(57)【要約】本発明は、組換えレンチウイルスベクター、および該ベクターを産生する遺伝子伝達システム、該組換えレンチウイルスベクターの産生に利用される細胞株ならびに組換えベクターおよび遺伝子伝達システムに利用されるウシ免疫不全ウイルスＤＮＡ配列を提供する。本発明は、遺伝子導入システム（ウイルスＲＮＡのパッケージングングおよび感染細胞染色体へのプロウイルスＤＮＡの組み込みに必要なＢＩＶ  レンチウイルスパッケージングング遺伝子およびシス作用遺伝子が、異なるＤＮＡ構築物上に提供される）を包含し、ここで、一つ以上の構築物は、一つ以上のＢＩＶパッケージングング遺伝子（標的細胞に目的の異種遺伝子を送達するための複製欠損感染性粒子を提供するために、追加のＤＮＡ構築物を補足し得る）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えレンチウイルス遺伝子導入システムであって、以下：
（ａ）（ｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物、または（ｉｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；
（ｃ）第１のＲ領域に作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域および第２のＲ領域を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物；および
（ｄ）（ｉ）該パッケージングの一つに位置されるｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子ならびに導入ベクター構築物、または（ｉｉ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物、
を包含する、組換えレンチウイルス遺伝子導入システム。
【請求項２】
ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物を包含する、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３】
ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物、を包含する、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４】
前記パッケージング構築物が、さらにＲＲＥ配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項５】
少なくとも一つの前記パッケージング構築物が、さらにＲＲＥ配列を含む、請求項３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項６】
前記ｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列が、ＢＩＶ由来である、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項７】
前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項８】
前記ｇａｇ遺伝子および前記ｐｏｌ遺伝子各々が、再コード化核酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項９】
前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１０】
前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１１】
前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１２】
前記ｐｏｌ遺伝子が、５’末端にＡＴＧ開始コドンを含む、請求項１１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１３】
前記ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ領域が、該プロテアーゼの触媒中心の３つのアミノ酸モチーフで変異され、そして、変異されていないＢＩＶプロテアーゼと比較される場合、該変異プロテアーゼが、宿主細胞に対して毒性が少ない、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ領域が、該プロテアーゼポリペプチドのアミノ酸２６にて、ＴｈｒからＳｅｒへの変異をコードする、請求項１３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１５】
前記ＢＩＶパッケージング配列が、該ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子オープンリーディングフレーム配列の最初の１０１塩基対だけを含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１６】
パッケージング配列が、本質的に、配列番号３９の核酸配列からなる、請求項１５に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１７】
前記導入ベクター構築物が、第１のＲ領域に作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域、第２のＲ領域および第２のＵ５領域を含むＤＮＡセグメントを含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１８】
前記パッケージング構築物が、さらに前記ｒｅｖ配列を含む、請求項２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項１９】
前記ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物が、ｅｎｖ遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２０】
前記ｅｎｖ遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）ｅｎｖ、ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ、Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｐｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＧａＬＶ）  ｅｎｖ、Ｐｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅメンバー由来のｅｎｖ遺伝子、アルファウイルスｅｎｖ遺伝子、パラミキソウイルスｅｎｖ遺伝子、フラビウイルスｅｎｖ遺伝子、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子、アレナウイルスｅｎｖ遺伝子、パラインフルエンザウイルスｅｎｖ遺伝子、ソゴトウイルスｅｎｖ遺伝子およびバキュロウイルスｅｎｖ遺伝子からなる該群から選択される、請求項１９に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２１】
前記ウイルス表面タンパク質遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖをコードする、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２２】
前記パッケージングの一つに位置するｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子および導入ベクター構築物を含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２３】
ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物を含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２４】
前記ｒｅｖ遺伝子が、天然のＢＩＶ  ｒｅｖイントロンを含まない、請求項６に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２５】
前記ｒｅｖ遺伝子が、配列番号１０を含む、請求項２４に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２６】
前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたＥＦ−１プロモーターを含む、請求項２２に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２７】
前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された前記プロモーターが、ＥＦ−１プロモーターである、請求項２３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２８】
前記ＲＲＥ配列が、本質的に、配列番号４０の前記核酸配列からなる、請求項６に記載の遺伝子導入システム。
【請求項２９】
少なくとも二つの前記プロモーターが同じである、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３０】
全ての前記プロモーターが異なる、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３１】
少なくとも一つの前記プロモーターが、調節可能なプロモーターである、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３２】
ｃＰＰＴを含まない、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３３】
前記導入ベクター構築物がさらに、ｃＰＰＴを含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３４】
前記ｃＰＰＴが、ヒト免疫不全ウイルス由来の該ｃＰＰＴである、請求項３３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３５】
前記ｃＰＰＴが、ＢＩＶ  ｃＰＰＴである、請求項３３に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３６】
前記ｃＰＰＴが、本質的に、配列番号１を含めた塩基対４７５８〜５２９３のヌクレオチドに相当する５３５塩基対からなる、請求項３５に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３７】
前記Ｕ３領域が、ポリアデニル化のエンハンサーを含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３８】
ポリアデニル化の前記エンハンサーが、本質的に、前記ＳＶ４０後期ポリアデニル化エンハンサーエレメントを含む、請求項３７に記載の遺伝子導入システム。
【請求項３９】
少なくとも一つの前記ＢＩＶのｖｉｆ遺伝子、ｖｐｗ遺伝子、ｖｐｙ遺伝子またはｔａｔ遺伝子をコードしない、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４０】
前記ＢＩＶのｖｉｆ遺伝子、ｖｐｗ遺伝子、ｖｐｙ遺伝子、ｔｍｘ遺伝子およびｔａｔ遺伝子をコードしない、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４１】
前記Ｕ３領域における一つ以上のヌクレオチドが、改変されるかまたは除去され、この結果、Ｕ３媒介性転写が減少されるか消滅される、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４２】
目的の前記異種遺伝子と作動可能に連結されたマーモット肝炎ウイルス調節応答エレメントを含む、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４３】
目的の前記異種遺伝子が：Ｔ２−ＴｒｐＲＳ、Ｅｐｈ  Ｂレセプター、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂリガンド、フィブリノゲンＥフラグメント、ＶＥＧＦの可溶性レセプター、アンギオスタチン、エンドスタチン、オプチネウリン、小柱網タンパク質、Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ）および抗アポトーシス遺伝子産物からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４４】
目的の前記異種遺伝子が：配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７からなる群から選択されるＲｄＣＶＦポリペプチドをコードする、請求項１に記載の遺伝子導入システム。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれかの遺伝子導入システムを含む産生細胞。
【請求項４６】
前記遺伝子導入システムが、前記産生細胞のゲノムへ安定して挿入される、請求項４５の産生細胞。
【請求項４７】
前記遺伝子導入システムが、前記産生細胞へ一過性にトランスフェクトされる、請求項４５の産生細胞。
【請求項４８】
複製欠陥レンチウイルスベクター粒子を産生する方法であって、該方法は以下：
（ａ）該細胞によって、複製欠陥レンチウイルスベクター粒子の産生を十分に許容する細胞培養条件下で、細胞培地中に請求項４５に記載の産生細胞を増殖する工程；および
（ｂ）該培地から該複製欠陥レンチウイルスベクター粒子を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記培地にヒストンデアセチラーゼ阻害剤を添加する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、酪酸である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記請求項４８の方法に従って産生される、複製欠陥レンチウイルスベクター粒子。
【請求項５２】
疾患を有するかまたは疾患にかかるリスクを有する動物において、該疾患を処置するかまたは予防する方法であって、請求項５１に記載の複製欠陥組換えレンチウイルスベクター粒子と該動物の一つ以上の細胞を感染する工程を包含し、ここで、目的の前記異種遺伝子が、該疾患を処置するかまたは予防するのに効果的な治療薬をコードする、方法。
【請求項５３】
前記動物がヒトである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
一つ以上の前記細胞が眼細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が：眼の新血管新生、湿性ＡＭＤ（加齢黄斑変性症）、糖尿病性増殖性網膜症、非糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、分岐部静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、早産児の網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、中心窩周囲毛細血管拡張症、鎌状赤血球網膜症、Ｅａｌｅ’ｓ病、網膜血管炎、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ病、放射線網膜症、網膜寒冷損傷（ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）、網膜色素変性症、脈絡網膜欠損症、単純ヘルペス性角膜炎に起因する角膜新血管新生、角膜潰瘍、角膜移植、翼状片（ｐｔｅｒｉｇｙｉａ）、または外傷性網膜変性、病理学的な老化、網膜色素変性症、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｅｌ症候群、Ｂａｓｓｅｎ−Ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ症候群、Ｂｅｓｔ病、脈絡膜、脳回転状萎縮、先天性黒内症（ａｍｏｕｒｏｓｉｓ）、Ｒｅｆｓｕｎ症候群、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病およびＵｓｈｅｒ症候群、からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療薬が：Ｔ２−ＴｒｐＲＳ、Ｅｐｈ  Ｂレセプター、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂリガンド、フィブリノゲンＥフラグメント、ＶＥＧＦの可溶性レセプター、アンギオスタチン、エンドスタチン、オプチネウリン、小柱網タンパク質、Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｒｄｃｖｆ）および抗アポトーシス遺伝子産物からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療薬が：配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７からなる群から選択されるＲｄｃｖｆポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記疾患が：癌、同種骨髄移植に関連する移植片対宿主拒絶反応および神経系疾患からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
一つ以上の前記細胞が、インビボにて感染される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
一つ以上の前記細胞が、インビトロにて感染される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
組換えレンチウイルスベクター粒子を用いてインビトロにて細胞を形質転換する方法であって、請求項５１に記載の細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子と接触する工程を包含し、これにより該細胞が形質転換される、方法。
【請求項６２】
組換えレンチウイルスベクター粒子を用いてインビボにて細胞を形質転換する方法であって、請求項５１に記載の細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子と接触する工程を包含し、これにより該細胞が形質転換される、方法。
【請求項６３】
細胞中で目的の異種遺伝子を発現する方法であって、請求項５１に記載の該細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子で形質転換する工程を包含し、これにより目的の該異種遺伝子が該細胞中に発現される、方法。
【請求項６４】
パッケージング細胞であって、以下：
（ａ）（ｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物、または（ｉｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および
（ｃ）（ｉ）該パッケージングの一つに位置されるｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子ならびに導入ベクター構築物、または（ｉｉ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物、
を包含する、パッケージング細胞。
【請求項６５】
ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物を包含する、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項６６】
ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物を包含する、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項６７】
前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項６５に記載のパッケージング細胞。
【請求項６８】
前記ｇａｇ遺伝子および前記ｐｏｌ遺伝子各々が、再コード化核酸配列を含む、請求項６５に記載のパッケージング細胞。
【請求項６９】
前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項６５に記載のパッケージング細胞。
【請求項７０】
前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項６６に記載のパッケージング細胞。
【請求項７１】
前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、請求項６６に記載のパッケージング細胞。
【請求項７２】
前記ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ領域が、該プロテアーゼの該触媒中心の３つのアミノ酸モチーフで変異され、そして、変異されていないＢＩＶプロテアーゼと比較される場合、該変異プロテアーゼが、宿主細胞に対して毒性が少ない、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７３】
前記プロテアーゼ領域が、該プロテアーゼポリペプチドのアミノ酸２６で、ＴｈｒからＳｅｒへの変異をコードする、請求項７２に記載のパッケージング細胞。
【請求項７４】
前記ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物が、ｅｎｖ遺伝子を含む、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７５】
前記ｅｎｖ遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）ｅｎｖ、ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ、Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｐｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＧａＬＶ）  ｅｎｖ、Ｐｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅメンバー由来のｅｎｖ遺伝子、アルファウイルスｅｎｖ遺伝子、パラミキソウイルスｅｎｖ遺伝子、フラビウイルスｅｎｖ遺伝子、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子、アレナウイルスｅｎｖ遺伝子およびパラインフルエンザウイルスｅｎｖ遺伝子からなる群から選択される、請求項７４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７６】
前記ウイルス表面タンパク質遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖをコードする、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７７】
前記パッケージングの一つに位置するｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子および導入ベクター構築物を含む、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７８】
ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物を含む、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項７９】
前記ｒｅｖ遺伝子が、ＢＩＶ由来であるが、天然のＢＩＶ  ｒｅｖイントロンを含まない、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項８０】
前記ｒｅｖ遺伝子が、配列番号１０を含む、請求項７９に記載のパッケージング細胞。
【請求項８１】
前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたＥＦ−１プロモーターを含む、請求項７７に記載のパッケージング細胞。
【請求項８２】
前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された前記プロモーターが、ＥＦ−１プロモーターである、請求項７８に記載のパッケージング細胞。
【請求項８３】
少なくとも二つの前記プロモーターが同じである、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項８４】
全ての前記プロモーターが異なる、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項８５】
前記細胞が、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣｆ２ＴＨ細胞からなる群から選択される、請求項６４に記載のパッケージング細胞。
【請求項８６】
配列番号５１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％一致する該アミノ酸配列を含む、単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
【請求項８７】
配列番号５１を含む、請求項８６に記載の単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
【請求項８８】
前記ＰＯＬタンパク質のＮ末端にメチオニンを含む、請求項８６に記載の単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
【請求項８９】
請求項８６〜８８のうちいずれかに記載のＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９０】
前記核酸配列は、本質的に、配列番号５０を含む、請求項８７の前記ＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする該核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９１】
前記核酸配列は、本質的に、配列番号５３を含む、請求項８８の前記ＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする該核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９２】
最小のＢＩＶパッケージング配列は、配列番号３９に示される前記核酸配列と少なくとも９０％一致する、最小の該ＢＩＶパッケージング配列を含む単離された核酸分子。
【請求項９３】
最小の前記ＢＩＶパッケージング配列は、本質的に、配列番号３９に示される前記核酸配列からなる、請求項９２の単離された前記核酸分子。
【請求項９４】
ＢＩＶ  ＲＥＶタンパク質をコードする該核酸配列を含み、該核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％一致する前記アミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子。
【請求項９５】
前記ＢＩＶ  ＲＥＶタンパク質をコードする前記核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列によってコードされる同一のアミノ酸配列をコードする、請求項９４に記載の単離された前記核酸分子。
【請求項９６】
前記核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列と少なくとも９０％一致する、請求項９４に記載の単離された前記核酸分子。
【請求項９７】
前記核酸配列は、本質的に、配列番号１０に示される該核酸配列からなる、請求項９４に記載の単離された前記核酸分子。
【請求項９８】
最小のＢＩＶ  ＲＲＥ配列は、配列番号４０に示される前記核酸配列と少なくとも９０％一致する、最小の該ＢＩＶ  ＲＲＥ配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９９】
最小の前記ＢＩＶ  ＲＲＥ配列は、本質的に、配列番号４０に示される前記核酸配列からなる、請求項９８に記載の単離された前記核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／３５３，１７７号（２００２年２月４日出願）および米国仮出願第６０／４３３，９５６号（２００２年１２月１８日出願）の利益を主張し、これらの両方は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、一般に、ウイルスベクターの分野に関し、より詳細には、新しい組換えレンチウイルスベクターと該ベクターを産生する遺伝子導入システム、遺伝子導入システムの発現ならびにパッケージングングに関するベクターおよび細胞株、さらに組換えベクターの送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明の背景を説明するために、本明細書で使用される出版物などは、そして特に、本発明の方法に関係する追加の詳細を提供する場合は、明細書に参考として援用され、そして便宜上、以下の本文に著者および日付で参照され、添付された参考文献のリストに各々分類される。
【０００３】
レンチウイルスは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子および調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスは、例えば、分裂細胞のみに感染し得るオンコルナウイルスと対照的に、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る。非分裂細胞に感染する能力は、インビボおよびエキソビボの遺伝子療法において、レンチウイルスを特に有用なシステムにさせる。
【０００４】
遺伝子治療において、レンチウイルスを使用する上で考慮すべき重要なことは、ベクターとしての使用において、「安全」なレンチウイルスを利用することである。安全なレトロウイルスベクターは、細胞に目的の遺伝子を送達し得るが、このプロセスの間、複製能力のあるウイルス粒子を産生する能力が低下される。これらのベクターが安全に作製される方法の一つは、別個のＤＮＡ構築物上に必須のウイルス遺伝子を隔離することであり、ここで、ウイルスＲＮＡのパッケージングに必要とされる必須遺伝子（例えば、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子）は、感染細胞の核および染色体に目的の異種遺伝子を送達するのに必要とされるＤＮＡ配列および遺伝子と異なるＤＮＡ構築物上に提供される。パッケージングング細胞株およびベクター産生細胞株は、この必要性を満たすために開発されている。簡単に言えば、この方法論は、二つの構成要素（レンチウイルスベクターおよびパッケージング細胞株）の使用を利用する。レンチウイルスベクターは、宿主染色体、移行される非相同性の核酸配列およびパッケージングング配列（複製欠損ベクターではなく感染性ベクターへウイルスＲＮＡのパッケージングングを可能にする）へのプロウイルスＤＮＡの組み込みに必要である末端反復配列（ＬＴＰ）を含む。一般的に、真核細胞への遺伝子送達に利用されるウイルスベクターが構築され、この結果、多数の必須のウイルス遺伝子が欠失され、そして目的の遺伝子で置換される。構造タンパク質およびエンベロープタンパク質（例えば、ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶ）をコードする遺伝子が、ベクターゲノム内に含まれていないため、複製欠損レンチウイルスベクターは、それ自体で複製しない。このベクターから欠失される遺伝子は、一般的に、パッケージング細胞株において一つ以上のヘルパーまたはパッケージングング構築物によって提供される。パッケージングング細胞株は、必須のＧＡＧタンパク質、ＰＯＬタンパク質およびＥＮＶタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらの遺伝子構築は、パッケージングングシグナル（本明細書中では「パッケージングング配列」ともいわれる）を含まない。従って、パッケージング細胞株は、それ自体は空のビリオン粒子のみを形成し得る。しかしながら、標的細胞への送達において目的の遺伝子をパッケージングするために、必須のウイルス遺伝子は、トランスで提供されなければならず、この結果、組換えウイルスベクター構築物は、感染性でかつ複製欠損のベクターへと構築され得る。
【０００５】
パッケージングングシグナルを有するレンチウイルスベクター構築物が、パッケージング細胞株に導入される場合、細胞株は、他に必須のレンチウイルス遺伝子を持たないレンチウイルスベクター構築物のゲノムを含むベクター粒子を産生する。ベクター構築物から必須の遺伝子を除去することによって産生された感染性ウイルス粒子またはベクターは、複製能力のあるウイルスを産生しないで、目的の異種遺伝子を感染細胞に送達し得る。この様式において、必須の遺伝子がトランスで提供される場合にのみ、宿主細胞は、目的の遺伝子を有するベクター構築物を含む組換え複製欠損ベクターを産生する（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／３３７２５（ＷＯ  ０１／４４４５８））。
【０００６】
しかしながら、現在のベクターの使用およびパッケージングング構築の細胞株において、いくつかの欠点がある。一つの問題は、産生細胞による複製能力のあるレンチウイルスの産生を含む。簡単に言えば、例えば、ベクターＤＮＡを含む構築物および他の必須のウイルス遺伝子を含む構築物が、互いに組換えする場合、または、ベクターＤＮＡもしくは他の必須のウイルス遺伝子を含む構築物が、産生細胞において、相同の潜在性内因性レトロウイルスエレメントと組換えをおこす場合、複製能力のあるウイルスは、従来の産生細胞中に産生され得る。さらに、組換えレンチウイルスベクターが、ベクター構築物とのトランスフェクション後に、宿主細胞の相同性配列と遭遇する場合、感染された宿主細胞は、ベクターゲノムと宿主細胞内に存在する内因性ウイルス配列との間で組換えを起こす。
【０００７】
より安全なパッケージングング細胞株を構築する最近の手法の一つは、ヘルパーウイルスエレメントの相補部分（個々の二つのプラスミド（一つのプラスミドはｇａｇおよびｐｏｌを含み、別のプラスミドはｅｎｖを含む）の間で分割される）の使用を含む（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０−１１２４；およびＭａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６７：６００−６０６、１９８８を参照のこと）。この二重プラスミドシステムの利点の一つは、三つの組換えの事象が、複製能力のあるゲノムを産生するために必要とされるということである。この手法は、共パッケージングング（ｃｏ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ）、およびその後の野生型ウイルスゲノムの多数の構成成分の移行における能力を最小にし、そして、パッケージングング細胞において組換えレンチウイルスシステムを包含する特徴的なＤＮＡ構成成分の存在に起因する組換え頻度を有意に減少する。それにもかかわらず、二重構成成分システム（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）は、ベクター構築物に相同なＤＮＡ部分を含むという欠点を有し、従って、構築物間の相同組換えによって、複製能力のあるウイルスを産生する可能性を保持する。
【０００８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づく遺伝子導入システムは、最も発達したレンチウイルスシステムであり、ラットの脳、網膜ならびに筋肉および肝細胞のインビボ形質転換において実証されている。しかしながら、ＨＩＶは、ＡＩＤＳの病因である。さらに、ＨＩＶ−１由来のベクターは、エキソビボでヒト角膜組織を形質転換し、そして、インビトロでトランスフェクトされた非刺激性の造血幹細胞は、インビボのリンパ球開発モデルにおいて、成熟Ｔ細胞および成熟Ｂ細胞へと発達する（Ｄｏｕｇｌａｓら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２（４）：４０１−４１３（２００１）；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７（１９９９））。ＨＩＶに基づいた組換えレンチウイルスベクターは、遺伝子治療において、種々の安全性に関する問題をもたらす。例えば、複製欠損ＨＩＶベクターが、内因性ヒトレンチウイルスと潜在的にまたは一過性に感染細胞と組換えを起こす場合、複製能力のあるＨＩＶを産生する危険がある、ということが推測されている。同一の宿主細胞内で相同ウイルス配列と接触する非ヒトレンチウイルスまたは特に非霊長類レンチウイルス（例えば、ＢＩＶ）における危険は、発生する可能性がはるかに少ない。
【０００９】
ＨＩＶに基づいたレンチウイルスベクターの安全性に関する問題を回避するために、動物のレンチウイルス（例えば、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ビスナウイルス）は、遺伝子導入ベクターの産生に対して使用されている。しかしながら、これらの動物レンチウイルスから誘導されたベクターは、ＨＩＶから誘導されたベクターと同様に機能されないことが示されている（Ｐｒｉｃｅ  ＭＡら、２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  ＪＰら、２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；ｌｋｅｄａ  Ｙら、２００２，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ  ＲＤら、２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。
【００１０】
ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）は、レトロウイルスサブファミリーのｌｅｎｔｉｖｉｒｉｄａｅに分類される。レンチウイルスは、外因性の非腫瘍レトロウイルスであり、とりわけウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ビスナおよびヒツジの進行性肺炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス(ＦＩＶ)ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）を含む。レンチウイルスの間には、系統群の間で相同性の異なる系列がある。
【００１１】
ウシの免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ビスナウイルスと全体の相同性とに優位な共有はない（Ｇａｒｖｅｙ  ＫＪら、１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；Ｇｏｎｄａ  ＭＡら、１９９４，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。ＢＩＶは、系統学的な分析において、ＨＩＶおよびＳＩＶから最も離れたレンチウイルスである (Ｇｏｎｄａ  ＭＡら、１９９４, Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。他のレンチウイルスと異なって、ＢＩＶは、広範に研究されておらず、いくつかの重要なＢＩＶエレメントの位置（例えば、パッケージングシグナル配列およびＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ））は、同定されていない。従って、これは、このウイルスから進歩した遺伝子導入システムを誘導するために、重大な難題を提示する。広範囲の研究の後、ＢＩＶパッケージングングシグナル配列およびＲＲＥ配列は、本発明でマップされ、そして、進歩したＢＩＶベクターが産生された。ＢＩＶ由来のベクターは、力価（インビトロおよびインビボにおける形質転換の効率および遺伝子発現の持続時間）においてはＨＩＶに基づいたベクターと同様に機能した。
【００１２】
ＢＩＶはウシを感染し、また有害な効果は不明である。ＨＩＶのように、ＢＩＶは、アクセサリー遺伝子を有するが、大部分はＨＩＶのアクセサリー遺伝子と異なる。ＢＩＶは、ＨＩＶと系統学的に異なるが、Ｔ細胞を容易に感染しない。これは、インビボにおける単球および脾臓マクロファージで主に認められる。水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ−Ｇ)のＧタンパク質は、ゲノム内の偽性ビリオンおよび他のウイルスのマトリックス要素を効率的に形成する。ＶＳＶ−Ｇのエンベロープを含む組換えＢＩＶウイルス構築は、異種遺伝子の形質導入および発現の効率でヒト細胞へ首尾よく導入されている（ＨＩＶ遺伝子導入システムで見られる手法）（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７（７）：３３７１−３３８２（２００１））。
【００１３】
米国特許第６，２７７，６３３号（Ｏｌｓｅｎで発行）は、ｇａｇ/ｐｏｌ発現ベクターである第１ベクター、ベクターゲノムの逆転写を必要とするシス作用配列エレメント、パッケージングング配列、および異種遺伝子が挿入され得る付加的に含むマルチクローニングサイトを有する第２のベクターを含む、ＥＩＡＶに基づく組換えレンチウイルスベクター発現システムを記載する。Ｏｌｓｅｎに記載されたシステムはまた、ウイルスエンベロープタンパク質を発現する第３のベクターを利用する。第１ベクターおよび第３ベクターは、パッケージングングシグナル欠損である。
【００１４】
本発明は、広範囲な真核細胞への異種遺伝子の移行のために、ＢＩＶゲノムに基づいて最適化された遺伝子導入システムを提供する。このシステムは、本発明のベクターおよびパッケージングング細胞株が、種々のシステムの構築の間の相同性を最小にするように設計されており、その結果、複製能力のあるＢＩＶベクターを産生する可能性を減少している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（本発明の要旨）
本発明は、遺伝子導入システム（ウイルスＲＮＡのパッケージングングおよび感染細胞染色体へのプロウイルスＤＮＡの組み込みに必要なＢＩＶ  レンチウイルスパッケージングング遺伝子およびシス作用遺伝子が、異なるＤＮＡ構築物上に提供される）を包含し、ここで、一つ以上の構築物は、一つ以上のＢＩＶパッケージングング遺伝子（標的細胞に目的の異種遺伝子を送達するための複製欠損感染性粒子を提供するために、追加のＤＮＡ構築物を補足し得る）を含む。この構築物の種々の構成要素は、同じまたは異なるＤＮＡ分子に提供され得、そして三つ、四つもしくは五つの別個の構築物を含み得る。
【００１６】
一つの実施形態において、本発明は、組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを包含し、ここで、組換え複製欠損ベクターの産生に必要な遺伝子が、三つの異なるＤＮＡ構築物に提供され、このシステムは、以下：ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むパッケージングング構築物；ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および複製欠損ベクターへの目的の相同性遺伝子のパッケージングングのため、目的の相同性遺伝子および最少のＢＩＶパッケージングング配列を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物、を包含する。好ましい実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および
（ｃ）第１のＲ領域に作動可能に連続して連結された第３のプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域（非翻訳領域）、最小ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結された第４のプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域、第２のＲ領域および任意の第２のＵ５領域を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物；
パッケージングングの一つに位置するｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子および導入ベクター構築物；ここで、全てのプロモーターは、同じまたは異なり得るプロモーター、
を包含する、三構築システムを提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを包含し、ここで、組換え複製欠損ベクターの産生に必要な遺伝子が、四つの異なるＤＮＡ発現構築物において提供し、このシステムは、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを含むパッケージングング構築物；ＢＩＶ  ｒｅｖ遺伝子を含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物；ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子；および目的の異種遺伝子ならびに複製欠損ベクターへ目的の異種遺伝子のパッケージングングのためのＢＩＶパッケージングング配列を含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子ベクター構築物、を包含する。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、四構築システムを提供し、該組換えレンチウイルス遺伝子導入システムは、以下：
（ａ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；
（ｃ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された第３のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物；および
（ｄ）第１のＲ領域に作動可能に連続して連結された第４のプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、最小ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結された第５のプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域、第２のＲ領域および任意の第２のＵ５領域を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物；ここで、全てのプロモーターは、同じかまたは異なり得るプロモーター
、を包含する。
【００１９】
なお、さらなる実施形態において、本発明は、組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを包含し、ここで、組換え複製欠損ベクターの産生に必要な遺伝子は、五つの異なるＤＮＡ発現構築物上に提供され、このシステムは、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含む第１のパッケージングング構築物；ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含む第２のパッケージングング構築物；ｒｅｖ遺伝子を含むｒｅｖ構築物；ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および目的の異種遺伝子ならびに複製欠損ベクターへ目的の異種遺伝子のパッケージングングのためのＢＩＶパッケージングング配列を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物、を包含する。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、以下：
（ａ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物；
（ｂ）ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージングング構築物；
（ｃ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結された第３のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；
（ｄ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された第４のプロモーターを含むｒｅｖ構築物；および
（ｅ）第１のＲ領域に作動可能に連続して連結された第５のプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結された第６のプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域、第２のＲ領域および任意の第２のＵ５を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物；ここで、全てのプロモーターは、同じかまたは異なり得るプロモーター
、を包含する、五構築システムを提供する。
【００２１】
一つの実施形態において、一つ以上のプロモーターは、調節可能なプロモーターである。例えば、いくつかの模範的な実施形態において、調節可能なプロモーターは、誘導性プロモーターならびに抑制性プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターならびに組織特異的なプロモーターからなる群から選択される。別の実施形態において、異種遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、構造プロモーターである。別の実施形態において、異種遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、組織特異的なプロモーターである。別の実施形態において、異種遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性または抑制性である。別の実施形態において、少なくとも一つのｇａｇ遺伝子またはｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、調節可能である。別の実施形態において、少なくとも一つのｇａｇ遺伝子またはｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性または抑制性である。別の実施形態において、ウイルス表面タンパク質と作動可能に連結されたプロモーターは、調節可能である。別の実施形態において、ウイルス表面タンパク質と作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性または抑制性である。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＢＩＶパッケージングング配列および目的の異種遺伝子を有する導入ベクター構築物は、第１のＲ領域と作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＢＩＶ  ＲＲＥ、目的の異種遺伝子と作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ３領域および第２のＲ領域、そして必要に応じて、第２のＵ５領域を含む。
【００２３】
一つの実施形態において、本発明の種々の遺伝子導入システムは、再コード化（最適化されたコドン）核酸配列を含み、ここで、再コード化配列は、野生型ＢＩＶ遺伝子機能をコードし、以前のＢＩＶ遺伝子導入システムと比較した場合、このシステムの異なるＤＮＡ構築物の間における配列相同性はさらに減少している。
【００２４】
なお、別の実施形態において、本発明の種々の遺伝子導入システムは、再コード化された核酸配列を含み、ここで、再コード化された配列は、真核細胞におけるタンパク質の翻訳のために、最適の再コード化されたコドンの利用を含むが、野生型ＢＩＶ遺伝子機能をコードする。特に好ましい実施形態において、真核細胞はヒト細胞である。
【００２５】
本発明は、さらに本発明の遺伝子導入システムを利用するパッケージングング細胞およびパッケージングング細胞株を提供する。パッケージングング細胞およびパッケージングング細胞株は、パッケージングング構築またはパッケージングング構築物およびウイルス表面タンパク質遺伝子構築を包含する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の遺伝子導入システムを利用する産生細胞および産生細胞株を提供する。産生細胞および産生細胞株は、パッケージングング構築またはパッケージングング構築物、ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物および導入ベクター構築を包含する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明の遺伝子導入システム、細胞物および細胞株を利用する複製欠損組換えレンチウイルスベクターを産生する方法を提供する。
【００２８】
本発明はまた、産生細胞における本発明の遺伝子導入システムの発現によって生成されたベクターを提供する。パッケージングング細胞に対して導入ベクターを追加することにより、産生細胞が生成される。産生細胞は、ビリオンまたはベクターＲＮＡを含むベクターを産生する。ベクターを用いた細胞の感染は、細胞に目的の異種遺伝子の導入および細胞内に目的の異種遺伝子の発現を生じる。
【００２９】
なお別の実施形態において、本発明は、本発明の複製欠損組換えレンチウイルスベクターと動物の細胞とを接触することによって、動物を処置する方法を提供する。動物細胞の接触は、インビボまたはインビトロにて生じ得る。
【００３０】
本発明はさらに、ヒトにおける使用について、改善された安全性を有する組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを包含し、ここで、ＨＩＶのパッケージングング遺伝子をコードしそして発現する細胞へ導入される（例えば、野生型ＨＩＶへの感染によって）場合、このシステムのＢＩＶに基づいたベクターＲＮＡは、感染性のベクターへパッケージングされ得ない。
【００３１】
本発明はさらに、遺伝子導入ベクターおよび遺伝子導入ならびに発現の方法（特定の細胞型の遺伝子機能の研究における遺伝子の発現パターンを変えるために使用され得る）を提供する。
【００３２】
本発明に従って、ＢＩＶゲノム上の遺伝子（感染性ベクターへのウイルスＲＮＡの効率的なパッケージングングのために必要な、ＢＩＶパッケージングング配列の最小の核酸配列を含む）の位置が、決定される。
【００３３】
ＢＩＶゲノム上の遺伝子（感染細胞の核膜にプロウイルスの核酸を含むレンチウイルスのプレインテグレーション複合体の移行を促進するｃＰＰＴ（主要なポリプリン路）を含む）の位置がまた、決定される。これは、ｃＰＰＴが、非分裂細胞を形質転換するために、レンチウイルスベクターを絶対的に必要としないが、ｃＰＰＴは、非分裂細胞にレンチウイルスのプレインテグレーション複合体の核移行を増強するということを示唆している。リボゾームフレームシフト部位（単一のｍＲＮＡ転写物由来のＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子の同時翻訳を可能にする）を含むＢＩＶゲノム上の遺伝子位置がまた、決定される。
【００３４】
一つの実施形態において、ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子との間のフレームシフト部位の知見は、これらの遺伝子を再コードするために使用されている。結果として、再コード化されたｇａｇおよびｐｏｌは、宿主細胞中でより効率的に翻訳され、増強されたウイルス価を有する組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを提供する。また、再コード化されたｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は、パッケージングング構築とベクター構築との間の相同性の減少を伴う、組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを提供する。さらに、理論によって制限されないが、再コード化されたｇａｇ遺伝子配列およびｐｏｌ遺伝子配列は、そこから発現されたｍＲＮＡに改変された二次構造を有すると信じられており、この結果、ベクター産生細胞内にｇａｇおよびｐｏｌを機能的に発現するために、ＲＲＥ配列を必要としない組換えレンチウイルス遺伝子導入システムを提供する。このｇａｇ/ｐｏｌ構築物からのＲＲＥの除去は、ベクター構築物内のＲＲＥ配列の全ての相同性を除去し、この結果、さらに、複製能力のある組換えレンチウイルスを産生する可能性を減少させる。本発明のこの局面は、安全性の追加基準を提供する。
【００３５】
ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子の配列をコードするＲＮＡがまた、決定されている。一つの実施形態において、本発明は、配列番号５０に示されるように、野生型ｐｏｌからなる核酸配列を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号５２に示されるように、再コード化されたｐｏｌ配列を提供する。別の実施形態において、本発明は、配列番号５１に示されるように、ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子産物のポリペプチド配列をコードする単離された核酸を提供する。なお別の実施形態において、本発明は、野生型ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子配列にＡＴＧコドンを追加した合成配列である、配列番号５３に示された合成核酸を提供する。なお別の実施形態において、本発明は、再コード化されたＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子配列にＡＴＧコドンを追加した合成配列である、配列番号５４に示された合成核酸を提供する。
【００３６】
別の実施形態において、本発明のｇａｇ／ｐｏｌ構造物は、プロテアーゼをコードする配列が、コード化されたレンチウイルスプロテアーゼのＴ２６Ｓ置換に相当する変異を含む、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０２８０７（ＷＯ  ０２／０７２８５１）に記載されるような変異を含む。
【００３７】
ｒｅｖ遺伝子についてのＢＩＶゲノム上の遺伝子位置がまた、決定されている。ｒｅｖの位置に関する知見を利用して、単一のオープンリーディングフレームでｒｅｖ遺伝子をコードするＤＮＡを合成した。これに従って、組換えレンチウイルス遺伝子導入システムは、構築されている（ｒｅｖ遺伝子は、ｇａｇおよびｐｏｌから個々の発現構築物上に提供される）。ｒｅｖ遺伝子は、二つのエキソン内に含まれるスプライスされたメッセージとして、あるいは一つのエキソンおよびオープンリーディングフレーム内にコードされた単一のメッセージとして、発現され得る。
【００３８】
ＢＩＶ  ＲＲＥについてのＢＩＶゲノム上の遺伝子位置がまた、決定されている。ＢＩＶ  ｅｎｖ領域に位置されたＡ３１２核酸配列は、配列番号４０に示されるように、ＢＩＶ  ＲＲＥ遺伝子配列を含む。
【００３９】
本発明はさらに、細胞培地中にヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む培養液中で、産生細胞を培養する工程を包含し、この結果、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がない状態で培養されたウイルスベクターと比較された場合、宿主細胞のより高い力価およびより大きな感染力を有する組換え複製欠損ベクターを産生する。
（配列リストの簡単な説明）
本開示に関連する配列リストは、本明細書中において参考として本開示に援用される。以下は配列リストに含まれる配列の説明である：
配列番号１  ウシ免疫不全ウイルス
配列番号２〜９  オリゴヌクレオチド
配列番号１０  Ｒｅｖ遺伝子
配列番号１１〜３８  オリゴヌクレオチド  
配列番号３９  ＢＩＶパッケージングシグナル
配列番号４０  ＢＩＶ  ＲＲＥ配列を含む３１２ｂｐのＢＩＶ  ｅｎｖ配列
配列番号４１〜４８  オリゴヌクレオチド
配列番号４９  再コード化されたＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌのＤＮＡ配列
配列番号５０  ＢＩＶ  ｐｏｌ  ＤＮＡ配列
配列番号５１  ＢＩＶ  ｐｏｌアミノ酸配列
配列番号５２  再コード化されたＢＩＶ  ｐｏｌ  ＤＮＡ配列
配列番号５３  ＡＴＧを伴う野生型ＢＩＶ  ｐｏｌ配列
配列番号５４  ＡＴＧを伴う再コード化されたＢＩＶ  ｐｏｌ  ＤＮＡ配列
配列番号５５  ＨＩＶプロテアーゼの部分アミノ酸配列
配列番号５６  ＢＩＶプロテアーゼの部分アミノ酸配列
配列番号５７  変異されたＨＩＶ  ＨＸＢ２プロテアーゼの部分アミノ酸配列
配列番号５８  変異されたＢＩＶプロテアーゼの部分アミノ酸配列
配列番号５９  プロテアーゼ変異を伴う再コード化されたｇａｇ/ｐｏｌ
配列番号６０  マウスＲｄＣＶＦ１  ｃＤＮＡ
配列番号６１  翻訳されたマウスＲｄＣＶＦ１  ｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号６２  ヒトＲｄＣＶＦ１  ｃＤＮＡ
配列番号６３  翻訳されたヒトＲｄＣＶＦ１  ｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号６４  マウスＲｄＣＶＦ２  ｃＤＮＡ
配列番号６５  翻訳されたマウスＲｄＣＶＦ２  ｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号６６  ヒトＲｄＣＶＦ２  ｃＤＮＡ
配列番号６７  翻訳されたヒトＲｄＣＶＦ２  ｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号６８  Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ
配列番号６９  翻訳されたＴｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープのアミノ酸配列
配列番号７０  再コード化されたＴｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ
配列番号７１  翻訳された再コード化Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープのアミノ酸配列
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、別の方法で示されない限りは、従来の細胞生物学の技術、分子生物学、細胞培養、ウイルス学、免疫学およびその他（当業者に周知）を用いる。これらの技術は、現在の文献で十分に開示され、そして、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２編， Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｃｅｌｉｓ（１９９４）；Ｂａｈｎｓｏｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５４：１３１−１４３（１９９５）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）；Ｒｉｇｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：２９０−２９５が参照される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、文脈が他の方法で明確に示していない限り、単数の形態「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、複数の参照に含む。例えば、「ベクター粒子」に対する参照は、複数のベクター粒子を含む。
【００４１】
用語「構築物」は通常、プラスミドの文脈でＤＮＡ配列をいうが、多数の構築物は同じプラスミドの上に提供され得る。
【００４２】
用語「遺伝子」と「コード配列」は、本明細書に交換可能に使用され、そしてタンパク質をコードする「オープンリーディングフレーム」をいう。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「欠損」は、機能がないか、または生物活性（遺伝子産物をコードするかもしくは発現する、あるいはシス作用性核酸配列として作用する）に関して、野生型との比較において低下された機能を有するウイルスベクターまたは核酸配列をいう。非制限例で例証するために:欠損があるｅｎｖ遺伝子配列は、ＥＮＶタンパク質をコードしない；欠損があるパッケージングシグナルは、天然のパッケージシグナルと同じ有効性で、欠損シグナルが位置される核酸分子のパッケージングを促進しない；そして、複製「欠損」レンチウイルス粒子は、また宿主細胞へのエントリー後、新しい感染ウイルス粒子を複製かつ産生し得ない。核酸配列は、当該分野で公知の任意の手段によって（いくつかの配列もしくはすべての配列の欠失により、フレーム外にこの配列を置くことにより、または他の方法でこの配列をブロックすることにより）、欠損を作製され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「欠失された」または「欠失」は、標準的な使用に従って、効力のないセグメントまたは非機能性のセグメントにするための、特定のセグメントの総欠失または特定の十分な部分のセグメントの欠失のいずれかを意味する。本明細書で使用される場合、用語「複製欠損」は、ＢＩＶ構造タンパク質をコードする構築物が、カプシド形成され得ないか、または産生細胞またはパッケージング細胞においてわずかなレベルでカプシド形成されることを意味する。パッケージされたベクターがカプシド形成に必要であるウイルス構造タンパク質の全てを含まない場合、結果として生じるレンチウイルス粒子は複製欠損があり、少なくとも必要な構造タンパク質の1つがそこから欠失されて、この結果、パッケージされたベクターが全体のウイルスゲノムを複製できない。
【００４５】
本明細書で使用される場合、語句「必須遺伝子」または「ＢＩＶ必須遺伝子」は、感染性のレンチウイルス粒子を生成するために、ＢＩＶゲノムのカプシド形成(例えば、パッケージング)に必要とされるタンパク質をコードする遺伝子をいい、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖならびにｒｅｖ（ベクターゲノムＲＮＡをプロウイルスＤＮＡへの逆転写および標的細胞ゲノム（例えば、ＢＩＶ  ＬＴＲ）へのプロウイルスＤＮＡの挿入に必要とされるシス作用エレメント）を含む。
【００４６】
「発現構築物」とは、ＤＮＡセグメント上に含まれる一つ以上の遺伝子または遺伝子の一部を含むＤＮＡセグメント（当該分野で公知のコード化されたタンパク質もしくは核酸の転写および翻訳に関する全てのアクセサリー領域、オープンリーディングフレームをコードするタンパク質、シスに作用する調節エレメントおよびその他を含む）をいい、ここで、この遺伝子または遺伝子の一部は、プロモーター領域およびエンハンサー領域の組み合わせを含み得る。さらに、このような構築物は、複製起点を含み得、この結果、全体の構築物が宿主細胞内で複製し得る。本発明の構築物は、1つ以上のＤＮＡベクターを提供する。好ましい実施形態において、本発明の各々の構築物は、個々のＤＮＡ分子上に提供する。
【００４７】
「ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物」とは、ウイルス表面タンパク質遺伝子をコード化して、そして発現するＤＮＡセグメントをいう。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」または「遺伝子配列」は、核酸分子（好ましくは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）をいうことを意図する。このような核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プロウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡもしくはこれら自身の組み合わせを含む種々の起源に由来し得る。このような遺伝子配列は、天然に生じるイントロンを含み得るかまたは含み得ないゲノムＤＮＡを含み得る。さらに、このようなゲノムＤＮＡは、プロモーター配列またはポリアデニル化配列と関連して得られ得る。ゲノムまたはｃＤＮＡは、当業者に周知の任意の多数の方法で得られ得る。例えば、ゲノムＤＮＡは、当該分野で周知の手段により、適当な細胞から抽出し、そして精製され得る。あるいは、ｍＲＮＡは、細胞から単離され、そして逆転写または他の手段でｃＤＮＡを調製するために使用され得る。
【００４９】
用語「作動可能に連結された」は、遺伝子配列とプロモーターまたは他の調節配列もしくはプロセス配列との間の連結を説明するために使用され、この結果、遺伝子配列の転写が、作動可能に連結されたプロモーター配列によって指向され、遺伝子配列の翻訳が、作動可能に連結された翻訳調節配列によって指向され、そして／または、遺伝子配列の翻訳後のプロセシングは、作動可能に連結されたプロセシング配列によって指向される。非制限例は、ＡＴＧ開始コドン、ポリペプチドのエクスポートに関するリーダー配列、リボソーム結合部位、およびその他を含む。例えば、遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターは、宿主細胞内の遺伝子の発現を提供する。遺伝子配列が、それ自身のプロモーターおよびＡＴＧ開始コドンを含まない場合、ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子配列のケースにおいては、これらのアクセサリー配列は、当該分野で周知の技術を用いて提供され得る。
【００５０】
二つ以上の核酸配列またはタンパク質配列の文脈において、用語「同一性の」または「同一性」パーセントは、本明細書に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム）を用いて、あるいは目視検査によって測定される場合、同一である二つ以上の配列もしくは部分配列をいうか、または同一である特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（最大の一致を比較しそして一列にされる場合）ことをいう。配列比較のために、代表的には、1つの配列は、試験配列が比較される参考配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参考配列はコンピューターに入力され、必要ならば部分配列座標は指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメターに基づいて、参考配列と関連する試験配列に対して、パーセント配列同一性を計算する。
【００５１】
比較に関する最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局在的な相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’  ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似方法の検索によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピューター化しているインプリメンテーションによって、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒを通じてバイオテクノロジーインフォメーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／)を公的に利用可能なソフトウェアを有するＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））によって、または目視検査（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌら、以下を参照のこと）によって、行われ得る。本発明の目的において、比較のための最適な配列アライメントは、最も好ましくは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局在的相同性アルゴリズムによって行われる。
【００５２】
本発明の文脈において、用語「単離された」は人為的に、天然の環境から離れ、従って、天然の産物ではない核酸分子、ポリペプチド、ウイルス、または細胞をいう。単離された核酸分子またはポリペプチドは、精製された形態に存在し得るか、または非天然の環境（例えば、組換え宿主細胞）に存在し得る。単離されたウイルスまたは細胞は、精製された形態（例えば、細胞培養中）に存在し得るか、または非天然の環境（例えば、組換え体もしくは異種遺伝生物）に存在し得る。
【００５３】
用語「天然」は、野生型ウイルスまたは細胞のゲノムの中に存在している遺伝子をいう。
【００５４】
用語「天然に生じる」または「野生型」は、ヒトによって人工的に産生されるものとは異なり、天然に見出され得る物を記載するために使用される。例えば、有機体(ウイルスを含む)に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列（天然の供給源から単離され得、そして研究室のヒトによって意図的に改変されていない）が、天然に生じる。
【００５５】
特定の核酸配列をいうために使用される場合、用語「本質的になる」は、特定の配列が、５’末端または３’末端のいずれかもしくはその両方に、２０個までの付加残基を有し得ることを意味し、ここで、付加残基は、塩基および新しく特徴的な暗唱配列（ｒｅｃｉｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に物質的には影響しない。
【００５６】
本発明のプロモーター配列は、真核生物または原核生物起源のプロモーターを含み得、そして、細胞内の末端に位置する配列（すなわち、プロモーター配列の３’末端に連結された配列）の転写を指向するのに十分である。プロモーター領域はまた、転写の増強または抑制に関する制御エレメントを含み得る。適当なプロモーターは、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター(ｐＣＭＶ)、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列プロモータ(ｐＲＳＶ)、およびＳＰ６、Ｔ３もしくはＴ７プロモーターである。プロモーターから上流のエンハンサー配列およびコード配列の下流のターミネーター配列は、必要に応じて、発現を促進するために、本発明のベクター内に含まれ得る。本発明のベクターはまた、追加の核酸配列（例えば、ポリアデニル化配列）を含み得、そしてベクターの核酸によって発現されたタンパク質を、効率的にそして効果的にプロセスするために、細胞を許容するのに十分な局在化配列またはシグナル配列をコードし得る。好ましいポリアデニル化配列の例は、ＳＶ４０初期領域のポリアデニル化部位（Ｃ．Ｖ．Ｈａｌｌら、Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐ．Ｇｅｎｅｔ．２，１０１（１９８３））およびＳＶ４０後期領域のポリアデニル化部位（Ｓ．ＣａｒｓｗｅｌｌおよびＪ．Ｃ．Ａｌｗｉｎｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９，４２４８（１９８９））である。翻訳が所望される場合、このような追加配列がベクターへ挿入され、この結果、これらはプロモーター配列と作動可能に連結されたか、あるいは、翻訳およびプロセシングが所望される場合、付加的に開始配列およびプロセッシング配列と作動可能に連結されている。あるいは、挿入配列は、ベクター内の任意の位置へ置かれ得る。
【００５７】
「ヘルパー構築物」（ＤＮＡ配列という）と時々いわれる用語「パッケージング構築物」はまた、通常プラスミド上に存在するが、産生細胞ゲノム（一つ以上のレンチウイルスに必須遺伝子（レンチウイルスベクター粒子を得るために必要とされるトランスなタンパク質に提供する）の発現を指向し得る）へ組み込まれ得る。
【００５８】
本発明で使用される場合、「パッケージシグナル」または「パッケージシグナル配列」とは、ウイルスベクターＲＮＡを感染性ビリオンへ効率的にパッケージングするのに必要なウイルスＲＮＡ（またはＤＮＡ）をいう。
【００５９】
「再コード化」された遺伝子とは、核酸によってコードされるポリペプチドが、改変されない配列と同じ様に残存するが、ポリペプチドをコードする核酸配列が変更されているという様式で改変される遺伝子（ｇｅｎｅ）または遺伝子（ｇｅｎｅｓ）をいう。遺伝コードの縮退に起因し、同じアミノ酸翻訳産物をコードし得る多数のＤＮＡコドンおよびＲＮＡコドンが存在することは、当該分野で周知である。例えば、一つの実施形態において、ＢＩＶのｇａｇ遺伝子および／またはｐｏｌ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、「再コード化」され、その結果、核酸配列は改変されるが、ＧＡＧポリペプチドおよびＰＯＬポリペプチドに対するアミノ酸翻訳配列は、野生型アミノ酸配列とまったく同様に残存する。さらに、異なる有機体は、アミノ酸を合成するために、特定のコドンの利用において異なる優先性を有することもまた公知である。
【００６０】
用語「ベクター」とは、ウイルスベクター構築物の配列をコードするＲＮＡが、ウイルスベクター粒子へパッケージされる際に得られる組換え複製欠損レンチウイルスベクターをいう。従って、組換えレンチウイルスベクターとは、粒子およびこれらに含まれたＲＮＡの両方をいう。
【００６１】
「ベクター構築物」とは、通常、ＲＮＡ（感染性ウイルスベクター粒子の中にパッケージされ得る）を産生する配列をコードするプラスミドのコンテクストにおけるＤＮＡ配列をいう。
【００６２】
一般に、レンチウイルスは、複製周期（ウイルスベクター粒子の中へのウイルスＲＮＡのパッケージング、標的細胞の感染、ＲＮＡゲノムのＤＮＡプロウイルスコピーの産生、宿主の核へのＤＮＡのトランスポート、標的細胞染色体へのプロウイルスＤＮＡの組み込み、組み込まれたＤＮＡからのウイルスｍＲＮＡの転写、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子ならびにｅｎｖ遺伝子の発現、および宿主細胞から放出される成熟ウイルス粒子の中へのＲＮＡウイルス転写物のパッケージングを含む）の本質的な特徴を共有する。レンチウイルスゲノムの長末端反復配列（ＬＴＲ）は、逆転写、ウイルスＤＮＡ組み込み、および転写ならびにアデニル化に重要なシス作用配列を含み、そして、一つ以上のこれらのエレメントは、本発明の構築物に組み入れら得る。好ましくは、本発明のベクター構築物は、機能的なＬＴＲ（プロウイルスＤＮＡへのベクターＲＮＡの逆転写および標的細胞ゲノムへのプロウイルスＤＮＡの組み込みを指向し得る）を産生するために、５’末端のＬＴＲの十分量のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。この構築物はまた、３’ＬＴＲ領域を含み、そして、Ｕ３領域、Ｒ領域および必要に応じてＵ５領域を含む。
【００６３】
ｇａｇ遺伝子は、レンチウイルスゲノムの上の５’遺伝子に大部分に存在し、そして、成熟ウイルス粒子を形成する構造タンパク質をコードする。ｇａｇ遺伝子は、前駆体ポリペプチド（後に、これは、３〜５つの構造タンパク質を産生するために切断される）を産生するために翻訳される。
【００６４】
ｐｏｌ遺伝子は、レンチウイルスポリプロテイン産生物の切断、ウイルスＲＮＡの逆転写および宿主染色体へのプロウイルスＤＮＡの組み込みを担う酵素をコードする。
【００６５】
ｅｎｖ遺伝子は、ＢＩＶおよびレトロウイルスのウイルス表面蛋白質を含むエンベロープタンパク質をコードする。本開示に使用される場合、ｅｎｖ遺伝子は、天然のｅｎｖ遺伝子配列だけでなく、レトロウイルスおよびレンチウイルス標的特異性を改変した改変体を含むｅｎｖ遺伝子、または偽型レトロウイルス／レンチウイルスを生成するために使用されるｅｎｖ遺伝子に対する改変体を含む（例えば、ＷＯ  ９２／１４８２９を参照のこと）。一般に、用語「エンベロープ表面タンパク質遺伝子」および「ｅｎｖ遺伝子」は、別の方法で明確に示されない場合、同じ意味を有する。ｅｎｖ遺伝子は、任意のウイルス（レトロウイルスを含む）由来であり得る。ｅｎｖは、好ましくは、ヒトの細胞または他の種の細胞の形質転換を可能にする。ターゲッティングのために抗体または特定のリガンドとエンベロープタンパク質を連結することによって、特定の細胞型のレセプターに組換えウイルスを標的することが所望であり得る。このような実施形態において、エンベロープタンパク質と結合された抗体またはリガンドの両方が、ウイルス表面タンパク質遺伝子を含む。好ましくは、このリガンドは、遺伝的にＥＮＶタンパク質に組み込まれたペプチド配列である。例えば、糖脂質、タンパク質、またはペプチドを挿入することによって、ベクターは、標的特異性を作製され得る。さらに、レンチウイルスベクターを標的にするのに、抗体の抗原結合部分または組換え型の抗体タイプ分子（例えば、単一鎖抗体）を使用することによって、ターゲッティングは達成され得る。さらに、ベクターエンベロープタンパク質の特異的な改変（例えば、エンベロープへリガンド（例えば、ヘパリン硫プロテオグリカン結合モチーフ）を挿入する）によって、ベクター指向性または特異的ターゲッティングは達成され得る。エンベロープは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ、ＬＣＭＶエンベロープ（Ｂｅｙｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，１；７６（３）：１４８８−９５）、変異ＶＳＶ−Ｇエンベロープまたは変異ＬＣＭＶエンベロープを含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、リガンドは、エコトロピックなエンベロープタンパク質（リガンドを表すための足場として機能する）上に発現され得る。好ましい実施形態において、エコトロピックなエンベロープは、ベクターの安定性の改善のために改変される（ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９０３６（ＷＯ  ０２／２２６６３））。当業者は、特定の標的に対してレンチウイルスベクターの送達を達成する特定の方法を知っている（または、不当な実験をしないで容易に確かめられ得る）。
【００６６】
ＢＩＶの基本的なゲノム構成は、Ｇａｒｖｅｙら、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７５：３９１−４０９，１９９０）、および米国特許第５，３８０，８３０号に開示される。ＢＩＶクローン１２７のプロウイルスＬＴＲは、５８９ヌクレオチドの長さで、そしてＵ３エレメント、ＲエレメントおよびＵ５エレメントからなる（米国特許第５，３８０，８３０号を参照のこと）。ＢＩＶをコードする配列、およびベクター構築物の調製において、使用に適したレンチウイルスを含むプラスミドは、本明細書で提供された開示または寄託所ならびにデータベース（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（例えば、ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第６８０９２号、およびＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第６８０９３号）、およびＧＥＮＢＡＮＫ）から、容易に得られ得る。
【００６７】
本発明で使用される場合、「最小パッケージングシグナル」とは、効率的なパッケージングに必要でないヌクレオチドの大部分を同時に除去する場合、ウイルスベクターＲＮＡの効率的なパッケージングに必要な全ての配列を含むパッケージングシグナルをいう。この様式において、レンチウイルス遺伝子導入システムの組換え構築物に存在するパッケージングシグナルと他のウイルス遺伝子もしくは核酸セグメントとの間の相同性を最小にし得る。ＢＩＶの最小パッケージングシグナルは、配列番号３９（これは、非翻訳領域（５’ＬＴＲならびにｇａｇ開始コドンとｇａｇをコードする配列の最初の１０１ヌクレオチドとの間）を含む）に示される。なお、効率的にウイルスベクターＲＮＡをパッケージし得る場合、当業者は、ヌクレオチドの一層の欠失が可能であり得ることを容易に認識する。
追加のＢＩＶ核酸配列は、本明細書に報告され、最少量のＢＩＶ  ＲＲＥ、ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子との間に位置するリボゾームフレームシフト部位、および再コード化されたｇａｇ配列およびｐｏｌ配列（本発明のパッケージング構築物とベクター構築物との間に、減少される相同性を提供する）を含む。
【００６８】
「ＲＲＥ」または「ＲＲＥ配列」とは、感染細胞の核からウイルＲＮＡのエクスポートを促進するために、ｒｅｖ遺伝子産物と相互作用する核酸配列をいう。「最小ＲＲＥ」または「最小ＲＲＥ配列」とは、効率的なＲＮＡエクスポートには必要でないヌクレオチドの大部分を同時に除去する場合、宿主細胞の核からＲＲＥを含むＲＮＡの効率的なエクスポートに必要な全ての配列からなるＲＲＥをいう。この様式において、レンチウイルス遺伝子導入システムの組換え構築物に存在するＲＲＥと他のウイルス遺伝子もしくは核酸セグメントとの間の相同性を最小にし得る。なお、ＲＲＥ機能を保持する場合、当業者は、一層の欠失が可能であり得ることを容易に認識する。最小のＲＲＥまたはＢＩＶは、配列番号４０に記載される。
【００６９】
異なるＤＮＡセグメント上のＢＩＶゲノムの種々の構成要素を含む一つ、二つそして三つの構築システムは、前述されている。例えば、ＷＯ  ０ｌ／４４４５８を参照のこと。これらのシステムは、組換え型のレンチウイルスビリオンに目的の異種遺伝子をパッケージするために、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子ならびにｐｏｌ遺伝子を利用した構築物、ウイルス表面タンパク質遺伝子をコードするｅｎｖ構築物、およびＢＩＶパッケージングシグナルを有するベクター構築物のパッケージを包含する。前述されたＢＩＶ  ＲＮＡのパッケージングに必要なパッケージングシグナルは、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子の最初の２００塩基対に及ぶと報告された。前述された三つの構成要素システムは、パッケージング配列およびトランスジーン(または、目的の異種遺伝子)を含むＢＩＶベクター構築物、ＢＩＶからのｇａｇ遺伝子ならびにｐｏｌ遺伝子を含むＢＩＶパッケージング構築物、およびウイルス表面タンパク質をコードする遺伝子を含むｅｎｖ構築物を含んだ。
【００７０】
本発明は、三つの構成要素レンチウイルス遺伝子導入システムを提供し、このシステムは、以下 (ｉ)ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むパッケージング構築物、（ｉｉ）ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および（ｉｉｉ）目的の異種遺伝子ならびＢＩＶパッケージングシグナル、および一つの構築物上に位置するｒｅｖ遺伝子を含む導入ベクター構築物、を含む。
【００７１】
本発明はまた、四つの構成要素レンチウイルス遺伝子導入システムを提供し、このシステムは、以下(ｉ)ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むパッケージング構築物、（ｉｉ）ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；（ｉｉｉ）目的の異種遺伝子およびＢＩＶパッケージングシグナルを含む導入ベクター構築物、および（ｉｖ）ｒｅｖ遺伝子を含むｒｅｖ発現構築物、を含む。
【００７２】
本発明はさらに、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含む第１のパッケージング構築物、ＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含む第２のパッケージング構築物、ウイルス表面タンパク質遺伝子を含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物、目的の異種遺伝子ならびにＢＩＶパッケージングシグナルを含む導入ベクター構築物およびｒｅｖ遺伝子構築物を含む、五つの構成要素レンチウイルス遺伝子導入システムを提供する。
【００７３】
本発明の導入ベクター構築物はまた、機能遺伝子導入ベクターに必要なシス作用ウイルス配列を提供する。このような配列は、パッケージング配列（Ψ）、逆転写シグナル、プライマー結合部位、挿入シグナル、およびポリアデニル化配列を含む。導入ベクター構築物はまた、非相同核酸配列が分裂細胞または非分裂細胞に導入されるクローニング部位を含み得る。好ましい実施形態において、ＢＩＶパッケージングシグナルおよび目的の異種遺伝子を有する導入ベクター構築物は、５’から３’の順で：Ｒ領域に作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージングシグナル、ＲＲＥ、目的の異種遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、３’ポリプリン路、Ｕ３領域、第２のＲ領域および必要に応じて第２のＵ５領域を含む。
【００７４】
導入ベクター構築物の異種核酸配列は、調節核酸配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、用語「異種遺伝子」または「異種核酸配列」とは、外来種から（または同じ種から生じる場合）生じる配列をいい、これは、その核酸配列もしくはアミノ酸配列、または発現レベル（例えば、本来の形態から）で、実質的に改変される。異種遺伝子として示す場合、用語はまた、通常細胞内に発現されないか、または発現レベルと異なるレベルで発現される変わりのない核酸配列を含む。好ましくは、異種配列は、キメラ遺伝子をもたらすプロモーターに作動可能に連結されたオープンリーディングフレームである。異種核酸配列は、好ましくは、ウイルスＬＴＲプロモーター−エンハンサーシグナルまたは内部プロモーターのいずれかで制御されており、そして、レンチウイルスＬＴＲ内に保持されたシグナルは、依然としてベクターの効率的な組み込みを宿主細胞ゲノムにもたらし得る。
【００７５】
広範囲のプロモーターは、ウイルスプロモーターまたは哺乳動物プロモーターを含む目的の異種遺伝子を発現するために利用され得る。細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターは、特定の細胞集団における、遺伝子配列の発現を標的にするために利用され得る。本発明のための適当な哺乳動物プロモーターおよびウイルスプロモーターは、利用可能であり、また当該分野で周知である。
【００７６】
別の実施形態は、誘導プロモーターを利用する。制御プロモーターシステムの1つの例は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から現在入手可能なＴｅｔ−Ｏｎ  ＴＭ系およびＴｅｔ−Ｏｆｆ  ＴＭ系である。このプロモーター系は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）によって制御されたトランスジーンの調節発現を可能にする。この系は、このインスタントな発明において、目的の異種遺伝子の発現を制御するために使用され得た。他の調節可能プロモーター系は、ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８１９０（ＷＯ  ０２／０６４６３）およびＰＣＴ／ＥＰ００／１０４３０（ＷＯ  ０１／３０８４３）に記載される。
【００７７】
本発明の遺伝子導入システムの別の構築物は、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子を含むパッケージング構築物である。ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は、異なるリーディングフレーム内にあり、各々オーバーラップする。本発明の１つの実施形態において、遺伝子導入システムは、二つのパッケージング構築物（一つはｇａｇ遺伝子を含み、一つはｐｏｌ遺伝子を含む）を含む。別々の構築物の上にｐｏｌ遺伝子およびｇａｇ遺伝子が提供される場合、プロテアーゼはｐｏｌ遺伝子でコードされる。
【００７８】
ＢＩＶ  ｒｅｖ遺伝子は、二つのエクソンで作製される。第１は、中心領域の３’末端付近に位置され、そしてｅｎｖ遺伝子の５’末端にオーバーラップする。第２のｒｅｖエクソンは、異なるリーディングフレーム内ではなく、ｅｎｖの３’末端に見出される。ＲＥＶタンパク質は、イントロンを含むウイルスｍＲＮＡ（ＧＡＧならびにＰＯＬをコードする全長ＲＮＡ（スプライシングなし）、およびビリオンパッケージングシグナルを細胞質にコードする全長ＲＮＡ（スプライシングなし）を含む）を輸送する。ＲＥＶタンパク質は、「Ｒｅｖ応答エレメント」またはＲＲＥといわれたウイルスゲノムのシス作用配列と相互作用することによって機能する。
【００７９】
本発明の遺伝子導入システムのＢＩＶ導入ベクター構築物は、好ましくは、Ｒを含むＤＮＡセグメントに作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５、パッケージング配列、ＢＩＶ  ＲＲＥ配列、別のプロモーターに作動可能に連結された目的に異種遺伝子およびＢＩＶ  ３’ＬＴＲを５’配列に含む。好ましい実施形態において、パッケージング配列は、ＢＩＶパッケージング配列である。別の好ましい実施形態において、ＢＩＶパッケージング配列は、最小パッケージング配列または「最小パッケージングシグナル」である。
【００８０】
ＢＩＶの任意の株またはクローンから得られるＢＩＶゲノム由来の核酸セグメントが、本発明の構築物で使用され得る。ＢＩＶゲノムの核酸配列に関して、自然変異(疾患病理生理学を変更しない)は、ＢＩＶウイルスの間に存在し得ることが理解される。これらの変異は、遺伝子（ｇｅｎｅ）および遺伝子（ｇｅｎｅｓ）の機能が失われない限り、一つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、反転または付着を生じ得る。このような変異体をコードするＤＮＡ配列は、標準のクローニング法によって作成され得る。同様に、これは、本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、核酸またはポリペプチドに相当する機能を変えないで容易に変更され得るか、または本発明の範囲から離れないで容易に変更され得ることを当業者によって理解される。
【００８１】
前述のＢＩＶウイルスベクターにおいて、ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子の全てまたは部分が、ＢＩＶパッケージング配列(導入ベクター構築物上に提供される)を含むＤＮＡセグメントに組み込まれた。ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子は、約１，４３１の1ヌクレオチドである (Ｇａｒｖｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７５：３９１−４０９，１９９０)。安全で有効な複製欠損組換えレンチウイルスベクターシステムの所望の特徴は、パッケージング構築物と導入ベクター構築物との間の相同性を最小にする。構築物間の相同性を最小にすることによって、相同組換えの発生は減少され、この結果、構築物の所望でない再編成の機会を減少する。好ましい実施形態において、最小パッケージング配列は、パッケージングを促進するために必要な程度だけｇａｇ遺伝子の５’部分、および導入ベクターのエクスポートを含む。好ましくは、最小ＢＩＶパッケージング配列は、最初の５４ｂｐのｇａｇ遺伝子より多く、最初の２００ｂｐのｇａｇ遺伝子より少ない間に含む。さらに好ましくは、最少量のＢＩＶパッケージング配列は、最初の７５ｂｐのｇａｇ遺伝子配列（好ましくは最初の９０ｂｐより多い）より多いが、最初の１５０ｂｐのｇａｇ遺伝子配列（好ましくは、最初の１２５ｂｐより少ない）よりは少ない。最も好ましくは、ＢＩＶパッケージング配列は、最初の１０１ｂｐのｇａｇ遺伝子配列より多くは含まない。好ましい実施形態において、パッケージング配列の一部であるｇａｇ遺伝子フラグメントに関するＡＴＧ開始コドンは、最小パッケージング配列または任意の結果として生じる組換え体を含むＤＮＡ構築物から、ＧＡＧポリペプチドのタンパク質合成を妨げるために変異される。
【００８２】
一つの実施形態において、導入ベクター構築物、および必要に応じてパッケージング構築物は、最小ＢＩＶ  ＲＲＥをコードする。最小ＢＩＶ  ＲＲＥは、配列番号４０に示される核酸配列を有する。
【００８３】
一つの実施形態において、本発明の導入ベクター構築物は、中心にポリプリン路（ｃＰＰＴ）を含む。ｃＰＰＴは、ＢＩＶまたは別のレンチウイルス（例えば、ＨＩＶのｃＰＰＴを含む）由来であり得る。特に好ましい実施形態において、ベクター構築物のＵ３エレメントの一つ以上の配列は、任意の下流遺伝子のＵ３-媒介性転写を完全に減少するか、または除去するために変異するか、または欠失される。従って、本実施形態は、自己不活性化(ＳｌＮ)ベクター構築物を提供する。(Ｙｕら、ＰＮＡＳ  ８３（１０）：３１９４−３１９８（１９８６）)。このような実施形態において、目的の異種遺伝子は、内部プロモーターに作動可能に連結され、そして、これはまた、Ｕ３エレメントがさらに、ポリアデニル化を増強する配列を含むことが好ましい。一つの特定の実施形態において、ＳＶ４０後期のポリアデニル化シグナル上流エンハンサーエレメントのポリアデニル化配列が利用される。
【００８４】
一つの実施形態において、ｒｅｖおよびＲＲＥは、それぞれＢＩＶ由来のｒｅｖ配列およびＲＲＥ配列を含む。他の実施形態において、ＲＲＥ配列およびＲＥＶ配列が、宿主の核からのウイルスＲＮＡ量の輸送を促進するために、各々補完し得る限り、本発明の遺伝子導入システムは、ＢＩＶ以外のレンチウイルスからのｒｅｖセグメントおよびＲＲＥセグメントを含み得る。このような一つの実施形態において、ＲＥＶおよびＲＲＥの両方は、ＨＩＶ由来である。好ましい実施形態において、ＲＥＶおよびＲＲＥの両方は、ＢＩＶ由来である。
【００８５】
本発明の第２の遺伝子導入システム構築物は、ウイルス表面タンパク質遺伝子構成物である。好ましい実施形態において、ウイルス表面タンパク質遺伝子は、ｅｎｖ遺伝子である。一つの実施形態において、ｅｎｖ遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）エンベロープまたは変異ＬＣＭＶエンベロープをコードする。好ましいＬＣＭＶエンベロープは、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）株由来の一つである（Ｂｅｙｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１；７６（３）：１４８８−９５）。特に好ましい実施形態において、ｅｎｖ遺伝子は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープをコードする。例えば、Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：８０３３−８０３７（１９９３），Ｙｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５６３−９５６８（１９９４）および米国特許第５，８１７，４９１号（Ｙｅｅらにより発行）を参照のこと。ＶＳＶ−Ｇタンパク質が所望のｅｎｖ遺伝子である場合、ＶＳＶ−Ｇは、広範な宿主域を組換えウイルスに与えるので、ＶＳＶ−Ｇは、産生細胞またはパッケージング細胞に有害であり得る。従って、例えば、ＶＳＶ−Ｇのような遺伝子が使用される場合、誘導プロモーターシステムを使用することが好ましく、この結果、ＶＳＶ−Ｇ発現が必要とされない場合、ＶＳＶ−Ｇ発現は、産生細胞またはパッケージング細胞の毒性を最小にするよう調節され得る。例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：５５４７−５５５１）のテトラサイクリン調節可能な遺伝子発現システムは、ＶＳＶ−Ｇの誘導性発現を提供するために使用され得る。ｔｅｔ/ＶＰ１６トランス活性化因子は、第１のベクターに示され得、そしてＶＳＶ−Ｇをコードする配列は、別のベクター上のｔｅｔオペレーター配列によって制御されるプロモーターから下流にクローンされ得る。
【００８６】
本発明の実施に有用なｅｎｖ遺伝子の非制限例は、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＭｏＭＬＶＶ  ｅｎｖ、ギボンサル白血病ウイルス（例えば、ＧａＬＶ）ｅｎｖおよびＰｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｒａｂｉｅｓ，ＭｏｋｏｌａおよびＬｙｓｓａ)のｅｎｖ遺伝子、アルファウイルス(例えば、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒウイルス、シンドビス)、パラミクソウイルス (例えば、センダイ)、フラビウイルス(例えば、エボラ、マールブルク)、レトロウイルス(例えば、ＭＬＶ、１０Ａ１、Ｘｅｎｏ)、アレナウイルス(例えば、ＬＣＭＶまたはＬＣＭＶ  Ｅｎｖ変異)、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルス、バクロウイルスおよびパラインフルエンザウイルスが挙げられる。特定の好ましいｅｎｖは、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）株（Ｂｅｙｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，１：７６（３）：１４８８−９５（２００２））またはＶＳＶＧ由来である。
【００８７】
本発明のさらなる局面において、パッケージング構築物（本発明のエンベロープ構築物および必要に応じてｒｅｖ遺伝子構築物）を含む安定したパッケージング細胞株を提供する。特に好ましいパッケージング細胞株は、このような細胞株(少なくとも１０ｎｇ／ｍｌのＢＩＶ逆転写（ＲＴ）タンパク質を安定して発現し得る)である。パッケージング細胞株が、パッケージングシグナルおよび他のシス作用性エレメントをコードするレンチウイルス核酸を欠失するので、ベクター構築物がない状態で感染ベクターは産生され得ない。パッケージング細胞株の構築物は、エピソームであり得、または細胞染色体へ組み込まれ得る。
【００８８】
一般に、本発明の細胞株は、種々の別々の構築物（上述のように、組換えベクターのパッケージングに必要とされる全ての機能（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖ）を提供する）を含む。ベクター構築物がまた、細胞内に提示される場合、これらが、組換え複製欠損レンチウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株を形質転換し、そして産生するのに利用され得る限り、利用される構築物の数に制限はない。
【００８９】
種々の構築物は、パッケージング細胞株へ、トランスフェクションまたは感染を介して導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含むウイルス粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は、当業者に周知である。従って、パッケージング構築物は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションもしくはエレクトロポレーションによって、一般的に優性選択可能なマーカー（例えば、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンセターゼもしくはＡＤＡ）と共にヒト細胞株へ導入され得、その後、適切な薬物の存在下での選択およびクローンの単離が続く。
【００９０】
パッケージング細胞は、産生細胞を作製するために、導入ベクター構築物と共にトランスフェクトされる。産生細胞は培養され、そして、本発明の複数の組換え複製欠損レンチウイルスベクター粒子を産生する。このベクターは、所望の標的細胞を感染させるために使用されて、その結果、標的細胞に目的の異種遺伝子を移す。
【００９１】
好ましい実施形態において、本発明の産生細胞株は、さらに、少なくとも１０５形質導入単位／ｍｌのレンチウイルスベクター力価を産生し得ることで特徴付けられる。適当な宿主細胞株は、例えば、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｆ２ＴＨ細胞およびその他を含む。
【００９２】
レンチウイルスベクター粒子は、本発明の適切な産生細胞株から得られ得る。レンチウイルスベクター粒子を産生する方法は、本発明の安定したパッケージング細胞をレンチウイルスベクター構築物でトランスフェクトし、適切な培地において産生細胞を単離および増殖し、そして培地からのレンチウイルスベクター粒子の調製物を得る工程を包含する。
【００９３】
従って、本発明はさらに、本発明の遺伝子導入システムでトランスフェクトされた細胞の上清を回収することによって、得られた組換えレンチウイルスベクターのストックを提供する。
【００９４】
本発明のＢＩＶに基づく組換えレンチウイルスベクターは、単独で使用され得るか、または実質的に任意の宿主細胞もしくは細胞株を形質転換するための組み合わせで使用され得る。多数の標的細胞（細胞株およびヒト起源ならびに非ヒト起源の一次細胞を含む）は、インビトロまたはインビボにおいて、本発明の組換えベクターで感染され得る。本発明のベクターは、造血細胞などの非分裂性の一次ヒト細胞（例えば、幹細胞、赤血球、好中球、単球、血小板、肥満細胞、好酸球、好塩基球およびＢリンパ球ならびにＴリンパ球）を感染させるのに特に有用である。
【００９５】
一つの実施形態において、本発明は、分裂細胞または非分裂細胞を感染し得る組換えレンチウイルスベクターを提供する。組換えレンチウイルスは、ＢＩＶ  ＧＡＧタンパク質、ＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質、ウイルスＥＮＶタンパク質、調節核酸配列に作動可能に連結された異種核酸配列、およびパッケージング、逆転写ならびに組み込みに必要なシス作用性ＬＴＲ核酸配列を含む（ここで、パッケージングシグナルは、ＢＩＶ由来である）。本発明の組換えレンチウイルスは、分裂細胞と同様に非分裂細胞を感染し得る。
【００９６】
従って、本発明の組換えレンチウイルスは、このような方法（いくつかの構造において、天然ウイルスの調節遺伝子は除去され、そして代わりに標的細胞へ送達される核酸配列で置換される）で遺伝的に改変される。ウイルスベクター粒子による細胞の感染後に、ウイルスベクター粒子は、この細胞内へ核を放出し、レンチウイルスベクター構築物は逆転写され、次いで、宿主細胞ゲノムへ組み込まれる。次いで、導入されたレンチウイルス遺伝物質は、転写され、そして宿主細胞内のタンパク質へと翻訳される。
【００９７】
本発明は、適当な宿主細胞（上記のように、三つ、四つまたは五つのＤＮＡ構築システムを有する）をトランスフェクトし、および組換えウイルスを回復することによって、分裂細胞または非分裂細胞を感染し得る組換えレンチウイルスを産生する方法を提供する。一般に、この遺伝子は、宿主真核細胞（成熟の組換えウイルス粒子またはベクターが回復される）内に発現される。
【００９８】
一般に、ウイルスの上清は、標準的な技術（例えば、適切な時点での上清のろ過）を使用して回収される。トランスフェクト細胞によって産生されたビリオンを回収する方法は、例えば、Ｒｉｇｇｓ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：２９０−２９５）に記載される。その後、ベクター調製物は、当該分野で公知の技術を使用して、インビトロまたはインビボで標的細胞を感染するために使用され得る。
【００９９】
本発明の遺伝子導入システムは、特定の核酸配列の発現を提供するために、分裂細胞または非分裂細胞への核酸導入の方法を提供するために使用され得る。従って、別の実施形態において、本発明は、本発明の組換えウイルスベクター粒子を有する非分裂細胞を感染することによって、そして、非分裂細胞内に異種核酸配列を発現することによって、非分裂細胞内の異種核酸配列の導入および発現の方法を提供する。
【０１００】
一般に、トランスジーンといわれる各種の核酸配列は、本発明のＢＩＶに基づく導入ベクター構築物によって、目的の異種遺伝子として運ばれ得る。核酸配列は、ウイルス粒子またはベクターの産生を可能にするのに、十分なサイズである。ＢＩＶに基づく導入ベクター構築物の好ましいサイズは、１ＫＢと１０ＫＢとの間である。このようなトランスジーンに関する非完全なリストは、タンパク質、抗原、リボザイム類、アンチセンス配列、ＲＮＡｉ（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ３０（１−２）：９６−１０２，２００３）、スプライソソーム媒介性ＲＮＡトランススプライシング（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７（３）:２４６，１９９９；Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１５（２）: ３３２，２０００）、オリゴヌクレオチドおよびその他をコード化する配列を含む。
【０１０１】
必要に応じて、選択可能なマーカーの遺伝子は、トランスジーンと共に提示され得る。マーカー遺伝子は、ベクターの存在をアッセイするために利用され、従って感染および組み込みを確認するために利用される。マーカー遺伝子はまた、ベクターで形質転換されている細胞を選択するために使用され得る。選択マーカーの存在は、ベクター構築物を含むこれらの宿主細胞のみの増殖を確実にする。代表的に、選択遺伝子は、抗生物質に対する耐性を与えるタンパク質および他の有害物質（例えば、ヒスチジノール、プロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサートなど）をコードする。本明細書のいくつかの実例は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）システムもしくはマーカーシステムを利用する。
【０１０２】
アンチセンス核酸は、少なくとも特定のｍＲＮＡ分子の一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である (Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２６２：４０，１９９０)。細胞において、アンチセンス核酸は、二本鎖の分子を形成して、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズする。細胞は、二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。インビトロにて遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２：２８９，１９８８）。アンチセンス核酸は、変異タンパク質または優位に活性な遺伝子産物の発現(例えば、アルツハイマー病で蓄積するアミロイド前駆タンパク質)をブロックするのに使用され得る。このような方法はまた、ハンチントン病、遺伝性パーキンソン症、および他の疾患の処置のために有用である。アンチセンス核酸はまた、毒性に関連するタンパク質の発現の阻害に有用である。
【０１０３】
二本鎖ＤＮＡに巻きつくことにより、転写を失速させるオリゴヌクレオチドの使用は、三重らせんを形成する三重鎖のストラテジーとして公知である。従って、これらの三重鎖の化合物は、選ばれた遺伝子上に特有の部位を認識するように設計され得る(Ｍａｈｅｒら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．＆Ｄｅｖ．，１（３）:２２７，１９９１；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，６（６）：５６９，１９９１)。
【０１０４】
リボザイム類は、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似様で、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂する能力があるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードする核酸配列の改変を介して、ＲＮＡ分子内の特定の核酸配列を認識し、そしてそれを開裂する分子を設計することが可能である。(Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ，２６０：３０３０，１９８８)。この手法の主な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活性化されるということである。
【０１０５】
また、抗血管形成（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）効果を有する産物を発現する核酸配列を移すことは所望であり得る。このような化合物およびこれらをコードする遺伝子は、公知であり、そして前述されている。血管新生は、阻害分子（例えば、α−インターフェロン、トロンボスポンジン−１、アンギオスタチンおよびエンドスタチン）によって抑制され得る。さらに、トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼ誘導性ポリペプチド（天然に生じるものより短い）は、抑制する血管新生（特に、接眼レンズ新生血管形成）において活性的であることが見出されている（Ｏｔａｎｉら、ＰＮＡＳ  ９９（１）：１７８−１８３（２００２年１月）；Ｗａｋａｓｕｇｉら、ＰＮＡＳ  ９９（１）：１７３−１７７（２００２年１月））。本発明と共に使用され得る他の抗血管形成遺伝子は、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、ＰＥＤＦ、バソスタチン、種々の細胞外マトリックスタンパク質のフラグメントおよび増殖因子阻害剤／サイトカイン阻害剤を含むが、これらに限定されない。種々の細胞外マトリックスタンパク質のフラグメントは、アンギオスタチン、エンドスタチン、カイニノスタチン（ｋｉｎｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、フィブリノゲンＥフラグメント、トロンボスポンジン、タムスタチン（ｔｕｍｓｔａｔｉｎ）、カンスタチン（ｃａｎｓｔａｔｉｎ）およびレスチンを含むが、これらに限定されない。増殖因子阻害剤／サイトカイン阻害剤は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、可溶性ＶＥＧＦレセプター、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ／ｔｉｅアンタゴニスト、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮα）、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト（ｓＦＧＦＲ）、Ｅｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈアンタゴニスト（ｓＥｐｈＢ４およびｓｅｐｈｒｉｎＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβおよびＩＧＦ−１を含むが、これらに限定されない。本発明の組換えレンチウイルスベクターを介したこれらのペプチドまたはタンパク質の送達は、血管新生眼疾患（例えば、加齢黄斑変性症、糖尿病の眼の合併症、血管新生緑内障、糖尿病性増殖性網膜症、糖尿病性増殖性網膜症、未熟児の網膜症、角膜炎、うっ血性網膜症およびその他）に関連する血管新生の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を調節するのに有用である。本発明の組換えレンチウイルスベクターを介する腫瘍への抗血管形成因子の送達によって、新生血管形成およびその関連の病理学的効果を抑制することが可能であり得る。このような阻害ペプチドの例は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５１８５（ＷＯ０２／０６７９７０）およびＰＣＴ／ＵＳ０２／２３８６８（その全体が参考として援用される）で見出され得る。
【０１０６】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０１／１１２５２（ＷＯ０２／２６８２７）（２００１年９月２８日出願）（その全体が参考として援用される）で証明されているように、Ｅｐｈ  Ｂレセプターまたはｅｐｈｒｉｎ  Ｂリガンドのいくつかアミノ酸のまたは全てのアミノ酸配列を有する可溶性ペプチドはまた、血管新生の効率的な阻害剤である。従って、本発明は、このようなペプチドをコードする核酸を送達し、そしてこのようなペプチドを動物に（特にヒト）発現し得るのに有用である。このようなペプチドは、抗血管形成および腫瘍細胞への抗腫瘍効果を示している。
【０１０７】
トランスジーンはまた、生物学的応答変更因子をコードする核酸を含み得る。このカテゴリーに含まれているのは、「インターロイキン」として分類された多くのサイトカインをコードする核酸を含む免疫増強因子である。また、このカテゴリーに含まれているのは、必ずしも同じメカニズムに従って機能するというわけではないが、インターフェロン類、および特にγインターフェロン（γ−ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ならびに顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。酵素欠乏または免疫欠如を処置するために、このような核酸を骨髄細胞かマクロファージに送達することが望ましい。増殖因子、毒性ペプチド、リガンド、レセプター、または他の生理的に重要なタンパク質をコードする核酸はまた、特定の細胞に導入され得る。本発明のベクターは、宿主免疫応答を変更するために、例えば、同種骨髄移植後に生じる移植片対宿主拒絶反応において使用され得る。
【０１０８】
本発明のレンチウイルスベクターと共に感染させた宿主細胞および宿主動物は、さらに、因子（例えば、増殖因子、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経分泌ホルモン、毒素、神経突起促進分子およびこのような分子の代謝拮抗剤ならびに前駆物質（例えば、ドパミン（Ｌ−ＤＯＰＡ）の前駆体））と共に処置され得る。
【０１０９】
さらに、欠損遺伝子が置換され得る多数の遺伝性神経疾患は、以下：例えば、リボゾーム蓄積病（例えば、β−ヘキソサミニダーゼもしくはグルコセレブロシダーゼを含む）；ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性欠乏症（「Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群」）；アミロイド多発神経障害（−プレアルブミン）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー、および網膜芽細胞腫、を含む。別の実施形態において、本発明は、眼の疾患を処置する方法を提供する。これらの疾患は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、増殖性硝子体網膜症、光受容器の進行性の退化ならびに最終的な死滅を含む疾患、および眼の新血管新生で引き起こされた疾患を含むが、これらに限定されない。本発明の方法で処置され得る眼の疾患は、例えば、湿性ＡＭＤ（加齢黄斑変性症）、糖尿病性増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症に起因する新血管新生、非糖尿病性網膜症、分岐部静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、早産児の網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、中心窩周囲毛細血管拡張症、鎌状赤血球網膜症、Ｅａｌｅ’ｓ病、網膜血管炎、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ病、放射線網膜症、網膜寒冷損傷（ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）、網膜色素変性症、脈絡網膜欠損症、単純ヘルペス性角膜炎に起因する角膜新血管新生、角膜潰瘍、角膜移植、翼状片（ｐｔｅｒｉｇｙｉａ）、または外傷を含む。眼の疾患を処置する方法は、上記を含み、ＢＩＶ導入ベクター（抗血管形成遺伝子、Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ）、抗アポトーシス遺伝子、ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ遺伝子および小柱網タンパク質遺伝子（ＴＩＧＲ）からなる群から選択された遺伝子をコードする一つ以上の遺伝子を発現する）を個々に投与する工程を包含する。このベクターは、好ましくは、眼球への直接的な眼内注射によって送達される。眼球への注射方法は、当該分野で周知である。これらは、前眼房または後眼房へ（例えば、房水か硝子体液の中へ）の注射を含むが、これらに限定されない。あるいは、この注射は、例えば、網膜下（例えば、ベクターを含む溶液のアリコート（例えば、１〜１０μｌ／アリコート）を網膜の後ろへ注射することによって）であり得る（この溶液が吸収され、そして感染性ベクター粒子が眼球組織の局所細胞に感染した後）。このような投与は、単回投与、同日に複数回の投与、１週もしくは１ヶ月の期間にわたる単回投与、または１週もしくは１ヶ月の期間にわたる複数回の投与のいずれかを含み得る。
【０１１０】
Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ）は、円錐保護因子であることが見出された（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３８１０（ＷＯ  ０２／０８１５１３）。好ましい実施形態において、本発明のＢＩＶベクターは、ＲｄＣＶＦポリペプチドをコードする（配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７にコードされるように）少なくとも一つの核酸配列を含む。従って、別の実施形態において、本発明は、本発明のＢＩＶベクターシステムを使用することで、インビトロもしくはインビトロのいずれかにおいて、ＲｄＣＶＦ遺伝子を細胞に移すことにより、円錐保護効果を実証する方法を提供する。好ましい実施形態において、このＢＩＶベクターは、ヒトＲｄＣＶＦ１および／またはＲｄＣＶＦ２をコードする。
【０１１１】
ＲｄＣＶＦを発現するＢＩＶベクターは、眼に関連する種々の失陥を処置するために使用され得る。従って、別の好ましい実施形態において、本発明は、網膜ジストロフィー（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｅｌ症候群、Ｂａｓｓｅｎ−Ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ症候群、Ｂｅｓｔ病、脈絡膜、脳回転状萎縮、先天性黒内症（ａｍｏｕｒｏｓｉｓ）、Ｒｅｆｓｕｎ症候群、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病およびＵｓｈｅｒ症候群）に苦しむヒトを処置する方法を提供する。
【０１１２】
タンパク質産生の欠乏に起因する疾患に関しては、遺伝子導入は、補充療法のために正常遺伝子を罹患組織の中に導入し得る。遺伝子送達技術はまた、トランスジェニック動物を作成するために使用され得る。
【０１１３】
一つの実施形態において、ＢＩＶベクターは、遺伝子機能を同定する手段として使用され得る。従って、ベクターは、インビトロにおいて、特定の遺伝子を過剰発現するか、または特定の遺伝子の発現を減少させるために、発現カセットを細胞に移すのに使用され得る。特定の遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関連している表現型を観察することによって、この遺伝子の機能を決定することが可能である。この遺伝子産物が、医薬品の開発に対して有効な標的であるかどうかを決定する際に、この情報はかなりの価値を有する。
【０１１４】
特定の遺伝子の発現を減少する方法は、当業者に周知であり、そして発現が減少される遺伝子のｍＲＮＡに指向されたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉの発現を含む。発現を減少するための代替戦略は、終止コドンをコードする３’エキソン配列をトランスでスプライスすることである。第２の代替戦略は、機能が減少するタンパク質において、ドミナントネガティブに機能するタンパク質を発現することである。
【０１１５】
さらなる実施形態において、ＢＩＶベクターは、インビボにおける遺伝子機能を同定するために使用され得る。従って、ベクターは、インビボにおいて、特定の遺伝子を過剰発現するか、または特定の遺伝子の発現を減少するために、発現カセットを細胞に移すのに使用され得る。これは、組織または身体への直接的な注射を介して動物にベクターを投与することによって、または直接循環にベクターを投与することによって達成され得る。あるいは、このベクターは、インビトロで細胞に投与され得、次いで、この細胞は、動物に注射されるかまたは移植され得る。適切な注射部位または移植デバイスは、当業者に公知である。この遺伝子産物が、医薬品の開発に対して有効な標的であるかどうかを決定する際に、インビボにおける遺伝子機能の同定はまた、かなりの価値を有する。
【０１１６】
別の実施形態において、特定の機能の遺伝子をクローン化するために、ベクターは、特定の機能についてのライブラリーをスクリーンするのに使用され得る。この実施形態において、ライブラリー(ｃＤＮＡライブラリーであり得る)は、導入ベクター構築物でコードされる。次いで、導入ベクター構築物は、ベクターを生成するために使用され、そしてこのベクターは、インビトロまたはインビボにおいて細胞に適用される。所望の機能を示した細胞は、単離される。目的の遺伝子は、容易にＢＩＶベクター構成要素から回収され得る。遺伝子クローニングのためにベクターを組み込む方法は、当業者に周知である。レトロウイルスベクタはないが、本明細書に記載された技術は、ＢＩＶベクターがインビボにおいて効率的に細胞を形質転換するという点で、遺伝子クローニングに使用されるレトロウイルスベクターシステムより有意な利点を有する。
【０１１７】
別の実施形態において、ＢＩＶベクターは、強い免疫応答を特定タンパク質に確立するために使用され得る。動物へのＢＩＶベクターの投与（特に静脈注射を介して）は、脾臓内において、効率的な細胞の形質転換を生じる。この設定において、コードされたトランスジーンの発現は、発現タンパク質に対して強い免疫応答をもたらし得る。この技術は、生成する抗体（研究、診断もしくは治療目的のモノクローナル抗体を含む）の効率を改善するために使用され得る。この技術はまた、免疫療法目的のために直接ヒトで適用され得る。
【０１１８】
本発明の好ましいベクターは、ＢＩＶ由来である。天然のＢＩＶ核酸は、ウイルスで感染された細胞、およびこれらから調製されたベクターから単離され得る。例えば、ｃＤＮＡは、当該分野で公知の方法を使用して、逆転写によってＢＩＶ  ＲＮＡから産生され得る。次いで、二本鎖のＢＩＶ  ｃＤＭＡは産生され、そしてクローニングベクター（例えば、バクテリアのクローニングベクター）の中でクローン化され得る。当業者に公知でかつ使用される任意のクローニングベクター（例えば、細菌のベクター、酵母のベクターまたは真核生物のベクター）が使用され得る。
【０１１９】
本発明のＤＮＡ構築物を含む多量の核酸は、（ａ） 適当な宿主動物またはトランスジェニック動物での複製、または（ｂ）当該分野で周知の技術を用いる化学合成によって、産生され得る。原核生物の宿主または真核生物の宿主への導入のために調製された構築物（所望のポリペプチドをコードする対象とするポリヌクレオチドフラグメントを含む）は、宿主によって認識された複製システムを含み得、そしてまた、好ましくは、セグメントをコードするポリペプチドに作動可能に連結された転写開始調節配列および翻訳開始調節配列を含む。これらは、例えば、複製起点もしくは自己複製配列（ＡＲＳ）ならびに発現制御配列、プロモーター、エンハンサーならびにプロセシングに必要な情報部位（例えば、リボゾーム結合部位）、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネータ配列およびｍＲＮＡ安定化配列を含む。タンパク質が細胞膜で交差および／もしくは留まる場合、分泌シグナルが含まれ得、従って、機能的なトポロジーを獲得するか、またはこの細胞から分泌され得る。このようなベクターは、当該分野で周知の標準的な組換え技術の手段によって調製され得る。
【０１２０】
上記に従って、以下の本発明の実施形態が検討され、そして、本発明の一部を形成する。
１．組換えレンチウイルス遺伝子導入システムであって、以下：
（ａ）（ｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物、または（ｉｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；
（ｃ）第１のＲ領域に作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域および第２のＲ領域を含むＤＮＡセグメントを含む導入ベクター構築物；および
（ｄ）（ｉ）該パッケージングの一つに位置されるｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子ならびに導入ベクター構築物、または（ｉｉ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物、
を包含する、組換えレンチウイルス遺伝子導入システム。
２．ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物を包含する、１に記載の遺伝子導入システム。
３．ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物、を包含する、１に記載の遺伝子導入システム。
４．前記パッケージング構築物が、さらにＲＲＥ配列を含む、２に記載の遺伝子導入システム。
５．少なくとも一つの前記パッケージング構築物が、さらにＲＲＥ配列を含む、３に記載の遺伝子導入システム。
６．前記ｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列が、ＢＩＶ由来である、１に記載の遺伝子導入システム。
７．前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、２に記載の遺伝子導入システム。
８．前記ｇａｇ遺伝子および前記ｐｏｌ遺伝子各々が、再コード化核酸配列を含む、２に記載の遺伝子導入システム。
９．前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、２に記載の遺伝子導入システム。
１０．前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、３に記載の遺伝子導入システム。
１１．前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、３に記載の遺伝子導入システム。
１２．前記ｐｏｌ遺伝子が、５’末端にＡＴＧ開始コドンを含む、１１に記載の遺伝子導入システム。
１３．前記ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ領域が、該プロテアーゼの触媒中心の３つのアミノ酸モチーフで変異され、そして、変異されていないＢＩＶプロテアーゼと比較される場合、該変異プロテアーゼが、宿主細胞に対して毒性が少ない、１に記載の遺伝子導入システム。
１４．前記プロテアーゼ領域が、該プロテアーゼポリペプチドのアミノ酸２６にて、ＴｈｒからＳｅｒへの変異をコードする、１３に記載の遺伝子導入システム。
１５．前記ＢＩＶパッケージング配列が、該ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子オープンリーディングフレーム配列の最初の１０１塩基対だけを含む、１に記載の遺伝子導入システム。
１６．パッケージング配列が、本質的に、配列番号３９の核酸配列からなる、１５に記載の遺伝子導入システム。
１７．前記導入ベクター構築物が、第１のＲ領域に作動可能に連結されたプロモーター、Ｕ５領域、ＵＴＲ領域、ＢＩＶパッケージング配列、ＲＲＥ配列、目的の異種遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、３’ポリプリン路領域、Ｕ３領域、第２のＲ領域および第２のＵ５領域を含むＤＮＡセグメントを含む、１に記載の遺伝子導入システム。
１８．前記パッケージング構築物が、さらに前記ｒｅｖ配列を含む、２に記載の遺伝子導入システム。
１９．前記ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物が、ｅｎｖ遺伝子を含む、１に記載の遺伝子導入システム。
２０．前記ｅｎｖ遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）ｅｎｖ、ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ、Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｐｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＧａＬＶ）  ｅｎｖ、Ｐｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅメンバー由来のｅｎｖ遺伝子、アルファウイルスｅｎｖ遺伝子、パラミキソウイルスｅｎｖ遺伝子、フラビウイルスｅｎｖ遺伝子、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子、アレナウイルスｅｎｖ遺伝子、パラインフルエンザウイルスｅｎｖ遺伝子、ソゴトウイルスｅｎｖ遺伝子およびバキュロウイルスｅｎｖ遺伝子からなる該群から選択される、１９に記載の遺伝子導入システム。
２１．前記ウイルス表面タンパク質遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖをコードする、１に記載の遺伝子導入システム。
２２．前記パッケージングの一つに位置するｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子および導入ベクター構築物を含む、１に記載の遺伝子導入システム。
２３．ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物を含む、１に記載の遺伝子導入システム。
２４．前記ｒｅｖ遺伝子が、天然のＢＩＶ  ｒｅｖイントロンを含まない、６に記載の遺伝子導入システム。
２５．前記ｒｅｖ遺伝子が、配列番号１０を含む、２４に記載の遺伝子導入システム。
２６．前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたＥＦ−１プロモーターを含む、２２に記載の遺伝子導入システム。
２７．前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された前記プロモーターが、ＥＦ−１プロモーターである、２３に記載の遺伝子導入システム。
２８．前記ＲＲＥ配列が、本質的に、配列番号４０の前記核酸配列からなる、６に記載の遺伝子導入システム。
２９．少なくとも二つの前記プロモーターが同じである、１に記載の遺伝子導入システム。
３０．全ての前記プロモーターが異なる、１に記載の遺伝子導入システム。
３１．少なくとも一つの前記プロモーターが、調節可能なプロモーターである、１に記載の遺伝子導入システム。
３２．ｃＰＰＴを含まない、１に記載の遺伝子導入システム。
３３．前記導入ベクター構築物がさらに、ｃＰＰＴを含む、１に記載の遺伝子導入システム。
３４．前記ｃＰＰＴが、ヒト免疫不全ウイルス由来の該ｃＰＰＴである、３３に記載の遺伝子導入システム。
３５．前記ｃＰＰＴが、ＢＩＶ  ｃＰＰＴである、３３に記載の遺伝子導入システム。
３６．前記ｃＰＰＴが、本質的に、配列番号１を含めた塩基対４７５８〜５２９３のヌクレオチドに相当する５３５塩基対からなる、３５に記載の遺伝子導入システム。
３７．前記Ｕ３領域が、ポリアデニル化のエンハンサーを含む、１に記載の遺伝子導入システム。
３８．ポリアデニル化の前記エンハンサーが、本質的に、前記ＳＶ４０後期ポリアデニル化エンハンサーエレメントを含む、３７に記載の遺伝子導入システム。
３９．少なくとも一つの前記ＢＩＶのｖｉｆ遺伝子、ｖｐｗ遺伝子、ｖｐｙ遺伝子またはｔａｔ遺伝子をコードしない、１に記載の遺伝子導入システム。
４０．前記ＢＩＶのｖｉｆ遺伝子、ｖｐｗ遺伝子、ｖｐｙ遺伝子、ｔｍｘ遺伝子およびｔａｔ遺伝子をコードしない、１に記載の遺伝子導入システム。
４１．前記Ｕ３領域における一つ以上のヌクレオチドが、改変されるかまたは除去され、この結果、Ｕ３媒介性転写が減少されるか消滅される、１に記載の遺伝子導入システム。
４２．目的の前記異種遺伝子と作動可能に連結されたマーモット肝炎ウイルス調節応答エレメントを含む、１に記載の遺伝子導入システム。
４３．目的の前記異種遺伝子が：Ｔ２−ＴｒｐＲＳ、Ｅｐｈ  Ｂレセプター、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂリガンド、フィブリノゲンＥフラグメント、ＶＥＧＦの可溶性レセプター、アンギオスタチン、エンドスタチン、オプチネウリン、小柱網タンパク質、Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ）および抗アポトーシス遺伝子産物からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、１に記載の遺伝子導入システム。
４４．目的の前記異種遺伝子が：配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７からなる群から選択されるＲｄＣＶＦポリペプチドをコードする、１に記載の遺伝子導入システム。
４５．１〜４４のいずれかの遺伝子導入システムを含む産生細胞。
４６．前記遺伝子導入システムが、前記産生細胞のゲノムへ安定して挿入される、４５の産生細胞。
４７．前記遺伝子導入システムが、前記産生細胞へ一過性にトランスフェクトされる、４５の産生細胞。
４８．複製欠陥レンチウイルスベクター粒子を産生する方法であって、該方法は以下：
（ａ）該細胞によって、複製欠陥レンチウイルスベクター粒子の産生を十分に許容する細胞培養条件下で、細胞培地中に４５に記載の産生細胞を増殖する工程；および
（ｂ）該培地から該複製欠陥レンチウイルスベクター粒子を回収する工程、
を包含する、方法。
４９．前記培地にヒストンデアセチラーゼ阻害剤を添加する工程をさらに包含する、４８に記載の方法。
５０．前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、酪酸である、４９に記載の方法。
５１．前記４８の方法に従って産生される、複製欠陥レンチウイルスベクター粒子。
５２．疾患を有するかまたは疾患にかかるリスクを有する動物において、該疾患を処置するかまたは予防する方法であって、５１に記載の複製欠陥組換えレンチウイルスベクター粒子と該動物の一つ以上の細胞を感染する工程を包含し、ここで、目的の前記異種遺伝子が、該疾患を処置するかまたは予防するのに効果的な治療薬をコードする、方法。
５３．前記動物がヒトである、５２に記載の方法。
５４．一つ以上の前記細胞が眼細胞である、５２に記載の方法。
５５．前記疾患が：眼の新血管新生、湿性ＡＭＤ（加齢黄斑変性症）、糖尿病性増殖性網膜症、非糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、分岐部静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、早産児の網膜症、虹彩ルベオーシス、血管新生緑内障、中心窩周囲毛細血管拡張症、鎌状赤血球網膜症、Ｅａｌｅ’ｓ病、網膜血管炎、Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ  Ｌｉｎｄａｕ病、放射線網膜症、網膜寒冷損傷（ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）、網膜色素変性症、脈絡網膜欠損症、単純ヘルペス性角膜炎に起因する角膜新血管新生、角膜潰瘍、角膜移植、翼状片（ｐｔｅｒｉｇｙｉａ）、または外傷性網膜変性、病理学的な老化、網膜色素変性症、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｅｌ症候群、Ｂａｓｓｅｎ−Ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ症候群、Ｂｅｓｔ病、脈絡膜、脳回転状萎縮、先天性黒内症（ａｍｏｕｒｏｓｉｓ）、Ｒｅｆｓｕｎ症候群、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病およびＵｓｈｅｒ症候群、からなる群から選択される、５４に記載の方法。
５６．前記治療薬が：Ｔ２−ＴｒｐＲＳ、Ｅｐｈ  Ｂレセプター、ｅｐｈｒｉｎ  Ｂリガンド、フィブリノゲンＥフラグメント、ＶＥＧＦの可溶性レセプター、アンギオスタチン、エンドスタチン、オプチネウリン、小柱網タンパク質、Ｒｏｄ誘導性Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｒｄｃｖｆ）および抗アポトーシス遺伝子産物からなる群から選択される、５５に記載の方法。
５７．前記治療薬が：配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７からなる群から選択されるＲｄｃｖｆポリペプチドである、５５に記載の方法。
５８．前記疾患が：癌、同種骨髄移植に関連する移植片対宿主拒絶反応および神経系疾患からなる群から選択される、５２に記載の方法。
５９．一つ以上の前記細胞が、インビボにて感染される、５２に記載の方法。
６０．一つ以上の前記細胞が、インビトロにて感染される、５２に記載の方法。
６１．組換えレンチウイルスベクター粒子を用いてインビトロにて細胞を形質転換する方法であって、５１に記載の細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子と接触する工程を包含し、これにより該細胞が形質転換される、方法。
６２．組換えレンチウイルスベクター粒子を用いてインビボにて細胞を形質転換する方法であって、５１に記載の細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子と接触する工程を包含し、これにより該細胞が形質転換される、方法。
６３．細胞中で目的の異種遺伝子を発現する方法であって、５１に記載の該細胞を組換えレンチウイルスベクター粒子で形質転換する工程を包含し、これにより目的の該異種遺伝子が該細胞中に発現される、方法。
６４．パッケージング細胞であって、以下：
（ａ）（ｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物、または（ｉｉ）ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物；
（ｂ）ウイルス表面タンパク質遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むウイルス表面タンパク質遺伝子構築物；および
（ｃ）（ｉ）該パッケージングの一つに位置されるｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子ならびに導入ベクター構築物、または（ｉｉ）ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物、
を包含する、パッケージング細胞。
６５．ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むパッケージング構築物を包含する、６４に記載のパッケージング細胞。
６６．ＢＩＶ  ｇａｇ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第１のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第１のパッケージング構築物、およびＢＩＶ  ｐｏｌ遺伝子を含むＤＮＡセグメントと作動可能に連結された第２のプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含む第２のパッケージング構築物を包含する、６４に記載のパッケージング細胞。
６７．前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、６５に記載のパッケージング細胞。
６８．前記ｇａｇ遺伝子および前記ｐｏｌ遺伝子各々が、再コード化核酸配列を含む、６５に記載のパッケージング細胞。
６９．前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、６５に記載のパッケージング細胞。
７０．前記ｇａｇ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、６６に記載のパッケージング細胞。
７１．前記ｐｏｌ遺伝子が、再コード化核酸配列を含む、６６に記載のパッケージング細胞。
７２．前記ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ領域が、該プロテアーゼの該触媒中心の３つのアミノ酸モチーフで変異され、そして、変異されていないＢＩＶプロテアーゼと比較される場合、該変異プロテアーゼが、宿主細胞に対して毒性が少ない、６４に記載のパッケージング細胞。
７３．前記プロテアーゼ領域が、該プロテアーゼポリペプチドのアミノ酸２６で、ＴｈｒからＳｅｒへの変異をコードする、７２に記載のパッケージング細胞。
７４．前記ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物が、ｅｎｖ遺伝子を含む、６４に記載のパッケージング細胞。
７５．前記ｅｎｖ遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ  ｅｎｖ、ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＷＥ−ＨＰＩ）ｅｎｖ、ＭｏＭＬＶ  ｅｎｖ、Ｇｉｂｂｏｎ  Ａｐｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＧａＬＶ）  ｅｎｖ、Ｐｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅメンバー由来のｅｎｖ遺伝子、アルファウイルスｅｎｖ遺伝子、パラミキソウイルスｅｎｖ遺伝子、フラビウイルスｅｎｖ遺伝子、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子、アレナウイルスｅｎｖ遺伝子およびパラインフルエンザウイルスｅｎｖ遺伝子からなる群から選択される、７４に記載のパッケージング細胞。
７６．前記ウイルス表面タンパク質遺伝子が、ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖをコードする、６４に記載のパッケージング細胞。
７７．前記パッケージングの一つに位置するｒｅｖ遺伝子、ウイルス表面タンパク質遺伝子および導入ベクター構築物を含む、６４に記載のパッケージング細胞。
７８．ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡセグメントを含むｒｅｖ構築物を含む、６４に記載のパッケージング細胞。
７９．前記ｒｅｖ遺伝子が、ＢＩＶ由来であるが、天然のＢＩＶ  ｒｅｖイントロンを含まない、６４に記載のパッケージング細胞。
８０．前記ｒｅｖ遺伝子が、配列番号１０を含む、７９に記載のパッケージング細胞。
８１．前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結されたＥＦ−１プロモーターを含む、７７に記載のパッケージング細胞。
８２．前記ｒｅｖ遺伝子と作動可能に連結された前記プロモーターが、ＥＦ−１プロモーターである、７８に記載のパッケージング細胞。
８３．少なくとも二つの前記プロモーターが同じである、６４に記載のパッケージング細胞。
８４．全ての前記プロモーターが異なる、６４に記載のパッケージング細胞。
８５．前記細胞が、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣｆ２ＴＨ細胞からなる群から選択される、６４に記載のパッケージング細胞。
８６．配列番号５１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％一致する該アミノ酸配列を含む、単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
８７．配列番号５１を含む、８６に記載の単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
８８．前記ＰＯＬタンパク質のＮ末端にメチオニンを含む、８６に記載の単離されたＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質。
８９．８６〜８８のうちいずれかに記載のＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
９０.前記核酸配列は、本質的に、配列番号５０を含む、８７の前記ＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする該核酸配列を含む、単離された核酸分子。
９１．前記核酸配列は、本質的に、配列番号５３を含む、８８の前記ＢＩＶ  ＰＯＬタンパク質をコードする該核酸配列を含む、単離された核酸分子。
９２．最小のＢＩＶパッケージング配列は、配列番号３９に示される前記核酸配列と少なくとも９０％一致する、最小の該ＢＩＶパッケージング配列を含む単離された核酸分子。
９３．最小の前記ＢＩＶパッケージング配列は、本質的に、配列番号３９に示される前記核酸配列からなる、９２の単離された前記核酸分子。
９４．ＢＩＶ  ＲＥＶタンパク質をコードする該核酸配列を含み、該核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％一致する前記アミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子。
９５．前記ＢＩＶ  ＲＥＶタンパク質をコードする前記核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列によってコードされる同一のアミノ酸配列をコードする、９４に記載の単離された前記核酸分子。
９６．前記核酸配列は、配列番号１０に示される該核酸配列と少なくとも９０％一致する、９４に記載の単離された前記核酸分子。
９７．前記核酸配列は、本質的に、配列番号１０に示される該核酸配列からなる、９４に記載の単離された前記核酸分子。
９８．最小のＢＩＶ  ＲＲＥ配列は、配列番号４０に示される前記核酸配列と少なくとも９０％一致する、最小の該ＢＩＶ  ＲＲＥ配列を含む、単離された核酸分子。
９９．最小の前記ＢＩＶ  ＲＲＥ配列は、本質的に、配列番号４０に示される前記核酸配列からなる、９８に記載の単離された前記核酸分子。
【０１２１】
本発明はさらに、以下の実施例（例証の方法で提供され、任意の様式において本発明を限定することを意図しない）を列挙する。当該分野で周知の標準的な技術、または以下に明確に記載される技術が利用される。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
配列番号１は、ウシ免疫不全ウイルスプロウイルスのＤＮＡ配列を示す。
【０１２３】
（実施例２）
（プラスミド構築物）
哺乳動物発現プラスミド（ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））の中にＢＩＶの必要な構築物を連結することによって、パッケージング構築物を作製した。ＢＩＶプロウイルス由来の４４８５塩基対のＢｓｐＥＩ−ＢｓｔＵＩフラグメントとして、主要なスプライシングのドナー（ＭＳＤ）部位ならびにｇａｇおよびｐｏｌのコード配列を単離した（Ｇａｒｖｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９０年４月；１７５（２）：３９１−４０９，Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＣ＿００１４１３およびＭ３２６９０）。このフラグメントを、クレノウ処理によって平滑末端にし、ＥｃｏＲＩで線形化したｐＣＩに連結し、そしてｐＣＩｉｇｐを作製するためにクレノウ処理によって平滑末端にした。次に、プライマーＲＲＥ６５’ＮｏｔＩ（５’−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧ−３’）（配列番号２）およびＲＲＥ６３’ＮｏｔＩ（５’−ＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣ−３’）（配列番号３）を用いたＢＩＶプロウイルスのＰＣＲ増幅により、最小量のＲＲＥフラグメントを作製した。この３４４塩基対のＰＣＲフラグメントをＮｏｔＩで消化し、ｐＣＩｉｇｐに連結し、またＮｏｔＩで消化し、そしてホスファターゼ（ＣＩＰ）処理をした。作製されたプラスミドは、ｐＣＩｉｇｐＲＲＥと名称し、四つの構成成分系で使用した。最後に、ｒｅｖに隣接するコーディング配列（二つのエキソンが融合されている）を、以下に記載するように、二つの異なる方法（ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ  ＳＯＥ法）で作製した。
【０１２４】
四つの構成成分系で使用されるｒｅｖ配列をＲＴ−ＰＣＲ法で作製した。要するに、ＰｒｏＦｅｃｔｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、１０ｃｍの培養皿の中に播種された２３９Ｔ細胞を、２０μｇのｐＢＨ２プラスミドでトランスフェクトした（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１）。トランスフェクション４８時間後、細胞を収集し、そして、総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で精製した。製造業者の指示に従って、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｃＤＮＡを合成するために、５μｇの総ＲＮＡを使用した。ｒｅｖ  ｃＤＮＡ配列をプライマー：Ｒｅｖ１５Ａｆ１３（５’−ＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＧ−３’)(配列番号４)）およびＲｅｖ２３Ａｇｅｌ２（５’−ＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＧＡＧＣＴＴＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＣＣ−３’)(配列番号５)）を用いて増幅した。ＰＣＲ反応を以下の条件下で実施した：９４℃で１分間；９４℃で１分間、５４℃で１分間および７２℃で１分間（２５サイクル）；および７２℃でさらに１０分間。０．７ｋｂのｒｅｖ  ｃＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で検出し、次いで、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターの中でクローン化した。ｒｅｖ  ｃＤＮＡ挿入物を有する二つのクローンを同定した。制限酵素消化によって、ｒｅｖ挿入物の配向を決定した。自動配列決定によって、ｒｅｖ  ｃＤＮＡクローンを確認後、哺乳動物細胞における発現のために、ｒｅｖ遺伝子をｐＴｒａｃｅｒＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ＥＦ−１ａプロモーターの制御下で、ＰｍｅＩ部位とＮｏｔＩ部位との間にｒｅｖ配列を挿入した（ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖを作製する）。ｐＣＩｉｇｐＲＲＥおよびｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖの両方は、構築物の完全性を確認するために配列決定されたＤＮＡである。三つの構築系に関して、ｐＣＩｉｇｐＲＲＥに連結されたｒｅｖコード配列を、ＰＣＲ  ＳＯＥｉｎｇ（Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎによりスプライシング)によって作製した。プライマーＲｅｖ  ｌ５５８６８（５’−ＧＴＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧ−３’）(配列番号６)およびＲｅｖ  ｌ３(新)（５’−ＧＡＧＡＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧ−３’)(配列番号７)を用いて、ＢＩＶプロウイルスからｒｅｖの第１のエキソンをＰＣＲで増幅した。また、プライマーＲｅｖ２５(新)(５’−ＧＧＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＡＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴＧＴ−３’)(配列番号８)およびＲｅｖ  ２３７５２６(５’−ＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＣＴＧＧ−３’)(配列番号９)を用いて、第２のエキソンをプロウイルスから増幅した。二つの生成物を等モル量で混合し、そして、プライマーＲｅｖ  ｌ５５８６８およびＲｅｖ  ２３７５２６と共に増幅した。最終的な６９８塩基対の産物をＸｂａＩとＳｐｅＩで消化し、そして、ＸｂａＩで消化したｐＣＩｉｇｐＲＲＥに連結した。結果として生じたプラス��ドをｐＢＩＶｍｉｎｉｐａｃｋと名称し、これは、ＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌコード配列を促進するＣＭＶ即時型初期プロモーター、その後に、ｒｅｖ、最小量のＲＲＥをコードする融合配列、最後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。ｇａｇの開始部位の上流ＭＳＤ部位、およびｒｅｖについてのスプライシングアクセプター（ＳＡ）部位はなおも残存する。次いで、構築物の完全性を確認するために、パッケージング構築物を、ＤＮＡ配列決定に供した。介入するイントロンのないｒｅｖ遺伝子の配列は、配列番号１０で示される。一つの実施形態において、本発明は、ｒｅｖ遺伝子が天然のＢＩＶを介入するイントロンを含まない遺伝子導入システムを提供し、そして、別の実施形態において、ｒｅｖ遺伝子は任意の介入するイントロンを含まない。
【０１２５】
導入ベクター構築物ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃは、ｐＢＣ４ＭＧｐｐｔ由来である（前述（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１））。クローニングを容易にするために、全体のＢＩＶ導入ベクターのコード配列を、ＢＳｐＭＩでｐＢＣ４ＭＧｐｐｔを消化することによって、発現プラスミドｐＢＳＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ)にクローン化し、そして、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔを作製するために、ｐＢＳＩＩＫＳ＋（前もって、平滑末端ライゲーションとして、ＨｉｎｃＩＩで消化した）に連結した。プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＮＩで消化し、クレノウで処理し、そして、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧを作製するために、ｇａｇ遺伝子の２９７ｂｐフラグメントを除去するよう再度連結した。増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポータ遺伝子直後のユニークで簡便性な制限酵素認識部位の不足に起因して、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧ  ＰｓｔＩを作製するために、プライマーＷＰＲＥ５（５’−ＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧ−ＡＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧ−３’）(配列番号１１)およびＷＰＲＥ３（５’−ＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣ−３’)（配列番号１２）を用いて、ユニークなＰｓｔＩ部位を組み込ませた。次いで、マーモット肝炎の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を骨組み（ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧ  ＰｓｔＩ（前もって、ＰｓｔＩで消化した））にクローン化し、クレノウで処理し、そして、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧ  ＰＲＥを作製するために、ＰＲＥフラグメントに連結した。全ての推定ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を除去することによって、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧ  ＰＲＥをさらに改変した（これは、元のＢＩＶ導入ベクター（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１）に約７７８ｂｐ存在し、そして、ＲＲＥの３１２ｂｐのフラグメントでこれを置換している（本発明者らは、ＲＲＥ機能に関する原因を十分に見出した））。まず初めに、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧ  ＰＲＥをＫａｓＩとＢｂｖＣＩで消化した。次いで、この領域をプライマーＲＲＥＩ（５’−ＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号1３）、ＲＲＥ２（５’−ＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＴＧ−ＡＣＣＴＡＴＴＴＣ−３’）(配列番号１４)、ＲＲＥ３  （５’ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＧ−ＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣ−３’）（配列番号１５）およびＲＲＥ4（５’−ＡＡＣＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＧＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧ−３’）(配列番号１６)と共にＰＣＲ増幅した。ＲＲＥ１およびＲＲＥ２は、推定ＲＲＥの上流領域を増幅し、そして、プライマーＲＲＥ３およびプライマーＲＲＥ４は、推定ＲＲＥの下流領域を増幅した。次いで、産物を等モル量で混合し、そしてプライマーＲＲＥ１およびＲＲＥ４と共に増幅した。全体の推定ＲＲＥが欠落している状態で、最終産物はＫａｓＩおよびＢｂｖＣＩ部位に組み込んだ。さらに、目的の最終産物をアニーリングするため（第一に、種々のＲＲＥ領域の後のクローニングのため）に、プライマーＲＲＥ２とＲＲＥ３との間に、接合部位を作製するために構築されたユニークなＥｃｏＲＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位がある。このＰＣＲ戦略で、プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧΔＲＲＥ  ＰＲＥを作製した。次いで、骨組み（ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧΔＲＲＥ  ＰＲＥ）にクローン化するために、５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＢｇｌＩＩ部位をコードする全ての種々の領域において、７セットのプライマー（表１）と共に推定ＲＲＥをＰＣＲ増幅した。一旦作製すると、各フラグメントをＥｃｏＲ１およびＢｇｌＩＩで消化し、前述のようにクローン化した（表１）。ＲＲＥ６を含むベクター構築物は、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃと名称した。
【０１２６】
ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物を含むプラスミド（前述されたＶＳＶ−Ｇを発現する）を、本実施例で使用した（Ｂｕｒｎｓら、１９９３，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７）。
【０１２７】
【表１−１】
2005533485.tif 000002
【０１２８】
【表１−２】
2005533485.tif 000003
さらに、最小量のベクターにおいて残存する２１２ｂｐのｇａｇ配列を欠失するために、パッケージングシグナルを決定するｇａｇ配列において欠失を作製するためのＰＣＲ反応のテンプレートとして、構築物ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧΔＲＲＥ  ＰＲＥ（単純にｐＢｖΔＲＲＥと表す）を使用した。ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウで処理し、そして次いで再連結することによって、１８４ｂｐのＧＡＧを欠失するために、構築物ｐＢｖΔＲＲＥ(前述された)を使用した。このクローニング戦略法は、２８ｂｐのＧａｇコード配列を含む構築物をもたらした（プラスミドｐＢｖ２８ΔＲＲＥを作製する）。次に、本発明者らは、５４ｂｐのｇａｇ配列を含むベクター構築物を作製した。まず初めに、テンプレートｐＢｖΔＲＲＥをＫａｓＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして、アルカリホスファターゼで処理した。プライマーＮＲＳ１（５’ＡＡＣＡＧＴＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＧＴＧＧＧＧＣＴＣ−３’)（配列番号３１）、ＮＲＳ２（５’ＡＴＧＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＧＧＴＧＴＣＡＣＣＣＴＡＡＣＣＴＴＡＣＧＡＡ−３’）（配列番号３２)、ＮＲＳ３（５’ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＣ−３’)（配列番号３３）およびＮＲＳ４（５’ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＣＴＡＡＧＴＧ−３’）（配列番号３４）を用いて、Ｇａｇコード領域を増幅した。Ｇａｇの５４番目の塩基対に対して、Ｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）の５’領域を増幅するために、ＮＲＳ１とＮＲＳ２を使用した。ＮＲＳ３およびＮＲＳ４は、ＢＩＶ  ｃＰＰＴを介してＧａｇの３’終止コドンを増幅した。次いで、生成物を等モル量で混合し、そして、プライマーＮＲＳ１およびＮＲＳ４と共に増幅した。最終的な産物をＫａｓＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（５４ｂｐのＧａｇコード配列を含む構築物で生じるテンプレート内に、少なくともＧａｇの１５８ｂｐを欠失している）に組み込んだ。さらに、最終産物をアニーリングし、そしてスクリーニングするために、プライマーＮＲＳ２とＮＲＳ３との間に、接合部位を作製するために組み込まれた固有のＮｓｉ  Ｉ部位およびＰｍｌＩ部位がある。このＰＣＲ戦略で、プラスミドｐＢｖ５４ΔＲＲＥを作製した。構築物ｐＢｖ１０４ΔＲＲＥを作製するために、同じＰＣＲ戦略を実施した。ＮＲＳ１およびＮＲＳ４を外部プライマーとしてとして使用し、そして新しい内部プライマーは、ＮＲＳ３２（５’ＡＴＧＣＡＴＣＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＡＴＧＧＣＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＴＣ−３’）(配列番号３５）、およびＮＲＳ３３（５’ＣＡＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＴＧＧＣ−３’)(配列番号３６)である。Ｇａｇの１０１番目の塩基対まで、Ｇａｇの開始コドン（ＡＴＧ）の５’領域を増幅するために、ＮＲＳ１およびＮＲＳ３２を使用した。ＮＲＳ３３およびＮＲＳ４は、ＢＩＶ  ｃＰＰＴを介してＧａｇの３’終止コドンを増幅した。次いで、生成物を等モル量で混合し、そして、ＮＲＳ１およびＮＲＳ４と共に増幅した。最終的な産物をＫａｓＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（テンプレートｐＢｖΔ１０４ＲＲＥ内のＧａｇの最後の１１１ｂｐを欠失している）に組み込んだ。そして、上���に記載されるように、最終産物をアニーリングし、そしてスクリーニングするために、ＮＲＳ３２とＮＲＳ３３との間に、接合部位を作製するために組み込まれた固有のＮｓｉ  Ｉ部位およびＰｍｌＩ部位がある。最終的に、全てのこれらの構築物（ｐＢｖ２８ΔＲＲＥ、ｐＢｖ５４ΔＲＲＥおよびｐＢｖ１０４ΔＲＲＥ）をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、次いで、プラスミドｐＢｖ２８、ｐＢｖ５４およびｐＢｖ１０１各々を作製するために、上記に記載されるように最少量のＲＲＥ６を、ＥｃｏＲＩフラグメントおよびＢｇｌＩＩフラグメントにクローン化した。全てのこれらの導入ベクターは、構築物の安全性を確認するために、ＤＮＡ配列決定に供した。ｐＢｖ１０１をｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃＡＴＧとして設計した。
【０１２９】
ＢＩＶ  ｇａｇの開始コドンを変異させるために、発明者らは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ戦略法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。ｐＢＳＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）をＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。次に、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃをＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃからのＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＢＳＩＩＫＳ＋骨格へサブクローンした。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ反応に使用されるプライマーは、以下：ＫＯＡＴＧ順方向（５’−ＧＣＧＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧ−３’）配列番号３７およびＫＯＡＴＧ逆方向（５’−ＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣ−３’）配列番号３８である。
【０１３０】
このプラスミドをｐＢＳＩＩＫＳ＋ＮＨΔＡＴＧと名称した。次いで、生成物の完全性を確認するために、生成物をＤＮＡ配列決定に供した。次いで、ｐＢＳＩＩＫＳ＋ＮＨΔＡＴＧをＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃＡＴＧに元の位置でクローン化した。作製された最終構築物は、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃを設計し、そして、ｇａｇを変異させたＡＴＧを有した。次いで、構築物の完全性を確認するために、全体のｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃをＤＮＡ配列決定に供した。
【０１３１】
（実施例３）
（３．１）
図１には、ＢＩＶの三つの構成成分の遺伝子導入システムの配置が示されており、これは以下：（ｉ）パッケージング構築物、（ｉｉ）導入ベクター構築物、および（ｉｉｉ）ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物、を含む。パッケージング構築物ｐＢＩＶｍｉｎｉｐａｃｋおよび導入ベクター構築物ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃに関するプラスミド構築物は、実施例２に記載する。パッケージング構築物（ｐＢＩＶｍｉｎｉｐａｃｋ）は、ＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌコード配列を駆動するＣＭＶ最初期プロモーターを含み、その後ｒｅｖの融合コード配列、最小量のＲＲＥ、および最後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと続いた。なおも、ｇａｇの開始部位の上流のＭＳＤ部位、およびｒｅｖのスプライシングアクセプター（ＳＡ）部位は残存する。導入ベクター構築物（ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃ）は、ＣＭＶプロモーターの後にＲ、Ｕ５、ＵＴＲ、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ（トランスジーンを駆動する内部プロモーター）、改変されたＵ３（ＳｌＮ）、Ｒ、およびＵ５を有する。（ＣＭＶ：ＣＭＶ初期プロモーター；Δφ：パッケージングシグナル配列の欠失；ＭＳＤ：主要スプライシングドナー部位；ＳＡ：スプライシングアクセプター部位；ｒｅｖ：ＢＩＶ  ｒｅｖ；ＲＲＥ：ＢＩＶ  Ｒｅｖ応答エレメント；ＵＴＲ：非翻訳リーダー配列；ΔＧＡＧ：ＢＩＶ  ｇａｇ配列の最初の１０１ｂｐ；ｃＰＰＴ：中心ポリプリン路；ＳＩＮ：自己不活性化；ＳＶ４０ＵＳＥ：ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル上流エンハンサーエレメント；ＶＳＶ−Ｇ：水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇ）
（３．２．）
図２には、ＢＩＶの四つの構成成分の遺伝子導入システムの配置が示されており、これは以下：（ｉ）ｒｅｖがないパッケージング構築物、（ｉｉ）ｒｅｖ発現構築物、（ｉｉｉ）導入ベクター構築物、および（ｉｖ）ウイルス表面タンパク質遺伝子構築物、を含む。パッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＲＲＥ、ｒｅｖ発現構築物ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ、導入ベクター構築物ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃ、およびウイルス表面タンパク質遺伝子表現構築物に関するプラスミド構築物は、実施例２に記載する。ＥＦ−１α：ＥＦ１αのプロモーター。
【０１３２】
（実施例４）
（ＢＩＶパッケージングシグナル配列の同定）
親のベクターｐＢＣ４ＭＧｐｐｔ（５０９ｂｐのｇａｇ配列を有する）と同じ効率で、導入ベクターｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃ（ｇａｇの欠失の結果、ｇａｇに２１２ｂｐだけ残存する）を２９３Ｔ細胞に形質転換した。５０９ｂｐのｇａｇ配列または２１２ｂｐのｇａｇ配列のいずれかを含むＢＩＶベクターで形質転換した細胞において、ｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を実施した。ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリー分析によって測定した。ｅＧＦＰ陽性細胞の割合として、以下の結果が与えられる：Ｍｏｃｋ形質転換は０．１％；ベクターｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔで形質転換された細胞は８５％；ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃで形質転換された細胞は９５．５％。さらに、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃの３’末端から、追加のｇａｇ配列を欠失し、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃを作製した（各々、２８ｂｐ（ｐＢＶ２８）、５４ｂｐ（ｐＢｖ５４）、または１０１ｂｐ（ｐＢｖ１０１）のｇａｇ配列だけを含む）。ｐＢｖ１０１およびｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃＡＴＧに存在する１０１ｂｐのｇａｇ配列は、配列番号３９に示される。構築物ｐＢＶ１０１から産生されたベクターは、十分に機能し、そして、効率的に細胞に形質転換し得たが、ｐＢｖ２８およびｐＢｖ５４は機能的でなかった（図３）。従って、１０１ｂｐのｇａｇ配列を含むｐＢＶ１０１を、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃＡＴＧとして設計した。また、興味深いことに、本発明者らは、ＲＲＥの除去が形質転換効率を完全に消失させたことから、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃＡＴＧに対してでさえ、ＲＲＥはなおも、標的細胞を形質転換する能力の点から、ベクターの生物学的機能に絶対必要であることを見出した（図３パネルＢ）。本発明者らは、ｇａｇのＡＴＧから開始する最初の１０１ｂｐのＢＩＶのｇａｇ配列が、ＢＩＶパッケージングシグナルを含むと結論する。この１０１ｂｐのＢＩＶのｇａｇ配列（５’のＵ５とｇａｇ開始コドンＡＴＧとの間に位置された非翻訳リーダー配列を伴う）は、配列番号３９に記述されるように、最小量のＢＩＶパッケージングシグナル配列を構成する。
【０１３３】
（実施例５  ＢＩＶのＲｅｖ応答エレメントの同定）
プラスミドｐＢＣ４ＭＧｐｐｔは、７７８ｂｐエンベロープコーディング領域において、推定ＲＲＥ配列を含んだ（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１；ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ０１／４４４５８）。ＢＩＶのＲＲＥの正確な位置を決定するために、いくつかの独立した推定ＲＲＥ領域部分を有する種々の構築物を作製した。核輸送に必要な最小量の核酸配列を同定するために、これらの異なる構築物を作製した。ＢＩＶパッケージングシグナルを有するベクター構築物とＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌ発現パッケージング構築物との間の配列ホモロジーを減少させるために、最小量のＲＲＥの定量を実施した。合計で、７つの異なる構築物を生成した（７つの異なる推定ＲＲＥ領域を組み込んだ）（表１）。ＢＩＶパッケージング構築物ｐＢＨ２（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３３７２５（ＷＯ  ０１／４４４５８））およびＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドと共に、全ての７つの構築物を２９３Ｔ細胞に個々にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ウイルスの上清を収集した。逆転写酵素（ＲＴ）活性（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，カタログ番号１８２８６５７）の量を決定することによって、これらの各々の上清を規格化し、そして、ベクター上清を含む同量のＲＴを、同数の２９３Ｔ細胞に形質転換するために使用した。ＲＴは、ベクター粒子の正確な測定法である（同量のＲＴの投入量は、同数のベクター粒子の投入量を表す）。親ベクターが全長７７８ｂｐの推定ＲＲＥ配列を有する構築物ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧＰＲＥから産生されるように、作製された７つの構築物では、ベクター構築物ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔΔＧＡＧＰＲＥＲＲＥ６から生成されたベクターを同等の効率で細胞に形質転換した（表１）。このデータは、この構築物（配列番号４０の３１２ｂｐの配列が含まれる）が、核外移行の原因となる十分なＲＲＥ配列を含むことを示す。この３１２ｂｐの最小量のＲＲＥは、本発明者らの全てのＢＩＶパッケージングに使用されて、そしてＲＲＥが必要である場所にベクター構築物を移す。
【０１３４】
（実施例６）
（６．１．細胞株および培養条件）
１０％のウシ胎仔血清（熱失活させた）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳａｌｔＬａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、５０ＩＵペニシリン／ｍｌ、５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸（完全ＤＭＥＭ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ  １１２６８）およびＨｅＬａ（ＡＴＣＣ；ＣＣＬ−２）細胞を培養した。マウスのニューロンでアメーバー様の幹細胞（Ｎｅｕｒｏ−２Ａ）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から入手した。１０％のウシ胎仔血清（熱失活させた）、５０ＩＵペニシリン／ｍｌ、５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ、１．０ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウム、および０．１ｍＭ  非必須アミノ酸を補充したＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））で、Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞を培養した。０．１％ヒト上皮細胞成長因子、１％インスリン、５％ＢＳＡ、５％フェチュイン、１％ゲンタマイシンアンホテリシンＢおよび０．５Ｍデキサメタゾンを含むＳｋＧＭ一括キットと共に、ＳｋＢＭの基本培地で、ヒトプライマリー骨格筋細胞（ＳｋＭＣ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を培養した。５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、細胞株を維持した。
【０１３５】
（６．２．ウイルスベクター産生）
１０ｃｍの皿に４×１０６の濃度で、２９３Ｔ細胞を一晩中播種した。翌日、培地を吸引し、新鮮な完全なＤＭＥＭと交換した。Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（カルシウムリン酸共沈殿法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．））を用いて、２９３Ｔ細胞を４時間後にトランスフェクトした。代表的に、各皿に播種された細胞をトランスフェクトするために、１５μｇの導入ベクター構築物、１５μｇのパッケージング構築物および４．５μｇのＶＳＶ−Ｇウイルス表面タンパク質遺伝子構成物を使用した。４つの構築物システムの場合、１各皿に播種された細胞をトランスフェクトするために、１５μｇの導入ベクター構築物、１５μｇのパッケージング構築物（ｐＣＩｉｇｐＲＲＥ）、９μｇのｒｅｖ発現構築物（ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ）、４．５μｇのＶＳＶ−Ｇウイルス表面タンパク質遺伝子構築物を使用した。２４時間後、培地を吸引し、新鮮な完全なＤＭＥＭと交換した。トランスフェクション４８時間後に、ウイルスの上清を収集し、細胞破片を除去するために２０００ＲＰＭで遠心分離（１０分間）し、アリコートの中で凍結保存（−８０℃）した。５μｌの透明な上清を溶解し、市販のキット（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，カタログ番号１８２８６５７）を用いて逆転写（ＲＴ）活性を分析した。ＶＳＶ−Ｇを偽型化したｅＧＦＰをコードするマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターの生成は、前述される（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００１）。
【０１３６】
（６.３.形質転換）
分裂細胞を形質転換するために、２×１０５細胞を、６ウエルの皿に１ウエルごとに播種した。２４時間後に、培地を吸引し、そして、代表的に、２ｍｌのウイルス上清（約２×１０６のベクター粒子形質転換単位）を細胞へ添加した。次いで、最終濃度が８μｇ／ｍｌになるように、硫酸プロタミンをウエルに添加した。次いで、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、３時間、細胞株を維持した。３時間後、ウイルスの上清を吸引し、そして新鮮な培地と交換し、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、４８時間インキュベートした。非分裂細胞を形質転換するために、１×１０５細胞を、６ウエルの皿に１ウエルごとに播種した。次いで、２４時間後、最終濃度が４μｇ／ｍｌになるように、アフィジコリンを添加した。アフィジコリンの処理１６時間後に、培地を吸引し、そして、代表的に、アフィジコリン存在下で、２ｍｌのウイルスの上清を細胞に添加した。次いで、最終濃度が８μｇ／ｍｌになるように、硫酸プロタミンをウエルに添加した。５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、３時間、細胞株を維持した。次いで、ウイルスの上清を吸引し、そして新鮮な培地（最終濃度２μｇ／ｍｌになるようにアフィジコリンを含む）と交換し、その後、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、４８時間インキュベートした。
【０１３７】
（６．４．フローサイトメトリー分析法および力価法）
ｅＧＦＰ発現の分析のために、培地をウエルから吸引した。２ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で、細胞をリンスした。次いで、ＰＢＳを吸引し、細胞をトリプシン処理し洗浄し、そして５％ウシ胎仔血清細胞（熱失活させた）を含むＰＢＳの中に再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてのｅＧＦＰ発現について、細胞を分析した。
【０１３８】
ｅＧＦＰをコードするＢＩＶベクターの力価を決定するために、硫酸プロタミン存在下において、６ウエルの皿（４×ｌ０５細胞／ウエル）のＣｆ２Ｔｈ細胞を異なる希釈のウイルスベクターを含む２ｍｌの培地と共に形質転換した。３時間後、ウイルスの上清を吸引し、そして新鮮な培地と交換し、その後、５％  ＣＯ２の加湿されたインキュベーター（３７℃）で、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、そしてｅＧＦＰの発現について、フローサイトメトリーによってアッセイした。ベクターの力価は、以下の方法で計算した：力価（形質転換単位／ｍｌ）＝％陽性細胞×４×１０５細胞×希釈因子。
【０１３９】
（実施例７  遺伝子導入システムに基づく三つのＢＩＶ構築物から生成されるベクターによって媒介される遺伝子発現）
（７．１.分裂細胞および非分裂細胞の形質転換）
実施例６．２に記載されるように、ＶＳＶ−Ｇウイルス表面タンパク質遺伝子構築物と共に、パッケージング構築物および導入ベクター構築物を用いた２９３Ｔ細胞の同時導入を介して、ｅＧＦＰをコードするＢＩＶベクターを生成した。ベクターの上清を逆転写（ＲＴ）活性（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ａｓｓａｙ，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，カタログ番号１８２８６５７）についてアッセイした。同量のＲＴ（非濃縮ベクター上清を含む）（２ｍｌにおいて４０ｎｇ  ＲＴと等量のベクター粒子）（ＲＴをアッセイしていないオンコルナウイルスベクターに基づくＭＬＶを除く）を当量で使用した。オンコレトロウイルスベクターに基づくＭＬＶは、分裂細胞のみを形質転換するが、非分裂細胞を形質転換し得ないので、細胞の分裂状態または非分裂状態を確認するためのコントロールとして、ＭＬＶベクターを使用した。次いで、分裂ならびに非分裂（実施例６.３.を参照のこと）性のＨｅＬａ細胞およびＮｅｕｒｏ−２Ａ細胞の両方を形質転換するために、ＭＬＶベクターを使用した。分裂ＨｅＬａ細胞および分裂Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞の両方は、ＶＳＶ−Ｇを偽型化したＭＬＶを効率的に形質転換したが、アフィジコリンで処理された細胞は、アフィジコリンで処理された細胞（最終濃度が１μｇ／ｍｌになるようにアフィジコリンを使用した）は、ＭＬＶ媒介性形質転換に対して完全な耐性を有し、本発明者らの実験条件下で、おそらく分裂しなかったと予想される（表２）。しかしながら、比較的高い効率で、非分裂性のＨｅＬａおよび非分裂性のＮｅｕｒｏ−２Ａの両方を非濃縮性の最小化ＢＩＶベクターで形質転換し、これは、最小化されたＢＩＶパッケージング構築物および最小化された導入ベクター構築物から生成されたベクターが、分割細胞および非分裂細胞の両方においてトランスジーン発現を媒介する能力が十分にあることを示している。
【０１４０】
【表２】
2005533485.tif 000004
（７．２．ヒトプライマリー細胞の形質転換）
最小化させたＢＩＶベクターがプライマリー細胞において形質転換および発現する能力を調べるために、ヒトプライマリー骨格筋細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｅ，ＭＤ）をアフィジコリン（ａｌｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）ありの状態で（１μｇ／ｍｌの最終濃度でアフィジコリンを使用した）、またはアフィジコリンがない状態で処理した。ＭＬＶに基づくベクターは、分裂するプライマリー細胞に非常によく形質転換したが、非分裂細胞においてはいかなる有意な形質転換も示さなかった（表２）。これに反して、非濃縮性の最小化させたＢＩＶベクターは分裂プライマリー細胞および非分裂プライマリー細胞の両方（表２）を効率的に形質転換し、ＢＩＶパッケージング構築物および導入ベクター構築物の有意な最小化は、ベクターがヒトプライマリー非分裂細胞を形質転換する能力に影響なかったことを確認している。
【０１４１】
（実施例８  遺伝子導入システムに基づくＢＩＶの三つの構成成分および四つの構成成分から作成されたベクターの比較）
表３は、形質転換された２９３Ｔ細胞において、遺伝子導入システムに基づくＢＩＶの三つの構成成分および四つの構成成分から作成されたベクターにおけるｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析の比較を示す。実施例６．２.に記載されるように、ｍｏｃｋ（本明細書において、Ｍｏｃｋは、ベクターのトランスフェクションの非存在下において、２９３Ｔ細胞から収集された細胞培地を意味する）、ＢＩＶの三つの構成成分システムから産生されたベクター、またはＢＩＶの四つの構成成分システムから産生されたベクターのいずれかを用いて、２９３Ｔ細胞を形質転換した。ＲＴ活性によって測定される場合、ＢＩＶの三つの構成成分システムおよびＢＩＶの四つの構成成分システムに対して、当量のベクター粒子（４０ｎｇ  ＲＴ等量のベクター粒子）を使用した。この結果（表３）は、遺伝子導入システムに基づくＢＩＶの四つの構成成分が、三つの構成成分システムから生成されるベクターと同じ特性のベクターを産生したことを示す。さらに、四つの構成成分システムは、ＢＩＶのＲＥＶに依存性であり、ＢＩＶのｒｅｖ発現構築物ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ（表３：Ｒｅｖ−（マイナス））の非存在下において、機能ベクターを作製しない。
【０１４２】
【表３】
2005533485.tif 000005
（実施例９  ＨＩＶ中心のポリプリン路（ＨＩＶｃＰＰＴ）によるＢＩＶ中心のポリプリン路（ＢＩＶｃＰＰＴ）の置換）
パッケージング構築物と導入ベクター構築物との間のオーバラップを最小にするために、ＢＩＶ導入ベクター構築物のｃＰＰＴをＨＩＶｃＰＰＴに置換した。具体的には、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃは、ＢＩＶのｃＰＰＴ（平滑末端にされ、そして、平滑末端連結の場合、ＨＩＶｃＰＰＴと連結された）を除去するために、ＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＨＩＶｃＰＰＴは、Ｃｈａｒｎｅａｕら（Ｃｈａｒｎｅａｕら、１９９２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６５：２４１５−２４２１）に記載される。このベクターを作成し、そして、異なるｃＰＰＴを含むベクター粒子を、ＲＴによって規格化した。分裂ＨｅＬａ細胞および非分裂ＨｅＬａ細胞の両方を形質転換するために、同量のＲＴを使用した。この結果は、ＢＩＶｃＰＰＴまたはＨＩＶｃＰＰＴのいずれかを有するベクターが、分裂標的細胞および非分裂標的細胞の両方を十分に形質転換し、これは、ＢＩＶｃＰＰＴが、機能的にＨＩＶｃＰＰＴで置換し得ることを示唆した（表４）。最小量のＢＩＶのｃＰＰＴは、ＢＩＶのＲＮＡゲノム配列（ＢＩＶは１２７を単離する）のｐｏｌコード領域において、４３７４塩基対〜４９０９塩基対のヌクレオチドに対応する必須の５３５塩基対を含む。
【０１４３】
（実施例１０  ＢＩＶのＧＡＧ／ＰＯＬ発現におけるリボゾームフレームシフト部位の同定）
いくつかのレトロウイルスおよびレンチウイルスについて、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は、異なった翻訳リーディングフレーム（ｇａｇの３’末端はｐｏｌの５’末端とオーバーラップする）に位置する。従って、ＧＡＧ−ＰＯＬ融合タンパク質の産生は、メッセンジャーＲＮＡプロセシングまたは翻訳フレームシフトのいずれかを必要とする。後者のメカニズムは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ肉腫／白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のＧＡＧ−ＰＯＬタンパク質の合成で示される。これらのウイルスに関する研究は、リボゾームフレームシフトが、フレームシフト部位の７塩基配列およびこの部位のすぐ下流の二次構造エレメント（すなわち、ステムループ）を必要とすることを示している。シフト化（本明細書で使用される場合、用語「シフト化（ｓｈｉｆｔｙ）」とは、リボゾーム翻訳複合体が、一つのヌクレオチドを後方に移動させ、そして、同じｍＲＮＡを使用して別のタンパク質の翻訳を開始することを意味する）配列の例は、Ａ  ＡＡＵ  ＵＵＡ（配列番号４１；ＡＳＬＶ）、Ｕ  ＵＵＵ  ＵＵＡ（配列番号４２；ＨＩＶ−１）、Ａ  ＡＡＡ  ＡＡＣ（配列番号４３；ＭＭＴＶ）およびＧ  ＧＧＡ  ＡＡＣ（配列番号４４；ＦＩＶ）が挙げられる。従って、シフト部位の一般的な形態は、配列Ｘ  ＸＸＹ  ＹＹＺである（トリプレットは、初期（または、「０」）の翻訳フレームであり、また、ＸはＹと一致し得る）。
【０１４４】
ＨＩＶまたはＳＩＶと異なり、ＢＩＶは、広範に研究されていない。ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子の翻訳開始部位に関する翻訳フレームシフトの正確な位置は、以前に決定されていない。フレームシフトは、配列Ｃ  ＡＡＡ  ＡＡＴ（配列番号４５）で生じ、ここでＣは、ＢＩＶウイルスゲノムＲＮＡの１２７番株の１５７６番目のヌクレオチドである（Ｇａｒｖｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７５：３９１−４０９，１９９０）。しかしながら、本発明者らは、この代わりに、翻訳フレームシフトは、配列Ａ  ＡＡＡ  ＡＡＣ（配列番号４６）（ＢＩＶプロウイルスＤＮＡ配列）（ＢＩＶウイルスゲノムＲＮＡの１６２９〜１６３５番目のヌクレオチド、および配列番号１の２０１３〜２０１９番目のヌクレオチドに一致する）で行われることを同定した。さらに、本発明者らは、図５に図示されるように、フレームシフト配列直後のステムロープを発見した。ウイルス配列および構造（図５に示され、また、配列番号４７（ＤＮＡ）および配列番号４８（ＲＮＡ）にも示されているように）は、ウシ免疫不全ウイルスのＧａｇ/Ｐｏｌリボゾームフレームシフト部位を構成する。
【０１４５】
（実施例１１  再コード化ｇａｇ/ｐｏｌ配列を有するＢＩＶパッケージング構築物）
レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＢＩＶ）は、これらのウイルスＲＮＡ（ＲＮＡの不安定性を引き起こす）に核酸配列を含むと考えられており、これによって、ウイルスＲＮＡの効率的な核外移行を防止している。これは、レンチウイルスがコドンの使用頻度、および／または、ＲＮＡ配列で決定されるＲＮＡの二次構造をまれに利用するという事実に起因すると考えられる。これらのまれなコドンを含むウイルスＲＮＡは、ｒｅｖ／ＲＲＥがない状態では、核から効率的に輸送され得ない。パッケージング構築物からＲＲＥを除去するために、パッケージング構築物と導入ベクター構築物との間のオーバーラップを最小にするかまたは除去するために、そして、ＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子発現レベルを増強するために、本発明者らは、好ましいＨｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓコドン（配列番号４９）を用いて、ＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌコード配列を再コード化した。ｐＣＩ哺乳動物発現ベクターに、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌコード配列をクローン化した（ｐＣＩｉｇｐＳｙｎを作成）（図６）。当該分野で公知の技術、およびＰＣＴ公開ＷＯ  ０１／６８８３５に記載された技術を用いて、合成ＢＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を構築した。具体的には、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌを合成した場合、ＸｈｏＩ部位およびＸｂａＩ部位を、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌコード領域各々の隣接する５’末端および３’末端に組み込んだ。次いで、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌをＸｈｏIおよびＸｂａIで消化し、そして、前もってＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したｐＣＩ発現構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した（ｐＣＩｇｐＳｙｎを作製）。ｐＣＩｉｇｐＳｙｎの生成は、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎ、ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ、ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃ、およびｐＣＭＷＳＶ−Ｇによる四つの構成成分システムから、ＢＩＶベクターを産生させた。細胞を効率的に形質転換させる能力によって示される場合、このシステムから生成されたＢＩＶベクター（再コード化されたｇａｇ/ｐｏｌを有する）は、十分に機能した。表４は、２９３Ｔ細胞におけるｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析からの結果を示す。「Ｒｅｖ−（マイナス）」場合（Ｒｅｖ発現構成成分の非存在下において、ウイルスベクター産生を実施した）を除いて、２９３Ｔ細胞は、四つの構成成分システムから生成されたＢＩＶベクターによって、形質転換された。この実験は、野生型ＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌ発現構成成分から産生されたウイルスベクターと、再コード化されたＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌ発現構成成分から産生されたウイルスベクターとを比較した（表４）。
【０１４６】
【表４】
2005533485.tif 000006
遺伝子または遺伝子の一部分の再コード化は、当該分野で公知の技術を用いて実施され得る。非制限例の方法によって、Ｃａｓｉｍｉｒｏ  ＤＲらは、遺伝子合成に関するＰＣＲに基づく方法を記載する（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９７年１１月１５日；５（１１）：１４０７−１２）（Ｂｒｏｃｃａら、「Ｄｅｓｉｇｎ，ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ  ｌｉｐ１ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｌｉｐａｓｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ、１９９８年６月；７（６）：１４１５−２２；Ｗｉｔｈｅｒｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃら、「ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ＋Ｔ−ｒｉｃｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｇｅｎｏｍｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１９９９年１２月；１２（１２）：  １１１３−２０；およびＳｔｅｍｍｅｒら、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｇｅｎｅ、１９９５年１０月１６日；１６４（１）：４９−５３）もまた参照のこと）。
【０１４７】
再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌを有するパッケージング構築物を野生型ｇａｇ／ｐｏｌを有するパッケージング構築物と比較するために、パッケージング構築物がベクター産物を補完する能力を試験した。実施例６．２に記載されるように、ＢＩＶベクターを産生した。再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌを有するＢＩＶパッケージング構築物は、野生型ＢＩＶのｇａｇ／ｐｏｌを有するパッケージング構築物より強力である。１０倍低いプラスミドの投入量（１．５μｇ  対  １５μｇ）で、ｐＣＩｉｇｐＲＲＥまたはｐＣＩｉｇｐＳｙｎのいずれかと共に、ＢＩＶベクターを産生した。ｅＧＦＰ発現（ＦＡＣＳによって分析された）によって示されるように、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌによって産生されたベクターは、野生型ｇａｇ/ｐｏｌ（２７％）を含むパッケージング構築物によって産生されたベクターで形質転換されたものよりも、高い割合の細胞（４７％）を形質転換した。Ｍｏｃｋを形質転換させた細胞は、０％の細胞を形質転換した。再コード化されたｇａｇ/ｐｏｌサンプルおよび野生型ｇａｇ／ｐｏｌサンプルの両方について、当量のベクターを使用した。このデータは、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌを有するパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎが、野生型ｇａｇ／ｐｏｌを有するパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＲＲＥより強力であることを示す。また、再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌは、ＲＲＥエレメントの非存在下において、完全に機能した。再コード化されたｇａｇ／ｐｏｌ構築物におけるＲＲＥの存在（野生型ＲＲＥを含む）は、導入ベクターを有する相同性をさらに最小にするか、または除去することを供した。
【０１４８】
実施例１０のように、リボソームフレームシフト部位を決定し、標準的なＤＮＡコドンおよびオープンリーディングフレーム分析を使用して、ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子のアミノ酸配列を決定した。野生型ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５０に示す。ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子の推定アミノ酸配列（ｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子との間のリボソームフレームシフト部位の識別に基づいている）は、配列番号５１に示す。ＢＩＶのｐｏｌのアミノ酸配列を決定したので、ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子の再コード化が容易になった。ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子のアミノ酸配列を決定したので、当業者は、特定の細胞型における発現を最適化するために、再コード化されるようにこの配列を改変し得た。ｇａｇ／ｐｏｌ組換えＤＮＡフラグメントを再コード化するのに使用されたものと類似の方法を使用して、ｐｏｌ遺伝子のＤＮＡをまた再コード化した。再コード化されたＢＩＶ  ＤＮＡのｐｏｌ遺伝子は、配列番号５２に示す。
【０１４９】
配列番号５１に記載されるように、ＢＩＶのｐｏｌ遺伝子は、配列番号５２に記載されるように、ｍｅｔ開始アミノ酸をコードしない（この遺伝子の５’末端に、ｍｅｔおよびタンパク質合成の開始についてのコドンを含まない）。ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子が別々の構築物の上に提供される、ＢＩＶ導入システムを構築するために、合成ＤＮＡを構築した（オープンリーディングフレーム（ｍｅｔ開始コドンを有するＰＯＬポリペプチドの合成を可能にする）の５’末端に追加のコドンを有するｐｏｌ遺伝子をコードする）。合成ＤＮＡの配列（ｐｏｌを再コード化し、そしてｍｅｔ開始コドンを含む）は、配列番号５４に示す。
【０１５０】
（実施例１２  レンチウイルスベクターの産生を増加し、そしてベクター形質転換効率を増強するヒストンデアセチラーゼのインヒビター）
レンチウイルスベクターについて、広範の適用に関連する技術的な障害の１つは、比較的に低い力価（種々のベクター系に依存して、約１０５〜１０７の形質転換単位／ｍｌ）である。この障害を克服するために、超遠心を介してベクターを集結し得る。ベクターの特性に影響しない手段で、レンチウイルスベクターの力価を増強することは重要である。本発明の一つの実施形態において、ベクター産生細胞の培地において見出された逆転写活性によって示されるように、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（酪酸（ＢＡ））は、５〜１０倍のウシ免疫不全ウイルスに基づくレンチウイルスベクターの産生を有意に増加する（図７）。具体的には、ベクターを収集する２４時間前に、最終濃度が５ｍＭになるように、酪酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をベクター産生細胞に添加した。逆転写活性は、ウイルスベクター粒子の測定である。さらに、形質転換効率で測定されるように、酪酸の存在下で産生されたベクターは、より感染性である（図８）。実施例６．２．に記載されるように、ＢＩＶベクター粒子が産生された。
【０１５１】
（実施例１３  インビボにおけるＢＩＶベクターを有する網膜色素上皮細胞の形質転換）
眼の遺伝子療法に関して、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）は、眼の中の標的の一つである。ＢＩＶベクターを有するＲＰＥの形質転換効率を試験するために、ｅＧＦＰをコードするＢＩＶベクターを、三つの構成要素システムから生成し、そして、網膜下注射（５×１０５形質転換単位／眼）を介して、マウスの眼の中に注射した。注射後１週間から１０週間までにおよぶ異なる時点で、眼組織を収集し、切片にし、そしてｅＧＦＰ発現を検査した。切片化組織は、ｅＧＦＰ発現については免疫蛍光顕微鏡検査法によって検査するか、あるいは免疫組織化学染色で検出した。ｅＧＦＰ発現によって示されるように、有意な網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の部分をＢＩＶベクターで形質転換した。ベクター注射１，２、８、および１０週間目に、眼を凍結切片にした。１週目では、ＧＦＰの発現は、ＲＰＥ層に認められる。ベクター注射２週後では、ｅＧＦＰの発現は、ＲＰＥ層に認められ、また、網膜、視細胞、およびグリア細胞の中に検出された。ベクター注射８週間後では、ｅＧＦＰの発現は、ＲＰＥ層および網膜の両方に認められた。ベクター注射１０週間後では、ｅＧＦＰを発現するＲＰＥ細胞は、明らかに基底部に認められた。
【０１５２】
（実施例１４  マウス脳におけるＢＩＶベクター媒介性トランスジーン発現）
レンチウイルスベクター媒介性遺伝子発現には、ヒトの疾病の処置のために、種々の適用に対して大きな潜在能力を有する。ニューロン疾患および眼の疾患は、レンチウイルスベクターに基づく遺伝子治療に関して、最も適した二つの有望な領域を示す。マウス脳のトランスジーンの発現を媒介する能力について、本発明のＢＩＶに基づく組換えレンチウイルスベクターを試験した。ｅＧＦＰをコードするＢＩＶベクター（２μ１の中に１×ｌ０６の形質転換単位）をマウス黒質に注射した。注射１７日間後に、マウス脳の切片を、免疫組織学染色によってｅＧＦＰの発現を検査した。比較的高い効率で、マウス脳内の細胞を形質転換した。ｅＧＦＰ（緑色）とＮｅｕＮ（赤、ニューロン細胞特異的マーカ）の共染色によって示されるように、いくつかの細胞は、実際にニューロン細胞であった（黄斑に生じる）。
【０１５３】
（実施例１５  全身送達後のラット脾臓におけるＢＩＶベクター媒介性トランスジーン発現）
ルシフェラーゼベクターをコードするＢＩＶベクター（２５０ｍｌあたり１×１０９形質転換単位）をラットにｉ．ｖ．(尾静脈)で注射した。コントロールの場合、ネガティブコントロールとして、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝液生理食塩水）をラットのコントロール群に注射した。ベクター注射１５日後、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）をラットに投与し、そしてこのラットをＸｅｎｏｇｅｎ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍで検査した。ＢＩＶベクターによって、このラットの脾臓を効率的に形質転換し、そして、高レベルのルシフェラーゼ発現を画像システムで観察した。ネガティブコントロール（ラット）と同じ条件下では、有意なシグナルを検出し得なかった。
【０１５４】
（実施例１６  ＢＩＶベクター媒介性抗血管新生遺伝子発現によるインビボにおける眼の血管新生の阻害）
眼の疾患（例えば、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））に関連した多くの血管新生は、例えば、効果的な処置法がなく、また、広範囲にわたる医療の必要性（対処されていない）を示す。実施例１３に示されるように、マウス網膜色素上皮細胞に、本発明の組換えＢＩＶに基づくベクターを効率的に形質転換した。トランスジェニックマウス（ＩＲＢＰ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦ  ｔｇＭＩＣＥ）（ドキシサイクリンの誘導によって、マウス視細胞由来の血管内皮細胞増殖因子を発現する）の網膜下の注射を介して、マウスエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）をコードするＢＩＶベクター（抗血管新生遺伝子（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ；８８（２）：２７７−８５（１９９７）））を投与した。ＢＩＶベクターをマウスの右眼に注射したが、左眼は、ベクターの注射をしないコントロールとした。ベクター注射３週後、このトランスジェニックマウスに対して、０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを飲料水の中に入れた。ドキシサイクリンの誘導５日後、結果を分析した。ドキシサイクリンはＶＥＧＦの発現を誘導し、その結果、蛍光血管造影法で示されるように、トランスジェニックマウスの左眼に重度の血管新生を生じた。ＶＥＧＦ誘導性の血管新生は、同じ動物における右眼のＢＩＶベクター媒介性エンドスタチン発現によって、完全にブロックされた。
【０１５５】
（実施例１７  ＨＩＶおよびＢＩＶはパッケージングを交差しない）
レンチウイルスベクターに基づく遺伝子処置に関連する問題の一つは、安全性である。一つは、患者がＨＩＶに感染する場合、野生型ＨＩＶは、処置用途について意図される可動性のレンチウイルスベクターによって、新しい組換え体を作成するパッケージング機能を潜在的に供し得ることが想像され得た。この問題に対応するために、交差パッケージングの実験（ＢＩＶに基づくベクター（ＢＩＶ／ＢＩＶ）を産生するのに、ＢＩＶに基づくパッケージング構築物を使用するか、または、ＨＩＶに基づくベクター（ＨＩＶ／ＨＩＶ）を生成するために、ＨＩＶに基づくパッケージング構築物を使用する）を実施した。交差パッケージングを試験するために、本発明者らは、ベクターをパッケージングしたＨＩＶに基づくベクター（ＢＩＶ／ＨＩＶ）を試験および産生するために、または、ベクターにパッケージングされたＢＩＶに基づくベクター（ＨＩＶ／ＨＩＶ）を試験および産生するために、ＨＩＶに基づくパッケージング構築物を使用した。ベクターを作成し、そして、ＲＴ活性アッセイによって示されるように、等数のＣｆ２Ｔｈ細胞を形質転換するために、等量のベクター粒子を使用した。ＨＩＶベクター、ＢＩＶベクター、ＨＩＶ／ＢＩＶを交差パッケージングしたベクターまたはＢＩＶ／ＨＩＶを交差パッケージングしたベクターで形質転換されたＣｆ２Ｔｈ細胞におけるｅＧＦＰ発現の分析を、ＦＡＣＳによって、分析した。ＢＩＢ／ＢＩＢから作成されたＢＩＶベクターおよびＨＩＶ／ＨＩＶから作成されたＨＩＶベクターの両方は、各々、３１％の細胞および２１％の細胞を形質転換した。しかしながら、ＢＩＶ／ＨＩＶペアまたはＨＩＶ／ＢＩＶペアのいずれかによって産生されたベクター粒子は、検出可能なｅＧＦＰ陽性細胞を産生しなかった（これは、これらの二つのペアによって産生されたベクターが、空の粒子または欠陥がある粒子であったことを示している）。Ｍｏｃｋ形質転換は、ネガティブコントロール（０％のｅＧＦＰ陽性細胞）として使用した。ｍｏｃｋ感染細胞、ＢＩＶ／ＨＩＶ感染細胞またはＨＩＶ／ＢＩＶ感染細胞との間に相違は認められなかった。本発明者らのデータは、ＨＩＶパッケージング構築物は、ＢＩＶベクター産生にクロスでパッケージングし得ず、そして、ＢＩＶパッケージング構築物は、パッケージングＨＩＶベクターをクロスし得ないことを示す。さらなる分析では、ＢＩＶベクターＲＮＡの核外移行を確実にするために、ＢＩＶベクター構築物およびＢＩＶのＲｅｖ構築物と共に、ＨＩＶパッケージング構築物を同時トランスフェクトした。ここでは、ＨＩＶは、ＢＩＶベクターをパッケージングし得ないか、あるいは少なくとも効率的ではないことをさらに示す標的細胞の形質転換は、観察されなかった。
【０１５６】
（実施例１８  ＢＩＶプロテアーゼの変異）
安定したレンチウイルスに基づくパッケージング細胞株を産生する際に直面する主要な障害の一つは、ＧＡＧタンパク質およびＰＯＬタンパク質の高レベルの発現を維持し得ないことである。ＨＩＶプロテアーゼの触媒中心は、三つのアミノ酸モチーフ（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）を含む（Ｋｏｎｖａｌｉｎｋａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７１８０−７１８６，１９９５）。これらの３つのアミノ酸は、今までに記録されたＨＩＶ単離体およびＳＩＶ単離体の間で保存されている（Ｋｏｒｂｅｒ  Ｂ，Ｔｈｅｉｌｅｒ  Ｊ，Ｗｏｌｉｎｓｋｙ  Ｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年６月１９日、２８０：５３７１  １８６８−７１）。Ｋｏｎｖａｌｉｎｋａ，Ｊ．らは、Ｔｈｒ残基（ＨＩＶ単離体ＨＸＢ２のプロテアーゼの開始から２６番目のアミノ酸に対応する）をＳｅｒに変異させた。変異したＨＩＶプロテアーゼは、プロテアーゼ活性を保存しつつ、有意に減少した毒性を有することを見出した。この情報は、高レベルのレンチウイルスのＧａｇ／ｐｏｌタンパク質を発現するために、安定した細胞株の生成を可能にさせる。これらのタンパク質の発現は、レンチウイルスベクター（特に、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターまたはＢＩＶに基づくレンチウイルスベクター）のために安定したパッケージング細胞株を樹立するのに絶対に必要である。Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙモチーフもまた、同じ位置のＢＩＶプロテアーゼの中に存在している。ＨＩＶプロテアーゼおよびＢＩＶプロテアーゼの最初の２９番目のアミノ酸の比較は、アミノ酸番号２５〜２９が、ＨＩＶプロテアーゼとＢＩＶプロテアーゼとの間で同一であることを明らかにし、これは以下、前述のＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙモチーフを含む：
【０１５７】
【数１】
2005533485.tif 000007
配列番号４０のアミノ酸Ｔｈｒのパッケージング構築物ｐＣｌＩｇｐＳｙｎで、点変異を作製した（ここで、パッケージング構築物の任意の他のコーディング領域において、任意の変化がない状態で、２６番目のアミノ酸Ｔｈｒ（ＢＩＶウイルスゲノムＲＮＡ単離体１２７の１８０６番目〜１８０８番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドＡＣＴによってコードされる（Ｇａｒｖｅｙら、１９９０年）；変異された形態かまたは再コードされた形態のいずれかにおいて、配列番号５６および配列番号５８は、ＢＩＶプロテアーゼの部分配列（本発明のベクターの一つの実施形態においてコードされる全配列）を表す））を同じ位置のＳｅｒと置換した。ＴｈｒからＳｅｒへの変異を有するこのパッケージング構築物を、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒと設計した。ＢＩＶベクターの産生を支持する能力、およびＢＩＶベクターによって達成される形質転換効率に関するｐＣＩｉｇｐＳｙｎと、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒを比較した。
【０１５８】
具体的には、ｐＣＩｉｇｐＳｙｎもしくはｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒ（１μｇ）、ｐＴｒａｃｅｒＡＲｅｖ（１０μｇと、ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃ（１５μｇ）およびｐＣＭＶＶＳＶ−Ｇ（４．５μｇ）と共に、１０ＣＭ皿の８×ｌ０６個の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、トランスフェクションした細胞からベクターを収集した。逆転写酵素（ＲＴ）活性で示されるように、等数のベクター粒子をＨｅＬａ細胞に形質転換した。形質転換４８時間後、ｅＧＦＰ陽性ＨｅＬａ細胞を測定するために、フローサイトメトリー分析を実施した。表５に示されるように、ＴｈｒからＳｅｒへの変異を有するパッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎＳｅｒによって作成されたベクターは、パッケージング構築物ｐＣＩｉｇｐＳｙｎによって産生されたベクターと同じくらいの効率でＨｅＬａ細胞を形質転換した。この変異されたｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子に対するヌクレオチド配列は、配列番号５９に示す。
【０１５９】
【表５】
2005533485.tif 000008
（実施例１９  ＢＩＶ導入ベクターからのｃＰＰＴの除去）
ＢＩＶ導入ベクター構築物の１つは、推定ｃＰＰＴ（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら、２００ｌｂ；Ｍａｔｕｋｏｎｉｓら、２００２年；Ｍｏｌｉｎａら、２００２年）を有する。ＢＩＶのｃＰＰＴが、インビトロおよびインビボにおいて形質転換効率を必要とするか否かを決定するために、本発明者らは、非分裂培養ＨｅＬａ細胞内およびラット網膜内において、ｃＰＰＴを有するベクターまたはｃＰＰＴを有さないベクターを比較した。ｃＰＰＴを除去するために、ＣｌａＩおよびＥｃｏｒＩを有するｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃの消化によって、推定ｃＰＰＴを有さないベクター変形を作成し、そして、このフラグメントを、平滑末端にして連結した。
【０１６０】
ｃＰＰＴの有無に関わらず、ベクターは、当量のベクター粒子投入量を用いて、それぞれ３５％の非分裂ＨｅＬａ細胞および３４％の非分裂ＨｅＬａ細胞を形質転換させた。さらに、以下の実験に関して、ｃＰＰＴの除去は、インビボにおける遺伝子導入の効率に有意な影響を及ぼさなかった。ｅＧＦＰをコードするＣＰＰＴの有無に関わらず、ＢＩＶベクターをラットの右眼網膜下腔へ注射し（４．８×１０５Ｔ．Ｕ．／眼）、左眼をコントロール（５匹のラット／群）とした。注射２週後、蛍光顕微鏡下で、網膜の平坦なマウントをｅＧＦＰ発現について検査した。
【０１６１】
結果：注射をしていない左眼は、任意の検出可能なＧＦＰ発現も表さなかった。ところが、ｅＧＦＰ  ＢＩＶベクターを注射した右眼は、かなりの量のＧＦＰの発現を表した。ｃＰＰＴを含むＢＩＶベクターおよびｃＰＰＴを欠失したＢＩＶベクターの両方は、眼の中の同量の細胞を形質転換した（データは示していない）。
【０１６２】
これは、推定ｃＰＰＴを含まないＢＩＶベクターを使用することで、インビトロおよびインビボの形質転換が達成され得ることを示す。また、ｃＰＰＴを除去することで、３６４ｂｐブロックのパッケージング構築物を有する配列類似性を除去する。これらの改変は、導入ベクターとパッケージング構築物が、１０１ｂｐのみの配列（パッケージングシグナル）類似性（８ｂｐより長い同一性は有さない）を共有するシステムを生じた。実施例１１に記載されるように、ｇａｇ／ｐｏｌの再コード化は、１０１ｂｐブロックの相同性を除去する。
【０１６３】
（実施例２０）
ＰＯＡＧの処置は、Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ遺伝子（Ｒｅｚａｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５：１０７７−１０７９（２００２））および／または小柱網タンパク質遺伝子（ＴＩＧＲ；Ｓｔｏｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６６８−６７０）をコードする本発明のベクターを患者に送達することによって、達成され得る。このベクターは、好ましくは、眼において直接の眼内注射によって送達される。眼の中への注射方法は、当該分野で周知である。
【０１６４】
視細胞の変性を引き起こす疾患は、遺伝性網膜ジストロフィー（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、Ｂａｒｄｅｔ−Ｂｉｅｄｅｌ症候群、Ｂａｓｓｅｎ−ｋｏｒｎｚｗｅｉｇ症候群、ｂｅｓｔ病、脈絡膜、脳回状網脈絡膜萎縮、先天性黒内症（ａｍｏｕｒｏｓｉｓ）、Ｒｅｆｓｕｎ症候群、Ｓｔａｒｇａｒｄｔ病ならびにＵｓｈｅｒ症候群）、網膜剥離、加齢黄斑変性症および他の黄斑症を含むが、これらに限定されない。これらの疾患の処置は、Ｒｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄＣｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３８１０（ＷＯ  ０２／０８１５１３））をコードする本発明のベクターを患者に送達するか、または抗アポトーシス遺伝子をコードする本発明のベクターを患者に送達することによって達成され得る。
【０１６５】
さらに、疾患（例えば、ヒストプラスマ症および病的な近視に起因する脈絡膜の血管新生ならびに網膜色素線条から生じる脈絡膜の血管新生、前部虚血性視神経症ニューロパシー、細菌性心内膜炎、Ｂｅｓｔ病、ｂｉｒｄｓｈｏｔｒｅｔｉｎｏｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ、脈絡膜血管腫、脈絡膜母斑、非潅流性脈絡膜（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｏｎｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、脈絡膜骨腫（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｏｓｔｅｏｍａｓ）、脈絡膜裂傷、脈絡膜欠如症、慢性網膜剥離、網膜欠損、ドルーゼン（Ｄｒｕｓｅｎ）、内因性カンジダ眼内炎、網膜色素上皮の乳頭外過誤腫、黄色斑眼底、特発性、黄斑円孔、悪性黒色腫、膜増殖性糸球体腎炎（ＩＩ型）、眼内の異物（金属性）、ｍｏｒｎｉｎｇ  ｇｌｏｒｙ  ｄｉｓｃ症候群、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗｈｉｔｅ−ｄｏｔ症候群（ＭＥＷＤＳ）、鋸状縁の血管新生、熱傷の顕微鏡手術、頭部視神経窩（Ｏｐｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ  ｈｅａｄ  ｐｉｔ）、光凝固、点状内部脈絡膜症、風疹、肉芽腫、蛇行状脈絡膜炎もしくは地域上の脈絡膜炎、網膜下液ドレナージ、ｔｉｌｔｅｄ  ｄｉｓｃ症候群、トキソプラズマ（Ｔａｘｏｐｌａｓｍａ）脈絡網膜炎、結核またはＶｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群）を処置するために、ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ、ＴＩＧＲ、血管新生（ａｎｔｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子およびその他の発現に、本発明のベクターは有用である。
【０１６６】
（実施例２１  ＢＩＶベクターを有するＲｄＣＶＦ遺伝子の治療的な導入および発現）
視細胞は、視覚を担う網膜神経細胞のサブセットで特定される。視細胞は、杆体および円錐からなる（これらは、網膜の感光性細胞である）。杆体および円錐各々は、特定化された外節部分と呼ばれる繊毛（光伝達機構を持つ）を産生する。杆体は、特定の光吸収性の視覚色素（ロドプシン）を含む。ヒトにおいては、三つの円錐の分類（特徴的な視覚色素の発現によって特徴付けられる）がある：青色錐体色素、緑色円錐色素、および赤色円錐色素。各タイプの視覚色素タンパク質は、異なる波長で光を最大限に吸収するために調整される。杆体ロドプシンは、暗順応の視覚（ほのかな明かり）を媒介するが、錐体色素は明順応（明光）の原因となる。また、赤色色素、青色色素および緑色色素は、ヒトの色覚の基礎を形成する。杆体および円錐における視覚色素は、光に反応し、そして、産出細胞（杆体双極性ニューロン）（従って、視野において視刺激を産生するために、網膜神経節ニューロンによってリレーされる）の活動電位を生成する。
【０１６７】
ヒトにおいて、多数の網膜疾患は、進行性の変性および視細胞の最終的な死滅（容赦なく盲へと導く）を含む。視細胞の変性（例えば、遺伝性網膜ジストロフィー（例えば、網膜色素変性）、加齢黄斑変性症、緑内障および他の黄斑症または網膜剥離）は、視細胞外節の機能の進行性の萎縮および欠失によって、全て特徴付けられる。さらに、視細胞の死滅または視細胞機能の損失は、網膜ジストロフィーを罹患する患者の二次オーダー網膜神経細胞（杆体双極細胞と水平細胞）の部分的な求心路遮断を生じ、その結果、視細胞によって生成される電気シグナルの伝達の全体的な効率を減少させる。二次視細胞の変性に次ぐ二次グリア上皮組織および色素上皮組織の変化は、虚血および神経膠症を導く血管変化をもたらす。細胞死からの視細胞を救出し得る栄養因子および／または、機能障害性（萎縮性もしくはジストロフィーの）の視細胞の機能を回復し得る栄養因子は、このような条件化の処置のために、有用な治療法を表し得る。さらに、これらの遺伝子の過剰発現または非発現の生理学的効果、および眼の様々な疾患に対する発現の関連性を決定するために、ＲｄＣＶＦ遺伝子を発現するＢＩＶ導入ベクターは、細胞内に調節可能に発現され得る。
【０１６８】
これらの状態の進行は、視細胞の二つの分類の一連の欠失を指摘する：初めの杆体は、遺伝的病変もしくは環境的病変、または未知の病変の結果、直接欠失し、その結果、夜盲症を生じ、そして全盲へと導く錐体の欠失によって必然的に視野が低下する。従って、錐体は原発病変に発現しないので、これらは間接的に死滅する。
【０１６９】
Ｒｏｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＲｄＣＶＦ）は、錐体保護因子で見出される（ＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３８１０（ＷＯ  ０２／０８１５１３））。Ｒｏｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｏｎｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒｓ（ＲｄＣＶＦ)は、眼の組織に発現し、そして特に杆体細胞に産生する。ＲｄＣＶＦの遺伝子は、杆体細胞の局所領域内の他の細胞型によって発現し得、そしてなおも保護的な利益を提供する。網膜ジストロフィーを罹患するヒトのＲｄＣＶＦの産生は、網膜ジストロフィーを罹患しないヒトの組織と一致して、発現量は減少する。ＲｄＣＶＦの遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ、およびそのようなｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質は、杆体組織に存在し、そして／または少なくとも約半分未満、好ましくは少なくとも約５倍未満、さらに好ましくは少なくとも約１０倍未満、最も好ましくは少なくとも約１００倍未満（網膜ジストロフィーを罹患しないヒトに対応する組織で見出されたｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルに）の量でこのような組織に関連する。ＲｄＣＶＦの転写におけるこのような減少は、「減少された転写」と本明細書でいう。
【０１７０】
好ましい実施形態において、ＢＩＶベクターは、ＲｄＣＶＦをコードする核酸配列を含む。配列番号６０および配列番号６２は、各々マウスＲｄＣＶＦ１遺伝子およびマウスＲｄＣＶＦ２遺伝子であり、そして配列番号６１および配列番号６３は、各々マウスＲｄＣＶＦ１ポリペプチドおよびＲｄＣＶＦ２ポリペプチドをコードする（Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号ＸＭ＿１３４２６３，ＢＣ０１７１５３およびＢＣ０２１９１１）。配列番号６４および配列番号６６は、各々ヒトＲｄＣＶＦ１およびヒトＲｄＣＶＦ２に対応する遺伝子であり、そしてさらに、Ｇｅｎｂａｎｋ取得番号ＮＭ＿１３８４５４およびＢＣ０１４１２７に記載される。ヒトＲｄＣＶＦ１ポリペプチドおよびヒトＲｄＣＶＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列は、各々配列番号６５および配列番号６７に示される。
【０１７１】
当業者は、ＲｄＣＶＦをコードする核酸は、最終的なＲｄＣＶＦタンパク質のアミノ酸配列を変えない変化コドン（ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｃｏｄｏｎ）によって、改変され得る。また、ＲｄＣＶＦをコードする核酸の改変体が、提供される（この改変体は、ＲｄＣＶＦタンパク質のアミノ酸配列の機能的改変体に対応してコードする）。機能的な改変体は、一つ以上の置換、付加、欠失またはトランケーション（任意の組み合わせで表され得る）によってアミノ酸配列が異なり得るが、ＲｄＣＶＦの基準と同じ生物学的機能を保持する。
【０１７２】
本明細書の意味する範囲内の「生物学的機能」とは、広範な意味で理解される。ＲｄＣＶＦタンパク質の特定の機能は、本明細書中に開示したことを含むが、これに限定されない。従って、生物学的機能は、ポリペプチドが生理学的な背景（すなわち、生物または細胞の一部として）で表すものだけでなく、非生理的な背景（例えば、インビトロ）で実施され得る機能を含む。例えば、本明細書の意味する範囲内のＲｄＣＶＦタンパク質の生物学的機能は、例えば、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、錐体保護効果を実証する能力である。必要な性質を評価するアッセイは、当業者に周知である。
【０１７３】
また、ＲｄＣＶＦタンパク質の治療効果は取り除かれない小規模のコドンの置換、欠失および挿入が作製され得る。従って、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７は、ＲｄＣＶＦタンパク質をコードするが、本発明は、同じまたは類似の治療効果もしくは生物学的機能を有する任意のＲｄＣＶＦタンパク質をコードするＢＩＶベクターを含む。好ましい実施形態において、ＢＩＶベクターは、ヒトＲｄＣＶＦ１および／またはヒトＲｄＣＶＦ２をコードする。
【０１７４】
ＲｄＣＶＦを発現するＢＩＶベクターは、眼に関連する種々の疾患を処置するのに使用され得る。また、細胞におけるＲｄＣＶＦ発現の生理作用を分析するために、このようなベクターが使用され得る。ＲｄＣＶＦ遺伝子または遺伝子は、本発明のＢＩＶベクターに挿入され、そして、このベクターは、眼細胞に移される（ＲｄＣＶＦ遺伝子は、正常な眼細胞の発現と同等なレベルで発現される）。
【０１７５】
本明細書に記載されるように、目的の異種遺伝子を含むベクターは、遺伝子療法のために、目的の異種遺伝子の発現を含む種々の用途を有するが、これらに限定されない。当業者によって容易に理解されるように、細胞増殖、細胞バイアビリティーおよび細胞機能において遺伝子発現の改変の効果を決定するために、これらのベクターは、遺伝子発現を改変するのに使用され得る。例えば、遺伝子発現の改変は、種々の生理学的な現象（例えば、米国特許第６，４６５，７１５号（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ開発）；米国特許第６，４６５，２４６号（腫瘍遺伝子）；および米国特許第６，４６１，８０７号（薬物標的の改変による薬物スクリーニング））に識見を与え得る。
【０１７６】
（実施例２２  レンチウイルスベクターを偽型させたＴｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ糖タンパク質）
ＶＳＶ−Ｇは、種々のレンチウイルスベクターを偽型するためのエンベロープ糖タンパク質として、広範に使用されている。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇは、細胞に対して毒性である。ＢＴＶベクターを偽型する能力について、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ糖タンパク質を試験する。平滑末端ライゲーションとして、ｐＣＩ発現プラスミドのＸｈｏｌ部位に、配列（配列番号６８）をコードするＴｈｏｇｏｔｏウイルス糖タンパク質コードをクローン化した。その結果生じた構築物、ｐＣＩ  ＴｈｏｇｏｔｏＧＰは、構築物の安全性を確認するためにＤＮＡ配列決定を供する。次いで、実施例６．２．（ウイルスベクター産生）に記載される方法により、ｐＣＩｇｐＳｙｎＳｅｒ（パッケージング構築物）、ｐＴｒａｃｅｒＡ  Ｒｅｖ（Ｒｅｖ発現構築物）；ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃ（導入ベクター構築物）およびｐＣＩＴｈｏｇｏｔｏＧＰ（Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ糖タンパク質発現構築物）と共に、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトすることによって、ＢＩＶベクターを生成する。Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープで偽型されたＢＩＶベクターを、ヒトプライマリー細胞を含む種々のヒト細胞および動物細胞において、力価、安定性、および形質転換効率を試験した。実施例１３および実施例１４に各々記載されるように、網膜細胞、ニューロン細胞を形質転換する能力に対してベクターをさらに試験する。
【０１７７】
ヒト細胞の中でｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ糖タンパク質の発現効率を増強するために、ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープ糖タンパク質に対するコード配列を最適化する（再コード化する）。再コード化配列を配列番号７０に示す。
ＢＩＶベクターに対するパッケージング細胞株として、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルスエンベロープタンパク質を発現する細胞を使用し得る。
【０１７８】
（実施例２３  レンチウイルスベクターを偽型したバキュロウイルスウイルスエンベロープ）
ＢＩＶベクターシステムで使用され得る別のウイルスエンベロープは、バキュロウイルスエンベロープタンパク質である。好ましくは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａウイルスから誘導されたＧＰ６４である。当該分野で公知の技術によって、ＧＰ６４領域のＤＮＡコード領域をクローン化する。上述のＢＩＶシステムと適合する発現構築物に、このコード配列をクローン化する。例えば、ｐＣｉプラスミドの中にクローン化する。これは、Ｔｈｏｇｏｔｏエンベロープにおいては実施例２２または、ＶＳＶ−ＧについてはＢｕｒｎｓら（１９９３年、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ９０：８０３３−８０３７）に記載されるような類似の様式で実施し得る。
【０１７９】
ＧＰ６４エンベロープを含むＢＩＶウイルスベクターは、実施例６．２．に記載される方法により、ｐＣＩｇｐＳｙｎＳｅｒ（パッケージング構築物）、ｐＴｒａｃｅｒＡ  Ｒｅｖ（Ｒｅｖ発現構築物）；ｐＢＩＶｆｉｎａｌｖｅｃ（導入ベクター構築物）およびｐＣＩＧＰ６４（バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質発現構築物）と共に、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトすることによって、ＢＩＶベクターを生成する。
【０１８０】
一般的に実施例７に記載されるように、分裂性ならびに非分裂性のプライマリーＲＰＥ（ＡＲＰＥ）細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の両方を形質転換するために、ＧＰ６４エンベロープを有するこのＢＩＶウイルスベクターを使用する。この結果は、表６に示す。比較的高い効率で、ＢＩＶベクターと共に非分裂性ＡＲＰＥ細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の両方を形質転換した（最小にされたＢＩＶパッケージング構築物および最小にされた導入ベクター構築物から生成されたベクターは、分割細胞および非分裂細胞の両方でトランスジーン発現を媒介するために十分な構成成分であることを示している）。
【０１８１】
【表６】
2005533485.tif 000009
また、超遠心に耐える能力に基づいて、ＢＩＶ−ＧＰ６４粒子は安定していることを見出した。
【０１８２】
また、網膜下の注射を介してラットの網膜下領域に、ＢＴＶ−ＧＰ６４を注射した。この知見は、インビボにおいて網膜色素上皮細胞を形質転換するのに、ＢＩＶベクターを偽型させたＰ６４を使用し得ることを示唆する。
【０１８３】
ＢＩＶベクターに対するパッケージング細胞株として、バキュロウイルスエンベロープタンパク質を発現する細胞を使用し得る。
【０１８４】
本発明は、本発明の好ましい実施形態の詳細を参照することによって、本出願で開示したが、本発明の範囲および添付の特許請求の範囲内での改変は当業者に容易であると考えられるので、この開示は、限定する意味というよりむしろ、例示を意図する。
【０１８５】
【数２】
2005533485.tif 000010
【０１８６】
【数３】
2005533485.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ＢＩＶの三つの構築物の遺伝子導入システムの配置図である。
【図２】図２は、ＢＩＶの四つの構築物の遺伝子導入システムの配置図である。
【図３】図３は、異なる量のｇａｇ配列を含むＢＩＶベクターで形質転換された細胞における、ｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。パネルＡ）偽（ｍｏｃｋ）感染、Ｂ）ｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔ由来のＢＩＶベクター、Ｃ）ｐＢＩＶｍｉｎｉｖｅｃ由来のＢＩＶベクター、Ｄ）２８ｂｐのｇａｇ配列を含むｐＢＶ２８由来のＢＩＶベクター、Ｅ）５４ｂｐのｇａｇ配列を含むｐＢＶ５４由来のＢＩＶベクター、Ｆ）１０１ｂｐのｇａｇ配列を含むｐＢＶ１０１由来のＢＩＶベクター。
【図４】図４は、ＢＩＶまたはＨＩＶ  ｃＰＰＴのいずれかを含むＢＩＶベクターによる形質転換の効率の機能的な比較を示す。
【図５】図５は、ＢＩＶ  Ｐｏｌの翻訳リボゾームフレームシフト部位を示す。
【図６】図６は、再コード化されたＢＩＶ  ｇａｇ/ｐｏｌ発現の構築物の配置図を示す。
【図７】図７は、ウシ免疫不全ウイルスに基づくレンチウイルスベクター生成において、ウイルスベクター産生の間にヒストンデアセチラーゼインヒビターを添加した結果を示す。
【図８】図８は、ウシ免疫不全ウイルスに基づくレンチウイルスベクターの形質転換の効率に対してウイルスベクター産生の間にヒストンデアセチラーゼインヒビターを添加した結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005533485000001.app
【国際調査報告】
2005533485.tif 000052
2005533485.tif 000053
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