(57)【要約】バキュロウィルスを、カプシドが１種以上の異種ペプチドまたはタンパク質を提示するように遺伝子操作する。このようなバキュロウィルスを用いて治療用薬剤を送達するように、機能的ゲノム中で使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ペプチドを１種以上提示するように修飾されているカプシドを有する、バキュロウィルス。
【請求項２】
ｖｐ３９、ｐ２４またはｐ８０が修飾されている請求項１に記載のバキュロウィルス。
【請求項３】
ｖｐ３９が修飾されている請求項２に記載のバキュロウィルス。
【請求項４】
ｖｐ３９がＮ−および／またはＣ−末端において融合タンパク質で修飾されている請求項３に記載のバキュロウィルス。
【請求項５】
修飾が核または細胞内標的化を可能にするものである、請求項１〜４のいずれかに記載のバキュロウィルス。
【請求項６】
カプシド内で異種ペプチドを１つ以上発現するようにゲノムが修飾されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項７】
バキュロウィルスベクターが少なくとも３個の遺伝子を含む、請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項８】
異種遺伝子の１つ以上が少なくとも１０ｋｂの長さである、請求項６または７に記載のバキュロウィルス。
【請求項９】
遺伝子がヒト遺伝子である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項１０】
別の細胞の核内にペプチドを送達するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバキュロウィルスの使用。
【請求項１１】
別の細胞が昆虫細胞である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
別の細胞が哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
別の細胞が大腸菌である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１〜９のいずれか１項に記載のバキュロウィルス中にクローニングした遺伝子またはゲノムフラグメントのライブラリーを作製する工程、
（ｉｉ）宿主細胞を該ベクターで形質転換する工程、および
（ｉｉｉ）所定の条件下で遺伝子の発現を検出する工程を含む標的遺伝子を選択する方法。
【請求項１５】
所定の条件が、標的遺伝子の発現を検出できる、または検出できない、異なる条件のセットを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
異なる条件が限界希釈を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉｉｉ）が表現型の同定を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
所定の条件での産物のうちの１つまたはいくつかを選択した後、工程（ｉｉｉ）を繰り返す、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、所定の条件下で発現される遺伝子を特徴付けすることを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子操作したバキュロウィルスおよびその使用に関し、特に、バキュロウィルス中に提供されるライブラリーおよびペプチドディスプレイに関する。
【０００２】
背景技術
過去数年にわたり、多数の生物のゲノムが完全に配列決定されている。ヒトゲノムの全配列の草案は公開されている。しかしながら、配列情報自体は、全ての遺伝子が何をしているのか、細胞がどのように働くのか、細胞はどのようにして生物を形成するのか、疾患においては何がおかしくなっているのか、我々はどのように老化するのか、または薬物はどのように開発されるのか、を説明していない。これこそ、遺伝子とその生成物の機能的分析を取り扱うポストゲノム時代の一領域である、機能的ゲノム学が関与する分野である。
【０００３】
機能的ゲノム学の技術の中でも、ＤＮＡマイクロアレイおよびプロテオミクスの両方が複雑な生物学的システムの研究に関して大いに期待できる。ＤＮＡマイクロアレイはトランスクリプトーム（常に細胞のゲノムから転写されたｍＲＮＡ全体）のハイスループット分析を可能にする。しかし、遺伝子が存在するかもしれないし、それらが変異しているかもしれないが、必ずしも転写されている訳ではない。転写されるが翻訳されないメッセンジャーもあり、ｍＲＮＡコピーの数は必ずしも機能的なタンパク質分子の数を反映しない。プロテオミクス（常に細胞によりコードされているタンパク質の完全なセット）は、ＤＮＡ分析によりアプローチできない問題（すなわちタンパク質産物の相対存在量、翻訳後修飾、細胞内局在、ターンオーバー、他のタンパク質との相互作用および機能的局面）に取り組む。
【０００４】
発現ライブラリー中の遺伝子により付与される観察可能な特性により、新規に配列決定したゲノム中の機能的なオープンリーディングフレーム（ゲノムライブラリー）の発見および未知の遺伝子（ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の機能の特徴付けが可能になる。その意味で、細菌細胞および真核生物細胞に同時に適合性であるライブラリー、ならびにインビトロ実験およびインビボ実験は強力な道具であろう。理論上は、プラスミドベクターで可能であるが、インビボにおけるプラスミドの遺伝子移入効率があまり良くないことはいうまでもなくプラスミドＤＮＡでは真核細胞への形質導入が効率的ではないので、フェノミクスの高生産性手段（タンパク質の自動／高処理能分析）としてのプラスミドライブラリーの有用性も減少する。
【０００５】
バキュロウィルスは長い間、バイオ農薬として、そして昆虫細胞での効率の良い組換えタンパク質産生用の道具（ツール）として用いられてきた。これらは元来、種特異性が高く、無脊椎動物以外の宿主中で増殖することは知られていないので、一般的には安全であると認識されている。
【０００６】
適切な真核生物プロモーターを含むＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は効率よく移入することができ、種々の哺乳動物細胞型においてインビトロで標的遺伝子を発現することができる。さらに、ＷＯ−Ａ−０１／９０３９０で報告されているように、バキュロウィルスはアデノウィルスと適合性であるインビボ遺伝子移入を媒介することができる。Ａｉｒｅｎｎｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１４９９−１５０４（２０００）をも参照のこと。組換えバキュロウィルスの操作の簡便性および迅速な構築、高多重度の感染の場合ですら存在しない哺乳動物細胞における細胞毒性の欠如、哺乳動物細胞における先天的な複製不能、および異種配列の挿入に対する能力の高さ（挿入制限は知られていない）が、バキュロウィルスの特徴である。
【０００７】
ｖｐ３９はバキュロウィルスの大きなカプシドタンパク質である。バキュロウィルスはレセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に入る。ウィルスは多数の哺乳動物細胞株により効率よくインターナライズされるが、非許容状態の細胞の核には侵入することができない。
【０００８】
哺乳動物細胞の効率的な形質導入の障害（ｂｌｏｃｋ）は、レセプター媒介性エンドサイトーシスによるバキュロウィルスの細胞への透過の欠如によるのではなく、ウィルスが核へと到達し得ないことによるとこれまで示唆されていた（Ｂｏｙｃｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：２３４８−２３５２，１９９６；Ｂａｒｓｏｕｍ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２０１１−２０１８，１９９７）。ウィルスの場合、エンドソームからの脱出が形質導入の障害であるというのが一般的な仮説である。
【０００９】
ウィルス表面に外来性タンパク質を提示するために、ＡｃＮＰＶの主要表面グリコプロテインを遺伝子操作することが知られている（Ｂｏｕｂｌｉｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１３：１０７９−１０８４，１９９５）。また、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４）を参照することができる。
【００１０】
困難かつ時間のかかるプラーク精製方法を避けるために、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ中での相同組換えにより遺伝物質をバキュロウィルスゲノムに形質導入することができる。Ｐａｔｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，９７−１０４，１９９２を参照のこと。この方法は迅速で、（１０〜１２日以内に純粋な組換えウィルス）、親ウィルスのバックグラウンドが確実に存在しないが、酵母培養を必要とし、この系は、古典的な移入ベクターとは適合しないおそれがある。
【００１１】
Ｌｕｃｋｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４５６６−４５７９，１９９３）は、組換えバキュロウィルス（これは、Ｔｎ７での部位特異的転位を用いて異種遺伝子を大腸菌細胞内で増幅させたバクミド（ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡ（ウィルスゲノム）に挿入する）の迅速な産生法（７日〜１０日以内に純粋な組換えウィルス）を記載している。組換えバクミドを含む大腸菌クローンを色（β−ガラクトシダーゼ）により選択し、単独の白コロニーから精製したＤＮＡを用いて昆虫細胞をトランスフェクトする。この系は複数の組換えウィルスの同時単離に適しているが、トランスフェクションの際に得られる組換えコロニー（バキュロウィルスゲノム）の相対的な割合が低い傾向がある。
【００１２】
本来の系の選択特性の悪さは、Ｌｅｕｓｃｈら（Ｇｅｎｅ  １６０，１９１−１９４，１９９５）に記載の温度感受性選択方法により改善されている。しかし、この系は使用に際して不確実であることが証明されている。
【００１３】
発明の要旨
本発明の第１の局面に従って、標的遺伝子の選択方法は以下の工程を含む。
（ｉ）ベクターとしてのバキュロウィルス中にクローニングしたゲノムまたはゲノムフラグメントのライブラリーを作製すること。
（ｉｉ）宿主細胞をベクターで形質転換すること。
（ｉｉｉ）所定の条件下で遺伝子発現を検出すること。
【００１４】
バキュロウィルスゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーは、インビトロおよびインビボの両方で真核生物細胞中で構築したライブラリーの機能的なスクリーニングを可能にすることにより、フェノミクスの強力な道具となる。細菌プロモーターのバキュロウィルスドナーベクターへの追加は、細菌細胞におけるｃＤＮＡライブラリーの発現スクリーニングをも可能にする。バキュロウィルスライブラリーは、ヒトおよび他の脊椎動物供給源由来の適切で有効な全長クローンならびに配列から構築することができる。これにより、バキュロウィルスによる標的細胞の有効な感染の組み込み（昆虫細胞）および形質導入（脊椎動物細胞）を可能にし、フェノミクスへの適用を可能にする。
【００１５】
本発明の第２の局面に従い、１種以上の異種タンパク質またはペプチド（本明細書中、後者の単語を用いるが、これにはタンパク質も含まれる）を提示するようにバキュロウィルスカプシドを修飾する。ゲノムがこれに対応して修飾されているバキュロウィルスは、本発明のさらなる局面を示す。このようなバキュロウィルスを用いて哺乳動物および他の細胞に形質導入することができる。特に、哺乳動物細胞のバキュロウィルス形質導入の主な障害が、エンドソームからの脱出にあるのではなく、ウィルスカプシドの核輸送にあることが現在示された。
【００１６】
ウィルス力価およびＡｃＭＮＰＶカプシド表面上のｖｐ３９融合タンパク質の機能性を犠牲にすることなく、新規なタンパク質体がｖｐ３９のＮ−またはＣ−末端に縮合し得ることも見出された。さらに、インビボで遺伝子移入にタグ型ウィルスを用いることができる。それゆえ、構築したバキュロウィルスは、哺乳動物細胞およびインタクトな動物へのＡｃＭＮＰＶの形質導入経路ならびに昆虫細胞における感染メカニズムのリアルタイム分析に用途の広い道具（手段）を提供する。また、カプシド修飾型バキュロウィルスは、トランスジーンの核および細胞内への標的化、真核生物細胞に対する新規なペプチドディスプレイシステムとして極めて有望である。
【００１７】
カプシドディスプレイシステムは、ｇｐ６４エンベロープディスプレイシステムと比較して多数の利点を有する。ｖｐ３９では、間質物質内の分子との会合またはカプシドアセンブリのいずれに関しても、構造モチーフは認識されておらず、ウィルスの感染の原因でもない。さらに、免疫電子顕微鏡法は、ウィルスエンベロープ上のｇｐ６４とは反対に、ｖｐ３９がカプシドの表面にランダムに分布していることを示している。バキュロウィルスエンベロープディスプレイ系はｇｐ６４のＮ末端への融合のみを可能にし、他方、ｖｐ３９は両方の末端にタグ化することができる。結果は、（どのくらいの大きさのタンパク質がバキュロウィルスカプシド上に提示され得るのか、という点については現時点では不明であるが）少なくとも２７ｋＤａのタンパク質が有効に発現されうることが示された。カプシドの長さは比較的自由に伸長することができるので、ｖｐ３９がより大きなタンパク質（例えば、最大１００ｋＤａ以上）にも適合しうると予測するのは当然である。カプシド上でのペプチドまたはタンパク質のランダムディスプレイにより、核または他の細胞内オルガネラへのカプシドの輸送が可能な部分の発見が可能になる。
【００１８】
本発明はまた、Ｔｎ７媒介性転位による組換えバキュロウィルスの産生に関する改善された方法を提供する。この方法は、修飾ドナーベクターおよびＳａｃＢ遺伝子を有する大腸菌におけるバキュロウィルスバクミドの改善された選択スキームに基づく。組換えバクミドは、ドナーベクター１μｇあたり１０５以上の頻度（無視できる程度のバックグラウンドを含む）で作製することができる。この使いやすく、効率の良いシステムは、組換えバキュロウィルスのハイスループットな作製の基礎、および単一ウィルスのより簡便な産生方法を提供する。導入された選択スキームは、大腸菌内での転位による他のベクターの構築にも有用でありうる。
【００１９】
本発明の修飾バキュロウィルスに関するさらなる使用は、任意の形態の「カプシド療法」を含む。従って、タンパク質をペプチドまたはタンパク質を核に直接輸送するためのシステムとして使用することができる。
【００２０】
特に、バキュロウィルス媒介療法の概念は、古典的なタンパク質輸送スキームの代替としてバキュロウィルスカプシドを治療用タンパク質の細胞への輸送用シャトルとして用いる可能性を含む。トランスジーン発現を必要としない治療の利点は明らかである。
【００２１】
バキュロウィルスカプシドディスプレイシステムは、哺乳動物細胞へのバキュロウィルス形質導入メカニズムならびに昆虫細胞への感染メカニズムを試験するための手軽な道具を提供する。さらに、このシステムは細胞内レベルでのバキュロウィルス標的化の可能性の拡大、および複合体ペプチドおよびタンパク質のディスプレイを強化するための新規な道具を提供する。さらに、ＥＧＦＰバキュロウィルス構築物はウィルスの哺乳動物細胞内における侵入および細胞内挙動のリアルタイムでの試験、および体内分布およびインビボ形質導入の追跡のための価値のある道具を提供する。
【００２２】
本発明のさらなる局面は新規なテトラプロモーターベクター（ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ）であり、これは細菌、昆虫および哺乳動物細胞における大型インサート含有ライブラリーのスクリーニングを可能にする。所望のＤＮＡフラグメントのクローニングは、バクテリオファージλの有効な部位特異的組換え系に基づく。さらに、ベクターは改良型ミニＴｎ７ベースの転位クローニング系であるｐＢＶｂｏｏｓｔと適合性であり、これは簡便かつ迅速な組換えバキュロウィルスの産生を可能にし、バックグラウンドを伴わない。ベクターは以下のプロモーターを含む。トリβ−アクチン、Ｔ７ｌａｃ、ｐ１０およびｐＰｏｌｈ（これらを用いてクローニングしたインサートを哺乳動物細胞、細菌細胞および昆虫細胞中で発現させることができる）。本発明により、試験遺伝子ニワトリアビジンおよび緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）を新規なベクターに簡単かつ効率よくクローニングし、宿主細胞中で発現させる。このベクターを用いることにより、全ゲノムのスケールで大型ライブラリーをスクリーニングすることが可能であり、これによりｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧをゲノム機能解析のための道具とする。
【００２３】
開発したベクターへのライブラリーのクローニングは、バクテリオファージλの有効な部位特異的組換え系に基づく。クローニングしたライブラリーは同一の組換えクローニングスキームに基づいて任意の他の系へと簡単に移すことができる。さらに、クローニングした遺伝子の形質導入は、インビボで任意のさらなるサブクローニング工程を伴うことなくバキュロウィルス媒介形質導入により直接行うことができる。アデノウィルスおよびレトロウィルスベースの系とは対照的に、バキュロウィルスをライブラリー含有ベクターとして用いることにより得られる利点は、ゲノム中に組み込むことができる挿入ＤＮＡに、既知の上限がないことである。
【００２４】
好ましい態様の説明
無脊椎動物細胞、大腸菌細胞および昆虫細胞におけるバキュロウィルスライブラリー遺伝子の高レベルでの発現を指示するために、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における標的遺伝子の高レベルでの発現を可能にするハイブリッドプロモーターまたは他の適切なプロモーターに基づいて、発現カセットを構築することができる。例えば、ｃｒｅ−リコンビナーゼ（ｌｏｘＰ）に対する標的部位を発現カセットに含めて、インビトロでの部位特異的組換えを用いてのバキュロウィルスライブラリーの簡単な構築を可能にすることができる（Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：３８１−３９２，１９９８）。バキュロウィルスライブラリーを構築するための選択肢を増やすために、ａｔｔＲおよびｃｃｄＢ部位（および、例えば、カセットでの成功したライゲーションを選択するためのクロラムフェニコール耐性または他のマーカー）を、発現カセットに含めることができる。これにより、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（登録商標）  ＧａｔｅｗａｙＴＭ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と適合するライブラリーの新規なバキュロウィルスライブラリーへの簡単な変換を可能にする。ｃｒｅ／ｌｏｘおよびＧａｔｅｗａｙ適合性に加えて、発現カセットは、例えば、上記の様な修飾後にベクターＭＣＳ中の利用可能な種々の独特な制限酵素を用いることにより古典的ライブラリー構築を可能にすることができる。
【００２５】
構築した発現カセットを、ドナーベクターとして働きうる任意の適切なバキュロウィルスプラスミドまたはバキュロウィルス系にクローニングすることができる。ｐＦａｓｔＢａｃ−１は、大腸菌内での部位特異的転位による迅速かつ簡便なｒｅ−バキュロウィルスの製造を可能にするＢａｃ−Ｔｏ−ＢａｃＴＭバキュロウィルス発現系（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と適合性であるので好ましい骨格プラスミドである。望ましい場合、カセットはまた、任意の所望のプラスミド／発現系に（例えば、バキュロウィルスのより効率の良い、直接構築を可能にするＢａｃ−ＴＯ−ＢａｃＴＭバキュロウィルス発現系のバージョンに）組み込むことができる（Ｌｅｕｓｃｈら、Ｇｅｎｅ  １６０：１９１−１９４，１９９５）。
【００２６】
また、発現カセットをバキュロウィルスゲノムの一部としてクローニングし、次いでｃｒｅ／ｌｏｘ，Ｇａｔｅｗａｙまたは直接クローニング法によりライブラリー構築を直接行う。
【００２７】
全てのクローニング作業は、標準的な分子生物学的方法を用いて行うことができる。構築したバキュロウィルスライブラリーを適切な大腸菌株（ドナープラスミド形式中でのライブラリー）、昆虫細胞および無脊椎動物細胞中での発現／表現型の影響についてスクリーニングする。選択したウィルスまたは全ライブラリーは、インビボ試験に直接用いることができる。このことは、新規なバキュロウィルスライブラリーの重大でユニークな潜在能力が緩和される；同じライブラリーを、原核生物および真核生物細胞で、および細胞（インビトロ）および動物（インビボ）研究において用いることができる。
【００２８】
例として、そしてＡｃＭＮＰＶの細胞内標的化を可能にするために、バキュロウィルスカプシドディスプレイ系を開発した。この系は、汎用性ドナーベクターに基づき、これにより所望のタンパク質をバキュロウィルス主要カプシドタンパク質ｖｐ３９（Ｔｈｉｅｍ＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２００８−２０１８，１９８９）へのＮ−またはＣ−末端融合物として効率よく産生することができる。ペプチドまたはタンパク質を標的化する可能性のある別のバキュロウィルスカプシドタンパク質としては、ｐ２４およびｐ８０が挙げられる。
【００２９】
高力価のｒｅ−ＡｃＭＮＰＶの構築物は、カプシド中における高濃度の異種タンパク質を示すことができる。タグ型ウィルスは哺乳動物細胞中への、細胞表面から核へのバキュロウィルスの形質導入経路およびバキュロウィルスのインビボでのトランスフェクション能力を試験するための簡単なツールである。このシステムは、同時に、非許容性細胞株のＡｃＭＮＰＶ形質導入の障害を研究するための強力なツール、およびｖｐ３９タンパク質中への特定の配列の組込により核または細胞内標的化を改善する可能性を提供する。ＡｃＭＮＰＶはまた、特定のリガンドまたは抗体をエンベロープに挿入することにより細胞表面レベルでの二重標的化、続いてｖｐ３９修飾による細胞内標的化を可能にすることができる。
【００３０】
機能的融合およびカプシドアセンブリを達成する機会を最大にするために、所望の物質のｖｐ３９のＮ−またはＣ−末端のいずれかへの融合を可能にする移入プラスミドを構築した（図１）。融合タンパク質産生は、強力なポリヘドリンプロモーター（例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、既出、に開示されているもの）により駆動される。コンピューターによる推測は、ｖｐ３９はＣ−末端では複雑性は低いが、Ｎ−末端で束縛されており、リンカー配列（例えば、ＧＧＧＧＳ）をＮ−末端に付加させてＮ−末端融合タンパク質に対して距離および柔軟性を与えて正確に折り畳むことができることを示した。ｖｐ３９融合タンパク質にＨｉｓ−タグをタグ化するという選択もまた好ましくあり得る。例えば、ｐＢＡＣｃａｐ−１プラスミドはＮ−末端にＨｉｓ−タグを有するｖｐ３９を産生する。しかしながら、同じ移入プラスミドを、Ｈｉｓ−タグ有り、または無しでＮ−またはＣ−末端融合物に用いることができる。この系はトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｒｏｎ）媒介性のウィルス製造に適合性である。しかしながら、ｐＢＡＣｃａｐ−１中の発現カセットは任意の所望のバキュロウィルスベクターへと簡単に動かすことができる。
【００３１】
本発明は、組織レベルまたは細胞表面レベルで主に作用する慣習的な標的化の延長として、二重標的化の可能性を含む。組織標的化の基本的な考えは、所望の細胞または組織への特異的結合を達成するために遺伝子移入ベクターの表面に特異的リガンドを付加することである。特異的なリガンド−レセプター相互作用が標的細胞の効率よい形質導入を保証するわけではないことは周知である。インターナリゼーション、エンドソームからの脱出および遺伝物質の核への輸送もまた必要とされる。形質導入は細胞膜標的部分の選択により改善することができるが、細胞質ゾルから核への経路の改善は困難なままである。エンベロープ型（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウィルスは、組織レベルまたは細胞内レベルでの効率のよい二重標的を保証する。エンベロープを所望の組織標的化部分で修飾すること、およびカプシドを細胞内標的化部分で修飾することにより、標的細胞の効率的かつ特異的な形質導入が達成されるはずである。特異的プロモーターでの転写標的化もまた、これらのベクターに加えられ得る。
【００３２】
組換えバキュロウィルスの改良型産生のための本発明の方法は、ドナープラスミドへの致死遺伝子の組込を含む。致死遺伝子産物はドナーベクターをなおも保有している細胞を殺傷することができ、一方で併用型選択負荷（ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は発現カセットのドナープラスミドからバクミドへの成功した転位の結果として、組換えバクミドのみを効率よく救出することができる。特定の実施態様において、ドナーベクターｐＢＶｂｏｏｓｔはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＳａｃＢ遺伝子を保持する（Ｔａｎｇら、Ｇｅｎｅ  ９６，８９−９３，１９９０を参照）。ＳａｃＢはスクロースの加水分解を触媒して致死性産物であるレバン（ｌｅｖａｎ）を産生するレバンスクラーゼをコードする。レバンはスクロースの存在下で細胞を殺傷する。スクロース存在下でのレバンの致死効果と追加の抗生物質負荷と比較するために、変異型遺伝子の使用は有効であり得る。
【００３３】
トランスジーンのｐＢＶｂｏｏｓｔへのクローニングが改善型選択スキームに影響を与えないことは明らかである。これらのウィルスの収率および発現特性は、通常、他の系で産生されたウィルスに類似しているか、または同一である。昆虫細胞中で、または適切なプロモーターを用いて哺乳動物細胞中で、所望の遺伝子産物を大量に発現しうる高力価のウィルス（約１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を産生する（Ａｉｒｅｎｎｅら、（２０００）、既出を参照のこと）。しかしながら、本来の方法と比較した場合の著しい差異は、バクミド組換え物はわずかなバックグラウンドを伴い、ドナーベクター１μｇあたり１０５以上の頻度で産生されうる点にある。この頻度はコンピテントＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７細胞の製造を最適化し、そして形質転換プロトコルをさらに最適化することによりさらに改善され得る。ｐＢＶｂｏｏｓｔ系のさらなる利点は、強力な選択スキームに起因して呈色選択の必要性がないことである（すなわち、プレート中での高価なＸ−ＧａｌおよびＩＰＴＧの必要がない）。このため、この系は費用効率がよい。
【００３４】
要するに、提示した新たな選択スキームの使用は大腸菌中でのバキュロウィルスゲノムの本来の転位に基づく生産と関連した欠点を迂回しつつ、簡単で迅速かつ便利なウィルス産生を保持する。大腸菌株での染色体ａｔｔＴｎ７を占める致死性遺伝子のドナープラスミドへの追加は、費用効率のよい様式での組換えバクミドの効率のよい選択を可能にする。改良型ｐＢＶｂｏｏｓｔシステムは発現ライブラリースクリーニングと同様に高処理適用に適しているが、また、単独の組換えウィルスの構築をも向上させる。
【００３５】
上記のように、本発明の１つの局面は特定のベクターである。任意のさらなるサブクローニングを用いることなく単独のベクターのみを用いることにより、異なる宿主系でのクローニング遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーの発現を可能にするベクターを構築するため、同じベクター中で４つの異なるプロモーターを組み合わせた。このテトラプロモーターカセットは、ｐＰｏｌｈ、ＣＡＧ（ＣＭＶｉｅエンハンサー＋ニワトリβアクチンプロモーター）、Ｔ７ｌａｃおよびｐ１０からなり、これは、脊椎動物細胞、大腸菌およびバキュロウィルス感染昆虫細胞での標的遺伝子の高レベルでの発現を指令する。これを以下により詳細に記載し、図３に示す。ｐＰｏｌｈプロモーターの後の複数のクローニングサイトは、バキュロウィルスの特性を修飾するか、またはマーカー遺伝子を発現して本明細書中に記載の組換えバキュロウィルスの合成を検出する選択肢を可能にする。所望のライブラリー（または遺伝子／ｃＤＮＡｓ）のベクターへの効率のよい組換えクローニングを可能にするため、ａｔｔＲ１／２部位（これにより、この組換えクローニング系用にはベクターをデスティネーションベクターにする）を含むバクテリオファージλの部位特異的ＲＣカセットをプラスミドに含ませた。さらに、テトラプロモーター−ＲＣカセットを用いて組換えバキュロウィルスの迅速かつ高処理能の産生を可能にするために、それを組換えバキュロウィルスのゼロバックグラウンド産生を可能にするｐＢＶｂｏｏｓｔベクターの一部としてクローニングすることができ、これによりライブラリースクリーニングに適切となる。実際の、クローニング方法および所望のバキュロウィルスライブラリーの産生方法を示すフローチャートを、図４に示す。
【００３６】
ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧベースの系をライブラリースクリーニングベクターとしての普遍的な選択とする事項がいくつかある。主な利点の１つは、多数の別の宿主系に対する適合性である。ライブラリー（または単独の遺伝子／ｃＤＮＡ）は、大腸菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞およびインタクトな動物中でさえ、作製したバキュロウィルスを用いることによりインビボで発現され得る。任意のさらなるサブクローニング工程を伴うことなくインビトロライブラリースクリーニングから動物試験への迅速な移行を提供し得、それゆえ疾患に関連する遺伝子のスクリーニングを顕著に容易にするので、最後の選択肢が最も重要である。この状況では、バキュロウィルスの親和性は試験したウィルス遺伝子移入ベクターの中で最も広いものの１つである。
【００３７】
この系の第２の長所は、野生型のバックグラウンドを伴わずにバキュロウィルスを含むライブラリーを作製する効率のよいクローニングスキームに依る。バクテリオファージλの部位特異的組換えおよび改良型ミニＴｎ７転位システムを含む２個の連続したＲＣ工程に基づく。ライブラリー構築におけるＲＣストラテジーの使用は、クローニング方法に基づいて従来の制限酵素／リガーゼを超える種々の利点を提供する。まず、希望のクローンは内部に存在する制限部位では消化されず、クローニングの間の制限酵素消化が無いので全長ライブラリーの忠実度は改善される。第２に、用いるバクテリオファージλのＲＣ系は、制限酵素処理−ライゲーションに基づくストラテジーよりも良好なクローニング効率を提供する。さらに、他の多くの対応する部位特異的リコンビナーゼ系とは反対に、バクテリオファージλの部位特異的組換え系は可逆的である。この特性は、新規ベクターにクローニングした任意のフラグメントを同じ系を用いて任意の他のベクターに簡単に移すことができること、そして逆もまた同様であることを意味する。
【００３８】
高いクローニング効率といっしょになった迅速かつバックグラウンドを有さないバキュロウィルスの産生により、同様の組換え方法または慣習的なクローニング方法により可能となった以上に簡単に代表的ライブラリーが得られる。この系における組換えバキュロウィルスゲノムは大腸菌内で産生されるので、個別のクローンに単離するためのプラーク精製を行う必要がない。これはまた、ラベルした（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）ライブラリーのスクリーニングおよび産生を可能にする。
【００３９】
バキュロウィルスライブラリーを用いるさらなる利点は、長いＤＮＡインサートをスクリーニングできることである。また、ライブラリー構築に用いたＲＣ工程は長いインサートの移入を可能にする。対照的に、近年のアデノウィルスおよびレトロウィルス移入ベクターは、８ｋｂ未満の外来ＤＮＡをゲノムに組み込むことができる。取出したポリＡ  ＲＮＡから開始する、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧベースの系を用いるバキュロウィルスライブラリーの構築は、１週間以内に完成させることができる（図４）。候補クローンのスクリーニングおよび同定後、インビボ試験用のウィルス増幅は１〜２週間以内に完成させることができる。
【００４０】
バクテリオファージλのＲＣの概要から分離した、ベクター中の第２のバキュロウィルスプロモーター（例えば、ｐＰｏｌｈ）の存在は、産生したバキュロウィルスライブラリーへのさらなる特性のクローニングを可能にする。この特性は、産生した組換えバキュロウィルスの同定用ｐＰｏｌｈの下の蛍光マーカーのクローニングにより例示される。他の対応するアプローチは、ｐＰｏｌｈプロモーター下でＧＰ６４またはＶＰ３９融合タンパク質をクローニングすることによりバキュロウィルスコートまたはカプシドのウィルスライブラリーまたは修飾を偽タイプ分け（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｉｎｇ）し、これにより、産生したウィルスの特定の細胞型への、またはその内部へのより具体的かつより効率のよい標的化が可能になる。
【００４１】
以下の表は本試験で用いたベクターを示す。
【表１】
2005519620.tif 000002
【００４２】
以下の実施例は本発明を例示する。
【００４３】
実施例１
カプシドディスプレイベクター
カプシドディスプレイ用の一般的なバキュロウィルスベクターを構築するために、ｖｐ３９（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ２２９７８）の４６９〜１５０６位のヌクレオチド（ｎｔ）に対応する領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により精製バクミドＤＮＡから増幅した（Ｌｕｃｋｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４５６６〜４５７９，１９９３）。正方向プライマーは、以下：
【数１】
2005519620.tif 000003
（ｖｐ３９遺伝子のｎｔ４６９〜４８６位に特異的な配列は太文字である。ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位は下線を付した。開始コドンを有する６×ヒスチジンタグはイタリックである。）で示される。逆方向プライマーは、以下：
【数２】
2005519620.tif 000004
（ｖｐ３９遺伝子のｎｔ１４８９〜１５０６位に特異的な配列は太文字である。ＫｐｎＩ，ＸｂａＩおよびＳｐｅＩ部位は下線を付した。６×ヒスチジンタグはイタリックである。停止コドンは小文字である。）で示される。アニーリングを５８℃に設定したことを除いて、ＰＣＲは基本的にはＡｉｒｅｎｎｅら、Ｇｅｎｅ１４４：７５−８０、１９９４に記載されるとおりに実施した。増幅フラグメントをＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩ酵素で消化し、Ａｉｒｅｎｎｅら、既出に記載の通りに精製した。精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩ消化ｐＦａｓｔＢＡＣ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＡＣｃａｐ１と命名した。ヌクレオチド配列は配列決定により確認した（ＡＬＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００４４】
ＥＧＦＰ提示ウィルスの調製
ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ５５７６２，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）からＰＣＲにより増幅し、ｐＢＡＣｃａｐ−１にクローニングした。２個のプライマーセットを用いてｖｐ３９のＮ−およびＣ−末端の両方へのＥＧＦＰの融合を可能にした。Ｎ末端融合に関しては、正方向プライマーは、以下：
【数３】
2005519620.tif 000005
（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ６７０〜６９９位に特異的な配列は太文字。ＥｃｏＲＩ部位はイタリック。）であり、逆方向プライマーは、以下：
【数４】
2005519620.tif 000006
（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ１３７５〜１３９５位に特異的な配列は太文字。ＢａｍＨＩ部位はイタリック。）である。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ６７０〜１３９５位に対応する増幅フラグメントをＳｐｅＩ／ＸｂａＩ欠失ｐＢＡＣｃａｐ−１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＥＧＦＰｖｐ３９と命名した。
【００４５】
Ｃ末端バージョンに関しては、正方向プライマーは、以下：
【数５】
2005519620.tif 000007
（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ６８２〜７０２位に特異的な配列は太文字。ＳｐｅＩ部位はイタリック。）であり、逆方向プライマーは、以下：
【数６】
2005519620.tif 000008
（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ１３７５〜１３９８位に特異的な配列は太文字。ＳｐｅＩ部位はイタリック。停止コドンは小文字）である。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のｎｔ６８２〜１３９８位に対応する増幅フラグメントをｐＢＡＣｃａｐ−１のＳｐｅＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドはｐｖｐ３９ＥＧＦＰと命名した。ヌクレオチド配列を配列決定（ＡＬＦ）により確認した。
【００４６】
製造業者の説明書に従ってＢａｃ−Ｔｏ−ＢａｃシステムＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、組換えウィルスを作製した。ウィルスを濃縮し、Ａｉｒｅｎｎｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１４９９〜１５０４，２０００に記載の通りに勾配精製した。Ｓｆ９細胞で終点希釈アッセイによりウィルス力価を測定した。ウィルス調製物に対して不稔試験を行い、リポ多糖およびマイコプラズマ汚染を伴わないことを分析した。
【００４７】
イムノブロット法
約６０，０００感染細胞に対応するサンプルまたは培養培地（４ｍｌ）由来のウィルスを還元条件下で１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ゲルをニトロセルロースフィルターにブロットし、Ａｉｒｅｎｎｅら（１９９４）、既出に記載の通りに免疫染色した。ポリクローナルウサギ抗ＥＧＦＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）を１次抗体（１：４０００）として使用し、ヤギ抗ウサギ血清（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）を２次抗体（１：２０００）として使用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量標準はＢｉｏ−Ｒａｄからのものである。
【００４８】
電子顕微鏡法
免疫電子顕微鏡法に関しては、ｖｐ３９ＥＧＦＰバキュロウィルス粒子を、ＰＢＳ中５％ウシ胎仔血清で処理したホルムワル（ｆｏｒｍｗａｒ）コート金属グリッドに結合させ、抗ＧＦＰ抗体（１：６００希釈、３０分）と反応させ、ＰＢＳで洗浄した。次いで、グリッドを金結合型タンパク質Ａ（直径５ｎｍ、Ｇ．Ｐｏｓｔｈｕｍａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓｌｏｔ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で２５分間処理し、ＰＢＳで２５分間洗浄した。グリッドを２．５％グルタルアルデヒドで固定し、対照とし（ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ）、１．５％メチルセルロース中０．３％酢酸ウラニルを用いて包埋した。ウィルスを形質導入したヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２およびヒト内皮大動脈ハイブリドーマ細胞（ＥＡＨｙ９２６，Ｄｒ．Ｅｄｇｅｌｌ，Ｕｎｉｖ．Ｎ．Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）を、室温で２．５％グルタルアルデヒドで１時間固定し、次いで＋４℃で１％４酸化オスミウムで１時間、固定した。脱水和の後、２％酢酸ウラニルで細胞を３０分間、室温で染色し、Ｅｐｏｎ中に包埋し、電子顕微鏡法用に切片化した。切片をクエン酸鉛および酢酸ウラニルで染色した。サンプルをＪＥＭ−１２００  ＥＸ電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ  Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて試験した。
【００４９】
免疫蛍光および共焦点顕微鏡法
コンフルエント未満のＥＡＨＹ、ＨｅｐＧ２、ＭＧ６３（ヒト骨肉腫）およびＮＨＯ（正常ヒト骨芽細胞）細胞培養物を、ｖｐ３９ＥＧＦＰバキュロウィルスで以下のようにして感染させた。最初に、細胞を氷上でＰＢＳで洗浄し、１細胞当たり８０〜１００ｐｆｕの形質導入効率を用いてウィルスを１％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中に加え、氷上で１時間インキュベートした（振盪）。バキュロウィルス侵入の際のリソソームｐＨの効果を、モネンシンを０．５μＭで補充した培地中で細胞をインキュベートして試験した。細胞を０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。次いで、ＤＭＥＭ（１０％血清含有）を加え、細胞を３７℃で種々の時間でインキュベートし、最後にＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２０分間、固定した。細胞をＥＥＡ１（初期エンドソーム抗原１；ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）で標識した。マウス抗体に対するヤギ２次抗体（Ａｌｅｘａレッド５４６ｎｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）を標識の際に用いた。細胞をモヴィオール（ｍｏｗｉｏｌ）に配置し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００  Ｍ  ＳＰエピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０）で試験した。ＥＧＦＰおよびＡｌｅｘａレッド５４６を可視化するため、誤った同時位置測定を避けるために４８８および５４６レーザー光線に対する多重トラックを用いた。ＨｅｐＧ２およびＥＡＨＹ細胞に対するライブ共焦点顕微鏡法を以下の通りに行った。細胞をチャンバー型カバーガラス（Ｎａｌｇｅ  ＮＵＮＣ，  Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）にプレーティングした。氷上にウィルスを結合させた後、細胞を、加熱作業ステージおよびＴｅｍｐｃｏｎｔｒｏｌ  ３７−２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により制御される対物レンズを備えた共焦点顕微鏡に移した。ＥＧＦＰに関してポジティブである細胞を、ＬＳＭ５１０ソフトウェアのプログラム（プログラムバージョン２．３；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて種々の時間間隔でスキャンした。
【００５０】
ラット脳へのインビボ注射
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（３２０〜３５０ｇ）をフェンタニール−フルアニゾン（ｆｌｕａｎｉｓｏｎｅ）（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ，Ｈｙｐｎｏｒｍ（登録商標），Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）およびミダゾラム（ｍｉｄａｚｏｌａｍｅ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｄｏｒｍｉｃｕｍ（登録商標），Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を含む溶液（０．１５０ｍｌ／１００ｇ）の腹腔内投与で麻酔し、定位固定装置に配置した（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。バーホールを以下の定位座標に従って開けた。矢状縫合（ｓａｔｕａ  ｓａｇｉｔｔａｌｉｓ）に対して１ｍｍおよびブレグマに対して＋１ｍｍ。０．９Ｎ  ＮａＣｌ中、ＥＧＦＰｖｐ３９またはｖｐ３９ＥＧＤＰバキュロウィルス（１００μｌ、０．９×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を、３．５ｍｍの深さまで２７ゲージ針のＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて４×５分の期間で注射した。遺伝子移入の７時間後、ＣＯ２で動物を屠殺した。ラットを、心臓横断経路で１０分間還流し、続いて４％パラホルムアルデヒド／０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１０分間、固定した。脳を取り出し、イソペンタンで簡単に凍結させ、４０μｍの厚さの凍結切片を調製した。スライドを蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７０顕微鏡、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｊａｐａｎ）ですぐに分析し、データをＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアで回収した。
【００５１】
ＥＧＦＰ提示ウィルスの特徴付け
ＥＧＦＰｖｐ３９またはｖｐ３９ＥＧＦＰをコードするウィルスで感染させたＳｆ９細胞は、イムノブロットにおいて予測された６７ｋＤａのバンドを生じた。同じ結果は勾配精製したウィルス調製物から得られた。これらの結果より、両方のｖｐ３９変異体は昆虫細胞中で効率よく産生され、ウィルス粒子中に組み込まれることが示唆された。しかしながら、融合タンパク質がウィルスカプシドの一部であることを確認するために、ｖｐ３９ＥＧＦＰウィルスを勾配精製し、抗ＥＧＦＰとインキュベートし、タンパク質Ａ金（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｇｏｌｄ）で標識し、電子顕微鏡で分析した。ウィルスカプシドは典型的な棒状形態を示し、エンベロープ型ではないカプシドの表面は密に金で標識されていた。インタクトなビリオンは標識されていなかった。従って、大量のＥＧＦＰは、組換えバキュロウィルスカプシドの周りに均一に分配されていた。
【００５２】
１ウィルス粒子当たりに組み込まれたＥＧＦＰの量を推定するために、精製ウィルス粒子の系列希釈を免疫ブロットし、既知量の精製ＥＧＦＰと比較した。分析は、１ウィルス粒子当たり約８６０ＥＧＦＰ分子が組み込まれていることを示した。ｖｐ３９ＥＧＦＰウィルス調製物の検出した蛍光をＥＧＦＰコントロールと比較することにより、１カプシド当たり５９０ＥＧＦＰ分子と評価した。また、高い割合のカプシドがｖｐ３９ＥＧＦＰから構成されていることに従い、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより高い組込率もまた支持された。勾配精製し、濃縮した（２００×）ＥＧＦＰｖｐ３９およびｖｐ３９ＥＧＦＰウィルスの力価はそれぞれ９．５×１０９および８．８×１０９ｐｆｕ／ｍｌであるので、ウィルスのアセンブリは融合タンパク質による影響を受けない。
【００５３】
バキュロウィルス媒介性形質導入
ｖｐ３９ＥＧＦＰウィルスの細胞内経路を、ＥＧＦＰタグ化カプシドおよび蛍光標識した細胞内コンパートメントを共焦点顕微鏡によりモニターすることにより追跡した。ＥＡＨＹ、ＨｅｐＧ２、ＭＧ６３およびＮＨＯ細胞を種々の時点で形質導入し、ウィルスの初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）との同時局在を研究した。ＥＡＨＹ、ＭＧ６３およびＮＨＯ細胞はＬａｃＺ−バキュロウィルスを用いてのバキュロウィルス形質導入に関して完全に非許容性であることがわかっているので、これらの細胞を選択した。プレート内には、非常に高い形質導入効率（１０００）での１０ｍＭ酪酸ナトリウム存在下の場合（これは遺伝子発現を増強する）でさえ、Ｘ−ｇａｌ染色により青く染色された細胞は検出されず、他方、青く染色されたウサギ大動脈平滑筋細胞（ＲＡＡＳＭＣ）の量はＡｉｒｅｎｎｅら（２０００、既出）により示された結果と一致した。
【００５４】
バキュロウィルスはエンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入することが知られている。カプシドが核に送達される前に、バキュロウィルス外殻は、ウィルスのｇｐ６４の助けを借りて中程度の酸性条件下で初期エンドソームの膜と融合する。形質導入の３０分後（ｐ．ｔ．）、ＨｅｐＧ２およびＥＡＨＹ細胞の両方で初期エンドソーム中になおウィルスが存在することが見いだすことができた。形質導入の４および２４時間後に、ウィルスはＥＡＨＹ細胞中でＥＥＡ１と同時に局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｓｅ）しなかった。このことは、ウィルスが既に初期エンドソームから脱出していることを示唆している。しかしながら、これらの細胞ではカプシドは核には侵入しないが、他方ＨｅｐＧ２細胞ではカプシドは形質導入の４時間後に核における明るい点として観察される。形質導入４時間後では、ＥＡＨＹ細胞では、カプシド（ＥＧＦＰ）陽性核の数は非常に低い（０．１％）が、他方、ＨｅｐＧ２細胞においては、ほとんど全ての核は陽性であった（９１％）。形質導入２４時間後では、ＥＧＦＰはもはやＨｅｐＧ２細胞の核とはっきりとは区別することができず、このことはカプシドが分解されていることを示唆しているが、ＥＡＨＹ細胞においては、細胞質になおも存在していた。ｒａｂ１１でのリサイクリング初期エンドソームの蛍光標識、および後期エンドソームおよびリソソームの抗ＣＤ６３での標識は、ＥＡＨＹ細胞での形質導入２４時間後でのＥＧＦＰとの同時局在は示さず、このことはウィルスカプシドがエンドサイトーシス経路に存在しないことを示唆する。形質導入４時間後のＥＡＨＹ細胞の電子顕微鏡検査によりウィルスカプシドが細胞質に存在しないことを確認し、さらに初期エンドソームから脱出していることを示唆した。ＨｅｐＧ２細胞では、カプシドは形質導入４時間後に核に存在し、これはインタクトなカプシドは初期エンドソームから放出された後に核へと輸送されたことを示す。ｖｐ３９ＥＧＦＰウィルスのライブイメージングは、同時局在研究の結果を裏付けるものであった。ＥＡＨＹ細胞の電子顕微鏡検査により、形質転換４時間後の核にはウィルスカプシドは存在しないことが確認された。バキュロウィルスのＥＡＨＹ細胞への核侵入におけるブロックが他の非許容性細胞に関しても有効であるかどうかを解明するために、ＭＧ６３（図４）およびＮＨＯ細胞をｖｐ３９ＥＧＦＰウィルスで試験した。結果は、非許容性細胞におけるバキュロウィルスカプシドの核侵入における一般的なブロックを示唆していた。
【００５５】
モネンシン存在下での細胞の形質導入は、細胞質へのウィルスカプシド入り口のブロックを導く。モネンシンは初期エンドソーム酸性化（ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を阻害し、初期エンドソームへのウィルスカプシド（ｃａｒｇｏ）の蓄積を起こす。ＨｅｐＧ２およびＥＡＨＹ細胞では、モネンシンは形質転換４時間後にＥＥＡ１陽性初期エンドソームにウィルスの蓄積を引き起こした。従って、結果は、ウィルスが許容性および非許容性細胞で同じ経路をたどることを示唆する。両方の細胞型において、これまでに昆虫細胞および哺乳動物細胞で生じることが示されているように、吸着性エンドサイトーシスにより取り込まれ、続いてｐＨ依存性の外殻とエンドソームとの融合により、バキュロウィルスが取り込まれる。
【００５６】
インビボにおけるラット脳でのウィルスの可視化
バキュロウィルス体内分布研究に対するｖｐ３９ＥＧＦＰの有用性を調査するために、ウィルスのアリコートをラット脳に注射した。ラット脳の右脳梁への注射７時間目に、ウィルスは注射部位近傍になおも明瞭に見いだされた。従って、ｖｐ３９ＥＧＦＰバキュロウィルスはインビボでのより詳細な体内分布研究に用いることができる。
【００５７】
実施例２
細菌株、プラスミド、細胞株およびウィルスＤＮＡ
大腸菌株ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）をプラスミドの増殖のために用いた。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞およびｐＦａｓｔｂａｃ１をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。ＳａｃＢ遺伝子を含むｐＤＮＲ−ＬＩＢベクターはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡから購入した。
【００５８】
修飾型ドナーベクターの構築
修飾型ドナーベクターを、ｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター中のアンピシリン耐性遺伝子をｐＤＮＲ−ＬＩＢ由来のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ＳａｃＢ）で置換することにより構築した。実際には、ｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターをＢｓｐＨＩ制限酵素で切断し、線状ベクター骨格をゲル電気泳動により精製した。ＳａｃＢ発現カセットを、プライマーＤＮＲ５’：
【数７】
2005519620.tif 000009
（ｐＤＮＲ−ＬＩＢのｎｔ１２６３〜１２８２位に関する配列は太文字。ＢｓｐＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位に下線を付す。）、ＤＮＲ３’：
【数８】
2005519620.tif 000010
（ｐＤＮＲ−ＬＩＢのｎｔ３１４９〜３１７９に関する配列は太文字。ＢｓｐＨＩ部位に下線を付す。）を用いて、ｐＤＮＲ−ＬＩＢからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。ＰＣＲは、５８℃でアニーリングを行い、ＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を増幅用に用いることを除いては、基本的にはＡｉｒｅｎｎｅら（１９９４、既出）に記載の通りに行った。増幅したフラグメントをＢｓｐＨＩで消化し、Ａｉｒｅｎｎｅら（１９９４、既出）に記載されるように精製した。精製したＰＣＲ産物を、図２に示される配向でＢｓｐＨＩで消化したｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＶｂｏｏｓｔと命名した。ＳａｃＢ＃３カセットヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定（ＡＬＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により確認した。
【００５９】
染色体ａｔｔＴｎ７ブロック型大腸菌株の構築
ＤＨ１０Ｂａｃ中の潜在性の（ｃｒｙｐｔｉｃ）ａｔｔＴｎ７部位をブロックするために、ｐＢＶｂｏｏｓｔをＢｓｅＲＩ／ＡｖｒＩＩで切断した。切除したゲンタマイシン耐性をｐＦａｓｔｂａｃ１由来のアンピシリン耐性カセット（ＡＲＣ）で置き換えた。ＡＲＣは、プライマー、ＤＨ１０Ｂａｃｉｎｔｔｎ７ｄｅｓｔｒｏｙｂｙａｍｐ５’：
【数９】
2005519620.tif 000011
（ｐＦａｓｔｂａｃ１のｎｔ４７１〜４９０位に対する配列は太文字。ＢｓｅＲＩ部位には下線を付す。）、ＤＨ１０Ｂａｃｉｎｔｔｎ７ｄｅｓｔｒｏｙｂｙａｍｐ３’：
【数１０】
2005519620.tif 000012
（ｐＦａｓｔｂａｃ１のｎｔ１４３０〜１４４９位に対する配列は太文字。ＡｖｒＩＩ部位に下線を付す。）を用いてＰＣＲにより得た。前記の通りにＰＣＲを行った。増幅したフラグメントをＢｓｅＲＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、前記の通りに精製した。精製したＰＣＲ産物をＢｓｅＲＩ／ＡｖｒＩＩ消化型ｐＢＶｂｏｏｓｔにクローニングした。得られたプラスミドをｐＢＶｂｏｏｓｔΔａｍｐと命名した。アンピシリンカセットのヌクレオチド配列をＤＮＡ配列決定法により確認した（ＡＬＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００６０】
ＤＨ１０Ｂａｃ細胞をｐＢＶｂｏｏｓｔΔａｍｐにより形質転換した。ＬＢ培地５ｍｌ中に５０μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン（Ｋａｎ）、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（Ｔｅｔ）、５０μｇ／ｍｌアンピシリン（Ａｍｐ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌ，１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１０％スクロースを含有するＬＢプレートから、シングル青色コロニーを取り出した。翌日、Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｆｏｃｕｓ１７，１０１−１０２，１９９５に記載のように、ＰＣＲによりインタクトなバクミドの存在についてコロニーをスクリーニングした。ゲル電気泳動で３２５ｂｐのバンド（インタクトなバクミドの印）を生じるコロニーにドナープラスミドが存在しないことについて、サンプルの精製したプラスミドＤＮＡをゲルに泳動することによりさらに試験した（Ｗｉｚａｒｄミニプレプ、Ｐｒｏｍｅｇａ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）。得られたクローンを大腸菌ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７として−７０℃で保存した。
【００６１】
エレクトロコンピテント細胞の調製
エレクトロコンピテント細胞を調製するために、ＬＢ−プレート（ＤＨ１０Ｂａｃに対してはＫａｎ、Ｔｅｔ、またはＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７細胞に対してはＫａｎ、ＴｅｔおよびＡｍｐ。上記の濃度。）からシングルコロニーを、適切な抗生物質を加えたＳｕｐｅｒブロス１０ｍｌ（ＳＢ；トリプシン３０ｇ、酵母抽出物２０ｇ、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸１０ｇ、水１ｌ、ｐＨ７．０）に接種した。懸濁物を一晩、３７℃で振盪機上で培養した。次いで、新規培養物の光学密度が６００ｎｍで０．８〜０．９に到達するまで（約２〜４時間）、２Ｍグルコース（５ｍｌ）を加えたＳＢ（１リットル）に、一晩培養した培養物を５ｍｌ接種した。次いで、培養物を氷上で１５分間冷却し、４℃で１５分間、１５００ｇで遠心分離した。細胞を、８００、５００、３００、２００および１００ｍｌの氷冷水／１０％グリセロールで洗浄し、上記のように遠心分離した。最終的に、細胞を１０％グリセロールで最終体積３〜４ｍｌに懸濁し、４０μｌのアリコートで−７０℃で保存した。
【００６２】
バクミドへの転位および組換えバキュロウィルスの産生
ｐＦａｓｔｂａｃ１またはｐＢＶｂｏｏｓｔドナーベクターを用いてのＨ１０ＢａｃまたはＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７（４０μｌ）のエレクトロトランスフォーメーションにより転位を行った。エレクトロトランスフォーメーションはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬにより記載されているように、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）を用いて行った。３７℃で激しく振盪して形質転換した後、細胞を４時間回復させた。培養物を７μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｅｎｔ）およびＴｅｔ（１０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ−プレート（１０％スクロース有りまたは無し）にプレーティングした。組換えバキュロウィルスゲノムの存在について、ＰＣＲにより上記の通りにコロニーを試験した。組換えウィルスを、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により提供されるプロトコルに従って作製した。
【００６３】
結果
ＤＨ１０ＢａｃまたはＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７（ここでは、染色体ａｔｔＴｎ７部位を占める）細胞における転位効率を、本来のｐＦａｓｔｂａｃ１またはｐＢＶｂｏｏｓｔドナーベクターを用いて試験し、結果を比較した。予測されたように、ｐＢＶｂｏｏｓｔの使用により、スクロース存在下での組換えバクミドの産生効率に顕著な上昇が生じた。転位効率（白コロニー）の１０倍を超える上昇がＤＨ１０Ｂａｃ細胞でのｐＢＶｂｏｏｓｔで検出された。さらに、ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７のｐＢＶｂｏｏｓｔでの形質転換では、通常、ｐＦａｓｔｂａｃ１プレートでわずか２７％のみの白コロニーが生じる場合と比較して１００％白コロニーが生じた。形態が白コロニーであるものにおける組換えバクミドの存在は、ＰＣＲにより証明した。とりわけ、ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７株の使用もまた、ｐＦａｓｔｂａｃ１を有する組換えバクミドの顕著な上昇を生じた。
【００６４】
実施例３
ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲの構築
計画したベクターへの組換えクローニングを可能にするために、ＧａｔｅｗａｙクローニングカセットＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾ｐＴｒｉＥｘ−１．１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。構築したカセットを、バキュロウィルスの迅速な産生を可能にするｐＢＶｂｏｏｓｔベクターにクローニングし（実施例２）、得られたベクターはｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧと称する（図３）。ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧのマーカー遺伝子含有バージョンを構築するために、ＤｓＲｅｄをコードする配列（ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクター、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ由来）を、ポリへドロンプロモーター（ｐＰｏｌｈ）のもと、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧのＭＣＳにサブクローニングした。このベクターをｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲと命名する。
【００６５】
アビジンおよびＥＧＦＰのｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲベクターへのクローニング
組換えクローニングに必要なａｔｔＬ１（５’）およびａｔｔＬ２（３’）部位と隣接したアビジンｃＤＮＡに縮合した細菌ｏｍｐＡ分泌シグナルを含むＤＮＡ構築物を、ＳＥＳ−ＰＣＲを用いて３工程で入手した（図５）。この産物をｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧにＬＲ−クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、得られたプラスミドをｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ａｖｉと命名した。ＥＧＦＰ構築物（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）は、アイデンティカル（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）ＳＥＳ−ＰＣＲ方法を用いて２工程で調製した後、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲにクローニングした。得られたプラスミドはそれぞれ、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＥＧＦＰおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲ＋ＥＧＦＰとして設計した。
【００６６】
遺伝子の発現およびタンパク質の特徴付け
ｏｍｐＡ−アビジンおよびＥＧＦＰの細菌発現はＴ７ポリメラーゼを発現する大腸菌ＢＬ２１株で行った。ｏｍｐＡ−アビジンの発現に関して、まず、光学密度が０．２（Ａ５９５）に達するまで、細胞を振盪培養条件で３７℃で培養し、この後、ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭで添加することによりタンパク質産生のスイッチをオンにした。一晩室温にしてアビジン合成を続けさせた。細胞を、全画分、ペリプラズム画分および不溶性画分に分画し、これらの画分を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ナイロンビーズフィルターに移した。ポリクローナルウサギ抗アビジン抗体（１：５０００）によりタンパク質を検出し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ（１：２０００）を二次抗体として用いた。０．４ｍＭ  ＩＰＴＧおよびゲンタマイシンを含有するＬＢプレートで細菌を増殖させることによりＥＧＦＰ発現を行い、産生されたＥＧＦＰをＵＶ光のもと、培養物から直接検出した。
【００６７】
ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＥＧＦＰおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲ＋ＥＧＦＰベクターを用いて、上記（実施例２）のように組換えバキュロウィルスを構築した。バキュロウィルス感染は、Ｓｆ９細胞（６ウェルプレートの各ウェルに１×１０６細胞）で３日間行った。
【００６８】
構築した発現カセットを哺乳動物細胞中で試験するために、ＨｅｐＧ２およびＣＨＯをＣＡＧプロモーターを通してのＥＧＦＰの発現用の試験細胞株として用いた。カセットの機能性を、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＥＧＦＰを用いてバキュロウィルス形質導入およびトランスフェクション（ＦｕＧＥＮＥＴＭ６，Ｒｏｃｈｅ）の両方により試験した。両方の試験で、１５０，０００細胞を６ウェルプレートのウェルにプレーティングし、２４時間後、プラスミドＤＮＡ（１〜２μｇ）によるトランスフェクションまたはＭＯＩ３００のウィルスによる形質導入のいずれかを細胞に行った。細胞をさらに２４時間インキュベーションし、蛍光顕微鏡で画像化した。
【００６９】
試験遺伝子のｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧおよびｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲへのクローニング
合成したアビジンを大腸菌のペリプラズム空間に輸送するために細菌ｏｍｐＡ分泌シグナルをアビジン遺伝子に融合させる。ｏｍｐＡ−アビジンおよびＥＧＦＰを１工程でｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ（Ｒ）にＲＣクローニングするために（図５）、クローニングシステムに必要な長形ａｔｔＬ部位を、ＳＥＳ−ＰＣＲを用いることにより含ませる。Ｍａｊｕｍｅｒら、Ｇｅｎｅ  １１０，９４，１９９２を参照。
【００７０】
試験遺伝子のアビジンおよびＥＧＦＰの発現
アビジンの発現（ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＡＶＩ）はＢＬ２１大腸菌中で効率的であり、一晩の形質導入の後、著しい割合の全細胞性タンパク質がアビジンから構成されていた。アビジンの一部は不溶性封入体として産生された。封入体ならびに全細胞サンプルはプロセシングされていない形態のタンパク質をも含んでいた（すなわち、未だにシグナルペプチドを含んでいるタンパク質）。これに対して、ｏｍｐＡシグナルは実質上全てのペリプラズムアビジンから切断されていた。ペリプラズムアビジンの機能性は、ビオチンアガロースへの結合およびアガロースに結合した全画分により試験した。プラスミドｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＥＧＦＰで形質転換した大腸菌において機能的な形態としてもまたＥＧＦＰは良好に産生されている。というのも、ＬＢプレート上で増殖する細菌培養物から直接、簡単に検出したからである。
【００７１】
ＥＧＦＰをコードするバキュロウィルスを用いてＳｆ９細胞を感染させた。感染３日後、細胞を蛍光顕微鏡で試験した。実際に、全細胞が感染していた。相応して、ＤｓＲｅｄおよびＥＧＦＰの両方を含むウィルスはＳｆ９細胞を同様に感染させた。
【００７２】
テトラ−プロモーター構築物が哺乳動物細胞においても作動することを示すためにＨｅｐＧ２およびＣＨＯ細胞を用いた。この場合、Ｓｆ９細胞を用いる場合と同様に、同じＥＧＦＰ構築物を用いた。構築物は、ＨｅｐＧ２およびＣＨＯ細胞へのバキュロウィルスとしての形質導入およびＣＨＯ細胞へのプラスミド（ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧ＋ＥＧＦＰ）としてのトランスフェクションの両方に用いた。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１はカプシドディスプレイプラスミドｐＢＡＣｃａｐ−１のマップである。プラスミドは、ペプチドまたはタンパク質のＡｃＭＮＰＶカプシドタンパク質ｖｐ３９とのＮ−末端またはＣ−末端縮合によるバキュロウィルスカプシドディスプレイ用に設計されている。
【図２】図２はｐＢＶｂｏｏｓｔドナーベクターのプラスミドマップである。昆虫細胞発現カセットは、ポリヘドリンプロモーター（ｐＰｏｌｈ）およびサルウィルス４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０  ｐＡ）が隣接するマルチクローニングサイト（ＭＣＳ、独特の制限酵素を示す）、Ｔｎ７ＬおよびＴｎ７Ｒ（Ｔｎ７カセットの左末端および右末端）、ＳａｃＢ＃３（変異型レバンスクラーゼ遺伝子）、ｏｒｉ（ＣｏｌＥ１複製起点）、ＧＥＮＴ（ゲンタマイシン遺伝子）から構成されている。
【図３】図３はｐＢＶＢｏｏｓｔＦＧベクターのマップである。ベクターは、バクテリオファージラムダのＲＣ系によるバキュロウィルス発現ライブラリーの効率的な構築のために設計されているが、伝統的な制限酵素ベースでのライブラリー構築用の選択肢をも備えている。この系は、昆虫および哺乳動物細胞および動物におけるプラスミドライブラリーまたはバキュロウィルスライブラリーとして、大腸菌におけるクローニングされたオープンリーデングフレームの活性の同時特徴付けを可能にするユニバーサル（ハイブリッドテトラプロモーター）系の下での所望の遺伝子の発現を可能にする。ｐＰｏｌｈプロモーターの下でのマーカー遺伝子のクローニングは、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧＲの場合に産生されるバキュロウィルスの簡単な検出のため、または他の手段により産生されるバキュロウィルスライブラリーを修飾するために使用されうる。
【図４】図４は、ユニバーサルバキュロウィルスライブラリーをクローニングおよび産生するためのｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧベースの系の使用の概略図である。工程を以下に示す。  １．ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧのＲＣカセットに所望のライブラリーをＲＣクローニングする。  ２．大腸菌ＤＨ１０ＢａｃΔＴｎ７細胞を組換えｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧライブラリーで形質転換する。  ３．ゲンタマイシン、テトラサイクリンおよびスクロース選択により、１００％組換えのバクミドを得る。  ４．コロニーを形質転換し、一晩増殖させる。  ５．アルカリ溶解により組換えバクミドを抽出し、昆虫細胞をトランスフェクトさせる。  ６．１次ウィルススクリーニング。力価約１０８ｐｆｕ／ｍｌ。  ７．所望の標的細胞への形質導入およびインビボ試験。
【図５】図５は、ｐＢＶｂｏｏｓｔＦＧにクローニングするためのアビジン（Ａ）およびＥＧＦＰ（Ｂ）カセットを構築するためのＳＥＳ−ＰＣＲストラテジーの模式図である。最下段の点線は、オリゴヌクレオチド中の用いたＲＣ系のＬＲ反応と適合するａｔｔＬ部位および細菌ｏｍｐＡシグナル（アビジン中）を示す。（Ｃ）ＬＲ反応と適合するアビジンおよびＥＧＦＰ構築物を合成するためのオリゴヌクレオチド。ａｔｔＬ配列をイタリックで示し、ｏｍｐＡシグナルペプチドをコードする配列に下線を付す。
【配列表】
2005519620.tif 000013
2005519620.tif 000014
2005519620.tif 000015
2005519620.tif 000016
2005519620.tif 000017
2005519620.tif 000018
【図１】
2005519620.tif 000019
【図２】
2005519620.tif 000020
【図３】
2005519620.tif 000021
【図４】
2005519620.tif 000022
【図５】
2005519620.tif 000023
2005519620.tif 000024
2005519620.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月15日(2004.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005519620000001.app
【国際調査報告】
2005519620.tif 000026
2005519620.tif 000027