(57)【要約】本発明はプロテオミクス・アプローチを用いて生物からプロモーターを得る方法、真菌から単離されたプロモーター、およびその単離されたプロモーターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物体からの遺伝子のプロモーターを検出し、または得る方法であって、その方法は：
（ａ）所望の条件で生物により製造される１以上のタンパク質を得；
（ｂ）タンパク質についてのアミノ酸配列のデータを得；
（ｃ）そのタンパク質のアミノ酸配列に基づいて１以上のオリゴヌクレオチドを調製し；
（ｄ）その１以上のオリゴヌクレオチドでゲノムまたは染色体ＤＮＡを処理してそのタンパク質およびその調節領域をコードするゲノムまたは染色体ＤＮＡを得；そして
（ｅ）得られたゲノムまたは染色体ＤＮＡの配列決定をしてそのタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを検出し、または得る；
ことを含む方法。
【請求項２】
生物が微生物、植物または動物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が細菌、酵母および真菌よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物が糸状菌である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１以上のタンパク質の発現を誘導する所望の条件下で生物により製造されるタンパク質を分離することにより工程（ａ）を行い、プロテオミックディスプレーを提供する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
所望の条件が栄養源若しくは基質、または環境状態の提供を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
行程（ｃ）をゲノム歩行ＰＣＲにより行う請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られる単離されたプロモーター。
【請求項９】
真菌細胞の遺伝子の転写を促進することができる真菌プロモーターである請求項８に記載のプロモーター。
【請求項１０】
糸状菌由来の単離されたｈｅｘ−１プロモーター。
【請求項１１】
Ophiostoma種, Trichoderma種, Aspergillus種, Penicillium種, Topylocladium種, Fusarium種, Chrysosporium種, Magnaporthe種, Neurospora種, Clsviceps種, Mycosphaerella種, Collectotichum種, Ustilago種, Podospora種, Mucor種よりなる群から選択される真菌の種に由来する請求項１０に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１２】
Trichoderma reeseiに由来する請求項１０に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１３】
図２（配列番号１）に実質的に示すヌクレオチド配列、ストリンジェント条件下に図２（配列番号１）に示す配列にハイブリダイズする配列、または真菌種における場合、遺伝子の発現を調節できる図２（配列番号１）に示す配列の機能的な部分、を有する請求項１２に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１４】
図２（配列番号１）に実質的に示すヌクレオチド配列を有する請求項１３に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１５】
高ストリンジェント条件下に図２（配列番号１）に示す配列にハイブリダイズするヌクレオチド分子である請求項１３に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれかに記載の単離されたｈｅｘ１プロモーターを含むベクターまたは形質転換された細胞。
【請求項１７】
核酸ベクター、プラスミド、およびウイルスベクターよりなる群から選択される請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
遺伝子に作動可能に結合した請求項１０〜１５のいずれかに記載の単離されたｈｅｘ１プロモーターを含む組み替えＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
遺伝子が外来性のタンパク質をコードする請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
外来性タンパク質が加水分解酵素、治療的／薬学的重要性を有する分子よりなる群から選択される請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
加水分解酵素が、フィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、β―グルカナーゼ、アミラーゼ、リパゼおよびプロテアーゼよりなる群から選択される請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
治療的／薬学的重要性を有する分子が、タンパク質、抗生物質、増殖因子、増殖阻害剤および組織活性化因子よりなる群から選択される請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項１９〜２２いずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む発現システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子発現のためのプロモーターを得る方法および新しい遺伝子プロモーター、特に真菌の種からのプロモーターに関する。
背景技術
【０００２】
プロモーター領域は遺伝子発現を駆動し、制御するために必須である。ＤＮＡ配列のこれらの範囲は通常遺伝子のオープンリーディングフレームの上流に見出される。プロモーターにおける鍵となる遺伝子要素は、エンハンサー部位、サイレンシング部位、上流アクチベーター配列、転写因子結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む（例えば、Lewin, B., Genes V, Oxford University Press, 1994）。これらの要素はある生物の外部環境に応答する増殖条件に従い遺伝子発現を制御する。
【０００３】
強いプロモーターは効果的な遺伝子発現に必要である。糸状菌について今まで記載された最良のプロモーターはTrichoderma reesei セロビオハイドラーゼ  １（ｃｂｈ１）プロモーター（Ilm駭, M. et al., 1996.  Mol. Gen. Genet. 251, 451-460）およびAspergillus Niger Var. awamoriグルコアミラーゼＡプロモーター（Ward, M. et al., 1990.  Bio/Technology 8:435-440）を含む。しかしながら、これら両方のプロモーターは適当な炭素源（例えば、それぞれセルロースおよび澱粉）により誘導され、グルコースにより抑制される（即ち、カタボライト抑制により制御される）。今までのところ、ｃｂｈ１およびglaAに強さで匹敵しうる天然の構成的な、または炭素カタボライト抑制に非感受性のプロモーターは報告されていない。
【０００４】
プロモーター単離について記載された戦略は（ｉ）プロモータープローブベクターの使用。クローン化された断片がプロモーター活性を有する場合のみ発現されるリポータ遺伝子の前にゲノムＤＮＡ断片をランダムにクローン化する。（例えば、Neve et al., 1979. Nature 277:324-325）；（ｉｉ）遺伝子特異的プローブ（例えば、Vanhanen,et al., 1989, Curr. Genet., 15:181-186）またはアミノ酸配列から推定した核酸配列をベースにするハイブリダイゼーションを用いる遺伝子ライブラリーからの遺伝子およびそのプロモーターの単離；（ｉｉｉ）誘導および非誘導ｃＤＮＡプローブを用いる遺伝子バンクのディファレンシャルハイブリダイゼーション（例えばTeeri et al., 1983. Bio/technology 1:696-699）を含む。
【０００５】
本発明は遺伝子プロモーター単離のためにプロテオームディスプレーと名付ける新しい戦略を用いる。これは上に挙げたような核酸をベースにする戦略とは異なる。プロテオミック分析は典型的にはタンパク質の等電点および分子質量（２次元ゲル電気泳動）により試料中のタンパク質の分離を含む。ゲルを次に染色してタンパク質スポットを可視化し、さらなる処理のために適当な膜上にブロットしうる。２−ＤＥ技術は複雑な混合物中の数百のタンパク質の分離（O'Farrell, P.H., et al., 1975.  J. Biol. Chem. 250:4007-4021）および与えられた培養条件（例えば炭素源による）下に増殖する生物中で高度に発現するタンパク質の検出を可能にする。プロテオームディスプレーにおけるタンパク質のスポットはそれらが発現されるレベルを反映してそれらの強度が異なる。従って強く発現したタンパク質の検出はその特定のタンパク質をコードする遺伝子を駆動する強力なプロモーターの存在を示す。強く発現したタンパク質のスポットを切り出し、マススペクトルメトリーにより分析する（Verrils, N.M., et al., 2000.  Electrophoresis 21:3810-3822）。得られたアミノ酸配列を用いて特に強く発現した遺伝子（タンパク質）からのプロモーターを単離するため、染色体歩行PCR（Morris, D., et al., 1995.  Appl. Environ. Microbiol. 61:2262-2269）のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計できる。タンパク質の同定は得られたペプチドおよび／またはアミノ酸配列を例えばＷＷＷで利用可能なデータベースと比較することを含む。しかしながら、強く発現するタンパク質の同定はその発現を駆動するプロモーターの単離のためには必ずしも必要でない。
【０００６】
ｈｅｘ１遺伝子は真菌Woronin体の６角形の（HEX1）タンパク質をコードし、糸状菌に独特である（Tenney, K., et al., 2000. Fungal. Genet. Biol. 31:205-217）。ＨＥＸ１タンパク質は、炭素源としてセロビオーズ−ラクトース−大豆抽出培地またはグルコースで増殖したTrichoderma  reesei培養物から製造した細胞壁抽出物の最有力のタンパク質として、２次元ゲル電気泳動（Lim et al., 2001.  Proteomics 1:899-910）により同定された。従ってプロテオームディスプレーに基づくhex1遺伝子プロモーターの同定と単離は、炭素カタボライト抑制により必ずしも影響されないプロモーターを用いるプロモーター単離および遺伝子発現の強力な戦略を提供する。
【０００７】
本発明者は遺伝子の新しいプロモーターを得、または検出するための方法を今考案した。
【０００８】
発明の開示
第一の態様において、本発明は生物体からの遺伝子のプロモーターを検出し、または得る方法であって、その方法は：
（ａ）所望の条件で生物により製造される１以上のタンパク質を得；
（ｂ）タンパク質についてのアミノ酸配列のデータを得；
（ｃ）そのタンパク質の得られたアミノ酸配列に基づいて１以上のオリゴヌクレオチドを調製し；
（ｄ）１以上のオリゴヌクレオチドでゲノムまたは染色体ＤＮＡを処理して、そのタンパク質およびその調節領域をコードするゲノムまたは染色体ＤＮＡを得；そして
（ｅ）得られたゲノムまたは染色体ＤＮＡの配列決定してそのタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを検出または得る；
ことを含む方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、生物は細菌、酵母、真菌または糸状菌等の微生物である。しかしながら、生物はヒトを含む動物および植物等のより高級な生物から得られるいかなる細胞タイプでもよいことは理解されるであろう。
【００１０】
好ましくは、工程（ａ）は所望の条件で生物により製造したタンパク質を分離し、プロテオミックディスプレーを提供することにより行われる。
【００１１】
例えば微生物からプロモーターを得る場合、１以上のタンパク質の発現を誘導し得る条件下で生物を培養するのが望ましい。そのような誘導は、炭素源等の栄養分の供給、熱、ｐＨ、飢餓等の環境的条件であり得る。培養後、微生物により製造されたタンパク質を２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）等の適当な手段により分離しうる。目的のタンパク質を単離し、アミノ酸配列データを公知の配列決定法によりタンパク質のペプチド断片から得る。ペプチド情報が確められたら、そのタンパク質をコードする遺伝子の相補的ＤＮＡ配列とハイブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプローブを製造しうる。その生物からのゲノムまたは染色体ＤＮＡを、そのオリゴヌクレオチドにより次に処理し、その遺伝子およびそのプロモーター制御領域をコードするＤＮＡを例えばゲノムウオーキングＰＣＲを用いることにより得る。得られたならば、ＤＮＡの配列決定を行い、遺伝子のプロモーターおよびターミネーターについての情報を得る。
【００１２】
新規な遺伝子を得る標準的な方法は遺伝子物質源としてｃＤＮＡを用いることである。ｃＤＮＡは当業界で現在用いられている標準的な方法により用いられている場合、ｃＤＮＡは制御情報または配列を含まないので遺伝子プロモーターは得られない。対照的に、ゲノムまたは染色体ＤＮＡが本発明により用いられ、より多くの情報および有用な配列が得られる。
【００１３】
第２の態様では、本発明の第一の態様による方法により得られる単離されたプロモーターを提供する。
【００１４】
本発明による方法は真菌細胞における転写を促進できる新規な真菌プロモーター（ｈｅｘ１と呼ばれる遺伝子の部分として）を得るのに用いることができる。従って本発明のプロモーターを用いて異種の遺伝子または真菌の他の核酸配列を発現させることができる。
【００１５】
従って第３の態様では、本発明は糸状菌からのｈｅｘ１プロモーターを提供する。
【００１６】
好ましくは、そのプロモーターはOphiostoma 種, Trichoderma 種, Aspergillus 種, Penicillium sp., Topylocladium 種, Fusarium 種, Chrysosporium 種, Magnaporthe 種, Neurospora 種, Claviceps 種, Mycosphaerella 種, Collectotrichum 種、 Ustilago 種, Podospora 種 および Mucor 種より選択される真菌の種に由来する。
【００１７】
第４の態様では、本発明は図２（配列番号１）に実質的に示す核酸配列および／または図２（配列番号１）の配列に好ましくはストリンジェント条件下にハイブリダイズする配列を有する単離された真菌プロモーターを提供する。
【００１８】
ＨＥＸ１タンパク質が合理的な量の相同性を示すとしても、プロモーター領域が顕著な相同性を共有することを保証するものではないことは理解されるであろう。従ってＨＥＸ１タンパク質のアライメントは、他の微生物源からの類似のまたは機能的に均等なプロモーターを得るための出発点として用いることができる。
【００１９】
好ましい形では、単離されたプロモーターはｈｅｘ１遺伝子プロモーターのＤＮＡ配列を含み、そのＤＮＡ配列は、図２（配列番号１）に記す配列、または目的の遺伝子の発現を調節するに十分な図２（配列番号１）の部分配列；または図２（配列番号１）の配列に好ましくはストリンジェント条件下でハイブリダイズし、目的の遺伝子の発現を調節できる配列を有するヌクレオチド分子から選択される
【００２０】
１つの形ではヌクレオチド分子は高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で図２（配列番号１）の配列にハイブリダイズする。
【００２１】
好ましくは真菌細胞中で異種の遺伝子の発現を促進できる真菌プロモーター配列。Trichoderma reeseiからのｈｅｘ１遺伝子の完全な配列を図３（配列番号２；配列番号３）に示す。
【００２２】
本発明はストリンジェント条件下で図２（配列番号１）にハイブリダイズするか、または図２（配列番号１）の配列に少なくとも７０％（少なくとも８０，９０，９５または９９％）同一である配列を有する単離された核酸をも特色にする。図２（配列番号１）に示すプロモーター配列はオープンリーディングフレームに作動可能に結合したとき真菌細胞中で転写を促進することができる。図２（配列番号１）のプロモーター配列は図３（配列番号２；配列番号３）に示すようにｈｅｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームの上流にあるプロモーターの部分である。
【００２３】
第５の態様では、本発明は本発明の方法により得られるプロモーターを構成する単離された核酸を含むベクターまたは形質転換された細胞を提供する。ベクターは発現プラスミドまたはウイルスベクター等の核酸ベクターを含む。
【００２４】
本発明のプロモーター配列は真菌細胞を含む細胞中で外来のタンパク質を発現させるために様々な発現ベクターに導入できる。そのような外来性のタンパク質はフィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、β―グルカナーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼ等の加水分解酵素および抗生物質、ヒト増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子および商業的に価値のある他のいずれかのポリペプチドを含む。より具体的には、新規なプロモーター配列とそれが作動可能に結合したオープンリーディングフレームはゲノム中に組み込まれ、酵素、およびその例を上に示した治療剤を発現するトランスジェニック細胞を製造する。一時的発現であろうとまたは安定な発現であろうと、核酸を細胞に運搬する方法は分子生物学の分野で周知である。
【００２５】
第６の態様で本発明は目的の遺伝子に作動可能に結合した本発明の第２，第３または第４の態様によるプロモーターを含む組み替えＤＮＡ構築物を提供する。
【００２６】
好ましくは目的の遺伝子を特別の特徴について適当な源から選択する。その適当な源は商業的または有用な活性のために利用できる、ある代謝的または機能的活性を有する目的の微生物であり得る。
【００２７】
第７の態様では、本発明は本発明の第６の態様による構築物を含む発現システムを提供する。
【００２８】
発現システムは当業界で知られており、プロモーターの調節下に遺伝子を発現できる構築物を含む微生物などの細胞を含む。
【００２９】
第８の態様では、本発明は遺伝子の発現を調節する本発明によるプロモーターの使用を提供する。
【００３０】
本明細書を通して、文脈が要求しないかぎり「含む」の語は、述べた要素、整数若しくは工程、または要素、整数若しくは工程の群の包含を意味し、他の要素、整数または工程の排除を意味しない。
【００３１】
本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、製品についての議論は、本発明の文脈を提供するためだけである。これらの事項のいずれかまたはすべてが先行技術ベースを形成し、または本願の各クレームの優先日前にオーストラリアでそれが存在した時、本発明に関連する分野における共通の一般的な技術であると解すべきではない。
【００３２】
本発明をより明確に理解するために、好ましい形態を次の図面および実施例を参照して記述する。
【００３３】
本発明を実施する態様
定義
高ストリンジェント条件下にハイブリダイゼーションでき、または本発明で用いる核酸分子と高い相同性を有する均等な配列に関して、「高ストリンジェント条件下にハイブリダイズする」は「ストリンジェントハイブリダイズ条件」と同意語であり、当業者によく知られた用語である。例えば、Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985を参照。その両者は本明細書の一部を構成する。本発明の実施に用いることができる核酸分子およびポリペプチドに関して、核酸分子およびポリペプチドは有利には少なくとも約８４−８５％またはそれ以上の相同性または同一性、例えば少なくとも約８５％または約８６％または約８７％または約８８％または８９％の相同性または同一性、例えば少なくとも約９０％以上の相同性または同一性、例えば少なくとも約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％の相同性または同一性、より有利には少なくとも約９５−９９％の相同性または同一性またはそれ以上、例えば約９５％以上の相同性または同一性、少なくとも約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または１００％の相同性または同一性、または約８４−約１００％、または約９０−約９９または約１００％の相同性または同一性、約９５−約９９または１００％の相同性または同一性を有する。
【００３４】
ヌクレオチド配列相同性はＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒの「Ａｌｉｇｎ］プログラム（Optimal Alignments in Linear Space. CABIOS4, 11-17, 1988, 本明細書の一部を構成する）を用いて決定できる。あるいは、またはそれに加えて、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して、「相同性」または「同一性」は２つの配列間の相同性の定量的な尺度を示しうる。配列相同性％は、（Ｎ．ｓｕｂ．ｒｅｆ−Ｎ．ｓｕｂ．ｄｉｆ）＊１００／Ｎ．ｓｕｂ．ｒｅｆ（式中、Ｎ．ｓｕｂ．ｄｉｆは整列させた場合、２つの配列で同一でない残基の全数であり、Ｎ．ｓｕｂ．ｒｅｆは配列の１つにおける残基の数である）として計算できる。従って例えば、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列類似性を有する（Ｎ．ｓｕｂ．ｒｅｆ＝８；Ｎ．ｓｕｂ．ｄｉｆ＝２）
【００３５】
あるいは、またはそれに加えて、配列に関する「相同性」または「同一性」は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置の数を、２つの配列のより短いもののヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割ったものであり、２つの配列のアラインメントはWiburおよびLipmanアルゴリズムに従い決定できる（Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726,  本明細書の一部を構成する）。例えば、２０ヌクレオチドのウインドウサイズ、４つのヌクレオチドの語の長さ、４のギャップペナルティー、およびコンピューター補助分析、およびアラインメントを含む配列データの解釈を用いることは商業的に利用できるプログラム（Intelligenetics（登録商標）Suite, Intelligenetics Inc. California）を用いて便利に行われる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と同様であるか、配列同一性または相同性を有すると云われる場合、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列におけるウラシルと等しいと考えられる。本発明の範囲内でＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列におけるウラシル（Ｕ）と等しいと考えることによってＤＮＡ配列から誘導できる。
【００３６】
あるいは、またはそれに加えて、アミノ酸配列の類似性または同一性または相同性はBlastPプログラムを用いて決定できる（Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402）。次の文献（それぞれ本明細書の一部を構成する）は２つのタンパク質のアミノ酸残基の同一性または相同性の比較のためのアルゴリズムを提供し、あるいはまたはそれに加えて、これらの文献における教示は相同性または同一性％を決定するために用いることができる：Needleman S B and Wunsch C D, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453（1970）; Smith T F and Waterman M S, "Comparison of Bio-sequences," Advances in Applied Mathematics 2:482-489（1981）; Smith T F, Waterman M S and Sadler J R, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11:2205-2220（1983）; Feng D F and Dolittle R F, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Mol. Evol., 25:351-360（1987）; Higgins D G and Sharp P M, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS, 5:151-153（1989）; Thompson J D, Higgins D G and Gibson T J, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res., 22:4673-480（1994）; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids Res., 12: 387-395（1984）。
【００３７】
長さで少なくとも約１２のヌクレオチド配列、例えば少なくとも約１５，約１８，約２１，約２４，または約２７のヌクレオチド、例えば少なくとも約３０，約３３，約３６，約３９，約４２のヌクレオチド、例えば少なくとも約１２のヌクレオチド、例えば約１２−約３０，約１２−約５０、約１２−約６０，約１２−約７５，または約１２−約１００またはそれ以上ヌクレオチドを含む開示された核酸配列またはその部分若しくは断片は、プローブまたはプライマーとしてハイブリダイゼーションに使用可能である。本発明はさらにそのような核酸分子を含むおよび／または発現する微生物、ベクターまたはプラスミドを更に包含する。それ故に、核酸分子はエピトープまたはエピトープ領域、または配列により発現されるポリペプチドに機能的に均等なポリペプチドをコードでき、インビトロまたはインビボにおける発現のため、定義された遺伝子またはその同族体を増幅し、検出するための核酸分子の使用、および新しい組成物におけるそのようなベクターの使用を含む。
【００３８】
勿論ハイブリダイゼーションのために用いる核酸は放射性、または他の検出可能なマーカーを導入または付着させることにより便利に標識できる。そのようなマーカーは当業者によく知られている。該核酸分子の標識は従来の方法により行うことができる。プロモーターの調節下のプロモーターまたは遺伝子の存在または発現は、対応する核酸配列のどちらかに特異的にハイブリダイズするプライマーペアを用いることによって、および標準的な方法にしたがってポリメラーゼチェイン反応（PCR）を行うことによってモニターできる。プローブまたはプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で好ましくは生ずる。プローブまたはプライマーは、それに独特な定義された核酸分子における、少なくとも８，好ましくは少なくとも１０，より好ましくは少なくとも１２，１３，１４，または１５，例えば少なくとも２０，少なくとも２３または２５，例えば少なくとも２７または３０ヌクレオチドのいずれかの長さである。ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションプライマーまたはプローブおよびその最適の長さに関しては、Kajimura et al., GATA 7（4）:71-79（1990）を参照。本明細書の一部を構成する。
【００３９】
更に、本発明によるプロモーターの調節下における核酸分子の発現は、試料または標本中のタンパク質（またはその抗原）の存在または不存在を検出するのに用いることができる抗体を作るのに有用であり；または発現したポリペプチドは試料または標本中のタンパク質に対する抗体の存在または不存在を検出するのに用いることができる。従って、核酸分子およびその発現生成物は診断的有用性を有する
【００４０】
「ポリペプチド」とは、長さ、または翻訳後修飾（グリコシル化またはホスホリル化）に関係なく、アミノ酸の鎖を意味する。
【００４１】
「実質的に同一」とは、対照アミノ酸または核酸に対して、少なくとも５０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％の相同性を示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは、一般に少なくとも１６のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５のアミノ酸、最も好ましくは３５のアミノ酸である。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５のヌクレオチド、最も好ましくは１１０のヌクレオチドである。
【００４２】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウエア（Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）を用いて測定する。そのようなソフトウエアは、様々な置換、欠失、置換および他の修飾に対する相同性の程度を割り当てることにより類似の配列をマッチさせる。同類的置換は典型的には次のグループ：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン；内部の置換を含む。
【００４３】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然に付随する成分から分離されていることをいう。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に伴うタンパク質および天然に存在する有機物質から少なくとも６０重量％である時、実質的に純粋であるという。好ましくは製品は少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、もっとも好ましくは少なくとも９９重量％である。実質的に純粋なポリペプチドは、例えば、天然源（細胞等の）からの抽出により、ポリペプチドをコードする組み替え核酸の発現により、または化学的にタンパク質を合成することにより得られ得る。純度はカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に記載されたもののような適当な方法により、またはＨＰＬＣ分析により測定できる
【００４４】
タンパク質はその天然の状態でそれに伴う汚染物質から分離されている場合天然に伴う成分を実質的に含まない。従って化学的に合成された、またはそれが天然に生ずる細胞とは異なった細胞系で製造されたタンパク質はその天然に伴う成分を実質的に有さないであろう。従って実質的に純粋なポリペプチドはＥ．ｃｏｌｉまたは他の原核生物で合成されたものを除く真核生物に由来するものを含む。
【００４５】
「実質的に純粋なＤＮＡ」とは、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まないことを意味する。従ってその語は、例えばベクターに；自動的に複製するプラスミドまたはウイルスに；または原核または真核生物のゲノムＤＮＡに導入され、他の配列から独立の別の分子（ｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により製造されたゲノム若しくはｃＤＮＡ断片）として存在する組み替えＤＮＡを含む。それは付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡを含む。
【００４６】
「形質転換された細胞」とは、組み替えＤＮＡ技術により本発明によるプロモーターの調節の下にあるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が導入された（またはその先祖）細胞を意味する。
【００４７】
「発現にために配置されている」とは、ＤＮＡ分子が配列の転写と翻訳を駆動する（即ち、組換えタンパク質またはＲＮＡ分子の製造を促進する）プロモーターを定義するＤＮＡ配列に隣接して配置されることを意味する。
【００４８】
「レポーター遺伝子」とは、その発現は分析しうる遺伝子を意味する。そのような遺伝子は限定するものではないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、およびβ−ガラクトシダーゼを含む。
【００４９】
「プロモーター」とは、転写を指揮するに十分な最小の配列を意味する。本発明では、プロモーター依存性の遺伝子発現を細胞タイプ特異的に、組織特異的に、外部シグナルまたは薬剤により誘導可能的に、調節可能にするに十分なプロモーター要素をも含む。そのような因子は天然の遺伝子の５’または３’領域に位置する。
【００５０】
「作動可能に結合する」とは遺伝子および制御配列が、適当な分子（転写活性因子タンパク質）が制御配列に結合したとき、遺伝子発現を可能にする方法で結合していることをいう。
【００５１】
「植物細胞」とは、半透性の膜により境界づけられ、プラスチドを含む自己増殖性の細胞を意味する。そのような細胞はさらなる増殖が望ましいならば細胞壁をも必要とする。本発明に含まれる植物細胞は限定するものではないが藻類、シアノバクテリア、種子懸濁液培養物、胚嚢、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む。
【００５２】
「トランスジーン」とは、細胞に挿入され、細胞から発達する生物のゲノムの部分となるＤＮＡ片である。そのようなトランスジーンはトランスジェニック生物に部分的にまたは完全に異種の（即ち外来の）であるか、生物の内因性の遺伝子にホモロガスである遺伝子である。
【００５３】
「トランスジェニック」とは、細胞に挿入され、その細胞から発達する生物のゲノムの部分となるＤＮＡ配列を含むいずれかの細胞である。本明細書で用いる場合、トランスジェニック生物は一般的にトランスジェニック真菌であり、ＤＮＡ（トランスジーン）は核または色素体ゲノムに挿入される。
【００５４】
「保存された領域」とは２つまたはより多いｈｅｘ１ファミリーのメンバーの間で少なくとも３０％、好ましくは５０％、もっとも好ましくは７０％のアミノ酸配列同一性を示す６以上の隣接するアミノ酸の広がりを意味する。
【００５５】
「検出可能に標識された」とは分子、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、遺伝子またはその断片、またはｃＤＮＡ分子の存在に印をつけ、同定することをいう。検出可能に標識する方法は当業界でよく知られ、限定するものではないが、放射性標識（３２Ｐまたは３５Ｓのような同位体で）および非放射性標識（化学ルミネセンス標識または蛍光標識）を含む
【００５６】
「バイオリスチックトランスホーメーション」とは、タングステンまたは金粒子のような速度で駆動されるミクロプロジェクチルを用いて外来分子を細胞に導入する方法である。そのような速度で駆動される方法は、限定するものではないが、ヘリウム駆動、空気駆動、および火薬駆動技術を含む圧力バーストから始まる。バイオリスチックトランスホーメーションは、限定するものではないが、細胞内オルゲネラ（葉緑体およびミトコンドリア）、細菌、酵母、真菌、藻類、花粉、動物組織、植物組織（葉、苗、胚、表皮、花、分裂組織、およびね）、花粉、および培養した細胞を含む様々な細胞タイプおよび無傷の組織である。
【００５７】
「精製された抗体」とは、少なくとも６０重量％の、それが天然に会合するタンパク質および天然に存在する有機物質を含まない抗体を意味する。好ましくは製品は少なくとも７５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９９重量％の抗体である。精製抗体は例えば組換えで製造されたタンパク質または保存されたモチーフペプチドおよび標準技術を用いて、アフィニティクロマトグラフィーにより得られ得る。
【００５８】
「特異的に結合する」とは、あるタンパク質を認識し結合するが、天然にrpsタンパク質を含む試料、生物学的試料中の他の分子を実質的に認識しない抗体を意味する。
【００５９】
材料および方法
Trichoderma reeseiからのｈｅｘ１プロモーターの単離
ＨＥＸ１タンパク質は、炭素源としてセロビオース−ラクトース−大豆抽出物培地またはグルコースで増殖したTrichoderma reesei培養物から調製した細胞壁抽出物中で強く発現するタンパク質として、２次元ゲル電気泳動により同定した（Lim et al., 2001.  Proteomics 1:899-910）。真菌ｈｅｘ１遺伝子プロモーターはTrichoderma reeseiゲノムＤＮＡから染色体歩行ＰＣＲ方法（Morris et al., 1985. Appl. Environ. Microbiol. 61:2262-2269）を用いて単離した。最初に、２つのコンセンサス（コードホップ）プライマー（hex1fwd.pr：５’−ACA TCC TCC AAA ATG GGN TAY TAY GA-3’およびhex1rev.pr：５’−ACG GGG CCG CAC ATN GTY TGN AC-3'）を、HEX1ペプチド配列のアラインメントから保存されたアミノ酸配列のヌクレオチド翻訳に基づいて設計した（Lim et al., 2001.  Proteomics 1:899-910; Jedd and Chua, 2000. Nature Cell Biology 2:226-231）。ＰＣＲ増幅は次の条件を用いて行った。［１ｘ］９４℃、１０分［５ｘ］９４℃、３０秒；４０℃、３０秒；７２℃、３０秒［３５ｘ］９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２℃、３０秒。熱活性化したAmplitaq gold Polymerase（Perkin and Elmer, USA）１単位を次の成分を含む５０μｌのＰＣＲ反応に用いた。１００ｎｇのそれぞれの２つのプライマー、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１２．５ｍＭ  ｄＮＴＰおよび約１０ｎｇの標的真菌ゲノムＤＮＡ。
【００６０】
約６００ｂｐのＰＣＲ生成物を上記２つのコンセンサスプライマーから得、Macquarie  大学（オーストラリア）のABI３７７配列決定装置を用いて配列決定した。新しい５’−および３’−染色体歩行プライマーを６００ｂｐのｈｅｘ１配列にもとづいて設計し、ＰＣＲ反応に用いてオーバーラップしたｈｅｘ１遺伝子断片を得た。更なるプライマーを設計し、用いて、すべてのｈｅｘ１遺伝子コード領域そしてまた十分なプロモーターおよびターミネーター領域ＤＮＡ断片が増幅され配列決定されるまで、上流および下流ＦＮＡ断片を得た。T.reeseiゲノムＤＮＡリンカーライブラリーをMorris et al., 1985. Appl. Environ. Microbiol. 61:2262-2269に記載のように最初に調製した後、ゲノム歩行PCR反応の前方または逆の染色体歩行プライマーの適当なリンカープライマーとの組み合わせを用いて行った。PCR条件は以下のようである：［１ｘ］９４℃、１０分［４０ｘ］９４℃、３０秒；６０−６５℃、３０秒；７２℃、４−５分。上に記載したPCR成分を染色体歩行PCR反応にも用いた。
【００６１】
ＨＥＸ１タンパク質配列は糸状菌で高度に保存されており、Trichodermaについて記載したのと類似した方法を用いて、他の糸状菌（本明細書に挙げたような）からｈｅｘ１遺伝子のプロモーターの単離を可能にする
【００６２】
他の遺伝子からのプロモーターが本発明に従った方法を用いて検出できることはこの実施例から理解されるであろう。Ｔ．reesei  のｈｅｘ１遺伝子を得るために考案されたプライマーを用いて、本発明者はOphiostoma floccosumからのｈｅｘ１遺伝子が約７４７ｂｐのコンセンサスＤＮＡ領域を有することを決定した、O. floccosumについてのゲノムＤＮＡを得たので、この生物からＨｅｘ１プロモーターを単離することが可能である。
【００６３】
遺伝子発現および生成物分泌のためのプラスミドの構築
プラスミドはｈｅｘ１プロモーターの下にいずれかの選択された遺伝子または核酸の発現のために構築できる。単離されたｈｅｘ１プロモーターの下に目的の特定の遺伝子をクローニングするために、マルチクローニングサイトが付加されるであろう。そのベクターは発現宿主中で機能する適当な選択マーカーをも含むであろう。ｈｅｘ１についての十分なフランキングＤＮＡ断片を含め、適用可能なら相同のゲノム座での組込みを促進する。唯一の制限部位を導入し、ｐＵＣ１９ベクター部分の除去を行った後、リニアーな発現ＤＮＡ断片を単離し、真菌宿主に形質転換する。タンパク質分泌のための適当なシグナルが含まれるであろう。分泌シグナルは目的の遺伝子生成物に相同であっても、異種であってもよい。そのようなシグナルは例えば、OphiostomaプロテアーゼおよびリパーゼおよびT.reesei  cbh1をコードする遺伝子から、またはいずれかの高度に分泌した、または製造された真菌タンパク質から利用可能である。発現カセットは、シグナルペプチダーゼによりシグナルペプチドを正しく解裂させるための配列を有し、培地の外側に目的のタンパク質を分泌させる結果となる。形質転換後、生じた形質転換体はスクリーニングされて高収率の目的の遺伝子生成物を製造する形質転換体を単離し、詳細に分析する。そのようなスクリーニングは当業界で知られたルーチンな試験であることは理解されるであろう。
【００６４】
ｈｅｘ１プロモーターの下での異種のＤｓＲｅｄ１−Ｅ５タンパク質の発現
クローン化されたｈｅｘ１プロモーターをＤｓＲｅｄ１−Ｅ５（Clontech）をコードする遺伝子に結合する。これはｈｅｘ１プロモーターの下に発現する異種のタンパク質の例を提供し、例えば異なった増殖培地（例えばグルコース、ラクトース、セルロース）でのｈｅｘ１プロモーターの機能を更に試験するのに適用できる。ＤｓＲｅｄ１−Ｅ５は、その蛍光強度を増加させ、タンパク質が成熟するにつれその蛍光を緑から赤に変化させる赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ１（Terskikh et al., 2000. Science 290:1585-1588）の変異体である。形質転換体により示される蛍光のレベルまたは強度は分泌されたＤｓＲｅｄ１−Ｅ５タンパク質の量の良い指標を与える。培養上澄はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで更に分析されるであろう。レポーターとしてＤｓＲｅｄ１−Ｅ５を使用することは異なったプロモーターの比較を可能にする。最後に、宿主中で発現させようと意図する問題の遺伝子を図１に示すようにＤｓＲｅｄ１−Ｅ５との融合タンパク質として発現させることができる。
【００６５】
図１は、ｈｅｘ１プロモーターを用いる遺伝子発現カッセトを示す。カセット中のＤＮＡ断片は、E.coli中での複製のためのキャリアーとしてプラスミドｐUC19を用いて構築する。Ａ．シグナル発現に結合または融合した目的の遺伝子を有する基礎の発現ベクター。
Ｂ．レポーター遺伝子として蛍光性のｄｓＲｅｄ１−Ｅ５を用いたｈｅｘ１遺伝子プロモーター強度を試験するための発現ベクター。
Ｃ．形質転換マーカーに結合または融合した目的の遺伝子を有する発現ベクター。強調された特徴はＰにより示されるｈｅｘ１遺伝子プロモーター、分泌シグナル配列、ＳＳ、タンパク質分解のＫｅｘ２様解裂部位、ＲＱ，選択可能なマーカー遺伝子、Ｍ（例えば蛍光性または抗生物質）およびｈｅｘ１遺伝子ターミネータＴを含む。制限酵素部位はＸにより示される
【００６６】
ｈｅｘ１遺伝子およびそのプロモーターのキャラクタリゼーション
染色体歩行ＰＣＲを用いてTrichoderma reeseiから単離された、５’および３’フランキング領域を有するｈｅｘ１遺伝子配列を図３に示す。６つの可能なオープンリーディングフレームにおける４３７６ｂｐのヌクレオチド配列のアミノ酸翻訳は、位置２４７９でメチオニン（ＡＴＧ）で出発し位置３２６２で終止コドン（ＴＡＡ）で終わるＨＥＸ１に対応する７８４ｂｐのオープンリーディングフレームを明らかにした。短いイントロン配列が位置２５０３および２６１２の間に存在し、予想されたコンセンサススプライシング配列によく対応する（例えば、Ballance, D.J., 1986.  Yeast 2:229-236）。プロモーター領域（図３）の詳細な分析はＡＴＧの上流に明瞭なＴＡＴＡ様ボックスを示さなかった。また原核様シャイン・ダルガルノ配列（5'-AGGAGGACAGCUAUG-3）も検出できない。しかしながら、開始ＡＴＧのすぐ上流でそれを含み位置するリボソーム結合部位は、コザック配列（5'-A/GCCACCAUGG-3'）ともよばれる真核の開始部位についてのコンセンサスに適合する。
【００６７】
図３は、Trichoderma reesei hex1遺伝子配列の「PUBLISH」（GCG, Wisconsin Package Version 8.1）フォーマットである。太字および下線で強調したのはｍＲＮＡ翻訳を指示するリボソーム結合部位に重要な、可能性あるコザック配列である（Kozak, M. 1987. Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148）。短いイントロンは下の場合に示す。２つのコンセンサス（コードホップ）プライマー（hex1fwd および hex1rev）を矢印で強調する。
【００６８】
ｈｅｘ１遺伝子ターミネーター領域（位置３２６３−４３７６）の分析は数個の完全な逆さの繰り返し（パリンドローム）配列を示し、その配列はループを形成し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがさらに転写することを止める（例えば、Lewin, B., Genes V, Oxford University Press, 1994）。１つの例は位置３２７６−３７２０に見出される-GGGGTAC-の完全なパリンドローム配列を有する配列-CCCCATG-（位置 3368 − 3374）である（図３）
【００６９】
多くのよく保存されたアミノ酸であることを証明する多くの生物からのＨＥＸ−１ペプチド配列のアライメントを行なった。タンパク質レベルにおけるこの相同性は染色体歩行ＰＣＲにより多くの糸状菌からのｈｅｘ１プロモーターの単離を可能にする。
【００７０】
詳細なペプチド分析はT.reeseiからのＨＥＸ１が長さで２２５のアミノ酸、予期される分子量２５２０７，等電点７．０９を有することを示した。高度のアミノ酸相同性がT.reeseiからのＨＥＸ１とｇｅｎｂａｎｋ  データベースに提出された他のものの間に見出された。
【００７１】
図２はTrichoderma reeseiからのＨＥＸ１タンパク質のプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
【００７２】
Ophiostoma floccosumからのｈｅｘ１遺伝子コンセンサスＤＮＡ断片の単離
７４７ｂｐのＤＮＡ断片をOphiostoma floccosumから２つのコンセンサス（コードホッポプライマー（ｈｅｘ１ｆｗｄ．ｐｒ：５’−ＡＣＡ ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＧＮ ＴＡＹ ＴＡＹ ＧＡ−３’およびｈｅｘ１ｒｅｖ．ｐｒ：５’−ＡＣＧ ＧＧＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＡＴＮ ＧＴＹ ＴＧＮ ＡＣ−３’）を用いて、Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いるＰＣＲ増幅反応で増幅した。用いたＰＣＲ条件は［１ｘ］９５℃，１５分［５ｘ］９５℃，３０秒；４０℃，３０秒；７２℃，３０秒［３５ｘ］９５℃，０  秒；５０℃，３０秒；７２℃，３０秒であった。５０μｌのＰＣＲ反応物は０．２５単位のポリメラーゼおよび１００ｎｇのそれぞれの２つのプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， １２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび約１０ ｎｇの標的O. floccosum ゲノム ＤＮＡを含んだ。  その  ７４７  ｂｐ  ＤＮＡ  断片をゲル精製し（QIAGEN, Germany）、Macquarie University, Australia でABI 377配列決定装置を用いて配列決定した。
【００７３】
全ＲＮＡ単離およびｍＲＮＡノーザン分析
Trizol 法（Invitrogen, USA） を用いて、炭素源として2 % glucose そして１％セロビオーズ、１％ラクトースおよび３％大豆加水分解物を補った最小また培地（Pentill  et al., 1987. Gene. 61: 155-164）で培養した培養物から除去した菌糸体から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをグルオキザールおよびジメチルスリホオキサイドを用いてSambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratories Press, NYに記載のように変性し、電気泳動した。電気泳動の後、製造者の指示に従ってBiorad バキュムブロッター（BioRad, USA）を用いてHybond正荷電膜（Roche, Germany）上にＲＮＡを移した。
【００７４】
ＤＮＡ ハイブリダイゼーションプローブをPCR DIG 標識混合物（Roche, Germany）を用いてPCRにより作った。240 bpのDsRed1-E5 ＤＮＡプローブの増幅用プライマーはdsredprobe.fwdpr: 5'- CCA CCG AGC GCC TGT ACC -3'  dsredprobe.revpr: 5'- CTA CAG GAA CAG GTG GTG -3'であった。 615 bp のhex1 ＤＮＡ プローブはプライマー hexprobe2.fwdpr: 5'- CCT CAA GCA CGG CGT CGC C -3' 及び hexprobe2.revpr: 5'- CCT TCA TCT CAA CAG CGA GC -3'を用いてPCR生成させた。PCR 条件は以下のようである、 [1x] 94 ℃, 10 分 [35x] 94℃, 30 秒; 50 ℃ 30 秒; 72 ℃ 30 秒 [1x] 72 ℃, ５分。１単位の熱活性化 Amplitaq Gold Polymerase（Perkin and Elmer, USA）を次の成分を含む50 μｌ PCRの反応物で用いた: 約10 ng の標的ＤＮＡ, 100 ng のそれぞれの２つのプライマー, 3 mM MgCl2, 1x DIG 標識 dNTP's。核酸のための DIG Luminescent Detection Kit （Roche, Germany） を用いて製造者により提供されたプロトコールに従って遺伝子特異的なｍＲＮＡを検出した。２つの遺伝子ＤＮＡプローブと１晩のハイブリダイゼーションを、DsRed1-E5メッセージの検出のために55℃の温度で、hexlについて60℃で行った。
【００７５】
要約
一般に目的の相同のおよび異種の遺伝子生成物の発現のために用いることができる有効な真菌プロモーターの欠点がある。組み替え発現に用いる遺伝子プロモーターは２つの範疇、誘導的および構成的、に大まかに分けることができる。炭素カタボライト抑制により制御される最強の誘導性プロモーターにはA.niger var.awamoriグルコアミラーゼAプロモーター（glaA）（Ward, M. et al., 1990.  Bio/Technology 8:435-440）およびT. reeseiセロビオヒドロラーゼ１（cbh1） プロモーター（Ilm駭, M. et al., 1996.  Mol. Gen. Genet. 251, 451-460）がある。真菌種で用いられる構成的プロモーターはA. nidulans グルセルアルデヒド-3-ホスフェート デハイドロゲナーゼ gpdA（Punt et al. 1991. J Biotechnol 17:19-34）がある。現在までcbh1およびglaAに対して強さで匹敵する天然の構成的な、または炭素カタボライト抑制非感受性プロモーターは報告されていない。
【００７６】
本発明は、２−Dプロテオミックディスプレイを用いてカタボライト抑制を媒介するグルコース培地などの特定の環境下に高度に機能的であるT. reesei  hex1プロモーター等のプロモーターを同定することができることを示した。hex1遺伝子プロモーターはcbh1の誘導を促進する条件下も機能的である（グルコースおよびCLSのhex1発現を示す図４および図５を参照）。更に、異種の遺伝子の発現におけるhex1プロモーターの用途を証明するために、本発明者はhex1プロモーター下でイソギンチャクからDsRed-51の発現を示した（図５）。要約すると、hex1プロモーターは遺伝子発現の用途の広い選択を提供し、真菌発現システムの適合性に寄与する。本発明によるプロモーター単離の２−D戦略は、目的の特定の遺伝子の製造に有益であるいずれの真菌（またはいずれの他の生物）およびいずれの培養条件にも適用できる
【００７７】
多くの変形および修飾が、広く記載した本発明の精神または範囲から離れることなく特定の態様で示した発明に加えられ得ることが理解されるであろう。従って、本態様はすべての点で説明的であり、制限的でないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はhex-1プロモーターを用いる遺伝子発現カセットを示す。カセット中のＤＮＡ断片はE.coli中での複製のキャリアーとしてプラスミドｐUC19を用いて構築する。A.シグナル配列と結合または融合した目的の遺伝子を有する発現ベクター。B.リポーター遺伝子として蛍光性dsRed1-E5を用いてhex1遺伝子プロモーターの強度を試験するための発現ベクター。C.形質転換マーカーに結合または融合した問題の遺伝子を有する発現ベクター。強調する特徴は、Pにより示されるhex1遺伝子プロモーター、分泌シグナル配列SS、タンパク質分解解裂部位RQ,選択可能なマーカ遺伝子M（例えば蛍光または抗生物質），およびＴにより示されるhex1遺伝子ターミネータ。  制限酵素の位置はXにより示した。
【図２】図２はTrichoderma resseiから単離された本発明によるhex1プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号１）。
【図３】図３はTrichoderma reesei hex1遺伝子配列のPUBLISH' フォーマット（GCG, Wisconsin Package Version 8.1）を示す。太字および下線で強調したのはmRNA翻訳を指揮するリボソーム結合部位に重要な可能性のあるコザック配列である（Kozak, M. 1987. Nucleic Acids Res. 15: 8125-8148）。短いイントロン配列を下の場合に示した。２つのコンセンサス（コードアップ）プライマー（hex1fwd and hex1rev）は矢印で強調した。（配列番号２はＤＮＡ配列であり、配列番号２はアミノ酸配列である。
【図４】図４はhex1プロモーター下の異種の遺伝子の発現を示すノーザンブロットである。ノーザンブロットをDsRed1-E5 ＤＮＡでプローブした。A,非形質転換体；T,T. reesei hex1プロモーター下のDsRed1-E5遺伝子を含む形質転換体。
【図５】図５はいろいろな培地中でのhex-1の発現のノーザンブロットを示す。ノーザンブロッはhex-1でプローブした。A,非形質転換体、T1およびT24, hex-1プロモーター下でのDsRed1-E5を含む形質転換体。培養はCLSまたはグルコース（GLU）培地で増殖させた。
【配列表】
2005511082.tif 000002
2005511082.tif 000003
2005511082.tif 000004
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2005511082.tif 000010
2005511082.tif 000011
2005511082.tif 000012
【図１】
2005511082.tif 000013
【図２】
2005511082.tif 000014
【図２Ｂ】
2005511082.tif 000015
【図２Ｃ】
2005511082.tif 000016
【図３】
2005511082.tif 000017
【図３Ｂ】
2005511082.tif 000018
【図３Ｃ】
2005511082.tif 000019
【図３Ｄ】
2005511082.tif 000020
【図３Ｅ】
2005511082.tif 000021
【図４】
2005511082.tif 000022
【図５】
2005511082.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月11日(2004.2.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物体からの遺伝子のプロモーターを検出し、または得る方法であって、その方法は：
（ａ）所望の条件で生物により製造される１以上のタンパク質を得；
（ｂ）タンパク質についてのアミノ酸配列のデータを得；
（ｃ）そのタンパク質の得られたアミノ酸配列に基づいて１以上のオリゴヌクレオチドを調製し；
（ｄ）その１以上のオリゴヌクレオチドでゲノムまたは染色体ＤＮＡを処理して、そのタンパク質およびその制御領域をコードするゲノムまたは染色体ＤＮＡを得；そして
（ｅ）得られたゲノムまたは染色体ＤＮＡの配列決定をして、そのタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターを検出し、または得る；
ことを含む方法。
【請求項２】
生物が微生物、植物または動物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が細菌、酵母および真菌よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物が糸状菌である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１以上のタンパク質の発現を誘導する所望の条件下で生物により製造されるタンパク質を分離することにより、行程（ａ）を行い、プロテオミックディスプレーを得る請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
所望の条件が栄養源若しくは基質、または環境状態の供給を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
行程（ｃ）をゲノム歩行ＰＣＲにより行う請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られる単離されたプロモーター。
【請求項９】
真菌細胞の遺伝子の転写を促進することができる真菌プロモーターである請求項８に記載のプロモーター。
【請求項１０】
糸状菌由来の単離されたｈｅｘ−１プロモーターである請求項９に記載のプロモーター。
【請求項１１】
Ophiostoma種, Trichoderma種, Aspergillus種, Penicillium種, Topylocladium種, Fusarium種, Chrysosporium種, Magnaporthe種, Neurospora種, Claviceps種, Mycosphaerella種, Collectotrichum種, Ustilago種, Podospora種, および Mucor種よりなる群から選択される真菌の種に由来する請求項１０に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１２】
Trichoderma reseiに由来する請求項１１に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１３】
図２（配列番号１）に実質的に示すヌクレオチド配列、ストリンジェント条件下に図２（配列番号１）に示す配列にハイブリダイズする配列、または真菌種における場合、遺伝子の発現を調節できる図２（配列番号１）に示す配列の機能的な部分を有する請求項１２に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１４】
図２（配列番号１）に実質的に示すヌクレオチド配列を有する請求項１３に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１５】
高ストリンジェント条件下に図２（配列番号１）に示す配列にハイブリダイズするヌクレオチド分子である請求項１３に記載のｈｅｘ１プロモーター。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれかに記載の単離されたｈｅｘ１プロモーターを含むベクターまたは形質転換された細胞。
【請求項１７】
核酸ベクター、プラスミド、およびウイルスベクターよりなる群から選択される請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
遺伝子に作動可能に結合した請求項１０〜１５のいずれかに記載の単離されたｈｅｘ１プロモーターを含む組み替えＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
遺伝子がタンパク質をコードする請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
外来性タンパク質が加水分解酵素、治療的／薬学的重要性を有する分子よりなる群から選択される請求項１９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
加水分解酵素が、フィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、β―グルカナーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼよりなる群から選択される請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
治療的／薬学的使用に適した分子が、タンパク質、抗生物質、増殖因子、増殖阻害剤、組織活性化因子よりなる群から選択される請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項１９〜２２いずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む発現システム。
【請求項２４】
Ophiostoma 種, Trichoderma 種, Aspergillus 種, Penicillium 種, Topylocladium 種., Fusarium 種, Chrysosporium 種, Magnaporthe 種, Claviceps 種, Mycosphaerella 種, Collectotrichum 種, Ustilago 種, Podospora 種, および Mucor 種よりなる群から選択される糸状菌種に由来する単離されたhex1プロモーター。
【請求項２５】
Trichoderma reeseiに由来する請求項２４に記載のhex1プロモーター。
【請求項２６】
実質的に図２（配列番号１）に示すに示すヌクレオチド配列、ストリンジェント条件下図２（配列番号１）に示すに示すヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列、または真菌種中の場合、遺伝子の発現を調節できる図２（配列番号１）に示す配列の機能的な部分を有する請求項２５に記載のhex1プロモーター。
【請求項２７】
実質的に図２（配列番号１）に示すヌクレオチド配列を有する請求項２６に記載のhex1プロモーター。
【請求項２８】
高ストリンジェント条件下に図２（配列番号１）に示す配列にハイブリダイズするヌクレオチド分子である請求項２７に記載のhex1プロモーター。
【請求項２９】
遺伝子に作動可能に結合した請求項２４〜２８のいずれかに記載の単離されたｈｅｘ１プロモーターを含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
遺伝子がタンパク質をコードする請求項２９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
タンパク質が加水分解酵素および治療的／薬学的用途の分子よりなる群から選択される請求項３０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
加水分解酵素が、フィターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、β−グルカナーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびプロテアーゼよりなる群から選択される請求項３１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
治療的／薬学的用途に適した分子が、タンパク質、抗生物質、増殖因子、増殖防止剤、組織活性化剤よりなる群から選択される請求項３１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
請求項２９〜３３のいずれかに記載のＤＮＡ構築物を含む発現システム。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月13日(2004.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005511082000001.app
【国際調査報告】
2005511082.tif 000024
2005511082.tif 000025