(57)【要約】【課題】簡便且つ正確にアルツハイマー病の進行度を診断可能な診断薬を提供する。【解決手段】本発明は、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬であって、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体のみに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬であって、
粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体のみに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備えることを特徴とする診断薬。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、
を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、
を含む重鎖可変ドメインを有する請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する請求項２に記載の診断薬。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、
配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する請求項２又は３に記載の診断薬。
【請求項５】
被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、
前記被検者から採取した血液試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断薬とを接触させて、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する検出工程と、
前記検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量と、アルツハイマー病の各進行度におけるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の基準値とを比較して、アルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、
を備えることを特徴とする方法。
【請求項６】
被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、
定期的に前記被検者から血液試料を採取し、前記血液試料と、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断薬とを接触させ、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する定期検出工程と、
前記定期検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の経時的な変化からアルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、
を備えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬、及び被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は患者本人だけでなくその介護者の生活の質を大幅に病気であり、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）は認知症の約半分を占める。ＡＤは、病気の進行を遅らせる薬がすでに多く上市されているが、現状の診断方法は医師の問診に頼るものであり、正確な早期診断方法が求められている。
【０００３】
また、ＡＤの発症はアミロイドβタンパク質（Ａβ）が脳に沈着することが引き金となるとの説が有力であり、より正確なＡＤ診断方法として、例えば、Ａβの凝集体に結合する放射性マーカーを患者に注射し、ＰＥＴで画像診断する方法や、髄液中のＡβの濃度を測定する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
一方、脳内に沈着するのは、単量体のＡβではなく、繊維状や非晶質のＡβの凝集体（Ａβ凝集体）であり、３２量体以下の小さな非晶質のＡβ凝集体については神経毒性が強いことなどから、研究が進められてきた。例えば、この小さな非晶質のＡβ凝集体は、微小管結合タンパク質であるタウタンパク質の線維化を促進することが知られており、繊維化したタウタンパク質は繊維状封入体（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ；ＮＦＴ）を形成し、神経原線維変化を引き起こす。ブラークらのアルツハイマー病の進行の分類では、ＮＦＴの形成度合いによりＩからＶＩまでのステージに分類している（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
本発明者らは、直径が５０ｎｍ程度の非晶質のＡβ凝集体に対する複数のモノクローナル抗体を作製し、該モノクローナル抗体を用いた赤血球中のＡβ凝集体の免疫学的測定法を開発した（例えば、特許文献１、２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−１２２１７９号公報
【特許文献２】特開２０１５−１４１１４９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】下濱俊、「アルツハイマー病の新たな診断基準」、日本老年医学会雑誌、５０巻１号、２０１３．
【非特許文献２】Braak H., et al., “Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes”, Neurobiol. Aging., vol.16, p271-278, (discussion) p278-284, 1995.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＤ診断方法として、Ａβの凝集体に結合する放射性マーカーを患者に注射し、ＰＥＴで画像診断する方法では、簡便であるが病気がある程度進行してからでないと確認ができないという問題があった。また、髄液中のＡβの濃度を測定する方法では、髄液の採取は患者への負担が大きく、健康診断等でのＡＤスクリーニングが難しい。
さらに、既存の単量体のＡβに対する抗体を用いた測定では、血中のＡβ濃度が低いため、髄液を用いた場合と同等の精度で測定を行うことができないという課題があった。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便且つ正確にアルツハイマー病の進行度を診断可能な診断薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、直径が５０ｎｍ程度の非晶質のＡβ凝集体に対するモノクローナル抗体を用いることにより、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬であって、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体のみに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備えることを特徴とする診断薬。
［２］前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する［１］に記載の診断薬。
［３］前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有する［２］に記載の診断薬。
［４］前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有する［２］又は［３］に記載の診断薬。
［５］被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、前記被検者から採取した血液試料と、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の診断薬とを接触させて、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する検出工程と、前記検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量と、アルツハイマー病の各進行度におけるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の基準値とを比較して、アルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、を備えることを特徴とする方法。
［６］被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、定期的に前記被検者から血液試料を採取し、前記血液試料と、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の診断薬とを接触させ、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する定期検出工程と、前記定期検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の経時的な変化からアルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、を備えることを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便且つ正確にアルツハイマー病の進行度を診断可能な診断薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）〜（Ｄ）実施例１におけるアルツハイマー病を発症している患者１３名、及びアルツハイマー病を発症していない健常者１０名の血清について、抗体Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤを用いたＥＬＩＳＡ法によりアミロイドβタンパク質の凝集体を検出した結果を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるブラークステージ０〜ＶＩであった６６歳以上女性の死後血清約１０８検体について、抗体Ｄを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりアミロイドβタンパク質の凝集体を検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞
一実施形態において、本発明は、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬であって、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体のみに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備える診断薬を提供する。
【００１５】
本実施形態の診断薬によれば、簡便且つ正確にアルツハイマー病の進行度を診断することができる。
【００１６】
一般に、「アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＤ）」とは、不可逆的な進行性の脳疾患で、記憶や思考能力がゆっくりと障害され、最終的には日常生活の最も単純な作業を行う能力さえも失われる病気である。ほとんどのＡＤ患者では、６０歳以降に初めて症状が現れる。ＡＤの発症はアミロイドβタンパク質（Ａβ）が脳に沈着することが引き金となると考えられている。
また、本明細書において、「アルツハイマー病の進行度」は、ブラークらのアルツハイマー病の進行の分類における繊維状封入体（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ；ＮＦＴ）の形成度合いに基づいて、ＩからＶＩまでのステージ（ブラークステージ、Ｂｒａａｋ  Ｓｔａｇｅ（ＢＳ））のいずれのステージにあるかを意味する。各ブラークステージにおけるＮＦＴの形成度合いを以下の表１に示す。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
本実施形態の診断薬を用いることで、後述の実施例に示す通り、ブラークステージＩ〜ＩＩＩでは、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度が徐々に上がり、ブラークステージＩＶ以上では前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度が下がることで、被検者がブラークステージＩＩＩ以下、又はＩＶ以上であることを診断することができる。これは、前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度の上昇に伴い、血管に前記アミロイドβタンパク質の凝集体が蓄積し、血液脳関門がつぶれることで、前記アミロイドβタンパク質の凝集体が脳に蓄積し、前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度が下がるためである。
さらに、後述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法＞＞に示す通り、被検者における前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度と、各ブラークステージにおける前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度の基準値とを比較することで、被検者がいずれのブラークステージにあるかを診断することができる。
【００１９】
＜モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント＞
本実施形態の診断薬は、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質の凝集体のみに特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを備える。
【００２０】
一般に、「アミロイドβタンパク質（Ａβ）」は、アミロイドβ前駆体（Ａｍｙｌｏｉｄ−β  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）からβセクレターゼ及びγセクレターゼによる連続した二段階切断により切り出されて産生される４０〜４２アミノ酸からなるペプチドであり、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２の２種が同定されていた。このうち、Ａβ１−４２はインビトロでの凝集性が高く、ＡＤ患者の脳において初期から有意に蓄積することが知られている。近年、さらに凝集性が高い分子種として、Ａβ１−４３が同定され、ＡＤ患者の脳において初期から有意に蓄積することが明らかとなった（参考文献：Saito T., et al., “Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43”, Nat. Neurosci., vol.14, no.8, p1023-1032,2011.）。また、Ａβは産生後に、Ｎ末端の部分分解とピログルタミル化が生じることで、疎水性が上がることが知られている（参考文献：Saido. C. T., et al., “Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques”, Neuron., vol.14, no.2, p457-466,1995.）。
よって、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、３番目のグルタミン酸がピログルタミル化したＡβ１−４２又はＡβ１−４３に特異的に結合するものであることが好ましい。
また、脳内に沈着するのは、単量体のＡβではなく、繊維状や非晶質のＡβの凝集体（Ａβ凝集体）であり、３２量体以下の小さな非晶質のＡβ凝集体については神経毒性が強いことが知られている。
よって、本実施形態の診断薬に含まれるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体のみに特異的に結合するものであって、単量体のＡβ及び繊維状のＡβには実質的に結合しないものであり、粒子径２２０ｎｍ以上の非晶質のＡβ凝集体への結合が弱いものである。
【００２１】
本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な特異性を持つ抗体を意味する。また、本明細書において、モノクローナル抗体には、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。
本明細書において、モノクローナル抗体の「抗原結合フラグメント」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的タンパク質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体等が挙げられる。
【００２２】
本明細書において、「特異的結合」とは、抗体が標的タンパク質（抗原）にのみ結合することを意味し、例えば試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ等）における抗体の抗原のエピトープへの結合等により定量することができる。結合の親和性は、ｋａ（抗体−抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって規定することができる。抗体が抗原に特異的に結合している場合の結合親和性（ＫＤ）は、１０−８ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１０−９Ｍ〜１０−１３ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
【００２３】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとしてより具体的には、例えば、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、
及び／又は、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｆ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有するもの等が挙げられる。
なお、本明細書において、「ＣＤＲ」はｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎを意味する。
【００２４】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体のみを特異的に認識するものである。従って、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体の特異的認識能を保持していれば、前記（ａ）〜（ｆ）の配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１個以上１５個以下が好ましく、１個以上１０個以下がより好ましく、１個以上５個以下がさらに好ましい。
【００２５】
本明細書中において「置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・スレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）等で分類することができる。
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントにおける１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、従来の非晶質のＡβ凝集体に対する抗体等）よりも高いことが好ましい。
【００２６】
中でも、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを有するものであることが好ましい。
【００２７】
さらに、発現精製が容易であることから、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原を認識するために必要な最小単位である重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインをフレキシブルなペプチドリンカーで結合した単可変ドメインフラグメントであることが好ましい。即ち、ｓｃＦｖ抗体であることが好ましい。
具体的には、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５に示されるアミノ酸配列と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と、配列番号１に示されるアミノ酸配列と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、をこの順に有することが好ましい。
【００２８】
また、本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは標識物質が結合していてもよい。
【００２９】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの標識物質としては、例えば、安定同位体、放射性同位体、蛍光物質、酵素、磁性体等が挙げられる。中でも、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの標識物質としては、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質又は酵素であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体が結合しているか否かを簡便且つ高感度に確かめることができる。
【００３０】
安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏが挙げられ、これらに限定されない。
放射性同位体としては、例えば３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓが挙げられ、これらに限定されない。
蛍光物質としては、例えばシアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、その他公知の蛍光色素（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３１】
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。標識物質が酵素である場合、酵素基質を使用することが好ましい。酵素基質としては、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｓｅ；ｐＮＰＰ）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）等を用いることができ、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２−アジノ−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）等を用いることができる。
【００３２】
磁性体としては、例えばガドリニウム、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ヨード、鉄、酸化鉄、クロム、マンガン、又はその錯体、或いはキレート錯体等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３３】
＜モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法＞
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。
【００３４】
ハイブリドーマ法としては、例えば、ケーラーおよびミルスタインの方法（例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256:495,1975. 参照）等が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞としては、例えば抗原（例えば、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体、そのペプチド断片、又はこれらを発現する細胞等）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられる。また、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することができる。抗体産生細胞及びミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。ハイブリドーマを得る方法としては、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る方法等が挙げられる。ハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体を得る方法としては、例えば標的タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得する方法等が挙げられる。
【００３５】
組換えＤＮＡ法としては、例えば上記本実施形態のモノクローナル抗体又は抗体の機能的断片をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入し、本実施形態のモノクローナル抗体を組換え抗体として産生させる手法等が挙げられる（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０）参照）。
本実施形態のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際特許出願第９４／１１５２３号参照）。本実施形態のモノクローナル抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液から分離及び精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離及び精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いた方法では、例えば、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ等）を作製し、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得する方法等が挙げられる。
【００３６】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体のみに特異的に結合できるものであれば、上述したようなアミノ酸配列変異体であってもかわない。
アミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域及びＣＤＲ）であってもよい。また、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法等を用いてもよい（例えば、ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８）参照）。
【００３７】
本実施形態のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント（上述のアミノ酸配列変異体等も含む）の抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ラジオイムノアッセイ法、免疫沈降法、免疫染色法等により評価することができる。
【００３８】
＜ハイブリドーマ＞
本実施形態の診断薬は、モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの代わりに、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを備えていてもよい。前記ハイブリ―ドーマを培養することにより、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と、を含む軽鎖可変ドメイン、及び／又は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、を含む重鎖可変ドメインを含む抗体であることが好ましい。
【００３９】
前記ハイブリドーマは、上述のハイブリドーマ法を用いて、製造することができる。
具体的には、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体、そのペプチド断片、又はこれらを発現する細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、生理食塩水などで適当量に希釈・懸濁し、通常のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を適量混合し、乳化し、それをマウスに４〜２１日毎に計２〜１０回皮下又は腹腔内投与する。また、抗原免疫時に適当な担体を使用してもよい。マウスの血清中の抗体レベルが免疫により上昇するのを確認した後、最終免疫を行い、その面系の２〜５日後に免疫した動物の脾臓又はリンパ節を採取する。続いて、採取された細胞をマウスミエローマ細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生マウスハイブリドーマ細胞を作製する。
【００４０】
細胞融合は、公知の方法で行うことができる。例えば、免疫した動物から採取した抗体産生細胞（脾臓、リンパ節等の細胞）とミエローマ細胞とを培養液中で１：１〜１０：１程度の割合でよく混合し、ＰＥＧ溶液（例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のもの）を３７℃に加温し、両細胞にＰＥＧを３０〜６０％（ｗ/ｖ）の濃度で添加し、混合し、両細胞を融合する。ＰＥＧを除去した後、融合細胞を所定濃度で播種する。
【００４１】
マウス由来のミエローマ細胞株としては、例えば、Ｐ３（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８）、Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）、Ｘ６３．６５３（Ｘ６３Ａｇ８．６５３）、ＳＰ２（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、ＦＯ、ＮＳ−１（ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１）、ＮＳＯ／１、ＦＯＸ−ＮＹなどが、ラット由来のミエローマ細胞株として、例えば、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＹＢ２／０、ＩＲ９８３Ｆ等が挙げられる。
【００４２】
次に、例えば、ＨＡＴ選択培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培養液）などで数日〜数週間培養し、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させてハイブリドーマを選択培養する。
【００４３】
次に、選択培養液で生存したハイブリドーマの中から、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニング方法は特に限定されないが、上述の＜モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法＞において、抗原への結合活性の評価方法として例示された方法を用いて、抗原とハイブリドーマ培養上清中の抗体との結合性の有無を調べることにより、目的のハイブリドーマ株を選抜できる。そして、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、必要に応じてモノクローニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる。
【００４４】
＜その他構成＞
（２次抗体）
本実施形態の診断薬は、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに加えて、さらに、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに標識物質が結合したもの、又は前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体に標識物質が結合したものを２次抗体として備えていてもよい。
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに標識物質が結合したものを２次抗体として備える場合、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法や抗原測定系による化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）等を用いて、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体を検出することができる。
また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体に標識物質が結合したものを２次抗体として備える場合、抗体測定系によるＥＬＩＳＡ法、間接蛍光抗体法、抗体測定系によるＣＬＥＩＡ法等を用いて、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のＡβ凝集体を検出することができる。
【００４５】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体に標識物質が結合したものとしては、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの由来動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ等）に対する抗体であることが好ましい。例えば、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの由来がマウスである場合、抗マウス抗体であることが好ましい。また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに対する抗体に標識物質が結合したものには、免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。
標識物質としては、上述の＜モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント＞において、例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４６】
（支持体）
本実施形態の診断薬において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは支持体上に固定化された状態であってもよい。
【００４７】
支持体の形態としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップ等が挙げられる。
【００４８】
支持体の材料としては、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン等）、セルロース及びその誘導体（例えば、ニトロセルロース等）等が挙げられる。
支持体への前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの固定方法は、例えば、物理的吸着、共有結合又は非共有結合（例えば、イオン結合、静電結合、疎水性相互作用等）等が挙げられる。
【００４９】
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、検出対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン（例えば、対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、脱脂粉乳、カゼイン等が挙げられる。
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、或いはヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル等）、又は非還元多糖類（例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース等）等でコーディングされていてもよい。このようなコーディングにより、支持体上の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
【００５０】
（その他）
本実施形態の診断薬は、必要に応じて、さらに反応停止液を備えていてもよい。反応停止液としては、例えば、硫酸、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
【００５１】
本実施形態の診断薬は、さらに、緩衝液を備えていてもよい。緩衝液としては、緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液は、必要に応じて、ＮａＣｌ、界面活性剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等)及び防腐剤（例えば、アジ化ナトリウム等）のうち少なくともいずれか一方を含んでいてもよい。緩衝液の具体例としては、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）、トリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）、又はＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）等が挙げられる。
【００５２】
本実施形態の診断薬において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、及び２次抗体は、乾燥状態であってもよく、上述の緩衝液に溶解した上であってもよい。中でも、これらの抗体は、保存安定性から、乾燥状態であることが好ましい。
【００５３】
本実施形態の診断薬は、さらに、標準曲線（検量線）作成用の標準溶液、標準溶液希釈剤（例えば、上述の緩衝液等）を備えていてもよい。
本実施形態の診断薬は、さらに、洗浄液（例えば、上述の緩衝液等）や、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材（例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール等）を備えていてもよい。
【００５４】
本実施形態の診断薬は、さらに、検出装置を備えていてもよい。検出装置としては、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。
【００５５】
＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法＞＞
本実施形態の診断薬は後述に示す通り、被検者におけるアルツハイマー病の進行度の診断に用いることができる。詳細な診断方法について、以下に説明する。
【００５６】
本実施形態の診断方法が適用される被検者としては、例えば、健康診断を受診する者、すでにアルツハイマー病を発症している者、アルツハイマー病を発症している疑いがある者、アルツハイマー病を発症する危険性がある者（例えば、６５歳以上の高齢者）等が挙げられる。
【００５７】
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明は、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、前記被検者から採取した血液試料と、上述の診断薬とを接触させて、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する検出工程と、前記検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量と、アルツハイマー病の各進行度におけるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の基準値とを比較して、アルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、を備える方法を提供する。
【００５８】
本実施形態の診断方法によれば、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を簡便に診断することができる。また、本実施形態の診断方法は、低侵襲性の方法であることから、健康診断などで採取した血液試料を用いてアルツハイマー病患者をスクリーニングすることができ、従来の髄液の採取による診断方法よりも被検者の負担も少ない。
本実施形態の診断方法の各工程について、以下に詳細に説明する。
【００５９】
［検出工程］
まず、被検者から血液試料を採取する。血液試料としては、例えば、血液、血清、血漿等が挙げられる。中でも、本実施形態の診断方法で用いられる血液試料としては、余分な血球成分及び凝固因子を含まないことから、血清が好ましい。
【００６０】
次いで、採取した血液試料と、上述の診断薬とを接触させて、血液試料中の抗原（アミロイドβタンパク質の凝集体）と前記診断薬に含まれる前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとによる抗原抗体反応（以下、「１次抗原抗体反応」と称する場合がある。）を行う。この抗原抗体反応は、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの抗体価及び血液試料中の抗原（アミロイドβタンパク質の凝集体）の量によって、適宜調整することができる。
なお、本実施形態の診断方法において用いられる前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、上述の通り、粒子径５０ｎｍ以上２２０ｎｍ未満の非晶質のアミロイドβタンパク質（Ａβ）の凝集体のみに特異的に結合するものであって、単量体のＡβ及び繊維状のＡβには実質的に結合しないものであり、粒子径２２０ｎｍ以上の非晶質のＡβ凝集体への結合が弱いものである。
【００６１】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、上述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞の＜その他構成＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００６２】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体に、血液試料を滴下し、接触させればよい。また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を緩衝液等に懸濁し、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を含む溶液と、血液試料とを混合して接触させればよい。使用する緩衝液としては、上述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞の＜その他構成＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００６３】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに標識物質が結合したものを用いる場合、１次抗原抗体反応を検出してもよい。
また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントに結合した際に、センサー等により１次抗原抗体反応を検出してもよい。
検出感度及び反応特異性の観点から、２次抗体を用いて、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出することが好ましい。２次抗体を用いた場合の検出方法について、以下に詳細に説明する。
【００６４】
まず、１次抗原抗体反応後、血液試料を取り除き、洗浄する。この洗浄は、例えば、緩衝液等を用いて行えばよい。使用する緩衝液としては、上述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞の＜その他構成＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００６５】
次いで、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、２次抗体を接触させ、アミロイドβタンパク質の凝集体、又は前記モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントと２次抗体（前記モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントに標識物質が結合したもの、又は前記モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントに対する抗体に標識物質が結合したもの）とによる抗原抗体反応（以下、「２次抗原抗体反応」と称する場合がある。）を行う。２次抗原抗体反応についても、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、使用する２次抗体の抗体価によって、適宜調整することができる。
【００６６】
使用する２次抗体としては、上述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞の＜その他構成＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
また、使用する２次抗体は、例えば、緩衝液等を用いて溶解又は希釈して用いればよい。使用する緩衝液としては、上述の＜＜被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための診断薬＞＞の＜その他構成＞において例示したものと同様のものが挙げられる。
【００６７】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、２次抗体を含む溶液を滴下し、接触させればよい。また、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがビーズ、粒子等の支持体に固定されている場合、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが固定されている支持体を含む溶液と、２次抗体を含む溶液とを混合して接触させればよい。
【００６８】
また、２次抗原抗体反応後に、１次抗原抗体反応後と同様に洗浄を行ってもよい。また、２次抗体の標識物質が酵素である場合、酵素基質と接触させる工程、反応停止液を添加して反応を停止させる工程等をさらに備えていてもよい。
【００６９】
次いで、２次抗体を検出することにより、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出することができる。さらに、２次抗体を検出することにより、血液試料中に含まれるアミロイドβタンパク質の凝集体を定量することができ、定量されたアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度を検出量とすることができる。検出方法としては、標識物質の種類により、当業者が適宜選択することができる。例えば、標識物質が蛍光物質である２次抗体を検出する場合、蛍光スキャナー又は２光子励起スキャナー等により検出することができる。
【００７０】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントがマイクロタイタープレート、チューブ、スライドグラス又はチップ等の支持体に固定されている場合、検出機構やサンプル分注機構等の解析に必要な周辺装置と組み合わせることによって、全自動あるいは半自動の血液試料中のアミロイドβタンパク質の凝集体の検出システムとして提供することができる。この検出システムによれば、血液試料中に含まれるアミロイドβタンパク質の凝集体を全自動あるいは半自動で簡便に検出することができる。さらに、血液試料中に含まれるアミロイドβタンパク質の凝集体を定量することができ、アミロイドβタンパク質の凝集体の正確な血液中濃度を測定することができる。
【００７１】
［判断工程］
次いで、検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度を検出量として、アルツハイマー病の各進行度におけるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の基準値とを比較して、アルツハイマー病の進行度を判断する。
【００７２】
本実施形態の診断方法において、アルツハイマー病の各進行度におけるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の基準値は、年齢、性別及びブラークステージが異なる複数の被検者の血液試料を用いて、上述の検出工程を行い、アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度を測定する。ここで、ブラークステージの違いは、従来のＡβの凝集体に結合する放射性マーカーを患者に注射し、ＰＥＴで画像診断する方法や、髄液中のＡβの濃度を測定する方法を用いて判断すればよい。
次いで、測定された複数のアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度について、統計処理を行うことで、各年齢、性別及びブラークステージにおけるアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度の絶対値を算出し、これを基準値とする。  
【００７３】
よって、上述の検出工程を行い、測定されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量（血液中濃度）について、被検者の年齢、及び性別に応じた基準値と比較することで、被検者がいずれのブラークステージにあるかを判断することができる。
【００７４】
＜第二実施形態＞
一実施形態において、本発明は、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を診断するための方法であって、定期的に前記被検者から血液試料を採取し、前記血液試料と、上述の診断薬とを接触させ、アミロイドβタンパク質の凝集体を検出する定期検出工程と、前記定期検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の経時的な変化からアルツハイマー病の進行度を判断する判断工程と、を備える方法を提供する。
【００７５】
本実施形態の診断方法によれば、被検者におけるアルツハイマー病の進行度を簡便に診断することができる。さらに、本実施形態の診断方法は定期的に実施されるものであり、被検者におけるアルツハイマー病の発症を早期に診断することができ、また、すでにアルツハイマー病を発症している被検者におけるアルツハイマー病の進行度、及びアルツハイマー病の治療の効果を判断することができる。
本実施形態の診断方法の各工程について、以下に詳細に説明する。
【００７６】
［定期検出工程］
本実施形態の診断方法において、定期的に検出工程を行うこと以外は、上述の＜第一実施形態＞の［検出工程］と同様である。
検出工程を行う頻度としては、特別な限定はなく、例えば、年に１〜２回の健康診断において血液試料を採取する際に同時に行ってもよい。または、例えば、アルツハイマー病をすでに発症している被検者、又はアルツハイマー病を発症している恐れがある被検者である場合は、３〜４か月に１回程度であってもよい。
本実施形態の診断方法は、血液試料の採取により診断を行うことができるため、定期的な診断を要しても、従来の診断方法よりも被検者の負担が少ない。
【００７７】
［判断工程］
次いで、前記定期検出工程で検出されたアミロイドβタンパク質の凝集体の検出量の経時的な変化からアルツハイマー病の進行度を判断する。
例えば、アルツハイマー病を発症しておらず、ブラークステージ０の被検者、又はアルツハイマー病を発症している恐れがあり、ブラークステージが不明の被検者において、アミロイドβタンパク質の凝集体の検出量が経時的に増加した場合、アルツハイマー病を発症したと判断することができる。さらに、上述の＜第一実施形態＞における［判断工程］の基準値から、被検者がブラークステージＩ〜ＶＩのいずれのブラークステージにあるかを判断することができる。
また、例えば、アルツハイマー病をすでに発症しており、ブラークステージＩ〜ＩＩの被検者において、アミロイドβタンパク質の凝集体の検出量が経時的に増加した場合、ブラークステージがＩＩ〜ＩＩＩへ移行したと判断することができる。さらに、上述の＜第一実施形態＞における［判断工程］の基準値から、被検者がブラークステージＩＩ〜ＩＩＩのいずれのブラークステージにあるかを判断することができる。
また、例えば、アルツハイマー病をすでに発症しており、ブラークステージＩＩＩの被検者において、アミロイドβタンパク質の凝集体の検出量が経時的に減少した場合、ブラークステージがＩＶ以上へ移行したと判断することができる。さらに、上述の＜第一実施形態＞における［判断工程］の基準値から、被検者がブラークステージＩＶ〜ＶＩのいずれのブラークステージにあるかを判断することができる。
また、例えば、アルツハイマー病をすでに発症しており、ブラークステージＩ〜ＩＩの被検者において、アミロイドβタンパク質の凝集体の検出量が経時的に変化しない、又は減少した場合、ブラークステージが変わらず、アルツハイマー病の進行が抑えられていると判断することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７９】
［実施例１］
（１）モノクローナル抗体の作製
（１−１）抗原の作製
Ａβ１−４２（ＡｎｙＧｅｎ社製）を０．２２ｍＭとなるように１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに溶解し、４℃で１６時間静置、３７℃で３時間
静置したのち、減圧乾燥させた。次いで、この溶解と減圧乾燥の操作を２回繰り返し、水に溶解しやすい非晶質のナノ凝集体を作製した。作製したナノ凝集体には様々な大きさの凝集体が含まれているため、２２０ｎｍ、３００ｋＤａ（約５０ｎｍ）、及び１００ｋＤａのフィルターでろ過することによりサイズ分画を行った。
【００８０】
（１−２）ハイブリドーマの作製
（１−１）で作製した３００ｋＤａ（約５０ｎｍ）のＡβ１−４２ナノ凝集体０．１ｍｇを完全又は非完全フロイントアジュバントと混合し、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ、８週目、雌）に免疫した。免疫は、２週おきに３回行った。次いで、免疫したマウスの脾臓を摘出し、その細胞数の２割のマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を混合後、この混合細胞にＰＥＧ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）１ｍＬを１分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。次いで、１分間攪拌後、無血清培地ＦＣＳ３ｍＬを３分間かけて攪拌しながらゆっくり加えた。次いで、無血清培地１０ｍＬを３分間かけて攪拌しながらゆっくりと加えた。その後、５分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）を行い、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）により上清を捨てた。次いで、ＨＡＴ培地で希釈することで細胞を解して培養した。
【００８１】
（１−３）ハイブリドーマのスクリーニング
次いで、（１−２）で作製したハイブリドーマの培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法によりナノ凝集体に反応する抗体を産生する細胞のスクリーニングを行った。陽性が得られた細胞を限界希釈しハイブリドーマの単一化を行った。
ＥＬＩＳＡ法はＮｕｎｃイムノプレートマキシソープ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４℃、１６時間インキュベートしてＡβ１−４２ナノ凝集体を非共有結合で固定した。コントロールとして、２２０ｎｍ以上のナノ凝集体、マイクロ凝集体、繊維状のＡβ１−４２凝集体、及び単量体のＡβ１−４２を抗原として固定したものも準備した。次いで、ＰＢＳに０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を加えた溶液（ＰＢＳ−Ｔ）により洗浄を行った後、ブロッキングバッファー（イムノブロック、ＤＳファーマバイオメディカル社製）添加し、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、培養上清を添加し、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体としてＨＲＰを標識した抗マウスＩｇＧヤギ由来（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の説明に従って発色させ、４９２ｎｍで測定した。
【００８２】
（１−４）モノクローナル抗体の選別
ＥＬＩＳＡ法の結果から、３００ｋＤａ（約５０ｎｍ）のＡβ１−４２ナノ凝集体のみに高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリドーマを得た。得られた複数のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を精製した。次いで、精製したモノクローナル抗体と、アルツハイマー病を発症していない健常者１０名、及びアルツハイマー病を発症している患者１３名の血清とを用いて、ＥＬＩＳＡ法により、血清に含まれるＡβ１−４２ナノ凝集体に反応する抗体を選別した。結果を図１（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００８３】
図１（Ａ）〜（Ｄ）から、アルツハイマー病を発症していない健常者の血清とは反応せず、アルツハイマー病を発症している患者の血清と高い反応性を示すモノクローナル抗体として、抗体Ｄを選別した。
【００８４】
（２）死後血清を用いたＥＬＩＳＡ法によるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出試験
（２−１）検体の選定
統計処理を行うために、検体数の多いブラークステージ０〜ＶＩであった６６歳以上女性の死後血清約１０８検体を用いた。いずれの死後血清も死後４時間以上経過後に採取されたものであった。また、各検体のブラークステージは死後、脳切片を確認することで確定し、ブラークステージ０〜ＩＩＩに分類された検体数は７３、ブラークステージＩＶ以上に分類された検体数は３５であった。
【００８５】
（２−２）サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるアミロイドβタンパク質の凝集体の検出
Ｎｕｎｃイムノプレートマキシソープ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて４℃、１６時間インキュベートして（１）で選別した抗体Ｄを固定した。次いで、ＰＢＳ−Ｔにより洗浄を行った後、ブロッキングバッファー（イムノブロック、ＤＳファーマバイオメディカル社製）添加し、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、各死後血清を加え、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、１次抗体として（１）で選別した抗体Ｄを加え、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、抗体ＤＰＢＳ−Ｔで洗浄後、２次抗体としてＨＲＰを標識した抗マウスＩｇＧヤギ由来（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を加え、３７℃、２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ  ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の説明に従って発色させ、４９２ｎｍで測定した。各ブラークステージの死後血清における測定値を図２に示す。
【００８６】
図２から、ブラークステージＩ〜ＩＩＩにかけて測定値が増加し、ブラークステージＩＩＩからＩＶにかけて測定値が減少することが明らかとなった。これは、ブラークステージＩＩＩからＩＶにかけてアミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度の上昇に伴い、血管に前記アミロイドβタンパク質の凝集体が蓄積し、さらに、ブラークステージＩＩＩからＩＶにかけて血液脳関門がつぶれることで、前記アミロイドβタンパク質の凝集体が脳に蓄積し、前記アミロイドβタンパク質の凝集体の血液中濃度が下がるためであると推察された。
以上のことから、抗体Ｄを用いることで、被検者がブラークステージＩＩＩ以下、又はＩＶ以上であることを診断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、簡便且つ正確にアルツハイマー病の進行度を診断可能な診断薬を提供することができる。また、本発明の診断薬を用いたアルツハイマー病の進行度の診断方法によれば、低侵襲性であるため、健康診断等で採取した血清を用いて、簡便にアルツハイマー病のスクリーニングを行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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