオチドもそれぞれ、デソキシチミジンがリボヌクレオシドアナログウリジン（ｒＵ）によって置換される単一部位を有する。溶液中では、これらのＤＮＡ／ＲＮＡキメラは、酵素ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理すると、そのリボヌクレオチドの所で速やかに切断される。ｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵにおける切断生成物は、以下：
フラグメント１：５’−ｃａｃ  ａｃａ  ｃｃａ  ｇｃｔ  ａａ（ｒＵ）−３’リン酸（配列番号２４）分子量＝４８８５．２Ｄａ、および、
フラグメント２：５’−ｃｃｃ  ａａｔ  ａｇｇ  ｃｔｔ  ａｔｃ  ｃａａ  ｇ（配列番号２５）分子量＝５７５６．８Ｄａ
ＣＦ６２１（ｓｅｑ１９）ｒＵにおける切断生成物は：
フラグメント１：５’−ｔａｔ  ａｔｇ  ｃｇｔ  ｃｔｃ  ｃｇｔ  ｇｔｔ  ｔａｇ  （ｒＵ）−３’リン酸（配列番号２６）分子量＝６８０４Ｄａおよび、
フラグメント２：５’−ｔｔｔ  ｇａｔ  ｔｔａ  ｔａａ  ｇａａ  ｇ、分子量＝４９３４Ｄａ（配列番号Ｎｏ．２７）
完全長オリゴヌクレオチド、ｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵおよびＣＦ６２１（ｓｅｑ１９）ｒＵの５‘末端、および、対応するフラグメント１を、基板上において、捕捉オリゴヌクレオチドＳｅｑ＃６ＮＨ２またはＳｅｑ＃１９ＮＨ２を持つ部位とハイブリダイズするように設計した。
【０２５２】
（ハイブリダイゼーション）
４種の異なる捕捉配列を有する基板をＦｒａｍｅＳｅａｌＴＭセル（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で覆った。オリゴヌクレオチド、Ｈｙｂ１５、ＣＦ６２１（ｓｅｑ１９）ｒＵおよびｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵの１μＭ混合液を、０．１％ＳＤＳと２５μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含む５×ＳＳＣ緩衝液中に調製した。１２５μｌ溶液を、基板上のＦｒａｍｅＳｅａｌセルに加え、蓋で覆った。基板を９５℃で５分間、３５℃で２０分間、９５℃で２分間、そして再び３５℃で３０分間インキュベートした。チップを４℃まで冷却し、室温で５×ＳＳＣ緩衝液浴中に直接配置した。軌道回転攪拌器の上で５分間穏やかに攪拌した後、２番目の５×ＳＳＣ緩衝液洗浄を実施し、その後、７０ｍＭクエン酸アンモニウムによる２回の洗浄とナノ純粋水による短い１回の洗浄を実行した。
【０２５３】
（ＲＮａｓｅＡによる切断およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析）
捕捉配列Ｓｅｑ＃１４ＮＨ２を基板上に有する全部で２４個のスポットに、オリゴヌクレオチドｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵの１μＭ溶液を投与した（１００ｎＬ、または、水に溶解した１００ｆｍｏｌｅ、ＧｅＳｉＭナノ分注器でスポット投与）。この２種のオリゴヌクレオチドはハイブリダイズしないので、ＲＮａｓｅＡによる効果的な切断に対する内部コントロールとして使用した。チップをカートリッジ内に配置し、本明細書に記述する通りの、チップ用高速サーマルサイクラーに接続した。基板の背面金属層に制御電流を流すために、チップ表面を約５０℃に加熱した。ナノ純水中の０．００１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液を調製し、チップを５０℃に維持しながら投与した。このサーマルサイクラーをソレノイドナノ分注器（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）に接続した。装置は、基板の、６０個の中央スポットそれぞれに３×３０ｎＬを投与した。溶液は急速に、約１０秒間で蒸発するので、従って、ＲＮａｓｅＡによる切断のための全反応時間は３０秒であった。基板をＲＴに冷却し、カートリッジから外した。マトリックス液を、チップ上のハイブリダイズした標的核酸を有する９６部位に投与した。３２ｍＭクエン酸ジアンモニウムの添加物を含む、３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシピコリン酸）の３００ｍＭ水溶液２×７ｎｌを、ミクロドロップ圧電分注器（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ  ＧｍｂＨ，Ｎｏｒｄｅｒｓｔｅｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて投与した。結晶化の後、チップをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ標的ホルダーに固定し、Ｂｉｆｌｅｘ  ＭＳ装置（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｒｅｍｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、ＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲ−ＲＴソフトウェア（ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、完全自動化運転によって分析した。
【０２５４】
代表的には、その方法は、強烈なＭＡＬＤＩ−ＭＳ信号および内部対照（捕捉配列Ｓｅｑ＃１４ＮＨ２上のｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵ、未切断の完全長オリゴヌクレオチドに対する主要信号は４８８５．２ｍ／ｚおよび５７５６．８ｍ／ｚ、小信号は１０６２４ｍ／ｚ）に対して推定７０％の切断をもたらした。捕捉配列Ｓｅｑ＃１５ＮＨ２上に１４マーのＨｙｂ１５を有するスポットは、４２５７ｍ／ｚで強力な単一ピークを示し、効果的なハイブリダイゼーションおよびサンプル調製を示した。捕捉配列Ｓｅｑ＃６ＮＨ２またはＳｅｑ＃１９ＮＨ２を有するスポット由来の信号は、非効果的なハイブリダイゼーションのために弱かった。しかし、この信号は依然としてリボヌクレオチドにおける効果的な切断を示す。完全長オリゴヌクレオチドは通常検出されない。信号は、配列ｒｉｂｏ２（ｓｅｑ６）ｒＵの切断においては、４８８５．２でフラグメント１に、５７５６．８ｍ／ｚでフラグメント２に一致する。または、配列ＣＦ６２１（ｓｅｑ１９）ｒＵの切断においては、６８０４ｍ／ｚでフラグメント１に、４９３４ｍ／ｚでフラグメント２に一致する。
【０２５５】
当業者には改変は明白であるので、本発明は、添付した特許請求の範囲によってのみ限定されることが意図される。従って、添付した特許請求の範囲内に含まれる、全ての改変、変更、または、等価的配置および導入は、本発明の範囲内であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１】図１は、本発明の基板アセンブリの分解斜視図である。
【図２】図２は、部分的に組み立てられた基板アセンブリの斜視図である。
【図３】図３は、基板アセンブリを用いてサンプル物質を受容する標的位置を備えた基板の平面図である。
【図４】図４は、図３に示した基板の側面図であり、基板の底面における抵抗性コーティングを示す。
【図５】図５は、図１に示した基板アセンブリのカートリッジ基盤の斜視図である。
【図６】図６は、図５の直線６−６に沿って得られたカートリッジ基盤の断面模式図であり、カートリッジ基盤に取り付けた基板を示す。
【図７】図７は、図１に示した基板アセンブリのカートリッジカバーの斜視図である。
【図８】図８は、図１に示した基板アセンブリの反応封入部材を表す第１実施態様の斜視図である。
【図９Ａ】図９Ａは、図８の直線９−９に沿って得られた、図８の反応封入部材の断面図であり、流入ポートおよび流出ポートをつなぐフローチャネルを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの直線１０−１０に含まれる、反応封入部材の一部の拡大図である。
【図１０】図１０は、図８および９Ａに示した、反応封入部材のフローチャネルの断面図である。
【図１１】図１１は、図８に示した反応封入部材の平面図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、対応基板の各標的位置に対する流入ポートを含む、反応封入部材の第２実施態様の平面図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、流入ポートおよび流出ポートを備えるフローチャネルを含む、反応封入部材の別態様の平面図である。
【図１３】図１３は、図１２Ａに示した反応封入部材の側面図である。
【図１４】図１４は、図１に示した基板アセンブリにおいて配置される、基板と並列された反応封入部材の側面図である。
【図１５】図１５は、図１に示した基板アセンブリ中の反応封入部材を支持する、反応封入部材背面プレートの斜視図である。
【図１６】図１６は、図１５の直線１６−１６に沿って得られた反応封入部材背面プレートの断面図である。
【図１７】図１７は、基板アセンブリの断面模式図であり、同図において、流入ポートを流出ポートに接続するフローチャネル内に基板の一列の標的部位が配置されているフローチャネルが示される。
【図１８】図１８は、基板アセンブリの断面模式図であり、それぞれ、基板の対応する標的部位に整列される複数の流入ポートを示す。
【図１９】図１９は、図１の基板アセンブリを用いて生物学的サンプルを処理するのに使用される基板処理機を示す。
【図２０】図２０は、基板アセンブリの断面模式図であり、中空密閉ペンを用いて、反応封入部材の流入ポートおよび流出ポートを密閉する第１密閉法を示す。
【図２１】図２１は、基板アセンブリの断面模式図であり、ウェルを締め付け封鎖する力を用いて反応封入部材の流入・流出ポートを密閉する、別の密閉法を示す。
【図２２】図２２は、基板アセンブリの断面模式図であり、ウェル開口部を被うプレートを用いて反応封入部材の流入・流出ポートを密閉する、別の密閉法を示す。
【図２３】図２３は、例えば、ＰＣＲ過程の間に、基板にサーマルサイクルを施すのに使用される、サーマルサイクラーの模式図である。
【図２４】図２４は、基板を加熱するのに使用される電気接点の模式図である。この接点は、基板と接触する上先端部を有するポゴピンを含む。
【図２５Ａ】図２５Ａは、図２３のサーマルサイクラーの熱プローブの第１実施態様を示し、ここで、この熱プローブは基板の温度を測定する。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、図２３のサーマルサイクラーの温度プローブの第２実施態様を示す。
【図２６】図２６は、サーマルサイクラーの各種要素の斜視図である。
【図２７】図２７は、サーマルサイクラーの、電気接点インターフェースの模式図である。
【図２８】図２８は、基板上の標的部位を試薬に暴露するために、基板アセンブリの一つの流入ポート中に配置された試薬を示す。
【図２９】図２９は、基板上の標的部位を試薬に暴露するために、基板アセンブリの複数の流入ポート中に配置された試薬を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月13日(2005.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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