(57)【要約】本発明は、免疫組織化学的に染色した腫瘍試料の識別画像解析を使用して、個体における癌治療への応答を測定するまたは予測するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を評価するための方法であって、
（ａ）個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝す前に、その個体から第一組織または細胞試料を採取すること；
（ｂ）前記個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝したあと、その個体から第ニ組織または細胞試料を採取すること；
（ｃ）第一及び第二組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｄ）前記第一組織または細胞試料と第二組織または細胞試料における１つまたは複数の前記生物学的マーカーの量を比較すること；
（ｅ）第二組織試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量が第一組織試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量よりも少ないとき、前記化学療法剤または生物学的治療薬への曝露に続いて、１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化が低下するかどうかを判定すること；
を含み、その中で、化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を評価する方法。
【請求項２】
１つまたは複数の生物学的マーカーが腫瘍関連遺伝子から発現される、請求項１の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の生物学的マーカーが腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記生物学的マーカーが、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、請求項１の方法。
【請求項５】
前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法が、その１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
１つまたは複数の生物学的マーカーの量を免疫組織化学的に測定する、請求項５の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する請求項６の方法が、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、その生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して第一及び第二組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した第一及び第二組織試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度が前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する方法。
【請求項８】
画像解析を用いて光学密度を測定する、請求項７の方法。
【請求項９】
検出可能標識が色原体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）または蛍光標識試薬（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）である、請求項８の方法。
【請求項１０】
検出可能標識がＤＡＢである、請求項９の方法。
【請求項１１】
化学療法剤または生物学的治療薬がＧｌｉｖａｃ（登録商標）である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を予測するための方法であって、
（ａ）個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝す前に、その個体から組織または細胞試料を採取すること；
（ｂ）前記組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｃ）（ｂ）で定量した１つまたは複数の生物学的マーカーの量を、既知量のマーカーを発現する１つまたは複数の試料の量と比較すること；及び
（ｄ）対照試料の発現または活性化レベルと比較して１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化のレベルを測定すること；
を含み、その中で１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化レベルの低下の測定に基づいて、化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を予測する方法。
【請求項１３】
１つまたは複数の生物学的マーカーが腫瘍関連遺伝子から発現される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
１つまたは複数の生物学的マーカーが、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記生物学的マーカーが、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、請求項１２の方法。
【請求項１６】
前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法が、前記の１つまたは複数の生物学的マーカーに対して免疫特異的な、１つまたは複数の抗体を使用することを含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
１つまたは複数の生物学的マーカーの量が免疫組織化学的に測定される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法である請求項１７の方法で、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した組織または細胞試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度が前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する方法。
【請求項１９】
画像解析を用いて光学密度を測定する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
検出可能標識が色原体または蛍光標識試薬である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
検出可能標識がＤＡＢである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
化学療法剤または生物学的治療薬がＧｌｉｖａｃ（登録商標）である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
化合物を化学療法剤または生物学的治療薬として同定するための方法であって、
（ａ）第一組織または細胞試料を得ること；
（ｂ）第ニ組織または細胞試料を得ること；
（ｃ）第二組織または細胞試料を化合物に曝すこと；
（ｄ）第一組織または細胞試料と第ニ組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｅ）前記第一組織または細胞試料と第ニ組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量を比較すること；
（ｆ）第二組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量が第一組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量よりも少ないとき、前記化合物への曝露に続いて、１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化が低下するかどうかを判定すること；
を含み、その中で前記化合物を化学療法剤または生物学的治療薬として同定する方法。
【請求項２４】
１つまたは複数の生物学的マーカーが腫瘍関連遺伝子から発現される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
１つまたは複数の生物学的マーカーが、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記生物学的マーカーが、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法が、前記の１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
１つまたは複数の生物学的マーカーの量を免疫組織化学的に測定する、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する請求項２８の方法で、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して第一及び第二組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した第一及び第二組織試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度が前記１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する方法。
【請求項３０】
画像解析を用いて光学密度を測定する、請求項３１の方法。
【請求項３１】
検出可能標識が色原体または蛍光標識試薬である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
検出可能標識がＤＡＢである、請求項３１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年８月２１日に出願された米国特許仮出願番号第６０／３１４，１８８号による優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
１．技術分野
本発明は、個体において癌治療に対する応答を測定するまたは予測するための方法に関する。本発明はまた、ｃ−ｋｉｔ／ＳＣＦ／ｐＡＫＴの発現及び活性化を定量するため及び有効な抗癌性化合物を同定するために、免疫組織化学的に染色した組織生検の画像解析を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術
癌治療の第一のゴールは、正常細胞に有害な影響を及ぼすことなく、悪性細胞を選択的に死滅させること若しくは悪性細胞の制御されない増殖を阻止することである。伝統的な化学療法剤は、好ましくは正常細胞よりも悪性細胞に対してより大きな親和性を有する、若しくは悪性細胞の速い増殖速度と代謝活性に基づいて少なくとも優先的に悪性細胞に作用する、高度細胞傷害性物質である。しかし、これらの薬剤はしばしば正常細胞を損傷する。
【０００４】
一般に、抗癌薬、モノクローナル抗体、化学療法剤または化学予防剤は、癌細胞または前癌細胞の増殖停止、最終分化及び細胞死を生じさせるために使用される（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９０年、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．１：３３９〜４４；Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５〜８０；Ａｒｔｅａｇａら、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：３７５８〜６５；Ｐｉｅｔｒａｓら、１９９４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１８２９〜３８；Ｂａｃｕｓら、１９９７年、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．１９：３１６〜２８；Ｂａｃｕｓら、１９９９年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｊ．；Ｂａｓｅｌｇａら、１９９９年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  ＮＣＩ  ＥＯＲＴＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ９８；Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２６３９〜４８；ＤｉＧｉｏｖａｎｎａ，１９９９年、ＰＰＯ  Ｕｐｄａｔｅｓ：Ｐｒｉｎｃ．Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌ．１３：１〜９；Ｈｏｒｔｏｂａｇｙｉ，１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２５〜２９；Ｓｈａｋ，１９９９年、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：７１〜７７；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、１９９９年、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６：６０〜７０；Ｖｉｎｃｅｎｔら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：２３１〜３８）。薬剤が誘導する増殖停止または細胞死は、しばしばプログラム細胞死または最終分化に結びつく形態的及び生化学的変化を特徴とする（有糸分裂細胞死に相反して）。
【０００５】
化学療法剤は細胞死を引き起こすのに十分な高さの用量で投与しうるが、そのような用量は、典型的には腫瘍細胞と同様に正常細胞にも有害作用をもたらす。分化誘導薬、及び低用量の化学療法剤の使用は、しばしば細胞死よりもむしろ増殖停止を生じさせる。そのような増殖停止のあとには、アポトーシス及び細胞死が続くか、若しくはひとたび化学療法剤を中止すると増殖が継続することがある。細胞傷害性薬剤及び化学療法剤の投与または電離放射線はまた、主としてｐ５３及びｐ５３調節サイクリン依存性キナーゼ阻害因子（ｐ１６、ｐ２７及びｐ１９など）または増殖阻害因子（ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−６など）の機能に依存する状態である、一過性の増殖停止を誘導しうる。化学療法剤を取り除くと、薬剤治療を受けた細胞は最終的に再び分裂を始め、増殖し続けるかまたは死滅する。一部の薬剤処置腫瘍細胞は、長期的な増殖停止を受け、薬剤から解き放たれたときに細胞分裂を再開することができない。
【０００６】
アポトーシスは、一般に様々な生理的または病的刺激に対する積極的な自殺応答とみなされる。最近の試験は、Ｘ線照射及びいくつかの化学療法剤（例えばアルキル化剤及びトポイソメラーゼＩＩ阻害因子）を含む多様なＤＮＡ損傷剤が、アポトーシスを導く経路を開始させることを明らかにした。これらの薬剤によってアポトーシスが誘導される正確な機序はまだ不明である。しかし、癌抑制遺伝子ｐ５３の発現がこの過程に関係付けられてきた（ＫｗｏｋとＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，１９８９年、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１：１０２０〜２４；ＫｗｏｋとＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，１９９１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４９：７３〜７６；Ｌａｎｅ，１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：１５〜１６；Ｋｕｅｒｂｉｔｚら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７４９１〜９５；Ｌｕｏら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：１５９〜６１；Ｌｉｕら、１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３１〜３５；ＭｅｌｌｉｎｇｈｏｆｆとＳａｗｙｅｒｓ，２０００年、ＰＰＯ  Ｕｐｄａｔｅｓ  １４：１〜１１）。さらに、カスパーゼ（例えばカスパーゼ９またはカスパーゼ３）またはそれらのシャペロン分子（例えば熱ショックタンパク質６０）の上方調節がアポトーシスに結びついてきた。
【０００７】
細胞は、癌抑制遺伝子ＰＴＥＮなどの細胞遺伝子の欠失、活性型Ｒａｓの過剰発現、及び活性型ＰＩ３Ｋの過剰発現を含む様々な方法でアポトーシスに対して抵抗性となりうる。特定細胞タンパク質、ＡＫＴ（ｃ−ａｋｔ遺伝子のタンパク質産物）が、腫瘍形成及び薬剤耐性にとって重要な意味を持つ、細胞生存の鍵となる調節因子及びアポトーシスの阻害因子として同定された。例えば、ＰＴＥＮの喪失はＡＫＴ活性の上昇と相関する（Ｌｉら、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１９４３〜４７；Ｌｉａｗら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：６４〜６７；Ｎｅｌｅｎら、１９９７年、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３８３〜８７；ＣａｎｔｌｅｙとＮｅｅｌ，１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４２４０〜４５；Ｄａｔｔａら、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５〜２７）。さらに、アポトーシスの抑制は、腫瘍形成を促進する上でＡＫＴが有しうる唯一の機能ではない。ＡＫＴは同時に、細胞周期の進行を誘導することができる。しかし、ＡＫＴがアポトーシスを抑制しうるという所見は、癌遺伝子が、ＡＫＴを過度に活性化することによって適応細胞アポトーシスを遮断しうることを示唆する。
【０００８】
アポトーシス機構の複雑さを考慮して、ＡＫＴが細胞の生存を促進し、細胞死を阻害するために作用すると考えられるいくつかの経路が存在する。ＡＫＴは、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーの成員（細胞生存または細胞死において役割を果たすことが知られている）の発現または活性を調節することによってアポトーシスを遮断しうる。選択的に、ＡＫＴはカスパーゼファミリーのタンパク質の発現または活性、若しくは細胞死受容体経路の機能を調節しうる。ＡＫＴの調節作用は、直接機序―例えばアポトーシス機構の成分のリン酸化―または間接機序―細胞死機構の成分をコードする遺伝子の発現レベルを変化させることなどによって―を通してでありうる。最近の試験は、ＡＫＴが多部位でアポトーシスを調節することを示唆している。そのすべてが細胞死を仲介する上で重要な役割を果たす、いくつかのＡＫＴ標的が同定されており、ＢＡＤ、カスパーゼ９、フォークヘッドファミリーの転写因子及びＮＦκＢ調節因子ＩＫＫ（Ｄａｔｔａら、１９９９年、前出）が含まれる。
【０００９】
ｃ−ｋｉｔ原癌遺伝子は、それらの類似する免疫グロブリン様細胞外ドメイン及び親水性インサートによる細胞質チロシンキナーゼドメインの中断により、ＰＤＧＦ及びＣＳＦ−１についての受容体と同じクラスに位置づけられる、膜貫通チロシンキナーゼ増殖因子受容体をコードする（Ｙａｒｄｅｎら、１９８７年、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３３４１〜３３５１）。代替的に幹細胞増殖因子（「ＳＣＦ」）、マスト細胞増殖因子、ｋｉｔリガンドまたはＳｌ因子としても知られるそのリガンドは、他の増殖因子と共に、多くの造血系統の増殖と分化を支える初期造血細胞増殖因子である（同上）。
【００１０】
いくつかの小細胞肺癌細胞系及び乳癌細胞系において、ｃ−ｋｉｔとＳＣＦの同時発現が起こることが明らかにされており、自己分泌増殖刺激が非造血系腫瘍において役割を果たしうることを示唆している。自己分泌増殖はｃ−ｋｉｔとＳＣＦの同時発現を必要とする。２つの独立した試験において、ｃ−ｋｉｔのカルボキシル末端に対するポリクローナル抗血清を用いた凍結切片の免疫染色は、正常乳房管上皮細胞の均一な強い染色を明らかにした。これらの試験はまた、同じ方法を用いて、乳癌の少なくとも１０〜２０％がｃ−ｋｉｔの発現を持続することを示した。これらの試験のいずれも、しかしながら、乳癌におけるＳＣＦの発現は取り上げなかった。それ故、ｃ−ｋｉｔとＳＣＦの同時発現が一部の乳癌の増殖調節において役割を果たす可能性がある（Ｈｉｎｅｓら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，６：７６９〜７７９；Ｎａｔａｌｉら、１９９２年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５２：７１３〜７１７；Ｃｈｕｉら、１９９６年、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，７３：１２３３〜１２３６）。加えて、乳癌におけるｃ−ｋｉｔと他の増殖因子の同時発現は、ＥＧＦファミリーの増殖因子に対する高い感受性を生じさせる（Ｈｉｎｅｓら、１９９９年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ５８：１〜１０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
それ故、ＡＫＴの発現または活性化の直接または間接的な責任を担うタンパク質及びリガンドの発現と活性化の改善された検出がこの技術分野において求められている。また、ｃ−ｋｉｔの発現と活性化及びそのリガンドであるＳＣＦの発現の改善された検出も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、癌患者からの細胞及び組織試料において腫瘍形成の生物学的マーカーの発現または活性化を、同定及び検出するための試薬及び方法を提供する。ここで提供する方法は、特定治療プログラムに対する個々の癌患者の応答を予測するまたは評価するために有用であり、また有効な抗癌性化合物を同定するために有用である。
【００１３】
第一の局面では、本発明は、
（ａ）個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝す前に、その個体から第一組織または細胞試料を採取すること；
（ｂ）前記個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝したあと、その個体から第ニ組織または細胞試料を採取すること；
（ｃ）第一組織または細胞試料と第二組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｄ）前記第一組織または細胞試料における１つまたは複数の前記生物学的マーカーの量を第二組織または細胞試料における量と比較すること；
（ｅ）第二組織試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量が第一組織試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量よりも少ないとき、前記化学療法剤または生物学的治療薬への曝露に続いて、１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化が低下するかどうかを判定すること；
を含み、その中で化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を評価する、化学療法剤または化学予防剤の個体への投与に対する応答を評価するための方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは腫瘍関連遺伝子から発現される。他の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である。さらなる他の実施形態では、生物学的マーカーは、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである。一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、その１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む。他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を免疫組織化学的に測定する。
【００１５】
さらなる他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、その生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して第一及び第二組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した第一及び第二組織試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度は前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する。
【００１６】
他の実施形態では、画像解析を用いて光学密度を測定する。さらなる実施形態では、検出可能標識は色原体（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）または蛍光標識試薬（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）である。さらなる実施形態では、検出可能標識はＤＡＢである。他の実施形態では、前記薬剤はＧｌｉｖａｃ（登録商標）である。
【００１７】
第二の局面では、本発明は、
（ａ）個体を化学療法剤または生物学的治療薬に曝す前に、その個体から組織または細胞試料を採取すること；
（ｂ）前記組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｃ）（ｂ）で定量した１つまたは複数の生物学的マーカーの量を、１つまたは複数の対照試料において既知量のマーカーを発現する１つまたは複数の試料の量と比較すること；及び
（ｅ）１つまたは複数の対照試料におけるマーカーの発現または活性化レベルと比較して１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化のレベルを測定すること；
を含み、その中で１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化レベルの低下の測定に基づいて、化学療法剤または生物学的治療薬の個体への投与に対する応答を予測する、化学療法剤または化学予防剤の個体への投与に対する応答を予測するための方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは腫瘍関連遺伝子から発現される。他の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である。さらなる他の実施形態では、生物学的マーカーは、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである。一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、その１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む。他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を免疫組織化学的に測定する。
【００１９】
さらなる他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、その生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して第一及び第二組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した第一及び第二組織試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度は前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する。
【００２０】
他の実施形態では、画像解析を用いて光学密度を測定する。さらなる実施形態では、検出可能標識は色原体または蛍光標識試薬である。さらなる実施形態では、検出可能標識はＤＡＢである。他の実施形態では、前記薬剤はＧｌｉｖａｃ（登録商標）である。
【００２１】
第三の局面では、本発明は、
（ａ）第一組織または細胞試料を得ること；
（ｂ）第ニ組織または細胞試料を得ること；
（ｃ）第二組織または細胞試料を化合物に曝すこと；
（ｄ）第一組織または細胞試料と第ニ組織または細胞試料において１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出すること；
（ｅ）前記第一組織または細胞試料と第ニ組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量を比較すること；
（ｄ）（ｆ）第二組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量が第一組織または細胞試料における１つまたは複数の生物学的マーカーの量よりも少ないとき、前記化合物への曝露に続いて、１つまたは複数の生物学的マーカーの発現または活性化が低下するかどうかを判定すること；
を含み、その中で前記化合物を化学療法剤または生物学的治療薬として同定する、化合物を化学療法剤または生物学的治療薬として同定するための方法を提供する。
【００２２】
一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは腫瘍関連遺伝子から発現される。他の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーは、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分である。さらなる他の実施形態では、生物学的マーカーは、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである。一部の実施形態では、上記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、その１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む。他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を免疫組織化学的に測定する。
【００２３】
さらなる他の実施形態では、１つまたは複数の生物学的マーカーの量を検出する方法は、
（ａ）少なくとも１つの抗体が１つまたは複数の生物学的マーカーに免疫特異的であり、その生物学的マーカーがｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐＡＫＴ、またはｐｃ−ｋｉｔである、光学密度標識で検出可能に標識した１つまたは複数の抗体を使用して第一及び第二組織または細胞試料を染色すること；及び
（ｂ）（ａ）において染色した第一及び第二組織試料の光学密度を測定すること；
を含み、前記光学密度は前記の１つまたは複数の生物学的マーカーの量に対応する。
【００２４】
他の実施形態では、画像解析を用いて光学密度を測定する。さらなる実施形態では、検出可能標識は色原体または蛍光標識試薬である。さらなる実施形態では、検出可能標識はＤＡＢである。
【００２５】
本発明は、ｃ−ａｋｔ遺伝子の発現を誘導する及び／またはＡＫＴタンパク質を活性化することの直接の責任を担うタンパク質及びリガンドの発現と活性化を検出するための試薬及び方法を提供する。ｃ−ｋｉｔ原癌遺伝子及びそのリガンドである幹細胞増殖因子（「ＳＣＦ」または「ＳＣＧＦ」）が乳癌において様々な量で同時発現されること及びｃ−ｋｉｔの活性化がリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）の産生をもたらすという発見をここで開示する。
【００２６】
本発明はまた、腫瘍の治療のために、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐｃ−ｋｉｔ及びｐＡＫＴの発現及びタンパク質レベルを検出し、測定すること及びそれらの活性化状態を検出し、測定することのための診断方法を提供する。本発明は、病理学者が正常細胞を解析から除外することも可能にする、患者から採取した細胞または組織試料においてｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐｃ−ｋｉｔ及びｐＡＫＴタンパク質レベル及びそれらの活性化状態を測定するための信頼しうるアッセイを提供する。さらに、本発明は、癌患者が、ｃ−ｋｉｔシグナル伝達経路の成分を対象とした治療薬を使用する治療経過から恩恵を受けるかどうかを判定するための方法を提供する。本発明はさらに、ｃ−ｋｉｔシグナル伝達経路の成分を対象とした治療薬を使用する治療の経過を監視するための方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって同定される治療薬を提供する。
【００２７】
本発明の個々の実施形態は、一部の好ましい実施形態についての下記の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、腫瘍関連遺伝子の発現及び活性化レベルを定量的に測定するための方法を提供する。本発明は特に、個体からの細胞または組織試料において検出されるような、ヒト腫瘍細胞を含む腫瘍細胞において、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びＡＫＴによってコードされる細胞タンパク質についての発現及び活性化レベルを定量的に測定するための方法を提供する。
【００２９】
ｃ−ｋｉｔ及びそのリガンドであるＳＣＦは、乳癌及び膀胱癌において様々な量で同時発現され、ＳＣＦによるｃ−ｋｉｔ活性化に関連するその下流シグナルは、基質ＡＫＴのリン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）へのリン酸化である。本発明によれば、化学療法剤または生物学的治療薬による治療から恩恵を得ることができる患者を同定するため、そのような薬剤で治療した患者を監視するため、または化学療法剤または生物学的治療薬を同定するために、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びＡＫＴの発現と活性化を分析し、監視する。例えば、チロシンキナーゼ阻害因子を含むがこれらに限定されない化学療法剤または生物学的治療薬による治療から恩恵を得ることができる患者を同定するために、定量的画像解析を免疫組織化学と共に本発明に従って使用して、これら３つの腫瘍マーカーの発現を解析する。特定実施形態では、そのようなチロシンキナーゼ阻害因子は、ｃ−ｋｉｔキナーゼを阻害することが知られているＳＴＩ−５７１を含むが、これに限定されない。（Ｄｒｕｃｋｅｒ，２００１年、Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００１  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  ３７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，カリフォルニア州）。
【００３０】
手術処置の補助として及び手術処置後に化学療法剤治療を実施する伝統的な制癌法に対して、ネオアジュバント（または一次）化学療法は、癌患者において初期治療として薬剤を投与することから成る。そのようなアプローチの１つの利点は、３ｃｍ以上の原発腫瘍に関して、患者の大部分に対して保存的手術手技（例えば乳癌患者における定型的乳房切除術と異なって）の使用を可能にすることである。もう１つの利点は、多くの癌に関して、全症例の約３分の２において部分的及び／または完全な応答が達成されることである。最後に、患者の大部分が２〜３サイクルの化学療法治療後に応答性であるので、使用される化学療法プログラムのインビボでの効果を監視することが可能であり、これは化学療法治療に対して非応答性である癌の適時の同定のために重要である。非応答性腫瘍の適時の同定によって、臨床医は、癌患者を必要のない治療副作用に暴露することを制限し、代替治療を開始することができる。しかし、組織学的検査を含む、当技術分野において存在する方法は、そのような適時の正確な同定のためには不十分である。本発明は、より情報に富みかつ有効な治療領域を管理することができる方法を提供する。さらに、本発明は、治療計画の応答性または非応答性を評価することができ、それによって患者の化学療法剤への暴露を制限する方法を提供する。
【００３１】
癌の診断は、疾患の初期診断及びその後の治療前、治療中または治療後の疾患経過の監視の両方が、患者から切除した細胞または組織試料の組織学的検査を通して好都合に確認される。臨床病理学者は、そのような試料が良性であるかまたは悪性であるかを正確に判定し、悪性と判断された腫瘍試料の進行性を分類できることを必要とする。これらの判定がしばしば、患者の適切な治療コースを選択するための基礎となるからである。同様に、病理学者は、特に治療の結果としてまたは治療に関連して、最も殊更には化学療法剤または生物学的薬剤による治療の結果としてまたは治療に関連して、癌が増殖したまたは寛解に向かった度合を検出できることを必要とする。
【００３２】
組織学的検査は伝統的に、試料の形態的特徴を光学顕微鏡下で容易に観察することを可能にする組織染色手順が必要である。病理学者は、染色した試料を検査した後、典型的には腫瘍試料が悪性であるかどうかの定性的判定を行う。しかし、腫瘍の進行性はしばしば、試料の形態に反映されうるまたは反映されない、タンパク質の発現または抑制及びタンパク質の活性化のような腫瘍内の細胞の生化学の結果であるので、腫瘍の進行性を単に試料の組織学的検査だけを通して確認することは困難である。それ故、腫瘍試料内の細胞の生化学を評価できることが重要である。さらに、腫瘍関連遺伝子またはタンパク質の遺伝子発現とタンパク質活性化の両方を、より明細には腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分を観察し、定量できることが望ましい。
【００３３】
当技術分野において知られる自動（コンピュータ援用）画像解析システムは、試料の視覚的検査を高めることができる。代表的なシステムでは、細胞または組織試料を、特定生物学的マーカーに特異的な検出可能標識試薬に曝し、その後細胞の拡大画像を、電荷結合素子カメラ（ＣＣＤ）またはテレビカメラなどのカメラから画像を受け取るコンピュータによって処理する。そのようなシステムは、例えば、試料中のｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐｃ−ｋｉｔ、及びｐＡＫＴの発現及び活性化レベルを検出し、測定するために使用できる。この方法は、癌のより正確な診断と、組織学的に同定された癌細胞における遺伝子発現のより良好な特徴づけ、最も殊更には腫瘍マーカー遺伝子または特定の型及び亜型（すなわち種々の悪性度）の癌において発現されることが知られている遺伝子の発現に関してより良好な特性付けを提供する。この情報は、ある種の腫瘍型または亜型に対して臨床効果を有する薬剤を、細胞がそのように同定された患者に対して投与することができるので、より情報に富みかつ有効な治療法を管理することを可能にする。非制限的な一例は、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐｃ−ｋｉｔ及びｐＡＫＴに関して試験陽性である腫瘍生検または他の試験試料を有する患者へのチロシンキナーゼ阻害因子の投与である。
【００３４】
従来の抗癌治療のもう１つの欠点は、個々のヒト患者において特定の癌を治療する場合に特定の化学療法剤の効果が予測できないことである。この予測不能性の故に、当技術分野では、治療を開始する前に、１つまたはそれ以上の選択薬剤が抗癌剤として活性であるかどうかを判定すること、または個々の患者において治療経過の正確な予後を示すことができない。同じ臨床的癌が、いずれの措置が特定個人にとって最も有効であるかを評価する現行の方法がないにもかかわらず、臨床医に治療措置の選択を迫ることがあるため、これは特に重要である。個々の患者において提案されている治療薬（または薬剤の組合せ）の予想される効果をより良好に評価できることが、本発明の方法の１つの利点である。化学療法措置の効果を評価するための、特許請求されている方法のさらなる特徴は、それらが時間効果的及びコスト効果的であり、癌患者への損傷を最小限に抑えることである。
【００３５】
本発明の方法の１つの実施形態を実施する場合、ニ成分免疫組織化学的染色システムを使用する。この実施形態では、細胞ペレットまたは組織を、第一の色を生じる染料、染色剤または検出可能標識で対比染色し、一方、前記細胞ペレットまたは組織試料中の対象タンパク質を、第二の異なる色を生じる染料、染色剤または検出可能標識で染色する。次に、細胞ペレットまたは組織試料中の細胞の画像を光学顕微鏡で拡大し、別々の画像の対に分割する。各々の特異染色について最大吸収を有するように特異的に適合させた一対の光学フィルターを使用して、分割画像を増強する。光学フィルターの１つは、対比染色した組織の吸収波長の波長を有する光を選択的に透過する。他方の、好ましくは狭い帯域の光学フィルターは、対象タンパク質を検出するために使用する染料、染色剤または検出可能標識に関するスペクトル吸収の領域内の光を選択的に透過する。画像解析フィルターを使用して、細胞膜、細胞質及び核などの様々な成分中の異なる細胞タンパク質を定量することができる。最良の結果を得るためには、測定を行う前に画像システムを検定する。
【００３６】
二成分免疫組織化学的染色法を利用した本発明の方法を使用することの利点の１つは、対象タンパク質の細胞内局在を測定できることである。
【００３７】
本発明の方法のもう１つの実施形態を実施する場合、標的タンパク質特異的染色の量と度合を生物学的試料中の標的タンパク質の量に関係付ける検量線を使用して、生物学的試料中の標的タンパク質の量を定量する（すなわち、標的タンパク質の量を測定する）。これは、最も一般的には、実験試料または患者の試料を、細胞を用いて、最も好ましくは高度の正確さと精度で測定することができる一貫した量の標的タンパク質を生産する培養細胞系を用いて調製した細胞試料と比較することによって実施される。一部の好ましい実施形態では、各々異なる量の標的タンパク質を発現する複数の細胞個体群を検定して、染色強度を試料中のタンパク質の量に関係付ける検量線を作成することができる。そのような細胞個体群を使用して、異なる細胞個体群中の異なる量の標的タンパク質に結びつく標的タンパク質特異的染色の量を測定する。一部の好ましい実施形態では、細胞数の測定が実際的ではないかまたは信頼できない場合に、標的タンパク質特異的染色の量を基準化するかまたは総細胞タンパク質の量に対する比率で表わして、生物学的組織、好ましくは腫瘍組織、最も好ましくは悪性腫瘍組織を分析するために都合のよい測定値を提供する。本発明を実施する場合、標的タンパク質特異的染色と細胞内で発現される標的タンパク質の量との相関は、標的タンパク質の量を、標的タンパク質特異的染色に結びつく物理的パラメータ、最も好ましくは光学密度に関係付ける検量線として表わされる。本発明の方法に従い、本発明の方法を使用して作成される検量線はまた、アルゴリズムとして、最も好ましくは線形または対数方程式の形態で好都合に表わされ、好ましくは、例えばコンピュータなどの装置を、試料の染色強度を試料中の標的タンパク質の量に変換するようにプログラムすることによって、自動化される。
【００３８】
本発明の方法のもう１つの実施形態を実施する場合、対象タンパク質の細胞内局在を測定することができる。エストロゲン受容体などの一部のタンパク質は、活性化されるまでは細胞質内に局在し、活性化された時点で核内へと移行して、そこで、例えば遺伝子発現に関与することができるので、これは有益である。
【００３９】
組織試料の定量的免疫組織化学画像解析についての手順例の説明は、一般に、いずれも２００１年１月１２日に出願された共同係属中の米国特許出願番号第０９／７６０，１２０号及び第０９／７６０，１２１号、及び、いずれも２００１年１月１２日に出願されたＷＯ０１／５１９２４号及びＷＯ０１／５１９２８号の中に認めることができ、それらはすべて、その全体が参照してここに組み込まれる。一例として、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州より入手可能な、Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２００上で定量的画像解析を実施した。本発明に包含される定量的画像解析は、Ｃｈｒｏｍａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，カリフォルニア州）などの、但しこれに限定されない、他の販売者からのシステムでも実施することができる。
【００４０】
本発明の方法の実施において、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ、ｐｃ−ｋｉｔ及びｐＡＫＴを含むがこれらに限定されない標的タンパク質は、特異試薬、最も好ましくはそれ自体が検出可能に標識されている抗体を用いて、若しくは標識されていない標的タンパク質特異的抗体と、検出可能に標識されており、標的タンパク質特異的抗体を認識する第二抗体を使用して、検出することができる。選択的に、検出可能に標識することができ、標的タンパク質に特異的に結合するいかなる分子も、本発明の方法を実施する場合に使用できる。本発明の方法の好ましい実施形態では、染色した標的タンパク質を対比染色した組織または細胞試料からより容易に識別できるように、ニ成分免疫組織化学的染色システムを使用して、標的タンパク質と組織または細胞試料を区別して染色する。免疫組織化学的染色後、好ましくはコンピュータ援用画像解析システムによって作成した組織または細胞試料の光学画像を光学顕微鏡の下で拡大し、一対の画像に分離する。分離した画像を一対の光学フィルターを用いて増強し、それらの光学フィルターの１つは染色に対応する最大吸収を有し、他方は対比染色に対応する最大吸収を有しており、それによって２つの染色間の最適の識別が提供される。本発明の方法の他の実施形態では、複数の画像解析フィルターを使用して、様々な成分（例えば膜、細胞質及び核）において異なる細胞タンパク質の染色レベルを検出し、識別し、及び定量することができる。非制限的な例では、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて標的を染色し、エチルグリーンまたはメチレンブルーを用いて組織または細胞試料を対比染色することができる。
【００４１】
相対湿度のようなある種の環境条件における染料ロットの変動性及び変異性が、本発明の方法を用いて種々の時点で得られる結果に影響を及ぼしうることは、免疫組織化学技術分野における当業者には認識されよう。本発明の方法の一部の実施形態では、染色及び対比染色ロットの変異性は、試料細胞と第一及び第二対照細胞ペレットを染色するのに同じ試薬を使用することによって制御される。本発明の方法の他の一部の実施形態では、染色手順における環境的相違及び変異性は、同じ時点で試料細胞と第一及び第二対照細胞ペレットを染色することによって制御される。
【００４２】
一部の実施形態では、ここでは光学または蛍光顕微鏡、画像伝達カメラ（ｉｍａｇｅ−ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ  ｃａｍｅｒａ）及び映像スクリーンを含む、最も好ましくは、装置の作動を指令し、同時に、最も好ましくは染色組織標本の特定領域の光学密度の形態で、収集した情報を保存して操作するために使用できるコンピュータを同時に含むと定義される、画像解析装置を用いて標的タンパク質特異的染色を検出し、測定して、定量する。本発明の実施において有用な画像解析装置は、ＣＡＳ２００システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，カリフォルニア州）を含むが、これに限定されない。
【００４３】
一部の実施形態では、次のような画像解析ステムを使用して本発明の方法を実施する。上述したような免疫組織化学的染色後、染色試料の顕微鏡画像をデジタル化し、デジタル化画像の各々の画素（ピクセル）での光の強さの値を、染色細胞成分（例えば核）のパーセンテージに対応する光学密度値に変換することにより、発現細胞パーセンテージの数量化測定を得ることができる。より具体的には、デジタルグレースケール画像を用いて特定染色を有する細胞の量を測定するためにコンピュータ画像解析を使用することができる。グレースケール画像は、試験下にある特異的標識に結合し、それによって光学的増幅と標的の視覚化を可能にする、色原体などの光学的増強因子の量を表わす。
【００４４】
本発明の方法の実施において使用するとき、コンピュータ画像解析装置は、顕微鏡スライド上の領域から標本の細胞群の画像を拡大し、表示するためのレンズなどの手段を含む。前記標本細胞群は、酵素染色法及び化学的染色法などの、免疫組織化学技術分野において既知の染色及び対比染色手法を用いて調製する。適切な染色剤及び対比染色剤は、コンピュータ画像解析システムと共に使用するカメラを通して、細胞を識別することができる能力によって選択され、中でも特に、特異的酵素またはマーカーを含む抗体サンドイッチ複合体を含むもの及びそのような複合体を含まないものが挙げられる。染色後、画像領域を前記装置によってデジタル化し、前記システムによって提供されるメモリーに保存する。デジタル化画像から、画像を形成するための赤色波長または緑色光学フィルターなどの１つの波長の光を使用することによって核または細胞質画像マスクを形成する。組織マスクを保存し、第二フィルターを使用して、光学的増強因子と同じ領域のもう１つの濾過画像を形成する。第一画像を第二画像と比較して、光学的増強因子で染色した物質の数量化を得ること、従って試験下にある特異的標的の量の測定を得ることにより、細胞特徴の識別を行うことができる。
【００４５】
最初の段階では、標的タンパク質に特異的な検出可能標識一次抗体、または選択的に非標識一次抗体と一次抗体に特異的な検出可能標識二次抗体を加えることによって、細胞中の発現された標的タンパク質を同定する。前記抗体を、もしこれらの抗原が存在すれば複合体を形成するだけの時間、試料と共にインキュベートする。次にその複合体を、直接標識を検出することによって、若しくは検出可能標識が酵素である場合は、切片を適切な条件下に色原体などの化合物と共にインキュベートすることによって、視覚化する。一例として、一次抗体をペルオキシダーゼで標識し、その後色原体ＤＡＢを使用することができる。第二段階では、エチルグリーンなどの、但しこれに限定されない、もう１つの光学的増強因子で組織を対比染色する。ペルオキシダーゼ及びエチルグリーンを使用する染色手法は例示であるが、他の染料及び光学的増強因子も適切である。例えば、赤色を生じる３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び４−クロロ−１−ナフトールを含むがこれらに限定されない、他の色原体をペルオキシダーゼと共に使用することができる。さらに、アルカリホスファターゼを含むがこれに限定されない、一次抗体を標識するために使用できる他の酵素は、本発明に包含される。アルカリホスファターゼと共に使用できる色原体の例は、ファストレッド、ファストグリーン、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を含むが、これらに限定されない。蛍光染料の非制限的例として、フルオレセイン（フルオロイソチオシアネートまたはＦＩＴＣ）及びローダミンが使用できる。
【００４６】
さらに、エチルグリーンの使用は対比染色剤の例であるが、他の対比染色剤の使用も本発明の方法に包含される。例えば、さらなる対比染色剤の非制限的なリストは、ヘマトキシリン、ファストレッド、メチルグリーンを含む。対比染色剤は、２つの別個の波長での濾過を達成しうるように、実施しうるスペクトル分離に基づいて個々の染色に関して選択される。例えば、エチルグリーンは、下記でより詳細に述べるように、ＤＡＢ沈殿物からの良好なスペクトル分離を提供する。良好なスペクトル分離を提供する染色剤／対比染色剤の対の他の例は、ファストレッドとヘマトキシリン、ＡＥＣとヘマトキシリン、及びＦＩＴＣとテキサスレッドを含むが、これらに限定されない。当業者は、染色剤と対比染色剤のこのリストが単なる例示であり、それ故、本発明を限定する働きをしないことを認識するであろう。
【００４７】
本発明の方法の実施形態の一例として、スペクトル試験は、エチルグリーン染色が、免疫ペルオキシダーゼによって生成されたＤＡＢ沈殿物からの良好なスペクトル分離を提供し、２つの異なる波長で画像を濾過することによって画像の異なる特徴を容易に分離できることを示した。これは、画像を２つの別々の画像にデジタル化すること、例えば、１つはすべての核が光学的に増強されている画像（例えば、エチルグリーンまたはファストグリーンを用いて）、及び１つは受容体染色（ＤＡＢ）を有する組織領域だけが光学的に増強されている画像へとデジタル化することを可能にする。その結果得られる、エチルグリーンで染色された組織標本は、マーカータンパク質の発現レベルに比例して、細胞質または核に局在する様々な度合の褐色ＤＡＢ沈殿物と共に緑色の核を有するであろう。ペルオキシダーゼとエチルグリーンを用いた染色手法を述べるが、他の染色剤及び光学的増強因子も適切である（ファストレッドまたはファストグリーン対比染色剤などの特異的色原体と組み合わせたアルカリホスファターゼなど）。スペクトル試験は、エチルグリーンが免疫ペルオキシダーゼ手法のＤＡＢ沈殿物からの良好なスペクトル分離を提供し、その結果２つの異なる波長での濾過が画像の異なる特徴を容易に分離できることを示した。これは、画像を２つの別々の画像、すなわち１つはすべての細胞核が光学的に増強されている画像であり（エチルグリーンまたはファストグリーン）、１つは受容体染色（ＤＡＢ）を有する組織領域だけが光学的に増強されている画像へとデジタル化することを可能にする。特定実施形態では、対比染色領域の画像を作製するための６００ナノメートル（レッド）フィルター及びＤＡＢ沈殿物で染色されている組織領域の画像を作製するための５００ナノメートル（グリーン）フィルターによって画像を分離することができる。
【００４８】
染色領域をさらに識別するために、画像を視覚化するオペレーターが、検討下にある領域に関して境界を設定することができる、相互作用閾値設定手法（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｅｔｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が使用できる。そのような境界を設定するとき、光学密度の閾値以下である画像のすべての部分を排除することによって画像が形成される。ここに含まれる教示に従って実施されるように、第一画像に関して閾値を好都合に設定し、第二画像について第二の閾値を設定する。
【００４９】
さらに、好ましくは本発明の画像解析システムを用いて実施される画像処理方法は、最初に、例えばレッドフィルターで検討下の組織のマスク画像を形成することを含む。このマスク画像を、好ましくはシステムのコンピュータメモリーに保存し、発現タンパク質定量についてのもう１つの画像を、例えば同じ画像のグリーンで濾過したバージョンを使用することによって獲得する。組合せフィルターの効果は、組織成分がＤＡＢで染色されている組織マスクの領域を光学的に増強すること（すなわちより濃くすること）及びグリーン対比染色剤でのみ染色された組織成分をより明るくすることである。その後、染色されている、マスク内にある画像の領域だけを使用して画像解析を実施することができる。
【００５０】
レッドとグリーンの光学フィルター及びＤＡＢとエチルグリーンまたは他のグリーン対比染色剤の組合せは、本発明の方法の実施において好都合に使用される。この組合せは、２つの対比染色領域を識別するための便利で好都合な方法を提供する。当業者は、ファストグリーン、エオシンなどの、ある特定領域を光学的に増強するためまたはもう１つ別の細胞特徴に比べて際立たせるために使用できる多数の他の染色剤、フィルター、染色法または光学的増強法及び濾過方法が存在することを認識するであろう。
【００５１】
例えば、腫瘍関連遺伝子から発現されるタンパク質の発現と活性化を、本発明の方法を用いて検出し、定量することができる。さらに、腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分であるタンパク質の発現と活性化を、本発明の方法を用いて検出し、定量することができる。さらに、乳癌に結びつくタンパク質を、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、ｐ−Ｈｅｒ−１、ｐ−Ｈｅｒ−２、ｐ−ＥＲＫ、ｃ−ｋｉｔ、ｐ−ＡＫＴ、またはＳＣＦ、若しくはそれらのリン酸化形態に対する適切な一次抗体、及び二次抗体（マウス一次抗体を使用するときはウサギ抗マウスＩｇＧなど）及び／または三次アビジン（またはストレプトアビジン）ビオチン複合体（「ＡＢＣ」）を使用した画像解析によって定量することができる。試薬の例は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州、カタログ番号９２７７）から入手される、ｐＡＫＴに特異的なウサギポリクローナル抗体；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州、カタログ番号ＳＣ−９１３２）から入手される抗ＳＣＦ抗体；及びＮｅｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，カリフォルニア州、カタログ番号ＲＢ−１５１８）から入手されるポリクローナル抗ｃ−ｋｉｔ抗体を含む。
【００５２】
本発明の方法を実施する場合、染色手順は検査室の技術者によって実施されうる。選択的に、染色手順は自動化システムを使用して実施されうる。
【００５３】
次に、染色された抗原の平均光学密度によって標的タンパク質の量を定量することができる。また、染色された総組織面積の割合またはパーセンテージを、第二画像において抗体閾値レベル以上に染色された面積として、容易に算定しうる。ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴを含む核を視覚化した後、治療後の患者に由来する組織におけるそのような細胞のパーセンテージまたは量を、未処置組織におけるそのような細胞のパーセンテージまたは量と比較することができる。
【００５４】
これらの比較から、腫瘍に対する推定上の治療薬または化学的予防剤の潜在的有効性を判定することができる。特に、試料の未処置部分において腫瘍関連遺伝子から発現されるタンパク質の発現及び活性化の量が試料の処置部分におけるよりも大きい場合は、処置に使用した治療薬が癌を治療するために有効な薬剤であることが予測される。さらに、試料の未処置部分において腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分であるタンパク質の発現及び活性化の量が試料の処置部分におけるよりも大きい場合は、処置に使用した治療薬が癌を治療するために有効な薬剤であることが予測される。さらに、試料の未処置部分においてｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴの発現及び活性化の量が試料の処置部分におけるよりも大きい場合は、処置に使用した治療薬が癌を治療するために有効な薬剤であることが予測される。逆に、試料の処置部分と未処置部分においてｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴを発現する細胞のパーセンテージが実質的に等しい場合、若しくは試料の未処置部分においてタンパク質発現がより少ない場合、推定上の治療薬は癌の治療のために有効ではないと予測される。例えば、この手順を使用して、ｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ阻害因子であるＮｏｖａｒｔｉｓの薬剤ＳＴＩ−５７１（ＧＬＩＶＥＣ（登録商標））が癌試料を治療するために潜在的に有効な薬剤であると予測されることを確認できる。
【００５５】
実施例１〜７を参照することにより、本発明の特に有用な実施形態及びその利点を罹患することができる。これらの実施例は、本発明の具体的な実施形態、及びそれらの様々な使用の例示である。それらは説明のためにのみ提示するものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００５６】
ｃ−ｋｉｔについての染色手順
ｃ−ｋｉｔに対するポリクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，カリフォルニア州）を使用して、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（登録商標）自動染色モジュール（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，アリゾナ州）でｃ−ｋｉｔについての染色を実施した。試料の１０％中性緩衝ホルマリン固定４ミクロンパラフィン切片を被覆スライド上に置いた。ｃ−ｋｉｔ染色プロトコールに特異的なＢｅｎｃｈｍａｒｋバーコードをスライド上に置き、そのスライドをＢｅｎｃｈｍａｒｋ上に置いた。その後のすべての段階、すなわち乾燥、脱パラフィン化、抗原回収（細胞順化、ＥＤＴＡ  １ｍＭ）、及び検出は、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋによって自動的に実施された。すべての試験試薬は、特に異なる記載がない限り、Ｉ−Ｖｉｅｗ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを含めて、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手可能である。自動システムを使用する際に実施したプロトコールを表１に示す。１滴と記載されている場合は、１つの試薬の配薬である。その後、試料を手操作により、４％エチルグリーン０．１Ｍ  ｐＨ４酢酸緩衝液で１０分間対比染色した。ｃ−ｋｉｔについての染色の結果は下記の実施例５で述べる。
【００５７】
表１
【表１】
2005527781.tif 000002
【００５８】
2005527781.tif 000003
【実施例２】
【００５９】
ＳＣＦについての染色手順
ＳＣＦに対するポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州）を使用してＳＣＦ染色を実施した。ビオチニル化抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｋｅ，ペンシルヴェニア州）、「ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ−ＨＲＰ」（ストレプトアビジン／ビオチンのホースラディッシュペルオキシダーゼとの複合体）標識キット（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，カリフォルニア州）、及びＤＡＢ色原体（Ｄａｋｏ）をＳＣＦについての検出系として使用した。試料の１０％中性緩衝ホルマリン固定４ミクロンパラフィン切片を被覆スライド上に置いた。染色用の試料を調製するために、最初に試料を脱パラフィン化し、水に水和した。フィシン消化溶液、Ｄｉｇｅｓｔ−Ａｌｌ  １（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ）により、酵素的に抗原回収を実施した。前記製品の即時使用溶液１〜２滴を切片に加え、３７℃で２０分間インキュベートした。次に切片を脱イオン水で十分に洗い、ＴＢＳで洗浄した。切片を３％過酸化水素／メタノール溶液と共に１０分間インキュベートし、その後脱イオン水で洗浄することにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断した。次に０．１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ中の１０％遮断ヤギ血清を１０分間使用して切片を遮断した。その後ヤギ血清を除去した。
【００６０】
前記切片をＳＣＦ一次抗体の１：２０希釈と共に３７℃で４５分間インキュベートした。一次抗体を切片と共にインキュベートしている間に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６  １ｍｌ中のビオチン４μｌ溶液と共にストレプトアビジン溶液４μｌを加えて、ＳｔｒｅｐｔＡＢＣ標識を調製した。ＳＣＦ一次抗体のインキュベーション後、切片をＴＢＳで十分に洗い、ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧの１：３００希釈と共に３７℃で２０分間インキュベートした。切片をＴＢＳで十分に洗った後、ＳｔｒｅｐｔＡＢＣ標識と共に３７℃で２０分間インキュベートした。切片をＴＢＳで十分に洗い、ＤＡＢ液体色原体を室温で５分間適用した。次に切片を脱イオン水で十分に洗った。スライドを４％エチルグリーンで対比染色した。ＳＣＦについての染色の結果は下記の実施例５で述べる。
【実施例３】
【００６１】
ホスホ−ＡＫＴについての染色手順
Ｄａｋｏ  ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒをＬＳＡＢ２キット（上述）と共に使用して、ｐ−ＡＫＴ染色を実施した。試料の１０％中性緩衝ホルマリン固定４ミクロンパラフィン切片を被覆スライド上に置いた。染色用の試料を調製するために、最初に試料を脱パラフィン化し、水に水和した。製造者に指示に従ってＤｅｃｌｏａｋｅｒ  Ｃｈａｎｍｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｇｒｏｖｅ，カリフォルニア州）中０．１Ｍクエン酸回収緩衝液、ｐＨ６．０で抗原回収を実施した。切片を１５分間放置して冷却し、その後脱イオン水で十分に洗った。切片を３％過酸化水素／メタノール溶液と共に１０分間インキュベートし、その後脱イオン水で洗浄することにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断した。次に０．１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ中の１０％遮断ヤギ血清を１０分間使用して切片を遮断した。その後ヤギ血清を除去した。
【００６２】
次に、前記切片をｐ−ＡＫＴ一次抗体の１：７５希釈（Ｃｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌朝、切片を冷蔵庫から取り出し、約３０分間室温に置いた。スライドをＴＢＳで十分に洗い、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに充填した。Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒは、ビオチニル化リンクを３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬を３０分間、及びＤＡＢ色原体を５分間適用するようにプログラムした。抗体結合、標識及びＤＡＢ色原体適用の間にオートステイナーによってスライドをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ＤＡＢ色原体適用後、オートステイナーからスライドを取り出し、脱イオン水で十分に洗った。スライドを４％エチルグリーンで対比染色した。ＳＣＦについての染色の結果は下記の実施例５で述べる。
【実施例４】
【００６３】
ホスホ−ＫＩＴについての染色手順
ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ．より入手した試薬キット（ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識を含むＬＳＡＢ２キット（標識ストレプトアビジン−ビオチン））と共にＤａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒをと共に使用して、ｐｃ−ｋｉｔ染色を実施した。試料の１０％中性緩衝ホルマリン固定４ミクロンパラフィン切片を被覆スライド上に置いた。染色用の試料を調製するために、最初に試料を脱パラフィン化し、水に水和した。製造者の指示に従って、熱誘導エピトープ回収（ＨＩＥＲ）手順に使用できる電気圧力調理器（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｏｏｋｅｒ）、Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ  Ｃｈａｎｍｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｎｕｔ  Ｇｒｏｖｅ，カリフォルニア州）中１ｍＭ  ＥＤＴＡで抗原回収を実施した。切片を１５分間放置して冷却し、その後脱イオン水で十分に洗った。切片を３％過酸化水素／メタノール溶液と共に１０分間インキュベートし、その後脱イオン水で洗浄することにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断した。次に０．１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ中の１０％遮断ヤギ血清を１０分間使用して切片を遮断した。その後ヤギ血清を除去した。
【００６４】
次に、前記切片をｐ−ｋｉｔ（Ｔｒｙ  ７１９）一次抗体の１：５０希釈（Ｃｅｌｌ  ＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）と共に４℃で一晩インキュベートした。翌朝、切片を冷蔵庫から取り出し、約３０分間放置して室温にした。スライドをＴＢＳで十分に洗い、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに充填した。Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒは、ビオチニル化リンクを３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ試薬を３０分間、及びＤＡＢ色原体を５分間適用するようにプログラムした。抗体結合、標識及びＤＡＢ色原体適用の間にオートステイナーによってスライドをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。ＤＡＢ色原体適用後、オートステイナーからスライドを取り出し、脱イオン水で十分に洗った。スライドを４％エチルグリーンで対比染色した。その結果は、試料中のｐｃ−ｋｉｔの発現または活性化のレベルを検出することができた（データは示していない）。
【実施例５】
【００６５】
ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴについての腫瘍試料の免疫組織化学的染色
ＮｏｖａｒｔｉｓのＧｌｉｖｅｃ（登録商標）などの、ｃ−ｋｉｔ阻害因子についての候補である患者を同定するために、腫瘍試料をｃ−ｋｉｔ及びＳＣＦの発現に関して検査した。腫瘍試料のパラフィンブロックを４〜５ミクロンの切片にし、それらの切片を被覆スライド上に置いた。次にスライドをｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦまたはｐＡＫＴのいずれかについて上述したように染色した。これらの実験の結果を図１Ａから１Ｄまでに示す。これらの図は１名の個人の乳癌試料の顕微鏡写真である。２枚の顕微鏡写真（図１Ａ及び１Ｃ）はＳＣＦに対する抗体で染色した領域であり、２枚の顕微鏡写真（図１Ｂ及び１Ｄ）はｃ−ｋｉｔに対する抗体で染色した領域である。すべての写真が染色を示し、従って、同じ腫瘍がｃ−ｋｉｔとＳＣＦの両方を発現することを示している。それ故、この乳癌試料は、この患者がｃ−ｋｉｔ阻害因子についての良好な候補であると同定された。
【００６６】
ｃ−ｋｉｔ阻害因子についての候補であると判定された腫瘍試料のさらなる例として、図２Ａ〜２Ｅは、上述したように、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴに対する抗体で染色した膀胱癌試料（２Ａ、２Ｄ及び２Ｅ）または乳癌試料（２Ｂ及び２Ｃ）のいずれかを示す。図２Ｂは、ｃ−ｋｉｔについて染色した乳癌試料７４７を示す。図２Ｃは、ＳＣＦに関して染色した乳癌試料８４８を示す。図２Ｄ及び２Ｅは、ｃ−ｋｉｔ（図２Ｄ）及びＳＣＦ（図２Ｅ）の両方について染色した膀胱癌試料９２０を示しており、この患者がｃ−ｋｉｔ阻害因子についての良好な候補であることを示唆している。図２Ａは、ｐＡＫＴに関して染色した同じ膀胱癌試料９２０を示す。
【実施例６】
【００６７】
ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴタンパク質発現の画像解析
腫瘍試料をｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴに対する抗体で染色し、画像解析を使用してこれら３つのタンパク質の発現レベルを測定した。解析した個々の腫瘍試料は、乳癌（７４７、８４８、８６４、８９５）及び膀胱癌（９２０）の両方の試料を含んだ。Ｂａｃｕｓら（その全体が参照してここに組み込まれる、１９９７年、Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．１９：３１６〜２８）に述べられているようにＣＡＳシステムを使用して測定を行った。ピクセル当りの光学密度の単位で表わした、ｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴタンパク質のレベルを表ＩＩに示す。図３は、これら５つの腫瘍において画像解析とＩＨＣ染色によって測定したｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴのレベルを示す棒グラフであり、３つのタンパク質すべてが発現されたこと、３つのタンパク質すべてが測定できたこと、及び３つのタンパク質の発現レベルにかなりの変動があったことを示している。おそらく、これらの変動が癌の薬剤感受性に影響を及ぼすのであろう。
【００６８】
表２
ピクセル当りの光学密度として表わした、腫瘍試料におけるｃ−ｋｉｔ、ｐＡＫＴ及びＳＣＦの画像解析定量
【表２】
2005527781.tif 000004
【実施例７】
【００６９】
乳癌細胞系におけるＳＴＩ−５７１に対する応答
乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−３６１を使用して、ｃ−ｋｉｔチロシンキナーゼ阻害因子、特にＮｏｖａｒｔｉｓの薬剤ＳＴＩ−５７１（ＧＬＩＶＥＣ（登録商標））に対する乳癌細胞系の応答を測定した。図４は、細胞培養においてＳＴＩ−５７１の存在下または不在下にＳＣＦリガンドで処置した乳癌細胞におけるｃ−ｋｉｔ活性を示すウエスタンブロットの表示である。前記細胞系を、３日間の細胞培養中に、１μＭ〜４０μＭまでのＳＴＩ−５７１に曝した。次に、この培養細胞系と対照の未処置細胞系を溶解し、総タンパク質５０μｇを含む細胞溶解産物を、Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ  ＣＤ１１７／ｃ−Ｋｉｔ抗体クローンＡｂ〜６及びＤＡＫＯ  ＣＤ１１７／ｃ−Ｋｉｔ抗体クローンＡ４５０２の両方で免疫沈降させた。図５は、この実験においてｃ−ｋｉｔを免疫沈降させるのに使用した同じ抗体でプローブしたＨｅＬａ細胞におけるｃ−ｋｉｔ発現のウエスタンブロットの表示であり、両方の抗体がｃ−Ｋｉｔを単離できたことを明らかに示している。図４、レーン１は、活性化ｃ−ｋｉｔが、そのリガンドであるＳＣＦの不在下では発現されないことを示している。レーン２は、細胞培養をＳＣＦに曝したときの活性化ｃ−ｋｉｔの単離を示唆する、１４５ｋＤａの異なるバンドを示す。残りのレーン（３〜６）は１４５ｋＤａのバンドを有さず、１μＭという低いＳＴＩ−５７１の存在下ではｃ−ｋｉｔの発現が起こらないことを明らかにしている。この結果は、ＳＴＩ−５７１（ＧＬＩＶＥＣ（登録商標））が、そのリガンドであるＳＣＦの存在下でｃ−ｋｉｔの発現または活性化の量を低下させうることを示している。それ故、ＳＴＩ−５７１（ＧＬＩＶＥＣ（登録商標））は、ｃ−ｋｉｔの発現または活性化を低下させるため、そしてそれに対応して、ＡＫＴの活性化を低下させるために有用な化合物であると同定される。
【００７０】
上記の開示は本発明の一部の具体的な実施形態を強調していること、及びそれに等価のすべての修正または選択肢は、添付の特許請求の範囲に述べられている本発明の精神と範囲内であることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａから１Ｄまでは、Ｎｏ．１２６６９ｂ９によって同定されたヒト乳房組織試料の免疫組織化学的分析を示す。図１Ａは、実施例２に記述のようにＳＣＦに免疫特異的な抗体で免疫組織化学的に染色した、実施例５に記述の技術を用いて４００×の倍率での、試料組織の顕微鏡写真を示す。図１Ｂは、実施例１に記述のように、ｃ−ｋｉｔに対する抗体で染色した同じ乳癌試料を示す（４００×）。図１Ｃは、ＳＣＦに関して染色した同じ癌組織の異なる領域を示す（４００×）。図１Ｄは、ｃ−ｋｉｔに関して染色したもう１つ別の領域を示す（４００×）。
【図２】図２Ａから２Ｅまでは、腫瘍試料の免疫組織化学的分析の結果を示す。図２Ａは、ｐＡＫＴに関して染色した腫瘍である。図２Ｂは、ｃ−ｋｉｔに関して染色した腫瘍試料７４７を示す。図２Ｃは、ＳＣＦに関して染色した試料８４８を示す。図２Ｄ及び２Ｅは、ｃ−ｋｉｔ（図２Ｄ）またはＳＣＦ（図２Ｅ）に関して染色した腫瘍試料９２０の異なる領域である。
【図３】図３は、画像解析と組み合わせて、免疫組織化学によって測定したｃ−ｋｉｔ、ＳＣＦ及びｐＡＫＴのレベルを示す棒グラフである。この棒グラフは光学密度／ピクセルの単位で表わしている。
【図４】図４は、ＳＴＩ−５７１（Ｇｌｉｖａｃ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより入手した）の存在下または不在下にＳＣＦリガンドで処理した乳癌細胞におけるｃ−ｋｉｔの活性化を示すウエスタンブロットの写真である。ｐｃ−ｋｉｔをＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞溶解産物（総タンパク質５０μｇ）から免疫沈降させ、ゲル電気泳動によって分離して、活性ｃ−ｋｉｔ受容体を検出するために抗ホスホチロシン抗体でスクリーニングした。予想されたように、ｃ−ｋｉｔ受容体はＳＣＦ処理によって活性化されたが、わずかに１μＭのＳＴＩ−５７１で阻害された。
【図５】図５は、ＨｅＬａ細胞から調製したｃ−ｋｉｔのウエスタンブロットの写真である。ｃ−ｋｉｔに対するウサギポリクローナル抗体を、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ（１：２００希釈）及びＤＡＫＯ（１：４００希釈）から入手し、ウサギＩｇＧに対するＨＰＲ複合抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び化学発光基質（ＮＥＮ）を用いて検出した。
【図１Ａ】
2005527781.tif 000005
【図１Ｂ】
2005527781.tif 000006
【図１Ｃ】
2005527781.tif 000007
【図１Ｄ】
2005527781.tif 000008
【図２Ａ】
2005527781.tif 000009
【図２Ｂ】
2005527781.tif 000010
【図２Ｃ】
2005527781.tif 000011
【図２Ｄ】
2005527781.tif 000012
【図２Ｅ】
2005527781.tif 000013
【図３】
2005527781.tif 000014
【図４】
2005527781.tif 000015
【図５】
2005527781.tif 000016
【国際調査報告】
2005527781.tif 000017
2005527781.tif 000018
2005527781.tif 000019
2005527781.tif 000020
2005527781.tif 000021