(57)【要約】本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中で検出され得る表面露出タンパク質、前記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、及び前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片に関する。ＤＮＡセグメント、ワクチン、プラスミド及びファージ、非ヒト宿主、組換えＤＮＡ分子及び植物、融合タンパク質及びポリペプチド並びに融合産物をも開示する。ＩｇＤの検出方法、ＩｇＤの分離方法、モラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の単離方法及び自己免疫疾患の治療方法をも開示する。
2005500837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中で検出され得ることを特徴とする表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片。
【請求項２】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体。
【請求項３】
配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片。
【請求項４】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に結合する能力を有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片。
【請求項５】
配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の免疫原性接着性断片。
【請求項６】
配列番号２に記載されており、請求の範囲第１項に記載のモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質をコードするＤＮＡ配列、または前記ＤＮＡ配列の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を含むことを特徴とするＤＮＡセグメント。
【請求項７】
請求の範囲第２項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡセグメント。
【請求項８】
配列番号１１に記載されており、請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第７項に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項９】
請求の範囲第４項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするＤＮＡセグメント。
【請求項１０】
配列番号９に記載されており、請求の範囲第５項に記載の免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第９項に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１１】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１２】
膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１３】
請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を含むことを特徴とする請求の範囲第１２項に記載のワクチン。
【請求項１４】
請求の範囲第４項に記載のモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１５】
請求の範囲第５項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のワクチン。
【請求項１６】
別のワクチンと組み合わせることを特徴とする請求の範囲第１１項〜第１５項のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１７】
別の分子の免疫原性部分と組み合わせることを特徴とする請求の範囲第１１項〜第１６項のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプラスミドまたはファージ。
【請求項１９】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプラスミドまたはファージ。
【請求項２０】
請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１９項に記載のプラスミドまたはファージ。
【請求項２１】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプラスミドまたはファージ。
【請求項２２】
請求の範囲第５項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第２１項に記載のプラスミドまたはファージ。
【請求項２３】
請求の範囲第１８項〜第２２項のいずれか１項に記載のプラスミドまたはファージの少なくとも１つを含み、前記タンパク質または変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記タンパク質の免疫原性接着性断片を産生し得る細菌、酵母及び植物から選択されることを特徴とする非ヒト宿主。
【請求項２４】
大腸菌であることを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の宿主。
【請求項２５】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
【請求項２６】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含んでいることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
【請求項２７】
請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含んでいることを特徴とする請求の範囲第２６項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項２８】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含んでいることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
【請求項２９】
請求の範囲第５項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含んでいることを特徴とする請求の範囲第２８項に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３０】
請求の範囲第２５項〜第２９項のいずれか１項に記載の融合ＤＮＡ配列を含むことを特徴とするプラスミドまたはファージ。
【請求項３１】
請求の範囲第３０項に記載のプラスミドまたはファージの少なくとも１つを含み、細菌、酵母及び植物から選択されることを特徴とする非ヒト宿主。
【請求項３２】
大腸菌であることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の宿主。
【請求項３３】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が請求の範囲第２５項に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされていることを特徴とする融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項３４】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が請求の範囲第２６項に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされていることを特徴とする融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項３５】
請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が請求の範囲第２７項に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされていることを特徴とする請求の範囲第３４項に記載の融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項３６】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が請求の範囲第２８項に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされていることを特徴とする融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項３７】
請求の範囲第５項に記載の免疫原性接着性断片が請求の範囲第２９項に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされていることを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合していることを特徴とする融合産物。
【請求項３９】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第２項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合していることを特徴とする融合産物。
【請求項４０】
請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合していることを特徴とする請求の範囲第３９項に記載の融合産物。
【請求項４１】
モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する請求の範囲第２項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合していることを特徴とする融合産物。
【請求項４２】
請求の範囲第５項に記載の免疫原性接着性断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合していることを特徴とする請求の範囲第４１項に記載の融合産物。
【請求項４３】
場合により標識されていたり及び／またはマトリックスに結合していてもよい、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを検出する方法。
【請求項４４】
場合により標識されていたり及び／またはマトリックスに結合していてもよい、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第２項に記載の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを検出する方法。
【請求項４５】
場合により標識されていたり及び／またはマトリックスに結合していてもよい、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第３項のモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、または前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを検出する請求の範囲第４４項に記載の方法。
【請求項４６】
場合によりマトリックスに結合していてもよい、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを分離する方法。
【請求項４７】
場合によりマトリックスに結合していてもよい、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第２項の表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを分離する方法。
【請求項４８】
場合により標識されていたり及び／またはマトリックスに結合していてもよい、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第３項に記載のモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、または前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを分離する請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項４９】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片の単離方法であって、
ａ）任意にＥＤＴＡの存在下で双イオン性またはノニオン性界面活性剤を添加することによりモラクセラ・カタラーリスの懸濁液を抽出するステップ、
ｂ）ステップａ）からのモラクセラ・カタラーリスのＩｇＤ結合タンパク質を含む抽出物を吸着カラムにかけるステップ、
ｃ）ＩｇＤ結合タンパク質を溶離するステップ、及び
ｄ）ＩｇＤ結合タンパク質を分離するステップ
を含むことを特徴する前記方法。
【請求項５０】
界面活性剤がエンピゲン（登録商標）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド及びトリトンＸ−１００＋０．０１Ｍ  ＥＤＴＡからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第４９項に記載の方法。
【請求項５１】
ステップａ）における界面活性剤の濃度が０．１〜５％、好ましくは約３％であることを特徴とする請求の範囲第４９項または第５０項に記載の方法。
【請求項５２】
血液からＩｇＤを除去するために前記血液を請求の範囲第１項に記載の表面露出タンパク質または請求の範囲第２項または第３項に記載のその断片を含む材料中に体外循環させることを特徴とする自己免疫疾患の治療方法。
【請求項５３】
配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片の免疫原性部分に特異的であることを特徴とする精製抗体。
【請求項５４】
膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する請求の範囲第３項に記載の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体に特異的であることを特徴とする請求の範囲第４８項に記載の精製抗体。
【請求項５５】
赤血球及び上皮細胞に結合する能力を有している請求の範囲第５項に記載の免疫原性または接着性断片に特異的であることを特徴とする請求の範囲第４８項に記載の精製抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中で検出され得、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質、前記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、及び前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）は、長年気道において比較的無害な片利共生生物と見做されてきたグラム陰性双球菌である。現在、モラクセラ・カタラーリスは中耳炎の原因の中で３番目に多く、肺疾患を患っている成人における副鼻腔炎及び下気道感染の重大な原因菌でもある。モラクセラ・カタラーリスは健康な小児の咽頭の最も一般的な常住菌の１つでもある。
【０００３】
２０年前、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びモラクセラ・カタラーリスは可溶性及び表面結合ヒトＩｇＤに対して強いアフィニティーを示すことが判明した（１）。ＩｇＤ−結合は、インフルエンザ菌及びモラクセラ・カタラーリスによるヒトリンパ球に対する強い分裂促進効果を説明する現象である表面結合ＩｇＤとの類似相互作用に細胞レベルで類似しているようである（２−４）。インフルエンザ菌からのＩｇＤ結合外膜タンパク質（タンパク質Ｄ）を分離し、クローン化し、重要な病原性因子であることが分かった（５）。しかしながら、タンパク質Ｄは試験したＩｇＤミエローマの大部分に結合せず、血清型ｂのカプセル化インフルエンザ菌は別のＩｇＤ受容体を発現することが示唆された（６）。
【０００４】
初期の研究では、多種多様なモラクセラ単離物コレクション由来の外膜タンパク質（ＯＭＰ）が高度の類似性を示すことが立証された（７）。研究者たちの研究の主眼は特定群のタンパク質に向けられていた。最近の研究では、ＵｓｐＡまたはＨＭＷ−ＯＭＰと称される高分子量表面抗原が実際には２種のタンパク質から構成されていることが立証された。これらのタンパク質はＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２と名付けられている（８，９，１０）。上記ＯＭＰの見かけ分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定して２５０ｋＤａ以上である。ギ酸で還元すると、約１２０〜１４０ｋＤａのバンドが生じたことから、ＵｓｐＡタンパク質が数個のモノマーサブユニットから構成されるオリゴマー複合体を形成していることが示唆された（１１）。クローン化遺伝子から推定して各タンパク質の推定分子量はＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２のそれぞれについて８８ｋＤａ及び６２ｋＤａである。推定分子量及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定した分子量の違いは予想される渦巻状コイル構造に起因すると考えられる（９）。
【０００５】
最近の特許文献では、約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ・カタラーリスの外膜タンパク質が単離された（１２）。約２００ｋＤａのタンパク質をコードする配列も提供された。前記タンパク質は免疫原性であることが分かったが、それ以上の生物学的機能は記載されていなかった。更に、２００ｋＤａのタンパク質は赤血球凝集モラクセラ・カタラーリスと関連している（１３，１４）。
【０００６】
ＣｏｐＢは、中程度の抗原保存を示す８０ｋＤａ表面露出主要ＯＭＰである。更に、ＯＭＰ  ＣＤは多数の表面露出エピトープを有する４６ｋＤａ高保存タンパク質であり、ＯＭＰ  Ｅは各種の異種株で検出される４７ｋＤａタンパク質である。ラクトフェリン結合（ＬｂｐＡ及びＢ）及びトランスフェリン結合（ＴｂｐＡ及びＢ）タンパク質はそれぞれ９９〜１１１ｋＤａ及び７４〜１０５ｋＤａの分子サイズを有する。
【０００７】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のある株は、いずれも食中毒及びトキシンショック症候群（ＴＳＳ）に関連するトキシンショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ＳＥＢ及びＳＥＣのような免疫刺激エキソトキシンを生ずる。これらのエキソトキシンはＴリンパ球を高頻度で活性化する能力を有するためにスーパー抗原（ＳＡｇ）と呼ばれてきた。ＳＡｇは未プロセスタンパク質としてＡＰＣ上のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、特定のＴＣｒ  Ｖβ鎖を発現するＴ細胞をオリゴクローン的に活性化する。過剰量のＳＡｇをインビボで接触させると、強いサイトカインが産生し、トキシックショック様症候群に関連するＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＮＦ−γが含まれる。
【０００８】
１９６６年に免疫グロブリン結合細菌タンパク質の黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）が初めて発見されて以来、このタンパク質の性質が徹底的に調べられた。ＳｐＡがＩｇＧのＦｃ部分に結合する能力は公知であるが、ＳｐＡは特定重鎖の可変領域との相互作用を表す所謂“選択的”結合のためにすべてのクラスのＩｇＧ分子のフラクションにも結合する。黄色ブドウ球菌のすべてのＩｇＧ結合能力はＳｐＡにより媒介されると考えられてきた。しかしながら、黄色ブドウ球菌中にＩｇ結合タンパク質をコードする第２遺伝子の存在も報告された。
【０００９】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）及びペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）はＩｇ結合細菌の他の例である。化膿連鎖球菌はタンパク質のＭファミリーに属するタンパク質Ｈを産生し、ＩｇＧのＦｃ領域に対して強いアフィニティーを有する。幾つかの株が発現するタンパク質はＩｇＧではなくＩｇＡに結合するかまたはＩｇＧとＩｇＡの両方に結合する。タンパク質ＢａｃまたはＢ−抗原はグループＢストレプトコッカスのある株が発現するＩｇＡ結合タンパク質である。最後に、ペプトストレプトコッカス・マグヌスはＩｇ軽鎖、特にκ軽鎖に対して高くて特異的なアフィニティーを示し、よってすべてのクラスのＩｇと相互作用するタンパク質Ｌを発現する。
【００１０】
ＩｇＤは可溶性形態及び免疫結合形態の両方で存在するユニークな免疫グロブリンである。いずれの形態も同一遺伝子によりコードされ、スプライシング産物である。すべての成熟Ｂリンパ球は膜結合ＩｇＤ及びＩｇＭから構成されるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を有する。可溶性ＩｇＤは血清Ｉｇの全量の約０．２５％を占める。ＩｇＤの主要な機能は、Ｂ細胞漸増及び急速アフィニティー成熟を最適化するためにＢ細胞上に抗原受容体として存在すると見られる。抗原はエンドサイトーシスによりＩｇＤを介して吸収された後細胞内劣化及びＴ細胞に対するＭＨＣクラスＩＩでの提示が生じ、よって活性化され、サイトカインを産生する。多数のサイトカイン（例えば、インターロイキン−４）及び同時刺激分子（例えば、ＣＤ２８）を含めたＴ細胞ヘルプが得られる。
【００１１】
マクロファージ、樹枝細胞及びＢ細胞はすべてＴリンパ球に対する抗原を提示し得るが、Ｂ細胞は表面上の抗原提示免疫グロブリンの重要性のために１００倍以上有効である。免疫化を増強するための魅力的な方法はＢ細胞受容体に対して抗原を直接標的することである。抗−ＩｇＤモノクローナル抗体にコンジュゲートさせたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するマウス抗体応答は抗体なしにＢＳＡを投与したときに比して１００倍強いことは以前判明している。同時に、マウスミエローマ抗原を表面結合ＩｇＤに標的させた抗−ＩｇＤ抗体の定常領域に導入すると、ＭＨＣクラスＩＩ上での抗原提示は最高１００倍有効となる（１５）。
【００１２】
追加のＴ細胞ヘルプなしにＩｇＤ  ＢＣＲによりＢ細胞を活性化することにより、実験的に耐性を誘導し得る。Ｂ細胞アネルギーを誘導することにより自己免疫疾患を治療すること、よって自己抗体の産生を抑制することも可能であろう。実際、デキストラン結合抗−ＩｇＤ抗体を投与したＳＬＥ傾向マウスは自己免疫の遅い発現を示す。別の研究で、ＩｇＤを介するＢ細胞活性化はＴヘルパー２誘導ＩｇＥ応答を低下させることが判明し、このことから重篤なアレルギー患者における抗体応答をＴｈ２応答からＴｈ１応答へ変更することによりＩｇＥ産生を低下させる治療が示唆された。Ｂ細胞受容体ＩｇＤに対して抗原を標的することにより、刺激、トレランス及びＩｇＥ産生からの切り替えが達成され得る。加えて、ポリクローナル活性化が報告された。結果は使用する実験モデルに依存する。各種反復ＩｇＤ−結合セグメントを含めた各種構築物により、応答を調節することができる。
【００１３】
腫瘍特異性抗原を認識するので、Ｔ細胞は抗腫瘍応答において重大な役割を果たす。しかしながら、全身免疫抑制のためにガン患者では重要なＴ細胞は通常弱い活性を示す。従って、Ｔヘルパー細胞のトリガーは非常に有効であろう。抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いる腫瘍に対するワクチン接種が最近認められている（１７）。エキソビボで腫瘍抗原（ペプチド）をパルスしたＡＰＣを用いる免疫化プロトコルが細胞毒性Ｔ細胞に対する有効なＭＨＣクラスＩ提示を誘導することが判明している。また、ＥＢＶ形質転換したＢ細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＬＣ）に対するメラノーマ抗原を提示し得ることも立証された。実験モデルでは、Ｂ細胞上に豊富にある受容体のＭＨＣクラスＩＩ及びＢ７表面分子をトランスフェクトした腫瘍細胞は腫瘍ワクチン接種のための実行可能なアプローチであろうことも分かった。驚くことに、対応細胞株からの腫瘍ライゼートをパルスしたＢ細胞を注射したＢ１６メラノーマ担持マウスはＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞が増加するために長い生存を示した。誘導したＴヘルパー細胞は充実性腫瘍に対してより強い細胞毒性応答を示したことも立証された。ＩｇＤに標的したミエローマ抗原はＴ細胞応答を誘発するので、特定腫瘍抗原にコンジュゲートしたＩｇＤ結合細菌タンパク質を用いる示唆されているアプローチは実行可能であろう。
【００１４】
体液及び細胞免疫応答をトリガーすべく抗原（例えば、微生物または特定腫瘍から誘導したペプチド）をＩｇＤ担持Ｂ細胞に標的するためには、ＩｇＤ結合タンパク質またはより短いＩｇＤ結合ペプチドが非常に有用なベクターであろう。同様のアプローチ手段を有する有効な戦略の例は幾つか存在する。抗−ＩｇＤモノクローナル抗体にコンジュゲートしたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するマウスの体液性免疫応答は、ＢＳＡを単独で投与したときに比較して１００倍強い。最近のＬｕｎｄｅらの文献（１５）には、ミエローマ誘導ペプチドを抗−ＩｇＤ  Ｆａｂ’断片の定常領域に取り込み、マウスに注入したとき問題の抗原に対する抗原提示は１，０００倍以上効率的であることが記載されている（１５）。また、コレラ毒素に融合した黄色ブドウ球菌タンパク質ＡのＩｇ結合断片はコレラ毒素に対する全身及び粘膜免疫応答を１０〜１００倍増加させる（１６）。最後に、実験的に十分に規定されたＢ１６メラノーマからなるマウス腫瘍モデルでは、エキソビボで腫瘍組織から誘導したペプチドをパルスした活性化Ｂリンパ球はインビボでより強い抗腫瘍応答を惹起し得、その結果生存を延長させ得る（１７）。
【発明の開示】
【００１５】
１つの態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中で検出され得、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片に関する。
【００１６】
別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体に関する。
【００１７】
更なる態様で、本発明は、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する上記免疫原性またはＩｇＤ結合断片に関する。
【００１８】
更なる態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得、赤血球及び上皮細胞に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片に関する。
【００１９】
更なる態様で、本発明は、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する上記免疫原性接着性断片に関する。
【００２０】
１つの態様で、本発明は、配列番号２に記載されており、上記のモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質をコードするＤＮＡ配列、または前記ＤＮＡ配列の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を含むＤＮＡセグメントに関する。
【００２１】
別の態様で、本発明は、上記免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。
【００２２】
更なる態様で、本発明は、配列番号１１に記載されており、上記免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。
【００２３】
更なる態様で、本発明は、上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。
【００２４】
更なる態様で、本発明は、配列番号９に記載されており、上記免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントに関する。
【００２５】
更なる態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片を含むワクチンに関する。
【００２６】
更なる態様で、本発明は、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を含むワクチン、好ましくは配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性またはＩｇＤ結合断片を含むワクチンに関する。
【００２７】
更に別の態様で、本発明は、上記モラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片を含むワクチン、好ましくは配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性接着性断片を含むワクチンに関する。
【００２８】
１つの好ましい実施態様では上記ワクチンは別のワクチンと組み合わされ、別の好ましい実施態様では上記ワクチンは別の分子の免疫原性部分と組み合わされる。
【００２９】
１つの態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージに関する。
【００３０】
別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージ、好ましくは配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージに関する。
【００３１】
更に別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージ、好ましくは配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージに関する。
【００３２】
更に別の態様で、本発明は、上記したプラスミドまたはファージの少なくとも１つを含み、前記タンパク質または変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記タンパク質の免疫原性接着性断片を産生し得る細菌、酵母及び植物から選択される非ヒト宿主に関する。１つの実施態様で、宿主は大腸菌である。
【００３３】
１つの態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００３４】
別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含む組換えＤＮＡ分子、好ましくは配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性またはＩｇＤ結合断片をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００３５】
更に別の態様で、本発明は、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体をコードするＤＮＡ配列を別の遺伝子に融合して含む組換えＤＮＡ分子、好ましくは配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性接着性断片をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。
【００３６】
更に別の態様で、本発明は上記融合ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはファージに関する。
【００３７】
更なる態様で、本発明は、上記プラスミドまたはファージの少なくとも１つを含み、細菌、酵母及び植物から選択される非ヒト宿主に関する。１つの実施態様で、宿主は大腸菌である。
【００３８】
１つの態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が上記した組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされている融合タンパク質またはポリペプチドに関する。
【００３９】
更なる態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、またはその天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が上記組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされている融合タンパク質またはポリペプチドに関する。
【００４０】
更に別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を上記組換えＤＮＡ分子を用いて別のタンパク質と組み合わされている融合タンパク質またはポリペプチドに関する。
【００４１】
更に別の態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合している融合産物に関する。
【００４２】
更なる態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合している融合産物に関する。
【００４３】
更に別の態様で、本発明は、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ赤血球及び上皮細胞に選択的に結合する能力を有する上記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合している融合産物に関する。好ましい融合産物では、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性またはＩｇＤ結合断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合している。好ましい融合産物では、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を有する免疫原性接着性断片が共有結合によるかまたは他の手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックスに結合している。
【００４４】
１つの態様で、本発明は、場合により標識されている及び／またはマトリックスに結合していてもよい、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを検出する方法に関する。
【００４５】
更なる態様で、本発明は、場合により標識されている及び／またはマトリックスに結合していてもよい、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを検出する方法に関する。
【００４６】
別の態様で、本発明は、場合により標識されている及び／またはマトリックスに結合していてもよい、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列及び膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを検出する方法に関する。
【００４７】
更なる態様で、本発明は、場合によりマトリックスに結合していてもよい、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片を用いてＩｇＤを分離する方法に関する。
【００４８】
更に別の態様で、本発明は、場合によりマトリックスに結合していてもよい、モラクセラ・カタラーリス中で検出され得且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを分離する方法に関する。
【００４９】
別の態様で、本発明は、場合により標識されているか及び／またはマトリックスに結合していてもよい、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体を用いてＩｇＤを分離する方法に関する。
【００５０】
１つの態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、前記タンパク質の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片の単離方法に関する。前記方法は、
ａ）任意にＥＤＴＡの存在下で双イオン性またはノニオン性界面活性剤を添加することによりモラクセラ・カタラーリスの懸濁液を抽出するステップ、
ｂ）ステップａ）からのモラクセラ・カタラーリスのＩｇＤ結合タンパク質を含む抽出物を吸着カラムにかけるステップ、
ｃ）ＩｇＤ結合タンパク質を溶離させるステップ、及び
ｄ）ＩｇＤ結合タンパク質を分離させるステップ
を含む。
【００５１】
別の実施態様で、ステップａ）における界面活性剤の濃度が０．１〜５％、好ましくは３％である。
【００５２】
更に別の態様で、本発明は、血液からＩｇＤを除去するために前記血液を上記表面露出タンパク質またはその上記断片を含む材料中に体外循環させることを含む自己免疫疾患の治療方法に関する。
【００５３】
１つの態様で、本発明は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列、２００ｋＤａの見かけ分子量且つ膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有するモラクセラ・カタラーリスの表面露出タンパク質、その天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体、または前記タンパク質または変異体の免疫原性またはＩｇＤ結合断片の免疫原性断片に特異的な精製抗体に関する。
【００５４】
別の態様で、本発明は、膜結合または可溶性ＩｇＤに選択的に結合する能力を有する上記免疫原性またはＩｇＤ結合断片、または前記断片の天然に存在するかまたは人工的に修飾した変異体に特異的である上記精製抗体に関する。
【００５５】
更に別の態様で、本発明は、上記免疫原性または接着性断片に対して特異的であり、赤血球及び上皮細胞に結合する能力を有する上記精製抗体に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
ＭＩＤは、既に十分に特性づけられているモラクセラ・カタラーリスの外膜タンパク質とは同一でない。ＭＩＤはＵｓｐＡまたはＣｏｐＢ外膜抗原に対するモノクローナル抗体により認識されない。ＭＩＤはまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて異なる移動パターンを有し、アミノ酸及びＤＮＡ配列分析により示すように異なる組成を有している。ＭＩＤは推定アミノ酸配列からのＭｗに相当する２００ｋＤａバンドとして現れるが、１，０００ｋＤａ以上の推定分子量を有するエキストラバンドとしても現れる。エキストラバンドは、天然ＭＩＤがＵｓｐＡと同様にオリゴマー複合体であることを示している（１１）。このことは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムからのボイド容量の直後にＭＩＤが最高８，０００ｋＤａの分画範囲で溶離されるという事実によっても更に裏付けられる。ＭＩＤのアミノ酸配列はモラクセラ・カタラーリス由来のＵＳＰＡ１及びＵＳＰＡ２外膜タンパク質とそれぞれ１１．１％、６．７％との同一性を示す（図７）。
【００５７】
最近の特許文献で、約２００ｋＤａの分子量を有するモラクセラ・カタラーリスの外膜タンパク質が単離された（１２）。約２００ｋＤａのタンパク質をコードする配列も提供された。しかしながら、前記タンパク質配列は本出願人が提示した配列とは同一でなく、ＭＩＤとの同一性は４５．９〜５４．４％でしかなかった（図７）。タンパク質が免疫原性であることは分かったが、更なる生物学的機能は明らかにされていない。更に、２００ｋＤａのタンパク質は赤血球凝集モラクセラ・カタラーリスに関連している（１３，１４）。
【実施例】
【００５８】
ヒトＩｇＤに対してアフィニテイーを有するモラクセラ・カタラーリスのＭＩＤと呼ばれる新規なＩｇＤ結合タンパク質、前記表面露出タンパク質の免疫原性またはＩｇＤ結合断片、及び前記表面露出タンパク質の免疫原性接着性断片の単離、精製、性質決定、クローニング及び発現について調べる。
【００５９】
（材料及び方法）
細菌及びプラスミド
モラクセラ・カタラーリス菌株Ｂｃ５は本発明者らの部門の鼻咽頭スワブ培養物からの臨床単離物である。血液、鼻咽喉及び痰から単離した１１８個の株をスウェーデン国、デンマーク国、フィンランド国、ハンガリー国、日本国及び米国から入手した。発現のために使用した配列決定した株及びプラスミドを表Ｉに示す。
【００６０】
【表１】
2005500837.tif 000003
【００６１】
細菌を栄養ブイヨン（英国ベーシングストーク−ハンプシャーに所在のＯｘｏｉｄ）において一晩増殖させ、収集し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）において遠心することにより洗浄した。
【００６２】
免疫グロブリン、血清及び他のタンパク質
Ｉｇ調製物のＩｇＧ１（κ）、ＩｇＧ１（λ）、ＩｇＧ２（κ）、ＩｇＧ２（λ）、ＩｇＧ３（κ）、ＩｇＧ３（λ）、ＩｇＧ４（κ）、ＩｇＧ４（λ）、ＩｇＡ１（κ）、ＩｇＡ１（λ）、ＩｇＡ２（κ）、ＩｇＡ２（λ）、ＩｇＭ（κ）、ＩｇＭ（λ）、ＩｇＤ（κ）、ＩｇＤ（λ）及びＩｇＥ（κ）はすべてヒト起源であり、英国バーミンガムに所在のＴｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅから購入した。ＩｇＤミエローマ血清ＩｇＤ（κ）及びＩｇＤ（λ）は同一会社から購入し、ＩｇＤ標準血清ＯＴＲＤ  ０２／０３はドイツ国マールブルクに所在のＢｏｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧから購入した。ミエローマ血清ＩｇＤ（λ）Ａ、ＩｇＤ（λ）Ｂ、ＩｇＧ  Ａ、ＩｇＧ  Ｂ、ＩｇＧ  Ｃ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  Ａ及びＩｇＡ  Ｂはスウェーデン国マルメに所在のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙから入手した。各免疫グロブリンの濃度は製造業者に従った。
【００６３】
抗体
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗−ヒトＩｇＤはカリフォルニア州カマリロに所在のＢｉｏｓｏｕｒｃｅから入手した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合マウス抗−ヒトＩｇＤ、非標識家兎抗−ヒトＩｇＤ及びＨＲＰ標識家兎抗−マウスＩｇはデンマーク国ゲントフテに所在のＤａｋｏｐａｔｔｓから購入した。ヤギ抗−ヒトＩｇＤ及びＨＲＰ結合家兎抗−ヒト多価免疫グロブリンはミズーリ州セントルイトに所在のＳｉｇｍａから入手した。フィコエリトリン（ＲＰＥ）結合マウス抗−ヒトＣＤ３及びＣＤ１９はカリフォルニア州サンノゼに所在のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手した。マウスモノクローナル抗体１７Ｃ７（ＵｓｐＡ）及び１０Ｆ３（ＣｏｐＢ）はテキサス州ダラスに所在のテキサス大学の微生物部門のＥｒｉｃ  Ｊ．Ｈａｎｓｅｎ博士から好意により提供された。
【００６４】
抗血清
フロイント完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ，ドイツ国ハイデルベルクに所在のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に乳化させた２００μｇの精製ＭＩＤ（Ｆｏｒｓｇｒｅｎら，２００１）、組換えＭＩＤ断片または組換えＵｓｐＡ１を家兎に筋肉注射して免疫化した後１８日目と３６日目にフロイント不完全アジュバンド中の同一用量のタンパク質を用いて追加免疫した。２〜３週後に採血した。ウェスタンブロット検査から、抗−ＵｓｐＡ１ポリクローナル抗体は組換えＵｓｐＡ１及びＵｓｐＡ２の両方と反応した。
【００６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び膜でのタンパク質の検出（ウェスタンブロット）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１０％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、ランニング（ＭＥＳ）、サンプル（ＬＤＳ）及び移動緩衝液からなる市販の電気泳動システムを用い、ブロッティング装置（カリフォルニア州サンジェゴに所在のＮｏｖｅｘ）を用いて実施した。簡単に説明すると、サンプルを１０分間煮沸した後、室温においてタンパク質ＩＩ垂直スラブ電気泳動セル（Ｎｏｖｅｘ）を用いて１５０定電圧下で電気泳動した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（スウェーデン国スンドビーベリーに所在のＢｉｏ−Ｒａｄ）で染色した。更に、タンパク質バンドのゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）への電気泳動移動を３０Ｖで２〜３時間実施した。移動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜を５％  粉ミルク含有０．０５％  ツイーン２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−ツイーン）でブロックした。ＰＢＳ−ツイーンで数回洗浄した後、膜を室温において２％  粉ミルク含有ＰＢＳ−ツイーン中で精製ＩｇＤミエローマタンパク質（０．５μｇ／ｍｌ，ｈｕ  ＩｇＤ（κ）ミエローマ；英国バーミングガムに所在のＴｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）とインキュベートした。ＰＢＳ−ツイーンで数回洗浄後同一緩衝液で１／１０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＤを添加した。幾つかの実験では、ＩｇＤミエローマタンパク質の代わりに他の免疫グロブリンクラスのミエローマタンパク質を用い、第２層としてＨＲＰ標識抗−ヒト多価免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）を用いた。モラクセラ外膜タンパク質ＵｓｐＡ１、２及びＣｏｐ  Ｂを検出するためにそれぞれマウスｍＡｂ  １７Ｃ７及び１０Ｆ３を用いた（７，８）。これらの実験では、第２層としてＨＲＰ標識家兎抗−マウス免疫グロブリンを用いた。室温で４０分間インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーンを用いて更に数回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（スウェーデン国ウプサラに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて展開した。ウェスタンブロットをＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。
【００６６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡを用いて免疫グロブリンＤ−結合タンパク質を定量した。０．１Ｍ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）で５倍数希釈したモラクセラ・カタラーリス抽出物を１００μｌ容量で微量滴定プレート（Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｂ，デンマーク国ロスキレに所在のＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ｍｏｄｕｌｅ）に添加した。このプレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ−ツイーンで４回洗浄した後、ブロッキング緩衝液として１．５％オボアルブミン含有ＰＢＳ−ツイーンを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、更にＰＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。各ウェルに１．５％オボアルブミン含有ＰＢＳ−ツイーン１００μｌ中に０．０５μｇのＩｇＤ（κ）ミエローマタンパク質を添加し、室温で１時間インキュベートした後プレートをＰＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。同一緩衝液で１／１０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＤと１時間インキュベートし、その後ＰＢＳ−ツイーンで洗浄した後、過酸化水素（最終濃度０．００２％）と混合した０．１Ｍ  クエン酸カリウム溶液（ｐＨ４．２５）中テトラメチルベンジジン（２０ｍＭ）を添加した。３０分後、２Ｍ  硫酸を添加して酵素反応を停止した。次いで、光学密度（ＯＤ）を自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｐｌｕｓ，フィンランド国に所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
【００６７】
ドットブロットアッセイ
０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中の精製ＭＩＤ（０．０００５〜０．２μｇ）を１００μｌの容量でドットブロット装置（ドイツ国デセルに所在のＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いてニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に手で加えた。飽和後、膜を室温において１％  オボアルブミン及び５％  粉ミルク含有ＰＢＳ−ツイーン中で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。ＰＢＳ−ツイーン（１００μｌ）中のヒトミエローマタンパク質（０．５μｇ）を添加し、２時間インキュベートし、ＰＢＳ−ツイーンで数回洗浄した後、１／２００希釈したＨＲＰ標識抗−ヒト軽鎖（κ及びλ）（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）を第２抗体として使用した。ウェスタンブロットについて上記したように展開した。別の実験では、まず０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中のヒトミオローマ血清の希釈物を１００μｌの容量で膜に適用した。飽和後、インキュベーションステップ、ブロッキングステップ及び洗浄ステップを上記したように実施した。その後、ＰＢＳ−ツイーン中の［１２５Ｉ］標識タンパク質ＭＩＤプローブ（５〜１０×１０５ｃｐｍ／ｍｌ）を添加した。一晩インキュベートした後、膜をＰＢＳ−ツイーンで４回洗浄し、風乾し、−７０℃においてコダックＸ−Ｏｍａｔレギュラー増感スクリーン（ニューヨーク州ロチェスターに所在のＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）を用いてコダックＣＥＡ．Ｃ  Ｘ線フィルムに露出させた。
【００６８】
ＩｇＤ結合タンパク質の抽出
モラクセラ・カタラーリス（１〜５×１０１１コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）を０．１〜５％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）含有０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）に懸濁させた。幾つかの実験では、Ｅｍｐｉｇｅｎの代わりにＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｎ−オクチル−ｐ−Ｄ−グルコシド（スイス国ブーベンドルフに所在のＢａｃｈｅｍ）またはトリトン  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）を用いた。いずれの界面活性剤も０．１〜５％で場合により０．０１Ｍ  ＥＤＴＡと共に試験した。細菌懸濁液を３７℃において２時間磁気撹拌して混合した。４℃において８０００×ｇで２０分間遠心後、上清を滅菌フィルター（０．４５μｍ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＳｔｅｒｉｖｅｘ−ＨＶ）を用いて濾過した。
【００６９】
ＩｇＤ結合タンパク質の精製
３％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）中のモラクセラ・カタラーリス抽出物を、０．１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）含有０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で平衡化したＱ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に適用した。カラムを同一緩衝液中０→１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配を用いて溶離させた。ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットで検出して多くのＩｇＤ結合活性を示すフラクションをプールし、Ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｒ膜チューブ（分子量カットオフ２５，０００；カリフォルニア州ラグーナヒルズに所在のＳｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）に対して透析し、ＹＭ１００ディスク膜（分子量カットオフ１００，０００；マサチューセッツ州ビバリーに所在のＡｍｉｃｏｎ）上で濃縮した後ゲルクロマトグラフィーにかけた。ＩｇＤ結合タンパク質のゲル濾過を、０．１％  Ｅｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）含有０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙ  Ｓ−４００高解像カラム（２０×９００ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実施した。最高のＩｇＤ結合活性を含むフラクションを上記したように濃縮し、再度クロマトグラフィーにかけた。
【００７０】
ペプチド開裂及びアミノ酸配列分析
０．１％  Ｅｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）含有０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中の精製ＭＩＤを３７℃において１：１０の酵素／タンパク質比でトリプシンまたはキモトリプシンで一晩処理した。開裂混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に移したペプチドバンドを自動的に配列決定したり、上記したウェスタンブロット分析にかけた。タンパク質のＮ末端配列を得るために、無傷のＭＩＤを存在し得るピログルタメート基から脱ブロックするように試みた。２つの異なるプロトコルを使用して可溶性タンパク質及び膜結合タンパク質の両方を脱ブロックした。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）４７０Ａ気液固相シーケンサーを用いて自動化アミノ酸配列分析を実施し、遊離したアミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル１２０Ａ  ＰＴＨアナライザを用いてオンライン検出した。
【００７１】
タンパク質ＭＩＤの標識
精製ＭＩＤをラクトペルオキシダーゼを用いて高比活性まで放射性ヨウ素化した（［１２５Ｉ］；英国バッキンガムシャーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ）。調製物はタンパク質１モルあたり約０．０５モルのヨウ素を含んでいた。標準プロトコルを用いて精製ＭＩＤにＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍ）をコンジュゲートさせた。簡単に説明すると、０．１Ｍ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中のＭＩＤ（２ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＳＯ中で可溶化した０．１５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣとインキュベートした。室温で４５分間一定撹拌した後、サンプルを希釈し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で予め平衡したｐＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にかけた。生じたＭＩＤ−ＦＩＴＣを結合研究のために使用した。
【００７２】
ＤＮＡ単離及び配列決定
ゲノムＤＮＡを表Ｉに示す５つのモラクセラ・カタラーリス株からゲノムＤＮＡ作成キット（ドイツ国ヒルデンに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて抽出した後、ＰＣＲによるＭＩＤ遺伝子の増幅のための鋳型として使用した。４つのペプチド断片のアミノ末端配列に従って縮重プライマーを合成した（表ＩＩ）。
【００７３】
【表２】
2005500837.tif 000004
【００７４】
幾つかのＰＣＲ反応（高適合度ＰＣＲシステム；スウェーデン国ブロンマに所在のＲｏｃｈｅ）では、特定プライマーを上記した縮重プライマーと一緒に使用した。ペプチド断片の起源である遺伝子の中心領域に隣接するＤＮＡ配列を逆ＰＣＲ（ＩＰＣＴ）を用いて単離した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを以下の制限酵素を別々に用いて開裂した。スタートコドンを単離するためにＥｃｏＲＶ、ＳｐｈＩ及びＰｓｔＩ、ストップコドン配列を単離するためにＡｃｃＩ、ＡｓｕＩ、最後にＨｉｎｃＩＩ。生じた断片をそれ自体に再結紮し（Ｒｏｃｈｅの迅速ＤＮＡ結紮キット）、ＤＮＡをＩＰＣＲに用いた。遺伝子のスタート及びストップコドン領域を増幅させるために、特定プライマーを設計し、長鋳型ＰＣＲ（ＬＴＰＣＲ）（Ｒｏｃｈｅの拡張長鋳型ＰＣＲシステム）で使用した。すべてのＰＣＲ産物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−Ａｍｐ（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（英国ウォリントンに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて再度配列決定した。ゲノムＤＮＡを増幅させるためのプライマーをオリゴプライマー分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏ）を用いて設計した。シグナルペプチドを、生物学的配列分析のためのシグナルＰ  Ｖ１．１ワールドワイドウェブ予測サーバーセンター(SignalP V1.1 World Wide Web Prediction Server Center for Biological Sequence Analysis)（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を用いて推定した。
【００７５】
ｍｉｄ遺伝子のＰＣＲ増幅
ｍｉｄ遺伝子の完全６．４ｋｂオープンリーディングフレームを鋳型としてモラクセラ・カタラーリスＢｃ５株ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅させた。ＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーは５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇｃｃｇｔｇｇｃｇｇａａｔａｔｇｃｃ−３’（プライマーＡ，配列番号３）及び５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇａａａａｇｔｇａａａａｃｃｔｇｃａｃｃａａｃｔｇｃｔｇｃ−３’（プライマーＢ，配列番号４）であり、６３９１塩基対のＰＣＲ産物を得た。ＢａｍＨＩ消化インサートをｐＥＴ１６（ｂ）に結紮し、生じたプラスミドｐＥＴ１６−ＭＩＤをＤＨ５αに形質転換した。クローン化ＰＣＲ産物の両方の鎖を配列決定した。
【００７６】
他のモラクセラ・カタラーリス株中の完全長ｍｉｄ遺伝子を試験するために、プライマーＡ及びＢを用いた。更に、シグナルペプチドをコードする配列を狭めるために使用したプライマーはプライマーＡまたは５’−ｔｇｔｃａｇｃａｔｇｔａｔｃａｔｔｔｔｔｔｔａａｇｇｔａａａｃｃａｃｃａｔｇ−３’（プライマーＣ；上部スタートコドンを検出する，配列番号５）を５’−ｃａｔｃａａｔｔｇｃｇａｔａｔｇｔｃｔｇｇｇａｔｃｔｔｇ−３’（プライマーＤ；シグナルペプチドの丁度外側の保存領域に位置する，配列番号６）であり、それぞれ１９２塩基対及び２６６塩基対の長さのＰＣＲ産物（鋳型としてＢｃ５ゲノムＤＮＡを用いる）を得た。更に、ｍｉｄ遺伝子の存在を確認するために、プライマーＡまたはＣを５’−ｃｔｔｃａｃｃｃｃａｔｃａｇｔｇｃｃａｔａｇａｃｃ−３’（プライマーＥ，配列番号７）を用い、それぞれ１３５５塩基対及び１４２９塩基対の長さの断片を得た。すべての反応で延長長鋳型ＰＣＲシステムを用い、条件は製造業者（スウェーデン国ブロンマに所在のＲｏｃｈｅ）が推奨する通りであった。
【００７７】
大腸菌におけるｍｉｄ遺伝子産物の発現及び細胞フラクション
ｍｉｄ遺伝子産物を発現させるために、ｐＥＴ１６−ＭＩＤをｌａｃＵＶ５コントロール下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む発現宿主ＢＬ２１ＤＥ３に形質転換した。２％グルコース及びアンピシリンを補充したＬＢ培地において組換え細菌を増殖させた。０．６のＯＤ６００で対数成長相まで細胞を増殖させた後１ｍＭ  ＩＰＩＧを添加することにより過剰発現させた。４時間の誘導後、細菌を標準プロトコルに従って音波処理し、生じたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００７８】
ｐＥＴ１６−ＭＩＤ由来の組換えタンパク質の局在化を公知の浸透圧ショックにより実施した。簡単に説明すると、誘導細胞及び非誘導細胞のブロス培養物を収集し、２０％スクロース含有３０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に再懸濁した。１ｍＭの最終濃度となるようにＥＤＴＡを添加し、溶液を室温においてゆっくり１０分間撹拌した。４℃において１０，０００ｇで１０分間遠心した後、細胞を氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁し、氷上で１０分間撹拌した。このステップ中にペリプラズムタンパク質が緩衝液中に遊離した。ペリプラズムフラクションを含む上清を遠心により回収した。細菌を１００ｍｇ／ｍｌの最終濃度でリゾチームにより完全に溶解させた後音波処理した。最後に、可溶性細胞質フラクション及び不溶性膜フラクションを回収した。
【００７９】
切端ＭＩＤ誘導組換えタンパク質
タンパク質を作製させるための異なるサイズ及びプライマーを有する各種切端部ＭＩＤ断片（Ａ〜Ｉと称される）を図１０に示す。（ｐＥＴ２６−ＭＩＤ中の）モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｆｏｒｓｇｅｎｅら，２００１）を鋳型として使用した。ＭＩＤ３６７−５９０（Ｃ）を除くすべてのＭＩＤ構築物を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を導入する特定プライマーを用いてＰＣＲにより増殖した。断片Ｃ中の内部ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位のために、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩの代わりにＸｈｏＩを用いた。ＭＩＤ１６１６−２１３９（Ｉ）を除くすべてのＰＣＲ産物をｐＥＴ２６（ウィスコンシン州マディソンに所在のＮｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。断片ＩをコードするＰＣＲ産物をｐＭＡＬ−ｃ２（マサチューセッツ州ビバリーに所在のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）にクローン化した。推定毒性を避けるために、生じたプラスミドをまず非発現宿主の大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。その後、断片Ａ〜Ｄ、Ｇ及びＨをコードするプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳは断片Ｅ及びＦを含むベクターのために使用した。いずれの大腸菌菌株もカナマイシンの存在下でインキュベートしたのに対して、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳ形質転換体を使用したときにはクロラムフェニコールをも補充した。断片ＩはＤＨαにおいて発現させた。細菌を中間ｌｏｇ相まで増殖させた後１ｍＭ  イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を導入した。３．５時間後、形質転換体を音波処理し、過剰発現タンパク質を製造業者の指示に従って精製した。ヒスチジンタグを有するかまたはマルトース結合タンパク質に融合させた、得られた組換えタンパク質をそれぞれニッケルまたはアミロースを含有する樹脂を用いて精製した。溶離タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。その後、組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより分析した。
【００８０】
赤血球凝集
ヒト赤血球を採血したばかりのヘパリン処理ヒト血液から得た。赤血球をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、最終濃度が１％となるようにＰＢＳ中に懸濁させた。栄養ブイヨクにおいて培養した細菌を遠心により収集し、洗浄し、１〜２×１０９／ｍｌまでＰＢＳ中に懸濁させた。細菌及び赤血球懸濁液（それぞれ５０μｌ）を丸底微量滴定プレート（ノースカロライナ州ニュートンに所在のＳａｒｓｔｅｄｔ）において混合した。幾つかの実験では、赤血球をＰＢＳ（１５０μｌ）中でＭＩＤ−セファロースまたはＢＳＡ−セファロースと混合した。凝集を肉眼で観察した。
【００８１】
細胞株及び接着アッセイ
肺癌細胞株Ａ５４９（ＩＩ型肺胞上皮細胞；ＣＣＬ−１８５）はＡＴＣＣから入手した。細胞を、１０％  ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１２μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（英国スコットランドのペーズリーに所在のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（“培地”と呼ぶ）において培養した。接着実験の前日に、細胞を収集し、ゲンタマイシン非含有ＲＰＭＩ  １６４０で２回洗浄し、ゲンタマイシン非含有培地（２．０ｍｌ）中に１×１０４細胞／ウェルの濃度で１２ウェル組織培養プレート（デンマーク国ロスキレに所在のＮｕｎｃ）に添加した。その後、細胞を３７℃、５％  ＣＯ２において一晩インキュベートした。実験日に、０．１５％  ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）含有ＰＢＳ中のモラクセラ・カタラーリス（約２×１０８）を単層上に接種した。特定抗血清を用いる中和実験では、細菌を予めポリクローナル抗体（１／２５０希釈）とインキュベートした。４℃において１時間後、細菌を上皮細胞に添加した。すべての実験で、組織培養プレートを３，０００ｇで５分間遠心し、３７℃、５％  ＣＯ２においてインキュベートした。３０分後、感染させた単層をゆっくり振盪させながら０．１５％  ゼラチン含有ＰＢＳで２回洗浄して非接着細菌を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％  トリプシン，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で処理して単層をプラスチック支持体から遊離させた。その後、生じた細胞／細菌懸濁液を１．１％  イソビタレックス、７．８％  ヒト血液及び０．９％  プロテオースペプトンを含有する寒天プレートに接種した。２つの培地からデータを計算した。
【００８２】
フローサイトメトリー分析
健康なドナーから採取したヘパリン処理血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，スウェーデン国ウプサラに所在のＰｈａｒｍａｃｉａ）の段階勾配で遠心することによりヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。フローサイトメトリー分析のために、一般的な染色プロトコルをＰＢＳ緩衝液中０．５％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）と一緒に用いた。ＰＢＬ（１００μｌ中２．５×１０５）を製造業者の指示に従って抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ１９  ｍＡｂを場合によりＦＩＴＣ結合抗−ＩｇＤ  ｍＡｂと併用して氷上で３０分間標識した。ブロッキング実験では、リンパ球を予め抗−ＩｇＤ免疫グロブリンと３０分間インキュベートした。２回洗浄後、１０μｇ／ｍｌの精製ＦＩＴＣ結合ＭＩＤを細胞に補充し、氷上で４５分間インキュベートした。過剰の０．５％  ＢＳＡ含有ＰＢＳで４回洗浄後、各サンプルにつき１０５細胞をＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬフローサイトメトリー（フロリダ州ハイアリーアに所在のＣｏｕｌｅｔｅｒ）で分析した。適当ならば、家兎及びヤギ前免疫血清並びにマウスＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）をネガティブコントロールとして含めた。
【００８３】
（結果）
ＭＩＤの抽出及び精製
ＭＩＤの可溶化は精製プロセスにおける大きな障害であった。ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットで推定して、試験した数種の界面活性剤の中で３％の最終濃度のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）及びｎ−オクチル−ｂ−Ｄ−グルコシドのみがモラクセラ・カタラーリス懸濁液からＭＩＤを効率的に可溶化した。２つの界面活性剤は同等に有効であった。トリトンＸ−１００のみではＭＩＤを可溶化しなかったが、トリトンＸ−１００と０．０１Ｍ  ＥＤＴＡはＭＩＤを効率的に可溶化した。ＣＨＡＰＳ単独、ＣＨＡＰＳとＥＤＴＡの組合せまたはＥＤＴＡのみではＭＩＤを可溶化しなかった。以下の実験では、ＭＩＤの可溶化及びその後の精製のためにＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）抽出を使用した。モラクセラ・カタラーリスのＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）抽出物をＱ−セファロースカラムに適用したとき、すべてのＩｇＤ結合物質が０．０５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中０．１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）でカラムから溶離した。同一カラムに対して１ＭまでのＮａＣｌ勾配を適用してもＩｇＤ結合物質を更に溶離させることはできなかった。Ｑ−セファロースでの分離後得られたＩｇＤ結合物質を濃縮した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムを用いて０．１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）の存在下でゲル濾過すると抽出物が分画化した（図１）。殆どのＩｇＤ結合物質がボイド容量直後の第１ピーク中に溶離された。同一条件下で第１ピークを再クロマトグラフィーにかけることによりＭＩＤを更に精製した。
【００８４】
図２は、精製後ＭＩＤが２つのバンドとして現れたことを示している。第１は２００ｋＤＡのバンドであり、第２は１，０００ｋＤａ以上の見かけ分子量を有していた。ＭＩＤが従来公知の見かけ分子量が３５０〜７２０ｋＤの外膜タンパク質ＵｓｐＡ１及び２（８−１０）または８０ｋＤａの分子量を有するＣｏｐＢと同一でないことを確認するためにウェスタンブロット実験を実施した。モラクセラ・カタラーリスの粗なＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）抽出物またはＭＩＤの部分精製調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎフィルターに移し、モラクセラタンパク質に対する抗体及びヒトＩｇＤを用いてブロットした。図２に示すように、ＭＩＤ（ＩｇＤ結合により示されるように）は外膜タンパク質ＵｓｐＡ及びＣｏｐＢと同一ではない。
【００８５】
精製ＭＩＤのアミノ末端アミノ酸配列を調べるために３つの試みを実施した。それぞれ約１０００ピコモルのＭＩＤを自動アミノ酸シーケンサーに適用した。アミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体が得られない限り、好ましくはシグナルＭＩＤポリペプチド鎖のアミノ末端をブロックした。最近、エドマン分解に対する耐性をも有するモラクセラＵｓｐＡ１及び２がピログルタミル残基を含んでおり、これらの残基はピログルタメートアミノペプチダーゼで処理することにより除去されたことが判明した。しかしながら、モラクセラ・カタラーリスから精製したＭＩＤまたは組換えＭＩＤを２つの異なるプロトコル（各方法につき２回）に従ってこの酵素で処理し、エドマン分解にかけたときには、Ｎ末端アミノ酸配列は得られなかった。
【００８６】
ＭＩＤのＩｇＤ結合性
モラクセラ・カタラーリスの粗なＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）抽出物及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、フィルターに移した高精製ＭＩＤをすべてのヒトＩｇクラス及びサブクラスの十分に精製した市販Ｉｇ調製物に接触させた（表ＩＩＩ）。
【００８７】
【表３】
2005500837.tif 000005
【００８８】
２つのＩｇＤ調製物のみが図２にＩｇＤについて示したと同様に２００ｋＤａ位置でＭＩＤバンドと相互作用した。ドットブロット実験を実施し、異なる希釈度の精製ＭＩＤを膜に添加し、その後精製ヒトミエローマタンパク質及び第２抗体を適用したとき、２つのＩｇＤミエローマのみがＭＩＤと相互作用した。２つのミエローマの１つが膜上でＭＩＤの０．００１μｇほどの微量で検出された。更に、ＭＩＤとＩｇＤの相互作用の特異性を他のドットブロット実験で放射性標識ＭＩＤを用いて確認した。図３では、ＭＩＤが４つのＩｇＤミエローマ血清に効果的に結合することが示されている。０．０３〜４μｇのＩｇＤで明らかな反応が検出され得た。ＩｇＤ標準血清（Ｂ．Ｗ．）の場合、かなりの低濃度でも反応性が見られた（示さず）。対照的に、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭの６種のＩｇミエローマ血清は４μｇでもＭＩＤと目に見える反応を示さなかった。
【００８９】
ドット及びウェスタンブロットで明らかなように精製ＭＩＤはヒト可溶性ＩｇＤを特異的に誘引した（図２及び３、表ＩＩＩ）。ＭＩＤが表面発現Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）ＩｇＤに結合するかを調べるために、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離した。ＦＩＴＣをＭＩＤにコンジュゲートした後氷上でＰＢＬと４５分間インキュベートした。ＰＢＬをＴ細胞マーカーＣＤ３またはＢ細胞特異的表面抗原ＣＤ１９に対するＲＰＥ結合ｍＡｂで標識し、その後フローサイトメトリーにより分析した（図４）。驚くことに、大部分のＣＤ１９＋リンパ球は大量のＭＩＤ−ＦＩＴＣに結合した（図４Ａ）のに対して、Ｔ細胞（ＣＤ３＋リンパ球）は非特異的バックグラウンド結合しか示さなかった（図４Ｄ）。ＭＩＤ−ＦＩＴＣシグナルはＩｇＤ−ポジティブＢ細胞を示す抗−ＩｇＤ  ｍＡｂとインキュベートしたＣＤ１９＋細胞とうまく対応していた（図４Ｂ）。ＩｇＤ担持ＣＤ１９＋リンパ球に対するＭＩＤ−ＦＩＴＣ結合の特異性を更に解明するために、ＰＢＬを家兎抗−ヒトＩｇＤ免疫グロブリンフラクションと前沈殿させた。インキュベートし、洗浄した後、ＭＩＤ−ＦＩＴＣ結合を標準プロトコルに従ってフローサイトメトリーにより分析した。前免疫した血清とインキュベートした細胞と比較して、前記抗血清はＩｇＤ  ＢＣＲへの特異的ＭＩＤ−ＦＩＴＣ結合をほぼ完全に抑制した。平均蛍光強度は７９．２任意単位から１４．６任意単位に低下した。ＩｇＤに対するヤギ免疫グロブリンでも同様の結果が得られた（データ示さず）。よって、ＩｇＤ−発現Ｂ細胞は表面発現ＢＣＲ  ＩｇＤに対する特異的ＭＩＤ−ＦＩＴＣ結合を促進した。
【００９０】
ＭＩＤをコードする遺伝子のクローニング及びＤＮＡ配列分析
ＭＩＤを起源とする４つのペプチド断片の得られたアミノ末端配列（表ＩＩ）に従って縮重プライマーを設計し、可能性あるすべての組合せでＰＣＲにおいて使用した。縮重プライマー対２６２９＋／３６９３−で作成した特徴的なＰＣＲ産物の推定配列を用いて特定プライマー２９８２＋及び３６９２−（図５）を合成した。特定プライマーと縮重プライマー（７１８＋及び５７７２−）を併用したＰＣＲ反応により、全部でＭＩＤをコードする遺伝子の５０５４ｂｐが生じた。ｍｉｄ遺伝子のコアを取り巻く隣接配列を逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）により得た。ＥｃｏＲＶ−及びＡｓｕＩ／ＡｃｃＩ−消化モラクセラ・カタラーリスゲノムＤＮＡをそれぞれプライマー対２９８２＋／９４５−及び３６６８＋／１２０−を用いてＩＰＣＲすると、スタートコドン領域の配列が得られた。更に、ＨｉｎｃＩＩ消化モラクセラゲノムＤＮＡをプライマー対５８９８＋／５５１１−を用いてＩＰＣＲすると、ストップコドンを含む３’配列が得られた。モラクセラ・カタラーリスＢｃ５中のＭＩＤをコードする遺伝子の完全ヌクレオチド配列を配列番号２に示し、生じたアミノ酸配列を配列番号１に示す。２つの選択的オープンリーディングフレームが明らかとなり、アミノ酸Ｎｏ．１及び１７に示す（図６参照）。その結果、ｍｉｄ遺伝子産物の長さは２１２３または２１３９アミノ酸であった。推定リボソーム結合部位（ＡＡＡＧ）、−１０（ＴＡＡＴＴＡ）及び−３５（ＴＴＧＡＡＴ）に加えて、コンセンサス配列ボックスを同定した。更に、ＴＡＡストップコドン下流の６２塩基に転写停止のために必要なステム−ループ形成の可能性がある逆方向反復配列が見られた。異なるｍｉｄ遺伝子間の類似性及び同一性を調べるために、５つのＯＲＦ  ＭＩＤタンパク質の配列を分析した。４つの株で、同一性及び類似性はそれぞれ≧７５．８％及び≧７８．３％であった（図７）。対照的に、第５単離物（ＲＨ４）では、僅かに低い値≧６５．３％及び≧７１．２％が得られた。ＵｓｐＡ１との同一性及び類似性はそれぞれ５．５〜１１．１％及び８．３〜１７．９％であり、ＵｓｐＡ２との同一性及び類似性はそれぞれ６．５〜７．５％及び１１．１〜１２．４％であった。
【００９１】
ｍｉｄ遺伝子はすべてのモラクセラ・カタラーリス株中で検出され得る
ＰＣＲ分析により、１１８個のモラクセラ・カタラーリス株中でｍｉｄ−１遺伝子が検出されたのに対して、モラクセラ（ｎｅｓｃｅｒｉａ）関連コントロールはネガティブであった。加えて、ｍｉｄ−１遺伝子のサイズをスタートコドン及びストップコドンを含めた遺伝子全体に及ぶプライマーを用いて確認した。
【００９２】
ＭＩＤの推定アミノ酸配列の分析はＵｓｐＡ１、ＵｓｐＡ２及び米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質と異なる
オープンリーディングフレームは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判明した約２００ｋＤａの実験値に容易に対応する丁度２２０ｋＤａ以下の分子量計算値を有するタンパク質を規定した。Ｎ末端アミノ酸配列は、アミノ酸６６と６７の間に潜在的な開裂部位を有するシグナルペプチドの典型的な特徴を示した。シグナルペプチダーゼ開裂部位の後の第１アミノ酸が恐らくグルタミン残基であるにも関わらず、エドマン分解により配列は決定できなかった。更に、ピログルタメートアミノペプチダーゼ処理後アミノ酸配列は得られなかった。推定されるアミノ酸配列もＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法による疎水性プロフィール分析にかけたところ、強疎水性である推定シグナルペプチドを除いて主に親水性を示した。ＭＩＤの推定アミノ酸配列は米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質ともＵｓｐＡ−タンパク質のアミノ酸配列とも有意に異なっている（図７及び８）。
【００９３】
ｍｉｄ遺伝子はすべてのモラクセラ・カタラーリス株に分布している。ｍｉｄ遺伝子がすべてのモラクセラ・カタラーリス株中に存在しているか否かを調べるために、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流の保存領域及びストップコドン配列を含めた下流の保存領域（Ｆｏｒｓｇｒｅｎら，２００１）に基づいてプライマーを選択した。ｍｉｄ遺伝子は８６臨床単離物のすべてにおいて検出され、７タイプの株を分析したところ、ゲノムｍｉｄ  ＤＮＡの長さは約６，０００塩基対であった。遺伝子の３’末端から選択した配列を含むプローブを用いるサザンブロットにより、その存在が更に確認された。サザンブロット実験は、モラクセラ株は１つのｍｉｄ遺伝子のみを含んでいることを示した。
【００９４】
大腸菌における組換えＭＩＤの発現
クローン化ｍｉｄ遺伝子が精製ＩｇＤ結合タンパク質に相当することを確認するために、予想シグナル配列及びスタートコドンを含む遺伝子を発現ベクターｐＥＴ１６（ｂ）にＴ７プロモーターのコントロール下でサブクローン化した。その後、生じたｐＥＴ１６−ＭＩＤを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３に形質転換し、ＩＰＴＧを用いて誘導した。細菌細胞を溶解し、細分画化し、組換えＭＩＤをプローブとしてヒトＩｇＤを用いるウェスタンブロットにより局在化させた。ＭＩＤの重要な特徴は発現実験から明らかとなった（図９）。第１に、誘導後ＰＥＴ１６−ＭＩＤを含む細胞は組換えＭＩＤを産生することができ、遺伝子の正しいリーディングフレームを確認した。第２に、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示すように）組換えＭＩＤは約２００ｋＤＡの分子量を示し、これはアミノ酸配列から計算した２１７ｋＤａという値に対応していた。第３に、ＩｇＤ結合表現型がウェスタンブロット分析により確認されたので、組換えタンパク質は実際大腸菌におけるｍｉｄ遺伝子産物であった。インサートなしの誘導ｐＥＴ１６（ｂ）ベクターを含む大腸菌からの総タンパク質はＩｇＤ結合能力を示さなかった（データ示さず）。第４に、組換えタンパク質の細胞下局在化は、ＭＩＤが細胞質及び膜フラクション中に均等に見られるがペリプラズモスペースには見られなかったことを示した。膜フラクションにおけるＭＩＤの局在化はモラクセラ・カタラーリスにおける公知の外膜局在化に非常にうまく相関していた。
【００９５】
ＩｇＤ結合はＭＩＤの２３８アミノ酸中に保存される
ＭＩＤ  ＩｇＤ結合領域を詳細に調べるために、完全長ＭＩＤから誘導した９個の配列をｐＥＴ２６ｂ（＋）にクローン化し、大腸菌において発現させた。組換えタンパク質は全ＭＩＤ配列をカバーしており、それぞれの長さ及び位置は図１０に示した通りであった。ＭＩＤのアミノ酸残基６９−１１１１または１０１１−２１３９を含む組換えタンパク質はウェスタン及びドットブロットで明らかなようにＩｇＤに結合しなかった。対照的に、タンパク質ＭＩＤ９０２−１２００（タンパク質断片Ｆ１）はＩｇＤを誘引し、このことからＭＩＤの１つのＩｇＤ結合領域が特定配列内にあったことが強く示唆された。
【００９６】
ＩｇＤ結合に関与する配列を正確に特定するために、切端ＭＩＤ９０２−１２００をＮ末端及びＣ末端で対称的に短くした（図１１）。等モル濃度の各種組換えタンパク質をモラクセラ・カタラーリスから単離した天然の完全長ＭＩＤ１−２１３９と比較した。各種組換えタンパク質を４倍数希釈し、膜に添加し、ヒトＩｇＤとインキュベートした。モル基準で、本質的に保存されるＩｇＤ結合能力がアミノ酸残基９６２〜１２００の切端ＭＩＤタンパク質で検出された。ＩｇＤと相互作用する最短の切端タンパク質はＭＩＤ９８５とＭＩＤ１１４２の間に局在化していた（断片Ｆ６）。Ｎ末端をＭＩＤ１０００残基に短縮したとき（断片Ｆ４）、Ｃ末端をＭＩＤ１１３０に短縮したとき（断片Ｆ７）にはＩｇＤ結合能力はなくなった。最後に、（ＭＩＤ９８５−１２００；Ｆ３と比較して）より長いＮ末端及びより短いＣ末端を有する断片（ＭＩＤ９０２−１１３０；Ｆ８）も製造し、分析した。しかしながら、この切端ＭＩＤはＩｇＤと相互作用せず、結合能力はより長いＣ末端に依存することが示唆された。
【００９７】
特異的ＭＩＤ依存性ＩｇＤ結合を更に特徴づけるために、ＩｇＤ  ＥＬＩＳＡをベートとしてヒトＩｇＤを用いて構築した。組換え切端ＭＩＤ断片のすべてをＥＬＩＳＡにかけた後、ＭＩＤ９０２−１２００に対する特異的家兎抗血清とインキュベートした。ＥＬＩＳＡをＨＲＰ−結合ヤギ抗−家兎ポリクローナル抗体を用いて展開した。ドットプロット（図１１）と同一のパターンが観察された。すなわち、断片Ｆ４、Ｆ７及びＦ８は固相ＩｇＤに誘引しなかったのに対して、他の断片は完全長ＭＩＤとは異なる程度で結合した（データ示さず）。
【００９８】
最適なＭＩＤ９６２−１２００とＩｇＤの相互作用はテトラマー構造に依存する
最適なＩｇＤ結合を得るためのテトラマー構造の必要性を解明するために、ＭＩＤ９６２−１２００（Ｆ２，配列番号１０）を６０または１００℃でインキュベートした後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより分析した。６０℃で予備処理後ＭＩＤ９６２−１２００はモノマー及びテトラマーを形成した（図１２Ａ）。しかしながら、テトラマー構造は１００℃で分裂し、モノマー形態となった。ウェスタンブロットで調べたときこのモノマー形態のＩｇＤに対する結合はかなり弱かった（図１２Ａ及びＢ）。モノマー形態と比較したテトラマーのＩｇＤ結合能力を調べるために、ＭＩＤ９６２−１２００断片（配列番号１０）を６０℃において６種の実験で分析した。熱処理したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＩｇＤ結合活性をウェスタンブロットにより分析した。生じたゲル及びフィルターをデンシトメトリーにより分析し、モノマーのタンパク質濃度（密度）を対応のテトラマー濃度で割った。得られた値（％）はゲルに充填した総タンパク質の濃度（μｇ）に関連する。驚くことに、テトラマー形態に対するＩｇＤ結合をモノマー形態と比較したところ、テトラマーＭＩＤ９６２−１２００では２３倍高いＩｇＤ結合が見られた（図１２Ｃ）。
【００９９】
モラクセラ・カタラーリスＩｇＤ結合タンパク質（ＭＩＤ）はヒト赤血球を凝集する
ＭＩＤの赤血球凝集における予想される関与を調べるために、ＭＩＤを発現するかまたは相変異によりｍｉｄ遺伝子を切り離した一連の臨床単離物を選択した。驚くことに、ＭＩＤを発現した２１単離物のすべてがヒト赤血球を凝集したのに対して、ＭＩＤ−ネガティブ株（ｎ＝２１）のうち４つしか赤血球細胞を凝集しなかった。赤血球凝集能力とＭＩＤ発現との間にほぼ完全な相関関係が認められた。ＵＳＰＡ１／２発現は同様であり、ＭＩＤ発現と無関係であった。
【０１００】
この初期実験に続けて、モデル菌株モラクセラ・カタラーリスＢｃ５（Ｆｏｒｓｇｒｅｎら，２００１）由来の精製ＭＩＤタンパク質が赤血球を凝集するか否かを調べた。細菌表面を模擬するために、ＭＩＤをセファロースビーズにコンジュゲートし、ヒト赤血球とインキュベートした。セファロースに結合したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をネガティブコントロールとして含めた。驚くことに、ヒト赤血球はＭＩＤ−セファロースの存在下で凝集したのに対して、ＢＳＡ−セファロースは赤血球と干渉しなかった（データ示さず）。
【０１０１】
ＭＩＤの赤血球凝集ドメインはアミノ酸残基アラニン７６４とセリン９１３の間に位置する
分子を精査し、赤血球凝集に関与した分子の特定部位を正確に定めるために、一連のｍｉｄ遺伝子の切端ＤＮＡ断片をクローン化し、大腸菌において組換え発現させた（図１０）。家兎において切端ＭＩＤタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成し、ＥＬＩＳＡで使用した。予備実験で、ＭＩＤ及びＭＩＤ誘導タンパク質に対する抗体を滴定して、各抗原についてＥＬＩＳＡで試験したときと同じ値を得た。次いで、切端ＭＩＤタンパク質の溶解赤血球への結合能力を特定抗体を適当な濃度で用いてＥＬＩＳＡで測定した。ＭＩＤまたはＭＩＤ７６４−９１３（断片Ｅ）は他の切端ＭＩＤタンパク質に比較してより高い（４〜１６倍）ＥＬＩＳＡ値を示した。よって、ＭＩＤの赤血球凝集構造はＭＩＤアミノ酸残基７６４−９１３内にあるようである（配列番号８）。
【０１０２】
ＭＩＤ７６４−９１３（断片Ｅ，配列番号８）は直接赤血球及びＩＩ型肺胞上皮細胞に結合する
接着としてのＭＩＤ７６４−９１３の重要性を更に確認するために、ＭＩＤ及び特定の切端ＭＩＤ誘導タンパク質を放射性標識し、ヒト赤血球及び肺胞上皮細胞との直接結合実験で試験した（図１３）。［１２５Ｉ］−ＭＩＤ及び［１２５Ｉ］−ＭＩＤ７６４−９１３はいずれも赤血球に強く結合したのに対して、切端ＭＩＤ断片のＭＩＤ３６７−５９０（断片Ｃ）、ＭＩＤ９０２−１２００（断片Ｆ）、ＭＩＤ１０１１−１４４６（断片Ｇ）及びＭＩＤ１６１６−２１３９（断片Ｉ）はバッグラウンドレベル以上で結合しなかった（図１３Ａ）。同時に、肺胞上皮細胞Ａ５４９も完全長［１２５Ｉ］−標識ＭＩＤ及び切端ＭＩＤ７６４−９１３の両方を誘引した（図１３Ｂ）。他の断片はすべて上皮細胞に結合しなかった。これらを勘案すると、断片ＭＩＤ７６４−９１３（配列番号８）が哺乳動物細胞への接着を媒介する接着ＭＩＤの重要な部分であった。
【０１０３】
完全長ＭＩＤ１−２１３９及びＭＩＤ７６４−９１３に対する抗体はモラクセラ・カタラーリスのＩＩ型肺胞上皮細胞への接着を阻害する
ＩＩ型肺胞上皮細胞へのモラクセラ・カタラーリス接着に対する完全長ＭＩＤ及びＭＩＤ７６４−９６３の影響を更に分析するために、ＭＩＤ発現及びＭＩＤ欠乏モラクセラ・カタラーリス株を予めＭＩＤに対する抗体とインキュベートした後、接着のために肺胞上皮細胞に添加した。図１４に示すように、ＭＩＤ発現単離物の場合完全長ＭＩＤ１−２１３９及びＭＩＤ７６３−９１３（断片Ｅ，配列番号８）に対するポリクローナル抗体は接着を効果的に阻害した。対照的に、前免疫血清及びＭＩＤ１０１１−１４６６（断片Ｇ）に対するｐＡｂは殆ど接着と干渉しなかった。
【０１０４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】イオン交換クロマトグラフィー後のモラクセラ・カタラーリスからのＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）可溶性抽出物のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムでのクロマトグラフィー及び再クロマトグラフィー。実線は第１クロマトグラフィーのタンパク質含量を示し、破線は第１ピークの再クロマトグラフィーを示す。Ｖｏはボイド容量である。
【図２】ＭＩＤの各種精製ステップを表すフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｑ−セファロースカラムでのイオン交換クロマトグラフィー後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００カラムでの第１回及び第２回ゲル濾過後の３％  Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）中の粗抽出物についてのフラクションを示す。２つのゲルを同時に流し、１つはクーマシーブルー（染色剤）で染色し、１つはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にブロットし、ヒトＩｇＤ（κ）ミエローマタンパク質（ＩｇＤ）、抗−ＵｓｐＡ（αＵｓｐ）または抗−ＣｏｐＢ（αＢ）モノクローナル抗体を用いてプローブし、その後適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合第２抗体とインキュベートした。マーカータンパク質の分子量を左側に表示する。
【図３】各種免疫グロブリンクラスを表すヒトミエローマ血清に対するＭＩＤの結合。すべての血清を倍数希釈（４〜０．３μｇ）し、ニトロセルロース膜に適用した。飽和、洗浄及びブロッキング後、［１２５Ｉ］−ＭＩＤ標識プローブを添加した。一晩インキュベートし、更に洗浄した後、特異的ＭＩＤ−ＩｇＤ結合をオートラジオグラフィーにより可視化した。
【図４】ＦＩＴＣ結合ＭＩＤに特異的に結合したＩｇＤ担持Ｂ細胞。ＣＤ１９＋（Ａ）またはＣＤ３＋（Ｄ）に対するＲＰＥ結合ｍＡｂで染色した後ＭＩＤ−ＦＩＴＣとインキュベーションしたＰＢＬを抗−ＩｇＤ−ｍＡｂ（Ｂ）及び抗−ＣＤ１９  ｍＡｂとインキュベートしたＰＢＬと比較した。ＣＤ３＋及び抗−ＩｇＤ−ｍＡｂを用いる２重染色を（Ｅ）に示す。（Ｃ）では、予めヒトＩｇＤに対する家兎免疫グロブリンフラクションとインキュベートした後抗−ＣＤ１９  ｍＡｂ及びＭＩＤ−ＦＩＴＣを添加したＰＢＬのパネルを示す。抗体もＭＩＤ−ＦＩＴＣも含まないコントロールサンプルも含める（Ｆ）。ＰＢＬをヘパリン処理したヒト血液からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ１ステップ勾配を用いて単離した。リンパ球（２．５×１０５）を適当な抗体とインキュベートし、洗浄し、更にＭＩＤ−ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。インキュベーションはすべて氷上で実施し、最終洗浄後ＰＢＬをフローサイトメトリーにより分析した。この特別実験では、総リンパ球集団の６８％をゲーティングし、分析した。ネガティブコントロールとしてイソマッチｍＡｂを含めたときには細胞の２％未満が標識された。前免疫した家兎血清はＩｇＤ  ＢＣＲに対するＭＩＤ−ＦＩＴＣの結合を殆ど阻止しなかった（示さず）。分析した３つの別々のドナーの内の典型的なドナーについての実験を示す。
【図５】クローニング戦略を示すｍｉｄ遺伝子の概略マップ。ＤＮＡ増幅のために使用したオリゴヌクレオチドプライマーを関連配列の上（ＰＣＲ）及び下（逆ＰＣＲ［ＩＰＣＲ］）の矢印で示す。表ＩＩに概説したアミノ酸配列に基づく縮重プライマー及び特定プライマーをそれぞれ破線及び実線で示す。
【図６−１】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−２】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−３】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−４】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−５】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−６】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−７】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−８】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−９】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−１０】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図６−１１】モラクセラ・カタラーリスＢｃ５由来のｍｉｄ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列。推定−３５，−１０領域、考えられるリボソソーム結合部位（ＲＢＳ）、逆方向反復配列、予測シグナルペプチド、及びアミノ酸Ｎｏ．１及び１７の２つの選択的スタートコドンを示す。ストップコドン及び逆方向反復配列も示す。
【図７】モラクセラ・カタラーリス菌株から単離したＭＩＤとＡＴＣＣ  ２５２３８由来のＵｓｐＡ１及びＡ２との間の同一度及び類似度。同一性及び類似性はソフトウェアＮｅｅｄｌｅを用いて計算した。
【図８−１】ＭＩＤのアミノ酸配列と米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質との比較。
【図８−２】ＭＩＤのアミノ酸配列と米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質との比較。
【図８−３】ＭＩＤのアミノ酸配列と米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質との比較。
【図８−４】ＭＩＤのアミノ酸配列と米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質との比較。
【図８−５】ＭＩＤのアミノ酸配列と米国特許第５，８０８，０２４号明細書に記載されているタンパク質との比較。
【図９】組換え発現させたＭＩＤはそのＩｇＤ結合能力を保持していた。左図はクーマシーブリリアントブルー染色したゲル、右図はヒトＩｇＤでプローブしたウェスタンブロットを示す。天然ＭＩＤタンパク質（ＭＩＤ）を流し、細胞質フラクション（Ｃ）、ペリプラズマフラクション（Ｐ）及び膜フラクション（Ｍ）と比較した。左側の数字は分子量標準を指す。ｐＥＴ１６−ＭＩＤを含む大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３をＩＰＴＧにより４時間誘導した。細胞フラクションを集め、タンパク質を平行に並べた２つのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、それぞれクーマシーブリリアントブルーで染色するかまたはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜にブロットした。膜をヒトＩｇＤでプローブした後ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合第２抗体とインキュベートした。
【図１０】ＭＩＤ７６４−９１３（断片Ｅ）及びＭＩＤ９０２−１２００（断片Ｆ）はそれぞれ赤血球凝集及びＩｇＤ結合に関わる。一連の切端ＭＩＤタンパク質（Ａ〜Ｉと称する）を製造した。Ｃ末端にヒスチジンタグを含む組換えタンパク質（Ａ〜Ｈ）またはマルトース結合タンパク質に融合した組換えタンパク質（Ｉ）を大腸菌において産生し、それぞれニッケル及びアミロース樹脂カラムを用いて精製した。
【図１１】ＭＩＤ９６２−１２００（断片Ｆ２）は完全長ＭＩＤ１−２１３９に比較して保存ＩｇＤ結合能力を有している。等モル濃度（２４０〜０．０６ナノモル）の精製完全長ＭＩＤ１−２１３９及び８個の切端ＭＩＤ断片（Ｆ１〜Ｆ８）をドットプロットによりＩｇＤ結合について分析した。タンパク質ＭＩＤ９０２−１１３０（Ｆ８）、ＭＩＤ９８５−１１３０（Ｆ７）及びＭＩＤ１０００−１２００（Ｆ４）はＩｇＤを誘引しなかったが、他の断片はすべてＩｇＤに結合した。複数の切端ＭＩＤタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）にクローン化し、大腸菌において産生した。Ｈｉｓタグを含む組換えタンパク質を精製し、ニトロセルロース膜にドットブロットした。この膜をヒトＩｇＤでプローブした後、検出のために使用した第２ＨＲＰ結合ポリクローナル抗体でプローブした。
【図１２】ＭＩＤ９６２−１２００（Ｆ２）のテトラマー構造は最適ＩｇＤ結合のために必須である。（Ａ）：６０℃で処理後ＭＩＤ９６２−１２００のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモノマー及びテトラマーを分離した。１００℃で熱処理後モノマーのみが検出され得る。（Ｂ）：プローブとしてＩｇＤを用いる対応のウェスタンブロットはモノマーに対する弱いＩｇＤ結合を示す。（Ｃ）：６種の実験でのテトラマー及びモノマーに対する平均ＩｇＤ結合。ＩｇＤ結合はタンパク質１μｇ当たりの任意単位で示す。ＭＩＤ９６２−１２００をＳＤＳ−サンプル緩衝液において６０℃または１００℃で１０分間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析にかけた。生じたクーマシー染色ゲル及びウェスタンブロットをデンシトメトリーにより分析した。テトラマーまたはモノマーとして移動するタンパク質の％を計算し、ＩｇＤ結合能力を比較した。
【図１３】［１２５Ｉ］標識組換えＭＩＤ７６４−９１３（断片Ｅ）は赤血球及び上皮細胞に特異的に誘引される。［１２５Ｉ］標識ＭＩＤ及び一連の切端［１２５Ｉ］−ＭＩＤ断片（Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＩ）をヒト赤血球に添加した（Ａ）。組換え［１２５Ｉ］標識ＭＩＤ断片を上皮細胞にも添加した（Ｂ）。（断片Ｉを除く）すべての切端ＭＩＤタンパク質を大腸菌において産生し、ニッケル樹脂を用いて精製した。断片ＩはＭＢＰとの融合タンパク質であり、よってアミロース樹脂を用いて精製した。組換えタンパク質を［１２５Ｉ］で標識し、赤血球または上皮細胞株Ａ５４９に添加した。数回洗浄後、結合放射能をガンマカウンターで測定した。データを２回ずつ実施した２つの実験の平均値として示す。誤差バーはＳＤを指す。
【図１４】ＭＩＤ発現モラクセラ・カタラーリスの上皮細胞への接着はアミノ酸残基ＭＩＤ７６４−９１３（断片Ｅ）に依存する。家兎抗−ＭＩＤ１−２１３９または抗−ＭＩＤ７６４−９１３ポリクローナル抗体をコートしたＭＩＤ発現細菌で、上皮細胞への接着が前免疫血清または抗−ＭＩＤ１０１１−１４６６（断片Ｇ）ｐＡｂと比較して低下していた。細菌を前免疫血清または特定の抗血清と４℃で１時間インキュベートした。上皮細胞に細菌を添加した後遠心し、３７℃において３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理し、懸濁液を血液寒天プレートにおいて平板培養した。一晩インキュベートした後コロニー形成単位をカウントした。接着率（添加したｃｆｕ／接着したｃｆｕ）を計算した。２回ずつ実施した４つの別個の実験の平均値として示す。誤差バーはＳＤを指す。＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊Ｐ≦０．０１、及び＊Ｐ≦０．０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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