(57)【要約】心疾患状態に関与する遺伝子を同定する方法が提供される。この方法は、疾患患者と治療処置された患者の遺伝子発現を比較する。新規標的の同定によって、薬剤スクリーニング及び治療のためのさらなる方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与する遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）前記疾患状態に罹患している第１の対象から核酸含有試料を得る段階、
（ｂ）（ｉ）前記疾患状態に罹患している対象であって、前記対象が前記疾患状態の表現型を改善する治療をすでに受けている対象、及び（ｉｉ）前記疾患状態に罹患している対象であって、前記対象が前記疾患状態の表現型を改善しない治療をすでに受けている対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階、
（ｃ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、並びに
（ｄ）段階（ａ）及び（ｂ）の遺伝子発現プロファイルを比較する段階であって、
段階（ａ）及び（ｂ）（ｉｉ）の試料と比較して、段階（ｂ）（ｉ）の試料でその発現が増加又は減少している遺伝子を、前記疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与していると同定する段階を含む方法。
【請求項２】
（ｅ）その後の少なくとも１回の時点で段階（ｂ）（ｉ）の対象から第２の核酸含有試料を得る段階、
（ｆ）段階（ｅ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、及び
（ｇ）段階（ｆ）の遺伝子発現プロファイルを段階（ｂ）（ｉ）の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患状態が、心不全、癌、肥満、神経変性疾患、腎不全、及び肝不全である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸含有試料が、組織試料である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
発現プロファイルを得る段階が、ＰＣＲを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲが、ＲＴ−ＰＣＲを含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
発現プロファイルを得る段階が、チップに配列した遺伝子アレイの使用を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患状態が、心不全である請求項３に記載の方法。
【請求項９】
段階（ａ）、（ｂ）（ｉ）、及び／又は（ｂ）（ｉｉ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、治療ではなくプラセボを受けている前記疾患状態に罹患している対象の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）、（ｂ）（ｉ）、及び／又は（ｂ）（ｉｉ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、健康な個体の組織学的に類似の試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患状態に罹患している少なくとも１つの第２の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階、及び第１の対象から得られた結果と比較する段階をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
個体の疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与する遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）前記疾患状態に罹患している対象から核酸含有試料を得る段階、
（ｂ）その後の少なくとも１回の時点で段階（ａ）の対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階であって、それに先立って前記対象が前記疾患状態の表現型を改善する治療をすでに受けている段階、
（ｃ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、並びに
（ｄ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを比較する段階であって、
段階（ａ）の試料と比較して、段階（ｂ）の試料でその発現が増加又は減少している遺伝子を、前記疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与していると同定する段階を含む方法。
【請求項１３】
さらにその後の第２の時点で段階（ｂ）を繰り返す段階を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｅ）前記疾患状態に罹患している対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階であって、前記対象が前記疾患状態の表現型を改善しない治療をすでに受けている段階、
（ｆ）段階（ｅ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、及び
（ｇ）段階（ｆ）の遺伝子発現プロファイルを、段階（ｂ）の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
心疾患治療の有効性を評価する方法であって、
（ａ）心疾患に罹患している第１の対象から第１の心臓組織試料を得る段階、
（ｂ）第１の対象を候補療法で処置する段階、
（ｃ）処置後に第１の対象から第２の心臓組織試料を得る段階、並びに
（ｄ）第１及び第２の試料の１つ又は複数の指示遺伝子の発現を比較する段階であって、１つ又は複数の前記指示遺伝子は表１に記載のとおりであり、
１つ又は複数の指示遺伝子の発現の変化は第１の対象の心疾患処置において前記候補療法が有効であることを示す段階を含む方法。
【請求項１６】
前記指示遺伝子が、アップレギュレートされている請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記指示遺伝子が、ダウンレギュレートされている請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
発現プロファイルを得る段階が、ＰＣＲを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＰＣＲが、ＲＴ−ＰＣＲを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
発現プロファイルを得る段階が、チップに配列した遺伝子アレイの使用を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、健康な個体の心臓組織試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、治療ではなくプラセボを受けている心疾患に罹患している第２の対象の心臓組織試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
心疾患に罹患している少なくとも１つの第２の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階、及び第１の対象から得られた結果と比較する段階をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
候補療法の投与量又は投与計画の変更後、第１の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
心臓細胞において１つ又は複数の心疾患遺伝子産物の活性を調節する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）筋細胞を提供する段階、
（ｂ）筋細胞を前記候補物質と接触させる段階、及び
（ｃ）表１に記載の遺伝子産物からなるグループから選択された１つ又は複数の遺伝子産物の活性を測定する段階であって、
前記候補物質と接触させていない筋細胞の活性と比較した、表１からなるグループから選択された１つ又は複数の遺伝子産物の活性の変化は、前記候補物質が１つ又は複数の心疾患遺伝子産物の活性のモジュレーターであることを示す段階を含む方法。
【請求項２６】
前記活性の測定が、ｍＲＮＡレベルの測定を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｍＲＮＡレベルの測定が、ＲＴ−ＰＣＲを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記活性の測定が、タンパク質レベルの測定を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記活性の測定が、酵素活性の測定を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記筋細胞が、心筋細胞である請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記筋細胞を、培養において接触させる請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記筋細胞を、非ヒト動物において接触させる請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記筋細胞が、表１から選択された遺伝子由来のプロモーターの制御下、スクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む発現構築物で形質転換されている請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記筋細胞が、心疾患様遺伝子発現パターンを示す請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
心疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、表１に記載の１つ又は複数のダウンレギュレートされた遺伝子産物の活性を阻害する物質を投与する段階を含む方法。
【請求項３６】
前記物質が、タンパク質である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記物質が、核酸発現構築物である請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸発現構築物が、アンチセンス構築物、又はリボザイムをコードする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記物質が、低分子、又は有機薬剤である請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
心疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、表１の１つ又は複数のアップレギュレートされた遺伝子産物の活性を増大する物質を投与する段階を含む方法。
【請求項４１】
前記物質が、タンパク質である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記物質が、核酸発現構築物である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸発現構築物が、表１の１つ又は複数のアップレギュレートされた遺伝子産物をコードする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記物質が、低分子、又は有機薬剤である請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府は、国立予防衛生研究所の助成金番号ＨＬ４８０１０に従って、本出願の権利を所有する。本出願は、２００１年９月１１日に出願され、その全体を無条件で参照により本発明の一部とする米国仮出願第６０／３１８８５４号の優先権の特典を主張する。
【０００２】
本発明は、心臓学、及び分子生物学に関する。特に、遺伝子発現プロファイリング、心肥大及び関連する病的状態に関与する遺伝子の同定、並びに心疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
心肥大は、高血圧、機械的負荷、心筋梗塞、心不整脈、内分泌障害、及び心筋収縮タンパク質遺伝子の遺伝子突然変異から生じるものを含む、事実上すべての形態の心疾患に対する心臓の順応性応答である。肥大性応答は、最初は心拍出量を増大する代償性機構であるが、持続性肥大は、拡張型心筋症、心不全、及び突然死に至り得る。米国では、毎年およそ５０万人が心不全と診断され、死亡率は５０％に迫っている。
【０００４】
心肥大の原因と結果は広範囲にわたって文献に記されているが、基礎をなす分子のメカニズムは明確にされていない。これらのメカニズムを理解することは心疾患の予防及び治療において主要な関心事であり、心肥大及び心不全を特異的に標的とする新しい薬剤の設計において治療様式として極めて重大であろう。
【０００５】
以前のアプローチは、培養の心筋細胞を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで心肥大に関与する様々なシグナル経路を対象としている。しかしながら、このアプローチの主たる注意点は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生理的関連性が明らかにされないことである。他のアプローチは、アンギオテンシンＩＩ、エンドセリン−１、及びノルエピネフリンの作用を仲介するものなど、神経ホルモン受容体を遮断する種々の薬剤を用い、心肥大に対する効果を評価している。これらのアプローチの注意点は、ほとんどの場合急激な改善とはならないことである。いくつかのアプローチは、カルシニューリン（Ｒａｏ等、１９９７、Ｆｌａｎａｇａｎ等、１９９１、Ｌｏｈ等、１９９６ａ、及びＬｏｈ等、１９９６ｂ）、及び筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（Ｚａｒａｉｎ−Ｈｅｒｚｂｅｒｇ等、１９９９）の調査によってカルシウムの関与を対象にしているが、種々の肥大性刺激の伝達にそれらの経路がどの程度関与するのかは解明されていない。アンギオテンシンＩＩ、及びエンドセリン−１細胞表面受容体の活性化は、それに続くホスホリパーゼＣの活性化に通じ、ジアシルグリセロール及びイノシトール三リン酸の産生をもたらし、これは次に細胞内Ｃａ２＋の動員、及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化をもたらす（Ｓａｄｏｓｈｉｍａ等、１９９３、Ｙａｍａｚａｋｉ等、１９９６、及びＺｏｕ等１９９６）。さらにＲａｓ及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ回路が肥大シグナルの伝達因子であるという証拠もある（Ｆｏｒｃｅ等、１９９６）。
【０００６】
心血管疾患状態における心肥大の現行の医療管理には、少なくとも２種の薬剤の使用が含まれ、レニン−アンギオテンソイン系の阻害剤、及びβ−アドレナリン遮断薬である（Ｂｒｉｓｔｏｗ、１９９９）。心不全状態における病的肥大を治療する治療薬剤には、アンギオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、及びβ−アドレナリン受容体遮断剤が含まれる（Ｅｉｃｈｈｏｒｎ及びＢｒｉｓｔｏｗ、１９９６）。心肥大の治療に関して開示されている他の薬剤には、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（米国特許第５６０４２５１号）、及び神経ペプチドＹアンタゴニスト（国際特許公開ＷＯ９８／３３７９１）が含まれる。現在薬剤化合物が利用できるにもかかわらず、心肥大、及び続いて起こる心不全の予防及び治療は、依然として治療上の課題を提起する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ヒトの心疾患の予防及び治療において新しい治療戦略の開発が求められている。そのような戦略を開発するために、疾患の生理学的及び病理学的プロファイルを正確に反映し、それによって治療的介入のための新規な遺伝子標的の同定を可能にするインタクトなヒトモデルが求められている。さらに心疾患の予防及び治療のための潜在的な新規治療薬剤の同定を可能にする新規なアッセイが求められている。最後に、類似の表現型を有する異なる患者を比較する実験によって生じる患者間ノイズを除去することができ、単一の患者の疾患に関与する遺伝子のより正確な時間的評価を可能にする治療戦略の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、心疾患及びその回復に関与する遺伝子を同定する新規なアプローチを提供することによって、当分野における欠陥を克服する。したがって、本発明によれば、疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与する遺伝子を同定する方法であって、（ａ）その疾患状態に罹患している第１の対象から核酸含有試料を得る段階、（ｂ）その疾患状態に罹患している対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階であって、その対象が疾患状態の表現型を改善する、又は変更しない治療をすでに受けている段階、（ｃ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、並びに（ｄ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを比較する段階であって、表現型の改善を示す対象において、段階（ａ）の試料及び改善した表現型を示さない対照の対応試料と比較して、段階（ｂ）の試料で発現が増加又は減少している遺伝子を、その疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与していると同定する段階を含む方法が提供される。この方法はさらに、（ｅ）その後の少なくとも１回の時点で段階（ｂ）（ｉ）の対象から第２の核酸含有試料を得る段階、（ｆ）段階（ｅ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、及び（ｇ）段階（ｆ）の遺伝子発現プロファイルを段階（ｂ）（ｉ）の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。
【０００９】
この疾患状態は、これに限定されるものではないが、心不全、癌、肥満、神経変性疾患、腎不全、及び肝不全であることができる。核酸含有試料は、組織試料であることができる。発現プロファイルを得る段階には、ＰＣＲ、たとえばＲＴ−ＰＣＲなどを含むことができる。チップに配列した遺伝子アレイを用いることができる。この方法はさらに、段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、治療ではなくプラセボを受けている疾患状態に罹患している対象の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。この方法はさらに、段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、健康な個体の組織学的に類似の試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。この方法はさらに、この疾患状態に罹患している少なくとも１つの第２の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、第１の対象から得られた結果と比較する段階を含むことができる。
【００１０】
さらなる実施形態において、個体の疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与する遺伝子を同定する方法であって、（ａ）その疾患状態に罹患している対象から核酸含有試料を得る段階、（ｂ）その後の少なくとも１回の時点で段階（ａ）の対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階であって、それに先立ってその対象が疾患状態の表現型を改善する治療をすでに受けている段階、（ｃ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、並びに（ｄ）段階（ａ）及び（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを比較する段階であって、段階（ａ）の試料と比較して、段階（ｂ）の試料で発現が増加又は減少している遺伝子を、その疾患状態の発生、進行、及び／又は持続に関与していると同定する段階を含む方法が提供される。この方法はさらに、その後の第２の時点で、段階（ｂ）を繰り返す段階を含むことができる。この方法はさらに、（ｅ）その疾患状態に罹患している対象から組織学的に類似の核酸含有試料を得る段階であって、その対象が疾患状態の表現型を改善しない治療をすでに受けている段階、（ｆ）段階（ｅ）の試料から遺伝子発現プロファイルを得る段階、及び（ｇ）段階（ｆ）の遺伝子発現プロファイルを、段階（ｂ）の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。
【００１１】
他の実施形態において、心疾患治療の有効性を評価する方法であって、（ａ）心疾患に罹患している第１の対象から第１の心臓組織試料を得る段階、（ｂ）第１の対象を候補療法で処置する段階、（ｃ）処置後に第１の対象から第２の心臓組織試料を得る段階、並びに（ｄ）第１及び第２の試料の１つ又は複数の指示遺伝子の発現を比較する段階であって、１つ又は複数の指示遺伝子は表１に記載のとおりであり、１つ又は複数の指示遺伝子の発現の変化は第１の対象の心疾患処置において候補療法が有効であることを示す段階を含む方法が提供される。この方法は、表１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、又はすべての遺伝子の使用に依存することができる。この方法はまた、少なくとも１つのダウンレギュレートされた遺伝子及び少なくとも１つのアップレギュレートされた遺伝子、各クラスの少なくとも２つ、各クラスの少なくとも３つ、各クラスの少なくとも４つ、又は各クラスの少なくとも５つに依存することができる。対象となる特定の遺伝子には、α−ＭｙＨＣ、ＭＥＫ５、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）産生又は調節遺伝子、Ｓｈａｋｅｒ型、遅延整流（Ｋｖ１．１）電位感受性カリウムチャネルベータサブユニット（β１、又はＫＣＮＡ１Ｂ）、及びコラゲナーゼＩＶ（ＭＭＰ２とも呼ばれる）が含まれる。
【００１２】
この方法はさらに、段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、健康な個体の心臓組織試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。この方法はさらに、段階（ａ）及び／又は（ｂ）の試料の遺伝子発現プロファイルを、治療ではなくプラセボを受けている心疾患に罹患している第２の対象の心臓組織試料の遺伝子発現プロファイルと比較する段階を含むことができる。この方法はさらに、心疾患に罹患している少なくとも１つの第２の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返し、第１の対象から得られた結果と比較する段階を含むことができる。この方法はさらに、候補療法の投与量又は投与計画の変更後、第１の対象で段階（ａ）〜（ｄ）を繰り返す段階を含むことができる。
【００１３】
さらに他の実施形態において、心臓細胞において１つ又は複数の心疾患遺伝子産物の活性を調節する能力に関して候補物質をスクリーニングする方法であって、（ａ）筋細胞を提供する段階、（ｂ）筋細胞を候補物質と接触させる段階、及び（ｃ）表１からなるグループから選択された１つ又は複数の遺伝子産物の活性を測定する段階であって、候補物質と接触させていない筋細胞の活性と比較して、表１からなるグループから選択された１つ又は複数の遺伝子産物の活性の変化は、その候補物質が１つ又は複数の心疾患遺伝子産物の活性のモジュレーターであることを示す段階を含む方法が提供される。この方法は、表１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、又はすべての遺伝子の使用に依存することができる。この方法はまた、少なくとも１つのダウンレギュレートされた遺伝子及び少なくとも１つのアップレギュレートされた遺伝子、各クラスの少なくとも２つ、各クラスの少なくとも３つ、各クラスの少なくとも４つ、又は各クラスの少なくとも５つに依存することができる。対象となる特定の遺伝子には、α−ＭｙＨＣ、ＭＥＫ５、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）産生又は調節遺伝子、Ｓｈａｋｅｒ型、遅延整流（Ｋｖ１．１）電位感受性カリウムチャネルベータサブユニット（β１、又はＫＣＮＡ１Ｂ）、及びコラゲナーゼＩＶ（ＭＭＰ２とも呼ばれる）が含まれる。
【００１４】
活性の測定は、場合によってＲＴ−ＰＣＲを含むｍＲＮＡレベルの測定、タンパク質レベルの測定、又は酵素活性の測定を含むことができる。筋細胞は、心筋細胞であることができる。筋細胞は、培養、又は非ヒト動物において接触させることができる。筋細胞は、表１から選択された遺伝子由来のプロモーターの制御下、スクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む発現構築物を用いて形質転換することができる。筋細胞は、心疾患様遺伝子発現パターンを示すことができる。
【００１５】
さらに他の実施形態において、心疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、表１に記載の１つ又は複数のダウンレギュレートされた遺伝子産物の活性を阻害する物質を投与する段階を含む方法が提供される。この方法は、表１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００のダウンレギュレートされた遺伝子の使用に依存することができる。この物質は、タンパク質、又は核酸発現構築物であることができる。この核酸発現構築物は、アンチセンス構築物、又はリボザイムをコードすることができる。この物質は、低分子、又は有機薬剤であることができる。
【００１６】
さらなる実施形態において、心疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、表１の１つ又は複数のアップレギュレートされた遺伝子産物の活性を増大する物質を投与する段階を含む方法が提供される。この方法は、表１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のアップレギュレートされた遺伝子の使用に依存することができる。この物質は、タンパク質、又は核酸発現構築物であることができる。この核酸発現構築物は、表１の１つ又は複数のアップレギュレートされた遺伝子産物をコードすることができる。この物質は、低分子、又は有機薬剤であることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
Ａ．本発明
本発明は、心不全及び関連する病的状態などの疾患に関与する遺伝子を同定するための遺伝子発現プロファイリングの改良された方法を提供する。一実施形態において、心不全に関与する遺伝子は、罹患及び処置組織の一連の研究を用いて同定することができる。しかしながら、本発明はさらに、当分野の技術者に理解されるとおり、癌、肥満、神経変性疾患、腎不全、肝不全などを含む他の疾患にも適用される。
【００１８】
全体として、現行のアプローチと比較して本発明が本明細書で扱う主たる利点は、（１）遺伝子発現はコンビナトリアルであり、したがってｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系と対比してインタクトな心臓器官を必要とすること、（２）現行の外移植心臓モデルは、末期疾患、コントロールとしての臓器ドナー、介入を行えないこと、及び外見上の表現型グループ内の対象間における著しいばらつきのため、非常に不確かであることが今のところ証明されていること、並びに（３）本発明は疾患の進行又は後退中の複数の時点で得た単一の対象の連続的な分析を可能にすることにより、データ分析における対象間のばらつきを大いに低減することである。さらに、インタクトな心臓の使用は、生理学的及び病理学的により適切な器官モデル系を提供するのに役立つ。本発明の他の重要な態様は、健康な組織と対比して、疾患組織を成功裡に処置された組織と比較することである。遺伝子チップアレイ、及びＲＴ−ＰＣＲなどの効果的な技法と組み合わせて用いたとき、本明細書に記載の方法は、典型的なアプローチに比べてはるかに強固なデータを提供する。
【００１９】
本発明はさらに、新たに同定された心疾患標的に対する物質の活性をさらに評価するために、種々の候補物質を用いて心筋細胞及びインタクトな有機体をスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、標的心疾患及び関連する病的状態を治療する方法を提供する。
【００２０】
添付の表１において、成功裡に処置された心臓組織に対する罹患心臓組織に関して、差異的に調節されていることが本発明に従って同定されたいくつかの遺伝子標的を提供する。
【００２１】
Ｂ．相対遺伝子発現のアッセイ
本発明は、種々の実施形態において、遺伝子発現に関するアッセイを含む。遺伝子発現を評価する多種多様な方法があり、そのほとんどはハイブリダイゼーション分析に依存する。特定の実施形態において、（量的に）検出可能な量の遺伝子産物を産生するために鋳型に基づく増幅法が用いられ、これは種々の方法で評価される。以下の技法及び試薬は、本発明において有用であろう。
【００２２】
１．インタクトな心臓組織試料の獲得
心内膜心筋生検は、細胞及び細胞下レベルの両方で心内膜心筋を分析するための、許容された有用な侵襲的ツールである。心内膜心筋試料は、定着しているいくつかの技法によって得ることができる。通常の方法には、左内頚又は大腿静脈から、あるいは右又は左内頸又は鎖骨下を用いて、生検試料を採取することが含まれる。左又は右心室心内膜心筋生検は、診断時に心臓のいずれの側が主として心疾患に関与しているか、又はある生検がいつ特定の側でより好結果を示すかによって決まる。
【００２３】
他のアプローチには、７Ｆｒ３５ｃｍシース及び先端にバルーンを設けたカテーテルの上で右心室に配置された拡張器系を用いる、より通常の手順を含むことができる。内頸静脈又は鎖骨下静脈を経てシースを配置した後、標準的な生検鉗子を用いて複数の試料を得ることができる。他のアプローチには、トランスデューサを心尖及び肋骨下部に置き、４チャンバビューを利用した２次元心エコー図法が含まれる。その後、生検鉗子を右心房に入れ、３尖弁から右心室に渡す。次いで、試料採取前に２つの異なる古典的なビューを用い、２次元エコー図法下でカテーテルを操作し、先端の位置を厳密に適合させる。
【００２４】
２．増幅法
核酸を扱う有用な技法には、増幅が含まれる。増幅は通常鋳型依存性であり、これは鋳型のさらなるコピーを作製するための鋳型鎖の存在に依存することを意味する。鋳型依存方法において、発生期核酸の合成をプライミングできる短い核酸、プライマーを鋳型鎖にハイブリダイズする。典型的に、プライマーは１０から３０塩基対の長さであるが、長い配列も用いることができる。プライマーは２本鎖及び／又は１本鎖形態で提供することができるが、１本鎖形態が一般に好ましい。
【００２５】
多くの場合、プライマー対は、鋳型核酸の別個の領域に選択的にハイブリダイズするように設計されており、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させる。所望の増幅に応じて、そのプライマーに完全に相補的な配列へのハイブリダイゼーションのみを可能にする高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を選択することができる。他の実施形態において、核酸の増幅が１つ又は複数のプライマー配列とのミスマッチを含有することを可能にする低減したストリンジェンシーでハイブリダイゼーションを生じることができる。ハイブリダイズされたら、鋳型−プライマー複合体を、鋳型依存性核酸合成を促進する１種又は複数の酵素と接触させる。「サイクル」とも呼ばれる増幅の複数循環は、充分な量の増幅産物が産生されるまで行われる。
【００２６】
ＰＣＲ
所与の鋳型試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、いくつかの鋳型依存性の方法を利用できる。もっともよく知られている増幅方法の１つは、その全体をそれぞれ参照により本明細書の一部とする米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、及び第４８００１５９号、並びにＩｎｎｉｓ等、１９８８に詳細に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（商標）と呼ばれる）である。ＰＣＲ（商標）において、核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー対が、選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で用いられる。本明細書では、プライマーという用語は、鋳型依存方法において発生期核酸の合成をプライミングすることのできる任意の核酸を包含する。プライマーは２本鎖又は１本鎖形態で提供することができるが、１本鎖形態が一般に好ましい。
【００２７】
プライマーは、所与の鋳型試料に存在する標的遺伝子配列を増幅するいくつかの鋳型依存性の方法のいずれかで用いられる。もっともよく知られている増幅方法の１つは、それぞれ参照により本明細書の一部とする米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号、及び第４８００１５９号に詳細に記載されているＰＣＲ（商標）である。
【００２８】
ＰＣＲ（商標）では、標的遺伝子配列の相対する相補鎖の領域に相補的な２つのプライマー配列を調製する。標的配列が試料に存在する場合、このプライマーはハイブリダイズし、核酸−プライマー複合体を形成する。過剰のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、鋳型依存性核酸合成を促進するＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑポリメラーゼと共に反応混合物に添加する。
【００２９】
標的遺伝子配列−プライマー複合体が形成されている場合、ポリメラーゼはヌクレオチドに付加することによって、標的遺伝子配列に従ってプライマーを伸長させる。反応混合物の温度を上下することにより、伸長したプライマーを標的から解離して反応産物を形成させ、過剰のプライマーを標的遺伝子及び反応産物に結合させ、工程を繰り返す。「サイクル」と呼ばれる増幅の複数循環は、充分な量の増幅産物が産生されるまで行われる。
【００３０】
増幅したｍＲＮＡの量を定量するために、逆転写酵素ＰＣＲ（商標）増幅手順を行うことができる。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９に記載されている。逆転写の別法は、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いる。これらの方法は、１９９０年１２月２１日出願のＷＯ９０／０７６４１に記載されている。
【００３１】
ＬＣＲ
別の増幅方法は、参照により本明細書の一部とする欧州特許出願第３２０３０８号に開示されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。ＬＣＲでは、２つの相補的プローブ対を調製し、標的配列の存在下、それらが隣接するように各対を標的の相対する相補鎖に結合させる。リガーゼの存在下、それらの２つのプローブ対は結合して、単一のユニットを形成する。ＰＣＲ（商標）と同様に温度を循環することによって、結合したライゲートユニットは標的から解離し、次いで過剰プローブ対のライゲーションの「標的配列」となる。参照により本明細書の一部とする米国特許第４８８３７５０号は、プローブ対を標的配列に結合するＬＣＲに類似の方法を記載している。
【００３２】
Ｑベータレプリカーゼ
ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載のＱベータレプリカーゼも、本発明において他の増幅方法として用いることができる。この方法では、標的の領域と相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下、試料に添加する。ポリメラーゼは複製配列をコピーし、その後それを検出することができる。
【００３３】
等温増幅
制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼを用いて、制限酵素認識部位の一方の鎖にヌクレオチド５’−［α−チオ］−３リン酸を含有する標的分子の増幅を達成する等温増幅法も、本発明の核酸の増幅に有用である。そのような増幅法は、Ｗａｌｋｅｒ等（１９９２）に記載されている。
【００３４】
鎖置換増幅
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は核酸の等温増幅を行う他の方法であり、鎖置換及び合成、すなわちニックトランスレーションの複数循環を含む。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる類似の方法は、増幅の標的となる領域の全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする段階を含み、４つの塩基のうち２つのみが存在する修復反応がそれに続く。他の２つの塩基は、容易に検出するためにビオチン化誘導体として添加できる。類似のアプローチがＳＤＡにも用いられる。
【００３５】
循環プローブ反応
標的特異配列は、循環プローブ反応（ＣＰＲ）を用いて検出することもできる。ＣＰＲでは、非特異ＤＮＡの３’及び５’配列、並びに特異ＲＮＡの中間配列を有するプローブを、試料に存在するＤＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションと同時に、反応物をＲＮａｓｅＨで処理し、消化後に放出される顕著な産物として、プローブの産物を同定する。元の鋳型を別の循環プローブにアニールし、反応を繰り返す。
【００３６】
転写に基づく増幅
他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）を含み、これには核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び３ＳＲが含まれる（Ｋｗｏｈ等、（１９８９）、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５、１９８９）。
【００３７】
ＮＡＳＢＡでは、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、溶解バッファによる処理、並びにＤＮＡ及びＲＮＡを分離するミニスピンカラム、又はＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出によって、増幅のために核酸を調製できる。これらの増幅技法には、標的特異配列を有するプライマーのアニーリングが含まれる。重合に続いて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化し、２本鎖ＤＮＡ分子は再び熱変性する。いずれの場合も、１本鎖ＤＮＡは、第２の標的特異プライマーを付加し、続いて重合することによって完全な２本鎖とする。次いでこの２本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ７又はＳＰ６などのポリメラーゼによって多重に転写する。等温順環反応では、ＲＮＡは２本鎖ＤＮＡに逆転写され、Ｔ７又はＳＰ６などのポリメラーゼによって再び転写される。結果として生じる産物は、短縮型であっても完全長であっても標的特異配列を示す。
【００３８】
他の増幅法
それぞれ参照により本明細書の一部とする英国特許出願ＧＢ２２０２３２８、及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載の別の増幅法も、本発明によって用いることができる。前者の出願では、ＰＣＲ（商標）のような鋳型及び酵素依存性合成において、「修飾された」プライマーが用いられる。このプライマーは、捕捉部分（たとえばビオチン）及び／又は検出部分（たとえば酵素）で標識することによって修飾することができる。後者の出願では、過剰の標識プローブが試料に添加される。標的配列の存在下、ブロープは結合し、触媒により開裂される。開裂後、標的配列はそのまま放出され、過剰のプローブと結合する。標識プローブは、標的配列の存在を示す。
【００３９】
Ｄａｖｅｙ他の欧州特許出願第３２９８２２号（参照により本明細書の一部とする）は、本発明によって用いることのできる、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｓｓＤＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を循環的に合成することを含む核酸増幅法を開示している。
【００４０】
ｓｓＲＮＡは第１プライマーオリゴヌクレオチドの第１の鋳型であり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、このＲＮＡを、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ又はＲＮＡとの２本鎖においてＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、生じたＤＮＡ／ＲＮＡ２本鎖から除去する。生じたｓｓＤＮＡは、第２プライマーの第２の鋳型であり、その鋳型との相同性のＲＮＡポリメラーゼプロモーター（たとえばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）５’の配列を含む。次いで、このプライマーをＤＮＡポリメラーゼ（たとえばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメント）によって伸長し、プライマー間に元のＲＮＡの配列と同一の配列を有し、さらに一端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を生じる。適切なＲＮＡポリメラーゼによって、このプロモーター配列を用いてＤＮＡの多数のＲＮＡコピーを作製することができる。次いで、これらのコピーを再びサイクルに導入し、非常に迅速な増幅をもたらすことができる。酵素の適切な選択により、各サイクルに酵素を添加することなく、等温で増幅を行うことができる。この工程が循環的な性質であるため、開始配列はＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形態を選択できる。
【００４１】
Ｍｉｌｌｅｒ他、ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６７００（参照により本明細書の一部とする）は、プロモーター／プライマー配列の標的１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へのハイブリダイゼーション、それに続く配列の多数のＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは循環型ではなく、すなわち生じたＲＮＡ転写産物から新しい鋳型は産生されない。
【００４２】
他の適切な増幅法には、「ｒａｃｅ法」、及び「片側ＰＣＲ（商標）」が含まれる（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０、Ｏｈａｒａ等、１９８９、それぞれ参照により本明細書の一部とする）。結果として生じる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下、２つ（又はそれ以上）のオリゴヌクレオチドをライゲートし、それによってジオリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法も、本発明の増幅段階で用いることができる、Ｗｕ等、（１９８９）。
【００４３】
２．チップ及びアレイ
ＤＮＡアレイ及び遺伝子チップ技術は、固体基板上に固定された種々の１本鎖ＤＮＡプローブをハイブリダイズするそれらの能力に関して、多数のＤＮＡ試料を迅速にスクリーニングする手段を提供する。特に考慮されたのは、チップに基づくＤＮＡ技術であり、たとえばＨａｃｉａ等（１９９６）、及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ等（１９９６）によって記載されているものなどである。これらの技法は、多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための量的方法を含む。この技術は、ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ試料をスクリーニングするために、１本鎖ＤＮＡの相補的結合性を利用する。Ｐｅａｓｅ等、（１９９４）、Ｆｏｄｏｒ等（１９９１）。基本的に述べれば、ＤＮＡアレイ及び遺伝子チップは、その上に１本鎖ＤＮＡ分子のアレイが結合する固体基板からなる。スクリーニングのために、このチップ又はアレイを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる１本鎖ＤＮＡ試料と接触させる。次いで、チップ又はアレイをスキャンして、どのプローブがハイブリダイズされたかを判定する。本発明の特定の実施形態において、遺伝子チップ又はＤＮＡアレイは、新生物性又は新生物発生前表現型の発生の証拠となる染色体変化に特異的なプローブを含む。この実施形態において、そのようなプローブは、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、染色体マーカー、又は当分野の技術者が遺伝子変化の実証に適切であると認識する他の構築物を含むことができる。
【００４４】
種々の遺伝子チップ又はＤＮＡアレイの形式は当分野において記載されており、たとえば参照により本明細書の一部とする米国特許第５８６１２４２号、及び第５５７８８３２号である。開示された方法をそのようなチップ又はアレイの構築に適用する手段は、当分野の技術者に明らかであろう。簡潔に述べれば、遺伝子チップ又はアレイの基本構造は、（１）励起源、（２）プローブのアレイ、（３）試料採取エレメント、（４）検出器、及び（５）シグナル増幅／処理システムを含む。チップはプローブを固定する支持体を含むこともできる。
【００４５】
特定の実施形態において、標的核酸は、検出可能なシグナルを放射する物質でタグをつける、又は標識することができ、たとえばルミネセンスである。標識核酸は、さらに光トランスデューサ及び関連する検出回路を支持する集積マイクロチップ上に固定することができる。別法として、遺伝子プローブは膜又はフィルタ上に固定することができ、次いでそれをマイクロチップ、又は検出器表面自体に付着する。さらなる実施形態において、固定されたプローブは、標的核酸と結合したときに検出可能シグナル又は変化したシグナルを放射する物質でタグをつける、又は標識することができる。タグ又は標識種は、蛍光、リン光、又はルミネセンスであることができ、あるいはＲａｍａｎエネルギーを放出するか、エネルギーを吸収することができる。プローブが選択的に標的種と結合するとき、チップによって検出されるシグナルが生じる。次いで、シグナルの性質に応じて、シグナルをいくつかの方法で処理することができる。
【００４６】
ＤＮＡプローブは、最適な接触、及び最大の検出を確保するために、トランスデューサ検出表面に直接又は間接的に固定することができる。固体基板にポリヌクレオチドプローブを直接合成又は付着する能力は当分野でよく知られている。参照により共に本明細書の一部とする米国特許第５８３７８３２号、及び第５８３７８６０号を参照されたい。プローブを永久的又は可動的に基板に付着するために、種々の方法が用いられてきた。方法の例には、ビオチン化核酸分子のアビジン／ストレプトアビジン被覆支持体への固定（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ、１９９３）、短い５’リン酸化プライマーの化学変性ポリスチレンプレートへの直接共有結合（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ等、１９９１）、あるいはポリスチレン又はガラス固相のポリＬ−Ｌｙｓ又はポリＬ−Ｌｙｓ，Ｐｈｅによるプレコート、それに続く２官能架橋剤を用いるアミノ又はスフフィドリル修飾オリゴヌクレオチドの共有結合（Ｒｕｎｎｉｎｇ等、１９９０、Ｎｅｗｔｏｎ等、１９９３）が含まれる。基板に固定されたとき、プローブは安定し、したがって繰り返し用いることができる。一般論として、ハイブリダイゼーションを固定化核酸標的上で行うか、又はプローブ分子をニトロセルロース、ナイロン膜、又はガラスなどの固体表面に結合する。他の多数のマトリクス材料を用いることができ、強化ニトロセルロース膜、活性石英、活性ガラス、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ポリスチレン基板、ポリアクリルアミドベース基板、他のポリマー、たとえばポリ（ビニルクロライド）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ジメチルシロキサン）、フォトポリマー（標的分子と共有結合を形成することのできる、ニトレン、カルベン、及びケチルラジカルなどの光反応性種を含有する）を含む。
【００４７】
選択された支持体へのプローブの結合は、いくつかの手段のいずれかによって達成できる。たとえば、通常ＤＮＡは、まずガラス表面をシラン化し、次いでカルボジイミド又はグルタルアルデヒドで活性化することによりガラスに結合させる。別法では、ＤＮＡ合成中、分子の３’末端又は５’末端に組み入れたアミノリンカを介して結合したＤＮＡと共に３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）、又はアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）などの試薬を用いることができる。ＤＮＡは、紫外線放射を用いて膜に直接結合させてもよい。ニトロセルロース膜を用い、ＤＮＡプローブを膜にスポットする。ＤＮＡスポットを照射し、架橋を誘導するために、ＵＶ光源（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いる。架橋の別法には、スポットした膜を８０℃で２時間、真空で焼成することを含む。
【００４８】
特定のＤＮＡプローブは、最初に膜に固定し、次いでトランデューサ検出表面と接触している膜に結合することができる。この方法は、プローブがトランデューサに結合するのを回避し、大規模な産生に望ましい可能性がある。この適用に特に適した膜には、ニトロセルロース膜（たとえばＢｉｏＲａｄ製、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、ナイロン膜（Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ、ＢｉｏＲａｄ）、又はポリスチレンベース基板（ＤＮＡ．ＢＩＮＤ（商標）Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれる。
【００４９】
３．分離技法
核酸産物を鋳型及び過剰プライマーなどの他の材料から分離するのが望ましいことがある。一実施形態において、増幅産物は、標準的な方法を用いるアガロース、アガロース−アクリルアミド、又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）。さらなる操作のために、分離した増幅産物は切り出し、ゲルから溶出することができる。低融点アガロースゲルを用い、ゲルを加熱することによって分離バンドを除去し、続いて核酸を抽出することができる。
【００５０】
核酸の分離は、当分野で知られているクロマトグラフィ技法によって行うこともできる。本発明の実施に用いることのできる多くの種類のクロマトグラフィがあり、吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、分子ふるい、逆相、カラム、ペーパ、薄層、及びガスクロマトグラフィ、並びにＨＰＬＣが含まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、増幅産物は視覚化される。典型的な視覚化方法には、臭化エチジウムによるゲルの染色、及びＵＶ光によるバンドの視覚化が含まれる。別法として、増幅産物が放射性又は蛍光標識ヌクレオチドによって完全に標識されている場合、分離増幅産物は、Ｘ線フィルムに曝露するか、適切な励起スペクトル下で視覚化できる。
【００５２】
Ｃ．タンパク質機能モジュレーターのスクリーニング
本発明はさらに、表１に特定した遺伝子標的の機能モジュレーターを同定する方法を含む。これらのアッセイは、候補物質の大きなライブラリのランダムスクリーニングを含むことができ、あるいはこのアッセイは、標的遺伝子の機能又は発現を調節する可能性が高いと考えられる構造的属性に配慮して選択された特定の類の化合物に焦点を合わせるために用いることができる。
【００５３】
モジュレーターを同定するために、一般に機能又は発現を変える任意の物質として定義されるモジュレーター、候補物質の存在下及び不在下で標的遺伝子の発現又は活性を求めることになる。アッセイは、無細胞系、単離細胞、又はトランスジェニック動物を含む有機体において行うことができる。
【００５４】
当然ながら、本発明のすべてのスクリーニング法は、有効な候補が見出されない可能性があるにもかかわらず、それ自体が有用であることが理解される。本発明は候補を見出す方法だけでなく、そのような候補をスクリーニングする方法も提供する。
【００５５】
１．モジュレーター
本明細書では、「候補物質」という用語は、標的遺伝子の活性又は発現を潜在的に阻害又は増強することのできる任意の分子を指す。この候補物質は、タンパク質又はそのフラグメント、低分子、核酸分子、又は発現構築物であってよい。もっとも有用な薬理化合物は、標的遺伝子、あるいは結合パートナー又は基板に構造的に関連している化合物である可能性がある。改善された化合物の開発を助けるためにリード化合物を用いることは「合理的薬剤設計」として知られており、知られている阻害剤及び活性化剤との比較だけでなく、標的分子の構造に関する予測を含む。
【００５６】
合理的薬剤設計の目的は、生理活性ポリペプチド、又は標的化合物の構造的アナログを生成することである。そのようなアナログを作り出すことによって、天然分子より活性であるか安定である、変性に対して異なる感受性を有する、又は他の種々の分子の機能に影響を及ぼすことができる薬剤を作ることができる。一アプローチにおいて、標的分子、又はそのフラグメントの３次元構造を作製する。これは、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリング、又は両方のアプローチの組み合わせによって達成できる。
【００５７】
標的化合物の活性化剤又は阻害剤の構造を確認するために、抗体を用いることもできる。原理的には、このアプローチによってファーマコアが得られ、その後の薬剤設計はこれに基づくことができる。機能性の薬理活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することによって、タンパク質結晶学を完全に回避することができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、元の抗原のアナログであることが予期される。次いで、抗イディオタイプは、化学的又は生物学的に生成されたペプチド群からペプチドを同定及び単離するために用いることができる。その後、選択されたペプチドは、ファーマコアとしての役割を果たす。抗イディオタイプは、抗原として抗体を用い、本明細書に記載の抗体を産生する方法を用いて生成することができる。
【００５８】
他方、有用な化合物の同定を「強引に」行うために、有用な薬剤の基本的な基準を満たすと考えられる低分子ライブラリを様々な供給業者から簡単に得ることができる。コンビナトリアルに作製されたライブラリ（たとえばペプチドライブラリ）を含む、そのようなライブラリのスクリーニングは、多数の関連する（及び関連しない）化合物を活性に関してスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法である。コンビナトリアルアプローチは、活性であるが、その他は望ましくない化合物をモデルにした第２、第３、及び第４世代の化合物を作り出すことにより、潜在的薬剤の迅速な進化に役立つ。
【００５９】
候補化合物は、天然化合物のフラグメント又は一部を含むことができ、あるいは他の状態では不活性である既知の化合物の活性な合剤として見出すことができる。動物、細菌、真菌、葉及び樹皮を含む植物源、並びに海産試料などの天然源から単離された化合物は、潜在的に有用な薬剤の存在に関して、候補としてアッセイできることが提案される。スクリーニングされる薬剤は、化学組成物又は人工化合物に由来するか、それらから合成できることが理解されるであろう。したがって、本発明によって同定された候補物質は、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子阻害剤、知られている阻害剤又は刺激物質から開始する合理的薬剤設計によって設計することのできる他の任意の化合物であり得ることが理解される。
【００６０】
他の適切なモジュレーターには、アンチセンス分子、リボザイム、及び抗体（１本鎖抗体を含む）が含まれ、それぞれ標的分子に特異的である。そのような化合物は、本明細書の他の場所で詳細に記載される。たとえば、翻訳又は転写開始部位、あるいはスプライスジャンクションに結合したアンチセンス分子は、理想的な候補阻害剤である。
【００６１】
初めに同定された調節化合物に加えて、本発明者等は、他の立体的に類似した化合物もモジュレーターの構造の基本部分を模倣するように製剤できることを企図する。ペプチドモジュレーターのペプチド様物質を含むそのような化合物は、初めのモジュレーターと同じ様式で用いることができる。
【００６２】
２．ｉｎ  ｃｙｔｏアッセイ
本発明は、細胞内で標的遺伝子を調節する能力に関する化合物のスクリーニングを企図する。そのようなスクリーニングアッセイのために種々の細胞系を利用することができ、この目的のために特に操作された細胞を含む。操作には、標的遺伝子由来のプロモーター制御下でのスクリーン可能なマーカー遺伝子の添加を含むことができる。
【００６３】
アッセイに応じて、培養が必要となる可能性がある。細胞はいくつかの異なる生理的アッセイのいずれかを用いて検査する。あるいは、分子の分析は、たとえばタンパク質発現、ｍＲＮＡ発現（全細胞又はポリＡ  ＲＮＡのディファレンシャルディスプレイを含む）などを見て行うこともできる。
【００６４】
３．ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイには種々の動物モデルの使用が含まれ、特定の欠陥を有するように操作されたトランスジェニック動物、有機体内の異なる細胞に到達し影響を与える候補物質の能力を測定するために用いることのできる輸送マーカーを含む。それらの大きさ、取り扱いの容易さ、並びにそれらの生理機能及び遺伝子構造に関する情報により、マウスが好ましい実施形態であり、特にトランスジェニックが好ましい。しかしながら、他の動物も適しており、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ジャービル、ウッドチャック、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、及びサル（チンパンジー、ギボン、及びヒヒを含む）が含まれる。モジュレーターのアッセイは、これらの種のいずれかに由来する動物モデルを用いて行うことができる。特に、アッセイは臨床試験においてヒトの使用を企図する。
【００６５】
そのようなアッセイにおいて、１種又は複数の候補物質を対象に投与し、候補物質で処置していない同様の動物と比較して、１種又は複数の標的遺伝子の活性を変化させる候補物質の能力がモジュレーターを同定する。試験対象は、自然又は人工的に誘導された疾患状態、たとえば心肥大、心不全などを有することができる。
【００６６】
これらの対象の試験化合物による処置は、適切な形態で化合物を対象に投与することを含む。投与は臨床又は非臨床目的に利用できる任意の経路により、これに限定されるものではないが、経口、鼻、頬、又は局所も含む。あるいは、投与は、気管内点滴注入、気管支点滴注入、真皮内、皮下、筋内、腹腔内、又は静脈内注射による。詳細には、企図された経路は、全身静脈内注射、血液又はリンパ液供給による局所投与、あるいは罹患部位への直接投与である。
【００６７】
Ｄ．治療薬剤
１．心疾患遺伝子標的化
ａ．タンパク質発現配列
一実施形態において、治療ポリヌクレオチドを発現する治療導入遺伝子を提供することによって選択された標的遺伝子の発現を調節することができる。第１の実施形態において、発現の増加が所望である標的遺伝子産物をコードする遺伝子を用いることができる。あるいは、活性の低減が所望である標的遺伝子に結合する１本鎖抗体をコードする遺伝子を用いることができる。そのような分子を発現させるために、選択された核酸を適切な調節機構と組み合わせなければならず、次いで構築物を標的細胞に送達しなければならない。本発明のこれらの態様を以下に記載する。
【００６８】
ｉ．クローニング、遺伝子導入、及び発現ベクター
いくつかの実施形態において、治療用遺伝子産物を発現させるために発現ベクターを用いる。発現は、ベクターに提供される適切なシグナルを必要とし、これには種々の調節エレメント、たとえば宿主細胞において対象となる遺伝子の発現を駆動するウイルス及び哺乳類由来のエンハンサー／プロモーターなどである。宿主細胞においてメッセンジャーＲＮＡの安定性及び翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメントも定義される。
【００６９】
調節エレメント
本出願において、「発現構築物」という用語は、一部又はすべての核酸を転写することのできる配列をコードする遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の型の遺伝子構築物を含むものとする。転写物はタンパク質に翻訳されてもよいが、その必要はない。いくつかの実施形態において、発現は、遺伝子の転写、及びｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、対象となる遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。
【００７０】
好ましい実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されたＤＮＡ配列を指す。「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するために、核酸に関してプロモーターが正しい位置及び配向にあることを意味する。
【００７１】
本明細書では、プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の周囲に集まっている転写制御モジュールのグループを指す。プロモーターがどのように組織されているのかという考察の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＳＶ４０初期転写ユニットを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析から得られる。より最近の研究によって補強されたこれらの研究は、プロモーターが個別の機能性モジュールからなり、それぞれ約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写アクチベーター又はレプレッサータンパク質の１つ又は複数の認識部位を含有することを示している。
【００７２】
各プロモーターの少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成の開始部位を配置するように機能する。この種のモジュールのもっともよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチド転移酵素遺伝子のプロモーター、及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどの、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーターでは、開始部位を覆う個別エレメント自体が開始の場所を固定するのを助ける。
【００７３】
付加的なプロモーターエレメントが転写開始の頻度を調節する。典型的には、それらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能性エレメントを含有していることが近年示された。多くの場合プロモーターエレメント間の間隔は順応性があり、そのためエレメントが互いに逆転されるか、動かされたとき、プロモーター機能は維持される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下を始める前に、５０ｂｐ離れるまで増大させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同して、又は独立して転写を活性化する機能を果たすと考えられる。
【００７４】
種々の実施形態において、ヒトサイトメガウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、対象となるコード配列の高レベルの発現を得るために用いることができる。対象となるコード配列の発現を得るために、発現レベルが所与の目的に充分であるならば、当分野でよく知られている他のウイルス又は哺乳動物細胞、あるいはバクテリオファージプロモータを使用することも企図される。
【００７５】
特に興味深いのは筋肉特異的プロモーターであり、さらには心臓特異的プロモーターである。これらには、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｆｒａｎｚ等、１９９４、Ｋｅｌｌｙ等、１９９５）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓ等、１９９６）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒ等、１９９６）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター（Ｂａｒｎｅｓ等、１９９７）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａ等、１９９７）、クレアチンキナーゼプロモーター（Ｒｉｔｃｈｉｅ、Ｍ．Ｅ．、１９９６）、アルファ７インテグリンプロモーター（Ｚｉｏｂｅｒ及びＫｒａｍｅｒ、１９９６）、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅ等、１９９６）、αＢ−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｒ．、１９９５）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａ等、１９８９）、及びＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅ等、１９８８）が含まれる。
【００７６】
エンハンサーは、同一のＤＮＡ分子において遠隔に位置するプロモーターからの転写を増大する遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同じように組織され、すなわちそれぞれが１つ又は複数の転写タンパク質に結合する多くの個々のエレメントからなる。エンハンサーとプロモーターの基本的な差異は操作上のことである。エンハンサー領域は全体として距離を置いて転写を刺激できなければならないが、プロモーター領域又はその成分エレメントではそうである必要はない。他方、プロモーターは特定の部位及び特定の配向で、ＲＮＡ合成の開始を指示する１つ又は複数のエレメントを持たなければならないが、エンハンサーはこの特殊性を持たない。プロモーターとエンハンサーは多くの場合重複し隣接しており、多くの場合非常に類似したモジュラー組織を有するようである。
【００７７】
ｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的に遺伝子転写の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むことが望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の実施の成功に決定的であるとは考えられず、ヒト成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの任意のそのような配列を用いることができる。発現カセットのエレメントとして、ターミネーターも企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列への読み取りを最小化するのに役立ち得る。
【００７８】
選択可能マーカー
本発明のいくつかの実施形態において、細胞は本発明の核酸構築物を含有し、発現構築物にマーカーを含むことによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで同定することができる。そのようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にする。通常、薬剤選択マーカーは、クローニング、及び形質転換体の選択を助け、たとえばネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択可能マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を用いることもできる。免疫学的マーカーも用いることができる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に選択されることが可能である限り、用いられる選択可能マーカーが重要であるとは考えられない。選択可能マーカーのさらなる例が当分野の技術者によく知られている。
【００７９】
多重遺伝子構築物及びＩＲＥＳ
本発明のいくつかの実施形態において、多重遺伝子、又はポリシストロン性メッセージを作り出すために、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントが用いられる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピカノウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、並びに哺乳動物メッセージのＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、１９９１）がすでに記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに結合することができる。複数のオープンリーディングフレームを合わせて転写することができ、それぞれＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロン性メッセージを作る。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。多重遺伝子は、単一メッセージを転写する単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率よく発現させることができる。
【００８０】
任意の異種オープンリーディングフレームをＩＲＥＳエレメントに結合することができる。これには、分泌タンパク質、独立遺伝子によってコードされたマルチサブユニットタンパク質、細胞内又は膜結合タンパク質、及び選択可能マーカーの遺伝子が含まれる。このようにして、いくつかのタンパク質の発現を、単一の構築物、及び単一の選択マーカーと共に同時に細胞内に操作することができる。
【００８１】
ｉｉ．発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入することのできるいくつかの方法がある。本発明のいくつかの実施形態において、発現構築物は、ウイルス、又はウイルスゲノム由来の操作構築物を含む。ある種のウイルスがレセプター媒介エンドサイトーシスを経て細胞に進入し、宿主細胞ゲノムに統合され、安定かつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力により、それらのウイルスは外来遺伝子を哺乳動物細胞に移入するための魅力的な候補となった（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、及びポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）、及びアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは外来ＤＮＡ配列に対して比較的低い受容能力を有し、限定された宿主範囲を有する。さらに、許容性細胞におけるそれらの腫瘍形成能及び細胞変性効果は安全性の懸念を提起する。それらのウイルスは８ｋｂまでの外来遺伝物質しか収容できないが、種々の細胞系及び実験動物に容易に導入することができる（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の好ましい方法の１つには、アデノウイルス発現ベクターの使用が含まれる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持し、（ｂ）そこでクローン化されたアンチセンスポリヌクレオチドを発現するのに充分なアデノウイルスを含有する構築物を含むことを意味する。この場合、発現は遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【００８３】
この発現ベクターは、遺伝子操作型のアデノウイルスを含む。３６ｋｂ、直線状、２本鎖ＤＮＡウイルスであるというアデノウイルスの遺伝子構成の知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片の７ｋｂまでの外来配列による置換が可能となる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは潜在的遺伝子毒性なしにエピソーム様式で複製することができるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組込みを起こさない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、大規模な増幅後にゲノムの再配列は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期段階にかかわらず、実質的にすべての上皮細胞に感染できる。これまでのところ、アデノウイルスはヒトの急性呼吸疾患などの軽度の疾患にのみ関連していると考えられる。
【００８４】
アデノウイルスは、中程度の大きさのゲノム、取り扱いの容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染性のため、遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡの複製及びパッケージングに必要なｃｉｓエレメントである１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含有する。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分けられた異なる転写ユニットを含有する。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノム及び少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、及び宿主細胞停止に関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の１次転写産物の著しいプロセシング後にのみ発現する。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は感染の後期に特に有効であり、このプロモーターから生じたすべてのｍＲＮＡは５’−トリパータイトリーダー（ＴＰＬ）配列を有し、そのため翻訳に好ましいｍＲＮＡとなる。
【００８５】
現在のシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同組換えから産生される。２つのプロウイルスベクター間の組換えが可能なため、野生型アデノウイルスがこのプロセスから産生される可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を検査することが重要である。
【００８６】
複製不能である現在のアデノウイルスベクターの産生及び増殖は、２９３と呼ばれる独特なヘルパー細胞系に依存しており、これはヒト胚腎細胞からＡｄ５  ＤＮＡフラグメントによって形質転換されたもので、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍ等、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムから欠失可能であるので（Ｊｏｎｅｓ及びＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助力を受けて、Ｅ１又はＤ３、あるいは両方の領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。自然状態では、アデノウイルスは約１０５％の野生型ゲノムをパッケージすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ等、１９８７）、さらに約２ｋｂのＤＮＡに対する受容能力を提供する。Ｅ１及びＥ３領域で複製可能な約５．５ｋｂのＤＮＡと合わせて、現在のアデノウイルスベクターの最大受容能力は７．５ｋｂ未満、又はベクターの全長の約１５％である。８０％超のアデノウイルスゲノムがベクターのバックボーンに残り、ベクター媒介細胞毒性源である。さらに、Ｅ１欠失ウイルスの複製不能は不完全である。たとえば、ウイルス遺伝子発現の漏れが、高感染多重度（ＭＯＩ）の現在入手できるベクターで認められた（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【００８７】
ヘルパー細胞系は、ヒト細胞、たとえばヒト胚腎細胞、筋細胞、造血細胞、又は他のヒト胚間葉細胞又は上皮細胞などに由来することができる。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性である他の哺乳動物種の細胞から得ることができる。そのような細胞には、たとえばベロ細胞、あるいは他のサル胚間葉細胞又は上皮細胞が含まれる。上述のとおり、好ましいヘルパー細胞系は２９３である。
【００８８】
Ｒａｃｈｅｒ等（１９９５）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖する改良された方法を開示している。１つの方式において、１００〜２００ｍｌの培地を含有する１ｌのシリコーン処理したスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に個々の細胞を接種することによって、天然の細胞集合体を増殖する。４０ｒｐｍで攪拌後、細胞の生存をトリパンブルーで評価する。他の形式では、次のようにＦｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を用いる。５ｍｌの培地に再懸濁した細胞接種物を、２５０ｍｌのエルレンマイアーフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に加え、時折攪拌しながら１から４時間静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮な培地と交換し、振盪を開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約８０％のコンフルエンスに増殖させ、その後、培地を交換し（最終容量の２５％まで）、ＭＯＩ０．０５でアデノウイルスを添加する。培養物を一晩静置し、容量を１００％まで増加し、さらに７２時間振盪を始める。
【００８９】
アデノウイルスベクターが複製不能であること、又は少なくとも条件付きで複製不能であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は本発明の実施の成功に重要であるとは考えられていない。このアデノウイルスは、知られている４２種の異なる血清型又はサブグループＡ〜Ｆのいずれであってもよい。本発明に用いる条件付き複製不能アデノウイルスベクターを得るためには、サブグループＣのアデノウイルス５型が好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス５型は多くの生化学及び遺伝子情報が知られているヒトアデノウイルスであり、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるたいていの構築に用いられてきたためである。
【００９０】
上述のとおり、本発明による典型的なベクターは複製不能であり、アデノウイルスＥ１領域を持たないことになる。したがって、Ｅ１コーディング配列が除去された位置に対象となる遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入するのがもっとも好都合であろう。しかしながら、アデノウイルス配列に構築物を挿入する位置は、本発明に重要でない。Ｋａｒｌｓｓｏｎ等（１９８６）によって記載されているように、対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Ｅ３置換ベクターの欠失したＥ３領域の代わりに、あるいはヘルパー細胞系又はヘルパーウイルスがＥ４欠失を補っているＥ４領域に挿入することもできる。
【００９１】
アデノウイルスは増殖及び操作が容易であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで広範な宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高力価、たとえば１０９〜１０１２プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、非常に感染力がある。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであり、したがって宿主細胞に対する低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究において副作用は報告されておらず（Ｔｏｐ等、１９７１）、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターとしての安全性及び治療潜在性を実証している。
【００９２】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ等、１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ等、１９９２）、及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ、１９９２）に用いられてきた。近年、動物実験により、組換えアデノウイルスを遺伝子治療に用い得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等、１９９０、Ｒｉｃｈ等、１９９３）。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究には、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ等、１９９３）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ及びＧｅｒａｒｄ、１９９３）、及び脳への定位的接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ等、１９９３）が含まれる。
【００９３】
レトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞においてＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに変換する能力を持つことを特徴とする１本鎖ＲＮＡウイルスのグループである（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。結果として生じるＤＮＡは次いでプロウイルスとして細胞染色体に安定して組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を行う。この組込みによって、レシピエント細胞及びその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をコードする３種の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に見出された配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするシグナルを含有する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、このウイルスゲノムの５’及び３’末端に存在する。これらは強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムでの組込みにも必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【００９４】
レトロウイルスベクターを構築するためには、対象となる遺伝子をコードする核酸を、複製不能なウイルスを産生するある種のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入する。ビリオンを産生するためには、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲを含まないパッケージング細胞系、並びにパッケージング成分を構築する（Ｍａｎｎ等、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドをこの細胞系に導入するとき（たとえばリン酸カルシウム沈降による）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージされることを可能にし、これは次いで培養培地に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、Ｔｅｍｉｎ、１９８６、Ｍａｎｎ等、１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を集め、場合によって濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは広範な細胞型に感染することができる。しかしながら、組込み及び安定な発現には、宿主細胞の分裂を要する（Ｐａｓｋｉｎｄ等、１９７５）。
【００９５】
近年、レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアログリコタンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を可能にした。
【００９６】
レトロウイルスエンベロープタンパク質及び特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体を用いる、組換えレトロウイルスを標的化する異なるアプローチが設計された。これらの抗体は、ストレプトアビジンを用いることによってビオチン成分を介して結合した（Ｒｏｕｘ等、１９８９）。主要な組織適合性複合体クラスＩ及びクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏエコトロピックウイルスにより、表面抗原を有する種々のヒト細胞の感染が実証された（Ｒｏｕｘ等、１９８９）。
【００９７】
本発明のすべての態様において、レトロウイスルベクターの使用にはある種の制限がある。たとえば、レトロウイルスベクターは通常、細胞ゲノムのランダムな部位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の中断、又はフランキング遺伝子の機能を妨げ得るウイルス調節配列の挿入による挿入突然変異に至る可能性がある（Ｖａｒｍｕｓ等、１９８１）。欠損レトロウイルスベクターを用いることの他の懸念は、パッケージング細胞における野生型複製可能ウイルスの潜在的な出現である。これは、宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列の上流に組換えウイルスの非損傷配列が挿入される組換え事象に由来し得る。しかしながら、現在では新しいパッケージング細胞系が入手可能であり、組換えの可能性は大いに低減されるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等、１９８８、Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒ等、１９９０）。
【００９８】
他のウイルスベクターも、本発明において発現構築物として用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｃｏｕｐａｒ等、１９８８）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、及びヘルペスウイルスなどのウイルス由来のベクターを用いることができる。これらは種々の哺乳動物細胞に関していくつかの魅力的な特徴を提示する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９、Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６、Ｃｏｕｐａｒ等、１９８８、Ｈｏｒｗｉｃｈ等、１９９０）。
【００９９】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識により、異なるウイルス配列の構造／機能相関に新しい洞察が得られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究は、このウイルスが８０％までのゲノム欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージング及び逆転写の能力を維持できることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈ等、１９９０）。これは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質で置き換えられることを示した。肝親和性及び存続性（組込み）は、肝指向性遺伝子導入に特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇ等は近年、ポリメラーゼ表面及び前表面コーディング配列の代わりに、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を導入した。これは鳥類肝癌細胞系に野生型ウイルスとコトランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含有する培養培地は、子アヒル初代肝細胞の感染に用いられた。トランスフェクション後、少なくとも２４日間、安定なＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ等、１９９１）。
【０１００】
センス又はアンチセンス遺伝子構築物の発現を行うためには、発現構築物を細胞に送達しなければならない。この送達は、形質転換細胞系の実験手順のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、あるいはある種の疾患状態の処置のようにｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで達成できる。送達の機構の１つは、ウイルス感染を介するもので、ここで発現構築物は感染ウイルス粒子内にキャプシド化される。
【０１０１】
発現構築物を培養哺乳動物細胞に導入するための非ウイルス性のいくつかの方法も本発明によって企図される。これらには、リン酸カルシウム沈降（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３、Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７、Ｒｉｐｐｅ等、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ等、１９８６、Ｐｏｔｔｅｒ等、１９８４）、直接マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ負荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２、Ｆｒａｌｅｙ等、１９７９）、及びリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体、細胞音波破砕（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ等、１９８７）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃（Ｙａｎｇ等、１９９０）、及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｗｕ及びＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技法の一部はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用に首尾よく適合させることができる。
【０１０２】
発現構築物がひとたび細胞に送達されたら、対象となる遺伝子をコードする核酸は異なる部位に配置され、発現することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれることができる。この組込みは、相同組換えによる同種の配置及び配向であってよく（遺伝子置換）、あるいはランダムな非特異的配置に組み込まれてもよい（遺伝子増大）。さらなる実施形態において、核酸はＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞内に安定して維持されることができる。そのような核酸セグメント又は「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立した、又は同調した維持及び複製を可能にするのに充分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、細胞のどこに核酸が保持されるかは、用いられる発現構築物のタイプによって決まる。
【０１０３】
本発明の他の実施形態において、発現構築物は単に裸の組換えＤＮＡ又はプラスミドからなることができる。構築物の導入は、物理的又は化学的に細胞膜を透過性にする上記のいずれかの方法で行うことができる。この方法は特にｉｎ  ｖｉｔｒｏの導入に適用できるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用にも適用することができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙ等（１９８４）は、成体及び新生マウスの肝臓及び脾臓にポリオーマウイルスＤＮＡをリン酸カルシウム沈降物の形態で成功裡に注入し、活性ウイルスの複製及び急性感染を実証した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ及びＮｅｓｈｉｆ（１９８６）もまた、リン酸カルシウム沈降プラスミドの直接腹腔内注入が、トランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを実証した。対象となる遺伝子をコードするＤＮＡがさらにｉｎ  ｖｉｖｏで同様の様式で導入され、遺伝子産物を発現できることが想定される。
【０１０４】
本発明のさらに他の実施形態において、裸のＤＮＡ発現構築物の細胞への導入は、粒子衝撃を含むことができる。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速に加速し、細胞を死滅させることなく細胞膜を貫通して、細胞に侵入することを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ等、１９８７）。小粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の１つは、電流を発生する高圧放電に依存し、これは次に推進力を提供する（Ｙａｎｇ等、１９９０）。使用されたマイクロプロジェタイルは、タングステン、又はゴールドビーズなどの生物学的に不活性な物質からなる。
【０１０５】
ラット及びマウスの肝臓、皮膚、及び筋肉組織を含む選択された器官は、ｉｎ  ｖｉｖｏで衝撃されている（Ｙａｎｇ等、１９９０、Ｚｅｌｅｎｉｎ等、１９９１）。これは、銃と標的器官との間に介在する任意の組織を除去するために、組織又は細胞の外科的曝露、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏ処置を必要とする可能性がある。さらに、特定の遺伝子をコードするＤＮＡはこの方法によって送達され、本発明によって組み込むことができる。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態において、発現構築物をリポソームに取り込むことができる。リポソームは、リン脂質２重層膜及び内部水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたとき自然に形成される。その脂質成分は閉鎖構造の形成前に自己再配列し、水及び溶解溶質を脂質２重層の間に取り込む（Ｇｈｏｓｈ及びＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体も企図される。
【０１０７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリポソーム媒介核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は非常に成功している。Ｗｏｎｇ等（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、及び肝癌細胞において、リポソーム媒介送達及び外来ＤＮＡの発現の可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子導入に成功した。
【０１０８】
本発明のいくつかの実施形態において、リポソームはセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合することができる。これは細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ等、１９８９）。他の実施形態において、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合されるか、又は合わせて用いることができる（Ｋａｔｏ等、１９９１）。さらに他の実施形態において、リポソームはＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合されるか、又は合わせて用いることができる。そのような発現構築物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて核酸の導入及び発現に首尾よく用いられたので、本発明に適用することができる。細菌プロモーターがＤＮＡ構築物に用いられる場合、リポソーム内にも適切な細菌ポリメラーゼを含むことが望ましい。
【０１０９】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために用いることのできる他の発現構築物は、受容体媒介送達ビヒクルである。これらは、ほぼすべての真核細胞において受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取込みを利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布のため、この送達は非常に特異的であり得る（Ｗｕ及びＷｕ、１９９３）。
【０１１０】
受容体媒介遺伝子標的化ビヒクルは、一般に以下の２つの成分からなる。細胞受容体特異的リガンド、及びＤＮＡ結合剤である。受容体媒介遺伝子導入のためにいくつかのリガンドが用いられてきた。もっとも広く特徴づけられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７）、及びトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒ等、１９９０）である。近年、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成ネオグリコプロテインが、遺伝子送達ビヒクルとして用いられており（Ｆｅｒｋｏｌ等、１９９３、Ｐｅｒａｌｅｓ等、１９９４）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）も遺伝子を扁平上皮癌細胞に送達するために用いられている（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ  ０２７３０８５）。
【０１１１】
他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンド及びリポソームを含むことができる。たとえば、Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）は、リポソームと組み合わせたラクトシル−セラミド、ガラクトース−末端アシアロガングリオシドを用い、肝細胞によるインスリン遺伝子の取込みの増加を認めた。したがって、特定の遺伝子をコードする核酸はまた、リポソームを含むか又は含まないいくつかの受容体リガンド系によって細胞型に特異的に送達され得ることが可能である。たとえば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦ受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の媒介送達のための受容体として用いることができる。マンノースは、肝細胞のマンノース受容体を標的とするために用いることができる。さらに、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）、及びＭＡＡ（メラノーマ）の抗体は、同様に標的化部分として用いることができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、遺伝子導入は、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件下でさらに容易に行うことができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療とは、動物から細胞を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を細胞に送達し、変性細胞を動物に戻すことを指す。これは動物からの組織／器官の外科的除去、又は細胞及び組織の初代培養を含むことができる。
【０１１３】
ｂ．非タンパク質発現配列
いくつかの実施形態において、所与の標的遺伝子の発現の阻害を望むことができる。これは、タンパク質として発現されない、すなわち転写されるが翻訳されない導入遺伝子を用いて達成することができる。表現型に影響を及ぼすように機能するが、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ転写物を発現するために、ＤＮＡを有機体に導入することができる。２つの例は、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイム活性を有するＲＮＡである。いずれも、天然又は導入遺伝子の発現を減少又は排除する機能を果たすことができる。しかしながら、以下に詳細に示すように、ＤＮＡは有機体の表現型のために発現される必要はない。
【０１１４】
ｉ．アンチセンスＲＮＡ
いくつかの態様において、治療導入遺伝子はアンチセンスメッセージを発現することができる。転写されたとき、標的化メッセンジャーＲＮＡの一部又はすべてと相補的であるアンチセンスＲＮＡを産生する核酸が構築又は単離され得る。アンチセンスＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡのポリペプチド産物の産生を低減する。ポリペプチド産物は、細胞のゲノムによってコードされた任意のタンパク質であってよい。前述の遺伝子は、アンチセンス遺伝子と呼ばれる。したがって、アンチセンス遺伝子は、形質転換方法によって細胞に導入され、選択された対象となるタンパク質の低減された発現を備えた新規なトランスジェニック細胞又は有機体を産生することができる。たとえば、タンパク質は、細胞又は有機体で反応を触媒する酵素であってよい。酵素活性の低減は、脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、核酸などの、細胞又は有機体内で酵素によって合成される任意の化合物を含む反応産物を減少又は排除することができる。
【０１１５】
あるいは、植物細胞の形質転換などの非限定的な例において、タンパク質は、ゼインなどの貯蔵タンパク質、又は構造タンパク質であることができ、その発現の低減は、それぞれ種子アミノ酸成分の変化、又は植物の形態学的な変化をもたらす可能性がある。上述の可能性は、例として示したものにすぎず、本出願の全範囲を示すものではない。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体又はアナログを含む核酸を本発明の方法及び組成物に用いてよいことが企図される。非限定的な例は、参照により本明細書の一部とする米国特許第５９０８８４５号に記載の「ポリエーテル核酸」である。ポリエーテル核酸では、１つ又は複数の核酸塩基がポリエーテル主鎖のキラル炭素原子に結合している。
【０１１７】
アンチセンス構築物の他の非限定的な例は、参照によりそれぞれ本明細書の一部とする米国特許第５７８６４６１号、第５８９１６２５号、第５７７３５７１号、第５７６６８５５号、第５７３６３３６号、第５７１９２６２号、第５７１４３３１号、第５５３９０８２号、及びＷＯ９２／２０７０２に記載の「ＰＮＡ」とも呼ばれる「ペプチド核酸」、「ペプチドベース核酸アナログ」又は「ＰＥＮＡＭ」である。ペプチド核酸は一般に、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの分子と比較して、向上した配列特異性、結合性、酵素分解に対する耐性を有する（ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９）。ペプチド核酸は一般に、核酸塩基部分を含む１つ又は複数のヌクレオチド又はヌクレオシド、５−炭素糖ではない核酸塩基リンカー部分、及び／又はリン酸主鎖ではない主鎖部分を含む。ＰＮＡに関して記載されている核酸塩基リンカー部分の例には、アザ窒素原子、アミド、及び／又はウレイドつなぎ鎖が含まれる（たとえば米国特許第５５３９０８２号を参照のこと）。ＰＮＡに関して記載されている主鎖部分の例には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィンアミド、又はポリスルホンアミド主鎖部分が含まれる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ペプチド核酸などの核酸アナログは、米国特許第５８９１６２５号に記載のとおり、発現を阻害するために用いることができる。非限定的な例において、米国特許第５７８６４６１号は、分子の溶解性を改善するために、ＰＮＡ主鎖に結合したアミノ酸側鎖を伴うＰＮＡを記載している。他の例において、ＰＮＡの細胞取込み性は、脂肪親和性基の連結によって増大する。他の例は米国特許第５７６６８５５号、第５７１９２６２号、第５７１４３３１号、及び第５７３６３３６号に記載されており、これらは天然の核酸に比べて、配列特異性、溶解性、及び／又は結合親和性に向上をもたらす天然又は非天然核酸塩基及びアルキルアミン側鎖を含むＰＮＡを記載している。
【０１１９】
ｉｉ．リボザイム
他の態様において、治療導入遺伝子はリボザイムを産生することができる。転写されたとき、エンドリボヌクレアーゼとして作用し、選択された配列を有するＲＮＡ分子の開裂を触媒するＲＮＡ酵素（リボザイム）を産生する核酸が構築又は単離され得る。選択されたメッセンジャーＲＮＡの開裂は、コードされたポリペプチド産物の生産の低減をもたらす。これらの遺伝子は、それらを運搬する１つ又は複数の細胞、組織、又は有機体を調製するために用いることができる。これらのトランスジェニック細胞、組織、又は有機体は、これに限定されるものではないが上述のポリペプチドを含む低減されたレベルのポリペプチドを有する。
【０１２０】
リボザイムは、部位特異的に核酸を開裂するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ及びＣｅｃｈ、１９８７、Ｇｅｒｌａｃｈ等、１９８７、Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。たとえば、多数のリボザイムは高度の特異性でリン酸エステル転移反応を促進し、多くの場合オリゴヌクレオチド基質においていくつかのリン酸エステルの１つのみを開裂する（Ｃｅｃｈ等、１９８１、Ｍｉｃｈｅｌ及びＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ及びＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、化学反応に先立って、基質が特異的塩基対相互作用を介して内部ガイド配列（ＩＧＳ）に結合するという要件に起因する。
【０１２１】
リボザイム触媒作用は、主として配列特異的開裂／ライゲーション反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９、Ｃｅｃｈ等、１９８１）。たとえば、米国特許第５３５４８５５号は、ある種のリボザイムが既知のリボヌクレアーゼより大きく、ＤＮＡ制限酵素に近い配列特異性を有するエンドヌクレアーゼとして作用できることを報告している。
【０１２２】
いくつかの異なるリボザイムモチーフがＲＮＡ開裂活性に関して記載されている（Ｓｙｍｏｎｓ、１９９２）。例には、タバコリングスポットウイルス（Ｐｒｏｄｙ等、１９８６）、アボカドサンブロッチウイロイド（Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ等、１９７９）、及びアルファルファ一過性条斑ウイルス（Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＳｙｍｏｎｓ、１９８７）を含むグループＩ自己スプライシングイントロンの配列が含まれる。これらのウイルス及び関連ウイルスの配列は、予測される折返し２次構造に基づいてハンマーヘッドリボザイムと呼ばれる。
【０１２３】
他の適切なリボザイムには、ＲＮＡ開裂活性を有するＲＮａｓｅの配列（Ｙｕａｎ等、１９９２、Ｙｕａｎ及びＡｌｔｍａｎ、１９９４、米国特許第５１６８０５３号及び第５６２４８２４号）、ヘアピンリボザイム構造（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ等、１９９２、Ｃｈｏｗｒｉｒａ等、１９９３）、及びデルタ肝炎ウイルスベースリボザイム（米国特許第５６２５０４７号）が含まれる。ＲＮＡ開裂活性指向リボザイムの一般設計及び最適化は、詳しく検討されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｓｙｍｏｎｓ、１９９２、Ｃｈｏｗｒｉｒａ等、１９９４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９５）。
【０１２４】
リボザイム設計における他の変数は、所与の標的ＲＮＡの開裂部位の選択である。リボザイムは、相補塩基対相互作用によるある部位へのアニーリングによって、所与の配列に標的化される。この標的化には相同性の２つのストレッチが必要とされる。これらの相同性配列のストレッチは、上に定義した触媒性リボザイム構造の側面に位置する。各相同性配列ストレッチは、７から１５ヌクレオチドの長さであり得る。相同性配列を定義する唯一の要件は、標的ＲＮＡにおいて、開裂部位である特定の配列によって分離されていることである。ハンマーヘッドリボゾームの場合、開裂部位は標的ＲＮＡのジヌクレオチド配列であり、ウラシル（Ｕ）にはアデニン、シトシン、又はウラシル（Ａ、Ｃ、又はＵ）が続いている（Ｐｅｒｒｉｍａｎ等、１９９２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９５）。任意のＲＮＡに生じるジヌクレオチドの頻度は、統計的に１６のうち３である。したがって、１０００塩基の所与の標的メッセンジャーＲＮＡの場合、統計的に１８７のジヌクレオチド開裂部位が可能である。
【０１２５】
標的ＲＮＡを有効に開裂するためのリボザイムの設計及び試験は、当分野の技術者によく知られている工程である。リボザイムを設計及び試験する科学的方法の例は、それぞれ参照により本明細書の一部とするＣｈｏｗｒｉｒａ等（１９９４）、並びにＬｉｅｂｅｒ及びＳｔｒａｕｓｓ（１９９５）によって記載されている。所与の遺伝子のダウンレギュレーションにおける使用に有効で好ましい配列の同定は、単に所与の配列の調製及び試験の問題であり、当分野の技術者に知られており通常行われている「スクリーニング」法である。
【０１２６】
２．併用療法
所与の療法の有効性を高めるために、本発明の組成物及び方法と、血管又は心血管疾患又は障害の治療に有効な薬剤とを組み合わせることが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態において、これに限定されるものではないが、薬理学的治療薬剤、外科的治療因子（たとえば、外科的処置）、又はそれらの組み合わせを含む通常の療法又は薬剤を、標的遺伝子を対象とする治療と組み合わせてよいことが企図される。非限定的な例において、治療効果には、血管組織における高血圧の低下、あるいは医療又は外科的処置の間に起こるものなど、血管又は心血管介入後の再狭窄の低減が含まれる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の治療方法は、他の治療薬剤と組み合わせて、表１の遺伝子の発現を調節することを含む。
【０１２７】
この工程は、同時に、あるいはモジュレーター及び薬剤の細胞、組織、又は有機体への分離投与が所望の治療効果を生じる期間内に、細胞を薬剤及び標的遺伝子モジュレーションに接触させることを含む。細胞、組織、又は有機体に適用されるとき、本明細書では「接触」及び「曝露」という用語は、それによってモジュレーター及び／又は治療薬剤が標的細胞、組織、又は有機体に送達される、あるいは標的細胞、組織、又は有機体に直接並ぶように配置される工程を言う。この細胞、組織、又は有機体は、モジュレーター及び１種又は複数の薬剤の両方を含む単一の組成物又は薬理学的製剤と接触させることができ（たとえば投与によって）、あるいは１つの組成物がモジュレーターを含み、他の組成物が１種又は複数の薬剤を含む、２種以上の別個の組成物又は製剤と細胞を接触させることもできる。
【０１２８】
遺伝子モジュレーターは、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤に先行するか、並行するか、かつ／又は続くことができる。モジュレーター及び他の薬剤が細胞、組織、又は有機体に別個に適用される実施形態において、一般にモジュレーター及び薬剤が依然として有利な組み合わせの影響を細胞、組織、及び有機体に及ぼせるように、各送達の時間の間に相当量の時間が切れないことを保証する。たとえば、そのような場合、細胞、組織、又は有機体を、モジュレーターとして実質的に同時に（すなわち約１分未満内に）２、３、４以上の治療様式に接触できることが企図される。他の態様において、１種又は複数の薬剤を、モジュレーターの投与前及び／又は後、実質的に同時から、約１分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１４日、約２１日、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６ヵ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、又は約１２カ月、及び任意の送達可能な範囲で投与することができる。
【０１２９】
モジュレーター及び１種又は複数の薬剤の多様な組み合わせ投与計画を用いることができる。そのような組み合わせの非限定的な例は以下に示すとおりであり、ここで組成物モジュレーターは「Ａ」であり、他の薬剤は「Ｂ」である。
（記号）
2005502367.tif 000002
【０１３０】
モジュレーターの細胞、組織、又は有機体への投与は、毒性がある場合には、それに配慮して、血管又は心血管療法の投与のための一般的なプロトコルに従うことができる。治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予期される。特定の実施形態において、種々の追加の薬剤を本発明との任意の組み合わせで適用できることが企図される。
【０１３１】
３．薬理学的治療薬剤
薬理学的治療薬剤、投与方法、用量などは、当分野の技術者によく知られており（たとえば、関連部分を参照により本明細書の一部とする「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、及び「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、第１１版」を参照のこと）、本明細書の開示に照らして本発明と組み合わせることができる。治療される対象の状態に応じて、いくらかの用量の変化が必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれの場合にも、個々の対象に関して適切な用量を決定し、そのような個々の決定は当分野の技術者の技術の範囲内である。
【０１３２】
本発明において用いることのできる薬理学的治療薬剤の非限定的な例には、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓／線溶剤、血液凝固剤、抗不整脈剤、血圧降下剤、血管収縮剤、鬱血性心不全の治療薬、抗狭心症剤、抗菌剤、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【０１３３】
さらに、本発明の実施例でβ−遮断薬を用いたように（以下を参照のこと）、心臓治療標的遺伝子の新しいセットを開発するために以下の任意のものを用いてよいことに留意されたい。これらの遺伝子の多くが重複することが予期されるが、新しい遺伝子標的が開発され得ると考えられる。
【０１３４】
ａ．抗高リポタンパク血症剤
いくつかの実施形態において、本明細書では「抗高リポタンパク血症剤」と呼ばれる１種又は複数の血中脂質及び／又はリポタンパク質の濃度を下げる薬剤の投与は、特にアテローム性動脈硬化症、及び血管組織の肥厚又は閉塞の治療において、本発明による心血管療法と組み合わせて用いることができる。いくつかの態様において、抗高リポタンパク血症剤は、アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸（ｆｉｂｒｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体、樹脂／胆汁酸抑制剤、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素抑制剤、ニコチン酸誘導体、甲状腺ホルモン又は甲状腺ホルモンアナログ、その他の薬剤、又はそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１３５】
ｉ．アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体
アリールオキシアルカン酸／フィブリン酸誘導体の非限定的な例には、ベクロブレート（ｂｅｃｌｏｂｒａｔｅ）、エンザフィブレート（ｅｎｚａｆｉｂｒａｔｅ）、ビニフィブレート（ｂｉｎｉｆｉｂｒａｔｅ）、シプロフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブレート（アトロミド−Ｓ）、クロフィブリン酸、エトフィブレート（ｅｔｏｆｉｂｒａｔｅ）、フェノフィブレート、ジェムフィブロジル（ロビド（ｌｏｂｉｄ））、ニコフィブレート（ｎｉｃｏｆｉｂｒａｔｅ）、ピリフィブレート（ｐｉｒｉｆｉｂｒａｔｅ）、ロニフィブレート（ｒｏｎｉｆｉｂｒａｔｅ）、シムフィブレート（ｓｉｍｆｉｂｒａｔｅ）、及びテオフィブレート（ｔｈｅｏｆｉｂｒａｔｅ）が含まれる。
【０１３６】
ｉｉ．樹脂／胆汁酸抑制剤
樹脂／胆汁酸抑制剤の非限定的な例には、コレスチラミン（コリバール（ｃｈｏｌｙｂａｒ）、クエストラン）、コレスチポール（コレスチド）、及びポリデキシドが含まれる。
【０１３７】
ｉｉｉ．ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素抑制剤
ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素抑制剤の非限定的な例には、ロバスタチン（メバコール）、プラバスタチン（プラボコール（ｐｒａｖｏｃｈｏｌ））、又はシンバスタチン（ゾコール）が含まれる。
【０１３８】
ｉｖ．ニコチン酸誘導体
ニコチン酸誘導体の非限定的な例には、ニコチネート、アセピモックス（ａｃｅｐｉｍｏｘ）、ニセリトロール、ニコクレネート、ニコモール、及びオキシニアシン酸（ｏｘｉｎｉａｃｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる。
【０１３９】
ｖ．甲状腺ホルモン及びアナログ
甲状腺ホルモン及びそのアナログの非限定的な例には、エトロキセート（ｅｔｏｒｏｘａｔｅ）、チロプロピオン酸、及びチロキシンが含まれる。
【０１４０】
ｖｉ．他の抗高リポタンパク血症剤
他の抗高リポタンパク血症剤の非限定的な例には、アシフラン（ａｃｉｆｒａｎ）、アザコステロール（ａｚａｃｏｓｔｅｒｏｌ）、ベンフルオレックス、β−ベンザルブチルアミド、カルニチン、コンドロイチン硫酸、クロメストロン（ｃｌｏｍｅｓｔｒｏｎｅ）、デタクストラン、デキストラン硫酸ナトリウム、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、エリタデニン、フラザボール、メグルトール（ｍｅｇｌｕｔｏｌ）、メリナミド、ミタトリエンジオール（ｍｙｔａｔｒｉｅｎｅｄｉｏｌ）、オルニチン、γ−オリザノール、パンテチン、四酢酸ペンタエリトリトール、α−フェニルブチルアミド、ピロザジル（ｐｉｒｏｚａｄｉｌ）、プロブコール（ロレルコ）、β−シトステロール、スルトシル酸（ｓｕｌｔｏｓｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）−ピペラジン塩、チアデノール（ｔｉａｄｅｎｏｌ）、トリパラノール、及びキセンブチンが含まれる。
【０１４１】
ｂ．抗動脈硬化剤
抗動脈硬化剤の非限定的な例には、ピリジノールカルバメートが含まれる。
【０１４２】
ｃ．抗血栓／線溶剤
いくつかの実施形態において、血餅の除去又は予防を助ける薬剤の投与は、特にアテローム性動脈硬化症、及び血管（たとえば動脈）閉塞の治療において、モジュレーターの投与と組み合わせることができる。抗血栓及び／又は線溶剤の非限定的な例には、抗凝血剤、抗凝血剤アンタゴニスト、抗血小板剤、血栓溶解剤、血栓溶解剤アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【０１４３】
いくつかの態様において、たとえばアスピリン、及びワーファリン（クマジン）などの経口的に投与できる抗血栓剤が好ましい。
【０１４４】
ｉ．抗血液凝固剤
抗血液凝固剤の非限定的な例には、アセノクマロール、アンクロド、アニシンジオン、ブロムインジオン、クロルインジオン（ｃｌｏｒｉｎｄｉｏｎｅ）、クメタロール、シクロクマロール、デキストラン硫酸ナトリウム、ジクマロール、ジフェナジオン、ビスクマ酢酸エチル、エチリデンジクマロール、フルインジオン（ｆｌｕｉｎｄｉｏｎｅ）、ヘパリン、ヒルジン、リアポレートナトリウム（ｌｙａｐｏｌａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、オキサジジオン（ｏｘａｚｉｄｉｏｎｅ）、ポリ硫酸ペントサン、フェニンジオン、フェンプロクーモン、ホスビチン、ピコタミド（ｐｉｃｏｔａｍｉｄｅ）、チオクロマロール（ｔｉｏｃｌｏｍａｒｏｌ）、及びワーファリンが含まれる。
【０１４５】
ｉｉ．抗血小板剤
抗血小板剤の非限定的な例には、アスピリン、デキストラン、ジピリダモール（ペルサンチン）、ヘパリン、スルフィンピラノン（アンツラン）、及びチクロピジン（チクリッド）が含まれる。
【０１４６】
ｉｉｉ．血栓溶解剤
血栓溶解剤の非限定的な例には、組織プラスミノゲン活性化剤（アクチバーゼ）、プラスミン、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ（アボキナーゼ）、ストレプトキナーゼ（ストレプターゼ）、アニストレプラーゼ／ＡＰＳＡＣ（エミナーゼ（ｅｍｉｎａｓｅ））が含まれる。
【０１４７】
ｄ．血液凝固剤
患者が出血、又は出血可能性の増加を患っているいくつかの実施形態において、血液凝固を増大する可能性のある薬剤を用いることができる。血液凝固促進剤の非限定的な例には、血栓溶解剤アンタゴニスト、及び抗血液凝固剤アンタゴニストが含まれる。
【０１４８】
ｉ．抗血液凝固剤アンタゴニスト
抗血液凝固剤アンタゴニストの非限定的な例には、プロタミン、及びビタミンＫ１が含まれる。
【０１４９】
ｉｉ．血栓溶解剤アンタゴニスト及び抗血栓剤
血栓溶解剤アンタゴニストの非限定的な例には、アミノカプロン酸（アミカール（ａｍｉｃａｒ）、及びトラネキサム酸（アムスタット（ａｍｓｔａｔ））が含まれる。抗血栓剤の非限定的な例には、アナグレライド、アルガトロバン、シルスタゾール、ダルトロバン（ｄａｌｔｒｏｂａｎ）、デフィブロタイド（ｄｅｆｉｂｒｏｔｉｄｅ）、エノキサパリン、フラキシパリン、インドブフェン、ラモパラン（ｌａｍｏｐａｒａｎ）、オザグレル、ピコタミド（ｐｉｃｏｔａｍｉｄｅ）、プラフィブリド（ｐｌａｆｉｂｒｉｄｅ）、テデルパリン（ｔｅｄｅｌｐａｒｉｎ）、チクロピジン、及びトリフルサルが含まれる。
【０１５０】
ｅ．抗不整脈剤
抗不整脈剤の非限定的な例には、クラスＩ抗不整脈剤（ナトリウムチャネル遮断剤）、クラスＩＩ抗不整脈剤（ベータ−アドレナリン遮断剤）、クラスＩＩ抗不整脈剤（再分極遅延剤）、クラスＩＶ抗不整脈剤（カルシウムチャネル遮断剤）、及びその他の抗不整脈剤が含まれる。
【０１５１】
ｉ．ナトリウムチャネル遮断剤
ナトリウムチャネル遮断剤の非限定的な例には、クラスＩＡ、クラスＩＢ、及びクラスＩＣ抗不整脈剤が含まれる。クラスＩＡ抗不整脈剤の非限定的な例には、ジスピラミド（ｄｉｓｐｐｙｒａｍｉｄｅ）（ノルペース）、プロカインアミド（プロネスチル）、及びキニジン（キニデクス（ｑｕｉｎｉｄｅｘ））が含まれる。クラスＩＢ抗不整脈剤の非限定的な例には、リドカイン（キシロカイン）、トカイニド（トノカード（ｔｏｎｏｃａｒｄ））、及びメキシレチン（メキシチル）が含まれる。クラスＩＣ抗不整脈剤の非限定的な例には、エンカイニド（エンカイド（ｅｎｋａｉｄ））、及びフレカイニド（タンボコール）が含まれる。
【０１５２】
ｉｉ．ベータ遮断剤
β−アドレナリン遮断剤、β−アドレナリンアンタゴニスト、又はクラスＩＩ抗不整脈剤とも呼ばれるベータ遮断剤の非限定的な例には、アセブトロール（セクトラール）、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、塩酸ブチドリン（ｂｕｔｉｄｒｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール（ブレビブロック）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ニフェナロール（ｎｉｆｅｎａｌｏｌ）、ニプラジロール、オキシプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロパノロール（インデラル）、ソタロール（ベータペース）、スルフィナロール（ｓｕｌｆｉｎａｌｏｌ）、タリノロール、テルタトロール（ｔｅｒｔａｔｏｌｏｌ）、チモロール、トリプロロール、及びキシビノロール（ｘｉｂｉｎｏｌｏｌ）が含まれる。いくつかの態様において、ベータ遮断剤は、アリールオキシプロパノールアミン誘導体を含む。アリールオキシプロパノールアミノ誘導体の非限定的な例には、アセブトロール、アルプレノロール、アロチノロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブニトロロール、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、エパノロール、インデノロール、メピンドロール、メチプラノロール、メトプロロール、モプロロール、ナドロール、ニプラジロール、オキシプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、タリノロール、テルタトロール（ｔｅｒｔａｔｏｌｏｌ）、チモロール、及びトリプロロールが含まれる。
【０１５３】
ｉｉｉ．再分極遅延剤
クラスＩＩＩ抗不整脈剤とも呼ばれる、再分極を遅延する薬剤の非限定的な例には、アミオダロン（コルダロン）、及びソタロール（ベータペース）が含まれる。
【０１５４】
ｉｖ．カルシウムチャネル遮断剤／アンタゴニスト
クラスＩＶ抗不整脈剤とも呼ばれるカルシウムチャネル遮断剤の非限定的な例には、アリールアルキルアミン（たとえば、ベプリジル、ジルチアゼム、フェンジリン（ｆｅｎｄｉｌｉｎｅ）、ガロパミル（ｇａｌｌｏｐａｍｉｌ）、プレニルアミン、テロジリン、ベラパミル）、ジヒドロピリジン誘導体（フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン）、ピペラジンド誘導体（たとえば、シンナリジン、フルナリジン、リドフラジン）、又はベンシクラン、エタフェノン、マグネシウム、ミベフラジル、又はペルヘキシリンなどの他のカルシウムチャネル遮断剤が含まれる。いくつかの実施形態において、カルシウムチャネル遮断剤は、長時間作用性ジヒドロピリジン（ニフェジピン型）カルシウムアンタゴニストを含む。
【０１５５】
ｖ．他の抗不整脈剤
他の抗不整脈剤の非限定的な例には、アデノシン（アデノカード）、ジゴキシン（ラノキシン）、アセカイニド（ａｃｅｃａｉｎｉｄｅ）、アジマリン、アモプロキサン（ａｍｏｐｒｏｘａｎ）、アプリンジン、ブレチリウム、トシレート、ブナフチン（ｂｕｎａｆｔｉｎｅ）、ブトベンジン（ｂｕｔｏｂｅｎｄｉｎｅ）、カポベン酸、シフェンリン、ジソピラニド、ヒドロキニジン、インデカイニド、臭化イパトロピウム、リドカイン、ロルアジミン（ｌｏｒａｊｉｍｉｎｅ）、ロルカイニド、メオベンチン（ｍｅｏｂｅｎｔｉｎｅ）、モリシジン、ピルメノール、プラジマリン、プロパフェノン、ピリノリン（ｐｙｒｉｎｏｌｉｎｅ）、ポリガラクツロン酸キニジン、硫酸キニジン、及びビキジル（ｖｉｑｕｉｄｉｌ）が含まれる。
【０１５６】
ｆ．血圧降下剤
血圧降下剤の非限定的な例には、交感神経遮断性アルファ／ベータ遮断剤、アルファ遮断剤、抗アンギオテンシンＩＩ剤、ベータ遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、血管拡張剤、及び他の血圧降下剤が含まれる。
【０１５７】
ｉ．アルファ遮断剤
α−アドレナリン遮断剤、又はα−アドレナリンアンタゴニストとも呼ばれるアルファ遮断剤の非限定的な例には、アモスラロール、アロチノロール、ダピプラゾール（ｄａｐｉｐｒａｚｏｌｅ）、ドキサゾシン、エルゴロイド、メシレート、フェンスピリド、インドラミン、ラベタロール、ニセルゴリン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、トリマゾシン（ｔｒｉｍａｚｏｓｉｎ）、及びヨヒンビンが含まれる。いくつかの実施形態において、アルファ遮断剤は、キナゾリン誘導体を含むことができる。キナゾリン誘導体の非限定的な例には、アルフゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、及びトリマゾシンが含まれる。
【０１５８】
ｉｉ．アルファ／ベータ遮断剤
いくつかの実施形態において、血圧降下剤は、アルファ及びベータアドレナリンアンタゴニストである。アルファ／ベータ遮断剤の非限定的な例には、ラベタロール（ノルモジン（ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ）、トランデート）が含まれる。
【０１５９】
ｉｉｉ．抗アンギオテンシンＩＩ剤
抗アンギオテンシンＩＩ剤の非限定的な例には、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、及びアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストが含まれる。アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）の非限定的な例には、アラセプリル、エナラプリル（バソテック）、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリラト、フォシノプリル、リシノプリル、モベルトプリル（ｍｏｖｅｌｔｏｐｒｉｌ）、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ＡＮＧ受容体遮断剤、又はＡＮＧ−ＩＩ１型受容体遮断剤（ＡＲＢＳ）とも呼ばれるアンギオテンシンＩＩ受容体遮断剤の非限定的な例には、アンギオカンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、及びバルサルタンが含まれる。
【０１６０】
ｉｖ．交感神経遮断剤
交感神経遮断剤の非限定的な例には、中枢性交感神経遮断剤、又は末梢性交感神経遮断剤が含まれる。中枢神経系（ＣＮＳ）交換神経遮断剤とも呼ばれる中枢性交感神経遮断剤の非限定的な例には、クロニジン（カタプレス）、グアナベンズ（ワイテンシン（ｗｙｔｅｎｓｉｎ））、グアンファシン（テネックス（ｔｅｎｅｘ））、及びメチルドパ（アルドメット）が含まれる。末梢性交感神経遮断剤の非限定的な例には、神経節遮断剤、アドレナリン作用性ニューロン遮断剤、β−アドレナリン遮断剤、又はアルファ１−アドレナリン遮断剤が含まれる。神経節遮断剤の非限定的な例には、メカミラミン（インベルシン（ｉｎｖｅｒｓｉｎｅ））、及びトリメタファン（アルフォナード）が含まれる。アドレナリン作用性ニューロン遮断剤の非限定的な例には、グアネチジン（イスメリン）、及びレセルピン（セルパシル）が含まれる。β−アドレナリン遮断剤の非限定的な例には、アセニトロール（ａｃｅｎｉｔｏｌｏｌ）（セクトラール）、アテノロール（テノルミン）、ベタキソロール（ケルロン）、カルテロール（カルトロール（ｃａｒｔｒｏｌ））、ラベタロール（ノルモジン（ｎｏｒｍｏｄｙｎｅ）、トランデート）、メトプロロール（ロプレソール）、ナダノール（ｎａｄａｎｏｌ）（コルガード）、ペンブトロール（レバトール）、ピンドロール（ビスケン）、プロプラノロール（インデラル）、及びチモロール（ブロカドレン）が含まれる。アルファ１−アドレナリン遮断剤の非限定的な例には、プラゾシン（ミニプレス）、ドキサゾシン（カルデュラ）、及びテラゾシン（ヒトリン）が含まれる。
【０１６１】
ｖ．血管拡張剤
いくつかの実施形態において、心血管治療剤は血管拡張剤（たとえば、脳血管拡張剤、冠動脈拡張剤、又は末梢血管拡張剤）を含むことができる。いくつかの好ましい実施形態において、血管拡張剤は冠動脈拡張剤を含む。冠動脈拡張剤の非限定的な例には、アモトリフェン（ａｍｏｔｒｉｐｈｅｎｅ）、ベンダゾール、ベンフロジル（ｂｅｎｆｕｒｏｄｉｌ）、ヘミスクシネート、ベンジオダロン（ｂｅｎｚｉｏｄａｒｏｎｅ）、クロラシジン（ｃｈｌｏｒａｃｉｚｉｎｅ）、クロモナール、クロベンフロール（ｃｌｏｂｅｎｆｕｒｏｌ）、クロニトレート（ｃｌｏｎｉｔｒａｔｅ）、ジラゼップ、ジピリダモール、ドロプレニルアミン（ｄｒｏｐｒｅｎｉｌａｍｉｎｅ）、エフロキセート（ｅｆｌｏｘａｔｅ）、四硝酸エリトリチル、エタフェノン、フェンジリン（ｆｅｎｄｉｌｉｎｅ）、フロレジル（ｆｌｏｒｅｄｉｌ）、ガングレフェン（ｇａｎｇｌｅｆｅｎｅ）、ヘレストロール（ｈｅｒｅｓｔｒｏｌ）ビス（β−ジエチルアミノエチルエーテル）、ヘキソベンジン、イトラミントシレート、ケリン、リドフラニン、マンニトールヘキサニトラン（ｈｅｘａｎｉｔｒａｎｅ）、メディバジン（ｍｅｄｉｂａｚｉｎｅ）、ニコルグリセリン（ｎｉｃｏｒｇｌｙｃｅｒｉｎ）、四硝酸ペンタエリトリトール、ペントリニトロール（ｐｅｎｔｒｉｎｉｔｒｏｌ）、ペルヘキシリン、ピメフィリン（ｐｉｍｅｆｙｌｌｉｎｅ）、トラピジル、トリクロミル（ｔｒｉｃｒｏｍｙｌ）、トリメタジジン、リン酸トロルニトレート、及びビスナジンが含まれる。
【０１６２】
いくつかの態様において、血管拡張剤は、長期治療血管拡張剤、又は高血圧緊急血管拡張剤を含むことができる。長期治療血管拡張剤の非限定的な例には、ヒドララジン（アプレソリン）、及びミノキシジル（ロニテン）が含まれる。高血圧緊急血管拡張剤の非限定的な例には、ニトロプルシド（ニプライド）、ジアゾキシド（ハイパースタット（ｈｙｐｅｒｓｔａｔ）ＩＶ）、ヒドララジン（アプレソリン）、ミノキシジル（ロニテン）、及びベラパミルが含まれる。
【０１６３】
ｖｉ．他の血圧降下剤
他の血圧降下剤の例には、アジマリン、γ−アミノ酪酸、ブフェニオード（ｂｕｆｅｎｉｏｄｅ）、シクレタイニン（ｃｉｃｌｅｔａｉｎｉｎｅ）、シクロシドミン（ｃｉｃｌｏｓｉｄｏｍｉｎｅ）、タンニン酸クリプテナミン、フェノルドパム、フロセキナン、ケタンセリン、メブタメート、メカミラミン、メチルドパ、メチル４−ピリジルケトンチオセミカルバゾン、ムゾリミン、パルジリン、ペンピジン、ピナシジル、ピペロキサン、プリマペロン（ｐｒｉｍａｐｅｒｏｎｅ）、プロトベラトリン、ラウバシン（ｒａｕｂａｓｉｎｅ）、レスシメトール（ｒｅｓｃｉｍｅｔｏｌ）、リルメニデン（ｒｉｌｍｅｎｉｄｅｎｅ）、サララシン、ニトロルシド（ｎｉｔｒｏｒｕｓｓｉｄｅ）ナトリウム、チクリナフェン、カンシル酸トリメタファン、チロシナーゼ、及びウラピジルが含まれる。
【０１６４】
いくつかの態様において、血圧降下剤には、アリールエタノールアミン誘導体、ベンゾチアジアジン誘導体、Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体、ジヒドロピリジン誘導体、グアニジン誘導体、ヒドラジン／フタラジン、イミダゾール誘導体、第四級アンモニウム化合物、レセルピン誘導体、及びスフロンアミド（ｓｕｆｌｏｎａｍｉｄｅ）誘導体が含まれる。
【０１６５】
アリールエタノールアミン誘導体  アリールエタノールアミン誘導体の非限定的な例には、アモスラロール、ブフラロール、ジレバロール、ラベタロール、プロネタロール、ソタロール、及びスルフィナロール（ｓｕｌｆｉｎａｌｏｌ）が含まれる。
【０１６６】
ベンゾチアジアジン誘導体  ベンゾチアジアジン誘導体の非限定的な例には、アルチジド（ａｌｔｈｉｚｉｄｅ）、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、シクロチアジド、ジアゾキシド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン（ｆｅｎｑｕｉｚｏｎｅ）、ヒドロクロロチジド、ヒドロフルメチジド、メチルクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド（ｐａｒａｆｌｕｔｉｚｉｄｅ）、ポリチジド（ｐｏｌｙｔｈｉｚｉｄｅ）、テトラクロルメチアジド、及びトリクロルメチアジドが含まれる。
【０１６７】
Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体  Ｎ−カルボキシアルキル（ペプチド／ラクタム）誘導体の非限定的な例には、アラセプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラト、フォシノプリル、リシノプリル、モベルチプリル（ｍｏｖｅｌｔｉｐｒｉｌ）、ペリンドプリル、キナプリル、及びラミプリルが含まれる。
【０１６８】
ジヒドロピリジン誘導体  ジヒドロピリジン誘導体の非限定的な例には、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、及びニトレンジピンが含まれる。
【０１６９】
グアニジン誘導体  グアニジン誘導体の非限定的な例には、ベタニジン、デブリソキン、グアナベンズ、グアナクリン、グアナドレル、グアナゾジン（ｇｕａｎａｚｏｄｉｎｅ）、グアネチジン、グアンファシン、グアノクロール、グアノキサベンズ（ｇｕａｎｏｘａｂｅｎｚ）、及びグアノキサンが含まれる。
【０１７０】
ヒドラジン／フタラジン  ヒドラジン／フタラジンの非限定的な例には、ブドララジン、カドララジン、ジヒドララジン、エンドララジン（ｅｎｄｒａｌａｚｉｎｅ）、ヒドラカルバジン、ヒドララジン、フェニプラジン、ピルドララジン（ｐｉｌｄｒａｌａｚｉｎｅ）、及びトドララジンが含まれる。
【０１７１】
イミダゾール誘導体  イミダゾール誘導体の非限定的な例には、クロニジン、ロフェキシジン、フェントラミン、チアメニジン（ｔｉａｍｅｎｉｄｉｎｅ）、及びトロニジン（ｔｏｌｏｎｉｄｉｎｅ）が含まれる。
【０１７２】
第四級アンモニウム化合物  第四級アンモニウム化合物の非限定的な例には、臭化アザメトニウム、塩化クロルイソンダミン、ヘキサメトニウム、ペンタシニウム（ｐｅｎｔａｃｙｎｉｕｍ）ビス（メチルスルフェート）、臭化ペンタメトニウム、酒石酸ペントリニウム、塩化フェナクトロピニウム（ｐｈｅｎａｃｔｒｏｐｉｎｉｕｍ）、及びメソ硫酸トリメチジウムが含まれる。
【０１７３】
レセルピン誘導体  レセルピン誘導体の非限定的な例には、ビエタセルピン、デセルピジン、レシナミン、レセルピン、及びシロシンゴピンが含まれる。
【０１７４】
スフロンアミド（ｓｕｆｌｏｎａｍｉｄｅ）誘導体  スルホンアミド誘導体の非限定的な例には、アンブシド（ａｍｂｕｓｉｄｅ）、クロパミド、フロセミド、インダパミド、キネサゾン、トリパミド、及びキシパミド（ｘｉｐａｍｉｄｅ）が含まれる。
【０１７５】
ｇ．血管収縮剤
血管収縮剤は一般に、外科的処置時に起こる可能性のあるショック中に血圧を上昇させるために用いられる。抗低血圧剤とも呼ばれる血管収縮剤の非限定的な例には、メチル硫酸アメジニウム、アンギオテンシンアミド、ジメトフリン（ｄｉｍｅｔｏｆｒｉｎｅ）、ドパミン、エチフェルミン、エチレフリン、ジェペフリン（ｇｅｐｅｆｒｉｎｅ）、メタラミノール、ミドドリン、ノルエピネフリン、フォレドリン、及びシネフリンが含まれる。
【０１７６】
ｈ．鬱血性心不全の治療薬
鬱血性心不全を治療するための薬剤の非限定的な例には、抗アンギオテンシンＩＩ剤、後負荷／前負荷軽減処置、利尿剤、及び強心剤が含まれる。
【０１７７】
ｉ．後負荷／前負荷軽減
いくつかの実施形態において、アンギオテンシンアンタゴニストに耐性でない動物患者は、併用療法で処置することができる。そのような療法は、ヒドララジン（アプレソリン）とイソソルビドジニトレート（イソルジル（ｉｓｏｒｄｉｌ）、ソルビトレート（ｓｏｒｂｉｔｒａｔｅ）の投与を組み合わせることができる。
【０１７８】
ｉｉ．利尿剤
利尿剤の非限定的な例には、サイアザイド又はベンゾサイアジアザイド誘導体（たとえば、アルチアジド（ａｌｔｈｉａｚｉｄｅ）、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ブチアジド、クロロチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、シクロペンチアジド、エピチアジド、エチアジド、エチアジド、フェンキゾン（ｆｅｎｑｕｉｚｏｎｅ）、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチジド、メチルクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド（ｐａｒａｆｌｕｔｉｚｉｄｅ）、ポリチジド（ｐｏｌｙｔｈｉｚｉｄｅ）、テトラクロルメチアジド、トリクロルメチアジド）、有機水銀化合物（たとえば、クロルメロドリン、メラルリド、メルカンファミド（ｍｅｒｃａｍｐｈａｍｉｄｅ）、メルカプトメリンナトリウム、マーキュマリン酸（ｍｅｒｃｕｍａｌｌｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、マーキュマチリンドディウム（ｄｏｄｉｕｍ）、塩化第一水銀、マーサリル）、プテリジン（たとえば、フルテレン（ｆｕｒｔｅｒｅｎｅ）、トリアムテレン）、プリン（たとえば、アセフィリン、７−モルホリノメチルテオフィリン、パモブロム、プロテオブロミン、テオブロミン）、アルドステロンアンタゴニストを含むステロイド（たとえば、カンレノン、オレアンドレン、スピロノラクトン）、スルホンアミド誘導体（たとえば、アセタゾラミド、アンブシド（ａｍｂｕｓｉｄｅ）、アゾセミド、ブメタニド、ブタゾラミド（ｂｕｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）、クロルアミノフェンアミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジフェニルメタン−４，４’−ジスルホンアミド、ジスルファミド、エトキシゾラミド、フロセミド、インダパミド、メフルシド、メタゾルアミド、ピレタニド、キネサゾン、トラセミド、トリパミド、キシパミド（ｘｉｐａｍｉｄｅ））、ウラシル（たとえば、アミノメトラジン、アミソメタラジン）、カリウム保持性アンタゴニスト（たとえば、アミロライド、トリアムテレン）、又はアミノジン、アルブチン、クロラザニル、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドラカルバジン、イソソルビド、マンニトール、メトカルコン（ｍｅｔｏｃｈａｌｃｏｎｅ）、ムゾリミン、ペルヘキシリン、チクリナフェン、及び尿素などの他の利尿剤が含まれる。
【０１７９】
ｉｉｉ．強心剤
強心剤（ｃａｒｄｉｏｔｏｎｉｃ）とも呼ばれる強心剤（ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）の非限定的な例には、アセチルジギトキシン、２−アミノ−４−ピコリン、アムリノン、ベンフロジル（ｂｅｎｆｕｒｏｄｉｌ）、ヘミスクシネート、ブクラデシン、セルベロシン（ｃｅｒｂｅｒｏｓｉｎｅ）、カンフォタミド、コンバラトキシン、シマリン、デノパミン、デスラノシド、ジギタリン、ジギタリス、ジギトキシン、ジゴキシン、ドブタミン、ドパミン、ドペキサミン（ｄｏｐｅｘａｍｉｎｅ）、エノキシモン、エリトロフレイン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｈｌｅｉｎｅ）、フェナルコミン（ｆｅｎａｌｃｏｍｉｎｅ）、ギタリン、ジトキシン、グリコシアミン、ヘプタミノール、ヒドラスチニン、イボパミン、ラナトシド、メタミバム（ｍｅｔａｍｉｖａｍ）、ミルリノン、ネリフォリン、オレアンドリン、ウアバイン、オキシフェドリン、プレナルテロール、プロスシラリジン、レシブホゲニン、シラレン、シラレニン、ストロファンチン、スルマゾール（ｓｕｌｍａｚｏｌｅ）、テオブロミン、及びキサモテロール（ｘａｍｏｔｅｒｏｌ）が含まれる。
【０１８０】
特定の態様において、強心剤は、強心配糖体、ベータ−アドレナリンアゴニスト、又はホスホジエステラーゼ阻害剤である。強心配糖体の非限定的な例には、ジゴキシン（ラノキシン）、及びジギトキシン（クリストジギン（ｃｒｙｓｔｏｄｉｇｉｎ））が含まれる。β−アドレナリンアゴニストの非限定的な例には、アルブテロール、バンブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキシエテドリン（ｄｉｏｘｅｔｈｅｄｒｉｎｅ）、ドブタミン（ドブトレックス）、ドパミン（イントロピン（ｉｎｔｒｏｐｉｎ））、ドペキサミン（ｄｏｐｅｘａｍｉｎｅ）、エフェドリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、ホルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール（ｓｏｔｅｒｅｎｏｌ）、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール、及びキサモテロール（ｘａｍｏｔｅｒｏｌ）が含まれる。ホスホジエステラーゼ阻害剤の非限定的な例には、アムリノン（イノコール（ｉｎｏｃｏｒ））が含まれる。
【０１８１】
ｉ．抗狭心症剤
抗狭心症剤は、有機硝酸塩、カルシウムチャネル遮断剤、ベータ遮断剤、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１８２】
ニトロ血管拡張剤とも呼ばれる有機硝酸塩の非限定的な例には、ニトログリセリン（ニトロ−ビド、ニトロスタット）、イソソルビドジニトレート（イソルジル（ｉｓｏｒｄｉｌ）、ソルビトレート（ｓｏｒｂｉｔｒａｔｅ））、及び亜硝酸アミル（アスピロール（ａｓｐｉｒｏｌ）、バポロール（ｖａｐｏｒｏｌｅ））が含まれる。
【０１８３】
４．外科的治療因子
いくつかの態様において、第２の治療因子はある種の外科手術を含むことができ、たとえば予防、診断又は病期分類、治療、及び緩和手術が含まれる。外科手術、特に治療的外科手術は、他の療法、たとえば本発明、及び１種又は複数の他の薬剤と合わせて用いることができる。
【０１８４】
血管及び心血管疾患及び障害のためのそのような外科手術的治療因子は、当分野の技術者によく知られており、これに限定されるものではないが、有機体への手術の実施、心血管人工器官の提供、血管形成、冠動脈再潅流、カテーテルアブレーション、対象への植え込み型除細動器の提供、機械的循環補助、又はそれらの組み合わせを含むことができる。本発明に用いることのできる機械的循環補助の非限定的な例には、大動脈内バルーンカウンターパルセイション、左心室補助循環装置、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【０１８５】
Ｅ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために包含される。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において支障なく機能するように発明者によって見出された技法であり、したがってその実施のための好ましい様式を構成するものであるとみなされ得ることが、当分野の技術者によって理解されるべきである。しかしながら当分野の技術者は、本発明の開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、依然として同様又は類似の結果を得られることを理解すべきである。
【実施例１】
【０１８６】
材料及び方法
動的発現プロファイリングを、ベースライン及びβ−遮断剤（ｎ＝６）又はプラセボ（ｎ＝２）による処置の６カ月後に行ったＲＶ中隔心内膜心筋生検材料から抽出したＲＮＡにおいて、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）を有する８例の対象のインタクトなヒト心臓で行った。発現プロファイリングには、１２６２５遺伝子配列／チップを含むＡｆｆｍｅｔｒｉｘ（商標）Ｕ９５ａＧｅｎｅＣｈｉｐを用いた。β−遮断で処置した６例の対象はすべて表現型が改善した。プラセボ処置患者の１例は自然に改善したが、もう１例は表現型が低下した。表現型の改善を示した７例の対象において、遺伝子発現を機能別カテゴリにさらに分類し、増加又は減少を示している遺伝子の数を、各チップを読むために必要とされるスケールファクタの程度に合わせた標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアルゴリズムによって求めた。
【０１８７】
発現の減少を示す遺伝子カテゴリには、成長因子、細胞外マトリクスタンパク質、転写及び翻訳因子、シグナル伝達タンパク質、免疫学／血液学的因子、収縮性タンパク質の胎生形態、及びいくつかの未知遺伝子が含まれた。代謝遺伝子は、発現の減少より多くの増加を示した唯一の遺伝子カテゴリであった。これらの発見は、ＩＤＣ表現型の改善は肥大及びリモデリングに寄与する遺伝子の発現の優先的な減少によって特徴づけられるという結論を支持している。これらのデータは、リモデルされたヒト不全心臓がリモデリング工程を維持／推進するために遺伝子発現の活性化状態にあることを示唆している。
【０１８８】
データ表示の複合方法を考案し、それにより７例の改善した対象の４例、又は特定の類の分析ですべての対象で変化を示した遺伝子を同定した。遺伝子は機能別遺伝子カテゴリによって増加又は減少することが示された。表現型が改善したとき、合わせて１７の遺伝子が発現の増加を示し、１３６の発現が減少した。転写及び翻訳因子、シグナル伝達因子、成長因子、及び細胞外マトリクスタンパク質など、リモデリング工程に関与すると考えられる遺伝子が、発現の増加とは不釣合いに、最大数の発現の減少を示した。この一般法は、拡張型心筋症及び慢性心不全の病態生理学に関与する新規な遺伝子／機構の分子発見に有用なツールである可能性がある。
【０１８９】
心内膜心筋生検材料を、ベースライン特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）を有する８例の対象から、６〜７カ月の間に得た。これらの対象のうち、６例をβ−遮断剤カルベジロール及びメトプロロールで処置し、２例をプラセボで処置した。最初のグループの６例の対象はすべて左心室駆出分画（ＬＶＥＦ）に改善を示した。プラセボグループの２例の対象のうち、１例は左心室駆出分画に改善を示したが、他の１例はＬＶＥＦが悪化した。
【０１９０】
これらの対象から得た生検試料を、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）によって分析し、得られたｍＲＮＡをさらにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐによって分析した。理想的な実質ノイズ比を有する対象は低スケールファクタグループに分類し、定量を損なった実質ノイズを有する対象は、高スケールファクタグループに分類した。遺伝子発現パターンを、改善した表現型を示す７例の対象と悪化表現型を示す１例の対象との間でさらに比較した。低スケールグループの４例のうち、改善したＬＶＥＦを示す１例はプラセボ、１例はカルベジロール、１例はメトプロロールを受けており、プラセボで処置された４例目の対象はＬＶＥＦの低下を示した。高スケールグループの４例の対象のうち、３例はカルベジロールを受け、１例はメトプロロールを受けていた。
【実施例２】
【０１９１】
結果
低スケールグループの中で改善されたＬＶＥＦを示す３例の対象と悪化ＬＶＥＦを示す１例の対象の遺伝子発現パターンを比較した。このグループから得られた試料のうち、いくつかの遺伝子が疾患心内膜疾患組織と非疾患組織とで差異的に調節されることが見出された。これらの結果は表１に要約する。この結果は、同一遺伝子背景に重なり合った遺伝子発現、及び成功裡に治療された対象における疾患特異的表現型を測定する強力なツールとしての動的発現プロファイリングの利点を実証している。
【０１９２】
心筋遺伝子発現の一連の測定を、ベースライン及びβ−遮断剤（ｎ＝２、１カルベジロール及び１メトプロロール）又はプラセボ（ｎ＝２）による処置の６カ月後に、ＩＣＭを有する４例の対象で行った。ＲＮＡを心内膜心筋生検材料から抽出し、発現プロファイリングをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＵ９５ａ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐによって行った。β−遮断剤処置患者と１例のプラセボ処置患者の表現型が改善し、１例のプラセボ処置患者が低下した。改善した３例の対象のうち、ベースラインで対象間分析を行い、ベースラインと研究終了時の対象内比較と比べた。
【０１９３】
この結果は、進行した疾患と著しい疾患改善を比較した１個体内より同一表現型を有する対象間に遺伝子発現の大きな変動を示した。表現型の調節前及び調節後の一連のサンプリングは、分子発見の有用な方法であり、横断的アプローチの向上となることをこれらのデータは示唆している。
【０１９４】
データの収集分析には以下のフィルタが含まれる。（１）過半数が発現に変化を示す遺伝子（すなわち平均では（ＥＦ単位±ＳＤ）２４．１±９．７（ベースライン２１．９±９．２、６〜７カ月後のフォローアップ４６．０±８．１、対応のあるｔ検定  ｐ値＝．０００６））であるＬＶＥＦの改善を示す対象≧４／７）、又は（２）分析グループ内の対象の１００％が発現の変化を示す遺伝子（低スケールファクタチップ対Ｄｉｆｆ  Ｃａｌｌ又はＡｂｓ  Ｃａｌｌにより３／３、高スケールファクタチップＡｂｓ  Ｃａｌｌにより４／４）、及び（３）（１）又は（２）で定義されたとおり変化を示し、ＬＶＥＦの低下（２６から１５）を示した対象において変化又は逆方向の変化を示さない遺伝子である。これらの基準を適用することによって、左心室表現型が正常化するとき発現の減少を示す遺伝子の数が増加を示す数より７．７倍も大きく上回ることが認められる（減少１１６、増加１５）。重篤な不全、拡張ヒト左心室のベースラインデータ分析、及び非不全、正常化心室表現型から得たフォローアップデータの観点からデータを検討すると、不全心室はほぼ８倍の遺伝子が高い発現を示し、遺伝子発現の「活性化状態」にあることが理解できる。非不全、正常化左心室対不全ヒト左心室におけるこのような度合いの増加又は減少発現を示す遺伝子数の差異は、本発明者等又は他の研究者によって横断的設計によって行われた遺伝子チップ分析では認められず、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ分析を用いたとき、不全対非不全ヒト心室においてアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子との差異はそれぞれ１．１倍、及び１．７倍であった（Ｔａｎ等、２００２）。この相違は、表現型の調節により連続的遺伝子発現測定の改善された精度を浮き彫りにする。
【０１９５】
増加を示す遺伝子のカテゴリの調査は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）表現型が正常化したとき、細胞骨格、細胞外マトリクス、転写／翻訳因子、シグナル伝達、成長因子、アポトーシス／細胞周期、未分類及び未知機能遺伝子カテゴリが発現の減少を示したことを明らかにする。これらの遺伝子カテゴリはすべて重篤ＤＣＭのアップレギュレーションに対して著しい不均衡を示し、この発見は病的肥大を生じる分子プロファイルと矛盾しない。さらに、収縮性タンパク質カテゴリで、２種の胎生イソフォーム（骨格イソフォームトロポミオシン又はトロポニンＩ）は表現型が正常化したとき発現の減少を示し、動物モデルにおいて、及びおそらくヒトにおいても直接に収縮性機能の改善をもたらすミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の成体（α）イソフォームは表現型の正常化と共に発現の増加を示し、同時に悪化した左心室で発現の減少を示した。表現型の正常化と共に発現の量的増加を示した唯一の遺伝子カテゴリは代謝カテゴリであり、表現型の正常化と共に２種の遺伝子が発現の減少を示し、４種の遺伝子が発現の増加を示した。
【０１９６】
カテゴリ内の個々の遺伝子の変化に関して、同定されたものの一部はＤＣＭ表現型の発生に関連する、又は直接に関与することが知られている。それらの例には、不全ヒト左心室でダウンレギュレートされ、表現型の改善に密接に関連することが知られているα−ＭｙＨＣ（Ｌｏｗｅｓ等、２００２）、活性化形態で発現したとき、トランスジェニックマウスにおいて拡張型心筋症を引き起こす可能性があり（Ｎｉｃｏｌ等、２００１）、表現型の改善と共に発現の減少を示したＭＥＫ５、及び表現型の正常化と共に減少することが示された（ｎ＝６）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）産生又は調節遺伝子が含まれ、複数のＥＣＭ遺伝子はＤＣＭで発現が増加することが示されている（Ｓｐｉｎａｌｅ他、２０００）。
【０１９７】
さらにこの方法は、ＤＣＭ表現型に関連する可能性の高い新規な機構を検出する能力を有する。たとえば、Ｓｈａｋｅｒ型、遅延整流（Ｋｖ１．１）電位感受性カリウムチャネルベータサブユニット（β１、又はＫＣＮＡ１Ｂ、Ｌｅｉｃｈｅｒ等、１９９６）は表現型の正常化と共に増加し、表現型の進行を伴う患者で発現の減少を示した。このサブユニットは電位型カリウムチャネルα−サブユニットの機能を著しく変え、カリウムチャネル遅延整流は不全心臓で著しく無調節化されている（Ｎａｂａｕｅｒ及びＫａａｂ、１９９８）。Ｋｖ１．１が心臓で遺伝子的に破損しているとき、ＤＣＭを暗示する不整脈表現型、すなわち活動電位の延長、及び心室性頻拍が生じる（Ｌｏｎｄｏｎ等、１９９８）。したがって、ダウンレギュレートされたＫｖ１．１β１サブユニットの機能又は発現を増大する治療ストラテジーは、不全、拡張、及び肥大ヒト心臓における突然死を予防する論理的な治療アプローチであろう。他の例は表現型の正常化の間に発現が減少した特定の遺伝子に由来し、一部の例では関連するファミリーメンバーが不全ヒト心臓においてアップレギュレートされることが示されているが（Ｓｐｉｎａｌｅ等、２０００）、コラゲナーゼＩＶ（ＭＭＰ２とも呼ばれる）を除いて、この分析で同定されたいずれの特定の遺伝子も不全ヒト心臓での発現増加は示されてない。したがって、これらのいずれか又はすべては、病的リモデリング減少の治療アプローチとしての阻害ストラテジーの候補となるであろう。
【０１９８】
最後に、代謝遺伝子カテゴリが表現型正常化と共に発現の純増加を示す唯一のカテゴリであったという観察は、Ｎａ／グルコース共輸送体（ＳＧＬＵＴ１）、長鎖アシルＣｏＡシンターゼ、又はトランスケトラーゼ様タンパク質の活性又は遺伝子発現の治療的増強が、ＤＣＭ／心不全において治療有効性を有するであろうことを示唆する。
【０１９９】
本明細書に開示し、権利を請求するすべての組成物及び方法は、本発明の開示に照らして過度の実験を行うことなく製造され、実施され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び方法、並びに方法の段階又は順序に変更を加えられることは当分野の技術者に明らかであろう。より詳細には、同一又は類似の結果が達成される限り、本明細書に記載の薬剤を化学的及び生理学的に関連するある種の薬剤と置き換えてもよいことは明らかであろう。当分野の技術者に明らかであるそのような類似の置換及び変更はすべて、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念に含まれるものとみなされる。
【０２００】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０２０１】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書の記載を補足する典型的な手順又は他の詳細を提供する限り、参照により特に本明細書の一部とする。
（参考文献）
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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