(57)【要約】本発明の方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与による糖尿病、特に２型糖尿病及び関連障害の処置に関連する。そのようなＰＤＥ１１Ａ阻害剤をアルファ−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進薬、肝臓グルコース排出量低下化合物、ベータ３アゴニスト又はインスリンと組み合わせて投与することができる。そのようなＰＤＥ１１Ａ阻害剤を体重減量薬と組み合わせて投与することもできる。本発明のさらに別の方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与により、特に血液グルコース濃度の上昇に応答した膵臓細胞からのインスリンの放出を刺激することに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる、糖尿病、若年発症の成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、成人の潜在性自己免疫糖尿病（ｌａｔｅｎｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｄｕｌｔ）（ＬＡＤＡ）、耐糖能障害（ｉｍｐａｉｒｅｄｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）（ＩＧＴ）、空腹時糖障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＩＦＧ）、妊娠性糖尿病及び代謝性シンドロームＸよりなる群から選ばれる疾患又は状態の処置又は予防方法。
【請求項２】
糖尿病が２型糖尿病である請求項１の方法。
【請求項３】
ＰＰＡＲ−アゴニスト、インスリン感作物質、スルホニルウレア、インスリン分泌促進薬、肝臓グルコース排出量低下化合物、α−グルコシダーゼ阻害剤又はインスリンを該ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と組み合わせて投与することをさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項４】
該ＰＰＡＲ−アゴニストがロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及びピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）から選ばれる請求項３の方法。
【請求項５】
該スルホニルウレアがグリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）及びグリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）から選ばれる請求項３の方法。
【請求項６】
該インスリン分泌促進薬がＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＡＣ／ＶＰＡＣレセプターアゴニスト、セクレチン、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）、メグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、グリベンクラミド、グリメピリド、クロルプロパミド及びグリピジドから選ばれる請求項３の方法。
【請求項７】
該α−グルコシダーゼ阻害剤がアカルボース、ミグリトール及びボグリボースから選ばれる請求項３の方法。
【請求項８】
該肝臓グルコース排出量低下化合物がメツフォルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）である請求項３の方法。
【請求項９】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸封鎖剤（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）、フィブリン酸誘導体、血圧降下薬又は抗−肥満薬を該ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と組み合わせて投与することをさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項１０】
該抗−肥満薬がβ−３アゴニスト、ＣＢ−１アンタゴニスト及びリパーゼ阻害剤から選ばれる請求項９の方法。
【請求項１１】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、褐色細胞腫及び薬剤−誘導糖尿病から選ばれる糖尿病の二次的原因を処置もしくは予防する方法。
【請求項１２】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる、インスリン分泌促進薬への膵臓ベータ細胞の感受性を向上させる方法。
【請求項１３】
該インスリン分泌促進薬がＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＡＣ／ＶＰＡＣレセプターアゴニスト、セクレチン、ナテグリニド、メグリチニド、レパグリニド、グリベンクラミド、グリメピリド、クロルプロパミド及びグリピジドから選ばれる請求項１２の方法。
【請求項１４】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる痴呆の処置もしくは予防の方法。
【請求項１５】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる、高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞、安定及び不安定狭心症、末梢閉塞疾患及び虚血性発作から選ばれる心臓血管障害の処置もしくは予防の方法。
【請求項１６】
有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤を哺乳類に投与することを含んでなる、失禁、ストレス失禁、良性前立腺過形成、勃起機能障害、女性性機能障害及び前立腺肥大から選ばれる尿生殖路障害の処置もしくは予防の方法。
【請求項１７】
該女性性機能障害が女性性覚醒障害（ｆｅｍａｌｅ  ｓｅｘｕａｌ  ａｒｏｕｓａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＰＤＥ１１Ａを阻害する化合物を投与することにより糖尿病及び関連障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
糖尿病は損なわれたグルコース代謝を特徴とし、他の症状の中でも糖尿病患者における高い血液グルコースレベルにより顕症する。基となる欠陥から、糖尿病は２つの主な群：１型及び２型に分類される。１型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、患者にその膵腺中でインスリン−生産性ベータ−細胞が欠けている場合に起こる。２型糖尿病又は非−インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、損なわれたベータ−細胞機能及びインスリン作用における変調を有する患者において起こる。
【０００３】
１型糖尿病患者のための現在の処置はインスリンの注射であるが、２型糖尿病患者の大部分は、ベータ−細胞機能を刺激する薬剤又はインスリンに対する患者の組織感受性を強化する薬剤を用いて処置される。２型糖尿病の処置のために現在用いられている薬剤にはアルファ−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進薬、メツフォルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）及びインスリンが含まれる。
【０００４】
時間を経ると、すべての２型糖尿病患者の３分の１より多くが経口的薬剤へのそれらの応答を失う。食事、運動及び経口的薬剤投与が血液グルコースを適切に制御するのに失敗した後、インスリン処置が始められる。インスリン処置の欠点は、薬剤注射の必要性、低血糖の可能性及び体重増加である。
【０００５】
糖尿病治療のための他の戦略は、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）シグナリング機構及びインスリン分泌へのその効果に基づく。グルコースの代謝はＡＴＰ−依存性Ｋ＋チャンネルの閉鎖を促進し、それは細胞脱分極及び続くＣａ＋＋チャンネルの開放に導く。これは今度はインスリン顆粒のエキソサイトーシスを生ずる。ｃＡＭＰは、グルコース−刺激インスリン分泌の主な調節物質である。しかしながらｃＡＭＰの効果はグルコース−依存性であり、すなわちｃＡＭＰは低いグルコース濃度において、もしあったとしても小さいインスリン分泌への効果しか有していない（非特許文献１）。インスリン分泌へのｃＡＭＰの効果は、タンパク質キナーゼＡ経路により媒介されると考えられる。
【０００６】
内在性分泌促進薬は、グルコース−依存的様式でインスリン分泌を調節するためにｃＡＭＰシステムを用いる（非特許文献２）。そのような内在性分泌促進薬の例には下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩＰ）及びグルカゴン−様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が含まれる。
【０００７】
ＰＡＣＡＰは膵臓ベータ細胞からのグルコース−依存性インスリン分泌の有力な刺激物質である。３種のＰＡＣＡＰレセプター型（Ｒ１、Ｒ２及びＲ３）が記載されている（非特許文献３）。ＰＡＣＡＰの向インスリン作用はＧＴＰ結合タンパク質Ｇｓにより媒介される。細胞内ｃＡＭＰの堆積は、今度はベータ細胞中の非選択的カチオンチャンネルを活性化し、［Ｃａ＋＋］を向上させ、インスリン−含有分泌顆粒のエキソサイトーシスを促進する。
【０００８】
バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（ＶＩＰ）は、ブタの上部小腸から最初に単離された２８アミノ酸ペプチドである（非特許文献４；特許文献１）。ＶＩＰの生物学的効果は、細胞内ｃＡＭＰシグナリングシステムに共役した膜−結合レセプタータンパク質の活性化により媒介される。
【０００９】
ＧＬＰ−１は食後に腸Ｌ−細胞から放出され、インクレチンホルモン（ｉｎｃｒｅｔｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ）として機能する（すなわちそれは膵臓ベータ細胞からのグルコース−誘導インスリン放出に力を与える）。それは、組織型に依存して種々にグルカゴン遺伝子により発現される３７−アミノ酸ペプチドである。β−細胞中のｃＡＭＰレベルを上昇させる有益な効果を支持する臨床的データが、ＧＬＰ−１を用いて集められた。制御が劣った２型糖尿病におけるＧＬＰ−１の輸液は、それらの空腹血液グルコースレベルを正常化し（非特許文献５）、より長期間の輸液はベータ細胞機能を正常人（ｎｏｒｍａｌ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ）のそれまで向上させた（非特許文献６）。最近の報告は、耐糖能障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を有する患者において、グルコースに応答するβ−細胞の能力をＧＬＰ−１が向上させることを示した（非特許文献７）。
【００１０】
２型糖尿病の処置のためのそのような内在性分泌促進薬の使用もいくつかの欠点を有する。例えば、これらの化合物のペプチジル性（ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｎａｔｕｒｅ）は、注入によりそれらを投与することを必要とする。さらに、内在性分泌促進薬の効果は、ペプチドの短い半減期のために短−寿命である。
【００１１】
現在の処置に伴う問題のために、２型糖尿病の処置のための新規な治療が必要である。特に正常な（グルコース−依存性）インスリン分泌を保持する新規な処置が必要である。そのような新規な薬剤は以下の特性を有していなければならない：１）インスリン分泌促進に関するグルコースへの依存性、すなわち高められた血液グルコースの存在下のみでインスリン分泌を刺激する化合物であり、従って低い低血糖の可能性；２）低い一次及び二次無効率（ｌｏｗ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｒａｔｅｓ）；ならびに３）島細胞機能の保存。本発明は、ホスホジエステラーゼ１１Ａ（ＰＤＥ１１Ａ）の阻害によるｃＡＭＰシグナリングシステムの調節に焦点を当てることにより、これらの要求と向き合った。
【００１２】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）は、３’，５’−環状ヌクレオチド一リン酸を５’−ヌクレオチド一リン酸に切断するｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰ−加水分解酵素の群である。ＰＤＥｓはｃＡＭＰシステムの調節に含まれることが既知である。特定的にＰＤＥ１１Ａは、約１〜５μＭのＫｍ値でｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを加水分解するホスホジエステラーゼである（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＰＤＥ１１Ａの少なくとも４種のスプライス変異体が、それらのＣ−末端触媒ドメインにおいて同じであるが、分子のＮ−末端部分の寸法が異なると記載されている。非特許文献１１；非特許文献１２。
【非特許文献１】Ｗｅｉｎｈａｕｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１９９８年，１４２６−１４３５
【非特許文献２】Ｋｏｍａｔｓｕ，  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．著，，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：１９９７年，１９２８−１９３８
【非特許文献３】Ｈａｒｍａｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０：１９９８年，２６５−２７０
【非特許文献４】Ｓａｉｄ  ａｎｄ  Ｍｕｔｔ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６９：１９７０年，１２１７−１２１８
【特許文献１】米国特許第３，８７９，３７１号明細書
【非特許文献５】Ｇｕｔｎｉａｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．著，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３２６：１９９２年，１３１６−１３２２
【非特許文献６】Ｒａｃｈｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：１９９６年，１５２４−１５３０
【非特許文献７】Ｂｙｒｎｅ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１９９８年，１２５９−１２６５
【非特許文献８】Ｆａｗｃｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０００  Ｍａｒ  ２８；９７（７）：２０００年，３７０２−７
【非特許文献９】Ｈｅｔｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０００  Ｎｏｖ  ７；９７（２３）：２０００年，１２８９１−５
【非特許文献１０】Ｙｕａｓａ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００１  Ａｕｇ；２６８（１６）：２００１年，４４４０−８
【非特許文献１１】Ｙｕａｓａ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２６８（１６），２００１年，４４４０−８
【非特許文献１２】Ｙｕａｓａ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７５（４０），２０００年，３１４６９−３１４７９
【発明の開示】
【００１３】
発明の概略
本発明は、有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与により、哺乳類における糖尿病、特に２型糖尿病を処置する方法に関する。本発明の他の方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与による、糖尿病に関連する他の障害、例えばシンドロームＸ、耐糖能障害及び空腹時糖障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）の処置に関連する。本発明は、さらに、有効量のＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与により、哺乳類において膵臓細胞からのインスリン放出を刺激する方法に関する。このインスリン放出の方法は、哺乳類の血液中のグルコースの濃度の上昇に応答することができる。本発明の方法において、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を他の糖尿病治療、例えば、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース）、インスリン感作物質（例えばチアゾリジンジオン）、肝臓グルコース排出量を低下させる化合物（例えばメツフォルミン）、インスリン分泌促進薬（例えばスルホニルウレア）、ベータ３−アゴニスト及びインスリンと組み合わせて投与することもできる。さらに、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を１種もしくはそれより多い体重減量薬、例えばキセニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）、メリジア（Ｍｅｒｉｄｉａ）、ベータ３−アゴニスト又はＣＢ−１アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。最後に他の態様において、本発明の方法はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸封鎖剤（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ）、フィブリン酸誘導体又は血圧降下薬と組み合わされたＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与を提供する。
【００１４】
本発明の他の方法において、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を痴呆又は尿生殖路障害の処置のために投与することができる。尿生殖路障害には失禁、ストレス失禁、良性前立腺過形成、勃起機能障害、女性性機能障害及び前立腺肥大が含まれるがこれらに限られない。本発明の他の方法において、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を心臓血管障害、例えば高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞、安定及び不安定狭心症、末梢閉塞疾患及び虚血性発作の処置のために投与することができる。
【００１５】
従って、本発明は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与を介するＰＤＥ１１Ａの阻害により糖尿病を処置するための方法を提供する。本発明のこれらの及び他の側面は、以下の図面、記述及び特許請求の範囲からもっと明らかになるであろう。
図面の簡単な記述
図１Ａ−１Ｃは、島細胞におけるＰＤＥ１１Ａの発現を示す。
【００１６】
図１Ａは、Ｆ２／Ｒ１プライマー組み合わせを用い、鋳型としての島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す。
【００１７】
図１Ｂは、Ｆｏｒ３／Ｒ２プライマー組み合わせを用い、島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す。
【００１８】
図１Ｃは、Ｆ４／Ｒｅｖ２プライマー組み合わせを用い、島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す。
【００１９】
図中、矢印は予測される寸法を有するＰＣＲ産物を示す。レーンの同定は以下の通りである：１Ｋｂ＝１Ｋｂ  ＤＮＡ標準マーカー、島＝島ｃＤＮＡ鋳型、−ＤＮＡ＝マイナスＤＮＡ標準、ＰＤＥ１１Ａ＝鋳型としてＰＤＥ１１Ａを含有するプラスミドを用いる正の標準、Ｎｅｇ＝鋳型として関連性のない遺伝子を含有するプラスミドを用いる負の標準。
発明の詳細な記述
本発明の方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与により、糖尿病及び関連障害、特に２型糖尿病の処置ならびに／あるいは膵臓細胞からのインスリン放出の刺激を与える。そのような方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与により、空腹又は食後状態にグルコースが高められるいずれの状態の処置をも与える。ＰＤＥ１１Ａはランゲルハンス島において同定された。ＰＤＥ１１ＡはｃＡＭＰをＡＭＰに加水分解し、それによりｃＡＭＰの細胞内濃度を低下させる。ＰＤＥ１１Ａ活性の阻害によってｃＡＭＰの細胞内レベルは上昇し、それによりインスリン−含有分泌顆粒の放出が増加し、従ってインスリン分泌が増加する。本明細書に示される通り、ＰＤＥ１１Ａの活性を阻害する化合物は、島アッセイにおいてインスリン分泌を刺激もする。やはり本明細書に記載される通り、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を痴呆、心臓血管疾患又は尿生殖路障害の処置のために投与することができる。
処置の方法
本発明の方法を、１型及び２型糖尿病の両方を含む糖尿病のような疾患の処置のために用いることができる。そのような方法は糖尿病及び糖尿病合併症の発症を遅らせることもできる。本発明の方法を用いて処置もしくは予防され得る他の疾患及び状態には：若年発症の成人型糖尿病（Ｍａｔｕｒｉｔｙ−Ｏｎｓｅｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｏｕｎｇ）（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：１９９４年，４０）、成人の潜在性自己免疫糖尿病（Ｌａｔｅｎｔ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｄｕｌｔ）（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：１９９４年，２９９）、耐糖能障害（ＩＧＴ）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）Ｓ５（１９９９））、空腹時糖障害（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：１９９１年，７９６）、妊娠性糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ著，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４０：１９９１年，１９７）及び代謝性シンドロームＸが含まれる。
【００２０】
糖尿病の二次的原因の処置のために本発明の方法を用いることもできる（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）Ｓ５（１９９９））。そのような二次的原因にはグルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、褐色細胞腫及び薬剤−誘導糖尿病が含まれる。糖尿病を誘導し得る薬剤には、ピリミニル（ｐｙｒｉｍｉｎｉｌ）、ニコチン酸、グルココルチコイド、フェニトイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、甲状腺ホルモン、β−アドレナリン作用薬、α−インターフェロン及びＨＩＶ感染の処置に用いられる薬剤が含まれるがこれらに限られない。
【００２１】
インスリンのｃＡＭＰ−媒介放出は、刺激性のグルコース濃度の存在にも依存する。本発明の方法はさらに、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与による島細胞からのインスリン放出の刺激にも関連する。従って非−ペプチド化合物を用いるインスリン分泌のグルコース−依存性刺激は、低血糖を引き起こすことなく血液グルコース濃度を低下させる。
【００２２】
本発明の方法を単独で、あるいは糖尿病及び関連障害の処置において当該技術分野における熟練者に既知の追加の治療及び／又は化合物と組み合わせて用いることができる。あるいはまた、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を部分的にもしくは完全に組み合わせ治療において用いることができる。
【００２３】
ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニルウレア薬、非−スルホニルウレア分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作物質、インスリン分泌促進薬、肝臓グルコース排出量低下化合物及びインスリンを含む、糖尿病の処置のための他の既知の治療と組み合わせて投与することもできる。そのような治療をＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与の前に、それと同時に又はそれに続いて施すことができる。インスリンは長期及び短期作用形態の両方ならびにインスリンの調剤を含む。ＰＰＡＲアゴニストは、ＰＰＡＲサブユニットのいずれか又はそれらの組み合わせのアゴニストを含むことができる。例えばＰＰＡＲアゴニストはＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−δ又はＰＰＡＲのサブユニットの２種もしくは３種のいずれかの組み合わせのアゴニストを含むことができる。ＰＰＡＲアゴニストは、例えば、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）及びピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）を含む。スルホニルウレア薬は、例えば、グリブリデ（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリメピリデ（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）及びグリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）を含む。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と一緒に投与されると糖尿病の処置に有用であり得るα−グルコシダーゼ阻害剤にはアカルボース、ミグリトール及びボグリボースが含まれる。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と一緒に投与されると糖尿病の処置に有用であり得るインスリン感作物質にはチアゾリジンジオン及び非−チアゾリジンジオンが含まれる。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と一緒に投与されると糖尿病の処置に有用であり得る肝臓グルコース排出量低下化合物には、メツフォルミン、例えばグルコファージ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）及びグルコファージ  ＸＲが含まれる。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤と一緒に投与されると糖尿病の処置に有用であり得るインスリン分泌促進薬にはスルホニルウレア及び非−スルホニルウレア薬：ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＰＡＣ／ＶＰＡＣレセプターアゴニスト、セクレチン、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）、メグリチニド（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、グリベンクラミド、グリメピリド、クロルプロパミド及びグリピジドが含まれる。ＧＬＰ−１には、本来のＧＬＰ−１より長い半減期を有するＧＬＰ−１の誘導体、例えば脂肪酸誘導体化ＧＬＰ−１及びエキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）が含まれる。本発明の１つの態様において、インスリン分泌促進薬への膵臓ベータ細胞の感受性を向上させるために、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤はインスリン分泌促進薬と組み合わせて用いられる。
【００２４】
ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を抗−肥満薬と組み合わせて用いることができる。抗−肥満薬には、β−３アゴニスト、ＣＢ−１アンタゴニスト、食欲抑制剤、例えばシブトラミン（ｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅ）（メリディア（Ｍｅｒｉｄｉａ））及びリパーゼ阻害剤、例えばオルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）（キセニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ））が含まれる。
【００２５】
糖尿病患者における脂質障害の処置に通常用いられる薬剤と組み合わせてＰＤＥ１１Ａ阻害剤を用いることもできる。そのような薬剤には、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸封鎖剤及びフィブリン酸誘導体が含まれるがこれらに限られない。血圧降下薬、例えばβ−遮断薬及びＡＣＥ阻害剤と組み合わせて本発明の方法を用いることもできる。
【００２６】
そのような共−治療を２種もしくはそれより多くの薬剤のいずれかの組み合わせ（例えばインスリン感作物質及び抗−肥満薬との組み合わせにおけるＰＤＥ１１Ａ阻害剤）において施すことができる。そのような共−治療を上記のように製薬学的組成物の形態で施すことができる。
【００２７】
本発明の他の方法は、痴呆の処置のためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与に関連する。Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９７６年，５（４）：２４１−２５０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９１年，１２（１）：１９−２７。
【００２８】
本発明のさらに別の方法は、ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与による尿生殖路障害の処置に関連する。そのような尿生殖路障害には、失禁、ストレス失禁、良性前立腺過形成、勃起機能障害、女性性機能障害（女性性覚醒障害（ｆｅｍａｌｅ  ｓｅｘｕａｌ  ａｒｏｕｓａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を含む）及び前立腺肥大が含まれるがこれらに限られない。Ｂａｌｌａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  １５９（６）：１９９８年，２１６４−２１７１；欧州特許出願公開第１２１１３１３号明細書（精子形成へのＰＤＥ１１Ａの効果に関して）。
【００２９】
本発明の他の方法は心臓血管障害、例えば高血圧、虚血性心疾患、心筋梗塞、安定及び不安定狭心症、末梢閉塞疾患及び虚血性発作の処置のためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与に関連する。ＰＤＥ１１群は、種々の組織におけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの分解を担う酵素を含む（Ｆａｗｃｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．著，ＰＮＡＳ，２０００年，９７，３７０２−３７０７）。さらに、ＰＤＥ１１の発現を心臓において検出することができる（Ｙｕａｓａ，ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１年，２６８，４４４０−４４４８）。サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）及びサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、血管平滑筋緊張の調節に含まれる重要な二次メッセンジャーである。可溶性及び膜結合グアニル酸シクラーゼの活性化は細胞内ｃＧＭＰレベルを向上させ、血管拡張を誘導する。血管平滑筋細胞内で発現される種々のＧタンパク質−共役レセプター（ＧＰＣＲｓ）（例えばアドレノメジュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）及びＣＧＲＰレセプター）の刺激は、アデニル酸シクラーゼの活性化、細胞内ｃＡＭＰの生成及び血管拡張を誘導する。３’，５’−環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）は、３’，５’−環状ヌクレオチドのそれらのそれぞれのヌクレオシド５’−一リン酸への加水分解を触媒する。上記に示したすべての理由のために、ＰＤＥ１１Ａは心臓血管系においてある役割を果たすと思われる。
製薬学的組成物
本発明の方法で用いるためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤は、化合物自体として投与され得る。あるいはまたＰＤＥ１１Ａ阻害剤を、製薬学的組成物の形態で許容され得る担体と一緒に投与することができる。製薬学的に許容され得る担体は組成物の他の成分と適合性でなければならず、受容者にとって許容されないほど有害であってはならない。担体は固体又は液体あるいは両方であることができ、好ましくは投薬形態の合計重量に基づいて約０．０５重量％〜約９５重量％の単数種もしくは複数種の活性化合物を含有することができる単位−投薬量組成物、例えば錠剤として化合物と調製される。糖尿病的状態の処置に有用な他の化合物を含む他の薬理学的に活性な物質も存在することができる。
【００３０】
本発明の方法で用いるためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤はいずれかの適した経路により、好ましくはそのような経路に適合させた製薬学的組成物の形態で且つ意図される処置のために治療的に有効な投薬量で投与することができる。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を例えば経口的に、舌下に、鼻に、肺に、粘膜に、非経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、筋肉内に又は局所的に投与することができる。単位投薬量調剤、特に経口的に投与可能な単位投薬量調剤、例えば錠剤又はカプセルは一般に、例えば約０．００１〜約５００ｍｇ、好ましくは約０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇそしてより好ましくは約０．０１〜約５０ｍｇの活性成分を含有する。製薬学的に許容され得る塩の場合、活性成分に関して上記に示した重量は、塩から誘導される製薬学的に活性なイオンの重量を指す。
【００３１】
経口的投与のために、製薬学的組成物は例えば錠剤、カプセル、懸濁剤、乳剤、ペースト、溶液、シロップの形態又は他の液体形態にあることができる。製薬学的組成物は、好ましくは特定の量の活性成分を含有する投薬量単位の形態で調製される。口により投与する場合、化合物を例えばラクトース、スクロース、デンプン粉、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、ゼラチン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及び／又はポリビニルアルコールと混合し、次いで簡便な投与のために錠剤化されるか又はカプセル封入することができる。
【００３２】
ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の経口的送達は、いくつかの機構により胃腸管への薬剤の即時送達又は長期もしくは持続的送達を与えるために当該技術分野で周知の調剤を含むことができる。即時送達調剤には経口用溶液、経口用懸濁剤、即−溶解性錠剤又はカプセル、舌下錠、崩壊性錠剤などが含まれるがこれらに限られない。長期もしくは持続的送達調剤には、小腸のｐＨの変化に基づく投薬形態からの活性成分のｐＨ感受性放出、錠剤又はカプセルの遅い侵食、調剤の物理的性質に基づく胃における貯留（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、腸管の粘膜内層（ｍｕｃｏｓａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）への投薬形態の生物学的付着（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ）あるいは投薬形態からの活性成分の酵素的放出が含まれるがこれらに限られない。意図される効果は、投薬形態の操作により活性薬剤分子が作用部位に送達されている時間を延長することである。かくして腸溶−コーティングされた、及び腸溶−コーティングされ制御された放出の調剤を本発明の方法で用いることができる。適した腸溶コーティングには酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチル−セルロースフタレート及びメタクリル酸とメタクリル酸メチルエステルのアニオン性ポリマーが含まれる。
【００３３】
経口的投与に適した製薬学的組成物は、それぞれあらかじめ決められた量の少なくとも１種の本発明の化合物を含有する分離された単位、例えばカプセル、カシェ剤、ロゼンジ又は錠剤において；粉剤又は顆粒剤として；水性もしくは非−水性液中の溶液又は懸濁剤として；あるいは水中油型もしくは油中水型乳剤として存在することができる。示した通り、そのような組成物はいずれかの適した薬学の方法により調製することができ、その方法は単数種もしくは複数種の阻害剤及び担体（１種もしくはそれより多い補助成分を構成することができる）を一緒にする段階を含む。一般に組成物は、単数種もしくは複数種の阻害剤を液体又は微粉砕された個体の担体あるいは両方と均一且つ緊密に混合し、次いで必要なら生成物を成形することにより調製される。例えば阻害剤の粉末又は顆粒を、場合により１種もしくはそれより多い補助成分と一緒に圧縮又は成形することにより錠剤を調製することができる。圧縮錠剤は適した機械において、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤及び／又は界面活性／分散剤と混合されていることができる粉末もしくは顆粒のような流動性形態における化合物を圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、例えば適した機械において粉末化合物を成形することにより調製することができる。
【００３４】
経口的投与のための液体投薬形態は、当該技術分野で通常用いられる不活性希釈剤、例えば水を含有する製薬学的に許容され得る乳剤、溶液、懸濁剤、シロップ及びエリキサーを含むことができる。そのような組成物は添加剤、例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤ならびに甘味剤、風味剤及び香料も含むことができる。
【００３５】
頬的（舌下）投与に適した製薬学的組成物には、風味付けされた基剤、通常はスクロース及びアラビアゴムもしくはトラガカント中にＰＤＥ１１Ａ阻害剤を含むロゼンジならびに不活性基剤、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアゴム中に阻害剤を含むトローチ剤（ｐａｓｔｉｌｌｅｓ）が含まれる。
【００３６】
非経口的投与のための調剤は、例えば水性もしくは非−水性等張無菌注入用溶液又は懸濁剤の形態にあることができる。これらの溶液及び懸濁剤は、経口的投与のための調剤中における使用に関して挙げた担体又は希釈剤の１種もしくはそれより多くを有する無菌の粉末又は顆粒から調製することができる。ＰＤＥ１１Ａ阻害剤を水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナツ油、ごま油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は種々の緩衝液中に溶解することができる。他の添加剤及び投与の様式は、製薬の技術分野において十分に且つ広く知られている。
【００３７】
製薬学的に許容され得る担体は、前記のすべてなどを包含する。本発明の方法において用いるためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤を含有する製薬学的組成物は、周知の薬学の方法のいずれか、例えば成分の混合により調製することができる。有効な調剤及び投与法に関する上記の考察は当該技術分野において周知であり、標準的教本に記載されている。
【００３８】
本発明の方法において用いるためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投薬量は、典型的には１日に約０．００１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、好ましくは１日に約０．００５ｍｇ〜約１，０００ｍｇである。１回のもしくは分割された投薬量において与えられる１日のｍｇ／ｋｇ投薬量に基づくと、投薬量は典型的に約０．００１／７５ｍｇ／ｋｇ〜約１０，０００／７５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５／７５ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００／７５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００３９】
各阻害剤の合計の１日の投薬量を１回の投薬量において、又は複数の細分投薬量において患者に投与することができる。典型的には、細分投薬量を１日当たり２〜６回、好ましくは１日当たり２〜４回、そしてさらにもっと好ましくは１日当たり２〜３回投与することができる。投薬は、糖尿病的状態への所望の抑制を得るのに十分に有効な即時放出形態又は持続性放出形態にあることができる。
【００４０】
本発明の組み合わせ及び組成物を用いて糖尿病的状態又は障害を予防するため、処置するため、それを軽減するため又は改善するため、あるいはそうでなければ（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）糖尿病的状態に対して保護するか又はそれを処置するための投薬量管理は、多様な因子に従って選ばれる。これらの因子には患者の型、年令、体重、性別、食事及び医学的状態、疾患の重度、投与の経路、薬理学的考察、例えば用いられる特定の阻害剤の活性、有効性、薬物動力学及び毒物学的側面、薬剤送達システムが用いられるか否か及び阻害剤が他の活性成分と一緒に投与されるか否かが含まれるがこれらに限られない。かくして実際に用いられる投薬量管理は広く変化し得、従って上記に示した好ましい投薬量管理から変動し得る。
【００４１】
本発明の方法においてＰＤＥ１１Ａ阻害剤として有用な化合物の製薬学的に許容され得る塩には、遊離の酸もしくは遊離の塩基のアルカリ金属塩の形成又は付加塩の形成に通常用いられる塩が含まれる。塩の性質は重要ではなく、但しそれは製薬学的に許容され得る。適した製薬学的に許容され得る酸付加塩は、無機酸又は有機酸から製造することができる。そのような無機酸の例は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸及びリン酸である。適した有機酸は、脂肪族酸、環状脂肪族酸、芳香族酸、複素環式酸、カルボン酸及びスルホン酸の種類の有機酸から選ばれることができる。有機酸及びスルホン酸の種類の有機酸の例にはギ酸、酢酸、フロピオン酸、コハク酸、グルコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデリン酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ）（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸（ａｌｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎ−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタール酸及びガラクツロン酸ならびにそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限られない。
【００４２】
本発明の方法で用いるためのＰＤＥ１１Ａ阻害剤を、ＰＤＥ１１Ａの活性を阻害することが見出された化合物の製薬学的に許容され得る塩、保護酸、共役酸、互変異性体、プロドラッグ又は立体異性体として投与することもできる。互変異性体には、例えばヒドロキシ互変異性体が含まれる。保護酸には例えばエステル、ヒドロキシアミノ誘導体、アミド及びスルホンアミドのような保護酸が含まれるがこれらに限られない。プロドラッグの形成は、親化合物の性質を強化するために当該技術分野において周知であり；そのような性質には溶解性、吸収性、生物学的安定性及び放出時間が含まれる（Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．により編集され、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓにより出版された“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”（第６版），１９９５年，２７−２９頁を参照されたく、それは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる）。通常用いられるプロドラッグは、主な薬剤生物変換を利用するように設計され、且つそれも本発明の範囲内であると考えられるべきである。主な薬剤生物変換反応にはＮ−脱アルキル化、Ｏ−脱アルキル化、脂肪族ヒドロキシル化、芳香族ヒドロキシル化、Ｎ−酸化、Ｓ−酸化、脱アミノ化、加水分解反応、グルクロニド化、硫酸化及びアセチル化が含まれる（編集者  Ｍｏｌｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ出版のＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第９版），１９９６年，１１〜１３頁を参照されたく、それは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる）。
【００４３】
ＰＤＥ１１Ａ阻害剤の投与は、人の処置のために有用である他に、コンパニオンアニマル（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ａｎｉｍａｌｓ）（例えば馬、犬、猫など）、外来動物及び農場動物の獣医学的処置にも有用であり得る。本発明を人の生物学に関して記載するが、本発明が他の哺乳類に同様に適用可能であることが当該技術分野における通常の熟練者により理解される。
【実施例】
【００４４】
発現分布測定
ランゲルハンス島におけるＰＤＥ１１Ａの発現をＰＣＲにより確証した。ＰＣＲは、島ｃＤＮＡライブラリからの鋳型ＤＮＡを用い、ＰＤＥ１１Ａ遺伝子全体に及んで種々の領域を認識する以下のプライマー組み合わせを用いて行なわれた：
９２８塩基対の予測産物を生成するであろうＦ２（５’−ＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＡ−３’）プラスＲ１（５’−ＣＡＧＴＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＴＣＡ−３’）
１０６０塩基対の予測産物を生成するであろうＦｏｒ３（５’−ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡ−３’；このプライマーはクローニング目的のための追加の配列を含むことに注意されたい）プラスＲ２（５’−ＣＴＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡ−３’）
４７４塩基対の予測産物を生成するであろうＦ４（５’−ＣＧＣＴＧＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＡ−３’）プラスＲｅｖ２（５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴ−３’；このプライマーはクローニング目的のための追加の配列を含むことに注意されたい）。
【００４５】
５０μｌ  ＰＣＲ反応を以下の通りに組み立てた：
５μｌ  １０ｘ  増幅緩衝液（ポリメラーゼと一緒に供給）
５μｌ  １０ｘ  ＰＣＲエンハンサー（ポリメラーゼと一緒に供給）
１μｌ  ５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４
８μｌ  それぞれ１．２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
１μｌ  １００μＭ  前進プライマー
１μｌ  １００μＭ  逆進プライマー
１μｌ  島ｃＤＮＡ
２７μｌ  Ｈ２Ｏ
１μｌ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００４６】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて以下のパラメーターを用いて反応をサイクリングさせた：
９５℃２分／３５ｘ（９５℃３０秒／５５℃３０秒／７２℃２分）／７２℃１０分
１μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を７２℃において追加の１０分間反応物に加え、次いで反応物を４℃に冷却した。
【００４７】
反応物を１％アガロースＴＢＥゲル上に負荷し、１５０Ｖにおいて２０分間電気泳動させた。エチジウムブロミド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）染色の後にＵＶ照明によりＰＣＲ産物を視覚化した。
【００４８】
ＤＮＡ配列決定によるさらなる特性化のためにＦ２／Ｒ１反応のＰＣＲ産物を選び、それはこの産物が触媒ドメインをコードするＰＤＥ１１Ａ遺伝子の部分に相当するからである。簡単に記載すると、ＰＣＲバンドをゲルから切除し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、キットと一緒に供給される案に従って精製した。精製されたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター中に挿入し、続いてＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造者により記載されている通りにＴＯＰ１０感応バクテリア細胞を形質転換した。１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリンを含む２ｍｌ  ＬＢブロス中に５個のコロニーを取り上げ（ｐｉｃｋｅｄ）、３７℃で終夜生育させた。終夜培養物から微量調製ＤＮＡ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ）を調製し、制限酵素分析によりＰＣＲ産物挿入片の存在を確証した。挿入片はＤＮＡ配列決定によりＰＤＥ１１Ａとして正に同定された。
【００４９】
図１Ａ〜１Ｃは、上記のプライマー組み合わせを用いて生成したＰＤＥ１１Ａ  ＰＣＲ産物を示す。図において示される通り、ＰＤＥ１１Ａは島細胞中に見出される。島細胞におけるＰＤＥ１１Ａの発現は、ＰＤＥ１１Ａがインスリン放出／血液グルコース濃度の調節において役割を有し得ることを示す。
ＰＤＥ１１Ａ阻害アッセイ
９６−ウェルの白壁／透明底イソプレート（ｗｈｉｔｅｗａｌｌ／ｃｌｅａｒ  ｂｏｔｔｏｍ  ｉｓｏｐｌａｔｅ）（Ｗａｌｌａｃ）に、アッセイ緩衝液中のヒト組換え酵素に化合物を加える。３Ｈ−ｃＡＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）又は３Ｈ−ｃＧＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加により反応を開始させる。室温で４５分の後、ＳＰＡ珪酸イットリウムビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の添加により反応を停止させる。３０分後、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ）においてＳＰＡモードで３０秒間プレートを読み取る。データを標準のパーセンテージとして表す。ＰＤＥ２、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｂ及びＰＤＥ１１Ａの場合、３Ｈ−ｃＡＭＰを基質として用いた。ＰＤＥ５の場合、３Ｈ−ｃＧＭＰを基質として用いた。
【００５０】
１μＭもしくはそれ未満のＩＣ５０値でＰＤＥ１１Ａの活性を阻害する化合物を同定した。化合物には以下が含まれる：
【００５１】
【化１】
2005527524.tif 000002
【００５２】
同じこれらの化合物をＰＤＥ２、ＰＤＥ３Ａ、ＰＤＥ４Ｂ及びＰＤＥ５に関する阻害アッセイにおいて実験した。これらのアッセイにおいて、化合物はＰＤＥ１１Ａに関するＩＣ５０値より１０−倍大きいＩＣ５０値を有することが見出された。従って化合物はＰＤＥ１１Ａに関して選択的である。
【００５３】
これらのような化合物を本発明の方法において投与することができる。さらにそれらの立体異性体、製薬学的に許容され得る塩、互変異性体、保護酸及び共役酸及び／又はプロドラッグを本発明の方法において投与することができる。
島アッセイ
ランゲルハンス島単離：ネンブタール（ｎｅｍｂｕｔａｌ）（６０ｍｇ／ｋｇ，腹腔内）を用いて痩せたラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，雄，２００〜２５０ｇ）を麻酔し、腹を開いて肝臓及び膵臓を露出する。胆管中へのＨａｎｋ’ｓ溶液の注入により膵臓を膨張させ、次いで膵臓を切除し、Ｈａｎｋ’ｓ溶液中にある間にハサミで切り刻む。緩衝液で組織を濯いだ後、コラーゲナーゼを用いて膵臓を１０分間消化し、濯ぎ、島をＦｉｃｏｌｌ勾配上でデブリスから分離する。単離された島画分を緩衝液で濯ぎ、島を顕微鏡下に、手で取り上げる。島を３ｍＭ  グルコース中で３０分間予備−インキュベーションし、次いで適した条件を包含する培地に移し、さらに３０分間インキュベーションする。次いでＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を用い、培地をインスリン含有量に関して検定する。
【００５４】
上記のＰＤＥ１１Ａ阻害アッセイにおいてＰＤＥ１１Ａの阻害剤として同定された化合物を、この島アッセイにおいて調べた。化合物が、基礎インスリン放出を超える少なくとも１．５−倍インスリン放出を刺激することも見出された。
生体内アッセイ
痩せたラット（Ｗｉｓｔａｒ，雄，２５０〜３００ｇ）を終夜断食させ、２つのグループ：ビヒクル及び化合物処置（グループ当たり８匹のラット）に分ける。経口的強制飼養を介してビヒクル又は化合物を投与する（１．５ｍｌ／ラット）。２時間後、グルコース溶液（３０％，体重のｋｇ当たり２ｇ）を腹腔内に注入する。グルコース注入から０、１５、３０及び６０分後に尾の血液試料を集め、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍｉｓｈａｗａｋａ，ＩＮ）を用いて血液グルコースを測定する。
【００５５】
上記のＰＤＥ１１Ａ阻害アッセイにおいて同定され、且つ上記の島アッセイにおいて調べられた化合物は、このアッセイで調べると血液グルコース低下効果を有することが予測される。
【００５６】
本発明の精神又は必須の特性から逸脱することなく、他の特定の形態で本発明を具体化することができる。前記の実施例は例示としてのみ含まれる。従って本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって制限される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】Ｆ２／Ｒ１プライマー組み合わせを用い、鋳型としての島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す図。
【図１Ｂ】Ｆｏｒ３／Ｒ２プライマー組み合わせを用い、島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す図。
【図１Ｃ】Ｆ４／Ｒｅｖ２プライマー組み合わせを用い、島ｃＤＮＡから生成するＰＣＲ産物を示す図。
【図１Ａ】
2005527524.tif 000003
【図１Ｂ】
2005527524.tif 000004
【図１Ｃ】
2005527524.tif 000005
【国際調査報告】
2005527524.tif 000006
2005527524.tif 000007
2005527524.tif 000008
2005527524.tif 000009
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2005527524.tif 000011
2005527524.tif 000012
2005527524.tif 000013
2005527524.tif 000014