(57)【要約】喘息患者またはアレルギー患者の肺ではいくつかの遺伝子がアップレギュレートされる。喘息でアップレギュレートされる遺伝子の多くは肺でのアルギニン代謝に関与している。さらに、喘息の発症しやすさおよび重症度を示すために利用することができる291個のシグネチャー遺伝子からなる集合を見いだした。また、患者がアレルギーを発症しやすいことを示す59個のシグネチャー遺伝子からなる集合も見いだした。喘息に関係してアップレギュレートされる遺伝子の多くは、アルギニン代謝経路に由来した。他の遺伝子、例えばADAM8、SPRR2AおよびSPRR2Bも、喘息では強くアップレギュレートされた。肺のアルギナーゼI、アルギナーゼII、CAT2、または他のアルギナーゼ経路メンバーのレベルを低下させる組成物を投与することによって、喘息の処置を達成することができる。また、これらのタンパク質のレベルまたはそれらをコードするmRNAのレベルの変化を検出することは、患者における喘息の存在を診断するのに役立ちうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息またはアレルギーを処置するための医薬品の製造における、アルギニン代謝に関与するタンパク質の産生量を低下させる化合物の使用。
【請求項２】
前記タンパク質がCAT2、アルギナーゼIおよびアルギナーゼIIからなる群より選択される、請求項１の化合物。
【請求項３】
前記分子が前記タンパク質をコードする遺伝子を阻害することによって前記タンパク質の産生量を低下させる、請求項１の化合物。
【請求項４】
前記化合物がN-ω-ヒドロキシ-L-アルギニン（NOHA）である請求項１の化合物。
【請求項５】
薬学的に許容できる担体を伴っている請求項１の化合物。
【請求項６】
患者における喘息またはアレルギーの存在を検出する方法であって、
前記患者のアルギニン代謝に関与する少なくとも1つの遺伝子から産生される産物のレベルを測定すること、
アルギニン代謝に関与する少なくとも1つの遺伝子から産生される産物の遺伝的変異性（発現または遺伝子配列の変異性）を測定すること、および
前記測定結果を対照個体から得られる測定結果と比較することを含み、
前記少なくとも1つの遺伝子のレベルが対照個体と比較して高い患者は、喘息またはアレルギーを持つと決定する方法。
【請求項７】
前記少なくとも1つの遺伝子がCAT2、アルギナーゼIおよびアルギナーゼIIからなる群より選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
前記産物がmRNAである請求項６の方法。
【請求項９】
前記産物がタンパク質である請求項６の方法。
【請求項１０】
喘息またはアレルギーの危険にさらされている個体を同定する方法であって、
喘息またはアレルギーの症状をまだ示していない個体を同定すること、
アルギナーゼ経路中の遺伝子から産生される産物のレベルを測定すること、および
前記産物のレベルを、対照個体から得られる測定結果と比較することを含み、
前記産物のレベルが上昇している患者は喘息またはアレルギーの危険にさらされていると決定する方法。
【請求項１１】
アルギナーゼ経路中の前記遺伝子がアルギナーゼI、アルギナーゼIIおよびCAT2からなる群より選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記産物がmRNAである、請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記産物がタンパク質である、請求項１０の方法。
【請求項１４】
患者の喘息またはアレルギーを処置する方法であって、
喘息またはアレルギーの処置を必要とする個体を同定すること、および
前記患者におけるADAM8タンパク質の活性を低下させることができる分子を投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記分子がADAM8の構造を変化させる、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記分子がADAM8を膜貫通型から可溶型に変換する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記分子がADAM8タンパク質をコードする遺伝子を阻害することによってADAM8の活性を低下させる、請求項１４の方法。
【請求項１８】
インターロイキン-4またはインターロイキン-13の肺レベルを低下させるか抑制することができる化合物を投与することをさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
患者の喘息またはアレルギーを処置する方法であって、
喘息またはアレルギーの処置を必要とする個体を同定すること、および
前記患者におけるSPRR2A、SPRR2Bまたは類縁SPRRファミリーメンバータンパク質の活性を低下させることができる分子を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記分子がSPRR2Aタンパク質をコードする遺伝子を阻害することによってSPRR2Aタンパク質の活性を低下させる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記分子が、SPRR2Bタンパク質をコードする遺伝子を阻害することによってSPRR2Bタンパク質の活性を低下させる、請求項１９の方法。
【請求項２２】
ある患者の、喘息を発症する危険性を決定する方法であって、
その患者から採取した生物学的試料を用意すること、および
その生物学的試料における、表1に記載した遺伝子の部分集合の発現レベルを決定することを含み、
対照生物学的試料と比較した上記遺伝子の前記部分集合の発現レベルの上昇は、その患者にとって喘息を発症する危険性が増大していることを示す方法。
【請求項２３】
前記部分集合が表1に記載した遺伝子の少なくとも1％を含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記部分集合が表1に記載した遺伝子の少なくとも30％を含む、請求項２２の方法。
【請求項２５】
前記部分集合が表1に記載した遺伝子の少なくとも50％を含む、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記部分集合が表1に記載した遺伝子の少なくとも80％を含む、請求項２２の方法。
【請求項２７】
ある患者の、アレルギーを発症する危険性を決定する方法であって、
その患者から採取した生物学的試料を用意すること、および
その生物学的試料における、表2に記載した遺伝子の部分集合の発現レベルを決定することを含み、
対照生物学的試料と比較した上記遺伝子の前記部分集合の発現レベルの上昇は、その患者にとってアレルギーを発症する危険性が増大していることを示す方法。
【請求項２８】
前記部分集合が表2に記載した遺伝子の少なくとも1％を含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記部分集合が表2に記載した遺伝子の少なくとも30％を含む、請求項２７の方法。
【請求項３０】
前記部分集合が表2に記載した遺伝子の少なくとも50％を含む、請求項２７の方法。
【請求項３１】
前記部分集合が表2に記載した遺伝子の少なくとも80％を含む、請求項２７の方法。
【請求項３２】
喘息またはアレルギーの処置に有効な化合物を発見する方法であって、
候補化合物を用意すること、
前記化合物がアルギニン代謝を阻害するかどうかを決定することを含み、
アルギニン代謝の阻害は、前記化合物が喘息またはアレルギーの処置に有効であることを示す方法。
【請求項３３】
前記化合物がアルギナーゼI活性の阻害剤である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
前記化合物がアルギナーゼII活性の阻害剤である、請求項３２の方法。
【請求項３５】
前記化合物がCAT2活性の阻害剤である、請求項３２の方法。
【請求項３６】
患者の喘息またはアレルギーを処置する方法であって、
喘息またはアレルギーの処置を必要とする個体を同定すること、および
アルギニン代謝に関与するタンパク質の産生量を低下させることができる分子を投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記タンパク質がCAT2、アルギナーゼIおよびアルギナーゼIIからなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記分子が前記タンパク質をコードする遺伝子を阻害することによって前記タンパク質の産生量を低下させる、請求項３６の方法。
【請求項３９】
インターロイキン-4またはインターロイキン-13の肺レベルを低下させるか抑制することができる化合物の投与をさらに含む、請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は国立衛生研究所/国立アレルギー感染病研究所の助成金番号ROlAI42242-04として政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に対して権利を有する場合がある。
【０００２】
本発明は、概して、喘息またはアレルギーの処置または検出を補助することを意図した組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
喘息は、有害で時には潜在的に致死的な肺の慢性的な炎症で、1500万人の米国人が罹患しており、年間医療費のうち約127億ドルを占めている。大規模な研究が継続して行われているにもかかわらず、喘息は現在も増加している。研究者が喘息の有効な処置法を開発できないのは、主に、この疾患が複雑なためである。喘息は多種多様な要因に起因しているので、広範囲に適用できる有効な処置法を発見することは極めて困難である。例えば、その多くはまだよく分かっていない複数の特異的炎症系路が互いに相互作用し合うことによって、ある患者に喘息という診断をもたらす症状が生じるのだと考えられている。その上、これらの経路の相対的重要性は喘息患者間でも異なる場合があるという事実が、研究を、より一層複雑にしている。
【０００４】
喘息分野の実験では、主として、アレルゲンばく露によって感作動物（主にマウス）およびヒトに誘発される細胞事象および分子事象を解析することに、その焦点が置かれてきた。これらの研究により、IgE産生量の増加、粘液分泌過多、気道閉塞、炎症、および喘息反応での収縮因子に対する気管支反応性の亢進が確認されている。臨床的研究および実験的研究により、CD4+Tヘルパー2リンパ球（Th2細胞）の存在と疾患重症度との間には強い相関関係が証明されていることから、喘息の病態生理にはこれらの細胞が欠かすことのできない役割を果たしていることが示唆される。Th2細胞は、炎症や常在エフェクター経路を直接的にも間接的にも活性化する一連のサイトカインを分泌することによって喘息を誘発すると考えられる。特に、インターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）は喘息肺では産生レベルが上昇しており、疾患の顕著な特徴の多くの中心的調節物質であると考えられる。
【０００５】
（アルギニン代謝）
L-アルギニンは、図1に図解するように、シトルリン・一酸化窒素(NO)回路および尿素回路という2つの生化学経路に関与する準必須塩基性アミノ酸である。尿素回路の大半は肝臓（尿素回路に必要な全酵素機構を含む臓器）で起こる。酵素アルギナーゼは、尿素回路酵素の中では唯一、2つのアイソフォーム（アミノ酸相同性60％）が存在し、それらは異なる染色体上の異なる遺伝子によってコードされ、I型およびII型と呼ばれている。アルギナーゼIが主として肝臓で発現する細胞質タンパク質であるのに対して、アルギナーゼIIはさまざまな組織（特に腎臓および前立腺）中で発現するミトコンドリアタンパク質である。下流酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）およびL-オルニチンアミノトランスフェラーゼ（OAT）は、それぞれ細胞質およびミトコンドリアで特異的に発現されることから、上記2つのイソ酵素について協調的な生化学的つながりが示唆される。
【０００６】
ヒトにおけるアルギナーゼI欠損症は、通常は致死的な進行性神経変質をもたらす。アルギナーゼI欠損トランスジェニックマウスは生後9〜11日以内に死亡するが、アルギナーゼIIマウスは見たところ正常である。L-アルギニン代謝に関して、過去数年間に得られた進歩の一つは、さまざまなサイトカインおよび薬剤へのばく露の結果として、アルギナーゼを多くの組織および細胞タイプで発現させることができるという発見である。アルギナーゼを調節することが明らかになったサイトカインの中では、IL-4、IL-10およびIL-13が（特にマクロファージでは）最も強力なようである。インビトロではどちらのアルギナーゼもさまざまな刺激によって誘導されうるが、アルギナーゼIはTh2サイトカイン類によって、より強く誘導されるようである。しかし、このことは、マクロファージ以外の細胞タイプでは、まだ詳しく研究されていない。
【０００７】
肝外組織におけるアルギナーゼの正確な機能はよく分かっていない。しかし、アルギナーゼの産物、すなわちL-オルニチンは、ポリアミン類（例えばプトレシン、スペルミジンおよびスペルミン）ならびにプロリンを産生する際の前駆体であり、ポリアミン類およびプロリンは、それぞれ細胞増殖およびコラーゲン産生を制御する。実際、血管平滑筋細胞および血管内皮細胞の増殖速度の増加をもたらすには、アルギナーゼIの発現量が増加するだけで十分である。このようにアルギナーゼ活性は細胞増殖および結合組織産生と潜在的に決定的なつながりがあり、注目すべきことに、これらの過程はどちらも、慢性喘息およびアレルギーの顕著な病理学的特徴である（図1）。
【０００８】
L-アルギニンはL-オルニチンに代謝されるだけでなく、広範な生物学的過程に関与するフリーラジカル分子NOの前駆体でもある。NOは酵素NOSによってL-アルギニンから生成する。NOSには3つのアイソフォームが記載されている。NOS1およびNOS3は構成的に発現しており、それらの活性はカルシウム依存性である。NOS1はニューロンに発現し、神経伝達に関与すると考えられているのに対して、NOS3（すなわち内皮NOS）は平滑筋弛緩および気管支拡張に関与する。誘導性NOS（iNOS）であるNOS2はカルシウム非依存性であり、内毒素やインターフェロン-γなどの炎症媒介因子に反応してアップレギュレートされ、大量のNOの産生を引き起こす。
【０００９】
図1に示す略図はアルギナーゼ経路における陽イオンアミノ酸輸送体-2（CAT2）の役割を表している。L-アルギニンからの持続的なNOおよびL-オルニチン生成には細胞外L-アルギニンが必要であることから、形質膜を通したL-アルギニン輸送の重要な役割が示唆される。L-アルギニンの取り込みを媒介するいくつかの輸送系のうち、系y+は広範に発現しており、ほとんどの細胞および組織で、主要なL-アルギニン輸送体であると考えられている。陽イオンアミノ酸輸送体CAT1、CAT2およびCAT3によってコードされる系y+はNa+非依存性の高親和性陽イオンアミノ酸輸送系である。肝臓を除くと、CAT1は事実上遍在的に発現しており、生存にとって必要であるのに対して、CAT2はもっと限られた数の組織で発現し、CAT3は主に脳内で発現する。
【００１０】
2つのエクソンの差次的スプライシングにより、CAT2 mRNAは2つのアイソフォーム、すなわち主として肝臓で発現される低親和性輸送体CAT2Aと、高親和性CAT2（CAT2B）の形で存在する。CAT1およびCAT2は、シグナルペプチドを欠くが、12個の膜貫通ドメインを含み、細胞内アミノ末端を持つ、相同タンパク質である。興味深いことに、CAT2は最初はリンパ腫細胞株cDNAからクローニングされ、分裂促進因子に対する正常T細胞の応答の初期に誘導されることから、Tea（T cell early activation factor：T細胞初期活性化因子）と名付けられた。T細胞免疫応答におけるCAT2の役割はまだ報告されていないが、予備研究では、実験的自己免疫性脳炎におけるこの分子の重要な役割が示されている。iNOSまたはアルギナーゼの基質利用可能性の決定的な調節にCAT2が関与するかもしれないことを最初に示したのは、炎症誘発性分子（例えばリポ多糖［LPS］）がCAT2発現を調節するという発見だった。これに対してcat-1は、CAT2を誘導する条件下で誘導されない「ハウスキーピング」遺伝子である。好酸球陽イオンタンパク質がマクロファージによるL-アルギニンの取り込みを阻害するという発見により、さらに興味深い関係が確立されている。最近行われたCAT2欠損マウスの解析により、マクロファージにおける持続的NO産生にはCAT2が必要であることが明らかになった。CAT2欠損マクロファージによるL-アルギニンの取り込みが95％減少したことは、CAT2がマクロファージにおける主要なL-アルギニン輸送体であることを示している。
【００１１】
CAT2は最初はリンパ腫細胞株cDNAからクローニングされ、分裂促進因子に対する正常T細胞の応答の初期に誘導されることから、Tea（T細胞初期活性化因子）と名付けられた（MacLeodら，J Exp Biol，196:109-21（1994））。免疫応答におけるCAT2の役割に関してこれまでに行われてきた研究は、主としてNO産生に対するその作用に限られてきた（Nicholsonら，J Biol Chem，276:15881-5（2001））。したがって、喘息肺ではどのCAT2アイソフォームが発現しているのかをさらに正確に特徴づけることが重要だった。CAT2は、エクソン7（2B型）またはエクソン8（2A型）を特異的に利用するかどうかに応じて、2つの独立したアイソフォームとして発現する（Nicholsonら，J Biol Chem，276:15881-5（2001））。CAT2Aの方がL-アルギニンに対して低い親和性を持ち、主に肝臓で発現すると考えられている（MacLeodら，J Exp Biol，196:109-21（1994））。
【００１２】
喘息およびアレルギーの発生率は増加傾向にあるので、この疾患のより良い理解と処置につながる研究が必要である。したがって、当技術分野で必要とされているのは、喘息またはアレルギーを患っている個体の新しい処置方法、喘息またはアレルギーの危険にさらされている個体の新しい検出方法、および患者の表現型を判定する（例えば患者の予後および処置に対する反応を予測する）新しい方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一態様は、患者の喘息またはアレルギーを処置する方法であって、喘息またはアレルギーの処置を必要とする個体を同定すること、およびアルギニン代謝に関与するタンパク質の産生量を低下させることができる分子を投与することを含む方法である。
【００１４】
もう一つの態様は、患者における喘息またはアレルギーの存在を検出する方法であって、その患者のアルギニン代謝に関与する少なくとも1つの遺伝子から産生される産物のレベルを測定すること、アルギニン代謝に関与する少なくとも1つの遺伝子から産生される産物の遺伝的変異性（発現または遺伝子配列の変異性）を測定すること、およびその測定結果を対照個体から得られる測定結果と比較することを含み、上記少なくとも1つの遺伝子のレベルが対照個体と比較して高い患者は、喘息またはアレルギーを持つと決定する方法である。
【００１５】
さらにもう一つの態様は、薬学的に許容できる担体中のアルギナーゼ阻害剤を含む、喘息またはアレルギーを処置するための治療用組成物である。
【００１６】
さらにもう一つの態様は、薬学的に許容できる担体中のCAT2活性の阻害剤を含む、喘息またはアレルギーを処置するための治療用組成物である。
【００１７】
さらにもう一つの態様は、喘息またはアレルギーの危険にさらされている個体を同定する方法であって、喘息またはアレルギーの症状をまだ示していない個体を同定すること、アルギナーゼ経路中の遺伝子から産生される産物のレベルを測定すること、およびその産物のレベルを、対照個体から得られる測定結果と比較することを含み、産物のレベルが上昇している患者は喘息またはアレルギーの危険にさらされていると決定する方法である。
【００１８】
もう一つの態様は、患者の喘息またはアレルギーを処置する方法であって、喘息またはアレルギーの処置を必要とする個体を同定すること、およびその患者におけるADAM8タンパク質の活性を低下させることができる分子を投与することを含む方法である。
【００１９】
さらにもう一つの態様は、喘息またはアレルギーの処置を必要する個体を同定し、その患者に、SPRR2A、SPRR2Bまたは類縁SPRRファミリーメンバータンパク質の活性を低下させることができる分子を投与することによって、患者の喘息またはアレルギーを処置する方法である。
【００２０】
もう一つの態様は、ある患者の、喘息を発症する危険性を決定する方法であって、その患者から採取した生物学的試料を用意すること、およびその生物学的試料における、表1に示す遺伝子の部分集合の発現レベルを決定することを含み、対照生物学的試料と比較した前記遺伝子の部分集合の発現レベルの上昇は、その患者にとって喘息を発症する危険性が増大していることを示す方法である。
【００２１】
さらにもう一つの態様は、ある患者の、アレルギーを発症する危険性を決定する方法であって、その患者から採取した生物学的試料を用意し、その生物学的試料における、表2に示す遺伝子の部分集合の発現レベルを決定することによって行われ、対照生物学的試料と比較した前記遺伝子の部分集合の発現レベルの上昇は、その患者にとってアレルギーを発症する危険性が増大していることを示す方法である。
【００２２】
もう一つの態様は、喘息またはアレルギーの処置に有効な化合物を発見する方法であって、候補化合物を用意すること、およびその化合物がアルギニン代謝を阻害するかどうかを決定することを含み、アルギニン代謝の阻害は、その化合物が喘息またはアレルギーの処置に有効であることを示す方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の諸態様は喘息およびアレルギーに関与する遺伝子の発見に関係する。例えば、本発明の一態様は、喘息疾患モデルで一貫して調節されることがわかった291個の「シグネチャー（signature）」遺伝子からなる集合（表1）の発見に関係する。また、59個の遺伝子からなる部分集合（表2）は、関与する組織（肺対小腸）とは関係なく、さまざまなアレルギー疾患で一貫して上昇していて、アレルギーの普遍的遺伝子「シグネチャー」になることがわかった。したがって、患者が喘息またはアレルギーを発症する危険性を決定するために、これらのシグネチャー遺伝子のそれぞれの発現または遺伝的変異性に関して、患者の遺伝子型を判定することができる。さらに、喘息またはアレルギーを患っている患者の予後および処置計画に対する反応をより一層正確に予測するために、そのような患者を上記シグネチャー遺伝子の発現について調べることもできる。また、これらの遺伝子のそれぞれを、アレルギー疾患の薬物介入/処置候補の標的にすることもできる。
【００２４】
本発明の諸態様は、患者における喘息またはアレルギーシグネチャー遺伝子の発現レベルを、表1および表2に示すレベルと比較することによって、患者が喘息またはアレルギーを発症する危険性を決定することに関するが、本発明の範囲に包含されるために、厳密な相関関係が要求されるわけではない。例えば、ある患者がシグネチャー遺伝子の一部でしか発現量の増加を示さないという決定であっても、依然として、その患者がアレルギーまたは喘息を発症する危険性を示している。したがって、患者から採取され、シグネチャー遺伝子のうちの例えば1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95または100％の発現量が増加していると決定された生物学的試料は、依存として、アレルギーまたは喘息の危険にさらされていると決定することができる。ある人がアレルギーまたは喘息を発症する危険性を示すのは、シグネチャー遺伝子の遺伝子発現パターンと個々の遺伝子の発現レベルとの組合せである。したがって本発明の範囲は、291個の喘息シグネチャー遺伝子の全ての発現レベルを符号させることによって、ある患者が喘息の危険にさらされていることを決定することには限定されない。同様に、ある患者がアレルギーを発症する危険にさらされていることを決定するために、59個のアレルギーシグネチャー遺伝子の全ての発現レベルを符号させる必要はない。同様の理由から、既存の患者の予後または処置計画に対する反応を予測するために、患者の遺伝子発現プロファイルがアレルギーシグネチャー遺伝子または喘息シグネチャー遺伝子に正確に符号する必要はない。
【００２５】
また、本発明の諸態様は、肺アルギナーゼ経路と喘息との間の関係の発見に関係する。本明細書に記載する方法を使って、実験的喘息とヒト喘息との両方で、アルギナーゼ経路の関与を解明した。CAT2タンパク質、アルギナーゼIタンパク質およびアルギナーゼIIタンパク質をコードするものを含めて、いくつかの重要なアルギナーゼ代謝遺伝子の発現レベルの上昇は、喘息およびアレルギーと強く関連していた。また、IL-4/IL-13シグナル伝達によるアルギナーゼ誘導はアレルギー性気道反応のマーカーであるだけでなく、アルギナーゼは喘息の多彩な側面の病理発生過程に関与することも発見した。したがって、喘息またはアレルギーを処置するための治療戦略および診断戦略を考え出すために、これらのアルギナーゼ経路遺伝子またはそれらの産物の調整を利用することができる。
【００２６】
本発明の諸態様は、有意なアルギニン代謝がアルギナーゼによって起こり、その過程が喘息および関連疾患の症状発現に対して重要な派生効果を持つという発見にも関係する。したがってアルギナーゼ代謝経路は、全てのアレルギー性肺疾患を処置するための重要な治療的介入戦略になる。アルギナーゼ活性そのものを阻害するか、または他のアルギナーゼ経路メンバーの作用を阻害することによって、アルギナーゼ経路を操作することは、有用な喘息処置になると予想される。また、肺アルギナーゼ経路の操作は、喘息の発症を予防するために有用だろう。また、アルギニン代謝に関与する遺伝子を解析することは、喘息代謝経路の酵素または産物のレベルを定量することによって喘息またはアレルギーの存在を診断するために利用することができる。
【００２７】
本発明のもう一つの態様は、シグネチャー遺伝子の一つであるADAM8が、喘息およびアレルギーと極めて強く関係していたという発見に関係する。したがって、本発明の諸態様には、患者におけるADAM8のレベルを決定することによって喘息を診断するためのキット、システムおよび方法が包含される。また、ADAM8を阻害する化合物の治療有効量を投与することによる喘息またはアレルギーの処置も考えられる。そのような化合物の一例は、Schlomannら，J Biol Chem 2002 Dec 13;277(50):48210-9に記載のバチマスタット（batimastat）（BB-94）である。したがって本発明の一態様は、治療有効量のバチマスタットを患者に投与することによる喘息またはアレルギーの処置である。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、シグネチャー遺伝子が、低分子プロリンリッチタンパク質（small proline rich proteins＝SPRR）、具体的にはSPRR2AおよびSPRR2Bと呼ばれる、今まで喘息と関連づけられたことのない分子ファミリーを含んでいたという発見に関係する。SPRRタンパク質ファミリーは、角化皮膚上皮の分化および成長に関与することが知られている（Tesfaigzi J，Carlson DM，Cell Biochem Biophys 1999;30(2):243-65「SPRタンパク質ファミリーの発現、調節および機能−総説（Expression, regulation, and function of the SPR family of proteins. A review）」）。
【００２９】
SPRR2AおよびSPRR2Bは喘息およびアレルギーと極めて強く関係していた。また、喘息の中心的調節物質であると考えられるIL-13で処置した野生型マウスは、肺SPRR2レベルの著しい上昇を引き起こした（データの記載なし）。
【００３０】
したがって本発明の諸態様には、患者におけるSPRRタンパク質またはSPRR遺伝子のレベルおよび変異性（遺伝子レベルまたはタンパク質レベル）を決定することによって喘息を診断するためのキット、システムおよび方法が包含される。また、SPRRタンパク質機能を調整する化合物を投与することによる喘息またはアレルギーの処置も考えられる。
【００３１】
後述するように、さまざまなタイプのアレルゲンで処置されたマウスでマイクロアレイ解析を行うことにより、喘息の病理発生過程でアップレギュレートされる遺伝子の初期決定が示された。
【００３２】
実験的喘息を起こしている動物からの遺伝子発現のマイクロアレイ解析
本明細書に記載するように、実験的喘息を起こしているマウスのDNAマイクロアレイプロファイル解析により、疾患の病理発生過程に関与する複雑な経路へのかつてない洞察が得られた。喘息反応には試験したゲノムの約6％の動的発現が関わるという結果は、極めて多数の遺伝子産物が疾患の病理発生に寄与することを示している。アレルギー性肺反応には、表1に示す「喘息シグネチャー遺伝子」からなる共通集合と、疾患誘発様式に依存するユニークな遺伝子転写物プロファイルとの両方が関わることがわかった。今まで喘息と関連づけられたことのなかった複数の遺伝子が同定され、CAT2およびアルギナーゼ酵素経路によるアルギニンの代謝が関与する経路の解明によって例証された。
【００３３】
確立した喘息モデルで差次的に発現される遺伝子を再現性よく正確に同定するために、マウスを、ミョウバン（アジュバント）の存在下にオバルブミン（OVA）（アレルゲン）で、14日間の間隔をおいて2回、腹腔内感作した（図2Aおよび実施例1）。次に、レプリケートマウスの鼻腔内に、OVAまたは食塩水（対照）を、3日間の間隔をおいて2回チャレンジした。最後のアレルゲンチャレンジの18時間後に、マウス肺葉の1つを組織学的解析にかけ、残りの肺をRNA解析に使用した。予想どおり、アレルゲンをチャレンジしたマウスは、先に報告されているように（Rothenberg，M.E.，MacLean，J.A.，Pearlman，E.，Luster，A.D.およびLeder，P. 1997.「ケモカイン・エオタキシンの標的破壊によって抗原誘発性組織好酸球増加がある程度減少する（Targeted disruption of the chemokine eotaxin partially reduces antigen-induced tissue eosinophilia）」J Exp Med 185:785-790）、著しい好酸球性炎症反応を持つことが、組織学的解析によって明らかになった。
【００３４】
アレルゲンによって誘導されるmRNA転写物の存在を確認するために、RNAをノーザンブロット解析にかけ、アレルゲンチャレンジによって有意に誘導されることが先に示されているケモカイン、エオタキシン-1の誘導について解析した（Rothenbergら，1997，前掲）。アレルゲンをチャレンジした肺ではエオタキシン-1 mRNAレベルが高かったのに対して、食塩水で処置したマウスは極めて低レベルだったという結果により、この実験的誘導プロトコールは正しいことが確認された。
【００３５】
次にRNAを、12,422個の遺伝要素に相当するオリゴヌクレオチドプローブセットを含むアフィメトリックス（AFFYMETRIX）チップU74Av2を使ったマイクロアレイ解析にかけた（実施例2）。実施例4に記載の方法に従って、マイクロアレイデータをさらに解析した。
【００３６】
食塩水をチャレンジした2匹のマウスを互いに比較すると共に、アレルゲンをチャレンジした2匹のマウスを互いに比較したところ、2倍を超えて変化する遺伝子は1％以下であることがわかった。存在する遺伝子を散布図で解析したところ、2倍の境界外に認められる点は、比較的少数だった。これに対して、アレルゲンをチャレンジしたマウスと食塩水をチャレンジしたマウスとをペアワイズ比較すると、遺伝子の6.5±0.8％に2倍を超える変化が見つかった。上述のように、エオタキシン-1はアレルゲン誘導性遺伝子中に再現性よく同定された（図2B）。アレルゲンと食塩水の間のエオタキシン-1に関する平均差シグナルの定量的解析により、25倍の誘導（P＝0.001）が明らかになった。総合すると、このデータによって、上記実験解析の妥当性が立証され、使用した科学的アプローチの潜在的価値が例証されたことが、次の実験群への起動力となった。
【００３７】
（喘息の遺伝子制御：発現される遺伝子および重複する誘導遺伝子）
より大きなマウス群で、実験的喘息系の急性期および慢性期における肺mRNA転写物のパターンを明確にするために、追加実験を行った。第1アレルゲンチャレンジ後は、もっと後の第2チャンレンジ後の時点と比較して、遺伝子のユニークな集合が、急性に誘導されるという仮説を立てた。まず、第1アレルゲン遭遇後の初期時点（3時間）を解析した。これは、この解析により、肺でのアレルゲンばく露に対する初期応答への洞察が得られるだろうという推論に基づいている。実際、アレルゲンとの初期遭遇によって誘導された遺伝子は100個だけだった（図3）。
【００３８】
次に、第1アレルゲンチャレンジの18時間後に誘導される遺伝子を解析した。この後期時点では、132個の遺伝子の漸進的誘導が起こっていて、その多くはアレルゲンチャレンジ直後は顕著でなかったものである。実際、初期活性化遺伝子のうち41個は上昇したままだったが、新たに91個の遺伝子が増加した（図3）。急性時点とは異なり、2回目のアレルゲンチャレンジの18時間後に誘導される遺伝子と比較して、ユニークな「遺伝子シグネチャー」は存在しなかった。事実、第1アレルゲンチャレンジの18時間後に誘導された遺伝子の大半は、第2チャレンジ後にはさらに増加した。
【００３９】
慢性アレルギー性肺反応の病理発生過程への重要な洞察を得るために、実験的喘息の比較的「慢性」期に誘導される遺伝子の特徴づけを試みた。慢性期における適応免疫応答の拡大を示すものとして、増加群（44％）では減少群（4.4％）と比較して免疫関連遺伝子が優勢だった。これに対し、発生と恒常性に関与する遺伝子は、減少群の過半数（54％）を構成するが、増加遺伝子では20％を占めるに過ぎなかった。
【００４０】
（アレルゲン特異的遺伝子の比較：OVA誘発対アスペルギルス誘発喘息）
次に、2つの独立した喘息モデルにおける全体的転写物プロファイルの比較に焦点を当てた。すなわち、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）によって誘発される実験的喘息を解析した。なぜなら、このモデルでは、OVAモデルと比較してユニークな粘膜感作経路（鼻腔内）を使用するからであり（Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.およびLuster，A.D. 1998「好酸球上に発現するマウスロイコトリエンB4受容体の分子的および生物学的特徴づけ（Molecular and biological characterization of the murine leukotriene B4 receptor expressed on eosinophils）」J. Exp. Med. 188:1063-1074）、また、アスペルギルス・フミガーツスは遍在する一般的な空中アレルゲンだからでもある。重要なことに、どちらの喘息モデルも、Th2関連好酸球性炎症、粘液産生および気道反応性亢進を含む、よく似た表現型を持っている。9回のアスペルギルス・フミガーツス鼻腔内アレルゲンチャレンジの18時間後に、肺RNAを、最後のOVAチャレンジの18時間後に行ったものと同じマイクロアレイおよびデータ処理にかけた。アスペルギルス・フミガーツスをチャレンジしたマウスでは、鼻腔内食塩水をチャレンジしたマウスと比較して、527個の遺伝子が誘導されていた（図4）。
【００４１】
誘導された転写物の過半数（OVAの63％およびアスペルギルスの61％）は上記2つの実験的喘息モデルで重複したが、OVAモデルとアスペルギルス・フミガーツスモデルでは、それぞれ182個（2回のOVAチャレンジ後に増加した496個の遺伝子の37％）および208個（アスペルギルスによって増加した遺伝子の39％）の遺伝子がユニークだった。
【００４２】
両方の喘息モデルによって誘導される遺伝子を比較したところ、例えばOVAモデルにおける12-リポキシゲナーゼなど、いくつかのシグナル伝達経路の上流にある遺伝子の特異的調節不全が明らかになった。このように、ほぼ同様の喘息表現型にもかかわらず、上記2つの独立した喘息モデルは、ユニークに異常調節される多数の遺伝子によって特徴づけられた。これは、個々のアレルギー性気道炎症状態が、著しく多様な遺伝子シグネチャーと作動経路を持つらしいことを示している。
【００４３】
（実験的喘息はL-アルギニン代謝に関与する遺伝子の誘導と関係している。）
結果として、特定のアレルゲンまたは疾患の誘発様式にユニークではなく、疾患の病理発生過程に共通して関与していた291個の遺伝子（表1）からなる集合が同定された。これらの喘息シグネチャー遺伝子により、アレルギー性気道炎症の病理発生過程に関与する新しい経路を明確にする貴重な機会が得られる。一例として、L-アルギニンの代謝に関与する遺伝子の高い転写物レベルは際だっていた。
【００４４】
【表１Ａ】
2005532997.tif 000002
【００４５】
【表１Ｂ】
2005532997.tif 000003
【００４６】
【表１Ｃ】
2005532997.tif 000004
【００４７】
【表１Ｄ】
2005532997.tif 000005
【００４８】
【表１Ｅ】
2005532997.tif 000006
【００４９】
【表１Ｆ】
2005532997.tif 000007
【００５０】
【表１Ｇ】
2005532997.tif 000008
【００５１】
表1に示すように、アルギナーゼI（Genbankアクセッション番号NM_007482）、アルギナーゼII（GenbankアクセッションNM_009705）およびL-アルギニン輸送体である陽イオンアミノ酸輸送体CAT2（GenbankアクセッションNM_007514）が強く誘導された。L-アルギニン代謝に関与する他の酵素、例えばアルギニノコハク酸シンセタ−ゼ、L-オルニチンデカルボキシラーゼおよびL-オルニチンアミノトランスフェラーゼには、食塩水をチャンレンジしたマウスとアレルゲンをチャレンジしたマウスとの間で、有意差がなかった。興味深いことに、マイクロアレイ解析により、一酸化窒素シンターゼ（NOS）と比較して、アルギナーゼの極めて特異的な調節不全が明らかになった。例えば、食塩水をチャンレンジしたマウスおよびアレルゲンをチャレンジした肺で、内皮NOSおよびニューロンNOSのハイブリダイゼーションシグナルはバックグラウンド未満だった（データの記載なし）。誘導性NOS（iNOS）mRNAはほとんどの条件下で検出できたが、食塩水チャレンジとアレルゲンチャレンジとの間で有意に変化しなかった。
【００５２】
次に、OVA誘発性実験喘息の進行中にアルギナーゼIの時間および用量依存的な誘導が起こることが、ノーザンブロット解析（実施例3）によって確認された。アルギナーゼIは最初のアレルゲンチャレンジの18時間後に誘導され、2回目のアレルゲンチャレンジ後はさらに高くなった。また、アルギナーゼII mRNA誘導はアルギナーゼIよりも弱かったが、実験的喘息の進展時に、より早く誘導された。例えば、アルギナーゼIIは、1回目のアレルゲンチャレンジの3時間後には容易に検出できた。さらに、CAT2はアレルゲンチャレンジによって誘導され、その発現は1回目のアレルゲンチャレンジの3時間後には既に顕著であることが、ノーザンブロット解析によって証明された。iNOS mRNAは弱く検出され、OVAチャレンジによって有意に誘導されなかった。また、9回の食塩水鼻腔内投与によってチャレンジしたマウスと比べると、アスペルギルス・フミガーツスをチャレンジしたマウスでは、アルギナーゼI、アルギナーゼIIおよびCAT2の発現が著しかった。OVAモデルでの結果と一致して、iNOS mRNAの誘導は低レベルにしか起こらなかった。したがって、アレルゲンチャレンジによるアルギナーゼおよびCAT2の誘導は、使用する抗原に特異的ではないが、実験的喘息の遺伝的プログラムの一部であるようだった。
【００５３】
また、実施例14に記載の方法により、胃腸アレルギーのモデルで強くアップレギュレートされることがわかった遺伝子を、表2に示す。
【００５４】
【表２Ａ】
2005532997.tif 000009
【００５５】
【表２Ｂ】
2005532997.tif 000010
【００５６】
（喘息におけるアルギナーゼの増加）
実験的喘息の誘発に続いて肺アルギナーゼ活性の著しい増加が起こることも見いだした
。対照マウスの肺にはアルギナーゼmRNAが存在しないことと合致して、食塩水をチャレンジした肺でのアルギナーゼ活性のレベルは、バックグラウンドに近かった。対照として、肝臓中のアルギナーゼ活性は、食塩水およびOVAをチャレンジしたマウスで、それぞれ1522±183nmol/分/mgタンパク質および1390±78nmol/分/mgタンパク質だった。
【００５７】
したがってアルギニンは、喘息マウスの肺では、少なくともその一部は、アルギナーゼによって代謝されるようである。さらに、喘息で見られるさまざまなNOレベルは、基質の消耗によってNOSを機能的に阻害する酵素であるアルギナーゼ活性の間接的な現れでありうる（Morris，S.M.，Jr. Annual Review of Nutrition 22，87-105（2002）、Mills，C.D. Crit Rev Immunol 21，399-425（2001））。
【００５８】
また、喘息ではアルギナーゼIおよびアルギナーゼIIがアップレギュレートされることがわかったので、喘息およびアレルギーを処置するために、薬物の標的をアルギナーゼ経路のさまざまな反応物および産物にすることができる。例えば、アルギナーゼの下流産物は、細胞成長および結合組織リモデリングを調節するポリアミンおよびプロリンである。これらの経路は喘息の病態生理に関与することが知られている。アルギナーゼ経路のどこか一部を阻害すれば、喘息またはアレルギーが抑制されると思われる。
【００５９】
（アルギナーゼI mRNAインサイチューハイブリダイゼーション）
これらの分子の細胞供給源に取り組むにあたってまず、下記実施例7に示すように、アルギナーゼIに関して、mRNAインサイチューハイブリダイゼーションを行った。OVAまたは食塩水を2回チャレンジしたOVA/ミョウバン感作マウスについて、アルギナーゼIアンチセンス（AS）およびセンス（S）プローブのハイブリダイゼーションシグナルを決定した。2回目の食塩水またはアレルゲンチャレンジの18時間後に組織を解析した。喘息肺のアンチセンス染色により、血管周囲および気管支周囲の炎症ポケットに、高レベルのアルギナーゼIが見いだされた。OVAをチャレンジしたマウスにセンスプローブによる特異的染色はみられなかった。食塩水をチャレンジした肺におけるアンチセンスプローブおよびセンスプローブのハイブリダイゼーションは、バックグラウンドと同等だった。マクロファージに最も合致する豊富な大型単核細胞の亜集団に、アンチセンスプローブの特異的染色がみられた。それよりも程度は低いが、好酸球の亜集団もアルギナーゼIを発現させた。また、アンチセンスプローブは、肺胞マクロファージおよび粘膜下紡錘状細胞（筋線維芽細胞または平滑筋細胞に合致する）にもハイブリダイズした。
【００６０】
（肺のアルギナーゼを減少させるまたは阻害する組成物を投与することによる喘息またはアレルギーの処置または予防）
本発明の一態様は、喘息の処置を必要としている個体に治療有効量のアルギナーゼ阻害剤を投与することによって喘息を抑制する方法である（実施例15〜20）。例えば、L-アルギニン輸送体CAT2およびL-オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）（アルギナーゼの下流にある酵素）が治療的処置の標的である。例えば、ODCの阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン（DFMO）は、喘息またはアレルギーを抑制するための有用な処置薬になりうる（実施例17〜19）。したがって本発明の一態様は、オルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)の既知の阻害剤であるジフルオロメチルオルニチン（DFMO）による、喘息またはアレルギーの処置である。本発明のさらなる態様には、喘息またはアレルギーを患っている個体に対する有効量のDFMOの投与が含まれる。
【００６１】
本明細書にいう抗アルギナーゼ化合物とは、アルギナーゼの作用を阻害するまたは減少させる化合物である。一態様として、アルギナーゼ阻害剤は、アルギナーゼ経路に関与する遺伝子の小分子阻害剤またはアンチセンス阻害剤である。
【００６２】
本発明のもう一つの態様では、アルギナーゼ阻害剤が、アルギナーゼI阻害剤またはアルギナーゼII阻害剤である。アルギナーゼ阻害剤は、好ましくは、個体の肺に投与されるが、他の処置様式も考えられる。アルギナーゼの阻害剤は、好ましくは、例えばN-ω-ヒドロキシ-L-アルギニン（NOHA）、N-ヒドロキシ-ノル-L-アルギニン（nor-NOHA）、ボロン酸に基づく遷移状態類似体、例えば2(S)-アミノ-6-ボロノヘキサン酸（ABH）およびS-(2-ボロノエチル)-L-システイン（BEC）などの小分子である。他の阻害剤はQueらによって記載されている（Nitric Oxide. 2002 Feb；6(1):1-8）。実施例15に示すように、NOHAは喘息肺におけるアルギナーゼ活性をブロックし、実施例20では、アレルゲン誘発性気道反応性亢進の発症を阻止するようである。したがって、本発明の一態様は、治療有効量のNOHAを投与することによる喘息の処置である。
【００６３】
また、NOシンターゼ阻害剤の一部はアルギニン輸送体CAT2をブロックするので、利用可能なアルギニンレベルを低下させることによって、喘息の作用を低減させると予想される。したがって、本発明の一態様は、喘息またはアレルギーを持つ個体に、その個体におけるArg I、Arg IIまたはCAT2のレベルまたは機能を低下させる化合物の有効量を投与することによる、喘息またはアレルギーの処置である。
【００６４】
本発明のもう一つの態様は、喘息またはアレルギーを処置するための、薬学的に許容できる担体中のアルギニン阻害剤を含む治療用組成物である。他の態様として、薬学的に許容できる担体中のADAM8阻害剤を含む阻害剤治療用組成物が挙げられる。そのようなADAM8の阻害剤は、例えばADAM8を膜貫通型から可溶型に変換することなどによって、ADAM8のコンフォメーションまたは構造を変化させることができる。
【００６５】
本明細書で使用する「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置と予防的または防止的処置の両方を意味し、その目的は、癌の発症または拡大などの望ましくない生理学的変化または障害を防止するかまたは減速させる（減少させる）ことである。「処置する」という用語は、将来の予後に派生的影響を持ちうるまたは特異的処置に必要な、疾患のタイプまたは重症度の特徴づけも意味する。本発明の場合、有益な臨床結果または望ましい臨床結果として、例えば、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の軽減、疾患度の低減、疾患状態の安定化（すなわち悪化しないこと）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一時的軽減、および寛解（部分的であるか全面的であるかを問わない）などが挙げられる。「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較した生存期間の延長も意味しうる。処置を必要とする者には、その状態または疾患を既に持つ者、その状態または障害に掛かりやすい者、またはその状態もしくは疾患を予防すべき者が含まれる。
【００６６】
抗アルギナーゼまたは抗ADAM8化合物の治療用製剤は、望ましい純度を持つ抗アルギナーゼ化合物を随意の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」第19版，Alfonso，R.編，Mack Publishing Co.（ペンシルバニア州イーストン：1995））と、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形で混合することによって調製して、貯蔵することができる。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用する用量および濃度で受容者にとって無毒であり、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、および他の糖質；EDTAなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および/またはツウィーン（Tween）、プルロニック（Pluronic）またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン界面活性剤などが挙げられる。
【００６７】
インビボ投与に使用する抗アルギナーゼ、抗CAT2、または抗ADAM8化合物は、滅菌状態でなければならない。これは、凍結乾燥および復元を行う前または後に、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。化合物は通常、凍結乾燥状態または溶液状態で保存されるだろう。
【００６８】
治療用抗アルギナーゼ、抗CAT2または抗ADAM8化合物は、一般的には、滅菌注入口を持つ容器、例えば皮下注射針を突き刺せる栓を持つ静脈内溶液バッグまたはバイアルなどに入れられる。
【００６９】
化合物の投与経路は、既知の方法に従って、例えば静脈内、腹腔内、脳内、皮下、表皮、鼻腔内、気管内、噴霧、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内もしくは病巣内経路による注射もしくは注入、または以下に述べる徐放系による方法によって行う。
【００７０】
徐放性製剤の好適例として、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成型品の形態をした半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性製剤マトリックスには、ポリエステル類、ヒドロゲル類、ポリラクチド類（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー（Sidmanら，Biopolymers 22:547-556（1983））、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)（Langerら，J. Biomed. Mater. Res.，15:167-277（1981）およびLanger，Chem. Tech. 12:98-105（1982））、エチレンビニルアセテート（Langerら，前掲）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP133,988）などがある。徐放性組成物として、リポソームに封入された組成物を挙げることもできる。化合物含有リポソームは以下に挙げる自体公知の方法によって製造される：DE3,218,121、Epsteinら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692（1985）、Hwangら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034（1980）、EP52,322、EP36,676、EP88,046、EP143,949、EP142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号、ならびにEP102,324。リポソームは通常、小さな（約200〜800オングストローム）単層型で、その脂質成分は約30モル％以上がコレステロールであって、治療が最適になるように調節した比率が選択される。
【００７１】
抗アルギナーゼ、抗CAT2、または抗ADAM8化合物を、吸入によって投与することもできる。投与にはジェットネブライザおよび超音波ネブライザを含む市販の液体用ネブライザが役立つ。液体製剤を直接噴霧することもできるし、凍結乾燥粉末を復元してから噴霧することもできる。あるいは、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使って、これらの化合物をエアロゾル化したり、凍結乾燥摩砕粉末として吸入することもできる。
【００７２】
治療的に使用される化合物の「有効量」は、例えば治療対象、投与経路、使用する化合物のタイプ、および患者の状態などに依存するだろう。したがって、治療者は、最適な治療効果が得られるように、必要に応じて投与量を滴定し、投与経路を変更する必要があるだろう。臨床家は、典型的には、所望の効果が得られる用量に達するまで、本化合物を投与することになる。この治療法の経過は通常のアッセイで容易にモニターすることができる。
【００７３】
抗アルギナーゼ、抗CAT2、または抗ADAM8化合物による喘息またはアレルギーの処置および予防では、適切な医療に合致する方法で、化合物を製剤化し、用量調節し、投与する。これに関連して考慮すべき要因には、処置される喘息/アレルギーのレベル、個々の患者の臨床状態、化合物の送達部位、化合物の具体的タイプ、投与方法、投与スケジュール、および医療実務者に知られている他の要因が含まれる。投与すべきそのような化合物の「治療有効量」は、上記のような考察によって決定され、喘息を予防、改善または処置するのに必要な最少量である。そのような量は、好ましくは、ホストにとって有毒な量またはホストが有意に感染症にかかりやすくなる量よりも少ない。
【００７４】
一般的提案として、経口投与される抗アルギナーゼまたは抗ADAM8化合物の初期医薬有効量は、好ましくは、1日あたり約0.1〜50mg/kg-患者体重で、使用する化合物の典型的な初期範囲は好ましくは0.3〜20mg/kg/日、より好ましくは0.3〜15mg/kg/日である。望ましい投与量は、実務医が達成したいと思う薬物動態的消失パターンに依存して、化合物の単回ボーラス投与、複数回ボーラス投与、または持続注入投与によって送達することができる。
【００７５】
しかし上述したように、ここに提案した化合物量は、使用する化合物のタイプを含めて、治療上の裁量に大きく依存する。適切な投与量を選択する際に重要な要因は、上述のように、得られる結果である。例えば、本化合物は、所望であれば、喘息の予防または処置に現在使用されている1つ以上の薬剤と一緒に製剤化してもよい。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する上記化合物の量、喘息の臨床的レベル、および上述した他の要因に依存する。これらは、一般的には、上述したものと同じ投与量および投与経路で、または今まで使用されきた投与量の約1〜99％で使用される。
【００７６】
（特定組織中のアルギナーゼを増加させると同時に他の組織中のアルギナーゼを減少させることによる喘息またはアレルギーの処置）
本発明のさらにもう一つの態様には、保護的応答を得るために、患者の特定組織中のアルギナーゼレベルを増加させることが含まれる。これは、アルギナーゼを増加させると、NOシンターゼが機能的（直接的または間接的）に阻害されることにより、NO産生量が低下するという事実に関係する。NO酸化産物はさまざまな炎症反応を誘発するので、肺におけるアルギナーゼ産生は、NO依存的な炎症を減少させるという点で保護効果を持ちうるが、肺の慢性的変化（例えば平滑筋細胞増殖および線維症）という点では有害でもある。本発明の一態様には、肺の特定細胞タイプ（マクロファージ）中のアルギナーゼを増加させるが、肺の他の細胞（内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋）中のアルギナーゼは減少させる化合物を、患者に投与することが含まれる。
【００７７】
（アルギナーゼI、アルギナーゼII、CAT2またはADAM8遺伝子またはタンパク質と相互作用または結合する分子のスクリーニング）
別の態様として、本発明は、アルギナーゼI遺伝子およびタンパク質の発現を誘導または阻害することができるタンパク質、小分子または他の化合物をスクリーニングまたは同定する方法を提供する。アッセイは、形質転換細胞、非形質転換細胞、不死化細胞株を使ってインビトロで、または形質転換された哺乳類細胞を使ってインビボで行うことができる。特に、アッセイでは、mRNA発現量の増減、アルギナーゼIタンパク質レベルの増減、またはアルギナーゼ経路産物（例えばプトレシンまたはオルニチン）の発現レベルの増減に基づいて、アルギナーゼI遺伝子またはアルギナーゼIタンパク質の発現量に増減があることを、検出することができる。また、気道から得た生物学的液体（例えば肺抽出物、喀痰、気管支肺胞洗浄液）または血液試料（白血球）をアルギナーゼ活性について測定し、次に、その酵素活性の阻害剤を得るためにスクリーニングすることもできる。
【００７８】
例えば、アルギナーゼIポリペプチドを発現させることがわかっている単離された細胞、またはアルギナーゼIポリペプチドを発現させるように形質転換されている単離された細胞を培養し、1つ以上の試験化合物をその培地に加える。その化合物がアルギナーゼIの発現を誘導または阻害するのに十分な時間（例えば0〜72時間またはそれ以上）が経ってから、確立したベースラインからの発現レベルの変化を検出することができる。
【００７９】
本発明の他の態様では、アルギナーゼIタンパク質に結合するか、またはアルギナーゼIタンパク質と結合以外の方法で直接相互作用するタンパク質および他の化合物を同定する方法が提供される。これらのタンパク質および化合物には、インビボでアルギナーゼIと相互作用し、それゆえに医薬剤の新しい標的になる内在性細胞成分、ならびにアルギナーゼI結合能を持ち、それゆえに喘息反応を阻害するための候補となりうる組換え、合成およびそれ以外の外因性化合物が含まれるだろう。
【００８０】
したがって、一連の態様として、アルギナーゼI遺伝子/タンパク質、アルギナーゼII遺伝子/タンパク質、Cat2遺伝子/タンパク質、またはADAM8遺伝子/タンパク質に結合するタンパク質または他の化合物を求めて、ハイスループットスクリーン（HTS）タンパク質またはDNAチップ、細胞溶解液または組織ホモジネートをスクリーニングすることができる。あるいは、天然物および/または合成物である任意の多様な外因性化合物（例えば小分子またはペプチドのライブラリー）をアルギナーゼI結合能に関してスクリーニングすることもできる。
【００８１】
さまざまな態様で、アルギナーゼI、アルギナーゼII、cat2、ADAM8および他の成分の結合を検出するためのアッセイを行う。これらのアッセイにおけるアルギナーゼI、アルギナーゼII、cat2、ADAM8は、天然型または突然変異型のアルギナーゼIタンパク質（アルギナーゼIの機能ドメインまたは抗原決定基を含む）、アルギナーゼII、cat2、またはADAM8融合タンパク質を含むまたはそれらから得られる任意のポリペプチドでありうる。結合は非特異的手段（例えば、ディファレンシャルディスプレイ、2Dゲル電気泳動、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、またはSAGE法によってモニターすることができる転写調整、クロマチン構造の変化、ペプチド産生、および他の下流遺伝子の発現の変化）または直接的手段、例えば免疫沈降、生体分子相互作用アッセイ（Biomolecular Interaction Assay）（BIAcore）またはタンパク質ゲル電気泳動の変化などによって検出することができる。好ましい方法では以下の技術の変法を使用する：（1）アフィニティクロマトグラフィーによる直接抽出、（2）免疫沈降によるアルギナーゼI成分と結合したタンパク質または他の化合物との同時単離、（3）BIAcore解析、および（4）酵母ツーハイブリッドシステム。
【００８２】
本発明の別の態様では、正常型または突然変異型のアルギナーゼI、アルギナーゼII、cat2またはADAM8の活性を調整することができるタンパク質、小分子および他の化合物を同定する方法が提供される。
【００８３】
本発明の別の態様では、アルギナーゼI、アルギナーゼII、cat2またはADAM8の発現、アルギナーゼIの活性、アルギナーゼIが調節する他の遺伝子の活性、正常型または突然変異型アルギナーゼIタンパク質と相互作用するタンパク質の活性に影響を及ぼす能力に基づいて化合物を同定する方法が提供される。アルギナーゼI遺伝子またはアルギナーゼIタンパク質に対する活性を持つ化合物を同定する方法は、正常細胞もしくは組換え細胞を使うか、または本明細書に記載するマウス実験的喘息モデルを使って実施することができる。
【００８４】
本発明のもう一つの側面によれば、本発明のタンパク質を、リガンドまたは他のタイプの小化学分子を得るための合理的化合物設計の出発点として使用することができる。あるいは、上述のスクリーニングアッセイによって同定される小分子または他の化合物は、哺乳類におけるアルギナーゼI経路の調整物質を設計する際の「リード化合物」として役立ちうる。
【００８５】
（アルギナーゼの検出および定量を利用して患者の喘息またはアレルギーを診断することができる）
本発明のもう一つの態様は、ある個体の生物学的液体/組織（例えば肺、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血漿、尿または鼻汁/鼻洗浄液）中のアルギナーゼレベルを測定することによって、その個体の喘息を検出する方法である。正常値を超えるアルギナーゼレベルは、その個体が喘息を持つことを示す。また、アルギナーゼレベルは診断的価値を持つ表現型マーカーでもある。例えば、アルギナーゼ活性が高い患者は、アレルギー性の病因を持つ可能性、アレルゲン曝露が最近あった可能性、または疾患重症度が高い可能性も高いと言える。
【００８６】
（サイトカイン類とアルギナーゼI誘導との関係）
上述のように、本発明の諸態様は、下記実施例8に示すように、喘息では酵素アルギナーゼIおよびアルギナーゼIIが強くアップレギュレートされるという発見に関係している。アルギナーゼは、L-アルギニン＋H2O→L-オルニチン＋尿素という反応を触媒する。知られているように、アルギナーゼはクレブス-ヘンゼライト尿素回路に関与し、哺乳類の肝臓に最も強く濃縮されている。
【００８７】
しかしまた、肺アルギナーゼIは、サイトカイン・インターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-13（IL-13）によって、STAT-6（Signal-Transducer-and-Activator-of-Transcription 6）依存的に、著しく誘導されることも発見した。上述のように、IL-4およびIL-13はどちらも、実施例9に示す通り、炎症の活性化ならびに臨床的喘息およびアレルギー徴候をもたらす残存エフェクター経路の活性化に役割を果たすことが分かった。したがって、IL-4、IL-13、STAT6を遮断する薬物は、アルギナーゼレベルを低下させ、喘息またはアレルギーに苦しむ患者の処置薬になると思われる。当然の帰結として、血液、喀痰、肺液、生検などの生物学的液体中のアルギナーゼ活性の低下は、グルココルチコイド類または抗IL-4、抗IL-13もしくは抗STAT6化合物などの薬物に対する陽性反応の目安になりうる。
【００８８】
（アレルギー性気道炎症は肺プトレシン産生の増加を伴う）
本発明の別の態様は、Th2サイトカイン類によって媒介されるアレルギー反応がアルギナーゼによるアルギニン代謝の著しい誘導を伴いうるという我々の発見に関係している。アルギナーゼの下流にある産物がアレルギー肺で実際に過剰産生されることを立証するために、本発明者らは、アルギニンのアルギナーゼ依存性代謝産物であるポリアミン、プトレシンを解析した。
【００８９】
本発明者らは、肺組織全体を測定した場合に、OVAをチャレンジしたマウスがプトレシンレベルの有意な上昇を示すことを発見した（食塩水群とOVA群でそれぞれ14.7±5.6対32±13 nmol/g 組織［p＜0.05]）。肺全体を測定したことを考えると、2倍というプトレシンの増加は注目に値する。気道炎症は肺プトレシン産生量の増加と関連づけられるので、本発明の一態様は、アレルギー肺を持つ個体を有効に処置するために、肺プトレシンレベルを低下させることである。したがって本発明の一態様は、肺のプトレシンレベルを低下させる組成物によるアレルギー肺の処置である。さらに、本発明のもう一つの態様は、肺でのプトレシンレベルを増加を決定することによるアレルギー肺の検出および/または診断である。
【００９０】
（ヒト喘息ではアルギナーゼが誘導される）
マウスにおける実験的喘息モデルで得られた知見は、ヒト喘息と相関することがわかった（図10）。マウスモデルの結果をヒトに置き換えるために、喘息を持つ個体および対照患者から得た気管支肺胞洗浄液細胞でのアルギナーゼIタンパク質発現を解析した（実施例13）。免疫細胞化学によると、喘息群ではアルギナーゼIを発現させる細胞の数が有意に高かった（図10）。
【００９１】
どちらの群でも、免疫陽性細胞は主としてマクロファージの形態を持つ単核細胞だった。喘息群では、免疫陽性顆粒球の小さい集団も存在した。また、アルギナーゼIセンスプローブによるインサイチューハイブリダイゼーションでは、非喘息肺（対照）との比較で喘息肺におけるアルギナーゼI mRNA発現レベルの上昇も明らかになった。喘息肺中のアルギナーゼI＋細胞には、上皮細胞ならびに平滑筋細胞および浸潤性骨髄性細胞を含む粘膜下細胞が含まれた。
【００９２】
（CAT2は実験的喘息のさまざまな過程に関与する）
本発明のもう一つの態様は、アミノ酸輸送体CAT2も、アルギナーゼ経路による喘息の病理発生過程に関与するという発見に関係する。喘息肺ではCATのどのアイソフォームが発現されるかを決定するために、本発明者らは肺CAT2 cDNAをPCRによってクローニングした（図9）。
【００９３】
次に、PCR産物をTAベクター（pCR2.1、Invitrogen，Inc.）にクローニングし、EcoRI（エクソン8を特異的に消化する）とBamHI（エクソン7を特異的に消化する）でインサートを消化した（図9）。解析したクローンインサート（n＝6）は全て、BamHIで予想される消化産物を遊離させたが、EcoRIでは消化されなかった。対照として、肝臓由来のcDNAは、EcoRIのみによる消化後に、予想される4kbベクター産物と、CAT2Aアイソフォームを示す600bpおよび100bpのインサート産物とを遊離させた。これらの結果から、アレルギー肺におけるCAT2が主として高親和性CAT2Bアイソフォームであることが示された。
【００９４】
CAT2欠損マウスから得られるマクロファージは、L-アルギニン取り込みが95％減少していて、NO産生に著しい障害を持つことが示されている（Nicholsonら，J Biol Chem, 276:15881-5（2001））。実験的喘息におけるCAT2の役割を調べるために、CAT2欠損マウス（およびその同腹仔対照）をOVA誘発実験的喘息法にかけた。マイクロアレイ解析を使って、大きな潜在的エンドポイントセットについてスクリーニングし、アレルゲンチャレンジ後にこれらのマウスから得られる転写物プロファイルを解析した。注目すべきことに、野生型マウスと比較すると、CAT2欠損マウスは、アレルゲン誘導性遺伝子産物のレベルが6.8％と低下していた。これらの産物の1つはCAT2そのものであることから、このゲノム解析の妥当性が確認された。興味深いことに、CAT2欠損マウスでは、ケモカインTARC（Lloydら，J Exp Med，191:265-74（2000）、Kawasakiら，J Immunol，166:2055-62（2001））および酵素15-リポキシゲナーゼ（Sigalら，J Lipid Mediat，6:75-88（1993）、Kuitertら，Thorax，51:1223-8（1996）、Braddingら，Am J Respir Crit Care Med，151:1201-4（1995））など、アレルギー性気道反応に重要であることが知られている分子の誘導が損なわれていた。また、CAT2欠損マウスでは、細胞外マトリックスの完全性に重要であることが知られている上皮分泌分子、低分子プロリンリッチ（SPR）タンパク質2Aの誘導も損なわれていた（Cabralら，J Biol Chem，276:19231-7（2001）、De Heller-Milevら，Br J Dermatol，143:733-40（2000））。各遺伝子について、アレルゲンによる適正な誘導にはCAT2が実際に必要であることを、ノーザンブロット解析を使って確認した。
【００９５】
CAT2は当初T細胞活性化分子として記載されていたが、T細胞性免疫応答におけるその役割は過去には報告されていない（MacLeodら，J Exp Biol，196:109-21（1994））。CAT2がiNOSまたはアルギナーゼの基質利用可能性の決定的な調節に関与しうることを最初に示したのは、炎症誘発分子（例えばリポ多糖）がCAT2発現を調節するという発見だった（MacLeodら，J Exp Biol，196:109-21（1994））。CAT2欠損マクロファージがアルギニン取り込みおよびNO産生に著しい障害を持つという最近の知見は、CAT2が免疫学的応答に果たす役割を裏付けている（Nicholsonら，J Biol Chem，276:15881-5（2001））。CAT2によるアミノ酸輸送は喘息に関係する多くの生化学経路に影響を持つようであるが、CAT2が喘息肺における遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを、マイクロアレイ解析を使って決定した。実際、本発明者らは、TARCおよび15-リポキシゲナーゼを含むアレルゲン誘導性遺伝子、アレルギー性気道反応のいくつかの側面に関与することが既に証明されているタンパク質をコードする遺伝子からなる選ばれた亜集団での障害を実証した（Kawasakiら，J ImmunolI，166:2055-62（2001）、Sigalら，J Lipid Mediat，6:75-88（1993）、Braddingら，Am J Respir Crit Care Med，151:1201-4（1995））。CAT2は、転写に対する直接作用または下流生化学シグナル事象のカスケードによって媒介される間接作用を含む多くの機序によって、遺伝子発現を調節し、喘息に役割を果たしうる。
【００９６】
（肺のCAT2を減少させるか阻害する方法は喘息またはアレルギーの処置または予防に役立ちうる）
喘息ではCAT2がこのような役割を果たしているので、肺のCAT2を減少させるか阻害することができる組成物で喘息またはアレルギーを処置することは有用でありうる。これは、例えばCAT2阻害剤を肺に投与することによって達成できる。またこれは、CAT2遺伝子配列のアンチセンス断片を投与するか、そのようなアンチセンス断片を肺に送達することができる核酸ベクター配列を投与することによって達成することもできる。CAT2の発現または機能を減少させることができる方法はいずれも喘息またはアレルギーの処置に役立ちうる。
【００９７】
（特定組織中のCAT2を増加させることによる喘息またはアレルギーの処置）
本発明のさらにもう一つの態様には、eNOSによる気管支拡張剤NOの産生に関係する保護的応答をもたらすために、患者の特定組織中のCAT2レベルを増加させることが含まれる。これは、CAT2のレベルまたは機能を増加させることでNO産生量が増加するという事実に関係する。本発明の一態様には、肺の特定細胞タイプ（例えば内皮細胞）中のCAT2を増加させるが肺の他の細胞中のアルギナーゼを減少させる化合物を患者に投与することが含まれる。
【００９８】
（ADAM-8と喘息との関係）
本発明のもう一つの態様は、空中アレルゲンであるアスペルギルス・フミガーツスによる粘膜アレルゲンチャレンジを繰り返すことによって誘導される喘息の別個のモデルで、CD156とも呼ばれるADAM-8の誘導が起こることが示されたという発見に関係する。ADAM-8は抗原誘発性気道炎症に関係する遺伝的プログラムの一部であると同定されていることから、その発現の調節に特異的に関与するシグナルを分析することは当を得ていた。ADAM-8の発現は肺へのIL-4およびIL-13送達によって著しく増加し、その誘導はSTAT（signal-transducer-and-activator-of-transcription）-6とはほとんど無関係だった。したがって、患者におけるADAM-8のレベルを低下させる処置は、治療的利益をもたらすと予想される。また、ADAM-8レベルの増加を探すことによって、患者の喘息およびアレルギーを診断することができ、そのようなレベルの増加は喘息またはアレルギーを示す。
【００９９】
ADAM-8は、I型膜貫通タンパク質のADAM（a disintegrin and metalloprotease、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）ファミリーに属する（Yamamoto，S.，Higuchi，Y.，Yoshiyama，K.，Shimizu，E.，Kataoka，M.，Hijiya，N.およびMatsuura，K. 1999「免疫系のADAMファミリータンパク質（ADAM family proteins in the immune system）」Immunol Today 20:278-284）。ADAM1〜7は主として生殖器に発現し、精子-卵子融合および精子形成に役割を果たすようであるが、このファミリーの他のメンバーはもっと広く発現している。ADAMファミリーの特定メンバー（ADAM-10およびADAM-17）は免疫系における役割が実証されており、これらはTNF-aの細胞表面前駆体のプロセシングに関与する。ADAM-8も免疫系で役割を果たしているようである。このタンパク質はマクロファージcDNAライブラリーから同定されて以来、マウスおよびヒトのPMNおよびマクロファージで実証されてきた（Yoshiyama，K.，Higuchi，Y.，Kataoka，M.，Matsuura，K.およびYamamoto，S. 1997「CD156（ヒトADAM8）：その発現、一次アミノ酸配列および遺伝子座（CD156 (human ADAM8): expression, primary amino acid sequence, and gene location）」Genomics 41:56-62）。肝臓および腎臓でADAM-8の細胞外部分を発現させるトランスジェニックマウスは、オキサゾロンによる接触過敏後に好中球浸潤を示した。ADAM-8遺伝子発現は、LPSおよびIFN-γによってアップレギュレートされることも実証されている（Kataoka，M.，Yoshiyama，K.，Matsuura，K.，Hijiya，N.，Higuchi，Y.およびYamamoto，S. 1997「マウスCD156遺伝子の構造、そのプロモーターの特徴づけ、および染色体位置（Structure of the murine CD156 gene, characterization of its promoter, and chromosomal location）」J. Biol. Chem. 272:18209-18215）。
【０１００】
しかし、アレルギー反応におけるADAM-8の役割はまだ確立されていない。上述のマイクロアレイはADAMファミリーのメンバーを18個含んでいたが、有意に誘導されたADAMは1個しかなかった。この遺伝子は、食塩水処置マウスと比較して、各アレルゲン処置マウスでは再現性よく高レベルに確認された。また、I型膜貫通タンパク質のADAMファミリーのメンバーは免疫応答の調節（例えば細胞表面TNF-α前駆体のタンパク質分解的プロセシング）に関連づけられているので（Black，R.A.，Rauch，C.T.，Kozlosky，C.J.，Peschon，J.J.，Slack，J.L.，Wolfson，M.F.，Castner，B.J.，Stocking，K.L.，Reddy，P.，Srinivasan，S.ら 1997「細胞から腫瘍壊死因子アルファを放出するメタロプロテイナーゼディスインテグリン（A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells）」Nature 385:729-733）、この分子は、実験的喘息の重要な新規経路である可能性があった。次に、肺、脾臓および精巣での低レベルな構成的発現と比較して、ADAM-8がアレルゲンチャレンジによって実際に誘導されることを、ノーザンブロット解析を利用して確認した。
【０１０１】
（異なる喘息モデルにおけるADAM-8誘導）
ADAM-8と実験的喘息モデルとの関係が、OVAを使ったこのモデルに限定されるかどうかを決定した。すなわち、アスペルギルス・フミガーツス鼻腔内抗原の反復投与によって実験的喘息を誘発した（Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.およびLuster，A.D. 1998「好酸球上に発現するマウスロイコトリエンB4受容体の分子的および生物学的特徴づけ（Molecular and biological characterization of the murine leukotriene B4 receptor expressed on eosinophils）」J. Exp. Med. 188:1063-1074）。このモデルが腹腔内感作を伴わないことと、アスペルギルス・フミガーツスが遍在性の一般的な空中アレルゲンであることは注目に値する。アスペルギルス・フミガーツスを鼻腔内に9回投与した18時間後に、全肺RNAをノーザンブロット解析にかけて、ADAM-8についてプローブした。9回の鼻腔内食塩水でチャレンジしたマウスと比較して、アスペルギルス・フミガーツスをチャレンジしたマウスには、著しいADAM-8 mRNA発現が認められた。したがって、アレルゲンチャレンジによるADAM-8の誘導は、使用した抗原に特異的なものではなく、実験的喘息の遺伝的プログラムに関与する遺伝子であるようだった（図6および表1）。
【０１０２】
（ADAM-8発現の調節）
ADAM-8はアレルギー性気道反応に関係する新規遺伝子であることが確認されたので、本発明者らは、ADAM-8の調節に関与する分子を調べることに興味を持った。アレルギー反応の中心的特徴はIL-4およびIL-13などのTh2サイトカイン類の過剰発現であるので、次に、本発明者らは、これらのサイトカイン類がADAM-8発現を直接誘導するかどうかを決定した。この仮説を検証するために、本発明者らは、肺で特異的にIL-4を過剰発現させるトランスジェニックマウスにおけるADAM-8発現を調べた。
【０１０３】
野生型マウスと比較して、IL-4肺トランスジェニックマウスでは、ADAM-8 mRNA発現レベルが著しく上昇していた。次に、本発明者らは、肺へのIL-13送達のADAM-8誘導能を調べた。鼻腔内アプローチによる肺へのIL-13の薬理学的送達により、食塩水で処置した動物と比較して、増加したレベルのADAM-8 mRNAが誘導された。IL-4およびIL-13は、STAT-6依存的および非依存的な受容体後事象を含む共通の受容体シグナル伝達系路を共有している。そこで本発明者らは、STAT-6がADAM-8誘導に必要かどうかを決定することに関心を持った。この仮説を検証するために、本発明者等は、STAT-6野生型またはSTAT6遺伝子欠失型のIL-4肺トランスジェニックマウスにおけるADAM-8発現を調べた。興味深いことに、ノーザンブロット解析も併用して、IL-4が誘導するADAM-8発現はほとんどがSTAT-6非依存性であることが確認された。
【０１０４】
（肺でのADAM-8発現レベルを調整することによる喘息またはアレルギーの処置）
したがって本発明のもう一つの態様は、患者のADAM-8レベルを低下させる組成物を患者に投与することによって喘息またはアレルギーを処置する方法である。これは、例えばADAM-8阻害剤を肺に投与することによって達成することができる。またこれは、ADAM-8遺伝子配列のアンチセンス断片を投与するか、またはそのようなアンチセンス断片を肺に送達することができる核酸ベクター配列を投与することによって達成することもできる。ADAM-8発現を減少させることができる方法はいずれも、喘息またはアレルギーの処置に役立ちうる。さらに、患者におけるADAM-8レベルまたはADAM-8遺伝子発現の変動の検出および定量は、喘息またはアレルギーの存在または重症度を診断するために役立つ。
【０１０５】
本発明の精神から逸脱せずに数多くの多様な変更を行いうることは、当業者には理解されるだろう。以下の具体例を参照することにより、本発明をより詳しく理解することができるが、以下の実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１０６】
（マウスにおける実験的喘息の誘導）
Balb/cマウスを国立癌研究所（National Cancer Institute、メリーランド州フレデリック）から入手し、病原体フリーの条件下で飼育した。0日目と14日目にOVAと1mgの水酸化アルミニウム（アルミニウムアジュバント）を腹腔内注射した後、24日目と27日目に鼻腔内OVAまたは食塩水チャレンジを（肺へのタンパク質の送達が促進されるような条件で）行うことによって、喘息モデルを誘発した。アスペルギルス・フミガーツス抗原誘発性喘息は、Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.およびLuster，A.D. 1998「好酸球上に発現するマウスロイコトリエンB4受容体の分子的および生物学的特徴づけ（Molecular and biological characterization of the murine leukotriene B4 receptor expressed on eosinophils）」J. Exp. Med. 188:1063-1074およびMishra，A.，Weaver，T.E.，Beck，D.C.およびRothenberg，M.E. 2001「インターロイキン-5が媒介するアレルギー性気道炎症はトランスジェニックマウスにおけるヒトサーファクタントプロテインCプロモーターを阻害する（Interleukin-5-mediated allergic airway inflammation inhibits the human surfactant protein C promoter in transgenic mice）」J. Biol. Chem. 276:8453-8459に記載されているように、麻酔したマウスにタンパク質の鼻腔内適用を繰り返すことにより、3週間かけて誘発した。
【実施例２】
【０１０７】
（RNAの調製およびマイクロアレイハイブリダイゼーション）
トリゾル（Trizol）試薬を製造者の説明書に従って使用することにより、RNAを抽出した。トリゾル精製後に、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを再精製した。マイクロアレイハイブリダイゼーションは、チルドレンズ・ホスピタル・メディカル・センターのアフィメトリックス・ジーン・チップ・コア施設によって行われた。簡単に述べると、まず、アジレント・バイアナライザー（Agilent technologies，カリフォルニア州パロアルト）を使ってRNAの品質を評価し、それ以降は、28S/18S比が1.3〜2の試料だけを使用した。RNAを、cDNA合成用スーパースクリプト・チョイス（Superscript choice for cDNA Synthesis）（Invitrogen，カリフォルニア州カールズバッド）でcDNAに変換した後、エンゾ高収率RNA転写物ラベリングキット（Enzo High Yield RNA Transcript labeling kit）（Enzo diagnostics、ニューヨーク州ファミングデール）でビオチン化cRNAに変換した。マウスU74Av2ジーンチップ（Affymetrix，カリフォルニア州サンタクララ）にハイブリダイズさせた後、フルイディクス（fluidics）システムを使って、その遺伝子チップを自動で洗浄し、ストレプトアビジン-フィコエリトリンで染色した。チップをヒューレット・パッカード・ジーンアレイ・スキャナ（Hewlett Packar GeneArray Scanner）で走査した。この解析を1チップにつき1匹のマウスで行った（各アレルゲンチャレンジ条件につきn≧3、各食塩水チャレンジ条件につきn≧2）。
【実施例３】
【０１０８】
（ノーザンブロットおよびRT-PCR解析）
先に報告されているように（Yangら，Am J Respir Cell Mol Biol, 25:522-30（2001）、Popeら，J Allergy Clin Immunol，108:594-601（2001））、野生型Balb/cマウスの肺、STAT6遺伝子（Shimodaら，Nature，380:630-3（1996））の野生型または欠失型コピーを持つIL-4クララ細胞10肺トランスジェニックマウス（Rankinら，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93:7821-7825（1996））の肺、食塩水または組換えマウスIL-13で処置したマウスの肺から、RNAを抽出した。PCRによって作成するか市販のベクター［American Tissue Culture Collection（メリーランド州ロックビル）またはIncyte Genomics（カリフォルニア州パロアルト）から入手したIMAGEコンソーシアム］から作成したcDNAプローブの配列を確認し、32Pで放射標識し、標準的条件でハイブリダイズした。RT-PCRは、遺伝子特異的なプライマーと標準的手順を使って、肺cDNAをテンプレートとして行った。
【実施例４】
【０１０９】
（データ解析）
遺伝子チップのデータイメージファイルから、マイクロアレイ・アナリシス・スイート・バージョン4（Microarray Analysis Suite Version 4）ソフトウェア（Affymetrix）のアルゴリズムを使って、遺伝子転写物レベルを決定した。チップごとに遺伝子を比較するために、グローバルスケーリングを行った。すなわち各チップを恣意的な値（1500）に標準化した。各遺伝子は典型的には、16〜20個のプローブ対からなるプローブセットによって表される。各プローブ対は、完全マッチ（perfect match）オリゴヌクレオチドと中央位置に1つの塩基ミスマッチを含むミスマッチ（mismatch）オリゴヌクレオチドとからなる。遺伝子発現については、絶対判定（absolute call）および平均差（average difference）という2つの尺度を使用した。絶対判定は、プローブセットへのRNAのハイブリダイゼーションに基づいて、各遺伝子に「存在する（present）」「不明（marginal）」または「存在しない（absent）」という判定を割り当てる定性的尺度である。平均差は、各プローブ対のミスマッチと完全マッチとの差を求め、その差をプローブセット全体にわたって平均することによって計算される遺伝子発現レベルの定量的尺度である。食塩水処置マウスとOVA処置マウスとの差も、ジーンスプリング（GeneSpring）ソフトウェア（Silicon Genetics，カリフォルニア州レッドウッドシティ）を使って決定した。各アレルゲンチャレンジ時点に関するデータを、食塩水処置マウスの平均値に標準化した。P＜0.05かつ＞2倍の変化を持つ遺伝子を含む遺伝子リストを作成した。未知の発現配列タグに由来するcDNAの割り当てにはGenBankを利用した。機能的分類は、NetAffxサーバー（www.netaffx.com）を通して得たジーンオントロジー（Gene Ontology）の分類［Ashburner，2000＃2003］およびGenBankの公的情報に基づいて行った。実験群の平均値間の有意差は対応のないスチューデントのt検定を使って解析した。値を平均±平均の標準誤差（SEM）として報告した。平均値の差はP＜0.05なら有意であるとみなした。
【実施例５】
【０１１０】
（プレチスモグラフィ測定）
メタコリンに対する気道反応性を、意識下の無拘束マウスで、気圧測定式プレチスモグラフィーにより、Buxco（ニューヨーク州トロイ）が供給する装置とソフトウェアを使って評価した。このシステムでは、エンハンスト・ポーズ（enhanced pause）（Penh）と呼ばれる無次元パラメータが得られる。これは、プレチスモグラフィチャンバからの圧力シグナルの波形の変化と初期および後期呼息のタイミング比較との組合せを反映する値で、気道機能を実験的にモニターするために使用することができる。測定は、Yang，M.ら，Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30（2001）およびHamelmann，E.ら，American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine 156，766-75（1997）に先に記載されているように行った。
【０１１１】
簡単に述べると、マウスをチャンバに入れ、3分間にわたってベースライン測定値を記録して平均した。次に、エアロゾル化したメタコリン（3.125〜50mg/mlの溶液濃度）を注入口からチャンバ内に2分間送達し、各投与後の3分間にわたる測定値を平均した。
【実施例６】
【０１１２】
（アルギナーゼ活性およびプトレシンレベルの測定）
Wei，L.H.ら，Proc Natl Acad Sci U S A 98，9260-4（2001）、Li， H.ら，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 282，R64-R69（2002）、Wei，L.H.ら，Am J Physiol Cell Physiol 279，C248-56（2000）に例示されている確立した技術に従って、血中尿素窒素試薬（Sigma Chemical Company、ミズーリ州セントルイス）を用いてアルギナーゼ活性を測定した。酸抽出に続いてプトレシンレベルを測定するために、イオンペア逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。
【実施例７】
【０１１３】
（アルギナーゼI mRNAを局在するためのインサイチューハイブリダイゼーション）
アルギナーゼI mRNAの細胞での位置を決定するために、インサイチューハイブリダイゼーションを行った。2回目の食塩水またはアレルゲンチャレンジの18時間後に組織を解析した。プローブを作製するために、プラスミドpCMV-SPORTT6（Incyte Genomics，ミズーリ州セントルイス）におけるマウスアルギナーゼI cDNAをEcoRI又はNotI消化によって直線化した。アンチセンスおよびセンスRNAプローブを、T7およびT3 RNAポリメラーゼ（リボプローブ・ジェミニ・コア・システム（Riboprobe Gemini Core System）II転写キット、Promega、ウィスコンシン州マディソン）によって、それぞれ作製した。放射標識した[αS35-UTP]プローブを、制御されたアルカリ加水分解により、平均の長さが200塩基になるまで短くした。OVAまたは食塩水を2回チャレンジしたOVA/ミョウバン感作マウスで、アルギナーゼIアンチセンス（AS）およびセンス（S）プローブのハイブリダイゼーションシグナルを決定した。ハイブリダイズさせたスライドを抗ストリンジェンシー条件下で洗浄した。食塩をチャレンジした肺におけるアンチセンスおよびセンスプローブのハイリダイゼーションはバックグランドと同等だった。
【実施例８】
【０１１４】
（アルギナーゼI発現の解析）
上述の遺伝子チップ解析を使って、チャレンジ1回目の3時間後、チャレンジ1回目または2回目の18時間後に、アルギニン代謝酵素アルギナーゼIおよびiNosをコードする遺伝子の発現を評価した。また、アルギナーゼIおよびiNOS発現のノーザンブロット解析により、OVA誘発性アレルギーは3時間の時点では目立ったアルギナーゼI発現をもたらさないが、18時間の時点ではかなりの発現をもたらし、最初にチャレンジを2回行った場合は18時間の時点で高レベルの発現をもたらすこともわかった。これとは対照的に、iNOS発現のノーザンブロット解析は見えなかった。食塩水をチャレンジしたマウスおよびOVAをチャレンジしたマウスの肺におけるアルギナーゼ酵素の活性（図5D）を、血中尿素窒素試薬を使って、肺溶解液で測定した。対照として、肝臓中のアルギナーゼ活性は、食塩水をチャレンジしたマウスとOVAをチャレンジしたマウスで、それぞれ1522±183および1390±78だった。
【実施例９】
【０１１５】
（IL-4およびIL-3に関するアルギナーゼIの解析）
肺でアルギナーゼを誘導する喘息関連シグナルを解明するために、アルギナーゼIがTh2サイトカイン類IL-4およびIL-13の下流にあるかどうかを決定することに、研究の焦点を置いた。IL-4肺トランスジェニックマウスおよびIL-13処置肺におけるアルギナーゼIのノーザンブロット解析を行った。IL-4肺トランスジェニックマウスは、野生型マウスと比較して、著しく上昇したレベルのアルギナーゼIを発現させた。さらに、肺へのIL-13の薬理学的送達は、食塩水処置動物と比較して、アルギナーゼI mRNAを増加させた。IL-4とIL-13は、IL-4Rα鎖の利用や、ヤヌスキナーゼ1およびSTAT（signal-transducer-and-activator-of-transcription）6の誘導など、部分的に、類似するシグナル伝達要件を共有している。アルギナーゼI誘導がSTAT6に依存するかどうかを決定するために、野生型STAT6または遺伝子ターゲティングで突然変異が導入されたSTAT6を含むIL-4肺トランスジェニックマウスを調べた。IL-4が誘導するアルギナーゼIの発現は、STAT6依存的であることがわかった。また、アレルゲンが誘導するアルギナーゼIの誘導も、STAT6依存的であることがわかった。
【０１１６】
これらの研究は、IL-4およびIL-13がインビトロでマクロファージ中のアルギナーゼを誘導することができ、結果としてNOS依存的なNO産生を制限できることと合致している。この知見は、喘息における一酸化酸素の役割を否定するものではなく、むしろ本発明者らは、喘息肺ではアルギニンは主としてアルギナーゼによって代謝されると考える。この考えは、マウスのTh1関連肉芽腫応答とTh2関連肉芽腫応答に際して、NOSとアルギナーゼとが、それぞれ異なる調節を受けるという最近の知見によって裏付けられる。
【実施例１０】
【０１１７】
（IL-4の過剰発現はインビトロで肺アルギナーゼを強く誘導する）
喘息はTh2関連過程であり、またIL-4は、いくつかの細胞株（例えばマクロファージ、平滑筋細胞）でアルギナーゼを誘導することがインビトロで示されているので（Munder，M.ら，J Immunol 163，3771-7（1999）、Wei，L.H.ら，Am J Physiol Cell Physiol 279，C248-56（2000））、アルギナーゼの誘導にはIL-4が（特に肺で）過剰発現すれば充分であるという仮説を検証することに、本発明者らは関心をもった。肺上皮でIL-4を（クララ細胞10プロモーターの制御下で）過剰発現させるマウスは、好酸球に富む炎症細胞浸潤物、粘液産生およびベースライン気道緊張の変化など、喘息の特徴をいくつか持っている（Rankin，J.A.ら，Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 93，7821-7825（1996））。本発明者らは、IL-4導入遺伝子によってアルギナーゼmRNAが誘導されるという仮説を立てた。実際、IL-4肺トランスジェニックマウスでは、どちらのアルギナーゼアイソタイプのmRNAレベルも、著しく上昇していた。また、IL-4肺トランスジェニックマウスでは、CAT2も誘導された。
【実施例１１】
【０１１８】
（IL-13は気道反応性亢進（AHR）と相関する時間枠でアルギナーゼを迅速に誘導する）
肺アルギナーゼがIL-13（実験的喘息のいくつかの特徴の発生に決定的に関与すること（Wills-Karp，M.，J Allergy Clin Immunol 107，9-18（2001）、Grunig，G.ら，Science 282，2261-3（1998））と、インビトロで細胞株中のアルギナーゼを誘導すること（Wei，L.H.ら，Am J Physiol Cell Physiol 279，C248-56（2000）、Rutschman，R.ら，J Immunol 166，2173-7（2001））が示されているサイトカイン）でも誘導されるかどうかを決定するために、本発明者らは、麻酔したマウスへの鼻腔内適用を繰り返すことによって、IL-13を投与した。このプロコールは、好酸球性炎症、ケモカイン誘導、粘液産生およびAHRを含む実験的喘息の特徴をいくつか誘発する（Grunig，G.ら，Science 282，2261-3（1998）、Yang，M.ら，Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30（2001））。IL-13投与は、食塩水処置対照マウスと比較して、著しいレベルのアルギナーゼI mRNAを誘導した。IL-4トランスジェニックマウスではアルギナーゼII mRNAのレベルが上昇していたという知見と合致して、IL-13もアルギナーゼII mRNAレベルを上昇させた。
【０１１９】
IL-13の単回気管内投与は12時間以内に著しいAHRを誘発する。また、IL-13誘発性のAHRは気道への白血球動員に先立って起こる（Yang，M.ら，Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30（2001））ことから、IL-13が初期AHRを誘発する能力は浸潤性白血球とは無関係であることが示唆される。そこで、IL-13によるアルギナーゼ誘導の動的解析を行った。注目すべきことに、IL-13を1回だけ投与した後に、12時間の時点では既にI型イソ酵素のmRNAが誘導されていた（図8A）。II型アイソタイプは構成的に存在し、I型ほどには誘導されなかった。初期AHRが発生した時にアルギナーゼの誘導を検出することができた。アルギナーゼの初期誘導とAHRは白血球動員に先だって起こる（Yang，M.ら，前掲）。本発明者らは、IL-13によるAHRの誘発は、血管拡張剤NOの産生を基質消耗によって機能的に阻害するというアルギナーゼの能力に関係しているのではないかと考える（Morris，S.M.，Jr. Annual Review of Nutrition 22，87-105（2002）、Mills，C.D. Crit Rev Immunol 21，399-425（2001））。
【実施例１２】
【０１２０】
（インビボでの肺アルギナーゼ誘導は主としてSTAT6依存的である）
IL-4とIL-13は、IL-4Rα鎖の利用や、ヤヌスキナーゼ1およびSTAT6の誘導など、共通のシグナル伝達要件を共有している。それらの応答の一部はSTAT6依存性であることが示されている（Shimoda，K.ら，Nature 380，630-3（1996）、Ihle，J.N. Curr Opin Cell Biol 13，211-7（2001））。インビボでのアルギナーゼIの誘導におけるSTAT6の役割を調べるために、野生型STAT6または遺伝子ターゲティングによって突然変異させたSTAT6を含むIL-4肺トランスジェニックマウスを調べた。IL-4肺トランスジェニックマウスは豊富なアルギナーゼI mRNAを持っていたが、STAT6の不在下では、IL-4によって誘導されるアルギナーゼI mRNAは完全に失われていた。興味深いことに、IL-4導入遺伝子が誘導するアルギナーゼII mRNAシグナルは、STAT6欠損マウスでも減衰が（たとえあったとしても）部分的に過ぎなかった。これはアルギナーゼIIが、アルギナーゼIとは対照的に、主としてSTAT6非依存的であることを示している。これらの知見は、これら2つのイソ酵素について、共通するシグナル伝達要件と異なるシグナル伝達要件とを証明したインビトロ研究を裏付けている（Morris，S.M.，Jr. Annual Review of Nutrition 22，87-105（2002））。本研究室の次の焦点は、アレルゲンによって誘導されるアルギナーゼがSTAT6に依存するかどうかを決定することだった。これにより、アレルゲン誘導性アルギナーゼが主としてIL-4およびIL-13シグナル伝達の下流にあるかどうかが決定されるだろう。注目すべきことに、STAT6欠損マウスではアレルゲン誘導性肺アルギナーゼ活性が90％低下したことから（図8B）、喘息肺ではアルギナーゼIが主な誘導性イソタイプであることが示唆された。これらの知見は全体として、アレルギー性肺炎症中に起こるアルギナーゼの誘導が主としてIL-4、IL-13およびSTAT6の下流にあることを示している。これらの結果は、IL-4およびIL-13がSTAT6依存的経路によりマクロファージでのNO産生を阻害するという最近の知見と合致している（Rutschman，R.ら，J Immunol 166，2173-7（2001））。これらの知見と合致して、マウスアルギナーゼIプロモーターは、IL-4への応答に必要なSTAT6部位を一つ持っている（Morris，S.M.，Jr. Annual Review of Nutrition 22，87-105（2002））。
【実施例１３】
【０１２１】
（ヒト気管支肺胞洗浄液細胞の解析）
アレルギー性喘息患者（12週間はグルココルチコイドを用いていない患者）および健常対照の気管支ファイバースコープを、インフォームドコンセントを得た後で、先に報告されているように行った（Olivensteinら，J Allergy Clin Immunol 103，238-45（1999））。希釈率1/100のモノクローナルマウスIgG1抗ヒトアルギナーゼI（BD Biosceince）を使って、サイトスピン標本の免疫組織化学染色（メタノール／アセトン凝固した後）を行った。スライドは、Hamid，Q.「免疫組織化学（Immunohistochemistry）」Allergy and Allergic Disease，1:775-778（Blackwell Science Ltd，ロンドン，1997）に記載されているように、レバミソールの存在下、ファストレッド（Fast Red）（Sigma Chemical）中で発色させた。陰性対照調製物では、一次抗体を食塩水または非免疫マウスIgG1で置き換えた。盲検的に符号化したサイトスピンスライド上の最低1000個の細胞を陽性細胞の数について算出し、全細胞数に対する百分率として表した。
【実施例１４】
【０１２２】
（アレルギーシグネチャー遺伝子の決定）
1mgの硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン：AlK(SO4)2-12H2O；SIGMA A-7210）の存在下で50μgのオバルブミン（OVAグレードV、SIGMA A-5503）を使用し、腹腔内注射により、2週間の間隔を空けて、マウスを2回感作した。各胃内チャレンジの前に、マウスを3〜4時間絶食させた。1週間に3回、マウスを仰臥位に保ち、0.9％の滅菌食塩水250μlに溶解した可溶性OVAを経口投与した。チャレンジは、胃内供給針（22G-1.5インチ-1.25mmボール、Fisher 01-290-2B）を使って行った。下痢は、経口アレルゲンチャレンジ後1時間にわたってマウスを目視することによって評価した。
【０１２３】
トリゾル精製後に、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを再精製した。次に、4匹の食塩水処置マウスおよび4匹のOVAチャレンジマウスから得た精製RNA（10回のOVAチャレンジまたは食塩水チャレンジの90分後に採取したもの）を一つにまとめ、チルドレンズ・ホスピタル・メディカル・センターのアフィメトリックス・ジーン・チップ・コア施設で処理した。簡単に述べると、まず、アジレント・バイアナライザー（Agilent Technologies，カリフォルニア州パロアルト）を使ってRNAの品質を評価し、それ以降は、28S/18S比が1.3〜2の試料だけを使用した。RNAを、cDNA合成用スーパースクリプト・チョイス（Invitrogen，カリフォルニア州カールズバッド）でcDNAに変換した後、エンゾ高収率RNA転写物ラベリングキット（Enzo diagnostics、ニューヨーク州ファミングデール）でビオチン化cRNAに変換した。
【０１２４】
マウスU74Av2ジーンチップ（Affymetrix，カリフォルニア州サンタクララ）にハイブリダイズさせた後、フルイディクス・システムを使って、その遺伝子チップを自動で洗浄し、ストレプトアビジン-フィコエリトリンで染色した。チップをヒューレット・パッカード・ジーンアレイ・スキャナで走査した。遺伝子チップのデータイメージファイルから、マイクロアレイ・アナリシス・スイート・バージョン4ソフトウェア（Affymetrix）のアルゴリズムを使って、遺伝子転写物レベルを決定した。遺伝子発現については、絶対判定および平均差という2つの尺度を使用した。絶対判定は、プローブセットへのRNAのハイブリダイゼーションに基づいて、各遺伝子に「存在する」「不明」または「存在しない」という判定を割り当てる定性的尺度である。平均差は、各プローブ対のミスマッチと完全マッチとの差を求め、その差をプローブセット全体にわたって平均することによって計算される遺伝子発現レベルの定量的尺度である。
【０１２５】
食塩水処置マウスとアレルゲン処置マウスとの差も、ジーンスプリング・ソフトウェア（Silicon Genetics，カリフォルニア州レッドウッドシティ）を使って決定した。データを食塩水処置マウスの平均値に標準化した。P＜0.05かつ＞2倍の変化を持つ遺伝子を含む遺伝子リストを作成した（ハイブリダイゼーションシグナルに基づいて、存在するという判定（present call）を受けた遺伝子を使用）。次に、喘息「シグネチャー」遺伝子とGIアレルギー「シグネチャー」遺伝子との間で遺伝子リストを重ね合わせて、普遍的「アレルギー」シグネチャー遺伝子の共通集合を得た。
【実施例１５】
【０１２６】
（NOHAによるインビトロおよびインビボでの肺アルギナーゼの阻害）
肺アルギナーゼのmRNAレベルと活性レベルが著しく上昇しているIL-4肺トランスジェニックマウスを使って、NOHAの効果をインビトロおよびインビボで調べた（図11）。図11Aでは、IL-4肺トランスジェニックマウスから得た肺溶解液をNOHAと共にインキュベートした。さまざまなNOHA用量（x軸）およびアルギニンでのアルギナーゼ活性を示す。図11Bでは、IL-4トランスジェニックマウスを気管内NOHA（用量は10mcgと100mcgの2つ）で処置し、4時間後に肺内のアルギナーゼ活性を測定した。図に示すように、NOHAは、肺溶解液中のアルギナーゼ活性を低下させるのに有効であり、IL-4トランスジェニックマウスに気管内投与した場合にも有効だった。
【実施例１６】
【０１２７】
（抗アルギナーゼ化合物による個体の処置）
喘息を患っている個体を同定する。喘息の徴候を減少させるために、その個体に治療有効量のN-ω-ヒドロキシ-L-アルギニンを投与する。この化合物の吸入後は、その個体の喘息症状が減少する。
【実施例１７】
【０１２８】
（アルギナーゼ下流産物を調節する他の化合物）
ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）はODCの阻害剤であり、喘息またはアレルギーの抑制に役立つ処置薬であると予想される。他の潜在的に有用な化合物として、例えばN-ω-ヒドロキシ-L-アルギニン、ボロン酸に基づく遷移状態類似体、例えば2(S)-アミノ-6-ボロノヘキサン酸（ABH）およびS-(2-ボロノエチル)-L-システイン（BEC）などが挙げられ、これらは喘息症状を抑制しうる。他の阻害剤はQueらによって記載されている（Nitric Oxide. 2002 Feb;6(1):1-8）。
【実施例１８】
【０１２９】
（免疫病理発生に対するアルギナーゼ経路阻害剤DFMOの効果）
アルギナーゼ作用の下流にあるアルギナーゼ経路の遮断は、マウスにおける実験的喘息に対して重要な作用を持ちうる。DFMOは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）作用（プトレシンが前駆体分子オルニチンから合成される反応を触媒する生化学的ステップ）をブロックする不可逆的阻害剤である。DFMOは、マウスを含む複数の種でよく研究されている市販薬（SigmaおよびIlex Oncology，Inc）である（Prakashら（1978）Cancer Res 38:3059-3062、MeyskensおよびGerner（1999）Clin. Cancer Res 5:945-951）。
【実施例１９】
【０１３０】
（実験的マウス喘息モデルにおける喘息誘発後のアルギナーゼ経路阻害剤DFMO投与の効果）
肺におけるアルギナーゼ経路を遮断する薬剤は、患者の肺で喘息がいったん確立してしまってから、その喘息の効果を軽減または緩和するのに役立ちうる。アルギナーゼ経路の遮断が何らかの効果を持つかどうかを決定するために、アルギナーゼ経路活性の代表的阻害剤であるDFMOを通常の手段によって患者に投与する。DFMOを投与された患者では、食塩水で処置された患者と比較して、喘息の効果が低下していることがわかる。
【実施例２０】
【０１３１】
（アレルゲン誘発性気道反応性亢進の発症に対するアルギナーゼI阻害剤NOHA投与の効果）
メタコリンに対する気道反応性を、意識下の無拘束マウスで、気圧測定式プレチスモグラフィーにより、Buxco（ニューヨーク州トロイ）が供給する装置とソフトウェアを使って評価した。このシステムでは、エンハンスト・ポーズ（Penh）と呼ばれる無次元パラメータが得られる。これは、プレチスモグラフィチャンバからの圧力シグナルの波形の変化と初期および後期呼息のタイミング比較との組合せを反映する値で、気道機能を実験的にモニターするために使用することができる。測定は、Yang，M.ら，Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30（2001）およびHamelmann，E.ら，American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine 156，766-75（1997）に先に記載されているように行った。
【０１３２】
簡単に述べると、マウスをチャンバに入れ、3分間にわたってベースライン測定値を記録して平均した。次に、エアロゾル化したメタコリン（3.125〜50mg/mlの溶液濃度）を注入口からチャンバ内に2分間送達し、各投与後の3分間にわたる測定値を平均した。
【０１３３】
NOHAの効果を調べるために、IL-4/IL-5トランスジェニック肺（Penhによる測定で気道反応性亢進が増大しているもの）を気管内NOHA（100mcg）に曝露し、4時間後にPenh測定値を記録した（図12）。対照として、無処置IL4/IL5肺トランスジェニックマウスでのPenh値を示す。
【０１３４】
好ましい態様を含めて本発明をここに詳しく充分に説明し終えたが、本発明の精神から逸脱しなくても当業者には変更態様が思い浮かぶことは言うまでもない。したがって、本発明を一定の好ましい態様について説明したが、本明細書の開示に照らして当業者には明白な他の態様も、本発明の範囲に包含される。したがって本発明は、本願特許請求の範囲およびその等価物を参照することによってのみ定義されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】アルギニン代謝経路の概略図である。
【図２】図2Aは、アレルゲンチャレンジプロトコールの一態様を示す略図である。0日目と14日目にオバルブミン（OVA）（100μg）とミョウバン（1mg）をマウスに2回腹腔内投与した。次に、マウスの鼻腔内にOVA（50μg）または食塩水をチャレンジし、1回目または2回目のアレルゲンチャレンジの3時間後または18時間後に解析した。図2Bは、食塩水処置マウスおよびOVA処置マウスに関するエオタキシン-1シグナルの定量分析を表す棒グラフである。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図３】OVA処置マウスで実験的喘息の特定時期に誘導される遺伝子の部分的な重なりを表すベン図である。
【図４】マウスにおいてアレルゲンとしてのOVAおよびアスペルギルス抗原によって誘導される遺伝子の部分的な重なりを表すベン図である。
【図５】アルギニン代謝酵素の発現を表す図である。アレルゲンをチャレンジしたマウスにおけるアルギナーゼIおよびiNOSの発現（遺伝子チップ解析によって測定したもの）を、それぞれ図5Aおよび図5Bに示す。食塩水チャレンジ後（灰色の棒）およびアレルゲンチャレンジ後（黒色の棒）のハイブリダイゼーションシグナルの平均差を図示する。エラーバーは標準偏差を表す。測定時点は、3H＝チャレンジ1回目の3時間後、18H＝チャレンジ1回目の18時間後、2C＝チャレンジ2回目の18時間後、asp＝アスペルギルスである。アルギニン代謝経路の概略図を図5Cに示す。遺伝子チップアレイ上に存在しない遺伝子を白い枠で表し、遺伝子チップ上に存在するが有意に増加していない遺伝子を灰色の枠で表し、有意に増加した遺伝子を黒い枠で表す。食塩水をチャレンジしたマウスおよびOVAをチャレンジしたマウスの肺におけるアルギナーゼ活性を、図5Dに示す。肺溶解液中のアルギナーゼ活性を、血中尿素窒素試薬を使って測定した。対照として、食塩水をチャレンジしたマウスおよびOVAをチャレンジしたマウスの肝臓中のアルギナーゼ活性は、それぞれ1522±183および1390±78だった。
【図６】アレルゲンをチャレンジしたマウスにおけるADAM-8の誘導（遺伝子チップ解析によって測定したもの）を表す棒グラフである。食塩水チャレンジ後（灰色の棒）およびアレルゲンチャレンジ後（黒い棒）のADAM-8のハイブリダイゼーションシグナルに関する平均差を図示する。エラーバーは標準偏差を表す。測定時点は、3H＝チャレンジ1回目の3時間後、18H＝チャレンジ1回目の18時間後、2C＝チャレンジ2回目の18時間後である。
【図７】オバルブミン（OVA）をチャレンジしたマウスおよびアスペルギルス・フミガーツス（Asp）をチャレンジしたマウスにおけるL-アルギニン代謝酵素、アルギナーゼI（図7A）、アルギナーゼII（図7B）およびCAT2（図7C）の発現（遺伝子チップ解析によって測定したもの）を表す図である。食塩水チャレンジ後（灰色の棒）およびアレルゲンチャレンジ後（黒い棒）のハイブリダイゼーションシグナルの平均差を図示する。エラーバーは標準偏差を表す。
【図８】IL-13およびSTAT6によるアルギナーゼの調節を表す図である。図8Aは、IL-13が誘発する気道反応性亢進（AHR）と肺でのアルギナーゼmRNAレベルの動的特徴を表す棒グラフである。マウス（n＝4〜10/群）にIL-13（10μg）またはPBSを単回気管内投与し、さまざまな時点でAHRを分析し、Penh（最大反応を与えた25mg/mlのメタコリンに関する値）として表した。下側の図では、肺RNAをcDNAに変換して、アルギナーゼI（ArgI）、アルギナーゼII（ArgII）または対照ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）のPCR分析に使用した。「対照」と記したレーンはcDNAテンプレートを含んでいない。図8Bは、食塩水またはOVAをチャレンジした野生型（WT）マウスおよびSTAT6欠損（STAT6-KO）マウスの肺におけるアルギナーゼ活性を表す棒グラフである。肺溶解液中のアルギナーゼ活性を、血中尿素窒素試薬を使って測定した。
【図９】実験的喘息におけるCAT2（特にCAT2Aアイソフォーム対CAT2Bアイソフォーム）の関与を決定するために使用した方法の概略図である。アレルゲンをチャレンジしたマウスの肺からRT-PCRによってCAT2を増幅し、pCR2.1ベクターにサブクローニングした。次に、CAT2AサブタイプとCAT2Bサブタイプを区別するために、それぞれEcoRIまたはEcoRI/BamHIで、クローンを消化した。
【図１０】ヒト喘息でのアルギナーゼIタンパク質発現を表すグラフである。アレルギー性喘息患者および健常対照者の気管支ファイバースコープ検査を行い、BALFをアルギナーゼI免疫組織化学について分析した。全細胞数に対する百分率として表現した免疫陽性細胞数を示す。
【図１１】図11Aおよび図11Bは、肺溶解液をN-ω-ヒドロキシ-L-アルギニン（NOHA）で処理した結果を示す線グラフである。図11Aは、オバルブミンをチャレンジしたマウスから得た肺溶解液の、NOHAによるインビトロ処理を表す。図11Bは、インターロイキン4を過剰発現させるトランスジェニックマウスの、NOHAによるインビトロ処置を表す。
【図１２】気管内NOHAで処置した喘息マウス（IL4/IL5二重トランスジェニック肺マウス）における気道反応性亢進測定（Penhとして記録）の結果を示す線グラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
2005532997.tif 000031
2005532997.tif 000032
2005532997.tif 000033