(57)【要約】β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルはＣ型肝炎ウイルスを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに対して優れた結果を提供する。この発見に基づき、場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持した有効量のｖａｌ−ｍＣｙｄ又はその塩、エステル、プロドラッグもしくは誘導体を投与することを含む、ＨＣＶを含むフラビウイルス科の治療用化合物、組成物、方法及び使用を提供する。代替態様では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介して複製する任意ウイルスを治療するためにｖａｌ−ｍＣｙｄを使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2005533824.tif 000024
の化合物又はその医薬的に許容可能な塩。
【請求項２】
医薬的に許容可能な塩が塩酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
医薬的に許容可能な塩が式（ＩＩ）：
【化２】
2005533824.tif 000025
の二塩酸塩である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
医薬的に許容可能なキャリヤー中に有効量の式（Ｉ）：
【化３】
2005533824.tif 000026
の化合物又はその医薬的に許容可能な塩を含むフラビウイルス科感染の治療用医薬組成物。
【請求項５】
医薬的に許容可能な塩が塩酸塩である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬的に許容可能な塩が二塩酸塩である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬的に許容可能なキャリヤーが経口送達に適している請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
更に第２の抗ウイルス剤を含む請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤、及びリボザイムから構成される群から選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンである請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
第２の抗ウイルス剤がペグ化インターフェロンα２ａ、インターフェロンαｃｏｎ−１、天然インターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ−１ａ、ωインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ及びインターフェロンγ−１ｂから構成される群から選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンα２である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
化合物が用量単位の形態である請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
用量単位が .０１〜５０ｍｇの化合物を含有する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記用量単位が錠剤又はカプセル剤である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
化合物が実質的に純粋形態である請求項４に記載の組成物。
【請求項１７】
化合物の少なくとも９０重量％がβ−Ｄ異性体である請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
化合物の少なくとも９５重量％がβ−Ｄ異性体である請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
式（Ｉ）：
【化４】
2005533824.tif 000027
の構造をもつ有効量の化合物又はその医薬的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持して治療を必要とする宿主に投与することを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した宿主の治療方法。
【請求項２０】
医薬的に許容可能な塩が塩酸塩である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
医薬的に許容可能な塩が二塩酸塩である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
更に化合物を医薬的に許容可能なキャリヤー、希釈剤又は賦形剤に担持して投与することを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
化合物を第２の抗ウイルス剤と併用又は交互投与する請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、フェナントレンキノン、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤、及びリボザイムから構成される群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
第２の抗ウイルス剤がペグ化インターフェロンα２ａ、インターフェロンαｃｏｎ−１、天然インターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ−１ａ、ωインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ及びインターフェロンγ−１ｂから構成される群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンα２である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
宿主がヒトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
化合物が用量単位の形態である請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
用量単位が１０〜５００ｍｇの化合物を含有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記用量単位が錠剤又はカプセル剤である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
医薬的に許容可能なキャリヤーが経口又は静脈内送達に適している請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
化合物を実質的に純粋形態で投与する請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
化合物の少なくとも９０重量％がβ−Ｄ異性体である請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
化合物の少なくとも９５重量％がβ−Ｄ異性体である請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスがＨＣＶである請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
５’−水酸基が５’−ＯＲで置換されており、Ｒがリン酸；安定化リン酸プロドラッグ；アシル；アルキル；アルキルもしくはアリールアルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む）を含むスルホン酸エステル；フェニル基が場合により置換されていてもよいベンジル；脂質；アミノ酸；炭水化物；ペブチド；コレステロール；又はｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合にＲが独立してＨもしくはリン酸である化合物を提供することができる他の医薬的に許容可能な脱離基である式Ｉ又はＩＩの化合物。
【請求項３８】
５’−水酸基が５’−ＯＲで置換されており、Ｒがリン酸；安定化リン酸プロドラッグ；アシル；アルキル；アルキルもしくはアリールアルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む）を含むスルホン酸エステル；フェニル基が場合により置換されていてもよいベンジル；脂質；アミノ酸；炭水化物；ペブチド；コレステロール；又はｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合にＲが独立してＨもしくはリン酸である化合物を提供することができる他の医薬的に許容可能な脱離基である式Ｉ又はＩＩの化合物を医薬的に許容可能なキャリヤー中に含む医薬組成物。
【請求項３９】
医薬的に許容可能なキャリヤー中に含まれる、５’−水酸基が５’−ＯＲで置換されており、Ｒが水素；リン酸；安定化リン酸プロドラッグ；アシル；アルキル；アルキルもしくはアリールアルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む）を含むスルホン酸エステル；フェニル基が場合により置換されていてもよいベンジル；脂質；アミノ酸；炭水化物；ペブチド；コレステロール；又はｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合にＲが独立してＨもしくはリン酸である化合物を提供することができる他の医薬的に許容可能な脱離基である有効量の式Ｉ又はＩＩの化合物を投与することを含むＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼウイルスに感染した宿主の治療方法。
【請求項４０】
ウイルスがフラビウイルス科ウイルスである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
フラビウイルス科ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
宿主がヒトである請求項３９、４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
場合によりフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した宿主の治療用医薬の製造における式（Ｉ）：
【化５】
2005533824.tif 000028
の構造をもつ化合物又はその医薬的に許容可能な塩又はプロドラッグの使用。
【請求項４４】
医薬的に許容可能な塩が塩酸塩である請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
医薬的に許容可能な塩が二塩酸塩である請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
更に化合物を医薬的に許容可能なキャリヤー、希釈剤又は賦形剤に担持して投与することを含む請求項４３に記載の使用。
【請求項４７】
化合物を第２の抗ウイルス剤と併用して製造する請求項４３に記載の使用。
【請求項４８】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、フェナントレンキノン、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤、及びリボザイムから構成される群から選択される請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンである請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
第２の抗ウイルス剤がペグ化インターフェロンα２ａ、インターフェロンαｃｏｎ−１、天然インターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ−１ａ、ωインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ及びインターフェロンγ−１ｂから構成される群から選択される請求項４７に記載の使用。
【請求項５１】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンα２である請求項４７に記載の使用。
【請求項５２】
宿主がヒトである請求項４７に記載の使用。
【請求項５３】
化合物が用量単位の形態である請求項４７に記載の使用。
【請求項５４】
用量単位が１０〜５００ｍｇの化合物を含有する請求項４３に記載の使用。
【請求項５５】
前記用量単位が錠剤又はカプセル剤である請求項４３に記載の使用。
【請求項５６】
医薬的に許容可能なキャリヤーが経口送達に適している請求項４３に記載の使用。
【請求項５７】
化合物を実質的に純粋形態で投与する請求項４３に記載の使用。
【請求項５８】
化合物の少なくとも９０重量％がβ−Ｄ異性体である請求項４３に記載の使用。
【請求項５９】
化合物の少なくとも９５重量％がβ−Ｄ異性体である請求項４３に記載の使用。
【請求項６０】
ウイルスがＨＣＶである請求項４３に記載の使用。
【請求項６１】
フラビウイルス又はペスチウイルスに感染した宿主の治療に使用し、場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持した式（Ｉ）：
【化６】
2005533824.tif 000029
の構造をもつ化合物又はその医薬的に許容可能な塩もしくはプロドラッグ。
【請求項６２】
医薬的に許容可能な塩が塩酸塩である請求項６１に記載の化合物。
【請求項６３】
医薬的に許容可能な塩が二塩酸塩である請求項６１に記載の化合物。
【請求項６４】
医薬的に許容可能なキャリヤー、希釈剤又は賦形剤を更に含有する請求項６１に記載の化合物。
【請求項６５】
第２の抗ウイルス剤を更に含有する請求項６１に記載の化合物。
【請求項６６】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、フェナントレンキノン、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤、及びリボザイムから構成される群から選択される請求項６５に記載の化合物。
【請求項６７】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンである請求項６５に記載の化合物。
【請求項６８】
第２の抗ウイルス剤がペグ化インターフェロンα２ａ、インターフェロンαｃｏｎ−１、天然インターフェロン、アルブフェロン、インターフェロンβ−１ａ、ωインターフェロン、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターフェロンτ、インターフェロンδ及びインターフェロンγ−１ｂから構成される群から選択される請求項６５に記載の化合物。
【請求項６９】
第２の抗ウイルス剤がインターフェロンα２である請求項６５に記載の化合物。
【請求項７０】
宿主がヒトである請求項６５に記載の化合物。
【請求項７１】
化合物が用量単位の形態である請求項６５に記載の化合物。
【請求項７２】
用量単位が１０〜５００ｍｇの化合物を含有する請求項６１に記載の化合物。
【請求項７３】
前記用量単位が錠剤又はカプセル剤である請求項７２に記載の化合物。
【請求項７４】
医薬的に許容可能なキャリヤーが経口送達に適している請求項６１に記載の化合物。
【請求項７５】
化合物を実質的に純粋形態で投与する請求項６１に記載の化合物。
【請求項７６】
化合物の少なくとも９０重量％がβ−Ｄ異性体である請求項６１に記載の化合物。
【請求項７７】
化合物の少なくとも９５重量％がβ−Ｄ異性体である請求項６１に記載の化合物。
【請求項７８】
ウイルスがＨＣＶである請求項６１に記載の化合物。
【請求項７９】
医薬的に許容可能な塩がトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭素酸水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸塩から選択される請求項１又は６１に記載の化合物。
【請求項８０】
医薬的に許容可能な塩がトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭素酸水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸塩から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項８１】
医薬的に許容可能な塩がトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭素酸水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸塩から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項８２】
医薬的に許容可能な塩がトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭素酸水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸塩から選択される請求項４２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬化学の分野に関し、特に２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルとその医薬的に許容可能な塩、誘導体及びプロドラッグ、その合成並びにフラビウイルス科、特にＣ型肝炎ウイルスに感染した宿主、特にヒトの治療における抗フラビウイルス科剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科ウイルス
フラビウイルス科ウイルスは少なくとも３種の異なる属、即ちウシやブタに疾患を生じるペスチウイルス；デング熱や黄熱病等の疾患の主原因であるフラビウイルス；及びＨＣＶのみから構成されるヘパシウイルスを含む。フラビウイルス属は血清学的関連性に基づいて分類される６８を越えるメンバーを含む（Ｃａｌｉｓｈｅｒら，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，７０，３７−４３）。臨床症状は多様であり、発熱、脳炎及び出血熱が挙げられる（Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，９３１−９５９）。世界的関心を集めているヒト疾患に関連するフラビウイルスとしては、デング出血熱ウイルス（ＤＨＦ）、黄熱病ウイルス、ショック症候群及び日本脳炎ウイルスが挙げられる（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９８４，６，２５１−２６４；Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４７６−４８１，１９８８；Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８８，３１９，６４１−６４３）。
【０００３】
ペスチウイルス属としてはウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ，ブタコレラウイルスとも言う）及びヒツジのボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）が挙げられる（Ｍｏｅｎｎｉｇ，Ｖ．ら，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２，４１，５３−９８）。家畜（ウシ、ブタ及びヒツジ）のペスチウイルス感染は世界中に多大な経済的損失をもたらす。ＢＶＤＶはウシの粘膜疾患の原因となり、畜産業に経済的に非常に重要である（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｇ．ａｎｄ  Ｔｈｉｅｌ，Ｈ．−Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，４７，５３−１１８；Ｍｏｅｎｎｉｇ  Ｖ．ら，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．１９９２，４１，５３−９８）。ヒトペスチウイルスは動物ペスチウイルスほど詳しく特性決定されていない。しかし、血清学的調査によると、ヒトも相当のペスチウイルス暴露を受けていると思われる。
【０００４】
ペスチウイルスとヘパシウイルスはフラビウイルス科内で近縁ウイルス群である。この科の他の近縁ウイルスとしてはＧＢウイルスＡ、ＧＢウイルスＡ様物質、ＧＢウイルスＢ及びＧＢウイルスＣ（Ｇ型肝炎ウイルス，ＨＧＶとも言う）が挙げられる。ヘパシウイルス群（Ｃ型肝炎ウイルス；ＨＣＶ）は遺伝子型の異なる多数の近縁ウイルスから構成され、ヒトに感染する。約６種のＨＣＶ遺伝子型と５０種を越えるサブタイプが存在する。ペスチウイルスとヘパシウイルスの類似性と、ヘパシウイルスが細胞培養で効率的に増殖する能力が低いことから、ＨＣＶウイルスを研究するためにウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を代用することが多い。
【０００５】
ペスチウイルスとヘパシウイルスの遺伝子機構は非常によく似ている。これらの＋鎖ＲＮＡウイルスはウイルス複製に必要な全ウイルス蛋白質をコードする単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をもつ。これらの蛋白質はポリプロテインとして発現され、細胞プロテイナーゼ及びウイルスによりコードされるプロテイナーゼの両者により翻訳と同時及び翻訳後にプロセシングされ、成熟ウイルス蛋白質を生じる。ウイルスゲノムＲＮＡの複製に関与するウイルス蛋白質はほぼカルボキシ末端内に位置する。ＯＲＦの３分の２は非構造（ＮＳ）蛋白質と呼ばれる。ペスチウイルスとヘパシウイルスのＯＲＦの非構造蛋白質部分の遺伝子機構とポリプロテインプロセシングは非常によく似ている。ペスチウイルスとヘパシウイルスのどちらも、成熟非構造（ＮＳ）蛋白質は非構造蛋白質コーディング領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端に向かって順にｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂから構成される。
【０００６】
ペスチウイルスとヘパシウイルスのＮＳ蛋白質は特定蛋白質機能をもつ配列ドメインを共有する。例えば、両者群のウイルスのＮＳ３蛋白質はセリンプロテイナーゼとヘリカーゼの特徴的アミノ酸配列モチーフをもつ（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：２２；Ｂａｚａｎ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：６３７−６３９；Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７．３８８９−３８９７）。同様に、ペスチウイルスとヘパシウイルスのＮＳ５Ｂ蛋白質はＲＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼの特徴的モチーフをもつ（Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄｏｌｊａ，Ｖ．Ｖ．（１９９３）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２８：３７５−４３０）。
【０００７】
ウイルスの生活環におけるペスチウイルスとヘパシウイルスのＮＳ蛋白質の実際の役割と機能は直接類似している。どちらの場合も、ＮＳ３セリンプロテイナーゼはＯＲＦにおけるその位置の下流のポリプロテイン前駆物質の全蛋白分解プロセシングに関与している（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：３４１−３５０；Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３８３５−３８４４；Ｅｃｋａｒｔら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９２：３９９−４０６；Ｇｒａｋｏｕｉら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２８３２−２８４３；Ｇｒａｋｏｕｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０５８３−１０５８７；Ｈｉｊｉｋａｔａら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４６６５−４６７５；Ｔｏｍｅら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４０１７−４０２６）。ＮＳ４Ａ蛋白質はどちらの場合もＮＳ３セリンプロテアーゼの補因子として作用する（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５０４５−５０５５；Ｆａｉｌｌａら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３７５３−３７６０；Ｌｉｎら（１９９４）６８：８１４７−８１５７；Ｘｕら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５３１２−５３２２）。両者ウイルスのＮＳ３蛋白質は更にヘリカーゼとして機能する（Ｋｉｍら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１５：１６０−１６６；Ｊｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３２３：４７−５３；Ｗａｒｒｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｅｔｔ（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７２０−１７２６）。最後に、ペスチウイルスとヘパシウイルスのＮＳ５Ｂ蛋白質は予想されるＲＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼ活性をもつ（Ｂｅｈｒｅｎｓら（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：１２−２２；Ｌｃｈｍａｎｎら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８４１６−８４２８；Ｙｕａｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３２：２３１−２３５；Ｈａｇｅｄｏｒｎ，ＰＣＴ  ＷＯ９７／１２０３３；Ｚｈｏｎｇら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２．９３６５−９３６９）。
【０００８】
Ｃ型肝炎ウイルス
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は世界中で慢性肝疾患の主原因である（Ｂｏｙｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３２：９８−１１２，２０００）。ＨＣＶはゆっくりと拡大するウイルス感染をもたらし、肝硬変や肝細胞癌の主原因である（Ｄｉ  Ｂｅｓｃｅｇｌｉｅ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｏｃｔ．：８０−８５，（１９９９）；Ｂｏｙｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３２：９８−１１２，２０００）。世界中で１７０，０００，０００人がＨＣＶに感染していると推定される（Ｂｏｙｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３２：９８−１１２，２０００）。米国で年間８，０００〜１２，０００人が慢性Ｃ型肝炎に起因する肝硬変で死亡しており、ＨＣＶ感染は肝移植の主要適応症である。
【０００９】
ＨＣＶは輸血後肝炎の少なくとも８０％と実質的割合の散発性急性肝炎の原因であることが知られている。ＨＣＶは「突発性」慢性肝炎、「特発性」肝硬変、及び恐らくＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等の他の肝炎ウイルスに無関係の肝細胞癌の多くの症例に関与していることも分かっている。地理や他の疫学的因子に応じて健常人の一部も慢性ＨＣＶキャリヤーであると思われる。その数はＨＢＶを実質的に上回ると思われるが、情報はまだ予備的であり、これらのうちの何人が無症状慢性肝疾患をもっているかは不明である（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，ｃｈ．６９，ｐ．９０１，１６ｔｈ  ｅｄ．，（１９９２））。
【００１０】
ＨＣＶは約９．４ｋｂのポジティブセンス１本鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。ウイルスゲノムは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、約３０１１アミノ酸のポリプロテイン前駆物質をコードする長いオープンリーディングフレームと、短い３’ＵＴＲから構成される。５’ＵＴＲはＨＣＶゲノムの最も高度に保存された部分であり、ポリプロテイン翻訳の開始と制御に重要である。ＨＣＶゲノムの翻訳は内部リボソーム侵入として知られるｃａｐ非依存メカニズムにより開始される。このメカニズムは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）として知られるＲＮＡ配列とリボソームの結合を含む。ＲＮＡシュードノット構造がＨＣＶ  ＩＲＥＳの必須構造エレメントであることが最近判明した。ウイルス構造蛋白質はヌクレオキャプシドコア蛋白質（Ｃ）と２個のエンベロープ糖蛋白質Ｅ１及びＥ２を含む。ＨＣＶは更に、ＮＳ２−ＮＳ３領域によりコードされる亜鉛依存性メタロプロテイナーゼとＮＳ３領域でコードされるセリンプロテイナーゼの２種のプロテイナーゼをコードする。これらのプロテイナーゼは前駆物質ポリプロテインの特定領域を成熟ペプチドに開裂するために必要である。非構造蛋白質５のカルボキシル側半分ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。残りの非構造蛋白質ＮＳ４Ａ及びＮＳ４ＢとＮＳ５Ａ（非構造蛋白質５のアミノ末端側半分）の機能はまだ分かっていない。
【００１１】
現在の抗ウイルス研究の大きな焦点はヒトにおける慢性ＨＣＶ感染の改良治療方法の開発に向けられている（Ｄｉ  Ｂｅｓｃｅｇｌｉｅ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｂ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｏｃｔ．：８０−８５，（１９９９））。
【００１２】
インターフェロンによるＨＣＶ感染の治療
インターフェロン（ＩＦＮ）は約１０年前から慢性肝炎の治療薬として市販されている。ＩＦＮはウイルス感染に応答して免疫細胞により産生される糖蛋白質である。ＩＦＮはＨＣＶを含む多数のウイルスの複製を阻害し、Ｃ型肝炎感染の単独療法として使用した場合にＩＦＮは場合により血清ＨＣＶ−ＲＮＡを検出不能なレベルまで抑制することができる。更に、ＩＦＮは血清アミノトランスフェラーゼ値を正常化することができる。しかし、ＩＦＮの効果は一時的であり、持続応答が生じるのは慢性ＨＣＶ感染患者の８％〜９％に過ぎない（Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。大半の患者はインターフェロン治療に耐えられず、重度インフルエンザ様症状、体重減少、及びエネルギーとスタミナ不足を生じる。
【００１３】
多数の特許がインターフェロン療法によるフラビウイルス科（ＨＣＶを含む）の治療を開示している。例えば、米国特許第５，９８０，８８４号（Ｂｌａｔｔら）はコンセンサスインターフェロンを使用したＨＣＶ患者の治療方法を開示している。米国特許第５，９４２，２２３号（Ｂａｚｅｒら）はヒツジ又はウシインターフェロン−τを使用した抗ＨＣＶ療法を開示している。米国特許第５，９２８，６３６号（Ａｌｂｅｒら）はＨＣＶを含む感染性疾患の治療法としてインターロイキン−１２とインターフェロンαの併用療法を開示している。米国特許第５，８４９，６９６号（Ｃｈｒｅｔｉｅｎら）はＨＣＶの治療薬としてのサイモシンの単独使用又はインターフェロンとの併用を開示している。米国特許第５，８３０，４５５号（Ｖａｌｔｕｅｎａら）はインターフェロンとフリーラジカルスカベンジャーを使用する併用ＨＣＶ療法を開示している。米国特許第５，７３８，８４５号（Ｉｍａｋａｗａ）はＨＣＶ治療用としてのヒトインターフェロンτ蛋白質の使用を開示している。ＨＣＶの他のインターフェロン療法は米国特許第５，６７６，９４２号（Ｔｅｓｔａら）、米国特許第５，３７２，８０８号（Ｂｌａｔｔら）、及び米国特許第５，８４９，６９６に開示されている。ペグ化形態のインターフェロンも米国特許第５，７４７，６４６号、５，７９２，８３４号及び５，８３４，５９４号（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３２１３９号及びＷＯ９９／３２１４０号（Ｅｎｚｏｎ）；ＷＯ９５／１３０９０と米国特許第５，７３８，８４６号及び５，７１１，９４４号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；並びに米国特許第５，９０８，６２１号（Ｇｌｕｅら）等の多数の特許に開示されている。
【００１４】
インターフェロンα−２ａとインターフェロンα−２ｂが現在ＨＣＶの単独療法剤として認可されている。ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ（Ｒｏｃｈｅ）は組換え形のインターフェロンα−２ａである。ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）はペグ化（即ちポリエチレングリコールで修飾した）形態のインターフェロンα−２ａである。ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は組換え形のインターフェロンα−２ｂであり、ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）はペグ化形態のインターフェロンα−２ｂである。
【００１５】
他の形態のインターフェロンα、並びにインターフェロンβ、γ、τ及びωもＨＣＶ治療薬として現在臨床開発中である。例えば、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社によりＩＮＦＥＲＧＥＮ（インターフェロンαｃｏｎ−１）、Ｖｉｒａｇｅｎ社によりＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社によりＡＬＢＵＦＥＲＯＮ、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ社によりＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ社によりωインターフェロン、Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社により経口インターフェロンα、並びにＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社によりインターフェロンγ、インターフェロンτ、及びインターフェロンγ−１ｂが開発中である。
【００１６】
リバビリン
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は商品名Ｖｉｒａｚｏｌｅで市販されている合成非インターフェロン誘導広スペクトル抗ウイルスヌクレオシド類似体である（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｂｕｄａｖａｒｉ，Ｓ．，Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ，ｐｌ３０４，１９８９）。米国特許第３，７９８，２０９号及びＲＥ２９，８３５号はリバビリンを開示請求している。リバビリンはグアノシンに構造的に類似し、フラビウイルス科を含む数種のＤＮＡ及びＲＮＡウイルスに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をもつ（Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。
【００１７】
リバビリンは患者の４０％で血清アミノトランスフェラーゼ値を正常値まで低下させるが、血清ＨＣＶ−ＲＮＡ値は低下させない（Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８：Ｓ１０４−Ｓ１１４，２０００）。従って、リバビリンは単独ではウイルスＲＮＡレベルを低下させるのに有効ではない。更に、リバビリンは有意毒性があり、貧血を誘発することが知られている。
【００１８】
リバビリンはＨＣＶに対する単独療法剤として認可されていない。インターフェロンα−２ａ又はインターフェロンα−２ｂとの併用がＨＣＶの治療に認可されている。
【００１９】
インターフェロンとリバビリンの併用
慢性Ｃ型肝炎の現在の標準治療法はαインターフェロンとリバビリンの併用療法である。ＨＣＶ感染の治療にインターフェロンとリバビリンを併用すると、インターフェロンナイーブ患者の治療（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ａ．Ｍ．ら，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．３４：４８７−４９４，２０００）、及び組織疾患が存在する患者の治療（Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，Ｍ．らＡｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．３（Ｓｕｐｐｌ．３）：１２５−１３６，１９９８）に有効であることが報告されている。非ペグ化インターフェロンαとの併用療法よりもペグ化インターフェロン−α／リバビリン併用療法に多くのＣ型肝炎患者が反応することが報告されている。しかし、単独療法の場合と同様に、併用療法中にも溶血、インフルエンザ様症状、貧血、及び疲労等の多くの副作用が生じる（Ｇａｒｙ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１８：Ｓ  １０４−Ｓ  １１４，２０００）。
【００２０】
ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）（ペグインターフェロンα−２ｂ）及びＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（リバビリン，ＵＳＰ）カプセル剤による併用療法剤がＳｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）はＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（組換えインターフェロンα−２ｂ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）との併用も認可されている。ＲｏｃｈｅのＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａ）とＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）（リバビリン）もＨＣＶの治療に認可されている。
【００２１】
ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５９６２１号、ＷＯ００／３７１１０号、ＷＯ０１／８１３５９号、ＷＯ０２／３２４１４号及びＷＯ０３／０２４４６１号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）はＨＣＶの治療用としてペグ化インターフェロンαとリバビリンの併用療法の使用を開示している。ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１９４号、ＷＯ９９／６４０１６号、及びＷＯ００／２４３５５号（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ）もＨＣＶ治療用としてペグ化インターフェロンαとリバビリンの併用療法の使用を開示している。
【００２２】
他のフラビウイルス科感染治療法
フラビウイルス科感染、特にＣ型肝炎の新規抗ウイルス剤の開発は現在途上にある。プロテアーゼ、ヘリカーゼ、及びポリメラーゼ阻害剤等のＨＣＶ由来酵素の特定阻害剤が開発中である。ＨＣＶ複製の他の段階を阻害する薬剤も開発中であり、例えば、ＲＮＡからのＨＣＶ抗原の産生を阻止する薬剤（ＩＲＥＳ阻害剤）、ＨＣＶ蛋白質の正常なプロセシングを妨げる薬剤（グリコシル化の阻害剤）、（その受容体をブロックすることにより）ＨＣＶの細胞侵入を阻止する薬剤及びウイルス感染に起因する細胞傷害を阻止する非特異的細胞保護剤が挙げられる。更に、Ｃ型肝炎を治療するために分子アプローチとして例えば、特定ウイルスＲＮＡ分子を分解する酵素であるリボザイムも開発中であり、ウイルスＲＮＡと結合してウイルス複製を阻害するＤＮＡの小さな相補的セグメントであるアンチセンスオリゴヌクレオチドも研究中である。Ｂｙｍｏｃｋら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１１：２；７９−９５（２０００）とＤｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，５８：１−１６（２００３）には多数のＨＣＶ治療法が記載されている。
【００２３】
フラビウイルス科感染を治療するために開発中の類の薬剤の例を以下に挙げる。
【００２４】
（１）プロテアーゼ阻害剤
基質型ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ＰＣＴ  ＷＯ９８／２２４９６，１９９８；Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９９，１０，２５９−２７３；Ａｔｔｗｏｏｄら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，ドイツ特許公開ＤＥ  １９９１４４７４；Ｔｕｎｇら，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＰＣＴ  ＷＯ９８／１７６７９）として、αケトアミド及びヒドラジノ尿素や、ボロン酸又はホスホン酸等の求電子物質を末端にもつ阻害剤（Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＰＣＴ  ＷＯ９９／０７７３４）が研究中である。
【００２５】
２，４，６−トリヒドロキシ−３−ニトロベンズアミド誘導体等の非基質型ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（Ｓｕｄｏ  Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９７，２３８，６４３−６４７；Ｓｕｄｏ  Ｋ．らＡｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，９，１８６）も研究中であり、アミド上を１４炭素鎖で置換したＲＤ３−４０８２と、パラフェノキシフェニル基をもつＲＤ３−４０７８が挙げられる。
【００２６】
フェナントレンキノンであるＳｃｈ  ６８６３１はＨＣＶプロテアーゼ阻害剤である（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７：７２２９−７２３２，１９９６）。同一著者による別の例で、真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍから単離されたＳｃｈ  ３５１６３３はプロテアーゼ阻害剤として同定された（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９：１９４９−１９５２）。巨大分子エグリンｃに基づく選択的阻害剤の設計によりＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ酵素に対するナノモル力価が達成された。ヒルから単離されたエグリンｃはＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼＡ及びＢ、α−キモトリプシン、キマーゼ及びスプチリシン等の数種のセリンプロテアーゼの強力な阻害剤である。Ｑａｓｉｍ  Ｍ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１５９８−１６０７，１９９７。
【００２７】
数件の米国特許はＨＣＶの治療用としてプロテアーゼ阻害剤を開示している。例えば、米国特許第６，００４，９３３号（Ｓｐｒｕｃｅら）はＨＣＶエンドペプチダーゼ２を阻害する類のシステインプロテアーゼ阻害剤を開示している。米国特許第５，９９０，２７６号（Ｚｈａｎｇら）はＣ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの合成阻害剤を開示している。この阻害剤はＮＳ３プロテアーゼの基質又はＮＳ４Ａ補因子の基質のサブ配列である。ＨＣＶを治療するための制限酵素の使用は米国特許第５，５３８，８６５号（Ｒｅｙｅｓら）に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのペプチドはＷＯ０２／００８２５１（Ｃｏｒｖａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）とＷＯ０２／０８１８７及びＷＯ０２／００８２５６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示されている。ＨＣＶ阻害剤トリペプチドは米国特許第６，５３４，５２３号、６，４１０，５３１号、及び６，４２０，３８０号（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）とＷＯ０２／０６０９２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのジアリールペプチドはＷＯ０２／４８１７２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのイミダゾリジンジオンはＷＯ０２／０８１９８（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とＷＯ０２／４８１５７（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）に開示されている。ＷＯ９８／１７６７９（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とＷＯ０２／４８１１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）もＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を開示している。
【００２８】
（２）ＮＳ３／４Ａ融合蛋白質及びＮＳ５Ａ／５Ｂ基質による逆相ＨＰＬＣアッセイで該当阻害を示すチアゾリジン誘導体（Ｓｕｄｏ  Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，３２，９−１８）、特に長鎖アルキル鎖で置換された融合シンナモイル部分をもつ化合物ＲＤ−１−６２５０、ＲＤ４  ６２０５及びＲＤ４  ６１９３；
（３）Ｋａｋｉｕｃｈｉ  Ｎ．ら，Ｊ．ＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ  ４２１，２１７−２２０；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｎ．らＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，２４７，２４２−２４６で同定されたチアゾリジン及びベンズアニリド；
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーアッセイでプロテアーゼに対する活性をもつフェナントレンキノンとして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の発酵培養ブロスから単離されたＳｃｈ  ６８６３１（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９６，３７，７２２９−７２３２）、及び真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍから単離され、シンチレーション近接アッセイで活性を示すＳｃｈ  ３５１６３３（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９，１９４９−１９５２）；
（５）ヘリカーゼ阻害剤（Ｄｉａｎａ  Ｇ．Ｄ．ら，Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，米国特許第５，６３３，３５８；Ｄｉａｎａ  Ｇ．Ｄ．ら，Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，ＰＣＴ  ＷＯ９７／３６５５４）；
（６）ヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤及びグリオトキシン（Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，７３，１６４９−１６５４）、及び天然物質セルレニン（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２４９，１０８−１１８）；
（７）ウイルスの５’非コーディング領域（ＮＣＲ）の配列部分（Ａｌｔ  Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９５，２２，７０７−７１７）、又は３’末端ＮＣＲを含むヌクレオチド３２６−３４８とＨＣＶ  ＲＮＡのコアコーディング領域に位置するヌクレオチド３７１−３８８（Ａｌｔ  Ｍ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１４２，５８９−５９９；Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ  Ｕ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１８１，２５１−２５７）に相補的なアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）；
（８）ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤（Ｉｋｅｄａ  Ｎら，Ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，日本特許公開特開平０８２６８８９０；Ｋａｉ  Ｙ．ら，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，日本特許公開特開平１０１０１５９１）；
（９）ヌクレアーゼ耐性リボザイム（Ｍａｃｃｊａｋ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９９，３０，ａｂｓｔｒａｃｔ  ９９５）や、米国特許第６，０４３，０７７号（Ｂａｒｂｅｒら）並びに米国特許第５，８６９，２５３号及び５，６１０，０５４号（Ｄｒａｐｅｒら）に開示されているもの等のリボザイム；
（１０）ヌクレオシド類似体もフラビウイルス科感染の治療用に開発されている。
【００２９】
Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓはフラビウイルス（ＨＣＶを含む）とペスチウイルスの治療における分枝ヌクレオシドの使用を国際公開第ＷＯ０１／９０１２１号及び第ＷＯ０１／９２２８２号に開示している。具体的に、Ｉｄｅｎｉｘの公開明細書にはヒト及び他の宿主動物におけるＣ型肝炎感染（並びにフラビウイルス及びペスチウイルス）の治療方法として、有効量の生物学的に活性な１’，２’，３’もしくは４’−分枝β−Ｄもしくはβ−Ｌヌクレオシド又はその医薬的に許容可能な塩もしく誘導体を、場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持して、単独又は別の抗ウイルス剤と併用投与することを含む方法が開示されている。
【００３０】
Ｃ型肝炎ウイルスを治療するための所定ヌクレオシド類似体の使用を開示している他の特許出願としては、ＢｉｏＣｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（現Ｓｈｉｒｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）により出願されたＰＣＴ／ＣＡ００／０１３１６（ＷＯ０１／３２１５３；出願日２０００年１１月３日）及びＰＣＴ／ＣＡ０１／００１９７（ＷＯ０１／６０３１５；出願日２００１年２月１９日）；Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．により出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０１５３１（ＷＯ０２／０５７４２５；出願日２００２年１月１８日）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０３０８６（ＷＯ０２／０５７２８７；出願日２００２年１月１８日）；Ｒｏｃｈｅにより出願されたＰＣＴ／ＥＰ０１／０９６３３（ＷＯ０２／１８４０４；公開日２００１年８月２１日）；並びにＰｈａｒｍａｓｓｅｔ，Ｌｔｄ．により出願されたＰＣＴ公開第ＷＯ０１／７９２４６号（出願日２００１年４月１３日）、ＷＯ０２／３２９２０号（出願日２００１年１０月１８日）及びＷＯ０２／４８１６５号が挙げられる。
【００３１】
ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４３６９１号（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，発明の名称「２’−フルオロヌクレオシド（２’−ｆｌｕｏｒｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）」）はＨＣＶを治療するための所定２’−フルオロヌクレオシドの使用を開示している。
【００３２】
Ｅｌｄｒｕｐら（Ｏｒａｌ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  Ｖ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｐｒｉｌ  ２７，２００３，Ｓａｖａｎｎａｈ，Ｇａ．））はＨＣＶの阻害のための２’修飾ヌクレオシドの構造活性関係について記載している。
【００３３】
Ｂｈａｔら（Ｏｒａｌ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  Ｖ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ，２００３（Ｏｒａｌ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  Ｖ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｐｒｉｌ  ２７，２００３，Ｓａｖａｎｎａｈ，Ｇａ．）；ｐ  Ａ７５）はＨＣＶ  ＲＮＡ複製の潜在的阻害剤としてのヌクレオシド類似体の合成と薬物動態特性について記載している。著者らは２’修飾ヌクレオシドが細胞レプリコンアッセイで強力な阻害活性を示すと報告している。
【００３４】
Ｏｌｓｅｎら（Ｏｒａｌ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  Ｖ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ，Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；１６ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｐｒｉｌ  ２７，２００３，Ｓａｖａｎｎａｈ，Ｇａ．）ｐ  Ａ７６）も２’修飾ヌクレオシドがＨＣＶ  ＲＮＡ複製に及ぼす効果について記載している。
【００３５】
（１１）その他の化合物としては、１−アミノ−アルキルシクロヘキサン（米国特許第６，０３４，１３４号（Ｇｏｌｄら））、アルキル脂質（米国特許第５，９２２，７５７号（Ｃｈｏｊｋｉｅｒら））、ビタミンＥ及び他の酸化防止剤（米国特許第５，９２２，７５７号（Ｃｈｏｊｋｉｅｒら））、スクアレン、アマンタジン、胆汁酸（米国特許第５，８４６，９６４号（Ｏｚｅｋｉら））、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（米国特許第５，８３０，９０５号（Ｄｉａｎａら））、ベンゼンジカルボキサミド（米国特許第５，６３３，３８８号（Ｄｉａｎａら））、ポリアデニル酸誘導体（米国特許第５，４９６，５４６号（Ｗａｎｇら））、２’，３’−ジデオキシイノシン（米国特許第５，０２６，６８７号（Ｙａｒｃｈｏａｎら））、ベンズイミダゾール（米国特許第５，８９１，８７４号（Ｃｏｌａｃｉｎｏら））、植物抽出物（米国特許第５，８３７，２５７号（Ｔｓａｉら）、米国特許第５，７２５，８５９号（Ｏｍｅｒら）、及び米国特許第６，０５６，９６１号）、及びピペラジン（米国特許第５，８３０，９０５号（Ｄｉａｎａら））が挙げられる。
【００３６】
（１２）Ｃ型肝炎ウイルスの治療用に現在前臨床又は臨床開発中の他の化合物としては、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社のインターロイキン−１０、Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ社のＩＰ−５０１、Ｖｅｒｔｅｘ社のＭｅｒｉｍｅｂｏｄｉｂ（ＶＸ−４９７）、Ｅｎｄｏ  Ｌａｂｓ  Ｓｏｌｖａｙ社のＡＭＡＮＴＡＤＩＮＥ（登録商標）（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）、ＲＰＩ社のＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（登録商標）、Ｉｄｕｎ  Ｐｈａｒｍａ．社のＩＤＮ−６５５６、ＸＴＬ．社のＸＴＬ−００２、Ｃｈｉｒｏｎ社のＨＣＶ／ＭＦ５９、ＮＡＢＩ社のＣＩＶＡＣＩＲ（Ｃ型肝炎免疫グロブリン）、ＩＣＮ／Ｒｉｂａｐｈａｒｍ社のＬＥＶＯＶＩＲＩＮ（登録商標）、ＩＣＮ／Ｒｉｂａｐｈａｒｍ社のＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ（登録商標）、Ｓｃｉ  Ｃｌｏｎｅ社のＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（チモシンα−１）、Ｓｃｉ  Ｃｌｏｎｅ社のチモシン＋ペグ化インターフェロン、Ｍａｘｉｍ社のＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（二塩酸ヒスタミン）、Ｖｅｒｔｅｘ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社のＶＸ  ９５０／ＬＹ  ５７０３１０、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／Ｅｌａｎ社のＩＳＩＳ  １４８０３、Ｉｄｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社のＩＤＮ−６５５６、ＡＫＲＯＳ  Ｐｈａｒｍａ社のＪＴＫ  ００３、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社のＢＩＬＮ−２０６１、Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｌｌＣｅｐｔ（ミコフェノール酸モフェチル）、Ｔｕｌａｒｉｋ社のβ−チューブリン阻害剤Ｔ６７、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＥ２特異的治療用ワクチン、Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．社のＦＫ７８８、ＩｄＢ  １０１６（Ｓｉｌｉｐｈｏｓ，経口シリビン−ホスファチジルコリンフィトソーム）、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ／Ｗｙｅｔｈ社のＲＮＡ複製阻害剤（ＶＰ５０４０６）、Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ社の治療用ワクチン、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の治療用ワクチン、Ａｎａｄｙｓ社のＩＲＥＳ阻害剤、Ａｎａｄｙｓ社のＡＮＡ２４５及びＡＮＡ２４６、Ａｖａｎｔ社の免疫療法剤（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、Ｃｏｒｖａｓ／ＳＣｈｅｒｉｎｇ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ社のヘリカーゼ阻害剤、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ社の融合阻害剤、ＣｅｌｌＥｘＳｙｓ社のＴ細胞療法剤、Ｂｉｏｃｒｙｓｔ社のポリメラーゼ阻害剤、ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の標的ＲＮＡ化学、Ｉｍｍｔｅｃｈ，Ｉｎｔ．社のＤｉｃａｔｉｏｎ、Ａｇｏｕｒｏｎ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｃｈｉｒｏｎ／Ｍｅｄｉｖｉｒ社のプロテアーゼ阻害剤、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ社のアンチセンス療法剤、Ｈｙｂｒｉｄｏｎ社のアンチセンス療法剤、Ａｅｔｈｌｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社のヘモピュリファイヤー、Ｍｅｒｉｘ社の治療用ワクチン、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ａｘｙｓ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｔｒｉｐｅｐ社の治療用ワクチンＣｈｒｏｎ−ＶａｃＣ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＵＴ２３１Ｂ、Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロテアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼ阻害剤、Ｉｍｍｕｓｏｌ社のＩＲＥＳ阻害剤、Ｒｉｇｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＲ８０３、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社のＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）���インターフェロンαｃｏｎ−１）、Ｖｉｒａｇｅｎ社のＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ社のＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ社のωインターフェロン、Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の経口インターフェロンα、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社のインターフェロンγ、インターフェロンτ、及びインターフェロンγ−１ｂが挙げられる。
【００３７】
他の型の肝炎の治療用ヌクレオシドプロドラッグが従来記載されている。ＷＯ０１／９６３５３（出願日２００１年６月１５日、出願人Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）はＨＢＶの治療用として２’−デオキシ−β−Ｌ−ヌクレオシドとその３’−プロドラッグを開示している。米国特許第４，９５７，９２４号（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）はアシクロビルの各種治療用エステルを開示している。
【００３８】
ＨＣＶ感染が世界中で流行し、感染患者に悲劇的な結果を招いているという事実に鑑み、宿主に低毒性でＣ型肝炎を治療するために有効な新規薬剤を提供することが強く必要とされている。
【００３９】
更に、他のフラビウイルス科感染の脅威が高まっていることから、宿主に低毒性で有効な新規薬剤を提供することが強く必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４０】
従って、本発明の目的はＣ型肝炎ウイルスに感染した宿主の治療用化合物、方法及び組成物を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的はペスチウイルス、フラビウイルス、又はヘパシウイルスに感染した患者の治療に一般に使用される方法と組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステル（以下、ｖａｌ−ｍＣｙｄとも言う）はＣ型肝炎ウイルスを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに対して優れた結果を提供することが発見された。この発見に基づき、場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持した有効量のｖａｌ−ｍＣｙｄ又はその塩、エステル、プロドラッグもしくは誘導体を投与することを含む、ＨＣＶを含むフラビウイルス科の治療用化合物、組成物、方法及び使用を提供する。代替態様では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介して複製する任意ウイルスを治療するためにｖａｌ−ｍＣｙｄを使用する。
【００４３】
従って、第１の態様は式（Ｉ）の化合物β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン又はその医薬的に許容可能な塩と、ＨＣＶを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに感染した宿主、特にヒトを治療するための薬物療法及び医薬製造におけるその使用を提供する。
【００４４】
化合物ｖａｌ−ｍＣｙｄは胃腸粘膜、血液又は肝臓で脱エステル化により親ＭＣｙｄに変換され、経口送達後に胃腸腔から胃腸管の粘膜におけるアミノ酸輸送機能により血流中に能動輸送される。この結果、主にヌクレオシド輸送機能により輸送される親２’−分枝ヌクレオシドよりも経口バイオアベイラビリティーが増加する。また、アミノ酸輸送機能ではなくヌクレオシド輸送機能により輸送される他のヌクレオシド又はヌクレオシド類似体との競合が低下する。完全な吸収前に部分的な脱エステル化が生じるので、モノ又はジバリンエステルはアミノ酸輸送機能を使用して吸収され続ける。従って、良好な吸収、バイオアベイラビリティー、及び血流取込みに関する他のヌクレオシド又はヌクレオシド類似体との競合低下という優れた結果が得られる。
【００４５】
Ｃ型肝炎感染チンパンジーでは、ｖａｌ−ｍＣｙｄは７日間で平均ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを０．８３ｌｏｇ１０コピー／ｍｌ（８．３ｍｇ／ｋｇ／日）及び１．０５ｌｏｇ１０コピー／ｍｌ（１６．６ｍｇ／ｋｇ／日）低下させた。チンパンジーは薬剤に関連する安全性の問題を示さなかった。
【００４６】
親ヌクレオシド（ｍＣｙｄ）フレームワークはβ−Ｄ又はβ−Ｌヌクレオシドとして存在することができる。１好適態様では、少なくとも９０％がβ−Ｄエナンチオマーの形態で医薬的に許容可能な化合物を投与する。別の態様では、ｖａｌ−ｍＣｙｄは少なくとも９５％がβ−Ｄエナンチオマーである。バリンエステルもエナンチオマー形態をとる。１好適態様では、バリン部分は少なくとも９０％がＬ−エナンチオマーである。別の態様では、バリン部分は少なくとも９５％がＬ−エナンチオマーである。代替態様では、ラセミ混合物として又はβ−Ｄもしくはβ−Ｌ親ヌクレオシドとＬもしくはＤアミノ酸の任意組合せとして化合物を使用する。
【００４７】
【化７】
2005533824.tif 000002
【００４８】
１特定態様では、式（Ｉ）の化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル−ＨＣｌ塩である。別の特定態様では、フラビウイルス又はペスチウイルスに感染した宿主、特にヒトに投与するための式（ＩＩ）の化合物β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン二塩酸塩が提供される。他の態様では、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭素酸水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸塩が提供される。特に好ましい態様は一又は二塩酸塩である。
【００４９】
【化８】
2005533824.tif 000003
【００５０】
別の態様では、２’−Ｃ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル−又はその医薬的に許容可能な塩（一又は二ＨＣｌ塩を含む）、エステル、プロドラッグもしくは誘導体と医薬的に許容可能なキャリヤー、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【００５１】
代替態様では、５’−水酸基は５’−ＯＲで置換されており、Ｒはリン酸（一リン酸、二リン酸、三リン酸、又は安定化リン酸プロドラッグを含む）；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；アルキルもしくはアリールアルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む）を含むスルホン酸エステル；フェニル基が場合により本明細書のアリールの定義に記載するような１個以上の置換基で置換されていてもよいベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペブチド；コレステロール；又はｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合にＲが独立してＨもしくはリン酸である化合物を提供することができる他の医薬的に許容可能な脱離基である。
【００５２】
本発明の活性化合物は（背景技術の欄に記載又は言及した任意のものを含む）ＨＣＶを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに対して活性な別の物質又は他の有用な生物剤と併用又は交互投与することができる。従って、別の主要な態様はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル又はその医薬的に許容可能な塩（一又は二ＨＣｌ塩を含む）、エステル、プロドラッグもしくは医薬的に許容可能な誘導体と、１種以上の他の有効な抗ウイルス剤と、場合により医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含む医薬組成物である。別の態様では、β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル又はその塩、エステル、プロドラッグもしくは誘導体を場合により医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤と共に１種以上の第２の抗ウイルス剤と併用又は交互投与することを含む方法が提供される。
【００５３】
所望生物効果を付与する任意第２の抗ウイルス剤を選択することができる。非限定的な例としてはインターフェロン、リバビリン、インターロイキン、ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、フェナントレンキノン、チアゾリジン誘導体、チアゾリジン、ベンズアニリド、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体、グリオトキシン、セルレニン、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤、又はリボザイムが挙げられる。１特定態様では、第２の抗ウイルス剤は天然インターフェロン、インターフェロンα（インターフェロン−α−２ａ及びインターフェロン−α−２ｂを含む）、インターフェロンβ（インターフェロンβ−１ａを含む）、ωインターフェロン、インターフェロンγ（インターフェロンγ−１ｂを含む）、インターフェロンτ、及びコンセンサスインターフェロンから選択される。耐性及び生物学的安定性又は他の生物学的特性を改善するようにこれらのインターフェロンの任意のものを安定化又は他の方法で修飾することができる。一般的な修飾の１例はペグ化（ポリエチレングリコールによる修飾）である。１特定態様では、第２の抗ウイルス剤はペグ化又は非ペグ化インターフェロン２−αである。
【００５４】
代替態様では、活性化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アミノ酸エステルであり、アミノ酸は天然でも合成でもよく、Ｄ又はＬのいずれの立体配置でもよい。別の態様では、活性化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アシルエステルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステル（以下、ｖａｌ−ｍＣｙｄとも言う）はＣ型肝炎ウイルスを含むフラビウイルス又はペスチウイルスに対して優れた結果を提供することが発見された。この発見に基づき、場合により医薬的に許容可能なキャリヤーに担持した有効量のｖａｌ−ｍＣｙｄ又はその塩、エステル、プロドラッグもしくは誘導体を投与することを含む、ＨＣＶを含むフラビウイルス科の治療用化合物、組成物、方法及び使用を提供する。代替態様では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介して複製する任意ウイルスを治療するためにｖａｌ−ｍＣｙｄを使用する。
【００５６】
開示する化合物又はその医薬的に許容可能な誘導体もしくは塩又はこれらの化合物を含有する医薬的に許容可能な製剤はフラビウイルス科（ＨＣＶを含む）感染及び他の関連状態（例えば抗ＨＣＶ抗体陽性及びＨＣＶ陽性状態、並びにＣ型肝炎関連肝癌（例えば肝細胞癌）及び肝腫瘍）の予防と治療に有用である。更に、これらの化合物又は製剤は抗ＨＣＶ（又はより一般には抗フラビウイルス科）抗体又はＨＣＶ抗原又はフラビウイルス科抗原に陽性であるか、あるいはＨＣＶ又は別のフラビウイルス科ウイルスに暴露された個体における臨床疾患の進行を予防又は遅延させるために予防的に使用することができる。
【００５７】
要約すると、本発明は以下の特徴を含む。
（ａ）β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルと、その医薬的に許容可能なプロドラッグ、誘導体及び塩（特に一及び二塩酸塩を含む）；
（ｂ）例えばフラビウイルス科（ＨＣＶを含む）感染の治療又は予防用として薬物療法に使用するためのβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルと、その医薬的に許容可能なプロドラッグ、誘導体及び塩；
（ｃ）フラビウイルス科（ＨＣＶを含む）感染の治療用医薬の製造におけるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルと、その医薬的に許容可能なプロドラッグ、誘導体及び塩の使用；
（ｄ）β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルと、その医薬的に許容可能なプロドラッグ、誘導体及び塩と医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤を含む医薬製剤；
（ｅ）β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルの製造方法；
（ｆ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介して複製するウイルスに起因する感染の治療におけるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルの使用；並びに
（ｇ）別の抗ウイルス剤との併用又は交互投与によるウイルス感染の治療におけるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−Ｌ−バリンエステルの使用。
【００５８】
代替態様では、活性化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アミノ酸エステルであり、アミノ酸は天然でも合成でもよく、Ｄ又はＬ立体配置でもよい。別の態様では、活性化合物はβ−Ｄ又はβ−Ｌ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アシルエステルである。本発明の化合物は抗ウイルス活性をもつか、又はこのような活性を示す化合物に代謝される。
【００５９】
理論に拘束されるものではないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用メカニズム試験によると、ｍＣｙｄはゲノムＲＮＡ複製の特異的阻害剤であると思われる。更に、細胞内５’−三リン酸部分ｍＣｙｄ−ＴＰはＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性−ＲＮＡポリメラーゼを直接阻害すると想われる。ｍＣｙｄ−ＴＰの存在下でＲＮＡ合成を分析した処、ｍＣｙｄ−ＴＰは未確認のメカニズムを介してウイルスＲＮＡ合成の特異的チェーンターミネーターとして作用するらしい。抗ウイルスヌクレオシド及びヌクレオシド類似体は一般に細胞内キナーゼにより活性代謝産物５’−三リン酸（ＴＰ）誘導体に変換される。その後、ヌクレオシド−ＴＰはウイルス複製中にウイルスポリメラーゼを阻害することによりその抗ウイルス作用を発揮する。培養細胞において細胞内リン酸化はｍＣｙｄを主に活性種であるｍＣｙｄ−三リン酸（ｍＣｙｄ−ＴＰ）と低レベルのｍＣｙｄ−二リン酸に変換する。更に、ｍＣｙｄ又はｍＣｙｄ−５’−リン酸種の細胞内脱アミノ化により産生されると考えられる第２のＴＰ産物２’−Ｃ−メチル−ウリジンＴＰ（ｍＵｒｄ−ＴＰ）が存在する。
【００６０】
本発明の範囲に含まれるフラビウイルスはＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｆｉｅｌｄｓ，．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１（１９９６）に概説されている。特定フラビウイルスとしては限定されないが、Ａｂｓｅｔｔａｒｏｖ；Ａｌｆｕｙ；Ａｐｏｉ；Ａｒｏａ；Ｂａｇａｚａ；Ｂａｎｚｉ；Ｂｏｕｏｕｉ；Ｂｕｓｓｕｑｕａｒａ；Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ；Ｃａｒｅｙ  Ｉｓｌａｎｄ；Ｄａｋａｒ  ｂａｔ；デングウイルス１，２，３及び４；Ｅｄｇｅ  Ｈｉｌｌ；Ｅｎｔｅｂｂｅ  ｂａｔ；Ｇａｄｇｅｔｓ  Ｇｕｌｌｙ；Ｈａｎｚａｌｏｖａ；Ｈｙｐｒ；Ｉｌｈｅｕｓ；イスラエル七面鳥髄膜脳炎；日本脳炎；Ｊｕｇｒａ；Ｊｕｔｉａｐａ；Ｋａｄａｍ；Ｋａｒｓｈｉ；Ｋｅｄｏｕｇｏｕ；Ｋｏｋｏｅｒａ；Ｋｏｕｔａｎｇｏ；Ｋｕｍｌｉｎｇｅ；Ｋｕｎｊｉｎ；キャサヌール森林病；Ｌａｎｇａｔ；Ｌｏｕｐｉｎｇ病；Ｍｅａｂａｎ；Ｍｏｄｏｃ；Ｍｏｎｔａｎａ  ｍｙｏｔｉｓ白質脳炎；Ｍｕｒｒａｙ  ｖａｌｌｅｙ脳炎；Ｎａｒａｎｊａｌ；Ｎｅｇｉｓｈｉ；Ｎｔａｙａ；Ｏｍｓｋ出血熱；Ｐｈｎｏｍ−Ｐｅｎｈ  ｂａｔ；Ｐｏｗａｓｓａｎ；Ｒｉｏ  Ｂｒａｖｏ；Ｒｏｃｉｏ；Ｒｏｙａｌ  Ｆａｒｍ；ロシア春夏脳炎；Ｓａｂｏｙａ；セントルイス脳炎；Ｓａｌ  Ｖｉｅｊａ；Ｓａｎ  Ｐｅｒｌｉｔａ；Ｓａｕｍａｒｅｚ  Ｒｅｅｆ；Ｓｅｐｉｋ；Ｓｏｋｕｌｕｋ；Ｓｐｏｎｄｗｅｎｉ；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ；Ｔｅｍｕｓｕ；Ｔｙｕｌｅｎｉｙ；Ｕｇａｎｄａ  Ｓ，Ｕｓｕｔｕ，Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ；Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ；Ｙａｏｕｎｄｅ；黄熱病；及びＺｉｋａが挙げられる。
【００６１】
本発明の範囲に含まれるペスチウイルスもＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（前出）に概説されている。特定ペスチウイルスとしては限定されないが、ウシウイルス性下痢ウイルス（“ＶＤＶ”）；ブタコレラウイルスとしても知られる古典的ブタ熱ウイルス（“ＣＳＦＶ”）；及びボーダー病ウイルス（“ＤＶ”）が挙げられる。
【００６２】
定義
本明細書で使用するアルキルなる用語は特に指定しない限り、一般にＣ１〜Ｃ１０の飽和直鎖、分枝鎖又は環状第１、第２又は第３炭化水素を意味し、特にＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＦＣｌ２、ＣＦ２Ｃｌ、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＦ２ＣＦ３、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、第２ブチル、第３ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルが挙げられる。この用語は置換及び非置換アルキル基の両者を含み、特にハロゲン化アルキル基、更に具体的にはフッ素化アルキル基を含む。アルキル基を置換することができる部分の非限定的な例はハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸から構成される群から選択され、保護されていなくてもよいし、例えば参考資料として本明細書に組込むＧｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に教示されているように、当業者に公知の通り、必要に応じて保護されていてもよい。
【００６３】
本明細書で使用する低級アルキルなる用語は特に指定しない限り、Ｃ１〜Ｃ４飽和直鎖、分枝鎖又は環状（例えばシクロプロピル）アルキル基を意味し、置換及び非置換アルキル基の両者を含む。本明細書では特に記載しない限り、アルキルが適切な部分である場合には、低級アルキルが好ましい。同様に、アルキル又は低級アルキルが適切な部分である場合には、非置換アルキル又は低級アルキルが好ましい。
【００６４】
アルキルアミノ又はアリールアミノなる用語は夫々１又は２個のアルキル又はアリール置換基をもつアミノ基を意味する。
【００６５】
本明細書で使用する「保護」なる用語は特に定義しない限り、それ以上反応しないようにするため又は他の目的で酸素、窒素、又はリン原子に付加される基を意味する。多種多様の酸素及び窒素保護基が有機合成分野の当業者に公知である。
【００６６】
本明細書で使用するアリールなる用語は特に指定しない限り、フェニル、ビフェニル、又はナフチルを意味し、フェニルが好ましい。この用語は置換及び非置換部分の両者を含む。アリール基は任意所望部分で置換することができ、限定されないが、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸から構成される群から選択される１種以上の部分が挙げられ、保護されていなくてもよいし、例えば参考資料として本明細書に組込むＧｒｅｅｎｅら，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に教示されているように、当業者に公知の通り、必要に応じて保護されていてもよい。
【００６７】
アルカリール又はアルキルアリールなる用語はアリール置換基をもつアルキル基を意味する。アラルキル又はアリールアルキルなる用語はアルキル置換基をもつアリール基を意味する。
【００６８】
本明細書で使用するハロなる用語はクロロ、ブロモ、ヨード、及びフルオロを個々に記載しているものとみなす。
【００６９】
プリン又はピリミジン塩基なる用語は限定されないが、アデニン、Ｎ６−アルキルプリン、Ｎ６−アシルプリン（但し、アシルはＣ（Ｏ）（アルキル、アリール、アルキルアリール、又はアリールアルキルである））、Ｎ６−ベンジルプリン、Ｎ６−ハロプリン、Ｎ６−ビニルプリン、Ｎ６−アセチレンプリン、Ｎ６−アシルプリン、Ｎ６−ヒドロキシアルキルプリン、Ｎ６−アルキルアミノプリン、Ｎ６−チオアルキルプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、チミン、シトシン、５−フルオロシトシン、５−メチルシトシン、６−アザピリミジン（６−アザシトシン、２−及び／又は４−メルカプトピリミジンを含む）、ウラシル、５−ハロウラシル（５−フルオロウラシルを含む）、Ｃ５−アルキルピリミジン、５−ヨード−ピリミジン、６−ヨード−ピリミジン、２−Ｂｒ−ビニル−５−ピリミジン、２−Ｂｒ−ビニル−６−ピリミジン、Ｃ５−ベンジルピリミジン、Ｃ５−ハロピリミジン、Ｃ５−ビニルピリミジン、Ｃ５−アセチレンピリミジン、Ｃ５−アシルピリミジン、Ｃ５−ヒドロキシアルキルプリン、Ｃ５−アミドピリミジン、Ｃ５−シアノピリミジン、Ｃ５−ニトロピリミジン、Ｃ５−アミノピリミジン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アルキル−６−チオプリン、５−アザシチジニル、５−アザウラシニル、チアゾロピリジニル、イミダゾロピリジニル、ピロロピリミジニル、及びピラゾロピリミジニルを含む。プリン塩基としては限定されないが、グアニン、アデニン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、及び６−クロロプリンが挙げられる。塩基上の機能的酸素及び窒素原子は必要又は所望に応じて保護することができる。適切な保護基は当業者に周知であり、トリメチルシリル、ジメチルヘキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、及びｔ−ブチルジフェニルシリル、トリチル、アルキル基、及びアシル基（例えばアセチル及びプロピオニル）、メタンスルホニル、及びｐ−トルエンスルホニルが挙げられる。
【００７０】
アシル又はＯ結合エステルなる用語は式Ｃ（Ｏ）Ｒ’の基を意味し、式中、Ｒ’は直鎖、分枝鎖又は環状アルキル（低級アルキルを含む）、アミノ酸のカルボン酸残基、アリール（フェニルを含む）、ヘテロアリール、アルカリール、アラルキル（ベンジルを含む）、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）、アリールオキシアルキル（例えばフェノキシメチル）；あるいは置換アルキル（低級アルキルを含む）、場合によりクロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ１〜Ｃ４アルコキシ、スルホン酸エステル（例えばアルキル又はアラルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む））、一、二、又は三リン酸エステル、トリチル又はモノメトキシ−トリチル、置換ベンジル、アルカリール、アラルキル（ベンジルを含む）、アルコキシアルキル（メトキシメチルを含む）、アリールオキシアルキル（例えばフェノキシメチル）で置換されたアリール（フェニルを含む）である。エステル内のアリール基は場合によりフェニル基を含む。非限定的な態様において、アシル基としてはアセチル，トリフルオロアセチル、メチルアセチル、シクロプロピルアセチル、シクロプロピル−カルボキシ、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、ネオ−ヘプタノイル、フェニルアセチル、２−アセトキシ−２−フェニルアセチル、ジフェニルアセチル、α−メトキシ−α−トリフルオロメチル−フェニルアセチル、ブロモアセチル、２−ニトロ−ベンゼンアセチル、４−クロロ−ベンゼンアセチル，２−クロロ−２，２−ジフェニルアセチル、２−クロロ−２−フェニルアセチル、トリメチルアセチル、クロロジフルオロアセチル、ペルフルオロアセチル、フルオロアセチル、ブロモジフルオロアセチル、メトキシアセチル、２−チオフェンアセチル、クロロスルホニルアセチル、３−メトキシフェニルアセチル、フェノキシアセチル、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、トリクロロアセチル、モノクロロアセチル、ジクロロアセチル、７Ｈ−ドデカフルオロ−ヘプタノイル、ペルフルオロ−ヘプタノイル、７Ｈ−ドデカ−フルオロヘプタノイル、７−クロロドデカフルオロ−ヘプタノイル、７−クロロ−ドデカフルオロ−ヘプタノイル、７Ｈ−ドデカフルオロヘプタノイル、７Ｈ−ドデカフルオロヘプタノイル、ノナ−フルオロ−３，６−ジオキサ−ヘプタノイル，ノナフルオロ−３，６−ジオキサヘプタノイル、ペルフルオロヘプタノイル、メトキシベンゾイル、メチル−３−アミノ−５−フェニルチオフェン−２−カルボキシル、３，６−ジクロロ−２−メトキシ−ベンゾイル、４−（１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシ）−ベンゾイル、２−ブロモ−プロピオニル、ω−アミノカプリル、デカノイル、ｎ−ペンタデカノイル、ステアリル、３−シクロペンチル−プロピオニル、１−ベンゼン−カルボキシル、Ｏ−アセチルマンデリル、ピバロイルアセチル、１−アダマンタン−カルボキシル、シクロヘキサン−カルボキシル、２，６−ピリジンジカルボキシル、シクロプロパン−カルボキシル、シクロブタン−カルボキシル、ペルフルオロシクロヘキシルカルボキシル、４−メチルベンゾイル、クロロメチルイソキサゾリルカルボニル、ペルフルオロシクロヘキシルカルボキシル、クロトニル、１−メチル−１Ｈ−インダゾール−３−カルボニル、２−プロペニル、イソバレリル、１−ピロリジンカルボニル、４−フェニルベンゾイルが挙げられる。
【００７１】
アミノ酸なる用語は天然及び合成α、β、γ、又はδアミノ酸を含み、限定されないが、蛋白質に存在するアミノ酸、即ちグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。１好適態様では、アミノ酸はＬ配置であるが、Ｄ配置で使用することもできる。あるいは、アミノ酸はアラニル、バリニル、ロイシニル、イソロイシニル、プロリニル、フェニルアラニニル、トリプトファニル、メチオニニル、グリシニル、セリニル、スレオニニル、システイニル、チロシニル、アスパラギニル、グルタミニル、アスパルトイル、グルタロイル、リジニル、アルギニニル、ヒスチジニル、β−アラニル、β−バリニル、β−ロイシニル、β−イソロイシニル、β−プロリニル、β−フェニルアラニニル、β−トリプトファニル、β−メチオニニル、β−グリシニル、β−セリニル、β−スレオニニル、β−システイニル、β−チロシニル、β−アスパラギニル、β−グルタミニル、β−アスパルトイル、β−グルタロイル、β−リジニル、β−アルギニニル又はβ−ヒスチジニルの誘導体が挙げられる。
【００７２】
本明細書で使用する「実質的に含まない」又は「実質的に不在下」なる用語は該当ヌクレオシドの指定エナンチオマーを少なくとも８５又は９０重量％、好ましくは９５％、９８、９９％又は１００重量％含有するヌクレオシド組成物を意味する。
【００７３】
同様に、「単離」なる用語はヌクレオシドを少なくとも８５又は９０重量％、好ましくは９５％、９８、９９％又は１００重量％含有するヌクレオシド組成物を意味する。
【００７４】
本明細書で使用する宿主なる用語はウイルスが複製することができる単細胞又は多細胞生物を意味し、細胞株と動物を含み、ヒトが好ましい。あるいは、宿主は本発明の化合物によりその複製又は機能を改変することができるフラビウイルス科ウイルスゲノムの一部をもつものでもよい。宿主なる用語は具体的には感染細胞、フラビウイルス科ゲノムの全部又は一部をトランスフェクトした細胞及び動物、特に霊長類（チンパンジーを含む）及びヒトを意味する。本発明の大半の動物適用では、宿主はヒト患者である。しかし、所定適応症では、獣医学適用も本発明により明白に予想される（例えばチンパンジー）。
【００７５】
「医薬的に許容可能な塩又はプロドラッグ」なる用語は本明細書全体を通してヌクレオシド化合物の医薬的に許容可能な任意形態（例えばエステル、リン酸エステル、エステルの塩又は関連基）であり、患者に投与するとヌクレオシド化合物を提供するものを意味する。医薬的に許容可能な塩としては医薬的に許容可能な無機又は有機塩基及び酸から誘導されるものが挙げられる。適切な塩としては医薬分野で周知の多数の酸のうちでアルカリ金属（例えばカリウムやナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばカルシウムやマグネシウム）から誘導されるものが挙げられる。医薬的に許容可能なプロドラッグとは宿主で代謝、例えば加水分解又は酸化されると本発明の化合物を形成する化合物を意味する。プロドラッグの典型例としては活性化合物の機能的部分に生物学的に不安定な保護基をもつ化合物が挙げられる。プロドラッグとしては、活性化合物を生成するように酸化、還元、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、脱水酸化、加水分解、脱加水分解、アルキル化、脱アルキル化、アシル化、脱アシル化、リン酸化、脱リン酸化されることができる化合物が挙げられる。本発明の化合物はフラビウイルス科に対して抗ウイルス活性をもつか、又はこのような活性を示す化合物に代謝される。
【００７６】
Ｉ．活性化合物、生理的に許容可能なその塩及びプロドラッグ
本発明は治療を必要とする宿主に有効量の２’−Ｃ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリン、又はその医薬的に許容可能な塩、エステルもしくはプロドラッグを投与することを含む、ペスチウイルス、フラビウイルス及びＣ型肝炎ウイルス感染の治療方法及び組成物に関する。
【００７７】
１態様では、式（Ｉ）の化合物の塩酸塩を使用する。別の態様では、式（Ｉ）の化合物の二塩酸塩が好ましい。しかし、レシピエントに投与すると、親化合物を直接もしくは間接的に提供することができるか又はそれ自体が活性を示す任意塩又はプロドラッグとして活性化合物を投与することができる。非限定的な例は医薬的に許容可能な塩（「生理的に許容可能な塩」とも言う）であり、「医薬的に許容可能なプロドラッグ」を形成するように５’位又はプリンもしくはピリミジン塩基をアルキル化、アシル化又は他の方法で修飾した化合物である。更に、修飾により化合物の生物活性を変化させ、場合によっては親化合物よりも活性を増加することもできる。これは、塩又はプロドラッグを製造し、本明細書に記載する方法又は当業者に公知の他の方法に従ってその抗ウイルス活性を試験することにより容易に評価することができる。
【００７８】
第１の主要態様では、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを提供する。
【００７９】
【化９】
2005533824.tif 000004
【００８０】
当然のことながら、化合物の全立体異性、互変及び多型形態が本発明に含まれる。２’−メチル置換はエチル、プロピル等の他のアルキル基でもよいし、あるいはエテニルでもよい。
【００８１】
代替態様では、活性化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アミノ酸エステルであり、アミノ酸は天然でも合成でもよく、Ｄ又はＬのいずれの立体配置でもよい。別の態様では、活性化合物はβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの３’−アシルエステルである。
【００８２】
別の代替態様では、５’−水酸基は５’−ＯＲで置換されており、Ｒはリン酸（一リン酸、二リン酸、三リン酸、又は安定化リン酸プロドラッグを含む）；安定化リン酸プロドラッグ；アシル（低級アシルを含む）；アルキル（低級アルキルを含む）；アルキルもしくはアリールアルキルスルホニル（メタンスルホニルを含む）を含むスルホン酸エステル；フェニル基が場合により本明細書のアリールの定義に記載するような１個以上の置換基で置換されていてもよいベンジル；脂質（リン脂質を含む）；アミノ酸；炭水化物；ペブチド；コレステロール；又はｉｎ  ｖｉｖｏ投与した場合にＲが独立してＨもしくはリン酸である化合物を提供することができる他の医薬的に許容可能な脱離基である。
【００８３】
ＩＩ．活性化合物の合成
本発明の化合物は当分野で公知の手段により合成することができる。例えば、１態様では、２’Ｃをジ置換されたヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、又はその塩、プロドラッグ、立体異性体又は互変体を製造する。別の態様では、活性ヌクレオシドとして有効であるか又はプロセス中間体として使用されるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−シチジン（４−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−Ｃ−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン）を製造する。更に別の態様では、β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−シチジンの３’−Ｏ−バリニルエステル（２−アミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−４−Ｃ−メチル−２−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル）又は塩酸塩形態を製造する。製造したヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、塩又はエステルプロドラッグは多種多様な他のヌクレオシド類似体の製造における中間体として使用することもできるし、抗ウイルス及び／又は抗腫瘍薬として直接使用することもできる。
【００８４】
以下、実施例により本発明を例証する。当業者に自明の通り、これらの実施例は発明を限定するものではなく、本発明の精神と範囲から逸脱することなく細部を変更することができる。
【実施例１】
【００８５】
β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルの合成
図１ａに示す１合成法では、合成はシトシン、ＢＳＡ及びＳｎＣｌ４／アセトニトリルを１，２，３，５−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノース（１）と反応させ、４−アミノ−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−ベンゾイルオキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（２）を形成する段階と；（２）をＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨと反応させ、４−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（３）（２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノースとしても知られる）を提供する段階を含む。出発材料としてベンゾイル−シトシンではなくシトシンを使用することにより、製法の「原子経済性」を改善し、後期段階で精製を簡略にする。
【００８６】
この製法の次段階は（３）をＤＭＦ中にてＭｅ２ＮＣＨ（ＯＭｅ）２と反応させ、（３）のアミノ保護形であるＮ−［１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−４−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミジン（４）を形成する段階と；（４）をＤＣＭ中にてＴＢＤＰＳＣｌ及びイミダゾールと反応させ、Ｎ’−｛１−［５−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラニルオキシメチル）−３，４−ジヒドロキシ−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−４−イル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミジン（５）として（４）の５’−シリル保護形を提供する段階（ＤＣＭを使用すると、ジシリル副生物形成を制御し易くなるという利点がある）と；（５）をＤＣＭ中にてＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−バリン、ＥＤＣ及びＤＭＡＰと室温で反応させ、２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸２−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラニルオキシ−メチル）−５−［４−（ジメチルアミノ−メチレンアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル］−４−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル（６）を形成する段階と；酢酸エチル約１０モル当量の存在下に（６）をＭｅＯＨ中にてＮＨ４Ｆと反応させて遊離したアンモニアによる３’−Ｏ−バリニルエステルの開裂を防ぐと共に混合物を還流することによりシリル及びアミノ保護基を除去し、２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル（７）を提供する段階と；（７）をＥｔＯＨ中にてＨＣｌと反応させ、２−アミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル二塩酸塩（８）を最終生成物として提供する段階を含む。
【００８７】
代替合成
図１ｂに示す本発明の化合物を合成するための別法では、ベンゾイルシトシン、ＢＳＡ及びＳｎＣｌ４／アセトニトリルを１，２，３，５−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノース（１）と反応させ、４−ベンゾイルアミノ−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−ベンゾイルオキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（２ａ）を形成する段階と；（２ａ）をメタノール中にてＮＨ３と反応させ、生成物４−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（３）（β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−シチジンとしても知られる）をクロマトグラフィー分離する段階と；（３）をＤＭＦ中にてＭｅ２ＮＣＨ（ＯＭｅ）２と室温で１．５時間反応させ、Ｎ−［１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−４−イル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミジン（４）を形成する段階と；（４）をＴＢＤＰＳＣｌ及びピリジンと室温で６時間反応させ、Ｎ’−｛１−［５−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラニルオキシメチル）−３，４−ジヒドロキシ−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリミジン−４−イル｝−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミジン（５）を提供する段階と；（５）をＴＨＦ／ＤＭＦ中にてＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−バリン、ＤＥＣ及びＤＭＡＰと室温で２日間反応させ、この反応から形成された生成物をＨＰＬＣにかけ、２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸２−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シラニルオキシ−メチル）−５−［４−（ジメチルアミノメチレンアミノ）−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル］−４−ヒドロキシ−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル（６）を提供する段階と；（６）をＭｅＯＨ中にてＮＨ４Ｆの存在下に約３時間還流し、シリル及びアミノ保護基を除去し、生成物をクロマトグラフィー精製し、２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル（７）を提供する段階と；最後に（７）をＥｔＯＨ中にてＨＣｌと室温で反応させ、２−アミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステル二塩酸塩（８）を最終生成物として提供する段階を含む。
【実施例２】
【００８８】
２’−Ｃ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル（ｖａｌ−ｍＣｙｄ）の合成
【００８９】
【化１０】
2005533824.tif 000005
【００９０】
段階１：化合物９：２−Ｃ−メチル−Ｄ−リボン酸−γ−ラクトンの合成
オーバーヘッドスターラー、撹拌シャフト、ディジタル温度計測装置及びアルゴン供給管を取り付けた２５０ｍＬ容３頚丸底フラスコで脱イオン水（１００ｍＬ）を撹拌した。アルゴンを水中に３０分間バブリングし、Ｄ−フルクトース（２０．０ｇ，０．１１１ｍｏｌｅ）を加えると、溶液は数分間で透明になった。酸化カルシウム（１２．５ｇ，０．２２３ｍｏｌｅ）を５分間かけて少量ずつ加え、混合物を激しく撹拌した。発熱が観察され、酸化カルシウム添加の開始から１０分後に反応温度は３９．６℃に達した。約１５分後に反応混合物は黄色になり、時間がたつにつれて濃くなった。３時間後に、ＴＬＣ分析用アリコートを取出した。飽和蓚酸水溶液を使用してアリコートをｐＨ２まで酸性化した。得られた白色懸濁液を減圧蒸発させて脱水した。トルエン（２ｍＬ）を残渣に加え、混合物を減圧蒸発（４５〜５０℃）させて脱水した。残留固形分を１：１テトラヒドロフラン：メタノール混合物２ｍＬで再構成した。十分に混合後、懸濁液を沈殿させ、透明上清液をＴＬＣ用にスポットした（シリカプレートを酢酸エチル中２％メタノールで展開し、１％アルカリ過マンガン酸カリウムに浸して染色した。次にピンク色のバックグラウンドに黄色がかったスポットが出現するまでヒートガンを使用してプレートを加熱した）。上記条件下で一般にＲｆ値０．３３で所望ラクトンが出現する。Ｒｆ値範囲０．０〜０．２で高極性副生物と未反応材料が検出される。
【００９１】
３時間後に生成物形成が観察されたが、反応混合物を２５℃で撹拌しながら２２時間反応を続けた。この時間後に混合物のｐＨは１３．０６であった。二酸化炭素ガスを反応混合物中に約２．５時間バブリングした（ｐＨは７．２５になった）。形成された炭酸カルシウム固体を減圧濾去し、フィルターケーキを脱イオン水５０ｍＬで洗浄した。水層を合わせて蓚酸（５．０ｇ，０．０５６ｍｏｌｅ）で処理し、混合物を２５℃で３０分間激しく撹拌した（初期暗色はほぼ消え、混合物は乳白色スラリーとなった）。この段階の混合物のｐＨは一般に２〜３である。スラリー混合物を４５〜５０℃で一晩撹拌した。次に混合物を４５〜５０℃で減圧蒸発させ、水７５ｍＬを除去した。塩化ナトリウム（３０ｇ）とテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）を水性スラリー（約７５ｍＬ）に加え、混合物を２５℃で３０分間激しく撹拌した。層分離し、水層に新たにテトラヒドロフラン７５ｍＬを加えて１０分間撹拌した。このプロセスを３回繰返し、テトラヒドロフラン溶液を合わせ、無水硫酸マグネシウム１０ｇを加えて３０分間撹拌した。混合物を濾過し、硫酸マグネシウムフィルターケーキをテトラヒドロフラン６０ｍＬで洗浄した。濾液を４０℃で減圧蒸発すると、粗生成物１０．８６ｇが濃いオレンジ色の半固体として得られた。（大規模工程では、粗生成物を蒸発乾涸する代わりにテトラヒドロフランをアセトンで置換する）。粗生成物にアセトン（２０ｍＬ）を加えて２０℃で３時間撹拌した。生成物を減圧濾取し、フィルターケーキをアセトン１２ｍＬで洗浄すると、所望生成物９が白色結晶質固体として得られた。生成物を減圧乾燥すると、２．４５ｇが得られた（１３．６％収率）。化合物９の融点：１５８−１６２℃（文献融点：１６０−１６１℃）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ５．６９（ｓ，１Ｈ，Ｄ２Ｏと交換），５．４１（ｄ，１Ｈ，Ｄ２Ｏと交換），５．００（ｔ，１Ｈ，Ｄ２Ｏと交換），４．１５（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．５２（ｍ，１Ｈ），１．２２（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １７６．４４，８２．９５，７２．１７，７２．０２，５９．６３，２０．９５。（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５：計算値Ｃ，４４．４５；Ｈ，６．２２。実測値Ｃ，４４．３４；Ｈ，６．３０）。
【００９２】
段階２：化合物１０：２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−リボン酸−γ−ラクトンの合成
１，２−ジメトキシエタン（５０ｍＬ）中のラクトン１（３．０ｇ，１８．５０ｍｍｏｌ．）、４−ジメチルアミノピリジン（０．４５ｇ，３．７２ｍｍｏｌ．）及びトリエチルアミン（２５．２７ｇ，２４９．７２ｍｍｏｌ．）の混合物を２５℃でアルゴン雰囲気下に３０分間撹拌した。この白色懸濁液を５℃まで冷却し、塩化ベンゾイル（１１．７ｇ，８３．２３ｍｍｏｌ．）を１５分間かけて加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル中２％メタノール）によると、出発材料は完全に消費されていた。氷冷水（１００ｇ）を反応混合物に加え、撹拌を３０分間続けた。形成された白色固体を減圧濾取し、フィルターケーキを冷水（５０ｍＬ）で洗浄した。この粗生成物にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（６０ｍＬ）を加えて２０℃で３０分間撹拌した後、濾過し、フィルターケーキをｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２５ｍＬ）で洗浄し、減圧乾燥すると、７．３３ｇ（８３．４％収率）の化合物１０が白色固体として９７．７４％純度（ＨＰＬＣ／ＡＵＣ）で得られた。化合物１０の融点：１３７−１４０℃（文献融点：１４１−１４２℃）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ８．０４（ｄ，２Ｈ），７．９２（ｄ，２Ｈ），７．７３（ｄ，２Ｈ），７．５９（ｔ，１Ｈ），７．４５（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｔ，２Ｈ），７．１７（ｔ，２Ｈ），５．５１（ｄ，１Ｈ），５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８２−４．６６（ＡＢ四重項のｄ，２Ｈ），１．９５，（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  １７２．８７，１６６．１７，１６６．０８，１６５．５８，１３４．０６，１３３．９１，１３３．７２，１３０．０９，１２９．８５，１２９．８０，１２９．３７，１２８．７８，１２８．６０，１２８．４９，１２７．９６，１２７．８９，７９．６７，７５．４９，７２．６０，６３．２９，２３．８０。ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳ＋（Ｍ＋１：４７５）。
【００９３】
段階３：化合物１１：２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノースの合成
Ｒｅｄ−ＡＩ（トルエン中６５重量％，２．０ｍＬ，６．５６ｍｍｏｌ．）の無水トルエン（２．０ｍＬ）溶液を０℃でアルゴン雰囲気下に撹拌した。無水エタノール（０．３８ｍＬ，６．５６ｍｍｏｌ．）の無水トルエン（１．６ｍＬ）溶液をトルエン溶液に５分間かけて加えた。得られた混合物を０℃で１５分間撹拌し、このＲｅｄ−Ａｌ／エタノール試薬２ｍＬ（２．１８ｍｍｏｌ．）を２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−リボノラクトン２（４７５ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ．）の無水トルエン（１０ｍＬ）冷（−５℃）溶液に１０分間かけて加えた。反応混合物を−５℃で４０分間撹拌した。ＴＬＣ分析（シリカプレート，ヘプタン中３５％酢酸エチル）によると、出発材料は完全に消費されていた。ＨＰＬＣ分析によると、出発材料は０．１％しか残留していなかった。アセトン（０．２ｍＬ）、水（１５ｍＬ）及び１Ｎ  ＨＣｌ（１５ｍＬ）を０℃で加えて反応混合物をクエンチし、室温まで昇温させた。１Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ）を加えて無機塩を溶解させた（ｐＨ：２−３）。混合物を酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出し、有機溶液をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（無水硫酸ナトリウム１０ｇ）し、溶媒を４０℃の温度で減圧除去すると、所望生成物１１が定量可能な収率（４８０ｍｇ）で得られた。この材料をそのまま次段階で使用した。
【００９４】
段階４：化合物１２：１，２，３，５−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノースの合成
化合物１１（４８０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ．）、４−ジメチルアミノピリジン（１２．３ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ．）及びトリエチルアミン（５０６ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ．）の無水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）冷溶液（５℃）に塩化ベンゾイル（２８３ｍｇ，２．０ｍｍｏｌ．）を５分間かけて加えた。反応混合物を室温でアルゴン雰囲気下に一晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析によると、未反応出発材料は０．２５％であった。氷冷水（１０ｇ）と飽和重炭酸ナトリウム水溶液を加えることにより反応を停止した。テトラヒドロフランを減圧除去し、混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機溶液を水（２５ｍＬ）、ブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（無水硫酸ナトリウム１２ｇ）し、溶媒を減圧除去すると、粘稠油状生成物６５０ｍｇが得られた。この粗生成物にｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル５ｍＬを加えて５分間撹拌し、ヘプタン（５ｍＬ）と水（０．１ｍＬ）を加えて２０℃で撹拌を更に２時間続けた。固形分を減圧濾取し、フィルターケーキを１：１ヘプタン：ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル溶液（６ｍＬ）とｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２ｍＬ）で洗浄した。固形分を減圧乾燥すると、３００ｍｇ（５２％）の融点１５４−１５６．３℃の所望生成物１２（ＨＰＬＣ／ＡＵＣによる純度９８．４３％）が白色固体として得られた（文献融点：１５５−１５６℃）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  ８．１３（ｍ，４Ｈ），８．０７（ｄ，２Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ），７．６３（ｍ，３Ｈ），７．４８（ｍ，６Ｈ），７．１５（ｍ，３Ｈ），７．０６（ｓ，１Ｈ），５．８６（ｄｄ，１Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．５２（ＡＢ四重項のｄ，２Ｈ），１．９５，（ｓ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δｐｐｍ  １６６．３１，１６５．８３，１６５．０１，１６４．７７，１３４．０１，１３３．８６，１３３．７０，１３３．１７，１３０．４４，１３０．１３，１２９．９７，１２９．８１，１２９．５９，１２９．３９，１２９．０７，１２８．８４，１２８．７６，１２８．３７，９８．０１，８６．８７，７８．７７，７６．３５，６４．０５，１７．０７。（Ｃ３４Ｈ２８０９：計算値Ｃ，７０．３４；Ｈ，４．８６。実測値Ｃ，７０．２０；Ｈ，４．９５）。
【００９５】
【化１１】
2005533824.tif 000006
【００９６】
段階５：化合物１３：４−アミノ−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−ベンジルオキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オンの合成
還流冷却器、オーバーヘッドスターラー及びアルゴン供給口アダプターを取り付けた１２Ｌ容丸底フラスコでシトシン（８９ｇ，０．８０ｍｏｌ）をアセトニトリル（９００ｍｌ）に懸濁した。懸濁液を２０℃でアルゴン雰囲気下に撹拌し、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（５３７ｍｌ，２．２ｍｏｌ）を一度に加えた。得られた溶液を８０℃まで加熱し、同一温度で更に１時間撹拌した。１，２，３，５−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｃ−メチル−β−Ｄ−リボフラノース（４２５．０ｇ，０．７３ｍｏｌ）をアセトニトリル（４０００ｍｌ）に懸濁し、反応混合物に加えた。反応混合物は数分後に透明になり、温度は約５０℃まで低下した。塩化錫（ＩＶ）（１５４ｍｌ，１．３１ｍｏｌ）を１５分間かけて加え、８０℃で撹拌を続けた。１時間後に重炭酸ナトリウム水溶液を加えて水層を酢酸エチルで抽出することにより反応混合物のアリコートをクエンチした。酢酸エチル層をＴＬＣにより試験した（シリカゲル，ヘプタン中２０％酢酸エチル，糖誘導体のＲｆ：０．４０）。ＴＬＣ分析によると、糖誘導体は完全に消費されていた。ジクロロメタン中１０％メタノールを使用してＴＬＣにより所望生成物が検出された（Ｒｆ：０．３７）。反応を更にＨＰＬＣによりモニターした（方法番号２）。反応混合物を２０℃まで冷却し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３０００ｍｌ）を３０分間かけて加えることによりクエンチした（重炭酸ナトリウム溶液の最初の数滴を加えると発熱が観察された）。発泡を避けるために固体重炭酸ナトリウム（１３５０ｇ）を少量ずつ加えた。ｐＨ≧７となるように混合物をチェックした。撹拌を停止し、２０分間層分離させた。水層を排出し、酢酸エチル（１５００ｍｌ）を加えて撹拌し、混合物を分離した（３０分間）。有機層を単離し、アセトニトリル溶液に加えた。有機溶液をブライン（５００ｍｌ）で洗浄した後、容量約７５０ｍｌまで溶媒をストリップした。生成物を後続反応でそのまま使用することができる。定量可能な収率で白色フォーム状固体になるまで更にストリップしてもよい。化合物１０の構造を１Ｈ  ＮＭＲ分析により確認した。
【００９７】
段階６：化合物ｍＣｙｄ：４−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オンの合成
化合物１０（４１６ｇ，０．７３ｍｏｌ）のメタノール（２０００ｍｌ）溶液にナトリウムメトキシド（１３．８ｇ，０．２６ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣによりモニターした（（シリカゲル，ジクロロメタン中１０％メタノール，化合物９のＲｆ：０．５３）及び（シリカゲル，ジクロロメタン中３０％メタノール，化合物１１のＲｆ：０．２１））。３０分後に生成物が沈殿し始め、ＴＬＣによると、２時間後に反応は完了した。反応を更にＨＰＬＣによりモニターした（方法番号２）。メタノールを容量約５００ｍｌまで減圧除去した後、エタノール（２×５００ｍｌ）で容量約５００ｍｌまで抽出した。残留粘稠スラリーをエタノール７５０ｍｌで希釈し、混合物を２０℃で１時間撹拌した。生成物を濾取し、フィルターケーキをエタノール（１００ｍｌ）とｔｅｒｔ−ブチル−メチルエーテル（１００ｍｌ）で洗浄し、乾燥すると、１６８ｇ（２段階の収率９０％）の１１が純度＞９７％（ＨＰＬＣ／ＡＵＣ）で得られた。生成物を更に１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲにより分析した。
【００９８】
段階７：化合物１４：２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−イルエステルの合成
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−バリン（４６．５０ｇ，２１４ｍｍｏｌ．）、カルボニルジイミダゾール（３４．７０ｇ，２１４ｍｍｏｌ．）、及び無水テトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）の溶液を２Ｌ容丸底フラスコに仕込み、２５℃でアルゴン下に１．５時間、次いで４０〜５０℃で２０分間撹拌した。オーバーヘッドスターラー、冷却塔、温度プローブ、添加漏斗、及びアルゴン供給管を取り付けた別の５Ｌ容５頚丸底フラスコに４−アミノ−１−（３，４−ジヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−３−メチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２−オン（５０．０ｇ，１９５ｍｍｏｌ．）と無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０００ｍＬ）を仕込んだ。ピリミジン−２−オン誘導体化合物が完全に溶解するまでこの混合物を１００℃に２０分間加熱した後、トリエチルアミン（５００ｍＬ）と４−ジメチルアミノピリジン（２．３８ｇ，１９ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。次に混合物を９７℃に２０分間加熱し、温度を８２℃以上に維持しながらテトラヒドロフラン溶液を添加漏斗から２時間かけてゆっくりと加えた。反応混合物を８２℃に１時間加熱し、ＨＰＬＣによりモニターした（生成物＝６８％，ＳＭ＝１１％，約１２分の不純物＝１７％，ジメチルアミノピリジンを除く）。反応混合物を室温まで冷却した後、トリエチルアミンとテトラヒドロフランを３０℃で減圧除去した。次に溶液を酢酸でｐＨ７．６９まで中和した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミジンを３５℃で減圧除去した後、酢酸エチル（２×２００ｍＬ）で抽出した。粗生成物に酢酸エチル（５００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）を加えて撹拌した。２層を分離し、水層を酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて飽和ブライン水溶液（５００ｍＬ）で洗浄した。次に、有機層をマロン酸の水溶液（４×４００ｍＬ，１０重量％）で抽出した。有機層から所望生成物が完全に除去されるように有機層をＴＬＣ（シリカ，ジクロロメタン中２０％メタノール）によりチェックした。酸性水性抽出液を合わせて氷浴で冷却し、トリエチルアミンでｐＨ７．４０まで中和し、固形分を溶液から沈殿させた。次に酢酸エチルを水層に加えた。白色固体を減圧濾取した。得られた固体を減圧乾燥すると、純度９９．０１％（ＨＰＬＣ）の初産物８１．０８ｇが得られた。
【００９９】
段階８：ｖａｌ−ｍＣｙｄ−２−アミノ−３−メチル−酪酸５−（４−アミノ−２−オキソ−２Ｈ−ピリミジン−１−イル）−４−ヒドロキシ−２−ヒドロキシ−メチル−４−メチル−テトラヒドロ−フラン−３−エステル（二塩酸塩）の合成
オーバーヘッドスターラー、温度プローブ、アルゴン供給管及び塩化水素ガスバブラーを取り付けた丸底フラスコで化合物１４（２１．０ｇ，０．０４６ｍｏｌ）のエタノール（１６８ｍｌ）溶液を撹拌した。塩化水素ガス（２２ｇ）を透明溶液中に１時間かけてバブリングした。反応温度は氷水浴を使用して３０℃未満に維持した。塩化水素ガスの導入から数分後に固体形成が開始した。４時間後に、ＨＰＬＣ（方法番号３）によると出発材料は０．８％しか残留していなかった。固形分を濾取し、フィルターケーキをエタノール（２０ｍｌ）とジエチルエーテル（１００ｍｌ）で洗浄した。生成物を１６時間減圧乾燥後に、ｖａｌ−ｍＣｙｄ１９．０６ｇ（９６．５％）が純度９７．２６％（ＨＰＬＣ，方法番号３）で得られた。ｍ．ｐ．２１０℃（茶色），２４８−２５０℃（溶融）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １０．０（ｓ，１Ｈ，１／２ＮＨ２，Ｄ２Ｏ交換性），８．９−８．６（２  ｂｒ  ｓ，４Ｈ，１／２ＮＨ２，ＮＨ３，Ｄ２Ｏ交換性），８．４２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−６，Ｊ５−６＝７．９Ｈｚ），６．２４（ｄ，１Ｈ，Ｈ−５，Ｊ５−６＝７．９Ｈｚ），５．８４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’），５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−３’，Ｊ３’−４’＝８．８Ｈｚ），４．２２（ｄ，１Ｈ，Ｈ−４，Ｊ３’−４’＝８．７Ｈｚ），４．０−３．９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．８−３．５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’，Ｈ−５”），２．３−２．１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），１．１６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．０（ｍ，６Ｈ，（ＣＨ３）２ＣＨ）；ＦＡＢ＞０（ＧＴ）７１３（２Ｍ＋Ｈ）＋，４４９（Ｍ＋Ｇ＋Ｈ）＋，３５７（Ｍ＋Ｈ）＋，２４６（Ｓ）＋，１１２（Ｂ＋２Ｈ）＋；ＦＡＢ＜０（ＧＴ）７４７（２Ｍ＋Ｃ１）−，４８３（Ｍ＋Ｇ＋Ｃｌ）−，３９１（Ｍ＋Ｃｌ）−，３５５（Ｍ−Ｈ）−，１１６（Ｖａｌ）−，１１０（Ｂ）−，３５（Ｃｌ）−。
【０１００】
２種の異なるＨＰＬＣ法を使用して上記化合物を分析した。どちらの方法も以下の逆相カラムを使用する。
【０１０１】
方法１
２５４ｎｍ。流速１．００ｍｌ／分で後記アセトニトリル／水直線勾配を使用する。分析時間２０分間。分析毎に５分間の平衡化を挟む。
【０１０２】
【表１】
2005533824.tif 000007
【０１０３】
方法２
２７２ｎｍで同定する。使用するカラムはＷａｔｅｒｓ  Ｎｏｖａｐａｋ（登録商標）Ｃ１８，３．９×１５０ｍｍ  ＩＤ，４μｍ粒度，６０Å細孔寸法又は同等品とする。クロマトグラフィー条件は注入容量＝１０μｌ、カラム温度＝２５℃、流速＝１．００ｍｌ／分、紫外線検出器２７２ｎｍ、分析時間３５分間とする。参照標準の相対標準偏差百分率のシステム適性要件は１．０％以下とする。
【０１０４】
【表２】
2005533824.tif 000008
【０１０５】
立体化学
当然のことながら、本発明のヌクレオシドは数個のキラル中心をもち、光学活性及びラセミ形で存在及び単離することができる。化合物によっては多型性を示す場合もある。当然のことながら、本発明は本明細書に記載する有用な特性をもつ本発明の化合物の任意ラセミ、光学活性、ジアステレオマー、多型、又は立体異性形、又はその混合物を含む。（例えば、再結晶法によるラセミ形の分割、光学活性出発材料からの合成、キラル合成、又はキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離により）光学活性形を製造する方法は当分野で周知である。
【０１０６】
特に、ヌクレオシドの１’及び４’炭素はキラルであるので、水素以外の置換基（夫々塩基及びＣＨＯＲ基）は糖環系に関してシス（同一側）又はトランス（反対側）とすることができる。従って、（酸素原子が奥になるように糖部分を水平面に配置した場合に）４種の光学異性体は以下の立体配置により表される：シス（両方の基が「上向き」で天然β−Ｄヌクレオシドの立体配置に対応）、シス（両方の基が「下向き」で非天然β−Ｌ配置に対応）、トランス（Ｃ２’置換基が「上向き」でＣ４’置換基が「下向き」）、及びトランス（Ｃ２’置換基が「下向き」でＣ４’置換基が「上向き」）。「Ｄ−ヌクレオシド」は天然立体配置のシスヌクレオシドであり、「Ｌ−ヌクレオシド」は非天然立体配置のシスヌクレオシドである。
【０１０７】
同様に、殆どのアミノ酸はキラル（Ｌ又はＤで表し、Ｌエナンチオマーが天然立体配置である）であり、別個のエナンチオマーとして存在することができる。
【０１０８】
光学活性材料の獲得方法は当分野で公知であり、少なくとも以下の方法が挙げられる。
【０１０９】
ｉ）結晶の物理的分離−個々のエナンチオマーの巨視的結晶を手動で分離する方法。この方法は別個のエナンチオマーの結晶が存在する場合、即ち材料がコングロマリットであり、結晶が目視的に識別可能である場合に使用することができる。
【０１１０】
ｉｉ）同時結晶化−ラセミ化合物の溶液から個々のエナンチオマーを別々に結晶化させる方法であり、ラセミ化合物が固体状態のコングロマリットであり場合のみに可能である。
【０１１１】
ｉｉｉ）酵素分割−エナンチオマー毎の酵素との反応速度の相違によりラセミ化合物を部分的又は完全に分離する方法。
【０１１２】
ｉｖ）酵素的不斉合成−合成の少なくとも１段階が純エナンチオマー又はエナンチオマー含有度の高い所望エナンチオマーの合成前駆物質を獲得するために酵素反応を使用する合成法。
【０１１３】
ｖ）化学的不斉合成−生成物中に不斉（即ちキラリティー）を生じる条件下で非キラル前駆物質から所望エナンチオマーを合成する合成法であって、キラル触媒又はキラル助剤を使用して実施することができる。
【０１１４】
ｖｉ）ジアステレオマー分離−個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換する純エナンチオマー試薬（キラル助剤）とラセミ化合物を反応させる方法。得られたジアステレオマーをその後、より明確になった構造相違によりクロマトグラフィー又は結晶化により分離した後、キラル助剤を除去して所望エナンチオマーを得る。
【０１１５】
ｖｉｉ）一次及び二次不斉変換−ラセミ化合物からのジアステレオマーが平衡し、所望エナンチオマーからジアステレオマーが主に溶解するか又は所望エナンチオマーからジアステレオマーが優先的に結晶して平衡を乱し、その結果、基本的に全材料が所望エナンチオマーから結晶質ジアステレオマーに変換される方法。その後、所望エナンチオマーがジアステレオマーから放出される。
【０１１６】
ｖｉｉｉ）動的分割−この方法は動的条件下のエナンチオマーとキラル非ラセミ試薬又は触媒の反応速度の相違によりラセミ化合物の部分的又は完全な分割（又は部分的に分割された化合物の更なる分割）を行う方法である。
【０１１７】
ｉｘ）非ラセミ前駆物質からのエナンチオ特異的合成−非キラル出発材料から所望エナンチオマーを獲得する合成法であり、合成過程を通して立体化学完全性が全く又は最小限にしか損なわれない方法である。
【０１１８】
ｘ）キラル液体クロマトグラフィー−固定相との相互作用の相違により液体移動相でラセミ化合物のエナンチオマーを分離する方法。相互作用の相違を生じるために、固定相をキラル材料から構成してもよいし、移動相に付加キラル材料を加えてもよい。
【０１１９】
ｘｉ）キラルガスクロマトグラフィー−ラセミ化合物を揮発させ、固定非ラセミキラル吸着相を充填したカラムを使用して気相移動相で相互作用の相違によりエナンチオマーを分離する方法。
【０１２０】
ｘｉｉ）キラル溶媒による抽出−特定エナンチオマーが特定キラル溶媒に優先的に溶解することを利用してエナンチオマーを分離する方法。
【０１２１】
ｘｉｉｉ）キラル膜透過−ラセミ化合物を薄膜バリヤーと接触させる方法。バリヤーは一般に一方にラセミ化合物を含む２種の混和性液体を分離し、濃度又は圧力差等の駆動力により膜バリヤーの優先的透過を生じる。ラセミ化合物の一方のエナンチオマーのみを通過させる膜の非ラセミキラル性の結果として分離が生じる。
【０１２２】
ＩＩＩ．医薬組成物
ペスチウイルス、フラビウイルス、ＨＣＶもしくはＲＮＡ依存性ＲＮＡウイルスポリメラーゼを介して複製する別の生物に感染しているか又は本明細書に記載する他の任意疾患を治療するための宿主（ヒトを含む）は医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の存在下で有効量の活性化合物又はその医薬的に許容可能なプロドラッグもしくは塩を患者に投与することにより治療することができる。活性材料は例えば経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、又は局所等の適当な任意経路により液体又は固体形態で投与することができる。
【０１２３】
ペスチウイルス、フラビウイルス又はＨＣＶに用いる化合物の好適用量は約１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、より一般にはレシピエント体重１ｋｇ当たり１日０．１〜約１００ｍｇである。例えば、０．５〜１００ｍｇ、０．５〜５０ｍｇ、０．５〜１０ｍｇ、又は０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日等の低用量が好ましい場合もある。もっと低用量が有用な場合もあり、例えば０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日とすることができる。医薬的に許容可能な塩及びプロドラッグの有効用量範囲は送達すべき親ヌクレオシドの重量に基づいて計算することができる。塩又はプロドラッグ自体が活性を示す場合には、有効用量は塩又はプロドラッグの重量を使用するかあるいは当業者に公知の他の手段により上記のように算出することができる。
【０１２４】
化合物は従来通りに適切な任意単位用量形態で投与され、限定されないが、単位用量形態当たり活性成分７〜３０００ｍｇ、好ましくは７０〜１４００ｍｇを含有するものが挙げられる。一般に５０〜１０００ｍｇの経口用量が簡便であり、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００ｍｇの単一又は多重用量形態が挙げられる。例えば、１０〜１００又は１〜５０ｍｇ等の低用量が好ましい場合もある。０．１〜５０ｍｇ、又は０．１〜２０ｍｇ又は０．１〜１０．０ｍｇの用量も考えられる。更に、例えば注射や吸入等の非経口経路により投与する場合には低用量を使用することができる。
【０１２５】
活性化合物のピーク血漿濃度が約０．２〜７０μＭ、好ましくは約１．０〜１０μＭとなるように活性成分を投与すると理想的である。これは、例えば場合により食塩水中の活性成分の０．１〜５％溶液を静脈内注射するか又は活性成分のボーラスとして投与することにより達成することができる。
【０１２６】
薬剤組成物中の活性化合物の濃度は薬剤の吸収、不活化及び排泄速度と当業者に公知の他の因子により異なる。用量値は緩和すべき状態の重篤度によっても異なることに留意すべきである。更に、当然のことながら、任意特定対象の特定用量レジメンは個々の必要と組成物の投与の管理又は監督者の専門的判断に従って継時的に調節しなければならず、本明細書に記載する濃度範囲は例示に過ぎず、請求する組成物の範囲又は実施を制限するものではない。活性成分は一度に投与してもよいし、種々の時間間隔で少量の用量に分けて多数回投与してもよく、他の抗ウイルス剤を併用してもしなくてもよい。
【０１２７】
活性化合物の好適投与方法は経口である。経口組成物は一般に不活性希釈剤又は食用キャリヤーを含む。ゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよい。経口治療投与の目的では、活性化合物を賦形剤と配合し、錠剤、トローチ、又はカプセル剤の形態で使用することができる。医薬的に適合可能な結合剤、及び／又は補助剤も組成物の一部として添加することができる。
【０１２８】
錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ等は以下の成分又は同種の化合物の任意のものを添加することができる：微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチン等の結合剤；澱粉又はラクトース等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の潤滑剤；スクロース又はサッカリン等の甘味剤；あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジフレーバー等の芳香剤。用量単位形態がカプセル剤である場合には、上記型の添加剤に加えて、脂肪油等の液体キャリヤーを加えることができる。更に、用量単位形態は用量単位の物理的形状を変化させる種々の他の材料（例えば、糖コーティング、シェラック又は他の腸溶剤）を含むことができる。
【０１２９】
化合物はエレキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハース、チューインガム等の成分として投与することができる。シロップは活性化合物に加えて甘味剤としてスクロースと所定の防腐剤、色素及び着色剤並びにフレーバーを添加することができる。
【０１３０】
化合物又はその医薬的に許容可能なプロドラッグもしくは塩は所望作用を減じない他の活性材料、又は所望作用を補う材料（例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、又は他のヌクレオシド化合物を含む他の抗ウイルス剤）と混合することもできる。非経口、皮内、皮下、又は局所投与用溶液又は懸濁液は、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶剤等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝液及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透張力調節剤等の成分を含むことができる。非経口製剤はガラス又はプラスチック製アンプル、使い捨て注射器又は多重用量バイアルに封入することができる。
【０１３１】
静脈内投与する場合には、好適キャリヤーは生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【０１３２】
１好適態様では、インプラントやマイクロカプセル封入送達システムを含む制御放出製剤のように、体内から化合物が迅速に排出されないように保護するキャリヤーを用いて活性化合物を製造し、酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の製造方法は当業者に自明である。このような材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販品として入手することもできる。
【０１３３】
リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体の感染細胞を標的とするリポソームを含む）も医薬的に許容可能なキャリヤーとして好ましい。これらは例えば、（その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む）米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような当業者に公知の方法により製造することができる。例えば、リポソーム製剤はステロールホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びコレステロール等の適当な脂質を無機溶媒に溶解した後に溶媒を蒸発させ、容器の表面に乾燥脂質の薄膜を残すことにより製造することができる。次に活性化合物又はその一リン酸、二リン酸及び／又三リン酸誘導体の水溶液を容器に導入する。次に容器を手で旋回させて容器の側面から脂質材料を放出させ、脂質凝集物を分散させることにより、リポソーム懸濁液を形成する。
【０１３４】
ＩＶ．プロドラッグ及び誘導体
塩製剤
医薬的に許容可能な塩としてヌクレオシドを投与することも本発明の範囲に含まれる。医薬的に許容可能な塩の例は酸と共に形成される有機酸付加塩であって、生理的に許容可能なアニオンを提供するものである。これらの塩としては、例えばトシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、琥珀酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ピルビン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、及びサリチル酸塩が挙げられる。硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、炭酸塩、及びリン酸等の適切な無機塩を形成することもできる。特に好ましい態様は一又は二塩酸塩である。
【０１３５】
医薬的に許容可能な塩は当分野で周知の標準手順により得ることができ、例えば、アミン等の十分に塩基性の化合物を適切な酸と反応させて生理的に許容可能なアニオンを提供することにより得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム又はリチウム）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩を製造することもできる。１態様では、塩は化合物の塩酸塩である。別の態様では、医薬的に許容可能な塩は式（Ｉ）の化合物の二塩酸塩である。本発明の化合物はフラビウイルス、ペスチウイルス又はＨＣＶに対して抗ウイルス活性をもつか、あるいはこのような活性を示す化合物に代謝される。
【０１３６】
ヌクレオチドプロドラッグ
本明細書に記載するヌクレオシドは活性、バイオアベイラビリティー、安定性を改善するか又は他の点でヌクレオシドの特性を改変するためにヌクレオチドプロドラッグとして投与することができる。多数のヌクレオチドプロドラッグリガンドが公知である。一般に、ヌクレオシドの一、二又は三リン酸塩をアルキル化、アシル化又は他の方法で親油性修飾すると、極性が低下し、細胞に導入できるようになる。リン酸部分の１個以上の水素を置換することができる置換基の例はアルキル、アリール、ステロイド、炭水化物（糖を含む）及びアルコール（例えば１，２−ジアシルグリセロール）である。Ｒ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｂｉｓｃｈｏｆｅｒｇｅｒ，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２７：１−１７に多数の置換基が記載されている。これらの任意のものを本明細書に開示するヌクレオシドと併用し、所望効果を達成することができる。
【０１３７】
活性ヌクレオシドは５’−ホスホエーテル脂質又は５’エーテル脂質として提供することもできる。非限定的な例は参考資料として本明細書に組込む以下の文献に開示されている：Ｋｕｃｅｒａ，Ｌ．Ｓ．，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｅ．Ｌｅａｋｅ，Ａ．Ｒａｅｎ，Ｍｏｄｅｓｔ  Ｅ．Ｋ．，Ｄ．Ｌ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ．１９９０．“Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｅｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．“ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．６：４９１−５０１；Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，Ｃ．，Ｊ．Ｍａｒａｓｃｏ  Ｃ．Ｊ．，Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ−Ｎａｔｓｃｈｋｅ，Ｋ．Ｌ．Ｍｅｙｅｒ，Ｆ．Ｇｕｍｕｓ，Ｊ．Ｒ．Ｓｕｒｌｅｓ，Ｋ．Ｓ．Ｉｓｈａｑ，Ｌ．Ｓ．Ｋｕｃｅｒａ，Ｎ．Ｉｙｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｗａｌｌｅｎ，Ｓ．Ｐｉａｎｔａｄｏｓｉ，ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｍｏｄｅｓｔ．１９９１．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ＨＩＶ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４：１４０８．１４１４；Ｈｏｓｔｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ａ．Ｃａｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．Ｔ．ｖａｎ  Ｗｉｊｋ，ａｎｄ  Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ．，１９９２．“Ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＥＭ  ａｎｄ  ＨＴ４−６Ｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ３’ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ，ａ  ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｏｆ  ３−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６：２０２５．２０２９；Ｈｏｓｅｔｌｅｒ，Ｋ．Ｙ．，Ｌ．Ｍ．Ｓｔｕｈｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．．Ｌｅｎｔｉｎｇ，Ｈ．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｓｃｈ，ａｎｄ  Ｄ．Ｄ．Ｒｉｃｈｍａｎ，１９９０．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６１１２７。
【０１３８】
ヌクレオシド、好ましくはヌクレオシド又はその親油性製剤の５’−ＯＨ位に共有結合することができる適切な親油性置換基を開示している米国特許の非限定的な例としては、米国特許第５，１４９，７９４号（１９９２年９月２２日，Ｙａｔｖｉｎら）；５，１９４，６５４号（１９９３年３月１６日，Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；５，２２３，２６３号（１９９３年６月２９日，Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；５，２５６，６４１号（１９９３年１０月２６日，Ｙａｔｖｉｎら）；５，４１１，９４７号（１９９５年５月２日，Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；５，４６３，０９２号（１９９５年１０月３１日，Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒら）；５，５４３，３８９号（１９９６年８月６日，Ｙａｔｖｉｎら）；５，５４３，３９０号（１９９６年８月６日，Ｙａｔｖｉｎら）；５，５４３，３９１号（１９９６年８月６日，Ｙａｔｖｉｎら）；及び５，５５４，７２８号（１９９６年９月１０日；Ｂａｓａｖａら）が挙げられ、いずれも参考資料として本明細書に組込む。本発明のヌクレオシド又は親油性製剤に結合することができる親油性置換基を開示している外国特許出願としては、ＷＯ８９／０２７３３、ＷＯ９０／００５５５、ＷＯ９１／１６９２０、ＷＯ９１／１８９１４、ＷＯ９３／００９１０、ＷＯ９４／２６２７３、ＷＯ９６／１５１３２、ＥＰ  ０  ３５０  ２８７、ＥＰ  ９３９１７０５４．４、及びＷＯ９１／１９７２１が挙げられる。
【０１３９】
Ｖ．併用又は交互療法
本発明の活性化合物は別の抗フラビウイルス又はペスチウイルス剤、又は特に抗ＨＣＶ剤と併用又は交互投与することができる。併用療法では、有効用量の２種以上の薬剤を同時に投与し、交互又は逐次段階療法では有効用量の各薬剤を順次又は逐次投与する。投与量は薬剤の吸収、不活化及び排泄速度と当業者に公知の他の因子により異なる。用量値は緩和すべき状態の重篤度によっても異なることに留意すべきである。更に、当然のことながら、任意特定対象の特定用量レジメン及びスケジュールは個々の必要と組成物の投与の管理又は監督者の専門的判断に従って継時的に調節しなければならない。好適態様では、１０〜１５μＭ、又は好ましくは１〜５μＭ未満のＥＣ５０を示す抗ＨＣＶ（又はペスチウイルス又は抗フラビウイルス）化合物が望ましい。
【０１４０】
抗ウイルス剤の長期投与後にフラビウイルス、ペスチウイルス又はＨＣＶの薬剤耐性変異体が出現する可能性があることは認められている。薬剤耐性はウイルス複製に使用される酵素をコードする遺伝子の突然変異により生じることが最も一般的である。ウイルス感染に対する薬剤の効力は主薬剤により生じる突然変異とは異なる突然変異を誘導する第２、及び恐らく第３の抗ウイルス化合物と主化合物を併用又は交互投与することにより延長、増強、又は回復することができる。あるいは、このような併用又は交互療法により薬剤の薬物動態、体内分布又は他のパラメーターを改変することができる。一般に、併用療法はウイルスに多重同時ストレスを誘導するので交互療法よりも概して好ましい。
【０１４１】
背景技術の欄に記載したウイルス治療薬の任意のものを本明細書に記載する化合物と併用又は交互使用することができる。非限定的な例を以下に挙げる。
【０１４２】
（１）プロテアーゼ阻害剤
例を挙げると、基質型ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ＰＣＴ  ＷＯ９８／２２４９６，１９９８；Ａｔｔｗｏｏｄら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９９，１０，２５９−２７３；Ａｔｔｗｏｏｄら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，ドイツ特許公開ＤＥ  １９９１４４７４；Ｔｕｎｇら，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＰＣＴ  ＷＯ９８／１７６７９）として、αケトアミド及びヒドラジノ尿素や、ボロン酸又はホスホン酸等の求電子物質を末端にもつ阻害剤（Ｌｌｉｎａｓ−Ｂｒｕｎｅｔら，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＰＣＴ  ＷＯ９９／０７７３４）；２，４，６−トリヒドロキシ−３−ニトロベンズアミド誘導体等の非基質型ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（Ｓｕｄｏ  Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９７，２３８，６４３−６４７；Ｓｕｄｏ  Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，９，１８６）として、アミド上を１４炭素鎖で置換したＲＤ３−４０８２と、パラフェノキシフェニル基をもつＲＤ３−４０７８；更に、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤として、フェナントレンキノンであるＳｃｈ  ６８６３１（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７：７２２９−７２３２，１９９６）が挙げられる。
【０１４３】
真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍから単離されたＳｃｈ  ３５１６３３はプロテアーゼ阻害剤として同定された（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９：１９４９−１９５２）。ヒルから単離されたエグリンｃはＳ．ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼＡ及びＢ、α−キモトリプシン、キマーゼ及びスプチリシン等の数種のセリンプロテアーゼの強力な阻害剤である。Ｑａｓｉｍ  Ｍ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１５９８−１６０７，１９９７。
【０１４４】
ＨＣＶの治療用としてプロテアーゼ阻害剤を開示している米国特許としては、例えば、ＨＣＶエンドペプチダーゼ２を阻害する類のシステインプロテアーゼ阻害剤を開示している米国特許第６，００４，９３３号（Ｓｐｒｕｃｅら）；Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３プロテアーゼの合成阻害剤を開示している米国特許第５，９９０，２７６号（Ｚｈａｎｇら）；米国特許第５，５３８，８６５号（Ｒｅｙｅｓら）；ＷＯ０２／００８２５１（Ｃｏｒｖａｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）、並びにＷＯ０２／０８１８７及びＷＯ０２／００８２５６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。ＨＣＶ阻害剤トリペプチドは米国特許第６，５３４，５２３号、６，４１０，５３１号、及び６，４２０，３８０号（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）とＷＯ０２／０６０９２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのジアリールペプチドはＷＯ０２／４８１７２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示されている。ＨＣＶのＮＳ３セリンプロテアーゼ阻害剤としてのイミダゾリジンジオンはＷＯ０２／０８１９８（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とＷＯ０２／４８１５７（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）に開示されている。ＷＯ９８／１７６７９（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とＷＯ０２／４８１１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）もＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を開示している。
【０１４５】
（２）ＮＳ３／４Ａ融合蛋白質及びＮＳ５Ａ／５Ｂ基質による逆相ＨＰＬＣアッセイで該当阻害を示すチアゾリジン誘導体（Ｓｕｄｏ  Ｋ．ら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，３２，９−１８）、特に長鎖アルキル鎖で置換された融合シンナモイル部分をもつ化合物ＲＤ−１−６２５０、ＲＤ４  ６２０５及びＲＤ４  ６１９３；
（３）Ｋａｋｉｕｃｈｉ  Ｎ．ら，Ｊ．ＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２１，２１７−２２０；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｎ．らＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，２４７，２４２−２４６で同定されたチアゾリジン及びベンズアニリド；
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーアッセイでプロテアーゼに対する活性をもつフェナントレンキノンとして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の発酵培養ブロスから単離されたＳｃｈ  ６８６３１（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９６，３７，７２２９−７２３２）、及び真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍから単離され、シンチレーション近接アッセイで活性を示すＳｃｈ  ３５１６３３（Ｃｈｕ  Ｍ．ら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９，１９４９−１９５２）；
（５）ヘリカーゼ阻害剤（Ｄｉａｎａ  Ｇ．Ｄ．ら，Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，米国特許第５，６３３，３５８号；Ｄｉａｎａ  Ｇ．Ｄ．ら，Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，ＰＣＴ  ＷＯ９７／３６５５４）；
（６）ヌクレオチドポリメラーゼ阻害剤及びグリオトキシン（Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｒ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，７３，１６４９−１６５４）、及び天然物質セルレニン（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，２４９，１０８−１１８）；
（７）ウイルスの５’非コーディング領域（ＮＣＲ）の配列部分（Ａｌｔ  Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９５，２２，７０７−７１７）、又は３’末端ＮＣＲを含むヌクレオチド３２６−３４８とＨＣＶ  ＲＮＡのコアコーディング領域に位置するヌクレオチド３７１−３８８（Ａｌｔ  Ｍ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１４２，５８９−５９９；Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ  Ｕ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１８１，２５１−２５７）に相補的なアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｓ−ＯＤＮ）；
（８）ＩＲＥＳ依存的翻訳の阻害剤（Ｉｋｅｄａ  Ｎら，Ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ，日本特許公開特開平０８２６８８９０；Ｋａｉ  Ｙ．ら，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，日本特許公開特開平１０１０１５９１）；
（９）ヌクレアーゼ耐性リボザイム（Ｍａｃｃｊａｋ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９９，３０，ａｂｓｔｒａｃｔ  ９９５）や、米国特許第６，０４３，０７７号（Ｂａｒｂｅｒら）並びに米国特許第５，８６９，２５３号及び５，６１０，０５４号（Ｄｒａｐｅｒら）に開示されているもの等のリボザイム；
（１０）ヌクレオシド類似体もフラビウイルス科感染の治療用に開発されている。
【０１４６】
（１１）Ｉｄｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより国際公開第ＷＯ０１／９０１２１号及びＷＯ０１／９２２８２号に記載されている化合物の任意のもの；
（１２）Ｃ型肝炎ウイルスを治療するための所定ヌクレオシド類似体の使用を開示している他の特許出願としては、ＢｉｏＣｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．（現Ｓｈｉｒｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）により出願されたＰＣＴ／ＣＡ００／０１３１６（ＷＯ０１／３２１５３；出願日２０００年１１月３日）及びＰＣＴ／ＣＡ０１／００１９７（ＷＯ０１／６０３１５；出願日２００１年２月１９日）；Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．により出願されたＰＣＴ／ＵＳ０２／０１５３１（ＷＯ０２／０５７４２５；出願日２００２年１月１８日）及びＰＣＴ／ＵＳ０２／０３０８６（ＷＯ０２／０５７２８７；出願日２００２年１月１８日）；Ｒｏｃｈｅにより出願されたＰＣＴ／ＥＰ０１／０９６３３（ＷＯ０２／１８４０４；公開日２００１年８月２１日）；並びにＰｈａｒｍａｓｓｅｔ，Ｌｔｄ．により出願されたＰＣＴ公開第ＷＯ０１／７９２４６号（出願日２００１年４月１３日）、ＷＯ０２／３２９２０号（出願日２００１年１０月１８日）及びＷＯ０２／４８１６５号が挙げられる。
【０１４７】
（１３）ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４３６９１号（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，発明の名称「２’−フルオロヌクレオシド（２’−ｆｌｕｏｒｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）」）はＨＣＶを治療するための所定２’−フルオロヌクレオシドの使用を開示している。
【０１４８】
（１４）その他の化合物としては、１−アミノ−アルキルシクロヘキサン（米国特許第６，０３４，１３４号（Ｇｏｌｄら））、アルキル脂質（米国特許第５，９２２，７５７号（Ｃｈｏｊｋｉｅｒら））、ビタミンＥ及び他の酸化防止剤（米国特許第５，９２２，７５７号（Ｃｈｏｊｋｉｅｒら））、スクアレン、アマンタジン、胆汁酸（米国特許第５，８４６，９６４号（Ｏｚｅｋｉら））、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（米国特許第５，８３０，９０５号（Ｄｉａｎａら））、ベンゼンジカルボキサミド（米国特許第５，６３３，３８８号（Ｄｉａｎａら））、ポリアデニル酸誘導体（米国特許第５，４９６，５４６号（Ｗａｎｇら））、２’，３’−ジデオキシイノシン（米国特許第５，０２６，６８７号（Ｙａｒｃｈｏａｎら））、ベンズイミダゾール（米国特許第５，８９１，８７４号（Ｃｏｌａｃｉｎｏら））、植物抽出物（米国特許第５，８３７，２５７号（Ｔｓａｉら）、米国特許第５，７２５，８５９号（Ｏｍｅｒら）、及び米国特許第６，０５６，９６１号）、及びピペラジン（米国特許第５，８３０，９０５号（Ｄｉａｎａら））が挙げられる。
【０１４９】
（１５）Ｃ型肝炎ウイルスの治療用に現在前臨床又は臨床開発中の他の任意化合物、例えばＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社のインターロイキン−１０、Ｉｎｔｅｒｎｅｕｒｏｎ社のＩＰ−５０１、Ｖｅｒｔｅｘ社のＭｅｒｉｍｅｂｏｄｉｂ（ＶＸ−４９７）、Ｅｎｄｏ  Ｌａｂｓ  Ｓｏｌｖａｙ社のＡＭＡＮＴＡＤＩＮＥ（登録商標）（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ）、ＲＰＩ社のＨＥＰＴＡＺＹＭＥ（登録商標）、Ｉｄｕｎ  Ｐｈａｒｍａ．社のＩＤＮ−６５５６、ＸＴＬ．社のＸＴＬ−００２、Ｃｈｉｒｏｎ社のＨＣＶ／ＭＦ５９、ＮＡＢＩ社のＣＩＶＡＣＩＲ（Ｃ型肝炎免疫グロブリン）、ＩＣＮ／Ｒｉｂａｐｈａｒｍ社のＬＥＶＯＶＩＲＩＮ（登録商標）、ＩＣＮ／Ｒｉｂａｐｈａｒｍ社のＶＩＲＡＭＩＤＩＮＥ（登録商標）、Ｓｃｉ  Ｃｌｏｎｅ社のＺＡＤＡＸＩＮ（登録商標）（チモシンα−１）、Ｓｃｉ  Ｃｌｏｎｅ社のチモシン＋ペグ化インターフェロン、Ｍａｘｉｍ社のＣＥＰＬＥＮＥ（登録商標）（二塩酸ヒスタミン）、Ｖｅｒｔｅｘ／Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社のＶＸ  ９５０／ＬＹ  ５７０３１０、Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ／Ｅｌａｎ社のＩＳＩＳ  １４８０３、Ｉｄｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．社のＩＤＮ−６５５６、ＡＫＲＯＳ  Ｐｈａｒｍａ社のＪＴＫ  ００３、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社のＢＩＬＮ−２０６１、Ｒｏｃｈｅ社のＣｅｌｌＣｅｐｔ（ミコフェノール酸モフェチル）、Ｔｕｌａｒｉｋ社のβ−チューブリン阻害剤Ｔ６７、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＥ２特異的治療用ワクチン、Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．社のＦＫ７８８、ＩｄＢ  １０１６（Ｓｉｌｉｐｈｏｓ，経口シリビン−ホスファチジルコリンフィトソーム）、ＶｉｒｏＰｈａｒｍａ／Ｗｙｅｔｈ社のＲＮＡ複製阻害剤（ＶＰ５０４０６）、Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ社の治療用ワクチン、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社の治療用ワクチン、Ａｎａｄｙｓ社のＩＲＥＳ阻害剤、Ａｎａｄｙｓ社のＡＮＡ２４５及びＡＮＡ２４６、Ａｖａｎｔ社の免疫療法剤（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ）、Ｃｏｒｖａｓ／ＳＣｈｅｒｉｎｇ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｖｅｒｔｅｘ社のヘリカーゼ阻害剤、Ｔｒｉｍｅｒｉｓ社の融合阻害剤、ＣｅｌｌＥｘＳｙｓ社のＴ細胞療法剤、Ｂｉｏｃｒｙｓｔ社のポリメラーゼ阻害剤、ＰＴＣ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社の標的ＲＮＡ化学、Ｉｍｍｔｅｃｈ，Ｉｎｔ．社のＤｉｃａｔｉｏｎ、Ａｇｏｕｒｏｎ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｃｈｉｒｏｎ／Ｍｅｄｉｖｉｒ社のプロテアーゼ阻害剤、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ社のアンチセンス療法剤、Ｈｙｂｒｉｄｏｎ社のアンチセンス療法剤、Ａｅｔｈｌｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社のヘモピュリファイヤー、Ｍｅｒｉｘ社の治療用ワクチン、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ａｘｙｓ社のプロテアーゼ阻害剤、Ｔｒｉｐｅｐ社の治療用ワクチンＣｈｒｏｎ−ＶａｃＣ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社のＵＴ２３１Ｂ、Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロテアーゼ、ヘリカーゼ及びポリメラーゼ阻害剤、Ｉｍｍｕｓｏｌ社のＩＲＥＳ阻害剤、Ｒｉｇｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＲ８０３、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社のＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標���（インターフェロンαｃｏｎ−１）、Ｖｉｒａｇｅｎ社のＯＭＮＩＦＥＲＯＮ（登録商標）（天然インターフェロン）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ社のＲＥＢＩＦ（インターフェロンβ−１ａ）、ＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ社のωインターフェロン、Ａｍａｒｉｌｌｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の経口インターフェロンα、ＩｎｔｅｒＭｕｎｅ社のインターフェロンγ、インターフェロンτ、及びインターフェロンγ−１ｂ。
【０１５０】
Ｖ．生物学的データ
抗ウイルス活性の測定用細胞培養システム
ＨＣＶとその阻害を検出するために有用な細胞アッセイはＨＣＶレプリコンをもつＨｕｈ７細胞からレプリコンＲＮＡのレベルを測定する。これらの細胞は標準培地、例えば１０％胎仔ウシ血清、１×非必須アミノ酸、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｕ（夫々１００単位／ｌ，１００μｇ／ｌ，及び２．９２ｍｇ／ｌ）、及びＧ４１８（Ｃ２０Ｈ４０Ｎ４Ｏ１０；５００〜１０００μｇ／ｍｌ）を加えたＤＭＥＭ培地（高グルコース、ピルビン酸不含有）で培養することができる。抗ウイルススクリーニングアッセイはＧ４１８を欠損する同一培地で実施することができる。細胞を対数増殖期に維持するために、細胞を９６ウェルプレートに低密度（例えば、細胞１０００個／ウェル）で播種する。その後、試験化合物を細胞播種直後に添加し、３〜７日間３７℃でインキュベーターにて孵化する。次に培地を除去し、全ＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ＋宿主ＲＮＡ）抽出用細胞を調製する。その後、レプリコンＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコールで増幅し、定量することができる。
【０１５１】
レプリコンＲＮＡの定量に観察される差は試験化合物の抗ウイルス活性を表す方法の１つである。典型的実験では、陰性対照で不活性化合物を用いて同等量のレプリコンを生成する。これは両者環境でＨＣＶ  ＲＴ−ＰＣＲに測定された閾値サイクルがほぼ同一である場合に実施することができる。このような実験では、化合物の抗ウイルス効力を表す方法の１つは試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクル（Ｃｔｔｅｓｔｃｏｍｐｏｕｎｄ）から陰性対照の平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクル（Ｃｔｎｅｇａｔｉｖｅ）を差し引く方法である。この値をΔＣｔ（ΔＣｔ＝Ｃｔｔｅｓｔｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｃｔｎｅｇａｔｉｖｅ）と言う。ΔＣｔ値３．３はレプリコン生成の１−ｌｏｇ低下に相当する。陽性対照として、組換えインターフェロンα−２ａ（例えば、Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｒｏｃｈｅ，ＮＪ，米国）を試験化合物と共に使用することができる。更に、化合物を希釈系列（一般に１００、３３、１０、３及び１μＭ）で試験することができる。各濃度のΔＣｔ値から５０％有効濃度（ＥＣ５０）を計算することができる。
【０１５２】
上記アッセイは細胞システムとウイルス病原体を変更することによりフラビウイルス科の他のメンバーに応用することができる。これらの抗ウイルス化合物の効力の測定方法としては、Ｈｏｌｂｒｏｏｋ  ＭＲら，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２０００，６９，３１；Ｍａｒｋｌａｎｄ  Ｗら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００，４４，８５９；Ｄｉａｍｏｎｄ  ＭＳら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００，７４，７８１４；Ｊｏｒｄａｎ  Ｉら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０００，１８２，１２１４；Ｓｒｅｅｎｉｖａｓａｎ  Ｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９３，４５（１），１；又はＢａｇｉｎｓｋｉ  ＳＧら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７（１４），７９８１に記載されている標準方法の変法や、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。１例として、ＨｕＨ７細胞でＨＣＶレプリコンシステム（Ｌｏｈｍａｎｎ  Ｖら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８５（５４２４），１１０）又はその変法（Ｂｌｉｇｈｔら，２０００）を使用することができる。
【０１５３】
ＨＣＶ検出用非細胞アッセイ
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）等の多数の微生物が存在し、なおも増え続けているが、これらの微生物を生物サンプル中で同定するために現在最適な方法は核酸増幅技術である。核酸増幅技術としてはポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び転写媒介増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。数種のＦＤＡ認可診断製品はこれらの分子診断法を組込んでいる（下表参照）。核酸増幅技術試験は増幅だけでなく、検出法も含む。分子診断を成功させるにはその検体処理、増幅、及びターゲット検出段階の改良と、これらの段階の自動フォーマット化が重要である。
【０１５４】
【表３】
2005533824.tif 000009
【０１５５】
増幅産物検出スキーム
増幅産物検出スキームはヘテロジニアス型とホモジニアス型の２種類の基本型がある。ヘテロジニアス検出はハイブリダイズしたプローブからハイブリダイズしていないプローブを除去するための洗浄等の別段階を実施することを特徴とし、ホモジニアス検出は結合したプローブから遊離プローブを除去する物理的分離段階がない。複数のヘテロジニアス及びホモジニアス検出法が存在する。これらのヘテロジニアス又はホモジニアスアッセイのいずれかを使用してＨＣＶ等のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼウイルスに対する本発明の化合物の効力を評価することができる。
【０１５６】
ヘテロジニアス検出：例えば、サザンブロッティングはヘテロジニアス検出法である。サザンブロッティングでは、電気泳動を使用してサイズと電荷により増幅産物を分離する。サイズ分画産物を拡散、減圧、又はエレクトロブロッティングにより膜又はフィルターに移す。次に、標識検出プローブを溶液中の膜結合ターゲットとハイブリダイズさせ、フィルターを洗浄し、ハイブリダイズしていないプローブを除去し、膜にハイブリダイズしたプローブを各種方法により検出する。
【０１５７】
他の型のヘテロジニアス検出として、酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による増幅産物の特異的捕獲に基づく方法もある。ＰＣＲと併用される１方法は一方のプライマーをハプテン又はビオチン等のリガンドで標識し、増幅後に抗体又はストレプトアビジンをコーティングしたマイクロプレートで捕獲する。他方のプライマーはフルオレセイン等のレポーターで標識し、抗フルオレセイン抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを加えることにより検出する。この型の方法は特定の該当増幅産物にハイブリダイズする検出プローブを使用する方法ほど特異的ではない。
【０１５８】
ＬＣｘプローブシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）とＡｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１試験（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）はヘテロジニアス検出法を使用するシステムである。ＬＣｘシステムでは、ハプテン標識オリゴヌクレオチドでリガーゼ連鎖反応における熱サイクルをプローブする。捕獲ハプテン又は検出ハプテンを４種のプライマーオリゴヌクレオチドの各々に共有結合する。増幅後、各増幅産物（アンプリコン）は１個の捕獲ハプテンと１個の検出ハプテンをもつ。増幅が完了すると、ＬＣｘシステム装置は反応を新規ウェルに移し、抗体をコーティングした微粒子が捕獲ハプテンと結合する。その後、各微粒子をグラスファイバーマトリックスに不可逆的に結合する。洗浄段階で検出ハプテンのみを含むプローブを微粒子から除去する。ＬＣｘ装置は検出ハプテンと結合するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−抗体コンジュゲートを添加する。ＡＰの蛍光基質は４−メチルウンベリフェリルである。４−メチルウンベリフェリルはＡＰにより脱リン酸化され、蛍光物質４−メチルウンベリフェロンに変換される。
【０１５９】
Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−Ｉ試験はＥＬＩＳＡフォーマットを使用する。ＰＣＲ増幅後、アンプリコンは化学的に変性される。アンプリコン特異的オリゴヌクレオチドプローブはコーティングされたマイクロプレート上の変性鎖を捕獲する。オペレーターは洗浄段階で取込まれなかったプライマーとハイブリダイズしなかった材料を洗い流した後に、アビジン−ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルに添加する。コンジュゲートはプレート上に捕獲されたビオチン標識アンプリコンと結合する。次にオペレーターは発色ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を添加する。過酸化水素が存在する場合には、ＨＲＰはＴＭＢを酸化する。シグナルを比色測定する。
【０１６０】
ホモジニアス検出：ハイブリダイズした検出プローブとハイブリダイズしなかった検出プローブはホモジニアス検出システムでは物理的に分離していないので、これらの方法はヘテロジニアス法よりも必要な段階数が少なくなり、従って、汚染の危険も減る。蛍光及び化学発光ラベルのホモジニアス検出を使用する市販キットとしては、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＢＤＰｒｏｂｅＴｅｃＥＴシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＱＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．；Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、及びＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）が挙げられる。
【０１６１】
ＴａｑＭａｎシステムはアンプリコンをリアルタイムで検出する。アンプリコンの内側の領域とハイブリダイズする検出プローブはその５’末端にフルオレセイン等のドナーフルオロフォアと、その３’末端にクエンチャー分子（例えばローダミン）を含む。クエンチャーとフルオロフォアの両者が同一オリゴヌクレオチドに配置されている場合には、ドナー蛍光は阻害される。増幅中にプローブはターゲットと結合する。Ｔａｑポリメラーゼは検出プローブに置換し、置換鎖を合成するにつれて検出プローブを開裂する。検出プローブの開裂の結果、フルオロフォアがクエンチャーから分離し、ドナー蛍光シグナルが増加する。各増幅サイクル中にこのプロセスを繰返す。アンプリコンの量が増加するにつれて蛍光シグナルの量も増加する。
【０１６２】
分子ビーコンもクエンチャーとフルオロフォアを使用する。ビーコンはターゲットアンプリコンに相補的なプローブであるが、各末端の相補的オリゴヌクレオチドが短い（約５ヌクレオチド）。ビーコンの５’及び３’末端を夫々フルオロフォアとクエンチャーで標識する。ビーコンがターゲットとハイブリダイズしない場合にはヘアピン構造が形成され、フルオロフォアとクエンチャーが接触し、蛍光消光が生じる。ループ領域はアンプリコンに相補的な領域を含む。ターゲットとハイブリダイズすると、ヘアピン構造は開き、クエンチャーとフルオロフォアは分離し、蛍光シグナルが発生する１４。蛍光計がシグナルをリアルタイムで測定する。
【０１６３】
ＢＤＰｒｏｂｅＴｅｃＥＴシステムはＴａｑＭａｎと分子ビーコンの側面を組合せたリアルタイム検出法である。プローブはヘアピン構造をもち、フルオレセイン及びローダミンラベルを含む。他方、このシステムでは、ターゲット分子に相補的な領域はループ内ではなく、ローダミンラベルの３’領域に位置する。ターゲットに相補的な配列を含む代わりに、１本鎖ループは制限酵素ＢｓｏＢＩの制限部位を含む。１本鎖配列は酵素の基質ではない。フルオレセイン及びローダミンラベルは増幅前には相互に近接しており、フルオレセイン蛍光を消光する。鎖置換増幅はプローブを２本鎖分子に変換する。その後、ＢｓｏＢＩ制限酵素は分子を開裂させることができ、その結果、ラベルが分離し、蛍光シグナルが増加する。
【０１６４】
ＱＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５０００はルテニウムラベルによるエレクトロケミルミネッセンスを利用している。ビオチン化プライマーを使用する。増幅後に、ビオチン産物はストレプトアビジンをコーティングした常磁性ビーズに捕獲される。ビーズを吸引により電気化学フローセルに移し、電極の表面に磁気的に保持する。電気刺激すると、ルテニウム標識プローブは発光する。
【０１６５】
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ＡｓｓａｙはＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅの非増幅型ＰＡＣＥアッセイと増幅型Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓアッセイで使用される。ＨＰＡにおける検出オリゴヌクレオチドプローブはリンカーアームにより化学発光アクリジニウムエステル（ＡＥ）で標識されている。増幅が行われる同一チューブで１５分間６０℃でハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション後に添加される緩塩基性緩衝溶液である選択試薬はハイブリダイズしていないプローブ上のＡＥとハイブリダイズし、これを非化学発光性にする。ハイブリダイズしたプローブ上のＡＥは二重螺旋の細い溝の内側で折り畳まれ、選択試薬により加水分解から自己保護する。ＡＥは過酸化水素に次いで水酸化ナトリウムにより加水分解されると化学発光シグナルを発生する。ルミノメーターは化学発光シグナルを２秒間（ライトオフと呼ぶ時間）記録し、発生したフォトンを相対発光量（ＲＬＵ）として報告する。
【０１６６】
検出プローブデザインは増幅産物を検出するためにプローブを使用する全方法で重要である。良好な検出プローブは特定増幅産物のみとハイブリダイズし、非特異的産物とはハイブリダイズしない。検出法の最適化に重要な他の問題はプローブの標識とサンプルスループットの最大化である。
【０１６７】
標識方法とレポーター分子。検出プローブは数種の異なる方法で標識することができる。３２Ｐ又は３５Ｓをプローブに酵素により組込む方法が同位元素標識に最も一般的な方法である。ハイブリダイゼーションと洗浄後に、オートラジオグラフフィルムでシグナルを検出する。
【０１６８】
非放射性検出を実施するためには、プローブを種々の分子で酵素標識することができる。ビオチンは酵素による取込み後にリン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ＢＣＩＰ）やニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）等のＡＰ基質を使用してストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートで検出することができる。Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  ５３０又はＬｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓ（Ｌｕｍｉｇｅｎ，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ）等の化学発光基質をＡＰと併用することもできる。更に、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰをＤＮＡ又はＲＮＡに酵素により取込み、抗ジゴキシゲニンＡＰコンジュゲートを比色又は化学発光検出と併用することもできる。
【０１６９】
アクリジニウムエステル等の化学発光部分を含む他の型の多数のレポーター分子も存在する。多くの蛍光部分も入手できる。トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）等のエレクトロケミルミネッセント化合物も使用できる。これら及び同様の技術の更に詳細についてはＳｃｈｉｆｆ  ＥＲ，ｄｅ  Ｍｅｄｉｎａ  Ｍ，Ｋａｈｎ  ＲＳ．Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．１９９９；１９（Ｓｕｐｐｌ  １：３−１５）を参照されたい。
【実施例３】
【０１７０】
２’−Ｃ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル（ｖａｌ−ｍＣｙｄ）の細胞薬理
ヌクレオシドから活性三リン酸塩へのリン酸化アッセイ
化合物の細胞代謝を測定するために、ＨｅｐＧ２細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、２２５ｃｍ２組織培養フラスコで非必須アミノ酸、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最少必須培地で増殖させる。培地を３日おきに交換し、細胞を週に一度継代する。トリプシン−ＥＤＴＡ３０ｍＬに１０分間暴露して接着性単層を剥離し、培地で３回連続洗浄後に、コンフルエントＨｅｐＧ２細胞を６ウェルプレートに密度２．５×１０６個／ウェルで播種し、１０μＭ［３Ｈ］標識活性化合物（５００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ）に指定時間暴露する。細胞を３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下に維持する。選択時点で細胞を氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄する。細胞ペレットを−２０℃で６０％メタノールと共に一晩インキュベートすることにより細胞内活性化合物とその夫々の代謝産物を抽出した後に氷浴にて更に２０μＬの冷メタノールで１時間抽出する。次に、抽出液を合わせ、温和な除菌空気流下に乾燥し、ＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存する。
【０１７１】
抗ウイルスヌクレオシド及びヌクレオシド類似体は一般に細胞内キナーゼにより活性代謝産物５’−三リン酸（ＴＰ）誘導体に変換される。その後、ヌクレオシド−ＴＰはウイルス複製中にウイルスポリメラーゼを阻害することによりその抗ウイルス作用を発揮する。初代ヒト肝細胞培養物、ヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、及びウシ腎細胞株（ＭＤＢＫ）でｍＣｙｄを主要代謝産物２’−Ｃ−メチル−シチジン−５’−三リン酸（ｍＣｙｄ−ＴＰ）と少量のウリジン５’−三リン酸誘導体２’−Ｃ−メチル−ウリジン−５’−三リン酸（ｍＵｒｄ−ＴＰ）に変換させた。ｍＣｙｄ−ＴＰはＢＶＤＶ複製酵素であるＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験した場合に阻害性であり、ｍＣｙｄの抗ウイルス活性に関与していると考えられた。
【０１７２】
１０μＭ［３Ｈ］−ｍＣｙｄに暴露したＭＤＢＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞及びヒト初代肝細胞を使用することによりｍＣｙｄの細胞内代謝を試験した。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によると、ｍＣｙｄは全３種の細胞型でリン酸化され、ｍＣｙｄ−ＴＰが２４時間後の主要代謝産物であった。ヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を１０μＭ［３Ｈ］−ｍＣｙｄに４８時間暴露して得られる代謝プロフィルを試験した。ＨｅｐＧ２細胞では、ｍＣｙｄ−ＴＰレベルは２４時間後に４１．５±１３．４μＭでピークに達し（下表３参照）、その後、ゆっくりと低下した。初代ヒト肝細胞では、２４時間のピークｍＣｙｄ−ＴＰ濃度は１０．７±６．７μＭと４分の１に低下した。ＭＤＢＫウシ腎細胞のｍＣｙｄ−ＴＰレベルは中間であった（２４時間で３０．１±６．９μＭ）。
【０１７３】
肝細胞をｍＣｙｄに暴露すると、第２の５’−三リン酸誘導体ｍＵｒｄ−ＴＰが産生された。１０μＭ［３Ｈ］−ｍＣｙｄに暴露したＨｅｐＧ２細胞では、ｍＵｒｄ−ＴＰレベルは２４時間で１．９±１．６μＭに達し、これに対してＭＤＢＫ細胞では８．１±３．４μＭであり、初代ヒト肝細胞では３．２±２．０μＭであった。ＭＤＢＫ及びＨｅｐＧ２細胞は２４時間で同等量のリン酸化種（夫々約４３及び４７μＭ）を生産したが、全産物に占めるｍＵｒｄ−ＴＰはＭＤＢＫ細胞では１９％であったのに対し、ＨｅｐＧ２では４％に過ぎなかった。ｍＵｒｄ−ＴＰ濃度は継時的に着実に増加したが、２４時間後はプラトーに達するか又は低下した。
【０１７４】
【表４】
2005533824.tif 000010
【０１７５】
ｍＣｙｄ−ＴＰの見掛けの細胞内半減期はＨｅｐＧ２細胞では１３．９±２．２時間であり、ＭＤＢＫ細胞では７．６±０．６時間であり、データはｍＵｒｄ−ＴＰの半減期の計算には不適切であった。上記特定相違以外に、初代ヒト肝細胞で検出されたリン酸化パターンはＨｅｐＧ２又はＭＤＢＫ細胞を使用して得られたパターンと定性的に類似していた。
【実施例４】
【０１７６】
細胞毒性
ミトコンドリア毒性アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞を上記のように１２ウェルプレートで培養し、Ｐａｎ−Ｚｈｏｕ  Ｘ−Ｒ，Ｃｕｉ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｘ−Ｊ，Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ−Ｐ，Ｄａｒｌｅｙ−Ｕｓｍｅｒ  ＶＭ．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ｃｅｌｌｓ”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０００；４４：４９６−５０３に教示されているような各種濃度の薬剤に暴露した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ乳酸アッセイキットを使用して４日間薬剤暴露後の培養培地内の乳酸レベルを測定した。血球計カウントにより測定した細胞数により乳酸レベルを標準化した。
【０１７７】
細胞毒性アッセイ
細胞を５×１０３及び５×１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、加湿ＣＯ２（５％）雰囲気下に増殖培地で一晩３７℃にて培養した。次に、薬剤の系列希釈液を含有する新規増殖培地を加えた。４日間インキュベーション後に培養液を５０％ＴＣＡで固定し、スルホローダミンＢで染色した。５５０ｎｍで光学密度を読取った。細胞数を５０％減らすために必要な濃度（ＣＣ５０）として細胞毒性濃度を表した。
【０１７８】
慣用細胞増殖アッセイを使用して迅速に分割中の細胞でｍＣｙｄとその細胞代謝産物の細胞毒性を試験した。ｍＣｙｄは特定細胞株について対応ＣＣ５０を著しく上回る濃度のコンフルエント細胞で毒性を示さなかったので、ｍＣｙｄの阻害効果は細胞増殖抑制性であると判断された。ｍＣｙｄは最高試験濃度（ＣＣ５０＞２５０μＭ）で迅速増殖中のＨｕｈ７ヒト肝癌細胞又はＨ９ｃ２ラット心筋細胞に対して非細胞毒性であった。ｍＣｙｄ  ＣＣ５０値はＢＨＫ−２１ハムスター腎及びＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞株で夫々１３２及び１６１μＭであった。コラーゲンをコーティングしたプレートで細胞を４又は１０日間増殖させると、ＨｅｐＧ２細胞におけるｍＣｙｄのＣＣ５０は２００μＭまで増加した。比較のために、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞でリバビリンを試験した処、３５〜３６μＭのＣＣ５０値が得られた。ＢＶＤＶ抗ウイルス試験に使用したＭＤＢＫウシ腎細胞では、ｍＣｙｄのＣＣ５０は３６μＭであった。ＭＴ−４ヒトＴ−リンパ球細胞に対するｍＣｙｄについても同様のＣＣ５０値（３４μＭ）が測定された。更に、ｍＣｙｄはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｇｒａｍにより実施された試験で数種のヒト癌細胞株を含む多数の他のヒト及び他の哺乳動物起源の細胞株に対してほぼ非細胞毒性又は低細胞毒性であった（ＣＣ５０＞５０〜＞２００μＭ）。但し、迅速に増殖するＨＦＦヒト包皮線維芽細胞及びＭＥＦマウス胚線維芽細胞はこの例外であり、ｍＣｙｄは高い細胞毒性を示した（夫々ＣＣ５０１６．９及び２．４μＭ）。この場合も、ｍＣｙｄは静止期線維芽細胞に対しては著しく低毒性であった。
【０１７９】
［３Ｈ］−チミジン又は［３Ｈ］−ウリジンに暴露したＨｅｐＧ２細胞でｍＣｙｄ量の増加が細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ合成に及ぼす細胞毒性効果を試験した。ＨｅｐＧ２細胞では、放射性標識チミジン及びウリジンの細胞ＤＮＡ及びＲＮＡ取込みを５０％低下させるために必要なｍＣｙｄのＣＣ５０は夫々１１２及び１８６μＭであった。ＤＮＡ及びＲＮＡ合成についてリバビリン（ＲＢＶ）で測定されたＣＣ５０値は夫々３．１６及び６．８５μＭであった。これらの値は一般に従来の細胞増殖細胞毒性アッセイで夫々ｍＣｙｄ及びＲＢＶに測定された１６１及び３６μＭのＣＣ５０を反映している。ｍＣｙｄの細胞ＲＮＡ及びＤＮＡ取込みを試験するために、ＨｅｐＧ２細胞を１０μＭ［３Ｈ］−ｍＣｙｄ又は対照ヌクレオシド（比活性５．６〜８．０Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ，塩基を標識）に３０時間暴露した。標識細胞ＲＮＡ又はＤＮＡ種を別々に単離し、シンチレーションカウンティングにより取込みを測定した。ＨｅｐＧ２細胞をｍＣｙｄに暴露した結果、リボヌクレオシド類似体の非常に低レベルの細胞ＤＮＡ又はＲＮＡ取込みが生じた（０．００１３〜０．００１４ｐｍｏｔｅ／μｇ核酸）。これらのレベルは夫々ＺＤＶ及びｄｄＣのＲＮＡ取込みに測定された０．０００９及び０．００１３ｐｍｏｌｅ／μｇ値と同等であり、これらのデオキシヌクレオシドはＲＮＡに取込まれると予想されないので、これらのレベルはアッセイバックグラウンドを反映していると思われる。ＺＤＶ及びｄｄＣのＤＮＡ取込みは有意に高かった（夫々０．１０３及び０．００５５ｐｍｏｌｅ／μｇ）。リバビリン（ＲＢＶ）はＤＮＡ及びＲＮＡの両者にｍＣｙｄの１０倍のレベルで取込まれた。
【０１８０】
【表５】
2005533824.tif 000011
【０１８１】
ヒト骨髄前駆細胞に及ぼす効果
骨髄毒性アッセイ
ヒト骨髄細胞を健常ボランティアから採取し、Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ−Ｐ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ  Ｒ．“Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ３’−ａｚｉｄｏ−３’−ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ９−（１，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｇｕａｎｉｎｅ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １９８７；３１：４５２−４５４；及びＳｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ−Ｐ，Ｓｃｈｉｎａｚｉ  ＲＦ，Ｃｈｕ  ＣＫ，Ｘｉｅ  Ｍ−Ｙ．“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ（−）−ａｎｄ（＋）−ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ  ｏｆ  ２’，３’−ｄｉｄｅｏｘｙ−３’−ｔｈｉａｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９９２；４４：１９２１−１９２５に従来記載されているように単核集団をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心により分離した。二重層軟寒天又はメチルセルロース法を使用してＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅの培養アッセイを実施した。薬剤を組織培養培地で希釈し、濾過した。空気中加湿５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で１４〜１８日間後に倒立顕微鏡を使用して細胞が５０個を上回るコロニーを計数した。溶媒対照培養液と比較して薬剤の存在下のコロニー形成の阻害百分率として結果を表す。
【０１８２】
細胞保護アッセイ（ＣＰＡ）
このアッセイは主にＢａｇｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｐｅｖｅａｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｅｉｐｅｌ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．；Ｂｅｎｅｔａｔｏｓ，Ｃ．Ａ．；Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｓ．Ｋ．；Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２０００，９７（１４），７９８１−７９８６に記載されているように実施した。使用の２４時間前にＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ）を９６ウェル培養プレートに播種した（細胞４，０００個／ウェル）。０．０２プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ株，ＡＴＣＣ）を感染させた後、試験化合物の系列希釈液を感染及び未感染細胞の両者に増殖培地中０．５％ＤＭＳＯの最終濃度で加えた。各希釈液を４回ずつ試験した。細胞密度とウイルス接種材料は実験期間を通して連続的な細胞増殖を確保すると共に感染から４日後に未処理対照で９０％を上回るウイルス誘導細胞破壊を達成するように調節した。４日後にプレートを５０％ＴＣＡで固定し、スルホローダミンＢで染色した。ウェルの光学密度をマイクロプレートリーダーで５５０ｎｍにて読取った。５０％有効濃度（ＥＣ５０）値はウイルスの細胞変性効果の５０％低下を達成した化合物濃度として定義される。
【０１８３】
所定ヌクレオシド類似体が骨髄抑制効果をもつことから、クローン化アッセイでヒト骨髄前駆細胞の増殖に及ぼす治験薬の潜在的効果を試験する必要があることが明白になっている。特に、貧血と好中球減少症はＨＣＶ治療に使用されている標準併用療法の抗ＨＩＶ薬ジドブジン（ＺＤＶ）又はリバビリン（ＲＢＶ）成分に関連する最も一般的な薬剤関連臨床毒性である。これらの毒性は健常ボランティアから得られた骨髄細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでモデル化されている（Ｓｏｍｍａｄｏｓｓｉ  Ｊ−Ｐ，Ｃａｒｌｉｓｌｅ  Ｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８７；３１（３）：４５２−４５４）。ＺＤＶはこのモデルで１〜２μＭの臨床関連濃度でヒト顆粒球−マクロファージコロニー形成（ＣＦＵ−ＧＭ）及び赤血球バースト形成（ＢＦＵ−Ｅ）活性を直接阻害することが従来示されている（Ｂｅｒｍａｎ  Ｅら，Ｂｌｏｏｄ  １９８９；７４（４）：１２８１−１２８６；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｃ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９０；６（７）：９２９−９３２．；Ｌｅｒｚａ  Ｒら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ．１９９７；２５（３）：２５２−２５５；Ｄｏｒｎｓｉｆｅ  ＲＥ，Ａｖｅｒｅｔｔ  ＤＲ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９６；４０（２）：５１４−５１９；Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ  Ｊ，Ｃａｒｔｅｒ  ＳＧ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９０；１８（１０）：１０９４−１０９６；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＳら，Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９８；６５（１）：５−１３）。ヒト骨髄クローン化アッセイを使用すると、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−ＥにおけるｍＣｙｄのＣＣ５０値は１４．１±４．５及び１３．９±３．２μＭであった（表５参照）。ｍＣｙｄは骨髄細胞に対してＺＤＶ及びＲＢＶよりも有意に低毒性であった（表５）。
【０１８４】
【表６】
2005533824.tif 000012
【０１８５】
ミトコンドリア機能に及ぼす効果
ＺＤＶ、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、及びザルシタビン（ｄｄＣ）等のＨＩＶ治療薬に認可されている抗ウイルスヌクレオシド類似体は末梢神経障害、ミオパシー、及び膵炎等の臨床上の制限となる遅延毒性に結び付けられることがある（Ｂｒｏｗｎｅ  ＭＪら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９３；１６７（１）：２１−２９；Ｆｉｓｃｈｌ  ＭＡら，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９３；１８（１０）：７６２−７６９．；Ｒｉｃｈｍａｎ  ＤＤら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８７；３１７（４）：１９２−１９７；Ｙａｒｃｈｏａｎ  Ｒら，Ｌａｎｃｅｔ  １９９０；３３６（８７１４）：５２６−５２９）。専門家によっては、これらの臨床有害事象の原因がミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）含量の低下とヌクレオシド類似体のｍｔＤＮＡ取込みに起因するミトコンドリア機能の阻害にあるとしている。更に、特定ヌクレオシド類似体であるフィアルウリジン（１，−２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−５−ヨード−ウラシル；ＦＩＡＵ）は直接ミトコンドリア毒性により肝不全、膵炎、神経障害、ミオパシー及び乳酸アシドーシスを誘発している（ＭｃＫｅｎｚｉｅ  Ｒら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９５；３３３（１７）：１０９９−１１０５）。乳酸産生の薬剤関連増加はミトコンドリア機能又は酸化的リン酸化障害のマーカーであるとみなすことができる（Ｃｏｌａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｍ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  １９９６  ２９（２−３）：１２５−３９）。
【０１８６】
ｍＣｙｄがミトコンドリア毒性を発生するか否かを調べるために、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２又はＨｕｈ７を使用して数種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を実施した。これらの試験は乳酸産生の分析、ｍｔＤＮＡ含量、及びミトコンドリア超構造の形態変化（例えば、クリスタ喪失、マトリックス溶解及び膨潤、並びに脂質液滴形成）の測定を行った。
【０１８７】
ミトコンドリアに及ぼすｍＣｙｄの効果を表６に示す。Ｈｕｈ７細胞中ｍＣｙｄ５０μＭまで又はＨｅｐＧ２細胞中ｍＣｙｄ１０μＭまでではｍＣｙｄで処理した細胞と未処理細胞に乳酸産生の相違は観察されなかった。５０μＭｍＣｙｄで処理したＨｅｐＧ２細胞には低度（３８％）の乳酸産生増加が認められた。特にｍＣｙｄは臨床で５０μＭの血漿濃度に達するとは思われないので、この知見の意味は不明である。比較のために、乳酸産生は１０μＭ  ＦＩＡＵで処理した細胞では対照細胞に比較して１００％増加する（Ｃｕｉ  Ｌ，Ｙｏｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９５；９５：５５５−５６３）。ＨｅｐＧ２細胞を５０μＭまでの濃度のｍＣｙｄに６又は１４日間暴露してもミトコンドリアＤＮＡ含量に負の効果はなかったが、これに対してｄｄＣで処理した細胞では夫々５６又は８０％低下した。
【０１８８】
１０μＭｍＣｙｄに１４日間暴露後、ＨｅｐＧ２細胞の超構造、特にミトコンドリアを透過型電子顕微鏡で試験した。細胞アーキテクチャー、又はミトコンドリア数もしくは形態（クリスタを含む）の変化は大半の細胞では観察されなかった。細胞の１７％では、細胞１個当たり平均２５個のミトコンドリアのうちの１〜２個が拡大しているようであった。このような小さい変化がミトコンドリア機能に有意影響をもつとは考えにくい。ｄｄＣで処理した細胞はクリスタ喪失と脂肪液滴蓄積を伴う異常なミトコンドリア形態を示した（Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．Ｊ．，Ｃ．Ｈ．Ｔｓａｉら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９４  ３８（８）：１８２４−８；Ｌｅｗｉｓ  Ｗら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２；８９（４）：１３５４−１３６０．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｆ．Ｍ．Ｈａｍｚｅｈら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９２  ３６（９）：２０６１−５）。
【０１８９】
【表７】
2005533824.tif 000013
【０１９０】
ヒトＤＮＡポリメラーゼα、β及びγに及ぼす効果
細胞ＤＮＡポリメラーゼは正常核内及びミトコンドリアＤＮＡ合成及び修復に関与している。ヌクレオシド類似体三リン酸塩はＤＮＡポリメラーゼの潜在的な阻害剤であり、従って、重要な細胞機能を妨害すると考えられる。特に、ミトコンドリアＤＮＡ合成に関与する酵素であるヒトポリメラーゼγの阻害はミトコンドリア機能の欠損に結び付けられている（Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．，Ｅ．Ｓ．Ｌｅｖｉｎｅら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ  １９９６  ９３（８）：３５９２−７）。ｍＣｙｄ−ＴＰがヒトＤＮＡポリメラーゼを阻害するか否かを調べるために実験を行った。表７に示すように、ｍＣｙｄ−ＴＰはヒトＤＮＡポリメラーゼα、β、又はγの基質ではなかった。１ｍＭ  ｍＣｙｄ−ＴＰでも反復アッセイの大半でこれらの酵素を５０％阻害することはできず、ＩＣ５０値は＞８８０〜１０００μＭにしかならないことが分かった。他方、ｄｄＣは全３種のヒトＤＮＡポリメラーゼの強力な阻害剤であり、特にポリメラーゼβ及びγで強力であった（夫々ＩＣ５０４．８及び２．７μＭ）。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの公知阻害剤である対照薬剤アクチノマイシンＤでも強力な阻害が認められた。
【０１９１】
【表８】
2005533824.tif 000014
【実施例５】
【０１９２】
ＢＶＤＶに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性
化合物はフラビウイルスもしくはペスチウイルスポリメラーゼを阻害するか、複製サイクルで必要な他の酵素を阻害するか、又は他の経路により抗フラビウイルス又はペスチウイルス活性を示すことができる。
【０１９３】
プラーク低下アッセイ
各化合物について、２４ウェルプレート２個でプラーク低下アッセイにより有効濃度を測定した。細胞単層にウイルス１００ＰＦＵ／ウェルを感染させた。次に、２％不活化血清と０．７５％メチルセルロースを加えたＭＥＭ中の試験化合物の系列希釈液を単層に加えた。培養液を更に３７℃で３日間インキュベートした後、５０％エタノールと０．８％クリスタルバイオレットで固定し、洗浄及び風乾した。次に、プラークを計数し、９０％ウイルス抑制を得るための濃度を決定した。
【０１９４】
収率低下アッセイ
各化合物について、２４ウェルプレート２個で収率低下アッセイによりウイルス負荷の６ｌｏｇ低下を得るための濃度を測定した。アッセイはＢａｇｉｎｓｋｉ，Ｓ．Ｇ．；Ｐｅｖｅａｒ，Ｄ．Ｃ．；Ｓｅｉｐｅｌ，Ｍ．；Ｓｕｎ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．；Ｂｅｎｅｔａｔｏｓ，Ｃ．Ａ．；Ｃｈｕｎｄｕｒｕ，Ｓ．Ｋ．；Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｃｏｌｌｅｔｔ“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ２０００，９７（１４），７９８１−７９８６に記載されてい方法を多少変更して実施した。要約すると、０．１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ株）を感染させる２４時間前にＭＤＢＫ細胞を２４ウェルプレートに播種した（細胞２×１０５個／ウェル）。試験化合物の系列希釈液を増殖培地中０．５％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞に添加した。各希釈液を３回ずつ試験した。３日後に、細胞培養液（細胞単層と上清）を凍結−融解３サイクルにより溶解させ、ウイルス収率をプラークアッセイにより定量した。要約すると、ＭＤＢＫ細胞を使用の２４時間前に６ウェルプレートに播種した（細胞２×１０５個／ウェル）。細胞に試験溶解液０．２ｍＬを１時間接種し、洗浄し、増殖培地中０．５％アガロースを重層した。３日後に、細胞単層を３．５％ホルムアルデヒドで固定し、１％クリスタルバイオレット（５０％エタノール中ｗ／ｖ）で染色してプラークを可視化した。プラークを計数し、ウイルス負荷の６ｌｏｇ低下を得るための濃度を決定した。
【０１９５】
培養細胞におけるｍＣｙｄの抗ウイルス活性に関する試験を実施した。ｍＣｙｄ抗ウイルス力価を測定するために使用した一次アッセイはＢＶＤＶ細胞保護アッセイ（ＣＰＡ）を使用した。このアッセイはｍＣｙｄが増殖中のＭＤＢＫウシ腎細胞をＢＶＤＶの細胞変性ＮＡＤＬ株による破壊から保護する能力を測定する。未感染細胞に対する試験薬剤の細胞毒性も同時に測定した。ＣＰＡにおけるｍＣｙｄとリバビリンの抗ウイルス活性を表８ａで比較する。ｍＣｙｄはｄｅ  ｎｏｖｏ感染ＭＤＢＫ細胞を濃度依存的に有効に保護し、ＥＣ５０＝０．６７±０．２２μＭであった（表８ａ）。ｍＣｙｄはこのアッセイでｍＣｙｄのＣＣ５０（３８±９μＭ）を優に下回る濃度で完全な細胞保護を生じた。ＣＰＡ及び以下に記載する他のアッセイでリバビリンは明白な抗ウイルス効果を示さず、リバビリンの細胞毒性は保護効果にオーバーラップして隠してしまったので、有意（５０％以上）細胞保護は達成されなかった。従って、リバビリンはＣＰＡではＣＣ５０４．３±０．６μＭ及びＥＣ５０＞４．３μＭであった。
【０１９６】
【表９】
2005533824.tif 000015
【０１９７】
細胞保護アッセイ、プラーク低下アッセイ及び収率低下アッセイで各種ＢＶＤＶ株と細胞変性（ｃｐ）及び非細胞変性（ｎｃｐ）生物型両者に対するｍＣｙｄの総抗ウイルス力価を測定した。後者２種のアッセイは細胞から感染性ウイルスの産生量を測定するので、抗ウイルス効力のストリンジェントな試験を提供する。全３種のアッセイからの各種データは表９にまとめるように一致を示す。ｍＣｙｄの５０％及び９０％有効阻害濃度（ＥＣ５０及びＥＣ９０）値の範囲は夫々０．３〜２．８μＭ及び０．８７〜４．８μＭであった。
【０１９８】
ＢＶＤＶ収率低下アッセイでは、細胞毒性濃度よりも低濃度（約２０μＭ）のｍＣｙｄがｄｅ  ｎｏｖｏ  ＢＶＤＶ産生を６ｌｏｇ１０まで抑制し、この時点まで感染性ウイルスは検出されなかった。６．０〜１３．９μＭｍＣｙｄでＢＶＤＶ産生の４ｌｏｇ１０有効低下（ＥＣ４ｌｏｇ１０又はＥＣ９９．９９）が達成された。これに対して、インターフェロンα２ｂ（ＩＦＮα２ｂ）はこのアッセイではＢＶＤＶに対して活性であったが（ＥＣ５０２．６ＩＵ／ｍｌ）、１０００ＩＵ／ｍｌでもウイルス低下は２ｌｏｇ以下であった。従って、ＢＶＤＶに対するｍＣｙｄの抗ウイルス効果はＩＦＮα２ｂ又はＲＢＶよりも著しく高かった。
【実施例６】
【０１９９】
他の＋鎖ＲＮＡウイルスに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性
ＢＶＤＶ以外の＋鎖ＲＮＡウイルスに対するｍＣｙｄの効力を試験した。得られたデータを表９及び１０にまとめる。フラウイルスに対してｍＣｙｄは低度の活性を示した。両データから決定した複合ＥＣ５０範囲（μＭで表す）は西ナイルウイルス（４６〜９７）；黄熱病ウイルス（９〜８０）；及びデングウイルス（５９〜９５）であった。αウイルスであるベネズエラ馬脳炎ウイルスに対するｍＣｙｄのＥＣ５０値は１．３〜４５μＭであった。ｍＣｙｄはポリオウイルス（ＥＣ５０＝６μＭ）、コクサッキーウイルス（ＥＣ５０＝１５μＭ）、５型及び１４型ライノウイルス（ＥＣ５０＜０．１及び０．６μｇ／ｍｌ）並びに２型ライノウイルス（ＥＣ５０２〜１０μＭ）等のピコルナウイルスに対して広く活性であった。ｍＣｙｄは一般に＋鎖ＲＮＡウイルス以外の試験した全ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスに対して不活性であった。ｍＣｙｄはＭＴ−４ヒトＴリンパ球細胞でＨＩＶに対して又はＨｅｐＧ２．２．１５細胞でＨＢＶに対して活性をもたないことも判明した。
【０２００】
【表１０】
2005533824.tif 000016
【０２０１】
【表１１】
2005533824.tif 000017
【実施例７】
【０２０２】
感染多重度（ＭＯＩ）と抗ウイルス効力
細胞保護アッセイフォーマットを使用してＢＶＤＶウイルス量の増加がｍＣｙｄのＥＣ５０に及ぼす効果を試験した。このアッセイでＢＶＤＶの感染多重度（ＭＯＩ）を０．０４から０．１６まで増加すると、ｍＣｙｄのＥＣ５０は０．５μＭから約２．２μＭまで直線的に増加した。
【実施例８】
【０２０３】
ｍＣｙｄ処理細胞におけるウイルスリバウンド
ＢＶＤＶの非細胞変性株（Ｉ−Ｎ−ｄｌｎｓ株）を持続感染させたＭＤＢＫ細胞でｍＣｙｄ処理中断の効果を試験した。細胞培養で継代すると、これらの細胞は培地１ｍｌ当たり１０６から＞１０７個のいずれかの量の感染性ウイルス粒子を持続的に産生する。このウイルスは処理ＭＤＢＫ（ＢＶＤＶ）細胞からの培養上清を未感染ＭＤＢＫ細胞に添加し、ＢＶＤＶ特異抗体で免疫染色による可視化後に得られたウイルスフォーカスの数を計数することにより測定することができる。持続感染細胞株を４μＭ  ｍＣｙｄで１細胞継代（３日間）処理すると、ＢＶＤＶ力価は１０７感染単位／ｍｌを僅かに下回る処理前対照細胞レベルから約３ｌｏｇ１０低下した。この時点でｍＣｙｄ処理を中断した。１回の継代でＢＶＤＶ力価は１０７感染単位／ｍｌを僅かに上回る未処理対照レベルまでリバウンドした。
【実施例９】
【０２０４】
作用メカニズム
標準ＢＶＤＶ  ＣＰＡアッセイでは、ｍＣｙｄ処理の結果、ＢＶＤＶの細胞変性作用から保護されるので細胞が増殖するにつれて総細胞ＲＮＡ含量は著しく増加する。これと共に、ｍＣｙｄによりＢＶＤＶ  ＲＮＡ産生は著しく減少する。逆に、ｍＣｙｄの不在下では、細胞変性ウイルスによる細胞の破壊によりＢＶＤＶ  ＲＮＡが増加するにつれて総細胞ＲＮＡは実際に減少する。ウイルス及び細胞ＲＮＡに及ぼすｍＣｙｄの効果を更に試験するために、感染から１８時間後（約１ウイルス複製サイクル後）にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用してＭＤＢＫ細胞で細胞内ＢＶＤＶ  ＲＮＡの蓄積をモニターした。同時に、細胞ハウスキーピングリボソーム蛋白質ｍＲＮＡ（ｒｉｇ  Ｓ１５ｍＲＮＡ）も特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより定量した。その結果、ｍＣｙｄはｄｅ  ｎｏｖｏ感染ＭＤＢＫ細胞でＢＶＤＶ  ＲＮＡレベルを劇的に低下させ、ＥＣ５０１．７μＭ及びＥＣ９０２．３μＭであった。最大ウイルスＲＮＡ低下は試験した最高阻害濃度（１２５μＭ）で４ｌｏｇ１０であった。ｒｉｇＳ  １５細胞ｍＲＮＡ対照のレベルには全く効果が観察されなかった。以上の知見をまとめると、ｍＣｙｄは細胞ＲＮＡ含量に影響を与えずにウイルスゲノムＲＮＡ合成を特異的に妨害することによりＢＶＤＶを阻害したと考えられる。この見解はＨｅｐＧ２細胞の［３Ｈ］−ウリジン取込みにより測定したＲＮＡ合成の阻害に高濃度のｍＣｙｄ（ＥＣ５０＝１８６μＭ）が必要であるという所見（表４ａ）により更に裏付けられる。
【０２０５】
精製ＢＶＤＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｋａｏ，Ｃ．Ｃ．，Ａ．Ｍ．Ｄｅｌ  Ｖｅｃｃｈｉｏら，（１９９９）．“Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５３（１）：１−７）と合成ＲＮＡ鋳型を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてｍＣｙｄ−ＴＰはＩＣ５００．７４μＭでＲＮＡ合成を阻害し、天然ＣＴＰ基質に対するＢＶＤＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの競合的阻害剤であった。ｍＣｙｄ−ＴＰの阻害定数（Ｋｉ）は０．１６μＭであり、ＣＴＰのミハエリス−メンテン定数（Ｋｍ）は０．０３μＭであった。ＲＮＡ合成をｍＣｙｄ−ＴＰにより阻害するにはＲＮＡ鋳型にコグネイトＧ残基の存在が必要であった。単一Ｇ残基を含む一連の短い（２１量体）合成ＲＮＡ鋳型を使用し、この残基を鋳型に沿って漸次移動させ、ＣＴＰの不在下のＲＮＡ合成に及ぼすｍＣｙｄ−ＴＰの効果を検討した。ｍＣｙｄ−ＴＰの存在下にこれらの鋳型から生産された新規合成転写産物の分析の結果、ＲＮＡ伸長はＧ残基までしか続かず、その後に停止することが判明した（図２）。２個以上のＧ残基を含む鋳型では、ポリメラーゼに遭遇する最初のＧ残基でＲＮＡ合成が停止した。これらのデータはｍ−Ｃｙｄ−ＴＰが非必須チェーンターミネーターとして作用していることを強く示唆している。この明白な連鎖停止のメカニズムについては更に検討中である。
【実施例１０】
【０２０６】
持続ＢＶＤＶ感染の根絶
ＢＶＤＶの非細胞変性株（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）を持続感染させたＭＤＢＫ細胞でｍＣｙｄがウイルス感染を根絶する能力を試験した（Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｖ．Ｂ．ａｎｄ  Ｒ．Ｏ．Ｄｏｎｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ２０００  ６９（２）：９５−１０７．）。未処理細胞に比較して、持続感染細胞を１６μＭ  ｍＣｙｄで処理すると、ウイルス産生は２細胞継代（３〜４日間／継代）以内に６ｌｏｇウイルス／ｍｌを上回るレベルから検出不能なレベルまで低下した。ｍＣｙｄで引き続き１２継代処理するとそれ以上ウイルス産生は認められなかった。継代８、９及び１０（矢印，図３）で細胞の一部を薬剤の不在下に更に２継代培養し、ｍＣｙｄ−ＴＰの減衰とウイルス複製の再開に十分な時間を与えた。処理ＭＤＢＫ（ＢＶＤＶ）細胞からの培養上清を未処理ＭＤＢＫ細胞に加え、ＢＶＤＶ特異抗体で免疫染色による可視化後に得られたウイルスフォーカスを計数することにより細胞からの培地にウイルスが再出現しているかどうかを反復試験した。このアッセイは単一ウイルス粒子を検出することができるが、薬剤処理後の細胞からウイルスは出現しなかった。従って、持続感染細胞からウイルスを除去するには８継代以上ｍＣｙｄで処理すれば十分であった。
【実施例１１】
【０２０７】
インターフェロンα２ｂとの併用試験
ＢＶＤＶのＮｅｗ  Ｙｏｒｋ−１（ＮＹ−１）株を持続感染させたＭＤＢＫ細胞で実施した第１の試験では単独療法の効果をｍＣｙｄ（８μＭ）又はインターフェロンα２ｂ（２００ＩＵ／ｍｌ）、又は２種の薬剤の併用と比較した（図４Ａ）。この実験で８μＭｍＣｙｄは単独で１継代後にウイルス力価を２継代以上維持されるレベルまで約３．５ｌｏｇ１０低下させた。インターフェロンα２ｂは単独ではｄｅ  ｎｏｖｏ  ＢＶＤＶ感染には活性であったが、持続ＢＶＤＶ感染に対しては本質的に不活性であった（ウイルス力価約０．１ｌｏｇ１０低下）。他方、ｍＣｙｄとインターフェロンα２ｂを併用すると、第２継代までにウイルスは検出不能なレベルまで低下し、単独療法よりも明らかに良好な効力を示した。
【０２０８】
ＢＶＤＶのＩ−Ｎ−ｄＩｎｓ非細胞変性株による持続感染ＭＤＢＫ細胞の追跡試験（図４Ｂ）では、ｍＣｙｄを０、２、４及び８μＭの固定用量で投与し、インターフェロンα２ｂを０〜２，０００ＩＵ／ｍｌに漸増した。この場合も、インターフェロンα２ｂは本質的に不活性であった（ウイルス力価０．１ｌｏｇ低下）が、ｍＣｙｄは単独でＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）増殖を用量依存的に阻害した。ｍＣｙｄは８μＭでウイルス産生をほぼバックグラウンドレベルまで６．２ｌｏｇ１０低下させた。
【実施例１２】
【０２０９】
耐性発現
初期細胞培養試験では、ｍＣｙｄの存在下にＭＤＢＫ細胞でＢＶＤＶの細胞変性株を反復継代したが、耐性突然変異体を作製することができず、ｍＣｙｄ耐性ＢＶＤＶ突然変異体の単離は困難であると思われた。しかし、ＢＶＤＶの非細胞変性形を持続感染させた細胞株で試験した処、最適治療濃度に満たない薬剤濃度（実験に応じて２〜８μＭ）のｍＣｙｄで比較的長期処理すると耐性ウイルスを選択することができた。図５Ａに示す代表的実験では、８μＭ  ｍＣｙｄの存在下に２継代後にウイルスは検出できなくなったが、６継代までに再出現した。再出現ウイルスは力価が低いことがデータから明らかであり、耐性ウイルスは一般に野生型ウイルスの力価の１０分の１以下であり、ＩｎｔｒｏｎＡとの併用療法により容易に抑制される（図５Ａ）。再出現したウイルスの表現型は初期野生型と著しく異なり、図５Ｂに示すように、著しく小さいフォーカスを形成した（一般に野生型ウイルスのフォーカスの直径の３〜１０分の１）。この表現型は阻害剤の存在下に長期培養継代後も変化しなかった（少なくとも７２日間）が、処理の中断後は迅速に野生型表現型（大きいフォーカス）に戻った。
【０２１０】
耐性突然変異体のＲＴ−ＰＣＲシーケンシングを使用して耐性の原因となる突然変異を同定した。シーケンシングはヌクレオシド阻害剤のターゲットである可能性が高いと予想されたＢＶＤＶのＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ領域を中心に行った。ポリメラーゼの高度に保存されたＢドメインモチーフの始点に特異的Ｓ４０５Ｔアミノ酸置換が同定された。Ｂドメインはポリメラーゼ活性部位の一部であり、ヌクレオシド結合に関与していると考えられる（Ｌｅｓｂｕｒｇ，Ｃ．Ａ．，Ｍ．Ｂ．Ｃａｂｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９  ６（１０）：９３７−４３）。ＨＢＶ等の他のウイルスについてこのドメインにヌクレオシド耐性がマッピングされている（Ｏｎｏら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  Ｆｅｂ；１０７（４）：４４９−５５）。この突然変異が観察される耐性に関与していることを確認するために、ＢＶＤＶの組換え分子クローンのバックボーンに突然変異を再導入した。得られたクローンは単離突然変異体ウイルスから表現型特性を区別できず、Ｓ４０５Ｔが耐性に関与していることと、ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがｍＣｙｄの分子ターゲットであることが確認された。このモチーフはヌクレオチド配列（Ｌａｉ，Ｖ．Ｃ．，Ｃ．Ｃ．Ｋａｏら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９９  ７３（１２）：１０１２９−３６）と構造レベルが＋鎖ＲＮＡウイルス（ＨＣＶを含む）間で高度に保存されているので、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの等価突然変異はＳ２８２Ｔであると予想することができる。
【０２１１】
Ｓ４０５Ｔ突然変異体ＢＶＤＶは試験可能な最高濃度（ＥＣ５０＞３２μＭ）までｍＣｙｄに耐性であったが、野生型ウイルスに比較して生存性も有意に低下した。上述のように、Ｓ４０５Ｔ突然変異体は野生型ＢＶＤＶよりも１〜２ｌｏｇ１０低い力価を示し、著しく小さいウイルスプラークを生じた。更に、この突然変異体ウイルスは単一複製サイクルの速度の著しい低下を示し（１２時間で＞１０００倍のウイルス力価低下）、３６時間複製後でも野生型ウイルスの約１００分の１しか蓄積しなかった（図５Ｃ）。更に、ウイルスは薬剤停止後に迅速に野生型ウイルスに復帰した。最後に、突然変異体は図５Ｄに示すようにＩＦＮ  α２ｂ処理に対してに野生型よりも感受性であった（〜４０倍）。
【０２１２】
薬剤の存在下にＳ４０５Ｔ突然変異体ウイルスを更に継代すると、第２の付加的突然変異体Ｃ４４６Ｓが観察された。この突然変異はＢＶＤＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＣドメインで必須ＧＤＤモチーフの直前に生じる。予備試験によると、両方の突然変異をもつウイルスはＳ４０５Ｔ突然変異体よりもさほど良好に複製しないので、この突然変異体とウイルス適性の関係はまだ不明である。
【実施例１３】
【０２１３】
動物効力モデルにおけるｖａｌ−ｍＣｙｄのｉｎ  ｖｉｖｏ抗ウイルス活性
ＨＣＶに慢性感染したチンパンジーはヒト患者におけるＨＣＶ感染の最も広く認められている動物モデルである（Ｌａｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．，Ｃ．Ｂｉｇｇｅｒら，Ｉｌａｒ  Ｊ２００１  ４２（２）：１１７−２６；Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，Ｈ．Ｌ．Ｈａｎｓｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１  ３３（３）：４８９−９５）。慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染のチンパンジーモデルでｖａｌ−ｍＣｙｄの経口投与の単一ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。
【０２１４】
従業員の潜在的安全性欠陥を認識するために施設の全動物の疾患状態を確認することを目的とした委任施設内健康管理プログラムの一部としてＳｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒでチンパンジー５頭のＨＣＶゲノタイピングを実施した。本試験で使用したチンパンジー５頭は遺伝子型１  ＨＣＶを他の全遺伝子型から区別するが、遺伝子型１ａを１ｂから区別しないゲノタイピングＲＴ  ＰＣＲアッセイで高いＨＣＶ力価を示した。これは本試験で使用したチンパンジーが遺伝子型１  ＨＣＶ（ＨＣＶ−１）に感染していることを示した。
【０２１５】
【表１２】
2005533824.tif 000018
【０２１６】
慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染のチンパンジーモデルにおける７日間抗ウイルス活性試験
４頭のチンパンジー（１０ｍｇ／ｋｇ／日又は２０ｍｇ／ｋｇ／日の各用量群２頭）に風味のよいフルーツドリンク担体に新たに溶かしたｖａｌ−ｍＣｙｄ二塩酸塩を投与した。これらの用量は夫々ｖａｌ−ｍＣｙｄ遊離塩基８．３及び１６．６ｍｇ／ｋｇ／日に等価であった。５頭目はプラセボ対照として担体単独を投与した。試験デザインは処置前に３回採血してウイルス負荷の基線変動を設定し、１週間処置中に３回（２、５及び７日目の治療日）採血して抗ウイルス効力を評価した。１週間の投与期間の終わりに分析を完了し、それ以上追跡しなかった。
【０２１７】
ＨＣＶ  ＲＮＡ測定
全試験期間中の血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを２カ所の臨床院内実験室で独立して測定した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ核酸増幅試験（Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｔｅｓｔ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を使用してＨＣＶ  ＲＮＡをアッセイした。このアッセイは検出下限（ＬＬＯＤ）６００ＩＵ／ｍＬ及び直線範囲６００〜８５０，０００ＩＵ／ｍＬである。
【０２１８】
治療中に検出されるウイルス負荷低下の解釈を容易にするために、（ｉ）個体動物における基線ＨＣＶウイルス負荷の変動の程度と、（ｉｉ）ＨＣＶウイルス負荷アッセイの固有変動性及び再現性を測定することに重点をおいた。これらの課題を検討するために、２カ所の実験室で得られたウイルス負荷データセット全体を比較した。２カ所からの結果は近似することが判明し、処置前ＨＣＶウイルス負荷の安定性とＨＣＶ  Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイの再現性が確認された。試験の最もバランスのとれた概観を示すために、両者データセットをまとめることにより得られた平均値を使用して図６及び７に示す結果を作成した。図６は用量コホートの平均データを示し、図７は個体動物データを示す。更に各施設で各動物の治療中に認められた基線からのウイルス負荷の変動を表１２にまとめる。
【０２１９】
２カ所からのＨＣＶウイルス負荷分析の結果、処置前ＨＣＶウイルス負荷は（ｉ）全５頭及び全３用量群間で非常によく似ており、（ｉｉ）３週間処置前期間にわたって非常に安定していることが判明した。５頭の個体動物間の平均処置前ｌｏｇ１０ウイルス負荷と標準偏差は５．８±０．１（施設１）及び５．６±０．１（施設２）であった。これらのデータから、アッセイのｃ．ｖ．（変動係数）は両施設で約２％に過ぎないことが分かった。処置前期間に任意動物で認められるＨＣＶウイルス負荷の最大変動は約０．３ｌｏｇ１０であった。
【０２２０】
図６及び７に示すように、ｖａｌ−ｍＣｙｄを１日１回経口送達すると、プラセボ動物にも処置前期間中にも見られない迅速な抗ウイルス作用を生じた。ウイルス力価はｖａｌ−ｍＣｙｄを投与した全動物で２日間投与後に基線から実質的に低下し、引き続き投与すると２つの処置群で更に低下する傾向があった。処置終点（７日）までに、基線ＨＣＶウイルス負荷からの平均低下は８．３及び１６．６ｍｇ／ｋｇ／日用量群で夫々０．８３ｌｏｇ１０と１．０５ｌｏｇ１０であった。プラセボ動物の力価は治療期間中、基線からほぼ変化しなかった。
【０２２１】
治療に応答する基線ＨＣＶウイルス負荷の変化に関する２カ所の定量施設からのデータの分析を表１２に示す。全体として２つのデータセットはよく一致しており、アッセイの信頼性が確認された。動物５０１を除き、２カ所のウイルス負荷の差は一般に０．３ｌｏｇ１０以下であり、処置前期間中に観察された変動と同等であった。動物５０１では、差異は０．５ｌｏｇ１０に近かった。治療に応答して観察されたウイルス負荷低下は０．４３６（動物５０１，施設１）〜１．５１４ｌｏｇ１０（動物４９７，施設２）であった。後者はゲノム５３５，０００（処置前）〜１６，５００（７日）個／ｍｌのＨＣＶウイルス負荷の変化に対応する。
【０２２２】
【表１３】
2005533824.tif 000019
【０２２３】
チンパンジーのｍＣｙｄ暴露
ｖａｌ−ｍＣｙｄ投与後にチンパンジーの血清で得られたｍＣｙｄ濃度を測定するために制限ＨＰＬＣ分析を実施した。２日目と５日目の投与日の投与後１〜２時間に採取した血清では、ｍＣｙｄ濃度は一般に処置動物で２．９〜１２．１μＭ（夫々７５０及び３１００ｎｇ／ｍＬ）であった。処置前血清又はプラセボ対照血清中にｍＣｙｄは検出されなかった。最終投与から２４時間以内に血清ｍＣｙｄ濃度は０．２〜０．４μＭ（夫々５０及び１００ｎｇ／ｍＬ）まで低下した。使用した方法のｍＵｒｄの定量下限は０．４μＭ（１００ｎｇ／ｍＬ）であるが、血清サンプル中にｍＵｒｄは検出されなかった。
【０２２４】
慢性ＨＣＶ感染のチンパンジーモデルにおけるｍＣｙｄの安全性
全試験期間にわたってチンパンジーの体重減少、体温、食欲、及び一般健康問題と、血液化学プロフィル及びＣＢＣを熟練獣医によりモニターした。薬剤により有害事象は認められなかった。薬剤は全４頭の処置動物により十分に耐えられるようであった。全５頭の動物は試験中に多少体重が減少し、多少のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）上昇を示したが、これらは試験薬剤ではなく使用した鎮痛処置に伴う正常な発生である。１頭は投与開始前の処置前期間にアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）が急増したが、ＡＬＴレベルは処置中に低下した。従って、この孤立ＡＬＴイベントは薬剤によるものではなかった。
【実施例１４】
【０２２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ代謝
ヒト血漿中のｖａｌ−ｍＣｙｄ及びｍＣｙｄの安定性を調べるための試験を実施した。ｖａｌ−ｍＣｙｄをヒト血漿中で０、２１又は３７℃にてインキュベートし、１０時間までの各種時点でサンプルを分析した（図８）。３７℃でｖａｌ−ｍＣｙｄは有効にｍＣｙｄに変換され、１０時間後に初期ｖａｌ−ｍＣｙｄの２％しか残存していなかった。３７℃でのヒト血漿中のｖａｌ−ｍＣｙｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期は１．８１時間であった。ヒト血漿中又はヒトシチジン／デオキシシチジンデアミナーゼ酵素濃度の高い粗製剤で処理後のｍＣｙｄのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性の試験では、ｍＣｙｄはほぼ変化せず、３７℃でインキュベーション後にｍＣｙｄのウリジン誘導体（ｍＵｒｄ）への脱アミノ化は生じなかった。アカゲザルとカニクイザル血漿のみに低度の脱アミノ化が観察された。ｍＣｙｄをカニクイザル血漿中で３７℃にてインキュベーションすると、対照シチジン類似体を高度に脱アミノ化する条件下で２４及び４８時間後に夫々６．７及び１３．０％のｍＵｒｄ脱アミノ化物が得られた。
【０２２６】
ｍＣｙｄ及びｍＵｒｄのＴＰ誘導体に加え、対応するＴＰの量の約１０％に相当する少量のｍＣｙｄ−５’−二リン酸塩ｍＣｙｄ−ＤＰが全３種の細胞型で認められた。初代ヒト肝細胞とＭＤＢＫ細胞の２種の細胞型のみには更に少量のｍＵｒｄ−ＤＰが検出された。一リン酸塩（ＭＰ）代謝産物はどの細胞型でも検出されなかった。細胞内ｍＵｒｄは全く存在せず、他のシチジン類似体の細胞代謝後に認められる５’−ジホスホコリン種等のリポヌクレオチド代謝産物の形成も認められなかった。
【０２２７】
図９はＨｅｐＧ２細胞を１０μＭ［３Ｈ］−ｍＣｙｄに２４時間暴露後に測定したｍＣｙｄ−ＴＰの減衰プロフィルを示す。ｍＣｙｄ−ＴＰの見掛けの細胞内半減期はＨｅｐＧ２細胞で１３．９±２．２時間であり、ＭＤＢＫ細胞で７．６±０．６時間であり、データはｍＵｒｄ−ＴＰの半減期を計算するには不適切であった。ヒト肝癌細胞におけるｍＣｙｄ−ＴＰの長い半減期はＨＣＶ治療の臨床試験におけるｖａｌ−ｍＣｙｄの１日１回投与の概念を裏付けた。図９ＣにＨｅｐＧ２細胞について示すように、全３種の細胞型で５０μＭ薬剤まで用量依存的にｍＣｙｄのリン酸化が生じた。上記特異的差異以外に、初代ヒト肝細胞で検出されたリン酸化パターンはＨｅｐＧ２又はＭＤＢＫ細胞を使用して得られたものと定性的に類似していた。
【０２２８】
ｍＵｒｄの寄与
細胞内活性部分ｍＣｙｄ−ＴＰに加え、種々の種に由来する細胞は細胞内ｍＣｙｄ種の脱アミノ化により少量の可変量の第２の三リン酸塩ｍＵｒｄ−ＴＰを産生することが分かった。ＢＶＤＶＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するｍＵｒｄ−ＴＰの活性はまだ試験していないが、計画中である。これまでのｍＵｒｄの抗ウイルス効力及び細胞毒性に関する予備的な細胞培養試験からのデータによると、ｍＵｒｄは（ａ）ＢＶＤＶに対してｍＣｙｄの約１０分の１の強度であり；（ｂ）基本的に多種多様の他のウイルスに対して抗ウイルス活性をもたず；（ｃ）種々の細胞毒性試験（骨髄アッセイ、ミトコンドリア機能アッセイ及び細胞核酸取込みを含む）で高濃度で試験した場合に陰性であることが示唆されている。これらの結果によると、ｍＣｙｄの全体的な抗ウイルス活性又は細胞毒性プロフィルへのｍＵｒｄの寄与は少ないと思われる。サルでｖａｌ−ｍＣｙｄを用いて実施した亜慢性試験によると、ｍＣｙｄのｍＵｒｄ代謝産物には広い毒性範囲が存在する。
【実施例１５】
【０２２９】
代謝活性化の細胞経路
ｍＣｙｄのリン酸化に関与する酵素の性質を基質競合実験で検討した。シチジン（Ｃｙｄ）はＣｙｄからＣｙｄ−５’−一リン酸（ＣＭＰ）への変換に関与するピリミジンサルベージ酵素である細胞質ウリジン−シチジンキナーゼ（ＵＣＫ）の天然基質である。ｍＣｙｄからｍＣｙｄ−ＴＰへの細胞内リン酸化はシチジン又はウリジンの存在下で用量依存的に低下し、ＥＣ５０値はシチジン１９．１７±４．６７μＭであり、ウリジン２０．９２±７．１０μＭであった。他方、酵素デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）の基質であるデオキシシチジンはｍＣｙｄ−ＴＰの形成に効果が少なく、ＥＣ５０＞１００μＭであった。ｍＣｙｄリン酸化がシチジン及びウリジンの両者により阻害され、デオキシシチジンにより阻害されないことから、ｍＣｙｄはピリミジンサルベージ酵素であるウリジン−シチジンキナーゼによりリン酸化されると考えられる（Ｖａｎ  Ｒｏｍｐａｙ，Ａ．Ｒ．，Ａ．Ｎｏｒｄａら，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００１  ５９（５）：１１８１−６）。ｍＣｙｄの活性化においてこのキナーゼが果たすと推定される役割を確認するには更に研究が必要である。
【実施例１６】
【０２３０】
ｍＵＲＤ−ＴＰの細胞内生合成経路
上記に要約したように、ｍＵｒｄ−ＴＰは種々の種に由来する細胞内で種々の程度まで産生される副次的代謝産物である。脱アミノ化活性を欠損する細胞培地にｍＵｒｄは認められなかったので、ｍＵｒｄはｍＣｙｄの細胞外脱アミノ化に起因しない。細胞代謝データはｍＵｒｄ−ＴＰが細胞内ｍＣｙｄ種の生体内変換により生じるという見解と一致する。公知リボヌクレオシド代謝経路を考慮すると、最も可能性の高い経路は２種の異なる脱アミノ化酵素による２種のｍＣｙｄの一方の脱アミノ化、即ちシチジル酸デアミナーゼ（例えばデオキシシチジル酸デアミナーゼ，ｄＣＭＰＤ）によるｍＣｙｄ−ＭＰ又はシチジンデアミナーゼ（ＣＤ）によるｍＣｙｄの脱アミノ化であると思われる。更にリン酸化段階を経てｍＵｒｄ−ＴＰとなる。これらの可能性は更に検討中である。
【実施例１７】
【０２３１】
ｖａｌ−ｍＣｙｄの臨床評価
適格基準を満たす患者を試験薬剤投与初日である基線（１日目）時に無作為に試験に加えた。各投与コホートを１２人とし、１０：２比で薬剤又は対応プラセボ投与群に無作為に分けた。１、２、４、８、１１、及び１５日に患者をプロトコール評価のために試験センターに来院させた。１５日後に試験薬剤を停止した。その後、１６、１７、２２、及び２９日に患者を追跡来院させた。治療初日と最終日（１日目と１５日目）に全患者で絶食条件下に薬物動態サンプリングを実施した。
【０２３２】
（ｉ）１５日目にＨＣＶ  ＲＮＡレベルが基線から≧１．０ｌｏｇ１０低下した患者の割合、（ｉｉ）血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルが≧１．０ｌｏｇ１０低下するまでの時間、（ｉｉｉ）１日目から１５日目までのＨＣＶ  ＲＮＡレベルの変化、（ｉｖ）１日目から２９日目までのＨＣＶ  ＲＮＡレベルの変化、（ｖ）２９日目に血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルが基線まで回復した患者の割合、及び（ｖｉ）１日目から１５日目までのｖａｌ−ｍＣｙｄ用量とＨＣＶ  ＲＮＡ変化の関係によりｖａｌ−ｍＣｙｄの抗ウイルス効果を評価した。
【０２３３】
用量を増加しながらｖａｌ−ｍＣｖｄを経口投与後のｍＣｙｄの臨床薬物動態
１日目の初回投与及び１５日目の最終投与後８時間にわたって薬物動態を評価し、２、４、８、１１及び１６日目の２４時間トラフレベルと１７日目の４８時間トラフレベルをモニターした。ｍＣｙｄ、ｍＵｒｄ及びｖａｌ−ｍＣｙｄの血漿濃度を定量下限（ＬＯＱ）２０ｎｇ／ｍｌのＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法により測定した。
【０２３４】
ｍＣｙｄの薬物動態はノンコンパートメントアプローチを使用して分析した。下表に示すように、主薬物動態パラメーターは１日目と１５日目で同等であり、反復投与後に血漿薬剤蓄積のないことを示した。血漿暴露は更に用量の一次関数であるように思われた。下表に示すように、用量が５０ｍｇから１００ｍｇに増加すると薬剤暴露の主薬物動態パラメーター（ＣｍａｘとＡＵＣ）は倍加した。
【０２３５】
【表１４】
2005533824.tif 000020
【０２３６】
【表１５】
2005533824.tif 000021
【０２３７】
５０及び１００ｍｇのｍＣｙｄの１日目と１５日目の平均血漿動態プロフィルを図１０に示す。
【０２３８】
要約すると、ｖａｌ−ｍＣｙｄの経口投与後に、親化合物ｄｍＣｙｄはＨＣＶ感染対象の血漿中に検出可能であった。ｍＣｙｄはこれらの対象でこれまでに試験した２種の用量レベル間に線形血漿薬物動態を示した。これまでに試験した用量で１５日間毎日投与後に対象の血漿中にｍＣｙｄの明白な蓄積は認められなかった。
【０２３９】
５０ｍｇ／日から出発してｖａｌ−ｍＣｙｄの用量を増加しながら１５日間ＨＣＶ感染患者に経口投与後のｍＣｙｄの抗ウイルス活性
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するＡｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）アッセイｖ２．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ，米国）を使用して血清ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを測定した。このアッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は約６００ＩＵ／ｍＬであると推定され、このアッセイの定量上限（ＵＬＯＱ）は約５００，０００ＩＵ／ｍＬであると推定された。
【０２４０】
ＨＣＶ  ＲＮＡの血清サンプルをスクリーニング（−４２日〜−７日）で採取し、試験適格性を調べた。スクリーニング血清ＨＣＶ  ＲＮＡ値は中央試験実験室でＡｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＢＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）アッセイにより≧５ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬでなければならない。
【０２４１】
試験期間中、ＨＣＶ  ＲＮＡの血清サンプルを基線（１日目）とプロトコールに規定した全基線後試験来院日（２、４、８、１１、１５、１６、１７、２２、及び２９日目）に採取した。試験を早期に停止した患者についてもプロトコールに規定した追跡来院中にＨＣＶ  ＲＮＡの血清サンプルを採取した。
【０２４２】
進行中の試験で最初の２種のコホート（５０及び１００ｍｇ／日）に関連する抗ウイルス活性を下表及びグラフに要約する。投与期間は短く（１５日間）、初期用量レベルは低かったが、感染患者の血漿中ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに既に明白な効果があった。
【０２４３】
【表１６】
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【０２４４】
【表１７】
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【０２４５】
図１１は来院毎の基線からのＬｏｇ１０ＨＣＶ  ＲＮＡの変化の中央値を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１ａ】図１ａ及び図１ｂは実施例１に記載するようなβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル二塩酸塩の２種の製造方法を示す。
【図１ｂ】図１ａ及び図１ｂは実施例１に記載するようなβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステル二塩酸塩の２種の製造方法を示す。
【図２】実施例９に記載するようにＲＮＡ鋳型で特定グアニン残基におけるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン三リン酸塩によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ合成の部位特異的連鎖停止を例証するゲルの写真である。
【図３】ＢＶＤＶ感染ＭＤＢＫ細胞の多数継代に伴うウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の力価のグラフであり、実施例１０に記載するようにβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン（１６μＭ）の長期投与により持続性ＢＶＤＶ感染を根絶できることを示す。矢印は細胞の一部で薬剤投与を中止した時点を示す。
【図４】図４ａ及び図４ｂは実施例１１に記載するようにウイルスを持続感染させたＭＤＢＫ細胞におけるウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の濃度のグラフである。これらのグラフはウイルス力価の低下におけるβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンとインターフェロンα２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ）の相乗作用を示す。図４ａは持続感染ＭＤＢＫ細胞でＢＶＤＶ（ＮＹ−Ｉ株）力価に及ぼすβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンとＩｎｔｒｏｎＡの効果の経時グラフである。図４ｂは持続感染ＭＤＢＫ細胞でＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）力価に及ぼすβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンとＩｎｔｒｏｎＡの併用の効果のグラフである。
【図５】図５ａ〜ｄは実施例１２に記載するようにウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を感染させたＭＤＢＫ細胞に投与したβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンに対する耐性の発現を試験する実験の結果を示す。図５ａは持続感染ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）力価に及ぼすβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン又はＩｎｔｒｏｎＡの２８日間投与の効果を示す代表的実験のグラフである。図５ｂは感染ＭＤＢＫ細胞をプレーティングした皿の写真であり、野生型ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ株）とβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン耐性ＢＶＤＶ（Ｉ−Ｎ−ｄＩｎｓ  １０７Ｒ）の表現型により形成されるフォーカスのサイズを比較し、耐性ウイルスが野生型Ｉ−Ｎ−ｄｌｎｓ株よりも著しく小さいフォーカスを形成したことを示す。図５ｃは感染ＭＤＢＫ細胞における感染後時間に伴うＢＶＤＶ株Ｉ−Ｎ−ｄｌｎｓ又はＩ−Ｎ−ｄｌｎｓ−１０７Ｒの力価のグラフである。図５ｄはｄｅ  ｎｏｖｏ感染ＭＤＢＫ細胞にＩｎｔｒｏｎＡを投与した場合のＢＶＤＶウイルス力価収率に及ぼすＩｎｔｒｏｎＡの効果のグラフである。
【図６】実施例１３に記載するようにβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルを投与した日数に伴う個体チンパンジーにおけるＣ型肝炎ウイルスの濃度（Ｌｏｇ１０）のグラフである。
【図７】実施例１３に記載するようにβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルを投与した日数に伴う個体チンパンジーにおけるＣ型肝炎ウイルスの濃度を基線と比較したグラフである。
【図８】実施例１４に記載するように４℃、２１℃、及び３７℃でヒト血漿中で薬剤をインキュベーション後にサンプル中に残存する総β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルの百分率を継時的に示すグラフである。
【図９】図９ａは実施例１４に記載するようにＨｅｐＧ２細胞を１０μＭβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンと共にインキュベーション後のβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンとβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルウリジン（ｍＵｒｄ）の二及び三リン酸誘導体の相対濃度を継時的に示すグラフである。図９ｂはＨｅｐＧ２細胞を１０μＭβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンと共にインキュベーション後のβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの三リン酸誘導体の継時的減衰のグラフである。図９ｃはＨｅｐＧ２細胞を１０μＭ  β−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンと共にインキュベーション後に薬剤の濃度（μＭ）を増加させた場合のβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンとβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルウリジン（ｍＵｒｄ）の二及び三リン酸誘導体の濃度のグラフである。
【図１０】実施例１７に記載するようにβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルを患者に投与後のヒト血清中のβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジンの濃度（ｎｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図１１】実施例１７に記載するようにβ−Ｄ−２’−Ｃ−メチル−リボフラノシルシチジン−３’−Ｏ−Ｌ−バリンエステルの投与後のヒト患者におけるＣ型肝炎ウイルスの力価変化の中央値のグラフである。グラフは患者来院によるＬｏｇ１０ＨＣＶ  ＲＮＡの基線からの変化を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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