(57)【要約】本発明は、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の新規な使用であって、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための医薬の製造のための使用に関する。【化１】2005526107.tif 000014
2005526107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための方法であって、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2005526107.tif 000011
の化合物の治療上有効な量を、その必要とする哺乳動物レシピエントに投与する工程を包含する方法。
【請求項２】
前記方法が、慢性拒絶反応を予防するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移植術が、同種異系移植片移植術である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、治療上有効な量のタクロリムスを投与する工程をさらに包含する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、治療上有効な量のタクロリムスを投与する工程をさらに包含する方法。
【請求項６】
前記方法が、経口投与である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化２】
2005526107.tif 000012
の化合物の使用であって、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項８】
前記医薬が、慢性拒絶反応を予防するためである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記移植術が、同種異系移植片移植術である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
タクロリムスを用いた前記医薬の製造のための、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
タクロリムスを用いた前記医薬の製造のための、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が、経口投与に用いるものである請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための薬学的組成物であって、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化３】
2005526107.tif 000013
の化合物の治療上有効な量を、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と混合して含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、慢性拒絶反応を予防するためである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記移植術が、同種異系移植片移植術である、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の薬学的組成物であって、治療上有効な量のタクロリムスを同時投与するためである、薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の薬学的組成物であって、治療上有効な量のタクロリムスを同時投与するためである、薬学的組成物。
【請求項１８】
経口投与のためである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の新規な使用方法であって、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための医薬の製造のための使用に関する。
【０００２】
【化１】
2005526107.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
肝臓、腎臓、肺および心臓の臓器移植は、末期段階の臓器疾患のための処置として現在通常的に実施されている。移植の結果は、組織適合試験、外科的技術およびさらに有効な免疫抑制処置における工夫の発展に伴い革新的に改善している。しかし、慢性拒絶反応のため、臓器移植が不可逆性の臓器疾患の完全な治療法とはなり得てない。
【０００４】
慢性拒絶反応は、進行性かつ不可逆性の移植片機能不全として顕在化するが、これは、臨床上の移植術における後発的な臓器移植片喪失の主な原因の１つである。
【０００５】
代表的な慢性拒絶反応の予後は、動脈硬化症様の変化、例えば、移植に伴う慢性血管炎（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ）、移植臓器急性血管疾患（ｇｒａｆｔ  ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、移植臓器動脈硬化症、移植冠疾患、血管狭窄、間質性線維症などである。この血管病変は、平滑筋細胞の遊走および増殖によって特徴付けられる。すなわち、これは、内膜の増殖および肥厚、平滑筋細胞肥大修復、ならびに最終的には、段階的な管腔の閉塞（脈管の再構築）をもたらす。特に、腎臓の場合、慢性拒絶反応は、慢性の同種異系移植片腎症とも呼ばれる。
【０００６】
慢性拒絶反応は、有効な処置も予防の方法も未知であることから、変えられないものでありかつ制御不能なものであると考えられる。従って、臨床上の臓器移植術において、慢性の同種異系移植片拒絶を予防および／または処置するのに有効な治療手段の必要性が依然として存在している。
【０００７】
本発明において用いられる化合物（Ｉ）または（ＩＩ）に関して、この化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、慢性関節リウマチ、免疫原性または非免疫原性の慢性炎症性疾患、ならびに癌の処置に有用であることが、米国特許第５，３０８，８６５号において公知である。慢性の炎症性疾患は、この特許において開示されているが、これは、血管の病変によって特徴付けられる移植された臓器における慢性拒絶反応とは異なる。それゆえ、移植された臓器における慢性の拒絶反応は開示されていない。
【０００８】
レフルノミドおよび関連の化合物は、血管傷害後の平滑筋細胞の過剰な増殖を軽減することにより、これらの化合物は、血管傷害後の血管狭窄および閉塞性動脈硬化症の予防および処置に有用であることが欧州特許第０６６５０１３号において公知である。しかし、本発明の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、この特許出願においては開示されていない。さらに、本発明における慢性拒絶反応は、宿主免疫および非免疫応答の結果として、移植された臓器の血管全体において発見されているが、この特許出願において記載された疾患は、損傷の修復のために傷害された部分でみられる。従って、これらの疾患は、発生学の点でお互いに全く異なる。
【０００９】
一般的なレフルノミド化合物は、移植された臓器において慢性拒絶反応を制御または逆転する活性を有することが、米国特許第５，６２４，９４６号および米国特許第５，６８８，８２４号において、公知である。しかし、本発明の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、これらの特許では開示されていない。
【００１０】
従って、この化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、移植された臓器または組織において慢性拒絶反応を予防および／または処置するための活性を有するということは決して公知ではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、この化合物（Ｉ）または（ＩＩ）が、哺乳動物レシピエントにおいて、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するために有効であることを見出した。
【００１２】
従って、本発明は、移植された臓器または組織において、慢性拒絶反応を予防および／または処置するため方法であって、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の治療上有効な量を、その必要な哺乳動物レシピエントに投与する工程を包含する新規な方法を提供する。
【００１３】
さらに、この方法は、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の新規な使用であって、移植された臓器または組織において、慢性拒絶反応を予防および／または処置するための医薬の製造のための使用を提供する。
【００１４】
なおさらに、本発明は、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための方法であって、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の治療上有効な量を、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と混合して含む新規な薬学的組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
慢性拒絶反応を予防することができる治療手段とは、慢性拒絶反応の機能的兆候または組織学的兆候の発現を予防する治療手段であって、慢性拒絶反応が発現する前には、長期間または短期間の投与を開始する事になる。
【００１６】
本発明において用いられる「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患を「制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）」および「逆転（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）」を包含する両方の処置を意味する。そして、慢性拒絶反応を制御できる処置とは、それぞれ、慢性拒絶反応の機能的または組織学的な兆候が観察された後に開始された場合、疾患の経過の進行を遅らせる処置である。さらに、慢性拒絶を逆転させることができる処置とは、（それぞれ）慢性拒絶反応の機能的な兆候または組織学的な兆候が出現した後に開始された場合、疾患の経過を逆転させて、機能的な所見および組織学的な所見を正常に近く復帰させる処置である。
【００１７】
本発明の化合物（Ｉ）、すなわち、（２Ｚ）−２−シアノ−３−ヒドロキシ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−２−ヘプテン−６−インアミド、または化合物（ＩＩ）、すなわち、５−（３−ブチニル）−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−イソキサゾールカルボキサミドに関しては、米国特許第５，３０８，８６５号の説明、実施例１４またはそれに類似する方式に従って生成することが可能である。そして配座異性体および立体異性体で存在していてもよいことが理解され、そしてこのような配座異性体および異性体も本発明の範囲内に包含さる。そしてこの化合物（Ｉ）は、別の互変異性体型であってもよい。例えば、化合物（Ｉ）は、そのエノール型（Ｉ）またはケト型（ＩＩＩ）のいずれでもありえる、すなわち、以下のスキームで示されるような、２−シアノ−３−オキソ−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−６−ヘプチナミドであってもよく、そしてこのような互変異性体型はまた、本発明の範囲内に包含される。
【００１８】
【化２】
2005526107.tif 000004
【００１９】
化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、溶媒和物であってもよく、これは、本発明の範囲内に含まれる。この溶媒和物は好ましくは、水和物およびエタノラートを含む。
【００２０】
本発明の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、薬学的調製物の形態で、例えば、固体、半固体または液体型で、用いられてもよいが、この形態は、活性成分として化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を、経口投与、非経口投与、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与または動脈内投与、外部投与、例えば、局所投与、経腸投与、直腸内投与、経膣投与、吸入投与、眼科投与、経鼻投与または舌下投与に適切な有機または無機のキャリアまたは賦形剤と混合して含む。この活性な成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、点眼剤、坐剤、溶液（例えば、生理食塩水）、エマルジョン、懸濁液（例えば、オリーブオイル）、軟膏、エアロゾルスプレー、クリーム、皮膚絆創膏、パッチおよび使用に適切な任意の他の形態のための、通常非毒性の、薬学的に受容可能なキャリアと配合されてもよい。用いることが可能なキャリアは、固体、半固体、または液体型で、水、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、コーンスターチ、ケラチン、コロイダルシリカ、カタクリ粉（ジャガイモデンプン）、尿素および調製物を製造するのにおける使用のために適切な他のキャリアであり、そしてさらに補助剤、安定化剤、増粘剤および着色剤および香料が用いられてもよい。活性な目的の化合物は、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するために十分な有効量で薬学的組成物中に含まれる。
【００２１】
本発明において処置され得る哺乳動物としては、ウシ、ウマなどのような家畜の哺乳動物、イヌ、ネコ、ラットなどのような愛玩動物、およびヒト、好ましくはヒトが挙げられる。
【００２２】
臓器または組織は、ドナーから同じ個体（自家移植片）、同系種（同系移植片）、同じ種（同種異系移植片）、または異なる種（異種移植片）のレシピエントに移植されてもよい。このような移植された臓器または組織は、肝臓、腎臓、心臓、肺、合わせて心肺、気管、脾臓、膵臓（全体または一部、例えば、ランゲルハンス島）、皮膚、小腸、角膜、骨髄、四肢、筋肉、神経、椎間板、筋芽細胞もしくは軟骨、または前述のいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２３】
慢性拒絶反応の予防および／または処置における使用のため、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、単独で、あるいは１つ以上の他の免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリンＡ、タクロリムス、ラパマイシン、アザリオプリン、コルチコステロイド、抗リンパ球グロブリンまたはＯＫＴ３；特にサイクロスポリンＡまたはタクロリムス、と組み合わせて、同時に、別個に、または連続して投与されてもよい。さらに、この用途のための化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、上記の、１つ以上の他の免疫抑制剤と薬学的組成物中で混合した形態で投与されてもよい。このような併用（組み合わせ）または混合の治療手段は、本発明の範囲内に包含される。
【００２４】
治療上有効な量の化合物（Ｉ）または（ＩＩ）の投薬量は、異なっており、そしてまた処置されるべき各々の個々の患者の年齢および状態に依存しているが、活性成分の本体あたり約１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは５ｍｇ〜５ｇそしてより好ましくは、１０ｍｇ〜２ｇの１日用量が、一般に、この疾患を予防および／または処置するために与えられ、そして約０．５〜１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、２ｇおよび３ｇの平均単回用量が一般に投与される。慢性拒絶反応を予防または処置するための、ヒトにおける投与のための１日用量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。併用または混合の治療手段において、例えば、タクロリムスは、約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの１日用量でヒトに投与され得る。
【００２５】
慢性拒絶反応を予防するために化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を投与するための期間は、種、ならびに予防されるべき状態の性質および重篤度に依存して変化するが、化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は通常、慢性拒絶反応が開始しない限り、ヒトに短期間投与されても、長期間投与されても、すなわち、移植後、１週間〜１年間またはそれ以後まで投与されてもよい。
【００２６】
化合物（Ｉ）または（ＩＩ）において慢性拒絶反応を予防および処置における可能性のあるメカニズムは、抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体の減少、その後のＴＧＦβの抑制の維持に関連している。
【００２７】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定的に解釈されないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００２８】
（慢性拒絶反応の予防）
（１）方法
秤量２５０〜３５０ｇの近交系の雄性Ｌｅｗｉｓラット（ＬＥＷ）（ＲＴ１Ｉ）を、腎臓移植術のレシピエントとして用いた。秤量２５０〜３５０ｇの近交系の雄性ＬＥＷあるいはＦｉｓｈｅｒ（Ｆ３４４）（ＲＴ１ＩＶＩ）を、それぞれ、同系移植片および同種異系移植片のドナーラットとして用いた。ＦｉｓｈｅｒおよびＬｅｅの変法を用いて腎臓移植術を実施した。［Ｆｉｓｈｅｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ，５８：９０４〜９１４，１９６５］。腎臓移植の生存を、レシピエントラット生存の期間として測定した。血漿クレアチニン、尿タンパクについて、そしてドナーの糸球体基底膜タンパク質（ＧＢＭ）に対する抗体力価の測定のために、血液および２４時間の尿サンプルを、週に１回採取した。腎臓移植片を移植後９０日で回収して、組織学および逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析に供した。化合物（Ｉ）を、１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量で、移植後、０日から９日まで毎日、レシピエントのラットに経口投与した。コントロールの同系移植および同種異系移植無処置群のレシピエントには、移植後、薬物を与えなかった。
【００２９】
９０日間、週１回レシピエントの血漿クレアチニンおよび尿タンパクを測定することによって、レシピエントの腎機能を確認した。血液および尿のサンプルを、上記の腎臓移植片を有するレシピエントから採取した。血漿クレアチニンをＳｉｇｍａ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔによって測定し、尿タンパクをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって測定した。
【００３０】
組織学的解析のために移植後９０日で、腎臓移植片組織をレシピエントから回収した。移植片サンプルを、１０％のＮＢＦ中に固定して、引き続き処理して、次いで直ちに、ＰａｒａＰｌａｓｔＴＭパラフィン包埋媒体中に包埋した。サンプルを３μｍに切片化して、予め暖め、脱パラフィン処理して、再水和して、引き続き以下の４種の染色法にて染色した：ヘマトキシリンおよびエオシン、Ｐｅｒ−Ｉｏｄｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ’ｓ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｅｌａｓｔｉｃ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、およびＰｅｒ−Ｉｏｄｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ。病理切片を、２名の組織学者によって盲検的に評価させて、移植病理学についてのＢａｎｆｆの基準の変法に基づいて半定量的にスコア付けした。［Ｓｏｌｅｚら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，４４：４１１〜４２２，１９９３］。
【００３１】
ＴＧＦβは、慢性の同種異系移植片拒絶を生じるために重要な役割を果たすと考えられている。ＴＧＦβ遺伝子発現のため、移植術後９０日でレシピエントから回収された腎臓移植片組織をＲＴ−ＰＣＲに供した。ＴＲＩＺＯＬにより、移植された腎臓組織から総ＲＮＡを抽出した。げっ歯類のＧＡＰＤＨに対して標準化した、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システムおよびＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの試薬を用いて、Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈらによって記載される方法で［Ｏｖｅｒｂｅｒｇｈら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１１：３０５，１９９９］、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。ラットのＴＧＦβのプライマーおよびプローブは、以下であった：５’−ＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＴ−（センス）、５’−ＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＧＡＣＡＡＣＴＣ−（アンチセンス）、およびＣＧＣＣＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＧＡＣＧＴ−ＴＡＭＲＡ。げっ歯類のＧＡＰＤＨプライマーおよびプローブは、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍによって設計された。
【００３２】
同系移植、無処置群の同種異系移植、ならびに化合物（Ｉ）を１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量を移植術後２０日、４０日および９０日付近から投与した同種異系移植において、Ｆ３４４腎臓を有するＬＥＷレシピエント由来の血漿におけるＦ３４４ラット糸球体基底膜タンパク質に対する特定の抗体をＥＬＩＳＡアッセイを用いることによって測定した。
【００３３】
（２）結果
同系移植群は、９０日より長く生存した。対照的に、コントロールの同種異系移植群ではわずか４０％が移植後９０日を越えて生存した。化合物（Ｉ）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたラットの同種異系移植群、および化合物（Ｉ）を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたラットの同種移植群では、移植後９０日を越えて生存したのは、それぞれ、８０％および１００％であった。（表１）。
【００３４】
【表１】
2005526107.tif 000005
【００３５】
化合物（Ｉ）の処置がない場合、レシピエントの血漿クレアチニンは、７週から増加し、尿タンパクは５週から増加した。化合物（Ｉ）を１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量で用いて処置したレシピエントの両方とも、未処置のラットおよび同系移植片レシピエントと同様に、観察期間中正常なクレアチニンを維持し、尿タンパクは検出されなかった。（図１〜４）
【００３６】
同種異系移植無処置群を、進行性の組織学的慢性拒絶反応の発現について観察した。化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇで処置したレシピエントからの腎臓移植片のＢａｎｆｆスコアにおける近似的な累積減少は以下のとおりである：同種異系移植片無処置群と比べた場合、それぞれ、間質性の炎症５０％ vs ６７％、尿細管炎１００％ vs １００％、脈管炎３３％ vs ５０％、メサンギウム融解８３％ vs １００％、糸球体炎７５％ vs ３８％、尿細管萎縮４０％ vs ８５％、糸球体硬化症８３％ vs １００％、線維内膜過形成６３％ vs ４４％、ならびに移植糸球体症７９％vs １００％であった。本評価においては腎臓移植病理学のＢａｎｆｆ基準に基づいて、（−）：等級０−正常、（＋）：等級１−軽度、（＋＋）：等級２−中度、および（＋＋＋）：等級３−重度を、慢性拒絶反応の診断評価のために用いた。（表２）
【００３７】
【表２】
2005526107.tif 000006
【００３８】
同系移植片コントロールと比較して、ＴＧＦβのｍＲＮＡは、同種異系移植無処置群において有意に発現が上昇した。化合物（Ｉ）処置群は、同種異系移植無処置群と比べて、移植後９０日のＴＧＦβ遺伝子発現を用量依存性的に阻害した（図５）。
【００３９】
同系移植片コントロール群において、血漿抗ＧＢＭは、検出限界以下であった。同種異系移植無処置群では、血漿抗 GBM は移植後２０日付近で検出可能になり、その後、増大した。化合物（Ｉ）の１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの用量での処置群では、ドナーＧＢＭに対する抗体産生の低下の傾向を示した（図６〜９）。
【実施例２】
【００４０】
（タクロリムスを併用した慢性拒絶反応の予防）
（１）方法
実施例１に記載されたラットおよび腎臓の移植方法を用いた。化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で、そしてタクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で、移植術後９０日間、毎日、レシピエントのラットに経口投与した。同系移植片、同種異系移植無処置群、およびタクロリムス１ｍｇ／ｋｇのみで９０日間単独処置した同種異系移植をコントロール群として用いた。
【００４１】
血液および尿のサンプルを、９０日間、週に１回実施例１に記載の腎臓移植片を有するレシピエントから、それらのレシピエントの血漿クレアチニンおよび尿タンパクを測定するために採取した。血漿クレアチニンをＳｉｇｍａ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔによって測定し、尿タンパクをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって測定した。
【００４２】
実施例１に記載の方法を用いて、慢性同種異系移植片拒絶反応の組織学的変化を解析した。病理切片を、２名の組織学者によって盲検的に評価させて、移植病理学についてのＢａｎｆｆの基準の変法に基づいて半定量的にスコア付けした。
【００４３】
同系移植片、同種異系移植無処置群、タクロリムス  １ｍｇ/ｋｇ単独処置群、ならびに本タクロリムスに加え化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で併用した群において、移植術後２０日、４０日および９０日付近でのＦ３４４ラット糸球体基底膜タンパク質に対する特定の抗体を、実施例１に記載した方法を用いることによって測定した。
【００４４】
（２）結果
同系移植群は、９０日より長く生存した。対照的に、同種異系移植群無処置群ではわずか４０％が、移植後９０日を超えて生存した。タクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたラットの同種異系移植群、そして化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量とタクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で併用して投与されたラットの同種異系移植群では、両方とも、移植術後９０日、１００％が生存した（表３）。
【００４５】
【表３】
2005526107.tif 000007
【００４６】
同種異系移植無処置群においては、血漿クレアチニンは、７週までに増大して、尿タンパクは５週までに増加が見られた。化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量でタクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で併用して処置したレシピエントは、同種異系移植無処置群と比較して血漿クレアチニンおよび尿タンパクの両方のレベルの低下を示した（図１０、１１）。
【００４７】
同種異系移植無処置群を、進行性の組織学的慢性拒絶反応の発症について観察した。化合物（Ｉ）３ｍｇ／ｋｇおよびタクロリムスの１ｍｇ／ｋｇを併用投与処置した群の腎臓移植片のＢａｎｆｆスコアにおける大体の累積減少は同種異系移植無処置群と比較すると以下のとおりである：間質性の炎症５０％、尿細管炎８５％、脈管炎９２％、メサンギウム融解７５％、糸球体炎３８％、尿細管萎縮５５％、糸球体硬化症５８％、線維内膜過形成６３％、および移植糸球体症５７％。そして、腎臓移植病理学のＢａｎｆｆ基準に基づいて、（−）、（＋）、（＋＋）、および（＋＋＋）を、表２と同様に定義する。（表４）
【００４８】
【表４】
2005526107.tif 000008
【００４９】
同系移植片コントロール群において、血漿抗ＧＢＭは、検出限界以下であった。同種異系移植無処置群では、移植後２０日までに検出可能になり、その後、増加した。化合物（Ｉ）の３ｍｇ／ｋｇとタクロリムスを１ｍｇ／ｋｇとを併用した群は、同系移植群と同様、ドナーＧＢＭに対する抗体を検出できなかった（図１２）。
【実施例３】
【００５０】
（慢性拒絶反応の処置）
（１）方法
実施例１に記載されたラットおよび腎臓の移植方法を用いた。血漿クレアチニンの増加または明確な尿タンパク増加のいずれかが明らかになった時点から化合物（Ｉ）を２０ｍｇ/ｋｇの用量で３週間にわたって投薬した。同系移植群、および同種異系移植無処置群をコントロールとして用いた。血液および尿のサンプルを、週に１回、移植腎臓を有するレシピエントから、採取した。血漿クレアチニンをＳｉｇｍａ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔによって測定し、尿タンパクをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって測定した。
【００５１】
実施例１に記載の方法を用いて、化合物（Ｉ）の救済処置下で、慢性同種移植拒絶反応の組織学的変化を解析した。病理切片を、２名の組織学者によって盲検的に評価させて、移植病理学についてのＢａｎｆｆの基準の変法に基づいて半定量的にスコア付けした。
【００５２】
（２）結果
同種異系移植無処置群においては、血漿クレアチニンは、７週から増加し、尿タンパクは５週から増加した。化合物（Ｉ）による救済処置は、レシピエントの腎臓機能の即効的な改善を示さなかったが、長期的には、血漿クレアチニンおよび尿タンパクの両方が正常なレベルになる傾向であった（図１３、１４）。
【００５３】
同種異系移植無処置群での進行性の組織学的慢性拒絶反応の経過について観察した。慢性の同種異系移植における慢性拒絶反応の進行中に３週間にわたって、化合物（Ｉ）２０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した群腎臓移植片のＢａｎｆｆスコアにおける大体の累積減少は以下のとおりである：同種異系移植無処置群と比べた場合、それぞれ、間質性の炎症５０％、尿細管炎７０％、脈管炎９２％、メサンギウム融解３３％、糸球体炎３８％、尿細管萎縮４２％、糸球体硬化症５３％、および移植糸球体症８９％であった。腎臓移植病理学のＢａｎｆｆ基準に基づいて、（−）、（＋）、（＋＋）、および（＋＋＋）を、表２と同じく定義する。（表５）
【００５４】
【表５】
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【実施例４】
【００５５】
（タクロリムスの短期間処置を併用した慢性拒絶反応の処置）
（１）方法
実施例１に記載されたラットおよび腎臓の移植方法を用いた。タクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で、移植術後０日〜９日、そして化合物（Ｉ）を１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇの用量で、移植術後２８日〜６０日まで、レシピエントのラットに経口投与した。本実験では、急性の拒絶反応を回避しながら、ヒトにおける慢性拒絶反応と同様の機能的変化および組織学的変化を生じるＦ３４４移植腎臓に対する慢性の拒絶反応を遅らせるために、ＬＥＷレシピエントに、移植術後１０日間、１ｍｇ／ｋｇ／日のタクロリムスを短期間経口投与した。同系移植群、同種移植無処置群、およびタクロリムス１ｍｇ／ｋｇ１０日間単独で処置した同種異系移植群をコントロール群として用いた。血液および尿のサンプルを、週に１回、採取した。血漿クレアチニンをＳｉｇｍａ  Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔによって測定し、尿タンパクをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって測定した。
【００５６】
（２）結果
同系移植群は、９０日より長く生存した。対照的に、コントロールの同種異系移植無処置群ではわずか４０％が、移植後９０日まで生存した。移植術後、タクロリムスを１ｍｇ／ｋｇの用量で単独で１０日間投与されたラットの同種異系移植片は、１００％の同種異系移植生存率を示した。移植術後、タクロリムスの短期間用量および化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇで２８日〜６０日まで処置したレシピエントについての個々の同種異系移植群の生存率は、動物の症例数の増加により得られるが、現在は確定していない（表６）。
【００５７】
【表６】
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【００５８】
レシピエントの腎臓機能を、９０日間、週１回その血漿クレアチニンおよび尿タンパクを測定することによって求めた。血漿クレアチニンは、移植術後、同種異系移植無処置群では７週後、短期間低用量のタクロリムスで処置した同種異系移植群では８週後に急速に増大したが、同系移植群では正常な範囲内に維持されている。化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇで２８日〜６０日まで投与した群では、この試験期間全体にわたって、血漿クレアチニンレベルは、１．５ｍｇ／ｄＬの正常値未満に維持された。化合物（Ｉ）１５ｍｇ／ｋｇ／日で処置した群は、移植術後３週〜９週で開始して、血漿クレアチニンの増加を示したが、これはその後、正常なレベルに戻って維持された（図１５、１６）。同種異系移植無処置群ではその４０％および短期間低用量タクロリムスで処置した同種異系移植群ではその１００％が、移植術後９０日より長く生存して、尿タンパクは、それぞれ移植術後２週および５週から増加が認められ、同系移植群と比べた場合、その後、劇的に増大した。化合物（Ｉ）の１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ処置の両方とも２８日〜６０日まで、尿タンパクの増加を軽減した（図１７、１８）。
【００５９】
化合物（Ｉ）または（ＩＩ）は、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置する活性を有することが証明された。そのため、本発明は、移植された臓器または組織における慢性拒絶反応を予防および／または処置するための有用な免疫抑制剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇの用量での処置後の血漿クレアチニン濃度を示す（実施例１）。
【図２】化合物（Ｉ）２０ｍｇ／ｋｇの用量での処置後の血漿クレアチニン濃度を示す（実施例１）。
【図３】化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇの用量での処置後の尿タンパクの量を示す（実施例１）。
【図４】化合物（Ｉ）２０ｍｇ／ｋｇの用量での処置後の尿タンパクの量を示す（実施例１）。
【図５】化合物（Ｉ）を用いた処置におけるＴＧＦ遺伝子発現の阻害を示す（実施例１）。
【図６】同系の移植術におけるＧＢＭに対する抗体の産生を示す（実施例１）。
【図７】同種の移植術におけるＧＢＭに対する抗体の産生を示す（実施例１）。
【図８】化合物（Ｉ）１０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した、同種移植術におけるＧＢＭに対する抗体の産生を示す（実施例１）。
【図９】化合物（Ｉ）２０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した、同種移植術におけるＧＢＭに対する抗体の産生を示す（実施例１）。
【図１０】化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で、タクロリムス１ｍｇ／ｋｇの用量と併用して処置した、移植術における血漿クレアチニン濃度を示す（実施例２）。
【図１１】化合物（Ｉ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で、タクロリムス１ｍｇ／ｋｇの用量と併用して処置した、移植術における尿タンパクの量を示す（実施例２）。
【図１２】化合物（Ｉ）を、タクロリムスと併用して処置した、同種の移植術におけるＧＢＭに対する抗体の産生を示す（実施例２）。
【図１３】化合物（Ｉ）の２０ｍｇ／ｋｇの用量の救済を用いて処置した移植術における血漿クレアチニン濃度を示す（実施例３）。
【図１４】化合物（Ｉ）の２０ｍｇ／ｋｇの用量の救済を用いて処置した移植術における尿タンパクの量を示す（実施例３）。
【図１５】化合物（Ｉ）の１０ｍｇ／ｋｇの用量と、短期間のタクロリムスの処置とを用いて処置した移植術における血漿クレアチニン濃度を示す（実施例４）。
【図１６】化合物（Ｉ）の１５ｍｇ／ｋｇの用量と、短期間のタクロリムスの処置とを用いて処置した移植術における血漿クレアチニン濃度を示す（実施例４）。
【図１７】化合物（Ｉ）の１０ｍｇ／ｋｇの用量と、短期間のタクロリムスの処置とを用いて処置した移植術における尿タンパクの量を示す（実施例４）。
【図１８】化合物（Ｉ）の１５ｍｇ／ｋｇの用量と、短期間のタクロリムスの処置とを用いて処置した移植術における尿タンパクの量を示す（実施例４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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