(57)【要約】【課題】  クスノキ科クロモジの抽出物の薬理作用の検討に基づき、その抽出物が有する免疫機能改善作用による免疫機能改善用組成物を提供すること。【解決手段】  クスノキ科クロモジの溶媒抽出物、特に、水、低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒による抽出物を有効成分とすることを特徴とする免疫機能改善用組成物であり、免疫機能低下が、精神的ストレスによる全身免疫系及び／又は腸管免疫系の免疫機能の予防的改善及び／又は治療的改善である免疫機能改善用組成物である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クスノキ科クロモジの溶媒抽出物を有効成分とすることを特徴とする免疫機能改善用組成物。
【請求項２】
抽出溶媒が、水、低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒である請求項１に記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項３】
低級アルコールがメタノール又はエタノールである請求項２に記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項４】
溶媒抽出物が、乾燥品の形態にある請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項５】
免疫機能低下が、精神的ストレスによるものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項６】
免疫機能低下が、腸管免疫系の機能低下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項７】
免疫機能低下が、全身免疫系の機能低下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項８】
免疫機能改善が、免疫機能の予防的改善及び／又は治療的改善である請求項１〜７のいずれかに記載の免疫機能改善用組成物。
【請求項９】
機能性表示食品、医薬品、動物飼料、養魚用飼料として使用する請求項１〜７のいずれか記載の免疫機能改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の溶媒抽出物、詳細にはクスノキ科クロモジの抽出物を有効成分とする免疫機能改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クスノキ科クロモジであるクロモジの幹枝及び根皮を乾燥させた生薬である烏樟（ウショウ）は、釣樟（チョウショウ）とも称され、和漢木草書ではその効能効果として、「霍乱（激しい嘔吐、下痢など）、疝気、腹痛、腹張、宿食不消」等、主に消化器系症状に対する適用が記載されている（非特許文献１）。
烏樟の薬理作用に対する研究は古くから行われており、例えば、鎮痙作用（非特許文献２）、鎮静作用（非特許文献３）、抗潰瘍作用（非特許文献４及び５）、或いはメラニン合成阻害作用（非特許文献６）などが報告されている。
【０００３】
また、クロモジ自体の抽出エキスを種々の用途に応用した提案もなされており、例えば、抽出エキスを有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤及びそれを含む組成物並びに飲食物（特許文献１）、血圧降下剤（特許文献２）、血糖値降下飲料（特許文献３）、プロテアーゼ阻害剤（特許文献４）、皮膚外用剤（特許文献５）などの用途が提案されている。
【０００４】
クロモジはクスノキ科植物であることから、葉や樹皮に芳香性があり、その特異的芳香と殺菌力から、和菓子などに添えられる高級爪楊枝が作られており、また、クロモジの木、葉を蒸留して得られるクロモジ油は香料としてかつては盛んに利用されていた。
そのため、クロモジの精油成分に関する報告は多く、リナロール、ゲラニオールなどが代表する精油成分として報告されている（非特許文献７〜９）。
一方、非精油成分に関する報告は少なく、数種類のタンニン類、アルカロイド、フラボノイド等が報告されているに過ぎない（非特許文献５、１０）。
【０００５】
一般に、クスノキ科クロモジと総称される植物は、クスノキ科クロモジ群のクロモジ（Lindera umbellata Thunb.）、オオバクロモジ（L. umbellata var. membranacea (Maxim.) Momiyama）、ヒメクロモジ（L. umbellata var. lancea Momiyama）、ケクロモジ（L. sericea (Sieb.et zucc.)Blume）、ウスゲクロモジ（L. sericea var. glabrata Blume）であり、北海道南部から九州までの山野に広く分布する落葉性の低木である。烏樟としては、クスノキ科クロモジ群のクロモジの幹枝及び根皮を用いるのが一般的であるが、その他に、オオバクロモジ、ヒメクロモジ、ケクロモジ、ウスゲクロモジも植物学的形態が類似しているため、原料として用いる場合もある。
なお、テンダイウヤク（Lindera strychnifolia）の根を乾燥させて得られる鳥薬（ウヤク）とは別の植物である（非特許文献１１、１２）。
【０００６】
本発明者は、クロモジについて研究を重ねた結果、クロモジの抽出物に極めて優れた免疫機能改善作用があることを新規に見出した。
クロモジは烏樟としての生薬の原料であり、その毒性も極めて低いとされており（非特許文献３）、和漢木草書のなかでも「無毒」とも記載されている（非特許文献１）。
また、その優れた芳香性により、香料として食品にも広く応用されてきており、極めて安全性が高く、日常的に安心・安全に食することができるものである。
したがって、クロモジの抽出物は、免疫機能改善用組成物の素材として、安全性の高い、機能性表示食品、医薬品、動物飼料、養魚用飼料を提供し得るものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−０５９４６３号公報
【特許文献２】特開２００７−０５１１２０号公報
【特許文献３】特開２００２−１９９８６４号公報
【特許文献４】特開２００１−１２２７２８号公報
【特許文献５】特開平０７−２７７９４１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】和漢薬：424-426頁、1970年、医歯薬出版社
【非特許文献２】生薬学雑誌：36(2)、134-138 (1982)
【非特許文献３】生薬学雑誌：36(2)、139-144 (1982)
【非特許文献４】生薬学雑誌：36(4)、350-355 (1982)
【非特許文献５】Planta Medica：1, 34-38 (1985)
【非特許文献６】Chem. Pharm. Bull.,: 43(5), 893-895 (1995)
【非特許文献７】The Flavour Industry,: 405-406 (1970)
【非特許文献８】Phytochemistry,: 13, 2171-2174 (1974)
【非特許文献９】香料：115, 31-40 (1976)
【非特許文献１０】薬学雑誌: 85(5), 737-740 (1969)
【非特許文献１１】植物の世界 No.99, 週刊朝日百科、66-71 (1997) 朝日新聞社
【非特許文献１２】原色日本薬用植物辞典、No.2, 89-90 (1066) 誠文堂新光社
【非特許文献１３】Acta. Phytotax. Geobot., 161-167 (1987)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって本発明は、上記現状に鑑み、クスノキ科クロモジの抽出物の薬理作用の検討に基づき、その抽出物が有する免疫機能改善作用による免疫機能改善用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、クスノキ科クロモジの抽出物を有効成分とすることを特徴とする免疫機能改善用組成物である。
【００１１】
具体的には、本発明は、抽出溶媒が、水、低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒であり、特に低級アルコールがメタノール又はエタノールであり、得られた溶媒抽出物、特に抽出物が乾燥したものである上記の免疫機能改善用組成物である。
【００１２】
また本発明は免疫機能低下が、精神的ストレスによるものであることを特徴とする上記の免疫機能改善用組成物であり、かかる免疫機能低下が、全身免疫系及び／又は腸管免疫系の機能低下であり、免疫機能改善が、免疫機能の予防的改善及び／又は治療的改善である、上記の免疫機能改善用組成物である。
【００１３】
更に本発明は、別の態様として、上記した免疫機能改善用組成物を含有する飲食物等であり、なかでも機能性表示食品、医薬品、動物飼料、養魚用飼料としての使用である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、極めて安全性の高い免疫機能改善用組成物が提供される。
特に、本発明が提供するクスノキ科クロモジの抽出物を有効成分として含有する組成物は、免疫機能の低下を予防し、更には、低下した免疫機能を回復させることができ、現代のストレス社会から生じる免疫機能低下を改善できるものであり、安全性が高いものであることから、日常生活の中で気軽に摂取できる安全性の高い免疫機能改善作用を有する飲食物、特に機能性表示食品、医薬品、更にはペットあるいは酪農等における動物飼料、養魚における飼料を提供できる利点を有している。
【００１５】
すなわち本発明は、免疫機能低下の改善、特に精神的ストレス負荷による全身免疫及び／又は腸管免疫機能の低下を抑制し、しかも必要以上に全身免疫及び／又は腸管免疫能を高めないことによって、常に免疫システムを正常レベルに保つ効果を有する全身免疫及び／又は腸管免疫機能の予防的改善及び／又は治療的改善用の組成物として優れた効果を発揮するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】予防効果試験における、胸腺細胞数の結果を示した図である。
【図２】予防効果試験における、末梢血白血球数の結果を示した図である。
【図３】予防効果試験における、血清中１１−ＯＨＣＳ（１１−ヒドロキシコルチコステロイド）の結果を示した図である。
【図４】予防効果試験における、パイエル板細胞数の結果を示した図である。
【図５】予防効果試験における、Annexin V（アネキシンＡ）染色によるパイエル板細胞のアポトーシスの結果を示した図である。
【図６】予防効果試験における、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能の結果を示した図である。
【図７】予防効果試験における、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の結果を示した図である。
【図８】予防効果試験における、パイエル板ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの結果を示した図である。
【００１７】
【図９】回復促進効果試験における、胸腺細胞数の結果を示した図である。
【図１０】回復促進効果試験における、末梢血白血球数の結果を示した図である。
【図１１】回復促進効果試験における、パイエル板細胞数の結果を示した図である。
【図１２】回復促進効果試験における、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能の結果を示した図である。
【図１３】回復促進効果試験における、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の結果を示した図である。
【図１４】回復促進効果試験における、腸管洗浄液中のＩｇＡ量を示した図である。
【図１５】回復促進効果試験における、腸管組織中のＩｇＡ量の結果を示した図である。
【００１８】
なお、二群間の検定にはStudentのＴ検定を用い、多群間の検定には、ボンフェローニ（Bonferroni）の多重比較検定を行い、図中、
＃：ｐ＜０．０５以下で正常対照群に対して統計学的有意差あり、
＃＃：ｐ＜０．０１以下で正常対照群に対して統計学的有意差あり、
＊：ｐ＜０．０５以下でストレス負荷対照群に対して統計学的有意差あり、
＊＊：ｐ＜０．０１以下でストレス負荷対照群に対して統計学的有意差あり、
を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、上記したように、その基本的態様は、クスノキ科クロモジの抽出物、特に溶媒抽出物を凍結乾燥したものを有効成分とすることを特徴とする免疫機能改善用組成物である。
本発明において使用するクスノキ科クロモジとしては、クロモジ（Lindera umbellata Thunb.）、オオバクロモジ（L. umbellata var. membranacea (Maxim.) Momiyama）、ヒメクロモジ（L. umbellata var. lancea Momiyama）、ケクロモジ（L. sericea (Sieb.et zucc.)Blume）、ウスゲクロモジ（L. sericea var. glabrata Blume）等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、「クロモジ」と記載される種類の全てを含むものである。
【００２０】
なお、クロモジの幹枝及び根皮を乾燥させた生薬として烏樟（ウショウ）があり、この烏樟は釣樟（チョウショウ）とも称されている。
したがって、本発明にあってはこの烏樟（ウショウ）或いは釣樟（チョウショウ）もクスノキ科クロモジに包含される点に注意すべきである。
なお、このクスノキ科クロモジであるクロモジ等の溶媒抽出エキスに免疫機能改善作用があることは、今まで知られておらず、その点で本発明は特異的なものである。
【００２１】
本発明において、その有効成分である抽出物を調製するに当たって、そのクスノキ科クロモジであるクロモジ等の抽出部位としては、例えば、幹枝、根皮、葉、花、果実等の各部分の乾燥物、或いはこれらを含めた全草乾燥物であり、好ましくは幹枝、根皮の乾燥物を使用するのがよい。
また、生薬としての烏樟、或いは釣樟をそのまま用いることができる。
以下、本発明にあっては、クスノキ科クロモジであるクロモジ、オオバクロモジ、ヒメクロモジ、ケクロモジ、ウスゲクロモジ、或いは烏樟又は釣樟をまとめて、「クスノキ科クロモジ」と称する場合もある。
【００２２】
抽出に当たっては、例えば、当該クスノキ科クロモジであるクロモジ等の幹枝、根皮の乾燥物、或いは烏樟或いは釣樟を適当に裁断し、溶媒抽出を行うのがよい。
抽出に使用する溶媒としては、水、低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒がよく、特に低級アルコールとしてメタノール或いはエタノールを使用するのが好ましい。
【００２３】
抽出の具体的手法としては、一般的に使用されている抽出手段が採用され、例えば、クスノキ科クロモジであるクロモジ等の幹枝、根皮の乾燥物、或いは烏樟或いは釣樟を適当に裁断した後、その全重量に対して１〜５０倍、好ましくは５〜２０倍量の水、低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒、好ましくはメタノール或いはエタノールを用い、１〜２４時間程度、室温〜使用溶媒の沸点の範囲で浸漬・加熱抽出を行い、必要に応じて、加圧下に抽出を行ってもよい。抽出後には、必要に応じて濾過を行い、得られた抽出液を減圧濃縮したりして、使用した抽出溶媒を除去し、凍結乾燥したりして、目的とするクスノキ科クロモジの抽出物を調製することができる。乾燥手段は、減圧乾燥や噴霧乾燥であってもよい。
【００２４】
かくして本発明の有効成分であるクスノキ科クロモジの抽出物を調製することができ、本発明者らの検討の結果、得られた抽出物、特に抽出エキスの乾燥品には、優れた免疫機能改善作用があることが判明した。
【００２５】
ところで、免疫系は、初期防御を担うマクロファージや好中球に代表される自然免疫系と、その後に続くＴ細胞やＢ細胞などのリンパ球に代表される獲得免疫系によって成り立っている。
獲得免疫系の中でもＴ細胞は、免疫系の司令塔を担う重要なリンパ球である。Ｔ細胞は、前駆細胞とし骨髄で造られた後、胸腺に移動し、胸腺内上皮細胞の間を移動しながら増殖・分化・成熟を繰り返し、自己と非自己を見分ける能力を身につけた後、Ｔ細胞となって胸腺外へ出てリンパ節などの全身に送られる。このため、胸腺は全身免疫系の中枢を担う重要な臓器といえる。
【００２６】
さらに、腸管免疫系も血液、胸腺及びリンパ節の全身免疫系と並び、身体にとっては重要な生体防御機構である。
消化管は外界と直接つながっている器官であるため、微生物や細菌、病原菌などが最も入りやすい場所である。もしこの部分に免疫系が存在しなかったら、病原菌の巣窟となり生命さえ奪われることになるため、身体の中で最も免疫系が密集する場所になっている。
腸管には消化管吸収を司る器官の間に挟まり存在するパイエル板という腸管固有のリンパ節が存在する。抗原刺激を受けたパイエル板ではＴ細胞が活性化されると、Ｂ細胞が盛んに増殖し、分泌型免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）が産生される。このＩｇＡは消化管における外敵の侵入を防いでいるため、腸管免疫機能の低下は、ＩｇＡの産生を低下させ、容易に感染症を引き起こすことになる。
したがって、パイエル板は腸管免疫にとって特に重要な免疫系である。
【００２７】
また、Ｔ細胞の中でもヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は免疫系を調節する細胞であり、インターロイキン−２（ＩＬ−２）やインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生するＴｈ１とＩＬ−４やＩＬ−５を産生するＴｈ２が存在する。
Ｔｈ１やＴｈ２は、マクロファージなどから抗原提示を受けてナイーブＴ細胞から分化・成熟する。Ｔｈ１は細胞性免疫（細胞やウイルスに対して反応）の調節に、また、Ｔｈ２は液性免疫（ダニ、カビなどのアレルゲンに反応）の調節に働く。
【００２８】
このＴｈ１とＴｈ２のバランスは、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスと呼ばれ、どちらか一方の反応が過剰にならないように、それぞれの細胞から分泌されるサイトカインによりお互いの働きを抑制し合うように働いているため、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが保たれている。
しかしながら、このバランスが崩れると、数々の免疫疾患を引き起こすことが分かってきており、Ｔｈ１が優位になると細胞性免疫が強くなり過ぎ自己免疫疾患などの発症原因となり、一方で、Ｔｈ２が優位になると液性免疫が強くなりすぎて感染症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患を起こし易くなる。
【００２９】
免疫系に異常が生じると感染症、がん発症、花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギー、自己免疫疾患などを引き起こすことが知られている。
免疫系の異常は、遺伝的要因以外にも、加齢、食生活、運動不足などの生活習慣、環境因子、ストレスなどが原因となり引き起こされるといわれている。現代社会はストレス社会、超高齢化社会と呼ばれるように、免疫機能に異常が生じる多くの問題を抱えているといえる。
【００３０】
ストレスを受けると、脳は視床下部からＣＲＨ（Corticotropin Releasing Hormone：副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）が放出され、下垂体からＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン：Adrenocorticotropic Hormone）の放出が促される。
血中に放出されたＡＣＴＨは副腎皮質に作用してグルココルチコイド産生が高められ、免疫系を抑制する。また、免疫細胞は、自律神経の支配を受けており、ストレスによる交感神経の興奮によりアドレナリンやノルアドレナリンの放出が起こり、免疫系に影響を及ぼす。
【００３１】
臨床試験においても、配偶者の死により残された片方の配偶者はストレスを感じることでリンパ球の反応性が低下することや、精神的なストレスが強くなればなるほどウイルスの罹患率が上昇することなどが報告されている。
【００３２】
また、家畜においても、離乳、拘束・隔離、群再編・再配置、および狭飼養スペースなどがストレスとなり、免疫機能を低下させる原因となり、日和見感染を引き起こしやすくなる。
また、実験動物を用いた研究も多く、ヒトの精神的ストレスモデルであるマウスの拘束ストレスにより、胸腺の委縮、末梢血白血球数の減少、腸管免疫系パイエル細胞におけるアポトーシス誘導などが報告されている。このように、ストレスは胸腺及び末梢血白血球などの全身免疫系のみならず、腸管免疫系まで広く影響を及ぼすことが知られている。
【００３３】
また、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスもストレスの影響を受けることが知られており、精神的なストレスを過剰に受けると、細胞性免疫機能が低下することから、Ｔｈ２に傾く傾向にあることが知られている。現代社会におけるアレルギー人口の増加は、ストレスが原因とも言われている。このため、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを正常に保つことも免疫機能を正常に保つためのカギとなる。
【００３４】
このように、ストレスによる免疫機能の低下は、感染症をはじめ免疫系が関る多くの疾病につながることになるが、一部の免疫系のみならず、複数の免疫系の機能の低下を予防、回復させることは、生体防御の観点から極めて重要である。
【００３５】
本発明者らは、本発明のクロモジの溶媒抽出エキスは、マウスへの拘束ストレスにより低下した全身免疫機能、および腸管免疫機能を予防的および治療的に改善させることを実験的に確認した（後記する試験を参照）。
以上より、クロモジの溶媒抽出エキスは、ヒトおよび動物（ペット、家畜）において、食品又は家畜、ペット用餌に広く応用できる天然物由来の副作用の少ない免疫機能低下を抑制、低下した免疫機能回復できる食品組成物として提供できるものである。
【００３６】
すなわち、本発明は、精神的ストレス負荷によって低下した全身免疫機能及び／又は腸管免疫の機能を改善させ、或いは精神的ストレス負荷による全身免疫機能及び／又は腸管免疫機能の低下を抑制し、しかも必要以上に全身免疫機能及び／又は腸管免疫能を高めないことによって、常に免疫システムを正常レベルに保つ効果を有する全身免疫機能及び／又は腸管免疫機能の予防的改善及び／又は治療的改善用の組成物を提供するものである。
【００３７】
本発明が提供する免疫機能改善用組成物は、溶媒抽出物又は乾燥物をそのまま、或いは汎用されている賦形剤、添加剤等を用いて、通常の方法により種々の形態の製剤として調製することができる。
例えば、固体状物、液状物、乳化状物、ペースト状物、ゼリー状物等の形態に加工して、飲食物として製造することができる。
【００３８】
すなわち、本発明が提供する免疫機能改善用組成物は、飲食物として有効に適用することができるものである。
本発明の免疫機能改善用組成物は、そのまま直ちに食品として摂取し得るものとして、また、その他調理して摂取し得るもの、あるいは食品製造用のプレミックスされた材料として提供することもできる。
【００３９】
本発明の免疫機能改善用組成物を含有する飲食物としては、固形状、粉末状、顆粒状のいずれの形態であってもよい。具体的には、例えば、ビスケット、クッキー、ケーキ、スナック、煎餅などの各種の菓子類、パン、粉末飲料（粉末コーヒー、粉末ココアなど）、飴、キャラメル等が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
また、液状、乳化状、ペースト状、ゼリー状のものとしては、ジュース、炭酸飲料、乳酸菌飲料などの各種の飲料を挙げることができ、これらに限定されるものではない。そのなかでも、好ましくはペースト状、ゼリー状、液状のものである
【００４１】
本発明の免疫機能改善用組成物において、有効成分として使用する抽出物は、その免疫機能改善作用を標準として、１日約１ｍｇ〜５０ｇ程度、好ましくは、１０ｍｇ〜１０ｇ程度を摂取するのがよく、一般的には、１日１〜３回、好ましくは１日３回毎食直前に服用する有効成分の含有量を設定し、その用量を摂取する製剤として設計すればよい。
【００４２】
また、溶媒抽出物そのものを含有する場合には、溶媒抽出物を適当な溶媒で希釈し、液状組成物とし調製することもできる。また、溶媒抽出物そのものを適当な担体、好ましくは脂肪酸トリグリセライドと混合し、液状のままソフトカプセル等に充填し、調製することもできる。
【００４３】
上記の製剤化においては、通常使用されている賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、界面活性剤、溶解補助剤、還元剤、緩衝剤、吸着剤、流動化剤、帯電防止剤、抗酸化剤、甘味剤、矯味剤、清涼化剤、遮光剤、着香剤、香料、芳香剤、コーティング剤、可塑剤等の製剤添加物の一種または二種以上を適宜選択して添加してもよいことはいうまでもない。
【００４４】
そのような製剤添加物としては、具体的には、例えば、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クロスカルメロースナトリウム、マルトデキストリン、エチルセルロース、乳糖、ソルビトール、無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸、オレイン酸、流動パラフィン、第二リン酸カルシウム、セバチン酸ジブチル、マクロゴール、プロピレングリコール、コーンスターチ、デンプン、アルファー化デンプン、ゼラチン、ポピドン、クロスポピドン、グリセリン、ポリソルベート８０、クエン酸、アセスルファムカリウム、アスパルテーム、炭酸ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等を挙げることができる。
【００４５】
また、本発明の免疫機能改善用組成物としての製剤化にあたっては、有効成分である抽出物が有する免疫機能改善作用を損なわない程度の質及び量の範囲で、ビタミン、ミネラル等の他の成分を添加させることもできる。
【００４６】
さらに本発明は、上記で調製された溶媒抽出物を有効成分として含有する免疫機能改善用組成物であるが、かかる組成物を食品として使用することができる。すなわち、上記で調製された免疫機能改善用組成物をそのまま食品、また他の成分と共に混合し、機能性表示食品、または医薬の形態とすることができる。
さらには、家畜、ペット用の餌として提供することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を具体的試験例、実施例等により詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：クロモジの溶媒抽出物の調製
クロモジの乾燥幹枝１ｋｇを細かく裁断し、これに１０Ｌの３０％エタノール／７０％水−混合液を加え、６０℃にて１時間加熱し抽出を行った。抽出処理後、濾過して得たアルコール溶液を減圧下に濃縮乾固後、凍結乾燥し、４４．５ｇのクロモジ抽出エキスを得た。
【００４９】
実施例２：クロモジ抽出物の、拘束ストレス負荷マウスの免疫機能低下に対する予防的および治療的改善効果の確認（試験１及び試験２）
【００５０】
実験方法
１）使用動物
Balb/cマウス（９週齢、雄性）を１週間予備飼育後、実験に用いた。
２）被験物質
クロモジ６．５ｋｇに３０％メタノール／７０％水−混合液を２０Ｌ加え、実施例１と同様に加熱抽出後（６０℃、１時間）、濃縮し、凍結乾燥して得られたもの（以下、「クロモジエキス」と記載する）を、０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース：和光純薬社製）溶液に懸濁して用いた。
３）スケジュール
ストレスは、プラスチック製５０ｍＬ遠心チューブにマウスを入れ１６時間（ＰＭ５：００〜翌日ＡＭ９：００）拘束した。
【００５１】
試験１：予防的効果の検討・確認
ストレス負荷１時間前にクロモジエキスを経口投与し、１６時間の拘束ストレスを負荷した後、処理を施し、各項目について測定を行った（ｎ＝８〜１０）。
クロモジエキスの投与量：
０．５ｇ／ｋｇ及び１．０ｇ／ｋｇの２用量
なお、対象として０．５％ＣＭＣ溶液を与え拘束ストレスを負荷しない正常対照群と、拘束ストレスを負荷し０．５％ＣＭＣ溶液のみを与えたストレス対照群とをおいた。
【００５２】
測定項目：
胸腺細胞数
末梢血白血球
血中１１−ＯＨＣＳ
パイエル板細胞数
パイエル板アポトーシス
パイエル板増殖能
パイエル板Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス
【００５３】
試験２：回復促進効果の検討・確認
１６時間の拘束ストレス負荷から解放直後（ＡＭ９：００）及び開放１日目（２４時間後のＡＭ９：００）にクロモジエキスを経口投与し、開放２日目（４８時間後のＡＭ９：００）に処置を施し、各項目について測定を行った（ｎ＝７〜８）。
クロモジエキスの投与量：
０．５ｇ／ｋｇ及び１．０ｇ／ｋｇの２用量
なお、対象として０．５％ＣＭＣ溶液を与え拘束ストレスを負荷しない正常対照群と、拘束ストレスを負荷し０．５％ＣＭＣ溶液のみを与えたストレス対照群とをおいた。
【００５４】
測定項目：
胸腺細胞数
末梢血白血球
パイエル板細胞数
パイエル板増殖能
腸管ＩｇＡ量
【００５５】
以下に、測定の実際について、詳細に記載する。
マウスは麻酔下にて腹部大静脈より採血した後、胸腺および腸管を摘出し、重量を測定した。
末梢血は、セルタック（日本光電社製）を用いて血球数を測定した。また、末梢血は遠心分離後、血清を採取し、副腎皮質ステロイドホルモンである１１−ＯＨＣＳ（１１−ヒドロキシコルチコステロイド）を蛍光法により測定した。
腸管については、十二指腸〜回腸末端までの小腸を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｍＬにて腸内容物を洗浄、回収したものを攪拌・遠心した後、上清を採取し、洗浄液中のＩｇＡ量を、BD OptEIA ELISA Sets（BD Pharmingen社製）で測定した。残った小腸からパイエル板を全て摘出し、腸管組織を５０倍量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳでホモジナイズし、遠心した後、上清を採取し、腸管上皮組織中のＩｇＡ量を測定した。
【００５６】
摘出したパイエル板は、ステンレス製メッシュにて細胞をすりつぶしながら非動化済の１０％Fetal Bovine Serum（ＦＢＳ：牛胎児血清）の入ったRPMI1640培地に浮遊させ、フローサイトメーターを用いて細胞数、ポピュレーションおよびアポトーシスの測定を行った。アポトーシスの測定については、Annexin V-FITC kit（Sigma社製）を用いて測定を行った。残ったパイエル板細胞は、細胞数を測定後，１０％ＦＢＳの入ったRPMI1640培地に細胞数を調整し（１×１０６／ｍＬ）、マイトジェン（mitogen）であるＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ：Sigma社製）２μｇ／ｍＬ、またはＬＰＳ（リポポリサッカライド：Difco社製）２５μｇ／ｍＬを加え、５％ＣＯ２、３７℃の条件下にて刺激培養を行い５日後に細胞増殖能を、Cell Counting Kit-8法（同仁化学社製）にて４５０ｎｍの吸光値を測定した。
細胞増殖能は、刺激培養（ＣｏｎＡおよびＬＰＳ加えて培養）したものについての吸光値を無刺激培養したものについての吸光値で割ったStimulation Index（S.I.）値で示した。
【００５７】
さらに、パイエル板細胞浮遊液に、洗浄したDynabeads Mouse CD4溶液（Dynal社製）を加え反応させ、マグネチックセパレーターでＣＤ４細胞のみを分離し、DETACHa BEAD Mouse CD4（Dynal社製）溶液を加えてDynabeads（マイクロビーズ）を外した細胞浮遊液に、ＰＭＡ［ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート］（５０ｎｇ／ｍＬ：和光純薬社製）＋Ionomycin（１μｇ／ｍＬ：Sigma社製）を加え、５％ＣＯ２、３７℃の条件下にて刺激培養を行い、培養２日後の上清中のＩＬ−４、ＩＦＮ−γ量をBD OptEIA ELISA Sets（BD Pharmingen社製）により定量し、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＴｈ１サイトカインであるＩＮＦ−γ（ｎｇ／ｍＬ）とＴｈ２サイトカインであるＩＬ−４（ｐｇ／ｍＬ）の比（ＩＬ−４／ＩＮＦ−γ）で表した。
【００５８】
上記の各測定に基づく結果を、以下に記載する。
【００５９】
実験結果
＜予防効果試験：試験１の結果＞
【００６０】
１．胸腺細胞数、末梢血白血球数及び血清中１１−ＯＨＣＳ
結果を、図１、２及び３に示した。
図１は胸腺細胞数の結果を示し、図２は末梢血白血球数の結果を示し、図３は血清中１１−ＯＨＳの結果を示したものである。
図中に示した結果からも判明するように、全身免疫系の胸腺細胞数及び末梢血白血球数は、拘束ストレス負荷により顕著に減少していたが、クロモジエキス（０．５、１．０ｇ／ｋｇ）の投与は、この減少を有意に抑制した。また、血清中の１１−ＯＨＣＳは拘束ストレスにより顕著に増加していたが、クロモジエキス（０．５、１．０ｇ／ｋｇ）の投与は、この増加に影響を与えなかった。
【００６１】
２．パイエル板細胞数
結果を、図４及び５に示した。
図４はパイエル板細胞数の結果を示し、図５はAnnexin V（アネキシンＡ）染色によるパイエル板細胞のアポトーシスの結果を示したものである。
図中に示した結果からも判明するように、腸管免疫系のパイエル板細胞数は、拘束ストレス負荷によって顕著に減少し、アポトーシス（細胞死）が増加していた。
クロモジエキスの投与は、パイエル板細胞数の減少に対する抑制傾向がみられ、アポトーシスの増加に対しては有意に抑制した。
【００６２】
３．パイエル細胞増殖能、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス
結果を、図６〜８に示した。
図６は、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能の結果を示し、図７はＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の結果を示し、図８はＴｈ１／Ｔｈ２バランスの結果を示したものである。
図中に示した結果から判明するように、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能は、拘束ストレス負荷により抑制傾向がみられ、また、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能は、顕著に抑制していた。
また、ＰＭＡ＋Ionomycin刺激によるパイエル板Ｔｈ細胞のサイトカイン産生量の比（ＩＬ−４／ＩＮＦ−γ）は、拘束ストレス負荷によりＩＬ−４優位となり、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスは、Ｔｈ２優位に傾いていた。
クロモジの投与は、ＣｏｎＡ刺激による増殖能の低下に対する抑制傾向を示し、ＬＰＳ刺激による増殖能の低下に対しては有意に抑制した。
また、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスにおけるＴｈ２への偏りを有意に抑制した。
【００６３】
＜回復促進効果試験：試験２の結果＞
結果を、図９〜図１５に示した。
図９は胸腺細胞数の結果を示し、図１０は末梢血白血球数の結果を示し、図１１はパイエル板細胞数の結果を示し、図１２は、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能の結果を示し、図１３はＬＰＳ（リポポリサッカライド）刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の結果を示し、図１４は腸管洗浄液中のＩｇＡ量を示し、図１５は腸管組織中のＩｇＡ量の結果を示した図である。
【００６４】
図中に示した結果からも判明するように、全身免疫系の胸腺細胞及び末梢血白血球は、拘束ストレス負荷解放２日後においても顕著に減少していた。ストレス負荷解放後のクロモジエキス（０．５、１．０ｇ／ｋｇ）の投与は、この減少を有意に回復させていた。
【００６５】
拘束ストレス負荷を解放してから２日後では、腸管免疫系のパイエル板細胞は減少しており、ＣｏｎＡ刺激によるパイエル板Ｔ細胞の増殖能の抑制傾向が認められ、ＬＰＳ刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の抑制が認められた。
クロモジエキス（０．５、１．０ｇ／ｋｇ）の投与は、ＬＰＳ刺激によるパイエル板Ｂ細胞の増殖能の低下を有意に回復させていた。
【００６６】
また、拘束ストレス負荷を解放してから２日後においては、腸管洗浄液中及び腸管組織中のＩｇＡ量は減少していたが、クロモジエキス（０．５、１．０ｇ／ｋｇ）の投与は、腸管洗浄液中及び腸管組織中のＩｇＡ量は減少を回復させていた。
【００６７】
これらの実験から、本発明のクロモジエキスは、免疫機能低下，特に精神的ストレスによる全身免疫機能および腸管免疫機能の低下を予防的および治療的に改善させる効果が確認された。
【００６８】
実施例３：クロモジの溶媒抽出エキスを含有する医薬品
（１）錠剤
実施例１で得られたクロモジの３０％エタノール抽出エキス（凍結乾燥品）５５．０ｇを、乳糖２４９．５ｇおよびステアリン酸マグネシウム０．５ｇとともに、単発式打錠機にて打錠することにより、直径１０ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。
【００６９】
（２）散剤：
上記実施例１で得られたクロモジの３０％エタノール抽出エキス（凍結乾燥品）１００．０ｇにステアリン酸マグネシウム０．５ｇを加え、圧縮、粉砕、整粒、篩別して２０〜５０メッシュの顆粒剤を得た。
【００７０】
実施例４：クロモジの溶媒抽出エキスを含有する各種飲食物
以下に示す組成にて、実施例１で得られたクロモジの３０％エタノール抽出エキス（凍結乾燥品：以下、単に抽出エキスと記す）入りの各種飲食物を製造した。
（１）飴：
（組成）                          （重量部）
粉末ソルビトール                  ８９．７０
香料                                ０．２５
抽出エキス                        １０．００
ソルビトールシード                  ０．０５
全量                            １００．００
【００７１】
（２）ガム：
（組成）                          （重量部）
ガムベース                        ２０．００
炭酸カルシウム                      ２．００
ステビオサイド                      ０．１０
抽出エキス                        １０．００
乳糖                              ６６．９０
香料                                １．００
全量                            １００．００
【００７２】
（３）キャラメル：
（組成）                          （重量部）
グラニュー糖                      ３２．００
水飴                              ２０．００
粉乳                              ３０．００
硬化油                              ４．００
食塩                                ０．６０
香料                                ０．０３
水                                  ３．３７
抽出エキス                        １０．００
全量                            １００．００
【００７３】
（４）炭酸飲料：
（組成）                          （重量部）
グラニュー糖                        ８．００
濃縮レモン果汁                      １．００
Ｌ−アスコルビン酸                  ０．１０
クエン酸                            ０．０９
クエン酸ナトリウム                  ０．０５
着色料                              ０．０５
炭酸水                            ８０．７１
抽出エキス                        １０．００
全量                            １００．００
【００７４】
（５）ジュース：
（組成）                          （重量部）
冷凍濃縮オレンジ果汁                ５．００
果糖ブドウ糖液糖                    １．００
クエン酸                            ０．１０
Ｌ−アスコルビン酸                  ０．０９
抽出エキス                        １０．００
香料                                ０．２０
色素                                ０．１０
水                                ８３．５１
全量                            １００．００
【００７５】
（６）乳酸菌飲料：
（組成）                          （重量部）
乳固形２１％発酵乳                １４．７６
果糖ブドウ糖液糖                  １３．３１
ペクチン                            ０．５０
クエン酸                            ０．０８
香料                                ０．１５
水                                ６１．２０
抽出エキス                        １０．００
全量                            １００．００
【００７６】
（７）アルコール飲料：
（組成）                          （重量部）
５０％エタノール                  ３２．００
砂糖                                ８．６０
果汁                                ２．４０
抽出エキス                        １０．００
水                                ４７．００
全量                            １００．００
【産業上の利用可能性】
【００７７】
以上記載のように、本発明は、植物抽出物、詳細にはクスノキ科クロモジの溶媒抽出物を有効成分とする免疫機能改善用組成物を提供するものであり、本発明のクスノキ科クロモジの溶媒抽出物を応用して、日常生活の中で気軽に摂取できる安全性の高い免疫機能改善用組成物を用いた飲食物、特に機能性表示食品、更にはペット、家畜用の飼料を提供できることから、その産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
2018095594.tif 000003
【図２】
2018095594.tif 000004
【図３】
2018095594.tif 000005
【図４】
2018095594.tif 000006
【図５】
2018095594.tif 000007
【図６】
2018095594.tif 000008
【図７】
2018095594.tif 000009
【図８】
2018095594.tif 000010
【図９】
2018095594.tif 000011
【図１０】
2018095594.tif 000012
【図１１】
2018095594.tif 000013
【図１２】
2018095594.tif 000014
【図１３】
2018095594.tif 000015
【図１４】
2018095594.tif 000016
【図１５】
2018095594.tif 000017