(57)【要約】本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質およびポリメラーゼを提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示唆される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されたアーキアグロブス・ベネフィカスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを含む組成物。
【請求項２】
エンドヌクレアーゼが、配列番号：１を含むアミノ酸配列を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
エンドヌクレアーゼが、配列番号：２を含むＤＮＡ配列によりコードされる、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
請求項１記載の組成物を含むキット。
【請求項５】
キメラＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼを含む組成物であって、該キメラＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼが請求項１記載のエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含む、組成物。
【請求項６】
請求項５記載の組成物を含むキット。
【請求項７】
単離核酸配列を含む組成物であって、該核酸配列が請求項１記載のエンドヌクレアーゼをコードする、組成物。
【請求項８】
ベクターを含む組成物であって、該ベクターが請求項７記載の核酸配列を含む、組成物。
【請求項９】
宿主細胞を含む組成物であって、該宿主細胞が請求項８記載のベクターを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸配列を含むキット。
【請求項１１】
ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼがヒスチジンタグを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
以下の段階を含む、標的核酸を検出する方法：
ａ）標的核酸と共に切断構造を形成する段階；および
ｂ）該切断構造をアーキアグロブス・ベネフィカスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼに曝露する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。
【０００２】
発明の背景
特異的な核酸配列および配列の変異を検出および特徴付けるための方法は、感染を示すウイルスまたは細菌性の核酸配列の存在を検出するため、疾患および癌に関連する遺伝子の変種または対立遺伝子の存在を検出するために使用されている。これらの方法は、法医学的な分析または父子鑑定のためなどの、核酸起源の同定における適用も見出されている。
【０００３】
特定の核酸配列および配列の変種を検出および特徴付けるために、当技術分野において様々な方法が知られている。それにもかかわらず、ヒトゲノムおよび多くの病原性生物ゲノムの核酸配列決定の完了に伴い、特異的な核酸配列を検出するための、迅速で、信頼性が高く、費用効果性が高く、且つ使いやすい試験の必要性が依然として増加している。重要なことに、これらの試験は関心対象の配列のわずかに数コピーを含む試料から検出可能なシグナルを発生させることができなければならない。本発明は、改良された核酸検出方法のための、新規の構成要素を提供する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、核酸の切断および改変のための新規の切断物質を提供する。切断物質およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列の変異を検出および特徴付けするための使用が見出されている。いくつかの態様において、様々な酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、それによって、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列の変異の存在が示される。本発明は、臨床診断薬の目的を含むが、これらに制限されることはない様々な使用のための新規検出法の使用を意図する。
【０００５】
本発明は、複数の精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼである、精製された天然型のエンドヌクレアーゼおよび組換えエンドヌクレアーゼの両方を提供する。好ましい態様において、精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは、古細菌生物または真正細菌生物から得られる。特に好ましい態様において、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカス（Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ）から得られる。好ましい態様において、精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは約３９キロダルトンの分子量を有する。
【０００６】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。１つの態様において、本発明は、ＦＥＮ−１、ＸＰＧ、およびＲＡＤ相同体からなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラのエンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼに由来するアミノ酸部分を含む。
【０００７】
本発明はさらに、キメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、上記のキメラのエンドヌクレアーゼをコードする単離オリゴヌクレオチドを含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
【０００９】
これらの組換えベクターにより形質転換された宿主細胞もまた提供される。
【００１０】
本発明はまた、以下の段階を含む核酸を処理する方法を提供する：ａ）精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼおよび核酸基質を提供する段階；ｂ）基質が１つまたは複数の切断構造を形成するような条件下で、核酸基質を処理する段階；ならびにｃ）エンドヌクレアーゼと切断構造を反応させて、１つまたは複数の切断産物を作製する段階。いくつかの態様において、精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは、アーキアグロブス・ベネフィカスのＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼである。
【００１１】
本発明はさらに、アーキアグロブス・ベネフィカスのエンドヌクレアーゼと組み合わせて使用される、本明細書に記載の任意の組成物、混合物、方法、およびキットを提供する。これらには、生物に由来する精製されたＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ（本明細書に提供された配列によって記載される特定のエンドヌクレアーゼならびに変種および相同体を含む）を含む組成物、これらの組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼの少なくとも一部分を含むキメラのエンドヌクレアーゼを含む組成物、そのような組成物を含むキット、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物（ベクターおよび宿主細胞を含む）、そのような組成物を含むキット、エンドヌクレアーゼに対して産生される抗体、これらの生物に由来するエンドヌクレアーゼを含む混合物、切断アッセイ法においてエンドヌクレアーゼを使用する方法（例えば、侵襲的切断アッセイ法、ＣＦＬＰなど）、およびそのような方法に有用な構成要素を含むキットが含まれる。
【００１２】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、核酸切断アッセイ法において機能的改変（例えば、改良）が提供される非相同機能ドメインを含む酵素を含む組成物を提供する。本発明は、核酸切断アッセイ法の性質に制限されることはない。例えば核酸切断アッセイ法は、酵素の存在下で、核酸が直接または間接的に切断される任意のアッセイ法を含む。特定の好ましい態様において、核酸切断アッセイ法は、侵襲的切断アッセイ法である。特に好ましい態様において、切断アッセイ法には、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を有する切断構造が利用される。他の特に好ましい態様において、切断アッセイには少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を有する切断構造が利用され、切断構造のＤＮＡメンバーが切断される。
【００１３】
本発明は、非相同機能ドメインにより提供される機能的改変の性質によって制限されるものではない。例示的な改変には、非相同機能ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改良されたヌクレアーゼ活性、改良された基質結合活性、および／または改良されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列（例えば、１つまたは複数のアミノ酸）を含むような酵素が含まれるが、これらに制限されることはない。
【００１４】
本発明は非相同機能ドメインの性質によって制限されるものではない。例えばいくつかの態様において、非相同機能ドメインは、ポリメラーゼにおけるポリメラーゼドメインに由来する２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む（例えば、キメラ機能ドメインの挿入によって酵素に導入された、または突然変異によって生じた）。特定の好ましい態様において、２つまたはそれ以上のアミノ酸のうち少なくとも１つは、ポリメラーゼドメインのパーム（ｐａｌｍ）領域またはサム（ｔｈｕｍｂ）領域に由来する。本発明は、選択される２つまたはそれ以上のアミノ酸からポリメラーゼの同一性が制限されることはない。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼには、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のポリメラーゼが含まれる。
【００１５】
本発明の新規の酵素には、疾患もしくは他の状態に関連するか、または関連する可能性のあるヒト、他の動物、または植物を非制限的に含む、野生型遺伝子および変異型対立遺伝子を含む標的ＤＮＡおよびＲＮＡの検出が含まれるが、これらに制限されることはない。加えて、本発明の酵素を、細菌、真菌、原虫、繊毛虫、およびウイルスを含む微生物の株を検出および／または同定するため（および特にＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルスなどのＲＮＡゲノムを有するウイルスの検出および同定のため）に使用してもよい。例えば、本発明は、本発明の酵素および基質核酸を提供する段階；ならびに（例えば、検出されうる切断産物を作製するため）基質核酸を酵素に曝露する段階を含む、核酸を切断する方法を提供する。
【００１６】
発明の説明
本発明のヌクレアーゼの新規の特性は、特定の核酸配列を検出する方法の基礎となる。
【００１７】
本発明の方法における特に有用なＦＥＮ−１ヌクレアーゼには、アーキアグロブス・ベネフィカスが含まれる。
【００１８】
Ａｖｅ ＦＥＮ１ ＯＲＦ ＤＮＡ配列
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【００１９】
Ａｖｅ ＦＥＮ１タンパク質配列
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【００２０】
本発明は、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成するための手段、および特徴的な切断産物を放出するように核酸切断構造を切断するための手段を提供する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性は、標的依存性の切断構造を切断するために使用され、得られた切断産物により試料中の特異的な標的核酸配列の存在が示される。二本鎖の核酸またはオリゴヌクレオチドの場合、両者は、重複する侵襲性切断構造を形成するように標的核酸鎖とハイブリダイズし、以下に示すように、侵襲性切断が生じ得る。切断物質（例えば、５’ヌクレアーゼ）と上流のオリゴヌクレオチドとの相互作用により、切断物質は特徴的な断片を産生するような方法において、内部部位で下流のオリゴヌクレオチドを切断させることができる。このような態様は、ＩＮＶＡＤＥＲアッセイ法（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と呼ばれ、米国特許出願第５，８４６，７１７号、同第５，９８５，５５７号、同第５，９９４，０６９号、同第６，００１，５６７号、同第６，０９０，５４３号、国際公開公報第９７／２７２１４号、および国際公開公報第９８／４２８７３号に記載されている。
【００２１】
酵素の改良によって、１つまたは複数の種類の構造の切断率が増加もしくは減少しうる。また、改良により、１つまたは複数の切断構造においてより多数の切断部位またはより少数の切断部位が生じうる。核酸切断アッセイ法に使用するための新規の構造特異的ヌクレアーゼのライブラリーの開発において、改良には多くの異なる態様が含まれ、その各々は特定のアッセイ法に使用される特異的基質構造に関連する。
【００２２】
本発明はさらに、キメラ構造特異的ヌクレアーゼを提供する。好ましい態様において、キメラ構造特異的ヌクレアーゼは、５’ヌクレアーゼに由来する機能ドメイン（例えば、アーチ領域またはそれと物理的に関連する配列を含む酵素領域）を、他の酵素（例えば、他の５’ヌクレアーゼ）に由来するドメインと結合させたものを含む。いくつかの好ましい態様において、所与の機能ドメインは２つまたはそれ以上の酵素に由来する配列を含む。例えば、第１の構造特異的ヌクレアーゼの機能ドメインにおけるアミノ酸配列を、１つまたは複数のアミノ酸の位置で変化させ、機能ドメインまたはその一部を第２の構造特異的ヌクレアーゼの配列に改変し、それによって、第１における第２のヌクレアーゼの特徴付けがなされる。このような特徴付けには、触媒活性、特異性、および安定性（例えば、熱安定性）が含まれるが、これらに制限されることはない。
【００２３】
本発明のいくつかの態様は、本明細書に記載の酵素の変異体または変種の形態を提供する。切断率、基質特異性、安定性などを増強するなどの目的のため、本明細書に記載の酵素活性を有するペプチド構造を改変することができる。例えば、改変ペプチドは、アミノ酸配列をアミノ酸の置換、欠失、または付加などにより変化させて産生される。例えば、ロイシンからイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸からグルタミン酸、トレオニンからセリンへの単離された置換、またはアミノ酸から構造的に関連するアミノ酸への類似置換（即ち、保存的突然変異）は、得られた分子の生物活性に大きな作用を及ぼすことはないと考えられる。したがって、本発明のいくつかの態様は、保存的置換を含む本明細書に記載の酵素の変種を提供する。保存的置換は、アミノ酸側鎖の関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。遺伝子コードアミノ酸は、４つのファミリーに分けることができる：（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；および（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として両方に分類されることがある。同様の様式において、アミノ酸のレパートリーは以下のように分類されうる：（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、セリンおよびトレオニンは任意で別個に脂肪族−水酸基として分類される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；ならびに（６）含硫（システインおよびメチオニン）（ストライヤー（Ｓｔｒｙｅｒ）編、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２版、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． （１９８１）参照）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能相同体を生じるかどうかは、本明細書に記載のアッセイ法を使用して、野生型タンパク質と同様の様式で反応を生じる、変種ペプチドの能力を評価することによって、容易に決定することができる。複数の置換が生じたペプチドを同じ方法で容易に試験することができる。
【００２４】
本明細書において、「キメラタンパク質」および「キメラ性タンパク質」という用語は、２つまたはそれ以上の親タンパク質に由来するアミノ酸配列を含む単一のタンパク質分子を意味する。これらの親分子は、遺伝的に異なる起源に由来する類似のタンパク質、単一の生物に由来する異なるタンパク質、または異なる生物に由来するものであってもよい。例示の方法によって（これらの例示の方法によって制限されることはないが）、本発明のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、非天然型のヌクレアーゼを形成するように組み合わされた、ＦＥＮ−１遺伝子を有する２つまたはそれ以上の生物からのＦＥＮ−１遺伝子に由来したアミノ酸配列の混合物を含みうる。本明細書において、「キメラ」という用語は、天然型遺伝子から特定の割合のいかなる寄与を意味することも意図されることはなく、その部分が組み合わされる方法に制限されることもない。本明細書に記載の試験方法によって決定されるような切断活性を有する任意のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、本発明の範囲内の改良された切断物質である。
【００２５】
本明細書に使用される「融合タンパク質」という用語は、外因性タンパク質断片に結合した関心対象のタンパク質を含むキメラタンパク質を意味する。融合相手は、宿主細胞で発現されるように、組換えキメラタンパク質の溶解性を増強させてもよく、宿主細胞もしくは培養上清またはその両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするために、アフィニティータグ（例えばヒス−タグ）を付与してもよい。望ましい場合には、融合タンパク質は、当技術分野に公知の様々な酵素的手法または化学的手法によって、関心対象のタンパク質から分離してもよい。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005500821.tif 000876
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