(57)【要約】  本発明は、免疫系を刺激するための組成物および方法を提供する。このような方法には、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからの抽出物、精製ペプチド結合グルカンまたはその活性成分の投与がある。前記方法は、感染症、悪性新生物疾患、自己免疫疾患、タンパク質損失疾患、免疫抑制治療、外科手術または麻酔薬投与の結果として発症する、続発性免疫不全の予防および治療に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１→３）結合によって結合されたグルコース分子を有し、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．３ｋＤａ〜５ｋＤａの分子量をもち、免疫刺激活性を備えた少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有する、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの精製抽出物。
【請求項２】
前記分子量が０．７ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項３】
前記平均分子量が２．６ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項４】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって判定されるような腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項２に記載の精製抽出物。
【請求項５】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって判定されるような腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項３に記載の精製抽出物。
【請求項６】
請求項１に記載の精製抽出物であって、
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒをアルカリで処理し、その後で上澄みを分離するプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得た溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた前期溶出液を篩い分けし、少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスとによって調製された
精製抽出物。
【請求項７】
前期篩い分け法が、分子篩い分けクロマトグラフィーまたはエタノール分画化であることを特徴とする、請求項６に記載の精製抽出物。
【請求項８】
前記陽イオン交換がＣＭセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項６に記載の精製抽出物。
【請求項９】
前記陰イオン交換がＤＥＡＥセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項６に記載の精製抽出物。
【請求項１０】
ペプチド結合グルカンが、水、エタノール、アセトン中で可溶性であり、クロロホルムおよびジクロロホルム中で不溶性であり、さらに非吸湿性であることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項１１】
（１→３）結合によって結合され、分子量が、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．７〜３．０ｋＤａの分子量をもつ、複数のグルコース分子を有するＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの単離ペプチド結合グルカンであって、前記グルカンとその活性成分が、免疫刺激活性を有していることを特徴とするグルカン
【請求項１２】
ペプチド結合グルカンのペプチド成分である、請求項１１に記載の活性成分。
【請求項１３】
ペプチド結合グルカンのグルカン成分である、請求項１１に記載の活性成分。
【請求項１４】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって定量される、腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項１５】
平均分子量が、０．８ｋＤａであることを特徴とする、請求項１１に記載の複数のペプチド結合グルカン。
【請求項１６】
分子量が、０．７ｋＤａであることを特徴とする、請求項１１に記載の、ペプチド結合グルカン。
【請求項１７】
平均分子量が、２．６ｋＤａであることを特徴とする、請求項１１に記載の複数のペプチド結合グルカン。
【請求項１８】
平均分子量が、６．２ｋＤａであることを特徴とする、請求項１１に記載の複数のペプチド結合グルカン。
【請求項１９】
平均分子量が、３．０ｋＤａ未満であることを特徴とする、請求項１１に記載の複数のペプチド結合グルカン。
【請求項２０】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって定量される、腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド結合グルカン。
【請求項２１】
活性成分が、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって定量される、腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１２に記載の活性成分。
【請求項２２】
活性成分が、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって定量される、腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１３に記載の活性成分。
【請求項２３】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのアルカリ処理と上澄みのを分離行うプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得られた溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた溶出液を篩い分けし、ひとつのペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスとによって精製された、請求項１１に記載のペプチド結合グルカン。
【請求項２４】
篩い分け法が分子篩い分けクロマトグラフィーまたはエタノール段階勾配法であることを特徴とする、請求項２３に記載のペプチド結合グルカン。
【請求項２５】
陽イオン交換がＣＭセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項２３に記載のペプチド結合グルカン。
【請求項２６】
先行請求項のどれかひとつに記載の抽出物または単離ペプチド結合グルカンを有する薬理学的組成物。
【請求項２７】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのアルカリ処理と上澄みの分離を行うプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得られた溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた溶出液を篩い分けし、分子量０．７〜５ｋＤａをもつペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスとから、ペプチド結合グルカンを精製する方法。
【請求項２８】
処置プロセスに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体を浸軟するプロセスと、
前記浸軟したＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体をアルカリで抽出することによって抽出物を取得するプロセスと、
前記抽出物からの不溶性物質を除去するプロセスと、
前記第一の抽出物から上澄みを清澄化するプロセスと、
第三の粗抽出物を陽イオン交換に供することを特徴とする、前記第三の抽出物を取得するため上澄みを濃縮するプロセスを含むことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アルカリ抽出プロセスが、アルカリ性水溶液内で浸軟したＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ子実体を煮沸するプロセスを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アルカリ性水溶液が、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アルカリ性水溶液の常態が、０．１Ｎ未満かまたはこれに等しいことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
アルカリ性水溶液の常態が０．０１Ｎであることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
不溶性物質が、ろ過によって前記第一の抽出物から除去されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
分子量０．７〜５ｋＤａを持つペプチド結合グルカンを有する分画を、遠心分離法によって清澄化することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
分子量０．７〜５ｋＤａをもつペプチド結合グルカンを有する分画を、ロータリーエバポレーション、凍結または凍結乾燥によって濃縮することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチド結合グルカンを有する分画が分子量０．７〜約３．０ｋＤａをもつことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１、請求項６または請求項１１のどれかひとつの抽出物、ペプチド結合グルカンまたはその活性成分と免疫系の細胞とを接触させるプロセスを有する、免疫反応を刺激する方法。
【請求項３８】
細胞が脾細胞または骨髄細胞で、接触により、前記細胞の増殖反応が誘導されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がマクロファージで、接触が前記細胞による一酸化窒素の分泌を誘導することを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
接触がｉｎ  ｖｉｖｏで行われることを特徴とする、請求項3７に記載の方法。
【請求項４１】
接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることを特徴とする、請求項3７に記載の方法。
【請求項４２】
免疫反応を刺激するための、請求項１、請求項６、請求項１１または請求項２３に記載の、抽出物、精製ペプチド結合グルカンまたはその活性成分の効果的量を患者に投与するプロセスを有する、免疫系の刺激を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項４３】
前記患者が免疫不全症であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者が無症候であるが免疫不全の疑いのあることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫不全症が、感染症、悪性新生物疾患、自己免疫疾患、タンパク質損失常態、免疫抑制治療、外科手術または麻酔の投与の結果として発生したことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記感染症が、風疹、先天性風疹、麻疹、ハンセン氏病、結核、コクシジオイデス症、慢性感染症、急性ウイルス感染症、サイトメガロウイルス、多重ウイルス感染症および反復性ウイルス感染症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記悪性新生物疾患が、ホジキンス病、急性白血病、慢性白血病、非リンパ系ガンおよび骨髄腫からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リューマチ様関節炎および慢性能動性肝炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記タンパク質損失状態が、ネフローゼ症候群およびタンパク質損失腸症からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫抑制治療が、コルチコステロイド、細胞傷害性薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗胸腺細胞グロブリン、放射線、サイクロポリン、フェニトインおよびペニシラミンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫不全症が、糖尿病、アルコール性肝硬変、栄養不良、熱傷、サルコイドーシス、脾臓摘出、鎌状赤血球病、尿毒症、加齢、亜急性硬化性汎脳炎、ダウン症候群、新生児および早産児からなる群から選択された症状の結果として発生することを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫反応が、脾細胞または骨髄細胞の増殖もしくはマクロファージによる一酸化窒素の分泌を含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
投薬プロセスに反応する症状の改善または予防を検出するための、前記患者の症状をモニターするプロセスをさらに有している、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫不全症が、患者における獲得免疫不全症であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記獲得免疫不全症が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する感染の結果から発生していることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者が、ヘルペスウイルス１型、ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、水痘、アデノウイルス、ＥＢウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｓ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｐ、Ｃｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｓｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐおよびＣｈｌａｍｙｄｉａに感染しているかまたは感染している疑いがあることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
投薬プロセスに反応する免疫刺激を検出するため、患者における脾細胞および／または骨髄細胞の増殖をモニターするプロセスをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１１に記載のペプチド結合グルカンは、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であるというさらなる特徴を示す。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、出願日を２００２年５月２２日とする米国仮出願  番号６０／３８３，３３９と、出願日を２００２年９月６日とする米国正規出願  番号１０／２３６，９９６とに基づくＰＣＴ出願である。
【０００２】
最近まで、宿主の自然防衛能に対する免疫機能の各構成要素の重要性は、孤立性欠損が原因で臨床上の疾患が発症するまで、あまり明らかにはされてこなかった。しかし現在では、新しい実験法によってこのような異常を効果的に検出し、特定することが可能となったため、免疫不全による各種疾患が数多く発見されるようになってきている。免疫不全症は、多くが遺伝学的に決定される原発性免疫不全と、続発性免疫不全状態との２種類に大別されるとみなさねばならない。後者は、感染と外寄生、胃腸疾患、栄養失調、加齢、悪性リンパ腫、その他の種類の癌およびその他の多数の疾患の合併症として発症する。また、さまざまな重篤度の免疫不全が、癌に対する放射線療法や化学療法をはじめとする多数の治療法で副作用として発症する。このような観点からすれば、原発性および続発性の免疫不全症は、奇病であるとはいえない。このような問題に対処するため、免疫増強特性を有する新規な治療剤の追究が必要とされるようになってきた。
【０００３】
増加し続ける疾患の病因に免疫系が関与することが突き止められたことから、免疫学的機序の様々な要素を操作することによりこれらの疾患の発症過程を修正する試みを行わざるを得ない状況となってきている。免疫系を刺激するという方法は、免疫不全状態を改善するための常套手段として採用されている。現在、複数の効き目のある治療薬（すなわち、カルメットゲラン菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）や内毒素類）を使用できるこの治療法は、癌と感染症という医学界における２種類の主要な治療分野で特にその将来性が期待されている。
【０００４】
免疫学的監視という考え方によれば、免疫系は悪性細胞を発生した時点で脱離させる。Ｔ細胞だけでなく、最近では癌に対するナチュラルキラー細胞であるマクロファージの働きが報告されている。たとえ抗腫瘍免疫反応が腫瘍成長の抑制に基本的には関与しない場合であっても、十分な免疫刺激を与えれば、効果的な免疫反応を誘導できるか、あるいは他の方法では効果のない反応を有効にできる可能性がある。このような考察すべてを鑑みて、癌治療における外科手術、放射線療法または化学療法の補助的な治療法としての免疫刺激の採用が正当化されてきた。
【０００５】
免疫賦活剤については、動物モデルにおける感染症に関する治験が広く行われている。免疫不全の症状を示しており、なおかつ細菌による日和見感染の発症が頻繁に認められる感染被験者は、理論的には免疫療法の恩恵を受ける。しかし、免疫反応を増進すると、正常な生理反応を抑制する毒性の強い作用物質の排除に役立つ可能性があるので、免疫不全とは明らかに関わりをもたない感染症に対しても免疫増強剤による治療が可能であることに留意すべきである。さらに、多くの場合、さまざまなワクチン（例えば、インフルエンザワクチン）に対する反応が微弱な高齢被験者の症例にも特に注目すべきである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明のひとつの態様では、本発明は、（１→３）結合によって結合したグルコース分子を含み、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．７〜５ｋＤａの分子量と免疫刺激活性をもつ、少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有するＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの精製抽出物を提供する。本発明のもうひとつの態様では、本発明は、（１→３）結合によって結合した複数のグルコース分子を含み、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．７〜３．０ｋＤａの分子量をもつ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒから単離したペプチド結合グルカンを提供するが、前記単離ペプチド結合グルカンおよびその活性成分は、免疫刺激活性を備えている。本発明はさらに、単離ペプチド結合グルカンとその活性成分を有する製剤組成物を提供する。
【０００７】
さらにもうひとつの態様では、本発明は、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのアルカリ処理および上澄みの分離、前記上澄みの陽イオン交換、前記陽イオン交から得られた溶出液の陰イオン交換、前記陰イオン交換から得られた溶出液の篩い分け、および分子量が０．７〜５ｋＤａのペプチド結合グルカンを含む分画の収集の各プロセスを有する、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからペプチド結合グルカンを精製するための方法を提供する。
【０００８】
本発明のさらにもうひとつの態様では、本発明は、前記抽出物、ペプチド結合グルカンまたはその活性成分を免疫系の細胞に接触させるプロセスを有する、免疫反応を刺激する方法を提供する。本発明のさらにもうひとつの態様では、本発明は、免疫反応を刺激するための、請求項に記載の抽出物、ペプチド結合グルカンまたはその活性成分を有効量患者に投与するプロセスを含む、免疫系の刺激を必要とする患者に対する治療法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本発明に関して使用されている用語について、以下に定義する。
【００１０】
本明細書で使用されている『免疫賦活剤』、『免疫刺激剤』および『免疫調節剤』は、免疫反応を誘発する作用薬を表す。
【００１１】
『イムノゲン』は、免疫反応を誘導するか、あるいは免疫を獲得させることのできる作用薬または物質を表す。
【００１２】
『免疫原性』は、免疫反応を誘導するイムノゲンの能力を表す。
【００１３】
『免疫不全』は、体液または細胞媒介免疫性の産生の欠陥によるような、免疫学的反応能力の欠損を表す。
【００１４】
『免疫能力』は、抗原やイムノゲンに対する免疫学的反応能力を表す。
【００１５】
『非特異的免疫』は、抗体の形成や特異的抗原反応リンパ球の生成以外の機序から生じる病原体の侵入に対する抵抗を表す。
【００１６】
『ペプチド』は、アミド結合によって結合したアミノ酸残基を含む物質を表す。
【００１７】
『多糖』は、分子が単糖サブユニットの重合から生成される炭水化物類を表す。多糖は、一般に、グリコシド結合によって相互に結合した５個以上の単糖サブユニットを含んでいる。
【００１８】
『グルカン』は、グルコースからなる多糖を表す。
【００１９】
『免疫媒介』という用語は、先天的自己免疫性または炎症性であるようなプロセスを表す。
【００２０】
抽出物または組成物の活性成分は、免疫系を刺激する成分である。
【００２１】
『白血球』は、白血球細胞を意味する。白血球の例として、リンパ球、単球およびマクロファージがあげられる。
【００２２】
『リンパ球』という用語は、体液免疫または細胞免疫を媒介する単核細胞白血球を表す。
【００２３】
『単球』という用語は、組織内に移染してマクロファージ化する前に、血流中を短期間循環する単核食細胞白血球である。
【００２４】
『Ｔ細胞』は、胸腺で成熟し、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ８を発現するリンパ球を表す。複数のＴ細胞小集団が認識されている。
【００２５】
『患者』には、予防のための投薬または治療のための投薬のどちらかを受けるヒトと他の哺乳類被験体が含まれる。
【００２６】
『単離された』、『精製された』または『実質的に純粋な』という用語は、その生来の環境の中で蓄積されているかまたは成分から分離された目的種を意味する。したがって、抽出物におけるペプチド結合グルカンは、他のペプチド結合グルカンや他の細胞成分とともに存在しうるにもかかわらず、単離される。この用語は、目的種が存在する優勢な高分子種として存在しており（すなわち、モルを基準として、前記組成物内の他のどの個別種よりも豊富にあり）、さらに存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルを基準として）を有することが好ましいことを示しているとも考えられる。一般に、単離された組成物、精製された組成物または実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種を８０〜９０％より多く含んでいる。前記組成物が基本的に単一の高分子種から構成されるような必須の均質性に至るまで、目的種を精製することが最も好ましい（すなわち、汚染種が、従来の検出法によって、前記組成物内で検出不能であること）。
【００２７】
定量値にはすべて、数量の測定における代表的実験誤差を表す誤差限界が含まれている。
【００２８】
ＩＩ．概説
本発明は、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）の精製抽出物とその活性成分、該抽出物を精製するための方法および該抽出物を用いて免疫反応を刺激する方法を提供する。本発明の精製抽出物の活性成分は、低分子量（０．７〜５ｋＤａ、好ましくは０．７〜３ｋＤａ）のひとつ以上のペプチド結合グルカンである。前記ペプチド結合グルカンは、定期的摂取で健康状態を改善し、長寿命を実現するための手段として、中国社会で広く推進されてきた粗ＣＶ抽出物の免疫刺激特性を保持している。近年、従来の抽出物が、一般的な免疫能の衰弱や腫瘍の治療にさらに広く用いられるようになってきている。外科手術、化学療法、および／または放射線療法を受けた癌患者に従来のＣＶ抽出物を長期間にわたって経口投与した結果、免疫能と健康状態双方における大幅な改善が観察されている。
【００２９】
本発明の抽出物、ペプチド結合グルカンおよびそれらの活性成分は、中国漢方界で従来から実践されてきたような、ＣＶのもっと粗い抽出物に対する同様の方法での患者およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫反応の刺激に使用されている。さらに、本出願は、本発明のペプチド結合グルカンは腸壁を通して吸収できるので、従来の中国漢方のもっと粗い抽出物と同様に経口投与が可能である点を示すデータを提供する。しかし、本発明の抽出物およびペプチド結合グルカン、さらにそれらの活性成分には、高い純度、高い潜在能力および／または高い再現性という利点が備わっている。本発明の抽出物、ペプチド結合グルカンおよびそれらの活性成分は、さらに単離するのに使用することも可能である。例えば、本明細書の例にあげたデータは、グルカン成分がさらなる免疫刺激活性を与える可能性があるにもかかわらず、ペプチド結合グルカンのペプチド成分が主免疫刺激活性を備えていることを示唆している。したがって、前記抽出物およびペプチド結合グルカンを使用して、単離したペプチドおよびそれらの活性フラグメントを調製することが可能である。
【００３０】
本発明の実施に際しては、機序を理解する必要はないが、リンパ球および骨髄細胞の増殖およびマクロファージの活性化には、作用形態が明らかに関与していると考えられる。
【００３１】
ＩＩＩ．本発明の精製抽出物およびペプチド結合グルカン
本発明の精製抽出物は、篩分けクロマトグラフィーによって定量された０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有している。前記少なくともひとつのペプチド結合グルカンは、免疫刺激活性を有している。前記免疫刺激活性は、以下に述べる試験または例に掲載する試験のいずれにおいても、統計的に有意な反応によって観察することができる。
【００３２】
本発明の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも５０％のペプチド結合グルカンを含んでいることが好ましい。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも６０％のペプチド結合グルカンを含んでいる。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも７０％のペプチド結合グルカンを含んでいる。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも８０％のペプチド結合グルカンを含んでいる。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも８５％のペプチド結合グルカンを含んでいる。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも９０％のペプチド結合グルカンを含んでいる。本発明の一部の精製抽出物は、０．７〜５ｋＤａの分子量をもつ少なくとも９９％のペプチド結合グルカンを含んでいる。
【００３３】
ペプチド結合グルカンのグルカン成分は、１‐３結合によって結合したグルコース分子を有している。一部の抽出物にはいくつかのペプチド結合グルカンが含まれている一方で、それ以外の抽出物には、単一ペプチド結合グルカンが含まれている。複数のペプチド結合グルカンを含む抽出物では、ペプチド成分が、グルカン成分と同様に、各種ペプチドグルカンが同じ場合と異なっている場合とがありうる。好ましい抽出物では、ペプチド結合グルカンの平均分子量は０．７〜３ｋＤａである。一部の抽出物では、ペプチド結合グルカンの平均分子量は０．７〜１．０ｋＤａである。３ｋＤａ未満の分子量は、腸壁を確実に通過するのに有利である。本発明の一部のペプチド結合グルカンは、さらに、水、エタノールおよびアセトン中では可溶性、クロロホルムおよびヂクロロホルム中では不溶性および無吸湿性という特徴を示す。
【００３４】
ＩＶ．本発明の精製抽出物およびペプチド結合グルカンの調製
１．Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの活性抽出物水溶液の調製
図１のフローチャートに示されているように、液体溶剤で子実体を抽出し、得られた溶液を濃縮して濃縮抽出物を形成することにより、ＣＶの活性抽出物水溶液をＣＶの乾燥子実体から調製することができる。一部の方法では、ＣＶの乾燥子実体を浸軟し、色素を脱失させ、０．０１Ｎの水酸化ナトリウム溶液などの希釈アルカリ性水溶液中で煮沸する。水酸化カリウムなどの他のアルカリ性溶液も使用可能である。このような加熱条件下では、これらのアルカリ抽出剤溶液の濃度が０．１Ｎ未満で、活性の損失を回避できることが好ましい。抽出後には、不溶性物質を、例えば、ろ過などによって取り除き、残留生成物を遠心分離法またその他の手段によって清澄化する。清澄化して得た上澄みを保存および使用する前に濃縮し、凍結乾燥する。
【００３５】
凍結乾燥した上澄みは、ペプチド組成がブラッドフォードの検定によって定量された重量にして約４‐６％、好ましくは４．７％（実験誤差の範囲内で）であるという特徴を示す。好ましい抽出物は、フェノール硫酸法によって定量された重量にして５０〜６０％（好ましくは５５％）であるようなグルコース化合物を含んでいる。好ましい抽出物は、重量にして約４‐６％、好ましくは約４．８％であるようなウロン酸化合物を含んでいる。
【００３６】
２．ＣＶ抽出物の精製活性分画または部分精製活性分画の調製
図１５のフローチャートは、部分精製抽出物を調製するための模範的方法が示されている。乾燥粗ＣＶ抽出物を水中で溶解させ、水に溶けにくい物質を遠心分離法によって取り除く。ｐＨ４の水溶性ＣＶ抽出物の陽イオン物質をカチオン交換樹脂によって吸着し、除去することができる。次に、負電荷分子にするために選択可能ないずれかの技術を用いて、活性成分をさらに精製することができる。カチオン交換樹脂であるＤＥＡＥセルロースを使用していることが好ましい。部分精製分画は、分子量に基づいて分子を分離する段階的エタノール分画化またはゲルろ過によって、さらに細分画化することができる。好ましい分子量の範囲は、０．７〜３ｋＤａである。５段階のエタノール勾配では、９５％のエタノール水溶性物質を除き、活性分画がすべての段階で単離された。クロマトグラフィーなどのような技術で知られているいくつかの標準の方法を用いて、さらに精製を行うことができる。例えば、ペプチド結合グルカンのグルカン成分は、ペプダーゼで処理することによって、ペプチド成分から分離することができる。前記ペプチドは、グルカナーゼで処理することによって、グルカン成分から分離することができる。ペプチド結合グルカンのペプチドフラグメントは、選択したタンパク質分析消化作用によって調製することもできる。個々のペプチド結合グルカンは、任意選択により二次元でゲル電気泳動を行い、分離したバンドを切り取ることによって分離することができる。
【００３７】
Ｖ．精製抽出物および活性成分の免疫刺激活性を判定するための方法
免疫刺激活性は、種類の異なる細胞で異なる効果を発揮する。未成熟の免疫細胞の場合、免疫刺激剤を負荷すると、リン脂質の合成の亢進および二価の陽イオンの浸透性の増強などといった一連の生化学的イベントが発生する。タンパク質、ＲＮＡおよび最終的ＤＮＡの合成が、その後すぐに開始する。これは最終的現象、すなわちリンパ球および骨髄細胞の活性化を測定するための定量的基盤を形成する、ＤＮＡ合成（最終的に細胞分裂に導く）の亢進である。ＤＮＡ合成は、トリチウム化チミジン（３Ｈ‐Ｔｄｒ）、すなわち新たに合成されたＤＮＡに取り込まれるヌクレオシド前駆物質で培養液にパルスラベルすることによって観察する。ＤＮＡ合成速度に関する３Ｈ‐Ｔｄｒの取り込み量は、シンチレーション計数法によって定量化される。シンチレーション計数法では、マイトジェン反応性の標準の指標として一般に使用されている、カウント／分（ＣＰＭ）のデータが得られる。刺激した培養液のＣＰＭは、対照培養液で測定したＣＰＭで正規化して、刺激指数と呼ばれる比率を求める。
【００３８】
マクロファージのような効果免疫細胞は、免疫賦活剤によって活性化されると、細胞傷害性メディエーター（例：ＮＯ‐）およびサイトカイン（例：インターロイキンや組織壊死因子）を分泌することができる。マクロファージは免疫原刺激でのみＮＯ‐を分泌するので、マクロファージによるＮＯ‐産生の増加は一般に、イムノゲンの免疫刺激活性を定量化するための方法として使用されている。免疫刺激剤を用いた培養時には、マクロファージによって産生される反応性の高いＮＯ‐が即時酸化され、さらに安定性の高い亜硝酸塩（ＮＯ２‐）になる。次に、培養液の上澄みにおける亜硝酸塩イオンの量を、グリース反応によって測定することができる。
【００３９】
免疫刺激活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫モデルでも測定することができる。これらのモデルは、動物の全レベルで免疫反応を取り込むという利点を有する。免疫に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価するのに利用可能なモデルとして、重要な免疫臓器および遅延型過敏症の細胞質の検査（生存成分細胞数）などがあげられる。免疫学的研究における最新の動向では、免疫反応性を実証する際にｅｘ  ｖｉｖｏリンパ球増殖反応の採用にさらに重点が置かれている３，４。ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が、十分に認識されているリンパ球の特性であり、宿主細胞の免疫の良好な相関関係が実証されているので、ｅｘ  ｖｉｖｏ検定は、培養されたリンパ球が増殖する能力をもつという利点を活用できる。投薬治療の終了時に、被験動物を屠殺し、免疫適格細胞を収集する。次に、細胞を一定時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、滴定チミジンの細胞取り込みを評価する。ほとんどの免疫適格細胞が培養時に増殖可能であるにもかかわらず、測定可能なレベルに達するまで、例えばＣｏｎ  ＡやＬＰＳなどといった免疫賦活剤で増殖を亢進せねばならない３。
【００４０】
遅延型過敏症反応は、細胞媒介免疫の好適な相関現象である。接触性過敏症は一種の遅延型過敏症である。表皮における抗原、本質的にはハプテンを採取し、処理した後に、ランゲルハンス細胞によってＴ  ＣＤ４＋リンパ球に供与し、最終的に耳の血管拡張や膨潤を引き起こさせる。ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）などの効力のある接触増感剤を用いて、マウスで接触感受反応を誘導するが、その強度は、薬剤を実験動物に投与するかまたは化学物質に暴露させることによって調節することができる。デジタルキャリパーを用いて感作させる直前と感作の２４時間後にそれぞれ、耳介の厚さを測定する。耳介の厚さの増大は、遅延型過敏症の好適な指標となる３。
【００４１】
免疫刺激活性は、従来の癌治療の臨床試験や臨床前試験において、患者で測定してもよく、これらからは、従来の癌治療の臨床での効能を増強し、免疫障害状態から免疫機能を回復させ、感染に対する抵抗力を増強させる免疫賦活剤の能力は、基本的には、免疫学的防御系をそれらが非特異的に刺激することに起因することが示唆されている２。非特異的免疫能は、抗原またはさらに直接的にイムノゲンによって亢進することができる。分子レベルでは、抗原決定基と呼ばれる特殊な構造単位を所有するイムノゲンが、特定の免疫細胞の表面受容体を交差結合し、クローンの増殖または活性化に導く。
【００４２】
本発明の抽出物またはペプチド結合グルカンまたはそれらの活性成分は、上記検定法のどれかひとつで統計的に有意な反応を誘導するときに、免疫刺激活性を示す。前記抽出物またはペプチド結合グルカンまたは活性成分に対する反応は、対照薬やプラセボの反応としばしば比較されている。
【００４３】
ＶＩ．腸壁透過度
本発明の精製抽出物、ペプチド結合グルカンまたはそれらの活性成分に対しては、腸壁透過性スクリーニングを実施することもできる。このようにすると、経口投与が可能となり、好都合である。スクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸壁吸収度を調査するための腸壁表皮細胞の代用として、厳正に正当性が評価された結腸直腸悪性腫瘍に由来する高分化ヒト腸細胞系であるＣａｃｏ−２細胞系を用いて実施することができる。ヒトにおける生物学的利用能と、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）  インサートでＣａｃｏ−２単分子層を用いて取得した浸透性試験の結果との間には、良好な相関関係が認められた。Ｃａｃｏ−２単分子層全体にわたってトランスポート可能な成分の分子量分布と免疫原性は、前記の篩い分けクロマトグラフィーおよび生物学的検定法によって特徴づけすることができる5，6。浸透度は、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルでも測定することができる。
【００４４】
ＶＩＩ．細胞反応に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定法
ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカン、または活性成分は、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｅｘ  ｖｉｖｏ法で利用できる。一部の方法では、これら作用薬に対する細胞反応を分析し、これらの作用物質のｉｎ  ｖｉｖｏ投与計画を最適化するための情報を取得している。また別の一部の方法では、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、脾細胞または骨髄細胞の増殖あるいはマクロファージの分泌に対する効果について他の薬剤をスクリーニングするための陽性コントロールとして使用されている。陽性コントロールが脾細胞または骨髄細胞の増殖あるいはマクロファージの分泌を刺激する一方で、候補薬が併発反応を示さない場合には、試験薬は効果がないという結論に達しうる。それ以外の方法では、増殖しているＰＭＢを、免疫障害の患者から取得している。リンパ球をＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分でｅｘ  ｖｉｖｏ処理した後で、患者の体内に戻す。さらに、ＣｏｎＡまたはＬＰＳなどの免疫系を刺激する他の作用薬と同様に、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、研究所で細胞の活性化状態を調査するのに使用する科学的試薬として市販したり、免疫系を刺激する他の作用薬を発見するための対照薬として使用することも可能である。
【００４５】
ＶＩＩＩ．治療に敏感に反応する患者
治療に敏感に反応する患者には、免疫不全発症のリスクのある患者が含まれるが、実際の免疫不全症患者はその対象とはならず、現在免疫不全症である患者もまた除外される。免疫不全を発症すると、日和見感染に対する感受性が増長される。したがって、ＣＶ抽出物またはペプチド結合グルカンまたはそれらの活性成分を投与された患者は、日和見感染に対する感受性が低下している。
【００４６】
これらの方法は、特に、原発症状から引き起こされる続発性免疫不全を治療するのに好適である。一部の疾患では、続発性免疫不全は一過性のものであり、例えば結核やハンセン氏病などの原発性疾患を十分に治療しさえすれば、免疫能を回復するようになると考えられる。他の症状では、続発性免疫不全は、例えば先天的風疹のように、永久的疾患となる。このように、治療計画は原発症状によって異なるであろう。上述のように、多様な疾患が、続発性免疫不全症から生じる。続発性免疫不全は、感染、悪性新生物疾患、自己免疫疾患、タンパク質損失状態、免疫抑制治療、外科手術または麻酔薬投与から生じる可能性がある。
【００４７】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のある感染症には、風疹、先天性風疹、麻疹、ハンセン氏病、結核、コクシジオイデス症、慢性感染症、急性ウィルス感染症、サイトメガロウィルス感染、多重ウィルス感染および反復ウィルス感染などがある。
【００４８】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のある悪性新生物疾患には、ホジキンス病、急性白血病、慢性白血病、非リンパ系癌および骨髄腫などがある。
【００４９】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のある自己免疫疾患には、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎および慢性能動肝炎などがある。
【００５０】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のあるタンパク質損失状態には、ネフローゼ症候群およびタンパク質損失腸疾患などがある。
【００５１】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のある免疫抑制治療には、クルチコステロイド、細胞傷害性薬剤、アルキル化剤、抗代謝物質、抗胸腺細胞グロブリン、放射線、サイクロスポリン、フェニトイン、およびペニシラミンなどの使用がある。
【００５２】
続発性免疫不全を引き起こす可能性のあるその他の症状には、糖尿病、アルコール性肝硬変、栄養不良、熱傷、サルコイドーシス、脾臓摘出、鎌状赤血球病、尿毒症、加齢、亜急性硬化性汎脳炎、ダウン症候群、新生児および早産児などがある。
【００５３】
ＶＩＩＩ．治療法、薬剤組成および投与法
Ａ．治療法
予防のための利用法では、免疫不全を発症している疑いのある患者、またはそれ以外に発症するリスクのある患者に適切な量の薬剤組成物または薬剤を投与して、免疫不全の発症を予防、緩和または抑制する。治療を目的とした利用法では、組成物や薬剤は、免疫疾患症候群の症状を好転、抑制または少なくとも一部抑制することができるだけの十分な量で免疫不全疾患を発症している疑いのある患者または発症している患者に投与する。予防投与計画と治療投与計画の両方で、本発明のＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ抽出物またはペプチド結合グルカンまたは活性成分は、一般に、十分な反応を示すまで数種類の投与量で投与されている。ただし、予防計画と治療計画の両方で、本発明の抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分、あるいは本発明の部分精製ＣＶ抽出物を、十分な反応が得られるまで、一種類の投与量で投与してもよい。通例、治療をモニタして、反復投薬を実施してもよい。さらに治療計画には、他の免疫媒介障害を治療するのに使用されている投与量、投与経路および投与頻度と同じ内容を採用することができる。
【００５４】
単回投与形態を実現するため担体物質と結合することができるＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたはそれらの活性成分の量は、治療する疾患、動物種および特定の投与方式次第で異なっていてもよい。特定の患者にとって『効果的投与量』、『薬理学的許容可能な用量』または『薬理学的許容可能な量』は、採用されている特異的化合物の活性、治療する患者の種、年齢、体重、全般的健康状態、性別および食餌、投与時間と経路、代謝または排出速度、現在服用しているかまたは以前に服用したことのある他の薬剤、免疫学的疾患の種別と重篤度、副作用の重篤度、患者が動物かヒトかなどをはじめとする、多種多様な要因によって異なる可能性がある。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類などヒト以外の哺乳類も治療可能である。
【００５５】
本発明の方法で使用されている抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分に関しては、はじめにヒト以外の動物モデルから、ヒトにとって効果的用量を推定することができる。効果的用量は、当技術分野における周知のパラメータを用いることにより、医師が判定できる。一般に、投与は、最適な効果的用量よりやや少なめの量から開始されている。その後で、効果的投与量に至るまで、少量ずつ増やしていく（参考のため本書に引用されている、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ§２２,１９９２,Ｂｅｒｋｏｗ、Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｙを参照）。
【００５６】
投薬は、安全性と効能を最適化するために滴定により実施する必要がある。本書に記載されている化合物の毒性および治療上の効能は、実験動物における標準の薬理学的処置、例えば、ＬＤ５０（被験母集団の５０％までが致死に至る用量）およびＥＤ５０（被験母集団の５０％で薬理学的に効果のある用量）を判定することによって決定できる。毒作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらのヒト以外の動物に対する治験から得られたデータは、ヒトに応用したときに毒性を示さない用量範囲を処方するのに使用できる。このような化合物の投与量は、ほとんどまたはまったく毒性を示さない状態でのＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の症状に関する見解に基づいて、各医師が選択することができる（参考のために本書に引用されているＦｉｎｇｌらによるＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの第一章（１９７５）などを参照）。
【００５７】
一部の方法では、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、１．０〜１，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で、または好ましくは２０〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）・日の投与量で経口投与されている。ほかの方法では、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で経口投与されている。ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、単回日用量としてまたは複数回日容量として投与してもよい。一部の方法では、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたはそれらの活性成分は、体重／日に換算して少なくとも５０ｍｇの粗ＣＶ抽出物に等価の日投与量で経口投与されている。
【００５８】
Ｂ．薬剤組成と投与法
ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンおよびそれらの活性成分は、哺乳類、例えばヒトの患者または被験体に、単独で、あるいは薬理学的に許容可能な塩またはその加水分解型前駆物質の形態または、化合物が効果的投与量で好適な担体または賦形剤と混合されている薬理学的組成形態で供給するか投与することが可能である。薬理学的組成としては、固形の経口投与が好ましい。効果的計画とは、十分な量と頻度で、免疫学的疾患の少なくともひとつの症状の抑制、遅延、阻害、または逆発症を検出するのに適切な経路を用いて一種類の薬剤または併用薬剤類を投与することを意味する。『効果的投与量』、『薬理学的許容可能な用量』、『薬理学的許容可能な量』とは、適切な計画で十分な量のＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分が投与されたときに、例えば免疫反応の刺激、または免疫疾患の進行の防止、遅延、阻害または好転などを実現することを意味する。
【００５９】
本発明の方法で使用されているＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、単独で、併用しておよび／または多種多様な他の薬理学的許容可能な成分と一緒に薬理学的組成物として投与してもよい。薬理学的組成物は、（粉末、顆粒、糖衣錠、錠剤、またはピルなどの）固形剤形、（ゲル、スラリーまたは軟膏などの）半固形剤形、液体または（エアロゾルや吸入液などの）気体の剤形で用いることができる。
【００６０】
本発明で使用するための好適な処方は、参考のため本書に引用されているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９８５）Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）およびＬａｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：１５２７−１５３３に記載されている。本明細書に記載されている薬理学的組成物は、混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、微粉末化、乳化、カプセル化、内包化または凍結乾燥の各種プロセスなど、従来の製剤法で製造することができる。
【００６１】
ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、共通の剤形、希釈剤または担体と処方し、錠剤化するか、または使いやすい経口投与向けにエリキシル剤または溶液として処方してもよい。ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、徐放性錠などの剤形として処方してもよい。化合物の投与は、経口、舌下、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、動脈内、皮下および筋肉投与などの様々な方法で実現することができる。ただし、好ましい方法は、経口投与である。前記化合物は、全身的投与法ではなく、局部的投与法により貯蔵処方または徐放処方で投与を行う。さらに、前記化合物は、リポソームで投与してもよい。さらに、前記化合物は、食品または摂取液と組み合わせたり、飲料として摂取してもよい。
【００６２】
経口投与の場合、前記化合物は、従来の方法で、ピル、錠剤、カプセル、粉末または顆粒のいずれかの剤形を取ることができる。経口投与では、前記組成物は、液体、懸濁液、乳状液などの液体剤形を取ることができる。
【００６３】
舌下投与では、前記化合物は、従来の方法で処方された錠剤やトローチ状の剤形を取ることができる。
【００６４】
吸入投与では、本発明に従って使用する化合物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素などの好適な高圧ガスまたは他の好適なガスなどとともに使用して、加圧パック、ネブライザまたはシリンジスプレイから、あるいは高圧ガスを使用しない乾燥粉末吸入器からエアロゾルスプレイ調整剤の剤形で供給すると好都合である。加圧式エアロゾル投与の場合、計量された量を供給できるようにバルブを取り付けることによって、投与量の単位を決定できる。前記化合物とラクトースやスターチなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含んだ、例えば吸入器類で使用するためのゼラチンなど、カプセルやカートリッジとして処方することもできる。
【００６５】
前記化合物は、注射、例えば静脈内ボーラスまたは連続注射などによって非経口投与向けに処方することができる。注射向けの処方は、単位投与量剤形、例えば防腐剤を添加したアンプルや多用量コンテナで提供することができる。前記組成物は、オイルを基剤とした賦形剤または水液賦形剤における懸濁液、溶液、またはオイルを使用した乳状液などの剤形で処方することもでき、懸濁液、安定剤および／または分散剤としての処方剤を含んでもよい。非経口投与向けの組成物は、滅菌された、実質的にはアイソトニック飲料として、米国食料品医薬品局の適正製造基準、医薬品製造管理および品質管理基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））のすべてに完全に準拠して処方されている。
【００６６】
ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、すべて体温で溶け、さらに室温では固形化するココアバター、カーボンワックス、トリエチレングリコールまたはその他のグリセリドなど、従来の坐薬基剤を含有する坐薬や停留浣腸剤などの直腸組成物して処方することも可能である。
【００６７】
すでに述べた処方に加え、ＣＶ抽出物、ペプチド結合グルカンまたは活性成分は、貯蔵型調剤として処方することもできる。このように長時間作用する処方は、インプランテーション（例えば皮下や皮内）または筋肉注射によって投与することができる。したがって、例えば前記化合物を好適な高分子剤または疎水性剤（例えば使用可能なオイルにおける乳状液など）、またはイオン交換樹脂とともに、またはやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として処方することもできる。（参考として本書に引用されているＵｒｑｕｈａｒｔら著、（１９８４）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．，１９８１，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，米国特許番号３，７７３，９１９および３，２７０，９６０を参照）。
【００６８】
あるいは、疎水性の製剤化合物のための他のデリバリシステムを採用してもよい。リポソームや乳状液は、疎水性薬剤のための薬剤供給賦形剤や担体としてよく知られた例である。一部の方法では、長時間循環型、すなわちステルスリポソームを採用することができる。このようなリポソームについては、教示内容が参考のため本書に引用されている、Ｗｏｏｄｌｅら、米国特許番号５，０１３，５５６に概要が記載されている。本発明の化合物は、開示内容が参考のため本書に引用されている米国特許番号３，８４５，７７０；３，９１６，８９９；３，５３６，８０９；３，５９８，１２３および４，００８，７１９に記載されている化合物など、調整された放出手段、徐放手段および／または供給デバイスによって投与することができる。
【００６９】
薬理学的組成物は、好適な固体相またはゲル相の担体や賦形剤を含んでいてもよい。このような担体や賦形財の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類、スターチ類、セルロース誘導体類、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどの重合体などがあげられる。
【００７０】
ＸＩ．例
以下の例は、図解するために提供されているもので、制限することは意味していない。したがって、試薬の選択だけでなく、試薬の濃度、温度および他の様々なパラメータは、本発明の適用を例示することを目的として使用されており、それらの制限事項と考えてはならない。本分野の当業者は、本書に記載されている本発明を実現するために変更することができる非重要パラメータをすぐに認識することができるであろう。
【００７１】
例Ｉ
粗Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）抽出物の調製
粗Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）抽出物は、以下のプロセスを実施することによって調製する。乾燥したＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）子実体を浸軟させる。浸軟させたＣＶ子実体を細かく刻む。浸軟させ、細かく刻んだＣＶ子実体から色素を脱失させるプロセスを実施してもよい。次に、ＣＶ子実体を抽出する。抽出は、アルカリ性溶液、例えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどでＣＶ子実体を煮沸することによって実施してもよい。０．１Ｎ未満のアルカリ性水溶液が好ましい。抽出プロセスに続き、粗ＣＶ抽出物の調製では、ろ過などの不溶性物質の除去、遠心分離などによる抽出物の清澄化、ロータリーエバポレータなどによる前記抽出物の濃縮、前記抽出物の凍結、またはフリーズドライヤなどによる前記抽出物の凍結乾燥などの各種プロセスのひとつまたは複数に従ってもよい。その後、精製された粗ＣＶ抽出物を使用するか、または後で使用できるように保管しておくことができる。
【００７２】
図１は、粗ＣＶ抽出物の精製に関するプロトコルの各ステップを表すフローチャートである。３００ｇのＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）乾燥子実体を１Ｌの脱イオン化水中に約１時間浸して、浸軟させる。脱イオン化水を注ぎ出した後に、浸軟したＣＶ子実体を細かく刻む。浸軟させ、細かく刻んだＣＶ子実体から色素を脱失させてもよい。色素の脱失は、３Ｌの脱イオン化水中に、浸軟させて細かく刻んだＣＶ子実体を一晩浸すことによって実施せねばならない。ＣＶ子実体の抽出は、浸軟させ、細かく刻んだＣＶ子実体を２Ｌの０．０１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中で、定常的に静かに攪拌ながら５時間煮沸することによって実施する。
【００７３】
不溶性物質は、前記不溶性物質を捕獲する目の粗い布上に前記抽出物を注ぐことによって除去する。生成された上澄みは１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離にかけることによって清澄化する。次に、清澄化された上澄みを体積が５０％分減少するまで、８０℃でロータリーエバポレーションによって濃縮する。次に、清澄化された濃縮上澄みを−７０℃で凍結させることによって凍結乾燥する。精製された粗ＣＶ抽出物の乾燥重量は、約４３〜４７ｇで、色は暗褐色をしており、ふわふわした感触をもつ。粗ＣＶ抽出物は、すぐに使用してもよいし、後で使用できるように保管しておいてもよい。
【００７４】
例ＩＩ
粗ＣＶ抽出物の物理化学的特性
粗ＣＶ抽出物を分析し、その溶解性、融点、分解温度および吸湿性を調べた。分析に使用した方法および個々の結果について、表１にまとめる。
【００７５】
【表１】
2005526142.tif 000002
【００７６】
粗ＣＶ抽出物を分析し、平均分子量、および中性糖、ウロン酸およびペプチド／タンパク質のｗ／ｗパーセンテージを定量した。粗ＣＶ抽出物を、成分単糖としてのグルコースの有無および（１→３）グルカン結合の有無を調べた。粗ＣＶ抽出物に存在する炭水化物とペプチド分の結合を特徴づけした。分析および特徴づけに用いた方法およびそれぞれの結果について表ＩＩにまとめる。
【００７７】
【表２】
2005526142.tif 000003
【００７８】
粗ＣＶ抽出物の平均分子量を篩い分けクロマトグラフィーによって定量した。２００μｌの１−２ｍｇ／ｍｌ水性サンプルを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（高速性能液体クロマトグラフィーシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注射し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３０カラムで走査させ、０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液ｐＨ７．０で溶出させた。次に、溶離剤を２ｘ４０ｃｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３０カラムに供給し、２００ｍＭのアンモニアアセテート（ｐＨ７．０）を用いて溶出した。溶離剤を１ｍｌの分画として収集した。次に、分画を分析用サンプルとして用いた。分離プロセス全体を通じて、ＵＶ吸収率を２１０ｎｍでモニタした。
【００７９】
サンプルの分子量は０．５−４０ｋＤａの範囲であった。サンプルの平均分子量は、２．６ｋＤａであった。分子量は、各種炭水化物標準を用いて描かれた校正曲線を参照して定量した。
【００８０】
図２Ａは、粗ＣＶ抽出物のタンパク質成分の溶出像を表す篩い分けクロマトグラムである。２５４ｎｍにおけるタンパク質含有物質の溶出像をモニタすることによってサンプル中のタンパク質含有量を定量した（表ＩＩを参照）。図２Ｂは、粗ＣＶ抽出物の炭水化物成分の溶出像を表す、粗ＣＶ溶出物の篩い分けクロマトグラムである。溶離剤中の炭水化物含有量をフェノール硫酸試験によって測定した（表ＩＩを参照）。
【００８１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
例ＩＩＩ
粗ＣＶ抽出物とｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させた生存マウス脾細胞の増殖
頚椎脱臼によって３匹のＩＣＲマウスを屠殺した。屠殺したマウスの脾臓を無菌状態で除去した。ステンレススチール製の篩いを用いて、各マウスの脾臓を静かに押し当てて単離した。各マウスから単離された脾細胞を浸せきし、得られた細胞懸濁液を３分間１６００ｒｐｍの遠心分離にかけ、上澄みを静かに注ぎ出した。細胞ペレットに約６ｍｌの溶解緩衝液を添加し、前記ペレット中に存在している赤血球を破壊させた。次に、残留溶解緩衝液をＰＢＳで洗浄した。次に、脾細胞を完全な培地内で懸濁した。
【００８２】
細胞懸濁液の生存可能性をトリパンブルー篩い分け試験によって評価した（Ｐａｒｓｌｏｗ  Ｔ．Ｇ．  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；  Ｓｉｔｉｅｓ  Ｄ．Ｐ．、Ｔｅｒｒ  Ａ．Ｉ．，  Ｐａｒｓｌｏｗ  Ｔ．Ｇ．，  Ｅｄｓ．，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９９７；ｐｐ６３−７３を参照）。生存細胞懸濁液の細胞密度を２ｘ１０６個／ｍｌに調節した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣTM）に１００μｌの細胞懸濁液をシードした。
【００８３】
次に、シードした細胞を（１）粗ＣＶ抽出物の１００μｌサンプル（１−５００μｇ／ｍｌの最終濃度）、（２）１００μｌのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ）（０．０１６−４．０μｇ／ｍｌの最終濃度）と陽性コントロールとして（Ｓｉｇｍａ）、または（３）１００μｌの培地と陰性コントロールとして接触させた。
【００８４】
次に、接触させた細胞を９５％のＯ２および５％のＣＯ２の湿潤雰囲気中で３７℃の温度条件の下に７２時間培養した。５４時間後に、接触させた細胞に０．５μＣｉ／１０μｌ／ウェルの３Ｈ−メチル−チミジンでパルスラベルした。７２時間後に、前記細胞をセルハーベスタでグラスファイバフィルターペーパー上に収集し、ＤＮＡ合成に関連して取り込まれた３Ｈ−メチル−チミジンの量をシンチレーション係数法によって定量した。接触させた細胞の個数／分（ＣＰＭ）を、陰性コントロール細胞内のＣＰＭによって正規化し、刺激指数を取得した。刺激指数を、陰性コントロール細胞の細胞取込み数によって、接触した細胞内の３Ｈ−メチル−チミジン（ＣＰＭ）の細胞取込み量を割ることによって算出した。
【００８５】
ＣＶ抽出物を投与したマウスから取得した脾細胞の増殖活性は、低Ｃｏｎ  Ａ濃度では用量に依存していた。ＣＶ抽出物を投与したマウスから得られた脾細胞の増殖活性は、コントロールに比べ、５０μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａの濃度では２０倍にも達した。１００μｇ／ｍｌ〜３５０μｇ／ｍｌの濃度で粗ＣＶ抽出物を投与し、約１μｇ／ｍｌ〜３μｇ／ｍｌの濃度のＣｏｎ  Ａで刺激したマウスから得られた脾細胞の増殖反応は、同様であった。結果は、刺激指数として表わされている（図３を参照）。
【００８６】
例ＩＸ
粗ＣＶ抽出物にｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたマウス骨髄細胞
５匹のＩＣＲマウスを頚椎脱臼によって屠殺した。屠殺したマウスの大腿骨を無菌状態で切除した。大腿骨に付随している筋肉を可能なかぎりすべて除去し、骨髄栓子を２５Ｇの針を取りつけた２ｍｌの注射器を用いてＰＢＳで洗浄した。各骨髄栓子から単離した骨髄細胞を浸せきした。得られた細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液の生存可能性を、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。生存細胞懸濁液の密度４ｘ１０６個／ｍｌの細胞懸濁液が精製されるように調整した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣTM）にシードした。
【００８７】
次に、前記細胞を（１）粗ＣＶの１００μｌサンプル（２５−２００μｇ／ｍｌの最終濃度）、（２）１００μｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）（２．５−２０μｇ／ｍｌの最終濃度）と陽性コントロールとして（Ｓｉｇｍａ）、または（３）１００μｌの培地と陰性コントロールとして接触させた。前記接触させた細胞を、９５％のＯ２および５％のＣＯ２の雰囲気中で、３７℃の温度条件下で１２０時間培養した。１０４時間後に、前記細胞に０．５μＣｉ／１０μｌ／ウェルの３Ｈ−メチル−チミジンでパルスラベルした。１２０時間後に、前記細胞を収集し、上記例ＩＩＩに記載されているように、刺激指数を判定した。
【００８８】
図４は、粗ＣＶ抽出物またはＬＰＳと単離マウス骨髄細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたときの増殖効果を示したものである。結果は、刺激指数として表されている。粗ＣＶ抽出物は、２００μｇ／ｍｌでは４０倍骨髄を増殖することが実証されている。同様の相対的濃度のＬＰＳに比べ、粗ＣＶ抽出物と接触させた骨髄細胞の増殖反応度は高かった。
【００８９】
例Ｖ
粗ＣＶ抽出物とｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたマウスマクロファージ
１ｍｌの３％ｗ／ｖ水溶性チオグリコール酸を１０匹のＩＣＲマウス腹腔内に注射した。３日後に頚椎脱臼によって上記マウスを屠殺した。腹腔を開き、ＰＢＳで腹腔洞内を洗浄した。各マウスから得られたＰＢＳ洗浄物を集積した。得られた細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。生存細胞懸濁液の密度を、４ｘ１０６個／ｍｌの細胞懸濁液を精製できるように調製した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣTM）にシードした。
【００９０】
前記細胞を、９５％のＯ２および５％のＣＯ２湿潤雰囲気中で、３７℃の温度条件下で１時間マイクロタイタープレートのウェル底部に付着させた。次に、ウェル内の上澄みをそっと取り除いた。次に、上記細胞を（１）２５−２００μｇ／ｍｌの濃度の２００μｌの粗ＣＶ抽出液、（２）０．１２５−１μｇ／ｍｌの濃度の２００μｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）と陽性コントロールとして、または（３）２００μｌ完全細胞培地に陰性コントロールとして接触させた。前記接触させた細胞を９５％のＯ２および５％のＣＯ２湿潤雰囲気中で、３７℃の温度条件下で２４時間培養した。
【００９１】
２４時間目に、無細胞培地内に存在する硝酸エステルの量をグリース反応によって判定した。（Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｃ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒａｔｅ，  ｎｉｔｒｉｔｅ，  ａｎｄ  ［１５Ｎ］ｎｉｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄｓ，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８２，１２６：１３１−１３８を参照。）１５０μｌの無細胞培地部分サンプルを各マイクロタイタープレートのウェルからピペットで採取し、新鮮なマイクロタイタープレートウェル内に１０分間５０μｌのグリース試薬と反応させた。次に、マイクロプレートリーダー（ＢＴＩ、ＥＬＸ８００）を用いて、５４０ｎｍで部分標本の吸収率を測定した。
【００９２】
図５は、祖ＣＶ抽出物またはＬＰＳにｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたマウス腹腔内マクロファージによる一酸化窒素の分泌の増加を示している。粗ＣＶ抽出物を投与したマウスの腹腔内マクロファージの増殖活性による一酸化窒素の分泌の増加は、約１００μｇ／ｍｌ未満のＣＶ濃度では、用量に依存していた。粗ＣＶ抽出物の１００μｇ／ｍｌより高い濃度に接触させた細胞の増殖活性には、亢進は認められなかった。ＬＰＳの増殖活性は、低ＬＰＳ濃度では用量に依存していた。
【００９３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
例ＶＩ
正常なマウスに対する粗ＣＶ抽出物の投与
治験計画
２０匹のＩＣＲマウスを５匹のマウスからなる４対象群に分類した。表ＩＩＩに示されているように、群１に対しては、粗ＣＶ抽出物を腹腔内投与した。群２に対しては、正常食塩水を陰性コントロールとして腹腔内投与した。群３に対しては、粗ＣＶ抽出物を経口投与した。さらに群４に対しては、脱イオン化水を陰性コントロールとして経口投与した。経口投与は、胃腸管を通じてマウスの体内に強制注射した。
【００９４】
表ＩＩＩは、各群の用量と投与計画を表したものである。群１と群２のマウスは、４日目に屠殺した。群３と群４のマウスは、８日目に屠殺した。
【００９５】
１日目には、粗ＣＶ抽出物を計量し、脱イオン化水に溶解させ、前記溶液の濃度を５ｍｇ／ｍｌの溶液が得られるように調整した。前記溶液を３０分間超音波処理し、１０分間４０００ｒｐｍの遠心分離にかけて不溶性物質を取り除き、その後で滅菌したボトル内に滅菌した０．２２μｍのフィルタ（ＩＷＡＫＩ）の上から注ぎ込んだ。前記溶液を、次回使用するまで４℃の温度条件下で保管しておいた。
【００９６】
【表３】
2005526142.tif 000004
【００９７】
１．正常なマウスから得た生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
コントロールマウス（群２）に比べ、マウス（群１）に腹腔内投与した粗ＣＶ抽出物は、５８．６％分、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を増加させた。（図６Ａを参照。）脾細胞を、上記例ＩＩＩに記載されているように、収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【００９８】
２．正常なマウスから得られたＬＰＳにより刺激したマウス骨髄細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
粗ＣＶ抽出物を腹腔内投与したマウスの骨髄細胞（群１）は、コントロールマウス（群２）の骨髄細胞に比べ、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激増殖活性が亢進していた。（図６Ｂを参照。）骨髄細胞を、上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。骨髄細胞に対する粗ＣＶ抽出物の増殖活性を上記例ＩＶに記載されているように試験した。
【００９９】
３．正常なマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与の効果
マウス（群３）に経口投与した粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群４）に比べ、４０％ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を増加させた。（図７Ａを参照。）脾細胞を、上記例ＩＩＩに記載されているように、収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１００】
４．正常なマウスから得られたＬＰＳ刺激骨髄細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与の効果
粗ＣＶ抽出物を経口投与したマウス（群３）の骨髄細胞は、コントロールマウス（群４）の骨髄細胞に比べ、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激増殖活性が亢進していた。（図７Ｂを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように、収集し、単離した。骨髄細胞に対する粗ＣＶ抽出物の増殖活性を、上記例ＩＶに記載されているように試験した。
【０１０１】
例ＶＩＩ
免疫障害のあるマウスまたは重篤な免疫障害のあるマウスに対する、ＣＶ抽出物の投与
治験計画
４０匹のＩＣＲマウスを５匹からなる８対象群に分類した。一日目に、群１−４のマウスに対し２０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射することによって免疫障害を発生させた。一日目にさらに、群５−８のマウスに対し、１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射することによって重篤な免疫障害を引き起こさせた。（シクロホスファミドの用量と投与計画については表ＩＶを参照。）免疫抑制後、第５、６および７日目に、群１に対し、粗ＣＶ抽出物を腹腔内注射し、群２に対し、正常食塩水を腹腔内注射した。免疫抑制後、１−７日目に、群３に対し、粗ＣＶ抽出物を経口投与し、群４に対し脱イオン化水を投与した。重度の免疫抑制処置後、１−７日目に、群５に対し、粗ＣＶ抽出物を経口投与し、群６に対し、脱イオン化水を投与した。重度の免疫抑制処置後１−１４日目に、群７に対し、粗ＣＶ抽出物を経口投与し、群８に対し脱イオン化水を投与した。（粗ＣＶ抽出物の用量、投薬計画および投与経路については、表ＩＶを参照。）群２、４、６および８は陰性コントロール群である。群１−６のマウスは、８日目に屠殺した。群７と群８のマウスは１５日目に屠殺した。
【０１０２】
群１−４に対しては、次のように調製したシクロホスファミド溶液を注射した。シクロホスファミド２００ｍｇ／バイアル（Ｅｎｄｏｘａｎ−Ａｓｉａ）を、Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａから購入した。シクロホスファミドを滅菌済みの脱イオン水で指示に従って再構成した。前記溶液の濃度を滅菌済み正常食塩水で１ｍｇ／ｍｌに調整し、滅菌済みボトル内に部分標本を入れ、−８０℃で保管した。シクロホスファミド溶液を、無菌条件下で調製した。１日目に、シクロホスファミド溶液を解凍し、群１−４のマウスに注射した。
【０１０３】
前記溶液の濃度が５ｍｇ／ｍｌに調整されている点を除き、群１−４に関して記載されているように調製されたシクロホスファミド溶液を群５−８に対し注射した。１日目に、前記シクロホスファミド溶液を解凍し、群５−８のマウスに注射した。
【０１０４】
粗ＣＶ抽出物を上記例ＶＩに記載されているように、腹腔内投与または経口投与向けに調製した。
【０１０５】
【表４】
2005526142.tif 000005
【０１０６】
１．免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
免疫障害を発生させたマウス（群１）に対して腹腔内投与した粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群２）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。（図８Ａを参照。）脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１０７】
２．免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
粗ＣＶ抽出物を腹腔内投与したマウスの骨髄細胞は、コントロールマウス（群２）の骨髄細胞に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。（図８Ａを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。前記骨髄細胞の生存可能性を、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１０８】
３．免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与（7日間投与計画）の効果
免疫抑制マウス（群３）に対して経口投与粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群４）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させることはなかった（ｐ＜０．００５）。（図８Ｂを参照。）脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。前記骨髄細胞の生存可能性を、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１０９】
４．免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与（7日間投与計画）の効果
粗ＣＶ抽出物を経口投与したマウス（群３）の骨髄細胞は、コントロールマウス（群４）の骨髄細胞に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．００５）。（図８Ｂを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。前記骨髄細胞の生存可能性を、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１１０】
５．重篤な免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物（７日間投与計画）の経口投与の効果
重篤な免疫障害を発生させたマウス（群５）に対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群６）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存可能脾細胞の数を増加させた。ただし、前記増加は統計的に有意なものではなかった。（図８Ｃを参照。）脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１１１】
６．重篤な免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物（７日間投与計画）の経口投与の効果
重篤な免疫障害を発生させたマウス（群５）に対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群６）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。（図８Ｃを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１１２】
７．重篤な免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の経口投与（１４日間投与計画）の効果
免疫抑制処置したマウス（群７）に対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群８）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を増加させることはなかった。（図９Ａを参照。）脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１１３】
８．重篤な免疫障害を発生させたマウスから得られた生存マウス骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与（１４日間投与計画）の効果
免疫抑制処置したマウス（群７）に対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群８）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。（図９Ａを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＶに記載されているように試験した。
【０１１４】
９．重度の免疫抑制処置を行ったマウスから得られたＣｏｎ  Ａ刺激脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出液（１４日間投与計画）の経口投与の効果
粗ＣＶ抽出物を経口投与したマウス（群７）の脾細胞は、コントロールマウス（群８）の脾細胞に比べ、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖活性が亢進した。（図９Ｂを参照。）前記脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。前記脾細胞に対する粗ＣＶ抽出物の増殖活性を、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１１５】
１０．重篤な免疫障害を発生させたマウスから得られたＬＰＳ刺激骨髄細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の経口投与の効果
粗ＣＶ抽出物を経口投与したマウス（群７）の骨髄細胞は、コントロールマウス（群８）の骨髄細胞に比べ、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＬＰＳ刺激増殖活性が亢進した（ｐ＜０．０５）。（図９Ｃを参照。）骨髄細胞を上記例ＩＶに記載されているように収集し、単離した。骨髄細胞に対する粗ＣＶ抽出物の増殖活性は、上記例ＩＶに記載されているように試験した。
【０１１６】
例ＶＩＩＩ
免疫障害発生マウスにおける用量反応に関する治験
治験計画
２０匹のＩＣＲマウスを５匹からなる４対象群に分類した。１日目に、１−４群のマウスに対し、２０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射することによって免疫抑制処置を施した。（シクロホスファミドの用量および投与計画については、表Ｖを参照。）シクロホスファミド投与後１−７日目に、１、２および３の各群のマウスに対し、５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日および５０ｍｇ／ｋｇ／日の粗ＣＶ抽出物をそれぞれ経口投与した。シクロホスファミド投与後１−７日目には、群４のマウスに対し、脱イオン化水を投与した。（粗ＣＶ抽出物の用量および投与計画については、表Ｖを参照。）群４は陰性コントロール群である。群１−４のマウスは、８日目に屠殺した。
【０１１７】
シクロホスファミドを、上記例ＶＩＩに記載されているように調製および投与した。
【０１１８】
５０ｍｇ／ｋｇ／日の粗ＣＶ抽出物の経口投与向けに、粗ＣＶ抽出物を上記例ＶＩに記載されているように調製した。前記溶液の濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌに調整した点を除き、５ｍｇ／ｋｇ／日および２０ｍｇ／ｋｇ／日の粗ＣＶ抽出物の経口投与向けに、粗ＣＶ抽出物を上記ＶＩに記載されているように調製した。
【０１１９】
【表５】
2005526142.tif 000006
【０１２０】
１．免疫抑制マウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の各種投与量での経口投与の効果
５ｍｇ／ｋｇ／日（群１）および２０ｍｇ／ｋｇ／日（群２）の用量でマウスに対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群４）に比べ、用量依存法でｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞数を増加させた。（図１０を参照。）５０ｍｇ／ｋｇ／日（群３）の用量でマウスに対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群４）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞数を増加させることはなかった。（図１０を参照。）群３のマウスに観察されたデータは、上記例ＶＩＩＩおよび図８Ａに示されている結果と一致している。
【０１２１】
脾細胞を上記例ＩＩＩに記載されているように収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１２２】
２．免疫抑制マウスから得られた生存マウス骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の各種投与量での経口投与の効果
５ｍｇ／ｋｇ／日（群１）、２０ｍｇ／ｋｇ／日（群２）および５０ｍｇ／ｋｇ／日（群３）の用量でマウスに対し経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群４）に比べ、用量依存法でｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞数を増加させた。（図１０を参照。）コントロールマウス（群４）に比べ、群２のマウスに経口投与したＣＶ抽出物は、骨髄細胞の増殖率を高め（ｐ＜０．０１）、さらにコントロールマウス（群４）に比べ、群３のマウスに対し経口投与したＣＶ抽出物は、骨髄細胞の増殖率を高めた（ｐ＜０．００１）。
【０１２３】
上記例ＩＶに記載されているように、骨髄細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１２４】
例ＩＸ
正常なマウス、免疫障害を与えたマウスおよび重篤な免疫障害を与えたマウスに対するＣＶ抽出物の経口投与；細胞媒介免疫反応に対する効果
治験計画
マウスモデルを用いて、細胞媒介免疫反応における増加率を判定した。接触性過敏症、細胞媒介免疫反応である。このモデルは、接触性過敏症の発症を判定するのにマウスの耳介膨満測定に依存する、標準の接触性過敏症に関する治験を根拠としている。
【０１２５】
次に、３６匹のマウスをそれぞれ６匹からなる６群に分類した。以後個体を識別できるように、各マウスの尾部にマークを施した。群１および群２は正常なマウスで、群３および群４は免疫障害を与えたマウスで、群５と群６は重篤な免疫障害を与えたマウスであった。１−７日目に、群１、群３および群５に対し、５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で粗ＣＶ抽出物を経口投与した。１−７日目に、群２、群４および群６に対し、０．２５ｍｌの脱イオン化水を経口投与した。３および４日目に、３６匹のマウスすべてに対し、２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）に感作させた。７日目に、３６匹のマウスすべてに対しＤＮＦＢを投与した。８日目に、３６匹のマウスすべてに関する耳介の測定値を収集した。（表ＶＩを参照。）
【０１２６】
上記例ＶＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を群１、群３および群５に経口投与できるよう調製した。上記例ＶＩおよび表ＩＩＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を投与した。（粗ＣＶ抽出物の用量および投薬計画については、表ＶＩを参照。）
【０１２７】
上記例ＶＩＩに記載されているように、保管および投与が可能なように、シクロホスファミドを調製した。群３および群４のマウスに対し、上記例ＶＩＩおよび表ＩＶに記載されているように、１日目に、２０ｍｇ／ｋｇの投与量で免疫抑制処置を施した。群５および群６のマウスに対し上記例ＶＩＩおよび表ＩＶに記載されているように、１日目に、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で重度の免疫抑制処置を施した。（シクロホスファミドの用量と投与計画については、表ＶＩも参照。）
【０１２８】
３日目と４日目に、３６匹のマウスすべてに対し、次のように２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）に感作させた。ＤＮＦＢに対する曝露は、各マウスの毛を剃った腹部にピペットを用いて２５μｌの０．２５％  ｗ／ｖ  ＤＮＦＢを直接塗布し、さらに各マウスのそれぞれの足に５μｌの０．２５％  ｗ／ｖ  ＤＮＦＢを直接塗布した。７日目に、３６匹のマウスすべてに対し、次のように２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を投与した。ＤＮＦＢに対する曝露は、各マウスの耳の両側にピペットを用いて１０μｌの０．２０％ｗ／ｖ  ＤＮＦＢを直接塗布することによって行った。８日目に、デジタルキャリパーすなわちＭｉｔｕｔｏｙｏデジタルマイクロメーターを用いて耳介の厚さの測定を行った。
【０１２９】
【表６】
2005526142.tif 000007
【０１３０】
１．ＣＶ抽出物を経口投与した正常なマウスにおける結果
正常なマウス（群１）は、コントロールマウス（群２）に比べ、耳介の膨満を測定したときに、過敏症反応が有意に亢進していた（ｐ＜０．０５）。（図１１参照。）
【０１３１】
２．ＣＶ抽出物を経口投与した免疫抑制マウスにおける結果
コントロールマウス（群４）に比べ、耳介の膨満を測定したときに、免疫抑制マウス（群３）は過敏症反応が有意に亢進していた（ｐ＜０．０５）。（図１１を参照。）
【０１３２】
免疫抑制マウス（群３）の過敏症反応と、コントロールマウス（群２）における過敏症反応との間には有意な差は認められなかった。
【０１３３】
３．ＣＶ抽出物を経口投与した重度の免疫抑制処置マウスにおける結果
コントロールマウス（群６）に比べ、耳介の膨満を測定したときに、重度の免疫抑制処置マウス（群５）の過敏症反応は有意に亢進していた（ｐ＜０．００１）。（図１１参照。）
【０１３４】
重度の免疫制御処置を施したマウス（群５）の過敏症反応（ｐ＜０．００１）は、免疫抑制マウス（群３）または正常なマウス（群１）（ｐ＜０．０５）で観察された過敏症反応（ｐ＜０．０５）に比べ、亢進していた。
【０１３５】
例Ｘ
ＣＶ抽出物の正常なマウスに対する長期（３０日）経口投与
治験計画
ＩＣＲマウスを５匹からなる２群に分類した。表ＶＩＩに示されているように、群１に対しては、粗ＣＶ抽出物を経口投与し、群２に対しては、脱イオン化水を陰性コントロールとして経口投与した。表ＶＩＩは各群の容量と投与計画をまとめたものである。両群ともマウスを３１日目に屠殺した。上記例ＶＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を調製、保管および投与した。（表ＶＩＩも参照。）
【０１３６】
【表７】
2005526142.tif 000008
【０１３７】
１．正常なマウスから得たマウス生存脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の長期経口投与（３０日）の効果
マウス（群１）に経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群２）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させることはなかった。（図１２Ａを参照。）上記例ＩＩＩに記載されているように、脾細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１３８】
２．正常なマウスから得た生存骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、粗ＣＶ抽出物の長期経口投与の効果
マウス（群１）に経口投与された粗ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群２）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させることはなかった。（図１２Ａを参照。）上記例ＩＶに記載されているように、骨髄細胞を収集し、単離した。骨髄細胞の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１３９】
３．正常なマウスから得た生存マウス脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の長期的経口投与の効果
コントロールマウス（群２）の増殖反応に比べ、粗ＣＶ抽出物を投与した（群１）脾細胞の増殖反応は亢進していた。（図１２Ｂを参照。）上記例ＩＩＩに記載されているように、脾細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、上記例ＩＩＩに記載されているように、細胞懸濁液の生存可能性を試験した。脾細胞をＣｏｎ  Ａで刺激し、刺激指数を上記例Ｖに記載されているように計算した。
【０１４０】
４．正常なマウスから得たＬＰＳ刺激骨髄細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖に対する、ＣＶ抽出物の長期的経口投与の効果
コントロールマウス（群２）の骨髄細胞に比べ、粗ＣＶ抽出物を経口投与したマウス（群１）骨髄細胞のｅｘ  ｖｉｖｏＬＰＳ刺激増殖活性は亢進していた。（図１２Ｃを参照。）
【０１４１】
上記例ＩＶに記載されているように、骨髄細胞を収集し、単離した。骨髄細胞に対する粗ＣＶ抽出物の増殖活性を上記例ＩＶに記載されているように試験した。
【０１４２】
例ＸＩ
経口投与した粗ＣＶ抽出物の急性毒性
１日目にメスとオスのＩＣＲマウスそれぞれ５匹ずつに対して、１ｇ／ｋｇの粗ＣＶ抽出物を経口投与し、１４日目まで中毒の兆候がないか観察した。観察期間中、いずれのマウスも死に至らず、観察期間全体を通じて１０匹のマウスのいずれもが中毒の兆候を示すことはなかった。
【０１４３】
上記例ＶＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を１０匹のマウスに経口投与できるように（濃度を除く）調製した。粗ＣＶ抽出物を単回投与した。
【０１４４】
１０匹のマウスに投与した粗ＣＶ抽出物は、内毒素に汚染されていなかった。粗ＣＶ抽出物の２ｍｇ／ｍｌのサンプルを内毒素試験に供した。試験は、検出限界が０．２５ＥＵ／ｍｌ  ＬＡＬの（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｌｔｄ．提供の）Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験キットを用いて試験を行った。
【０１４５】
例ＸＩＩ
ペプチドグルカン結合の免疫活性に対する負の電荷密度の効果
陽イオン交換クロマトグラフィーすなわちＣ１Ｄ２、Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ４およびＣ１Ｄ５の手段を用いて、各種負電荷密度群に分画化したＣＶペプチドグルカンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫活性を比較した。図１３は、Ｃ１Ｄ２、Ｃ１Ｄ３、Ｃ１Ｄ４およびＣ１Ｄ５にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させた生存マウス脾細胞の増殖率を表している。免疫の潜在的可能性における大きな相違が各種分画間に観察された。高負電荷密度のペプチド結合グルカンは、低い負電荷密度分画や分画化されていないＣＶ抽出物に比べ、高い最大活性（すなわちプラトーレベル）および潜在的可能性（すなわち低いサンプル濃度における急峻な活性の上昇）を示した。この結果は、負の電荷密度がＣＶ誘導ペプチド結合グルカンの免疫原性の重要な決定因子であることを示している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫活性は、上記例ＩＩＩに記載されているとおりに評価した。
【０１４６】
例ＸＩＩＩ
ペプチド結合グルカンの免疫活性に対する分子量の効果
分画Ｃ１Ｅ８、Ｃ１Ｅ６、Ｃ１Ｅ４、Ｃ１Ｅ２およびＣ１Ｅ０に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫活性を判定した。図１４は、Ｃ１Ｅ８、Ｃ１Ｅ６、Ｃ１Ｅ４、Ｃ１Ｅ２およびＣ１Ｅ０とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させたマウスの腹膜マクロファージによって増加した一酸化窒素の分泌を表している。免疫活性は、特定の分子量範囲内に限定されてはいなかった。Ｃ１Ｅ８、Ｃ１Ｅ６、Ｃ１Ｅ４Ｃ１Ｅ２およびＣ１Ｅ０では、同様の用量反応像が認められ、プラトーは１００と２００μｇ／ｍｌの間に達していた。最大（プラトー）活性は、分画の分子量が増大するに伴って高まっていった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫活性は上記例ＩＩＩに記載されているとおりに評価した。
【０１４７】
例ＸＩＶ
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの部分精製抽出物の調製
部分精製Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＣＶ）抽出物を、例Ｉに記載されている方法で調製した粗ＣＶ抽出物を分解して調製し、二回のクロマトグラフィーによる分離プロセスと一回のエタノール分画化プロセスを実施した。粗ＣＶ抽出溶液に対し一回目のクロマトグラフィー（例えばＣＭセルロースカラムなど）を実施し、陽イオン物質を除去した。得られた溶出液を二回目のクロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥセルロースカラム、を実施して陰イオン物質を結合させた。この溶出液に対して、分子量を基準とした分離プロトコル、例えばエタノール分画化やゲルろ過などを実施した。得られた溶出液すなわち部分精製ＣＶ抽出液は、部分精製ＣＶ抽出物から陽イオンをさらに取り除く方法によってさらに精製してもよい。
【０１４８】
図１５は、図１のＣＶ抽出物内の活性成分をさらに精製するためのプロトコルで使用されているプロセスを表しているフローチャートである。例Ｉの方法によって調製された、１．０ｇの粗ＣＶ抽出物を脱イオン化水で溶解した。溶解した粗ＣＶ抽出物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、不溶性物質を除去した。次に、０．４５μｍのフィルター（ＩＷＡＫＩ）を用いて上澄みをろ過し、不溶性粒子をさらに除去した。
【０１４９】
Ｆｉｂｒｏｕｓ（Ｓｉｇｍａ）ＣＭセルロース６００ｍｌのふたのないガラス製カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、毎回０．５Ｍ  のＮａＯＨで三回樹脂を３０分間洗浄することによって平衡化し、次に、毎回０．５Ｍ  のＨＣＩで３０分間三回洗浄した。上記カラムを脱イオン化水で平衡化した。
【０１５０】
次に、上澄みをカラム上にアプライし、溶出液を収集した。（緩衝液の条件については図１５を参照。）分画の活性を検定した。分画Ｃ１は活性を示しており、ＤＥＡＥセルロースカラム上にアプライし、溶出液を収集した。（緩衝液の条件については、図１５を参照。）分画の活性を検定した。分画Ｃ１Ｄ５に対しエタノール分画化プロセスを実施し（緩衝液の条件については図１５を参照）、得られた分画の活性を、例ＩＩＩに記載されているようにマウス脾細胞を用いて検定した。部分精製抽出物である分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７、Ｃ１Ｄ５Ｅ４およびＣ１Ｄ５ＥＸは活性を示した。分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７、Ｃ１Ｄ５Ｅ４およびＣ１Ｄ５ＥＸを凍結乾燥したところ、それぞれの重量は５、１４、４９および１３ｍｇであった。特に陽イオン分子を除去するプロセスなど、さらなる精製プロセスを分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７、Ｃ１Ｄ５Ｅ４およびＣ１Ｄ５ＥＸで実施してもよい。
【０１５１】
例ＸＶ
ＣＶペプチド結合グルカンにおける抗原決定因子としてのペプチド成分の役割
この例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマイトジェン活性とＣＶ分画基本構造単位（中性糖、ウロン酸およびタンパク／ペプチド）の組成とを関係付けるものである。図１６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマイトジェン反応の刺激指数と反応性分画の基本構造単位の含有量との間の相関関係を示している。分析したＣＶ分画に関しては、ペプチドの含有量がマイトジェン活性と強い相関関係を示した（ｒ＝０．９９、ｐ＜０．０５）。マイトジェン活性とウロン酸含有量との間の相関係数は、１０％レベル（ｒ＝０．６１）で、ほとんど有意な値は認められなかったが、中性糖との相関関係は有意であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫活性を上記例ＩＩＩのように評価した。
【０１５２】
例ＸＶＩ
部分精製したＣＶ分画の生理化学的および生物学的特徴付け
分子量の範囲と平均分子量を、分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸで定量した。（表Ａを参照。）
【０１５３】
【表８】
2005526142.tif 000009
【０１５４】
Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸの中性糖、ウロン酸およびタンパク質の含有量を定量した。（表Ｂを参照。）
【０１５５】
【表９】
2005526142.tif 000010
【０１５６】
例ＩＩに記載されているように、分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸに関する、中性糖、ウロン酸およびタンパク質の含有量を定量した。ＧＣ／ＭＳ分析を基準とすると、グルコースは唯一の検出可能な単糖であった。グルコース分子は、１→３結合によって結合されていた。
【０１５７】
分画Ｃ１Ｄ５Ｅ７のタンパク質／ペプチド成分のアミノ酸配列は、Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であると判定した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、アミノ酸シーケンサー（ＨＰＬＣシステムを装備した、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ提供１０００Ａタンパク質シーケンサー）を用いて判定した。
【０１５８】
部分精製ＣＶ分画のＣ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸの免疫活性（図１５を参照）を判定した。図１７は、三つの部分精製活性ＣＶ分画、すなわちＣ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸのマウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素の分泌に対する刺激によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示している。部分精製ＣＶ分画すべてがＬＰＳのような活性および効能があることを特定した。（図１７を参照。）
【０１５９】
例ＸＶＩＩ
粗ＣＶ抽出物および部分精製ＣＶ抽出物の腸壁吸収率に対する分子量の効果
粗ＣＶ抽出物および部分精製ＣＶ抽出物すなわち分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸの腸壁吸収率を、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量した。天然(native)のＣＶサンプルとそれらのＣａｃｏ−２細胞透過性化合物の分子量分布を比較した。分析は、Ｓｕｐｅｄｅｘ  ７５  １０／３０カラムを連結したＨＰＬＣシステムを用いて実施した。溶出緩衝液は、２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液ｐＨ７．０で、溶出物をＵＶ  ２１０ｎｍでモニタした。
【０１６０】
３７℃の温度制御条件下で、すべての実験を実施した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を８０ｍＭの塩化マグネシウムと組み合わせ、９０ｍＭの塩化カルシウムをすべての透過性測定のためのトランスポート緩衝液として使用した。実験を行う前に、細胞単分子層をトランスポート緩衝液で二回洗浄した。試験するサンプルを含む１．５μｌのトランスポート緩衝液を、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層の基底側細胞膜側に添加した。３７℃で３０分間平衡化処理した後で、サンプル溶液とトランスウェルを、２．６ｍｌのトランスポート緩衝液で満たされているクラスタープレートにトランスファーした。実験の終わりに、細胞を透過する成分を基底側細胞膜側で収集した。収集したサンプルを脱塩した後、化学的特徴付けと生物学的特徴付けを行えるように凍結乾燥した。
【０１６１】
１．ＣＶ抽出物
Ｃａｃｏ−２細胞単分子層（ｋＤａ）を透過する粗ＣＶ抽出物の成分を以下の表Ｃに示す。
【０１６２】
図１８Ａは、粗ＣＶ抽出物の篩い分けクロマトグラムを表し、図１８Ｂは、トランスポート試験後に収集した粗ＣＶ抽出物Ｃａｃｏ−２細胞透過性含有物を表している。例Ｉにおいて調整された粗ＣＶ抽出物は、０．５ｋＤａから４０ｋＤａに及び、その平均は２．６ｋＤａである。図１８Ｂに表されているように、７．０７および８．８９ｍｌで溶出したピークは、基底側細胞膜チャンバー（コントロールを含む、すなわち粗ＣＶ抽出物なし）で収集したすべてのサンプルで認められた。この結果から、粗ＣＶ抽出物サンプルに対しピークが生来のものではないが、おそらくはＣａｃｏ−２細胞から浸食されるマクロ分子によるものであることを示唆している。１７．６７ｍｌの分画で溶出したピークは、おそらくは、粗ＣＶ抽出物に存在する生物活性グルカンではなく小分子によるものであると考えられる。図１８Ａおよび１８Ｂに示されている分子量像に基づき、われわれは低分子量の組成分が高分子量の組成分よりも早い速度で単分子層を通過するという結論に達している。さらに、粗ＣＶ抽出物の腸壁吸収に関する分子量の上限は、おそらく３ｋＤａであろうという結論にも達している。
【０１６３】
【表１０】
2005526142.tif 000011
【０１６４】
１．部分精製ＣＶ抽出物；Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸ
３．Ｃａｃｏ−２細胞単層（ｋＤａ）を透過可能な分画Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸの成分を以下の表Ｄに示す。
【０１６５】
図１９Ａは、Ｃ１Ｄ５Ｅ８におけるＣａｃｏ−２細胞透過性物質の篩い分けクロマトグラムである。Ｃ１Ｄ５Ｅ８の平均分子量は０．８ｋＤａであった。図１９Ｂに示されているように、相当量のペプチド結合グルカンが１６．７３ｍｌで溶出し、このことは、Ｃ１Ｄ５Ｅ８に存在する約０．７ｋＤａの組成分が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ吸収モデルでは単分子層を透過してトランスポートされたことを示している。
【０１６６】
図２０Ａは、Ｃ１Ｄ５Ｅ７におけるＣａｃｏ−２細胞透過性物質の篩い分けクロマトグラムである。Ｃ１Ｄ５Ｅ７の平均分子量は２．６ｋＤａであった。（図２０Ａを参照。）トランスポート試験の終わりに、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層の基底側細胞膜で、分子量の低い成分（すなわち平均分子量が１．２ｋＤａ）しか検出されなかった。
【０１６７】
図２１Ａは、Ｃ１Ｄ５ＥＸにおけるＣａｃｏ−２細胞透過性物質の篩い分けクロマトグラムである。Ｃ１Ｄ５ＥＸの平均分子量は約６ｋＤａであると想定された。（図２１Ａを参照。）図２１Ｂは、１７．６７ｍｌで溶出した小分子とは別に、ごく少量の他の成分も単分子層の基底側細胞膜側へ腸壁バリアを透過してトランスポートされているということを示している。
【０１６８】
【表１１】
2005526142.tif 000012
【０１６９】
例ＸＶＩＩＩ
部分精製ＣＶ抽出物のＣａｃｏ−２透過性成分とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させたマウスクロファージ
図２２は、部分精製ＣＶ抽出物またはＬＰＳのＣａｃｏ−２細胞透過性成分と接触させたマウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素の分泌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの効果を表している。部分精製ＣＶサンプルすべての細胞透過性成分が免疫学的には活性を有し、サンプルすべてがＬＰＳの活性に比べ大きな活性を有していた。低分子量分画と中分子量分画である、Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７はそれぞれ、高分子量分画Ｃ１Ｄ５ＥＸより強い活性を示した。Ｃ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７におけるペプチド結合グルカンの平均分子量は、約３ｋＤａ未満である。
【０１７０】
例ＸＩＸ
正常なマウスに対する部分精製ＣＶ抽出物の投与
治験計画
２５匹のＩＣＲマウスを５匹ずつの５群に分類した。表ＶＩＩＩに示されているように、各群を以下のように処置した。
【０１７１】
群１に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ８を腹腔内投与し、群２に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ７を腹腔内投与し、群３に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ４を腹腔内投与し、群４に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５ＥＸを腹腔内投与し、さらに群５に対しては、陰性のコントロールとして、正常食塩水を腹腔内投与した。
【０１７２】
表ＶＩＩＩは、各群の用量および投薬計画を表したものである。群１−５のマウスは８日目に屠殺した。
【０１７３】
上記例ＶＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を調製し、腹腔内投与または経口投与のため保管しておいた。
【０１７４】
【表１２】
2005526142.tif 000013
【０１７５】
１．正常なマウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、部分精製ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
全群（群１−４）（ｐ＜０．００１）で、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏの生存脾細胞の数が増加していた。（図２３Ａを参照。）群１−３、すなわちＣ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５Ｅ４の投与群はそれぞれ、約１００%脾細胞数が増加していた。Ｃ１Ｄ５ＥＸ投与群の群４（高分子量の部分精製ＣＶ抽出物）は約６４%の脾細胞数の増加を示した。
【０１７６】
上記例ＩＩＩに記載されているように、脾細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を精製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１７７】
２．正常なマウスから得られた生存骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、部分精製ＣＶ抽出物の腹腔内投与の効果
全群（群１−４）で、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数が増加していた。（図２３Ｂを参照。）Ｃ１Ｄ５ＥＸを投与した群４のみ、生存骨髄細胞の数が統計的に有意に増加していた（ｐ＜０．００２）。
【０１７８】
上記例ＩＶに記載されているとおりに、骨髄細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調整し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１７９】
例ＸＸ
免疫障害マウスに対する部分精製ＣＶ抽出物の投与
一般的材料と実験法
２５匹のＩＣＲマウスを５匹ずつの５群に分類した。表ＩＸに示されているように、これらの群を次のように処置した。群１−５のマウスに対し、上記例ＶＩＩに記載されているように免疫抑制処置を施した。群１に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ８を経口投与し、群２に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ７を経口投与し、群３に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ４を経口投与し、群４に対しては、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５ＥＸを経口投与し、さらに群５に対しては、陰性のコントロールとして、脱イオン水を経口投与した。表ＩＸは、各群の用量と投与計画を表している。群１−５のマウスは８日目に屠殺した。
【０１８０】
上記例ＶＩＩに記載されているように、シクロホスファミドを調製し、投与した。
【０１８１】
上記例ＶＩに記載されているように、粗ＣＶ抽出物を調製し、腹腔内投与または経口投与できるように保管しておいた。
【０１８２】
【表１３】
2005526142.tif 000014
【０１８３】
１．免疫障害マウスから得られた生存マウス脾細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する、部分精製ＣＶ抽出物の経口投与の効果
群１−４のマウスに経口投与した部分精製ＣＶ抽出物は、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を増加させた。（図２４Ａを参照。）群１に投与したＣ１Ｄ５Ｅ８は、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）（６６％）。群２に投与したＣ１Ｄ５Ｅ７は、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。群３に投与したＣ１Ｄ５Ｅ４は、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。群４に投与したＣ１Ｄ５ＥＸは、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存脾細胞の数を有意に増加させることはなかった。
【０１８４】
上記例ＩＩＩに記載されているように、脾細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１８５】
２．免疫不全を与えたマウスから得られた生存骨髄細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に対する部分精製ＣＶ抽出物の経口投与の効果
全群（１−４）で、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数の増加が認められた。（図２４Ｂを参照。）
【０１８６】
群１に対し投与したＣ１Ｄ５Ｅ８は、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。群２、群３および群４にそれぞれ対し投与したＣ１Ｄ５Ｅ７、Ｃ１Ｄ５Ｅ４およびＣ１Ｄ５ＥＸは、コントロールマウス（群５）に比べ、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存骨髄細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。
【０１８７】
上記例ＩＶに記載されているように、骨髄細胞を収集し、単離した。得られた細胞懸濁液を調製し、前記細胞懸濁液の生存可能性を上記例ＩＩＩに記載されているように試験した。
【０１８８】
１．種の維持管理
（近交系）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＩＣＲ）マウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから提供された。これらのマウスを各檻に多くて２０匹ずつ収容した。これらのマウスを、１８−２６℃の温度条件、約４０−７０%の相対湿度条件の施設で飼育した。１２時間間隔で、点灯／消灯サイクルを繰り返した。これらのマウスたちには、食餌基準の齧歯類用餌を与え続けた。上記例で使用したマウスの体重は２５−３０ｇであり、週齢は８−１２歳であった。
【０１８９】
２．Ｃａｃｏ細胞培養
Ｃａｃｏ−２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から取得）（３０〜５０回通過）を成長させ、５％のＣＯ２および９０の％Ｏ２雰囲気中で、１０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸、１％のＬグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有した２５ｍＭ  Ｄグルコース（すべてＧｉｂｂｓ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．から取得）を補給したＤＭＥＭ培地内で３７℃の温度条件下で成長させ、日常的に維持管理を行った。それらの細胞を０．０５％のトリプシンＥＤＴＡを含む約７０％のコンフルーエンスで収集し、フィルターごとに３×１０５細胞の細胞密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ細胞培養チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ−Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから取得）内でＩ型コラーゲンを事前に塗布したポリカーボネートフィルター（３．０μｍのポア径、４．７１ｃｍ２成長面積）上にシードした。培地（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサート内で１．５ｍｌおよびクラスタープレート上に２．６ｍｌ）を４８時間ごとに交換した。シード後２１日〜２５日目に単分子層を使用した。
【０１９０】
３．緩衝液
溶解緩衝液
８．２９ｇ  ＮＨ４Ｃｌ
１．００２ｇ  ＮａＨＣＯ３
２９．２ｍｇ  ＥＤＴＡ
すべて１Ｌの脱イオン化水で溶解し、ｐＨを７．２に調整し、０．２２μｍの滅菌フィルターでろ過することによって滅菌した。
【０１９１】
４．完全細胞培地
１０％のｖ／ｖ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ食塩水（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンと混合したＲＭＰＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）。
【０１９２】
上記の文献および特許出願はすべて、各出版物または特許出願を参照することによって、特異的にさらには個々に取り込まれかのように指摘されている場合と同程度まで、あらゆる目的でそのまま参照することにより取り込まれる。本発明については、明確さと良好な理解が得られるように、図と例を用いてある程度詳細に説明してきたが、添付の請求項の意図する範囲内で特定の変更や修正を実施してもよいということは明らかである。特に文脈から明らかではないかぎり、本出願に記載されている本発明の各要素、プロセス、特徴および実施例は、相互にあらゆる組み合わせで使用することができる。
【０１９３】
（参考文献）
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6. Borchardt R.T.、Hidalgo I.J.、Hillgren K.M.、Hu M、“細胞培養の医薬応用：概要”、Wilson G.編、Pharmaceutical Applications of Cell and Tissue Culture to Drug Transport、Plenum press、ニューヨーク、1991年、p1-14
7. Lee V.H.L.、“ペプチドおよびタンパク質のドラッグデリバリ”、Lee V.H.L、Hashida M.、Mizushima Y.編、Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery、Harwood academic publishers、ロンドン、1995年、p3-15
8. Ueno S.、Yoshikumi C.、Omura Y.、Fujii T.、Wada T.、Takahashi E.、Hirose F.、米国特許第４，６９９，７８７号明細書、「窒素含有多糖類」、1987年10月13日
9. Ueno S.、Yoshikumi C.、Omura Y.、Fujii T.、Wada T.、Takahashi E.、Hirose F.、米国特許第４，８５１，３９５号明細書、「窒素含有多糖類」1989年7月25日
10. Ikuzawa M.、Oguchi Y.、Matsunaga K.、Toyoda N.、Furusho T.、Fujii T.、Yoshikumi C.、米国特許第４，８２０，６８９号明細書、「糖タンパクを含有する医薬組成」、1989年4月11日
11. Ikuzawa M.、Oguchi Y.、Matsunaga K.、Toyoda N.、Furusho T.、Fujii T.、Yoshikumi C.、米国特許第５，００８，２４３号明細書、「糖タンパクを含有する医薬組成」、1991年4月6日
12. Sugiura M.、Ohno H.、Sasaki Y.、Hama K.、米国特許第４，２２５，６７３号明細書、「抗腫瘍作用を有するグルカン」、1980年9月30日
13. Yang M.P.、Chen G.、米国特許第５，８２４，６４８号明細書、「Rnase-CV（Coriolus versicolor）」、1998年10月20日
14. Yang M.P.、Chen G.、米国特許第６，０８７，３３５号明細書、「Rnase-CV（Coriolus versicolor）」、2000年7月11日。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、粗ＣＶ抽出物の精製に関するプロトコルに採用されている各プロセスを説明しているフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、粗ＣＶ抽出物中のタンパク質成分の溶出像を表している、篩い分けクロマトグラムである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、粗ＣＶ抽出物中の炭水化物成分の溶出像を表している、粗ＣＶ抽出物の篩い分けクロマトグラムである。
【図３】図３は、粗ＣＶ抽出物またはコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）にｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させた、生存マウス脾細胞の増殖度を表している。
【図４】図４は、粗ＣＶ抽出物またはＬＰＳに単離マウス骨髄細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させた場合の増殖効果を表している。
【図５】図５は、粗ＣＶ抽出物またはＬＰＳにｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたマウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素分泌の増加を表している。
【図６Ａ】図６Ａは、粗ＣＶ抽出物を腹腔内投した（３日間投与計画）、マウスの生存脾細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、粗ＣＶ抽出物を腹腔内投与した（３日間投与計画）、マウスの生存骨髄細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図７Ａ】図７Ａは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、正常なマウスの生存脾細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）正常なマウスの生存骨髄細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図８Ａ】図８Ａは、粗ＣＶ抽出物を腹腔内投与した（３日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図８Ｃ】図８Ｃは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、重篤な免疫傷害マウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図９Ａ】図９Ａは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（１４日間投与計画）、重篤な免疫傷害マウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（１４日間投与計画）、重篤な免疫傷害マウスの生存脾細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（１４日間投与計画）、重篤な免疫傷害マウスの生存脾細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図１０】図１０は、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果を表している。
【図１１】図１１は、粗ＣＶを経口投与し、次いで２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を負荷した、正常なマウス、免疫抑制マウス、重度の免疫抑制マウスの耳介に関する測定結果を表している。
【図１２Ａ】図１２Ａは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（３０日間投与計画）、正常なマウスの生存脾細胞および生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（３０日間投与計画）、正常なマウスの生存脾細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、粗ＣＶ抽出物を経口投与した（３０日間投与計画）、正常なマウスの生存骨髄細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ増殖効果を表している。
【図１３】図１３は、粗ＣＶ抽出物、ＣＶ−Ｄ２、ＣＶ−Ｄ３，ＣＶ−Ｄ４およびＣＶ−Ｄ５にｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させた生存マウス脾細胞の増殖度を表している。
【図１４】図１４は、粗ＣＶ抽出物、ＣＶ−Ｅ８、ＣＶ−Ｅ６，ＣＶ−Ｅ４、ＣＶ−Ｅ２およびＣＶ−Ｅ０にｉｎ  ｖｉｔｒｏ接触させたマウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素分泌の増加を表している。
【図１５】図１５は、図１の粗ＣＶ抽出物における活性成分をさらに精製するため、プロトコルに採用されているプロセスを表しているフローチャートである。
【図１６】図１６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏマイトジェン活性と、ＣＶ分画の基本構造単位（中性糖、ウロン酸およびタンパク質／ペプチド）の組成物との相関関係を表している。
【図１７】図１７は、マウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素分泌に対する、３種類の部分精製活性ＣＶ分画、すなわちＣ１Ｄ５Ｅ８、Ｃ１Ｄ５Ｅ７およびＣ１Ｄ５ＥＸのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激活性を表している。
【図１８Ａ】図１８Ａは、粗ＣＶ抽出物の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層を透過する粗ＣＶ抽出物の成分の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ８の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層を透過するＣ１Ｄ５Ｅ８抽出物の成分の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５Ｅ７の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層を透過するＣ１Ｄ５Ｅ７抽出物の成分の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、部分精製ＣＶ抽出物であるＣ１Ｄ５ＥＸの分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層を透過するＣ１Ｄ５ＥＸ抽出物の成分の分子量分布を表しているクロマトグラムである。
【図２２】図２２は、部分精製ＣＶ抽出物またはＬＰＳの成分のＣａｃｏ−２細胞単分子層透過成分と接触させた、マウス腹膜マクロファージによる一酸化窒素の分泌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を表している。
【図２３Ａ】図２３Ａは、部分精製ＣＶ抽出物を腹腔内投与した（３日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存脾細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、部分精製ＣＶ抽出物を腹腔内投与した（３日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図２４Ａ】図２４Ａは、部分精製ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存脾細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、部分精製ＣＶ抽出物を経口投与した（７日間投与計画）、免疫傷害マウスの生存骨髄細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を表している。
【配列表】
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【図１】
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2005526142.tif 000017
【図２Ｂ】
2005526142.tif 000018
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005526142.tif 000021
【図６Ａ】
2005526142.tif 000022
【図６Ｂ】
2005526142.tif 000023
【図７Ａ】
2005526142.tif 000024
【図７Ｂ】
2005526142.tif 000025
【図８Ａ】
2005526142.tif 000026
【図８Ｂ】
2005526142.tif 000027
【図８Ｃ】
2005526142.tif 000028
【図９Ａ】
2005526142.tif 000029
【図９Ｂ】
2005526142.tif 000030
【図９Ｃ】
2005526142.tif 000031
【図１０】
2005526142.tif 000032
【図１１】
2005526142.tif 000033
【図１２Ａ】
2005526142.tif 000034
【図１２Ｂ】
2005526142.tif 000035
【図１２Ｃ】
2005526142.tif 000036
【図１３】
2005526142.tif 000037
【図１４】
2005526142.tif 000038
【図１５】
2005526142.tif 000039
【図１６】
2005526142.tif 000040
【図１７】
2005526142.tif 000041
2005526142.tif 000042
2005526142.tif 000043
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【図２２】
2005526142.tif 000046
【図２３Ａ】
2005526142.tif 000047
【図２３Ｂ】
2005526142.tif 000048
【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月10日(2005.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１→３）結合によって結合されたグルコース分子を有し、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．３ｋＤａ〜５ｋＤａの分子量をもち、免疫刺激活性を備えた少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有する、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの精製抽出物。
【請求項２】
平均分子量が０．７ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項３】
平均分子量が２．６ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項４】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって判定されるような腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の精製抽出物。
【請求項５】
請求項１に記載の精製抽出物であって、
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒをアルカリで処理し、その後で上澄みを分離するプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得た溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた前期溶出液を篩い分けし、少なくともひとつのペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスとによって調製された
精製抽出物。
【請求項６】
前期篩い分け法が、分子篩い分けクロマトグラフィーまたはエタノール分画化であることを特徴とする、請求項５に記載の精製抽出物。
【請求項７】
前記陽イオン交換がＣＭセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の精製抽出物。
【請求項８】
前記陰イオン交換がＤＥＡＥセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の精製抽出物。
【請求項９】
ペプチド結合グルカンが、水、エタノール、アセトン中で可溶性であり、クロロホルムおよびジクロロホルム中で不溶性であり、さらに非吸湿性であることを特徴とする、請求項１に記載の精製抽出物。
【請求項１０】
（１→３）結合によって結合され、分子量が、篩い分けクロマトグラフィーによって定量された０．７〜３．０ｋＤａの分子量をもつ、複数のグルコース分子を有するＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの単離ペプチド結合グルカンであって、前記グルカンとその活性成分が、免疫刺激活性を有していることを特徴とする単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１１】
前記活性成分がペプチド結合グルカンのペプチド成分である、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１２】
前記活性成分がペプチド結合グルカンのグルカン成分である、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１３】
複数のペプチド結合グルカンの平均分子量が、０．８ｋＤａであることを特徴とする、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１４】
分子量が、０．７ｋＤａであることを特徴とする、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１５】
複数のペプチド結合グルカンの平均分子量が２．６ｋＤａであることを特徴とする、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１６】
複数のペプチド結合グルカンの平均分子量が３．０ｋＤａ未満であることを特徴とする、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１７】
ペプチド結合グルカンが、Ｃａｃｏ−２細胞単分子層トランスウェル法によって判定されるような腸壁吸収が可能であることを特徴とする、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１８】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのアルカリ処理と、
上澄みの分離を行うプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得られた溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた溶出液を篩い分けし、ひとつのペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスとによって精製された、請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項１９】
篩い分け法が分子篩い分けクロマトグラフィーまたはエタノール段階勾配法であることを特徴とする、請求項１８に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項２０】
陽イオン交換がＣＭセルロースカラムで実施されることを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【請求項２１】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の精製抽出物、または請求項１０乃至２０のいずれか１項に記載の単離ペプチド結合グルカンを有する薬理学的組成物。
【請求項２２】
Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのアルカリ処理と、
上澄みの分離を行うプロセスと、
前記上澄みを陽イオン交換に供するプロセスと、
前記陽イオン交換から得られた溶出液を陰イオン交換に供するプロセスと、
前記陰イオン交換から得られた溶出液を篩い分けし、分子量０．７〜５ｋＤａをもつペプチド結合グルカンを有する分画を収集するプロセスを備える、ペプチド結合グルカンを調整する方法。
【請求項２３】
処置プロセスに、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体を浸軟するプロセスと、
前記浸軟したＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの子実体をアルカリで抽出することによって抽出物を取得するプロセスと、
前記抽出物からの不溶性物質を除去するプロセスと、
前記第一の抽出物から上澄みを清澄化するプロセスと、
第三の粗抽出物を陽イオン交換に供することを特徴とする、前記第三の抽出物を取得するため上澄みを濃縮するプロセスを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アルカリ抽出プロセスが、アルカリ性水溶液内で浸軟したＣｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ子実体を煮沸するプロセスを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
アルカリ性水溶液が、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アルカリ性水溶液の常態が、０．１Ｎ未満かまたはこれに等しいことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
アルカリ性水溶液の常態が０．０１Ｎであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
不溶性物質が、ろ過によって前記第一の抽出物から除去されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
分子量０．７〜５ｋＤａを持つペプチド結合グルカンを有する分画を、遠心分離法によって清澄化することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
分子量０．７〜５ｋＤａをもつペプチド結合グルカンを有する分画を、ロータリーエバポレーション、凍結または凍結乾燥によって濃縮することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
ペプチド結合グルカンを有する分画が分子量０．７〜約３．０ｋＤａをもつことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１、請求項５または請求項１０のどれかひとつの抽出物、ペプチド結合グルカンまたはその活性成分と免疫系の細胞とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるプロセスを有する、免疫反応を刺激する方法。
【請求項３３】
細胞が脾細胞または骨髄細胞で、接触により、前記細胞の増殖反応が誘導されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がマクロファージで、接触が前記細胞による一酸化窒素の分泌を誘導することを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であることを特徴とする請求項１０に記載の単離ペプチド結合グルカン。
【国際調査報告】
2005526142.tif 000051
2005526142.tif 000052
2005526142.tif 000053