(57)【要約】本発明は、ヒトＩＳＲＥ結合タンパク質（ＨＩＢＰ）と、ＨＩＢＰを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＨＩＢＰの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。
2005502301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及びその断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製された変異体。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項５】
厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの検出法であって、
（ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプル内の少なくとも一つの核酸とハイブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。
【請求項８】
前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチドの増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の検出法。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びその断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項１１】
請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を培養する過程と、
（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
好適な医療用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む医薬品組成物。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
【請求項１８】
請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１９】
ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を含む、ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
【請求項２０】
ＨＩＢＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、ＨＩＢＰの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒトＩＳＲＥ結合タンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれらの配列を用いた細胞増殖異常症及び免疫疾患の診断及び治療、予防に関する。
【０００２】
（発明の背景）
プロトオンコジーンは、細胞増殖や分裂の制御に必要とされる。不適切に発現した場合、これらの遺伝子は癌を発病しうる。ｍｙｃプロトオンコジーンは、転写因子のへリックス−ループ−へリックスロイシンジッパースーパーファミリーのメンバーをコードする。ｍｙｃ遺伝子は、通常の細胞増殖、形質転換、及び分化の制御に関係している。ｍｙｃの転写は、初期反応遺伝子として成長因子によって活性化され、ｍｙｃ遺伝子生成物（ＭＹＣ）は、成長因子遅延反応遺伝子の転写を活性化する。ＭＹＣにより活性化された遅延反応遺伝子は、サイクリンＡ、Ｅ、及びヒト熱ショックタンパク７０を含む。ＭＹＣタンパク質は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原及びニューロン細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）をコードする遺伝子を含む数種の遺伝子の転写抑制にも働く。
【０００３】
ｍｙｃ遺伝子ファミリーは、そのファミリーが固有の組織及び一時性の発現パターンを示す少なくとも７つの密接に関連した遺伝子からなる。例えば、ｍｙｃ遺伝子生成物ＭＹＣは、増殖中や胚発生のすべてのステージで種々の成体組織に於いて発現する。一方、ＭＹＣＮ及びＭＹＣＬのファミリーメンバーの発現は、胎児の脳、肝臓、及び肺に制限されている。（Ｈｅｓｋｅｔｈ， Ｒ． （１９９５） Ｉｎ Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ． ｐｐ． ２０１−２１０）
非形質転換細胞におけるｍｙｃの発現は成長因子に依存し、ｍｙｃの発現は細胞周期の進行に必須である。ｍｙｃを発現不可能な細胞は、たとえ成長因子の存在下であっても分裂し得ない。加えて、ｍｙｃの発現のダウンレギュレーションは、通常分化に関連する。逆に、ｍｙｃの過剰発現によって、成長因子の刺激に依存しないで増殖が起こる。このような増殖は、最終的に通常細胞をプログラムされた細胞死へと導く。ｒａｓ及びｒａｆを含むｍｙｃと協力するとして知られる遺伝子は、細胞の生存維持に必要だと考えられる。あいにく、それらの存在は、ｍｙｃの過剰発現細胞中では、アポトーシスではなく形質転換を起こし得る（Ｈｅｓｋｅｔｈ， 前出）。
【０００４】
ｍｙｃの発現は、転写および翻訳の段階の両方で制御される。ｍｙｃ遺伝子は、種間で７０〜９０％の同一性を示す３つのエキソンからなる。ＭＹＣタンパク質のコード領域部分ではない５’末端は、二つの転写活性部位Ｐ１及びＰ２を有している。二つの異なるタンパク質であるｐ６４およびｐ６７は、エキソン１の３’末端に近いＣＵＧ開始コドンとエキソン２のＡＵＧ開始コドンとのどちらかの翻訳開始による、ｍｙｃ転写により産生される（Ｈｅｓｋｅｔｈ， 前出）。
【０００５】
幾つかの転写調節要素は、の５’非翻訳領域にマップされている。これらの要素は、ＡＰ−１及びＡＰ−２、Ｐ２プロモーター要素ＭＥｌａ２、Ｅ２Ｆ、及びＮ４Ｅｌａ１、及びＭＹＣ関連Ｚｎフィンガータンパク質（ＭＡＺ）結合部位を含む。幾つかののインターフェロン依存遺伝子の上流に見られる二つのインターフェロン刺激反応要素（ＩＳＲＥ）も、ｍｙｃ遺伝子の５’ＵＴＲにマップされている。ＩＳＲＥ（ｉｒｌＡ）の一つはＰ１の上流に位置し、２番目のＩＳＲＥｓ（ｉｒｌＢ）はＰ１とＰ２の間に位置している。これらの調節要素は、ｍｙｃ遺伝子の転写に対して正及び負の調節の両方を行う。（Ｈｅｓｋｅｔｈ． Ｓｕｐｒａ； Ｓｔａｓｉｖ， Ｙ．Ｚ．ら （１９９４） Ｇｅｎｅ １４５：２６７−２７２）
ｍｙｃの５’ＵＴＲに於ける調節要素に結合する性質を示す因子は、核因子１（ＮＦ１）、ＴＧＦβ１、Ｅ２Ｆ、及びＭＡＺを含む。ｍｙｃ発現の抑制及び活性化は、それらの因子間の相互作用で調節される。例えば、ｃ−ｍｙｃ中に於いてＩＳＲＥ配列と結合するタンパク質因子は、イントロン１で開始される遺伝子転写の阻止にある役割を果たすことが示唆されている。Ｍｙｃ調節領域におけるＩＳＲＥに対する結合性を示す３つの結合タンパク質が確認された。それらのタンパク質のうち２つは、インターフェロン応答性遺伝子９−１６に於いてＩＳＲＥｓと結合するのは勿論のこと、低い結合性でｍｙｃ調節領域に於いてＩＳＲＥｓと結合する。３つ目のタンパク質ＩＲＬＢは、ｉｒｌＡに対してよりｒＩＢに対してより高い結合性で結合し、９−１６のＩＳＲＥとは結合しない。ＩＲＬＢに対するＩＳＲＥ結合部位は、部分的にＭＥ１ａｌにオーバーラップする。ＭＥ１ａｌは、Ｅ２Ｆ及びＭＡＺの結合部位であり、転写開始と転写遮断の両方にとって必要である。それ故、ＩＲＬＢ、Ｅ２Ｆ、及びＭＡＺ間の結合は、ｍｙｃ遺伝子の転写の状態を調節しうる。
【０００６】
新規のヒトＩＳＲＥ結合タンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、細胞増殖異常症及び免疫疾患の診断、予防、治療において、有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズを満たすことができる。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＨＩＢＰ」、個別には「ＨＩＢＰ−１」及び「ＨＩＢＰ−２」と呼ぶ実質的に精製されたポリペプチド、ヒトＩＳＲＥ結合タンパク質を提供する。本発明の一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２（配列番号：１−２）及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【０００８】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列の相補体を、少なくとも１つのサンプルのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。
【００１２】
本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれる。
【００１３】
本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に提供する。
【００１５】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防が必要な患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＨＩＢＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防が必要な患者に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与することを含む、ＨＩＢＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１８】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【００１９】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２０】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００２１】
（定義）
「ＨＩＢＰ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＨＩＢＰのアミノ酸配列を指す。
【００２２】
用語「アゴニスト」は、ＨＩＢＰと結合したとき、ＨＩＢＰの効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子を指す。このアゴニストには、ＨＩＢＰに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子を含み得る。
【００２３】
「アレル変異配列」は、ＨＩＢＰをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００２４】
ＨＩＢＰをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＨＩＢＰと同じポヌクレオチド或いはＨＩＢＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドである。この定義には、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではない位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及びＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＨＩＢＰと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＨＩＢＰの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。
【００２５】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、それらの任意の断片、天然の分子または合成された分子を指す。ＨＩＢＰの断片である「断片」及び「免疫原性断片」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、ＨＩＢＰのある生物学的活性または免疫学的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。
【００２６】
「増幅」は、核酸配列の追加的な複製を生成することに関連する。増幅は、一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる。
【００２７】
「アンタゴニスト」は、ＨＩＢＰと結合したとき、ＨＩＢＰの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮する分子を指す。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはＨＩＢＰの効果を減少させるの他の分子である。
【００２８】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２及びそれらの断片などの、無傷の分子及びＦｖ断片を指す。ＨＩＢＰポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり、化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００２９】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子のフラグメント（即ちエピトープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３０】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的な核酸配列を含む全ての組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現はセンス鎖を指す。
【００３１】
用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然或いは組換え体のＨＩＢＰ、合成のＨＩＢＰまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力のことである。
【００３２】
用語「相補的」及び「相補性」は、許容の塩と許容の温度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することを指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。
【００３３】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液、無菌組成物を含み得る。ＨＩＢＰ若しくはＨＩＢＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００３４】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するために再配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて５’及び／または３’の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）などのフラグメントの構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン社の重複配列から構築された核酸配列を指す。延長及び構築の両方によってコンセンサス配列に構築されるものもある。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」は、ノーザン分析によるＨＩＢＰをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サンプル内のＨＩＢＰをコードする核酸の存在を示すことから、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有すること指す。
【００３６】
「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化を指す。
【００３７】
本明細用語「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたものである。
【００３８】
「類似性」とは、相補性の程度を表す用語である。これには、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性ともいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイゼーションしない。
【００３９】
句「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。この百分率同一性は、例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）など電子装置を用いて決定可能である。このＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムは、様々な方法、例えば、クラスター方法に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能である（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．及びＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８８） Ｇｅｎｅ７３：２３７−２４４．を参照）。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法などの当分野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である（例えば、Ｈｅｉｎ． Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６２６−６４５．を参照）。配列間の同一性はまた、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周知の別の方法によって決定することも可能である。
【００４０】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ．等 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。
【００４１】
用語「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子である。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。
【００４３】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ０ｔまたはＲ０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成され得る。
【００４４】
用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子の配列に対して、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００４５】
「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などと関係する症状のことである。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現によって特徴づけられ得る。
【００４６】
本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌクレオチドのアレイのことである。
【００４７】
本明細書のマイクロアレイの記述における「エレメント」或いは「アレイエレメント」とは、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのことである。
【００４８】
用語「変調」とは、ＨＩＢＰの活性の変化のことである。変調の例として、ＨＩＢＰのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。
【００４９】
句「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（ＰＮＡ）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例えば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３−４を特別に同定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、更に、関連ポリヌクレオチド配列からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３−４を区別する類似性の検査にも有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３−４の断片は、少なくともヌクレオチド１５〜２０個の長さである。この断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３−４の正確な長さ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３−４の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技術の１つを用いて日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全長のポリペプチドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的ドメイン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。
【００５０】
用語「機能的に関係した」または「機能的に結合した」とは、機能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロモーターが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さは少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５から３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチドである。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じである。
【００５２】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ．他（１９９３） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ８：５３−６３を参照）。
【００５３】
用語「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。ＨＩＢＰをコードする核酸若しくはその断片、ＨＩＢＰ自体を含むと推測される生物学的サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。
【００５４】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用のことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペプチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００５５】
用語「厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳密性を高めることができる。
【００５６】
用語「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。
【００５７】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００５８】
「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャネル、孔などの様々な表面形態を有する。
【００５９】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【００６０】
「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。
【００６１】
ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる用語「変異配列」とは、ＨＩＢＰに関連したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変異配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセシング中のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わったり、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。
【００６２】
（発明）
本発明は、新規のヒトＩＳＲＥ結合タンパク質（ＨＩＢＰ）及びＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、細胞増殖異常症及び免疫疾患の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００６３】
本発明のＨＩＢＰ−１をコードする核酸は、核酸配列及び／またはアミノ酸配列のアラインメント用のコンピュータ検索によって、脳腫瘍ｃＤＮＡライブラリ（ＢＲＡＩＴＵＴ２１）由来のインサイトクローン２５１８５４７において同定された。コンセンサス配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、以下の核酸配列の重複及び／または伸長によって導き出された。インサイトクローン２５１８５４７Ｈ１ （ＢＲＡＩＴＵＴ２１）、１５０９６２２Ｈ１及び１５０９６２２Ｔ６ （ＬＵＮＧＮＯＴ１４）、１５６２９４５Ｆ６ （ＳＰＬＮＮＯＴ０４）、１６４０１３６Ｘ１８Ｃ１、１６４０１３６Ｘ１３Ｃ１及び１６４０１３６Ｘ２１Ｃ１ （ＵＴＲＳＮＯＴ０６）、１４３２０１４Ｒ１ （ＢＥＰＩＮＯＮ０１）。
【００６４】
一実施例では、本発明は、図１Ａ−図１Ｆに示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ＨＩＢＰ−１は、アミノ酸２４５個分の長さであり、Ｓ２７における１個の潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位と、Ｓ５及びＴ２２９における２つの潜在プロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する。ＨＩＢＰ−１は、ＳＰＳｃａｎによって同定された残基Ｍ１からＲ２２までの潜在シグナルペプチドを有する。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、ＨＩＢＰ−１は、ヒトＩＲＬＢ （ＧＩ ３３９６９： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＨＩＢＰ−１はＩＲＬＢと３６％の同一性を有し、等電点（それぞれ８．４と８．７）も類似している。更に、ＨＩＢＰ−１の残基Ｔ２２９の潜在プロテインキナーゼＣリン酸化部位が、ＩＲＬＢの残基Ｓ１７６の潜在プロテインキナーゼＡリン酸化部位として保存されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド７９７から８５６までの断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の同定、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と関連する配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用である。
【００６５】
ノーザン分析によって様々なライブラリにおけるＨＩＢＰ−１の発現が明らかになり、その内の少なくとも７８％が細胞増殖に関連し、少なくとも２８％が炎症及び免疫応答に関連することがわかった。特筆すべきは、ＨＩＢＰ−１が生殖組織及び造血／免疫組織、神経組織に発現することである。
【００６６】
本発明のＨＩＢＰ−２をコードする核酸が、核酸及び／またはアミノ酸配列アラインメント用のコンピュータ検索で、子宮筋組織ｃＤＮＡライブラリ（ＵＴＲＳＮＯＴ０６）からのインサイトクローン１６４０１３６において同定された。コンセンサス配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、以下の核酸配列の重複及び／または延長によって構築された。インサイトクローン１５０９６２２Ｈ１、１５０９６２２Ｔ６及び１５０９６２２Ｆ６ （ＬＵＮＧＮＯＴ１４）、４９４４６６Ｈ１ （ＨＮＴ２ＮＯＴ０１）、１６４０１３６Ｈ１及び１６４０１３６Ｘ１７Ｃ１ （ＵＴＲＳＮＯＴ０６）、１５６２９４５Ｆ６ （ＳＰＬＮＮＯＴ０４）、１４３２０１４Ｒ１ （ＢＥＰＩＮＯＮ０１）。
【００６７】
一実施例では、本発明は、図２Ａ−図２Ｄに示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ＨＩＢＰ−２は、アミノ酸２２０個分の長さであり、Ｓ２７における１個の潜在カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位と、Ｓ５及びＴ２０４における２つの潜在プロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する。ＨＩＢＰ−２は、ＳＰＳｃａｎによって同定される残基Ｍ１からＲ２２までの潜在シグナルペプチドを有する。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、ＨＩＢＰ−２はＨＩＢＰ−１と化学的及び構造的類似性を有し、はＨＩＢＰ−１のスプライスバリアントと考えられる。更に、図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、ＨＩＢＰ−２はヒトＩＲＬＢ（ＧＩ ３３９６９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ｓ）と化学的及び構造的類似性を有する。詳細には、ＨＩＢＰ−２はＩＲＬＢと２９％の同一性を有し、等電点（それぞれ８．７３と８．７０）も類似している。更に、ＨＩＢＰ−２の残基Ｔ２０４の潜在プロテインキナーゼＣリン酸化部位が、ＩＲＬＢの残基Ｓ１７６の潜在プロテインキナーゼＡリン酸化部位として保存されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド５１３から５７５までの断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の同定、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と関連する配列とを区別するハイブリダイゼーションまたは増幅技術に有用である。
【００６８】
ノーザン分析によって様々なライブラリにおけるＨＩＢＰ−２の発現が明らかになり、その内の少なくとも８１％が細胞増殖に関連し、少なくとも２３％が炎症及び免疫応答に関連することがわかった。特筆すべきは、ＨＩＢＰ−２が生殖組織及び造血／免疫組織、神経組織に発現することである。
【００６９】
本発明はまた、ＨＩＢＰの変異体を含む。好適なＨＩＢＰの変異体は、ＨＩＢＰアミノ酸配列と少なくとも約８０％、より好適には少なくとも約９０％、最も好適には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＨＩＢＰの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも１つを有する。
【００７０】
本発明はまた、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例では、本発明は、ＨＩＢＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４からなる一群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
本発明はまた、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、もっとも好適には少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、最も好適には約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４からなる一群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異配列は、ＨＩＢＰの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００７２】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＨＩＢＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、自然発生のＨＩＢＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００７３】
ＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳密な条件の下で、自然発生のＨＩＢＰのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用を有するＨＩＢＰ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＨＩＢＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【００７４】
本発明はまた、ＨＩＢＰ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＨＩＢＰまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００７５】
更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； 及び Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低いハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーションになる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えることができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例では、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００７６】
ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００７７】
当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【００７８】
部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法を用いてＨＩＢＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する。（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．等（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． 他 （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。
【００７９】
完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのときは、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００８０】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ 及び ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒを参照）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【００８１】
本発明の別の実施例では、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＨＩＢＰ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＨＩＢＰのクローン化及び発現に利用可能である。
【００８２】
種々の目的でＨＩＢＰをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可能である。
【００８３】
別の実施例によれば、ＨＩＢＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．等（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＨＩＢＰ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．等（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成し得る。更にＨＩＢＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチドを作ることが可能である。
【００８４】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ． Ｔ． （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。
【００８５】
生物学的に活性なＨＩＢＰを発現させるために、ＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む。これらの要素には、ベクター及びＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＨＩＢＰをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＨＩＢＰをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【００８６】
当業者に周知の方法を用いて、ＨＩＢＰをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章、１６章を参照）。
【００８７】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＨＩＢＰをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【００８８】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＨＩＢＰをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＨＩＢＰが必要な場合は、ＨＩＢＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【００８９】
ＨＩＢＰの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ．； 及びＢｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他 （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−７９４： Ｓｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）
植物系もＨＩＢＰの発現に使用可能である。ＨＩＢＰをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【００９０】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＨＩＢＰをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＨＩＢＰを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【００９１】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【００９２】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＨＩＢＰの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＨＩＢＰをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【００９３】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ−又はａｐｒ−細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃＨＩＢＰｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．他（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−７９１を参照）。
【００９４】
マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＨＩＢＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＨＩＢＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＨＩＢＰをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【００９５】
一般に、ＨＩＢＰをコードする核酸配列を含み、ＨＩＢＰを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＨＩＢＰの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＨＩＢＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他．（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【００９７】
種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＨＩＢＰをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【００９８】
ＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＨＩＢＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【００９９】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１００】
本発明の別の実施例では、ＨＩＢＰをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＨＩＢＰタンパク質が、ＨＩＢＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＨＩＢＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＨＩＢＰが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１０１】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＨＩＢＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、好ましくは３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１０２】
ＨＩＢＰの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合成によって作製され得る（例えば、前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ｐｐ． ５５−６０．を参照）。タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことが可能である。ＨＩＢＰの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１０３】
（治療）
例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が、ＨＩＢＰのある領域とヒトＩＲＬＢのある領域との間に存在する。更に、ＨＩＢＰの発現は、生殖、免疫及び神経組織、並びに癌を含む脂肪増殖、炎症及び免疫応答と密接な関係がある。従って、ＨＩＢＰは、細胞増殖異常症及び免疫疾患に関係すると考えられる。ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、ＨＩＢＰの発現または活性を増大させることが望ましい。また、ＨＩＢＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＨＩＢＰの発現または活性を低下させることが望ましい。
【０１０４】
従って、一実施例において、ＨＩＢＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＩＢＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、細胞増殖異常症が含まれ、その中には、日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、また、免疫疾患も含まれ、その中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれる。
【０１０５】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を疾患の治療または予防のために、ＨＩＢＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１０６】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＨＩＢＰを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０１０７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む疾患の治療または予防のために、ＨＩＢＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１０８】
更なる実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＩＢＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＩＢＰのアンタゴニストを投与することが可能である。一実施態様では、ＨＩＢＰと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨＩＢＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１０９】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む疾患の治療または予防のために、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１１０】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１１１】
ＨＩＢＰのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＨＩＢＰを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＨＩＢＰと特異的に結合するものを同定が可能である。ＨＩＢＰの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１１２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＨＩＢＰまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０１１３】
ＨＩＢＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望ましいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。ＨＩＢＰアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１１４】
ＨＩＢＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 等． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 等． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 等． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 等． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０１１５】
更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．等． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＨＩＢＰ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０１１６】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生することもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０１１７】
ＨＩＢＰに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）に断片と、Ｆ（ａｂ’）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 等． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０１１８】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＨＩＢＰとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ＨＩＢＰエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１１９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＨＩＢＰ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＨＩＢＰ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったものである。多数のＨＩＢＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体試薬の測定値Ｋａは、ＨＩＢＰ抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＨＩＢＰエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＨＩＢＰ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＨＩＢＰが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１２０】
ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、ＨＩＢＰ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。（例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出， 及びＣｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０１２１】
本発明の別の実施例では、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態では、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相補的分子または断片は、ＨＩＢＰの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＨＩＢＰをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１２２】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＨＩＢＰをコードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他、及び前出のＡｕｓｕｂｅｌ 他によるものを参照）。
【０１２３】
ＨＩＢＰをコードする遺伝子は、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド又はその断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持続し得る。
【０１２４】
上記した通り、遺伝子の発現は、ＨＩＢＰをコードする遺伝子の制御５’または調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 等． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０１２５】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＨＩＢＰをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１２６】
任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０１２７】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＢＰをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１２８】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０１２９】
ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６：を参照）。
【０１３０】
上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１３１】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物は、ＨＩＢＰ、ＨＩＢＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はＨＩＢＰのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１３２】
本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することもできる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１３３】
活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術については、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＰＡ）に記載されている。
【０１３４】
経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体により、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１３５】
経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或いは糖衣錠コア（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅｓ）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が加えられる。
【０１３６】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。このような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤または糖衣錠に加えられる。
【０１３７】
経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィット型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルには、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含まれる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或いは懸濁され得る。
【０１３８】
非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リンガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソームなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１３９】
局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１４０】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、溶離（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥処理を用いて製造され得る。
【０１４１】
医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１４２】
医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の薬としてラベルが貼られる。ＨＩＢＰの投与のため、このようなラベルには、量、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１４３】
本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な服用量を決めることができる。
【０１４４】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０１４５】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＨＩＢＰ又はその断片、ＨＩＢＰの抗体、ＨＩＢＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはＬＤ５０（服用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１４６】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０１４７】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇまでの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１４８】
（診断）
別の実施例では、ＨＩＢＰに特異的に結合する抗体が、ＨＩＢＰの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＨＩＢＰやＨＩＢＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＨＩＢＰの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＨＩＢＰを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０１４９】
ＨＩＢＰを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＨＩＢＰの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＨＩＢＰの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採取した体液または細胞とＨＩＢＰに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）が好ましい。被験者のＨＩＢＰの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。
【０１５０】
別の実施例によれば、ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＨＩＢＰを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＨＩＢＰの不在、存在、及び過度の発現を調べ、治療中のＨＩＢＰレベルの制御を監視する。
【０１５１】
ある実施形態では、ＨＩＢＰまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＨＩＢＰをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがＨＩＢＰをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１５２】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＨＩＢＰをコードする任意の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４の配列、或いはＨＩＢＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０１５３】
ＨＩＢＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＨＩＢＰ及びＨＩＢＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０１５４】
ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＨＩＢＰの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、細胞増殖異常症が含まれ、その中には、日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれ、また、免疫疾患も含まれ、その中には、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれる。ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＨＩＢＰの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０１５５】
特定の形態において、ＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１５６】
ＨＩＢＰの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＨＩＢＰをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１５７】
疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０１５８】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【０１５９】
ＨＩＢＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや低い厳密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０１６０】
ＨＩＢＰの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．等（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．等（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを用いることによって加速された。
【０１６１】
別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び開発に有用である。
【０１６２】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他 （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）
本発明の別の実施例ではまた、ＨＩＢＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， １．３． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４， 及びＴｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）
ｉｎ ｓｉｔ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他による（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８．を参照）。遺伝子マップデータの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＨＩＢＰをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検出することもある。
【０１６３】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他による（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０１６４】
本発明の別の実施例では、ＨＩＢＰ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＨＩＢＰとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成は計測されることもある。
【０１６５】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，他による（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、ＨＩＢＰ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＨＩＢＰが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＨＩＢＰはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１６６】
別の実施例では、ＨＩＢＰと結合可能な中和抗体がＨＩＢＰと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＨＩＢＰと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０１６７】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＨＩＢＰをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０１６８】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１６９】
前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願第０９／１５７，０９１号を引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１７０】
（実施例）
１  ｃＤＮＡライブラリの作製
ＢＲＡＩＴＵＴ２１
ＢＲＡＩＴＵＴ２１ ｃＤＮＡライブラリは、６１歳の白人女性の大脳髄膜病変の切除中に正中線前頭葉から脳腫瘍組織を採取し、その脳腫瘍組織から単離したＲＮＡを用いて作製した。病理学的には、定型性前頭髄膜皮髄膜種を示していた。１つの篩骨及び粘膜組織サンプルは髄膜腫を示していた。病歴には、脳血管障害、アテローム性冠状動脈疾患、鼻出血、高脂肪血症、抑うつ障害、過敏性腸、及び皮膚癌が含まれた。家族歴には、脳血管疾患、老年痴呆、高脂血症、良性高血圧、アテローム性冠状動脈疾患、うっ血性心不全、及び乳癌が含まれた。
【０１７１】
凍結組織は、均質化され、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−３０００（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を用いて、フェノールとグアニジンイソチオシアネートの単相性溶液であるＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に置かれた。氷冷しながらの短いインキュベーションの後、クロロホルムが（ｖ／ｖ１：５で）加えられ、溶解産物が、遠心分離された。上部クロロホルム層は取り除かれ、ＲＮＡは、イソプロパノールと共に抽出され、水中で再懸濁され、ＤＮａｓｅと共に２５分間３７度で処理された。抽出及び沈殿は繰り返された。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて単離された。
【０１７２】
ＵＴＲＳＮＯＴ０６
ＵＴＲＳＮＯＴ０６ライブラリは、５０歳白人女性の膣式子宮摘出の際に採取した子宮筋層組織から単離したＲＮＡを用いて作製した。病理学的には、残存異型性複合子宮内膜増殖症を示していた。拡大法および掻爬術により取り除かれた関連組織の病理学的には、異型性複合過形成症及びグレード１の単一顕微鏡的局所性腺癌を示していた。患者の病歴には、良性乳房腫瘍、甲状腺機能低下症、ポリープ切除、関節痛があった。家族歴には、脳血管障害、アテローム性冠状動脈疾患、脂肪過剰血症、及び慢性肝炎があった。
【０１７３】
凍結組織は、均質化され、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ−３０００ホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を用いて、グアジニウムイソチオシアネート（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）溶液中に置かれた。溶解産物は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ８−７０Ｍ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ＣＡ）中に於いて、外界温度、２５， ０００ｒｐｍで１８時間に渡り、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ ローターを用いて５．７ ＭのＣｓＣＩ緩衝剤中で遠心分離された。
【０１７４】
ＲＮＡは、酸フェノールと共に抽出され、酢酸ナトリウム及びエタノールを用いて沈殿され、ＲＮＡｓｅ遊離水中で再懸濁され、ＤＮａｓｅと共に処理された。ＲＮＡは酸フェノールを用いて抽出され、先のように沈殿した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡは、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて単離された。
【０１７５】
ＢＲＡＩＴＵＴ２Ｉ及びＵＴＲＳＮＯＴ０６
ポリ（Ａ＋） ＲＮＡは、ｃＤＮＡの合成及び推奨プロトコルに関連のライブラリの構築に、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で用いられた。ｃＤＮＡは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で分割され、４００ ｂｐを越えるそれらのｃＤＮＡは、ｐＩＮＣＹ （Ｉｎｃｙｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）へと結紮され、続いてＤＨ５α成分細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと形質転換された。
【０１７６】
２  ｃＤＮＡクローンの単離
ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６ プラスミドキット （ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ）．を用いて、プラスミドＤＮＡを細胞から遊離して精製した。このとき、以下の変更点を除いて推奨プロトコルに従った。その変更点とは、１）細菌を、０．４％のグリセリン及び２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含む１ｍｌの無菌Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） で培養する。２）培養物を１９時間インキュベートした後、細胞を０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解する。４）イソプロパノールによる沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットをそれぞれ、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。この後、ＤＮＡサンプルを４℃で保管した。
【０１７７】
３  シークエンシング及び分析
シークエンシングのためのｃＤＮＡの準備には、ＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）をＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒｓ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に用いた。ｃＤＮＡのシークエンシングには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び標準ＡＢＩプロトコル、塩基対呼び出しソフトウェア、キットを用いた。別法では、ｃＤＮＡのシークエンシングには、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いた。更なる別法では、ｃＤＮＡの増幅及びシークエンシングにＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いた。また、更なる別法では、ｃＤＮＡのシークエンシングにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の溶液と色素を用いた。ＥＳＴの読み枠は、標準的な方法（ Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７を参照）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で延長した。
【０１７８】
ｃＤＮＡ、延長及びショットガンシークエンシングから導き出すポリヌクレオチド配列の構築及び分析は、当分野の技術者に既知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。配列の分析には、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア （ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いた。
【０１７９】
ポリヌクレオチド配列の確証は、ＢＬＡＳＴ及び動的計画法、ジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースやＢＬＯＣＫＳデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Ｐｈｒｅｄ及びＰｈｒａｐ、Ｃｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（上記）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰＦＡＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅなどのデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。
【０１８０】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼーション及び増幅に有用であり、上記の（発明）の部分で説明した。
【０１８１】
４  ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０１８２】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００
として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０１８３】
ノーザン分析の結果は、ＨＩＢＰをコードする転写物が発生したライブラリの分布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症／外傷、神経、貯留（ｐｏｏｌｅｄ）が含まれる。それぞれのカテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライブラリの数で除した。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で発現する割合は（発明）の記載の部分にすでに記載した。
【０１８４】
５  ＨＩＢＰをコードするポリヌクレオチドの延長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の延長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の延長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを延長した。
【０１８５】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【０１８６】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ２＋と（ＮＨ４）２ＳＯ４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２及び３、４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ５７℃で１分間
ステップ４    ６８℃で２分間
ステップ５    ステップ２及び３、４を２０回繰り返す
ステップ６    ６８℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管。
【０１８７】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｍｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。
【０１８８】
延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて延長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０１８９】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１    ９４℃で３分間
ステップ２    ９４℃で１５秒
ステップ３    ６０℃で１分間
ステップ４    ７２℃で２分間
ステップ５    ステップ２及び３、４を２９回繰り返す
ステップ６    ７２℃で５分間
ステップ７    ４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（ １：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてシークエンシングした。
【０１９０】
同様に上述の手順で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４のヌクレオチド配列を利用し、この延長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′調節配列を得た。
【０１９１】
６  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−４から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０１９２】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。ＸＯＭＡＴ ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）を、ブロットに数時間曝した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０１９３】
７  マイクロアレイ
化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を合成することが可能である（例えば、上記Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒを参照）。ドットブロット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的なアレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べることが可能である。
【０１９４】
完全長のｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（ＵＶ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる（例えば、 Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０； 及び Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ． 他． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５を参照）。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーションするために用いる。上記した方法でこの基質を分析する。
【０１９５】
８  相補的ポリヌクレオチド
ＨＩＢＰをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発生のＨＩＢＰの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨＩＢＰのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＨＩＢＰをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０１９６】
９  ＨＩＢＰの発現
ＨＩＢＰの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＨＩＢＰが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節要素に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＨＩＢＰを発現する。真核細胞でのＨＩＢＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＩＢＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０１９７】
殆どの発現系では、ＨＩＢＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＩＢＰからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＨＩＢＰを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０１９８】
１０  ＨＩＢＰ活性の実証
ＨＩＢＰ活性は、ゲノムｍｙｃ構成物と共に形質変換されるＮＩＨ３Ｔ３ネズミ繊維芽細胞細胞の変質の調整能力により測定される。ＭＹＣ及び５’調節領域をコードするゲノムＤＮＡは、適正な真核性ベクターへとサブクローンされる。この構成物は、前記技法で知られる方法を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞へと形質転換される。形質転換された細胞は、ＨＩＢＰ及びＥ２Ｆと組み合わせてＨＩＢＰ及びＥ２Ｆで処理されるか、未処理で放置される。細胞は、以下に述べる発癌性に形質転換細胞に特徴的な定量可能特性で評価される。その特性とは、接触抑制の喪失に関連した高い濃度への培養中における成長、懸濁液若しくは柔らかい寒天培地における成長、血清要求の低下、及び免疫欠如マウスに注入した際に腫瘍を誘発する能力である。ＨＩＢＰの活性は、Ｅ２Ｆ単独で処理される細胞に関係してＨＩＢＰ及びＥ２Ｆで処理されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換の程度に比例している。
【０１９９】
１１  機能的アッセイ
ＨＩＢＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＨＩＢＰをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞の状態などの細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成のダウンレギュレーションと、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０２００】
遺伝子発現におけるＨＩＢＰの影響は、ＨＩＢＰをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＨＩＢＰ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２０１】
１２  ＨＩＢＰに特異的な抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＨＩＢＰを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０２０２】
別法では、ＨＩＢＰアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０２０３】
通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２０４】
１３  特異的抗体を用いる自然発生ＨＩＢＰの精製
自然発生ＨＩＢＰ或いは組換えＨＩＢＰを、ＨＩＢＰに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＨＩＢＰ抗体とを共有結合させることにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。
【０２０５】
ＨＩＢＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＨＩＢＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＨＩＢＰとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＨＩＢＰを回収する。
【０２０６】
１４  ＨＩＢＰと相互作用する分子の同定
ＨＩＢＰ又は生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ他 （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＩＢＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＨＩＢＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＨＩＢＰ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＨＩＢＰとの関連、親和性、数について数値を計算する。
【０２０７】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法における様々な改変は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｂ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｃ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｄ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｅ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｆ】
ＨＩＢＰ−１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｔｓｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図２Ａ】
ＨＩＢＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｂ】
ＨＩＢＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｃ】
ＨＩＢＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェアを用いて作成した。
【図２Ｄ】
ＨＩＢＰ−２のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及び核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。また、このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェアを用いて作成した。
【図３Ａ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＥＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＩＢＰ−１（２５１８５４７； ＳＥＱＩＤＮＯ：ｌ）、ＨＩＢＰ−２（１６４０１３６ ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２）及びヒトＩＲＬＢ（ＧＩ ３３９６９： ＳＥＱＩＤＮＯ：５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ】
ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＥＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＩＢＰ−１（２５１８５４７； ＳＥＱＩＤＮＯ：ｌ）、ＨＩＢＰ−２（１６４０１３６ ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２）及びヒトＩＲＬＢ（ＧＩ ３３９６９： ＳＥＱＩＤＮＯ：５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１Ａ】
2005502301.tif 000003
【図１Ｂ】
2005502301.tif 000004
【図１Ｃ】
2005502301.tif 000005
【図１Ｄ】
2005502301.tif 000006
【図１Ｅ】
2005502301.tif 000007
【図１Ｆ】
2005502301.tif 000008
【図２Ａ】
2005502301.tif 000009
【図２Ｂ】
2005502301.tif 000010
【図２Ｃ】
2005502301.tif 000011
【図２Ｄ】
2005502301.tif 000012
【図３Ａ】
2005502301.tif 000013
【図３Ｂ】
2005502301.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005502301.tif 000015
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【国際調査報告】
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