(57)【要約】  哺乳動物膵島細胞に由来する内分泌前駆細胞の細胞組成物であって、該細胞組成物の細胞が、機能性インスリン生産性β細胞へと分化するように糖尿病患者に移植することができる細胞組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物膵島細胞に由来する内分泌前駆細胞を含む細胞組成物であって、規定培地中で連続継代後の該細胞が哺乳動物膵島細胞に由来する初期培養細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーｐｄｘ１およびネスチンを発現する、前記細胞組成物。
【請求項２】
哺乳動物膵島細胞を培養して内分泌前駆細胞を産生する方法であって、
（ａ）ドナーの膵臓から哺乳動物膵島細胞を単離し；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を規定培地中で連続的に培養して該細胞を増加させ；そして
（ｃ）該細胞を培養し続けて内分泌前駆細胞を産生する
工程を含み、
このとき、該内分泌前駆細胞が工程（ａ）の細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーｐｄｘ１およびネスチンを発現する、前記方法。
【請求項３】
糖尿病を有する患者を処置する方法であって、
（ａ）哺乳動物膵島細胞に由来する細胞を規定培地中で連続的に培養して細胞を増加させ、且つ内分泌前駆細胞を産生し、
このとき、該内分泌前駆細胞が初期培養細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーｐｄｘ１およびネスチンを発現し；そして
（ｂ）糖尿病を有するレシピエント患者へ該内分泌前駆細胞を移植する
ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、糖尿病および膵島の分野に関し、より詳しくは、機能性インスリン生産性β細胞へと分化する可能性を有する膵島細胞由来の内分泌始原（progenitor）／前駆（precursor）細胞に関する。
【０００２】
発明の背景：
真性糖尿病は、米国において約１６００万人を襲っている有意の健康課題である。膵島β細胞による充分なインスリン生産の損失は、Ｉ型およびII型双方の糖尿病の特徴である。再生または移植によるこれら細胞の置換は、糖尿病のための終生処置を与えることができるだろう。しかしながら、処置を行う場合の主な課題は、移植のための充分な小島細胞組織の不足である。米国では、毎年僅か約３，０００のヒトドナー膵臓が求めに応じることができると報告されてきているが、さらに毎年新たに３５，０００例を超えるＩ型糖尿病が診断される。インスリン生産性膵島細胞として機能するであろう細胞の移植によって糖尿病患者を処置する方法が継続して要求されている。
【０００３】
発明の要旨：
本発明は、哺乳動物膵臓、好ましくは、ヒト膵臓、典型的には、成体膵臓由来の内分泌始原／前駆細胞であって、規定培地中において連続継代で培養されていて、しかも小島始原マーカーｐｄｘ１およびネスチンを発現する細胞を含む細胞組成物である。これら内分泌始原／前駆細胞を、規定培地中において多数回の継代にわたって培養して、細胞数を増加させる。細胞は、増加するにつれて、一層増殖性になり且つ一層少なく分化するようになる。充分な細胞数が得られた時点で、内分泌始原／前駆細胞を含む本発明の細胞組成物を用いて、インスリン欠乏性糖尿病の一人またはそれを超える患者を処置する生細胞インプラントを作成することができる。
【０００４】
詳細な説明：
本発明の一つの特徴は、規定培地中において連続継代で培養する前の初期の由来細胞より少ない分化を特徴とする、哺乳動物の膵島（pancreatic islet）、典型的には、成体膵島細胞由来の内分泌始原／前駆細胞の細胞組成物である。
【０００５】
本発明のもう一つの特徴は、内分泌前駆細胞の培養物のための規定培地製剤である。
本発明のもう一つの特徴は、哺乳動物膵島由来の細胞を培養して、培養物の初期細胞より少なく分化している内分泌始原／前駆細胞を生じる方法である。
【０００６】
本発明の細胞組成物を開始するのに用いられる細胞は、哺乳動物膵島、好ましくは、ヒト膵島、典型的には、成体膵島細胞に由来する。記載された本発明の培養方法にしたがって、これら初期膵島細胞を規定培地中で培養し、規定培地中での連続継代によって増加させて、小島始原マーカーｐｄｘ−１およびネスチンを発現する少なく分化している内分泌始原／前駆細胞を生じる。これら内分泌始原／前駆細胞は、機能性インスリン生産性β細胞へと分化する可能性を有する。本明細書中で用いられる「内分泌始原／前駆細胞（endcrine progenitor/precursor cell）」、「内分泌始原細胞（endcrine progenitor cell）」および「内分泌前駆細胞（endcrine precursor cell）」はいずれも、規定培地中で連続継代が可能であり、培養する前の初期細胞（initial cell）より少なく分化していて、そしてマーカーｐｄｘ１およびネスチンを発現する哺乳動物膵島に由来する細胞を意味するものである。本発明の細胞組成物において、内分泌始原細胞は、インスリン欠乏性糖尿病を処置するために患者に移植された場合、機能性インスリン生産性β細胞へと分化する。
【０００７】
初期膵臓細胞を培養し且つ内分泌前駆細胞へと連続継代するのに用いられる培地は、化学的に規定され、血清も臓器抽出物も含有しないということになる。その培地は、内分泌前駆細胞を数回の継代にわたって培養し且つ維持して、集団の細胞数を増加させることができる。細胞数を増加させる能力は、ヒト膵臓組織が限られている場合に有益である。さらなる利点は、多数の治療的細胞組成物を一の膵臓から生じることができるということである。
【０００８】
規定培地は、通常は他の成分を更に補給された栄養基剤から構成される。当業者は、本発明の組織構築物を首尾良く生じることを相応に期待して、動物細胞培養技術分野において適当な栄養基剤を決定することができる。多数の商業的に入手可能な栄養源は、本発明の実施に有用である。これらには、ダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）（ＤＭＥＭ）；最少必須培地（Minimal Essential Medium）（ＭＥＭ）；Ｍ１９９；ＲＰＭＩ１６４０；イスコヴ修飾ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）（ＥＤＭＥＭ）などの、無機塩類、エネルギー源、アミノ酸およびビタミンＢを供給する商業的に入手可能な栄養源が含まれる。Minimal Essential Medium（ＭＥＭ）およびＭ１９９は、リン脂質前駆体および非必須アミノ酸の追加の補給を必要とする。追加のアミノ酸、核酸、酵素補因子、リン脂質前駆体および無機塩類を供給する商業的に入手可能でビタミンの多い混合物には、Ham's Ｆ−１２、Ham's Ｆ−１０、ＮＣＴＣ１０９およびＮＣＴＣ１３５が含まれる。たとえいろいろな濃度でも、全ての基礎培地は、細胞のための基本的な栄養源をグルコース、アミノ酸、ビタミンおよび無機イオンの形で、他の基本的な培地成分と一緒に提供する。
【０００９】
本発明の好ましい基本培地は、グルコース、マグネシウムを含まず、４．０ｍＭのＬ−グルタミンを含み、ピルビン酸ナトリウムを含まず、そして Ham's Ｆ−１２（５ｍＭグルコース含有）を３対１の比率で含む、カルシウム不含かまたは低カルシウムの Dulbecco's Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）の栄養基剤を含む。この基剤の最終グルコース濃度は、約２ｍＭ〜約８ｍＭ、より好ましくは、約３ｍＭ〜約７ｍＭ、最も好ましくは、約５ｍＭに調整される。
【００１０】
基本培地は、アミノ酸、増殖因子およびホルモンなどの成分を補給される。本発明の細胞培養物のための規定培地は、本明細書中にそれらの開示が援用される、Parenteau による米国特許第５，７１２，１６３号および国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／３１４７３号に記載されている。他の培地は、Ham and McKeehan, Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979) に、または他の適当な化学規定培地について、Bottenstein et al., Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979) に開示されたものなどが当該技術分野において知られている。
【００１１】
好ましい態様において、基本培地は、動物細胞培養業者に知られている次の成分、すなわち、インスリン、トランスフェリン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、エタノールアミンおよびｏ−ホスホリルエタノールアミンのどちらかまたは両方、上皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、セレン、アデニン、塩化ストロンチウム、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）およびグルコースを補給される。これら補給物の濃度および代用は、当業者が滴定実験を行うことによって決定することができる。
【００１２】
インスリンは、グルコースおよびアミノ酸の取込みを促進して、多数回の継代にわたって長期間の利点を与えるポリペプチドホルモンである。インスリンまたはインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の補給は、グルコースおよびアミノ酸を取り込む細胞の能力の最終的な喪失と、細胞表現型退化の可能性とが存在するであろうから、長期間培養にとっては必要である。インスリン補給は、連続培養（serial culture）にとっては望ましく、培地に、好ましくは、約０．５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌの最も好ましくは約１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられる。インスリンの代わりに用いられるＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２などのインスリン様増殖因子の補給に適当な濃度は、当業者が、培養物に選択される細胞タイプについて簡単な力価測定実験を行うことによって容易に決定することができる。
【００１３】
トランスフェリンは、鉄輸送調節のために培地中にある。鉄は、血清中に見出される必須微量元素である。鉄は、遊離型では細胞に毒性がある場合があるので、血清中には、それをトランスフェリンに結合した状態で、好ましくは約０．０５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５μｇ／ｍｌ〜約１５μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５μｇ／ｍｌの濃度範囲で細胞に供給される。
【００１４】
トリヨードチロニン（Ｔ３）は、基本的な成分であり、細胞代謝速度を維持するように培地中に含まれる甲状腺ホルモンの活性型である。トリヨードチロニンは、約０〜約４００ｐＭ、より好ましくは約２ｐＭ〜約２００ｐＭ、最も好ましくは約２０ｐＭの濃度範囲で培地に補給される。
【００１５】
リン脂質であるエタノールアミンおよびｏ−ホスホリルエタノールアミンのどちらか、または両方が加えられるが、その機能は、イノシトール経路および脂肪酸代謝における重要な前駆体である。血清中に通常見出される脂質の補給は、血清不含培地には必要である。エタノールアミンまたはｏ−ホスホリルエタノールアミン、または双方は、約１０-6Ｍ〜約１０-2Ｍ、より好ましくは約１ｘ１０-4Ｍの濃度範囲で培地に与えられる。
【００１６】
ヒドロコルチゾンは、他の上皮細胞タイプを培養する場合に、表現型を促進し、したがって、分化した特徴を増強する利点を有することが分かっている（Rubin et al., J.Cell Physiol., 138:208-214 (1986)）。ヒドロコルチゾンは、約０．０４μｇ／ｍｌ〜約４．０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４μｇ／ｍｌの濃度範囲で与えられてよい。
【００１７】
セレンは、血清によって通常与えられるセレンの微量元素を再補給するために血清不含培地に加えられる。セレンは、約１０-9Ｍ〜約１０-7Ｍ、最も好ましくは約５．３ｘ１０-8Ｍの濃度範囲で与えられてよい。
【００１８】
アミノ酸Ｌ−グルタミンは、若干の栄養基剤中に存在しているが、全くまたは不充分な量しか存在しない場合に加えられてよい。Ｌ−グルタミンは、Gluta ＭＡＸ−１TM（Gibco BRL, Grand Island, NY）という商標で販売されているもののような安定な形で与えられてもよい。Gluta ＭＡＸ−１TMは、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの安定なジペプチド型であり、Ｌ−グルタミンと交換可能に用いることができ、Ｌ−グルタミンの代用物として等モル濃度で与えられる。このジペプチドは、Ｌ−グルタミンに安定性を与えて、培地中のＬ−グルタミンの有効濃度を不確定にすることがありうる貯蔵期間にわたるおよびインキュベーション時間中の分解からそれを保護する。典型的には、基本培地は、グルタミンを、好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜約８ｍＭの濃度で、そして最も好ましくは６ｍＭのＬ−グルタミンを補給される。
【００１９】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの増殖因子は、細胞の拡大および播種によって培養物の樹立を助けるために培地に加えられてもよい。天然型または組換え型のＥＧＦを用いることができる。天然または組換えのヒト型ＥＧＦは、非ヒト生体成分を含有しない皮膚同等物を加工する場合に培地中に用いるのに好適である。ＥＧＦは、任意の成分であり、約１〜１５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５〜１０ｎｇ／ｍＬの濃度で与えられてよい。
【００２０】
上記の規定培地は、典型的には、下記のように調製される。しかしながら、規定培地の成分を、それらの物理的性質に適合したいずれか慣用的な方法を用いて調製し且つ組み合わせることができるということは理解されるはずである。利用可能性または経済性の目的に適当な類似体または機能的に同等の作用性物質を若干の成分に代用し且つ同様の結果に達することは、当該技術分野において周知である。天然に存在する増殖因子は、培養に用いられた場合に同様の品質および結果を有する組換えまたは合成の増殖因子で代用することができる。これら補給物の最適濃度は、異なった哺乳動物種に由来する細胞について僅かに調整する必要がありうるし、異なったドナーからの細胞系は、その年齢、体格および健康状態によってそれらの性能が異なるであろう。力価測定実験は、ある成分の最適濃度に達するようにその成分の濃度を変化させて行われる。
【００２１】
本発明による培地は滅菌済みである。滅菌済み成分が購入されるか、または調製後に、濾過などの慣用法によって滅菌される。適当な滅菌手順を、以下の実施例中で用いた。ＤＭＥＭおよびＦ−１２を一緒にし、個々の成分を加えて培地を完成させる。全ての成分のストック溶液は、４℃で貯蔵することができる栄養源を除いて、−２０℃で貯蔵することができる。全てのストック溶液を、上に挙げた５００Ｘ最終濃度で調製する。インスリン、トランスフェリンおよびトリヨードチロニン（いずれも Sigma 製）のストック溶液は、次のように調製する：最初に、トリヨードチロニンを、１Ｎ塩酸（ＨＣｌ）中の無水エタノール中に２：１の比率で溶解させる。インスリンを希ＨＣｌ（約０．１Ｎ）中に溶解させ、トランスフェリンを水中に溶解させる。次に、この三つを混合し、水中で５００Ｘ濃度に希釈する。エタノールアミンおよびｏ−ホスホリルエタノールアミンを水中に溶解させて５００Ｘ濃度にし、濾過滅菌する。ヒドロコルチゾンは無水エタノール中に溶解させ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈する。セレンは水に溶解させて５００Ｘ濃度にし、濾過滅菌する。ＥＧＦは滅菌済みの状態で購入し、ＰＢＳ中に溶解させる。アデニンは、溶解し難いが、当業者に知られている多数の方法のいずれかによって溶解させることができる。長期間の貯蔵のためにはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて、ＥＧＦストック溶液の活性を維持することができる。培地は、調製直後に用いるかまたは４℃で貯蔵することができる。貯蔵する場合、ＥＧＦは、使用時まで加えるべきでない。
【００２２】
本発明の内分泌前駆細胞の連続培養のためのより好ましい培地製剤は、Dulbecco's Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）（グルコース不含、カルシウム不含、４ｍＭのＬ−グルタミン含有）および Hams Ｆ−１２培地の３：１混合物基剤を含み、この基剤は、次の成分を各々指定した最終成分濃度で補給される。６ｍＭのＬ−グルタミン（または同等物）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１ｘ１０-4Ｍエタノールアミン、１ｘ１０-4Ｍ  ｏ−ホスホリルエタノールアミン、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２０ｐＭトリヨードチロニン、６．７８ｎｇ／ｍｌのセレン、２４．４μｇ／ｍＬのアデニン、２６６．６μｇ／ｍＬの塩化ストロンチウム、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１２．５ｍｇ／ｍＬのダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）および５ｍＭグルコース。
【００２３】
内分泌前駆細胞は、三次元の組織様構造の形成が可能な、培養皿、フラスコまたはローラーボトルなどの動物細胞または組織培養に適した容器中で培養する。細胞を増殖させることができる適当な細胞増殖面は、細胞が付着し、細胞マトリックス構築物を形成するための定着手段を与えることができるいずれか生物学的に適合した材料でありうる。ガラス；ステンレス鋼；ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、フルオロポリマーおよびフッ素化エチレンプロピレンを含めたポリマー；および溶融シリカ、多ケイ素またはケイ素結晶を含めたケイ素支持体などの材料は、細胞増殖面として用いることができる。この細胞増殖面材料は、化学的に処理または修飾されてよいし、静電的に帯電してよいし、またはペプチドなどの生体物質でコーティングされてよい。ペプチドコーティングの一例は、ＲＧＤペプチドである。
【００２４】
本発明の細胞は、均質な細胞増殖面上で、または多孔質膜のような、培養物への培地の両側接触を可能にするように膜の上下両面に通じている細孔を有する細胞増殖面上で増殖させることができる。両側接触は、培地中に含有される栄養素への最大表面積暴露のために、培養物の上下両面に培地が接触することを可能にする。増殖面にある細孔は、膜を介して培養物の下側に栄養素を与えるための培地の通過を考慮しているので、細胞が双方向から栄養供給されることを可能にする。多孔質膜を組み込まれた培養容器は、当該技術分野において知られていて、本発明を実施するのに好適であり、そして例えば、本明細書中にそれらの開示が援用される米国特許第５，７６６，９３７号、第５，４６６，６０２号、第５，３６６，８９３号、第５，３５８，８７１号、第５，２１５，９２０号、第５，０２６，６４９号、第４，８７１，６７４号、第４，６０８，３４２号を含めた当該分野の米国特許に記載されていて、若干のものは商業的に入手可能になっている。好ましい細孔サイズは、膜を介して細胞を増殖させないように充分に小さいが、培地中に含有される栄養素を、毛管作用などによって細胞培養物の下面に自由に通過させるように充分に大きいものである。好ましい細孔サイズは、約３ミクロン未満であるが、約０．１ミクロン〜約３ミクロン、より好ましくは、約０．２ミクロン〜約１ミクロンであり、最も好ましくは、約０．４ミクロン〜約０．６ミクロンのサイズの細孔を用いる。
【００２５】
培養は、細胞培養のための調節された温度、湿度およびガス混合物の充分な環境条件を確実にするようにインキュベーター中で維持される。好ましい条件は、約５〜１０±１％ＣＯ2の雰囲気および約８０〜９０％の相対湿度（Ｒｈ）で、約３４℃〜約３８℃、より好ましくは、３７±１℃である。
【００２６】
規定培地は、初代培養物を樹立することおよびそれら培養物を連続継代することを考慮しているので、細胞を検査用にまたは治療用物質として用いるための増加した多数の細胞を与える。ヒト小島細胞培養物における障害の一つは、標的上皮細胞、小島始原／前駆細胞の特徴を有する部分集団の増殖に勝る場合がある線維芽細胞の過増殖である。規定培地で細胞を培養することは、この課題を克服している。この規定培地を用いてヒト小島から増殖した細胞は、上皮様形態を優先的に示し、サイトケラチン上皮マーカーを発現している。
【００２７】
これら細胞の各々の継代において、ｐｄｘ１およびネスチンを含めた、始原細胞および内分泌前駆細胞双方に特異的なマーカーは、それら細胞によって継続して示されている。培養された細胞は、小島細胞マーカーの発現の減少を示し、それら細胞は、各々の継代で脱分化しうることが示されるが、しかしながら、それら細胞は、各々の継代を通して始原表現型を維持している。
【００２８】
ＩＤＸ−１としても知られる転写因子ｐｄｘ１は、膵臓分化の既知のマーカーであり、且つ膵臓発生（pancreatic development）の調節物質である。（Jonsson et al. Nature 371:606 (1994) および Offield et al. Development 122:983 (1996)）。
【００２９】
ネスチンは、発育中の（developing）膵島細胞の細胞マーカーである。（Lendahl, et al. Cell 60:585-595 (1990) および Zulewski et al. Diabetes. 2001 Mar; 50(3):521-33）。
【００３０】
内分泌前駆細胞は、化学的または物理的手段を用いて、例えばインスリン生産性β細胞への分化を促進する物質を培地に補給することにより、または細胞外マトリックスなどのマトリックス中で細胞クラスターを形成する方法により、分化が誘導されうる。適正な環境における細胞のインプラント誘導分化（in vivo）が細胞を分化させるであろう。それら細胞は、小腸の粘膜下組織内または腎被膜下の皮下に移植することができる。
【００３１】
以下の実施例は、本発明の実施をより良く説明するために与えられ、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するために解釈されるべきではない。当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、本明細書中に記載の方法にいろいろな改変を行うことができることを理解するであろう。
【００３２】
実施例：
実施例１：死体のヒト膵臓からの膵臓小細胞の単離：
ヒト膵島単離を、Ricordi（Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 1988 37:413-420）によって最初に提案された半自動法によって行った。入手した膵臓を、Liberase ＨＩ（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）または Serva Collagenase（Cresent Chemical, Brooklyn, NY）の管内注入によって広げ（Linetsky E, Bottno R, Ehmann R, et al. Improved human islet isolation using a new eyzyme blend, Liberase. Diabetes 1997 46:1120-1123）、そして次に、自動法（Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 1988 37:413-420）を用いて分離した。この分離は、約１２〜３０分間続く連続消化工程中に生じ、その後、消化回路を冷却し、そして組織を約８リットルの冷ハンクス液中に集め、洗浄した。遊離した小島を、Cobe ２９９１細胞分離器中において Euroficoll の連続勾配で非島組織から分離した。
【００３３】
次に、Cobe 細胞分離器から部分精製された小島の標品を、一連の異なったサイズの鋼メッシュスクリーン（１００〜２５μ細孔）を介して通過させ、そして回収される組織を、培地中のプラスチック上で直接的に培養し、伸展させた。
【００３４】
実施例２：ブタ小島細胞の単離：
膵島細胞を、ブタドナーから単離し、規定培地を用いてプレーティングして、上皮様表現型を有する培養物を得た。ブタ小島細胞単離手順は、次の通りである。２個の Nalgene 容器、数個の５０ｍＬ丸底遠心管、トレーおよびスクリーンを、オートクレーブ処理した。２種類の溶液、すなわち、ＵＷ−Ｄ臓器保存溶液と、２７％、２４．６％および１１％の３種類の濃度のＦＩＣＯＬＬ溶液を調製した。
【００３５】
ＵＷ−Ｄ臓器保存溶液は、Sumimoto et al（Transplantation 1989 July; 48(1):1-5）によって与えられた明細書にしたがって作成した。１リットルの１Ｘ  ＵＷ−Ｄ臓器保存溶液は、３５．８３ｇのラクトビオン酸（Aldrich, Milwaukee, WI）、１７．８３ｇのラフィノース（Sigma, St. Louis, MO）、１．２３ｇのＭｇＳＯ4（Sigma, St. Louis, MO）、０．９２ｇのグルタチオン（Sigma, St. Louis, MO）、０．１３６ｇのアロプリノール（Sigma, St. Louis, MO）および３．４０ｇの第一リン酸カリウム（Sigma, St. Louis, MO）および２回蒸留水から成った。次に、この溶液を、０．２ｕフィルターを用いて濾過滅菌し、必要とされるまで４℃で貯蔵した。
【００３６】
ＦＩＣＯＬＬ溶液は、Eurocollins 基剤から調製した。Eurocollins 基剤溶液（ｐＨ７．３）は、４．１ｇの第一リン酸カリウム（Sigma, St. Louis, MO）、１４．８ｇの第二リン酸カリウム（Sigma, St. Louis, MO）、２．２４ｇの塩化カリウム（Sigma, St. Louis, MO）、１．６８ｇの重炭酸ナトリウム（Sigma, St. Louis, MO）、７０ｇのＤ−グルコース（Sigma, St. Louis, MO）と、それを２リットルに達しさせる適量の２回蒸留水から成った。１リットルの Eurocollins 基剤溶液を、５００ｇのＦＩＣＯＬＬ（Sigma, St. Louis, MO）に加えた。このＦＩＣＯＬＬを溶液にさせ、その工程は約２時間を要した。更に５００ｍＬの Eurocollins を加えた。その溶液を、ＢＲＩＸについて分析したが、屈折率は、それぞれ、２８〜２８．４および１．３７７４〜１．３７７９ｎ0である。必要により、追加の Eurocollins 基剤を加えた。次に、そのＦＩＣＯＬＬ溶液を、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ−ＭＩＬＬＩＰＡＣＫ（Millipore, Bedford, MA）を用いて滅菌濾過し、滅菌１Ｌボトル中に分配した。２４．６％ＦＩＣＯＬＬ溶液を調製するには、４５６ｍＬのＦＩＣＯＬＬ原液（２７％）を、４４ｍＬの Eurocollins 溶液で希釈した。１１％ＦＩＣＯＬＬ溶液を生成するには、２０４ｍＬのＦＩＣＯＬＬ原液を、２９６ｍＬの Eurocollins で希釈した。これらＦＩＣＯＬＬ溶液を、必要とされるまで５℃で貯蔵した。
【００３７】
膵臓は、４０ポンド（約２０ｋｇ）を超える体重の混合品種ブタから入手した。このブタには、普通飼料を与え、外科手術前の２４時間絶食させた。氷を充填した冷却器、５００ｍＬの冷ＵＷ溶液、１０ｃ．ｃ．および３０ｃ．ｃ．シリンジ、および２０ゲージ血管カテーテルを、膵臓の採取および輸送に用いた。膵臓をいったん取り出したら、それを冷ＵＷ溶液で、膨張するまで灌流した。次に、それを２５０ｍＬの Nalgene 容器中に入れ、氷上に置いた。
【００３８】
膵臓の採取中に、水浴を４１℃に加熱し、濾過滅菌された Liberase ＰＩ溶液（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN）を調製した。膵臓の Liberase 注入を容易にするために、解剖用トレー、大小鉗子、余分の血管カテーテル、３０ｃ．ｃ．および６０ｃ．ｃ．シリンジ、および Nalgene 容器を、生物学的安全キャビネットの滅菌済みの領域に置いた。次に、臓器を氷から取り出し、解剖用トレー上に置いた。Liberase ＰＩ溶液を臓器中に灌流させた。この工程は、外科手術中にそこに配置されたカニューレの妨げとならないように、そして更に、逆流を防止するように徐々に行った。臓器がいったん充満したら、それを、若干の追加の Liberase 溶液が入っている別の Nalgene 容器中に入れた。その容器を密封し、４１℃水浴中に入れてインキュベートした。
【００３９】
次に、膵臓を、分離し始めたと認められるまで消化し、その工程は１５〜３０分間を要した。滅菌済みの生物学的安全キャビネットに臓器を戻す前に、その Nalgene 容器にエチルアルコールを噴霧して、確実に滅菌した。次に、臓器を分離用スクリーン上に置き、細胞スクレーパーで５〜１０分間静かにこすり落とした。しばしば、洗浄剤を加えて、組織の分離を容易にした。この洗浄剤は、修飾ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（カルシウムおよびマグネシウム含有、フェノールレッド不含）（JRH Biosciences, Lenexa, KS）、ドナー群ウマ血清（JRH Biosciences, Lenexa, KS）、１０，０００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）、５０ｍｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン（ＯＩ  Ｐ／Ｎ  １００〜５０）、２５０ｍｇ／ｍＬのファンギゾン（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）、アンフォテリシンＢ（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）および２０５ｍｇ／ｍＬのデソキシコール酸ナトリウム（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）から成った。
【００４０】
スクリーンの下側をこすって、確実に小島細胞が後に残らないようにした。次に、洗液／細胞液を大形遠心用ボトル中に入れた後、７００ｒｐｍで１分半の間回転させた。次に、上澄みを注意深く吸引除去した。各々のボトルの内容物を、洗浄剤を用いて再懸濁させ、それを一つの遠心用ボトル中に一緒にした。洗浄剤を、そのビンが充満するまで加えた後、再度遠心分離した。次に、上澄みを吸引除去し、組織の容量を決定した。
【００４１】
密度分離を開始するために、組織１ｍＬにつき５ｍＬの２４．６％ＦＩＣＯＬＬを加えた。次に、その懸濁液を充分に混合し、５０ｍＬ丸底管に加えた。各々の管には、１２ｍＬ以下のこの懸濁液が入っているべきである。第二層の２７％ＦＩＣＯＬＬを、その懸濁液の上に加えた。第三層の１１％ＦＩＣＯＬＬを、その勾配の上に加えた。それら層が確実に混合しないように特に注意した。次に、これら管を遠心分離機中に装填し、１７００ｒｐｍで１８分間回転させた。勾配を維持するために、遠心分離機の加速度を遅くし、ブレーキを外した。
【００４２】
小島細胞を集めるために、１１〜２４．６％界面層を取り出した。小島細胞および洗浄剤を洗浄管に加え、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。上澄みを除去し、小島細胞を追加の洗浄剤で再懸濁した。この再懸濁および遠心分離を３回繰り返した。次に、小島細胞を培地で再懸濁し、プレーティングした。
【００４３】
実施例３：小島細胞培養物：
次に、実施例１の方法によって得られた小島細胞を、６０ｍｍ組織培養処理済み培養皿にプレーティングした。この実施例で用いられる培地には、次のものが含まれた。Dulbecco's Modified Eagle's Medium（ＤＭＥＭ）（グルコース不含、カルシウム不含、４ｍＭのＬ−グルタミン含有）および Hams Ｆ−１２培地の３：１混合物基剤であって、次の成分を各々指示される最終成分濃度で補給されている基剤。２ｍＭのＬ−グルタミン（または同等物）、１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子、０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、１ｘ１０-4Ｍエタノールアミン、１ｘ１０-4Ｍ  ｏ−ホスホリルエタノールアミン、５μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、２０ｐＭトリヨードチロニン、６．７８ｎｇ／ｍｌのセレン、２４．４μｇ／ｍＬのアデニン、２６６．６μｇ／ｍＬの塩化ストロンチウム、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ非必須アミノ酸、１２．５ｍｇ／ｍＬのダイズトリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）および５ｍＭグルコース。
【００４４】
ヒト小島細胞を、実施例１に記載のような膵臓組織に由来する初代培養物から培養し、規定培地中で８継代まで継代した（図面に「Ｈ２９７」として定義される）。図１は、各々の継代の累積集団倍増（cumulative population doubling）を示す。
【００４５】
ヒト小島細胞を、培養皿（予め、０．０５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを３０分間コーティングされる）にプレーティングし、プレーティング後１日目程度の初期の小島クラスターから塗抹し、第１週中徐々に増殖させた。ほぼ１０日目に、小さい有糸分裂活性細胞が出現し且つコロニーを形成し始めた。これらコロニーは、急速に増加し、最終的には互いに一緒になって、上皮形態を有する集団を３〜４日以内に形成した。細胞培養物を分割し且つそれらを新しい培養皿に継代後、継代培養された培養物は、約３０時間の倍増時間できわめて速く増殖した。これら細胞は、増殖能力を少なくとも７継代の間維持し、全集団倍増は９まで達した。
【００４６】
実施例４：特性決定研究：
増加した細胞手段を特性決定するために、小島幹／始原マーカーｐｄｘ１およびネスチン並びに小島ホルモンインスリンの発現を、実施例２に示されるようにＲＴ−ＰＣＲによって調べた。０、２、４および８継代によるＨ２９７細胞は全て、ｐｄｘ１発現について陽性であった。そのｐｄｘ１発現レベルは、培養期間の間中、比較的一定であるように見える。ネスチンの同様の発現パターンも、これら継代全てによる細胞で検出された。増加した細胞中でのｐｄｘ１およびネスチン双方の継続した発現は、培養物中の小島幹／始原細胞の存在の可能性を示唆し、そして細胞ベースの療法のための増加戦略の可能性を示している。期待されるインスリンの発現は、初期継代による細胞から検出されうるにすぎない。４継代では、実際上、インスリンｍＲＮＡシグナルを検出することができない。この結果は、４継代による細胞において僅かなインスリン陽性細胞しか認められなかった免疫蛍光法結果（データは示されていない）と一致する。インスリンシグナルの減少は、増加している細胞が、一層増殖性であり且つ一層少なく分化することを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、ヒト小島由来細胞Ｈ２９７の累積集団倍増の表およびグラフを示す。
【図２】図２は、ヒト小島由来細胞Ｈ２９７におけるｐｄｘ１、ネスチンおよびインスリンの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図１】
2005511046.tif 000002
【図２】
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【国際調査報告】
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