(57)【要約】内皮リパーゼ（ＥＬ）の発現を調節するため、アンチセンス化合物、組成物及び方法を提供する。当該組成物は、アンチセンス化合物、特にＥＬをコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＥＬ発現を調節、及びＥＬ発現に関連する疾患を治療するための当該化合物の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＬをコードする核酸分子を標的とする８〜３０塩基長のアンチセンス化合物であって、ＥＬと特異的にハイブリダイズし、かつ当該ＥＬの発現を阻害する前記アンチセンス化合物。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載のアンチセンス化合物。
【請求項３】
配列番号１〜配列番号３９０８の少なくとも８連続塩基からなる群より選ばれる核酸配列を含む、請求項２記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号３９０８からなる群より選ばれる核酸配列を含む、請求項２記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項２〜４のいずれか１項記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項５記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項２〜４のいずれか１項記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】
前記修飾糖部分が２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項７記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾塩基を含有する、請求項２〜４のいずれか１項記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
前記修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項９記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである、請求項２〜４のいずれか１項記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
請求項１記載のアンチセンス化合物及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含有する組成物。
【請求項１３】
コロイド分散系を更に含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
細胞又は組織中のＥＬ発現を阻害する方法であって、当該細胞又は組織を請求項１記載のアンチセンス化合物と接触させて当該ＥＬ発現を阻害することを含む前記方法。
【請求項１６】
ＥＬに関連する疾患又は症状を有するヒトの治療方法であって、請求項１記載のアンチセンス化合物の治療又は予防有効量を当該動物に投与して当該ＥＬの発現を阻害することを含む前記方法。
【請求項１７】
前記疾患又は症状が異常脂質血症(dyslipidemia)である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患又は症状が低ＨＤＬである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患又は症状が心臓血管疾患である、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患又は症状が代謝性症候群Ｘである、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮リパーゼ（ＥＬ）の発現を調節する組成物及び方法を提供する。特に本発明は、内皮リパーゼをコードする核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。かかるオリゴヌクレオチドは、内皮リパーゼの発現を調節する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリドリパーゼ遺伝子ファミリーは、食事脂肪吸収、エネルギーホメオシタシス及び血漿リポ蛋白代謝において重要な役割を有する。そのメンバーは、膵臓リパーゼ、リポ蛋白リパーゼ（ＬＰＬ）、肝性リパーゼ及び内皮細胞由来リパーゼ（ＬＩＰＧ）とも言われる内皮リパーゼ（ＥＬ）を含有する。後者の３つは、血漿中で機能し、血漿リポ蛋白として運ばれる脂質の代謝に重要である。
【０００３】
ＥＬは、ほとんど排他的にホスホリパーゼＡ１活性を示す（トリグリセリド活性は僅か示すか又は全く示さない）。ＥＬのホスホリパーゼＡ１活性はアポＣＩＩによって阻害されるが、ＬＰＬは非常に低密度のリポ蛋白（ＶＬＤＬ）に作用し、アポＣＩＩによって活性化される。テストした種々のリパーゼの中で、ＥＬのみがin vitro下で高密度リポ蛋白(ＨＤＬ)脂質の加水分解を主に促進することが見出されており、ＥＬは、少なくとも部分的にはホスホリパーゼ活性により、リポ蛋白代謝を調節すると結論付けられている（McCoy MG,et al. J.Lipid Res.2002,43:921-9）。
【０００４】
アデノウィルスによって劇的に引き起こされる野生型Ｃ５６Ｂ１／６マウス又はｈａｐｏＡＩ−Ｔｇマウスの肝臓中のＥＬ過剰発現は、ＨＤＬコレステロール及びａｐｏＡＩ濃度を減少させ、また血漿リポ蛋白濃度を大いに変動させた（Jaye M,et al.Nat Genet.1999,21:424-8）。もう一つのホスホリパーゼであるｓ−ＰＬＡ２は、ハポＡＩ-Ｔｇマウスで過剰発現すると、ＨＤＬ粒子を微粒子化すると共に、ＨＤＬコレステロール及びアポＡＩを減少させる。
【０００５】
ＥＬは、サイカイン、ＩＬ−１ｂ及びＴＮＦ−ａに反応し、ずれ応力、循環性応力、アテローム性動脈硬化症及びアテローム班の不安定に係る全ての要因に反応し、内皮細胞中でアップレギュレートされる。かかる要因によるＥＬのアップレギュレーションは、アテローム性動脈硬化症及びその後遺症における当該新規なリパーゼの役割に関連している。動物での説明や入手可能な文献データによるものではないが、ＥＬ阻害は、ＨＤＬ濃度を上げ、アテローム性動脈硬化症の改善に有益な効果をもたらす、ことが判かっている。ＥＬに特異的なアンチセンスオリゴーは、異常脂質血症（dyslipidemia）及びアテローム動脈硬化症の医薬となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させる効果的な手段として出現し、そのため、多数の治療、診断及びＥＬ発現の調節のための検査に非常に有用であることが判る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アンチセンス化合物、特にＥＬをコードする核酸を標的とし、ＥＬ発現を調節するオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物及び他の組成物も提供する。更に、細胞又は組織を、本発明の１以上のアンチセンス化合物又は組成物を接触させることを含む当該細胞又は組織中のＥＬ発現を調節する方法を提供する。更に、本発明の１以上のアンチセンス化合物又は組成物の治療又は予防有効量を投与することによって、ＥＬ発現と関連する疾患又は症状が疑われるあるいは疑われやすい動物、特にヒトを治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、ＥＬをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的にはＥＬ産物量を調節するために、オリゴマー性アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。本発明は、更に、特に、ＥＬをコードする１以上の核酸とハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で使用する限りにおいて、「ターゲット核酸」及び「ＥＬをコードする核酸」という語は、ＥＬをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡから翻訳されたＲＮＡ（ｍＲＮＡの前駆体及びｍＲＮＡを含む）、及び当該ＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡをも含む。
【００１０】
オリゴマー化合物をターゲット核酸と特定のハイブリダイズを行うと、核酸の通常の機能が妨害される。特に、ターゲット核酸にハイブリダイズする化合物によるターゲット核酸機能の当該調節は、通常「アンチセンス」と呼ばれている。妨害されるＤＮＡの機能は、複製及び翻訳を含む。妨害されるＲＮＡの機能は、例えばＲＮＡの蛋白質翻訳部位への転座、ＲＮＡからの蛋白質の翻訳、１以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡスプライシング、及びＲＮＡ中に存在し又はＲＮＡによって促進される触媒活性等の全ての生体機能を含む。このようなターゲット核酸機能の妨害の総合的な効果は、ＥＬ発現の調節である。本発明の文脈中、「調節」は、遺伝子発現における増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈中、阻害は好ましくは調節、すなわち遺伝子発現であり、ｍＲＮＡは好適なターゲットである。
【００１１】
アンチセンスは、特定の核酸をターゲットとすることが好ましい。本発明の文脈中、特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「ターゲッティング」は複数のステップを含む。当該プロセスは、通常、機能が調節されている核酸配列の識別から始まる。これは、例えば、発現が特定の疾患又は病気状態に関連している細胞遺伝子（又は当該遺伝子から翻訳されるｍＲＮＡ）、あるいは病原菌由来の核酸分子あってもよい。本発明において、ターゲットはＥＬをコードする核酸分子である。ターゲッティングプロセスは、アンチセンス相互作用ための当該遺伝子内の一つのサイト又は複数のサイトを決定し、蛋白質の発現の検出又は調節等の所望の効果を発揮することを含む。
【００１２】
本発明の文脈中、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始又は翻訳終止を含む領域である。当該技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは、概して、転写されたｍＲＮＡ分子では５’−ＡＵＧ（対応するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるため、コドンの翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」又は「ＡＵＧ開始コドン」とも言われる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列  ５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧを持つ翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧは、in vivoで機能することが判明している。
【００１３】
従って、開始アミノ酸が、たいていそれぞれメチオニン（真核生物）又はホルミルメチオニン（原核生物）であったとしても、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」の語は、多数のコドン配列を含む。当該分野では、真核生物又は原核生物遺伝子が、２以上の別の開始コドンを有し、いずれの遺伝子も、特に細胞系又は組織における、あるいは特定のセット条件下における翻訳開始に好ましく使用されることも知られている。本発明の文脈中、「開始コドン」」又は「翻訳開始コドン」は、かかるコドン配列を無視して、ＥＬをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにin vivoで用いられるコドン又はコドン類を言う。
【００１４】
遺伝子の翻訳終止コドン（又は「ストップコドン」）は、３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（それぞれ５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡの一つを有していればよいことも知られている。「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」の語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）に、約２５〜５０の連続ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を言う。同様に、「ストップコドン領域」及び「翻訳終止コドン領域」の語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’又は３’）に、約２５〜５０の連続ヌクレオチドを含むｍＲＮＡ又は遺伝子の一部を言う。
【００１５】
当該分野で知られた、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を言うオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）又は「コーディング領域」もまた、有効にターゲッティングされる領域である。他のターゲッティング領域は、当該分野で知られた５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）であり、これは翻訳開始コドンから５’方向にあって、５’キャップサイトとｍＲＮＡ翻訳開始コドン又は遺伝子上の対応ヌクレオチドとの間のヌクレオチドを含むｍＲＮＡサイトを言う。また、他のターゲッティング領域は、当該分野で知られた３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）であり、これは翻訳終止コドンから３’方向にあって、翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’末端又は遺伝子上の対応ヌクレオチドとの間のヌクレオチドを含むｍＲＮＡサイトを言う。ｍＲＮＡの５’キャップサイトは、５’−５’トリホスフェート結合によりｍＲＮＡの５’末端残基に結合しているＮ７位メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、キャップに隣接した最初の５０ヌククオチドと同様に、それ自身、５’キャップ構造を含むと考えられている。
【００１６】
真核生物のｍＲＮＡ転写の中には、直ちに翻訳されるものがあるが、「イントロン」として知られている多くのある一つ以上の領域は、翻訳される前に転写から切り取られる。残余領域（及びその翻訳領域）は、「エキソン」として知られ、継ぎ合わされ、連続ｍＲＮＡ配列を作る。ｍＲＮＡスプライスサイト、すなわちイントロン−エキソン部位は好ましいターゲッティング領域でもあり、異常なスプライシングが病気に関与し、あるいは特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生産が病気に関与しているような状況に特に有用である。転位又は欠失による異常結合部位も、好ましいターゲットである。イントロンは有効であり、それゆえ、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体等のターゲットアンチセンス化合物のターゲット領域が好ましい、ことも明らかとなっている。
【００１７】
１以上のターゲットサイトが一旦認識されると、ターゲットに十分に相補的である、すなわち十分にハイブリダイズし、高い特異性を有し、所望の効果を付与するオリゴヌクレオチドが選ばれる。
【００１８】
本発明の文脈中、「ハイブリダイズ」は、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基の間の水素結合を意味し、Watson-Crick、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合でもよい。例えばアデニン及びチミンは、相補的塩基であり、水素結合を形成して塩基対となる。本発明で使用される「相補的」とは、２つの核酸塩基を正確に一対とする能力を言う。例えば、もしオリゴヌクレオチドのある部位のヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同位置でヌクレオチドと水素結合を形成することが可能ならば、当該オリゴヌクレオチド及び当該ＤＮＡ又は当該ＲＮＡは、その位置で互いに相補的であると考えられる。当該オリゴヌクレオチド及び当該ＤＮＡ又当該ＲＮＡは、各分子中の多数の対応位置が互いに水素結合可能なヌクレオチドで占められている場合に、互いに相補的である。
【００１９】
従って、「特異的にハイブリダイズすることができる」及び「相補的」は、安定で特異的な結合がオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとの間に生じるような、十分な相補性又は正確なペアリングを意味するのに用いられる語である。当該分野では、アンチセンス化合物配列、特異的にハイブリダイズし得るターゲット核酸の配列に対し、必ずしも１００％相補的である必要がない、ことが判っている。アンチセンス化合物は、ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対する当該化合物の結合がターゲットＤＮＡ又はＲＮＡの通常の機能を妨害し、有用性を損失させる場合に、特異的にハイブリダイズすることができる。また、特異的結合が、所望される条件、すなわちin vivoアッセイ又は治療及びin vitroアッセイの場合の生理学的条件やアッセイが実施される条件下で、アンチセンス化合物の非ターゲット配列への非特異的結合を回避できれば、十分程度の相補性が存在する。
【００２０】
アンチセンス化合物は、研究試薬及び診断試薬として通常使用される。例えば絶妙な特異性で遺伝子発現を阻害可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子機能を解明する当業者に使用されることが多い。例えばアンチセンス化合物は、多数の生物学的経路の機能の識別にも用いられる。そのため、アンチセンス調節は、研究用途として利用されてきた。
【００２１】
アンチセンスの特異性及び感度は、治療用途分野の当業者によっても利用されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物及びヒトの病気の治療に治療パートとして使用されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これまでヒトに安全にかつ効果的に投与され、現在、多数の臨床試験が進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織及び動物、特にヒトの治療体制において有用とされる有効な治療様式である、ことが確立している。
【００２２】
本発明の文脈中、「オリゴヌクレオチド」の語は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー又はポリマー又はそれらの模倣体を言う。当該語は、天然由来の核酸、糖及びヌクレオシド間共有結合（骨格）を含有するオリゴヌクレオチド、並びに同様な機能を有する非天然由来部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば増加した細胞性取り込み、増加したターゲット核酸に対する親和性及びヌクレアーゼ存在下での向上した安定性等の所望の性質の点から、天然のオリゴヌクレオチドがより好ましいことが多い。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好適なアンチセンス化合物であるが、本発明は他のオリゴマー性アンチセンス化合物も包含する。しかし、以下に述べる模倣オリゴヌクレオチドに限定されるものではない。本発明のアンチセンス化合物は、好ましくは約８〜３０の塩基を含む（すなわち、約８〜２０の結合ヌクレオシド）。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、更に好ましくは約１２〜２５の塩基を含む。
【００２４】
当該分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基と糖との結合体である。ヌクレオシドの糖部分は、通常、ヘテロ環塩基である。かかるヘテロ環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基が糖の２’、３’又は５’位の水酸基部分に結合する。オリゴヌクレオチド形成では、リン酸基は隣接ヌクレオシドを他のヌクレオシドと共有結合させ、直線状ポリマー性化合物を形成する。
【００２５】
次に、当該直線状ポリマー性構造の各末端は、更に環状構造を形成するために結合されるが、開環直線構造が一般的に好ましい。リン酸基は、オリゴヌクレオチド構造内では、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するために用いられる。ＲＮＡ及びＤＮＡの標準Ｉ型結合又は骨格は、３’と５’のホスホジエステル結合である。
【００２６】
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の特別な例は、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド結合を含むオリゴヌクレオチドを含有する。本明細書中で定義したとおり、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保有し、骨格中にリン原子を有さないオリゴヌクレオチドを含む。本明細書の目的のために、そして当該分野で時々引用されているように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオチドと考えてよい。
【００２７】
好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えばホスホロチオエート、光学活性ホスホロチアオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及び光学活性ホスホネートを含むメチルホスホネート及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チノホスホルアミデート、チノアルキルホスホネート、チノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートを含有する。これらは、通常の３’-５’結合、当該結合の２’-５’アナローグ結合を有するが、ヌクレオシド単位の隣接ペアは、５’-３’に対し３’-５’に、又は５’-２’に対し２’-５’に結合すると、極性が逆転する。
【００２８】
上記リン酸含有結合の調製を示している代表的な米国特許は、本発明に各々参考として示した、米国第３，６８７，８０８号、４，４６９，８６３号、４，４７６，３０１号、５，０２３，２４３号、５，１７７，１９６号、５，１８８，８９７号、５，２６４，４２３号、５，２７６，０１９号、５，２７８，３０２号、５，２８６，７１７号、５，３２１，１３１号、５，３３９，６７６号、５，４０５，９３９号、５，４５３，４９６号、５，４５５，２３３号、５，４４６，６７７号、５，４７６，９２５号、５，５１９，１２６号、５，５３６，８２１号、５，５４１，３０６号、５，５５０，１１１号、５，５６３，２５３号、５，５７１，７９９号、５，５８７，３６１号及び５，６２５，０５０号を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
好適なリン原子を含有しない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド骨格の混合結合、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子又はヘテロ環状ヌクレオシド結合によって形成される骨格を有する。かかる骨格は、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部分形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及びＮ、Ｏ、Ｓ及びメチレン構成成分を混合してなる骨格を含む。
【００３０】
上記オリゴヌクレオチドの調製を示している代表的な米国特許は、本発明に各々参考として示した、米国第５，０３４，５０６号、５，１６６，３１５号、５，１８５，４４４号、５，２１４，１３４号、５，２１６，１４１号、５，２３５，０３３号、５，２６４，５６２号、５，２６４，５６４号、５，４０５，９３８号、５，４３４，２５７号、５，４６６，６７７号、５，４７０，９６７号、５，４８９，６７７号、５，５４１，３０７号、５，５６１，２２５号、５，５９６，０８６号、５，６０２，２４０号、５，６１０，２８９号、５，６０２，２４０号，５，６０８，０４６号、５，６１０，２８９号、５，６１８，７０４号、５，６２３，０７０号、５，６６３，３１２号、５，６３３，３６０号、５，６７７，４３７号及び５，６７７，４３９号を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
他の好ましい模倣オリゴヌクレオチドでは、糖及びヌクレオシド単位のヌクレオシド結合、すなわち骨格が新規な基で置換されている。当該塩基単位は、特定のターゲット核酸化合物とのハイブリッド形成で維持されている。一つの当該オリゴマー性化合物、すなわち高いハイブリダイゼーション特性を示す模倣オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。ＰＮＡ化合物では、塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。
【００３２】
ＰＮＡ化合物の調製を示している代表的な米国特許は、本発明に各々参考として示した、米国第５，５３９，０８２号、５，７１４，３３１号及び５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡ化合物についての更なる記述は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500に見られる。
【００３３】
本発明の最も好ましい具体例は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、特に、上記米国特許第５，４８９，６７７号の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-［メチレン（メチルアミノ）又はＭＭＩ骨格］、-CH2-O-N-(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)-CH2-及び-O-N(CH3)-CH2-CH2-[天然のホスホジエステル骨格は-O-P-O-CH2-として表される]、上記米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。上記米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００３４】
修飾オリゴヌクレオチドは、１以上の置換糖部分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に次の中の一つを含む。すなわち、OH；F；O-、S-又はN-アルキル；O-、S-又はN-アルケニル；O-、S-又はN-アルキニル；あるいはO-アルキル-O-アルキルである。ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は無置換のC1〜C10のアルキル又はC2〜C10のアルケニル及びアルキニルでもよい。特に好ましくは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)n、OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及びO(CH2nON[(CH2)nCH3)]2である。ここで、ｎ及びｍは１〜約１０を示す。
【００３５】
他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に次の中の一つを含む。すなわち、C1〜C10、(低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリル又はO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ分裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動力学的特性を向上する基又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上する基、及び他の類似した性質を有する置換基である。
【００３６】
好適な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’-O-CH2CH2OCH3、２’-O-(２-メトキシエチル)又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Martin et al.,Helv.Chim.Acta, 1995,78,486-504）、すなわちアルコキシアルコキシ基である。更に好適な修飾は、以下に例示した、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているO(CH2)2ON(CH3)2基、及び以下に例示した、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野では２’-O-ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとして知られている）、すなわち２’-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2である。
【００３７】
他の好適な修飾は、２’-メトキシ（２’−OCH3）、２−アミノプロポキシ（２’-OCH2CH2CH2NH2）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドの他の部位、特に３’末端ヌクレオチドの糖３’位又は２’−結合ヌクレオチド及び５’−末端ヌクレオチドの５’−位になされてもよい。
【００３８】
オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の場所にシクロブシル部分等の模倣糖を有していてもよい。かかる修飾糖構造の調製を示している代表的な米国特許は、本発明に各々参考としてそのまま示した、米国特許第４，９８１，９５７号、５，１１８，８００号、５，３１９，０８０号、５、３５９，０４４号、５，３９３，８７８号、５，４４６、１３７号、５，４４６、７８６号、５、５１４，７８５号、５，５１９，１３４号、５，５１９，１３４号、５，５６７，８１１号、５，５７６，４２７号、５，５９１，７２２号、５，５９７，９０９号、５，６１１０，３００号、５，６２７，０５３号、５，６３９，８７３号、５，６４６，２６５号、５，６５８，８７３号、５，６７０，６３３号及び５，７００，９２０号を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
オリゴヌクレオチドは、核塩基（当該分野では「塩基」と言われることが多い）の修飾又は置換を含んでもよい。本発明で示したように、「非修飾」又は「天然」の塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。
【００４０】
修飾塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメシルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体；２−チオウラシル；２−チオチミン及び２−チオシトシン；５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル；シトシン及びチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン；５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン；７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン；８−アザグアニン及び８−アザアデニン；７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン等の他の合成又は天然塩基を含む。
【００４１】
更に核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示された塩基、「ポリマー科学及びエンジニアリングの簡潔百科事典」、pages 858-859、Kroschwitz,J,I.,著  John Wiley & Sons,1990、Englisch et al.,Angewandet Chemie,Internatinal Edition,1991,30,613によって開示された塩基、Sanghvi,Y,S.によってChapter 15、「アンチセンス研究及び応用」、pages 289-302、Crooke,S.T.and Lebleu,B.著  CRC Press,1993に開示された塩基を含む。
【００４２】
当該塩基の特定の塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の向上に特に有用である。当該塩基は、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン等の５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ２−、Ｎ６−及びＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換体は、核酸の多重（duplex）安定性を０．６〜１．２℃向上させることが判明しており（Sanghvi,Y,S., Crooke,S.T.and Lebleu,B.著、「アンチセンス研究及び応用」,CRC Press,Boca Raton,1993,276-278頁）、本発明では好ましい塩基置換体であり、２−メトキシエチル糖修飾体と併用した場合に特に好ましい。
【００４３】
上記修飾塩基及び他の修飾塩基の調製を示している代表的な米国特許は、本発明に参考として各々示した、上記米国特許第３、６８７，８０８号の他、第４，８４５、２０５号、５，１３０，３０２号、５，１３４、０６６号、５，１７５，２７３号、５，３６７，０６６号、５，４３２，２７２号、５，４５７，１８７号、５，４５９，２５５号、５，４８４，９０８号、５，５０２，１７７号、５，５２５，７１１号、５，５５２，５４０号、５，５８７，４６９号、５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号、５，６１４，６１７号、５，７５０，６９２号及び５，６８１，９４１号を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の別のオリゴヌクレオチ修飾は、オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの活性、すなわちオリゴヌクレオチドの細胞分配又は細胞取り込みを向上する、１以上の部分又はコンジュゲートに化学結合することを含む。当該部分は、コレステロール部分等の脂質部分（Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556）；コリン酸（Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060）、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール等のチオステル（Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan et al., Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770）；チオコレステロール（Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20、533-538）；ドデカンジオール又はウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.1991,10,1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49-54）等の脂肪族鎖；ジ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,365’-3654; Shea et al.,Nucl.Acids Res., 1990,18,
3777-3783）等のリン脂質；ポリアミン；ポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14,969-973）；アダマンタン酢酸（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,365’-3654）；パルミチル部分（Mishra et al.,Biochem.Biophys.Acta,1995,1264,229-237）；オクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ccrooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937）を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
当該オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を示している代表的な米国特許は、本発明に参考として各々示した、米国特許第４，８２８，９７９号、４，９４８，８８２号、５，２１８，１０５号、５，５２５，４６５号、５，５４１，３１３号、５，５４５，７３０号、５，５５２，５３８号、５，５７８，７１７号、５，５８０，７３１号、５，５８０，７３１号、５，５９１，５８４号、５，１０９，１２４号、５，１１８，８０２号、５，１３８，０４５号、５，４１４，０７７号、５，４８６，６０３号、５，５１２，４３９号、５，５７８，７１８号、５，６０８，０４６号、４，５８７，０４４号、４，６０５，８３５号、４，６６７，０２５号、４，７６２，７７９号、４，７８９，７３７号、４，８２４，９４１号、４，８３５，２６３号、４，８７６，３３５号，４，９０４，５８２号、４，９５８，０１３号、５，０８２，８３０号、５，１１２，９６３号、５，２１４，１３６号、５，０８２，８３０号、５，１１２，９６３号、５，２１４，１３６号、５，２４５，０２２号、５，２５４，４６９号、５，２５８，５０６号、５，２６２，５３６号、５，２７２，２５０号、５，２９２，８７３号、５，３１７，０９８号、５，３７１，２４１号、５，３９１，７２３号、５，４１６，２０３号、５，４５１，４６３号、５，５１０，４７５号、５，５１２，６６７号、５，５１４，７８５号、５，５６５，５５２号、５，５６７，８１０号、５，５７４，１４２号、５，５８５，４８１号５，５８７，３７１号、５，５９５，７２６号、５，５９７，６９６号、５，５９９，９２３号、５，５９９，９２８号及び５，６８８，９４１号を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
上で挙げた化合物の全ての位置が一様に修飾されている必要はない。実際、上記修飾の１つ以上が単一化合物内あるいは、オリゴヌクレオチド内の単一化合物に均一に取り込まれていればよい。
【００４７】
本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈中、「キメラ性」アンチセンス化合物又は「キメラ」とは、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを言う。これは、２以上の化学的に識別可能な領域を有し、かつ各々は少なくとも一つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドから成る。当該オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ減少にする抵抗性の増大、細胞取り込みの増加、及び／又はターゲット核酸に対する更なる結合親和性を付与するべく、オリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一つの領域をたいてい有している。
【００４８】
オリゴヌクレオチドの更に別の領域は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質として働いてもよい。例を挙げれば、ＲナーゼＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。それゆえ、ＲナーゼＨの活性は、ターゲットＲＮＡを切断し、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大いに増大させる。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを使用すると、同一のターゲット領域にハイブリダイズするホスホロチオエート  デオキシオリゴヌクレオチドに比較して、より短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果が得られることが多い。ターゲットＲＮＡの切断は、通常、ゲル電気泳動によって検出され、もし必要ならば、当該分野で知られた核酸ハイブリダイゼーション技術を組み合わせることができる。
【００４９】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上記の模倣オリゴヌクレオチドの複合構造として作製してもよい。かかる化合物は、当該分野では、ハイブリッド又はギャップマーとも呼ばれている。当該ハイブリッド構造の調製を示している代表的な米国特許は、本発明で参考としてそのまま示した、米国特許第５，０１３，８３０号、５，１４９、７９７号、５，２２０，００７号、５，２５６，７７５号、５，３６６，８７８号、５，４０３，７１１号、５，４９１，１３３号、５，５６５，３５０号、５，６２３，０６５号、５，６５２，３５５号、５，６５２，３５６号及び５，７００、９２２号を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明で使用されるアンチセンス化合物は、よく知られた固相合成技術で簡便にかつ規定どおりに製造される。かかる合成装置は、種々の製造メーカー、例えばApplied Biosystems,Foster City,CAによって販売されている。当該分野で知られた合成法であれば他いかなる合成法も付加的又は代替的に使用してもよい。同様な技術を使用して、ホスホロチオアート及びアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドが調製できることはよく知られている。
【００５１】
本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物、又はアンチセンス化合物のin vivo合成を指揮するように設計された遺伝性ベクターコンストラクトを含まない。本発明の化合物は、混合し、カプセルに包み、コンジュゲート化し、あるいは他の分子、分子構造体又は化合物の混合物、すなわちリポゾーム；リセプターターゲット分子；取り込み、分配及び／又は吸収を促進する経口剤、直腸剤、局所薬又は他の薬剤、と結合させてもよい。
【００５２】
上記取り込み、分配及び／又は吸収を促進する薬剤の調製を示している代表的な米国特許は、本発明で参考として各々示した、米国特許第５，１０８，９２１号、５，３５４，８４４号、５，４１６，０１６号、５，４５９，１２７号、５，５２１，２９２号、５，５４３，１５８号、５，５４７，９３２号、５，５８３，０２０号、５，５９１，７２１号、４，４２６，３３０号、４，５３４，８９９号、５，０１３，５５６号、５，１０８，９２１号、５，２１３，８０４号、５，２２７，１７０号、５，２６４，２２１号、５，３５６，６３３号、５，３９５，６１９号、５，４１６，０１６号、５，４１７，９７８号、５，４６２，８５４号、５，４６９，８５４号、５，５１２，２９５号、５，５２７，５２８号、５，５３４，２５９号、５，５４３，１５２号、５，５５６，９４８号、５，５８０，５７５号及び５，５９５，７５６号を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のアンチセンス化合物は、薬学的に許容される塩、エステル、当該エステルの塩ン又は他の化合物であって、ヒトを含む動物に投与した場合に、生物学的に活性な代謝物又はその残留物を（直接又は間接に）与えることが可能な化合物であればいかなるものも含有する。従って、例えば、開示もまた、プロドラッグ、本発明の化合物の薬学的に許容される塩、当該プロドラッグの薬学的に許容される塩及び他の生物等価物についてされている。
【００５４】
「プロドラッグ」の語は、体内又は細胞内において、内因性酵素又は他の化学的及び／又は条件によって活性体（すなわち薬物）に変換される不活性体として調製される治療剤を意味する。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグは、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として、１９９３年１２月９日に発行されたＷＯ９３／２４５１０号に開示されたGosselineらの方法、又はＷＯ９４／２６７６４号に開示されたImbachらの方法に従って調製される。
【００５５】
「薬学的に許容される塩」の語は、本発明の化合物の生理的及び薬学的に許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。
【００５６】
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ、アルカリ土類又は有機アミン等の金属又はアミンで形成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。好適なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカイン（例えば、Bergeら、「薬学的塩」、J.of Pharma Sci.,1997,66,119参照）である。
【００５７】
当該酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸体を十分な量の所望の塩基と接触させ、常法により塩を製造することによって調製される。遊離酸体は、塩体を酸と接触させ、常法により遊離酸を分離することにより再生してもよい。当該遊離酸体は、極性溶媒中の溶解性等のある物性の点で、その塩とは若干異なるが、それでも当該塩は、本発明の目的の点ではその遊離酸と等価である。
【００５８】
本発明で使用される「薬学的付加塩」は、本発明の組成物中の一つの成分の酸性型の薬学的に許容される塩を含む。薬学的付加塩は、アミンの有機又は無機酸塩を含む。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の好適な薬学的に許容される塩は、当業者によく知られており、多数の無機及び有機酸の塩基性塩を含む。例えば塩酸、臭化水素、硫酸又はリン酸等の無機酸；酢酸、プロピオン酸、グリオール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サルチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、安息香酸、ニコチン酸又はイソニコチン酸等の有機酸有機カルボン酸、有機スルホニックアシッド、有機スルホアシッドもしくは有機ホスホアシッド又はＮ−置換スルファミン酸；蛋白質合成に用いられるグルタミン酸又はアスパラギン酸等の天然に存在する２０個のα−アミノ酸；フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２もしくは３−ホスホグリセレート、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートを形成している）、又はアスコルビン酸等の他の酸有機化合物が挙げられる。
【００５９】
化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容されるカチオンを用いて調製してもよい。好適な薬学的に許容されるカチオンは、当業者によく知られており、アルカリカチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン及び四級アンモニウムカチオンを含む。カーボネート及び水素カーボネートも使用できる。
【００６０】
オリゴヌクレオチドに関し、薬学的に許容される塩の好適な例は、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジン等のポリアミンなどのカチオンで形成される塩、（ｂ）塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸で形成される酸付加塩、（ｃ）酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等の有機酸で形成される塩、並びに（ｄ）塩素、臭素、ヨウ素等の元素性アニオンから形成される塩を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬、治療薬及び予防薬に、また研究試薬及びキットとして使用される。治療薬については、ＥＬ発現を調節することによって治療され得る病気又は障害を持っていると推定される動物、好ましくはヒトは、本発明のアンチセンス化合物の投与により治療される。本発明のアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の有効量を好適な薬学的に許容される希釈剤又は担体に添加した医薬組成物において使用される。本発明のアンチセンス化合物の使用及び方法は、例えば感染、炎症又は癌腫形成の予防又は遅延のように予防的にも有用である。
【００６２】
本発明のアンチセンス化合物は、研究試薬及び診断薬にも有用である。これは、当該化合物がＥＬをコードする核酸にハイブリダイズし、それによってハイブリダイズを活用するためのサンドイッチアッセイや他のアッセイを簡単に構築できるからである。ＥＬをコードする核酸を用いる本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイーゼーションは、当該分野で知られた手段で検出できる。当該手段は、酵素のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーション、オリゴヌクレオチドの放射性同位体標識又は他の好適な手段ならいかなる手段も含む。試料中のＥＬ濃度の検出手段に使用するキットもまた調製できる。
【００６３】
本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含有する医薬組成物及び薬剤も包含する。本発明の医薬組成物は、局所又は全身治療のいずれが望ましいかにより、また治療される面積により、多数の方法によって投与される。投与は、局所投与（眼科を含む。粘膜については、膣及び直腸送達を含む）、例えば粉末又はエアゾールの吸息又は吸入による肺投与（ネブライザーによる気管内挿管、鼻腔内、表皮性及び経皮性投与を含む）、経口投与又は非経口投与でもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射又は注入；くも膜下、心室内等の神経管内部投与を含む。少なくとも一つの２’−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。
【００６４】
局所投与用の医薬組成物及び薬剤は、経皮性パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、ドロップ、座剤、スプレー、液体及び粉末でもよい。慣用の薬学的担体、水溶性、粉末又は油性原料、増粘剤等は、必須としてもよく、あるいは添加してもよい。被覆コンドーム、グローブ等も有用である。
【００６５】
経口投与用の本発明の組成物及び薬剤は、粉末又は顆粒、水もしくは非水媒体の懸濁液又は溶液、カプセル、袋又は錠を含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散剤又は結合剤は望ましい。
【００６６】
非経口、くも膜下注入、心室内投与用の組成物及び薬剤は、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含んでもよい殺菌水溶液を含むことができる。添加剤は、浸透促進剤、担体化合物及び他の薬学的に許容される担体又は賦形剤に限定されない。
【００６７】
本発明の医薬組成物及び薬剤は、溶液、エマルション及びリポソーム含有剤を含むが、これらに限定されない。当該組成物は、プレフォーム液体、自己乳化固体及び自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない様々な成分から得られてもよい。
【００６８】
本発明の薬剤は、限定されるものでないが、錠剤、カプセル、液状シロップ、軟ジェル、坐剤及び浣腸剤等の多くの可能性のある剤型に製剤化することができる。本発明の組成物は、水、非水又はこれらの混合媒体中で懸濁液しても製剤できる。水溶性サスペンションは、更に、例えばナトリウム・カルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。当該懸濁液はまた、安定化剤を含有してもよい。
【００６９】
本発明の一つの具体例では、医薬組成物は発泡体して製剤化され、使用される。医薬発泡体は、限定されるものではないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ゼリー及びリポソーム等の製剤を含む。当該製剤は基本的には類似した性質を有するが、成分及び最終生成物の粘度は異なる。当該組成物及び製剤の調製は、一般的に医薬及び製剤分野の当業者によく知られており、本発明の組成物の製剤に適用される。
【００７０】
本発明の組成物は、エマルションとして調製又は製剤される。エマルションは、概して、通常、直径０．１μｍを超える水滴の形態で別の液体中に分散されたある液体の不均一系である(Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199； Rosoff, 「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block, 「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al., 「Remingtonの薬科学」,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1985 P.301）。
【００７１】
エマルションは、２相を互いによく混合し、分散した２つの混和液相からなる双相系であることが多い。一般的に、エマルションは、油中水型（w/o）又は水中油型（o/w）である。水相が微細に分配され、微小な水滴として大量の油相に分散される場合に、得られる組成物は油中水型（w/o）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が微細に分配され、微小な溶滴として大量の水相に分散される場合に、得られる組成物は水中油型（o/w）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて、水相、油相中で溶液として、あるいは分離相としてそのものが存在してもよい構成成分を更に含有してもよい。必要に応じて、乳化剤、安定剤、色素及び抗酸化剤等の薬学的賦形剤をエマルションに存在させてもよい。
【００７２】
医薬エマルションは、例えば油中水中油（o/w/o）及び水中油中水（w/o/w）エマルション等の２相以上からなる多エマルションでもよい。当該コンプレックス製剤は、単純な２成分エマルションが有さないある利点を与えることが多い。o/wエマルションの個々の油滴が小さい水滴を取り囲む多エマルションは、w/o/wエマルションを構成する。油滴系と同様に、油中で安定化された水の小球で取り囲まれ、o/w/oエマルションを生成する。
【００７３】
エマルションは熱力学安定性がほとんどないか又全くないことが特徴である。一般に、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相によく分散され、乳化剤又は製剤の粘度によりその形が維持される。エマルション相はいずれも、軟膏及びクリームのエマルション型の場合には半固体又は固体である。エマルションを安定する他の手段は、エマルションの各相に取り込まれることになる乳化剤の使用である。乳化剤は、大まかには、４つのカテゴリー、すなわち合成界面活性剤、天然由来の乳化剤、吸収基材及び微細分散性固体（Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199）に分類される。
【００７４】
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルションの形成に幅広く利用されており、文献（Rieger,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199）に概説されている。界面活性剤は概して両親媒性であり、親水性及び疎水性部分からなる。界面活性剤の疎水性に対する親水性の割合は、親水性に対する脂肪親和性の平衡（ＨＬＢ）と言われ、製剤調製における界面活性剤の分類や選択に有用なツールである。界面活性剤は親水性基、すなわち非イオン、アニオン、カチオン及び両性に基いて異なったクラスに分類される（Rieger,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285）。
【００７５】
エマルション製剤で使用される天然由来の乳化剤は、ラノリン、ビーズワックス、ホスファチド、レクチン及びアカシアを含む。吸収基材は親水性を有し、そのため、水を吸収してw/oエマルションを形成し、更に無水ラノリン及び親水性ワセリン等の半固体性粘度を保持する。微細分散固体はまた、界面活性剤との併用及び粘性調整において特に好適な乳化剤として使用されている。当該固体は、重金属水酸化物等の極性の無機固体；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状アルミニウムシリケート及びコロイド状マグネシウムアルミニウムシリケート等の非膨張粘度；顔料；並びに炭素又はトリステアリン酸グリセリル等の非極性固体を含む。
【００７６】
多数の非乳化材もまた、エマルション製剤に含有され、エマルション特性に寄与している。非乳化材は、脂質、油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料及び抗酸化剤を含む（Block,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199）。
【００７７】
親水性コロイド又は親水コロイドは、ポリサッカライド（例えばアカシア、アガー、アルギン酸、カラギーナン、グアールガム、インドガム及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメシルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）及び合成ポリマー（例えばカーボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）等の天然由来のガム及び合成ポリマーを含む。当該コロイドは、水中で膨張又は分散して、分散相滴の周りに強い界面層を形成し、外相の粘度を向上することによってエマルションを安定化するコロイド溶液をつくる。
【００７８】
エマルションは、たいてい、微生物の成長を確実に後押しする炭水化物、蛋白質、ステロール及びホスファチド等の多数の成分を含むため、当該製剤は保存剤を含有することが多い。エマルション製剤に含有される慣用的な保存剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩酸ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル及びホウ酸を含む。抗酸化剤もまた、通常、製剤の劣化を防ぐためにエマルション製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン等のフリーラジカルスキャヴェンジャー、あるいはアスコルビン酸、ナトリウム・タバイサルファイト等の還元剤、及びクエン酸、酒石酸及びレシチン等の抗酸化共力剤である。
【００７９】
経口及び非経口ルートを経由するエマルション製剤の適用や製造方法は、文献（Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199）に概説されている。経口送達用エマルション製剤は、製剤化の容易さ、吸収効率及びバイオアベイラビリティの点で、非常に幅広く使用されている（Rosoff,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199）。鉱物油系緩下薬、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養食品は、通常、o/wエマルションとして経口投与される材料である。
【００８０】
本発明の一つの具体的では、オリゴヌクレオチド及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤される。マイクロエマルションは、親水性、新油性及び両親媒性系であって、光学的に単一異性体であり、熱力学的に安定な溶液である（Rosoff,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245）。マイクロエマルションは、たいてい、油を界面活性剤水溶液にまず分散し、次いで十分量の第四成分、一般的には中鎖アルコールを加え、透明系をつくることによって得られる系である。そのため、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面層によって安定化される２つの不混和性液体の熱力学的に安定であって、光学的に透明な分散物とも説明されている（Leung and Shah,「薬剤の制御徐放」:「ポリマー及び集合系」,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 1852’5）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤及電解質を含む３〜５の成分を組み合わせて調製される。マイクロエマルションが油中水型（w/o）又は水中油型（o/w）であるかは、使用される油及び界面活性剤の性質により、また界面活性剤分子の極性ヘッド（head）と炭化水素テイル（tail）の構造及び幾何学的充填による（Schott,「Remingtonの薬科学」,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1985 P.271）。
【００８１】
相図を利用する現象的アプローチは大いに研究され、マイクロエマルションの作製方法に関し、当業者に膨大な知識をもたらしている（Rosoff,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335）。慣用されているエマルションと比べると、マイクロエマルションは、自発的に形成される熱力学的に安定な滴の製剤化において、水不溶性薬物を溶解するという利点がある。
【００８２】
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤は、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、すなわち、Brij  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノオレート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセコイオレート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオルエート（ＤＡＯ７５０）、又は共界面活性剤との組み合わせを含むが、これらに限定されない。共界面活性剤、すなわちエタノール、１−プロパノール及び１−ブタノール等の一般的に短鎖アルコールは、界面活性剤分子間に生じる空間のため、界面活性層中に入り、次いで無秩序層を形成することによって界面活性流動性を上げるのに役立つ。
【００８３】
しかしながら、マイクロエマルションは、共界面活性剤を使用せずに調製してもよく、アルコールが存在しない自己乳化系は当該分野で知られている。水相は、典型的には、水、薬物、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコールの誘導体の水溶液であるが、これらに限定されない。
【００８４】
油相は、Captex  ３００、Captex  ３５５、Capmul  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ−、ジ−及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコシドグリセリド、飽和ポリグリコシドＣ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油等の材料を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
マイクロエマルションは、薬物の安定化及び薬物の吸収増加の点から、特に興味深いものである。脂質系マイクロエマルション（o/w及びw/o）は、ペプチドを含む経口バイオアベイラビリティを向上させると提案されている（Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.clin.Pharmacol.,1993,13,205）。マイクロエマルションは、薬物の安定性を向上させ、薬物を酵素的加水分解から保護し、薬物吸収を増加させ、調製が容易で、固体剤型以上に経口投与が容易で、臨床能力を改善し、及び毒性の低減という利点を有する（Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Hoe et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143）。
【００８６】
マイクロエマルションの構成成分が室温で接触すると、通常、マイクロエマルションは自然発生的に生成する。このことは、熱不安定薬物、ペプチド又はオリゴヌクレオチドの製剤化に特に利益がある。マイクロエマルションはまた、化粧料及び医薬のいずれの利用においても活性成分の経皮的送達に効果的である。本発明のマイクロエマルション及び製剤は、オリゴヌクレオチド及び核酸の胃腸管からの向上した系統的吸収を更に促進し、胃腸管、膣、口腔及び他の投与部位内で、オリゴヌクレオチド及び核酸の部分的細胞取り込みを改善するだろう。
【００８７】
本発明のマイクロエマルションはまた、ソルビタンモノステアレート（Grill  ３）、すなわち、ラブラソール等の付加成分及び添加物、並びに製剤性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を高める浸透促進剤を含有してもよい。本発明のマイクロエマルションで使用される浸透促進剤は、おおよそ５つのカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート性非界面活性剤の中の一つに属するものとして分類される（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92）。当該クラスの各々については上述した。
【００８８】
＜リポソーム＞
薬物の製剤用に研究され、使用されているマイクロエマルションに加えて、組織化された界面活性剤構造物が多数ある。これらは、単層、ミセル、二重層及び小胞を含む。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点から、それが提供する特異性及び作用時間のため大いに興味が持たれている。本発明で使用される「リポソーム」の語は、球状の単層又は二重層に配列された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【００８９】
リポソームは、親油性物質及び水溶性内部から形成される膜を有する単層又は二重層の小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁に効果的に融合することはできないが、in vivoでマクロファージによって吸収される。
【００９０】
全ての哺乳類の皮膚に浸透するためには、脂質小胞は、適当な経皮性勾配に影響されながら、直径が各々５０ｎｍ以下である一連の細孔を通過する必要がある。そのため、変形可能性が高く、該細孔を通過できるリポソームを使用することが望ましい。
【００９１】
リポソームは更なる利点として、天然由来のリポソームは生物適合的及び生物分解的である；リポソームは多数の水溶性及び脂溶性薬物を取り込める；リポソームはカプセル化した薬物をその内部中に存在させて代謝及び劣化から保護できる、ことが含まれる（Rosoff,「医薬剤形」, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245）。リポソーム製剤の調製には、リポソームの脂質表面電荷、小胞及び水性体積を考慮することが重要である。
【００９２】
リポソームは、活性成分を活性部位に輸送及び送達するために有用である。リポソーム膜は構造的には生物膜と類似しているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜に融合し始める。リポソームと細胞との融合が進むと、リポソームの内容物は空になり、活性薬剤が作用する細胞となる。
【００９３】
リポソーム製剤は、多くの薬物のデリバリーシムテムとして膨大な研究の対象となっている。局所投与に関しては、リポソームは他の製剤以上の種々の利点を有する。当該利点は、投与薬物の高い系統的な吸収、投与薬物の所望の標的への蓄積の増大、並びに親水性及び疎水性の幅広い薬物を皮内に投与する能力に関連する低副作用を含む。
【００９４】
高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮内に送達するリポソーム能力を詳述した報告がいくつかある。鎮痛薬、抗生物質、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大多数は上表皮への投与である。
【００９５】
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正電荷リポソームであり、負電荷ＤＮＡ分子と相互作用して安定なコンプレックスをつくる。正電荷ＤＮＡ−リポソームコンプレックスは、負電荷細胞表面に結合し、エンドソームに吸収される。エンドソームの酸性ｐＨのため、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する（Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985）。
【００９６】
リポソームは、ｐＨ感受性又は負電荷を帯び、コンプレックスよりもむしろＤＮＡをリポソーム中に取り込む。ＤＮＡ及び脂質は同様に電荷されているので、コンプレックス形成よりも反発が起こる。それにも関わらず、リポソームの水性内部にトラップされるＤＮＡもある。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、培養液中の細胞単層に送達するのに用いられている。外因性遺伝子の発現は標的細胞中で検出される（Zhou et al.,Journal of Controlled Release,1992,19,269-274）。
【００９７】
リポソーム組成物の一つの主なタイプは、天然の由来のホスファチジルコリンよりもリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えばジミリストイル  ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイル  ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から作られる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的にジミリストイル  ホスファチジルグリセロールから作られるが、アニオン性リポソームは、にディオレオイル  ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から作られる。リポソーム組成物の他のタイプは、例えば大豆ＰＣ及び卵ＰＣ等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から作られる。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から作られる。
【００９８】
リポソーム薬物の皮膚への局所送達を評価した研究もいくつかある。インターフェロン含有リポソームをギニアピッグの皮膚へ適用すると、他の手段（例えば溶液又はエマルション）ではインターフェロンの効果が認められないのに対し、皮膚のヘルペス痛を減じた（Weiner et al.,Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410）。更に、水溶系を用いるインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの効果を試験した研究もあり、リポソーム製剤は水溶性投与よりも優れていると結論付けている（du Plessis et al.,Antiviral Research,1992,18,259-265）。
【００９９】
非イオン性リポソーム系もまた、薬物の皮膚への送達、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含有する系、の有用性を決定するために試験されている。ノヴァゾーム（登録商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びノヴァゾーム（登録商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含有する非イオン性リポソーム製剤は、シクロスポリン−Ａをマウスの皮膚の真皮に送達するために使用された。当該非イオン性リポソーム系は、皮膚の異なった層にシクロスポリン−Ａの沈着を促進する点で効果がある（Huet al.,S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466）。
【０１００】
リポソームは、本発明で使用される「立体的に安定な」リポソームも含む。これは、１以上の安定な脂質を含むリポソームを言い、当該脂質がリポソームに取り込まれると、当該特定の脂質を欠いたリポソームに比べて、循環ライフタイムが促進される。立体的に安定なリポソームの例としては、当該リポソームの小胞形成脂質部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧM1等の１以上の糖脂質を含むか、あるいは（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１以上の親水性ポリマーから誘導されるリポソームが挙げられる。特別な理論的根拠はないが、当該分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン又はＰＥＧ由来脂質を含む立体的に安定なリポソームに関しては、立体的に安定なリポソームの促進された循環ライフタイムは、細網内皮系（ＲＥＳ）細胞への低取り込みに起因する、と考えられる（Allen et al.,FEBS Letters,1987,223,42;Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765）。
【０１０１】
１以上のガングリオシドを含む種々のリポソームは当該分野で知られている。Papahadjopoulosらは、モノシアロガングリオシドＧM1、ガラクトセレプロシド硫酸塩及びホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期改善能力について報告している（Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64）。当該知見は、Gabizonらによって支持されている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1988,85,6949）。米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４号はいずれも、Allen et al.によるものだが、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシド  Gjor、すなわちガラクトセレブロシド  サルフェートエステルを含有するリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al.）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９号に開示されている（Limet al.）。
【０１０２】
１以上の親水性ポリマーから誘導される脂質を含む多くのリポソーム及びその製造方法は当該分野で知られている。Sunamoto et al.（Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性洗剤、すなわち２Ｃ12１５Ｇを含有するリポソームについて記載している。
【０１０３】
Illum et al.（FEBS Lett.,1984,167,79）は、ポリスチレン粒子のポリマー性グリコールによる水性コーティングは、血中半減期を有意に増加することを記述している。
【０１０４】
ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシ基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Sears（米国特許第４，４２６，３３０号及び４，５３４，８９９号）によって説明されている。
【０１０５】
Klibanov et al.（FEBS Lett.,1990,268,235）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートから誘導されるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期を有意に増加することを説明する実験を記載している。
【０１０６】
Blume et al.（Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91）は、上記の知見を他のＰＥＧ誘導リン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから得られるＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げている。その外面上に共有結合ＰＥＧ部分を有するリポソームは、Fisherによる欧州特許第ＥＰ  ０４４５１３１  Ｂ１及びＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。
【０１０７】
ＰＥＧから誘導されるＰＥを１〜２０モル％含むリポソーム組成物及びその使用方法は、Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号及び５，３５６，６３３号）及びMartin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第ＥＰ  ０４９６８１３  Ｂ１）に記載されている。多数の液体ポリマーのコンジュゲートを含むリポソームは、ＷＯ９１・０５５４５号、米国特許第５，２２５，２１２号（共にMartin et al.）及びＷＯ９４／２００７３号（Zalipsky et al.）。
【０１０８】
ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Choi et al.）に記載されている。
【０１０９】
米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al）及び５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）は、その表面上の官能基で更に誘導されるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０１１０】
核酸含有リポソームの中には、当該分野で知られているものもある。ThierryらのＷＯ９６／４００６２号は、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化する方法を開示している。Tagawaらの米国特許第５，２６４，２２１号は、蛋白質結合リポソームを開示しており、当該リポソームの内容はアンチセンスＲＮＡを含んでもよいことを主張している。
【０１１１】
Rahmanらの米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化するある方法を開示している。LoveらのＷＯ９７／０４７８７号は、ラフ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。
【０１１２】
トランスファーソームは、また別のタイプのリポソームであり、高い変形可能性脂質集合体であって、薬物送達媒体にとって魅力的な候補である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載され、その高い変形可能性から、当該小滴よりも小さい細孔を容易に通過できる。トランスファーソームは、それが使用される環境に適応可能である。例えば、自己最適（皮膚上の細孔の形に順応）や自己修復、切断せずに頻繁に標的に到達したり、よく自動装填したりすることが挙げられる。トランスファーソームは、表面先端活性化剤、通常界面活性剤であるが、を標準リポソーム組成物に添加することにより作製できる。トランスファーソームは、血漿アルブミンを皮膚に送達するのに使用される。血漿アルブミンのトランスファーソームを媒介とする送達は、血漿アルブミンを含む溶液の皮下注射が効率的であることが判っている。
【０１１３】
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）やリポソームの製剤化に幅広く利用されている。多くの異なったタイプの界面活性剤、天然及び合成のいずれも含むが、の性質を分類及び評価する最も一般的な方法は、親水性に対する親油性の平衡（ＨＬＢ）を利用することである。親水性基（「head」としても知られている）の性質は、製剤化に使用できる異なった界面活性剤の分類に最も有用な手段である（Rieger,「医薬剤形」, arcel Dekker,Inc.,New York,N.Y,1988,p.285）。
【０１１４】
界面活性剤分子がイオン性でなければ、非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に幅広く利用されており、幅広いｐＨ値で使用可能である。一般的に当該ＨＬＢ値は、その構造により２〜１８の範囲である。非イオン性界面活性剤は、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、シュークロースエステル及びエトキシ化エステル等の非イオン性エステルを含む。脂肪酸アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコール及びエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミド及びエステルもこの分類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の最も一般的なものである。
【０１１５】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散されているときに負電荷を運ぶならば、当該界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤は、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド等のカルボキシレート；アルキルサルフェート及びエトキシ化アルキルサルフェート等の硫酸エステル；アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート及びアシルタウトレート等のスルホネート；及びホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤の最も重要なものは、アルキルサルフェート及び石鹸である。
【０１１６】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散しているときに正電荷を運ぶならば、当該界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤は四級アンモニウム及びエトキシ化アミンを含む。四級アンモニウムは、カチオン性界面活性剤の中で最もよく使用されるものである。
【０１１７】
界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを運ぶ能力を有するならば、当該界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤はアクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドを含む。
【０１１８】
医薬品、医薬製剤及びエマルションにおける界面活性剤の使用が記載されている（Rieger,「医薬剤形」，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，p.285）。浸透促進剤。
【０１１９】
一つの具体例では、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドを動物の皮膚に効果的に送達する種々の浸透促進剤を使用する。ほとんどの薬物は、溶液中にイオン性及び非イオン性の形で存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性薬物のみが細胞膜を容易に通過する。通過する細胞膜が浸透促進剤で処理されているならば、非親油性薬物だけが細胞膜を通過できることが判っている。非親油性薬物の細胞膜への拡散に加えて、浸透促進剤は親油性薬物の透過も促進する。
【０１２０】
浸透促進剤は、５つのおおよそのカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート非界面活性剤の中の一つに属するように分類してもよい（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92）。上述の分類の浸透促進剤について、それぞれ以下により詳述する。
【０１２１】
＜界面活性剤＞
本発明に関連して、界面活性剤（又は「表面活性剤」は化学的構成要素であって、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、又は水溶液と他の液体との間の界面張力を減じ、粘膜を通過してオリゴヌクレオチドの吸収を促進する。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、浸透促進剤は、例えばラウリルサルフェートナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92）、並びにＦＣ−４３等のパーフルオロ化学エマルション（Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252）を含む。
【０１２２】
＜脂肪酸＞
浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸及びその誘導体は、例えばオレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸(ｎ−デカリン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ラセミ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール  １−モノヒドレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、これらのＣ1-10アルキルエステル（例えばメチル、エチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、並びにモノ−、ジ−及びトリ−グリセリド（例えばオレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、ステアレート、リノレート等）を含む（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92；Muranishi，「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1990,7,1-33；Hariri et al.,Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654）。
【０１２３】
＜胆汁酸塩＞
胆汁の生理学的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を含む（Brunton，第38章，「Goodman & Gilmanの治療学の薬学的基礎」，第９版，Hardman著，McGraw-Hill，ニューヨーク，1996,pp.934-935）。種々の天然胆汁酸塩及びその合成誘導体は浸透促進剤として働く。従って、「胆汁酸塩」の語は、天然由来の胆汁成分及びその合成誘導体のいずれも含む。
【０１２４】
本発明の胆汁酸塩は、例えばコリン酸（又は薬学的に許容される塩）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92；Swinyard，第３章，「Remingtonの薬科学」，第18版，Gennaro著，Mack Publishing社，Easton,ＰＡ,1990,pages 782-783；Muranishi，「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583）。
【０１２５】
＜キレート剤＞
本発明で関連して使用されるキレート剤は、コンプレックスを形成して溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通してオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物と定義される。本発明でキレート剤を浸透促進剤として使用する点に関し、キレート剤は、主なＤＮＡヌクレアーゼのほとんどが、触媒として二価金属イオンを必要とし、そのため、ＤＮＡヌクレアーゼがキレート剤によって阻害される（Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339）のと同様に、ＤＮアーゼ阻害剤としても働く利点を加える。
【０１２６】
本発明のキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サルチル酸塩（例えばサルチル酸ナトリウム、５−メトキシサルチル酸及びホモヴァニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,p.92；Muranishi，「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control.Rel.,1990,14,43-51）含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
＜非キレート非界面活性剤＞
ここで使用される非キレート非界面活性剤浸透促進剤化合物は、キレート剤又は界面活性剤としては大した活性を有さないにもかかわらず、消化器系粘膜を通してオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物と定義される（Muranishi，「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1990,7,1-33）。この類の浸透促進剤は、例えば不飽和環状尿素、１−アルキル−；並びにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾン等の１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Lee et al.,「治療薬物送達システムの批判的な批評」,1991,page 92）及び非ステロイド性抗炎症剤（Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626）を含む。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドの取り込みを細胞レベルで促進する薬剤は、本発明に医薬組成物及び他の組成物として添加されてもよい。例えばリポフェクチン（Junichi et al.,米国特許第５，７０５，１８８号）等のカチオン性脂質、カチオン性グルセロール誘導体及びポリリシン（Lollo et al.,ＰＣＴ出願  ＷＯ９７／３０７３１号）等のポリカチオン性分子も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを促進することが知られている。
【０１２９】
他の薬剤、例えばエチレングリコール、プリピレングリコール等のグリコール、２−ピロール等のピロール、アゾン、リモネン及びメントーン等のテルペン、を投与された核酸の侵入を促進するために使用してもよい。
【０１３０】
＜担体＞
本発明のある組成物は、本製剤中に担体化合物を含有してもよい。ここで使用される「
担体化合物」又は「担体」は、核酸又はそのアナローグである。すなわち、不活性（すなわち、それ自体生物学的活性を有さない）であるが、in vivoで生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低減するプロセス、例えば生物学的に活性な核酸を失活させる、あるいは当該核酸をサイクルから取り除くことによって核酸として認識されるものである。通常、担体化合物を過剰に用いる核酸及び担体化合物の同時投与は、おそらく共通のリセプターに対する担体化合物と核酸との競争のため、肝臓、又は他の余分のリザーバに見られる核酸の量を実質的に低減することができる。例えば、肝臓組織におけるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの部分的な回収は、ポリイノシン酸、デキストランサルフェート、ポリシチジン酸又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’ジスルホン酸と同時投与すると、減少する（Miyao et al.,Antisense Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura et al.,Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183）。
【０１３１】
＜賦形剤＞
担体化合物と比べると、「薬学的担体」又は「賦形剤」は、薬学的に許容される溶媒であって、動物に１以上の核酸を送達する薬剤又は他の薬学的に不活性な媒体を懸濁する溶媒である。賦形剤は、液体でも固体でもよく、また核酸や本医薬組成物の他の構成成分を組み合わせた場合に、所望のバルク、粘度等を提供できるように考慮された投与方式と併せて選択される。
【０１３２】
通常の医薬担体は、結合剤（例えば未ゼラチン化とうもろこしでんぷん、ポリビニルピロリドン又はマイクロクリスタリンセルロース等）；フィラー（例えばラクトース及び他の糖、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム等）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えばでんぷん、ナトリウムでんぷんグリコシレート等）；及び湿潤剤（例えばナトリウムラウリルサルフェート等）を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機賦形剤であって、核酸と有害に反応しない賦形剤も、本発明の組成物の製剤化に使用できる。好適な薬学的に許容される担体は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
核酸に局所投与用製剤は、滅菌又は非滅菌水溶液、アルコール等の標準的溶媒又は核酸の液体もしくは固体油基材溶液を含んでもよい。当該溶液もまた、緩衝液、希釈剤及び他の好適な添加剤を含んでもよい。非経口投与に好適な薬学的に許容される有機又は無機賦形剤であって、核酸と有害に反応しない賦形剤を使用できる。
【０１３５】
好適な薬学的に許容される賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含むが、これらに限定されない。他の構成成分。
【０１３６】
本発明の組成物は、更に、医薬組成物に通常見受けられる他の添加成分を、当該分野で実施されている使用レベルで含んでもよい。例えば、当該組成物は、添加可能で、相性がよく、医薬活性な成分、例えば止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬又は抗炎症剤を含んでもよく、あるいは本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤化するのに有用な添加成分、例えば芳香剤、保存料、抗酸化剤、増粘剤及び安定剤、を含んでもよい。しかしながら、かかる成分は、当該成分を加える場合には、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に邪魔しないようにする必要がある。当該製剤は殺菌し、もし必要ならば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、色素、香料及び／又は芳香性物質等の補助剤であって、製剤の核酸と有害に反応しない補助剤と混合してもよい。
【０１３７】
水性懸濁液は、例えばナトリウム・カルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストラン等の懸濁粘度を高める物質を含んでもよい。当該懸濁液は、また安定剤を含んでもよい。
【０１３８】
本発明のある具体例としては、（ａ）１以上のアンチセンス化合物及び（ｂ）非アンチセンス機構で作用する１以上の他の化学療法剤を含む医薬組成物を提供する。かかる化学療法剤は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドクソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェン・マスタード、クロランビシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストール（ＤＥＡ）等の抗癌剤を含むが、これらに限定されない。一般的には、「メルクの診断薬及び治療薬マニュアル,15版,Berkowら著,1987,Rahway,,N.J.,pages 1206-1228を参照。非ステロイド性抗炎症剤及びコルチコステロイドに限定されない抗炎症剤、並びにリビヴィリン、ヴィダラビン、アシクロビル及びガンチクロビルに限定されない抗菌剤も、本発明の組成物中に混合してもよい。一般的には、「メルクの診断薬及び治療薬マニュアル」,15版、Berkowら著,1987，Rahway,N.J.,pages 2499-2506及び46-49をそれぞれ参照。２以上の化合物を組み合わせる場合には、同時に又は連続して使用できる。
【０１３９】
別の関連した具体例としては、本発明の組成物は、１以上のアンチセンス化合物、特に最初の核酸を標的とするオリゴヌクレオチド及び２番目のターゲット核酸を標的とする１以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。アンチセンス化合物の多数の例は当該技術で知られている。２以上の化合物を組み合わせる場合には、同時に又は連続して使用できる。
【０１４０】
治療薬組成物の製剤及びそれに続く投与は、当業者が有していると考えられる。投与量は、数日から数ケ月あるいは治療効果が認められるまで又は疾患状態が軽減されるまで続く治療経過で、治療される疾患状態の重度や感応性による。最適な投与スケジュールは、患者の身体に蓄積した薬物の測定により計算できる。当業者であれば容易に最適な投与量、投薬方法及び反復速度を決定できる。最適な投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性によって変化するが、一般的には、in vitro及びin vivo動物モデルにおいて効果が認められるＥＣ50値に基いて見積られる。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇ当り、０．０１μｇ〜１００ｇであり、日、週、月又は年に１回以上、あるいは２〜２０年に１回投薬される。当業者であれば、測定された滞留時間及び体液又は組織中の薬物濃度に基いて投薬反復速度を容易に見積ることができる。成功した治療法によれば、患者に疾患状態の再発を避けるための維持療法を体験させることが望ましい。すなわち、オリゴヌクレオチドが、体重１ｋｇ当り、０．０１μｇ〜１００ｇの範囲、１日に１回以上から２０年に１回の範囲の維持量で投与される治療法である。
【０１４１】
本発明は、特定の好ましい具体例に従って記述してきたが、以下の実施例は本発明を説明するにすぎず、これに限定されるものではない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成用ヌクレオチドホスホラミデート
【０１４３】
デオキシ及び２’−アルコキシアミデート
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミデートは、市販品として入手した（例えばChemgenes，Needham MA又は Glen Research,Inc.Sterling VA）。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオチドアミデートは、ここに参考として記載した米国特許第５，５０６，３５１号に記載に準じて調製した。２’−アルコキシアミデートを用いて合成されるオリゴヌクレオチドについては、非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルは、テトラゾール及び塩基のパルス伝達が３６０秒に増加された後に待機ステップを省いて使用した。
【０１４４】
５−メチル−１’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホラミデート（Sanghviet al.,「核酸研究」，1993,21,3197-3203）を用いる公知の方法に従って合成した。
【０１４５】
２’−フルオロアミデート
【０１４６】
２’−フルオロデオキシアデノシンアミデート
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、前記（Kawasaki et al,J.Med.Chem., 1993,36,
831-841）及びここに参考として示した米国特許第５，６７０，６００号に従って合成した。簡単に言えば、保護ヌクレオチドＮ６−ベンソイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデニンは、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発原料として用い、２’−α−フッ素原子を２’−β−トリチル基のＳN２−置換によって導入する文献方法を少し変更して合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは、３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として定量的かつ選択的に保護した。当該ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は、標準的方法論を用い、標準的方法を使用して５’−ジメトキシトリシル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホラミデート中間体を得た。
【０１４７】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンは、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使用し、中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに変換した。ＴＰＤＳ基を脱保護した後、水酸基をＴＨＰで保護し、ジイソブチリルジＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的Ｏ−脱アセチル化オリゴヌクレオチド及びトリフレート化の後、フッ素によって租生成物を処理し、該ＴＨＰ基を脱保護した。標準的方法論を使用して５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホラミデートを得た。
【０１４８】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンは、２，２’アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンで処理する文献方法の変更によって合成した。標準的方法を使用して５−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホラミデートを得た。
【０１４９】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは、２’−デオキシ−２−フルオロウリジンのアミノ化の後、選択的保護によりＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得ることによって合成した。標準的な方法を使用して５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３−ホスホラミデートを得た。
【０１５０】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミデート
２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオチドアミデートは、以下のようにしてあるいはMartin,P.,Helvetica Chimica Acta,1995,78,486-504の方法に従って調製した。
【０１５１】
２，２’−アンヒドロ[１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）]−５−メチルウリジネル
５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ、銚子、日本から市販されている）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）及び炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。当該混合物を攪拌しながら沸騰するまで加熱し、発生した二酸化炭素ガスを制御された方法で放出した。１時間後、薄黒色溶液を減圧下濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）に攪拌しながら注いだ。生成物はガム状となった。エーテルをろ過し、残渣を少量のメタノール（約４００ｍＬ）で溶解した。当該溶液を新たなエーテル（２．５ｍＬ）に注ぎ、固いガムを得た。そのエーテルをろ過し、ガムを真空乾燥機（６０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）乾燥し、薄黄褐色粉体に粉砕される固体を得た。当該固体は別の反応に使用できる（又は酢酸エチル中のメタノールを１０〜２５％変化させるカラムクロマトグラフィーにより更に精製して、白色固体を得てもよい）。
【０１５２】
２−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−Ｍトキシエチル）ホウ酸エステル（２３１ｇ、０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌステンレス鋼減圧容器に加え、１６０℃に予熱したオイルバス中に置いた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、当該容器を開き、溶液を濃縮して乾燥し、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で溶解した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）で懸濁した。不溶性塩をろ過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、ろ液を濃縮した。残渣（２８０ｇ）をＣＨ3ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解し、濃縮した。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を０．５％Ｅｔ3ＮＨを含むＣＨ2Ｃｌ2／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）に充填した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（２５０ｍＬ）に溶解し、カラムに付す前にシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を装填溶媒で希釈し、標題化合物を得た。本化合物は、不純物分画を再精製すると更に得られた。
【０１５３】
２−Ｏメトキシエチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）はピリジン（２５０ｍＬ）で共濃縮し、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第一分を加え、当該混合物を室温で１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ、０，２７８Ｍ）の第二分を加え、反応混合物を更に１時間攪拌した。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を反応に加えた。溶媒を濃縮し、ＣＨ3ＣＮ（２００ｍＬ）で溶解した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１．５Ｌ）で溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3  ５００ｍＬで２回、飽和ＮａＣｌ  ５００ｍＬで２回抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を３．５ｋｇシリカゲルカラムに付し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出して精製した。純粋な分画を濃縮し、標題化合物を得た。
【０１５４】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（ＤＭＦ  ５６２ｍＬ及びピリジン  １８８ｍＬから得られる３：１混合物７５０ｍＬ）及び無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を混合し、室温で２４時間攪拌した。反応は、まずＴＬＣサンプルにＭｅＯＨを加えて反応を止め、ＴＬＣによりモニターした。反応の終結はＴＬＣで判断し、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合物を３５℃で濃縮した。残渣をＣＨＣｌ3（８００ｍＬ）に溶解し、飽和炭酸ナトリウム  ２００ｍＬで２回、飽和ＮａＣｌ  ２００ｍＬで２回抽出した。水層をＣＨＣｌ3  ２００ｍＬで再度抽出した。併せた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して残渣を得た。当該残渣を３．５ｋｇシリガゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／へキサン（４：１）で溶出した。純粋な生成物分画を濃縮し、標題化合物を得た。
【０１５５】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
第一溶液は、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１１４Ｍ）をＣＨ3ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解することによって調製し、保存した。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）のＣＨ3ＣＮ溶液（１Ｌ）に加え、−５℃に冷却し、オバーヘッド・スターラー（overhead stirrer）を使って０．５時間攪拌した。ＰＯＣｌ3を３０分間かけて一滴ずつ加え、攪拌溶液を０〜１０℃に保持し、得られた混合物を更に２時間攪拌した。当該溶液に、第一溶液を４５分間かけて一滴ずつ加えた。得られた反応混合物を低温室で一晩保存した。塩を反応混合物からろ過し、その溶液を濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性塩をろ過によって除いた。ろ液をＮａＨＣＯ3  ３００ｍＬで１回及び飽和ＮａＣｌ  ３００ｍＬで２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃで溶かし、標題化合物を得た。
【０１５６】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ4ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室温で２時間攪拌した。当該ジオキサン溶液を濃縮し、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬで２回）共沸した。残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し、２Ｌのステンレス鋼減圧容器に移した。ＮＨ3ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、当該容器を２時間かけて１００℃まで加熱した（ＴＬＣは完全に反応が終了したことを示した）。当該容器の内容を乾燥するまで濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を濃縮し、標題化合物を得た。
【０１５７】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、安息香酸無水物（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌後、ＴＬＣにより反応が約９５％完了していた。溶媒を濃縮し、残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸した。当該残渣をＣＨＣｌ3（７００ｍＬ）で溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3（３００ｍＬで２回）及び飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬで２回）で抽出し、上で乾燥し、濃縮して残渣を得た。残渣は１．５ｋｇのシルカカラムを使って、ＥｔＯＡｃ／へキサン（１：１）でクロマトグラフした。純粋な生成物分画を濃縮し、標題化合物を得た。
【０１５８】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミデート
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解した。テトラゾール  ジイソプロピルアミン（７．１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を、窒素雰囲気下、攪拌しながら加えた。当該反応混合物を室温で２０時間攪拌した（ＴＬＣは９５％の反応完了を示した）。当該反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ3（３００ｍＬで１回）及び飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬで３回）抽出した。水層を更にＣＨ2Ｃｌ2（３００ｍＬ）で抽出し、抽出物を併せ、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。得られた残渣は、１．５ｋｇのシルカカラムを使って、ＥｔＯＡｃ／へキサン（３：１）でクロマトグラフした。純粋な分画を併せ、標題化合物を得た。
【０１５９】
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシド  アミデート及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシド  アミデート
【０１６０】
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシド  アミデート
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシド  アミデート［当該分野では、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシド  アミデートとしても知られている］は、次の段落に記載のようにして調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミデートは、環外アミンがアデノシン及びシチジンの場合にはベンゾイル部分で保護され、グアノシンの場合にはイソブチリル部分で保護されることを除いて、チミジン（５−メチルウリジン）と同様にして調製される。
【０１６１】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Pro.Bio.Sint.,Varese,Italy,１０．０ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３ｅｑ.、０．００５４ｍｍｏｌ）を、室温で窒素雰囲気下、メカニカルスターラーで攪拌しながら、乾燥ピリジン（５００ｍＬ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ.、０．４５８ｍｍｏｌ）を１回で加えた。反応は室温で１６時間行った。ＴＬＣ（Ｒｆ値０．２２、酢酸エチル）は反応完了を示した。当該溶液を減圧濃縮し、固い油を得た。これをジクロロメタン（１Ｌ）及び飽和炭酸ナトリウム（１Ｌで２回）及び飽和食塩水に分配した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下に濃縮し、固い油を得た。当該油を酢酸エチル及びエチルエーテルの１：１の混合溶媒（６００ｍＬ）に溶解し、溶液を−１０℃まで冷却した。得られた結晶生成物をろ過によって集め、エチルエーテル（２００ｍＬで３回）で洗浄し、乾燥し（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）、白色固体を得た。
【０１６２】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌステンレス鋼の非攪拌型減圧反応容器に、ボランのテトラヒドロフラン（１．０Ｍ、２．０ｅｑ.、６２２ｍＬ）溶液を加えた。最初に、エチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰）を、ヒュウーム・フードの中、手動で攪拌しながら、水素ガスの放出が弱まるまで注意深く加えた。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１ｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３ｅｑ.）を手動攪拌しながら加えた。反応容器を遮光し、オイルバス中で内温が１６０℃になるまで加熱し、その後１６時間保持した（圧は１００ｐｓｉｇ未満）。反応容器を室温まで冷却し、開いた。ＴＬＣ（所望の生成物はＲｆ値０．６７、アラ−Ｔ−副生成物はＲｆ値０．８２、酢酸エチル）は、約７０％生成物に変換していることを示した。更なる副反応物の生成を防止するべく、反応を停止し、エチレングリコールを除去するために使用される過激な条件下、熱水浴（４０〜１００℃）中で減圧（１０〜１ｍｍＨｇ）下にて濃縮した。（あるいは、低沸点溶媒を一旦除いた後、残留溶液を酢酸エチル及び水に分散した。生成物は有機相に存在する。）当該残渣をカラムクロマトグラフィー（２ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン  グラジュエント  １：１〜４：１）で精製した。適切な分画を集め、溶媒を留去し、乾燥し、出発物質が混入した白色のサクサクした泡、及び純粋な再利用可能な出発物質を得た。
【０１６３】
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）をトリフェニルホスフィン（１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、これをＰ2Ｏ5上で高減圧下、４０℃で２日間乾燥した。反応混合物にアルゴンを噴霧し、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ、アルドリッチ、固くシールされたボトル）を加え、透明な溶液を得た。ジエチル−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を当該反応混合物に一滴ずつ加えた。添加速度は、得られる濃赤色が次の一滴を加える前に消失するように保持した。添加が完了した後、反応物を４時間攪拌した。その時までに、ＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）が反応の完了を示した。溶媒を減圧下濃縮した。得られた残渣は、フラッシュカラムに付し、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出し、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡として得た。
【０１６４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（４．５ｍＬ）に溶解し、メチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０〜０℃で一滴ずつ加えた。１時間後、混合物をろ過し、ろ液を冷却ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄し、併せた有機相を水、飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。当該溶液を濃縮し、２−Ｏ（アミノオキシエチル）チミジンを得、次いでＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）に溶解した。ここに、ホルムアルデヒド（２０％水溶液、w/w、１．１ｅｑ.）を加え、得られた混合物を１時間攪拌した。溶媒を減圧下留去し、残渣をクロマトグラフィーに付し、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡として得た。
【０１６５】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を１Ｍ  ピリジニウム・ｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）の乾燥ＭｅＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）に溶解した。この溶液にナトリウム・シアノボロハイドリド（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を、不活性ガス雰囲気下、１０℃で加えた。反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。反応容器をアイスバスから除き、室温で２時間攪拌した後、ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨのＣＨ2Ｃｌ2溶液）で反応をモニターした。ＮａＨＣＯ3水溶液（５％、１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２０ｍＬで２回）で抽出した。酢酸エチル相を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、乾燥するまで濃縮した。
【０１６６】
当該残渣を１Ｍ  ＰＰＴＳのＭｅＯＨ溶液（３０．６ｍＬ）で溶解した。ホルムアルデヒド（２０％、w/w、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合物をアイスバスで１０℃に冷却し、ナトリウム・シアノボロハイドライド（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。１０分後、反応混合物をアイスバスから除き、室温で２時間攪拌した。反応混合物に５％ＮａＨＣＯ3溶液（２５ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２５ｍＬで２回）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、乾燥するまで濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、５％ＭｅＯＨのＣＨ2Ｃｌ2溶液で溶出し、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを泡として得た。
【０１６７】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミン  トリハイドロフロリド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、ＫＯＨ上で乾燥）に溶解した。次いで、当該トリエチルアミン−２ＨＦの混合物を５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に加え、室温で２４時間攪拌した。反応はＴＬＣ（５％ＭｅＯＨのＣＨ2Ｃｌ2溶液）でモニターした。溶媒を真空下留去し、残渣をフラッシュカラムに付し、１０％ＭｅＯＨのＣＨ2Ｃｌ2溶液で溶出し、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た。
【０１６８】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）をＰ2Ｏ5上で、高真空下４０℃で乾燥した。次いで、無水ピリジン（２０ｍＬ）で共沸した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下、ピリジン（１ｍＬ）で溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、４，４−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、反応混合物を室温で出発物質が全て消えるまで攪拌した。ピリジンを真空下留去し、残渣をクロマトグラフし、１０％ＭｅＯＨのＣＨ2Ｃｌ2溶液（ピリジン数滴を含む）で溶出し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た。
【０１６９】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスラミデート］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）で共沸した。当該残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン  テトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を加え、Ｐ２０上で、高真空下一晩４０℃で乾燥した。反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）で溶解し、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ1，Ｎ1−テトライソプロピルホスホラミデート（２．１２ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間、不活性ガス雰囲気下攪拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル  １：１）でモニターした。溶媒を留去し、次いで残渣を酢酸エチル（７０ｍＬ）で溶解し、５％ＮａＨＣＯ3（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフ（酢酸エチルで溶出）し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスラミデート］を泡として得た。
【０１７０】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシド  アミデート
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシド  アミデート［当該分野では、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシド  アミデートしても知られている］は、以下の段落に記載のようにして調製した。アデニン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミデートは同様にして調製した。
【０１７１】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデート］
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン  アナローグは、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化によって得てもよい。数グラム量のジアミノプリンリボシドは、シェリング（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）ＡＧ（ベルリン）から市販されており、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを少量の３’−Ｏ−異性体と共に与える。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを還元し、アデノシンデアミナーゼ処理によって、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換した（McGee,D.P.C.,Cook,P.D.,Guinosso,C.J.,ＷＯ９４／０２５０１  Ａ１  ９４０２０３）。
【０１７２】
一般的な保護手段により、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン、及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得、これらを還元して２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得た。従来通り、水酸基は、ミツノブ反応によりＮ−ハイドロキシフタルイミドに置換し、保護ヌクレオチドは通常通りホスフィチル化し、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミデート］を得た。
【０１７３】
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシド  アミデート
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ  ヌクレオシド  アミデート（当該分野では、２’−ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち２’Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ2）2又は２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシド  アミデートとしても知られている）は以下のようにして調製した。他のヌクレオシド  アミデートも同様に調製した。
【０１７４】
２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（アルドリッチ、６．６６ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬのボム（bomb）中で攪拌しながら、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ、１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）にゆっくり加えた。Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ、５ｍｍｏｌ）及び炭酸ナトリウム（２．５ｍｇ）を加え、ボムを遮光し、オイルバス中に移し、１５５℃まで２６時間加熱した。当該ボムを室温まで冷却し、開いた。租溶液を濃縮し、残渣を水（２００ｍＬ）及びヘキサン（２００ｍＬ）に分配した。過剰のフェノールでヘキサン層を抽出した。水層は酢酸エチル（２００ｍＬで３回）抽出し、併せた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮した。残渣を、溶出としてメタノール／メチレンクロリド  １：２０（２％のトリエチルアミンを含む）を用いてシリカゲルカラムに付した。カラム分画を濃縮すると無色の固体が得られ、これを集めて標題化合物を白色固体として得た。
【０１７５】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
無水ピリジン（８ｍＬ）中の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジンの１．５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（０．３６ｍＬ）及びジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ｇ、２ｅｑ.）を加え、１時間攪拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）に注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2（２００ｍＬで２回）抽出した。併せたＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を濃縮後、ＭｅＯＨ：：Ｅｔ3Ｎ（２０：１、v/v、１％トリエチルアミンを含む）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより、標題化合物を得た。
【０１７６】
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピル）ホスホラミデート
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）及び２−シアノエトキシＮ，Ｎ−ジイソプロピル  ホスホラミデート（１．１ｍＬ、２ｅｑ.）を、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ、３ｍｍｏｌ）溶液にアルゴン雰囲気下に加えた。反応混合物を一晩攪拌し、溶媒を留去した。得られる残渣を、溶出に酢酸エチルを用いてシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た。
【０１７７】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
非置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素で酸化する標準ホスホラミデート化学を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems model  380B）により合成した。
【０１７８】
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、標準的な酸化用ボトルを、亜リン酸エステル結合の段階的チエーション用に、０．２Ｍ  ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキサイドのアセトニトリル溶液に替える以外はホスホジエステル  オリゴヌクレオチドとして合成した。チエーションの待機ステップは６８秒まで増加し、次いでキャッピングステップを実施した。ＣＰＧカラムからの除去及び５５℃（１８時間）の濃水酸化アンモニウム中での非ブロック化の後、オリゴヌクレオチドを０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液から、２．５倍量のエタノールで２回沈殿させることにより精製した。ホスフィン酸  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，５０８，２７０号に記載のようにして調製した。
【０１７９】
アルキルホスホン酸エステルは、ここで参考として示した米国特許第４，４６９，８６３号に記載のようにして調製した。
【０１８０】
３’−デオキシ−３’−メチレン  ホスホン酸エステル  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，６１０，２８９号又は５，６２５，０５０号に記載のようにして調製した。
【０１８１】
ホスホラアミデート  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，２５６，７７５号又は５，３３６，８７８号に記載のようにして調製した。
【０１８２】
アルキルホスホノティオエート  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示したＷＯ９４／１７０９３号及びＷＯ９４／０２４９９号に記載のようにして調製した。
【０１８３】
３’−デオキシ−３’−アミノ  ホスホラミデート  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，４７６，９２５号に記載のように調製した。
【０１８４】
ホスホトリエステル  オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５、０２３，２４３号に記載のようにして調製した。
【０１８５】
ボランホスホリン酸エステルは、ここでいずれも参考として示した米国特許第５、１３０，３０２号及び５，１７７，１９８号に記載のようにして調製した。
【０１８６】
実施例３
オリゴヌクレオチド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオチドとしても分類されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオチド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオチドとしても分類されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオチド、アミド−３結合オリゴヌクレオチドとしても分類されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオチド、及びアミド−４結合オリゴヌクレオチドとしても分類されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオチドは、例えばＭＭＩ及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ結合を有する混合骨格化合物と同様に、ここで全て参考として示した米国特許第５，３７８，８２５号、５，３８６，０２３号、５，４８９，６７７号、５，６０２，２４０号及び５,６１０，２８９号に記載のようにして調製した。
【０１８７】
ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，２６４，５６２号及び５，２６４，５６４号に記載のようにして調製した。
【０１８８】
エチレンオキサイド結合オリゴヌクレオチドは、ここで参考として示した米国特許第５，２２３，６１８号に記載のようにして調製した。
【０１８９】
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」、すなわち「特性及び適用可能性」、Bioorganic & Medicinal Chemistry,1996,4,523に記載の種々の方法ならいずれの方法でも調製できる。ペプチド核酸は、ここで参考として示した米国特許第５，５３９，０８２号、５，７００，９２２号及び５，７１９，２６２号に記載のようにして調製した。
【０１９０】
実施例５
キメラオリゴヌクレオシド合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、種々の異なったタイプの一つである。これらは、結合ヌクレオシドの「ギャップ」部分が結合ヌクレオシドの５’「ウィング」部分及び３’「ウィング」部分に位置する第一タイプ、及び「ギャップ」部分がオリゴマー性化合物の３’末端又は５’末端に位置する第二タイプを含む。第一タイプのオリゴヌクレオチドは、当該分野で「ギャップマー」又はギャップオリゴヌクレオチドとしても知られている。第二タイプのオリゴヌクレオチドは、当該分野で「ヘミマー」又は「ウィングマー」としても知られている。
【０１９１】
[２’−Ｏ−Ｍｅ]--[２’−デオキシ]--[２’−Ｏ−Ｍｅ]キメラ  ホスホロチオエート
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエート及び２’−デオキシホスホロチオエート  オリゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上記のApplied Biosystems model  自動ＤＮＡ合成装置  380Bを用いて合成した。オリゴヌクレオチドは、自動合成装置、当該ＤＮＡ部分用の２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホラミデート、及び５’及び３’ウィング用の５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミデートを用いて合成した。
【０１９２】
標準合成サイクルは、テトラゾール及び塩基送達後の待機ステップを６００秒まで増加することにより変更し、ＲＮＡ用に４回及び２−Ｏ−メチル用に２回繰り返した。完全に保護されたオリゴヌクレオチドは、支持体から切断し、ホスホン酸基は、３：１アンモニア／エタノールにより室温で一晩脱保護し、凍結乾燥により乾燥した。次いで、室温で２４時間のメタノール性アンモニア処理を行い、全ての塩基を脱保護し、試料は、再度凍結乾燥により乾燥した。当該ペレットは、１Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液に室温で２４時間、再懸濁して、２’位を脱保護した。次いで、反応を１Ｍ  ＴＥＡＡで停止し、試料を、Ｇ２５サイズの排斥カラムで脱塩する前に、ロトバック（rotovac）によって１／２の体積に減じた。回収されたオリゴは、キャピラリー電気泳動及びマススペクトロメトリーによって分光光度法的に収率及び純度を分析した。
【０１９３】
[２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）]--[２’−デオキシ]--[２’−Ｏ−（メトキシエチル）]キメラホスホロチオエート  オリゴヌクレオチド
[２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）]--[２’−デオキシ]--[２’−Ｏ−（メトキシエチル）]キメラホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドは、上記方法によって、ホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドの置換体と共に、２’−Ｏ−メチル  キメラオリゴヌクレオチド用に調製し、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミデートは、上記方法によって、２’−Ｏ−メチルアミデート用に調製した。
【０１９４】
[２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル]--[２’−デオキシ  ホスホロチオエート]--[２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチド
[２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル]--[２’−デオキシ  ホスホロチオエート]--[２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル]キメラオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル  キメラオリゴヌクレオチド用に、上記方法により、２’−Ｏ−メチル  アミデート用の２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミデート置換体と共に、調製した。すなわち、ヨウ素で酸化して、キメラ構造体のウィング部位内にホスホン酸ジエステル  ヌクレオチド間結合を生成させ、次いで３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキサイド（ビューケージ試薬（Beaucage Reagent））を用いるスルフリル化により、中央ギャップのためのホスホリン酸チオエステル  ヌクレオチド間結合を形成した。
【０１９５】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド及び混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、ここに参考として示した国特許第５，６２３，０６５号に従って調製した。
【０１９６】
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシチドは、制御ポアグラスカラム（Applied Biosystems）からの除去及び５５℃、１８時間の濃水酸化アンモニア中での非ブロック化の後、２．５倍量のエタノールで０．５ｍＮａＣｌから２回沈殿させることにより精製した。合成オリゴヌクレオチドは、変性ゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、少なくとも８５％の全長材料であることが判った。合成によって得られたホンホン酸チオエステル及びホスホジエステル結合は、Ｐ核磁気共鳴スペクトルにより定期的に確認し、オリゴヌクレオチドは、研究によっては、Chiang et al.J.Biol.Chem18162-18171によって説明されているように、ＨＰＬＣによって精製した。
【０１９７】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルフォーマット
オリゴヌクレオチドは、標準９６ウェルフォーマット内で９６配列を自動的に作ることが可能な自動合成機を用い、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホラミデート化学により合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水溶性ヨウ素によって酸化することによって得られた。ホスホロチオエート  ヌクレオチド間結合は３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキサイド（ビューケージ試薬）を用いるスルフリル化によって生成した。標準的保護β−シアノエチルジイソプロピル  ホスホラミデートは、市販品されている（例えば、PE-Applied Biosystems，Foster City，CA又はPharmacia，Piscataway，N.J）。非標準ヌクレオシドは、周知の文献又は特許された方法により合成した。これらは、β−シアノエチルジイソプロピル  ホスホラミデート保護塩基として使用した。
【０１９８】
オリゴヌクレオチドは支持体から切断し、高温（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃ＮＨ4ＯＨで脱保護し、次いで得られた生成物を真空下にて乾燥した。乾燥生成物を滅菌水で再懸濁し、全ての分析プレート及びテストプレートからマスタープレートに移した。
試料を、ロボットピペッターを用いて希釈した。
【０１９９】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルフォーマット
各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度は、試料の希釈及びＵＶ吸収スペクトルによって評価した。各々の生成物の完全長は、９６ウェルフォーマット（Beckman  Ｐ／ＡＣＥ（登録商標）ＭＤＱ）中であるいは個々の調製試料を、市販のＣＥ機器（例えばBeckman  Ｐ／ＡＣＥ（登録商標）5000、ABI270）を用いて、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）することによって評価した。塩基及び骨格組成は、マススペクトルを利用する化合物のマス分析により決定した。アッセイテストプレートは、単一又は複数チャンネルのロボットピペッターを用いて、マスタープレートから希釈した。プレートは、当該プレート上の少なくとも８５％の化合物が少なくとも８５％の全長であるならば、許容可能と判断した。
【０２００】
実施例９
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
アンチセンス化合物のターゲット核酸発現に対する効果は、ターゲット核酸が測定可能な濃度で存在するならば、種々のタイプの細胞のいずれでも試験できる。これは、通常、例えばＰＣＲ又はノーザンブロット分析により決定できる。次の６つのタイプの細胞は、実例の目的に使用できるが、他のタイプの細胞も、選択した当該細胞においてターゲットが発現しているならば、通常使用できる。これは、当該分野で一般的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ蛋白質アッセイ又はＲＴ−ＰＣＲによって容易に決定できる。
【０２０１】
Ｔ−２４細胞：
ヒト転移細胞膀胱癌セルラインＴ−２４は、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ）（Manassas,VA）から入手した。Ｔ−２４細胞は、通常、１０％牛胎児血清（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）、ペニシリン  １００ユニット／ｍＬ及びストレプトマイシン  １００ｍｇ／ｍＬ（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）を補った、完全ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ基礎培地（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）で培養した。細胞は、通常、トリプシン消化し、９０％コンフルエントになるまで希釈した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、９６ウェルプレート（Falcon-Primaria＃3872）に７０００cells/wellの密度で播いた。
【０２０２】
ノーザンロット又は他の分析のため、細胞は、培地及びオリゴヌクレオチドの適当量を用いて、１００ｍｍ培養プレート又は他の標準的組織培養プレート及び同様に処理されたプレート上に播いてもよい。
【０２０３】
Ａ５４９細胞：
ヒト肝臓癌セルラインＡ５４９は、American Type Culture Collecton（ＡＴＣＣ）（Manassas,VA）から入手した。Ａ５４９細胞は、通常、１０％牛胎児血清（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）、ペニシリン  １００ユニット／ｍＬ及びストレプトマイシン  １００ｍｇ／ｍＬ（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）を補った、ＤＭＥＭ基礎培地（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）で培養した。細胞は、通常、トリプシン消化し、９０％コンフルエントになるまで希釈した。
【０２０４】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Clonetics Corporation（Walkersville MD）から入手した。ＮＨＤＦｓは、通常、供給者によって推奨されているように補足した繊維目細胞生育培地（Clonetics Corporation,Walkersville MD）で継代した。細胞は、供給者によって推奨されているように１０回まで継代した。
【０２０５】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児ケラチノサイト（ＨＥＫ）は、Clonetics Corporation（Walkersville MD）から入手した。ＨＥＫｓは、通常、供給者の推奨の通りに調製したケラチノサイト生育培地（Clonetics Corporation,Walkersville MD）で継代した。細胞は、供給者によって推奨されているように１０回まで継代した。
【０２０６】
ＭＣＦ−７細胞：
ヒト乳癌セルラインは、American Type Culture Collecton（Manassas,VA）から入手した。ＭＣＦ−７細胞は、通常、１０％牛胎児血清（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）を補った、ＤＭＥＭ低グルコース（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）で培養した。細胞は、通常、トリプシン消化し、９０％コンフルエントになるまで希釈した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、９６ウェルプレート（Falcon-Primaria＃3872）に７０００cells/wellの密度で播いた。
【０２０７】
ノーザンロット又は他の分析のため、細胞は、培地及びオリゴヌクレオチドの適当量を用いて、１００ｍｍ培養プレート又は他の標準的組織培養プレート及び同様に処理されたプレート上に播いてもよい。
【０２０８】
ＬＡ４細胞：
マウス肝上皮セルラインＬＡ４は、American Type Culture Collecton（Manassas,VA）から入手した。ＬＡ４細胞は、通常、１０％牛胎児血清（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）を補った、Ｆ１２Ｋ培地（Gibco／Life Technologies,Gaithersburg,MD）で培養した。細胞は、通常、トリプシン消化し、９０％コンフルエントになるまで希釈した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ分析用に、９６ウェルプレート（Falcon-Primaria＃3872）に３０００〜６０００cells/wellの密度で播いた。
【０２０９】
ノーザンロット又は他の分析のため、細胞は、培地及びオリゴヌクレオチドの適当量を用いて、１００ｍｍ培養プレート又は他の標準的組織培養プレート及び同様に処理されたプレート上に播いてもよい。
【０２１０】
アンチセンス化合物による処理：
細胞が８０％コンフルエントになったら、オリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートで培養した細胞については、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）−１還元血清培地（Gibco BRL）で１回洗浄し、次いで３．７５μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Gibco BRL）及び所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）−１の１３０μＬで処理した。処理の４〜７時間後に、培地を新鮮な培地と交換した。細胞は、オリゴヌクレオチド処理後、１６〜２４時間で採収した。
【０２１１】
使用するオリゴヌクレオチド濃度は、セルラインによって変えた。特定のセルラインについて最適オリゴヌクレオチド濃度を決定するために、ある範囲の濃度のポジティブコントロールで細胞を処理した。
【０２１２】
実施例１０
ＥＬ発現のオリゴヌクレオチド阻害分析
ＥＬ発現のアンチセンス調節は、当該分野で知られた種々の方法でアッセイできる。例えば、ＥＬ  ｍＲＮＡ濃度は、ノーザンブロット分析、competitive  ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）又はreal-time ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量的できる。本発明では、Real-time ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が好ましい。ＲＮＡ分析は、細胞ＲＮＡ又はpoly(A)+ｍＲＮＡの全てについて行った。ＲＮＡの単離方法は、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Volume 1,pp.4.1.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3,John Willy & Sons,Inc.,1993に説明されている。ノーザンブロット分析は、当該分野で一般的なものであり、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Volume 1,pp.4.2.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3,John Willy & Sons,Inc.,1996に説明されている。
【０２１３】
Real-time quantitative（ＰＣＲ）は、PE-Applied Biosystems,Foster City,CAから市販されているＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）7700  Sequence Detection Systemを使い、製造者の指示に従って容易に行うことができた。Quantitative ＰＣＲの前に、測定するターゲット遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットについて、ＧＡＰＤＨ増幅反応を用いて多重化（「multiplexed」）する能力を評価した。多重化では、ターゲット遺伝子及び内部標準ＧＡＰＤＨ遺伝子を単一試料中で容易に増幅した。当該分析では、非処理細胞から単離されたｍＲＮＡを連続的に希釈した。各希釈液を、ＧＡＰＤＨのみ、ターゲット遺伝子（「一重型（single-plexing）」のみ又は両方（多重型（multiplex））に特異的なプライマープローブセットの存在下で、増幅した。ＰＣＲ増幅後、希釈として働くＧＡＰＤＨ及びターゲットｍＲＮＡシグナルのスタンダートカーブを、一重型試料と多重型試料の双方から得た。多重型試料から得られるＧＡＰＤＨ及びターゲットシグナルの傾き及び相関係数が、一重型試料から得られる対応する値の１０％以内であれば、当該ターゲットに特異的なプラマーセットは、多重化可能と考えられる。ＰＣＲの他の方法も当該分野で知られている。
【０２１４】
ＥＬの蛋白濃度は、当該分野で知られている、例えば免疫沈降法、ウェエスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ又は分類する蛍光によって活動化させた細胞（ＦＡＣＳ）等の種々の方法で定量できる。ＥＬに対する抗体は識別が可能であり、ＭＳＲＳの抗体カタログ（Aerie Corporation,Birmingham,MI）等の種々の情報源から得られ、あるいは慣用的な抗体産生方法によって調製できる。ポリクローナル抗体抗血清の調製方法は、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 2,pp.11.12.1-11.12.9,John Willy & Sons,Inc.,1997に説明されている。モノクローナル抗体の調製は、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 2,pp.11.4.1-11.11.5,John Willy & Sons,Inc.,1997に説明されている。
【０２１５】
免疫沈降法は、当該分野では一般的であり、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 2,pp.10.16.110.16.11,John Willy & Sons,Inc.,1998に記載されている。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該分野では一般的であり、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 2,pp.10.8.1-10.8.21,John Willy & Sons,Inc.,1997に記載されている。酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、当該分野では標準的であり、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 2,pp.11.2.1-11.2.22,John Willy & Sons,Inc.,1991に記載がある。
【０２１６】
実施例１１
ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Miura et al.,Clin.Chem.,1996,42,1758-1764に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離の他の方法は、例えばAusubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Volum 1,pp.4.5.1-4.5.3,John Willy & Sons,Inc.,1993に記載がある。簡単に言えば、９６ウェルプレート上の細胞生育では、生育倍地を細胞から除き、各ウェルを２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ７．６、１ｍ  ＭＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシドコンプレックス）を各ウェルに加え、当該プレートを緩やかに攪拌し、次いで室温で５分間インキュベートした。５５μＬの溶解物をオリゴ  ｄ（Ｔ）被覆９６ウェルプレート（ＡＧＣＴInc,Irvine CA）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最終洗浄後、当該プレートをペーパータオルで拭き取り、余分の洗浄緩衝液を除き、次いで５分間風乾した。６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭ  トリス−塩酸  ｐＨ７．６）を７０℃に予熱したプレートの各ウェルに加え、当該プレートを９０℃ホットプレート上で５分間インキュベートし、溶出液を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０２１７】
全ＲＮＡの単離
全ｍＲＮＡは、ＲＮＥＡＳＹ  ９６（登録商標）キット及びQiagen Inc.（Valencia CA）から購入した緩衝液を用い製造者の指示に従って単離した。すなわち、９６ウェルプレート上の細胞生育では、生育倍地を細胞から除き、各ウェルを２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄した。１００μＬのＲＬＴ緩衝液を各ウェルに加え、当該プレートを激しく２０秒間攪拌した。１００μＬの７０％エタノールを各ウェルに加え、内容を３回、上下にピペッティングすることにより混合した。そして、試料を、廃棄物回収トレーに嵌め込んだＱＩＡＶＡＣ（登録商標）マニホールド（manifold）に取り付けられ、かつ真空源に取り付けられたＲＮＥＡＳＹ  ９６（登録商標）ウェルプレートに移した。真空は、１５秒間行った。１ｍＬのＲＷ１緩衝液をＲＮＥＡＳＹ  ９６（登録商標）の各ウェルに加え、真空を再度１５秒間行った。次いで、１ｍＬのＲＰＥ緩衝液をＲＮＥＡＳＹ  ９６（登録商標）プレートの各ウェルに加え、１５秒間真空した。ＲＰＥ緩衝液による洗浄を繰り返し、真空を更に１０秒間行った。
【０２１８】
当該プレートをＱＩＡＶＡＣ（登録商標）マニホールドから取り出し、ペーパータオル上で拭き取った。当該プレートを、１．２ｍＬの回収チューブを含む回収チューブラックに嵌め込んだＱＩＡＶＡＣ（登録商標）マニホールドに再度取り付けた。ＲＮＡは６０μＬの水を各ウェルにピペッティングして希釈し、１分間インキュベートし、そして３０秒間真空した。希釈ステップを更に６０μＬの水を使って繰り返した。
【０２１９】
繰り返しピペッティング及び希釈ステップは、QIAGEN Bio-Robot 9604（Qiagen,Inc.,Valencia CA）を用いて自動化してもよい。培養プレート上で細胞を溶解した後、当該プレートを、ピペッティング、ＤＮアーゼ及び希釈ステップを行うロボットデッキに移した。
【０２２０】
実施例１３
ＥＬ  ｍＲＮＡ濃度のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ分析
ＥＬ  ｍＲＮＡ濃度の評価は、ＡＢＩ  ＲＩＳＭ（登録商標）7700 Sequence detection Systems(PE-Applied Biosystems,Foster City,A)を用い、製造者の指示に従って、real-time quantitative PCRにより行った。これは、チューブが閉鎖した、非ゲル系の蛍光検出システムであって、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）生成物をリアルタイムでハイスループット評価するものである。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物を評価する標準的なＰＣＲと異なり、real-time quantitative PCRでは、生成物を蓄積しながら評価する。
【０２２１】
当該ＰＣＲでは、ＰＣＲ反応において、フォワード及びリバース  ＰＣＲプライマーとの間に特異的にアニールし、２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを使用した。レポーター色素（例えばＪＯＥ、ＦＡＭ（登録商標）又はＶＩＣ、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA又はPE-Applied Bioystems,foster City,CAから入手）は、当該プローブの５’末端に結合させ、停止色素（例えばＴＡＭＲＡ、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA又はPE-Applied Bioystems,foster City,CAから入手）は、当該プローブの３’末端に結合させた。
【０２２２】
当該プローブ及び色素がintactである場合には、レポーター色素の放出は、３’停止色素の接近によって停止した。増幅中、ターゲット配列にプローブをアニーリングすると、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって切断される基質を生成した。ＰＣＲ増幅サイクルの伸張段階で、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断は、プローブのリマインダーから（及び停止部分から）レポーター色素を放出させ、配列特異的蛍光シグナルを発生した。各サイクルで、追加のレポーター色素分子をそのプローブからそれぞれ切断し、蛍光強度を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）7700配列検出システム内に設置されたレーザー光によって一定間隔でモニターした。各アッセイでは、非処理コントロール試料からのｍＲＮＡの連続希釈を含む一連の並発反応は、テスト試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後に阻害百分率を評価するために用いるスタンダートカーブを描いた。
【０２２３】
ＰＣＲ試薬はPE-Applied Biosystems，Foster City,CAより入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２５μＬ  ＰＣＲカクテル[１×ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）緩衝液Ａ、５．５ＭＭ  ＭｇＣｌ2、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭのｄＵＴＰ、１００ｎＭの各フォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブ、２０ユニットのＲＮアーゼ阻害剤、１．２５ユニットのＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ（登録商標）、及び１２．５ユニット  ＭｕＬＶ  逆転写酵素]を、２５μＬのポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含む９６ウェルプレートに加えることにより行った。ＲＴ反応は、４８℃で３０分間インキュベーションすることにより行った。ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ（登録商標）を活性化するために９５℃で１０分間インキュベーション後、２ステップＰＣＲプロトコール、すなわち、９５℃で１５秒間（変性）、次いで６０℃で１．５分間（アニーリング／伸張）を４０サイクル行った。
【０２２４】
ヒトＥＬに対するプローブ及びプライマーは、公開されている配列、すなわち情報（GenBank accession number NM_006033は、本発明で図１として示した）を使って、ヒトＥＬ配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトＥＬのプライマーは、
フォワードプラマー：CCGGACGGGAGCTGAATAT  SEQ  ID  NO：3909；
リバースプライマー：CAGTTTCCGCTGGGTTTCC  SEQ  ID  NO:3910；及び
ＰＣＲプローブ：ＦＡＭ（登録商標）-AGGCGCATCCGGGTGAAGTCTG  SEQ  ID  NO：3911-ＴＡＭＲＡ。
ＦＡＭ（登録商標）[PE-Applied Biosystems,Foster City,CA]は蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（PE-Applied Biosystems,Foster City,CA）は停止色素である。
【０２２５】
ヒトシクロフィリンのＰＣＲプライマーは、
フォワードプラマー：CCCACCGTGTTCTTCGACAT  SEQ  ID  NO：3912
リバースプライマー：TTTCTGCTGTCTTTGGGACCTT  SEQ  ID  NO:3913；及び
ＰＣＲプローブ：５’ＪＯＥ-CGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTTTTGCA  SEQ  ID  NO：3914-ＴＡＭＲＡ３’。
ＪＯＥ（PE-Applied Biosystems,Foster City,CA）は蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（PE-Applied Biosystems,Foster City,CA）は停止色素である。
【０２２６】
実施例１４
２’−ＭＯＥウィング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドによる、ヒトＥＬ発現のアンチセンス阻害
本発明によれば、一連のオリゴヌクレオチドは、公開された配列（NM_006033；本発明に図１として示した）を用いて、ヒトＥＬ  ＲＮＡの異なった領域にターゲットするように設計した。当該オリゴヌクレオチドを表１〜１３３に示す。「位置」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定のターゲット配列上の最初（５’末端）のヌクレオチド番号を示す。各オリゴについて示したパラメーターは、David H.Mathews,Michael Zuker及びDouglas H.TurnerによるＲＮＡ構造３．７を使って予測した。当該パラメーターは、自由エネルギー（反応が起こると放出されるエネルギー。数値がマイナスになればなるほど、反応は起こりやすくなる。自由エネルギーの単位はｋｃａｌ/ｍｏｌである。）又は融解温度（ポリ核酸の２つのアニールストレンドが乖離する温度。温度が高くなればなるほど、２つのストレンドの親和性は大きくなる。）として記載した。
【０２２７】
高い親和性で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を設計する場合には、ターゲットＲＮＡストレンド及びアンチセンスオリゴマーの構造を考慮することが望ましい。特に、オリゴマーが固く結合するためには（表では、「duplex形成」と記載した）、僅かに自己組織化構造（表では、「ターゲット構造」して記載した自由エネルギー）を有するターゲットＲＮＡのストレッチに相補的であることが必要である。また、オリゴマーは、分子間（表では、「分子内オリゴ」として記載したエネルギー）又は二分子間（表では、「分子間オリゴ」として記載したエネルギー）で、若干の自己組織化構造を有することが必要である。自己組織化構造が崩れると、結合が不利となる。表１の全ての化合物は、１０つの２’デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域から構成される２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、当該キメラオリゴヌクレオチドは、両端（５’及び’３方向）にある４つのヌクレオチド「ウィング」の近くに位置する。当該ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオシドから構成される。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの全体に渡りホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は、５−メチルシチジンである。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０２２８】
【表１】
2005533505.tif 000002
【０２２９】
【表２】
2005533505.tif 000003
【０２３０】
【表３】
2005533505.tif 000004
【０２３１】
【表４】
2005533505.tif 000005
【０２３２】
【表５】
2005533505.tif 000006
【０２３３】
【表６】
2005533505.tif 000007
【０２３４】
【表７】
2005533505.tif 000008
【０２３５】
【表８】
2005533505.tif 000009
【０２３６】
【表９】
2005533505.tif 000010
【０２３７】
【表１０】
2005533505.tif 000011
【０２３８】
【表１１】
2005533505.tif 000012
【０２３９】
【表１２】
2005533505.tif 000013
【０２４０】
【表１３】
2005533505.tif 000014
【０２４１】
【表１４】
2005533505.tif 000015
【０２４２】
【表１５】
2005533505.tif 000016
【０２４３】
【表１６】
2005533505.tif 000017
【０２４４】
【表１７】
2005533505.tif 000018
【０２４５】
【表１８】
2005533505.tif 000019
【０２４６】
【表１９】
2005533505.tif 000020
【０２４７】
【表２０】
2005533505.tif 000021
【０２４８】
【表２１】
2005533505.tif 000022
【０２４９】
【表２２】
2005533505.tif 000023
【０２５０】
【表２３】
2005533505.tif 000024
【０２５１】
【表２４】
2005533505.tif 000025
【０２５２】
【表２５】
2005533505.tif 000026
【０２５３】
【表２６】
2005533505.tif 000027
【０２５４】
【表２７】
2005533505.tif 000028
【０２５５】
【表２８】
2005533505.tif 000029
【０２５６】
【表２９】
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【表３２】
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【表３９】
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【表５９】
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【表８９】
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【表９８】
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【０３２６】
【表９９】
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【０３２７】
【表１００】
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【０３２８】
【表１０１】
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【０３２９】
【表１０２】
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【０３３０】
【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【０３３５】
【表１０８】
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【０３３６】
【表１０９】
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【０３３７】
【表１１０】
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【０３３８】
【表１１１】
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【０３３９】
【表１１２】
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【０３４０】
【表１１３】
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【０３４１】
【表１１４】
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【０３４２】
【表１１５】
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【０３４３】
【表１１６】
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【０３４４】
【表１１７】
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【０３４５】
【表１１８】
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【０３４６】
【表１１９】
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【０３４７】
【表１２０】
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【０３４８】
【表１２１】
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【０３４９】
【表１２２】
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【０３５０】
【表１２３】
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【０３５１】
【表１２４】
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【０３５２】
【表１２５】
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【０３５３】
【表１２６】
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【０３５４】
【表１２７】
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【０３５５】
【表１２８】
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【０３５６】
【表１２９】
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【０３５７】
【表１３０】
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【０３５８】
【表１３１】
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【０３５９】
【表１３２】
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【０３６０】
【表１３３】
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【０３６１】
実施例１５
ＥＬ蛋白質の濃度のウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）は、標準的な方法を用いて行った。細胞をオリゴヌクレオチド処理後、１６〜２０時間収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、Laemmli緩衝液（１００μ/ウェル）で懸濁し、５分間加熱し、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填した。ゲルは、１５０Ｖで１．５時間展開し、ウェスタンブロット用膜に移した。好適な抗ＥＬ一次抗体を、一次抗体種に対する放射性同位体標識又は蛍光標識した二次抗体と共に使用した。バンドは、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ(登録商標)（Molecular Dynamics，Sunnyvale CA）。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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