(57)【要約】本発明は、ヒトマウス二重微小染色体-2(MDM2)遺伝子のエキソン12において354位の多型性A？Gを特に検出することにより腫瘍感受性の増大を検出する方法に関する。前記多型性は、ヒトにおいてがんのリスクが高いことの遺伝マーカーである。本発明は、また、前記マーカーを診断法、予後法、おそらくは治療法へ特定の方法で組込む試験管内及び生体内試験システムを開発する前記腫瘍感受性マーカーの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍感受性を検出する方法であって、被検者の核酸を分離し、ヒトMDM2遺伝子の配列をエキソン12における354位の塩基交換A→G(GAA→GAG)を用いて遺伝子型別すること、及びその多型遺伝子座の対立遺伝子状態の決定が行われることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
同型接合又は異型接合多型性(変異)の検出が、潜在的腫瘍感受性に対する遺伝的素因の十分な基準として用いられる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
同型接合又は異型接合多型性(変異)の検出が、被検者とその子孫の潜在的腫瘍のリスクに対する遺伝的素因の十分な基準として用いられる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
同型接合又は異型接合変異の検出が、前立腺がん、乳がん、頚管がん及び/又は卵巣がんに対する潜在的腫瘍感受性の十分な基準として用いられる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子型別が、DNAのシークエンシング又は点変異の検出に適した他の方法によって行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
型別が、複数の高度に特異的な増幅プライマーと標識ハイブリダイゼーションプローブを用いたDNA-ELISAにより行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
MDM2遺伝子による経路に働きかける遺伝子に特定され及び/又はMDM2遺伝子又はそれに付随した遺伝子のエキソン12において354位の多型性A→G(GAA→GAG)を攻撃し、遺伝子及び転写や翻訳の調節によって、また、それらの効率に影響するように、好ましくは発現を調節することにより作用する、治療剤。
【請求項８】
ヒトMDM2遺伝子に特定され、MDM2遺伝子のエキソン12において354位の交換位置A→G(GAA→GAG)を攻撃し、転写や翻訳の調節によって、また、それらの効率に影響するように、好ましくは発現を調節することにより作用する、治療剤。
【請求項９】
MDM2遺伝子のエキソン12における354位に変異(多型性)A→G(GAA→GAG)をもつ形でヒトMDM2遺伝子を発現させる試験管内及び生体内試験システムであって、MDM2遺伝子を含む疾患を調べるために、また、一般的には個別に特定的な治療剤を開発し試験するために用いられる、前記試験システム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトマウス二重微小染色体-2(MDM2)遺伝子のエキソン12において354位の多型性A→Gを特に検出することにより腫瘍感受性の増大を検出する方法に関する。前記多型性は、ヒトにおいてがんのリスクが高い遺伝マーカーである。本発明は、また、前記マーカーを特定の方法で診断法、予後法、おそらくは治療法へ組込む試験管内及び生体内試験システムを開発する前記腫瘍感受性マーカーの使用に関する。
MDM2遺伝子は、二重微小染色体に自然に形質転換した3T3DMマウス細胞系において最初に同定された。遺伝子産物MDM2がマウス線維芽細胞を形質転換するとともに制御されない腫瘍誘発増殖をもたらし得ることは既知である。ヒトMDM2遺伝子は、染色体セグメント12q13-14に局在し、p53腫瘍サプレッサ遺伝子の重要なアンタゴニストであることがわかったときに重要性が増してきた。相互調節はフィードバックループによって行われる。即ち、p53タンパク質はMDM2遺伝子の転写を活性化し、形成されたMDM2タンパク質がp53タンパク質の分解を引き起こしてしまう。MDM2タンパク質はp53のユビキチンリガーゼを示し、後者はプロテオソーム分解を標識する。結果として、p53タンパク質の発現の非常に細密な調節が達成され、これは胚発生には特に不可欠なものである。従って、MDM2ノックアウトマウスは死亡するが、機能的に活性なp53遺伝子を更にもたない場合にはマウスは生存する。p53腫瘍サプレッサ、MDM2は他の腫瘍サプレッサ代謝経路、即ち、Rb-E2F-p16INK4A/p19ARFに働きかけることも既知である。従って、MDM2はＲbタンパク質に結合し、Rb仲介G1細胞周期の停止を阻止するか又は転写因子E2F1/DPと直接相互作用し、S相への細胞転移を誘導する。腫瘍の約80％に働きかけるいずれの腫瘍サプレッサ経路の調節が負であり、また、MDM2タンパク質が腫瘍形成性であることがわかった知見が多いことから、MDM2遺伝子は遺伝子治療の標的として有利である。
【０００２】
結論として、MDM2の特定領域が多くのタンパク質、例えば、p53、CBP/p300、pRb、p73、E2F1、DP1、リボソームL５リボヌクレオプロテイン粒子、p14ARF又はRNAと相互作用し得ると述べることができる。腫瘍形成、細胞周期、アポトーシスにおけるMDM2の特定の機能が優れた総説で述べられている(Freedmam et al., 1999, Momand et al., 2000, Juven-Gershon and Oren, 1999)。
MDM2の役割は、特に肉腫、即ち、間充織由来の悪性腫瘍について調べられてきたことである。悪性腫瘍の中でも肉腫はMDM2遺伝子の最も多くの増幅率-20〜30％を示すものである。トランスジェニックにおけるMDM2の過剰発現により38％の症例で肉腫の発症(p53状態と無関係に)が引き起こされている。肉腫患者のMDM2過剰発現は、多変量Ｃox回帰分析に示されているように関与する患者の生存が悪くなることに相関する(Wuerl et al., 1997)。
全体的に、正常又は腫瘍特異的代謝経路がMDM2 mRNA又はMDM2タンパク質によって働きかけられることについてはほとんど知られていない。遺伝子の機能を調べる一方法は、遺伝子の変化の影響を分析することである。しかしながら、MDM2遺伝子はこれまで遺伝子の変化、即ち、変異又は多型性が調べられてきた。多くの文献の研究からこの論題について全部で4つしか発表されていないことがわかった。これらは、ヒト原発性腫瘍における知見が負であること(遺伝子の変化が見出されていない)(Siva et al., 2000)、MDM2のZnフィンガー領域において点変異と挿入変異がめったに存在しないこと(Schlott et al., 1997)、5’非翻訳領域における多型性が一例(Heighway et al., 1994)、Znフィンガー領域におけるエキソン10の多型性が一例(Taubert et al., 2000)あることである。この多型性は、軟組織にのみ確認された(健康な対照被検者における多型対立遺伝子頻度と比べて)。多型性は、生存が短くなる傾向と関連がある(多型性のない患者の57ヶ月に対して38ヶ月)。
【０００３】
本発明は、ヒトMDM2遺伝子の腫瘍関連変異又は多型性を同定するとともに素因との相関を確認する目的に基づいている。これらの相関から出発してこれらの素因の分子-遺伝子診断方法を開発することである。目標は、外科手術や薬剤の種類の双方であり得る予防治療又は姑息的治療が実施可能である結果としてのモデルを確立することである。
本発明は、MDM2遺伝子のエキソン12におけるコドン354に存在する多型性A→G(GAA→GAG)(配列NM＿002392のヌクレオチド1373)が軟組織肉腫に制限されずに様々な悪性腫瘍型素因と相関し、驚くべきことに遺伝性を有する、即ち、生殖細胞系に既に保存されているという認識に基づく。
この多型性は上皮由来のある種の固形腫瘍(前立腺がんの疾病)に相関する傾向があるが、これらに制限されず、固形腫瘍や血液腫瘍に対する感受性が重要性の鍵を握っていることがわかった。
【０００４】
本発明は、特許請求の範囲に従って理解される。それ故、本発明は、腫瘍感受性を検出する方法であって、試験被検者の核酸を分離し、ヒトMDM2遺伝子の配列をエキソン12における354位の塩基交換A→G(GAA→GAG)によって遺伝子型別し、この多型遺伝子座の対立遺伝子状態の非常に特異的で且つ非常に感受性のある定量が、好ましくは高処理能力プロセスで行われることを特徴とする、前記方法に関する。
遺伝子型別は、点変異の検出に適したシークエンシング又は他の方法によって行われる。これらは、PCR支持遺伝子型別法、例えば、対立遺伝子特異的PCR、オリゴヌクレオチドを用いた他の遺伝子型別法[例はドットプロッティングオリゴヌクレオチドライゲーション分析(OLA)]、制限酵素を用いた方法、マトリクッス援助レーザ脱着/イオン化質量分析法(MALDI)、また、原則的にはそのすべての技術的実施態様においてチップ技術を含む、変異体検出のあらゆる利用可能な方法を含んでいる。
上記に基づき、本発明の方法は広範囲の非常に異なる素因を求めるのに適している。本発明の一実施態様においては、本方法は、潜在的腫瘍感受性に対する遺伝的素因に十分な基準として、特に、罹患した患者やその子孫の潜在的腫瘍のリスクに対する遺伝的素因に十分な基準として354位(エキソン12)の同型接合又は異型接合多型性A→Gを検出するのに用いられる。
【０００５】
好適態様においては、同型接合又は異型接合多型性を検出することによる本方法は、上皮固形腫瘍、例えば、前立腺がん(PCa)、乳がん、頚管がん及び/又は卵巣がんに対する潜在的腫瘍感受性に十分な基準として用いられるものである。本方法は、PCaに対する腫瘍感受性を検出するのに適している。
このように分子生物学が専門の診断医は、彼の裁量で一般的な遺伝的腫瘍マーカーをもっている。
本発明によれば、ある種のハプロタイプの同型接合又は異型接合検出によっては、遺伝的素因について情報を与える表現をすることが可能である。従って、分子遺伝学に基づく遺伝的助言を可能にする。
更に、この多型性の同定は、予防策の診断基準として働くことができる。
検出は、分離した核酸によって行われ、DNA又はRNAが使用し得る。分離したRNAは当業者によく知られた方法を用いてmRNAやcDNAへ転写される。この後、DNAが配列決定される。
この知識に基づいて、この可変(変異)ヌクレオチドDNA配列を用いることにより、MDM2遺伝子の経路に働きかける遺伝子に特定するとともにMDM2遺伝子(又はそれに付随する遺伝子)を攻撃し、転写と翻訳の調節によって、また、それらの効率に影響するように、好ましくは発現を調節することにより作用する新規な種類の治療剤が本発明に従って開発され得る。
【０００６】
MDM2遺伝子に働きかける遺伝子の経路の一部は既知である。これらは、例えば、
・ｐ53-ｐ14
・Rb-p16INK4A/p19ARF-E2F
・mdr-1
を含んでいる
これにより、好ましくは、ヒトMDM2遺伝子に特定されるとともにMDM2遺伝子のエキソン12において354位A→Gで攻撃する治療剤の開発がもたらされる。
更に、本発明は、また、試験管内及び生体内試験システムに関する。これらの試験システムは、エキソン12の354位でA→Gに変異したヒトMDM2遺伝子の配列を発現させ、MDM2遺伝子を含む疾患を調べるとともに一般的には個々に特異的な治療剤を開発し試験するために使用し得る。
そのような試験システムは、当業者に周知であり、細胞系、異種移植片、他の動物モデルであり得る。
限定するものでないが、前立腺がん(PCa)に対する腫瘍感受性の検出の例を用いて本発明を以下に更に詳細に説明する。
【０００７】
泌尿器科学的腫瘍試料をもつ患者からの血液DNA試料を選択し前作用的に得られた分析の性能においては、原発性PCaが対応する家族の既往症(家族にPCaの症例がない)と対応する治療(治癒的処理目標をもつ根治的前立腺切除術によって除去した主に限局性のPCa; 更に稀には化学療法で治療したホルモン無反応性PCaの症例)で診断された患者は354位(エキソン12)のMDM2 SNP A→Gについてドイツ連邦共和国の正規母集団より異型接合性が高いことがわかった。
連続的拡張分析においては、多型性はこれまで229のうちの31を調べたDNA試料(13.5％)で明らかに検出されてきた。この数の例から、MDM2多型率が正規母集団の二倍を超えることが明らかに結論し得る(健康で若い正規母集団における異型接合性を求めるために調べた対照被検者には非予測的に定義可能なPCaリスクをもつ男性被検者を含むことを前提としている)。この結果は、異型接合遺伝子座が散在性PCaをもつ患者の潜在的腫瘍感受性因子であることを意味する。
【０００８】
PCaが進行した患者の2つのDNA試料中に同型接合対立遺伝子結果が得られたことを観察したことは興味深いことであった(いずれの対立遺伝子も354位(エキソン12)の多型性A→Gに対応した)。
調べるべきMDM2遺伝子座において個々に特異的な対立遺伝子状態を検出する分子スクリーニングにおいてHTSを用いた場合に現在の問題を解決することが可能であった。調べたMDM2多型性の定量は、高感受性と患者のDNAにおける現在の同型-又は異型接合性の正確な型別と同時に行われた。選択した方法は行うのに簡便且つ迅速であり、高度の再現性と安定性が著しい。
【０００９】
これに加えて、本方法は、核形成血液細胞から完全な自動DNA抽出に高度に組込まれて関連することができ、別個の又は分子試料調製と組合わせて完全な自動化の可能性もある。好適検出法は、96ウェル方式においてハイブリダイゼーション結果のDNA ELISAと続いての間接酵素検出に基づいている。しかしながら、DNA ELISAのこの好適実施態様は、調べるべきMDM2座の分子スクリーニング方法の範囲を限定すべきでない。好適実施態様(DNA ELISA)においては、研究中患者血液試料から以前に分離したゲノムDNAを、PCR技術によって研究中MDM2遺伝子座に隣接している二本鎖DNA断片を生成するのに用いた。PCR用のプライマー対は、5’位がビオチニル化したプライマーを含有した。従って、生成PCR断片を増幅後ビオチニル化する。次にPCR断片をストレプトアビジンで被覆されビオチニ化によってプレート表面に共有結合した96ウェルマイクロテストプレートの表面に移す。プレート表面に結合した二本鎖DNA断片をNaOH溶液を添加して変性し、結合していないDNA単鎖を簡単な洗浄ステップで除去する。その後、共有結合DNA単鎖はMDM2状態の遺伝子型別に塩基相補的ハイブリダイゼーション反応の標的配列として働く。
【００１０】
次に、研究中MDM2座にいずれも潜在的に可能なMDM2対立遺伝子変異体に塩基相補的な2つのFITC標識オリゴヌクレオチドプローブ/増幅試料と各々の場合にハイブリダイゼーションが行われる。ハイブリダイゼーション反応は酵素結合抗FITC抗体反応、続いて基質変換によって酵素的に間接検出される。現在の対立遺伝子状態は、反応の終わりにそれぞれのウェルで色の変化又はその強さを評価することにより同定する。色パターンに基づき、同型接合又は異型接合担体の特性の存在を明らかに同定することは可能である。本方法は、単一の96ウェルプレートで同時に48人の患者のDNAを調べることを可能にする。本方法の再現性と安定性を、一連のブランクテストを含む多くの研究試料に関連して証明した。DNAシークエンシングによって、更に、DNA ELISAで生成した結果から一連の試料を明らかに証明した。
【００１１】
試験結果について特徴的なすべての試料と代表的な数の特徴的でない試料をいろいろな認識検出システム(直接PCR DNAシークエンシング、ALF Express、PharmaciaBiotech)を用いて再評価した。
更に、ブランク試験においては、同一試験被検者と負の対照の複数のDNAアリコートを依存性と非依存性の試験シリーズで求めた。これらの研究から、選択した検出法の感度を強調する定性結果の完全な一致が得られた。更に進んだ到達研究が現在進行中であり、検出可能な特発性PCaをもつ400人を超える患者の最も確実な統計評価が行われている。
他の種類のがんについて現在の試験から、この遺伝子多型の存在と上皮固形腫瘍の疾病の高腫瘍率との関連を確認した。例えば、乳がん、頚管がん又は卵巣がんをもつ患者のこれまでに調べた32人の血液DNA試料のうち5人(15.6％)に異型接合MDM2状態が証明された。
【００１２】
記載されたPCR-ELISA分析結果の特異性を証明するために、多型MDM2遺伝子座の対立遺伝子状態が既知の被検者亜集団を再評価した。更に、正規母集団での正確な異型接合性頻度を定義するために対照グループを増加することによる試みを行った(このプロジェクトに記載されたDNA試料はすべて健康な対照被検者と1996〜2001年のサクソンとサクソン-アンハルトの区域からの腫瘍患者から来た)。これに用いたDNA試料は、関連の血液提供に関連の厳密な封入基準をもった血液提供者のみからにした(提供時又は提供前に腫瘍疾患でないこと、既知の家系疾患がないこと、仕事中又は家庭で変異原性/発がん性物質や放射線に対する自然暴露が高くないこと)。
【００１３】
正常被検者からの108の血液DNA試料のうち、その比率についてはシークエンシングと制限消化によってTaubert et al.(2000)によりMDM2多型性を独立して既に調べてあり、同時に検出した異型接合性DNA試料のすべてがPCR-ELISAによって明らかに証明された。更に、この従来の研究からＷＴＳ組織の31のDNA試料の多型性の知見は100％の特異性で確認された。更に、腫瘍組織DNAがMDM2多型性を示したこれらのWTS患者(n＝6)の一部から、対応するDNA血液試料が分析され、再びすべて正であることがわかった。従って、WTS患者の組織DNA試料において検出された多型性は遺伝的性質の可能性が高い。即ち、多型性は生殖細胞系に保存されていると考えられ得る。
【００１４】
前立腺がん(PCa)は、中欧において男性が罹患する2番目に多く発症するがん疾患であり、近年その発症率が高くなっているために重要性を増してきた。米国では、現在最も多く診断されるタイプの腫瘍であり、肺がん次に腫瘍関連致死率が最も高い腫瘍の疾病である。80％の症例では、年齢が65歳を超える男性に疾患が診断されている。限局性PCaが前立腺を除去することにより治癒できるが、治癒的治療は局所に進行した腫瘍又は転移に付随した腫瘍の場合にはほとんど不可能である。転移した腫瘍の3年生存率はわずか40％である。PCaの場合には、転移は血流とリンパ管によって拡散する。リンパ球生成転移の最初の転移場所は骨盤のリンパ節である。血行性微小転移は、骨格系、特に骨盤と脊柱、また、肝臓や肺のような個々の臓器に主に働きかける。転移によるPCaの場合には、手術や薬剤治療は、前立腺とPCa細胞の増殖の主な原因であるホルモンテストステロンの形成と作用を抑制することが目標である。それ故、腫瘍期の正しい決定は、即ち、限局性PCaにしても既に発症した転移にしても続いての治療形態に絶対に不可欠である。
【００１５】
PCaの最初の診断で用いられる現在の試験法は、直腸指頭診法、血清中の腫瘍マーカーPSA(前立腺特異抗原)の定量、取り出した生検材料の場合には、組織病理学的検査、個々の場合には、診断用骨盤リンパ節切除術、任意のMRTやCT又は骨シンチグラフィである。これまで、血液中の初期転移形成(血液中の播種PCa細胞、局所的リンパ節の低侵入)を診断的に検出することは可能でなく、リンパ節の場合には、術後に組織病理学的検査による検査のみ可能であった。手術前検査に利用できるイメージング法(CT、MRT)は感度が低く、22〜26％の範囲にあり、広範囲の転移を示すことを可能にするだけである。転移発症が腫瘍期、腫瘍量、腫瘍分類に依存することは明らかであるので、これらは組織学的分化(グリーソンスコア)とは別に患者の予後を求めるのに関係する最も重要な要因である。
【００１６】
直腸指頭診法に加えて、腫瘍マーカーPSA(前立腺特異抗原)の定量はPCaの初期診断の非常に選択的で感度の高い標準法である。しかしながら、前立腺特異抗原は、前立腺の組織特異マーカーを除いてがん特異的ではない。高PSA血清値は、PCaの存在を示すものである。PSA値によるBPHとがんの区別は、BPHが加齢とともに起こることが多く、PSA値が前立腺の自然増殖により加齢とともに上昇するので、2〜10 ng/ml範囲で特に難しい。PSAの発現は、ホルモンのテストステロンとジヒドロテストステロン(DHT)により調節される。患者のホルモン治療(テストステロン、ジヒドロテストステロンの作用の阻止)の間、血清中のPSA値は低下する。
PCaの健康方針の重要性(特に西の工業国において)、腫瘍特異的マーカーの欠除、腫瘍の既知の腫瘍生物学的細胞不均一性に基づき、PCaの臨床研究分野において徹底的に探索され、特に散在性や遺伝性のPCaの遺伝補因子や後成補因子を更に同定することに集中している。特に米国では、PCa発生率の高い十分に確認された家族があり、(家族関連)PCaの遠大なヒト遺伝研究が可能になる。
【００１７】
本発明は、特にPCaのMDM2遺伝子のエキソン12の354位における多型性A→G(GAA→GAG)による汎用遺伝性腫瘍マーカーを開示する。多型性がPCaと厳密な関連を示すことがわかった。この多型性を検出することにより、PCaに対する遺伝的素因とおそらくは関連の臨床像について確実な表現にすることが可能である。
【００１８】
参考文献
2005529613.tif 000002
【国際調査報告】
2005529613.tif 000003
2005529613.tif 000004
2005529613.tif 000005
2005529613.tif 000006
2005529613.tif 000007
2005529613.tif 000008