(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明で開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの調節を行なうTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を開示する。本発明はまた、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、などのような関連障害にもまた関連する、診断、研究、予防、および疾患と障害の治療におけるこれらの配列の使用に関連するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリ、またはそれによってコードされたポリペプチド、または断片または当該核酸分子の変異型、または転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリ、またはそれによってコードされたポリペプチドを、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)アジュバントと共に認識する当該ポリペプチドまたは抗体、アプタマーまたは別の受容体から成る医薬組成品。
【請求項２】
核酸分子が、脊椎動物または昆虫Trp1、MCT、またはFtz-F1核酸、Trp1(GenBankアクセッション番号NM＿003262)、MCT(例えば、GenBankアクセッション番号NP＿037488、Genbankアクセッション番号NP＿004686、またはGenBankアクセッション番号AC040977)、またはFtz-F1(GenBankアクセッション番号NM＿003822、GenBankアクセッション番号AF146343に由来する;またはGenBankアクセッション番号NM＿004959、GenBankアクセッション番号U76388に由来する)、またはショウジョウバエ核酸のようなGenBankアクセッション番号Z38100;配列識別番号1、GenBankアクセッション番号M63711、またはM98397のような、特にヒトTrp1、MCT、またはFtz-F1核酸である、請求項1に記載の成分。
【請求項３】
当該核酸分子が下記を行う場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  66℃にて0.2 x SSCおよび0.1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んでいる溶液において、SPTREMBLアクセッション番号Q24559、配列識別番号2、GenBankアクセッション番号AAA28542、またはGenBankアクセッション番号AAA28915のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補鎖に対して;またはGenBankアクセッション番号NM＿003262(Trp1);NP＿037488(MCT3);NP＿004686(MCT5);NP＿003813(FTZ-F1)またはNP＿004950.2(FTZ-F1)から選択されたヒト相同性核酸分子に対してハイブリタイズする場合;
(b)  (a)の核酸分子に対して縮重する場合;
(c)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で99.6％まで、SPTREMBLアクセッション番号Q24559、配列識別番号2、GenBankアクセッション番号AAA28542、またはGenBankアクセッション番号AAA28915のアミノ酸配列に同一のポリペプチド、またはGenBankアクセッション番号NM＿003262(Trp1);NP＿037488(MCT3);NP＿004686(MCT5);NP＿003813(FTZ-F1)またはNP＿004950.2(FTZ-F1)から選択されたヒト相同性タンパク質に同様の％で同一のポリペプチドをコードする場合;
(d)  突然変異によって(a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となる場合。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の成分。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドををコードし、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与する、請求項1〜4の任意の1項の成分。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である、請求項1〜5の任意の1項の成分。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の成分。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の成分。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の成分。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーション プローブ、プライマーおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドから選択される請求項1〜7の任意の1項の成分。
【請求項１１】
診断用成分である、請求項1〜10の任意の1項の成分。
【請求項１２】
医療用成分である、請求項1〜10の任意の1項の成分。
【請求項１３】
体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患と障害のほかに、細胞障害、細胞塊、器官および(または)被験者における、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための検出用および(または)検証用の薬剤の製造のための請求項1〜12の任意の1項の組成物。
【請求項１４】
転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドまたは抗体の変異型、アプタマーまたは、転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリーまたは転移タンパク質モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体相同性ポリペプチドを制御するためにそれによってコードされたポリペプチドを認識する別の受容体の使用法。
【請求項１５】
転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドまたは抗体の変異型、アプタマーまたは、転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリーまたはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するため、それによってコードされたポリペプチドを認識する別の受容体の使用法。
【請求項１６】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドの発現が増大または減少した請求項16の動物。
【請求項１８】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与するポリペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a)  Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドまたはその断片を用い、当該(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下(ポリ)ペプチドの回収に接触するステップ。
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドまたはその断片に結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチド、またはその断片またはその断片;
(ab)当該Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤;および
(ac)候補薬剤
下記参照の親和性にて当該Trp1、MCT、またはFtz-F1ポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下;
(b)(候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該Trp1、MCT、および(または)Ftz-F1ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出する;および
(c)(候補)薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する、請求項20の方法によって識別された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって識別された薬剤、を含む組成物を産出する方法。
【請求項２３】
当該成分が、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患のほかに、肥満症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸などに関連する疾患と障害を予防、軽減または治療するための医薬品成分である請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項20に記載の方法によって同定されたポリペプチドの使用法または、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患と障害のほかに、細胞障害、細胞塊、器官および(または)被験者における、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品成分の調製(調合)に対して請求項21に記載の方法によって同定された薬剤。
【請求項２５】
Trp1、MCT、またはFtz-F1遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備(preparation)のための転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体ファミリーまたはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２６】
下記の最低1つを備えたキット。
(a)  Trp1、MCT、またはFtz-F1核酸分子またはその断片;
(b)(a) の核酸を含むベクター;
(c)(a) の核酸または (b) のベクターを含む宿主細胞;
(d)(a) の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)(a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)(a) の核酸または (d) または (e) のポリペプチド に対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)(a) の核酸の抗センス オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の核酸とアミノ酸配列の使用に関連するものであり、また、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患と障害のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害の診断、研究、予防と治療におけるこれらの配列の使用に関連するものである。
【０００２】
肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の１つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満症は体脂肪過多として特定され、多くの場合、深刻な健康障害を招く。肥満症に悩む人は、糖尿病、高血圧症および心臓病のような病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。ヒトの肥満症は、環境的要因および遺伝的要因によって強く影響され、そのために環境的な影響が多くの場合に(ヒト)肥満症の遺伝子同定の障害物となっている。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響される。このような事情から、肥満症は、持続的な良い臨床結果を達成するためには、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合体障害と言える。肥満した人のかかりやすい病気には以下が含まれる:真性糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸。
【０００３】
肥満症は単一障害と考慮されるべきでなく、潜在的に複数の原因をともなう異種の条件群から成る障害と考慮されるべきである。また、肥満症は、空腹時血漿インシュリンの上昇およびグルコースの経口摂取に対する過度なインシュリン反応を特徴とし(Koltermann、J. Clin. Invest 65、1980、1272〜1284)、2型真性糖尿病における明らかな肥満症の介入が確認されている(Kopelman、Nature 404、2000、635〜643)。
【０００４】
たとえいくつかの、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような、体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満調節または重/重量調節に影響を及ぼす、特有の分子機構および(または)分子は、知られていない。
【０００５】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【０００６】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関与する、特定の遺伝子体重の調節を開示し、無秩序に、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧症、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば、生殖器官の癌、および睡眠時無呼吸などに関連する。本発明では、ヒト転移タンパク質1(Trp1)、モノカルボン酸トランスポーター(MCT)、および核ホルモン受容体1(FTZ-F1)遺伝子が上述した条件に関与しているものとして記載されている。
【０００７】
キイロショウジョウバエ遺伝子Trp1(転移タンパク質1)は、小胞体膜における輸送タンパク質複合体(トランスコロンと呼ばれる)中の保存機能の成分であり、保存機能を有する。ショウジョウバエTrp1遺伝子は、酵母菌小胞体の膜結合転移タンパク質Sec62pの構造および機能的相同体であるタンパク質をコードする。ショウジョウバエの成長の間中のTrp1遺伝子の発現は、成虫のmRNA蓄積の継続期間に先立つ、中期胚発生および中期蛹態期におけるピークを特徴とする(Noel P.およびCartwright I. L、1994、EMBO J 13(22):5253-5261)。ヒトcDNA HTP1 (ヒト転移タンパク質1用)は、Sec62pのショウジョウバエ相同体、ショウジョウバエ転移タンパク質1(Trp1)に対して36.3％同一(64.6％類似)の399アミノ酸のタンパク質をコードする。HTP1転写物は、心臓、脳、胎盤、肝臓およびすい臓のような種々のヒト組織において発現される(Daimon M.らの1997、Biochem Biophys Res Commun 230(1):100-104)。
【０００８】
モノカルボン酸トランスポーター(MCT)は、乳酸、ピルビン酸、およびその他のモノカルボン酸の転移に関与し、コリ回路や最近になって発見された筋肉および精子のモノカルボン酸代謝の経路にも関与する。筋肉解糖によって産生される乳酸は、血流を介して肝臓に輸送され、糖新生によってグルコース変換される。そのグルコースは、次に血流を介して筋肉へ送り戻され、グリコーゲン(コリ回路)として保管される。
【０００９】
MCT活性は、生理的濃度でのミトコンドリアのピルビン酸の利用を限定する。コリ回路の増大が、非インスリン依存型糖尿病(NIDDM)の肥満した被験者において観察され、体重減少の影響が検討された。乳酸/モノカルボン酸トランスポーターのイソ型は、すい臓の膵島および外分泌すい臓において発現される。食餌誘発性ケトン症は、ラットの脳におけるモノカルボン酸トランスポーター(MCT1)レベルを高める。ラットの脂肪細胞における乳酸輸送は、MCT1に仲介され、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病中に調節される。MCT1 cDNAの突然変異体は、乳酸輸送における無症候性の欠乏症の患者において記載されている。低親和性モノカルボン酸トランスポーターMCT4は、高度に解糖性を持つ細胞において乳酸の搬出に適用される。モノカルボン酸トランスポーターおよび乳酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、ベータ細胞におけるピルビン酸および乳酸に対するインシュリン分泌応答を変える。心筋および骨格筋ミトコンドリアには、モノカルボン酸トランスポーターMCT1が備わっている。
【００１０】
Ftz-F1(フシタラズ)タンパク質は、進化的に最古の核受容体のタイプの1つであり、核(ステロイドホルモン)受容体スーパーファミリーの保存メンバーである。高度に保存された相同体が、脊椎動物(ヒトを含む)および節足動物において発見されている。Ftz-F1のための保存機能は、キイロショウジョウバエおよび線虫の胚形成、脱皮および変態中のその補助因子フシタラズの調節に関連付けられており、Ftz-F1は、マウスにおけるステロイド産生および性的分化に必要である。ヒトFtz-F1は、肝臓および消化器器官における発現を示し、その発現を自己調整する。ヒトおよびショウジョウバエのFtz-F1は、表皮および生殖腺の成長にとって必須であり、性別決定に関与する。ヒトFtz-F1活性は、脳下垂体の成長に関与し、脳下垂体の制御に依存する。脳下垂体は、HPA系(視床下部−下垂体−副腎皮質(ＨＰＡ)系)の活性を通してホルモン分泌を介して食物摂取を調節し、ホルモンを介して代謝の制御に関与する。興味深いことには、HPA系の活性の変化は、異なる肥満症の表現型において観察される。
【００１１】
ショウジョウバエFTZ-F1タンパク質のヒト相同分子種は、核オーファン受容体ファミリーのメンバーとして記載されている。FTZ-F1が、コレステロールによって誘導され、胆汁酸によって抑制されるチトクロームP450ファミリー(コレステロール7-ヒドロキシラーゼ、Cyp7)のミクロソーム肝臓タンパク質の発現の調節に関与していることが提案された(例えば、米国特許5,958,697；米国特許6,027,901；米国特許6,297,019)。Cyp7は、肝臓中のコレステロール異化反応における最初の律速酵素である。コレステロールは、膜形成およびステロールおよび非ステロールの合成にとって必須であり、過剰コレステロールは動脈に析出されアテローム性動脈硬化症を引き起こす。Cyp7に欠けるマウスは、異常な脂質排泄、皮膚病理および行動の不規則性を示すのに対して、Cyp7無しのホモ接合性マウスは出生時には正常だが初めの18日以内に死亡する。母親が飲む水にビタミンを加えることによって、子孫の初期の死が防止され、コール酸を加えることによって、子孫の後期の死が防止された。Cyp7-/-エスケーパーは、胆汁酸生合成のための代替経路の誘発を示す(野生型と同様、出生後21〜30日目にオキシステロール7-ヒドロキシラーゼの誘発)。Cyp7-/-マウスは、正常の割合で体重が増えず、過剰なモノグリセリドエステル、角質増殖のために、油質の外皮と明白な視力欠陥を持つ。加えて、Cyp7-/-マウスは、正常な血清脂質、コレステロール、およびリポタンパク質含有量を持つが、検出不可能なほどに低いビタミンD3およびEレベルを持つ。新生のCyp7-/-マウスの糞中の脂肪含有量は著しく上昇している。
【００１２】
これまでは、転移タンパク質(例えばTrp1)、モノカルボン酸トランスポーター(例えばMCT)、または核ホルモン受容体(例えばFtz-F1)の遺伝子ファミリーのメンバーが、エネルギー恒常性の調節に関与することは記載されていないので、代謝疾患における機能は検討されていない。本発明において、Trp1、MCT、またはFtz-F1のキイロショウジョウバエ相同体の正しい遺伝子投与量が、ハエの成体におけるエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子学的スクリーニングを用い、転移タンパク質(例えばTrp1)、モノカルボン酸トランスポーター(例えばMCT)、または核ホルモン受容体(例えばFtz-F1)の遺伝子ファミリーのメンバーが、キイロショウジョウバエにおけるエネルギー恒常性に関与することを同定した。
【００１３】
つまり、エネルギー恒常性の修飾因子としてTrp1、MCT、またはFtz-F1に関連する分子の同定は、代謝疾患および機能障害(例えば、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害(例えば真性糖尿病)、高血圧、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症)、および骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸などの関連障害のようなエネルギー恒常性調節に関連する疾患および障害の診断、治療、および予後において有用である新規組成物を提供することによって当分野における要望に応えることができる。
【００１４】
特に、本発明は、転移タンパク質の核酸分子、モノカルボン酸トランスポーター、または核ホルモン受容体遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたはエフェクター、例えば抗体、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)補助剤と共に、アプタマーまたは当該核酸またはポリペプチドを認識する別の受容体から成る医薬品成分に関するものである。
【００１５】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１６】
本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、およびそのタンパク質を同定およびをコードするポリヌクレオチドの調節を行なう、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を開示する。また、本発明は、ベクター、宿主細胞、タンパク質のエフェクターおよびポリヌクレオチド、例えば抗体および本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産出するための組換えの方法に関するものである。また、本発明は、体重調節に関連する疾患および障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの配列およびそのエフェクターの使用法に関するものである。
【００１７】
よって、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ヒトTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性核酸、特にヒトTrp1タンパク質(cDNAに対するGenBankアクセッション番号NM＿003262、タンパク質に対するNP＿003253)、ヒトMCTタンパク質(例えばcDNAに対するGenBankアクセッション番号NM＿013356;タンパク質に対するNP＿037488、モノカルボン酸トランスポーター3、cDNAに対する  Genbankアクセッション番号NM＿004695.2、タンパク質に対するNP＿004686、溶質キャリアファミリー16-モノカルボン酸トランスポーターメンバー5)をコードする核酸、またはヒトftz-F1相同性核酸、特にヒトFtz-F1タンパク質(例えばGenBankアクセッション番号に由来するAF146343 GenBankアクセッション番号NM＿003822;GenBankアクセッション番号NM＿004959(GenBankアクセッション番号U76388に由来する)をコードする核酸である。
【００１８】
よって、ヒトftz-F1相同性核酸およびタンパク質コーディングの好適な実施例は、Genbankアクセッション番号AB019246 Ftz-F1 関連タンパク質、AF049102 ａ1-胎児タンパク質転写因子、短い変異型、U93553ａ1胎児タンパク質転写因子、NM＿003822核受容体サブファミリ(亜科)5、グループA、メンバー2、U76388ステロイド産生因子1、U80251肝細胞転写因子(hB1F)、AF146343CYP7Aプロモーター結合因子(CPF)、XM＿001441、AF190464、AF124247、AF228413、AF112344またはその断片から選択される。
【００１９】
また、特に好適なのは、ショウジョウバエTrp1相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチド(アクセッション番号Z38100、アブ アクセッション番号AAF52847、またはアブ アクセッション番号AAF52848)、ショウジョウバエMCT様核酸およびそれによってコードされたポリペプチド(例えばアブ アクセッション番号CG8051またはアブ アクセッション番号CG3456)、またはショウジョウバエftz-F1相同性核酸およびそれによってコードされたポリペプチド(ftz-F1アルファに対するアクセッション番号M63711、ftz-F1ベータに対するアクセッション番号M98397)である。
【００２０】
本発明好適な実施例においては、ジンク・フィンガー・ドメイン(ショウジョウバエFtz-F1アルファ アミノ酸48-523におけるzf-c4型、アクセッション番号AAA28542)および(または)タンパク質および核酸分子コーディングの結合基結合ドメイン(ショウジョウバエFtz-F1アルファ アミノ酸778-938においてhormone＿recと呼ばれる)も含まれる。また、これらのジンク・フィンガー・ドメインおよび(または)結合基結合ドメインを異種タンパク質ドメインおよび核酸コーディングに融合することも可能である。
【００２１】
本発明は特に、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、当該核酸分子は下記から成る。
(a)  GenBankアクセッション番号Z38100、配列識別番号1(アブ アクセッション番号CG8051)、GenBankアクセッション番号M63711、またはGenBankアクセッション番号M98397またはヒト相同性核酸のヌクレオチド配列、
(b)  66℃にて0.2×SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んでいる溶液において、SPTREMBLアクセッション番号Q24559、配列識別番号2、GenBankアクセッション番号AAA28542、またはGenBankアクセッション番号AAA28915またはヒト相同性核タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補鎖に対してハイブリタイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および99,6％までアクセッション番号Q24559、配列識別番号2、GenBankアクセッション番号AAA28542、またはGenBankアクセッション番号AAA28915またはヒト相同性タンパク質に同一のポリペプチドをコードする配列、
(e)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異体が、コードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を引き起こす配列、または
(f)  少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２２】
本発明は、転移タンパク質1(本明細書中でTrp1と呼ばれる)、モノカルボン酸トランスポーター様(本明細書中でMCTと呼ばれる)、またはFtz転写因子1(本明細書中でFtz-F1と呼ばれる)相同性タンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが、中性脂肪の保管の調節および以上の点からエネルギー恒常性に関与するという発見に基づくものである。
【００２３】
エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子学的スクリーニングを実施した。スクリーニングのための1つのリソースは、専売のキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションであった。このコレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、近傍するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これは、EPラインコレクションが内在性側面遺伝子配列の過剰発現を行うことを可能にする。加えて、UAS部位の活性化なしの、EP因子の遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下の原因となる可能性があり、機能喪失の表現型を検討することによって、その機能の決定を可能にする。
【００２４】
中性脂肪は細胞において最も効果的なエネルギー保管場所である。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を単離するために、数千のEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる食餌期間後にテストした。さらなる分析のための肯定的な候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。
【００２５】
肥満した人々は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。本発明において、6日間の給餌後の同一遺伝子型を有するハエのプールの中性脂肪含有量を、例えば、中性脂肪測定法のような方法を使用して分析したが、これは本発明の範囲を限定するものではなく、その結果を以下に実施例の項において記載した。ショウジョウバエ ラインEP(2)0663ベクター統合に対するオスのハエのヘテロ接合性、およびショウジョウバエ ラインEP(Ｘ)11089、EP(3)0447、またはEP(3)25823のベクター統合に対するオスのハエのホモ接合性を、「実施例」項でより詳細に図解されているこれらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析した。中性脂肪含有量分析の結果を図1、4、および9にそれぞれを示した。
【００２６】
単離されたゲノムDNA配列を、EPベクター(本明細書中ではEP(2)0663、EP(Ｘ)11089、EP(3)0447、またはEP(3)25823)統合に対して局在化した。それらの単離したゲノム配列を使用して、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(アブ)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってベクターの統合部位、および実施例の項においてより詳細に記載した対応遺伝子を同定した。遺伝子の分子構造を、図2、5、および10にそれぞれ示した。
【００２７】
また、本発明には、Trp1、MCT、またはFtz-F1および相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配を、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現する組換え分子を生成するために使用することができる。特定の実施例において、本発明には、Trp1(アブ アクセッション番号CG4758;cDNAに対するGenBankアクセッション番号Z38100、タンパク質に対するSPTREMBLアクセッション番号Q24559)、ヒト転移タンパク質1(cDNAに対するGenBankアクセッション番号NM＿003262、タンパク質に対するNP＿003253)、MCT(アブ アクセッション番号CG8051、cDNAに対する配列識別番号1、タンパク質に対する配列識別番号2)、ヒト モノカルボン酸トランスポーター3(MCT3;cDNAに対するGenBankアクセッション番号NM＿013356、タンパク質に対するNP＿037488)ヒト溶質キャリア ファミリー16-モノカルボン酸トランスポーターメンバー5(cDNAに対するGenBankアクセッション番号NM＿004695.2、タンパク質に対するNP＿004686)、またはFtz-F1(Ftz-F1アルファに対するGenBankアクセッション番号M63711、Ftz-F1ベータに対するアクセッション番号M98397)、またはヒトFtz-F1相同性核酸、特に核受容体サブファミリ(亜科)のヒトメンバーをコードする核酸(GenBankアクセッション番号NM＿003822;GenBankアクセッション番号AF146343に由来する;GenBankアクセッション番号NM＿004959、GenBankアクセッション番号U76388に由来する)をコードする核酸配列が包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、Trp1、MCT、またはFtz-F1をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は既知および天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を産生することが可能である。したがって本発明では、可能コドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。これらの組み合わせは、天然のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号に従って作製され、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えることなく、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質およびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質上変更するその他の理由には、より好ましい性質、例えば、天然の配列から産生される転写物より長い半減期などを有するRNA転写物の産生が含まれる。本発明には、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質およびその誘導体をコードするDNA配列またはその部分を全て合成化学によって産出することも包含される。その産生後には、本発明の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、この合成配列を任意の入手可能な多数の発現ベクターおよび細胞系中に挿入することが可能である。その上に、合成化学を用いて、突然変異体をTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質またはその任意の一部をコードする配列の中に導入することも可能である。
【００２８】
また、本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、具体的には、GenBankアクセッション番号Z38100、配列識別番号1(アブ アクセッション番号CG8051)、GenBank アクセッション番号M63711、またはGenBankアクセッション番号M98397または種々のストリンジェントな条件下におけるそのヒト相同体に示した配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987: Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、特定のストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間1×SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃ にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間0.2×SSCおよび0.1％ SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて洗浄後、正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されるTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする変異核酸配列には、欠損、挿入、または異なるヌクレオチドの置換が含まれており、同一または機能的に等価なTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００２９】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を産生し、機能的に等価なTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を結果としてもたらす、アミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸置換は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性を基に行い得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ;正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ;そして類似の親水性値を持つ非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスバラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンが含まれ得る。
【００３０】
また、本発明の範囲内に含まれているものには、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子もある。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は遺伝子の代替形態であり、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る。対立遺伝子は、構造または機能が変異し得るかどうかわからない変異mRNAsまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を持つことが可能である。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異性変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。当分野で公知であり、一般に入手可能なDNAシーケンシングのための方法を用いて、本発明の任意の実施例を実行することが可能である。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し、且つ当分野で周知の種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターおよび調節要素などの上流配列を検出することが可能である。
【００３１】
完全長cDNAをスクリーニングする際には、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、遺伝子の5’領域を含んだ、より多くの配列を含むランダムプライムライブラリも望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5’および3’非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シーケンシング産生物またはPCR産生物のサイズを分析すること、またはそのヌクレオチド配列を確認することが可能である。
【００３２】
本発明の他の実施例では、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質または融合タンパク質またはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片は、適切な宿主細胞内でTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現を誘導するために、組換えＤＮＡ分子内で使用することが可能である。遺伝暗号の固有縮重により、実質上同一あるいは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする、他のDNA配列を産生することができ、これらの配列を用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をクローニングおよび発現することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を産生することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるため、または、例えば天然配列から生成された転写物の半減期よりも長い半減期などの好ましい特性を有する組換えRNA転写を産生するために、選択することが可能である。本発明のヌクレオチド配列は、種々の理由からTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のコードする配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して遺伝子操作することができ、この理由には、遺伝子産物のクローニング、処理、および(または)発現を修飾する変化が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびPCR再アセンブリによるDNAシャフリングを用い、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産生、または突然変異の導入、等々を行い得る。
【００３３】
本発明の他の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。例えば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質活性の阻害剤に対してペプチドライブラリをスクリーニングするためには、市販の抗体によって識別可能なキメラTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を産生することが有用であり得る。また、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質が異種部分から切断され、離れて精製され得るようにするため、融合タンパク質が、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように遺伝子操作することも可能である。別の実施例によれば、当分野で周知の化学的方法を用いて、Trp1、MCT、orFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列の全部または一部を合成することが可能である(Caruthers、 M.H.らの(1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:215-223、 Horn、 T.らの(1980)Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 7:225-232を参照)。あるいは、タンパク質自体を、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のアミノ酸配列またはその一部の合成するための化学的方法を使用して産生することが可能である。例えば、種々の固相技術を使用してペプチド合成を行うことができ(Roberge, J. Y.らの(1995)Science 269:202-204)、例えばABI 431A ペプチド シンセサイザ(Perkin Elmer 社)を使用して自動合成を達成することが可能である。新規に合成したペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.)によって実質上精製することが可能である。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシーケンシングによって確認することが可能である(例えば、Edman degradation procedure； 前出のCreighton)。さらに、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および(または)変異型ポリペプチドを産生するために、化学的方法を使用して、別のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることも可能である。
【００３４】
生物学的に活性なTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現するために、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の機能的な等価物をコードするヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、例えば挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、生体外の組換えDNA技術、合成技術、および生体内の遺伝的な組換えが含まれる。その技術は、Sambrook,J.らの(1989) Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、および Ausubel, F. M. らの(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. に記載されている。
【００３５】
種々の発現ベクターおよび宿主系を利用して、Trp1、MCT、または Ftz-F1相同性タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワー モザイク ウイルスCaMVまたはタバコ モザイク ウイルス TMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」とは、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する5’および3’の非翻訳領域である。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されるベクター システムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ任意数の適切な転写要素および翻訳要素を利用することが可能である。例えば、細菌系においてクローニングを行なう場合、BLUESCRIPTファージミドのハイブリッドlacZプロモーターような誘導型プロモーター(カリフォルニア州ラ・ホヤのStratagene)またはPSPorT1プラスミド(Gibco BRL)などを使用することが可能である。バキュロウイルス ポリヘドリン プロモーターは昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショックであるRUBISCO；および保管タンパク質遺伝子など)または植物ウィルス(例えば、ウィルス プロモーターおよびリーダー配列)に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の細胞系では、哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからのプロモーターが望ましいとされる。必要な複数のコピーのTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列を含む細胞株を生成する必要がある場合には、ＳＶ40またはＥＢＶに基づいたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００３６】
細菌系では、多数の発現ベクターがTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、多量のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質が抗体の誘発のために必要な場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する配列をアミノ末端Metおよびその結果生じた7つのβ-ガラクトシターゼ残基に対する配列を有するフレーム中のベクターに結合することが可能であり、BLUESCRIPTファージミド(Stratagene)のような多機能結腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えばpINベクター(Van Heeke、G. および S. M. Schuster (1989)J. Biol. Chem・ 264:5503-5509)などが含まれるが、それらに限定されるものではない。PGEX ベクター(ウィスコンシン州マディソン市のPromega)を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として発現することが可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオン アガロース ビーズに対する吸着、それに続く遊離グルタチオンの存在下における溶出によって産生した溶解細胞から容易に精製することが可能である。そのようなシステムで作られたタンパク質は、所定のクローン ポリペプチドがGST部分から意のままに開放することができるように、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインすることが可能である。酵母菌、サッカロミセス セレビジエにおいて、＿因子、アルコール オキシダーゼ、およびPGHなどの構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むいくつかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出のAusubelら、および Grantらの(1987) Methods Enzymol. 153:516-544 を参照。
【００３７】
植物発現ベクターを使用する事例においては、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する配列の発現を、いくつかのプロモーターの任意の1つによって駆動することが可能である。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウィルス プロモーターを単独またはTMVからのオメガ リーダー配列(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311)と共に使用することが可能である。あるいは、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショック プロモーターを使用することが可能である(Coruzzi, G.らの(1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R.らの(1984) Science 224:838-843、および Winter, J. らの(1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105)。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性の形質移入によって、植物細胞内に導入することが可能である。そのような技術は、一般に入手できるいくつかの論評に記載されている(例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill New York NY のHobbs, S. または Murry, L. E. を参照。ページ番号191-196)。
【００３８】
昆虫系を用いても、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現することが可能である。例えば、昆虫系の1つでは、オートグラファ カリフォルニア ニュークレアの多面性ウィルス(AcNPV)がベクターとして使用され、ハスモンヨウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞またはウワバ（Trichoplusia)の幼虫における外来遺伝子を発現している。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウィルスの不必須領域にクローニングされ、ポリヘドリン プロモーターの制御下に置くことが可能である。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質に欠ける組換えウィルスを産生する。その時点で、その組換えウィルスを用いて、例えば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現し得る、ウワバ(Trichoplusia)幼虫のハスモンヨウ近似種(S. frugiperda)細胞を感染することが可能である(Engelhard、E. K. らの (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227)。
【００３９】
哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウィルスベースの発現系を利用することが可能である。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する事例においては、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する配列を、後発プロモーターおよび3連リーダー配列から成るアデノウイルス転写・翻訳複合体に結合することが可能である。ウィルス ゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞においてTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現する能力のある生ウィルスを得ることが可能である(Logan、J. および Shenk、T. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659)。加えて、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物の宿主細胞における発現を高めることが可能である。
【００４０】
固有開始シグナルを用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列をより効果的に翻訳することが可能もある。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質、開始コドン、および上流配列をコード化する配列が適切な発現ベクターに挿入される事例においては、追加転写または翻訳調節シグナルが必要とされない可能性がある。但し、コーディング配列のみ、またはその一部のみが挿入される事例においては、ATG開始コドンを含んだ外来性翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらに、その開始コドンは、全挿入の翻訳を確実にするため、正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、天然および合成の両方を含めた様々な起源の産物であり得る。発現の効率は、文献(Scharf、D.らの(1994)Results Probl. Cell Differ. 20:125-162)に記載されたように、使用される特定の細胞系に対して適切なエンハンサーを包括することによって高めることが可能である。
【００４１】
加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することが可能である。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および(または)機能を促進することが可能である。CHO、HeLa、MDCK、HEK293、および WI38などの翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００４２】
長期にわたる、組換えタンパク質の高歩留産生のためには、安定した発現が望ましい。例えば、安定してTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現する細胞株は、複製発現因子および(または)内在性発現因子のウィルス起源を含み、選択可能マーカー遺伝子を同一ベクター上または別個のベクター上に含み得る発現ベクターを使用して、形質転換することが可能である。ベクターの導入後、細胞は、選択培地に移行せしめる前に強化培地において1〜2日間増殖せしめることが可能である。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、その存在によって、導入された配列を首尾良く発現する細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。任意数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収することが可能である。
【００４３】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプローブまたは一部または断片を使用して、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することができる。核酸増幅ベースの測定法には、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含む形質転換体を検出するために、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約10ヌクレオチド、および約60ほどのヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００４４】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である。これらを含めた他の測定法は、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Serological Methods, Laboratory Manual, APS Press)および Maddox、D. E. らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４５】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。標識ハイブリダイゼーションを産生するための手段、またはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連する配列検出するためのPCRプローブには、標識ヌクレオチドを使用する、オリゴ標識、ダコン翻訳、末端標識またはPCR増幅が含まれる。
【００４６】
あるいは、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列、またはその任意の一部分をmRNAプローブの産生のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野で周知であり、市販もされており、T7、T3、またはSP6および標識ヌクレオチドのような適切なRNAポリメラーゼを追加することによって、生体外RNAプローブの合成に使用することが可能である。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn 社)、Promega (ウィスコンシン州マディソン)、および U.S. Biochemical Corp.(オハイオ州クリーブランド)を用いて実行することが可能である。
【００４７】
使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子などもまた含まれる。
【００４８】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって産生されたタンパク質は、使用される配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内に含有せしめることが可能である。当業者であれば理解し得るように、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、シグナル配列を含むように設計することが可能であり、そのシグナル配列は、原核細胞膜または真核細胞膜を通してTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の分泌を誘導する。他の組換え構造を用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチド ドメインをコードするヌクレオチド配列に対して結合することが可能である。そのような精製促進ドメインには、固定化金属上の精製を可能にするヒスチダイン トライトファン分子のような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Aドメインおよびフラグ伸長・親和性精製システム(ワシントン州シアトル市のImmunex Corp.)において利用されるドメインが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製ドメインとTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質との間にあるXA因子またはエンテロキナーゼ(腸活素)(カリフォルニア州のサンディエゴ市のInvitrogen社)に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて、精製を促進することが可能である。組換え産生に加えて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の断片は、固相技術(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)を用いた、直接ペプチド合成によって産生することが可能である。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することが可能である。自動合成は、例えば Applied Biosystems 431A ペプチド シンセサイザ(Perkin Elmer 社)を用いて達成することが可能である。Trp1、MCT、または Ftz-F1 相同性タンパク質の種々の断片は、完全長分子を産生するために、化学的方法を使用して、個別に化学的な合成および結合を行なうことが可能です。
【００４９】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて、遺伝子組換え動物または部位特定の遺伝子改変を細胞株において生成することができる。遺伝子組換え動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が変異される場合、相同性組換えを介して作ることができる。別法として、核酸構成物をランダムにゲノムに統合することもできる。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、YACs などが含まれる。修飾された細胞 または動物は、本発明のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。例えば、一連の小欠損および(または)置換を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子において行い、すい臓の分化などにおけるタンパク質の特定のドメイン、機能の役割を決定することが可能である。対象の特定構成物には、本発明のタンパク質の発現、または優性阻害の突然変異体の発現を阻止する、アンチセンス分子が含まれる。lac Z のような検出可能なマーカーを、本発明の遺伝子の発現の上方制御が表現型における容易に検出される変化を結果としてもたらす、本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。また、通常には発現されないか、または異常発生中の細胞や組織において、本発明の遺伝子の発現またはその変異体を提供することも可能である。加えて、本発明のタンパク質の発現を、通常には産生されない細胞中に提供することによって、細胞行為の変化を誘引することが可能である。相同性組換え DNA 構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対する相同性領域も含まれる。ランダムな統合の DNA 構成物には、組換えを仲介するための相同性領域が含まれる必要がない。好都合なことには、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーが含まれている。相同性組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を生成する方法は、当分野で周知である。胚幹(ES)細胞に関しては、ES 細胞株を用いるか、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得することが可能であるそのような細胞は、適切は線維芽細胞-支持細胞層上で増殖するか、白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。形質転換された ES または胚細胞を用いて、遺伝子組換え動物を産生することが可能である。形質転換後、細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって検出することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同性組換えまたは構成物の統合の発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および胚盤胞注入に用いることが可能である。胚盤胞は、4〜6 週間の過排卵メスから取得する。ES 細胞をトリプシン処理し、および修飾細胞を胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後、胚盤胞を偽妊娠メスの各子宮角へ戻す。次に、メスに出産させ、結果として得られた子孫をその構成物に対してスクリーニングした。胚盤胞の異なる表現型および遺伝子操作された細胞を提供することで、キメラ子孫を容易に検出することができる。キメラ 動物を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾を有するオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合性の子孫を産生する。その遺伝子改変が成長の過程で死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植または類遺伝子性移植、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子組換え動物は、実験動物、家畜などのような任意の非ヒト哺乳動物である。 遺伝子組換え動物は、機能研究、薬物スクリーニングなどにおいて使用することが可能である。
【００５０】
診断および治療
本発明の核酸およびタンパク質が、関与する診断および治療用途、例えば、これらに限定されるものではないが、体重調節に関連する疾患および障害、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害(例えば真性糖尿病)、高血圧、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸などのような関連障害においてもまた有用であることを示す。従って、本発明のTrp1、MCT、または Ftz-F1 相同性タンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである。(i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的 (治療、診断、薬剤標的・細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内 における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００５１】
本発明の核酸およびタンパク質は、以下に記載した種々の疾患と障害および(または)その他の病理学および障害に関与する診断用途および治療目的において有用である。例えば、限定するものではないが、遺伝子療法、および本発明の Trp1、MCT、または Ftz-F1 相同性タンパク質および特にそのヒト相同体において有用であり得る、本発明のタンパク質をコードする cDNAs および特にそのヒト相同体は、それを必要とする被験体に投与された場合、有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、エネルギー恒常性、例えば、限定するものではないが、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、すい臓の機能障害(例えば真性糖尿病)のような代謝疾患、高血圧、および動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸などのようなその他の疾患に関連する疾患と障害に苦しむ患者の治療に有効性を持つ。
【００５２】
本発明のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質タンパク質をコード化する核酸、またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在または量が算定されるべき診断適用例においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。
【００５３】
例えば、一実施態様においては、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に特異的な抗体を拮抗薬として直接的に、またはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を発現する細胞または組織に薬剤を結合するための標的機構または送達機構として間接的に使用することが可能である。その抗体は、当分野で周知の方法を用いて生成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５４】
抗体を産生するため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって、免疫化することが可能である。宿主の種によるが、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を高めることが可能である。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、およびリゾレシチン、プルオニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、およびジニトロフェノールのような表面活性物質などが含まれるが、それらに限定されるものではない。ヒトに使用されるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム パルヴムが特に望ましい。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約5のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約10のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらが、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であること、および小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。Trp1、MCT、またはFtz-F1アミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体などの、別のタンパク質の伸長部と融合することが可能である。
【００５５】
Trp1、MCT、またはFtz-F1および相同性タンパク質に対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して、培養中の連続した細胞株によって調製することが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Koehler、G.らの(1975)Nature 256:495-497; Kozbor、D. らの (1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J. らの Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S. P. らの (1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５６】
加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morrison, S. L.らの (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S. らの (1985) Nature 314:452-454)。あるいは、一本鎖抗体を産出するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、Trp1、MCT、または Ftz-F1 相同性タンパク質および特異性一本鎖抗体を産出することができる。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ成分の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって生成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生の誘導によって産生することが可能であり、または組換え免疫グロブリン ライブラリまたは文献に開示したされているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても産生することが可能である(Orlandi、R. らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter、G. らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００５７】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に対する特異結合部位を含む抗体断片もまた、生成することが可能である。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できるF(ab’)2断片、およびF(ab’)2のスルフィド架橋を還元することによって生成できるFab断片が含まれるが、それらに限定されるものではない。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる(Huse, W. D. らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００５８】
種々の免疫学的測定法をスクリーニングに対して使用し、所望の特異性を有する抗体を同定することが可能である。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する、競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野で周知である。通常このようなイムノアッセイには、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。2つの非干渉 Trp1、MCT、または Ftz-F1 相同性タンパク質エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、2部位モノクローナルベースの免疫学的測定法は好適ではあるが、競合結合アッセイを用いることが可能である(前出のMaddox)。
【００５９】
本発明の別の実施例によれば、TTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質、またはその断片、またはアンチセンス分子をコード化するポリヌクレオチドは、治療目的に使用することが可能である。一実施態様において、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするアンチセンスは、mＲＮＡの転写を阻止することが望ましい状況において使用することができる。具体的には、細胞は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を用いて形質転換することができる。このようにアンチセンス分子を用いてTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。そのような技術は今、当分野で周知であり、センスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴマー、またはより大きな断片を、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列のコーディングまたは制御領域に沿った種々の位置からデザインすることができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニア ウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者であれば周知の方法を用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する遺伝子のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを作製することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する遺伝子は、高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクター、またはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化するその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることができる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内在性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで、継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より長く持続することが可能である。
【００６０】
上述のように、プロモーター、エンハンサー、イントロン等のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする遺伝子の制御領域に対して、アンチセンス分子、DNA、RNA、またはPNAを設計することによって遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10と+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている(Gee,J. E. らの (1994) In; Huber, B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。アンチセンスもまた、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNA の翻訳を阻止する目的でデザインすることが可能である。
【００６１】
酵素性RNA分子であるリボソームを用いても、RNAの特異的切断を触媒することが可能である。リボザイム作用の機構は、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与する。使用可能な実施例には、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性切断を特異的かつ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型モチーフ リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって、初めに同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造機能に対して評価することが可能となる。候補標的の適合性もまた、リボヌクレアーゼ保護測定法を使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス容易性をテストすることによって、評価することが可能である。
【００６２】
本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で知られている任意の方法を用いて調製することが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするDNA配列の生体外および生体内転写によって、RNA分子生成することが可能である。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNAポリメラーゼ プロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、RNA を構成的または誘導的に合成するこれらの cDNA 構成物アンチセンスは、細胞株、細胞、または組織内に導入することができる。RNA 分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5’末端および(または)3’末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2’ O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの産出に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を含めた、好適な被験体に適用することが可能である。
【００６４】
本発明の追加実施例は、上述した任意の治療効果対して、医薬用に許容できるキャリアと併せて、医薬品成分の投与に関するものである。そのような医薬品成分には、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の阻害剤が含まれる。本成分は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などを含めた、任意の消毒した、生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明で利用した医薬品成分は、幾つもの経路によって投与することが可能であり、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
その活性成分に加えて、これらの医薬品成分は、医薬用に使用することができる、活性化合物の製剤への処理を促進する、賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンの Maack Publishing Co.)の最新版を参照。
【００６６】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知の様式、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、および(または)凍結乾燥プロセスなどの手段によって製造することが可能である。
【００６７】
本発明に好適な医薬品成分には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養アッセイ、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養アッセイおいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの動物モデルにおいてのいずれかで、初めに治療に有効な投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用することが可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、特定の状態を治療するために有効である活性成分の量、例えば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質またはその断片、およびTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の抗体の量を指す。治療有効度および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準的な調剤手順によって決定することが可能であり、その例としては、ED50(集団の50％において治療に有効な量)およびLD50(集団の50％に対する致死量)などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投与量の比は、治療指数であり、LD50/ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような成分に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の採用元(dosage from employed)、患者の感受性、および投与の経路によって、この範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するように調節する。配慮される要因には、疾患の重症度、被験者の身体全体の健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品成分は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質または阻害剤用の製剤とは異なったヌクレオチド用製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００６８】
別の実施例によれば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を特異的に結合する抗体を、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の過剰発現または低発現を特徴とするまたはそれらの発現に関連する状態または疾患の診断のため、または測定法において用い、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤によって治療を受けている患者を監視することが可能である。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同様の様式で調製することが可能である。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質用の診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液または細胞または組織の抽出物におけるTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を検出する方法が含まれる。その抗体は、修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、共有結合または非共有結合のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのいくつかのレポーター分子を上記した。
【００６９】
ELISA、RIA、およびTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を測定するためのFACSを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、改変または異常レベルのTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質発現を診断する基準を提供する。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に対する抗体と結合させて確定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検組織から得た対照試料および疾患試料において発現したTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の量は、標準値と比較する。標準値と被験体の値の偏差は、疾患の診断のためのパラメータを確定する。
【００７０】
本発明の別の実施例によれば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、診断目的に使用することが可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現が疾患と相関し得るような生検組織における遺伝子発現を検出および定量化することが可能である。診断アッセイを用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質レベルの調節を監視することが可能である。
【００７１】
一実施形態において、ゲノム配列を含み、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質または密接に関連する分子をコードするポリヌクレオチド配列を検出する能力のあるPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば5’調節領域における独特のヌクレオチド、またはあまり特異的ではない領域、例えば特に3’コーディング領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブがTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコード化する天然の配列、対立遺伝子、または関連配列のみを同定するかどうかを決定する。プローブはまた、関連する配列の検出に用いることも可能であり、配列をコードする任意のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質からのヌクレオチドの少なくとも50％を含んでいることが望ましい。本発明に関するハイブリダイゼーション プローブは、DNAまたはRNAであり、GenBankアクセッション番号Z38100、配列識別番号1、GenBankアクセッション番号M63711、またはGenBankアクセッション番号M98397のヌクレオチド配列、またはそのヒト相同性配列またはプロモーター、エンハンサーエレメントを含むゲノム配列、および天然Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質のイントロンに由来する。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ産生の手段には、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質または誘導体をmRNAプローブの産生のためのベクターにコード化する核酸配列のクローニングが含まれる。当業者に知られ、市販されている、このようなベクターを用いて、好適なRNAポリメラーゼおよび好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、生体内でRNAプローブを合成することが可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することが可能であり、その例としては、32Pまたは35Sのような放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼのような酵素標識が挙げられる。
【００７２】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することが可能である。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、変異Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。
【００７３】
特定の実施形態では、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、活性化の検出または、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患に関連する疾患と障害のほかに、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群(悪質液)、膵臓の機能障害(真性糖尿病など)、高血圧症、動脈硬化症、冠動脈疾患(CAD)、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸のような関連障害を含んだ種々の代謝疾患および障害を誘発するアッセイにおいて有用であり得る。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後、その試料を洗浄して、そのシグナルを定量化し、標準値と比較する。生検試料または抽出試料におけるシグナル量が、類似試料がその試料中でTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションを行なった結果のシグナル量と比べて著しく変化している場合は、その試料中のヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾患の存在を示す。このような測定法を用いても、動物研究、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の療法の有効性を評価することが可能である。
【００７４】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現に関連する疾患の診断に対する基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これを達成するには、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列またはその断片と結合させることがでる。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験体から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被験体値との間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を確定し、治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを評価することが可能である。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことが可能である。
【００７５】
代謝疾患および上記の障害に関して、個人の生検組織における比較的大きい量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することができる。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防手段または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする配列からデザインされたオリゴヌクレオチドの診断上の追加用途は、PCR法の使用に関与し得る。このようなオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に生成するか、または組換えソースから産出することが可能である。オリゴマーは望ましくは2つのヌクレオチド配列から成り、1つはセンス方向(5’fwdarw.3’)を有し、別の1つアンチセンス方向(3’rarw.5’)を有し得、特定の遺伝子または条件を同定するために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である、2つの同一のオリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用い、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことが可能である。
【００７６】
Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質の発現を定量化するために使用し得る方法には、放射標識またはビオチン ヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P.C. らの (1993) J. Immunol Methods, 159:235-244; Duplaa, C. らの (1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にある、ELSA形態のアッセイを実行することによって加速することが可能である。
【００７７】
本発明の別の実施例によれば、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする核酸配列のTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を用いても、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブ生成することが可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を使用して染色体の特定領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, および Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Verma らによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝地図データと相関することが可能である。遺伝地図データの例は、1994 Genome Issue of Science (265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体地図上の Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードする遺伝子の位置、および特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得るものである。
【００７８】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを使用する、染色体標本および連鎖分析のような物理的マッピング技術の原位置ハイブリダイゼーションを用いて、遺伝地図を拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報を提供する。ひとたび疾患または症候群を、例えばAT to 11q22-23 (Gatti, R.A. らの(1988) Nature 336:577-580)などの特定ゲノム領域への遺伝的連鎖によって大まかに位置決めを行なうと、その領域に対してマッピングする任意の配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子を表することが可能である。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することが可能である。
【００７９】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、生体外モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合し、その作用を調節または模倣するリガンドまたは基質を同定することもできる。このようなスクリーニングで用いた断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。本発明のタンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は、測定することが可能である。特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、および典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能的化学基が含まれる。候補薬剤には多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能基と置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン(pyrimidies)、誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、任意抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。別法として、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生できる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然または合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを産生することが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を産出するために、有向またはランダムな化学的修飾の対象であり得る。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８０】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、公開PCT出願番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法では、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質に対して適用したように、多数の異なる小試験化合物を、プラスチックのピンまたはその他の表面のような固形基質上に供給または合成した。試験用化合物は、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄する。次に、結合したTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例では、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を結合するために、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質を完全に試験化合物と結合する能力のある中和抗体において、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが可能である。この様式で、抗体を用いて、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。別の実施例では、Trp1、MCT、またはFtz-F1相同性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その新規技術が既知のヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用などを含む特性に依存する限り、今後開発される任意の分子生物学技術においてでも使用することができる。
【００８１】
最終的に、本発明は、上記のように、核酸、タンパク質およびエフェクター分子から成るキットに関するものである。
【００８２】
この実施例は、本発明を図解するものである。
【００８３】
実施例1:中性脂肪含有量の測定
交雑またはラインによる子孫のオスを中性脂肪測定法にて分析した。ヘテロ接合性EP(2)0663ハエ、ホモ接合性EP(X)11089ハエ、およびホモ接合性EP(3)0447およびEP(3)25823ハエの中性脂肪含有量の平均変化を、制御ハエ(異なる野生型集団)(図1、4、および9)と比較して検討した。中性脂肪の決定のため、ハエを、5分間90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を使用してインキュベートした後に、熱抽出を行なった。さらなる5分間90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma中性脂肪(INT336-10または-20)測定法を使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエの中性脂肪含有量抽出を決定した。参照として、BIO-RAD DC タンパク質測定法 を使用し、製造者のプロトコルに従って、同一抽出のタンパク質含有量を測定した。そのアッセイを何度か繰返した。野生型ハエは、常に中性脂肪レベルを示し、それは100％として図1、4、および9に示した。
【００８４】
EP(2)0663ヘテロ接合性ハエの中性脂肪含有量分析の結果は図1に示した。ヘテロ接合性EP(2)0663の中性脂肪含有量の平均減少は、制御ハエ(異なる野生型集団)(「コントロール群」、図1、カラム2)と比較して60％(「EP(2)0663ヘトロ接合性」、図1、カラム1)である。以上の点から、EP(2)0663ハエのEPベクターが半致死的に結合している、その染色体遺伝子座2L、30F5(推定)における遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表した。遺伝子機能の潜在的損失による中性脂肪含有量の減少は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【００８５】
EP(X)11089ヘテロ接合性ハエの中性脂肪含有量分析の結果は図4に示した。ホモ接合性生存EP(X)11089の中性脂肪含有量の平均減少は30％(「EP(X)11089ホモ接合性」、図4、カラム1)である。EP(X)11089ハエを、コントロール群(異なる野生型集団)(「コントロール群」、図4、カラム3)およびヘテロ接合性EP(X)11089ハエ(「EP(X)11089ヘトロ接合性」、図4、カラム2)と比較して示した。以上の点から、EP(X)11089ハエのEPベクターが生存結合している、その染色体遺伝子座X、18C1-2(推定)における遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表した。遺伝子機能の潜在的損失による中性脂肪含有量の減少は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【００８６】
EP(3)0447およびEP(3)25823ヘテロ接合性ハエの中性脂肪含有量分析の結果は図9に示した。ホモ接合性生存EP(3)0447の中性脂肪含有量の平均増加は69％(「EP(3)0447ホモ」、図9、カラム2)であり、およびホモ接合性生存EP(3)25823の中性脂肪含有量の平均増加は145％(「EP(3)25823ホモ」、図9、カラム4)である。ヘテロ接合性EP(3)25823ハエでさえ、中性脂肪含有量(dosis効果)(「EP(3)25823ヘテロ」、図9、カラム5)の72％の増加を示す。EP(3)25823およびEP(3)0477ハエをコントロール群(異なる野生型集団)(「コントロール群」、図9、カラム1)と比較して示した。以上の点から、その染色体遺伝子座3L、75D4-6(推定、EP(3)0447ハエおよびEP(3)25823ハエのEPベクターがホモ接合性生存結合している染色体部位)における非常に可能性が高い遺伝子活性の損失は、エネルギー保管中性脂肪代謝における変化の原因であり、以上の点から、両方の事例において、肥満したハエモデルを表している。遺伝子機能の潜在的損失による中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪としてエネルギー保管の量を制御する、投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における潜在的遺伝子活性を示唆する。
【００８７】
実施例2：エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関連するショウジョウバエ遺伝子の同定
本発明のTrp1タンパク質をコードをする核酸を、プラスミド救出技術を使用して同定した。単離された約0.8kbのゲノムDNA配列を、EP(2)0663統合に対して直接的に3’局在化した。それら単離したゲノム配列を使用して、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(アブ)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって内在性遺伝子(図2)の近傍に局在するEP(2)0663の統合部位を確認した。図2は、Trp1遺伝子座の分子構造を示す。ゲノムDNA配列を、アセンブリによって、EP(2)0663の統合部位を含んだ、中間の灰色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体2L上の9915000位置から始まり、9921250位置で終わる)。転写されたDNA配列(DGCおよび血栓のEST)は、「EST+」線上(左から右へのEST::血栓896＿2、血栓896＿1の2つの灰色ボックス)の灰色バーとして示した。予測遺伝子は、「cDNA+」線上の灰色バーとして示した(アブとカササギによる予測のとおり)。遺伝子CG4758(アブ、Ｔｒｐ1)の予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは「cDNA+」線上の薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。「P-エレメント-」線上の矢印は、EPベクターEP(2)0663統合部位およびEPベクターにおけるGal4プロモーターによって制御される内在性遺伝子の異所性発現の方向を表す。
【００８８】
EP(2)0663は、アンチセンス方向において相互に非常に近接して、Trp1(CG4758)転写単位のイントロンに統合される。また、Trp1はEST血栓896＿2および血栓896＿1としても表される。血栓896＿2および＿1は、cDNAクローンを表し、それはDNA配列がショウジョウバエにおいて発現されていることを意味している。すべてのEST配列は、予測遺伝子CG4758(Trp1)の配列とオーバーラップしており、EP(2)0663はTrp1の転写単位においてヘテロ接合性半致死的に結合されている。CG4758の発現は、EP(2)0663のヘテロ接合性半致死統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の減少につながる。
【００８９】
Trp1は、アブ配列分析プログラムおよび単離されたCG4758クローンによって予測される遺伝子をコードする(CG4758)。本発明においてTrp1と呼ばれる、アクセッション番号Z38100、AE003627、AE003627、およびNM＿003262を有する遺伝子に関して、肥満症および代謝疾患の調節を記載した機能的データは従来の技術には存在しない。
【００９０】
本発明のモノカルボン酸トランスポーター様(MCT)タンパク質をコードをする核酸を、プラスミド救出技術を使用して同定した。単離された約0.8kbのゲノムDNA配列を、EP(X)11089統合に対して直接的に3’局在化した。それら単離したゲノム配列を使用して、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(アブ)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって内在性遺伝子(図5)の近傍に局在するEP(X)11089の統合部位を確認した。図5は、MCT遺伝子座の分子組織を示す。ゲノムDNA配列を、アセンブリによって、EP(X)11089(「Pエレメント-」線上の灰色矢印)の統合部位を含んだ、中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体Ｘ上の19023645位置から始まり、19048645位置で終わる)。転写されたDNA配列(DGCおよび血栓のEST)は、「EST+」線中(左から右へ、血栓7515＿1、DGCSD10554の3つの灰色ボックス)のバーとして灰色バーとして示した。予測遺伝子は、「cDNA-」線上の灰色バーとして示した(アブとカササギによる予測のとおり)。遺伝子CG8051(アブ)の予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは「cDNA-」線上の薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。「P-エレメント-」線上の矢印は、EPベクターEP(X)11089統合部位およびEPベクターにおけるGal4プロモーターによって制御される内在性遺伝子の異所性発現の方向を表す。
【００９１】
EP(X)11089は、センス方向において相互に非常に近接して、CG8051転写単位のイントロンに統合される。血栓7515＿1およびDGC SD10554 は、cDNAクローンを表し、それは DNA 配列がショウジョウバエにおいて発現されていることを意味している。すべての EST 配列は、予測遺伝子 CG8051 (MCT) の配列とオーバーラップしており、EP(X)11089 は MCT の転写単位においてホモ接合性生存的に結合されている。CG8051 の発現は、EP(X)11089 のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の減少につながる。
【００９２】
本発明のMCTタンパク質は、アブ配列分析プログラム(CG8051)によって予測される2704塩基対の遺伝子によってコードされる。本発明においてMCTタンパク質と呼ばれる遺伝子に関して、肥満症および代謝疾患の調節を記載した機能的データは従来の技術には存在しない。
【００９３】
本発明では、ＭＣＴタンパク質、配列認識番号2(CG8051)のアミノ酸配列を備えているポリペプチドを図6Bにおいて説明するが、その符号は順番の1文字コードを使用した。本発明のMCTタンパク質は、長さが645のアミノ酸である。オープンリーディング、ヌクレオチド422のATP開始コドンを発端とし、ヌクレオチド2356の終止コドンで終了とした。本発明のタンパク質の計算分子量は72139ドルトンである。
【００９４】
本発明のFtz-F1タンパク質をコードする核酸を、プラスミド救出技術を使用して同定した。単離された約0.8kbのゲノムDNA配列を、EP(3)0447およびEP(3)25823統合に対して直接的に3’局在化した。それら単離したゲノム配列を使用して、Berkeleyショウジョウバエ ゲノムプロジェクト(アブ)のような公共データベースをスクリーニングし、それによって内在性遺伝子(図10)の近傍に局在するEP(3)0447およびEP(3)25823の統合部位を確認した。図10は、ftz-F1遺伝子座の分子構造を示す。ゲノムDNA配列を、アセンブリによって、EP(3)0447の統合部位を含んだ、中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体3L上の18633000位置から始まり、18693000位置で終わる)。転写されたDNA配列(ＤＧＣのESTおよび血栓)は、「ＥＳＴ］線中にバーとして示した。血栓3727＿2および＿2およびDGC LD34889は、cDNAクローンを表し、それはDNA配列がショウジョウバエにおいて発現されていることを意味している。予測遺伝子は、「cDNA-」線上の灰色バーとして示した(アブとカササギによる予測のとおり)。遺伝子CG4059(アブ、Ftz-F1)の予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。「P-エレメント」線上の灰色矢印は、EPベクター統合部位を示す。「P-エレメント+」線上のオーバーラップする矢印は、EP-vectors EP(3)0447および EP(3)25823統合部位およびEPベクターにおけるGal4プロモーターによって制御される内在性遺伝子の異所性発現の方向を表す。
【００９５】
EP(3)0447およびEP(3)25823は、アンチセンス方向において相互に非常に近接して、Ftz-F1(CG4059)転写単位の第二番目に大きいイントロンに統合される。すべてのEST配列は、予測遺伝子CG4059(Ftz-F1)の配列とオーバーラップしており、EP(3)0447およびEP(3)25823はFtz-F1の転写単位においてホモ接合性生存的に結合されている。また、遺伝子Ftz-F1は、ESTのDGC LD34889、血栓3727＿2および＿1によって表されるが、それらのGal4プロモーターは、内在性遺伝子の異所性の発現を、CG4059発現の方向に対して逆の方向に誘導する。以上の点から、CG4059の発現は、EP(3)0447およびEP(3)25823のホモ接合性生存統合によって影響され、エネルギー保管中性脂肪の増大につながる。
【００９６】
Ftz-F1は、アブ配列分析プログラムおよび単離されたCG4059クローンによって予測される遺伝子をコードする(CG4758)。本発明においてFtz-F1と呼ばれる、アクセッション番号M63711、M98397、およびAB019246を有する遺伝子に関して、肥満症および代謝疾患の調節を記載した機能的データは従来の技術には存在しない。
【００９７】
実施例3：ヒトTrp1、MCT、またはFtz-F1相同性遺伝子およびタンパク質の同定
本発明は、Trp1(アブ アクセッション番号CG4758;ｃＤＮＡに対するGenBankアクセッション番号Z38100、タンパク質に対するSPTREMBLアクセッション番号Q24559)のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明している。図3Aに示すように、Trp1の遺伝子産物は、55％の相同性をヒト転移タンパク質1(TLOC1;ｃＤＮＡに対するGenBankアクセッション番号NM＿003262、タンパク質に対するNP＿003253)に対して持つ。異なる種(ショウジョウバエイソ型dmTrpalt1(アクセッション番号AAF52847)、dmTrpalt2(アクセッション番号AAF52848)、dmTrp1(アクセッション番号Q24559)、マウスmmtrp1(アクセッション番号BAB29058)、およびヒトhstrp1(アクセッション番号NP＿003253))のTrp1タンパク質間の比較(Clustal X 1.8)を実施して図3Bに示した。
【００９８】
予測核酸およびアミノ酸配列は、NCBI nr タンパク質、nt ヌクレオチド、NCBI 予測タンパク質ゲノム、EnsEMBL予測タンパク質、NCBIヒトEST、ヒト ゲノム(染色体armsおよびhtgs)のような公的に利用可能であるデータベースにて検索した。配列データベースの検索において、例えば、ショウジョウバエMCTタンパク質(アブ アクセッション番号CG8051)が40％の相同性をヒトモノカルボン酸トランスポーター3タンパク質(アクセッション番号:NP＿037488)に対して有することが発見された。具体的には、MCTタンパク質およびモノカルボン酸トランスポーター3タンパク質は約40％の相同性を共有し、発端はMCTタンパク質のアミノ酸80〜263、および41％の相同性、発端はMCTタンパク質のアミノ酸423〜567が挙げられる。
【００９９】
加えて、例えば、ショウジョウバエMCTタンパク質(アブ アクセッション番号CG8051)が41％の相同性をヒト溶質キャリア ファミリー16(モノカルボン酸トランスポーター)、メンバー5(アクセッション番号:NP＿004686)に対して有することが発見された。具体的には、MCTタンパク質およびモノカルボン酸トランスポーター、メンバー5、タンパク質は約40％の相同性を共有し、発端はMCTタンパク質のアミノ酸81〜274が挙げられる。加えて、ゲノム配列AC040977ヒト染色体17クローンRP11-589P10 map 17に対する相同性を発見した。このゲノム配列に関しては、それ以上説明していない。本配列は、本発明のMCTタンパク質における領域に一致している2つの翻訳済領域(エキソン)を示す。AC040977の塩基対161145〜161318の翻訳は、56％の相同性を本発明のMCTタンパク質のアミノ酸80〜137に対して示し、AC040977の塩基対162880 to 163122 の翻訳は、46％の相同性を本発明のMCTタンパク質のアミノ酸183〜263に対して示す。
【０１００】
加えて、例えば、本発明のMCTタンパク質が、ショウジョウバエ(例えば、アクセッション番号:CG3456)において見出される他のモノカルボン酸トランスポーターに対して相同性を有することが発見された。タンパク質ドメインは高度に保存されるので、本発明のタンパク質に対してタンパク質ドメイン分析を実施した。発明者らは、本発明のタンパク質(MCT、アブ アクセッション番号CG8051)が砂糖トランスポータードメインおよび小胞モノアミントランスポーター ドメインを有することを発見した(図7Aを参照)。
【０１０１】
例えば、本発明のMCTタンパク質が少なくとも10の、タンパク質を細胞膜にアンカーする膜貫通ドメイン(図7B)を有することが発見された。つまり、MCTタンパク質は、原核生物および真核生物の両方において、種々の固有の生物学的プロセス関連する可能性がある、タンパク質におよぶ膜であり、例えば、輸送プロセスにおいて、細胞質膜を横断するような小さな親水性分子のアクティブな輸送のようなものである。
【０１０２】
本発明では、Ftz-F1のアミノ酸配列から成るポリペプチドを説明している。ショウジョウバエFtz-F1アルファ(アクセッション番号AAA28542)タンパク質およびFtz-F1ベータ(アクセッション番号AAA28915)タンパク質は、短いアミノ末端配列を除いて同一である。異なる種(ヒト、マウス、およびショウジョウバエ)のFtz-F1タンパク質間の比較(Clustal X 1.8)を実施し、図11(マウス相同体を指すNP＿032076;ヒトFTZ-F1ベータを指すBAA34092;FTZ-F1アルファのショウジョウバエイソ型を指すFTF1＿DROME;ショウジョウバエFTZ-F1ベータを指すAAA2891)に示した。
【０１０３】
Pfam-タンパク質分析ツールを使用して、例えば、本発明のDevG4タンパク質が少なくとも2つの特有のタンパク質モチーフ ドメインを持つことを発見した。これらのモチーフおよび標的配列は、全Ftz-F1ファミリの至るとことで発見された。Ftz-F1は、typ zf-c4 (Ftz-F1 アルファ中のアミノ酸 448-523)のジンク・フィンガー・ドメインおよびリガンド結合ドメイン(Ftz-F1アルファ中のhormone＿recタイプ、778-938アミノ酸)を有する。相同性に基づいて、本発明のFtz-F1タンパク質および各相同性タンパク質またはペプチドは少なくともある程度の活性を共有する。
【０１０４】
実施例4:哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株(望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究である、マウス菌株C57Bl/6J、C57Bl/6肥満型およびC57Bl/KS db/db)は、Harlan Winkelmann (33178 Borchen、Germany)から購入し、一定の温度下に維持した(望ましくは22℃)、湿度40パーセントおよび明/暗サイクルの望ましくは14/10時間。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaeten有限責任会社、製品番号ssniff M-Z V1126-000)。動物は6〜8週間の年令で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って単離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて保管した。
【０１０５】
本発明において開示した、生体外分化におけるタンパク質の役割の分析のため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green & Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)を American Tissue Culture Collection(米国バージニア州ハナサスの ATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1 細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した(例えばQiu. らの J. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; Slieker らのBBRC 251: 225-9、1998)。分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加;例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチン)、および10日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。別法として、哺乳動物の線維芽細胞3T3-F442A細胞(例えば、Green & Kehinde, Cell 7: 105-113, 1976)は、Harvard Medical School, Department of Cell Biology (米国ボストン州マサチューセッツ)から取得した。3T3-F442A細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した(Djian、P. らの、J. Cell. Physiol.、124:554-556、1985)。分化手順のいくつかの時点、第0日目(密集日および(ホルモン追加;例えばインシュリン)を始めに、10日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。3T3-F442A細胞は、ホルモン(インシュリン)追加後に既に密集段階の生体外で分化している。
【０１０６】
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から単離した。およびさらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば既知の方法で精製した。全RNAを逆転写した(望ましくはSuperscript II RNaseH- Reverse Transcriptase を利用する。Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ)また、全RNAはTaqman分析の対象となり、望ましくはTaqman2xPCR Master Mix を使用して(Applied Biosystems、Weiterstadt、ドイツ;このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaqゴールドDNAポリメラーゼ、AmpEraseUNG、dUTPを有するdNTP、GeneAmp5700配列検出システム上(Applied Biosystemsより、Weiterstadt、ドイツ)上の受動的な参照Roxおよび最適化された緩衝液成分)などが含まれている。
【０１０７】
MCT3およびMCT5の発現の分析のため、次のプライマー/プローブ対を用いてtaqman分析を実施した(図8を参照):
マウスMCT3フォーワードプライマー(配列識別番号3)5’-GAC CGT GCT TTC GTG GTG TAC-3’;
マウス MCT 3 逆プライマー (配列識別番号4) 5’-AGA TGG CCG GCA CAA AGA-3’;
マウス MCT 3 Taqman プローブ (配列識別番号5) (5/6-FAM) TCA CCA AGT TCC TGA TGG CAC TCG G(5/6-TAMRA)
マウス MCT 5 フォーワードプライマー (配列識別番号6) 5’-CAT CAA CGG GCT CAC CAA TC-3’;
マウス MCT 5 逆 プライマー (配列識別番号7) 5’-AGG CAA TAG CCC AGG AGC A-3’;
マウス MCT 5 Taqman プローブ (配列識別番号8) (5/6-FAM) TGC ACG GTG TCA GCC GAC TTC C (5/6-TAMRA)
Taqman 分析は、MCT 5 がより興味深いハエ遺伝子の相同体であることを明らかにした。むしろ偏在的に発現する MCT 3 と比較して、MCT 5 の発現は極めて結腸および小腸に限定されており、脂肪生成組織における発現はほとんど見られない(図8A)。ところが、遺伝的に肥満した肥満型マウスの茶色脂肪組織における MCT 5 発現は、野生型組織と比較して50 倍も上方制御されている(図8B)。加えて、MCT 5 は、絶食型マウスおよび肥満型マウスの肝臓においても高度に上方制御され、その組織では野生型状況において発現された MCT 5 が測定可能である(図8B)。これらの MCT 5 の応答は、高脂肪食下にあるマウスの肝臓および BAT(茶色脂肪組織)において再利用する。再び、強力な上方制御が認められる(図8B)。
【０１０８】
前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の発現強度における変化に関しては、MCT 3 発現の増加が 3T3-F442A 細胞において観察することができる。一方、MCT 5 は、3T3-F442A 細胞 および TA1 細胞の生体外分化プログラム中に、相対シグナル強度において明らかな低減を示す。(図8C)。
【０１０９】
Ftz-F1-1 および Ftz-F1-2 の発現の分析のため、次のプライマー/プローブ対を用いてtaqman 分析を実施した(図12を参照):
マウス Ftz-F1-1フォーワードプライマー (配列識別番号9) 5’-CCT CCT GAG TCT CGC ACA GG-3’;
マウス Ftz-F1-1逆プライマー (配列識別番号10) 5’-AAC TCC CGC TGA TCG AAC TG-3’;
マウス Ftz-F1-1 Taqman プローブ (配列識別番号11) (5/6-FAM) CTG GTG GTG AGG CTC CGT TCC CT (5/6-TAMRA)
マウス Ftz-F1-2 フォーワードプライマー (配列識別番号12) 5’-GCC AAA AGC GGC  TCT GAC-3’;
マウス Ftz-F1-2 逆プライマー (配列識別番号13) 5’-ATA AAG GTC TGG TCG GCC ATT-3’;
マウス Ftz-F1-2 Taqman プローブ (配列識別番号14) (5/6-FAM) AGC GCC CTT CAG CCT CCT CTG C (5/6-TAMRA)
Taqman分析は、Ftz-F1-1およびFtz-F1-2が、異なる実験用マウスの代謝活性組織の発現パターンにおいて興味深い応答を示すことを明らかにした。両者は、むしろ野生型組織において限定された発現を示す(図12A)。ところが、この発現は代謝制御下にあり:遺伝的に肥満した肥満型マウスにおいては、発現は、BAT(Ftz-F1-1)およびWATおよび腎臓(Ftz-F1-2)において強く増加する。加えて、Ftz-F1-2の発現は、絶食型マウスの腎臓および中脳において強く誘導される(図12B)。加えて、Ftz-F1-2は、高脂肪食下のマウスの筋肉およびBATにおいて発現が顕著に増加することを示す(図12B)。
【０１１０】
脂肪生成細胞株の生体外分化中には、これらタンパク質の全体的にむしろ弱い発現のレベルが観察される。いずれにしても、TA1細胞の分化中にFtz-F1-1発現の下方制御を実証することができる。これに対して、3T3-F442A細胞の前脂肪細胞からの生体外分化中には、Ftz-F1-2の発現は上方制御である(図12C)。市販のヒトの全RNAを用いて、ヒト脂肪組織におけるFtz-F1-1の明らかな発現を実証することができる(図12D)。
【０１１１】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０１１２】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、Pベクター(コントロール群と比較して)のヘテロ接合性の結合に起因する、EP(2)0663 ハエの中性脂肪含有率の減少を示す。
【０１１４】
【図２】図２は、Trp1 遺伝子の遺伝子座の分子構造を示す。「cDNA +」線上の濃灰色ボックスはCG4758予測を示し;「EST+」(左から右)線上のボックスは血栓896＿2および血栓896＿1の2つの記号を表し;および「Pエレメント+」線上のボックスは中性脂肪含有量の減少の原因ともなるl(2)k13305 Pベクター統合を指し;および「Pエレメント-」線上の矢印はEP(2)0663統合の位置を示す。
【０１１５】
【図３Ａ】図３Ａは、Trp1のBlastP結果を示す。示したのは、ヒトとの最高マッチである。
【０１１６】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ショウジョウバエのイソ型(dmTrpalt1、アクセッション番号AAF52847;dmTrpalt2、アクセッション番号AAF52848; dmTrp1、アクセッション番号Q24559)、マウス(mmtrp1、アクセッション番号BAB29058)、ヒト(hstrp1、アクセッション番号NP＿003253)相同体 Trp1 タンパク質の比較(CLUSTAL X 1.8)を示す。アライメントにおけるギャップは、- として表す。
【０１１７】
【図４】図４は、P ベクター(コントロール群と比較して)のホモ接合性生存およびヘテロ接合性の統合に起因する、EP(X)11089 ハエの中性脂肪含有率の減少を示す。
【０１１８】
【図５】図５は、モノカルボン酸トランスポーター様遺伝子の遺伝子座の分子構造を示す。「cDNA -」線上の濃灰色ボックスはアブ CG8051 予測を示し; 「EST-」線上(左から右)のボックスは血栓 7515＿1 および DGC SD10554 を表し; および「+」記号は中性脂肪含有量の減少の原因となる EP(X)11089 統合を指し; および P エレメント「-」線上の矢印はホモ接合性生存EP(X)1550 統合の位置を示す。
【０１１９】
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の最も好適な遺伝子の核酸配列を示す(配列識別番号1; CG8051)。
【０１２０】
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明のタンパク質のモノカルボン酸トランスポーター様の最も好適なタンパク質配列を示す(配列識別番号2; CG8051)。
【０１２１】
【図７Ａ】図７Ａは、本発明のタンパク質のモノカルボン酸トランスポーター様のタンパク質 ドメインを示す。MCT は、モノカルボン酸トランスポーターを指し、sugar＿tr は surgar トランスポーターを指し、および VMAT は 小胞モノアミントランスポーターを指す。
【０１２２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の MCT タンパク質の膜貫通ドメイン プロットを示す。J. GlasgowらのProc. Sixth Int. Conf. Of Intelligent Systems for Molecular Biology. 175-182- AAAI Press, 1998 に従って計算した。
【０１２３】
【図８】図８は哺乳動物組織における MCT 3 および MCT 5 の発現。
【０１２４】
【図８Ａ】図８Ａは、野生型マウス組織におけるMCT 3 および MCT 5 発現のリアルタイム PCR 分析を示す。相対RNA 発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した(WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織)。
【０１２５】
【図８Ｂ】図８Ｂは、異なるマウスモデルにおける MCT 5 発現のリアルタイムPCR 法を介した分析を示す。相対RNA 発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した(WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織)。
【０１２６】
【図８Ｃ】図８Ｃは、3T3-F442A 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の MCT 3 および MCT 5 発現のリアルタイム PCR 法を介した比較を示す。相対 RNA 発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した(d0=第0日目、実験の始動、至d10=第10日目)。
【０１２７】
【図９】図９は、Pベクター(コントロール群と比較して)のホモ接合性の生存結合に起因する、EP(3)0447およびEP(3)25823ハエの中性脂肪含有率の増加を示す。
【０１２８】
【図１０】図１０は、ftz-F1遺伝子の遺伝子座の分子構造を示す。
【０１２９】
【図１１】図１１は、マウス(アクセッション番号NP＿032076)、ヒト(アクセッション番号BAA34092)および2つのイソ型ショウジョウバエ(アクセッション番号AAA28542、ここではFTF1＿DROMEと呼ばれるFtz-F1アルファ;およびアクセッション番号AAA28915、Ftz-F1ベータ)相同体Ftz-F1タンパク質の比較(CLUSTAL X 1.8)を示す。アライメントにおけるギャップは、- として表す。
【０１３０】
【図１２】図１２哺乳動物組織における Ftz-F1-1 および Ftz-F1-2 の発現。
【０１３１】
【図１２Ａ】図１２Ａは、野生型マウスの組織における Ftz-F1-1 および Ftz-F1-2 発現のリアルタイムPCR分析を示す。相対RNA発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した(WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織)。
【０１３２】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、異なるマウスモデルにおける Ftz-F1-1 および Ftz-F1-2 発現のリアルタイム PCR 法を介した分析を示す。相対RNA 発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した(WAT = 白色脂肪組織、BAT = 茶色脂肪組織)。
【０１３３】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、3T3-F442A 細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のFtz-F1-1およびFtz-F1-2 発現のリアルタイム PCR 法を介した比較を示す。相対RNA発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した(d0=第0日目、実験の始動、至d10=第10日目)。
【０１３４】
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ヒト組織におけるFtz-F1-1発現のリアルタイムPCR法を介した分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2005500320.tif 000020
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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