(57)【要約】本発明は、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７を特異的に標的とする薬剤１つ以上を投与することにより慢性関節リウマチ（ＲＡ）を治療する方法に関する。ここに開示された結果は、滑膜組織に浸潤する白血球の活性化の制御に、これらの３つのＬＩＲが関係しているかもしれないことを示している。従って、ＲＡ患者の関節における炎症は、炎症を起こした関節に存在する単球又はマクロファージの活性化を減少させるかもしくは排除するため、又はそれらの炎症部位への動員を減少させるため、ＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３及び／又はＬＩＲ−７の発現又は機能を調節する薬剤を投与することにより改善され得る。これは、刺激シグナルを伝達するＬＩＲ−７を調節することにより、かつ／又は誘起された場合に阻害効果を発揮するＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３を調整することにより、又はこれらのＬＩＲのうちの２つもしくは３つ全てを同時に調節することにより、達成され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３及び／又はＬＩＲ−７の発現又は機能を調節する薬剤１つ以上を治療的に有効な量患者に投与することを含む、慢性関節リウマチを有する患者を治療する方法。
【請求項２】
該治療が、ＬＩＲ−７の活性に拮抗する薬剤を該患者へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該治療が、ＬＩＲ−２に作動する薬剤を該患者へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該治療が、ＬＩＲ−３に作動する薬剤を該患者へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該治療が、ＬＩＲ−３に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤；ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤；ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−２に作動する薬剤；ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤：からなる群より選択される薬剤の組み合わせを該患者へ同時に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該ＬＩＲ−７のアンタゴニストが、ＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性であるアンタゴニスト性抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該ＬＩＲ−２のアゴニストが、ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
該ＬＩＲ−３のアゴニストが、ＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
該患者が、ＴＮＦαアンタゴニスト、ＩＬ−１アンタゴニスト、ＣＤ４に対する抗体、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬及び疾患修飾性抗リウマチ薬からなる群より選択される付加的な薬物少なくとも１つにより同時に治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性モノクローナル抗体、ＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性モノクローナル抗体及びＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性であるアンタゴニスト性モノクローナル抗体からなる群より選択される薬剤１つ以上を治療的に有効な量患者に投与することを含む、慢性関節リウマチを有する患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節周囲の軟骨及び骨の破壊を伴う、滑膜肥厚及び滑膜パンヌス形成を特徴とする慢性炎症性滑膜炎である（Ｔａｋ，ＰＰ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４３（１２）：２６１９−３３（２０００））。炎症部位に見出される優勢な炎症細胞は、マクロファージ（Ａ型滑膜細胞）及び繊維芽細胞様細胞（Ｂ型滑膜細胞）、並びに増加した数の好中球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、形質細胞及びリンパ球である（Ｌｅｉｒｉｓａｌｏ−Ｒｅｐｏら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  １７（４）：４２７−４２（１９９３）；Ｇｏｔｉｓ−Ｇｒａｈａｍ  Ｉ及びＭｃＮｅｉｌ  ＨＰ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４０（３）：４７９−８９（１９９７）；Ｍａｌｏｎｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３０（２）：１３０−３７（１９８７）；Ｂｒｏｍｌｅｙ  Ｍ及びＷｏｏｌｅｙ  ＤＥ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ２７：８５７−６３（１９８４）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（２）：３１２−３１（１９９５））。これらの細胞は、脂質メディエーター（Ｅｌｍｇｒｅｅｎら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ４６：５０１−０５（１９８７）；Ｍｏｉｌａｎｅｎ  Ｅ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７５（Ｓｕｐｐｌ  ２）：４−８（１９９４））、炎症前（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：３３４７−５３（１９９０）；Ｗｅｓｔａｃｏｔｔら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ４９：（９）６７６−８１（１９９０）；Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８６：１７９０−９８（１９９０）；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｂｒ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ３０（Ｓｕｐｐｌ  １）：７６−８０（１９９１））及び組織分解酵素（Ｈｅｍｂｒｙら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５４（１）：２５−３２（１９９５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５３（１）：７６８−７２（１９９４））のような多数の因子を放出することにより、炎症及び組織破壊を促進するようである。
【０００２】
滑膜マクロファージは、インターロイキンＩＬ−１β及び腫瘍壊死因子ＴＮＦα（これらは、これらのサイトカインを標的とした疾患修飾療法の効力により立証されるように、ＲＡの病原の中心である）の優勢な起源である（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ及びＭａｉｎｉ  ＲＮ、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：１６３−９６（２００１）））。ＲＡにおける関節破壊は、マクロファージ及び破骨細胞に由来するプロテアーゼによって媒介される可能性が高い。リウマチ滑膜における活性化された白血球の存在に関する証拠は豊富に存在するが、それらの活性化の（１つ以上の）メカニズム及び制御はよく理解されていない。
【０００３】
「白血球免疫グロブリン様受容体（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」（ＬＩＲ）又は「免疫グロブリン様転写物（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）」（ＩＬＴ）と名付けられた新しいタンパク質のファミリーは、炎症及び免疫応答に関与している様々な細胞の表面上に発現している。このファミリーのメンバーは、細胞質尾部に存在するイムノレセプターチロシンベースドインヒビトリーモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆｓ）（ＩＴＩＭ）によって、又は「イムノレセプターチロシンベースドアクチベーションモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）」すなわち「ＩＴＡＭモチーフ」を含有している他のタンパク質との細胞膜における会合によって、細胞応答を調整することがインビトロで示されている（Ａｒｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：２３４２（１９９７）；Ｆａｎｇｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：３４２３−３４（１９９８）；Ｂｏｒｇｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：５１９２−９６（１９９７）；Ｓａｍａｒｉｄｉｓ  Ｊ及びＣｏｌｏｎｎａ  Ｍ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：６６０−６５（１９９７）；ＷＯ９８／４８０１７；米国特許第６，１４０，０７６号；及びＷＯ００／６８３８３）。
【０００４】
ＬＩＲによって制御される細胞性応答の範囲は、インビトロで研究されている。ＬＩＲ−１又はＬＩＲ−２によるＭＨＣクラスＩ分子の認識は、ＮＫ細胞活性及びＴ細胞細胞障害性を阻害することが示された（例えば、Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｊ  Ｅｘｐ  ＭｅｄＩ  １８６：１８０９−１８（１９９７）；Ｆａｎｇｅｒら、１９９８を参照）。阻害性のＬＩＲ−１、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−５のＢＣＲ、ＴＣＲ、ＦｃγＲ又はＭＨＣクラスＩ分子のような活性化受容体との同時ライゲーション（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、活性化分子によって誘発されるＣａ２＋流動及び後続の下流イベントを阻害した（Ｃｅｌｌａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１７４３−５１；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８；及びＳａｖｅｒｉｎｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：３７４２−５５（２０００））。これらのイベントは、ＬＩＲ−１のＴ細胞受容体との相互作用に関して最近解明された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５１４−２１（２００１））。
【０００５】
ＬＩＲ及び関連分子が、炎症状態における白血球の活性化のしきい値及び／又は程度を決定するかもしれないことが示唆された。この概念は、ＬＩＲとの類似性を有するタンパク質であるｇｐ４９Ｂ１の破壊を有するマウスにおける最近の研究により支持されている（Ｄａｈｅｓｈｉａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：３０９−３１８（２００１））。
【０００６】
ＬＩＲ−１、２、３、５及び８を含む阻害性ＬＩＲは、２個から４個のＩＴＩＭを含有している長い細胞質ドメインを示す。「ＩＬＴ４」又は「ＭＩＲ１０」としても既知のＬＩＲ−２は、３個のＩＴＩＭモチーフを含有しており、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含むＭＨＣクラスＩタンパク質の多様なアレイに結合する（Ｆａｎｇｅｒら、１９９８）。ＬＩＲ−１及びＬＩＲ−２は、広い特異性でクラスＩ分子と相互作用し、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＨＬＡ−Ｇ内の対立遺伝子を認識することが知られている（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８；Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２７３−８２（１９９７）；Ｂａｎｈａｍら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ６５：８４１−４５（１９９９））。阻害性ＬＩＲが細胞活性化の阻害を媒介する１つの手段は、非受容体チロシンキナーゼカスケードを介するシグナリングを阻害するか又は終結させるため、ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン含有ホスファターゼ１（ＳＨＰ−１）を動員することによる（例えば、Ｃｅｌｌａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：３０９６−３１００（１９９８）；及びＤｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５１４−２１（２００１）を参照）。
【０００７】
ＬＩＲ−６ａ、ＬＩＲ６ｂ及びＬＩＲ−７を含む活性化ＬＩＲは、短い細胞質ドメイン、及びＦｃεＲＩγとの会合を容易にし得る膜貫通ドメイン内の正電荷を有するアルギニン残基を特徴とする。ＬＩＲ−７は「ＩＬＴ１」とも呼ばれる。ＬＩＲ−７自体は、かなり短い細胞質尾部を含有しているが、細胞膜においてＦｃ受容体ガンマ鎖（ＦｃεＲＩγ）と特異的に会合する（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５−８（１９９９））。このＦｃ受容体ガンマ鎖は、ＩＴＡＭを含有している細胞質尾部を有しており、従って刺激シグナルを伝達することができる。ＦｃεＲＩγは、他のタンパク質、即ちＦＣαＲ及び活性化ＮＫ細胞受容体のためのシグナリングパートナーを務めることが知られている。ナカジマらは、ＬＩＲ−７が、会合したタンパク質ＦｃεＲＩγを使用して、刺激シグナルを変換するよう細胞を活性化するということを提唱している。ＦｃεＲＩγとの会合を容易にし得るＬＩＲ−７の膜貫通ドメイン内の正電荷を有するアルギニン残基。ナカジマらは、トランスフェクトされたＬＩＲ−７を発現しているラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ細胞）におけるセロトニン放出をＬＩＲ−７が誘起し得ることを示すことにより、細胞活性化を媒介するＬＩＲ−７の能力を証明した。セロトニン放出は、細胞表面Ｌ１Ｒ−７を架橋する抗体に細胞を曝すことにより誘起された。さらに、このグループは、ＬＩＲ−７の架橋が、初代単球、ＬＩＲ−７発現ベクターにより形質転換されたＰ８１５細胞、及びトランスフェクトされたＲＢＬ細胞（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９）を含むいくつかの細胞型において、細胞内カルシウム移動を誘発することを証明した。カルシウムの移動は、単球活性化における初期のイベントである。
【０００８】
ＬＩＲ−１、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−５及びＬＩＲ−７の細胞分布は、モノクローナル抗体を使用して詳細に研究されている。ＬＩＲ−１は、全ての末梢血単球、インビトロで派生した樹状細胞及びマクロファージ、Ｂ細胞、並びにＴ細胞及びＮＫ細胞のサブセットに発現している（Ｓａｍａｒｉｄｉｓら、１９９７；Ｃｏｓｍａｎら、１９９７）。より限定された細胞分布が、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−５に関して報告されており、それらは単球及び樹状細胞において最も顕著である（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８）。ＬＩＲ−７は、全ての末梢血単球及び顆粒球、インビトロで派生したマクロファージ、並びに樹状細胞に発現している（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９）。ｍＲＮＡレベルでは、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−６の転写物は単球及びＢ細胞に検出され、ＬＩＲ−４の転写物はＢ細胞、ＮＫ細胞及び単球に検出され、ＬＩＲ−８の転写物はＮＫ細胞にのみ検出された（Ｂｏｒｇｅｓら、１９９７；Ａｒｍら、１９９８）。従って、ＬＩＲ発現の治療的な調節は、有望な探究分野である。
【発明の開示】
【０００９】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７を特異的に標的とする薬剤１つ以上を投与することによりＲＡを治療する方法が、ここで提供される。ここに開示された結果は、これらの３つのＬＩＲが、滑膜組織に浸潤する白血球の活性化の制御に関係しているかもしれないことを示している。従って、ＲＡ患者の関節における炎症は、炎症を起こした関節に存在する単球もしくはマクロファージの活性化を減少させるかもしくは排除するため、又はそれらの炎症部位への動員を減少させるため、ＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３及び／又はＬＩＲ−７の発現又は機能を調節する薬剤を投与することにより改善され得る。これは、刺激シグナルを伝達するＬＩＲ−７を調節することにより、かつ／もしくは誘起された場合に阻害効果を発揮するＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３を調節することにより、又はこれらのＬＩＲのうちの２つもしくは３つ全てを同時に調節することにより、達成され得る。
【００１０】
ＲＡを有する患者は、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３に結合するアゴニスト性薬剤を有効量投与するか、又はこれらのタンパク質の各々に結合するアゴニストを同時に投与し、それによりそれらの阻害活性を誘起することにより、本発明に従い治療される。ＬＩＲ−２アゴニスト及び／又はＬＩＲ−３アゴニストのＲＡ患者への投与は、患者における滑膜単球内のカルシウム移動を減少させる。本発明の好ましい実施形態において、その薬剤は、ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である。もう１つの好ましい実施形態において、その薬剤は、ＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である。モノクローナル抗体が好ましい。好ましくは、モノクローナル抗体は、可変部がげっ歯動物に由来し、残部がヒトに由来するヒト化抗体である。より好ましくは、モノクローナル抗体は完全にヒトのものである。他の実施形態において、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３アゴニストは、小さい有機分子である。
【００１１】
本発明のもう１つの局面において、ＲＡ患者は、ＬＩＲ−７の生物学的活性に拮抗する薬剤により治療される。そのような薬剤は、ＬＩＲ−７が誘起されるのを部分的又は完全に阻止し、従って炎症を起こした関節の部位においてそれが単球又はマクロファージを活性化するのを防止する。ＲＡ患者へのＬＩＲ−７アンタゴニストの投与は、患者における滑膜単球から放出されるカルシウムの量を減少させる。本発明の１つの局面において、薬剤は、ＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性であるアンタゴニスト性抗体であり、即ち、その抗体はＬＩＲ−７に特有のエピトープと特異的に結合する。そのような抗体は、阻止抗体であり、ＬＩＲ−７のそのリガンドとの結合を阻止する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。好ましい実施形態において、モノクローナル抗体はヒト化抗体であり、もう１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は完全にヒトのものである。もう１つの実施形態において、ＬＩＲ−７アンタゴニストは、ＬＩＲ−７の細胞外領域がヒト免疫グロブリンタンパク質のＦｃ領域に連結されている融合タンパク質を含む、ＬＩＲ−７の細胞外領域を含む可溶性ポリペプチドである。さらに他の実施形態において、ＬＩＲ−７アンタゴニストは小さい有機分子である。ＬＩＲ−７アンタゴニストは、単独で、又はＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３のアゴニストと一緒に投与され得る。
【００１２】
本発明の他の局面は、互いに同時に投与されるか、又はＬＩＲ−７に拮抗する薬剤と同時に投与されるＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３を誘起するアゴニスト性薬剤の様々な組み合わせによるＲＡの同時治療を含む治療法を提供する。これには、以下の組み合わせのうちの１つの同時投与を含む治療が含まれる：ｉ）ＬＩＲ−３に作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）薬剤；ｉｉ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤；ｉｉｉ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−３に作動する薬剤；ｉｖ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−３に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤。好ましくは、そのような薬剤は、ヒト化抗体又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。他の好ましい薬剤は、ＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３に作動するか、又はＬＩＲ−７に拮抗する、小さい有機分子である。さらに、前記のＬＩＲ調節剤を、慢性関節リウマチを治療するために使用される他の薬物療法の同時使用と組み合わせた治療法が、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７が、ＲＡを有する患者の滑膜に浸潤している白血球にディファレンシャルに発現していることが、免疫組織化学的技術を使用して、ここで示される。ＲＡ患者とは、１つ以上の炎症を起こした関節又は敏感な関節を有しており、血清がリウマチ因子陽性と判定された人々である。ＲＡ患者に見られるもののような炎症応答は、阻害シグナル及び活性化シグナルの複雑なネットワークによって制御されている可能性が高い。従って、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７のＲＡ滑膜における発現を調節する薬剤の投与を含む治療法が、ここで提供される。本発明の１つの実施形態において、開示された治療的処置は、非ＲＡ患者（対照組織）と比較して上昇したレベルのＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７を発現している滑膜組織を有するＲＡ患者に投与される。これらのタンパク質のレベルが上昇しているか否かを決定するためには、滑膜生検に由来する組織が、これらのＬＩＲに対する抗体による染色により分析される。ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の生物学的活性を阻害又は増強する薬剤は、ここで、「ＬＩＲ調節剤」と呼ばれる。
【００１４】
ここに開示された観察は、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７が、ＲＡを有する患者の滑膜に浸潤している白血球には上昇したレベルで発現しているが、骨関節炎（ＯＡ）を有している患者の滑膜においては上昇していないことを示している。ＲＡは炎症を媒介する白血球の滑膜組織への広範な浸潤を特徴とするが、ＯＡは通常炎症には関連していない慢性変性性状態である。開示された観察はまた、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の発現が、疾患の初期段階にあるＲＡ患者より、確立された繊維症を有するＲＡ患者の方が低いことを示している。一般に、繊維症は、罹患年数が長いＲＡ患者においてのみ発症する。例えば、罹患年数が８年以上である者は、関節繊維症を発症している可能性が高い。本発明の１つの実施形態において、ＬＩＲ調節剤は、関節が繊維症になっていないＲＡ患者に投与される。
【００１５】
ここで使用されるように、ＬＩＲ−２という用語には、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有している異型及びミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）が包含される。配列番号２に示されたＬＩＲ−２は、アミノ酸１〜１６に１６アミノ酸のシグナルペプチドを含む４５８アミノ酸（配列番号２のアミノ酸１〜４５８）の予想された細胞外領域を有している。このＬＩＲ−２は、配列番号２のアミノ酸４５９〜４８３に膜貫通ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸４８４〜５９８を含む細胞質ドメインも含んでいる。細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメインを含んでおり、細胞質ドメインはアミノ酸５３１〜５３６、５６０〜５６５及び５９０〜５９５に３個のＩＴＩＭモチーフを含んでいる。
【００１６】
「ＬＩＲ−２」という用語には、ここで使用されるように、配列番号２に示されたＬＩＲ−２のアミノ酸１７〜４５８との少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、又はより好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するＬＩＲに関連した生物学的活性も有するポリペプチドも含まれる。そのような生物学的活性の一例は、ＭＨＣクラスＩポリペプチドとの結合能である。ＬＩＲ−２ポリペプチドのＭＨＣ  Ｉとの結合能は、細胞表面上に発現されたＭＨＣクラスＩタンパク質とのＬＩＲ−２ポリペプチドの結合を検出するアッセイのような任意の便利なアッセイにより決定され得る。結合の特異性は、推定ＬＩＲ−２が、ＭＨＣ  Ｉを発現していることが既知の細胞と結合するのを、ＭＨＣ  Ｉに特異的な抗体が阻止し得るか否かをテストすることにより確認され得る。そのようなテストに使用され得る細胞及び細胞系には、ＣＢ２３、ＨＳＢ２、ＭＰ−１、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、初代Ｔ細胞、初代Ｂ細胞又は初代ＮＫ細胞のような、ＭＨＣ  Ｉを発現している任意の細胞が含まれる。
【００１７】
ＬＩＲ−２のＭＨＣ  Ｉとの結合を検出するのに適しているアッセイは、参照して完全にここに組み込まれるＷＯ９８／４８０１７に記載されたフローサイトメトリーアッセイである。簡単に説明すると、このアッセイを実施するには、まず、ＭＨＣ  Ｉを発現している細胞を、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳを含む０．２％アジ化物含有ＰＢＳ）により洗浄し、次いで、約１０５個に等分した細胞を、ブロッキングバッファー（２％ＦＣＳ、５％ＮＧＳ、５％ウサギ血清を含むＰＢＳ）１００μＬ中で約１時間インキュベートする。各細胞試料に、増加する量（例えば、０、２、５又は１０μｇ）の対照血清又はＷ６／３２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−９５）を含むブロッキングバッファー１００μＬを添加する。Ｗ６／３２とは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣポリペプチドを含むＭＨＣクラスＩ重鎖に特異的な抗体であり、この抗体とのプレインキュベーションは、他のタンパク質のＭＨＣ  Ｉとの特異的結合を競合的に阻止する。Ｗ６／３２又は対照血清の添加の後、試料を約１時間氷上でインキュベートし、次いで、ＦＡＣＳバッファー２００μＬで約３回洗浄する。次に、ＬＩＲ−２ポリペプチド約５μｇを添加する。このアッセイのためのＬＩＲ−２ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンタンパク質のＦｃ領域に連結されたＬＩＲ−２の細胞外領域を含む可溶性融合タンパク質（ｓＬＩＲ−２／Ｆｃ）である。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃポリペプチドを含むブロッキングバッファーを各試料に添加し、その混合物を約１時間氷上でインキュベートする。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃとのインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳバッファーで数回洗浄し、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と特異的に免疫反応性であるビオチン標識マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手可能）及びＳＡＰＥ（ストレプトアビジン−フィコエリトリン；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓより入手可能）により約４５分間処理する。ＳＡＰＥは、抗ヒトＦｃ／ビオチンのビオチン部分と結合し、適切な励起条件及び放射条件に曝された場合に蛍光を発する蛍光性化合物である。従って、ビオチン化抗ヒトＦｃが、細胞と結合したｓＬＩＲ−２／Ｆｃと反応し、代わってＳＡＰＥが抗ヒトＦｃのビオチン部分と結合する。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃが結合した細胞を検出するため、ＬＩＲ−２／Ｆｃ、抗ヒトＦｃ及びＳＡＰＥに曝された細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＳＡＰＥ標識細胞を検出するためフローサイトメトリーに供する。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃが細胞と結合するが、それがＷ６／３２によって競合的に防止される場合、このことは、ｓＬＩＲ−２／ＦｃがＭＨＣ  Ｉとの特異的結合が可能であることを示す。
【００１８】
ここで使用されるようなアミノ酸配列同一率は、同一である整列化されたアミノ酸の数を、比較される２つの配列のより短い方のアミノ酸の総数によって割ることにより決定される。配列を整列化し配列の同一性及び可変性を決定するための多数のコンピュータプログラムが、商業的に入手可能である。これらのプログラムは、前述の同一性の定義に基づく同一性情報を提供する。１つの適切なコンピュータプログラムは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載された、ウィスコンシン大学ジェネティクスコンピューターグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰプログラム（バージョン６．０）である。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）によって改訂されたような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列化法を利用する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメータは、以下のものを含む：（１）アミノ酸のための単項比較マトリックス（同一に対する１及び非同一に対する０の値を含有）及びＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３〜３５８頁，１９７９によって記載されたようなＧｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティ及び各ギャップ内の各シンボルに対するさらに０．１０のペナルティ；並びに（３）エンドギャップに対するペナルティなし。配列操作のための、ＧＣＧコンピュータパッケージの一部としてやはりウィスコンシン大学より入手可能である、ＢＥＳＴＦＩＴと呼ばれるもう１つの類似のプログラムも、これらの比較に有用である。
【００１９】
ここで使用されるような「ＬＩＲ−２」という用語は、さらに、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされたポリペプチドを指す。そのような核酸分子には、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡが含まれる。等価であるが、「Ｔ」が「Ｕ」に置換されている配列を有するＲＮＡ分子も含まれる。そのような核酸によってコードされたＬＩＲ−２ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉとの結合能を有する。
【００２０】
「ＬＩＲ−２」という用語には、配列番号２に示されたＬＩＲ−２によって示される生物学的活性を保有しており、かつ中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件の下で配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズすることができる相補鎖を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、不適正な塩基対の形成を最小限に抑えるために設計されている。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに影響する基本パラメータ及び適切な条件を考案するための案内は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，チャプター９及び１１；並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０及び６．３〜６．４）に記述されている。ハイブリダイゼーションは、溶液中で、又はニトロセルロースもしくはナイロンフィルターのような固体表面へ標的核酸を固定することにより実施され得る。テストすべきＤＮＡが、標識され、変性させられ、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして使用される。所望のストリンジェンシーの程度の条件は、例えばＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づき、当業者によって容易に決定され得る。フィルターに結合した標的ＤＮＡのための中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの様式は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有している予備洗浄溶液、６×ＳＳＣを含有しているハイブリダイゼーションバッファー、及び約６８℃のハイブリダイゼーション温度を使用し（又は、５０％ホルムアミド及び６×ＳＳＣを含有しているハイブリダイゼーションバッファー、並びに約４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用し）、次いで、０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有しているバッファー中で約６０℃でフィルターを洗浄することを含む。「ＳＳＣ」（１×）とは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）である。一般に、高度にストリンジェントな条件は、約６８℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄工程が実施されることを除き、前記と同様に定義される。所望により、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））が、上記ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファー中のＳＳＣの代わりに使用されてもよく、ＳＤＳは、ストリンジェンシーに影響することなく、増加させられてもよいし、又はハイブリダイゼーションバッファーもしくは洗浄バッファーのいずれかから省略されてもよい。これらの核酸によってコードされたＬＩＲ−２タンパク質が保有している生物学的活性には、以下のうちの１つ以上が含まれる：ＭＨＣクラスＩタンパク質と結合する能力；誘起時に、活性化された単球における細胞内カルシウム流動を減少させる能力；及び誘起時に、活性化された単球における細胞内リン酸化チロシンのレベルを減少させる能力。
【００２１】
さらに、本発明に係るＬＩＲ−２ポリペプチドには、ＭＨＣ  Ｉに結合することができ、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体と免疫反応性であるタンパク質が含まれる。ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性の抗体とは、他のタンパク質との認め得る程度の結合を示さないものである。例えば、ＬＩＲ−２に特異的な抗体は、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７とは結合しない。特異的抗体を作製する方法は、この技術分野において周知であり、後述の方法のような任意の適切な方法が、そのような抗体を作製するために使用され得る。一般に、そのような抗体と反応するＬＩＲ−２ポリペプチドは、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされる。
【００２２】
ここで使用されるように、「ＬＩＲ−３」という用語には、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有する異型及びミューテインが包含される。配列番号４のＬＩＲ−３ポリペプチドは、例えば、配列番号３に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ得る。「ＬＩＲ−３」という用語には、少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％の配列番号４とのアミノ酸配列同一性を有しており、さらに配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドによって発現される生物学的活性を保有している異型も含まれる。そのような生物学的活性には、活性化された単球における細胞内カルシウム流動を減少させる能力、及び活性化された単球に存在するタンパク質内のリン酸化チロシンの量を減少させる能力が含まれる。同一率は、前記のようにして決定される。配列番号４に提示されたＬＩＲ−３アミノ酸配列は、アミノ酸１〜１６のシグナルペプチドを含む、アミノ酸１〜４４３を含有している細胞外ドメイン；アミノ酸４４４〜４６４を含む膜貫通ドメイン；及びアミノ酸４６５〜６３１を有する細胞質ドメインを有している。配列番号４のＬＩＲ−３ポリペプチドの細胞外領域は、４つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含有しており、その細胞質領域は２つのＩＴＩＭモチーフ対を含有している。配列番号４において、最初のＩＴＩＭモチーフ対は、アミノ酸５１２〜５１７、５４１〜５４６に位置しており、第二の対は、アミノ酸５９３〜５９８及び６２３〜６２８に位置している。従って、ここで使用されるように、「ＬＩＲ−３」という用語には、細胞外領域に４個のＩｇ様ドメイン、細胞質尾部に４個のＩＴＩＭモチーフを有しており、かつ配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するＬＩＲ−３によって示される生物学的活性を少なくとも１つ有しているポリペプチドが包含される。本発明に係るＬＩＲ−３ポリペプチドは、このタンパク質を発現している単球におけるカルシウム放出を抑制する阻害性の刺激を伝達することができる。
【００２３】
ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３は、阻害性タンパク質である。これらのタンパク質の生物学的活性には、活性化された単球を阻害する能力が含まれる。ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３のこの活性をアッセイするための１つの方法においては、まず、単球を抗ＣＤ６４抗体に曝すことにより活性化する。この活性化には、これらの細胞における細胞内カルシウム放出及びタンパク質上のチロシン残基のリン酸化が伴う。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３は活性化された単球の表面上に発現される。これらの単球上のＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の誘起は、例えば、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３のいずれかに特異的なアゴニスト性抗体に細胞を曝すことにより達成され得る。いくつかの場合において、誘起は、細胞表面上に発現されたＬＩＲの架橋をもたらす、抗ＬＩＲ抗体と反応する二次抗体を添加することも含む。この架橋は、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の阻害機能を誘起し、それにより、下記のようにしてアッセイされ得る、減少したカルシウム流動をもたらす。
【００２４】
「ＬＩＲ−７」という用語には、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有する異型及びミューテインが包含される。配列番号６に提示されたアミノ酸配列は、アミノ酸１〜４４９を含む細胞外ドメイン、アミノ酸１〜１６のシグナルペプチド、アミノ酸４５２の電荷を有するアルギニン残基を含むアミノ酸４５０〜４６８を含む膜貫通ドメイン及びアミノ酸４６９〜４８３の短い細胞質ドメインを有している。細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメインを含んでいる。
【００２５】
本発明の１つの局面において、ＬＩＲ−７ポリペプチドは、配列番号５に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。さらに、「ＬＩＲ−７」という用語には、番号５に示されたヌクレオチド配列を有する核酸の相補鎖と中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされ、さらに、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質が保有している生物学的活性を有しているポリペプチドが包含される。ハイブリダイゼーション条件は、前記と同様に定義される。
【００２６】
本発明に係るＬＩＲ−７ポリペプチドは、刺激能を保有している（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９参照）。ＬＩＲ−７ポリペプチドの誘起は、ラット好塩基球性白血病細胞からのセロトニン放出を刺激し、このタンパク質を発現している初代単球又はその他の細胞からのカルシウム放出を刺激する。カルシウム放出は、単球活性化の測定可能な指標であり、例えば個々の細胞における細胞質カルシウムレベルをモニタリングするためのナカジマらのアッセイ（１９９９）を使用して検出され得る。このアッセイを実施するためには、細胞に、Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ色素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を負荷し、以前に記載されたような（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７及びＮａｋａｊｉｔａら、１９９９参照）フローサイトフルオロメーターで分析する。簡単に説明すると、ＬＩＲ−７を架橋する抗体の添加のために分析を休止する前に、基線を取得する。架橋は、一般に、ＬＩＲ−７に対するモノクローナル抗体、及び抗ＬＩＲ−７抗体を生成させた動物種に由来するＩｇＧに対する抗体を添加することを必要とする。分析は、フローサイトメトリーによって、負荷されたＩｎｄｏ−１色素の４０５／５２５スペクトル放射比率を測定することからなる。
【００２７】
セロトニン放出は、ＬＩＲ−７活性を測定するために使用され得るもう１つの指標である。セロトニン放出は、Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７に以前に記載されたようにしてアッセイされる。簡単に説明すると、細胞を、Ｈ３−セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）でパルス処理し、洗浄し、次いでセロトニンに対する抗体及び細胞表面上のＬＩＲ−７を架橋する抗体又は自発的放出に関して補正するための対照抗体のいずれかと接触させる。セロトニン放出は、以下の式に従い計算される：セロトニン放出率（％）＝１００×（［ｃｐｍ試料］−［ｃｐｍ自発的放出］）／（ｃｐｍ全）。
【００２８】
ここで使用されるような「ＬＩＲ−２」という用語には、配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドも包含される。ここで使用されるような「ＬＩＲ−３」という用語には、配列番号４によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドも包含される。「ＬＩＲ−７」という用語には、配列番号６によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドが包含される。
【００２９】
治療剤
開示された治療法のために有用な治療剤には、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の発現又は機能のレベルを増加させ得る非毒性の薬剤、及びＬＩＲ−７の発現又は機能のレベルを減少させ得る非毒性の薬剤が含まれる。この目的のための例示的な薬剤には、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性のアゴニスト性抗体及びＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性のアンタゴニスト性抗体が含まれる。他の実施形態において、治療剤は、ＬＩＲ−７の細胞外領域がヒトＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域に連結されている融合タンパク質（ｓＬＩＲ−７：Ｆｃ）を含む、ＬＩＲ−７の細胞外領域の一部又は全部を含む可溶性ポリペプチドである。Ｓｌｉｒ−７：Ｆｃは、天然ＬＩＲ−７の競合的阻害剤として作用する。本発明の１つの局面において、治療剤は、配列番号６のアミノ酸１〜４４９又は１７〜４４９が前記のようなＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合しているポリペプチドである。
【００３０】
ＬＩＲのうちの１つに特異的な抗体を生成させるためには、完全ＬＩＲ、又はＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３もしくはＬＩＲ−７の細胞外領域を含むポリペプチド、又はそれらの抗原性副次部分を抗原性刺激として使用することが可能である。ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の細胞外領域は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸１〜４５８、配列番号４のアミノ酸１〜４４３及び配列番号６のアミノ酸１〜４４９に相当する。配列番号２、４及び６のアミノ酸１〜１６は、ＬＩＲの成熟中に開裂されるシグナル配列に相当する。全長ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３もしくはＬＩＲ−７、又はシグナル配列を含む、もしくは含まないそれらの細胞外領域が、抗体を生成させるために使用され得る。シグナルペプチドを欠くＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の細胞外領域は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸１７〜４５８、配列番号４の１７〜４４３又は配列番号６の１７〜４４９に相当する。さらに、そのＬＩＲに特有の抗原性エピトープを少なくとも１つ含有しているＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の副次部分を使用して抗体を生成させることもできる。
【００３１】
治療剤として使用するためのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、従来の技術によって調製され得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８０；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｄ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８参照；米国特許第４，４１１，９９３号も参照のこと）。モノクローナル抗体を作成するための１つの例示的なプロトコルは、ＷＯ９８／４８０１７に記載されたものである。簡単に説明すると、ＢＡＬＢ−Ｃマウスを、抗原性ＬＩＲポリペプチド１０μｇで、０週目、２週目及び６週目に免疫感作する。初回免疫感作はバキセル社（Ｖａｘｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．）のタイターマックス（ＴＩＴＥＲＭＡＸ）アジュバントを利用し、後続の免疫感作は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用する。１１週目に、３μｇから４μｇの抗原性タンパク質を含むＰＢＳの静脈内投与によってマウスを追加免疫する。静脈内追加免疫の３日後に、脾細胞を採集し、５０％ＰＥＧ１５００水溶液を使用して、Ａｇ８．６５３骨髄腫融合パートナーと融合させる。ハイブリドーマ細胞をスクリーニングするため、ハイブリドーマ細胞の個々のコロニーからの上清を、抗体を生成させているＬＩＲでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞に対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。このスクリーニングのためには、トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞２×１０３個を含むＰＢＳを、ポリスチレン９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェルに添加し、プレートコート抗原として細胞をプレートに乾燥させる。続いて、陽性上清を、ＦＡＣＳ分析及びＬＩＲでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を使用したＲＩＰによって確認する。ハイブリドーマをクローニングし、同アッセイを使用して追跡する。モノクローナル培養物を増殖し、上清をＢｉｏＲａｄプロテインＡアガロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。上記の手法の変形物は、この技術分野において既知であり、所望により、ハイブリドーマを作成又はスクリーニングするために使用され得る。
【００３２】
本発明のモノクローナル抗体には、マウス又はラットのモノクローナル抗体のヒト化バージョンも含まれる。そのようなヒト化抗体は、既知の技術により調製され得、ヒトに投与された場合、減少した免疫原性という利点を与える。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス又はラットの抗体の可変部（又はそれの抗原結合部位のみ）、及びヒト抗体に由来する定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウス又はラットのモノクローナル抗体の抗原結合部位、並びにヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠く）可変部断片及び定常部を含み得る。キメラモノクローナル抗体及びさらに改変されたモノクローナル抗体の作製のための手法には、リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８）、リウ（Ｌｉｕ）ら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，１９８７）、ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，１９８９）、並びにウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及びハリス（Ｈａｒｒｉｓ）（ＴＩＰＳ  １４：１３９，Ｃａｎ，１９９３）に記載されたものが含まれる。抗体をヒト化するための有用な技術は、米国特許第６，０５４，２９７号にも論じられている。トランスジェニックに抗体を製造する手法は、ＧＢ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号及び第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出され得る。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトのもの又はヒト化したものであり；そのようなヒト抗体又はヒト化抗体を作出するための技術も周知であり、例えばメダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びアブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）より商業的に入手可能である。もう１つの好ましい実施形態において、ヒトで使用するための完全にヒトの抗体は、ヒト抗体可変ドメインのファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより作製される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（６）：５３５−５３９；及び米国特許第５，９６９，１０８号）。
【００３３】
ＬＩＲ特異的抗体がアゴニスト性であるか又はアンタゴニスト性であるかを決定するため、スクリーニング手法が使用される。ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３に特異的なアゴニスト性抗体は、ＲＡを治療するための治療剤として有用であり、例えば、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３を発現している活性化された単球におけるカルシウム流動又はチロシンリン酸化をダウンレギュレートする能力によって特定され得る。そのようなアッセイのためには、単球を活性化し、スクリーニングされるＬＩＲ−２特異的又はＬＩＲ−３特異的な抗体の存在下又は非存在下で、前記のようにしてカルシウム流動を測定する。活性化された単球を、分析中、推定アゴニスト性抗体に曝す。ＲＡの治療剤として有用なＬＩＲ−７に対するアンタゴニスト性抗体は、ＬＩＲ−７と結合することができ、かつ単球におけるカルシウム流動を誘起し得ないことにより特定され得る。
【００３４】
本発明の１つの局面において、治療剤として使用するためのＬＩＲ特異的抗体を生成させるために使用される抗原性刺激は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分及び標的ＬＩＲの細胞外領域を含む融合タンパク質である。この目的に適している１つのＦｃポリペプチドは、参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／１０１５１に記載されているヒトＩｇＧ１に由来する天然Ｆｃ領域ポリペプチドである。融合タンパク質を構築するためのもう１つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号に記載されたＦｃミューテインである。このミューテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している点を除き、ＷＯ９３／１０１５１に提示された天然Ｆｃ配列のものと同一である。このミューテインＦｃは、免疫グロブリン受容体に対する減少した親和性を示す。
【００３５】
ＬＩＲ：Ｆｃ融合タンパク質を作成する１つの適切な手段は、ＷＯ９８／４８０１７に記載されたものである。この方法を適用するためには、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の細胞外領域の全部又は一部をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域をコードするＤＮＡと融合させる。ＬＩＲ−２：Ｆｃ融合体を作成するためには、細胞外領域全体（配列番号２のアミノ酸１〜４５８）又はＭＨＣ  Ｉと結合し得るその一部を使用することができる。ＬＩＲの細胞外領域をコードするｃＤＮＡは、細胞外領域をコードするヌクレオチド配列の両側に隣接するＰＣＲプライマーを使用することにより得られる。この目的のためには、例えば、配列番号１、番号３又は番号５に示されるようなヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡのような全長ＬＩＲ  ｃＤＮＡが、ＰＣＲのための鋳型として使用され得る。本発明の１つの実施形態において、増幅産物が増幅されたＤＮＡ断片の５’及び３’末にそれぞれＳａｌＩ及びＮｏｔＩＩ制限部位を導入するよう、５’及び３’末端にＳａｌＩ及びＮｏｔＩＩ制限部位が挿入されたプライマーが合成される。これらの制限部位は、増幅されたＤＮＡの発現ベクターへの付着を容易にする。あるいは、その他の制限部位が、増幅されたＤＮＡの末端に挿入されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質の発現のためのベクター構築物を調製するため、ＩｇＧ１のミューテインヒトＦｃ領域をコードするＤＮＡを、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の細胞外領域をコードするＤＮＡにライゲートさせる。本発明の１つの実施形態において、これは、ＬＩＲ細胞外領域が融合タンパク質のアミノ末端に位置するようなされる。次いで、融合ＤＮＡ構築物を、ＰＤＣ４０９のような適切な発現ベクターとライゲートさせ、ＣＶ１−ＥＢＮＡ又はＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＴＬ−１６５０）のような適切な宿主細胞において発現させる。サル細胞株ＣＯＳ−１は、融合タンパク質の発現を確証するために使用され得る。融合タンパク質を精製するため、ＣＯＳ−１培養物からの上清を遠心分離によって清浄化し、例えばＢｉｏＣａｄシステム及びＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａカラムを使用することにより、又は当業者に既知の他の比較可能な方法により精製する。プールされた溶出したタンパク質は、発現を確証し、発現された組換えタンパク質が予想された分子量を有していることを立証するため、銀染色と共にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析され得る。
【００３６】
同時治療
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の調節剤の１つ以上が、ＲＡを治療するために使用される他の薬物１つ以上と同時に投与される組み合わせ治療が、ここで提供される。そのような治療法において、ＬＩＲ調節剤は、ＲＡを治療するために使用される１つ、２つ、３つ又はそれ以上の他の薬物療法と同時に投与され得る。付加的な薬物療法は、ＬＩＲ調節剤と同時期的に又は交互に投与され得る。あるいは、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のアンタゴニスト又はＩＬ−１のアンタゴニストのようなＲＡを治療するために使用される他の何らかの薬剤による継続的な治療の背景に対して、ＬＩＲ調節剤が断続的に投与されてもよい。ＬＩＲ調節剤及びその他のＲＡ治療は、同時に、交互に、又は連続的に投与され得、また、それらの投与の頻度は同じであってもよいし、又は異なっていてもよい。
【００３７】
ＲＡの治療におけるＬＩＲ調節剤との同時使用に適しているＴＮＦαアンタゴニストには、ＴＮＦαに対する抗体が含まれる。そのような抗体には、ヒト化モノクローナル抗体及び完全にヒトのモノクローナル抗体が含まれる。ＬＩＲ調節剤との同時投与のための例示的なヒト化抗体は、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（登録商標）としてＣｅｎｔｏｃｏｒより販売されているインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）と呼ばれるキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ヒト定常部及びマウス可変部から構成されており、ヒトＴＮＦαと特異的に結合する。その他の適切な抗ＴＮＦα抗体には、ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７及びＣＤＰ５７１、並びにＥＰ  ０  ５１６  ７８５  Ｂ１、米国特許第５，６５６，２７２号、ＥＰ  ０  ４９２  ４４８  Ａ１に記載された抗体が含まれる。
【００３８】
ＬＩＲ調節剤は、ＩＬ−１の阻害剤、Ｔ細胞表面タンパク質に対する抗体、及びＴＮＦα、ＴＮＦα受容体又はＴＮＦαの合成のための代謝経路の酵素の翻訳に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムを含む、ＲＡを治療するために使用される様々な種類の薬剤と併せて投与され得る。ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているアンチセンスオリゴヌクレオチドには、米国特許第６，２２８，６４２号に記載されたものが含まれる。米国特許第５，６４１，７５１号及び米国特許第５，５１９，０００号に開示されたペプチドＴＮＦα阻害剤、並びに米国特許第５，７５３，６２８号に記載されたＤ−アミノ酸含有ペプチドも、ＬＩＲ調節剤との同時投与に適している。さらに、ここに記載された状態は、ＴＮＦα変換酵素の阻害剤により治療され得る。
【００３９】
好ましい組み合わせには、可溶型ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）であるＴＮＦα阻害剤と同時のＬＩＲ調節剤の投与が含まれる。ｓＴＮＦＲには、単量体、融合タンパク質（「キメラタンパク質とも呼ばれる）、二量体、三量体又はより高次の多量体が含まれ得る。本発明のある種の実施形態において、ｓＴＮＦＲ誘導体は、７５ｋＤａ  ＴＮＦＲ又は５５ｋＤａ  ＴＮＦＲを模倣し、かつ患者体内でＴＮＦαと結合するものである。本発明のｓＴＮＦＲ模倣体は、ＴＮＦＲ  ｐ５５もしくはｐ７５又はそれらの断片に由来し得る。例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載されたＴＮＦＲのような、ｐ５５及びｐ７５以外のＴＮＦＲも、ここに記載された様々な医学的障害の治療用の可溶性化合物を導出するのに有用である。ＴＮＦＲ模倣体を構築するために使用されるｓＴＮＦＲ分子には、例えば、天然ＴＮＦＲの膜貫通領域を欠き、かつＴＮＦαに結合し得る、少なくとも２０個のアミノ酸を有する天然ＴＮＦＲの類似体又は断片が含まれる。ｓＴＮＦＲのＴＮＦαとの結合は、ＥＬＩＳＡ又はその他の任意の便利なアッセイを使用して分析され得る。
【００４０】
本発明のｓＴＮＦＲポリペプチド又は断片は、キメラタンパク質を形成するよう第２のポリペプチドと融合させられ得る。第２のポリペプチドは、ＴＮＦα又はＬＴα分子に結合し、それが細胞結合受容体と結合することを防止することができる二量体、三量体又はより高次の多量体の、キメラタンパク質による自発的な形成を促進し得る。アンタゴニストとして使用されるキメラタンパク質には、例えば、抗体分子の定常部及びＴＮＦＲの細胞外部分に由来する分子が含まれる。そのような分子は、ここで、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質と呼ばれる。ヒト及びその他の哺乳動物における疾患を治療するのに適している好ましいＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、組換えＴＮＦＲ：Ｆｃである。この用語は、ここで使用されるように、ｐ７５  ＴＮＦα受容体の細胞外部分の分子（各分子は、ヒトＩｇＧ１の２３２アミノ酸Ｆｃ部分と融合した２３５アミノ酸ＴＮＦＲ由来ポリペプチドからなる）２個の二量体である「エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）」を指す。エタネルセプトは、現在、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）という商品名でイムネックスコーポレーション（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より販売されている。ＩｇＧのＦｃ部分と融合した５５ｋＤａ  ＴＮＦＲの細胞外部分を含む化合物と、ＬＩＲ調節剤を組み合わせた治療、並びにそのような治療剤を含有している組成物及び組み合わせも、本発明に包含される。さらに、適切なＴＮＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載されたＴＮＦＲ（このＴＮＦＲに由来するＴＮＦＲ−Ｉｇを含む）のような、ｐ５５及びｐ７５  ＴＮＦＲ以外のＴＮＦα受容体分子の細胞外領域に由来してもよい。
【００４１】
さらに、本発明のＬＩＲ調節剤は、例えばＲＡＮＫ：Ｆｃ又はオステオプロテジェリン（米国特許第６，０１７，７２９号及びＷＯ９８／４６７５１参照）のような可溶型ＲＡＮＫを含む、関節炎関節における骨破壊を減じる薬剤と同時にＲＡ患者に投与され得る。
【００４２】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているその他の薬物には、以下に限定はされないが、アセトアミノフェン、コデイン、プロポキシフェンナフシレート（ｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｅ  ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、オキシコドン塩酸塩、ヒドロコドン重酒石酸塩及びトラマドールを含む鎮痛剤が含まれる。さらに、ＬＩＲ調節剤は、以下に限定はされないが、メトトレキサート、スルファサラジン、金塩、アザチオプリン、シクロスポリン、抗マラリア薬、ステロイド（例えば、プレドニゾン）及びコルヒチンを含む疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と併せて投与され得る。
【００４３】
抗炎症薬も、ＬＩＲ調節剤と共投与され得る。そのような抗炎症薬には、以下に限定はされないが、アスピリン；イブプロフェン；インドメタシン；セレコキシブ；ロフェコキシブ；ケトロラック；ナムブメトン（ｎａｍｂｕｍｅｔｏｎｅ）；ピロキシカム；ナプロキセン；オキサプロジン；スリンダク；ケトプロフェン；ジクロフェナク；並びに新たに開発された関節炎関節の治療に有効な抗炎症薬を含む、その他のＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の阻害剤、サリチル酸誘導体、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、カルボン酸誘導体、酪酸誘導体、オキシカム系、ピラゾール系並びにピラゾロン系が含まれる。
【００４４】
ＬＩＲ調節剤との同時使用に適しているＩＬ−１阻害剤には、遺伝学的に修飾されたミューテイン、多量体型及び徐放性製剤を含む、ＩＬ−１の受容体結合性ペプチド断片、ＩＬ−１又はＩＬ−１ベータ又はＩＬ−１受容体Ｉ型に対する抗体、及びＩＬ−１の受容体又は修飾されたその異型の全部又は一部を含む組換えタンパク質が含まれる。特定のアンタゴニストには、ＩＬ−１ｒａポリペプチド、ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、アンタゴニスト性Ｉ型ＩＬ−１受容体抗体、ＩＬ−１結合型のＩ型ＩＬ−１受容体及びＩＩ型ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ及びその他のＩＬ−１ファミリーメンバーを含むＩＬ−１に対する抗体、並びにＩＬ−１トラップとして既知の治療薬が含まれる。ＩＬ−１ｒａポリペプチドには、米国特許第５，０７５，２２２号に記載された型のＩＬ−１ｒａ、並びに米国特許第５，９２２，５７３号、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９２／１６２２１及びＷＯ９６／０９３２３に記載されたものを含む修飾型及び異型が含まれる。ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤には、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５５７７；ＷＯ９３／０５０７１；ＷＯ９３／０９１３５；ＷＯ９３／１４７７７及びＷＯ９３／１６７１０；及び欧州特許出願０  ５４７  ６９９に記載されたものを含む、ペプチジルＩＣＥ阻害剤及び低分子ＩＣＥ阻害剤が含まれる。非ペプチジル化合物には、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２６９５８、米国特許第５，５５２，４００号、米国特許第６，１２１，２６６号、Ｄｏｌｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：２４３８−２４４０（１９９６）に記載されたものが含まれる。さらなるＩＣＥ阻害剤は、米国特許第６，１６２，７９０号、第６，２０４，２６１号、第６，１３６，７８７号、第６，１０３，７１１号、第６，０２５，１４７号、第６，００８，２１７号、第５，９７３，１１１号、第５，８７４，４２４号、第５，８４７，１３５号、第５，８４３，９０４号、第５，７５６，４６６号、第５，６５６，６２７号、第５，７１６，９２９号に記載されている。
【００４５】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているＩＬ−１結合型のＩ型ＩＬ−１受容体及びＩＩ型ＩＬ−１受容体は、米国特許第４，９６８，６０７号、第４，９６８，６０７号、第５，０８１，２２８号、Ｒｅ３５，４５０、第５，３１９，０７１号及び第５，３５０，６８３号に記載されている。ＩＬ−１トラップは、ＷＯ０１８９３２に記載されている。
【００４６】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適している適切なＩＬ−１アンタゴニストには、抗体分子及びＩＬ−１アンタゴニスト分子の両方の一部を含んでいるキメラタンパク質がさらに含まれる。そのようなキメラ分子は、単量体、二量体又はより高次の多量体を形成し得る。その他の適切なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１シグナリング受容体、ＩＬ−１ＲＩ型と競合的に結合し得るＩＬ−１に由来するペプチドが含まれる。
【００４７】
さらに、ＬＩＲ調節剤は、サリドマイド又はサリドマイド類似体、ペントキシフィリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤又はその他の低分子のような低分子と共同でＲＡを治療するために使用され得る。適切なＭＭＰ阻害剤には、例えば、米国特許第５，８８３，１３１号、第５，８６３，９４９号及び第５，８６１，５１０号に記載されたもの、並びに米国特許第５，８７２，１４６号に記載されたメルカプトアルキルペプチジル化合物が含まれる。同時投与に適しているその他の低分子は、ＬＩＲ調節剤と組み合わせて投与され得る、米国特許第５，５０８，３００号、第５，５９６，０１３号及び第５，５６３，１４３号に記載されたものを含むＴＮＦα産生を減少させることができる分子である。ＬＩＲ調節剤と共同でＲＡを治療するのに有用な付加的な低分子には、米国特許第５，７４７，５１４号又は米国特許第５，６９１，３８２号に記載されたＭＭＰ阻害剤、並びに米国特許第５，８２１，２６２号に記載されたヒドロキサム酸誘導体、並びに置換されたオキシム誘導体（ＷＯ９６／００２１５）、キノリンスルホンアミド（米国特許第５，８３４，４８５号）、アリールフラン誘導体（ＷＯ９９／１８０９５）及びヘテロ二環式誘導体（ＷＯ９６／０１８２５；ＧＢ２  ２９１４２２  Ａ）のような、ホスホジエステラーゼＩＶ及びＴＮＦαの産生を阻害する低分子、ＴＮＦα及びＩＦＮγを抑制するチアゾール誘導体（ＷＯ９９／１５５２４）、並びにＴＮＦα及びその他の炎症前サイトカインを抑制するキサンチン誘導体（例えば、米国特許第５，１１８，５００号、米国特許第５，０９６，９０６号及び米国特許第５，１９６，４３０号参照）が含まれる。
【００４８】
医薬調製物
生理学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤のような他の成分と組み合わされた、（制限はされないが組換え起源及び非組換え起源を含む、あらゆる起源に由来する）本発明のＬＩＲ調節剤を有効量含む医薬組成物が、ここで提供される。「医薬適合性の」という用語は、（１つ以上の）活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない、非毒性の材料を意味する。投与に適している製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性及び非水性の無菌の注射用溶液；並びに懸濁化剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性及び非水性の無菌の懸濁液が含まれる。本発明に係る治療剤は、唯一の活性材料として、又は所定の適応症に適している他の既知の活性材料と共に、医薬適合性の希釈剤（例えば、生理食塩水、トリス−ＨＣｌ、酢酸緩衝溶液及びリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、佐剤及び／又は担体と混和され組み合わされ得る。医薬組成物に適している製剤には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版  １９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されたものが含まれる。さらに、医薬組成物のためのＬＩＲ調節剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化されてもよいし、又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等のような重合体化合物に取り込まれてもよいし、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴースト又はスフェロブラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔｓ）に取り込まれてもよい。リポソーム製剤に適している脂質には、制限はされないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が含まれる。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；第４，８３７，０２８号；及び第４，７３７，３２３号に開示されるように、そのようなリポソーム製剤の調製は、この技術分野における技術の範囲内にある。そのような組成物は、物理学的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし、従って意図された適用に依って選択され、そのため、担体の特徴は選択された投与経路に依存する。
【００４９】
本発明の１つの好ましい実施形態において、徐放型のＬＩＲ調整ポリペプチドが使用される。開示された方法において使用するのに適している徐放型には、以下に制限はされないが、（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されたアルギン酸塩微粒子のような）徐々に溶解する生体適合性ポリマーに封入され、（局所的に適用されるヒドロゲルを含む）そのようなポリマーと混和され、かつ／又は生体適合性半透性インプラントに被包されたＬＩＲ調節剤が含まれる。１つ以上の治療剤が組み込まれている注射に適している微粒子の製剤も、含まれる。血中半減期を増加させるために修飾された治療用ＬＩＲ調節剤も、含まれる。例えば、ＬＩＲ調節剤は、既知の方法を使用して、注射のためポリエチレングリコールと結合体化され得る。
【００５０】
投与計画
ここで使用されるように、ＬＩＲ−７に拮抗するか、又はＬＩＲ−２もしくはＬＩＲ−３に作動する薬剤を「治療的に有効な量投与する」という語句は、障害の重度を反映する少なくとも１つの指標の改善、好ましくは持続性の改善を誘導するのに十分な量及び時間で、患者が治療剤により治療されることを意味する。患者が、１日以上、又はより好ましくは１週以上の間隔の少なくとも２つの時点で改善を示した場合、その改善は「持続性」であると見なされる。改善の程度は、兆候又は症状に基づき決定され、決定は、生活の質に関する質問調査票のような患者に与えられる質問調査票を利用してもよい。患者の疾病の程度を反映する様々な指標が、治療の量及び時間が十分であるか否かを決定するために査定され得る。選択された１つ以上の指標の基線値は、治療剤の初回投与の前に、患者を調査することにより確立される。好ましくは、基線調査は、初回投与の約６０日以内に行われ、初回投与と同じ日までの任意の時点において実施され得る。改善は、患者が選択された１つ以上の指標の基線に対する改善を明示するまで、本発明に係る治療剤を投与することにより誘導される。これに関して、「基線」とは、治療を受ける患者における初回投与前の選択された指標の測定値を指す。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、治療が、フェルソン（Ｆｅｌｓｏｎ）ら（Ｆｅｌｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６：７２７−７３５，１９９５）によって改定されたような米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）基準による改善を誘導した場合、十分な量及び時間のＲＡの治療が起こる。ＡＣＲ基準が使用される場合、患者が、敏感な関節の数（ｔｅｎｄｅｒ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔ）（約７８の関節が査定される）及び腫大した関節の数（ｓｗｏｌｌｅｎ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔ）（約７６の関節が査定される）の両方に関して少なくとも２０％（ＡＣＲ２０）又は少なくとも５０％（ＡＣＲ５０）改善され、かつ以下の５つのうち３つの改善を示す場合、その治療は十分であると見なされる：１）対象による疼痛の査定（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｐａｉｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；２）対象による総体的な査定（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；３）医師による総体的な査定（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；４）対象により自己査定された能力障害（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）；５）急性期反応物質（ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｒｅａｃｔａｎｔ）（ヴェステルグレン（Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｅｎ）赤血球沈降速度又はＣ反応性タンパク質レベル）。先の５つの基準のうち、最初の４つはリカート尺度でスコア化される。対象による査定及び総体的な査定（Ｓｕｂｊｅｃｔ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）は、患者の疾患の全体的な状態に基づき決定される。
【００５２】
本発明のもう１つの実施形態において、治療が十分であるか否かは、患者による自己査定又は医師による査定により査定される。患者による自己査定又は医師による査定は、例えば、尺度の一端が「疾患なし」を表し、他方の端が「重篤な疾患」を示すような主観的な数的尺度（即ち、「リカート」尺度）で測定され得る。尺度のいずれかの端が、「疾患なし」を表すために使用され得る。そのような尺度は、任意の所望の数値範囲、例えば、０〜３、０〜４、０〜５、０〜６、０〜７等を有することができ、基線時の患者の状態との比較のための基礎を提供する。例えば、０〜３点数制は、以下のカテゴリーを含み得る：０＝疾患なし；１＝軽度の疾患；２＝中程度の疾患；３＝重篤な疾患。この例において、スコアが１カテゴリー低下した場合、患者は「改善された」と考えられる。ここで使用されるように、「リカート尺度」という用語は、患者又は医師が測定されるパラメーターに関して患者の状態を最もよく表すと感じる数字に丸を付ける視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を含むものと理解される。基線スコアと比較して患者のスコアが悪化した場合、そのリカートスコアの変化には負の値が割り当てられる。
【００５３】
適切な投薬量は、治療される障害の性質及び重度、患者の体重、年齢、全身状態及び過去の疾病及び／又は治療、並びに投与経路のような要因に依って変動する。予備用量は、動物テストに従って決定され得、ヒトへの投与のための投薬量の概算は、標準的な投薬試験のようなこの技術分野において認められている実務に従って実施される。毒性を最小限に抑えつつ、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（即ち、症状の最大の半分の阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて公式化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。最終的には、主治医が、個々の各患者を治療するための本発明の治療剤の量を決定し、個々の患者の必要に応じて投与の用量及び頻度を調整することができる。
【００５４】
任意の効果的な投与経路が、本発明の治療法のためのＬＩＲ調節剤を治療的に投与するために使用され得る。注射される場合、ＬＩＲのアゴニスト又はアンタゴニストは、例えば、ボーラス注射又は連続注入により、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内又は皮下の経路を介して投与され得る。その他の適切な投与手段には、インプラントからの徐放、エアロゾル吸入、点眼剤、錠剤、シロップ剤、ロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）又はチューインガム剤を含む経口調製物、並びにローション剤、ゲル剤、スプレー剤、軟膏剤又はその他の適切な技術のような局所調製物が含まれる。あるいは、タンパク質性ＬＩＲ調節剤は、そのタンパク質を発現する培養細胞を移植することにより、例えば、調整タンパク質、即ちＬＩＲ−７のアンタゴニスト、ＬＩＲ−２のアゴニスト又はＬＩＲ−３のアゴニストを発現する細胞を移植することにより、投与され得る。１つの実施形態において、患者自身の細胞が、調整剤をコードするＤＮＡによるインビボ又はエクスビボでのトランスフェクションによってＬＩＲ調節剤を産生するよう誘導される。このＤＮＡは、例えば、調整剤をコードする裸のＤＮＡもしくはリポソームに封入されたＤＮＡの注射、ＤＮＡを発現するウイルスベクターの感染、又はこの技術分野において既知のその他の手段により、患者の細胞へ導入され得る。ＬＩＲ調節剤が、１つ以上の他の生物学的に活性な化合物と組み合わせて投与される場合、これらは、同じ経路により投与されてもよいし、又は異なる経路により投与されてもよく、また、同時期的に、別々に、又は連続的に投与され得る。
【００５５】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の調節剤であるタンパク質を含む注射用の医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇから約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラム〜約１ｍｇ）の用量の治療用ポリペプチドを含有しているべきである。本発明の１つの実施形態において、そのような組成物は、ここに開示された様々な医学的障害を治療するために１ヶ月に１回投与され、もう１つの実施形態においては、少なくとも１週間に１回投与され、もう１つの実施形態においては、少なくとも１週間に２回以上投与される。
【００５６】
投与経路が注射又は静脈内注入である場合、成人の１回当たりのＬＩＲ調節剤の有効量は、体表面積に基づき計算され得る。治療用抗体又はタンパク質を含むその他の治療剤の好ましい用量範囲は、１〜２０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、５〜１００ｍｇ／回の範囲であり得る均一（ｆｌａｔ）用量が投与されてもよい。皮下注射によって投与される均一用量の例示的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／回、２５〜５０ｍｇ／回及び５０〜１００ｍｇ／回である。本発明の１つの実施形態において、医学的障害は、１、５、１０、２５又は５０ｍｇを含有している均一用量の治療用ポリペプチドを含有している注射用に許容される調製物を投与することにより治療される。治療剤は、８週間に１回、７週間に１回、６週間に１回、５週間に１回、４週間に１回、３週週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は毎日という頻度で、繰り返し投与され得る。注射以外の投与経路が使用される場合、その用量は、標準的な医学的実務に従い適切に調節される。
【００５７】
抗体がＬＩＲ−７アンタゴニスト又はＬＩＲ−２もしくはＬＩＲ−３のアゴニストとして使用される場合、１つの好ましい用量範囲は１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、もう１つの好ましい用量範囲は、体重１ｋｇ当たり０．７５〜７．５ｍｇ／ｋｇである。ヒト化抗体、即ち抗体分子の抗原結合部分のみが非ヒト起源に由来する抗体が、好ましい。そのような抗体は皮下、筋肉内に注射されてもよいし、又は静脈内に投与されてもよく、また、治療剤に対する宿主抗体の発生を減少させるためにメトトレキサートと同時に使用されてもよい。
【００５８】
治療の期間は、患者の応答に依って変動し得る。所望の程度の改善を誘導するために、より長期間の治療が必要である場合もあり得るが、多くの場合、患者の状態の改善は、少なくとも３週間にわたり治療用量を注射することにより得られる。患者の医師によって必要であると考えられた場合には、計画は、用量及び頻度を調節しながら、無期限に継続され得る。小児科患者（４歳から１７歳）の場合、１つの適切な計画は、皮下注射によって１週当たり１回以上投与される、０．４ｍｇ／ｋｇ、最高で２５ｍｇの用量のポリペプチドＬＩＲ調節剤の皮下注射を含む。
【００５９】
慢性状態であるＲＡの治療において、患者の状態の改善は、少なくとも１週間以上、又はより好ましくは１ヶ月以上、又は１ヶ月、２ヶ月もしくは３ヶ月以上の期間にわたり、又は無期限に、この医薬品を繰り返し投与することにより得られる。治療は、治療の最初の月と同じ用量及び頻度で、又は縮小された用量もしくは頻度で、無期限に継続されてもよいし、又は所定の患者のための一次治療として使用されている他の何らかの治療と共同で断続的に投与されてもよい。投与の用量又は頻度が縮小又は中止された場合、症状が悪化するようであれば、後にそれは元のレベルで再開され得る。そのような決定は、標準的な医学的実務に従い患者の医師によってなされる。
【００６０】
前述の薬物療法に対する個々の患者による応答が変動し得ること、並びに各患者にとって最も効果的な薬物の組み合わせ及び投薬計画が、その患者の医師によって決定されることが理解される。
【００６１】
以下の実施例は、制限のためではなく例示のために提示される。当業者であれば、特にここで引用された様々な参照の教示を考慮して、この実施例において具現化された本発明を変形させ得ることを認識する。
【実施例】
【００６２】
この研究は、ＲＡ、骨関節炎（ＯＡ）を有している患者及び正常患者の滑膜における、いくつかのＬＩＲのインビボ発現及び細胞分布を比較した。ＲＡとは対照的に、ＯＡにおける滑膜組織中の炎症反応は、パンヌス形成及び組織侵襲の非存在下で起こるため、ＯＡ滑膜をこの研究に含めた（Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚら編，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９−２１１（１９８４）；Ｄｉｅｐｐｅら、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚら編，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ／ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．第２版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，３９９−４１２（１９９２））。免疫組織化学を使用して、阻害性ＬＩＲ及び活性化ＬＩＲの発現を、ＲＡ患者６人、骨関節炎患者３人及び対照対象３人の滑膜において研究した。特異的抗体による染色を、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の発現を検出するために使用し、細胞系統特異的抗体による連続切片の染色を、発現されたＬＩＲの細胞局在を評価するために使用した。
【００６３】
２つの阻害性ＬＩＲポリペプチドＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３、並びに１つの活性化ＬＩＲポリペプチドＬＩＲ−７の発現を、この実験セットにおいて調査した。一般に、これらの３つのＬＩＲは、ＲＡにおけるサイトカイン及びプロテアーゼの重要な起源である骨髄起源の細胞における比較的限定された発現を有している。ＬＩＲ−２は、ＭＨＣクラスＩ分子を認識することが既知であり、ヒト組織に広範囲に分布している。
【００６４】
２歳から１４歳の範囲のＲＡの履歴を有する患者６人、及び３歳から１３歳の範囲のＯＡの履歴を有する患者３人が、全身麻酔下で膝関節からの滑膜組織の切除を受けた。正常滑膜組織は、外傷性半月板破裂のための再建膝手術中に３人の対象から得られた。滑膜組織はＯＣＴ化合物で包埋され、液体窒素（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）で急速凍結させられ、組織病理学的分析及び免疫組織化学的研究のため２μｍから４μｍに切片化された。
【００６５】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７に対する特異的マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体は、記載されたようにして（Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２７３−２８２（１９９７）参照）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合したＬＩＲ細胞外ドメインを含有しているＬＩＲ／Ｆｃ融合タンパク質による免疫感作により、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて生成させた。その抗体を、ＬＩＲ／Ｆｃ融合タンパク質のパネルに対するＥＬＩＳＡ、及び全長ＬＩＲ  ｃＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を使用したＦＡＣＳ分析により、特異的免疫反応性に関してスクリーニングした。無関係なマウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を、陰性対照として使用した。
【００６６】
これらの抗体を、参照して完全にここに組み込まれるＴｅｄｌａら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４８（５）：１３６７−７３（１９９６）に記載されたような３段階アルカリホスファターゼ染色技術において使用した。簡単に説明すると、アセトン固定された切片を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）により平衡化し、室温で２０分間、未希釈のウマ血清によりブロッキングした。次いで、４℃で一晩５μｇ／ｍｌの一次抗体と共に切片をインキュベートした。ＴＢＳによる４回の洗浄の後、室温で１時間、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に切片をインキュベートした。ＴＢＳによる４回の洗浄の後、室温で４５分間、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に切片をインキュベートした。熱量測定用アルカリホスファターゼ基質（（ベクターレッド（ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｄ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びヘマトキシリンによる短時間対比染色を使用して、免疫反応性を検出した。各抗ＬＩＲ抗体の使用のための最適条件は、皮膚、胸腺、リンパ節及び脾細胞を含む、ＬＩＲ発現細胞を含有している可能性が高い正常組織のパネルを使用して最初に定義した。
【００６７】
抗ＬＩＲ抗体により分析されたものに隣接している切片も、ＬＩＲに特異的な抗体と免疫反応性の特異的細胞型を決定するために分析した。これは、参照してここに組み込まれるＴｅｄｌａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １１（７）：５３１−４０（１９９９）及びＴｅｄｌａら、１９９６に記載された方法を使用して行った。この作業は、マクロファージ（マウスＩｇＧ１抗ＣＤ６８）、Ｔ細胞（ウサギポリクローナル抗ＣＤ３）、内皮細胞（マウスＩｇＧ１抗フォンビルブラント因子）、好中球カテプシンＧ（ウサギポリクローナル）及び肥満細胞トリプターゼ（マウスＩｇＧ１）を検出するための抗体を使用した。これらの抗体は、ＤＡＫＯ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より購入した。使用した染色手法は、前記の抗ＬＩＲ抗体による染色と本質的に同様であった。特異的抗体による免疫組織化学的染色に加え、標準的なヘマトキシリン及びエオシンによる染色を、各切片の質及び組織学を評価するために使用した。
【００６８】
免疫組織化学的研究からの組織切片を、切片全体を横切る連続的な視野に見られる細胞を計数することにより査定した。簡単に説明すると、各切片について２５０×倍率の平均１８個の視野を、系統的な抽出手法で選択した。アイソタイプ対照抗体により染色された対照切片が有意な免疫反応性を示さないことを保証した後に、１視野当たりの陽性細胞（赤色染色）の数を数えた。有意な領域間の染色の変動が観察されたが、切片全体についての数の中央値を、各抗体に関する染色の保存的な測定値として報告した。
【００６９】
観察された滑膜組織試料の組織学的特質及び３つのＬＩＲの発現を、表１に要約した。比較的短い疾病期間（２年から５年）を有していた２人のＲＡ患者（ＲＡ１及びＲＡ２）に由来する切片は、ＣＤ６８陽性マクロファージ、カテプシンＧ陽性好中球、中程度の数のトリプターゼ陽性肥満細胞及びＣＤ３陽性Ｔ細胞のクラスターを含む炎症細胞による広範な浸潤を示した。罹患年数８年から１４年の残りの４人のＲＡ患者においては、炎症細胞浸潤の程度は一様でなく、これらの患者においては組織繊維症が明白であった。ＯＡを有する患者のうちの２人に由来する切片には、限定された数のＴ細胞及び肥満細胞と共に有意なマクロファージ浸潤が存在した（表１）。３人目のＯＡ患者は、滑膜の外側の端部にマクロファージを含む広範な繊維症を有していた。正常対象から得られた切片には、炎症細胞がほとんど又は全く観察されなかった。
【００７０】
表１に示されるように、疾病期間が初期〜中程度の３人のＲＡ患者（患者ＲＡ１、ＲＡ２及びＲＡ３）から得られた切片には、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の広範な発現が存在した。ＬＩＲ−２は、リウマチ滑膜に浸潤している好中球及びマクロファージにＬＩＲ−７と共局在していた。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の発現は、初期リウマチ様疾患においては特に顕著であったが（表１）、ＲＡの期間が長い（８年以上）患者については非常に限定されていた。ＲＡの期間が増加するにつれ、滑膜組織はより多くの繊維症性変化を示し、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７を発現する細胞の数は劇的に減少した。ＯＡを有する患者から得られた滑膜組織には、活性化ＬＩＲ及び阻害性ＬＩＲ両方の無視し得る程度の発現が見出された。正常ドナーに由来する滑膜組織には、ＬＩＲ発現が検出されなかった。
【００７１】
ＬＩＲ−３は、３人の初期ＲＡ患者のうち２人のリウマチ様滑膜中の浸潤マクロファージに発現していたが、後期ＲＡ患者には発現していなかった。正常対象から得られた対照組織には、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の発現が検出されなかった。
【００７２】
表２は、ＬＩＲ特異的抗体、並びにマクロファージ、内皮細胞、好中球、肥満細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞に特異的な抗体による滑膜組織試料の連続切片の染色により得られた結果を示す。ＬＩＲはＣＤ３＋Ｔ細胞には検出されなかった。表２に示されるように、ＲＡ患者の滑膜において、炎症性白血球へのＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３発現の制限とは対照的に、ＬＩＲ−７は、好中球、マクロファージ、肥満細胞、繊維芽細胞様細胞（細胞形態学によって決定）及び内皮細胞に様々に発現していた。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の細胞分布は炎症細胞浸潤物の性質の差を反映して、ＲＡ患者間で異なっていた。患者ＲＡ１においては好中球がＬＩＲ−２の主な細胞起源であったが、患者ＲＡ２においてはマクロファージがＬＩＲ−２の主な細胞起源であった。一般に、ＲＡ患者において、ＬＩＲ−７の発現はＬＩＲ−２のものより幾分低く、ＬＩＲ−７の細胞分布はＬＩＲ−２のものより広範囲であった。ＬＩＲ−７は、患者ＲＡ１においては、好中球、マクロファージ、肥満細胞及び内皮細胞によって発現されており、患者ＲＡ２においては、マクロファージ、内皮細胞及び繊維芽細胞様滑膜細胞によって発現されていた。残りの全てのＲＡ患者において、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の細胞起源は、マクロファージと、程度は低かったが内皮細胞であった。ＯＡにおいて観察されたＬＩＲ−２の限定された発現は、主としてＣＤ６８＋マクロファージに見出された。ＲＡを有する患者において、ＬＩＲ−３は、マクロファージ及び繊維芽細胞様滑膜細胞によって排他的に発現されていた。アイソタイプ一致陰性対照抗体は、いずれかの患者においても免疫染色を与えなかった。
【００７３】
上に提示された結果は、初期ＲＡを有する患者に由来する滑膜が、ＭＨＣクラスＩ分子を認識しそれと会合することができる阻害性ＬＩＲ−２の上昇した発現を示したことを明らかにしている。上昇したＬＩＲ−３の発現も、ＲＡ患者において観察された。細胞を活性化する能力を有するＬＩＲ−７の広範な発現も、ＲＡ患者に由来するマクロファージ及び好中球に観察された。さらに、ＬＩＲ−７発現は肥満細胞及び内皮細胞で観察された。ＯＡを有する患者に由来する滑膜、対照対象、又は繊維症を伴う長期のＲＡを有する２人の患者には、ＬＩＲ発現がほとんど観察されなかった。従って、これらの結果は、ＬＩＲが、ＲＡにおける炎症性浸潤物中のプロテアーゼ及びサイトカインの発現を制御し、それによりパンヌス形成及び関節破壊の過程に寄与しているかもしれないことを示唆している。
【００７４】
【表１】
2005532256.tif 000002
【００７５】
【表２】
2005532256.tif 000003
【配列表】
2005532256.tif 000004
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月6日(2003.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、補助金番号Ｒ０１  ＡＩ３１５９９に従い、米国保健省、国立衛生研究所からの支援を少なくとも一部受けて、為された。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節周囲の軟骨及び骨の破壊を伴う、滑膜肥厚及び滑膜パンヌス形成を特徴とする慢性炎症性滑膜炎である（Ｔａｋ，ＰＰ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４３（１２）：２６１９−３３（２０００））。炎症部位に見出される優勢な炎症細胞は、マクロファージ（Ａ型滑膜細胞）及び繊維芽細胞様細胞（Ｂ型滑膜細胞）、並びに増加した数の好中球、肥満細胞、ナチュラルキラー細胞、形質細胞及びリンパ球である（Ｌｅｉｒｉｓａｌｏ−Ｒｅｐｏら、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  １７（４）：４２７−４２（１９９３）；Ｇｏｔｉｓ−Ｇｒａｈａｍ  Ｉ及びＭｃＮｅｉｌ  ＨＰ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４０（３）：４７９−８９（１９９７）；Ｍａｌｏｎｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ３０（２）：１３０−３７（１９８７）；Ｂｒｏｍｌｅｙ  Ｍ及びＷｏｏｌｅｙ  ＤＥ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ２７：８５７−６３（１９８４）；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  Ｒ．、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（２）：３１２−３１（１９９５））。これらの細胞は、脂質メディエーター（Ｅｌｍｇｒｅｅｎら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ４６：５０１−０５（１９８７）；Ｍｏｉｌａｎｅｎ  Ｅ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ７５（Ｓｕｐｐｌ  ２）：４−８（１９９４））、炎症前（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：３３４７−５３（１９９０）；Ｗｅｓｔａｃｏｔｔら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ４９：（９）６７６−８１（１９９０）；Ａｌｖａｒｏ−Ｇｒａｃｉａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８６：１７９０−９８（１９９０）；Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｂｒ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ３０（Ｓｕｐｐｌ  １）：７６−８０（１９９１））及び組織分解酵素（Ｈｅｍｂｒｙら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５４（１）：２５−３２（１９９５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ５３（１）：７６８−７２（１９９４））のような多数の因子を放出することにより、炎症及び組織破壊を促進するようである。
【０００３】
滑膜マクロファージは、インターロイキンＩＬ−１β及び腫瘍壊死因子ＴＮＦα（これらは、これらのサイトカインを標的とした疾患修飾療法の効力により立証されるように、ＲＡの病原の中心である）の優勢な起源である（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍ及びＭａｉｎｉ  ＲＮ、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：１６３−９６（２００１）））。ＲＡにおける関節破壊は、マクロファージ及び破骨細胞に由来するプロテアーゼによって媒介される可能性が高い。リウマチ滑膜における活性化された白血球の存在に関する証拠は豊富に存在するが、それらの活性化の（１つ以上の）メカニズム及び制御はよく理解されていない。
【０００４】
「白血球免疫グロブリン様受容体（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」（ＬＩＲ）又は「免疫グロブリン様転写物（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）」（ＩＬＴ）と名付けられた新しいタンパク質のファミリーは、炎症及び免疫応答に関与している様々な細胞の表面上に発現している。このファミリーのメンバーは、細胞質尾部に存在するイムノレセプターチロシンベースドインヒビトリーモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆｓ）（ＩＴＩＭ）によって、又は「イムノレセプターチロシンベースドアクチベーションモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）」すなわち「ＩＴＡＭモチーフ」を含有している他のタンパク質との細胞膜における会合によって、細胞応答を調整することがインビトロで示されている（Ａｒｍら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：２３４２（１９９７）；Ｆａｎｇｅｒら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：３４２３−３４（１９９８）；Ｂｏｒｇｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：５１９２−９６（１９９７）；Ｓａｍａｒｉｄｉｓ  Ｊ及びＣｏｌｏｎｎａ  Ｍ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：６６０−６５（１９９７）；ＷＯ９８／４８０１７；米国特許第６，１４０，０７６号；及びＷＯ００／６８３８３）。
【０００５】
ＬＩＲによって制御される細胞性応答の範囲は、インビトロで研究されている。ＬＩＲ−１又はＬＩＲ−２によるＭＨＣクラスＩ分子の認識は、ＮＫ細胞活性及びＴ細胞細胞障害性を阻害することが示された（例えば、Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｊ  Ｅｘｐ  ＭｅｄＩ  １８６：１８０９−１８（１９９７）；Ｆａｎｇｅｒら、１９９８を参照）。阻害性のＬＩＲ−１、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−５のＢＣＲ、ＴＣＲ、ＦｃγＲ又はＭＨＣクラスＩ分子のような活性化受容体との同時ライゲーション（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、活性化分子によって誘発されるＣａ２＋流動及び後続の下流イベントを阻害した（Ｃｅｌｌａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１７４３−５１；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８；及びＳａｖｅｒｉｎｏら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：３７４２−５５（２０００））。これらのイベントは、ＬＩＲ−１のＴ細胞受容体との相互作用に関して最近解明された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５１４−２１（２００１））。
【０００６】
ＬＩＲ及び関連分子が、炎症状態における白血球の活性化のしきい値及び／又は程度を決定するかもしれないことが示唆された。この概念は、ＬＩＲとの類似性を有するタンパク質であるｇｐ４９Ｂ１の破壊を有するマウスにおける最近の研究により支持されている（Ｄａｈｅｓｈｉａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：３０９−３１８（２００１））。
【０００７】
ＬＩＲ−１、２、３、５及び８を含む阻害性ＬＩＲは、２個から４個のＩＴＩＭを含有している長い細胞質ドメインを示す。「ＩＬＴ４」又は「ＭＩＲ１０」としても既知のＬＩＲ−２は、３個のＩＴＩＭモチーフを含有しており、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含むＭＨＣクラスＩタンパク質の多様なアレイに結合する（Ｆａｎｇｅｒら、１９９８）。ＬＩＲ−１及びＬＩＲ−２は、広い特異性でクラスＩ分子と相互作用し、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＨＬＡ−Ｇ内の対立遺伝子を認識することが知られている（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８；Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２７３−８２（１９９７）；Ｂａｎｈａｍら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ６５：８４１−４５（１９９９））。阻害性ＬＩＲが細胞活性化の阻害を媒介する１つの手段は、非受容体チロシンキナーゼカスケードを介するシグナリングを阻害するか又は終結させるため、ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン含有ホスファターゼ１（ＳＨＰ−１）を動員することによる（例えば、Ｃｅｌｌａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７；Ｃｏｌｏｎｎａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：３０９６−３１００（１９９８）；及びＤｉｅｔｒｉｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：２５１４−２１（２００１）を参照）。
【０００８】
ＬＩＲ−６ａ、ＬＩＲ６ｂ及びＬＩＲ−７を含む活性化ＬＩＲは、短い細胞質ドメイン、及びＦｃεＲＩγとの会合を容易にし得る膜貫通ドメイン内の正電荷を有するアルギニン残基を特徴とする。ＬＩＲ−７は「ＩＬＴ１」とも呼ばれる。ＬＩＲ−７自体は、かなり短い細胞質尾部を含有しているが、細胞膜においてＦｃ受容体ガンマ鎖（ＦｃεＲＩγ）と特異的に会合する（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５−８（１９９９））。このＦｃ受容体ガンマ鎖は、ＩＴＡＭを含有している細胞質尾部を有しており、従って刺激シグナルを伝達することができる。ＦｃεＲＩγは、他のタンパク質、即ちＦＣαＲ及び活性化ＮＫ細胞受容体のためのシグナリングパートナーを務めることが知られている。ナカジマらは、ＬＩＲ−７が、会合したタンパク質ＦｃεＲＩγを使用して、刺激シグナルを変換するよう細胞を活性化するということを提唱している。ＦｃεＲＩγとの会合を容易にし得るＬＩＲ−７の膜貫通ドメイン内の正電荷を有するアルギニン残基。ナカジマらは、トランスフェクトされたＬＩＲ−７を発現しているラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ細胞）におけるセロトニン放出をＬＩＲ−７が誘起し得ることを示すことにより、細胞活性化を媒介するＬＩＲ−７の能力を証明した。セロトニン放出は、細胞表面Ｌ１Ｒ−７を架橋する抗体に細胞を曝すことにより誘起された。さらに、このグループは、ＬＩＲ−７の架橋が、初代単球、ＬＩＲ−７発現ベクターにより形質転換されたＰ８１５細胞、及びトランスフェクトされたＲＢＬ細胞（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９）を含むいくつかの細胞型において、細胞内カルシウム移動を誘発することを証明した。カルシウムの移動は、単球活性化における初期のイベントである。
【０００９】
ＬＩＲ−１、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−５及びＬＩＲ−７の細胞分布は、モノクローナル抗体を使用して詳細に研究されている。ＬＩＲ−１は、全ての末梢血単球、インビトロで派生した樹状細胞及びマクロファージ、Ｂ細胞、並びにＴ細胞及びＮＫ細胞のサブセットに発現している（Ｓａｍａｒｉｄｉｓら、１９９７；Ｃｏｓｍａｎら、１９９７）。より限定された細胞分布が、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−５に関して報告されており、それらは単球及び樹状細胞において最も顕著である（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９８）。ＬＩＲ−７は、全ての末梢血単球及び顆粒球、インビトロで派生したマクロファージ、並びに樹状細胞に発現している（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９）。ｍＲＮＡレベルでは、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−６の転写物は単球及びＢ細胞に検出され、ＬＩＲ−４の転写物はＢ細胞、ＮＫ細胞及び単球に検出され、ＬＩＲ−８の転写物はＮＫ細胞にのみ検出された（Ｂｏｒｇｅｓら、１９９７；Ａｒｍら、１９９８）。従って、ＬＩＲ発現の治療的な調節は、有望な探究分野である。
【発明の開示】
【００１０】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７を特異的に標的とする薬剤１つ以上を投与することによりＲＡを治療する方法が、ここで提供される。ここに開示された結果は、これらの３つのＬＩＲが、滑膜組織に浸潤する白血球の活性化の制御に関係しているかもしれないことを示している。従って、ＲＡ患者の関節における炎症は、炎症を起こした関節に存在する単球もしくはマクロファージの活性化を減少させるかもしくは排除するため、又はそれらの炎症部位への動員を減少させるため、ＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３及び／又はＬＩＲ−７の発現又は機能を調節する薬剤を投与することにより改善され得る。これは、刺激シグナルを伝達するＬＩＲ−７を調節することにより、かつ／もしくは誘起された場合に阻害効果を発揮するＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３を調節することにより、又はこれらのＬＩＲのうちの２つもしくは３つ全てを同時に調節することにより、達成され得る。
【００１１】
ＲＡを有する患者は、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３に結合するアゴニスト性薬剤を有効量投与するか、又はこれらのタンパク質の各々に結合するアゴニストを同時に投与し、それによりそれらの阻害活性を誘起することにより、本発明に従い治療される。ＬＩＲ−２アゴニスト及び／又はＬＩＲ−３アゴニストのＲＡ患者への投与は、患者における滑膜単球内のカルシウム移動を減少させる。本発明の好ましい実施形態において、その薬剤は、ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である。もう１つの好ましい実施形態において、その薬剤は、ＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性であるアゴニスト性抗体である。モノクローナル抗体が好ましい。好ましくは、モノクローナル抗体は、可変部がげっ歯動物に由来し、残部がヒトに由来するヒト化抗体である。より好ましくは、モノクローナル抗体は完全にヒトのものである。他の実施形態において、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３アゴニストは、小さい有機分子である。
【００１２】
本発明のもう１つの局面において、ＲＡ患者は、ＬＩＲ−７の生物学的活性に拮抗する薬剤により治療される。そのような薬剤は、ＬＩＲ−７が誘起されるのを部分的又は完全に阻止し、従って炎症を起こした関節の部位においてそれが単球又はマクロファージを活性化するのを防止する。ＲＡ患者へのＬＩＲ−７アンタゴニストの投与は、患者における滑膜単球から放出されるカルシウムの量を減少させる。本発明の１つの局面において、薬剤は、ＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性であるアンタゴニスト性抗体であり、即ち、その抗体はＬＩＲ−７に特有のエピトープと特異的に結合する。そのような抗体は、阻止抗体であり、ＬＩＲ−７のそのリガンドとの結合を阻止する。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。好ましい実施形態において、モノクローナル抗体はヒト化抗体であり、もう１つの好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は完全にヒトのものである。もう１つの実施形態において、ＬＩＲ−７アンタゴニストは、ＬＩＲ−７の細胞外領域がヒト免疫グロブリンタンパク質のＦｃ領域に連結されている融合タンパク質を含む、ＬＩＲ−７の細胞外領域を含む可溶性ポリペプチドである。さらに他の実施形態において、ＬＩＲ−７アンタゴニストは小さい有機分子である。ＬＩＲ−７アンタゴニストは、単独で、又はＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３のアゴニストと一緒に投与され得る。
【００１３】
本発明の他の局面は、互いに同時に投与されるか、又はＬＩＲ−７に拮抗する薬剤と同時に投与されるＬＩＲ−２及び／又はＬＩＲ−３を誘起するアゴニスト性薬剤の様々な組み合わせによるＲＡの同時治療を含む治療法を提供する。これには、以下の組み合わせのうちの１つの同時投与を含む治療が含まれる：ｉ）ＬＩＲ−３に作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）薬剤；ｉｉ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤；ｉｉｉ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−３に作動する薬剤；ｉｖ）ＬＩＲ−２に作動する薬剤とＬＩＲ−３に作動する薬剤とＬＩＲ−７に拮抗する薬剤。好ましくは、そのような薬剤は、ヒト化抗体又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。他の好ましい薬剤は、ＬＩＲ−２及び／もしくはＬＩＲ−３に作動するか、又はＬＩＲ−７に拮抗する、小さい有機分子である。さらに、前記のＬＩＲ調節剤を、慢性関節リウマチを治療するために使用される他の薬物療法の同時使用と組み合わせた治療法が、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７が、ＲＡを有する患者の滑膜に浸潤している白血球にディファレンシャルに発現していることが、免疫組織化学的技術を使用して、ここで示される。ＲＡ患者とは、１つ以上の炎症を起こした関節又は敏感な関節を有しており、血清がリウマチ因子陽性と判定された人々である。ＲＡ患者に見られるもののような炎症応答は、阻害シグナル及び活性化シグナルの複雑なネットワークによって制御されている可能性が高い。従って、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７のＲＡ滑膜における発現を調節する薬剤の投与を含む治療法が、ここで提供される。本発明の１つの実施形態において、開示された治療的処置は、非ＲＡ患者（対照組織）と比較して上昇したレベルのＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７を発現している滑膜組織を有するＲＡ患者に投与される。これらのタンパク質のレベルが上昇しているか否かを決定するためには、滑膜生検に由来する組織が、これらのＬＩＲに対する抗体による染色により分析される。ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の生物学的活性を阻害又は増強する薬剤は、ここで、「ＬＩＲ調節剤」と呼ばれる。
【００１５】
ここに開示された観察は、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７が、ＲＡを有する患者の滑膜に浸潤している白血球には上昇したレベルで発現しているが、骨関節炎（ＯＡ）を有している患者の滑膜においては上昇していないことを示している。ＲＡは炎症を媒介する白血球の滑膜組織への広範な浸潤を特徴とするが、ＯＡは通常炎症には関連していない慢性変性性状態である。開示された観察はまた、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の発現が、疾患の初期段階にあるＲＡ患者より、確立された繊維症を有するＲＡ患者の方が低いことを示している。一般に、繊維症は、罹患年数が長いＲＡ患者においてのみ発症する。例えば、罹患年数が８年以上である者は、関節繊維症を発症している可能性が高い。本発明の１つの実施形態において、ＬＩＲ調節剤は、関節が繊維症になっていないＲＡ患者に投与される。
【００１６】
ここで使用されるように、ＬＩＲ−２という用語には、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有している異型及びミューテイン（ｍｕｔｅｉｎ）が包含される。配列番号２に示されたＬＩＲ−２は、アミノ酸１〜１６に１６アミノ酸のシグナルペプチドを含む４５８アミノ酸（配列番号２のアミノ酸１〜４５８）の予想された細胞外領域を有している。このＬＩＲ−２は、配列番号２のアミノ酸４５９〜４８３に膜貫通ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸４８４〜５９８を含む細胞質ドメインも含んでいる。細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメインを含んでおり、細胞質ドメインはアミノ酸５３１〜５３６、５６０〜５６５及び５９０〜５９５に３個のＩＴＩＭモチーフを含んでいる。
【００１７】
「ＬＩＲ−２」という用語には、ここで使用されるように、配列番号２に示されたＬＩＲ−２のアミノ酸１７〜４５８との少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、又はより好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するＬＩＲに関連した生物学的活性も有するポリペプチドも含まれる。そのような生物学的活性の一例は、ＭＨＣクラスＩポリペプチドとの結合能である。ＬＩＲ−２ポリペプチドのＭＨＣ  Ｉとの結合能は、細胞表面上に発現されたＭＨＣクラスＩタンパク質とのＬＩＲ−２ポリペプチドの結合を検出するアッセイのような任意の便利なアッセイにより決定され得る。結合の特異性は、推定ＬＩＲ−２が、ＭＨＣ  Ｉを発現していることが既知の細胞と結合するのを、ＭＨＣ  Ｉに特異的な抗体が阻止し得るか否かをテストすることにより確認され得る。そのようなテストに使用され得る細胞及び細胞系には、ＣＢ２３、ＨＳＢ２、ＭＰ−１、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）、初代Ｔ細胞、初代Ｂ細胞又は初代ＮＫ細胞のような、ＭＨＣ  Ｉを発現している任意の細胞が含まれる。
【００１８】
ＬＩＲ−２のＭＨＣ  Ｉとの結合を検出するのに適しているアッセイは、参照して完全にここに組み込まれるＷＯ９８／４８０１７に記載されたフローサイトメトリーアッセイである。簡単に説明すると、このアッセイを実施するには、まず、ＭＨＣ  Ｉを発現している細胞を、ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳを含む０．２％アジ化物含有ＰＢＳ）により洗浄し、次いで、約１０５個に等分した細胞を、ブロッキングバッファー（２％ＦＣＳ、５％ＮＧＳ、５％ウサギ血清を含むＰＢＳ）１００μＬ中で約１時間インキュベートする。各細胞試料に、増加する量（例えば、０、２、５又は１０μｇ）の対照血清又はＷ６／３２（ＡＴＣＣ  ＨＢ−９５）を含むブロッキングバッファー１００μＬを添加する。Ｗ６／３２とは、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣポリペプチドを含むＭＨＣクラスＩ重鎖に特異的な抗体であり、この抗体とのプレインキュベーションは、他のタンパク質のＭＨＣ  Ｉとの特異的結合を競合的に阻止する。Ｗ６／３２又は対照血清の添加の後、試料を約１時間氷上でインキュベートし、次いで、ＦＡＣＳバッファー２００μＬで約３回洗浄する。次に、ＬＩＲ−２ポリペプチド約５μｇを添加する。このアッセイのためのＬＩＲ−２ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンタンパク質のＦｃ領域に連結されたＬＩＲ−２の細胞外領域を含む可溶性融合タンパク質（ｓＬＩＲ−２／Ｆｃ）である。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃポリペプチドを含むブロッキングバッファーを各試料に添加し、その混合物を約１時間氷上でインキュベートする。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃとのインキュベーションの後、細胞をＦＡＣＳバッファーで数回洗浄し、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と特異的に免疫反応性であるビオチン標識マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手可能）及びＳＡＰＥ（ストレプトアビジン−フィコエリトリン；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓより入手可能）により約４５分間処理する。ＳＡＰＥは、抗ヒトＦｃ／ビオチンのビオチン部分と結合し、適切な励起条件及び放射条件に曝された場合に蛍光を発する蛍光性化合物である。従って、ビオチン化抗ヒトＦｃが、細胞と結合したｓＬＩＲ−２／Ｆｃと反応し、代わってＳＡＰＥが抗ヒトＦｃのビオチン部分と結合する。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃが結合した細胞を検出するため、ＬＩＲ−２／Ｆｃ、抗ヒトＦｃ及びＳＡＰＥに曝された細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ＳＡＰＥ標識細胞を検出するためフローサイトメトリーに供する。ｓＬＩＲ−２／Ｆｃが細胞と結合するが、それがＷ６／３２によって競合的に防止される場合、このことは、ｓＬＩＲ−２／ＦｃがＭＨＣ  Ｉとの特異的結合が可能であることを示す。
【００１９】
ここで使用されるようなアミノ酸配列同一率は、同一である整列化されたアミノ酸の数を、比較される２つの配列のより短い方のアミノ酸の総数によって割ることにより決定される。配列を整列化し配列の同一性及び可変性を決定するための多数のコンピュータプログラムが、商業的に入手可能である。これらのプログラムは、前述の同一性の定義に基づく同一性情報を提供する。１つの適切なコンピュータプログラムは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）によって記載された、ウィスコンシン大学ジェネティクスコンピューターグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰプログラム（バージョン６．０）である。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）によって改訂されたような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列化法を利用する。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメータは、以下のものを含む：（１）アミノ酸のための単項比較マトリックス（同一に対する１及び非同一に対する０の値を含有）及びＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，３５３〜３５８頁，１９７９によって記載されたようなＧｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティ及び各ギャップ内の各シンボルに対するさらに０．１０のペナルティ；並びに（３）エンドギャップに対するペナルティなし。配列操作のための、ＧＣＧコンピュータパッケージの一部としてやはりウィスコンシン大学より入手可能である、ＢＥＳＴＦＩＴと呼ばれるもう１つの類似のプログラムも、これらの比較に有用である。
【００２０】
ここで使用されるような「ＬＩＲ−２」という用語は、さらに、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされたポリペプチドを指す。そのような核酸分子には、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡが含まれる。等価であるが、「Ｔ」が「Ｕ」に置換されている配列を有するＲＮＡ分子も含まれる。そのような核酸によってコードされたＬＩＲ−２ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉとの結合能を有する。
【００２１】
「ＬＩＲ−２」という用語には、配列番号２に示されたＬＩＲ−２によって示される生物学的活性を保有しており、かつ中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件の下で配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズすることができる相補鎖を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、不適正な塩基対の形成を最小限に抑えるために設計されている。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに影響する基本パラメータ及び適切な条件を考案するための案内は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，チャプター９及び１１；並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０及び６．３〜６．４）に記述されている。ハイブリダイゼーションは、溶液中で、又はニトロセルロースもしくはナイロンフィルターのような固体表面へ標的核酸を固定することにより実施され得る。テストすべきＤＮＡが、標識され、変性させられ、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとして使用される。所望のストリンジェンシーの程度の条件は、例えばＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づき、当業者によって容易に決定され得る。フィルターに結合した標的ＤＮＡのための中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの様式は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有している予備洗浄溶液、６×ＳＳＣを含有しているハイブリダイゼーションバッファー、及び約６８℃のハイブリダイゼーション温度を使用し（又は、５０％ホルムアミド及び６×ＳＳＣを含有しているハイブリダイゼーションバッファー、並びに約４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用し）、次いで、０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有しているバッファー中で約６０℃でフィルターを洗浄することを含む。「ＳＳＣ」（１×）とは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）である。一般に、高度にストリンジェントな条件は、約６８℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄工程が実施されることを除き、前記と同様に定義される。所望により、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））が、上記ハイブリダイゼーションバッファー及び洗浄バッファー中のＳＳＣの代わりに使用されてもよく、ＳＤＳは、ストリンジェンシーに影響することなく、増加させられてもよいし、又はハイブリダイゼーションバッファーもしくは洗浄バッファーのいずれかから省略されてもよい。これらの核酸によってコードされたＬＩＲ−２タンパク質が保有している生物学的活性には、以下のうちの１つ以上が含まれる：ＭＨＣクラスＩタンパク質と結合する能力；誘起時に、活性化された単球における細胞内カルシウム流動を減少させる能力；及び誘起時に、活性化された単球における細胞内リン酸化チロシンのレベルを減少させる能力。
【００２２】
さらに、本発明に係るＬＩＲ−２ポリペプチドには、ＭＨＣ  Ｉに結合することができ、かつ配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体と免疫反応性であるタンパク質が含まれる。ＬＩＲ−２と特異的に免疫反応性の抗体とは、他のタンパク質との認め得る程度の結合を示さないものである。例えば、ＬＩＲ−２に特異的な抗体は、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７とは結合しない。特異的抗体を作製する方法は、この技術分野において周知であり、後述の方法のような任意の適切な方法が、そのような抗体を作製するために使用され得る。一般に、そのような抗体と反応するＬＩＲ−２ポリペプチドは、配列番号１に示されたヌクレオチド配列を有する核酸とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされる。
【００２３】
ここで使用されるように、「ＬＩＲ−３」という用語には、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有する異型及びミューテインが包含される。配列番号４のＬＩＲ−３ポリペプチドは、例えば、配列番号３に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされ得る。「ＬＩＲ−３」という用語には、少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％、又は最も好ましくは少なくとも９８％の配列番号４とのアミノ酸配列同一性を有しており、さらに配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドによって発現される生物学的活性を保有している異型も含まれる。そのような生物学的活性には、活性化された単球における細胞内カルシウム流動を減少させる能力、及び活性化された単球に存在するタンパク質内のリン酸化チロシンの量を減少させる能力が含まれる。同一率は、前記のようにして決定される。配列番号４に提示されたＬＩＲ−３アミノ酸配列は、アミノ酸１〜１６のシグナルペプチドを含む、アミノ酸１〜４４３を含有している細胞外ドメイン；アミノ酸４４４〜４６４を含む膜貫通ドメイン；及びアミノ酸４６５〜６３１を有する細胞質ドメインを有している。配列番号４のＬＩＲ−３ポリペプチドの細胞外領域は、４つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを含有しており、その細胞質領域は２つのＩＴＩＭモチーフ対を含有している。配列番号４において、最初のＩＴＩＭモチーフ対は、アミノ酸５１２〜５１７、５４１〜５４６に位置しており、第二の対は、アミノ酸５９３〜５９８及び６２３〜６２８に位置している。従って、ここで使用されるように、「ＬＩＲ−３」という用語には、細胞外領域に４個のＩｇ様ドメイン、細胞質尾部に４個のＩＴＩＭモチーフを有しており、かつ配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するＬＩＲ−３によって示される生物学的活性を少なくとも１つ有しているポリペプチドが包含される。本発明に係るＬＩＲ−３ポリペプチドは、このタンパク質を発現している単球におけるカルシウム放出を抑制する阻害性の刺激を伝達することができる。
【００２４】
ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３は、阻害性タンパク質である。これらのタンパク質の生物学的活性には、活性化された単球を阻害する能力が含まれる。ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３のこの活性をアッセイするための１つの方法においては、まず、単球を抗ＣＤ６４抗体に曝すことにより活性化する。この活性化には、これらの細胞における細胞内カルシウム放出及びタンパク質上のチロシン残基のリン酸化が伴う。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３は活性化された単球の表面上に発現される。これらの単球上のＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の誘起は、例えば、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３のいずれかに特異的なアゴニスト性抗体に細胞を曝すことにより達成され得る。いくつかの場合において、誘起は、細胞表面上に発現されたＬＩＲの架橋をもたらす、抗ＬＩＲ抗体と反応する二次抗体を添加することも含む。この架橋は、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の阻害機能を誘起し、それにより、下記のようにしてアッセイされ得る、減少したカルシウム流動をもたらす。
【００２５】
「ＬＩＲ−７」という用語には、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにこのタンパク質の生物学的特性を有する異型及びミューテインが包含される。配列番号６に提示されたアミノ酸配列は、アミノ酸１〜４４９を含む細胞外ドメイン、アミノ酸１〜１６のシグナルペプチド、アミノ酸４５２の電荷を有するアルギニン残基を含むアミノ酸４５０〜４６８を含む膜貫通ドメイン及びアミノ酸４６９〜４８３の短い細胞質ドメインを有している。細胞外ドメインは、４個の免疫グロブリン様ドメインを含んでいる。
【００２６】
本発明の１つの局面において、ＬＩＲ−７ポリペプチドは、配列番号５に示されたヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。さらに、「ＬＩＲ−７」という用語には、番号５に示されたヌクレオチド配列を有する核酸の相補鎖と中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされ、さらに、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質が保有している生物学的活性を有しているポリペプチドが包含される。ハイブリダイゼーション条件は、前記と同様に定義される。
【００２７】
本発明に係るＬＩＲ−７ポリペプチドは、刺激能を保有している（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９参照）。ＬＩＲ−７ポリペプチドの誘起は、ラット好塩基球性白血病細胞からのセロトニン放出を刺激し、このタンパク質を発現している初代単球又はその他の細胞からのカルシウム放出を刺激する。カルシウム放出は、単球活性化の測定可能な指標であり、例えば個々の細胞における細胞質カルシウムレベルをモニタリングするためのナカジマらのアッセイ（１９９９）を使用して検出され得る。このアッセイを実施するためには、細胞に、Ｉｎｄｏ−１  ＡＭ色素（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を負荷し、以前に記載されたような（Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７及びＮａｋａｊｉｔａら、１９９９参照）フローサイトフルオロメーターで分析する。簡単に説明すると、ＬＩＲ−７を架橋する抗体の添加のために分析を休止する前に、基線を取得する。架橋は、一般に、ＬＩＲ−７に対するモノクローナル抗体、及び抗ＬＩＲ−７抗体を生成させた動物種に由来するＩｇＧに対する抗体を添加することを必要とする。分析は、フローサイトメトリーによって、負荷されたＩｎｄｏ−１色素の４０５／５２５スペクトル放射比率を測定することからなる。
【００２８】
セロトニン放出は、ＬＩＲ−７活性を測定するために使用され得るもう１つの指標である。セロトニン放出は、Ｃｏｌｏｎｎａら、１９９７に以前に記載されたようにしてアッセイされる。簡単に説明すると、細胞を、Ｈ３−セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）でパルス処理し、洗浄し、次いでセロトニンに対する抗体及び細胞表面上のＬＩＲ−７を架橋する抗体又は自発的放出に関して補正するための対照抗体のいずれかと接触させる。セロトニン放出は、以下の式に従い計算される：セロトニン放出率（％）＝１００×（［ｃｐｍ試料］−［ｃｐｍ自発的放出］）／（ｃｐｍ全）。
【００２９】
ここで使用されるような「ＬＩＲ−２」という用語には、配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドも包含される。ここで使用されるような「ＬＩＲ−３」という用語には、配列番号４によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号４に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドも包含される。「ＬＩＲ−７」という用語には、配列番号６によるアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫反応性であり、さらに、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に特徴的な生物学的活性を保有しているポリペプチドが包含される。
【００３０】
治療剤
開示された治療法のために有用な治療剤には、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３の発現又は機能のレベルを増加させ得る非毒性の薬剤、及びＬＩＲ−７の発現又は機能のレベルを減少させ得る非毒性の薬剤が含まれる。この目的のための例示的な薬剤には、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３と特異的に免疫反応性のアゴニスト性抗体及びＬＩＲ−７と特異的に免疫反応性のアンタゴニスト性抗体が含まれる。他の実施形態において、治療剤は、ＬＩＲ−７の細胞外領域がヒトＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域に連結されている融合タンパク質（ｓＬＩＲ−７：Ｆｃ）を含む、ＬＩＲ−７の細胞外領域の一部又は全部を含む可溶性ポリペプチドである。Ｓｌｉｒ−７：Ｆｃは、天然ＬＩＲ−７の競合的阻害剤として作用する。本発明の１つの局面において、治療剤は、配列番号６のアミノ酸１〜４４９又は１７〜４４９が前記のようなＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合しているポリペプチドである。
【００３１】
ＬＩＲのうちの１つに特異的な抗体を生成させるためには、完全ＬＩＲ、又はＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３もしくはＬＩＲ−７の細胞外領域を含むポリペプチド、又はそれらの抗原性副次部分を抗原性刺激として使用することが可能である。ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の細胞外領域は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸１〜４５８、配列番号４のアミノ酸１〜４４３及び配列番号６のアミノ酸１〜４４９に相当する。配列番号２、４及び６のアミノ酸１〜１６は、ＬＩＲの成熟中に開裂されるシグナル配列に相当する。全長ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３もしくはＬＩＲ−７、又はシグナル配列を含む、もしくは含まないそれらの細胞外領域が、抗体を生成させるために使用され得る。シグナルペプチドを欠くＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の細胞外領域は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸１７〜４５８、配列番号４の１７〜４４３又は配列番号６の１７〜４４９に相当する。さらに、そのＬＩＲに特有の抗原性エピトープを少なくとも１つ含有しているＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の副次部分を使用して抗体を生成させることもできる。
【００３２】
治療剤として使用するためのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、従来の技術によって調製され得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８０；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｄ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８参照；米国特許第４，４１１，９９３号も参照のこと）。モノクローナル抗体を作成するための１つの例示的なプロトコルは、ＷＯ９８／４８０１７に記載されたものである。簡単に説明すると、ＢＡＬＢ−Ｃマウスを、抗原性ＬＩＲポリペプチド１０μｇで、０週目、２週目及び６週目に免疫感作する。初回免疫感作はバキセル社（Ｖａｘｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．）のタイターマックス（ＴＩＴＥＲＭＡＸ）アジュバントを利用し、後続の免疫感作は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用する。１１週目に、３μｇから４μｇの抗原性タンパク質を含むＰＢＳの静脈内投与によってマウスを追加免疫する。静脈内追加免疫の３日後に、脾細胞を採集し、５０％ＰＥＧ１５００水溶液を使用して、Ａｇ８．６５３骨髄腫融合パートナーと融合させる。ハイブリドーマ細胞をスクリーニングするため、ハイブリドーマ細胞の個々のコロニーからの上清を、抗体を生成させているＬＩＲでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞に対するＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。このスクリーニングのためには、トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞２×１０３個を含むＰＢＳを、ポリスチレン９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェルに添加し、プレートコート抗原として細胞をプレートに乾燥させる。続いて、陽性上清を、ＦＡＣＳ分析及びＬＩＲでトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を使用したＲＩＰによって確認する。ハイブリドーマをクローニングし、同アッセイを使用して追跡する。モノクローナル培養物を増殖し、上清をＢｉｏＲａｄプロテインＡアガロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。上記の手法の変形物は、この技術分野において既知であり、所望により、ハイブリドーマを作成又はスクリーニングするために使用され得る。
【００３３】
本発明のモノクローナル抗体には、マウス又はラットのモノクローナル抗体のヒト化バージョンも含まれる。そのようなヒト化抗体は、既知の技術により調製され得、ヒトに投与された場合、減少した免疫原性という利点を与える。１つの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス又はラットの抗体の可変部（又はそれの抗原結合部位のみ）、及びヒト抗体に由来する定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウス又はラットのモノクローナル抗体の抗原結合部位、並びにヒト抗体に由来する（抗原結合部位を欠く）可変部断片及び定常部を含み得る。キメラモノクローナル抗体及びさらに改変されたモノクローナル抗体の作製のための手法には、リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８）、リウ（Ｌｉｕ）ら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，１９８７）、ラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，１９８９）、並びにウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）及びハリス（Ｈａｒｒｉｓ）（ＴＩＰＳ  １４：１３９，Ｃａｎ，１９９３）に記載されたものが含まれる。抗体をヒト化するための有用な技術は、米国特許第６，０５４，２９７号にも論じられている。トランスジェニックに抗体を製造する手法は、ＧＢ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号及び第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出され得る。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトのもの又はヒト化したものであり；そのようなヒト抗体又はヒト化抗体を作出するための技術も周知であり、例えばメダレックス社（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ．）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）及びアブジェニクス社（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）より商業的に入手可能である。もう１つの好ましい実施形態において、ヒトで使用するための完全にヒトの抗体は、ヒト抗体可変ドメインのファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより作製される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（６）：５３５−５３９；及び米国特許第５，９６９，１０８号）。
【００３４】
ＬＩＲ特異的抗体がアゴニスト性であるか又はアンタゴニスト性であるかを決定するため、スクリーニング手法が使用される。ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３に特異的なアゴニスト性抗体は、ＲＡを治療するための治療剤として有用であり、例えば、ＬＩＲ−２又はＬＩＲ−３を発現している活性化された単球におけるカルシウム流動又はチロシンリン酸化をダウンレギュレートする能力によって特定され得る。そのようなアッセイのためには、単球を活性化し、スクリーニングされるＬＩＲ−２特異的又はＬＩＲ−３特異的な抗体の存在下又は非存在下で、前記のようにしてカルシウム流動を測定する。活性化された単球を、分析中、推定アゴニスト性抗体に曝す。ＲＡの治療剤として有用なＬＩＲ−７に対するアンタゴニスト性抗体は、ＬＩＲ−７と結合することができ、かつ単球におけるカルシウム流動を誘起し得ないことにより特定され得る。
【００３５】
本発明の１つの局面において、治療剤として使用するためのＬＩＲ特異的抗体を生成させるために使用される抗原性刺激は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分及び標的ＬＩＲの細胞外領域を含む融合タンパク質である。この目的に適している１つのＦｃポリペプチドは、参照してここに組み込まれるＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／１０１５１に記載されているヒトＩｇＧ１に由来する天然Ｆｃ領域ポリペプチドである。融合タンパク質を構築するためのもう１つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号に記載されたＦｃミューテインである。このミューテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している点を除き、ＷＯ９３／１０１５１に提示された天然Ｆｃ配列のものと同一である。このミューテインＦｃは、免疫グロブリン受容体に対する減少した親和性を示す。
【００３６】
ＬＩＲ：Ｆｃ融合タンパク質を作成する１つの適切な手段は、ＷＯ９８／４８０１７に記載されたものである。この方法を適用するためには、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の細胞外領域の全部又は一部をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域をコードするＤＮＡと融合させる。ＬＩＲ−２：Ｆｃ融合体を作成するためには、細胞外領域全体（配列番号２のアミノ酸１〜４５８）又はＭＨＣ  Ｉと結合し得るその一部を使用することができる。ＬＩＲの細胞外領域をコードするｃＤＮＡは、細胞外領域をコードするヌクレオチド配列の両側に隣接するＰＣＲプライマーを使用することにより得られる。この目的のためには、例えば、配列番号１、番号３又は番号５に示されるようなヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡのような全長ＬＩＲ  ｃＤＮＡが、ＰＣＲのための鋳型として使用され得る。本発明の１つの実施形態において、増幅産物が増幅されたＤＮＡ断片の５’及び３’末にそれぞれＳａｌＩ及びＮｏｔＩＩ制限部位を導入するよう、５’及び３’末端にＳａｌＩ及びＮｏｔＩＩ制限部位が挿入されたプライマーが合成される。これらの制限部位は、増幅されたＤＮＡの発現ベクターへの付着を容易にする。あるいは、その他の制限部位が、増幅されたＤＮＡの末端に挿入されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質の発現のためのベクター構築物を調製するため、ＩｇＧ１のミューテインヒトＦｃ領域をコードするＤＮＡを、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の細胞外領域をコードするＤＮＡにライゲートさせる。本発明の１つの実施形態において、これは、ＬＩＲ細胞外領域が融合タンパク質のアミノ末端に位置するようなされる。次いで、融合ＤＮＡ構築物を、ＰＤＣ４０９のような適切な発現ベクターとライゲートさせ、ＣＶ１−ＥＢＮＡ又はＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＴＬ−１６５０）のような適切な宿主細胞において発現させる。サル細胞株ＣＯＳ−１は、融合タンパク質の発現を確証するために使用され得る。融合タンパク質を精製するため、ＣＯＳ−１培養物からの上清を遠心分離によって清浄化し、例えばＢｉｏＣａｄシステム及びＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  ２０Ａカラムを使用することにより、又は当業者に既知の他の比較可能な方法により精製する。プールされた溶出したタンパク質は、発現を確証し、発現された組換えタンパク質が予想された分子量を有していることを立証するため、銀染色と共にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析され得る。
【００３７】
同時治療
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の調節剤の１つ以上が、ＲＡを治療するために使用される他の薬物１つ以上と同時に投与される組み合わせ治療が、ここで提供される。そのような治療法において、ＬＩＲ調節剤は、ＲＡを治療するために使用される１つ、２つ、３つ又はそれ以上の他の薬物療法と同時に投与され得る。付加的な薬物療法は、ＬＩＲ調節剤と同時期的に又は交互に投与され得る。あるいは、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のアンタゴニスト又はＩＬ−１のアンタゴニストのようなＲＡを治療するために使用される他の何らかの薬剤による継続的な治療の背景に対して、ＬＩＲ調節剤が断続的に投与されてもよい。ＬＩＲ調節剤及びその他のＲＡ治療は、同時に、交互に、又は連続的に投与され得、また、それらの投与の頻度は同じであってもよいし、又は異なっていてもよい。
【００３８】
ＲＡの治療におけるＬＩＲ調節剤との同時使用に適しているＴＮＦαアンタゴニストには、ＴＮＦαに対する抗体が含まれる。そのような抗体には、ヒト化モノクローナル抗体及び完全にヒトのモノクローナル抗体が含まれる。ＬＩＲ調節剤との同時投与のための例示的なヒト化抗体は、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（登録商標）としてＣｅｎｔｏｃｏｒより販売されているインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）と呼ばれるキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ヒト定常部及びマウス可変部から構成されており、ヒトＴＮＦαと特異的に結合する。その他の適切な抗ＴＮＦα抗体には、ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７及びＣＤＰ５７１、並びにＥＰ  ０  ５１６  ７８５  Ｂ１、米国特許第５，６５６，２７２号、ＥＰ  ０  ４９２  ４４８  Ａ１に記載された抗体が含まれる。
【００３９】
ＬＩＲ調節剤は、ＩＬ−１の阻害剤、Ｔ細胞表面タンパク質に対する抗体、及びＴＮＦα、ＴＮＦα受容体又はＴＮＦαの合成のための代謝経路の酵素の翻訳に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムを含む、ＲＡを治療するために使用される様々な種類の薬剤と併せて投与され得る。ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているアンチセンスオリゴヌクレオチドには、米国特許第６，２２８，６４２号に記載されたものが含まれる。米国特許第５，６４１，７５１号及び米国特許第５，５１９，０００号に開示されたペプチドＴＮＦα阻害剤、並びに米国特許第５，７５３，６２８号に記載されたＤ−アミノ酸含有ペプチドも、ＬＩＲ調節剤との同時投与に適している。さらに、ここに記載された状態は、ＴＮＦα変換酵素の阻害剤により治療され得る。
【００４０】
好ましい組み合わせには、可溶型ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）であるＴＮＦα阻害剤と同時のＬＩＲ調節剤の投与が含まれる。ｓＴＮＦＲには、単量体、融合タンパク質（「キメラタンパク質とも呼ばれる）、二量体、三量体又はより高次の多量体が含まれ得る。本発明のある種の実施形態において、ｓＴＮＦＲ誘導体は、７５ｋＤａ  ＴＮＦＲ又は５５ｋＤａ  ＴＮＦＲを模倣し、かつ患者体内でＴＮＦαと結合するものである。本発明のｓＴＮＦＲ模倣体は、ＴＮＦＲ  ｐ５５もしくはｐ７５又はそれらの断片に由来し得る。例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載されたＴＮＦＲのような、ｐ５５及びｐ７５以外のＴＮＦＲも、ここに記載された様々な医学的障害の治療用の可溶性化合物を導出するのに有用である。ＴＮＦＲ模倣体を構築するために使用されるｓＴＮＦＲ分子には、例えば、天然ＴＮＦＲの膜貫通領域を欠き、かつＴＮＦαに結合し得る、少なくとも２０個のアミノ酸を有する天然ＴＮＦＲの類似体又は断片が含まれる。ｓＴＮＦＲのＴＮＦαとの結合は、ＥＬＩＳＡ又はその他の任意の便利なアッセイを使用して分析され得る。
【００４１】
本発明のｓＴＮＦＲポリペプチド又は断片は、キメラタンパク質を形成するよう第２のポリペプチドと融合させられ得る。第２のポリペプチドは、ＴＮＦα又はＬＴα分子に結合し、それが細胞結合受容体と結合することを防止することができる二量体、三量体又はより高次の多量体の、キメラタンパク質による自発的な形成を促進し得る。アンタゴニストとして使用されるキメラタンパク質には、例えば、抗体分子の定常部及びＴＮＦＲの細胞外部分に由来する分子が含まれる。そのような分子は、ここで、ＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質と呼ばれる。ヒト及びその他の哺乳動物における疾患を治療するのに適している好ましいＴＮＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、組換えＴＮＦＲ：Ｆｃである。この用語は、ここで使用されるように、ｐ７５  ＴＮＦα受容体の細胞外部分の分子（各分子は、ヒトＩｇＧ１の２３２アミノ酸Ｆｃ部分と融合した２３５アミノ酸ＴＮＦＲ由来ポリペプチドからなる）２個の二量体である「エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）」を指す。エタネルセプトは、現在、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（登録商標）という商品名でイムネックスコーポレーション（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より販売されている。ＩｇＧのＦｃ部分と融合した５５ｋＤａ  ＴＮＦＲの細胞外部分を含む化合物と、ＬＩＲ調節剤を組み合わせた治療、並びにそのような治療剤を含有している組成物及び組み合わせも、本発明に包含される。さらに、適切なＴＮＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載されたＴＮＦＲ（このＴＮＦＲに由来するＴＮＦＲ−Ｉｇを含む）のような、ｐ５５及びｐ７５  ＴＮＦＲ以外のＴＮＦα受容体分子の細胞外領域に由来してもよい。
【００４２】
さらに、本発明のＬＩＲ調節剤は、例えばＲＡＮＫ：Ｆｃ又はオステオプロテジェリン（米国特許第６，０１７，７２９号及びＷＯ９８／４６７５１参照）のような可溶型ＲＡＮＫを含む、関節炎関節における骨破壊を減じる薬剤と同時にＲＡ患者に投与され得る。
【００４３】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているその他の薬物には、以下に限定はされないが、アセトアミノフェン、コデイン、プロポキシフェンナフシレート（ｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｅ  ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、オキシコドン塩酸塩、ヒドロコドン重酒石酸塩及びトラマドールを含む鎮痛剤が含まれる。さらに、ＬＩＲ調節剤は、以下に限定はされないが、メトトレキサート、スルファサラジン、金塩、アザチオプリン、シクロスポリン、抗マラリア薬、ステロイド（例えば、プレドニゾン）及びコルヒチンを含む疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と併せて投与され得る。
【００４４】
抗炎症薬も、ＬＩＲ調節剤と共投与され得る。そのような抗炎症薬には、以下に限定はされないが、アスピリン；イブプロフェン；インドメタシン；セレコキシブ；ロフェコキシブ；ケトロラック；ナムブメトン（ｎａｍｂｕｍｅｔｏｎｅ）；ピロキシカム；ナプロキセン；オキサプロジン；スリンダク；ケトプロフェン；ジクロフェナク；並びに新たに開発された関節炎関節の治療に有効な抗炎症薬を含む、その他のＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の阻害剤、サリチル酸誘導体、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、カルボン酸誘導体、酪酸誘導体、オキシカム系、ピラゾール系並びにピラゾロン系が含まれる。
【００４５】
ＬＩＲ調節剤との同時使用に適しているＩＬ−１阻害剤には、遺伝学的に修飾されたミューテイン、多量体型及び徐放性製剤を含む、ＩＬ−１の受容体結合性ペプチド断片、ＩＬ−１又はＩＬ−１ベータ又はＩＬ−１受容体Ｉ型に対する抗体、及びＩＬ−１の受容体又は修飾されたその異型の全部又は一部を含む組換えタンパク質が含まれる。特定のアンタゴニストには、ＩＬ−１ｒａポリペプチド、ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、アンタゴニスト性Ｉ型ＩＬ−１受容体抗体、ＩＬ−１結合型のＩ型ＩＬ−１受容体及びＩＩ型ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ及びその他のＩＬ−１ファミリーメンバーを含むＩＬ−１に対する抗体、並びにＩＬ−１トラップとして既知の治療薬が含まれる。ＩＬ−１ｒａポリペプチドには、米国特許第５，０７５，２２２号に記載された型のＩＬ−１ｒａ、並びに米国特許第５，９２２，５７３号、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９２／１６２２１及びＷＯ９６／０９３２３に記載されたものを含む修飾型及び異型が含まれる。ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤には、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５５７７；ＷＯ９３／０５０７１；ＷＯ９３／０９１３５；ＷＯ９３／１４７７７及びＷＯ９３／１６７１０；及び欧州特許出願０  ５４７  ６９９に記載されたものを含む、ペプチジルＩＣＥ阻害剤及び低分子ＩＣＥ阻害剤が含まれる。非ペプチジル化合物には、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２６９５８、米国特許第５，５５２，４００号、米国特許第６，１２１，２６６号、Ｄｏｌｌｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：２４３８−２４４０（１９９６）に記載されたものが含まれる。さらなるＩＣＥ阻害剤は、米国特許第６，１６２，７９０号、第６，２０４，２６１号、第６，１３６，７８７号、第６，１０３，７１１号、第６，０２５，１４７号、第６，００８，２１７号、第５，９７３，１１１号、第５，８７４，４２４号、第５，８４７，１３５号、第５，８４３，９０４号、第５，７５６，４６６号、第５，６５６，６２７号、第５，７１６，９２９号に記載されている。
【００４６】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適しているＩＬ−１結合型のＩ型ＩＬ−１受容体及びＩＩ型ＩＬ−１受容体は、米国特許第４，９６８，６０７号、第４，９６８，６０７号、第５，０８１，２２８号、Ｒｅ３５，４５０、第５，３１９，０７１号及び第５，３５０，６８３号に記載されている。ＩＬ−１トラップは、ＷＯ０１８９３２に記載されている。
【００４７】
ＬＩＲ調節剤との同時投与に適している適切なＩＬ−１アンタゴニストには、抗体分子及びＩＬ−１アンタゴニスト分子の両方の一部を含んでいるキメラタンパク質がさらに含まれる。そのようなキメラ分子は、単量体、二量体又はより高次の多量体を形成し得る。その他の適切なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１シグナリング受容体、ＩＬ−１ＲＩ型と競合的に結合し得るＩＬ−１に由来するペプチドが含まれる。
【００４８】
さらに、ＬＩＲ調節剤は、サリドマイド又はサリドマイド類似体、ペントキシフィリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤又はその他の低分子のような低分子と共同でＲＡを治療するために使用され得る。適切なＭＭＰ阻害剤には、例えば、米国特許第５，８８３，１３１号、第５，８６３，９４９号及び第５，８６１，５１０号に記載されたもの、並びに米国特許第５，８７２，１４６号に記載されたメルカプトアルキルペプチジル化合物が含まれる。同時投与に適しているその他の低分子は、ＬＩＲ調節剤と組み合わせて投与され得る、米国特許第５，５０８，３００号、第５，５９６，０１３号及び第５，５６３，１４３号に記載されたものを含むＴＮＦα産生を減少させることができる分子である。ＬＩＲ調節剤と共同でＲＡを治療するのに有用な付加的な低分子には、米国特許第５，７４７，５１４号又は米国特許第５，６９１，３８２号に記載されたＭＭＰ阻害剤、並びに米国特許第５，８２１，２６２号に記載されたヒドロキサム酸誘導体、並びに置換されたオキシム誘導体（ＷＯ９６／００２１５）、キノリンスルホンアミド（米国特許第５，８３４，４８５号）、アリールフラン誘導体（ＷＯ９９／１８０９５）及びヘテロ二環式誘導体（ＷＯ９６／０１８２５；ＧＢ２  ２９１４２２  Ａ）のような、ホスホジエステラーゼＩＶ及びＴＮＦαの産生を阻害する低分子、ＴＮＦα及びＩＦＮγを抑制するチアゾール誘導体（ＷＯ９９／１５５２４）、並びにＴＮＦα及びその他の炎症前サイトカインを抑制するキサンチン誘導体（例えば、米国特許第５，１１８，５００号、米国特許第５，０９６，９０６号及び米国特許第５，１９６，４３０号参照）が含まれる。
【００４９】
医薬調製物
生理学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤のような他の成分と組み合わされた、（制限はされないが組換え起源及び非組換え起源を含む、あらゆる起源に由来する）本発明のＬＩＲ調節剤を有効量含む医薬組成物が、ここで提供される。「医薬適合性の」という用語は、（１つ以上の）活性成分の生物学的活性の有効性に干渉しない、非毒性の材料を意味する。投与に適している製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性及び非水性の無菌の注射用溶液；並びに懸濁化剤又は増粘剤を含んでいてもよい水性及び非水性の無菌の懸濁液が含まれる。本発明に係る治療剤は、唯一の活性材料として、又は所定の適応症に適している他の既知の活性材料と共に、医薬適合性の希釈剤（例えば、生理食塩水、トリス−ＨＣｌ、酢酸緩衝溶液及びリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、佐剤及び／又は担体と混和され組み合わされ得る。医薬組成物に適している製剤には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版  １９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されたものが含まれる。さらに、医薬組成物のためのＬＩＲ調節剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化されてもよいし、又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等のような重合体化合物に取り込まれてもよいし、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層の小胞、赤血球ゴースト又はスフェロブラスト（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔｓ）に取り込まれてもよい。リポソーム製剤に適している脂質には、制限はされないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が含まれる。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；第４，８３７，０２８号；及び第４，７３７，３２３号に開示されるように、そのようなリポソーム製剤の調製は、この技術分野における技術の範囲内にある。そのような組成物は、物理学的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼし、従って意図された適用に依って選択され、そのため、担体の特徴は選択された投与経路に依存する。
【００５０】
本発明の１つの好ましい実施形態において、徐放型のＬＩＲ調整ポリペプチドが使用される。開示された方法において使用するのに適している徐放型には、以下に制限はされないが、（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されたアルギン酸塩微粒子のような）徐々に溶解する生体適合性ポリマーに封入され、（局所的に適用されるヒドロゲルを含む）そのようなポリマーと混和され、かつ／又は生体適合性半透性インプラントに被包されたＬＩＲ調節剤が含まれる。１つ以上の治療剤が組み込まれている注射に適している微粒子の製剤も、含まれる。血中半減期を増加させるために修飾された治療用ＬＩＲ調節剤も、含まれる。例えば、ＬＩＲ調節剤は、既知の方法を使用して、注射のためポリエチレングリコールと結合体化され得る。
【００５１】
投与計画
ここで使用されるように、ＬＩＲ−７に拮抗するか、又はＬＩＲ−２もしくはＬＩＲ−３に作動する薬剤を「治療的に有効な量投与する」という語句は、障害の重度を反映する少なくとも１つの指標の改善、好ましくは持続性の改善を誘導するのに十分な量及び時間で、患者が治療剤により治療されることを意味する。患者が、１日以上、又はより好ましくは１週以上の間隔の少なくとも２つの時点で改善を示した場合、その改善は「持続性」であると見なされる。改善の程度は、兆候又は症状に基づき決定され、決定は、生活の質に関する質問調査票のような患者に与えられる質問調査票を利用してもよい。患者の疾病の程度を反映する様々な指標が、治療の量及び時間が十分であるか否かを決定するために査定され得る。選択された１つ以上の指標の基線値は、治療剤の初回投与の前に、患者を調査することにより確立される。好ましくは、基線調査は、初回投与の約６０日以内に行われ、初回投与と同じ日までの任意の時点において実施され得る。改善は、患者が選択された１つ以上の指標の基線に対する改善を明示するまで、本発明に係る治療剤を投与することにより誘導される。これに関して、「基線」とは、治療を受ける患者における初回投与前の選択された指標の測定値を指す。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、治療が、フェルソン（Ｆｅｌｓｏｎ）ら（Ｆｅｌｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６：７２７−７３５，１９９５）によって改定されたような米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）基準による改善を誘導した場合、十分な量及び時間のＲＡの治療が起こる。ＡＣＲ基準が使用される場合、患者が、敏感な関節の数（ｔｅｎｄｅｒ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔ）（約７８の関節が査定される）及び腫大した関節の数（ｓｗｏｌｌｅｎ  ｊｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔ）（約７６の関節が査定される）の両方に関して少なくとも２０％（ＡＣＲ２０）又は少なくとも５０％（ＡＣＲ５０）改善され、かつ以下の５つのうち３つの改善を示す場合、その治療は十分であると見なされる：１）対象による疼痛の査定（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｐａｉｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；２）対象による総体的な査定（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；３）医師による総体的な査定（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）；４）対象により自己査定された能力障害（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）；５）急性期反応物質（ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｒｅａｃｔａｎｔ）（ヴェステルグレン（Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｅｎ）赤血球沈降速度又はＣ反応性タンパク質レベル）。先の５つの基準のうち、最初の４つはリカート尺度でスコア化される。対象による査定及び総体的な査定（Ｓｕｂｊｅｃｔ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）は、患者の疾患の全体的な状態に基づき決定される。
【００５３】
本発明のもう１つの実施形態において、治療が十分であるか否かは、患者による自己査定又は医師による査定により査定される。患者による自己査定又は医師による査定は、例えば、尺度の一端が「疾患なし」を表し、他方の端が「重篤な疾患」を示すような主観的な数的尺度（即ち、「リカート」尺度）で測定され得る。尺度のいずれかの端が、「疾患なし」を表すために使用され得る。そのような尺度は、任意の所望の数値範囲、例えば、０〜３、０〜４、０〜５、０〜６、０〜７等を有することができ、基線時の患者の状態との比較のための基礎を提供する。例えば、０〜３点数制は、以下のカテゴリーを含み得る：０＝疾患なし；１＝軽度の疾患；２＝中程度の疾患；３＝重篤な疾患。この例において、スコアが１カテゴリー低下した場合、患者は「改善された」と考えられる。ここで使用されるように、「リカート尺度」という用語は、患者又は医師が測定されるパラメーターに関して患者の状態を最もよく表すと感じる数字に丸を付ける視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を含むものと理解される。基線スコアと比較して患者のスコアが悪化した場合、そのリカートスコアの変化には負の値が割り当てられる。
【００５４】
適切な投薬量は、治療される障害の性質及び重度、患者の体重、年齢、全身状態及び過去の疾病及び／又は治療、並びに投与経路のような要因に依って変動する。予備用量は、動物テストに従って決定され得、ヒトへの投与のための投薬量の概算は、標準的な投薬試験のようなこの技術分野において認められている実務に従って実施される。毒性を最小限に抑えつつ、細胞培養において決定されるようなＩＣ５０（即ち、症状の最大の半分の阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて公式化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。最終的には、主治医が、個々の各患者を治療するための本発明の治療剤の量を決定し、個々の患者の必要に応じて投与の用量及び頻度を調整することができる。
【００５５】
任意の効果的な投与経路が、本発明の治療法のためのＬＩＲ調節剤を治療的に投与するために使用され得る。注射される場合、ＬＩＲのアゴニスト又はアンタゴニストは、例えば、ボーラス注射又は連続注入により、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内又は皮下の経路を介して投与され得る。その他の適切な投与手段には、インプラントからの徐放、エアロゾル吸入、点眼剤、錠剤、シロップ剤、ロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）又はチューインガム剤を含む経口調製物、並びにローション剤、ゲル剤、スプレー剤、軟膏剤又はその他の適切な技術のような局所調製物が含まれる。あるいは、タンパク質性ＬＩＲ調節剤は、そのタンパク質を発現する培養細胞を移植することにより、例えば、調整タンパク質、即ちＬＩＲ−７のアンタゴニスト、ＬＩＲ−２のアゴニスト又はＬＩＲ−３のアゴニストを発現する細胞を移植することにより、投与され得る。１つの実施形態において、患者自身の細胞が、調整剤をコードするＤＮＡによるインビボ又はエクスビボでのトランスフェクションによってＬＩＲ調節剤を産生するよう誘導される。このＤＮＡは、例えば、調整剤をコードする裸のＤＮＡもしくはリポソームに封入されたＤＮＡの注射、ＤＮＡを発現するウイルスベクターの感染、又はこの技術分野において既知のその他の手段により、患者の細胞へ導入され得る。ＬＩＲ調節剤が、１つ以上の他の生物学的に活性な化合物と組み合わせて投与される場合、これらは、同じ経路により投与されてもよいし、又は異なる経路により投与されてもよく、また、同時期的に、別々に、又は連続的に投与され得る。
【００５６】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の調節剤であるタンパク質を含む注射用の医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは約０．１ｎｇから約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１マイクログラム〜約１ｍｇ）の用量の治療用ポリペプチドを含有しているべきである。本発明の１つの実施形態において、そのような組成物は、ここに開示された様々な医学的障害を治療するために１ヶ月に１回投与され、もう１つの実施形態においては、少なくとも１週間に１回投与され、もう１つの実施形態においては、少なくとも１週間に２回以上投与される。
【００５７】
投与経路が注射又は静脈内注入である場合、成人の１回当たりのＬＩＲ調節剤の有効量は、体表面積に基づき計算され得る。治療用抗体又はタンパク質を含むその他の治療剤の好ましい用量範囲は、１〜２０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ２である。あるいは、５〜１００ｍｇ／回の範囲であり得る均一（ｆｌａｔ）用量が投与されてもよい。皮下注射によって投与される均一用量の例示的な用量範囲は、５〜２５ｍｇ／回、２５〜５０ｍｇ／回及び５０〜１００ｍｇ／回である。本発明の１つの実施形態において、医学的障害は、１、５、１０、２５又は５０ｍｇを含有している均一用量の治療用ポリペプチドを含有している注射用に許容される調製物を投与することにより治療される。治療剤は、８週間に１回、７週間に１回、６週間に１回、５週間に１回、４週間に１回、３週週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、１週間に５回、１週間に６回、又は毎日という頻度で、繰り返し投与され得る。注射以外の投与経路が使用される場合、その用量は、標準的な医学的実務に従い適切に調節される。
【００５８】
抗体がＬＩＲ−７アンタゴニスト又はＬＩＲ−２もしくはＬＩＲ−３のアゴニストとして使用される場合、１つの好ましい用量範囲は１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、もう１つの好ましい用量範囲は、体重１ｋｇ当たり０．７５〜７．５ｍｇ／ｋｇである。ヒト化抗体、即ち抗体分子の抗原結合部分のみが非ヒト起源に由来する抗体が、好ましい。そのような抗体は皮下、筋肉内に注射されてもよいし、又は静脈内に投与されてもよく、また、治療剤に対する宿主抗体の発生を減少させるためにメトトレキサートと同時に使用されてもよい。
【００５９】
治療の期間は、患者の応答に依って変動し得る。所望の程度の改善を誘導するために、より長期間の治療が必要である場合もあり得るが、多くの場合、患者の状態の改善は、少なくとも３週間にわたり治療用量を注射することにより得られる。患者の医師によって必要であると考えられた場合には、計画は、用量及び頻度を調節しながら、無期限に継続され得る。小児科患者（４歳から１７歳）の場合、１つの適切な計画は、皮下注射によって１週当たり１回以上投与される、０．４ｍｇ／ｋｇ、最高で２５ｍｇの用量のポリペプチドＬＩＲ調節剤の皮下注射を含む。
【００６０】
慢性状態であるＲＡの治療において、患者の状態の改善は、少なくとも１週間以上、又はより好ましくは１ヶ月以上、又は１ヶ月、２ヶ月もしくは３ヶ月以上の期間にわたり、又は無期限に、この医薬品を繰り返し投与することにより得られる。治療は、治療の最初の月と同じ用量及び頻度で、又は縮小された用量もしくは頻度で、無期限に継続されてもよいし、又は所定の患者のための一次治療として使用されている他の何らかの治療と共同で断続的に投与されてもよい。投与の用量又は頻度が縮小又は中止された場合、症状が悪化するようであれば、後にそれは元のレベルで再開され得る。そのような決定は、標準的な医学的実務に従い患者の医師によってなされる。
【００６１】
前述の薬物療法に対する個々の患者による応答が変動し得ること、並びに各患者にとって最も効果的な薬物の組み合わせ及び投薬計画が、その患者の医師によって決定されることが理解される。
【００６２】
以下の実施例は、制限のためではなく例示のために提示される。当業者であれば、特にここで引用された様々な参照の教示を考慮して、この実施例において具現化された本発明を変形させ得ることを認識する。
【実施例】
【００６３】
この研究は、ＲＡ、骨関節炎（ＯＡ）を有している患者及び正常患者の滑膜における、いくつかのＬＩＲのインビボ発現及び細胞分布を比較した。ＲＡとは対照的に、ＯＡにおける滑膜組織中の炎症反応は、パンヌス形成及び組織侵襲の非存在下で起こるため、ＯＡ滑膜をこの研究に含めた（Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚら編，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，１９９−２１１（１９８４）；Ｄｉｅｐｐｅら、Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚら編，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ／ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．第２版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，３９９−４１２（１９９２））。免疫組織化学を使用して、阻害性ＬＩＲ及び活性化ＬＩＲの発現を、ＲＡ患者６人、骨関節炎患者３人及び対照対象３人の滑膜において研究した。特異的抗体による染色を、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７の発現を検出するために使用し、細胞系統特異的抗体による連続切片の染色を、発現されたＬＩＲの細胞局在を評価するために使用した。
【００６４】
２つの阻害性ＬＩＲポリペプチドＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３、並びに１つの活性化ＬＩＲポリペプチドＬＩＲ−７の発現を、この実験セットにおいて調査した。一般に、これらの３つのＬＩＲは、ＲＡにおけるサイトカイン及びプロテアーゼの重要な起源である骨髄起源の細胞における比較的限定された発現を有している。ＬＩＲ−２は、ＭＨＣクラスＩ分子を認識することが既知であり、ヒト組織に広範囲に分布している。
【００６５】
２歳から１４歳の範囲のＲＡの履歴を有する患者６人、及び３歳から１３歳の範囲のＯＡの履歴を有する患者３人が、全身麻酔下で膝関節からの滑膜組織の切除を受けた。正常滑膜組織は、外傷性半月板破裂のための再建膝手術中に３人の対象から得られた。滑膜組織はＯＣＴ化合物で包埋され、液体窒素（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）で急速凍結させられ、組織病理学的分析及び免疫組織化学的研究のため２μｍから４μｍに切片化された。
【００６６】
ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３及びＬＩＲ−７に対する特異的マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体は、記載されたようにして（Ｃｏｓｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２７３−２８２（１９９７）参照）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合したＬＩＲ細胞外ドメインを含有しているＬＩＲ／Ｆｃ融合タンパク質による免疫感作により、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて生成させた。その抗体を、ＬＩＲ／Ｆｃ融合タンパク質のパネルに対するＥＬＩＳＡ、及び全長ＬＩＲ  ｃＤＮＡによりトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞を使用したＦＡＣＳ分析により、特異的免疫反応性に関してスクリーニングした。無関係なマウスＩｇＧ１抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を、陰性対照として使用した。
【００６７】
これらの抗体を、参照して完全にここに組み込まれるＴｅｄｌａら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４８（５）：１３６７−７３（１９９６）に記載されたような３段階アルカリホスファターゼ染色技術において使用した。簡単に説明すると、アセトン固定された切片を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）により平衡化し、室温で２０分間、未希釈のウマ血清によりブロッキングした。次いで、４℃で一晩５μｇ／ｍｌの一次抗体と共に切片をインキュベートした。ＴＢＳによる４回の洗浄の後、室温で１時間、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に切片をインキュベートした。ＴＢＳによる４回の洗浄の後、室温で４５分間、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合体（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に切片をインキュベートした。熱量測定用アルカリホスファターゼ基質（（ベクターレッド（ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｄ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びヘマトキシリンによる短時間対比染色を使用して、免疫反応性を検出した。各抗ＬＩＲ抗体の使用のための最適条件は、皮膚、胸腺、リンパ節及び脾細胞を含む、ＬＩＲ発現細胞を含有している可能性が高い正常組織のパネルを使用して最初に定義した。
【００６８】
抗ＬＩＲ抗体により分析されたものに隣接している切片も、ＬＩＲに特異的な抗体と免疫反応性の特異的細胞型を決定するために分析した。これは、参照してここに組み込まれるＴｅｄｌａら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １１（７）：５３１−４０（１９９９）及びＴｅｄｌａら、１９９６に記載された方法を使用して行った。この作業は、マクロファージ（マウスＩｇＧ１抗ＣＤ６８）、Ｔ細胞（ウサギポリクローナル抗ＣＤ３）、内皮細胞（マウスＩｇＧ１抗フォンビルブラント因子）、好中球カテプシンＧ（ウサギポリクローナル）及び肥満細胞トリプターゼ（マウスＩｇＧ１）を検出するための抗体を使用した。これらの抗体は、ＤＡＫＯ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より購入した。使用した染色手法は、前記の抗ＬＩＲ抗体による染色と本質的に同様であった。特異的抗体による免疫組織化学的染色に加え、標準的なヘマトキシリン及びエオシンによる染色を、各切片の質及び組織学を評価するために使用した。
【００６９】
免疫組織化学的研究からの組織切片を、切片全体を横切る連続的な視野に見られる細胞を計数することにより査定した。簡単に説明すると、各切片について２５０×倍率の平均１８個の視野を、系統的な抽出手法で選択した。アイソタイプ対照抗体により染色された対照切片が有意な免疫反応性を示さないことを保証した後に、１視野当たりの陽性細胞（赤色染色）の数を数えた。有意な領域間の染色の変動が観察されたが、切片全体についての数の中央値を、各抗体に関する染色の保存的な測定値として報告した。
【００７０】
観察された滑膜組織試料の組織学的特質及び３つのＬＩＲの発現を、表１に要約した。比較的短い疾病期間（２年から５年）を有していた２人のＲＡ患者（ＲＡ１及びＲＡ２）に由来する切片は、ＣＤ６８陽性マクロファージ、カテプシンＧ陽性好中球、中程度の数のトリプターゼ陽性肥満細胞及びＣＤ３陽性Ｔ細胞のクラスターを含む炎症細胞による広範な浸潤を示した。罹患年数８年から１４年の残りの４人のＲＡ患者においては、炎症細胞浸潤の程度は一様でなく、これらの患者においては組織繊維症が明白であった。ＯＡを有する患者のうちの２人に由来する切片には、限定された数のＴ細胞及び肥満細胞と共に有意なマクロファージ浸潤が存在した（表１）。３人目のＯＡ患者は、滑膜の外側の端部にマクロファージを含む広範な繊維症を有していた。正常対象から得られた切片には、炎症細胞がほとんど又は全く観察されなかった。
【００７１】
表１に示されるように、疾病期間が初期〜中程度の３人のＲＡ患者（患者ＲＡ１、ＲＡ２及びＲＡ３）から得られた切片には、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の広範な発現が存在した。ＬＩＲ−２は、リウマチ滑膜に浸潤している好中球及びマクロファージにＬＩＲ−７と共局在していた。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の発現は、初期リウマチ様疾患においては特に顕著であったが（表１）、ＲＡの期間が長い（８年以上）患者については非常に限定されていた。ＲＡの期間が増加するにつれ、滑膜組織はより多くの繊維症性変化を示し、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７を発現する細胞の数は劇的に減少した。ＯＡを有する患者から得られた滑膜組織には、活性化ＬＩＲ及び阻害性ＬＩＲ両方の無視し得る程度の発現が見出された。正常ドナーに由来する滑膜組織には、ＬＩＲ発現が検出されなかった。
【００７２】
ＬＩＲ−３は、３人の初期ＲＡ患者のうち２人のリウマチ様滑膜中の浸潤マクロファージに発現していたが、後期ＲＡ患者には発現していなかった。正常対象から得られた対照組織には、ＬＩＲ−２、ＬＩＲ−３又はＬＩＲ−７の発現が検出されなかった。
【００７３】
表２は、ＬＩＲ特異的抗体、並びにマクロファージ、内皮細胞、好中球、肥満細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞に特異的な抗体による滑膜組織試料の連続切片の染色により得られた結果を示す。ＬＩＲはＣＤ３＋Ｔ細胞には検出されなかった。表２に示されるように、ＲＡ患者の滑膜において、炎症性白血球へのＬＩＲ−２及びＬＩＲ−３発現の制限とは対照的に、ＬＩＲ−７は、好中球、マクロファージ、肥満細胞、繊維芽細胞様細胞（細胞形態学によって決定）及び内皮細胞に様々に発現していた。ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の細胞分布は炎症細胞浸潤物の性質の差を反映して、ＲＡ患者間で異なっていた。患者ＲＡ１においては好中球がＬＩＲ−２の主な細胞起源であったが、患者ＲＡ２においてはマクロファージがＬＩＲ−２の主な細胞起源であった。一般に、ＲＡ患者において、ＬＩＲ−７の発現はＬＩＲ−２のものより幾分低く、ＬＩＲ−７の細胞分布はＬＩＲ−２のものより広範囲であった。ＬＩＲ−７は、患者ＲＡ１においては、好中球、マクロファージ、肥満細胞及び内皮細胞によって発現されており、患者ＲＡ２においては、マクロファージ、内皮細胞及び繊維芽細胞様滑膜細胞によって発現されていた。残りの全てのＲＡ患者において、ＬＩＲ−２及びＬＩＲ−７の細胞起源は、マクロファージと、程度は低かったが内皮細胞であった。ＯＡにおいて観察されたＬＩＲ−２の限定された発現は、主としてＣＤ６８＋マクロファージに見出された。ＲＡを有する患者において、ＬＩＲ−３は、マクロファージ及び繊維芽細胞様滑膜細胞によって排他的に発現されていた。アイソタイプ一致陰性対照抗体は、いずれかの患者においても免疫染色を与えなかった。
【００７４】
上に提示された結果は、初期ＲＡを有する患者に由来する滑膜が、ＭＨＣクラスＩ分子を認識しそれと会合することができる阻害性ＬＩＲ−２の上昇した発現を示したことを明らかにしている。上昇したＬＩＲ−３の発現も、ＲＡ患者において観察された。細胞を活性化する能力を有するＬＩＲ−７の広範な発現も、ＲＡ患者に由来するマクロファージ及び好中球に観察された。さらに、ＬＩＲ−７発現は肥満細胞及び内皮細胞で観察された。ＯＡを有する患者に由来する滑膜、対照対象、又は繊維症を伴う長期のＲＡを有する２人の患者には、ＬＩＲ発現がほとんど観察されなかった。従って、これらの結果は、ＬＩＲが、ＲＡにおける炎症性浸潤物中のプロテアーゼ及びサイトカインの発現を制御し、それによりパンヌス形成及び関節破壊の過程に寄与しているかもしれないことを示唆している。
【００７５】
【表１】
2005532256.tif 000022
【００７６】
【表２】
2005532256.tif 000023
【国際調査報告】
2005532256.tif 000024
2005532256.tif 000025