(57)【要約】ゲラニルピロホスフェートから環式テルペノイドを産生するようにメタノトロフィック細菌を遺伝子操作した。
2005500805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）適切なレベルのゲラニルピロホスフェート、および
（ｉｉ）適切な調節配列の制御下で環式テルペンシンターゼをコードする少なくとも１つの単離された核酸分子
を含む形質転換されたＣ１代謝宿主細胞を提供する工程と、
（ｂ）適切な増殖条件下で工程（ａ）の宿主細胞を有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって、モノテルペン化合物を産生させる工程と、
を含むことを特徴とするモノテルペンの製造方法。
【請求項２】
Ｃ１炭素基質は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン類、メチル化チオール類、および二酸化炭素から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ１代謝宿主細胞は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒポミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ１代謝宿主はメタノトロフである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
メタノトロフは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃ１炭素基質はメタンおよびメタノールから成る群より選択され、そしてＣ１代謝宿主細胞はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択されるメタノトロフである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
絶対メタノトロフは、機能的エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含む高増殖メタノトロフィック株であり、前記経路はピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
高増殖メタノトロフィック細菌株は、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子を必要に応じて含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
高増殖メタノトロフィック細菌株は、機能的エントナー−ドゥドロフ炭素経路を必要に応じて含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
高増殖メタノトロフィック細菌株は、ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を必要に応じて含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高増殖メタノトロフィック細菌株は、ＡＴＣＣ番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ２４０２を有するメチロモナス１６ａである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
環式テルペンシンターゼは、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、およびサビネンシンターゼから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
モノテルペンは、リモネン、ピネン、ボルニルジホスフェート、β−フェランドレン、１，８−シネオール、およびサビネンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
環式テルペンシンターゼはリモネンシンターゼであり、モノテルペンはリモネンであり、そして組換え宿主はメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
リモネンシンターゼは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リモネンシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ３１７６９５、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＢ００５２３５、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２４１７９０、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２３３８９４、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１３９２０７、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１７５３２３およびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｌ１３４５９から成る群より選択される配列に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ピネンシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２７６０７２、およびジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｕ８７９０９から成る群より選択される配列に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ボルニルシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１９００に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
フェランドレンシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１３９２０５に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
シネオールシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１８９９に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
サビネンシンターゼは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１９０１に記載の遺伝子によってコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
適切なレベルのゲラニルピロホスフェートは、異種上流経路イソプレノイド経路遺伝子の発現によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記上流経路イソプレノイド遺伝子は、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトールシチジリルトランスフェラーゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ（ＩｓｐＦ）、ＣＴＰシンターゼ（ＩｓｐＡ）およびゲラニルトランスフェラーゼ（ＰｙｒＧ）から成る群より選択される酵素をコードする、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月１日に出願された米国仮出願第６０／２２９，９０７号の利益および２０００年９月１日に出願された米国仮出願第６０／２２９，８５８号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、微生物学の分野に属する。より具体的には、本発明は、唯一の炭素源として単一炭素基質を代謝する微生物宿主における環式テルペノイド化合物の製造方法に関する。
【０００３】
発明の背景
モノテルペン類は、産業用溶媒の成分として風味および芳香産業において、そして選択された化合物が充実性腫瘍の化学予防および化学療法の両方の薬剤として有望であることが示されている製薬業界において価値を有する。
【０００４】
細菌、菌類、藻類、昆虫ならびにワニおよびビーバーなどの高等動物をも含む広い範囲の生物体に見出されるが、モノテルペン類は花の香り、精油、およびテルペンチンの成分などの陸生植物から最も広範に産生される。モノテルペン類の最も一般的な供給源の１つは、草本植物および針葉樹のテルペンチン類である。ピネンの位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）（α−ピネン、β−ピネン）は、テルペンチンの２つの主なモノテルペン類であり、それらは大量の香気化学物質として有用である。他の（オレンジ、ライム、レモンおよびペパーミント由来の）精油は、風味付けおよび香料としての価値がある。直鎖状テルペノイド化合物を環化して環式誘導体を形成することにより、異なる機能性を有する多様な芳香性構造を作製することができる。
【０００５】
現在、モノテルペン類は、天然供給源からの抽出または化学合成のいずれかによって得ることができる。いずれのプロセスも時間を浪費しかつ高価である。選択されたモノテルペン類を小規模で製造することは微生物宿主において実証されているが、産業規模でモノテルペン類を製造するための容易な方法についてはまだ報告されていない。例えば、いくつかのモノテルペン合成が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において首尾よくクローン化され、発現されている。具体的には、ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）においてゲラニルジホスフェートの環化を触媒してオレフィン４（Ｓ）−リモネンを生じるリモネンシンターゼが大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）にクローン化され、機能的に発現されている（Ｙｕｂａら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３３２：２８０−２８７，  （１９９６））。しかし、微生物の発現に関する報告は、複雑な炭素基質上で増殖させた発酵産生に伝統的に使用される微生物に限定されている。
【０００６】
唯一のエネルギー源として単一炭素基質を利用する多くの微生物が存在する。これらの生物体はメチロトロフと呼ばれ、本明細書では「Ｃ１代謝体（Ｃ１  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）」と呼ぶ。これらの生物体は、エネルギーおよびバイオマスの唯一の供給源として炭素−炭素結合を有さない炭素基質を使用する能力を特徴とする。メチロトロフの部分集合には、唯一のエネルギー源としてメタンを利用する独特な能力を有するメタノトロフがある。多くのこれらの生物体は公知であるが、これらの微生物のうち、材料の合成のための産業プロセスに首尾よく利用された例はほとんどない。単一炭素基質は費用効果が高いエネルギー源であるが、これらの微生物の遺伝子操作は困難であり、それらの遺伝子機構に関する情報は不足しているため、生来の産物の合成に主としてそれらを使用することは制限されている。例えば、メタンの生物変換の商業的応用は、歴史的に大きく分けて次の３つの範疇に当てはまる：１）単一の細胞タンパク質の産生（Ｓｈａｒｐｅ  Ｄ．  Ｈ．  ＢｉｏＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  １９８９．  Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｐｒｅｓｓ．）（Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ，  Ｊｏｈｎ，  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅａｃｔ．  Ｅｎｇ．，  ［Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅａｃｔ．  Ｅｎｇ．  Ｃｏｎｆ．］，  ２ｎｄ  （１９８７），  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ３２０−３３．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，  Ｂ．  Ｄ．；  Ｍａｓｈｅｌｋａｒ，  Ｒ．  Ａ．；  Ｓｈａｒｍａ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｗｉｌｅｙ  Ｅａｓｔ．，  Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，  Ｉｎｄｉａ；  Ｎａｇｕｉｂ，  Ｍ．，  Ｐｒｏｃ．  ＯＡＰＥＣ  Ｓｙｍｐ．  Ｐｅｔｒｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ［Ｐａｐ．］  （１９８０），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９７９，  ２５３−７７  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｏｒｇａｎ．  Ａｒａｂ  Ｐｅｔ．  Ｅｘｐｏｒｔｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，  Ｋｕｗａｉｔ，  Ｋｕｗａｉｔ．）；２）化学物質産生のためのアルケン類のエポキシ化（米国特許第４３４８４７６号）；および３）塩素処理された汚染物質の生物分解（Ｔｓｉｅｎら、Ｇａｓ，  Ｏｉｌ，  Ｃｏａｌ，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２，  ［Ｐａｐ．  Ｉｎｔ．  ＩＧＴ  Ｓｙｍｐ．  Ｇａｓ，  Ｏｉｌ，  Ｃｏａｌ，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．］，  ２ｎｄ  （１９９０），  ８３−１０４．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ａｋｉｎ，  Ｃａｖｉｔ；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊａｒｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｓｔ．  Ｇａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ．；  ＷＯ  ９６３３８２１；  Ｍｅｒｋｌｅｙら、Ｂｉｏｒｅｍ．  Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ  Ｏｒｇ．，  ［Ｐａｐ．  Ｉｎｔ．  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｏｎ−Ｓｉｔｅ  Ｂｉｏｒｅｃｌａｍ．  Ｓｙｍｐ．］，  ３ｒｄ  （１９９５），  １６５−７４．  Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：  Ｈｉｎｃｈｅｅ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｄａｎｉｅｌ  Ｂ．；  Ｈｏｅｐｐｅｌ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｅ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｂａｔｔｅｌｌ���  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ：  Ｍｅｙｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｒｅｌｅａｓｅｓ  （１９９３），  ２（１），  １１−２２）。ここでも、産生収量が低く、生成物に毒性があり、プロセスに関連する生成物を作製するのに大量の細胞塊が必要であるため、メタン生物分解で商業的に成功しているのはアルケンのエポキシ化に限られている。
【０００７】
単一炭素代謝体の最も一般的なクラスの１つはメタノトロフである。メタノトロフィック細菌は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてメタンを使用する能力によって規定される。メタンモノオキシゲナーゼは、メタン活性化の主な工程に必要な酵素であり、この反応の生成物はメタノールである（Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２０００），  １７３（５−６），  ３２５−３３２）。この反応は周囲温度および圧力で生じるのに対し、メタンからメタノールへの化学変換には、数百度の温度および高圧が必要である（Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ，  Ｅ．  Ａ．，  Ｋｉｎｅｔ．  Ｃａｔａｌ．  （１９９９），  ４０（３），  ３５０−３６３；  ＷＯ  ２０００００７７１８；  米国特許第５，７５０，８２１号）。メタンの生物変換を潜在的に独特かつ価値あるプロセスにしているのは、豊富なメタンを伴う周囲条件下でメタンを変換するこのような能力である。
【０００８】
多くのメタノトロフは、これらの生物体が他の非内因性イソプレノイド化合物を合成するのを可能にする固有のイソプレノイド経路を含有する。メタノトロフは、エネルギー源として１つの炭素基質（メタンまたはメタノール）を使用することができるため、低い費用でモノテルペン類を製造することが可能である。さらに、発酵中、メタンが発酵媒体を通過する際に、揮発性化合物を容易に取り出すことができる。また、モノテルペン類の多くは対掌性を有し、化学合成において特定のキラル活性化合物の合成および精製を制御することが困難であるため、生体経路を介して製造することは有利である。
【０００９】
従って、安価な供給原料から非常に価値のあるモノテルペン類を製造するための方法が必要とされている。本出願人らは、環式テルペンシンターゼをコードする形質転換された遺伝子を有し、様々なモノテルペン類を産生する能力を有するＣ１代謝微生物を提供することによって、上記の問題を解決した。
【００１０】
発明の概要
本発明は、ａ）（ｉ）適切なレベルのゲラニルピロホスフェート、および
（ｉｉ）適切な調節配列の制御下で環式テルペンシンターゼをコードする少なくとも１つの単離された核酸分子
を含む形質転換されたＣ１代謝宿主細胞を提供する工程と、
（ｂ）適切な増殖条件下で工程（ａ）の宿主細胞を有効量のＣ１炭素基質と接触させ、それによって、モノテルペン化合物を産生させる工程と、
を含んで成る、モノテルペンの製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の好適な単一炭素基質として、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン類、メチル化チオール類、および二酸化炭素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
好適なＣ１代謝体または条件的メチロトロフであって、ここで、絶対的メタノトロフィック細菌が最も好ましい。最も好適なＣ１代謝体は、機能的エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含む絶対メタノトロフであり、前記経路はピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含む。
【００１３】
本発明の好適な環式テルペンシンターゼとして、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、およびサビネンシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
代替的実施態様において、本発明は、モノテルペン類の下流産生のための上流経路イソプレノイド遺伝子の発現を提供し、該上流経路イソプレノイド遺伝子は、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトールシチジリルトランスフェラーゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ（ＩｓｐＦ）、ＣＴＰシンターゼ（ＩｓｐＡ）およびゲラニルトランスフェラーゼ（ＰｙｒＧ）から成る群より選択される。
【００１５】
本発明は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００１６】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００１７】
配列番号１〜４は、プライマー配列である。
【００１８】
配列番号５は、プラスミドｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎのヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号６は、Ｎ末端から５７アミノ酸配列を欠失させたメンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）由来のリモネンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号７は、配列番号６において使用されたリモネンシンターゼ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００２１】
出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、以下の生物学的寄託を行った。
【００２２】
【表１】
2005500805.tif 000003
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えメチロトロフィックまたはメタノトロフィック宿主におけるモノテルペン類の合成方法について記載している。モノテルペン類は、風味および芳香剤、被覆剤ならびに栄養および健康アプリケーションにおいて使用されている。
【００２４】
請求の範囲および明細書の解釈のために、以下の定義を使用することができる。
【００２５】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略称される。
【００２６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略称される。
【００２７】
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、リモネン、ピネン、サビネン、β−フェランドレン、ボルネオール、カロテノイド類およびキサントフィル類などの化合物または１０炭素テルペノイド（モノテルペン）およびそれらの誘導体を含むイソプレノイド経路から誘導される任意の分子を指す。
【００２８】
用語「イソプレンサブユニット」は、テルペノイドを形成するためにさらに縮合するイソペンテニルジホスフェートの基本５炭素単位を指す。
【００２９】
用語「環式テルペンシンターゼ」は、環式テルペノイド化合物を生成するための基質としてゲラニルピロホスフェートを使用することが可能な酵素を指す。
【００３０】
用語「モノテルペン」は、ゲラニルピロホスフェートから誘導される任意の１０炭素化合物または２イソプレンサブユニットに基づくその誘導体を指す（例えば、図３を参照のこと）。
【００３１】
用語「環式モノテルペン」は、１０個の炭素原子を有するゲラニルピロホスフェートから誘導される環式テルペノイドを指す。
【００３２】
用語「リモネンシンターゼ」は、ゲラニルピロホスフェートから（−）−リモネンへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３３】
用語「ピネンシンターゼ」は、ゲラニルピロホスフェートからピネンへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３４】
用語「ボルニルシンターゼ」は、ゲラニルピロホスフェートからボルネオールへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３５】
用語「フェランドレンシンターゼ」は、ゲラニルピロホスフェートからβ−フェランドレンへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３６】
用語「シネオール」は、ゲラニルピロホスフェートからシネオールへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３７】
用語「サビネンシンターゼ」は、ゲラニルピロホスフェートからサビネンへの変換を触媒する酵素を指す。
【００３８】
用語「ゲラニルジホスフェート」および「ゲラニルピロホスフェート」は交換可能に使用され、以下の一般式を有する化合物を指す。
【００３９】
【化１】
2005500805.tif 000004
【００４０】
用語「Ｄｘｓ」は、ｄｘｓ遺伝子によってコードされる１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ酵素を指す。
【００４１】
用語「Ｄｘｒ」は、ｄｘｒ遺伝子によってコードされる１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ酵素を指す。
【００４２】
用語「ＹｇｂＰ」または「ＩｓｐＤ」は、ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤ遺伝子によってコードされる２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素を指す。遺伝子ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｇｂＰまたはＩｓｐＤの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００４３】
用語「ＹｃｈＢ」または「ＩｓｐＥ」は、ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥ遺伝子によってコードされる４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼ酵素を指す。遺伝子ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｃｈＢまたはＩｓｐＥの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００４４】
用語「ＹｇｂＢ」または「ＩｓｐＦ」は、ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦ遺伝子によってコードされる２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ酵素を指す。遺伝子ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｇｂＢまたはＩｓｐＦの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００４５】
用語「ＰｙｒＧ」は、ｐｙｒＧ遺伝子によってコードされるＣＴＰシンターゼ酵素を指す。
【００４６】
用語「ＩｓｐＡ」は、ｉｓｐＡ遺伝子によってコードされるプレニルトランスフェラーゼファミリーの１つとしてのゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシルジホスフェートシンターゼ酵素を指す。
【００４７】
用語「ＬｙｔＢ」は、イソプレノイド経路においてジメチルアリルピロホスフェートの形成に役割を有し、ｌｙｔＢ遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００４８】
用語「上流経路イソプレン遺伝子」は、ｄｘｓ遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼをコードする）、ｄｘｒ遺伝子（１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼをコードする）、「ｉｓｐＤ」遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシチジルトランスフェラーゼをコードする）、「ｉｓｐＥ」遺伝子（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼをコードする）、「ｉｓｐＦ」遺伝子（２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼをコードする）、「ｐｙｒＧ」遺伝子（ＣＴＰシンターゼをコードする）、「ｉｓｐＡ」遺伝子（ゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシルジホスフェートシンターゼをコードする）および「ｌｙｔＢ」遺伝子を含む、イソプレノイド生合成経路に関連する遺伝子および遺伝子産物を指す。
【００４９】
用語「単一炭素基質」は、炭素−炭素結合を含まない微生物の供給原料として有用な炭素基質を指す。
【００５０】
用語「Ｃ１代謝体」は、唯一のエネルギー源およびバイオマスとして単一炭素原子を使用する能力を有する微生物を指す。Ｃ１代謝体は、典型的にメチロトロフおよび／またはメタノトロフである。
【００５１】
用語「メチロトロフ」は、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することが可能な生物体を意味する。メチロトロフがＣＨ４を酸化することができる場合、メチロトロフもまたメタノトロフである。
【００５２】
用語「メタノトロフ」は、基質としてメタンを利用することが可能な原核生物を意味する。メタンの二酸化炭素への完全な酸化は、好気的分解経路によって生じる。本発明において有用なメタノトロフの典型的な例として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびメチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
用語「メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）」および「メチロモナス１６ａ  ｓｐ．（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ  ｓｐ．）」は交換可能に使用され、本明細書において使用されるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）株を指す。
【００５４】
用語「エムデン−マイヤーホフ経路」は、グルコースおよびフルクトースなどのヘキソースをグリセルアルデヒド３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、ホスホエノールピルベートおよびピルベートなどの重要な細胞３炭素中間体に変換するための一連の生化学反応を指す。これらの反応は、典型的にＡＴＰの形で生化学的に有用なエネルギーの正味の産出を進行させる。エムデン−マイヤーホフ経路に独特な重要な酵素は、ホスホフルクトキナーゼおよびフルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼである。
【００５５】
用語「エントナー−ドゥドロフ経路」は、生化学的に有用なエネルギーの任意の正味の産生を伴うことなく、グルコースまたはフルクトースなどのヘキソースをピルベートおよびグリセルアルデヒド３−ホスフェートなどの重要な３炭素中細胞間体に変換するための一連の生化学反応を指す。エントナー−ドゥドロフ経路に独特な重要な酵素は、ホスホグルコネートデヒドラターゼおよびケトデオキシホスホグルコネートアルドラーゼである。
【００５６】
用語「高増殖メタントロフィック細菌株」は、唯一の炭素およびエネルギー源としてのメタンまたはメタノールによる増殖が可能な細菌を指し、該細菌は、高い増殖速度および代謝されたＣ１基質の１グラムあたり細胞塊の高収量を生じる機能的エムデン−マイヤーホフ炭素フラックス経路を有する。本明細書に記載の特定の「高増殖メタントロフィック細菌株」を「メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）」または「１６ａ」と呼び、これらの用語は交換可能に使用される。
【００５７】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、必要に応じて、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから成り得る。
【００５８】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質として発現され得る核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んでいる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００５９】
「コーディング配列」は、特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００６０】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見いだされる異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントから成るか、または合成ＤＮＡセグメントをも含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞タイプ、または異なる発生段階において、あるいは異なる環境または生理的条件に応答して遺伝子の発現を指令することができることを理解する。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成プロモーター」と呼ぶ。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全には規定されていないため、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００６１】
用語「操作可能に連結される」は、一方の機能が他方の機能の影響を受けるような単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現に影響することが可能である（即ち、コーディング配列はプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。コーディング配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に操作可能に連結することができる。
【００６２】
本明細書で使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【００６３】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００６４】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて外来宿主の遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００６５】
ここで使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）（以後「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，  Ｔ．  Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，  Ｍ．  Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）により説明されている。
【００６６】
本発明は、メチロトロフィックまたはメタノトロフィック微生物宿主においてモノテルペン類を合成する方法を提供する。本発明の典型的なモノテルペン類は、ゲラニルピロホスフェートから誘導され、１０個の炭素原子を含有するモノテルペンである。典型的に、宿主は、ゲラニルピロホスフェートの産生を生じるイソプレノイド経路のエレメントを有する。微生物宿主はまた、モノテルペンを産生するための基質としてゲラニルピロホスフェートを使用することが可能なシンターゼをコードする遺伝子を含む。
【００６７】
Ｃ１代謝微生物の同定および単離
本発明は、唯一のエネルギー源として単一炭素基質を使用することができる微生物における環式テルペンシンターゼの発現を提供する。かかる微生物を本明細書ではＣ１代謝体と呼ぶことにする。宿主微生物は、多くのモノテルペン類の前駆体であるゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）を合成する能力を有するいずれのＣ１代謝体であってもよい。
【００６８】
多くのＣ１代謝微生物が当該分野において公知であり、様々な単一炭素基質を使用することが可能である。本発明において有用な単一炭素基質としては、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、メチル化アミン類（例えば、ジ−およびトリメチルアミン）、メチル化チオール類、ならびに二酸化炭素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
すべてのＣ１代謝微生物は、一般にメチロトロフに分類される。メチロトロフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化することが可能な任意の生物体として規定することができる。メチロトロフの部分集合は、メタンを酸化する特殊な能力を有するメタノトロフである。条件的メチロトロフは、炭素−炭素結合を含有しない有機化合物を酸化する能力を有するが、エネルギーならびにバイオマスのために糖および複雑な炭水化物などの他の炭素基質を使用してもよい。絶対メチロトロフは、エネルギーの生成のために使用される有機化合物が炭素−炭素結合を含有しない有機化合物に限定されたメチロトロフであり、絶対メタノトロフは、メタンを酸化する能力を有する絶対メチロトロフである。
【００７０】
条件的メチロトロフィック細菌は多くの環境で見出されるが、土壌、ごみ埋立地およびごみ処理施設から最も一般的に単離される。多くの条件的メチロトロフは、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のβ、およびγ亜群のメンバーである（Ｈａｎｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．，  ［Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］，  ７ｔｈ  （１９９３），  ２８５−３０２．    Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎ；  Ｋｅｌｌｙ，  Ｄｏｎ  Ｐ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，  Ａｎｄｏｖｅｒ，  ＵＫ；  Ｍａｄｉｇａｎら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，  ８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，  ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，  ＮＪ  （１９９７））。本発明に適切な条件的メチロトロフィック細菌としては、メチロフィラス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、メチロバチルス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヒポミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
単一炭素基質を利用する能力は細菌に限定されるものではなく、酵母および菌類にまで及ぶ。例えば、様々な酵母属は、エネルギー源としてより複雑な材料に加えて単一炭素基質を使用することが可能である。本発明において有用な特定のメチロトロフィック酵母としては、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
メタンを利用するさらなる能力を有するメチロトロフをメタノトロフと呼ぶ。メタン利用体であるが、炭素−炭素結合を有さない有機化合物を使用することが要求されている絶対メタノトロフが本発明において興味深い。これらの生物体の例として、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロコッカス（Ｍｅｈｔｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）属、メチロサイティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｃｔｉｓ）属、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、およびメタノモナス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
エネルギー的に好ましい炭素フラックス経路を有する高増殖絶対メタノトロフは、本発明において特に興味深い。例えば、本出願人らは、炭素フラックス操作に特に有用となるいくつかの経路特徴を有するメタノトロフの特定の株を発見した。このタイプの株は、本出願の宿主としての役割を果たし、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）として公知である（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ２４０２）。
【００７４】
本株は、炭素利用経路におけるいくつかの異形を含有する。例えば、ゲノム配列データに基づいて、該株はヘキソース代謝の２つの経路に対する遺伝子を含有することが明らかにされている。該株には、ケト−デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ酵素を利用するエントナー−ドゥドロフ経路が存在する。これは絶対メタノトロフにおいて有効な経路であることが、一般によく認められている。しかし、現在、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素を利用するエムデン−マイヤーホフ経路も存在する。この経路は、絶対メタノトロフに存在せず、また有効でもないことは周知である。エネルギー的に、後者の経路は最も好適であり、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）において生物学的に有効なエネルギーをより多く産生し、細胞塊および他の細胞塊依存性産物を究極的に産生することが可能である。本１６ａ株におけるこの経路の活性は、マイクロアレイデータおよびＡＴＰの減少を測定する生化学的証拠によって確認されている。１６ａ株はエムデン−マイヤーホフおよびエントナー−ドゥドロフ経路の酵素の両方を有することが明らかにされているが、データは、エムデン−マイヤーホフ経路の酵素の方がエントナー−ドゥドロフ経路の酵素よりも強く発現されることを示唆している。この結果は驚くべきことであり、メタノトロフィック細菌の解糖代謝に関する現在の知見に反する。本出願人らは、他にも例えば、このような特徴を有するメチロモナス・クララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａ）およびメチロシヌス・スポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ）を含むメタノトロフィック細菌を発見した。
【００７５】
１６ａ株におけるエムデン−マイヤーホフ経路の特に新規かつ有用な特徴は、重要なホスホフルクトキナーゼ工程が、ＡＴＰ依存性ではなく、ピロホスフェート依存性であることである。この特徴のため、ＡＴＰの代わりにピロホスフェートを使用することによって、経路のエネルギー収量が増加する。該株にエネルギー的利点を提供するという重要性のため、炭素フラックス経路におけるこの遺伝子は、本株の診断に役立つと思われる。
【００７６】
メタノトロフィック細菌では、メタンはリブロースモノホスフェート経路またはＲｕＭＰサイクルとして公知の循環反応を介して生体分子に変換される。この経路は、それぞれの相が一連の酵素工程である３つの相から成る（図３）。第１の工程は、ヘキソースまたは６炭糖を形成するための「固定化」またはＣ−１（ホルムアルデヒド）のペントースへの取込みである。これは、５炭糖（ペントース）とホルムアルデヒドとの間の縮合反応を介して生じ、ヘキスロースモノホスフェートシンターゼによって触媒される。第２の相は「切断」と呼ばれ、ヘキソースを２つの３炭素分子に分割する。それらの３炭素分子のうちの一方がＲｕＭＰ経路によって再利用され、他方の３炭素フラグメントは細胞の増殖に利用される。メタノトロフおよびメチロトロフでは、ＲｕＭＰ経路は３つの変異体のうちの１つとして生じる。しかし、これらの変異体のうち次の２つしか一般には見出されていない。ＦＢＰ／ＴＡ（フルクトースビスホスファターゼ／トランスアルドラーゼ）またはＫＤＰＧ／ＴＡ（ケト−デオキシホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ）経路。（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，  Ｇ．Ｅ．  Ｄｅｖｒｉｅｓ．    Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．    Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ  １９９２，  ｅｄ  Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ）。
【００７７】
本株は、「切断」工程を扱う方法において独特であり、ここで、重要な中間体としてフルクトースビスホスフェートを介するこのような変換を行う遺伝子が見出された。フルクトースビスホスフェートアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの遺伝子は、一片のＤＮＡ上で共にクラスター形成していることが見出された。第２に、ケト−デオキシホスホグルコネート中間体に関与する他の変異体の遺伝子も共にクラスター形成していることが見出された。利用可能な文献は、これらの生物体（メチロトロフおよびメタノトロフ）が唯一ＫＤＰＧ経路に依存し、ＦＢＰ依存性固定化経路が条件的メチロトロフに利用されることを教示している（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎら、上掲）。従って、後者の観察は予測されるが、前者の観察は予測されない。絶対メタン利用細菌のＦＢＰ遺伝子に関する知見は、驚くべきものであり、同時に利用性が示唆される。ＦＢＰ経路は、ＫＤＰＧ経路よりも利用されるエネルギー（ＡＴＰ）が少ないという事実のため、エネルギー的に宿主微生物に好適である。従って、ＦＢＰ経路を利用する生物体は、ＫＤＰＧ経路を利用する生物体よりも優れたエネルギー的利点および増殖利点を有し得る。このような利点も、株のエネルギー要求産生経路に有用であり得る。この経路を使用することによって、メタン利用細菌は、単一細胞タンパク質またはＲｕＭＰ経路への炭素の流動から誘導される他の任意の産物のいずれかの産生プラットホームとして、他のメタン利用生物体よりも優れた利点を有することができる。
【００７８】
従って、本発明は、
（ａ）メタンおよびメタノールから成る群より選択されるＣ１炭素基質上で増殖し、そして
（ｂ）機能的エムデン−マイヤーホフ炭素経路を含み、前記経路はピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含み、そして
（ｃ）ゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）の内因性供給源を含有する、
形質転換されたＣ１代謝宿主細胞を提供することを含んで成る、モノテルペン化合物の製造方法を提供する。
【００７９】
Ｃ１代謝微生物の単離
本発明のＣ１代謝微生物は偏在しており、多くは単離され、特徴付けされている。これらの株の一般的スキームには、メタンまたはメタノールを含有する密閉液体無機塩類培地への接種物の添加が含まれる。容量：気体比については注意が必要であり、培養物は典型的に２５〜５５℃でインキュベートされる。典型的に、増殖が初めて目視されるときにプレート化するかまたは固体培地上で画線すると、様々な異なるメチロトロフィック細菌を第１の冨化物から単離することができる。メタノトロフの単離方法は一般的であり、当該分野において周知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３６：  ２２７  （１９９２）；またはＨａｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｓ．ら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：  ａ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  ｈａｂｉｔａｔｓ，  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ；  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８１；  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１８を参照のこと）。
【００８０】
上記のように、好適なＣ１代謝体は、活性エムデン−マイヤーホフ経路を取り込むＣ１代謝体であり、ピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼの存在によって示される。本発明の教示内容は、同様の株の一般的同定および単離を可能にすることが考慮される。例えば、本高増殖株の重要な特徴は、該株が、唯一の炭素源としてメタンまたはメタノールのいずれかのみを使用する絶対メタントロフであり、そして機能的エムデン−マイヤーホフ、および特にピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子を有することである。メタノトロフの単離方法は一般的であり、当該分野において周知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ、上掲、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、上掲を参照のこと）。同様に、ピロホスフェート依存性ホスホフルクトキナーゼは、哺乳動物系において良好に特徴付けられており、アッセイ方法が良好に開発されている（例えば、Ｓｃｈｌｉｓｅｌｆｅｌｄら、Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９６），  ２９（１），  ７９−８３；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  （１９８０），  １２（１０），  １０５３−６４）。現在の微生物学者であれば、これらの技術を使用して、本高増殖株を同定することが可能であろう。
【００８１】
モノテルペン合成に関与する遺伝子
多くのＣ１代謝株は、モノテルペンシンターゼの基質であるゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）を産生する能力を有する。ＧＰＰを作製する宿主細胞を用いる場合、特定のモノテルペンの産生には特定のテルペンシンターゼを誘導する必要があるであろう。
【００８２】
多くの環式テルペンシンターゼは当該分野において公知であり、いずれの環式テルペンシンターゼも本発明の宿主での発現に適切である。リモネンシンターゼは、最も良好に特徴付けされており、ペリラ・フルテセンス（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ３１７６９５）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＢ００５２３５）、ペリラ・シトリオドラ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２４１７９０）、シゾネペタ・テヌイホリア（Ｓｃｈｉｚｏｎｅｐｅｔａ  ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２３３８９４）、アビエス・グランジス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１３９２０７）、メンタ・ロンギホリア（Ｍｅｎｔｈａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１７５３２３）およびメンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｌ１３４５９）を含む様々な生物体から単離されている。本発明における発現のためには、リモネンシンターゼをコードする公知の遺伝子のいずれを使用してもよく、ここで、メンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）から単離される遺伝子が好ましい。
【００８３】
他の環式テルペンシンターゼも公知である。例えば、ボルニルジホスフェートシンターゼはサルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１９００）から単離され；１，８−シネオールシンターゼはサルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１８９９）から単離され；フェランドレンシンターゼはアビエス・グランジス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ１３９２０５）から単離され；サビネンシンターゼはサルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ０５１９０１）から単離され；そしてピネンシンターゼはアルテミシア・アンヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＡＦ２７６０７２）、およびアビエス・グランジス（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｕ８７９０９）から単離されている。
【００８４】
従って、モノテルペンの発現に適切なシンターゼとしては、リモネンシンターゼ、ピネンシンターゼ、ボルニルシンターゼ、フェランドレンシンターゼ、シネオールシンターゼ、およびサビネンシンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
ＧＰＰが宿主細胞に存在する場合、特定のテルペンシンターゼの発現により対応するモノテルペンが作製されることが理解されよう。このため、例えば、リモネンシンターゼの発現によってリモネンが作製され、ピネンシンターゼの発現によってピネンが作製され、サビネンシンターゼの発現によってサビネンが作製され、フェランドレンシンターゼの発現によってβ−フェランドレンが作製され、そしてボルニルジホスフェートシンターゼの発現によってボルネオールが作製される（図３）。
【００８６】
場合によって、特定のＣ１代謝宿主細胞は、ゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）の産生に必要な経路のいくつかまたはすべてのエレメントを含んでいなくてもよい。あるいは、この経路のいくつかのエレメントは速度が制限されていてもよく、ＧＰＰの有効な合成のために過剰発現が必要であってもよい。これらの状況において、ＧＰＰ合成経路遺伝子もしくは「上流経路イソプレノイド遺伝子」のいくつかまたはすべてを宿主に導入すること、または経路の特定の速度制限工程の産生を調節もしくは増加するための経路において現存の遺伝子のさらなるコピーを導入することが必要であり得る。ＧＰＰは、グリセルアルデヒド−３Ｐとピルベートとの縮合から始まり、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）とジメチルアリル−ジホスフェートとの間の縮合で終了してＧＰＰを形成する生合成経路の最終産物である。
【００８７】
イソプレノイド経路の多くの工程は公知である。例えば、代替的経路の最初の工程は、５炭素化合物を生じるためのピルベート由来の２個の炭素とＣ１アルデヒド基であるＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートとの縮合に関与する（図３および図４）。Ｌｏｉｓらは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）におけるＤ−１−−デオキシキシルロース−５−ホスフェートの合成を触媒するＤ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）をコードする遺伝子ｄｘｓについて報告している（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ２１０５−２１１０  （１９９８））。
【００８８】
次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートの異性化および還元によって２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートを生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素のうちの１つは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、ｄｘｒ遺伝子産物が大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の代替的経路において２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートの形成を触媒することを報告した（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ９８７９−９８８４  （１９９８））。
【００８９】
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートをイソペンテニルモノホスフェートに変換する工程についてはあまり特徴付けされていないが、いくつかの工程については既知である。次いで、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−ホスフェートは、ＣＴＰ依存性反応において、注釈が付いていない（ｎｏｎ−ａｎｎｏｔａｔｅｄ）遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素によって４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される。Ｒｏｈｄｉｃｈらは、上記の反応を触媒する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のタンパク質であるＹｇｂＰについて報告した。最近、ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスター（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号Ｑ４６８９３）の一部としてｉｓｐＤと改名された（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１１７５８−１１７６３  （１９９９））。
【００９０】
次いで、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの２位の水酸基は、ｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる酵素によって、ＡＴＰ依存性反応においてホスフェート化することができる。Ｌｕｔｔｇｅｎらは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールをホスフェート化して４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−ホスフェートを生じる大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のＹｃｈＢタンパク質の存在について報告している。最近、ｙｃｈＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスター（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号Ｐ２４２０９）の一部としてｉｓｐＥと改名された（Ｌｕｔｔｇｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１０６２−１０６７  （２０００））。
【００９１】
Ｈｅｒｚらは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のｙｇｂＢ遺伝子産物が４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−ホスフェートを２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートに変換することを報告した。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートは、カロテノイド生合成経路においてさらにカロテノイドに変換することができる（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：２４８６−２４９０  （２０００））。最近、ｙｇｂＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスター（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号Ｐ３６６６３）の一部としてｉｓｐＦと改名された。
【００９２】
ＹｇｂＰ酵素によって触媒される反応は、ＣＴＰ依存性様式において行われる。従って、ＣＴＰシンターゼは、イソプレノイド経路において重要な役割を果たす。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）においてｐｙｒＧ遺伝子によってコードされるＰｙｒＧは、ＣＴＰシンターゼをコードすることが決定された（Ｗｅｎｇら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６１：５５６８−５５７４  （１９８６））。
【００９３】
未だ特徴付けされていない反応に続いて、イソペンテニルモノホスフェートが形成される。イソペンテニルモノホスフェートは、上記のｙｈｃＢ（ｉｓｐＥ）と同一であるｉｐｋ遺伝子によりコードされるイソペンテニルモノホスフェートキナーゼによって、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ、Ｃ５）に変換される（ＬａｎｇｅおよびＣｒｏｔｅａｕ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１３７１４−１３７１９  （１９９９））。イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）は、ＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼ（ＩＰＰイソメラーゼ、ＥＣ５．３．３．２）またはイソペンテニルジホスフェートイソメラーゼ（ｉｄｉ）によって、ジメチルアリル−ピロホスフェートに異性化される。あるいは、最近の証拠により、ＤＭＡＰＰは、メバロネート非依存性経路の初期の工程で個別に形成され得ること（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｊ．  Ｂａｃ．  １８２  Ｎｏ．  ２０：  ５８４１−５８４８（２０００））およびｌｙｔＢによってコードされる酵素は、ＤＭＡＰＰ形成のこのような代替的経路に必須な役割を果たすことが示唆されている。ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰは、ゲラニルトランストランスフェラーゼ（ｉｓｐＡ）遺伝子によって縮合し（Ｏｈｔｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０  （２），  ３０７−３２１  （１９９９））、モノテルペンシンターゼの基質である直鎖状Ｃ−１０化合物ゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）を生成する。
【００９４】
従って、任意のＣ１代謝体においてＧＰＰの合成に必要な経路のエレメントを調節または設置する必要がある場合、Ｄｘｓ（１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ）、Ｄｘｒ（１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ）、ＩｓｐＤ（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシチジリルトランスフェラーゼ）、ＩｓｐＥ（４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリトリトールキナーゼ）、ＩｓｐＦ（２Ｃ−メチル−ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ）、ＰｙｒＧ（ＣＴＰシンターゼ）、ＩｓｐＡ（ゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシルジホスフェートシンターゼ）およびＬｙｔＢから成る群より選択される当該分野において公知の酵素をコードする遺伝子を、本Ｃ１代謝体宿主細胞において使用することができる。
【００９５】
モノテルペン産生のための組換えＣ１代謝体の構築
適当な環式テルペンシンターゼをコードする遺伝子を適切なメチロトロフィック宿主に導入する方法は一般的である。メチロトロフにおける異種遺伝子の発現に適切な調節配列を含有する微生物発現系および発現ベクターは公知である。これらのいずれをも使用して、上記の任意の環式テルペンシンターゼの発現のためのキメラ遺伝子を構築することができる。次いで、これらのキメラ遺伝子を、形質転換によって適切なメチロトロフ宿主に導入し、高レベルの酵素発現を提供することができる。
【００９６】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットが利用可能である。例えば、プロモーターのいくつかのクラスを、メチロトロフおよびメタノトロフにおいて環式テルペンシンターゼをコードする遺伝子を発現させるために使用することができ、該プロモーターとして、デオキシ−キシルロースホスフェートシンターゼなどの内因性プロモーター、メタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９９８）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １６０：１１９−１２４）、ポリヒドロキシアルカノン酸シンターゼのプロモーター（Ｆｏｅｌｌｎｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （１９９３）  ４０：２８４−２９１）、またはメチロトロフの生来のプラスミドから同定されるプロモーター（ＥＰ  ２９６４８４）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの生来のプロモーターに加えて、例えば、ラクトースオペロンＰｌａｃ（Ｔｏｙａｍａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９７）  １４３：５９５−６０２；  ＥＰ  ６２９７１）またはＰｔｒｃ（Ｂｒｏｓｉｕｓら、（１９８４）  Ｇｅｎｅ  ２７：１６１−１７２）などのハイブリッドプロモーターなどの非生来のプロモーターを使用することもできる。同様に、抗生物質耐性、例えば、カナマイシン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９９８）  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １６０：１１９−１２４；Ｕｅｄａら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９１）  ５７：９２４−９２６）またはテトラサイクリン（米国特許第４８２４７８６号）に関連するプロモーターも適切である。
【００９７】
一旦、特定の調節エレメントが選択されると、プロモーター−遺伝子カセットを、エピソーム発現のためのレプリコン（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  （１９９１）  ６０：４３−４８；Ｕｅｄａら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９１）  ５７：９２４−９２６）かまたは染色体組込みのための相同領域（Ｎａｕｍｏｖら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．  Ｖｉｒｕｓｏｌ．  （１９８６）  １１：４４−４８）のいずれかを含有するプラスミドに対して、メチロトロフに導入することができる。
【００９８】
典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含む。両方の制御領域が形質転換された宿細胞に相同な遺伝子に由来することが最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。
【００９９】
特定のモノテルペンの蓄積を所望する場合、標的経路またはエネルギーもしくは炭素の競合取り込み（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｓｉｎｋ）として役割を果たし得る競合する経路において特定の遺伝子の発現を減少または排除する必要があることがある。この目的のための遺伝子をダウンレギュレーションする方法が探査されている。破壊しようとする遺伝子の配列が既知である場合、遺伝子ダウンレギュレーションのための最も有効な方法の１つは、標的化された遺伝子破壊であり、ここで、転写を破壊するように外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される。このことは、破壊しようとする遺伝子の一部に高度な相同性を有する配列に隣接する挿入すべきＤＮＡ（しばしば、遺伝子マーカーである）を含む遺伝子カセットを作製することによって生じることができる。カセットを宿主に導入することによって、細胞の生来のＤＮＡ複製機構を介して外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される。（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１：４６１７−４６２２、Ｂａｌｂａｓら（１９９３）  Ｇｅｎｅ  １３６：２１１−２１３、Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら（１９９６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４：２５１９−２５２４、およびＳｍｉｔｈら（１９９６）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：２７０−２７７。）
【０１００】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が既知である場合の遺伝子のダウンレギュレーションのもう１つの方法である。これを達成するために、所望の遺伝子由来の核酸セグメントをクローン化し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに操作可能に連結する。次いで、この構築物を宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を産生させる。アンチセンスＲＮＡは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨害することによって、遺伝子の発現を阻害する。当業者であれば、特定の遺伝子の発現を減少するためにアンチセンス技術の使用が特に考慮されることを知っているであろう。例えば、アンチセンス遺伝子の適切なレベルで発現させるには、当業者に既知の異なる調節エレメントを利用して異なるキメラ遺伝子を使用することが必要であり得る。
【０１０１】
標的化された遺伝子の破壊およびアンチセンス技術は、配列が既知である遺伝子をダウンレギュレーションするための効果的な手段を提供するが、この他にも配列には基づかないそれほど特異的ではない方法論も開発されている。例えば、細胞をＵＶ放射に暴露させ、次いで、所望の表現型についてスクリーニングしてもよい。化学薬剤による変異誘発も変異を作製するのに有効であり、通常使用される物質には、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を及ぼす化学物質、ならびにフレームシフト変異が顕著であるアクリジン色素などの複製中のＤＮＡに影響を及ぼす薬剤が含まれる。照射または化学薬剤を使用して変異を作製するための特定の方法については、当該分野において良好に記載されている。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ．，  ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３６，  ２２７，  （１９９２）を参照のこと。
【０１０２】
遺伝子破壊のためのもう１つの非特異的方法は、可動遺伝要素またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入するが、配列に基づいて後で回収し、挿入が生じた場所を決定することができる遺伝子エレメントである。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ転移方法の両方が公知である。両方法ともトランスポザーゼ酵素と組み合わせた可動遺伝要素の使用を要する。可動遺伝要素またはトランスポゾンをトランスポザーゼの存在下で核酸フラグメントと接触させると、可動遺伝要素は核酸フラグメントに無作為に挿入する。破壊された遺伝子は可動遺伝要素の配列に基づいて同定することができるため、該技術は無作為変異および遺伝子の単離に有用である。インビトロ転移のためのキットが市販されている（例えば、Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，  ＮＪより市販、酵母Ｔｙ１エレメントに基づく；Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡより市販；細菌トランスポゾンＴｎ７に基づく；およびｔｈｅ  ＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより市販、Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ、Ｔｎ５細菌可動遺伝要素に基づく；を参照のこと）。
【０１０３】
本発明において、テルペノイド経路において特定の遺伝子を破壊すると特定のモノテルペン類の蓄積が増強され得るが、どの遺伝子を破壊するかを決定するには、経験に基づいて決定する必要がある。候補遺伝子は、１つ以上のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を含むことができ、これは、先に記載のように、イソペンテニルジホスフェートの連続縮合を触媒し、様々な鎖長（複数のＣ−５イソプレン単位）のプレニルジホスフェートが形成される。破壊のための他の候補遺伝子は、テルペノイド骨格であるプレニルジホスフェートに作用するタンパク質をコードするいずれの遺伝子をも含む。
【０１０４】
産業上での製造
本タンパク質の商業的製造を所望する場合、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、バッチまたは連続培養方法論の両方によって、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大規模製造を行うことができる。
【０１０５】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体または複数の生物体を接種し、増殖および代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、最終産物産生の大部分を担うかまたはいくつかの系において中間的である。定常または指数後期産生は他の系で得ることができる。
【０１０６】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加培養プロセスも本発明に適切であり、培養の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ形を構成する。異化産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、培地中の基質量を制限することを所望するならば、流加培養系は有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ．，  ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ３６，  ２２７，  （１９９２）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【０１０７】
本タンパク質の商業的製造は、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、有益な産物、副産物または不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料から成る広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１０８】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調整することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの制限栄養物または一定速度での窒素レベルを維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子は連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は培養物中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスの栄養および増殖因子を調整するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法が上掲のＢｒｏｃｋによって詳述されている。
【０１０９】
本発明の発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な炭素基質は、重要な生化学中間体への代謝返還が実証されているメタンおよびメタノールなどの１炭素基質であり得る。例えば、メチロトロフィック酵母は、メチルアミン由来の炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが公知である（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，  ［Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．］，  ７ｔｈ  （１９９３），  ４１５−３２．  Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎ；  Ｋｅｌｌｙ，  Ｄｏｎ  Ｐ．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，  Ａｎｄｏｖｅｒ，  ＵＫ）。同様に、様々な種のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５３：４８５−４８９  （１９９０））。しかし、本発明において利用される炭素源は広範な炭素含有基質を包含することができ、生物体を選択することによってのみ制限される。
【０１１０】
好適な実施態様の説明
唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンを使用する池堆積物からメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）を単離した。唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンを使用して増殖することが可能なコロニーのうち、迅速な増殖速度およびカロテノイドに対し固有のイソプレノイド経路を示す桃色の色素を対象にメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）株を選択した。
【０１１１】
遺伝子発現プロファイリングならびに確認されている機能的ピロホスフェート連結ホスホフルクトキナーゼ酵素の存在を含むエムデン−マイヤーホフ経路の存在および活性によって、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の炭素フラックス経路を分析した。
【０１１２】
メンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）由来のタンパク質の最初の５７アミノ酸を含まない切断型リモネンシンターゼ遺伝子はｐＲ５８プラスミドから得た。切断型リモネンシンターゼ遺伝子を広範な宿主ベクターｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎにクローン化した。得られたプラスミドｐＤＨ３を、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ヘルパーｐＲＫ２０１３および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ドナーＤＨ１０Ｂ／ｐＤＨ３の新鮮１晩培養物との三親接合交配により、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）に転移した。同様に、ベクターｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎをメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎｓ）に転移した。クローン化方法および三親接合交配は当該分野において周知である。リモネンシンターゼ遺伝子の存在をＰＣＲを使用して確認した。
【０１１３】
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の形質転換された培養物を、揮発性リモネン化合物の消失を防止するために気密瓶中で増殖させた。形質転換されたメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）によって産生された化合物を抽出し、ガスクロマトグラフィーによって分析した。標準リモネンと比較して、化合物をリモネンと確認した。形質転換された培養物から約０．５ｐｐｍのリモネンを検出した。
【０１１４】
実施例
以下の実施例において本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【０１１５】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  （１９８９）  （Ｍａｎｉａｔｉｓ）ならびにＴ．  Ｊ．  Ｓｉｌｈａｖｙ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．  Ｗ．  Ｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８４）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂ．  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）  により記載されている。
【０１１６】
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｒ．  Ｇ．  Ｅ．  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｒａｌｐｈ  Ｎ．  Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，  Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．  Ｗｏｏｄ，  Ｎｏｅｌ  Ｒ．  ＫｒｉｅｇおよびＧ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編），  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ．  （１９９４））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：    Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  （１９８９）に記載の通りに見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｄｅｔｒｏｉｔ，  ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ  （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）より入手した。
【０１１７】
略語の意味は次のようである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【０１１８】
微生物の培養および細胞懸濁液の調製、ならびに関連分析
１６０ｍＬ総容量のＷｈｅａｔｏｎ瓶（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｈｅａｔｏｎ  ＩＬ）中の少なくとも８：１の気体／液体比（即ち、２０ｍＬの硝酸液体培地）の培地を使用して、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）を血清用栓付きＷｈｅａｔｏｎ瓶中で典型的に増殖させる。培養のための標準気体相は空気中に２５％のメタンを含有した。これらの条件は培養条件を含み、細胞を増殖細胞と呼ぶ。すべての場合において、他に特定しない限り、培養は、ｌａｂ−ｌｉｎｅロータリーシェーカー中で一定の振とうを伴い３０℃で増殖させた。
【０１１９】
実験目的で得た細胞を最大光学密度（Ｏ．Ｄ．６６０＝約１．０）まで増殖させた。回収した細胞は、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心分離機中で、６０００ｒｐｍで２０分間ＳＳ−３４ローターを使用して遠心分離によって得た。これらの細胞ペレットを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７中に再懸濁した。これらの細胞懸濁液を洗浄した休止細胞と呼ぶ。
【０１２０】
微生物の増殖は、１ｃｍ光路キュベットを使用し、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｎｇｌａｎｄ）中６６０ｎｍで光学密度を測定することによって、すべての実験において評価した。あるいは、上記のように遠心分離により培養培地から細胞を回収し、蒸留水中に細胞を再懸濁し、２回目の遠心分離で培地の塩を除去することによって、微生物の増殖を評価した。次いで、洗浄した細胞を、乾燥重量決定のために乾燥オーブン中、１０５℃で１晩乾燥した。
【０１２１】
メタンの濃度は、Ｅｍｐｔａｇｅら（１９９７  Ｅｎｖ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：７３２−７３４）（本明細書において参考として援用される）により記載の通りに決定した。
【０１２２】
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の硝酸培地
「規定培地」とも呼ばれる硝酸液体培地は、下記の溶液１と混合された様々な塩から成り、またはここで特記した場合、硝酸を１５ｍＭ塩化アンモニウムに置き換えた。
【０１２３】
【表２】
2005500805.tif 000005
【０１２４】
【表３】
2005500805.tif 000006
【０１２５】
硝酸塩および亜硝酸塩アッセイ
１ｍＬの細胞培養物サンプルを採取し、０．２ミクロンのＡｃｒｏｄｉｓｃフィルターでろ過し、細胞を取り出した。この工程のろ過物は、分析すべき亜硝酸塩または硝酸塩を含有する。この分析は、ＡＳ３５００オートサンプラーによりＤｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフ５００システム（Ｄｉｏｎｅｘ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上で実施した。使用したカラムは、ＡＧ−ＡＣガードカラムおよびＡＴＣトラップカラムを有する４ｍｍＩｏｎ−Ｐａｃ  ＡＳ１１−ＨＣ分離カラムであった。カラムはすべてＤｉｏｎｅｘより提供される。
【０１２６】
移動相は、水酸化カリウムであり、１２分間隔の０〜５０ｍＭ水酸化カリウム勾配であった。細胞温度は１ｍＬ／分の流速で３５℃であった。
【０１２７】
遺伝子発現のマイクロアレイ
ＤＮＡ構築のためのＤＮＡ領域の増幅
マイクロアレイ：
特異的プライマー対を使用して、メチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １６ａ）株のＯＲＦを特定するそれぞれのタンパク質を増幅した。ゲノムＤＮＡ（１０〜３０ｎｇ）をテンプレートして使用した。ＰＣＲ反応はＨｏｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）およびｄＮＴＰ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）の存在下で実施した。９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で２分間の重合の３５サイクルを行った。１％アガロースゲルの電気泳動でＰＣＲ反応の質を確認した。ＤＮＡサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ製高スループットＰＣＲ精製キットによって精製した。
【０１２８】
増幅されたＯＲＦの整列
整列の前に、等容量のＤＭＳＯ（１０μＬ）およびＤＮＡ（１０μＬ）サンプルを３８４ウェルマイクロタイタープレート内で混合した。ジェネレーションＩＩ  ＤＮＡスポッター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を使用して、コートされたガラススライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）上でサンプルを整列した。それぞれのＰＣＲ産物を２回繰り返してそれぞれのスライドに整列した。ＵＶ光による架橋後、スライドを減圧下、デシケーター中、室温で貯蔵した。
【０１２９】
ＲＮＡの単離：
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）を、窒素源としてアンモニウムまたは硝酸塩（１０ｍＭ）を含む規定培地中、空気中２５％メタン下で培養した。Ｏ．Ｄ．がＡ６００で０．３（指数期）に達するとき最小培地培養物のサンプルを回収した。細胞培養物を迅速に回収し、ビーズ−ビーター（Ｂｉｏ１０１，  Ｖｉｓｔａ，  ＣＡ）を伴うＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）中で破砕した。破砕物を、３分間、１４，０００×ｇ、４℃での遠心分離によりペレット化した。ＲＮＡの単離は、このキットより供給されているプロトコルを使用して完了した。カラム上でのＤＮＡアーゼ処理後、５０〜１００μＬのＲＮＡアーゼ−フリーでＲＮＡ産物を溶出させた。ＲＮＡ調製物を−２０または−８０℃のいずれかで冷凍貯蔵した。
【０１３０】
全ＲＮＡ由来の蛍光ｃＤＮＡの合成
ＲＮＡサンプル（７〜１５μｇ）およびランダムヘキサマープライマー（６μｇ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＲＮＡアーゼを含まない水で希釈して、容積を２５μＬとした。サンプルを７０℃で１０分間変性し、次いで、氷上で３０秒間冷却した。１４μＬの標識混合物を添加した後、室温で１０分間のインキュベーションによって、アニーリングを達成した。標識混合物は、８μＬの５×酵素緩衝液、４μＬ  ＤＴＴ（０．１Ｍ）、および２μＬの２０×染料混合物を含有した。染料混合物は、２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ、１ｍＭ  ｄＧＴＰ、ならびに１ｍＭのＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰから成る。１〜１．５μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（２００単位／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を添加後、ｃＤＮＡの合成を４２℃で２時間進行させた。２μＬのＮａＯＨ（２．５Ｎ）を反応物に添加することによりＲＮＡを除去した。３７℃で１０分間のインキュベーション後、１０μＬのＨＥＰＥＳ（２Ｍ）でｐＨを調整した。次いで、標識したｃＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）で精製した。Ｃｙ３取り込みに対するＡ５５０またはＣｙ５に対するＡ６５０のいずれかを使用して、標識効率をモニターした。
【０１３１】
ゲノムＤＮＡの蛍光標識
ゲノムＤＮＡをネブライザー処理して約２ｋｂ対のフラグメントにした。ゲノムＤＮＡ（０．５〜１μｇ）を１５μＬの水中で６μｇのランダムヘキサマーのプライマー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。混合物を沸騰水に５分間置くことによって変性させた。次いで、室温に置く前に氷上で３０秒間アニーリングする。次いで、２μＬ５×緩衝液２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および２μｌの染料混合物を添加した。染料混合物の成分および標識手順は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（５μｇ／μＬ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を酵素として使用したことを除いて、ＲＮＡ標識について先に記載されている通りである。３７℃で２時間のインキュベーション後、標識したＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）で精製した。
【０１３２】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄
最初に、スライドを、３．５×ＳＳＣ（ＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、０．１％ＳＤＳ（ＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ，  Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含有するプレハイブリダイゼーション溶液と共にインキュベートした。プレハイブリダイゼーション後、標識したプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）をスライドに添加し、カバースリップを被せた。スライドは、４２℃インキュベーター中の加湿チャンバ内に置いた。１晩のハイブリダイゼーション後、最初にスライドを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液により５分間、室温で洗浄した。次いで、同溶液で、６５℃で１０分間、３回洗浄した。洗浄後、スライドを窒素気体のスチームで乾燥した。
【０１３３】
データの回収および分析
レーザースキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）により、各スライドから発生したシグナルを定量した。画像は、ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ  ４．０ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）により分析した。各スポットの生蛍光強度は、バックグランドを差し引くことによって調整した。これらの読み取り値はさらなる分析のためにスプレッドシートにエキスポートした。
【０１３４】
実施例１
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の単離
単離物を含有する本来の環境サンプルは池堆積物から入手した。池堆積物を、空気中２５％メタン下で窒素源としてアンモニウムを含む規定培地に直接接種した。メタンは、唯一の炭素およびエネルギー源であった。６６０ｎｍでの光学密度が安定するまで増殖を追跡し、ここで、１：１００希釈が達成されるように、培養物を新鮮培地に移した。唯一の炭素およびエネルギー源としてのメタンで連続３回移した後、窒素源としてアンモニウムを含む増殖寒天上にプレート化し、空気中２５％メタン下でインキュベートした。多くのメタノトロフィック細菌種をこの方法で単離した。しかし、コロニーの迅速な増殖、大きなコロニーサイズ、最小培地上で増殖する能力、およびカロテノイドの活性な生合成経路を示す桃色の色素のため、研究のための生物体として、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）を選択した。
【０１３５】
実施例２
最小培地中のメタンに対する迅速増殖
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）は、最小塩を含む規定培地、空気中メタンを含む培養ヘッドスペース上で培養する。しかし、増殖のためのメタン濃度は、典型的に、培養ヘッドスペースの５〜５０容量％である。図５に示すように、増殖を達成するのに、酵母抽出物などの有機添加物またはビタミンは不要である。図５は、同一の増殖条件（即ち、基質として空気中２５％メタンを含む最小培地）下でメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）の増殖と比較した１６ａの増殖を示す。データは、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）は２〜２．５時間ごとに倍加するが、メチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）は基質としてのメタンにより３．５時間ごとに倍加する。基質としてメタノールを使用すると、メタノールに対する倍加時間は、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）では２．５〜３およびメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）では４．５〜５である。細胞密度も、メタン上で増殖するメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の方が有意に高い。メチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）は、実験および商業目的で広範に利用されるメタノトロフである。
【０１３６】
実施例３
エムデン−マイヤーホフ経路と比較したエントナー−ドゥドロフ経路における遺伝子発現レベルの比較
実施例３は、１６ａ株におけるエムデン−マイヤーホフ経路の使用に対するマイクロアレイの証拠を示す。
【０１３７】
図６は、エントナー−ドゥドロフ経路とエムデン−マイヤーホフ経路に対する遺伝子の発現の相対レベルを示す。先に記載のＤＮＡマイクロアレイによって、それぞれの遺伝子の相対転写活性を予想した（Ｗｅｉら、２００１．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．  １８３：５４５−５５６）。
【０１３８】
具体的には、メチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １６ａ）株の４０００個のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含有する単一のＤＮＡマイクロアレイを、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡから作製したプローブとハイブリダイズさせる。１６ａのゲノムＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントおよび蛍光染料Ｃｙ−５で標識し、全ＲＮＡは逆転写酵素およびＣｙ−３で標識した。ハイブリダイゼーション後、アレイの各スポットに対するＣｙ−３およびＣｙ−５両方のシグナル強度を定量した。次いで、Ｃｙ−３とＣｙ−５との強度比を使用し、次の式でそれぞれの転写の分数を（百分率で）算出した：（遺伝子比／すべての比の合計）×１００。得られる数値は、個々の遺伝子のｍＲＮＡの相対量を反映する。従って、アレイによって表されるすべての遺伝子の転写活性は、相対的ｍＲＮＡ量に基づいて多い順から格付けすることができる。例えば、メタンモノオキシゲナーゼのｍＲＮＡ量は、生物体が炭素源としてのメタンで増殖する場合にその遺伝子が最も高い転写活性を有することから、１番に格付けされた（図６）。
【０１３９】
エントナー−ドゥドロフに対する「診断可能」と思われる遺伝子は、６ホスホグルコネートデヒドラターゼおよび２ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコネートアルドラーゼである。ホスホフルクトキナーゼおよびフルクトースビスホスフェートアルドラーゼは、エムデン−マイヤーホフ配列に対して「診断可能」である。図６において各工程の隣に付してある番号は、酵素の相対的発現レベルを示す。例えば、細胞において最も高度に発現された酵素はメタンモノオキシゲナーゼである（１番に格付けされた）。次に最も高度に発現された酵素はメタノールデヒドロゲナーゼである（２番に格付けされた）。ホスホフルクトキナーゼ（２３２番に格付けされた）およびフルクトースビスホスフェートアルドラーゼ（６５番に格付けされた）のメッセンジャーＲＮＡ転写物は、グルコース６ホスフェートデヒドロゲナーゼ（７１７番に格付けされた）、６ホスホグルコネートデヒドラターゼ（７６３番に格付けされた）または２−ケト−３−デオキシ−６−グルコネートアルドラーゼよりも量が多い。データは、エムデン−マイヤーホフ経路の酵素は、エントナー−ドゥドロフ経路の酵素よりも強力に発現されることを示唆している。この結果は驚くべきことであり、メタノトロフィック細菌の中心的代謝に関する現在の知見（参考図書のページ：Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５．  １９９２．  Ｅｄｓ．：Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ．  １４９−１５７頁）に反する。
【０１４０】
実施例４
ピロホスフェート連結ホスホフルクトキナーゼの直接的酵素的証拠
実施例４は、本株においてピロホスフェート連結ホスホフルクトキナーゼ酵素が存在する証拠を示し、これにより本株のエムデン−マイヤーホフ経路の機能性が確認される。
【０１４１】
下記の結合酵素アッセイを使用することによって、ホスホフルクトキナーゼ活性がメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）に存在することを明らかにした。以下の表２にアッセイ条件を示す。このアッセイをさらに使用して、表３に示す他の多くのメタノトロフィック細菌の活性をアッセイした。表３のデータは、ホスホリル供与体としてのＡＴＰまたはピロホスフェートによってホスホフルクトキナーゼ活性について試験した既知のＡＴＣＣ株を示す。これらの生物体は、タイプＩまたはタイプＸリブロースモノホスフェート利用株またはタイプＩＩセリン利用体のいずれかに分類された。
【０１４２】
結合アッセイ反応
結合酵素アッセイによってホスホフルクトキナーゼ反応を測定した。ホスホフルクトキナーゼ反応を、１，６ビスホスフェートアルドラーゼ、続いてトリオースホスフェートイソメラーゼに結合させた。ＮＡＤＨの消失によって酵素活性を測定した。
【０１４３】
具体的には、酵素ホスホフルクトキナーゼは、フルクトース６ホスフェートおよびピロホスフェートをフルクトース１，６ビスホスフェートおよびオルトホスフェートに変換する主な反応を触媒する。フルクトース−１，６−ビスホスフェートは、フルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼによって、３−ホスホグリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンホスフェートに切断される。ジヒドロキシアセトンホスフェートは、トリオースホスフェートイソメラーゼによって、３−ホスホグリセルアルデヒドに異性化される。グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ＋ＮＡＤＨおよび３−ホスホグリセルアルデヒドは、アルコールグリセロール−３−ホスフェートおよびＮＡＤを生じる。ＮＡＤＨの消失は、分光光度計（ＵｌｔｒａＳｐｅｃ  ４０００，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、３４０ｎｍでモニターする。
【０１４４】
【表４】
2005500805.tif 000007
【０１４５】
【表５】
2005500805.tif 000008
【０１４６】
上記のデータからいくつかの結論を導き出すことができる。第１に、（ホスホフルクトキナーゼの典型的なホスホリル供与体である）ＡＴＰは、メタノトロフィック細菌のホスホフルクトキナーゼ反応において本質的に非効率的であることが明らかである。無機ピロホスフェートのみが試験したすべてのメタノトロフにおける反応を支持することが見出された。第２に、すべてのメタノトロフがこの活性を含有するわけではない。この活性は、メチロバクター・ウィッテンバリー（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｗｈｉｔｔｅｎｂｕｒｙ）およびメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）には本質的に存在しない。活性の中間レベルは、メチロモナス・クララ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｃｌａｒａ）およびメチロシヌス・スポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｓｐｏｒｉｕｍ）において見出された。これらのデータは、多くのメタノトロフィック細菌がこれまで報告されていなかったホスホフルクトキナーゼ活性を含有し得ることを示す。このことから、この活性を含有するメタノトロフは、活性なエムデン−マイヤーホフ経路を有することが推測され得る。
【０１４７】
実施例５
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）による増殖収量および炭素変換
増殖収量および炭素変換効率を、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）およびメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）について比較した。１６ａは高レベルのホスホフルクトキナーゼを含有し、Ｍ．キャプスラツス（Ｍ．  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）は本質的に該酵素活性を含まないため、これらの株を選択した。メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）は、よりエネルギー的に好ましいエムデン−マイヤーホフ経路を利用し得、メチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）はエントナー−ドゥドロフ経路のみを使用し得る場合、細胞収量および炭素変換効率において本メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）のより上位のエネルギー論に反映されることを考慮した。エネルギー効率におけるこの差は、エネルギー制限条件下でのみ明らかである。これらの条件は、各培養物中の酸素量を２０％ではなく僅か１０％にまで制限することによって、本実験において達成した。これらの酸素制限条件下で、メタンに対する好気的呼吸から最もエネルギーを産生する株は、より多くの細胞塊を産生する。
【０１４８】
細胞は、血清用栓付きＷｈｅａｔｏｎ瓶中２００ｍＬ培養物として増殖させた。瓶内のヘッドスペースを２５％メタンおよび１０％酸素に調整した。規定培地の処方は両方とも同じである。
【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
収量の測定：
収量は、酸素制限下、窒素源としてアンモニウムを有する規定培地上で５００ｍＬ瓶中、培養物を３回繰り返して増殖させることによって、測定した。これは、２５％メタンおよび１０％酸素（残りは窒素）の３００ｍＬヘッドスペースを有する３００ｍＬの培養物を使用することによって行った。増殖の終了時（即ち、定常期）に、ヘッドスペース内の残りのメタンは、ガスクロマトグラフィーによって測定した。細胞を遠心分離によって回収し、蒸留水で洗浄し、秤量前に乾燥オーブン内で１晩乾燥させた。
【０１５１】
炭素変換効率は、どれだけ多くの炭素が細胞塊に同化されるかを示す測定値である。バイオマス組成をＣＨ２Ｏ０．５Ｎ０．２５と仮定して算出する：
メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）：１６ｇ／モル  メタン×（１ｇ乾燥重量／ｇ  メタン）／２５ｇ／モル  バイオマス
Ｍ．キャプスラツス（Ｍ．  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）：１６ｇ／モル  メタン×（０．６４ｇ乾燥重量／ｇ  メタン）／２５ｇ／モル  バイオマス
【０１５２】
これらのデータ（表４中）は、温度を除いて同一の増殖条件下でメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）が、メチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）株よりも有意に多くの細胞塊を産生することを示す。メチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）は、４５度で最適に増殖するが、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）は３３℃で増殖する。データから、よりエネルギー収量の高いエムデン−マイヤーホフ経路が存在するためメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の方が有利であることが推測され得る。
【０１５３】
表５は、すべての場合において炭素出力量をピルベートに正規化し、酸素同化経路の関数としてＡＴＰ収量を示す理論算出値を示す（Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｇｒａｍ−  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｉｎ：  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈａｎｏｌ  Ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ５．  １９９２．  Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ．  １４９−１５７頁）。表５は、セリンサイクル、キシルロースモノホスフェートサイクルおよびリブロースモノホスフェートサイクル経路について（ホルムアルデヒドまたは二酸化炭素として）３分子の炭素ごとに産生されるかまたは消費されるＡＴＰの量を示す。後者の経路は、考察されているように、典型的に２−ケト−３デオキシ−６−ホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ（ＫＤＰＧ／ＴＡ）の変異体として存在すると思われる。これらのデータは、事実、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ／トランスアルドラーゼ（ＦＢＰＡ／ＴＡ）の変異体がメタノトロフに存在する可能性があることを示す。メタノトロフがＡＴＰ連結ホスホフルクトキナーゼおよびピロホスフェート連結酵素についてさらなる２ＡＴＰを有する場合、これに対するエネルギー的影響は、メタノトロフについてのさらなる１ＡＴＰの正味の産生である。従って、メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）は、同化された３炭素あたりさらなる２ＡＴＰを誘導すること、ならびにこのことからメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）に対し該株の収量および炭素効率が高いことを説明できると予想される。
【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
実施例６
プラスミドの構築
プラスミドｐＲ５８は、酵素の最初の５７アミノ酸の欠失を担持するメンタ・スピカタ（Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）リモネンシンターゼ遺伝子を含有する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，  ３７，  １２２１３−１２２２０）。ｐＲ５８を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨ１で消化し、切断型リモネンシンターゼを放出した。１６３８塩基対の遺伝子を、アガロースゲル電気泳動およびＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２００２１）によって精製した。４塩基対の５’突出部（５’−ＴＡＴＧ−３’）ギャップを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、カタログ番号１８００５−０１７）を使用して充填し、生来の遺伝子の５８番目のアミノ酸に対応するアルギニンコドンのすぐ前に、メチオニン開始コドンを維持した。同時に、３’ＢａｍＨ１突出部を、生来のリモネンシンターゼ終止コドンを中断させることなく、同酵素で充填した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用して、平滑末端インサートを精製した。
【０１５６】
ベクターｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎは、カナマイシン耐性ならびに２つの目的のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）遺伝子：５’デオキシ−Ｄ−キシルロースシンターゼをコードするｄｘｓおよび５’デオキシ−Ｄ−キシルロースレダクトイソメラーゼをコードするｄｘｒを含むように改変された広範な宿主範囲のプラスミド（Ｊ．  Ｂａｃｔ．，  １６４，  ４４６−４５５）であるＲＫ２の誘導体である。このベクターを、ＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出部を平滑化し、仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で脱リン酸化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム上で精製することによって、連結反応用に調製した。
【０１５７】
リモネンシンターゼ遺伝子挿入物をベクターに連結し、大腸菌エレクトロＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｅｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ）細胞（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）にエレクトロポレートした。ｐＤＨ３と命名された得られたプラスミドは、ｄｘＳに５’末端上でおよびｄｘＲに３’末端上で隣接するリモネンシンターゼ遺伝子を含有する（図１）。
【０１５８】
プラスミドｐＤＨ３を、三親接合交配によってメチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １６ａ）に移した。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ヘルパーｐＲＫ２０１３および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ドナーＤＨ１０Ｂ／ｐＤＨ３の新鮮１晩培養物を、カナマイシンを有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）中で増殖させたベクター（ｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎ）コントロールと共に補充物を含まないＬＢ中で３回洗浄し、本来の培養容量の約６０倍濃度を示す１容量のＬＢに再懸濁した。メチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１６ａ）のリファンピシン耐性継代培養物（１６ａＡと命名した）であるレシピエント細胞を、２５％メタン下、リファンピシン（５０μｇ／ｍＬ）を有するＢＴＺ−３（表１）中で４８時間増殖させ、ＢＴＺ−３で３回洗浄し、本来の培養容量の約１５０倍を示す１容量のＢＴＺ−３に再懸濁した。得られたドナー、ヘルパー、およびレシピエント細胞ペーストを、それぞれ１：１：２の割合で０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物を含有するＢＴＺ−３アガープレートの表面上に結合させた。プレートを１６〜２４時間２５％メタンに維持し、接合を生じさせた。細胞ペーストを回収し、ＢＴＺ−３に再懸濁した。連続希釈物を、リファンピシン（５０μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＢＴＺ−３アガー上にプレート化した。得られたコロニーを新たな選択プレートにパッチングした。次いで、２回成長させたコロニーを、リファンピシン（５０μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む液体ＢＴＺ−３に移した。それぞれリモネンシンターゼのＮ末端およびＣ末端にアニールするプライマーの組５’−ａｔｇａｇａｃｇａｔｃｃｇｇａａａｃｔａｃａａｃｃｃ−３ ’（配列番号１）および５’−ｔｃａｔｇｃａａａｇｇｇｃｔｃｇａａｔａａｇｇｔｔｃｔｇｇ−３ ’（配列番号２）を使用するＰＣＲによって、１６ａ接合体中のリモネンシンターゼ遺伝子の存在を確認した。プライマーの組５’−ａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃ−３ ’（配列番号３）および５’−ａａｇｃｔｔｔｃａａａａｇａａｃｔｃｇｔｃ−３ ’（配列番号４）を使用して、コントロールとしてカナマイシン耐性遺伝子を検出した。
【０１５９】
実施例７
リモネンの検出
メチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  １６ａ）トランス接合体の液体培養物を、リファンピシン（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および２５％メタンを補充したＢＴＺ−３中、気密瓶中で約４８時間増殖させた。培養容器の内容物を、リモネンを対象に回収し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によって分析した。簡単に説明すると、ヘッドスペースおよび液体の両方からリモネンを抽出するために隔膜を介して酢酸エチルを注入した。サンプルを５分間撹拌し、適切な遠心管に移し、遠心分離して有機相および水相の完全な分離を達成する。有機相を取り出して、ＤＢ−１カラム（３０Ｍ／０．２５ＩＤ／０．２５フィルム厚、Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｆｏｌｓｏｍ，  ＣＡ）に充填した。
【０１６０】
最初のオーブン温度は５０℃に設定し、１分間あたり１０℃の速度で温度を２５０℃まで上昇させた。２５０℃で５分後、サンプルをカラムに注入した。隔膜パージを１分間あたり２．４ｍＬの速度で１分間適用した。８ｐｓｉの上部圧力および１分間あたり２４．５ｍＬの流速で作動させた。標準物質として使用したリモネンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号１８，３１６−４）より購入した。ＧＣ／ＭＳによって分析したサンプルは、ＧＣのみで分析したサンプルと同一であった。ＧＣ／ＭＳ装置の型：ＰｒｏＳｐｅｃ。ソースタイプ：結合型ＥＩ／ＣＩ  ＳＲＣ。電子エネルギー：６９．０ｅＶ。電子増倍管の電圧：Ｎｏ．１：１９８．６Ｖ、Ｎｏ．２：２５０．０Ｖ、Ｎｏ．３：２５０．０Ｖ、Ｎｏ．４：２５０．０Ｖ。放出電流：０．０ｍＡ。トラップ電流：４４４．１μＡ。イオン反射電極：５．７Ｖ。ソース温度：２２５．３℃。抽出ヒーターの電流：０．０ｍＡ。スリット基準：ソース：４７．８％、コレクター：５０．４％、アルファ：１００％、Ｚ２制限：０．０％、Ｚ３制限：０．０％、Ｚ４制限：０．０％。レンズ基準：イオンエネルギー：１．４、焦点Ｎｏ．１：２．２Ｖ、ビーム中心：−４８．７Ｖ、焦点Ｎｏ．２：５．８Ｖ、Ｙ−焦点：４．４Ｖ、Ｙ−解像度Ｎｏ．１：−８８．０Ｖ、Ｚ−解像度Ｎｏ．１：７．５Ｖ、回転Ｎｏ．１：０．０Ｖ、Ｚ−解像度Ｎｏ．２：−１２．６Ｖ、Ｚ−焦点Ｎｏ．２：６．０Ｖ、回転Ｎｏ．２：−１３．６Ｖ、曲線Ｎｏ．２：−４．０Ｖ、曲線Ｎｏ．３：−８．６Ｖ、回転Ｎｏ．３：−９．０Ｖ、Ｚ−焦点Ｎｏ．３：９．３Ｖ、Ｚ−解像度Ｎｏ．３：０．０Ｖ、回転Ｎｏ．４：０．０Ｖ。磁気パラメータ：ＩＭＲ１１６０．１６、標準コイル。不変パラメータ。ＨＰ６８９０ＧＣパラメータ：自動再開始、キャピラリーライン温度（１）：２４０．０℃、キャピラリーライン温度（２）：２４０．０℃、凹部温度：２４０．０℃、最大オーブン温度：３２５．２℃、平衡時間：０．２分間、オーブン温度ランプ：温度Ｎｏ．１：５０．０℃、時間Ｎｏ．１：１．０分間、速度Ｎｏ．１：１０．０℃／分、温度Ｎｏ．２：２００．０℃、時間Ｎｏ．２：１．０分間、速度Ｎｏ．２：１０．０℃／分、温度Ｎｏ．３：２５０．０℃、時間Ｎｏ．３：１０．０分間、速度Ｎｏ．３：０．０℃／分。注入器：「Ａ」：活性、注入器「Ａ」温度：２７０．０℃、注入のタイプ：スリットレス、パージ「Ａ」時間：１．０分、パージ「Ａ」の流速：１．０ｍＬ／分、コル１定流速度：１．０ｍＬ／分。「Ｂ」：活性、注入のタイプ：コル上冷却、「Ｂ」注入器温度ランプ：温度Ｎｏ．１：５０．０℃、時間Ｎｏ．１：６５０．０分、速度Ｎｏ．１：０．０℃／分、コル１定流速度：２．０ｍＬ／分。
【０１６１】
リモネンシンターゼ遺伝子を収容したメチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  １６ａ）は、リモネン（約０．５ｐｐｍ）を算出した。ＧＣ分析では、これらの抽出物のクロマトグラフは、リモネン標準物と重複するピークを示す（図２）。予想される通り、メチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  １６ａ）単独またはベクターｐＴＪＳ７５：ｄｘＳ：ｄｘＲ：Ｔｎ５Ｋｎを含有するメチロモナスｓｐ．１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  １６ａ）は検出可能なリモネンをまったく産出しなかった。ＧＣ／ＭＳによって、リモネンの有無をさらに確認した。ＧＣ由来のリモネンのピークは、６８でのサインピークを有するリモネン標準物と同一なフラグメント化パターンを生じ、分子量（ＭＷ）は１３６と予測された。産生レベルは２つのアッセイで同程度であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】切断型リモネンシンターゼ遺伝子を含有するｐＴＪＳ７５：ｄｘｓ：ｄｘｒ：Ｔｎ５Ｋｎプラスミドの地図を示す。
【図２】メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）培養物中に産生されたリモネンのガスクロマトグラフィー分析を示す。
【図３】ゲラニルジホスフェートから誘導されるモノテルペン類の例を示す。
【図４】上流イソプレノイド経路を例示する。
【図５】同一の増殖条件下でメチロコッカス・キャプスラツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）の増殖と比較したメチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）の増殖を示す。
【図６】メチロモナス１６ａ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  １６ａ）におけるエントナー−ドゥドロフおよびエムデン−マイヤーホフ経路のスキームであって、発現レベルが高い順に番号で格付けされたマイクロアレイ発現の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2005500805.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500805.tif 000080
2005500805.tif 000081
【国際調査報告】
2005500805.tif 000082
2005500805.tif 000083
2005500805.tif 000084
2005500805.tif 000085
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