(57)【要約】パラジウムにより促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
2005527632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラジウム複合体により促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、モノカルボン酸、ヒドロキシ置換した酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸、ウロン酸、アルドン酸およびアルダル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが、封入体（inclusion body）の形態で組換え的に発現されるキメラタンパク質であって、反応混合液中封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合液の温度が約５０℃〜７０℃に維持されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
キメラタンパク質の切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’−ビピリジル(bipyridyl)；1,10-フェナントロリン(phenanthroline)：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン（dithiacyclooctane）；3,6-ジチアオクタン(dithiaoctane)-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン(diphenylphosphineethane)；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン(diphenylphosphineferrocene)；および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2シス−[Pd(en)(OH2)2]2+、シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+、シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+、シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+；および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)またはT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
有機溶媒がマロン酸である、請求項１、２または９に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸のモル比が約１０：１である、請求項１、２、９または１４に記載の方法。
【請求項１６】
キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒がクエン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、GLP-1、GLP-2、PTH、GRF、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン（enkephalin）、エンドルフィン（endorphin）、エキセンディン（exendin）、アミリン（amylin）、多様なオピオイドペプチド（opioid peptide）、ゲーグリン5（gaegurin 5）、ゲーグリン6、ブレビニン（brevinin）1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン（ranatuerin）、エスクレチン（esculetin）、GIP、グルカゴン、モチリン（motilin）、チモポイエチン（thymopoietin）、チモシン(thymosin)、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシン（neurotensin）、タフトシン（tuftsin）、またはこれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが、ガストリン（gastrin）、カルシトニン（calcitonin）、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン（galanin）、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、インスリン、ならびにこれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項１８および１９に記載の方法。
【請求項２１】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項１８および１９に記載の方法。
【請求項２２】
宿主細胞が大腸菌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
切断反応の温度が約６０℃である、請求項１または９に記載の方法。
【請求項２４】
クエン酸が３Ｍ クエン酸であり、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic（ピコリルアミン）、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
ペプチド精製方法であって、以下の工程：
（ａ）酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸、トリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にキメラタンパク質を可溶化することにより、Cys-His切断部位で、ペプチドのＮ末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質からペプチドを切断し；そして、
（ｂ）限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより工程（ａ）の反応混合液から切断されたペプチドを回収する（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）
を含む方法。
【請求項２６】
封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
反応混合液の温度が約５０℃〜約７０℃に維持されている、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３１】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’-ビピリジル；1,10-フェナントロリン：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン；3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン；および、ジエチレントリアミンから選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項３２】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2シス−[Pd(en)(OH2)2]2+、シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+、シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+、シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+；および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
有機溶媒がマロン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸のモル比が約１０：１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
有機溶媒がクエン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
ペプチドがGLP-1、GLP-2、PTH、GRF、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、チモポイエチン、チモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチド、インスリン、ならびにそれらのペプチドの断片および誘導体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態にて宿主細胞から回収されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
宿主細胞が大腸菌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
切断反応の温度が約６０℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
クエン酸が３Ｍ クエン酸であり、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項５０】
ペプチドを生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）Cys-His切断部位でペプチドのＮ末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現し、封入体の形態で宿主細胞からキメラタンパク質を回収し；
（ｂ）酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸およびトリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中に工程（ａ）で回収した封入体を可溶化することによってキメラタンパク質からペプチドを切断し（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度が約１〜２２モルである）；そして、
（ｃ）限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーによって工程（ｂ）の反応混合液から切断されたペプチドを回収する
を含む方法。
【請求項５１】
封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比が約２：１〜約２０：１である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
反応混合液の温度が約５０℃〜約７０℃に維持されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
切断反応を１〜６時間続行させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
切断部位がCysに隣接するリンカーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
リンカーが、DDDD(配列番号：10)、DDDK(配列番号：11)、DTRL(配列番号：12)およびGGPR(配列番号：13)からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
有機酸溶媒が、エチレンジアミン；プロピレンジアミン；2-アミノメチルピリジン；2(2-アミノエチル)ピリジン；2(2-メチルアミノエチル)ピリジン；2,2’-ビピリジル；1,10-フェナントロリン：3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン；3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン；3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール；1,2-ジフェニルホスフィンエタン；トリフェニルホスフィン；ジフェニルホスフィンフェロセン；および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する１つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
パラジウム・プロモーターが、Na2PdCl4；シス−[Pd(en)Cl2]；シス−[Pd(bp)Cl2]；シス−[Pd(phen)Cl2]；シス−[Pd(pn)Cl2]；シス−[Pd(pic)Cl2]；シス−[Pd(dtco-OH)Cl2シス−[Pd(en)(OH2)2]2+、シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+、シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+、シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+；シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+；シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+；および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34)(配列番号：3)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質がT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4、HClO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
有機溶媒がマロン酸である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
有機溶媒が５Ｍマロン酸または６Ｍマロン酸であって、パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
パラジウム・プロモーターがテトラクロロパラジウム酸であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸のモル比が約１０：１である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ペプチドがGLP-1、GLP-2、PTH、GRF、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、チモポイエチン、チモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
パラジウム複合体により促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸、トリカルバリル酸からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む（ここに、反応混合液中の有機溶媒の濃度は約１〜２２モルである）、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異性が高く立体構造に非依存的なパラジウムにより促進されるポリペプチドの加水分解的切断方法であり、封入体（inclusion body）の形態で比較的不溶性のキメラタンパク質を切断することを含む方法を提供する。
【発明の背景】
【０００２】
組換え宿主細胞、例えば大腸菌中でペプチドをコードするＤＮＡを発現させることにより約１００アミノ酸以下の長さのペプチドを生産することは、宿主細胞内で発現されたペプチドの酵素的分解に悩まされ、しばしば部分的または完全にペプチドを損失する結果となることがよく知られている。この問題を克服するために最も一般的に用いられる手段は、宿主細胞内でペプチドを不溶化することである。これは、融合パートナーと連結したキメラタンパク質としてペプチドを発現させることにより実行可能である。通常、融合パートナーはペプチドのＮ末端と融合され得る。キメラタンパク質は、ペプチドがタンパク質分解酵素による分解から保護される封入体を細胞内で形成している。封入体が一旦宿主細胞から回収されれば、ペプチドはリーダー配列から分離され、精製され、活性型に戻されなければならない。リーダー配列からの切断は、適した条件下、例えば酸切断または酵素的切断で特異的に認識され切断されるアミノ酸配列を、リーダー配列とペプチドの連結部に配置することにより行うことができる。
【０００３】
例えば、キメラタンパク質の２つの断片間に酸に不安定なアスパルチル−プロリン結合を挿入することは、低ｐＨにおけるそれらの切断を容易にする。この技術は、ポリペプチドから切断される産物ペプチドが酸に不安定でない場合でなければ、うまくいかない。ホルモン、例えばインスリンおよびソマトスタチンを含むキメラタンパク質は、メチオニン残基のカルボキシル側を特異的に臭化シアンで切断される。この方法は産物ペプチドがメチオニン残基を含む場合には適さない。
【０００４】
部位特異的タンパク質分解によるキメラタンパク質の切断についても、検討されている。チキン・プロα2・コラーゲン・リンカーを含むキメラタンパク質は、精製された微生物コラゲナーゼにより特異的に分解され得、キメラタンパク質の成分を放出する。タンパク質分解酵素の使用は酵素が高価であって、産物ペプチドの切断率が低いことが多く、また、後に所望のペプチド産物からの酵素の分離が困難であることが分かる。所望の組換えタンパク質の精製および回収のための他の方法は、ポリペプチドのＣ末端にポリアルギニン・テイル（poly-arginine tail）を構築することを含む。アルギニン残基は、イオン交換クロマトグラフィーによる精製を容易にするタンパク質の全体的な塩基性度の増加をもたらす。その後のカルボキシベプチダーゼＢによるポリアルギニン・テイルの除去により所望のタンパク質が再生し、所望のタンパク質のｐＩが低下することによって塩基性混入物質からの精製が可能になる。
【０００５】
酸切断は、リーダー配列とペプチドの連結部に特定のジペプチドを配置することにより行われ得る。第二のアミノ酸の選択は、ジペプチド結合が酸性条件下で分解される割合（率）を決定するだろう。もちろん、所望のペプチドが酸切断可能な内生のジペプチド配列を含む場合、リーダー配列とペプチドの連結部の切断部位では、産物の許容できない損失を避けるために内部切断よりも実質的に高い率で酸切断が起こらなければならない。
【０００６】
Zhuらの、J. Am. Chem. Soc. 116: 5218 (1994)には、酸性条件下でパラジウム（ＩＩ）酸（Ｐｄ（ＩＩ））複合体を用いた、S−ヘモ−システイニル−ヒスチジン(Cys(ヘモ)−His)でのシトクロムＣの選択的な切断が記載されている。Zhuらの文献に記載の反応条件下で、シトクロムＣの切断を４０℃で２日間行った結果、たった３５〜５０％の切断率であった（実際、SDS-PAGE分析は非特異的な切断の減少を示した；タンパク質に対するPdのモル比を１：１〜４：１に増加した場合、Cys(ヘモ)-His配列よりも他の部位での切断が見られた）。
【０００７】
Zhuらの文献の5220ページによれば、100mM HBF4、HClO4、およびCF3COOHまたは70％ギ酸がシトクロムＣを切断した。前記文献はその後段に、切断が塩化物イオンの存在により阻害され、生体系から精製されたタンパク質の特記すべき欠点はほとんどの場合に塩化物イオンを含むことだと結論づけている。特に、Zhuらの文献の5219ページには、加水分解率がシトクロムＣの立体構造に依存することが示されている（すなわち、切断は、切断されるペプチド断片の大きさおよび切断されるポリペプチドの配列に影響されると考えられた）。
【０００８】
Douらの「Preliminary Study On The Cleavage Of Chimeric protein GST-CMIV With Palladate(II) complex」、Prep. Biochem & Biotechnol.、301(1)：69-78 (2000) (「Douら」)には、ギ酸、酢酸、リン酸、HBF4および[Pd(en)(H2O)2]2+を用いたセクロピン（cecropin）CMIVキメラタンパク質のパラジウム酸により促進される加水分解的切断が記載されている。Douらは、Cys-His-LysおよびCys-His-Argの２つの切断部位でそのキメラタンパク質を特異的に切断することを目指した。Douらの文献の76ページによれば、HBF4反応媒質のみが、４０℃で反応時間４８時間の実験条件にてキメラタンパク質を切断した。HBF4中での切断は、Cys-Hisに隣接するアミノ酸に依存し、ｐＨ依存的または非依存的なものであると言われていた。Cys-His-Lysでの切断はｐＨ非依存的であるが、Cys-His-Argでの切断はｐＨ依存的である（前記）。さらに、HBF4中におけるどちらかの部位での切断は共に、温度依存的である；温度が６０℃に上昇するとキメラタンパク質が可溶化し、もはや選択的に切断される可能性はなくなる（前記）。Douらは、それらの反応が塩化物イオンの存在により強く阻害され、切断反応前にエクストラ（extra）イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程を用いることを発見した。
【０００９】
文献中、DouらおよびZhuらは、パラジウム酸により促進されるポリペプチドの加水分解的切断は高濃度の酸性有機溶媒中で確実ではないが、切断されるポリペプチドの配列、反応温度、および実用性の高い塩化物含有パラジウム酸を含む塩化物含有種の阻害効果の可能性に依存することを示唆した。Douらは、それらのキメラタンパク質の可溶化が切断の特異性を減ずる結果となることを示している。
【００１０】
つまり、加水分解的ポリペプチド切断方法は高濃度の酸性媒質においてさえ、ポリペプチドの配列、反応媒質の温度または反応媒質中に存在するイオン種のいずれかにより切断率および切断の特異性が制限されることを示唆していた。
【本発明の目的】
【００１１】
本発明の目的は、ポリペプチドを加水分解的に切断する改善された方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、特異性が高く、ポリペプチド配列または切断されるペプチド産物の大きさに影響されない、ポリペプチドの加水分解的切断の改善された方法を提供することである。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、キメラタンパク質の形態、特に比較的不溶性の封入体の形態で組換え的に発現されたポリペプチドの加水分解的切断の改善された方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、特異性が高く、不要の副産物を生成することのない、塩化物含有パラジウム酸（パラダート）種を用いた、ポリペプチドの加水分解的切断の改善された方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１５】
上記の目的に従って、本発明の方法は、様々な反応物質濃度、温度またはｐＨに比較的影響を受けない反応条件下で、パラジウムにより促進されるポリペプチドの加水分解的切断を高い部位特異性で行う方法を提供する。本方法は、立体構造および配列に非依存的であり、すなわち特定の切断部位に隣接するアミノ酸基類の型（タイプ）に関わりなく高い切断率を達成する。さらに、本発明の方法は、不要な副産物の形成を抑え、塩化物を含む触媒および反応媒質の使用を可能とする条件下で、ポリペプチドを切断する。本方法は、単一コピーの組換えポリペプチド、多重コピーの組換えポリペプチド、または単一あるいは多重コピーの組換えキメラタンパク質構築物を高い特異性で切断するために用いられ得る。よって、本方法は、さらなる処理に適した多数の切断されたペプチド断片を生産し得る。
【００１６】
さらに具体的には、本発明は、高濃度の有機酸およびパラジウム・プロモーターを含む反応媒質中にてCys-His切断部位でポリペプチドを切断する方法を提供する。１つの態様では、Cys-His切断部位でペプチドのＮ末端と連結されたリーダー配列を含むキメラタンパク質は、モノカルボン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸およびピルビン酸；ヒドロキシ置換した酸、例えば乳酸、酒石酸およびクエン酸；ジカルボン酸、例えばシュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、コハク酸およびピメリン酸；トリカルボン酸、例えばトリカルバリル酸；糖酸（sugar acid）、例えばグルクロン酸および他のウロン酸；アルドン酸、例えばグルコン酸；および、アルダル酸、例えば糖酸（saccharic acid）からなる群から選択される高濃度の有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム・プロモーターを含む反応混合液中にキメラタンパク質を可溶化することによって切断される。反応混合液中の有機溶媒の濃度は、約１〜２２モルの間である。酢酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸およびトリカルバリル酸は、好ましい酸である。これらの反応媒質は、前述の比較的不溶性であると見なされるキメラタンパク質または封入体を可溶化し、そのような可溶化が実際に、切断の特異性を減ずるよりもむしろ切断されたペプチドの改善された収率をもたらす。重要なことに、本方法は、切断されたペプチドの翻訳後修飾（例えば、アミド化）に必要なさらなる処理を容易にする方法で、そのようなキメラタンパク質を切断する。
【００１７】
好ましい態様にて、（ｉ）反応媒質中における封入体に対するパラジウム・プロモーターのモル比は、約２：１〜約２０：１であり、（ｉｉ）反応混合液の温度は、約５０℃〜約７０℃に維持されており；そして、（ｉｉｉ）溶媒は、有機酸が反応媒質中に１〜２２Ｍの濃度で存在する。
【００１８】
本発明の方法に従ったパラジウムにより促進される酸切断は、封入体、例えばT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)、T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-A (配列番号：2)、T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)またはT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号：4)を可溶化する前記の高濃度の酸性有機溶媒を使用することにより容易にされる。
【００１９】
本発明の方法は、天然に生じるペプチド、合成的に誘導されるペプチドおよび組換え的に誘導されるペプチドを切断するために用いられ得る。本発明の態様を、封入体の形態で組換え的に発現されたキメラタンパク質を切断することに関して後段に詳細に記載した。
【００２０】
本発明の方法は、既知の組換えＤＮＡ調製技術を用いて微生物宿主細胞中で組換え的に発現させ封入体の形態で宿主細胞から回収されたキメラタンパク質を切断するために利用され得る。組換えＤＮＡ法によるタンパク質の発現に有用であることが知られている適当な宿主細胞は、真核および原核の宿主細胞ならびに細胞株を含み、そのようなキメラタンパク質を発現するために用いられ得る。大腸菌は好ましい宿主細胞である。宿主細胞は、その宿主にてキメラタンパク質の発現を促すことのできる調節配列の制御下にそれをコードする発現ベクターと、宿主細胞にて作動する複製開始点を包含する。ベクターは、組換えＤＮＡ技術にて通常用いられる他のＤＮＡ配列、例えば選択マーカーをコードする配列を含んでいて良い。宿主体中で外来遺伝子を発現する方法もまた、当業者に周知である（例えば、Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1989を参照のこと）。
【００２１】
特定のポリペプチドをコードする遺伝子は、増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により全ヌクレオチド配列を化学的に合成するか、目的の遺伝子をクローニングすることにより構築され得る。次に、遺伝子を適した発現ベクターにサブクローニングする。クローニングベクター、発現ベクター、プラスミドおよびウイルスベクターは、当業者に周知である（例えば、Maniatis et al., supra, and Goedell, Methods in Enzymology, Vol. 185 (Academic Press 1990)を参照のこと）。実施例１は、大腸菌におけるほ乳類タンパク質の高レベルな発現に有用なＴ７を用いた発現系（T7-based expression system）の調製の説明を提供する。
【００２２】
発現ベクターを含む宿主細胞を増殖させ、適当な条件下でキメラタンパク質を発現させる。宿主細胞が増殖しキメラタンパク質が発現する条件は、様々な因子、例えば用いた宿主細胞、プロモーターおよび発現させる特定のキメラタンパク質に依存して変化するだろう。当業者は、用いた特定の宿主／ベクター系に適した条件を決定することができる。宿主体中で外来遺伝子を発現する方法もまた、当業者に周知である（例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1989を参照のこと）。特定のポリペプチドをコードする遺伝子は、増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により全ヌクレオチド配列を化学的に合成するか、目的の遺伝子をクローニングすることにより構築され得る。次に、遺伝子を適した発現ベクターにサブクローニングする。クローニングベクター、発現ベクター、プラスミドおよびウイルスベクターは、当業者に周知である（例えば、Maniatis et al., supra, and Goedell, Methods in Enzymology, Vol. 185 (Academic Press 1990)を参照のこと）。実施例１は、大腸菌におけるほ乳類タンパク質の高レベルな発現に有用なＴ７を用いた発現系（T7-based expression system）の調製の詳細な説明を提供する。
【００２３】
ポリペプチドを組換え技術により調製する場合、様々な方法、例えば部位特異的変異導入によってコードしている核酸中に適当なヌクレオチドを挿入または変異させることにより、ポリペプチドの配列内にCys-His切断部位を加えることができる。そのようなCys-His配列は、本明細書に記載のパラジウム複合体により切断される部位を供し得る。組換え法はまた、反復ポリペプチド配列（それぞれの配列がCys-His切断部位により分離される）を有するタンパク質をコードする核酸の生成に用いられ得る。この場合、パラジウム複合体により促進される切断が、ポリペプチド中の多数のCys-His部位で起こり、所望のペプチドの多数のコピーを放出することができる。
【００２４】
Cys-His配列を含むペプチドまたはタンパク質への本発明の方法の利用は、結果としてCys-His配列での選択的切断をもたらす。あるいは、切断を容易にするCysまたはHis残基をペプチドに存する残基に隣接する部位へ挿入し、Cys-His切断部位を作成することができる（例えば、部位特異的変異導入により）。このようにして、挿入されたCys-His部位で選択的切断が起こり、ペプチド断片を生産することができる。所望のペプチドまたはタンパク質が内在性のCys-His配列を含んでいるまれな場合にはパラジウムにより促進される切断はペプチドまたはタンパク質を望ましくない断片に切断するかもしれないが、部位特異的変異導入を用いて、CysまたはHis残基のどちらかを他のアミノ酸に変換し、そのような部位における切断を避けうる。
【００２５】
従って、本発明の方法は、グルカゴン様ペプチド-2(GLP-2)、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、成長ホルモン放出因子(GRF)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、様々なオピオイドペプチド、カエル皮抗生物質ペプチド、例えばゲーグリン 5および6、ブレビニン 1、ラナテリン 1〜9、およびエスクレチン、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（GIP）、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン（thymopoietin）、サイモシン（thymosin）、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシン、タフトシンおよびこれらのペプチドの断片ならびに誘導体を含むが、これに限定されないペプチドを包含するキメラタンパク質の切断を提供する。
【００２６】
多くのポリペプチドが、そのＣ末端にアミドを有し、および／または分子内に-S-S-結合を有する。これらのペプチドの前駆体非アミド化型または還元型はそれぞれ、Cys-His切断部位を挿入された融合構築物として発現され、本発明の方法に従ってパラジウム複合体により切断され得る。その後、産物は、アミド化または酸化され、最終的に所望な分子を産し得る。そのようなペプチドの例は、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓 ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドＹ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチド、インスリン、およびこれらのペプチドの断片ならびに誘導体を含む。
【００２７】
キメラタンパク質と一緒に用いることができるリーダー配列の例としては、細胞からの直接的な蛋白分泌に用いられるようなシグナル配列、構造遺伝子由来のような成熟タンパク質配列のＮ末端部分、リンカー配列、またはそれらの組合せを含む。
【００２８】
本発明の好ましい態様にて、前記キメラタンパク質は、約４００〜１００，０００ダルトンまたはそれ以上（約１，０００〜５０，０００ダルトンの間が好ましい）の分子量を有し、かつ天然アミノ酸、例えばAla (A)、Arg (R)、Asp (D)、Asn (N)、Glu (E)、Gln (Q)、Gly (G)、His (H)、Leu (L)、Ile (I)、Lys (K)、Met (M)、Cys (C)、Phe (F)、Pro (P)、Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V) (かっこ内は１文字表記のアミノ酸コードを表す)のいずれか、またはペプチド化学に通常用いられる側鎖を修飾されたアミノ酸誘導体を含むことができる。後者のアミノ酸誘導体は、例えばニペコチン酸、１−または２−ナフチルアラニン、およびｐ−ベンゾイルアミノ−Ｌ−フェニルアラニンなどを含む。
【００２９】
封入体は、既知の方法、例えば細胞を化学的または機械的に溶解し遠心によって封入体（キメラタンパク質）を分離する方法により宿主細胞から（封入体の形態で）回収され得る。
【００３０】
本発明の方法に基づくパラジウムにより促進される切断中に、パラジウム・リガンド、例えばエチレンジアミン、ピコリルアミン(2-アミノメチルピリジンまたは「pic」)、メチオニン、あるいはヒスチジンを反応混合液に付加し、収率を増すことができる。尿素を、好ましくは少なくとも４Ｍの濃度で反応混合液に付加し、キメラタンパク質の可溶性を増すことができる。切断は、通常約５０℃〜約７０℃の温度で行われる。
【００３１】
本発明の方法の切断工程の反応条件は、用いたパラジウム複合体および切断されるポリペプチドの特性に依存して調整されることが理解されている。パラジウム複合体は、可溶化されて、反応条件に影響する。さらに、好ましい態様では、用いた反応条件は、切断されるポリペプチドを少なくとも一部変性するだろう。
【００３２】
本発明により、ポリペプチドの切断を促進しうるパラジウム酸(Pd (II))複合体は、[Pd(OH2)3(OH)]+、[PdCl4]2-、シス−[Pd(en)(OH2)2]2+、シス−[Pd(pn)(OH2)2]2+、シス−[Pd(pic)(OH2)2]2+、シス−[Pd(bpy)(OH2)2]2+、シス−[Pd(phen)(OH2)2]2+およびシス−[Pd(dtco-OH)( OH2)2]2+を含む。加えて、パラジウム・ヘキサクロライド（palladium hexachloride)として塩化物イオンを有するPd (IV)複合体も、効果的に切断物質を供することができる。Ｐｄ複合体は、当業者に周知の方法（例えば、(H. Hohmann et al., Inorg. Chim. Acta, 174：87 (1990);T. Rau et al., Inorg. Chem., 36: 1454 (1997)；C. Drexler et al., Inorg. Chem., 30: 1297 (1991)、または米国特許番号ＵＳ5,352,771を参照のこと）によって調製され得、あるいは商業的に購入され得る。好ましいパラジウム複合体は、以下の塩類を含む：[PdCl4]2-、[Pd(NCCH3)2(OH2)2]2+、[PdCl6]2-、[Pd(dppe)(OH2)2]2+、[Pd(tpp)(OH2)2]2+および[Pd(dppf)(OH2)2]2。最も好ましいパラジウム複合体は、[PdCl4]2-、[Pd(NCCH3)(OH2)2]2+および[PdCl6]2を含む。前記複合体は、無機塩基、例えばナトリウムまたはカリウムの塩として用いられる。[PdCl4]2-のナトリウム塩が好ましい。
【００３３】
本発明の方法にて、Cys-His部位でのキメラタンパク質の切断は、ヒスチジン残基とＣ末端側でヒスチジンに直接隣接する残基の間のカルボキシアミド結合で起こる。例えば、タンパク質、NH2-Ala-Ala-Cys-His-Gly-Gly-Gly-COOH (配列番号：6)は、以下のように切断される：
【００３４】
NH2-Ala-Ala-Cys-His-Gly-Gly-Gly-COOH (配列番号：6)＋パラジウム複合体→NH2-Ala-Ala-Cys-His-COOH (配列番号：7)
(ポリペプチドは、本明細書中にてアミノ酸略号で表記され、Ｎ末端アミノ酸が左側、Ｃ末端アミノ酸が右側で左から右へ記載され、例えばNH2-Ala-Ala-Cys-His-Gly-Gly-Gly-COOH (配列番号：6)と記載される。）
【００３５】
本発明の方法に従って生産された切断ペプチドを、限外ろ過、沈殿、またはより好ましくはイオン交換クロマトグラフィーによってその融合パートナーから回収することができる。単離されたペプチドに適した商業的に利用可能なイオン交換カラムを用いることができる。多くの場合、イオン交換カラムから回収されたペプチドは、未変性の構造に再び畳み直されるが、特にペプチドがその活性に内生ジスルフィド結合の形成を必要とする場合、付加的工程（例えば、酸化）が、生物活性型にペプチドを回復するために必要かもしれない。
【００３６】
必要に応じて、さらなる精製工程を当業者に既知の技術を用いて行うことができる。そのような工程は、例えばHPLC（例えば、RP-HPLC）または付加的イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む。
【００３７】
本発明の方法に従い、キメラタンパク質T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：1)は、大腸菌中で組換え的に発現され、その後封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである。このキメラタンパク質は、システイン(cys)-ヒスチジン(his)配列で成長ホルモン放出因子ペプチド誘導体、GRF(1-44)-CHと連結されたリーダー配列を有する。T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)は、14残基のシグナル配列に続き、27残基の痕跡（vestigial：Vg)配列（封入体の形成と高発現を誘導する）およびCys-His切断部位を含む13残基のリンカーを共に含む。
【００３８】
単離された封入体を、（ｉ）3M クエン酸、3M 酒石酸、3M マレイン酸、3M〜6Mのマロン酸、3M リンゴ酸および80％ピルビン酸のいずれか、ならびに（ｉｉ）キメラタンパク質(封入体)よりもモル比にして１０倍（10：1）多いテトラクロロパラジウム酸を含む反応混合液中に可溶化することにより、パラジウムにより促進される酸切断を行った。切断反応は、約５０℃〜約７０℃までの温度で１〜２４時間、一般に約１〜６時間行った。ある場合では、エチレンジアミン、ピコリルアミン(2-アミノメチルピリジまたは「pic」)；メチオニンまたはヒスチジンを反応混合液に付加し、収率を増加した。
【００３９】
これらの条件下、２時間という短時間で、約３０％（3M 酒石酸を用いて）〜約５０％（5M マロン酸を用いて）の範囲の収率で切断されたペプチドを得た。rGRF(1-44)-CHは、本発明の好ましい態様により生産された。すなわち、約９０分間の切断工程で、封入体(キメラタンパク質)を5M マロン酸およびテトラクロロパラジウム酸と反応させ(封入体(キメラタンパク質)に対するテトラクロロパラジウム酸のモル比が10:1)、約４５％の切断されたタンパク質を生産し、その後ＨＰＬＣにより精製した。
【００４０】
本発明のもう一つの態様では、ＰＴＨ（１−３４）をコードするＤＮＡをバクテリア発現ベクター中のリーダー配列の下流にクローンし、大腸菌中で発現させ、キメラタンパク質T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)を産生させた。このキメラタンパク質を、封入体として宿主細胞から回収し、3M クエン酸、テトラクロロパラジウム酸ナトリウム、およびpic、メチオニンまたはヒスチジンのいずれかを含む反応混合液中にてパラジウムにより促進される酸切断を行った。この反応は、２時間以内でほぼ１００％の切断されたｒＰＴＨ（１−３４）を産した。
【００４１】
本発明のさらに他の態様では、ＰＴＨ（１−８４）をコードするＤＮＡをバクテリア発現ベクター中のリーダー配列の下流にクローンし、大腸菌内で発現させ、キメラタンパク質 T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号：4)を産した。このキメラタンパク質を、封入体として宿主細胞から回収し、3M クエン酸または5M マロン酸のいずれかを含む反応混合液中にてパラジウムにより促進される酸切断を行った。エチレンジアミン(5.2mM)およびテトラクロロパラジウム酸(2.6mM)を、これらの２つの切断試料溶液にそれぞれ付加し、切断反応を６０℃で４時間行い、ＨＰＬＣによる測定の結果、約５０％の切断されたｒＰＴＨ（１−８４）が生産された。 
【００４２】
本発明の他の態様を、以下の実施例により開示するが、これらは例示にすぎず本発明を限定するものではない。実施例は、具体例としてT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-A (配列番号：2)、T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)、T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)およびT7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号：4)のパラジウムにより促進される切断を示し、一般的に用いられる方法を開示するために提供される。
【実施例】
【００４３】
実施例１
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)前駆体ペプチドの発現：
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)は、以下のように大腸菌中で組換え的に発現される。リーダー-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：23)ポリペプチド(図7)をコードする発現プラスミドを含む大腸菌を、トリプトン、酵母、グルコース、バッチ塩類（ナトリウムおよびカリウム、モノリン酸塩およびジリン酸塩、ならびに硫酸アンモニウム）および抗生物質を含む５００ｍＬの振とうフラスコで増殖させた。植菌した振とうフラスコを回転振とうした（２００ｒｐｍ、３７℃）。培養液が５４０ｎｍで０．８〜１．８の吸光度（ＯＤ）に達した時点でインキュベーションを終了した。
【００４４】
５Ｌ〜１００Ｌ容量の発酵槽に、振とうフラスコ培養を用いて植菌した。媒質は、バッチ塩類、グルコースおよびキレート金属溶液（クエン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸・塩化第二鉄、塩化亜鉛、塩化コバルト、モリブデン酸ナトリウム、塩化マンガン、塩化カルシウムおよび硫酸銅）を含む。媒質のｐＨを、植菌する前に６．９に調節し、培養の間ｐＨ６．９に維持した。溶存酸素を、撹拌および酸素補給により約４０％に維持した。シリコンベースまたはポリプロピレン・グリコールベースの「消泡剤」を、発酵培養液の泡形成を減ずるために「必要に応じて」無菌的に付加した。
【００４５】
発酵培養液のＯＤが５４０ｎｍで２５に達した時、フィルター滅菌したイソプロピルチオガラクトシド(IPTG、 600 mM)を終濃度０．５ｍＭで付加し、次にフィルター滅菌したマグネシウム誘導サプリメント(クエン酸カリウムおよび硫酸マグネシウム)を付加して組換えタンパク質の発現を誘導した。培養液をさらに６時間インキュベートし、その後１０℃〜１５℃に冷却した。
【００４６】
実施例２
封入体、T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)前駆体ペプチドの単離：
生じた発酵槽の細胞を遠心により発酵ブロスから採取した。細胞ペレットを集め、溶菌緩衝液（lysis buffer）(993gの水に6g トリス遊離塩基と0.93g EDTA)の適量（例えば、５Ｌの発酵槽由来の物質に対し２Ｌの溶菌緩衝液）に再懸濁し、高圧ホモジナイザー中で溶解した。
【００４７】
細胞固形物と封入体を含むペプチド前駆体を遠心によりペレットとし、集め、約1.0のｐＨで1.5M クエン酸／1.0mM EDTA溶液中でホモジナイズして溶解した（例えば、5L発酵槽からの物質に対し1.5L溶液）。この懸濁液のｐＨを、温度を１５℃以下に維持しつつ連続的に混合しながら10M 水酸化ナトリウムをゆっくり付加して４．９に調整した。ＧＲＦ前駆体ペプチドを含む沈殿物を遠心により集め、水に再懸濁して２度洗浄し、遠心してペレットとした。
【００４８】
実施例３
パラジウム酸切断プロモーターの調製：
以下の化学物質の略号を本明細書にて用いた：en＝エチレンジアミン；pic＝ピコリルアミン(または2-アミノメチルピリジン)；aep＝2(2-アミノエチル)ピリジン；dien＝ジエチレントリアミン。
Na2PdCl4およびK2PdCl4は、Aldrich Chemical Co.とStrem Chemical Co.から購入した。
テトラクロロパラジウム酸の固形試料を適当な水性溶媒中に溶解し、約２５０ｍＭ濃度にした。その後、一部を反応混合液により適切な濃度まで希釈した。溶媒を、検討中の反応の酸性溶液と同様になるように選択した。
【００４９】
実施例４
分析方法：
以下の分析方法および装置を用いた。
HPLC 方法１：
Microsorb-MV Cyano-C8 100 Å、5μm、4.6×150 mmカラムを用いる、逆相クロマトグラフィー(Catalog #R0086800D5)。
移動相系は以下の通りであった。Ａ＝5％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸；Ｂ＝95％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸。
封入体試料を定量するために用いた勾配は、以下の通りであった(t＝0、時間)：10〜100％B (10.8分)、100％B (0.6分)、100〜10％B (0.6分)；流速1 mL/分；室温。
クエンチした反応を分析するための勾配は、以下の通りであった： 20〜30％B (3分)、30〜40％B (6分)、40〜100％B (1.5分)、100〜20％B (0.6分)、20％B (3分)；流速１mL／分；30℃。
吸光度を２１０−３２０ｎｍで測定した。
【００５０】
HPLC 方法２：
Waters Symmetry C18、100 Å、3.5μm、4.6×150 mmカラムを用いた逆相HPLC。移動相系は以下の通りであった：Ａ＝5％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸；Ｂ＝95％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸。勾配は、25〜33％B(24 分)、33〜60％B(6 分)、60〜90％B(1分)、90〜25％B(0.5 分)、25％B(4 分)；流速１mL/分；40℃。吸光度を２１０−３２０nmで測定した。
【００５１】
HPLC 方法３：
Waters Symmetry C18カラム、100Å、3.55μm、2.1×150 mmカラムを用いる、LC/MS法。移動相系は以下の通りであった：Ａ＝10％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸；B＝60％(v/v)アセトニトリル、0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸。勾配は、20〜30％B(１分)、30〜50％B(25 分)、50〜100％B(４分)、100〜20％B(1 分)、20％B (7 分)；流速0.25 mL/分；40℃。吸光度を２１０〜３２０nmで測定した。LCQ Duo MS検出器を、7〜19分と24〜30分の間、ソースに設定した。走査（scan）を、700−2000 m/zユニットに設定し行った。
【００５２】
すべての逆相HPLCデータは、フォトダイオードアレイ検出器を用いる、Beckman System Gold HPLCにて収集されたものである。LC/MSデータは、フォトダイオードアレイ検出器およびThermoQuest Finnigan LCQDuo質量検出器を備えた、ThermoQuest Surveyor HPLCにて収集されたものである。
【００５３】
パラジウム複合体切断反応条件では、複合体中で、パラジウムとGRFおよびPTH誘導体の結合を生じ、その結合は分析的HPLC条件下で残存するのに十分強い。それ故、GRF-A-誘導試料を注入前に、尿素/トリカルボキシエチルホスフィン(TCEP)中に終濃度6.8M 尿素および5mM TCEPとなるように１０倍希釈し、強固に結合したパラジウムを除去した。
【００５４】
別法として、６倍希釈し終濃度20mM チオ尿素および200mM HClの溶液にすることにより、同様の効果を達成することができた。あるいは、0.4M NaClに４倍希釈し、ＨＰＬＣに試料を注入する前に沈殿を遠心することにより、同様の効果を達成した。GRF(1-44)-CH分析試料を、以下に記載のように処理した。PTH(1-34)試料を、0.25M HClおよび25mM チオ尿素中に６倍希釈することにより処理した。PTH(1-84)試料を、終濃度20mM チオ尿素および7M 尿素となるように１０倍希釈した。
【００５５】
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)のパラジウム切断の最適化の間、パラジウムがC末端CH部位に強固に結合していることが分かった。このPd-GRF複合体は変化したスペクトルを有しており、ピーク領域が増加し、すなわち切断による収率が増大した。試料を調製するための処理方法（dtc処理と呼称）を開発した。処理方法は以下の通りである。試料50μLを、8M 尿素中、20mM ジエチルジチオカルバミン酸(ddtc)ナトリウム溶液425μLに付加し、５分間室温で放置する。インキュベーション後、100mM TCEPを25μL付加し、試料を遠心し、黄色のパラジウム酸沈殿物を除去する。
【００５６】
実施例５
クエン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala(配列番号：2)のPdにより促進される加水分解的切断：
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号：2)前駆体ペプチド(図6)を実施例１に記載した手順で調製し、封入体を実施例２のように単離し、封入体１ｇ（湿潤重量）を3M クエン酸５０ｍＬに溶解した（ペプチド濃度3mg/mL）。その溶液を等量の２液に分け、それぞれにテトラクロロパラジウム酸を付加し、5.56mM濃度とした。一方の溶液に11mM エチレンジアミンを付加した。その溶液を６０℃で５時間インキュベートし、一部を１時間毎に採取し、クエンチし、実施例４の方法１を用いるHPLCにより分析した。結果を、GRF(1-44)-Alaの理論的最大予想収率（maximum theoretically expected yield）に対する割合として表１に示した。
表１：エチレンジアミンの有無にて、クエン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号：2)を用いた、テトラクロロパラジウム酸の反応の時間コース
【表１】
2005527632.tif 000003
【００５７】
エチレンジアミン処理した反応混合液におけるより高い収率は、エチレンジアミンがT7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号：2)のパラジウムにより促進される切断における、GRF(1-44)-Alaの達成可能収率を増加することを示す。
【００５８】
実施例６
3Mクエン酸、3M 酒石酸、3M マレイン酸、3M マロン酸、3M リンゴ酸および80％ピルビン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)のテトラクロロパラジウム酸により促進される加水分解的切断
【００５９】
3Mクエン酸、3M酒石酸、3M マレイン酸、3M マロン酸、3M リンゴ酸および80％ピルビン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)の可溶化および切断を検討した。それぞれの酸を、エチレンジアミンを添加して、または添加せずに調べた。それぞれの酸について、前駆体ペプチドを、〜5mg/mLまたは0.45mM 前駆体ペプチドを目指しながらプラスチック・プローブとOMNI 5000 high-sheer homogenizerを用いてホモジナイズした。可溶化後、ｔ＝０時間点で採取したそれぞれの溶液の試料を、100％理論切断率の測定に用い、それぞれ個々の酸における構築物の可溶性を試験した。テトラクロロパラジウム酸を、Cys-His１つに対し５モル過剰に、または4.5mM付加した。エチレンジアミンが存在する反応にて、パラジウムを２：１過剰に付加した。前記反応を６０℃で６時間行い、１時間毎に時間点を取った。時間点を、48mM チオ尿素で６倍に希釈した(終濃度、40 mMチオ尿素)。すべての分析的分析を、実施例４の方法１に記載の方法を用いて行った。これらの実験の結果は、全ての場合の切断が時間依存的に起こり、最大収率はマロン酸を用いて約３時間で成される約６３％であることを示している（図１）。マレイン酸中の反応は非常にゆっくりであった。エチレンジアミン存在下での反応は、一般にゆっくりであるが、マロン酸中で６時間後に約６８％というより高い収率を達成した。
【００６０】
実施例７
マロン酸および酒石酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)のテトラクロロパラジウム酸により促進される加水分解的切断における温度の効果
マロン酸および酒石酸中におけるテトラクロロパラジウム酸切断をさらに検討するために実験マトリクスを設計した。マトリクスを以下のように調製した： 5M マロン酸と4mM テトラクロロパラジウム酸、それぞれ５０℃および６０℃。3M 酒石酸に対し、4mM テトラクロロパラジウム酸を用いた。試料をddtc処理し、実施例４の方法２および３を用いて分析した。図３は５０℃と比較し、６０℃の試料がかなり早く切断したことを示す。マロン酸は、２時間以内に約５５％の最大切断率に達した。同様の結果が酒石酸で見られたが、収率はかなり低かった。より低温での反応は速度が遅く、有効収率を達するために実用的でない。
【００６１】
実施例８
マロン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)の切断のためのテトラクロロパラジウム酸およびマロン酸濃度の最適化
マロン酸とテトラクロロパラジウム酸両方の濃度の効果を測定するためにマトリクスを設計した。それぞれの反応を約5mg/mLの構築物にて行った。マロン酸シリーズは、2、3、4、5および6M マロン酸と共に、5mM テトラクロロパラジウム酸および10mM エチレンジアミンを含む。第二のシリーズは、それぞれ6M マロン酸と、2、3、5および10mM テトラクロロパラジウム酸および4、6、10ならびに20mM エチレンジアミン中で行った。反応液を、６０℃で2、4、6および18時間の時間点で採取した。それぞれの時間点を、8M 尿素、20mM ddtcおよびTCEPで１０倍に希釈した。分析は、実施例４の方法１を用いた。図４は、至適マロン酸濃度が5Mであることを示し、図５は、3〜5mM テトラクロロパラジウム酸が同等であり高収率を供することを示す。
【００６２】
実施例９
T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)の生産
実施例１に記載の方法を用い、PTH(1-34)をコードするＤＮＡを、バクテリア発現ベクターにおけるリーダー配列、T7tag-Vg-G5PR (配列番号：8)の下流にクローンし、T7tag-Vg- G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)を作製した。基本的に実施例２のGRF(1-44)-CHの生産に関して記載したようにして、発現構築物で形質転換した大腸菌より、封入体調製液を得た。沈殿した封入体を水に懸濁し超音波処理して洗浄し、遠心してペレットを得た。
【００６３】
実施例１０
テトラクロロパラジウム酸によるT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)の切断
実施例９からのペレットを、表１に示したようにクエン酸とパラジウム酸複合体の混合液中に6mg／mLの濃度で溶解した。
溶液を、６０℃〜７０℃の温度で表２に示した時間インキュベートした。以下に示したように、反応液はさらに、テトラクロロパラジウム酸より約２倍モル過剰に付加した物質を含み、産物PTH(1-34)の収率に影響し得るかどうかを測定した。規定のインキュベーション時間後、反応液を0.2mM HCl中に１：１０に希釈し、１６時間室温で保存した。その後、混合液を2mM チオシアン酸カリウムで処理し、未反応のPd複合体と封入体を沈殿させた。
【００６４】
反応中にキメラタンパク質から切断したPTH(1-34)の量を測定するためにＨＰＬＣを用いた。処理後の物質を、緩衝液Ａ(水に5％アセトニトリル、0.1％TFA含有)中でPhenomenex 5 micron C18 逆相分析カラムにロードした。カラム溶出を、緩衝液Ａ中にて緩衝液Ｂ(0.1％TFA中に95％アセトニトリル)の線形勾配で行った(4分間で30％B、30％Bに４分間維持し、３３分に50％Bとし、その後３５分に100％Bに上昇)。２つの主なペプチド含有ピークを得た：一つは１５．４分、もう一つは１６．６分。１５．４分のピークのMALDI-TOFマススペクトルは、４１１９で単一のピークを与え、示したピークはPTH(1-34)のピークと同一の質量を有していた。標準品のPTH(1-34)も、ＨＰＬＣ分析で１５．４分に単一のピークを与え、切断した物質由来の１５．４分のピークがPTH(1-34)であることを示した。PTH(1-34)のテトラクロロパラジウム酸により促進された切断の全結果を表２に示した。
表２：T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)のテトラクロロパラジウム酸により促進された切断によるPTH (1-34)の収率
【表２】
2005527632.tif 000004
【表３】
2005527632.tif 000005
これらの結果は、高濃度のクエン酸中でテトラクロロパラジウム酸(II)ナトリウムと一緒に６０℃−７０℃でインキュベートした場合の、キメラタンパク質を含む封入体由来のPTH(1-34)の迅速かつ高収率の切断を示す；pic、D/Lメチオニンまたはヒスチジンの存在下、天然PTH(1-34)のほぼ100％の切断が、２時間以内で得られた。
【００６５】
実施例１１
T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号：4)の生産
PTH(1-84)をコードするＤＮＡを、実施例１に開示の技術を用いて、バクテリア発現ベクター中のリーダー配列T7tag-Vg-D4K(配列番号：9)の下流にクローンし、T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)を作製した。全細胞調製液を、基本的に実施例１のGRF(1-44)-CHの生産に関する上述のように発現構築物で形質転換した大腸菌から得た。全細胞を遠心により集め、凍結保存した。少量の液を超音波処理により細胞を破壊して調べた時、前駆体ペプチドは封入体と上清液の間に分布していた。
【００６６】
T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号：4)封入体から作製した全細胞ペーストの一部の約１ｇを、20mLの3M クエン酸および20mLの5M マロン酸に溶解した。両溶液を遠心により分離した。遠心した両溶液からの上澄み液を、２つの試料に分けた。生じた４つの溶液それぞれが、封入体を約２ｍｇ／ｍＬ含んでいた；エチレンジアミンを１つのクエン酸試料と１つのマロン酸試料に５．２ｍＭの濃度で付加し、２つの切断試料を作成した。テトラクロロパラジウム酸(2.6mM)を４つの切断試料それぞれに付加し、切断試料を４時間６０℃に維持した。試料を、２つの切断試料それぞれから回収し、LC-MSおよびPAGEにより定性的に分析した。２つの切断試料を、尿素中でトリカルボキシエチルホスフィンと処理し、パラジウム酸を除去し、その後試料を実施例４の方法３により分析した。
【００６７】
切断反応は、両方の試料にて４時間で完結し、約５０％の収率でのPTH(1-84)の生産が見られた（マススペクトルにより同一性確認）。図１０は、ゲル電気泳動分析により測定された得られた切断の量を示す。
【００６８】
すべての刊行物、特許および特許出願は引用により本明細書に包含される。上述の明細書にて本発明は、その好ましい態様に関して記載され、多くの詳細な記載が例示の目的で示されているが、本発明には態様を追加する余地があり、本明細書に詳述した事項が発明の基本原則を逸脱しない範囲で相当に変更されうるということは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、種々の有機酸中における６時間にわたるT7tag-D4K-CH-GRF(1-44)-CH(配列番号：5)のテトラクロロパラジウム酸切断を示す。種々の酸を以下に示す：マロン酸(長い破線)、酒石酸(丸い点線)、ピルビン酸(交互の破線)、クエン酸(短い破線)、リンゴ酸(四角の破線)、およびマレイン酸(実線)。
【図２】図２は、本発明の方法によるエチレンジアミンの存在下での種々の有機酸中における、６時間にわたるT7tag-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：5)のテトラクロロパラジウム酸切断を示す。種々の酸を以下に示す：マロン酸(長い破線)、酒石酸(丸い点線)、ピルビン酸(交互の破線)、クエン酸(短い破線)、リンゴ酸(四角の破線)、およびマレイン酸(実線)。
【図３】図３は、本発明の方法による異なる温度でのマロン酸および酒石酸中におけるT7tag-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：5)の切断収率を示す。実線：60℃におけるマロン酸、点線：50℃におけるマロン酸、破線:50℃における酒石酸、長い破線：50℃における酒石酸。
【図４】図４は、本発明の方法によるマロン酸濃度の関数としてのT7tag-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：5)の切断を示す。酸濃度は、下の曲線から上の曲線までそれぞれ2、3、4、5および6モルである。
【図５】図５は、本発明の方法によるテトラクロロパラジウム酸濃度の関数としてのT7tag-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：5)の切断を示す。テトラクロロパラジウム酸濃度は、下の曲線から上の曲線までそれぞれ、2、3、5および10mMである。
【図６】図６は、キメラタンパク質 T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号：2)のヌクレオチド配列(配列番号：14)およびアミノ酸配列(配列番号：15)を示す。
【図７】図７は、キメラタンパク質 T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号：1)のヌクレオチド配列(配列番号：16)およびアミノ酸配列(配列番号：17)を示す。
【図８】図８は、キメラタンパク質 T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号：3)のヌクレオチド配列(配列番号：18)およびアミノ酸配列(配列番号：19)を示す。
【図９】図９は、キメラタンパク質 T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号：4)のヌクレオチド配列(配列番号：20)およびアミノ酸配列(配列番号：21)を示す。
【図１０】図１０は、本発明の方法によるクエン酸およびマロン酸中におけるT7tagVgD4KCH-PTH(1-84) (配列番号：4)の切断を示す。矢印は、T7tagVgD4KCH-PTH(1-84) (配列番号：4)前駆体ペプチド、PTH(1-84)およびT7tagVgD4KCHの位置を示す。
【配列表】
2005527632.tif 000006
2005527632.tif 000007
2005527632.tif 000008
2005527632.tif 000009
2005527632.tif 000010
2005527632.tif 000011
2005527632.tif 000012
2005527632.tif 000013
2005527632.tif 000014
2005527632.tif 000015
2005527632.tif 000016
【図１】
2005527632.tif 000017
【図２】
2005527632.tif 000018
【図３】
2005527632.tif 000019
【図４】
2005527632.tif 000020
【図５】
2005527632.tif 000021
【図６】
2005527632.tif 000022
【図７】
2005527632.tif 000023
【図８】
2005527632.tif 000024
【図９】
2005527632.tif 000025
【図１０】
2005527632.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月24日(2005.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005527632000001.app
【国際調査報告】
2005527632.tif 000027