(57)【要約】本発明は、なかでも、異種細胞表面上に示されるポリペプチドをコードする、核酸配列を調製する方法を提供する。本発明は一般的に、ドナー核酸および受容体核酸を組換えて、示されるポリペプチドをコードする組換えられた核酸を形成させることを含んでいる。組換え反応は典型的にはインビボ反応であり、それにおいては、少なくとも組換え中間体の分割が細胞内で起こる。部位特異的組換えおよび相同的組換えの両方を使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体タンパク質の配列を改変する方法であって、
各々が、プロモーターおよび機能可能なように連結されたコード領域を含んでなる、異種核酸を含んでなる酵母細胞を提供し、ここにおいて、コード領域は免疫グロブリン可変ドメインコード核酸に相同的な核酸を含んでなる；
酵母細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでなる；そして
導入されたＩｇセグメント−コード核酸がコード領域と組換わるのを可能にする条件下で酵母細胞を維持し、それにより、コード領域が、免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをコードする組換えられた核酸を産生する、可変ドメインは、少なくとも一部は、Ｉｇセグメント−コード核酸により導入された配列によりコードされている、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項２】
免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドが、細胞表面上に示され、およびプローブに到達可能であるように、組換えられた核酸を発現することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組換えに先立っては、コード領域が非機能性のコード領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
融合された細胞が、Ｉｇ  ＬＣを含むポリペプチドおよびＩｇ  ＨＣを含むポリペプチドをコードする核酸を含むように、組換えられた核酸を含む酵母細胞と、組み換えられた核酸によりコードされた免疫グロブリン可変ドメインに適合性の、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を含む他の酵母細胞を融合させることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
酵母細胞を提供することが、異種核酸を含む酵母細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵母細胞を提供することが、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸、および異種核酸の免疫グロブリン可変ドメインの領域と相同的な１つ以上の核酸を、酵母細胞内へ同時に導入することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
融合することが、酵母接合を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
抗体タンパク質の配列を改変する方法であって、
多数の酵母細胞を提供し、多数の酵母細胞の各々の細胞は、独特の抗体タンパク質をコードする抗体コード核酸配列を含んでなり、ここにおいて、抗体タンパク質は軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでなる；
多数の酵母細胞からの１つ以上の細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでなる；そして
多数の酵母細胞からの細胞または複数の細胞を、導入されたＩｇセグメント−コード核酸が、サブセットの細胞の抗体−コード核酸配列と組換わるのを可能にする条件下で維持し、それにより、改変された免疫グロブリン可変ドメインを有している抗体タンパク質を発現できる、１つまたは多数の細胞を産生する、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項９】
Ｉｇセグメント−コード核酸が各々、免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲをコードしている配列またはその相補体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｉｇセグメント−コード核酸が各々、免疫グロブリン可変ドメインの単一のＣＤＲをコードしている配列またはその相補体を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸がヒト核酸から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸が、同一ＣＤＲの異なった変異体をコードする多数の核酸を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸が、多数の異なったＣＤＲの異なった変異体をコードする多数の核酸を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸が、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の異なった変異体をコードしている核酸を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
各々のＩｇセグメント−コード核酸が、３００ヌクレオチドより短い長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
導入することが、少なくとも１０3の異なったＩｇセグメント−コード核酸を、１つ以上の酵母細胞と接触させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸が１本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
多数のＩｇセグメント−コード核酸が、多数の酵母細胞の細胞内に、平行して導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
多数のＩｇセグメント−コード核酸が、多数の酵母細胞の細胞内に、同一の反応混合物中で導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
導入することに先立って、サブセットの細胞の核酸メンバー内へ、計数器−選択可能マーカーを挿入し、そして導入した後、計数器−選択可能マーカーがＩｇセグメント−コード核酸により置き換えられている細胞を選択することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
導入することに先立って、コード領域内へ突然変異を挿入することをさらに含んでなり、ここにおいて、突然変異は機能性免疫グロブリン可変ドメインの発現を妨げる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
突然変異が、終止コドン、マーカー遺伝子、フレームシフト、または部位特異的エンドヌクレアーゼの部位を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドの回収が、ポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる細胞の回収を生じるように、組み換えられた核酸から発現されたポリペプチドが、細胞との相互作用を可能にする配列を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞との相互作用を可能にする配列が、膜貫通ドメインまたは酵母細胞表面へＧＰＩ−連結されるようになるドメインを含んでなるアンカードメインをコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗体−コード核酸配列が、ＬＣ可変免疫グロブリンドメインを含んでなるポリペプチドをコードするＬＣコード配列、およびＨＣ可変免疫グロブリンドメインを含んでなるポリペプチドをコードするＨＣコード配列を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも選択の時点で酵母細胞は２倍体細胞であり、２倍体細胞が胞子形成するときにＬＣ−コード配列およびＨＣ−コード配列が異なった胞子内へ隔離されるように、ＬＣ−コード配列およびＨＣ−コード配列が相同的染色体上の座位内に組み込まれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
座位がＭＡＴ座位へ連結されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体−コード核酸配列が、酵母染色体内へ組み込まれている、請求項８に記載の方法。
【請求項２９】
ＬＣおよびＨＣコード配列が、異なった酵母染色体内へ組み込まれている、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
抗体−コード核酸配列が、ＬＣ可変免疫グロブリンドメインおよびＨＣ可変免疫グロブリンドメインを含んでなるポリペプチドをコードする、単鎖コード配列を含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項３１】
抗体タンパク質がＦａｂである、請求項６に記載の方法。
【請求項３２】
抗体タンパク質を示す細胞を選択する方法であって、
多数の酵母細胞を提供し、多数の酵母細胞は、軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでなる抗体タンパク質をコードすることが可能な、またはＩｇセグメントコード核酸と組換えて、抗体タンパク質をコードする機能性コード配列を形成することが可能な、抗体コード配列を各々が含んでいる；
以下の１つ以上のサイクルを実施する：
（ｉ）各々が免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含んでなる核酸を、サブセットの細胞からの抗体コード配列の少なくとも一部を含む細胞内へ導入し；
（ｉｉ）（ｉ）において核酸と接触した細胞を、導入された核酸が細胞の抗体コード配列と組換わるのを可能にする条件下で維持し、それにより、１つ以上の改変された免疫グロブリン可変ドメインを有する、改変された抗体コード配列を含む、修飾された細胞を産生し；
（ｉｉｉ）修飾された細胞において改変されたコード配列を発現させ；
（ｉｖ）修飾された細胞と標的を接触させ；および
（ｖ）修飾された細胞からさらなる細胞のサブセットを選択する、ここにおいて、さらなるサブセットは標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでなる、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項３３】
少なくとも２回のサイクルが実施される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｉｖ）の接触させることが、異なったサイクルの間に異なった条件下で、細胞を標的と接触させることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ｖ）の選択することが、前の選択工程と比較して、標的への改善された結合を必要としていることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｉ）の核酸を導入することに先立って、マーカー配列が抗体コード配列内へ挿入される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
１つ以上のサイクルからの、さらなるサブセットの細胞から、抗体コード配列を回収することをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
１つ以上のサイクルからの、さらなるサブセットの細胞中の抗体コード配列の、少なくともＣＤＲ−コード領域を配列決定することをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
核酸が、サブセットの細胞内へ導入される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
１つ以上のサイクルにおいて、（ｉ）に先だって、サブセットの細胞を胞子形成させ、そして（ｉｉ）の後に、核酸が導入されている細胞を接合させることをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
多数の酵母細胞を提供することが、多数の酵母細胞が実質的に同一であるように、本来の細胞を増幅することを含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
多数の酵母細胞を提供することが、多数の本来の細胞を増幅することを含んでなり、ここにおいて、本来の細胞は、同一の標的と相互作用する、異なった抗体のための抗体コード配列を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
多数の酵母細胞を提供することが、ファージディスプレイライブラリーから１つ以上の核酸を選択し、そしてファージディスプレイシステムからの１つ以上の核酸を、酵母発現系内へ再編成させることを含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
酵母細胞上に示された抗体タンパク質のサブユニットを変化させる方法であって、
抗体タンパク質の第１のサブユニットをコードしている第１の核酸メンバーを含む、第１の１倍体酵母細胞を提供し、第１のサブユニットは免疫グロブリン可変ドメインを含んでなる；
免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲコードしているセグメントまたはその相補体を各々が含んでなる１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；そして
１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を、１つ以上の第２の１倍体細胞と接合させて、１つ以上の２倍体細胞を提供する、ここにおいて、第２の１倍体酵母細胞は抗体タンパク質の第２のサブユニットをコードしている第２の核酸メンバーを含んでおり、第２のサブユニットは、第１のサブユニットの免疫グロブリン可変ドメインに相補的な免疫グロブリン可変ドメインを含んでなり、そして、各々の２倍体細胞は、その細胞表面に、第１および第２のサブユニットを含んでなる抗体タンパク質を発現できる、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項４５】
導入することに先立って、第１の核酸メンバー内へ非免疫グロブリン配列を挿入し、それにより、第１のサブユニットのコードを破壊することを含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
非免疫グロブリンコード配列が計数器−選択可能マーカーを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
酵母細胞上に示された抗体タンパク質のサブユニットを変化させる方法であって、
抗体タンパク質の第１のサブユニットを含んでなるポリペプチドをコードできる、第１の核酸メンバーを含んでいる、第１の１倍体酵母細胞を提供し、第１のサブユニットは免疫グロブリン可変ドメインを含んでなり、ここにおいて、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸メンバーの領域は破壊されている；
免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を各々が含んでなる、１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；そして
１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を、１つ以上の第２の１倍体酵母細胞と接合させて、１つ以上の２倍体細胞を提供する、ここにおいて、第２の１倍体酵母細胞は、抗体タンパク質の第２のサブユニットを含んでなるポリペプチドをコードしている第２の核酸メンバーを含んでおり、第２のサブユニットは第１のサブユニットの免疫グロブリン可変ドメインに相補的な免疫グロブリン可変ドメインを含んでなり、そして、各々の２倍体細胞は、その細胞表面に、第１および第２のサブユニットを含んでなる抗体タンパク質を発現できる、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項４８】
接合することに先立って、１つ以上のラウンドの細胞分割により、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を増幅することをさらに含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
酵母細胞上に示された抗体タンパク質のサブユニットを変化させる方法であって、
抗体タンパク質の第１のサブユニットを含んでなるポリペプチドをコードしている第１の核酸メンバーを含む、第１の１倍体酵母細胞、第１のサブユニットは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなり、および、抗体タンパク質の第２のサブユニットを含んでなるポリペプチドをコードしている第２の核酸メンバーを含む、第２の１倍体酵母細胞、第２のサブユニットは免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなる、を提供し；
免疫グロブリン可変軽鎖ドメインのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を各々が含んでなる、１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；
免疫グロブリン可変重鎖ドメインのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を各々が含んでなる１つまたは多数の核酸を、第２の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第２の１倍体細胞またはそのクローン中の第２の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第２の１倍体細胞を産生し；そして、
１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞と１つ以上の第２の１倍体細胞を接合し、変化した免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび変化した免疫グロブリン重鎖可変ドメインを有する抗体タンパク質を、各々が細胞表面上に発現できる、１つ以上の２倍体細胞を提供する、
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項５０】
第１および第２の１倍体細胞を提供する工程が、
（ｉ）抗体タンパク質の第１のサブユニットをコードしている第１の核酸メンバー、第１のサブユニットは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなる、および（ｉｉ）ヘテロオリゴマータンパク質の第２のサブユニットをコードしている第２の核酸メンバー、第２のサブユニットは免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなる、を含む２倍体酵母細胞を提供し；そして
２倍体酵母細胞を胞子形成させて、第１の核酸メンバーを含むが第２の核酸メンバーを含まない第１の１倍体細胞、および第２の核酸メンバーを含むが第１の核酸メンバーを含まない第２の１倍体細胞を提供する、
工程を含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
接合することに先立って、１つ以上のラウンドの細胞分割により、１つ以上の修飾された第１または第２の１倍体細胞を増幅することをさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
接合することにより形成された、１つ以上の２倍体細胞を胞子形成させることをさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上の２倍体細胞またはそのクローンを標的へ接触させることにより、１つ以上の２倍体細胞のサブセットを選択することをさらに含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
サブセットが、標的と相互作用する１つ以上の細胞を含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
サブセットが、標的と相互作用しない１つ以上の細胞を含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
サブセットの細胞を胞子形成させることをさらに含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
結合タンパク質を示す細胞を選択する方法であって、
タンパク質コード配列またはその相補体を含む、多数の多様な核酸を提供し；
多数の真核細胞を提供し、多数の真核細胞の各々の細胞は、１つ以上の多様な核酸中に存在する相同的配列と組換え可能な受容配列を含んでなる異種核酸を含んでなり、ここにおいて、受容配列および多様な核酸の組換えは、多様な核酸によりコードされているセグメントまたはその相補体を含む、ポリペプチドをコードする、組換えられた核酸を産生する；
多数の多様な核酸からの核酸を、多数の細胞の細胞内へ導入し；
１つ以上の導入された核酸を、各々の細胞中の異種核酸と組換え、それにより、１つ以上の導入された核酸によりコードされたセグメントまたはその相補体を含んでなるポリペプチドを各々がコードしている組換えられた核酸を産生し；
組換えられた核酸によりコードされているポリペプチドが細胞の表面に会合するように、細胞中で組換えられた核酸を発現させ；
組換えられた核酸を発現する細胞と標的を接触させ；そして
その標的との相互作用の機能で１つ以上の細胞を選択する、
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項５８】
異種核酸が、組換えのための受容配列を提供する、非機能性免疫グロブリンドメインコード配列を含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
非機能性免疫グロブリンドメインコード配列が、免疫グロブリンドメインコード配列の３’末端より前に終止コドンを含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
終止コドンがＣＤＲをコードしている領域中に存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
非機能性免疫グロブリンドメインコード配列が、ＣＤＲをコードしている領域中にマーカー遺伝子を含んでおり、そして免疫グロブリンドメインのＦＲ領域をコードしている配列は無傷である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
マーカー遺伝子が、計数器−選択可能マーカーを含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
組換えられた核酸が抗体軽鎖をコードし、および発現することが、抗体重鎖および軽鎖が会合し、そしてアンカードメインが細胞表面に抗体重鎖を繋ぎ止めるように、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインおよびアンカードメインを含んでなる抗体重鎖をコードしている核酸をさらに発現することを含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
異種核酸が、アンカードメインをコードしているセグメントを含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
真核生物細胞が酵母細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
標的がタンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
標的が哺乳動物細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
アンカードメインが膜貫通ドメインを含んでなる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
アンカードメインがＧＰＩ−連結を仲介する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
組換えることに先立っては、異種核酸が機能性タンパク質をコードしていない、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
組換えることに先立っては、計数器−選択可能マーカーは異種核酸の受容配列間に位置されており、そして組換えることが計数器−選択可能マーカーを除去する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
組換えることが、各々の細胞中の異種核酸を切断することにより促進される、請求項５７に記載の方法。
【請求項７３】
切断することが、異種核酸中に２本鎖中断を作り出す、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
組換えることに先立って、酵母細胞中に発現されることが可能である、部位特異的エンドヌクレアーゼにより認識される部位が、異種核酸の受容配列間に位置されており、そして組換えることが、各々の細胞中に部位特異的エンドヌクレアーゼを提供することにより促進される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
部位特異的エンドヌクレアーゼがＨＯエンドヌクレアーゼであり、そして提供することが、ＨＯエンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子を転写することを含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
組換えられた核酸が、免疫グロブリン可変ドメインをコードしている配列を含んでなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項７７】
１つの基準で１つ以上の組換えられた核酸を選択し、そして、さらなる酵母細胞を提供することにより本方法を繰り返すことをさらに含んでなり、ここにおいて、さらなる酵母細胞のコード領域は１つ以上の選択された組換え核酸から調製される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２００２年６月１４日提出の米国特許出願第６０／３８９，０３２号、その開示全体が本明細書において援用される、に優先権を主張する。
技術分野
本発明は、組換えにより核酸配列を変更する方法に関する。核酸組換えは一般的に、相同的または部位特異的に分類できる。
【背景技術】
【０００２】
相同的組換えは、１つの親鎖の５’末端が別の親鎖の３’末端へ連結されるように、親鎖からの配列を取り込んだ、新規核酸配列を発生する。典型的には、しかし必須ではないが、相同的組換えは、ホリデイジャンクション（Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と称される中間体を通って進行し、そこでは、基質核酸の４方向ジャンクションが分割されて組換え鎖が形成される。相同的組換えの本質的な特色は、もし基質核酸が相同的であるとすれば、組換えは基礎となる配列に主に依存していることである。
【０００３】
対照的に、部位特異的組換えは、特定の部位での核酸交換を生じる。部位特異的組換えを仲介する酵素、部位特異的リコンビナーゼはこうした部位を認識するように働き、そしてその部位で配列を組み換える。多くの天然の場合において、部位特異的組換えは  配列の組込みおよび／または除去を生じる。例えば、バクテリオファージラムダゲノムは、細菌内部および外部へラムダゲノムを特異的に組込むまたは切除するために部位特異的組換えを使用する酵素をコードしている。別の例において、酵母ＦＬＰ−ＦＲＴシステムは、複製中間体を分割するためにリコンビナーゼを使用する。
両方の型の組換えが、多様な応用例において使用されてきた。例えば、相同的組換えは、例えば、標的遺伝子組み換えにおけるように、相同的情況内へ配列を挿入するために使用されてきた。減数分裂組換えは、例えば、農作物および農業動物の系統の広範な育種におけるように、新規の配列組合わせを発生させるために使用されてきた。部位特異的組換えは核酸のクローニングのために、インビトロで使用されてきた（例えば、米国特許第５，８８８，７３２号を参照されたい）。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
１つの様相において、本発明は以下のことを含むことを特色とする：第１の多数の酵母細胞を提供し、第１の多数の酵母細胞の各々の細胞は、細胞の表面に会合する抗体タンパク質を発現しており、そして各々の細胞は、抗体タンパク質をコードする抗体コード核酸配列を含んでなり、ここにおいて、抗体タンパク質は軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでなり、およびここにおいて、第１の多数の酵母細胞は独特の抗体タンパク質を発現する；標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでなるサブセットを、第１の多数から選択し；１つ以上のサブセットの細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでなる；そして、導入されたＩｇセグメント−コード核酸がサブセットの細胞の抗体−コード核酸配列と組換わるのを可能にする条件下で、細胞またはサブセットの細胞を維持し、それにより、改変された免疫グロブリン可変ドメインを有している抗体タンパク質を発現できる、１つまたは多数の細胞を産生する。クローンおよび他の細胞が、第１の多数の細胞に加えて存在することができる。
【０００５】
１つの様相において、本発明は以下の工程を含んでいる方法を特色とする：
各々が、プロモーターおよびコード領域を含んでいる異種核酸を含む酵母細胞を提供し、ここにおいて、コード領域は免疫グロブリン可変ドメインコード核酸に相同的な核酸を含み、そしてプロモーターはコード領域へ機能可能であるように連結されている；
酵母細胞内へ１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでいる；そして
導入されたＩｇセグメント−コード核酸がコード領域と組換わるのを可能にする条件下で酵母細胞を維持し、それにより、コード領域が免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをコードする組換えられた核酸を産生し、可変ドメインは、少なくとも一部は、Ｉｇセグメント−コード核酸により導入された配列によりコードされている。本方法は、例えば、抗体タンパク質の配列を改変するために使用できる。
【０００６】
１つの態様において、本方法は免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドが細胞表面上に示され、そしてプローブへ到達可能であるように、組換えられた核酸を発現することをさらに含んでいる。
【０００７】
１つの態様において、組換えに先立っては、コード領域は非機能性のコード領域である。１つの態様において、コード領域は非免疫グロブリン配列（例えば、終止コドン）、非免疫グロブリンタンパク質のための挿入されたコード配列（例えば、マーカー遺伝子、例えば、計数器選択可能マーカー遺伝子）を含んでいる。例えば、組換えがないときは、非免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドの産生を防止できる。１つの態様において、コード領域は、フレームシフト、反転、または免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドの産生を妨げるその他の改変を含んでいる。
【０００８】
１つの態様において、本方法はさらに、融合された細胞が、Ｉｇ  ＬＣを含むポリペプチドおよびＩｇ  ＨＣを含むポリペプチドをコードする核酸を含むように、組換えられた核酸を含む酵母細胞と、組み換えられた核酸によりコードされた免疫グロブリン可変ドメインに適合性の、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を含む他の酵母細胞を融合させることを含んでいる。
【０００９】
１つの態様において、酵母細胞を提供することは、異種核酸を含む酵母細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入することを含んでいる。１つの態様において、酵母細胞を提供することは、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸、および異種核酸の免疫グロブリン可変ドメインの領域と相同的な１つ以上の核酸を、酵母細胞内へ同時に導入することを含んでいる。例えば、酵母細胞は、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸、および免疫グロブリン可変ドメインコード配列、例えば、ＣＤＲコード配列中に中断を含む線状化された核酸を同時形質導入することができる。
【００１０】
本方法はさらに、１つの基準で１つ以上の組換えられた核酸を選択し、そして、さらなる酵母細胞を提供することにより本方法を繰り返すことを含むことが可能であり、ここにおいて、さらなる酵母細胞のコード領域は１つ以上の選択された組換えられた核酸から調製される。
【００１１】
１つの態様において、Ｉｇセグメント−コード核酸は各々、免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲをコードしている配列またはその相補体を含んでおり、例えば、各々は免疫グロブリン可変ドメインの単一ＣＤＲをコードしている配列またはその相補体を含んでいる。１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、ヒト核酸から得られる。
【００１２】
１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、同一ＣＤＲの異なった変異体をコードする多数の核酸を含んでいる。例えば、酵母細胞を、ＣＤＲ１のみが異なった変異体を含む核酸と接触させる。
【００１３】
１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、多数の異なったＣＤＲの異なった変異体をコードする多数の核酸を含んでいる。例えば、酵母細胞を、ＬＣ  ＣＤＲ１の異なった変異体およびＨＣ  ＣＤＲ２の異なった変異体を含む核酸と接触させる。
【００１４】
１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の異なった変異体をコードしている核酸を含んでいる。
【００１５】
１つの態様において、各々のＩｇセグメント−コード核酸は、長さが３００、２５０、２００、１５０、または１００ヌクレオチド未満である。
１つの態様において、導入することは、少なくとも１０3、１０4、１０5、１０6、１０8、１０9、または１０10の異なったＩｇセグメント−コード核酸を１つ以上の酵母細胞へ接触させることを含んでいる。１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は１本鎖である。本方法はさらに、導入することに先立って、サブセットの細胞の核酸膜内へ計数器−選択可能マーカーを挿入し、導入した後に、計数器−選択可能マーカーがＩｇセグメント−コード核酸により置き換えられている細胞を選択することを含んでいる。本発明はさらに、導入することに先立って、コード領域内へ突然変異を導入することを含むことが可能で、ここにおいて、突然変異は機能的免疫グロブリン可変ドメインの発現を妨げる。
【００１６】
１つの態様において、突然変異は、終止コドン、マーカー遺伝子、フレームシフト、または部位特異的エンドヌクレアーゼの部位を含んでいる。
１つの態様において、組換えられた核酸から発現されるポリペプチドは、ポリペプチドの回収が、ポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる細胞を回収する結果となるように、細胞との相互作用を可能にする配列を含んでいる。例えば、細胞との相互作用を可能にする配列は、膜貫通ドメインまたは酵母細胞表面へＧＰＩ−連結されるようになるドメインを含む、アンカー（ａｎｃｈｏｒ）ドメインをコードしている。
【００１７】
１つの態様において、核酸メンバーは、例えば本明細書に記載しているように、酵母細胞の染色体（例えば、内在性染色体または人工染色体）内へ組み込むことが可能であり、若しくはプラスミド上に存在することが可能である。
【００１８】
本方法は、本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：多数の酵母細胞を提供し、多数の酵母細胞の各々の細胞は、独特の抗体タンパク質をコードする抗体コード核酸配列を含んでおり、ここにおいて、抗体タンパク質は軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでいる；多数の酵母細胞からの１つ以上の細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでいる；そして多数の酵母細胞からの細胞または複数の細胞を、導入されたＩｇセグメント−コード核酸がサブセットの細胞の抗体−コード核酸配列で組換わることを可能にする条件下で維持し、それにより、改変された免疫グロブリン可変ドメインを有している抗体タンパク質を発現できる、１つまたは多数の細胞を産生する。本方法は、例えば、抗体タンパク質の配列を改変するために使用できる。
【００１９】
多数のＩｇセグメント−コード核酸は、別々に（例えば、異なったときに）、平行して（例えば、別々の反応混合物中で、または同一の反応混合物中で、多数の酵母細胞の細胞内へ導入できる。
【００２０】
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色とする：
多数の酵母細胞を提供し、多数の酵母細胞は、軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含む抗体タンパク質をコードできるか、またはＩｇセグメント−コード核酸と組換えて、抗体タンパク質をコードする機能性コード配列を形成できる、抗体コード配列を各々が含む細胞を含んでおり；
以下の１つ以上のサイクルを実施する：
（ｉ）免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を各々が含んでなる核酸を、サブセットの細胞からの抗体コード配列の少なくとも一部を含む細胞内へ導入し；
（ｉｉ）（ｉ）において核酸と接触させた細胞を、導入された核酸と細胞の抗体コード配列が組換わるのを可能にする条件下で維持し、それにより、１つ以上の改変免疫グロブリン可変ドメインを有する、改変抗体コード配列を含む修飾された細胞を産生し；
（ｉｉｉ）修飾された細胞において改変コード配列を発現させ；
（ｉｖ）修飾された細胞と標的を接触させ；および
（ｖ）修飾された細胞からさらなる細胞のサブセットを選択する、ここにおいて、さらなるサブセットは標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでいる。
【００２１】
例えば、少なくとも２、３、４または５回のサイクルを実施する。
１つの態様において、工程（ｉｖ）の接触させることは、異なったサイクルの間に、細胞を異なった条件下で標的と接触させることを含んでいる。１つの態様において、工程（ｖ）の選択することは、前の選択工程と比較して、標的への改善された結合を必要としていることを含んでいる。例えば、より高いストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）での洗浄がより後のサイクルで使用することができ、またはより高い濃度の競合剤が使用できる。
【００２２】
１つの態様において、工程（ｉ）の核酸を導入させることに先立って、マーカー配列が抗体コード配列内へ挿入される。
１つの態様において、本方法はさらに、１つ以上のサイクルからのさらなるサブセットの細胞から、抗体コード配列を回収することを含んでいる。１つの態様において、本発明はさらに、１つ以上のサイクルからのさらなるサブセットの細胞中の、少なくとも抗体コード配列のＣＤＲコード領域を配列決定することを含んでいる。１つの態様において、核酸はサブセットの細胞内へ導入される。
【００２３】
１つの態様において、本方法はさらに、１つ以上のサイクルにおいて、（ｉ）に先だって、サブセットの細胞を胞子形成させ、そして（ｉｉ）の後に、核酸が導入されている細胞を接合させることを含んでいる。
【００２４】
１つの態様において、多数の酵母細胞を提供することは、多数の酵母細胞が実質的に同一であるように、本来の細胞を増幅することを含んでいる。１つの態様において、多数の酵母細胞を提供することは、多数の本来の細胞を増幅することを含んでおり、ここにおいて、多数の本来の細胞は、同一の標的と相互作用する、異なった抗体のための抗体コード配列を含んでいる。例えば、本方法は単一抗体、または多数の抗体を親和性成熟させる（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅ）ために使用でき、抗体または抗体類は任意の起源である。
【００２５】
１つの態様において、多数の酵母細胞を提供することは、ファージディスプレイライブラリーから１つ以上の核酸を選択し、そしてファージディスプレイシステムからの１つ以上の核酸を酵母発現系内へ再編成させることを含んでいる。
【００２６】
本方法は、抗体タンパク質を示す細胞を選択するために使用することができる。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
別の様相において、本発明は酵母細胞上に示される抗体タンパク質のサブユニットを変化させる方法を特色としている。本方法は以下の工程を含んでいる：
抗体タンパク質の第１のサブユニットをコードしている第１の核酸メンバーを含む、第１の１倍体（ｈａｐｌｏｉｄ）酵母細胞を提供し、ここにおいて、第１のサブユニットは免疫グロブリン可変ドメインを含んでいる；
各々が免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含む１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；そして
１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を１つ以上の第２の１倍体酵母細胞と接合させて、１つ以上の２倍体細胞を提供し、ここにおいて、第２の１倍体酵母細胞は抗体タンパク質の第２のサブユニットをコードしている第２の核酸メンバーを含んでおり、第２のサブユニットは第１のサブユニットの免疫グロブリン可変ドメインに相補的な免疫グロブリン可変ドメインを含んでおり、そして、各々の２倍体細胞は、その細胞表面に、第１および第２のサブユニットを含んでいる抗体タンパク質を発現できる。
【００２７】
１つの態様において、本方法はさらに、導入することに先立って、第１の核酸メンバー内へ非免疫グロブリン配列を挿入することを含んでおり、それにより、第１のサブユニットのコードを破壊する。
【００２８】
１つの態様において、非免疫グロブリンコード配列は計数器−選択可能マーカーを含んでいる。本方法はさらに、本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
別の様相において、本方法は以下の工程を含んでいる：
抗体タンパク質の第１のサブユニットを含んでいるポリペプチドをコードできる第１の核酸メンバーを含む第１の１倍体酵母細胞を提供し、第１のサブユニットは免疫グロブリン可変ドメインを含んでおり、ここにおいて、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸メンバーの領域は破壊されている；
各々が免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含む、１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；そして
１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を、１つ以上の第２の１倍体細胞と接合させて、１つ以上の２倍体細胞を提供し、ここにおいて、第２の１倍体酵母細胞は抗体タンパク質の第２のサブユニットを含んでいるポリペプチドをコードしている第２の核酸メンバーを含んでおり、第２のサブユニットは第１のサブユニットの免疫グロブリン可変ドメインに相補的な免疫グロブリン可変ドメインを含んでおり、そして、各々の２倍体細胞は、その細胞表面に、第１および第２のサブユニットを含んでいる抗体タンパク質を発現できる。本方法はさらに、例えば、接合することに先立って、１つ以上のラウンドの細胞分割により、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を増幅することを含むことができる。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
【００２９】
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：抗体タンパク質の第１のサブユニットを含んでいるポリペプチドをコードしている第１の核酸メンバーを含む、第１の１倍体酵母細胞、第１のサブユニットは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでいる、および、抗体タンパク質の第２のサブユニットを含んでいるポリペプチドをコードしている第２の核酸メンバーを含む、第２の１倍体酵母細胞、第２のサブユニットは免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでいる、を提供し；各々が免疫グロブリン可変軽鎖ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含む、１つまたは多数の核酸を、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ、導入された核酸が第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；各々が免疫グロブリン可変重鎖ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含む１つまたは多数の核酸が、第２の１倍体細胞またはそのクローン内へ導入された核酸が第２の１倍体細胞またはそのクローン中の第２の核酸メンバーと組換わるように導入し、それにより、１つ以上の修飾された第２の１倍体細胞を産生し；そして、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞と１つ以上の第２の１倍体細胞を接合し、各々が変化した免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび変化した免疫グロブリン重鎖可変ドメインを有する抗体タンパク質を、細胞表面上に発現できる、１つ以上の２倍体細胞を提供する。
【００３０】
１つの態様において、第１および第２の１倍体細胞を提供する工程は、以下の工程を含んでいる：
（ｉ）抗体タンパク質の第１のサブユニットをコードしている第１の核酸メンバー、第１のサブユニットは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでいる、および（ｉｉ）抗体タンパク質の第２のサブユニットをコードしている第２の核酸メンバー、第２のサブユニットは免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでいる、を含む２倍体酵母細胞を提供し；および２倍体酵母細胞を胞子形成させて、第１の核酸メンバーを含む（しかし第２の核酸メンバーを含まない）第１の１倍体細胞、および第２の核酸メンバーを含む（しかし第１の核酸メンバーを含まない）第２の１倍体細胞を提供する。
【００３１】
１つの態様において、本方法はさらに、例えば、接合することに先立って、１つ以上の回の細胞分割により、１つ以上の修飾された第１または第２の１倍体細胞を増幅することを含んでいる。
【００３２】
１つの態様において、本方法はさらに、例えば、接合することに先立って、１つ以上のラウンドの細胞分割により、１つ以上の修飾された第１および第２の１倍体細胞を増幅することを含んでいる。
【００３３】
１つの態様において、本方法はさらに、接合することにより形成された１つ以上の２倍体細胞を胞子形成させることを含んでいる。
１つの態様において、本方法はさらに、１つ以上の２倍体細胞またはそのクローンを標的と接触させることにより、１つ以上の２倍体細胞のサブセットを選択することを含んでいる。例えば、サブセットは、標的と相互作用する１つ以上の細胞、または標的と相互作用しない１つ以上の細胞を含んでいる。サブセットの細胞は胞子形成できる。
【００３４】
本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：
タンパク質コード配列またはその相補体を含む多数の多様な核酸を提供し；
多数の真核細胞を提供し、多数の真核細胞の各々の細胞は、１つ以上の多様な核酸中に存在する相同的配列と組換え可能な受容（ａｃｃｅｐｔｏｒ）配列を含む異種核酸を含んでおり、ここにおいて、受容配列および多様な核酸の組換えは、多様な核酸によりコードされているセグメントまたはその相補体を含むポリペプチドをコードする、組換えられた核酸を産生する；
多数の多様な核酸からの核酸を、多数の細胞の細胞内へ導入し；
１つ以上の導入された核酸を、各々の細胞中の異種核酸と組換え、それにより、１つ以上の導入された核酸によりコードされたセグメントまたはその相補体を含むポリペプチドを各々がコードしている組換え核酸を産生し；
組換えられた核酸によりコードされているポリペプチドが細胞の表面に会合するように、細胞中で組換えられた核酸を発現させ；
組換えられた核酸を発現する細胞と標的を接触させ；そして
その標的との相互作用の機能で１つ以上の細胞を選択する。本方法は、結合タンパク質を示す細胞を選択するためにも使用できる。
【００３５】
１つの態様において、異種核酸は、組換えのための受容配列を提供する、非機能性免疫グロブリンドメインコード配列を含んでいる。例えば、非機能性免疫グロブリンドメインコード配列は、免疫グロブリンドメインコード配列の３’末端より前に突然変異（例えば、終止コドンまたはフレームシフト）を含んでいる。１つの態様において、突然変異は、ＣＤＲをコードしている領域中に存在する。
【００３６】
１つの態様において、非機能性免疫グロブリンドメインコード配列は、ＣＤＲをコードしている領域中にマーカー遺伝子を含んでおり、そして免疫グロブリンドメインのＦＲ領域をコードしている配列は無傷である。例えば、マーカー遺伝子は、計数器−選択可能マーカーを含んでいる。
【００３７】
１つの態様において、組換えられた核酸は抗体軽鎖をコードしており、および発現することはさらに、抗体重鎖および軽鎖が会合し、そしてアンカードメインが細胞表面に抗体重鎖を繋ぎ止めるように、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインおよびアンカードメインを含む抗体重鎖をコードしている核酸を発現することをさらに含んでいる。
【００３８】
１つの態様において、異種核酸は、ポリペプチドの回収がポリペプチドをコードしている核酸を含んでいる細胞の回収を結果として生じるように、細胞との相互作用を可能にする配列を含んでいる。例えば、配列はアンカードメイン（例えば、膜貫通ドメイン）、または酵母細胞表面にＧＰＩ−連結されるようになるドメインをコードしている。
【００３９】
１つの態様において、真核細胞は酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビジエ細胞である。
１つの態様において、標的はタンパク質である。別の態様において、標的は細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、癌細胞または分化細胞である。
【００４０】
１つの態様において、組換えることに先だって、異種核酸は機能性タンパク質をコードしていない。１つの態様において、組換えることに先立って、計数器−選択可能マーカーが異種核酸の受容配列間に位置しており、そして組換えることで計数器−選択可能マーカーが除去される。
【００４１】
１つの態様において、組換えることが、各々の細胞中の異種核酸を切断することにより促進される。例えば、切断することは、異種核酸中に２本鎖中断を作り出す。１つの態様において、組換えることに先立って、酵母細胞中に発現されることが可能である部位特異的エンドヌクレアーゼにより認識される部位が、異種核酸の受容配列間に位置しており、そして組換えることが、各々の細胞中に部位特異的エンドヌクレアーゼを提供することにより促進される。例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼはＨＯエンドヌクレアーゼであり、そして提供することは、ＨＯエンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子を転写することを含んでいる。典型的には、もしエンドヌクレアーゼが発現されるとしたら、致死性を生じないように、エンドヌクレアーゼが選択される。
【００４２】
１つの態様において、組換えられた核酸は、免疫グロブリン可変ドメインをコードしている配列を含んでいる。
本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
【００４３】
別の様相において、本発明は抗体タンパク質の配列を改変する方法を特色としている。本方法は以下の工程を含んでいる：第１の多数の酵母細胞（例えば、酵母細胞ディスプレイライブラリーまたは本来の細胞の複製物）を提供し、第１の多数の酵母細胞の各々の細胞は細胞の表面に会合する抗体タンパク質を発現しており、および各々の細胞は抗体タンパク質をコードする抗体コード核酸配列を含んでおり、ここにおいて、抗体タンパク質は軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでおり、およびここにおいて、第１の多数の酵母細胞の各々の細胞は、独特の抗体タンパク質を発現できる；任意に、標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含むサブセットを、第１の多数の酵母細胞から選択し；サブセットの、または第１の多数の酵母細胞（例えば、本来の細胞の複製物を使用した場合）の１つ以上の細胞内へ、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸を導入し、ここにおいて、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸の各々は、免疫グロブリン可変ドメインのセグメントをコードしている配列またはその相補体を含んでいる；そしてサブセットの、または第１の多数の酵母細胞（例えば、本来の細胞の複製物を使用した場合）の細胞または複数の細胞を、導入されたＩｇセグメント−コード核酸がサブセットの細胞の抗体−コード核酸配列と組換わるのを可能にする条件下で維持し、それにより、改変された免疫グロブリン可変ドメインを有する抗体タンパク質を発現できる、１つまたは多数の細胞を産生する。クローンまたは他の細胞が、第１の多数の細胞に加えて存在できる。
【００４４】
１つの態様において、Ｉｇセグメント−コード核酸は各々、免疫グロブリン可変ドメインのＣＤＲをコードしている配列またはその相補体を含んでいる。例えば、それらは、単一ＣＤＲを含むことができ、例えば、完全ＦＲドメインには広がっていない、例えば、単一ＣＤＲおよび隣接するＦＲ領域の一部を含んでいる。別の態様において、Ｉｇセグメント−コード核酸は各々、免疫グロブリン可変ドメインのＦＲをコードしている配列またはその相補体を含んでいる。
【００４５】
１つの態様において、１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、ヒト核酸から得られる。
１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、同一ＣＤＲの異なった変異体（例えば、ＣＤＲ１の異なった変異体）、または多数の異なったＣＤＲ（例えば、免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の異なった変異体をコードする多数の核酸を含むことができる。
【００４６】
１つの態様において、各々のＩｇセグメント−コード核酸は、その長さが３００、２５０、２００、または１５０ヌクレオチド未満である。１つの態様において、導入することは、少なくとも１０3、１０5、または１０7の異なったＩｇセグメント−コード核酸を、サブセットの１つ以上の細胞と接触させることを含んでいる。１つ以上のＩｇセグメント−コード核酸は、１本鎖または２本鎖であることができる。多数のＩｇセグメント−コード核酸は、平行して若しくは同一の反応混合物中で、サブセットの細胞内へ導入できる。
【００４７】
本方法はさらに、非免疫グロブリンコード配列、例えば、計数器−選択可能マーカーを、サブセットの細胞の核酸メンバー内へ挿入することを含むことができ、そして導入した後、計数器−選択可能マーカーがＩｇセグメント−コード核酸により置き換えられている細胞を選択する。
【００４８】
本方法はさらに、細胞のプールからの細胞と標的を接触させ、標的と相互作用する細胞のサブセットを選択することを含むことができる。
１つの態様において、抗体タンパク質（例えば、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン重鎖）の少なくとも一部が、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメインまたは酵母細胞表面上のＧＰＩ−連結ポリペプチド）へ融合される。免疫グロブリン重鎖はさらに、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むことができる。免疫グロブリン軽鎖は、免疫グロブリン重鎖との共有結合または非共有結合により、酵母細胞表面へ会合することができる。別の態様において、免疫グロブリン軽鎖は、アンカードメイン（例えば、膜貫通ドメインまたは酵母細胞表面上のＧＰＩ−連結ポリペプチド）へ融合される。
【００４９】
核酸メンバーは、酵母細胞の染色体（例えば、内在性染色体または人工染色体）内へ組み込むことができ、若しくはプラスミド上に存在できる。例えば、ＬＣおよびＨＣコード配列は、異なった酵母染色体（例えば、異なった相同的染色体または異なった非相同的染色体）内へ組込まれる。
【００５０】
例えば、抗体−コード核酸配列は、ＬＣ可変免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドをコードしているＬＣコード配列、およびＨＣ可変免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドをコードしているＨＣコード配列を含んでいる。
【００５１】
１つの態様において、少なくとも選択する時点において、酵母細胞は２倍体細胞であり、および２倍体細胞が胞子形成するときにＬＣ−コード配列およびＨＣ−コード配列が異なった胞子内へ隔離されるように、ＬＣ−コード配列およびＨＣ−コード配列は相同的染色体上の座位内に組み込まれる。例えば、配列は、例えば、少なくともＭＡＴα２タンパク質をコードするＭＡＴα遺伝子が破壊されないように、例えばＭＡＴ座位内のＭＡＴ座位の、例えば２０ｋｂ内のＭＡＴ座位へ連結している位置に組み込むことができる。例えば、胞子形成後、同一のＣＤＲ、別のＣＤＲ、ＣＤＲの他の組などを修飾するために、インビボ組換えを実行することが望ましいであろう。例えば、ＣＤＲ内の異なった組のアミノ酸、例えば、ＣＤＲ内の異なった組の４つのアミノ酸を変異誘発するオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＣＤＲに沿って歩行（ｗａｌｋ）させることができる。
【００５２】
１つの態様において、抗体タンパク質はＦａｂである。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：第１の多数の酵母細胞を提供し、第１の多数の酵母細胞は各々、細胞表面に会合する、異なった抗体タンパク質および抗体タンパク質をコードする抗体コード配列を含む細胞を含んでおり、ここにおいて、抗体タンパク質は、軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでいる；第１の多数の酵母細胞からの細胞のサブセットを選択し、ここにおいて、サブセットは標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでいる；以下の１つ以上のサイクルを実施する：
（ｉ）各々が免疫グロブリン可変ドメインの１つのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含んでなる核酸を、サブセットの細胞からの抗体コード配列の少なくとも一部を含む細胞内へ導入し；
（ｉｉ）（ｉ）において核酸と接触させた細胞を、導入された核酸と細胞の抗体コード配列が組換わるのを可能にする条件下で維持し、それにより、１つ以上の改変された免疫グロブリン可変ドメインを有する、改変抗体コード配列を含む修飾された細胞を産生し；
（ｉｉｉ）修飾された細胞において改変されたコード配列を発現させ；
（ｉｖ）修飾された細胞と標的を接触させ；および
（ｖ）修飾された細胞からさらなる細胞のサブセットを選択する、ここにおいて、さらなるサブセットは標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでいる。本方法は、抗体タンパク質を示す細胞を選択するために使用できる。１つの態様において、少なくとも２回のサイクルを実施する。１つの態様において、工程（ｉｖ）の接触させることは、異なったサイクルの間に、異なった条件下で、細胞を標的と接触させることを含んでいる。１つの態様において、工程（ｖ）の選択することは、前の選択工程と比較して、標的への改善された結合を必要としていることを含んでいる。１つの態様において、工程（ｉ）の核酸を導入することに先立って、配列が抗体コード配列内へ挿入される。挿入配列は１つ以上の：終止コドン、マーカー遺伝子（例えば、計数器−選択可能マーカー）、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、酵母細胞に対して致死的結果なしに発現できるエンドヌクレアーゼ、例えば、酵母細胞中の内在性遺伝子を修復できないようには切断しないエンドヌクレアーゼ）による切断のための部位を含むことができる。
【００５３】
本方法はさらに、１つ以上の：１つ以上のサイクルからの、さらなるサブセットの細胞から、抗体コード配列を回収し、１つ以上のサイクルからの、さらなるサブセットの細胞中の、少なくとも抗体コード配列のＣＤＲコード領域を配列決定することを含んでいる。
【００５４】
１つの態様において、核酸はサブセットの細胞内へ導入される。
本方法はさらに、１つ以上のサイクルにおいて、（ｉ）に先だって、サブセットの細胞を胞子形成させ、そして（ｉｉ）の後に核酸が導入されている細胞を接合させることを含むことができる。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
【００５５】
別の様相において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：第１の多数の酵母細胞を提供し、第１の多数の酵母細胞の各々の細胞は、細胞の表面に会合した抗体タンパク質を発現しており、および各々の細胞は抗体タンパク質をコードする核酸配列を含んでなり、ここにおいて、抗体タンパク質は軽鎖可変免疫グロブリンドメインおよび重鎖可変免疫グロブリンドメインを含んでなり、およびここにおいて、第１の多数の酵母細胞の各々の細胞は、独特の抗体タンパク質を発現する；免疫グロブリン可変ドメインのセグメント（例えば、ＣＤＲまたはＦＲ）をコードしている配列またはその相補体を含んでなる、１つまたは多数の免疫グロブリン−コード核酸を提供し；第１の多数の酵母細胞から、標的と相互作用する１つ以上の酵母細胞を含んでなるサブセットを選択し；サブセットの１つ以上の細胞内へ、１つ以上の免疫グロブリン−コード核酸を導入し；そして、導入された多様な核酸が、サブセットの細胞の抗体−コード核酸配列と組換わるのを可能にする条件下で、細胞またはサブセットの細胞を維持し；それにより、改変された免疫グロブリン可変ドメインを有する抗体タンパク質を発現できる、１つまたは多数の細胞を産生する。クローンおよび他の細胞が、第１の多数の細胞に加えて存在することができる。本方法は、抗体タンパク質の配列を改変するために使用できる。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことができる。
【００５６】
別の様相において、本発明は修飾されたポリペプチドを同定する方法を特色としている。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）（１）各々が酵母細胞の表面へ結合されるようになるポリペプチドドメインをコードしているセグメントを含む、多数のコード核酸、ここにおいて、ポリペプチドドメインは酵母細胞に対して異種である、および（２）多数の多様な核酸、を提供し；（ｂ）多数の酵母細胞のコード核酸の各々に対し、多様な核酸の１つおよびコード核酸を酵母細胞中で組換えて、修飾されたポリペプチドドメインをコードする修飾された核酸を形成し；（ｃ）酵母細胞中で修飾された核酸を発現し、ここにおいて、修飾されたポリペプチドドメインは酵母細胞の表面に結合されており、および各々の修飾された核酸は免疫グロブリン可変ドメインを含んでいる；（ｄ）酵母細胞を標的（例えば、標的化合物または標的細胞）に接触させ；そして（ｅ）標的へ結合する１つ以上の細胞を回収し、それにより回収された細胞の修飾された核酸によりコードされている１つ以上のポリペプチドを同定する。本方法は、回収された細胞の１つ以上の修飾された核酸を修飾すること（例えば、本方法を繰り返すことにより）をさらに含むことができる。
【００５７】
１つの態様において、各々の多様な核酸は、ＣＤＲをコードするセグメントまたはその相補体を含んでいる。
本発明さらに、哺乳動物細胞発現のために、回収された細胞の修飾された核酸を再編成すること、および再編成された核酸を哺乳動物細胞中で発現することを含むことができる。本方法はまた、哺乳動物細胞により発現されたポリペプチド（例えば、免疫グロブリンドメインを含むポリペプチド）の生物学的特性（例えば、細胞毒性細胞または補体タンパク質の動員を含む特性）を評価することを含むことが可能である。
【００５８】
１つの態様において、組換えることはさらに、プラスミド内へカセット（例えば、計数器−選択可能マーカー（例えば、ＵＲＡ３またはｋａｎＲ）を含んでいる）を挿入して受容核酸を形成させ、そして次ぎに、カセットをドナー（ｄｏｎｏｒ）核酸で置換することを含むことができる。１つの態様において、カセットを挿入することは、標的−結合配列を除去する。
【００５９】
１つの態様において、各々の修飾されたポリペプチドは、細胞表面アンカードメイン、例えば、膜貫通ドメインまたはＧＰＩ−繋留ドメインのごとき、膜に会合されているドメインへ、例えば、融合されることにより、共有結合で結合される。１つの態様において、アンカードメインは、酵母Ａｇａ１ｐ、Ａｇａ２ｐ、またはその断片を含んでいる。
【００６０】
１つの態様において、多様なドナー核酸は、少なくとも１０3、１０4、１０5、１０6、１０8、１０9または１０10の異なったドナー核酸を含んでいる。例えば、多様なドナー核酸は１０3−１０12、１０3−１０10または１０4−１０9の間の異なったドナー核酸を含むことができる。１つの態様において、各々の多様なドナー核酸は、その長さが２０００、５００、２００、１２０、８０、５０または４０ヌクレオチド未満である。多様なドナー核酸は、その長さが少なくとも約２０、４０、１００、５００、１０００または２０００ヌクレオチドであることができる。各々の多様なドナー核酸は、少なくとも別の多様なドナー核酸と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一であることができる。例えば、多様なドナー核酸は、別の多様なドナー核酸に関して、１、２、３または少なくとも４の不適正塩基対を有することができる。
【００６１】
１つの態様において、多様なドナー核酸の各々は、他と等しい長さであるか、若しくは多様なドナー核酸の平均した長さの３０、２０、１５または１０％以内である。１つの態様において、多数の酵母細胞の多様なドナー核酸はすべて、お互いに８、６、４、３、２または１ヌクレオチド以内の長さを有している。多様なドナー核酸の各々は、他の多様なドナー核酸の各々の対応する末端領域と同一である（または少なくとも７０％同一）、少なくとも６塩基対の３’および／または５’末端領域を含むことができる。好ましい態様において、末端領域は、鋳型核酸上の対応する部位と正確に相補的である。１つの態様において、多様なドナー核酸の各々は、鋳型の共通領域（例えば、少なくとも５または１０ヌクレオチド）に対応する（例えば、部分的に相補的である）配列を含んでいる。各々の多様なドナー核酸は、天然に存在する配列、または人工配列を含むことができる。
【００６２】
１つの態様において、各々の多様なドナー核酸は、ＣＤＲまたはその断片、例えば、少なくとも５アミノ酸を含んでいる断片をコードしている。１つの態様において、多様なドナー核酸はさらに、ＣＤＲをコードしている配列（またはその相補体）に隣接する配列にアニール（ａｎｎｅａｌ）した３’および／または５’末端領域、例えば、フレームワーク領域をコードする配列（またはその相補体）、例えば、その少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド、を含んでいる。末端領域は、好ましくは、多様なドナー核酸中の末端領域の間にある配列よりも変化が少ない。ＣＤＲは重鎖ＣＤＲ（例えば、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）または軽鎖ＣＤＲ（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）であることができる。好ましい態様において、多様なドナー核酸は、好ましくはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域の全配列を含んでおらず、例えば、各々の隣接フレームワーク領域のアミノ酸を２、５、８、１０または１５未満だけ含んでいる。
【００６３】
別の態様において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：（ａ）（１）第１の組換え部位および受容配列を含む受容核酸、および（２）第２の組換え部位および対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）ポリペプチドをコードしているセグメントまたはその相補体を含むドナー核酸、を提供し；（ｂ）細胞（例えば、酵母細胞）中で各々の受容およびドナー核酸の第１および第２組換え部位を組換えて、対象ポリペプチドをコードし、そして受容配列を含んでいる組換えられた核酸を形成し；そして（ｃ）対象ポリペプチドが細胞の表面上で検出可能であるように（例えば、対象ポリペプチドは細胞の表面に共有結合で、若しくは非共有結合で結合されている）、組換えられた核酸を細胞中で発現する。１つの態様において、ドナー核酸はＣＤＲをコードする配列を含んでいる。
【００６４】
別の様相において、本発明は修飾されたポリペプチドを発現する方法を特色としている。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）（１）細胞表面上で検出可能な異種ポリペプチドドメインをコードしているセグメントを含むコード核酸、および（２）修飾する核酸、を提供し；（ｂ）修飾する核酸およびコード核酸を細胞中で組換えて、修飾されたポリペプチドドメインをコードする修飾された核酸を形成し；そして（ｃ）修飾された核酸が細胞の表面上で検出可能であるように、修飾された核酸を細胞中で発現する。ポリペプチドは細胞表面上に、直接的にまたは間接的に結合できる。例えば、ポリペプチドは膜貫通タンパク質に融合でき、共有結合（例えば、膜貫通タンパク質へのジスルフィド結合）により結合されるか、または膜貫通タンパク質へ非共有結合相互作用により結合される。ポリペプチドは同様に、別の膜（例えば、非膜貫通タンパク質）または細胞会合タンパク質へ結合することができる。
【００６５】
細胞は微生物、例えば、酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビジエまたはＳ．ポムベであることが可能である。
本方法はさらに、修飾された核酸の特性、例えば、標的（例えば、標的化合物または標的細胞）への結合を評価することを含んでいる。評価することは、標的と細胞を接触させ、そして細胞および標的間の、例えば、修飾されたポリペプチドドメインおよび標的間の相互作用を評価することを含むことができる。評価することはさらに、結合親和性の定量的測定を査定することを含むことができる。
【００６６】
１つの態様において、細胞は酵母細胞であり、および方法はさらに、哺乳動物細胞発現のために修飾された核酸を再編成すること、および再編成された核酸を哺乳動物細胞中で発現することを含むことができる。本方法はまた、哺乳動物細胞により発現された修飾されたポリペプチド（例えば、免疫グロブリンドメインを含むポリペプチド）の生物学的特性（例えば、細胞毒性細胞または補体タンパク質の動員を含む特性）を評価することを含むことが可能である。
【００６７】
別の様相において、本発明は修飾されたポリペプチドを発現する方法を特色としている。本方法は以下の工程を含んでいる：（ａ）（１）各々が、細胞の表面上で検出可能であるポリペプチドドメインをコードしているセグメントを含む、多数のコード核酸、ここにおいて、ポリペプチドドメインは酵母細胞に対して異種である、および（２）多数の多様な核酸、を提供し；（ｂ）多数の酵母細胞のコード核酸の各々に対し、多様な核酸の１つとコード核酸を細胞中で組換えて、修飾されたポリペプチドドメインをコードする修飾された核酸を形成し；そして（ｃ）修飾されたポリペプチドドメインが細胞の表面上で検出可能であるように、修飾された核酸を細胞中で発現する。
【００６８】
細胞は微生物、例えば、酵母細胞、例えば、Ｓ．セレビジエまたはＳ．ポムベであることが可能である。
本方法はさらに、修飾された核酸の特性、例えば、標的標的化合物への結合を評価することを含んでいる。評価することは、細胞を標的化合物と接触させること、そして標的化合物へ結合する細胞、例えば、その表面に標的化合物へ結合する修飾されたポリペプチドドメインを示す細胞を回収することを含むことができる。評価することはさらに、結合親和性の定量的測定を査定することを含むことができる。
【００６９】
本方法はさらに、組換えた後、細胞を、例えば、第２のドナー核酸および第２の受容核酸が組み換えられている別の細胞へ接合することを含むことが可能である。もし、細胞を接合に先立って分割することを可能にすると、多数の組合わせの組換え産物を生成することが可能である。
【００７０】
１つの態様において、各々の修飾されたポリペプチドは、細胞表面アンカードメイン、例えば、膜貫通ドメインまたはＧＰＩ−繋留ドメインのごとき、膜に会合されているドメインへ、例えば、融合されることにより、共有結合で結合される。１つの態様において、アンカードメインは、酵母Ａｇａ１ｐ、Ａｇａ２ｐ、またはその断片を含んでいる。
【００７１】
１つの態様において、細胞は酵母細胞であり、および方法はさらに、哺乳動物細胞発現のために修飾された核酸を再編成し、および再編成された核酸を哺乳動物細胞中で発現することを含むことができる。本方法はまた、哺乳動物細胞により発現されたポリペプチド（例えば、免疫グロブリンドメインを含むポリペプチド）の生物学的特性（例えば、細胞毒性細胞または補体タンパク質の動員を含む特性）を評価することを含むことが可能である。
【００７２】
１つの態様において、多様なドナー核酸は、少なくとも１０3、１０4、１０5、１０6、１０8、１０9または１０10の異なったドナー核酸を含んでいる。１つの態様において、各々の多様なドナー核酸は、その長さが２０００、５００、２００、１２０、８０、５０または４０ヌクレオチド未満である。多様なドナー核酸は、その長さが少なくとも約２０、４０、１００、５００、１０００または２０００ヌクレオチドであることができる。各々の多様なドナー核酸は、少なくとも別の多様なドナー核酸と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％同一であることができる。例えば、多様なドナー核酸は、別の多様なドナー核酸に関して、１、２、３または少なくとも４の不適正塩基対を有することができる。
【００７３】
１つの態様において、多様なドナー核酸の各々は、他と等しい長さであるか、若しくは多様なドナー核酸の平均した長さの３０、２０、１５または１０％以内である。１つの態様において、多数の酵母細胞の多様なドナー核酸はすべて、お互いに８、６、４、３、２または１ヌクレオチド以内の長さを有している。多様なドナー核酸の各々は、他の多様なドナー核酸の各々の対応する末端領域と同一である（または少なくとも７０％同一）、少なくとも６塩基対の３’および／または５’末端領域を含むことができる。好ましい態様において、末端領域は、鋳型核酸上の対応する部位と正確に相補的である。１つの態様において、多様なドナー核酸の各々は、鋳型の共通領域（例えば、少なくとも５または１０ヌクレオチド）に対応する（例えば、部分的に相補的である）配列を含んでいる。各々の多様なドナー核酸は、天然に存在する配列、または人工配列を含むことができる。
【００７４】
１つの態様において、各々の多様なドナー核酸は、ＣＤＲまたはその断片、例えば、少なくとも５アミノ酸を含んでいる断片をコードしている。１つの態様において、多様なドナー核酸はさらに、ＣＤＲをコードしている配列（またはその相補体）に隣接する配列にアニールした３’および／または５’末端領域、例えば、フレームワーク領域をコードする配列（またはその相補体）、例えば、その少なくとも１、２、３、４または５ヌクレオチド、を含んでいる。末端領域は、好ましくは、多様なドナー核酸中の末端領域の間にある配列よりも変化が少ない。ＣＤＲは重鎖ＣＤＲ（例えば、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）または軽鎖ＣＤＲ（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）であることができる。好ましい態様において、多様なドナー核酸は、好ましくはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域の全配列を含んでおらず、例えば、各々の隣接フレームワーク領域のアミノ酸を２、５、８、１０または１５未満だけ含んでいる。
【００７５】
本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。
別の態様において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：（ａ）（１）第１の組換え部位および受容配列を含む受容核酸、および（２）第２の組換え部位および対象ポリペプチドをコードしているセグメントまたはその相補体を含むドナー核酸、を提供し；（ｂ）細胞中で各々の受容およびドナー核酸の第１および第２組換え部位を組換えて、対象ポリペプチドをコードし、そして受容配列を含んでいる、組換えられた核酸を形成し；そして（ｃ）対象ポリペプチドが細胞の表面上で検出可能であるように（例えば、対象ポリペプチドは細胞の表面に共有結合で、若しくは非共有結合で結合されている）、組換えられた核酸を細胞中で発現する。
【００７６】
細胞は微生物、例えば、酵母細胞のごとき真核微生物、例えば、Ｓ．セレビジエまたはＳ．ポムベ、または原核微生物、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌、であることが可能である。
【００７７】
１つの態様において、本方法はさらに、組換えることに先立って、細胞内へドナー核酸を導入し、および／または細胞内へ受容核酸を導入することを含んでいる。例えば、ドナー核酸は１本鎖であり、および／または受容核酸は１本鎖である。１つの態様において、受容核酸は環状である。
【００７８】
１つの態様において、本方法はさらに、受容核酸中に、中断（例えば、ニック（ｎｉｃｋ）または２重鎖の中断）を発生させることを含んでいる。中断は、インビトロまたは細胞中で発生させることが可能である。例えば、中断は、切断酵素（例えば、ＨＯエンドヌクレアーゼ）の誘導された発現により発生させる。別の例において、中断は、切断−定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）オリゴヌクレオチドにより発生させる。
【００７９】
本方法はさらに、プラスミド内へカセットを挿入して、受容核酸を形成させることを含むこと可能であり、ここにおいて、カセットはマーカーを含んでいる。組換えることは、カセットをドナー核酸で置換することができる。１つの態様において、カセットを挿入することは、標的−結合配列を除去する。１つの態様において、受容核酸は、第１の組換え部位間に、計数器−選択可能マーカー（例えば、ＵＲＡ３またはｋａｎＲ）を含んでいる。
【００８０】
１つの態様において、ドナー核酸は１本鎖、例えば、オリゴヌクレオチドまたは１本鎖プラスミドであるか、または２本鎖、例えば、２本鎖プラスミドである。ドナー核酸は、ＣＤＲをコードしている配列、またはそのセグメントを含むことが可能である。ドナー核酸は、多様な核酸プールのメンバーであることが可能である。組換えられた核酸は、免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドをコードすることが可能である。別の態様において、組換えられた核酸は、酵素またはその断片をコードすることが可能である。例えば、ドナー核酸は、活性部位残基、例えば、結合された基質または補因子の２オングストローム以内の残基をコードすることが可能である。
【００８１】
１つの態様において、第１および／または第２の組換え部位は、部位特異的組換え部位、例えば、酵母ＦＬＰ認識部位またはラムダａｔｔＢ部位、を含む部位を含んでいる。本方法はさらに、部位特異的リコンビナーゼを誘導することを含むことが可能である。
【００８２】
本方法は、ドナー核酸を含む第１の細胞および受容核酸を含む第２の細胞を融合させることを含むことが可能である。融合は酵母接合が可能である。本方法はさらに、部位特異的リコンビナーゼを誘導すること、またはドナーまたは受容核酸中に、例えば、ＨＯエンドヌクレアーゼを使用して、中断（例えば、２本鎖中断）を発生させることを含むことが可能である。
【００８３】
１つの態様において、受容配列は、多量体タンパク質の第１のサブユニットをコードしている配列、および少なくとも多量体タンパク質の第２のサブユニットの断片をコードしている対象配列を含んでいる。例えば、多量体タンパク質は抗体またはＴ細胞レセプターである。１つの態様において、カセットはＣＤＲまたはそのタンパク質をコードしている配列を除去する。
【００８４】
受容および／またはドナー核酸は、核酸結合タンパク質、例えば、１本鎖結合タンパク質、例えば、ｒｅｃＡにより結合（例えば、コーティング）することが可能である。
１つの態様において、受容およびドナー核酸を、組換えることに先立って、インビトロで結合する。結合することにより形成された混合物を細胞内へ導入することが可能である。
【００８５】
提供することは、既定の特性でディスプレイライブラリー、例えば、細胞ディスプレイライブラリー、例えば、酵母ディスプレイライブラリー、のメンバーを選択することを含むことが可能である。提供することはさらに、ディスプレイライブラリーの選択されたメンバーから受容核酸を単離すること、および／または選択されたメンバー内へドナー核酸を導入することを含むことが可能である。受容核酸を提供することは、受容核酸をＰＣＲで増幅すること、および／またはタグ付けされたまたはタグ付けされていない核酸鎖を単離すること、またはオリゴヌクレオチド−仲介切断を含むことが可能である。
【００８６】
本方法はさらに、以下の１つ以上の工程を含むことが可能である：細胞をリガンドと接触させ、リガンドへの細胞の結合を評価するか、またはリガンドへ結合する能力に基づいて細胞を単離する；そして組換えした後、細胞を、例えば、第２のドナー核酸および第２の受容核酸が組換えられている別の細胞と接合する。
【００８７】
１つの態様において、対象ポリペプチドを細胞−表面アンカードメイン、例えば、膜貫通ドメインまたはＧＰＩ−繋留ドメインのごとき、膜に会合されているドメインへ融合する。１つの態様において、アンカードメインは：酵母Ａｇａ１ｐ、Ａｇａ２ｐまたはその断片を含んでいる。
【００８８】
本方法はさらに、インビトロで第１のおよび第２の核酸をライゲートし（ｌｉｇａｔｉｎｇ）、そして細胞内へライゲートされた核酸を導入することを含むことが可能であり、ここにおいて、細胞中での組換えは核酸を環状化する。
【００８９】
１つの態様において、ドナー核酸は、マーカー遺伝子の第１の非機能性アレル（ａｌｌｅｌｅ）を含み、そして受容核酸は、マーカー遺伝子の第２の非機能性アレルを含んでおり、ここにおいて、第１および第２のアレルは結合できて、マーカー遺伝子の機能性アレルを発生させる。
【００９０】
本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。
別の態様において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：（ａ）第１の多数の酵母細胞を提供し、第１の多数の酵母細胞は、各々異なった核酸メンバー、および細胞表面上で検出可能なヘテロオリゴマータンパク質を含む細胞を含んでおり、核酸メンバーはポリペプチドをコードしている；（ｂ）第１の多数の酵母細胞と第１の標的を接触させ；（ｃ）１つ以上の第１の多数の酵母細胞を含むサブセットを選択し、１つ以上の酵母細胞は、第１の標的へ結合するヘテロオリゴマータンパク質を発現する核酸メンバーを含んでいる；そして（ｄ）サブセットの細胞の核酸メンバーを、ドナー核酸の多様なプールと組換える。少なくとも１つの組換えの反応相が酵母細胞に生じ、第２の多数の酵母細胞を得る。第２の多数の酵母細胞は、各々がサブセットの細胞の核酸メンバーに対応する変異体を含む細胞を含んでいる。ドナー核酸は、機能性ドメインのセグメントをコードしており、および１つの選択された細胞のヘテロオリゴマータンパク質をコードしている配列の領域に相同的な領域を含んでいる。
【００９１】
本方法はさらに、（ｅ）第２の多数の酵母細胞からの細胞を、第２の標的と接触させ、そして（ｆ）第２の標的を結合するポリペプチドをコードする第２のライブラリーメンバーを含む、１つ以上の酵母細胞を選択する工程を含むことが可能である。
【００９２】
第２の標的は、第１の標的と同一であることが可能である。
本方法はさらに、組み換えることに先立って、マーカー遺伝子を、サブセットの細胞の、各々の核酸メンバー領域内へ挿入することを含むことが可能であり、領域は発現されたポリペプチドのセグメントをコードしている。１つの態様において、挿入は、結合決定基をコードする配列を除去する。
【００９３】
サブセットの細胞の、各々の核酸メンバーは、免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをコードすることが可能である。こうした場合、結合決定基はＣＤＲまたはその断片を含むことが可能である。例えば、第１の多数の酵母細胞は、少なくとも１０3  １０4、１０5、１０6、１０7または１０8の異なった細胞を含むことが可能である。サブセットは、少なくとも１０、１０3、１０3、１０5、１０6、１０7の異なった細胞を含むことが可能である。第２の多数の酵母細胞は、１０、１０3、１０3、１０5、１０6、１０7の異なった細胞を含むことが可能である。
【００９４】
本方法はさらに、組換えることのために選択されたサブセットのメンバーを自動的に処理すること、例えば、選択されたサブセットのメンバーをロボット的に選び取り、そして組換えるための共通の容器にメンバーを合併するか、または各々を組換えるための個々の容器に入れること、を含むことが可能である。本方法はさらに、対応する変異体核酸の発現により与えられた特性で、第２の多数の酵母細胞メンバーを自動的に評価することを含むことが可能である。例えば、本方法は自動的に評価することにより得られた情報を電子的に記録することを含むことが可能である。
【００９５】
本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。
別の態様において、本発明はポリペプチドの配列を変化させる方法を含んでいる。本方法は：（ａ）第１の多数の酵母細胞を提供し、第１の多数の酵母細胞は、各々がポリペプチドの少なくとも一部をコードしているセグメント、および第１のマーカー遺伝子を含む、異なった核酸メンバーを含んでいる；（ｂ）第２の多数の酵母細胞を提供し、第２の多数の酵母細胞は、各々がポリペプチドの少なくとも一部をコードしているセグメント、および、任意に、第２のマーカー遺伝子を含む、異なった核酸メンバーを含んでおり、ここにおいて、第１および第２の多数の酵母細胞の核酸メンバーは、第１の多数の酵母細胞のメンバーが第２の多数の酵母細胞のメンバーと組換わることが可能なように、相同性領域を含んでいる；（ｃ）接合した細胞を形成させ、各々の接合した細胞は、第１の多数の細胞である１つの親細胞および第２の多数の細胞である別の親細胞の生成物である；そして（ｄ）親細胞からの核酸メンバーが組み換えられて、第１のマーカー遺伝子（および任意に第２のマーカー遺伝子）が排除され、および親細胞よりの核酸メンバーからの配列を含む、組み換えられた核酸が形成された、接合した細胞を選択する。
【００９６】
１つの態様において、組み換えられた核酸は免疫グロブリン可変ドメインをコードしている。加えて、親核酸は、各々が免疫グロブリン可変ドメインの一部をコードすることが可能である。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。
【００９７】
別の態様において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：制限活性および
ヘテロオリゴマーレセプターの第１および第２のサブユニットをコードしている宿主核酸を含む、宿主細菌細胞を提供し；宿主細菌細胞を、制限活性により切断可能で、およびヘテロオリゴマーレセプターの異なった第１および第２のサブユニットをコードしている、非メチル化核酸を含む、ファージ粒子で感染させ、ここにおいて、非メチル化核酸は感染後に切断される；切断された核酸および宿主核酸を、ヘテロオリゴマーレセプターの第１および第２のサブユニットをコードしている領域中の部位で組換え；そして組み換えられた核酸によりコードされているヘテロオリゴマーレセプターを示すファージディスプレイ粒子を単離する。非メチル化核酸はさらに、マーカー遺伝子の第１の非機能性アレルを含むことが可能であり、そして宿主核酸はマーカー遺伝子の第２の非機能性アレルを含んでおり、ここにおいて、第１および第２の非機能性アレルを結合させて、機能性アレルを発生させることが可能である。
【００９８】
本方法はさらに、マーカー遺伝子の機能性アレルに依存する活性で選択することを含むことが可能である。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。
別の態様において、本発明は以下の工程を含む方法を特色としている：（ｉ）ヘテロオリゴマータンパク質の第１のサブユニットをコードしている第１の核酸メンバー、ここにおいて、第１のサブユニットは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでなり、および（ｉｉ）ヘテロオリゴマータンパク質の第２のサブユニットをコードしている第２の核酸メンバー、ここにおいて、第２のサブユニットは免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでなり、および（ｉｉｉ）細胞の表面上で検出可能なヘテロオリゴマータンパク質、を含む２倍体酵母細胞を提供し；２倍体酵母細胞を胞子形成させて、第１の核酸メンバーを含んでなる（しかし第２の核酸メンバーは含んでいない）第１の１倍体細胞、および第２の核酸メンバーを含んでなる（しかし第１の核酸メンバーは含んでいない）第２の１倍体細胞、を提供し；各々が免疫グロブリン可変軽鎖ドメインのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含んでなる１つまたは多数の核酸を、導入された核酸が、第１の１倍体細胞またはそのクローン中の第１の核酸メンバーと組換わるように、第１の１倍体細胞またはそのクローン内へ導入し、それにより、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を産生し；各々が免疫グロブリン可変重鎖ドメインのＣＤＲをコードしているセグメントまたはその相補体を含んでなる１つまたは多数の核酸を、導入された核酸が、第２の１倍体細胞またはそのクローン中の第２の核酸メンバーと組換わるように、第２の１倍体細胞またはそのクローン内へ導入し、それにより、１つ以上の修飾された第２の１倍体細胞を産生し；そして、１つ以上の修飾された第１の１倍体細胞を、１つ以上の修飾された第２の１倍体細胞へ融合（接合）させて、各々が細胞表面上に、変化した免疫グロブリン可変軽鎖ドメインおよび免疫グロブリン可変重鎖ドメインを有するヘテロオリゴマータンパク質を発現することが可能な細胞（例えば、２倍体）を提供する。本方法は本明細書に記載したその他の特色を含むことが可能である。さらに、胞子形成して、別の胞子へ融合することが可能な胞子を産生できる、任意の倍数体細胞を使用することが可能である。例えば、対生交配型の２倍体細胞を産生する、４倍体細胞を使用することが可能である。加えて、交配型座位欠失を、交配を容易にするために使用または発生することが可能である。
【００９９】
本明細書に記載した方法は、例えば、酵母細胞ディスプレイに対して、連続的スクリーニング法で使用することが可能である。例えば、標的へ結合するタンパク質を示している細胞について、酵母細胞のライブラリーがスクリーニングされる。示されたタンパク質をコードしている核酸は、本明細書に記載された方法により修飾し（例えば、形質転換による、多様な核酸の導入を含んでいる組換え、接合、計数器−選択可能マーカーの導入、それらの組合わせなど）、別のディスプレイライブラリーを形成させる。例えば、少なくとも前もって決定された親和性および／または特異性で標的に結合することが、タンパク質で同定されるまで、このサイクルを繰り返すことが可能である。本方法は、ディスプレイライブラリーの各々の選択されたメンバーから、核酸を精製および／またはクローニングすることなく、タンパク質変異体を発生させるために使用できる。
【０１００】
別の様相において、本発明はまた、その核酸が本明細書に記載した方法により修飾されたメンバーを含む酵母細胞ディスプレイライブラリー、本明細書に記載した方法により修飾され、および単離された酵母細胞ディスプレイメンバー、および本明細書に記載した方法により修飾され、および単離された免疫グロブリンを含む免疫グロブリンタンパク質も特色としている。
【０１０１】
別の様相において、本発明は５’組換え配列、マーカー、および３’組換え配列を含んでなる単離された核酸を特色としている。各々の組換え配列は、少なくとも１０、２０、３０または５０ヌクレオチド長であることが可能である（例えば、１０−５０または２０−５０または３０−１００ヌクレオチド長の間）。各々の組換え配列は、異なった免疫グロブリンフレームワーク領域と相同的または同一であることが可能である。例えば、５’組換え配列はＦＲ１と相同的であることが可能であり、および３’組換え配列はＦＲ２と相同的であることが可能であり、逆もまた同じである。マーカーは、選択可能マーカー、優性マーカー、または計数器選択可能マーカー（例えば、ＵＲＡ３）であることが可能である。典型的には、マーカーとは、マーカーを失った細胞が、例えば、成長または他の表現型により、選択的に同定されるようにするマーカーである。マーカーは酵母細胞中で機能性であることが可能である；例えば、マーカーは酵母遺伝子であることが可能である。
【０１０２】
別の様相において、本発明は、免疫グロブリン可変ドメインをコードするためのコード領域を含んでなる、異種核酸を含む酵母細胞を特色としており、ここにおいて、コード領域が機能性免疫グロブリン可変ドメインをコードしないように、および免疫グロブリン可変ドメインコード配列からの１つ以上の他の断片との組換えでコード領域が復活し、それが機能性免疫グロブリン可変ドメインをコードするように、前記領域は、免疫グロブリン可変ドメインの１つ以上の部分、および非免疫グロブリンコード配列をコードしている配列を含んでいる。１つの態様において、非免疫グロブリンコード配列は、遺伝子マーカー、例えば、選択可能マーカーまたは検出可能マーカーを含んでなる。１つの態様において、選択可能マーカーは計数器−選択可能マーカーである。１つの態様において、酵母細胞はさらに、第２の免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、抗体の他の鎖）をコードするための第２のコード領域を含んでいる。第２のコード領域はまた、例えば、非免疫グロブリンコード配列、例えば、異なった遺伝子マーカーで破壊することが可能である。コード領域の少なくとも１つは、コード領域の機能性体の発現により形成される抗体が、酵母細胞の表面上に発現されるように（例えば、原形質膜へ結合されることにより、例えば、膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーにより）形成することが可能である。酵母細胞は、本明細書に記載した核酸で処理された酵母細胞（例えば、前記のもの）であることが可能であり、そして本明細書に記載された他の特色を含むことが可能である。
【０１０３】
「異種」配列とは、技術を用いて、細胞内、または核酸に関連して導入された配列を指している。異種配列は、内在性遺伝子のコピーでもよいが、例えば、外来性プラスミド内へ、またはその内在性位置以外の位置の染色体位内へ挿入される。
【０１０４】
用語「融合」とは、融合された成分を含む単一ポリペプチド鎖を指している。融合タンパク質の例には、免疫グロブリンドメインおよび膜貫通ドメインまたはＧＰＩ−連結ドメインが含まれる。融合された成分は、お互いに直接的に隣接されている必要はない。例えば、１つ以上の他の配列（例えば、リンカーポリペプチドまたは機能性ドメイン）を、融合された要素の間に位置させることが可能である。
【０１０５】
用語「コード領域」とは、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドのコーディングを妨げることができるが、例えば、組換え、特に相同的組換えにより修復ことができる、１つ以上の突然変異を含む、ヌクレオチド配列を指している。突然変異の例には、非コード配列、分離したコード配列（例えば、マーカー遺伝子）、終止コドン、フレームシフト突然変異などが含まれる。
【０１０６】
「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインからのドメインを指している。免疫グロブリンドメインは典型的には、約７のβ鎖から形成された２つのβシート、および保存されたジスルフィド結合を含んでいる（例えば、Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５、を参照されたい）。可変ドメインは典型的には、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として記述できる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と名付けられた、超可変性の領域、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と名付けられた、より保存的である領域に副分割できる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に決定されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，米国保健社会福祉省，ＮＩＨ出版番号第９１−３２４２号，およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，を参照されたい）。本明細書での定義について、ＣＤＲを描写するためのＫａｂａｔ参考文献が使用された。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４、で配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。可変ドメインは、１つ以上のヒトまたはヒト化フレームワーク領域および／または１つ以上のヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことが可能である。
【０１０７】
用語「抗体」または「抗体タンパク質」とは、ＶＨおよびＶＬ断片対が抗原結合部位を形成した、少なくとも１対のＶＨおよびＶＬドメイン、または十分に大きなＶＨおよびＶＬ断片を指している。従って、用語「抗体」は、完全長抗体（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ、しかし好ましくはＩｇＧ）、１つ以上の定常免疫グロブリンドメインを欠いた抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2または単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ断片））、および少なくとも１対のＶＨおよびＶＬドメインを含むその他の構造を包含するが、これらに限定されるわけではない。抗体は、２つの重鎖免疫グロブリンポリペプチドおよび２つの軽鎖免疫グロブリンポリペプチド；１つの重鎖免疫グロブリンポリペプチドおよび１つの軽鎖免疫グロブリンポリペプチド；を含むことが可能であるが、単鎖抗体であることも可能である。抗体は、任意に、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンまたはミュー定常領域遺伝子から選択された定常領域を含んでいる。抗体の例には、実質的にヒト抗体からの重および軽鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部、が含まれる。
【０１０８】
抗体は好ましくは単一特異性、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、である。用語“単一特異性抗体”とは、特定の標的、例えば、エピトープ、に対する単一の結合特異性および親和性を示す抗体を指している。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体成分」を含んでおり、それらは本明細書において、単一分子組成物の、抗体またはその断片の調製物を指すために使用される。
【０１０９】
１つの態様において、抗体は組換え抗体である。用語「組換え」抗体とは、本明細書で使用される場合、宿主細胞内へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換え、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである、動物（例えば、マウス、ヤギまたはウシ）から単離された抗体、または、他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む、任意の他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体のように、組換え法により調製、発現、作製または単離されたすべての抗体を含んでいる。
【０１１０】
用語「示された抗体」とは、示された抗体が遺伝子パッケージと生理的に会合するように、遺伝子パッケージ上に存在する抗体を指しており、そして遺伝子パッケージは、示された抗体の少なくとも可変領域をコードする核酸を含んでいる。遺伝子パッケージの例には、細胞（例えば、酵母細胞）およびファージ粒子が含まれる。
【０１１１】
「抗原結合部位」とは、対になったＶＨおよびＶＬの抗原結合領域を指している。特定の抗原結合領域が、抗原結合部位により結合される、既知のリガンドを有していても、またはいなくてもよい。
【０１１２】
用語「組換え」とは、核酸鎖間の遺伝子情報を交換するプロセスを指している。１つの例において、本プロセスは、ドナー鎖からの領域および受容鎖からの領域を含む、新規核酸鎖の形成を生じる。別の例において、本プロセスは、標的または受容体鎖のような別の鎖内への、ドナー核酸配列のような１つの鎖の挿入を生じる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「相同的」とは、適切な宿主細胞中で、特に酵母細胞中で、２つの配列がお互いに組換わるように、基準配列に十分に関連している配列を指している。ほとんど同一の配列およびその基準配列間で許容される相違の数は、宿主細胞中でお互いに組換わる、２つの配列の能力により定義される。相同的配列は、基準配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９５、９６、９７、９８または９９％同一、ほとんど同一、または同一であろう。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」とは、剤、好ましくは、核酸間の遺伝子情報の交換を刺激する、例えば、触媒するポリペプチドを指している。
用語「１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質」とは、例えば、１０μＭ、１００ｎＭまたは１０ｎＭより強い親和性で、可変配列の１本鎖ＤＮＡへ結合するポリペプチドを指している。しかしながら、大腸菌ＳＳＢタンパク質（１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）は、具体的なポリペプチド（即ち、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：Ｐ０２３３９）を指している。
【０１１５】
本発明の１つ以上の態様の詳細は、以下の記述に示されている。本発明の他の特色、目的および利点は、該記述および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本出願を通して引用されている、すべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、特に本明細書に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１６】
詳細な説明
本発明は、なかでも、異種細胞表面上に示されるポリペプチドをコードする核酸配列を製造する方法を提供する。多くの実行において、核酸配列の集団が製造される（例えば、核酸ライブラリーを形成させる）。ライブラリーは、例えば、細胞に基づいたディスプレイおよび選択を使用して、スクリーニングすることが可能である。
【０１１７】
本方法は一般的に、ドナー核酸および受容核酸を組み換えて、示されたポリペプチドをコードする、組換えられた核酸を形成させる。組換え反応はインビボ反応であり、少なくとも組換え中間体（いくつかの実行において、それは細胞の外側で形成されてもよい）の分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が細胞内で起こることを意味している。部位特異的組換えおよび相同的組換えの両方を使用することが可能である。
【０１１８】
酵母、細菌および哺乳動物細胞を含む多様な細胞が、異種核酸による相同的組換えを支えている。特に、酵母細胞は、遊離末端を有する核酸と相同的対応物を組換えることに、高度に有効であることが示されている。例えば、Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６３５４−８、を参照されたい。酵母においては、約１００ヌクレオチドの相同性の配列、および１５ヌクレオチドほどの少ない相同性を有する配列さえも、相同的組換えにうまく使用することが可能である。およそ８０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが、相同的位置に組み込まれ、そして計数器選択可能マーカーを切り取ることが示されている（Ｓｔｏｒｉｃｉら、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３）。
【０１１９】
最初に、多様な態様例が示される。
１．第１の例においては、ドナー核酸および受容核酸がインビトロで組み合わされ、そして次ぎに、細胞内へ導入される。
【０１２０】
酵母ディスプレイのためのベクターは、プロモーターおよびシグナル配列をコードしている配列、免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ＶＬ）のＮ末端定常領域をコードしている第１のコード配列、および免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、ＣＬ）のＮ末端定常領域をコードしている第２のコード配列を含んでいる。独特の制限酵素部位は、第１および第２のコード配列間に位置している。この段階では、ＣＤＲ領域および介在フレームワーク領域がベクターから取り除かれているので、ベクターは機能性免疫グロブリン鎖をコードしていない。
【０１２１】
いくつかの実行において、ベクターはまた、アンカータンパク質またはその断片も含むことが可能である。アンカータンパク質は、例えば、Ａｇａ１ｐまたはＡｇａ２ｐであることが可能である。
【０１２２】
ベクター核酸を制限酵素で消化し、そして次ぎに、免疫グロブリン可変ドメインおよび少なくとも定常ドメインのＮ末端をコードする、多様な核酸のプールと組み合わせる。プールの核酸は線状化ベクターの末端に相同的である。線状化ベクターおよび多様な核酸の混合物を酵母細胞内へ電気穿孔する。細胞内の相同的組換えはベクターの環状化、およびベクターの各々のコピー内への、１つの多様な核酸の導入を生じる。組換え後、免疫グロブリン可変ドメインをコードしている配列が完成する。この段階で、ベクターはシグナル配列および完全可変ドメインおよび定常ドメイン（例えば、ＶＬ−ＣＬ）を有するポリペプチドをコードしている。
【０１２３】
２．第２の例においては、候補リガンドを同定するために、細胞ディスプレイライブラリーをスクリーニングする。候補リガンドは、組換えにより多様化させ、２次の細胞ディスプレイライブラリーを形成させる。
【０１２４】
Ｆａｂ断片を示す酵母ディスプレイライブラリーを、標的分子に対する結合でスクリーニングする。標的に結合するＦａｂをコードしている酵母細胞を選択する。Ｆａｂをコードしているライブラリープラスミドを酵母細胞から単離する。プラスミドを、免疫グロブリン鎖の１つの、１つ以上のＣＤＲを含む領域のどちらかの側を独特に切断する制限酵素で消化する。プラスミドのより大きな断片（即ち、主鎖断片）を精製する。
【０１２５】
線状化プラスミドを、切り出された１つ以上のＣＤＲをコードする、多様な核酸のプールと組み合わせる。多様な核酸は２本鎖でもまたは１本鎖でもよい。１つの必要条件は、多様な核酸が線状化プラスミドの末端領域と配列が重なっていることである。重なりは、各々の末端で少なくとも１５、２０または５０ヌクレオチドであろう。組換えを保証し、そして第１のスクリーニングで選択された抗原結合部位に関連して、切り出されたＣＤＲコード配列を導入する酵母細胞を、混合物で形質転換する。
【０１２６】
形質転換された酵母細胞は、細胞ディスプレイライブラリーとして使用することが可能である。例えば、細胞を、標的分子への結合で再スクリーニングすることが可能である。この戦略は、最初のスクリーニングで同定されたポリペプチドを、１つ以上のＣＤＲのごとき特定の領域で再多様化させることを可能にする。さらに以下に記載するように、組換えにより取り込まれた多様な核酸は、多様な起源からであることが可能である；例えば、同一の分子の集団（それにより、特定の領域の組合わせを混ぜ合わせる）、合成配列、および天然起源の配列。
【０１２７】
３．第３の例においては、第２の例のように、細胞ディスプレイライブラリーからの候補リガンドを、組換えにより多様化して、細胞ディスプレイライブラリーを形成させる。選択されたリガンドは、選択された細胞からライブラリー核酸を単離することなく多様化させる。
【０１２８】
Ｆａｂ断片を示す酵母ディスプレイライブラリーを、標的分子に対する結合でスクリーニングする。標的に結合するＦａｂをコードしている酵母細胞を選択する。各々の細胞を、ＵＲＡ３マーカーを含む核酸カセットで形質転換する。カセットの末端は、Ｆａｂ鎖の１つの配列と相同的である。２つの末端は非隣接または隣接配列を表すことができる。
【０１２９】
もしカセット末端が非隣接配列に対応するとしたら、形質転換およびＵｒａ＋細胞の選択で、免疫グロブリンをコードしている配列の一部がＵＲＡ３マーカーで置き換えられた、細胞の集団が得られる。ＵＲＡ３マーカーは、１つ以上のＣＤＲを欠失させるために使用することが可能である。もしカセット末端が隣接配列に対応するとしたら、形質転換およびＵｒａ＋細胞の選択で、免疫グロブリンをコードしている配列の一部がＵＲＡ３マーカーにより破壊された、細胞の集団が得られる。破壊は、例えば、ＣＤＲ内の位置であることが可能である。
【０１３０】
細胞を、ＵＲＡ３マーカーにより欠失または破壊されている免疫グロブリン遺伝子配列の少なくとも一部、および免疫グロブリンコード配列との相同的組換えを可能にする領域に隣接する十分な配列をコードする、核酸（１本鎖または２本鎖）の多様なプールで形質転換する。形質転換後、ｕｒａ−細胞を選択するため、細胞を５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）上で増殖させる。こうした細胞は、多様なプールの核酸がＦａｂコード配列と組換えられた、およびカセットと置き換えられた場合に生じる。その結果、多様なプールからの免疫グロブリンコード配列（例えば、ドナー配列）が、ディスプレイライブラリーから単離された他の免疫グロブリン配列（例えば、受容配列）と組み合わされる。
【０１３１】
本方法は、Ｆａｂの１つの鎖を変化させると同時に、別の鎖のための配列は保持することに使用することが可能である。さらに、もし、ＵＲＡ３マーカーによる破壊または欠失が、１つの免疫グロブリン鎖内の３つのＣＤＲすべてよりもむしろ、１つまたは２つのＣＤＲに局在しているとしたら、鎖内に新規のＣＤＲの組み合わせを発生させることが可能である。
【０１３２】
４．第４の例においては、各々が異なったＦａｂ鎖をコードしている２つのライブラリーが、異なった接合型の酵母細胞中で構築される。ライブラリーは、接合および組換えにより組み合わされ、Ｆａｂ座位、即ち、軽鎖をコードしている配列および重鎖をコードしている配列を含む人工遺伝子座位、を形成させる。
【０１３３】
組換えに先立ち、軽鎖のライブラリーを、１つの接合型の細胞を使用して構築する。軽鎖ライブラリー（プラスミド−運搬かまたは染色体）は、軽鎖および部位特異的組換え部位をコードする、ポリペプチドコード領域を含んでいる。マーカー遺伝子を、組換え部位によりコード領域から引き離されているように、配置することが可能である。同様に、組換えに先立ち、重鎖のライブラリーを、逆の接合型の細胞を使用して構築する。重鎖ライブラリーは、重鎖および部位特異的組換え部位をコードする、ポリペプチドコード領域を含んでいる。異なったマーカー遺伝子を、再び、組換え部位によりコード領域から引き離されているように、配置することが可能である。
【０１３４】
２つのライブラリーの細胞を一緒に接合させる。部位特異的組換え部位に特異的なリコンビナーゼをコードしている遺伝子が誘導される。リコンビナーゼは、接合により生成された２倍体細胞中の重鎖および軽鎖間の鎖交換を活性化する。組換えの結果はＦａｂ座位である。例えば、染色体ライブラリーの場合においては、重および軽鎖は同一の染色体上へ組換えられる。
【０１３５】
重および軽鎖の両方を含む単一座位の構築は、バルクで選択されたＦａｂを回収するために特に有用である。もしコード配列が別の鎖上に存在したとしたら、異なったＦａｂを発現している細胞の集団からの核酸精製後、単一Ｆａｂの重および軽鎖をコードしている配列は、他のＦａｂをコードしているもので無作為に選別されるであろう。対照的に、両方の鎖をコードする単一核酸断片は、多くの異なったＦａｂコード配列が同じ反応混合物中で操作される場合でさえも、連鎖を保持しているであろう。
【０１３６】
５．第５の例においては、第２の例に関連して、細胞ディスプレイライブラリーを、候補リガンドを同定するためにスクリーニングする。候補リガンドは組換えにより多様化し、第２の細胞ディスプレイライブラリーを形成させる。
【０１３７】
Ｆａｂ断片を示す酵母ディスプレイライブラリーを、標的分子への結合でスクリーニングする。標的に結合するＦａｂをコードする酵母細胞を選択する。Ｆａｂの免疫グロブリン鎖の１つまたは両方をコードしている１本鎖核酸を単離する。ＣＤＲの１つの両端のフレームワーク領域をコードしている配列（またはその相補体）へオリゴヌクレオチドをアニールする。これらのオリゴヌクレオチドは２本鎖領域を形成し、それを制限酵素で切断する。結果は、ＣＤＲコード配列が切り出されている線状１本鎖核酸である。
【０１３８】
この切断された１本鎖核酸を、ＣＤＲコード配列（またはその相補体）をコードする、多様な核酸のプールと組み合わせる。もしプールの核酸が１本鎖であれば、プールの核酸のセンスは、切断された１本鎖核酸のセンスとは反対である。組換えを保証し、そして第１のスクリーニングで選択された抗原結合部位に関連して、切り出されたＣＤＲコード配列を導入する酵母細胞を、混合物で形質転換する。
【０１３９】
６．第６の例においては、細胞ディスプレイライブラリーは哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーである。
第１の哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーを、機能性選択可能マーカー（例えば、ヒグロマイシン）および非機能性選択可能マーカー（例えば、変異させたブラストシジン耐性遺伝子）を含む、第１のＦａｂ発現カセット（例えば、エピソームの、または組み込まれた）から構築する。Ｆａｂ軽鎖遺伝子およびＦａｂ重鎖遺伝子は、部位特異的組換え部位（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ）により分離されている。コードされているＦａｂ断片は、鎖の１つ（典型的には重鎖）が真核生物膜貫通ドメインへ結合されて、哺乳動物細胞表面上に示されている。第２のＦａｂ抗体ディスプレイライブラリーを、第２の機能性選択可能マーカー（例えば、ネオマイシン）および非機能性選択可能マーカー（例えば、変異させたブラストシジン耐性遺伝子）を含む、第２のＦａｂ発現カセット（例えば、エピソームの、または組み込まれた）から同様に構築する。第２のカセットの非機能性選択可能マーカーは、第１のカセットの非機能性選択可能マーカーの異なったアレルである。２つのアレル間の組換えは、機能性アレルを再生する。２つの非機能性アレルは操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）ことが可能である。第１のカセットと同様に、軽鎖および重鎖遺伝子は、部位特異的組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ）により分離されている。
【０１４０】
２つの異なった哺乳動物細胞ディスプレイライブラリーの、Ｆａｂ抗体の２つのカセットは、細胞融合により（例えば、ＰＥＧまたはセンダイウイルスを使用して）結び合わせる。２つのカセットは、鎖交換、および非機能性選択可能マーカーの２つの欠陥アレル（例えば、２つの異なったブラストシジン耐性アレル）間の相同的組換えにより分割できる、組換え中間体の発生を可能にする、部位特異的組換えが起こることが可能なように、お互いに接触することが可能である。組換えは機能性ブラストシジン耐性マーカー遺伝子を発生させる。ヒグロマイシンおよびブラストシジン、またはネオマイシンおよびブラストシジンでの選択は、２つの本来のライブラリーには存在しない、重および軽鎖遺伝子の新規組み合わせをコードしている配列を含む、細胞のプールを発生させる。
【０１４１】
７．第７の例は、インビボ組換えにより多様化されたファージディスプレイレパートリーを特色としている。Ｆａｂ抗体の第１のプールを、ｐ３ファージアンカータンパク質へ融合されたファージミド内へクローン化させるが、しかし、独特のＥｃｏＲＩ制限部位により、第１の抗生物質耐性マーカーの第１の非機能性アレル（第１の突然変異を運んでいるＴｅｔ遺伝子）から分離されている。ファージミドベクターはまた、機能性で選択可能な第２の抗生物質耐性マーカー（ＡｍｐＲ）も運んでいる。ファージミドＦａｂディスプレイライブラリーは、制限陰性および修飾陰性宿主細胞（Ｒ−Ｍ−）中のヘルパーファージを使用してパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）され、選ばれた制限−修飾系によりメチル化されない核酸を含む、ライブラリーファージを産生する。
【０１４２】
これらのファージで、制限陽性および修飾陽性宿主細胞（Ｒ＋Ｍ＋）であるＦ＋大腸菌細胞を感染させる。特に、これらの細胞はまた、Ｆａｂ抗体をコードしている構築物の第２のプールからの核酸を宿している。Ｆａｂコード構築物の第２のプールは、第３の機能性抗生物質耐性マーカー（例えば、クロラムフェニコール耐性）を運んでいる第２の発現プラスミド内へクローン化され、第１の抗生物質耐性マーカーの第２の非機能性アレル（例えば、第１の突然変異とは異なった第２の突然変異を運んでいるｔｅｔ耐性遺伝子、しかしそれはお互いに補完できて機能的に活性なＴｅｔ遺伝子を生成する）とは分離されている。
【０１４３】
大腸菌株は制限および修飾プラスであり、それゆえ非メチル化ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ制限部位で切断され、それゆえ第１の該非保護ファージミドＦａｂプールは、適切な独特のＥｃｏＲＩ制限部位で切断され、線状ベクターを産生する。第２の該発現プラスミド内に含まれているＦａｂ抗体の第２の該プールは、保護され、および切断されないで残っている。相同的組換え（または部位特異的組換え）は、Ｆａｂ抗体遺伝子（即ち、軽鎖および重鎖遺伝子）間の、および組換えられて機能性耐性マーカー（例えば、ｔｅｔＲ）を生成する２つの欠陥抗生物質耐性遺伝子（例えば、異なった補完突然変異を有する２つのｔｅｔ遺伝子）間の相同性の部位で保証される。この組換えられたファージミドベクターは次ぎに、ヘルパーファージにより救出され、組換えられたＦａｂ遺伝子を示す、ウイルス粒子を産生するために使用される。
【０１４４】
８．第８の例においては、候補リガンドを同定するため、酵母細胞ディスプレイライブラリーをスクリーニングする。候補リガンドは、組換えにより多様化されて、以下のように第２のディスプレイライブラリーを形成する。
【０１４５】
また図３を参照すると、第１の酵母ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂ軽鎖をコードしている遺伝子、Ｆａｂ重鎖をコードしている遺伝子、および栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を含む、酵母プラスミド上に形づくられる。２つの独特の非互換性制限部位、Ｒ１およびＲ２が、Ｆａｂ重鎖遺伝子および栄養要求性マーカー間に位置されている。第２の酵母ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂ軽鎖をコードしている遺伝子、Ｆａｂ重鎖をコードしている遺伝子、および、第１のライブラリー中の対応するマーカーとは異なった栄養要求性マーカー遺伝子を含む、酵母プラスミド上に形づくられる。例えば、第２のライブラリーの栄養要求性マーカーは、第１のライブラリー中の対応するマーカーがＵＲＡ３である場合は、ＴＲＰ１であろう。２つの独特の非互換性制限部位、Ｒ２’およびＲ３が、栄養要求性マーカーおよびＦａｂ軽鎖遺伝子間に位置されている。Ｒ２’部位は、第１の酵母ディスプレイライブラリーのＲ２制限部位と互換性である。例えば、Ｒ２’およびＲ２は同一の制限エンドヌクレアーゼにより切断できる。別の例において、これらは異なった制限エンドヌクレアーゼにより切断されるが、それにもかかわらず、互換性の付着オーバーハングを有している。
【０１４６】
第１および第２の酵母ディスプレイライブラリーを、標的分子に対して少なくとも最小結合活性を有するＦａｂを同定するためにスクリーニングする。同定されたＦａｂをコードしているプラスミドのプールを各々のライブラリーから単離する。第１のプールを、Ｒ１およびＲ２で切断する制限エンドヌクレアーゼにより消化する。第２のプールは、Ｒ２’およびＲ３で切断する制限エンドヌクレアーゼにより消化する。各々のプールからの適切な断片（図５で観察されるような）を、Ｒ２およびＲ２’により形成された互換性末端を使用して、一緒にライゲートする。ライゲーション生成物は、２つのＦａｂ抗体および２つの異なった栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３およびＴＲＰ１）をコードしている遺伝子を含む、線状ＤＮＡである。
【０１４７】
これらの線状ＤＮＡ分子で酵母細胞を形質転換する。細胞内において、分子内相同的組換えにより、ＤＮＡ分子が環状化される。組換えは、任意の相同的部位、例えば、２つの軽鎖遺伝子および２つの重鎖遺伝子内で、起こることが可能である。実行に依存し、組換えは、重および軽鎖遺伝子間の介在領域でも起こることが可能である。しかしながら、この領域中の組換えを減少させるために、異種であるようにこの領域を操作することが可能である。別の実行において、重および軽鎖遺伝子はＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１およびＣＬ）を欠いており、例えば、それらはｓｃＦｖのごとく配置されている。ＣＨドメインの脱落は、多様性が観察される可変ドメイン内の組換えに有利である。形質転換後、細胞は、両方の栄養要求性マーカーに選択的な条件下で、例えば、ウラシルおよびトリプトファンを欠いた培地で増殖させることができる。
【０１４８】
９．第９の例においては、細胞ディスプレイライブラリーを、部位特異的組換えおよび相同的組換えの組み合わせを使用するＶ遺伝子シャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により多様化する。多様化されたライブラリーは、２つの異なったプールからの細胞を接合し、部位特異的組換えを導入し、そして遺伝子シャフリング現象のために選択することにより形成させる。
【０１４９】
また図４を参照すると、第１のプールの酵母細胞（図４、上の左）は、Ｆａｂ軽鎖をコードしている遺伝子、Ｆａｂ重鎖をコードしている遺伝子、非機能性で第１の栄養要求性マーカーの第１のアレル（例えば、ｌｅｕ２−７０１）、および機能性の第２の栄養要求性マーカー（例えば、ＴＲＰ１）を有する発現プラスミドを含んでいる。部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘ部位）は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子間に位置している。ｌｅｕ２−７０１はＬＥＵ２の非機能性アレルであり、ＬＥＵ２コード領域の５’領域内（例えば、最初の２０コドン内）に終止コドンを含んでいる。こうしたアレルは遺伝子工学により作り出すことが可能である。第１のプールの酵母細胞は、第１の接合型を有している。
【０１５０】
第２のプールの酵母細胞（図４、上の右）は、Ｆａｂ軽鎖をコードしている遺伝子、Ｆａｂ重鎖をコードしている遺伝子、第１の栄養要求性マーカーの第２の非機能性アレル（例えば、ｌｅｕ２−７０２）、および機能性の第３の栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３）を有する発現プラスミドを含んでいる。機能性の第３のマーカーは、典型的には第１のプールの機能性、第２のマーカーとは異なっている。部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘ部位）は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子間に位置している。ｌｅｕ２−７０２はＬＥＵ２の非機能性アレルであり、ＬＥＵ２コード領域の３’領域内に終止コドンを含んでいる。こうしたアレルは遺伝子工学により作り出すことが可能である。第２のプールの酵母細胞は、第２の接合型を有している。
【０１５１】
２つのプールの細胞が、例えば、多数の組み合わせで接合するように、２つのプールの細胞を合わせる。接合の間または後で、適切な部位特異的リコンビナーゼが発現される。例えば、リコンビナーゼをコードしている遺伝子は、ＦＵＳ１のごときフェロモン誘導可能プロモーター、または２倍体特異的プロモーターにより、制御することが可能である。リコンビナーゼは部位特異的組換えを誘導し、第１のプールのプラスミドおよび第２のプールのプラスミドからの配列を含む、大きなプラスミドを形成することが可能である。第１の栄養要求性マーカーの機能性アレルの選択は、マーカーの第１および第２のアレル間の相同的組換えを必要とする。接合、そして任意の非選択的条件下での増殖後、接合した細胞は、第１および第２のマーカーを必要とする（例えば、Ｔｒｐ＋Ｌｅｕ＋細胞）、または第１および第３のマーカーを必要とする（例えば、Ｕｒａ＋Ｌｅｕ＋細胞）培地で選択することが可能である。得られた細胞は、出発プールにおける組合わせと比較して、軽鎖および重鎖が新規の組合わせで存在するような、Ｖ遺伝子シャフリングが行われたＦａｂ抗体をコードする多様なライブラリーを形成している。
部位特異的組換え
部位特異的リコンビナーゼは、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ特性の両方を有している。それらはＤＮＡ中の塩基の特異的配列を認識し、そしてこれらのセグメントに隣接するＤＮＡセグメントを交換する。多様な生物体から多数の部位特異的組換えシステムが記述されている。例には、バクテリオファージ  ラムダからのインテグラーゼ／ａｔｔシステム（Ｌａｎｄｙ，Ａ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７）、バクテリオファージ  Ｐ１からのＣｒｅ／ｌｏｘＰシステム（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ（１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中，第４巻：  ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編，Ｂｅｒｌｉｎ−  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ｐｐ．９０−１０９）、およびサッカロミセス  セレビジエ  ２μ環状プラスミドからのＦＬＰ／ＦＲＴシステム（Ｂｒｏａｃｈら，Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４（１９８２））が含まれる。本明細書に例示したように、部位特異的リコンビナーゼは、異なった鎖上に存する親材料からの、同一の鎖上に存する核酸配列の核酸組合わせを発生させるために使用することが可能である。
【０１５２】
トランスポザーゼもまた、鎖間で核酸セグメントを移すために使用することが可能である。トランスポザーゼは典型的には、トランスポゾンとして知られている、移動性遺伝子要素を有する遺伝子によりコードされている。トランスポゾンの組み込みは、無作為であるか、または高度に特異的であろう。高度に部位特異的である、Ｔｎ７のごとき代表物は、レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボ移動に応用されている（Ｌｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。核酸配列に１つの鎖から別の鎖への移動性をもたせるために、人工トランスポゾンを使用することが可能である。例えば、タンパク質コード配列のライブラリーを、トランスポゾン内に発生させることが可能である。
計数器−選択可能マーカー
計数器−選択可能マーカーとは、典型的には特殊化された条件下で、その非存在が細胞増殖または生存を可能にするマーカーである。計数器−選択可能マーカーは、マーカーを切り出す組換え現象で選択するために使用することが可能である。これらのマーカーは、酵母および哺乳動物細胞を含む、多くの細胞型で使用することが可能である。
【０１５３】
例えば、ＵＲＡ３およびＣＡＮ１は、Ｓ．セレビジエで機能する計数器−選択可能マーカーである。ＣＡＮ１は、カナバニンに対する感受性を与える。ＣＡＮ１マーカーの喪失は、カナバニン中で細胞を増殖させることにより選択される。ＵＲＡ３は、宿主細胞がｕｒａ−であるとしたら、その存在および不在の両方が選択可能であるので特に有用である。ＵＲＡ３の存在は、ウラシルを欠いている最少培地での増殖により選択可能であり、一方、その不在は、５−ＦＯＡを含む培地での増殖により選択可能である。
【０１５４】
哺乳動物細胞に対しては、チミジンキナーゼ遺伝子を計数器−選択可能マーカーとして使用できる。ｔｋ遺伝子の喪失は、ガンシクロビルを含む培地における増殖により選択可能である。多くの他の計数器−選択可能マーカーが、多様な系に対して知られている。
細胞に基づいたディスプレイライブラリー
さらに別の様式においては、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリーである。
【０１５５】
タンパク質は細胞、例えば、真核生物または原核生物細胞の表面上に示されている。原核生物細胞の例には大腸菌細胞、Ｂ．サブチリス細胞、胞子が含まれる（例えば、Ｌｕら，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６を参照されたい）。真核生物細胞の例には酵母（例えば、サッカロミセス  セレビジエ、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）  ポムベ、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｓ））が含まれる。酵母表面ディスプレイの１つの実行が、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７、に記載されている。
【０１５６】
ＷＯ  ０３／０２９，４５６およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３２６，３２０は、なかでも、Ｆａｂ断片のごとき免疫グロブリンタンパク質を示すために使用できる酵母ディスプレイシステム、および重および軽鎖の組合わせを発生させるための接合の使用を記載している。
【０１５７】
１つの態様において、免疫グロブリン可変ドメインをコードしている核酸が、酵母ディスプレイのためのベクター内へクローン化される。クローニングは、可変ドメインの少なくとも１つをコードしている核酸と、酵母細胞表面タンパク質の断片、例えば、Ｆｌｏ１、ａ−アグルチニン、α−アグルチニンまたはそれらの断片、例えば、Ａｇａ２ｐ、Ａｇａ１ｐ、をコードしている核酸をつなぎ合わせる。これらのタンパク質のドメインは、ＧＰＩ−アンカー（例えば、ａ−アグルチニン、α−アグルチニンまたはそれらの断片、例えば、Ａｇａ２ｐ、Ａｇａ１ｐ）により、膜貫通ドメイン（例えば、Ｆｌｏ１）により、多様な核酸配列によりコードされたポリペプチドを繋ぎ止めることが可能である。ベクターは、鎖の１つが酵母細胞表面タンパク質に連結されるように、細胞表面上の２つのポリペプチド鎖を発現させるために形成することが可能である。例えば、２つの鎖は免疫グロブリン鎖であろう。
【０１５８】
ＬｉＡｃ／ＰＥＧ法、電気穿孔およびスフェロプラスト法を含む、多数の方法が、酵母細胞内へ核酸を導入するために利用可能である。
哺乳動物細胞ディスプレイのための細胞の例には：ＣＯＳ細胞、ＣＶ−１細胞、ＯＶＣＡＲ細胞、リンパ球、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる。
【０１５９】
さらに、前にみられたように、いくつかの実行はまた、他のディスプレイ法、例えば、ファージディスプレイにも適している。
酵母接合
本方法の実行の例は、Ｓ．セレビジエ細胞の接合を利用している。第１の細胞は第１の接合型、例えば、ＭＡＴａを有しており；第２の細胞は、第１とは異なった第２の接合型、例えば、ＭＡＴαを有している。２つの細胞をお互いに接触させると、酵母接合は第１および第２の細胞の両方の各々のゲノムの融合により形成された核を有する単一細胞（例えば、ＭＡＴａ／α）を産生する。融合現象は、第１の細胞のディスプレイライブラリー核酸および第２の核酸を同一の核内へ導き、そしてそれらが組換える機会を提供する。２つの同様の座位（例えば、２つの人工Ｆａｂ座位）間の組換えで、両方の親座位からのＣＤＲを含む、新規Ｆａｂコード配列を生じることが可能である。例えば、相同的組換え交叉が、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３間の領域で起こることが可能で、１つの親座位からのＣＤＲ２および他の親からのＣＤＲ３をコードしている配列を有する、組換え配列を生じる。
【０１６０】
別の例においては、部位特異的組換えが誘導される。例えば、実施例４を参照されたい。この実施例の変法は、部位特異的組換えが２つの完全Ｆａｂ座位間で誘導される方法である。
【０１６１】
第２の細胞の核酸もまた、ディスプレイライブラリー核酸、例えば、第１の核酸と同時に、または別に選択された核酸、であることが可能である。核酸は、非ディスプレイライブラリー核酸、例えば、ＰＣＲ増幅生成物または合成オリゴヌクレオチドのごとき線状核酸、であることが可能である。
【０１６２】
本方法は、多数の第１の細胞を提供し、すべてが同一の第１の接合型で、各々の第１の細胞は、第１の特性を有するポリペプチド（第１の核酸によりコードされている）を示している；多数の第２の細胞を提供し、すべてが同一の第２の接合型で、各々の第２の細胞は、第２の特性を有し、少なくともいくつかの領域で第１の核酸と相同的である。細胞を、例えば、多数の対での組合わせで融合する。組換えを誘導するかまたは可能にする。次ぎに表示させ、変化した特性で、例えば、第１または第２の特性、または新規特性で、ポリペプチドを選択する。この方法は、タンパク質を「繁殖させる（ｂｒｅｅｄ）」ために使用する。
組換え刺激剤
多様な剤が、組換えを刺激するために使用できる。完全に細胞内で起こる態様のためには、例えば、典型的には異種発現カセットを使用して、遺伝子発現を誘導することによる、こうした剤が提供可能である。細胞の外側で開始される態様のためには、剤は、例えば、それらの細胞内への導入に先立って核酸と接触できるか、核酸と同時に導入できるか、若しくは細胞内から表出できるものが可能である。
【０１６３】
例えば、相同的組換えのためのドナー核酸を、インビトロで、組換えを刺激する剤で処理することが可能である。核酸を剤でコーティングすることが可能である。剤は、リコンビナーゼまたは１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のごときポリペプチドであることが可能である。
【０１６４】
リコンビナーゼは、入来するｓｓＤＮＡ上のフィラメントのごとく多量化するｒｅｃＡ様タンパク質であることが可能であり、入来する鎖との２重鎖からの、アニール化された鎖の１つを示すことにより、鎖交換を誘導する。こうしたタンパク質は、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４、ＤＭＣ１およびｍｅｉ３のごとき真核生物タンパク質；および大腸菌  ｒｅｃＡ（例えば、ｒｅｃＡ−８０３および野生型ｒｅｃＡ）、大腸菌  ＳＳＢ（１本鎖結合タンパク質）およびＴ４バクテリオファージ遺伝子３２のごとき原核生物タンパク質を含むことが可能である。さらに、多くの生物体がｒｅｃＡ様鎖輸送タンパク質を有している（例えば、Ｆｕｇｉｓａｗａら、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７４７３；Ｈｓｉｅｈら、（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４４：８８５；Ｈｓｉｅｈら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５０８９；Ｆｉｓｈｅｌら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｃａｓｓｕｔｏら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１０；Ｇａｎｅａら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：３１２４；Ｍｏｏｒｅら、（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９：１１１０８；Ｋｅｅｎｅら、（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３０５７；Ｋｉｍｉｅｃ（１９８４）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．４８：６７５；Ｋｉｍｅｉｃ（１９８６）  Ｃｅｌｌ  ４４：５４５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５５６０；Ｓｕｇｉｎｏら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３６８３；Ｈａｌｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１４０３；Ｅｉｓｅｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４８１；ＭｃＣａｒｔｈｙら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８５４；Ｌｏｗｅｎｈａｕｐｔら、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２０５６８）。追加の例には以下のものが含まれる：ｓｅｐ１（Ｋｏｌｏｄｎｅｒら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：５５６０；Ｔｉｓｈｋｏｆｆら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５９３）、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：５０６）、ＤＳＴ２、ＫＥＭ１、ＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａら、（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５８３）、ＳＴＰα／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋら、（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５７６）、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９０６７）、およびｕｖｓＸ。ｒｅｃＡ−８０３タンパク質はｒｅｃＡの高活性突然変異体である。加えて、これらのタンパク質の機能的に活性な断片を使用することが可能である。
【０１６５】
ポリペプチドの実質的に純粋な調製試料を、例えば、当該分野で既知の方法を使用し、リコンビナーゼを過剰発現している大腸菌から、標準生化学的精製により調製することが可能であり、例えば、ＭｃＥｎｔｅｅら、（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：８５７−８６１、を参照されたい。もしくは、ｒｅｃＡタンパク質はまた、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ピスカタウェイ、ＮＪ）から購入することが可能である。核酸は、精製されたポリペプチドと、例えば、緩衝液中、室温で、ポリペプチドが核酸に付着する、または核酸をコーティングするために十分な時間、インキュベートすることが可能である。ｒｅｃＡで核酸をコーティングする１つの方法は以下のごとくである。簡単に記すと、核酸を水性溶液中、９５℃で５分間変性させ、直ちに１分で４℃へ冷却し、そして次ぎに、迅速に２０秒、０℃で遠心分離する。変性核酸は次ぎに、非加水分解性ヌクレオチド、例えば、ＡＴＰγＳを含んでいる反応緩衝液と混合する。反応緩衝液はまた、０．５から２ｍＭのＭｇ2+Ｃ１2、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、および０．５ｍＭジチオスレイトールを含むことが可能である。コーティングは、精製ｒｅｃＡを、３７℃で１０分添加することにより開始することが可能である。ｒｅｃＡの濃度は、変性核酸中の個々の塩基の濃度に関係して、１：３から３：１の比で変化させることが可能である。
【０１６６】
コートされた核酸は、例えば、ゲル濾過により、例えば、スピンカラムを使用して、単離することが可能である。コーティングの程度は、未変性条件下での電気泳動により評価することが可能である。
【０１６７】
エンドヌクレアーゼ  リン酸主鎖内の核酸を切断するエンドヌクレアーゼは、組換えの基質である末端を発生させるために使用することが可能である。末端は、例えば、内在性エキソヌクレアーゼにより、少なくとも部分的に１本鎖にすることが可能である。
【０１６８】
サッカロミセス  セレビジエにおいて、ＨＯエンドヌクレアーゼはゲノム中の３つの部位のみを切断する。切断現象は単一部位、ＭＡＴ座位のＨＯ切断部位を消化する。他の２つの部位は、サイレント接合カセットＨＭＲａおよびＨＭＬα中にあり、切断に抵抗性である。ＭＡＴ座位の切断は、接合型転換の引き金となり、それはＭＡＴ座位と２つのサイレント接合カセットの１つとの間の組換え現象である。酵母株は、ＨＯを発現するが、ＭＡＴ座位の欠失による接合型転換を行わないように操作することが可能である。ＨＯエンドヌクレアーゼは、酵母細胞中のディスプレイライブラリーベクターとドナー核酸間の組換えを刺激するために使用することが可能である。
【０１６９】
１つの態様において、ディスプレイライブラリーベクターは、ＨＯ切断部位を含む選択可能マーカーカセットで標的化される。選択可能マーカー、例えば、ＵＲＡ３は、選択可能および計数器−選択可能の両方であることが可能である。ＨＯエンドヌクレアーゼ仲介切断と組み合わせ、ドナー核酸またはドナー核酸のプールを細胞内へ導入することが可能である。ドナー核酸は、ベクターと相同的である末端を含んでいる。
【０１７０】
別の態様において、イントロン、例えば、酵母ＭＡＴａイントロンが、示されたリガンドをコードする配列内へ挿入される。免疫グロブリンディスプレイの例に関しては、イントロンは、２つのＣＤＲコード領域間のフレームワークコード領域内に位置することが可能である。イントロンはＨＯエンドヌクレアーゼ部位を含んでいる。イントロン配列はスプライスされて除かれるので、この部位は免疫グロブリンドメインの翻訳を混乱させることはない。免疫グロブリンコード配列中の組換えは、ＨＯエンドヌクレアーゼの発現により誘導される。ＨＯ遺伝子は、例えば、誘導可能ＧＡＬプロモーターにより制御することが可能である。例えば、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚら、（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１３２−４６、を参照されたい。エンドヌクレアーゼは、例えば、多様な核酸プールでの形質転換の間またはその後に、または相同的配列を含む細胞への接合の間またはその後に、誘導することが可能である。
【０１７１】
もちろん、任意のエンドヌクレアーゼを細胞中で異所的に発現させることが可能である。例えば、レアカッター（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ）を有害な影響無しで使用することができる。
多様な核酸の構築
多くの実行において、組換え法は、１つ以上の異なった受容配列内への取り込みためのドナー配列として、多様な核酸のプールを使用する。こうした核酸の多様なプールは、多様な供給源から得ることが可能である。
【０１７２】
初期設計  多様なプールの構築は、一部、意図された使用、例えば、受容配列および組換えが起こる細胞型に基づいている。設計の１つの例は、多様な核酸の３’および５’末端での高い（または完全な）相同性の領域、および中心セグメントを含んでいる。この場合、多様なオリゴヌクレオチドは、中心セグメントにおいて最も大きな程度で変化し、そして相同性領域ではより少ない程度で変化する。
【０１７３】
相同的領域は、組換えを確実にするため、意図された鋳型核酸または共通配列と十分に相同的であるように設計することが可能である。
ＰＣＲ増幅  ＰＣＲを多様な核酸を増幅するために使用することが可能である。正および逆プライマーは、多様性の領域、例えば、相同性領域に隣接する保存領域へアニールするように設計される。潜在的多様性を含む任意の混合物が、増幅のための鋳型であることが可能である。例えば、混合物は、異なった微生物または不均一な細胞集団（例えば、脾臓）を含む、環境試料であってもよい。
【０１７４】
オリゴヌクレオチド−定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）切断  多様な核酸は、オリゴヌクレオチド−定方向切断により得ることが可能である。この方法は、１本鎖核酸の正確な切除を生じる。一般的に、合成オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの１本鎖領域と多様性の起源である核酸の領域間の２重鎖（例えば、ホモ−またはヘテロー−２重鎖）の形成により、１本鎖標的核酸の切断を方向付ける。
【０１７５】
こうした切断のためのいくつかの方法例は、２００１年４月１１日に提出された、ＵＳＳＮ  ０９／８３７，３０６、に記載されている。１つの特別な態様において、本方法は、多数の多様な１本鎖核酸および１つ以上の切断−定方向オリゴヌクレオチドにより形成された、ホモ−またはヘテロ−２重鎖を切断するために使用された。それ故、本方法は、多様性の天然供給源に、容易にアクセスできるようにする。例えば、多様な１本鎖セグメントの集団は、供給源から切り出し、受容核酸との組換えのために使用することが可能である。免疫グロブリンドメインをコードしている核酸への本方法の応用例は、ＵＳＳＮ  ６０／３４３，９５４およびＷＯ  ０３／０３５，８４２に記載されている。
【０１７６】
自動化オリゴヌクレオチド合成  多様な核酸は、例えば、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して合成することが可能である。合成機は、特定の位置に：特定のヌクレオチド、ヌクレオチドの混合物、トリヌクレオチド（または他のオリゴマー）の混合物、または人工ヌクレオチド、を含むオリゴヌクレオチドを生成するようにプログラムすることが可能である。合成機は典型的には、固体支持体へヌクレオチド（またはオリゴマー）を連続的に加えるため、３’ホスホラミド−活性化および５’−保護ヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドはまた、例えば、写真平板（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、Ｆｏｄｏｒら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｆｏｄｏｒら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６を参照されたい）または噴射式インク印刷（例えば、米国特許第５，４７４，７９６号）を使用する、平板固体支持体上でも合成することが可能である。これらのオリゴヌクレオチド合成法は、たくさんの多様な個々のオリゴヌクレオチドを生成するようにプログラムすることが可能である。合成後、オリゴヌクレオチドは、例えば、化学的処理または酵素を使用して、アレイから放出される。放出されたオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載した多様化法のためにプールする。
多様な核酸の供給源
ディスプレイライブラリーは、示されたポリペプチド中の１つ以上の位置に変異を含んでいる。既定の位置での変異は、合成的または天然であることが可能である。いくつかのライブラリーでは、合成的および天然の多様性の両方が含まれている。
【０１７７】
合成的多様性  ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする、多様な核酸配列の領域を含むことが可能である。典型的には、これらは、各々の既定の位置におけるヌクレオチドの分布を含む、縮重オリゴヌクレオチド集団から形成される。既定の配列の包含は、分布に関して無作為である。合成的多様性の縮重供給源の１例は、ＮＮＮを含むオリゴヌクレオチドであり、式中Ｎは、等しい比率で、４つのヌクレオチドのいずれかである。
【０１７８】
合成的多様性はまた、例えば、ＮＮＮより少ない分布まで、既定のトリヌクレオチドにおける核酸配列中のコドン数を限定することで、より束縛されるようにすることが可能である。例えば、こうした分布は、コドンのいくつかの位置で、４つより少ないヌクレオチドを使用して構築することが可能である。加えて、トリヌクレオチド付加技術は、分布をさらに束縛するために使用することが可能である。
【０１７９】
いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」が、例えば、Ｖｉｒｎｅｋａｓら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２５）：５６００−７、に記載されている。オリゴヌクレオチドは、固相支持体上で、１つのコドン（即ち、トリヌクレオチド）が同時に、合成される。支持体は、多くのオリゴヌクレオチドが平行して合成されるように、合成のための多くの官能基を含んでいる。支持体は最初に、第１の位置のためのコドンの組の混合物を含んでいる溶液に暴露する。ユニットは、さらなるユニットが付加しないように保護されている。第１の混合物を含んでいる溶液を洗い流し、第２の位置のためのコドンの組を含んでいる第２の混合物が、第１のユニットへ付加できるように、固体支持体を脱保護する。連続的に多数のコドンを組み立てるために、この過程を繰り返す。トリヌクレオチド付加技術は、既定の位置で多数のアミノ酸をコードできる、ヌクレオチドの合成を可能にする。これらのアミノ酸の頻度は、混合物中のコドンの比率により制御することが可能である。さらに、既定の位置でのアミノ酸の選択は、単一ヌクレオチドの混合物が合成の間に加えられる場合のように、コドン表の４分円に制限されない。
【０１８０】
天然の多様性  ライブラリーは異なった天然に存在する配列を起源とする（またはそれに基づいて合成された）多様な核酸配列の領域を含むことが可能である。ディスプレイライブラリーに含むことが可能な、天然の多様性の例は、免疫細胞に存在する配列多様性である（下記も参照されたい）。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレイのための様式に操作される。天然の多様性の別の例は、生物体の異なった種間における配列の多様性である。例えば、多様な核酸配列は、土壌のごとき環境試料から増幅され、そしてディスプレイライブラリーを構築するために使用することが可能である。
抗体ディスプレイライブラリー
１つの態様において、ディスプレイライブラリーは、各々が免疫グロブリンドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメインを含む、ポリペプチドの多様なプールを表示する。ディスプレイライブラリーは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するために、特に有用である。こうした抗体は、癌のごときヒト障害を処置するための治療薬として使用することが可能である。抗体の定常およびフレームワーク領域はヒトであるので、これらの治療抗体は、抗原としてそれら自信が認識されおよび標的化されるのを避けることができる。定常領域はまた、ヒト免疫システムのエフェクター機能を動員するために最適化される。インビトロディスプレイ選択プロセスは、正常免疫システムが自己抗原に対する抗体を発生させることができないことを打破した。
【０１８１】
典型的抗体ディスプレイライブラリーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むタンパク質を示している。ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂ断片（例えば、２つのポリペプチド鎖を使用して）または単鎖Ｆｖ（例えば、単一のポリペプチド鎖を使用して）として抗体を示すことが可能である。他の様式もまた使用することが可能である。
【０１８２】
Ｆａｂおよび他の様式の場合のように、示された抗体は軽鎖または重鎖の一部として、定常領域を含むことが可能である。１つの態様において、各々の鎖は、例えば、Ｆａｂの場合のように、１つの定常領域を含んでいる。別の態様において、追加の定常領域が示される。
【０１８３】
ライブラリー内では、例えば、単一免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）において、または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）において、変異を発生させるために組換えを使用することが可能である。変異は、免疫グロブリン可変ドメイン内へ、例えば、重および軽鎖可変ドメインのどちらかおよび両方のこうした領域に関連して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の１つ以上の領域中に、導入することが可能である。１つの態様において、既定の可変ドメインの、３つすべてのＣＤＲ内へ変異が導入される。別の望ましい態様において、変異は、例えば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２内へ導入される。任意の組み合わせが実行できる。
【０１８４】
細胞に基づいたディスプレイのための抗体ライブラリーは、多くのプロセスにより構築することが可能である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３２６，３２０およびＷＯ  ０３／０２９，４５６を参照されたい）。
【０１８５】
本明細書に記載した組換え法は、合成核酸、天然核酸、患者（例えば、免疫化した、または病気にかかったヒト被検者）、および動物（例えば、免疫化動物）を含む、多様な供給源から多様性を取り込むために使用することが可能である。
【０１８６】
天然免疫源  １つの態様において、免疫細胞を、抗体、ＭＨＣ−複合体およびＴ細胞レセプターの変異のための、多様化の天然源として使用することが可能である。免疫細胞のいくつかの例は、Ｂ細胞およびＴ細胞である。免疫細胞は、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたは齧歯類から得ることが可能である。細胞は特定の特性で選択可能である。例えば、ＣＤ４+およびＣＤ８-であるＴ細胞が選択できる。Ｂ細胞は多様な成熟度の段階で選択できる。
【０１８７】
別の態様においては、蛍光−活性化細胞ソーティングを、表面に結合されたＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を選別するために使用する。さらに、異なったアイソタイプのＩｇＧを発現しているＢ細胞を単離することが可能である。別の態様において、ＢまたはＴ細胞をインビトロで培養する。例えば、フィーダー細胞と培養することにより、またはＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０、ホルボールミリステートアセテート、細菌リポ多糖体、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンまたはアメリカヤマゴボウマイトジェンのごとき、マイトジェンまたは他の調節試薬を加えることにより、インビトロで刺激することが可能である。
【０１８８】
さらに別の態様においては、免疫学的障害、例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎、血管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症または抗リン脂質症候群、を有する被検者から、細胞を単離する。被検者は、ヒトまたは動物（例えば、ヒト疾患の動物モデル、または類似の障害を有している動物）であろう。さらに別の態様においては、ヒト免疫グロブリン座位を含む、トランスジェニック非ヒト動物から細胞を単離する。
【０１８９】
１つの態様において、細胞は体細胞高頻度変異のプログラムが活性化されている。細胞が、免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異誘発を進行させるように、例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０および抗ＣＤ３８抗体による処理により刺激することができる（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒら、（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８、を参照されたい）。別の態様において、細胞は自然のままである。
【０１９０】
もちろん、多様な配列は、細胞から単離されたｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡ、および本明細書で記載された試料として得ることが可能である。完全長（即ち、キャップされた）ｍＲＮＡを分離する（例えば、キャップされていないＲＮＡを子ウシ腸ホスファターゼで分解することにより）。次ぎに、キャップをタバコ酸ピロホスファターゼで除去し、そしてｃＤＮＡを生成するために逆転写を使用する。第１の（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適したプライマーで、任意の方法で行うことが可能である。例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０、を参照されたい。プライマー結合領域は、例えば、免疫グロブリンの異なったアイソタイプを逆転写するため、異なった免疫グロブリン間で不変であろう。プライマー結合領域はまた、免疫グロブリンの特定のアイソタイプに対して特異的であることが可能である。典型的には、プライマーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードしている配列に対して３’である領域に特異的である。ポリ−ｄＴプライマー（例えば、重鎖遺伝子のための）、またはｍＲＮＡ鎖へ連結されている合成配列へハイブリダイズする合成プライマー、もまた使用することができる。
【０１９１】
ｃＤＮＡは増幅、修飾、断片化またはベクター内へクローン化可能で、抗体ライブラリーが形成される。例えば、オリゴヌクレオチド定方向切断を使用してｃＤＮＡを切断し、そして鋳型免疫グロブリン配列内へ免疫学的多様性を取り込む方法を記載している、ＷＯ  ００／７００２３およびｄｅ  Ｈａａｒｄら、（１９９９）、上記文献、およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３４３，９５４およびＷＯ  ０３／０３５，８４２を参照されたい。
【０１９２】
マウス由来ヒト免疫グロブリン  多様な核酸のプールは、免疫した動物の免疫細胞から得ることが可能である。１つの態様において、免疫した動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）である。例えば、米国特許第６，１５０，５８４号；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５；Ｍｅｎｄｅｚら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−１５６；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６８９８、を参照されたい。１つのこうしたトランスジェニックマウスは、ＷＯ  ９４／０２６０２に記載されているように、ヒト重鎖座位のためのＹＡＣ、例えば、ｙＨ１Ｃ（１０２０ｋｂ）、およびヒト軽鎖座位ＹＡＣ、例えば、ｙＫ２（８８０ｋｂ）を使用して、構築することが可能である。ｙＨ１Ｃは８７０ｋｂのヒト可変領域、全ＤおよびＪＨ領域、ヒトμ、δ、γ２定常領域、およびマウス３’エンハンサーを含んでいる。ｙＫ２は６５０ｋｂのヒトカッパ鎖近位可変領域（Ｖκ）、全Ｊκ領域、およびその隣接する配列と共にＣκを含んでいる。こうしたマウスへの抗原の投与は、抗原に対するヒト抗体の発生を惹起する。こうしたマウスの脾臓を単離する。ヒト抗体遺伝子をコードしているｍＲＮＡを抽出し、そして抗原に対する抗体をコードしている核酸ライブラリーを生成させるために使用する。いくつかの実行において、選択およびスクリーニングに先立って、インビトロでライブラリーを突然変異誘発する（例えば、親和性が成熟された）。
細胞−ディスプレイライブラリースクリーニング
細胞−ディスプレイ技術は、標的へ結合するリガンドを得るために使用することが可能である。例示したように、ディスプレイ技術は、組換えプロセス中の多数の時点で使用することが可能である。１つの例においては、細胞−ディスプレイライブラリーを、配列を同定するためにスクリーニングし、それは次ぎに組換えにより多様にする。別の例においては、細胞−ディスプレイライブラリーを組換えにより構築し、そして次ぎにスクリーニングする。さらに別の例において、細胞−ディスプレイライブラリーをスクリーニングし、結合リガンドをコードする細胞を組換えにより多様にして、２次細胞−ディスプレイライブラリーを生成させ、そして次ぎに２次ライブラリーをスクリーニングする。
【０１９３】
一般に、リガンドは、選択の１つ以上のサイクルにより、細胞−ディスプレイライブラリーから同定することが可能である。いくつかの選択の例は以下のごとくである。
パニング  標的分子を、マイクロタイターウェル、マトリックス、粒子またはビーズのごとき固体支持体上に固定する。ディスプレイライブラリーと支持体を接触させる。標的に親和性を有するライブラリーメンバーを結合させる。非特異的に、または弱く結合されたメンバーを、支持体から洗浄する。次ぎに、結合されたメンバーをさらなる分析（例えば、スクリーニング）のために集めるか、または選択の追加のラウンドのためにプールする。
【０１９４】
磁気粒子プロセッサー  自動化選択の１つの例は、磁気粒子および磁気粒子プロセッサーを使用する。この場合、標的を、例えば、以下に説明するような磁気粒子上に固定する。Ｔｈｅｒｍｏ  ＬａｂＳｙｓｔｅｍｓ（ヘルシンキ、フィンランド）からの磁気粒子プロセッサー、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（登録商標）システムを、標的に対するディスプレイライブラリーメンバーを選択するために使用した。ディスプレイライブラリーを、チューブ中で磁気粒子と接触させる。ビーズおよびライブラリーを混合する。次ぎに、使い捨ての鞘に覆われた磁気ピンで磁気粒子を回収し、そしてそれらを、洗浄溶液を含む別のチューブへ移す。粒子を洗浄溶液で洗浄する。この様式において、非特異的にまたは弱く結合されたライブラリーメンバーを粒子から洗浄するため、多数のチューブへ磁気粒子を連続的に移すのに磁気粒子プロセッサーを使用することが可能である。洗浄後、特異的におよび／または強く結合されたライブラリーメンバーを粒子から放出させるため、溶出緩衝液を含むチューブへ移す。こられの溶出されたライブラリーメンバーは、分析のため（例えば、スクリーニング）のために個々に単離するか、または選択の追加のラウンドのためにプールすることが可能である。
【０１９５】
ＦＡＣＳ  細胞ディスプレイライブラリーから細胞を選別するため、蛍光細胞ソーティングを使用することも可能である。細胞は、蛍光で標識されている標的と接触させることが可能である。標的と相互作用した細胞は、ＦＡＣＳソーターにより検出し、そして容器内へ偏向させることが可能である。さらに、細胞を非標識標識と接触させて、細胞−標識複合体を形成させることが可能である。細胞−標識複合体は次ぎに、例えば、標的に特異的である蛍光試薬を使用して、標識することが可能である。
【０１９６】
磁気粒子を洗浄するためのキャピラリーデバイス  Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３３７，７５５は、１つの実行において、キャピラリーチューブ中の磁気粒子を洗浄するために使用できる、装置および方法を記載している。装置の１つの例は、磁気粒子を収容するキャピラリーを特色としている。チャンバーが、第１の磁石および第２の磁石間に位置されている。磁石は、第１の位置から第２の位置へ動かせるフレームへ取り付けられている。フレームが動いたとき、キャピラリー中の磁気粒子がかき混ぜられる。
【０１９７】
ディスプレイライブラリースクリーニングのための装置を使用するには、ライブラリーメンバーを、結合された標的を有する磁気粒子へ接触させる。粒子をキャピラリーに配置する（接触前、中、または後に）。次ぎに、非特異的にまたは弱く結合されたライブラリーメンバーを粒子から除去するため、かき混ぜおよび液体流動のサイクルで、粒子をキャピラリー中で洗浄する。洗浄後、結合されたライブラリーメンバーを粒子から溶出または解離し、そして回収することが可能である。結合された細胞を増幅するため、例えば、選択の間、細胞を増殖させることも可能である。
【０１９８】
結合されているリガンドのためのスクリーニングは、標的の特定のエピトープへ結合されている、または特定の特異性を有するリガンドを同定するための測定を含むことが可能である。このことは、例えば、特定のエピトープを欠く、またはエピトープ内が変異されている（例えば、アラニンで）、競合的非標的分子を使用することにより行うことが可能である。こういう非標的分子は、以下に説明するようなネガティブ選択法において、例えば、標的に特異的ではないディスプレイライブラリーメンバーを、解離している洗浄溶液中で捕捉するため、ディスプレイライブラリーを標的に結合させるときの競合分子として、または前溶出剤として使用できる。
【０１９９】
反復選択  １つの態様において、ディスプレイライブラリー技術を、反復様式で使用する。第１のディスプレイライブラリーを、標的のための１つ以上のリガンドを同定するために使用する。これらの同定されたリガンドは次ぎに、組換えにより多様化され、第２のディスプレイライブラリーを形成する。より高い親和性リガンドを、例えば、より高いストリンジェンシーまたはより競合的な結合および洗浄条件を使用することにより、第２のライブラリーから選択する。
【０２００】
議論したように、組換えは、結合界面での既知のまたはそうでありそうな領域を標的とすることが可能である。例えば、もし同定されたリガンドが抗体であるならば、そのときは、組換えは本明細書に記載しているように重または軽鎖のＣＤＲ領域へ方向付けることが可能である。同様に、もし同定されたリガンドが酵素であるならば、組換えは活性部位および近辺へ方向付けることが可能である。
【０２０１】
反復選択の１つの例において、本明細書に記載された方法を、少なくとも標的に対し最小結合特異性または最小活性で結合する（例えば、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭよりも大きな結合の平衡解離定数）、タンパク質リガンドをディスプレイライブラリーから最初に同定するために使用する。最初に同定されたタンパク質リガンドをコードしている核酸配列を、例えば、最初のタンパク質リガンドと比較して促進された特性（例えば、結合親和性、動力学または安定性）を有する第２のタンパク質リガンドを同定するために、変異の導入のための鋳型核酸として使用する。
【０２０２】
オフ−レート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）選択  遅い解離速度は、高親和性を予測するものであろうので（特にポリペプチドおよびその標的間に関して）、本明細書に記載した方法は、標的との結合相互作用に対して望ましい（即ち、遅い）動力学的解離速度を有するリガンドを単離するために使用することが可能である。
【０２０３】
ディスプレイライブラリーから遅く解離するリガンドを選択するため、ライブラリーを固定化された標的と接触させる。次ぎに、固定化された標的を、非特異的にまたは弱く結合された生体分子を除去する、第１の溶液で洗浄する。次ぎに、固定化された標的を、飽和量の遊離標的、即ち、粒子へ結合されていない標的の複製、を含む第２の溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離した生体分子を結合する。再結合は、より少ない濃度の固定化された標的に関して飽和量の遊離標的により、有効に妨げられる。
【０２０４】
第２の溶液は、実質的に生理学的である、若しくはストリンジェントである溶液条件を有することが可能である。典型的には、第２の溶液の溶液条件は第１の溶液の溶液条件と同一である。第２の溶液の分画は、初期から後期の分画を区別するために時間順に集める。後期の分画が、初期の分画の生体分子よりも標的からより遅い速度で解離する生体分子を含んでいる。
【０２０５】
さらに、延長されたインキュベーション後でさえも、標的に結合されて残っているディスプレイライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらは、例えば、支持体から標的を切断することにより、または結合された細胞が分割し、そして固体支持体上の利用可能な結合部位より数でまさるように、細胞分割を支える条件下で標的をインキュベートすることにより、解離させることが可能である。
【０２０６】
特異性のための選択またはスクリーニング  本明細書に記載されているディスプレイライブラリースクリーニング法は、非標的分子へ結合したディスプレイライブラリーメンバーを廃棄する、選択またはスクリーニングプロセスを含むことが可能である。１つの実行において、いわゆる「ネガティブ選択」工程を、標的および関連する非標的分子、および関連するが異なる非標的分子間を区別するために使用する。ディスプレイライブラリーまたはそれらのプールを非標的分子と接触させる。非標的分子と結合しない試料のメンバーを集め、そして標的分子への結合のための続いての選択、または続いてのネガティブ選択のために使用する。ネガティブ選択工程は、標的分子へ結合するライブラリーメンバーを選択することに先立って、またはその後であることができる。
【０２０７】
個々のライブラリーメンバーのスクリーニング  標的へ結合する候補ディスプレイライブラリーメンバーを選択した後、各々の候補ディスプレイライブラリーメンバーを、例えば、標的へのその結合特性をさらに特徴付けるため、さらに分析することが可能である。各々の候補ディスプレイライブラリーメンバーを、１つ以上の２次スクリーニングアッセイにかけることが可能である。アッセイは、結合特性、触媒特性、生理学的特性（例えば、細胞毒性、腎クリアランス、免疫原性）、構造的特性（例えば、安定性、コンホメーション、オリゴマー化状態）または別の機能性特性のためであることが可能である。例えば、ｐＨ、イオン性、または熱感受性を決定するために、同一のアッセイを、条件を変化させて、繰り返し使用することが可能である。
【０２０８】
適切だと、アッセイは、ディスプレイライブラリーメンバーを直接的に、示されたポリペプチドをコードしている核酸から産生された組換えポリペプチドを、示されたペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを、使用することが可能である。結合特性のためのアッセイの例には以下のものが含まれる。
【０２０９】
ＥＬＩＳＡ  ディスプレイライブラリーによりコードされたポリペプチドはまた、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、結合特性をスクリーニングすることが可能である。例えば、各々のポリペプチドを、その底表面が標的で被覆されている（例えば、制限量の標的）、マイクロタイタープレートと接触させる。プレートは、非特異的に結合されているポリペプチドを除去するために緩衝液で洗浄する。次ぎに、プレートへ結合されているポリペプチドの量を、ポリペプチドを認識できる抗体、例えば、タグまたはポリペプチドの定常部分でプレートを探索することにより決定する。抗体は、適切な基質が提供されたときに比色生成物を産生する、アルカリホスファターゼのごとき酵素へ連結されている。ポリペプチドは細胞から精製することも可能であり、または、例えば、細胞表面タンパク質として、ディスプレイライブラリー型式中で、アッセイすることも可能である。ＥＬＩＳＡアッセイの別の変型においては、多様性鎖ライブラリーの各々のポリペプチドを、マイクロタイタープレートの異なったウェルを被覆するために使用する。次ぎに、各々のウェルを調べるために、普遍の標的分子を使用して、ＥＬＩＳＡを始める。
【０２１０】
均一結合アッセイ  標的との候補ポリペプチドの結合相互作用は、均一アッセイ（即ち、アッセイのすべての成分を添加した後、追加の液体操作は必要ではない）を使用して分析することが可能である。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が均一アッセイとして使用することが可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）。第１の分子（例えば、分画で同定された分子）上のフルオロフォア標識は、その放射された蛍光エネルギーを、もし第１の分子に近接して第２の分子が存在するとしたら、第２の分子（例えば、標的）上のフルオロフォア標識により吸収できるように、選択する。第２の分子上の蛍光標識は、それが転移されたエネルギーを吸収したときに蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は、分子が離れている距離に関係しているので、分子間の空間的関係を評価することが可能である。分子間で結合が生じているような状況では、アッセイ中の「受容体」分子標識の蛍光発光は最大であるべきである。ＦＲＥＴによりモニタリングするために形づくられた結合現象は、当該分野ではよく知られている標準蛍光定量的検出手段により、都合よく測定することが可能である（例えば、蛍光光度計を使用して）。第１または第２の結合分子の量を滴定することにより、平衡結合定数を見積もるための結合曲線を生成することが可能である。
【０２１１】
均一アッセイの別の例は、Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，メリデン  ＣＴ）である。Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎは２つの標識されたビーズを使用する。１つのビーズは、レーザーで励起されたときに、１重項酸素を発生する。他のビーズは、１重項酸素が第１のビーズから拡散され、そしてそれに衝突したときに、光信号を発生する。信号は、２つのビーズが近接している場合にのみ発生する。結合の程度を決定するために、信号を測定する。
【０２１２】
均一アッセイは、候補ポリペプチドが提示細胞の細胞表面に結合されている間に、実行することが可能である。
細胞アレイ  さらに別の態様において、組換えにより発生された細胞ディスプレイライブラリーを、細胞アレイとしてフォーマットする。ライブラリーの個々の細胞または小さなプールを、格子上に配置し、そして培養する。標識標的を格子へ接触させることができて、標的に結合するライブラリーメンバーを同定する。細胞アレイは同様に、適切な検出可能活性でスクリーニングできる。
【０２１３】
中でも、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／３０９，３９１は、本明細書に記載した方法に関連して使用できる、方法および自動化を記載している。
真核生物ディスプレイベクターの例
真核生物細胞の表面に多鎖ポリペプチドを提示するために有用な遺伝子ベクターは、以下に説明するようなものであろう。多鎖ポリペプチドは、単一ベクターにコードされてもよいし、若しくは多鎖ポリペプチドの個々の鎖は、別のベクターにコードされていてもよい。１つの例において、ベクターはベクターの組として存在してもよく、ここにおいて、ベクター対が単一の真核生物細胞中に存在する場合、多鎖ポリペプチドの鎖が会合し、そして多鎖ポリペプチドの生物学的活性が真核生物細胞の表面に示されるように、多鎖ポリペプチドの各々の鎖は、ベクターの対応対の１つにコードされている。別の例において、ディスプレイベクターは、２重ディスプレイベクターであってもよく、ここにおいて、ベクターは、（ｉ）生物学的に活性な多鎖ポリペプチドを、真核生物細胞中で発現し、そして真核生物細胞の表面上に提示でき、および（ｉｉ）生物学的に活性な多鎖ポリペプチドを、原核生物細胞中で発現し、そしてバクテリオファージ（または原核生物細胞）の表面上に提示できる。
【０２１４】
多鎖ポリペプチドは、２つ以上の分離したポリペプチド要素（多鎖ポリペプチドの鎖と呼ばれる）、その鎖は共有結合的に若しくは非共有結合的に連結されて生物学的に活性なポリペプチドを形成する、を含むポリペプチドであってもよい。例えば、多鎖ディスプレイベクター（類）によりコードされている多鎖ポリペプチドは、２つの、３つの、または４つのポリペプチド鎖を含むタンパク質を形成することが可能である。ポリペプチドの鎖は、同一でも（例えば、ホモ２量体、ホモ３量体またはホモ４量体）または異なっていてもよい（例えば、ヘテロ２量体、ヘテロ３量体またはヘテロ４量体）。１つの態様において、多鎖ポリペプチドは、２つの異なった鎖から成る２鎖または４鎖ポリペプチドである。例えば、多鎖ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、免疫グロブリンおよび生物学的に活性な免疫グロブリン断片（例えば、Ｆａｂ）から成る多鎖ポリペプチドの群より選択される。多鎖ポリペプチドはＩＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭまたはそれらの生物学的に活性な断片であることができる。多鎖ポリペプチドは、ＩｇのＦａｂ断片であることができ、ここにおいて、多鎖ディスプレイベクターの第１のポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖のＶＨおよびＣＨドメインをコードするセグメントを含んでなり、そして第２のポリヌクレオチドはＩｇ軽鎖（即ち、ＶＬおよびＣＬドメイン）をコードするセグメントを含んでなる。
【０２１５】
多鎖ポリペプチドの鎖（例えば、第１鎖、第２鎖、第３鎖、その他）は、発現ベクター内において、ポリヌクレオチド（例えば、各々の第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド、第３ポリヌクレオチド、その他）としてコードされることが可能である。前に述べたように、鎖をコードしているポリヌクレオチド配列は、機能性多鎖ポリペプチドを産生するために、同一のプラスミド内へ挿入されている、または同一の遺伝子発現制御下にある必要性はない。例えば、Ｉｇ  Ｆａｂの軽鎖および重鎖をコードしているポリヌクレオチドは、別のプラスミド上に位置していてもよく、機能性多鎖ポリペプチドへの同時発現および同時プロセッシングのために、同一の宿主細胞内へそれとして形質転換する。
【０２１６】
多鎖ポリペプチドの鎖をコードしているポリヌクレオチドの配列は、同一起源から生じる必要はない。例えば、Ｉｇ分子は、所望の特異性を有している、モノクローナルからのものと同一の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）、および所望の特性（例えば、ヒト適合性を提供するように、または、特定の補体結合部位を提供するように）を有している、異なったモノクローナルからの定常領域（ＣＨおよびＣＬ）を有するように産生することができる。さらに、多鎖ポリペプチドの鎖（例えば、Ｉｇドメイン）をコードしている異種ポリヌクレオチドは斑入りにする（ｖａｒｉｅｇａｔｅ）ことができ、同一の全体の構造を有する一方で、お互いのアミノ酸配列がわずかに変化しているポリペプチド鎖をコードしている、ポリヌクレオチド相同体のファミリーを産生する。このように、同族体が異なった宿主細胞内へ取り込まれ、そして発現された場合、変化した（鎖）配列の非常に多数のポリペプチドが提示され、例えば、促進された生物学的活性を有する相同的多鎖ポリペプチドを発見するような、スクリーニングに適したディスプレイライブラリーを提供する。こういうアミノ酸配列の変化（または斑入り）は、適した突然変異、または部分合成および交換、または対応するポリヌクレオチドコード配列の適した領域の、部分または完全置換により達成することができる。置換定常ドメイン部分は、適合性組換えＤＮＡ配列から得ることができる。発現ベクター成分および適合性宿主細胞の妥当な選択を仮定すれば、多鎖ポリペプチドの鎖が、真核生物宿主細胞の表面上に提示されるであろう。このことは、例えば、任意の多数の可変性発現ベクター構築物を使用して達成することができる。ディスプレイベクターそれ自身、当該分野で既知である、および商業的に入手可能な（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバット、カリフォルニア）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ、カリフォルニア）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア）から）、任意の多数の遺伝子ベクターおよび遺伝子制御要素で構築または修飾することができる。
【０２１７】
典型的には、ベクター構築物は、多鎖ポリペプチドの生物学的活性が宿主細胞の表面で示されるように、ベクターで形質転換された、真核生物細胞の表面上に完全に組み立てられた多鎖ポリペプチドの有効な輸送および繋留を得るために、ポリペプチド鎖を発現するように設計する。
【０２１８】
多鎖ポリペプチドの有効な細胞発現を達成するためには、多鎖ポリペプチドの鎖の各々をコードしているポリヌクレオチドは、例えば、ポリペプチド鎖の発現を調節するために、転写プロモーターに機能可能であるように連結されている。有効なプロモーターは真核生物系で機能しなければならず、そして随意に（特に２重ディスプレイベクターの場合）同様に原核生物プロモーターとしても有効である。２重ディスプレイベクターにおいて、多鎖ポリペプチドの異種ポリペプチド鎖の発現を調節するために選択された、真核生物プロモーターおよび原核生物プロモーターは、同一でも、または異なったプロモーター（それらが意図された宿主生物体で適切に機能的であるかぎり）でもよく、または特定の宿主中の、各々の鎖の発現のために独立して選択されてもよい。真核生物プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターであることができる。平衡のとれた発現を達成するため、および発現の同時誘導を確実にするため、各々の鎖のために同一のプロモーターを利用するベクター構築物が好適である。多数の真核生物プロモーターが使用可能である。真核生物プロモーターの例には、ガラクトース誘導可能プロモーター、ｐＧＡＬ１、ｐＧＡＬ１−１０、ｐＧａ１４およびｐＧａ１１０；ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ｐＰＧＫ；チトクロームｃプロモーター、ｐＣＹＣ１；およびアルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター、ｐＡＤＨ１、のごとき酵母プロモーターが含まれる。もしＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが細胞中で発現されるとすれば、Ｔ７プロモーターもまた、原核生物および真核生物で使用することが可能である。
【０２１９】
多鎖ポリペプチドの鎖をコードしているポリペプチドの各々は、シグナル配列（またはリーダーペプチド配列）へ連結することも可能である。シグナル配列は、細胞内へのまたは細胞を横切る、新生ポリペプチドの輸送（しばしば分泌と呼ばれる）を方向付けるように働く。ベクターから真核生物細胞で発現された多鎖ポリペプチドの鎖は、組み立ておよび細胞外表示のため、細胞表面への輸送のために、小胞体（ＥＲ）へ輸送することが可能である。有効なシグナル配列は真核生物系で機能する。随意に（例えば、２重ディスプレイベクターの場合）、シグナル配列は原核生物系で同様に有効である。多鎖ポリペプチドの鎖をコードしているポリペプチドは、典型的には、フレーム中でシグナル配列へ直接連結されており（ポリヌクレオチドにすぐ隣接して、または随意にリンカーまたはスペーサー配列を経て連結されている）、それ故、ポリペプチド鎖シグナルペプチド融合タンパク質を発生している。好ましくは、多鎖ポリペプチドの各々の鎖は、別のシグナルペプチドへ融合されている。シグナルペプチドをコードしているシグナル配列は、多鎖ポリペプチドの各々の鎖に対して同一でも、または異なっていてもよい。シグナル配列は、それが融合されるポリペプチドの細胞外輸送を達成することが実行可能である限り、宿主または異種に本来のものであることができる。いくつかのシグナル配列が当業者には知られている（例えば、酵母で機能可能なＭｆα１プレプロ、Ｍｆα１プレ、酸性ホスファターゼＰｈｏ５、インベルターゼＳＵＣ２シグナル配列；大腸菌で機能可能なｐＩＩＩ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡシグナル配列；昆虫細胞で機能可能なｇｐ６４リーダー；哺乳動物で機能可能なＩｇＫリーダー、ミツバチメリチン分泌シグナル配列）。シグナル配列は、宿主細胞の天然の分泌タンパク質から誘導することが可能である。真核生物シグナル配列の他の例には、酵母のα−接合因子（例えば、Ｓ．セレビジエの）、酵母のα−アグルチニン（例えば、Ｓ．セレビジエの）、酵母のインベルターゼ（例えば、Ｓ．セレビジエの）、クライベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のイヌリナーゼのシグナル配列、およびα−アグルチニンのＡｇａ２ｐサブユニットのシグナル配列（例えば、Ｓ．セレビジエの）（特に、ポリペプチドを繋留することに使用される態様においては、Ａｇａ２ｐポリペプチドである）、が含まれる。
【０２２０】
例えば、多鎖ポリペプチドがＦａｂである場合、第１のポリヌクレオチドは、Ｉｇ重鎖のＶＨおよびＣＨ領域をコードするセグメントと共に、フレーム内にＡｇａ２ｐシグナル配列を含むことが可能であり、そして第２のポリヌクレオチドはＩｇ軽鎖をコードするセグメントと共に、フレーム内にＡｇａ２ｐシグナル配列を含んでなる。
【０２２１】
多鎖真核生物ディスプレイベクターは、真核生物宿主細胞内で、ベクターによりコードされている多鎖ポリペプチドが宿主細胞の表面上に示されるように働くことが可能である。宿主細胞の表面上での固定化（「繋ぎ止め」または「表示」）は、例えば、宿主細胞壁または宿主細胞原形質膜上に固定された分子部分へ、多鎖ポリペプチドの少なくとも１つの鎖を連結することにより達成することが可能である。結合は、共有結合的でも非共有結合的でもよい。典型的には、結合は共有結合的である（例えば、ペプチド、ジスルフィド、アミドまたは他の結合）。多鎖ポリペプチドの１つより多くの鎖を、アンカーに連結することができる。一般的に、完全に組み立てられた多鎖ポリペプチドは、宿主細胞表面へのただ１つの付着点しか有していない。１つより多い付着を使用することができるが、細胞へ付着されているには、多鎖ポリペプチドのただ１つの鎖しか必要とされない。細胞の表面上での表示は、アンカータンパク質またはその機能的断片へ、少なくとも１つのポリペプチド鎖を連結することにより達成することが可能である。有効なアンカーは、真核生物系で機能的でなければならず、そして随意に（特に２重ディスプレイベクターの場合）、アンカーはバクテリオファージの表面上のアンカーとしても同様に有効である必要がある。アンカーは、宿主細胞に天然の表面発現タンパク質であることができる（例えば、膜貫通タンパク質かまたはグリカン架橋を経て細胞表面へ連結されているタンパク質）。いくつかの機能可能アンカータンパク質を使用することが可能である（例えば、原核生物／ファージで機能可能な〜１１１、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ１、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ、フラゲリン（ＦｌｉＣ）またはそれらの膜貫通部分；哺乳動物細胞で機能可能な血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー；昆虫細胞中のｇｐ６４アンカー、など）。酵母が宿主である場合、アンカータンパク質は、酵母細胞表面への結合を天然で形成する、α−アグルチニン、α−アグルチニン（副成分Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐを有している）またはＦＬＯであることが可能である。
【０２２２】
アンカーへのポリペプチド鎖の結合は、直接的にまたは間接的に、多様な生物学技術により、および他の間接的結合の工学技術により達成することができる（例えば、ジスルフィド結合、または非共有結合相互作用）。
【０２２３】
鎖−アンカー結合の１つの方法例は、鎖：アンカー融合タンパク質の構築を通したものである。多鎖ポリペプチドの鎖をコードしているポリペプチドは、フレーム中でアンカーへ直接連結されており（ポリヌクレオチドにすぐ隣接して、または随意にリンカーまたはスペーサー配列を経て連結されている）、それ故、シグナルペプチドおよび鎖：アンカー融合タンパク質を含むポリペプチド発生している。ペプチド−ペプチド結合の別の様式が知られており、そして有効な鎖−アンカー結合を達成するために利用可能である。例えば、多鎖ポリペプチドの鎖は、ファージまたは宿主細胞のアンカーへポリペプチド鎖を共有結合で連結するために、ＪｕｎおよびＦｏｓロイシンジッパーｃ−ｊｕｎ／ｆｏｓ結合の高親和性相互作用のごとき、中間会合を経てアンカーへ間接的に連結することができる（例えば、ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｕｔｅｒ，１９９３；ＣｒａｍｅｒｉおよびＢｌａｓｅｒ，１９９６、を参照されたい）。
【０２２４】
多鎖ディスプレイベクターは、多鎖ポリペプチドの鎖をコードしているポリヌクレオチド配列の移送を容易にする、クローニング部位を含むことが可能である。こういうベクタークローニング部位は、読み枠中に、ポリヌクレオチドセグメントの切り出しおよび挿入を容易にするように位置された、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。当該分野で知られている任意の制限部位を、ベクター構築物に利用することができる；ほとんどの商業的に入手可能なベクターはすでに、多数のクローニング部位またはポリリンカーを含んでいる。加えて、新規および独特な制限部位をベクター内へ取り込むために有用な遺伝子工学技術が知られており、当業者によりルーチン的に実行されている。
【０２２５】
クローニング部位は、単一ポリヌクレオチド断片の挿入または切り出しを可能にする、最小１つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことができる。より典型的には、２つ以上の制限部位を、例えば、挿入のより卓越した制御（例えば、挿入の方向付け）、および操作のより卓越した融通性（例えば、１つより多くのポリヌクレオチド断片の方向付けられた輸送）を提供するために用いる。
【０２２６】
米国シリアル番号第６０／３２６，３２０号およびＷＯ  ０３／０２９４５６に開示されているベクター構築物の１つの例においては、多鎖ポリペプチドはＦａｂであり、第１のポリヌクレオチドは、フレーム中のＡｇａ２ｐアンカーをコードするセグメントと共に、そしてフレーム中のＩｇ重鎖のＶＨおよびＣＨ領域をコードするセグメントと共に、Ａｇａ２ｐシグナル配列を含んでなり、ここにおいて、Ｉｇ重鎖領域は独特の制限部位（例えば、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ）により拡げられている；および第２のポリヌクレオチドは、フレーム中のＩｇ軽鎖をコードするセグメントと共に、Ａｇａ２ｐシグナル配列を含んでなり、ここにおいて、Ｉｇ軽鎖領域は独特の制限部位（例えば、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ）により拡げられている。
【０２２７】
多鎖真核生物ディスプレイベクターの例において、宿主細胞中でベクターにより発現される、１つ以上の多鎖ポリペプチドの鎖は、分子タグ若しくはレポーター遺伝子へ連結されている。結合は、ポリペプチドタグおよび多鎖ポリペプチドの鎖を含む、融合タンパク質を経て達成することが可能である。タグの例には、エピトープタグ（例えば、目的のポリペプチドに対して抗原性決定基として認識される、融合ペプチド配列により発生されたタグ）および金属をキレートするタグ（例えば、ポリＨｉｓタグ）が含まれる。エピトープタグの例には、ＨＡタグおよびｍｙｃ１２ＣＡ５タグが含まれる。
【０２２８】
前に説明したように、免疫グロブリンのＦａｂ断片のごとき多鎖ポリペプチドをコードするためのベクター構築物の例が以下に例示される：第１のポリヌクレオチドは、フレーム中のＡｇａ２ｐアンカーをコードするセグメントと共に、フレーム中のＩｇ重鎖のＶＨおよびＣＨ領域をコードするセグメントと共に、そしてフレーム中のｍｙｃタグをコードするセグメントと共に、Ａｇａ２ｐシグナル配列を含んでなり、ここにおいて、Ｉｇ重鎖領域は独特の制限部位（例えば、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ）により拡げられている；および第２のポリヌクレオチドは、フレーム中のＨＡタグをコードするセグメントと共に、そしてフレーム中のＩｇ軽鎖をコードするセグメントと共に、Ａｇａ２ｐシグナル配列を含んでなり、ここにおいて、Ｉｇ軽鎖領域は独特の制限部位（例えば、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩ）により拡げられている。
【実施例】
【０２２９】
以下は、親和性成熟Ｆａｂ抗体のための方法の例である。本方法はＬＣおよびＨＣレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の反復コンビナトリアル接合を使用している。これらのレパートリーは、ＣＤＲコード配列を含む多様なＤＮＡ断片によるインビボ組換えにより多様化される。
Ｍａｔα１倍体細胞染色体中のＬＣ発現カセットの構築
図５を参照すると、ＬＣ発現カセットが、１倍体Ｍａｔα  Ｓ．セレビジエ細胞の酵母染色体中に構築される。標的特異的リード（ｌｅａｄ）抗体のＬＣを、ＡｐａＬ１／Ａｓｃ１断片として、酵母ディスプレイベクターｐＴＱ６内へクローン化すると、結果は、そのＮ末端がＡｇａ２ｐシグナル配列および付加されたＨＡエピトープタグへ融合された、誘導可能ＧＡＬ１プロモーターの発現により駆動されるＬＣである。発現カセットの方向性は：ＧＡＬ１：Ａｇａ２ｐシグナル配列（ＳＳ）：ＬＣ：ＨＡエピトープタグ：ＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列、である。この発現カセットに対応するＰＣＲ断片を、ＧＡＬ１プロモーターに隣接する５’およびＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列に隣接する３’のベクター配列に特異的なプライマーを使用して増幅する。
【０２３０】
ＬＥＵ２マーカー遺伝子は、宿主プラスミド（例えば、ｐＥＳＣ）からＰＣＲにより増幅し、ＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列に隣接する３’末端に相同的である、５’末端で配列に付加する。ＰＣＲ生成物ＧＡＬ１：ＳＳ：ＬＣ：ＨＡ：ＣＹＣｔｔおよびＬＥＵ２  ＰＣＲ生成物を一緒に混合し、ＧＡＬ１プロモーターに隣接する５’配列およびＬｅｕマーカーに隣接する３’に特異的なプルスルー（ｐｕｌｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ）プライマーを使用して組み立てると、ＧＡＬ１：ＳＳ：ＬＣ：ＨＡ：ＣＹＣｔｔ：ＬＥＵ２のＰＣＲ生成物を与える。
【０２３１】
また図５を参照すると、ＰＣＲ生成物ＧＡＬ１：ＳＳ：ＬＣ：ＨＡ：ＣＹＣｔｔ：ＬＥＵ２の両端に付加している配列は、適切なｙＩＰプラスミド内へのクローニングのための、２つの適合しない独特の制限部位を含んでいる。ＰＣＲ生成物は適切な制限酵素で消化し、そしてｙＩＰプラスミド内へクローニングする。酵母株ＢＪ５４５７（Ｍａｔα）は次ぎに、ＬＣ発現ベクターを含んでいるｙＩＰベクターで形質転換し、そして酵母染色体およびＬｅｕ＋表現型内へ組み込むために選択する。この方法は、１倍体酵母株ＢＪ５４５７−ＬＣを産生する。
【０２３２】
この株の構築が成功した後は、インビボ組換えを使用する、抗体ＬＣの直接クローニングのための株を作製するため、ＵＲＡ３のごとき計数器選択可能マーカーでＬＣを置き換えることが可能である（図７Ａ、一番上の左を参照されたい）。ＬＣ発現株は、ＳＳ：ＨＡ配列に相同的な５’隣接配列およびＣＹＣｔｔ遺伝子に対する３’隣接配列を運んでいるプライマーでの、標的ＬＣの増幅により構築することが可能である。
Ｍａｔａ１倍体細胞染色体中のＨＣ発現カセットの構築
図６をまた参照すると、ＨＣ発現カセットが、１倍体Ｍａｔａ  Ｓ．セレビジエ細胞の酵母染色体中に構築される。標的特異的リード抗体のＨＣを、Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１断片として、酵母ディスプレイベクターｐＴＱ７内へクローン化すると、結果は、そのＮ末端がシグナル配列アルファアグルチニン酵母細胞表面アンカータンパク質（ＳＳ）、およびそのＣ末端がアルファアグルチニン酵母細胞表面アンカー遺伝子（αＡＧＧ）に融合された、誘導可能ＧＡＬ１プロモーターの発現により駆動されるＨＣである。構築物にはさらに、ｃ−ＭｙｃエピトープタグおよびＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列を付加した。発現カセットの方向性は：ＧＡＬ１：ＳＳ：ＨＣ：ｃ−Ｍｙｃ：αＡＧＧ：ＣＹＣｔｔであった。この発現カセットに対応するＰＣＲ断片を、ＧＡＬ１プロモーターに隣接する５’およびＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列に隣接する３’のベクター配列に特異的なプライマーを使用して増幅する。
【０２３３】
ＴＲＰ１マーカー遺伝子は、宿主プラスミド（例えば、ｐＹＤ１）からＰＣＲにより増幅し、ＣＹＣｔｔ転写ターミネーター配列に隣接する３’末端に相同的である、５’末端で配列に付加する。ＰＣＲ生成物ＧＡＬ１：ＳＳ：ＨＣ：ｃ−Ｍｙｃ：αＡＧＧ：ＣＹＣｔｔおよびＴＲＰ１  ＰＣＲ生成物を一緒に混合し、ＧＡＬ１プロモーターに隣接する５’配列およびＴＲＰ１マーカーに隣接する３’に特異的なプルスループライマーを使用して組み立てると、ＧＡＬ１：ＳＳ：ＨＣ：ｃ−Ｍｙｃ：αＡＧＧ：ＣＹＣｔｔ：ＴｒｐのＰＣＲ生成物を与える。
【０２３４】
配列を、ＰＣＲ生成物ＧＡＬ１プロモーターの末端およびＴＲＰ１マーカーへ隣接する３’に付加させると：
ＧＡＬ１：ＳＳ：ＨＣ：ｃ−Ｍｙｃ：αＡＧＧ：ＣＹＣｔｔ：ＴＲＰ１
であるＰＣＲ生成物が産生される。
【０２３５】
この生成物は、適切なｙＩＰプラスミド内へのクローニングのための、２つの独特の制限部位を含んでいる。ＰＣＲ生成物は適切な制限酵素で消化し、そしてｙＩＰプラスミド内へクローニングする。酵母株ＢＪ５４５９（Ｍａｔａ）は次ぎに、ＨＣ発現ベクターを含んでいるｙＩＰベクターで形質転換し、そして酵母染色体およびＴｒｐ＋表現型内へ組み込むために選択する。この方法は、１倍体酵母株ＢＪ５４５９−ＨＣ−ＡＧＧを産生する（図６）。
【０２３６】
この株の構築が成功した後は、インビボ組換えを使用する、抗体ＨＣの直接クローニングのための株を作製するため、ＵＲＡ３のごとき計数器選択可能マーカーでＨＣを置き換えることが可能である。ＨＣ発現株は、ＳＳ：ｃＭｙｃ配列に相同的な５’隣接配列およびαＡＧＧ遺伝子に対する３’隣接配列を運んでいるプライマーでの、標的ＨＣの増幅により構築することが可能である。
計数器−測定可能マーカーによる抗体ＬＣおよびＨＣの標的化破壊
１倍体酵母を、ＨＣのＣＤＲ３ループ、およびＬＣのＣＤＲ３ループを多様化するため、多様化されたオリゴヌクレオチドで形質転換する。これらのオリゴヌクレオチドは、標的ＬＣおよびＨＣのフレームワーク領域３（ＦＲ３）およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）と相同的な配列により挟まれた、多様性の領域（ＣＤＲ３をコードしている）を含んでいる。これらの相同的な配列は、染色体ＬＣおよびＨＣ発現カセット内への組換えを可能にする。計数器−測定可能マーカーＵＲＡ３またはＬＹＳ２は、組換え体を選択するために使用する。これらを、ＶＨ−ＣＤＲ３またはＶＬ−ＣＤＲ３配列の標的化欠失により導入する。続いての、組換えられたオリゴヌクレオチドによるＵＲＡ３マーカーの置換は、５−ＦＯＡ上の増殖により選択する（図３）。この計数器選択は、組換え後の野生型抗体の存在を減少または排除する。
【０２３７】
ＬＣ−ＣＤＲ３配列の標的化欠失を作製するため、その５’末端で抗原特異的ＬＣのフレームワーク領域３（ＦＲ３）に対して相同的な、およびその３’末端でフレームワーク領域４（ＦＲ４）に対して相同的な配列により挟まれた、ＵＲＡ３遺伝子の翻訳領域を運んでいるＵＲＡ３カセットを構築する。ＦＲ３−ＵＲＡ３−ＦＲ４  ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ、およびＵＲＡ３遺伝子に対する相同性および付随するＦＲ３およびＦＲ４相同的配列を運んでいるオリゴヌクレオチドを使用して構築する。ＬＣ発現カセット（ＢＪ５４５７−ＬＣ）を繋ぎ止めている酵母株を、ＦＲ３−ＵＲＡ３−ＦＲ４  ＰＣＲ生成物で形質転換し、そしてＬＣ−ＣＤＲ３の標的化欠失を、Ｕｒａ３−選択的プレートで選択すると、酵母株ＢＪ５４５７−ＬＣ／ＵＲＡ３を得る。組換えが、酵母染色体中の正しい位置で起こったかどうかを決定するため、ＵＲＡ３遺伝子およびＬＣに特異的なプライマーによる診断的ＰＣＲを使用して、挿入の位置を確認する。
【０２３８】
図７Ａは、ＨＣ−ＣＤＲ３配列の標的化欠失を作製するための方法を例示している。その５’末端で抗原特異的ＨＣのフレームワーク領域３（ＦＲ３）に対して相同的な、およびその３’末端でフレームワーク領域４（ＦＲ４）に対して相同的な配列により挟まれた、ＵＲＡ３遺伝子の翻訳領域を運んでいるＵＲＡ３カセットを構築する。ＦＲ３−ＵＲＡ３−ＦＲ４  ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ、およびＵＲＡ３遺伝子に対する相同性および付随するＦＲ３およびＦＲ４相同的配列を運んでいるオリゴヌクレオチドを使用して構築する。ＨＣ発現カセット（ＢＪ５４５９−ＨＣ−αＡＧＧ）を繋ぎ止めている酵母株を、ＦＲ３−ＵＲＡ３−ＦＲ４  ＰＣＲ生成物で形質転換し、そしてＨＣ−ＣＤＲ３の標的化欠失を、Ｕｒａ３−選択的プレートで選択すると、酵母株ＢＪ５４５９−ＨＣ／ＵＲＡ３を得る。組換えが、酵母染色体中の正しい位置で起こったかどうかを決定するため、ＵＲＡ３遺伝子およびＨＣに特異的なプライマーによる診断的ＰＣＲを使用して、挿入の位置を確認する。
【０２３９】
幾らかの代表的クローンを配列決定し、ライブラリーサイズおよびＨＣ−ＣＤＲ３配列中の突然変異頻度を決定する。
インビボ組換えにより多様化された、１倍体ＬＣ−ＣＤＲ３およびＨＣ−ＣＤＲ３レパートリーの構築
標的ＬＣのＬＣ−ＣＤＲ３配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを構築する。オリゴヌクレオチドの合成では、ＣＤＲの長さを通してスパイクし、９０％の野生型ヌクレオチドおよび２．５％のＡ、Ｃ、ＧおよびＴの各々の比で合成すると、ＦＲ３−ＬＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４のオリゴヌクレオチドプールを得る。多様性の領域は、標的ＬＣのＦＲ３およびＦＲ４に相同的な２０ｂｐ配列により挟まれている。酵母株ＢＪ５４５７−ＬＣ／ＵＲＡ３をＦＲ３−ＬＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４で形質転換し、相同的組換えを、ＵＲＡ３遺伝子の喪失、および変異したＦＲ３−ＬＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４オリゴヌクレオチドによる交換により選択する。このことは、ＬＣが、インビボで組換えられた変異原性のオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＤＲ３ループで多様化された、１倍体ＭａｔαレパートリーＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３*を創造する。このレパートリーは約１０6のサイズ、またはより大きいまたはより小さいであろう。
【０２４０】
標的ＨＣのＬＣ−ＣＤＲ３配列に対応するオリゴヌクレオチドのプールを構築する。オリゴヌクレオチドの合成では、ＣＤＲの長さを通してスパイクし、９０％の野生型ヌクレオチドおよび２．５％のＡ、Ｃ、ＧおよびＴの各々の比で合成すると、ＦＲ３−ＨＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４のオリゴヌクレオチドプールを得る。多様性の領域は、標的ＬＣのＦＲ３およびＦＲ４に相同的な２０ｂｐ配列により挟まれている。酵母株ＢＪ５４５７−ＬＣ／ＵＲＡ３をＦＲ３−ＬＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４で形質転換し、相同的組換えを、５−ＦＯＡ（５’−フルオロオロチン酸；５−ＦＯＡ上での増殖はＵＲＡ３の喪失を必要とする）、および変異したＦＲ３−ＨＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４オリゴヌクレオチドによる交換により選択する。このことは、ＨＣが、インビボで組換えられた変異原性のオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＤＲ３ループで多様化された、１倍体ＭａｔａレパートリーＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３*を創造する。このレパートリーは約１０6のサイズ、またはより大きいまたはより小さいであろう。
【０２４１】
幾らかの代表的クローンを配列決定し、ライブラリーサイズおよびＨＣ−ＣＤＲ３配列中の突然変異頻度を決定する。
変異したＬＣ−ＣＤＲ３およびＨＣ−ＣＤＲ３を有する抗体を含んでなるＦａｂレパートリーを作製するための、ＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３*およびＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３*レパートリーのコンビナトリアル接合
新規Ｆａｂ（２倍体）酵母ディスプレイライブラリーを産生するため、２つの（１倍体）宿主細胞集団：ＣＤＲ３ループ中で多様化されたＬＣ断片のレパートリーを含んでいる第１の集団、およびＣＤＲループ中で多様化されたＨＣ断片のレパートリーを含んでいる第２の集団、を、細胞融合を可能にする十分な条件下で同時培養し、生じた２倍体集団を、Ｆａｂ（ＬＣ−ＣＤＲ３*／ＨＣ−ＣＤＲ３*）ライブラリーの発現および表示を可能にする十分な条件下で増殖させる。
【０２４２】
約１０10のＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３*細胞と、を約１０10のＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３*細胞を接合させる。１０％の接合効率は、約１０9の２倍体を生じる（例えば、１０12の可能なコンビナトリアルＬＣ／ＨＣ多様性の、１０9のＬＣ／ＨＣの組み合わせを獲得することは、１倍体親中の個々の成分ＬＣおよびＨＣレパートリーの最大の出発多様性を与える）（図７）。
コンビナトリアル〔ＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３*〕〔ＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３*〕Ｆａｂ提示レパートリーの親和性選択
２倍体レパートリーを培養し、ＬＣおよびＨＣの発現を誘導する。２倍体培養物は次ぎに抗原とインキュベートし、第１ラウンドの選択のための磁気ビーズに基づいた選択法（例えば、ＭＡＣＳ）、続いてのフローサイトメトリーソーティングの組み合わせを使用して選択する。第１ラウンドのＭＡＣＳ選択は、すべての機能性クローンが濃縮されていることを確実にするために過剰の抗原で実施し、そして親和性成熟されるべき標的抗体の出発Ｋｄよりも約５倍低い濃度での、親和性駆動選択を続いて行う。
【０２４３】
親和性変異体は、１つ以上のラウンドのコンビナトリアル酵母接合およびインビボ組換え後の、親和性改良を定量するため、例えば、ＦＡＣＳを使用してオフレイトをスクリーニングする。
選択された２倍体ＦａｂのＬＣおよびＨＣ１倍体酵母細胞への分割およびインビボ組換えよる反復遺伝子多様化
親和性が改良されたＦａｂ抗体を含んでいる選択された２倍体は、窒素飢餓の条件下で単離物を培養することにより、胞子形成を行うように誘導する（ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ，１９９１）。胞子形成した２倍体を収集し、ザイモラーゼで処理し、超音波処理し、およびリッチプレートに撒いた。１倍体コロニーは続いて、１倍体ＨＣ細胞（−Ｔｒｙ選択）かまたは１倍体ＬＣ細胞（−Ｌｅｕ選択）を選択するため、選択的プレートへ移した。このことは、各々、組換えおよび最適化されたＣＤＲ３を有するＨＣおよびＬＣ発現カセットを含む、細胞ＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３selおよびＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３selを生じる。改良されたＬＣ−ＣＤＲ３*またはＬＣ−ＣＤＲ３*を繋ぎ止めている１倍体コロニーは次ぎに、いくつかの戦略の１つによるインビボ組換えにより、多様化の第２ラウンドにかける：
（ｉ）ＨＣ多様化のためのＦＲ３−ＨＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４またはＬＣ多様化のためのＦＲ３−ＬＣ／ＣＤＲ３*−ＦＲ４に対応する変異原性オリゴヌクレオチドでの、１倍体細胞ＢＪ５４５７−ＨＣ／ＣＤＲ３selおよびＢＪ５４５７−ＬＣ／ＣＤＲ３selの形質転換。
【０２４４】
（ｉｉ）各々、標的ＬＣおよびＨＣのＦＲ１およびＦＲ２に相同的な配列により挟まれたＵＲＡ３発現カセットを使用する、ＬＣ−ＣＤＲ１ループおよびＨＣ−ＣＤＲ１ループの標的化された除去。これに続く、ＣＤＲ１ループが多様化され、およびＬＣまたはＨＣのＦＲ１およびＦＲ２に相同的な配列により挟まれた、変異原性オリゴによる形質転換。
【０２４５】
（ｉｉｉ）各々、標的ＬＣおよびＨＣのＦＲ１およびＦＲ２に相同的な配列により挟まれたＵＲＡ３発現カセットを使用する、ＬＣ−ＣＤＲ３ループおよびＨＣ−ＣＤＲ３ループの反復標的化除去。これに続く、ＣＤＲ３ループが多様化され、およびＬＣまたはＨＣのＦＲ１およびＦＲ２に相同的な配列により挟まれた、変異原性オリゴによる形質転換。
【０２４６】
第２ラウンドのコンビナトリアル酵母接合および親和性選択を次ぎに実施する。
多数の本発明の態様を説明してきた。しかしながら、多様な修飾が、本発明の精神および範囲から離れることなく行うことができることが理解されるであろう。従って、他の態様も特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】図１は、酵母細胞における免疫グロブリンタンパク質を組換える方法の例を示している。
【図２】図２は、酵母細胞における免疫グロブリンタンパク質を組換える循環法の例を示している。
【図３】図３は、酵母細胞ディスプレイのための、酵母細胞における免疫グロブリンタンパク質を組換える方法の例を示している。
【図４Ａ】図４は、酵母細胞ディスプレイのための、酵母細胞における免疫グロブリンタンパク質を組換える方法の例を示している。図４において、１倍体細胞中のプラスミドは、部位特異的組換え４６のための部位４２および４４を含んでいる。相同的組換え４８は、２つの異なったＬＥＵ２アレル間で起こる。
【図４Ｂ】図４は、酵母細胞ディスプレイのための、酵母細胞における免疫グロブリンタンパク質を組換える方法の例を示している。図４において、１倍体細胞中のプラスミドは、部位特異的組換え４６のための部位４２および４４を含んでいる。相同的組換え４８は、２つの異なったＬＥＵ２アレル間で起こる。
【図５】図５は、免疫グロブリン軽鎖発現核酸を、組み込み酵母ベクター内へ組み立てるための方法の例を示している。
【図６】図６は、免疫グロブリン重鎖発現核酸を、組み込み酵母ベクター内へ組み立てるための方法の例を示している。
【図７Ａ】図７は、別々の１倍体細胞中で免疫グロブリン重および軽鎖コード配列を変化させ、変化したコード配列を含んでいる細胞を接合して、２倍体Ｆａｂレパートリーを産生し、レパートリーから結合性Ｆａｂを親和性選択し、結合性Ｆａｂを示す細胞を胞子形成させ、そして随意に、親和性成熟の追加のラウンドを実行する、方法の例を示している。
【図７Ｂ】図７は、別々の１倍体細胞中で免疫グロブリン重および軽鎖コード配列を変化させ、変化したコード配列を含んでいる細胞を接合して、２倍体Ｆａｂレパートリーを産生し、レパートリーから結合性Ｆａｂを親和性選択し、結合性Ｆａｂを示す細胞を胞子形成させ、そして随意に、親和性成熟の追加のラウンドを実行する、方法の例を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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