(57)【要約】本発明は、レグヘモグロビンおよびアルコール化合物、グリコール化合物、パラベン類、四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン化合物、アルデヒド放出剤、酸化防止剤およびハロゲン化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有するパーソナルケア組成物を提供する。好ましくは、このレグヘモグロビンは組成物の総重量に基づき０．０００１％〜約１０％の組成物中レグヘモグロビン濃度を提供する窒素固定根粒抽出物である。本発明はまた、パーソナルケア組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レグヘモグロビンおよびアルコール化合物、グリコール化合物、パラベン類、四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン化合物、アルデヒド放出剤、酸化防止剤およびハロゲン化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有することを特徴とするパーソナルケア組成物。
【請求項２】
レグヘモグロビンが窒素固定根粒抽出物の形態であり、組成物の総重量に基づき０．０００１％〜約１０％の組成物中レグヘモグロビン濃度を提供する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
植物生長調節剤、アミノ酸化合物、ビタミン類、タンパク質類、酵素類、ミネラル類、炭水化物、エキソ多糖類およびその組合せからなる群から選択される少なくとも１種の根粒抽出成分をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
水をさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ローション、軟膏、クリーム、スプレイ、スピリッツ、水性または水性アルコール性混合物、ゲル、ムース、貼布剤、パッド、マスク、含水布およびハンカチ、固形スティック、クリアースティック、口紅、エアゾルクリーム、無水粉末、タルク、トニック、オイル、エマルジョン、およびバスソルトからなる群から選択される稠度を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のパーソナルケア組成物の製造方法であって、
（ａ）藍色細菌［シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）］、嫌気性細菌（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色無硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色硫黄細菌（Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、マメ科細菌（ｌｅｇｕｍｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびその組合せからなる群から選択される細菌に感染した根粒からレグヘモグロビンを抽出し、レグヘモグロビン抽出物を得る工程、および
（ｂ）このレグヘモグロビン抽出物を保存剤と組合せ、パーソナルケア組成物を得る工程、
を特徴とする、上記製造方法。
【請求項７】
レグヘモグロビンをリゾビウム（Ｇｅｎｕｓ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属またはブラッキオリゾビウム（Ｂｒａｃｈｙｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属からの細菌に感染した植物の根から得る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
レグヘモグロビンを多年生マメ科植物、一年生マメ科植物、樹木様マメ科植物、およびその組合せに見出される植物根から選択される植物根から採取する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
レグヘモグロビンを一年生マメ科植物の根から採取する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
窒素固定根粒抽出物が、別種の微生物用の増殖培地または密集皮膚培養物を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
微生物が酵母である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
上記レグヘモグロビンがもう一種の成分内に封入されており、これにより上記レグヘモグロビンに対し一定期間放出特性が付与されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
上記別種の成分が、リポソーム、ニオゾーム、準ミクロンエマルジョン、ポリマー封入剤、ゲル、クリーム、ローションおよびその組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ニトロゲナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、一酸化窒素シンターゼ、スクロースシンターゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンおよびその組合せからなる群から選択される酵素を含有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
キネチン、ゼアチン、別種のフルフリル型分子、オーキシンのような補助的植物生長調節剤およびその組合わせからなる群から選択される植物生長調節剤を含有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１６】
上記成分が、エキソ多糖類を、単独でまたはリポ多糖類または莢膜多糖類、またはその組合せと組合わせて包含する、請求項３に記載の組成物。
【請求項１７】
皮膚上の遊離基の結合方法であって、レグヘモグロビンを皮膚と接触させることを包含し、これにより上記レグヘモグロビンを遊離基に対する捕獲剤として作用させる、上記方法。
【請求項１８】
レグヘモグロビンが、反応性酸素、一酸化窒素およびその組合せからなる群から選択される遊離基用の捕獲剤として作用する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
皮膚から遊離基を除去する方法であって、レグヘモグロビンを皮膚と接触させ、皮膚上の遊離基をレグヘモグロビンに結合させ、これにより皮膚から上記遊離基を除去する、上記方法。
【請求項２０】
上記レグヘモグロビンが、レグヘモグロビンおよびアルコール化合物、グリコール化合物、パラベン類、四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン化合物、アルデヒド放出剤、酸化防止剤およびハロゲン化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有するパーソナルケア組成物を用いることによって提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記レグヘモグロビンが窒素固定根粒抽出物の形態であり、組成物の総重量に基づき０．０００１％〜約１０％の組成物中レグヘモグロビン濃度を提供する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、パーソナルケア（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃａｒｅ）組成物に関し、さらに特にレグヘモグロビンを含有するパーソナルケア組成物に関する。レグヘモグロビンは窒素固定根粒から適当に抽出される。レグヘモグロビンは皮膚に対する反応性酸素および一酸化窒素遊離基の制御を促進することによって使用期間中における有利な性質をパーソナルケア組成物に付与する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
パーソナルケア組成物は広く種々の用途を有し、石鹸、シャンプー、スキンケア医療品、化粧品、ならびに治療およびホメオパシースキンケア製剤を包含する。パーソナルケア組成物における植物由来原材料の使用は、充分に確立されている。一例として、ＰＣＴ特許公開ＷＯ９９１３８５５は、化粧品および皮膚用医薬品用途に対する藻類抽出物およびエキソ多糖類（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）の組合せの使用を開示している。
【０００３】
パーソナルケアに植物由来物質を使用するという考えは、或る種の動物がもたらす疾病、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）が感染した肉および肉副産物との接触によりヒトに蔓延するという最近の発見の観点から重要になってきた。これらの争点に対するパーソナルケア業界の感受性はラノリンの販売にまで大きくなっており、羊毛の毛刈りに由来する副産物は動物由来製品であると考えられることから、影響を受けている。
【０００４】
パーソナルケア組成物におけるヒト由来成分の使用はまた、上記動物由来生成物にかかわる上記示唆と同一の理由で難色が示されている。ヒト由来化粧品成分の病因性は、ヒト健康に対する有害な作用を有するものでさえあることから、ヒト由来生成物は動物由来成分よりも大きくさえある影響を有することがある。例えば、米国特許６，１６０，０２１には、局所投与された場合、ヒト由来血液成分、例えばヘモグロビンが皮膚におけるメラニン産生に影響を与えることができ、皮膚に光沢を与える方法が提供されることが示唆されている。
【０００５】
これら市場の圧力の結果として、パーソナルケア組成物製造業者は、動物タンパク質の代用として植物由来原材料、例えばトウモロコシ、大豆および麦から得られる植物タンパク質にさらに重い信頼をおいている。さらに、化粧品およびパーソナルケア業界は、製品開発傾向にかかわり健康食品とハーブサプリメントとを密接に関係付けて見ている。このような傾向は、例えば最近の刊行物であるＨＡＰＰＩ  ３８（２００１）８１に要約されている。この刊行物は、地球規模の化粧品原材料製造業者が直面している多くの圧力を要約しており、最近の傾向は「天然」基材製品に向けられている。この良適例は、アロマセラピイおよび機能性を提供し、また「天然」基材パーソナルケア製品のような表示を支持する、有用な成分としての天然抽出物、特に植物抽出物に対する最近の傾向がある。
【０００６】
数種の植物は、それらのヒトに対する有益な評判の観点から、パーソナルケア組成物における健康増進に喜ばれている。一例として、アロエ  ベラ（Ａｌｏｅ  Ｖｅｒａ）は、傷の治癒を助けることが知られている抽出物を提供する周知の植物である。ギンゴ  ビロバ（Ｇｉｎｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）（イチョウ）およびブドウは、ヒト皮膚に対し酸化防止効果を付与し、皮膚に対する紫外線損傷の有害な作用を軽減するものと言われているポリフェノールを含有することが知られている。大豆抽出物は、植物フィトエストロゲンを含有することが示唆されている大豆イソフラボンの存在に基づいて格別によく知られている。このフィトエストロゲン化合物はヒトエストロゲンに類似しており、老化作用、特に閉経後女性における老化作用を軽減する助けとなる。
【０００７】
アサファエチダ（Ａｓａｆａｅｔｉｄａ）（阿魏）およびイエロードック（Ｙｅｌｌｏｗ  ｄｏｃｋ）からの抽出物などの製品は、例えば皮膚上の老人斑の発現に責任がある過剰のメラニン形成を最低にすることが示唆されている。最近になって、米国特許５，３７１，０８９および同５，６０２，１３９は、サイトカイニンとして知られている植物生長調節体がヒト繊維芽細胞（この細胞からヒト角質細胞が生じる）の寿命を延長するように見えることを開示している。角質細胞は、角質層を構成する保護的細胞になり、地球におけるヒトの生存を可能にしている。或る種の細菌および酵母菌抽出物、特にサッカロマイセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母菌抽出物は、有用な化粧、治療またはホメオパシー効果を提供することが知られている。さらに、数種の根抽出物、例えばチョウセンニンジンの抽出物は、健康およびエネルギイに対する歴史的趨勢を有し、パーソナルケア製品においてこのような主張は評判であるものと見なされているように見える。
【０００８】
地球を取囲む大気の主要成分は気体状窒素、Ｎ２である。植物および動物の両方は、空気から気体状窒素を浴びており、しかもこの分子の異常な化学的安定性から、気体状窒素は基本的に、植物および動物の両方に対し化学的に不活性である。しかしながら、分子状窒素はアミノ酸、ビタミン類、タンパク質、酵素および両生物界（Ｋｉｎｇｄｏｍｓ）の細胞の全部の鍵となる成分である。気体状窒素を有用な窒素化合物、例えばアンモニアに変換する手段が存在しない場合、我々が知っているような生命はこの星に存在しない。気体状窒素の有用な窒素基質への変換は、自然の手段および工業的手段により生起し、窒素サイクルとして知られているものを包含する、図１。
【０００９】
図１：窒素サイクル
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【００１０】
幸いなことに、植物および動物は窒素を有用な窒素含有成分に化学的に変換することはできないが、或る種の細菌、特に藍藻類シアノバクテリア界（ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、例えばリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は窒素をさらに有用なアンモニアに変換するメカニズムを展開する。この変換プロセスは、「窒素固定」として知られており、このプロセスはこれらの生物におけるニトロゲナーゼとして知られている鍵となる酵素の存在に依存している。
窒素固定は下記図２に例示されている複雑な酵素プロセスである。
【００１１】
図２．窒素固定
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【００１２】
窒素をアンモニアに変化させる一般的酵素プロセスは、下記のとおりに要約することができる：
Ｎ２  ＋  ８Ｈ＋  ＋８ｅ−  ＋  １６ＡＴＰ＝２ＮＨ３  ＋  Ｈ２  ＋  １６ＡＤＰ  ＋  １６Ｐｉ
このプロセスは、ニトロゲナーゼ酵素による窒素のアンモニアへの還元を経るアデノシントリホスフェートＡＴＰのアデノシンジホスフェートへの還元によって直接的に進行する。この反応は還元反応であることから、酸素の存在に対し非常に敏感である。
【００１３】
数種の自由生存生物、例えば地衣類は、窒素を固定することができるが、典型的には非常に小規模である。しかしながら、興味深いことに、リゾビウム細菌は、これらが単独で存在する場合、窒素をアンモニアに変換しない。この細菌は一般に、総合的窒素固定反応に有害である酸素を近づけないことができない。この問題を克服するために、細菌はかなりの緑色植物と異常な連合関係を展開する。土壌中に容易に見出すことができる細菌は、種々の植物の根、特に例えばマメ科植物の根に感染する。この細菌は種々のフラボノイド、例えばルチンおよびヘスペレチンなどの分泌によって根に引き付けられる。このようなフラボノイドについては、例えばＢｅｇｕｍ，Ａ．Ａ．等によるＪ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｏｔ．２００１；５２，１５３７−１５４１を参照することができる。
【００１４】
植物の根内に入ると、細菌は、共生として科学的に知られており、さらに細菌が生存でき、また窒素固定反応を行うことができる通常「根粒」と称される小規模の酸素欠乏ホームの形成を植物に強制する。しかしながら、この植物は、この感染から悪影響を受けず、むしろその代わりに、それ自体の生命プロセスにアンモニアを使用することによって窒素のアンモニアへの細菌変換から利益を受ける。この藍藻類細菌と緑色植物との間の関係は共生である。すなわち、両生物がこの関係から利益を得る。窒素固定細菌に対する安全な避難所を備えているかなりの市販穀類の種子が実際に市販されており、これは種まきに先立ち、種子と混合される。このような組合せは、例えば下記Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより提供されているような市場ウエブサイトに見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．ｃｏｍ／ｇｌｏｓｓａｒｙ／Ｃｏｎｔ６．ｈｔｍ。
【００１５】
これらの細菌は、緑色植物の根毛に感染し、次いで感染部位の周辺の植物細胞を急速な生長させる植物生長調節体のスイッチを入れることによって根粒を形成する。これらの細菌は種々の植物生長調節体、例えばサイトカイニン、ならびに重要な無料の植物生長調節体、例えばオーキシン（ａｕｘｉｎｓ）を用いることによって根の局限化された生長メカニズムを譲り受けることにより根粒の生長を制御する。このような植物生長調節体については、例えばＳｃｈｕｌｔｚｅ，Ｍ．等によるＡｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８；３２，３３−５７を参照することができ、その全体を本発明の本体に組入れる。さらに、細菌はその大きさを拡大し、それらの細胞壁を脱ぎ捨て、分泌される莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、リポ多糖類およびエキソ多糖類からそれら自体の周囲に形成される微生物膜様ライニングを形成し始めるバクテロイドになり、根粒への酸素の浸潤をさらに防止する。
【００１６】
このような多糖類については、例えばＲｏｄｒｉｑｕｅｚ−Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｍ．Ａ．等によるＢｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００１；３５７，５０５−５１１を参照することができる。窒素固定プロセスは酸素および反応性酸素基の存在に対し非常に敏感であることから、根粒細菌はまた、蓄積し、これらに制限されないものとして、例えばペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン類、カタラーゼ、オキシダーゼおよび例えばＩｔｕｒｂｅ−Ｏｒｍａｅｔｘｅ，Ｉ．等によるＭｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２００１；１４，１１８９−１１９６の記載に見出すことができるような保護的酵素および分子を包含する種々の酸化防止体を産生する。
【００１７】
追加の防衛機構として、細菌は、ヒトヘモグロビンにかなり類似した反応を示す「レグヘモグロビン」として知られているタンパク質を産生し始める。ヒト身体は４種の重要なグロビン分子を有する（これらは、タンパク質の活性部位にヘム−ベースポルフィリン環が存在することによって区別される）。これらには、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、ニューログロビン（ｎｅｕｒｏｇｌｏｂｉｎ）、ヘモグロビンおよび最近に発見されたヒストグロビン（ｈｉｓｔｇｌｏｂｉｎ）と称される４番目のグロビンが包含される。グロビンタンパク質は、ヒト身体全体に分布しており、これらは酸素反応性分子、例えばＯ２、ＣＯ２およびＮＯ（一酸化窒素）を捕獲し、また制御する。共生において、酸素は酸素輸送メカニズムによりレグヘモグロビンに結合し、また分離し、これにより細菌が窒素固定反応の生起に要する嫌気性条件をさらに改善する。
【００１８】
従って、窒素固定根粒の内部は、植物生長調節体、アミノ酸、ビタミン類、タンパク質類、多糖類、ミネラル類および酵素の複雑な混合物であり、これらの全部が植物生長を助けるか、または細菌を保護または育成する。これらの根粒抽出物の大部分の組成はまた、各植物が生長する土壌および気象条件により地域的に制御される。しかしながら、植物供給源、気象条件またはその他の因子とは関係なく、活性な根粒は常時、レグヘモグロビンおよびニトロゲナーゼを含有する。
【００１９】
酸素結合に加え、グロビン型タンパク質、例えばヘモグロビン、ミオグロビンおよびレグヘモグロビンは、一酸化窒素を結合するものと見なされることが最近になって確立された（例えば、Ｈａｒｇｒｏｖｅ，Ｍ．等によるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７；２６６：１０３２−１０４２参照）。一酸化窒素はヒト血流の強力な調節体であることが見出されている（例えば、Ｓｔｉｘ，Ｇ．によるＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２００１，１１月参照）。一酸化窒素シンターゼと称される酵素は、皮膚における一酸化窒素の存在を制御することがまた、充分に確立されるようになった。一酸化窒素は、皮膚が刺激された場合、皮膚に生じる生化学的カスケードの一部であることが見出されている（例えば、Ｂｒｕｃｈ−Ｇｅｒｈａｒｚ，Ｄ．等によるＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９８；１１０：１−７参照）。
【００２０】
特に、皮膚における一酸化窒素遊離基の存在は、酸素に由来する遊離基、例えば過酸化水素とともに、皮膚の健康に対し有害な作用を有することが証明されている（例えば、Ｈｅｒｒｌｉｎｇ，Ｔ．等によるＳＯＦＷ  Ｊ．２０００；１２６：２０−２６参照）。従って、皮膚における一酸化窒素レベルを減少させる処置が、刊行物に開示されている。一例として、米国特許６，１６０，０２１は、その第３欄２８−４５行に、皮膚に対しＮＯシンターゼの抑制剤またはＮＯ捕獲剤、例えばヘモグロビンなどのヘム化合物を局所または皮下投与することによって一酸化窒素レベルを減少させる皮膚処置方法を開示している。
【００２１】
さらに、一酸化窒素基はまた、ヒトメラニン細胞でメラニン合成を生じさせるカスケードの開始に責任があるように見えることが、最近になって認識された。一例として、例えばＲｏｍｅｒｏ−Ｇｒａｉｌｌｅｔ，Ｃ．等によるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７；９９：６３５−６４２で示唆されているように、ヒト由来ヘモグロビンは繊維芽細胞におけるチロシナーゼの産生を制御することができることが示唆された。従って、皮膚における酸素および一酸化窒素遊離基の制御および調整は、格別の商業的および学術的興味および研究の分野で残されている。
植物は根粒が曝される土壌で生長し、またこの土壌から分離することができる、図３。
【００２２】
図３．オーストラリアン  パイン（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｐｉｎｅ）の根からの窒素固定根粒
2005526037.tif 000004
【００２３】
興味深いことに、窒素固定根粒の内容物は、当業者に知られている種々の抽出方法を使用して抽出することができる。このような例は、単純な水性抽出、例えばＲｅｅｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅウエブサイトのｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｒｅｅｄ．ｅｄｕ／ａｃａｄｅｍｉｃ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｆｉｘ２．ｈｔｍｌに見出される“Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ．Ｐａｒｔ  ＩＩ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ”で検討されており、またはこれらは、例えばＭｅｎｄｏｎｃａ，ＥＨＭ．等によるＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９９；５０：３１３−３１６に記載されているようなさらに複雑な抽出であることもできる。さらに、この抽出は、超限界（ｓｕｐｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ）二酸化炭素抽出法の使用を包含し、この方法は当業者に知られている。これらの抽出物は、根粒を構成する植物生長調節体、アミノ酸、ビタミン類、タンパク質類、多糖類、ミネラル類および酵素の混合物を包含する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
（発明の簡単な要旨）
一態様において、本発明は、レグヘモグロビンおよびアルコール化合物、グリコール化合物、パラベン類、四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン化合物、アルデヒド放出剤、酸化防止剤およびハロゲン化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有するパーソナルケア組成物に関し、このような保存剤は、例えばＳｔｅｉｂｅｒｇ，Ｄ．Ｃ．によるＣｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔ．１９９７；１１２，５７−６５に記載の一覧に見出される。好ましくは、レグヘモグロビンは窒素固定根粒抽出物の形態であり、組成物の総重量に基づき０．０００１％〜約１０％の組成物中レグヘモグロビン濃度を付与する。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明はパーソナルケア組成物の製造方法に関し、この方法は、
（ａ）藍色細菌［シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）］、嫌気性細菌（Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色無硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、緑色硫黄細菌色無硫黄細菌（Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、マメ科細菌（ｌｅｇｕｍｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、およびその組合せからなる群から選択される細菌に感染した根粒からレグヘモグロビンを抽出し、レグヘモグロビン抽出物を得る工程、および
（ｂ）このレグヘモグロビン抽出物を保存剤と組合せ、パーソナルケア組成物を得る工程、
を包含する。
【００２６】
さらにもう一つの態様において、本発明は皮膚上の遊離基の結合方法に関し、この方法はレグヘモグロビンを皮膚と接触させることを包含し、これにより上記レグヘモグロビンを遊離基に対する捕獲剤として作用させる。
これらのおよびその他の態様は、本発明の下記詳細な説明を読むことによって明白になるものと見なされる。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
レグヘモグロビンおよびその他のかなりの有用な成分を含有する種々の植物、例えば多年生マメ科植物（例えば、セイヨウナシ、インゲンマメ、および大豆）、一年生マメ科植物（例えば、クローバーおよびアルファルファ）、および樹木状マメ科植物（例えばオーストラリアン  パイン（ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＰｉｎｅ））からの根粒抽出物がパーソナルケア組成物中に配合した場合、利益をもたらすことがここに見出された。この抽出物の別種の有用な成分は、例えば植物生長調節体、アミノ酸、ビタミン類、タンパク質類、多糖類、ミネラル類および酵素を包含する。
【００２８】
さらに、これらの抽出物は別種の生物、例えばサッカロマイセス  セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母菌用の増殖培地の一部として機能し、これらの生物に鍵となる生長因子を提供することができ、これらの生物の抽出物はさらにまた、パーソナルケア組成物に使用することができる。
さらにまた、これらの抽出物の１種または２種以上の成分は、リポソーム、ニオゾーム、準ミクロンエマルジョン、ポリマー封入剤、ゲル、クリームまたはローション内に封入することができ、これにより抽出成分に一定期間放出性が付与される。さらにまた、抽出成分の数種、特にレグヘモグロビンは皮膚における酸素および一酸化窒素を結合し、これらの分子の存在を効果的に制御し、また遊離基の形成を最低にする。
【００２９】
いずれか特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明は、皮膚に局所施用された場合、レグヘモグロビンの存在が皮膚に存在する酸素および一酸化窒素に結合し、それらの常態基分解サイクルからこれらの分子を効果的に排除し、これにより皮膚上におけるこれらの遊離基の有害な作用が効果的に排除されるものと仮定される。いずれか特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者は、レグヘモグロビンが別種の重要なヘム−ベース酵素、例えば環状−ＧＭＰの産生の上向き調整に責任がある酵素であるグアニリルシクラーゼなどとの結合から一酸化窒素を競合様相で分離することができ、ｃ−ＧＭＰの上向調整に依存するヒト細胞における重要な生化学経路を効果的に遅くすることができることを示唆した。
【００３０】
本発明の窒素固定根粒抽出物は、要約していずれか多数の微生物、例えば
ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｏｓ．ｂｔｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｂｔｏ／ｍｉｃｒｏｂｅｓ／ｎｉｔｒｏｇｅｎ．ｈｔｍにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈのウエブサイトに見出される題名「Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｗｏｒｌｄ．Ｔｈｅ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ」の彼等のウエブサイトに記載の表中の微生物から得ることができ、この記載の全体を引用してここに組入れる。
【００３１】
代表的生物は、例えば好気性細菌（例えばアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ベイジェリンキア（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属およびその他のシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）属細菌）、嫌気性細菌（例えば、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、紅色硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、紅色非硫黄細菌（Ｐｕｒｐｌｅ  ｎｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）および緑色硫黄細菌（Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｌｆｕｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ）からの微生物）、例えばリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属およびブラキオルヒゾビウム（Ｂｒａｃｈｙｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属からの細菌のようなマメ科に寄生する細菌および例えばフランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）属およびアゾスピリリウム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属からの細菌などの別種の植物に感染する細菌を包含する。一年生および多年生マメ科植物に感染するリゾビウムおよびブラキオルヒゾビウム細菌からの窒素固定根粒抽出物、特に大豆根粒抽出物は、特に好適である。
【００３２】
根粒を採取することができる植物は、地球全体から見出される種々の植物種を包含することができる。このような植物種には、これらに制限されないものとして、ｈｔｔｐ：／／ｉｎｂｉｏ．ｂｉｏ．ｉｎｄｉａｎａ．ｅｄｕ／Ｒ３５５４１−２０９７１８−／ｎｅｗｓ／ｂｉｏｎｅｔ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎ２−ｆｉｘａｔｉｏｎ／９７０２．ｎｅｗａｍに見出される「Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｌｅｇｕｍｅｓ」と題するＬｉｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｃ．およびＧｌｏｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．による文献に挙げられている植物が包含される。このような植物は、例えば多年生マメ科植物（例えば、アルファルファ、スウィートクローバー（ｓｗｅｅｔｃｌｏｖｅｒ）、ソラマメ（ｖｅｔｃｈｅｓ）および真正クローバー（ｔｒｕｅ  ｃｌｏｖｅｒ））または好気性マメ科植物（例えば、インゲンマメ類（ｂｅａｎｓ）、ファバビーンズ（ｆａｂａ  ｂｅａｎｓ）、エンドウマメ（ｐｅａｓ）、ササゲ（ｃｏｗｐｅａｓ）、ナンキンマメ（Ｐｅａｎｕｔｓ）および大豆（ｓｏｙｂｅａｎｓ））を包含することができる。或る種のマメ科樹木状植物、例えばこれら制限されないが、オウストラリアン  パインのような植物は、窒素固定細菌感染を担持することが知られている。大豆に見出される根粒は、特に好適である。
【００３３】
本発明によるパーソナルケア組成物は、レグヘモグロビンおよびアルコール化合物、グリコール化合物、パラベン類、四級窒素含有化合物、イソチアゾリノン化合物、アルデヒド放出剤、酸化防止剤およびハロゲン化化合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を適当に含有する。代表的アルコール化合物は、フェノキシエタノール、イソプロピルアルコール、およびベンジルアルコールを包含する；代表的グリコール化合物は、プロピレン、ブチレン、およびペンチレングリコールを包含する；代表的パラベン化合物（この化合物はまた、パラヒドロキシ安息香酸としても知られている）は、メチル、プロピル、およびブチル−パラベンを包含する；代表的四級窒素−含有化合物は、ベンズアルコニウムクロライド、およびクオーテルニウム（Ｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ）１５を包含する；代表的イソチアゾリノン化合物は、メチルイソチアゾリノンおよびメチルクロロイソチアゾリノンを包含する；代表的アルデヒド−放出剤は、ＤＭＤＭヒダントイン、イミダゾリジニル尿素およびジアゾリジニル尿素を包含する；代表的酸化防止剤は、ブチレート化ヒドロキシトルエンおよびトコフェノールを包含する；および代表的ハロゲン化化合物は、トリクロサンおよびクロロヘキシジンジグルコネートを包含する。
【００３４】
さらに、パーソナルケア組成物は、任意に、別種の官能性成分、例えば水、界面活性剤、乳化剤、コンディショナー、柔軟化剤、ワックス、オイル、ポリマー、増粘剤、定着剤、着色剤、湿潤稀釈剤、湿潤剤、安定剤、稀釈剤、溶剤、香料等、ならびに活性成分、例えば植物性薬品、中立性薬品（ｎｅｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、化粧用薬品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、治療剤、医薬剤、抗カビ剤、抗菌剤、ステロイドホルモン、フケ防止剤、ニキビ防止成分、サンスクリーン、保存剤などを含有することができる。化粧品組成物中の根粒成分または複数の根粒成分の濃度は、適当には当該化粧品組成物の総重量に基づき０．０００１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜１０重量％の範囲である。本発明による組成物は、これらに制限されないものとして、ローション、軟膏、クリーム、スプレイ、スピリット、水性または水性アルコール性混合物、ゲル、ムース、貼布剤、パッド、マスク、含水布およびハンカチ、固形スティック、クリアースティック（ｃｌｅａｒ  ｓｔｉｃｋｓ）、口紅、エアゾルクリーム、無水パウダー、タルク、オイル、エマルジョン、およびバスソルト（ｂａｔｈ  ｓａｌｔｓ）を包含する種々の種類の化粧品に使用することができる。
【００３５】
根粒抽出物は、当業者に知られている種々の抽出方法により根から得ることができる。このような抽出は、水の使用、水混和性有機溶剤（例えば、アセトン、ベンチレングリコールまたはエタノール）、もしくは有機溶剤（例えばこれらに制限されないものとして、ヘキサンまたはメチルエチルケトン）の使用を包含する。抽出にはまた、超限界液体抽出法、例えばこれに制限されないが、超限界二酸化炭素抽出法の使用が包含される。根粒は湿った状態または乾燥した状態で生じることが見出される。このような条件は抽出物の最終組成に影響するが、抽出方法には影響しない。根粒抽出は単独で、または別の植物部分、例えば葉、茎、花、種子および根に対し行うことができる。これらの部分の存在は、生成する抽出物組成を修正することができる。抽出は抽出方法に応じて、正常大気圧で、もしくは高圧または低圧下に行うことができる。抽出は−３０℃〜２００℃、さらに好ましくは５℃〜１００℃、最も好ましくは２５℃〜４５℃の温度で行うことができ、このような抽出溶剤、圧力および温度は根粒抽出物に見出されるレグヘモグロビンタンパク質が変性されないように適当に選択する。
【００３６】
本発明による抽出物は、当業者に知られている多数の手段のいずれかにより精製することができ、このような手段は、これらに制限されないものとして、クロマトグラフイ、水蒸気蒸留、溶剤抽出、遠心分離、デカンテーション、濾過、またはカーボン処理を包含する。本発明による抽出物は、当業者に知られている多数の手段のいずれかにより濃縮することができ、このような手段は、これらに制限されないものとして、蒸発、噴霧乾燥、凍結乾燥、水蒸気蒸発もしくはベルトまたはドラム乾燥を包含する。
【００３７】
下記例は、本発明の技術を例示しようとするものであって、下記特許請求の範囲の範囲を制限しようとするものではない。
例１
根を包含する新しく摘み取った大豆植物［グリシン  マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）］２キログラムを、脱イオン水の穏やかな蒸気により洗浄し、残留土壌を除去した。充分に感染した根上に容易に見ることができる窒素固定根粒は、手により容易に取り出すことができ、これらを採取した。単離した根粒約１００グラムに、脱イオン水２００ｍｌを添加し、この混合物全体を、高せん断下にワーニング（Ｗａｒｉｎｇ）ブレンダーで浸軟させた。生成する暗色不均質ライゼートを布地に通して濾過し、大量の未溶解物質を分離した。生成する濁った暗色溶液を、細かいろ紙を通す濾過およびカーボンおよび無菌濾過によってさらに精製し、抽出物の強力な土臭の原因である生物を分離した。
【００３８】
この特定の抽出物中のレグヘモグロビンレベルは、下記分析法により測定し、約０．３ｍｇ／ｍｌであることが見出された。この抽出物の試料１０ｍｌに、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７）中の０．１Ｍジチオン酸ナトリウム１ｍｌを添加した。この試料を気体状一酸化炭素（ＣＯ）の蒸気を試料中に２０分間にわたり穏やかに泡立てて通すことにより、気体状一酸化炭素で処理した。この操作は、レグヘモグロビンのヘム鉄に一酸化炭素を永久的に結合させる。これにより、紫外線スペクトル内の４１６ｎｍ波長において２００ｍＭ−１ｃｍ−１の吸光係数を有するレグヘモグロビン−ＣＯ複合体（Ｌｂａ−ＣＯと称する）が得られた。このＬｂａ−ＣＯ複合体溶液０．４ｍｌを１−ｃｍ光路ＵＶキュベット中で使用し、次いでｐＨ７．０でＰＢＳの吸光ブランクと比較し、生じる吸光係数およびＬｂａ−ＣＯ複合体にかかわる公知吸光係数を用い、レグヘモグロビンの濃度を測定する。
【００３９】
例２
活性窒素固定根粒を含有する根２キログラムを、ブラキオルヒゾビウム（Ｂｒａｃｈｙｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属からの細菌を接種したバーミキュライト中で水栽培により生長させたマメ科植物（ロータス  ジャポニカス（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ））から得た。この窒素固定根粒約１００グラムを洗浄し、取り出し、生成する根粒を、８０％水性エタノール２００ｍｌを用いワーリングブレンダーにおいて根粒を浸軟させることによって抽出した。生成する不均質混合物を上記のとおりに濾過した。エタノールを低温減圧蒸留により除去し、次いで相対量の脱イオン水で置き換え、例１に記載の方法を用いて分析し、約０．６ｍｇ／ｍｌのレグヘモグロビンを含有する根粒抽出物を得た。
【００４０】
例３
アルファルファ（Ａｌｆａｌｆａ）（メディカゴ  サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））から得た根粒の試料を、例１に記載と同様の方法で処理した。サイトカイニン  ゼアチン（ｚｅａｔｉｎ）（ゼアチンの純粋試料はセルバ（Ｓｅｒｖａ）（Ｉｓｌａｎｄｉａ，ＮＹ）から得られる）の存在にかかわるこれらの抽出物のＨＰＬＣ分析は、刊行物、特にＨａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｔ．等によるＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５；４９：３４８１−３４８４に報告されている濃度に匹敵する濃度を示した。この抽出物を例１に記載の方法を用いて分析し、レグヘモグロビン約０．５ｍｇ／ｍｌを含有することが見出された。
【００４１】
例４
例１に記載の方法を使用し、植物ルピネ（Ｌｕｐｉｎｅ）（ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ）？）から育成された根粒から、水性抽出物を調製した。この抽出物は、レグヘモグロビン０．４ｍｇ／ｍｌを含有することが見出された。
【００４２】
例５
種々の水性根粒抽出物の試料を、大豆マメから得られたレシチンおよびリン脂質を含有するリポソーム中に配合した。この抽出物を、リン脂質およびレシチン成分とともにスラリー形成し、この混合物を次いで、Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から入手される高圧ホモゲナイザーを用い、均質化した。この乳白色混合物は、リポソーム成分により封入された窒素固定根粒抽出物を含有していた。
【００４３】
例６
例１からの根粒抽出物およびマルトデキストリン糖と水との６７％混合物としてＲｏｑｕｅｔｔｅ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｋｅｏｋｕｃ，ＩＡ）から入手できるマルトデキストリン封入性オリゴサッカライドの１：１混合物を、市販噴霧乾燥機を用い噴霧乾燥させた。試料を採取し、次いで水中に再溶解し、次いでこの混合物を例１に記載の方法を用いて、生成する封入された粉末中のレグヘモグロビンについて分析することによって測定し、レグヘモグロビン約０．１５ｍｇ／ｍｌを含有していた。
【００４４】
例７
例１からの水性大豆根粒抽出物の試料を、レッドスター酵母菌（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｙｅａｓｔ）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から得られたベーカー（Ｂａｋｅｒ）の酵母増殖培地の水性混合物中に入れた。この培地に、レッドスター（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ）からまた得られる活性酵母培養物を接種し、この混合物を、制御好気性条件下に発酵させ、米国特許２，２３９，３４５に記載のストレス条件を用いて得られる生存酵母細胞由来物質（Ｌｉｖｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（ＬＹＣＤ）を得た。生成する酵母菌ライゼートは、例１で引用されている方法を用いることによって証明して、レグヘモグロビンの存在にかかわり陽性の試験結果を継続した。
【００４５】
例６−９は、例１−４に記載の種々の根粒抽出物を用いて調製することができる、本発明によるスキンケア（ｓｋｉｎ  ｃａｒｅ）組成物を例示している。
例６
この例は、例１に記載の根粒抽出物を配合した高内部相油中水型エマルジョンを例示する。
成分 重量％
１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン              ０．２
ブリジ（Ｂｒｉｊ）９２１                             ５．０
ベントン（Ｂｅｎｔｏｎｅ）３８                      ０．５
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２ Ｏ                                 ０．３
ＤＭＤＭ  ヒダントイン                              ０．０１
根粒抽出物                                        １０．０
水                                      全量を１００にする量
１  ブリジ（Ｂｒｉｊ）９２はポリオキシエチレン（２）オレイルエーテルである。
【００４６】
例７
この例は、例４に記載のとおりに調製した根粒抽出物を配合した水中油型クリームを例示する。
成分 重量％
鉱油                                                  ４
１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン                １
ブリジ（Ｂｒｉｊ）５６１                               ４
アルホル（Ａｌｆｏｌ）１６ＲＤ２                       ４
トリエタノールアミン                                  ０．７５
ブタン−１，３−ジオール                              ３
キサンタンガム                                        ０．３
メチル、プロピルおよびブチルパラベン                  ０．０１
根粒抽出物                                        １０．０
水                                    全量を１００にする量
１  ブリジ（Ｂｒｉｊ）５６は、セチルアルコールＰＯＥ（１０）である。
２  アルホル（Ａｌｆｏｌ）１６ＲＤは、セチルアルコールである。
【００４７】
例８
この例は、例２に記載のとおりに調製した根粒抽出物を配合したアルコール性ローションを例示する。
成分 重量％
１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン          ０．３
エタノール                                      ４０
根粒抽出物                                      １０．０
水                                    全量を１００にする量
【００４８】
例９
この例は、例３に記載のとおりに調製した根粒抽出物を含有する準ミクロンエマルジョンコンセントレートを例示する。
成分 重量％
トリメチロールプロパントリカプリレート／
トリカプレート                                  １８．０
グリセリン                                        ８．０
セテアリルアルコール                              ２．０
セテアレス（Ｃｅｔｅａｒｅｔｈ）２０              ２．０
グリセリルステアレート                            ２．０
ＢＨＴ                                            ０．０１
根粒抽出物                                      １０．０
水                                    全量を１００にする量
【００４９】
例１０
レグヘモグロビンを含有する根粒抽出物のヒト繊維芽細胞における一酸化窒素レベルの制御能力を試験するために、下記評価を行った。
繊維芽細胞の調製
６−ウエルプレートの各ウエルに繊維芽細胞を、総量２ｍｌの繊維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で３，５００細胞／ｃｍ２の初期細胞密度で接種した。接種細胞を培養器内で３７±２℃および５±１％ＣＯ２において一夜かけてインキュベートした。翌日、ＦＧＭを吸引によって除去し、いずれの未接着細胞も排除し、その代わりに新鮮なＦＧＭ２ｍｌを添加した。培地は、各４８時間のインキュベーション毎に再度、取替え、細胞を充分に密集させた。
【００５０】
試験材料の施用
密集繊維芽細胞からの培地を、例１に記載の抽出物に取り換え、ＦＧＭ中で稀釈し、１％の最終濃度を得た。ガンマ−インターフェロンを陽性対照として使用し（約３００Ｕ／ｍｌ）、一方、陰性対照として未処理細胞を使用した。各条件を、６反復で試験した。細胞は、３７±２℃および５±１％ＣＯ２においてインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞培養培地を採取し、次いで引続く亜硝酸分析用に凍結保存した。
【００５１】
硝酸の亜硝酸への酵素による変換
それぞれ３００μｌの各細胞培養培地試料を、硝酸レダクターゼ溶液（０．１Ｕ／ｍｌ硝酸レダクターゼ酵素、５μＭ  ＦＡＤ、３０μＭ  ＮＡＤＰＨ）１０μｌと混合した。この混合物を水浴（３７±２℃）中で少なくとも１５分間にわたりインキュベートした。この初期反応で消費されなかったいずれの残留ＮＡＤＰＨも除去するために（ＮＡＤＰＨは引続くグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を干渉するものと見なされる）、ラクテートデヒドロゲナーゼ溶液（ラクテートデヒドロゲナーゼ１００Ｕ／ｍｌおよびピルビン酸ナトリウム０．３ｍＭ）を添加し、この混合物を水浴（３７±２℃）中で少なくとも５分間にわたりインキュベートした。
【００５２】
亜硝酸分析：グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応
９６−ウエルプレートのウエルに、それぞれ１００μｌ定量の各細胞培養培地を添加した。各定量に、スルファニルアミド溶液（５％リン酸中１％スルファニルアミド）５０μｌを添加し、プレートを室温で５〜１０分間にわたりインキュベートした（光から保護する）。この最初のインキュベート後、ＮＥＤ溶液（ＤＩＨ２Ｏ中０．１％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン２塩酸塩）を各ウエルに添加し、次いでプレートを室温で５〜１０分間にわたりインキュベートした（光から保護する）。インキュベーション後、９６−ウエルプレートの各ウエルについて吸光値を５４０ｎｍで読み取った。
【００５３】
亜硝酸標準曲線
亜硝酸標準による一連の稀釈を行うことによって、下記一連の濃度を生じさせ、亜硝酸標準曲線を作成した：１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１３μＭ、１．５６μＭ、および０。これらの試料を細胞培養培地で稀釈した。
【００５４】
亜硝酸分析
亜硝酸分析用標準曲線を作成するために、標準用に吸光値対亜硝酸濃度（μＭ）をグラフに描き入れた。線型回帰を行い、これらのデータ点に最高に適合する線を確立した。被験試料および未処理試料にかかわる平均吸光値を使用し、各試料中に存在する亜硝酸の量を推定した。
この分析法を使用し、大豆根粒からの抽出物がヒト繊維芽細胞における一酸化窒素レベルを、未処理対照に比較し６０％減少させることができたことが測定された。
【００５５】
例１１
根粒抽出物のヒト皮膚繊維芽細胞生存率を改良する能力を試験するために、例４からの根粒抽出物を下記分析法を使用して試験した。
ヒト繊維芽細胞を、例１０に記載の方法を用いて密集まで増殖させた。この繊維芽細胞を例１０に記載の方法に従い被験材料で処理した。被験材料に露呈して４８時間後、下記試験を行った。
【００５６】
ＭＴＴ分析
細胞培養培地を取り除き、次いで繊維芽細胞をＰＢＳにより２回、洗浄し、いずれの残留試験材料も分離した。最終洗浄後、ＭＴＴ  ２ｍｇ／ｍｌを補給したＦＧＭを各ウエルに添加し、次いで細胞を約３７±２℃および５±１％ＣＯ２において約２時間にわたりインキュベートした。２時間のインキュベーション後、ＦＧＭ／ＭＴＴ溶液を分離し、次いで細胞をＰＢＳにより再度一回、洗浄し、次いでイソプロピルアルコール２ｍｌをウエルに添加し、紫色ホルマジン（ｐｕｒｐｌｅ  ｆｏｒｍａｚｉｎ）結晶を抽出した。このイソプロピル抽出液２００マイクロリットルを、９６−ウエルプレートに移し、このプレートをブランクとしてイソプロピルアルコールを使用し、５４０ｎｍで読み取った。
【００５７】
ＭＴＴ分析
平均ＭＴＴ吸光値を、陰性対照ウエルについて計算した。これらの細胞は処理されていなかったので、この平均値を使用し、１００％生存率を示した（未処理）。被験材料により処理したウエルの吸光値（処理試料）の場合、生存可能細胞のパーセンテージを、この方程式を用いて計算した：
［（各処理吸光値）／（平均未処理吸光値）］ｘ１００
この分析法を使用し、例４からの抽出物で処理した細胞が未処理細胞に比較し３０％大きい生存率を有することが測定され、この抽出物がヒト皮膚繊維芽細胞の細胞生存率を改善したことを示す。
【００５８】
例１２
根粒抽出物が可溶性ヒトエラスチンの成長を促進することができる可能性を試験するために、下記実験を行った。大豆根粒抽出物は例１に記載のとおりに調製した。抽出物および等張塩類偽薬をＰＢＳにより中性ｐＨに緩衝した。
【００５９】
新生児ヒト繊維芽細胞を、例１０に上記したとおりに繊維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）に入れ、培養フラスコに接種した。これらのフラスコを３７℃および５％ＣＯ２においてインキュベートし、細胞を充分に密集させた。フラスコへの初期接種後の２４時間の時点で、この培地を取替え、生存していない細胞の全部を取り除き、次いでその後、４８時間毎に取替えた。密集に到達した時点で、ＦＧＭを分離し、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝された塩類溶液（ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳ）９ｍｌにより１回、洗浄し、トリプシンを中和することができるＦＧＭからいずれの残留タンパク質も除去した。ＨＥＰＥＳ−ＢＳＳの除去後、トリプシン／ＥＤＴＡ６ｍｌを使用し、繊維芽細胞単層を覆った。トリプシンは培養フラスコに繊維芽細胞を保持する細胞接着性タンパク質を消化し、他方、ＥＤＴＡはいずれの残留カルシウムもキレート形成し、接着タンパク質をさらに不活性化した。
【００６０】
トリプシン処理は３分を超えなかった。細胞を集めた後、トリプシン中和溶液１２ｍｌを添加し、放出された細胞を１５ｍｌ遠心管に移した。このフラスコをＨＥＰＥＳ−ＢＳＳ  ６ｍｌですすぎ、前回の洗浄液に添加された残留細胞を採集した。遠心管を次いで、５分間かけて２２０ｘｇで回転させ、細胞をペレット化した。上清を吸引により除去し、次いで細胞をＦＧＭ  ４ｍｌ中に再懸濁し、次いで６−ウエルプレートに接種した。少量の一定量を採取し、細胞数を数えた。細胞を次いで、ＦＧＭにより稀釈し、１７，５００細胞／ｍｌの細胞密度に到達させた。接種された細胞を上記のとおりに一夜かけてインキュベートした。一日後、ＦＧＭを吸引除去し、いずれの未接着細胞も除去し、新鮮なＦＧＭで取替えた。細胞が充分に密集するまで、４８時間のインキュベーション毎に培地を取り換えた。
【００６１】
密集繊維芽細胞の培地を新鮮な培地または例１からの根粒抽出物含有培地のどちらかと取替えた。細胞を次いで、上記と同一の条件下に４８時間にわたりインキュベートした。
４８時間のインキュベーション期間後、この細胞培養培地を採取し、繊維芽細胞を収容しているウエルに０．２５Ｍシュウ酸１ｍｌを添加することによって、不溶性エラスチンを細胞から抽出した。細胞スクラッパーを用いて、細胞をプラスティック壁から開放し、次いで懸濁されている細胞／シュウ酸混合物を遠心管に添加した。これらの管を９５℃で６０分間かけてインキュベートし、細胞を溶解させた。これらの管を次いで、室温まで迅速に冷却させ、次いで１０分間にわたり３０００ｒｐｍで遠心処理した。この上清を、低分子量カットオフ値（〜１５，０００ＭＷ）を有する透析管に一夜にわたり入れ、エラスチンを少量に濃縮するとともに、シュウ酸を分離した。
【００６２】
各３００ｍｌの上記試料を、１．５ｍｌ微小遠心管内の冷たいファスチン沈殿試薬（Ｆａｓｔｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（これは、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ，Ｎｏｒｔｈｅｍ  Ｉｒｅｌａｎｄから入手できる）１．０ｍｌと混合した。この混合物を４℃で２４時間にわたりインキュベートし、エラスチンを沈殿させた。冷却した微小遠心管を１０分間にわたり８，０００ｘｇで回転させ、沈殿したエラスチンを詰め込んだ。排水のために、遠心管を逆さにし、次いで吸収性紙タオル上で穏やかに叩くことによって上清を分離した。
【００６３】
各管に、ファスチン染料試薬（Ｆａｓｔｉｎ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）一（１）ｍｌを、９０％飽和硫酸アンモニウム２００μｌとともに添加した。これらの微小遠心管を次いで、渦巻ミキサーを用いて混合し、次いで穏やかな機械的撹拌下に室温において６０分間、インキュベートした。ファスチン染料試薬は、特にエラスチンのアミノ酸と相互反応し、着色したエラスチン／染料複合体を形成する。この複合体は硫酸アンモニウムの存在下に沈殿する。これらの微小遠心管を１０分間にわたり８，０００ｘｇで回転させ、沈殿したエラスチン／染料複合体を未結合染料から分離した。上清を注意して分離し、管を逆さにし、いずれの残留上清も排除した。
【００６４】
各微小遠心管に、ファスチン  デスタイン試薬（Ｆａｓｔｉｎ  Ｄｅｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）一（１）ｍｌを添加した。各試料管からの各１００ｍｌを、９６−ウエルプレートに移し、次いでミクロプレート読取機により５１３ｎｍで読み取った。可溶性エラスチンの量および不溶性エラスチンの量を、ファスチン  ダイ  キット（Ｆａｓｔｉｎ  Ｄｙｅ  Ｋｉｔ）製造業者により供給されているエラスチン試料から作成された標準化曲線に対する比較により測定した。開示されている方法を使用し、根粒抽出物の存在下に増殖させた細胞は、未処理対照の細胞増殖よりも多量のエラスチンを含有していたことが見出された。繊維芽細胞生存率は例１１に記載のとおりに測定し、これらの細胞が本実験条件下に生存することを示した。
【００６５】
例１３
レグヘモグロビンを含有する根粒からの抽出物がヒト皮膚繊維芽細胞における環状ＧＭＰの産生を制御することができる可能性を試験するために、例２で製造された抽出物を使用し、下記試験を行った。
【００６６】
ｃＧＭＰ分析：繊維芽細胞細胞培養調製物および処理
ヒト真皮繊維芽細胞を、１２ウエル組織培養プレートのウエル中の細胞培養培地１ｍｌに、７．５ｘ１０４細胞／ｍｌで接種した（各処理に、３個のウエルを調製した）。接種後、細胞を３７±２℃および５±１％ＣＯ２において一夜かけてインキュベートした。翌日、この培養培地を吸引により分離し、細胞を予備刺激緩衝液［ストック（Ｓｔｏｃｋ）８００ｍＭ  ＩＢＭＸ；５６３μｌＤＭＳＯ中に溶解したＩＢＭＸ  １００ｍｇ；予備刺激緩衝液；リン酸塩緩衝塩類溶液１０ｍｌに添加した８００ｍＭ  ＩＢＭＸ  ９．４μｌ］４００μｌ中で１０分かけてインキュベートした。この予備処理後、各ウエルに、リン酸塩緩衝塩類溶液２００μｌ（陰性対照）またはスペルミンＮＯＮＯａｔｅ（３００ｍＭ、陽性対照）を添加した。
【００６７】
この時点で、添加される物質が、それらの意図する最終濃度の３ｘで調製されるように稀釈されていることに留意すべきである（スペルミンＮＯＮＯａｔｅの最終濃度は１００ｍＭであった）。細胞を次いで、３７±２℃および５±１％ＣＯ２において１．５時間かけてインキュベートした。この処理期間の終了時点で、各ウエルに細胞溶解緩衝液２００μｌを添加し、次いで１２−ウエルプレートを室温で１０分間にわたり揺動台上に置いた。この細胞ライゼートを次いで、採取し、次いでｃＧＭＰについて分析した。繊維芽細胞に加えて、既知量のｃＧＭＰを含有するブランクのウエルを処理した（これらのウエルは細胞を含有していない）。これらの試料を上記のとおりに処理し、また採取し、次いでこれらを用いてｃＧＭＰにかかわる標準曲線を作成した。
【００６８】
キャッチポイントｃＧＭＰ分析
キャッチポイント（ｃａｔｃｈｐｏｉｎｔ）ｃＧＭＰ分析は、競合蛍光ベースＥＬＩＳＡ分析法である。この種の分析において、試料中のｃＧＭＰの量が増加するほど、蛍光信号は減少する。この分析法は下記のとおりである：
１．分析する各試料五十（５０）μｌを、清明な底黒９６−ウエルプレートの各ウエルに添加した（これらの試料は標準曲線に用いられるｃＧＭＰ試料を包含する）。このウエルプレートのウエルは、抗ウサギＩｇＧで予め被覆した。
２．ウサギ抗−ｃＧＭＰ抗体五十（５０）μｌを次いで、上記で用いられたウエルに添加した。
【００６９】
３．ｃＧＭＰ−ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役結合体五十（５０）μｌを次いで、上記で用いられたウエルに添加し、このウエルプレートを揺動台上で室温において２時間かけてインキュベートした。
４．このインキュベーション後、ウエルプレートを洗浄緩衝液（キットとともに供給される；０．０２Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＣａＣｌ、０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、および０．０５％プロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ））３００μｌにより４回、洗浄した。
【００７０】
５．吸引により最終洗浄液を分離した後、ストップライト  レッド（Ｓｔｏｐｌｉｇｈｔ  Ｒｅｄ）蛍光基質溶液をウエルプレートで用いられる各ウエルに添加し（１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２とともに）、このプレートを少なくとも１時間にわたりインキュベートした（１０分間が最低インキュベーション期間であるが、信号は２４時間まで安定である）。インキュベーション期間中、９６−ウエルプレートは光から保護した。
６．インキュベーション期間後、９６−ウエルプレートを、フルオロスカン  アセント（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）Ｆ／Ｌプレート読取機を用い、これらの設定で読み取った：
ａ．励起フィルター：５３０ｎｍ
ｂ．発光フィルター：５９０ｎｍ
ｃ．集積期間：５０秒
【００７１】
ＣＧＭＰ分析
ｃＧＭＰ存在量を定量するために、既知濃度のｃＧＭＰを用い、標準曲線を作成した。回帰分析法を次いで行い、これらのデータ点に最高に適合する線を確立した。種々の条件で処理された試料中の環状ｃＧＭＰ含有量を次いで、この標準曲線から推定した。この分析法を使用し、スペルミンＮＯＮＯａｔｅ１００ｍＭで処理された繊維芽細胞がほぼ８０％のｃ−ＧＭＰの増加した産生を示したことが見出された。同一の繊維芽細胞を例２からの根粒抽出物１０％を含有するスペルミンＮＯＮＯａｔｅ１００ｍＭにより処理すると、ｃ−ＧＭＰのレベルは減少し、未処理細胞について記録されるレベルに逆戻りし、ヒト繊維芽細胞中のｃ−ＧＭＰに対する制御能力を有することを示す。
【００７２】
例１４
レグヘモグロビンを含有する根粒からの抽出物がヒト皮膚におけるメラニン産生［黒く、硬くなる（ｔａｎｎｉｎｇ）］に影響することができることを試験するために、下記インビトロ試験を、例２から得た抽出物を用いて行った。
組織調製
到着時点で、マットテック  メラノダーム（ＭａｔＴｅｋ  Ｍｅｌａｎｏ  Ｄｅｒｍ）組織を使用時点まで４℃で保存した。使用に先立ち、組織をアガロース出荷トレイから取り出し、分析培地０．９ｍｌ含有６−ウエルプレートに入れた（３７±２℃）。いずれかの残留アガロースは組織の広がりから分析培地を妨害することができることから、アガロースの全部を挿入された組織培養物の外部から取り除いた。この組織を、３７±２℃および５±１％ＣＯ２において少なくとも１時間かけてインキュベートした。この初期インキュベーション後、分析培地を新鮮な培地５．０ｍｌで置換え（３７±２℃）、組織挿入物を２本の無菌ステンレス鋼洗浄機に置き、挿入物の底部レベルが分析培地の表面に触れるようにしてすすいだ。
【００７３】
試験物質の適用
二十五（２５）μｌまたはｍｇを、組織の表面上に直接に適用した。被験物質に加え、陽性対照（分析培地中１０−７Ｍアルフアメラニン細胞刺激ホルモンおよび３ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ）および陰性対照（無処理）を各組織に適用した。この６−ウエルプレートを３７±２℃および５±１％ＣＯ２においてインキュベートし、次いで同一セットのプレートを１０日間および１７日間、インキュベートした。このインキュベーション期間中、組織をすすぎ、新しい被験物質を適用し、また分析培地は一日おきに取り換えた。
【００７４】
顕微鏡検査
インキュベーション期間の終了時点で、数個の６−ウエルプレートの分析培地を、ＰＢＳ０．９ｍｌと取り換え、次いでステンレス鋼洗浄機を取り除いた。組織を含有する６−ウエルプレートを、逆転顕微鏡下に置き、次いで評価し、被験物質がメラニン細胞に対しいずれかの細胞毒性作用を発揮したかを測定した。毒性作用は、集合形態および／または非樹枝状形態を有するメラニン細胞によって示される。顕微鏡評価後、メラノダーム（Ｍｅｌａｎｏｄｅｒｍ）組織を培養挿入物から取り出し、次いでメラニン含有量について分析するまで、−７５±５℃で保存した。
【００７５】
組織からのメラニン抽出
各処理および経過時間点について２個の凍結組織を集め、１％  ＳＤＳ含有０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ０．４５ｍｌおよび１０ｍＭトリス（ｐＨ６．８）中で均質化した。５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）溶液二十（２０）μｌを次いで、各ホモジネートに添加し、この混合物を４５±２℃に設定した水浴内で一夜にわたり消化させた。一夜にわたる消化後、さらに２０μｌのプロテイナーゼＫを、各ホモジネート添加し、この混合物をさらに４時間（または塊状組織が残らなくなるまでさらに長時間）かけて消化させた。消化後、５００ｍＭ炭酸ナトリウム５０μｌを添加し、消化物を塩基性にし、次いで３０％過酸化水素１０μｌを添加した。これらの試料を次いで、８０±２℃において３０±５分間にわたりインキュベートし、次いで室温まで冷却させた。冷却後、クロロホルム／メタノール（２：１）混合物１００μｌを、各試料に添加した。これらの試料を次いで、１０，０００ｘｇにおいて１０分間にわたり遠心処理した。各試料の頂上面を採取し、次いでその吸光値を４０５ｎｍにおいて９６−ウエルプレート読取機により測定した。
【００７６】
メラニン標準
既知濃度の合成メラニンは、上記抽出方法により採取した。これら既知濃度の吸光値を使用し、メラニン濃度の標準曲線を作成した。
メラニン標準にかかわる吸光値を、それらの各濃度に対してグラフに描き、標準曲線を作成した。この曲線に最高に適合する方程式を回帰分析により評価し、この方程式を使用して未知試料のメラニン濃度を計算した。この組織メラニン濃度を次いで、偏差にかかわる２因子分析法を使用し（２種の因子として、処理および経過時間を使用する）、比較した。例２から得られた抽出物で処理した組織試料は、メラニン濃度対未処理対照において統計学的に有意の減少を示すことが見出された。
【００７７】
本発明を、その特定の例を引用して前記したが、かなりの変更、修正および変化が本明細書に記載の本発明の概念から逸脱することなくなしうることは明白である。従って、添付特許請求の範囲の精神および広い範囲内に入るこのような変更、修正および変化の全部が包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】窒素サイクルを示す。
【図２】窒素固定を示す。
【図３】オーストラリアン  パインの根からの窒素固定根粒を示す。
【国際調査報告】
2005526037.tif 000005