(57)【要約】この発明は、核酸の並行配列決定を行なうための方法に関し、この方法は、  １．固定化される核酸分子により区別される領域を有する多孔性の担体を提供するステップと、  ２．ステップ（１）の担体を流通構成体内に挿入するステップと、  ３．核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列の少なくとも一部を同時に決定するステップとを含む。
2005527242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の並行配列決定を行なうための方法であって、
（１）  固定された核酸分子によって区別される領域を有する多孔性の担体を提供するステップと、
（２）  流通構成体内にステップ（１）の担体を挿入するステップと、
（３）  核酸分子の少なくとも一部の核酸配列の少なくとも一部を同時に決定するステップとを含む、方法。
【請求項２】
多孔性の担体が、平行かつ平らな２つの表面を有するように形成され、かつ、上面および底面を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多孔性の担体が、互いに本質的に平行であって、かつ、それを介して上面と底面とが互いに連通するチャネルを有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
チャネルの直径が、０．５μｍと５０μｍとの間であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
チャネルの直径が、１μｍと２５μｍとの間であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
多孔性の担体がガラスで形成されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
多孔性の担体がガラスキャピラリーアレイであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多孔性の担体がシリコンで形成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１）の領域に位置付けられる核酸分子が、予め生成された核酸溶液として担体に移送されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
移送が、ピン、キャピラリーによるか、またはインクジェットにより行なわれることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（１）の領域に位置付けられる核酸分子が、担体の中空の空間内における増幅により生成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
増幅の開始時において、中空の空間内に、平均で０．５以下の増幅可能な核酸分子が存在することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
増幅の開始時において、中空の空間内に、平均で０．２以下の増幅可能な核酸分子が存在することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅の開始時において、中空の空間内に、平均で０．１と０．０２との間の増幅可能な核酸分子が存在することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
増幅されると、出発分子の１０6以上のコピーが生成されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
増幅されると、出発分子の１０7以上のコピーが生成されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
増幅されると、出発分子の１０8以上のコピーが生成されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子の配列決定が、ヌクレオチド三リン酸の取込みと、反応副産物の決定とによって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子の配列決定が、標識されたヌクレオチドの取込みによって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
核酸分子の配列決定が、可逆的に標識されたヌクレオチドの取込みによって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子の配列決定が、標識された可逆的なチェインターミネーティングヌクレオチドの取込みによって行なわれることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
担体が１０3以上の領域を有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
担体が１０4以上の領域を有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
担体が１０5以上の領域を有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
担体が１０6以上の領域を有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
壁面が、核酸分子の固定化に適した被覆を有することを特徴とする、請求項２〜８、２２〜２５のいずれかに記載の多孔性の担体。
【請求項２７】
各場合において、本質的に同一の複数の核酸分子が位置付けられる領域によって特徴付けられる、請求項２〜８、２２〜２５のいずれかに記載の多孔性の担体。
【請求項２８】
各場合において、本質的に同一の複数の核酸分子が位置付けられる領域によって特徴付けられ、各領域が、いくつかの場合において少なくとも１つの中空の空間を含む、請求項２〜８、２２〜２５のいずれかに記載の多孔性の担体。
【請求項２９】
多孔性の担体により接続された少なくとも２つの空間と、圧力差を確立するための手段と、検出器と、適切であれば、蛍光の励起に適切な放射源と、適切であれば、増幅反応および／または配列決定反応を実施するための試薬を保管するための容器とを含む、流通構成体。
【請求項３０】
核酸の大規模並行配列決定を行なうための方法であって、
（１）  多孔性の担体を提供するステップと、
（２）  多孔性の担体の中空の空間に、増幅可能な核酸分子を含む増幅混合物を導入するステップと、
（３）  担体の中空の空間において核酸分子の増幅を行なうステップと、
（４）  多孔性の担体を表面に接触させるステップとを含み、このステップは任意に、増幅を行なうステップの前に実施され、前記方法はさらに、
（５）  ステップ（３）の増幅された核酸分子の少なくとも一部を表面に固定化するステップと、
（６）  表面に固定化された核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列の少なくとも一部を同時に決定するステップとを含む、方法。
【請求項３１】
固定化の後に多孔性の担体が表面から除去されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、異なる複数の核酸分子の配列決定を同時に行なう方法と、この発明を実施するのに有用な多孔性の担体とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的解析において、核酸の配列の解析は重要な方法である。この方法により、興味の対象となるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の正確な塩基配列を決定することができる。この塩基配列を知ることにより、たとえば、特定の遺伝子もしくは転写産物（すなわち、これらの遺伝子に由来するメッセンジャＲＮＡ分子）の同定、突然変異および多形性の検出、または特定の核酸分子により明確に認識され得る生物およびウイルスの同定さえもが可能になる。通常、核酸の配列決定は、チェインターミネーション法（サンガー（Sanger）他（１９７７）、ＰＮＡＳ  ７４、５４６３〜５４６７）に従って実施される。したがって、一本鎖の核酸の、二本鎖の核酸への酵素的相補が行なわれる。上述の一本鎖の核酸にハイブリダイズされたいわゆるプライマー（通常、合成オリゴヌクレオチド）は、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドが加えられた後に伸長する。わずかな比率のチェインターミネーティングヌクレオチド（「チェインターミネータ」）は、成長中の鎖に取込まれると、さらなる伸長を阻止し、それぞれのチェインターミネータにより決定される既知の端部により区別される部分鎖の集積を生じる。次に、長さの異なる鎖の混合物を、ゲル電気泳動法によりサイズに応じて溶解する。そして、得られたバンドパターンから、未知の鎖のヌクレオチド配列を導出することができる。この手順の大きな欠点は、機器装備に関して必要とされる多大な労力であり、この労力が、達成可能なスループットを制限してしまう。１回の配列決定反応につき、（４つの異なる蛍光体で標識されたチェインターミネータを使用する場合、）スラブゲル上に少なくとも１つのレーンが必要とされ、キャピラリー電気泳動法を用いる場合は、少なくとも１本のキャピラリーが必要とされる。現在最も高度な市販の配列決定機を用いると、結果的に必要とされる労力により、並行処理され得る配列決定反応の数が３８４に制限される。さらに、各配列決定反応に必要とされる試薬は、相対的に高いコストを生じる。さらなる欠点は、ゲルシステムの解像度により、読出長さ、すなわち、１回の配列決定のランにつき正確に同定される塩基の数が制限されてしまうことである。配列決定のための代替的な方法である、質量分析測定による配列決定は、より高速であることから、同一時間フレーム内でより多くの試料の処理を可能にする。しかしながら、質量分析測定による配列決定は、相対的に小さな、たとえば長さが４０〜５０塩基のＤＮＡ分子に限られる。さらに別の配列決定技術である、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ、Drmanac 他、サイエンス（Science）２６０（１９９３）、１６４９〜１６５２参照）では、塩基配列が、既知のオリゴヌクレオチドと未知の試料との特異的なハイブリダイゼーションにより同定される。複雑なアレイ内において上述の既知のオリゴヌクレオチドを担体に付着させ、配列決定されるべき、標識された核酸とのハイブリダイゼーションを実施し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドが決定される。どのオリゴヌクレオチドが未知の核酸にハイブリダイズしたかに関する情報と、それらの配列とにより、未知の核酸の配列を決定することができる。このＳＢＨ技術の欠点は、オリゴヌクレオチド���対する最適なハイブリダイゼーションの条件を厳密に予測し得ないことである。したがって、一方では考え得るすべての配列の変異体（それらの所定の長さにより規定される）を含み、他方では厳密に同一の最適なハイブリダイゼーションの条件を共有する、オリゴヌクレオチドの大きなセットを設計することができない。その結果、非特異的なハイブリダイゼーションが、配列決定のエラーを生じる。さらに、ＳＢＨは、配列決定されるべき核酸の反復領域に対して使用できない。
【０００３】
既知の遺伝子の発現レベルの解析、たとえばドットブロットハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、または定量的ＰＣＲによりそれぞれ可能となる解析に加え、異なる生物学的試料間において区別的に発現した未知の遺伝子のデノボ（de novo）同定を可能にする、当該技術から公知の技術もまた存在する。この種の遺伝子発現の解析に対する１つの方策が、別個の配列単位の定量化である。このような単位は、いわゆる発現された配列タグ、すなわちＥＳＴであり得る。比較されるべき試料に由来するｃＤＮＡライブラリからの十分な数のクローンが配列決定される場合、同一の配列を検出およびカウントすることができ、異なる試料間で相対的に多量のこれらの配列を比較することができる（リー（Lee）他、ＰＮＡＳ  ９２（１９９５）、８３０３〜８３０７参照）。相対的に多量の異なる特定の配列は、対応する転写産物の区別的な発現を示す。しかしながら、この手順はかなりの労力を要する。なぜなら、最も多量に存在する転写産物の定量化に対しても、数千個のクローンの配列決定が必要とされるためである。その一方で、転写産物の明確な同定は、通常、約１３〜２０の塩基対の配列の短い伸長鎖（Laenge）のみを必要とする。「遺伝子発現の連続解析」（ＳＡＧＥ；Velculescu 他、サイエンス  ２７０（１９９５）、４８４〜４８７）と呼ばれる方法は、このことを利用している。ここでは、ＤＮＡの短い伸長鎖（「タグ」と呼ばれる）を連鎖させてクローン化し、結果的に得られたクローンの配列を決定する。このようにして、１つの配列決定反応で約２０個のタグを決定することができる。しかしながら、この技術はまだそれほど効果的ではない。なぜなら、最も多量に存在する転写産物の定量化に対しても、従来の多くの配列決定反応を実施して解析しなければならないためである。必要とされるかなりの労力により、ＳＡＧＥを用いて希少な転写産物を信頼可能な態様で定量化することは極めて難しい。
【０００４】
核酸のタグの並行配列決定を行なうための方法が、ＷＯ  ９８／４４１５１に開示されている。表面がＰＣＲプライマーで被覆され、その後、その表面において、配列決定されるべき核酸分子の増幅が行なわれる。したがって、鋳型として働く一本鎖核酸分子は、後に配列決定され得る同一の分子の「ＤＮＡコロニー」または「ＤＮＡアイランド」を生じる。増幅用に２つの固定化されたＰＣＲプライマーを用いることは、ＵＳ−Ａ  ５  ６４１  ６５８から既に公知であるが、重大な欠点を有する。すなわち、第１に、表面に付着させ表面に対して折り曲げられた核酸鎖のトポロジーが、プライマーの伸長の過程には好ましくなく、結果的に増幅効率が極めて低くなる（アデッシ（Adessi）他、Nucleic Acids Res. ２８（２０００）、ｅ８７）。このことを補償するために、極めて多数の増幅サイクルが必要となり、このことは、核酸分子が受けるかなりの熱応力による鎖の破損と、プライマーの、表面からの部分的な離脱とを生じ得る。第２に、増幅産物は、両端において表面に付着している限り、ハイブリダイゼーションまたは配列決定によるさらなる解析に利用することができない。したがって、核酸分子の片側の離脱が必要になる。換言すると、解析が開始され得る前に、２つの端部の一方を選択的に表面から離脱させなければならない。この離脱は次いで、ＷＯ  ９８／４４１５１に記載された適切な制限酵素とともにインキュベーションすることによって達成され得るが、問題がないわけではない。なぜなら、制限酵素が、固体の担体に結合された核酸を完全に切断し得ないことが多いためである。この方法のさらなる欠点は、たとえばそのハイブリダイゼーション挙動により興味の対象になっていることが考えられる一本鎖核酸のアイランドを、復元および同定できない点である。さらに、アイランドを形成する極めて短い伸長鎖（約１５〜２０塩基）の核酸以外の配列決定の可能性は開示されていない。
【０００５】
当該技術から公知の、核酸の配列を決定するための方法は、以下の欠点の１つ以上により特徴付けられる。
【０００６】
−  これらの方法は、個々の配列決定反応の並行処理を可能にする際に、かなりの制約を受ける。
【０００７】
−  これらの方法は、１回の配列決定反応につき、高いコストを生じる。
【０００８】
−  これらの方法は、配列決定されるべき核酸を、相対的に大量に必要とする。
【０００９】
−  これらの方法は、短い伸長鎖のＤＮＡの配列の決定にのみ適しており、機器装備の点でかなりの労力を要する。
【００１０】
ＷＯ  ０１／６１０５４は、複数の孔部により特徴付けられる基板上で複数の微量反応を同時に実施するための方法を開示している。孔部により反応チャンバが形成され、反応チャンバ内の液体は、孔部における表面張力により保持される。特に、微量反応は、配列決定反応であり得る。チェインターミネーション法に従ってサイクルシークエンシングを実施すると、標識されかつ長さの異なる一本鎖の核酸が生成され、その後、これらの核酸を、そのサイズに応じて、たとえばキャピラリー電気泳動法またはゲル電気泳動法により分離する。配列は、バンドパターンから決定され得る。
【００１１】
この方法は、いずれの場合も、配列を得るために分離のステップを導入しなければならないという欠点を有する。標識された核酸の分離がゲル電気泳動法により実施される場合、反応量の、ゲルへの転写に関する処理の問題に加え、容量が小さいことによる、検出の感度に関する問題が生じる。この分離がキャピラリー電気泳動法により実施され得る場合、印加される高電圧により生じる絶縁の問題が生じる。加えて、電気力線に沿って基板を正確に配置することは難しい。最後に、Ｔａｑポリメラーゼに基づいた配列決定方法は、熱安定性ポリメラーゼに依存しない他の配列決定方法よりも著しく多くの配列決定エラーを生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
この発明の目的は、先行技術の欠点を有さない方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この発明の目的は、核酸の大規模並行配列決定のための方法により達成され、この方法は、
（１）  固定化された核酸分子により区別される領域を有する多孔性の担体を提供するステップと、
（２）  流通構成体内にステップ（１）の担体を挿入するステップと、
（３）  少なくとも一部の核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列を同時に決定するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
多孔性の担体は、中空の空間を含む固体である。この担体は、ゲル状であってよいが、好ましくは固体である。中空の空間は、液体または気体で充填され得、特に、担体を取巻く液相または気相がこれらの中空の空間を浸透し得る。中空の空間は、規則的または不規則的な任意の形状を有し得る。多孔性の担体の中空の空間は、本質的に同じサイズおよび／または形状を有し得るが、異なるサイズおよび／または形状を有することもできる。いずれの場合も、多孔性の担体は、開放孔を有する固体であるものとし、したがって、中空の空間は、互いにおよび／または周囲の液体媒体または気体媒体と少なくとも部分的に連通するものとする。ここで、「連通する」とは、拡散、対流、または能動輸送の過程、たとえば圧力差を生じることにより達成され得る過程によって物質を交換する可能性を意味する。このことは、多孔性の担体が１つではなくいくつかの固体であり、たとえば、同一または非同一の固体粒子からなる、中空の空間を有するパッキンであるという可能性を除外することを意味しない。多孔性の担体の材料は、構造（上記を参照）、湿潤性、耐溶剤
性、耐温性、核酸の配列決定が実施されるステップとの互換性等に関する要件が満たされる限り、ほぼ任意に選択され得る。多孔性の担体は、ポリマー、ガラス、シリコン、または、別の金属、半金属、もしくは非金属の物質を含み得る。また、たとえば異なるモノマーの共重合によるか、異なる材料を含む粒子の焼結によるか、多孔性の固体の中空の空間の壁面を１つ以上の他の任意の物質で被覆するか、または強度を媒介するマトリクスに充填材料を加えることにより、２つ以上の材料から多孔性の担体を製造することも考えられる。大抵、この発明の目的を達成するために用いられる多孔性の担体は、規則的に、特に平坦に、好ましくは担体に上面と底面とをそれぞれ割当てることができるように平行かつ平らな２つの表面を有して形成される。担体は、かなりの程度まで任意の厚さを有し得るが、５０μｍと２０ｍｍとの間の厚さ、特に３００μｍと１ｍｍとの間の厚さが好ましい。チャネルにより区別される多孔性の担体を用いることが特に好ましく、特に、そのチャネルが一方側では担体の上面により、他方側では担体の底面により境界を定められることによって、その上面と底面とがチャネルの少なくとも一部を介して互いに連通する支持体を用いることが特に好ましい。チャネルは本質的に互いに平行であり、および／または、支持体の上面および／または支持体の底面に対して直角またはほぼ直角であることが好ましく、加えて、チャネルが円筒形であり、本質的に同じ直径を有し、したがって平均径からたとえば１０％を超えて、または５０％を超えて逸脱しないことが好ましい。原則として、チャネルの直径は、２００μｍを超えないものとする。好ましい態様において、チャネルの直径は、１００μｍ以下、３０μｍ以下、１０μｍ以下、３μｍ以下、１μｍ以下、または０．３μｍ以下である。特に好ましい態様において、チャネルの直径は、０．５μｍと５０μｍとの間であり、特に５μｍと２５μｍとの間である。多孔性のシリコンウェハの使用と同様に、いわゆる「ガラスキャピラリーアレイ」（「ＧＣＡ」、バール・エレクトロオプティクス・インク（Burle Electro-Optics, Inc.）、スターブリッジ（Sturbridge）、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）または「ナノチャネルガラス」（トヌッチ（Tonucci）他、サイエンス  ２５８：７８３〜５（１９９２））の使用が特に好ましい。
【００１５】
ステップ（１）の領域は、１つ以上の中空の空間、特に１つ以上のチャネルを含み得る。領域は、多孔性の担体自体の特性（たとえば特別な形状等であるが、このようなものを除外しないものとする）によって優先的に規定されず、むしろ、固定化された核酸分子の不均等な分散により規定される。たとえば、特定のチャネルは、その壁面に固定化された特異的な種類の核酸分子を含み得、このチャネルに近接する隣のチャネルは上述の種類の核酸分子を含まない。そのようにして、このチャネルは独自の領域を形成する。しかしながら、隣接するいくつかのチャネル（すなわち、互いに近接するチャネル）が、その壁面に沿って固定化された同種の核酸分子を含むこともでき、このとき領域は、上述のこれらのチャネルのすべてにより形成される。
【００１６】
いずれの場合も、領域内に固定化される核酸分子は、当然ながら、それらの配列の決定を可能にするために、本質的に同一の配列を有するものとする。しかしながら、ここで、配列決定の過程に関与しない、異なる配列の核酸分子は、何ら害を及ぼさない。「同一の配列を有する」とは、核酸分子の一本鎖と、本質的に相補的な配列の、それらに「対向する鎖」と、鎖および対向する鎖から形成される二本鎖とを指す。たとえば少なくとも１つの同一の配列部分と少なくとも１つの非同一の配列部分とを有し得る、部分的にしか同一の配列を有していない核酸分子は、配列決定が主にその同一の配列部分に関している限り、やはり害を及ぼさない。
【００１７】
固定化された核酸分子を担持する領域の生成は、予め生成された核酸分子溶液を多孔性の担体に移送した後に固定化することと、いずれの場合も、担体の部位、特に担体の中空の空間内で１つの出発分子を増幅することによって同一の配列を有する多数の核酸分子をインサイチュ生成することとにより可能であり、その過程で、増幅中および／または増幅後に固定化が生じ得る。当然ながら、予め生成された核酸分子溶液の形で担体に移送され
た核酸分子を最初に増幅した後に固定化することもさらに可能である。いずれの場合も、予め生成された核酸分子溶液は、いずれの場合も優先的に１種類の核酸分子の溶液の収集物であり、この収集物を微量定量プレート等の適切な容器に沈殿させることができる。核酸分子は、たとえばゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの処理により生成され得る。好ましい態様において、ゲノムＤＡＮＮは、大抵の場合、頻繁に切断する１つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより切断され、結果的に得られたフラグメントをクローニングし、それらのクローン（ファージクローン、細菌性クローン、または酵母クローン等）から単離したＤＮＡまたはインビトロで生成したそのコピーを「ゲノムライブラリ」として保管する。さらに好ましい態様において、ｍＲＮＡは第１の鎖のｃＤＮＡに転写され、これが二本鎖のｃＤＮＡに変換され、ゲノムＤＮＡに対して説明した過程が続く。核酸分子溶液の、多孔性の担体への移送は、ＤＮＡアレイを生産するための最新技術に従った方法により行なわれ得、たとえば、特別に形成された針（「ピン」）、キャピラリーの助けを借りて、または、インクジェット技術（ピエゾ技術もしくはバルブジェット技術等）の使用により、適量の液体（１ｎｌと１００ｎｌとの間等）を多孔性の担体の表面にアプライすることによって行なわれ得る。通常、アプライされた液体は、毛管作用により担体に吸収され、それにより、或る特定の核酸分子を含むそれぞれの領域が、移送された液滴（または適切であればいくつかの液滴）により充填された（すなわち、その壁面が湿潤している）担体の中空の空間のすべての範囲から生じるようにする。特別な場合、上述の領域は、１つの中空の空間のみ、たとえば１本のキャピラリーのみを含む。しかしながら多くの場合、領域は、いくつかの隣接する中空の空間／キャピラリーを含む。
【００１８】
予め生成された核酸分子溶液で多孔性の担体の中空の空間を充填する代わりに、個々の核酸分子を「クローン」に増幅すること、すなわち、本質的に同じ配列を有しかつ担体の異なる領域に局在化された核酸分子を集積することによって固定化された領域を生成することが意図される場合、通常は最初に、適切な増幅混合物内で増幅されるべき核酸分子混合物の、適切に希釈された溶液が調製される。この溶液は、増幅されるべき「鋳型」分子に加え、増幅反応を実施するのに必要とされる成分、特に水性緩衝剤、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、イオン、少なくとも１つのポリメラーゼ、および多くの場合、増幅プライマーを含む。この溶液で担体の中空の空間が部分的にまたは完全に充填されるように、多孔性の担体にこの溶液を接触させる。好ましい態様において、鋳型核酸分子の濃度は、複数の中空の空間内に１以下の増幅可能な鋳型核酸分子が存在するように選択される。さらなる好ましい態様では、計算による平均で０．５以下の増幅可能な核酸分子が１つの中空の空間内に存在する。別の好ましい態様では、計算による平均で０．２以下の増幅可能な核酸分子が１つの中空の空間内に存在する。さらに別の好ましい態様では、計算による平均で約０．１と０．０２との間の増幅可能な核酸分子が１つの中空の空間内に存在する。多孔性の担体の中空の空間内に増幅溶液を導入した後に増幅条件が確立された場合、増幅可能な鋳型分子を含む中空の空間で、全く同じコピーが生成される。鋳型分子の１０6以上のコピーの生成が好ましく、１０7以上のコピーまたは１０8以上のコピーの生成が特に好ましい。ここで、増幅は、任意の適切な等温または非等温の方法、たとえばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＲＮＡ増幅、ローリングサークル複製、またはＱベータレプリカーゼを介した複製によって生じ得る。この増幅の結果、いずれの場合も、多孔性の担体の多くの中空の空間は、いずれの場合も１つの核酸分子の多数のコピー、好ましくは１０6以上、１０7以上、または１０8以上のコピーを含み、その過程において、異なる中空の空間は一般に、異なる配列を有する核酸分子の少なくとも部分的なコピーを含む。増幅されるべき核酸分子として、たとえばゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、または非短縮ｃＤＮＡ分子（いわゆるフルサイズｃＤＮＡ）から得られる制限フラグメントを使用することもできる。好ましい態様において、これらの制限フラグメントまたは分子には、一方端または両端に、いくつかの異なる分子に共通であるか、または好ましくはすべての分子に共通である「汎用」プライマー結合部位が設けられる。このことは、適切なベクター内でのクローニングだけでなく、「リンカー」、すなわち、たとえば１５ｂｐと５０ｂｐとの間の長さの二本
鎖のＤＮＡ分子を付着させることによっても生じ得る。増幅反応を実施するために、中空の空間から水が蒸発することを減じるか、または完全に防ぐことが望ましいと考えられる。このことは、多数の異なる措置によって達成され得る。たとえば、増幅溶液を含む多孔性の担体を、水蒸気で飽和した大気内に導入するか、または、パラフィン油または鉱油等の疎水性の物質に接触させることができる。さらに、担体の一面または二面を、担体を封止する面に接触させることができる。これらは、たとえばガラスまたはポリマーを含み得る。増幅を実施するための好ましいスキームでは、増幅溶液を含む多孔性の担体の一方の表面を、その温度が適切に制御されるかまたは適切に制御され得る表面に接触させ、かつ、他方の表面を油でカバーする。それにより、増幅に適した１つの温度／複数の温度が確立される。さらなる好ましい態様では、増幅溶液を含む多孔性の担体を、その温度が適切に制御されるかまたは適切に制御され得るオイルバスに浸漬し、それにより、この油は増幅に適した１つの温度または複数の温度に調節される。各場合において、非等温性の増幅反応を実施することにより、適切な場合は周期的な配列決定において適切な温度変化を生じることができる。
【００１９】
この発明の方法の変更例において、手順は上述の態様と同様であるが、増幅により生成される核酸分子は多孔性の担体の壁面に固定化されるのではなく、壁面に接触する、好ましくは平らな表面に固定化される。そして、固定化が増幅中および／または増幅後に実施され得る。固定化の後に多孔性の担体はその表面から除去され、それによって固定化された核酸分子がその表面上の規定された領域として存在するようにする。その後、その表面上の領域に存在する上述の核酸分子の配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）に述べる手順の１つに従って少なくとも部分的に決定される。したがって、上述の変更例は、核酸分子の大規模並行配列決定のための方法に関し、この方法は、
（１）  多孔性の担体を提供するステップと、
（２）  多孔性の担体の中空の空間内に、増幅可能な核酸分子を含む増幅混合物を導入するステップと、
（３）  多孔性の担体の中空の空間内で核酸分子の増幅を行なうステップと、
（４）  多孔性の担体を表面に接触させるステップとを含み、このステップは任意に、増幅を行なうステップの前に実施され、この方法はさらに、
（５）  ステップ（３）の増幅された核酸分子の少なくとも一部を表面に固定化するステップと、
（６）  表面に固定化された核酸分子の少なくとも一部のヌクレオチド配列の少なくとも一部を同時に決定するステップとを含む。
【００２０】
核酸分子の固定化は、当該技術から公知の方法に従って実施され得、分子が末端において固定化されること、すなわち、それらの３′−末端または５′−末端を介して固定化されることが好ましい。この固定化は不可逆性であるものとし、すなわち、ステップ（３）において、ヌクレオチド配列の決定に必要とされる条件下において（温度、イオン強度、酵素活性等）、最大でも一部の固定化された分子、優先的には１０％以下または５０％以下の固定化された分子が多孔性の担体から離脱する。特に好ましくは、核酸配列の決定中に、固定化された核酸分子の５％以下、または１％以下が離脱する。この固定化は、非共有結合の相互作用により媒介され得、たとえば、固定化されるべき核酸分子はビオチン基を担持し得る。この場合、多孔性の担体は、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆され、それによって、ビオチン修飾した核酸分子が、被覆された担体に結合され得るようにする。しかしながら、共有結合の相互作用による核酸分子の固定化が好ましい。このため、通常は適切に修飾された核酸分子が使用され、たとえば５′−または３′−末端アミノ基（「アミノ修飾子（Aminomodifier）」グレン・リサーチ（Glen Research）、スターリン（Sterling）、バージニア（Virginia）２０１６４：カタログ（Catalog）２００２、ｐ．５６ｆ．参照）、末端チオール基、末端リン酸基、アクリダイト（Acrydite）基、カルボキシ−ｄＴ基、または別の反応基を含む核酸分子が用いられる。所望される場合、固
定化を媒介する反応基と核酸分子との間に任意の種類のスペーサまたはリンカー、たとえばオリゴエチレングリコールスペーサまたは開裂可能な基、たとえばジチオール基または光分解により開裂可能なニトロベンジル基が存在してよい。このような開裂可能な基により、所望される場合、適切な条件を調節した後に、多孔性の担体からの離脱による、固定化された核酸分子の復元が可能になる。当然ながら、固定化を媒介する基を、核酸分子の他の位置、たとえばヌクレオチド塩基の側鎖だけでなく、核酸分子の末端に位置付けることもできる。後者は、たとえば核酸分子の生成中におけるアミノアリルｄＵＴＰまたはビオチンｄＵＴＰの取込みにより想定することができる。いずれの場合も、最初に担体と核酸分子とが適切な態様で調整され、それによっていずれの場合も、担体と固定化されるべき核酸分子とが、２つのパートナーからなる特異的な結合対のうちの１つのパートナーを有するようにし、かつ、両方のパートナーを互いに結合することにより核酸分子の固定化が生じ得るようにする。この文脈では、当然ながら、さらなる成分が同様に結合対の両方のパートナーの結合に関与し得ることが除外されないものとする。生体分子の固定化に対しては、当該技術から公知の多数の方法が存在し、その例は、たとえば Nucleic Acids Res. ２２、５４５６〜６５（１９９４）、および Nucleic Acids Res. ２７、１９７０〜７７（１９９９）に提示されている。固定化の過程で達成されるべきさらなる目標は、表面上における適切な高密度の核酸分子であり、これにより、配列決定の過程中に十分なシグナル強度が保証されるはずである。分子生物学の適用から公知の蛍光体、たとえばＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、またはＣｙ５が用いられて、配列決定されるべき各核酸分子が１つの蛍光体により標識される場合、表面上の核酸分子の密度は、優先的に１０分子／μｍ2以上、１００分子／μｍ2以上、１，０００分子／μｍ2以上、または１０，０００分子／μｍ2以上である。
【００２１】
増幅により生成される核酸分子の固定化は、増幅中または増幅後にのみ生じ得る。増幅中に、プライマー伸長に基づいた増幅のための方法を用いることにより固定化が可能であり、たとえばＰＣＲの過程で、溶液内に存在するプライマーに加え、中空の空間の内壁に一部が既に固定化されたプライマー（または、たとえばＷＯ  ９６／０４４０４に記載されたもの等の、まさに排他的に固定化されたプライマー）を用いることにより固定化が可能である。このプライマーは次に、一本鎖の鋳型分子にハイブリダイズし得るだけでなく、プライマーの伸長によってその後取込まれ得る。したがって、この発明の精神に従い、溶液内に存在する核酸分子の固定化は、溶解分子にハイブリダイズされたプライマーの伸長、したがって、液相から固体相への分子の「転写」による、対向する相補的な鎖分子の合成も意味し得る。
【００２２】
ステップ２の流通構成体の特徴は、多孔性の担体を介して互いに接続された２つの空間であり、それによって液体は、これらの空間の一方から多孔性の担体を通ってこれらの２つの空間の他方へと流動し得る。この構成体のさらなる特徴は、液体の能動輸送が可能になるように両方の空間と空間との間に圧力差を生じるための手段であり得る。ここで、液体は溶液を意味し、通常は、ステップ（３）においてヌクレオチド配列の決定に必要とされる試薬を特に含む水溶液を意味する。好ましい態様において、流通構成体は、多孔性の担体に固定化された核酸分子を必要とする過程の観察が可能であるように設計される。「観察」とは、ここで、固定化された核酸分子を含む領域の選択された特性、たとえば伝導率、容量、屈折率、ルミネセンス、蛍光、放射の吸収等の変化の表示を意味する。光学現象、特にルミネセンスまたは蛍光の観察が特に好ましい。したがって、この発明の方法を実施するために使用される装置のさらなる特徴は、上述の表示を可能にする少なくとも１つの検出器であり、したがって、特に、赤外域、可視域および／または紫外域の光を検出することができる光学検出器である。この検出器は、共焦点顕微鏡から公知の装置であり得る。別の態様において、検出器は、多孔性の担体の上または内部において十分な解像度での観察が可能な、光学系を備えたＣＣＤカメラである。優先的に、このＣＣＤカメラの１画素に投影される多孔性の担体の領域は、１００μｍ×１００μｍ以下のサイズ、特に
１０μｍ×１０μｍ以下のサイズ、または２μｍ×２μｍ以下のサイズを有する。配列決定の過程が蛍光により標識された分子により観察されることが意図される場合、この発明の方法を実施するために使用される装置のさらなる特徴は、蛍光を生じさせるのに適した少なくとも１つの放射源、優先的には単色光源、特にレーザ源である。
【００２３】
固定化された核酸分子の配列の少なくとも一部を同時に決定することは、任意の方法で実施され得るが、優先的には、段階的な鎖の合成または鎖の分解によって実施される。「段階的な」とは、配列決定の過程で修飾される核酸の鎖が、いずれの場合も同じ量だけ、すなわち、既知の数のヌクレオチド分だけ、優先的にはいずれの場合も厳密に１つのヌクレオチド分だけ、同時に伸長または短縮することを意味する。各段階において、多孔性の担体のいくつかの領域か、優先的にすべての領域か、または本質的にすべての領域に固定化された核酸分子に対して、それぞれのヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列の同一性が決定される。核酸分子の配列決定は、たとえば以下の態様で実施され得る。
【００２４】
ａ）  反応副産物の決定時における、ヌクレオチド三リン酸（「通常の」ヌクレオチド、ｄＮＴＰ）の取込み。
【００２５】
ｂ）  標識されたヌクレオチドの取込み。
【００２６】
ｃ）  可逆的に標識されたヌクレオチドの取込み。
【００２７】
ｄ）  標識された可逆的チェインターミネータヌクレオチドの取込み。
【００２８】
手順（ａ）に従って配列決定が行なわれると、ヌクレオチド三リン酸の取込みに関連するピロリン酸塩の形成が測定され得る。このため、スルフリラーゼを用いることにより、生成されたピロリン酸塩をＡＴＰに変換することができ、このＡＴＰは次いで、ルシフェラーゼの触媒作用を利用した化学発光反応に関与し、したがって検出され得る（Ronaghi 他、Analyt. Biochem. ２４２、８４〜８９（１９９６）参照）。
【００２９】
手順（ｂ）に従って配列決定が行なわれると、配列決定されるべき核酸鎖を含む部分的な核酸の二本鎖が、ポリメラーゼ触媒されたフィルイン反応に好ましい条件下において、いずれの場合も１種類の標識されたヌクレオチド（標識されたｄＡＴＰ等）とともにインキュベートされる。取込まれなかったヌクレオチドを洗浄除去してから、ラベルを検出することにより、ヌクレオチドが取込まれたか否か、またはいくつのヌクレオチドが取込まれたか（１×Ａ、２×Ａ等）が決定される。次のステップにおいて、部分的な核酸の二本鎖は、第２の種類の標識されたヌクレオチド（標識されたｄＣＴＰ等）とともにインキュベートされて検出され、その後、第３の種類のヌクレオチド（標識されたｄＧＴＰ等）とともにインキュベートされて検出され、最後に、第４の種類のヌクレオチド（標識されたｄＴＴＰ等）とともにインキュベートされて検出される。次に、第１の種類の標識されたヌクレオチドを加えることにより、サイクルが再び開始される。検出値に測定されるシグナル強度は、いずれの場合も、最後に行なわれたヌクレオチドの取込みと、それまでに行なわれたすべてのヌクレオチドの取込みとのシグナル強度の総和から生じる。
【００３０】
（ｃ）に従った手順において、取込まれたヌクレオチドの標識は、たとえば、ヌクレオチドを加えるごとにその後で、または４つの異なるヌクレオチドのすべてを順次加えることを含む各サイクルの後に、またはそれらの一回以上の繰返しからなる各サイクルの後に等の適切な時点で削除される。優先的に、このことは、１つの標識基または複数の標識基の除去または変更によって生じる。たとえば、標識基は、化学的、光化学的、または酵素的に開裂可能なスペーサ、たとえばジスフィルド基またはニトロベンジル基を含むスペーサを介してそれぞれのヌクレオチドに結合され得る。標識基を修飾する１つの可能性は、
たとえば、蛍光染料の漂白であり、このことは、レーザによる十分に強い照射により可能となる。手順（ｂ）に勝る手順（ｃ）の利点は、測定毎に、既に取込まれたヌクレオチドのシグナルのバックグラウンドを考慮する必要なしに、いずれの場合も取込まれたヌクレオチドの一部のみが決定されること、理想的にはいずれの場合も最後に取込まれたヌクレオチドのみが排他的に決定されることである。既に取込まれたヌクレオチドのシグナルのバックグラウンドは、興味の対象となっているシグナルのバックグラウンドの数倍になることが多い。
【００３１】
手順（ｄ）に従った配列決定は、たとえばＵＳ−Ｐ  ５  ３０２  ５０９に記載されるように実施され得る。ここで、核酸鎖のヌクレオチドに関する伸長は、それらの３′−ＯＨ基において可逆的にブロックされたヌクレオチド三リン酸を使用することによって達成され、このヌクレオチド三リン酸は、ポリメラーゼにより、成長中のＤＮＡ二本鎖内に取込まれ得るが、取込まれた後に、チェイン伸長ターミネータとして働く。ブロック基が開裂されると、遊離３′−ＯＨ基が再び確立され、それによって次のヌクレオチドが取込まれ得るようにする。たとえば、カナール（Canard）およびサルファティ（Sarfati）（ジーン（Gene）１４８、１〜６（１９９４））は、可逆的保護基を蛍光標識することによって取込まれた後に同定され得る、可逆的にブロックされるヌクレオチド三リン酸を記載している。
【００３２】
固定化された核酸分子が手順（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）に従ってステップ（３）において配列決定されるべき場合、通常は、核酸分子の少なくとも一部が少なくとも部分的に一本鎖の状態で存在する。公知の塩基対形成の規則に従って成長中の鎖内にヌクレオチド構成単位を取込むことによる配列決定を行なうことができるように、通常、いわゆる配列決定用プライマーが必要とされ、すなわち、配列決定されるべき核酸鎖とハイブリダイズすることが可能であって、かつ、その３′−末端においてＤＮＡポリメラーゼにより伸長し得るようにハイブリダイズされた状態で存在する、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが必要とされる。この過程で、配列決定されるべき領域に相補的な、対向する鎖が合成される。したがって、実際の配列決定に先立つステップとして、固定化された核酸分子は、適切であれば、対向する鎖を除去することによって一本鎖の状態にしばしば変換され、その後、その核酸分子に少なくとも部分的に相補的であって、かつ、ポリメラーゼによる伸長が可能な３′−末端を有する適切な配列決定用プライマーが、この核酸分子とハイブリダイズされる。別の態様では、核酸分子に３′−末端のヘアピン構造を形成させるか、または、このような構造を核酸分子に付着させることが可能であり、一部がポリメラーゼによって伸長し得る（ＵＳ−Ｐ  ５  ７９８  ２１０参照）。特に好ましい態様において、多孔性の担体に固定化されるべきであり、かつ、ステップ（３）において配列決定されるべき核酸分子には、末端において、優先的には一方端を介した固定化の後に溶液の空間内に突出する他方端において、折り返されるかまたは折り返され得る一本鎖または二本鎖の核酸分子、たとえば部分的に自己相補的なオリゴヌクレオチドがさらに与えられる。また、二本鎖の状態で存在する核酸分子に対し、固定化の前に、「マスクされたヘアピン」、すなわち、逆向き反復配列を含む二本鎖の核酸分子を付着することが可能である。固定化の後に変性によって２つの鎖の一方を除去すると、配列決定されるべき核酸分子に残存しかつこの核酸分子に５′−末端を介して付着した、対向する鎖が、次に「折り返され」得、ポリメラーゼによりその遊離３′−末端において伸長され得る。
【００３３】
当然ながら、それ自体が公知である配列決定方法の上述の例は、この発明の方法の範囲内で使用される他の配列決定方法を除外するように意図されない。
【００３４】
この発明は、以下の説明により、より綿密に特徴付けられる。
【００３５】
この発明は特に、核酸の並行配列決定を行なうための方法に関し、この方法は、
（ｉ）  モノリシックな多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、核酸分子がそれに対して固定化される１つ以上の表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有し、核酸は一本鎖の部分を有し、多孔性の担体は、異なる配列の核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ii）  モノヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドから選択される１つ以上のヌクレオチド化合物を含む溶液を提供するステップと、
（iii）  それにより、ヌクレオチド化合物の、固定化された核酸の一本鎖の部分への結合、したがって多孔性の担体への媒介された結合が行なわれる、多孔性の担体の試料チャンバ内にステップ（ii）の溶液を導入するステップと、
（iv）  多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において、固定化された核酸により多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチド化合物の量および／または同一性を検出するステップとを含む。
【００３６】
ステップ（ii）から（iv）は１回または数回繰返され得、その過程で各サイクルにより配列情報が得られる。
【００３７】
多孔性の担体の試料チャンバ内にステップ（ii）の溶液を導入するステップは、試料チャンバを通る、ステップ（ii）の溶液の流れを生じることにより、ステップ（iii）において実施される。
【００３８】
ステップ（iv）において、検出は、ヌクレオチド化合物が多孔性の担体に間接的に結合されたか否かに関して行なわれる。ステップ（ii）の溶液がいくつかのヌクレオチド化合物を含む場合、ステップ（iv）では、どのヌクレオチド化合物が結合されたかが試験され、すなわち、その同一性が決定される。通常、有意なシグナルとバックグラウンドとを区別することができるように、結合されたヌクレオチド化合物の量を測定することも必要とされる。或る状況下では、その量をより厳密に測定することが適切である。このことは、可能性として、ステップ（iii）において、固定化された核酸の一本鎖の部分にいくつかのヌクレオチド化合物が結合され得る場合と、たとえばチェインターミネーション基を有さないヌクレオチドを用いた、酵素による鎖の伸長による配列決定の過程において、これにより配列についての結論が導出され得る場合とに当てはまる。
【００３９】
多孔性の担体は、中空の空間を有し、かつ、ゲル状であり得るが優先的には固体である固体本体を含む。中空の空間は、液体によって充填され得るだけでなく気体によっても充填され得、特に、この担体を取り巻く液相または気相がこれらの中空の空間を浸透し得る。中空の空間は、規則的または不規則的な任意の形状を有し得る。多孔性の担体の中空の空間は、本質的に同じ形状および／またはサイズを有し得るが、不均一な形状および／またはサイズも有し得る。優先的に、中空の空間は、気体での充填時に毛管力によって液体の溶液を吸い上げることができるように、または、液体での充填時に液体を保持することができるように、寸法が決定される。
【００４０】
いずれの場合も、多孔性の担体は、開放孔を有する固体を指すものとし、すなわち、中空の空間が、固体を取り巻く液体媒体または気体媒体と少なくとも部分的に連通し得るものとする。さらに、中空の空間が互いに連通することも考えられる。ここで、「連通する」とは、圧力差を確立することによって達成され得るような、たとえば拡散、対流、または能動輸送の過程による物質の交換の可能性を意味する。
【００４１】
多孔性の担体は、凝集性の固体、モノリスであり、たとえば緊密に、特に共有結合により接続された同一のまたは非同一の固体粒子またはキャピラリーからなる、中空の空間を有するパッキンである。多孔性の担体の材料は、構造（上記を参照）、湿潤性、耐溶剤性
、耐熱性、実施されるべき核酸の配列決定のステップとの互換性等に関する要件が満たされる限り、本質的には任意に選択され得る。多孔性の担体は、ポリマー、たとえば異なるモノマーのコポリマー、ガラス、シリコン、または別の金属、半金属、もしくは非金属の物質で形成され得る。また、たとえば、異なる材料で形成された粒子を焼結するか、多孔性の担体の中空の空間の壁面を１つもしくはいくつかの任意の異なる物質で被覆するか、または強度を媒介するマトリクスに充填材料を加えることにより、２つ以上の材料からなる多孔性の担体を製造することも考えられる。通常、この発明の目的を達成するために使用される多孔性の担体は、規則的に、特に平坦に、優先的には平行かつ平らな２つの表面を有して形成される。通常、多孔性の担体は、互いに対向する表面、すなわち、互いに隣接しない表面を有し、これらの表面は優先的に、互いに本質的に平行であり、すなわち第１の面および第２の面であり、これらの表面は優先的に、担体の上面と底面とをそれぞれ現わし、優先的に（必ずしもそうである必要ではないが）平らである。担体は、かなりの程度まで任意の厚さを有し得るが、５０μｍと２０ｍｍとの間の厚さ、特に３００μｍと１ｍｍとの間の厚さが好ましい。
【００４２】
多孔性の担体は、２つ以上、好ましくは１００よりも多く、１０3よりも多く、１０４または１０5よりも多く、１０6よりも多く、特に１０7よりも多くの試料チャンバを有し、これらのチャンバは中空の空間によって形成される。試料チャンバは、多孔性の担体の全体を通って延び、したがって多孔性の担体を通って外面から外面へと延び、その管腔内に１つ以上の面と少なくとも入口および出口とを有し、優先的には各場合において、１つの入口と少なくとも１つもしくはいくつかの出口とを有するか、または各場合において、１つの出口と少なくとも１つもしくはいくつかの入口とを有する。通常、試料チャンバは、内容物が液体である場合に、その内容物が毛管力により試料チャンバ内に保持されるような寸法によって特徴付けられる。
【００４３】
優先的に、試料チャンバは、その軸に沿って、規則的な、好ましくは円形または六辺形の断面を有する。試料チャンバは本質的に同じ直径を有し、したがって、平均径から５０％を超えて、特に１０％を超えて逸脱しないことが好ましい。しかしながら、焼結の手続きにより製造された多孔性の担体の場合のように、この断面は不規則であることも可能である。
【００４４】
さまざまな試料チャンバが互いに接続されていることは除外されない。このことは特に、焼結の手続きにより製造された多孔性の担体の場合に当てはまる。この発明の枠組内でこのような担体を使用することも可能である。この場合、個々の試料チャンバの判別を難しくする網状組織が存在する。この文脈では、試料チャンバの軸に沿った物質の運搬量が、２つの異なるチャンバ間における物質の運搬量を上回ることに留意されるべきである。試料チャンバの軸に沿った物質の（ステップ（iii）の拡散および対流による）運搬量と、２つの異なるチャンバ間における物質の運搬量との比率は、１０以上、好ましくは１００以上、特に１０００以上である。試料チャンバが、本質的に直線に延びることと、ステップ（iii）で試料チャンバを通る流れの生成を容易にする好ましい方向を有するように多孔性の担体内で配向されることとが好ましい。なぜなら、このようにして、１つの流れが複数の試料チャンバを通って一様に生じることが確保されるためである。試料チャンバの軸は、２つの点、すなわち入口の中心と出口の中心とにより規定される。試料チャンバがいくつかの入口または出口を有する場合、試料チャンバはいくつかの軸を有する。試料チャンバの軸は、優先的に、３０°未満、特に１５°未満、特に５°未満の角度を形成し、本質的に平行の配置が最も好ましい。
【００４５】
試料チャンバ内の核酸分子は、配列決定用試料を表わす。好ましくは、多孔性の担体内の核酸分子は仕切られており、すなわち、試料チャンバ内に固定化された核酸分子は、好ましくは、一本鎖の部分に関して本質的に同じ配列を有し、したがって、以下の定義の範
囲内において、好ましくは同一の配列を有する。「同一の配列を有する」という用語は以下に規定され、この発明の範囲内において、通常はそうであるものの、配列が厳密に同じでなければならないということを意味しない。「同一の配列を有する」という用語は、酵素により生成された核酸分子が、共通の鋳型核酸分子の間違った生成により配列の同一性からの逸脱を表わす配列エラーを有することが多いものの、そのエラーが十分に稀少であって配列決定を妨げないことを考慮に入れている。しかしながら、この文脈において、異なる配列を有して配列の決定に関与しない核酸分子は有害ではなく、すなわち、これらの核酸分子は、配列の同一性が与えられているか否かを考慮する際に考慮外に置かれる。また、部分的に同一の配列しか有さない核酸分子の配列の逸脱例、たとえば、少なくとも同一の配列部分と少なくとも非同一の配列部分とを有する核酸分子は、配列決定が主に配列の同一部分に関している限り、考慮外に置かれ得る。この発明の枠組内において、配列決定は優先的に、酵素により鎖を伸長させる方法に従って実施される。分子間のプライマー処理を用いる場合、配列決定は、酵素により鎖を伸長させる方法に従い、ポリメラーゼのプライマー処理に用いられる配列決定用プライマーが結合される部分に対する配列３′の部分のみに関連する。分子内のプライマー処理の場合、核酸は、ヘアピンを形成することができる場合にのみ配列決定に関与する。一般に、酵素により鎖を伸長させる方法に従った配列決定は、最大読出長さに対応するだけの数の塩基に関し、核酸分子の二本鎖の部分と一本鎖の部分との間の境界から３′−方向に延びる核酸の一部にのみ関連する。
【００４６】
好ましい態様において、多孔性の担体は、各々が異なる配列を有する核酸を有する、１００以上、特に１００以上、特に１０3以上、１０4以上、１０5以上または１０6以上、特に１０7以上の区別可能な部位を含み、配列の差は、好ましくは核酸の一本鎖の部分を指す。したがって、ステップ（ｉ）における区別可能な部位は、好ましくは、異なる配列を有する一本鎖の部分を備えた核酸を有する。「区別可能な」という用語は、ステップ（iv）で実施される検出を指し、その空間解像度により、区別可能な部位の同定が可能にならなければならない。この発明に従った部位は、２次元または３次元の拡張を有する。
【００４７】
好ましくは、区別可能な部位は、各場合において、多孔性の担体（より厳密にはその表面）上に、少なくとも１つの試料チャンバを含むが、いくつかの試料チャンバを含むこともできる。これらの試料チャンバは、いずれの場合も、多孔性の担体上の少なくとも１つの中空の空間により形成される。
【００４８】
この発明の好ましい実施例において、試料チャンバはチャネルとして設計される。これらのチャネルはキャピラリーであり得る。
【００４９】
チャネルは、少なくとも入口と出口とを形成することによって担体の第１の面および第２の面に対して開放され、それによって担体の両面、たとえば上面と底面とがチャネルを介して連通するようにする。担体の二面が上面および底面である場合、チャネルは一方側で担体の上面によって境界を定められ、他方側で担体の底面によって境界を定められる。多孔性の担体内に閉じた端部を形成するチャネルは、上の定義に対応しないため、以下の説明は、この種のチャネルに言及しない。しかしながら、多孔性の担体内にこのようなチャネルが存在することは除外されない。
【００５０】
この発明の範囲内において、「チャネル」という用語は、接続されたもの、すなわち、互いに連通するものも含む。このことは、その各々が独自の入口および出口を有して互いに接続されたいくつかのチャネルにより、区別可能な部位が形成されることにつながり得る。実際には、これによって解像度の低下、すなわち、ステップ（ｉ）に従い多孔性の担体の１つの単位面積内に存在し得る区別可能な部位の最大数の減少を生じる。しかしながら、いくつかのチャネル間の連通の可能性にもかかわらず、チャネルの直径が十分な解像度を確保するほど十分に小さい限り、このことは有害にはならない。チャネルが部分的に
互いに接続されている多孔性の担体の一例は、パムジーン（PamGene）社（パムジーン、バーヘミスター（Burgemeester）ルーフプレイン（Loeffplein）７０Ａ、５２１１ＲＸ'ｓ−ヘルトゲンボシュ（Hertogenbosch）、ＮＬ）が販売する、PamChip（登録商標）−アレイと呼ばれる多孔性の担体である。
【００５１】
チャネルは、本質的に直線に延び、ステップ（iii）においてチャネルを通る流れを容易に生成する好ましい方向を有するように多孔性の担体内で配向されていることとが好ましい。なぜなら、このようにして、１つの流れが複数のチャネルを通って一様に生じることが確保されるためである。好ましくは、チャネルの軸は３０°未満の角度、特に１５°未満の角度、特に５°未満の角度を形成し、本質的に平行な配置が最も好ましい。
【００５２】
優先的に多孔性の担体の上面または底面を表わす担体の第１および／または第２の表面に対し、チャネルが直角にまたはほぼ直角に延びることがさらに好ましい。
【００５３】
チャネルは、円筒形または多角形、特に六辺形であることがさらに好ましい。チャネルは本質的に同じ直径を有し、したがって、平均径から５０％を超えて、特に１０％を超えて逸脱しないことがさらに好ましい。通常、チャネルの直径は２００μｍを超えるべきではない。好ましい実施例において、チャネルの直径は、１００μｍ以下、３０μｍ以下、１０μｍ以下、３μｍ以下、１μｍ以下、または０．３μｍ以下である。特に好ましい態様において、チャネルの直径は０．５μｍと５０μｍとの間、特に５μｍと２５μｍとの間である。この明細書で援用されているＷＯ  ９９／３４９２０およびＷＯ  ００／５６４５６に開示された基板を担体として用いることもできる。
【００５４】
いわゆる「ガラスキャピラリーアレイ」（「ＧＣＡ」、バール・エレクトロオプティクス・インク、スターブリッジ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）または「ナノチャネルガラス」（トヌッチ他、サイエンス  ２５８：７３８〜５（１９９２））の使用、または多孔性のシリコンウェハの使用が特に好ましい。
【００５５】
この発明の方法の好ましい態様において、ステップ（ｉ）は、
（ｉ−ａ０）  多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有して１つ以上の表面を有する少なくとも２つの試料チャンバを有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ｉ−ａ１）  それによって少なくとも２つの試料チャンバが核酸溶液で充填されるようにする、異なる配列を有する少なくとも２つの核酸分子を含む核酸溶液に多孔性の担体を浸漬するステップと、
（ｉ−ａ２）  試料チャンバ内で核酸分子を増幅するステップと、
（ｉ−ａ３）  その過程でステップ（ｉ−ａ２）および（ｉ−ａ３）が同時に実施され得る、多孔性の担体の試料チャンバの表面に核酸分子を固定化するステップとを含み、
（ｉ−ａ４）  核酸分子を、核酸分子が一本鎖の部分を有する状態に変換するステップとを含み、
その過程で（ｉ−ａ４）はまた、ステップ（ｉ−ａ３）の前にまたはステップ（ｉ−ａ３）と同時に実施され得る。
【００５６】
優先的に、ステップ（ｉ−ａ４）における核酸分子は、一本鎖の部分と二本鎖の部分とを有する。
【００５７】
この発明の方法のさらなる態様において、ステップ（ｉ）は、
（ｉ−ｂ０）  多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも１つの入口および１つの出口を有し、かつ、１つ以上の表面を有する少なくとも２つの試料チャンバを有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ｉ−ｂ１）  それによって少なくとも２つの試料チャンバが核酸溶液で充填されるようにする、多孔性の担体の異なる位置に、いずれの場合も異なる配列を有する核酸分子を含む少なくとも２つの核酸溶液を移送するステップと、
（ｉ−ｂ２）  多孔性の担体の試料チャンバの表面に核酸分子を固定化するステップと、
（ｉ−ｂ３）  核酸分子を、核酸分子が一本鎖の部分を有する状態に変換するステップとを含み、
その過程で、ステップ（ｉ−ｂ２）もしくはステップ（ｉ−ｂ１）の前に、またはこれらのステップの１つと同時に、ステップ（ｉ−ｂ３）を実施することもでき、その過程で、ステップ（ｉ−ｂ１）における核酸分子が一本鎖の部分を有する場合はステップ（ｉ−ｂ３）を省略することができる。
【００５８】
好ましくは、ステップ（ｉ−ｂ３）の核酸分子は、一本鎖の部分と二本鎖の部分とを有する。
【００５９】
ステップ（ｉ−ｂ１）の移送するステップは、好ましくはピン、キャピラリーの助けを借りて、またはインクジェット技術により実施される。
【００６０】
固定化され、かつ、領域内に、または別のバージョンに従いチャネル内に位置付けられる核酸分子の生成は、以下の２つの措置のうちの一方により可能である。
【００６１】
（ｉ−ａ）  各場合において、多孔性の担体の試料チャンバ内の１つの出発分子を増幅することにより、同一の配列を有する多数の核酸分子をインサイチュ生成する。
【００６２】
（ｉ−ｂ）  各場合において、多孔性の担体の異なる位置に、各場合において異なる配列を有する核酸分子を含む少なくとも２つの核酸溶液を移送し、その後、核酸を固定化する。
【００６３】
措置（ｉ−ａ）に従い、異なる配列を有する少なくとも２つの核酸分子を含む溶液、すなわち異なる核酸の混合物に多孔性の担体を浸漬し、その後核酸の増幅が行なわれる。まず、適切に希釈された、この混合物の溶液が生成され、増幅の成功に必要とされる成分が加えられる。この増幅溶液は、増幅されるべき核酸分子（鋳型分子）に加え、特に水性緩衝剤、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、イオン、少なくとも１つのポリメラーゼ、および選択された増幅方法に従って増幅プライマーも含む。多孔性の担体にこの溶液を接触させ、それによって担体の試料チャンバが、溶液で部分的にまたは完全に充填されるようにする。
【００６４】
この文脈において、増幅可能な核酸の濃度は優先的に、複数の試料チャンバ（またはチャネル）が１以下の（増幅可能な）核酸分子を含むように選択される。増幅可能でない核酸分子、特にプライマーは考慮されない。このようにして、異なる配列を有する核酸を有する区別可能な部位が、多孔性の担体上に形成される。後のステップ（ｉ−ａ４）において、二本鎖の核酸は、二本鎖の核酸が一本鎖の部分を有する状態に変換される。通常、核酸分子の、核酸分子が一本鎖の部分を有する状態への変換は、変性により生じる。
【００６５】
通常、異なる配列を有する核酸を有する、多孔性の担体の区別可能な部位は、このように、異なる配列を有する一本鎖の部分を備えた核酸を有する。このことは、配列の差が通常、一本鎖の部分に関連することを意味する。これは特に、酵素により鎖を伸長させることによって配列決定を行なう方法に当てはまる。ここで、部位の区別可能性は、これらの部位が多孔性の担体の異なる試料チャンバに配置されていること、したがって、検出時に互いに区別され得ることから生じる。上述の内容から、多孔性の担体上の区別可能な部位
は、結果的に、ランダムアレイに従って統計学的に配置される。
【００６６】
さらに好ましい態様では、計算による平均で０．５以下の増幅可能な核酸分子が１つの試料チャンバ内に存在する。別の好ましい態様では、計算による平均で０．２以下の（増幅可能な）核酸分子が１つの試料チャンバ内に存在する。さらに別の好ましい態様では、計算による平均で約０．１と０．０２との間の（増幅可能な）核酸分子が１つの試料チャンバ内に存在する。非増幅可能な核酸分子、特にプライマーは考慮されない。
【００６７】
次に、この分子は、（増幅可能な）核酸分子を含む試料チャンバ内で多数のコピーへと増幅される。核酸分子の１０6以上のコピーの生成が好ましく、１０7以上のコピーまたは１０8以上のコピーの生成が特に好ましい。増幅は、任意の適切な等温または非等温の方法、たとえばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＲＮＡ増幅、ローリングサークル複製、またはＱベータレプリカーゼの使用による複製に従って生じ得、ＰＣＲが好ましい。増幅の結果、増幅が行なわれた多孔性の担体の試料チャンバの各々は、各場合において１つの核酸分子の複数のコピー、優先的には１０6以上、１０7以上、または１０8以上のコピーを含み、異なる試料チャンバは一般に、異なる核酸分子の少なくとも部分的なコピーを含む。
【００６８】
ステップ（ｉ−ａ２）で増幅されるべき核酸分子は、たとえば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、または非短縮ｃＤＮＡ分子（いわゆるフルサイズｃＤＮＡ）から得られた制限フラグメントを表わし得る。
【００６９】
好ましい態様において、これらの制限フラグメントまたは分子には、一方端または両端において、いくつかの異なる分子に共通であるか、または好ましくはすべての分子に共通である、「汎用」プライマー結合部位が設けられる。このことは、適切なベクターへのクローン化により生じ得るが、リンカー、すなわち、たとえば１５ｂｐと５ｂｐとの間の長さを有する二本鎖のＤＮＡ分子を取付けることによっても生じ得る。増幅を実施するために、中空の空間からの水の蒸発を減じるか、または完全に防ぐことが望まれ得る。このことは、多数の異なる措置により達成され得る。たとえば、増幅溶液を収容する多孔性の担体を、蒸気により飽和された雰囲気に導入するか、または、疎水性の物質、たとえばパラフィン油または鉱油に接触させることができる。担体の１つの表面または２つの表面を、担体を密封する表面に接触させることもさらに可能である。これらの表面は、たとえばガラス、金属、またはポリマーで形成され得る。
【００７０】
増幅を実施するための好ましい態様では、増幅溶液を収容する多孔性の担体の一方の面を、その温度が適切に制御されるかまたは適切に制御され得る表面に接触させて被覆し、他方の面を油に接触させる。そのようにして、増幅に適した１つの温度／複数の温度が調節される。
【００７１】
さらに好ましい構成では、増幅溶液を収容する多孔性の担体を、その温度が適切に制御されるかまたは適切に制御され得るオイルバスに浸漬する。そして、この油は、増幅に適した１つの温度または複数の温度に調節される。各場合において、適切であれば、非等温性の増幅反応を行なうのに適した周期的な配列決定において温度を変化させることができる。
【００７２】
ステップ（ｉ−ａ３）における核酸分子の固定化は、ステップ（ｉ−ａ２）の増幅中または増幅後に実施され得る。
【００７３】
この方法の好ましい態様において、増幅はＰＣＲにより実施され、増幅中の固定化は、ＰＣＲ反応に関与するプライマーが試料チャンバの表面に固定化されることにより生じる。このため、いずれの場合も、プライマー対の一方のプライマーまたは両方のプライマー
が試料チャンバの表面に固定化される。プライマー対の一方のプライマーのみが固定化される場合、それぞれの試料チャンバ内のプライマー対の他方のプライマーは、遊離溶液中に存在し、すなわち固定化されない。また、プライマー対のプライマーは部分的にしか固定化され得ず、すなわち、プライマー対のうち或る一定の割合のプライマーのみが固定化される一方で、他の部分は固定化されない。このことは、増幅されるべき核酸の濃度が低い場合に、固定化されていないプライマーを利用できることから増幅の効率が比較的良好になるという利点を有する。このことは、増幅の信頼性に有益である。いくつかの増幅サイクルの後に、固定化されていないプライマーの減少が生じ、それによって、固定化されたプライマーにより増幅反応が継続するようにする。このことは、増幅の効率低下を生じるが、増幅された核酸分子の、試料チャンバの表面への固定化を生じる。
【００７４】
措置（ｉ−ｂ）に従い、各場合において、多孔性の担体の異なる位置への少なくとも２つの核酸溶液の移送が生じ、各溶液は、異なる配列を有する一本鎖または二本鎖の核酸分子を含む。したがって、ステップ（ｉ−ｂ１）の１つの核酸溶液は、各場合において、好ましくは、上述の定義に従って同一の配列を有する核酸分子のみを含む。特に、ステップ（ｉ−ｂ１）の１つの核酸溶液は、いずれの場合も、同じ配列を有する核酸分子のみを含む。
【００７５】
担体に移送された核酸分子はまず、適切であればそこで増幅され、その後初めて固定化され、または、最初に固定化されて、適切であればその後増幅される。しかしながら、増幅は任意である。増幅が重要な意味をなすか否かは、担体に与えられた核酸分子の個々の溶液内における核酸の量に依存する。
【００７６】
ステップ（ｉ−ｂ１）の核酸溶液は、同一の配列を有する核酸分子の溶液の完全な集合体であり得る。この文脈において、可能であれば、異なる配列を有する核酸分子を各々が含む核酸溶液が混合されないように、これらの溶液を多孔性の担体に接触させる。このようにして、１つまたはいくつかの試料チャンバを含み得る１種類の核酸分子の領域が、多孔性の担体上に形成される。このようにして、異なる配列を有する核酸を保持する区別可能部位が、多孔性の担体上に形成される。後のステップ（ｉ−ｂ３）において、核酸は、核酸が一本鎖の部分を有する状態に変換される。
【００７７】
原則として、異なる配列を有する核酸を保持する、多孔性の担体の区別可能な部位は、異なる配列を有する一本鎖の部分を備えた核酸をこのように保持する。このことは、原則として、配列の差が一本鎖の部分に関連することを意味する。このことは特に、酵素による鎖の伸長による配列決定方法に当てはまる。上述の内容から、措置（ｉ−ｂ）に従うと、多孔性の担体上の区別可能な部位は、結果として統計学的に配置されない。むしろ、区別可能な部位の各々の位置は、選択され得る。
【００７８】
ステップ（ｉ−ｂ１）における核酸溶液は、微量定量プレート等の適切な容器に保管され得る。核酸分子は、たとえばゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの処理により生成可能である。
【００７９】
好ましい態様において、ゲノムＤＮＡは、通常頻繁に切断を行なう１つまたはいくつかの制限エンドヌクレアーゼにより切断され、結果的に得られたフラグメントがクローン化され、結果的に得られたクローン（ファージクローン、細菌性クローン、または酵母クローン等）から単離したＤＮＡまたはインビトロで生成したそのコピーは、「ゲノムライブラリ」として保管される。
【００８０】
さらなる好ましい態様において、ｍＲＮＡは第１の鎖のｃＤＮＡに転写され、これは二本鎖のｃＤＮＡに変換され、ゲノムＤＮＡに対して説明された手順が引続き行なわれる。
その過程で、制限エンドヌクレアーゼによるフラグメンテーションは省略され得る。
【００８１】
ステップ（ｉ−ｂ１）における、多孔性の担体への核酸溶液の移送は、当該技術から公知の、ＤＮＡアレイを調製するための方法に従い、多孔性の担体の表面に、特別に形成された針（「ピン」）、キャピラリーの助けを借りて、またはインクジェット技術（ピエゾ技術またはバブルジェット技術等）により、適量の液体（１ｎｌと１００ｎｌとの間等）を与えることによって実施され得る。通常、この液体は、好ましくは１つの液滴またはいくつかの液滴として多孔性の担体上の或る位置に与えられ、毛管作用によって担体により吸収され、核酸分子が、定義に従って同様の配列または同一の配列を有する領域、または区別可能な部位を形成するようにする。この文脈において、同一の核酸または同一の配列を有する核酸の領域または区別可能な部位は、核酸溶液の移送時に１つまたは複数の液滴で充填された担体の試料チャンバのすべてをカバーする。特別な場合、同一の配列を有する核酸の領域または区別可能な部位は、１つの試料チャンバ、たとえば１つのキャピラリーのみを含む。
【００８２】
ステップ（ｉ−ａ３）または（ｉ−ｂ２）における核酸分子の固定化は、当該技術から公知の方法によって行なわれ得る。そして、これらの分子は、末端において、すなわちそれらの３′−末端または５′−末端を介して固定化されることが好ましい。この固定化は不可逆的であるものとし、すなわち、ヌクレオチド配列の決定に必要とされる条件（温度、イオン強度、酵素活性等）下において、固定化された分子のうち最大でも一部、好ましくは１０％以下または５０％以下が多孔性の担体から離脱するものとする。核酸の配列決定中に、固定化された核酸分子の５％以下または１％以下が離脱することが特に好ましい。固定化は、非共有結合の相互作用により媒介され得、たとえば、固定化されるべき核酸分子はビオチン基を担持し得る。この場合、多孔性の担体は、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆され得、それによってビオチン修飾された核酸分子が、被覆された担体に結合され得るようにする。しかしながら、共有結合の相互作用による核酸分子の固定化が好ましい。このため、通常は適切に修飾された核酸分子を用いることが好ましく、たとえば５′−または３′−末端アミノ基（「アミノ修飾子」、グレン・リサーチ、スターリン、バージニア  ２０１６４：カタログ２００２、ｐ．５６ｆ．参照）、末端チオール基、末端リン酸基、アクリダイト基、カルボキシ−ｄＴ基、または別の反応基を含む核酸分子が用いられることが好ましい。所望であれば、固定化を媒介する反応基と核酸分子との間に、任意の種類のスペーサまたはリンカー、たとえばオリゴエチレングリコール−スペーサまたは開裂可能な基、たとえばジチオール基または光分解により開裂可能なニトロベンジル基が配置され得る。所望であれば、このように開裂可能な基により、適切な条件の調節後に、多孔性の担体からの離脱による、固定化された核酸分子の復元が可能となる。当然ながら、固定化を媒介する基は、核酸分子の末端以外にも、核酸分子内の他の位置に、たとえばヌクレオチド塩基における側鎖に位置付けられ得る。たとえば後者は、核酸分子の生成中におけるアミノアリル−ｄＵＴＰまたはビオチン−ｄＵＴＰの取込みにより考えられ得る。いずれの場合も、担体および核酸分子が適切な方法でまず調製され、それによって担体と、固定化されるべき核酸分子との各々が、２つのパートナーからなる特異的な結合対の一方のパートナーを有するようにし、かつ、両方のパートナーを互いに結合することによって核酸分子の固定化が生じ得るようにする。当然ながら、この文脈において、結合対の２つのパートナーの結合に関与するさらなる成分が存在し得ることは除外されないものとする。当該技術から公知の、生体分子を固定化するための多くの方法が存在し、その例は、たとえば Nucleic Acids Res. ２２、５４５６〜６５（１９９４）および Nucleic Acids Res. ２７、１９７０〜７７（１９９９）に提示される。固定化の際に達成されるべきさらなる目標は、表面上における適切な高密度の核酸分子であり、このことは、配列決定の過程中に十分なシグナル強度を保証するはずである。分子生物学の適用から公知の蛍光体、たとえばＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、またはＣｙ５が用いられて、配列決定されるべき核酸分子の各々が１つの蛍光体により標識される場合、表面上の核酸分子の密
度は、好ましくは１０分子／μｍ2以上、１００分子／μｍ2以上、１，０００分子／μｍ2以上、または１０，０００分子／μｍ2以上である。使用され得る蛍光染料のさらなる例に関しては、モルキュラー・プローブズ（Molecular Probes）社、ユージン（Eugene）、ＯＲ、ＵＳＡのカタログ第６版、１９９６を参照されたい。
【００８３】
措置（ｉ−ａ）において既に上で述べたように、ステップ（ｉ−ａ３）の増幅によって生成されたか、またはステップ（ｉ−ｂ２）において増幅が生じる措置（ｉ−ｂ）中に提供された核酸分子の固定化は、増幅中または増幅後に行なわれ得る。増幅中の固定化は、たとえば、プライマー伸長に基づいたＰＣＲ等の増幅方法については、溶液中に存在するプライマーに加え、中空の空間の内壁に既に一部固定化されたプライマーを使用することにより（または、たとえばＷＯ  ９６／０４４０４に記載されているように、固定化されたプライマーを排他的に使用することによっても）可能であり、このプライマーは次に、一本鎖の鋳型分子にハイブリダイズし、その後プライマー伸長により取込まれ得る。試料チャンバの表面に固定化されたプライマーを介して核酸分子の固定化が行なわれる場合、プライマー対の一方のプライマーのみの固定化が有利である。なぜなら、このようにして、二本鎖の核酸分子の１つの核酸鎖のみが固定化され、それによって固定化されていない核酸鎖の除去が容易になり、したがって一本鎖の部分を備えた核酸分子を提供するようになるためである。
【００８４】
したがって、この発明の精神内において、溶液内に存在する核酸分子の固定化は、固定化されかつ溶解分子にハイブリダイズされたプライマーの伸長により、そのプライマーに相補的な対向する鎖分子の合成と、したがって或る意味では、液相から固体相への分子の転写とに関連する。
【００８５】
この発明の好ましい態様は、酵素による鎖の伸長により、核酸の並行配列決定を行なうための方法に関し、その過程において、ステップ（ｉ）における二本鎖の部分および一本鎖の部分を有する核酸分子と、ステップ（ii）におけるヌクレオチド化合物とがヌクレオチドであり、溶液は、これらのヌクレオチドに加えて鎖伸長酵素も含み、ステップ（iv）において酵素は、水素結合を形成することにより、固定化された核酸分子の一本鎖の部分に、すなわち多孔性の担体に間接的に、ヌクレオチドを結合し、二本鎖の部分と一本鎖の部分との間の境界において、固定化された核酸分子内にそれらのヌクレオチドを取込む。
【００８６】
したがって、酵素による鎖の伸長により核酸の並行配列決定を行なうためのこの発明の方法の好ましい態様は、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）  モノリシックな多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、二本鎖の部分および一本鎖の部分を有する核酸分子が固定化される１つ以上の表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有し、多孔性の担体は、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ii）  １つ以上のヌクレオチドと、鎖伸長酵素とを有する溶液を提供するステップと、
（iii）  その過程で酵素は、水素結合を形成することにより、固定化された核酸分子の一本鎖の部分に、すなわち多孔性の担体に間接的に、ヌクレオチドを結合し、二本鎖の部分と一本鎖の部分との間の境界において、固定化された核酸分子内にそれらのヌクレオチドを取込む、多孔性の担体の試料チャンバ内にステップ（ii）の溶液を導入するステップと、
（iv）  固定化された核酸を介して多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性を検出するステップとを含む。
【００８７】
適切であれば、ステップ（ii）および以降のステップは、具体的には各場合において、先行するステップ（ii）中のものとは異なるヌクレオチドを用いて繰返される。
【００８８】
好ましくは、酵素による鎖の伸長による核酸分子の配列決定は、次に記載される方法の１つに従って実施される。
【００８９】
Ａ）  反応副産物の決定時における、ヌクレオチド三リン酸（「通常の」ヌクレオチド、ｄＮＴＰ）の取込み。
【００９０】
Ｂ）  標識されたヌクレオチドの取込み。
【００９１】
Ｃ）  可逆的に標識されたヌクレオチドの取込み。
【００９２】
Ｄ）  標識された、可逆的チェインターミネーティングヌクレオチドの取込み。
【００９３】
Ａ）  この発明の上述の方法の好ましい一態様において、ステップ（ii）の溶液は、４つのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰのうちの１つのみを含み、ステップ（iv）は、生成された反応副産物の量を決定することにより、固定化された核酸を介して多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドの量を検出するステップを含み、ステップ（iv）の次にステップ（ｖ）が続き、このステップ（ｖ）は、ステップ（ii）および以降のステップが、具体的には各場合において、先行するステップ（ii）中のものとは異なるヌクレオチドを用いて繰返される場合、取込まれなかったヌクレオチドを多孔性の担体から除去するステップと、適切であれば反応副産物を除去するステップとを含む。
【００９４】
方法（Ａ）に従った配列決定の際に、Ronaghi 他（Analyt. Biochem. ２４２、８４〜８９［１９９６］）により説明されるように、成長中の鎖内へのヌクレオチド三リン酸の取込みに関連するピロリン酸塩の生成が測定され得る。この文脈において、生成されたピロリン酸塩は、スルフリラーゼによりＡＴＰに変換され、このＡＴＰは次いで、ルシフェラーゼの触媒作用を利用した化学発光反応に関与し、したがって検出され得る。この方法によると、構成体を通る流れにより、配列決定の各サイクルにおいて、溶液が多孔性の担体の中空の空間またはチャネルを流通する。この溶液は、特定のデオキシヌクレオチド三リン酸（Desoxynukleosidtriphosphat）、たとえばｄＡＴＰ、またはそのチオ類似体ｄＡＴＰαＳに加え、鎖の伸長に必要とされるさらなる成分、たとえばポリメラーゼ、および適切であれば緩衝剤、イオン等を含む。試料チャンバを流通する特定のヌクレオチドに対して自由に設定されるピロリン酸塩の量は、生成されるＡＴＰの量に対応する。これは、光度分析的に決定され、位置により決定される。したがって、各場合において、多孔性の担体のどの部位において成長中の核酸鎖内へのヌクレオチドの取込みが生じたかを決定することができる。洗浄（Ronaghi 他、１９９６）またはアピラーゼによる劣化（Ronaghi 他、サイエンス  ２８１、３６３〜３６５［１９９８］）により、取込まれなかった過剰なｄＡＴＰを除去した後に、次の配列決定サイクルにおいて、第２の特異的なヌクレオチド三リン酸、たとえばｄＣＴＰが、流通する溶液に与えられ、生成されたＡＴＰの量が再び決定される。取込まれなかったｄＣＴＰは、通常、多孔性の担体の試料チャンバを流通する溶液を洗浄することによって除去され、上述の手順が、第３および第４のヌクレオチド三リン酸により繰返される。その後、次の反応サイクルが実施され、このサイクルは、時間をずらして一度に１つのヌクレオチド三リン酸を加えるステップと、生成されたＡＴＰの量を測定するステップと、取込まれなかったヌクレオチド三リン酸を除去するステップとを含み、これは所望の頻度で繰返される。相対的なシグナル強度から、ヌクレオチド三リン酸が加えられるたびに、鎖の伸長の過程で１つの鎖につき１つ以上の同一のヌクレオチド塩基が成長中の鎖内に取込まれ、それによって得られた化学発光シグナルの、位置
によって決定される配列および強度から、多孔性の担体のそれぞれの部位における核酸鎖、すなわち鋳型の塩基配列が再構築され得るかどうかを決定することができる。このようにして、多孔性の担体の異なる部位における核酸の配列を同定することができ、配列の、配列が特定された部分内の塩基配列を決定することができる。
【００９５】
Ｂ）  この発明の方法の別の態様において、ステップ（ii）の溶液は、４つのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰのうちの１つのみを含み、その各々は標識基により標識され、ステップ（iii）の後にステップ（iii−ｂ）が続き、このステップ（iii−ｂ）は、取込まれなかったヌクレオチドを多孔性の担体から除去するステップを含み、ステップ（iv）における、固定化された核酸によって多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性を検出するステップは、多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において担体に結合された標識基の量および／または同一性を決定することによって実施される。適切であれば、ステップ（ii）およびそれ以降のステップは、具体的には各場合において、先行するステップ（ii）のものとは異なるヌクレオチドを用いて繰返される。
【００９６】
方法（Ｂ）に従った配列決定の際に、配列決定されるべき核酸分子は、ポリメラーゼ触媒されたフィルイン反応に好ましい条件下において、一度に１種類の標識されたヌクレオチドで、すなわち、標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰとともにインキュベートされる。このことは、方法（Ａ）に対して既に説明されたように、各配列決定サイクル中に、多孔性の担体の試料チャンバを流通する溶液によって行なわれ、この溶液は、特定のヌクレオチド、酵素に加え、適切であれば、鎖の伸長を可能にするさらなる成分を含む。通常、多孔性の担体を流通する洗浄液により、取込まれなかったヌクレオチドを除去した後に、位置によって決定される標識の検出により、ヌクレオチドが取込まれたか否か、およびいくつのヌクレオチドが取込まれたか（１×Ａ、２×Ａ等）、および多孔性の担体のどの部位内でこのことが生じたかが決定される。次のステップにおいて、核酸分子は、第２の種類の標識されたヌクレオチド（標識されたｄＣＴＰ等）とともにインキュベートされて検出され、その後、同じことが第３の種類のヌクレオチド（標識されたｄＧＴＰ等）で行なわれ、最後に第４の種類のヌクレオチド（標識されたｄＴＴＰ等）で行なわれる。次に、第１の種類の標識されたヌクレオチドを加えることにより、このサイクルが再び開始される。検出値に測定されたシグナル強度は、各場合において、最後に行なわれたヌクレオチドの取込みと、それ以前のすべてのヌクレオチドの取込みとから生じるシグナル強度の総和から生じる。
【００９７】
相対的なシグナル強度から、ヌクレオチド三リン酸を追加するたびに、１サイクル内の鎖の伸長の過程において１つの鎖につき１つ以上の同一のヌクレオチド塩基が成長中の鎖内に取込まれ、それによって得られた標識シグナルの、位置によって決定される配列および強度から、多孔性の担体のそれぞれの部位（したがって位置によって決定される）において核酸分子の塩基配列が再構築され得るか否かが決定され得る。このようにして、多孔性の担体上で同一の配列を有する核酸分子の異なる領域または区別可能な部位を同定することができ、配列が決定された配列の部分内の塩基配列を決定することができる。
【００９８】
Ｃ）  この発明の方法の特定の態様において、ヌクレオチドは可逆的な態様で標識され、シグナルのバックグラウンドを減じるために、既に取込まれたヌクレオチドの標識は、ステップ（ii）から（iv）を１回または数回経た後に削除される。
【００９９】
方法（Ｃ）に従い、可逆的な態様で標識されたヌクレオチドの取込みは、方法（Ｂ）に従って実施されるが、ここで、取込まれたヌクレオチドの標識は、ヌクレオチドを加えるたびにその後で、または４つのすべてのヌクレオチドを連続して加えるステップを含む各サイクルの後に、またはこのサイクルを１回以上繰返した後に等の適切な時点で削除され
る。好ましくは、このことは１つの標識基または複数の標識基を除去または変更することによって生じる。たとえば、標識基は、化学的に、光化学的に、または酵素により開裂可能なスペーサ、たとえば光化学的または化学的に開裂されるジスルフィド基またはニトロベンジル基を含むスペーサにより、それぞれのヌクレオチドに連結され得る。酵素による開裂が選択された場合、このことは好ましくは、開裂酵素を含んで多孔性の担体の中空の空間またはチャネルを流通する溶液により、流通構成体の助けを借りて行なわれる。ヌクレオチドの核酸塩基における標識基の取付けは非常に適している。光化学的な開裂は、適切な強度および波長の光により、たとえばレーザの助けを借りて開裂可能な基を励起させることによって生じる。標識基を修飾する１つの可能性は、たとえば蛍光染料の漂白であり、このことは、たとえばレーザによる十分な強度の照射により可能である。方法（Ｂ）に勝る方法（Ｃ）の利点は、測定時に、各場合において、取込まれたヌクレオチドの一部のみ、理想的には最後に取込まれたヌクレオチドのみが排他的に、シグナルのバックグラウンドを考慮する必要なしに決定されることである。シグナルのバックグラウンドは、それまでに既に取込まれたヌクレオチドによって生じ、興味の対象となるシグナルの数倍にもなることが考えられる。
【０１００】
Ｄ）  この発明の方法の別の態様において、ステップ（ii）の溶液は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰから選択された１つ以上のヌクレオチドを含み、これらのヌクレオチドはチェインターミネーションを生じかつ標識基を有する除去可能な基を含み、ステップ（iii）の後に、取込まれなかったヌクレオチドを多孔性の担体から除去するステップを含むステップ（iii−ｂ）が続き、ステップ（iv）における、固定化された核酸によって多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドの量の検出は、多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において担体に結合された標識基の量を決定することによって行なわれ、ステップ（iii−ｂ）とステップ（iv）との間に、またはステップ（iv）とステップ（ｖ）との間に、多孔性の担体に結合されたヌクレオチドから、チェインターミネーションを生じる基を除去するステップを含むステップ（vi）が実行される。
【０１０１】
したがって、酵素による鎖の伸長により核酸の並行配列決定を行なうためのこの発明の方法の好ましいこの態様は、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）  モノリシックな多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、二本鎖の部分および一本鎖の部分を有する核酸分子が固定化される１つまたはいくつかの表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを含み、多孔性の担体は、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ii）  ヌクレオチドが、チェインターミネーションを生じかつ標識基により標識される除去可能な基を有する、鎖伸長酵素と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰから選択された１つ以上のヌクレオチドとを含む溶液を提供するステップと、
（iii）  その過程で酵素は、水素結合を形成することにより、固定化された核酸分子の一本鎖の部分にヌクレオチドを結合し、したがって多孔性の担体にヌクレオチドを間接的に結合し、固定化された核酸分子の一本鎖の部分と二本鎖の部分との間の境界においてこれらのヌクレオチドを取込む、多孔性の担体の試料チャンバ内にステップ（ii）の溶液を導入するステップと、
（iii−ｂ）  取込まれなかったヌクレオチドを多孔性の担体から除去するステップと、
（iv）  固定化された核酸により多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性を、多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において担体に結合された標識基の量および／または同一性を決定することによって検出するステップと、
（ｖ）  固定化された核酸により多孔性の担体に間接的に結合されたヌクレオチドから、チェインターミネーションを生じる基を除去するステップとを含み、その過程でステッ
プ（iv）と（ｖ）とが相互に交換され得る。
【０１０２】
好ましくは、チェインターミネーションを生じる除去可能な基は、同時に標識基を指し、ステップ（iv）と（ｖ）とは相互に交換されない。
【０１０３】
可逆的チェインターミネーティングヌクレオチドの取込みによる、方法（Ｄ）に従った配列の決定は、この明細書において完全に引用として援用される、たとえばＵＳ−Ａ  ５
３０２  ５０９、ＵＳ−Ａ  ５  ７９８  ２１０、またはＷＯ  ０１／４８１８４に記載されるように実施され得る。この手順が方法（Ｄ）に従う場合、方法（Ｂ）に対して説明した、標識されたヌクレオチドだけでなく、方法（Ｃ）に対して説明した、可逆的に標識されたヌクレオチドも使用することができるが、チェインターミネーションを生じる官能基を有するさらなる特徴を有するヌクレオチドは、除去され得る。方法（Ｄ）に従い、核酸鎖の、ヌクレオチドに関する伸長は、その３′−ＯＨ基において可逆的にブロックされたヌクレオチド三リン酸を用いることによって達成され、このヌクレオチド三リン酸はポリメラーゼにより、成長中のＤＮＡ二本鎖内に取込まれ得るが、取込まれた後に、チェイン伸長ターミネータとして働く。ブロック基が開裂されると、遊離３′−ＯＨ基が復元され、それによって次のヌクレオチドが取込まれ得るようにする。たとえば、カナールおよびサルファティ（ジーン１４８、１〜６［１９９４］）は、取込まれた後に可逆的保護基の蛍光標識によって同定され得る、可逆的にブロックされるヌクレオチド三リン酸について記載している。方法（Ｄ）における、各配列決定サイクルにおいて、溶液が多孔性の担体の試料チャンバを流通し、この溶液は、１つ以上の特定のデオキシヌクレオシド三リン酸（Desoxynukleosidtriphosphat）、特に４つのデオキシヌクレオシド三リン酸（Desoxynukleosidtriphosphate）のすべてを含む。その後、通常、多孔性の担体に洗浄液を流通させることにより、取込まれなかったヌクレオチドの除去が行なわれ、特定のヌクレオチドが取込まれた多孔性の担体の位置の、位置によって決定される判定が行なわれる。したがって、測定することにより、１つの配列決定サイクルにつき１つのヌクレオチドの取込みを追跡することができ、その過程で、多孔性の担体の試料チャンバを流通させるために使用される溶液が４つのヌクレオチドのすべてを含んでいる場合、４つの全種類のヌクレオチドの情報を同時に得ることができる。４つの全種類のヌクレオチドのチェインターミネータとしての機能により、ブロック基が再び開裂されるまで１サイクルにつき常に１つのヌクレオチドのみが取込まれ得、この開裂が、化学的に、光化学的に、または酵素により行なわれ得（ＷＯ  ０１／４８１８４参照）、かつ、特定のヌクレオチドが取込まれた多孔性の担体上の部位の決定前または決定後に生じ得、この決定結果が位置により解像されるという点により、４つの全種類のヌクレオチドを同時に与えることが可能である。ここでは、ステップ（ii）からステップ（ｖ）を含む１つの配列決定サイクルにつき、１つのヌクレオチドのみが取込まれ、このことは、それぞれの配列決定サイクル中にステップ（ii）および（iii）の溶液により与えられないヌクレオチドが取込まれなければならない時点まで、固定化された核酸の成長中のＤＮＡ鎖内に多くのヌクレオチドが取込まれることになる上述の方法（Ａ）〜（Ｃ）とは異なる。ここで、ヌクレオチドが異なる標識により区別可能である場合、ステップ（iii）において１つの配列決定サイクルにすべてのヌクレオチドを同時に与えることも可能である。より長い読出長さを得るために、既に取込まれたヌクレオチドによって生じるバックグラウンドを追い返すための、可逆的に標識されたヌクレオチドを使用することが好都合であると考えられる。標識の除去は、特に読出長さに依存するバックグラウンドのうちのどれが依然として許容可能であるかに依存して、１つまたはいくつかの配列決定サイクル後に実施することができる。しかしながら好ましくは、チェインターミネーションを生じる除去可能な基は、同時に標識基でもあり、その結果、この標識基は、別個に削除または除去されなくてよい。この場合、ステップ（iv）と（ｖ）とは相互に交換されない。
【０１０４】
酵素による鎖の伸長により核酸分子の配列を決定するための上述の方法（Ａ）〜（Ｄ）
は、酵素の使用、通常はＤＮＡポリメラーゼの使用に基づく。この酵素は、ＤＮＡの一本鎖が結合される、ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡの一本鎖を伸長させる。このことは、ステップ（ｉ）における核酸分子が一本鎖の部分と二本鎖の部分とを有していることを必要とする。核酸が最初からこの状態で存在していない場合、この状態をステップ（ｉ−ａ４）および（ｉ−ｂ３）において生じさせる。増幅がＰＣＲによって行なわれ、かつ、試料チャンバの表面に固定化されたプライマーを介して核酸分子の固定化が行なわれる場合、プライマー対のうちの１つのプライマーのみの固定化が有利である。なぜなら、このようにして、二本鎖の核酸分子のうちの１つの核酸鎖のみが固定され、したがって固定化されなかった核酸鎖の除去を容易にし、これによって一本鎖の部分を備えた核酸分子を提供するためである。
【０１０５】
既知の塩基対形成の規則に従い、成長中の鎖内にヌクレオチド構築ブロックを取込むことによる配列決定を可能にするために、一態様では配列決定用プライマーが用いられる。すなわち、配列決定されるべき核酸鎖とのハイブリダイズが可能であり、かつ、ハイブリダイズされた状態においてＤＮＡポリメラーゼにより、その３′−末端において伸長され得るオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが用いられ、その過程で、配列決定されるべき領域に相補的な、対向する鎖が合成される（ポリメラーゼの、分子間におけるプライマー処理）。したがって適切であれば、固定化された二本鎖の核酸分子は、対向する鎖を部分的または完全に除去することによって一本鎖の部分を有する状態へと変換され、その後、この核酸分子に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ、ポリメラーゼにより伸長され得る３´−末端を有する、適切な配列決定用プライマーが核酸分子にハイブリダイズされ、それによって核酸分子が、一本鎖の部分と二本鎖の部分とを有する状態に置かれるようにする。
【０１０６】
別の態様では、ＰＣＲによる核酸分子の増幅時に、自己相補的な領域を有するプライマーが用いられ（ＷＯ  ０１／４８１８４、第９頁、第１の丸印参照）、これによってＰＣＲにより増幅された核酸分子が、対向する鎖の部分的または完全な除去によって部分的または完全に変性した後にヘアピンの形成により折れ曲がり、したがって一本鎖の部分と二本鎖の部分とを生じるようにする。さらに、たとえばＵＳ−Ｐ  ５  ７９８  ２１０の第４頁、第６３行目以下および図７に記載されているように、一本鎖の部分を有する核酸分子にヘアピン構造を付着させることができ、その過程で一本鎖の部分と二本鎖の部分とが同じく生成される（ポリメラーゼの、分子内におけるプライマー処理）。
【０１０７】
固定化の前において、二本鎖の状態にある核酸分子に対し、「マスクされたヘアピン」、すなわち、逆向き反復配列を含む二本鎖の核酸分子を付着させることも可能である。固定化の後に２つの鎖のうちの一方が変性により除去されると、配列決定されるべき核酸分子に残存してその５′−末端を介してそれに付着する、対向する鎖は、「折れ曲る」ことが可能であり、したがって一本鎖の部分と二本鎖の部分とを形成し、その遊離３′−末端において、ポリメラーゼにより伸長され得る（ＷＯ  ０１／４８１８４、第９頁、第２の丸印参照）。
【０１０８】
それ以外では、酵素による鎖の伸長または短縮に加え、ＳＢＨ（ＳＢＨ、ハイブリダイゼーションによる配列決定、Drmanac 他、サイエンス  ２６０（１９９３）、１６４９〜１６５２参照）等の他の方法に従い、配列決定を行なうこともできる。この方法では、各配列決定サイクルにおいて、溶液を多孔性の担体の試料チャンバに流通させる。この溶液は、既知の配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドに加え、適切であれば、それに相補的な、配列決定されるべき核酸分子の配列部分によってオリゴヌクレオチドの正確なハイブリダイゼーションを確保するさらなる成分を含む。各場合において標識が異なる場合、この溶液は、その標識によって区別され得るだけの、異なる配列を有する多くの種類のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０１０９】
したがって、この発明の別の態様は、ハイブリダイゼーションにより核酸の並行配列決定を行なうための方法に関し、その過程において、ステップ（ii）におけるヌクレオチド化合物は、水素結合の形成によりステップ（iii）において固定化された核酸分子にハイブリダイズする標識基を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドであり、それによってこれらのオリゴヌクレオチドが多孔性の担体に結合されるようにする。その過程において、ステップ（iii）における、多孔性の担体に結合されたオリゴヌクレオチドの量の決定は、多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位においてこの担体に結合された標識基の量を決定することによって行なわれる。
【０１１０】
したがって、この方法のこの実施例は、以下のステップ、すなわち、
（ｉ）  モノリシックな多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、核酸分子が固定化される１つ以上の表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有し、核酸分子は一本鎖の部分を有し、その過程において、多孔性の担体は、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（ii）  標識基を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む溶液を提供するステップと、
（iii）  その過程において、オリゴヌクレオチドは、水素結合の形成により、固定化された核酸分子の一本鎖の部分に結合され、したがって多孔性の担体に間接的に結合される、多孔性の担体の試料チャンバ内にステップ（ii）の溶液を導入するステップと、
（iv）  固定化された核酸により多孔性の担体に間接的に結合されたオリゴヌクレオチド化合物の量および／または同一性を、多孔性の担体の少なくとも２つの区別可能な部位において担体に結合された標識基の量を決定することによって検出するステップとを含む。
【０１１１】
ステップ（ii）から（iv）は繰返すことができ、その過程で各サイクル中に配列情報が得られる。
【０１１２】
この発明はさらに、モノリシックな多孔性の担体に関し、モノリシックな多孔性の担体は、多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、核酸分子が固定化される１つ以上の表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有する。
【０１１３】
好ましくは、多孔性の担体に固定化される核酸分子は、一本鎖の部分を有し、多孔性の担体上に、異なる配列を有する核酸を保持する少なくとも２つの区別可能な部位が存在する。
【０１１４】
この発明はさらに、モノリシックな多孔性の担体に関し、モノリシックな多孔性の担体は、多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有し、かつ、１つ以上の表面を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有し、表面は、核酸の固定化に適した被覆を有する。
【０１１５】
問題のさらなる解決策は、核酸の並行配列決定を行なうための方法に存在し、この方法は、
（vi）  液体により充填され、かつ、モノリシックな多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有する少なくとも２つの試料チャンバを有し、多孔性の担体は、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（vii）  試料チャンバにおいて核酸分子を増幅するステップと、
（viii）  表面を設けるステップと、
（ix）  表面と試料チャンバとの間に液膜を形成することにより、ステップ（viii）の表面を多孔性の担体に接触させるステップと、
（ｘ）  異なる配列を有する核酸を保持する少なくとも２つの区別可能な場所を表面上に形成することにより、表面上にステップ（ix）の核酸を固定化するステップとを含み、
その過程でステップ（vii）、（viii）、（ix）、および（ｘ）を同時に実施することができ、この方法はさらに、
（xi）  ステップ（vii）と（ｘ）との間か、またはこれらのステップと同時にも行なわれ得る、表面上の核酸をこれらの核酸が一本鎖の部分を有する状態に変換するステップと、
（xii）  モノヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドから選択された１つ以上のヌクレオチド化合物を含む溶液を提供するステップと、
（xiii）  その過程において、固定化された核酸の一本鎖の部分へのヌクレオチド化合物の結合、したがって、表面への間接的な結合が行なわれる、ステップ（xii）の溶液をステップ（xi）の表面上の核酸に接触させるステップと、
（xiv）  固定化された核酸により、表面の少なくとも２つの区別可能な場所において表面に間接的に結合されたヌクレオチド化合物の量および／または同一性を検出するステップを含む。
【０１１６】
この発明の方法の好ましい態様において、ステップ（vi）は、
（vi−ａ０）  多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を含む少なくとも２つの試料チャンバを含む、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（vi−ａ１）  異なる配列を有する少なくとも２つの核酸分子を含む核酸溶液に多孔性の担体を浸漬するステップとを含み、それによって少なくとも２つの試料チャンバが核酸溶液で充填されるようにし、かつ、後に多孔性の担体が、異なる配列を有する核酸を保持する少なくとも２つの区別可能な部位を有するようにする。
【０１１７】
この発明の方法のさらなる好ましい態様において、ステップ（vi）は、
（vi−ｂ０）  多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有する少なくとも２つの試料チャンバを含む、モノリシックな多孔性の担体を提供するステップと、
（vi−ｂ１）  各場合において異なる配列を有する核酸分子を含む少なくとも２つの核酸溶液を、各場合において多孔性の担体の異なる位置に移送するステップとを含み、それによって少なくとも２つの試料チャンバが、核酸溶液によって充填されるようにし、かつ、後に多孔性の担体が、異なる配列を有する核酸を保持する少なくとも２つの区別可能な部位を有するようにする。
【０１１８】
ステップ（vi）のモノリシックな多孔性の担体は、ステップ（ｉ）の多孔性の担体を指し、この担体は、多孔性の担体を通って延び、かつ、少なくとも入口および出口を有する、少なくとも２つの試料チャンバを有する。この点に関し、上述の内容を参照されたい。しかしながら、試料チャンバは液体により充填される。なぜなら、液体により充填されなければ、ステップ（vii）における増幅も、ステップ（viii）における液膜の形成も、いずれも行なわれないためである。したがって、多孔性の担体は、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な部位を有する。「部位」という用語に関し、ステップ（ｉ）で述べた内容は、やはり有効である。ステップ（ix）において、これらの部位は、或る意味で、この表面により形成された平面に投影された表面に移されている。核酸の固定化の後に、異なる配列を有する核酸を保持する表面上の場所が参照される。ステップ（vi）における核酸は、一本鎖の部分を有する必要がなく、固定化される必要がない。しかしながら、固定化が可逆的な態様で行なわれるか、または核酸の二本鎖のうちの１本の鎖のみに関する限り、後者は当然ながら除外されず、それによって少なくともそれぞれの
対向する鎖がステップ（ix）において変性により離脱され得、かつ移送され得る。
【０１１９】
増幅は、説明したように（ｉ−ｂ）において、特にＰＣＲの助けを借りて実施される。次に、プライマー対の１つのプライマー、またはこのプライマーの一部が試料チャンバの表面に固定化され得る。したがって、固定化された核酸の場合、増幅産物の対向する鎖は、変性によって離脱され得る。
【０１２０】
ステップ（viii）では表面が設けられる。このことは、プラスチック、金属、ガラス、シリコン、または核酸の固定化を可能にし、かつ、適切であればそれに応じて機能的にされる、同様に適切な材料で形成された本体の、利用可能な表面を指す。この表面は、膨潤し得る層、たとえば膨潤し得るポリサッカライド、ポリ糖アルコール（Polyzuckeralkoholen）、またはケイ酸塩で形成された層を有し得る。特別な場合、この表面は、ステップ（vi）において規定された多孔性の担体を表わす。
【０１２１】
ステップ（ix）は、ステップ（viii）の表面を多孔性の担体に接触させるステップを含む。このことは、表面を多孔性の担体上に単に配置することによって行なわれ得る。試料チャンバが液体より充填されるため、この表面と試料チャンバとの間に液膜が形成される。この発明の範囲内において、「液体により充填される」という用語は、試料チャンバの管腔が部分的にまたは完全に占有されることを意味する。この措置により、固定化の後、以降のステップにおいて、異なる配列を有する核酸を有する少なくとも２つの区別可能な場所が表面上に形成される。異なる配列を有する核酸は、拡散または対流により表面に移送される。後者は、特に、試料チャンバ内の液体を毛管力によって吸込むか、または吸収することのできる多孔性の担体によってこの表面が形成されている場合に、重要な役割を果たす。ステップ（ix）は表面上において、多孔性の担体の区別可能な部位が或る平面上への投影を生じ、それによって固定化の後に、表面上の区別可能な場所が得られる。
【０１２２】
ステップ（ｘ）における核酸分子の固定化に関し、ステップ（ｉ−ａ３）または（ｉ−ｂ２）に関して上で述べた内容は、場合に応じて有効である。
【０１２３】
通常、ステップ（xi）における、核酸を、核酸が一本鎖の部分を有する状態に変換するステップは、核酸の二本鎖を完全にまたは部分的に変性することと、適切であれば、対向する鎖を除去することとによって行なわれる。このステップは、ステップ（vii）と（ｘ）との間に、またはこれらのステップと同時にも行なわれ得る。しかしながら、核酸が既に固定化されている場合、この変換は容易になるはずである。ステップ（ｉ−ａ４）および（ｉ−ｂ３）を参照するとよい。好ましくは、ステップ（xi）において、核酸は、核酸が一本鎖の部分を有する状態に変換される。このことは、配列決定が酵素による鎖の伸長によって行なわれる場合に特に当てはまる。
【０１２４】
ステップ（xii）、（xiii）、および（xiv）に関し、場合に応じてステップ（ii）、（iii）、および（iv）を参照するとよいが、その過程で、ステップ（xiii）において、以前のステップで提供された液体は、表面に単に接触させられるのみである。しかしながら、このことは、表面が試料チャンバを有する多孔性の担体によって形成されている場合、溶液が試料チャンバ内に導入されることを除外しない。
【０１２５】
ステップ（xii）から（xiv）は、１回または数回繰返され得、その過程において、各サイクルで配列情報が得られる。
【０１２６】
ステップ（xiv）では、ヌクレオチド化合物が表面に間接的に結合されたか否かが検出される。ステップ（ii）の溶液がいくつかのヌクレオチド化合物を含む場合、ステップ（xiv）において、表面に結合したヌクレオチド化合物はどれであるかが試験され、すなわ
ち、これらのヌクレオチド化合物の同一性が決定される。通常、重要なシグナルとバックグラウンドとを区別することができるように、結合されたヌクレオチド化合物の量を測定することもまた必要である。或る特定の状況下において、その量をより厳密に測定することが好都合である。これは、可能性として、ステップ（xiii）において、固定化された核酸の一本鎖の部分にいくつかのヌクレオチド化合物が結合され得る場合に当てはまり、これにより、チェインターミネーション基を有さないヌクレオチドによる、酵素による鎖の伸長によって配列決定を行なう場合と同様に、配列に関する結論が引出され得る。
【０１２７】
この発明の方法の好ましい態様において、ステップ（xii）、（xiii）、および（xiv）は、以下のように実現される。
【０１２８】
（xii）  １つ以上のヌクレオチドと鎖伸長酵素とを含む溶液を提供するステップ。
【０１２９】
（xiii）  ステップ（xii）の溶液を、ステップ（xi）からの表面上の核酸に接触させるステップ。酵素は、水素結合を形成すると、固定化された核酸分子の一本鎖の部分にヌクレオチドを結合し、したがって表面に間接的にヌクレオチドを結合し、二本鎖の部分と一本鎖の部分との間の境界において、固定化された核酸分子内にヌクレオチドを取込む。
【０１３０】
（xiv）  固定化された核酸により表面上の少なくとも２つの区別可能な場所において表面に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性を検出するステップ。
【０１３１】
適切であれば、ステップ（xii）と以降のステップは、具体的に各場合において、以前のステップ（ii）のものとは異なるヌクレオチドを用いて繰返される。
【０１３２】
酵素による鎖の伸長による核酸分子の配列決定は、以下に示す方法の１つによって好ましくは実施される。
【０１３３】
Ｂ）  標識されたヌクレオチドの取込み。
【０１３４】
Ｃ）  可逆的に標識されたヌクレオチドの取込み。
【０１３５】
Ｄ）  標識された可逆的チェインターミネーティングヌクレオチドの取込み。
【０１３６】
これらの方法に関し、ステップ（ii）から（xiv）に関する上述の内容を参照されたい。
【０１３７】
Ｂ）  この発明の方法の一態様において、ステップ（xii）の溶液は、４つのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰの１つのみを含み、これらのヌクレオチドは、各場合において標識基により標識され、ステップ（xiii）の次にステップ（xiii−ｂ）が続き、このステップ（xiii−ｂ）は、取込まれなかったヌクレオチドを表面から除去するステップを含み、ステップ（xiv）において、固定化された核酸により表面に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性の検出は、表面上の少なくとも２つの区別可能な場所において表面に結合された標識基の量および／または同一性を決定することによって行なわれる。適切であれば、ステップ（xii）およびそれ以降のステップは、具体的には各場合において、以前のステップ（xii）のものとは異なるヌクレオチドを用いて繰返される。
【０１３８】
Ｃ）  この発明の方法の特定的な態様において、ヌクレオチドは可逆的に標識され、シグナルのバックグラウンドを減じるために、既に取込まれたヌクレオチドの標識は、ステップ（xii）から（xiv）を１回通過するか、または繰返し通過した後に削除される。
【０１３９】
Ｄ）  この発明の方法の好ましい態様において、ステップ（xii）、（xiii）、および（xiv）は以下のように実現される。
【０１４０】
（xii）  鎖伸長酵素と、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰから選択された１つ以上のヌクレオチドとを含む溶液を提供するステップ。これらのヌクレオチドは、チェインターミネーションを生じ、かつ、標識基により標識される、除去可能な基を有する。
【０１４１】
（xiii）  ステップ（xi）の表面上の核酸に、ステップ（xii）の溶液を接触させるステップ。酵素は、水素結合を形成することにより、固定化された核酸分子の一本鎖の部分にヌクレオチドを結合し、したがって表面にヌクレオチドを間接的に結合し、一本鎖の部分と二本鎖の部分との間の境界において、固定化された核酸分子内にヌクレオチドを取込む。
【０１４２】
（xiii−ｂ）  取込まれなかったヌクレオチドを表面から除去するステップ。
【０１４３】
（xiv）  固定化された核酸により表面に間接的に結合されたヌクレオチドの量および／または同一性を、表面上の少なくとも２つの区別可能な場所において表面に結合された標識基の量および／または同一性を決定することによって検出するステップ。
【０１４４】
（xv）  固定化された核酸により表面に間接的に結合されたヌクレオチドから、チェインターミネーションを生じる基を除去するステップ。この過程で、ステップ（xiv）および（xv）は相互に交換可能であり得る。
【０１４５】
好ましくは、チェインターミネーションを生じる除去可能な基は、同時に標識基も表わし、ステップ（xiv）および（xv）は相互に交換されない。
【０１４６】
この発明の方法の別の態様において、ステップ（xii）、（xiii）、および（xiv）は以下のように実現される。
【０１４７】
（xii）  標識基を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む溶液を提供するステップ。
【０１４８】
（xiii）  ステップ（xi）の表面上の核酸に、ステップ（xii）の溶液を接触させるステップ。
この過程で、オリゴヌクレオチドは、水素結合の形成により、固定化された核酸分子の一本鎖の部分に固定され、したがって表面に間接的に結合される。
【０１４９】
（xiv）  固定化された核酸により表面に間接的に結合されたオリゴヌクレオチド化合物の量および／または同一性を、表面上の少なくとも２つの区別可能な場所において表面に結合された標識基の量を決定することによって検出するステップ。
【０１５０】
この発明は、以下の内容を示す図面により一層詳細に説明される。
【０１５１】
図１は、この発明の方法を実施するための多孔性の担体を示し、
１  多孔性の担体の上面、
２  多孔性の担体の底面、
３  多孔性の担体の上面から底面に延びるチャネル、および
４  ２つの隣接するチャネル間の仕切りを有する。
【０１５２】
図２は、多孔性の担体のチャネル内における核酸の固定化を示し、
１  核酸溶液を多孔性の担体に移送するための装置、たとえばピン、キャピラリー、またはジェット、および
２  同種の核酸分子の所望の量の溶液を有し、この溶液は、毛管力の作用により、多孔性の担体の上面に移送された後に担体のチャネルにより吸収され、図２はさらに、
３  多孔性の担体の詳細、
４  毛管力により多孔性の担体のチャネルによって吸収された核酸分子溶液、
５  充填されたチャネル、
６  充填されていないチャネル、
７  溶解された同種の核酸分子、
８  核酸分子の、末端における不可逆的な固定化を媒介する原子基（特異的な結合対の一方のパートナー）、
９  原子基（８）に特異的に結合し得る原子基（同一の特異的な結合対の他方のパートナー）、
１０  チャネルの壁面、および
１１  チャネルの壁面に固定化された同種の核酸分子を有する。
【０１５３】
図３は、多孔性の担体のチャネルにおける、適切に希釈された核酸分子溶液の増幅を示し、
１  多孔性の担体、
２  増幅反応を生じるのに必要とされる試薬を含む増幅混合物内の異なる核酸分子の希釈溶液による、担体の本質的に全チャネルの充填、
３  （２）の溶液により充填されたチャネル、
４  充填後に各々が増幅可能な１つの核酸分子を含むチャネル内における一本鎖分子の、その分子の多数のコピーへの増幅、
５  １つの核酸分子の、多数のコピーへの増幅が行なわれたチャネル、および
６  核酸分子の増幅が行なわれなかったチャネルを有する。
【０１５４】
図４は、この発明の方法を実施するための流通構成体を示し、多孔性の担体を挿入した後の流通構成体を示す図４ａと、動作中の流通構成体を示す図４ｂとを有し、
１  担体の保持装置、
２  Ｏシール、
３  多孔性の担体、
４  多孔性の担体に固定化された核酸分子の配列を決定するための、適切に調整された試薬溶液の流れ、
５  蓋、
６  観察窓、および
７  検出器を有する。
【０１５５】
図５は、図４の流通構成体に対して考えられる機能上の構造を示す。
【０１５６】
図６は、可逆的なチェインターミネーティングヌクレオチドによる、固定化された核酸分子の配列決定を示し、
１  チャネルの壁面、
２  末端のヘアピン構造を有する核酸分子、
３  蛍光により標識された保護基により、その３′位置において、さらなる鎖の伸長から可逆的に保護されたＣヌクレオチド、
４  ３′ＯＨ基の復元時における、保護基の開裂後の（３）のＣヌクレオチド、
５  蛍光により標識された保護基により、その３′末端において、さらなる鎖の伸長か
ら可逆的に保護されたＡヌクレオチド、
６  蛍光により標識されたｄＣＴＰ誘導体の取込みにより可能になり、かつ、その３′位置において可逆的に保護された、１つの塩基分の鎖の伸長、
７  最後に取込まれたヌクレオチドの同定による、ステップ（６）の鎖内に取込まれた蛍光標識の検出、およびその後の蛍光保護基の開裂、
８  蛍光により標識されたｄＡＴＰ誘導体の取込みにより可能になり、かつ、その３′位置において可逆的に保護された、１つの塩基分のさらなる鎖の伸長、ならびに
９  所望の読出長さが得られるまで、検出、開裂、および１つの塩基分の鎖の伸長のステップの繰返しを有する。
【０１５７】
図７は、多孔性の担体のいくつかの異なる領域に固定化された核酸分子の配列の同時決定を示し、
１  異なる領域を含む担体の詳細、および図面の異なる充填パターンにより同定されている第１の塩基の配列決定から得られるシグナル、
２  同じ領域を含む担体の詳細、および図面の異なる充填パターンにより同定されている第２の塩基の配列決定から得られるシグナル、
３  同じ領域を含む担体の詳細、および図面の異なる充填パターンにより同定されているｎ番目の塩基の配列決定から得られるシグナル、
４  各々が１つ以上のチャネルを含む多孔性の担体の２つの異なる領域、
５  被覆されたすべての領域に対して１番目の塩基からｎ番目の塩基までの配列を決定したときに得られた結果の重ね合わせ、ならびに
６  被覆された領域に固定化された核酸分子の１番目の塩基からｎ番目の塩基に対して（５）で得られた配列決定の結果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】この発明の方法を実施するための多孔性の担体の図である。
【図２】多孔性の担体のチャネル内における核酸の固定化を示す図である。
【図３】多孔性の担体のチャネルにおける、適切に希釈された核酸分子溶液の増幅を示す図である。
【図４】この発明の方法を実施するための流通構成体を示す図である。
【図５】図４の流通構成体に対して考えられる機能上の構造を示す図である。
【図６】可逆的なチェインターミネーティングヌクレオチドによる、固定化された核酸分子の配列決定を示す図である。
【図７】多孔性の担体のいくつかの異なる領域における、固定された核酸分子の配列の同時決定を示す図である。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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