(57)【要約】本発明は、溶離溶媒として非分岐アルキル末端ジオールを使用するＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより、分子を精製する方法を提供する。詳細には、本発明によって、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールまたは１，７−ヘプタンジオールのいずれかを含有する緩衝液を使用する逆相液体クロマトグラフィーカラム上で、分子、特に、タンパク質およびペプチドを精製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆相液体クロマトグラフィーカラム上に混合物を負荷すること、および１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，７−ヘプタンジオールからなる群から選択されたジオールを含有する緩衝液を用いてカラムから分子を溶離することを含む、混合物から分子を精製するための方法。
【請求項２】
分子がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分子がヒト成長ホルモンおよび成長ホルモン拮抗物質からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
分子がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドがα−ＭＳＨ，エンケファリン、ソマトスタチンおよびソマトトロピンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項６】
ジオールが１，６−ヘキサンジオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
カラムが高速液体クロマトグラフィーカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カラムが分取カラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カラムの直径が約５ｃｍから約２．０ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
カラムの直径が約１０ｃｍから約１００ｃｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カラムがポリマー樹脂を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマー樹脂がスチレンジビニルベンゼンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリマー樹脂がメタクリレートまたはアクリルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カラムに分子を充填層容積１リットル当たり約１．０ｇから約２５．０ｇの割合で負荷する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが成長ホルモン拮抗物質である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
緩衝液のｐＨが約２．０から約１２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
緩衝液のｐＨが約７．０から約１１．０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
緩衝液のｐＨが約６．０から約８．０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
緩衝液中での１，６−ヘキサンジオールの濃度が約０％〜約８０％である、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
緩衝液中での１，６−ヘキサンジオールの濃度が約０％〜約５０％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
分子のさらなる精製をさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非分岐アルキル末端ジオールを使用する分子の精製方法に関する。詳細には、本発明の方法は、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールまたは１，７−ヘプタンジオールを含有する緩衝液を使用する逆相液体クロマトグラフィーカラム上で、分子、特にタンパク質およびペプチドを精製するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質およびペプチドは、代謝、遺伝子発現、シグナル伝達、細胞および細胞外構造で極めて重要な役割を果たしており、あらゆる生物体の生存および／または繁殖にとって不可欠なものである。多くのタンパク質およびペプチドは治療および／または診断の応用分野で有用であり、純粋な形で利用できる場合には特に有用である。不純物のために、治療および／または診断の目的を達成することが妨げられ、患者の健康が危険に曝されることもある。
【０００３】
タンパク質の精製およびペプチドの精製は、特に治療または診断用に大量の材料が必要な場合にはとりわけ重要な課題となる。規模の大小に拘わらず、重要なタンパク質およびペプチドを純粋な形で、かつ高収率で、簡単、迅速に提供できる方法が強く求められている。
【０００４】
タンパク質およびペプチドは組換えＤＮＡ技術によって作り出されることが多い。なぜなら大量の異種材料を細菌または他の宿主細胞中に発現できるからである。当技術分野でよく知られているように、組換えＤＮＡ技術には、宿主細胞にタンパク質をコードしているＤＮＡを遺伝子注入し、異種タンパクの発現に有利な条件でその細胞を増殖させることを含んでいる（例えば、米国特許第４，５６５，７８５号、米国特許第４，６７３，６４１号、米国特許第４，７３８，９２１号を参照のこと）。
【０００５】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびｈＧＨ拮抗物質（すなわち成長ホルモン拮抗物質（ＧＨＡ））は、いくつかの治療分野で利用可能な、組換え法で製造されているタンパク質の例である。ヒト成長ホルモンは、下垂体機能低下性矮小発育症、および、その病態が遺伝子の欠損、損傷または下垂体切除のいずれに因るものであれ、ｈＧＨ産生レベルの低下に起因するすべての病態の治療に用いられている。また、ヒト成長ホルモンによって、火傷被災者およびその他の入院患者の回復速度を速めることができる。一方、ＧＨＡはｈＧＨの過剰発現に起因する巨人症の一形態である末端肥大症の治療に使用されている（Ｋｏｐｃｈｉｃｋ等、米国特許第５，６８１，８０９、５，９５８，８７９、５，３５０，８３６号）。その他にも、ＧＨＡは糖尿病患者における網膜症の予防、および成長ホルモンと結合するレセプターを過剰発現する腫瘍を持ったガン患者の治療に使用できる可能性がある（Ｃｌａｒｋ等、１９９６年、国際公開ＷＯ９７／１１１７８）。
【０００６】
逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＬＣ」）および逆相高速液体クロマトグラフィー（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）は、合成法または組換え法で製造したペプチドおよびタンパク質などの分子を精製するために、広く使用される。ＲＰ−ＬＣ法およびＲＰ−ＨＰＬＣ法は、密接に関連した不純物を効率的に分離することが可能であり、多くの多様な分子を精製するの使用されている（Ｌｅｅ等、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣ」第８回バイオテクノロジーシンポジューム、パート１、５９３−６１０頁（１９８８年））。さらに、ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣは、分子、特にタンパク質の工業的規模での精製に使用され、好結果が得られている（Ｏｌｓｅｎ等、１９９４年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ａ、６７５巻、１０１頁）。
【０００７】
ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣの代表的な溶離剤はエタノール、イソプロパノール、メタノールおよびアセトニトリルである。アセトニトリルは、インスリンなどのタンパク質の精製に使用されている（Ｋｒｏｅｆｆ等、１９８９年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４６１巻、４５頁）。しかし、これらの溶媒はすべて引火性が高く、毒性があり、大量に使用する場合には安全上、無視できない問題となる。さらに、アセトニトリルは、逆相クロマトグラフィーの溶離剤として使用した場合に、変性効果を示すことが多い。毒性有機溶媒を処分、特に製造規模で処分するには、かなりの費用が必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当技術分野では、ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣにおいて溶離剤として使用されている代表的な溶媒よりも毒性が低く、安価で、変性作用の少ない非引火性溶媒を用いるＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ｈＧＨおよびＧＨＡ）および有機化合物などの分子を不純物から選択的に分離する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、溶離溶媒として非分岐アルキル末端ジオールを使用するＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって、分子を精製する方法を提供する。詳細には、本発明は、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，７−ヘプタンジオールを含有する緩衝液を使用する逆相液体クロマトグラフィーカラムによって、分子、特にタンパク質およびペプチドを精製するものである。これらの非引火性末端アルキルジオールは、ＲＰ−ＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣで溶離剤として使用されている代表的な溶媒よりも毒性が低く、安価で、変性作用が少ない。
【００１０】
一つの態様として、本発明は、ある混合物から分子を精製するための方法を提供する。まず、逆相液体クロマトグラフィーカラムに混合物を負荷する。次いで、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、または１，７−ヘプタンジオールである１種のジオールを含有する緩衝液を用いてカラムから分子を溶離させる。好ましい実施形態では、ジオールは１，６−ヘキサンジオールである。もう１つの実施形態では、カラムは高圧逆相液体クロマトグラフィーカラムである。
【００１１】
緩衝液のｐＨは、好ましくは約２．０〜約１２．０、より好ましくは約７．０〜約１１．０、最も好ましくは約６．０〜約８．０の間である。緩衝液中の１，６−ヘキサンジオーの濃度は、好ましくは約０％〜約８０％、より好ましくは約０％〜約５０％の間である。
【００１２】
一つの実施形態では、分子はポリペプチドあり、好ましくはｈＧＨまたはＧＨＡである．好ましい実施形態では、ポリペプチドはＧＨＡである。他の好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト成長ホルモンである。他の実施形態では、分子はペプチドであり、好ましくはα−ＭＳＨ、エンケファリン、ソマトスタチンまたはソマトトロピンである。
【００１３】
一つの実施形態では、カラムは高速液体クロマトグラフィーカラムである。他の実施形態では、カラムは分取カラムである。カラムの直径は、好ましくは約５ｃｍ〜約２．０ｍ、より好ましくは約１０ｃｍ〜約１００ｃｍの間である。
【００１４】
好ましくは、カラムにはポリマー樹脂が充填されている。一つの好ましい実施形態では、ポリマー樹脂はスチレンジビニルベンゼン（すなわち、スチレン性）。他の好ましい実施形態では、ポリマー樹脂はメタクリレートまたはアクリルである。
【００１５】
一つの実施形態では、分子約１０．０ｇ／充填層体積（Ｌ）の割合で混合物をカラムに負荷する。他の実施形態では、ＲＰ−ＬＣで分画した後、分子をさらに精製する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、線状アルキル末端ジオールを使用する、分子の精製方法に関する。本発明を実施するための詳細を以下に記載する。
【００１７】
定義
本明細書中で「分子」は、ペプチド、ポリペプチドまたは非ペプチド化合物を指す。
【００１８】
本明細書中で「ペプチド」は、Ｌ型異性体またはＤ型異性体である天然および非天然アミノ酸を含むアミノ酸が最大約３０個まで共有結合した分子、ならびにそれらの誘導体および／または類似体を指す。ペプチドの例にはエンケファリン、ソマトスタチンおよびα−ＭＳＨなどの分子が含まれる。本発明の方法を使用して精製できるその他のペプチドには、それだけに限らないが、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（フィラデルフィア、ペンシルベニア州）から入手可能なカタログ中のリストに記載されている生物活性ペプチドが含まれる。
【００１９】
本明細書中で「ポリペプチド」は、３０個を超えるアミノ酸を含有するペプチドを指し、内因性および外因性（すなわち異種）ポリペプチドの双方を含んでいる。タンパク質の例には、それだけに限らないが、ヒト成長ホルモンおよび成長ホルモン拮抗物質が含まれる。
【００２０】
本明細書中で「非ペプチド化化合物」は、約２００〜８００ダルトンの分子量を有する無機または有機化合物を指す。その化合物は好ましくは有機化合物である。特に好ましい有機化合物は、バンコマイシン、セファロスポリン、ペニシリンなどの抗生物質である。
【００２１】
本明細書中で「成長ホルモン拮抗物質（「ＧＨＡ」）」は、ヒト成長ホルモンの拮抗物質を指す。ＧＨＡは成長抑制作用すなわちヒト成長ホルモン拮抗作用を有している。ＧＨＡは糖尿病、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、成長ホルモン腫瘍、末端肥大症または巨人症に罹患した患者のヒト成長ホルモン活性を低下させるために使用できる。
【００２２】
本明細書中で「緩衝液」は、酸−塩基共役成分によりｐＨ変化を阻止する溶液を指す。緩衝液を形成するのに適した遊離酸には、クエン酸、酢酸、リン酸、マレイン酸、マロン酸、フタル酸、サリチル酸、フマル酸、ジメチルマロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、ギ酸、酒石酸、イタコン酸、乳酸、バルビツール酸、アスコルビン酸、２，２−ジメチルコハク酸、コハク酸、安息香酸、プロピオン酸などが含まれる。緩衝液を形成するのに適した遊離塩基には、Ｔｒｉｓ、トリエチルアミン、イミダゾール、ブルシン、トリシン、グリシナミド、ヒスチジン、エタノールアミン、グリシン、エチルアミン、ジメチルアミンなどが含まれる。その他各種の酸および塩基を使用して緩衝液を調製できることは当業者の理解するところである。好ましい緩衝液のｐＨは一般に約２．０〜約１２．０である。
【００２３】
分子の供給源
分子は当業界で知られている任意の技術で調製できる。例えば、タンパク質またはペプチドは、野生型もしくは異種のタンパク質またはペプチドを分泌する原核生物の培養、原核生物の溶菌、異種タンパク質またはペプチドを発現する原核生物の溶菌、真核生物の溶解、異種タンパク質またはペプチドを発現する真核生物の溶解、可溶性タンパク質またはペプチドを分泌する真核生物の増殖、全合成などによって得ることができる。有機または無機分子は、当業者にとって公知である合成方法および手順を用いて調製できる。分子は、市販されていれば、公知の化学製品供給業者（例えば、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄｈｉｌｌ、マサチューセッツ州）、Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）など）から購入できる。
【００２４】
原核生物の細胞溶菌によってタンパク質またはペプチドが得られる。細菌細胞を溶菌するには幾つかの方法、例えば、ビーズ粉砕、浸透ショック、凍結破砕、および酵素処理などを使用できる。好ましくはミクロフリューダイザなどの高圧ホモジナイザーを用いて細菌細胞を溶菌する。別法としては、野生型もしくは異種のタンパク質またはペプチドを分泌する微生物を培養して、タンパク質またはペプチドを得ることができる。野生型原核生物細胞または異種タンパク質を発現している原核生物細胞は、当業者に知られている各種条件下で増殖させることができる。接種原の増殖法、接種培地は当業者に知られており、具体的な方法は当技術分野で説明されている。微生物の培養に好ましい培地、時間、温度、およびｐＨも当業界で知られている。従って、例えば、その細胞の増殖に適した培地、例えば最小培地または完全培地（すなわち富栄養培地）中で細胞を増殖できる。
【００２５】
異種タンパク質は、有利には遺伝子発現のための当技術分野でよく知られている技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生できる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成的技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１−３巻（１９８９年）およびその定期改訂版、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州）、およびＡｕｓｕｂｅｌ等の編集による「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９８９年、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，ａｎｄＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ（ニューヨーク州）に記載されている技術を参照されたい。あらゆる異種タンパク質をコードしているＤＮＡおよびＲＮＡを、例えばシンセサイザーを用いて化学的に合成できる。例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編集「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、１９８４年、ＧＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載の技術を参照されたい。
【００２６】
タンパク質を発現するために様々な宿主−発現ベクターシステムを利用できる。本発明の目的に利用できる発現システムは、組換えバクテリオファージＤＮＡで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物、所望のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むファージミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター、目的のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターを遺伝子注入した酵母（例えばＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）、目的のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム、目的のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に感染、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を遺伝子注入した植物細胞、または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、金属結合性タンパク質プロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス晩期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を内包している哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３、Ｕ９３７）である。
【００２７】
真核生物システムでは、幾つかの選択システムを利用することが可能であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ等、１９７７年、Ｃｅｌｌ、１１巻、２２３頁）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ等、１９６２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ４８巻、２０２６頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ等、１９８０年、Ｃｅｌｌ、２２巻、８１７頁）の遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｐｒｔ−、ａｐｒｔ−細胞中で使用できる。また、代謝拮抗物質耐性も以下の遺伝子に対する選択のベースとして使用される。すなわち、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ等、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ７７、３５６７頁；Ｏ’Ｈａｒｅ等、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ７８、１５２７頁）、マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８、２０７２頁）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ等、１９８１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０巻、１頁）、およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等、１９８４年、Ｇｅｎｅ、３０巻、１４７頁）である。
【００２８】
細菌システムでは、前述したように幾つかの発現ベクターを選択できる。本発明の実施に適した細菌はグラム陽性およびグラム陰性細菌である。好ましい実施形態では、可溶性タンパク質液はＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）中での異種タンパク質の発現およびそれに続く細胞溶菌によって得られる。タンパク質は、バイオテクノロジー分野の当業者に知られている発現システムを使用して原核生物中で発現させることができる。本発明の実施に役立つ発現システムは米国特許第５，７９５，７４５号、５，７１４，３４６号、５，６３７，４９５号、５，４９６，７１３号、５，３３４，５３１号、４，６３４，６７７号、４，６０４，３５９号、４，６０１，９８０号に記載されている。
【００２９】
原核生物は当業者に知られている様々な条件下で増殖させることができる。本発明の一態様として、その細胞の増殖に適した培地、例えば最小培地または完全（すなわち富栄養）培地中で細胞を増殖させる。
【００３０】
末端アルキルジオールを使用する分子の精製
本発明の最初のステップとして、逆相液体クロマトグラフィーカラムに分子を含む混合物を負荷する必要がある。混合物は、炭水化物、脂質、タンパク質、核酸などの生物学的な成分を幾つか含むことができる。混合物はまた、位置異性体、幾何異性体、立体異性体など、その分子に密接に関連した異性体も含むことができる。
【００３１】
分子は、ペプチド、ポリペプチドまたは有機分子（例えば抗生物質）でよい。好ましいペプチド分子は、エンケファリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、およびα−ＭＳＨである。本発明の方法を使用して精製できるその他の分子には、それだけに限らないが、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（フィラデルフィア、ペンシルベニア州）から入手可能な生物活性ペプチドのリストに記載されているものが含まれる。従って、心房性ナトリウム利尿ペプチド、基礎繊維芽細胞抑制ペプチド、ブラジキニン、コルチコトロピン抑制ペプチドなどが、本発明の方法を用いて精製できる分子の例である。
【００３２】
好ましいタンパク質分子はＧＨＡおよびｈＧＨである。本発明の方法を使用して精製できるその他の分子には、それだけに限らないが、血液凝固因子、因子ＶＩＩＩ、リラキシン、インスリン様成長因子、インターフェロン、ｔＰＡ、抗体、ウイルスワクチン表面抗原、例えばブタ、ウシまたはヒツジに由来する動物成長因子、インスリン、エリスロポイエチン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、ＩＧＦ−２、インターロイキンおよびその他のサイトカイン、可溶性レセプター、可溶性セレクチン、ヘレグリン、血管内皮成長因子、表皮成長因子（「ＥＧＦ」）、ＥＧＦ様成長因子、上皮形質転換成長因子、角化細胞成長因子、腫瘍壊死因子形質転換成長因子、トロンボポイエチンなどが含まれる。好ましい有機分子には、バンコマイシン、セファロスポリンＣ、ペニシリンＧおよびＶなどの抗生物質が含まれる。本発明の方法を使用して精製できるその他の有機分子には、それだけに限らないが、ポリエンマクロライド、テルペン、アルカロイド、炭水化物、ポリケチドなどが含まれる。
【００３３】
カラムは、低圧、中圧または高圧カラムでよく、後者のカラムには、粒子直径が約２０μｍ未満の充填剤を充填する。分取スケールでの精製用には低圧カラムが好ましい。カラムには、粒子直径が、好ましくは約１μｍ〜約３００μｍ、より好ましくは約１５μｍ〜約１２０μｍ、最も好ましくは約３５μｍ〜約１２０μｍの充填剤を充填する。カラム充填剤は、好ましくは約０Å〜約１０００Å、より好ましくは約１５０Å〜約３００Åの孔径を有する。従って、非多孔性（すなわち非多孔性樹脂ビーズ）および多孔性充填剤を使用してＲＰ−ＬＣカラムを充填することができる。
【００３４】
カラム樹脂は、それだけに限らないが、ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂（例えば、ＣＧ−３００、ＣＧ−１０００またはＣＧ−１６１）、アクリレート樹脂またはメタクリレート樹脂（例えば、ＣＧ−７１−ＣまたはＣＧ−７１−Ｍ）、シリカベースの樹脂（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキル基、フェニル誘導体、アミノアルキルまたはアミノフェニル化合物が付いたシリカ）、アガロースベースの樹脂（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキル基またはフェニル誘導体が付いたアガロース）、セファロースベースの樹脂（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキル基またはフェニル誘導体が付いたセファロース）、スパロースベースの樹脂（例えば、Ｃ１〜Ｃ１８のアルキル基またはフェニル誘導体が付いたスパロース）などのポリマー樹脂を含めて、任意の適切な疎水性材料である。当技術分野ではその他多くの疎水性吸着剤が知られており、本発明に利用できることを、当業者であれば理解するであろう。カラム樹脂は、例えば、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ、ニュージャージー州）、Ｓｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、イリノイ州）ＴｏｓｏＨａａｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ペンシルベニア州）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）、Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、カリフォルニア州）、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カルフォルニア州）およびＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｃｈｕｒｃｈ  Ｓｔｒｅｔｔｏｎ、Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ、イギリス）など、幾つかの供給業者から購入できる。分子を精製するために使用する樹脂の種類は、当業者にとって容易に決定可能であり、分子の性質、要求純度、精製分子の必要量などの要因によって決まる。
【００３５】
カラムは分析カラムまたは分取カラムでよい。カラムに負荷する分子の量は充填層１リットル当たりで、一般的には約０．０１ｇ〜約７０．０ｇ、好ましくは約０．０２ｇ〜約４０．０ｇ、より好ましくは約０，０５ｇ〜約３０．０ｇ、さらに好ましくは約１．０ｇ〜約２５．０ｇ、最も好ましくは約３．０ｇ〜約１５．０ｇである。好ましい実施形態では、カラムに負荷する分子の量は充填層１リットル当たりで約１０ｇである。一般に、負荷の下限量はカラム充填層から溶離してくる物質を検出できる量であり、負荷の上限量は樹脂の飽和容量である。上述の量は一般的な指針に過ぎず、負荷量は分子の性質、流速、樹脂の種類など実験上の要因によって決まる。
【００３６】
好ましい実施形態では、カラムは分取カラム、つまり、分取スケールで行いかつ／および分取のための負荷を行なうカラムである。カラムの直径は、好ましくは約５ｃｍ〜約２ｍ、より好ましくは約１０ｃｍ〜約１００ｃｍである。
【００３７】
カラムの長さはカラム直径に対して適切な比率にしなければならない。一般に、この決定は経験的に行なわれ、当業者によって容易になし得るものである。カラム直径とカラム長の間の関係を決定する際に重要と思われる要因には、ビーズの大きさ、溶離方法（例えば、定組成溶離対グラジエント溶離）、樹脂の種類（例えば、イオン交換カラムは短く、サイズ排除カラムはより長い、すなわち分離方式が異なるので両者のカラムは長さが異なる）、希望する処理時間などが含まれる。理想的には、ある直径に対する最適カラム長とは、その樹脂で分子から不純物を効率的に分離できる長さである。通常、個々の精製処理についてカラムの長さを決めた後、スケールアップには、カラムの長さを固定したままで、直径を太くし、かつ、それに比例して流速を増加させる必要がある。
【００３８】
一般に、精製分子の必要量によってカラムの大きさが決まる。従って、例えば、特に大量の材料を精製する場合には直径が２メートルあるいは３メートルにも達するカラムが使用される。
【００３９】
負荷用溶媒は、どんな溶媒でもよいが、特に大規模精製においてはペプチドまたはタンパク質を含有する緩衝水溶液が好ましい。場合によっては（すなわち、ＧＨＡの精製）、負荷用溶媒に大量（約１０〜２０％ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールを含めることができる。
【００４０】
カラムの流速は、約３０ｃｍ／時〜約３００ｃｍ／時の間で変えることができる。流速は、カラムに分子を負荷する場合で約６０ｃｍ／時、カラムから分子を溶離する場合で約１２０ｃｍ／時とすることが好ましい。流速は、移動相の速度、ビーズの大きさ、保持効率、ならびに樹脂および装置の耐圧限界に依存することに留意すべきである。グラジエントの勾配は、好ましくは約０．１％〜約５％（ｗ／ｗ）ジオール／カラム容積（ＣＶ）、より好ましくは約１．２５％〜約５％（ｗ／ｗ）ジオール／ＣＶ、最も好ましくは約２．５％（ｗ／ｗ）ジオール／ＣＶである。
【００４１】
本発明の次のステップとして、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールまたは１，７−ヘプタンジオールなどのジオールを含有する緩衝液を用いてカラムから分子を溶離する。通常、溶離中に混合物中の様々な成分がカラムによって分画される。緩衝液のｐＨは、好ましくは約２．０〜約１２．０、より好ましくは約７．０から約１１．０、最も好ましくは約６．０〜約８．０である。酸性でのクロマトグラフィーでは約２．０〜約６．０のｐＨが必要であることは、当業者の認めるところである。同様に、中性でのクロマトグラフィーでは約６．０〜約８．０のｐＨ、塩基性でのクロマトグラフィーでは約８．０〜約１２．０のｐＨが必要である。本発明を実施するに際しては、ｐＨを精製のために望ましい範囲に維持する、なんらかの適当な緩衝液（例えば、リン酸塩、酢酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、クエン酸塩など）を使用できる。当業者であれば適切な濃度の緩衝液を選択できるであろう。
【００４２】
溶離のために使用されるジオールの濃度は、精製される分子の種類、使用する樹脂の種類、流速などの要因に応じて異なる。しかし、当業者であれば、それほど多くの実験を行なわないでも、ある分子をカラムから溶離するために必要なジオールの濃度を容易に決定できるであろう。
【００４３】
溶離溶媒は、好ましくは末端アルキルジオール、より好ましくは１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオールまたは１，７−ヘプタンジオール、最も好ましくは１，６−ヘキサンジオールである。一般に、緩衝液中の溶離溶媒の最大濃度は、分子およびジオール双方の溶解限度によって決まる。緩衝液中の１．６−ヘキサンジオールの濃度は、好ましくは約０％〜８０％、より好ましくは約０％〜約５０％である。緩衝液中の１，５−ペンタンジオールの濃度は、好ましくは約０％〜８０％、より好ましくは約０％〜約７０％である。好ましい溶離温度は一般に約２５℃であるが、それより低温でも高温でもよい。
【００４４】
好ましい操作圧力はカラムの設計が高圧用、低圧用のいずれであるかによって異なる。高圧カラムは、好ましくは約３００ｐｓｉ〜約５，０００ｐｓｉ、より好ましくは約５００ｐｓｉ〜約２，０００ｐｓｉで操作する。低圧カラムは、好ましくは約０ｐｓｉ〜約５００ｐｓｉ、より好ましくは約０ｐｓｉ〜５０約ｐｓｉで操作する。
【００４５】
ＧＨＡを精製するための条件としては、直径が約４５ｃｍ〜約２００ｃｍのＲＰ−ＬＣカラムに、メタクリル酸エステル（例えばＣＧ７１）またはスチレン（例えばＣＧ３００）をベースにした樹脂を、ｐＨが中性の緩衝液を用いて充填し、充填層１リットル当たり約１．０ｇ〜約１０ｇのＧＨＡを負荷することが好ましい。５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ溶液中に溶解した約０％〜５０％（ｖ／ｖ）の１，６−ヘキサンジオールを使用して、カラムからＧＨＡを溶離させる。カラムの長さは、約１０ｃｍ〜約２０ｃｍが好ましい。操作圧力は、好ましくは約０ｐｓｉ〜約５００ｐｓｉ、より好ましくは約０ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉである。
【００４６】
非分岐アルキル末端ジオールによって精製した分子の後処理
例えばより高純度の分子を得るために、分子をさらに処理することができる。必要とされる純度はその分子の潜在的用途によって決まる。場合によっては、所期の用途に使用する前に緩衝液を取り替えること、または濃縮することを付け加えるだけで、本発明の方法を精製の最終工程とすることが可能である。また場合によっては、本発明の方法で精製した後、所期の用途に使用する前にさらに精製する必要があるかもしれない。
【００４７】
必要であれば、さらなる精製のために当業者に知られている任意の精製法を使用できる。このような精製技術は、タンパク質に対するものがＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｌｉｆｔｏｎ、ニュージャージー州）１９８８年発行の「Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」およびＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．著、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ニューヨーク州）１９８７年発行の「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ第３版」に広範囲に記載されている。一般に、それだけに限定はしないが、硫酸アンモニウム沈殿法、遠心法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー（およびそのＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ型）、再結晶、および吸着クロマトグラフィー（すなわち、シリカまたはアルミナ上での）を含む技術を使用して分子をさらに精製することができる。
【００４８】
以下、実施例で本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４９】
ＢＡＫＥＲ  ＢＯＮＤ  ＢＵＴＹＬでの実験
ＡＫＴＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を用いてＢＡＫＥＲ  ＢＯＮＤ  ＢＵＴＹＬの実験を行なった。ステップグラジエントおよびリニアグラジエントによりＧＨＡを溶離した。グラジエントの期間およびグラジエントの勾配は実験結果により調節した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度で溶出液をモニターした。緩衝液系は、１５ｍＭリン酸トリエチルアミン（［ＴＥＡＰ］）（ｐＨ７．２）である緩衝液Ａ、および６０％〜７０％の１，６−ヘキサンジオールを含む１５ｍＭ  ＴＥＡＰ（ｐＨ７．２）である緩衝液Ｂからなっている。
【００５０】
溶離剤として１，６−ヘキサンジオールを使用した、大孔径ブチルカラム（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ  Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌｌｐｓｂｕｒｇ、ニュージャージー州）からのＧＨＡの溶出プロフィールを図１に示す。溶離剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図２（レーン２〜４）に示す。分画２９に対応するレーン４には明らかにＧＨＡが含まれている。レーン２およびレーン３（それぞれ分画８および２２）にはＧＨＡがある程度含まれているが、レーン４よりかなり少ない。分画２９は２８０ｎｍでの吸収ピークの頂点に相当する。図３は分画をプールしたもののＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果であり、ＧＨＡのピークおよびコハク酸化ＧＨＡのピークが、それぞれ１２．６分および１３．４分に現れている。ＧＨＡの回収率は約３４％であった。
【実施例２】
【００５１】
メタクリレートカラムＣＧ７１−Ｍを使用した小スケール実験
１５ｍＭのＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）を２ｍｌ／分の流速で流して、１０ｍｍ×１０ｃｍ（８ｍｌ）のＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルベニア州）を平衡化した。ＧＨＡ溶液２７ｍｌ（２．６ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、２００ｍＭのＮａＣＬに溶解）を、平衡化したＣＧ７１−Ｍカラムに負荷し、次いで平衡化用緩衝液で洗浄した。１５ｍＭ  ＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）中、濃度が初め３２．５％、次いで４９％、そして６５％のヘキサンジオールを用い、カラムから段階的に溶離させた。溶離剤を２８０ｎｍでの吸光度でモニターし、集めた分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【００５２】
８．０ｍｌＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍカラムで得られたクトマトグラフィーの結果を図４に示す。３２．５％ヘキサンジオールＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）のステップグラジエント法により、ＧＨＡを９８％の回収率で溶離した。溶離したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図５に示す。図５から判るように、レーン１０の溶出タンパク質は若干の不純物を含んでいるが主としてＧＨＡである。分画１０から１４をプールして、Ｃ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣでタンパク質の含量を分析した。結果を図６に示す。プールした溶液の容積は２０ｍｌ、濃度は３．４３ｍｇ／ｍｌであり、ＧＨＡは全部で６８．６ｍｇとなる。カラムに負荷したＧＨＡ量は約６９ｍｇである。
【実施例３】
【００５３】
ＣＧ７１−Ｃを用いたｐＨ実験
ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｃ（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルベニア州）カラムを１本（５ｍｍ×１０ｍｍ、２．０ｍｌ）は１５ｍＭのＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）で平衡化し、同時にＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｃカラムのもう１本（５ｍｍ×１０ｍｍ、２．０ｍｌ）は０．１％トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）で平衡化した。低ｐＨでの実験は、緩衝液Ａを０．１％ＴＦＡ溶液、緩衝液Ｂを８０％１，６−ヘキサンジオール０．１％ＴＦＡ溶液とした。中性ｐＨでの実験では、緩衝液Ａを１５ｍＭのＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）、緩衝液Ｂを６５％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭ  ＴＥＡＰ（ｐＨ７．２）溶液とした。各カラムにＨａｙｅｎｇａ等の米国特許出願第０９／３０７，５４９号の方法で得られた総計１５ｍｇのＧＨＡを負荷した。緩衝液Ｂの量が０％から１００％までのリニアグラジエントをカラム容積の２０倍を越すまで行なった。溶出液を２８０ｎｍでの吸光度でモニターした。分画を集め、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５４】
結果を図７および図８に示すが、結果は、１，６−ヘキサンジオールによってメタクリレートをベースとするカラムからＧＨＡを溶離できることを示している。溶出プロフィールのピークにはショルダーが認められ、そのプロフィールから見ても他のタンパク質およびそれと密接に関連した不純物が分画されていることは明らかである。ｐＨが中性の実験での溶出プロフィールはその広がりが、低ｐＨでのプロフィールに比較してより狭い溶出量の範囲になっている。低ｐＨでの実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９、ゲル１、レーン５〜９およびゲル２、レーン２〜４）および中性ｐＨでの実験のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９、ゲル２、レーン５〜９）によりこれらの分画にはＧＨＡが含まれていることが判り、このことはＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析でも確認できた。分画をプールした量はｐＨ７．２の実験および低ｐＨの実験でそれぞれ１５ｍｌおよび３３ｍｌであった。各カラムの回収率は９６％を越え、ＧＨＡの回収量は約１４．５ｍｇであることを示している。
【実施例４】
【００５５】
メタクリレート樹脂（ＣＧ７１−ＭおよびＣＧ７１−Ｃ）およびスチレンジビニルベンゼン樹脂（ＣＧ３００−Ｍ）のスクリーニング
それぞれ、Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１−Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルベニア州）、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−ＣおよびＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００−Ｍ樹脂（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ペンシルベニア州）を充填した３種のカラムを１５ｍＭのＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）で平衡化した。各カラムに約０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のＧＨＡを含む４０ｍｌの希薄上相液（米国特許出願第０９／３０７，５４９号のＨａｙｅｎｇａ等の方法を使用して、２相抽出で調製したもの）を負荷した。カラムへの負荷量は１０ｍｇ／ｍｌの割合である。負荷後、各カラムを１５ｍＭのＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）で洗浄した。１５ｍＭ  ＴＥＡＰ溶液（ｐＨ７．２）中のヘキサンジオール濃度が０％から６５％になるリニアグラジエント法によりカラムからＧＨＡを溶離した（溶媒の使用量はカラム容量の約２０倍）。溶出液を２８０ｎｍでの吸光度でモニターして、適切な分画を集めた。分画をＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００５６】
米国特許出願第０９／３０７，５４９号のＨａｙｅｎｇａ等の方法を使用して得られる希薄上相液からＧＨＡを精製するために、従来使用されていたスチレンジビニルベンゼンをベースとする逆相樹脂であるＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ１０００に換えて、本発明の方法を採用することに決定した。ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ１０００からＧＨＡを溶離するには一般にアセトニトリルが使用されていたが、その取扱い上の要件および廃棄に費用がかさむことにより、その処理に要するコストがかなり大きかった。
【００５７】
従って、上で詳述した１，６−ヘキサンジオールを用いるグラジエント法を使用して、上述のようにして負荷したＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｃ、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍメタクリレート樹脂、およびＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ３００−Ｍスチレンジビニルベンゼン樹脂の溶離を行なった。各樹脂の溶出プロフィールをそれぞれ図１０，１１、１２に示す。各クロマトグラムから、１，６−ヘキサンジオールによってそれぞれの樹脂からタンパク質を溶離できることが判る。ＣＧ７１−ＣおよびＣＧ７１−Ｍからの溶離剤をプールしたもののＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図１３に示す。図１５および１６はそれぞれＣＧ７１−ＣおよびＣＧ７１−Ｍからの溶離剤をプールしたもののＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【００５８】
ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｃの実験では分画１１〜１８をプールして１つの分画（２４ｍｌ）にした（ＧＨＡの回収率は８４％）。除去した溶離剤中に未回収の材料が見出されたので、ＧＨＡに対するこの樹脂の保持能力は約８ｍｇ／ｍｌであると思われる。ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍの実験では分画１０〜１６をプールした（２１ｍｌ）（回収率１０３％）。このカラムへの負荷量はＧＨＡに対し１０ｍｇ／ｍｌである。ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍの実験では、除去した溶離剤中にＧＨＡが検出されなかった。データを下記の表１に要約する。
【００５９】
【表１】
2005502590.tif 000002
【００６０】
ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ３００−Ｍの実験、およびその結果得られたＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果（それぞれ図１７および１４）から、ＧＨＡが１，６−ヘキサンジオールによってこのカラムからある程度溶離されていることが判る。しかし、そのプロフィール（図１１）を見ると、溶離帯が広がりグラジエントの終点の後まで続いている。従って、これらの条件下では、５０％１，６−ヘキサンジオールでＧＨＡを樹脂から完全に溶離させることはできない。
【実施例５】
【００６１】
ステップグラジエントを用いたスケールアップ
実施例４で述べた予備実験の中で、ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍ樹脂で好結果が得られたので、スケールアップ実験にはこの樹脂を選択した。２３５ｍｌ（５ｃｍ×１２ｃｍ）ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍカラムに５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＬ溶液（ｐＨ７．２）を通し、平衡化した。米国特許出願第０９／３０７，５４９号のＨａｙｅｎｇａらの方法を使用して得られた２倍希釈上相液４リットルを、２０ｍｌ／分の流速でカラムに負荷し、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ７．２）中５０％１，６−ヘキサンジオールによるステップグラジエント法で溶離した。２８０ｎｍでの吸光度でカラムをモニターし、分画に分け、Ｃ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６２】
２３５ｍｌＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍの実験についてのクロマトグラムを図１８に示す。その溶出プロフィールのピークは１本であり、そのピークは５０％１，６−ヘキサンジオールでの溶離段階と一致している。この実験でのカラム負荷量は８．３ｍｇ／ｍｌの割合（２３５ｍｌの樹脂に約２０００ｍｇ）であった。除外した溶離剤のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図１９ａ）でＧＨＡは認められなかった。しかし、ＧＨＡ回収率は６７％に過ぎなかった。分画６〜１２がメインピークを構成し、溶出物の４７％を占める。残りは分画１〜５および分画１３〜２０の中にある。分画をプールしたもののＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（図１９ｂ）によれば、ＧＨＡはほぼ純品であった。その後の実験で、０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ・ＴｒｉｓＨＣＬ溶液（ｐＨ７．２）のリニアグラジエント法によって、ＧＨＡの優れた回収率、通常８０％〜９５％の回収率が得られることが判明した。
【実施例６】
【００６３】
大スケールでのＧＨＡ製造
１００Ｌ（１００ｃｍ×１３ｃｍ）ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍカラムを、カラム容積の３倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．２）を１５０ｃｍ／分の速さで流して平衡化した。米国特許出願第０９／３０７，５４９号のＨａｙｅｎｇａらの方法により得られた希釈上相液（約１０００Ｌ）をカラムに７．９Ｌ／分の流速で負荷した。カラムには樹脂１Ｌ当たり約１０ｇのＧＨＡを負荷したことになる。次いで、カラム容積の２倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．２）を６０ｃｍ／時で、そして３倍量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．２）を１２０ｃｍ／時で流して、カラムを洗浄した。１，６−ヘキサンジオール濃度が０％〜５０％のグラジエント法で、カラム容積の２０倍量の溶離剤を使用してＧＨＡを溶離した。緩衝液Ａは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．２）（カラム容積の１０倍）であり、緩衝液Ｂは１，６−ヘキサンジオールの濃度が５０％（ｗ／ｗ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．２）（カラム容積の１０倍）である。ＧＨＡの溶出を２８０ｎｍでの吸光度でモニターした。
【００６４】
グラジエント中に２つの主なピークが溶離して来るが、それぞれ別個に分画した。一般に、最初のピークはカラム容積単位で数えて２番目から３番目に溶離して来る。ＧＨＡを含む主要ピークはカラム容積単位で数えて６番目〜１２番目（約６容量分）に溶離して来て、プールすると約６００Ｌになる。両方のピークをＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣで分析し、ＧＨＡの濃度を測定した。通常、ＧＨＡの回収率は主要ピークの部分で約８０％〜９５％であった。図２０はＣＧ７１−Ｍ樹脂を用いた１００Ｌスケールでの精製における典型的なクロマトグラムである。下記の表２に、同じ樹脂を用いた５つの様々なＧＨＡ精製実験の回収率を示した。
【００６５】
【表２】
2005502590.tif 000003
【００６６】
各精製実験の終了後に、カラムを、カラム容積の２倍量の０％から１００％のイソプロパノ−ルグラジエント、カラム容積の１倍量のイソパノール、１００％から０％のイソパノール逆グラジエント、それに続くカラム容積の１倍量の水、およびカラム容積の１．５倍量の０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で再生した。カラムを０．５Ｎ  ＮａＯＨと約１２〜１８時間接触させた。次いで、カラムをカラム容積の２倍量の蒸留水で洗浄した。カラムは２０％エタノール中および０．０１Ｎ  ＮａＯＨ中に保存できる。
【実施例７】
【００６７】
その他のタンパクおよびペプチドを用いた実験
この方法の一般的適用性を調べるために５種類のタンパク質またはペプチドを選択した。合成メチオニンエンケファリン（Ｔｒｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルベニア州）、０．５ｍｇ／ｍｌ）、合成α−ＭＳＨ（アセチル−ＡＣＴＨ、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルベニア州）、０．５ｍｇ／ｍｌ）、合成ソマトトロピン（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルベニア州）、０．５ｍｇ／ｍｌ）、ソマトスタチン（ブタ下垂体から単離した、０．５ｍｇ／ｍｌ）、および組換えｈＧＨ（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルベニア州）０．５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ別個に、１ｍｌ（５ｍｍ×５ｃｍ）ＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＣＧ７１−Ｍカラムに、約１ｍｇ／ｍｌ樹脂の割合で負荷した。ＡＫＴＡ装置（すなわち、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州のＦＰＬＣ装置）を５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ７．５）の緩衝液Ａ、および１，６−ヘキサンジオール濃度が５０％の５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ７．５）の緩衝液Ｂで使用可能な状態にした。緩衝液Ｂの割合が０％から１００％で、カラム体積（ＣＶ）の２０倍以上のリニアグラジエント法で、それぞれのカラムからの溶離を行なった。分画を集めＣ−４ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６８】
１，６−ヘキサンジオールを用いるグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍから溶離したエンケファリンの溶離プロフィールを図２１に示す。エンケファリンは、カラムに流入する溶媒が約３１％の緩衝液Ｂを含む時点で溶離し出す。
【００６９】
α−ＭＳＨの溶離を描いたクロマトグラムが図２２である。タンパク質は、カラムに流入する溶媒が約５４％の緩衝液Ｂを含む時点で溶離し出す。図２３（ａ）は対照の、図２３（ｂ）はＣＧ−７１からの溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果である。
【００７０】
ソマトトロピンは、ＣＧ７１−Ｍカラムに流入する溶媒が約８０％の緩衝液Ｂを含む時点で溶離が始まるが、ヘキサンジオール濃度が５０％の溶離剤をカラム容積の１０倍量流した後でも完全には溶離しなかった（図２４参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、ピーク内で若干分画されていることが判る（図２５）。Ｃ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣでも確かに他の化学種の存在が示されたが、量的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果が示唆しているほどではなかった。ＣＧ７１−Ｍカラムによりサンプル内の異なるソマトトロピン種が分画されていると考えられる。
【００７１】
ソマトスタチンは、ＣＧ７１−Ｍカラムに流入する溶媒が約６６％の緩衝液Ｂを含む時点で溶離し出す（図２６）。Ｃ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、ピーク部分の分画中にソマトスタチンが存在することを確認した。
【００７２】
ヒト成長ホルモンは、ＣＧ７１−Ｍカラムに流入する溶媒が約６０％の緩衝液Ｂを含む時点で溶離し出す（図２７）。ヒト成長ホルモンは単一ピークであり、均質であると考えられる。そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、他の成分が存在する（図２８）。Ｃ−４ＨＰＬＣのクロマトグラム上でメインピークのテーリング端に総積分面積の５％を占めるショルダーが認められた。
【００７３】
本発明は、例示した実施形態によって範囲を限定されるものではなく、例示した実施形態は、本発明の態様を示すことを目的としたものであり、機能的に同等であるいかなる態様も本発明の範囲に含まれる。さらに、本明細書中で開示したことに加える様々な修正は、当業者にとって、これまでの説明および添付図面から明らかであろう。このような修正は添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【００７４】
本明細書中で引用したすべての刊行物はその全体を参照として本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】０％〜６０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＬ溶液（ｐＨ７．２）を使用したグラジエント法によってＷＰ−ｂｕｔｙｌカラムから溶離したＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図２】図１の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図３】図１の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図４】１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したステップグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍ  ＲＰ−ＬＣカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図５】図４の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図６】図４の溶離剤のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図７】１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｃ  ＲＰ−ＬＣカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図８】１，６−ヘキサンジオール０．１％トリフルオロ酢酸溶液を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｃ  ＲＰ−ＬＣカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図９】図７および図８の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図１０】０％〜６５％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｃカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図１１】０％〜６５％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図１２】０％〜６５％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したグラジエント法によってＣＧ３００−Ｍカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図１３】図１０および図１１の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図１４】図１２の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図１５】図１０の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１６】図１１の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１７】図１２の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１８】５０％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したステップグラジエント法によって２４０ｍＬＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図１９（ａ）】図１８のカラム実験で除外した分画のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図１９（ｂ）】図１８の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２０】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール１５ｍＭリン酸トリエチルアミン溶液（ｐＨ７．２）を使用したグラジエント法によって１００Ｌ  ＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたＧＨＡの溶離プロフィールを示す図である。
【図２１】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたエンケファリンの溶離プロフィールを示す図である。
【図２２】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたα−ＭＳＨの溶離プロフィールを示す図である。
【図２３（ａ）】α−ＭＳＨ溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２３（ｂ）】図２２の溶離液のＣ−４  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図２４】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたソマトトロピンの溶離プロフィールを示す図である。
【図２５】図２４の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図２６】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたソマトスタチンの溶離プロフィールを示す図である。
【図２７】０％〜５０％１，６−ヘキサンジオール５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．５）を使用したグラジエント法によってＣＧ７１−Ｍカラムから溶離してきたｈＧＨの溶離プロフィールを示す図である。
【図２８】図２７の溶離液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９（ａ）】
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【図１９（ｂ）】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３（ａ）】
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【図２３（ｂ）】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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