(57)【要約】位置づけ用構造を有する薄膜培養装置、ならびに位置づけ用構造との関係における装置上のコロニーの場所に基づいて、培養装置上のコロニーから細胞を採取するための方法が記載されている。さらに、位置づけ用構造との関係におけるコロニーの位置を識別する、コンピュータプログラムで符号化されたコンピュータ読取り可能媒体が記載されている。
2005500809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の増殖又は保管用培養装置において、前記装置が自立式防水基板およびカバーシートを含んで成り、ゲル化剤が前記自立式基板上に収納され、前記自立式基板および前記カバーシートが位置づけ用構造を含んで成る培養装置。
【請求項２】
前記位置づけ用構造が、穴、スリット、スロット、ベベルエッジ、切欠き、又は隆起構造である、請求項１に記載の培養装置。
【請求項３】
その表面上にさらにバーコードラベルを含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項４】
前記カバーシートが透明である、請求項１に記載の培養装置。
【請求項５】
前記自立式基板がさらにスペーサを含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項６】
前記自立式基板がさらに培地を含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項７】
前記カバーシートがさらにゲル化剤を含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項８】
前記カバーシートがさらに補強層を含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項９】
前記補強層が、発泡体、フィルム又は不織材料からなる群から選択される、請求項８に記載の培養装置。
【請求項１０】
指示薬および対応する誘導物質をさらに含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項１１】
微生物を区別するための異なる色を提供する２つの色素生産性指示薬をさらに含んで成る、請求項１に記載の培養装置。
【請求項１２】
第１の層および第２の層を含み、該第１の層および第２の層がゲル化剤を含み、かつさらに位置づけ用構造を含み、互いに分離可能である、微生物の増殖又は保管用の培養装置。
【請求項１３】
位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置上のコロニーから細胞を採取するためのシステムにおいて、
ａ）スキャナ；
ｂ）処理ユニット；および
ｃ）採集器具、
を含んで成り、前記スキャナが前記処理ユニットに対し画像ファイルを提供し、前記処理ユニットが前記位置づけ用構造との関係における前記コロニーの位置を提供し、前記採集器具が前記位置に基づいて前記コロニーから前記細胞を採取するシステム。
【請求項１４】
前記採集器具が、方向づけユニットを有し、該方向づけユニットが、前記培養装置内に対応する位置づけ用構造を収容するように適合された収容用構造を有する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記方向づけユニットがさらに、コンプライアンスのあるパッドを含んで成る、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記採集器具が液体ハンドリングチップを含んで成る、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１７】
位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置上のコロニーから細胞を採取するための採集器具において、
ａ）前記位置づけ用構造との関係において前記コロニーを位置づけする方向づけユニット；および
ｂ）前記位置づけ用構造との関係における前記コロニーの位置でプログラミングされ、前記位置に基づいて前記コロニーの細胞と接触するように適合されている採集用アーム
を含んで成る、採集器具。
【請求項１８】
前記方向づけユニットが前記培養装置内に対応する位置づけ用構造を収容するように適合された収容用構造を有している、請求項１７に記載の器具。
【請求項１９】
培養装置上のコロニーから細胞を採取するための方法において、
ａ）位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置を提供するステップ；
ｂ）前記培養装置の画像を取得するステップ；
ｃ）前記位置づけ用構造との関係における前記コロニーの位置を提供するべく前記画像を処理するステップ；および
ｄ）前記細胞を採取するべく前記コロニーの前記位置に基づいて採集器具と前記細胞を接触させるステップ、
を含んで成る方法。
【請求項２０】
前記採集器具が、前記細胞を採取するべく接触点から少なくとも１方向に移動される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記採集器具が、前記細胞を採取するべく接触点から少なくとも２方向に移動される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記画像を処理するステップとして、
ａ）前記位置づけ用構造の場所を識別するステップ；
ｂ）前記コロニーの場所を識別するステップ；および
ｃ）前記位置づけ用構造との関係において前記コロニーの位置を計算するステップ、
が含まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記画像を処理するステップに、前記位置づけ用構造との関係において特有のコロニーを選択するステップが含まれている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記特有のコロニーを選択するステップに、対照コロニーに比べて予め定められたサイズをもつコロニーを選択するステップが含まれている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記特有のコロニーを選択するステップに、予め定められた色を有するコロニーを選択するステップが含まれている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記画像を得るステップに、前記培養装置を走査するステップが含まれている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
プログラマブルプロセッサに、
ａ）表示装置上に位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置の画像を表示させ；
ｂ）前記培養装置上のコロニーから位置づけ用構造を区別させ；
ｃ）前記位置づけ用構造の場所を識別させ；
ｄ）前記コロニーの場所を識別させ；
ｅ）前記位置づけ用構造との関係における前記コロニーの位置を計算させ；かつ
ｆ）特有のコロニーを選択する、
命令を有するコンピュータ読取り可能な媒体。
【請求項２８】
命令を記憶するための記憶媒体である、請求項３６に記載のコンピュータ読取り可能媒体。
【請求項２９】
前記命令を伝送するための伝送媒体である、請求項３６に記載のコンピュータ読取り可能媒体。
【請求項３０】
位置づけ用構造を有する薄膜培養装置上のコロニーを表わす画像データを含む画像が中に記憶されている、コンピュータ読取り可能媒体。
【請求項３１】
前記培養装置上の位置づけ用構造との関係における培養装置上のコロニーの座標であるデータが中に記憶されている、コンピュータ読取り可能媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
本発明は、薄膜培養装置上の微生物コロニーからの細胞を画像形成し採取するための方法に関する。
【０００２】
数多くの組換え型および分子クローニング技術は、寒天平板上で細菌を培養しさらなる研究のために寒天から特定のコロニーを選択する能力に依存している。各々のコロニーは、標準的には、滅菌した爪楊枝を用いて手で選択され、これはかなり労力のいる仕事である。さらに、研究者が、もとの寒天平板から同じコロニーを再度位置特定しようとする場合に不確実性が存在しうる。
【０００３】
従って、培養装置上で成長するコロニーを識別してマーキングするために、自動化されたシステムが使用されてきた。例えばＢｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｕ．Ｋ．  によって販売されているＢＩＯ−ＰＩＣＫ自動コロニー採集システムといったような自動コロニー採集システムが、遺伝学的研究のために組換え型Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを処理できる速度を増大させる目的で開発されてきた。標準的には、これらのシステムには、ＣＣＤカメラといったような画像形成用コンポーネント、および各コロニー全体にわたり「ピン」を位置づけし寒天培養平板からコロニー材料の一部分を機械的に「採集する」ロボットアームを内含する。寒天平板からのコロニー材料は、次に、移された材料の中での遺伝学的材料の増幅又は分析又は細胞の成長のために培地又は試薬へと移される。
【０００４】
要約
本発明は、位置づけ用構造を伴う薄膜培養装置およびかかる培養装置上に存在するコロニーから細胞を採取するための方法に関する。培養装置の画像が得られ、かかる培養装置上で成長するか又は存在するコロニーの位置が位置づけ用構造との関係において識別されて、コロニーの識別された位置に基づきコロニーから細胞を採取することが可能となる。位置づけ用構造は、培養装置上のコロニーからの細胞がいつでも採取され得るような形で、培養装置を再整列させるために有用である。
【０００５】
一実施形態においては、本発明は、微生物の増殖又は保管のための培養装置である。該装置は、自立式防水基板およびカバーシート（例えば透明なカバーシート）を含んで成り、ここでゲル化剤が該自立式基板上に収納され、該自立式基板および該カバーシートは位置づけ用構造、例えば、穴、スリット、スロット、ベベルエッジ、切欠き、又は隆起構造を内含している。カバーシートは、その表面上にさらにバーコードラベルを内含していてよい。自立式基板は、さらにスペーサおよび（例えば単数又は複数の栄養物を含有する）成長培地を内含していてよい。培養装置はさらに、指示薬および対応する誘導物質を内含していてよい。カバーシートはさらに、ゲル化剤および／又は、発泡体、フィルム又は不織材料といったような補強層を内含し得る。
【０００６】
もう１つの実施形態においては、本発明は、互いに分離可能な第１および第２の層を内含する微生物の増殖又は保管のための培養装置である。第１および第２の層は、グアールガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲラン又は低単量体含有率のポリアクリル酸といったようなゲル化剤を内含することができる。第１および第２の層は同様に、穴、ベベルエッジ、スリット、スロット、切欠き又は隆起構造といった位置づけ用構造を内含している。第１又は第２の層はスペーサを内含していてよい。第１の層はさらに、成長培地を内含していてよい。この成長培地は、洗剤又は塩を内含することができる。第１の層は同様に、選択可能な作用物質を内含することもできる。第１および第２の層は、さらに、補強層を内含することができる。
【０００７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置上のコロニーから細胞を採取するためのシステムである。該システムには、スキャナ、処理ユニットおよび採集器具が内含されている。スキャナは、画像ファイルを取得し、処理ユニットにそれを提供する。処理ユニットは、培養装置上のセルコロニーを識別し必要であればそれを選択し、採集器具に対し位置づけ用構造との関係におけるコロニーの位置を提供する。採集器具は、位置に基づいてコロニーから細胞を採取する。採集器具は、方向づけユニットを有することができ、ここでこの方向づけユニットは、培養装置内に対応する位置づけ用構造を収容するように適合された収容用構造を有する。方向づけユニットはさらに、コンプライアンスのあるパッドを内含していてよい。採集器具は、液体ハンドリングチップを内含することができる。
【０００８】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置上のコロニーから細胞を採取するための採集器具である。採集器具は、位置づけ用構造との関係においてコロニーを位置づけする方向づけユニット；および位置づけ用構造との関係における選択されたコロニーの位置でプログラミングされ、該位置に基づいて選択されたコロニーの細胞と接触するように適合されている、採集用アームを内含する。方向づけユニットは、培養装置内に対応する位置づけ用構造を収容するように適合された収容用構造を有している。
【０００９】
培養装置上のコロニーから細胞を採取するための方法も本発明のもう１つの実施形態である。該方法は、位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置を提供するステップ；
（例えば培養装置を走査することによって）装置の表面上の細胞コロニーを内含する培養装置の画像を取得するステップ；装置の位置づけ用構造との関係における細胞コロニーの位置を提供するべく画像を処理するステップ；そして次に細胞を採取するべく細胞コロニーの位置および選択に基づいて採集器具と細胞コロニーを接触させるステップ、を内含する。細胞を採取するために、接触点から少なくとも一方向又は少なくとも二方向に、採集器具を移動させることができる。画像を処理するステップには、位置づけ用構造の場所を識別するステップ；単数又は複数のコロニーの場所を識別し、任意には特有のコロニーを選択するステップ；および位置づけ用構造との関係における選択されたコロニーの場所を識別するステップ；および位置づけ用構造との関係における選択されたコロニーの位置を計算するステップが含まれる可能性がある。位置づけ用構造との関係におけるコロニーの位置は、Ｘ−Ｙ座標を内含し得る。
【００１０】
もう１つの実施形態においては、発明は、プログラマブルプロセッサに、表示装置上に位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置の画像を表示させ；培養装置上のコロニーから位置づけ用構造を分別させ、位置づけ用構造の場所を識別させ、該コロニーおよび／又は選択されたコロニーの場所を識別させ、位置づけ用構造との関係におけるコロニーの位置を計算させる命令を有するコンピュータ読取り可能な媒体である。該コンピュータ読取り可能媒体は、命令を記憶するための記憶媒体であってもよいし、又は命令を伝送するための伝送媒体であってもよい。
【００１１】
本発明は、位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置上のコロニーを表わす画像データを含む画像が中に記憶されているコンピュータ読取り可能媒体、および培養装置上の位置づけ用構造との関係における培養装置上のコロニーの座標であるデータが中に記憶されているコンピュータ読取り可能媒体を内含している。
【００１２】
相反する定義のないかぎり、本書で使用された全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施するために本書に記載されたものと類似の又は等価の方法および材料を使用することが可能であるものの、適切な方法および材料が以下で記載されている。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法および例は、例示のみを目的としたもので、制限的意味はない。
【００１３】
発明のその他の特長および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになることだろう。
【００１４】
詳細な説明
本発明の薄膜培養装置は、分子クローニング技術のために有用であり、標準的に半固体栄養寒天培地を含有するペトリ皿および普通ブイヨン培地を含有するマルチウェル装置といったような従来の培養装置に比べ、数多くの利点を提供する。本発明の薄膜培養装置の一利点は、それらが「標本準備完了状態（ｓａｍｐｌｅ  ｒｅａｄｙ）」にあり、使用前にいかなる準備も必要としないという点にある。本発明の薄膜培養装置は、同様に、従来のペトリ皿よりもさらにコンパクトであり、そのため、安価なフラットベッド走査装置を用いてこれらの装置上に含まれた微生物コロニーを画像形成するのにきわめて適したものとなっている。
【００１５】
本発明の薄膜装置上に、スロットおよび切欠きといったような位置づけ用構造が包含されていることによって、装置を、培養装置内の微生物コロニーの精確な位置がマッピングされ得るような形で方向づけすることが可能となり、又その後、マッピングされたコロニーからの細胞を自動採集器具を用いて採集することが可能となる。さらに、多数の薄膜培養装置からの互いに類似しているか又は異なっているコロニーを、同時にマッピングすることができる。位置づけ用構造は、将来の時点で、培養装置を再整列させることができ又コロニーからの細胞をもとの地図に基づいて採取できるように、基準位置を提供する。
【００１６】
培養装置
適切な薄膜培養装置は、一般に米国特許第４，５６５，７８３号；同第５，０８９，４１３号；同第５，２３２，８３８号；および同第５，６０１，９９８号に記載されている通りに構築することができる。例えば、自立式防水基板１２をもつ本体部材を内含する培養装置１０を使用することができる（図１参照）。基板１２は、好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン又はポリスチレンといったような防水性又は不浸透性材料（すなわち水を吸収しない）で作られた比較的剛性の材料である。その他の適切な防水性材料には、防水性ウレタンコーティングを含む紙といった基板が含まれる。
【００１７】
基板１２の上部表面は、基板１２上に乾燥した培地を提供するべく乾燥させられた培地層１４を含有していてよい。代替的には、粉末として適用されうる培地を保持するのに役立つ接着剤層を基板１２上にコーティングすることもできる。接着剤は、コーティングされた基板を通して基板の表面上で成長している例えば細菌コロニーなどの微生物コロニーの検分を可能にするように水和された時点で充分透明であるべきである。接着剤は、同様に、接着剤の中に培地を完全に埋込むことなく乾燥培地で基板を均等にコーティングできるようにする厚みで、基板上にコーティングされるべきである。
【００１８】
培地を乾燥形態で、又は乾燥粉末として使用しなければならない場合、基板に対して液体として例えば栄養物、ゲル化剤および指示薬といった成分を添加し、その後乾燥させることができる。培地は、液体中の水の基本的に全てが蒸発してしまうまで、約１０４℃のオーブン内で液体培地を加熱することによって、容易に乾燥させることができる。しかしながら、水が蒸発した後に培地が加熱される場合、培地は分解し始める。
【００１９】
中心に円形開口部をもつスペーサ１６を、基板１２の培地でコーティングされた表面に接着させることができる。基板１２の周囲をカバーするスペーサ１６の一部分は、標本を接種するべき部域を画定し、基板から標本が漏出するのを防ぐ役割を果たす。スペーサ１６は、発泡プラスチック（すなわち発泡体）を含めたプラスチック又は非吸収性不織材料といったようなあらゆる非吸収性材料であってよい。代替的には、装置はスペーサ１６を含まなくてもよい。この装置の中では、一定量の標本は、培地のみの成分によって基板上に収納される。
【００２０】
カバーシート２０は、スペーサ１６の上部表面の１縁部に取付けることができる。カバーシート２０は、基板上に存在する微生物コロニーの視覚化を容易にするため、透明のフィルム又はシート材料で作られている。さらに、カバーシート２０は、好ましくは成分の汚染および劣化の危険性を回避するため、細菌又は水蒸気に対し不透性である。カバーシート２０として使用するための好ましい材料は、２軸延伸ポリプロピレンである。カバーシートは標準的に、ガムといったゲル化剤そして一部の実施形態においては、第２の指示薬をコーティングされている。カバーシート２０は、不織材料、発泡体（例えばスチレンフォーム）又はフィルム（例えばポリカーボネートフィルム）といったような補強層を内含することができる。
【００２１】
自立式基板１２およびカバーシート２０は各々、培養装置を方向づけできるようにする位置づけ用構造２２を収納している。位置づけ用構造２２は、穴（図１に描かれているような）、スリット、スロット、ベベルエッジ、突出部分又はその他の隆起構造、切欠き又は培養装置を方向づけするために使用可能なその他のあらゆる構造であり得る。標準的には、薄膜培養装置上に２つ以上の位置づけ用構造が収納されている。しかしながら、採取ステップ中に、方向づけすべき薄膜培養装置の全体的構成と組合わせて単一の位置づけ用構造を使用することができる場合、薄膜培養装置が単一の位置づけ用構造を収納していてもよいということに留意すべきである。さらに、例えば穴および切欠きといった位置づけ用構造の組合せを使用することが可能である。培養装置の標本トラッキングおよび識別を補助するため培養装置の表面上にバーコードラベルも存在していてよい。
【００２２】
使用中、カバーシート２０を引き開け、接種材料（例えば水性微生物懸濁液）を培地１４の中央に添加することによって、標準的には約１〜５ｍｌ（例えば２〜３ｍｌ）という予め定められた量の接種材料が、図１中に例示されている装置に添加される。その後培養装置２０が基板１２全体の上に置き直され、基板上に接種材料が均等に展着される。これを行なうための適切な手段が、基板１２の特定的部域に接種材料を閉じ込めるためにも使用される重み付きの円形鋳型である。接種材料が基板１２に接種しその上に展着されるにつれて、基板１２上の培地は水和して成長支持用栄養物ゲルを形成する。接種された装置は、次に予め定められた時間インキュベートされ、その後、基板上で成長する微生物コロニーの数を視覚化し、任意には透明なカバーシート２０を通して計数することが可能である。代替的には、培地１４の代りにゲル化剤が基板１２上に収納される。かかる実施形態においては、培地が、接種前又は接種ステップ中に添加される。
【００２３】
多数の層を収納するもう１つの適切な培養装置が図２に示されている。本書で使用される「層」という語には、固体基板およびあらゆる添加剤、指示薬、誘導物質、栄養物、ゲル化剤又は固体基板をコーティングするその他の試薬が内含される。装置は一般には上述のように構成されていてよい。装置４０は、不透水性基板４２といったような自立式固体基板から作られた第１層を内含する。底面基板４２は標準的に、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン又はガラスといったような水を吸収しない不透水性材料から成る比較的剛性の材料である。ポリエステル材料が、特に有用な基板である。その他の適切な防水性材料としては、「Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ  Ｔｙｐｅ  ＭＩＬ」写真印画紙（Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｕｌａｓｋｉ，  Ｎ．Ｙ．）といったような不透水性ポリエチレンコーティングを含有する紙といった不透水性基板が含まれる。一般に、本発明の装置は、コロニーを検分できるように透明又は半透明な基板を用いて構成される。コロニーの検分が必要でない実施形態においては、不透明な基板を使用することができる。基板の厚みは、約０．０８ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲内にありうる。例えば、ポリエステルフィルムは標準的に約０．１０〜約０．１８ｍｍの厚みを有し、ポリプロピレンフィルムの厚みは約０．１０〜約０．２０ｍｍ，ポリスチレンフィルムの厚みは約０．３８ｍｍである。
【００２４】
基板４２の上部表面は、成長培地４４でコーティングでき、これは次に乾燥させられて基板４２上に乾燥培地を提供する。代替的には、粉末として塗布されうる成長培地を保持するのに役立つ接着剤を基板４２上にコーティングすることもできる。接着剤は、コーティングされた基板を通して検分された場合に基板の表面上に成長する微生物コロニーを視覚化できるように、水和された時点で充分透明でなくてはならない。接着剤は同様に、その中に培地を完全に埋込むことなく乾燥した成長培地で基板を均等にコーティングできるようにする厚みで、基板上にコーティングされるべきである。
【００２５】
円形開口部をもつスペーサ４６を、基板４２の培地でコーティングされた表面に対し取付けることができる。スペーサ４６は、基板４２の周囲をカバーし、標本の接種を受けるべき部域を画定し、同様に、標本が基板から漏出するのを防止するのにも役立つ。スペーサ４６は、発泡性プラスチック（すなわち発泡体）を含めたプラスチック又は非吸収性不織材料といったようなあらゆる非吸収性材料であってよい。円形開口部の直径は改変できる。例えば、スチレンフォームウェブは直径５ｃｍ〜６ｃｍの打抜きされた円形穴を有し、同じ標本体積（約１ｍｌ）で使用することができる。さらに大きい表面については、スペーサ４６は、基板４２上に多数の平板固定用表面が形成されるように多数の円形開口部を有することができる。例えば、基板４２は、枚葉紙のサイズ（例えば２１．６ｃｍ×２７．９４ｃｍ）又は走査に便利な他のあらゆるサイズであってよく、スペーサ４６は、例えば同じ形質転換からの多数の平板固定又は同じ形質転換の異なる希釈物の平板固定を可能にするべく中に多数の開口部を有することができる。一変形実施形態においては、装置は、標本収納スペーサを内含していなくてもよい。この装置では、一定量の標本は、培地のみの成分により基板内に収納され封鎖される。
【００２６】
上部カバーシート５０は、スペーサ４６の上部表面の１縁部上に配置される。カバーシート５０は第２の層であり、好ましくは、基板上に存在する微生物コロニーの視覚化そして任意にはその計数を容易にするため、透明のフィルム又はシート材料で作られている。さらに、カバーシート５０は、好ましくは成分の汚染および劣化の危険性を回避するため、細菌又は水蒸気に対し不透性である。カバーシート５０のための材料は、そのタイプの微生物が成長するのに必要な量の酸素透過を提供するように選択することができる。例えば、ポリエステルフィルムは、低酸素透過性をもち、嫌気細菌を成長させるのに適しており、一方ポリエチレンフィルムは、高い酸素透過性をもち、好気細菌を成長させるために適している。カバーシート５０として使用するための好ましい材料は、２軸延伸ポリプロピレンである。カバーシートは、ゲル化剤を内含し、任意には、微生物成長培地、誘導物質、指示薬および／又は接着剤を内含しうる。さらに、カバーシートは、不織材料、発泡体（例えばスチレンフォーム）又はフィルム（例えばポリカーボネートフィルム）といった補強層を、さらなる支持のために内含することができる。
【００２７】
第１および第２の層の上−下の方向性は上述のものと逆転させることもできるということに留意すべきである。
【００２８】
装置の第１および第２の層は、さまざまな方法により、相互に取外し可能な形で又は永久的に取付けることができる。例えば、第１および第２の層を相互に取付けるためには、ヒンジ、留め金、糊、テープ、ホッチキス又はクランプを使用することができる。１つの実施形態では、第１および第２の層を相互に取付けるために、感圧接着剤が使用される。
【００２９】
培養装置の第１および第２の層は、各々、培養装置を方向づけできるようにする位置づけ用構造５２を収納している。位置づけ用構造５２は、穴（図２に描かれているような）スリット、スロット、ベベルエッジ、突出部分又はその他のあらゆる隆起構造、切欠き又は培養装置を方向づけするために使用可能なその他のあらゆる構造であり得る。標準的には、薄膜培養装置上に２つ以上の位置づけ用構造が収納されている。しかしながら、採取ステップ中に、方向づけすべき薄膜培養装置の全体的構成と組合わせて単一の位置づけ用構造を使用することができる場合、薄膜培養装置が単一の位置づけ用構造を収納していてもよいということに留意すべきである。さらに、例えば穴および切欠きといった位置づけ用構造の組合せを使用することが可能である。培養装置の標本トラッキングおよび識別を補助するため培養装置の表面上にバーコードラベルも存在していてよい。
【００３０】
一般に、装置の第１および第２の層には、有効量で、すなわち、層の分離時点で大部分、好ましくは少なくとも８０％の目に見える微生物コロニーの部分が装置の両方の層上に保持されるような形で、ゲル化剤を内含している。換言すると、目に見える微生物コロニーの少なくとも８０％が分割して、層の分離後に第１および第２の層上で複製を形成する。複製形成のためのコロニーの分割を表す図表として、図３を参照。例えば、コロニーの少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％が分割して、第１および第２の層上で複製を形成する。ゲル化剤の制限的意味のない例としては、グアール、キサンタン、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲランおよびポリアクリル酸（低単量体含有量）が含まれる。グアールは、特に有用なゲル化剤である。ゲル化剤についての適切な濃度は、本書に記載されている方法を使用することによって決定可能である。一般に、第１および第２の層上に変動する量のゲル化剤がある状態で装置が製造される。該装置は、微生物を含有する水性標本（例えば１〜５ｍｌ）の接種を受け、適切な長さの時間（例えば１６〜２４時間）インキュベートされる。装置の層は分離され、第１および第２の層の両方の上に保持されているコロニーの画分が決定される。
【００３１】
第１の層はさらに、成長培地を内含しうる。一部の実施形態においては、成長培地は、第１および第２の両方の層上にありうる。標準的には、ゲル化剤および成長培地は、第１の層内に内含された基板に対し一緒に適用される。適切な成長培地は、標準的に、脱水の前に溶液１体積あたり１重量％未満の濃度でゲル化剤を含有する。例えば、脱水前のゲル化剤濃度は、０．４〜０．９重量／体積％又は０．６〜０．８重量／体積％であり得る。第１の層内のゲル化剤の最終量は、乾燥後２０ｍｇ〜１００ｍｇ／２４ｉｎ２の範囲内にある。例えば、ゲル化剤の最終量は、第１の層内で３０〜８０又は４０〜５０ｍｇ／２４ｉｎ２でありうる。第２の層内のゲル化剤の量は、標準的に第１の層内の量の少なくとも５倍（５×）又は５倍以上（例えば７×、８×、９×又は１０×）大きいものである。例えば、第２の層内のゲル化剤の量は、３００〜５００ｍｇ／２４ｉｎ２又は４００〜４５０ｍｇ／２４ｉｎ２の範囲内にありうる。代替的には、成長培地を接種前又は接種中に適用することもできる。
【００３２】
成長培地中の栄養物は、培養すべき微生物に応じて変動しうる。細菌、酵母および真菌の培養のための成長培地の説明については、Ｈａｎｄｂｏｏｄ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（第２版、Ａｔｌａｓ，  Ｌ．Ｃ．Ｐａｒｋｓ（編）、１９９６、ＣＲＣＰｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ）を参照のこと。成長培地は、脱水前の溶液に対して約０．５〜約２重量／体積％の濃度で洗剤（例えばイオン洗剤）を内含しうる。洗剤の制限的意味のない例としては、デオキシコール酸塩、胆汁酸塩およびラウリル硫酸ナトリウムが内含されている。
【００３３】
成長培地の付加的成分としては、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムといったような塩、選択可能な作用物質、指示薬および誘導物質が内含され得る。例えば、選択可能な作用物質は、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコールといったような抗生物質であってよい。その他の選択可能な作用物質は、特定アミノ酸欠損でありうる。指示薬は、沈殿性、色素産性又は螢光および／又は螢光原性指示薬でありうる。適切な螢光又は螢光原性指示薬としては、例えば４−メチルウンベリフェリルホスフェート（２ナトリウム塩３水和物又は自由酸）、４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄグルクロン酸、４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオロセインジアセテート、又はフルオロセイン抗体複合体が含まれる。沈殿性指示薬は例えば２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドであってよい。色素産生指示薬は、標準的には、例えば酵素加水分解又は化学的結合の還元などの微生物による活性化まで、無色である。色素産生指示薬の制限的意味のない例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルエステル（トリフルオロアセテート塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−１−アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−３−アセテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルブチレート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリレート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（シクロヘキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（ナトリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミホ−イノシトール−ｌ−１−ホスフェート（アンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マルトトリオース、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミリステート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マンノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ノナノエート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−オレエート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−パルミテート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェート（ジ｛２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート（２リチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェート（２カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェート（２ナトリウム塩３／２水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェート（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−スルフェート（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−スルフェート（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−チミジン−３’−ホスフェート（シクロヘキシルアンモニウム塩）、又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシドが含まれる。亜テルル酸ナトリウムも同様に適切な指示薬である。
【００３４】
誘導物質は、対応する指示薬を分割するよう酵素を刺激する。例えば、１−Ｏ−メチルグルクロン酸は、グルコロニダーゼを刺激して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（指示薬）を分割させ、有色生成物を生成する誘導物質である。その他の誘導物質および指示薬対には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩又は３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩およびイソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、ナトリウム塩；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又はインドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−べータ−Ｄ−グルコピラノシド、又は５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよび１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが含まれる。
【００３５】
薄膜培養装置の１実施形態のさらなる実施形態は、ｌａｃ分別機構を内含する。薄膜培養装置が２つの色素再生指示薬を内含する場合、β−ガラクトシダーゼ欠損コロニーが第１の指示薬を活性化し、β−ガラクトシダーゼ産生コロニーが第２の指示薬を活性化し、かくして２つの色分別を生み出す。例えば、一部のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主ベクター系は、細菌プラスミドベクター内に挿入された外来性ＤＮＡの有無を示すためにβ−ガラクトシダーゼリポータ遺伝子を使用する。外来性ＤＮＡがベクター内にない場合、細胞は、不溶性の青色沈殿物を形成するべく５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を加水分解するβ−ガラクトシダーゼを発現する。外来性ＤＮＡがプラスミドベクター内のｌａｃＺ遺伝子内に挿入されている場合、細胞はＸ−ｇａｌ加水分解することができない。これらの細胞は、かかる細胞の存在下で赤に変わるもう１つの試薬２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）を用いて容易に識別され得る。要するにｌａｃ＋コロニーは青く見え、ｌａｃ−コロニーは赤く見える。
【００３６】
細胞を採取するための方法およびシステム
図４を参照すると、本発明の培養装置は、例えばＴＩＦＦ画像、ＪＰＥＧ画像、ＧＩＦＦ画像又はビットマップといった培養装置の画像を得るべくスキャナ１００を用いて走査することができる。スキャナに対する最小必要条件としては、本発明の培養装置上の微生物コロニーを解像するための５００ドット／インチ（ｄｐｉ）が含まれる。市販のフラットベッドスキャナ、例えばＡｓｔｒａ２０００（１２００ｄｐｉ、ＵＭＡＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，（Ａ）は、走査に適しておりかつ適切な解像度を提供する。薄膜培養装置は標準的に上からも下からも透明であることから、これらの装置は、いずれの方向からでも走査可能である。さらに、本発明の培養装置は、位置づけ用構造が既知の幾何形状を有することから、忠実性を失なうことなく、変動する倍率および方向性で走査可能である。
【００３７】
処理ユニット１２０は、走査された画像を記憶し、培養装置上の位置づけ用構造との関係における各コロニーの場所を提供するアルゴリズムを用いて、その画像を処理する。処理ユニット１２０は、ＰＣ、マッキントッシュ又はワークステーションといった汎用コンピュータの一部を成す中央処理ユニット（ＣＰＵおよび図形的出力のための検分用スクリーンを内含する表示装置を内含する。処理ユニット１２０は、プログラムコードを記憶する能力をもち、キーボード又はマウスといったようなユーザー入力用の入力装置を収納している。処理ユニット１２０は、入力装置、表示装置そして一部の実施形態においては、プリンタと、単数又は複数の入出力コントローラを介して通信する。処理ユニット１２０は同様に、処理ユニット１２０内の記憶済みファイルが採集器具２００にとってアクセス可能となるような形で、採集器具２００（図６参照）と通信状態にある。さらに、処理ユニット１２０は、ユーザーが、生データ又は処理済みデータに遠隔アクセスできるようにネットワークにより単数又は複数の処理ユニットに対し、通信する形でリンクされ得る。例えば、生データ又は処理済みデータが遠隔アクセス可能である場合、スキャナ１００および処理ユニット１２０が１つの場所にあり、一方で採集器具２００が異なる場所にあるということも可能である。
【００３８】
図５に示されているように、画像の処理には、予め定められた閾値に基づいて位置づけ用構造および微生物コロニーを分別するステップ、（例えばサイズ弁別により）位置づけ用構造の場所を識別するステップ、（例えばサイズ弁別により）微生物コロニーの場所を識別するステップおよび、位置づけ用構造との関係における微生物コロニーの位置を計算する（例えば位置づけ用構造との関係におけるコロニーのＸ−Ｙ座標を提供する）ステップが含まれる。
【００３９】
処理のためには、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ（Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）社製のＣｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｗｏｒｋｓ  ＩＭＡＱ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｖｅを使用することができる。このソフトウェアパッケージは、カラー又は白黒画像をグレースケール画素マップへと変換することによってヒストグラムをまず新規作成することにで画像を処理する。位置づけ用構造および微生物コロニーは、セットされたレベルに基づき画素を二進マップにセグメント化することによって区別される。位置づけ用構造および微生物コロニーは各々、画素を局所的にオブジェクトにグループ分けすること、各オブジェクトの面積を計算することおよび質量座標（すなわちＸ、Ｙ）の中心を計算することにより識別される。
【００４０】
例えば直径０．５〜１．０ｍｍといった或るサイズ又は或る色のコロニーが選択されるように、パラメータをセットすることができる。その他の選択オプションも同様に利用できる。利用可能な１つのオプションでは、色分別が用いられる。白黒画像形成システムではなくむしろカラー画像形成システムを用いて、各コロニーのＲＧＢ（赤−緑−青）ヒストグラムを使用して、平板上の各コロニーについて青対赤といったような色強度を区別することができる。もう１つの利用可能なオプションでは、フィルター分別が用いられる。１つ又は２つのフィルターを使用することで、白黒画像形成システムは、青色コロニーから赤色コロニーといったように、異なる色のコロニーを区別することができるようになる。例えば、青色フィルターでは、赤色コロニーのみが実質的に白黒画像形成システムにとって「可視的」である。赤色フィルターでは、青色コロニーのみが「可視的」となる。両方のフィルターで（逐次的に）培養装置を画像形成し、装置とカメラの位置合せを維持するシステムを用いることによっても、赤色および青色コロニーの一致又は重畳を明らかにすることができ、かくして、純粋なコロニーの識別が可能となる。
【００４１】
さらにもう１つの利用可能なオプションは、サイズ分別を使用する。対照の培養装置を適切に使用することで、分別可能な微生物を収納する培養装置上の特定のコロニーの選択は、それがかかるコロニーのサイズに基づいている場合、容易なものとなりうる。例えば、所望のＤＮＡインサートを含有するプラスミドで形質転換された細胞が、コロニーのサイズによって選択されなくてはならない場合、２つの対照を使用することができる。第１の対象培養装置は、ＤＮＡインサートをもたないプラスミドで形質転換された細胞を内含し、第２の対照培養装置は、ＤＮＡインサートをもつプラスミドで形質転換された細胞を内含する。未知の第１のおよび第２の対照培養装置は全て同じ温度（例えば３７℃）で同じ時間インキュベートされ、その後３つの装置全てが画像形成される。各対照培養装置菌株の平均コロニーサイズ（および標準偏差）が決定され、２つの対照装置間のコロニーサイズの差が見られた場合それが統計的に有意であるか否かを確認するべく適切な統計的試験（例えばＴ試験）が適用される。理想的には、「小型」および「大型」コロニー間のサイズの差は、両方のコロニーサイズグループの標準偏差よりも大きくなる。このとき、上限又は下限のいずれであれ、２つの対照サイズのコロニーサイズに基づく閾値が、未知の培養装置から所望のコロニーを選択するのに用いられる。ＣＬＯＮ  ｄｉｓｃ平板（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）といったような薄膜培養装置内で色素産生性、沈殿性指示薬を独特な形で組合せることで、コロニーサイズを用いてコロニーｌａｃ表現型を区別する技術が得られる。図９は、ＣＬＯＮ  ｄｉｓｋ平板内で用いられる指示薬系を収納する平板を例示している。Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株のｌａｃ＋およびｌａｃ−誘導体を両方共接種し、一晩成長させた。この図は、赤色コロニー（ｌａｃ−）および青色コロニー（ｌａｃ＋）のサイズの有意な差異を例示している。一部のケースでは、変色後細菌と基本的に物理的に会合した状態にとどまっている１つの指示薬（例えばＴＴＣ）と、細胞内および細胞外の色形成の蓄積を結果としてもたらす１つの指示薬（例えばＸ−ｇａｌ）の指示薬組合せは、結果としてコロニーサイズの測定可能な分別をもたらす。
【００４２】
コロニーの座標は、培養装置上のコロニーからの細胞を採取できるような形で、採集器具のための適切なファイル内に記憶される。特注のビジュアルベーシック（ＶＢ）ソフトウェアを用いて、採集器具での画像の処理を調整することができる。ＶＢは、画像ＡＱビジョンパッケージからのＡｃｔｉｖｅＸ制御機構およびダイナミックリンクライブラリ（ＤＬＬ）を利用する。
【００４３】
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓから市販されているＢｉｏｍｅｋ２０００流体ワークステーションは、適切な採集器具の一例である。Ｂｉｏｍｅｋ２０００の場合、コロニーの座標は、ツール指令言語（ＴＣＬ）ファイル内に記憶される。図６を参照すると、採集器具２００は、処理ユニット、採集用アーム２１０、液体ハンドリングチップ２１２、方向づけユニット２２０および方向づけユニットを収容するためのベース２５０（図７に例示）を収納している。方向づけユニット２２０は、収容用構造２３０を収納し、任意にはコンプライアンスをもつパッド２４０を内含することができる（図７参照）。収容用構造２３０は、培養装置の対応する位置づけ用構造を収容する。図８に例示されているように、位置づけ用構造２２又は５２が穴である場合、収容用構造２３０は円形支柱である。同様にして、位置づけ用構造２２又は５２が切欠き又はその他の構造である場合、収容用構造２３０はこれらの位置づけ用構造に相補的である。コンプライアンスあるパッド２４０は、ピペットチップが薄膜培養装置内に押し込まれてフィルムを損傷することなくコロニーから細胞を採取することができるような形で、圧縮可能な材料で構成されている。使用可能なコンプライアンスある材料の制限的意味のない例としては、ゴム又は発泡体がある。
【００４４】
採集器具２００は同様に、接触および／又は吸引により細胞を採取するべく培養装置上のコロニーと接触し次に採取した細胞を９６ウェルの平板又は試験管といったようなコンテナに移すことができるように適合されている。例えば、採集用アーム２１０は、コロニーと接触しかつ／又はこれを吸引するため、例えばピペットチップ、プラスチック管又はガラス管といった液体ハンドリングチップ２１２を備えて構成され得る。採集用アーム２１０は同様に、例えばコロニーと接触するためのプラスチックプローブ又は爪楊枝といった中実ロッドを備えて構成することもできる。さらに、採集用アーム２１０は、多数の液体ハンドリングチップを備えて構成され、かつ特定のチップを選択できるような形で制御されうる（例えば、アクティブチップを、それがその他のチップを超えて突出するような形で移動させることができる）。好ましくは、液体ハンドリングチップ２１２は使い捨てであり、コロニーとの接触後に処分される。例えば、ピペットチップのコンテナからピペットチップを取出し、コロニーと接触してそこから細胞を採取し、細胞を９６ウェル平板上の規定の場所に移し、ピペットチップを廃棄するように、採集器具をプログラミングすることができる。代替的には、ピペットチップを、取出されたものと同じコンテナに戻すこともできる。その他の実施形態では、液体ハンドリングチップ２１２はオンラインで清浄される（例えば、循環水、アルコール中で洗浄され、次に使用に先立ち乾燥させられる）か又は、コロニーの採集を邪魔することなく液体ハンドリングチップ２１２が清浄される再循環ステーションを通して循環させられる。
【００４５】
コロニーからの細胞の収量を増大させコロニー座標の計算における何らかの誤りを相殺するため、採集用アーム２１０を接触点から少なくとも１つの方向に、例えば接触点から２つ以上の方向に移動させることができる。例えば、採集用アーム２１０を、接触点から円形又はジグザクパターンで移動させることができる。培養装置の均等な表面トポグラフィのため、採集用アームはコロニーの表面全体にわたり移動することができるが、これに対し従来の培養装置（例えば寒天平板）については、表面トポグラフィはより可変的であり、そのため採集用アームが有用な量のコロニー表面に接触する確率はより少ない。
【００４６】
コンピュータ読取り可能媒体
本発明は同様に、ハードディスク、フロッピーディスク、ネットワーク化された記憶装置などといったようなコンピュータ読取り可能媒体からの命令を実行するように構成されたプログラマブルプロセッサにも関する。コンピュータプログラムは、プログラムが実行されるときに本発明の培養装置の画像が表示装置上に表示され、位置づけ用構造が培養装置上のコロニーから分別され、位置づけ用構造の場所が識別され、コロニーの場所が識別され、コロニーの位置が位置づけ用構造との関係において計算されるような形で準備される。その他の実施形態では、本発明の培養装置上のコロニーを表わす画像が中に記憶されているコンピュータ読取り可能媒体又は、位置づけ用構造との関係における本発明の培養装置上のコロニーの座標であるデータが中に記憶されているコンピュータ読取り可能媒体が特長となっている。さらに、本発明に従って遠隔処理するため大域的コンピュータネットワークといったようなコンピュータ読取り可能媒体内で命令、画像又は位置づけデータを伝送することもできる。
【００４７】
本発明は、特許請求の範囲中に記載されている発明の範囲を制限するものではない以下の例の中で、さらに詳述される。
【００４８】
実施例
実施例１
細菌培養
表１に列挙されている菌株を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、４０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）および８ｍｇ／Ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ，  Ｓｔａａｄ，  スイス）を含有するＬＢ寒天平板（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｐａｒｋｓ，  ＭＤ）上に保管した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αはＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から入手した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ．  から入手した。プラスミドｐＨＢ２は、ｌａｃ相補性領域の多重クローニング部位内にＤＮＡが挿入されたｐＵＣ１９の誘導体である。プラスミドｐＧＦ  Ｐｕｖは、Ｃｌｏｎｒｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したものであり、これは非常に低レベルの残留β−ガラクトシダーゼ活性を有し、かくして、ＣＬＯＮｄｉｓｃ平板上およびＸ−ｇａｌを含有する寒天平板上でコロニーをｌａｃ−で出現させた。各菌株からのコロニーを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢブロス５ｍＬが入った１７×１００ｍｍの無菌スナップキャップ式プラスチック管の中に接種した。管をキャッピングし、３７℃の環境振とう機の中に置き、２２０ｒｐｍで撹拌した。
【００４９】
【表１】
表１
2005500809.tif 000003
【００５０】
平板接種
２つの無菌希釈剤、すなわち、Ｉ）５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび４０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する０．８５％のＮａＣｌ（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，  ＣＡ）およびＩＩ）５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび４０μＭのイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有するＬＢブロスを調製した。７時間の接種後、培養を、上述の希釈剤の各々の中に階段希釈させた（１０倍ステップ）。以下のように接種材料を調製するべく、５ｍＬの希釈用ピペッター（３Ｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ，  ＭＮ）を使用した：  １）２．９ｍＬの希釈剤を、無菌ピペットチップ内に吸い込みた、２）０．１ｍＬの希釈した細胞懸濁液を同じピペットチップ内に吸い込んだ。そして３）メーカーの指示事項に従ってＣＬＯＮ  ｄｉｓｃ平板（ロット番号２００２  ０８ＰＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）に、３．０ｍＬの混合物全体を使用して接種を行なった。接種の後、２４時間３７℃で、スタック１つあたり最高８枚の割合でスタック状で平板をインキュベートした。
【００５１】
平板の画像形成と分析
Ｓｃａｎ  Ｊｅｔ  ６１００Ｃフラットベッドスキャナ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を用いて、インキュベート済み平板を走査した。走査された画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア、バージョン５．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いて分析した。細菌菌株ＧＰＭ−１、ＧＭＰ−５１、ＧＰＭ−３５０又はＧＰＭ−３５１が入った４枚の異なる平板の画像から、１０個のコロニーを無作為に選択した。画像を１６００Ｘまでズームし、最も暗い色強度をもつ画素の数を各コロニーについて計数した。表２は、各コロニータイプについての画素数および平均コロニーサイズ（画素単位）を示す。
【００５２】
【表２】
表２
細菌菌株ＧＰＭ−１、ＧＰＭ−５１、ＧＰＭ−３５０又はＧＰＭ−３５１の接種を受けた平板から選択された無作為コロニーの最も暗い色の部域を含む画素の数
2005500809.tif 000004
【００５３】
平均すると、青色ｌａｃ＋コロニーのサイズ（面積）は、同じ宿主Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の対応する赤色ｌａｃ−コロニーのサイズよりも大きいものであった。その上、ｌａｃ＋コロニーは、希釈剤が食塩水又はＬＢブロスといったような栄養物溶液のいずれで構成されていたかに関わらず、そのとき対応するｌａｃ−コロニーよりも大きいものであった。
【００５４】
実施例２
ＣａＣｌ２を用いてＥ．  ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α細胞に応答能を付与し、次にさまざまなサイズのインサートを含有するｐＵＣ１９又はｐＵＣ１９誘導体で形質転換させた。形質転換と回収の後、全ての細胞を混合し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄの緩衝液中で希釈し、１ｍｌの希釈剤を、組換え体と非組換え体を分別する能力をもつ薄膜培養装置上で平板固定した。培養装置は、培養装置が相対するコーナーに２つの０．３２ｃｍの位置づけ用穴を有し、補強用発泡体シートがカバーシートに接着されたという点を除いて、２０００年４月３日付の米国特許出願第０９／５４１，４１６号の例１に記載されている通りに構築した。平板を３７℃で１４〜１８時間インキュベートし、その後走査した。
【００５５】
Ｕｍａｘ２０００フラットベッドスキャナ（型式：Ａｓｔｒａ１２００Ｐ，１２００ｄｐｉ，  Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，  ＣＡ）上に、培養装置を表を下にして設置し、培養装置のビットマップファイルを得た。コロニーが色、強度レベルおよび最小／最大サイズにより識別されるような形でビットマップファイルを処理した。コロニーを、位置づけ用構造との関係においてピクチャーユニット内にマッピングした。位置づけ用構造の既知の幾何学的場所を用いて、コロニーマップを再度サイズ決定し、座標内へ回転させた。培養装置は、コロニー採集の前に剥ぎ取って開くように設計されているため、形質転換されたコロニーの座標を生成するべくロボットワークステーションのために鏡像を生成した。形質転換されたコロニーの座標を、Ｂｉｏｍｅｋロボット用の適切な命令ファイル（ＴＣＬファイル）内にダウンロードした。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋソフトウェアを、ＩＭを処理するプログラムから開始し、Ｂｉｏｍｅｋは、コロニー座標に基づいて修正されたコロニー採集アルゴリズムを実行した。
【００５６】
培養装置上で対応する位置づけ用構造を収容するように適合された収容用構造を収納するワークステーションの方向づけユニット上に、培養装置を位置づけした。ロボットアームは、Ｐ２０のピペットツールとピペットホルダからの選択されたピペットチップを使用した。コロニーから採集した細菌の収量を増大させ、あらゆるマッピングエラーを補償するために、１ｍｍのジグザグ動作を使用した。採集した細菌を、９６ウェル平板内の唯一の場所でインキュベションブロス内に移した。ピペットチップを、ピペットホルダ内の元の場所に戻し、新しいピペットチップを次の採集のために選択した。
【００５７】
９６ウェルの平板の各ウェルは、１．２ｍｌのＬＢおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを収納していた。培養を３７℃で１６時間、振とうさせながら成長させた（２００ｒｐｍ）。８５ウェル（８８．５％）の中で成長が見られ、アルカリ分解方法により、培養からプラスミドＤＮＡを単離させた。プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、０．７％のアガロースゲルを通して電気泳動させた。ゲルの臭化エチジウム染色は、異なるコロニーが採集され、変動するサイズのプラスミドが単離されたことを示した。
【００５８】
その他の実施形態
本発明についてその詳細な説明と合わせて記載してきたが、以上の記載は、本発明で例示することを意図したものであってそれを制限するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によって画定されている。その他の態様、利点および修正も以下の特許請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置の概略図である。
【図２および３】位置づけ用構造をもつ薄膜培養装置（図２）および微生物コロニーの位置づけ（図３）の概略図である。
【図４】培養装置上でコロニーから細胞を採取するためのシステムのダイヤグラムである。
【図５】コロニー同士又は培養装置上の位置づけ用構造との関係におけるコロニーの位置を計算するための処理ステップの流れ図である。
【図６】採集器具のダイヤグラムである。
【図７】方向づけユニットのダイヤグラムである。
【図８】方向づけユニット上に設置されつつある培養装置のダイヤグラムである。
【図９】ｌａｃ（＋）およびｌａｃ（−）  Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを収納する薄膜培養装置のカラーデジタル画像である。
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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