(57)【要約】本発明は酵素等の反応生成物誘導剤の存在を指示する反応生成物の検出方法に関する。本方法はエピトープに対する特異抗体を必要とせずに検出ストラテジーの基礎となるエピトープの認識を可能にする。本方法では、直接又は間接標識したモジュラードメインとビオチン化形態のコグネイトペプチドリガンドを測定可能な相互作用の基礎として使用する。ペプチドリガンドは例えばＳｅｒもしくはＴｈｒ残基のリン酸化又はＣ末端Ｖａｌを越えるアミノ酸配列の延長を介する修飾により遮蔽することができる。遮蔽した残基は標識モジュラードメインの結合に必須であるため、残基の少なくとも１個の遮蔽は、結合を阻止する。遮蔽した残基を適当な酵素で処理（例えばリン酸化残基をホスファターゼ酵素で処理又は延長残基をプロテアーゼ酵素で処理）すると、ペプチドは標識モジュラードメインに結合して測定可能な複合体を形成することが可能な元の非遮蔽リガンドに変換される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接又は間接標識したモジュラードメインと複合体を形成することができない修飾リガンドを、前記標識モジュラードメインと複合体を形成することができるリガンドに変換する複合体誘導剤の試料中の存在を適切な条件下に検出する方法であって、ａ）前記修飾リガンドと前記標識モジュラードメインと前記試料を混合して混合物を形成する段階と、およびｂ）前記混合物を分析し、前記試料中の複合体誘導剤の存在を示す複合体を検出する段階を含み、前記検出条件は、前記複合体誘導剤が存在する場合のみ前記修飾リガンドを変換するものである、前記方法。
【請求項２】
前記リガンドが、
【化１】
2005502334.tif 000006
（式中、各ＸＸは同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ２はＰｈｅ又はＴｙｒである）から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが、
【化２】
2005502334.tif 000007
（式中、各ＸＸは同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、各ＸＸ３は同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸である）から構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識モジュラードメインが標識キレートで標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識キレートがＥｕ３＋キレートである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識モジュラードメインが標識抗体で標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標識抗体がＥｕ３＋抗体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識モジュラードメインが標識コロイド粒子で標識されている請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識モジュラードメインが標識ＰＤＺドメイン、標識ＳＨ２ドメイン、標識ＳＨ３ドメイン及び標識ＰＴＢドメインから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体誘導剤がホスファターゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ及びデアセチラーゼから構成される群の酵素から選択される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
数十年来、免疫学的方法は広範な医学及び生物学用途で検出ストラテジーの基礎となっている。酵素免疫吸着アッセイＥＬＩＳＡの各種変形が臨床診断試験と製薬産業の薬剤発見プログラムに利用されている。モノクローナル抗体の出現とその後の研究により組換え及び表示技術からモノクローナル抗体ライブラリーレパートリーが開発され（Ｇａｏ，Ｃ．ら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（１１）：６０２５−６０３０）、多数の科学分野でこれらの選択的高親和性タンパク質の利用が広がっている。抗体技術の革新はアッセイ開発へのこれらの試薬の利用を拡大すると見込まれる一方、細胞シグナリング系を含むもの等の天然に存在する多様なタンパク質／ペプチド相互作用の固有の特異性と利用可能性に基づく代替アプローチも考えられる。多数のシグナル伝達ネットワーク内に存在する酵素、受容体及びアダプタータンパク質（例えばＧｒｂ２やＰＳＤ９５）は多くの場合にはペプチド−タンパク質会合を介して分子相互作用の媒介に関与する１個以上のモジュラードメイン（例えばＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢ及びＰＤＺドメイン）を含むことが多い（Ｐａｗｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４（９）：（２０００）ｐｐ．１０２７−１０４７）。これらのドメイン−リガンド組合せのあるものは、アッセイ検出系において抗体−抗原対と同じように機能する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要約）
本発明は、酵素等の反応生成物誘導剤の存在を指示する反応生成物の検出方法に関する。本方法はエピトープに対する特異抗体を必要とせずに検出ストラテジーの基礎となるエピトープの認識を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本方法では、直接又は間接標識したモジュラードメインとビオチン化形態のコグネイトペプチドリガンドを測定可能な相互作用の基礎として使用する。ペプチドリガンドは例えばＳｅｒもしくはＴｈｒ残基のリン酸化又はＣ末端Ｖａｌを越えるアミノ酸配列の延長による修飾により遮蔽することができる。遮蔽した残基は標識モジュラードメインの結合に必須であるため、この残基の少なくとも１個を遮蔽すると、結合できなくなる。遮蔽した残基を適当な酵素で処理（例えばリン酸化残基をホスファターゼ酵素で処理又は延長残基をプロテアーゼ酵素で処理）すると、ペプチドは標識モジュラードメインに結合して測定可能な複合体を形成することが可能な元の非遮蔽リガンドに変換される。
【０００５】
本発明は直接又は間接標識したモジュラードメインと複合体を形成することができない修飾リガンドを、標識モジュラードメインと複合体を形成することが可能なリガンドに変換する複合体誘導剤の存在を試料中で適切な条件下に検出する方法であって、ａ）修飾リガンドと標識モジュラードメインと試料を混合して混合物を形成する段階と、ｂ）混合物を分析し、試料中の複合体誘導剤の存在を示す複合体を検出する段階を含み、検出条件は複合体誘導剤が存在する場合のみ修飾リガンドを変換するものである、前記方法である。
【０００６】
前記方法の１分類では、前記リガンドは、
【０００７】
【化１】
2005502334.tif 000002
（式中、各ＸＸは同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ２はＰｈｅ又はＴｙｒである）から構成される群から選択される。
【０００８】
前記方法の１亜分類では、前記標識リガンドは、
【０００９】
【化２】
2005502334.tif 000003
（式中、各ＸＸは同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、ＸＸ１はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸であり、各ＸＸ３は同一又は異なり、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから構成される群から選択されるアミノ酸である）から構成される群から選択される。
【００１０】
前記亜分類の１グループでは、標識モジュラードメインは標識キレート（例えばＥｕ３＋キレート）、標識抗体（例えばＥｕ３＋抗体）又は標識コロイド粒子で標識されている。
【００１１】
前記グループのサブグループでは、前記標識モジュラードメインは標識ＰＤＺドメイン、標識ＳＨ２ドメイン、標識ＳＨ３ドメイン及び標識ＰＴＢドメインから構成される群から選択される。
【００１２】
前記サブグループの１区分では、前記複合体誘導剤はホスファターゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、ヒドロラーゼ及びデアセチラーゼから構成される群の酵素から選択される。
【００１３】
本発明は免疫検出ストラテジーの代用として酵素アッセイ用に開発されたモジュラードメインのリガンドに基づく時間分解蛍光共鳴エネルギー移動検出法である。ペプチド酵素基質はコンセンサス配列Ｓｅｒ−ＸＸ１−Ｖａｌ−ＯＨをもつ遮蔽ドメインリガンドである。リガンドの結合コンセンサス配列の必須残基を例えばＳｅｒのリン酸化又はＣ末端延長により修飾すると、結合不能モジュラードメインペプチドとなる。対応する酵素で処理すると、結合エピトープは露出し、生成物配列は例えば標識キレート（例えばＥｕ３＋キレート）、標識抗体（例えばＥｕ３＋抗体）又は標識コロイド粒子で標識されたモジュラードメインにより特異的に認識される。その後、ペプチドのＮ末端でビオチンに結合するアロフィコシアニンで標識したストレプトアビジンの添加により複合体が形成され、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動により検出される。
【００１４】
略語
ＡＬＰＨＡ  増幅発光近接均一系アッセイ
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＣＰＢ  カルボキシペプチダーゼＢ
ＤＥＬＦＩＡ  解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＧＳＴ−ＰＤＺ  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合ＰＤＺドメイン
ＧＳＴ−ＰＤＺ１  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合ＰＤＺ１ドメイン
ＨＴＲＦ  均一系時間分解蛍光
ＩＴＣ  イソチオシアネート
ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
ＰＢＳＴ  ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝食塩水
ＰＢＳＴＢ  ｔｗｅｅｎ−２０とＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水
ＰＣＩ  タンパク質カルボキシペプチダーゼ阻害剤
ＰＰ２Ａ１  タンパク質ホスファターゼ２Ａ１
ＳＨ２  ｓｒｃホモロジー２
ＳＨ３  ｓｒｃホモロジー３
ＰＴＢ  ホスホチロシン結合
ＰＤＺ  ＰＳＤ９５／Ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ／ＺＯ−１
ＰＳＤ９５  シナプス後デンシティ９５
ＴＲ−ＦＲＥＴ  時間分解蛍光共鳴エネルギー移動
［ＸＬ６６５］ＳＡ  ＸＬ６６５ストレプトアビジン
ＸＬ６６５  修飾アロフィコシアニン。
【００１５】
「複合体誘導剤」とは標識モジュラードメインに結合したリガンドである複合体の形成を誘導する酵素（例えばブタカルボキシペプチダーゼＢ、タンパク質ホスファターゼ２Ａ１）である。
【００１６】
「複合体」とは標識モジュラードメインに結合したリガンドである。
【００１７】
「リガンド」とは複合体誘導剤の作用下に標識モジュラードメインと結合して複合体を形成し、複合体誘導剤の非作用下では標識モジュラードメインと結合しない物質である。
【００１８】
「修飾リガンド」とは標識モジュラードメインと結合しないリガンドである。
【００１９】
「モジュラードメイン」とはペプチド−タンパク質結合又は相互作用を含むペプチド−タンパク質会合を介して分子相互作用を媒介する働きをもつ配列（例えばＳＨ２、ＳＨ３、ＰＴＢ及びＰＤＺ）である（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．８６  ｐｐ．３４１−３４３（１９９６）及びＰａｗｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４：１０２７−１０４７（２０００）参照）。
【００２０】
「標識モジュラードメイン」とはリガンドと標識モジュラードメインにより形成される複合体の検出を可能にするモジュラードメインである。
【００２１】
「適切な検出条件」とは標識モジュラードメインとの複合体を形成することができない修飾リガンドから標識モジュラードメインと複合体を形成することが可能なリガンドへの変換を複合体誘導剤の不在下では促進しない条件である。
【００２２】
ビオチン−ペプチドはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）又はＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。ペプチドはＤＭＳＯに〜１ｍＭ溶液まで溶解した（濃度はεＴｙｒ＝１２８０ｍｏｌ−１Ｌｃｍ−１を使用して２８０ｎｍの紫外線吸光度により測定した）。ブタカルボキシペプチダーゼＢとジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。タンパク質ホスファターゼ２Ａ１（ＰＰ２Ａ１）、カンタリジン酸及びオカダ酸はＢｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。Ａｓｐ−ＮはＲｏｃｈｅ（ドイツ）から購入した。ストレプトアビジン−ＸＬ６６５（モル比：１．９ＸＬ６６５／ストレプトアビジン）はＰａｃｋａｒｄ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）から購入した。
【００２３】
アッセイは９６穴黒色低結合Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ２プレート（Ｄｙｎｅｘ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）で実施した。アッセイプレートは励起波長３３７ｎｍでＶｉｃｔｏｒ２Ｖマイクロプレートアナラザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ（Ｔｕｒｋｕ，フィンランド））を使用して読取った。蛍光発光はＦＲＥＴシグナルについては６６５ｎｍ、Ｅｕ３＋キレートについては６１５ｎｍで測定し、蛍光強度比ＦＩ６６５ｎｍ／ＦＩ６１５ｎｍとして結果を表した。
【００２４】
モジュラードメインは標識キレート、抗体又はコロイド粒子を使用して標識することができる。標識キレートは例えばＥｕ３＋キレートとすることができ、標識抗体は例えばＥｕ３＋抗体とすることができ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃから入手できる。標識コロイド粒子は例えばＰａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから市販され、一般に使用されている読取り法であるＡＬＰＨＡ検出技術として知られる粒子とすることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｃｋａｒｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／２９８．ａｓｐ）。
【００２５】
モジュラードメインリガンドはリガンド中にＳｅｒ、ＴｈｒもしくはＴｙｒが存在する場合にはそのリン酸化（例えばＳｅｒをリン酸化してｐＳｅｒを形成）又はＣ末端を越える配列延長により遮蔽することができる。
【００２６】
Ｅｕ３＋キレートによるＧＳＴ−ＰＤＺの標識
ＰＳＤ−９５のＰＤＺモジュール３（Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：（１９９７）ｐｐ．７３−７７）に対応するＧＳＴ−ＰＤＺドメイン融合タンパク質は標準クローニング及び発現法により獲得した。要約すると、ＰＳＤ−９５（アミノ酸Ｌｅｕ３４３〜Ａｌａ４４５を含む）コーディング配列をラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）からＰＣＲ増幅し、細菌発現ベクターｐＧＥＸ２ＫＴ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサブクローニングし、標準細菌発現法（ＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ  Ｇｅｎｅ  ６７：（１９９８）ｐｐ．３１−４０）によりＧＳＴ−ＰＤＺを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、製造業者のプロトコールに従って還元グルタチオンアガロースビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で精製した。ＧＳＴ−ＰＤＺを製造業者により記載されているようにＥｕ３＋キレートＩＴＣ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ）で標識した。要約すると、ＧＳＴ−ＰＤＺをＰＢＳ中約３ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、タンパク質溶液５０μｌ（１６０μｇ，４．３ｎｍｏｌ）を凍結乾燥Ｅｕ３＋キレートＩＴＣ（１００μｇ，１４０ｎｍｏｌ）に加え、反応を１６時間４℃で進行させた。反応溶液をＮｉｃｋカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離し、標識タンパク質を含む画分（ＰＢＳ溶液４００μｌ）をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に加えた。標識タンパク質をＰＢＳ溶液４００μｌ画分から溶出させた。タンパク質を含む画分をプールした。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により定量し、タンパク質に結合したＥｕ３＋キレートをＥｕ３＋のＤＥＬＦＩＡ増強溶液とＥｕ３＋標準（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ）により定量した。最終タンパク質濃度は０．３２ｍｇ／ｍｌ（９ｍＭ，５倍モル比Ｅｕ３＋／タンパク質）であった。
【００２７】
検出条件
ビオチン−ペプチド濃度を一定にして［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺと［Ｘｌ６６５］ＳＡの量を同時に滴定することにより各酵素系に適したシグナル対バックグラウンド比を与える検出条件を決定した。ＸＬ６６５は６６５ｎｍで発光し、減衰時間の遅い修飾アロフィコシアニンアクセプターフルオロフォアである。１０％ターンオーバーを想定して合計ビオチン−ペプチド濃度を４０ｎＭ、即ち各酵素系でビオチン−生成物ペプチドを４ｎＭ及びビオチン−基質ペプチドを３６ｎＭに設定して検出条件を最適化した。５×ＨＴＲＦ混合物１０μｌをビオチン−ペプチド溶液４０μｌに加えた。濃度は最終アッセイ容量５０μｌ中の濃度である。ペプチドと検出試薬の最適インキュベーション時間は１時間であることが判明した。
【００２８】
検出のダイナミックレンジと検出下限値を決定するために、合計ペプチド量を４０ｎＭで一定に維持しながらビオチン−生成物ペプチドの量を増加した。上記と同様に、５×ＨＴＲＦ混合物１０μｌをビオチン−ペプチド溶液４０μｌに加えた。濃度は最終アッセイ容量５０μｌ中の濃度である。前項に記載したように最適であると判断した検出試薬濃度を使用してシグナルを測定した。
【００２９】
Ｅｕ３＋抗体によるＧＳＴ−ＰＤＺ１の間接標識
ＧＳＴ−ＰＤＺドメインのサブクローニングと発現。ウサギＮＨＥＲＦのＰＤＺモジュール１に対応するＧＳＴ−ＰＤＺドメイン融合タンパク質を標準クローニング及び発現法により獲得した。要約すると、以下のプライマー：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣ（配列番号２６）及び５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＧＴＣＴＣＧＧＧＧＴＣ（配列番号２７）を使用してラットＮＨＥＲＦのＰＤＺ１のＤＮＡ配列を含むプラスミドからＰＤＺ１  ＮＨＥＲＦ（アミノ酸Ｌｅｕ１１〜Ｌｅｕ９９を含む）コーディング配列をＰＣＲ増幅した。ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１制限部位を使用して細菌発現ベクターｐＧＥＸ−２ＴＫ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にＤＮＡをサブクローニングした。標準細菌発現法（ＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ  Ｇｅｎｅ  ６７：（１９８８）ｐｐ．３１−４０）を使用してＧＳＴ−ＰＤＺを大腸菌ＧＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、製造業者のプロトコールに従って還元グルタチオンアガロースビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で精製した。
【００３０】
アッセイ条件。Ｅｕ３＋によるＰＤＺ１ドメインの間接標識を使用してＮＨＥＲＦのＰＤＺ１ドメインと数種のペプチドリガンドの結合も検討した。Ｈｅｍｍｉｌａ，Ｉ．Ｗ．Ｓ．（１９９７）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２（９）；３７３−３８１及びＫｏｌｂら，（１９９８）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ３；３３３−３４２に記載されているこのアプローチで本発明者らはＥｕ３＋キレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ）で標識した抗ＧＳＴに結合した結合した先述のＧＳＴ−ＰＤＺを利用した。Ｅｕ３＋標識抗ＧＳＴを使用すると、ＰＤＺ１ドメイン自体を構造的に変化させずに（このドメイン内の遊離Ｌｙｓと直接結合せずに）ＧＳＴ−ＰＤＺ１を標識することができた。ペプチドとの結合を試験するために、１０ｎＭペプチドと１０ｎＭ  ＧＳＴ−ＰＤＺドメインを１時間（ＰＢＳＴＢ２０μＬ）インキュベートした。インキュベーション後に、アッセイの標識成分から構成される検出混合物を加えた。ＧＳＴ−融合タンパク質と抗ＧＳＴ抗体の相互作用は１：１であるので１０ｎＭ抗ＧＳＴ（Ｅｕ３＋）を使用し、ストレプトアビジンは四量体であるので２．５ｎＭ［ＸＬ６６５］ＳＡを加えた（ＰＢＳＴＢ２０μＬ）。最終混合物を室温でインキュベートし、Ｖｉｃｔｏｒ２で読取った。ＮＨＥＲＦ  ＧＳＴ−ＰＤＺ１の間接標識の結果、被験潜在ペプチドリガンドに結合する標識タンパク質が生じた。
【００３１】
ＡＬＰＨＡによるＧＳＴ−ＰＤＺ１−ペプチドリガンド結合の測定
ＡＬＰＨＡ技術（Ｇｌｉｃｋｍａｎら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ７（１）：３−１０参照）も潜在ペプチドリガンドとＮＨＥＲＦ  ＧＳＴ−ＰＤＺ１の結合を検出するための手段として検討した。（一重項酸素を遊離する）ドナービーズと（一重項酸素の存在下で蛍光発光する）アクセプタービーズの近接に基づくこのアッセイは先述のＧＳＴ−ＰＤＺ１を使用した。ビオチン化ペプチドとＧＳＴ−ＰＤＺ１の相互作用を探索するために、（ビオチン化ペプチドを捕獲するために）ストレプトアビジンドナービーズを使用し、（ＧＳＴ−ＰＤＺ１を捕獲するために）抗ＧＳＴ標識アクセプタービーズを使用した。ペプチドとＧＳＴ−ＰＤＺ１の間に相互作用が生じたならば、アクセプタービーズは蛍光発光し、ＡＬＰＨＡｑｕｅｓｔリーダーで読取られる。ペプチドの結合を試験するために、１０ｎＭビオチン−ペプチドと１０ｎＭ  ＧＳＴ−ＰＤＺ１を１時間（ＰＢＳＴＢ）インキュベートした。ストレプトアビジンドナービーズの最適濃度を決定するために、抗ＧＳＴアクセプタービーズ濃度を一定（２０μｇ／ｍＬ）（５μＬ）にしてストレプトアビジンドナービーズの量（ＰＢＳＴＢ中５μＬ）を滴定した。ドナー及びアクセプタービーズを含む検出混合物にペプチド／ＧＳＴ−ＰＤＺ１混合物１０μＬを加えた。プレートを密封し、暗所にて室温で３時間インキュベート後にＡＬＰＨＡｑｕｅｓｔリーダーで読取った。ＡＬＰＨＡ検出試薬を使用すると、ＧＳＴ−ＰＤＺ１の間接標識から（潜在ペプチドリガンドとＧＳＴ−ＰＤＺ１の結合を示す）結果を再現するアッセイが可能になり、シグナル／バックグラウンド比が上昇した。
【実施例１】
【００３２】
カルボキシペプチダーゼＢアッセイ
初期過程として、ビオチン−ＨＲＲＳＡＲＹＬＥＳＳＶＲ−ＯＨ（配列番号７）（１０ｍＭリン酸，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０，０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳＴＢ）中１００ｎＭ）２０μｌをＣＰＢ（ＰＢＳＴＢで２倍に希釈）２０μｌと混合し、ＰＢＳＴＢ中ＰＣＩ（１μＭ）、［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺ（６．２５ｎＭ）及び［ＸＬ６６５］ＳＡ（６２．５ｎＭ）の５×ＴＲ−ＦＲＥＴ混合物１０μｌを６０分間２５℃で加えて反応をクエンチし、読取った。
【００３３】
阻害実験として、阻害剤２μｌをＣＰＢ（ＰＢＳＴＢ中２００ｐＭ）２０μｌに加え、ペプチド基質（ＰＢＳＴＢ中１００ｎＭ）２０μｌを加えて反応を開始した。３０分後に上記のような５×ＴＲ−ＦＲＥＴクエンチング／検出混合物１０μｌを加えて反応をクエンチした。基質と検出混合物を含み、酵素を含まない反応混合物からバックグラウンドを測定した。
【実施例２】
【００３４】
タンパク質ホスファターゼアッセイ
初期過程として、ビオチン−ＨＲＲＡＡＲＹＬＥｐＳＡＶ−ＯＨ（配列番号４）（リン酸緩衝液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１０％グリセロール，１４ｍＭβ−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中１００ｎＭ）２０μｌをＰＰ２Ａ１（リン酸緩衝液で２倍に希釈）２０μｌと混合し、反応溶液を３２℃でインキュベートした。各種時点でＰＢＳＴＢ中カタリジン酸（５μＭ）、［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺ（１．６ｎＭ）及び［ＸＬ６６５］ＳＡ（１５．６ｎＭ）の５×ＴＲ−ＦＲＥＴ混合物１０μｌを６０分間２５℃で加えて４０μｌアリコートをクエンチし、読取った。
【００３５】
阻害実験として、阻害剤２μｌをＰＰ２Ａ１（リン酸緩衝液中３０ｐＭ）２０μｌに加え、ペプチド基質（リン酸緩衝液中１００ｎＭ）２０μｌを加えて反応を開始した。６０分後に上記のような５×ＴＲ−ＦＲＥＴクエンチング／検出混合物１０μｌを加えて反応をクエンチした。基質と検出混合物を含み、酵素を含まない反応混合物からバックグラウンドを測定した。
【００３６】
表１は実施例１及び２で得られた結果（被験酵素、酵素濃度、酵素加水分解速度、ＩＣ５０値及びアッセイ条件（例えば酵素希釈又は「トレーサー」の直接読取り）を含む）を示す。加水分解速度に基づき、ターゲット酵素の濃度を推定する目的で直線域に含まれると予想される測定値が得られる時点を特定することができる。
【００３７】
【表１】
2005502334.tif 000004
【実施例３】
【００３８】
Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼアッセイ
初期過程として、ビオチン−ＨＲＲＳＡＲＹＬＥＳＳＶＤＡＥＦ−ＮＨ２（配列番号５）（ＰＢＳＴ中２０μＭ）２０μｌをＡｓｐ−Ｎ（ＰＢＳＴで２倍に希釈）２０μｌと混合し、反応溶液を３２℃でインキュベートした。各種時点でアリコートをＰＢＳＴで２００倍に希釈し、５×検出混合物（ＰＢＳＴ中［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺ（６．２５ｎＭ）及び［ＸＬ６６５］ＳＡ（１５．６ｎＭ））１０μｌを希釈溶液４０μｌに加え、６０分間２５℃でインキュベートし、測定した。
【００３９】
トレーサー実験として、ＰＢＳＴ中ビオチン−ＨＲＲＳＡＲＹＬＥＳＳＶＤＡＥＦ−ＮＨ２（１００ｎＭ）及びＨＲＲＳＡＲＹＬＡＡＳＶＤＡＥＦ−ＮＨ２（配列番号６）（２０μＭ）の混合物２０μｌをＡｓｐ−Ｎ（ＰＢＳＴ中４０ｎＭ）２０μｌに加え、反応溶液を３２℃でインキュベートした。各種時点で５×クエンチング／検出混合物（ＰＢＳＴ中５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺ（６．３ｎＭ）及び［ＸＬ６６５］ＳＡ（１５．６ｎＭ））１０μｌを６０分間２５℃で加えて４０μｌアリコートをクエンチし、測定した。
【実施例４】
【００４０】
ＨＩＶプロテアーゼアッセイ
ビオチン−ＨＲＲＳＡＲＹＬＤＴＶＬＥＥＭＳ−ＯＨ（配列番号２４）とＥｕ３＋標識ＧＳＴ抗体と実施例１と同様の手順を使用してアッセイを実施し、ＨＩＶプロテアーゼの有無を確認した。
【００４１】
遮蔽モジュラードメインリガンドの設計
均一系フォーマットで酵素活性を測定するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用は蛍光標識レポーター分子による酵素生成物の特異的認識に依存する。本発明はプロセシングを受けると蛍光標識ＰＤＺドメインレポータータンパク質に結合する特定酵素のペプチド基質を含む。ブタカルボキシペプチダーゼＢ及びＡｓｐ−Ｎの２種のプロテアーゼとＳｅｒ／ＴｈｒホスファターゼＰＰ２Ａ１を試験した。
【００４２】
リガンドのＰＤＺ結合コンセンサス配列（−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｘ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号１及び２））中の必須残基を例えばＣ末端延長（ブタカルボキシペプチダーゼＢ及びＡｓｐ−Ｎアッセイ）と必須Ｓｅｒのリン酸化（ＰＰ２Ａ１アッセイ）により修飾し、結合不能ＰＤＺドメインペプチドである酵素基質とした。表２はペプチド配列対を示す。
【００４３】
【表２】
2005502334.tif 000005
【００４４】
ＰＤＺリガンドに特定Ｃ末端残基が必要であることは新規プロテアーゼアッセイの設計に利用できる。ＨＲＲＳＡＲＹＬＥＳＳＶ−ＯＨのＣ末端にアルギニンを加えると、カルボキシペプチダーゼのペプチド基質となる（Ｆｏｌｋ，Ｊ．Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１９（１９７０）ｐ．５０４）。単一付加アミノ酸残基を越えてアミノ酸配列を延長することにより、各種エンドプロテアーゼの基質を作製することができる。Ａｓｐ−ＮはＰ１’位でＡｓｐに特異性を示す。他のプロテアーゼ（例えばＨＩＶプロテアーゼ）は切断可能結合の周囲のＰ１−Ｐ１’の疎水性残基、Ｐ２’位のＧｌｕ又はＧｌｎ及びＰ２位の小残基に特異的であり（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）ｐｐ．１−６０）、いずれもプロＰＤＺリガンドとして潜在的に適合可能である。
【００４５】
ＰＳＤ９５ＰＤＺ−３との結合に必須のペプチドリガンドの第２の残基はＨＲＲＳＡＲＹＬＥＳＳＶ−ＯＨのＸ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ（配列番号２）結合モチーフのＳｅｒである。この残基を例えばリン酸化により遮蔽し、ペプチドがＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼにより脱リン酸化されるまでＰＤＺ結合を妨害する。このホスファターゼ検出スキームでは、結合に非必須のリガンド残基Ｓｅｒ−１をアラニンに置換し、ホスホセリンペプチド（ＨＲＲＡＡＲＹＬＥｐＳＡＶ−ＯＨ）の合成を簡単にした。
【００４６】
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動検出試薬
本発明で使用したＴＲ−ＦＲＥＴシステムは長寿命Ｅｕ３＋キレートエネルギードナーと修飾アロフィコシアニンエネルギーアクセプター［ＸＬ６６５］ＳＡの間に生じるＦＲＥＴに基づく（Ｋｏｌｂら，ＤＤＴ  ｖｏｌ．３  ｎｏ．７  Ｊｕｌｙ  １９９８  ｐｐ．３３３−３４２）。限定するものではないが、ドナー−アクセプターＦＲＥＴシグナリング対としてはＥｕ３＋−トリビピリジンクリプテート／アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）、Ｔｂ３＋−クリプテート／ローダミン、及びＥＤＡＮＳ（５−（２’−アミノエチル）アミノナフチレンスルホン酸）／ＤＡＢＣＹＬ（４−（４’−ジメチルアミノベンジンアゾ）安息香酸）が挙げられる。時間分解蛍光測定はＨｅｍｍｉｌａら，ＤＤＴ  ｖｏｌ．２，ｎｏ．９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９７  ｐｐ．３７３−３８１により全般的に記載されている。
【００４７】
４ｎＭ  ＰＤＺペプチドリガンド（反応生成物）と３６ｎＭ「遮蔽」形ペプチドリガンド（反応基質）の存在下に［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺと［ＸＬ６６５］ＳＡの濃度を変えてＦＲＥＴシグナルを測定することによりまず検出ストラテジーの実施可能性を試験した。ペプチド濃度は４０μｌアッセイ容量中５０ｎＭ総ビオチン化ペプチドの１０％基質ターンオーバーを想定して設計した１０％生成物ペプチドと９０％基質ペプチドを含む混合物に相当する。次に５×ＴＲ−ＦＲＥＴ検出混合物１０μｌを加えてＦＲＥＴシグナリング複合体を形成させた。３種の異なる上記酵素反応に対応する３種の基質／生成物系を試験した。その結果、ペプチド対の各々にシグナル対バックグラウンドが最大（少なくとも１０倍）となる［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺと［ＸＬ６６５］ＳＡ濃度の最適組合せがあることが分かった。例えば、ホスファターゼ反応に対応するビオチン−ＨＲＲＡＡＲＹＬＥｐＳＡＶ−ＯＨ／ビオチン−ＨＲＲＡＡＲＹＬＥＳＡＶ−ＯＨでは、［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺと［ＸＬ６６５］ＳＡの最適濃度は夫々０．３ｎＭと３．１ｎＭであることが分かった。同様の結果が得られるように各ペプチド基質／生成物組合せを設計して同様の実験を実施した（データは示さず）。その後、各酵素反応を試験する際にこれらの最適濃度の［Ｅｕ３＋］ＧＳＴ−ＰＤＺと［ＸＬ６６５］ＳＡを使用した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502334.tif 000036
【国際調査報告】
2005502334.tif 000037