(57)【要約】糖タンパク質又は糖ペプチドが、細菌に結合され、かつ標識が糖タンパク質又は糖ペプチドに結合される又はそれに生得的である、尿及び血液のような流体の細菌含量を測定する方法が、存在する細菌の量を確定する手段を提供する。好ましい糖タンパク質はアルカリホスファターゼであり、それは、流体試料中に存在する細菌すべてに結合することが可能な酵素であり、既知の試薬の添加によって発色させることができる標識部分を生得的に包含する。
2005529612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）有効量の糖タンパク質又は糖ペプチドを流体の試料に含有される細菌に結合させる工程であって、前記糖タンパク質又は糖ペプチドがその存在を示す標識を有する工程；
（ｂ）工程（ａ）における前記試料中において前記糖タンパク質又は糖ペプチドを細菌と反応させた後、前記流体試料から結合していない余剰の糖タンパク質又は糖ペプチドを分離する工程；
（ｃ）（ｂ）の前記結合していない余剰の糖タンパク質又は糖ペプチドを分離した後、残った前記標識を測定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で測定された前記標識の量に関係する前記試料の細菌含量を決定する工程を含む、流体の細菌含量の測定方法。
【請求項２】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、少なくとも１０６の細菌に対する結合定数及び少なくとも１００の結合部位を有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
糖タンパク質が、血清タンパク質、免疫グロブリン、酸素結合タンパク質、繊維状タンパク質、細胞内酵素、ホルモンならびに分泌される酵素及び阻害剤より成る群の少なくとも１員である請求項１記載の方法。
【請求項４】
血清タンパク質が、アルブミン、プレアルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、及びβ−２−マクログロブリンより成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭより成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項６】
繊維状タンパク質が、コラーゲン、フィブリノーゲン及びミオシンより成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項７】
酸素結合タンパク質が、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン及びミオグロビンより成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項８】
細胞内酵素が、グルタミン酸ヒドロゲナーゼ、ＡＬＰ、及び乳酸脱水素酵素より成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項９】
ホルモンが、インスリン、成長ホルモン及びグルカゴンより成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項１０】
分泌される酵素及び阻害剤が、プロテアーゼ阻害剤、α−１−マクログロブリン、トリプシノーゲン、リゾチーム、及びα−１−酸性糖タンパク質より成る群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項１１】
糖タンパク質又は糖ペプチドが酵素である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼ、ヘキサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ホスホリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヒドロラーゼ、アリールスルファターゼＡ、アミラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びペルオキシダーゼより成る群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
酵素が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＡＬＰが腸のＡＬＰである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、糖タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１６】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、糖ペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項１７】
糖ペプチドが少なくとも１種のペプチド及び１種の炭水化物を含有する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
糖ペプチドが、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｘ、Ｙ−Ｔｈｒ−Ｘ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ及びＧｌｙ−Ｘ−Ｈｙｌ−Ｙより成る群の少なくとも１員であり、その際、Ｘはアミノ酸であり、ＹはＭａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｕ、ＳＡ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、フコース又はキシロースである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
試薬としてＰＮＰＰを添加することによりＡＬＰを測定する請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
試薬による発色が４０５ｎｍの波長で読み取られる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、放射性標識、蛍光標識、電気活性標識、化学発光標識、酵素抗体標識、及び粒子状標識より成る群から選択される標識を有する請求項１記載の方法。
【請求項２２】
標識が、ラテックスビーズ及びゴールドゾルより成る群から選択される粒子である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
標識がクマシーブリリアントブルーである請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
ポリマー、非糖化タンパク質、非糖化ポリペプチド、及び多糖類より成る群から選択されるブロッキング化合物を試料に添加することをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項２５】
糖タンパク質又は糖ペプチドの細菌への結合を高めることが可能である少なくとも１種のカチオンをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項２６】
カチオンが、亜鉛、銅及び鉄より成る群の少なくとも１員である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
カチオンが亜鉛である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）糖タンパク質又は糖ペプチドを検出するための手段を提供するために標識された前記糖タンパク質又は糖ペプチド；
（ｂ）前記標識された糖タンパク質又は糖ペプチドの構造的支持体であって、それによって前記標識された糖タンパク質又は糖ペプチドを流体の試料に接触させることができる構造的支持体
を含む前記流体の細菌含量を測定する装置。
【請求項２９】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、少なくとも１０６の細菌に対する結合定数及び少なくとも１００の結合部位を有する請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
糖タンパク質が、血清タンパク質、免疫グロブリン、酸素結合タンパク質、繊維状タンパク質、細胞内酵素、ホルモンならびに分泌される酵素及び阻害剤より成る群の少なくとも１員である請求項２８記載の装置。
【請求項３１】
糖ペプチドが、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｘ、Ｙ−Ｔｈｒ−Ｘ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ及びＧｌｙ−Ｘ−Ｈｙｌ−Ｙより成る群の少なくとも１員であり、その際、Ｘはアミノ酸であり、ＹはＭａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｕ、ＳＡ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、フコース又はキシロースである請求項２８記載の装置。
【請求項３２】
糖タンパク質又は糖ペプチドが、放射性標識、蛍光標識、電気活性標識、化学発光標識、酵素標識、及び粒子状標識より成る群から選択される標識を有する請求項２８記載の装置。
【請求項３３】
標識された糖タンパク質がＡＬＰである請求項２８記載の装置。
【請求項３４】
糖タンパク質又は糖ペプチドの細菌への結合を高めることが可能である少なくとも１種のカチオンをさらに含む請求項２８記載の装置。
【請求項３５】
カチオンが亜鉛である請求項２８記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、流体中、特に生体試料中で細菌を検出する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、現在利用可能なものに比べて、改善された精度をもって、尿中及びそのほかの流体中の細菌を検出する迅速な方法に関する。尿の分析に特に関心が高いが、本発明の方法を用いて、血液、血清、水などのようなそのほかの流体を分析してもよい。
【０００２】
たとえば、種々の目的で今や使用されている種類の乾燥試験紙を使用することによる、細菌の迅速検査は望ましいものである。現在、尿試験紙を用いて、試料をスクリーニングし、臨床検査を必要としないものを除外している。しかしながら、亜硝酸塩や白血球の測定のような現在の検査では、正確な結果を迅速に提供することはできない。多数の間違った結果が得られ、不必要な追跡的臨床検査の原因となる。病院の臨床検査の仕事量の約５０％は、尿試料に関与しており、これら試料の約９０％は総細菌及びグラム陰性細菌について培養され、分析される。しかしながら、細菌検出のために培養される尿試料のたった約１０％が実際に、検査陽性と判明する。明らかに、尿の正確なプレスクリーニングによって臨床検査に送られる試料の数を大いに減すことが可能であると思われる。
【０００３】
現在利用可能な試験紙の市場浸透は、１つには、後で追跡的臨床検査により測定すると検査が偽陽性の結果を生じるために、大きくはない。したがって、細菌の存在の迅速且つ正確な測定を提供する試験紙によって、コストを減らし、臨床検査の結果を待つのではなく、患者において迅速に細菌を治療することが可能になる。
【０００４】
本発明者らは、正確に細菌を検出することができる方法を検討していた。可能性のあるアプローチの１つには、細菌に結合し、次いで検出され、存在する細菌の量を確定できるように測定される物質を発見することが含まれていた。課題は以下のように述べることができる。物質はどのように細菌に結合するのか？また、どの物質が、行われるべき正確な測定に必要とされる特性を示すのか？結合は細菌に特異的であるべきである。非特異的な結合は、極めて予測不能であり、不正確な結果を提供しうるので、結果を分かりにくくしうる。
【０００５】
抗体は細菌に結合する能力を有するとして認識されており、それが結合する発色材料により検出するのに使用することができるＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）それ自体が、細菌に結合可能であるもう１つの物質に結合でれば、存在する細菌の量を測定することが可能であろうと考えられていた。最初、実験は、ＡＬＰは非特異的な様式で細菌に結合することを示したので、試料に存在する細菌の量を測定する信頼できる方法を開発するには問題があるとみなされていた。さらなる研究は、細菌に結合できる物質に結合するＡＬＰのみを測定するようにＡＬＰの非特異的結合を排除する方向に向けられた。驚くべきことに、ＡＬＰが細菌に非特異的に結合するという考えは正しくなく、実際、それが細菌に結合するということが見い出され、本発明に至った。以下に見られるように、ＡＬＰは、細菌の量を測定するための好ましい物質ではあるが、そのほかの物質、特に糖ペプチド及び糖タンパク質を使用することができる。
【０００６】
関連文献と特許
細菌を迅速に検査する方法は既知であるが、それらは本発明の方法とは異なる。方法の１つでは、大腸菌、クラミジア又はサルモネラのようなグラム陰性細菌からリポ多糖類を検出する免疫アッセイで、リポ多糖体結合タンパク質又はリポ多糖体検体に特異的結合親和性を有する抗体を、一次又は二次結合試薬として使用する（ＷＯ  ００／６０３５４および米国特許第５，６２０，８４５号を参照のこと）。米国特許第５，８６６，３４４号では、細胞壁からポリペプチドを検出するそのほかの免疫アッセイが記載されている。多糖体結合ポリペプチド及びそれらの抱合体を用いる方法においてタンパク質を精製することができる（米国特許第５，９６２，２８９号、同第５，３４０，７３１号、及び同第５，９２８，９１７号を参照のこと）。米国特許第５，８５６，２０１号では、多糖体結合タンパク質及びそれらの抱合体を用いたタンパク質の検出が開示されている。上述の方法は、以下の本発明の考察で見られるように、本発明のものとは異なる。
【０００７】
リポ多糖体抗体又はリポ多糖体結合タンパク質に基づく方法は、存在する総細菌の測定を提供しない。それらはまた、細菌細胞に結合する糖ペプチド又は糖タンパク質も使用しない。ポリペプチドに基づく方法は、糖ペプチド又は糖タンパク質を使用するのではなく、細菌の細胞壁に結合する抗体を必要とする。ポリ多糖体結合ポリペプチドに基づく方法は、関心のある検体上への短い配列のポリペプチドの融合を必要とし、多糖体に結合するのに非糖化ポリペプチドを用いる。
【０００８】
糖タンパク質は種々の生体分子に結合することが示されている。たとえば、真菌細胞表面の糖タンパク質は、宿主のタンパク質に結合することが示されている。また、上皮細胞から分泌される糖タンパク質は、脂質に結合することが示されており、炭水化物への糖タンパク質の結合は周知である。糖タンパク質のそのような相互作用はすべて、イオン強度、ｐＨ及び生体分子に対する個々のタンパク質の親和性のような多数の因子に依存する。しかしながら、細菌含量の測定のためのアッセイにおける糖タンパク質の使用は、今まで記載されてこなかった。
【０００９】
糖タンパク質の受容体はヒト単球細胞で単離されている。ヒト単球の細胞壁から抽出された２つの結合タンパク質は、フルクトシルリジン（グルコースで糖化されたリシルペプチド）を結合するのに９ｘ１０＋６の親和性を有し、細胞当たり１０，０００の活性のある結合部位を持つことが示されている。これらの受容体タンパク質部位は、ＲＮＡ結合タンパク質ファミリーに属し、糖化アルブミンのような加齢関連タンパク質を結合することによる加齢過程に関与すると考えられている。しかしながら、糖タンパク質受容体における従来技術は、細胞壁における受容体を細胞の検出に使用すればよいことを教示していない。細胞の計数測定又は検出として使用できる着色粒子又は酵素反応のどちらかによるシグナル生成に提供された手段はない。
【００１０】
細菌は、多くは、細菌細胞膜が宿主の細胞外マトリクスタンパク質に接着することによって、宿主の組織に付着することが知られている。この結合は、その表面におけるグリコアミノグリカン、コラーゲン、タンパク質及びインテグリンによる幾つかの様式を介して生じることが知られている。したがって、細菌の細胞表面を含む細胞表面を、宿主の受容体部位と同様に、宿主組織のタンパク質に結合することが可能な分子のモザイクとして視覚化することができる。
【００１１】
細菌細胞と糖タンパク質の間の相互作用は一般的には知られているが、細菌細胞への特異的な糖ペプチドの結合は開示されていない。フィブロネクチン及びラミニンのような細胞外マトリクスタンパク質への細菌細胞の接着は記載されている。この結合は、細胞接着とタンパク質上の糖化基の間で生じることが示された。同様の結果は、結合組織のタンパク質と細菌細胞とで示されている。糖タンパク質のポリペプチド及び炭水化物の構造は大きく変化しうるし、細菌を結合するもののような、糖ペプチド及び糖タンパク質の化学構造は不明であることが多い。
【００１２】
細菌細胞への糖タンパク質の結合を測定する方法は記載されている；しかしながら、糖ペプチド又は糖タンパク質の結合による細菌の測定は記載されていない。さらに詳しくは、酵素である糖ペプチド又は糖タンパク質又は検出用標識に付着させた糖ペプチド又は糖タンパク質の結合は開示されてこなかった。
【００１３】
細胞壁のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）への結合は知られているが、現在のところ、リン酸モノエステルの加水分解の触媒以外にアルカリホスファターゼに正確な機能を割り当てることはできない。組織の損傷がこれらＡＬＰのイソ酵素の放出を招き、臨床的な意味を提供することは知られている。
【００１４】
特定のＡＬＰイソ酵素は、膜結合型であることが知られている。腸、肝臓、骨、腎臓及び胎盤のアルカリホスファターゼイソ酵素は、ジペプチジルペプチダーゼ、たとえばアラニンアミノペプチダーゼのようなアミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、ラクターゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、たとえばグルコシダーゼ及び５’ヌクレオチダーゼのようなヒドロラーゼを含む細胞壁への膜結合型で知られる酵素の例である。ＡＬＰの細胞膜結合は、アンカーの長鎖トリグリセリドがリポタンパク質の膜に組み込まれるＣ末端のグリカン−ホスファチジル−イノシトールアンカーを介して生じることが知られている。Ｃ末端のグリカン−ホスファチジル−イノシトールアンカーは、大腸菌より産生されるＡＬＰには存在せず、大腸菌のＡＬＰは可溶性酵素であるとみなされる。したがって、本発明におけるＡＬＰの大腸菌への結合はもう１つのメカニズムによって生じなければならない。
【００１５】
ＡＬＰはある種の診断応用で用いられている。たとえば、免疫アッセイの標識として免疫アッセイ診断検査でＡＬＰが用いられる；米国特許第５，２２５，３２８号を参照のこと。しかしながら、細菌の検出については抗体なしでは乾燥相の検査にそれは使用されていない。
【００１６】
本発明者らは、細菌細胞がすべて、複数の結合部位を介して特定の糖タンパク質に結合する能力を有することを発見した。この発見の結果、以下に続く本発明の詳細な考察に見られるように、彼らは、存在する細菌すべてを正確に検出する能力を有する試験紙においてそのような糖タンパク質を使用できることを見い出した。
【００１７】
発明の詳細な開示
態様の１つにおいて、本発明は、流体、通常、生体の流体中の細菌含量を測定する方法であり、その際、有効量の糖タンパク質又は糖ペプチドが流体の試料中の細菌と反応し、糖タンパク質又は糖ペプチドが検出可能な部分で標識される。細菌と反応しなかった余剰の糖タンパク質は分離され、その後、標識された部分の量を測定し、試料中に存在する細菌の量に関連付ける。好ましい実施態様では、糖タンパク質又は糖ペプチドはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）であり、試薬を添加して、細菌に結合したＡＬＰの存在を示す色を発色させる。細菌への糖タンパク質の会合（結合）定数は少なくとも１０＋６であり、且つ、結合部位の数は少なくとも１００であるべきである。
【００１８】
好ましい実施態様では、該タンパク質は糖化されており、一般に、血清タンパク質、免疫グロブリン、酸素結合タンパク質、繊維状タンパク質、細胞内酵素、ホルモンならびに分泌される酵素及び阻害剤を含む。血清タンパク質の例は、アルブミン、プレアルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質及びβ−２マクログロブリンである。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭが挙げられてもよい。酸素結合タンパク質には、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン及びミオグロビンが挙げられてもよい。繊維状タンパク質には、コラーゲン、フィブロネクチン及びミオシンが挙げられてもよい。細胞内酵素の例には、グルタミン酸ジヒドロゲナーゼ、ＡＬＰ及び乳酸脱水素酵素が挙げられる。代表的なホルモンには、インスリン、成長ホルモン及びグルカゴンが挙げられる。分泌される酵素及び阻害剤には、α−１−ミクログロブリン、トリプシノーゲン、リゾチーム及びα−１−酸性糖タンパク質が挙げられてもよい。
【００１９】
タンパク質に付着させてもよい炭水化物のモノマー単位は、ガラクトース（ＧＡＬ）、マンノース（ＭＡＮ）、グルコース（ＧＬＣ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（ＳＡ）、フコース及びキシロースであってもよい。
【００２０】
代表的な糖ペプチドには、Ｙ−Ｓｅｒ−Ｘ、Ｙ−Ｔｈｒ−Ｘ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ｙ−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ及びＧｌｙ−Ｘ−Ｈｙｌ−Ｙが挙げられ、その際、Ｘはアミノ酸であってもよく、ＹはＭａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｕ、ＳＡ、ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、フコース又はキシロースであってもよい。
【００２１】
糖タンパク質に添加してもよい標識部分には、放射性標識、蛍光標識、電気活性標識、化学発光標識、酵素抗体標識、及び粒子状標識が挙げられる。ポリマー、非糖化タンパク質、非糖化ポリペプチド、及び多糖類より成る群の構成員のようなブロッキング化合物が包含されてもよい。カチオン、特に亜鉛、銅及び鉄を加えて、糖タンパク質又は糖ペプチドの細菌への結合を増やしてもよい。
【００２２】
もう１つの態様では、本発明は、流体の細菌含量を測定する乾燥検査法であり、その際、標識部分を含有する糖タンパク質又は糖ペプチドを細菌に結合させ、標識部分を測定して流体試料中の細菌含量を確定する。
【００２３】
本発明は、種々の改変及び代替形態を許容するが、本明細書に詳細に記載される実施例のために、具体的な実施態様が示されている。しかしながら、本発明は、開示される実施態様に限定されることを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付のクレームにより定義されることが理解されるべきである。
【００２４】
好ましい実施態様の説明
糖タンパク質及び糖ペプチド
糖タンパク質及び糖ペプチドは双方共、ペプチド結合を持つアミノ酸及び炭水化物から構成される。一般に、糖タンパク質は、糖ペプチドよりも高い分子量を有する。電荷の誘引及び細胞壁上の分子に対する形状を介して、糖タンパク質及び糖ペプチドを細菌に付着させることができる。以下の実施例で見られるように、細菌細胞に結合する糖タンパク質又は糖ペプチドの量は、分子構造、金属の存在、イオン強度及び環境のｐＨを含む幾つかの因子に依存して変化する。
【００２５】
１又はそれより多くの炭水化物単位がタンパク質に共有結合する糖タンパク質は、生体分子の非常に多様な群である。細胞受容体のような膜成分であるような、分泌型タンパク質及びその断片はほとんど糖タンパク質であり、その際、炭水化物は細胞と細胞の接着に関与する。
【００２６】
糖化することができるタンパク質の例には、血清タンパク質（たとえば、アルブミン、プレアルブミン、トランスフェリン、レチノール結合タンパク質、β−２−マクログロブリン）、免疫グロブリン（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）、酸素結合（たとえば、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ミオグロビン）、繊維状タンパク質（たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン、ミオシン）、細胞内酵素（たとえば、グルタミン酸脱水素酵素、ＡＬＰ、乳酸脱水素酵素）、ホルモン（たとえば、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン）ならびに分泌される酵素及び阻害剤（たとえば、プロテアーゼ阻害剤、α−１−ミクログロブリン、トリプシノーゲン、リゾチーム、α−１−酸性糖タンパク質）が挙げられる。
【００２７】
普通、タンパク質に結合する炭水化物モノマーには、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（ＳＡ）、フコース及びキシロースが挙げられる。炭水化物鎖は、多種多様な長さ及び構造を持って生じるが、遭遇する典型的な構造の一部は、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−、ＧａｌＮＡｃ（Ｇａｌ）（ＳＡ）−、Ｍａｎ（Ｍａｎ（Ｍａｎ）２）（Ｍａｎ（Ｍａｎ）−、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−、Ｍａｎ（Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ）２ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−及び以下の表２に列記されるものである。
【００２８】
炭水化物鎖は一般に、セリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基のヒドロキシル基、アスパラギン（Ａｓｎ）側鎖のアミドのＮ原子あるいはヒドロキシ−リジン（Ｈｙｌ）残基を介してタンパク質及びペプチドに結合される。Ｏ−グリコシル化された特定のＳｅｒ及びＴｈｒ残基は独特のアミノ酸配列に生じるとは思われないので、Ｓｅｒ及びＴｈｒは、Ｓｅｒ−Ｘ、Ｔｈｒ−Ｘのようにいかなるアミノ酸にも接続することができ、その際、Ｘは任意のアミノ酸であることができる。Ｈｙｌ残基のグリコシル化は特徴的な配列、−Ｇｌｙ−Ｙ−Ｈｙｌ−Ｚ−Ａｒｇ−で生じ、その際、Ｙ及びＺは任意のアミノ酸である。Ｎ−グリコシル化されたＡｓｎ残基は、配列、−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒで生じ、その際、Ｘは、Ｐｒｏ以外の普通の任意のアミノ酸であってもよい。
【００２９】
特に有効な糖タンパク質の１つがアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。それは、細菌に結合することができ、免疫アッセイ診断検査で使用される技術である、既知の試薬を添加することにより発色させることができる標識部分を生得的に提供することができるという利点を有する。糖タンパク質の量は、試料に存在する細菌の量に依存し；たとえば、細菌が存在するとき、糖タンパク質の特定の量は、結合部位の数及び結合定数の強さに依存する。所定の糖タンパク質及び細菌細胞の種類によって、結合部位が決定され、結合する糖タンパク質の量は存在する細菌の量に直接比例する。
【００３０】
標識部分
上述のように、生得的に標識を提供するので、アルカリホスファターゼは特に有用である。そのほかの糖タンパク質又は糖ペプチドは、細菌に結合することと同様に、標識として生得的な能力を有さなくてもよい。したがって、そのような例では、糖タンパク質又は糖ペプチドの量を測定して存在する細菌の量を示すことができるように、標識部分を添加してもよい。有用であってもよいそのような標識部分の例には、比色標識、放射性標識、蛍光標識、電気活性標識、化学発光標識、酵素抗体標識、及び粒子状標識が挙げられる。
【００３１】
追加成分
本発明の方法は、当業者によく知られている乾式試験紙、又は以下の実施例で記載されているもののような湿式検査法に適用してもよい。具体的な技術に依存して、緩衝化合物、糖タンパク質又は糖ペプチドのための物質、酵素増幅化合物及び、たとえば、ブロッキング化合物のようなそのほかの添加物が存在してもよい。
【００３２】
特異的な遷移状態の金属を添加することにより細菌細胞壁へのタンパク質の結合が増えることが発見されている。必要ではないが、特異的な遷移状態の金属の使用は、糖化されたタンパク質の細菌への結合に基づいたアッセイの感度を高める。
【００３３】
本発明の特に好ましい実施態様では、そのような金属を用いて標識部分の反応を高める。種々の金属が評価されている。中でも、亜鉛、銅及び鉄、特に、以下の実施例で見られるように亜鉛は、有益な効果を有することが見い出されている。
【００３４】
ＡＬＰの基質には、以下の有機基、１級アルコール及び脂肪族アルコール、糖、糖アルコール、フェノール、ナフトール及びヌクレオシドのリン酸エステルが挙げられる。可視色を形成する基質の例には、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−リン酸、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−リン酸、ｐ−ニトロフェノールリン酸フェニルリン酸（ＰＰＮＰ）、インドキシルリン酸、たとえば、ブロモ−クロロ−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）、フェノールフタレインリン酸、チモールフタレイン一リン酸及び二リン酸、β−ナフチルリン酸、安定性のためのＰＰＮＰのジシクロヘキシルアンモニウム塩、チモールフタレイン一リン酸、フェノールフタレイン二リン酸、カルボキシフェニルリン酸、β−グリセロリン酸及びβ−グリセロールリン酸が挙げられる。ＡＬＰ用の蛍光基質の例には、メチルフルオレセインα−ナフチルリン酸が挙げられる。幅広い化学発光基質及び生物発光基質によってアルカリホスファターゼを測定することができる。ＡＬＰ用の化学発光基質の例には、アダマンチル１，２−ジオエタンアリールリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、フェナシルリン酸、ＮＡＤＰ、アスコルビン酸２−Ｏ−リン酸、コルチゾル−２１−Ｏ−リン酸、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム二硝酸、インドリル誘導体、たとえば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸二ナトリウム塩（ＢＣＩＰ−２Ｎａ）、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−リン酸及びアダマニル１，２−ジオキセタンアリールリン酸（ＡＭＰＰＤ）が挙げられる。
【００３５】
ＡＬＰの定量には、種々の緩衝液、非トランスリン酸化のもの及び種々の程度のトランスリン酸化特性のもの双方が用いられている（すなわち、炭酸、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール及びジエタノールアミン）。ＡＬＰ用に普通に利用される緩衝液には、エチルアミノエタノール（ｐＫａ９．９）、ジエタノールアミン（ｐＫａ８．７）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＫａ７．８）、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノールＭＡＰ（ｐＫａ９．３）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ｐＫａ８．６）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム（ｐＫａ９．９）、グリシル−グリシン（ｐＫａ８．２）、グリシン（ｐＫａ９．６）及びバルビタール（ｐＫａ７．４４）が挙げられ、ｐＨ７〜１０の範囲にて活性を測定する。
【００３６】
酵素補因子のような追加の添加剤を使用して酵素の反応条件を向上させてもよい。マンニトール及びそのほかのアルコール類を使用してＡＬＰの基質割合を高めることができる。ＡＬＰの場合、各ＡＬＰ分子に対する少なくとも１当量のＺｎ、Ｃａ及びＭｇの金属が存在し、触媒活性を提供し、おそらく天然の酵素構造の維持も提供する。酵素アッセイの範囲を調節し、干渉を覆い隠すのに酵素阻害剤を使用することも多い。ＡＬＰの場合、既知の阻害剤には、システイン、ＥＤＴＡ及びチオグリコール酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホモアルギニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、レバミソール及びイミダゾールが挙げられる。酵素を制御するのに塩化ナトリウムのような塩を使用できることも知られている。ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤及び胆汁酸が、酵素アッセイの範囲及び感度を調節することも知られている。
【００３７】
酵素アッセイの検出限界を高めるのに、酵素増幅システムを使用することもできる。アルカリホスファターゼの検出について、幾つかの酵素増幅法が知られている。これらには、ＮＡＤ補因子を用い、ＮＡＤＰ酵素を脱リン酸化してＮＡＤを生じるのにＡＬＰに頼る、酵素系（たとえば、ジアホラーゼ及びアルコール脱水素酵素）を介したホルマザンの形成（ＩＮＴ−バイオレットにより比色的に又はレサズリンにより蛍光的に）が挙げられる。たとえば、ＡＬＰによるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のＮＡＤ＋への変換が増幅に使用されている。次いで、反応媒体に含まれるエタノールの存在下、アルコール脱水素酵素によりＮＡＤ＋化合物はＮＡＤＨに還元される。次には、やはり媒体に存在するテトラゾリウム塩の同時還元と共に、ジアホラーゼの存在下でＮＡＤＨが変換されてＮＡＤに戻る。これにより結果的に、ＡＰにより生成されるＮＡＤ＋の濃度に比例する、着色された可溶性のホルマザン色素の蓄積を生じる。新しく形成されるＮＡＤ＋は何回もリサイクルされ、その結果、感度に１００倍の上昇を生じる。
【００３８】
干渉を減らし、又は色を改善するために、ポリマー、非糖化タンパク質、非糖化ポリペプチド及び多糖類より成る群から選択されるブロッキング化合物が包含されてもよい。干渉する物質を代わりにブロッキング化合物に結合することにより、干渉する物質による細菌への非特異的結合を妨げることによって干渉が改善される。乾燥試薬において色を均一にさせる拡散層として作用することにより色が改善される。
【００３９】
検査方法
細菌を検出するための糖タンパク質の使用は、多様な検査法に適用することができる。方法は、アッセイされる試料と糖タンパク質を混ぜ合わせること、遊離の結合していない糖タンパク質から細菌に結合した糖タンパク質を分離すること、及び結合した又は遊離の糖タンパク質を測定することを必要とする。２，３例を挙げると、遠心分離装置、微量流体素子、クロマトグラフィ紙、ろ過及び微量プレート読み取り器のような様々な流体取り扱い分析器を介して、そのような工程を達成することができる。
【００４０】
検査法ではすべて同一方法にて、細菌の検出のために糖タンパク質の有効性を測定する。細菌の非存在下で得られるシグナルの３つの標準偏差である細菌検出シグナルを得ることによって有効性を測定する。
【００４１】
１０００の細菌細胞／ｍＬの検出で糖タンパク質が有効であるためには、会合定数は少なくとも１０＋６でなければならず、結合部位の数は少なくとも１００でなければならない。細菌への糖タンパク質の結合強度及び細菌への糖タンパク質の結合部位の数のこれら測定値によって、十分な細菌検出シグナルが可能になる。１０００細菌細胞／ｍＬの検出限界は、最低限の臨床的に所望の閾値である。そのほかの試料成分、たとえば、そのほかのタンパク質への糖タンパク質の結合に関する差し支えのないバックグランドの読み取りは、１０＋４未満の会合定数でなければならない。代表例としてＡＬＰを用いて、５ｘ１０＋６の結合定数及び結合部位の数は５９０であると概算された。
【００４２】
実施例１
腸のアルカリホスファターゼの結合による細菌アッセイ
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１０６〜１０８細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ペレット形態における洗浄した細胞を水４０μＬに浮遊し、水性のウシ腸のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）１０μＬを加えた（２μｇ又は１０，０００単位）。混合物を室温にて３０分間静置し、次いで細菌のペレットを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。洗浄上清をすべて集めた。細胞なしのブランクを同じ方法で希釈した。最終ペレットを水５０μＬに浮遊し、ｐＨ７．５のトリス又はＥＰＰＳ緩衝液中０．００５Ｍのパラ−ニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ）２．５μＬを用いて、ＡＬＰの結合の検出について、上清及び細胞浮遊液の双方を検定した。基質の加水分解により、黄色（ＰＮＰＰ）又は青緑色（ＢＣＩＰ）を生じるが、それは細菌に結合したＡＬＰの量に直接比例する。ｐＨ７．５のトリス緩衝液において青／緑色を形成するＢＣＩＰ（ブロモ−クロロ−インドリル−リン酸）のような普通の基質を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を調べた。室温にて１０分後、プレートリーダー（バイオテック・パワーウエーブ・アブソーバンス・リーダー）において４０５ｎｍの波長にて試料を読み取った。対照として、ＡＬＰの添加なしで、細菌の並行したセットを扱った。
【００４３】
腸のＡＬＰの細菌への結合を観察した。図１では、縞模様の棒は、ＡＬＰ処理及び洗浄後浮遊した細胞が無処理の細胞（黒い棒）よりも多くの腸のＡＬＰ活性を有することを示している。黒い棒は、腸のＡＬＰで処理しなかった細胞が、細菌における生来のＡＬＰに由来すると考えられる、若干のＡＬＰ活性を有した事を示している。対照として、処理溶液のＡＬＰ活性は、生来のＡＬＰからの寄与なしで予想される最大の活性を示す。
【００４４】
図１は、調べた細菌株すべてに対する腸のＡＬＰの結合を立証している。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（Ｓｆ）株＃３及び＃６のようなグラム陽性細菌ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）株＃９及び１４のようなグラム陰性細菌は双方とも、ＡＬＰに結合することが見い出された。再び、黒い棒より有意に長い縞模様の棒はこのことを立証している。図２は、結合したＡＬＰ又は生成した活性の量が存在する細菌細胞の量に直接比例することを示す。浮遊した細胞のＡＬＰ活性は、細胞の量の増加と共に上昇した。
【００４５】
細菌へのＡＬＰの結合のメカニズムは完全に理解されているわけではないが、ＡＬＰ又はそのほかの糖タンパク質における糖化されたペプチドが細胞壁でアンカーとなっているタンパク質受容体に結合しているか、又はペプチドグリコン膜を結合していると考えられている。グラム陽性細菌及びグラム陰性の細菌は双方共、その外側膜にタンパク質受容体を有することが知られている。グラム陰性細菌については、外側のリポ多糖体膜が受容体タンパク質を有する。グラム陽性細菌については、外側のペプチドグリコン膜が受容体タンパク質を有する。
【００４６】
実施例２
非糖化タンパク質の細菌への結合による細菌アッセイ
対照として、細菌細胞壁への結合について、糖化を欠く酵素タンパク質、β−ガラクトシダーゼを調べた。Ｓｔａｐｈ．及びＥ．ｃｏｌｉの細菌をβ−ガラクトシダーゼ結合について調べた。双方の細菌の１０８細胞／ｍＬの生理食塩水浮遊液にβ−ガラクトシダーゼ（２０ｍＵ）を加え、基質としてジメチルアクリジニウムＢ−Ｄ−ガラクトース（ＤＭＡＧ）を用いて、細菌を遠心した後のペレット（水に再浮遊した細胞）及び上清を調べた。酵素の量を確定するためのアッセイは、水性ＤＭＡＧ（０．５ｍＭ）１０μＬ及びｐＨ７．５に調製した水性トリス緩衝液（１Ｍ）５μＬ、又は検査用細菌（１０７細胞）及び水を加えて１００μＬとした。５〜３０分で（β−ガラクトシダーゼは、５分以内で）ＤＭＡＧの明るい黄色が薄緑〜紺色に変化し、それはプレートリーダーにて６３４ｎｍで読み取られる。
【００４７】
β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、非糖タンパク質であり、かつ非膜タンパク質である。これらの実験では、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは細菌を結合しなかったし、細菌の測定は可能ではなかった。
【００４８】
実施例３
糖化タンパク質の細菌への結合による細菌アッセイ
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１〜４．５ｘ１０７細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ペレット形態の洗浄した細胞を、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］ＥＰＰＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）２０μＬ及び水３０μＬに浮遊した。糖化されたタンパク質（２〜４０μｇ）を加えた。場合によっては、糖化タンパク質（２〜４０μｇ）及び腸のアルカリホスファターゼ（２μｇ又は１０，０００単位）を加え、ＡＬＰの結合を減らすことにより糖化タンパク質の結合を測定した。
【００４９】
糖化タンパク質と細菌細胞の混合物を２５℃にて１５分間静置した。混合物を３０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、その後、細菌細胞が試験管の底でペレットを形成し、それを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。遠心分離によって、結合していない糖化タンパク質から細菌細胞に結合した糖タンパク質を分離することができる。
【００５０】
洗浄後、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬに細菌細胞を浮遊した。パラ−ニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ、１００ｍＭ）５μＬ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬ及び水１４０μＬを添加することにより、ＡＬＰの結合の検出について浮遊液の一部５μＬを調べた。ＰＮＰＰ基質の加水分解は結果として黄色を生じた。１５〜３０分の間で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにて色を読み取った。吸収は、糖化された基に対する細菌細胞の接着に結合したＡＬＰの量に直接比例する。
【００５１】
細菌への結合について、種々の糖化されたタンパク質及び糖化されていないタンパク質を調べた（表１を参照のこと）。アルブミン、プレアルブミン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−１−ミクログロブリン、レチノール結合タンパク質、α−１−酸性糖タンパク質、α−２−糖タンパク質、トランスフェリン、タム・ホースフォール糖タンパク質及び免疫グロブリンは、すべて供給業者から受領されるような糖化タンパク質として知られている。ヘモグロビン、リゾチーム及びミオグロビンはすべて供給業者から受領されるような非糖化タンパク質として知られている。クマシーブリリアントブルーを用いて、結合したタンパク質を測定することにより、タンパク質はすべて細菌細胞に結合することが判明した。
【００５２】
糖化された基に対する細胞接着に結合するタンパク質だけが、細菌によるＡＬＰの結合の阻害を引き起こす。糖化された基に対する細胞接着に結合するタンパク質は、表１において正の数を提供する。たとえば、アルブミンは、ＡＬＰの大腸菌への結合を５０％妨げた。表１に見られるように、糖化されたタンパク質はすべて細菌によるＡＬＰの結合を阻害した。ヘモグロビン、ミオグロビン及びリゾチームのような糖化されていないタンパク質は、ＡＬＰの結合を阻害しなかった。対照として、３種の非糖化ペプチド（ポリアルギニン、ポリリジン、ポリヒスチジン）を調べたが、ＡＬＰ活性の阻害は見られなかった。
【００５３】
【表１】
2005529612.tif 000003
【００５４】
見ることができるように、糖化されたタンパク質は細菌に結合することができ、試料に存在する細菌の量を確定するのに使用することができる。結合した、及び／又は遊離の糖化されたタンパク質の標識の量の決定は、幾つかの方法で行うことができる。
【００５５】
ＡＬＰは、実施例１で実証したように、酵素の機能性を有し、かつシグナルを生成する糖化タンパク質の一例である。酵素の糖化されたタンパク質のそのほかの例には、酸性ホスファターゼ、フコシダーゼ、ホスホリパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヒドロラーゼ、アリールスファターゼＡ、アミラーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びペルオキシダーゼが挙げられる。
【００５６】
別の方法としては、糖化タンパク質を標識して、細菌に結合した量を示すシグナルを提供してもよく、たとえば、クマシーブリリアントブルーが実施例３で使用されている。そのほかの標識は、色原体、標識を伴った酵素抗体、あるいはゴールドゾル又は着色ラテックスのような粒子であればよい。普通の標識には、放射活性化合物、蛍光化合物、電気活性化合物、化学発光化合物、酵素及び粒子状物質が挙げられる。
【００５７】
ブロッキング添加物を使用して、競合反応をブロックし、干渉を減らし、又は拡散剤として作用することができる。例は、実施例３の非結合性糖タンパク質である。そのほかは、ポリ（ビニルピロリドン）又はポリビニルアルコールのようなポリマー、及びカゼイン、ゼラチン、アルブミンのようなタンパク質、疎水性セルロース、及び多糖類である。
【００５８】
実施例４
細菌へのＡＬＰアイソフォームの結合による細菌アッセイ
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１〜４．５ｘ１０７細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０にて５０ｍＭ）２０μＬ及び水３０μＬに、ペレット形態で洗浄した細胞を浮遊した。ブロッキング添加剤としてヘモグロビン（２０μｇ）加えた。腸、胎盤及び細菌の供給源からのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（１００ミリ単位）を加えた。
【００５９】
糖化タンパク質及び細菌細胞の混合物を２５℃にて１５分間静置した。混合物を３０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、その後、細菌細胞が試験管の底でペレットを形成し、それを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。遠心分離によって、結合していない糖化タンパク質から細菌細胞に結合した糖タンパク質を分離することができる。
【００６０】
洗浄後、四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５にて２５ｍＭ）５０μＬに細菌ペレットを浮遊した。パラ−ニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ、１００ｍＭ）５μＬ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬ及び水１４０μＬを添加することにより、ＡＬＰの結合の検出について浮遊液の一部５μＬを調べた。ＰＮＰＰ基質の加水分解は結果として黄色を生じた。１５〜３０分の間で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにて色を読み取り、吸収は、糖化された基に対する細菌細胞の接着に結合したＡＬＰの量に直接比例する。結果を図３で説明する。
【００６１】
胎盤、細菌及び腸の供給源からのＡＬＰアイソフォームを比較することによって、どのグリコシル化が結合に必要なのかを理解することができる。腸、肝臓、骨及び胎盤のＡＬＰのアイソフォームは、炭水化物の構造及びシアル酸の量に差異を有する。腸のＡＬＰはその炭水化物鎖において末端シアル酸を欠くが、胎盤及び細菌のものはシアル酸残基を有する。細菌のＡＬＰは、哺乳類のＡＬＰに存在する膜結合型の糖リン脂質部分を欠く。胎盤のＡＬＰはフコース、マンノース及びガラクトースを含有するが、腸のＡＬＰは高いヘキソース及びヘキソアミン含量を有する。
【００６２】
図３によれば、細菌のＡＬＰは細菌を結合するが、糖リン脂質を欠くので、糖リン脂質は細菌への糖タンパク質の結合に対する必要条件ではない。胎盤のＡＬＰは細菌に対する最少の結合と同様に最少の酵素活性を示したが、ＡＬＰはすべて、ある程度、細菌に結合した。この結果は、ある程度のグリコシル化が細菌に対するさらに良好な結合剤であるという我々の考えを支持した。
【００６３】
ポリリジンを結合した腸のＡＬＰも細菌に結合することが判明した。非糖化ペプチドとのＡＬＰの結合が、細菌への結合を阻害することは見い出されず、標識のためのリンカーアームを提供すればよい。
【００６４】
実施例５
炭水化物、多糖類、糖ペプチド及びレクチンの存在下における細菌アッセイ
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１〜４．５ｘ１０７細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０にて５０ｍＭ）２０μＬ及び水３０μＬに、ペレット形態で洗浄した細胞を浮遊した。ブロッキング添加剤としてヘモグロビン（２０μｇ）加えた。ウシの腸からのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（１００ミリ単位）、単純糖質又はプロテオグリカン又はレクチン１５μｇを加えた。
【００６５】
糖化タンパク質及び細菌細胞の混合物を２５℃にて１５分間静置した。次いで、混合物を３０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、その後、細菌細胞が試験管の底でペレットを形成し、それを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。遠心分離によって、結合していない糖化タンパク質から細菌細胞に結合した糖タンパク質を分離することができる。
【００６６】
洗浄後、四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５にて２５ｍＭ）５０μＬに細菌ペレットを浮遊した。パラ−ニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ、１００ｍＭ）５μＬ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬ及び水１４０μＬを添加することにより、ＡＬＰの結合の検出について浮遊液の一部５μＬを調べた。ＰＮＰＰ基質の加水分解は結果として黄色を生じた。１５〜３０分の間で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにて色を読み取り、吸収は、糖化された基に対する細菌細胞の接着に結合したＡＬＰの量に直接比例する。
【００６７】
糖質、プロテオグリカン及びレクチンの非存在下、表２において、１．８〜２．０の吸収によってＡＬＰの細菌への結合が示された。グルコース、マンノース、ガラクトースを含む単糖類（単純糖質）及びシアル酸は、ＡＬＰ（供給源すべて）の細菌への結合にいかなる影響も生じなかった。したがって、単純糖質は、結合に関与せず、検出標識への結合のための細菌結合剤としては好適ではない。このことはまた、結合剤として、単純な糖単位ではなく、糖タンパク質又は糖ペプチドの必要性を支持している。
【００６８】
多糖類は、反復糖質単位によって、ある程度、ＡＬＰの細菌への結合を弱く阻害する。これらの結果は、多糖類がＡＬＰとの細菌の結合に関与することを示している。Ｎ−アセチルガラクトサミンを持つ多糖類はさらに阻害性であり、おそらく残留するペプチド単位を含有していた。それに対して、リポ多糖類（ＬＰＳ）は、調べた供給源（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２種の異なった血清型に由来するＢ４及びＢ８）について何ら影響はなかった。リポ多糖類は、外側構造に脂質Ａ及びＯ抗原を含有し、多糖体の核を露出していない。
【００６９】
リポタイコ酸は、反復糖質単位及びアミノ酸（Ｈｙｌ）単位を持つ多糖類の例である。多糖体の構造は、ＬＴＡの供給源によって変化する。Ｎ−アセチルガラクトサミンを持つ構造及びそれを持たない構造が知られている。我々の結果では、ＬＴＡ（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）は、細菌に結合するＡＬＰの活性を強く阻害したが、供給源によっては、阻害の変化又は阻害の欠損が観察された。反復糖質単位及びアミノ酸（Ｈｙｌ）単位を持つタイコ酸自体は、同等に阻害性であることが判明した。このことは、細菌への糖タンパク質の結合には糖質成分とアミノ酸成分とが関与するという我々の考えを支持している。
【００７０】
レクチンは、植物種子に見い出されるタンパク質であり、ペプチドに結合する多糖類及び単糖類を結合する。表２に見られるように、レクチンが結合する多糖体単位に依存して、レクチンは、ＡＬＰの細菌への結合を阻害した。これらの結果は、細菌とＡＬＰとの結合への糖ペプチドの関与を支持している。レクチンは、ＡＬＰの糖基を結合し、それが細菌と反応するのを妨げる。幾つかのレクチンは活性があるが、１種類の糖基のみを結合するので、幾種類かの糖ペプチド基は、細菌へのＡＬＰの結合を引き起こすことができる。
【００７１】
【表２】
2005529612.tif 000004
【００７２】
幾つかの方法で、糖化タンパク質又は糖化ペプチドを、標識又は標識の一部に接続することができる。実施例５におけるデータは、糖化される部分は、多糖体又は少なくとも１種のペプチドに結合した単糖体であることができることを示している。多糖類及び単糖類の例は、表２のものが挙げられる。
【００７３】
実施例６
細菌に結合した糖化タンパク質の代替分離法
マイクロタイタープレート（ヌンク・ナルゲインターナショナル）の裏に付けた膜（低タンパク質結合、ナイロン６６ロプロダイン）を用い、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に結合した細菌を分離することができる。
【００７４】
ロプロダイン膜を裏に付けたプレートを、水又は緩衝液（ＴＢＳ：１５０ｍＭのＮａＣｌ又は０．１ＭのＫＣＯ３、ｐＨ９．６を含有する２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．６）中で１％又は２％の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｒｏｎＸ３０５)により、室温にて一晩処理した。ブロッキング溶液を吸引ろ過した。生理食塩水中の細菌浮遊液（１０７細胞、１００μＬ）を、ＥＰＰＳ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８．１）５０μＬ及び２０ｍＵのＡＬＰを含有するＨ２Ｏ、５０μＬと混ぜ合わせた。振盪器上で、３７℃にて１５分間、混ぜ合わせた溶液をインキュベートし、次いで、ロプロダイン膜を裏に付けたプレートに加えた。
【００７５】
膜に付着した細菌を残して、溶液を吸引ろ過し、次いで、２％のＴｗｅｅｎ２０水溶液で２回洗浄した。洗浄した膜に、グリシン（０．０５Ｍ、ｐＨ１０．４）と共に、１ｍＭのＰＮＰＰを含有する水２００μＬを加え、細菌に結合したＡＬＰによる、４０５ｎｍで読み取る色を形成した。
【００７６】
【表３】
2005529612.tif 000005
【００７７】
実施例６ではサイズ排除膜によって、また、実施例１〜５では遠心分離によって、結合していないＡＬＰからＡＬＰを結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の分離が示された。大腸菌の大きさは、１ｘ１ｘ２μｍであり、このサイズの粒子を捕捉するいかなる膜、フィルター又は装置も許容可能である。これらには、微量流体装置、フィルター、カラムクロマトグラフィ及びクロマトグラフィ紙が挙げられる。大腸菌の質量は１．６ｘ１０−１２ｇｍ／細胞であり、このサイズの塊を捕捉するいかなる膜、フィルター又は装置も許容可能である。
【００７８】
実施例７
細菌へのタンパク質の結合における二価のカチオンの効果
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１〜４．５ｘ１０７細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０にて５０ｍＭ）２０μＬ及び水３０μＬに、ペレット形態で洗浄した細胞を浮遊した。ウシ腸のアルカリホスファターゼ（２μｇ又は１０，０００単位）を加え、数種のカチオンを０．２ｍＭ加えた。
【００７９】
糖化タンパク質及び細菌細胞の混合物を２５℃にて１５分間静置した。混合物を３０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、その後、細菌細胞が試験管の底でペレットを形成し、それを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。遠心分離によって、結合していない糖化タンパク質から細菌細胞に結合した糖タンパク質を分離することができる。
【００８０】
洗浄後、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬに細菌ペレットを浮遊した。パラ−ニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ、１００ｍＭ）５μＬ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬ及び水１４０μＬを添加することにより、ＡＬＰの結合の検出について浮遊液の一部５μＬを調べた。ＰＮＰＰ基質の加水分解は結果として黄色を生じた。１５〜３０分の間で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにて色を読み取った；吸収は、細菌細胞に結合したＡＬＰの量に直接比例する。
【００８１】
【表４】
2005529612.tif 000006
【００８２】
表４に見られるように、Ｚｎ２＋（０．２ｍＭ）は細菌へのＡＬＰの有意に高い結合を生じた。図４に示すように、濃度が上昇する亜鉛の存在下、Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓの株と共に、濃度依存性の結合試験を行った。結果は、最適な結合が１ｍＭの亜鉛濃度で生じることを示した。１ｍＭのＺｎ２＋の存在下、細菌の別の株とともにその試験を継続し、５ｘ１０６の細菌濃度でもＡＬＰの結合をモニターすることができた（図５）。
【００８３】
実施例８
細菌へのＡＬＰの結合における種々のカチオンの影響
上清液から細胞を密なペレットに分離する遠心分離の後、細菌細胞（１〜４．５ｘ１０７細胞／ｍＬ）を水で２回洗浄した。ＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．０にて５０ｍＭ）２０μＬ及び水３０μＬに、ペレット形態で洗浄した細胞を浮遊した。ウシ腸のアルカリホスファターゼ（２μｇ又は１０，０００単位）を加え、各カチオンを０．２ｍＭ加えた。
【００８４】
糖化タンパク質及び細菌細胞の混合物を２５℃にて１５分間静置した。混合物を３０，０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離し、その後、細菌細胞が試験管の底でペレットを形成し、それを水で４〜５回（５０μＬ）洗浄した。遠心分離によって、結合していない糖化タンパク質から細菌細胞に結合した糖タンパク質を分離することができる。
【００８５】
洗浄後、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬに細菌ペレットを浮遊した。パラニトロフェノールリン酸（ＰＮＰＰ、１００ｍＭ）５μＬ、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０にて２５ｍＭ）５０μＬ及び水１４０μＬを添加することにより、ＡＬＰの結合の検出について浮遊液の一部５μＬを調べた。ＰＮＰＰ基質の加水分解は結果として黄色を生じた。１５〜３０分の間で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにて色を読み取った；吸収は、細菌細胞に結合したＡＬＰの量に直接比例する。
【００８６】
前述のように、細菌細胞へのタンパク質の結合ではすべて、亜鉛依存性が認められた。様々な細菌へのウシ腸粘膜ＡＬＰ（バイオザイム）の結合における種々のカチオン（２ｍＭ）の効果を図６に示す。亜鉛に加えて、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋も、細菌のグラム陽性及びグラム陰性の株双方（Ｓｆ：Ｓｔａｐｈ．Ｆａｅｃ．、Ｅｃ：Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＡＬＰの結合を刺激すると思われる。図６はまた、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）の存在下でのＡＬＰ活性の完全な阻害も示している。続きのＡＬＰ結合試験には亜鉛を用いた。図６に見られるように、細菌へのアルカリホスファターゼの結合は、カチオンの存在に大きく依存すると思われた。図７のデータは、亜鉛の非存在下及び存在下における種々の糖化タンパク質の結合を示すが、それは、グラム陽性及びグラム陰性双方の細胞壁への結合について調べたタンパク質すべてのカチオン依存性を明瞭に実証している。この試験に用いたＡＬＰの量は極めて少なかったので、酵素活性を測定することによってのみ検出することができた。
【００８７】
実施例９
ＡＬＰの結合におけるＺｎ濃度に関する最適条件
図８〜９に見られるように、グリシン緩衝液でアッセイを行った場合、ヒト胎盤のＡＬＰ活性は、そのほかの供給源からのＡＬＰに匹敵した。細菌へのＡＬＰの結合に有効な３種のカチオンのうち、ＡＬＰに結合した細菌（Ｓｔａｐｈ及びＥ．ｃｏｌｉ双方）のアッセイをグリシン緩衝液、ｐＨ１０．０で行った場合、亜鉛が最良の金属であった（図１０〜１１）。結合は、ＥＰＰＳ緩衝液中ｐＨ８．０で行った。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】実施例１の結果を説明する。
【図２】実施例１の追加の結果を説明する。
【図３】実施例４の結果を説明する。
【図４】実施例７の結果を説明する。
【図５】実施例７の結果を説明する。
【図６】実施例８の結果を説明する。
【図７】実施例８の結果を説明する。
【図８】ＡＬＰの活性におけるｐＨの影響を説明する。
【図９】ＡＬＰの活性におけるｐＨの影響を説明する。
【図１０】ＡＬＰの結合における様々なカチオンの影響を説明する。
【図１１】ＡＬＰの結合における様々なカチオンの影響を説明する。
【符号の説明】
【００８９】
図８〜１１では以下の略語を用いた：
Ｂ１ＢＺ＝第１の業者からのウシ腸
Ｂ１Ｓｉ＝第２の業者からのウシ腸
ＨＰＬ＝ヒト胎盤
Ｂａｃｔ＝細菌
【図１】
2005529612.tif 000007
【図２】
2005529612.tif 000008
【図３】
2005529612.tif 000009
【図４】
2005529612.tif 000010
【図５】
2005529612.tif 000011
【図６】
2005529612.tif 000012
【図７】
2005529612.tif 000013
【図８】
2005529612.tif 000014
【図９】
2005529612.tif 000015
【図１０】
2005529612.tif 000016
【図１１】
2005529612.tif 000017
【国際調査報告】
2005529612.tif 000018