(57)【要約】本発明は、電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３及び（ＩＩ）ＣＨ２＝ＣＲ４−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであり、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであるが、その際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６の少なくとも１つがＣ１−Ｃ４アルキルである）の重合化モノマー単位を含む、上記ゲルに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３及び（ＩＩ）ＣＨ２＝ＣＲ４−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであり、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであるが、その際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６の少なくとも１つがＣ１−Ｃ４アルキルである）の重合化モノマー単位を含む、上記ゲル。
【請求項２】
Ｒ２及びＲ３がＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項３】
Ｒ２及びＲ３がＣＨ３である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項４】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２及びＲ３がＣＨ３である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項５】
Ｒ５及びＲ６が、同じ又は異なるものであり、水素又はプロパノールである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項６】
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６がＨである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項７】
Ｒ４及びＲ５がＨであり、Ｒ６がプロパノールである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項８】
単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比が約１：１０〜約１０：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項９】
単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比が約１：５〜約５：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１０】
単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比が約１：２〜約２：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１１】
単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比が約１：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１２】
アクリルアミドとジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の混合物、又はＮ−アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）とジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の混合物を含むものである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１３】
モル比が約１：１のアクリルアミド：ＤＭＡ又はＡＡＰ：ＤＭＡを含む、請求項１２に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１４】
固体支持体又は支持シートに結合させたものである、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１５】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離又は分析する方法であって、請求項１に記載のＩＰＧゲルを用いて、サンプルに対して等電点電気泳動を実施することを含む、上記方法。
【請求項１６】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を可溶化することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが、細胞外液、組織サンプル、細胞サンプル、微生物サンプル及び培養物サンプルからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
高分子がタンパク質である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
可溶化が、サンプルと疎水性溶剤とを混合することを含む方法により実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
疎水性溶剤が、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤及び還元剤からなる群より選択される活性成分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
疎水性溶剤が、スルホラン若しくはスルホレン又はそれらの混合物を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にサンプルを電気泳動させることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中の少なくとも１種の高分子の分離又は分析における、請求項１に記載のＩＰＧゲルの使用。
【請求項２４】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離又は分析するためのキットであって、可溶化剤、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、及び場合により使用説明書を含む、上記キット。
【請求項２５】
可溶化剤が疎水性溶剤である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
疎水性溶剤が、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤及び還元剤からなる群より選択される活性成分を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
疎水性溶剤が、スルホラン若しくはスルホレン又はそれらの混合物を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、アクリルアミドとジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の重合化モノマー単位、又はＮ−アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）とジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の重合化モノマー単位を含むものであり、該重合化モノマー単位はモル比が１：１である、上記ゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中で高分子を分析するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子を分析する分野では、一次元及び二次元ゲル電気泳動が、高分子を分離及び可視化するための標準的手段となっている。
【０００３】
一次元ゲル電気泳動によれば、変性条件下のポリアクリルアミドゲルにおいて、電気泳動させることにより、タンパク質のような高分子の混合物を質量差に従って個々の成分に分離することができる。まず、高分子の混合物を、例えば、アニオン両親媒性界面活性剤である、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液中に可溶化させる。タンパク質に関しては、この界面活性剤は、天然のタンパク質中のほぼすべての非共有相互作用、すなわち、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−脂質相互作用の大部分を破壊する。ＳＤＳのアニオンは、２個のアミノ酸残基につき約１個のＳＤＳという比でタンパク質の主鎖と結合し、これにより、ＳＤＳと変性タンパク質の複合体に、大きな負の実効電荷が賦与され、この電荷は、タンパク質の質量と大体比例する。次に、ＳＤＳを含むアクリルアミドゲルにおいて、上記タンパク質の混合物を電気泳動させる。
【０００４】
高分子の混合物を分離、分析及び可視化する、さらに感度の高い手段は、二次元電気泳動である。このような二次元電気泳動は、通常、一次元での等電点電気泳動と、二次元でのＳＤＳゲル電気泳動による連続的分離を含む。
【０００５】
等電点電気泳動は、電気泳動により、酸性及び塩基性残基の相対含量に基づいてタンパク質を分離する。印加された電場の影響下で、高度荷電タンパク質は、サイズ又は形状が類似するがこれより低荷電のタンパク質より速く移動する。タンパク質をサンプルゾーンから非対流媒質（典型的には、ポリアクリルアミドのようなゲル）を介して移動させると、電気泳動による分離が起こる。タンパク質は、このタンパク質がゼロの実効電荷を持つｐＨ値の領域（等電点、ｐｌ）に入ると、媒質に対して移動を停止する。さらに、移動が、陽極から単調に増加するｐＨ勾配によって起こる場合には、タンパク質は、その等電点に「集束（focus）」することになる。従って、異なる比率の荷電（すなわち滴定）アミノ酸を有する２つのタンパク質は、それらの異なる等電点によって分離することができる。実際に、この分離方法により、それぞれの配列において数百のうち１以下の荷電アミノ酸が異なる２つのタンパク質を分離することができる。
【０００６】
等電点電気泳動は、通常、共有結合により固定化したｐＨ勾配を含むポリアクリルアミドゲルの薄い平板ストリップ（例えば、ＩＰＧゲルストリップ）上で実施する。ＩＰＧゲルストリップは、脱水状態のものが市販されており、使用前に適当な溶液中で再水和させる。重要なことは、再水和溶液は、分離しようとするタンパク質を含む溶液と適合性でなければならないことである。
【０００７】
実際には、二次元ゲル電気泳動によって、目的とする高分子を含む細胞及び組織サンプルを溶解させ、抽出液で可溶化させる。目的とする高分子は、それらの自然電荷を保持したまま、可溶化させなければならない。非変性条件下で、いくつかの膜タンパク質は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤の溶液による抽出などの比較的穏やかな手段により、可溶化させることができる。変性条件下では、多くの膜タンパク質は比較的不溶性であり、強力な界面活性剤及びカオトロピック試薬、又は有機溶剤でしか可溶化することはできない。
【０００８】
変性条件下で膜タンパク質を可溶化するのに用いられる溶液としては、弱塩基であり、かつ低疎水性であるカオトロピック試薬の尿素、又はチオ尿素を含む溶液が挙げられる。従って、尿素を含む溶液は、ＩＰＧゲルを再水和するために用いられる。例えば、尿素溶液は、弱い疎水性のタンパク質を可溶化させ、市販のゲルと一緒に用いるのに有効であることが知られている（例えば、Pharmacia、Immobiline DryStrips）。通常の溶液の具体的な例としては、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、２ｍＭ  ＴＢＰが挙げられる。
【０００９】
しかし、非常に疎水性が高いタンパク質を含む細胞膜は、細胞膜タンパク質を可溶化するのに、非常に疎水性の高い抽出液を必要とする。このような高度に有機物をベースとした溶液（highly organic based solution）は、これまで、二次元電気泳動と一緒に用いられていなかった。なぜなら、市販のＩＰＧストリップ（二次元電気泳動の一次元における泳動）は、疎水性及び親水性相互作用のために、高度に有機物をベースとする溶液中で再水和するのに、適正な化学組成を有していないからである。例えば、スルホラン抽出液は、通常の１００％アクリルアミドＩＰＧストリップを再水和することができない。このために、等電点電気泳動用のタンパク質の可溶化には、弱い疎水性の溶液が使用されてきたのである。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、改善されたＩＰＧゲルを生成するために、親水性及び疎水性モノマーの混合物を含むハイブリッドＩＰＧゲルを生成した。
【００１１】
好ましくは、本発明のＩＰＧゲルは、市販のゲルより疎水性が高く、また、このＩＰＧゲルは、両親媒性であり、安定性が向上しているのが好ましい。さらに、これらのＩＰＧゲルは、好ましくは、スルホランのような強度の疎水性抽出液と一緒に用いることができ、これによって、サンプルから、さらに広い範囲のタンパク質及びその他の高分子を抽出することが可能になる。
【００１２】
本発明は、広範なタンパク質及びその他の高分子の分離に適した多様な特徴を有する様々なゲルを提供する。
【００１３】
従って、第１の態様では、本発明は、電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、該ゲルは、親水性及び疎水性モノマーの混合物を含み、該モノマーの少なくとも１つが１以上の低級アルキル基を含む、上記ゲルに関する。好ましくは、上記ゲルは、（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３及び（ＩＩ）ＣＨ２＝ＣＲ４−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであり、水素又はＣ１−Ｃ４アルキルであるが、その際、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６の少なくとも１つがＣ１−Ｃ４アルキルである〕の重合化モノマー単位を含む。
【００１４】
第１態様の第１の好ましい実施形態では、本発明は、電気泳動に用いるためのＩＰＧゲルであって、アクリルアミドとジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、又はＮ−アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）とジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の混合物を含む、上記ゲルに関する。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び／又は分析する方法であって、本明細書に記載した本発明のＩＰＧゲルを用いて、サンプルに対して等電点電気泳動を実施することを含む上記方法に関する。
【００１６】
好ましくは、上記方法はさらに、サンプル中の少なくとも１種の高分子を可溶化することを含む。
【００１７】
第２の態様に記載した方法に続いて、さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離又は分析を実施するのが好ましい。特に好ましい実施形態では、このような分離は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で実施する。
【００１８】
第２態様の方法は、好ましくは通常の分離方法と組み合わせることにより、改善された分離及び分析を達成する。
【００１９】
第３の態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び分析するための、本明細書に記載した本発明のＩＰＧゲルの使用を提供する。好ましくは、上記高分子は、タンパク質の混合物におけるタンパク質である。
【００２０】
第４の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離及び／又は分析するためのキットであって、可溶化剤、本発明の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、並びに、場合により、使用説明書を含む、上記キットに関する。
【００２１】
略語
ＡＡＰ：Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール
ＤＭＡ：ジメチルアクリルアミド
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＥＭＥＤ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
ＡＰＳ：過硫酸アンモニウム
Ｔ：全アクリルアミド
Ｃ：架橋剤
ＡＳＢ：アミドスルホベタイン；テトラデコノイルアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホネート
ＴＢＰ：トリブチルホスフィン
ＰＤＡ：ピペラジンジアクリルアミド
Ｔｒｉｓ：トリスバッファー
ＭＱ水：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（精製水）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明によれば、ＩＰＧゲルは、親水性及び疎水性モノマーサブユニットの混合物を含み、該サブユニットの少なくとも１つが１以上の低級アルキル基を含むものである。好ましくは、本発明のＩＰＧゲルは、アクリルアミドだけで生成したゲルよりも疎水性が高い。
【００２３】
重合化ゲルマトリックス
第１の態様によれば、ゲルは、固定化ｐＨ勾配ゲルであり、好ましくは、（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３及び（ＩＩ）ＣＨ２＝ＣＲ４−ＣＯ−ＮＲ５Ｒ６の重合化単位を含む。
【００２４】
好ましくは、単位（Ｉ）のＲ２及びＲ３はＣ１−Ｃ４アルキルであり、さらに好ましくはＲ２及びＲ３はＣＨ３である。特に好ましい実施形態では、単位（Ｉ）において、Ｒ１はＨ１であり、Ｒ２及びＲ３はＣＨ３である。
【００２５】
別の実施形態では、単位（ＩＩ）において、Ｒ５及びＲ６は、同じ又は異なるものであり、水素又はプロパノールである。一実施形態では、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はＨである。最も好ましい実施形態では、単位（ＩＩ）において、Ｒ４及びＲ５はＨであり、Ｒ６はプロパノールである。
【００２６】
一実施形態では、単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比は、約１：１０〜１０：１である。好ましくは、単位（Ｉ）：単位（ＩＩ）のモル比は、約１：５〜５：１であり、さらに好ましくは約１：２〜２：１であり、最も好ましくは１：１である。
【００２７】
好ましい実施形態では、ゲルを乾燥させ、その乾燥状態で保存することができる。
【００２８】
一実施形態では、上記ゲルは、ＤＭＡ及びアクリルアミドの混合物を含む。ＤＭＡは、アクリルアミドとは２個余分のメチル基がある点で異なる、疎水性分子である。このＩＰＧゲルは、通常の抽出サンプル溶液及び疎水性スルホラン溶液中で、実質的に再水和するのが好ましい。
【００２９】
好ましくは、再水和は、ＩＰＧストリップへの溶液の吸収により測定される。好ましくは、この測定は、乾燥ゲルと再水和ゲルとの重量差を算出することによって実施することができる。好ましくは、上記ストリップは、少なくとも「流延量（cast volume）」、すなわち、流延（casting）時の長さ×幅×厚さまで再水和する。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、上記ゲルは、ＡＡＰとＤＭＡの混合物を含mu。好ましくは、このゲルは、スルホラン抽出液、通常の抽出液、並びに、水をベースとする抽出液を用いて、再水和することができる。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、ＩＰＧゲルは、約１：１のモル比のアクリルアミドとＤＭＡ、又はＡＡＰとＤＭＡを有する。
【００３２】
好ましくは、ＩＰＧゲルは、安定しており、両親媒性を有する。
【００３３】
本発明によれば、安定なゲルプレートは、洗浄、乾燥させて、使用前の好適な期間保存することができるものである。好ましくは、安定なゲルプレートは、その機能性を失うことなく、室温又は低温で約１年間まで保存することができる。好ましくは、ゲルプレートは、保存の後、再水和することができ、確立されたｐＨ表面特性を提供すると共に、比較的脆弱になりにくい又は折れにくい傾向を呈する。好ましくは、ゲルプレートは、好適な条件（暗室又は低温）下で保存する期間中、重合化ヒドロゲルの化学分解に対して実質的に耐性である。
【００３４】
好ましくは、本発明に係るゲルプレートを下記の文献に記載されている標準的方法に従い、安定性について試験する：
１）Kirkwood, T.B.L Predicting the stability of biological standards and products. Biometrics 33:736-742（1977）；
２）Porterfield, R.I、及びCapone, J.J. Applications of Kinetic models and Arrhenius methods to product stability evaluations. Med. Devices Diagn. Industry April 1984, pg 45-50；
３）Kennon, L. Use of models in determining chemical pharmaceutical stability. J. Pharm. Sci. 53: 815-818（1964）
尚、上記文献は、本明細書に参照として組み込むものとする。
【００３５】
好ましくは、本発明のゲルプレートを酸性又はアルカリ性条件に対する化学的安定性について試験する。好ましくは、ジメチルアクリルアミドとＡＡＰは、アクリルアミドより優れた加水分解安定性を有する。例えば、Electrophoresis 1996 Apr: 17(4): 723-31（本明細書に参照として組み込む）を参照されたい。
【００３６】
一実施形態では、ＩＰＧゲルは、ＩＰＧゲルストリップ又はＩＰＧゲルスラブである。
【００３７】
好ましくは、ゲルスラブは、重合化したゲルのシート全体である。好ましくは、ストリップは、典型的に、スラブから切り抜かれ、２Ｄゲルに用いられる幅の狭い（幅３〜１０ｍｍ）断片である。好ましくは、スラブは、２Ｄゲルに通常用いられるものより幅が広いものである。典型的には、市販のＩＰＧゲルは、幅３．３ｍｍである。
【００３８】
好ましくは、ＩＰＧゲルストリップを、支持シートに結合させる。
【００３９】
好ましくは、上記支持シートは、プラスチック製支持シートである。好ましくは、このプラスチックは、処理されたプラスチックである。この処理により、重合しているアクリルアミドがプラスチックと架橋し、これによってゲルを安定化させる。
【００４０】
第２の態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び／又は分析する方法に関し、該方法は、本明細書に記載した本発明のＩＰＧゲルを用いて、サンプルに対して等電点電気泳動を実施することを含むものである。
【００４１】
好ましい実施形態では、上記方法は、サンプル中の１種の高分子を可溶化することを含む。
【００４２】
好ましくは、上記可溶化は、サンプルと疎水性溶剤を混合することを含む方法によって実施される。
【００４３】
好ましくは、可溶化した高分子は、可溶化したタンパク質性高分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質複合体）である。
【００４４】
一実施形態では、上記方法はさらに、アルキル化剤、好ましくはシステインアルキル化剤、例えばアクリルアミド又はヨードアセトアミドと、可溶化したサンプルとを混合することを含む。
【００４５】
好ましくは、上記サンプルは、細胞外液、組織サンプル、細胞サンプル、微生物サンプル及び培養物サンプルからなる群より選択される。サンプルの好ましい例としては、限定するものではないが、大腸菌サンプル及びラット肝臓サンプルが挙げられる。
【００４６】
好ましくは、本発明に係るＩＰＧゲルは、スルホランを含む溶剤のような強度の疎水性抽出液、及び通常のＩＰＧゲル又はストリップを再水和することができない溶液などのその他の疎水性溶剤と適合性である。細胞サンプルを、疎水性溶液、例えばスルホラン溶液中で溶解させる場合には、疎水性タンパク質は、典型的に可溶化される。本発明者らは、スルホラン溶液中で溶解させた細胞サンプルが、タンパク質を良好に可溶化し、その後このタンパク質が二次元ゲル上に提示されることを見出した。ゲル上に提示されたタンパク質の分離能は、現在市販されている最も強力なサンプル可溶化溶液よりも優れていた。
【００４７】
従って、好ましくは、上記疎水性溶剤は、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドからなる群より選択される活性成分を含む。
【００４８】
一実施形態では、上記疎水性溶剤はまた、界面活性剤、例えばＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＡＳＢ１４、Ｃ７ｂＺ０、ＳＢ３−１０、又は非イオン性若しくは双性イオン性界面活性剤、又はそれらの混合物を含み、あるいは、これらに代わり又はこれらに加えて、上記溶剤は、還元剤、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ＴＢＰ、トリスシアノエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）若しくはメルカプトエタノール、又はそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００４９】
一実施形態では、上記疎水性溶剤は、スルホラン、スルホレン又はそれらの混合物を含む。
【００５０】
好ましくは、上記疎水性溶剤は、スルホラン溶液である。一実施形態では、スルホラン溶液を用いて、組織サンプルから全タンパク質を抽出する。好ましくは、非常に疎水性の高いタンパク質をサンプルから抽出する。一実施形態では、非常に疎水性の高いタンパク質として、例えば、大腸菌由来の膜タンパク質が挙げられる。
【００５１】
一実施形態では、疎水性溶剤は、約０．１Ｍ〜約１０．５８Ｍスルホラン（飽和又は１００％スルホラン）を含む。このスルホラン溶液は、好ましくは１Ｍ〜８Ｍスルホラン、さらに好ましくは２Ｍ〜６Ｍスルホラン、さらに好ましくは３Ｍ〜５Ｍスルホラン、最も好ましくは４Ｍスルホランを含む。
【００５２】
好ましくは、疎水性溶剤はさらに、チオ尿素、ＡＳＢ１４及びＴＢＰを含む。一つの具体的な実施形態では、この疎水性溶剤は、４Ｍスルホラン、４Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、２ｍＭ  ＴＢＰを含む。
【００５３】
別の実施形態では、疎水性溶剤は、尿素、さらに具体的には７Ｍ尿素を含む溶剤など、市販の溶剤を含む。好ましくは、上記疎水性溶剤は、チオ尿素、ＡＳＢ１４及びＴＢＰも含む。一つの具体的な実施形態では、この尿素溶剤は、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ１４、２ｍＭ  ＴＢＰを含む。
【００５４】
第３の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離又は分析するための、例えばタンパク質の複合体混合物におけるタンパク質性分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又はタンパク質複合体）を分離又は分析するための、本明細書に記載した本発明のＩＰＧゲルの使用に関する。
【００５５】
第４の態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び／又は分析するためのキットに関し、該キットは、可溶化剤、本発明の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、及び場合により使用説明書を含むものである。
【００５６】
好ましくは、可溶化剤は、疎水性溶剤である。
【００５７】
好ましくは、上記可溶化剤は、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤及び還元剤からなる群より選択される活性成分を含む。
【００５８】
好ましい実施形態では、上記疎水性溶剤は、４Ｍスルホラン、４Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、及び２ｍＭ  ＴＢＰを含む。
【００５９】
好ましくは、上記キットはさらに、アルキル化剤、好ましくは、アクリルアミド又はヨードアセトアミドのようなシステインアルキル化剤を含む。
【００６０】
本明細書全体を通して、用語「含む（comprise）」、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」などのその変形は、記載した要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を包含することを意味するが、その他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の排除を意味するものではないことは理解されよう。
【００６１】
本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、物品についての記述はすべて、本発明の内容を説明することだけを目的とするものである。従って、これらのものの一部又は全部が、従来の基本技術の一部分を形成すること、あるいは、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在したために、本発明に関する分野での共通の一般知識であったという承認として、前記の記述を解釈すべきではない。
【００６２】
以下の非制限的実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００６３】
実施例１
アクリルアミドとＤＭＡのＩＰＧストリップのＩＰＧ流し込み
上記ＩＰＧを流し込むのに必要なアクリルアミド溶液は、５０％アクリルアミドと５０％ＤＭＡ（モルを基準とする）とから構成される。ＩＰＧの流し込みに用いられるアクリルアミドのパーセンテージは、４０％Ｔ、４％Ｃである。従って、アクリルアミド配合は、下記の通りである：
【表１】
2005500515.tif 000003
【００６４】
７ｃｍ、４−７ＤＭＡ  ＩＰＧ（０．５ｍｍ）を流し込むために、Ｄｒ  ｐＨを用いて、下記の配合を決定した。
【表２】
2005500515.tif 000004
【００６５】
７ｃｍ、３−１０ＤＭＡ  ＩＰＧ（０．５ｍｍ）を流し込むために、Ｄｒ  ｐＨを用いて、下記の配合を決定した。
【表３】
2005500515.tif 000005
【００６６】
前記溶液の両方に、２ｕＬのＴＥＭＥＤと５ｕＬの４０％ＡＰＳを添加した後、小型勾配流し込み器（mini gradient pourer）を用いて、ＩＰＧ勾配を流し込んだ。ＩＰＧを、５０℃で１時間重合化させた。次に、これらを１０％メタノール中で３回、５％グリセロール、１０％メタノール中で１回洗浄した後、一晩乾燥させた。こうして得られたＩＰＧは、ストリップ状に切断し、再水和に用いなければならないときまで、−２０℃又は−８０℃で保存する。
【００６７】
実施例２
ＡＡＰとＤＭＡのＩＰＧストリップのＩＰＧ流し込み
ＩＰＧストリップは、３〜１０のｐＨ勾配を有しており、７ｃｍスラブゲルを作製した。アクリルアミド溶液及び３−１０溶液の配合について概説する。５０：５０モル比のＤＭＡ及びＡＡＰを用いて、４０％Ｔ、４％Ｃアクリルアミド溶液を調製した。
【表４】
2005500515.tif 000006
【００６８】
【表５】
2005500515.tif 000007
【００６９】
続いて、ＩＰＧ流し込みの手順を実施した（アクリルアミドとＤＭＡのＩＰＧストリップと同様）。
【００７０】
実施例３
スルホランの性能を向上するためのスルホラン処理
１．スルホランを約５０℃まで加熱した後、活性炭のカラムに通過させる。これは、バッチ式でも実施することができる。
【００７１】
２．スルホラン／チオ尿素溶液を脱イオン（混床式イオン交換樹脂を用いる）した後、界面活性剤及び還元剤（それぞれ単数若しくは複数）を添加する。
【００７２】
実施例４
大腸菌全タンパク質抽出
凍結乾燥した大腸菌をＳｉｇｍａ（ＥＣ１）から購入し、全実験を通して用いた。５ｍＬの従来の抽出液又はスルホラン抽出液のいずれかにおいて大腸菌を再懸濁させた。次に、１５秒の送風を繰り返しながら、１．５分間超音波破砕し、氷上に保持して、低温を維持した。各サンプルを２１０００×ｇで１０分遠心した後、上清を回収し、これを用いて、ＤＭＡ  ＩＰＧ（スルホラン抽出液）又はファルマシア（Pharmacia）ＩＰＧ（従来の抽出液）のいずれかを再水和した。
【００７３】
実施例５
ラット肝臓全タンパク質抽出
１つの凍結したラット肝臓（湿量：７．６５ｇ）を解凍し、小さな切片に切断してから、液体窒素中で磨砕した。この肝臓を３つに分け、従来の抽出液、スルホラン抽出液、又はスルホラン抽出液の変種（６Ｍスルホラン、４Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、２ｍＭ  ＴＢＰ）のいずれか（２０ｍＬ）で抽出した。氷上で低温を維持しながらプローブを用いてサンプルを音波破砕した（７０％強度で４×１５秒）。次に、サンプルを１４０００×ｇで４５分遠心した後、上清を回収し、ＩＰＧ再水和に用いた。
【００７４】
実施例６
大腸菌膜タンパク質抽出
凍結大腸菌の２つの１ｍＬアリコートを解凍及びプールした。プールしたサンプルに、１０ｍＬの氷冷１００ｍＭ炭酸ナトリウムを添加した。次に、サンプルを超音波破砕（３０％強度で１×１５秒、４０％強度で３×１５秒及び５０％強度で２×１５秒）に付し、氷上に保持して、低温を維持した。このサンプルを室温にて２５００ｒｐｍで１０分遠心した。上清に、９０ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウムを添加した後、サンプルを氷上で１時間攪拌した。次に、サンプルを１１５０００×ｇで４℃で１時間遠心することにより、膜タンパク質をペレット化した。得られたペレットを１．５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）で２回洗浄し、４本のエッペンドルフ管に分けた。洗浄するたびに、タンパク質を２１０００×ｇで室温で１０分遠心した。こうして得たペレットは、従来の抽出液、スルホラン抽出液、又はスルホラン抽出液の変種（６Ｍスルホラン、４Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、２ｍｍ  トリブチルホスフィン）のいずれか（５００ｕＬ）に再懸濁させた。サンプルを音波浴中に５分置いた後、室温にて２１０００×ｇで１０分遠心した。上清を回収し、ＩＰＧ再水和に用いた。
【００７５】
実施例７
未処理ヒト血漿の調製
ヒト血液（５０ｍＬ）を採取し、ヘパリンを添加した。このサンプルを４℃にて２０００×ｇで２０分遠心した。赤血球を注意深く除去しながら血漿を回収し、−８０℃で保存した。
【００７６】
実施例８
ＩＰＧストリップ再水和
大腸菌サンプルを希釈せずに、ハイブリッドＩＰＧストリップにアプライした。ラット肝臓サンプルは、抽出液（タンパク質を含まない）で５倍希釈した後、ＩＰＧストリップの上にアプライした。ヒト血漿（未処理）を水で６０倍以上希釈した後、ＡＡＰ＋ＤＭＡ  ＩＰＧストリップにアプライした。各サンプルについて、１２５ｕＬをＩＰＧストリップにアプライし、追跡用色素として微量のオレンジＧを添加した。ＩＰＧストリップは、典型的に、５〜６時間かけて再水和させた。
【００７７】
実施例９
ＩＰＧ泳動（focusing）
ＩＰＧストリップの泳動をファルマシア・コンソート（Pharmacia Consort）ユニット（モデルＥ７５２）で実施した。等電点電気泳動のプログラムは、３００ボルトで４時間、１０００ボルトで４時間、２５００ボルトで４時間、及び５０００ボルトで４〜５時間とした。これにより、最大ＫＶｈは３５〜４０となる。
【００７８】
実施例１０
ＩＰＧストリップの平衡
平衡溶液（６Ｍ尿素、２％ｗ／ｖＳＤＳ、１×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルバッファー、ｐＨ８．８、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミド、５ｍＭ  ＴＢＰ）で、スルホラン抽出液中の大腸菌サンプル及びラット肝臓サンプルを２×５分、１×１０分平衡させてから、二次元ゲルを実施した。ヒト血漿（未処理）サンプルを１×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルバッファー、ｐＨ８．８、２０％グリセロールで２０分平衡させた。従来の抽出液で再水和したＩＰＧストリップはすべて、平衡バッファー（６Ｍ尿素、２％ｗ／ｖＳＤＳ、１×Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルバッファー、ｐＨ８．８、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミド、５ｍＭ  ＴＢＰ）で、１×２０分平衡させた。
【００７９】
実施例１１
二次元ゲル
大腸菌及びラット肝臓サンプルに用いた二次元ゲルは、Ｎｏｖｅｘ４〜１２％、厚さ１．５ｍｍのＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルであった。１×ＭＯＰＳバッファー（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の０．５％アガロース及び微量のブロモフェノールブルーを用いて、ＩＰＧストリップを上記ゲル上に固定した。５ｍＡ／ゲルを３０分、１０ｍＡ／ゲルを３０分、２０ｍＡ／ゲルを１時間及び２５ｍＡ／ゲルを２時間からなる定電流を用いて、二次元を泳動させた。ブロモフェノールブルー色素前端（front）がゲルから流れたとき、二次元目を終了した。ヒト血漿サンプルをＮｏｖｅｘ３〜８％  １．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸ゲルで泳動させた。１×Ｔｒｉｓ−酢酸ゲル泳動バッファー（５０ｍＭトリシン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、但し、天然の形態に血漿を保持するためにＳＤＳは含まない）中の０．５％アガロース及び微量のブロモフェノールブルーを用いて、ＩＰＧストリップを上記ゲル上に固定した。２ｍＡ／ゲルを１時間、５ｍＡ／ゲルを１時間、１０ｍＡ／ゲルを２時間及び１５ｍＡ／ゲルを２時間の定電流をそれぞれ用いて、二次元を泳動させた。色素前端をゲルから流出させ、ゲル動作をさらに３０分継続した。
【００８０】
実施例１２
タンパク質検出
この実験で用いたサンプルはすべて、コロイド状クーマシー（Colloidal Coomassie）Ｇ−２５０で検出した。ゲル泳動が完了したら、ゲルをそのカセットから回収し、Ｇ−２５０で染色した。染料を１回取り替えてから、染色を一晩継続した。次に、ゲルを１％酢酸中で２４時間脱染した後、スキャニング（Hewlett Packard Scanjet 5200：１５０ｄｐｉにて）し、画像化した。
【００８１】
実施例１３
アクリルアミドとＤＭＡのＩＰＧストリップからの結果
これらの結果から、スルホラン抽出液の方が多くのタンパク質を抽出し、抽出されたタンパク質の良好な分離を呈示する（特にＩＰＧのアルカリ末端において）ため、スルホラン抽出液は、従来の抽出液より優れた抽出液であることがわかる。ＤＭＡ  ＩＰＧストリップは、ＩＰＧのアルカリ末端でタンパク質の沈降を阻止することから、アルカリ性加水分解が有意に低減し、従って、ゲルの画質を改善することを示している。また、ＤＭＡを含まないＩＰＧストリップは、ＩＰＧストリップ中にタンパク質を保持する傾向（図１から明らかである）があるが、これは、ＤＭＡを含むＩＰＧストリップには認められないため、２Ｄ画像には、より多様なタンパク質があり、元のタンパク質抽出物より多くが存在する。
【００８２】
実施例１４
ＡＡＰとＤＭＡのＩＰＧストリップからの結果
図１及び図２を参照すると、ＩＰＧストリップ上の従来の抽出液及びスルホラン抽出液における大腸菌の分離によって、良好な分離が達成される。ＩＰＧストリップのすべてにタンパク質が残っているようであるが、これは、平衡ステップでの多数回洗浄により可溶化することができる。従来の抽出液及びスルホラン抽出液ゲルを重ねると、これらの溶液から様々な速度で様々なタンパク質が抽出されていることが明らかになる。これは、より多量のタンパク質回収を達成するには、両方の抽出方法が必要であることを示している。
【００８３】
図３を参照にすると、未処理ヒト血漿の二連試験は、ファルマシア３−１０ＩＰＧストリップを用いて認められたものと類似した分離特性を達成している。このゲル画像をElectrophoresis（T. Manabeら、1999、20、830-835）に公開されたものと比較すると、存在する筋（streaking）が少ない。しかし、公開されたゲルは、未処理血漿の大きなゲル（１８ｃｍＩＰＧストリップ、二次元では２０ｃｍ）であり、はるかに高い負荷を用いることにより、さらに多くのタンパク質スポットが認められる。
【００８４】
ＡＡＰ及びＤＭＡを含むＩＰＧストリップの新しい配合物は、様々な種類の抽出液を再水和するのに成功している。このようなサンプル溶液として、天然ゲル用の従来の抽出液及びスルホラン抽出液、並びに水をベースとする抽出液が挙げられる。上記溶液はまた、これらのタンパク質を集束させ、良好に分離された二次元ゲルを生成するのに成功している。このＩＰＧストリップ配合物は、多用途ＩＰＧストリップを形成する上で非常に有望である。
【００８５】
図７では、従来の抽出液がファルマシア４−７ＩＰＧストリップを用い、実験室調製アクリルアミド／ＤＭＡ４−７ＩＰＧストリップ上でスルホラン抽出液を再水和させたが、この図を参照すると、従来の抽出液及びスルホラン抽出液は、互いに類似した濃度で、類似タンパク質を抽出する。対照的に、スルホラン抽出液の変種は、はるかに低い濃度で、上記より少数のタンパク質しか抽出しない。
【００８６】
当業者であれば、広範に記載した本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態で示したように、様々な変更及び／又は改変を本発明に加えることができることは理解されよう。従って、本発明の実施形態は、制限的ではく、例示的であると考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】従来の溶液中で抽出及び分離した大腸菌の全細胞タンパク質抽出物を含む、ＡＡＰ＋ＤＭＡ  ＩＰＧストリップの写真のコピーである。
【図２】スルホラン溶液中で抽出及び分離した大腸菌の全細胞抽出物を含む、ＡＡＰ＋ＤＭＡ  ＩＰＧストリップの写真のコピーである。
【図３】水をベースとする抽出液中で抽出及び分離した天然ヒト血漿を含む、ＡＡＰ＋ＤＭＡ  ＩＰＧストリップの写真のコピーである。
【図４】従来の溶液及びスルホラン溶液を用いて、抽出及び分離した大腸菌全細胞調製物の写真のコピーである。図４（ａ）では、従来の溶液を７ｃｍ４−７ファルマシアＩＰＧストリップ上で泳動させた。図４（ｂ）では、スルホラン抽出液を、実験室作製の７ｃｍ４−７ＩＰＧストリップ（アクリルアミドとＤＭＡを含む）上で泳動させた。
【図５】従来の抽出液及びスルホラン抽出液を用いて、抽出及び分離した大腸菌全細胞調製物の写真のコピーである。図５（ａ）では、従来の抽出液を１８ｃｍ４−７ファルマシアＩＰＧストリップ上で泳動させた。図５（ｂ）では、スルホラン溶液を、実験室作製の１８ｃｍ４−７ＩＰＧ（アクリルアミドとＤＭＡを含む）上で泳動させた。
【図６】従来の溶液及びスルホラン溶液を用いて、抽出及び分離したラット肝臓全細胞調製物の写真のコピーである。
【図７】従来の溶液及びスルホラン溶液を用いて、抽出及び分離した大腸菌膜調製物の写真のコピーである。図７（ａ）では、従来の抽出液を用いてタンパク質を抽出した。図７（ｂ）では、スルホラン抽出液を用いてタンパク質を抽出した。図７（ｃ）では、スルホラン抽出液の変種（６Ｍスルホラン４Ｍチオ尿素、１％ＡＳＢ−１４、２ｍＭ  ＴＢＰ）を用いて、タンパク質を抽出した。
【図８】活性炭及びＡＧ５０１×８樹脂で、スルホラン抽出液を浄化することによる、ゲルの酸性末端でのイオン前端（ion front）の低減を示す写真のコピーである。その際、下記の溶液を用いる：（ａ）樹脂で処理していないスルホラン、チオ尿素、Ｃ７を含むスルホラン溶液、（ｂ）樹脂で処理していないスルホラン、チオ尿素及びＡＳＢ１４を含むスルホラン溶液、（ｃ）木炭及びバイオラド（Biorad）ＡＧ５０１×８樹脂で処理しておいたスルホラン、チオ尿素、Ｃ７を含むスルホラン溶液；（ｂ）木炭及びバイオラドＡＧ５０１×８樹脂で処理しておいたスルホラン、チオ尿素、ＡＳＢ１４を含むスルホラン溶液。
【図９】スルホラン溶液と従来のサンプル抽出液との比較を示す写真のコピーである。ゲルは、（ａ）従来の抽出液又は（ｂ）スルホラン抽出液のいずれかにおける、１ｍｇ／ｍＬ大腸菌全細胞タンパク質抽出を示す。四角で囲んだ領域は、両ゲルに認められるタンパク質であり、丸で囲んだ領域は、従来の抽出液では認められなかったいくつかのタンパク質を示す。
【図１】
2005500515.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005500515.tif 000015
【図９】
2005500515.tif 000016
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月4日(2003.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、アクリルアミドとジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の重合化モノマー単位、又はＮ−アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）とジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）の重合化モノマー単位を含むものであり、該重合化モノマー単位はモル比が約１：１０〜約１０：１である、上記ゲル。
【請求項２】
モル比が約１：５〜約５：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項３】
モル比が約１：２〜約２：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項４】
モル比が約１：１である、請求項１に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項５】
固体支持体又は支持シートに結合させたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項６】
乾燥状態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項７】
ＩＰＧゲルストリップ又はＩＰＧゲルスラブである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項８】
支持シートがプラスチックである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項９】
プラスチックが処理されたプラスチックである、請求項８に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１０】
アクリルアミド、ＤＭＡ又はＡＡＰの重合化モノマー単位が、処理されたプラスチックと架橋されている、請求項９に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項１１】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離又は分析する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＩＰＧゲルを用いて、サンプルに対して等電点電気泳動を実施することを含む、上記方法。
【請求項１２】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を可溶化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが、細胞外液、組織サンプル、細胞サンプル、微生物サンプル及び培養物サンプル、又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
高分子がタンパク質又はその断片である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
可溶化が、サンプルと疎水性溶剤とを混合することを含む方法により実施される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
疎水性溶剤が、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドからなる群より選択される１種以上の活性成分を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
疎水性溶剤が、スルホラン若しくはスルホレン又はそれらの混合物を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
疎水性溶剤が、界面活性剤、還元剤又はそれらの混合物をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記疎水性溶剤が、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＡＳＢ１４、Ｃ７ｂＺ０、ＳＢ３−１０、又は非イオン性若しくは双性イオン性界面活性剤、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ＴＢＰ、トリスシアノエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）若しくはメルカプトエタノール、又はそれらの混合物の１種以上をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にサンプルを電気泳動させることをさらに含む、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中の少なくとも１種の高分子の分離及び／又は分析における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＩＰＧゲルの使用。
【請求項２２】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離又は分析するためのキットであって、可溶化剤、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、及び場合により使用説明書を含む、上記キット。
【請求項２３】
可溶化剤が疎水性溶剤である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
疎水性溶剤が、スルホラン、スルホレン、尿素、チオ尿素、ブチル尿素、ジメチル尿素、リン酸トリブチル、ジメチルスルホキシド、及びジメチルホルムアミドからなる群より選択される１種以上の活性成分を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
疎水性溶剤が、スルホラン若しくはスルホレン又はそれらの混合物を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
疎水性溶液が約０．１Ｍ〜約１０．５８Ｍのスルホランを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
疎水性溶液が約１Ｍ〜約８Ｍのスルホランを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
疎水性溶液が約２Ｍ〜約６Ｍのスルホランを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
疎水性溶液が約３Ｍ〜約５Ｍのスルホランを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
疎水性溶液が約４Ｍのスルホランを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び／又は分析するためのキットであって、可溶化剤、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、及び場合により使用説明書を含むものであり、該可溶化剤が４Ｍスルホラン及び４Ｍチオ尿素を含む、上記キット。
【請求項３２】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分離及び／又は分析するためのキットであって、可溶化剤、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル、及び場合により使用説明書を含むものであり、該可溶化剤が尿素を含む、上記キット。
【請求項３３】
尿素が７Ｍ尿素である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
界面活性剤若しくは還元剤又はそれらの混合物をさらに含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
可溶化剤が界面活性剤若しくは還元剤又はそれらの混合物を含む、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
界面活性剤又は還元剤が、ＣＨＡＰＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＡＳＢ１４、Ｃ７ｂＺ０、ＳＢ３−１０、又は非イオン性若しくは双性イオン性界面活性剤、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ＴＢＰ、トリスシアノエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）又はメルカプトエタノールの１種以上を含む、請求項３４又は３５に記載のキット。
【請求項３７】
アルキル化剤をさらに含む請求項２２〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
アルキル化剤がシステインアルキル化剤である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
アルキル化剤が、アクリルアミド若しくはヨードアセトアミド又はそれらの混合物である、請求項３７に記載のキット。
【国際調査報告】
2005500515.tif 000052
2005500515.tif 000053