(57)【要約】本発明は、臓器、組織、および個別の細胞を移植する方法を特徴とする。更に、細胞をインビトロにおいて維持する方法、ならびに移植後の細胞の生存および／または機能を増強する方法を特徴とする。これらの方法は、細胞の生存および／または機能を増強するために十分な量の一酸化炭素を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器を移植する方法であり：
(a)ドナーへ、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を投与する工程；
(b)ドナーから、腎臓、肝臓、心臓、皮膚、小腸、および膵臓からなる群より選択される、臓器を入手する工程；および
(c)この臓器を、レシピエントへ移植する工程を含む方法であって、ここでドナーへ投与される一酸化炭素の量は、レシピエントへの移植後の臓器の生存または機能を増強するのに十分である、方法。
【請求項２】
薬学的組成物が生存ドナーに投与される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
薬学的組成物が脳死ドナーに投与される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、脳死の前後にドナーに投与される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
薬学的組成物が、第一の薬学的組成物であり、臓器を、ドナーにおいて一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物でインサイチュー処理することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
移植工程の前に、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物で、臓器をエクスビボで処理することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
薬学的組成物が、第一の薬学的組成物であり、工程(c)の前、途中、または後に、レシピエントに一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第二の薬学的組成物が、工程(c)の前にレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(c)の途中でレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(c)の後でレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(c)の前および途中でレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(c)の前および後でレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(c)の前、途中、および後でレシピエントに投与される、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
臓器が肝臓である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
臓器が腎臓である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
臓器が心臓である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
臓器が膵臓である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
臓器が小腸である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
臓器が皮膚である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
ドナーが、レシピエント種と異なる種である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
ドナーおよびレシピエントが同じ種である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ドナーおよびレシピエントの両方が、非ヒト動物である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
ドナーおよびレシピエントの両方が、ヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
ドナーが非ヒト動物であり、およびレシピエントがヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
臓器を移植する方法であり：
(a)ドナーの臓器を提供する工程；
(b)一酸化炭素を含有する薬学的組成物を、この臓器に投与する工程；および
(c)この臓器をレシピエントに移植する工程を含む方法であって、ここで工程(b)の臓器に投与される一酸化炭素の量は、レシピエントへの臓器移植後の臓器の生存または機能を増強するのに十分である、方法。
【請求項２６】
工程(b)が、臓器がドナー内にある期間における臓器のインサイチュー灌流により行われる、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
工程(b)が、エクスビボで行われる、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
工程(b)の前に、ドナーへ、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を投与する工程；および、ドナーから臓器を摘出する工程をさらに含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
第二の薬学的組成物が、生存ドナーへ投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
第二の薬学的組成物が、脳死ドナーへ投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
第二の薬学的組成物が、脳死の前および後にドナーへ投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
レシピエントへ、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を、工程(c)の前、途中、または後に投与する工程をさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の前に投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の途中で投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の後に投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の前および途中で投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の前および後に投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
第二の薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(c)の前、途中、および後に投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
臓器が肝臓である、請求項25記載の方法。
【請求項４０】
臓器が腎臓である、請求項25記載の方法。
【請求項４１】
臓器が心臓である、請求項25記載の方法。
【請求項４２】
臓器が膵臓である、請求項25記載の方法。
【請求項４３】
臓器が肺である、請求項25記載の方法。
【請求項４４】
臓器が小腸である、請求項25記載の方法。
【請求項４５】
臓器が皮膚である、請求項25記載の方法。
【請求項４６】
ドナーが、レシピエントの種と異なる種である、請求項25記載の方法。
【請求項４７】
ドナーおよびレシピエントが同じ種である、請求項25記載の方法。
【請求項４８】
臓器を移植する方法であり：
(a)ドナーから臓器を提供する工程；
(b)この臓器をレシピエントに移植する工程；および
(c)工程(b)の前、途中、または後に、レシピエントに、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を、レシピエントにおける移植された臓器の生存を増強するのに十分量で投与する工程を含む方法。
【請求項４９】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(b)の前にレシピエントへ投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(b)の途中でレシピエントへ投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、工程(b)の後でレシピエントへ投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の前および途中で投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の前および後に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５４】
一酸化炭素を含有する薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の前、途中、および後に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５５】
薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の後1〜20日以内に投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５６】
薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の後21日目に始まる期間内に少なくとも1回投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５７】
薬学的組成物が、レシピエントへ、工程(b)の後21日目に始まる期間に複数回または連続して投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５８】
薬学的組成物が、移植された臓器が慢性的拒絶反応を受けているまたは受け始めていることの決定時に、レシピエントへ投与される、請求項48記載の方法。
【請求項５９】
薬学的組成物が、移植された臓器が急性的拒絶反応を受けているまたは受け始めていることの決定時に、レシピエントへ投与される、請求項48記載の方法。
【請求項６０】
ドナーから臓器を得る前に、ドナーへ、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を投与する工程をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項６１】
第二の薬学的組成物が、生存ドナーへ投与される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
第二の薬学的組成物が、脳死ドナーへ投与される、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
工程(b)の前に、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を臓器へ投与する工程をさらに含む、請求項48記載の方法。
【請求項６４】
第二の薬学的組成物が、ドナーにおいてインサイチューで臓器へ投与される、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
第二の薬学的組成物が、エクスビボで臓器へ投与される、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
臓器が肝臓である、請求項48記載の方法。
【請求項６７】
臓器が腎臓である、請求項48記載の方法。
【請求項６８】
臓器が心臓である、請求項48記載の方法。
【請求項６９】
臓器が膵臓である、請求項48記載の方法。
【請求項７０】
臓器が肺である、請求項48記載の方法。
【請求項７１】
臓器が小腸である、請求項48記載の方法。
【請求項７２】
臓器が皮膚である、請求項48記載の方法。
【請求項７３】
ドナーが、レシピエントの種と異なる種である、請求項48記載の方法。
【請求項７４】
ドナーおよびレシピエントが同じ種である、請求項48記載の方法。
【請求項７５】
ドナー臓器の機能を増強する方法であり：
(a)最低限のドナー臓器を提供する工程；および
(b)臓器を、ドナー臓器の機能を増強するのに十分な量の一酸化炭素を含有する薬学的組成物に曝露する工程を含む方法。
【請求項７６】
動物細胞をインビトロで維持する方法であり：
(a)一酸化炭素ガスを含有する加圧されたガスを含む容器を提供する工程；
(b)初代細胞または幹細胞である、インビトロにおいて単離された細胞を提供する工程；
(c)加圧されたガスを容器から放出し、一酸化炭素ガスを含む大気を形成する工程；および
(d)一酸化炭素ガスを含有する大気の存在下で、動物細胞をインビトロで維持する工程を含む方法。
【請求項７７】
動物細胞をインビトロにおいて維持する方法であり：
(a)少なくとも0.0001g CO/100g培地 を含有する培養培地を提供する工程；および
(b)単離された細胞を培地において維持する工程を含む方法。
【請求項７８】
細胞を移植する方法であり：
(a)請求項77記載の方法に従い、動物細胞を維持する工程；および
(b)この動物細胞をレシピエントへ移植する工程を含む方法。
【請求項７９】
動物細胞が、レシピエントでないドナーから得られる、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
動物細胞がレシピエントから得られる、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
移植の前、途中、または後に、一酸化炭素組成物をレシピエントへ投与することを含む、請求項78記載の方法。
【請求項８２】
一酸化炭素組成物が移植の前にレシピエントへ投与される、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
一酸化炭素組成物が移植の途中でレシピエントへ投与される、請求項81記載の方法。
【請求項８４】
一酸化炭素組成物が移植の後でレシピエントへ投与される、請求項81記載の方法。
【請求項８５】
一酸化炭素組成物が移植の前および後でレシピエントへ投与される、請求項81記載の方法。
【請求項８６】
一酸化炭素組成物が移植の前、途中、および後でレシピエントへ投与される、請求項81記載の方法。
【請求項８７】
動物細胞が、
(i)一酸化炭素を含有する組成物をドナーへ投与する工程；および
(ii)ドナーの組織から細胞を得る工程を含む方法によりドナーから得られる、請求項78記載の方法。
【請求項８８】
動物細胞が、膵島の一部である、請求項76記載の方法。
【請求項８９】
動物細胞が肝細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９０】
動物細胞が膵β細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９１】
動物細胞が線維芽細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９２】
動物細胞が骨髄細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９３】
動物細胞が神経細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９４】
動物細胞が筋細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９５】
動物細胞が幹細胞である、請求項76記載の方法。
【請求項９６】
ドナーから摘出後に動物細胞の生存を増強する方法であり：
(a)生存または脳死のドナーへ、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を投与する工程；および
(b)このドナーから単離された細胞を得る工程であり、ここでドナーに投与された一酸化炭素の量は、ドナーから摘出後の細胞の生存を増強するのに十分である工程を含む方法。
【請求項９７】
薬学的組成物が加圧されたガスである、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
(c)インビトロにおいて、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物の存在下で細胞を維持する工程をさらに含む、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
工程(c)の細胞が、液体培地内に配置されている、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
工程(c)が、加圧された一酸化炭素ガスの給源を提供すること、および液体培地を、加圧された一酸化炭素ガスの給源から放出された一酸化炭素ガスと接触することにより実行される、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
液体培地が一酸化炭素を含む、請求項99記載の方法。
【請求項１０２】
細胞が膵島の一部である、請求項96記載の方法。
【請求項１０３】
細胞が肝細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０４】
細胞が膵β細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０５】
細胞が線維芽細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０６】
細胞が骨髄細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０７】
細胞が神経細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０８】
細胞が筋細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１０９】
細胞が幹細胞である、請求項96記載の方法。
【請求項１１０】
動物細胞を移植する方法であり：
(a)生存または脳死のドナーへ、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を投与する工程；
(b)このドナーから単離された細胞を得る工程；および
(c)この細胞を、レシピエントへ移植する工程であり、ここでドナーに投与される一酸化炭素の量が、ドナーから摘出後の細胞の生存を増強するのに十分である工程を含む方法。
【請求項１１１】
ドナーはレシピエントでない、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
ドナーおよびレシピエントは同じ動物である、請求項110記載の方法。
【請求項１１３】
一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物をレシピエントへ投与する工程をさらに含む、請求項110記載の方法。
【請求項１１４】
第二の薬学的組成物が移植工程の前にレシピエントへ投与される、請求項113記載の方法。
【請求項１１５】
第二の薬学的組成物が移植工程の途中でレシピエントへ投与される、請求項113記載の方法。
【請求項１１６】
第二の薬学的組成物が移植工程の後にレシピエントへ投与される、請求項113記載の方法。
【請求項１１７】
第二の薬学的組成物が移植工程の前または後にレシピエントへ投与される、請求項113記載の方法。
【請求項１１８】
第二の薬学的組成物が移植工程の前、途中、または後にレシピエントへ投与される、請求項113記載の方法。
【請求項１１９】
細胞が、膵島の一部である、請求項110記載の方法。
【請求項１２０】
細胞が肝細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２１】
細胞が膵β細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が線維芽細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２３】
細胞が骨髄細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２４】
細胞が神経細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２５】
細胞が筋細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２６】
細胞が幹細胞である、請求項110記載の方法。
【請求項１２７】
レシピエントへ移植された動物細胞の生存または機能を増強する方法であり：
(a)動物細胞をレシピエントへ移植する工程；および
(b)移植工程の前、途中、または後に、レシピエントがレシピエントに移植された細胞の生存または機能を増強するのに十分量の一酸化炭素ガスの吸入を引き起こす工程を含む方法。
【請求項１２８】
一酸化炭素ガスが、一酸化炭素を含有する加圧されたガスを含む容器の形で供給される、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
移植工程の前に、細胞を一酸化炭素組成物にエクスビボで曝露する工程をさらに含む、請求項127記載の方法。
【請求項１３０】
移植工程の前に、動物細胞が、少なくとも、少なくとも0.0001g一酸化炭素/100g培地 を含有する液体培地において維持される、請求項127記載の方法。
【請求項１３１】
移植工程の前に、細胞がインビトロにおいて一酸化炭素を含有する大気中に維持される、請求項127記載の方法。
【請求項１３２】
一酸化炭素ガスが移植工程の途中でレシピエントへ投与される、請求項127記載の方法。
【請求項１３３】
一酸化炭素組成物が移植工程の後にレシピエントへ投与される、請求項127記載の方法。
【請求項１３４】
一酸化炭素組成物が移植工程前にレシピエントへ投与される、請求項127記載の方法。
【請求項１３５】
細胞がレシピエントでないドナーから得られる、請求項127記載の方法。
【請求項１３６】
細胞がレシピエントから得られる、請求項127記載の方法。
【請求項１３７】
細胞がレシピエントへ移植される前にドナーから摘出され；
一酸化炭素を含有する薬学的組成物がドナーから細胞を摘出する前にドナーに投与される、請求項127記載の方法。
【請求項１３８】
細胞が膵島の一部である、請求項127記載の方法。
【請求項１３９】
細胞が肝細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４０】
細胞が膵β細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４１】
細胞が線維芽細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４２】
細胞が骨髄細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４３】
細胞が神経細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４４】
細胞が筋細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４５】
細胞が幹細胞である、請求項127記載の方法。
【請求項１４６】
細胞をレシピエントへ移植する前、途中、または後に一酸化炭素ガスを含有する薬学的組成物を有効量をレシピエントに投与し、これにより移植後の細胞の生存を改善することを含む、レシピエントにおける移植された細胞の生存を改善する方法。
【請求項１４７】
少なくとも0.001ppmの一酸化炭素を含有する加圧されたガスを含む容器、ならびに細胞の患者への細胞移植の前、途中、または後に、単離された動物細胞の生存を増強するためにガスを使用することを説明するラベルを備えた製品。
【請求項１４８】
(a)培地において動物細胞を維持するのに適した栄養素、および(b)少なくとも約0.0001gの一酸化炭素/100g培地 を含有する、滅菌細胞培地。
【請求項１４９】
動物細胞をインビトロにおいて維持する方法であり：
(a)一酸化炭素ガスを含有する加圧されたガスを含む容器を提供する工程；
(b)溶存する一酸化炭素を含有する培地中に配置される、単離された動物細胞をインビトロにおいて提供する工程；
(c)加圧されたガスを容器から放出し、一酸化炭素ガスを含有する大気を形成する工程；
(d)この大気の存在下で細胞を維持する工程；ならびに
(e)この細胞をレシピエントへ移植する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦の資金援助による研究に関する陳述
本発明は、米国立衛生研究所(NIH)基金番号第HL 58688号の下、米政府の支援で行われた。米政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞生存を増強する分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
一酸化炭素(CO)ガスは、高濃度では毒性がある。しかし、現在重要なシグナル伝達分子であることがわかっている(Vermaら、Science、259:381-384, 1993)。一酸化炭素は、脳において神経伝達分子として作用すること(同書)および海馬において神経-内分泌モジュレーターとして作用すること(Pozzoliら、Endocrinology、735:2314-2317, 1994)ことも示唆されている。一酸化炭素は、一酸化窒素(NO)同様、平滑筋弛緩物質であり(Utzら、Biochem Pharmacol.、47:195-201, 1991；Christodoulidesら、Circulation、97:2306-9, 1995)、および血小板凝集を阻害する(Mansouriら、Thromb Haemost.、48:286-8, 1982)。一部のモデルにおいて、低レベルのCOの吸入は、抗炎症作用があることが示されている。
【０００４】
島細胞移植は、I型糖尿病を改善するために実行可能な治療である(Lacyら、Annu. Rev. Immunol.、2:183-98, 1984；Weirら、J. Am. Optom. Assoc.、69:727-32, 2000；Berneyら、Langenbechs Arch. Surg.、385:378-8, 2000；Shapiroら、N Engl. J. Med.、343:230-8, 2000)。しかし、臨床の島移植の過程は、多くの要因により困難である。ひとつの要因は、移植片の初期機能不全(PNF)である。別の要因は、糖尿病の逆転がうまくいくためにはドナー島が多数必要であることである(Shapiroら、N Engl. J. Med.、343:230-8, 2000)。両方の状況は、同じ病態生理を反映しており；かなりの細胞が、移植後第一週のうちに移植片において喪失される。移植後、島は、続発性血管形成前の低酸素症のような、様々なストレス因子を受け(Carlssonら、Diabates、47:1O27-32, 1998)、ならびに移植の微小環境においてマクロファージから放出された前-炎症性サイトカインおよびフリーラジカルに曝され(Rabinovitchら、Diabates、48:1223-9, 1999；Kaufmanら、J. Exp Med. 772:291-3O2, 1990；Corbettら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、90:1731-5, 1993)、およびレジデント島マクロファージから放出されたものに曝される(Mandrup-Poulsenら、J. Immunol.、739:4077-82, 1987；Arnushら、J. Clin Invest.、7O2:516-26, 1998)。移植片拒絶反応に加え免疫抑制剤の毒性作用(Weirら、Diabates、46:1247-56, 1997)も、島細胞喪失に寄与する。実験的同系島移植後のPNFの存在(Nagataら、Transplant Proc.、22:855-6, 1990；Aritaら、Transplantation、65:1429-33, 1998)は、非特異的炎症がこのシナリオにおいて重要な役割を果たすことを示している。
【０００５】
移植された臓器の生存は、移植片拒絶反応につながる免疫反応の阻止の点で、免疫抑制の成功に大きく関係していると考えられる。しかしこれまでに、移植された臓器は、それら自身を、「保護的遺伝子」の発現を通じて拒絶反応につながる血管損傷から保護することができることが示されている(例えば、Bachら、Nature Med.、3:196-2O2 (1997)；および、Soaresら、Nature Med.、4:1073-1077, 1998)。このような遺伝子のひとつであるヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)は、ヘムをビリベルジン、遊離鉄、およびCOへと異化代謝する(Tenhunenら、Proc Natl Acad Sci USA、61:748-755, 1968)。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、一部、COが、臓器、組織、および個々の細胞の移植体の生存および／または機能を促進するという観察を基にしている。
【０００７】
従って、ひとつの局面において、本発明は、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を移植ドナーに投与し、このドナーから臓器、組織、または細胞を入手し、この臓器、組織、または細胞をレシピエントへ移植する方法であり、ここでドナーに投与される一酸化炭素量が、レシピエントへの移植後の臓器、組織、または細胞の生存または機能を増強するのに十分であるような方法を提供する。
【０００８】
この薬学的組成物は、生存ドナー、脳死ドナー、または脳死前および後のドナーに投与することができる。
【０００９】
選択的に、この臓器は、ドナーにおいてインサイチューでおよび／またはエクスビボで、一酸化炭素を含有する薬学的組成物により処理することができる。
【００１０】
この方法はさらに、または代わりに、レシピエントへ一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を、臓器または組織のレシピエントへの移植工程の前および／または途中および／または後に投与する工程を含むことができる。
【００１１】
本明細書に説明されたこの方法またはいずれかの方法において、臓器または組織は、移植されるいずれかの臓器または組織、例えば肝臓、腎臓、心臓、膵臓、肺、小腸、および／または皮膚であることができ、ならびにドナーは、レシピエントと異なる種であることができ、もしくはドナーおよびレシピエント同じ種であることができる。ドナーおよびレシピエントは両方とも非ヒト動物またはヒトであることができる。あるいは、ドナーは、ブタのような非ヒト動物であり、レシピエントはヒトであることができる。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ドナーの臓器、組織、または細胞を提供する工程、エクスビボまたはインサイチューでこの臓器、組織、または細胞に一酸化炭素を含有する薬学的組成物を投与する工程、ならびにこの臓器、組織、または細胞をレシピエントへ移植する工程を含み、ここで一酸化炭素の量は、レシピエントにおける臓器、組織、または細胞の生存または機能を増強するのに十分であるような、臓器、組織、または細胞を移植する方法を提供する。ひとつの態様において、薬学的組成物は、臓器または組織がドナー内にある間に、臓器または組織をインサイチューで灌流することにより投与される。
【００１３】
選択的に、この方法は、臓器または組織のレシピエントへの移植前および／または途中および／または後に、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物をレシピエントへ投与する工程を含む。
【００１４】
更に別の局面において、本発明は、ドナーの臓器、組織、または細胞を提供する工程、この臓器、組織、または細胞をレシピエントへ移植する工程、ならびにレシピエントへの臓器、組織、または細胞移植工程の前および／または途中および／または後に、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を、レシピエントにおいて移植された臓器、組織、または細胞の生存および／または機能を増強するのに十分量、レシピエントへ投与する工程を含む、臓器、組織、または細胞の移植法を提供する。
【００１５】
ひとつの態様において、この薬学的組成物は、臓器がレシピエントへ移植された後、0〜20日以内、例えば、1、2、4、6、8、10、12、14、18、または20日以内に、レシピエントに投与される。別の態様において、この薬学的組成物は、臓器または組織のレシピエントへの移植工程後21日目に始まる時点から、移植片の生存を確実にするのに必要な期間、少なくとも1回、例えば複数回または連続的にレシピエントへ投与される。この薬学的組成物は、移植された臓器または組織が、拒絶反応、例えば慢性的拒絶反応または急性的拒絶反応を受けるまたは受け始めていることの判定時に、レシピエントへ投与される。
【００１６】
選択的に、この方法はドナーから臓器、組織、または細胞を得る前に、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物をドナーへ投与する工程をさらに含む。この第二の薬学的組成物は、生存ドナーまたは脳死したドナーに投与することができる。
【００１７】
この方法は、一酸化炭素を含有する第二の薬学的組成物を臓器へ、ドナーにおいてインサイチューにおよび／またはエクスビボで投与する工程を含む。
【００１８】
別の局面において、本発明は、最低限のドナーの臓器、組織、または細胞を提供すること、ならびに臓器、組織、または細胞を、ドナー臓器、組織、または細胞の生存および／または機能を増強するのに十分量の一酸化炭素を含有する薬学的組成物に曝露することを含む、ドナーの臓器、組織、または細胞の生存および／または機能を増強する方法を提供する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、一酸化炭素ガスを含有する加圧したガスを含む容器を提供すること、初代細胞または幹細胞である単離された細胞をインビトロで提供すること、加圧したガスを容器から放出し、一酸化炭素ガスを含有する大気を形成すること、ならびに動物細胞をインビトロにおいて一酸化炭素ガスを含有する大気の存在下で維持することを含む、動物細胞をインビトロで維持する方法を提供する。
【００２０】
望ましい場合、その後この細胞は、レシピエントへ移植することができる。この細胞は、レシピエントでないドナーから得ることができるか、もしくはレシピエントから得ることができる。更に、一酸化炭素組成物はレシピエントへ移植工程の前および／または途中および／または後に投与することができる。この組成物は典型的には吸入ガスの形であると考えられる。
【００２１】
別の態様において、動物細胞は、一酸化炭素を含有する組成物をドナーへ投与すること、ならびにドナーの組織から細胞を得ることを含む方法により、ドナーから得られる。
【００２２】
本発明は更に、一酸化炭素を有効量、例えば少なくとも0.0001g CO/100g培地 含有する培養培地を提供すること、ならびに単離された細胞をこの培地において維持することを含む、動物細胞をインビトロにおいて維持する方法を提供する。この培地は、例えば、少なくとも0.00O2、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0O20、0.0O21、0.0O22、0.0O24、0.0O26、0.0O28、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、0.0042、または0.0044g CO/100g培地 を含有することができる。
【００２３】
更に本発明は、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を生存または脳死ドナーへ投与すること、およびドナーから単離された細胞を得ることを含む、ドナーから摘出した後に動物細胞の生存を増強する方法を提供する。この薬学的組成物は、例えば、ドナーが吸入するのに適した加圧したガスの形で供給することができる。
【００２４】
この方法は更に、一酸化炭素を含有する第二の組成物の存在下で、インビトロにおいて細胞を維持する工程を含む。
【００２５】
インビトロにおいて、この細胞は液体培地に配置することができる。このような場合、細胞を第二の一酸化炭素組成物に曝露する工程は、加圧した一酸化炭素ガスの給源を提供すること、および液体培地を給源から放出された一酸化炭素ガスと接触することにより実行することができる。この液体培地それ自身は、一酸化炭素組成物として、すなわちその中に溶解された一酸化炭素と共に提供することもできる。
【００２６】
更に本発明は、生存または脳死ドナーへ、一酸化炭素を含有する薬学的組成物を投与する工程、ドナーから単離された細胞を得る工程、および細胞をレシピエントへ移植する工程を含む、動物細胞を移植する方法を提供する。この動物細胞はレシピエントではないドナーから得ることができるか、もしくはレシピエントから得ることができる。望ましい場合、一酸化炭素組成物はレシピエントへ移植工程の前および／または途中および／または後に投与することができる。
【００２７】
本発明は更に、動物細胞をレシピエントへ移植する工程、ならびに移植工程の前、途中、および／または後に、移植された細胞のレシピエントにおける生存または機能を増強するのに十分量の一酸化炭素ガスの吸入をレシピエントに引き起こす工程を含む、レシピエントへ移植された動物細胞の生存または機能を増強する方法を提供する。この一酸化炭素ガスは、一酸化炭素を含有する加圧したガスを含む容器の形で供給することができる。ひとつの態様において、この細胞は、移植工程前に一酸化炭素を含有する大気中で、インビトロにおいて維持される。例えば、動物細胞は、少なくとも、少なくとも0.0001g一酸化炭素/100g培地 (例えば、少なくとも約0.00O2、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0O20、0.0O21、0.0O22、0.0O24、0.0O26、0.0O28、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、0.0042、または0.0044g CO/100g培地)を含有する液体培地中において維持することができる。
【００２８】
この方法は選択的に、移植工程の前に、細胞を一酸化炭素組成物にエクスビボにおいて曝露する工程を含む。
【００２９】
一酸化炭素ガスは移植工程の前および／または途中および／または後に、レシピエントへ投与することができる。動物細胞はレシピエントでないドナーから得ることができるか、もしくはレシピエントから得ることができる。一酸化炭素を含有する薬学的組成物は、ドナーから細胞を採取する前および／または途中にドナーへ投与することができる。
【００３０】
別の局面において、本発明は細胞のレシピエントへの移植の前および／または途中および／または後に一酸化炭素ガスを含有する薬学的組成物を有効量レシピエントへ投与することを含む、レシピエントにおいて移植された細胞の生存を改善する方法を提供する。
【００３１】
本発明の前記方法のいずれかにおいて、生存作用は、例えば、ヘム、重金属、サイトカイン、ホルモン、一酸化窒素、エンドトキシン、UV照射、またはグルタチオン枯渇剤により；または心不全を介して誘導された、ドナーまたはレシピエントにおいて酵素ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)を誘導することにより増強することができる。ドナーにおいて、このような誘導は、臓器、組織、または細胞の摘出前または途中に起こすことができる。レシピエントにおいて、このような誘導は、移植の前、途中または後に起こすことができる。あるいは、この酵素はレシピエントへの移植の前にエクスビボにおいて、臓器、組織、または細胞において誘導することができる。
【００３２】
本発明は更に、少なくとも0.001ppm、例えば少なくとも約1、10、50、100、150、200、250、300、500、1000、2000、5000、10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、および最大1,000,000ppmの一酸化炭素を含有する加圧したガスを含む容器、ならびに患者への細胞、組織、または島の移植の前、途中または後に、単離された動物細胞、組織、または島の生存を増強するためのガスの用法を説明するラベルを備える製品を提供する。
【００３３】
同じく、培養物中で動物細胞を維持するのに適した栄養素、ならびに少なくとも約0.0001g一酸化炭素/100g培地、例えば少なくとも0.00O2、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0O20、0.0O21、0.0O22、0.0O24、0.0O26、0.0O28、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、0.0042、または0.0044gCO/100g培地 を含有する滅菌細胞培地は、本発明内に含まれる。これは動物細胞も含む。
【００３４】
動物細胞をインビトロにおいて維持し、その後移植する方法も提供されている。この方法は、一酸化炭素ガスを含有する加圧したガスを含む容器を提供する工程；単離された動物細胞をインビトロにおいて提供する工程であり、ここでこの細胞は溶解した一酸化炭素を含有する培地内に配置される工程；容器から加圧したガスを放出し、一酸化炭素ガスを含有する大気を形成する工程；この大気の存在下細胞を維持する工程；ならびに、細胞をレシピエントへ移植する工程を含む。
【００３５】
前記本発明の局面または態様において、細胞はいずれかの細胞であることができる。例えばこの細胞は、初代、第二代、または細胞株の細胞などの動物細胞であることができる。別の例として、この細胞は、例えばe細胞のような、膵島の一部であることができる。更にこの細胞は、例えば、肝細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、神経細胞、筋細胞、リンパ球、または幹細胞であることもできる。本発明の各エクスビボ法において、組織は、好ましくは血液ではなく、および全血であるならばこれをほとんど含まず、ならびにこれらの細胞は、好ましくは赤血球細胞でなく、およびかなりの数の赤血球細胞を伴わない。
【００３６】
特に定義しない限りは、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明された方法および材料に類似したまたは同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において利用することができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、および他の参考文献は、それら全体が本明細書に参照として組入れられている。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。材料、方法、および実施例は単に例証するものであり、限定を意図するものではない。
【００３７】
本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および「特許請求の範囲」から明かであると考えられる。
【００３８】
詳細な説明
本明細書において使用される用語「一酸化炭素」(または「CO」)は、その気体状態、液体形へ圧縮された、または水溶液に溶解されたような分子一酸化炭素を説明している。用語「一酸化炭素組成物」および「一酸化炭素を含有する薬学的組成物」は、本明細書を通じて、ドナー患者、死体、もしくは動物へ；臓器へ；または、臓器の一部、例えば臓器の組織もしくは臓器を形成している個別の細胞、例えばニューロン、肝細胞、筋細胞、島、もしくは膵β細胞のような島細胞に投与することができる一酸化炭素を含有する気体、液体、固体、または半固体の組成物を説明するために使用される。当業者は、所定の適用について、どの形の薬学的組成物、例えば気体、液体、または気体および液体型の両方が好ましいかを理解するであろう。
【００３９】
本明細書において使用される用語「有効量」および「治療有効性」は、意図された作用または生理的転帰を生じるためのその投与の状況において有効である、ある期間(急性または慢性の投与および定期的または連続投与を含む)に利用される一酸化炭素の量または濃度を意味する。本発明における使用に関する一酸化炭素有効量は、例えば、インビボおよび／またはインビトロにおいて臓器または細胞の生存を増強および／または機能を改善するのに有効な量を含む。個別の細胞または細胞塊の移植の状況、例えば移植ドナーおよび／またはレシピエントにおいて、一酸化炭素の有効量は、細胞または細胞塊の生存を増強するのに十分な、例えば細胞もしくは細胞塊の喪失を低下するのに十分な、および／または移植された細胞もしくは細胞塊の機能性能を改善するのに十分な量で移植体ドナーおよび／またはレシピエントに投与される。体外の細胞を処理する状況、例えば培養されるおよび／または移植に使用される島細胞において、一酸化炭素の有効量は細胞の保存を増強するために、および／または細胞喪失、例えばアポトーシスによる喪失を低下するために、および／または機能を増強するために、細胞がインキュベーションまたは貯蔵される量である。臓器および組織の移植の状況、例えば移植体ドナーおよび／またはレシピエントにおいて、一酸化炭素の有効量は、移植体ドナーおよび／またはレシピエントに投与される、対象の臓器、組織、または細胞の生存を増強するため、例えば臓器または組織が構成される細胞の喪失を低下するため、および／または臓器の機能性能を向上するために十分な量である。貯蔵または移植に使用される臓器、組織、または細胞のエクスビボでの治療の状況において、一酸化炭素有効量は、臓器または組織の生存および／または機能を増強するのに十分な量である。本明細書において使用される用語「阻害」は、例えばアポトーシスのような、生物学的プロセスの開始の遅延、低下、予防または改善を含む。気体について、一酸化炭素の有効量は、一般に、約0.0000001％〜約0.3質量％、例えば、0.0001％〜約0.25質量％の範囲であり、好ましくは一酸化炭素の少なくとも約0.001％、例えば少なくとも0.005％、0.010％、0.O2％、0.O25％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.10％、0.15％、0.20％、0.22％、または0.24質量％である。好ましい一酸化炭素の範囲は、約0.001％〜約0.24％、約0.005％〜約0.22％、約0.01％〜約0.20％、および約0.01％〜約0.1質量％である。他の好ましい範囲は、約0.005％〜約0.24％、約0.01％〜約0.22％、約0.015％〜約0.20％、および約0.O25％〜約0.1質量％である。COの液体溶液について、有効量は、一般に、約0.0001〜約0.0044g CO/100g液体 の範囲に収まり、例えば、少なくとも 0.00O2、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0O20、0.0O21、0.0O22、0.0O24、0.0O26、0.0O28、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、または0.0042g CO/100g水溶液 である。好ましい範囲は、例えば約0.0010〜約0.0030g CO/100g液体、約0.0015〜約0.0O26g CO/100g液体、または約0.0018〜約0.0O24g CO/100g液体 である。当業者は、適用に応じてこれらの範囲を外れる量を使用することができることを理解するであろう。
【００４０】
本明細書を通じて使用される用語「患者」は、本発明の方法に従い処置が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを説明している。獣医適用は、本発明により明確に理解される。この用語は、鳥類、爬虫類、両生類、および哺乳類、例えばヒト、他の霊長類、ブタ、マウス、およびラットのような齧歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される用語「ドナー」または「ドナー患者」は、貯蔵および／またはレシピエント患者への移植を目的として、臓器、組織または個別の細胞が入手される、動物(ヒトまたは非ヒト)を意味する。用語「レシピエント」または「レシピエント患者」は、臓器、組織、細胞塊、または個別の細胞が移植される動物(ヒトまたは非ヒト)を意味する。
【００４１】
用語「糖尿病」は、当技術分野において例えば真性糖尿病として認められているような糖尿病性疾患を説明する一般用語である。真性糖尿病は、血糖値調節の不能を特徴としている。糖尿病の最も有力なふたつの型は、I型およびII型糖尿病として知られている。I型またはインスリン依存型糖尿病(IDDM)において、インスリン産生β細胞が破壊されているために、膵臓はほとんどまたは全くインスリンを産生しない。II型またはインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)において、膵臓は若干のインスリンを産生するがこのインスリンは効果がない。この用語は更に、急性および慢性の両方の、糖尿病により引き起こされた無数の続発性疾患、例えば糖尿病合併症、例として低血糖症および高血糖症、網膜症、アンギオパシー、ニューロパシー、およびネフロパシーも包含している。
【００４２】
本明細書において使用される用語「細胞」または「動物細胞」は、移植に適した動物細胞を含む、いずれかの種類の動物細胞を意味する。これらの細胞は、典型的には動物ドナーから得た初代細胞であるが、二次細胞または確立された細胞株の細胞であることもできる。これらは選択的に、エクスビボで、いくつかの方法でそれらの機能を変更する発現ベクターによりトランスフェクションされる。これらの細胞は、例えば、島細胞、例として膵島の一部である細胞、および肝細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、筋細胞、および幹細胞、ならびに脊髄を含む中枢神経系の細胞(例えば、ニューロン)を含むが、これらに限定されるものではない。用語「島細胞」は、本明細書を通じ、ランゲルハンス島のような、島として知られている膵臓内の細胞集団を説明する一般用語として使用される。ランゲルハンス島は、例えばβ細胞(これはインスリンを生成する)、α細胞(これはグルカゴンを生成する)、γ細胞(これはソマトスタチンを生成する)、F細胞(これは膵ポリペプチドを生成する)、腸クロム親和細胞(これはセロトニンを生成する)、PP細胞およびD1細胞を含む、いくつかの細胞型を含む。用語「幹細胞」は、培養において限定された期間に分裂する能力および特定の細胞を生じる能力を有する細胞を意味する、当技術分野において認められた用語である。この用語に含まれるのは、例えば、全能、多能(pluripotent、multipotent)および単能の幹細胞、例えば、神経、肝臓、筋肉、および造血系の幹細胞である。
【００４３】
「単離された細胞」は、細胞(またはその前駆体)が天然に生じる組織または臓器から細胞が取り除かれることを意味する。細胞は、その天然の環境から部分的に精製することができ、「単離された」とみなされる。例えば、完全なランゲルハンス島は、「単離された」細胞で作製されたと見なされ、この島は一旦膵臓から取り除かれ、他の島から物理的に分離することができる。腎臓もしくは心臓のような完全な臓器または血管片のような部分的臓器の細胞は、臓器の一部ではあるが、「単離された細胞」とはみなされない。
【００４４】
用語「臓器」は、動物において特異的機能を有する解剖学的部分または部材を説明する一般用語として本明細書を通じて使用される。更にこの用語の意味の中には、臓器の実質的部分、例えば、臓器から得られた合着した(cohesive)組織が含まれる。このような臓器は、腎臓、肝臓、心臓、腸、例えば大腸および小腸、膵臓および肺を含むが、これらに限定されるものではない。更にこの定義には、骨および血管、例えば大動脈移植体も含まれる。
【００４５】
用語「移植」は、臓器、組織、細胞塊、または個別の細胞を患者へ移植する手法を説明する一般用語として本明細書を通じて使用される。用語「移植」は、当技術分野において、レシピエントにおいて移植された組織または細胞の機能的完全性を維持することを意図した、ドナーからレシピエントへの生存組織または細胞の転移として定義される(例えば、The Merck Manual、Berkow、Fletcher、およびBeers編集、Merck Research Laboratories、ラーウェイ、NJ、1992参照)。用語「細胞移植」は、本明細書を通じて、少なくとも1種の細胞、例えば島細胞の患者への転移の過程を説明する一般用語として使用される。例えば、このような移植は、β細胞(または完全な島)をドナー膵から摘出すること、およびそれを膵が十分なインスリンを生成することができないレシピエント患者へ配置することにより行うことができる。これらの用語は、輸血以外の、当技術分野において公知の移植体の全ての範疇を含む。移植体は、部位およびドナーとレシピエント間の遺伝的関係により範疇分けされる。この用語は、例えば自家移植(患者のひとつの位置から同じ患者の同じまたは別の位置へと細胞または組織を摘出および転移する)、同種移植(同種のメンバー間での移植)、および異種移植(異種のメンバー間での移植)を含む。
【００４６】
用語「臓器拒絶反応」、「移植片拒絶反応」、または「拒絶反応」は、当技術分野において認められており、本明細書を通じて、レシピエントの臓器、組織、または細胞の拒絶反応の過程を説明する一般用語として使用される。この定義には、例えば、通常臨床の実践において定義される拒絶反応の3種のパターン：超急性拒絶反応、急性拒絶反応、および慢性拒絶反応が含まれる(例えば、Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press、1994)。
【００４７】
用語「最低限のドナー」および「最低限の臓器」は、移植手法におけるその使用が最適を下回るような問題を示しているドナーまたは臓器を説明する一般用語として、本明細書において使用される。例えば、最低限のドナーは、50歳よりも年長のドナー、または例えば糖尿病、HTA、およびアルコール摂取のような移植片機能に影響を及ぼし得る慢性疾患に罹患したドナーを含むことができる。最低限の臓器は、例えば(1)このようなドナー由来の臓器、または(2)長期の温または冷虚血時間を経験した臓器、もしくは(3)血管吻合の困難をもたらすことがある解剖学的異常(例えば、腎臓内などの小さく複数の血管)を示している臓器、もしくは移植血管上にアテローム性動脈硬化斑の証拠を伴う臓器である。
【００４８】
気体組成物の調製
一酸化炭素組成物は、気体状一酸化炭素組成物である。本発明の方法に有用な圧縮または加圧したガスは、商業的供給業者のいずれかから、および圧縮ガスの貯蔵に適した型の容器において入手することができる。例えば、圧縮または加圧したガスは、医療用途に、酸素のような圧縮ガスを供給する供給業者から得ることができる。本発明の方法において使用される一酸化炭素を含む加圧ガスは、望ましい最終組成の気体(例えば、COおよびO2、および選択的にN2、He、および／またはCO2)全てが、同じ容器内で互いに混合されるように提供することができる。望ましい場合、本発明の方法は、個別の気体を含有する複数の容器を用いて行うことができる。例えば、他の気体を伴いまたは伴わずに一酸化炭素を含有する単独の容器を提供することができ、この容器の内容物は、選択的に室内空気、または他の容器、例えば酸素、窒素、二酸化炭素、圧縮空気、または他の適当な気体もしくはそれらの混合物を含有する容器の内容物と混合することができる。
【００４９】
本発明に従い患者に投与される気体状組成物は、典型的には、0％〜約79質量％の窒素、約21％〜約100質量％の酸素、および約0.0000001％〜約0.3質量％(約0.001ppm(すなわち1ppb)〜約3,000ppmに相当)の一酸化炭素を含有する。好ましくは、この気体状組成物中の窒素量は約79質量％であり、酸素量は約21質量％であり、一酸化炭素量は約0.0001％〜約0.25質量％である。一酸化炭素量は、好ましくは少なくとも約0.001％、例えば少なくとも約0.005％、0.01％、0.O2％、0.O25％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.10％、0.15％、0.20％、0.22％、または0.24質量％である。好ましい一酸化炭素の範囲は、約0.001％〜約0.24％、約0.005％〜約0.22％、約0.010％〜約0.20％、および約0.015％〜約0.1質量％である。0.3％より多い(例えば1％またはそれよりも多い)一酸化炭素濃度を有する気体状一酸化炭素組成物は、用途に応じて、短期間(例えば、一呼吸または数呼吸)使用することができることは注目される。これらは特に、一酸化炭素毒がリスクではないようなエクスビボ適用において有用である。この気体が、インビトロ細胞培養のための大気の形で使用される場合、この気体は、更に培地のpHの維持を助けるために、二酸化炭素を含有することができる。二酸化炭素は、例えば、1％〜10質量％、通常5質量％で存在することができる。
【００５０】
気体状一酸化炭素組成物を、一酸化炭素ガスを含有する大気を作製するために使用してもよい。適当なレベルの一酸化炭素ガスを含有する大気は、例えば、一酸化炭素ガスを含有する加圧ガスが入った容器を提供すること、および加圧ガスをこの容器からチャンバーまたは空間に放出し、チャンバーまたは空間内に一酸化炭素ガスを含有する大気を形成することにより作製することができる。あるいは、これらの気体は、呼吸用マスクまたは呼吸用チューブ中で最高に達する装置へと放出することができ、これにより呼吸用マスクまたは呼吸用チューブ中に一酸化炭素ガスを含有する大気を作製し、患者だけが室内で有意レベルの一酸化炭素に曝露されることを確実にする。
【００５１】
大気または換気回路中の一酸化炭素レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、測定またはモニタリングすることができる。このような方法は、電気化学的検出、ガスクロマトグラフィー、放射性同位元素計測、赤外吸収、比色法、および選択膜を基にした電気化学的方法を含む(例えば、Sundermanら、Clin. Chem.、28:2O26-2032, 1982；Ingiら、Neuron、16:835-842, 1996参照)。ppmを下回る一酸化炭素レベルは、例えば、ガスクロマトグラフィーおよび放射性同位元素計測により検出することができる。更に、ppmを下回る範囲の一酸化炭素レベルは、中赤外ガス感知器により生物学的組織中で測定することができることは、当技術分野において公知である(例えば、Morimotoら、Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol、280:H482-H488, 2001)。一酸化炭素感知器およびガス検出装置は、多くの商業的供給業者から広く入手可能である。
【００５２】
液体組成物の調製
一酸化炭素組成物は、液体一酸化炭素組成物であることもできる。液体は、気体が液体中に溶解し始めるように、当技術分野において公知の方法により、一酸化炭素組成物を作製することができる。例えばこの液体は、「CO2インキュベーター」と称されるものの中に配置され、一酸化炭素の望ましい濃度にこの液体が到達するまで一酸化炭素の連続する流れに曝される。別の例において、一酸化炭素ガスは、一酸化炭素の望ましい濃度にこの液体が到達するまで、液体へ直接「泡立て」ることができる。所定の水溶液中に溶解することができる一酸化炭素の量は温度が低下するにつれて増加する。更に別の例として、適当な液体は、気体拡散を可能にするチューブを通過してもよく、ここでこのチューブは、一酸化炭素を含有する大気を通って延びている(例えば、体外の人工心肺膜のような装置を利用する)。この一酸化炭素は液体へと拡散し、液体一酸化炭素組成物を形成する。
【００５３】
この液体は、患者への投与に適するように(例えば、Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press、1994)、または臓器、組織、もしくは細胞をエクスビボで維持するために、当業者に公知の液体のいずれかであることができる。一般には、この液体は水溶液であると考えられる。溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、Celsior(商標)液、Perfadex(商標)液、Collins液、クエン酸液、およびウイスコンシン大学(UW)溶液(Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press、1994)である。この液体組成物は、一酸化炭素を、約0.0001〜約0.0044g CO/100g液体 の範囲の濃度で、例えば少なくとも0.00O2、0.0004、0.0006、0.0008、0.0010、0.0013、0.0014、0.0015、0.0016、0.0018、0.0O20、0.0O21、0.0O22、0.0O24、0.0O26、0.0O28、0.0030、0.0032、0.0035、0.0037、0.0040、または0.0042g CO/100g水溶液 で含有する。好ましい範囲は、例えば、約0.0010〜約0.0030g CO/100g液体、約0.0015〜約0.0O26g CO/100g液体、または約0.0018〜約0.0O24g CO/100g液体 である。0℃の水について、飽和点は、約0.0044g CO/100g培地 である。
【００５４】
いずれか適当な液体を、ガス拡散装置により設定濃度の一酸化炭素へ飽和することができる。あるいは、一酸化炭素設定レベルを含有するように品質管理されている予備形成した溶液を使用することができる。用量の正確な制御は、一酸化炭素分析装置に接続した気体透過性液体非透過性の膜を使った測定により達成することができる。溶液は望ましい作用濃度に飽和し、このレベルで維持することができる。液体および気体の両組成物において、不活性ガスヘリウムの封入は臓器の組織への一酸化炭素送達を改善することができる。
【００５５】
一酸化炭素組成物による患者の処置
本発明は、収集、貯蔵、および移植過程のいずれかの工程において、ドナー、レシピエント、臓器、組織、細胞塊、および／または個々の細胞を処理するための、一酸化炭素組成物の使用を企図している。臓器、組織、細胞塊、または個々の細胞は、本発明に従い、ドナーから収集し、エクスビボにおいて一酸化炭素組成物で処理し、レシピエントへ移植することができる。あるいは、または加えて、臓器、組織、細胞塊、または個別の細胞は、依然ドナー内にありながら、インサイチューで処理することができる。選択的に、一酸化炭素組成物は、レシピエントへ、手術前、途中、および／または後に：例えば臓器のレシピエント血液での再灌流後に投与することができる。この一酸化炭素組成物は、臓器、組織、細胞塊、または個々の細胞の収集過程の前または途中にドナーへ投与することもできる。
【００５６】
臓器、組織、細胞塊、および／または単離された細胞は、ドナーから収集され、当業者に公知のいずれかの方法により移植することができる(例えば、Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press、(1994)参照)。当業者は、収集および移植する方法はドナーの臓器、組織、または細胞の種類のような、多くの状況に応じて変動し得ることを認識するであろう。
【００５７】
更に本明細書に説明された方法は、臓器、組織、細胞塊、または単離された細胞をエクスビボで、例えば、生体用人工肝臓、腎臓、または膵臓などの生体用人工臓器を用いて使用することができることも本発明により企図されている(例えば、Sambanisら、Cytotechnology、15:351-363, 1994参照)。臓器、組織、または細胞(または細胞塊)は、それらをこの装置に入れる前に、またはそれらをこの装置内で利用する間のいずれかにおいて、または両方で、一酸化炭素で処理することができる。あるいは、または加えて、ドナー動物には、この装置において使用するために、臓器、組織、細胞塊、または個々の細胞を摘出する前に一酸化炭素を投与することができる。
【００５８】
あるいは、または加えて、細胞は、以下に説明したように培養し、レシピエントへ移植することができる。
【００５９】
患者は、患者へ気体および／または液体を投与する当技術分野においていずれか公知の方法により、一酸化炭素組成物で処置することができる。本発明は、液体または気体状一酸化炭素組成物を患者へ全身投与(例えば、吸入および／または摂食により)、および組成物を患者の臓器または組織へインサイチューにおいて局所的投与(例えば、摂食、ガス注入、および／または腹腔への導入により)することを企図している。
【００６０】
一酸化炭素の全身送達
気体状一酸化炭素組成物は、全身的に患者へ、例えば移植を受けているまたは移植が必要な患者へ送達することができる。気体状一酸化炭素組成物は、典型的には、口腔または鼻腔を通って肺への吸入により投与することができ、そこで一酸化炭素は、患者の血流に容易に吸収される。治療的気体状組成物において利用される活性化合物(CO)の濃度は、一酸化炭素の吸収率、分布率、不活性化率、および排泄率(一般に呼吸を通じて)に加え、当業者に公知の他の因子に応じて決まると考えられる。更にいずれか特定の対象のために、特定用量の投与計画を、個体の必要性、および投与または組成物投与を監督する専門家の判定に従い、経時的に調節されること、ならびに本明細書において説明した濃度範囲は単なる例証であり、特許請求される本発明の範囲または実践を制限することは意図しないことが理解されるべきである。一酸化炭素の急性、亜急性、および慢性投与は、本発明により、例えば患者の疾患の重症度または難治性に応じて企図される。一酸化炭素は、状態を治療し、意図された薬学的または生物学的作用を発揮するのに十分な時間(無期限を含む)をかけて患者へ送達することができる。
【００６１】
下記は、気体状一酸化炭素 組成物を患者へ投与するために利用することができるいくつかの方法および装置の例である。
【００６２】
人工呼吸器
一酸化炭素(濃度は変動し得る)は、圧縮ガスの標準のタンク内で空気または他の酸素-含有ガスと混合し(例えば、21％O2、79％N2)購入することができる。これは、非反応性であり、本発明の方法に必要とされる濃度は、可燃性範囲(空気中10％)を十分に下回る。病院での状況において、このガスは、恐らくベッドサイドまで送出され、そこで酸素または室内大気とブレンダー内で望ましい濃度に混合される。患者は、患者の快適さおよび必要性を基に流量を設定する人工呼吸器によりこのガス混合物を吸入する。これは、肺の図式(すなわち、呼吸率、1回換気量など)により決定される。患者が望ましい量の一酸化炭素よりも多くを不必要に受け取ることを防ぐためのフェイルセーフ機構を、この送達システムにデザインすることができる。患者の一酸化炭素レベルは、(1)静脈血中で測定することができる、カルボヘモグロビン(COHb)、および(2)人工呼吸器の側面孔から収集した、排気された一酸化炭素を試験することによりモニタリングすることができる。一酸化炭素曝露は、患者の健康状態およびマーカーの基礎を基に調節することができる。必要であるならば、100％O2吸入と交換することにより、一酸化炭素を患者からウォッシュアウトすることができる。一酸化炭素は、代謝されない；従って、吸入された限りは、CO2に転化される非常に小さい割合を除き、最終的には排気される。一酸化炭素は更に、いずれかのレベルのO2と混合され、結果的な低酸素状態を伴わずに、一酸化炭素の治療的送達を提供することができる。
【００６３】
フェースマスクおよびテント
一酸化炭素を含有するガス混合物は、前述のように、フェースマスクまたはテントを用い、患者が吸入できるように調製される。吸入される濃度は、変更することができ、単純に100％O2と交換することによりウォッシュアウトすることができる。一酸化炭素レベルのモニタリングは、非常に高濃度の一酸化炭素が吸入されることを防止するフェイルセーフ機構を伴うマスクまたはテントで、またはその近傍で行われる。
【００６４】
携帯式吸入器
例えば入院していないレシピエントの間欠的治療を可能にするために、圧縮した一酸化炭素を携帯式吸入装置に充填し、計測された用量で吸入することができる。様々な濃度の一酸化炭素を、この容器に充填することができる。この装置は、オン-オフバルブおよび患者が標準の投与計画に従い必要に応じてそこからCOの一吹き(whiff)を摂取するようなチューブを備えた、適切に希釈されたCOの小さいタンク(例えば、5kg以下)のように単純である。
【００６５】
静脈内人工肺
O2送達およびCO2除去のためにデザインされた人工肺(血中ガス交換のためのカテーテル装置)を、一酸化炭素送達のために使用することができる。カテーテルが移植される場合は、これは太い静脈のひとつに留置され、全身送達のためまたは局所的部位で一酸化炭素を所定の濃度で送達することができると考えられる。この送達は、特定部位での短期間の高濃度の一酸化炭素の局所的送達(この高濃度は迅速に血流中で希釈されると考えられる)、または低濃度の一酸化炭素への比較的長期の全身曝露であることができる(例えば、Hattlerら、Artif. Organs、18(11):806-812, 1994；および、Golobら、ASAIO J.、47(5):432-437, 2001参照)。
【００６６】
基準気圧チャンバー
ある場合には、患者の全身を一酸化炭素に曝露することが望ましい。この患者は、一酸化炭素(患者を危険にさらさないレベル、または曝される周囲の者がリスクを伴わない許容できるリスクのあるレベル)が溢れている密閉したチャンバー内に居る。曝露完了時に、このチャンバーに大気(例えば、21％O2、79％N2)が大量に流れ込み、試料を一酸化炭素分析装置により分析し、患者がこの曝露システムから退出する前に、一酸化炭素が残留していないことを確認する。
【００６７】
水溶液
本発明は更に、一酸化炭素を含有する水溶液を、例えば経口送達ならびに／または、例えば経静脈的、経動脈的、腹腔内、および／もしくは皮下での体への注射による、患者への全身送達のために作製することを企図している。
【００６８】
保存用緩衝液および培養培地は、ガス拡散装置または設定レベルの一酸化炭素を含有するように品質管理された予備作製されたストック溶液により、設定濃度の一酸化炭素に飽和することができる。投与量の精度管理は、一酸化炭素分析装置に連結された気体透過性液体非透過性の膜で測定することにより実行することができる。これらの緩衝液および溶液は、望ましい有効濃度に飽和し、これらのレベルで維持することができる。所定の臓器、組織、または細胞調製物の灌流を必要とする手法について、予備作製した飽和溶液は、一酸化炭素レベルを維持するように用意することができる。一酸化炭素レベルが下落した場合、新たな溶液を、一酸化炭素濃度が下落したものと置換えるために追加することができる。一旦臓器、組織、または細胞の調製が完了したならば、輸送用密閉容器内で溶液を維持することができる。不活性ガスヘリウムの存在は、一酸化炭素の取込みをより効率的にする。
【００６９】
臓器、組織、および単離された細胞の一酸化炭素によるインサイチューおよびエクスビボでの局所的処理
本発明は、臓器、組織、細胞塊、および／または単離された細胞を移植する方法を特徴としている。これらの方法は、臓器、組織、細胞塊、および／または単離された細胞を、移植前に、一酸化炭素組成物に曝露する工程を含むことができる。このような曝露は、インサイチューおよび／またはエクスビボで行うことができる。これらの臓器、組織、および／または単離された細胞は、一酸化炭素ガスを含有する大気へ、例えばその中に溶解した一酸化炭素を有する液体潅流液、貯蔵液、または洗浄液のような液体一酸化炭素組成物へ、または両方へ曝露することができる。
【００７０】
臓器または組織の液体一酸化炭素組成物への曝露は、当技術分野において公知の方法のいずれかにより、エクスビボおよび／またはインサイチューにおいて行うことができる。例えば、この曝露は、臓器または組織を完全にまたは部分的に一酸化炭素組成物中に浸漬するのに十分な容量を有するチャンバーまたは空間内で、エクスビボで行うことができる。別の例において、臓器をいずれか適当な容器中に配置し、一酸化炭素組成物が臓器の「上を洗浄」するようにし、その結果臓器は、一酸化炭素組成物の連続的な流れに曝されることにより、臓器を一酸化炭素組成物に曝露することができる。
【００７１】
あるいは、臓器は一酸化炭素組成物で灌流することができる。用語「灌流」は、認められている技術用語であり、ならびに例えば一酸化炭素組成物のような液体の、臓器または組織の血管を通った通過に関係している。エクスビボおよびインサイチューにおける臓器灌流法は、当技術分野において周知である。臓器は、例えば、連続低温灌流機により、エクスビボにおいて一酸化炭素組成物で灌流することができる(Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press社、1994年参照のこと)。選択的に、インサイチューまたはエクスビボ灌流において、臓器は、ドナー血液をその臓器から除去するために、一酸化炭素組成物による灌流の前に、例えば、一酸化炭素を含まないUW溶液のような洗浄液で灌流することができる。このような過程は、ドナーヘのモグロビンとの一酸化炭素の競合を避けるために行われる。別の選択肢として、洗浄液は、一酸化炭素組成物であることができる。適当な液体は、気体の拡散を可能にするチューブを通して流すことができ；このチューブは、一酸化炭素を含有する大気を通って(例えば、チャンバーを通って、例えば体外膜酸化を伴う)延びており、液体一酸化炭素組成物を作製し、その後これは臓器を通過する(例えば、臓器へのこのチューブの連結により、臓器へ灌流される)。
【００７２】
臓器または組織は、一酸化炭素を含有しない培地または溶液中に配置、例えば浸漬すること、ならびにこれらの培地または溶液を一酸化炭素含有大気に曝露するチャンバー内に配置することができる。あるいは、または加えて、一酸化炭素は培地または溶液へ「泡立て」ることができる。インサイチュー曝露は、当技術分野において公知のいずれかの方法、例えば、液体一酸化炭素組成物によるインサイチューでの臓器のフラッシュまたは灌流により行うことができる(Oxford Textbook of Surgery、MorrisおよびMalt編集、Oxford University Press社、1994年を参照のこと)。
【００７３】
本発明は、例えば、洗浄、浸漬、または灌流により、臓器または組織を液体一酸化炭素組成物に曝露するための、前述の方法のいずれかまたは全てが所定の移植手法において使用することができることを企図している。
【００７４】
本発明は更に、固体または半固体の一酸化炭素組成物を作製することができることを企図している。例えば、前述のような、一酸化炭素組成物である液体を、その中に臓器または組織が積層または包埋されるような、固体または半固体組成物へと作製することができる。あるいは、半固体一酸化炭素組成物を、臓器に封入することができる。固体または半固体組成物は、例えば、ゲル化剤(例えば、コラーゲンまたはアルギン酸塩)のような固化剤の、液体への添加により作製することができる。
【００７５】
細胞培養
本発明は、動物細胞をインビトロにおいて維持または培養する方法を特徴としている。この方法は、一酸化炭素ガスを含有する加圧ガスの入った容器を提供する工程、動物細胞をインビトロにおいて提供する工程、および加圧ガスを容器から放出し、一酸化炭素ガスを含有する大気を形成する工程を含む。次に動物細胞を、一酸化炭素ガスを含有する大気の存在下で培養または単純に維持する。
【００７６】
この方法は、適当なレベルの一酸化炭素ガスを含有する大気の作製に適したチャンバーまたは空間において行うことができる。このようなチャンバーまたは空間は、例えば、恒温器、混合シリンダー、および細胞の培養または維持に適したいずれかの容器、例えば回転びん、細胞培養フラスコ、ペトリ皿、および試験管などを含む。例えば、一酸化炭素ガスが、このガスを含む容器から連続的な流れで供給されるようなCO2恒温器を使用することができる。別の例として、回転びんの内部に適当な大気を形成するように、一酸化炭素が含まれた回転びんを使用することができる。
【００７７】
当業者は、例えば温度のような培養条件は、培養される細胞の種類に応じて選択および／または変動することができることを理解するであろう(例えば、Cells: A Laboratory Manual、SpectorおよびLeinwand編集、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、1997年を参照のこと)。例えば、マウスのインスリノーマ細胞株であるβTC3(DSMZ、ブラウンシュウェイグ、独国)は、加湿した5％CO2/95％空気中で、37℃でインキュベーションすることができる。
【００７８】
動物細胞は、液体培地に配置、例えば懸濁または浴びることができる。この培地は、対象の細胞の培養、保存、または洗浄に適していることが当業者に公知のいずれかの培地であることができる(例えば、Cells: A Laboratory Manual、SpectorおよびLeinwand編集、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、1997年を参照のこと)。このような種類の培地は、様々な緩衝液、イーグル最小必須培地(MEM)、ダルベッコ/フォークト変法イーグル最小必須培地(DMEM)、またはRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地を含むが、これらに限定されるものではない。このような培地は更に、適当な補充剤、例えばウシ胎仔血清(FBS)、個々のアミノ酸、抗生物質および／またはビタミンを含有してもよい。例えば、培地は、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンG、100U/mlストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清(FCS)(Life Technologies社)を補充した、RPMI培地1640(Life Technologies社、グランドアアイランド、NY)であることができる。細胞が液体培地中に存在する本発明のこれらの態様において、細胞は、液体培地を、一酸化炭素を含有する加圧ガスと、例えば本発明の方法に従い加圧ガスの給源から放出された一酸化炭素ガスと接触することにより、一酸化炭素組成物に曝露することができる。
【００７９】
別の本発明の態様において、液体培地それ自身は、前述のように作製された一酸化炭素組成物であることができる。この培地は、細胞を培地へ追加する前または後に、一酸化炭素を注入することができる。
【００８０】
本発明は更に、固体または半固体培地が一酸化炭素組成物であるような固体または半固体培地を作製することができることを企図している。例えば、前述のような一酸化炭素組成物である液体培地は、その中に細胞が積層または包埋されているような、固体または半固体培地を製造することができる。このような過程は、例えば、コラーゲン、アルギン酸塩、または寒天のようなゲル化剤の培地への添加により行うことができる。
【００８１】
ヘモキシゲナーゼ-1、ヘモキシゲナーゼ-1関連化合物、および他の化合物の使用および処理
更に本発明により、一酸化炭素の投与と組合わせた、ヘモキシゲナーゼ-1(HO-1)の誘導または発現も企図されている。HO-1は、患者においてHO-1を誘導または発現することにより、または外因性HO-1を直接患者へ投与することにより、患者へ提供することができる。本明細書において、使用される用語「誘導する(された)」は、例えばHO-1のようなタンパク質をコードしている細胞自身の内因性(例えば、非組換え)遺伝子を用い、単離された細胞または組織、臓器、もしくは動物の細胞において、このタンパク質の増大した産生を引き起こすことを意味する。
【００８２】
HO-1は、当技術分野において公知の方法により、患者、例えばドナーおよび／またはレシピエントにおいて誘導することができる。例えば、HO-1の生成は、ヘミンにより、プロトポルフィリン鉄により、またはプロトポルフィリンコバルトにより誘導することができる。重金属、サイトカイン、ホルモン、一酸化窒素、COCl2、内毒素、および心不全を含む、様々な非ヘム(non-hem)物質も、強力なHO-1発現誘導体である(Otterbeinら、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.、279:L1O29-L1037, 2000；Choiら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.、15:9-19, 1996；Maines、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.、37:517-554, 1997；および、Tenhunenら、J. Lab. Clin. Med.、75:410-421,1970)。HO-1は同じく、過酸化水素、グルタチオン枯渇剤、UV照射、および高酸素症を含む、酸化的ストレスを作り出す様々な物質および条件によっても高度に誘導される(Choiら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.、15:9-19, 1996；Maines、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.、37:517-554, 1997；および、Keyseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:99-103, 1989)。「HO-1の誘導体を含有する薬学的組成物」は、例えば、先に説明された物質のいずれか、例としてヘミン、プロトポルフィリン鉄、および／またはプロトポルフィリンコバルトのような、患者においてHO-1を誘導することが可能である物質を含有する薬学的組成物を意味する。
【００８３】
細胞におけるHO-1発現は、遺伝子導入により増強することができる。本明細書において使用された用語「発現する(された)」は、外因的に投与された遺伝子(例えば組換え遺伝子)を使用し、単離された細胞または組織、臓器、もしくは動物の細胞において、タンパク質、例えばHO-1またはフェリチンの増大した生成を引き起こすことを意味する。HO-1またはフェリチンは、あらゆる免疫応答を最小化するために、移植体レシピエントと同じ種(例えば、ヒト、マウス、ラットなど)であることが好ましい。発現は、構成的プロモーター(例えば、サイトメガロウイルスプロモーター)または組織特異的プロモーター(例えば、乳房細胞のためのミルクホエープロモーターもしくは肝細胞のためのアルブミンプロモーター)により駆動される。適当な遺伝子療法のためのHO-1またはフェリチンをコードしているベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ポックス(例えば、ワクシニア)ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、マウスの微小ウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、I型単純ヘルペスウイルス、およびレンチウイルス)が、移植拒絶反応の治療のために、患者へ経口、吸入、または適所への注射により投与されると考えられる。特に好ましいのは、移植されるドナーの臓器、組織、または細胞への、またはレシピエント内の移植部位への直接の局所投与である。同様に、HO-1またはアポ-フェリチンをコードしているプラスミドベクターを、例えば裸のDNAとして、リポソーム内、または微粒子内で投与することができる。
【００８４】
更に、外因性HO-1タンパク質は、当技術分野において公知の方法のいずれかにより患者へ直接投与することができる。外因性HO-1は、前述のような患者におけるHO-1の誘導または発現に追加するか、またはその代わりに直接投与することができる。HO-1タンパク質は、例えば、リポソーム内、および／または融合タンパク質として、例えばTAT-融合タンパク質として、患者へ送達することができる(例えば、Becker-Hapakら、Methods、24:247-256, 2001参照)。
【００８５】
あるいは、または加えて、HO-1による代謝産物、例えばビリルビン、ビリベルディン、鉄、および／またはフェリチンを、一酸化炭素と組合わせて、またはその代わりに、障害を予防または治療するために患者へ投与することができる。更に本発明は、フェリチン以外の鉄結合分子、例えばデスフェロキサミン(DFO)、デキストラン鉄、および／またはアポフェリチンなどを患者に投与することができることを企図している。前記化合物は、局所的および／または全身的に患者へ投与することができる。
【００８６】
本発明は、患者、臓器、組織、および／または単離された細胞に、一酸化窒素(NO)を、一酸化炭素、HO-1、および／またはHO-1関連化合物と組合わせて投与することも企図している。この技術は、NOを、HO-1および／またはCO、ビリベルディン、ビリルビン、鉄、およびフェリチンのようなヘム分解産物のいずれかもしくは全てと組合わせて、ドナー、レシピエント、または臓器、組織、もしくは細胞に、エクスビボにおいて提供することを含む。
【００８７】
本明細書において使用される用語「一酸化窒素」(または「NO」)は、その気体状または水溶液に溶解した分子一酸化窒素を説明する。NOを含有する気体状組成物は、典型的には口腔または鼻腔を通って肺への吸入により投与され、そこでNOは、直接その作用を発揮するか、または容易に患者の血流に吸収され得る。本発明において有用な圧縮または加圧したガス、例えばNO(および／または先により詳細に説明したようにCO)は、商業的供給業者から、圧縮ガスの貯蔵に適当な型の容器において入手することができる。望ましい場合、本発明の方法は、個別の気体が入った複数の容器を用いて行うことができる。あるいは、COおよびNOは、1個の容器内で一緒にし、望ましい場合不活性ガスで希釈することができる。
【００８８】
吸入用NOは、商業的に入手可能である(例えば、INOmax(商標)、INO Therapeutics社、Clinton、NJ)。このガスは、典型的には、純粋なN2ガス中200〜800ppmのNOの混合物として、商業的供給業者から入手することができる。NOの給源は、本質的に100％NOであるか、またはN2またはいずれか他の不活性ガス(例えば、ヘリウム)で望ましい濃度に希釈される。NOは、O2またはより高次の窒素酸化物の混入を伴わない混合物として得られ貯蔵されることは極めて重要であり、その理由は、より高次の窒素酸化物(これはO2のNOとの反応により生成することができる)は、肺組織に潜在的に有害であるからである。望ましい場合、NOの純度は、患者への投与前に、公知の方法を用い、化学発光分析により明らかにすることができる。化学発光NO-NOX分析装置は、市販されている(例えば、Model 14A、Thermo Environmental Instruments社、フランクリン、MA)。NO-N2混合物は、例えば、先に肺活量計についてバリデーションされている較正したロタメータを用い、患者への吸入の直前に、O2含有ガス(例えば、100％O2または空気)と配合される。呼吸混合物中のNOの最終濃度は、当技術分野において周知の化学的または化学発光的技術により証明することができる(例えば、Fontijinら、Anal Chem、42:575, 1970)。あるいは、NOおよびNO2濃度は、電気化学的分析装置を用いてモニタリングすることができる。NO2のような不純物は、NaOH溶液、バラライム、またはソーダ石灰への曝露によりスクラブ洗浄することができる。追加の対照として、最終ガス混合物中のFiO2を評価することができる。
【００８９】
NOを含有する薬学的組成物は、気体を患者へ投与するための当技術分野におけるいずれかの方法を用いて投与することができる。吸入によるNO投与の安全かつ有効な方法は、例えば米国特許第5,570,683号；米国特許第5,904,938号；および、Frostellら、Circulation、83:2038-2047, 1991に開示されている。気体(例えばCO)の患者への投与に関するいくつかの例証的方法が、これらにおいて詳細に説明されており、ならびにNOを投与するために使用することができる。NOを含有する気体状薬学的組成物を患者へ投与するために利用することができる方法および装置の例は、人工呼吸器、フェースマスク、およびテント、携帯式吸入器、静脈内人工肺(例えば、Hattlerら、Artif. Organs、18(11):806-812, 1994；および、Golobら、ASAIO J.、47(5):432.437, 2001参照)、ならびに基準気圧チャンバーを含む。しかしNOの特性は、これらの方法の若干の修正を可能にしまた必要とする。病院または救急現場の状況において、NOガスの投与は、例えばふたつの給源からの気体を混合するようにデザインされた吸入装置への、N2中の圧縮したNOガスのタンク、および酸素または酸素/N2混合物(空気など)の第二のタンクの装着により実行することができる。各給源からの気体の流れを制御することにより、患者により吸入されたNO濃度は、最適レベルに維持することができる。NOは同じく、標準の低流れブレンダー(例えば、Bird Blender、パームスプリングス、CA)を用い、室内空気と混合することができる。NOは、電気的NO発生装置を用い、N2およびO2(すなわち空気)から生成することができる。適当なNO発生装置は、米国特許第5,396,882号に開示されている。加えて、NOは、圧縮したNOのようなNO給源または電気式NO発生装置に装着した吸入器から間欠的に提供することができる。吸入器の使用は、第二の化合物(例えば、以下に詳述するような、ホスホジエステラーゼインヒビター)が、NOと共に経口または吸入により投与される場合に、特に利点となり得る。
【００９０】
好ましくは、NOガスを含有する薬学的組成物において、NO濃度は、吸入時点で、空気、純粋な酸素、または他の適当な気体もしくは気体混合物中、約0.1ppm〜約300ppm、例えば0.5ppm〜290ppm、1.0ppm〜280ppm、5ppm〜250ppm、10ppm〜200ppm、または10ppm〜100ppmである。吸入により投与されたNOの適当な開始量は、20ppmであり(例えば、INOmax(商標)添付文書参照)、ならびにその用量は、患者の年齢および状態、治療される疾患または障害、ならびに担当医が関連があると判断する他の因子に応じて、例えば0.1ppm〜100ppmを変動することができる。NOの急性、亜急性、および慢性の投与は、本発明により企図されている。NOは、状態を治療しおよび意図された薬学的または生物学的作用を発揮するのに十分な時間(無期限を含む)で患者へ送達することができる。この濃度は、例えば、200ppm NOを5分間のように、一時的に短期間に増大することができる。これは、即効が望まれる場合に行うことができる。患者のNO曝露にとって好ましい期間は、少なくとも1時間、例えば、少なくとも6時間；少なくとも1日；少なくとも1週間、2週間、4週間、6週間、8週間、10週間、または12週間；少なくとも1年；少なくとも2年；および、少なくとも5年を含む。このような期間、患者は連続的または間欠的に大気に曝露することができる。NO(および／またはCO)を含有する薬学的組成物の投与は、自然換気または機械的換気によることができる。
【００９１】
吸入されたNOが投与される場合、NO吸入の作用をモニタリングすることが望ましい。このようなモニタリングは、望ましい作用を証明し、および起こり得る望ましくない副作用を確定するために、特に個体において使用することができる。このようなモニタリングは同じく、所定の個体における吸入されたNO投与の用量レベル、期間、および頻度の調節においても有用である。
【００９２】
気体状NOは、水溶液中に溶解し、その形で使用することができる。例えば、このような溶液は、エクスビボにおける臓器、組織、または細胞を浸すために使用するか、または臓器または組織をインサイチューにおいて灌流するために使用することができる。この溶液は、CO、HO-1、ヘム、ビリベルジン、および／またはビリルビンなどの他の活性物質を含有することもできる。
【００９３】
患者内における吸入されたNOの有益な作用を延長することは望ましいと思われる。いかにして吸入されたNOの有益な作用を延長するかを決定することにおいて、NOのインビボ作用のひとつは、cGMPの生成を刺激する可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化することと考えることは有用である。少なくとも一部のNOの有益な作用は、cGMP生合成の刺激の結果である。従って、ホスホジエステラーゼインヒビターを、内因性ホスホジエステラーゼによるcGMPの破壊を阻害するために、NO吸入と組合わせて投与することができる。
【００９４】
ホスホジエステラーゼインヒビターは、経口、経粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を含むいずれか適当な方法により患者へ導入することができる。あるいはこのインヒビターは、患者が吸入することができる。吸入のために、ホスホジエステラーゼインヒビターは、肺胞への最適な付着のために、粒子または液滴サイズ10μm未満を有する、乾燥散剤またはエアロゾルもしくはネブライザー用溶液として有利に処方され、ならびに選択的にNO含有する気体内で吸入することができる。
【００９５】
患者内における吸入されたNOの有益な作用を延長することは望ましいと思われる。いかにして吸入されたNOの有益な作用を延長するかを決定することにおいて、NOのインビボ作用のひとつは、cGMPの生成を刺激する可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化することと考えることは有用である。少なくとも一部のNOの有益な作用は、cGMP生合成の刺激の結果である。従って、ホスホジエステラーゼインヒビターを、内因性ホスホジエステラーゼによるcGMPの破壊を阻害するために、NO吸入と組合わせて投与することができる。
【００９６】
ホスホジエステラーゼインヒビターは、経口、経粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内経路を含むいずれか適当な方法により患者へ導入することができる。あるいはこのインヒビターは、患者が吸入することができる。吸入のために、ホスホジエステラーゼインヒビターは、肺胞への最適な付着のために、粒子または液滴サイズ10μm未満を有する、乾燥散剤またはエアロゾルもしくはネブライザー用溶液として有利に処方され、ならびに選択的にNO含有する気体内で吸入することができる。
【００９７】
適当なホスホジエステラーゼインヒビターは、Zaprinast(M&B 22948；2-O-プロポキシフェニル-8-アザプリン-6-ワン；Rhone-Poulenc Rorer社、Dagenham、Essex、英国)。Zaprinastは、血管平滑筋細胞中の環状アデノシン一リン酸の分解に対する最小の作用を伴い、cGMPの加水分解を選択的に阻害する(Trapaniら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、258:269, 1991；Harrisら、J Pharmacol. Exp. Ther.、249:394, 1989；Lugnierら、Biochem. Pharmacol.、35:1743, 1986；Sounessら、Br J Pharmacol.、98:725, 1989)。本発明に従いZaprinastを使用する場合、好ましい投与経路は静脈内または経口である。適当な用量範囲は当業者により決定されうる。Zaprinastのストック溶液は、0.05N NaOH中に調製することができる。その後このストック液は、使用直前に、リンゲル乳酸液により望ましいZaprinast濃度に希釈することができる。
【００９８】
本発明は、他のホスホジエステラーゼインヒビターにより実践することができる。様々なホスホジエステラーゼインヒビターが当技術分野において公知であり、これはバイアグラ(登録商標)(クエン酸シルデナフィル)、ジピリダモルおよびテオフィリンを含む。適当な投与経路および適当な用量範囲を、当業者は決定することができる。
【００９９】
ホスホジエステラーゼインヒビターと一緒のNO投与は、以下のように行うことができる。NOは、空気中20ppmで45分間投与される。45分の開始時に、kg体重当たり1.0mgのZaprinastを4分間かけて静脈内注入により投与し、その後45分間の残りの期間、0.004mg/kg/分を連続注入する。あるいは、45分間の開始時に、kg体重当たり0.15mgのジピリダモールを4分間かけて投与し、引き続き45分間の残りの期間、0.004mg/kg/分を連続注入する。Zaprinastまたはジピリダモールは、生理食塩水中で投与される。
【０１００】
移植の状況において、本発明は更に、移植片生存／機能を増強する当技術分野において公知の他の手法を、本明細書に記した方法と共に使用することができることを企図している。このような手法は、免疫抑制療法およびドナー血輸血(DST)を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、DSTは、レシピエントへのCO、HO-1、他のヘム-関連産物、および／またはNOの投与の前、途中、および／または後に、レシピエントへ投与することができる。このような投与、例えばDSTの本明細書に説明した処理と一緒のような投与は、移植の前、途中、および／または後に行うことができる。
【０１０１】
実施例I：移植後、膵β細胞をアポトーシスから保護し、島の機能/生存を改善する一酸化炭素
細胞培養
マウスのインスリノーマ細胞株βTC3(DSMZ、ブランシュワイグ、独国)を、2mM L-グルタミン、100U/mlペニシリンG、100U/mlストレプトマイシン、および10％ウシ胎仔血清(FCS)(Life Technologies社)を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Life Technologies社、グランドアイランド、NY、米国)において培養し、加湿した5％CO2/95％空気中、37℃でインキュベーションした。このマウスβ細胞株は、ハイブリッドインスリン-プロモーターシミアンウイルス40腫瘍抗原を保持するトランスジェニックマウスから得られるが、これは培養において約50継代について分化したβ細胞の特徴を維持することはわかっている。これらの細胞は、インビボにおいてβ細胞と同等の方法で、プロインスリンIおよびIIから成熟型インスリンを産生し、ブドウ糖により最大30倍まで誘導可能である(Efratら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:9037-41, 1988)。RIN-m5FおよびHITのようなその他の頻繁に使用される形質転換したβ細胞株と比べ、βTC3細胞株において分泌されたインスリンのレベルは、正常なβ細胞に近かった。従って、これらの細胞は、β細胞の調節および遺伝子発現の研究に有用である(D'Ambraら、Endocrinology、726:2815-22, 1990)。
【０１０２】
C57BL/6マウスの膵ランゲルハンス島は、Joslin Diabetes Centerの島単離中核施設により供給された。
【０１０３】
クリスタルバイオレット生体染色
βTC3を、2x105細胞で播種した(Nunc、Marsh Products社、ロチェスター、NY、米国)。細胞を、500μl PBSで1回洗浄し、20％エタノール中の0.05％クリスタルバイオレット200μlにより、室温で10分間染色した。クリスタルバイオレットをすすいだ。細胞から染色液を溶離するために、各ウェルに50％酢酸100μlを添加した。50μlを、96ウェルマイクロタイタープレートに移し、マイクロタイタープレートリーダー(EL 340 biokinetics reader、Bio-Tek Instruments社)により562nmの吸光度を読みとった。
【０１０４】
発現プラスミド
β-ガラクトシダーゼ発現ベクター(Clontech Laboratories社、パロアルト、CA)を、pcDNA3ベクター(Satoら、J. Immunol.、166:4185-4194, 2001)(Invitrogen社、カールスバッド、CA)にクローニングした。完全長ラットHO-1 cDNAをコードしている1.0kbp XhoI-HindIII断片を、prHO-1ベクター(Shibabaraら、J. Biochem.、113:214-218, 1993)から切出し、pcDNA3ベクターへサブクローニングした。
【０１０５】
一過性トランスフェクション
βTC3を、16mmウェルに3x105細胞で播種し、15〜20時間後に、Lipofectamine plus(商標)試薬(Life Technologies社)を製造業者の指示に従い用い、トランスフェクションした。総DNAは、空のpcDNA3ベクターを用い、一定に維持した。生存細胞の割合は、各DNA調製物の生存細胞の、アポトーシス刺激を伴わない対照トランスフェクション細胞の数(100％生存率)に対する割合を標準化することにより評価した(Soaresら、Nature Med.、4:1073-1077, 1998；Satoら、J. Immunol.、166:4185-4194, 2001)。
【０１０６】
フローサイトメトリー
βTC3培養物を、組換えTNF-α(500または1000U/ml)(R&D Systems社)と共に24時間インキュベーションし、ならびに島培養物を、TNF-E(5000U/ml)(R&D Systems社)およびシクロヘキサミド(CHX)(50μg/ml)で48時間刺激した。βTC3または島を収集し、分散し、70％エタノール中で固定し、DNA染色緩衝液(PBS、pH7.4、0.1％Triton X-100、0.1mM EDTA、50μg/mlヨウ化プロピジウム、50mg/ml Rnase Aを含有)中に懸濁した。DNA含量を、Cell Questソフトウェア(Becton Dickinson社、パロアルト、CA)をインストールしたFACScan(商標)分析装置上で分析した。正常なDNA含量(2N)を伴う細胞は、生存とスコア化したのに対し、低倍数性のDNA含量(＜2N、A0と称す)は、アポトーシスとスコア化した。破片およびアポトーシス性細胞非含有断片を除くために、ニワトリ赤血球核のそれを下回るFL-2面積プロファイルを伴う全ての事象は、分析から省いた。
【０１０７】
細胞処理および試薬
マウスの組換えTNF-α(R&D Systems社)は、1％ウシ血清アルブミンを含むPBS中に溶解し、トランスフェクションの24時間後に培養培地へ添加した(17.5ng/ml＝500U)。カスパーゼ-3インヒビターZ-DEVD-FMKおよびカスパーゼ-8インヒビターIETD-CHO(Calbiochem社、サンディエゴ、CA)を、ジメチルスルホキシド(DMSO、Sigma社)に溶解し、培養培地(各々、10μMおよび1μM)へTNF-α処理の2時間前に添加した。プロトポルフィリンスズ(SnPPIX)(Porphyrin Products社、ローガン、UT)を、100mM NaOH中に溶解し(10mM)、トランスフェクションの6時間後に培養培地へ添加した(50μM)。グアニリルシクラーゼインヒビター1H[1.2,4]オキサジアゾロ[4,3-α]キノキサリン-1(ODQ；Calbiochem社)をDMSOに溶解し、培養培地へトランスフェクションの6 時間後に添加した(100μM)。cGMPアナログである環状8-ブロモグアノシン-3'-5'-環状一リン酸(8-Br-cGMP)(Sigma社)を水に溶解し、培養培地へアポトーシス誘導の30分前に添加した(10μM)。プロテインキナーゼGインヒビターKT5823(Calbiochem社)は、DMSOに溶解し、培養培地へトランスフェクションの6時間後に添加した(1.6μM)。
【０１０８】
CO曝露
細胞および島は、別所記載のように(例えば、Otterbeinら、Nature Med.、6:422-428, 2000参照)、5％CO2と平衡とした圧縮空気中の1％一酸化炭素に曝露した。島を、一酸化炭素で予め飽和(4℃、一晩、1％CO、5％CO2)としたRPMI培地において、2時間37℃でインキュベーションし、その間1％CO、5％CO2は維持した。
【０１０９】
マウスおよび糖尿病誘導
雄のC57BL/6を、Charles River Laboratories社(ウィルミントン、MA)から購入し、NIHの指針に従い飼育した。これらの実験は、米国所内実験動物委員会(Institutional Animal Care and Use Committee:IACUC)により承認されたものである。レシピエントマウス(8週齢)は、クエン酸緩衝液に溶解したStreptozotocin(Sigma社)の単回腹腔内注射(220mg/kg)により糖尿病とした。全血試料から2回の連続して350mg/dlより大きい非絶食時血糖値が得られたならば、マウスは移植体を受け取った。
【０１１０】
島単離
膵ランゲルハンス島(C57BL/6マウス)を、Harvard Medical SchoolのJDRF Center for Islet TransplantationのIslet Core Laboratoryにより得、先に説明したように単離した(Gotohら、Transplantation、40:437-438, 1985)。
【０１１１】
同系の最低限の塊島の移植
直径150〜250imの250個の島を、解剖顕微鏡を用い、手で摘出した。島は、先に説明されたように腎皮膜下に移植した(Kaufmanら、J. Exp. Med.、172:291-3O2, 1990)。各島調製物から、同数の対照および処置動物を移植した。
【０１１２】
移植片の機能の転帰の分析
移植片機能は、非絶食時血糖値が＜200mg/dlに3連続日して到達した場合の初日の時点として定義した。この実験の主要エンドポイントは、正常血糖値までの時間として定義した。
【０１１３】
統計解析
血糖のデータは、未処理島または処理島を受け取ったマウスの平均±標準偏差としてまとめた。島機能回復までの時間は、Kaplan-Meier生命表を用いて計算し、群間差を、対数-順位検定を用いて検定し、この解析における個別の階層としての処理された3種の島調製物、および回復までの時間の中央値、95％信頼区間を報告した。
【０１１４】
βTC3細胞においてアポトーシスを誘導するTNF-α
TNF-αのβTC3細胞に対する作用を調べた。下記の手法を用い、図1A-Cに示したデータを生じた。図1A：βTC3は、漸増濃度のTNF-αで処理した。生存細胞は、クリスタルバイオレットで活性化後24時間染色した。吸光は562nmで測定し、未処理の細胞に対して標準化した。図1B：βTC3は、TNF-αで処理し、24時間後ヨウ化プロピジウムで染色し、DNA断片化について分析した(FACScan(商標))。図1C：βTC3は、β-gal発現ベクター(pcDNA3/β-gal)＋対照(pcDNA3)で同時トランスフェクションした。示した時点で、細胞を、カスパーゼ-3インヒビターZ-DEVD-FMK(C3-i)またはカスパーゼ-8インヒビターIETD-CHO(C8-i)で処理した。灰色のヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで24時間処理したβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差であった。
【０１１５】
TNF-αは、インスリノーマ細胞株βTC3において高レベルの細胞死を、用量依存的に誘導した(Stephensら、Endocrinology、140:3219-3227,1999)(図1A)。DNA断片化は、ヨウ化プロピジウム(PI)染色により明らかにされ(図1B)、これはTNF-αは、アポトーシスを介してβ細胞死を誘導することを示している。TNF-αが媒介したアポトーシスは、カスパーゼ-8の活性化に厳密に依存し、一部はカスパーゼ-3に依存しており、これは特異的カスパーゼ-8インヒビター(IETD-CHO)によるカスパーゼ-8阻止は、アポトーシスを妨害した(96％阻害)のに対し、特異的カスパーゼ-3インヒビター(Z-DEVD-FMK)によるカスパーゼ-3の阻止は、アポトーシスを部分的にのみ妨害した(53％阻害)(図1C)という知見により例証される。
【０１１６】
βTC3細胞を保護する一酸化炭素
外因性一酸化炭素は、β細胞をアポトーシスから保護するかどうかを調べた(図2A-C)。以下の手法を利用し、図2A-Cに示したデータを作成した。図2A：外因性COは、HO-1活性が阻止された場合に、HO-1に代ることができる。βTC3は、β-gal発現ベクター＋対照またはHO-1発現しているベクターにより同時トランスフェクションした(Brouardら、J. Exp. Med.、192:1015-1O26, 2000)。示した時点で、HO-1酵素活性を、プロトポルフィリンスズ(SnPP)で阻害した。示した時点で、β細胞を先に説明したように外因性一酸化炭素(1％)に曝露した(Otterbeinら、Nature Med.、6:422-428, 2000)。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで処理したβ細胞を表わしている。示した結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。図2B：外因性一酸化炭素はDNA断片化分析においてアポトーシスからβ細胞を保護する。βTC3は、TNF-αで処理した。刺激後直ちに、βTC3を外因性一酸化炭素に24時間曝した。対照βTC3は、同じ方法で処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。24時間後、細胞はヨウ化プロピジニウムで染色し、DNA断片化についてFACScan(商標)で分析した。図2C：外因性一酸化炭素はHO-1非存在下でアポトーシスからβ細胞を保護する。βTC3は、β-gal発現ベクターでトランスフェクションし、外因性一酸化炭素に曝した(Stephensら、Endocrinology、740:3219-27, 1999)。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αもしくはエトポシドで処理するかまたは示したように血清剥奪を施されたβ細胞を表わしている。示した結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【０１１７】
HO-1発現がβ細胞をTNF-αが媒介したアポトーシスから保護するかどうかを評価するために、βTC3細胞をHO-1発現ベクターで一過性にトランスフェクションし、TNF-αに曝露された場合のそれらの生存能について試験した。HO-1の過剰発現は、βTC3をTNF-αが媒介したアポトーシスから保護した(Pileggiら、Diabetes、50:1983-1991, 2001)(生存87％、対、対照33％)(図2A)。HO-1活性がプロトポルフィリンスズIX(SnPPIX)により阻止された場合(Kappasら、Hepatology、4:336-341, 1994)、抗アポトーシス作用が抑制され(図2A)、これは少なくとも1種のHO-1によるヘム代謝最終産物の生成、すなわち鉄、ビリルビン、および／またはCOの生成が抗アポトーシス機能には必要であることを示唆している。
【０１１８】
HO-1の抗アポトーシス作用は一酸化炭素により媒介されるという仮説を基に、β細胞をアポトーシスから保護することにおいて外因性一酸化炭素の曝露がHO-1に代わるかどうかを試験した。HO-1の作用がSnPPIXにより抑制された場合、一酸化炭素曝露はTNF-αが媒介したアポトーシスをHO-1と同程度抑制した(図2A)。外因性一酸化炭素単独への曝露は、DNA断片化分析により示されるように(図2B)、保護的であった(アポトーシス細胞11.7％、対、CO非曝露対照20.3％)。同様に、エトポシドまたは血清飢餓により誘導されたβ細胞アポトーシスは、一酸化炭素曝露により抑制された(図2C)。
【０１１９】
延長された島移植片生存につながるドナーおよびレシピエントにおけるHO-1の誘導
ドナーおよびレシピエントにおけるHO-1の誘導が島細胞移植片を保護するかどうかを調べた。下記の手法を用い、下記表Iに示したデータを作成した。マウスモデルを実験のために使用した。島細胞のドナーは、1日1回プロトポルフィリンコバルト(CoPP)(20mg/kg)で処理し、その後島細胞を単離した。島細胞移植片のレシピエントは、1、3、5、7日目に1日1回CoPP(20mg/kg)で処理するか、または1、3、5、7、9、11、13、15、および17日目に1日1回CoPP(10mg/kg)で処理した。CoPPによる処理はヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)の発現を誘導する。
【０１２０】
（表I）延長された島移植片生存につながるドナーおよびレシピエントにおけるHO-1の誘導
2005500875.tif 000002
【０１２１】
「拒絶反応日数」欄に記されたのは、島が生存した日数である。例えば、「 ＞51x2"」は、2匹のレシピエントの島が51日目以降も依然生存していることを意味している。拒絶反応の平均日数は、第四欄に示している。これらのデータは、HO-1の誘導が、移植後、より長い島の生存を生じたことを明らかにしている。
【０１２２】
マウスの島細胞をアポトーシスから保護する外因性一酸化炭素
外因性一酸化炭素がマウスの島細胞をアポトーシスから保護するかどうかも調べた(図3)。下記の手法を用い、図3に示したデータを作成した。アポトーシスを、TNF-αおよびシクロヘキシミド(CHX)刺激により新たに単離されたマウスの島(C57BL/6)において誘導した。刺激後直ちに島を外因性一酸化炭素に24時間曝露した。対照島は、同じ方法で処理したが一酸化炭素には曝露しなかった。48時間後、細胞をFACScan(商標)においてDNA断片化について分析した。この実験は2回行い、結果は識別不可能であった。
【０１２３】
DNA断片化分析によりアッセイしたように(図3)、一酸化炭素への24時間の曝露は、単離されたマウスの(C57/BL6)ランゲルハンス島をTNF-α＋シクロヘキシミド(CHX)が媒介したアポトーシスから保護した(アポトーシス細胞11.7％、対、CO非曝露対照20.3％)。
【０１２４】
グアニル酸シクラーゼ活性化およびcGMP-依存性プロテインキナーゼ(cGK)を介したシグナルにより媒介される外因性一酸化炭素の抗アポトーシス作用
可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)の活性化およびcGMPの生成により作用された一酸化炭素の抗アポトーシス作用を調べた(図4A-C)。下記の手法を用い、図4A-Cを示すデータを作成した。図4A：外因性一酸化炭素の抗アポトーシス作用はグアニル酸シクラーゼ活性化により媒介される。βTC3を、β-gal発現ベクターでトランスフェクションし、外因性一酸化炭素(1％)に曝露した。示したところで、βTC3をグアニリルシクラーゼインヒビターODQで処理した。図4B：cGMPアナログは、アポトーシスからの保護について一酸化炭素の代わりとなり得る。βTC3は、β-gal発現ベクターでトランスフェクションした。示したところで、βTC3を外因性一酸化炭素に曝露した。示したところで、βTC3はcGMPアナログ8-Br-cGMPで処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。図4C：cGMP-依存性プロテインキナーゼ(cGK)は、一酸化炭素の抗アポトーシス作用を媒介する。βTC3は、β-gal発現ベクターで同時トランスフェクションした。示した時点で、βTC3を外因性一酸化炭素に曝露した。示した時点で、細胞をプロテインキナーゼGインヒビターKT5823(KT)で処理した。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで処理したβ細胞を処理した。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【０１２５】
可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化およびcGMPの生成(線維芽細胞において説明されている)を介して作用された一酸化炭素の抗アポトーシス作用を調べた(Petracheら、Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.、278:L312-319, 2000)。オキサジアゾキノキサリン(ODQ)によるsGC活性の阻害は、COの抗アポトーシス作用を抑制し、このことは、この実験システムにおいて可溶性グアニル酸シクラーゼが一酸化炭素についての主要なメディエーターであることを示唆している(図4A)。cGKアクチベーター／cGMPアナログである8-Br-cGMPは、βTC3のアポトーシスを、一酸化炭素により認められるものと同程度抑制した(図4B)。更に、特異的インヒビターKT5823によるcGMP-依存性プロテインキナーゼの阻害も、外因性一酸化炭素の抗アポトーシス作用を抑制し(図4C)、このことは、一酸化炭素の抗アポトーシス作用は、1種または数種のcGMP-依存性プロテインキナーゼの活性化を通じて媒介されることを示唆している。
【０１２６】
様々なプロトコール下において抗アポトーシス保護を提供する外因性一酸化炭素
一酸化炭素のアポトーシス誘導後にβ細胞を保護する能力を調べた(図1A-C)。下記の手法を用い、図5A-Cに示したデータを作成した。図5A：1時間の一酸化炭素曝露はアポトーシスを妨げるのに十分である。βTC3はβ-gal発現ベクターでトランスフェクションした。β細胞のアポトーシスはTNF-αで誘導した。TNF-αの活性化直後、細胞は、1％一酸化炭素に変動する期間(0〜24時間)曝した。対照βTC3は同じ方法で処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。細胞生存はTNF-α適用後24時間で決定した。図5B：一酸化炭素はアポトーシス誘導後β細胞を保護する。βTC3はβ-gal発現ベクターでトランスフェクションした。アポトーシスはTNF-αで誘導した。異なる期間の後(示したように、0.5〜12時間)、βTC3を1％一酸化炭素に曝露した(Otterbeinら、Nat. Med.、6:422-428, 2000)。対照βTC3は同じ方法で処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。細胞生存をTNF-α適用の24時間後に決定した。図5C：一酸化炭素とのプレインキュベーションはβ細胞アポトーシスを妨害した。βTC3はβ-gal発現ベクターでトランスフェクションし、およびアポトーシスをTNF-αにより誘導した。βTC3は1％一酸化炭素に1時間予め曝露した。対照βTC3を同じ方法で処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。予備曝露終了後1〜6時間に、アポトーシスがTNF-αにより誘導された。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、黒色ヒストグラムはTNF-αで処理したβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【０１２７】
βTC3は、TNF-αを添加した直後に異なる期間(1〜24時間)一酸化炭素に曝露し、24時間後のアポトーシスを試験した。1時間の一酸化炭素曝露はβ細胞のアポトーシスを防止するのに十分であった(図5A)。
【０１２８】
一酸化炭素曝露がアポトーシスの進行を阻止することができるかどうかを調べるために、β細胞をTNF-αによるアポトーシス誘導後の0.5〜12時間に、1時間COに曝露した。TNF-α刺激後2時間曝露された場合であっても、一酸化炭素はβ細胞アポトーシスを依然抑制することが可能であった(図5B)。
【０１２９】
一酸化炭素とのプレインキュベーションがβ細胞をアポトーシスから保護するかどうかを調べるために、βTC3を、アポトーシス誘導前に一酸化炭素に0.5〜3時間曝露した。一酸化炭素存在下での1時間のプレインキュベーションはβ細胞のアポトーシスを防止するのに十分であった(データは示さず)。プレインキュベーションとアポトーシス刺激の間の時間を延長した場合、どのくらい長くこの作用が続くかを評価するために、β細胞を、TNF-αによるアポトーシス誘導前1〜6時間に、COに1時間曝露した(図5C)。一酸化炭素との1時間のプレインキュベーションは、一酸化炭素による1時間処理の終了の2〜3時間後であっても、TNF-αにより刺激された細胞においてβ細胞アポトーシスを防止した。これらのデータは、一酸化炭素による比較的短時間の処理は抗アポトーシス的に作用することができること、およびこの抗アポトーシス作用は、延長された期間持続するであろうということを示している。
【０１３０】
移植後の島生存/機能を改善するマウス島の一酸化炭素への曝露
一酸化炭素がインビボにおいて島移植片の機能を改善するかどうかを決定するために、250個の手で摘出した島の最低限の島塊を、初代(primary)非機能モデルである同系システムに移植した(Breneyら、Transplantation、71:125-32, 2001；Kaufmanら、Diabetes、43:778-83, 1994)。島の最低限(例えば、最適以下)数(「最低限の塊」)の糖尿病同系レシピエントへの移植は、拒絶反応の作用または自己免疫疾患の再発を伴わずに正常糖血への回復の遅延を生じた。何がC57/BL6同系システムにおける最低限の島塊であるかを決定することにおいて、500個の手で摘出した島のレシピエント腎臓皮膜下への移植が正常糖血の迅速な回復につながった(1.5±0.5日(n＝4))のに対し、250個の島移植は、有意な遅延を生じた(14.2±2.94日(n＝9))ことを認めた。従って、250個の島は最低限の塊と定義した。この方法で最低限の塊を用いることは、拒絶反応または自己免疫疾患の再発に関係しない(Berneyら、Transplantation、71:125-132, 2000)。
【０１３１】
島移植片の移植前の一酸化炭素とのプレインキュベーションがインビボにおいてより良い機能性能を生じるかどうかを調べた(図6A-B)。下記の手法を用い、図6A-Bを示すデータを作成した。図6A：250個のC57BL/6マウスから新たに単離されおよび手で採取した島を、1％一酸化炭素で予め飽和した培地において、37℃で2時間インキュベーションした。対照島は同じ方法で処理したが、一酸化炭素には曝露しなかった。これらの島を、先に説明したように糖尿病同系レシピエントの腎臓皮膜下に移植した。移植後、血糖値を毎日を基本に測定した。合計16匹の動物(8匹は予め曝露した島；8匹は対照)に移植した。予め曝露した島を受け取った1匹の動物は、曝露に関係のない技術的理由により3日目に死亡し、および統計解析には打ち切り動物として含んだ。これらの実験の主要なエンドポイントは正常糖血となる初日である。データは平均±標準偏差として示した。図6B：一酸化炭素に曝露した島または対照島を受け取った動物について、回復確率を示す(血糖値が200mg/dl未満)。*P＝0.001、対対照。
【０１３２】
一酸化炭素処理の作用が延長された期間継続した(図5AおよびB)という観察、および一酸化炭素による比較的短期間の予備処理(アポトーシス刺激前に適用)は抗アポトーシス性である(図5C)という観察の両方を基に、島の一酸化炭素への予めの曝露は、移植後の島の生存および／または機能を改善することができるかどうかを評価した。最低限の島塊を糖尿病同系レシピエントの腎臓皮膜下に移植した。正常糖血に到達するのに必要な時間は、島を一酸化炭素を予め飽和した培地で2時間プレインキュベーションした場合(7日間、95％信頼区間：6〜8日間)を、一酸化炭素に予め曝露しなかった対照島(14日間、95％信頼区間：12〜18日間)と比較した場合に、非常に有意な様式で減少した(P＝0.0011)(図6)。全体として、3種の異なる島調製物をこれらの実験に使用した。これらの3種の異なる島調製物間の島について、正常糖血間での時間に統計学的有意差は存在しなかった(P＞0.25)。
【０１３３】
一酸化炭素曝露
細胞培養実験に関して、緩衝の必要要件として5％CO2が存在した。圧縮空気中濃度1％(10,000ppm)のCOを、曝露用チャンバーに送気する前に、ステンレス鋼製混合シリンダー内で、CO2を含むまたは含まない圧縮空気と混合した。3.70-ft2プレキシガラス動物チャンバーへの流れを12L/分で、および1.2-ft2細胞培養チャンバーへの流れを2L/分で維持した。この細胞培養チャンバーは、加湿し、37℃で維持した。CO分析装置(Interscan社、チャストウォース、CA)を用い、これらのチャンバー内のCOレベルを連続測定した。この分析装置により気体試料をチャンバーの頂上の孔から1L/分で採取し、電気化学的検出により感度10〜600ppmで分析した。濃度レベルは1時間当りについて測定した。一旦チャンバーが平衡になった(およそ5分)後は、CO濃度にばらつきはなかった。
【０１３４】
動物は、＞98％O2または98％O2＋CO混合物に、3.70-ft3ガラス製曝露用チャンバー内で、12L/分の流量で曝露した。動物は、曝露期間中は餌および水が与えられた。圧縮空気中のCO濃度1％(10,000ppm)を曝露用チャンバーへ送る前に、ステンレス鋼製混合シリンダー内で＞98％O2と混合した。COの混合シリンダーへの流量を変更することにより、曝露用チャンバーに送達される濃度を制御した。流量は主にO2流れで決定されるので、CO流れは、曝露用チャンバーへ送達される様々な濃度を生じるためのみに変更した。このチャンバー内のO2濃度は、ガス分光計を用いて決定した。
【０１３５】
細胞単離
下記実施例は、ラットまたはマウスから島細胞を単離するために使用したプロトコールを説明する。Rat Liberase(Boehringer Manheim/Roche社、カタログ番号1 815 032)1瓶を、滅菌HBSSの4mlに溶解し、氷上で30分間冷却し、0.5mlアリコートに分割し、-20℃で貯蔵した。各0.5mlアリコートを、例えば、ウシ血清を含まないM199、HBSS、またはRPMI 1640のような培地33mlに添加した。
【０１３６】
ラットは過量の麻酔をかけた(0.1ml＋0.1mL/100g体重 のネムブトールI.P.)。マウスについては、角度90°に曲がった27g-針をつけた3mlシリンジを用い、Liberase液2mlで調製した。手術のために、2対の鋏を使用し；大きい1対は腹部切開のためにおよび小さい1対は胆管をつみ取るために使用した。膵臓摘出のために、2対の鉗子を使用した。1個の止血鉗子を胆管をクランプ止めするために使用した。
【０１３７】
腹部を開き、腹部下方からV字切開することにより、膵臓をできる限り露出した。周囲の膵組織を損傷しないように注意しながら、膵管をその十二指腸への合流部位でクランプ止めした(ラットでは止血鉗子をまたはマウスでは小さいブルドッグクランプを用いる)。胆管を遠位端で単離した。カニューレ挿管前に脂肪を取り除き、門脈への穿孔のないことを確認した。胆管を横断方向に1/3細い鋏で切断し、その管にカニューレを挿入した。カニューレは、鋏で右側をクランプ止めすることにより管内に留置した。Liberase液を迅速に注射した。膵臓は膨張し、6ml液体を注射した後完全に拡張したたように見えた。マウスにおいては、針をできる限り肝の近傍に挿入し、Liberase液を注射した。その後ラットまたはマウスは横隔膜および心臓または大動脈を切除し屠殺した。
【０１３８】
Liberase浸潤後、膵臓を、始めに腸から離し、次に胃、その後脾臓から離し摘出した。膵臓が胆管によってのみ付着している場合は、ラットのそれを切除した。膵臓は、50mlの三角ビーカーに入れ、37℃の水浴中に30分間放置した。
【０１３９】
インキュベーション後、20mlの培地＋NCSを各チューブに添加した。単離の残りは氷上で完了した(complete)。チューブを、組織が破壊されるように5〜10秒間激しく手で振盪した。これらの島を数回洗浄し、臨床用遠心機において800rpm(約180xg)で120秒間または1200rpm(約200xg)で90秒間かけて、Liberaseを除去した。上清を注ぎ捨て、培地25〜35mlを加え、穏やかにボルテックスした(最大の約1/2)。この遠心工程を繰り返し、その後2〜3回洗浄した。組織を20ml培地中に再懸濁させ、懸濁液を直径400imのワイヤメッシュでろ過し(Thomas scientificメッシュ35、カタログ番号8321-M22)、残留している消化されなかった組織、脂肪、およびリンパを除去した。更に5〜10mlをチューブに加え、残留している島を洗浄除去し、同じメッシュでろ過した。
【０１４０】
これらの細胞を、1200rpmで90秒間回転させペレット化した。上清を除去し、過剰な培地をできる限り少量にした。
【０１４１】
勾配を形成するために、前述のペレットを、10〜15mlのHistopaque 1077(Sigma社、カタログ番号H1077)中に再懸濁させ、懸濁液が均等となるまでボルテックスした(洗浄のためと同じ)。NCSを含まない培地10mlを、Histopaqueと培地の間の明瞭な境界面を維持しながら慎重に積層した。培地を、ピペッティングによりこのチューブの側面から下側へゆっくり添加した。この勾配を、10℃でゆっくり加速し、ブレーキをかけずに、2400rpm(900g)で20分間遠心した。
【０１４２】
遠心後、島層を使い捨ての10cc血清用ピペット(Falcon社)により、境界面から収集し、50ccの三角チューブに入れた。Histopaqueを除去するために、25〜35mlの培地＋NCSを添加し、島を数回洗浄した。最初の遠心は1200rpmで2分間行ったが、引き続きの遠心は90秒間行った。3回洗浄後、島を上下にピペッティングすることにより再懸濁させた。手で採取するために、各々7〜10mlを60mm滅菌培養皿上に置いた。
【０１４３】
島細胞の手による採取は、顕微鏡下で、100ilの滅菌ピペットチップを用いて行った。各島を個別に採取し、他の組織は全て避けるように慎重にした。平坦および円形または楕円形を示している、直径50〜225imの間のこれらの島のみを、採取した。
【０１４４】
実施例II：マウス-から-ラットへの心臓移植体の拒絶反応を抑制する一酸化炭素
動物
BALB/cマウスの心臓を、近交系成体雄Lewisラット(Harlan Sprague-Dawley、インディアナポリス、IN)への移植のためのドナー臓器として使用した。動物は、米国実験動物管理協会(American Association for Laboratory Animal Care)の指針に従い飼育し、および研究プロトコールは、Beth Israel Deaconess Medical Centerの所内実験動物委員会(Institutional Animal Care and Use Committees)により承認された。
【０１４５】
手術モデル
動物は、全ての手技の間、メトキシフルラン(Pitman-Moore社、ムンデライン、IL)の吸入およびペントバルビタール(Abbott社、ノースシカゴ、IL)の用量30〜50mg/kgのi.p.と組合せにより、麻酔をかけた。異所性心臓移植を、先に説明されたように行った(Berkら、Physiol Rev.、8:999-1030, 2001；Petkovaら、J. Biol. Chem.、276:7932-7936, 2001)。移植片生存を、毎日の触診により評価した。拒絶反応は心室収縮の停止により診断し、および組織検査により確認した。
【０１４６】
実験試薬
コブラ毒因子(CVF；これは補体活性化を阻止する)(Quidel社、サンディエゴ、CA)を、移植日(0日目)に対して、-1日目(60U/kg)および0日目(20U/kg)にi.p.投与した。T細胞活性化を阻止するシクロスポリンA(CsA；Novartis社、バーゼル、スイス)のi.m.投与(15mg/kg)を、0日目に開始し、以後毎日各実験の終了時まで行った。プロトポルフィリンスズ(SnPPIX)、プロトポルフィリンコバルト(CoP-PIX)およびプロトポルフィリン鉄(FePPIX；Porphyrin Products社、ローガン、UT)を、100mM NaOH中に希釈し、50mMストック液とし、使用時まで-70℃で保存した。光への曝露はできる限り制限した。SnPPIXおよびFePPIXの両方は、PBS中でi.p.(30μM/kg)投与した。FePPIXおよびSnPPIXは、-2日目および-1日目にドナーへ投与し(30μM/kg)、ならびに移植時(0日目)およびその後毎日、レシピエントへ投与した(30μM/kg)。
【０１４７】
CO曝露
簡単に述べると、圧縮空気中濃度1％(10,000ppm)のCOを、ステンレス鋼製混合シリンダー内で、平衡状態の空気(21％酸素)と混合し、その後曝露用チャンバーへ送った。CO濃度は、チャンバーへ送気する前に、混合シリンダー内のCOの流量を変更することにより制御した。流量は、主にO2の流れによって決まるので、COの流れは、曝露用チャンバーへ送達するための最終濃度のみを変更した。CO分析装置(Interscan Corporation社、チャストウォース、CA)を用い、チャンバー内でCOレベルを連続測定した。移植片ドナーを、移植前にCO曝露用チャンバー内に2日間配置した。移植片レシピエントは、移植直後に曝露用チャンバー内に配置し、曝露用チャンバー内に14日間(n＝3)または16日間(n＝3)維持した。CO濃度は、全ての時点で、250〜400ppmに維持した。動物は毎日チャンバーから取り出し、移植片生存について評価し、前述のように、GsA、SnPPIX、またはFePPIXを投与した。
【０１４８】
HO酵素活性
HO酵素活性は、心臓および肝ミクロソームにおけるビリルビン生成により測定した。動物を屠殺し、肝臓および心臓を氷冷したPBSでフラッシュし、使用時まで-70℃で凍結した。臓器を、氷上、4容量のショ糖(250mM)Tris-HCl(10mM/L)緩衝液(pH7.4)中でホモジナイズ遠心した(28,000RPM 3X、20分間、4℃)。上清を遠心し(105,000RPM 3X、60分、4℃)、ミクロソームペレットを、MgCl2(2mM)リン酸カリウム(100mM)緩衝液(pH7.4)中に再懸濁させ、氷上で音波処理した。試料(タンパク質1mg)を、ラット肝細胞質ゾル(タンパク質2mg)、ヘミン(50iM)、グルコース-6-リン酸(2mM)、グルコース-6-リン酸脱水素酵素(0.25U)、およびNADPH(0.8mM)を含有する反応混合物(400il)に添加し、暗所で37℃で60分間維持した。生成されたビリルビンを、クロロホルムで抽出し、およびODを、464〜530nmで測定した(ビリルビンについての吸光係数、40mM/cm)。酵素活性を、60分間に1mgのタンパク質から生成されたビリルビンのピコモル数として表わした(pmol/mg/h)。タンパク質濃度を、ビシコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce社、ジョージタウン)から決定した。バックグラウンドは、〜5pmol/mg/hであった。このアッセイにおいて使用した全ての試薬は、特に記さない限りSigma社（セントルイス、MO）から購入した。カルボヘモグロビンは、Corning 865血液ガス分析装置(Clinical Chemistry、Massachusetts General Hospital、ボストン、MA)を用い、移植後2日間に測定した。
【０１４９】
組織形態計測分析
移植片を、移植後3日目に収集し、パラフィン中に包埋し、ホルマリン中に固定し、心尖から心底まで連続的に切出した(5im)。1枚のスライドにつき10個の切片を配置し、合計約20〜25スライドとした。組織形態計測分析のために、5番目のスライド毎に、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色した。日立3-CCDカラカメラー(モデルHV-C20；日立、東京、日本)およびIPLab Spectrumデジタル画像形成用ソフトウェア(Signal Analytics Corporation、ビエナ、VA)をインストールしたPower Macintosh 7300/200コンピュータ(Apple Computer社、キュパチーノ、CA)に連結した、ニコンEclipse E600顕微鏡(Nikon社、メルビル、NY)を用い、1枚のスライド当り2枚の写真を撮影した。各群2〜3匹の動物に由来した各移植した心臓からおよそ50枚の画像を撮影した。画像は、手作業による分割により分析し、各区画において、右心室および左心室から梗塞領域および非梗塞領域をトレースした。梗塞および非梗塞組織に相当する領域を、デジタル画像形成用ソフトウェアにより、それらの領域に対応する画素数として計算した。梗塞および非梗塞領域は、その後全面積に占める割合として算出した。画素数での面積としてまたは梗塞の割合として表わした、各群についてのプールしたデータをANOVを用いて解析した。この方法で得られた結果は、画素数または梗塞の割合のいずれを用いても類似しており、梗塞の割合を用いて得られた結果のみを示した(表II参照)。結果は、平均＝SDとして表わした。
【０１５０】
免疫組織学
移植片を、移植後3日目に収集し、液体窒素中で瞬時凍結し、-80℃で貯蔵した。クリオスタット切片を、先に説明されたように、固定および染色した(Soaresら、Nature Med.、4:1073, 1998)。ラット白血球集団を、抗ラット白血球共通Ag(LCA、CD45；OX-1)、Ee TCR(TCR Ee-鎖；R73)、B細胞(CD45RB；OX-33)、NK細胞(NKR-P1；3.2.3)、およびMΦ(CD68；ED-1)、mAb(Serotec、Harlan Bioproducts for Science、インディアナポリス、IN)を用いて分析した。フィブリン／フィブリノーゲンの検出は、ウサギ抗ヒトフィブリン／フィブリノーゲンポリクローナル抗体(Dako社、カーピンテリア、CA)を用いて行った。移植片間補体活性化を、抗ラットC1q(The Binding Site社、バーミンガム、英国)、C3(ED11；Serotec社)、またはC5b-9 mAb(Dako社)を用いて検出した。ラットIgMを、マウス抗ラットIgM mAb MARM-4(University of Louvain(ブリュッセル、ベルギー)のDr. H. Bazinのご厚意により入手)を用いて検出した。アイソタイプが合致したmAbまたは精製したIg、更には残留内因性ペルオキシダーゼ活性についての対照を、各実験に含んだ。アポトーシスの検出は、ApopTagインサイチューアポトーシス検出キット(Oncor社、ゲティスバーグ、MD)を製造業者の指示に従い使用し行った。
【０１５１】
補体溶血アッセイ(CH5O)
CH5O単位は、Ab感作したヒツジ赤血球の50％最大溶解を生じるのに必要なラット血清の希釈として定義した。簡単に述べると、Ab感作したヒツジ赤血球(1x108細胞/ml；Sigma社)は、ゼラチンVeronal緩衝液(GVB++；Sigma社)中でラット血清と共にインキュベーション(30分間、37℃)した。細胞を遠心し、およびヘモグロビン放出を測定した(1I＝550nm)。バックグラウンドは、ヒツジ赤血球の非存在下または血清の非存在下で測定し、全ての試料から減算した。
【０１５２】
細胞ELISA
ラット抗マウスAbの血清レベルは、細胞-ベースの間接ELISAにより測定した。マウス2F-2B内皮細胞株(CRL-2168；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、マナサス、VA)を、抗原性の標的として用いた。簡単に述べると、2F-2B細胞を、DMEM(Life Technologies社、ロックビル、MD)、10％FCS、100U/mlペニシリンおよび100ig/mlストレプトマイシン(Life Technologies社)において培養した。グルタルアルデヒド固定した2F-2B細胞を、PBS 0.05％Tween20(Sigma社)中に連続希釈したラット血清の存在下でインキュベーションし(1時間、37℃)、ラット抗マウスAbを、マウス抗ラットIgM(MARM-4)、IgG1(MARG1-2)、IgG2a(Marg2a-1)、IgG2b(MARGb-8)、またはIgG2c(MARG2c-5)(University of Louvain(ブリュッセル、ベルギー)のProf. H. Bazinのご厚意により入手)を用い検出した。マウス抗ラットAbを、抗ラットIg交差反応性を枯渇したHRP標識したヤギ抗マウスFab'を用いて検出した(0.1ig/ml、1時間、室温；Pierce社、ロックフォード、IL)。HRPは、クエン酸緩衝液(pH4.9)中のオルト-フェニレンジアミン(Sigma社)およびH2O2(0.03％)を用いて明らかにした。吸光度を、I＝490nmで測定した。血清中の循環血中の抗移植片Abの相対量を、直線状のアッセイ範囲(1:32〜1:1O24)でのひとつの連続希釈からのOD(I＝490)として表わした。
【０１５３】
ラットC3のマウス内皮細胞への結合は、抗原性標的(Miyatakeら、J. Immunol.、160:4114, 1998)としてマウス2F-2B内皮細胞で、変更した細胞ELISAにおいて測定した。簡単に述べると、固定していない2F-2B内皮細胞を、GVB++緩衝液で連続希釈したラット血清の存在下でインキュベーションした(1時間、37℃)。細胞を、PBS、0.05％グルタルアルデヒド中で固定し、およびラットC3付着を、マウス抗ラットC3mAb(Serotec社)を用いて検出した。
【０１５４】
血小板凝集アッセイ
マウス2F-2B内皮細胞を、88％DMEM(Life Technologies社)、10％FCS(FCS社)、100U/mlペニシリン、および100ig/mlストレプトマイシン(Life Technologies社)において、0.2％ゼラチン(Sigma社)で被覆した6-ウェルプレート上で培養した。集密な内皮細胞は、未処理のまま残すか、またはHO-誘導剤CoPPIX(50iM；18時間)、HOインヒビターSnPPIX(50iM, 18時間)、もしくはCoPPIX(50iM、15時間)およびSnPPIX(50iM、3時間)の両方により処理した。富血小板な血漿を、3.8％クエン酸ナトリウム中での正常なラット血漿の遠心により得た(290xg、12分、19℃)。ラットの血小板(3x108細胞/ml)を、HT緩衝液(8.9mM NaHCO3、0.8mM KH2PO、5.6mMデキストロース、2.8mM KCl溶液、0.8mM MgCl2、129mM NaCl、10mM HEPES)中に再懸濁させた。血小板をマウス内皮細胞上に積層し(5分；37℃)、および血小板凝集アッセイを、先に説明されたように、aggregometer(Chrono-Log社、ハレスタウン、PA)およびアゴニストとしてADP(0.5〜4μM)を用い行った(Kaczmarekら、J. Biol. Chem.、271:33116, 1996)。
【０１５５】
細胞抽出およびウェスタンブロット分析
内皮細胞を、PBS(pH7.2)で洗浄し、剥ぎ取りにより収集し、およびLaemmli緩衝液で溶解した。電気泳動を、10％ポリアクリルアミドゲルにより変性条件下で行った。タンパク質を、電気ブロッティングにより、ポリビニルジフルオリジン膜(Immobilon P；Millipore社、ベッドフォード、MA)上に移し、ヒトHO-1またはHO-2(StressGen社、ビクトリア、カナダ)またはe-チューブリン(Boehringer Mannheim社、マンハイム、独国)に対するウサギポリクローナルAbで検出した。タンパク質は、HRP複合したロバ抗ウサギIgGまたはヤギ抗マウスIgG(Pierce社)、およびECLアッセイ(Amersham Life Science社、アーリントンハイツ、IL)を製造業者の指示に従い用いて可視化した。
【０１５６】
一過性トランスフェクションおよびアポトーシスアッセイ
マウスの2F-2B内皮細胞株(ATCC)を、別所記載(Soaresら、Nature Med.、4:1073, 1998；Brouardら、J. Exp. Med.、192:1015, 2000)のように、一過性にトランスフェクションした。全ての実験は、トランスフェクション後24〜48時間で行った。e-ガラクトシダーゼでトランスフェクションした細胞は、別所記載のように検出した(Soaresら、Nature Med.、4:1073, 1998；Brouardら、J. Exp. Med.、192:1015, 2000)。生存細胞の割合は、別所記載のように(Soaresら、Nature Med.、4:1073, 1998；Brouardら、J. Exp. Med.、192:1015, 2000)、正常な形態を維持している、e-ガラクトシダーゼを発現している細胞数を調べることにより評価した。計数したランダム視野の数は、1個の対照ウェル当り最低200個の生存しているトランスフェクションした細胞を有するように決定した。生存細胞の割合は、各DNA調製物について、アポトーシス誘導剤の非存在下でトランスフェクションした細胞数(100％生存率)に対して標準化した。全ての実験は2つ組で少なくとも3回行った。アクチノマイシンD(Act.D；Sigma社)を、PBS中に溶解し、トランスフェクションの24時間後に培養培地に添加した(10ig/ml)。SnPPIX(Porphyrin Products社)を、100mM NaOH中に溶解し(10iM)、使用時まで-20℃で保存した。SnPPIXは、トランスフェクションの6時間後に培養培地に添加した(50iM)。ヒト組換えTNF-α(R&D Systems社、ミネアポリス、MN)を、PBS、1％BSA中に溶解し、およびトランスフェクションの24時間後に培養培地に添加した(10〜100ng/ml)。
【０１５７】
培養した内皮細胞のCOに対する曝露
細胞を、別所記載(Otterbeinら、Nature Med.、6:422, 2000；および、Brouardら、J. Exp. Med. 192:1015,2000)のように、圧縮空気または変動する濃度のCO(250および10,000ppm)に曝露した。
【０１５８】
大動脈移植モデル
大動脈移植は、別所記載のように行った(Plissonnierら、Transplant、60:414-424, 1995)。簡単に述べると、大動脈および下大静脈は、ヘパリン処理した後切断し、出血させた。更なる左側開胸術の後、肋間動脈の3または4対を、7-0ナイロン縫合糸(Keisei Medical Industrial社、東京、日本)を用いて結紮し、下行大動脈2cmを摘出した。この移植片を、9-0ナイロン縫合糸(Ethilon(商標)、Ethicon社、ソメルビル、NJ)を用い、標準の顕微手術技法により腎動脈と大動脈分岐の間に挿入した。完全な腹部大動脈を両端を結紮した後残した。
【０１５９】
圧縮空気中濃度1％(10,000ppm)のCOを、先に説明されたように、平衡状態の空気(21％酸素)と混合した(Otterbeinら、Am J Physiol、276(4 Pt 1):L688-L694, 1999)。移植モデルについて、移植片ドナーは、COチャンバー内に、移植の2日前に配置した。レシピエントは、移植後直ちにチャンバー内に入れ、そこで56日間過ごした。CO濃度は、常に250ppmに維持した。
【０１６０】
成体雄(250〜350g)Brown Norwayラット(RT1)を大動脈移植片ドナーとして用い、および成体雄(250〜350g)Lewisラット(RT1)をレシピエントとして用いた(Charles River Lab社、ウィルミントン、MA)。雄のC57BL/6、p21-/-、p53-/-ヌルマウスは、Jackson Laboratory(バーハーバー、ME)から購入した。MKK3(-/-)ヌルマウスは、先に説明されたように作出した(Luら、EMBO. J.、18:1845-1857, 1999)。マウスは、1週間馴化させ、齧歯類用固体餌および水を自在摂取させた。
【０１６１】
RT-PCR
RT-PCRを、RNA抽出キットを製造業者の指示に従い使用し、移植した心臓からRNA単離後に行った(Qiagen社、チャストウォース、CA)。マウスβ-アクチンのために使用したプライマー：
2005500875.tif 000003
およびマウスHO-1のために使用したプライマー：
2005500875.tif 000004
であった。
【０１６２】
急性血管拒絶反応の抑制に重要である酵素活性
マウス心臓を、移植後2〜3日の急性血管拒絶反応を呈している未処理のラットに移植したところ、観察は先の報告に一致した(Soaresら、Nature Med.、4:1073, 1998；および、Koyamadaら、Transplantation、65:1210,1998)。コブラ毒因子(CVF)＋シクロスポリンA(CsA)処理したマウス心臓移植片は、長期間生存し(下記表II参照)、この知見も先の報告に一致している。CVF＋CsA処理下において、移植片生存は移植片内皮細胞および平滑筋細胞に加え、心筋細胞によるHO-1発現のアップレギュレーションに関連していた(図7)。HO-1 mRNAの発現は、移植の12〜24時間後にRT-PCRにより検出し、およびHO-1タンパク質は移植の24〜72時間後に検出した(図7)。長期の移植片生存は、CVF＋CsA処理にもかかわらず、HOインヒビターSnPPIXがドナーへ、および次にレシピエントへ投与された場合には生じなかった。これらの条件下では、全ての移植片は、3〜7日で拒絶された(表II)。HO活性を阻害しないプロトポルフィリンであるFePPIXによる対照処理では、移植片拒絶反応にはつながらなかった(表II)。
【０１６３】
（表II）移植片拒絶反応に参画しているHO-1活性のSnPPIXによる阻害
2005500875.tif 000005
【０１６４】
表IIのデータを作成するために、マウス心臓をCVF＋CsA処理したラットへ移植した。移植片レシピエントをFePPIXまたはSnPPIXで処理した。SnPPIXによる処理は、移植片拒絶反応を移植後3〜7日で誘導した(p＜0.0001、CVF＋CsAのみ、またはCVF＋CsA＋FePPIXで処理したラットと比較)。統計解析は、Fisherの直接法により行った。
【０１６５】
SnPPIXはHO-1機能をインビボにおいて阻止するが、FePPIXはしないことを明らかにするために、総HO酵素活性を移植したおよびレシピエント心臓において移植後2日目に定量した(図8)。ナイーブマウス心臓は1時間当たり、総タンパク質の1mg当り、35.5±4ピコモルのビリルビンを生成した(pmol/mg/h；図8)。HO活性は、未処理のラット(98±7.21pmol/mg/h；p＝0.001)、CVF＋CsA-処理したラット(98.3±7.23pmol/mg/h)、またはCVF＋CsA＋FePPIX-処理したラット(77.3±5.51pmol/mg/h；p＝0.0009)へ移植したマウス心臓において、ナイーブ心臓と比べ有意に高かった(図8)。HO活性は、CVF＋CsA＋SnPPIXで処理したラットへ移植したマウス心臓において(32.37±7.23pmol/mg/h)、ナイーブ心臓において存在する基底レベルへと阻害された。このことは、未処理ラット(p＝0.0009)、CVF＋CsA-処理ラット(p＝0.0009)、またはCVF＋CsA＋FePPIX-処理ラット(p＝0.0018；図8)へ移植したマウス心臓と比べて、高度に有意な阻害を表わしている。レシピエント肝臓におけるHO活性も、移植された心臓におけるものを模倣した様式で移植後アップレギュレーションされた(データは示さず)。しかし、これはレシピエント自身の心臓については真実(the case)ではなく、この場合はHO活性は移植後にアップレギュレーションされなかった(図8)。SnPPIX-処理ラットへ移植された移植片において進行性の心筋梗塞が存在し、これは移植後2日と早期に明らかになった(データは示さず)。これは、FePPIXで処理した対照ラットに移植した移植片においては認められなかった(データは示さず)。
【０１６６】
マウス心臓移植片をCVF＋CsA処理下で受け取ったラットは、独占的にIgMアイソタイプである抗マウスAbを生じることがことが先に示されている(Koyamadaら、Transplantation、65:1210, 1998)。SnPPIXまたはFePPIXによる追加の処理は、このAb反応に影響を及ぼさなかった(図9)。抗移植片Abの産生は、マウス内皮細胞上へのC3付着により明らかにされるような補体活性化に相関していた(図9)。SnPPIXもFePPIX処理も、マウス内皮細胞上へのC3付着には影響を及ぼさなかった(図9)。
【０１６７】
急性血管拒絶反応の抑制において完全にHO-1酵素活性の代わりとなる外因性CO
SnPPIX処理しおよびCO曝露した(400ppm；0.04％)ラットに移植したマウス心臓は全て、長期間生存した(下記表III参照)。使用したCO用量(400〜500ppm)は、ほぼ致死量の1/20に相当している(データは示さず)。COに曝露したラットおよびマウスは有害な反応を示さなかった。CO曝露を移植後、14日目(n＝3)または16日目(n＝3)に中断したところ、移植片生存に影響を及ぼさず、すなわち、移植片は＞50日間機能し続けた(表III)。
【０１６８】
（表III）移植片拒絶反応の抑制において完全にHO-1の代わりとなる外因性CO
2005500875.tif 000006
【０１６９】
表IIIのデータを作成するために、マウス心臓をCVF+CsA処理ラットへ移植した。示した時点で、移植片レシピエントを、COへの曝露を伴うまたは伴わずにSnPPIXで処理した。SnPPIX-処理ラットで認められた移植片拒絶反応は、外因性COへの曝露下で抑制された(p＜0.0001、CVF＋CsA＋SnPPIXで処理したレシピエントと比較)。統計解析は、Fisherの直接法で行った。
【０１７０】
移植片拒絶反応を抑制するCOの能力を説明している、外因性COがSnPPIXによるHO-1酵素活性の阻害を妨害するかどうかを決定するために、COがSnPPIX処理ラットへ移植した心臓におけるHO酵素活性に影響を及ぼすかどうかを調べた。図10に示したようにこれは真実ではなかった。SnPPIX処理下で移植した心臓における総HO酵素活性(32.37±7.23pmol/mg/h)は、SnPPIXで処理しおよびCOに曝露したラットへ移植した心臓におけるものと有意差が無かった(43.6±7.57pmol/mg/h；p＝0.1095；図10)。同様の結果が、レシピエントの肝臓および心臓においても得られた(図10)。
【０１７１】
外因性COは、移植片拒絶反応の妨害において、HO-1活性の代わりとなることができる。これは、RBCへの吸入による外因性COの「負荷」およびその後の適当な濃度での移植片へ循環を介しての送達に関連する機構により作用しうる。この理論に従い、内因性HO-1活性がSnPPIXにより阻害される場合、外因性COは、HO-1酵素活性が損なわれた場合に作製される内因性COの作用に類似していると考えられる。移植レシピエントの400ppmの外因性COへの曝露は、カルボキシルヘモグロビンを、0.5±1.5％から32.1±6.9％へと増大した(図10)。移植された心臓は、例えこれらのSnPPIX抑制作用の下であってもCOに曝露された動物においては生存するという事実は、このCOレベルは、RBCの適切な「チャージ」、COの移植片への送達、および移植片拒絶反応の抑制に十分であることを示すことができる(図10)。あるいは、一酸化炭素は、移植片、および体の全ての組織に送達することができ、ならびに血漿中に溶解される。
【０１７２】
外因性COがSnPPIIX-処理ラットにおける移植片拒絶反応と特徴とする心筋梗塞の発生を抑制するかどうかを調べた。移植片は、移植後3日目に収集し、梗塞面積の割合について定量した。未処理のラットに移植した心臓は、右心室のほぼ完全な壁内心筋梗塞(右心室面積の87.1±4.9％)を、左心室の心内膜心筋および壁内の梗塞(左心室面積の32.0±6.7％；データは示さず)と共に示した。梗塞は、間質出血、浮腫、および神経炎を伴う、核を欠いている生存していない好酸球性心筋層を示した。左心室梗塞は常に、梗塞の程度に応じて決まる壁内の広がりを伴う心内膜心筋性であり、および右心室のそれは当初よりより拡散性であった。両心室の梗塞面積の割合は、一般に心底から心尖に向かうにつれて増大する。CVF＋CsA-処理ラットに移植した心臓は、右心室(4.5±4.9％)における梗塞の小さい拡散性の非壁内面積のみを示し、左心室においては示さなかった(0.7±2.1％)(下記表IV参照)。CVF＋CsA＋FePPIX-処理ラットに移植した心臓は、右心室(12.2±9.5％)に小さい拡散性の梗塞領域を示したが、左心室(0.7±1.3％)には示さなかった(表IV)。これらの心臓は、FePPIX処理を伴わないCVF＋CsA処理したラットへ移植したものとは識別できなかった(データは示さず)。CVF＋CsA＋SnPPIX-処理ラットに移植した心臓は、有意な壁内右心室梗塞(26.1±12.7％)を、広範な心内膜心筋および壁内の左心室梗塞(37.6±15.5％)と共に示し(表IV)、これは未処理のラットへ移植した心臓のものと異ならないパターンであった(データは示さず)。これらの病変は移植された心臓に特異的であった。レシピエントの本来の心臓は何ら梗塞を生じなかった。SnPFIX-処理ラットへ移植した心臓の梗塞面積の割合は、FePPIX処理を伴うまたは伴わないCVF＋CsA処理したラットへ移植した心臓のものと比べて有意に高かった(p＜0.001)(表IV)。外因性COを受け取っているSnPPIX処理ラットへ移植した心臓は、右心室(8.4±5.3％)および左心室(1.8±3.4％)に非常に小さい梗塞を示し(表IV)、そのパターンは、FePPIX処理を伴うまたは伴わないCVF＋CsA-処理ラットへ移植した心臓のものに類似していた(データは示さず)。外因性COを受け取ったSnPPIX-処理ラットへ移植した心臓の梗塞面積の割合は、FePPIX処理を伴うまたは伴わないCVF＋CsA-処理ラットへ移植した心臓のものと有意差はなかった。しかし、これらの心臓における梗塞面積の割合は、同じ処置下で移植された外因性COを受け取らなかった心臓のものとは有意差があった(p＜0.001)。
【０１７３】
（表IV）形態計測分析
2005500875.tif 000007
【０１７４】
表IVのデータを作成するために、マウス心臓を、CVF＋CsA-処理ラットへ移植した(n＝3/群)。示した時点で、移植片レシピエントを、FePPIXまたはSnPPIXで処理し、およびCOに曝露した。結果は梗塞面積の割合として示した。統計解析は、ANOVA検定を用いて行った。アスタリスクは他の処理全てと比較して有意差を示している。
【０１７５】
急性血管拒絶反応を特徴付ける血管血栓および単球／マクロファージ浸潤を抑制する外因性CO
マウス心臓をCVF＋CsA-処理ラットに移植した。SnPPIXまたはFePPIXを投与し、移植片レシピエントをCO(250〜400ppm)に曝露した。移植片は、移植後3日目に収集し(n＝3/群)、ラットIgM、ラットおよびマウス補体C1q、ラットおよびマウスPセレクチン、ラットおよびマウスフィブリン／フィブリノーゲン、ならびにラットCD45を発現している白血球について染色した。FePPIX処理を伴うまたは伴わないCVF＋CsA-処理ラットへ移植したマウス心臓は、ラットIgMおよびC1qの広範な血管内付着を示した(データは示さず)が、IgG、C3、またはC5b-9は検出されなかった(データは示さず)。HO-2、HO-1、およびフェリチンは、移植片の内皮細胞および平滑筋細胞に加え心筋細胞において検出された(データは示さず)。そこには最小の血管血栓または通常梗塞の病変領域に関連している宿主白血球による浸潤が存在した(データは示さず)。血管内皮上に低いが検出可能なPセレクチン発現が存在した(データは示さず)。SnPPIXによるHO-1活性阻害下で、CVF＋CsA-処理ラットへ移植した心臓は、対照FePPIX処理ラットと比べ、IgMおよびC1qの血管内付着の同様のレベル、ならびに検出不能なIgG、C3、またはC5b-9を示した(データは示さず)。Pセレクチン-発現している血小板凝集および血管内フィブリンに関連した太い冠動脈血管の蔓延した血管血栓が存在した。血栓は心底部の太い冠動脈血管内において一貫して認められた。微小血管系においては、検出可能なPセレクチン-発現している血小板凝集は存在しなかった(データは示さず)。そこには、宿主好中球に加え、CD45++白血球を発現している単球／MΦマーカーCD68/ED-1およびMHCクラスII抗原による、広範な移植片浸潤が存在した(データは示さず)。単球/MΦ浸潤は、梗塞領域に関連して、大動脈近傍に認められ、心筋層全体に散在している。
【０１７６】
COに曝露されたSnPPIX-処理ラットへ移植された心臓は、FePPIXを伴うまたは伴わずにCVF＋CsAで処理したラットへ移植したものと本質的に識別不能である(データは示さず)。これらの心臓は、SnPPIXで処理したがCOに曝露しなかったレシピエントに移植した心臓と比べ、IgMおよびC1q血管付着の同様のレベルを示した(データは示さず)。CO曝露下で、検出可能なPセレクチン-発現している血小板凝集物または血管内フィブリンの欠損により明らかになるような血管血栓の徴候は存在しない。Pセレクチンは、移植片の血管内皮上に検出した。そこには、梗塞の小さい病巣領域に関連した若干のレベルの単球/MΦ浸潤が存在した(データは示さず)。
【０１７７】
血小板凝集を阻害する内皮細胞中のHO-1のアップレギュレーション
COに曝露したラットへ移植した移植片において血小板凝集が存在しないならば、内皮細胞でのHO-1発現がインビトロにおいて血小板凝集を阻害するかどうかを調べた。マウス内皮細胞を、CoPPIXまたはSnPPIXに曝し、各々、これらの細胞におけるHO活性を誘導または抑制した。血小板を内皮細胞の上に積層し、それらのADP(2μM)による刺激に対する凝集の能力を試験した。未処理の内皮細胞上に積層した血小板は、通常ADPにより刺激された時に凝集した(図11)。血小板がSnPPIXにより予め処理された内皮細胞に曝された場合は、血小板凝集は、未処理の内皮細胞に曝露された血小板と比べて増強された(図11)。この観察は、未処理の内皮細胞が、恐らくこれらの細胞におけるHO-2の構成的発現に寄与しているHO活性の基底レベルを有することを示している(図11)。血小板がCoPPIXで予め処理した内皮細胞に曝された場合、血小板凝集は、未処理のまたはSnPPIX-処理した内皮細胞に曝された血小板と比べ有意に阻害された(図11)。この阻害作用は、血小板がCoPPIXおよびSnPPIXの両方で処理された内皮細胞で曝された場合には抑制された(図11)。CoPPIXおよびSnPPIXの両方が、培養された内皮細胞においてHO-1の発現をアップレギュレーションした(データは示さず)。これらのプロトポルフィリンの示差的作用は、SnPPIXのHO-1酵素活性の強力なインヒビターとして作用する能力に寄与するはずである。
【０１７８】
内皮細胞アポトーシスを抑制するCOを発生するHO-1
SnPPIXで処理したラットへ移植したマウス心臓の拒絶反応を特徴付ける主要な特徴のひとつは内皮細胞および心筋細胞に蔓延するアポトーシスである(図12)。アポトーシスは、FePPIXで処理したラットへ移植したマウス心臓では生じなかった(図12)。HO-1は内皮細胞アポトーシスをインビトロにおいて抑制する能力があると仮定すると(Soaresら、Nature Med.、4,1073-1077, 1998；および、Brouardら、J. Exp. Med.、192:1015,2000)、この細胞保護作用がCOの発生により媒介されるかどうかを調べた。アポトーシスは、SnPPIXで処理しおよびCOに曝露したラットに移植されたマウス心臓においては生じず、このことはこれが真実であることを示唆している(図12)。インビトロにおいて、SnPPIXによるHO-1活性の阻害下で、外因性COが内皮細胞がTNF-αが媒介したアポトーシスを受けることを妨げるかどうかを調べた。図6に示したデータは、これが真実であることを示唆している。HO-1の過剰発現は、アクチノマイシンDの存在下で生じるように、TNF-E-媒介した内皮細胞アポトーシスを抑制した(図12)。内皮細胞のSnPPIXに対する曝露はHO-1の抗アポトーシス作用を阻止するので、HO-1の抗アポトーシス作用は、その酵素活性を通じて媒介される。SnPPIXによるHO-1活性の阻害下で、外因性CO(10,000ppm)は、TNF-E-媒介アポトーシスを抑制し、これは、HO-1が、COの発生を介して、内皮細胞アポトーシスを抑制していることを示唆している(図12)。
【０１７９】
移植に関連したアテローム硬化症の発生を抑制する一酸化炭素
Brown Norway大動脈を、Brown Norwayラット(同系)、未処理のLewisラット(同種異系)、または一酸化炭素に曝露したLewisラット(250ppm；一酸化炭素を伴う同種異系)に移植した。移植の56日後、試料を収集し、修飾した弾性組織マソン三色染料、またはエオシン・ヘマトキシリンにより染色した。Lewisラットへ移植したBrown Norway大動脈断片は、慢性移植片拒絶反応に関連したものと一致しているアテローム硬化症病巣を発症した(データは示さず)。これらの病巣は、移植の20〜30日後に明らかになり、50〜60日目までに有意により顕著になっていた(データは示さず)。この理由のために、全ての分析は移植後56日目に行った。これらの病巣は、内膜過形成、中間平滑筋細胞(SMC)の喪失、および外膜への白血球の蓄積を特徴としており、ならびに移植レシピエントの大動脈内には認められなかった(データは示さず)。これらの病巣の徴候は、ラットの大動脈断片が同系レシピエントへ移植された場合には認められなかった。COがこれらの病巣の発生を抑制するかどうかを試験するために、大動脈移植片を移植直後および56日間に引き続いてCOに曝露した(250ppm)同種異系レシピエントへ移植した。内膜過形成は、COに曝露したレシピエントに移植した大動脈移植片において、空気に曝露されたレシピエントに移植されたものと比べて阻害され、外膜への白血球蓄積も同様であった(データは示さず)。COは、中間SMCの喪失については未処理のレシピエントへ移植した移植片と比べて有意な作用を有さなかった(データは示さず)。
【０１８０】
実施例III：移植手技の期間の臓器および組織、ドナー、ならびにレシピエントの処置のプロトコール
下記実施例は、移植手技の期間にドナー、および臓器、およびレシピエントの一酸化炭素処置に使用するためのプロトコールを説明する。下記手技のいずれかひとつ、またはそれよりも多くを、所定の移植手技において使用することができる。
【０１８１】
ドナーの処置
臓器または組織の収集の前に、ドナーは、吸入された一酸化炭素(250ppm)で1時間処置することができる。処置は、10ppm〜1000ppmの変動する用量を、1時間〜6時間の変動する期間で、または脳死(死体)ドナーの処置のためにはそれが可能になる瞬間から、臓器が摘出される時点までの全期間に投与することができる。処置は、脳死が存在することが宣告されたならばできるだけ速やかに開始されるべきである。一部の適用において、脳死前に開始されることが望ましいことがある。
【０１８２】
異種移植ドナーとして使用されるヒト以外の動物(例えばブタ)については、望ましい場合、その場合に生成されたカルボキシヘモグロビンが移植される臓器の生存性および機能を損なわない限りは生きている動物を、比較的高レベルの吸入された一酸化炭素で処理することができ、例えば、500ppmより高いレベル(例えば、1000ppmまたはそれ以上、および特に短時間に最大10,000ppm)を使用することができる。
【０１８３】
臓器のインサイチュー処置
臓器をドナーから収集する前に、依然それがドナー内にある間にこれを、例えば、赤血球を伴わない緩衝液または培地のような溶液でフラッシュすることができる。この意図は、臓器を一酸化炭素で飽和した溶液でフラッシュし、一酸化炭素大気中で維持し、その結果一酸化炭素含量が飽和を維持し続けることである。フラッシュは、少なくとも10分間、例えば1時間、数時間、またはそれよりも長く行われる。この溶液は、理想的には臓器の細胞へ可能な限り最高濃度の一酸化炭素を送達する。
【０１８４】
臓器または組織の処置
臓器または組織はそれをドナーから摘出した時点からレシピエントへ移植する時点まで、一酸化炭素を含有する培地内に保存することができる。これは、臓器または組織をCOを含有する培地内に維持するか、またはこれをこのような培地で灌流することにより行うことができる。これは動物内よりもむしろエクスビボで生じるので、非常に高濃度のCOガスを使用することができる(例えば、COで飽和した培地を維持するために10,000ppm)。
【０１８５】
レシピエントの処置
レシピエントを一酸化炭素で処置することができる。処置は移植日に手術開始の少なくとも30分前に開始することができる。あるいは、これはレシピエント内の臓器を再灌流する少なくとも30分前に開始することができる。これは少なくとも30分間、例えば1時間継続することができる。10ppm〜3000ppmの間の一酸化炭素用量は、変動する時間、例えば数分から数時間にわたり送達することができ、移植の当日および移植後に投与することができる。例えば、レシピエントは、3回連続して10秒の呼吸を持続することで、例えば、3000ppmの一酸化炭素濃度を吸入することができる。あるいは、レシピエントは20日間のような延長された期間に、いわゆる、200ppmを吸入することができる。カルボキシヘモグロビン濃度は患者への一酸化炭素の適当な投与の指針として利用することができる。通常レシピエントの処置は、移植が必要な患者が許容できないリスクを有すると考えられるレベルを上回るカルボキシヘモグロビンレベルは生じない。
【０１８６】
その他の態様
本発明は、それらの詳細な説明と組合わせて説明されると同時に、前述の説明は、添付された「特許請求の範囲」により定義された本発明の範囲を説明することを意図し、これを限定するものではないことは理解されるはずである。その他の局面、利点、および変更は、前記「特許請求の範囲」内である。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】βTC3細胞の、漸増濃度のTNF-α処理の作用を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】TNF-α処理後のβTC3細胞におけるDNA断片化のFACScan(商標)分析を示す図による説明である。
【図１Ｃ】βTC3を、β-gal発現ベクター(pcDNA3/β-gal)＋対照(pcDNA3)で同時トランスフェクションする作用、およびカスパーゼ-3インヒビターZ-DEVD-FMK(C3-i)またはカスパーゼ-8インヒビターIETD-CHO(C8-i)のいずれかによる処理を示す棒グラフである。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで24時間処理したβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【図２Ａ】HO-1(ヘムオキシゲナーゼ-1)活性が阻止された場合に、外因性一酸化炭素がHO-1の代わりとなり得ることを示す棒グラフである。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αもしくはエトポシドで処理したまたは血清剥奪を施されたβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【図２Ｂ】TNF-α処理後の一酸化炭素による24時間処理後の、βTC3細胞におけるDNA断片化のFACScan(商標)分析の図による説明である。
【図２Ｃ】外因性一酸化炭素が、β細胞を、HO-1の非存在下でアポトーシスから保護することを示す棒グラフである。βTC3細胞はβ-gal発現ベクターでトランスフェクションし、外因性一酸化炭素に曝露した。灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムは示されたようにTNF-αもしくはエトポシドで処理したまたは血清剥奪を施されたβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【図３】外因性一酸化炭素が、マウスのランゲルハンス島をアポトーシスから保護することを示す、FACScan(商標)によるDNA断片化分析である。CHX＝シクロヘキシミド。
【図４Ａ】外因性一酸化炭素の抗アポトーシス作用は、グアニル酸シクラーゼ活性化により媒介されることを示す棒グラフである。ODQ＝グアニリルシクラーゼインヒビターODQ。
【図４Ｂ】cGMPアナログが、細胞のアポトーシスからの保護において一酸化炭素の代わりとなり得ることを示す棒グラフである。8-Br-cGMP＝cGMPアナログ8-Br-cGMP。
【図４Ｃ】cGMP依存性プロテインキナーゼ(cGK)が、一酸化炭素の抗アポトーシス作用を媒介することを示す棒グラフである。βTC3細胞は、β-gal発現ベクターで同時トランスフェクションした。図4A-Cについて、灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで処理したβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。KT＝プロテインキナーゼGインヒビターKT5823。
【図５Ａ】1時間の一酸化炭素曝露がアポトーシスを防止するのに十分であることを示す棒グラフである。
【図５Ｂ】一酸化炭素がアポトーシス誘導後にβ細胞を保護することを示す棒グラフである。
【図５Ｃ】一酸化炭素とのプレインキュベーションが、β細胞アポトーシスを妨害することを示す棒グラフである。図5A-Cについて、灰色ヒストグラムは未処理のβ細胞を表わし、および黒色ヒストグラムはTNF-αで処理したβ細胞を表わしている。示された結果は、3回行った実験を代表する1回の2つ組のウェルからの平均±標準偏差である。
【図６Ａ】マウス島の一酸化炭素への曝露が、移植後の生存および機能を改善することを示す折れ線グラフである。
【図６Ｂ】一酸化炭素に予備曝露した島または対照島を受け取った動物についての、回復確率(血糖値200mg/dl未満)を示す折れ線グラフである。*p＝0.001、対対照。
【図７】CVF＋CsA処理したラットへ移植されたマウス心臓におけるHO-1発現を示す棒グラフである。マウス心臓は、移植時にコブラ毒因子(CVF)で処理し、加えて移植後毎日シクロスポリンA(CsA)で処理したラットへ移植した。HO-1およびβ-アクチンmRNAの発現は、RT-PCRで検出した。記号-/-は、陰性対照として使用した、HO-1-/-マウス心臓からのRNAを示している。ヒストグラムは、β-アクチンmRNAの発現について標準化されたHO-1 mRNA発現の相対レベルを示している。
【図８】SnPPIXが、インビボにおけるHO-1酵素活性を阻害することを示す棒グラフのセットである。マウス心臓は、未処置のラット(II)またはCVFおよびCsA(III)＋FePPIX(IV)もしくはSnPPIX(V)で処置したラットへ移植した。ドナーおよびレシピエント心臓における総HO活性は、移植後2日目に測定し、各々、正常マウスおよびラット心臓の基本的HO活性(I)と比較した。示した結果は、各処置について分析した3匹の動物の平均±標準偏差(SD)である。統計解析は、対のないWelshのt検定を用いて行った。
【図９】SnPPIXおよびFePPIXは、抗移植片抗体(Ab)の産生を妨害しないことを示す折れ線グラフのセットである。マウス心臓は、先に説明したように、CVF＋CsAで処置したラットへ移植した。抗移植片IgM Abの血清レベルは、細胞ELISAにより評価した。ラット補体成分C3のマウス内皮細胞への結合は、細胞ELISAにより評価した。補体溶血活性(CH50)は、標準の溶血アッセイにより評価した。示した結果は、平均±SDである(n＝3)。
【図１０Ａ】外因性COは、SnPPIXのHO-1酵素活性を抑制する能力に影響を及ぼさないことを示す棒グラフのセットである。マウス心臓は、CVF＋CsA＋SnPPIX(II)またはSNPPIX およびCO(III)で処置したラットへ移植した。総HO活性は、ドナーおよびレシピエントの心臓に加え、レシピエントの肝臓において移植の2日後に測定した。異なる標本のHO活性は、分析した試料に従い、正常マウス心臓(I)、ラット心臓(I)、または肝臓(I)の基本的HO活性と比較した。示した結果は、各処置について分析した動物3匹の平均±SDである。統計解析は、対のないWelshのt検定を用いて行った。
【図１０Ｂ】外因性COが、SnPPIXのHO-1活性を抑制する能力に影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。図10Aのデータを作成するために使用した動物は、移植後2日目のカルボキシヘモグロビン含量について分析した。示した結果は、平均±SDである(n＝3)。
【図１１】内皮細胞中のHO-1のアップレギュレーションが、血小板活性化を阻害することを示す折れ線グラフである。マウス2F-2B内皮細胞は、未処理のまま残すか(NT)、もしくはHO-1活性をアップレギュレーションするためにCoPPIX(50μM、16時間)で、HO-1活性を抑制するためにSnPPIX(50μM、16時間)で、またはHO-1活性のアップレギュレーションにおいてCoPPIXの特異性を制御するためにCoPPIX(50μM、12時間)＋SnPPIX(50μM、4時間)で処理した。ラット血小板を単離し、マウス内皮細胞上に5分間積層し、2μMアデノシン二リン酸(ADP)で刺激した後の凝集について試験した。
【図１２】一酸化炭素が内皮細胞アポトーシスを抑制することを示す棒グラフである。灰色ヒストグラムはAct.D単独で処理した細胞を示し、および黒色ヒストグラムはAct.D＋TNF-αで処理した細胞を表わしている。示されたように、内皮細胞は、SnPPIX(50μM)で処理し、外因性CO(10,000ppm)に曝露した。
【図１】
2005500875.tif 000008
【図２】
2005500875.tif 000009
【図３】
2005500875.tif 000010
【図４】
2005500875.tif 000011
【図５】
2005500875.tif 000012
【図６】
2005500875.tif 000013
【図７】
2005500875.tif 000014
【図８】
2005500875.tif 000015
【図９】
2005500875.tif 000016
【図１０】
2005500875.tif 000017
【図１１】
2005500875.tif 000018
【図１２】
2005500875.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2005500875.tif 000020
2005500875.tif 000021
2005500875.tif 000022
2005500875.tif 000023
2005500875.tif 000024
2005500875.tif 000025
2005500875.tif 000026
2005500875.tif 000027
2005500875.tif 000028
2005500875.tif 000029
2005500875.tif 000030
2005500875.tif 000031
2005500875.tif 000032
2005500875.tif 000033
2005500875.tif 000034
2005500875.tif 000035
2005500875.tif 000036
2005500875.tif 000037
2005500875.tif 000038
2005500875.tif 000039
2005500875.tif 000040
2005500875.tif 000041
2005500875.tif 000042
2005500875.tif 000043
2005500875.tif 000044
2005500875.tif 000045
2005500875.tif 000046
2005500875.tif 000047
2005500875.tif 000048
2005500875.tif 000049
2005500875.tif 000050
2005500875.tif 000051
2005500875.tif 000052
2005500875.tif 000053
2005500875.tif 000054
2005500875.tif 000055
2005500875.tif 000056
2005500875.tif 000057
2005500875.tif 000058
2005500875.tif 000059
2005500875.tif 000060
2005500875.tif 000061
2005500875.tif 000062
2005500875.tif 000063
2005500875.tif 000064
2005500875.tif 000065
2005500875.tif 000066
2005500875.tif 000067
2005500875.tif 000068
2005500875.tif 000069
2005500875.tif 000070
2005500875.tif 000071
2005500875.tif 000072
2005500875.tif 000073
2005500875.tif 000074
2005500875.tif 000075
2005500875.tif 000076
2005500875.tif 000077
2005500875.tif 000078
2005500875.tif 000079
2005500875.tif 000080
2005500875.tif 000081
2005500875.tif 000082
2005500875.tif 000083
2005500875.tif 000084
2005500875.tif 000085
2005500875.tif 000086
2005500875.tif 000087
2005500875.tif 000088
2005500875.tif 000089
2005500875.tif 000090
2005500875.tif 000091
2005500875.tif 000092
2005500875.tif 000093
2005500875.tif 000094
2005500875.tif 000095
2005500875.tif 000096
2005500875.tif 000097
2005500875.tif 000098
2005500875.tif 000099
2005500875.tif 000100
2005500875.tif 000101
2005500875.tif 000102
2005500875.tif 000103
2005500875.tif 000104
2005500875.tif 000105
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500875.tif 000106
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500875.tif 000107
2005500875.tif 000108
2005500875.tif 000109
2005500875.tif 000110
2005500875.tif 000111
2005500875.tif 000112
2005500875.tif 000113
2005500875.tif 000114
2005500875.tif 000115
2005500875.tif 000116
2005500875.tif 000117
2005500875.tif 000118
2005500875.tif 000119
2005500875.tif 000120
2005500875.tif 000121
2005500875.tif 000122
2005500875.tif 000123
2005500875.tif 000124
2005500875.tif 000125
2005500875.tif 000126
2005500875.tif 000127
2005500875.tif 000128
2005500875.tif 000129
2005500875.tif 000130
2005500875.tif 000131
2005500875.tif 000132
2005500875.tif 000133
2005500875.tif 000134
2005500875.tif 000135
2005500875.tif 000136
2005500875.tif 000137
2005500875.tif 000138
2005500875.tif 000139
2005500875.tif 000140
2005500875.tif 000141
2005500875.tif 000142
2005500875.tif 000143
2005500875.tif 000144
2005500875.tif 000145
2005500875.tif 000146
2005500875.tif 000147
2005500875.tif 000148
2005500875.tif 000149
2005500875.tif 000150
2005500875.tif 000151
2005500875.tif 000152
2005500875.tif 000153
2005500875.tif 000154
2005500875.tif 000155
2005500875.tif 000156
2005500875.tif 000157
2005500875.tif 000158
2005500875.tif 000159
2005500875.tif 000160
2005500875.tif 000161
2005500875.tif 000162
2005500875.tif 000163
2005500875.tif 000164
2005500875.tif 000165
2005500875.tif 000166
2005500875.tif 000167
2005500875.tif 000168
2005500875.tif 000169
2005500875.tif 000170
2005500875.tif 000171
2005500875.tif 000172
2005500875.tif 000173
2005500875.tif 000174
2005500875.tif 000175
2005500875.tif 000176
2005500875.tif 000177
2005500875.tif 000178
2005500875.tif 000179
2005500875.tif 000180
2005500875.tif 000181
2005500875.tif 000182
2005500875.tif 000183
2005500875.tif 000184
2005500875.tif 000185
2005500875.tif 000186
2005500875.tif 000187
2005500875.tif 000188
2005500875.tif 000189
2005500875.tif 000190
【国際調査報告】
2005500875.tif 000191