(57)【要約】新規ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、このポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、改変体、変異体またはフラグメントがまた、開示される。本発明は、これらの新規ヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関連する障害の、治療剤、診断方法ならびに、診断、処置および予防のための研究方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下で異なる、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下が異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下で異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下で異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドで異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、そのヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１ヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１ヌクレオチド配列中のコード配列におけるそのヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１ヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１ポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２ポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルと、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体とを接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルと、該核酸分子に結合するプローブとを接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型のマーカーとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が、癌腫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドと該因子とを接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該因子と該細胞とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、外因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節することを示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルと、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体において該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記障害が、心筋症およびアテローム性硬化症からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体において該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記障害が、心筋症およびアテローム性硬化症からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体において該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記障害が、糖尿病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４２】
請求項３９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４３】
請求項４０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４４】
第１の哺乳動物被験体において、請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルに関連する、疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおいて該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量と、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量とを、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４５】
前記素因が、癌に対してである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の哺乳動物被験体において、請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する、疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおいて、該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量と、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量とを、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸の発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４７】
前記素因が、癌に対してである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、ポリペプチドを、該病理学的状態を緩和するに十分な量で、該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントに、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、請求項１５に記載の抗体を、該病理学的状態を緩和するのに十分な量で、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して核酸およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、核酸およびそれにコードされるポリペプチドに関する。さらに具体的には、本発明は、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチドおよび分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、一部、新規のポリペプチドをコードする核酸配列の発見に基づく。この新規の核酸およびポリペプチドを、本明細書において、ＮＯＶＸ、すなわちＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６、ＮＯＶ７、ＮＯＶ８、ＮＯＶ９、ＮＯＶ１０およびＮＯＶ１１の核酸およびポリペプチドという。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、ホモログ、アナログ、およびフラグメントを、本明細書において以降は、総称して「ＮＯＶＸ」核酸配列または「ＮＯＶＸ」ポリペプチド配列と称する。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を含む。例えば、この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療上および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器中に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＮＯＶＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＮＯＶＸポリペプチドを回収し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１１】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１２】
サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＮＯＶＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合したか否かを検出することによる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量のこのＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物を接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子または無機分子）であり得る。
【００１４】
障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療剤の使用はまた、本発明の範囲内に包含され、このような障害または症候群として、例えば、アルツハイマー病、神経変性疾患、パーキンソン病、３型；発作、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、毛細血管拡張性運動失調、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、脳障害、疼痛、精神病性および神経性の障害（不安、精神分裂病、大うつ病、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞、動脈瘤、皮質の神経性疾患、ギャップジャンクション関連神経障害および他の神経系の病理状態（ここで接合部連絡（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）の機能不全は、正常な役割を果たすと考えられる）、脱髄神経障害（シャルコー−マリー−ツース病を含む）を含む）、心血管疾患、血液およびリンパの疾患、急性心不全、低血圧、高血圧、狭心症、心筋梗塞、虚血性の心臓病、心筋症、アテローム性動脈硬化症、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔ）、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、変異性紅斑角皮症（ＥＫＶ）、不整脈のような房室性の（ＡＶ）伝導欠陥、および水晶体白内障、骨障害、筋障害、アルストレーム症候群；口顔の裂溝−２、子かん癇前症；ヴェランデル遠位型ミオパシー、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、結節硬化症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、細胞接着、形状、相互作用連絡、サイトカイン障害；筋緊張性ジストロフィー；筋障害および筋疾患；アンゲルマン症候群、リドル症候群、プラーダー−ヴィリ症候群、カルマン症候群、皮膚障害、プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター欠損障害、残尿、骨粗しょう症、クローン病；多発性硬化症；ならびにオールブライト遺伝性骨形成異常（Ｏｓｔｏｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）症の処置、潰瘍、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）低リン酸塩血症、常染色体優性、ポイツ−ジェガーズ（Ｈｅｇｈｅｒｓ）症候群、線維筋性形成異常、先天性副腎過形成、子宮内膜症、肝硬変、重症筋無力症、乾癬、紫外線角膜炎、多毛症、脱毛症、色素沈着障害、膀胱炎、失禁、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、味覚および嗅覚検出（ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）障害、シグナル伝達経路障害、光受容害に関係する障害を含む網膜障害、難聴、角化障、卵母細胞成熟欠損、ミオトニーならびに結腸および肺および胸部の癌を含む癌、白質萎縮症、癌（特に前立腺および皮膚だが、限定されない）、新生物；腺癌；リンパ腫、子宮癌、良性の前立腺肥大、肛門（ｅｎａｌ）癌、多発性内分泌腺腫症ＩＩ型、家族性黒色腫、卵巣癌、副腎脳白質ジストロフィー、バーキットリンパ腫、グルコシダーゼＩ欠損症；重篤な乳児期開始（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ−ｏｎｓｅｔ）ウォルマン病および軽度の（ｍｉｌｄｅｒ）遅発性コレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）、糖尿病、膵炎、肥満、消化器（ｄｉｇｅｔｉｖｅ）系障害、食欲不振、過食症、胃腸のポリープ、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、内分泌系機能不全、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、免疫学的疾患および免疫学的障害、炎症および免疫疾患、細菌、真菌、原生動物およびウイルスの感染（特にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２による感染）、喘息、敗血症、対宿主性移植片疾患、移植、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシスまたはＩｇＡ腎症、ＭＨＣＩＩ疾患およびＩＩＩ疾患（免疫疾患）、低ゴナドトロピン性性機能低下、生殖系障害、不妊症、および／または他の病状および障害などが挙げられる。
【００１５】
治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１６】
例えば、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置のために効力を有する。このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、上に開示される疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害に罹患する患者の処置に対する効力を有する。
【００１７】
本発明はさらに、例えば、上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害または症候群のモジュレーター（調節因子）についてスクリーニングするための方法を包含する。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物が上記ＮＯＶＸポリペプチドに結合したか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポペプチドペプチドに対するこの試験化合物の結合によって、この試験化合物が、活性のモジュレーター、あるいは上述の障害または症候群の潜伏または素因のモジュレーターであることが示される。
【００１８】
また、本発明の範囲には、前述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによって、活性のモジュレーター、あるいは上で開示した疾患および障害ならびに／またはこのような他の病理状態および障害を含む、障害もしくは症候群の潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についての危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定する方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中に存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中のこのポリペプチドの量を比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害の素因が挙げられる。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量で、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することにより、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、例えば、上で開示された疾患および障害ならびに／または他のこのような病理状態および障害が挙げられる。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流のエフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッドシステム、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中において使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、例示に過ぎず、限定されることは意図されない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、本明細書中で集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない場合、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表Ａは、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドの要約を提供する。
【００２５】
【表Ａ】
2005502312.tif 000002
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の適用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドは、以前に記載されたタンパク質に対するドメインおよび配列の関連性の存在に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２６】
ＮＯＶ１は、ＣｕｂドメインおよびＳｕｓｈｉドメイン含有様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ１抗体および関連する化合物は、例えば：癌、肥満、炎症、高血圧、神経学的疾患、神経精神医学疾患、低身長（ｓｍａｌｌ  ｓｔａｔｕｒｅ）、肥満、糖尿病、高脂血症、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００２７】
ＮＯＶ２は、ミエリン様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ２ポリペプチド、ＮＯＶ２抗体および関連する化合物は、例えば：癌、炎症、神経学的障害、神経精神医学障害、肥満、糖尿病ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００２８】
ＮＯＶ３は、フォンビルブラント因子様タンパク質およびキエリン（Ｋｉｅｌｉｎ）様タンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ３核酸、ＮＯＶ３ポリペプチド、ＮＯＶ３抗体および関連する化合物は、例えば：癌、炎症、神経学的障害、神経精神医学障害、肥満、糖尿病、出血障害および他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用ならびに診断適用において有用である。
【００２９】
ＮＯＶ４は、セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ４核酸、ＮＯＶ４ポリペプチド、ＮＯＶ４抗体および関連する化合物は、例えば：パーキンソン病、精神病性障害および神経学的障害、アルツハイマー病、肺および他の癌ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３０】
ＮＯＶ５は、セリン／スレオニンキナーゼ様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ５核酸、ＮＯＶ５ポリペプチド、ＮＯＶ５抗体および関連する化合物は、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、ＡＲＤＳ、受胎能、子宮内膜症、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、アレルギー、免疫欠損、移植、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｅｄｅｍａ）、筋ジストロフィー、レッシュ−ナイハン症候群、重症筋無力症、乾癬、光線性角化症、結節硬化症、挫瘡、発毛／脱毛、脱毛症、色素沈着障害、内分泌障害、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、扁桃炎および他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用ならびに診断適用において有用である。
【００３１】
ＮＯＶ６は、ＴＧＦ−β様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ６核酸、ＮＯＶ６ポリペプチド、ＮＯＶ６抗体および関連する化合物は、例えば：アテローム性動脈硬化症ならびに腎臓、肝臓および肺の線維症疾患、癌（例えば、上皮、内皮および造血の）、遺伝性出血性毛細管拡張症ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３２】
ＮＯＶ７は、ＭＡＳ癌原遺伝子様ファミリーのタンパク質のメンバーと相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ７核酸、ＮＯＶ７ポリペプチド、ＮＯＶ７抗体および関連する化合物は、例えば：フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、神経保護、発達に関与する神経学的障害および疾患、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３３】
ＮＯＶ８は、膵臓リボヌクレアーゼ前駆体様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ８核酸、ＮＯＶ８ポリペプチド、ＮＯＶ８抗体および関連する化合物は、例えば：抗癌および抗腫瘍治療、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症、ならびに限定しないが甲状腺および膵臓のハンサー（ｈａｎｃｅｒ）、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３４】
ＮＯＶ９は、アミノトランスフェラーゼ様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ９核酸、ＮＯＶ９ポリペプチド、ＮＯＶ９抗体および関連する化合物は、例えば：癌、肝硬変または糖尿病のためのトログリタゾン処置においてみられるような肝臓毒性および肝臓の損傷；癌を含む脳および中枢神経系障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、精神分裂病、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３５】
ＮＯＶ１０は、トーロイド（ｔｏｌｌｏｉｄ）様−２様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１０核酸、ＮＯＶ１０ポリペプチド、ＮＯＶ１０抗体および関連する化合物は、例えば：線維症、瘢痕、ケロイド、外科的な接着、創傷治癒および骨折治癒、ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３６】
ＮＯＶ１１は、システインスルフィン酸脱炭酸酵素様ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明に従うＮＯＶ１１核酸、ＮＯＶ１１ポリペプチド、ＮＯＶ１１抗体および関連する化合物は、例えば：急性のまたは慢性の高浸透圧血漿、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、受胎能、膵臓、骨、結腸、脳、肺、胸部、または前立腺に生じるような癌、子宮内膜症、口内乾燥症、強皮症、高カルシウム血症、潰瘍、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、炎症性腸疾患、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、骨粗しょう症、高カルシウム血症、関節炎、強直性脊椎炎、脊柱側弯脊椎炎、ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群における腱炎、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、内分泌系機能不全、糖尿病、肥満、成長および生殖障害多発性硬化症、白質ジストロフィー、疼痛、重症筋無力症、疼痛、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、乾癬、紫外線角膜炎、結節硬化症、挫瘡、発毛、脱毛症、色素沈着障害、腎動脈狭窄症、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群ならびに他の疾患、障害、および状態などに関与する治療適用および診断適用において有用である。
【００３７】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、分子（これは、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または増強する）についてスクリーニングするために用いられ得る。特に、本発明に従う核酸またはポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および血管形成を調節または阻害する低分子の同定のための標的として用いられ得る。
【００３８】
本発明に従う、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性が、本明細書中に記載される。
【００３９】
（ＮＯＶ１）
ＮＯＶ１は、以下に開示されるように、２つのｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質を含む。開示された配列は、ＮＯＶ１ａおよびＮＯＶ１ｂと名付けられた。
【００４０】
（ＮＯＶ１ａ）
新規ＣｕｂおよびＳｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質をコードする１０，１３６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１核酸（１４６６４２８９２／ＣＧ５０３７７−０１ともよばれる）を、表１Ａに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド９３１３〜９３１５のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表１Ａにおいて下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【００４１】
【表１Ａ】
2005502312.tif 000003
2005502312.tif 000004
2005502312.tif 000005
公の配列データベースについての検索は、第１染色体に位置付られるＮＯＶ１ａ核酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ｍＲＮＡ  ｇｂ：ＧｅｎＢａｎｋ−ＩＤ：ＡＫ０２２６２０｜ａｃｃ：ＡＫ０２２６２０．１（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２５５８  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＭ４０００７８７）に２５９塩基中２５７塩基（９９％）同一であることが見出された。公の核酸データベースとして、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの全ておよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベースが挙げられる。
【００４２】
本明細書における全てのＢＬＡＳＴアラインメントにおいて、「Ｅ値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）」または「期待（Ｅｘｐｅｃｔ）」値とは、その整列された配列が、検索したデータベース内で、単なる偶然によって、ＢＬＡＳＴ問い合わせ配列に対してその類似性を達成し得た確率（可能性）の数的な指標である。例えば、ＮＯＶ１  ＢＬＡＳＴ分析から検索された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）（例えば、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｃＤＮＡ  ＦＬＪ１２５５８）が、純粋に偶然に問い合わせ（Ｑｕｅｒｙ）ＮＯＶ１配列にマッチした確率（可能性）は、１．１ｅ−４７である。期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する場合に、全く偶然に見出すことを「期待」し得る、ヒット数を示すパラメーターである。これは、２つの配列の間のマッチに割り当てられるスコア（Ｓｃｏｒｅ）（Ｓ）に伴い、指数関数的に減少する。本質的に、このＥ値は、配列の間のマッチに存在するランダムなバックグラウンドノイズを示す。
【００４３】
期待値（Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）は、結果を報告するための有意な閾値を作成するための都合のよい手段として使用される。ＢＬＡＳＴ処理（ｂｌａｓｔｉｎｇ）を行うために使用されるデフォルト値は、代表的には、０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ２．０において、この期待値をまた、Ｐ値（確率）の代わりに用いて、マッチの有意性を報告する。例えば、１ヒットに割り当てられる１であるＥ値は、現在のサイズのデータベースにおいて、類似のスコアを有する１つのマッチを単なる偶然によって見出すことを期待し得ることを意味すると解釈され得る。ゼロであるＥ値は、類似のスコアを有するいかなるマッチも単なる偶然では見出すことが期待されないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。時には、文字列Ｘおよび文字列Ｎが、ＢＬＡＳＴ検索から生じる。これは、人為的なヒットを妨げるように実施される、低い複雑性の配列の問い合わせの自動的フィルタリングの結果である。このフィルターは、ヌクレオチド配列において文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）またはタンパク質配列において文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）によって、見出される任意の低い複雑性の配列を置換する。低い複雑性の領域は、有意な位置ごとのアラインメントではなく、組成の偏りを反映する、高いスコアを生じ得る（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５５４〜５７１、１９９６）。
【００４４】
配列番号１によってコードされる開示されたＮＯＶ１ａポリペプチド（配列番号２）は、３１０４アミノ酸残基を有し、１文字アミノ酸コードを使用して表１Ｂに表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．３７００の確実性で細胞の外側に局在する可能性が高いことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ１ａはまた、０．１９００の確実性でリソソーム（ｌｙｓｏｍｅ）（管腔）に、０．１７６４の確実性でマイクロボディに、または０．１０００の確実性で小胞体（膜）に局在されているかもしれない。ＮＯＶ１ペプチドの最も可能性のある切断部位は、アミノ酸２１と２２との間：ＣＣＡ−ＳＮ、である。
【００４５】
【表１Ｂ】
2005502312.tif 000006
2005502312.tif 000007
データベースの検索は、ＮＯＶ１ａのアミノ酸配列が、２４８９アミノ酸残基のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来ｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ１６７４４タンパク質（ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １）に、４８９アミノ酸残基中１４５残基（２９％）同一であり、４８９アミノ酸残基中２１６アミノ酸残基（４４％）類似であることが見出された。公のアミノ酸データベースとして、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【００４６】
ＮＯＶ１は、少なくとも以下の組織中で発現される：副腎および下垂体。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的なＥＳＴ供給源、文献、および／またはＲＡＣＥ供給源を含む（がそれらに限定されない）本発明に含まれた配列の組織供給源を決定することによって導き出された。
【００４７】
（ＮＯＶ１ｂ）
ｃｕｂおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質をコードする、開示された８０１０ヌクレオチドのＮＯＶ１ｂ核酸（ＣＧ５０３７７−０２ともよばれる）を、表１Ｃに示す。
【００４８】
【表１Ｃ】
2005502312.tif 000008
2005502312.tif 000009
2005502312.tif 000010
配列番号３にコードされる開示されたＮＯＶ１ｂポリペプチド（配列番号４）は、２６６９アミノ酸残基を有し、そして１文字アミノ酸コードを使用して表１Ｄに表される。
【００４９】
【表１Ｄ】
2005502312.tif 000011
2005502312.tif 000012
以下に示されるように互いに相同的である限り、上記のいずれかのＮＯＶ１タンパク質に対する相同性は、他のＮＯＶ１タンパク質によって共有される。別に記載がなければ、ＮＯＶ１に対する任意の参照は、概して、両方のＮＯＶ１タンパク質についていうものと仮定される。
【００５０】
開示されたＮＯＶ１ａポリペプチドは、表１Ｅに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００５１】
【表１Ｅ】
2005502312.tif 000013
2005502312.tif 000014
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１Ｆに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。ＮＯＶ１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメント、および本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒地に白抜きで示されるアミノ酸残基は、保存配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示し、強調していないアミノ酸残基は、それほど保存されておらず、そして潜在的に、タンパク質の構造または機能を変化させることなく、非常に広範な程度に変更され得る。
【００５２】
【表１Ｆ】
2005502312.tif 000015
2005502312.tif 000016
2005502312.tif 000017
2005502312.tif 000018
2005502312.tif 000019
2005502312.tif 000020
2005502312.tif 000021
2005502312.tif 000022
2005502312.tif 000023
2005502312.tif 000024
2005502312.tif 000025
ＮＯＶ１ならびに他の全てのＮＯＶＸタンパク質における同定可能なドメインの存在は、ソフトウェアアルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓ）を用いる検索によって、続いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いてドメインマッチ（または数）をクロスすることによってＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって、決定した。表１Ｉに開示されるようにＮＯＶ１についてのＤＯＭＡＩＮ結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ分析を用いて、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴ分析ソフトウェアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションに見出されるドメインをサンプリングする。表１Ｉおよびその後の全てのＤＯＭＡＩＮ配列アライメントについて、完全に保存された単一の残基を、黒色影付きまたは印（｜）によって示し、そして「強い」半保存残基を、灰色影付きまたは印（＋）によって示す。この保存アミノ酸残基の「強い」グループは、以下のアミノ酸のグループのいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００５３】
表１Ｇは、ＮＯＶ１ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ１ａ配列が、このドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００５４】
【表１Ｇ】
2005502312.tif 000026
【００５５】
【表１Ｈ】
2005502312.tif 000027
ＣＵＢドメインは、種々の生物学的に重要な増殖因子を含む、分泌タンパク質中に主として見出される、重要なタンパク質相互作用ドメインである。ＣＵＢドメインは、ＥＧＦドメインに連結される場合、カルシウム結合に重要である。このタンパク質は、細胞−細胞接触、増殖、または他の重要な細胞プロセスを媒介し得る。
【００５６】
補完性のセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓの間のＣａ２＋依存性相互作用は、これらのＮ末端ＣＵＢ−ＥＧＦ−ＣＵＢ（ＥＧＦが、表皮成長因子である場合）モジュールアレイの主要部を含む、これらのα領域によって媒介される。Ｃａ２＋結合およびＣ１ｓとのＣａ２＋依存性相互作用を担うＣ１ｒドメインの境界を規定し、個々のモジュールのこれらの機能への寄与を評価するために、ＣＵＢフラグメント、ＥＧＦフラグメント、およびＣＵＢ−ＥＧＦフラグメントを、真核生物系で発現するか、または化学的に合成した。ゲル濾過研究、および固有のＴｙｒ蛍光の測定は、ＣＵＢ−ＥＧＦ対が、Ｃａ２＋の存在下で、よりコンパクトなコンフォメーションをとるという証拠を提供した。インタクトなＣ１ｒとＣ１ｓとのＣａ２＋依存性相互作用を、表面プラズモン共鳴によって研究し、１０．９〜２９．７ｎＭのＫＤ値を得た。Ｃ１ｒ  ＣＵＢ−ＥＧＦ対は、より高いＫＤ値（１．５〜１．８μＭ）で、固定されたＣ１ｓに結合し、その値は、ＣＵＢ−ＥＧＦが、固定されたリガンドとして使用され、Ｃ１ｓが遊離の状態であった場合、３１．４ｎＭに減少した。半最大結合は、インタクトのＣ１ｒによる５μＭからＣ１ｒαおよびＣＵＢ−ＥＧＦに対する、１０〜１６μＭの範囲の、類似するＣａ２＋濃度で得られた。単離されたＣＵＢフラグメントおよびＥＧＦフラグメントまたは、ＣＵＢ＋ＥＧＦ混合物は、Ｃ１ｓと結合しなかった。これらのデータは、Ｃ１ｒ  ＣＵＢ−ＥＧＦモジュール対（残基１〜１７５）が、高親和性Ｃａ２＋結合およびＣ１ｓとのＣａ２＋依存性相互作用に対して要求される最小のセグメントであることを示し、そして、Ｃａ２＋結合が、ＣＵＢ−ＥＧＦ対のよりコンパクトな折りたたみを含むことを示す（Ｔｈｉｅｌｅｎｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９  Ａｐｒ  ２；２７４（１４）：９１４９−５９）。
【００５７】
ｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ１核酸は、表１Ａもしくは表１Ｃに提供される配列を有する核酸、またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、任意の塩基が、表１Ａまたは表１Ｃに示される対応する塩基から変更され得るが、そのｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを包含する。本発明はさらに、記載される配列に相補的な配列を有する核酸（記載される核酸のいずれかに相補的な、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、その修飾された核酸の化学安定性を増強するために、少なくとも部分的に行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、これらの塩基の約１％までが、このように変更され得る。
【００５８】
本発明の開示されたＮＯＶ１タンパク質は、表１Ｂまたは表１Ｄに提供される配列を有するｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質を包含する。本発明はまた、いずれかの残基が、表１Ｂまたは表１Ｄに示される対応する残基から変更され得るが、そのｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。これらの変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約７１％までが、そのように変更され得る。
【００５９】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を包含する。
【００６０】
本発明についての上記に定義された情報は、このｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ１）が、「カルジザリン（Ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ）ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、本明細書中で同定されたＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明に関する潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【００６１】
本発明のＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）を含む癌に関連する、潜在的な治療適用において有用であり得る。例えば、ｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ１）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ１）は、それを必要とする被験体に投与される場合に、有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、癌、肥満症、炎症、高血圧、神経疾患、神経精神疾患、低身長、肥満症、糖尿病、高脂質血症ならびに他の疾患、障害および状態などに罹患している患者の処置に対する効力を有する。本発明のｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質様タンパク質をコードするＮＯＶ１核酸、またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、その核酸またはタンパク質の存在および量が、評価される。
【００６２】
ＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための新規ＮＯＶ１物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下のセクション「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような、ハイドロパシーチャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ１タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ１エピトープは、およそアミノ酸４００〜４５０である。他の実施形態において、ＮＯＶ１エピトープは、およそアミノ酸５００〜６００、およそアミノ酸１０００〜１１００、およそアミノ酸１５００〜１６００、およびおよそアミノ酸２５００〜２８００である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害に対する新規薬物標的の開発を補助する。
【００６３】
（ＮＯＶ２）
新規ミエリン様タンパク質をコードする１４６４ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２核酸（ｃｇ−１１８７３３２３４とも呼ばれる）を、表２Ａに示す。ヌクレオチド３３４〜３３６のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１０７１〜１０７３のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。
【００６４】
【表２Ａ】
2005502312.tif 000028
開示されたＮＯＶ２核酸配列は、第１１染色体に局在し、２８３塩基中１７５塩基（６１％）が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０３０４５５｜ａｃｃ：ＡＦ０３０４５５．１  ｍＲＮＡに同一である（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ上皮Ｖ様抗原前駆体（ＥＶＡ）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）。
【００６５】
配列番号７によってコードされるＮＯＶ２ポリペプチド（配列番号８）は、２４６アミノ酸残基を有し、１文字コードを使用して表２Ｂに表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ２が、位置３１と３２との間（すなわち、ＶＦＳ−ＬＥ）に最も可能性が高い切断部位を有する、シグナルペプチドを含む。ＮＯＶ２ポリペプチドは、０．６８５０の確実性でおそらく小胞体（膜）に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ２はまた、０．６４００の確実性で細胞膜に、０．４６００の確実性でゴルジ体に、または０．１０００の確実性で小胞体（内腔）に局在し得る。
【００６６】
【表２Ｂ】
2005502312.tif 000029
開示されたＮＯＶ２アミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の２４８アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｐ２５１８９タンパク質（ＭＹＥＬＩＮ  Ｐ０  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ）に、１９２アミノ酸残基中７０アミノ酸残基（３６％）同一であり、１９２アミノ酸残基中１０１アミノ酸残基（５２％）が類似することを示す。
【００６７】
ＮＯＶ２は、少なくとも下垂体および前立腺で発現される。この情報は、本発明に含まれる配列の組織起源を決定することによって得られた。ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源：副腎（Ａｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ）／副腎（Ｓｕｐｒａｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）、扁桃、骨、骨髄、脳、結腸直腸、冠状動脈、真皮、上皮、包皮、毛包、心臓、海馬、視床下部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／乳房、腸結節、卵巣、膵臓、上皮小体、末梢血、松果体、下垂体、胎盤、前立腺、網膜、唾液腺、小腸、脾臓、胃、精巣、視床、胸腺、扁桃、気管、臍静脈、子宮、全器官。
【００６８】
ＮＯＶ２はまた、表２Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００６９】
【表２Ｃ】
2005502312.tif 000030
これらの配列の相同性は、表２Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【００７０】
【表２Ｄ】
2005502312.tif 000031
2005502312.tif 000032
表２Ｅ〜２Ｆは、ＮＯＶ２に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ２配列が、このドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００７１】
【表２Ｅ】
2005502312.tif 000033
ミエリンは、神経細胞を保護する、重要な絶縁タンパク質である。ミエリンタンパク質の変異は、種々の神経障害を引き起こし得る。ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病（ＰＭＤ）および痙性対麻痺２型（ＳＰＧ２）は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響するミエリン形成のＸ連鎖発育欠損である。これらは、運動性障害の兆候および重篤度が臨床的に異なるが、両方ともプロテオリピドタンパク質遺伝子（ＰＬＰ）の対立遺伝子であり、この遺伝子は、ＣＮＳミエリンの重要なタンパク質構成要素、ＰＬＰおよびそのスプライシングされたアイソフォーム、ＤＭ２０をコードする。大きなＰＬＰの重複または欠失を有さない、５２ＰＭＤファミリーおよび２８ＳＰＧファミリーを、ＰＬＰ遺伝子のゲノムＰＣＲ増幅および配列決定によって調査した。それぞれ２９および４の異常を発見した。ＰＬＰ変異を有する患者は、ＰＭＤの重篤形態の間の連続を有し、運動性発育を有しない、ＳＰＧの純粋形態に対する広い範囲の疾患重篤度もたらす。臨床的重得度は、変異の性質と関連することが見出され、重篤なＰＭＤ、軽症のＰＭＤおよびＳＰＧの間のＰＬＰ点変異の検出に対する異なる戦略を示唆した。ＤＭ２０タンパク質の高度に保存された領域での単一アミノ酸変化は、ＰＭＤの最も重篤な形態を引き起こす。より保存されないアミノ酸の置換、切断、タンパク質の非存在およびＰＬＰ特異的変異は、ＰＭＤおよびＳＰＧの軽症の形態を引き起こす。従って、変異されたタンパク質の相互作用および安定性は、ＰＬＰ関連疾患の重篤度に対する主要な効果を有する（Ｃａｉｌｏｕｘら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００  Ｎｏｖ；８（１１）：８３７−８４５）。
【００７２】
部分的なステロイド反応性を有し、ミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子における新規の優性変異によって引き起こされる、新規の遺伝性運動神経障害および感覚神経障害（ＨＭＳＮ）表現型が、発見された。ほとんどのＭＰＺ変異は、ＨＭＳＮ  Ｉ型表現型を導き、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｓｏｔｔａｓ、先天的なミエリン形成減少症、およびＨＭＳＮ  ＩＩもまたＭＰＺ変更に起因するという最近の報告もある。異なる表現型は、特定の変異の、ＭＰＺ構造および粘着性に対する効果を反映し得る。異常な遺伝的神経障害が現れる家系の、臨床的分析、神経生理学的分析、神経病理学的分析、および分子遺伝学的分析を使用した。陽性の感覚現象および反射消失を有する進行性損傷低能は、上昇したＣＳＦタンパク質反応性および初期のステロイド反応性を有する発端者において生じたことが発見された。より低度に影響される子孫における神経生検は、コンパクト化されたミエリンの破壊を伴う、脱ミエリン化プロセスを開示した。より若い世代は、ある程度、低度に重篤に冒され、ほんの３０年後に症状を示すようになる。全ての冒された家系のメンバーは、保存された残基において、新規のＭＰＺ変異（Ｉｌｅ９９Ｔｈｒ）に対して、ヘテロ接合性であった。これは、慢性炎症性脱ミエリン化多発性神経障害として最初は診断された、ステロイド応答性神経障害を含むように、ＭＰＺ変異に関連する家族性神経障害の範囲を広げる（Ｄｏｎａｇｈｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０００  Ｄｅｃ；６９（６）：７９９−８０５）。
【００７３】
ミエリン様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ２核酸は、表２Ａに提供される配列を有する核酸、またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、任意の塩基が、表２Ａに示される対応する塩基から変更され得るが、そのミエリン様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを包含する。本発明はさらに、その記載される配列に相補的である配列を有する核酸（その記載される核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、その修飾された核酸の化学安定性を増強するために、少なくとも部分的に行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、これらの塩基の約３９％までが、このように変更され得る。
【００７４】
本発明の開示されたＮＯＶ２タンパク質は、表２Ｂに提供される配列を有するミエリン様タンパク質を包含する。本発明はまた、その残基のいずれかが、表２Ｂに示される対応する残基から変更され得るが、そのミエリン様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約６４％までが、そのように変更され得る。
【００７５】
本発明のＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２タンパク質は、神経障害、低身長、癌、特に前立腺癌、代謝障害、炎症ならびに／または病理および障害に関連する、潜在的な治療適用において有用である。本発明のミエリン様タンパク質をコードするＮＯＶ２核酸、および本発明のミエリン様タンパク質、またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、その核酸またはタンパク質の存在および量が、評価される。
【００７６】
ＮＯＶ２核酸およびＮＯＶ２ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下のセクション「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような、ハイドロパシーチャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されるＮＯＶ２タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸５〜３５である。別の実施形態において、ＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸１４５〜１８０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸２２０〜２４０である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発に有用である。
【００７７】
（ＮＯＶ３）
新規ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）様タンパク質およびキエリン様タンパク質をコードする５１２３ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ３核酸（ＣＧ１２２５６１２２７とも呼ばれる）を、表３ａに示す。ヌクレオチド４９５１〜４９４８のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド４３６〜４３４のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。
【００７８】
【表３Ａ】
2005502312.tif 000034
2005502312.tif 000035
開示されたＮＯＶ３核酸配列は、第７染色体に位置し、１７２９塩基中１０７４塩基（６２％）が、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０２６１９２｜ａｃｃ：ＡＦ０２６１９２．１  ｍＲＮＡに同一である（キエリンに対するＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）。
【００７９】
配列番号９によってコードされる開示されたＮＯＶ３タンパク質（配列番号１０）は、１４９７アミノ酸残基を有し、１文字コードを使用して表３Ｂに表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ３が、シグナルペプチドを有し、０．６０００の確実性で核に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ３はまた、０．４２７０の確実性でミトコンドリアマトリクス空間に、０．１０４７の確実性でミトコンドリア内膜に、または０．１０４７の確実性でミトコンドリア内膜空間に局在するようである。ＮＯＶ３に対する最も可能性が高い切断部位は、位置４３と４４との間（すなわち、ＣＬＡ−ＨＧ）にある。
【００８０】
【表３Ｂ】
2005502312.tif 000036
開示されたＮＯＶ３アミノ酸配列は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（アフリカツメガエル）由来の２３２７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＩＢＧ７タンパク質（ＫＩＥＬＩＮ）に、６４２アミノ酸残基中３５９アミノ酸残基（５５％）同一であり、６４２アミノ酸残基中４５７アミノ酸残基（７１％）が類似する。
【００８１】
ＮＯＶ３配列は、以下で発現されることが予想される：副腎（Ａｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ）／副腎（Ｓｕｐｒａｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ）、扁桃、大動脈、骨、骨髄、脳、小脳、頸、絨毛膜絨毛、蝸牛、結腸直腸、真皮、上皮、包皮、毛包、心臓、海馬、視床下部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ組織、乳腺／乳房、筋肉、子宮筋層、卵巣、膵臓、耳下腺唾液腺、下垂体、胎盤、前立腺、基部曲尿細管、脊髄（Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｈｏｒｄ）、脾臓、胃、黒質、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃、臍静脈、膀胱、子宮。
【００８２】
ＮＯＶ３はまた、表３Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【００８３】
【表３Ｃ】
2005502312.tif 000037
これらの配列の相同性は、表３Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【００８４】
【表３Ｄ】
2005502312.tif 000038
2005502312.tif 000039
2005502312.tif 000040
2005502312.tif 000041
2005502312.tif 000042
2005502312.tif 000043
2005502312.tif 000044
2005502312.tif 000045
表３Ｅは、ＮＯＶ３に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＮＯＶ３配列が、このドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似する特性を有することを示す。
【００８５】
【表３Ｅ】
2005502312.tif 000046
ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子ドメインは、増殖および細胞分裂に重要な多くのタンパク質に存在する。１つのそのようなタンパク質、キエリンは、初期の胎児生育に重要であり、癌に対する優秀な標的であり得る。正中組織は、初期の脊椎動物胎児の重要な誘導中心である。シグナルペプチド選択スクリーニングによって、本出願人らは、分泌された因子、キエリンを単離した。このキエリンは、コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）（Ｃｈｄ）中のシステインリッチリピートと類似した複数のシステインリッチリピートを含む。キエリンの発現は、中期原腸胚段階で、脊索中で始まり、神経胚の底板で検出される。キエリンは、結節関連遺伝子によって、中胚葉中および外胚葉中で誘導される。Ｃｈｄは、中胚葉でキエリンの発現を誘導するのに十分であるのに対して、Ｃｈｄに加えてＳｈｈまたはＨＮＦ−３βが、外胚葉中での誘導に必要とされる。キエリンは、Ｃｈｄとは異なる生物学的活性を有する。キエリンｍＲＮＡの注入は、神経胚において、腹側末端の領域の外食片の背側化およびＭｙｏＤ発現の拡張を引き起こす。Ｃｈｄと違って、キエリンは、肺尖帽外胚葉の神経分化を効率的には、引き起こさず、このことは、キエリンの活性は、単にＢＭＰ４遮断によって、引き起こされないことを示唆する。キエリンは、胎児正中線の誘導活性を媒介するシグナル伝達分子である（Ｍａｔｓｕｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０００  Ｍａｙ  ９；９７（１０）：５２９１−６）。
【００８６】
ＶＷＦ様タンパク質およびキエリン様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ３核酸は、表３Ａに提供される配列を有する核酸、またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、任意の塩基が、表３Ａに示される対応する塩基から変更され得るが、そのＶＷＦ様活性およびキエリン様活性ならびに生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを包含する。本発明はさらに、その記載される配列に相補的である配列を有する核酸（その記載される核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、その修飾された核酸の化学安定性を増強するために、少なくとも部分的に行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、これらの塩基の約３８％までが、このように変化され得る。
【００８７】
本発明の開示されたＮＯＶ３タンパク質は、表３Ｂに提供される配列を有するＶＷＦ様タンパク質およびキエリン様タンパク質を包含する。本発明はまた、その残基のいずれかが、表３Ｂに示される対応する残基から変更され得るが、そのＶＷＦ様活性およびキエリン様活性ならびに生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする、変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、それらの残基の約４５％までが、そのように変更され得る。
【００８８】
本明細書中に開示されるＶＷＦ様タンパク質およびキエリン様タンパク質ならびにそれらの核酸（ＮＯＶ３）のタンパク質類似性情報、発現パターン、およびマップ位置は、ＮＯＶ３がＶＷＦ様ファミリーおよびキエリン様キナーゼ様ファミリーに特徴的な、重要な構造的機能および／または生理学的機能を有することを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において有用である。これらとして、特異的核酸もしくは選択的核酸または特異的タンパク質もしくは選択的タンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして働くこと（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされる）。ならびに例えば以下が挙げられる潜在的な治療適用は：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療標的化抗体、診断標的化抗体、薬物標的化抗体／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子除去）において有用な核酸、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物である。
【００８９】
本発明のＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害に関与する潜在的な診断適用および治療適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、癌、炎症、神経性障害、神経精神障害、肥満症、糖尿病、出血障害および／または他の病理に罹患している患者の処置に効力を有する。ＮＯＶ３核酸またはそのフラグメントは、さらに診断適用において有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされる。
【００９０】
ＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような、ハイドロパシーチャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ３エピトープは、およそアミノ酸１〜２である。別の実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、およそアミノ酸４００〜４４０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ３エピトープは、およそアミノ酸９００〜９５０であり、およそアミノ酸１３７５〜１４２５である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系開発において価値を有し、これらは、疾患の病理の理解および種々の障害の新規薬物標的の開発を補助する。
【００９１】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４は、以下に開示される６個の新規セマホリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）様タンパク質を含む。この開示された配列は、ＮＯＶ４ａ、ＮＯＶ４ｂ、ＮＯＶ４ｃ、ＮＯＶ４ｄ、ＮＯＶ４ｅ、およびＮＯＶ４ｆと名づけられた。
【００９２】
（ＮＯＶ４ａ）
新規セマホリン様タンパク質をコードする１８９６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ４ａ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＳＣ７０５０４３７０＿Ａ／ＣＧ５９２５３−０１と示される）を、表４ａに示す。ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド１４７４〜１４７６のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。
【００９３】
【表４Ａ】
2005502312.tif 000047
ＮＯＶ４ａ核酸は、少なくとも脳（海馬、黒質）および腎臓で見られる。ＮＯＶ４ａ核酸配列は、１５８８塩基中１５８８塩基（１００％）が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２１６６０｜ａｃｃ：ＡＫ０２１６６０．１  ｍＲＮＡに同一である（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓセマホリンＶＩａ  ｍＲＮＡと適度に類似する、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１１５９８  ｆｉｓ、クローンＨＥＭＢＡ１００３８６６）。
【００９４】
配列番号１５によってコードされるＮＯＶ４ａポリペプチド（配列番号１６）は、４７６アミノ酸残基を有し、１文字コードを使用して表４Ｂに表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ４ａが、シグナルペプチドを有し、０．７３８０の確実性でおそらく細胞外に局在するであろうことを予測する。他の実施形態において、ＮＯＶ４ａはまた、０．１９００の確実性でリソソーム（内腔）に、０．１８７５の確実性で微小体に局在するようである。
【００９５】
【表４Ｂ】
2005502312.tif 000048
本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３６７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＢ１３８６９タンパク質（ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１１５９８  ＦＩＳ、クローンＨＥＭＢＡ１００３８６６、ｍＲＮＡを介してＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓセマフォリンに対して中程度に類似（ＣＤＮＡ  ＦＬＪ１１５９８  ＦＩＳ，ＣＬＯＮＥ  ＨＥＭＢＡ１００３８６６，ＭＯＤＥＲＡＴＥＬＹ  ＳＩＭＩＬＡＲ  ＴＯ  ＭＵＳ  ＭＵＳＣＵＬＵＳ  ＳＥＭＡＰＨＯＲＩＮ  ＶＩＡ  ＭＥＲＮＡ））に対して、３６７アミノ酸残基のうち同一な３６７アミノ酸残基（１００％）を、そして３６７アミノ酸残基のうち類似の３６７アミノ酸残基（１００％）を有することが見出された。
【００９６】
（ＮＯＶ４ｂ）
新規のセマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ）様タンパク質をコードする３０２５ヌクレオチドの、開示されたＮＯＶ４ｂ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０２と称する）が、表４Ｃ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まること、およびヌクレオチド３１５１〜３１５３のＴＡＧコドンで終結することが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は表４Ｃ中に下線で示され、そしてこの開始コドンおよび終止コドンを太字とする。
【００９７】
【表４Ｃ】
2005502312.tif 000049
2005502312.tif 000050
ＮＯＶ４ｂの核酸配列は、染色体１５ｑ２１．１に位置し、そしてマウスセマフォリンＩＶ  ｍＲＮＡ（登録番号ＡＦ０３０４３０）に対して、１６５６塩基のうち同一な１１３４塩基（６８％）を有する（Ｅ＝１．０ｅ−１３２）。
【００９８】
配列番号１７によりコードされるＮＯＶ４ｂポリペプチド（配列番号１８）は、１０３５アミノ酸残基であり、そして表４Ｄ中に１文字コードを使用して表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果から、ＮＯＶ４ｂがシグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確実性で原形質膜に位置する可能性が高いことが予測される。別の実施形態において、ＮＯＶ４ｂはまた、０．１０００の確実性で小胞体（膜または内腔）に、または０．１０００の確実性で細胞外に位置し得る。最も可能性の高い切断部位は、位置２０と２１との間（ＬＲＡ−ＶＳ）である。
【００９９】
【表４Ｄ】
2005502312.tif 000051
本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の１０３０アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｈ２Ｅ６  セマフォリン（ｓｅｍａｐｈｏｒｅｉｎ）６Ａ１タンパク質に対して、５８３アミノ酸残基のうち同一な３５４アミノ酸残基（６０％）、および５８３アミノ酸残基のうち類似の４４８アミノ酸残基（７６％）を有することが、見出された（Ｅ＝１．１ｅ−２２２）。
【０１００】
ＮＯＶ４ｂは少なくとも以下の組織に発現する：脂肪（ｄｉｐｏｓｅ）、心臓、膵臓、甲状腺、肝臓、胆嚢、結腸、脳、右小脳、左小脳、視床、視床下部、前頭葉、頭頂葉、大脳質／大脳白質、黒質、海馬、脊髄、末梢神経、乳腺／乳房、卵巣、胎盤、肺、腎臓、皮膚、包皮、および表皮。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０１の配列の起源に含まれた、その配列の組織供給源に由来した。
【０１０１】
（ＮＯＶ４ｃ）
新規のセマフォリン様タンパク質をコードする２１９１ヌクレオチドの、開示されたＮＯＶ４ｃ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０５と名付けられる）が、表４Ｅ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まること、およびヌクレオチド２１８２〜２１８４のＴＡＧコドンで終結することが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は表４Ｅ中に下線で示され、そしてこの開始コドンおよび終止コドンを太字とする。
【０１０２】
【表４Ｅ】
2005502312.tif 000052
ＮＯＶ４ｃの核酸配列は、第１５染色体に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２１６６０｜ａｃｃ：ＡＫ０２１６６０．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１１５９８  ｆｉｓ，クローンＨＥＭＢＡ１００３８６６，Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓセマフォリンＶＩａ  ｍＲＮＡに中程度に類似）に、１１６６塩基のうち同一な１１６１塩基（９９％）を有する。
【０１０３】
配列番号１７によりコードされるＮＯＶ４ｃポリペプチド（配列番号１８）は、７１２アミノ酸残基であり、そして表４Ｄ中に１文字コードを使用して表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果から、ＮＯＶ４ｃがシグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確実性で原形質膜に位置する可能性が高いことが予測される。別の実施形態において、ＮＯＶ４ｃはまた、〜０．１８１２の確実性で微小体に、または０．１０００の確実性で小胞体（膜または内腔）に位置し得る。最も可能性の高い切断部位は、位置２０と２１との間（ＬＲＡ−ＶＳ）である。
【０１０４】
【表４Ｆ】
2005502312.tif 000053
本発明のタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の１０２２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＡ９６００３タンパク質（ＫＩＡＡ１４７９タンパク質）に対して、５８６アミノ酸残基のうち同一な５７７アミノ酸残基（９８％）、および５８６アミノ酸残基のうち類似の５８０アミノ酸残基（９８％）を有することが見出された。
【０１０５】
ＮＯＶ４ｃは少なくとも以下の組織に発現する：胚全体、主に頭部および頚部。
【０１０６】
（ＮＯＶ４ｄ）
新規のセマフォリン様タンパク質をコードする３１９６ヌクレオチドの、開示されたＮＯＶ４ｄ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０６と名付けられる）が、表４Ｅ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まること、およびヌクレオチド３１４２〜３１４４で終結することが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は表４Ｅ中に下線で示され、そしてこの開始コドンおよび終止コドンを太字とする。
【０１０７】
【表４Ｇ】
2005502312.tif 000054
ＮＯＶ４ｄの核酸配列は、第１５染色体に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０４０９１２｜ａｃｃ：ＡＢ０４０９１２．２  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＫＩＡＡ１４７９タンパク質に関するｍＲＮＡ、部分ｃｄｓ）に、１７９８塩基のうち同一な１７８６塩基（９９％）を有する。
【０１０８】
配列番号１７によりコードされるＮＯＶ４ｄポリペプチド（配列番号１８）は、１０３２アミノ酸残基であり、そして表４Ｄ中に１文字コードを使用して表される。
【０１０９】
【表４Ｈ】
2005502312.tif 000055
開示されたＮＯＶ４ｅタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の１０２２アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＢＡＡ９６００３タンパク質（ＫＩＡＡ１４７９タンパク質）に対して、５８６アミノ酸残基のうち同一な５７７アミノ酸残基（９８％）、および５８６アミノ酸残基のうち類似の５８０アミノ酸残基（９８％）を有することが見出された。
【０１１０】
（ＮＯＶ４ｅ）
新規のセマフォリン様タンパク質をコードする２３５９ヌクレオチドの、開示されたＮＯＶ４ｅ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０７と名付けられる）が、表４Ｅ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まること、およびヌクレオチド２３５０〜２３５２で終結することが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は表４Ｅ中に下線で示され、そしてこの開始コドンおよび終止コドンを太字とする。
【０１１１】
【表４Ｉ】
2005502312.tif 000056
ＮＯＶ４ｅの核酸配列は、第１５染色体に位置する。
【０１１２】
配列番号１７によりコードされるＮＯＶ４ｅポリペプチド（配列番号１８）は、７６８アミノ酸残基であり、そして表４ｅ中に１文字コードを使用して表される。
【０１１３】
【表４Ｊ】
2005502312.tif 000057
（ＮＯＶ４ｆ）
新規のセマフォリン様タンパク質をコードする３３６４ヌクレオチドの、開示されたＮＯＶ４ｆ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５９２５３−０８と名付けられる）が、表４ｆ中に示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド４６〜４８のＡＴＧ開始コドンで始まること、およびヌクレオチド３３１０〜３３１２で終結することが同定された。開始コドンの上流および終止コドンの下流の推定非翻訳領域は表４ｆ中に下線で示され、そしてこの開始コドンおよび終止コドンを太字とする。
【０１１４】
【表４Ｋ】
2005502312.tif 000058
ＮＯＶ４ｆの核酸配列は、第１５染色体に位置する。
【０１１５】
配列番号１７によりコードされるＮＯＶ４ｆポリペプチド（配列番号１８）は、７６８アミノ酸残基であり、そして表４ｆ中に１文字コードを使用して表される。
【０１１６】
【表４Ｌ】
2005502312.tif 000059
ＮＯＶ４ａはまた、表４Ｍ中に列挙されるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるアミノ酸配列と相同性を有する。
【０１１７】
【表４Ｍ】
2005502312.tif 000060
これらの配列の相同性は、表４Ｎ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１１８】
【表４Ｎ】
2005502312.tif 000061
2005502312.tif 000062
2005502312.tif 000063
2005502312.tif 000064
2005502312.tif 000065
表４Ｏは、ＮＯＶ４ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの説明を記載する。これにより、このＮＯＶ４ａ配列が、このドメインを含むことが公知の他のタンパク質の特性と類似の特性を有することが示される。
【０１１９】
【表４Ｏ】
2005502312.tif 000066
このセマフォリン／コラプシンファミリーの分子は、神経発達の間の成長円錐の誘導に重要な役割を果たす。セマフォリン３Ｆ（６０１１２４）を参照のこと。これらは、神経成長円錐誘導シグナルをコードする、保存された遺伝子の１ファミリーを表す。癌遺伝子のポジショナルクローニングのために、この領域にわたる完全なコスミド／Ｐ１コンティグを構築する過程において、Ｓｅｋｉｄｏら（１９９６）は、ヒト  セマフォリンファミリー２つのさらなるメンバー、セマフォリン３Ｂ（Ｓｅｋｉｄｏらは、これをセマフォリンＡ（Ｖ）と称した）およびセマフォリン３Ｆ（Ｓｅｋｉｄｏらは、これをセマフォリンＩＶと称した）を染色体領域３ｐ２１．３に同定した。この２つの遺伝子は、お互いにおよそ７０ｋｂ以内に位置し、広範であるが非神経組織においては異なる発現パターンを有し、そして肺癌において異なる発現パターンを有する。ヒトセマフォリンＡ（Ｖ）は、マウスセマフォリンＡと８６％のアミノ酸相同性を有し、一方、セマフォリンＩＶは、５０％の相同性を有して、マウスセマフォリンＥとさらに密接に関係する。この２つのセマフォリン遺伝子は、ＧＮＡＩ２（１３９３６０）およびＧＮＡＴ１（１３９３３０）の２つのＧＴＰ結合タンパク質遺伝子に隣接する。Ｓｅｋｉｄｏら（１９９６）は、他のヒトセマフォリン遺伝子配列、例えばヒトセマフォリンＩＩＩ（ＳＥＭＡ３Ａ；６０３９６１）ならびにマウスセマフォリンＢ（ＳＥＭＡ４Ａ）およびセマフォリンＣ（ＳＥＭＡ４Ｂ）のホモログが第３染色体に位置しないことを確認した。Ｓｅｋｉｄｏら（１９９６）は、ヒトセマフォリンＡ（Ｖ）が、小胞体中に蓄積する９０ｋＤのタンパク質にインビトロで翻訳されることを示した。ヒトセマフォリンＡ（Ｖ）は、２３例の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）のうち僅か１例のみに発現し、１６例の非ＳＣＬＣのうち７例に発現し、一方でセマフォリンＩＶは２３例のＳＣＬＣのうち１９例に発現し、そして１６例の非ＳＣＬＣのうち１３例に発現した。セマフォリンＡ（Ｖ）の変異体分析は、４０例の肺癌のうち３例において変異（１例は生殖系列）を明らかにした。
【０１２０】
このセマフォリンは、シグナル伝達に関するタンパク質の１ファミリーである。このファミリーの全てのメンバーは、分泌シグナル、５００アミノ酸のセマ（ｓｅｍａ）ドメイン、および１６個の保存されたシステイン残基を有する（Ｋｏｌｏｄｋｉｎら、１９９３）。配列比較は、分泌されるセマフォリンを３つの一般的なクラスに分類し、それらのクラスの全てがまた免疫グロブリンドメインを有する。ヒトセマフォリンＩＩＩ（ＳＥＭＡ３Ａ；６０３９６１）、ニワトリコラプシンならびにマウスセマフォリンＡ、セマフォリンＤおよびセマフォリンＥから構成される、セマフォリンＩＩＩファミリーは、すべてＣ末端に塩基性ドメインを有する。ニワトリコラプシンは、ＵＮＣ−３３遺伝子産物（６０１１６８）に関連する軸索誘導の推定ホモログである、相対分子量６２Ｋのコラプシン応答媒介タンパク質（ＣＲＭＰ−６２）との相互作用を介して（Ｇｏｓｈｉｍａら、１９９５）、成長円錐の伸長を阻害することにより、発達中の軸索による進路検出に寄与する（Ｌｕｏら（１９９３））。Ｘｉａｎｇら（１９９６）は、２つの小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株においてホモ接合性欠損に関連する３ｐ２１．３領域のうちの１領域から、セマフォリンＩＩＩ／Ｆと名付けられた新規のヒトセマフォリンを単離した。この遺伝子は、種々の細胞株および組織において、３．８ｋｂの転写物として発現した。この遺伝子は、マウス発達中において胚の１０日ほどの想起に検出された。乳腺、腎臓、胎仔の脳、および肺で高発現であり、そして心臓および肝臓で低発現であった。いくつかのＳＣＬＣ株においてこの遺伝子の発現が低下していたが、変異は見出されなかった。この新規の遺伝子は、マウスセマフォリンＥと５２％の同一性およびニワトリコラプシン／セマフォリンＤと４９％の同一性を有し、セマフォリンＩＩＩファミリーの分泌性メンバーの特性を有した。Ｓｅｋｉｄｏら（１９９６）は、ＳＥＭＡ３Ｆ遺伝子およびＳＥＭＡ３Ｂ（６０１２８１）遺伝子を３ｐ２１．３に位置付けた。
【０１２１】
このセマフォリンは、巨大なファミリーの膜結合性タンパク質および分泌性タンパク質を含み、それらのうちのいくつかは軸索誘導において機能することが示されている。セマフォリン３Ｆ（６０１１２４）を参照のこと。Ｅｎｃｉｎａｓら（１９９９）は、新規のセマフォリンをクローニングし、ＥｎｃｉｎａｓらはこれをセマフォリンＷ（ＳＥＭＡＷ）と呼んだ。ＳＥＭＡＷ遺伝子の配列分析は、ＳＥＭＡＷがクラスＩＶサブグループの膜貫通型セマフォリンのメンバーであることを示した。セマフォリンＷのマウスおよびラットの形態は、９７％アミノ酸配列同一性を共有し、そして各々はヒト形態とおよそ９１％の同一性を示す。このＳＥＭＡＷ遺伝子は、１５個のエキソンを含み、それらの４つまでが、Ｅｎｃｉｎａｓら（１９９９）により配列解読されたヒトｃＤＮＡ中に欠損している。発現の研究は、ＳＥＭＡＷのｍＲＮＡが出生後の脳および肺において高レベルで発現し、そして多くの他のセマフォリンとは異なり、発達中の胚では低レベルで発現することを示した。機能研究は、セマフォリンＷが網膜神経節細胞の軸索を破綻させ得ることを示した。ヒト／ハムスターラディエーションハイブリッドを用いた遺伝子マッピングにより、Ｅｎｃｉｎａｓら（１９９９）は、ヒトＳＥＭＡＷ遺伝子を染色体２ｐ１３にマップした。マウス／ハムスターラディエーションハイブリッドを用いた遺伝子マッピングにより、ＥｎｉｃｉｎａｓはマウスＳｅｍａｗ遺伝子を第６染色体にマップした；物理的マッピングは、Ｄ６Ｍｉｔ７０およびＤ６Ｍｉｔ１８９のマイクロサテライトマーカーを保有するＢＡＣ上にこの遺伝子を位置付けた。この位置付けは、マウスＳｅｍａｗ遺伝子をマウスの運動ニューロン変性−２に関する遺伝子座中に位置付け、この遺伝子を運動ニューロン変性−２の障害に関する魅力ある候補とした。
【０１２２】
非常に複雑であるが各々のニューロンに特異的である神経網は、成長円錐が、それらの周囲にある種々の誘導分子を使用して特定の経路を選択して、そしてその正しい標的を見出す発達中に、形成される。このセマフォリン（ＳＥＭＡ）は、成長円錐の誘導中に機能するようである、膜貫通タンパク質および分泌性タンパク質の１ファミリーである。これらのタンパク質は、およそ５００アミノ酸の保存されたｓｅｍａドメインを含む。Ｉｎａｇａｋｉら（１９９５）は、新規のマウスセマフォリン遺伝子をクローニングし、ＩｎａｇａｋｉらはそれをセマフォリンＦ（ｓｅｍａＦ）と名付けた。インサイチュハイブリダイゼーションは、ＳｅｍａＦの発現をＥ１５．５、Ｅ１６．５およびＰ１のマウスの脳および脊髄全域に検出した。中枢神経系において、新皮質、海馬、視床、視床下部、蓋、橋核、脊髄、および網膜の原基において、発現は非常に高かった。また、種々の組織の原基（例えば、嗅上皮、鋤鼻器の上皮、歯のエナメル上皮、下垂体の前葉および中葉、内耳上皮、ならびに三叉神経節および脊髄神経節を含む感覚器神経節）において、高発現が見られた。さらに、ＳｅｍａＦは肺および腎臓に発現した。成体マウスにおいて、ＳｅｍａＦの発現は、海馬を含め、脳の幾つかの限定された領域において非常に低い発現で、明かに低下した。Ｉｎａｇａｋｉら（１９９５）は、ＳｅｍａＦが発達中の神経回路網の形成に機能することを示した。
【０１２３】
このセマフォリンは、軸索誘導に関すると考えられるタンパク質の１ファミリーである。公知のセマフォリンの大部分は、セマフォリンドメインおよびＣ末端Ｉｇモチーフにより特徴付けられた、類似の一次構造を有する。本明細書で本発明者らは、神経突起の成長を促進することが公知のモチーフである、７つのＣ末端トロンボスポンジンリピートを有する、新規クラスの膜結合性セマフォリンの２つのメンバー（ｓｅｍＦおよびｓｅｍＧ）のクローニングを報告する。ｓｅｍＦおよびｓｅｍＧの転写物は、初期のマウス胚の特定の領域において、ｓｅｍＤおよびｓｅｍＥと一緒になって発現し、発達中の体節または未分化の感覚上皮の明確なコンパートメントを区分する。ｓｅｍＦおよびｓｅｍＧの同定は、脊椎動物のセマフォリンの数を少なくとも２０個まで増加させ、そしていくつかのセマフォリンが正の軸索誘導の手掛かりとして機能し得ることを示唆する。
【０１２４】
セマフォリン様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ４核酸は、表４Ａまたは４Ｃにおいて配列を提供する核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、任意の塩基が表４Ａまたは４Ｃに示される対応する塩基から変化され得るがなおそのセマフォリン様の活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をコードする変異体核酸もしくは改変体核酸、またはそのような核酸のフラグメントを含む。本発明はさらに、配列が実際に記載された配列に対して相補的である核酸（実際に記載された任意の核酸に対して相補的である核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、構造が化学的修飾を含む、核酸もしくは核酸フラグメント、またはそれらの相補体を含む。このような修飾としては、非制限的な例として、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾もしくは誘導体化されている核酸が挙げられる。これらの修飾は、少なくとも一部は、修飾された核酸の化学的安定性を高めるために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体における治療的適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得る。この変異体核酸もしくは改変体核酸、またはそれらの相補体において、約０％までの塩基がそのようにして変更され得る。
【０１２５】
本発明の開示されたＮＯＶ４タンパク質は、表４Ｂまたは４Ｄにおいて配列を提供するセマフォリン様タンパク質を含む。本発明はまた、任意の残基が表４Ｂまたは４Ｄに示される対応する残基から変化され得るがなおそのセマフォリン様の活性および生理学的機能を維持しているタンパク質をコードする変異体タンパク質もしくは改変体タンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを含む。この変異体タンパク質または改変体タンパク質において、約０％までの残基がそのようにして変更され得る。
【０１２６】
本明細書中に開示されたセマフォリン様タンパク質および核酸（ＮＯＶ４）についてのタンパク質類似性情報、発現パターンおよびマップ位置は、このＮＯＶ４タンパク質が、セマフォリンファミリーに特徴的な重要な構造および／または生理学的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ４核酸およびタンパク質は、潜在的な診断的適用および治療的適用において有用である。これらとしては、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後判定マーカー（ここでは、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに、以下のような潜在的な治療的適用：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的抗体、診断的抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除（ｇｅｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ））、および（ｖ）インビトロおよびインビボにおいて組織再生を促進する組成物、として役立つことが挙げられる。
【０１２７】
本発明のＮＯＶ４核酸およびタンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害に関する潜在的な診断的適用および治療的適用において有用である。例えば、本発明の組成物は、パーキンソン病、精神病性障害および神経学的障害、アルツハイマー病、肺癌および他の癌、および／または他の病状に罹患している患者の処置のための効力を有する。ＮＯＶ４核酸またはそのフラグメントはさらに、診断的適用において有用であり得、ここではこの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。
【０１２８】
ＮＯＶ４核酸およびポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って産生され得る。例えば、開示されたＮＯＶ４ａタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その各々が免疫原として使用され得る。１つの実施形態では、意図されるＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約１〜１０由来である。別の実施形態では、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約１７０〜２００由来である。さらなる実施形態では、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約２７０〜３２５由来、およびアミノ酸約４２５〜４６０由来である。これらの新規タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、それらは、疾患の病理の理解および種々の障害についての新規薬物標的の開発を助ける。
【０１２９】
（ＮＯＶ５）
ＮＯＶ５は、以下に開示される２つの新規なセリン／スレオニンキナーゼ様タンパク質を含む。開示した配列を、ＮＯＶ５ａおよびＮＯＶ５ｂと名付けた。
【０１３０】
（ＮＯＶ５ａ）
新規なセリン／スレオニンキナーゼ様タンパク質をコードする、２３８８ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ５ａ核酸（ＣＧ５０２１１−０１ともいう）を、表５Ａに示す。ヌクレオチド２０１〜２０３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド２２９５〜２２９７のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。
【０１３１】
【表５Ａ】
2005502312.tif 000067
ＮＯＶ５ａ核酸は、第１９染色体上に同定され、そしてＲａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＮＭＡＲＫ１｜ａｃｃ：Ｚ８３８６８．１のｍＲＮＡ（セリン／スレオニンキナーゼＭＡＲＫ１についての、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのｍＲＮＡ）に対して、８４２塩基中５９２塩基（７０％）の同一性を有する。
【０１３２】
配列番号１９によりコードされる開示されたＮＯＶ５ａポリペプチド（配列番号２０）は、６９８アミノ酸残基であり、そして表５Ｂにおいて一文字コードを用いて提示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙでの結果は、ＮＯＶ５ａが、シグナルペプチドを有さず、そして０．４５００の確実性で細胞質内に局在化される可能性が高いことを予測する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ａはまた、０．３００の確実性でマイクロボディに局在化され得るか、０．１０００の確実性でミトコンドリアマトリクス腔に局在化され得るか、または０．１０００の確実性でリソソーム（管腔）に局在化され得る。
【０１３３】
【表５Ｂ】
2005502312.tif 000068
開示されたＮＯＶ５ａアミノ酸配列は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）由来のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＪＫＥ４タンパク質（ＥＬＫＬモチーフキナーゼ２短縮形態（ＥＬＫＬ  ＭＯＴＩＦ  ＫＩＮＡＳＥ  ２  ＳＨＯＲＴ  ＦＯＲＭ））の７２９アミノ酸残基に対して、４０１アミノ酸残基中２３７アミノ酸残基（５９％）の同一性を有し、そして４０１アミノ酸残基中２７９アミノ酸残基（６９％）の類似性を有する。
【０１３４】
ＮＯＶ５ａは、少なくとも以下において発現される：肺、胎盤、卵巣、肝臓、リンパ、結腸、精巣、Ｂ細胞、筋肉、皮膚、脳、扁桃。この情報は、本発明に含まれた配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、公的なＥＳＴ情報源、文献情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むが、これらに限定されない）を決定することによって導き出された。
【０１３５】
（ＮＯＶ５ｂ）
新規なセリン／スレオニンキナーゼ様タンパク質をコードする、１５４９ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ５ｂ核酸（ＣＧ５０２１１−０２ともいう）を、表５Ａに示す。ヌクレオチド２３〜２５のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１５４７〜１５４９のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。
【０１３６】
【表５Ｃ】
2005502312.tif 000069
ＮＯＶ５ｂ核酸は、第１９染色体上に同定され、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＢ０４９１２７｜ａｃｃ：ＡＢ０４９１２７．１のｍＲＮＡ（ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ様１、完全ｃｄｓについての、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのＭＡＲＫＬ１のｍＲＮＡ）に対して、１１０８塩基中１１０７塩基（９９％）の同一性を有する。
【０１３７】
配列番号１９によりコードされる開示されたＮＯＶ５ｂポリペプチド（配列番号２０）は、５０８アミノ酸残基であり、そして表５Ｂにおいて一文字コードを用いて提示される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙでの結果は、ＮＯＶ５ｂが、シグナルペプチドを有さず、そして０．４５００の確実性で細胞質内に局在化される可能性が高いことを予測する。他の実施形態では、ＮＯＶ５ｂはまた、０．３００の確実性でマイクロボディに局在化され得るか、０．１０００の確実性でミトコンドリアマトリクス腔に局在化され得るか、または０．１０００の確実性でリソソーム（管腔）に局在化され得る。
【０１３８】
【表５Ｄ】
2005502312.tif 000070
開示されたＮＯＶ５ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＢＹＤ８タンパク質（ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ様１（ＭＡＰ／ＭＩＣＲＯＴＵＢＵＬＥ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ−ＲＥＧＵＬＡＴＩＮＧ  ＫＩＮＡＳＥ  ＬＩＫＥ  １））の６８８アミノ酸残基に対して、３６２アミノ酸残基中３６１アミノ酸残基（９９％）の同一性を有し、そして３６２アミノ酸残基中３６１アミノ酸残基（９９％）の類似性を有する。
【０１３９】
ＮＯＶ５ｂは、少なくとも以下において発現される：肺、胎盤、卵巣、肝臓、リンパ、結腸、精巣、Ｂ細胞、筋肉、皮膚、脳、扁桃。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５０２１１−０２の配列の起源に含まれた、配列の組織供給源から導き出された。
【０１４０】
ＮＯＶ５ａはまた、表５Ｅに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０１４１】
【表５Ｅ】
2005502312.tif 000071
2005502312.tif 000072
これらの配列の相同性を、表５Ｆに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、図示する。
【０１４２】
【表５Ｆ】
2005502312.tif 000073
2005502312.tif 000074
2005502312.tif 000075
表５Ｇ〜５Ｉは、ＮＯＶ５ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ５ａ配列がこのドメインを含むことが公知である他のタンパク質の配列に類似する特性を有することを示す。
【０１４３】
【表５Ｇ】
2005502312.tif 000076
【０１４４】
【表５Ｈ】
2005502312.tif 000077
【０１４５】
【表５Ｉ】
2005502312.tif 000078
真核生物プロテインキナーゼ（Ｈｕｎｔｅｒ  Ｔ．（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：３−３７）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼおよびチロシンプロテインキナーゼの両方と共通する、保存された触媒コアを共有するタンパク質の非常に広範なファミリーに属する酵素である。タンパク質のリン酸化は、細胞の機能の調節のための基本的なプロセスである。プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼの両方の同調的な作用は、リン酸化のレベルを制御し、それ故、特定の標的タンパク質の活性を制御する。タンパク質のリン酸化の主な役割のひとつは、シグナル伝達中にあり、ここで細胞外シグナルは、タンパク質のリン酸化現象および脱リン酸化現象のカスケードにより増幅および伝播される。２つの最も特徴付けられたシグナル伝達経路は、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を含む。各々の経路は、プロテインキナーゼを活性化するための異なるセカンドメッセンジャーを使用し、これは次々に、特定の標的分子をリン酸化する。キナーゼ配列の広範な比較は、２５０〜３００アミノ酸の範囲である共通の触媒ドメインを規定した。このドメインは、キナーゼ間で保存された重要なアミノ酸を含み、そして触媒作用において必須の役割を果たすと思われる。触媒ドメインのＮ末端の端において、リジン残基の近くにグリシン富化残基ストレッチがあり、これはＡＴＰ結合に関与することが示されている。触媒ドメインの中心部分において、その酵素の触媒活性のために重要な保存されたアスパラギン酸残基がある（Ｔａｙｌｏｒ  Ｓ．Ｓ．，Ｘｕｏｎｇ  Ｎ−Ｈ．，Ｋｎｉｇｈｔｏｎ  Ｄ．Ｒ．，Ｚｈｅｎｇ  Ｊ．，Ｔｅｎ  Ｅｙｃｋ  Ｌ．Ｆ．，Ａｓｈｆｏｒｄ  Ｖ．Ａ．，Ｓｏｗａｄｓｋｉ  Ｊ．Ｍ．（１９９１）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：４０７−４１４）。
【０１４６】
プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼは、炎症プロセスに重要である細胞周期の進行事象、転写事象、翻訳事象、タンパク質選別事象および細胞接着事象を調節する。２つの最も特徴付けられた免疫抑制薬（シクロスポリンおよびラパマイシン）はまた、有効な抗炎症薬物である。これらは、タンパク質のリン酸化に対して直接的に作用し、従って、リン酸化カスケードの低分子調節薬が抗炎症性質を有するという概念を確証する（Ｂｈａｇｗａｔ  ＳＳ，Ｍａｎｎｉｎｇ  ＡＭ、Ｈｏｅｋｓｔｒａ  ＭＦ，Ｌｅｗｉｓ  Ａ．Ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．１９９９  Ｏｃｔ；４（１０）：４７２−４７９）。
【０１４７】
細胞増殖および疾患において重要なセリン／スレオニンプロテインキナーゼの役割のいくつかの例としては、ＡＫＴ、ＲＡＦ１およびＰＩＭ１が挙げられる。Ｄｕｄｅｋら（Ｄｕｄｅｋ，Ｈ．；Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．；Ｆｒａｎｋｅ，Ｔ．Ｆ．；Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｊ．；Ｙａｏ，Ｒ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇ．Ｍ．；Ｓｅｇａｌ，Ｒ．Ａ．；Ｋａｐｌａｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａｋｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６６１−６６３，１９９７）は、ＡＫＴが小脳ニューロンの生存のために重要であると実証した。従って、「オーファン」キナーゼは、細胞膜から発する、生および死の決定の重大なレギュレーターとして中心的な段階を動かした。Ｈｏｌｌａｎｄら（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｅ．Ｃ．；Ｃｅｌｅｓｔｉｎｏ，Ｊ．；Ｄａｉ，Ｃ．；Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｌ．；Ｓａｗａｙａ，Ｒ．Ｅ．；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｎ．：Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ａｎｄ  Ａｋｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：５５−５７，２０００．）は、組織特異的な方法において、マウスにおける星状細胞および神経前駆体にＲａｓの活性化形態をコードする遺伝子およびＡｋｔの活性化形態をコードする遺伝子を移入した。これらの著者は、活性化されたＲａｓもＡｋｔもどちらも単独では、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）形成を誘導するのに十分ではないが、活性化Ｒａｓと活性化Ａｋｔとの組み合わせは、ヒトＧＢＭの組織的特徴を有する良質の神経膠腫を誘導することを見出した。これらの腫瘍は、神経前駆体への遺伝子移入後に生じるが、分化した星状細胞への遺伝子移入後には生じないようであった。Ｒａｓの増加した活性は、多数のヒトＧＢＭで見出され、そしてＡｋｔ活性は、これらの腫瘍のほとんどで増加される。このことは、これらの２つの経路の組み合わせた活性化が、この疾患の生物学を正確にモデリングすることを意味する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｅ．Ｃ．；Ｃｅｌｅｓｔｉｎｏ，Ｊ．；Ｄａｉ，Ｃ．；Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｌ．；Ｓａｗａｙａ，Ｒ．Ｅ．；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｎ．：Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ａｎｄ  Ａｋｔ  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：５５−５７，２０００．）。
【０１４８】
さらに別のセリン／スレオニンキナーゼに関与する別の疾患は、唇、頬粘膜、および指のメラニン細胞の斑、多数の胃腸の過誤腫ポリープ、および種々の新生物の増加したリスクにより特徴付けられた常染色体優性障害である、ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）である。Ｊｅｎｎｅら（Ｊｅｎｎｅ，Ｄ．Ｅ．；Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｈ．；Ｎｅｚｕ，Ｊ．；Ｆｒｉｅｄｅｌ，Ｗ．；Ｌｏｆｆ，Ｓ．；Ｊｅｓｃｈｋｅ，Ｒ；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｏ．；Ｂａｃｋ，Ｗ．；Ｚｉｍｍｅｒ，Ｍ．：Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１８：３８−４３，１９９８．）は、セリン／スレオニンキナーゼＳＴＫ１１を同定および特徴付けし、そしてＰＪＳ患者における変異を同定した。生殖系列の５個の変異の全ては、キナーゼドメインの機能を中断させることが予想される。Ｊｅｎｎｅらは、ＳＴＫ１１における生殖系列変異は、おそらくＫｎｕｄｓｏｎモデルに従う体細胞における第２の対立遺伝子の後天的遺伝的欠損とともに、ＰＪＳの発現を引き起こすと結論した。これらの著者は、ＰＪＳが、プロテインキナーゼにおける変異を不活化することに起因する同定された最初の癌の感受性症候群であると論評し、そしてＰＪＳに関係のない１２個のファミリー中１１個のファミリーでＳＴＫ１１遺伝子における変異を見出した。この１１個中の１０個は、短縮変異（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）であった。全ては、生殖系列でヘテロ接合性であった。Ｓｕらは、その時までに報告された５３人の癌に罹患したＰＪＳ患者中の６人（１１％）が、膵臓腺癌であると診断されることを見出した。Ｓｕら（Ｓｕ，Ｊ．−Ｙ．；Ｅｒｉｋｓｏｎ，Ｅ．；Ｍａｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１４４３０−１４４３７，１９９６）は、ＳＴＫ１１遺伝子が、散発性および家族性（ＰＪＳ）の膵臓癌および胆道癌の両方の発生において役割を果たすという証拠を示した。Ｓｕらは、散発性の癌において、ＳＴＫ１１遺伝子が、試験された膵臓癌の５％および胆道癌の少なくとも６％で体細胞性変異されていることを見出した。ＰＪＳに関連する膵臓癌を有する患者では、ＳＴＫ１１遺伝子の変異したコピーの遺伝および残りの野生型対立遺伝子の体細胞欠失が存在した。
【０１４９】
セリン／スレオニンキナーゼ様タンパク質をコードする本発明の開示されたＮＯＶ５核酸は、表５Ａに配列が提供される核酸、またはそのフラグメントを包含する。本発明はまた、任意の塩基が、表５Ａに示される対応する塩基から変化されると同時にそのセリン／スレオニンキナーゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードし得る、変異体核酸または改変体核酸、あるいはそのような核酸のフラグメントを包含する。本発明はさらに、この記載される配列に相補的である配列を有する核酸（その記載される核酸のいずれかに相補的である、核酸フラグメントを含む）を包含する。本発明はさらに、その構造が化学修飾を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはその相補体を包含する。このような修飾としては、非限定的な例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの修飾は、少なくとも部分的には、その修飾された核酸の化学安定性を増強するために行われ、その結果、これらは、例えば、被験体中の治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。その変異体核酸または改変体核酸、ならびにそれらの相補体において、これらの塩基の約１％までが、そのように変化され得る。
【０１５０】
本発明の開示されたＮＯＶ５ａタンパク質は、表５Ｂに配列が提供されるセリン／スレオニンキナーゼ様タンパク質を包含する。本発明はまた、その残基のいずれかが、そのセリン／スレオニンキナーゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードしながら、表５Ｂに示される対応する残基から変化され得る変異体タンパク質または改変体タンパク質、あるいはそれらの機能的フラグメントを包含する。この変異体タンパク質または改変体タンパク質において、その残基の約１％までが、そのように変化され得る。
【０１５１】
本発明のＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５タンパク質は、種々の疾患、障害ならびに状態に関与する潜在的な治療的適用において有用である。このＮＯＶ５核酸またはそのフラグメントは、診断的適用においてさらに有用であり得る。この適用においてこの核酸またはタンパク質の存在または量がアッセイされるべきである。
【０１５２】
ＮＯＶ５核酸およびＮＯＶ５ポリペプチドはさらに、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されるＮＯＶ５ａタンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されるＮＯＶ５ａエピトープは、およそアミノ酸１２０〜１６０である。他の実施形態において、ＮＯＶ５ａエピトープは、およそアミノ酸２６０〜２８０、およそアミノ酸３１０〜３３０、およびおよそアミノ酸６６０〜６９０である。この新規タンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有し、これは、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発の助けとなる。
【０１５３】
（ＮＯＶ６）
ＮＯＶ６は、下記に開示される４つの新規なＴＧＦβ結合タンパク質様タンパク質を含む。開示される配列は、ＮＯＶ６ａ、ＮＯＶ６ｂ、ＮＯＶ６ｃおよびＮＯＶ６ｄと名付けられた。
【０１５４】
（ＮＯＶ６ａ）
新規なＴＧＦβ結合タンパク質様タンパク質をコードする４８１８ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ６ａ核酸（ＣＧ５０２１５−０１とも呼ばれる）が、表６Ａに示される。ヌクレオチド１３７〜１３９のＡＴＧ開始コドンで始まりヌクレオチド４５４４〜４５４６のＴＧＡコドンで終了する、オープンリーディングフレームが、同定された。
【０１５５】
【表６Ａ】
2005502312.tif 000079
開示されるＮＯＶ６ａ核酸配列は、染色体１９ｑ１３．１−１３．２に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、同一である２９８９塩基を３０２４塩基のうちに（９８％）有する。
【０１５６】
配列番号２１によりコードされる開示されるＮＯＶ６ａポリペプチド（配列番号２２）は、１４６９アミノ酸残基であり、そして表６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ａが、シグナルペプチドを含まず、そして確実度０．６５００で細胞質に局在化する可能性があることを予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ６ａはまた、確実度０．１０００でミトコンドリアのマトリックス空間にか、または確実度０．１０００でリソソーム（管腔）に局在化される可能性がある。
【０１５７】
【表６Ｂ】
2005502312.tif 000080
開示されるＮＯＶ６ａアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の１５１１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７５４１２タンパク質（ＬＡＴＥＮＴ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＩＮＧ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ−ＢＥＴＡ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ４Ｓ）に対して同一である９５０アミノ酸残基を９６８アミノ酸残基のうちに（９８％）有し、そして類似する９５６アミノ酸残基を９６８アミノ酸残基のうちに（９８％）有する。
【０１５８】
ＮＯＶ６ａは、以下において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全脳、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮，骨、頚部、肺および卵巣。
【０１５９】
（ＮＯＶ６ｂ）
新規ＴＧＦβ結合タンパク質様タンパク質をコードする４８１２ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｂ核酸（ＣＧ５０２１５−０３とも呼ばれる）を、表６Ａに示す。ヌクレオチド１３７〜１３９のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド４５３８〜４５４０のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表６Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１６０】
【表６Ｃ】
2005502312.tif 000081
2005502312.tif 000082
ＮＯＶ６ｂ核酸のＰＣＲクローニングを、実施例４で開示する。
【０１６１】
開示されるＮＯＶ６ｂ核酸配列は、第１９染色体に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、同一である２９４０塩基を３０２４塩基のうちに（９７％）有する。
【０１６２】
配列番号２１によりコードされる開示されるＮＯＶ６ｂポリペプチド（配列番号２２）は、１４６７アミノ酸残基であり、そして表６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ｂが、シグナルペプチドを含まず、そして確実度０．６５００で細胞質に局在化する可能性があることを予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ６ｂはまた、確実度０．１０００でミトコンドリアのマトリックス空間にか、または確実度０．１０００でリソソーム（管腔）に局在化される可能性がある。
【０１６３】
【表６Ｄ】
2005502312.tif 000083
2005502312.tif 000084
開示されるＮＯＶ６ｂアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）由来の１５１１アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７５４１２タンパク質（ＬＡＴＥＮＴ  ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＩＮＧ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ−ＢＥＴＡ  ＢＩＮＤＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ４Ｓ）に対して同一である９２７アミノ酸残基を９６８アミノ酸残基のうちに（９５％）有し、そして類似する９３８アミノ酸残基を９６８アミノ酸残基のうちに（９６％）有する。
【０１６４】
ＮＯＶ６ｂは、心臓、肺で発現される。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５０２１５−０３の配列の派生物について含まれる配列の組織供給源に由来した。ＮＯＶ６ｂは、密接に関連したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１）の発現パターンに基づき、以下の組織で発現されることが予測される：心臓、肺、大動脈、子宮、および小腸。
【０１６５】
（ＮＯＶ６ｃ）
新規ＴＧＦβ結合タンパク質様タンパク質をコードする４４７９ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｃ核酸（ＣＧ５０２１５−０４とも呼ばれる）を、表６Ａに示す。ヌクレオチド１３７〜１３９のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド４２０５〜４２０７のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表６Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１６６】
【表６Ｅ】
2005502312.tif 000085
2005502312.tif 000086
開示されるＮＯＶ６ｃ核酸配列は、第１９染色体に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、同一である２９４０塩基を３０２４塩基のうちに（９７％）有する。
【０１６７】
配列番号２１によりコードされる開示されるＮＯＶ６ｃポリペプチド（配列番号２２）は、１３５６アミノ酸残基であり、そして表６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ｃが、シグナルペプチドを含まず、そして確実度０．６５００で細胞質に局在化する可能性があることを予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ６ｃはまた、確実度０．１０００でミトコンドリアのマトリックス空間にか、または確実度０．１０００でリソソーム（管腔）に局在化される可能性がある。
【０１６８】
【表６Ｆ】
2005502312.tif 000087
開示されるＮＯＶ６ｃアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して同一である、２９８９塩基を３０２４塩基のうちに（９８％）有する。
【０１６９】
ＮＯＶ６ｃは、脳で発現される。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５０２１５−０４の配列の派生物について含まれる配列の組織供給源に由来した。この配列は、密接に関連したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種における完全ｃｄｓホモログ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１）の発現パターンに基づき、以下の組織で発現されることが予測される：心臓、肺、大動脈、子宮、および小腸。
【０１７０】
（ＮＯＶ６ｄ）
新規ＴＧＦβ結合タンパク質様タンパク質をコードする４４７３ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｄ核酸（ＣＧ５０２１５−０５とも呼ばれる）を、表６Ａに示す。ヌクレオチド１３７〜１３９のＡＴＧ開始コドンから始まり、ヌクレオチド４１９９〜４２０１のＴＧＡコドンで終結する、オープンリーディングフレームが同定された。開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドンの下流の推定非翻訳領域を、表６Ａに下線で示す。開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１７１】
【表６Ｇ】
2005502312.tif 000088
2005502312.tif 000089
開示されるＮＯＶ６ｄ核酸配列は、第１９染色体に位置し、そしてＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、同一である２９４０塩基を３０２４塩基のうちに（９７％）有する。
【０１７２】
配列番号２１によりコードされる開示されるＮＯＶ６ｄポリペプチド（配列番号２２）は、１３５４アミノ酸残基であり、そして表６Ｂにおいて一文字アミノ酸コードを用いて表される。ＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ６ｄが、シグナルペプチドを含まず、そして確実度０．６５００で細胞質に局在化する可能性があることを予想する。他の実施形態において、ＮＯＶ６ｄはまた、確実度０．１０００でミトコンドリアのマトリックス空間にか、または確実度０．１０００でリソソーム（管腔）に局在化される可能性がある。
【０１７３】
【表６Ｈ】
2005502312.tif 000090
2005502312.tif 000091
開示されるＮＯＶ６ｄアミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して、同一である２９４０塩基を３０２４塩基のうちに（９７％）有する。
【０１７４】
ＮＯＶ６ｄは、以下において発現される：副腎、骨髄、脳、腎臓、肝臓、肺、心臓、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮，骨、頚部、および卵巣。発現情報は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５０２１５−０５の配列の派生物について含まれる配列の組織供給源に由来した。この配列は、密接に関連したＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓの潜在型トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質４Ｓ  ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５１３４４｜ａｃｃ：ＡＦ０５１３４４．１）の発現パターンに基づき、以下の組織で発現されることが予測される：心臓。
【０１７５】
ＮＯＶ６はまた、表６Ｉに列挙されるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０１７６】
【表６Ｉ】
2005502312.tif 000092
2005502312.tif 000093
これらの配列のホモロジーは、表６Ｊ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示される。
【０１７７】
【表６Ｊ】
2005502312.tif 000094
2005502312.tif 000095
2005502312.tif 000096
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2005502312.tif 000098
2005502312.tif 000099
ヒト組織において、正常なホメオスタシスは、細胞と、細胞外マトリックスとして公知の分泌されたタンパク質のネットワークとの間の複雑に平衡化された相互作用を必要とする。これらの協同的な相互作用は、特異的な細胞表面レセプターを介して作用する多数のサイトカインを含む。細胞と細胞外マトリックス間の平衡が、乱される場合、疾患が生じ得る。これは、サイトカイントランスフォーミング増殖因子（β）（ＴＧＦ−（β））により媒介される相互作用における明白な証拠である。
【０１７８】
ＴＧＦ−（β）は、骨形成タンパク質およびアクチビンを含む二量体ポリペプチド増殖因子のファミリーのメンバーである。これらの増殖因子の全ては、分子内のジスルフィド結合により共に保有された共通のシステインノット（ｋｎｏｔ）構造を形成する保存システイン残基の群を共有する。体内の実質的にすべての細胞（上皮細胞、内皮細胞、造血性細胞、ニューロン細胞および結合組織細胞を含む）は、ＴＧＦ−（β）を産生し、そしてそのためのレセプターを有する。ＴＧＦ−（β）は、細胞の増殖および分化、胚発生、創傷治癒、血管新生を調節する。これらのプロセスにおけるＴＧＦ−（β）シグナル伝達経路の重要な役割は、マウスにおいてこの経路のメンバーをコードする遺伝子の標的欠失により実証されている。
【０１７９】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の生物活性は、潜在型の複合体としての細胞外区画におけるそれらの持続性により密接に制御される。３つの哺乳動物アイソフォーム遺伝子の各々は、細胞内で切断されて２つのポリペプチド（各々は二量体化される）を形成する産物をコードする。成熟ＴＧＦ−β（２４ｋＤホモダイマー）は、８０ｋＤの潜在型関連ペプチド（ＬＡＰ）に、非共有結合する。ＬＡＰは、その効率的な分泌に必要とされるＴＧＦ−βの基本的な成分であり、ＴＧＦ−βが偏在する細胞表面レセプターへ結合することを妨げ、活性化により容易に接近される大きな細胞外レザバにおいてＴＧＦ−βの利用性を維持する。この潜在型ＴＧＦ−β複合体（ＬＴＧＦ−β）は、全ての細胞により分泌され、そして循環形態および細胞外マトリックスへの結合の両方が豊富である。活性化は、ＴＧＦ−βの放出を導く集合的事象を記載する。生理学的組織プロセスおよび悪性組織プロセスにおける増殖および分化のＴＧＦ−β調節の重要性にもかかわらず、インサイチュでの活性化の機構について公知であることは著しく少ない。放射線を照射された乳腺の最近の研究は、正常乳腺および腫瘍性乳腺におけるその調節および潜在的な役割を解明し得るＴＧＦ−β１活性化の特定の特徴を明らかにする。
【０１８０】
形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βは、ＴＧＦ−β、そのＮ末端潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）プロペプチド、および潜在性のＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）からなる大きな潜在性の複合体中で分泌される。ＬＴＢＰは、細胞外マトリックスでのＴＧＦ−βの分泌および引き続く沈着に必要である。ＴＧＦ−β１は、ＬＡＰによってＬＴＢＰ−１の第３の８−Ｃｙｓ繰り返しに関連する。全てのＬＴＢＰ、ならびにフィブリリンは、多様な８−Ｃｙｓ繰り返しを含む。８−Ｃｙｓ繰り返しは、直接的なシステイン結合によってＴＧＦ−β１＊ＬＡＰと相互作用することが見出された。ＬＴＢＰ−２ならびにフィブリリン−１およびフィブリリン−２が、ネガティブであるのに対して、ＬＴＢＰ−１およびＬＴＢＰ−３は、全てのＴＧＦ−βアイソフォームに効率的に結合し、ＬＴＢＰ−４は、非常に弱い結合能力を有する。短い、特定のＴＧＦ−β結合モチーフは、ＴＧＦ−β結合８−Ｃｙｓ繰り返し中に同定される。ＬＴＢＰ−２の非ＴＧＦ−β結合第３の８−Ｃｙｓ繰り返し中のその封入は、ＴＧＦ−β結合を生じる一方、ＬＴＢＰ−１の第３の８−Ｃｙｓ繰り返し中のこのモチーフの欠損は、ＴＧＦ−β＊ＬＴＰ結合能の欠乏を生じる。８−Ｃｙｓ繰り返しの分子モデリンングは、疎水性相互作用表面および細胞内でのＴＧＦ−β＊ＬＡＰ−８−Ｃｙｓ繰り返しの形成に必要な、ＴＧＦ−β結合モチーフによって導入される３つの安定な水素結合の欠損を明らかにする。
【０１８１】
ＬＴＢＰ−４遺伝子は、染色体位１９ｑ１３．１〜１９ｑ１３．２に局在する。主なＬＴＢＰ−４ｍＲＮＡ形態は、大きさが約５．１キロ塩基対であり、心臓、大動脈、子宮および小腸で主に発現される。免疫ブロット法は、ＬＴＢＰ−４が、遊離の形態およびＴＧＦ−β、ＬＡＰ様タンパク質とのジスルフィド結合複合体の両方で、培養したヒトの肺線維芽細胞から分泌されたことを示した。マトリックス関連ＬＴＢＰ−４は、プラスミンを用いてのタンパク質分解性放出に影響されやすかった。ＬＴＢＰ−４は、タンパク質の増殖ＬＴＢＰ−フィブリンファミリーのメンバーであり、分泌および標的化したＴＧＦ−βまたは関連するタンパク質のマトリックス沈着のための代替の手段を提供する。
【０１８２】
ＬＴＢＰ−４は、２０ＥＧモジュール（１７のＥＧモジュールがカルシウム結合に対するコンセンサス配列を有する）８つのシステインおよび様々なプロリン富化領域を有する４ＴＢモジュールからなる。ノーザンブロットは、心臓だけでなく、骨格筋、膵臓、胎盤および肺でより高く発現する一本鎖の５ｋｂｍＲＮＡを証明した。モジュール構造は、ＬＴＢＰ−４がＴＧＦ−βにもまたおそらく結合するミクロフィブリルタンパク質であることが予想される。
【０１８３】
ＴＧＦ−βの生産における増加または減少は、アテローム性動脈硬化症および腎臓、肝臓および肺の線維症性の疾患を含む様々な疾患に状態ならびに発生に関連する。ＴＧＦ−β２欠損マウスは、心臓、肺、脳顔面頭蓋および尿生殖器の欠損症を有し、そしてＴＧＦ−（β）３欠損マウスは、口蓋裂を有する。ＴＧＦ−（β）３に対する遺伝子中の多型性は、ヒトの口蓋裂の発達に関連する。ＴＧＦ−（β）３に対する遺伝子の変異体、そのレセプターまたはＴＧＦ−（β）に関連する細胞内シグナル伝達分子はまた、疾患、特定の癌および遺伝性出血性毛細管拡張症の病理において重要である。
【０１８４】
ＴＧＦ−β結合タンパク質様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ６核酸は、配列が表６Ａで提供される核酸またはそのフラグメントが挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表６Ａに示された対応する塩基から変化され得るが、ＴＧＦ−β結合タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えばそれらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約３％までが変化され得る。
【０１８５】
本発明の開示されたＮＯＶ６タンパク質は、配列が表６Ｂに提供される配列のＴＧＦ−β結合タンパク質様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表６Ｂに示された対応する残基から変化され得るが、ＴＧＦ−β結合タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質あるいは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約１５％までがそのように変化され得る。
【０１８６】
本発明についての上記に定義された情報は、これらのＴＧＦ−β結合タンパク質様タンパク質（ＮＯＶ６）が、「ＴＧＦ−β結合タンパク質ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６タンパク質は、以下に示されるような種々の病理および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０１８７】
ＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６タンパク質は、以下に対して有用である：アテローム性動脈硬化症および腎臓、肝臓および肺の線維症性の疾患および癌（例えば、上皮細胞、内皮細胞および造血細胞）、遺伝性出血性毛細管拡張症ならびに／あるいは他の病態および障害。ＮＯＶ６タンパク質をコードする新規のＮＯＶ６核酸、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得る。ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。
【０１８８】
ＮＯＶ６核酸およびＮＯＶ６ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ６ａタンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。一つの実施形態において、企図されるＮＯＶ６エピトープは、約アミノ酸１〜５０である。他の実施形態において、ＮＯＶ６エピトープは、約アミノ酸２２０〜３００、約アミノ酸９００〜９５０または約アミノ酸１１５０〜１２００である。これらの新規タンパク質は、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のため強力なアッセイシステムの開発において価値を有する。
【０１８９】
（ＮＯＶ７）
新規のＭＡＳプロトオンコジーン様タンパク質をコードする９７３ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ７核酸（ＧＭＡＰ００８０８＿Ａ＿ｄａｌともいう）は、表７Ａで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３〜５におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９６６〜９６８におけるＴＧＡコドンで終了すると同定された。
【０１９０】
【表７Ａ】
2005502312.tif 000100
開示されたＮＯＶ７核酸配列は、第１１染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来ｇｂ：ＧＥＮＥＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＵＭＭＡＳ｜ａｃｃ：Ｍ１３１５０．１ｍＲＮＡ（ヒトｍａｓプロトオンコジーンｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ）に対して６７６塩基中４１３塩基（６１％）の同一性を有する。
【０１９１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３によってコードされる開示されたＮＯＶ７ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）は、３２１アミノ酸残基を有し、そして表７Ｂに一文字のアミノ酸符号で表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ７が、シグナルペプチドを有し、そして０．６０００の確実性で原形質膜に位置付けられると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ７はまた、０．４０００の確実性でゴルジ体または０．３０００の確実性で外形質小網（膜）に、あるいは０．３０００の確実性でマイクロボディーに位置付けられると思われる。ＮＯＶ７ペプチドに対する最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸４４と４５の間（ＭＡＧ−ＮＳ）である。
【０１９２】
【表７Ｂ】
2005502312.tif 000101
開示されたＮＯＶ７のアミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｒａｔ）（ＭＡＳ  ＰＲＯＴＯ−ＯＮＣＯＧＥＮＥ）由来３２４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ１２５２６タンパク質に対して３１８アミノ酸残基中１１４アミノ酸残基（３５％）の同一性、そして３１８アミノ酸残基中１８５アミノ酸残基（５８％）の類似性を有する。
【０１９３】
ＮＯＶ７はまた、表７Ｃで記載されたＢＬＡＳＴＰデータで示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【０１９４】
【表７Ｃ】
2005502312.tif 000102
これらの配列の相同性は、表７Ｄ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０１９５】
【表７Ｄ】
2005502312.tif 000103
2005502312.tif 000104
表７Ｅは、ＮＯＶ７に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ７配列が、このドメインに含まれる公知の他のタンパク質のドメインに対する特性の類似を有することを示す。
【０１９６】
【表７Ｅ】
2005502312.tif 000105
ヒトｍａｓオンコジーンは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換する能力によって本来検出された。本発明者らは、７つの疎水性の潜在的膜貫通ドメインを有し、そしてホルモンレセプタータンパク質のファミリーと類似する強い配列を共有する点から、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞のオンコジーン産物の間で特有であることを以前に示した（Ｙｏｕｎｇ  Ｄら；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８  Ｊｕｌ；８５（１４）：５３３９−４２）。本発明者らは、ｍａｓオンコジーンのラットのホモログを新しくクローン化し、そのＤＮＡ配列を決定し、そして様々なラットの組織においてその発現を試験した。ラットおよびヒトのｍａｓタンパク質の予想される配列の比較は、それらの親水性アミノ末端ドメインを除いて、これらがより高い保存性であることを示す。ｍａｓの発現の試験は、ＲＮＡ保護研究によって決定され、ｍａｓ  ＲＮＡ転写物の高いレベルは、他の神経領域または他の組織ではなく、脳の海馬または大脳皮質に存在することを示した。この発現パターンおよび公知のレセプタータンパク質に対するｍａｓタンパク質の類似性は、ｍａｓが、通常の神経生理学および／または特定の神経性細胞の発達に関するレセプターをコードすることを示唆する。
【０１９７】
トランスフェクトしたＮＩＨ／３Ｔ３に腫瘍形成性を与えるヒトｍａｓオンコジーンは、ゼノプス卵母細胞における一過性発現および哺乳動物のニューロン細胞株における安定な発現によってアンギオテンシンレセプターのサブタイプとして同定された（ＮＧ１１５−４０１Ｌ）（Ｈａｎｌｅｙ  ＭＲら、；Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １９９０；１５０：２３−３８；３８〜４６に議論）。ｍａｓレセプターは、アンギオテンシンＩＩＩを優先的に認識し、そして脳で高いレベルで発現した。ｍａｓ／アンギオテンシンレセプターは、イノシトール脂質の分解を通して機能し、そして別のイノシトール結合ペプチドレセプター（ブラジキニンに対するレセプター）と異なり、ＤＮＡ合成を誘導し得る。ｍａｓトランスフェクト細胞のアンギオテオシンまたはブラジキニンのいずれかの刺激によって誘発される様々な初期の生化学の事象の比較分析は、マイトジェン活性に関連する特定の差異を示さない。特に、血小板誘導増殖因子レセプターのマイトジェン機構に関して考えられるイノシトール脂質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼは、ｍａｓの活性化によって影響されない。これらの結果は、プロト−オンコジーンが、神経性ペプチドレセプターをコードしすることを示し、他の同定されたプロト−オンコジーンと同様なペプチドレセプターは、分化プロセスおよび増殖プロセスに関し得ることを示す。
【０１９８】
ＧＴＰ結合タンパク質に結合するレセプターのクラスは、「７回膜貫通セグメント」として記載された保存される構造モチーフを共有し、疎水性セグメントが膜橋架けαヘリックスを形成する予測が続く（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＴＲら；Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｓｅｐ  ２９；３３５（６１８９）：４３７−４０）。同定された例としては、哺乳動物のオプシン、α１アドレナリン性レセプター、α２アドレナリン性レセプター、β１アドレナリン性レセプター、β２アドレナリン性レセプター、ムスカリン性レセプターファミリー、５−ＨＴ１Ｃレセプターおよび物質Ｋレセプターが挙げられる。さらに、これらのレセプターに対して類似する配列を有する予測される遺伝子産物をコードする２つの哺乳動物遺伝子（Ｇ２１およびｍａｓオンコジーン）は、同定されたが、これらのリガンド特異性は、はっきりと知られていない。このｍａｓオンコジーンは、物質Ｋレセプターに非常によく類似する配列を示し、そしてこれに基づいてイノシトール脂質シグナル伝達経路を通して作用するマイトジェン活性を有するペプチドレセプターをコードすることが予測された。ｍａｓオンコジーン産物は、ゼノプス卵母細胞中に一過性で発現され、そしてトランスフェクトした哺乳動物細胞株中で安定的に発現される。この結果は、ｍａｓ遺伝子産物は、機能的なアンギオテンシンレセプターであることを実証する。
【０１９９】
ＭＡＳプロトオンコジーン前駆体様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ７核酸は、配列が表７Ａで提供される核酸またはそのフラグメント配列が挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表７Ａに示された対応する塩基から変化され得るが、ＭＡＳプロトオンコジーン前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えばそれらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約３９％までがこのように変化され得る。
【０２００】
本発明の開示されたＮＯＶ７タンパク質は、配列が表７Ｂに提供される配列のＭＡＳプロトオンコジーン前駆体様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表７Ｂに示された対応する残基から変化され得るが、ＭＡＳプロトオンコジーン前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質あるいは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約６５％までがこのように変化され得る。
【０２０１】
本明細書中に開示されるＭＡＳプロトオンコジーン前駆体様タンパク質および核酸（ＮＯＶ７）に対するタンパク質の類似性情報、発現パターン、およびマップ配置は、このＮＯＶ７がＭＡＳプロトオンコジーン前駆体ファミリーの重要な構造的および／または生理学的機能の特徴を有し得ることを示唆する。従って、本発明のＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７タンパク質は、潜在的な診断用途および治療用途において有用である。これらは、特定のまたは選択的核酸もしくはタンパク質の診断マーカーおよび／または予防マーカーとして機能すること（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療用途を含む：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物。
【０２０２】
本発明のＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７タンパク質は、以下に記載される種々の疾患および障害および／または他の症状に関係する潜在的な診断用途および治療用途において有用である。例えば、本発明の組成物は、以下に羅患している患者の処置に効力を有する：
低ゴナドトロピン性性機能低下症、カルマン（Ｋａｌｌｍａｎ）症候群、細菌性／ウイルス性感染、免疫学的および炎症性の疾患および障害ならびに／あるいは他の病理／障害。ＮＯＶ７核酸、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。
【０２０３】
ＮＯＶ７核酸およびＮＯＶ７ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ７タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。一つの実施形態において、企図されるＮＯＶ７エピトープは、約アミノ酸２０〜８０である。他の実施形態において、企図されるＮＯＶ７エピトープは、約アミノ酸１０５〜１２５、約アミノ酸１４０〜１６０、約アミノ酸１７５〜２００、または約アミノ酸２１５〜２７５である。これらの新規タンパク質はまた、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のため強力なアッセイシステムの開発において価値を有する。
【０２０４】
（ＮＯＶ８）
新規の膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質をコードする６７１ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ８核酸（ＡＬ１６３１９５＿ｄａ２ともいう）は、表８Ａで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３〜５で始まり、そしてヌクレオチド４６５〜４６７におけるＴＡＡコドンで終了すると同定された。
【０２０５】
【表８Ａ】
2005502312.tif 000106
開示されたＮＯＶ８核酸配列は、第１４染色体に位置する。
【０２０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５によってコードされる開示されたＮＯＶ８ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は、１５４アミノ酸残基を有し、そして表８Ｂに一文字のアミノ酸符号で表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ８が、シグナルペプチドを有し、そして０．６８００の確実性で原形質膜に位置付けられると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ８は、０．６４００の確実性で小胞体（膜）または０．３７００の確実性でゴルジ体に、あるいは０．１０００の確実性で小胞体（管腔）に位置付けられ得る。ＮＯＶ８に対する最も可能性の高い切断部位は、アミノ酸２７と２８の間（ＶＮＤ−ＥＡ）である。
【０２０７】
【表８Ｂ】
2005502312.tif 000107
配列データバースの検索は、ＮＯＶ８のアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＲＩＢＯＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＰＡＮＣＲＥＡＴＩＣ  ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．１．２７．５）（ＲＮＡＳＥ  １）（ＲＮＡＳＥ  Ａ）（ＲＮＡＳＥ  ＵＰＩ−１）（ＲＩＢ−１）由来１５６アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ０７９９８タンパク質に対して１４１アミノ酸残基中４３アミノ酸残基（３０％）の同一性、そして１４１アミノ酸残基中７５アミノ酸残基（５３％）の類似性を有することを示した。
【０２０８】
ＮＯＶ８は、少なくとも肺、精巣およびＢ細胞で見出される。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ情報源、Ｐｕｂｌｉｃ（公的）ＥＳＴ情報源、Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ（文献）情報源、および／またはＲＡＣＥ情報源を含むがこれに限定されない、本発明に含まれる配列の組織情報源を決定することによって導かれた。
【０２０９】
ＮＯＶ８はまた、表８Ｃで記載されたＢＬＡＳＴＰデータで示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２１０】
【表８Ｃ】
2005502312.tif 000108
これらの配列の相同性は、表８Ｄ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。
【０２１１】
【表８Ｄ】
2005502312.tif 000109
表８Ｅは、ＮＯＶ８に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ８配列が、このドメインに含まれる公知の他のタンパク質のドメインに対して類似の特性を有することを示す。
【０２１２】
【表８Ｅ】
2005502312.tif 000110
ＲＮＡに対する活性のような、リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーのメンバーの酵素特性、シトシンまたはウラシル（ｒａｃｉｌ）のどちらかの好ましい第一の結合部位Ｂ１、切断されたホスホジエステル結合の好ましい他の側面、Ｂ２部位、および２つの非触媒性のリン酸結合部位Ｐ０およびＰ２の特性は、この多数の論評中の様々な論文で議論され、そしてこの近接する論文に要約される（Ｂｅｉｎｔｅｍａ  ＪＪ，ら；Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  １９９８  Ａｕｇ；５４（８）：８２５−３２参照のこと）。リボヌクレアーゼ１ファミリーのメンバーの特定の特徴は、二重鎖核酸構造でのそれらの攪乱作用である。リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーの特徴は、祖先の脊椎動物の系列および最近進化した分類群の両方での遺伝子重複の頻繁な発生である。先祖の反すう動物の２つの遺伝子重複の結果である、３つの異なるウシリボヌクレアーゼ１は、それぞれ膵臓、精液および脳で同定された。類似の遺伝子重複は、様々な哺乳動物および他の脊椎動物分類群中の他のリボヌクレアーゼフェミリーで同定された。リボヌクレアーゼファミリー（ヒトメンバーが番号２、３および６で割り当てられた）は、遺伝子重複の未だ解明されていないパターンおよびリボヌクレアーゼ活性でのタンパク質としての機能表現および他の生理学的な特性を受けた。
【０２１３】
膵リボヌクレアーゼ（ＥＣ  ３．１．２７．５）は、膵臓によって大量に分泌される消化酵素の１つである。Ｅｌｌｉｏｔｔら（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．４２：１１０−１１２，１９８６）は、ラットのｃＤＮＡを有する膵臓のｃＤＮＡライブラリーから単離したプローブを用いて、マウスの組換え近交系からのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって、マウス遺伝子の第１４染色体にマッピングした。多型性のＢａｍＨＩ部位は、Ｔ細胞レセプター（１８６８８０）のαサブユニットおよびヌクレオシドホスホリラーゼ  （１６４０５０）をそれぞれコードするＴｃｒａとＮｐ−２を有するリブ−１遺伝子座の完全な一致率を説明するために使用された。マウス１４に対する割当ておよび他の２つの遺伝子座に密接な連鎖が、スネルの共通遺伝子系株の１つの研究で確認された：３つの遺伝子座が一緒になる。Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９８６）は、相同的なヒト遺伝子ＲＩＢＩが、第１４染色体にあることを予測した。
【０２１４】
ヒト膵ＲＮａｓｅは、単量体であり、そのＲＮＡ分解活性以外のいずれかの生物学的活性を欠く。Ｐｉｃｃｏｌｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：７７６８−７７７３，１９９９）は、マウスおよびヒト腫瘍細胞での細胞傷害性作用を有するニ量体タンパク質へと単量体形態を操作したが、しかしヒトおよびマウス正常細胞の任意のかなりの毒性を欠いている。選択的に感作された細胞のヒト膵ＲＮａｓｅのニ量体改変体は、ヒト甲状腺の腫瘍からアポトーシスの死までに派生した。腫瘍細胞の選択性およびヒト起源のために、このタンパク質は、抗癌治療のための魅力的なツールを示すため考えられた。
【０２１５】
膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ８核酸は、配列が表８Ａで提供される核酸またはそのフラグメントが挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表８Ａに示された対応する塩基から変化され得るが、膵リボヌクレアーゼ前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えば、それらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約１００％までがこのように変化され得る。
【０２１６】
本発明の開示されたＮＯＶ８タンパク質は、配列が表８Ｂに提供される配列の膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表２に示された対応する残基から変化され得るが、膵リボヌクレアーゼ前駆体様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質あるいは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約７０％までがこのように変化され得る。
【０２１７】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２を包含する。
【０２１８】
本発明についての上記に定義された情報は、この膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質（ＮＯＶ８）が、「膵リボヌクレアーゼ前駆体ファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２１９】
本発明のＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８タンパク質は、癌（傾斜、自己免疫疾患，老化および癌を含む）（限定されないが）に関係する潜在的な治療に有用であり得る。例えば、膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質（ＮＯＶ８）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そして膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質（ＮＯＶ８）は、それらを必要とする患者に投与する場合、有用であり得る。限定されない例によって、本発明の組成物は、以下を罹患する患者の処置のために効果的である：糖尿病、フォン  ヒッペリ−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵臓炎、肥満症、甲状腺機能亢進および甲状腺機能低下ならびに癌（甲状腺、膵臓を含む）、および他のこのような状態。膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質および本発明の膵リボヌクレアーゼ前駆体様タンパク質、またはそれらのフラグメントをコードするＮＯＶ８核酸は、さらに診断的用途において有用であり、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は、評価される。
【０２２０】
ＮＯＶ８核酸およびＮＯＶ８ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、新規なＮＯＶ８物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ８タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。一つの実施形態において、企図されるＮＯＶ８エピトープは、約アミノ酸５〜２５である。他の実施形態において、ＮＯＶ８エピトープは、約アミノ酸９０〜１００である。これらの新規タンパク質は、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のためアッセイシステムにおいて使用され得る。
【０２２１】
（ＮＯＶ９）
新規のアミノトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする１４７６ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ９核酸（ＳＣ８７４２１０５８＿Ａともいう）は、表９Ａで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２６〜２８におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１３７９〜１３８１におけるＴＡＡコドンで終了すると同定された。開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２２２】
【表９Ａ】
2005502312.tif 000111
開示されたＮＯＶ９核酸配列は、第４染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ１３４０８ｆｉｓ、クローンＰＬＡＣＥ１００１６７２、ＰＲＯＢＡＢＬＥ  ＡＭＩＮＯＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ  Ｔ０１Ｂ１１．２（ＥＣ２．６．１．−）に弱い類似性））由来ｇｂ：ＧＥＮＥＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２３４７０．１ｍＲＮＡに対して５４０塩基中３４２塩基（６３％）の同一性を有する。
【０２２３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７によってコードされる開示されたＮＯＶ９ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）は、４５１アミノ酸残基を有し、そして表９Ｂに一文字のアミノ酸コードを用いて表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ９が、シグナルペプチドを有し、そして０．５３６５の確実性でミトコンドリアマトリックス空間に位置付けられると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ９はまた、０．３６００の確実性で核に、０．２６６７の確実性でマイクロボディーに、または０．２６１２の確実性でミトコンドリアの内膜に位置付けられ得る。ＮＯＶ９ペプチドに対する最も可能性の高い切断部位は、３４位と３５位の間（ＳＳＣ−ＫＶ）である。
【０２２４】
【表９Ｂ】
2005502312.tif 000112
配列データベースの検索は、ＮＯＶ９のアミノ酸配列が、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ）（ＣＧ８７４５  ＰＲＯＴＥＩＮ）由来４７４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＶＵ９５タンパク質に対して３４０アミノ酸残基中１９７アミノ酸残基（５７％）の同一性、そして３４０アミノ酸残基中２５６アミノ酸残基（７５％）の類似性を有することを明らかにした。
【０２２５】
ＮＯＶ９は、脳および視床下部で発現される。
【０２２６】
開示されるＮＯＶ９ポリペプチドは、表９Ｃで記載されたＢＬＡＳＴＰデータで示されるアミノ酸配列に相同性を有する。
【０２２７】
【表９Ｃ】
2005502312.tif 000113
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表９Ｄ中に示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析に図示される。ＮＯＶ９タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアライメントおよび本明細書中の全ての他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒く輪郭を描いたアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造特性または機能特性を維持するために必要である領域）を示し、ここで強調していないアミノ酸残基は、低く保存され、そしてタンパク質の構造または機能を改変せずにより広い程度まで潜在的に改変され得る。
【０２２８】
【表９Ｄ】
2005502312.tif 000114
2005502312.tif 000115
表９Ｅは、ＮＯＶ９に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの説明を記載する。これは、ＮＯＶ９配列が、このドメインに含まれることの公知の他のタンパク質のドメインに対して類似の特性を有することを示す。
【０２２９】
【表９Ｅ】
2005502312.tif 000116
開示されたＮＯＶ９核酸は、酵素のトランスフェラーゼスーパーファミリーの新規メンバーをコードする。特に、この配列は、アミノトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする。アミノトランスフェラーゼ酵素は、肝臓の代謝で重大な役割を果たす。血清のアミノトランスフェラーゼ濃度は、肝臓の毒性および損傷（例えば、肝臓癌、アルコール中毒による肝硬変、糖尿病に対するｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ治療）の場合において正確な診断の手段として使用されている。この理由のために、アミノトランスフェラーゼスーパーファミリーの酵素は、診断的指示薬として潜在的に有用である。本明細書に記載された、脳およびＣＮＳ障害で機能を示し得るタンパク質は、脳組織で発現されることが公知である。本明細書中に記載されるアミノトランスフェラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ９；ＳＣ８７４２１０５８＿Ａ）は、肝硬変、癌または化学毒性による肝臓損傷、を検出するため；または特定の脳およびＣＮＳ障害の検出または処置のための診断的ツールとして使用され得た。
【０２３０】
肝臓炭水化物物質代謝の急性のホルモンの調節は、主にｃＡＭＰおよびＣａ２＋の細胞質ゾルレベルの変化を含む。β２−アドレナリン作用性レセプターを介して作用するエピネフリン、およびグルカゴンは、酵素に刺激的なグアニンヌクレオチド結合タンパク質に関する機構を通して、肝臓形質膜のアデニレートシクラーゼを活性化する。ｃＡＭＰの得られた蓄積は、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼの活性化をもたらし、続いてグリコーゲン代謝、糖新生および解糖の調節に関係する多くの細胞内酵素をリン酸化する。これらは、（１）活性化され、続いてホスホリラーゼおよびグリコーゲン崩壊の速度を制限する酵素をリン酸化し活性化するホスホリラーゼｂキナーゼ；（２）不活性化され、そしてグリコーゲン合成の速度を制御するグリコーゲンシンターゼ；（３）不活性化され、そして解糖のための重要な調節酵素であるピルビン酸キナーゼ；および（４）６−ホスホフルクト−１−キナーゼのアクチベーターおよびフルクトース１，６−ビスホスファターゼのインヒビター（これらはともに、解糖および糖新生の重要な調節酵素である）である、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ／フルクトース２，６−ビスホスファターゼの二機能性の酵素（フルクトース２，６−Ｐ２の形成の減少をもたらすリン酸化）。糖原分解および糖新生を刺激し、そしてグリコーゲンの合成および解糖を阻害することによって肝性のグルコース生産を増加するグルカゴンおよびβアドレナリン作用性アゴニストの急速な効果に加えて、生産し、これらの薬剤は、糖新生／解糖およびアミノ酸代謝の改変された特定の酵素の合成を通して、糖新生での長い期間の刺激性の効果を生成する。例えば、Ｐ−エノールピルビン酸塩カルボキシキナーゼは、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼによって媒介される転写レベルの効果を介して、導入される。チロシンアミノトランスフェラーゼ、セリンデヒドラターゼ、トリプトファンオキシゲナーゼおよびグルコキナーゼはまた、特定のメッセンジャーＲＮＡ合成のレベルで部分的にｃＡＭＰによって調節される。交感神経系およびその神経液性アゴニストのエピネフリンおよびノルエピネフリンはまた、α１−アドレナリン性レセプターを介して作用する肝性のグリコーゲン代謝および糖新生を迅速に改変する。これらのアゴニストの第１の応答は、形質膜ポリホスホイノシチドホスファチジルイノシトール４，５−Ｐ２からイノシトール１，４，５−Ｐ３および１，２−ジアシルグリセロールのホスホジエステラーゼ媒介崩壊である。これは、アデニレートシクラーゼの調節に関するこれらと異なるグアニンヌクレオチド結合タンパク質を含む。イノシトール１，４，５−Ｐ３は、小胞体からＣａ２＋を放出することによってＣａ２＋の可動化のために細胞内メッセンジャーとして作用する。
【０２３１】
アミノトランスフェラーゼ様タンパク質をコードする開示された本発明のＮＯＶ９核酸、は、配列が表９Ａで提供される核酸またはそのフラグメントが挙げられる。本発明はまた、それらのあらゆる塩基が表９Ａに示された対応する塩基から変化され得るが、アミノトランスフェラーゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントも含む。本発明はさらに、配列が先程記載されたばかりの配列と相補的である核酸を含む。これは、先程記載したばかりの核酸のいずれかと相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、それらの構造が化学的修飾を含む核酸または核酸フラグメントまたはそれらの相補体を含む。非限定的な例によって、このような修飾は、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾された、または誘導体化された核酸を含む。これらの修飾は、例えばそれらが被験体への治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得るように、修飾された核酸の化学的安定性を、少なくとも部分的に強化するように行われる。変異体核酸または改変体核酸およびそれらの相補体において、塩基の約３７％までがこのように変化され得る。
【０２３２】
本発明の開示されたＮＯＶ９タンパク質は、配列が表９Ｂに提供されるアミノトランスフェラーゼ様タンパク質を含む。本発明はまた、それらのあらゆる残基が表２に示された対応する残基から変化され得るが、アミノトランスフェラーゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードする変異体タンパク質あるいは改変体タンパク質、またはそれらの機能的なフラグメントも含む。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約４３％までがこのように変化され得る。
【０２３３】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２を包含する。
【０２３４】
本発明についての上記に定義された情報は、このアミノトランスフェラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ９）が、「アミノトランスフェラーゼファミリー」のメンバーとして機能し得ることを示唆する。従って、ここで同定されたＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９タンパク質は、以下に示されるような種々の病状および障害（しかし、これらに限定されない）に関連する、潜在的治療適用において有用であり得る。本発明のこれらの潜在的治療適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質治療、低分子薬物標的、抗体標的（治療抗体、診断抗体、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、診断および／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子治療／遺伝子除去（ａｂｌａｔｉｏｎ））、研究ツール、全ての組織および細胞型（本明細書中に定義されるものを含む（しかし、限定されない））のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２３５】
本発明のＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９タンパク質は、肝臓毒素および損傷（例えば、癌、肝硬変または糖尿病のトログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）治療）；癌を含む脳障害およびＣＮＳ障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、精神分裂病および他の疾患、障害ならびにそのような状態に関係する潜在的な治療に有用であり得る。例えば、アミノトランスフェラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ９）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり、そしてアミノトランスフェラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ９）は、それらを必要とする患者に投与する場合、有用である。限定されない例によって、本発明の組成物は、以下を罹患する患者の処置のために効果的である：細菌性感染、真菌類感染、原生動物感染およびウイルス感染（特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２による感染）、疼痛、癌（限定されないが、新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含む）、食欲不振、過食症、ぜん息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、．高血圧症、尿閉、骨粗しょう症、クローン病；多発性硬化症；およびオールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神病性の障害および神経性の障害（不安、精神分裂病、大うつ病、せん妄、痴呆、重症精神遅滞を含む）。歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低リン酸血症くる病、常染色体優性（２）のアクロカロソル（Ａｃｒｏｃａｌｌｏｓａｌ）症候群およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群および／または他の病理または状態。アミノトランスフェラーゼ様タンパク質および本発明のアミノトランスフェラーゼ様タンパク質、またはそれらのフラグメントをコードするＮＯＶ９核酸は、さらに診断的用途において有用であり、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量は、評価される。
【０２３６】
ＮＯＶ９核酸およびＮＯＶ９ポリペプチドは、治療方法または診断方法における使用のための、新規なＮＯＶ９物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項で記載されるような、疎水性チャートからの予測を用いる、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。開示されたＮＯＶ９タンパク質は、各々が免疫原として使用され得る、複数の親水性領域を有する。一つの実施形態において、企図されるＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸１０〜４０である。他の実施形態において、ＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸６０〜７５である。代替の実施形態において、ＮＯＶ９エピトープは、約アミノ酸２１０〜２５０、約アミノ酸３１０〜３４０、約アミノ酸３６０〜３９０である。これらの新規タンパク質は、疾患の病理学の理解および種々の障害に対する新たな薬物標的の開発を助ける、種々のヒト障害の機能分析のためアッセイシステムにおいて使用され得る。
【０２３７】
（ＮＯＶ１０）
ＮＯＶ１０は、以下に記載される２つのトロイド様２−様タンパク質を含む。開示された配列は、ＮＯＶ１０ａおよびＮＯＶ１０ｂと名付けられている。
【０２３８】
（ＮＯＶ１０ａ）
新規のトロイド様２−様タンパク質をコードする３３５０ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ１０Ａ核酸（ＣＧ５０２３５−０１ともいう）は、表１０Ａで示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３６５〜３６７におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド３３４１〜３３４３におけるＴＡＧコドンで終了すると同定された。開始コドンおよび終止コドンは、太字である。
【０２３９】
【表１０Ａ】
2005502312.tif 000117
2005502312.tif 000118
公の配列データベースの検索において、ＮＯＶ１０Ａ核酸配列は、第１０染色体に位置し、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓｃトロイド様２−様タンパク質（ＴＬＬ２）ｍＲＮＡ、完全なｃｄｓ）由来ｇｂ：ＧＥＮＥＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ０５９５１６｜ａｃｃ：ＡＦ０５９５１６．１ｍＲＮＡに対して２９５７塩基中２９５５塩基（９９％）の同一性を有する。
【０２４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９によってコードされる開示されたＮＯＶ１０Ａポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）は、９９２アミノ酸残基を有し、そして表１０Ｂに一文字のアミノ酸符号で表される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはＨｙｄｒｏｐａｔｈｙの結果は、ＮＯＶ１０Ａが、シグナルペプチドを有し、そして０．７５２３の確実性で細胞外に位置付けられると予測される。他の実施形態において、ＮＯＶ１０Ａは、０．２２８０の確実性でマイクロボディー（ペルオキソーム）に、０．１９００の確実性でリソソーム（管腔）に、または０．１０００の確実性で小胞体（膜）に位置付けられ得る。
【０２４１】
【表１０Ｂ】
2005502312.tif 000119
2005502312.tif 000120
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１０Ａのアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）（ＴＯＬＬＯＩＤ−ＬＩＫＥ  ２  ＰＲＯＴＡＩＮ）由来１０１５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ６Ｌ７タンパク質に対して８７９アミノ酸残基中８６８アミノ酸残基（９８％）の同一性、そして８７９アミノ酸残基中８６８アミノ酸残基（９８％）の類似性を有することが見出された。
【０２４２】
ＮＯＶ１０Ａは、少なくとも結腸、肺、耳下腺、唾液腺および生物体全体で発現される。
【０２４３】
（ＮＯＶ１０ｂ）
３１４６ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ１０Ｂ核酸（ＣＧ５０２３５−０３とも呼ばれる）は、新規のトロイド（Ｔｏｌｌｏｉｄ）様２様タンパク質をコードしており、表１０Ａに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２２７〜２２９のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド３１３７〜３１３９でのＴＡＧコドンで終止することが同定された。開始コドンおよび終止コドンを太字で示す。
【０２４４】
【表１０Ｃ】
2005502312.tif 000121
2005502312.tif 000122
公的な配列データベースの検索において、第１０染色体に位置するＮＯＶ１０Ｂ核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２６１０６｜ａｃｃ：ＡＫ０２６１０６．１  ｍＲＮＡ（ＡＦ０５９５１６  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓトロイド様２タンパク質（ＴＬＬ２）のｍＲＮＡに対して非常に類似の、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ：ＦＬＪ２２４５３  ｆｉｓ、クローン  ＨＲＣ０９６７９）に対して、１８８４塩基のうち１８８２塩基（９９％）の同一性を有する。
【０２４５】
配列番号２９によりコードされる、開示されるＮＯＶ１０Ｂポリペプチド（配列番号３０）は、９７０アミノ酸残基を有し、そして表１０Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーの結果は、ＮＯＶ１０Ｂがシグナルペプチドを有し、そして０．７５２３の確実度で細胞外に局在されるようであることを予測する。別の実施形態において、ＮＯＶ１０Ｂはまた、０．２２９１の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に、０．１９００の確実度でリソソーム（内腔）に、または０．１０００の確実度で小胞体（膜）に局在され得る。開示されるＮＯＶｌ０ｂポリペプチドの最も有望な切断部位は、２５位と２６位との間（ＡＡＧ−ＬＧ）である。
【０２４６】
【表１０Ｄ】
2005502312.tif 000123
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１０Ｂアミノ酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来の１０１５アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ６Ｌ７タンパク質（ヒト）（トロイド様２タンパク質）に対して、５３０アミノ酸残基のうち５１９アミノ酸残基（９７％）の同一性を、そして５３０アミノ酸残基のうち５１９アミノ酸残基（９７％）の類似性を有することを示す。
【０２４７】
ＮＯＶ１０Ｂは、少なくとも耳下唾液腺（Ｐａｒｏｔｉｄ  Ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ）、結腸、脊髄、および肺で発現される。
【０２４８】
開示されるＮＯＶ１０Ａポリペプチドは、表１０Ｅに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対する相同性を有する。
【０２４９】
【表１０Ｅ】
2005502312.tif 000124
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１０Ｆに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析で写実的に示される。ＮＯＶ１０Ａタンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントならびに本明細書中の他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の全てにおいて、黒ぬりの（ｂｌａｃｋ  ｏｕｔｌｉｎｅｄ）アミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示すのに対して、強調されていないアミノ酸残基は、ほとんど保存されておらず、タンパク質の構造および機能を変化させることなく、潜在的に非常に広範囲に変化され得る。
【０２５０】
【表１０Ｆ】
2005502312.tif 000125
2005502312.tif 000126
2005502312.tif 000127
表１０Ｇ〜１０Ｉは、ＮＯＶ１０Ａに対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ１０Ａ配列が、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質の配列に類似する特性を有することを示す。
【０２５１】
【表１０Ｇ】
2005502312.tif 000128
【０２５２】
【表１０Ｈ】
2005502312.tif 000129
【０２５３】
【表１０Ｉ】
2005502312.tif 000130
脊椎動物の骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１（ＢＭＰ−１）とＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  トロイド（ＴＬＤ）とは、種々の発生事象において重要な役割を有するメタロプロテアーゼのファミリーのプロトタイプである。ＢＭＰ−１は、少なくとも部分的に、筋原線維のコラーゲンの生合成プロセシングを介する形態発生に作用する一方、ＴＬＤは、分泌型タンパク質の短嚢胚形成（ＳＯＧ）を伴う潜在性の複合体からＴＧＦβ様リガンドを放出することにより、背側−腹側パターン形成（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）に作用する。この発生的プロテアーゼファミリーのさらなる哺乳動物のメンバーについてのスクリーニングにおいて、Ｓｃｏｔｔら（Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９９；２１３：２８３−３００）は、新規ファミリーメンバーである哺乳動物トロイド様２（ｍＴＬＬ−２）を同定し、そして４つの既知の哺乳動物のＢＭＰ−Ｉ／ＴＬＤ様プロテアーゼ［ＢＭＰ−１、哺乳動物トロイド（ｍＴＬＤ）、哺乳動物トロイド様１（ｍＴＬＬ−１）、およびｍＴＬＬ−２］全ての酵素活性および発現ドメインを比較した。
【０２５４】
高い配列類似性にも関わらず、個々の差異は、筋原線維コラーゲン前駆体をプロセシングする能力およびコーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）（ＳＯＧの脊椎動物のオルソログ）を切断する能力において示される。ＢＭＰ−１およびｍＴＬＤに関して事前に立証されるように、ｍＴＬＬ−１は、プロコラーゲンＣ−プロペプチドを生理学的関連部位で特異的にプロセシングすることが示されるが、ｍＴＬＬ−２は、この活性を欠くことが示される。ＢＭＰ−１およびｍＴＬＬ−１は、プロコラーゲンＣ−プロペプチド切断部位に類似する部位でのコーディンの切断、およびＸｅｎｏｐｕｓ胚での過剰発現の際にコーディンの背側化効果の相殺を示す。プロテアーゼｍＴＬＤおよびｍＴＬＬ−２は、コーディンを切断しない。４つのプロテアーゼの酵素活性および発現ドメインにおける差異は、哺乳動物の初期胚発生において、そして出生前および出生後の骨格形成において、主要なコーディンアンタゴニストとしてのＢＭＰ−１を示唆する。
【０２５５】
リシルオキシダーゼは、細胞外マトリクス生合成においてコラーゲンおよびエラスチンの架橋結合に必要とされる酵素の最終工程を触媒する。プロ−リシルオキシダーゼは、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性によりプロセシングされ、また、プロコラーゲンＩ〜ＩＩＩのＣ−プロペプチドを除去する。Ｂｍｐ１遺伝子は、２つのプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１（ＢＭＰ−１）および哺乳動物トロイド（ｍＴＬＤ））をコードする。哺乳動物トロイド様（ｍＴＬＬ）−ｌおよび哺乳動物トロイド様−２は、遺伝的に異なる２つのＢＭＰ−１−関連プロテイナーゼであり、そしてｍＴＬＬ−１は、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性を有することが示されている。Ｕｚｅｌら（２００１）は、これら４つの関連プロテイナーゼによるプロ−リシルオキシダーゼプロセシングを直接比較した。精製された組換え酵素を用いたインビトロアッセイは、４つのプロテイナーゼ全てが、プロ−リシルオキシダーゼを正確な生理学的部位で生産的に切断するが、ＢＭＰ−１は、ｍＴＬＬ−１、ｍＴＬＬ−２、およびｍＴＬＤよりも、それぞれ、３倍、１５倍、および２０倍より強く効果的であることを示す。リシルオキシダーゼ活性におけるＢＭＰ−１およびｍＴＬＬ−１の役割を、結合組織細胞によってより直接的に評価するため、線維芽細胞は、Ｂｍｐ１−ヌル（ｎｕｌｌ）マウス、Ｔｌｌ１−ヌルマウスおよびＢｍｐ１／Ｔｌｌ１二重ヌルマウス（ｄｏｕｂｌｅ  ｎｕｌｌ  ｍｏｕｓｅ）の胚から培養され、次いで、それぞれ、ＢＭＰ−１／ｍＴＬＤ、ｍＴＬＬ−１、または３つの酵素全てを欠く細胞が、リシルオキシダーゼ酵素活性、ならびにプロ−リシルオキシダーゼおよび約３０−ｋＤａの成熟リシルオキシダーゼの蓄積についてアッセイされた。野生型細胞あるいはＢｍｐ１またはＴｌｌ１についての単一ヌル細胞全てが、プロ−リシルオキシダーゼとプロセシングされたリシルオキシダーゼとの両方を類似のレベルで産生し、酵素活性データと一致するプロセシングの正常レベルを明らかに示した。対照的に、Ｂｍｐ１／Ｔｌｌ１ダブルヌル細胞は、大部分がプロセシングされていない５０ｋＤａのプロ−リシルオキシダーゼを産生し、そして野生型細胞、Ｂｍｐ１−ヌル細胞、およびＴｌｌ１−ヌル細胞と比較して７０％減少したリシルオキシダーゼ酵素活性を有した。従って、ＢＭＰ−１／ｍＴＬＤとｍＴＬＬ−１との組み合わせは、マウス胚性線維芽細胞によってリシルオキシダーゼの活性化を導くプロセシングの大部分の原因であることを示すが、インビトロ研究は、ｍＴＬＬ−２についての最初の既知の基質としてプロ−リシルオキシダーゼを同定した（Ｕｚｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１  Ｊｕｎ  ２２；２７６（２５）：２２５３７−２２５４３を参照のこと）。
【０２５６】
開示される本発明のＮＯＶ１０Ａ核酸は、トロイド様２様タンパク質をコードしており、配列が表１０Ａにおいて提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含み、これらの塩基のいずれかは、表１０Ａに示される対応する塩基から変更され得るが、トロイド様２様活性および生理学的機能を保持するタンパク質をなおコードする。本発明はさらに、配列がまさに記載された配列に相補的な核酸を含み、この核酸は、まさに記載された任意の核酸に相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学的改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはそれに対する相補体を含む。このような改変としては、非限定的な例示の目的で、改変された塩基、および糖リン酸バックボーンが改変または誘導体化されている核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学安定性を少なくとも部分的に増強するために、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得るように実施される。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、塩基の約１％までが、このように変化され得る。
【０２５７】
開示される本発明のＮＯＶ１０Ａタンパク質は、その配列が表１０Ｂにおいて提供されるトロイド様２様タンパク質を含む。本発明はまた、変異体タンパク質または改変体タンパク質、またはその機能フラグメントを含み、これらの残基のいずれかは、表１０Ｂに示される対応する残基から変更され得るが、そのトロイド様２様活性および生理学的機能を保持するタンパク質をなおコードする。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約３％までが、このように変化され得る。
【０２５８】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する、抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を含む。
【０２５９】
本発明に関する上記の規定された情報によって、このトロイド様２様タンパク質（ＮＯＶ１０Ａ）が、「トロイド様２ファミリー」のメンバーとして機能し得ることが示唆される。従って、本明細書において同定されたＮＯＶ１０Ａ核酸およびタンパク質は、以下に示されるような種々の病理学および障害に関連する潜在的な治療適用（ただしそれらに限定されない）において有用であり得る。本発明について潜在的な治療適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体の標的（治療標的、診断標的、薬剤標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、本明細書に規定される組織および細胞型を含む組織および細胞型全て（ただしこれらに限定されない）のインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２６０】
本発明のＮＯＶｌ０Ａ核酸およびタンパク質は、癌に関連する潜在的な治療適用（以下に示されるような種々の病理学および障害が挙げられるが、これらに限定されない）において有用である。例えば、トロイド様２様タンパク質（ＮＯＶ１０Ａ）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてトロイド様２様タンパク質（ＮＯＶ１０Ａ）は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例の目的で、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：内乾燥症、多発性硬化症、白質萎縮症、疼痛、神経保護、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、癌、外傷、再生（インビトロおよびインビボ）、ウイルス感染／細菌感染／寄生虫感染ならびに他の疾患、障害および状態。
【０２６１】
トロイド様２様タンパク質をコードする本発明のＮＯＶ１０Ａ核酸またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価されるべきである。
【０２６２】
ＮＯＶ１０Ａ核酸およびＮＯＶ１０Ａポリペプチドはさらに、新規なＮＯＶ１０Ａ物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、治療方法または診断方法における使用のために有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。この開示されるＮＯＶ１０Ａタンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されたＮＯＶ１０Ａエピトープは、アミノ酸約１〜３０である。別の実施形態において、ＮＯＶ１０Ａエピトープは、アミノ酸約３００〜３３０である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これが、疾患の病理学の理解において、そして種々の障害のための新しい薬物標的の開発において助けとなる。
【０２６３】
（ＮＯＶ１１）
１６０４ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ１１核酸（ＳＶ１３５００４５３４＿Ａとも呼ばれる）は、新規のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質をコードしており、表１１Ｃに示される。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド６１〜６３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１５４３〜１５４５でのＴＡＧコドンで終止することが同定された。
【０２６４】
【表１１Ａ】
2005502312.tif 000131
公的配列データベースの検索において、第３染色体上に位置するＮＯＶ１１核酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１１６５４７｜ａｃｃ：ＡＦ１１６５４７．１  ｍＲＮＡ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ−関連タンパク質３（ＣＳＡＤ）ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ）に対して、１５１２塩基のうち９８５塩基（６５％）の同一性を有する。
【０２６５】
配列番号３１によりコードされる、開示されるＮＯＶ１１ポリペプチド（配列番号３２）は、４９４アミノ酸残基を有し、そして表１１Ｄにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示される。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ、Ｐｓｏｒｔおよび／またはヒドロパシーの結果は、ＮＯＶ１１がシグナルペプチドを有さず、そして０．６０００の確実度で核に局在されるようであることを予測する。他の実施形態において、このＮＯＶ１１はまた、０．５７２０の確実度で微小体（ペルオキシソーム）に、０．１０００の確実度でミトコンドリアマトリクス腔に、または０．１０００の確実度でリソソーム（内腔）に局在され得る。
【０２６６】
【表１１Ｂ】
2005502312.tif 000132
配列データベースの検索は、ＮＯＶ１１アミノ酸配列が、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）由来の４９３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｑ６４６１１タンパク質（システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＹＳＴＥＩＮＥ  ＳＵＬＦＩＮＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＣＡＲＢＯＸＹＬＡＳＥ）（ＥＣ  ４．１．１．２９）（スルフィノアラニンデカルボキシラーゼ）（システイン−スルフィネートデカルボキシラーゼ（ＣＹＳＴＥＩＮＥ−ＳＵＬＦＩＮＡＴＥ  ＤＥＣＡＲＢＯＸＹＬＡＳＥ）））に対して、４９４アミノ酸残基のうち２９０アミノ酸残基（５８％）の同一性を、そして４９４アミノ酸残基のうち３７６アミノ酸残基（７６％）の類似性を有することを示す。
【０２６７】
開示されるＮＯＶ１１ポリペプチドは、表１１Ｃに列挙されたＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対して相同性を有する。
【０２６８】
【表１１Ｃ】
2005502312.tif 000133
これらの配列と他の配列との間の相同性は、表１１Ｄに示されるＣｌｕｓｔａｌＷ分析で写実的に示される。ＮＯＶ１１タンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントならびに本明細書中の他のＣｌｕｓｔａｌＷ分析の全てにおいて、黒ぬりのアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造的特性または機能的特性を保存するために必要とされ得る領域）を示すのに対して、強調されていないアミノ酸残基は、ほとんど保存されておらず、タンパク質の構造および機能を変化させることなく、潜在的に非常に広範囲に変化され得る。
【０２６９】
【表１１Ｄ】
2005502312.tif 000134
2005502312.tif 000135
表１１Ｅ〜１１Ｆは、ＮＯＶ１１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの記載を列挙する。これは、ＮＯＶ１１の配列が、このドメインを含むことが公知である他のタンパク質の配列に類似する特性を有することを示す。
【０２７０】
【表１１Ｅ】
2005502312.tif 000136
【０２７１】
【表１１Ｆ】
2005502312.tif 000137
システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ）（タウリン生合成における律速酵素）は、タンパク質リン酸化を支持する条件下で活性化され、そしてタンパク質脱リン酸化を支持する条件下で不活化されることが見出された。精製されたＣＳＡＤ内への３２Ｐの直接取り込みは、［γ３２Ｐ］ＡＴＰおよびＰＫＣを用いるがＰＫＡは用いずに立証されている。さらに、ＣＳＡＤの３２Ｐ標識は、ＰＫＣインヒビターによって阻害され、これは、ＰＫＣが、脳でのＣＳＡＤのリン酸化の原因であることを示唆する。オカダ酸は、１０μＭでＣＳＡＤ活性に対して効果を有さず、これは、タンパク質ホスファターゼ−２Ｃ（ＰｒＰ−２Ｃ）がＣＳＡＤの脱リン酸化に関与し得ることを示唆する。さらに、グルタミン酸塩誘導性脱分極または高Ｋ（＋）誘導性脱分極のいずれかが、ＣＳＡＤ活性ならびに神経細胞培養物への３２ＰのＣＳＡＤ内への取り込みを増加させ、これは、ＣＳＡＤ活性が脳でのタンパク質リン酸化により内因的に調節されるという概念を支持することが見出された。神経細胞の興奮、ＣＳＡＤのリン酸化、タウリン生合成の増加に関連するモデルが、提案されている。
【０２７２】
Ｍｅｔ代謝は、ＭｅｔのＡｄｏＭｅｔへの活性化により、そしてメチル基転移−硫黄基転移（ｔｒａｎｓｓｕｌｆｕｒａｔｉｏｎ）経路またはポリアミン生合成経路のいずれかによるＡｄｏＭｅｔの代謝によって、主に生じる。ポリアミン合成の副産物として形成されるＭＴＡが、Ｍｅｔに効率的に再生されるため、このメチル基、およびＭｅｔの硫黄原子の分解は、最終的にメチル基転移−硫黄基転移経路に依存して現れる。一方、Ｍｅｔの４つの炭素鎖の運命（ｆａｔｅ）は、Ｍｅｔ分子の初期の運命に依存して現れる。硫黄基転移中に、炭素鎖は、αケト酪酸として放出され、このαケト酪酸はさらにＣＯ２に代謝される。ポリアミン経路において、Ｍｅｔのカルボキシル炭素は、ｄＡｄｏＭｅｔの形成において失われるが、他の３つの炭素は、ポリアミン誘導体および分解産物として最終的に排出される。Ｍｅｔ代謝のアミノ基転移経路の役割は、完全には立証されていない。Ｃｙｓ（硫黄基転移経路を介するＭｅｔの硫黄、およびセリンの炭素から形成され得る）は、システインスルフィネート経路により最初にタウリンとＣＯ２とに、そして脱硫化経路により最初に硫酸塩とピルビン酸とに変換されるようである。この脱硫化経路において、比較的長い生物学的半減期を有する減少した硫黄形態は、中間体であるようである。ポリアミンに取り込まれるＭｅｔの窒素を除いて、アンモニウム［シスタチオニン（Ｍｅｔ由来）またはシステイン（Ｃｙｓ由来）のいずれかを基質として用いるシスタチオナーゼによって触媒される反応において］として放出されるか、またはケト酸（ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ基転移において）に転移された後に、ＭｅｔまたはＣｙｓの窒素は、尿素に取り込まれる。硫黄を含むアミノ酸代謝の多くの領域が、さらなる研究を必要としている。インタクトな動物においてポリアミン経路を介するＡｄｏＭｅｔ流転（ｆｌｕｘ）の大きさ、およびこの経路に関連する反応の詳細は、まだ確定されていない。アミノ基転移経路を含む交互の（ＡｄｏＭｅｔ−非依存性）Ｍｅｔ代謝の経路および生理学的に可能な役割の両方は、明らかにされねばならない。タウリン中の標的の増大にもかかわらず、Ｃｙｓ代謝の研究は、過去２０年間、比較的活発な領域ではなかった。Ｃｙｓ代謝について報告されたデータにおける明らかな矛盾は、解決される必要がある。さらなる研究は、アミノ酸代謝における肝臓外組織の役割、ならびにＭｅｔおよびＣｙｓの代謝における種々の経路の相対的役割における種差を考慮すべきである。
【０２７３】
免疫細胞化学的方法と電気生理学的方法との両方は、タウリン合成酵素、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ）およびラット海馬のＣＡ１領域におけるタウリンのシナプス後作用の局在が、タウリンがいくつかの海馬ニューロンによる神経伝達物質として使用され得るという仮説と一致するか否かを決定するために使用されている。光学顕微鏡レベルで、ＣＳＡＤ−免疫反応性（ＣＳＡＤ−ＩＲ）は、錐体かご細胞（ｂａｓｋｅｔ  ｃｅｌｌ）ならびに錐体細胞層および放線状層内の周囲の錐体細胞において見出された。電子顕微鏡レベルでは、ＣＳＡＤ−ＩＲは、神経細胞体および樹状突起において最も良く見られ、そして軸索または神経終末においてはむしろ稀であった。インビトロでの海馬切片に対する電気生理学的所見は、錐体ニューロンが、人為的に適用されたタウリン（塩化物イオンの増加したコンダクタンスの大半に依存する阻害を有する）に応答することを、立証した。電気生理学的知見は、タウリンに関する神経伝達物質の役割と一致するが、免疫細胞化学的研究の結果は、神経伝達物質としてタウリンについての比較的重要でない（ｍｉｎｏｒ）役割を示唆する。実際に、免疫細胞化学的所見は、タウリンが、少量の錐体かご介在ニューロンによってのみ神経伝達物質として使用され得、圧倒的多数のＣＳＡＤ−陽性ニューロンが、他の機能に対してタウリンを使用し得ることを示唆した。
【０２７４】
ラット脳でのタウリン生合成に対する３−アセチルピリジン（３−ＡＰ）投与の効果が、研究されている。３−ＡＰを用いた処置は、タウリンおよびその代謝前駆物質、システインスルフィン酸（ＣＳＡ）およびシステイン酸（ＣＡ）の小脳含量、ならびに小脳の分子層での登上線維の選択的分解において有意な減少を誘導した。大脳のシステインジオキシゲナーゼ（システイン由来のＣＳＡ形成を触媒する酵素）の活性は、低いＫｍ値および高いＫｍ値を有する２つの系からなることが見出された。この３−ＡＰが誘導する、低いＫｍ値を有するシステインジオキシゲナーゼ活性の減衰は、小脳においてのみ認められたが、高いＫｍ値を有するシステインジオキシゲナーゼ活性は、小脳でだけでなく、他の脳領域（例えば、延髄、線条および大脳皮質）においても検出された。対照的に、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＤ）の活性における変化は、下記の３−ＡＰ投与を試験したいずれの領域においても観察されなかった。さらに、本質的に、脳において、シスタミンが存在せず、そして非常に活性の低いシステアミンジオキシゲナーゼが存在することが見出された。本結果は、脳内のタウリンが、主にＣＳＡ経路およびＣＡ経路によってシステインから合成され、そして３−ＡＰで処置したラットにおいて観察された小脳のタウリンの減少が、生合成（おそらくシステインジオキシゲナーゼの工程）の減弱に起因し得ることを、示唆する。大脳タウリンの生合成における低いＫｍ値を有するシステインジオキシゲナーゼの調節性の役割の可能性もまた、示唆される。
【０２７５】
７種の哺乳動物の肝抽出物におけるシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ，ＥＣ  ４．１．１．２９）の活性は、大きく変化したが、同種由来の脳抽出物においては、その変化は顕著ではなかった。同種由来の脊髄抽出物（アカゲザルおよびヒト由来の抽出物を除く）におけるＣＳＡＤ活性を、容易に測定した。最も注目すべき所見は、ＣＳＡＤ活性が、７種の哺乳動物全てからの視神経抽出物および坐骨神経抽出物中に完全に存在しないことである。これは、タウリン生合成が軸索内で起こらないこと、およびその軸索内タウリンが、細胞体からの軸索輸送によって供給されていることを示唆する。
【０２７６】
タウリン、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ（ＣＳＡＤ）、グルタメート、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、胎児のアカゲザルおよび新生子アカゲザルの後頭葉から調製された亜細胞成分画分において測定された。さらに、亜細胞成分画分中の［３５Ｓ］タウリンの分布は、母親を通して胎児へ、誕生前の母親への投与を通して新生児へ、そして、誕生後種々の時点で新生児に直接投与した後に決定された。ＣＳＡＤ、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、およびＧＡＤ全てが、初期の胎児生活（ｌｉｆｅ）においては低いかまたは測定し得ず、後期の胎児生活と初期の新生児生活の間では母親において検出された値に至るまでの増加が見られた。タウリンは、初期の胎児生活において大量に存在し、そして新生児生活中にゆっくりと減少し、１５０日齢後までに母親において検出された量に到達した。顕著な量のタウリン、ＣＳＡＤ、ＧＡＢＡ、およびＧＡＤは、いくつかの指標（これらの小器官において見出される脳タウリンの割合が発達中に増加する）を有する神経終末成分に関係していた。亜細胞のタウリンのプール全てが、外因的に投与された［３５Ｓ］タウリンによって迅速に標識された。測定された成分全ての亜細胞分布は、神経伝達物質、またはグルタミン酸、ＧＡＢＡ、およびタウリンの推定の神経伝達物質機能に匹敵した。大量の、これら３つのアミノ酸は、このような機能に必要とされる量を超える。過剰のグルタミン酸およびＧＡＢＡは、エネルギーの供給源として使用され得る。過剰のタウリンの機能は、未だに明らかではないが、状況的な証拠は、ＣＮＳの発達および成熟における重要な役割を示す。
【０２７７】
開示される本発明のＮＯＶ１１核酸は、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質をコードしており、その配列が表１１Ａにおいて提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、変異体核酸または改変体核酸、またはこのような核酸のフラグメントを含み、これらの塩基のいずれかは、表１１Ａに示される対応する塩基から変更され得るが、そのシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様活性および生理学的機能を保持するタンパク質をなおコードする。本発明はさらに、配列がまさに記載されたこれらの配列に相補的な核酸を含み、この核酸は、まさに記載された任意の核酸に相補的である核酸フラグメントを含む。本発明はさらに、その構造が化学的改変を含む、核酸または核酸フラグメント、あるいはそれに対する相補体を含む。このような改変としては、非限定的な例示の目的で、改変された塩基、および糖リン酸バックボーンが改変または誘導体化されている核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化学安定性を少なくとも部分的に増強するために、例えば、被験体での治療適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得るように実施される。変異体核酸または改変体核酸、およびそれらの相補体において、塩基の約３５％までが、このように変化され得る。
【０２７８】
開示される本発明のＮＯＶ１１タンパク質は、その配列が表１１Ｂにおいて提供されるシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質を含む。本発明はまた、変異体タンパク質または改変体タンパク質、またはその機能フラグメントを含み、これらの残基のいずれかは、表１１Ｂに示される対応する残基から変更され得るが、そのシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様活性および生理学的機能を保持するタンパク質をなおコードする。変異体タンパク質または改変体タンパク質において、残基の約４２％までが、このように変化され得る。
【０２７９】
本発明はさらに、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する、抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を含む。
【０２８０】
本発明に関する上記の規定された情報によって、このシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ１１）が、「システインスルフィン酸デカルボキシラーゼファミリー」のメンバーとして機能し得ることが示唆される。従って、本明細書において同定されたＮＯＶ１１核酸およびタンパク質は、以下に示されるような種々の病理学および障害に関連する潜在的な治療適用（ただしそれらに限定されない）において有用であり得る。本発明について潜在的な治療適用としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンパク質治療剤、低分子薬物標的、抗体の標的（治療標的、診断標的、薬剤標的化／細胞傷害性抗体）、診断マーカーおよび／または予後マーカー、遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子切除）、検索ツール、本明細書に規定される組織および細胞型を含む組織および細胞型（ただしこれらに限定されない）全てのインビボおよびインビトロでの組織再生。
【０２８１】
本発明のＮＯＶ１１核酸およびタンパク質は、癌に関連する潜在的な治療適用（以下に示されるような種々の病理学および障害が挙げられるが、これらに限定されない）において有用である。例えば、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ１１）をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質（ＮＯＶ１１）は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。非限定的な例の目的で、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に効力を有する：副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、糖尿病、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、膵炎、肥満、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下不全、受胎能、癌（例えば、膵臓、骨、結腸、脳、肺、乳房、または前立腺において発生する癌）、子宮内膜症、口内乾燥症、強皮症、高カルシウム血症、潰瘍、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群、肝硬変、移植、炎症性腸疾患、憩室性疾患、ヒルシュスプルング病、クローン病、虫垂炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、動脈炎、強直性脊椎炎、側弯関節炎、フォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）症候群における腱炎、アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性麻痺、てんかん、レッシュ−ナイハン症候群、多発性硬化症、毛細血管拡張性運動失調、白質萎縮症、行動障害、嗜癖、不安、疼痛、内分泌系機能不全、糖尿病、肥満、成長および再生障害の多発性硬化症、白質萎縮症、疼痛、重症筋無力症、疼痛、全身性エリテマトーデス、自己免疫疾患、喘息、気腫、強皮症、アレルギー、ＡＲＤＳ、乾癬、光線角化症、結節硬化症、アクネ（Ａｃｎｅ）、発毛、脱毛症、色素沈着障害、腎動脈狭窄、間質性腎炎、糸球体腎炎、多発性嚢胞腎疾患、全身性エリテマトーデス、尿細管性アシドーシス、ＩｇＡ腎症、高カルシウム血症、レッシュ−ナイハン症候群ならびに他の疾患、障害および状態など。本発明のシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ様タンパク質をコードするＮＯＶ１１核酸またはそのフラグメントはさらに、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価されるべきである。
【０２８２】
ＮＯＶ１１核酸およびＮＯＶ１１ポリペプチドはさらに、新規なＮＯＶ１１物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、治療方法または診断方法における使用のために有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の項に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って生成され得る。この開示されるＮＯＶ１１タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、企図されたＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約２５〜５０である。別の実施形態において、ＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約１００〜１４０である。さらなる特定の実施形態において、ＮＯＶ１１エピトープは、アミノ酸約１４０〜１７０、アミノ酸約２３５〜２６０、そしてアミノ酸約３００〜３２０である。これらの新規なタンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これが、疾患の病理学の理解において、そして種々の障害のための新しい薬物標的の開発において助けとなる。
【０２８３】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子に関する。また、ＮＯＶＸをコードする核酸（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、ならびにＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントは、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡで構成される。
【０２８４】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロプロテイン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとしては、非限定的な例示の目的で、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これらは、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。産物「成熟」形態は、また非限定的な例示の目的で、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程（これらが、この遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る場合）の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態を導くこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、あるいはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基１がＮ末端メチオニンである場合）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残る残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜残基Ｍ）が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解切断事象以外の、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例示の目的で、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらの任意の組み合わせの操作から生じ得る。
【０２８５】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一の核酸配列、類似の核酸配列または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより長さの短いオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ技術、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を有するように設計され得る。
【０２８６】
本明細書中で用いられる場合、用語「単離された」核酸分子は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）に天然に隣接する配列がない。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含む。さらに、ｃＤＮＡのような「単離された」核酸分子は、組換え技術により生成された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、またはこの核酸分子が化学的に合成された場合、化学的前駆体または多の化学物質を実質的に含まない。
【０２８７】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３、またはこの前述のヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３の核酸配列の全部または一部を用いて、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ら、（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３に記載される）。
【０２８８】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または代わりにゲノムＤＮＡを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ得、ＤＮＡ配列分析により特徴付けられる。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて、調製され得る。
【０２８９】
本明細書中で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用されるヌクレオチド塩基の十分な数を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはこれらの配列から設計され得、特定の細胞もしくは組織中の同一の、類似の、または相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅、確認またはこれらの存在を明らかにするために用いられ得る。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは、約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する、核酸配列の一部を含む。本発明の１つの実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３、またはその相補体のさらに少なくとも６つの連続するヌクレオチドをさらに含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、プローブとしても用いられ得る。
【０２９０】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３、またはこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３に示されるヌクレオチド配列に十分相補的なものであり、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるヌクレオチド配列に対してほとんどまたは全くミスマッチなく水素結合して、安定な二重鎖を形成する。
【０２９１】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワトソンクリック塩基対形成またはフーグスティーン塩基対形成をいい、用語「結合」は、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連ポリペプチドもしくは化合物、またはそれらの組み合わせの間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合としては、イオン結合、非イオン結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じて生じ得るか、またはこの効果に起因し得る。直接的結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を通じて、またはこの効果に起因して生じない相互作用をいうが、代わりに、他の実質的な化学的中間体がない。
【０２９２】
本明細書中で提供されるフラグメントは、核酸の場合は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするに十分な長さ、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的認識を可能にするに十分な長さの、少なくとも６つの（連続する）核酸または少なくとも４つの（連続する）アミノ酸の配列としてそれぞれ規定され、このフラグメントは、全長配列より短い、多くていくつかの部分である。フラグメントは、選択された核酸またはアミノ酸の任意の連続する一部分から得られ得る。誘導体は、直接的に、または改変もしくは部分的置換のいずれかによりネイティブの化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、特定の成分または側鎖に関してネイティブの化合物とは異なる以外は、ネイティブの化合物に類似であるが、同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成であり得るか、または異なる進化起源に由来し得、野生型と比較して、類似もしくは逆の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０２９３】
誘導体およびアナログは、以下に記載されるように、誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長であってもよいし、全長以外のものでもよい。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々の実施形態において、同一のサイズの核酸配列またはアミノ酸配列に対して、または整列された配列と比較した場合（ここでこのアラインメントは、当該分野で公知のコンピューター相同性プログラムにより行われ、またはそのコード核酸は、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低いストリンジェントな条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％同一（好ましくは８０〜９５％同一）の本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同な領域を含む分子。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３、および以下を参照のこと。
【０２９４】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」あるいはそのバリエーションとは、上記で議論したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで相同性により特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によりコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物種が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子バリエーション、および本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の変異が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含む。相同な核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３における保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）ならびにＮＯＶＸの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするそれらの核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性が以下に記載される。
【０２９５】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンにより途切れない。完全タンパク質のコード配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の１つで終わる。本発明の目的に関して、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方があるか、またはこれらがないコード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質をコードするための良好な候補と考えられるＯＲＦについては、最小のサイズ要件は、しばしば、例えば、５０以上のアミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチとして設定される。
【０２９６】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細胞型における（例えば、他の組織から）ＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物からのＮＯＶＸホモログの同定および／またはクローニングにおける使用のために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３の天然に存在する変異体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの領域を含む。
【０２９７】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために用いられ得る。種々の実施形態において、このプローブは、これらに結合する標識基をさらに含み得る（例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を間違って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体からの細胞のサンプルにおけるＮＯＶＸコード核酸のレベルを測定する（例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡレベルを検出するか、ゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているか、または欠失しているか否かを決定する）ことにより用いられ得る。
【０２９８】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、用量依存性であってもそうでなくても、特定の生物学的アッセイにおいて測定される、本発明のポリペプチドの活性に類似するが、この活性に必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸ生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３の一部分を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現により）発現し、ＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価するすることにより、調製され得る。
【０２９９】
（ＮＯＶＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０３００】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、このＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつこのＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０３０１】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０３０２】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたまま残る条件を記載することを意図する。
【０３０３】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０３０４】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより低く、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）については、少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては、少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０３０５】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたまま残るような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、これは続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０３０６】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０３０７】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるような条件）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０３０８】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることを、当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０３０９】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、２６、２８、４０、４２および４４に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に対して少なくとも約９５％相同である。
【０３１０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失が、このコードされるタンパク質に導入される。
【０３１１】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０３１２】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表す）。
【０３１３】
１つの実施形態では、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのリガンドとの間の複合体形成；または（ｉｉｉ）変異体ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０３１４】
なお別の実施形態において、変異体ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０３１５】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＮＯＶＸコード鎖の全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２もしくは４４のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０３１６】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０３１７】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０３１８】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイド（シュード）ウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０３１９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０３２０】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、これらの鎖は、互いに平行に延びる（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０３２１】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０３２２】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０３２３】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０３２４】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０３２５】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）による遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０３２６】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（例えば、Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０３２７】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする因子。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０３２８】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０３２９】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０３３０】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０３３１】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を（乾燥重量にて）約３０％未満、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０３３２】
用語「化学前駆体も他の化学物質も実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体からも他の化学物質から分も離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０３３３】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０３３４】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０３３５】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０３３６】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、その分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０３３７】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ生成ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０３３８】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０３３９】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２または４４）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一かまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質の全てまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０３４０】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０３４１】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０３４２】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製するらめに用いられ得、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０３４３】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または付着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得、このフラグメントは、次いで、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合成分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０３４４】
（ＮＯＶＸのアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の活性の１つ以上を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０３４５】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする全ての配列の供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０３４６】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０３４７】
点変異または短縮化により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０３４８】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体もまた本発明に含まれる。用語「抗体」とは、本明細書において用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応）する抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに関する言及を包含する。
【０３４９】
本発明の単離されたＮＯＶＸ関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフラグメントとして機能することが意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質と、またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを包含する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域である；通常これらは親水性領域である。
【０３５０】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、ＮＯＶＸ関連タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸ関連タンパク質配列の疎水性分析によって、ＮＯＶＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体産生を標的するのに有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体産生を標的するための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、その各々がその全体において本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体もまた、本明細書中で提供される。
【０３５１】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０３５２】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０３５３】
（ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０３５４】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０３５５】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の唯一の分子種を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、この集団の全ての分子に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０３５６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０３５７】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、ヒト起源の細胞が所望される場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または、非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０３５８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感な細胞株である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０３５９】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０３６０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手順によって、クローンをサブクローニングし得、そして標準的な方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０３６１】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０３６２】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域の代りに用いられ得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代りに用いられ得、キメラの二価抗体を作製する。
【０３６３】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトへの投与に適切である。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。これらの内で、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのフレームワーク領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０３６４】
（ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の本質的に配列全体がヒト遺伝子から生じる抗体分子に関する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「完全なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得、そしてヒトハイブリドーマを使用することによってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのエプスタイン−バーウイルスを用いたヒトＢ細胞の形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０３６５】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察され、このことはすべての点（遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されることに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、そしてＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０３６６】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答する動物の内因性抗体よりも完全なヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非ヒト宿主における重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は、無能力にされ、そしてヒトの重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードする活性な座位が、宿主のゲノムに挿入される。例えば、ヒト遺伝子は、不可欠なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、改変の完全な相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、そしてＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収および発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０３６７】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例示される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：座位の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖座位の転写物の形成を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖座位由来のＪセグメント遺伝子を欠失する工程（この欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的化ベクターによってもたらされる）；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作製する工程。
【０３６８】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞を融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０３６９】
この手順に関するさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定するための方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択するための相関する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０３７０】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が、適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために方法が適合され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いる抗体分子の処理によって産生されるＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０３７１】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体）である。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットである。
【０３７２】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここで２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０３７３】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合物は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０３７４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一または同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加させるための機構を提供する。
【０３７５】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を生成するための技術は、文献に記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントは、隣接するジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウム（ｃｏｍＲｈｏ−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の存在下で還元される。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そして等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０３７６】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの指向性化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０３７７】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成できないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０３７８】
２より多くの結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０３７９】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＢ７）、またはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の誘発分子に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するように使用され得る。これらの抗体は、抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載されるタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０３８０】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用して調製され得ることが企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示される試薬が挙げられる。
【０３８１】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望まれ得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。このように作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーション能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は二重のＦｃ領域を有するように操作され得、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０３８２】
（免疫結合体）
本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤）に結合体化した抗体、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）に結合化した抗体、または放射性同位体に結合体化した抗体（すなわち、放射性結合体）を含む免疫結合体に関する。
【０３８３】
このような免疫接合体の作製において有用な化学療法剤は、上記される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合体化抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０３８４】
抗体と細胞傷害性因子との結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０３８５】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター結合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない結合体が循環から除去され、次いで、次に細胞傷害性因子に結合体化させた「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０３８６】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体をスクリーニングする方法は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介される技術を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本願明細書に提供される。
【０３８７】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する際の使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０３８８】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えば、親和性クロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチドの精製、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられ、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３８９】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価な機能を果たすウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことが意図される。
【０３９０】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列（これは発現される核酸配列に作動可能に連結される）を含むこと意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロの転写／翻訳系または宿主細胞において）可能にするような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０３９１】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０３９２】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０３９３】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０３９４】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０３９５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０３９６】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０３９７】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０３９８】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０３９９】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。
【０４００】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０４０１】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合の用語の範囲内に含まれる。
【０４０２】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０４０３】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０４０４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０４０５】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０４０６】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物（ここで外因性のＮＯＶＸ配列が、それらのゲノムに導入されている）または相同組換え動物（ここで内因性のＮＯＶＸ配列が変更されている）を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質の活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存し、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされる遺伝子産物の発現を指向する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＮＯＶＸ遺伝子は、動物の発生の前に、この内因性の遺伝子と、動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０４０７】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に導入し（例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって）、そしてこの卵母細胞を偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発生させることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヒトＮＯＶＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトＮＯＶＸ  ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上述にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向するために、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結される。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の産生のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物へと繁殖され得る。
【０４０８】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＮＯＶＸ遺伝子が変更（例えば、機能的に破壊）されている、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０４０９】
あるいは、このベクターは、相同組換えの際に、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、さもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計される（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。
【０４１０】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  １１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。それらの生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、この相同組換えＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０４１１】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０４１２】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルから出し、そしてＧ０期に入らせ得る。次いで、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物由来の、除核された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構築された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移入される。この雌性フォスター動物の産生子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０４１３】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で「活性化合物」といわれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは賦形剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対する、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。この活性化合物と不適合性である任意の従来の媒体または薬剤の範囲を除いて、組成物におけるその使用は、企図される。補助的な活性化合物はまた、この組成物に組み込まれ得る。
【０４１４】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合可能に処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口投与（例えば、吸入）、経皮的投与（すなわち、局所的）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌賦形剤（注射のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌性剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、アセテート、シトラートまたはホスフェート）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入され得る。
【０４１５】
注射使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能な溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性でなくてはならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなくてはならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒体であり得る：例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散に関しては、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０４１６】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質あるいは抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中に、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒体および上記で列挙される成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分および予め滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０４１７】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０４１８】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０４１９】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０４２０】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０４２１】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０４２２】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する当該分野に固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０４２３】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０４２４】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書とともに、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０４２５】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに記載されるように、ＮＯＶＸタンパク質を発現させるため（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞における組換え発現ベクターを介して）、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおける）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出するため、およびＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生またはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少された活性もしくは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴づけられる障害（例えば、糖尿病（インスリン放出を調節する）；肥満（脂質に結合しかつそれを輸送する）；肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘおよび食欲不振、慢性疾患および種々の癌に関連する消耗障害、ならびに感染症（抗菌活性を有する）および種々の異脂肪血症）を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面において、本発明は、ポジティブな様式およびネガティブな様式の両方で、食欲、栄養素の吸収および代謝基質の性質に影響を与える方法にて使用され得る。
【０４２６】
本発明は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤および上記される処置のためのそれらの使用に関する。
【０４２７】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質発現またはＮＯＶＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または候補薬剤、あるいは試験化合物または試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【０４２８】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと。
【０４２９】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、糖質、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０４３０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０４３１】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において示され得る。
【０４３２】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、その結果、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対するこの試験化合物の結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数によってか、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定することを包含する。
【０４３３】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはＮＯＶＸ標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞の表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０４３４】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはＮＯＶＸ標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはＮＯＶＸ標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０４３５】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質へのこの試験化合物の結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に相互作用する能力を決定することを包含する。
【０４３６】
さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、適切な基質に対するこの標的分子の触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０４３７】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはＮＯＶＸ標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０４３８】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０４３９】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進すること、およびそのアッセイに自動化に適用させることが、望ましくあり得る。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に導く条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０４４０】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を利用して、固定され得る。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子は、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、その標的分子へのＮＯＶＸタンパク質の結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する、酵素結合アッセイが挙げられる。
【０４４１】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０４４２】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸに結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの伝搬に関与するようである。
【０４４３】
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「餌」および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０４４４】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な因子および本明細書中に記載されるような処置のためのこの因子の使用に関する。
【０４４５】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得るが、これに限定されない。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０４４６】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＮＯＶＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０４４７】
簡潔には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０４４８】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないが（それらは特定の酵素を失うので）、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマッピングすることが可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０４４９】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０４５０】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、紡錘体を破壊するコルセミドのような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０４５１】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位をマークするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは、複数部位および／または複数染色体をマークするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交差ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０４５２】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０４５３】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０４５４】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限酵素断片長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０４５５】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０４５６】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体からおよび組織からこのような識別配列を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む一塩基多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０４５７】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００個のプライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０４５８】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患しているかどうか、あるいは障害を発症する危険性があるかどうかを決定する。この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々のガンと関連する消耗疾患が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症する危険性があるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置し得る。
【０４５９】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的因子を選択する（本明細書において「薬物ゲノム学」とよばれる）。薬物ゲノム学は、個体の遺伝子型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基づいて個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０４６０】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０４６１】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０４６２】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸのタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１および４３の核酸）またはそれらの一部（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０４６３】
ＮＯＶＸのタンパク質を検出するための薬剤は、ＮＯＶＸのタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンを用いたＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０４６４】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０４６５】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０４６６】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプル中のＮＯＶＸの量を、標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０４６７】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０４６８】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための薬剤で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０４６９】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０４７０】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０４７１】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法、およびその後の当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０４７２】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０４７３】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。簡潔には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによって、特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０４７４】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた企図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらの診断アッセイには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が挙げられる。
【０４７５】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０４７６】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する。例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０４７７】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る。例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受性であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０４７８】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０４７９】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみ、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多数の異なる変異にハイブリダイズされる。
【０４８０】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端に、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端での完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０４８１】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０４８２】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０４８３】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の効果を有する因子、すなわちモジュレーターは、障害を（予防的または治療的に）処置されるべき個体に投与され得る（この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患が挙げられる）。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０４８４】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０４８５】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないこと、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の分子基準は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０４８６】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０４８７】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験に適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するか、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートすることが決定された、因子の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートすることが決定された、因子の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、減少したタンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子の発現または活性が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０４８８】
例えば、ＮＯＶＸ活性を調節する因子（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される遺伝子（ＮＯＶＸを含む）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この因子に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０４８９】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおける、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、この因子の投与の増加は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加すること（すなわち、この因子の効力を増加すること）が望ましくあり得る。あるいは、この因子投与の減少は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少すること（すなわち、この因子の効力を減少すること）が望ましくあり得る。
【０４９０】
（処置方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。この障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０４９１】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０４９２】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０４９３】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０４９４】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、およびその後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０４９５】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険性がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防因子の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト因子またはＮＯＶＸアンタゴニスト因子が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な因子は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０４９６】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する因子と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低下したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補完するための治療として、投与する工程を包含する。
【０４９７】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、子癇前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０４９８】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０４９９】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０５００】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する潜在的予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患。
【０５０１】
例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪血症。
【０５０２】
本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にも有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途である（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。
【０５０３】
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に記載する。この実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定しない。
【０５０４】
（実施例）
（実施例１．ＮＯＶＸクローンの同定）
本発明で同定した新規のＮＯＶＸ標的配列を、配列を確認するためにエキソン連結プロセスに供した。ＰＣＲプライマーを、順方向プライマーについては入手可能な最も上流の配列で、そして逆方向プライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始するように設計した。表１６Ａは、種々のクローンを得るために使用したＰＣＲプライマーの配列を示す。それぞれの場合について、固有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで、または逆方向プライマーの場合には終止コドンに達するまで、コード配列に向ってそれぞれの末端から内側にウォーキングすることによって、配列を試験した。このようなプライマーを、標的配列の全長のｃＤＮＡ、ＤＮＡの一部（１つ以上のエキソン）またはタンパク質配列についてのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）予測に基づいてか、または他の種由来の密接に関連するヒト配列に対する推定エキソンの翻訳された相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づいてＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児の脳、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、心臓、腎臓、リンパ腫−Ｒａｊｉ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高い縮重性について配列決定した。エキソンの連結によって導いたＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローン化した完全なオープンリーディングフレームを包含している挿入物を有する。表１６Ｂは、これらの細菌クローンの列挙を示す。全てのクローンから得られた配列を、それ自体とともに、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベース中の他のフラグメントとともに、そして公のＥＳＴとともにまとめた。集合の別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含めた。さらに、配列のトレースを手動で評価し、そして適切である場合には修正を施した。これらの手順によって本明細書中に報告する配列を提供する。
【０５０５】
【表１２Ａ】
2005502312.tif 000138
物理的クローン：エキソンを相同性によって推定し、そしてイントロン／エキソンの境界を標準的な遺伝子規則を使用して決定した。エキソンを複数のＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびいくつかの場合には、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを使用する類似性の決定手段によって、さらに選択し、そして精緻化した。利用可能な場合、公のデータベースおよび独自データベースの両方からの発現配列もまた加え、こらの遺伝子配列をさらに定義しそして完全なものとした。次いで、ＤＮＡ配列を、明らかな不一致について手動で補正し、それによって、全長タンパク質をコードする配列を得た。
【０５０６】
【表１２Ｂ】
2005502312.tif 000139
（実施例２．種々の細胞および組織中でのクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、種々の正常および病理状態由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有しているマイクロタイタープレートを使用し、実時間定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を使用して評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって実施した。サンプルの種々のコレクションをプレート上に組み立て、そしてパネル１（正常組織および癌細胞株を含む）、パネル２（正常供給源および癌供給源由来の組織から誘導されたサンプルを含む）、パネル３（癌細胞株を含む）、パネル４（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症状態に関連する細胞を含む）、パネル５Ｄ／５Ｉ（代謝疾患に対する重要性を有するヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ＿包括的＿パネル（正常組織および自己炎症疾患由来のサンプルを含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常脳および疾患性の脳由来のサンプルを含む）およびＣＮＳ＿神経変性＿パネル（正常脳およびアルツハイマー疾患性の脳由来のサンプルを含む）と称する。
【０５０７】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性を、ガイド（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）として２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度を使用する、アガロースゲル電気泳動による目視評価、および分解産物の指標である低分子量ＲＮＡの非存在によって、品質について制御する。単一エキソンの長さを横切って増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを使用する、逆転写酵素の非存在下で行うＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、サンプルを、ゲノムＤＮＡ混入に対して制御する。
【０５０８】
最初に、ＲＮＡサンプルを、参照核酸（例えば、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ））に対して正規化した。正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに変換し、そしてＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用し、製造業者の説明書に従って、ＲＴＱ−ＰＣＲによって分析した。
【０５０９】
他の場合において、正規化していないＲＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号１８０６４−１４７）およびランダムヘキサマーを使用して、一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に変換した。１０μｇまでの全ＲＮＡを含有する反応を、２０μｌの容量で行い、そして６０分間４２℃にてインキュベートした。この反応は、１００μｌの最終容量において５０μｇまでの全ＲＮＡにまでスケールアップされ得る。次いで、ｓｓｃＤＮＡサンプルを、製造業者の指示書に従って、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、以前に記載されたような参照核酸に対して正規化する。
【０５１０】
プローブおよびプライマーを、入力として標的配列を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用バージョンＩ）または同様のアルゴリズムに従って、それぞれのアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そして以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さず、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよびプライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、ＨＰＬＣによって二重精製して、カップリングされなかった色素を除去し、そしてプローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーターおよびクエンチャー色素のカップリングを確認するために、質量スペクトル分析によって評価した。それらの最終濃度は、順方向プライマーおよび逆方向プライマーについては、それぞれ９００ｎＭであり、そしてプローブについては、２００ｎＭであった。
【０５１１】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡサンプルを用いて研究する場合、各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。ＰＣＲ混液は、単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または２つの多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）プローブおよびプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブと多重化する別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含有した。ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３１３８０３）を使用して、製造業者の指示書に従って設定した。逆転写を、４８℃で３０分間行い、続いて、以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを超えるサイクル）としてｌｏｇスケールを使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分を、２のΔＣＴ乗として表す。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そして１００を乗算することによって得る。
【０５１２】
ｓｓｃＤＮＡサンプルを用いて研究する場合、正規化したｓｓｃＤＮＡを、ＲＮＡサンプルについて先に記載したように使用した。１セットまたは２セットのプローブおよびプライマーを含むＰＣＲ反応を、１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を使用して、製造業者の指示書に従って、先に記載したように設定した。ＰＣＲ増幅を、以下のように行った：９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。結果を、先に記載したように分析および評価した。
【０５１３】
（パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄ）
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄのプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。これらのパネルのサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。これらの細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。これらのパネルにおいて使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養される。これらのパネルにおいて見出される正常組織は、１人の成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０５１４】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄの結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞変異株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０５１５】
（一般＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４））
パネル１．４のプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４個のウェルを含む。パネル１．４のサンプルは、２つのクラスに分類される：培養細胞株由来のサンプルおよび初代正常細胞由来のサンプル。この細胞株は、以下の型の癌に由来する：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル１．４において使用される細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（培養細胞株の寄託機関）から広く利用可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を使用して培養される。パネル１．４において見出された正常組織は、２〜５人の異なる成人個体または胎児の全ての主要な器官系由来のサンプルのプールから構成される。これらのサンプルは、以下の器官由来である：成人の骨格筋、胎児の骨格筋、成人の心臓、胎児の心臓、成人の腎臓、胎児の腎臓、成人の肝臓、胎児の肝臓、成人の肺、胎児の肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、胸部、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについて記載される通りである。
【０５１６】
（パネル２Ｄおよび２．２）
パネル２Ｄおよび２．２のプレートは、一般的には、２個のコントロールのウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。これは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との緊密な共同研究において、外科医の作業によって入手したヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「ぴったり沿った境界（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常な隣接組織と呼び、そして以下の結果には「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「ぴったり沿った境界」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もともとの外科の病理報告を含む。これは、患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらのぴったり沿った境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣接している）組織（表ＲＲにおいては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と示す）から採取する。さらに、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然死の被害者（事故など）について行った剖検による種々のヒト組織から得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認し、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０５１７】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルから構成される。詳細には、これらのサンプルのうちの９２個は、培養されたヒトの癌細胞株に由来し、２個のサンプルはヒトの初代小脳組織であり、そして２個はコントロールである。ヒトの細胞株は、一般的には、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手され、そして以下の組織グループに分かれる：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚癌、胃癌、結腸癌、肺癌およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞の全てを、標準的な推奨される条件下で培養し、そして標準的な手順を使用してＲＮＡを抽出した。パネル３Ｄおよび１．３Ｄの細胞株は、科学技術文献において使用される最も一般的な細胞株である。
【０５１８】
（パネル４Ｄ、４Ｒ、および４．１Ｄ）
パネル４は、９６ウェルプレート（２個のコントロールのウェル、９４個の試験サンプル）上にサンプルを含む。これは、炎症状態に関連している種々のヒトの細胞株または組織から単離したＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ／４．１Ｄ）を含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織に由来する総ＲＮＡを使用した。肝硬変患者由来の肝臓組織および狼瘡患者由来の腎臓に由来する総ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者からのＲＮＡの調製のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０５１９】
星状細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮細胞、気管支上皮細胞、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒトの肺大動脈の内皮細胞、ヒトの臍帯静脈の内皮細胞を、全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型に供給される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、示すように、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて６時間および／または１２〜１４時間の間、活性化した。以下のサイトカインを使用した：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、時折、０．１％の血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基底培地中での培養によって種々の時間枯渇させた。
【０５２０】
単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌを使用して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液から調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびインターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）２中での４〜６日間の培養によってこれらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで、６時間活性化した。いくつかの場合には、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウ有糸分裂促進剤）を含有する、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、４〜５日間培養した。ＲＮＡの調製のために、サンプルを２４、４８、および７２時間で採取した。ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを、２人のドナーからの採血、Ｆｉｃｏｌｌを使用する単核細胞の単離、および単離した単核細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中において約２×１０６個の細胞／ｍｌの最終濃度で１：１にて混合することによって得た。このＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡの調製のために、サンプルを１〜７日までの範囲の種々の時点で採取した。
【０５２１】
単球を、製造業者の説明書に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ  ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ  ５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％のＡＢヒト血清、または約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージ、および樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカリド（ＬＰＳ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０５２２】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、およびＮＫ細胞をまた、製造業者の説明書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを使用して単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡリンパ球およびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を使用してＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞、およびＣＤ１９細胞の単核細胞を除去することによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを使用してＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離し、残りの細胞はＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４、およびＣＤ８のリンパ球を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れ、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）で一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間および２４時間後、細胞をＲＮＡの調製のために回収した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコーティングしたプレート上で４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いで細胞を回収して、それらをＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中で拡大させた。次いで、拡大させたＣＤ８細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で４日間再度活性化し、そして前述のように拡大させた。ＲＮＡを２回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびに２回目の培養物の拡大の４日後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＩＬ−２中でＲＮＡを調製する前に４〜６日間培養した。
【０５２３】
Ｂ細胞を得るために、扁桃をＮＤＲＩによって獲得した。扁桃を、滅菌した解剖用の鋏で切断し、次いで篩に通過させた。次いで、扁桃体の細胞をスピンダウンさせ、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、５μｇ／ｍｌでＰＷＭ、または約１０μｇ／ｍｌで抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌでＩＬ−４を使用した。細胞をＲＮＡの調製のために、２４、４８、および７２時間で回収した。
【０５２４】
１次および２次のＴｈ１／Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞を調製するために、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０５〜１０６個の細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を、Ｔｈ１に指向させるために使用し、一方で、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）をＴｈ２に指向させるために使用し、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０をＴｒ１に指向させるために使用した。４〜５日後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球、およびＴｒ１リンパ球をＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間拡大させた。この後、活性化させたＴｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインを用いて、しかしアポトーシスを防ぐために抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の添加と共に５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで再びＩＬ−２を用いて４〜７日間拡大させた。活性化させたＴｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を、最大３回のサイクルまで、この方法で維持した。ＲＮＡを、プレートに結合させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂでの２回目および３回目の活性化の６時間および２４時間後、ならびにインターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）２中での２回目および３回目の拡大培養の４日目に、１次および２次のＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１から調製した。
【０５２５】
以下の白血球細胞株をＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、５×１０５個の細胞／ｍｌの０．１ｍＭのｄｂｃＡＭＰ中での８日間の培養、３日毎の培地の交換、および５×１０５個の細胞／ｍｌの細胞濃度への調節によってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、（ＡＴＣＣによって推奨されるように）ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した。ＲＮＡを、休止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化した細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまたＡＴＣＣから入手した。両方を、ＤＭＥＭ  ５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５．５×１０−５Ｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０５２６】
これらの細胞株および血液細胞について、約１０７個の細胞／ｍｌをトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して溶解させることによってＲＮＡを調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分後、チューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４回転装置で１４，０００ｒｐｍで回転させた。水相を採取し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃で一晩静置した。沈殿させたＲＮＡをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４回転装置中で９，０００ｒｐｍで１５分間スピンダウンさせ、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再度溶解させ、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎおよび８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。チューブを、混入しているゲノムＤＮＡを除去するために３７℃で３０分間インキュベートし、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２倍容量の１００％エタノールで再度沈殿させた。ＲＮＡをスピンダウンさせ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０５２７】
（ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０）
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールのウェルおよび８９個の試験サンプルを含む。これは、Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した外科的な死後のヒト組織から単離されたｃＤＮＡを含む。総ＲＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの施設にあるＢａｃｋｕｓ病院からの組織サンプルから抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０５２８】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Ｂａｃｋｕｓ病院で全ての膝または股関節部の置換手術を経験した患者から入手した。組織サンプルを、単離されたＲＮＡが最適な量で、分解されないことを確実にするように液体窒素中で瞬時に冷凍した。変形性関節症および慢性関節リウマチの関節組織のさらなるサンプルを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。正常なコントロール組織が、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓによって供給され、そして外傷犠牲者の剖検の間に得られた。
【０５２９】
乾癬組織の外科検体および隣接一致組織がＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって総ＲＮＡとして提供された。二人の男性患者および二人の女性患者が、２５歳と４７歳の間で選択された。その患者の誰もサンプルが単離された時に薬剤を処方されていない。
【０５３０】
潰瘍性大腸炎およびクローン病に罹患した患者由来の病変した結腸の外科検体および隣接一致組織を、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。４１歳〜６９歳の三人の女性クローン病患者および３人の男性クローン病患者由来の腸組織を使用した。他の患者がデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを摂取する一方、二人の患者は、処方箋を必要とする薬を摂取しなかった。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性患者および四人の女性患者由来である。その患者のうちの四人は、レブビド（ｌｅｂｖｉｄ）を摂取し、二人は、フェノバルビタールを摂取した。
【０５３１】
疾患または気腫、喘息またはＣＯＰＤに冒されていない外傷犠牲者からの死後の肺組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。４０歳〜７０歳の範囲の気腫患者および全ては、喫煙者であり、この年齢範囲を、タバコ関連肺気腫の患者に焦点を当て、そしてα−１抗トリプシン欠乏の患者を避けるために選択した。喘息患者は、３６歳〜７５歳の範囲であり、ＣＯＰＤも有し得る患者であることを避けるために喫煙者を除いた。ＣＯＰＤ患者は、３５歳〜８０歳の範囲であり、喫煙者と非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者が副腎皮質ステロイド、および気管支拡張薬を摂取していた。
【０５３２】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用する：
ＡＩ＝自己免疫
Ｓｙｎ＝滑液
Ｎｏｒｍａｌ＝見かけ上の疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝慢性関節リウマチ
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来
ＯＡ＝変形性関節症
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
Ｍａｔｃｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ＝隣接組織
−Ｍ＝男性
−Ｆ＝女性
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患
（パネル５Ｄおよび５Ｉ）
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートは、代謝病に重点をおいて、２個のコントロールウェルおよびヒトの組織および細胞株から単離された種々のｃＤＮＡを含む。代謝組織は、妊娠糖尿病研究に登録された患者から得られた。細胞は、ヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における異なる段階の間に得られた。ヒトランゲルハンス島がまた、得られた。
【０５３３】
妊娠糖尿病研究において、被験体は若く（１８歳〜４０歳）、慣用的な（選択的な）帝王切開を引き起こす妊娠糖尿病に罹患しているか、および罹患していない、その他の点では健常な女性である。乳児の分娩後、外科的切開が修復され／閉じられる際に、産科医は、小さいサンプルを除去した。
【０５３４】
患者２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリンなし
患者７〜９：非糖尿病の白人、肥満（ＢＭＩ＞３０）
患者１０：ラテンアメリカ系糖尿病患者、体重超過、インスリン投与
患者１１：非糖尿病のアメリカ黒人、体重超過
患者１２：ラテンアメリカ系糖尿病患者、インスリン投与
脂肪細胞分化は、Ｏｓｉｒｕｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒの部門）から入手されたドナー前駆体細胞において、２つの複製のみ有するドナー３Ｕを除いて三連で誘導された。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの科学者は、ＣｕｒａＧｅｎに対してＭａｒｋ  Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年４月２日：１４３−１４７において見出される公開されたプロトコルに基づいて、ヒト間葉幹細胞（ＨｕＭＳＣ）を単離し、増殖および分化した。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓは、トリゾール溶解物、ｍＲＮＡ単離およびｄｓ  ｃＤＮＡ生成に適切な凍結ペレットを提供した。各ドナーの一般的な記載は以下の通りである：
ドナー２および３Ｕ：間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー２および３ＡＭ：脂肪、分化中の脂肪
ドナー２および３ＡＤ：脂肪、分化された脂肪
ヒトの細胞株を、一般的には、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織グループに分けた：腎臓近位曲尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２癌細胞、心臓１次間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞。これらの細胞は全て標準の推奨条件下で培養され、そしてＲＮＡは、標準の手順を用いて抽出された。全てのサンプルは一本鎖ｃＤＮＡを生成するためにＣｕｒａＧｅｎで処理された。
【０５３５】
パネル５Ｉは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅにおけるＤｉａｖｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した５８歳の女性患者由来のランゲルハンス島の追加を伴う、前に記載した全てのサンプルを含む。島組織は、外部の供給源で総ＲＮＡに加工され、そしてパネル５Ｉに加えるためにＣｕｒａＧｅｎに送達された。
【０５３６】
５Ｄパネルおよび５Ｉパネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用する：
ＧＯ  Ａｄｉｐｏｓｅ＝より大きい網脂肪
ＳＫ＝骨格筋
ＵＴ＝子宮
ＰＬ＝胎盤
ＡＤ＝分化された脂肪
ＡＭ＝分化中の脂肪
Ｕ＝分化されない幹細胞
（パネルＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２個のコントロールウェルおよび９４個の試験サンプルを含む。これは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む。脳を、死後４時間〜２４時間の間にドナーの頭蓋冠から切り出し、神経解剖学者によって切片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を切片化し、そして明確な関連する神経病理学の診断を確認するために神経病理学者によって試験した。
【０５３７】
疾患の診断を患者記録から入手する。パネルは、以下の診断のそれぞれに由来する２つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、進行性核上性麻痺、うつ病、および「正常なコントロール」。これらの脳のそれぞれにおいて、以下の領域を示す：帯状回、大脳側頭極、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）、黒質、ブロードマン野４（主要な運動性ストリップ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｏｔｏｒ  ｓｔｒｉｐ））、ブロードマン野７（頭頂皮質）、ブロードマン野９（前前頭皮質）、およびブロードマン野１７（後頭皮質）。全てではない脳の領域を、全ての症例において示す；例えば、ハンティングトン病は、淡蒼球の神経変性によって一部特徴付けられ、従ってこの領域は確立されたハンティングトン病の症例から入手され得ない。同様に、パーキンソン病は黒質の変性によって特徴付けられ、この領域を得ることをさらに困難にさせる。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性に関係しているいかなる病理も含まないことを見出した。
【０５３８】
ＣＮＳパネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用する：
ＰＳＰ＝進行性核上性麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝大脳側頭極
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回
ＢＡ  ４＝ブロードマン野  ４。
【０５３９】
（パネルＣＮＳ＿神経変性（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）＿Ｖ１．０）
パネルＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０のプレートは、２個のコントロールウェルおよび４７個の試験サンプルを含む。これは、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＡ  Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）から入手した死後のヒトの脳組織から単離されたｃＤＮＡを含む。脳を、死後４時間〜２４時間の間にドナーの頭蓋冠から切り出し、神経解剖学者によって切片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を切片化し、そして明確な関連する神経病理学の診断を確認するために神経病理学者によって試験した。
【０５４０】
疾患の診断を患者記録から入手する。パネルは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来する６つの脳、および生前に痴呆の兆候を示さない「正常なコントロール」に由来する８つの脳を含む。８つの正常なコントロールの脳は、２つのカテゴリーに分けられる：痴呆もアルツハイマー様の病理症状もないコントロール（コントロール）および重篤なアルツハイマー様病理症状の証拠を示す痴呆がないコントロール、（特に、老人斑負荷を０〜３のスケールでレベル３として評価した；０＝斑を示さない、３＝重篤なＡＤの老人斑負荷）。これらの脳のそれぞれの範囲で、以下の領域を示す：海馬、側頭皮質（ブロードマン野２１）、頭頂皮質（ブロードマン野７）、および後頭皮質（ブロードマン野１７）。これらの領域は、ＡＤでの神経変性のすべてのレベルを含むように選ばれた。海馬は、ＡＤでの早期かつ重篤な神経欠損の領域である；側頭皮質は、海馬の後に、ＡＤでの神経変性を示すことが知られている；頭頂皮質は、疾患の後期段階で中程度の神経の死を示す；後頭皮質は、ＡＤで残され、従ってＡＤ患者内の「コントロール」領域として働く。脳のすべての領域がすべての症例において示されるわけではない。
【０５４１】
ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０パネル中の組織を同定するために使用した標識には、以下の略号を使用する：
ＡＤ＝アルツハイマー病の脳；痴呆になっており、そして剖検でＡＤ様の病理症状を示した患者
Ｃｏｎｔｒｏｌ＝コントロールの脳；痴呆がなく、神経病理症状を示さない患者
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐａｔｈ）＝コントロールの脳；痴呆ではないが重篤なＡＤ様の病理症状を示す患者
ＳｕｐＴｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝上位の側頭皮質
ＩｎｆＴｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝下位の側頭皮質。
【０５４２】
（Ａ．ＮＯＶ１  ＣＧ５０３７７−０１／１４６６４２８９２およびＣＧ５０３７７−０２：ＣｕｂおよびＳｕｓｈｉドメイン含有タンパク質）
遺伝子ＣＧ５０３７７−０１および改変体ＣＧ５０３７７−０２の発現を、表１３ＡＡ、表１３ＡＢ、表１３ＡＣおよび表１３ＡＤに記載されたプライマー−プローブのセットＡｇ２４２０、Ａｇ１６９、Ａｇ６５およびＡｇ５７５を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表１３ＡＥ、表１３ＡＦ、表１３ＡＧ、表１３ＡＨ、表１３ＡＩ、表１３ＡＪ、表１３ＡＫおよび表１３ＡＬに示す。
【０５４３】
【表１３ＡＡ】
2005502312.tif 000140
【０５４４】
【表１３ＡＢ】
2005502312.tif 000141
【０５４５】
【表１３ＡＣ】
2005502312.tif 000142
【０５４６】
【表１３ＡＤ】
2005502312.tif 000143
【０５４７】
【表１３ＡＥ】
2005502312.tif 000144
2005502312.tif 000145
【０５４８】
【表１３ＡＦ】
2005502312.tif 000146
2005502312.tif 000147
2005502312.tif 000148
【０５４９】
【表１３ＡＧ】
2005502312.tif 000149
2005502312.tif 000150
2005502312.tif 000151
【０５５０】
【表１３ＡＨ】
2005502312.tif 000152
2005502312.tif 000153
2005502312.tif 000154
【０５５１】
【表１３ＡＩ】
2005502312.tif 000155
2005502312.tif 000156
【０５５２】
【表１３ＡＪ】
2005502312.tif 000157
2005502312.tif 000158
【０５５３】
【表１３ＡＫ】
2005502312.tif 000159
2005502312.tif 000160
【０５５４】
【表１３ＡＬ】
2005502312.tif 000161
2005502312.tif 000162
2005502312.tif 000163
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要）Ａｇ２４２０。パネルＣＮＳ＿神経変性は、コントロールの死後脳とアルツハイマー病患者の死後脳との間で、この遺伝子の発現においていかなる差も示さない。しかし、このパネルは、患者の独立した群の脳において、中程度〜高いレベルでこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはパネル１．３ｄを参照のこと。
【０５５５】
（パネル１の概要）Ａｇ６５／Ａｇ１６９。２つの異なるプローブおよびプライマーのセットを用いる３つの実験は、この遺伝子の発現が正常な脳に由来した組織に特異的であることを示す。さらに、脳腫瘍細胞株由来のサンプルに関連した発現が存在するようである。従って、この遺伝子の発現を、このパネルにおいて、これらの脳由来の組織を他のサンプルと区別するために使用し得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療法の使用を介したこの遺伝子の治療的調節は、脳腫瘍の処置において有益であり得る。
【０５５６】
（パネル１．１および１．２要約）：Ａｇ５７５  この遺伝子の発現は、正常な脳由来の組織に限定されるようである。さらに、脳癌細胞株Ｕ８７−ＭＧにおいて見られる最も高い発現（ＣＴ＝２３．５）を伴って、脳癌細胞株から誘導される多くのサンプルと関連する発現があるようである。従って、この遺伝子の発現は、パネルにおける他のサンプルからのこれらの脳由来の組織と区別するために使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、脳癌の処置に有益であると思われる。
【０５５７】
この遺伝子はまた、多くの代謝性組織（例えば、副腎、下垂体、心臓、および胎児骨格筋）において中程度のレベルの発現を有する。従って、この遺伝子産物は、代謝性疾患（例えば、肥満）の原因、診断および／または処置のために重要であり得る。さらに、この遺伝子は、成人骨格筋（ＣＴ＝３７．７）よりも胎児骨格筋（ＣＴ＝３４．２）において高いレベルで発現する。従って、この遺伝子の発現は、この組織の成人供給源と胎児供給源との間を区別するのに使用され得る。さらに、胎児骨格筋におけるこの遺伝子の発現のより高いレベルは、この遺伝子産物が成人において筋肉質量または機能を回復するために使用され得ることを示唆する。
【０５５８】
（パネル１．３Ｄ要約）：Ａｇ２４２０  この遺伝子の発現は、正常な脳由来の組織に限定されるようであり、胎児脳において最も高い発現が見られる（ＣＴ＝２９．８）。さらに、脳癌細胞株由来の多くのサンプルと関連する発現があるようである。従って、この遺伝子の発現は、これらの脳由来の組織をパネルにおける他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、脳癌の処置に有益であると思われる。
【０５５９】
この遺伝子は、ＣＵＢおよびｓｕｓｈｉドメインを含む新規のタンパク質を示す。この発現性質は、高度に脳優先性である；ＣＮＳにおけるレベルは、他の組織におけるレベルよりも１０倍大きいようである。ＣＵＢおよびｓｕｓｈｉドメインを含む少なくとも１つの脳特異的タンパク質は、発作に関連し、そしてペンチレンテトラゾールに対する応答において異なる発現を示す。従って、このタンパク質は、てんかんまたは任意の発作疾患の処置のための薬物標的である。
【０５６０】
（参考文献）：
Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｋａｊｉｗａｒａ  Ｋ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｋａｔｓｕｋｉ  Ｍ，Ｓｕｇａｙａ  Ｅ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＥＺ−６，ａ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃＤＮＡ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９５  Ｆｅｂ；２８（２）：２０１−１０。
【０５６１】
発作のニューロンバースト活性の分子機構を明らかにするために、本発明者らは、けいれん薬の１つである、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）で処理したマウス大脳皮質由来の細胞からｃＤＮＡライブラリを構築している。ディファレンシャルスクリーニング技術を使用して、ＰＴＺ処理で発現を変化されたいくつかのｃＤＮＡクローンが得られた。これらのクローンの間で、ＳＥＺ−６は、ＰＴＺでの増加された発現によって特徴付けられた。詳述されたノーザン分析によって、ＳＥＺ−６の発現が、脳に制限され、インビトロの培養細胞のみならずインビボにおいて、ＰＴＺの投与によって増加されることを示した。ＳＥＺ−６  ｃＤＮＡの分析は、以下の複数のモチーフを示した：典型的なシグナル配列、トレオニン富化されたドメイン、短いコンセンサス反復（ＳＣＲ）の５つのコピーまたはｓｕｓｈｉドメイン（Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ結合部位と相補的）、ＣＵＢドメインと部分的に類似であるかまたはＣ１ｒ／ｓ様反復と相補的である２つの反復された配列、１つの膜貫通ドメインおよびＣ末端領域における短い細胞質セグメント。相補関連するタンパク質以外の、複数のＳＣＲドメインまたはＣＵＢドメインを有する多くのタンパク質が見出されているが、これは、ＳＣＲおよびＣＵＢドメイン様セグメントの両方を有する膜タンパク質をコードする脳特異的ｃＤＮＡについての最初の報告である。これらの知見に基づいて、ＳＥＺ−６が、発作に関連し得る新規のタンパク質型をコードすることは明らかである。
【０５６２】
（パネル２Ｄ要約）：パネル２Ｄにおけるこの遺伝子の発現は、膀胱癌由来のサンプルにおいて最も高いようである。さらに、この遺伝子の発現は、特定の組織（より具体的には、胃癌、卵巣癌、膀胱癌および肺癌）に対してかなり選択的なようである。従って、この遺伝子の発現は、これらのサンプルをこのパネルにおける他のサンプルと区別するのに使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、これらの型の癌の処置に有益であると思われる。
【０５６３】
（パネル４Ｄ要約）：Ａｇ２４２０  この遺伝子は、１方向の膜タンパク質を含むｃｕｂドメインおよびｓｕｓｈｉドメインをコードし、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−βで刺激される星状細胞において中程度のレベル（ＣＴ＝３２．２１）で発現され、休止している星状細胞においてより高いレベル（ＣＴ＝３０．６）で発現される。この遺伝子はまた、休止し、サイトカイン刺激される肺線維芽細胞および真皮線維芽細胞において中〜低いレベル（ＣＴ＝３０〜３４）で発現される。この遺伝子によってコードされる単離されたこのタンパク質の細胞外ドメインは、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または気腫、および乾癬の症状を軽減または取り除くための治療的タンパク質として有用であり得る。さらに、この遺伝子の機能を刺激または阻害するアゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体はまた、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または気腫、および乾癬の症状を軽減または取り除くための治療剤として有用であり得る。
【０５６４】
（パネルＣＮＳ＿１要約）：Ａｇ１６９／Ａｇ２４２０  このパネルは、成人ＣＮＳにおけるこのＣＵＢドメインおよびＳｕｓｈｉドメインタンパク質の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはパネル１．３ｄを参照のこと。
【０５６５】
（Ｂ．ＮＯＶ４（ＳＣ７０５０４３７０＿Ａ／ＣＧ５９２５３−０１およびＣＧ５９２５３−０２およびＣＧ５９２５３−０５およびＣＧ５９２５３−０６およびＣＧ５９２５３−０７およびＣＧ５９２５３−０８）
遺伝子ＳＣ７０５０４３７０＿Ａおよび改変体ＣＧ５９２５３−０２およびＣＧ５９２５３−０５およびＣＧ５９２５３−０６およびＣＧ５９２５３−０７およびＣＧ５９２５３−０８の発現は、表１４ＢＡおよび１４ＢＢに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１４９２およびＡｇ２４４１を使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１４ＢＣ、１４ＢＤ、１４ＢＥ、１４ＢＦ、１４ＢＧおよび１４ＢＨに示す。
【０５６６】
【表１４ＢＡ】
2005502312.tif 000164
【０５６７】
【表１４ＢＢ】
2005502312.tif 000165
【０５６８】
【表１４ＢＣ】
2005502312.tif 000166
2005502312.tif 000167
2005502312.tif 000168
【０５６９】
【表１４ＢＤ】
2005502312.tif 000169
2005502312.tif 000170
2005502312.tif 000171
【０５７０】
【表１４ＢＥ】
2005502312.tif 000172
2005502312.tif 000173
2005502312.tif 000174
【０５７１】
【表１４ＢＦ】
2005502312.tif 000175
2005502312.tif 000176
2005502312.tif 000177
【０５７２】
【表１４ＢＧ】
2005502312.tif 000178
2005502312.tif 000179
2005502312.tif 000180
【０５７３】
【表１４ＢＨ】
2005502312.tif 000181
2005502312.tif 000182
2005502312.tif 000183
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０要約）：Ａｇ１４９２／Ａｇ２４４１  パネルＣＮＳ＿神経変性は、コントロールの死後の脳とアルツハイマー病患者の死後の脳との間にこの遺伝子の発現における差異を全く検出しない。しかしながら、このパネルは、独立したグループの患者の脳において中〜高いレベルでこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはパネル１．３ｄを参照のこと。
【０５７４】
（パネル１．３Ｄ要約）：Ａｇ１４９２／Ａｇ２４４１  この遺伝子の発現は、２つの異なるプローブ／プライマーセットを利用するパネル１．３Ｄの３回の独立した実行を通して評価された。この実行は、優秀な一致を示した。この遺伝子は、脳優先性なる発現性質を示すセマホリンホモログをコードする。最も高い発現は、脳および脳癌由来の細胞株において見られる（ＣＴ＝２８〜２９）。セマホリンは、軸索ガイドタンパク質、具体的にはＣＮＳ修復能力を阻害する化学忌避物質として作用し得る。このタンパク質のレベルの操作は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、脊髄小脳性運動失調、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、頭部外傷、発作、またはニューロンの欠失に関連する任意の他の疾患／状態におけるニューロンの死に対する代償性シナプス形成応答を含む使用であり得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、脳癌の処置に有益であると思われる。
【０５７５】
この遺伝子はまた、広範な代謝性組織（例えば、膵臓、副腎、甲状腺、下垂体、成人および胎児の心臓、成人および胎児の骨格筋、成人および胎児の肝臓、および脂肪）において中程度のレベルの発現を有する。このことは、この遺伝子産物が、代謝性疾患（例えば、肥満ならびに１型および２型糖尿病）の原因、診断、および／または処置のために重要であることを示唆する。
【０５７６】
（パネル２．２要約）：Ａｇ１４９２／２４４１
この遺伝子の発現は、異なるプローブ／プライマー対を使用してパネル２．２において２回の独立した実行において良い一致で評価された。この遺伝子は、腎臓癌に隣接する他の正常な腎臓由来のサンプルにおいて最も高い発現を示すことが見出された。このパターンの発現は、他の正常な腎臓／腎臓癌対ならびに正常な結腸／結腸癌対に対して一致した。従って、この遺伝子の発現は、正常な結腸および腎臓組織をパネルにおける他の組織（特に、遺伝的に関連する悪性対応物）と区別するのに使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、腎臓癌または結腸癌の処置に有益であると思われる。
【０５７７】
（パネル２Ｄ要約）：Ａｇ２４４１  この遺伝子は、正常な腎臓組織由来のサンプルにおいて最も高く発現する。このパターンの発現は、他の正常な腎臓／腎臓癌対に一致し、そしてパネル２．２と一致する。従って、この遺伝子の発現は、パネルにおける他のサンプルから正常な腎臓組織、そして特にこれらは遺伝的に関連する悪性対応物を区別するために使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、腎臓癌の処置に有益であると思われる。
【０５７８】
（パネル４Ｄ要約）：Ａｇ１４９２／２４４１  この遺伝子は、セマホリンホモログをコードし、そしてＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−β刺激された肺上皮細胞、結腸、および胸腺において高いレベル（ＣＴ＝２８）で発現される。従って、この遺伝子産物は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気腫、および潰瘍性大腸炎の症状を軽減または取り除くための有用なタンパク質治療薬である。
【０５７９】
（パネルＣＮＳ＿１要約）：Ａｇ１４９２  このパネルは、成人中枢神経系におけるこのセマホリン前駆体の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはパネル１．３ｄを参照のこと。
【０５８０】
（Ｃ．ＮＯＶ５（ＣＧ５０２１１−０１およびＣＧ５０２１１−０２：セリン／トレオニンキナーゼ）
遺伝子ＣＧ５０２１１−０１および改変体ＣＧ５０２１１−０２の発現は、表１５ＣＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２４９２を使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表１５ＣＢ、１５ＣＣ、１５ＣＤおよび１５ＣＥに示される。
【０５８１】
【表１５ＣＡ】
2005502312.tif 000184
【０５８２】
【表１５ＣＢ】
2005502312.tif 000185
2005502312.tif 000186
【０５８３】
【表１５ＣＣ】
2005502312.tif 000187
2005502312.tif 000188
2005502312.tif 000189
【０５８４】
【表１５ＣＤ】
2005502312.tif 000190
2005502312.tif 000191
2005502312.tif 000192
【０５８５】
【表１５ＣＥ】
2005502312.tif 000193
2005502312.tif 000194
2005502312.tif 000195
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０要約）：Ａｇ２４９２  パネルＣＮＳ＿神経変性は、コントロールの死後の脳とアルツハイマー病患者の死後の脳との間にこの遺伝子の発現における差異を全く検出しない。しかしながら、このパネルは、独立したグループの患者の脳において中程度のレベルでこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはパネル１．３ｄを参照のこと。
【０５８６】
（パネル１．３Ｄ要約）：Ａｇ２４９２  この遺伝子は、ＣＮＳにおいて中〜高いレベルで発現されるセリン／トレオニンキナーゼホモログをコードし、大脳皮質において最も高く発現する（ＣＴ＝２６．５）。セリン／トレオニンキナーゼは、抗うつ剤によって活性化される；従って、この遺伝子は、うつ病または双極性障害の処置のための低分子標的であり得る。
【０５８７】
この遺伝子は、多くの代謝性組織（膵臓、副腎、下垂体、甲状腺、成人および胎児の心臓、成人および胎児の骨格筋、成人および胎児の肝臓、および脂肪が挙げられる）において中程度に発現される。このことは、このキナーゼが代謝性疾患（例えば、肥満ならびに１型および２型糖尿病）の処置のための低分子標的であり得ることを示唆する。この遺伝子はまた、成人の心臓および骨格筋における発現（ＣＴ＝３１．５）よりも胎児の心臓および骨格筋においてより高いレベルで発現される（ＣＴ＝２７．５）。このことは、この遺伝子の発現が、この組織の成人供給源と胎児供給源とを区別するために使用され得ることを示唆する。さらに、胎児組織における発現のより高いレベルは、この遺伝子によってコードされるタンパク質が、これらの器官の発達に関与し得ることを示唆する。従って、この遺伝子産物の発現または機能の治療的な改変は、心臓および骨格筋に影響を及ぼす疾患の処置において有用であり得る。
【０５８８】
脳癌細胞株由来の組織における一貫した発現がまた正常な脳における発現に加えて存在する。従って、この遺伝子の発現は、脳由来の組織または細胞株をパネルにおける他のサンプルと区別するために使用され得る。さらに、抗体、低分子薬物またはタンパク質治療剤の使用による、この遺伝子の治療的な改変は、脳癌の処置に有益であると思われる。
【０５８９】
（参考文献）：
Ｐｏｐｏｌｉ  Ｍ，Ｍｏｒｉ  Ｓ，Ｂｒｕｎｅｌｌｏ  Ｎ，Ｐｅｒｅｚ  Ｊ，Ｇｅｎｎａｒｅｌｌｉ  Ｍ，Ｒａｃａｇｎｉ  Ｇ．Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１  Ｆｅｂ；８９（２）：１４９−７０。
【０５９０】
ニューロンのシグナル伝達系の分子および細胞成分における順応性で可塑性の変化が、抗うつ剤での長期間の処置後に観察される気分および認知における影響に関連することは、現在広く受け入れられる意見である。タンパク質リン酸化は、ほとんどのシグナル伝達系に対する重要な工程を表し、そしてそれは、実質的に全ての細胞機能の調節に含まれる。２つのセリン／トレオニンキナーゼ、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存プロテインキナーゼＩＩおよび環状ＡＭＰ依存プロテインキナーゼが、抗うつ処置に続いて脳において活性化されることが示される。キナーゼ活性におけるこの変化は、細胞下の区画（シナプス前終端および微小管）における選択されるタンパク質基質のリン酸化における変化によって反映され、続いて、抗うつ剤とともに観察されるシナプス伝達の改変に寄与し得る。タンパク質キナーゼの活性化の分子結果は、抗うつ薬によって誘導される神経機能におけるいくつかの変化を説明し得、そして薬理学的な処置の新規の可能な戦略を示唆し得る。
【０５９１】
（パネル２Ｄ要約）：Ａｇ２４９２  パネル２Ｄにおけるこの遺伝子の発現は、乳癌由来のサンプルにおいて最も高いようである（ＣＴ＝２８．６）。同様に他の乳癌における実質的な発現もまた存在する。従って、この遺伝子の発現は、乳癌サンプルをパネルにおける他のサンプルと区別するために使用され得る。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用によるこの遺伝子の治療的改変は、乳癌の処置に有利であり得る。
【０５９２】
（パネル４Ｄの概要）：（Ａｇ２４９２）  この遺伝子は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼホモログをコードし、そしてこのパネル中の全ての細胞および組織において、中程度のレベルで発現され、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−βで刺激した小気道上皮、ＩＬ−９で刺激したＮＣＩ−Ｈ２９２肺粘膜表皮細胞、ならびにＴＮＦ−αで刺激したＣＣＤ１０７０皮膚線維芽細胞において、最も高い発現（ＣＴ＝２７．５）を有する。この発現プロファイルは、この新規のセリン／トレオニンプロテインキナーゼ様タンパク質を阻害する低分子薬剤が、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気腫、および乾癬の症状を軽減または除去する治療薬として有用であり得ることを示唆する。
【０５９３】
（Ｄ．ＮＯＶ６（ＣＧ５０２１５−０１およびＣＧ５０２１５−０４））
遺伝子ＣＧ５０２１５−０１および改変体ＣＧ５０２１５−０４の発現は、プライマー−プローブのセットＡｇ２４９３（表１６ＤＡ中に記載される）を用いて評価された。このＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表１６ＤＢ、表１６ＤＣ、および表１６ＤＤ中に見出される。
【０５９４】
【表１６ＤＡ】
2005502312.tif 000196
【０５９５】
【表１６ＤＢ】
2005502312.tif 000197
2005502312.tif 000198
2005502312.tif 000199
【０５９６】
【表１６ＤＣ】
2005502312.tif 000200
2005502312.tif 000201
2005502312.tif 000202
【０５９７】
【表１６ＤＤ】
2005502312.tif 000203
2005502312.tif 000204
（パネル１．３Ｄの概要）：（Ａｇ２４９３）  前立腺に対するこの遺伝子の発現は、制限される（ＣＴ＝３４．４）。従って、この遺伝子の発現は、前立腺組織を他の組織から区別するために用いられ得る。
【０５９８】
（パネル２．２の概要）：（Ａｇ２４９３）  正常な卵巣由来のサンプルおよび卵巣癌に隣接する正常な卵巣のサンプルに対するこの遺伝子の発現は、制限されるようである。卵巣癌組織において観察される発現の欠失は、注目すべきである。従って、この遺伝子の発現は、正常な卵巣組織を、このパネル中の他の組織および特に卵巣癌組織から区別するための用いられ得る。従って、この遺伝子の発現は、卵巣癌の診断または予後に用いられ得る。さらに、低分子薬剤、抗体、タンパク質治療薬の使用を介する、この遺伝子の治療的調節は、卵巣癌の処置において有益であり得る。
【０５９９】
（パネル４Ｄの概要）：（Ａｇ２４９３）  この遺伝子は、ＴＧＦ−β結合タンパク質４のホモログをコードする。ＴＧＦ−β結合タンパク質４のホモログは、増殖因子ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を調節する分泌タンパク質である。この遺伝子は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−βで活性化した気管支上皮、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１−βで活性化した小気道上皮、休止の肺線維芽細胞、ならびにＩＬ−４またはＩＬ−９またはＩＬ−１３またはＩＦＮ−γで活性化した肺線維芽細胞において、中程度のレベルで発現される。従って、この遺伝子産物は、慢性閉塞性肺疾患の症状を軽減または除去するための有用な治療タンパク質であり得る。さらに、この遺伝子によってコードされるタンパク質はまた、その病態生理学が一部ＴＧＦ−βファミリーのメンバーによって制御される他の疾患（例えば、変形性関節症および慢性関節リウマチ）の症状を軽減または除去するための治療薬としても有用であり得る。
【０６００】
（参考文献）
Ｉｅｍｕｒａ  Ｓ、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＴＳ、Ｔａｋａｇｉ  Ｃ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ、Ｕｅｎｏ  Ｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９年９月１７日；２７４（３８）：２６８４３〜９  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｍｂｒｙｏ．
感受がよくかつ特異的なモニターとして表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて、著者らは、２つの別々の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）結合タンパク質を単離し、そしてそれらの各々リポビテリン１およびＥｐ４５として同定した。リポビテリン１は、卵黄の前駆タンパク質からプロセシングされた卵黄タンパク質である。ビテロゲニンおよびＥｐ４５の両方は、肝臓におけるエストロゲン制御下で合成され、分泌され、そして卵子の発達により取り込まれる。この報告において、著者らは、試験されるＴＧＦ−βファミリーメンバーの中で、Ｅｐ４５がＢＭＰ−４とのみ結合し得るが、一方リポビテリン１は、ＢＭＰ−４およびアクチビンＡの両方と結合し得ることを示した。この特異性の差異に起因して、著者らは、Ｅｐ４５に注目し、さらに研究した。速度パラメーターは、表面プラズモン共鳴研究によって決定され、そしてＥｐ４５がＢＭＰ−４と迅速（ｋ（ａ）＝１．０６×１０（４）Ｍ（−１）ｓ（−１））に結合しかつゆっくりと（ｋ（ｄ）＝１．０６×１０（−４）Ｍ（−１）ｓ（−１））解離することを示した。Ｅｐ４５ｍＲＮＡでマイクロインジェクションしたＸｅｎｏｐｕｓ胚において、Ｅｐ４５は用量依存的な様式で、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）がＢＭＰ活性を阻害する能力および２次体軸（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｏｄｙ  ａｘｉｓ）を誘導する能力をブロックするが、一方で他のＢＭＰアンタゴニスト、コルジン（ｃｈｏｒｄｉｎ）およびノジン（ｎｏｇｇｉｎ）に対する効果を有さなかった。これらの結果は、Ｅｐ４５がＢＭＰと相互作用してインビボでのその活性を調節する可能性を支持する。
【０６０１】
Ｄａｌｅ  Ｌ、Ｗａｒｄｌｅ  ＦＣ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９９年１月；１０（３）：３１９−２６  Ａ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｏｆ  ＢＭＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ｄｏｒｓａｌ−ｖｅｎｔｒａｌ  ｆａｔｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ．
ＢＭＰ−４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する細胞外シグナル伝達分子であり、脊椎原腸胚における背腹方向へのパターン化において中心的な役割を果たす。著者らは、ＢＭＰ−４が濃度依存的様式で、背復方向の位置の値を特定するモルホゲンとして作用することを示す証拠を再検討した。ＢＭＰ−４の活性勾配（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）は、局在化された供給源からの単純な拡散によってではなく、単一レベルのＢＭＰ−４タンパク質に作用する阻害性結合タンパク質の拡散によって確立される。次いで、これらは、トロイド（ｔｏｌｌｏｉｄ）関連メタロプロテアーゼ（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｘｏｌｌｏｉｄおよびゼブラフィッシュトロイド）の活性によって調節される。
【０６０２】
Ｋｈａｌｉｌ  Ｎ、Ｐａｒｅｋｈ  ＴＶ、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  Ｒ、Ａｎｔｍａｎ  Ｎ、Ｋｅｐｒｏｎ  Ｗ、Ｙｅｈａｕｌａｅｓｈｅｔ  Ｔ、Ｘｕ  ＹＤ、Ｇｏｌｄ  ＬＩ．Ｔｈｏｒａｘ  ２００１  Ｄｅｃ；５６（１２）：９０７〜１５  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  １  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴｂｅｔａＲ−Ｉ  ａｎｄ  ＴｂｅｔａＲ−ＩＩ）ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．
（背景）：特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、胸膜の線維症によって特徴付けられ、これは、肺の全ての領域に関与して進行する。トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）（結合組織合成の有力な調節因子）の発現は、ＩＰＦの患者の肺切片中で増殖する。ＴＧＦ−β１は、一般的に、生物学的に潜在性形態（ＴＧＦ−β１）で放出される。生物学的に活性である前に、ＴＧＦ−βは、その活性形態に変換され、そしてＩ型およびＩＩ型のＴＧＦ−βレセプター（ＴβＲ−ＩおよびＴβＲ−ＩＩ）の両方と相互作用しなくてはならない。ＴＧＦ−β潜在結合タンパク質１（ＬＴＢＰ−１）（これは、Ｌ−ＴＧＦ−β１の放出および活性化を促進する）はまた、ＴＧＦ−β１の生物学において重要である。（方法）：ＩＰＦを有する患者からの開放した肺の細切採取サンプルおよび正常なコントロールは、ＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩおよびＬＴＢＰ−１の局在化することについて試験された。肺胞マクロファージ（ＡＭ）および肺気管支洗浄（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）（ＢＡＬ）流体は、ＴＧＦ−βが、ＩＰＦを有する患者の肺細胞中に活性形態で存在するか否かを決定するためにＣＣＬ−６４バイオアッセイを用いて試験された。（結果）：免疫反応性Ｌ−ＴＧＦ−β１は、蜂の巣状嚢の上皮下領域における線維芽細胞を除いて、ＩＰＦを有する患者の全ての肺細胞中に存在した。ＬＴＢＰ−１は、最初に、ＡＭおよび進行したＩＰＦの領域における蜂の巣状嚢を裏打ちする上皮細胞中で検出された。正常な肺において、ＬＴＢＰ−１免疫反応性は、いくつかのＡＭにおいて観察された。ＩＰＦを有する患者の上葉および下葉由来のＡＭは、各々１．６（０．６）ｆｍｏｌおよび４．１（１．９）ｆｍｏｌの活性ＴＧＦ−βを分泌したが、コントロールの患者の下葉由来のＡＭは、活性ＴＧＦ−βを分泌しなかった。
【０６０３】
Ｒｏｔｈ−Ｅｉｃｈｈｏｒｎ  Ｓ、Ｈｅｉｔｍａｎｎ  Ｂ、Ｆｌｅｍｍｉｎｇ  Ｐ、Ｋｕｂｉｃｋａ  Ｓ、Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｃ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００１年１１月；３６（１１）：１２０４−１０  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｕｒｓ．
（背景）：最近、潜在性ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ−１）のスプライス形態が、マトリクス会合およびプロテイナーゼ切断（ＬＴＢＰ−１Ｄ、−１δ５３）のために潜在的に重要な配列を欠失する肝臓において同定された。未知の（病原性）生理学的役割をより理解するために、ＬＴＢＰ−１ＤおよびＬＴＢＰ−１（全長）の発現レベルが、正常なヒトの肝臓および悪性のヒトの肝臓において、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで調査された。（方法）：正常な肝臓（５検体）、肝臓細胞癌（４検体）、および線維層板癌（２検体）を、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応および免疫組織化学によって試験し、特異的な抗体が作製された。（結果）：悪性肝臓組織中のＬＴＢＰ−１／−１ＤのｍＲＮＡレベルは、正常な肝臓と比較して減少し、ＨＣＣ中のＬＴＢＰ−１／−１ＤのｍＲＮＡレベルは、ＦＬＣ中のそれと比較してより減少する。この知見は、ＨＣＣおよびＦＬＣの新生物実質細胞におけるＬＴＢＰ−１／−１Ｄの免疫染色の顕著な減少によって確認される。しかし、ＬＴＢＰ−１（全長）タンパク質染色の強度は、腫瘍の細胞マトリクス中で増加したが、ＬＴＢＰ−１Ｄは、このマトリクス中に検出されなかった。（結論）：ＴＧＦ−βは、肝臓腫瘍中で過剰発現することが知れらているので、この結果は、ＬＴＢＰ−１との結合を伴わない、その増強された合成を示唆する。このことは、恐らく、腫瘍組織における生物活性ＴＧＦβの適合性に影響する。ＬＴＢＰ−１Ｄの損失するマトリクス局在化（ｍｉｓｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、ヘパリン結合部位を含むこのヒンジ領域が、細胞外マトリクスにおいてＬＴＢＰ−１の結合のために必須であることを示す。ＬＴＢＰ−１Ｄは、マトリクス非結合ＴＧＦ−β潜在性について特異的機能を満たし得る。
【０６０４】
Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ  ＭＨ．Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １９９６；  １（４）：３５３〜６３  Ｌａｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ．
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）３の生物学的活性は、潜在性複合体としての細胞外コンパートメント中のこれらの存続によって緊密に制御される。これら３つの哺乳動物アイソフォーム遺伝子の各々は、細胞内で切断されて２つのポリペプチドを形成する産物をコードし、この２つのポリペプチドの各々は、二量体化する。成熟ＴＧＦ−β（２４ｋＤホモ二量体）は、８０ｋＤの潜在性結合ペプチド（ＬＡＰ）と非共有結合的に結合する。ＬＡＰは、その効率的な分泌のために必要とされるＴＧＦ−βの必須成分であり、遍在する細胞表面レセプターに結合することを防ぎ、そして活性化により容易にアクセスされる大きな細胞外レザバにおける適合性を維持する。この潜在性ＴＧＦ−β複合体（ＬＴＧＦ−β）は、全ての細胞によって分泌され、そして循環形態および細胞外マトリクスに結合した形態の両方で豊富に存在する。活性化は、ＴＧＦ−βの放出に導く選択的事象を記載する。生理学的過程および悪性組織過程における増殖および分化のＴＧＦ−β調節の重要性にも関らず、インサイチュでの活性化の機構については、ほとんど知られていない。放射線照射された乳腺の最近の研究は、ＴＧＦ−β１活性化の特定の特徴を明らかにし、それは、正常な乳腺および新生物乳腺におけるその調節および潜在的役割に光を当て得る。
【０６０５】
Ｂａｒｒｙ  Ｆ、Ｂｏｙｎｔｏｎ  ＲＥ、Ｌｉｕ  Ｂ、Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００１年８月１５日；２６８（２）：１８９〜２００  Ｃｈｏｎｄｒｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｄｉｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．
骨髄由来間葉幹細胞のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β誘導軟骨形成は、軟骨特異的な細胞外マトリクスの迅速な沈着に関連する。未分化の幹細胞から成熟軟骨を導くこの経路における連続的な事象は、鍵となるマトリクスエレメントの分析によって調査された。分化は、ＴＧＦ−β３またはＴＧＦ−β２の存在下で培養された細胞中で迅速に誘導され、そしてフィブロモジュリンおよび軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質の初期の発現を伴う。アグリカンおよびバーシカンコアタンパク質合成の増大は、中間段階を規定し、それはまた、小さなロイシンリッチな小プロテオグリカンのデコリンおよびビグリカンに関連する。これに続いて、ＩＩ型コラーゲンおよびコンドロアドへリンが発生する。この経路はまた、Ｘ型コラーゲンの発生によって特徴付けられ、通常肥大性軟骨に関連した。コンドロイチンサルフェートの硫酸化の変化もまた起こり、６つの硫酸化種の比率が漸増した。新しく合成されたグリコサミノグリカンの大部分は、凝集するプロテオグリカンネットワークの部分であった。これらのデータは、著者らに、分化した細胞の表現型の規定およびマトリクスアセンブリの連続的プロセスより詳細の理解を可能とした。
【０６０６】
Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＤＡ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００１年３月；２１９（１〜２）：１６３〜７０  Ｌａｔｅｎｔ−ＴＧＦ−ｂｅｔａ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に関連する潜在性は、１９８４年に発見された。その年のこの主題について２つ刊行物以来、過去１０年の夫々の年に潜在性が主要なテーマである平均して６０以上の報告がされており、増殖因子の研究のこの分野における興味は十分に試験されている。ＴＧＦ−βの成熟２５ｋＤ形態は、これらの多くの異なる生物学的効果をもたらすために必要とされるので、この潜在性複合体の構造および活性化の説明が要求されることは、必然であった。本総説は、これらの本質的部分の記述を提供する。現在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の特定構成要素の調節異常が、多くのヒト疾患に関連することが明白に示されており、潜在性ＴＧＦ−β複合体の活性化が追加の重要性を有している。技術的改善は、インビボでの活性ＴＧＦ−βタンパク質と潜在性ＴＧＦβタンパク質との区別を可能にし、そして種々の病理学的状況に関連する活性化の制御の異常を明らかにし始めた。
【０６０７】
Ｆａｇｅｎｈｏｌｚ  ＰＪ、Ｗａｒｒｅｎ  ＳＭ、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ＪＡ、Ｂｏｕｌｅｔｒｅａｕ  ＰＪ、Ｓｐｅｃｔｏｒ  ＪＡ、Ｃｒｉｓｅｒａ  ＦＥ、Ｌｏｎｇａｋｅｒ  ＭＴ．Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００１年３月；１２（２）：１８３〜９０  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、いくつかのＴＧＦ−βアイソフォーム（骨形態形成タンパク質、アクチビン、インヒビン、ならびに増殖因子および分化因子）を含む多くの重要な増殖因子を包含する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、３つの密接に関連したアイソフォームであり、骨格の形態形成および骨の修復の間、広範に発現される。多くの研究は、各々のアイソフォームが、インビボでの独特の機能を有するが；しかし骨芽細胞遺伝子の発現および成熟に対するこれらＴＧＦ−βアイソフォームの効果が、直接的に比較されなかったことを示唆する。現行の研究において、著者らは、２．５ｎｇ／ｍｌの各々のＴＧＦ−βアイソフォームを用いて未分化の新生児ラット頭蓋冠の骨芽細胞が豊富な細胞培養物を処理し、そして０時間、３時間、６時間、および２４時間で遺伝子発現を分析した。著者らは、内因性ＴＧＦ−β  １およびＩ型コラーゲンｍＲＮＡ転写の、アイソフォーム特異的な独特の調節を実証した。骨芽細胞の成熟に対する長期のＴＧＦ−β１  処理の効果を評価するために、著者らは、２．５ｎｇ／ｍｇの各々のＴＧＦ−βアイソフォームの存在下で、骨芽細胞培養物を分化した。コラーゲンＩ、アルカリフォスファターゼ、およびオステオカルチンの分析は、各々のＴＧＦ−βアイソフォームが、これらの骨芽細胞分化マーカーの転写を、独自に抑制したことを実証した。興味深いことに、ＴＧＦ−βアイソフォーム処理は、初期の骨芽細胞において、分化の４日後および１０日後にオステオポンチンの発現を増加させた。著者らの知見として、これらのデータは、インビトロでの骨芽細胞の遺伝子発現に対するＴＧＦ−βアイソフォームの効果の最初の直接的な比較を提供する。さらに、これらのデータは、ＴＧＦ−βアイソフォームが、骨芽細胞サイトカイン分泌、細胞外マトリクス産生、および細胞成熟の速度を特異的に調節することにより、これらのインビボでの独特の効果をもたらすことを示唆する。
【０６０８】
（Ｅ．ＮＯＶ７（ＧＭＡＰ０００８０８＿Ａ＿ｄａ１））
遺伝子ＧＭＡＰ０００８０８＿Ａ＿ｄａ１の発現は、プライマー−プローブのセットＡｇ２４９６（表１７ＥＡ中に記載される）を用いて評価された。このＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表１７ＥＢ、および表１７ＥＣ中に見出される。
【０６０９】
【表１７ＥＡ】
2005502312.tif 000205
【０６１０】
【表１７ＥＢ】
2005502312.tif 000206
2005502312.tif 000207
2005502312.tif 000208
【０６１１】
【表１７ＥＣ】
2005502312.tif 000209
2005502312.tif 000210
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要）：（Ａｇ２４９６）  発現は、このパネル中の全ての細胞において低い／検出されない（ＣＴ＝３５）。（データ示さず）
（パネル１．３Ｄの概要）：（Ａｇ２４９６）この遺伝子は、小脳に特異的であるようであり、従ってこの遺伝子の発現は、他のＣＮＳ組織から小脳組織を区別するために用いられ得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、この領域初期の病理学を示す疾患（脊髄小脳性運動失調）の処置に用いられ得る。
【０６１２】
（パネル４Ｄの概要）：この転写物は、休止エフェクターＴｈ１  Ｔ細胞において最も高く発現（ＣＴ＝３１．５）され、かつ対応する活性化細胞においては発現されない。従って、この遺伝子は、Ｔｈ１細胞についてのマーカーとして有用であり得る。この遺伝子はまた、休止ＣＤ４  Ｔ細胞およびＬＡＫ細胞において低いレベルで発現される。従って、このコードされたタンパク質の機能をブロックする低分子アンタゴニストは、Ｔｈ１媒介疾患（例えば、炎症性腸疾患、慢性関接性リウマチ、および他の自己免疫疾患（例えば、遅延型過敏性反応）の処置に有用であり得る。この転写物はまた、腎臓において有意なレベルで発現され、従って、腎臓組織についてのマーカーとして強力に作用し得る。
【０６１３】
（Ｆ．ＮＯＶ８（ＡＬ１６３１９５＿ｄａ２））
遺伝子ＡＬ１６３１９５＿ｄａ２＿の発現は、プライマー−プローブセットＡｇ２４７７（表１８ＦＡ中に記載される）を用いて評価された。このＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表１８ＦＢおよび表１８ＦＣ中に記載される。
【０６１４】
【表１８ＦＡ】
2005502312.tif 000211
【０６１５】
【表１８ＦＢ】
2005502312.tif 000212
2005502312.tif 000213
2005502312.tif 000214
【０６１６】
【表１８ＦＣ】
2005502312.tif 000215
2005502312.tif 000216
（パネル１．３Ｄの概要）：（Ａｇ２４７７）この遺伝子の有意な発現は、精巣に対して制限（ＣＴ＝３３．１）される。従って、この遺伝子の発現は、他の組織から精巣組織を区別するために用いられ得る。さらに、この遺伝子の非常に特異的な発現は、そのタンパク質産物が、精巣の正常な機能に関連し得ることを示唆する。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、不妊症および精巣に関連する他の障害の処置に有用であり得る。
【０６１７】
（パネル４Ｄの概要）：（Ａｇ２４７７）この転写物は、ほとんど排他的に肝硬変において発現（ＣＴ＝３３．５）されるが、正常な肝臓においては発現されない。このことは、この転写物によってコードされたタンパク質が肝臓の病理学に関与または関連し、肝硬変または他の肝臓の疾患についての診断マーカーとして作用し得ることを示唆する。
【０６１８】
（Ｇ．ＣＧ５８６１０−０１／ＳＣ８７４２１０５８＿Ａ：ＡＭＩＮＯＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ）
遺伝子ＣＧ５８６１０−０１の発現は、プライマー−プローブセットＡｇ４７３７（表１９ＧＡ中に記載される）を用いて評価された。
【０６１９】
【表１９ＧＡ】
2005502312.tif 000217
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要）：（Ａｇ２２６７）  発現は、このパネル中の全ての細胞において低い／検出されない（ＣＴ＞３５）。（データ示さず）
（パネル１．３Ｄの概要）：（Ａｇ２２６７）  発現は、このパネル中の全ての細胞において低い／検出されない（ＣＴ＞３５）。（データ示さず）
（パネル２Ｄの概要）：（Ａｇ２２６７）  発現は、このパネル中の全ての細胞において低い／検出されない（ＣＴ＞３５）。（データ示さず）
（パネル４Ｄの概要）：（Ａｇ２２６７）  発現は、このパネル中の全ての細胞において低い／検出されない（ＣＴ＞３５）。（データ示さず）
（Ｈ．ＮＯＶ１０ａ（ＣＧ５０２３５−０１）
遺伝子ＣＧ５０２３５−０１の発現は、プライマー−プローブセットＡｇ２４７７（表２０ＨＡ中に記載される）を用いて評価された。このＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表２０ＨＢ、表２０ＨＣおよび表２０ＨＤ中に記載される。
【０６２０】
【表２０ＨＡ】
2005502312.tif 000218
【０６２１】
【表２０ＨＢ】
2005502312.tif 000219
【０６２２】
【表２０ＨＣ】
2005502312.tif 000220
2005502312.tif 000221
2005502312.tif 000222
【０６２３】
【表２０ＨＤ】
2005502312.tif 000223
2005502312.tif 000224
2005502312.tif 000225
（ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０の概要）：（Ａｇ４７３７）  パネルＣＮＳ＿神経変性は、コントロール患者またはアルツハイマー病患者の死後の脳の間でのこの遺伝子の発現の差異を全く示さなかった。しかし、このパネルは、患者の独立した群の脳において低いレベルでのこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系における有用性の議論についてはＧｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４を参照のこと。
【０６２４】
（Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．４の概要）：（Ａｇ４７３７）  この遺伝子の発現は、腎臓癌細胞株由来のサンプルにおいて最も高い（ＣＴ＝２９．９）ようである。全体的に、これらは、腎臓癌、卵巣癌、および肺癌由来の細胞株に対して制限される特異的な発現であるようである。従って、この遺伝子の発現は、パネル中の他の細胞からこれらの細胞株を区別するために用いられ得る。さらに、低分子治療剤、抗体またはタンパク質治療剤の使用を介するこの遺伝子の治療的調節は、腎臓癌、卵巣癌または肺癌の処置に有益であり得る。
【０６２５】
この遺伝子はまた、成体の心臓および胎児の心臓、下垂体、ならびに骨格筋を含むいくつかの代謝組織において中程度に発現され得る。従って、この遺伝子産物は、肥満を含む、代謝病の病源論、診断および／または処置のために重要であり得る。さらに、この遺伝子は、成体の骨格筋（ＣＴ値＝３３）に対して胎児（ＣＴ値＝３５）において示差的に発現されるようであり、そしてこの組織の成体対胎児供給源の区別に有用であり得る。
【０６２６】
この遺伝子は、発現レベルが中程度である脊髄を除いて、ＣＮＳ中で低いレベルで発現される。従って、この遺伝子は、脊髄外傷または脊髄小脳性運動失調のような脊髄が損傷を受けた状態の処置に有益であり得る。
【０６２７】
（パネル４．１Ｄの概要）：（Ａｇ４７３７）  この転写物は、ＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１ｂで処理された星状細胞腫において最も高く発現（ＣＴ＝３１．９）され、そして休止の星状細胞腫においてより低いレベルで発現（ＣＴ  ３２．３）される。この遺伝子はまた、小気道上皮およびケラチノサイトにおいて低いレベルで発現され、炎症性サイトカインＴＮＦ−ａおよびＩＬ−１ｂを用いる処理の際、両方の細胞型においてダウンレギュレートされる発現を有する。この転写物は、トロイド様２タンパク質（ＢＭＰ−１関連プロテイナーゼ）をコードし、このタンパク質は、細胞外マトリクス生合成における役割を果たすことが示されている。従って、この遺伝子産物は、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気腫および炎症性皮膚疾患において生じる、炎症反応の症状を軽減または取り除くためのタンパク質治療剤として有用であり得る。
【０６２８】
（参考文献）
Ｕｚｅｌ  ＭＩ，Ｓｃｏｔｔ  ＩＣ，Ｂａｂａｋｈａｎｌｏｕ−Ｃｈａｓｅ  Ｈ，Ｐａｌａｍａｋｕｍｂｕｒａ  ＡＨ，Ｐａｐｐａｎｏ  ＷＮ，Ｈｏｎｇ  ＨＨ，Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＤＳ，Ｔｒａｃｋｍａｎ  ＰＣ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１  Ｊｕｎ  ２２；２７６（２５）：２２５３７-４３  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｐｒｏ-ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｃｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ。
【０６２９】
リシルオキシダーゼは、細胞外マトリックス生合成におけるコラーゲンおよびエラスチン架橋結合に必要とされる最終的な酵素工程を触媒する。プロリシルオキシダーゼは、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性により処理され、これはまた、プロコラーゲンＩ−ＩＩＩのＣ−プロペプチドを除去する。Ｂｍｐ１遺伝子は２つのプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼをコードする：骨形成タンパク質１（ＢＭＰ−１）および哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ（ｍＴＬＤ）。哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ様（ｍＴＬＬ）−１およびｍＴＬＬ−２は、２つの遺伝的に異なるＢＭＰ−１関連プロテイナーゼであり、ｍＴＬＬ−１はプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性を有することが示されている。本研究は、これら４つの関連するプロテイナーゼによるプロリシルオキシダーゼ処理を、直接的に比較することが最初である。精製した組換え酵素を用いるインビトロアッセイにおいて、４つの全てのプロテイナーゼは、プロリシルオキシダーゼを正確な生理学的部位で産生的に切断するが、ＢＭＰ−１は、ｍＴＬＬ−１、ｍＴＬＬ−２およびｍＴＬＤよりも、それぞれ３倍、１５倍および２０倍効果的であることを示す。結合組織細胞によるリシルオキシダーゼ活性化におけるＢＭＰ−１およびｍＴＬＬ−１の役割をより直接的に評価するために、Ｂｍｐ１−ヌル、Ｔｌｌ１-ヌルおよびＢｍｐ１／Ｔｌｌ１二重ヌル（よって、それぞれＢＭＰ−１／ｍＴＬＤ、ｍＴＬＬ−１または３つの酵素てを欠く）のマウス胚由来の培養線維芽細胞全、リシルオキシダーゼ酵素活性ならびにプロリシルオキシダーゼおよび成熟した約３０ｋＤａのリシルオキシダーゼの蓄積についてアッセイした。野生型細胞あるいはＢｍｐ１またはＴｌｌ１の１つがヌルの細胞は全て、類似した低レベルでプロリシルオキシダーゼおよびプロセシングされたリシルオキシダーゼの両方を生成した。このことは、明らかに正常なレベルのプロセシングを示し、酵素活性データと一致する。対照的に、二重ヌルＢｍｐ１／Ｔｌｌ１細胞は、５０ｋＤａのプロセシングされていないプロリシルオキシダーゼを優先的に生成し、そして野生型細胞、Ｂｍｐ１−ヌル細胞、Ｔｌｌ１−ヌル細胞と比較して、リシルオキシダーゼ酵素活性が７０％減少した。従って、ＢＭＰ−１／ｍＴＬＤおよびｍＴＬＬ−１の組み合わせは、マウス胚性線維芽細胞によるリシルオキシダーゼの活性化を誘導する大部分のプロセシングを担うことが示される。ところが、インビトロの研究では、プロリシルオキシダーゼを、最初に知られたｍＴＬＬ−２に対する基質として同定する。
【０６３０】
パネルＣＮＳ＿１．１の概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ４７３７発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６３１】
（Ｉ．ＮＯＶ１０ｂ（ＣＧ５０２３５−０３）
遺伝子ＣＧ５０２３５−０３の発現は、表２１ＩＡに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ５１１２を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実験結果は、表２１ＩＢに示される。
【０６３２】
【表２１ＩＡ】
2005502312.tif 000226
【０６３３】
【表２１ＩＢ】
2005502312.tif 000227
2005502312.tif 000228
2005502312.tif 000229
ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０の概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ５１１２発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６３４】
Ｇｅｎｅｒａｌ＿ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ＿ｐａｎｅｌ＿ｖ１．５の概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ５１１２発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６３５】
パネル４．１Ｄの概要：Ａｇ５１１２：この転写物は、もっぱら腎臓（ＣＴ３１．５）および胸腺（ＣＴ３４）において発現された。この転写物によりコードされる転写物は、腎臓組織および胸腺組織の検出のために使用され得る。この転写物によりコードされる推定タンパク質はまた、これら組織の正常なホメオスタシスにおいて重要な役割を果たし得る。この転写物によりコードされるタンパク質を有するように設計された治療剤は、炎症の間、これらの器官の正常機能を維持するか、または回復させるために重要である。
【０６３６】
（Ｊ．ＮＯＶ１１（ＣＧ５５７４８−０１）
遺伝子ＣＧ５５７４８−０１の発現は、表２２ＪＡに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ２２３０を用いて評価した。
【０６３７】
【表２２ＪＡ】
2005502312.tif 000230
ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｖ１．０の概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ２２３０発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６３８】
パネル１．３Ｄの概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ２２３０発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６３９】
パネル２Ｄの概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ２２３０発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
【０６４０】
パネル４Ｄの概要：このパネルの全サンプルにおいて、Ａｇ２２３０発現は、低／未検出である（ＣＴ＞３５）（データは示さず）。
（実施例３．ＮＯＶＸクローンのＳＮＰ分析）
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、異なるドナーに由来する複数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発生状態を示す種々のヒトサンプルから導いた。サンプルを、組織全体、細胞株、初代細胞、または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的または化学的な試薬（例えば、成長因子、ケモカイン、ステロイド）で処理していてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎに所有権のあるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して配列決定した。配列トレースを手作業によって評価し、そして適切である場合には修正を施した。全てのサンプルに由来するｃＤＮＡ配列を、それ自体および公のＥＳＴを用いて、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを作成するためのバイオインフォーマティックプログラムを使用してまとめた。それぞれの集合は、１つ以上のヒトのサンプルに由来する１つ以上の重複しているｃＤＮＡ配列を含む。集合の別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合には、集合の構成要素としてフラグメントおよびＥＳＴを含んだ。それぞれの集合は、遺伝子、ならびに／あるいはスプライシング形態および／または一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のような改変体、およびそれらの組合せを示し得る。
【０６４１】
改変体配列が、本出願に含まれる。改変体配列は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの例においては、ＳＮＰを含有しているヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源することを示すために、「ｃＳＮＰ」と呼ばれる。ＳＮＰは、いくつかの様式で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位でのあるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。この場合には、多型の部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子中の特定のヌクレオチドに関してギャップを保有している部位である。遺伝子中に存在しているＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。しかし、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする場合には、遺伝子内ＳＮＰはまた、サイレントでもあり得る。遺伝子の領域の外側に存在しているＳＮＰ、または遺伝子内のイントロンに存在しているＳＮＰは、タンパク質のアミノ酸配列には全く変化を生じないが、発現パターンの調節の変更（例えば、一過性発現、生理学的応答の調節、細胞型による発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性における変更）を生じ得る。
【０６４２】
新規のＳＮＰの同定方法：ＳＮＰは、ＣｕｒａＧｅｎに所有権があるＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズムを使用して配列の集合を分析することによって同定される。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準で集合の中の変化を同定する：ＳＮＰは、アラインメントの両方の末端上の１０塩基対は分析しない；ウィンドウの大きさ（視野（ビュー）（ｖｉｅｗ）の中の塩基数）は１０である；ウィンドウ内の許容されるミスマッチの数は２である；最少のＳＮＰ塩基量（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；ＳＮＰをスコアするための変化の最少の数は２／（集合の位置）である。ＳＮＰＴｏｏｌは、集合を分析し、そしてＳＮＰの位置、集合中の関連する個々の改変体配列の部位、その所定の位置での集合の深さ、推定される集合の対立遺伝子の頻度、およびＳＮＰ配列のバリエーションを示す。次いで、配列トレースが選択され、そして手作業による確認のためにビュー内に入れられる。コンセンサス集合配列は、ＳＮＰの配列のバリエーションによって生じる可能性のあるアミノ酸変化を同定するために、改変体配列の変化とともにＣｕｒａＴｏｏｌにインポートされる。次いで、広範囲のＳＮＰデータ分析が、ＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースに送られる。
【０６４３】
新規のＳＮＰの確認方法：ＳＮＰを、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）として公知の検証方法を使用して確認した。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための詳細なプロトコルは、Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（２０００）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０、８月８日発行、１２４９−１２６５に見出され得る。簡潔には、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型分類の実時間プライマーエクステンションプロセスである。このプロトコルは、ゲノムＤＮＡサンプルに由来する二本鎖のビオチン化ＰＣＲ産物を使用し、そしてそれらをストレプトアビジンビーズに結合させる。次いで、これらのビーズは、一本鎖のＤＮＡを生じるように変性させられる。ＳＮＰは、ＤＮＡ鎖の伸長の際にそれぞれのｄＮＴＰから放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）の間接的な生体照度アッセイ（ｂｉｏｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）に基づく技術を利用して特徴付けられる。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによって媒介される塩基の取り込み後、ＰＰｉは放出され、そしてＡＴＰスルフリラーゼ（これは、ＡＴＰの形成を生じる）についての基質として、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）とともに使用される。続いて、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの作用によって、ルシフェリンのそのオキシ誘導体への転換を達成する。その後の発光は、約４個の塩基までは付加された塩基の数に比例する。この方法のプロセッシビティーを可能にするために、過剰のｄＮＴＰはアピラーゼによって分解させられる。アピラーゼもまた、最初の反応混合物中に存在し、その結果、配列決定の間にのみｄＮＴＰが鋳型に付加される。このプロセスは、完全に自動化されており、そして９６ウェル形式に適応させられている。これによって、大きなＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングが可能である。新規の一ヌクレオチド多型による改変体のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、報告する。改変体を個別に報告するが、全ての任意の組合せまたは改変体の選択したサブセットもまた含む。さらに、改変体の塩基の位置および改変体のアミノ酸残基には、下線を付ける。
【０６４４】
（結果）
改変体を個別に報告するが、全てのあらゆる組合せまたは改変体の選択したサブセットもまた、本発明の企図されるＮＯＶＸ実施形態として含む。
【０６４５】
（ＮＯＶ１ａのＳＮＰデータ）
ＮＯＶ１ａは、４個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号１および２と番号を付ける。
【０６４６】
【表２３】
2005502312.tif 000231
（ＮＯＶ４ａのＳＮＰデータ）
ＮＯＶ４ａは、５個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号１１および１２と番号を付ける。
【０６４７】
【表２４】
2005502312.tif 000232
（ＮＯＶ６ａのＳＮＰデータ）
ＮＯＶ６ａは、９個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号２７および２８と番号を付ける。
【０６４８】
【表２５】
2005502312.tif 000233
（ＮＯＶ７のＳＮＰデータ）
ＮＯＶ７は、２個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号３５および３６と番号を付ける。
【０６４９】
【表２６】
2005502312.tif 000234
（ＮＯＶ８のＳＮＰデータ）
ＮＯＶ８は、２個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号３７および３８と番号を付ける。
【０６５０】
【表２７】
2005502312.tif 000235
（ＮＯＶ１０ａのＳＮＰデータ）
ＮＯＶ１０ａは、２個のＳＮＰ改変体を有する。そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列についてのそれらの改変体位置に、それぞれ、配列番号４１および４２と番号を付ける。
【０６５１】
【表２８】
2005502312.tif 000236
（実施例４  ＮＯＶ６ＢのＰＣＲクローニング）
ＣＧ５０２１５−０３の残基４３６〜９７５のドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングのための標的とした。ＰＣＲテンプレートは、ヒトｃＤＮＡに基づく。
【０６５２】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、標的ｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した：
【０６５３】
【数１】
2005502312.tif 000237
下流をクローニングするために、この順方向プライマーは、インフレームでＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、そしてこの逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０６５４】
２つの並列ＰＣＲ反応を、各反応のためのテンプレートとしてプールしたヒトｃＤＮＡの合計０．５〜１．０ｎｇを使用して、設定した。このプールは、以下のヒト組織のｃＤＮＡ各々５μｇから構成されている：副腎、脳全体、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットラージ細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。
【０６５５】
発現組織が既知でありかつ入手可能である場合、上記プライマーと、以下のヒト組織のｃＤＮＡのうちの１つの０．５ｎｇ〜１．０ｎｇとを使用して、第２のＰＣＲを実施した：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、脳扁桃、脳海馬、脳黒質、脳視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気管、胃、膵臓、視床下部。
【０６５６】
この反応混合物は、２μｌの各プライマー（元の濃度５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０μｌ反応体積中に含んだ。以下の反応条件を使用した：
ＰＣＲ条件１：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  ３０秒変性
ｃ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｄ）７２℃  ６分伸長
工程ｂ〜ｄを１５回反復する
ｅ）９６℃  １５秒変性
ｆ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｇ）７２℃  ６分伸長
工程ｅ〜ｇを２９回反復する
ｈ）７２℃  １０分最終伸長。
ＰＣＲ条件２：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  １５秒変性
ｃ）７６℃  ３０秒、プライマーアニーリング、１サイクルあたり１℃ずつ温度を低下させる
ｄ）７２℃  ４分伸長
工程ｂ〜ｄを３４回反復する
ｅ）７２℃  １０分最終伸長。
【０６５７】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。このフラグメントを、ゲル精製し、そして製造業者の推奨に従ってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に連結した。ＰＣＲ反応１回あたり１２クローンを選び、そして配列決定した。それらのインサートを、ベクター特異的Ｍ１３  ＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーと、以下の遺伝子特異的プライマーとを使用して、配列決定した：
【０６５８】
【数２】
2005502312.tif 000238
そのインサートアセンブリ１９７１８８００２は、標的配列ＣＧ５０２１５−０３の残基４３６と９７５との間のオープンリーディングフレームをコードすることが見出された。１９７１８８００２は、元の配列と２つのヌクレオチド位置および２つのアミノ酸位置で異なる。
【０６５９】
ＣＧ５０２１５−０３の残基４０〜３４５のドメインをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングのための標的とした。ＰＣＲテンプレートは、ヒトｃＤＮＡに基づく。
【０６６０】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、標的ｃＤＮＡ配列をクローニングするために使用した：
【０６６１】
【数３】
2005502312.tif 000239
下流をクローニングするために、この順方向プライマーは、インフレームでＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、そしてこの逆方向プライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０６６２】
２つの並列ＰＣＲ反応を、各反応のためのテンプレートとしてプールしたヒトｃＤＮＡの合計０．５〜１．０ｎｇを使用して、設定した。このプールは、以下のヒト組織のｃＤＮＡ各々５μｇから構成されている：副腎、脳全体、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットラージ細胞株、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。
【０６６３】
発現組織が既知でありかつ入手可能である場合、上記プライマーと、以下のヒト組織のｃＤＮＡのうちの１つの０．５ｎｇ〜１．０ｎｇとを使用して、第２のＰＣＲを実施した：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、脳扁桃、脳海馬、脳黒質、脳視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気管、胃、膵臓、視床下部。
【０６６４】
この反応混合物は、２μｌの各プライマー（元の濃度５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０μｌ反応体積中に含んだ。以下の反応条件を使用した：
ＰＣＲ条件１：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  ３０秒変性
ｃ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｄ）７２℃  ６分伸長
工程ｂ〜ｄを１５回反復する
ｅ）９６℃  １５秒変性
ｆ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｇ）７２℃  ６分伸長
工程ｅ〜ｇを２９回反復する
ｈ）７２℃  １０分最終伸長。
ＰＣＲ条件２：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  １５秒変性
ｃ）７６℃  ３０秒、プライマーアニーリング、１サイクルあたり１℃ずつ温度を低下させる
ｄ）７２℃  ４分伸長
工程ｂ〜ｄを３４回反復する
ｅ）７２℃  １０分最終伸長。
【０６６５】
増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。このフラグメントを、ゲル精製し、そして製造業者の推奨に従ってｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に連結した。ＰＣＲ反応１回あたり１２クローンを選び、そして配列決定した。それらのインサートを、ベクター特異的Ｍ１３  ＦｏｒｗａｒｄプライマーおよびＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーと、以下の遺伝子特異的プライマーとを使用して、配列決定した：
【０６６６】
【数４】
2005502312.tif 000240
そのインサートアセンブリ１９７１８７９７０、１９７１８７９８２および１９７１８７９９０は、標的配列ＣＧ５０２１５−０３の残基４０と３４５との間のオープンリーディングフレームをコードすることが見出された。クローニングしたインサートアセンブリ１９７１８７９８２は、元の配列と１００％同一である。１９７１８７９７０は、元の配列と２つのヌクレオチド位置および１つのアミノ酸位置で異なる。１９７１８７９９０は、元の配列と１つのヌクレオチド位置および１つのアミノ酸位置で異なる。
【０６６７】
（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは例示の目的のみのための例として行われており、そして添付される特許請求の範囲の範囲に関して限定するようには意図されない。詳細には、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、目的のクローン、ライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載されている実施形態の知見を考慮すると、当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【国際公開パンフレット】
2005502312.tif 000241
2005502312.tif 000242
2005502312.tif 000243
2005502312.tif 000244
2005502312.tif 000245
2005502312.tif 000246
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2005502312.tif 000248
2005502312.tif 000249
2005502312.tif 000250
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2005502312.tif 000254
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2005502312.tif 000262
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005502312.tif 000541
【国際調査報告】
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