(57)【要約】Ｇタンパク質共役（結合）レセプター関連ポリペプチドをコードする核酸配列が、本明細書中で開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、およびこのポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体の誘導体、改変体、変異体、またはフラグメントもまた、開示される。本発明はさらに、これらの新規なヒト核酸およびタンパク質のいずれか１つに関与する障害を診断、処置、および予防するための、治療方法、診断方法、および研究方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該成熟形態のアミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの改変体の、少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、該アミノ酸配列と、そのアミノ酸残基のうちの１５％以下において異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）  （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドで異なる、核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１つ以上のヌクレオチドで異なる、ヌクレオチド配列であって、ただし、該ヌクレオチドの２０％以下が、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）第１ヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１ヌクレオチド配列中のコード配列におけるヌクレオチドの２０％以下が、該コード配列と異なる、第１ヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１ポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２ポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、該核酸分子に結合するプローブと接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合した該プローブの存在または量を決定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸分子の存在または量が、細胞型または組織型についてのマーカーとして使用される、方法。
【請求項２１】
前記細胞型または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを該因子と接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が、細胞レセプターまたは下流エフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と該因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が、該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程、
を包含し、それによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該ポリペプチドの発現または活性を調節する該因子を示す、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルを、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で、該ポリペプチドに結合する化合物とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記障害が、心筋症およびアテローム硬化症からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＧＰＣＲＸ関連障害を処置または予防するに十分な量で、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記障害が糖尿病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が、細胞シグナルのプロセシングおよび代謝経路の調節に関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記被験体がヒトである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３８に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４２】
請求項３９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４３】
請求項４０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項４４】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドの変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの発現レベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有さないことが既知であるか、または該疾患に罹患しにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と、比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４５】
前記素因が癌に対するものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子の変化したレベルと関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプル中の該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、該疾患を有さないことが既知であるかまたは該疾患にかかりにくいことが既知の、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプルと比較した場合の該第１の被験体における該核酸のレベルにおける変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項４７】
前記素因が癌に対するものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理状態を緩和するに十分な量でポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性なフラグメントと、少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するに十分な量で請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択される嗅覚レセプターポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは改変体と相互作用する候補物質をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８の配列からなる群から選択されるポリペプチド、あるいはそのペプチドフラグメントまたは改変体を提供する工程；
ｂ）候補物質を得る工程；
ｃ）該ポリペプチドを、該候補物質と接触させる工程；ならびに
ｄ）該ポリペプチドと該候補物質との間で形成した複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択される嗅覚レセプターポリペプチドと相互作用するリガンド分子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え真核生物宿主細胞を提供する工程；
ｂ）該組換え真核生物宿主細胞の膜抽出物を調製する工程；
ｃ）工程ｂ）で調製した膜抽出物を、選択したリガンド分子と接触させる工程；ならびに
ｄ）セカンドメッセンジャー代謝産物の産生レベルを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択される嗅覚レセプターポリペプチドと相互作用するリガンド分子をスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスを提供する工程；
ｂ）嗅覚上皮に該アデノウイルスを感染させる工程；
ｃ）工程ｂ）の嗅覚上皮を、選択したリガンド分子と接触させる工程；ならびに
ｄ）該リガンド分子に対する応答の増加を検出する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、新規なＧＰＣＲ１、ＧＰＣＲ２、ＧＰＣＲ３、ＧＰＣＲ４、ＧＰＣＲ５、ＧＰＣＲ６、ＧＰＣＲ７、ＧＰＣＲ８、およびＧＰＣＲ９の核酸、ならびにそれによってコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、新規なポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、概して、核酸およびポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、新規なＧタンパク質共役型（結合）レセプター（ＧＰＣＲ）ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法に関する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規ポリペプチドをコードする核酸配列の発見に一部基づく。これらの新規核酸およびポリペプチドは、本明細書中でＧＰＣＲＸ、あるいはＧＰＣＲ１、ＧＰＣＲ２、ＧＰＣＲ３、ＧＰＣＲ４、ＧＰＣＲ５、ＧＰＣＲ６、ＧＰＣＲ７、ＧＰＣＲ８、およびＧＰＣＲ９の核酸およびポリペプチドと呼ばれる。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにそれらの誘導体、ホモログ、アナログおよびフラグメントは、本明細書中以降、まとめて、「ＧＰＣＲＸ」核酸またはポリペプチド配列と称する。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、ＧＰＣＲＸポリペプチドをコードする単離されたＧＰＣＲＸ核酸分子を提供し、これは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、このＧＰＣＲＸ核酸分子は、ＧＰＣＲＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＧＰＣＲＸポリペプチド、あるいはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする、単離された核酸を包含する。例えば、この核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードし得る。この核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＧＰＣＲＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドまたはそのオリゴヌクレオチドの相補体）もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
実質的に精製されたＧＰＣＲＸポリペプチド（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、このＧＰＣＲＸポリペプチドは、ヒトＧＰＣＲＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＧＰＣＲＸポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量または予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を包含する。この治療剤は、例えば、ＧＰＣＲＸ核酸、ＧＰＣＲＸポリペプチド、またはＧＰＣＲＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１以上の容器に、この薬学的組成物の治療有効量または予防有効量を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ポリペプチドを産生する方法を包含し、この方法は、ＧＰＣＲＸ核酸を含む細胞を、このＤＮＡによってコードされるＧＰＣＲＸポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養することによる。所望の場合、次いで、このＧＰＣＲＸポリペプチドを回収し得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＧＰＣＲＸポリペプチドの存在を検出する方法を包含する。この方法において、サンプルを、このポリペプチドに選択的に結合する化合物と、このポリペプチドとこの化合物との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる。この複合体は、存在するならば、検出され、それによって、このサンプル中のＧＰＣＲＸポリペプチドを同定する。
【００１１】
本発明はまた、ＧＰＣＲＸの発現に基づいて特定の細胞型または組織型を同定するための方法を包含する。
【００１２】
サンプル中のＧＰＣＲＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた本発明に包含され、この方法は、このサンプルに、ＧＰＣＲＸ核酸プローブまたはプライマーを接触させ、そしてこの核酸プローブまたはプライマーが、このサンプル中のＧＰＣＲＸ核酸分子に結合したか否かを検出するによる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＧＰＣＲＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供し、この方法は、このＧＰＣＲＸポリペプチドを含む細胞サンプルに、このＧＰＣＲＸポリペプチドに結合する化合物を、このポリペプチドの活性を調節するに十分な量で接触させることによる。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるような、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖質、脂質または他の有機分子（炭素含有）または無機分子）であり得る。
【００１４】
例えば、以下を含む障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における治療剤の使用もまた、本発明の範囲内にある：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、るいそう障害（慢性疾患、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害および造血障害に関連する）、または細胞シグナル伝達プロセシングおよび代謝経路調節に関連する他の障害。治療剤は、例えば、ＧＰＣＲＸ核酸、ＧＰＣＲＸポリペプチド、またはＧＰＣＲＸ特異的抗体、あるいはそれらの生物学的に活性な誘導体またはフラグメントであり得る。
【００１５】
例えば、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に対する効力を有する：発生疾患、ＭＨＣＩＩおよびＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚および嗅覚の検出能の障害、バーキットリンパ腫、皮質神経性（ｃｏｒｔｉｃｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ）疾患、シグナル伝達経路障害、網膜疾患（光受容性に関連する疾患を含む）、細胞増殖速度障害；細胞形状障害、摂食障害；摂食の制御；過食に起因する潜在的肥満；飢餓（食欲の損失）に起因する潜在的障害、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌、真菌、原生生物およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ぜん息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神学的および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁鬱、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低リン酸血症性くる病、常染色体優性（２）先端脳梁（Ａｃｒｏｃａｌｌｏｓａｌ）症候群およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）ならびに／または他の病態および障害など。
【００１６】
ポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＧＰＣＲＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＧＰＣＲＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に対する効力を有する：細菌、真菌、原生生物およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、ぜん息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神学的および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁鬱、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群））、ならびに／または他の病態および障害。
【００１７】
本発明はさらに、例えば、以下を含む障害または症候群のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を包含する：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、るいそう障害（慢性疾患、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害および造血障害に関連する）、細胞シグナル伝達プロセシングおよび代謝経路調節に関連する他の障害。この方法は、試験化合物にＧＰＣＲＸポリペプチドを接触させる工程、およびこの試験化合物がこのＧＰＣＲＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。ＧＰＣＲＸポリペプチドへの試験化合物の結合は、この試験化合物が、前述の障害または症候群に対する活性あるいは前述の障害または症候群に対する潜在性または素因のモジュレーターであることを示す。
【００１８】
また、本発明の範囲には、以下を含む障害もしくは症候群の活性のモジュレーター、または以下を含む障害もしくは症候群の潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝異常症候群Ｘ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、食欲不振、慢性病に関連する消耗障害（るいそう障害）、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌に関連した悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または、細胞シグナル伝達プロセシングおよび代謝経路調節に関連した他の障害。このスクリーニング方法は、上述の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによる。試験動物は、ＧＰＣＲＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＧＰＣＲＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＧＰＣＲＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についても危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＧＰＣＲＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＧＰＣＲＸポリペプチドの活性の変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＧＰＣＲＸポリペプチド、ＧＰＣＲＸ核酸またはその両方のレベルの改変に関連した疾患の存在または素因を決定する方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中におけるＧＰＣＲＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中において存在するＧＰＣＲＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中におけるこのポリペプチドの量を比較する工程、を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＧＰＣＲＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、以下の素因が挙げられる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝異常症候群Ｘ、食欲不振、慢性病に関連する消耗障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌に関連した悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングするための方法および癌の病期を決定するための方法において使用され得る。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量において、被験体（例えば、ヒト被験体）にＧＰＣＲＸポリペプチド、ＧＰＣＲＸ核酸、またはＧＰＣＲＸ特異的抗体を投与することによって、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、以下が挙げられる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝異常症候群Ｘ、食欲不振、慢性病に関連する消耗障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌に関連した悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害。
【００２１】
なお別の局面では、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法において使用され得る。これらの技術としては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、本明細書中において参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書中が制御する。さらに、物質、方法および例は、例示のみであり、限定されることを意図されない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部、新規なポリペプチドをコードする新規な核酸配列の発見に基づく。この新規な核酸およびそれによりコードされるポリペプチドを、個々に、ＧＰＣＲ１、ＧＰＣＲ２、ＧＰＣＲ３、ＧＰＣＲ４、ＧＰＣＲ５、ＧＰＣＲ６、ＧＰＣＲ７、ＧＰＣＲ８、およびＧＰＣＲ９という。これらの核酸およびこれらによってコードされるポリペプチドを、本明細書中では集合的に、「ＧＰＣＲＸ」と称する。
【００２５】
本発明の新規なＧＰＣＲＸ核酸は、表１Ａ、２Ａ、２Ｃ、３Ａ、４Ａ、４Ｃ、４Ｅ、５Ａ、５Ｃ、６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、７Ａ、７Ｃ、８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｇ、および９Ａまでのすべてを含んだ中から配列が提供される核酸、それらのフラグメント、誘導体、アナログまたはホモログを含む。本発明の新規なＧＰＣＲＸタンパク質は、表１Ｂ、２Ｂ、２Ｄ、３Ｂ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ、５Ｂ、５Ｄ、６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、６Ｈ、７Ｂ、７Ｄ、８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈ、および９Ｂまでのすべてを含んだ中から配列が提供されるタンパク質フラグメントを含む。個々のＧＰＣＲＸ核酸およびタンパク質を、以下に記載する。細胞のシグナル伝達または代謝経路調節に関連した障害の処置または予防において、これらの核酸およびペプチドを使用する方法は、本発明の範囲内である。
【００２６】
本発明のＧＰＣＲＸタンパク質は、７ｔｍ＿１ドメイン（ＰＦａｍ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ｐｆａｍ００００１）に対して高い相同性を有する。この７ｔｍ＿１ドメインは、７回膜貫通レセプターファミリー由来である。この７回膜貫通レセプターファミリーは、多くの異なるタンパク質（例えば、セロトニンレセプター、ドーパミンレセプター、ヒスタミンレセプター、アドレナリン作動性レセプター、カンナビノイドレセプター、アンギオテンシンＩＩレセプター、ケモカインレセプター、オピオイドレセプター、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）タンパク質、嗅覚レセプター（ＯＲ）などを含む）を含む。いくつかのタンパク質およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  Ｉｄｓ／ｇｅｎｅ  ｉｎｄｅｘｅｓは、例えば、以下を含む：ロドプシン（１２９２０９）；５−ヒドロキシトリプタミンレセプター；（１１２８２１、８４８８９６０、１１２８０５、２３１４５４、１１６８２２１、３９８９７１、１１２８０６）；Ｇタンパク質結合レセプター（１１９１３０、５４３８２３、１７３０１４３、１３２２０６、１３７１５９、６１３６１５３、４１６９２６、１１６９８８１、１３６８８２、１３４０７９）；味覚レセプター（５４４４６３、４６２２０８）；ｃ−ｘ−ｃケモカインレセプター（４１６７１８、１２８９９９、４１６８０２、５４８７０３、１３５２３３５）；オプシン（１２９１９３、１２９１９７、１２９２０３）；および聴覚レセプター様タンパク質（１２９０９１、１１７１８９３、４００６７２、５４８４１７）。
【００２７】
ＧＰＣＲＸファミリーのメンバー内での密接な相同性のおかげで、このファミリーのいずれか１つのメンバーと相同性であるタンパク質はまた、その配列が以下に示されるように異なる場合を除いて、他のメンバーとかなり相同性である。
【００２８】
本明細書に開示されたＧＰＣＲＸのタンパク質および核酸についての類似性情報によって、ＧＰＣＲ１−ＧＰＣＲ９が、嗅覚レセプター（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリーおよびＧＰＣＲファミリーの重要な構造的および／または生理学的機能の特徴を有し得ることを示唆する。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において有用であり、そして検索ツールとして有用である。これらは、特定のまたは選択的な核酸またはタンパク質の診断および／または予防マーカーとして機能すること（ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用を含む：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビボおよびインビトロで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御武器。
【００２９】
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）は、多数の種における、Ｇタンパク質共役型レセプターの大きなファミリーとして同定された。これらのレセプターは、多くの神経伝達物質レセプターおよびホルモンレセプターと、７回膜貫通ドメイン構造を共有し、そして種々のシグナルの認識およびＧタンパク質媒介性変換の根底をなすようである。ヒトＧＰＣＲは、一般的に、イントロンを含まず、そして高い配列可変性を示す４つの異なる遺伝子サブファミリーに属する。これらの遺伝子は、優先的に、嗅覚上皮において発現される。例えば、Ｂｅｎ−Ａｒｉｅら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９４  ３：２２９−２３５；およびＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）エントリー番号１６４３４２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｄｉｓｐｏｍｉｍ．ｃｇｉ．）を参照のこと。
嗅覚レセプター（ＯＲ）遺伝子ファミリーは、最大のＧＰＣＲ多重遺伝子ファミリーの１つを構成し、そしてヒトゲノムにおける多くの染色体部位の中に分散されている。Ｒｏｕｑｕｉｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７（９）：１３３７−４５（１９９８）；Ｍａｌｎｉｃら、Ｃｅｌｌ  ９６：７１３−２３（１９９９）を参照のこと。嗅覚レセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプターの中でも最大のファミリーを構成し、推定上１０００までものメンバーを有する。Ｖａｎｄｅｒｈａｅｇｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３９（３）：２３９−４６（１９９７）；Ｘｉｅら、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １１（１２）：１０７０−７８（２０００）；Ｉｓｓｅｌ−Ｔａｒｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２０）：１０８９７−９０２（１９９６）を参照のこと。嗅覚レセプターによる臭気物質の認識は、臭気の識別における最初の段階である。Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔら、Ｃｅｌｌ  ９５（７）：９１７−２６（１９９８）；Ｂｕｃｋら、Ｃｅｌｌ  ６５（１）：１７５−８７（１９９１）を参照のこと。多くのＯＲは、いくつかの特徴的な配列モチーフを共有し、そして推定リガンド結合部位に対応する中心可変領域を有する。Ｉｓｓｅｌ−Ｔａｒｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０８９７−９０２（１９９６）を参照のこと。
【００３０】
ＧＰＣＲに関連した７回膜を貫通するタンパク質の他の例は、化学受容体である。Ｔｈｏｍａｓら、Ｇｅｎｅ  １７８（１−２）：１−５（１９９６）を参照のこと。化学受容体は、味覚組織、嗅覚組織、および雄性生殖組織において同定された。同上；Ｗａｌｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１６）：９３７８−８７（１９９８）；Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５（６３５９）：４５３−５５（１９９２）；Ａｓａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２１（２）：２４０−４７（１９９６）を参照のこと。
【００３１】
ＧＰＣＲＸの核酸およびタンパク質は、以下にさらに記載される種々のＧＰＣＲに関連した病理的障害および／またはＯＲ関連病理障害において意図される可能性のある治療的適用において有用である。例えば、ＧＰＣＲ（または嗅覚レセプター）様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてレセプター様タンパク質は、投与の必要な被験体に投与された場合有用であり得る。本発明の核酸およびタンパク質はまた、以下の処置において用いた可能性のある治療適用において有用である：発生障害、ＭＨＣ  ＩＩおよびＭＨＣ  ＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚および嗅覚検知障害、バーキットリンパ腫、コルチコ神経性疾患（ｃｏｒｔｉｃｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、シグナル伝達経路障害、光受容体に関連する疾患を含む網膜疾患、細胞増殖速度障害；細胞形状障害、栄養補給障害；過食に起因する潜在的な肥満；飢餓（食欲の欠如）に起因する潜在的な障害、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌感染、真菌感染、原性生物感染、ウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって発生する特定の感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫、前立腺癌；子宮癌が挙げられるが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、アレルギー、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿貯留、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、良性前立腺肥大、精神病学的障害および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆、および重篤な精神遅滞を含む）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低ホスファターゼ血症くる病、常染色体優性（２）脳梁先端症候群およびジスキネジア（例えば、ハンティングトン病もしくはジル・ド・ラ・ツレット症候群）、ならびに／あるいは他の病態および障害。他のＧＰＣＲ関連疾患および障害が意図される。
【００３２】
このポリペプチドは、免疫原として使用され得、本発明に特異的な抗体を、ワクチンとして産生し得る。これらをまた使用して、強力なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物をスクリーニングし得る。例えば、ＧＰＣＲ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＧＰＣＲ様タンパク質は、それを必要とする被験体に対して投与される場合に有用であり得る。実施例を限定するのではなく、本発明の組成物は、以下を患った患者の処置に効果を有する：発生障害、ＭＨＣ  ＩＩおよびＭＨＣ  ＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚および嗅覚検知障害、バーキットリンパ腫、コルチコ神経性疾患（ｃｏｒｔｉｃｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、シグナル伝達経路障害、光受容体に関連する疾患を含む網膜疾患、細胞増殖速度障害；細胞形状障害、栄養補給障害；過食に起因する潜在的な肥満；飢餓（食欲の欠如）に起因する潜在的な障害、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌感染、真菌感染、原性生物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって発生する感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫、前立腺癌；子宮癌が挙げられるが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、アレルギー、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿貯留、骨粗しょう症、クローン病、多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、良性前立腺肥大、精神学的障害および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁うつ病、せん妄、痴呆、および重篤な精神遅滞を含む）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低ホスファターゼ血症くる病、常染色体優性（２）脳梁先端症候群およびジスキネジア（例えば、ハンティングトン病もしくはジル・ド・ラ・ツレット症候群）、ならびに／あるいは他の病態および障害。本発明の新規のＧＰＣＲ様タンパク質をコードする核酸、およびＧＰＣＲ様タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得る。ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの材料は、治療方法または診断方法における使用のために、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。
【００３３】
（ＧＰＣＲ１）
開示された新規なＧＰＣＲ１（本明細書においては、あるいはＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ａと呼ばれる）は、表１Ａに示される９６８のヌクレオチド配列（配列番号１）を含む。ＧＰＣＲ１  ＯＲＦは、ヌクレオチド３〜５のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９５１〜９５３のＴＧＡコドンで終わる。表１Ａにおいて、開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【００３４】
【表１Ａ】
2005500802.tif 000002
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書においてＧＰＣＲ１と呼ばれる）は、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（嗅覚レセプター）（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ１タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【００３５】
配列番号１によってコードされたＧＰＣＲ１ポリペプチド（配列番号２）は、３１６アミノ酸長であり、３５１８３．４ダルトンの分子量を有し、これを表１Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ１のＰｓｏｒｔプロフィールによって、これらの配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ１ポリペプチドは、０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３００の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．３００の信頼度で微小体（ペルオキシソーム）に局在化する。このＳｉｇｎａｌ  Ｐによって、ＧＰＣＲ１ペプチドの可能性の高い切断部位が、５４位置と５５位置との間（すなわち、配列ＩＳＳ−ＤＰにおけるダッシュ）であることが予測される。
【００３６】
【表１Ｂ】
2005500802.tif 000003
ＧＰＣＲ１のアミノ酸配列は、表１Ｃに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【００３７】
【表１Ｃ】
2005500802.tif 000004
さらなるＢＬＡＳＴＰの結果を表１Ｄに示す。
【００３８】
【表１Ｄ】
2005500802.tif 000005
マルチプル配列アライメントを表１Ｅに示す。ここでは、表１Ｄに開示された関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ１を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ１タンパク質が、１行目に示される。
【００３９】
【表１Ｅ】
2005500802.tif 000006
2005500802.tif 000007
本明細書に開示されたタンパク質における同定可能なドメインの存在を、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを用いた検索によって、次いでＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を用いてドメインマッチ（または数）をクロスすることによってＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって決定した。
【００４０】
（ＤＯＭＡＩＮ（ドメイン））
この結果は、ＧＰＣＲ１タンパク質が、（Ｉｎｔｅｒｐｒｏによって規定される場合）以下のタンパク質ドメインを含むことを示す：ドメイン名７ｔｍ＿１７膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）。ＧＰＣＲ１についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションにおいて見出したドメインをサンプリングした。
【００４１】
以下に考察するように、本発明の全てのＧＰＣＲＸタンパク質は、７ｔｍ＿１ドメインに対して有意な相同性を含む。このことは、ＧＰＣＲＸ配列が、この７ｔｍ＿１ドメインを含むことが公知の他のタンパク質の配列と類似の特性を有し、かつこれらのドメインの特性に対して類似の特性を有することを示す。７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）である、７ｔｍ＿１と名付けられた２５４のアミノ酸ドメイン（配列番号３９）を表１Ｆに示す。
【００４２】
【表１Ｆ】
2005500802.tif 000008
コードされたＧＰＣＲ１ポリペプチドを、以下の表１Ｇに示されたサインコンセンサス配列（配列番号４０）の存在に起因してＧタンパク質レセプターファミリーのメンバーとして同定された。
【００４３】
【表１Ｇ】
2005500802.tif 000009
表１Ｈは、ＧＰＣＲ１に対するＤＯＭＡＩＮ分析結果からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＧＰＣＲ１配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の配列と類似の特性を有し、かつ２５４アミノ酸の７ｔｍドメイン（配列番号３９）と類似の特性を有することを示す。表１Ｈおよび全ての連続的ＤＯＭＡＩＮ配列アラインメントについて、完全に保存された単一の残基を、黒い影付きで示し、そして「強力な」半保存残基を、灰色の影付きで示す。保存されたアミノ酸残基の「強力な」基は、以下の基のアミノ酸のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００４４】
ＤＯＭＡＩＮの結果を、統計値およびドメインの説明を伴って、表１Ｈに列挙する。全７ｔｍ＿１ドメイン残基１〜２５４（配列番号３９）とＧＰＣＲ１残基４１〜２９０（配列番号２）の整列（アラインメント）を表１Ｈに示す。
【００４５】
【表１Ｈ】
2005500802.tif 000010
2005500802.tif 000011
ＧＰＣＲ１の核酸およびタンパク質は、本明細書にさらに記載されるような、種々のＧＰＣＲ関連の病理的障害および／または嗅覚レセプター（ＯＲ）関連の病状に関係した潜在的な治療適用において有用である。
【００４６】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質、またはそのフラグメントをコードする新規な核酸は、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ１タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されたＧＰＣＲ１エピトープは、アミノ酸約１５〜２５である。別の実施形態において、ＧＰＣＲ１エピトープは、アミノ酸約１２５〜１３５である。さらなる特定の実施形態において、ＧＰＣＲ１エピトープは、アミノ酸約２３５〜２４５、アミノ酸約２５８〜２７５、そしてアミノ酸約２８５〜３１６である。
【００４７】
（ＧＰＣＲ２）
本発明の第二のＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ２と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ２タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【００４８】
２つの別の新規なＧＰＣＲ２核酸およびコードされたポリペプチド（ＧＰＣＲ２ａおよびＧＰＣＲ２ｂと名付けられた）が提供される。
【００４９】
（ＧＰＣＲ２ａ）
１つの実施形態において、ＧＰＣＲ２改変体は、新規なＧＰＣＲ２ａ（本明細書においては、あるいは、ＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｂと呼ばれる）は、表２Ａに示される１０３４のヌクレオチド配列（配列番号３）を含む。ＧＰＣＲ２  ＯＲＦは、ヌクレオチド１５〜１７のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９４５〜９４７のＴＡＡコドンで終わる。表２Ａにおいて、開始コドンの上流の推定非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【００５０】
【表２Ａ】
2005500802.tif 000012
ＧＰＣＲ２ａの配列を、この配列のインシリコ予測によって、ｃＤＮＡフラグメントの実験的クローニングによって誘導する。ＤＮＡ配列の全長、もしくはこの配列の一部のいずれか、またはその両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントをクローニングした。インシリコの予測は、ＣｕｒａＧｅｎの独自の配列データベースにおいて、または公的なヒト配列データベース利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列、またはその一部のいずれかを提供した。
【００５１】
ＧＰＣＲ２ａ配列をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長または一部（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づいてプライマーを設計した。新規な嗅覚レセプター様遺伝子のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、エキソン連結によって得、そしてここでＧＰＣＲ２ａとして報告した。ＧＰＣＲ２ａ  ｃＤＮＡを増幅するために用いたこれらのプライマーおよび方法を、実施例中に記載する。
【００５２】
配列番号３によってコードされたＧＰＣＲ２ａポリペプチド（配列番号４）は、３１０アミノ酸長であり、３５３２９．７ダルトンの分子量を有し、これを表１Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ２ａおよびＧＰＣＲ２ｂの両方についてのＰｓｏｒｔプロフィールによって、これらの配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ２ポリペプチドは、０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３８２８の信頼度でミトコンドリア内膜に局在化するか、または０．３５６５の信頼度でミトコンドリア膜間腔に局在化する。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐによって、ＧＰＣＲ２ペプチドの可能性の高い切断部位が、４８位置と４９位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＲにおけるダッシュ）であることが予測される。
【００５３】
【表２Ｂ】
2005500802.tif 000013
（ＧＰＣＲ２ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ２改変体は、新規なＧＰＣＲ２ｂ（本明細書においてはあるいは、ＣＧ５６５８２−０１と呼ばれる）は、表２Ｃに示される１０１１のヌクレオチド配列（配列番号５）を含む。ＧＰＣＲ２ｂのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、エキソン連結プロセスによってのみ得られた。ＧＰＣＲ２ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド２５〜２７のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９５５〜９５７のＴＡＡコドン（表２Ｃにおいて、太字にしている）で終わる。
【００５４】
【表２Ｃ】
2005500802.tif 000014
配列番号５によってコードされたＧＰＣＲ２ｂタンパク質（配列番号６）は、３１０アミノ酸長であり、３５３１４．３５ダルトンの分子量を有し、これを表２Ｄにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ２ａと同様、ＧＰＣＲ２ｂペプチドの最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、４８アミノ酸位置と４９アミノ酸位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＲにおけるダッシュ）である。
【００５５】
【表２Ｄ】
2005500802.tif 000015
（ＧＰＣＲ２のクローン）
ＧＰＣＲ２ａまたはＧＰＣＲ２ｂとして特に取り組まない限り、ＧＰＣＲ２に対するいずれの言及も、全ての改変体を包含すると想定される。本明細書における任意のＧＰＣＲＸ改変体の間の残基の差異を記して、「ａ」改変体における残基、「ａ」改変体に関する残基位置、および「ｂ」改変体における残基を示す。
【００５６】
ＧＰＣＲ２のアミノ酸配列は、表２Ｅに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【００５７】
【表２Ｅ】
2005500802.tif 000016
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ２の核酸配列が、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＯＬＦＰＲＯＣ｜ａｃｃ：Ｍ６４３７７．１  ｍＲＮＡ（Ｒａｔ嗅覚タンパク質ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して９４２塩基のうち６２０塩基（６５％）の同一性を有することが見出された。ＧＰＣＲ２タンパク質の全アミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｒａｔ）由来の３１３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２３２６６タンパク質（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｆ５）に対して、３０５アミノ酸残基中１６５アミノ酸残基（５４％）の同一性、および３０５アミノ酸残基中２２４アミノ酸残基（７３％）の類似性を有することが見出された。
【００５８】
さらなるＢＬＡＳＴＰの結果を表２Ｆに示す。
【００５９】
【表２Ｆ】
2005500802.tif 000017
2005500802.tif 000018
マルチプル配列アライメントを表２Ｇに示す。ここでは、表２Ｆの関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ２を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ２タンパク質が、１行目および２行目に示されている。ＧＰＣＲ２ａとＧＰＣＲ２ｂとの間で異なる残基に（ｏ）の印をつけた。
【００６０】
【表２Ｇ】
2005500802.tif 000019
2005500802.tif 000020
ＧＰＣＲ２についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴサンプルドメインは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションにおいて見出した。この結果を、統計値およびドメインの説明とともに表２Ｈに列挙する。７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）である、７ｔｍ＿１は、ＧＰＣＲ２に対して有意な相同性を有することが示された。７ｔｍ＿１残基１〜２５４（配列番号３９）とのＧＰＣＲ２残基４１〜２９０（配列番号４）の整列（アラインメント）を、表２Ｈに示す。
【００６１】
【表２Ｈ】
2005500802.tif 000021
2005500802.tif 000022
本発明において開示されたＧＰＣＲ２は、少なくとも以下の組織において発現される：網膜色素上皮の先端の微絨毛、動脈（大動脈）、基底前脳、脳、バーキットリンパ腫細胞株、脳梁、心（心房および心室）、尾状核、ＣＮＳおよび末梢組織、小脳、大脳皮質、結腸、皮質神経細胞、内皮（冠状動脈および臍静脈）細胞、口蓋上皮、眼、新生児眼、前頭皮質、胎児造血細胞、心臓、海馬、視床下部、白血球、肝臓、胎児肝臓、肺、肺リンパ腫細胞株、胎児リンパ様組織、成人リンパ様組織、ＭＨＣＩＩおよびＩＩＩを発現する組織、神経組織、髄質、視床下核、卵巣、膵臓、下垂体、胎盤、橋、前立腺、被殻、血清、骨格筋、小腸、平滑筋（大動脈中の冠状動脈）、脊髄、脾臓、胃、舌の味覚レセプター細胞、精巣、視床、および胸腺組織。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公のＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むが、これらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、導かれる。これは、嗅覚レセプターが、全ての組織型において発現されることが公知であるクラスのＧタンパク質結合レセプターであるという点で限定されない。さらなる組織発現分析を実施例中に提供する。
【００６２】
ＧＰＣＲ２の核酸およびタンパク質は、上にさらに記載されるような、種々のＧＰＣＲ関連の病状および／または嗅覚レセプター（ＯＲ）関連の病状に関係した潜在的な治療適用において有用である。
【００６３】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質、またはそのフラグメントをコードする新規な核酸は、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ２タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されたＧＰＣＲ２エピトープは、アミノ酸約５〜２５である。他の実施形態において、ＧＰＣＲ２エピトープは、アミノ酸約８５〜９５、アミノ酸約１８０〜１９５、アミノ酸約２３０〜２４０、アミノ酸約２５５〜２７０、そしてアミノ酸約２８５〜３１０である。
【００６４】
（ＧＰＣＲ３）
本発明の第三のＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ３と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ３タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【００６５】
開示された新規なＧＰＣＲ３（本明細書においては、あるいはＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｃと呼ばれる）は、表３Ａに示される９８１のヌクレオチド配列（配列番号７）を含む。ＧＰＣＲ３  ＯＲＦは、ヌクレオチド１５〜１７のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９６９〜９７１のＴＧＡコドンで終わる。表３Ａにおいて、開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【００６６】
【表３Ａ】
2005500802.tif 000023
配列番号７によってコードされるＧＰＣＲ３タンパク質（配列番号８）は、３１８アミノ酸長であり、３５２９２．３ダルトンの分子量を有し、これを表３Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ３のＰｓｏｒｔプロフィールによって、これらの配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６４０の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ３ポリペプチドは、０．４６０の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３７０の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．１００の信頼度で小胞体（内腔）に局在化する。このＳｉｇｎａｌ  Ｐによって、ＧＰＣＲ３ペプチドの可能性の高い切断部位が、４３位置と４４位置との間（すなわち、配列ＩＬＧ−ＮＶにおけるダッシュ）であることが予測される。
【００６７】
【表３Ｂ】
2005500802.tif 000024
ＧＰＣＲ３のアミノ酸配列は、表３Ｃに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【００６８】
【表３Ｃ】
2005500802.tif 000025
ＧＰＣＲ３はまた、表３ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質に対して相同性を有する。
【００６９】
【表３Ｄ】
2005500802.tif 000026
マルチプル配列アライメントを表３Ｅに示す。ここでは、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、ＧＰＣＲ３タンパク質が、表３Ｅの１行目に示されており、そして表３Ｄに示された関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ３を比較している。このＢＬＡＳＴＰデータは、表３ＥにおけるＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示される。
【００７０】
【表３Ｅ】
2005500802.tif 000027
2005500802.tif 000028
表３Ｆは、ＧＰＣＲ３に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの詳細を列挙する。このことは、ＧＰＣＲ３配列が２５４アミノ酸の７ｔｍドメイン（配列番号３９）自体に対してと同様に、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性に対して類似の特性を有することを示す。
【００７１】
【表３Ｆ】
2005500802.tif 000029
ＧＰＣＲ３の核酸およびタンパク質は、上記にさらに記載している、種々のＧＰＣＲ関連病状（病態）および／またはＯＲ関病状において意図される潜在的な治療適用において有用である。
【００７２】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質をコードする新規な核酸、またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、企図されたＧＰＣＲ３エピトープは、アミノ酸約５〜２５である。別の実施形態において、ＧＰＣＲ３エピトープは、アミノ酸約５５〜６５である。さらなる特定の実施形態において、ＧＰＣＲ３エピトープは、アミノ酸約１７０〜２００、アミノ酸約２３５〜２５０、アミノ酸約２６０〜２８０、そしてアミノ酸約２９０〜３１８である。
【００７３】
（ＧＰＣＲ４）
本発明のさらなるＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書においては、ＧＰＣＲ４と呼ばれる）は、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（嗅覚レセプター）（「ＯＲ」）様タンパク質である。新規なＧＰＣＲ４核酸配列が、実施例１に記載されるように第１１染色体上で同定された。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ４タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【００７４】
３つの別の新規なＧＰＣＲ４核酸およびコードされたポリペプチド（すなわち、ＧＰＣＲ４ａ、ＧＰＣＲ４ｂ、およびＧＰＣＲ４ｃ）が提供される。
【００７５】
（ＧＰＣＲ４ａ）
１つの実施形態において、ＧＰＣＲ４改変体は、新規なＧＰＣＲ４ａ（あるいは、本明細書においてＣＧ５５９４０−０１と呼ばれる）であり、これは表４Ａに示される１０２１のヌクレオチド配列（配列番号９）を含む。ＧＰＣＲ４ａ  ＯＲＦは、ヌクレオチド４４〜４６のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９７７〜９７９のＴＡＧコドンで終わる。表６Ａにおいて、開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【００７６】
【表４Ａ】
2005500802.tif 000030
配列番号９によってコードされたＧＰＣＲ４タンパク質（配列番号１０）は、３１１アミノ酸残基を有し、そしてこれを表４Ｂにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ４タンパク質の推定分子量は、約３４６３８．２９ダルトンである。ＧＰＣＲ４についてのＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ４は、０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３００の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．３００の信頼度で微小体（ペルオキシソーム）に局在化する。このＳｉｇｎａｌ  Ｐによって、可能性の高い切断部位が、４６位置と４７位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＧにおけるダッシュ）であることが予測される。
【００７７】
ＧＰＣＲ４ａのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、実施例１に記載のようにエキソン連結によって得た。
【００７８】
【表４Ｂ】
2005500802.tif 000031
（ＧＰＣＲ４ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ４改変体は、新規なＧＰＣＲ４ｂ（あるいは、本明細書において、ＣＧ５５９４０−０２と呼ばれる）であり、これは、表４Ｃに示される１０２１のヌクレオチド配列（配列番号１１）を含む。ＧＰＣＲ１ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド４４〜４６のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９７７〜９７９のＴＡＧコドン（表４Ｃにおいて、太字にしている）で終わる。
【００７９】
【表４Ｃ】
2005500802.tif 000032
配列番号１１によってコードされたＧＰＣＲ４ｂタンパク質（配列番号１２）は、３１１アミノ酸長であり、３４６９８．３２ダルトンの分子量を有し、これを表４Ｄにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ４ａと同様、ＧＰＣＲ４ｂの最も可能性の高い切断部位は、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐの結果に基づいて、４６位置と４７位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＧにおけるダッシュ）である。ＧＰＣＲ４ａのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、実施例１に記載のようにエキソン連結によって得た。
【００８０】
【表４Ｄ】
2005500802.tif 000033
（ＧＰＣＲ４ｃ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ４改変体は、新規なＧＰＣＲ４ｃ（あるいは、本明細書において、ＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｄと呼ばれる）であり、これは、表４Ｅに示される９４０のヌクレオチド配列（配列番号１３）を含む。ＧＰＣＲ４ｃ  ＯＲＦは、ヌクレオチド３〜５のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９３６〜９３８のＴＡＧコドン（表４Ｅにおいて、太字にしている）で終わる。
【００８１】
【表４Ｅ】
2005500802.tif 000034
配列番号１３によってコードされたＧＰＣＲ４ｃタンパク質（配列番号１４）は、３１１アミノ酸長であり、３４６４９．７ダルトンの分子量を有し、これを表４Ｆにおいて１文字コードを用いて示す。他のＧＰＣＲ４タンパク質と同様、ＧＰＣＲ４ｃペプチドの最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、４６位置と４７位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＧにおけるダッシュ）である。
【００８２】
【表４Ｆ】
2005500802.tif 000035
（ＧＰＣＲ４クローン）
ＧＰＣＲ４のアミノ酸配列は、表４Ｇに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【００８３】
【表４Ｇ】
2005500802.tif 000036
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ４の核酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ嗅覚レセプター（ＯＲ１−２６）遺伝子、部分的ｃｄｓ）由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：Ｕ８６２１６｜ａｃｃ：Ｕ８６２１６．１  ｍＲＮＡに６４９塩基のうち６４６塩基（９９％）の同一性を有することが見出される。本発明のＧＰＣＲ４タンパク質の全アミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｒａｔ）由来の３１１のアミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９ＪＨＥ２タンパク質（ＧＵＳＴＡＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ４３）に対して３１１アミノ酸残基中２６５アミノ酸残基（８５％）同一であり、そして３１１アミノ酸残基中２８５アミノ酸残基（９１％）類似であることが見出された。
【００８４】
ＧＰＣＲ４はまた、表４ＨにおけるＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質に対して相同性を有する
【００８５】
【表４Ｈ】
2005500802.tif 000037
2005500802.tif 000038
マルチプル配列アライメントを表４Ｉに示す。ここでは、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、ＧＰＣＲ４タンパク質が、表４Ｉの１行目に示され、そして表４Ｈに示された関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ４タンパク質を比較している。このＢＬＡＳＴＰデータは、表４ＩにおけるＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示されている。ＧＰＣＲ４ａと、ＧＰＣＲ４ｂと、ＧＰＣＲ４ｃとの間で異なる残基に（ｏ（白丸））の印をつけた。
【００８６】
【表４Ｉ】
2005500802.tif 000039
2005500802.tif 000040
表４Ｊは、ＧＰＣＲ４に対するＤＯＭＡＩＮ分析の結果からのドメインの詳細を列挙する。ＧＰＣＲ４配列は、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似し、そして２５４アミノ酸の７ｔｍドメイン（配列番号３９）に類似の特性を有する。
【００８７】
【表４Ｊ】
2005500802.tif 000041
2005500802.tif 000042
本明細書において予想されたＧＰＣＲ４タンパク質は、「Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ（嗅覚レセプター様タンパク質ファミリー）」に類似しており、そのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在し、そこでその活性を示す。従って、新規なＧＰＣＲ４タンパク質は、適切な細胞下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途に利用しやすい可能性がある。
【００８８】
開示された嗅覚レセプター様ＧＰＣＲ４タンパク質は、少なくとも以下の組織において発現される：網膜色素上皮の先端の微絨毛、動脈（大動脈）、基底前脳、脳、バーキットリンパ腫細胞株、脳梁、心（心房および心室）、尾状核、ＣＮＳおよび末梢組織、小脳、大脳皮質、結腸、皮質神経細胞、内皮（冠状動脈および臍静脈）細胞、口蓋上皮、眼、新生児眼、前頭皮質、胎児造血細胞、心臓、海馬、視床下部、白血球、肝臓、胎児肝臓、肺、肺リンパ腫細胞株、胎児リンパ様組織、成人リンパ様組織、ＭＨＣＩＩおよびＩＩＩを発現する組織、神経組織、髄質、視床下核、卵巣、膵臓、下垂体、胎盤、橋、前立腺、被殻、血清、骨格筋、小腸、平滑筋（大動脈中の冠状動脈）、脊髄、脾臓、胃、舌の味覚レセプター細胞、精巣、視床、および胸腺組織。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公のＥＳＴ供給源、文献出典、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、引き出される。
【００８９】
これは、嗅覚レセプターが、全ての組織型において発現されることが公知であるクラスのＧタンパク質結合レセプターであるという点で限定されない。さらなる組織発現分析を実施例中に提供する。
【００９０】
ＧＰＣＲ４の核酸およびタンパク質は、本明細書にさらに記載されるような、種々のＧＰＣＲ関連の病状（病態）および／または嗅覚レセプター（ＯＲ）関連の病状に関係した潜在的な治療適用において有用である。
【００９１】
これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ４タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、企図されたＧＰＣＲ４エピトープは、アミノ酸約１〜２５である。さらなる実施形態において、ＧＰＣＲ４エピトープは、アミノ酸約７５〜１００、アミノ酸約２３０〜２４０、アミノ酸約２８５〜３１１である。
【００９２】
（ＧＰＣＲ５）
本発明の第５のＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ５と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ５タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【００９３】
２つの別の新規なＧＰＣＲ５核酸およびコードされたポリペプチド（いわゆる、ＧＰＣＲ５ａおよびＧＰＣＲ５ｂ）が提供される。
【００９４】
（ＧＰＣＲ５ａ）
１つの実施形態において、ＧＰＣＲ改変体は、新規なＧＰＣＲ５ａ（本明細書においては、あるいはＣＧ５０３８５−０３と呼ばれる）であり、表５Ａに示される１０１２のヌクレオチド配列（配列番号１５）を含む。ＧＰＣＲ５ａまたはそのスプライス形態の１つのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、単にエキソン連結によって得られた。ＧＰＣＲ５ａ  ＯＲＦは、ヌクレオチド５９〜６１のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１００１〜１００３のＴＧＡコドン（表５Ａに太字で示す）で終わる。
【００９５】
【表５Ａ】
2005500802.tif 000043
2005500802.tif 000044
配列番号１５によってコードされるＧＰＣＲ５ａポリペプチド（配列番号１６）は、３１４アミノ酸長であり、３４８０９．２３ダルトンの分子量を有し、これを表５Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ５ａおよびＧＰＣＲ５ｂのＰｓｏｒｔプロフィールによって、これらの配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ５ポリペプチドは、０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３００の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．３００の信頼度で微小体（ペルオキシソーム）に局在化する。このＳｉｇｎａｌ  Ｐによって、ＧＰＣＲ５ペプチドの可能性の高い切断部位が、４１位置と４２位置との間（すなわち、配列ＶＬＧ／ＮＬにおけるスラッシュ）であることが予測される。
【００９６】
【表５Ｂ】
2005500802.tif 000045
（ＧＰＣＲ５ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ５改変体は、新規なＧＰＣＲ５ｂ（本明細書においては、あるいはＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｅと呼ばれる）は、表５Ｃに示される９７１のヌクレオチド配列（配列番号１７）を含む。ＧＰＣＲ５ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド２〜４のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９４１〜９３４３のＴＧＡコドン（表５Ｃにおいて太文字にしている）で終わる。
【００９７】
【表５Ｃ】
2005500802.tif 000046
2005500802.tif 000047
配列番号１７によってコードされたＧＰＣＲ５ｂタンパク質（配列番号１８）は、３１３アミノ酸長であり、３４９５８．８ダルトンの分子量を有し、これを表５Ｄにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ５ａと同様、ＧＰＣＲ５ｂの最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づき、４１位置と４２位置との間（すなわち、配列ＶＬＧ／ＮＬにおけるスラッシュ）である。
【００９８】
【表５Ｄ】
2005500802.tif 000048
（ＧＰＣＲ５ｃ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ５の改変体は新規なＧＰＣＲ５ｃ（本明細書においてはあるいは、ＣＧ５０３８５−０１と呼ばれる）であり、これは、表５Ｅに示される１０５１のヌクレオチド配列（配列番号１０８）を含む。ＧＰＣＲ５ｃ  ＯＲＦは、ヌクレオチド３１〜３４のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９７０〜９７２のＴＡＡコドン（表５Ｅにおいて太文字である）で終わる。
【００９９】
【表５Ｅ】
2005500802.tif 000049
配列番号１０８によってコードされたＧＰＣＲ５ｃタンパク質（配列番号１０９）は、３１３アミノ酸長であり、３４９５８．８ダルトンの分子量を有し、そしてこれを表５Ｆにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ５ａと同様、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、ＧＰＣＲ５ｃペプチドの最も可能性の高い切断部位が、４１位置と４２位置との間（すなわち、配列ＶＬＧ／ＮＬにおけるスラッシュ）であることが予測される。
【０１００】
【表５Ｆ】
2005500802.tif 000050
（ＧＰＣＲ５クローン）
ＧＰＣＲ５ａまたはＧＰＣＲ５ｂとして特別に言及しない限り、ＧＰＣＲ５に対するいずれの言及も全ての改変体を包含することが仮定される。
【０１０１】
ＧＰＣＲ２のアミノ酸配列は、表５Ｇに示されるように、他のタンパク質に対して高い相同性を有した。
【０１０２】
【表５Ｇ】
2005500802.tif 000051
新規なＧＰＣＲ５ヌクレオチド配列は、第１７染色体にマッピングされた。この割り当ては、開示された配列と配列同一性を共有するゲノムクローン、公的遺伝子およびＥＳＴと関連するマッピング情報、ならびにＣｕｒａＧｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎバイオインフォーマティックツールを用いてなされた。
【０１０３】
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ５ａの核酸配列が、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＨＧＭ０７１｜ａｃｃ：Ｘ６４９９４．１  ｍＲＮＡ（嗅覚レセプターのＨ．ｓａｐｉｅｎｓ  ＨＧＭＰ０７Ｉ遺伝子）に対して９８８塩基のうち６９２塩基（７０％）の同一性を有することが見出された。ＧＰＣＲ５ａタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）由来の３１４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｐ３０９５３タンパク質（ＯＬＦＡＣＴＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １Ｅ１（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＨＧＭＰ０７Ｉ）（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １７−２／１７−３２）（ＯＲ１７−２）（ＯＲ１７−３２）に対して、３１４アミノ酸残基中１９２アミノ酸残基（６１％）の同一性、および３１４アミノ酸残基中２４４アミノ酸残基（７７％）の類似性を有することが見出された。
【０１０４】
さらなるＢＬＡＳＴＰの結果を表５Ｈに示す。
【０１０５】
【表５Ｈ】
2005500802.tif 000052
マルチプル配列アライメントを表５Ｊに示す。ここでは、表５Ｈに示す、関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ５を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ５タンパク質が、１行目に示されている。ＧＰＣＲ５ａとＧＰＣＲ５ｂとの間で異なる残基に（ｏ）の印をつけた。
【０１０６】
【表５Ｊ】
2005500802.tif 000053
2005500802.tif 000054
ＧＰＣＲ５についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションにおいて見出されるドメインをサンプリングした。この結果を、統計値およびドメインの説明とともに表５Ｈに列挙する。７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）である、７ｔｍ＿１は、ＧＰＣＲ５に対して有意な相同性を有することが示された。７ｔｍ＿１の残基１〜２５４（配列番号３９）とのＧＰＣＲ５の残基４１〜２８９とのアラインメントを、表５Ｋに示す。
【０１０７】
【表５Ｋ】
2005500802.tif 000055
本発明において開示された嗅覚レセプター様遺伝子ＧＰＣＲ５ａは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。発現情報は、ＧＰＣＲ５ａの配列の派生物（ＣｕｒａＧｅｎ  登録番号ＣＧ５０３８５−０３）に含まれた配列の組織供給源に由来する。これは、嗅覚レセプターが、全ての組織型において発現されることが公知であるクラスのＧタンパク質結合レセプターであるという点で限定されない。さらなる組織発現分析を実施例中に提供する。
【０１０８】
ＧＰＣＲ５の核酸およびタンパク質は、上記にさらに記載しているように、種々のＧＰＣＲ関連病状（病態）、および／またはＯＲ関連病状に関与する潜在的な治療適用において有用である。
【０１０９】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質、またはそのフラグメントをコードする新規な核酸は、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ５タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、企図されたＧＰＣＲ５エピトープは、アミノ酸約１〜２０である。他の特定の実施形態において、ＧＰＣＲ５エピトープは、アミノ酸約７５〜１０５、アミノ酸約１１５〜１３０、そしてアミノ酸約２７５〜３１３である。
【０１１０】
（ＧＰＣＲ６）
本発明のさらなるＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ６と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ６タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【０１１１】
３つの別の新規なＧＰＣＲ６核酸およびコードされたポリペプチド（すなわち、ＧＰＣＲ６ａ、ＧＰＣＲ６ｂ、およびＧＰＣＲ６ｃ）が提供される。
【０１１２】
（ＧＰＣＲ６ａ）
１つの実施形態において、ＧＰＣＲ６改変体は、ＧＰＣＲ６ａ（本明細書においては、あるいはｂａ４６０ｎ１１＿ｄａ１と呼ばれる）であり、表６Ａに示される９９６のヌクレオチド配列（配列番号１９）を含む。ＧＰＣＲ６ａ  ＯＲＦは、ヌクレオチド２〜４のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９４１〜９４３のＴＧＡコドンで終わる。表６Ａにおいて、開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【０１１３】
【表６Ａ】
2005500802.tif 000056
実施例１に記載されるように実験エキソン連結によってＧＰＣＲ６ａの配列が誘導された。
【０１１４】
配列番号１９によってコードされるＧＰＣＲ６ａタンパク質（配列番号２０）は、３１３アミノ酸長であり、３５３２５．０４ダルトンの分子量を有し、これを表６Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ６ａ、ＧＰＣＲ６ｂ、およびＧＰＣＲ６ｃのＰｓｏｒｔプロフィールによって、これらの配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６４０の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ６ポリペプチドは、０．４６００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３７００の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．１０００の信頼度で小胞体（管腔）に局在化する。このＳｉｇｎａｌ  Ｐによって、ＧＰＣＲ６ペプチドの可能性の高い切断部位が、４１位置と４２位置との間（すなわち、配列ＶＬＧ−ＮＬにおけるダッシュ）であることが予測される。
【０１１５】
【表６Ｂ】
2005500802.tif 000057
（ＧＰＣＲ６ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ６改変体は、新規なＧＰＣＲ６ｂ（本明細書においては、あるいはＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｆと呼ばれる）であり、表６Ｃに示される９７８のヌクレオチド配列（配列番号２１）を含む。ＧＰＣＲ６ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド２〜４のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９４１〜９４３のＴＧＡコドン（表６Ｃにおいて太字である）で終わる。
【０１１６】
【表６Ｃ】
2005500802.tif 000058
2005500802.tif 000059
配列番号２１によってコードされるＧＰＣＲ６ｂタンパク質（配列番号２２）は、３１３アミノ酸長であり、３５３８４．５ダルトンの分子量を有し、これを表６Ｄにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ６ａと同様、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、ＧＰＣＲ６ｂペプチドの最も可能性の高い切断部位は、４８位置と４９位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＨにおけるダッシュ）である。
【０１１７】
【表６Ｄ】
2005500802.tif 000060
（ＧＰＣＲ６ｃ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ６改変体は、新規なＧＰＣＲ６ｃ（あるいは、本明細書においては、ｂａ４６０ｎ１１＿ｄａ２または１４７３０７４９９と呼ばれる）であり、これは表６Ｅに示される９２５ヌクレオチド配列（配列番号２３）を含む。ＧＰＣＲ６ｃは、配列番号１９および２１に関してヌクレオチド位置２７で開始する部分的ＯＲＦであり、ヌクレオチド９１５〜９１７のＴＧＡコドン（表６Ｅにおいて太字である）で終わる。
【０１１８】
【表６Ｅ】
2005500802.tif 000061
配列番号２３によってコードされたＧＰＣＲ６ｃタンパク質（配列番号２４）は、３０４アミノ酸長であり、３４４６８．１０ダルトンの分子量を有し、そしてこれを表１Ｆにおいて１文字コードを用いて示す。他のＧＰＣＲ６タンパク質と同様、このＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、ＧＰＣＲ６ｃペプチドの最も可能性の高い切断部位は、配列ＩＬＡ−ＩＨのダッシュである。
【０１１９】
【表６Ｆ】
2005500802.tif 000062
ＧＰＣＲ６ｃのＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、単にエキソン連結プロセスによって得た。
【０１２０】
（ＧＰＣＲ６クローン）
ＧＰＣＲ６ａ、ＧＰＣＲ６ｂ、またはＧＰＣＲ６ｃとして特に言及しない限り、ＧＰＣＲ６に対するいずれの言及も、全ての改変体を包含すると想定される。本明細書における任意のＧＰＣＲＸ改変体の間の残基の差異を記して、「ａ」改変体における残基、「ａ」改変体に関する残基位置、および「ｂ」改変体における残基を示す。
【０１２１】
ＧＰＣＲ６のアミノ酸配列は、表６Ｇに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【０１２２】
【表６Ｇ】
2005500802.tif 000063
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ６ｃの核酸配列が、ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＦ１７９７３７｜ａｃｃ：ＡＦ１７９７３７．１  Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＴＲ２１２）遺伝子、部分的ｃｄｓ−Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（４８７ｂｐ）に対して４８６／４８７（９９％）の同一性を有することが見出された。さらに、このＧＰＣＲ６ａタンパク質の全アミノ酸配列は、ヒト由来の３１４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＮＥＷ−ＡＣＣ：Ｐ３０９５３  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １Ｅ１タンパク質（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＨＧＭＰ０７Ｉ）（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  １７−２）（ＯＲ１７−２）に対して、３１３アミノ酸残基中１９１アミノ酸残基（６１％）の同一性、および３１３アミノ酸残基中２５１アミノ酸残基（８０％）の類似性を有する。
【０１２３】
さらなるＢＬＡＳＴＰの結果を表６Ｈに示す。
【０１２４】
【表６Ｈ】
2005500802.tif 000064
2005500802.tif 000065
マルチプル配列アライメントを表６Ｉに示す。ここでは、表６Ｈに列挙した関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ６とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ６タンパク質が、１〜３行目に示されている。
【０１２５】
【表６Ｉ】
2005500802.tif 000066
2005500802.tif 000067
ＧＰＣＲ６についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴサンプルドメインは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍのコレクションにおいて見出した。この結果を、統計値およびドメインの説明とともに表６Ｇに列挙する。７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー）である、７ｔｍ＿１は、ＧＰＣＲ６に対して有意な相同性を有することが示された。７ｔｍ＿１残基１〜２５４（配列番号３９）とのＧＰＣＲ６残基４１〜２９０（配列番号２０）の整列（アラインメント）を、表６Ｊに示す。
【０１２６】
【表６Ｊ】
2005500802.tif 000068
本発明において開示されたＧＰＣＲ６ｃは、少なくとも以下の組織において発現される：精巣。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公のＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、引き出される。これは、嗅覚レセプターが、全ての組織型において発現されることが公知であるクラスのＧタンパク質結合レセプターであるという点で限定されない。さらなる組織発現分析を実施例中に提供する。
【０１２７】
本発明において開示されたＧＰＣＲ６ｃは、第９染色体にマッピングする。この情報は、ＯＭＩＭ、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって実現された電気的ノーザン（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）バイオインフォマティックツール、公的なＥＳＴ、公的な文献参照、および／またはゲノムクローン相同性を用いて割り当てられた。これを実行して、本発明に含まれた、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリの染色体マッピング、ゲノムクローン、文献参照、および／またはＥＳＴ配列を誘導した。
【０１２８】
ＧＰＣＲ６の核酸およびタンパク質は、本明細書にさらに記載された、種々のＧＰＣＲ関連病状、および／またはＯＲ関連病状に関与する潜在的な治療適用において有用である。
【０１２９】
これらの物質はさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ６タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。種々の実施形態において、意図されたＧＰＣＲ６エピトープは、アミノ酸約１〜２０。アミノ酸約７５〜９５、アミノ酸約２２５〜２３５、そしてアミノ酸約２８０〜３１３である。
【０１３０】
（ＧＰＣＲ７）
本発明のさらなるＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ７と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ７タンパク質は、適切な細胞以下の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【０１３１】
２つの別の新規なＧＰＣＲ７核酸およびコードされたポリペプチド、すなわちＧＰＣＲ７ａおよびＧＰＣＲ７ｂが提供される。
【０１３２】
（ＧＰＣＲ７ａ）
１つの実施形態において、ＧＰＣＲ７改変体は、新規なＧＰＣＲ７ａ（あるいは、本明細書においては、ＣＧ５７８０９−０１と呼ばれる）は、表７Ａに示される９３６のヌクレオチド配列（配列番号２５）を含む。ＧＰＣＲ７ａのＯＲＦは、ヌクレオチド４〜６のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９３４〜９３６のＴＧＡコドンで終わる。表７Ａにおいて、開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止（終止）コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【０１３３】
【表７Ａ】
2005500802.tif 000069
配列番号２５によってコードされるＧＰＣＲ７ａタンパク質（配列番号２６）は、３１０アミノ酸残基であり、そしてこれを表７Ｂにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ７ａタンパク質の推定分子量は、３５０７９．０５ダルトンである。ＧＰＣＲ７ａのＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６０４６の信頼度でミトコンドリア内膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ７は、０．６００の信頼度で原形質膜に局在化するか、０．４６１５の信頼度でミトコンドリアの膜間腔に局在化するか、または０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化する。このＳｉｇｎａｌＰによって、可能性の高い切断部位が、４８位置と４９位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＨにおけるダッシュ）であることが予測される。
【０１３４】
【表７Ｂ】
2005500802.tif 000070
ＧＰＣＲ７ａのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、単にエキソン連結プロセスによって得た。
【０１３５】
（ＧＰＣＲ７ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ７改変体は、新規なＧＰＣＲ７ｂ（あるいは、本明細書において、ＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｇと呼ばれる）であり、これは、表７Ｃに示される９３６のヌクレオチド配列（配列番号２７）を含む。ＧＰＣＲ７ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド４〜６のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９３４〜９３６のＴＧＡコドン（表１Ｃにおいて、太字にしている）で終わる。
【０１３６】
【表７Ｃ】
2005500802.tif 000071
配列番号２７によってコードされたＧＰＣＲ７ｂタンパク質（配列番号２８）は、３１０アミノ酸長であり、そしてこれを表７Ｄにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ７ａおよびＧＰＣＲ７ｂポリペプチドは、ＧＰＣＲ７ヌクレオチド配列の間のサイレントなコドン変化に起因して同一である。
【０１３７】
【表７Ｄ】
2005500802.tif 000072
（ＧＰＣＲ７クローン）
ＧＰＣＲ７ａまたはＧＰＣＲ７ｂとして特に取り組まない限り、ＧＰＣＲ７に対するいずれの言及も、全ての改変体を包含すると想定される。本明細書における任意のＧＰＣＲＸ改変体の間の残基の差異を記して、「ａ」改変体における残基、「ａ」改変体に関する残基位置、および「ｂ」改変体における残基を示す。例えば、ＧＰＣＲ７核酸配列は、以下の位置：Ｔ４７１Ｃで異なる。コードされたＧＰＣＲ７ａおよびＧＰＣＲ７ｂポリペプチドは同一である。
【０１３８】
ＧＰＣＲ７のアミノ酸配列は、表７Ｅに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【０１３９】
【表７Ｅ】
2005500802.tif 000073
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ７ａの核酸配列が、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＯＬＦＰＲＯＣ｜ａｃｃ：Ｍ６４３７７．１  ｍＲＮＡ（Ｒａｔ嗅覚タンパク質ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ）に対して９２２塩基のうち６０２塩基（６５％）の同一性を有することが見出された。ＧＰＣＲ７ａタンパク質の全アミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（Ｒａｔ）由来の３１３アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ２３２６６（ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｆ５）に対して、３０５アミノ酸残基中１６１アミノ酸残基（５２％）の同一性、および３０５アミノ酸残基中２１９アミノ酸残基（７１％）の類似性を有することが見出された。
【０１４０】
ＧＰＣＲ７はまた、表７ＦにおけるＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質に対して相同性を有する。
【０１４１】
【表７Ｆ】
2005500802.tif 000074
マルチプル配列アライメントを表７Ｇに示す。ここでは、表７Ｆに示される関連のタンパク質配列と本発明のタンパク質とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、ＧＰＣＲ７タンパク質が、１行目に示されている。このＢＬＡＳＴＰデータを、表７ＧにおけるＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示している。
【０１４２】
【表７Ｇ】
2005500802.tif 000075
2005500802.tif 000076
表７Ｈは、ＧＰＣＲ７に対するＤＯＭＡＩＮ分析からのドメインの詳細を列挙する。これは、ＧＰＣＲ７配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似し、そして２５４のアミノ酸７ｔｍドメイン（配列番号３９）自体に類似の特性を有することを示す。
【０１４３】
【表７Ｈ】
2005500802.tif 000077
2005500802.tif 000078
ＧＰＣＲ７の核酸およびタンパク質は、本明細書にさらに記載される、種々のＧＰＣＲ関連の病状および／または嗅覚レセプター（ＯＲ）関連の病状に関係した潜在的な治療適用において有用である。
【０１４４】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質をコードする新規なＧＰＣＲ７核酸、またはそのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここでこの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。
【０１４５】
これらの物質はさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ７タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されたＧＰＣＲ４エピトープは、アミノ酸約５〜２５である。さらなる実施形態において、ＧＰＣＲ７エピトープは、アミノ酸約５０〜６０、アミノ酸約８０〜１００、アミノ酸約１３０〜１４５、アミノ酸約２３０〜２４０、アミノ酸約２６０〜２７０、そしてアミノ酸約２９０〜３１０である。
【０１４６】
（ＧＰＣＲ８）
本発明の第８のＧＰＣＲ様タンパク質（本明細書中でＧＰＣＲ８と称される）は、嗅覚レセプター（「ＯＲ」）様タンパク質である。嗅覚レセプター様タンパク質ファミリーのいくつかのメンバーは、最終的に細胞表面に局在化し、ここで活性を示す。従って、これらの新規なＧＰＣＲ８タンパク質は、適切な細胞内の局在で効力があり、従って本出願に記載された治療用途について利用しやすい可能性がある。
【０１４７】
本発明において開示されたＧＰＣＲは、第９染色体にマッピングする。この情報は、ＯＭＩＭ、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって実現された電気的ノーザンバイオインフォマティックツール、公的なＥＳＴ、公的な文献参照、および／またはゲノムクローン相同性を用いて割り当てられた。これを実行して、本発明に含まれた、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリの染色体マッピング、ゲノムクローン、文献参照、および／またはＥＳＴ配列を誘導した。
【０１４８】
４つの別の新規なＧＰＣＲ８核酸、すなわちＧＰＣＲ８ａ、ＧＰＣＲ８ｂ、およびＧＰＣＲ８ｄ、ならびにそれらがコードするＧＰＣＲ８ポリペプチドが提供される。
【０１４９】
（ＧＰＣＲ８ａ）
第一の開示された新規なＧＰＣＲ８クローンは、ＧＰＣＲ８ａ（ｂａ５４２ｋ２３とも呼ばれる）は、表８Ａに示される１９２０のヌクレオチドの核酸（配列番号２９）を有する。ＯＲＦは、ヌクレオチド３８〜４０のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９６５〜９６７のＴＡＧコドンで終わる。
【０１５０】
以下のゲノムクローンは、嗅覚レセプター様タンパク質（ＨＳ６Ｍ１−６）に対する相同性を有することが同定された。表８Ａにおいて、出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にし、そして開始部位の上流でかつ終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付した。
【０１５１】
【表８Ａ】
2005500802.tif 000079
配列番号２９によってコードされるＧＰＣＲ８ａタンパク質（配列番号３０）は、３０９アミノ酸残基を有し、そしてこれを表８Ｂにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ８タンパク質の推定分子量は、３５０３５．７７ダルトンである。全てのＧＰＣＲ８ポリペプチドのＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．７０９９の信頼度でミトコンドリア内膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ８は、０．６００の信頼度で原形質膜に局在化するか、０．４０００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、または０．３３０６の信頼度でミトコンドリアの膜間腔に局在化するかである。このＳｉｇｎａｌＰによって、可能性の高い切断部位は、４９位置と５０位置との間（すなわち、配列ＩＬＡ−ＩＲにおけるダッシュ）であることが予測される。
【０１５２】
【表８Ｂ】
2005500802.tif 000080
第９染色体上のゲノム配列ＧＰＣＲ８ａを、ＧｅｎＢａｎｋによって利用可能にされたか、またはＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇセンターから入手した、ゲノムディリーファイルに対して実行した、ＧＰＣＲファミリーのメンバーについてのＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮによって同定した。次いで、これをＥｘｏｎ連結プロセスによって（本発明のＧＰＣＲ８ａの配列のヌクレオチド２３３〜１０４２）、そしてインシリコでゲノムクローンＡＬ１６２２５４（本発明の配列ＧＰＣＲ８ａの配列の１〜２３２ヌクレオチドに寄与した）を用いて実験的に伸長して、上記のような全長配列を生じた。従って、ＣｕｒａｇｅｎのＥｘｏｎ  Ｌｉｎｋｉｎｇプロセスとは別に、ゲノムクローンＡＬ１６２２５４由来の配列は、本発明に含まれる。
【０１５３】
（ＧＰＣＲ８ｂ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ８改変体は、新規なＧＰＣＲ８ｂ（あるいは、本明細書において、１４８５４０６６６またはＣＧ５０２５９−０１と呼ばれる）であり、これは、表８Ｃに示される１０３３のヌクレオチド配列（配列番号３１）を含む。ＧＰＣＲ８ｂ  ＯＲＦは、ヌクレオチド２９〜３１のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９５６〜９５８のＴＡＧコドン（表８Ｃにおいて、太字にしている）で終わる。
【０１５４】
【表８Ｃ】
2005500802.tif 000081
配列番号３１によってコードされたＧＰＣＲ８ｂタンパク質（配列番号３２）は、３０９アミノ酸長であり、３５０４６．７６ダルトンの分子量を有し、そしてこれを表８Ｄにおいて１文字コードを用いて示す。全てのＧＰＣＲ８タンパク質と同様、ＧＰＣＲ８ｂペプチドの最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、アミノ酸４９と５０との間、すなわち配列ＩＬＡ−ＩＲである。ＧＰＣＲ８ｂのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、エキソン連結プロセスによって得た。
【０１５５】
【表８Ｄ】
2005500802.tif 000082
（ＧＰＣＲ８ｃ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ８改変体は、新規なＧＰＣＲ８ｃ（本明細書においては、あるいはＡＬ１６２２５４−ｄａ１と呼ばれる）であり、これは、表８Ｅに示される９６９のヌクレオチド配列（配列番号３３）を含む。部分的なＧＰＣＲ８ｃ  ＯＲＦは、本発明の他のＧＰＣＲ８核酸のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンから６ｂｐ下流で始まり、そしてヌクレオチド９２２〜９２４のＴＡＧコドン（表８Ｃに太字で示す）で終わる。
【０１５６】
【表８Ｅ】
2005500802.tif 000083
配列番号３３によってコードされるＧＰＣＲ８ｃタンパク質フラグメント（配列番号３４）は、３０７アミノ酸長であり、３４８２０．５２ダルトンの分子量を有し、これを表８Ｂにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ８ｃタンパク質フラグメントは、本発明の他のＧＰＣＲ８核酸配列によってコードされる第一の２つのアミノ酸を欠く。ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、最も可能性の高いＧＰＣＲ８ｃの切断部位が、配列ＩＬＡ−ＩＲにおけるアミノ酸の間に残る。ＧＰＣＲ８ｃのＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、単にエキソン連結プロセスによって得た。
【０１５７】
【表８Ｆ】
2005500802.tif 000084
（ＧＰＣＲ８ｄ）
別の実施形態において、ＧＰＣＲ８改変体は、新規なＧＰＣＲ８ｄ（本明細書においては、あるいはＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｈと呼ばれる）であり、これは、表８Ｇに示される９５５のヌクレオチド配列（配列番号３５）を含む。ＧＰＣＲ８ｄ  ＯＲＦは、ヌクレオチド４〜６のＫｏｚａｋコンセンサスＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９３１〜９３３のＴＡＧコドン（表８Ｇに太字で示す）で終わる。
【０１５８】
【表８Ｇ】
2005500802.tif 000085
配列番号３５によってコードされるＧＰＣＲ８ｄタンパク質（配列番号３６）は、３０９アミノ酸長であり、３５０８０．８２ダルトンの分子量を有し、これを表８Ｈにおいて１文字コードを用いて示す。ＧＰＣＲ８ポリペプチドと同様、ＧＰＣＲ８ｄペプチドの最も可能性の高い切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰの結果に基づいて、配列ＩＬＡ−ＩＲにおけるアミノ酸４９と５０との間、すなわちダッシュである。
【０１５９】
【表８Ｈ】
2005500802.tif 000086
（ＧＰＣＲ８クローン）
ＧＰＣＲ８ａ、ＧＰＣＲ８ｂ、ＧＰＣＲ８ｃ、またはＧＰＣＲ８ｄとして特に取り組まない限り、ＧＰＣＲ８に対するいずれの言及も、全ての改変体を包含すると想定される。本明細書における任意のＧＰＣＲＸ改変体の間の残基の差異を記して、「ａ」改変体における残基、「ａ」改変体に関する残基位置、および「ｂ」、「ｃ」、または「ｄ」改変体における残基を示す。
【０１６０】
ＧＰＣＲ８のアミノ酸配列は、表８Ｉに示される他のタンパク質と高い相同性を有した。
【０１６１】
【表８Ｉ】
2005500802.tif 000087
配列データベースの検索において、例えば、ＧＰＣＲ８の核酸配列が、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のＲａｔ嗅覚タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＯＬＦＰＲＯＣ｜ａｃｃ：Ｍ６４３７７）に対して９２２塩基のうち６１９塩基（６７％）の同一性を有することが見出された。本発明のＧＰＣＲ８タンパク質の全アミノ酸配列は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来の３１３アミノ酸残基のＯＬＦＡＣＴＯＲＹ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ−ＬＩＫＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｆ５に対して、３０２アミノ酸残基中１６２アミノ酸残基（５３％）の同一性、および３０２アミノ酸残基中２２０アミノ酸残基（７２％）の類似性を有することが見出された。ＧＰＣＲ８はまた、表８ＪにおけるＢＬＡＳＴＰデータに示されるタンパク質に対して相同性を有する。
【０１６２】
【表８Ｊ】
2005500802.tif 000088
2005500802.tif 000089
マルチプル配列アライメントを表８Ｋに示す。ここでは、表８Ｊに示した関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ８ポリペプチドとを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ８タンパク質を、１〜４行目に示している。このＢＬＡＳＴＰデータを、表８ＫにおけるＣｌｕｓｔａｌＷにおいて図示する。
【０１６３】
【表８Ｋ】
2005500802.tif 000090
2005500802.tif 000091
ＧＰＣＲ８についてのＤＯＭＡＩＮ解析からのドメインの詳細を、表８Ｌに列挙する。これは、ＧＰＣＲ８配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の配列、そして２５４アミノ酸の７ｔｍドメイン（配列番号３９）に対して類似の特性を有することを示す。
【０１６４】
【表８Ｌ】
2005500802.tif 000092
2005500802.tif 000093
ＧＰＣＲ８ａは、少なくとも以下の組織において発現される：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。
【０１６５】
ＧＰＣＲ８ｃは、少なくとも以下の組織において発現される：網膜色素上皮の先端の微絨毛、動脈（大動脈）、基底前脳、脳、バーキットリンパ腫細胞株、脳梁、心（心房および心室）、尾状核、ＣＮＳおよび末梢組織、小脳、大脳皮質、結腸、皮質神経細胞、内皮（冠状動脈および臍静脈）細胞、口蓋上皮、眼、新生児眼、前頭皮質、胎児造血細胞、心臓、海馬、視床下部、白血球、肝臓、胎児肝臓、肺、肺リンパ腫細胞株、胎児リンパ様組織、成人リンパ様組織、ＭＨＣＩＩおよびＩＩＩを発現する組織、神経組織、髄質、視床下核、卵巣、膵臓、下垂体、胎盤、橋、前立腺、被殻、血清、骨格筋、小腸、平滑筋（大動脈中の冠状動脈）、脊髄、脾臓、胃、舌の味覚レセプター細胞、精巣、視床、および胸腺組織。この情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公のＥＳＴ供給源、文献供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源を含むがこれらに限定されない、本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、引き出される。
【０１６６】
さらに、ＧＰＣＲ８遺伝子は、脳における多くの臭気レセプターの発現パターンによって、脳において発現されることが予想される。ＧＰＣＲ８遺伝子はまた、密接に関連した｛Ｒａｔ嗅覚タンパク質ｍＲＮＡ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ種における完全ｃｄｓホモログ）である（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＲＡＴＯＬＦＰＲＯＣ｜ａｃｃ：Ｍ６４３７７．１）の発現パターンによって、以下の組織で発現されると予想される：視床下部腹内側部、大脳皮質、前頭皮質、小脳、橋、線条体、および視床、精巣、脳皮質構造（前葉帯、後葉帯、および前頭頭頂の構造を含む）体性感覚、および梨状皮質、嗅覚結節、カエハ島、視床下部の腹内側部核および後部核、中間中隔核、対角帯の核、ならびに腹側被蓋領域。
【０１６７】
これは、嗅覚レセプターが、全ての組織型において発現されることが公知であるクラスのＧタンパク質結合レセプターであるという点で限定されない。さらなる組織発現分析を実施例中に提供する。
【０１６８】
ＧＰＣＲ８の核酸およびタンパク質は、本明細書にさらに記載されるような、種々のＧＰＣＲ関連の病状および／または嗅覚レセプター（ＯＲ）関連の病状に関係した潜在的な治療適用において有用である。ＧＰＣＲ８タンパク質を標的するモノクローナル抗体、特にその細胞外領域は、ガンを処置するにおいて治療的な役割を有する。これはまた、血管形成関連疾患を処置するのにおいて役割を有する。ＧＰＣＲであれば、これを用いてガンを処置するための低分子薬物についてスクリーニングすることができる。
【０１６９】
これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の節に記載されるような、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野で公知の方法に従って、生成され得る。開示されたＧＰＣＲ８タンパク質は、複数の親水性領域を有し、この各々が、免疫原として用いられ得る。１つの実施形態において、意図されたＧＰＣＲ８エピトープは、アミノ酸約１〜２５である。さらなる実施形態において、ＧＰＣＲ８エピトープは、アミノ酸約８０〜１００、アミノ酸約１３０〜１４０、アミノ酸約２２５〜２４５、そしてアミノ酸約２８５〜３０９である。
【０１７０】
（ＧＰＣＲ９）
新規なＧＰＣＲ９（本明細書中でＧＭｂａ６４ｐ１４＿Ｉと称される）クローンを同定した。この９５８ヌクレオチドのＧＰＣＲ９核酸（配列番号３７）を表９Ａに示す。ＧＰＣＲ９のＯＲＦは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド９３９〜９４１のＴＡＧコドンで終わる。表９Ａにおいて、開始コドンの上流の非翻訳領域および終止コドン下流の推定非翻訳領域に下線を付し、そして出発コドン（ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎ）および停止（終止）コドン（ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）を太字にした。
【０１７１】
【表９Ａ】
2005500802.tif 000094
配列番号３７によってコードされるＧＰＣＲ９ａポリペプチド（配列番号３８）は、３１４アミノ酸長であり、３５５９７．１ダルトンの分子量を有し、そしてこれを表９Ｂにおいて１文字アミノ酸コードを用いて示す。ＧＰＣＲ９のＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．６００の信頼度で原形質膜に局在化する可能性があることが予想される。別の実施形態において、ＧＰＣＲ９ポリペプチドは、０．４００の信頼度でゴルジ体に局在化するか、０．３００の信頼度で小胞体（膜）に局在化するか、または０．３００の信頼度で微小体（ペルオキシソーム）に局在化する。このＳｉｇｎａｌＰソフトウェアプログラムによっては、ＧＰＣＲ９ペプチドについて可能性の高いシグナル切断部位は予想されない。
【０１７２】
【表９Ｂ】
2005500802.tif 000095
ＧＰＣＲ９のアミノ酸配列は、表９Ｃに示されるように他のタンパク質に対して、高い相同性を有した。
【０１７３】
【表９Ｃ】
2005500802.tif 000096
ＧＰＣＲ９についてのさらなるＢＬＡＳＴＰの結果を表９Ｄに示す。
【０１７４】
【表９Ｄ】
2005500802.tif 000097
マルチプル配列アライメントを表９Ｅに示す。ここでは、表９Ｄに列挙される関連のタンパク質配列とＧＰＣＲ９とを比較するＣｌｕｓｔａｌＷ解析において、本発明のＧＰＣＲ９タンパク質が、１行目に示されている。
【０１７５】
【表９Ｅ】
2005500802.tif 000098
2005500802.tif 000099
ＧＰＣＲ９に関するＤＯＭＡＩＮの結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴサンプルドメインは、Ｓｍａｒｔ  ａｎｄ  Ｐｆａｍのコレクションにおいて見出した。７ｔｍ＿１（７回膜貫通レセプター（ロドプシンファミリー））は、ＧＰＣＲ９に対して有意な相同性を有することが示された。７ｔｍ＿１残基１〜２５４（配列番号３９）と、ＧＰＣＲ９の残基４１〜２８７（配列番号２６）との整列（アラインメント）を表９Ｆに示す。
【０１７６】
【表９Ｆ】
2005500802.tif 000100
2005500802.tif 000101
ＧＰＣＲ９の核酸およびタンパク質は、以下でさらに記載されるように、様々なＧＰＣＲ関連の病理学的障害および／またはＯＲ関連の病理学的障害に関する潜在的な治療的適用において有用である。
【０１７７】
本発明のＧＰＣＲ様タンパク質をコードする新規の核酸、またはそのフラグメントは、診断用途においてさらに有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の作製において、さらに有用である。これらの抗体は、当該分野で公知の方法に従って、疎水性チャートによる予測を使用して、以下の「抗ＧＰＣＲＸ抗体」の章に記載されるようにして作製され得る。開示されたＧＰＣＲ９タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その各々が免疫原として使用可能である。１つの実施形態において、意図されるＧＰＣＲ９エピトープは、アミノ酸約５〜２０である。他の特異的な実施形態において、ＧＰＣＲ９エピトープは、アミノ酸約２４０〜２５０、アミノ酸約２５５〜２６５、そしてアミノ酸約２８５〜３１４である。
【０１７８】
（ＧＰＣＲＸ核酸およびポリペプチド）
本発明のＧＰＣＲＸ核酸およびタンパク質のまとめを、表１０に提供する。
【０１７９】
【表１０】
2005500802.tif 000102
2005500802.tif 000103
本発明の１つの局面は、ＧＰＣＲＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子に関する。また、ＧＰＣＲＸをコードする核酸（例えば、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用について十分な核酸フラグメント、およびＧＰＣＲＸ核酸分子の増幅および／または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを使用して作成されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびホモログを含むことを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡで構成される。
【０１８０】
ＧＰＣＲＸ核酸は、成熟ＧＰＣＲＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドの産物または前駆体形態またはプロプロテイン（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。天然に存在するポリペプチド前駆体またはプロプロテインとしては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これらは、本明細書中に記載されるＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）によりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロプロテインとして規定され得る。生成物「成熟」形態は、また非限定的な例の目的として、１以上の天然に存在するプロセシング工程（これらがこの遺伝子産物が生じる細胞または宿主細胞内で起こり得る場合）の結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態に至るこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（残基１がＮ末端メチオニンである場合）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残基２〜Ｎが残る。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、Ｎ末端シグナル配列（残基１〜残基Ｍ）が切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解事象ではなく、翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみまたはこれらの任意の組み合わせの操作から生じ得る。
【０１８１】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより長さの短いオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様の技術において特異性を有するように設計され得る。
【０１８２】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＧＰＣＲＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１８３】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または上記のヌクレオチド配列の相補体は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の核酸配列の全部または一部を使用して、ＧＰＣＲＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単離され得る。
【０１８４】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＧＰＣＲＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０１８５】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられるに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔの長さを有する核酸配列の部分を含む。本発明の１つの実施形態では、１００ｎｔ未満の長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてまたプローブとして用いられ得る。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＧＰＣＲＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二重鎖を形成する核酸分子である。
【０１８７】
本明細書で用いる場合、用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドもしくは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介して、またはその効果に起因して生じない、その他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１８８】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸配列または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する構造（ただし、同一ではない）を有するが、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または進化的に異なる起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０１８９】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列と比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０１９０】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＧＰＣＲＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＧＰＣＲＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に生じる対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＧＰＣＲＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、ならびにＧＰＣＲＸ生物学的活性を保有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＧＰＣＲＸタンパク質の種々の生物学的活性は以下に記載されている。
【０１９１】
本明細書において用いる場合、「同一な」残基は、２つの配列の間の比較において、２つの配列の整列（アラインメント）における等価なヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同じ残基である、それらの残基に対応する。あるいは、残基は、アラインメントにおける２つの配列の間の比較が、比較における等価な位置の残基が同じアミノ酸であるか、または下に規定する保存的アミノ酸であることのいずれかを示す場合、「類似（ｓｉｍｉｌａｒ）」または「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」と記載される。
【０１９２】
ＧＰＣＲＸポリペプチドは、ＧＰＣＲＸ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、停止コドンによって途切れない。全タンパク質についてのコード配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始（ｓｔａｒｔ）」コドンで始まり、そして３つの「停止（ｓｔｏｐ）」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）のうちの１つで終結する。本発明の目的で、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドンまたはその両方を有するかまたは有さない、コード配列の任意の部分であり得る。ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ細胞タンパク質のコードのための良好な候補としてみなされるＯＲＦについて、最小サイズの要求、例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチがしばしば設定される。
【０１９３】
ヒトＧＰＣＲＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＧＰＣＲＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＧＰＣＲＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の天然に存在する変異体のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１９４】
ヒトＧＰＣＲＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じかまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＧＰＣＲＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＧＰＣＲＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＧＰＣＲＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているか否かを決定すること）によって使用され得る。
【０１９５】
「ＧＰＣＲＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一である必要ははない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＧＰＣＲＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＧＰＣＲＸの生物学的活性（ＧＰＣＲＸタンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の一部を単離し、ＧＰＣＲＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＧＰＣＲＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０１９６】
（ＧＰＣＲＸの核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含し、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＧＰＣＲＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１９７】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるヒトＧＰＣＲＸヌクレオチド配列に加えて、このＧＰＣＲＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＧＰＣＲＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＧＰＣＲＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＧＰＣＲＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＧＰＣＲＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてこのＧＰＣＲＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＧＰＣＲＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０１９８】
さらに、他の種由来のＧＰＣＲＸタンパク質をコードし、従って、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＧＰＣＲＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＧＰＣＲＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０１９９】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【０２００】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＧＰＣＲＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０２０１】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、不安定化剤の添加で達成され得る。
【０２０２】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであり、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０２０３】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０２０４】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０２０５】
（保存的変異）
集団中に存在し得るＧＰＣＲＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、このＧＰＣＲＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、コードされるＧＰＣＲＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、その生物学的活性を変更することなく、このＧＰＣＲＸタンパク質のの野生型配列から変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＧＰＣＲＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換がなされ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０２０６】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＧＰＣＲＸタンパク質は、アミノ酸配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に対して少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に対して少なくとも約７０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に対してして少なくとも約８０％相同であり；なおより好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に対して少なくとも約９０％相同であり；そして最も好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に対して少なくとも約９５％相同である。
【０２０７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のタンパク質に相同なＧＰＣＲＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０２０８】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＧＰＣＲＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＧＰＣＲＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＧＰＣＲＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０２０９】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のいずれかであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで、一文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るこれらのアミノ酸残基によりグループ化される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のいずれか１つで有り得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで、各群内の文字は、一文字アミノ酸コードを表する）。
【０２１０】
１つの実施形態では、変異ＧＰＣＲＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＧＰＣＲＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異ＧＰＣＲＸタンパク質と、ＧＰＣＲＸのリガンドとの間の複合体形成；（ｉｉｉ）変異ＧＰＣＲＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０２１１】
なお別の実施形態において、変異体ＧＰＣＲＸタンパク質は、特定の生物学的機能を調節する能力（例えば、インスリン放出の調節）についてアッセイされ得る。
【０２１２】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはＧＰＣＲＸコード鎖の全体、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のＧＰＣＲＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のＧＰＣＲＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０２１３】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０２１４】
本明細書中に開示されるＧＰＣＲＸタンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０２１５】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュード（プソイド）ウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０２１６】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原にそれらが特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０２１７】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のα−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に延びる（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０２１８】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸バックボーンが改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０２１９】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ  １９８８．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＧＰＣＲＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＧＰＣＲＸ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＧＰＣＲＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０２２０】
あるいは、ＧＰＣＲＸ遺伝子発現は、ＧＰＣＲＸ核酸の調節領域（例えば、ＧＰＣＲＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＧＰＣＲＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７−１５を参照のこと。
【０２２１】
種々の実施形態において、ＧＰＣＲＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１４６７０−１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０２２２】
ＧＰＣＲＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＧＰＣＲＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０２２３】
別の実施形態において、ＧＰＣＲＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＧＰＣＲＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核酸塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０２２４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０２２５】
（ＧＰＣＲＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に提供されるＧＰＣＲＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＧＰＣＲＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０２２６】
一般に、ＧＰＣＲＸ様機能を保持するＧＰＣＲＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換されている任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０２２７】
本発明の１つの局面は、単離されたＧＰＣＲＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＧＰＣＲＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＧＰＣＲＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＧＰＣＲＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０２２８】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＧＰＣＲＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＧＰＣＲＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＧＰＣＲＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＧＰＣＲＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＧＰＣＲＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＧＰＣＲＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＧＰＣＲＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＧＰＣＲＸタンパク質を約５％未満有する、ＧＰＣＲＸタンパク質の調製物を含む。ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのＧＰＣＲＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０２２９】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＧＰＣＲＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＧＰＣＲＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＧＰＣＲＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＧＰＣＲＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＧＰＣＲＸ化学物質を約５％未満有する、ＧＰＣＲＸタンパク質の調製物を含む。
【０２３０】
ＧＰＣＲＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＧＰＣＲＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＧＰＣＲＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＧＰＣＲＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＧＰＣＲＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＧＰＣＲＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＧＰＣＲＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０２３１】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＧＰＣＲＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０２３２】
１つの実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８のＧＰＣＲＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０２３３】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０２３４】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０２３５】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０２３６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＧＰＣＲＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＧＰＣＲＸ「キメラタンパク質」またはＧＰＣＲＸ「融合タンパク質」は、非ＧＰＣＲＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＧＰＣＲＸポリペプチドを含む。「ＧＰＣＲＸポリペプチド」は、ＧＰＣＲＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＧＰＣＲＸポリペプチド」は、ＧＰＣＲＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＧＰＣＲＸ融合タンパク質において、このＧＰＣＲＸポリペプチドは、ＧＰＣＲＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＧＰＣＲＸ融合タンパク質は、ＧＰＣＲＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＧＰＣＲＸ融合タンパク質は、ＧＰＣＲＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＧＰＣＲＸ融合タンパク質は、ＧＰＣＲＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＧＰＣＲＸポリペプチドおよび非ＧＰＣＲＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＧＰＣＲＸポリペプチドは、ＧＰＣＲＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０２３７】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＧＰＣＲＸ融合タンパク質であり、ここではＧＰＣＲＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＧＰＣＲＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０２３８】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＧＰＣＲＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＧＰＣＲＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０２３９】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＰＣＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＧＰＣＲＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＧＰＣＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＧＰＣＲＸリガントとＧＰＣＲＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＧＰＣＲＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。このＧＰＣＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＧＰＣＲＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＧＰＣＲＸリガンド／ＧＰＣＲＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＧＰＣＲＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＧＰＣＲＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＧＰＣＲＸリガンドを精製し、そしてＧＰＣＲＸリガンドとのＧＰＣＲＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０２４０】
本発明のＧＰＣＲＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＧＰＣＲＸをコードする核酸は、この融合成分がＧＰＣＲＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０２４１】
（ＧＰＣＲＸのアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＧＰＣＲＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＧＰＣＲＸアンタゴニストのいずれかとして、あるいはＧＰＣＲＸアゴニストとして機能するＧＰＣＲＸタンパク質の改変体に関する。ＧＰＣＲＸタンパク質の改変体（例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質の離散した点変異または短縮）が、変異誘発により生成され得る。ＧＰＣＲＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＧＰＣＲＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＧＰＣＲＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＧＰＣＲＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＧＰＣＲＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体における副作用がさらに少ない。
【０２４２】
ＧＰＣＲＸアゴニスト（すなわち、模倣物）、またはＧＰＣＲＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＧＰＣＲＸタンパク質の改変体は、ＧＰＣＲＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてＧＰＣＲＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＧＰＣＲＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＧＰＣＲＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、潜在的なＧＰＣＲＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＧＰＣＲＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的に連結することによって、産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＧＰＣＲＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＧＰＣＲＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０２４３】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＧＰＣＲＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＧＰＣＲＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＧＰＣＲＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＧＰＣＲＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法によって、ＧＰＣＲＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０２４４】
点変異または短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技術を、ＧＰＣＲＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技術であるリクルーシブアンセブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＧＰＣＲＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１を参照のこと。
【０２４５】
（抗ＧＰＣＲＸ抗体）
ＧＰＣＲタンパク質、またはＧＰＣＲＸタンパク質のフラグメントに対する抗体がまた本発明に含まれる。用語「抗体」とは、本明細書において用いる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない。一般に、ヒトから得た抗体分子は、この分子に存在する重鎖の性質がお互いに異なるクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのいずれかに関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）を有する。さらに、ヒトにおいては、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関する本明細書における言及は、ヒト抗体種のこのようなクラス、サブクラス、およびタイプの全てに関する言及を包含する。
【０２４６】
本発明の単離されたＧＰＣＲＸ関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフラグメントとして機能することが意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として用いられ得る。全長のタンパク質が用いられ得るが、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体が、全長タンパク質と、またはこのエピトープを含む任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを包含する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、または少なくとも１５アミノ酸残基、または少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域である；通常これらは親水性領域である。
【０２４７】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、ＧＰＣＲＸ関連タンパク質の表面上に位置するＧＰＣＲＸ関連タンパク質の領域、例えば、親水性領域である。ヒトＧＰＣＲＸ関連タンパク質配列の疎水性分析によって、ＧＰＣＲＸ関連タンパク質のどの領域が特に親水性であり、従って抗体産生を標的するのに有用な表面残基をコードする可能性が高いかが示される。抗体産生を標的するための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、Ｋｙｔｅ  ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、その各々がその全体として本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の１つ以上のドメインに対して特異的な抗体はまた、本明細書中で提供される。
【０２４８】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用され得る。
【０２４９】
当該分野において公知の種々の手順が、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対して指向されるポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，およびＬａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらの抗体のうちのいくつかは、以下で考察される。
【０２５０】
（ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）は、ネイティブなタンパク質、その合成改変体、または前記の誘導体を用いる１以上の注射によって免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を提示する化学的に合成されたポリペプチド、または組換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパク質は、免役されている哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。この調製物はさらに、アジュバントを含み得る。種々のアジュバントが免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。
【０２５１】
免疫原性タンパク質に対して指向されるポリクロナール抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティクロマトグラフィー（これは、主に免疫血清のＩｇＧ画分を提供する））によってさらに精製され得る。続いて、または代替的に、求められている免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはその抗原のエピトープがカラムに固定され、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡより発行）、第１４巻、第８号（２０００年４月１７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０２５２】
（モノクローナル抗体）
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる唯一の分子種の抗体分子を含む抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、すべての分子の集団に同一である。従って、ＭＡｂは、抗原への独特の結合親和性によって特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含む。
【０２５３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるような方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、免疫因子で代表的に免疫され、免疫因子に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０２５４】
免疫因子としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的には、以下のいずれかである：ヒト起源の細胞が望まれる場合は、末梢血リンパ球が使用され、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合は、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、適切な融合因子（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、リンパ球を不死化細胞株に融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）第５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、１以上の物質（融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する）を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親の細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマからの培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【０２５５】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合する細胞株であり、それらは選択された抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体の発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に敏感である。より好ましい不死化細胞株はマウス骨髄腫細胞株であり、それらを、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから得ることが可能である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載される（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）第５１−６３頁）。
【０２５６】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって決定されるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。好ましくは、標的抗原に対する高い程度の特異性および高結合親和性を有する抗体が、単離される。
【０２５７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、希釈手順を限定することによって、クローンをサブクローニングし得、そして標準的な方法によって増殖し得る。例えば、この目的のために適切な培養培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物内の腹水としてインビボで増殖され得る。
【０２５８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０２５９】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され得、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、次いでそれらは、宿主細胞（例えば、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする配列の置換（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４））によってか、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列のすべてまたは一部の配列をコードする免疫グロブリンへの共有結合的な連結によって改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常領域に置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換され得、キメラの二価抗体を作製する。
【０２６０】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトへの投与に適切である。抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗体の抗原結合配列）であり、それらは主にヒト免疫グロブリンの配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って達成され得る。（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと。）いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても、移入されたＣＤＲまたは骨格配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含む。これらの領域内で、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、そしてすべてまたは実質的にすべての骨格領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｒｉｅｃｈａｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０２６１】
（ヒト抗体）
ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の配列全体がヒト遺伝子から本質的に生じる抗体分子に、十分なヒト抗体は関連する。このような抗体を、「ヒト抗体」、または「十分なヒト抗体」と本明細書中で呼ぶ。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術によって調製され得る；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実行において使用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでのエプスタイン−バー−ウイルスを用いたヒトＢ細胞による形質転換によって（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。
【０２６２】
さらに、ヒト抗体はまた、さらなる技術（ファージディスプレイライブラリー（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む）を使用して産生され得る。同様に、ヒト免疫グロブリン位置をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活化されているマウス）に導入することによって、ヒト抗体は作製され得る。チャレンジの際にヒト抗体の産生が観察され、このことはすべての点（遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む）でヒトにおいて観察されたものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、およびＭａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０、７７９−７８３（１９９２））；Ｌｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、８１２−１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８４５−５１（１９９６））；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６））；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５））。
【０２６３】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答する動物の内因性抗体ではなく十分なヒト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を使用して、さらに産生され得る。（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと。）非ヒト宿主における重免疫グロブリン鎖および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は、耐えられなくなっており、そしてヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な位置は、宿主のゲノムに挿入される。例えば、不可欠なヒトＤＮＡセグメントを含む酵母人工染色体を使用して、ヒト遺伝子は組み込まれる。次いで、すべての所望の改変を提供する動物を、完全な改変の相補体よりもより少ない改変の相補体を含む中間トランスジェニック動物を交配することによって子孫として得る。このような非ヒト動物の好ましい実施形態は、マウスであり、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭと呼ばれる。この動物は、ヒト免疫グロブリンを十分に分泌するＢ細胞を産生する。目的の免疫原での免疫後の動物から（例えば、ポリクローナル抗体の調製物として）、あるいは動物由来の不死化されたＢ細胞（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ）から、抗体を直接得ることが可能である。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例えば、単鎖Ｆｖ分子）を得るために、さらに改変され得る。
【０２６４】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠く非ヒト宿主（マウスとして例証される）を作製するための方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。それを、以下の工程を包含する方法によって得ることが可能である：位置の再配列を防ぎ、そして再配列された免疫グロブリン重鎖位置の転写物の形成、および選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的化ベクターによって影響される欠失を防ぐために、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖位置由来のＪセグメント遺伝子を欠失する工程；およびトランスジェニックマウス（その体細胞および生殖細胞は、選択マーカーをコードする遺伝子を含む）を、胚幹細胞から作製する工程。
【０２６５】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示される。それは以下の工程を包含する：重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養中の１つの哺乳動物宿主細胞に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する工程、およびハイブリッド細胞を形成するために２つの細胞を融合する工程。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【０２６６】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０２６７】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術が、適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のための方法が適用され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメント（（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって産生されたＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって産生されたＦａｂフラグメント、および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定ない）は、当該分野で公知の技術によって産生され得る。
【０２６８】
（二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体（好ましくはヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたモノクローナル抗体）である。この場合において、結合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に対してである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、そして有利には細胞表面タンパク質あるいはレセプターまたはレセプターサブユニットである。
【０２６９】
二重特異的抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。伝統的に、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づき、ここでこの２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を作製し、このうち１つのみが正確な二重特異的構造を有する。この正確な分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。同様の手順は、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９において開示される。
【０２７０】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合物は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有し、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合のために必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。この免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、この免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物体に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の作製のさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０２７１】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するために操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側鎖と同一または同様のサイズの代償的な「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面上に生成される。このことは、ホモダイマーのような他の不必要な最終生成物よりも、ヘテロダイマーの収量を増加するための機構を提供する。
【０２７２】
二重特異的抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を作製するための技術は、文献において記載される。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を阻止するために、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、この作製されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換され、そしてこれは等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異的抗体を形成する。生成された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０２７３】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的にカップリングされて二重特異的抗体を形成する。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、そしてインビトロの指向性化学的カップリングに供され、二重特異的抗体を形成する。従って、形成されたこの二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解性活性を誘因し得る。
【０２７４】
組換え細胞培養物から直接二重特異的抗体フラグメントを作製し、そして単離するための種々の技術がまた、記載されてきた。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生される。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合される。この抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた、抗体ホモダイマーの産生のために使用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載されるこの「ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異的抗体フラグメントを作製するための代替的な機構を提供した。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成できないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対になるように強制され、これによって２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異的抗体フラグメントを作製するための別のストラテジーもまた、報告されてきた。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０２７５】
２より多くの結合価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２７６】
例示的な二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、このうち少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に起源を有する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームは、Ｔ細胞レセプター分子のような白血球（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、あるいはＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））上の標的化分子に結合するアームに、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御機構に焦点を合わせるように結合され得る。二重特異的抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性因子に指向するために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞傷害性因子または放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡ）に結合するアームを保有する。目的の別の二重特異的抗体は、本明細書中に記載のタンパク質抗原に結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０２７７】
（ヘテロ接合体抗体）
ヘテロ接合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不必要な細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されてきた。この抗体（架橋剤を含む抗体を含む）は、インビトロで、合成タンパク質化学において公知の方法を使用して調製され得ることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号において開示される試薬が挙げられる。
【０２７８】
（エフェクター機能操作）
本発明の抗体を、エフェクター機能について、例えば癌の処置における抗体の効力を増大するように改変することが望ましくあり得る。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入され得、これによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。従って、作製されるこのホモダイマー抗体は、改良されたインターナリゼーションの能力および／または増加した補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１−１１９５（１１９２）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増大した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０−２６５６（１９９３）に記載されるヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、これは二重のＦｃ領域を有し、そしてこれによって増大した補体溶解およびＡＤＣＣの能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０２７９】
（免疫接合体）
本発明はまた、細胞傷害性の薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素学的に活性な毒素、あるいはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性接合体））に結合した抗体を含む免疫接合体に関する。
【０２８０】
このような免疫接合体の作製において有用な化学療法剤は、上記に記載される。使用され得る酵素学的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎ）が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性結合した抗体の作製のために利用可能である。その例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２８１】
抗体および細胞傷害性因子の接合体は、種々の二官能性タンパク質結合因子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート  ＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ））、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製され得る。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０２８２】
別の実施形態において、腫瘍の前標的化における利用のために、この抗体は、「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に結合され得、ここで抗体−レセプター接合体は患者に投与され、続いて除去剤を使用して結合していない接合体が循環から除去され、次いで細胞傷害性因子に次々に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０２８３】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法としては、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選択は、このようなドメインを所有しているＧＰＣＲＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＧＰＣＲＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０２８４】
抗ＧＰＣＲＸ抗体は、ＧＰＣＲＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のＧＰＣＲＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０２８５】
抗ＧＰＣＲＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＧＰＣＲＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＧＰＣＲＸ抗体は、細胞からの天然のＧＰＣＲＸポリペプチド、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＧＰＣＲＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＧＰＣＲＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＧＰＣＲＸタンパク質を検出するために用いられて、ＧＰＣＲＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＧＰＣＲＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２８６】
（ＧＰＣＲＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＧＰＣＲＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０２８７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０２８８】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質、ＧＰＣＲＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０２８９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＧＰＣＲＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０２９０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２９１】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０２９２】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２９３】
別の実施形態において、ＧＰＣＲＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０２９４】
あるいは、ＧＰＣＲＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２９５】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２９６】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指示し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））。
【０２９７】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２９８】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０２９９】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０３００】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０３０１】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＧＰＣＲＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０３０２】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＧＰＣＲＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＧＰＣＲＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＧＰＣＲＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明はさらに、培地または宿主細胞からＧＰＣＲＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０３０３】
（トランスジェニックＧＰＣＲＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＧＰＣＲＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＧＰＣＲＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＧＰＣＲＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＧＰＣＲＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＧＰＣＲＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここで、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物を発生させた）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここで内因性のＧＰＣＲＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０３０４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＧＰＣＲＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ  ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヒトのＧＰＣＲＸ  ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＧＰＣＲＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＧＰＣＲＸ遺伝子）は、ヒトのＧＰＣＲＸ  ｃＤＮＡ（上記にさらに記載された）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＧＰＣＲＸタンパク質の発現を指示するように、ＧＰＣＲＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ  １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＧＰＣＲＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０３０５】
相同組換え動物を作製するために、ＧＰＣＲＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子は、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＧＰＣＲＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＧＰＣＲＸ遺伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＧＰＣＲＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７のヒトのＧＰＣＲＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＧＰＣＲＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＧＰＣＲＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０３０６】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＧＰＣＲＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＧＰＣＲＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＧＰＣＲＸ遺伝子の変更された部分は、ＧＰＣＲＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＧＰＣＲＸ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性ＧＰＣＲＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＧＰＣＲＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＧＰＣＲＸ遺伝子が内因性ＧＰＣＲＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。
【０３０７】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０３０８】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０３０９】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０３１０】
（薬学的組成物）
本発明のＧＰＣＲＸ核酸分子、ＧＰＣＲＸタンパク質、および抗ＧＰＣＲＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０３１１】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０３１２】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは、水溶性）または分散物、および滅菌注入可能溶液または分散物の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０３１３】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質または抗ＧＰＣＲＸ抗体）を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散物は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒と上記で列挙される成分から必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０３１４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０３１５】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０３１６】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０３１７】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０３１８】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０３１９】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０３２０】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる除放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０３２１】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０３２２】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、以下にさらに説明されるように、ＧＰＣＲＸタンパク質（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中の組換え発現ベクターを介する）を発現するため、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＧＰＣＲＸ遺伝子における遺伝子損傷を検出するため、ならびにＧＰＣＲＸ活性を調節するために使用され得る。さらに、ＧＰＣＲＸタンパク質は、ＧＰＣＲＸタンパク質の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびにＧＰＣＲＸタンパク質の不十分もしくは過剰な産生によって、あるいはＧＰＣＲＸ野生型タンパク質と比較して減少した活性もしくは異常な活性を有するＧＰＣＲＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る（例えば、糖尿病（インスリン放出を調節）；肥満（脂質に結合し輸送する）；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘ、ならびに拒食症、および、慢性疾患および種々の癌に関連した消耗性障害、および感染性疾患（抗菌活性を有する）、および種々の異脂肪血症）。さらに、本発明の抗ＧＰＣＲＸ抗体が、ＧＰＣＲＸタンパク質を検出および単離するため、ならびにＧＰＣＲＸ活性を調節するために使用され得る。さらなる局面において、本発明を、正の様式および負の様式の両方で、食欲、栄養吸収、および代謝物の廃棄に影響する方法で用い得る。
【０３２３】
本発明は、さらに、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤、および上記で本明細書中で記載されるような処置のためのそれらの使用に関する。
【０３２４】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＧＰＣＲＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質の発現またはＧＰＣＲＸタンパク質の活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにおいて同定された化合物を含む。
【０３２５】
１実施形態において、本発明は、ＧＰＣＲＸタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはその膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的に位置付け可能な並行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（例えば、Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照のこと）。
【０３２６】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０３２７】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０３２８】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において提示され得る。
【０３２９】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＧＰＣＲＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＧＰＣＲＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＧＰＣＲＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＧＰＣＲＸと結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３３０】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＧＰＣＲＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質が、ＧＰＣＲＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＧＰＣＲＸタンパク質が天然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＧＰＣＲＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内面と会合する分子、または細胞質分子である。ＧＰＣＲＸ標的分子は、非ＧＰＣＲＸ分子あるいは本発明のＧＰＣＲＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＧＰＣＲＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通る細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＧＰＣＲＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＧＰＣＲＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０３３１】
ＧＰＣＲＸタンパク質がＧＰＣＲＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質がＧＰＣＲＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞性セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＧＰＣＲＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０３３２】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイであり、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＧＰＣＲＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＧＰＣＲＸを結合する既知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、ＧＰＣＲＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０３３３】
なお別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＧＰＣＲＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質が、ＧＰＣＲＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＧＰＣＲＸタンパク質が、ＧＰＣＲＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０３３４】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＧＰＣＲＸタンパク質を結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＧＰＣＲＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＧＰＣＲＸタンパク質が、ＧＰＣＲＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０３３５】
本発明の無細胞アッセイは、ＧＰＣＲＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＧＰＣＲＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＧＰＣＲＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｅｔｈｅｒ）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０３３６】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適合させることが、所望され得る。試験化合物の、ＧＰＣＲＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＧＰＣＲＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＧＰＣＲＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および未吸着標的タンパク質またはＧＰＣＲＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＧＰＣＲＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０３３７】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＧＰＣＲＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチン化ＧＰＣＲＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＧＰＣＲＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＧＰＣＲＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＧＰＣＲＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内に捕捉され得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記で述べた方法に加えて、ＧＰＣＲＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＧＰＣＲＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０３３８】
別の実施形態において、ＧＰＣＲＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりもその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０３３９】
本発明のなお別の局面において、ＧＰＣＲＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＧＰＣＲＸ（「ＧＰＣＲＸ結合タンパク質」または「ＧＰＣＲＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＧＰＣＲＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＧＰＣＲＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＧＰＣＲＸ経路の上流または下流エレメントとしてＧＰＣＲＸタンパク質によるシグナル伝達に関与する可能性がある。
【０３４０】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＧＰＣＲＸをコードする遺伝子が既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「餌」および「餌食」タンパク質がインビボで相互作用して、ＧＰＣＲＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＧＰＣＲＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０３４１】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤（因子）および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤（因子）の使用に関する。
【０３４２】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得るが、これに限定されない。これらの適用のいくつかは、以下の節において記載される。
【０３４３】
（染色体マッピング）
一旦、遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上に遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＧＰＣＲＸ配列の一部またはフラグメント、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７、またはそのフラグメントもしくは誘導体を用いて、それぞれ、ＧＰＣＲＸ遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。ＧＰＣＲＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０３４４】
簡潔には、ＧＰＣＲＸ遺伝子は、ＧＰＣＲＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングし得る。ＧＰＣＲＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＧＰＣＲＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じる。
【０３４５】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、それらは特定の酵素を失うので、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体いずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる（例えば、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４を参照のこと）。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０３４６】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＧＰＣＲＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０３４７】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに使用して、一工程で正確な染色体位置を提供し得る。染色体スプレッドは、コルセミド（紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０３４８】
染色体マッピングの試薬は、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルは複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されており、従って、染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０３４９】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ  ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ  ＩＮ  ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで入手可能）において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定され得る。
【０３５０】
さらに、ＧＰＣＲＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の候補薬剤（因子）である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別し得る。
【０３５１】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＧＰＣＲＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０３５２】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＧＰＣＲＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０３５３】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＧＰＣＲＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０３５４】
本明細書中に記載の配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０３５５】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の場合においては、ＧＰＣＲＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＧＰＣＲＸの活性を決定するための診断アッセイに関し、これによって、異常なＧＰＣＲＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定する。この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々のガンと関連する消耗疾患。本発明はまた、個体が、ＧＰＣＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＧＰＣＲＸの遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され、これによってＧＰＣＲＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたは関連した障害の発病の前に、個体を予防的に処置し得る。
【０３５６】
本発明の別の局面は、個体におけるＧＰＣＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的試薬（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいて、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０３５７】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＧＰＣＲＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０３５８】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０３５９】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＧＰＣＲＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＧＰＣＲＸのタンパク質またはＧＰＣＲＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）とを接触させ、その結果、ＧＰＣＲＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＧＰＣＲＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＧＰＣＲＸ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＧＰＣＲＸの核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、および３７の核酸またはそれらの一部）（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＧＰＣＲＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは、本明細書において記載されている。
【０３６０】
ＧＰＣＲＸのタンパク質を検出するための薬剤（因子）は、ＧＰＣＲＸのタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによってそのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識された別の試薬との反応性によってそのプローブもしくは抗体の間接的な標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＧＰＣＲＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＧＰＣＲＸのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＧＰＣＲＸのタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＧＰＣＲＸのゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＧＰＣＲＸのタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＧＰＣＲＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０３６１】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０３６２】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物もしくは薬剤（因子）と接触させ、その結果、ＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０３６３】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＧＰＣＲＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＧＰＣＲＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤（因子）；そのサンプルにおいてＧＰＣＲＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおいて、標準と、ＧＰＣＲＸの量とを比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための指示書を備え得る。
【０３６４】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＧＰＣＲＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸の存在は、ＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険性を有する被験体についての診断指標である。本明細書において使用される場合「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０３６５】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（因子）（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを、決定し得る。例えば、このような方法を使用して、被験体が障害のための因子で有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連する障害のための因子を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸の存在は、この因子が投与されてＧＰＣＲＸの異常発現または異常活性に関連する障害が処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０３６６】
本発明の方法はまた、ＧＰＣＲＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険性を有するか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＧＰＣＲＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＧＰＣＲＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＧＰＣＲＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＧＰＣＲＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＧＰＣＲＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＧＰＣＲＸ遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＧＰＣＲＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＧＰＣＲＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＧＰＣＲＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＧＰＣＲＸタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＧＰＣＲＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＧＰＣＲＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＧＰＣＲＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０３６７】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＧＰＣＲＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら，１９９５  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＧＰＣＲＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＧＰＣＲＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０３６８】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０３６９】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＧＰＣＲＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失による特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０３７０】
他の実施形態において、ＧＰＣＲＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＧＰＣＲＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０３７１】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＧＰＣＲＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＧＰＣＲＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０３７２】
ＧＰＣＲＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＧＰＣＲＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する因子を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するために、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０３７３】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＧＰＣＲＸ  ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＧＰＣＲＸ配列（例えば、野生型ＧＰＣＲＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０３７４】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＧＰＣＲＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＧＰＣＲＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと。
【０３７５】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと。
【０３７６】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０３７７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８を参照のこと）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することは、望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ．６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０３７８】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＧＰＣＲＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において好都合に使用され得る。
【０３７９】
さらに、ＧＰＣＲＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０３８０】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＧＰＣＲＸ活性（例えば、ＧＰＣＲＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、障害（この障害は、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患を含む）を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＧＰＣＲＸタンパク質の活性、ＧＰＣＲＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＧＰＣＲＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。
【０３８１】
薬理ゲノム学は、罹患した人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂食後の溶血である。
【０３８２】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物によって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０３８３】
従って、ＧＰＣＲＸのタンパク質の活性、ＧＰＣＲＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＧＰＣＲＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な因子を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＧＰＣＲＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０３８４】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＧＰＣＲＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく臨床試験にも適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって、ＧＰＣＲＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＧＰＣＲＸ活性をアップレギュレートすることが決定される因子の効力は、減少したＧＰＣＲＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＧＰＣＲＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって、ＧＰＣＲＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＧＰＣＲＸの活性をダウンレギュレートすることが決定される因子の効力は、増加したＧＰＣＲＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＧＰＣＲＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＧＰＣＲＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関与する他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして使用され得る。
【０３８５】
例えば、ＧＰＣＲＸを含む遺伝子（これは、ＧＰＣＲＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する因子（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が同定され得るが、これらに限定されない。従って、細胞性増殖障害に対する因子の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＧＰＣＲＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＧＰＣＲＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この因子を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０３８６】
１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）因子の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＧＰＣＲＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、この因子の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＧＰＣＲＸの発現または活性を増加すること（すなわち、この因子の効力を増加すること）が望ましくあり得る。あるいは、この因子の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＧＰＣＲＸの発現または活性を減少すること（すなわち、この因子の効力を減少すること）が望ましくあり得る。
【０３８７】
（処置方法）
本発明は、異常なＧＰＣＲＸの発現または活性に関連する障害の危険性のある（または感受性である）か、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。これらの障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、先天性心欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損症、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満症、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新形成；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固能亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支炎ぜん息、クーロン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨形成異常症の処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０３８８】
これらの処置方法は、以下により詳細に記載される。
【０３８９】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０３９０】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０３９１】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３９２】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＧＰＣＲＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＧＰＣＲＸの発現または少なくとも１つのＧＰＣＲＸ活性を調節する因子をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＧＰＣＲＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＧＰＣＲＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＧＰＣＲＸ異常の型に依存して、例えば、ＧＰＣＲＸアゴニスト薬剤またはＧＰＣＲＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の小節において、さらに議論される。
【０３９３】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＧＰＣＲＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＧＰＣＲＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する因子と接触させる工程を包含する。ＧＰＣＲＸタンパク質活性を調節する因子は、核酸またはタンパク質、ＧＰＣＲＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＧＰＣＲＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような因子であり得る。１つの実施形態において、この因子は、ＧＰＣＲＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性なＧＰＣＲＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＧＰＣＲＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、ＧＰＣＲＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンスＧＰＣＲＸ核酸分子、および抗ＧＰＣＲＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その因子とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその因子を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＧＰＣＲＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される因子）あるいはそのような因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＧＰＣＲＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＧＰＣＲＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３９４】
ＧＰＣＲＸ活性の刺激は、ＧＰＣＲＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＧＰＣＲＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連障害）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠性疾患（例えば、プレクランプシア（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０３９５】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行って、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３９６】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に、適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３９７】
（本発明の組成物の予防的用途および治療的用途）
本発明のＧＰＣＲＸ核酸およびタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない種々の障害に関連する強力な予防的適用および治療的適用に有用である：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂肪性浮腫（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、ならびに慢性疾患および種々の癌と関連する消耗疾患。
【０３９８】
例えば、本発明のＧＰＣＲＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのタンパク質は、遺伝子治療を必要とする被験体に投与される場合、有用であり得る。非制限的例示として、本発明の組成物は、以下に罹患した患者の処置についての効力を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪血症。
【０３９９】
本発明のＧＰＣＲＸタンパク質をコードする新規の核酸、およびＧＰＣＲＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントは、診断適用にもまた有用であり得、ここで、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。さらなる用途は、抗菌分子としての用途である（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出されている）。これらの材料は、治療的または診断的な方法における用途に関する本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の生成においてさらに有用である。
【０４００】
（実施例）
（実施例１．ＧＰＣＲＸクローンの同定）
本発明において同定された全ての新規なＧＰＣＲＸ標的配列を、エキソン連結プロセスに供してこの配列を確認した。フォワードプライマーについては、利用可能な最も上流の配列で、そしてリバースプライマーについては利用可能な最も下流の配列で開始することによって、ＰＣＲプライマーを設計した。表１１Ａは、異なるクローンを得るために用いたＰＣＲプライマーの配列を示す。各々の場合において、この配列を試験した。この試験では、特有であるかもしくは非常に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで、またはリバースプライマーの場合には、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内側にウォーキングする。このようなプライマーは、全長ｃＤＮＡ、標的配列のＤＮＡもしくはタンパク質の配列の部分（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づいて、または他の種由来の、ヒト配列に密接に関連することが予想されたエキソンの変換された相同性によって、設計した。次いで、これらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づいたＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常、得られたアンプリコンを、ゲル精製し、クローニングし、そして高い冗長性に対して配列決定した。エキソン連結から誘導したＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ由来のｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。得られた細菌クローンは、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングされたオープンリーディングフレーム全体をカバーするインサートを有する。表１１Ｂは、これらの細菌クローンの列挙を示す。全てのクローンから得られた配列を、それ自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、そして公的なＥＳＴとアセンブルした。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブリについての成分として含まれるのは、このアセンブリの別の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であったときである。さらに、配列トレースを手動で評価し、そして必要な場合、補正のために編集した。これらの手順によって本明細書に報告した配列を得ている。
【０４０１】
【表１１Ａ】
2005500802.tif 000104
【０４０２】
【表１１Ｂ】
2005500802.tif 000105
2005500802.tif 000106
（実施例２．種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的な発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を用いて種々の正常なおよび病理由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含むマイクロタイタープレートを用いて評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。サンプルの種々の収集をこのプレート上でアセンブルし、そしてパネル１（正常な供給源およびガン供給源由来の細胞および細胞株を含む）、パネル２（組織由来の、特に外科的サンプル由来の、正常供給源および癌供給源由来のサンプルを含む）、パネル３（広範な種々の癌供給源由来のサンプルを含む）、パネル４（正常な細胞および炎症性状態に関連した細胞由来の細胞および細胞株を含む）、およびパネルＣＮＳＤ．０１（正常な脳および疾患の脳由来のサンプルを含む）と称する。
【０４０３】
第１に、ＲＮＡサンプルをβアクチンおよびＧＡＰＤＨのような構成的に発現される遺伝子に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたは約１ｎｇポリＡ＋）を、製造者のプロトコールに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）およびランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれ、カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、別個のプレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、対数スケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルが、蛍光の閾値レベル超えるサイクル）として記録し、所与のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差を、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、相対発現パーセントを、このＲＮＡの差の逆数をとって１００を掛けることにより得る。βアクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られたＣＴの平均値を、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従ってこのサンプルと比較して希釈した。
【０４０４】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。インプットとして標的配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ用のバージョンＩ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイに対して、プローブおよびプライマーを設計した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴｍは、プライマーＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズ７５ｂｐ〜１００ｂｐである。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、未結合の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを立証するために、質量分析によって評価した。フォワード（正方向）プライマーおよびリバース（逆方向）プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２００ｎＭであった。
【０４０５】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的クローンに特異的なプローブ、および標的プローブで多重化された別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００の１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比））、０．２５Ｕ／ｍｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素を含む）を用いて設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで以下の増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９０℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。
【０４０６】
パネル１についての結果においては、以下の略語を使用した：
ｃａ．＝癌（Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
＊＝転移から樹立した（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｍｅｔ＝転移（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞改変体（Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｖａｒｉａｎｔ）
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小（Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ）
ｓｑｕａｍ＝鱗状（Ｓｑｕａｍｏｕｓ）
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水（Ｐｌｅｕｒａｌ  Ｅｆｆｕｓｉｏｎ）
ｇｌｉｏ＝神経膠腫（Ｇｌｉｏｍａ）
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫（Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、そして
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）。
【０４０７】
（パネル２）
パネル２についてのプレートは一般に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との密接な協力において働く外科医によって得られたヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡからなる、２つのコントロールウェルおよび９４の試験サンプルを含む。この組織は、ヒト悪性腫瘍に由来し、そしてここに示した例では、多くの悪性組織が、この腫瘍に直に隣接する非癌組織から得た「マッチしたマージン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎｓ）」を有する。これらは、正常な隣接組織と名付けられ、そして以下の結果においては、これを「ＮＡＴ」と示している。腫瘍組織および「マッチしたマージン」は、２人の独立した病理学者（外科的病理学者および再度ＮＤＲＩまたはＣＨＩＮの病理学者によって）によって評価される。この分析によって、腫瘍分化グレードの全体的組織病理学的アセスメントが提供される。さらに、ほとんどのサンプルはもともとの外科病理学的報告を含み、これが患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらのマッチしたマージンを、周辺の（すなわち、直に近接している）組織から手術の領域へとる（表ＲＲにおいて、正常な隣接組織について、「ＮＡＴ」と命名した）。さらに、高齢者または突然死した犠牲者（事故など）で行った生検に由来する種々のヒト組織から、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを得た。これらの組織に疾患がないことを確認し、そして種々の商業的供給源（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ），Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。
【０４０８】
ガイドとして２８Ｓと１８ＳとのリボソームＲＮＡ染色強度の比（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を用いた、アガロースゲル電気泳動図の視覚的アセスメントによって、全てのサンプルからのＲＮＡの完全性を品質について管理する。単一のエキソンのスパンにわたって増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の非存在下において実行したＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、ゲノムＤＮＡの混入に対してサンプルを管理する。
【０４０９】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４のｃＤＮＡサンプルおよび２つのコントロールサンプルからなる。詳細には、これらのサンプルのうち９２は、培養したヒト癌細胞株に由来し、２つのサンプルはヒト初代小脳組織のものであり、２つがコントロールである。ヒト細胞株は一般に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩ、またはＧｅｒｍａｎ腫瘍細胞バンクから入手し、そして以下の組織群におさまっている：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頸部の癌、胃癌、結腸癌、肺癌、およびＣＮＳ癌細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞は、全て標準的な推奨される条件下で培養され、そして標準的な手順を用いてＲＮＡを抽出する。パネル３Ｄおよび１．３Ｄにおけるこの細胞株は、科学論文において用いられた最も通常の細胞株である。
【０４１０】
ガイドとして２８Ｓと１８ＳとのリボソームＲＮＡ染色強度の比（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を用いた、アガロースゲル電気泳動図の視覚的アセスメントによって、全てのサンプルからのＲＮＡの完全性を品質について管理する。単一のエキソンのスパンにわたって増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の非存在下において実行したＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、ゲノムＤＮＡの混入に対してサンプルを管理する。
【０４１１】
（パネル４）
パネル４は、９６ウェルプレート（２つがコントロールウェル、９４が試験サンプル）上にサンプルを含む。これは、炎症性状態に関する種々のヒト細胞株または組織から単離されたＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）からなる。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常組織由来の総ＲＮＡを使用した。肝硬変患者からの肝臓組織および狼瘡患者からの腎臓由来の総ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から得た。クローン病および潰瘍性大腸炎を有すると診断された患者由来のＲＮＡ調製のために、腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０４１２】
星状細胞、肺線維芽細胞、真皮線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管真皮内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞を全てＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型に対して供給された培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、種々のサイトカイン、またはサイトカインの組み合わせを用いて、示したように、６時間および／または１２〜２４時間、活性化した。以下のサイトカインを用いた；ＩＬ−１β（約１〜５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（約２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）。０．１％血清を含有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓ由来の基本培地中での培養によって、内皮細胞を時に、異なる時間の間、飢餓させた。
【０４１３】
Ｆｉｃｏｌｌを用いて、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの勤務者の血液から単核球を調製した。ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびインターロイキン２における４〜６日間の培養によって、これらの細胞からＬＡＫ細胞を調製した。次いで、１０〜２０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ、および１〜２μｇ／ｍｌイオノマイシン、ＩＬ−１２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１８（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて６時間、細胞を活性化した。いくつかの場合、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、ＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）またはＰＷＭ（ヤマゴボウマイトジェン）（約５μｇ／ｍｌ）とともに、単核球細胞を４〜５日間培養した。ＲＮＡ調製のためにサンプルを２４時間、４８時間、および７２時間で採取した。２人のドナーから血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌを用いて単核球を単離し、そしてＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で、最終濃度約２×１０６細胞／ｍｌで、単離された単核球を１：１に混合することによって、ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを得た。ＭＬＲを培養して、ＲＮＡ調製のために１〜７日の範囲の種々の時点でサンプルを採取した。
【０４１４】
製造業者の指示に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｅａｄｓ，＋ｖｅ  ＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを用いて単核球から単球を単離した。ＤＭＥＭ５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌＧＭＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって、単球を樹状細胞に分化させた。ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％ＡＢヒト血清またはＭＣＳＦ（約５０ｎｇ／ｍｌ）中での５〜７日間の単球の培養によって、マクロファージを調製した。単球、マクロファージ、および樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌでリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いて６時間、および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０４１５】
ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、ポジティブＶＳ選択カラム、およびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを、製造業者の指示に従って用いて、単核球からＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球、およびＮＫ細胞も単離した。ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよびポジティブ選択を用いて、単核球のＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４、およびＣＤ１９細胞を枯渇することによって、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのＣＤ４のリンパ球を単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを用いて、ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球である細胞を残したままで、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を、単離した。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４、およびＣＤ８のリンパ球をＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）に入れ、そしてＦａｌｃｏｎ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートし、これをＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ）を用いて一晩コーティングした。ＲＮＡ調製のために、６時間後、および２４時間後に、この細胞を収集した。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８被覆したプレートおよび抗ＣＤ３被覆したプレートで４日間、単離したＣＤ８リンパ球を活性化し、次いでこの細胞を回収して、それをＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで増殖したＣＤ８細胞を、４日間抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合したプレートで再度活性化し、前のように増殖させた。第二の活性化後、６時間および２４時間で、そして第二の増殖培養の４日後、ＲＮＡを単離した。単離したＮＫ細胞を、ＲＮＡの調製の前に、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２中で４〜６日間培養した。
【０４１６】
Ｂ細胞を得るために、ＮＤＲＩから扁桃を獲得した。扁桃を無菌解剖鋏によって切り出し、次に篩いを通過させた。次いで、扁桃細胞をスピンダウンして、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化するために、本発明者らは、ＰＷＭ（５μｇ／ｍｌ）、または抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。ＲＮＡ調製のために、２４時間、４８時間、および７２時間で細胞を収集した。
【０４１７】
初代および二代目のＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するため、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および２μｇ／ｍｌＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）を用いて、６ウェルＦａｌｃｏｎプレートを一晩コーティングし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で、１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。Ｔｈ１を指向するために、ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ４（１μｇ／ｍｌ）を用い、一方、Ｔｈ２を指向するためにＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を用い、そしてＴｒ１を指向するためにＩＬ−１０を５ｎｇ／ｍｌで用いた。４〜５日後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。この後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１リンパ球を、上記のように、ただし、アポトーシスを防ぐための抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の添加を伴って、抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインとともに５日間、再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いでＩＬ−２とともに、再度４〜７日間増殖させた。活性化したＴｈ１およびＴｈ２のリンパ球を、最大３回のサイクルまでこの方式で維持した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂを結合したプレートでの第二および第三の活性化の後６時間後および２４時間後、、そしてインターロイキン２における第二および第三の増殖の４日後に、初代および二代目のＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒ１からＲＮＡを調製した。
【０４１８】
以下の白血球細胞株を、ＡＴＣＣ：Ｒａｍｏｓ，ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２から得た。ＥＯＬ細胞を、０．１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ中での８日間５×１０５細胞／ｍｌでの培養、３日ごとの培地の交換、および細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調節することによってさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを（ＡＴＣＣによって推奨されるように）、５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）の添加を伴って、用いた。休止している細胞、または６時間および１４時間、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で活性化した細胞のいずれかから、ＲＮＡを調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６、および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２も、ＡＴＣＣから得た。この両方をＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。約５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１βを用いて６時間および１４時間、ＣＣＤ１１０６細胞を活性化し、一方、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγ。
【０４１９】
これらの細胞株および血球について、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて約１０７細胞／ｍｌを溶解することによってＲＮＡを調製した。要するに、１／１０容積のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温で１０分の後に、このチューブをＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で１４，０００ｒｐｍでスピンした。水相を取り出し、そして１５ｍｌＦａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等容積のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃に一晩残した。沈殿したＲＮＡを、１５分間Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で９，０００ｒｐｍでスピンダウンし、そして７０％エタノール中で洗浄した。このペレットを３００μｌのＲＮＡｓｅを含有しない水に再溶解し、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ  ＤＴＴ、７μｌ  ＲＮＡｓｉｎおよび８μｌ  ＤＮＡｓｅを添加した。このチューブを３７℃で３０分間インキュベートし、混入しているゲノムＤＮＡを除去し、フェノールクロロホルムで１回抽出し、そして１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウム、および２容積の１００％エタノールで再沈殿させた。このＲＮＡをスピンダウンし、そしてＲＮＡｓｅを含有しない水に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０４２０】
（パネル  ＣＮＳＤ．０１）
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートには、２つのコントロールウェルおよび９４の試験サンプル（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した死後のヒト脳組織から単離したｃＤＮＡからなる）を含む。脳を、死後４時間〜２４時間の間にドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者によって切片化し、そして液体窒素蒸気中で−８０℃で凍結させた。全ての脳を神経病理学者によって切片化して試験し、明確に関連した神経病理学によって診断を確認した。
【０４２１】
疾患診断を患者記録から得る。このパネルは、以下の各々の診断由来の２つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｙ）、抑うつ、および「正常なコントロール（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」。これらの脳の各々において、以下の領域が示される：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマンエリア（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）４（一次運動条）、ブロードマンエリア（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）７（頭頂葉皮質）、ブロードマンエリア（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）９（前前頭皮質）、およびブロードマンエリア（Ｂｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）１７（後頭皮質）。全ての場合に全ての脳領域を示すわけではない；例えば、ハンティングトン舞踏病は、淡蒼球における神経変性によって部分的に特徴付けられる。従って、この領域は、確認されたハンティングトン舞踏病の症例から入手することが不可能である。同様にパーキンソン病は、黒質の変性によって特徴付けられ、このことがこの領域を入手することをさらに困難にする。正常なコントロールの脳を神経病理学について試験し、そして神経変性と合致するいかなる病理もないことを見出した。
【０４２２】
ガイドとして２８Ｓと１８ＳとのリボソームＲＮＡ染色強度の比（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）、および分解産物の指標となる低分子量ＲＮＡの非存在を用いた、アガロースゲル電気泳動図の視覚的アセスメントによって、全てのサンプルからのＲＮＡの完全性を品質について管理する。単一のエキソンのスパンにわたって増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の非存在下において実行したＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、ゲノムＤＮＡの混入に対してサンプルを管理する。
【０４２３】
ＣＮＳパネルにおいて組織を同定するために使用した表示においては、以下の略号を用いる：
ＰＳＰ＝進行性核上麻痺
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球（Ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝側頭極（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐｏｌｅ）
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回（Ｃｉｎｇｕｌａｔｅ  ｇｙｒｕｓ）
ＢＡ  ４＝ブロードマンエリア（Ｖｒｏｄｍａｎ  Ａｒｅａ）４
（実施例２Ａ．ＧＰＣＲ１（ｂａ６４ｐ１４−ＡまたはＣＧ５６８５３−０１としても公知））：
表１２Ａに記載したプライマー−プローブセットＡｇ１２５７を用いて、遺伝子ＧＰＣＲ１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１２Ｂ、１２Ｃ、および１２Ｄに示す。
【０４２４】
【表１２Ａ】
2005500802.tif 000107
【０４２５】
【表１２Ｂ】
2005500802.tif 000108
2005500802.tif 000109
2005500802.tif 000110
【０４２６】
【表１２Ｃ】
2005500802.tif 000111
2005500802.tif 000112
2005500802.tif 000113
2005500802.tif 000114
【０４２７】
【表１２Ｄ】
2005500802.tif 000115
2005500802.tif 000116
2005500802.tif 000117
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２５７）同じプライマー／プローブセットを用いた複製（反復）実験からの結果は、合理的な一致をみた。このパネルにおけるＧＰＣＲ１遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、肺癌細胞株において最高の発現が見出された。ＧＰＣＲ１遺伝子の発現は、正常なコントロールと比較して癌由来の培養細胞株において高い。詳細には、卵巣癌細胞株の３／６において、肺癌細胞株の５／１０、および単一の腎臓癌細胞株において、さらに高いＧＰＣＲ１遺伝子発現が存在し、このことは、この遺伝子が、これらの疾患の病因において役割を果たし得ることを示す。従って、ＧＰＣＲ１遺伝子の治療的調節が、腎臓、卵巣、および肺の癌の処置において有用であり得る。正常組織の間でも、ＧＰＣＲ１遺伝子は、唾液腺、膀胱、および腎臓で発現される。さらに、複製実験の１つでは、ＧＰＣＲ１遺伝子が、ＣＮＳにおいて、特に黒質および海馬において低レベルで発現される。いくつかの神経伝達物質レセプターはＧＰＣＲであり、これには、ドーパミンレセプターファミリー、セロトニンレセプターファミリー、ＧＡＢＡレセプター、ムスカリン性アセチルコリンレセプターなどが挙げられる。海馬は、長期記憶形成に重要である脳の領域であり、アルツハイマー病では顕著な神経変性を示し、そして精神分裂病、双極性障害、および抑うつの病理に関与している。従って、ＧＰＣＲ１タンパク質の治療的調節および／または活性化／拮抗作用（アンタゴニズム）は、これらの疾患の１つ以上において有利な効果を有し得る。パーキンソン病における黒質変性と同様に、このタンパク質の調節は、この疾患の処置においても有用であり得る。
【０４２８】
（パネル４Ｄ／４Ｒのまとめ：Ａｇ１２５７）ＧＰＣＲ１転写物の発現プロフィールを、同じプローブ／プライマーセットを用いて異なる３つの時間で試験し、そしてこの結果は良好な一致をみた。この転写物は、γインターフェロン処理した真皮線維芽細胞において高度に発現され、そしてこのサイトカインで処理された真皮線維芽細胞において誘導されるＧＰＣＲをコードする。これはまたγインターフェロン処理した肺線維芽細胞において誘導される。このプロフィールは、このＧＰＣＲの発現が、喘息、気腫、アレルギー、乾癬、およびウイルス感染（γインターフェロンが存在する場合）の結果として上方制御され得ることを示す。従って、ＧＰＣＲ１遺伝子によってコードされるＧＰＣＲの機能をブロックする抗体または低分子治療剤は、これらの疾患に関連する炎症および炎症に起因する組織再構築を軽減または阻害し得る。大腸炎１サンプルにおいて検出された発現は、ゲノムＤＮＡ汚染（混入）によって歪まされることに注意すること。
【０４２９】
（実施例２Ｂ．ＧＰＣＲ２ａ（ｂａ６４ｐ１４−Ｂとしても公知）：）
ＧＰＣＲ２ａ遺伝子の発現を、表１３Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１２５８を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１３Ｂに示す。
【０４３０】
【表１３Ａ】
2005500802.tif 000118
【０４３１】
【表１３Ｂ】
2005500802.tif 000119
2005500802.tif 000120
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２５８）このパネルにおけるＧＰＣＲ２ａ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、多数の正常組織（内皮細胞、膵臓、骨格筋、副腎、唾液腺、下垂体、脳（扁桃、海馬、および視床）、脊髄、胃、膀胱、腎臓（成体および胎児）、胎盤、前立腺、および精巣を含む）において、ＧＰＣＲ２ａ遺伝子の低〜中度の発現（ＣＴ値＝３２〜３５）が検出される。さらに、ＧＰＣＲ２ａ遺伝子の発現は、正常な肺組織に比べて肺癌細胞株の６／１０において高度である。従って、ＧＰＣＲ２ａ遺伝子の治療的調節は、肺癌の処置において有用であり得るか、あるいはこの遺伝子は、肺癌の診断において有用であり得る。扁桃体、海馬、視床、および脊髄における発現によって、ＧＰＣＲ２ａの遺伝子が、正常な神経系機能において役割を果たし得、そして神経学的疾患において制御され得ないことが示唆される。前に言及されたように、ＧＰＣＲ２ａの遺伝子はまた、骨格筋（ＣＴ値＝３２．５）、および膵臓（ＣＴ値＝３３．６）において低〜中度の発現を示す。骨格筋および膵臓β細胞は、インスリン反応性の組織であり、このことは、この遺伝子産物がインスリンによって調節され得、そして身体の代謝制御に重要であり得ることを示す。さらに、ＧＰＣＲ２ａ遺伝子は、下垂体において中度の発現を示し、これが、下垂体後葉において、下垂体刺激性のホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ソマトクリニン、ゴナドドトロピン放出ホルモン（生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン）、コルチコトロピン放出ホルモン（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン））に対する応答を通じて、そして下垂体前葉において末梢ホルモン（例えば、エストロゲン、テストステロンなど）に対する応答を通じて、内分泌をかなり制御する。下垂体の病態生理学に関連した多数の疾患（甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症、巨人症、小人症、末端肥大症、アジソン病、クッシング病、尿崩症）が存在する。そしてＧＰＣＲ２ａ遺伝子によってコードされるＧＰＣＲの治療的調節、アンタゴニズム（拮抗作用）、または刺激は、これらの疾患の１つ以上の処置において有用であり得る。さらに、ＧＰＣＲ２ａ遺伝子産物の治療的調節は、１型糖尿病および２型糖尿病、ならびに膵臓および下垂体に関与する全ての他の内分泌障害の処置において有用であり得る。
【０４３２】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２５８）ＧＰＣＲ２ａ遺伝子の発現は、このパネルにおける全てのサンプルにおいて低〜検出不能（Ｃｔ値＞３５）である。
【０４３３】
（実施例２Ｃ．ＧＰＣＲ３（ｂａ６４ｐ１４−Ｃとしても公知）：）
遺伝子ＧＰＣＲ３の発現を、表１４Ａにおいて記載されたプライマー−プローブセットＡｇ１２５９を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１４Ｂに示す。
【０４３４】
【表１４Ａ】
2005500802.tif 000121
【０４３５】
【表１４Ｂ】
2005500802.tif 000122
2005500802.tif 000123
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２５９）このパネルにおけるＧＰＣＲ３遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、この遺伝子は、海馬、膀胱、および胎児腎臓を含む２〜３の正常組織でのみ低レベルで発現される。ＧＰＣＲ３遺伝子の過剰発現は、このパネルの癌細胞株のいずれにおいても検出されない。成体腎臓と比べた場合、胎児腎臓における低いが有意な発現が存在するようである。従って、ＧＰＣＲ３遺伝子は、腎臓の発達において役割を果たし得、そしてこの遺伝子の治療的調節は、腎臓の障害の処置において有用性を有し得る。この遺伝子産物はまた、他の組織から胎児腎臓を識別するために有用であり得る。
【０４３６】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２５９）ＧＰＣＲ３遺伝子の発現は、ＩＢＤ大腸炎を除いて、このパネル上の全てのサンプルにおいて低〜検出不能（ＣＴ値＞３５）である；しかしこのサンプルは、ゲノムＤＮＡが混入していると考えられ、従って無視されるべきであり、そのためデータは示していない。
【０４３７】
（実施例２Ｄ．ＧＰＣＲ４ｃ（ｂａ６４ｐ１４−Ｄとしても公知）：）
表１５Ａに記載されたプライマー−プローブセットＡｇ１２６０を用いて遺伝子ＧＰＣＲ４ｃの発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を、表１５Ｂおよび１５Ｃに示す。
【０４３８】
【表１５Ａ】
2005500802.tif 000124
【０４３９】
【表１５Ｂ】
2005500802.tif 000125
2005500802.tif 000126
【０４４０】
【表１５Ｃ】
2005500802.tif 000127
2005500802.tif 000128
2005500802.tif 000129
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６０）このパネルにおけるＧＰＣＲ４ｃ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、いくつかのタイプの癌に由来する培養された細胞株において特異的な発現が存在するようである。ｂａ６４ｐ１４−Ｅ遺伝子の発現は、精巣を除いて、いずれの正常組織においても検出されない。しかし、卵巣癌および肺癌の細胞株においては中度の発現が存在し、このことは、この遺伝子が、これらの疾患の病原において役割を果たし得ることを示す。従って、この遺伝子の治療的な調節は、卵巣癌および肺癌の処置において有用であり得る。
【０４４１】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２６０）ＧＰＣＲ４ｃ転写物の発現プロフィールを、同じプローブ／プライマーセットを用いて２つの異なる時間に試験し、そして結果は合理的な一致をみた。この遺伝子は、γインターフェロンおよびＩＬ−４で処理した真皮線維芽細胞において高度に発現され、そしてこれらのサイトカインで処理した真皮線維芽細胞株において誘導されるＧＰＣＲをコードする。これはまた、γインターフェロン処理した肺線維芽細胞において誘導される。このプロフィールは、このＧＰＣＲの発現が、喘息、気腫、およびアレルギー（高レベルのＩＬ−４が存在する場合）の間、または乾癬およびウイルス感染（高レベルのγインターフェロンが存在する場合）の間、上方制御され得ることを示す。従って、ＧＰＣＲ４ｃ遺伝子によってコードされるＧＰＣＲの機能をブロックする抗体または低分子治療剤は、これらの疾患に関連する炎症および炎症に起因する組織再構築を軽減または阻害し得る。
【０４４２】
（実施例Ｅ．ＧＰＣＲ５ｂ（ｂａ６４ｐ１４−ＥまたはＣＧ５０３８５−０１としても公知）：）
遺伝子ＧＰＣＲ５ｂの発現を、表１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃに記載されたプライマー−プローブセットであるＡｇ１２６１、Ａｇ１２６１ｂ、およびＡｇ１２６１ｃを用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表１６Ｄ、１６Ｅ、１６Ｆ、１６Ｇ、１６Ｈ、および１６Ｉに示す。
【０４４３】
【表１６Ａ】
2005500802.tif 000130
【０４４４】
【表１６Ｂ】
2005500802.tif 000131
【０４４５】
【表１６Ｃ】
2005500802.tif 000132
【０４４６】
【表１６Ｄ】
2005500802.tif 000133
2005500802.tif 000134
2005500802.tif 000135
2005500802.tif 000136
【０４４７】
【表１６Ｅ】
2005500802.tif 000137
2005500802.tif 000138
【０４４８】
【表１６Ｆ】
2005500802.tif 000139
2005500802.tif 000140
2005500802.tif 000141
【０４４９】
【表１６Ｇ】
2005500802.tif 000142
2005500802.tif 000143
2005500802.tif 000144
2005500802.tif 000145
【０４５０】
【表１６Ｈ】
2005500802.tif 000146
2005500802.tif 000147
2005500802.tif 000148
【０４５１】
【表１６Ｉ】
2005500802.tif 000149
2005500802.tif 000150
2005500802.tif 000151
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６１）同じプライマー／プローブセットを用いた複製（反復）実験からの結果は、お互いに一致している。このパネルにおけるＧＰＣＲ５ｂ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、いくつかのタイプの癌由来の培養された細胞株において特異的な発現が存在するようである。いずれの正常な組織においてもＧＰＣＲ５ｂ遺伝子の発現は検出されない。しかし、卵巣癌、肺癌、および腎臓癌の細胞株において中度の発現が存在し、このことは、この遺伝子が、これらの疾患の病因において役割を果たし得ることを示す。従って、この遺伝子の治療的調節は、腎臓癌、卵巣癌および肺癌の処置において有用であり得る。
【０４５２】
（パネル１．３Ｄのまとめ：Ａｇ１２６１ｂ）このパネル上のＧＰＣＲ５ｂ遺伝子の発現は、脾臓に限定されている（ＣＴ＝３４．６）。これは、ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子が、脾臓の免疫機能、または脾臓の主な免疫機能に関連しない脾臓の機能に関与することを示唆し得る。従って、この遺伝子の発現の治療的調節は、免疫障害、または脾臓に関連した他の障害の処置において有用であり得る。ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子の産物は、他の組織から脾臓を識別するために用いられ得る。
【０４５３】
（パネル２Ｄのまとめ：Ａｇ１２６１）ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子発現レベルにおけるの有意な可変性は、おそらく検出された低レベルの発現に起因して、複数の実験で検出される。この遺伝子は、パネル２Ｄにおいて非常に低レベルで発現されるようである。しかし、卵巣癌、乳癌、腎臓癌、および結腸癌のサンプルにおいて、その正常なコントロールと比較した場合、検出可能な発現が存在する。従って、この遺伝子の発現の治療的な調節は、これらのタイプの癌の処置において有用であり得る。
【０４５４】
（パネル２．２のまとめ：Ａｇ１２６１ｂ）ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低〜検出不能である（Ｃｔ値＞３５）。
【０４５５】
（パネル４Ｄ／４．１Ｄ／４Ｒのまとめ：Ａｇ１２６１／１２６１ｂ／１２６１ｃ）ＧＰＣＲ５ｂ転写物の発現プロフィールを、３つの異なるプローブ／プライマーセットを用いて８つの異なる時間で試験した。この転写物は、線維芽細胞において、および大腸炎１において発現される。この発現のレベルは、いくつかの試行では低いが、パターンは一定である。ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子は、γインターフェロンおよびＩＬ−４で処理した真皮線維芽細胞株において高度に発現され、そしてこれらのサイトカインで処理された真皮線維芽細胞において誘導もされるＧＰＣＲをコードする。これはまた、γインターフェロン処理した肺線維芽細胞においても誘導される。このプロフィールは、このＧＰＣＲの発現が、喘息、気腫、およびアレルギー（高レベルのＩＬ−４が存在する場合）の間、または乾癬、大腸炎、もしくはウイルス感染（高レベルのγインターフェロンが存在する場合）の間、上方制御され得ることを示す。従って、ＧＰＣＲ５ｂ遺伝子によってコードされるＧＰＣＲの機能をブロックする抗体または低分子治療剤は、炎症および炎症に起因する組織再構築を軽減または阻害し得る。Ｂｉｓｐｉｎｇ  Ｇ．，Ｌｕｇｅｒｉｎｇ  Ｎ．，Ｌｕｔｋｅ−Ｂｒｉｎｔｒｕｐ  Ｓ．，Ｐａｕｅｌｓ  Ｈ．Ｇ．，Ｓｃｈｕｒｍａｎｎ  Ｇ．，Ｄｏｍｓｃｈｋｅ  Ｗ．，Ｋｕｃｈａｒｚｉｋ  Ｔ．（２００１）を参照のこと。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者は、腸管上皮細胞と同時培養された末梢ＣＤ８＋リンパ球において、細胞内インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の誘導能の増大を示す（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｎｏｌ．１２３：１５〜２２）。
【０４５６】
腸管上皮細胞は、ＩＢＤの間、重要な役割を果たすようである。上皮細胞と固有層単核球との間の細胞相互作用のネットワークは、まだ完全には理解されていない。以下の同時培養モデルにおいて、本発明者らは、ＩＢＤを有する患者、および健康なコントロール由来の細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞のサイトカイン発現に対する腸管上皮細胞の影響を検討した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配によって精製し、続いて直接接触でマルチウェル細胞培養物挿入プレートにおいて上皮細胞とともに同時インキュベートし、そしてトランスウェルフィルターによって分離した。本発明者らは、Ｃａｃｏ−２細胞、および外科的標品から得た新鮮に単離した結腸上皮を用いた。ＰＢＭＣの収集、刺激、ならびに抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＩＦＮγ、および抗ＩＬ−４を用いた染色後、３色免疫蛍光フローサイトメトリーを実施した。ＩＢＤを有する患者（クローン病（ＣＤ）、ｎ＝１２；潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、ｎ＝１６）、および健常コントロール（ｎ＝１０）を、この研究に含んだ。Ｃａｃｏ−２細胞との同時インキュベーションの２４時間後、本発明者らは、ＩＢＤを有する患者におけるＩＦＮγ誘導性ＣＤ８＋リンパ球の有意な増大を見出した。対照的に、健常なコントロールは、上皮刺激に応答しなかった。ＣＤとＵＣとの間、または活動期の疾患と非活動期の疾患との間に、有意な差異は見出されなかった。ＵＣを有する患者においてＩＦＮγ＋／ＣＤ８＋リンパ球の有意な増大がまた、結腸陰窩（ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃｒｙｐｔ）細胞の初代培養物とともに直接同時インキュベーションした後に見られた。観察された上皮リンパ球相互作用は、ＭＨＣ  Ｉ拘束されるようである。ＰＢＭＣ  ＣＤ４＋サブセットにおいて、サイトカイン発現に対する有意な上皮細胞媒介性の効果は検出されなかった。非活動的な疾患状態においてさえ、ＩＢＤを有する患者は、腸管上皮細胞によって媒介されたＣＤ８＋リンパ球におけるＩＦＮγ誘導の能力の増大を発揮した。この機構は、慢性の腸管炎症の間に重要であり得、変化した粘膜障壁機能の場合と同様、上皮細胞は、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋リンパ球の標的となり得る。例えば、ＰＭＩＤ：１１１６７９９２を参照のこと。
【０４５７】
（実施例Ｆ．ＧＰＣＲ６ｂ（ｂａ６４ｐ１４−ＦまたはＣＧ５７０３４−０１としても公知）：）
表１７Ａおよび１７Ｂに記載したプライマー−プローブセットＡｇ１２６２（Ａｇ２０２６と同一配列）、およびＡｇ２３７０を用いて、遺伝子ＧＰＣＲ６ｂの発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表１７Ｃおよび１７Ｄに示す。
【０４５８】
【表１７Ａ】
2005500802.tif 000152
【０４５９】
【表１７Ｂ】
2005500802.tif 000153
【０４６０】
【表１７Ｃ】
2005500802.tif 000154
2005500802.tif 000155
【０４６１】
【表１７Ｄ】
2005500802.tif 000156
2005500802.tif 000157
2005500802.tif 000158
2005500802.tif 000159
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６２）このパネルにおけるＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、肺癌細胞株において最高の発現が検出される。興味深いことに、肺癌細胞株の５／１０、および卵巣癌細胞株の４／６において高い発現が存在するようであり、このことは、この遺伝子の発現が、これらの疾患の病理に関連し得ることを示す。対照的に、正常な肺および卵巣のサンプルにおいてｍＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の発現はほとんどない。従って、ＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の治療的調節は、肺癌および卵巣癌の処置において有用性を示し得る。あるいは、この遺伝子は、肺癌および卵巣癌の診断において有用なマーカーであり得る。ＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の低い発現がまた、以下の正常組織において検出される：海馬、胃、膀胱、および精巣。
【０４６２】
（パネル１．３Ｄのまとめ：Ａｇ２０２６／Ａｇ２３７０）ＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の発現は、このパネルにおける全てのサンプルにおいて低〜検出不能である（Ｃｔ値＞３５）。
【０４６３】
（パネル２．２のまとめ：Ａｇ２３７０）ＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低〜検出不能である（Ｃｔ値＞３５）。
【０４６４】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２６２）ＧＰＣＲ６ｂ遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低〜検出不能である（Ｃｔ値＞３５）。（Ａｇ２３７０／Ａｇ２０２６）ＧＰＣＲ６ｂ転写物は、ＩＬ−４およびγインターフェロンで処理した線維芽細胞で発現される。ＩＬ−４によるか、またはγインターフェロンによる転写物の誘導がまた、ＣＣＤ１０７０細胞株および肺線維芽細胞においてみられる。ＩＬ−４による肺線維芽細胞でのこの転写物の誘導は、Ａｇ２３７０プローブおよびプライマーセットを用いて検出不能である。従って、この転写物によってコードされるＧＰＣＲは、γインターフェロンまたはＩＬ−４に対する線維芽細胞の応答において重要であり得る。抗体または低分子治療剤を用いたこのＧＰＣＲの機能のブロックは、これらの組織における炎症を軽減または阻害し得、そして乾癬、アレルギー、喘息、および気腫の処置において重要であり得る。
【０４６５】
（実施例Ｇ．ＧＰＣＲ７ｂ（ｂａ６４ｐ１４−ＧまたはＣＧ５７８０９−０１としても公知）：）
遺伝子ＧＰＣＲ７ｂの発現を、表１８Ａに記載のプライマー−プローブセットＡｇ１２６３を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表１８Ｂおよび１８Ｃに示す。
【０４６６】
【表１８Ａ】
2005500802.tif 000160
2005500802.tif 000161
【０４６７】
【表１８Ｂ】
2005500802.tif 000162
2005500802.tif 000163
【０４６８】
【表１８Ｃ】
2005500802.tif 000164
2005500802.tif 000165
2005500802.tif 000166
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６３）このパネルにおけるＧＰＣＲ７ｂ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ汚染（混入）によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、ＧＰＣＲ７ｂ遺伝子の低い発現（ＣＴｓ３２〜３５）が脳組織、唾液腺、胃、膀胱、および精巣において、ならびに肺癌および卵巣癌由来の２〜３の培養された細胞株において、検出される。さらに、その発現は、脳の癌由来の細胞株には存在しないようである。従って、モノクローナル抗体または低分子治療剤を用いたこの遺伝子の治療的なダウンレギュレーション（下方制御）は、肺癌または卵巣癌の処置において有用であり得るが、この遺伝子の発現の増大は、脳の癌の処置において有用であり得る。ＧＰＣＲ７ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＧＰＣＲであり、これが脳、具体的には海馬において高い発現レベルを示す。いくつかの神経伝達物質レセプターはＧＰＣＲであり、これには、ドーパミンレセプターファミリー、セロトニンレセプターファミリー、ＧＡＢＡＢレセプター、ムスカリンアセチルコリンレセプター、などが挙げられる。海馬は、長期記憶形成に重要である脳の領域であり、そしてアルツハイマー病（そしてより少ない程度でパーキンソン病）において著明な神経変性を示す。海馬はまた、精神分裂病および双極性抑うつのような重大な精神科の障害に関与している。従って、ＧＰＣＲ７ｂ遺伝子の発現レベルは、これらの疾患の１つ以上のマーカーであり得、そしてこの遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的な操作は、記憶の増強、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、双極性障害、または抑うつにおいて有利な効果を有し得る。
【０４６９】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２６３）このパネルにおけるＧＰＣＲ７ｂの発現は、ＩＢＤ大腸炎１サンプルにおけるゲノムＤＮＡ混入によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、ＧＰＣＲ７ｂ遺伝子は、混合されたリンパ球反応において非常に低レベルで発現される。この観察は、ＧＰＣＲが、Ｔ細胞活性化の後期段階で生じ得る事象において重要であり得ることを示唆する。これらの事象としては、特定のクラスの接着分子（例えば、ＰまたはＥ−セレクチンのリガンド）のクローン増殖、分極、および発現が挙げられ得る。従って、アンタゴニスト（拮抗的）抗体または低分子治療剤は、活性化Ｔ細胞の機能または循環能力をブロックし得、そしてＴ細胞が炎症を開始する能力を減じ得る。これらの治療剤は、喘息、アレルギー、乾癬、関節炎、ＧＶＨＤ、およびＴ細胞の活性化に関与する他の疾患の処置において重要であり得る。ＧＰＣＲ（アゴニスト）とのリガンド相互作用を模倣する低分子治療剤は、免疫応答を開始すること、および免疫化の効率を増大することにおいて重要であり得る。
【０４７０】
（パネルＣＮＳＤ．０１のまとめ：Ａｇ１２６３）ＧＰＣＲ７ｂ遺伝子の発現は、このパネルにおける全てのサンプルにまたがって低〜検出不能である（ＣＴ値＞３５）。しかし、パネル１．２において得られた結果は、この遺伝子が主に海馬において発現されること（これはこのパネルにおいて示されない）を示唆する。
【０４７１】
（実施例Ｈ．ＧＰＣＲ８ｄ（ｂａ６４ｐ１４−ＨおよびＣＧ５０２５９−０１としても公知）：）
遺伝子ｂａ６４ｐ１４−Ｈの発現を、表１９Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１２６４を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表１９Ｂに示す。
【０４７２】
【表１９Ａ】
2005500802.tif 000167
【０４７３】
【表１９Ｂ】
2005500802.tif 000168
2005500802.tif 000169
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６４）このパネルにおけるＧＰＣＲ８ｄ遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ汚染（混入）によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子の低〜中度の発現（ＣＴ値＝３１〜３５）が、広範な種々の正常組織（内皮細胞、心臓、骨格筋、肝臓、副腎、唾液腺、下垂体、脳（扁桃体、小脳、海馬、大脳皮質、および視床）、脊髄、脾臓、リンパ節、結腸、小腸、胃、膀胱、腎臓（成体および胎児）、気管、乳腺、子宮、胎盤、前立腺、および精巣を含む）において検出される。この遺伝子は、副腎（ＣＴ値＝３３．９）、および下垂体（ＣＴ値＝３３．８）において発現される。従って、ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子産物は、副腎−下垂体軸に関与し得、そしてこの神経内分泌軸によって調節される疾患の処置のための薬物標的として有用であり得る。ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子によってコードされるＧＰＣＲは、脳のいくつかの領域において発現を示し、これには、パーキンソン病において神経変性を示す脳の領域である、黒質で検出された最高の発現（ＣＴ値＝３１．５）を伴う。従って、このレセプターの治療的な調節、または選択的な刺激／アンタゴニズム（拮抗作用）は、この疾患の処置において有利な効果を有し得る。さらに、ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子は、卵巣癌および肺癌由来の培養細胞株の群において優先的に発現されるが、正常な卵巣および肺の組織においてはわずかな程度まで発現されるようである。これらのデータは、この遺伝子の治療的な調節が、卵巣癌および肺癌の処置において有用であり得ることを意味する。あるいは、ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子は、肺癌および卵巣癌の診断において有用なマーカーであり得る。
【０４７４】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２６４）ＧＰＣＲ８ｄ遺伝子の発現は、ＩＢＤ大腸炎１を除いて、このパネルのサンプルの全てにおいて低〜検出不能である（Ｃｔ値＞３５）；しかし、このサンプルは、ゲノムＤＮＡが混入していると考えられ、したがって無視しなければならない。
【０４７５】
（実施例Ｉ．ＧＰＣＲ９（ｂａ６４ｐ１４−Ｉとしても公知）：）
表２０Ａに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１２６５を用いて遺伝子ＧＰＣＲ９の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表２０Ｂおよび２０Ｃに示す。
【０４７６】
【表２０Ａ】
2005500802.tif 000170
【０４７７】
【表２０Ｂ】
2005500802.tif 000171
2005500802.tif 000172
【０４７８】
【表２０Ｃ】
2005500802.tif 000173
2005500802.tif 000174
2005500802.tif 000175
（パネル１．２のまとめ：Ａｇ１２６５）このパネルにおけるＧＰＣＲ９遺伝子の発現は、脂肪サンプルにおけるゲノムＤＮＡ汚染（混入）によって歪まされる。このサンプルを無視すれば、ＧＰＣＲ９遺伝子の中度〜低度の発現（ＣＴ値＝２９〜３５）が、このパネルのほとんどの組織において検出される。興味深いことに、いくつかの肺癌および卵巣癌の細胞株において高い発現が存在するようであり、このことは、この遺伝子の発現が、これらの疾患の病理と関連し得ることを示す。対照的に、正常な肺および卵巣のサンプルにはＧＰＣＲ９遺伝子の発現はほとんど存在しない。従って、ＧＰＣＲ９遺伝子の治療的な調節は、肺癌および卵巣癌の処置において有用性を示し得る。あるいは、ＧＰＣＲ９遺伝子は、肺癌および卵巣癌の診断において有用なマーカーであり得る。さらに、この遺伝子は、正常な代謝および神経内分泌機能において役割を果たす組織である、下垂体、膵臓、肝臓、および副腎において中度に発現される。下垂体は、下垂体後葉において、下垂体刺激ホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ソマトクリニン、ゴナドドトピン放出ホルモン（生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン）、コルチコトロピン放出ホルモン（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン））に対する応答を通して、そして下垂体前葉において末梢ホルモン（例えば、エストロゲン、テストステロンなど）に対する応答を通じて、内分泌をかなり制御する。下垂体の病態生理学に関連した多数の疾患（甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症、巨人症、小人症、末端肥大症、アジソン病、クッシング病、尿崩症）が存在する。そしてこの遺伝子の治療的調節、アンタゴニズム（拮抗作用）、または刺激は、これらの疾患の１つ以上の処置において有用であり得る。
【０４７９】
（パネル４Ｄのまとめ：Ａｇ１２６５）ＧＰＣＲ９転写物は、未処置の肺線維芽細胞、飢餓させられ、かつ未処置のＨＵＶＥＣ、および未処置の微小血管真皮内皮細胞において発現される。従って、ＧＰＣＲをコードするＧＰＣＲ９遺伝子は、正常なホメオスタシスを維持するために重要であり得る。さらに、この遺伝子は、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦα）によって選択的に下方制御され得る。他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１３およびγインターフェロン）は、発現を減じないようである。低分子治療剤（アンタゴニスト）は、ＧＰＣＲ９タンパク質の発現またはＧＰＣＲタンパク質が免疫応答に遭遇する活性を減少し得る。このタイプのアジュバントの効果は、細菌およびウイルスの感染の免疫または処置を補完し得る。あるいは、ＧＰＣＲ９遺伝子産物へのアゴニスト性機能を有する低分子治療剤（リガンド様分子）は、乾癬、気腫、喘息、アレルギー、および関節炎のような疾患による炎症性応答を減少またはブロックし得る。
【０４８０】
（実施例３．ＧＰＣＲＸクローンのＳＮＰ分析）
ＳｑｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡは、異なるドナー由来の、種々のヒトサンプル（正常状態および疾患状態、生理学的状態、および発生状態という複数の組織型を示す）に由来した。サンプルを、全組織、細胞株、初代細胞または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的因子または化合物（例えば、成長（増殖）因子、ケモカイン、ステロイド）で処置され得る。次いで、このように誘導されたｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの自社のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を用いて配列決定した。配列トレースを手動で評価し、そして必要に応じて補正のために編集した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列を、バイオインフォマティクスプログラムを用いて、それ自体と、および公的なＥＳＴとアセンブルして、ＣｕｒａＧｅｎのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのヒトＳｅｑＣａｌｉｎｇデータベースを作成した。各々のアセンブリは、１つ以上のヒトサンプルから誘導された１つ以上の重複するｃＤＮＡ配列を含む。フラグメントおよびＥＳＴが、アセンブチリついての成分として含まれたのは、そのアセンブリの別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合であった。各アセンブリは、遺伝子および／またはその改変体（例えば、スプライス型、および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、およびその組み合わせ）を示し得る。
【０４８１】
改変体配列は、この出願に含まれる。改変体配列は、単一ヌクレオチド多形態（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、ある場合には、「ｃＳＮＰ」と呼ばれ得、これは、このＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして起源することを示す。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位での１つのヌクレオチドと別のヌクレオチドの置換に起因し得る。このような置換は、転位または塩基転換（トランスバージョン）のいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照の対立遺伝子に対する、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が別の対立遺伝子における特定のヌクレオチドに関してギャップを保有する部位である。遺伝子内で生じるＳＮＰは、このＳＮＰの位置でその遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じ得る。しかし、遺伝子内のＳＮＰはまた、ＳＮＰを含むコドンが遺伝子コードの縮重性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、サイレントであり得る。遺伝子の領域の外側で、または遺伝子内のイントロンで生じるＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列にも変化を生じないが、発現パターンの変更された調節、例えば、一時的発現における変更、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、転写されたメッセージの安定性を生じ得る。
【０４８２】
（新規なＳＮＰ同定の方法：）ＣｕｒａＧｅｎの自社のＳＮＰＴｏｏｌアルゴリズムを用いて配列アセンブリを分析することによって、ＳＮＰを同定する。ＳＮＰＴｏｏｌは、以下の基準を用いてアセンブリにおけるバリエーションを同定する：ＳＮＰは、アラインメントの両方の末端の１０塩基対内では分析されない；ウインドウサイズ（一望できる塩基数）は１０である；ウインドウ中の許されるミスマッチ数は２である；最小ＳＮＰ基本量（ＰＨＲＥＤスコア）は２３である；ＳＮＰをスコアするための変化の最小数は、２／アセンブリ位置である。ＳＮＰＴｏｏｌは、アセンブリを分析し、そしてＳＮＰ位置、このアセンブリ中の関連する個々の改変体配列、所定の位置でのアセンブリの深さ、推定アセンブリ対立遺伝子頻度、およびＳＮＰ配列のバリエーションを提示する。次いで、配列トレースを選択し、そして手動の確証（バリデーション）のために視覚化した。コンセンサスアセンブリ配列を改変体配列変化とともにＣｕｒａＴｏｏｌにインポートし、ＳＮＰ配列のばらつきから生じる可能性のあるアミノ酸変化を同定する。次いで、包括的なＳＮＰデータ分析をＳＮＰＣａｌｌｉｎｇデータベースにエクスポートする。
【０４８３】
（新規なＳＮＰ確認（確証）の方法：）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）として公知のバリデート（確証）された方法を使用して、ＳＮＰを確認する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのための詳細なプロトコールは、以下に見出され得る：Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，Ｉｓｓｕｅ  ８，Ａｕｇｕｓｔ．１２４９〜１２６５に見出され得る。要するに、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、遺伝子型決定のリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコールは、ゲノムＤＮＡサンプルから二本鎖のビオチン化したＰＣＲ産物をとり、そしてそれらをストレプトアビジンビーズに結合させる。次いで、これらのビーズを変性して、一本鎖結合したＤＮＡを生成する。ＤＮＡ鎖伸長の際、各ｄＮＴＰから放出されるピロリン酸塩（ＰＰｉ）の間接的な生体発光定量（分析）アッセイに基づく技術を利用して、ＳＮＰを特徴付ける。Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ媒介の塩基組み込み後、ＰＰｉを遊離させて、アデノシン５’−ホスホサルフェート（ＡＰＳ）と一緒に、ＡＴＰスルフリラーゼの基質として用いて、ＡＴＰの形成を生じる。引き続き、ＡＴＰは、ルシフェラーゼの作用によって、ルシフェリンからオキシ−誘導体への転換を達成する。その後の光のアウトプットは、添加された塩基の数（約４塩基まで）に比例する。この方法の進歩性を可能にするため、過剰のｄＮＴＰをアピラーゼ（これは、出発反応混合物にも存在する）によって分解し、これによってｄＮＴＰのみが配列決定の間にこのテンプレートに付加される。このプロセスは、完全に自動化されており、そして９６ウェル様式に適合されているので、大きいＳＮＰパネルの迅速なスクリーニングが可能である。新規な単一ヌクレオチド多型改変体のＤＮＡおよびタンパク質の配列が報告されている。改変体を個々に報告するが、改変体の全てまたは選択されたサブセットの任意の組み合わせがまた含まれる。さらに、改変塩基および改変アミノ酸残基の位置に下線を付している。
【０４８４】
（結果）
改変体を個々に報告しているが、改変体の全てまたは選択されたサブセットの任意の組み合わせがまた含まれる。
【０４８５】
（ＧＰＣＲ２）
ＧＰＣＲ２について報告された１つの改変体が存在する。表２１に示すように、改変体１３３７４７９１は、このヌクレオチド配列の６５４ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２１４でＩｌｅからＶａｌへの変化を生じる。ＧＰＣＲ２ｂは、ＧＰＣＲ２ａに比べてその５’末端で１０の余計なヌクレオチドを有するので、ｃＳＮＰの塩基位置は、参照配列として、ＧＰＣＲ２ａのヌクレオチド配列（Ｇｍｂａ６４ｐ１４Ｂとしても公知）を用いて決定されることに注目することが重要である。
【０４８６】
【表２１】
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（ＧＰＣＲ３）
ＧＰＣＲ３について報告された３つの改変体が存在する。表２２に示すように、改変体１３３７４８１１は、このヌクレオチド配列の６２８ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２０５でＩｌｅからＴｈｒへの変化を生じ、改変体１３３７４８１２は、このヌクレオチド配列の１５２ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列の変化を生じない（サイレント）、そして改変体１３３７４８１３は、このヌクレオチド配列の１０９ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸３２でＬｅｕからＰｒｏへの変化を生じる。
【０４８７】
【表２２】
2005500802.tif 000177
（ＧＰＣＲ４）
ＧＰＣＲ４について報告された９つの改変体が存在する。表２３に示すように、改変体１３３７４１２５は、このヌクレオチド配列の３４０ｂｐのＧからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸９９でＭｅｔからＩｌｅへの変化を生じ、改変体１３３７４１２６は、このヌクレオチド配列の４０２ｂｐのＧからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１２０でＡｒｇからＬｅｕへの変化を生じ、改変体１３３７４１２７は、このヌクレオチド配列の４３５ｂｐのＣからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１３１でＳｅｒからＰｈｅへの変化を生じ、改変体１３３７４１２８は、このヌクレオチド配列の４８９ｂｐのＴからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１４９でＬｅｕからＨｉｓへの変化を生じ、改変体１３３７４１２９は、このヌクレオチド配列の６５３ｂｐのＧからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２０４でＶａｌからＬｅｕへの変化を生じ、改変体１３３７４１３０は、このヌクレオチド配列の９２７ｂｐのＴからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２９５でＭｅｔからＬｙｓへの変化を生じ、改変体１３３７４８０８は、このヌクレオチド配列の３１３ｂｐのＣからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列の変化を生じない（サイレント）、改変体１３３７４８０９は、このヌクレオチド配列の７９５ｂｐのＧからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２５１でＧｌｙからＡｌａへの変化を生じ、そして改変体１３３７４８１０は、このヌクレオチド配列の９４４ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸３０１でＡｒｇからＧｌｙへの変化を生じる。
【０４８８】
【表２３】
2005500802.tif 000178
（ＧＰＣＲ５ｃ）
ＧＰＣＲ５ｃについて報告された６つの改変体が存在する。表２４に示すように、改変体１３３７４７９９は、このヌクレオチド配列の１００ｂｐのＣからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２４でＧｌｎから終止コドンへの変化を生じ、改変体１３３７４８００は、このヌクレオチド配列の２９３ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸８８でＧｌｎからＡｒｇへの変化を生じ、改変体１３３７４８０１は、このヌクレオチド配列の３７９ｂｐのＴからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１１７でＳｅｒからＴｈｒへの変化を生じ、改変体１３３７４８０２は、このヌクレオチド配列の４１３ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１２８でＨｉｓからＡｒｇへの変化を生じ、改変体１３３７４８０３は、このヌクレオチド配列の５０２ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１５８でＳｅｒからＰｒｏへの変化を生じ、そして改変体１３３７４８０４は、このヌクレオチド配列の５３２ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１６８でＰｈｅからＬｅｕへの変化を生じる。
【０４８９】
【表２４】
2005500802.tif 000179
2005500802.tif 000180
（ＧＰＣＲ６）
ＧＰＣＲ６について報告された３つの改変体が存在する。表２５に示すように、改変体１３３７４７９４は、このヌクレオチド配列の１０５ｂｐのＣからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸３５でＬｅｕからＰｈｅへの変化を生じ、改変体１３３７４７９５は、このヌクレオチド配列の２２０ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸７３でＬｅｕからＰｒｏへの変化を生じ、そして改変体１３３７４７９６は、このヌクレオチド配列の３８１ｂｐのＡからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸１２７でＭｅｔからＶａｌへの変化を生じる。ＧＰＣＲ６ａ、６ｂ、および６ｃのヌクレオチド配列は、お互いに変化しているので、ｃＳＮＰの塩基位置は、参照配列として、ＧＰＣＲ６ｃのヌクレオチド配列（Ｇｍｂａ６４ｐ１４ｎ１１＿ｄａ１または１４７３０７４９９としても公知）を用いて決定されることに注目することが重要である。
【０４９０】
【表２５】
2005500802.tif 000181
（ＧＰＣＲ８）
ＧＰＣＲ８について報告された７つの改変体が存在する。表２６に示すように、改変体１３３７４０８６は、このヌクレオチド配列の４６０ｂｐのＧからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列に変化を生じない（サイレント）、改変体１３３７４０８７は、このヌクレオチド配列の６０１ｂｐのＧからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列に変化を生じない（サイレント）、改変体１３３７４０８８は、このヌクレオチド配列の７４３ｂｐのＴからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２３９でＰｈｅからＬｅｕへの変化を生じ、改変体１３３７４２７１は、このヌクレオチド配列の４６０ｂｐのＧからＣへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列の変化を生じない（サイレント）、改変体１３３７４２７３は、このヌクレオチド配列の６６０ｂｐのＣからＧへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２１１でＰｒｏからＡｒｇへの変化を生じ、改変体１３３７４７９２は、このヌクレオチド配列の４３ｂｐのＣからＴへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列の変化を生じない（サイレント）、そして改変体１３３７４７９３は、このヌクレオチド配列の１０７ｂｐのＣからＡへのＳＮＰであり、これは、タンパク質配列のアミノ酸２７でＰｒｏからＴｈｒへの変化を生じる。ＧＰＣＲ８ａ、８ｂ、８ｃ、および８ｄのヌクレオチド配列はお互いに変化しているので、ｃＳＮＰの塩基位置は、参照配列として、ＧＰＣＲ８ｂのヌクレオチド配列（ＣＧ５０２５９−０１としても既知）を用いて決定されることに注目することが重要である。
【０４９１】
【表２６】
2005500802.tif 000182
（実施例４．他のＳＮＰ）
このヌクレオチド配列の１つ以上のコンセンサス位置（共通位置）（Ｃｏｎｓ．Ｐｏｓ．）は、以下のＧＰＣＲクローンのＳＮＰとして同定されている。「Ｄｅｐｔｈ（深さ）（深度）」は、ＳＮＰの領域をカバーするクローンの数を示す。推定対立遺伝子頻度（Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（Ｐｕｔａｔｉｖｅ．Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑ．）は、ＳＮＰを含む全てのクローンの分数である。ダッシュ（「−」）が示される場合、これは、１塩基が存在しないことを意味する。「＞（→）」という印は、「〜へ変化される」ことを意味する。
【０４９２】
【表２７】
2005500802.tif 000183
【０４９３】
【表２８】
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【０４９４】
【表２９】
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【０４９５】
【表３０】
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【０４９６】
【表３１】
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【０４９７】
【表３２】
2005500802.tif 000189
（等価物）
特定の実施形態が、詳細に本明細書中に開示されているが、これは、例証の目的のみのための例として行われ、そして前述の添付される特許請求の範囲に関して、制限することを意図しない。特に、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲により規定されるような発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが、本発明により意図される。核酸出発物質、目的のクローン、ライブラリーの型の選択は、本明細書中に記載される実施形態の知見を用いると当業者に慣用的な内容であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるとみなされる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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