(57)【要約】本発明はヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）群および、ＤＭＥを同定しコードするポリヌクレオチド群を提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、ＤＭＥの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（ｅ）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３（配列番号１乃至１３）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｆ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のＲＮＡ等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２のポリヌクレオチドの配列を持つ標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを有することを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的なＤＭＥ（新規の薬物代謝酵素）の発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１７の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法で同定したアゴニスト化合物を有し、薬剤として許容できる賦形剤をも有する組成物。
【請求項２２】
機能的なＤＭＥの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２１の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的ＤＭＥの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項２４の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生体サンプル中のＤＭＥの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを請求項１１に記載の抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Ｆａｂ断片
（ｄ）Ｆ（ａｂ’）２ 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項１１の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者中のＤＭＥの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項３２の組成物。
【請求項３５】
被検者中のＤＭＥの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有するポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
【請求項４２】
Ｆａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
或るサンプルからのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチド群に完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチド群に完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、更に前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有する或るヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、薬物代謝酵素の核酸配列およびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害および、肝臓の疾患を含む胃腸疾患の、診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、薬物代謝酵素の核酸配列およびアミノ酸配列の発現における、外来性化合物の効果についての評価に関する。
【０００２】
（発明の背景）
薬物の代謝および薬物の体内での移動（薬物動態学）は、その効果、毒性、および他の薬物との相互作用を判定する上で重要である。薬物の吸収、様々な組織への薬物の分布、および薬物代謝産物の排除の、３つのプロセスが薬物動態を支配している。これらのプロセスは、様々な代謝修飾が、溶解性、受容体との結合性、および排泄速度を含む、薬物の物理化学的特性および薬理学的特性の大部分を変容させるため、薬物代謝に密接に関係する。薬物を修飾する代謝経路はまた、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびビタミン等の、様々な天然基質を受容する。従って、これらの経路における酵素は、天然化合物、薬物、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物の間の生化学的および薬理学的相互作用の重要な部位となる。
【０００３】
薬物代謝における遺伝的な差異が、個人間において薬物効果および毒性のレベルの著しい違いを引き起こすことが以前から知られている。治療指数が狭い薬物または、コデイン等、生理活性を必要とする薬物の場合、このような遺伝子多型は極めて重要たり得る。更に、有望な新規の薬物が、患者群の一部のみに副作用を引き起こし得るという毒性のため臨床試験で排除されることがよくある。薬物代謝酵素が重要な部分を占める薬理ゲノミックス研究が進歩すれば、薬物の効果および毒性の疑問に耐え得るツールが発展し、そのような情報が拡大されるであろう（Ｅｖａｎｓ， Ｗ． Ｅ．およびＲ． Ｖ． Ｒｅｌｌｉｎｇ （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：４８７−４９１を参照）。
【０００４】
薬物代謝反応は、薬物分子を機能化して更なる代謝のために準備するフェーズＩ、およびそれに引き続くフェーズＩＩに分類される。一般に、フェーズＩの反応生成物は部分的或いは完全に不活性であり、フェーズＩＩの反応生成物は主要な排泄種である。しかしながら、フェーズＩ反応生成物は、投与された元の薬物よりも活性が高い場合があり、この代謝活性化原理がプロドラッグとして利用される（例えば、Ｌ−ドパ）。加えて、数種の非毒性化合物（例えば、アフラトキシン、ベンゾ−α−ピレン）は、これらの経路を経て毒性中間体へ代謝される。フェーズＩ反応は通常、薬物代謝における律速段階である。しかし、その化合物または他の化合物類への事前曝露によって、フェーズＩ酵素群の発現を誘発させることができ、それによって、代謝経路を経る基質フラックスを増し得る（Ｋｌａａｓｓｅｎ， Ｃ． Ｄ．， 他 （１９９６） Ｃａｓａｒｅｔｔ ａｎｄ Ｄｏｕｌｌ’ｓ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １１３−１８６ ページ； Ｋａｔｚｕｎｇ， Ｂ．Ｇ． （１９９５） Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ａｐｐｌｅｔｏｎ および Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ， ４８−５９ ページ； Ｇｉｂｓｏｎ， Ｇ．Ｇ． および Ｐ． Ｓｋｅｔｔ （１９９４） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ， Ｌｏｎｄｏｎを参照）。
【０００５】
薬物代謝酵素（ＤＭＥ）は幅広い基質特異性を有する。これは、多種多様な抗体がそれらの抗原に対して高い特異性を有する免疫系とは対照的である。多様な分子を代謝するＤＭＥの能力によって、代謝のレベルにおいて薬物相互作用の可能性が生まれる。例えば、１化合物による、或るＤＭＥの誘導は、その酵素による他の化合物の代謝に影響し得る。
【０００６】
ＤＭＥ類は、それらが触媒する反応の種類、および関係する補助因子に従って分類されている。フェーズＩ酵素の主なクラスには、限定するものではないがチトクロームＰ４５０およびフラビン含有モノオキシゲナーゼが含まれる。フェーズＩ型触媒サイクルおよび反応に関与するその他の酵素クラスには、限定するものではないが、ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）、ミクロソームチトクロームｂ５／ＮＡＤＨチトクロームｂ５レダクターゼ系、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼレドックス対、アルド／ケト還元酵素、およびアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる。フェーズＩＩ酵素の主なクラスには、限定するものではないが、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、Ｎアシルトランスフェラーゼ、およびＮアセチルトランスフェラーゼが含まれる。
【０００７】
チトクロームＰ４５０およびＰ４５０触媒サイクル関連酵素
チトクロームＰ４５０スーパーファミリー酵素のメンバーは、様々な基質の酸化的代謝を触媒する。そのような基質としては、ステロイド、脂肪酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン、およびビタミン等の天然化合物や、薬物、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物が含まれる。Ｐ４５０ヘム−チオレートタンパク質としても知られるチトクロームＰ４５０は通常、Ｐ４５０含有モノオキシゲナーゼ系と呼ばれる多成分電子伝達鎖における末端酸化酵素として作用する。触媒される特異的反応には、ヒドロキシル化、エポキシ化、Ｎ−酸化、スルホキシド化、Ｎ−脱アルキル、Ｓ−脱アルキル、およびＯ−脱アルキル、脱硫酸化、脱アミノ化、並びにアゾ、ニトロ、およびＮ−オキシド基の還元が含まれる。これらの反応は、動物における糖質コルチコイド、コルチゾール、エストロゲン、およびアンドロゲンのステロイド産生や、昆虫における殺虫剤耐性や、植物における除草剤耐性および花の発色や、微生物による環境浄化バイオレメディエーションに関係する。薬物、発癌物質、変異誘発物質、および生体異物にチトクロームＰ４５０が作用して、解毒あるいは、その物質の、より毒性の強い生成物への変換を引き起こし得る。チトクロームＰ４５０は肝臓に豊富に存在するが、その他の組織にも出現し、これらの酵素はミクロソームに位置する（ＥｘＰＡＳＹＥＮＺＹＭＥ ＥＣ １．１４．１４．１； Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｈｅｍｅ−ｉｒｏｎ ｌｉｇａｎｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ； ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ； Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ， Ｓ．およびＰｅｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ａ． （１９９６） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：２０６−２１４を参照）。
【０００８】
４００種類のチトクロームＰ４５０が、細菌、真菌、植物、および動物を含む様々な生物において同定されている（Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ、前出）。Ｂクラスは原核生物および真菌に見られ、Ｅクラスは細菌、植物、昆虫、脊椎動物、および哺乳動物に見られる。５つのサブクラス即ちグループが、ＥクラスチトクロームＰ４５０の大きなファミリーの中に含まれる（ＰＲＩＮＴＳ ＥＰ４５０Ｉ Ｅ−Ｃｌａｓｓ Ｐ４５０ グループ Ｉ シグネチャ）。
【０００９】
全てのチトクロームＰ４５０はヘム補助因子を用いており、構造的特性を共有する。ほとんどのチトクロームＰ４５０は、４００〜５３０のアミノ酸の長さである。この酵素の二次構造は、約７０％のαヘリックスと約２２％のβシートである。このタンパク質のＣ末端部におけるヘム結合部位の周りの領域は、全てのチトクロームＰ４５０で保存されている。このヘム−鉄結合領域におけるアミノ酸１０個のシグネチャ配列が同定され、この配列には、第５の配位部位にある、ヘム鉄の結合に関与する保存されたシステインが含まれる。真核生物チトクロームＰ４５０では、通常は膜貫通領域がこのタンパク質の初めの１５〜２０のアミノ酸において見られ、一般に、約１５の疎水性残基およびそれに続く正に帯電した残基からなる（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ０００８１前出； Ｇｒａｈａｍ−Ｌｏｒｅｎｃｅ前出を参照）。
チトクロームＰ４５０酵素は、細胞増殖および発達に関係する。この酵素は、化学物質を代謝して、ＤＮＡとの付加体を形成する反応性中間体にすることで起こる化学的な変異誘発および発癌において役割を持つ（Ｎｅｂｅｒｔ， Ｄ． Ｗ．およびＧｏｎｚａｌｅｚ， Ｆ． Ｊ． （１９８７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６：９４５−９９３）。これらの付加体は、発癌に導く、ヌクレオチド変化およびＤＮＡ再編成を引き起こし得る。肝臓およびその他の組織におけるチトクロームＰ４５０の発現は、多環式芳香族炭化水素、ペルオキシソーム増殖因子、フェノバルビタール、および糖質コルチコイドデキサメタゾン等、生体異物によって誘発される（Ｄｏｇｒａ， Ｓ． Ｃ．他 （１９９８） Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２５：１−９）。或るチトクロームＰ４５０タンパク質は、Ｐ４５０遺伝子ＣＹＰ１Ｂ１における突然変異が原発性先天性緑内障を引き起こすように、眼の発達に関与する可能性がある（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ） ＊６０１７７１ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｉ （ｄｉｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）， ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １； ＣＹＰ１Ｂ１）。
【００１０】
チトクロームＰ４５０は炎症および感染に関係する。肝チトクロームＰ４５０活性は、様々な感染および炎症性の刺激によって大いに影響され、抑制される活性と誘発される活性がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｅ． Ｔ． （１９９７） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２９：１１２９−１１８８）。ｉｎ ｖｉｖｏで観察される効果は、炎症誘発性のサイトカインおよびインターフェロンによって模倣され得る。２つのチトクロームＰ４５０タンパク質に対する自己抗体は、自己免疫性多腺性内分泌不全症Ｉ型（ＡＰＥＣＥＤ、１種の多腺性自己免疫症候群）の患者に見られた（ＯＭＩＭ ＊２４０３００ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｐｏｌｙｅｎｏｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ−ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ−ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）。
【００１１】
チトクロームＰ４５０類における突然変異は、乳幼児期の副腎障害で最も多い先天性副腎過形成や、偽ビタミンＤ欠乏くる病、脳腱黄色腫症（進行性神経機能障害、早発性アテローム性動脈硬化症、および白内障によって特徴付けられる、１種の脂質貯蔵病）、抗凝血薬であるクマリンおよびワルファリンに対する遺伝性の耐性を含む、種々の代謝障害に結び付けられる（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ， Ｋ．Ｊ．他 （１９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９６８−１９７０ページ； Ｔａｋｅｙａｍａ， Ｋ．他 （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１８２７−１８３０； Ｋｉｔａｎａｋａ， Ｓ．他 （１９９８） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３８：６５３−６６１； ＯＭＩＭ ＊２１３７００ Ｃｅｒｅｂｒｏｔｅｎｄｉｎｏｕｓ ｘａｎｔｈｏｍａｔｏｓｉｓ； および ＯＭＩＭ ＃１２２７００ Ｃｏｕｍａｒｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）。チトクロームＰ４５０タンパク質アロマターゼの、極度に高レベルの発現が、重度の女性化乳房（ｇｙｎｅｃｏｍａｓｔｉａ， ｆｅｍｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を有する１少年の層状線維化肝細胞癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に見られた（Ａｇａｒｗａｌ， Ｖ．Ｒ． （１９９８） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８３：１７９７−１８００）。
【００１２】
チトクロームＰ４５０触媒サイクルは、ＮＡＤＰＨチトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）によるチトクロームＰ４５０の還元によって完了する。チトクロームｂ５とＮＡＤＰＨチトクロームｂ５レダクターゼとからなる別のミクロソーム電子伝達系は、チトクロームＰ４５０触媒サイクルへの電子の主要な供与体ではないと一般に思われている。しかしながら、Ｌａｍｂ， Ｄ．Ｃ．他（１９９９； ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４６２：２８３−２８８）による近年の研究報告は、ミクロソームチトクロームｂ５／ＮＡＤＰＨチトクロームｂ５レダクターゼ系によって効果的に還元およびサポートされ得る或る鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ５１）を同定する。従って、この代替電子供与系によってサポートされる多くのチトクロームＰ４５０が存在すると思われる。
【００１３】
チトクロームｂ５レダクターゼはまた、赤血球細胞において、酸化されたヘモグロビン（酸素を輸送できない、メトヘモグロビンすなわちｆｅｒｒｉｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）を、活性型ヘモグロビン（ｆｅｒｒｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）へ還元する。酸化剤または、充分に還元されていない異常ヘモグロビン（ヘモグロビンＭ）が高いレベルで存在すると、メトヘモグロビン血症が引き起こされる。メトヘモグロビン血症はまた、赤血球チトクロームｂ５レダクターゼの遺伝的な欠損症からも起こり得る（概説はＭａｎｓｏｕｒ， Ａ．およびＬｕｒｉｅ， Ａ．Ａ． （１９９３） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４２：７−１２を参照）。
【００１４】
チトクロームＰ４５０ファミリーのメンバーはまた、ビタミンＤの合成および異化に密接に関係している。ビタミンＤは、植物組織で生成されるエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）および動物組織で生成されるコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）の、２種の生物学的に等価なプロホルモンとして存在する。後者のコレカルシフェロールは、７−デヒドロコレステロールが近紫外線（すなわち２９０〜３１０ ｎｍ）に曝露されると形成される。通常は、皮膚が短時間日光に曝されれば生成される（概説はＭｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １１：３１５−３１９を参照）。
【００１５】
両方のプロホルモン型は更に、肝臓において酵素２５−ヒドロキシラーゼによって２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）へ更に代謝される。２５（ＯＨ）ＤはビタミンＤの最も豊富に存在する前駆体であって、腎臓において酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ １α−ヒドロキシラーゼ（１α−ヒドロキシラーゼ）によって、活性型である１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ）へ更に代謝される。１α，２５（ＯＨ）２Ｄ生成の調節は主に、合成経路の、この最終ステップで行われる。１α−ヒドロキシラーゼ活性は、酵素産物（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ）の循環レベル、並びに副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、インスリン、カルシウム、リン、成長ホルモン、およびプロラクチンのレベルなど、幾つかの生理学的因子に左右される。更に、腎臓外の１α−ヒドロキシラーゼ活性が報告され、組織特異的かつ局所的な、ｌα，２５（ＯＨ）２Ｄ生成の調節も生物学的に重要であり得ることを示唆している。ｌα，２５（ＯＨ）２Ｄの２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ）への触媒作用は、酵素２５−ヒドロキシビタミンＤ ２４−ヒドロキシラーゼ（２４−ヒドロキシラーゼ）を伴い、腎臓でも起こる。２４−ヒドロキシラーゼはまた、基質として２５（ＯＨ）Ｄを利用できる（Ｓｈｉｎｋｉ， Ｔ．他 （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１２９２０−１２９２５； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ．前出、並びにその参照文献）。
【００１６】
ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼ、ｌα−ヒドロキシラーゼ、および２４−ヒドロキシラーゼは全て、ＮＡＤＰＨ依存性Ｉ型（ミトコンドリア）チトクロームＰ４５０酵素であって、そのファミリーの他のメンバーとの高い相同性を示す。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼはまた、幅広い基質特異性を示し、胆汁酸中間体の２６−ヒドロキシル化および、コレステロールの２５−ヒドロキシル化、２６−ヒドロキシル化、および２７−ヒドロキシル化をも行う可能性がある（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ．Ｊ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１６７６６−１６７７４； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ．Ａ． 前出、並びにその参照文献）。
【００１７】
ビタミンＤの活性型（ｌα，２５（ＯＨ）２Ｄ）は、カルシウムおよびリン酸の恒常性に関与し、骨髄性細胞および皮膚細胞の分化を促進する。ビタミンＤの代謝に関与する酵素（例えば、１α−ヒドロキシラーゼ）の欠損によって生じるビタミンＤの欠損は、低カルシウム血症、低リン酸血症および、ビタミンＤ依存性 （感受性）くる病（骨密度の低下並びに、あひる歩行を伴う内反膝すなわちＯ脚という特徴的症状を示す疾患）を引き起こす。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼの欠損は、脳腱黄色腫症（アキレス腱、脳、肺、およびその他の多くの組織におけるコレステロールおよびコレスタノールの沈着という特徴をもつ脂質貯蔵病）を引き起こす。この疾患は、進行性神経機能障害（思春期後の小脳性運動失調症を含む）、アテローム性動脈硬化症、および白内障を示す。ビタミンＤ２５−ヒドロキシラーゼの欠損によってくる病が起きないことから、２５（ＯＨ）Ｄ合成の別の経路が存在することが推定される（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｊ． Ｅ．およびＺｅｒｗｅｋｈ， Ｊ． Ｅ． （１９８３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７２ ： １１９０−１１９９ ； Ｇａｍｂｌｉｎ， Ｇ． Ｔ．他 （１９８５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７５ ： ９５４−９６０ ； およびＭｉｌｌｅｒ， Ｗ． Ｌ．およびＰｏｒｔａｌｅ， Ａ． Ａ． 前出）。
【００１８】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは電子伝達アクセサリータンパク質であって、少なくとも１つのヒトチトクロームＰ４５０種（ＣＹＰ２７遺伝子によってコードされるチトクロームＰ４５０ｃ２７）をサポートする（Ｄｉｌｗｏｒｔｈ， Ｆ． Ｊ．他 （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３２０：２６７−７１）。ストレプトマイセス‐グリセウスチトクロームＰ４５０であるＣＹＰ１０４Ｄ１は、大腸菌において非相同的に発現され、内因性フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼ酵素によって還元される（Ｔａｙｌｏｒ， Ｍ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６３：８３８−４２）。このことから、多くのチトクロームＰ４５０種が、フェレドキシン／フェレドキシンレダクターゼ対によってサポートされることが示唆される。フェレドキシンレダクターゼはまた、或るモデル薬物代謝系に見られ、抗腫瘍性抗生物質であるアクチノマイシンＤを反応性フリーラジカル種に還元することが知られている（Ｆｌｉｔｔｅｒ， Ｗ．Ｄ．およびＭａｓｏｎ， Ｒ．Ｐ． （１９８８） Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６７：６３２−６３９）。
【００１９】
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）
フラビン含有モノオキシゲナーゼは、異例な範囲の基質群の、求核性の窒素、硫黄、およびリンのヘテロ原子を酸化する。チトクロームＰ４５０と同様に、ＦＭＯはミクロソーム酵素であり、ＮＡＤＰＨおよびＯ２を用い、その基質がチトクロームＰ４５０の基質と広範に重なる。ＦＭＯは、肝臓、腎臓、および肺などの組織に分布している。
【００２０】
組織特異的に発現される、５つの異なった既知のＦＭＯアイソフォーム（ＦＭＯ１、ＦＭＯ２、ＦＭＯ３、ＦＭ０４、およびＦＭＯ５）が哺乳動物に見られる。これらのアイソフォームは基質特異性が異なり、更に様々な化合物による阻害および、反応の立体特異性等、他の特性も異なる。ＦＭＯは、アミノ酸１３個のシグネチャ配列を有し、その成分はＮ末端の３分の２の配列にまたがる。それら成分には、また、多くのＮヒドロキシル化酵素に見られるＦＡＴＧＹモチーフ、およびＦＡＤ結合領域を含む（Ｓｔｅｈｒ， Ｍ．他 （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３：５６−５７； ＰＲＩＮＴＳ ＦＭＯＸＹＧＥＮＡＳＥ Ｆｌａｖｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【００２１】
特異的な反応には、求核性三級アミンのＮオキシドへの酸化、二級アミンのヒドロキシルアミンおよびニトロンへの酸化、一級アミンのヒドロキシルアミンおよびオキシムへの酸化、および硫黄含有化合物およびホスフィンのＳ−オキシドおよびＰ−オキシドへの酸化が含まれる。ヒドラジン、ヨウ化物、セレン化物、および硼素含有化合物も基質である。ＦＭＯは化学的にチトクロームＰ４５０に類似しているが、ＦＭＯは例えばその高い熱不安定性およびチトクロームＰ４５０の非イオン界面活性剤感受性に基づいてｉｎ ｖｉｔｒｏでチトクロームＰ４５０から通常は区別できる。しかしながら、ＦＭＯのアイソフォーム間で熱安定性および界面活性剤感受性が異なるため、これらの特性を同定に用いるのは困難である。
【００２２】
ＦＭＯは、幾つかの薬物および生体異物の代謝に重要な役割を果たす。ＦＭＯ（肝臓ＦＭＯ３）は、（Ｓ）ニコチンの（Ｓ）ニコチンＮ−１’−オキシド（尿中に排泄）への代謝において主に役割を果たす。ＦＭＯはまた、胃潰瘍の治療に広く用いられているＨ２−アンタゴニストであるシメチジンのＳ−酸素化に関係する。ＦＭＯの肝臓発現型は、チトクロームＰ４５０と同じ調節制御下にない。例えば、ラットにおいて、フェノバルビタール処理によりチトクロームＰ４５０が誘導されるが、ＦＭＯ１は抑制される。
【００２３】
ＦＭＯの内因性基質としては、システアミン（二硫化物であるシスタミンへ酸化される）および、トリメチルアミンＮ−オキシドへ代謝されるトリメチルアミン（ＴＭＡ）が含まれる。ＴＭＡは腐った魚のような臭いがし、ＦＭＯ３アイソフォームの突然変異によって、悪臭がする遊離アミンが大量に汗、尿、および呼気から排出されるようになる。これらの症状が、魚臭症候群の名を生んだ（ＯＭＩＭ ６０２０７９ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｕｒｉａ）。
【００２４】
リシルオキシダーゼ
リシルオキシダーゼ（リシン６−オキシダーゼ、ＬＯ）は、コラーゲンとエラスチンとの架橋結合による結合組織マトリクスの形成に関与する銅依存性アミンオキシダーゼである。ＬＯは、約５０ ｋＤａのＮグリコシル化された前駆体タンパク質として分泌され、或るメタロプロテアーゼによって切断され成熟型の酵素と成るが、この前駆体も活性である。ＬＯ内の銅原子は、酸素へ、また酸素からの電子の伝達に関与し、これらの細胞外マトリクスタンパク質においてリシン残基の酸化的脱アミノ反応を促進する。銅の配位がＬＯ活性に必須であるが、食事による銅の摂取が不充分でも、このアポ酵素の発現はその影響を受けない。しかし、機能的ＬＯの不在は、食事による銅の欠損に伴う、骨格組織および血管組織の障害に結び付けられる。ＬＯはまた、様々なセミカルバジド、ヒドラジン、およびアミノ亜硝酸（ａｍｉｎｏ ｎｉｔｒｉｔｅｓ）、並びにヘパリンによって阻害される。β−アミノプロピオニトリルは、一般に用いられるインヒビターの１つである。ＬＯの活性は、オゾンやカドミウムに応答して増大し、また、局所組織外傷に応答して放出されるホルモンのレベルの上昇に応答して増大する。このようなホルモンの例には、トランスフォーミング成長因子−β、血小板由来成長因子、アンギオテンシンＩＩ、および線維芽成長因子等が含まれる。ＬＯ活性における異常は、メンケス症候群および後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に結び付けられる。サイトゾル型のＬＯ酵素は、異常な細胞増殖に関係すると思われている（概説はＲｕｃｋｅｒ， Ｒ． Ｂ．他． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ６７：９９６Ｓ−１００２ＳおよびＳｍｉｔｈ−Ｍｕｎｇｏ， Ｌ． Ｉ．およびＫａｇａｎ， Ｈ． Ｍ． （１９９８） Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． １６：３８７−３９８を参照）。
【００２５】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は遍在性の酵素であって、ジヒドロ葉酸の、テトラヒドロ葉酸へのＮＡＤＰＨ依存性の還元を触媒するが、この反応はグリシンとプリン類とのｄｅ ｎｏｖｏ合成、並びにデオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）のデオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）への変換における、必須過程である。この基本的な反応は、
７，８−ジヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰＨ→５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸＋ＮＡＤＰ＋である。
【００２６】
ＤＨＦＲ酵素は、トリメトプリムｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍおよびメトトレキセートなど、様々なジヒドロ葉酸類似体によって阻害され得る。豊富なｄＴＭＰがＤＮＡ合成に必要であるため、迅速な細胞分裂にはＤＨＦＲ活性が必要である。ＤＮＡウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）の複製にも、高いレベルのＤＨＦＲ活性を必要とする。そのため、ＤＨＦＲを標的とする薬物が、癌の化学療法や、ＤＮＡウイルス複製の抑制に用いられている（同様の理由で、チミジル酸シンターゼ類も標的酵素である）。ＤＨＦＲを抑制する薬物は、急激に分裂する細胞（またはＤＮＡウイルス感染細胞）に対して優先的な細胞毒性を持つが、特異性を持たず、分裂する細胞を無差別に破壊する。更に、癌細胞は、獲得性の輸送欠陥、または１つ以上のＤＨＦＲ遺伝子の複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の結果として、メトトレキセート等の薬物に対して耐性を有するようになり得る（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ．Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ５１１−５６１９ページ）。
【００２７】
アルド／ケト還元酵素
アルド／ケト還元酵素類は、単量体ＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼであって幅広い基質特異性を有する（Ｂｏｈｒｅｎ， Ｋ． Ｍ．他 （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：９５４７−９５５１）。これらの酵素は、カルボニル含有糖および芳香族化合物など、カルボニル含有化合物の、対応するアルコールへの還元を触媒する。従って、様々なカルボニル含有薬物および生体異物はこのクラスの酵素によって代謝されると思われる。
【００２８】
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される既知の或る反応は、グルコースがソルビトールへ還元され、更にソルビトールデヒドロゲナーゼによってフルクトースに代謝される。通常の条件下で、グルコースのソルビトールへの還元は主な経路ではない。しかしながら、高血糖状態では、ソルビトールの蓄積は糖尿病合併症の発症に関係すると思われる（ＯＭＩＭ ＊１０３８８０ Ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １， ｍｅｍｂｅｒ Ｂ１）。この酵素ファミリーのメンバーらはまた、数種の肝癌で高発現される（Ｃａｏ， Ｄ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１１４２９−１１４３５）。
【００２９】
アルド／ケト還元酵素ファミリの別の重要メンバーは、ＮＡＤＰ＋−依存性モルヒネ６−デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）である。ＭＤＨは、モルヒネとコデインとの６−ヒドロキシル基の、ケトン類への酸化を触媒することにより、モルヒノン（ｍｏｒｐｈｉｎｏｎｅ）とコデイノン（ｃｏｄｅｉｎｏｎｅ）との形成をもたらす。ＭＤＨによる酸化は、これらアヘン剤の代謝のための幾つかの経路の１つを提示している。別の複数の経路には、グルクロン酸抱合、Ｏ−脱メチル化、および Ｎ−脱アルキル化が関与する。活性アヘン剤代謝物群が、これら酵素的反応の幾つかによって生産される （Ｃｏｎｅ， Ｅ．Ｊ． （１９７８） Ｄｒｕｇ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ６：４８８−９３ および Ｔｅｇｅｄｅｒ， Ｉ． 他 （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ３７：１７−４０）。精製した ＭＤＨ により、生体サンプル内のアヘン剤の存在を検出できそうである （Ｈｏｌｔ， Ｐ．Ｊ． 他 （１９９６） Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ６８：１８７７−８２）。
アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）は、単純アルコールを対応するアルデヒドへ酸化する。ＡＤＨはサイトゾル酵素であって、補助因子ＮＡＤ＋を好み、また亜鉛イオンに結合する。ＡＤＨのレベルは肝臓において最も高く、腎臓、肺、および胃粘膜においては低い。
【００３０】
既知のＡＤＨアイソフォームは、４０ ｋＤａのサブユニットからなる二量体タンパク質である。これらのサブユニットをコードする５つの既知の遺伝子座（ａ、ｂ、ｇ、ｐ、ｃ）が存在し、その内の幾つかは特徴的な対立遺伝子変異体（ｂ１、ｂ２、ｂ３、ｇ１、ｇ２）を有する。サブユニットはホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができ、サブユニットの構成によって活性な酵素の特異的特性が決定される。従って、ホロ酵素がクラスＩ（サブユニット構成、ａａ、ａｂ、ａｇ、ｂｇ、ｇｇ）、クラスＩＩ（ｐｐ）、およびクラスＩＩＩ（ｃｃ）として分類されている。クラスＩＡＤＨイソ酵素はエタノールその他の小さい脂肪族アルコールを酸化し、ピラゾールによって阻害される。クラスＩＩイソ酵素は長鎖の脂肪族アルコールおよび芳香族アルコールを好み、メタノールを酸化できない。また、ピラゾールによって阻害されない。クラスＩＩＩイソ酵素は、更に長い長鎖脂肪族アルコール（５炭素より長い）および芳香族アルコールを好み、ピラゾールによって阻害されない。
【００３１】
短鎖アルコールデヒドロゲナーゼには、様々な基質特異性を有する多数の近縁酵素が含まれる。このグループに含まれるものは哺乳動物酵素であるＤ−β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨ−依存性カルボニルレダクターゼ、コルチコステロイド１１−β−デヒドロゲナーゼ、エストラジオール−１７−β−デヒドロゲナーゼ、細菌酵素であるアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、グルコース１−デヒドロゲナーゼ、３−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、２０−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、３−オキソアシルレダクターゼ、２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ソルビトール−６−リン酸２−デヒドロゲナーゼ、７−α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ｃｉｓ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｉｅｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、シス−トルエンジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、シス−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ、ビフェニル−２，３−ジヒドロ−２，３−ジオールデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アシルマンノサミン１−デヒドロゲナーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、および２−デオキシ−Ｄ−グルコン酸３−デヒドロゲナーゼがある（Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９４） Ｊ． Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５１：１２５−１３０； Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ， Ｚ． （１９９２） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ８４：Ｃ２５−３１； およびＭａｒｋｓ， Ａ．Ｒ．他 （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１５４５９−１５４６３）。
【００３２】
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ
ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼファミリー（ＵＧＴ）のメンバーは、補助因子ウリジン二リン酸−グルクロン酸（ＵＤＰ−グルクロン酸）から基質へのグルクロン酸基の転移を触媒する。この転移は、通常は求核性ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）に対して行われる。基質の例には、フェーズＩ反応によって機能的になった生体異物並びに、ビリルビン、ステロイドホルモン、および甲状腺ホルモン等、内因性化合物が含まれる。グルクロン酸抱合の生成物は、基質の分子量が約２５０ ｇ／ｍｏｌ未満であれば尿中に排泄されるが、グルクロン酸抱合された基質がそれより大きい場合は胆汁に排泄される。
【００３３】
ＵＧＴは肝臓、腎臓、腸、皮膚、脳、脾臓、および鼻粘膜のミクロソームに存在する。これらの位置でＵＧＴは、チトクロームＰ４５０酵素およびフラビン含有モノオキシゲナーゼとは小胞体膜の同じ側にあるため、フェーズＩ薬物代謝の生成物への到達に理想的な位置にある。ＵＧＴは、そのＵＧＴを小胞体膜に固着するＣ末端膜貫通ドメイン並びに、そのＣ末端部分における約５０のアミノ酸残基の保存されたシグネチャドメインを有する（Ｐｒｏｓｉｔｅ ＰＤＯＣ００３５９ ＵＤＰ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）。
【００３４】
薬物代謝に関係するＵＧＴは、ＵＧＴ１およびＵＧＴ２の２つの遺伝子ファミリーによってコードされる。ＵＧＴ１ファミリーのメンバーは、補助因子結合および膜挿入に関係する定常領域、および可変基質結合ドメインを有する、単一の遺伝子座の選択的スプライシングによって生じる。ＵＧＴ２ファミリーのメンバーは異なる複数の遺伝子座によってコードされ、ＵＧＴ２ＡおよびＵＧＴ２Ｂの２つのファミリーに分類される。２Ａサブファミリーは嗅上皮で発現し、２Ｂサブファミリーは肝臓ミクロソームで発現する。ＵＧＴ遺伝子における突然変異は、高ビリルビン血症（ＯＭＩＭ＃１４３５００ Ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ Ｉ）、出生時からの著しい高ビリルビン血症によって特徴付けられるクリグラー−ナジャー症候群（ＯＭＩＭ＃２１８８００ Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ジルベール病と呼ばれる軽度の高ビリルビン血症（ＯＭＩＭ ＊１９１７４０ ＵＧＴ１）に関係する。
【００３５】
スルホトランスフェラーゼ
硫酸抱合はＯ−グルクロン酸抱合を受ける基質と同じ基質の多くに生じ、高水溶性の硫酸エステルが生成される。スルホトランスフェラーゼ（ＳＴ）は、補助因子３’‐ホスホアデノシン−５’‐ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）から基質へＳＯ ３−を転移することにより、この反応を触媒する。ＳＴの基質は主にフェノールおよび脂肪族アルコールであるが、抱合して対応するスルファミン酸を生成する芳香族アミンおよび脂肪族アミンも含まれる。これらの反応による生成物は主に尿中に排泄される。
【００３６】
ＳＴは、肝臓、腎臓、腸管、肺、血小板、および脳を含む様々な組織に見られる。ＳＴ酵素は、一般にサイトゾル酵素であって、多数の型が同時に発現される場合が多い。例えば、１２種類を越えるＳＴの型がラットの肝サイトゾルに存在する。これらの生化学的に特徴付けられたＳＴは、それらの基質選択性に基づいて、アリールスルホトランスフェラーゼ、アルコールスルホトランスフェラーゼ、エストロゲンスルホトランスフェラーゼ、チロシンエステルスルホトランスフェラーゼ、および胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼの５つのクラスに分類される。
【００３７】
ＳＴ酵素活性は、ラットの性別および年齢によって著しく異なる。発生の合図（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｕｅｓ）と性関連ホルモン類との効果があいまって、ＳＴ発現プロフィールにおけるこれらの差異並びに、チトクロームＰ４５０等の他のＤＭＥのプロフィールにおけるこれらの差異を生じさせると考えられている。注目すべきは、ネコにおけるＳＴの高発現が、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ活性のレベルの低下を部分的に補償する。
【００３８】
ＳＴの幾つかの型は、ヒト肝サイトゾルから精製されクローニングされている。熱安定性および基質選択性が異なった２つのフェノールスルホトランスフェラーゼが存在する。熱安定酵素は、パラニトロフェノール、ミノキシジル、およびアセトアミノフェン等のフェノールの硫酸化を触媒し、熱不安定酵素は、ドーパミン、エピネフリンおよびｌｅｖａｄｏｐａ等、モノアミン基質を好む。その他のクローニングされたＳＴには、エストロゲンスルホトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼが含まれる。この最後の酵素は、細胞生化学におけるＳＴの別の主要な役割を例示する。即ち、細胞分化およびプロテオグリカンの成熟に重要となり得る、糖構造の修飾である。実際、或るスルホトランスフェラーゼの遺伝性の欠損は、成熟したケラタン硫酸プロテオグリカンの合成不良という特徴をもつ障害である、斑状角膜変性症に関係すると思われる（Ｎａｋａｚａｗａ， Ｋ．他 （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１３７５１−１３７５７； ＯＭＩＭ ＊２１７８００ Ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ， ｃｏｒｎｅａｌ）。
【００３９】
ガラクトシルトランスフェラーゼ
ガラクトシルトランスフェラーゼ類は、溶液に遊離している糖脂質または糖タンパク質の一部であるＮ末端アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）オリゴ糖鎖にガラクトース（Ｇａｌ）を転移する、グリコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）のサブセットである（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ， Ｆ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４３３−４４０； Ａｍａｄｏ， Ｍ．他 （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４７３：３５−５３）。ガラクトシルトランスフェラーゼは細胞表面で検出される可溶性細胞外タンパク質であり、ゴルジ体にも存在する。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩ型糖鎖を形成する。既知のヒトおよびマウスβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、短いサイトゾルドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および８つの保存された領域を持つ１つの触媒ドメインを有すると考えられる（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ， Ｆ． 前出および Ｈｅｎｎｅｔ， Ｔ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５８−６５）。マウスＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉでは、領域１がアミノ酸残基の７８−８３、領域２がアミノ酸残基の９３−１０２、領域３がアミノ酸残基１１６−１１９、領域４がアミノ酸残基１４７−１５８、領域５がアミノ酸残基の１７２−１８３、領域６がアミノ酸残基の２０３−２０６、領域７がアミノ酸残基の２３６−２４６、領域８がアミノ酸残基の２６４−２７５に位置する。マウスＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミンβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉの領域８内に見られる１配列の１変異体が、細菌ガラクトシルトランスフェラーゼ類にも見られることから、この配列が、或るガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを規定することを示唆する（Ｈｅｎｎｅｔ， Ｔ． 前出）。近年の研究は、ｂｒａｉｎｉａｃタンパク質は１種のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであることを示唆している（Ｙｕａｎ， Ｙ．他（１９９７） Ｃｅｌｌ ８８：９−１１； およびＨｅｎｎｅｔ， Ｔ． 前出）。
【００４０】
ＵＤＰ−Ｇａｌ：ＧｌｃＮＡｃ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（−１，４−ＧａｌＴ）（Ｓａｔｏ， Ｔ．他 （１９９７） ＥＭＢＯ Ｊ． １６：１８５０−１８５７）は、Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ結合を有するＩＩ型糖鎖の形成を触媒する。βｌ，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの場合と同様に、この酵素の可溶型が、膜結合型の切断によって形成される。βｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼに保存されているアミノ酸としては、ジスルフィド結合によって連結された２つのシステイン残基および、触媒ドメインにおける推定上のＵＤＰ−ガラクトース結合部位が含まれる（Ｙａｄａｖ， Ｓ．およびＢｒｅｗ， Ｋ． （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１４１６３−１４１６９； Ｙａｄａｖ， Ｓ． Ｐ．およびＢｒｅｗ， Ｋ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：６９８−７０３；およびＳｈａｐｅｒ， Ｎ． Ｌ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３１３８９−３１３９９）。βｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質または糖脂質上に糖鎖を合成するのに加えて、いくつかの特化した役割を有する。哺乳類では、α−ラクトアルブミンを有するヘテロ二量体の一部として、或るβｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、泌乳時の乳腺ラクトース生成において機能する。精子の表面上のβｌ，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、卵を特異的に認識する受容体として働く。細胞表面β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ類はまた、細胞接着、細胞／基底膜相互作用、正常な細胞遊走、および転移性細胞遊走で作用する（Ｓｈｕｒ， Ｂ． （１９９３） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：８５４−８６３； およびＳｈａｐｅｒ， Ｊ． （１９９５） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６：９５−１０４）。
【００４１】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）によって触媒される基本的な反応は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と求電子体の抱合である。ＧＳＴはホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質であって、主にサイトゾルに局在するが、ある程度の活性がミクロソームにも見られる。主なイソ酵素は、共通の構造および触媒特性を有し、ヒトにおいてそれらは、α、μ、π、およびθの４つの大クラスに分類される。２つの最も大きなクラスであるαおよびμは、それぞれのタンパク質等電点（αはｐＩが約７．５〜９．０、μはｐＩが約６．６）によって同定される。それぞれのＧＳＴは、ＧＳＨに対する共通の結合部位および可変性疎水性結合部位を有する。それぞれのイソ酵素における疎水性結合部位は、特定の求電子性基質に対して特異的である。ＧＳＴ内の特定のアミノ酸残基が、これらの結合部位および触媒活性に重要であるとして同定されている。残基Ｑ６７、Ｔ６８、Ｄ１０１、Ｅ１０４、およびＲ１３１は、ＧＳＨの結合に重要である（Ｌｅｅ， Ｈ−Ｃ他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：９９−１０９）。残基Ｒ１３、Ｒ２０、およびＲ６９はＧＳＴの触媒活性に重要である（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｇ他（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４：５４９−５５５）。
【００４２】
殆どの場合、ＧＳＴは、潜在的な変異誘発性および発癌性の化学物質を不活性化し解毒するなど有用な機能をする。しかしながら、場合によってはそれらの作用が有害なもので、化学物質を活性化させて変異誘発性および発癌性にし得る。ラットおよびヒトＧＳＴの幾つかの型は、発癌の検出を助ける、信頼性の高い新生物発生前マーカーである。変異誘発性を調べるための良く知られたエイムス試験に用いられるサルモネラチフィムリウムなどの細菌株におけるヒトＧＳＴの発現は、変異誘発におけるこれらの酵素の役割を決定するのに役立つ。マウスにおいて肝腫瘍を引き起こすジハロメタン（ｄｉｈａｌｏｍｅｔｈａｎｅｓ）は、ＧＳＴによって活性化されると考えられている。この考えは、ジハロメタンはヒトＧＳＴを発現する細菌細胞において非形質導入細胞よりも突然変異誘発性が高いということから支持される（Ｔｈｉｅｒ， Ｒ．他 （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８５６７−８５８０）。二臭化エチレンおよび二塩化エチレンの変異誘発性はヒトαＧＳＴ， Ａ１−１を発現する細菌細胞において上昇し、アフラトキシンＢ１の変異誘発はＧＳＴの発現が増強されることで実質的に減少する（Ｓｉｍｕｌａ， Ｔ． Ｐ．他（１９９３） Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １４：１３７１−１３７６）。従って、ＧＳＴ活性の制御が、変異誘発および発癌の制御において有用であろう。
【００４３】
ＧＳＴは、多剤耐性（ＭＤＲ）として知られる、多くの癌の、薬物治療に対する獲得耐性に関係すると思われる。ＭＤＲは、シクロホスファミドなどの細胞毒で治療を受けた癌患者に起こり、その薬物に対する耐性を有するようになった後、更にその他の様々な細胞毒に対しても耐性を有するようになる。ＧＳＴレベルの上昇は、これらの薬物耐性癌の幾つかに関係する。また、薬剤に応答してＧＳＴレベルが上昇した後、ＧＳＴによって触媒されたＧＳＨ抱合反応によりその薬剤が不活化されると考えられる。次に、上昇したＧＳＴレベルにより癌細胞がその他の、ＧＳＴに結合する細胞毒から保護される。腫瘍におけるＡ１−１のレベルの上昇は、シクロホスファミド治療によって生じた薬物耐性に結び付けられる（Ｄｉｒｖｅｎ Ｈ． Ａ．他 （１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：６２１５−６２２０）。従って、癌組織におけるＧＳＴ活性の調節は、癌患者のＭＤＲ治療に有用であろう。
【００４４】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ
γ−グルタミルトランスペプチダーゼは広範に発現する酵素であって、γ−グルタミルアミド結合を切断して細胞外のグルタチオン（ＧＳＨ）の分解を開始させる。ＧＳＨの分解は、生合成経路のためにシステインが集まった領域を細胞に提供する。γ−グルタミルトランスペプチダーゼはまた、細胞の酸化防止に寄与し、その発現は酸化ストレスによって引き起こされる。この細胞表面局在糖タンパク質は、癌細胞において高いレベルで発現される。幾つかの研究の示唆するところでは、癌細胞の表面におけるγ−グルタミルトランスペプチダーゼの高レベルの活性を前駆薬の活性化に利用し、抗癌治療薬を局所的に高い濃度にできる（Ｈａｎｉｇａｎ， Ｍ． Ｈ． （１９９８） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １１１−１１２：３３３−４２； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．およびＩｋｅｄａ， Ｙ． （１９９８） Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７２：２３９−７８； Ｃｈｉｋｈｉ， Ｎ．他 （１９９９） Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２２：３６７−３８０）。
【００４５】
アシルトランスフェラーゼ
Ｎ−アシルトランスフェラーゼ酵素は、アミノ酸抱合体の、活性化したカルボキシル基への転移を触媒する。内因性化合物および生体異物は、サイトゾル、ミクロソームおよびミトコンドリアにおいて、アシル−ＣｏＡシンセターゼによって活性化される。次に、アシル−ＣｏＡ中間体は、サイトゾルまたはミトコンドリアにおけるＮ−アシルトランスフェラーゼによってアミノ酸（通常はグリシン、グルタミン、またはタウリンであるが、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、およびいくつかのジペプチドを含む）と抱合し、アミド結合を有する代謝産物を形成する。この反応はＯ−グルクロン酸抱合に相補的であるが、アミノ酸抱合は、グルクロン酸抱合によって生じる場合が多い、反応性および毒性の代謝産物を生成しない。
【００４６】
胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＴ）は、このクラスの良く特徴づけられた酵素の１つである。ＢＡＴは、胃腸管において界面活性剤として作用する、胆汁酸抱合体の生成を担う（Ｆａｌａｎｙ， Ｃ． Ｎ．他 （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１９３７５−１９３７９； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ．他 （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３）。ＢＡＴはまた、部分肝切除の後の肝臓癌患者の予後の予測インジケータとして有用である（Ｆｕｒｕｔａｎｉ， Ｍ．他（１９９６） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２４：１４４１−１４４５）。
【００４７】
アセチルトランスフェラーゼ
アセチルトランスフェラーゼは、ヒストンのアセチル化におけるその役割について広く研究された。ヒストンのアセチル化により、真核細胞におけるクロマチン構造が弛緩し、それによって転写因子が、ゲノムの、影響を受けた領域（またはゲノム全体）におけるＤＮＡの鋳型のプロモータエレメントに到達できるようになる。これとは対照的に、ヒストンの脱アセチル化により、クロマチン構造が閉じ転写因子の到達が制限されて転写が減少する。この最後に、ヒストンの脱アセチル化を阻害する化学薬品（例えば、酪酸ナトリウム）を細胞転写の刺激の一般的な手段として用いると、人為的結果であるが遺伝子発現が全体的に上昇する。アセチル化による遺伝子発現の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）はまた、限定するものではないが、ｐ５３、ＧＡＴＡ−１、ＭｙｏＤ、ＡＣＴＲ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、および高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）など、他のタンパク質のアセチル化によっても生じ得る。ｐ５３の場合、アセチル化によりＤＮＡへの結合が増大し、ｐ５３によって調節される遺伝子の転写が刺激される。プロトタイプのヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＧｃｎ５である。Ｇｃｎ５は、テトラヒメナｐ５５、ヒトＧｃｎ５、およびヒトｐ３００／ＣＢＰを含む、アセチラーゼの１ファミリーのメンバーである。ヒストンのアセチル化については概説（Ｃｈｅｕｎｇ， Ｗ． Ｌ．他 （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：３２６−３３３およびＢｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：３３６−３４１）を参照されたい。数種のアセチルトランスフェラーゼ酵素は、限定するものではないがアセチルコリンエステラーゼおよびカルボキシルエステラーゼなど幾つかの他の酵素の主なクラスに一般的である、α／βヒドロラーゼフォールド（ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｏｌｄ）（Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｌｚｂｕｒｇ， ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｉｒｂｍ−ｃｏｕｒｓｅ９７／Ｄｏｃｓ／ｍｓ／）を有する（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｈｔｔｐ：／／ｓｃｏｐ．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｃｏｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。
【００４８】
Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ
芳香族アミンおよびヒドラジン含有化合物は、肝臓その他の組織のＮ−アセチルトランスフェラーゼ酵素によってＮ‐アセチル化される。数種の生体異物は、同じ酵素によってある程度、Ｏ‐アセチル化され得る。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、補助因子アセチル−補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）を用いて２つの過程でアセチル基を転移するサイトゾル酵素である。第１の過程では、アセチル基がアセチル−ＣｏＡから活性部位システイン残基に転移され、第２の過程でアセチル基が基質アミノ基に転移され酵素が再生される。
【００４９】
他のほとんどのＤＭＥクラスとは対照的に、既知のＮ−アセチルトランスフェラーゼの数は少ない。ヒトの場合、２つの高度に類似した酵素であるＮＡＴ１およびＮＡＴ２が存在し、マウスには第３型酵素であるＮＡＴ３が存在するようである。Ｎ−アセチルトランスフェラーゼのヒト型は、独立した調節（ＮＡＴ１は広範に発現されるが、ＮＡＴ２は肝臓および腸のみに発現される）および、重複した基質選択性を有する。両方の酵素はある程度まで多くの基質を受容するようであるが、ＮＡＴ１は数種の基質（パラアミノ安息香酸、パラアミノサリチル酸、スルファメトキサゾール、およびスルファニルアミド）を好み、一方ＮＡＴ２は他の基質（イソニアジド、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、およびスルファメタジン）を好む。
【００５０】
１９５０年代の、抗結核薬であるイソニアジドを服用した患者らの臨床観察は、この化合物のアセチル化が速い人（ｆａｓｔ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）および遅い人（ｓｌｏｗ ａｃｅｔｙｌａｔｏｒ）の記述を生んだ。これらの表現型は後に、酵素の活性または安定性に影響を与える、ＮＡＴ２遺伝子における突然変異によることが示された。イソニアジドのアセチル化が遅い表現型は、中東の集団に非常に優勢（約７０％）であり、白人ではやや劣り（約５０％）、アジアの集団では２５％未満である。近年になって、ＮＡＴ１における機能的な多型が検出され、検査を受けた集団の約８％が、アセチル化が遅い表現型を示す（Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｎ． Ｊ．他 （１９９８） Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：６７−７２）。ＮＡＴ１は数種の既知の芳香族アミン発癌物質を活性化し得るため、広範に発現されるＮＡＴ１酵素における多型は、癌のリスクの判定に重要であると考えられる（ＯＭＩＭ ＊１０８３４５ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）。
【００５１】
アミノトランスフェラーゼ
アミノトランスフェラーゼ類は、ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素の１ファミリーを構成する。ＰＬＰ依存性酵素は、アミノ酸の成分置換を触媒する。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ （ＡｓｐＡＴ） は、最も広く研究された ＰＬＰ含有酵素である。ＡｓｐＡＴは、ジカルボキシルＬ−アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、および対応する２−オキソ酸（オキサロ酢酸、および２−オキソグルタル酸）の、可逆的なアミノ基転移反応を触媒する。このファミリーの他のメンバーには、ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）およびキヌレニンアミノトランスフェラーゼが含まれる（Ｖａｃｃａ， Ｒ． Ａ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２１９３２−２１９３７）。
【００５２】
原発性高シュウ酸尿症Ｉ型は、常染色体性劣性疾患であって、肝特異的ペルオキシソーム酵素であるアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ−１の欠損が起こる。この疾患の表現型は、グリオキシル酸代謝の欠損である。ＡＧＴが存在しない場合、グリオキシル酸はグリシンへアミノ基転移されず、シュウ酸へ酸化される。その結果、腎臓および尿管に不溶性シュウ酸カルシウムが沈着し、最終的に腎不全が起こる（Ｌｕｍｂ， Ｍ． Ｊ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ２０５８７−２０５９６）。
【００５３】
キヌレニンアミノトランスフェラーゼは、Ｌ−トリプトファン代謝産物Ｌ−キヌレニンの不可逆的なアミノ転移を触媒してキヌレニン酸を形成する。この酵素はまた、Ｌ−２−アミノアジピン酸から２−オキソグルタル酸およびその逆への可逆的なアミノ基転移反応を触媒して２−ｏｘｏａｄｉｐａｔｅおよびＬ−グルタミン酸を生成し得る。キヌレニン酸はグルタミン酸作動性神経伝達の推定上のモジュレーターであるため、キヌレニンアミノトランスフェラーゼの欠損は多面発現的（ｐｌｅｏｔｒｏｐｈｉｃ）効果に関係すると思われる（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【００５４】
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）は、カテコール基質（例えば、レボドパ、ドーパミン、またはＤＢＡ）の１つのヒドロキシル基への、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ； ＳＡＭ）供与体のメチル基の転移を触媒する。３’−ヒドキシル基のメチル化は４’−ヒドキシル基のメチル化より優先され、ＣＯＭＴの膜結合アイソフォームは可溶型よりも位置特異的である。この酵素の可溶型の翻訳は、完全長ｍＲＮＡ（１．５ｋｂ）の内部の開始コドンの利用によるか、或いは内部プロモータから転写された短いｍＲＮＡ（１．３ｋｂ）の翻訳による。提案されたＳＮ２様メチル化反応には、Ｍｇ２＋が必要であり、Ｃａ２＋によって抑制される。供与体および基質の、ＣＯＭＴへの結合は逐次的に起こる。まず、ＡｄｏＭｅｔがＭｇ２＋非依存的にＣＯＭＴに結合し、Ｍｇ２＋の結合およびカテコール基質の結合がそれに続く。
【００５５】
組織におけるＣＯＭＴの量は活性のために通常必要とされる量より多く存在するため、阻害が困難である。しかしながら、インヒビター群は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用（例えば、没食子酸、トロポロン、Ｕ−０５２１、および３’， ４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｒｏｐｉｏｐｈｅｔｒｏｐｏｌｏｎｅ）および臨床での使用（例えば、ｎｉｔｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ系化合物およびｔｏｌｃａｐｏｎｅ）のために開発されている。これらのインヒビターを投与すると、レボドパの半減期が長くなり、続いてドーパミンの生成が起こる。また、ＣＯＭＴの阻害により、限定するものではないがエピネフリン／ノルエピネフリン、イソプレナリン、リミテロール、ドブタミン、ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ、アポモルフィン、およびα−メチルドパなど、他の様々なカテコール構造化合物の半減期が長くなると思われる。ノルエピネフリンの欠損は臨床的抑鬱症に繋がるため、ＣＯＭＴインヒビターの使用は抑鬱症の治療に有用であると思われる。ＣＯＭＴインヒビターは通常、耐容性が良く副作用が最小限であり、最終的に肝臓で代謝され、体内にはわずかな代謝物が残るのみである（Ｍａｎｎｉｓｔｏ， Ｐ．Ｔ．およびＫａａｋｋｏｌａ， Ｓ． （１９９９） Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５１：５９３−６２８）。
【００５６】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼはコンパクトなホモ二量体金属酵素であって、酸化的な損傷に対する細胞防御に関係する。この酵素は１つの亜鉛原子および１つの銅原子を各サブユニットに有し、スーパーオキシドアニオンの、Ｏ２およびＨ２Ｏ２への不均化反応を触媒する。この不均化反応の速度は、拡散律速されるので、基質と酵素活性部位との間の好ましい静電的相互作用の存在によって増大する。このクラスの酵素の数例が、全て真核細胞の細胞質において同定され、幾つかの細菌種のペリプラズムでも同定された。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ類は強健な酵素であって、蛋白分解的消化や、尿素およびＳＤＳによる変性に対し、高い耐性を持つ。これらの酵素のコンパクトな構造に加えて、金属イオンおよびサブユニット内ジスルフィド結合が酵素の安定性に寄与していると考えられている。これらの酵素は７０℃もの高温でも可逆的に変性する（Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ， Ａ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：５６５５−５６６１）。
【００５７】
スーパーオキシドジスムターゼの過剰な発現は、遺伝子組み換えアルファルファの耐凍性を高めるのに関与し、ジフェニルエーテル除草剤であるアシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）などの環境毒素に対する耐性をも与えると思われる（ＭｃＫｅｒｓｉｅ， Ｂ． Ｄ．他（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０３：１１５５−１１６３）。加えて、酵母細胞は、過酸化水素への曝露の後に凍結融解損傷に対する耐性が高まる。これは、曝露によるスーパーオキシドジスムターゼの発現のアップレギュレートにより、酵母細胞が更なる過酸化ストレスに適応するようになるためである。この研究では、酵母スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子群の突然変異は、冷凍保存過程を経て生物が生存するか否かを決定するのに重要であると長い間考えられていたグルタチオン代謝の調節に影響を及ぼす突然変異よりも、凍結融解抵抗性に悪影響を与えた（Ｊｏｎｇ−Ｉｎ Ｐａｒｋ， Ｊ．−Ｉ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２２９２１−２２９２８）。
【００５８】
スーパーオキシドジスムターゼの発現はまた、結核を引き起こす生物である結核菌に関連する。スーパーオキシドジスムターゼは、結核菌によって分泌される１０種の主なタンパク質の内の１つであり、その発現は酸化ストレスに応じて約５倍アップレギュレートされる。結核菌は、非病原性ミコバクテリアの恥垢菌（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）よりスーパーオキシドジスムターゼをほぼ２桁多く発現し、極めてより高い比率で、発現された酵素を分泌する。この結果、結核菌は恥垢菌よりも最大３５０倍多い酵素を分泌し、酸化ストレスに対する実質的な耐性を与える（Ｈａｒｔｈ， Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４２８１−４２９２）。
【００５９】
銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現の低下、並びに抗酸化能力を有するその他の酵素の発現の低下は初期の癌に関係すると思われる。銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼの発現レベルは、正常な前立腺組織と比べ、前立腺の上皮内新形成および前立腺癌において低い（Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， Ｄ． Ｇ． （２０００） Ｃａｎｃｅｒ ８９：１２３−１３４）。
【００６０】
ホスホジエステラーゼ
ホスホジエステラーゼは、ホスホジエステル化合物の２つのエステル結合の一方の加水分解を触媒する酵素の１クラスを構成する。従って、ホスホジエステラーゼは様々な細胞プロセスにとって重要である。ホスホジエステラーゼには、細胞増殖および複製に必須であるＤＮＡおよびＲＮＡのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼや、ＤＮＡのトポロジー再編成中の核酸鎖の分解および再形成をするトポイソメラーゼが含まれる。或るＴｙｒ−ＤＮＡホスホジエステラーゼは、トポイソメラーゼＩ型とＤＮＡとの間に形成されたデッドエンド共有結合中間体を加水分解することでＤＮＡの修復において作用する（Ｐｏｕｌｉｏｔ， Ｊ． Ｊ．他（１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５５２−５５５； Ｙａｎｇ， Ｓ．−Ｗ． （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１５３４−１１５３９）。
【００６１】
酸性スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成するホスホジエステラーゼである。ホスホリルコリンは、様々な細胞内シグナル伝達経路に関与するホスファチジルコリンの合成に用いられ、一方のセラミドは神経組織に高濃度で見られる膜脂質であるガングリオシドの生成のための必須前駆体である。酸性スフィンゴミエリナーゼが欠損すると、リソソームにおいてスフィンゴミエリン分子が蓄積され、それによってニーマン−ピック病が引き起こされる（Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ， Ｅ． Ｈ．およびＳ． Ｒ． Ｍｉｒａｎｄａ （１９９７） Ｇｅｎｅｔ． Ｔｅｓｔ． １：１３−１９）。
【００６２】
グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｄｉｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）（グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼとも呼ばれる）は、脱アセチル化リン脂質グリセロホスホジエステル（ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒｓ）を加水分解してｓｎ−グリセロール−３−リン酸およびアルコールを生成するホスホジエステラーゼである。グリセロホスホコリン、グリセルホスホエタノールアミン（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、グリセロホスホグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）、およびグリセロホスホイノシトール（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ）は、グリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼのための基質の例である。大腸菌由来の或るグリセロホスホリルジエステルホスホジエステラーゼは、グリセロホスホジエステル（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）基質に対して広範な特異性を有する（Ｌａｒｓｏｎ， Ｔ． Ｊ．他（１９８３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４８：５４２８−５４３２）。
【００６３】
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、サイクリックヌクレオチドであるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの調節に極めて重要な酵素である。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、ホルモン、光および神経伝達物質など、様々な細胞外シグナルを伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能する。ＰＤＥはサイクリックヌクレオチドをそれらの対応する一リン酸に分解し、それによってサイクリックヌクレオチドの細胞内濃度およびシグナル伝達におけるそれらの効果を調節する。それらの役割がシグナル伝達の制御因子であることから、ＰＤＥは化学療法の標的として大規模に研究された（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１ ； Ｔｏｒｐｈｙ， Ｊ． Ｔ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：３５１−３７０）。
【００６４】
哺乳動物ＰＤＥのファミリーは、それらの基質特異性および親和性、補助因子に対する感受性、および抑制剤に対する感受性に基づいて分類される（Ｂｅａｖｏ， Ｊ． Ａ． （１９９５） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７５：７２５−７４８； Ｃｏｎｔｉ， Ｍ．他（１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）。これらのファミリーのいくつかは、固有の遺伝子群を持ち、その多くは様々な組織でスプライス変異体として発現される。ＰＤＥファミリーの中には、多数のイソ酵素およびこれらのイソ酵素の多数のスプライス変異体が存在する（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ．およびＳ．−Ｌ． Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。多数のＰＤＥファミリー、イソ酵素、およびスプライス変異体の存在は、サイクリックヌクレオチドを伴う調節経路の多様性および複雑性を示すものである（Ｈｏｕｓｌａｙ， Ｍ． Ｄ．およびＧ． Ｍｉｌｌｉｇａｎ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２２：２１７−２２４）。
【００６５】
ＰＤＥ１型（ＰＤＥ１）はＣａ２＋／カルモジュリン依存性であって、それぞれが少なくとも２つの異なったスプライス変異体を有する少なくとも３つの異なった遺伝子によってコードされると思われる（Ｋａｋｋａｒ， Ｒ． 他． （１９９９） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５５：１１６４−１１８６）。ＰＤＥ１は、肺、心臓、および脳で見出された。数種のＰＤＥ１イソ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化／脱リン酸化によって調節される。これらのＰＤＥ１イソ酵素をリン酸化すると、カルモジュリンに対するこの酵素の親和性が低下し、ＰＤＥ活性が低下し、ｃＡＭＰの定常状態レベルが増大する（Ｋａｋｋａｒ， 前出）。ＰＤＥ１は、サイクリックヌクレオチドおよびカルシウムのシグナル伝達の両方に関与するので、中枢神経系および心血管、免疫系の障害のための有用な治療標的を提供し得る（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００６６】
ＰＤＥ２は、小脳、新皮質、心臓、腎臓、肺、肺動脈、および骨格筋に見られるｃＧＭＰ刺激ＰＤＥ（ｃＧＭＰ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＰＤＥ）である（Ｓａｄｈｕ， Ｋ．他（１９９９） Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４７：８９５−９０６）。ＰＤＥ２は、カテコールアミン分泌におけるｃＡＭＰの効果を仲介し、アルドステロンの調節に関与し（Ｂｅａｖｏ， 前出）、更に嗅覚シグナル伝達においても或る役割を果たしていると思われる（Ｊｕｉｌｆｓ， Ｄ． Ｍ．他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：３３８８−３３９５）。
【００６７】
ＰＤＥ３はｃＧＭＰおよびｃＡＭＰの両方に対して高い親和性を有するため、これらのサイクリックヌクレオチドは、ＰＤＥ３の競合的基質として作用する。ＰＤＥ３は、心筋収縮能の刺激、血小板凝集の抑制、血管および気道の平滑筋の弛緩、Ｔリンパ球および血管平滑筋培養細胞の増殖抑制、脂肪組織からのカテコールアミン誘導性遊離脂肪酸放出の調節において作用する。ホスホジエステラーゼのＰＤＥ３ファミリーは、ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ、ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ、およびｌｉｘａｚｉｎｏｎｅなど、特異的インヒビターに対する感受性を有する。ＰＤＥ３のイソ酵素は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼまたはインスリン依存性キナーゼによって抑制され得る（Ｄｅｇｅｒｍａｎ， Ｅ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６８２３−６８２６）。
【００６８】
ＰＤＥ４はｃＡＭＰに特異的であって、気道平滑筋、血管上皮、および全ての炎症細胞に局在し、ｃＡＭＰ依存性リン酸化によって活性化され得る。ｃＡＭＰのレベルの上昇によって、炎症細胞の活性化が抑制され気管支平滑筋が弛緩し得るため、ＰＤＥ４は、喘息治療の発見に重点をおいて新規の抗炎症剤の可能性のある標的として広範に研究された。ＰＤＥ４インヒビターは、現在、喘息、慢性閉塞性肺疾患、およびアトピー性湿疹の治療薬として臨床試験が行われている。ＰＤＥ４の既知の４つ全てのイソ酵素は、マウスの行動記憶を向上させることが示された化合物であるインヒビター、ロリプラムに対して感受性を持つ（Ｂａｒａｄ， Ｍ．他（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１５０２０−１５０２５）。ＰＤＥ４インヒビターはまた、急性肺傷害、内毒素血症、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、および様々な神経や胃腸の疾患に対する可能性のある治療薬として研究された（Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ａ． Ｍ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３：４６６−４７３）。
【００６９】
ＰＤＥ５は、基質としてのｃＧＭＰに対して高い選択性を有し（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ． Ｖ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：４２００−４２０５）、２つのアロステリックｃＧＭＰ特異的結合部位を有する（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ， Ｌ． Ｍ． 他． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：３０６７１−３０６７９）。ｃＧＭＰのこれらのアロステリック結合部位への結合は、触媒活性の直接的な調節よりもｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼによるＰＤＥ５のリン酸化にとって重要であると思われる。高いレベルのＰＤＥ５は、血管平滑筋、血小板、肺、および腎臓に見られる。インヒビター、ザプリナストはＰＤＥ５およびＰＤＥ１に対して効果がある。ＰＤＥ５に対する特異性を得るためにザプリナストを改良してｓｉｌｄｅｎａｆｉｌを生成した（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。このｓｉｌｄｅｎａｆｉｌは男性勃起不全の治療薬である（Ｔｅｒｒｅｔｔ， Ｎ． 他． （１９９６） Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ６：１８１９−１８２４）。ＰＤＥ５のインヒビターは、心血管治療薬として現在研究されている（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。
【００７０】
光受容体サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼであるＰＤＥ６類は、光伝達カスケードの重要な要素である。ＰＤＥ６はＧタンパク質トランスデューシンと結合して、ｃＧＭＰを加水分解して光受容体膜におけるｃＧＭＰ作動性陽イオンチャネルを調節する。ｃＧＭＰ結合活性部位に加えて、ＰＤＥ６はまた、ＰＤＥ６の機能における調節的な役割を果たすと考えられる２つの高親和性ｃＧＭＰ結合部位を有する（Ａｒｔｅｍｙｅｖ， Ｎ． Ｏ．他（１９９８） Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：９３−１０４）。ＰＤＥ６の欠損は網膜の疾患に関係する。ｒｄマウスの網膜変性症（Ｙａｎ， Ｗ．他（１９９８） Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３９：２５２９−２５３６）、ヒトの常染色体性劣性網膜色素変性症（色素性網膜炎）（Ｄａｎｃｉｇｅｒ， Ｍ．他（１９９５） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３０：１−７）、およびアイリッシュセッター犬の杆状体／錐状体異形成１型（Ｓｕｂｅｒ， Ｍ． Ｌ．他（１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３９６８−３９７２）は、ＰＤＥ６Ｂ遺伝子における突然変異が原因である。
【００７１】
ＰＤＥのＰＤＥ７ファミリーは、複数のスプライス変異体を有する唯１つの既知のメンバーから成る（Ｂｌｏｏｍ， Ｔ． Ｊ．およびＪ． Ａ． Ｂｅａｖｏ （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１４１８８−１４１９２）。ＰＤＥ７はｃＡＭＰ特異的であるが、その他の生理的機能については殆ど知られていない。ＰＤＥ７をコードするｍＲＮＡが骨格筋、心臓、脳、肺、腎臓、および膵臓で見られるが、ＰＤＥ７タンパク質の発現は特定の組織型に限定される（Ｈａｎ， Ｐ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１６１５２−１６１５７； Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１）。ＰＤＥ７はＰＤＥ４ファミリーに密接に関連するが、ＰＤＥ４の特異的なインヒビターであるロリプラムによって阻害されない（Ｂｅａｖｏ， 前出）。
【００７２】
ＰＤＥ８類はｃＡＭＰ特異的であり、ＰＤＥ４ファミリーに密接に関連する。ＰＤＥ８は、甲状腺、精巣、眼、肝臓、骨格筋、心臓、腎臓、卵巣、および脳において発現される。ＰＤＥ８のｃＡＭＰ加水分解活性は、ＰＤＥのインヒビターであるロリプラム、ビンポセチン、ミルリノン、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、またはザプリナストによって抑制されないが、ＰＤＥ８はジピリダモールによって抑制される（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ． Ａ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４６：５７０−５７７； Ｈａｙａｓｈｉ， Ｍ．他（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５０：７５１−７５６； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ． Ｈ．他（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：８９９１−８９９６）。
【００７３】
ＰＤＥ９類はｃＧＭＰ特異的であって、ＰＤＥのＰＤＥ８ファミリーに最も類似している。ＰＤＥ９は、腎臓、肝臓、肺、脳、脾臓、および小腸において発現される。ＰＤＥ９はｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ（ＶＩＡＧＲＡ； Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）、ロリプラム、ビンポセチン、ジピリダモール、またはＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）によって抑制されないが、ＰＤＥ５インヒビターであるザプリナストに対して感受性を有する（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ． Ａ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５９−１５５６４； Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ． Ｈ．他（１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１５５５３−１５５５８）。
【００７４】
ＰＤＥ１０類は二重基質ＰＤＥであって、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を加水分解する。ＰＤＥ１０は、脳、甲状腺、及び精巣に発現する（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｇ， Ｓ．Ｈ．他（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：７０７１−７０７６； Ｆｕｊｉｓｈｉｇｅ， Ｋ．他（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１８４３８−１８４４５； Ｌｏｕｇｈｎｅｙ， Ｋ．他（１９９９）Ｇｅｎｅ ２３４：１０９−１１７）。
【００７５】
ＰＤＥ類は、約２７０−３００アミノ酸の触媒ドメイン、および補助因子の結合に働くＮ末端調節ドメインを持ち、場合によっては、機能が未知の親水性Ｃ末端ドメインを持つ（Ｃｏｎｔｉ， Ｍ． およびＳ．−Ｌ．Ｃ． Ｊｉｎ （１９９９） Ｐｒｏｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：１−３８）。全てのＰＤＥの触媒ドメイン中に保存されているある推定亜鉛結合モチーフが同定された。Ｎ末端調節ドメインとしては、ＰＤＥ２、ＰＤＥ５、およびＰＤＥ６における非触媒ｃＧＭＰ結合ドメイン、ＰＤＥ１におけるカルモジュリン結合ドメイン、およびＰＤＥ３およびＰＤＥ４におけるリン酸化部位を持つドメインを含む。ＰＤＥ５中では、Ｎ−末端ｃＧＭＰ−結合ドメインは約３８０のアミノ酸残基にまたがり、或る保存配列モチーフのタンデムリピートを含んでいる（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｕｃａｓ，Ｌ．Ｍ．他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２２８６３−２２８７３）。このＮＫＸｎＤモチーフは、変異誘発によって、ｃＧＭＰ結合に重要であることが示された（Ｔｕｒｋｏ， Ｉ． Ｖ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２２４０−２２２４４）。ＰＤＥファミリーは、触媒ドメイン内において約３０％のアミノ酸同一性を有するが、同じファミリー内のイソ酵素は通常約８５から９５％のこの領域における同一性を示す（例えばＰＤＥ４ＡとＰＤＥ４Ｂ）。更に、あるファミリー内の触媒ドメイン外の類似性は高いが（６０％を超える）、ファミリー間のこのドメイン外の配列類似性は殆ど存在しない。
【００７６】
免疫応答および炎症応答を構成する機能の多くは、細胞内のｃＡＭＰのレベルを上昇させる薬剤によって阻害される（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ， Ｍ． Ｗ．他（１９９５） Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４７：１１６４−１１７１）。様々な疾患がＰＤＥ活性の上昇が原因で起こり、サイクリックヌクレオチドのレベルの低下に関係する。例えば、マウスにおける尿崩症の或る型はＰＤＥ４活性の上昇に関係し、低ＫｍｃＡＭＰ ＰＤＥ活性の上昇がアトピー患者の白血球に見られ、ＰＤＥ３が心疾患に関連する。
【００７７】
ＰＤＥ類の多くのインヒビターが同定され、臨床試験が行われている（Ｐｅｒｒｙ， Ｍ． Ｊ．およびＧ． Ａ． Ｈｉｇｇｓ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：４７２−４８１； Ｔｏｒｐｈｙ， Ｔ． Ｊ． （１９９８） Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． １５７：３５１−３７０）。ＰＤＥ３インヒビター類は、抗血栓剤、血圧降下薬および、鬱血性心不全の治療に有用な強心薬として開発中である。ＰＤＥ４インヒビターであるロリプラムは、抑鬱症の治療に用いられ、ＰＤＥ４のその他のインヒビターは抗炎症薬として評価が行われている。ロリプラムはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１の複製を増強することが示された、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導性ＴＮＦ−αを阻害することが分かった。従って、ロリプラムはＨＩＶ−１の複製を阻害すると考えられる（Ａｎｇｅｌ， Ｊ． Ｂ．他（１９９５） ＡＩＤＳ ９：１１３７−１１４４）。更に、ロリプラムは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびインターフェロンγなど、サイトカインの生成を抑制する能力に基づいて、脳脊髄炎の治療に有効であることが示された。ロリプラムはまた、遅発性ジスキネジアに有効であると考えられ、実験動物モデルにおける多発性硬化症の治療に効果があった（Ｓｏｍｍｅｒ， Ｎ．他（１９９５） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １：２４４−２４８ ； Ｓａｓａｋｉ， Ｈ．他（１９９５） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８２：７１−７６）。
【００７８】
テオフィリンは、気管支喘息その他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的ＰＤＥインヒビターである。テオフィリンは、気道平滑筋の機能において作用し、呼吸器疾患の治療における抗炎症能力または免疫調節能力があると考えられる（Ｂａｎｎｅｒ， Ｋ． Ｈ．およびＣ． Ｐ． Ｐａｇｅ （１９９５） Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ８：９９６−１０００）。ペントキシフィリンは、間欠性跛行および糖尿病性末梢血管疾患の治療に用いられる別の非特異的ＰＤＥインヒビターである。ペントキシフィリンはまた、ＴＮＦ−αの生成を阻止することが知られ、また、ＨＩＶ−１の複製を阻害し得る（Ａｎｇｅｌ他， 前出）。
【００７９】
ＰＤＥ類は、様々な細胞型の細胞増殖に影響を与えると報告があり（Ｃｏｎｔｉ他（１９９５） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １６：３７０−３８９）、また様々な癌に関係すると思われる。前立腺癌細胞株ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰの成長は、ｃＡＭＰ誘導体およびＰＤＥインヒビターの送達によって抑制された（Ｂａｎｇ， Ｙ． Ｊ．他（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：５３３０−５３３４）。これらの細胞はまた、上皮からニューロン形態への、表現型における永久的な変換を示した。また、ＰＤＥインヒビターがメサンギウム細胞の増殖を調節する可能性があり（Ｍａｔｏｕｓｏｖｉｃ， Ｋ．他（１９９５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：４０１−４１０）、またリンパ球の増殖を調節する可能性もある（Ｊｏｕｌａｉｎ， Ｃ．他（１９９５） Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｄｉａｔ． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ． １１：６３−７９）ことが示唆された。或る癌治療は、ＰＤＥを腫瘍の特定の細胞区画に送達し、細胞死を導く過程を伴うと記述されている（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ， Ｍ． Ｐ．およびＡ． Ａ． Ｅｐｅｎｅｔｏｓ （１９９４） Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７０：７８６−７９４）。
【００８０】
ホスホトリエステラーゼ
ホスホトリエステラーゼ（ＰＴＥ、ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ）類の酵素は有毒の有機リン化合物を加水分解し、ＰＴＥは種々の組織から単離されている。ＰＴＥ酵素は、哺乳動物には豊富に存在するが鳥や昆虫では存在しないと思われ、鳥や昆虫の、有機リン化合物に対する耐性の低さの説明となる（Ｖｉｌａｎｏｖａ， Ｅ．およびＳｏｇｏｒｂ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ２９：２１−５７）。ホスホトリエステラーゼは、哺乳動物による殺虫剤の解毒において中心的な役割を果たす。ホスホトリエステラーゼ活性は個人によって差があり、大人より幼児の方が低い。ＰＴＥノックアウトマウスは、有機リン系の毒素であるｄｉａｚｏｘｏｎおよびｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ ｏｘｏｎに対して顕著な感受性を有する（Ｆｕｒｌｏｎｇ， Ｃ．Ｅ．，他（２０００） Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ２１：９１−１００）。ＰＴＥは、有機リン含有化学廃棄物および化学兵器（例えば、パラチオン）、並びに農薬や殺虫剤の解毒能力を有する酵素として注目されている。幾つかの研究により、ホスホトリエステラーゼがアテローム性動脈硬化症および、リポタンパク代謝に関係する複数の疾患に関与することが示された。
【００８１】
チオエステラーゼ
脂肪酸生合成に関係する２つの可溶性チオエステラーゼが、哺乳動物組織から単離された。その一方は、長鎖脂肪酸アシルチオエステルに対してのみ活性であり、他方は様々な長さの脂肪酸アシル鎖を有するチオエステルに対して活性である。これらのチオエステラーゼは、脂肪酸の新規生合成における脂肪酸鎖の終結段階を触媒する。脂肪酸鎖の終結段階は、脂肪酸アシル鎖を脂肪酸シンターゼのアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）のサブユニットの４’−ホスホパンテテイン置換基（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）に結合しているチオエステル結合の加水分解を伴う（Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ａ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８１−１８８； Ｓｍｉｔｈ， Ｓ． （１９８１ｂ） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７１：１８８−２００）。
【００８２】
大腸菌は、長鎖アシルチオエステルに対してのみ活性なチオエステラーゼＩ型および、様々な長さの鎖に対して特異性を有するチオエステラーゼＩＩ型（ＴＥＩＩ）の、２つの可溶性チオエステラーゼを持つ（Ｎａｇｇｅｒｔ， Ｊ．他（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１１０４４−１１０５０）。大腸菌ＴＥＩＩは、新規の脂肪酸生合成における脂肪酸鎖終結酵素（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）として機能する哺乳動物チオエステラーゼの２つの型のいずれとも配列類似性を有していない。哺乳動物チオエステラーゼとは異なり、大腸菌ＴＥＩＩは、特徴的なセリン活性部位ｇｌｙ−Ｘ−ｓｅｒ−Ｘ−ｇｌｙ配列モチーフを欠く上に、セリン変性剤であるジイソプロピルフルオロリン酸によって不活化されない。しかしながら、ヨードアセトアミドおよびジエチルピロカルボネートによるヒスチジン５８の修飾によってＴＥＩＩ活性が失われる。ＴＥＩＩの過剰発現は大腸菌に含まれる脂肪酸を変化させない。これは、脂肪酸生合成において脂肪酸鎖終結酵素として機能していないことを示すものである（Ｎａｇｇｅｒｔ他， 前出）。このような理由から、Ｎａｇｇｅｒｔ他（前出）の提起では、大腸菌ＴＥＩＩの生理学的基質はＡＣＰ−ホスホパンテテイン脂肪酸エステルではなく補酵素Ａ（ＣｏＡ）脂肪酸エステルである。
【００８３】
カルボキシルエステラーゼ
哺乳動物カルボキシルエステラーゼ類は、様々な組織および細胞型で発現される多重遺伝子ファミリーを構成する。アイソザイム群は顕著な配列相同性を持ち、主にアミノ酸配列に基づいて分類される。アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、およびカルボキシルエステラーゼは、エステラーゼのセリン スーパーファミリ（Ｂエステラーゼ）にグループ化される。他のカルボキシルエステラーゼとしては、サイログロブリン、トロンビン、第ＩＸ因子、グリオタクチン（ｇｌｉｏｔａｃｔｉｎ）、およびプラスミノーゲンがある。カルボキシルエステラーゼは、分子のエステル基およびアミド基の加水分解を触媒し、薬物、環境毒、および発癌物質の解毒に関与する。カルボキシルエステラーゼの基質としては、短鎖および長鎖アシルグリセロール、アシルカルニチン、炭酸、塩酸ジピベフリン（ｄｉｐｉｖｅｆｒｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、コカイン、サリチル酸、カプサイシン、パルミトイル−ＣｏＡ、イミダプリル、ハロペリドール、ピロリジジンアルカロイド、ステロイド、ｐ−ニトロフェニル酢酸、マラチオン、ｂｕｔａｎｉｌｉｃａｉｎｅ、およびイソカルボキサジドが含まれる。この酵素は低い基質特異性を示すことがよくある。カルボキシルエステラーゼはまた、プロドラッグを対応する遊離酸に変換するために重要である。対応する遊離酸は、例えば血中コレステロールを低下させるために用いられるロバスタチンなど、そのプロドラッグの活性型であり得る（概説はＳａｔｏｈ， Ｔ．およびＨｏｓｏｋａｗａ， Ｍ． （１９９８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３８：２５７−２８８を参照）。
【００８４】
ニューロリギン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）類は、（ｉ）Ｎ末端シグナル配列を有し、（ｉｉ）細胞表面受容体群に類似し、（ｉｉｉ）カルボキシルエステラーゼドメインを持ち、（ｉｖ）脳で高度に発現され、（ｖ）カルシウム依存的にニューレキシン類と結合する、分子の１クラスである。カルボキシルエステラーゼ類との相同性を持つものの、ニューロリギン類は活性部位セリン残基を欠き、これらは触媒作用ではなく基質結合において役割を果たすと考えられる（Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ， Ｋ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２６７６−２６８２）。
【００８５】
スクアレンエポキシダーゼ
スクアレンエポキシダーゼ（スクアレンモノオキシゲナーゼ、ＳＥ）は、ミクロソーム膜結合ＦＡＤ依存性オキシドレドクターゼであって、真核細胞のステロール生合成経路における初めの酸素添加ステップを触媒する。コレステロールは、ＬＤＬ受容体仲介経路、若しくは生合成経路によって獲得される、細胞質膜の必須の構成成分である。生合成では、コレステロール分子における２７全ての炭素原子がアセチル−ＣｏＡに由来する（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ．， 前出）。ＳＥはスクアレンを２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンに変換するが、これは次にラノステロールに変換され、更にコレステロールに変換される。コレステロール生合成に関係するステップを以下に要約する（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌ （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ．Ｈ ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏ．， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ５５４−５６０ページ、およびＳａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ．他（１９９５） ２７０：１７−２０）。アセテート（アセチル−ＣｏＡ由来）→３ヒドロキシ−３−メチル−グルタリルＣｏＡ→メバロン酸→５−ホスホメバロン酸→５−ピロホスホメバロン酸→イソペンテニルピロリン酸→ジメチルアリルピロリン酸→ゲラニルピロリン酸→ファルネシルピロリン酸→スクアレン→スクアレンエポキシド→ラノステロール→コレステロール
【００８６】
コレステロールは真核細胞の生存能力に必須であるが、血清コレステロールのレベルが過度に上昇すると高等生物の動脈ではアテローム斑が形成される。例えば冠状動脈など必須血管の壁部に、この高度に不溶性の脂質の沈着があると、血流が減少して充分な血液が組織に流れないようになり組織壊死が起こり得る。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）のメバロン酸への変換に必要であり、この変換がコレステロール生合成の第１のステップである。ＨＭＧ−ＣｏＡは、血漿コレステロールレベルを低下させるようにデザインされた様々な医薬化合物の標的である。しかし、ＨＭＧ−ＣｏＡの阻害はまた、その他の生化学経路に必要な非ステロール中間体（例えば、メバロン酸）の合成をも減少させる。ＳＥは、ステロール合成経路の後の方で起こる律速反応を触媒し、コレステロールは、ＳＥによる触媒ステップに続く、この経路の唯一の最終産物である。従って、ＳＥは、その他の必要な中間体を減少させない抗高脂血症薬をデザインするための理想的な標的である（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ．他（１９９６） ２７１：８０５３−８０５６）。
【００８７】
エポキシドヒドロラーゼ
エポキシドヒドロラーゼは、エポキシド含有化合物への水の添加を触媒し、それによってエポキシドがその対応する１，２−ジオールに加水分解される。これらは、細菌ハロアルカンデハロゲナーゼ（ｈａｌｏａｌｋａｎｅ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｓｅ）に近縁で、酵素のα／βヒドロラーゼフォールド（α／βｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｏｌｄ）ファミリーのその他のメンバーとの配列類似性を有する（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ由来ブロモペルオキシダーゼＡ２（ｂｒｏｍｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａ２）、シュードモナス‐プチダ由来のｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎｉｃ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ、および Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来ハロアルカンデハロゲナーゼ）。エポキシドヒドロラーゼは遍在性であって、哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、細菌に見られる。この酵素のファミリーは、生物内に導入されると求電子性が高く破壊性である場合が多い生体異物エポキシド化合物の解毒にとって重要である。エポキシドヒドロラーゼ反応の例には、ｃｉｓ−９，１０−ｅｐｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−９（Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ロイコトキシン）の、その対応するジオールであるｔｈｒｅｏ−９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−１２（Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ ｄｉｏｌ）を形成する加水分解、およびｃｉｓ−１２，１３−ｅｐｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−９（Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （ｉｓｏｌｅｕｋｏｔｏｘｉｎ）からその対応するジオールであるｔｈｒｅｏ−１２，１３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃ−９（Ｚ）−ｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ （イソロイコトキシンジオール）への加水分解が含まれる。ロイコトキシンは、膜の透過性とイオン輸送を改変し、炎症応答を引き起こす。加えて、エポキシド発癌物質は、薬物および環境毒素の解毒における中間体としてチトクロームＰ４５０によって生成されることが知られている。
【００８８】
これらの酵素は、Ａｓｐ（求核性）、Ａｓｐ（ヒスチジンをサポートする酸）およびＨｉｓ（水活性化ヒスチジン）からなる、触媒トライアッドを有する。エポキシドヒドロラーゼの反応メカニズムは、或る共有結合エステル中間体を経て進み、標的分子のエポキシド環の第１炭素原子に対するＡｓｐ残基の１つの求核攻撃によって開始され共有結合エステル中間体が形成される（Ａｒａｎｄ， Ｍ．他（１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：４２２３−４２２９； Ｒｉｎｋ， Ｒ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７； Ａｒｇｉｒｉａｄｉ， Ｍ．Ａ．他（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１５２６５−１５２７０）。
【００８９】
チロシン触媒作用に関与する酵素
コハク酸とピルビン酸か或いはフマル酸とアセト酢酸への、アミノ酸であるチロシンの分解には、多数の酵素が必要であり、多数の中間化合物が生成される。加えて、多くの生体異物化合物は、チロシン異化経路の一部である１つ以上の反応が用いられて代謝され得る。この経路は主に細菌で研究されているが、チロシン分解は様々な生物において起こることが知られ、多数の同様の生物学的反応が関係すると思われる。
【００９０】
コハク酸とピルビン酸へのチロシンの分解に関係する酵素には（例えばアルスロバクター属：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓで）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシフェニル酢酸３−ヒドロキシラーゼ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸２，３−ジオキシゲナーゼ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎｉｃ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、トランス，シス−５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼ（ｔｒａｎｓ，ｃｉｓ−５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ホモプロトカテチュ酸イソメラーゼ／デカルボキシラーゼ（ｈｏｍｏｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ／ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ｃｉｓ−２−ｏｘｏｈｅｐｔ−３−ｅｎｅ−１，７−ｄｉｏａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ、２，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｐｔ−ｔｒａｎｓ−２−ｅｎｅ−１，７−ｄｉｏａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ、およびコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）が含まれる。
【００９１】
チロシンのフマル酸とアセト酢酸への分解に関係する酵素には（例えばシュードモナス属で）、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、ホモゲンチシン酸−１，２−ジオキシゲナーゼ、マレイルアセト酢酸イソメラーゼ、およびフマリルアセトアセターゼが含まれる。コハク酸／ピルビン酸経路からの中間体が受け入れられた場合は、４−ヒドロキシフェニル酢酸１−ヒドロキシラーゼ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ １−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）が関係し得る。
【００９２】
様々な生物においてチロシン代謝に関係する更なる酵素の例として、４−クロロフェニル酢酸−３，４−ジオキシゲナーゼ（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ−３，４−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、芳香族アミノトランスフェラーゼ、５−ｏｘｏｐｅｎｔ−３−ｅｎｅ−１，２，５−ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、２−ｏｘｏ−ｈｅｐｔ−３−ｅｎｅ−１，７−ｄｉｏａｔｅ ｈｙｄｒａｔａｓｅ、および５−カルボキシメチル−２−ヒドロキシムコン酸イソメラーゼ（５−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｕｃｏｎａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）が挙げられる（Ｅｌｌｉｓ， Ｌ． Ｂ． Ｍ．他（１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７：３７３−３７６； Ｗａｃｋｅｔｔ， Ｌ． Ｐ． および Ｅｌｌｉｓ， Ｌ． Ｂ． Ｍ． （１９９６） Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２５：９１−９３； および Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ． （１９９６） Ａｍｅｒ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｎｅｗｓ ６２：１０２）。
【００９３】
ヒトにおいて、チロシン分解経路の酵素における後天性或いは先天性の遺伝的欠陥は、遺伝性チロシン血症を引き起こし得る。この疾患の１つの型である遺伝性チロシン血症Ｉ型（ＨＴ１）は、チロシンをフマル酸とアセト酢酸に代謝する生物における経路の最終酵素であるフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼの欠損によって引き起こされる。ＨＴ１は幼児期に始まる進行性の肝損傷によって特徴づけられ、肝癌のリスクが高い（Ｅｎｄｏ， Ｆ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２４４２６−２４４３２）。
【００９４】
新規の薬物代謝酵素群および、それらをコードするポリヌクレオチド群の発見により、新規の組成物群を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害および、肝臓の疾患を含む胃腸疾患の、診断・予防・治療において有用であり、また、薬物代謝酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【００９５】
（発明の概要）
本発明は、総称して「ＤＭＥ」、個別にはそれぞれ「ＤＭＥ−１」、「ＤＭＥ−２」、「ＤＭＥ−３」、「ＤＭＥ−４」、「ＤＭＥ−５」、「ＤＭＥ−６」、「ＤＭＥ−７」、「ＤＭＥ−８」、「ＤＭＥ−９」、「ＤＭＥ−１０」、「ＤＭＥ−１１」、「ＤＭＥ−１２」および「ＤＭＥ−１３」と呼ぶ、薬物代謝酵素である精製されたポリペプチドを提供する。或る実施例において本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した、単離されたポリペプチドを提供する。一実施例で本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３のアミノ酸配列を持つ、単離されたポリペプチドを提供する。
【００９６】
また、本発明は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択される。
【００９７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の実施態様で本発明は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換体を提供する。
【００９８】
更に本発明は、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００９９】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【０１００】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【０１０１】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも６０の連続したヌクレオチド群からなる。
【０１０２】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を持つ。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。
【０１０３】
本発明は更に、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる一群から選択されたアミノ酸配列を持つ組成物を提供する。更に、本発明は、この組成物を機能的ＤＭＥの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を必要とする患者に投与する方法を提供する。
【０１０４】
本発明はまた、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物を機能的ＤＭＥの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を必要とする患者に投与する方法を提供する。
【０１０５】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の一実施態様で本発明は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と薬物として許容し得る賦形剤とを有する組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、この組成物を機能的ＤＭＥの過剰発現に関連した疾患や症状の治療を必要とする患者に投与する方法を提供する。
【０１０６】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（ｂ）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【０１０７】
本発明は更に、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【０１０８】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１０９】
本発明は更に、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｉｖ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のＲＮＡ等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）〜（ｖ）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【０１１０】
（本発明の記述について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１１１】
請求の範囲および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【０１１２】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係があるであろう細胞、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１１３】
（定義）
用語「ＤＭＥ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＤＭＥのアミノ酸配列を指す。
【０１１４】
用語「アゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。アゴニストとしては、ＤＭＥと直接相互作用して、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の諸成分に作用してＤＭＥの活性を調節する、タンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１１５】
用語「対立遺伝子変異配列／アレル変異配列」は、ＤＭＥをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異配列群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る他、変容したｍＲＮＡ群を生じ得る。また、ポリペプチド群を生じ得るが、それらのポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１１６】
ＤＭＥをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、ＤＭＥと同じポリペプチド、或いはＤＭＥの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列にとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、アレル変異配列群との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性をも含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なＤＭＥとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＤＭＥの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【０１１７】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指す。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１１８】
用語「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる。
【０１１９】
用語「アンタゴニスト」は、ＤＭＥの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、ＤＭＥと直接相互作用して、或いはＤＭＥが関与する生物学的経路の諸成分に作用してＤＭＥの活性を調節する、抗体、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物などのタンパク質を含み得る。
【０１２０】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、およびＦｖ断片を指す。ＤＭＥポリペプチドと結合する抗体は、免疫化抗原として、無傷のポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、ＲＮＡの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合し得る。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するキャリアの例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１２１】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（すなわちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１２２】
用語「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、核酸またはオリゴヌクレオチド分子であって、特定の分子ターゲットに結合する分子を指す。アプタマーはｉｎ ｖｉｔｒｏでの進化プロセスに由来する（例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔの略、試験管内選択法）、米国特許第５，２７０，１６３号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの構成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの２’−ＯＨ基は２’−Ｆまたは２’−ＮＨ２によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（例えば、Ｂｒｏｄｙ， Ｅ．Ｎ．およびＬ． Ｇｏｌｄ（２０００）Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５−１３を参照）。
【０１２３】
用語「イントラマー（ｉｎｔｒａｍｅｒ）」は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るＲＮＡ発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のＲＮＡアプタマー類が高レベルに発現されている（Ｂｌｉｎｄ， Ｍ．他（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：３６０６−３６１０）。
【０１２４】
用語「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」は、アプタマーの内、Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡなどの左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性のヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に対して耐性がある。
【０１２５】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、ＤＮＡや、ＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば２’−メトキシエチル糖または２’−メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば５−メチルシトシン、２−デオキシウラシルまたは７−デアザ−２’−デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味し得る。
【０１２６】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のＤＭＥ、合成のＤＭＥまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１２７】
用語「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「５’−ＡＧＴ−３’」は、その相補配列「３’−ＴＣＡ−５’」との対を形成する。
【０１２８】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む（持つ）組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む（持つ）組成物」は、広い意味で、指定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。ＤＭＥをコード、若しくはＤＭＥの断片群をコードするポリヌクレオチド配列群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることも可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；ＳＤＳ）およびその他の成分（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のＤＮＡなど）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１２９】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにＤＮＡ配列解析を繰り返し行い、ＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を用いて５’および／または３’の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）またはＰｈｒａｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）などの断片構築用コンピュータプログラムを用いて１つあるいはそれ以上のオーバーラップするｃＤＮＡやＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡ断片から構築された核酸配列を指す。伸長および構築の両方を行ってコンセンサス配列を産生する配列もある。
【０１３０】
用語「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。すなわち、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存され、置換によって大きくは変わらない。下表は、タンパク質内で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示す。
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【０１３１】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、および／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１３２】
用語「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１３３】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１３４】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１３５】
「示差発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１３６】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって新規のタンパク質群を構築することが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１３７】
用語「断片」は、ＤＭＥまたはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの、固有の部分であって、その親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、あるいはその他の目的のために用いられる或る断片は、少なくとも長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０若しくは５００の、連続したヌクレオチドあるいはアミノ酸残基であり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１３８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を明確に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持つ。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６のある断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の或る断片によってコードされる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持つ。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に判定し得る。
【０１４０】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１４１】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１４２】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「％一致」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１４３】
ポリヌクレオチド配列間の一致率を判定するには、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムなどに組込まれているＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウエアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の一部である。このＣＬＵＳＴＡＬ Ｖは、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ． 他（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝５、ｗｉｎｄｏｗ＝４、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝４と設定される。「ｗｅｉｇｈｔｅｄ」残基重み付け表がデフォルトで選択される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによる一致率の報告は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」としてなされる。
【０１４４】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）が、一般的に用いられ、且つ、無料で利用可能な配列比較アルゴリズム一式を提供している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． 他（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるＮＣＢＩおよびインターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からも入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と、様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用できる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ および ｂｌａｓｔｐ（以下に記載）の両方に用い得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ（ｇａｐ）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１４５】
2005500006.tif 000003
【０１４６】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得た断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または少なくとも２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４７】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１４８】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１４９】
ポリペプチド配列間の一致率は、ＭＥＧＡＬＩＧＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１２ｅ配列アラインメントプログラムに組込まれているようなＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる（参照先と共に上述）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ＝３、ｗｉｎｄｏｗ＝５、「ｄｉａｇｏｎａｌｓ ｓａｖｅｄ」＝５と設定される。ＰＡＭ２５０マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖによって「ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（類似性パーセント）」として報告される。
【０１５０】
あるいは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２（２０００年４月２１日）のｂｌａｓｔｐをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１５１】
2005500006.tif 000004
【０１５２】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のＳＥＱ ＩＤナンバーで定義された配列）で測定し得る。あるいは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または少なくとも１５０の連続した残基の断片）の長さの一致率も測定し得る。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１５３】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は直鎖状の微小染色体であり、約６ｋｂ 〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離および維持に必要な、全てのエレメントを持つ。
【０１５４】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１５５】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容されるアニーリング条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×ＳＳＣ、約１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、並びに約１００μｇ／ｍｌの、せん断して変性したサケ精子ＤＮＡの存在下である。
【０１５６】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このＴｍは、所定のイオン強度およびｐＨの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Ｔｍを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹに記載されており、特に２巻の９章を参照されたい。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約０．２× ＳＳＣおよび約０．１％のＳＤＳの存在下、６８℃で１時間の洗浄条件を含む。別法では、温度は約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃を用い得る。ＳＳＣ濃度は、約０．１％のＳＤＳ存在下で、約０．１〜２×ＳＳＣの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μｇ／ｍｌの、せん断した変性サケ精子ＤＮＡがある。特定条件下で、例えばＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１５８】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ解析など）。あるいは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１５９】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいは核酸配列における変化を指す。
【０１６０】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞および全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１６１】
用語「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物など生物に導入すると免疫応答を引き起こす、ＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」には、また、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、ＤＭＥのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【０１６２】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１６３】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１６４】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、ＤＭＥの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、ＤＭＥのタンパク質活性の増減、或いは結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１６５】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなＤＮＡまたはＲＮＡや、ペプチド核酸（ＰＮＡ）や、任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ様物質を指すこともある。
【０１６６】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したＤＮＡ配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１６７】
「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」は、末端がリシンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリシンは、この組成に溶解性を与える。ＰＮＡは、相補的一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるＰＮＡの寿命を延長し得る。
【０１６８】
ＤＭＥの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解的切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、ＤＭＥの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１６９】
「プローブ」とは、同一配列或いはアレル核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、ＤＭＥやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的ポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はＤＮＡオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１７０】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも１５の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１７１】
プローブおよびプライマーの調製および使用方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， １−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． 他（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡなどを参照されたい。ＰＣＲプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５， １９９１， Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を用い得る。
【０１７２】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのＰＣＲプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５，０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、ＰｒｉｍＯＵプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Ｐｒｉｍｅｒ３プライマー選択プログラム（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＭＩＴ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｙ）」を入力できる。Ｐｒｉｍｅｒ３は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。ＰｒｉｍｅｒＧｅｎプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト−リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。したがって、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばＰＣＲまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１７３】
「組換え核酸」は、天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１７４】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１７５】
「調節エレメント」は、或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはＲＮＡ安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１７６】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１７７】
或るＤＮＡ配列に対する「ＲＮＡ等価物」は、基準となるＤＮＡ配列と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１７８】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。ＤＭＥ、ＤＭＥをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１７９】
用語「特異結合」および「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基すなわちエピトープ）であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１８０】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上除去、最も好ましくは９０％以上除去されたものを指す。
【０１８１】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１８２】
用語「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜およびフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１８３】
「転写イメージ」または「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１８４】
「形質転換」とは、外来性ＤＮＡが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【０１８５】
ここで用いる「遺伝形質転換体」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知の形質転換技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指すものではなく、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたＤＮＡは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のＤＮＡをこのような生物体に移入する技術は公知であり、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ ら （１９８９） 等の参考文献に記載がある。
【０１８６】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｎを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異配列は、例えば、「対立遺伝子」変異配列（上述）または「スプライス」変異配列、「種」変異配列、「多型」変異配列と記述され得る。スプライス変異配列は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型性変異配列は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１８７】
特定のポリペプチド配列の「変異配列」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）を用いてｂｌａｓｔｐを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１８８】
（発明）
本発明は、新規のヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）群および、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づき、また、これらの組成物を利用した、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患の、診断、治療、及び予防の開発に基づく。
【０１８９】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号（ＩｎｃｙｔｅプロジェクトＩＤ）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）とＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドＩＤ）によって表示した。
【０１９０】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質（ｇｅｎｐｅｐｔ）データベースに対するＢＬＡＳＴ分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：）と、それに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＮＯ）を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、該当箇所には適当な引用を示すとともにＧｅｎＢａｎｋ相同体群の注釈（アノテーション）を示し、これらはすべて本明細書では参考文献に含まれている。
【０１９１】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）およびそれに対応するＩｎｃｙｔｅポリペプチド配列番号（ＩｎｃｙｔｅポリペプチドＩＤ）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージのＭＯＴＩＦＳプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１９２】
表２および表３は共に、本発明のポリペプチド群の特性を要約したものであって、これらの特性は、請求の範囲にあるポリヌクレオチド群が薬物代謝酵素であることを立証する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ラットのチトクロームＰ４５０（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２０３８９０）との８１％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．９ｅ−２２５であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、ウサギのチトクロームＰ４５０ ２Ａ１０ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６５４３３）との５９％の、また、ウサギのチトクロームＰ４５０ ２Ａ１１ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６５４３５）との６０％の同一性を有することがＢＬＡＳＴ解析によって示され、その確立スコアは、それぞれ１．６ｅ−１６３ および ２．０ｅ−１６３であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はまた、チトクロームＰ４５０ドメインを有する。これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、およびＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析から得られたデータによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１がチトクロームＰ４５０であることが裏付けられた。
【０１９３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ヒトのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ オメガ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ８１３２７６２）に対し６４％が同一であり、これはＢＬＡＳＴ解析で判定され、確率スコアは１．６ｅ−８３である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２はまた、１つのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ 解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、ヒトのヘパラン硫酸Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４３２２２４７）との７６％の同一性を有することがＢＬＡＳＴ解析によって示され、その確率スコアは無視し得るものであった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、また、別の２種のヒトのヘパラン硫酸Ｎ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０３６７９７ および ｇ９７６３７２）との７８％の同一性を有することがＢＬＡＳＴ解析によって示され、その確率スコアも無視し得るものであった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ヒトのＮアセチルガラクトサミン転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２１２１２２０）との５８％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは８．７ｅ−１７２であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、また、別の２種の、ヒトのＮアセチルガラクトサミン転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１９３４９１２ および ｇ５８３４６００）との、それぞれ５７％および４６％の同一性を有することがＢＬＡＳＴ解析によって示され、その確率スコアは、それぞれ７．２ｅ−１６８ および １．４ｅ−１１８であった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はまた、グリコシルトランスフェラーゼ活性部位ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＭＯＴＩＦＳ 解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ がＮアセチルガラクトサミン転移酵素である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ は、ラットの ニューロリギン ２ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１４５７８９） との９８％の全般的同一性、および、ヒトの ニューロリギン ３ アイソフォーム （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ７９６０１３５）との５５０アミノ酸残基にわたる１００％の同一性を共有し、これはＢＬＡＳＴ解析に基づく。そのどちらも、ＢＬＡＳＴ確率スコアは無視し得る。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド （すなわち ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８） と、ｇ１１４５７８９をコードするポリヌクレオチド （すなわち ｇ１１４５７８８） とは、７８％の全般的同一性と、それぞれのコード領域間の ９２％の同一性とを共有し、これは ＢＬＡＳＴ解析に基づく。ニューロリギン類はカルボキシルエステラーゼ様ドメインを持つが、これらは触媒的には不活性である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、１つのカルボキシルエステラーゼ様ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された （表３参照）。ＭＯＴＩＦＳ、ＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ、およびＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ がニューロリギンであるという、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１９６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、ヒトＵＤＰ−Ｇａ１ＮＡｃ：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ９７１４６１）との５１％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって確認された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは３．０ｅ−１４６であり、それは、観測されたポリペプチド配列を偶然に得る確率を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はまた、１つのグリコシル転移酵素ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された（表３参照）。
【０１９７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ネズミのカルボニル還元酵素（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１０４９１０８）（１種の短鎖アルコール脱水素酵素）との８７％の同一性を有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された。ＢＬＡＳＴ 確率スコアは １．５ｅ−１２８である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ はまた、５種の、ヒトのカルボニル還元酵素 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤは ｇ１７９９７８、ｇ１８１０３７、ｇ３７０２６７９、ｇ６６９３６１６， ａｎｄ ｇ７７６８７２２） に対し８５％が同一であり、これは ＢＬＡＳＴ 解析で判定され、全ての確率スコアは ５．２ｅ−１２６である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ は、また、１つの短鎖アルコール脱水素酵素ドメインを持ち、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ が短鎖アルコール脱水素酵素である、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１９８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ は、チャイニーズハムスターのβ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１６９８６０１）に対し４９％が同一であり、これはＢＬＡＳＴ 解析によって判定され、確率スコアは １．１ｅ−１６９である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ は、また、ヒトのβ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素 （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ４５４５２２２）に対し５１％が同一であり、これは、ＢＬＡＳＴ 解析によって判定され、確率スコアは２．０ｅ−１６８である。
【０１９９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ９９４６３４０）に対して６６％が同一であり、これはＢＬＡＳＴ 解析で判定し、確率スコアは ５．８ｅ−５６である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ は、また、ネズミ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３０９５０４） およびヒトの （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１１０３９０４） Ｎ−アセチルトランスフェラーゼに対して３５％が同一であり、これは ＢＬＡＳＴ 解析で判定し、ＢＬＡＳＴ 確率スコアは、それぞれ ２．０ｅ−２１ および ６．９ｅ−２１である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、また、１つのアセチルトランスフェラーゼドメインを持つが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された。ＢＬＩＭＰＳ解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９がアセチルトランスフェラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２００】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ハムスターのカルボキシルエステラーゼ前駆体（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２６４１９８６）との４９％の同一性を５２５アミノ酸残基にわたり有することがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは１．９ｅ−１３０であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ は、また、ラットのカルボキシルエステラーゼ前駆体（５２４アミノ酸残基にわたる； ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ２６４１９９２）に対して４８％、また、ヒトのカルボキシルエステラーゼ ｈＣＥ−２ （５２５アミノ酸残基にわたる； ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１４０７７８０）に対して４７％が同一であり、これはＢＬＡＳＴ解析に基づいて判定し、ＢＬＡＳＴ確率スコアは、それぞれ ３．１ｅ−１２８ および ２．６ｅ−１２４である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０はまた、１つのカルボキシルエステラーゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ がカルボキシルエステラーゼであるという、さらに確証的な証拠を提供する。
【０２０１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ は、１０８ アミノ酸残基にわたり、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）由来のＣｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１４４２８３）に対して６２％が同一であり、これは ＢＬＡＳＴ 解析で判定し、確率スコアは ４．１ｅ−３２である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、また、１つのＣｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼドメインを持つが、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された （表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ、ＭＯＴＩＦＳ、及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ がＣｕ／Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼである、さらに確証的な証拠を提供する。
【０２０２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、４種のヒトのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ３０６８０９、ｇ３０６８１０、ｇ２５９１４１ および ｇ２４２７４９）に対して、Ｍ１残基からＦ２２２残基までの８６％が同一であることがＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）によって示された（表２参照）。ＢＬＡＳＴ確率スコアは６．３ｅ−９８であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はまた、１つのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された（表３参照）。ＢＬＩＭＰＳ 解析よりのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。
【０２０３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ は、Ｒ２ 残基から Ｖ２７３残基まで、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） モルヒネ−６−デヒドロゲナーゼ （ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ｇ１７３６４０９） に対して５５％が同一であり、これはＢＬＡＳＴ 解析で判定した。ＢＬＡＳＴ 確率スコアは８．０ｅ−７５である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３はまた、１つのアルド／ケト還元酵素ドメインを持ち、これは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のＰＦＡＭデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。 ＢＬＩＭＰＳ及びＰＲＯＦＩＬＥＳＣＡＮ解析からのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３がアルド／ケト還元酵素である、さらに実証的な証拠を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１３の解析用のアルゴリズム及びパラメータは表７に記載した。
【０２０４】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築した。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）および対応するＩｎｃｙｔｅポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Ｉｎｃｙｔｅ ＩＤ）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いたｃＤＮＡ配列および／またはゲノム配列の、また、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を同定するため、或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（５’）位置および終了ヌクレオチド（３’）位置を示す。
【０２０５】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的ｃＤＮＡライブラリ群やプールしたｃＤＮＡライブラリ群に由来するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ群を指す場合もある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列の構築（アセンブリ）に寄与したＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡまたはＥＳＴを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ＥＮＳＥＭＢＬ（Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ＥＮＳＴ」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓ データベースに由来する場合もあり（すなわち「ＮＭ」または「ＮＴ」の命名を含む配列）、またＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｒｄｓに由来する場合もある（すなわち「ＮＰ」の命名を含む配列）。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたｃＤＮＡおよびＧｅｎｓｃａｎ予測エキソン群の両方からなる集合を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、ＦＬ＿ＸＸＸＸＸＸ＿Ｎ１＿Ｎ２＿ＹＹＹＹＹ＿Ｎ３＿Ｎ４ として同定される配列は「スティッチされた」配列であり、その内、ＸＸＸＸＸＸは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、ＹＹＹＹＹは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、Ｎ１，２，３．．．がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列２のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（ｅｘｏｎ−ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの集合を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、ＦＬＸＸＸＸＸＸ＿ｇＡＡＡＡＡ＿ｇＢＢＢＢＢ＿１＿Ｎとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでＸＸＸＸＸＸはＩｎｃｙｔｅプロジェクト識別番号、ｇＡＡＡＡＡは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、ｇＢＢＢＢＢは一番近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体のＧｅｎＢａｎｋ識別番号、またはＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ識別番号、Ｎ は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るＲｅｆＳｅｑ配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「ＮＭ」、「ＮＰ」、または「ＮＴ」によって表されるＲｅｆＳｅｑ識別子が、ＧｅｎＢａｎｋ識別子（すなわち、ｇＢＢＢＢＢ）の代わりに使用され得る。
【０２０６】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムＤＮＡ配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005500006.tif 000005
【０２０７】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列カバレッジと重複するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが得られたが、該当するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ識別番号は示さなかった。
【０２０８】
表５は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なｃＤＮＡライブラリを示している。代表的なｃＤＮＡライブラリとはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡライブラリであり、これは、最も頻繁にはＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群によって代表されるが、これらは、上記のポリヌクレオチド配列を構築および確認するために用いられた。ｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２０９】
本発明には、また、ＤＭＥの変異体をも含む。好適なＤＭＥ変異体は、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴を少なくとも１つ有し、かつ、ＤＭＥアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【０２１０】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド群を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ＤＭＥをコードする、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６のポリヌクレオチド配列は、配列表に示されているように等価ＲＮＡ配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくてリボースから構成されている。
【０２１１】
本発明はまた、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択された１核酸配列との少なくとも約７０％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約９５％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６からなる群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０２１２】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、ｍＲＮＡプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。上記したスプライス変異配列は何れも、ＤＭＥの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０２１３】
遺伝暗号の縮重により、ＤＭＥをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然ＤＭＥのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、このような全ての変異が明確に開示されていると考慮されたい。
【０２１４】
ＤＭＥとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然ＤＭＥのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、ＤＭＥ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、ＤＭＥ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることもある。
【０２１５】
本発明には、また、ＤＭＥとその誘導体群とをコードする、ＤＮＡ配列群またはその断片群を、完全に合成化学によって作り出す過程をも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で周知の試薬類を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入できる。更に、合成化学を用いて、ＤＭＥをコード、またはその任意の断片をコードする或る配列の中に突然変異を導入できる。
【０２１６】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１を参照）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０２１７】
ＤＮＡシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例も、ＤＮＡシークエンシング方法を用い得る。ＤＮＡシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用い得る。あるいは、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）およびＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３ あるいは ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で公知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ７．７ユニット、Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ８５６−８５３ページを参照）。
【０２１８】
当分野で周知の、ＰＣＲ法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、ＤＭＥをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２：３１８−３２２を参照）。別の方法に逆ＰＣＲ法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ． 他 （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。第３の方法としてキャプチャＰＣＲ法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配列群に隣接するＤＮＡ断片群をＰＣＲ増幅する方法を含む（例えばＬａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、ＰＣＲを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で公知である（例えばＰａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ．他 （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネステッドプライマー類、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリ類（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いてゲノムＤＮＡをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのＰＣＲベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上で、温度約６８℃〜７２℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０２１９】
完全長ｃＤＮＡ群をスクリーニングする際は、より大きなｃＤＮＡ群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリ群は、しばしば遺伝子群の５’領域を有する配列を含み、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５’非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０２２０】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するＣＣＤカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲ、ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲなど）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析および電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２２１】
本発明の別の実施態様では、適切な宿主細胞内で、ＤＭＥ、その断片または機能的等価物を発現させる組換えＤＮＡ分子群に、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群またはその断片群をクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列群を作ることができ、これらの配列をＤＭＥの発現に利用できる。
【０２２２】
種々の目的で、ＤＭＥをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物の、クローン化、プロセッシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先の変更、スプライス変異配列の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０２２３】
本発明のヌクレオチドは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＲＥＥＤＩＮＧ （Ｍａｘｙｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ； 米国特許第５，８３７，４５８号； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：７９３−７９７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ， Ｆ．Ｃ． 他 （１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：２５９−２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ， Ａ． 他 （１９９６） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：３１５−３１９）などのＤＮＡシャフリング技術の対象となり得るもので、例えば生物活性、酵素活性あるいは、他の分子や化合物と結合する能力など、ＤＭＥの生物学的特性を改変あるいは改良できる。ＤＮＡシャッフリングは、ＰＣＲを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異配列のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異配列をプールし、更に反復してＤＮＡシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種および急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、方向付けした制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２２４】
別の実施態様では、ＤＭＥをコードする配列群は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．他（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ７：２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＤＭＥ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ５５−６０ページ、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。自動合成はＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成し得る。更に、ＤＭＥのアミノ酸配列、または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組み合わせることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０２２５】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（例えばＣｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ．およびＦ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる（例えば前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ２８−５３ページを参照）。
【０２２６】
生物学的に活性なＤＭＥを発現させるために、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列群またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の、転写及び翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、該ベクターと、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群とにおける調節配列群（エンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、特長および特異性が様々である。特定の開始シグナル類を用いて、ＤＭＥをコードする配列群の、より効果的な翻訳を達成できる。開始シグナルの例には、ＡＴＧ開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。ＤＭＥをコードする配列群、その開始コドン、および上流の調節配列群が、好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームＡＴＧ開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント群および開始コドン群は、様々な天然物および合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばＳｃｈａｒｆ， Ｄ． 他（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０：１２５−１６２を参照）。
【０２２７】
当業者に周知の方法を用いて、ＤＭＥをコードする配列群と、好適な転写及び翻訳制御エレメント群とを持つ発現ベクター群を作製できる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章および８章， および１６−１７章； および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ９章、１３章および１６章を参照）。
【０２２８】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＤＭＥをコードする配列群の保持及び発現ができる。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｅ．Ｋ． 他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５、Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７−３１１、『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， １９１−１９６ページ、Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｔ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５−３６５９、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（例えばＤｉ Ｎｉｃｏｌａ， Ｍ． 他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ． ５（６）：３５０−３５６、Ｙｕ， Ｍ． 他（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１３）：６３４０−６３４４、Ｂｕｌｌｅｒ， Ｒ．Ｍ． 他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７（６０４０）：８１３−８１５； ＭｃＧｒｅｇｏｒ， Ｄ．Ｐ． 他（１９９４）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１（３）：２１９−２２６、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． ａｎｄ Ｎ． Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２２９】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群の使用目的に応じて選択できる。例えば、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの、多機能の大腸菌ベクターを用い得る。ベクターのマルチクローニング部位に、ＤＭＥをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．およびＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３５５０９を参照）。例えば抗体類の産生などに多量のＤＭＥが必要な場合は、ＤＭＥの発現をハイレベルで指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導ＳＰ６バクテリオファージプロモーターまたは誘導Ｔ７バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２３０】
ＤＭＥの産生には、酵母発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨプロモーターなど、構成型あるいは誘導型のプロモーターを持つ多数のベクターが、出芽酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列群を組み込むことを可能にする（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９５，前出、Ｂｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、およびＳｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：１８１−１８４を参照）。
【０２３１】
植物系もＤＭＥの発現に使用可能である。ＤＭＥをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ． （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターによって促進される。あるいは、ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Ｃｏｒｕｚｚｉ， Ｇ． 他．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ， Ｒ． 他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３； および Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． 他（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５を参照）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換により、または病原体を媒介とする形質移入により、植物細胞内に導入し得る（例えば『マグローヒル科学技術年鑑』（Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，１９１−１９６ページを参照）。
【０２３２】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、ＤＭＥをコードする配列群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの可欠Ｅ１またはＥ３領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でＤＭＥを発現する感染ウイルスを得ることができる（例えばＬｏｇａｎ， Ｊ．およびＴ． Ｓｈｅｎｋ（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３６５５３６５９を参照）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。ＳＶ４０またはＥＢＶをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２３３】
また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなＤＮＡの断片群を送達し得る。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。
【０２３４】
哺乳類系での、組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株における、ＤＭＥの安定した発現が望ましい。例えば、ＤＭＥをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、および／または内因性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２３５】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、ｔｋ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、ａｐｒ−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある（例えばＷｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２、Ｌｏｗｙ， Ｉ．他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓはクロルスルフロンに対する耐性を、ｐａｔはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える（例えばＷｉｇｌｅｒ， Ｍ．他 （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５６７−３５７０、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他 （１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための、細胞の必要条件を改変するｔｒｐＢおよびｈｉｓＤも、文献に記載がある（例えばＨａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：８０４７８０５１を参照）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る（例えばＲｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ． （１９９５） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１１３１を参照）。
【０２３６】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＤＭＥをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＤＭＥをコードする配列群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、単一プロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子を、ＤＭＥをコードする１配列とタンデムに配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２３７】
一般に、ＤＭＥをコードする核酸配列を持ち、ＤＭＥを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。 これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２３８】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる、ＤＭＥの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などがある。ＤＭＥ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合結合試験も用い得る。これらのアッセイおよびこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（例えばＨａｍｐｔｏｎ， Ｒ． 他（１９９０）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ． Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ、Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、Ｐｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪを参照）。
【０２３９】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化）、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＤＭＥをコードする配列群、またはその任意の断片群を、ｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングできる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０２４０】
ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド群を持つ発現ベクター類は、原核細胞膜または真核細胞膜を透過してのＤＭＥの分泌を指示するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２４１】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、および／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８など）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択し得る。
【０２４２】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥをコードする天然の核酸配列、修飾された核酸配列、または組換えの核酸配列を、上記した任意の宿主系内の融合タンパク質の翻訳を生じる或る異種配列にライゲーションし得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＤＭＥタンパク質が、ＤＭＥ活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）がある。ＧＳＴは固定化グルタチオン上で、ＭＢＰはマルトース上で、Ｔｒｘはフェニルアルシンオキシド上で、ＣＢＰはカルモジュリン上で、そして６−Ｈｉｓは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃおよび赤血球凝集素（ＨＡ）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、ＤＭＥをコードする配列と異種タンパク質配列との間に、タンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、ＤＭＥが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２４３】
本発明の更なる実施態様では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、放射能標識したＤＭＥの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを結合する。翻訳は、例えば３５Ｓメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２４４】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、ＤＭＥへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２４５】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、ＤＭＥの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（ｍｉｍｅｔｉｃ）、あるいは自然結合パートナーである（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ． 他 （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）の５章等を参照）。同様に、この化合物は、ＤＭＥが結合する天然受容体に、或いは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に、密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、これらの化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてＤＭＥを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。ＤＭＥを発現する細胞、またはＤＭＥを含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、結合や、ＤＭＥまたは該化合物の何れかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２４６】
或るアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識によりその結合を検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたＤＭＥと結合させるステップと、ＤＭＥとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然産物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２４７】
本発明のＤＭＥまたはその断片を用いて、ＤＭＥの活性を調節する化合物をスクリーニングできる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、ＤＭＥが少なくとも１つの試験化合物と混合される、ＤＭＥ活性が許容される諸条件下で或るアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性を試験化合物不在下でのＤＭＥの活性と比較する。試験化合物の存在下でのＤＭＥの活性の変化は、ＤＭＥの活性をモジュレートする化合物の存在を標示する。別法では、試験化合物を、ＤＭＥの活性に適した条件下で、ＤＭＥを有するｉｎ ｖｉｔｒｏ系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、ＤＭＥの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２４８】
別の実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、ＤＭＥまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第５，１７５，３８３号および第５，７６７，３３７号などを参照）。例えば１２９／ＳｖＪ細胞系などのマウスＥＳ細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このＥＳ細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ： Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Ｍａｒｔｈ， Ｊ．Ｄ． （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７：１９９９−２００２； Ｗａｇｎｅｒ， Ｋ．Ｕ． 他 （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：４３２３−４３３０）。形質転換したＥＳ細胞を同定し、例えばＣ５７ＢＬ／６マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的治療薬や毒性薬物で検査することができる。
【０２４９】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト胚盤胞由来のＥＳ細胞において操作することが可能である。ヒトＥＳ細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． 他 （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０２５０】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製できる。ノックイン技術を用いて、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ＥＳ細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばＤＭＥを乳汁内に分泌するなどＤＭＥを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Ｊａｎｎｅ， Ｊ． 他 （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． ４：５５−７４）。
【０２５１】
（治療）
ＤＭＥの複数の領域と薬物代謝酵素類との間には、例えば配列及びモチーフの文脈で、化学的及び構造的類似性が存在する。また、ＤＭＥを発現する組織の数例は、表６を見られたい。このように、ＤＭＥは、自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害および、肝臓の疾患を含む胃腸疾患において、或る役割を果たすと考えられる。ＤＭＥの発現若しくは活性の亢進に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２５２】
従って、一実施態様では、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にＤＭＥまたはその断片や誘導体が投与され得る。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれ、自己免疫／炎症の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳腺、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。神経障害には、てんかん、虚血性脳血管病、卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン舞踏病、痴呆、パーキンソン病など錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化症など運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮、網膜色素変性、遺伝性運動失調、多発硬化など脱髄疾患、細菌性髄膜炎、ウイルス髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓静脈炎、脊髄炎、神経根炎、ウイルス性中枢神経病、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病と代謝病、神経線維腫症、結節硬化、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳三叉神経血管腫症、精神遅滞など中枢神経発達障害（ダウン症を含む）、脳性麻痺、神経骨格障害、自律神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィなど神経筋障害、末梢神経障害、皮膚筋炎、多発性筋炎、遺伝性・代謝性・内分泌性・中毒性ミオパシー、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害たとえば気分障害、不安障害、統合失調���（分裂病）、季節性感情障害、静坐不能、健忘、緊張病、糖尿病ニューロパシー、遅発性ジスキネジア（錐体外路性終末欠陥症候群）、ジストニア、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥレット障害、進行性核上麻痺、皮質基底核変性、家族性前頭側頭型痴呆が含まれる。発生・発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症など）、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、内分泌障害の中には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー−ジーヴェ病（Ｌｅｔｔｅｒｅｒ−Ｓｉｗｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（ｅｍｐｔｙ ｓｅｌｌａ）症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体亢進に関連した障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（慢性低カリウム症、原文ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａは誤りか）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば過形成、副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれ、眼の疾患の中には、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、中毒性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、網膜色素変性（色素性網膜炎）、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、視交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、代謝障害の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、低アドレナリン症、副甲状腺亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損くる病、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成・腺腫・癌腫を含む肝腫瘍とが含まれる。
【０２５３】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２５４】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＤＭＥを有する組成物を、好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２５５】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＤＭＥの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２５６】
更なる実施態様では、ＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にＤＭＥのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれる。一実施態様では、ＤＭＥに特異結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＤＭＥを発現する細胞または組織に薬物を運ぶターゲッティング或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２５７】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、ＤＭＥの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与し得る。
【０２５８】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２５９】
ＤＭＥのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造できる。詳しくは、精製されたＤＭＥを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリ群をスクリーニングしてＤＭＥと特異結合する薬物を同定できる。ＤＭＥの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造できる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。
【０２６０】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＤＭＥまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に好ましい。
【０２６１】
ＤＭＥに対する抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には、約１０個以上のアミノ酸からなる配列となる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。ＤＭＥアミノ酸類の短いストレッチ群は、ＫＬＨなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２６２】
ＤＭＥに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある（例えばＫｏｈｌｅｒ， Ｇ． 他．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 他（１９８５）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 他（１９８３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０、Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 他（１９８４）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０２６３】
更に、「キメラ抗体」作製のために発達した、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．他．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４を参照）。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＤＭＥ特異的一本鎖抗体を生成し得る。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（例えばＢｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０１３４−１０１３７を参照）。
【０２６４】
抗体類の産生は、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導によって、あるいは免疫グロブリンライブラリ類のスクリーニングまたは文献に開示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネル類のスクリーニングによっても行い得る（例えばＯｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０２６５】
ＤＭＥに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２ 断片と、Ｆ（ａｂ’）２ 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるＦａｂ断片とがある。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（例えばＨｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 他 （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【０２６６】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合試験、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＤＭＥとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。２つの非干渉性ＤＭＥエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０２６７】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＤＭＥに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＤＭＥ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多数のＤＭＥエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体試薬に関して判定したＫａは、ＤＭＥに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定のＤＭＥエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＤＭＥ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＤＭＥが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 （Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． および Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０２６８】
ポリクローナル抗体試薬の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体試薬は一般に、ＤＭＥ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（例えば前出のＣａｔｔｙ、同Ｃｏｌｉｇａｎ 他を参照）。
【０２６９】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用される。ある実施態様では、ＤＭＥをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、ＤＭＥをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。（例えばＡｇｒａｗａｌ， Ｓ．，編集（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｔｏｔａｗａ ＮＪを参照）。
【０２７０】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばＳｌａｔｅｒ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９８）Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２（３）：４６９−４７５ および Ｓｃａｎｌｏｎ， Ｋ．Ｊ． 他（１９９５）９（１３）：１２８８−１２９６を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（例えばＭｉｌｌｅｒ， Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、前出のＡｕｓｕｂｅｌ、Ｕｃｋｅｒｔ， Ｗ．およびＷ． Ｗａｌｔｈｅｒ（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ６３（３）：３２３−３４７を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Ｒｏｓｓｉ， Ｊ．Ｊ．（１９９５）Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ５１（１）：２１７−２２５； Ｂｏａｄｏ、Ｒ．Ｊ．他（１９９８）Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８７（１１）：１３０８−１３１５、Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ． 他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１４）：２７３０−２７３６などを参照）。
【０２７１】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（ｉ）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ， Ｍ．他 （２０００） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６９−６７２）により特徴付けられる重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ１病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Ｂｌａｅｓｅ， Ｒ．Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０、Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ， Ｃ．他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５）、嚢胞性繊維症（Ｚａｂｎｅｒ， Ｊ．他 （１９９３） Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６： Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｒ．Ｇ．他 （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６４３−６６６、Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ．他． （１９９５） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：６６７−７０３）、サラセミア（ｔｈａｌａｓｓａｍｉａ）、家族性高コレステロール血症や、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子欠損に起因する血友病（Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｒ．Ｇ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２）、（ｉｉ）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（ｉｉｉ）細胞内の寄生生物、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３５：３９５−３９６、Ｐｏｅｓｃｈｌａ， Ｅ．他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９３：１１３９５−１１３９９）などヒトレトロウイルス、Ｂ型若しくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。ＤＭＥの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からＤＭＥを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２７２】
本発明の更なる実施例では、ＤＭＥの欠損による疾患や異常症を、ＤＭＥをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってＤＭＥ欠損細胞に導入することによって治療する。ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｅｘ ｖｉｔｒｏの細胞に用いる機械的導入技術には、（ｉ）個々の細胞内への直接的なＤＮＡ微量注射法、（ｉｉ）遺伝子銃、（ｉｉｉ）リポソームを介した形質移入、（ｉｖ）受容体を介した遺伝子導入、および（ｖ）ＤＮＡトランスポゾンの使用がある（Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ． および Ｗ．Ｆ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７、Ｉｖｉｃｓ， Ｚ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：５０１−５１０； Ｂｏｕｌａｙ， Ｊ−Ｌ． およびＨ． Ｒｅｃｉｐｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４４５−４５０）。
【０２７３】
ＤＭＥの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、ＰＣＤＮＡ ３．１、ＥＰＩＴＡＧ、ＰＲＣＣＭＶ２、ＰＲＥＰ、ＰＶＡＸ、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ、ＰＣＭＶ−ＴＡＧ、ＰＥＧＳＨ／ＰＥＲＶ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、ＰＴＥＴ−ＯＦＦ、ＰＴＥＴ−ＯＮ、ＰＴＲＥ２、ＰＴＲＥ２−ＬＵＣ、ＰＴＫ−ＨＹＧ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）が含まれる。ＤＭＥを発現させるために、（ｉ）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０ウイルス、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、若しくはβ−アクチンの遺伝子など）、（ｉｉ）誘導性プロモーター（例えば、市販されているＴ−ＲＥＸプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． および Ｈ． Ｂｕｊａｒｄ （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：５５４７−５５５１； Ｇｏｓｓｅｎ， Ｍ． 他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１７６６−１７６９； Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４５１−４５６））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドＰＶＧＲＸＲおよびＰＩＮＤに含まれている：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＫ５０６／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはＲＵ４８６／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Ｒｏｓｓｉ， Ｆ．Ｍ．Ｖ． および Ｈ．Ｍ． Ｂｌａｕ， 前出）、または（ｉｉｉ）正常な個体に由来する、ＤＭＥをコードする内因性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２７４】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｅｒＦｅｃｔ Ｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ． Ｆ．Ｌ． および Ａ．Ｊ． Ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７）若しくは電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｂ． 他（１９８２）ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にＤＮＡを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２７５】
本発明の別の実施例では、ＤＭＥの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（ｉ）レトロウイルス長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター若しくは独立したプロモーターの調節の下でＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）好適なＲＮＡパッケージングシグナルと、（ｉｉｉ）追加のレトロウイルス・シス作用性ＲＮＡ配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコード配列を伴うＲｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばＰＦＢおよびＰＦＢＮＥＯ）はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から市販されており、刊行データ（Ｒｉｖｉｅｒｅ， Ｉ． 他（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６７３３−６７３７）に基づく。上記データを引用することを以て本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（ＶＰＣＬ）において増殖される。ＶＰＣＬは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはＶＳＶｇなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ， Ｄ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６４７−１６５０、Ｂｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ａ． 他 （１９８７） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１６３９−１６４６、Ａｄａｍ， Ｍ．Ａ． および Ａ．Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８０２−３８０６、Ｄｕｌｌ， Ｔ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８４６３−８４７１、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ， Ｒ． 他 （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９８７３−９８８０）。Ｒｉｇｇに付与された米国特許第５，９１０，４３４号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：７０２０−７０２９、Ｂａｕｅｒ， Ｇ． 他（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２５９−２２６７、Ｂｏｎｙｈａｄｉ， Ｍ．Ｌ．（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：４７０７−４７１６、Ｒａｎｇａ， Ｕ． 他（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１２０１−１２０６、Ｓｕ， Ｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９：２２８３−２２９０）。
【０２７６】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Ｃｓｅｔｅ， Ｍ．Ｅ． 他 （１９９５） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２７：２６３−２６８）。潜在的に有用なアデノウイルスベクター類はＡｒｍｅｎｔａｎｏに付与された米国特許第５，７０７，６１８号（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）に記載されており、引用することを以て本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Ａｎｔｉｎｏｚｚｉ， Ｐ．Ａ． 他 （１９９９） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｕｔｒ． １９：５１１−５４４ 並びに、Ｖｅｒｍａ， Ｉ．Ｍ． および Ｎ． Ｓｏｍｉａ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ １８：３８９：２３９−２４２も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。
【０２７７】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、ＤＭＥの発現に関して１以上の遺伝子異常を持つ標的細胞に、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド類を送達する。単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）系のベクターの利用は、ＨＳＶが向性を持つ中枢神経細胞にＤＭＥを導入する際に特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Ｌｉｕ， Ｘ． 他 （１９９９） Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１６９：３８５−３９５）。ＨＳＶ−１ウイルスベクターの作製についても、ＤｅＬｕｃａに付与された米国特許第５，８０４，４１３号（「Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ」）に詳細に開示されており、該特許の引用を以て本明細書の一部とする。米国特許第５，８０４，４１３号は、ヒト遺伝子治療などの目的で、好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外来遺伝子を有するゲノムを持つ、組換えＨＳＶ ｄ９２の利用について記載する。上記特許はまた、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、およびＩＣＰ２２を欠失した組換えＨＳＶ系統の、作製および使用について開示している。ＨＳＶベクター類については、Ｇｏｉｎｓ， Ｗ．Ｆ． 他 （１９９９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５１９−５３２ および Ｘｕ， Ｈ． 他 （１９９４） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６３：１５２−１６１も参照されたい。両文献は、引用を以て本明細書の一部とする。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（ｌａｒｇｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２７８】
別法では、αウイルス（正の一本鎖ＲＮＡウイルス）ベクターを用いて、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類は、ＳＦＶゲノムに基づく（Ｇａｒｏｆｆ， Ｈ． および Ｋ．−Ｊ． Ｌｉ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：４６４−４６９）。αウイルスＲＮＡの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムＲＮＡが産生される。このサブゲノムＲＮＡは、完全長ゲノムＲＮＡよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、ＤＭＥをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のＤＭＥをコードするＲＮＡが産生され、高いレベルでＤＭＥが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Ｄｒｙｇａ， Ｓ．Ａ． 他 （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２８：７４−８３）。様々な宿主にαウイルスを導入できることから、様々なタイプの細胞にＤＭＥを導入することができる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンの処置方法、αウイルスのｃＤＮＡおよびＲＮＡの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２７９】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位とは、例えば開始部位から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（例えばＧｅｅ， Ｊ．Ｅ． 他（１９９４）ｉｎ Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ．およびＢ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ， １６３−１７７ページを参照）。また、相補配列またはアンチセンス分子を設計し、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳をブロックし得る。
【０２８０】
リボザイム類は、酵素性ＲＮＡ分子である。ＲＮＡの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用い得る。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人為操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、ＤＭＥをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２８１】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を先ず同定するため、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列などリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンする。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２８２】
本発明の相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、ＤＭＥをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ転写によってＲＮＡ分子を産出し得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的ＲＮＡを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ構成物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２８３】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’ Ｏ−メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はＰＮＡ群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）を加える。
【０２８４】
本発明の更なる実施態様には、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現を改変する上で有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、ＤＭＥ の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥ をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、ＤＭＥ の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＤＭＥ  をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２８５】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、商用または専用の、天然または非天然の化合物のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合とである。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、少なくとも１つの試験化合物に曝露して得る。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。 通常、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）遺伝子発現系（Ａｔｋｉｎｓ， Ｄ． 他 （１９９９） 米国特許第５，９３２，４３５号、Ａｒｎｄｔ， Ｇ．Ｍ． 他 （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：Ｅ１５）またはＨｅＬａ細胞等のヒト細胞株（Ｃｌａｒｋｅ， Ｍ．Ｌ． 他 （２０００） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２６８：８−１３）を用いる。本発明の或る特定の実施例は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関する（Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６８６，２４２号、Ｂｒｕｉｃｅ， Ｔ．Ｗ． 他 （２０００） 米国特許第６，０２２，６９１号）。
【０２８６】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの使用に対して同程度に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：４６２−４６６などを参照）。
【０２８７】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２８８】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に記載されている。このような組成物は、ＤＭＥ、ＤＭＥの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどからなる。
【０２８９】
本発明に用いる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２９０】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Ｐａｔｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． 他， 米国特許第５，９９７，８４８号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２９１】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２９２】
ＤＭＥを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、ＤＭＥまたはその断片をＨＩＶ Ｔａｔ−１タンパク質の陽イオンＮ末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ． 他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２）。
【０２９３】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、あるいは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタなどにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２９４】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性成分の量、たとえばＤＭＥまたはその断片、ＤＭＥの抗体、ＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効度および毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬学手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の治療有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）統計を計算するなどして判定できる。毒性効果の、治療効果に対する投与量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲での調剤に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ＥＤ５０を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２９５】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重および性別、投与の時間および頻度、薬物の配合、反応感受性および治療に対する応答などを考慮し得る。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、あるいは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２９６】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約０．１〜１００，０００μｇであり、合計で約１ｇまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビター類についての処方とは異なる、ヌクレオチドについての処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２９７】
（診断）
別の実施態様では、ＤＭＥに特異結合する抗体類が、ＤＭＥの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＤＭＥやＤＭＥのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイ類に用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。ＤＭＥの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織内のＤＭＥを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２９８】
ＤＭＥを測定するための、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのＤＭＥ発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なＤＭＥの発現の値は、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とＤＭＥに対する抗体とを複合体の形成に適した条件の下で結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照および生検組織からの疾患サンプルで発現するＤＭＥの量を標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２９９】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド群を、診断のために用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、そしてＰＮＡが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、ＤＭＥの発現が疾患と相関し得る生検組織群における、遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、ＤＭＥの有無や過剰発現を調べ、治療時のＤＭＥ値の調節を監視し得る。
【０３００】
一実施形態では、例えばＤＭＥをコードまたは近縁の分子群をコードするゲノム配列群など、ポリヌクレオチド配列群を検出できるＰＣＲプローブ類とのハイブリダイゼーションを用いて、ＤＭＥをコードする核酸配列群を同定できる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５’調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているという、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがＤＭＥをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０３０１】
プローブ類はまた、関連する配列群の検出に利用され得る他、ＤＭＥをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を持ち得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６の配列、或いはＤＭＥ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０３０２】
ＤＭＥをコードするＤＮＡ群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製方法としては、ＤＭＥまたはＤＭＥ誘導体群をコードするポリヌクレオチド配列群を、ｍＲＮＡプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製用ベクター類は、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼと好適な標識されたヌクレオチドとを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用い得る。ハイブリダイゼーションプローブ類は、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性核種が、あるいはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど酵素標識が挙げられる。
【０３０３】
ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群を用いて、ＤＭＥの発現に関連する疾患を診断できる。限定するものではないが、このような疾患には自己免疫／炎症の疾患、細胞増殖異常、神経障害、発生または発達障害、内分泌障害、眼の疾患、代謝障害、および肝臓の疾患を含む胃腸疾患が含まれ、自己免疫／炎症の疾患の中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、細胞増殖異常には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳腺、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。神経障害には、てんかん、虚血性脳血管病、卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン舞踏病、痴呆、パーキンソン病など錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化症など運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮、網膜色素変性、遺伝性運動失調、多発硬化など脱髄疾患、細菌性髄膜炎、ウイルス髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓静脈炎、脊髄炎、神経根炎、ウイルス性中枢神経病、プリオン病（クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病と代謝病、神経線維腫症、結節硬化、小脳網膜血管腫症（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳三叉神経血管腫症、精神遅滞など中枢神経発達障害（ダウン症を含む）、脳性麻痺、神経骨格障害、自律神経障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィなど神経筋障害、末梢神経障害、皮膚筋炎、多発性筋炎、遺伝性・代謝性・内分泌性・中毒性ミオパシー、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害たとえば気分障害、不安障害、統合失調症（分裂病）、季節性感情障害、静坐不能、健忘、緊張病、���尿病ニューロパシー、遅発性ジスキネジア（錐体外路性終末欠陥症候群）、ジストニア、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥレット障害、進行性核上麻痺、皮質基底核変性、家族性前頭側頭型痴呆が含まれる。発生・発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性神経病（シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症など）、甲状腺機能低下症、水頭症、Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、内分泌障害の中には、例えば原発脳腫瘍、腺腫、妊娠性梗塞、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、感染症、免疫異常、頭部外傷合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、例えば性機能低下及びシーハン症候群、尿崩症、カルマン病、ハンド‐シュラー‐クリスチャン病、レテラー−ジーヴェ病（Ｌｅｔｔｅｒｅｒ−Ｓｉｗｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコイドーシス、トルコ鞍空虚（ｅｍｐｔｙ ｓｅｌｌａ）症候群、小人症を含む下垂体低下に関連した障害と、例えば先端巨大症、巨人症や、良性腺腫によって発生しやすい抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）不適合分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体亢進に関連した障害と、例えば甲状腺腫、粘液水腫、細菌感染性急性甲状腺炎、ウイルス感染性亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、クレチン病を含む甲状腺機能低下症に関連した障害と、例えば甲状腺中毒症及びその様々な型、グレーブス病、前脛骨粘液水腫、中毒性多結節性甲状腺腫、甲状腺癌、プラマー病を含む甲状腺機能亢進症と、Ｃｏｎｎ病（慢性低カリウム症、原文ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａは誤りか）を含む副甲状腺機能亢進症と、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病及び合併症などの膵臓疾患と、例えば過形成、副腎皮質の癌腫や腺腫、アルカローシス関連高血圧、アミロイド症、低カリウム血、クッシング病、リドル症候群、Ａｒｎｏｌｄ−Ｈｅａｌｙ−Ｇｏｒｄｏｎ症候群、褐色細胞腫瘍、アジソン病などの副腎関連障害と、例えば女性の異常プロラクチン産生、不妊症、子宮内膜症、月経周期摂動、多嚢胞卵巣疾患、高プロラクチン血症、ゴナドトロピン単独欠損（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、無月経、乳汁漏出症、半陰陽、多毛症及び男性化、乳癌、閉経後の骨粗鬆症、男性のライジッヒ細胞不全、男性更年期、胚芽細胞無形成症、ライジッヒ細胞腫瘍に関連した性機能亢進、アンドロゲン受容体の欠如に関連したアンドロゲン耐性、５α−還元酵素症候群、女性化乳房などの性腺ステロイドホルモン関連疾患とが含まれ、眼の疾患の中には、結膜炎、乾性角結膜炎、角膜炎、上強膜炎、虹彩炎、後部ブドウ膜炎、緑内障、一過性黒内障、虚血性視神経症、視神経炎、レーバー遺伝性視神経症、中毒性視神経症、硝子体剥離、網膜剥離、白内障、黄斑変性症、中心性漿液性脈絡網膜症、網膜色素変性（色素性網膜炎）、脈絡膜黒色腫、球後腫瘍、視交叉腫瘍（ｃｈｉａｓｍａｌ ｔｕｍｏｒ）が含まれ、代謝障害の中には、アジソン病、脳腱黄色腫症、先天性副腎過形成、クマリン耐性、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、果糖−１，６−ジホスファターゼ欠損症、ガラクトース血症、甲状腺腫、グルカゴノーマ、糖原病、遺伝性果糖不耐症、アドレナリン過剰症、低アドレナリン症、副甲状腺亢進症、副甲状腺低下症、高コレステロール血症、甲状腺亢進症、低血糖症、甲状腺低下症、高脂質血症、高脂血症、脂質ミオパシー（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、脂肪異栄養症、リソソーム蓄積症、メンケス症候群、後角症候群（ｏｃｃｉｐｉｔａｌ ｈｏｒｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、マンノシドーシス、ノイラミニダーゼ欠損症、肥満症、ペントース−フェニルケトン尿症、プソイドビタミンＤ欠損くる病、低カルシウム血症、低リン酸血症、思春期後小脳性運動失調症、チロシン血症が含まれ、胃腸疾患の中には、嚥下障害、消化性食道炎、食道痙攣、食道狭窄、食道癌、消化不良、消化障害、胃炎、胃癌、食欲不振、悪心、嘔吐、胃不全麻痺、洞または幽門の浮腫、腹部アンギナ、胸焼け、胃腸炎、イレウス、腸管感染、消化性潰瘍、胆石症、胆嚢炎、胆汁うっ滞、膵臓炎、膵臓癌、胆道疾患、肝炎、高ビリルビン血症、遺伝性高ビリルビン血症、硬変症、肝臓の受動的うっ血、ヘパトーム、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、クローン病、ホイップル病、マロリー‐ヴァイス症候群、結腸癌、結腸閉塞、過敏性腸症候群、短小腸症候群、下痢、便秘、胃腸出血、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）腸症、黄疸、肝性脳症、肝腎症候群、脂肪肝、血色素症、ウィルソン病、α−１−アンチトリプシン欠損症、ライ症候群、原発性硬化性胆管炎、肝梗塞、門脈循環閉塞及び血栓、小葉中心壊死、肝臓紫斑病、肝静脈血栓、肝静脈閉塞症、子癇前症、子癇、妊娠性急性脂肪肝、妊娠性肝臓内胆汁うっ滞と、結節性過形成・腺腫・癌腫を含む肝腫瘍とが含まれる。ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したＤＭＥ発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法や、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、およびマルチフォーマットのＥＬＩＳＡ式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３０４】
或る特定の態様では、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列群は、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類において有用であり得る。ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列群を、標準的な種々の方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化している場合は、該サンプル内の、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列群のレベル変化の存在が、関連する障害の存在を標示する。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３０５】
ＤＭＥの発現に関連する障害の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＤＭＥをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３０６】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３０７】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３０８】
ＤＭＥをコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＤＭＥをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０３０９】
或る特定の態様において、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）および蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。ＳＳＣＰでは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを増幅する。このＤＮＡは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形のＰＣＲ生成物の２次および３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＳＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）の検出が可能になる。更に、インシリコＳＮＰ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＳＮＰ， ｉｓＳＮＰ）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするＤＮＡ断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、または統計モデルとＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理ＭＡＳＳＡＲＲＡＹシステム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いた質量分析によりＳＮＰを検出し、特徴付ける。
【０３１０】
ＤＭＥの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び、標準曲線から得た結果の補間もある（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．他（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−２４４； Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．他（１９９３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１２：２２９−２３６を参照）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドを種々の希釈液中に置き、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットでのアッセイを行い得る。
【０３１１】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０３１２】
別の実施態様では、ＤＭＥ、ＤＭＥの断片群または、ＤＭＥに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０３１３】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ 他の米国特許第５，８４０，４８４号 「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ」を参照。該特許は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。したがって、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを作製し得る。或る実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０３１４】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはｉｎ ｖｉｖｏ、細胞株の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を反映する。
【０３１５】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル系および薬物の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Ｎｕｗａｙｓｉｒ， Ｅ．Ｆ． 他（１９９９）Ｍｏｌ． Ｃａｒｃｉｎｏｇ． ２４：１５３−１５９、Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｓ． および Ｎ．Ｌ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｌｅｔｔ． １１２−１１３：４６７−４７１、該文献は特に引用を以って本明細書の一部となす）。試験化合物が、既知毒性を有する化合物のシグネチャと同一のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データを標準化することに使用できるため、それらの遺伝子は重要である。正規化手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境健康科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より発行されたＰｒｅｓｓ Ｒｅｌｅａｓｅ ００−０２を参照されたい。これについてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｃ／ｎｅｗｓ／ｔｏｘｃｈｉｐ．ｈｔｍで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３１６】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写レベルの差は、処理済サンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を標示する。
【０３１７】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のＳｔｅｉｎｅｒ および Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３１８】
プロテオームのプロファイルは、ＤＭＥに特異的な抗体類を用いてＤＭＥ発現レベルを定量することによっても作成できる。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Ｌｕｅｋｉｎｇ， Ａ． 他 （１９９９） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１０３−１１１、Ｍｅｎｄｏｚｅ， Ｌ．Ｇ． 他 （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：７７８−７８８）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３１９】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｌ． および Ｊ． Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：５３３−５３７）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロフィールを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はｍＲＮＡの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０３２０】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生体サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３２１】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生体サンプル中のタンパク質の量を、未処理生体サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３２２】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製し、使用し、分析する（例えばＢｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他（１９９５）米国特許第５，４７４，７９６号、Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１０６１４−１０６１９、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２５１１１６号、Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他（１９９５）ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／３５５０５号、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：２１５０−２１５５、Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他（１９９７）米国特許第５，６０５，６６２号を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ． Ｓｃｈｅｎａ， 編集 （１９９９） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎに記載がある。該文献は、特に引用を以って本明細書の一部となす。
【０３２３】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥをコードする核酸配列群を用いて、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ群を作製できる。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、いくつかの例では、コード配列より非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１産物、あるいは単一染色体ｃＤＮＡライブラリ群に対してマッピングされる（例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ． 他（１９９７）Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４； Ｔｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）。一度マッピングすると、本発明の核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る（例えば、Ｌａｎｄｅｒ， Ｅ．Ｓ．およびＤ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７３５３−７３５７を参照）。
【０３２４】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、他の物理的および遺伝的地図データと相関し得る（例えば前出のＨｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他（１９９５）ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， ９６５−９６８ページを参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見られる。物理的染色体地図上の、ＤＭＥをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するＤＮＡの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３２５】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖分析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばＧａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３２６】
本発明の別の実施態様では、ＤＭＥ、その触媒作用断片群、或いは免疫原断片群、またはそのオリゴペプチド群を、種々の任意の薬物スクリーニング技術における、化合物群のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。ＤＭＥと、試験する薬物との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３２７】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる（例えばＧｅｙｓｅｎ他（１９８４）ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、ＤＭＥ、或いはその断片と反応してから洗浄する。次に、結合したＤＭＥが、当分野で周知の種々の方法で検出される。精製されたＤＭＥはまた、前記した薬物スクリーニング技術に用いるプレート上に直接、被覆し得る。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３２８】
別の実施例では、ＤＭＥと特異結合可能な中和抗体がＤＭＥとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＤＭＥと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３２９】
別の実施態様では、ＤＭＥをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用など）に依存する新技術に用い得る。
【０３３０】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３３１】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願および刊行物、特に米国特許出願第６０／２５４，３０８号、第６０／２５６，１８９号、第６０／２５７，７１３号、第６０／２６２，７０６号および第６０／２６６，０２０号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【０３３２】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ群の由来は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に記載されたｃＤＮＡライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０３３３】
ＲＮＡの純度を高めるため、フェノールによるＲＮＡの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮアーゼでＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを単離した。別法では、別のＲＮＡ単離キット、例えばＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を用いて、組織溶解物からＲＮＡを直接単離した。
【０３３４】
場合によってはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供し、対応するｃＤＮＡライブラリ群をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリを作製した（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ５．１−６．６ユニットなどを参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリに対して、ｃＤＮＡのサイズ選択（３００〜１０００ｂｐ）は、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ１０００、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２ＢまたはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、あるいは調製用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。ｃＤＮＡは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＰＣＤＮＡ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）、ＰＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ２−ＴＯＰＯＴＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＣＭＶ−ＩＣＩＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＧＥＮ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、ｐＲＡＲＥ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、またはｐｌＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦまたはＳＯＬＲ、あるいはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５α、ＤＨ１０ＢまたはＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３３５】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｉｎ ｖｉｖｏ切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ ＰｌａｓｍｉｄおよびＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｌ． Ｐｒｅｐ ９６プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３３６】
別法では、高処理フォーマットで直接結合ＰＣＲ法を用い、宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ．（１９９４）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを加工し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）およびＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮＩＩ蛍光スキャナ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３３７】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡを、以下に示すようにシークエンシングした。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）液体転移システムと併用して処理した。ｃＤＮＡのシークエンス反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する試薬、またはＡＢＩシークエンシングキット、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）か、標準ＡＢＩプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９７， ７．７ユニットに概説）を用いて同定した。いくつかのｃＤＮＡ配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３３８】
Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡに由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ（Ａ）配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、ＢＬＡＳＴと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド頻度分析とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群（例えばＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ）と、ヒト、ラット、マウス、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）および鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からの配列群を持つＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）、および、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群（ＰＦＡＭ等）である（ＨＭＭは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照のこと）。Ｅｄｄｙ， Ｓ．Ｒ． （１９９６） Ｃｕｆｆ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５等を参照）の選択に対するＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列またはその翻訳を問い合わせた。問合せは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳ、およびＨＭＭＥＲに基づくプログラムを用いて行った。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列を構築し、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ ｃＤＮＡ群、ＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡの集団を完全長まで伸長させた。ＰｈｒｅｄとＰｈｒａｐとＣｏｎｓｅｄとに基づくプログラムを用いて構築し、ＧｅｎＭａｒｋとＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとに基づくプログラムを用いて、ｃＤＮＡの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベース群（ｇｅｎｐｅｐｔ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＲＯＴＥＯＭＥデータベース群、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭおよびＰｒｏｓｉｔｅ等のデータベースや、ＰＦＡＭ等の隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡ��ＴＡＲ）を用いて分析した。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、ＭＥＧＡＬＩＧＮマルチシークエンスアラインメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）に組み込まれたＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３３９】
表７は、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡと完全長配列との分析と構築とに利用したツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラムおよびアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は、２つの配列が一致する強さを評価するために用いた、スコア、確率値などのパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の同一性が高い）。
【０３４０】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の構築および分析に用いる上記のプログラム群は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列２に示した。
【０３４１】
４  ゲノムＤＮＡからのコード配列の同定および編集
推定上の薬物代謝酵素類は、先ず、公共ゲノム配列データベース（例えば、ｇｂｐｒｉやｇｂｈｔｇ）に対してＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムを実行して同定された。Ｇｅｎｓｃａｎは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムＤＮＡ配列を分析する（Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９７）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６８：７８−９４、Ｂｕｒｇｅ， Ｃ． および Ｓ． Ｋａｒｌｉｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８：３４６−３５４参照）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、構築されたｃＤＮＡ配列を形成する。Ｇｅｎｓｃａｎの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のＦＡＳＴＡデータベースである。Ｇｅｎｓｃａｎが一度に分析する配列の最大範囲は、３０ｋｂに設定した。これらのＧｅｎｓｃａｎ予測ｃＤＮＡ配列の内、どの配列が薬物代謝酵素をコードするかを判定するために、コードされるポリペプチド群を、ＰＦＡＭモデル群に対して薬物代謝酵素について問合せて分析した。潜在的な薬物代謝酵素は、既に薬物代謝酵素としてアノテーションが付けられたＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群に対する相同性によっても同定された。これら選択したＧｅｎｓｃａｎ予測配列を、次にＢＬＡＳＴ分析により、公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。必要であれば、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットと比較することによりＧｅｎｓｃａｎ予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Ｇｅｎｓｃａｎが予測した配列におけるエラーを補正した。ＢＬＡＳＴ分析はまた、Ｇｅｎｓｃａｎ予測配列の、いかなるＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡまたは公共ｃＤＮＡカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてＧｅｎｓｃａｎ予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載した構築プロセスを用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列および／または公共ｃＤＮＡ配列でＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列を構築して得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のＧｅｎｓｃａｎ予測コード配列に、完全に由来する。
【０３４２】
５  ゲノム配列データのｃＤＮＡ配列データとの統合
スティッチ配列（Ｓｔｉｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ｃＤＮＡ配列群を伸長させるため、実施例４に記載のＧｅｎｓｃａｎ遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したように構築した部分ｃＤＮＡ群を、ゲノムＤＮＡにマッピングし、また、関連するｃＤＮＡ群と、１つ以上のゲノム配列からＧｅｎｓｃａｎ予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。ｃＤＮＡとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスターを分析し、潜在的スプライス変異配列群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、ｃＤＮＡ配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と変異配列群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、ＢＬＡＳＴ分析で公共データベースｇｅｎｐｅｐｔおよびｇｂｐｒｉと比較した。Ｇｅｎｓｃａｎが予測した不正確なエキソン群は、ｇｅｎｐｅｐｔからのトップＢＬＡＳＴヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加ｃＤＮＡ配列群を用いるかゲノムＤＮＡの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３４３】
ストレッチ配列（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
部分ＤＮＡ配列群を、ＢＬＡＳＴ分析に基づく１アルゴリズムにより完全長まで伸長した。先ず、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分ｃＤＮＡを問い合わせた。次に、最も近いＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体を、ＢＬＡＳＴ分析により、Ｉｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列または実施例４に記載のＧｅｎＳｃａｎエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体上にマッピングした。元のＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。ＧｅｎＢａｎｋタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なＤＮＡ配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０３４４】
６  ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６を構築するために用いた配列群を、ＢＬＡＳＴ他のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの実装群を用いて、Ｉｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱデータベース及び公共ドメインデータベース群の配列と比較した。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６と一致するこれらのデータベースの配列を、Ｐｈｒａｐなどの構築アルゴリズムを使用して、連続的配列及びオーバーラップした配列のクラスター群に構築した（表７）。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３４５】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に対して測定する（センチモルガン（ｃＭ）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１ｃＭは、ヒトＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。ｃＭ距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するＧｅｎｅｔｈｏｎによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。ＮＣＢＩ「ＧｅｎｅＭａｐ’９９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅｍａｐ／）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。この方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は、１３１．９０〜１３４．７０センチモルガンの間隔内で染色体１０にマッピングされた。
【０３４６】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのＲＮＡが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する（例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋ， ７章、同Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ４章および１６章を参照）。
【０３４７】
ＢＬＡＳＴを応用した類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのｃＤＮＡデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、いくつかの膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３４８】
【数１】
2005500006.tif 000006
【０３４９】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、０〜１００の正規化された値であり、次のようにして求める。ＢＬＡＳＴスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの５倍で除する。ＢＬＡＳＴスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のＨＳＰを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のＨＳＰがある場合には、最高ＢＬＡＳＴスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとＢＬＡＳＴアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３５０】
或いは、ＤＭＥをコードするポリヌクレオチド配列群を、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするＩｎｃｙｔｅ ｃＤＮＡ配列群を用いて構築される（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡの疾患特異的な発現を反映する。ｃＤＮＡ配列群およびｃＤＮＡライブラリ／組織の情報は、ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）から得ることができる。
【０３５１】
８  ＤＭＥをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させて産生した。或るプライマーは既知の断片の５’伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３’伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上となり、約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３５２】
選択したヒトｃＤＮＡライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３５３】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２００ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）を用いて９６穴プレート内で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡを有し、また、２００ ｎｍｏｌの各プライマーを有する。また、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４と２−メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを含有する。プライマー対であるＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂとに対し、以下のパラメータで増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
別法では、プライマー対であるＴ７とＳＫ＋に対し、以下のパラメータで増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１× ＴＥおよび０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％（ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配し、ＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量すべく、プレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μｌを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３５４】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。伸長させたクローンをＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いてｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、適格な大腸菌細胞に形質移入した。形質転換した細胞群の選択を抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液内の３８４穴プレート群に３７℃で一晩培養した。
【０３５５】
細胞を溶解し、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒間
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保存
【０３５６】
ＤＮＡは、上記のＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）によって定量した。ＤＮＡの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは２０％ジメチルスルホキシド（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、およびＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０３５７】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５’調節配列を得た。
【０３５８】
９  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４−２６由来のハイブリダイゼーションプローブ群を利用して、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０ｐｍｏｌと、［γ−３２Ｐ］アデノシン３リン酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）２５０μＣｉと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ， Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、ＸｂａＩまたはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムＤＮＡの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３５９】
各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば０．１×クエン酸ナトリウム食塩水および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３６０】
１０  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のＢａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、非多孔性の表面を持つ固体とすべきである（Ｓｃｈｅｎａ（１９９９）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウエハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（例えばＳｃｈｅｎａ， Ｍ． 他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０、Ｓｈａｌｏｎ． Ｄ． 他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５、Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ａ． および Ｊ． Ｈｏｄｇｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：２７−３１を参照）。
【０３６１】
完全長ｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはそれらの断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザ脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調整および使用について、以下に詳述する。
【０３６２】
組織または細胞サンプルの調製
全ＲＮＡを組織サンプル群から単離するためグアニジニウム チオシアネート法を用い、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製するためオリゴ（ｄＴ）セルロース法を用いる。各ポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを、ＭＭＬＶ逆転写酵素、０．０５ｐｇ／μｌのオリゴ（ｄＴ）プライマー（２１ｍｅｒ）、１×第一鎖バッファー、０．０３ｕｎｉｔ／μｌのＲＮアーゼ阻害因子、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、５００μＭのｄＴＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ−Ｃｙ３（ＢＤＳ）またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて逆転写する。逆転写反応は、ＧＥＭＢＲＩＧＨＴキット（Ｉｎｃｙｔｅ）を用い、２００ｎｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ群は、非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により合成する。３７℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはＣｙ３、もう１つはＣｙ５標識）は、２．５ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてＲＮＡを分解させる。サンプル群の精製には、２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ ３０ゲル濾過スピンカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （ＣＬＯＮＴＥＣＨ）， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を用いる。混合後、２つの反応サンプルのエタノール沈殿を、１ｍｌのグリコーゲン（１ｍｇ／ｍｌ）、６０ｍｌの酢酸ナトリウム、および３００ｍｌの１００％エタノールで行う。サンプルは次に、ＳｐｅｅｄＶＡＣ（Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＹ）を用いて完全に乾燥させ、１４μｌの５×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で再懸濁する。
【０３６３】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したｃＤＮＡインサート群により、ベクター含有細菌細胞群から増幅する。ＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ｎｇの初期量から５μｇを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。
【０３６４】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、０．１％のＳＤＳおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理中および処理後に多量の蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＶＷＲ）， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、多量の蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３６５】
米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている手順を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ｎｇ／μｌのアレイエレメントＤＮＡ１μｌを、高速ロボット装置（ｒｏｂｏｔｉｃ ａｐｐａｒａｔｕｓ）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（ｏｐｅｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５ｎｌのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３６６】
マイクロアレイをＵＶ架橋するため、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いる。マイクロアレイの洗浄を、室温において、０．２％ＳＤＳで１回、蒸留水で３回行う。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間行った後、前に行ったように０．２％ＳＤＳおよび蒸留水で洗浄する。
【０３６７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応には、５×ＳＳＣ，０．２％ＳＤＳハイブリダイゼーション緩衝液中に、Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したｃＤＮＡ合成産物群を各０．２μｇ含む９μｌのサンプル混合体が含まれる。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１．８ｃｍ２のカバーガラスで覆う。アレイを、顕微鏡用スライドよりわずかに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度１００に保つため、１４０μｌの５×ＳＳＣをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０．１×ＳＳＣ）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３６８】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ３の励起のために４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のために６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩｎｎｏｖａ７０混合ガス１０Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１．８ｃｍ×１．８ｃｍのアレイは、解像度２０μｍでスキャンする。
【０３６９】
異なる２回のスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。好適なフィルター群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３７０】
通常、各スキャンの感度を較正するため、ｃＤＮＡ対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補的ＤＮＡ配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比１：１００，０００で相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するｃＤＮＡのサンプルを２種の蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３７１】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア２０色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起および測定する場合には、各蛍光体の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３７２】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳ遺伝子発現分析プログラム（Ｉｎｃｙｔｅ）である。
【０３７３】
１１  相補的ポリヌクレオチド
ＤＭＥをコードする配列群に或いはその任意の一部に対して相補的な配列群は、天然ＤＭＥの発現を検出、低減、または阻害するために用いられる。約１５〜３０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び、ＤＭＥのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５’配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＤＭＥをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３７４】
１２  ＤＭＥの発現
ＤＭＥの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でＤＭＥを発現させるためには、抗生物質耐性遺伝子と、ｃＤＮＡ転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、ｌａｃオペレーター調節エレメントと併用するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター、およびｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＤＭＥを発現する。真核細胞でのＤＭＥの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の、組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＤＭＥをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力な多角体プロモーターによって高レベルのｃＤＮＡ転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７、Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他（１９９６）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５を参照）。
【０３７５】
殆どの発現系では、ＤＭＥが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、または、ＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの、組換え融合タンパク質の、親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行い得る。ＧＳＴは日本住血吸虫からの２６ｋＤａの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を、特異的に操作した部位でＤＭＥからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した６−Ｈｉｓは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（ＱＩＡＧＥＮ）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）１０章、１６章に記載されている。これらの方法で精製したＤＭＥを直接用いて、以下の実施例１６、１７、及び１８の、適用可能なアッセイを行い得る。
【０３７６】
１３  機能的アッセイ
ＤＭＥの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、ＤＭＥをコードする配列群の発現によって算定する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現させる強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターとしては、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｐＣＲ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、５〜１０μｇの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのｃＤＮＡ発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。ＦＣＭは、細胞死に先行するかあるいは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、プロピジウムヨウ化物によるＤＮＡ染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化、前方散乱光と９０°側方散乱光によって計測される細胞サイズと顆粒性の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面および細胞内におけるタンパク質の発現の変容、および蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ．Ｇ．（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹに記述がある。
【０３７７】
遺伝子発現におけるＤＭＥの影響は、ＤＭＥをコードする配列群と、ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて算定できる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率よく分離できる（ＤＹＮＡＬ， Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ ＮＹ）。ｍＲＮＡは、これら細胞から当業者に周知の方法で精製できる。ＤＭＥと目的の他の遺伝子群とをコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３７８】
１４  ＤＭＥに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＤＭＥを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０３７９】
別法では、ＤＭＥアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の或いは親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択方法については、当分野に記述が多い（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０３８０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、ＦＭＯＣケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗ＤＭＥ活性を試験するには、ペプチドまたはＤＭＥを基板に結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０３８１】
１５  特異抗体を用いる天然ＤＭＥの精製
天然ＤＭＥ或いは組換えＤＭＥを、ＤＭＥに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化したＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＤＭＥ抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３８２】
ＤＭＥを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＤＭＥを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下で高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＤＭＥとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロープで）溶出させ、ＤＭＥを回収する。
【０３８３】
１６  ＤＭＥと相互作用する分子の同定
ＤＭＥまたはその生物活性断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬で標識する（例えば Ｂｏｌｔｏｎ， Ａ．Ｅ．およびＷ．Ｍ． Ｈｕｎｔｅｒ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９を参照）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＤＭＥと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＤＭＥ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＤＭＥ濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したＤＭＥの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３８４】
別法では、ＤＭＥと相互作用する分子を、Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．及びＯ． Ｓｏｎｇ（１９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）や、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの２−ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０３８５】
ＤＭＥはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するＰＡＴＨＣＡＬＬＩＮＧプロセス（ＣｕｒａＧｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ ＣＴ）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を判定できる（Ｎａｎｄａｂａｌａｎ， Ｋ． 他 （２０００） 米国特許第６，０５７，１０１号）。
【０３８６】
１７  ＤＭＥ活性の実証
ＤＭＥのチトクロームＰ４５０活性は、アニリンの４−ヒドロキシル化を用いて測定する。アニリンは、この酵素によって４−アミノフェノールに変換され、アニリンの最大吸光波長は６３０ｎｍである（Ｇｉｂｓｏｎ および Ｓｋｅｔｔ、前出）。このアッセイは便利な測定ではあるが、２− および３−位置でも発生する総ヒドロキシル化を過小評価する。アッセイは３７℃で行い、反応バッファ（緩衝液）には一定分量の酵素および適量のアニリン（約２ｍＭ）が含まれる。この反応では、この緩衝液にＮＡＤＰＨ または ＮＡＤＰＨを産生する補因子系を含むようにする。この反応緩衝液の或る調製には８５ ｍＭ のＴｒｉｓ （ｐＨ ７．４）、１５ ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ ｍＭ ニコチン酸アミド、４０ ｍｇイソクエン酸三ナトリウムおよび ２ 単位のイソクエン酸デヒドロゲナーゼが含まれており、アッセイの直前に１０ｍｌの反応バッファストック溶液に８ｍｇのＮＡＤＰ＋ を加える。反応は光学キュベットで行い、６３０ｎｍでの吸光度を測定する。このアッセイでは、吸光度の増加率が酵素活性に比例する。標準曲線は４−アミノフェノールの既知濃度を用いて作成できる。
【０３８７】
ＤＭＥの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２４−ヒドロキシラーゼ活性は、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットにおける、３Ｈ標識された１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ）から２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ）への変換をモニタリングして判定する。エタノールに溶解した１μｇの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ（或いはコントロールとしてエタノールのみ）を、ＤＭＥを発現する約６週齢のオス遺伝子組換えラット群または、ＤＭＥの欠損変異体を発現する若しくはＤＭＥを発現していないという点を除けば同一のコントロールラット群に静脈内投与する。ラットを８時間後に断頭により屠殺し、腎臓を手早く取り除き、洗浄し、９倍量の氷冷バッファ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．４）、０．１９Ｍスクロース（蔗糖）、２ｍＭ酢酸マグネシウム、および５ｍＭコハク酸ナトリウム）においてホモジナイズする。次に、各ホモジネートの所定量（例えば３ｍｌ）を、０．２５ｎＭの１α，２５（ＯＨ）２［１−３Ｈ］Ｄ（比放射能は約３．５ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）と共に、常に振盪しながら酸素存在下、３７℃で１５分間インキュベートする。総脂質を記載どおりに抽出し（Ｂｌｉｇｈ， Ｅ．Ｇ．およびＷ．Ｊ． Ｄｙｅｒ （１９５９） Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：９１１−９１７）、次にクロロホルム相を、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でｎ−ヘキサン／クロロホルム／メタノール （１０：２．５：１．５） 溶剤系を含むＦＩＮＥＰＡＫ ＳＩＬカラム （ＪＡＳＣＯ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ） を用いてＨＰＬＣで分析する。別法では、クロロホルム相を、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でアセトニトリルバッファ系（４０〜１００％， 水中で３０分間）でＪ ＳＰＨＥＲＥ ＯＤＳ−ＡＭカラム （ＹＭＣ Ｃｏ． Ｌｔｄ．， Ｋｙｏｔｏ， Ｊａｐａｎ） を用いて逆相ＨＰＬＣで分析する。溶出液を３０秒（或いは３０秒未満）毎に集め、各分画における３Ｈの存在量をシンチレーションカウンタで測定する。コントロールサンプル（すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤまたは２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）２Ｄ）を含むサンプル）のクロマトグラムと反応生成物のクロマトグラムとを比較することにより、基質（１α，２５（ＯＨ）２［１３Ｈ］Ｄ）と生成物（２４，２５（ＯＨ）２［１−３Ｈ］Ｄ）との相対的な移動度（ｍｏｂｉｌｉｔｉｅｓ）を判定し、収集した各画分と相関させる。コントロールラットにおいて生成された２４，２５（ＯＨ）２［１−３Ｈ］Ｄの量を、ＤＭＥを発現する遺伝子組換えラットの２４，２５（ＯＨ）２［１−３Ｈ］Ｄの量から差し引く。遺伝子組換えラットとコントロールラットとの２４，２５（ＯＨ）２［１−３Ｈ］Ｄの生成の差が、そのサンプルに存在するＤＭＥの２５−ヒドロラーゼ活性の量に比例する。基質と生成物（群）との同一性の確認は、質量分光法によって行う（Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｙ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４１１５−１４１１９）。
【０３８８】
ＤＭＥのフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）活性を測定するには、代謝産物群のクロマトグラフィ分析を行う。例えば、Ｒｉｎｇ， Ｂ．Ｊ． 他 （１９９９； Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ． ２７：１０９９−１１０３） は、ＦＭＯ を ０．１ Ｍ リン酸ナトリウムバッファ （ｐＨ ７．４ または ８．３） および １ ｍＭ ＮＡＤＰＨ 中に３７℃でインキュベートし、反応を或る有機溶剤で停止させ、ＨＰＬＣによって産物形成を判定した。あるいは、活性の測定は、酸素の取り込みをクラーク型電極（Ｃｌａｒｋ−ｔｙｐｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を用いてモニタリングする。例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ， Ｄ．Ｍ． および Ｐｏｕｌｓｅｎ， Ｌ．Ｌ． （１９７８； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ５２：１４２−１５１） は、ＦＭＯを、基質であるメチマゾール（ｍｅｔｈｉｍａｚｏｌｅ）を含有する ＮＡＤＰＨ−産生補因子系 （上記のものに類似） において３７℃でインキュベートした。酸素取込み率は酵素活性に比例する。
【０３８９】
ＤＭＥのＵＤＰ グルクロニルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性は、遊離アミノ基の比色判定を用いて測定する （Ｇｉｂｓｏｎ および Ｓｋｅｔｔ， 前出）。アミン含有基質（例えば ２−アミノフェノール）のインキュベートを３７℃で、必要な補因子群を含有する反応バッファ（４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ ８．０）， ７．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．０２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， １ ｍＭ アスコルビン酸、０．７５ ｍＭ ＵＤＰ−グルクロン酸）中のこの酵素のアリコットと共に行った。充分な時間をおき、反応は氷冷した２０％トリクロロ酢酸（０．１ Ｍ リン酸バッファ （ｐＨ ２．７）中）を添加して停止させ、氷上でインキュベートし、遠心分離して上澄みを清澄化させる。全ての未反応２−アミノフェノールは、このステップで破壊される。充分な、新たに調製した亜硝酸ナトリウムを次に添加し、このステップにより、グルクロン酸抱合産物のジアゾニウム塩が形成される。過剰な亜硝酸を除去するため充分なスルファミン酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｍａｔｅ）を添加し、ジアゾニウム塩を芳香族アミン（例えばＮ−ナフチルエチレンジアミン）と反応させ、着色したアゾ化合物を産生する。この化合物は、分光光度法でアッセイできる（５４０ ｎｍなど）。標準曲線は、既知濃度のアニリンを用いて作成できる。このアニリンは、２−アミノフェノール グルクロニドと同様の特性を持つ発色団を形成することとなる。
【０３９０】
ＤＭＥのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の測定には、モデル基質、例えば２，４−ジニトロ−１−クロロベンゼンを用いる。この基質はグルタチオンと反応して生成物である２，４−ジニトロフェニル−グルタチオンを形成し、生成物の最大吸光波長は３４０ ｎｍである。重要な注意点はＧＳＴ類が様々な基質特異性を持つことであり、モデル基質の選択は、目的のＧＳＴの基質選択性（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に基づくべきである。アッセイは室温で行い、適切な反応バッファ（例えば１ ｍＭ グルタチオン、１ ｍＭ ジニトロクロロベンゼン、９０ ｍＭ リン酸カリウムバッファ、ｐＨ ６．５）に一定量の酵素を入れる。反応は光学キュベットで行い、３４０ｎｍでの吸光度を測定する。このアッセイでは、吸光度の増加率が酵素活性に比例する。
【０３９１】
ＤＭＥのＮ−アシルトランスフェラーゼ活性の測定には放射標識したアミノ酸基質を用い、抱合産物群への放射ラベルの取り込みを測定する。酵素をインキュベートする反応バッファには無標識のアシル−ＣｏＡ化合物と放射標識したアミノ酸とを入れ、放射標識されたアシル抱合体と無反応アミノ酸とを分離するため、ｎ−ブタノールまたは他の適切な有機溶剤への抽出を行う。例えばＪｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｒ 他 （１９９０； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１０２２７−１０２３３）は、胆汁酸−ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ活性の測定を、この酵素をコリル−ＣｏＡ および ３Ｈ−グリシンまたは ３Ｈ−タウリンと共にインキュベートし、また、トリチウム化コール酸抱合体（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ ｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をｎ−ブタノールへの抽出によって分離し、シンチレーションによって抽出産物内の放射活性を測定して行った。あるいはＮ−アシルトランスフェラーゼ活性の測定には、下記の還元されたＣｏＡ（ＣｏＡＳＨ）の分光光度測定法を用いる。
【０３９２】
ＤＭＥのＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性は、放射ラベルの、［１４Ｃ］アセチル−ＣｏＡから基質分子への転移を用いて測定される （例えば Ｄｅｇｕｃｈｉ， Ｔ． （１９７５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２４：１０８３−５を参照）。或いは、ＣｏＡＳＨとのＤＴＮＢ （５，５’−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ； Ｅｌｌｍａｎ試薬）反応に基づく分光光度アッセイを用い得る。遊離のチオール含有ＣｏＡＳＨは、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが触媒する、基質へのアセチル基の転移時に形成される。ＣｏＡＳＨの検出には、ＤＴＮＢ抱合体の吸光度（４１２ ｎｍ）を用いる（Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ， Ｊ． 他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３０４５−３０５０）。酵素活性は、基質への放射能取り込み率、または、この分光光度アッセイでは吸光度の増加率に比例する。
【０３９３】
ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を３７℃で様々の時間にわたり測定する。ＳアデノシルＬ［メチル３Ｈ］メチオニン （［３Ｈ］ＡｄｏＭｅｔ； 比放射能＝７５ Ｃｉ／ｍｍｏｌ； ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が、メチル供与体基質として用いられる。有用なメチル受容基質としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼフィブリラリングリシン−アルギニンドメイン融合タンパク質（ＧＳＴ−ＧＡＲ）、不均一核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）または、アデノシンジアルデヒドで処理した細胞からの可溶化液中に存在する低メチル化タンパク質が含まれる。メチル化反応はＳＤＳＰＡＧＥ サンプルバッファーを加えると停止する。反応の産物はＳＤＳＰＡＧＥによって分離され、蛍光光度分析によって視覚化される。３Ｈ標識メチル供与体基質の存在は、ＤＭＥのタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性の標示となる（Ｔａｎｇ， Ｊ． 他 （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：７７２３７７３０ および Ｔａｎｇ， Ｊ． 他（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５：１９８６６１９８７６）。
【０３９４】
ＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）、１．２ｍＭ ＭｇＣＩ２、２００μＭ ＳＡＭ （Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン） ヨウ化物（０．５μＣｉのメチル−［Ｈ３］ＳＡＭを含む）、１ｍＭジチオスレイトール、および様々な濃度のカテコール基質（例えば、Ｌ−ドパ、ドーパミン、またはＤＢＡ）から成る最終容量１．０ｍｌの反応混合液において測定する。この反応は、２５０〜５００μｇの精製したＤＭＥまたは未精製のＤＭＥを含むサンプルを加えて開始し、３７℃で３０分間行う。この反応を停止させるには、氷上で素早く冷却し、直後に７ ｍｌの氷冷ｎ−ヘプタンで抽出する。１０分間１０００×ｇで遠心分離した後、液体シンチレーションカウンタで、この有機抽出物の３ ｍｌのアリコット群を放射活性内容物について分析する。有機相におけるカテコール関連放射活性のレベルが、ＤＭＥのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性に比例する（Ｚｈｕ， Ｂ． Ｔ．およびＪ． Ｇ． Ｌｉｅｈｒ （１９９６） ２７１：１３５７−１３６３）。
【０３９５】
ＤＭＥのＤＨＦＲ活性を判定するには、１５℃で分光光度法により、３４０ｎｍ （ε３４０＝１１，８００ Ｍ−１・ｃｍ−１）においてＮＡＤＰＨの消滅を調べる。標準的なアッセイ混合液は、１００μＭ ＮＡＤＰＨ、１４ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ＭＴＥＮ バッファ（５０ｍＭ ２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、２５ ｍＭ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ、２５ｍＭエタノールアミン、および１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）並びにＤＭＥを含み最終容量を２．０ｍｌとする。反応は５０μｍのジヒドロ葉酸を（基質として）添加して開始させる。反応液におけるＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への酸化はジヒドロ葉酸の還元に一致し、また、サンプルにおけるＤＨＦＲ活性の量に比例する（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｔ．およびＩｗａｋｕｒａ， Ｍ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１９０４１−１９０４７）。
【０３９６】
ＤＭＥのアルド／ケト還元酵素活性は、ＮＡＤＰＨが消費される時の３４０ｎｍにおける吸光度の低下で測定する。標準的な反応混合液は、１３５ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（酵素によりｐＨ６．２〜７．２の範囲）、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．３Ｍ硫酸リチウム、０．５〜２．５ｍｇ酵素、および好適なレベルの基質を含む。この反応液を３０℃でインキュベートし、反応を分光光度計で連続的に測定する。酵素活性は、酵素１ｍｇ当たり消費されるＮＡＤＰＨのモル数として計算される。
【０３９７】
ＤＭＥのアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ＮＡＤ＋がＮＡＤＨへ還元される時の３４０ｎｍにおける吸光度の増大を利用して測定する。標準的な反応混合液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡである。反応液を２５℃でインキュベートし、分光光度計でモニタリングする。酵素活性は、酵素１ｍｇ当たり生成されたＮＡＤＨのモル数として計算する。
【０３９８】
ＤＭＥのカルボキシルエステラーゼ活性は、基質として４−メチルウンベリフェリル酢酸（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて判定する。酵素反応は、約１０μｌのＤＭＥ含有サンプルを、０．５ｍＭ ４−メチルウンベリフェリル酢酸を有する１ｍｌの反応バッファ（９０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， ４０ｍＭ ＫＣ１， ｐＨ７．３）に３７℃で加えて開始させる。４−メチルウンベリフェロンの生成を分光光度計（ε３５０＝１２．２ｍＭ−１ ｃｍ−１）で１分３０秒間モニタリングする。比活性は、１分間に１ｍｇのタンパク質で形成される生成物のμモルとして表され、サンプルにおけるＤＭＥ活性に対応する（Ｅｖｇｅｎｉａ， Ｖ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４７６９−１４７７５）。
【０３９９】
別法では、ＤＭＥのコカインベンゾイルエステル加水分解酵素活性を、約０．１ｍｌのＤＭＥおよび３．３ ｍＭ コカインを、１ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅおよび１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイトールを含む反応バッファ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．４）、３７℃でインキュベートして測定する。全量で０．４ｍｌの反応液を１時間インキュベートし、等量の５％トリクロロ酢酸で終了させる。０．１ ｍｌ の内標準 ３，４ジメチル安息香酸（１０μｇ／ｍｌ）を加える。沈降したタンパク質を１０分間１２，０００×ｇで遠心分離して分離する。上澄みを清浄な試験管に移して、０．４ｍｌの塩化メチレンで２回抽出する。２つの抽出物を混ぜ、窒素を流して乾燥させる。この残留物を、１００ ｍｌ当たり８μ１のジエチルアミンを含む１４％アセトニトリル、２５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．０）に再懸濁してから、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム上に注入して分離する。このカラム溶出液を２３５ｎｍでモニタリングする。ＤＭＥ活性を定量するため、内標準に対する分析物のピーク面積比を比較する。標準曲線は、トリクロロ酢酸処理したタンパク質マトリクス内で調製した安息香酸標準で作成する（Ｅｖｇｅｎｉａ， Ｖ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４７６９−１４７７５）。
【０４００】
別法では、水溶性基質のパラニトロフェニル酪酸に対するＤＭＥカルボキシルエステラーゼ活性を当業者に周知の分光光度法で判定する。この方法では、ＤＭＥ含有サンプルを、６ｍＭのタウロコール酸の存在下、０．５ Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ （ｐＨ ７．４または８．０）または酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．０） で希釈する。このアッセイを開始するには新たに調製したパラニトロフェニル酪酸溶液を加える（酢酸ナトリウム中に１００ μｇ／ｍｌ， ｐＨ ５．０）。次にカルボキシルエステラーゼ活性をモニタリングし、４０５ｎｍにセットした分光光度計で基質のコントロール自己加水分解と比較する（Ｗａｎ， Ｌ．他（２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１００４１−１００４６）。
【０４０１】
ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性は、［３５Ｓ］ＰＡＰＳからモデル基質（フェノールなど）への３５Ｓの取り込みを用いて測定する（Ｆｏｌｄｓ， Ａ． および Ｊ． Ｌ． Ｍｅｅｋ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ３２７：３６５−３７４）。一定量の酵素のインキュベートを、３７℃で、１ ｍｌの１０ ｍＭ リン酸バッファ（ｐＨ ６．４）、５０ ｍＭ フェノール、および０．４〜４．０ ｍＭ ［３５Ｓ］ アデノシン ３′リン酸 ５′ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）を用いて行う。充分な時間をおいて５〜２０％の放射ラベルを基質へ転移させ、０．２ ｍｌの０．１ Ｍ 酢酸バリウムを加えてタンパク質とリン酸バッファとを沈殿させる。次に、０．２ ｍｌの０．１ Ｍ 水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２ ）を、続いて０．２ ｍｌ 硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）を加える。上澄みを清澄化するため遠心分離し、これにより、タンパク質と、無反応 ［３５Ｓ］ＰＡＰＳとを除去する。上澄みの放射能を、シンチレーションで測定する。酵素活性は、反応産物における放射能のモル数から判定する。
【０４０２】
ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性は、ＤＭＥを有するサンプルを、２．５μｍｏｌイミダゾールＨＣ１ （ｐＨ６．８）、３．７５μｇの塩化プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２５ｎｍｏｌ（ヘキソサミンとして）の完全に脱硫酸化されＮ−再硫酸化されたヘパリン、および５０ｐｍｏｌ （約 ５×１０５ｃｐｍ）の［３５Ｓ］アデノシン３’−リン酸５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）と共に最終反応容量５０μｌ、３７℃で２０分間インキュベートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。この反応は、熱湯に反応試験管を１分間浸漬して停止させる。０．１μｍｏｌ（グルクロン酸として）コンドロイチン硫酸Ａを、キャリアとして反応混合液に加える。３５Ｓ標識ポリ多糖を、１．３％酢酸カリウムを有する冷却した三倍量のエタノールで沈殿させ、脱塩カラムを用いるゲルクロマトグラフィによって、取り込まれなかった［３５Ｓ］ＰＡＰＳおよびその分解生成物から完全に分離する。一単位の酵素活性は１分間に１ｐｍｏｌの硫酸を転移するのに必要な量と定義し、沈殿した多糖の中に取り込まれた［３５Ｓ］ＰＡＰＳの量によって判定する（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他 （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０４０３】
別法では、ＤＭＥのへパラン硫酸６−スルホトランスフェラーゼ活性を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した後、ゲルから酵素を抽出して再生し測定する。分離した後、ゲルをバッファ（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ８．０）で洗浄し、３〜５ｍｍのセグメントに切断し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを有する同じバッファと共に１００μｌで４℃で４８時間撹拌する。 溶出した酵素を遠心分離して収集し、上記したように、スルホトランスフェラーゼ活性についてアッセイする（Ｈａｂｕｃｈｉ， Ｈ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４１７２−４１７９）。
【０４０４】
別法では、ＤＭＥのスルホトランスフェラーゼ活性を、［３５Ｓ］ＰＡＰＳから、固定されたペプチドへの、［３５Ｓ］硫酸の転移を測定して判定する。この固定されたペプチドは、Ｃ末端システイン残基が付加された成熟Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドのＮ末端の１５残基である。このペプチドは３つの潜在的なチロシン硫酸化部位にわたる。このペプチドは、このシステイン残基によって、ヨードアセトアミド活性化した樹脂に連結される（１ｍｌの樹脂あたり１．５〜３．０μｍｏｌペプチドの密度）。この酵素アッセイは、４０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ （ｐＨ６．８）、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＦ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１ｍＭ ５’−ＡＭＰを含む最終容量１３０μｌにおいて、１０μｌのペプチド誘導体化ビーズと２〜２０μｌのＤＭＥ含有サンプルとを混合して行う。このアッセイは、０．５μＣｉの［３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１．７μＭ； １Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）を加えて開始させる。３７℃で３０分経過した後に、反応ビーズを６５℃で６Ｍグアニジンで洗浄し、ビーズに取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンタで測定する。ビーズ結合ペプチドに転移された［３５Ｓ］硫酸を測定し、サンプルにおけるＤＭＥ活性を判定する。１単位の活性は１分間に１ｐｍｏｌの生成物が形成されると定義する（Ｏｕｙａｎｇ， Ｙ−Ｂ．他 （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９５：２８９６−２９０１）。
【０４０５】
別法では、ＤＭＥスルホトランスフェラーゼのアッセイを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ （ｐＨ７．０）、２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭジチオスレイトール、１４μＭ［３５Ｓ］ＰＡＰＳ （１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および、ドーパミン（２５μＭ）、ｐニトロフェノール（５μＭ）または他の候補基質を含む最終容量３０μｌにおいて、硫酸供与体として［３５Ｓ］ＰＡＰＳを用いて行う。アッセイの反応は、精製されたＤＭＥ酵素試薬、或いはＤＭＥ活性を持つサンプルを加えて開始させ、その反応を３７℃で１５分間続け、１００℃で３分間加熱して終了させる。形成された沈降物を遠心分離によって除去する。次に３５Ｓ硫酸化物を調べるために、上澄みを薄層クロマトグラフィ或いは二次元薄層分離法のいずれかによって分析する。３５Ｓ硫酸化物の同定ができるように好適な標準を上澄みと平行して分析し、反応産物の移動の相対速度に基づいてＤＭＥ含有サンプルの酵素特異性を判定する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｙ．他 （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：６２４２−６２４７）。
【０４０６】
ＤＭＥのスクアレンエポキシダーゼ活性は、精製したＤＭＥ （またはＤＭＥを有する未精製の混合液）， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）、０．０１ｍＭ ＦＡＤ、０．２単位のＮＡＤＰＨ−チトクロームＣ （Ｐ−４５０）レダクターゼ、０．０１ ｍＭ［ｌ４Ｃ］スクアレン（２０μｌのＴｗｅｅｎ ８０を用いて拡散された）、および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を有する混合液においてアッセイする。１ｍＭ ＮＡＤＰＨを加えて反応を開始させ、３７℃で３０分間インキュベートする。非けん化脂質を、酢酸エチル／ベンゼン（０．５：９９．５， ｖ／ｖ）で展開したシリカゲルＴＬＣによって分析する。反応生成物を、ＤＭＥを含まない反応混合液による反応生成物と比較する。２，３（Ｓ）−オキシドスクアレンの存在を、好適な脂質標準を用いて確認する（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ， Ｊ．他（１９９５） ２７０：１７−２０）。
【０４０７】
ＤＭＥのエポキシドヒドロラーゼ活性は、エーテル抽出物のガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析を用いて基質枯渇を調べ、或いはアセトンで失活させた反応混合液をＧＣ分析し基質枯渇とジオール生成とを調べて判定する。ＤＭＥを有するサンプルまたはエポキシドヒドロラーゼコントロールサンプルを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、１ｍＭ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、および５ｍＭ エポキシド基質（例えば、エチレンオキシド、スチレンオキシド、プロピレンオキシド、一酸化イソプレン、エピクロロヒドリン、ｅｐｉｂｒｏｍｏｈｙｄｒｉｎ、ｅｐｉｆｌｕｏｒｏｈｙｄｒｉｎ、グリシドール、１，２−エポキシブタン、１，２−エポキシヘキサン、または１，２−エポキシオクタン）中でインキュベートする。様々な時点でサンプルの一部を反応混合液から取り出して、ＧＣ分析用の内標準（例えば１−ノナノール）を有する１ｍｌの氷冷アセトンに加える。タンパク質および塩類を遠心分離（１５分、４０００×ｇ）によって除去し、抽出物を０．２ｍｍ×２５ｍ ＣＰ−Ｗａｘ５７−ＣＢカラム（ＣＨＲＯＭＰＡＣＫ， Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および水素炎イオン化検出器を用いてＧＣにより分析する。ＧＣ産物の同定は、当業者に周知の好適な標準およびコントロールを用いて行う。 １単位のＤＭＥ活性は、１分間に１μｍｏｌのジオール生成を触媒する酵素の量と定義する（Ｒｉｎｋ， Ｒ．他（１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１４６５０−１４６５７）。
【０４０８】
ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性は、ＤＭＥを有するサンプルを、１ｍＭ Ｌ−キヌレニンおよび１ｍＭ ２−オキソグルタル酸の存在下で、最終容量２００μｌの、７０μＭ ＰＬＰを有する１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ 酢酸バッファ（ｐＨ８．０）、３７℃で１時間インキュベートしてアッセイする。キヌレニン酸の形成は、当業者に周知の好適な標準およびコントロールを用いて３３０ｎｍで分光光度検出によりＨＰＬＣで定量する。別法では、Ｌ−３−ヒドロキシキヌレニンを基質として用い、キサンツレン酸の生成を３４０ｎｍでのＵＶ検出で生成物のＨＰＬＣ分析により判定する。キヌレニン酸およびキサンツレン酸の生成はそれぞれ、アミノトランスフェラーゼ活性を示す（Ｂｕｃｈｌｉ， Ｒ．他（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２９３３０−２９３３５）。
【０４０９】
別法では、ＤＭＥのアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、酵素結合補助因子であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）のＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルにおける変化をモニタリングして、一回のターンオーバー条件下で、精製したＤＭＥ或いはＤＭＥを有する未精製サンプルの、様々なアミノ酸およびオキソ酸基質に対する活性を判定して行う。この反応は、９μＭ 精製ＤＭＥまたはＤＭＥ含有サンプルと試験する基質（アミノ酸およびオキソ酸基質）とを有する５０ｍＭ ４−メチルモルフォリン（ｐＨ７．５）において２５℃で行う。アミノ酸からオキソ酸への半反応を調べるため、酵素結合したＰＬＰのピリドキサミン５’リン酸（ＰＭＰ）への変換により生じる、３６０ｎｍにおける吸光度の低下および３３０ｎｍにおける吸光度の増加を測定する。ＤＭＥの特異性および相対的な活性を、特定の基質に対する酵素試薬の活性によって判定する（Ｖａｃｃａ， Ｒ． Ａ．他 （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２１９３２−２１９３７）。
【０４１０】
ＤＭＥのスーパーオキシドジスムターゼ活性は、細胞ペレット、培養した上澄み、または精製したタンパク質試薬からアッセイする。サンプルまたは溶解物を１５％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動法によって分離する。このゲルを、２．５ｍＭニトロブルーテトラゾリウムにおいて３０分間インキュベートし、その後３０ｍＭリン酸カリウム、３０ｍＭ ＴＥＭＥＤ、および３０μＭリボフラビン（ｐＨ７．８）において２０分間インキュベートする。スーパーオキシドジスムターゼ活性は背景のブルーに対して白いバンドとして可視化され、このためにはライトボックス上でゲルに照明を当てる。スーパーオキシドジスムターゼ活性の定量は、好適なスーパーオキシドジスムターゼのポジティブおよびネガティブコントロール（例えば様々な量の、市販の大腸菌スーパーオキシドジスムターゼなど）を用いて活性ゲルの走査型濃度計測法（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）により行う（Ｈａｒｔｈ， Ｇ．およびＨｏｒｗｉｔｚ， Ｍ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：４２８１−４２９２）。
【０４１１】
１８  ＤＭＥインヒビターの同定
実施例１７のアッセイで説明したように、試験する化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に、様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに分注する。ＤＭＥ活性を各ウェル毎に測定し、ＤＭＥ活性を阻害するそれぞれの化合物の能力、および用量反応プロフィール（ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｆｉｌｅｓ）を判定できる。ＤＭＥ活性を増強する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０４１２】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載する本発明の実施方法の様々な修正は、明確に特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４１３】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０４１４】
表２は、ＧｅｎＢａｎｋ識別番号と、本発明のポリペプチドに最も近いＧｅｎＢａｎｋ相同体の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４１５】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０４１６】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたｃＤＮＡ断片やゲノムＤＮＡ断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０４１７】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なｃＤＮＡライブラリを示す。
【０４１８】
表６は、表５に示したｃＤＮＡライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０４１９】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【表１】
2005500006.tif 000007
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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