(57)【要約】１又は２種以上の蛋白質を細胞へ移行させる方法を開示する。移行する蛋白質は、融合蛋白質の形態であり、トランスシグナリング及び／又は接着機能を有する蛋白質又はペプチドのためにエンコードする少なくとも１つのドメインを含んでいる。融合蛋白質は、細胞膜に一体化された脂質化蛋白質に結合することにより、細胞に移される。本発明のさらなる態様において、シスシグナリング能力を有し、また細胞自体の表面上のレセプターと結合する能力を有する融合蛋白質を作製する方法を提供する。ＧＰＩ又はホーミング要素と、共刺激体又は阻害性ドメインとを含む融合蛋白質もまた、細胞表面に直接移されることができる。本発明の方法に基づいて蛋白質移行が行われた細胞を使用する方法についても開示する。これは、癌ワクチンの使用、癌又は自己免疫疾患の治療のための使用、及び共刺激体の閾値レベルを決定する際の使用を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を細胞へ移行させる方法であって、
細胞の表面を、脂質化蛋白質である第１蛋白質でコーティングし、
前記細胞を、脂質化蛋白質に対して親和性の第１ドメインと、前記細胞の表面でレセプターに結合可能な第２ドメインとを有する融合蛋白質である第２蛋白質と接触させることを含んでいる、方法。
【請求項２】
細胞はＴ細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔ細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ細胞は腫瘍浸潤リンパ球である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞は腫瘍抗原に対して特異性を有する請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞はウイルス性ペプチド抗原に対して特異性を有する請求項２に記載の方法。
【請求項８】
細胞は、リンフォカイン活性キラー細胞、樹状細胞、単球、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、角化細胞、内皮細胞、島細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉細胞及び神経細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞は幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞は、造血性幹細胞、間葉幹細胞及び胚幹細胞からなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
融合蛋白質の第２ドメインは、細胞を活性化する能力を有する共刺激体ドメインを含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
共刺激体ドメインは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定性抗原、Ｂ７ｈ、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０及びＣＤ２４からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
融合蛋白質の第２ドメインは、ペプチド抗原と錯体を形成する主要組織適合性複合蛋白質を含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
融合蛋白質の第２ドメインは、抗原提示細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、幹細胞、角化細胞、内皮細胞、島細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉細胞及び神経細胞からなる群から選択される細胞を活性化させる能力を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
融合蛋白質の第２ドメインは、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＮＣＥ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群から選択されるドメインを含んでいる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
融合蛋白質の第２ドメインは、細胞を阻害する能力を有するインヒビタードメインを含んでいる請求項１の方法。
【請求項１７】
細胞は幹細胞である請求項１６の方法。
【請求項１８】
インヒビタードメインは、Ｔ細胞のアポトーシスを阻害又は誘導する能力を有している請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
インヒビタードメインは、Ｆａｓリガンド及びＴＲＡＩＬからなる群から選択され、細胞はＴ細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
融合蛋白質の第２ドメインは、ポリヒスチジンタグを含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
融合蛋白質は、キメラＦｃ融合蛋白質を含んでおり、脂質化蛋白質はパルミチン酸化蛋白質Ａである請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
脂質化蛋白質は、パルミチン酸化蛋白質Ａ及びキレート脂質ＮＴＡ−ＤＴＤＡからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
表面をコーティングする前に、細胞を精製するステップをさらに含んでいる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
２以上の第２の蛋白質が細胞に移行される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
患者の疾病を治療する方法であって、
複数の細胞の表面を、脂質化蛋白質である第１蛋白質でコーティングし、
前記複数の細胞を、前記第１蛋白質に対して親和性の第１ドメインと、前記細胞の表面でレセプターに結合可能な第２ドメインとを有し、前記疾病の治療に特異的である融合蛋白質である第２蛋白質と接触させ、
コーティングされた細胞を患者に有効量投与する、ことを含んでいる方法。
【請求項２６】
疾病は、癌、ウイルス感染症、自己免疫疾患及び同種免疫疾患からなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞は患者へ注入される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
患者に投与する前に、細胞を生体外で培養することをさらに含んでいる請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
細胞はリンフォカイン活性キラー細胞であり、患者は癌患者である請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
細胞は腫瘍浸潤リンパ球であり、患者は癌患者である請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
コーティングと接触は、生体内で行われる請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
コーティングと接触は、生体外で行われる請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１の方法によって作製された細胞。
【請求項３４】
細胞はＴ細胞である請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】
Ｔ細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３７】
Ｔ細胞は腫瘍浸潤リンパ球である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３８】
Ｔ細胞は腫瘍抗原に対して特異性を有する請求項３４に記載の細胞。
【請求項３９】
Ｔ細胞はウイルス性ペプチド抗原に対して特異性を有する請求項３４に記載の細胞。
【請求項４０】
細胞は、リンフォカイン活性キラー細胞、樹状細胞、単球、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、角化細胞、内皮細胞、島細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉細胞及び神経細胞からなる群から選択される請求項３３に記載の細胞。
【請求項４１】
細胞は幹細胞である請求項３３に記載の細胞。
【請求項４２】
幹細胞は、造血性幹細胞、間葉幹細胞及び胚幹細胞からなる群から選択される請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
融合蛋白質の第２ドメインは、細胞を活性化する能力を有する共刺激体ドメインを含んでいる請求項３３に記載の細胞。
【請求項４４】
共刺激体ドメインは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７ｈ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ４８、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定性抗原、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０及びＣＤ２４からなる群から選択される請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
融合蛋白質の第２ドメインは、ペプチド抗原と錯体を形成する主要組織適合性複合蛋白質を含んでいる請求項３３に記載の細胞。
【請求項４６】
融合蛋白質の第２ドメインは、抗原提示細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、幹細胞、角化細胞、内皮細胞、島細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、筋肉細胞及び神経細胞からなる群から選択される請求項３３に記載の細胞。
【請求項４７】
融合蛋白質の第２ドメインは、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＮＣＥ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦからなる群から選択される請求項３３に記載の細胞。
【請求項４８】
融合蛋白質の第２ドメインは、細胞を阻害する能力を有するインヒビタードメインを含んでいる請求項１の細胞。
【請求項４９】
細胞は幹細胞である請求項３３の細胞。
【請求項５０】
インヒビタードメインは、Ｔ細胞のアポトーシスを阻害又は誘導する能力を有している請求項４８に記載の細胞。
【請求項５１】
インヒビタードメインは、Ｆａｓリガンド及びＴＲＡＩＬからなる群から選択され、細胞はＴ細胞である請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
融合蛋白質の第２ドメインは、ポリヒスチジンタグを含んでいる請求項３３に記載の細胞。
【請求項５３】
融合蛋白質は、キメラＦｃ融合蛋白質を含んでおり、脂質化蛋白質はパルミチン酸化蛋白質Ａである請求項３３に記載の細胞。
【請求項５４】
脂質化蛋白質は、パルミチン酸化蛋白質Ａ及びキレート脂質ＮＴＡ−ＤＴＤＡからなる群から選択される請求項３３に記載の細胞。
【請求項５５】
細胞の表面をコーティングする前に、細胞は精製される請求項３３に記載の細胞。
【請求項５６】
２以上の第２の蛋白質が細胞に移行される請求項３３に記載の細胞。
【請求項５７】
患者の疾病の治療に用いられる薬学的組成物であって、適当な担体の中に、請求項１の方法によって作製された細胞を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項５８】
疾病は、癌、ウイルス感染症、自己免疫疾患及び同種免疫疾患からなる群から選択される請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
細胞は、リンフォカイン活性キラー細胞であり、患者は癌患者である請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
細胞は腫瘍浸潤リンパ球であり、患者は癌患者である請求項５７に記載の組成物。
【請求項６１】
蛋白質を細胞へ移行させる方法であって、
細胞の表面を、第１ドメインと第２ドメインを有する融合蛋白質でコーティングすることを含んでおり、
第１ドメインは細胞の膜の中に結合されることができ、第２ドメインは細胞の表面でレセプターに結合する能力を有する、方法。
【請求項６２】
第１ドメインはグリコホスホリピドを含んでいる請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
グリコホスホリピドはグリコシル・ホスファチジルイノシトールである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
蛋白質を患者の細胞へ移行させる方法であって、
第１ドメインと第２ドメインを有する融合蛋白質を患者に注入することを含んでおり、
第１ドメインは細胞に付着可能なホーミング要素を含み、第２ドメインは細胞の表面でレセプターに結合する能力を有する、方法。
【請求項６５】
ホーミング要素はｓｃＦｖである請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ホーミング要素はサイトカインである請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
細胞の表面でレセプターを結合する能力を有する膜蛋白質をエンコードするｃＤＮＡ配列を含んでいる細胞。
【請求項６８】
細胞の表面でリガンドと結合する能力を有する膜レセプターをエンコードするｃＤＮＡ配列を含んでいる細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この仕事は、少なくとも一部分は、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスの承認番号R01 CA-74958R01及びAI-31044による資金援助を受けている。
【０００２】
＜関連出願の記載＞
この出願は、２００１年９月２０日に出願された出願番号第０９／９５７,０５６号の一部継続出願である。前記出願は、２０００年１月３日に出願された第０９／４７６,８２８号(米国特許第６,３１６,２５６号として特許発行)の分割出願である。
【０００３】
本発明は、１又は２種以上の蛋白質を細胞に運ぶための新規な方法に関する。他の適用に加え、その方法論(methodology)は、癌及び自己免疫疾患の治療に有用であり、共刺激体(costimulator)の間での共刺激体活性化閾値及び協同的相互作用(cooperative interactions)の決定に有用である。本発明はまた、細胞表面上のレセプターをトリガする能力を有する外因性蛋白質がペイントされた細胞に関する。このような自己刺激性細胞(auto-stimulating cells)を作製する方法及び該細胞を薬剤として使用する方法についても開示する。
【背景技術】
【０００４】
＜発明の背景＞
例えば細胞傷害性Ｔリンパ球を含むＴ細胞は、腫瘍、ウイルス感染及び他の感染病に対する有効なヒト免疫応答の重要な要素である。Ｔ細胞は、新生物又はウイルスに感染した細胞を破壊する。これは、標的細胞の表面のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される抗原ペプチドを認識させることによって行われる。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞表面の抗原レセプター及び共刺激体レセプターを通じてコーディネートされるシグナリングに依存する。逆説的に言えば、抗原提示は、同時に共刺激(costimulation)が無い場合、クローン・アネルギーを生じさせる可能性がある[Gimmi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6586(1993)を参照]。
【０００５】
例えば樹状細胞の如き抗原提示細胞(ＡＰＣ)は、それら表面のＭＨＣと、それらの類似レセプター(cognate receptors)を特異的Ｔ細胞上でトリガすることのできる共刺激分子により、Ｔ細胞を活性化させるように作用する。これにより、両方の重要なシグナルが細胞に供給される[Watts st al., Curr. Opin. Immunol., 11:286(1999); Freedman et al., Cell. Immunol., 137:429(1991)を参照]。このように、Ｔ細胞調節に関して一般的に理解されているＡＰＣを中心とする考え方に基づくと、Ｔ細胞の活性化は、一般的には、細胞間の「トランス(trans)」シグナリングにより、プロフェッショナルＡＰＣの制御を受けているものと考えられる。
【０００６】
多くのメカニズムにより、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞は、免疫監視から免れる。そのメカニズムの１つは、これらの細胞では、Ｔ細胞活性化に必要な共刺激分子が欠乏していることである。腫瘍細胞及び他の抗原提示細胞の表面に発現する共刺激分子について予測される「能動的(active)」な免疫療法が開発されてきた。その他に、「受動的(passive)」な免疫療法があり、これは、腫瘍床から腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)を、又は癌患者の血液からＴ細胞を回収するステップ、生体外(ex vivo)で多数のこれらＴ細胞をリンフォカインで増殖するステップ、それらを患者に注入するステップを含んでいる。
【０００７】
治療用Ｔ細胞の臨床的適用が制限される主要因は、前記細胞が患者へ注入されると活性を喪失することである。これは、一般的には、可溶性サイトカイン及び表面共刺激体の如きＴ細胞活性体が剥奪される結果であると考えられている。共刺激は、Ｔ細胞の初期活性化だけでなく、活性化後のエフェクター能力の維持にも必要であり、「エフェクター共刺激(effector costimulation)」と称される。治療用Ｔ細胞を十分に活性化された状態に維持するために、Ｔ細胞の投与を受ける患者に対して、ＩＬ−２のような活性化サイトカインが全身投与されているが、ＩＬ−２は毒性があり、治療効果も十分ではない。
【０００８】
Ｔ細胞はまた、阻害性(inhibitory)レセプターをもつ。Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)刺激後のＴ細胞の運命は、投入された共刺激性因子及び阻害性レセプターの一体化によって導かれる。前述したように、ＡＰＣ上の共刺激リガンドは、Ｔ細胞上の類似レセプターをトリガーし、その結果として、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの分泌及び分化が促進される。これに対して、様々な細胞上の阻害性リガンド分子がＴ細胞上の類似レセプターに結合すると、Ｔ細胞の不応答又はアポトーシスを誘起することにより、エフェクターの機能は低下する。
【０００９】
プロフェッショナル抗原提示細胞(ＡＰＣ)は、表面の共刺激性分子により、Ｔ細胞を活性化させるように作用する。ＡＰＣは、表面に共阻害体(coinhibitors)を発現させることにより、欠失ＡＰＣ又は「人工拒否細胞(artificial veto cells)」に転換されることができる。これは、例えば米国特許第５,２４２,６８７号、第５,６０１,８２８号及び第５,６２３,０５６号に記載されている。このような共阻害体は、細胞上の共阻害体レセプターと結合し、Ｔ細胞の不活性化を引き起こす。
【００１０】
例えば腫瘍細胞のようなＡＰＣ上に共刺激体及び共阻害剤を発現させる方法の１つは、遺伝子導入である。ＡＰＣ及び腫瘍細胞工学に用いられる場合、遺伝子導入技術は欠点がある。例えば腫瘍細胞を含むＡＰＣは、しばしばトランスフェクションを十分にできない場合がある。その上、トランスフェクションの方法は、煩雑で時間のかかる問題がある。さらに、２以上の共刺激体(又は共阻害体)を発現させることは困難である。これら及びその他の問題は、ＡＰＣ及び腫瘍細胞工学に対する遺伝子治療の広範囲の適用を妨げている。
【００１１】
蛋白質の移行は、ＡＰＣ及び他の細胞をエンジニアリングするための遺伝子導入よりも多くの利点を提供する。これらの利点として、トランスフェクションが不十分な細胞(例えばバイオプシー由来腫瘍細胞)を改質できること、同じ細胞の表面に多くの蛋白質をより簡単に発現させられること、処理を容易且つ迅速に行なえることが挙げられる。蛋白質移行のために、組換えＧＰＩ変性共刺激体及びＭＨＣタンパク誘導体の使用の成功例が報告されている[Brunschwig, et al. J. Immunol., 155: 5498(1995) ; McHugh, et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8059(1995); and McHugh, et al. Cancer Res., 59: 2433(1999)を参照]。しかしながら、ＧＰＩ蛋白質移行方法の欠点は、トランスフェクトされた細胞の膜(membranes)からＧＰＩ蛋白質の精製をスケールアップすることにある。蛋白質移行のために、パルミチン酸化(palmitated)蛋白質Ａとの複合体である組換えＦｃ変性共刺激誘導体からなる蛋白質共役体を使用した成功例も報告されている[U.S. Pat. No. 6,316, 256; Chen, et al. J. Immunol., 164: 705(2000); Zheng, et al. Cancer Res., 61: 8127(2001)を参照]。また、別の蛋白質移行方法では、ｈｉｓ6タグ付き共刺激体を、キレート脂質であるＮＴＡ−ＤＴＤＡで前処理された細胞に付加することを必要とし、そのＮＴＡ基が、ヘキサヒスチジンタグを結合する[van Broekhoven et al. J. Immunol., 164: 2433(2000)を参照]。
【００１２】
細胞間相互作用を容易にする人工レセプターで細胞をコーティングするために、パルミテート共役(palmitate-conjugate)蛋白質Ａを使用することが報告されている[Kim and Peacock, J. Immunol. Methods, 158: 57(1993)]。より具体的には、パルミチン酸化蛋白質を使用して、細胞の表面に抗体を付加させる方法が報告されている。しかし、この報告では、抗体以外のものを細胞に付加するために、脂質化された蛋白質(lipidated protein)を使用することを開示していない。それらの変性細胞は、抗原に対する人工レセプターとしての機能を果たすだけである。
【００１３】
免疫グロブリンのＦｃドメインであるＣＤ８リーダーセグメントと、タイプII膜蛋白質のエクトドメインであるＣＤ９４を使用した融合蛋白質の調製が報告されている[Phillips et AL., Immunity, 5: 163-172(August, 1996)]。これに対し、本発明の移行方法は、タイプＩとタイプIIのどちらの蛋白質にも適用できるが、この文献には、それらの開示も示唆もない。
【００１４】
蛋白質移行のためにビオチン／アビジンをベースにしたシステムを使用することが報告されている[Darling, et al., Gene Therapy, 4(12): 1350-60(Dec. 1997)]。この方法は、標的細胞をビオチン化し、移行させるべき蛋白質にアビジン基を付加し、ビオチン化された標的細胞とアビジンタグ付きの蛋白質を合成するものである。しかしながら、この方法では、共有結合修飾に依存するという大きな制約があり、細胞表面上の多数の蛋白質に支障をきたす(perturb)虞れがある。
【００１５】
例えばＢ７−１、Ｂ７−２−１、４−１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドなどのＴ細胞共刺激体は、正常な状態又は疾患状態のどちらの場合にもＴ細胞上で発現される[Carreno et al. Annu. Rev. Immunol., 20: 29(2002); Nakamura et al. J. Exp. Med., 194: 629(2001); Kochli et al. Immunol. Lett., 65: 197(1999); Wolthers et al. Eur. J. Immunol., 26: 1700(1996); Takasaki et al. Intern. Med., 38: 175(1999); Weintraub et al. J. Immunol., 159: 4117(1997); Weintraub et al. Clin. Immunol., 91: 302(1999)を参照]。さらに、Ｔ細胞は、細胞間の移動によりＡＰＣから共刺激体を獲得できることは知られている[Hwang et al. J. Exp. Med., 191: 1137(2000); Sabzevari et al. J. Immunol., 166: 2505(2001)を参照]。これは、Ｔ細胞が、細胞間移動により、ＭＨＣ：ペプチド抗原錯体を獲得できるのと同じである[Lorber et al. J. Immunol., 128: 2798(1982); Hudrisier et al. J. Immunol., 166: 3645(2001)を参照]。Ｔ細胞上のこれら共刺激体及びＭＨＣ：ペプチド抗原錯体は、トランスである(in trans)隣接Ｔ細胞上の類似レセプターをトリガーすると考えられていた。
【００１６】
Ｔ細胞をトリガーした後、まず阻害性レセプターＦａｓが、次にその類似リガンドであるＦａｓリガンドが、Ｔ細胞表面上で順次アップレギュレートされる(upregulated)。間接的証拠に基づいて推量する者もあり、(Ｔ細胞の「同胞殺し(fratricide)／姉妹殺し(sororicide)」に付随して)Ｔ細胞の「自殺(suicide)」は、そのような細胞表面でのＦａｓリガンド：Ｆａｓペアリングによって生じる可能性のあることが報告されている[Brunner et al. Nature, 373: 441(1995); Dhein et al. Nature, 373: 438(1995); Ju et al. Nature, 373: 444(1995)を参照]。しかし、このメカニズムが確かに機能している(例えば、リガンド：レセプター対の強制的発現)という明確な証拠を欠いている。また、Ｔ細胞表面上で自然に共発現されるリガンド：レセプター対に関するその他の例として、例えばＣＤ５８(ＬＦＡ−３)及びその類似レセプターＣＤ２がある[Springer et al. Annu. Rev. Immunol., 5: 223(1987)を参照]。しかし、ここでは、同一細胞表面におけるこのペアリングの機能的関係(例えば入力するトランスシグナルの連続的トリガー及び／又は競合的妨害の可能性)が無視されている。
【００１７】
細胞は、それ自体のネガティブレセプターの１つを通じて結合し、信号を送る可溶性蛋白質リガンドを分泌するという「自己分泌シグナリング」の概念について記載した文献がある[例えば、Hoffbrand A.V., Semin. Hemato., 30: 306(1993)を参照]。例えば、白血病細胞は、細胞自体のレセプターに結合できる可溶性成長因子を分泌し、自己分泌シグナリングは、このリガンド：レセプターの相互作用によるものであり、白血病誘発の役割を果たしているという考え方をしている。しかしながら、この文献は、細胞のレセプターに結合する可溶性リガンドだけを取り扱っている。当該技術分野において、膜に埋め込まれた蛋白質が、それら自体の活性化レセプター又は阻害性レセプターをトリガーする能力を有するように設計された治療用細胞は、これまでにない。
【００１８】
それゆえ、蛋白質及びペプチドを、効率的且つ定量的に細胞へ移行させる方法が要請されている。さらには、免疫調節分子又はそれらの機能を維持できるその他分子が、細胞の自己刺激を可能にする膜結合性(membrane-binding)蛋白質を含む所定の細胞に結合されることができる方法が要請されている。
【００１９】
＜発明の要旨＞
本発明は、上記要請に応えるもので、トランスシグナリング及び／又は接着機能を有するドメインを、細胞表面上に定量的に移行させる方法を提供するものである。典型的には、ドメインは、これらの機能の一方又は両方を有する細胞外ドメインである。望ましい実施例では、免疫調節分子の細胞外ドメインが使用される。より具体的には、本発明の方法は、段階的な量(graded amounts)の蛋白質を細胞表面へ送達することができる２ステップ式蛋白質移行方法を提供する。この方法は、少なくとも２以上のドメインを含む融合蛋白質を利用しており、該ドメインの１つは、好ましくは、免疫調整機能を有する分子をエンコードする。融合蛋白質を、脂質化された蛋白質でコーティングされた細胞へ加えることにより、例えば免疫調節分子の細胞外ドメインの精密滴定が達成される。
【００２０】
この蛋白質移行方法は適用範囲が広い。例えば、共刺激体閾値(costimulator thresholds)が存在すること、及び、ＡＰＣ上の表面の共刺激体のレベルが、誘発されたＴ細胞応答の大きさと量の両方を決定できることを立証するために使用されてきた。本発明の方法はまた、癌のワクチンの生成にも適用可能であり、これらのワクチンは、生体内で有意的な抗腫瘍作用を示す。さらにまた、本発明の方法は、人工拒否細胞(artificial veto cells)を生成するために使用されることができ、病原性のＴ細胞を取り除くために使用されることができる１種又は２種以上の共阻害体を発現する。それゆえ、本発明の方法に従って産生された細胞は、癌の治療や自己免疫疾患(autoimmune diseases)の治療にも有用である。この明細書に記載された方法論は、動物モデルの確立の他、例えばＴ細胞の活性化、アポトーシスシグナルをオーバーライドするための共刺激体の使用、共阻害体対共刺激体の機能、癌治療に用いられる共刺激体の相乗作用、共阻害体の自己免疫疾患の治療での使用に関する免疫学的課題の研究に使用されることもできる。
【００２１】
さらなる目的において、本発明は、隣接細胞上の類似レセプターをトリガする(トランスシグナリング)だけでなく、リガンドの相互作用によって細胞表面のレセプターで自らの細胞を刺激する(シスシグナリング)ことができる１種又は２種以上の外因性蛋白質リガンドがコートされた治療用細胞を産生する方法を提供するものである。この明細書で用いられる「シスシグナリング(cis signaling)」という語は、細胞の表面におけるレセプターとリガンドの相互作用を意味し、シグナルをその細胞の内部に送り、そのシグナルにより、蛋白質のリン酸化反応又は脱ホスホリル化、ＤＮＡ転写又はその他の細胞の事象がトリガされる。上記のように、そのような細胞は、適用範囲が広く、癌及び自己免疫疾患を含む多くの疾病の治療に使用されることができる。融合蛋白質は、上記のように２段階の方法で細胞表面にコーティングされることができる。或いはまた、細胞膜の中へ直接一体化される(incorporate)ことのできるグリコホスホリピド(glycophospholipid)のような分子のドメインを有する融合蛋白質をペイントすることにより、１段階の方法で適用されることもできる。このような融合蛋白質は、第２ドメインとして、所定のシグナリング蛋白質を有している。
【００２２】
所定のリガンドが細胞表面上に固定されても、同一細胞上の類似レセプターと結合することができ、細胞の活性化(又は停止)に必要な刺激又は阻害をもたらすことができることが見出されたことは驚くべきことである。従来の技術では、このようなことは思いもよらなかったことである。さらに、強制されたリガンドと類似レセプターの相互作用は、細胞間のトランスシグナリングで見られるよりも遙かに強い相互作用がもたらされることが分かった。
【００２３】
例えば、免疫系のＴ細胞の場合、活性化蛋白質を使用すると、治療用Ｔ細胞は、癌やウイルス介在疾患の治療の使用に適するようになるが、阻害性蛋白質を使用すると、治療用Ｔ細胞は、自己免疫疾患及び同種免疫疾患の治療のための調節Ｔ細胞として機能することができる。他の多くの免疫性細胞型及び非免疫性細胞型(様々な幹細胞及び前駆細胞を含む)に対応する治療用自己刺激細胞は、同じ様に構成されることができる。
【００２４】
本発明はまた、本発明の治療用自己刺激細胞を作製する方法を提供するものであり、これらの細胞を、自己刺激細胞が有益だと思われる多くの状態のうちの何れかと同様に、癌、ウイルス性疾患、自己免疫疾患及び同種免疫疾患の研究及び治療に使用する方法を提供するものである。これらの疾患及び状態を、生体内及び生体外の両方で研究及び治療するための他の方法についても開示する。
【００２５】
それゆえ、本発明の目的は、自己刺激能力を有する新規な治療用細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、そのような自己刺激性細胞を産生する方法を提供することであり、この目的を達成するために望ましい方法は蛋白質の移行である。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、自己刺激性細胞が有益だと思われる多くの病気のうちの何れかと同様に、癌、ウイルス性疾患、自己免疫疾患及び同種免疫疾患の研究及び治療のための治療用細胞を提供することである。
本発明のこれら及びその他の目的は、以下の説明と特許請求の範囲から明かになるであろう。
【００２７】
＜発明の詳細な説明＞
本発明は、１種又は２種以上の蛋白質を移行させる方法に関するもので、概要を述べると、脂質化蛋白質(lipidated protein)である第１蛋白質で細胞の表面をコーティングし、コーティングされた細胞を融合蛋白質である第２蛋白質と接触させるステップを含んでいる。融合蛋白質は、脂質化蛋白質に対して親和性の第１ドメインと、トランスシグナリング及び／又は接着機能を有するペプチド、蛋白質又はそれらの誘導体若しくはフラグメントの第２ドメインとを含んでいる。好適には、細胞外ドメインが使用され、第２ドメインは免疫調節機能を有することが望ましい。ペプチド及び蛋白質に関連して用いられる「誘導体(derivatives)」という語は、ペプチド及び蛋白質に関連して使用される場合、例えば、ペプチド鎖内の１種又は２種以上のアミノ酸が削除、追加又は他のアミノ酸と置換された類似体のようなペプチド及び蛋白質の変異体(variants)を意味する。また、「フラグメント」は、ペプチド又は蛋白質のアミノ酸配列の一部を意味する。ペプチド及び蛋白質の「誘導体」や「フラグメント」は、野生型ペプチド又は蛋白質の生理学的機能を保持するので、生物学的に活性であることは理解されるであろう。
【００２８】
この方法は、脂質二重層膜を有するどんな細胞にも適用できる。例えば、患者の自己細胞(autologous cells)については、どのような種類であっても使用可能であり、当該分野で既知の手段によって使用し、集められる(harvested)。どんな類似哺乳類の細胞株を使用することも本発明の範囲内である。本発明で好適に使用される類似細胞株として、ＥＬ−４細胞(マウス胸腺腫細胞)、２９３細胞(ヒト腎細胞)、Ｋ５６２細胞(ヒト白血病細胞)、Ｄａｕｄｉ細胞(ヒトＢ細胞株)及びＪＹ細胞(ヒトＢ細胞株)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの細胞は、バージニア州マナッサスのAmerican Type Culture Collectionより、商業的に入手可能である。なお、商業的に入手することができない細胞株についても本発明の範囲内である。同質遺伝子系細胞及び異種遺伝子系細胞の使用についても本発明の範囲内である。
【００２９】
脂質化されることができるものであればどの蛋白質も、本発明の方法で好適に使用される。例えば、商業的に入手可能な蛋白質Ａ及び蛋白質Ｇが挙げられるがこれらに限定されるものではない。同様に、どんな脂質についても、脂質化蛋白質の調製に用いられることができる。炭素鎖が約１２〜２２の脂質が望ましく、炭素鎖１６(パルミテート)が最も好ましい。脂質鎖(lipid chain)の長さは、ユーザの要求や希望によって変えることができる。当該分野の専門家であれば、第１蛋白質の脂質化された部分は、細胞の膜を作り上げるリン脂質二重層の中に接着されるか、又は組み込まれることは理解されるであろう。また、それを意味する語として、この明細書では、「細胞の表面をコーティングする」という語句が用いられていることは理解されるであろう。
【００３０】
細胞をコートするのに使用される脂質化蛋白質の量は、ユーザの要求や希望により、また、選択される特定の脂質及び特定の蛋白質によって異なる。細胞全体をコートするには、十分に脂質化された蛋白質を使用することが望ましい。脂質化蛋白質の使用量は、一般的には、５×１０6の細胞毎に少なくとも約３０マイクログラム以上である。
【００３１】
細胞をコーティングした後、次に、細胞を第２蛋白質に接触させる。第２蛋白質は、融合蛋白質であって、これは、当該分野で標準的に使用されている組換えＤＮＡ技術を通じて、単一のＤＮＡ配列を作製するために２つの異なるドメインが融合されたものである。第１ドメインは、融合蛋白質のアミノ末端又はカルボキシル末端のどちらかに付着されることができる。第１蛋白質は、脂質化された蛋白質に対して親和性を有するペプチド、蛋白質又はそれらの誘導体又はフラグメントをエンコードする。それゆえ、脂質化された蛋白質に使用される蛋白質は、互いに親和性を有する蛋白質が使用されるように、融合蛋白質の第１ドメインによってエンコードされた蛋白質から選択されるのが理想的である。蛋白質どうしの親和性は、ビアコア技術(Biacore technology)又は当該分野で広く知られた他の方法によって決定されることができる。この親和性により、融合蛋白質は、既に細胞膜に一体化された脂質化蛋白質に結合する。この様にして、融合蛋白質は細胞へ移行する。特に好適な組合せは、パルミチン酸化蛋白質ＡとＦｃ領域をエンコードする第１ドメインを使用する。例えば、ヒト免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧｌ)のＦｃ領域であるＦｃγ1が使用される。融合蛋白質の他の適当な第１ドメインとして、ロイシン・ジッパー蛋白質ドメイン及び単鎖Ｆｖ誘導体ドメインが挙げられる。
【００３２】
融合蛋白質の第２ドメインは、免疫調節機能を有すると共に第２細胞にトランスシグナリングを行なうことのできるペプチド、蛋白質又はそれらの誘導体若しくはフラグメントをエンコードする。その例として、共刺激体及び共阻害体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。好適に使用できる共刺激体として、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−３、ＣＤ３０リガンド(ＣＤ３０Ｌ)、ＣＤ４０リガンド(ＣＤ４０Ｌ)、４−ＩＢＢリガンド(４−１ＢＢＬ)、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ７０及びＣＤ２４及び熱安定性抗原などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。同様に、好適に使用できる共阻害体として、例えばＣＤ８、ＦａｓＬ、ＰＰ１４及びＴＲＡＩＬなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
なお、注目すべきことは、本発明の融合蛋白質は、タイプＩ蛋白質又はタイプII蛋白質のどちらもよいことである。タイプII蛋白質を細胞に移行させる方法は、これまでに報告された例がない。本発明の方法は、タイプＩ蛋白質とタイプII蛋白質に対して等しく適用可能であるから、これらの方法は、これまでの技術に対して著しい進歩をもたらす。タイプＩ膜蛋白質として、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２及びＣＤ４８があり、タイプII膜蛋白質として、例えば、Ｆａｓリガンド(ＦａｓＬ又はＣＤ９５Ｌ)、ＣＤ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬがある。タイプII膜蛋白質の場合、第１ドメインは、分子の機能的末端(functional ends)を維持するために、タイプII膜蛋白質のカルボキシ末端で融合されている。これらのリストは、共刺激体、共阻害体、及び本発明に基づいて移されることができる他の蛋白質を網羅しておらず、限定されるものではないが、例えばヒト型及びマウス型を含む様々な分子の全ての形態を反映している。
【００３４】
本発明によってもたらされる他の著しい進歩は、融合蛋白質が細胞に移行した後も、トランスシグナリング機能を有する融合蛋白質の部分が、この機能を保持することである。それゆえ、本発明の方法に基づいて調製された細胞は、結合、及び第２細胞のカウンタ−レセプタ(counter-receptor)を介してトランスシグナリングを行なうことにより、免疫応答を引き出すことができる。
【００３５】
さらにまた、単細胞をコートするために、２以上の融合蛋白質を用いられることができる。この様に、２、３、４又は５以上のトランスシグナリングを行なう蛋白質、例えば免疫調節蛋白質が、細胞に移されることができる。共刺激体及び共阻害体の場合、最大の免疫学的効果をもつために、そのような蛋白質の組合せを選択されることができるし、また、付加的効果、さらには相乗的効果をもたらす組合せについても、本発明に基づいて選択され、使用されることができる。
【００３６】
本発明の方法は、蛋白質が定量に細胞の表面に送達されることができる点において、さらに特徴がある。上記のように、細胞を十分にコートするには、十分に脂質化された蛋白質を使用することが望ましい。細胞に移行させる融合蛋白質の量は、コーティングされた細胞と接触させるの用いられる融合蛋白質の量によって決定されるので、融合蛋白質の量は、限界因子又は決定因子である。２以上の蛋白質を使用する場合、コーティングされた細胞と接触させるために、所定比率の融合蛋白質を使用することができ、蛋白質はこれらに近い比率で細胞に移される。
【００３７】
本発明の方法は、生体内(in vivo)は生体外(in vitro)のどちらでも実施されることができる。生体内の方法では、脂質化された蛋白質及び融合蛋白質は、患者に直接注入される。注入は、順次に(最初は脂質化蛋白質を注入)行なうことができるし、又は脂質化蛋白質と融合蛋白質を予め混合しておき、同時に行なうこともできる。注入は、例えば、腫瘍内への局部注入として行なうことができるし、例えば血管の中へ全身注入として行なうことができる。本発明の方法及び該方法によって産生された細胞は、従来の他の方法と比べて、特に蛋白質の安定性が高く、本発明の方法は生体内で実施することができる。生体外の方法では、患者から細胞を抽出し、次に、前記細胞をコーティングし、接触させることにより行われる。なお、細胞については、商業的に入手可能な同種細胞を使用することもできる。どちらの場合も、処理された細胞は、患者に注入される。
【００３８】
細胞の種類、第１蛋白質、第２蛋白質、生体内、生体外及び他の送達技術に関する上記の全ての記載は、この明細書で開示される発明の全ての実施例についても同じ様に適用される。
【００３９】
本発明は、Ｔ細胞内の共刺激体の活性閾値を決定するための方法をさらに対象としている。これらの方法は、広い意味において、１又は２以上の融合蛋白質を、上記の要領にて、細胞へ移行させることを含んでいる。蛋白質に移行した細胞は、次にＴ細胞と混合される。Ｔ細胞は、例えば、当該分野で既知の方法によって末梢血単核細胞から取り入れられることができる。もし、Ｔ細胞の増殖があれば、当該技術で既知の手段(後の実施例の項での記載参照)により、サイトカイン分泌量と同じように、その増殖を測定することができる。
【００４０】
本発明は、本発明の蛋白質を移動させる技術を用いて疾病を治療する方法をさらに目的としている。これらの方法は、広い意味において、上記の方法に基づいて生体外で調製された有効量の細胞を患者に投与するか、又は蛋白質を生体内で投与することを含んでいる。この方法は、生体内又は生体外のどちらかで、融合蛋白質を標的細胞に蛋白質移行させることによって行われる。生体外の方法の場合、抽出された自己細胞又は同種細胞のどちらかの細胞は、脂質化蛋白質がコーティングされ、１又は２以上の融合蛋白質と接触させられる。次に、有効量のこれら細胞は、患者に投与される。生体内の方法の場合、脂質化蛋白質と１又は２以上の融合蛋白質が患者に投与され、投与量は、有効量の融合蛋白質が有効量の細胞へ移行するのに十分な量である。
【００４１】
この明細書で用いられる「疾病(illness)」という語は、癌、ウイルス性疾患、自己免疫疾患及び同種免疫疾患を意味し、限定するものではないが、メラノーマ、卵巣癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、多形性膠芽腫、前立腺癌及び白血病が挙げられる。その他にも、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−II、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−II及びＫＳＨＶとの慢性ウイルス感染症などのウイルス感染症があり、さらには、関節炎、関節リウマチ、喘息、移植片対宿主病、臓器拒絶反応、全身性エリテマトーデス、アトピー性アレルギー、炎症性大腸炎、多発性硬化症及びアレルギー性皮膚炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この方法は、特に、癌の治療への適用が可能であり、生体内の方法では、脂質化された蛋白質及び融合蛋白質が、生体外の方法では、コーティングされ接触された細胞が、患者の１又は２以上の腫瘍に直接注入されることができる。この明細書で用いられる「患者(patient)」という語は、ヒトを含む動物界の生物を意味する。この方法は、一般的には、少なくとも免疫応答を引き起こす可能性がある患者に適用される。
【００４２】
本発明の蛋白質移行方法によって産生された有効量の細胞は、本発明の治療法において使用されることができる。有効量とは、所望の結果をもたらすのに必要とされる量の蛋白質が患者に送達される細胞の量である。一般的に、所望の結果とは、例えば、免疫応答の刺激、又は免疫応答の抑制(suppression)である。癌治療の場合、有効量とは、腫瘍の成長から患者を保護することができる量で、腫瘍の除去とまではいかないとしても、少なくとも腫瘍を縮小させることのできる量である。自己免疫疾患又は同種免疫疾患の場合、有効量とは、治療されるべき自己免疫疾患又は同種免疫疾患の１又は２以上の症状の除去とまではいかないとしても、その症状が少なくとも緩和される量である。ウイルス性疾患の治療の場合、有効量とは、ウイルス感染症の除去とまではいかないとしても、その感染症が少なくとも軽減される量である。また、有効量は、患者のサイズ、患者の免疫系の状態、免疫応答に対する患者の実行能力、並びに疾病の種類及び重症度のような種々の要因に基づいて、患者によって異なることは理解されるであろう。各患者に対する適当な有効量は、当該分野の技術者であれば決定できるものであり、一般的には、腫瘍内で、被修飾細胞(modified cells)が約１０7以上、又はＦｃ融合蛋白質が１００μg以上である。自己刺激されたＴ細胞の場合、有効量は、被修飾細胞が約１０8以上である。これについては、後でより詳しく説明する。本発明は、本発明の蛋白質移行方法に基づいて調製され、適当な担体(carrier)に入れられた細胞を含む癌ワクチンをさらに対象としている。適合性の問題が生じない限り、どんな担体でも使用可能である。例えば、ＰＢＳ及び無血清培地が挙げられる。ワクチンは、様々な融合蛋白質を含むことができる。例えば、各々が異なる融合蛋白質を有する細胞、２以上の融合蛋白質が結合された細胞を使用することができる。このように、免疫調節蛋白質の「カクテル(cocktail)」を、本発明のワクチンに含有させることができるし、本発明の方法に基づいて患者に取り込ませることができる。カクテルの中で使用するための特定の免疫調節蛋白質は、当該分野の専門家であれば、治療を受ける患者並びに患者の疾病の種類及び重症度のような要因に基づいて決定することができるであろう。異なる種類の腫瘍を治療するには、異なる組合せを用いることができる。カクテルは、予め混合されたものが腫瘍床に注入され、それによって腫瘍の抑制が達成される。ワクチンは、免疫前のレシピエント(recipients)に対するその後の腫瘍チャレンジ、及び、形成された腫瘍の治療の両方に対して有効であることがわかった。
【００４３】
本発明は、自己刺激能力を与えるために、蛋白質を細胞の表面に移行させることにより、治療用細胞の有効性を向上させる方法をさらに対象とするものである。この方法は、概括的には、細胞の表面を脂質化された第１蛋白質でコーティングを形成し、該細胞を第２蛋白質と接触させることを含んでいる。第２蛋白質は、第１蛋白質に対して親和性の第１ドメインと、シスシグナリング機能を有する第２ドメインとを含む融合蛋白質であり、細胞自体の表面でレセプターに結合する能力を有している。
【００４４】
１ステップ式の実施例においても、移行方法は、細胞の膜に取り込まれることのできる第１ドメインと、細胞自体の表面でレセプターに結合することのできる第２ドメインとを有する融合蛋白質で、細胞の表面をコーティングすることが好ましい。１ステップ式方法の融合蛋白質の第１ドメインは、グリコホスホリピドによることが好ましく、グリコシル・ホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)によることがさらに好ましい。第２ドメインは、上記の共刺激体及び阻害体などの所定の蛋白質を含んでいる。
【００４５】
細胞の表面に移行された融合蛋白質は、同じ細胞のレセプターに結合するリガンドであり、移行の際に、細胞の生理学的状態に変化を生じさせる。この明細書で用いられる「自己刺激性細胞(auto-stimulating cell)」又は「自己刺激能力(auto-stimulating ability)」という語は、表面に外因性リガンドをもつ細胞を意味しており、前記リガンドは、一般的には、その表面でレセプターと結合し且つトリガする能力を有する蛋白質である。細胞表面でのリガンドとレセプターのそのような結合(engagement)により、上記の規定したとおりのシスシグナルを生じ、そのようなシグナルは、当該分野で理解されている刺激シグナル及び阻害シグナルを含んでいる。このように、「自己刺激」及び「シスシグナリング」という語は、レセプターとリガンドの相互作用でもたらされる刺激と阻害の両方を意味している。本発明は、リガンドが、類似レセプター担持細胞にペイントされると、レセプターがトリガーされるという発見に基づくものである。
【００４６】
本発明の望ましい実施例は、免疫療法の範囲内にある。望ましい実施例において、本発明は、患者の自己Ｔ細胞が患者へ注入して戻された後も、それら細胞を活性状態に維持するために、患者の自己Ｔ細胞を蛋白質でペイントすることを含んでいる。これは、抗腫瘍特性又は抗ウイルス特性をもつ治療用Ｔ細胞の活性を高めるのに特に有用である。ここで、Ｔ細胞を活性化させるために使用することができる適当な共刺激体として、Ｂ７ファミリーの共刺激体(Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ｈ／Ｂ７ｒｐ−１)、４−１ＢＢリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、ＣＤ２４、ＣＤ４８、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−３及びＣＤ３０リガンドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
他の実施例において、本発明は、患者の自己樹状細胞の増殖及び／又は分化を刺激することを目的として、前記細胞を蛋白質でペイントすることを含んでいる。樹状細胞の活性化のために、適当な樹状細胞活性剤を用いることができる。この活性剤として、例えば、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＮＣＥ及びＦｌｔ−３リガンドがあり、また、細胞表面で固定化される際にそれらの機能を保持する他の可溶性樹状細胞活性剤として、例えばグリコシル・ホスファチジルイノシトールが修飾されたＧＭ−ＣＳＦがあるが、これらに限定されるものではない。本発明の他の実施例では、増殖性又は他の機能的能力を高めるために、数多くの他の種類の細胞の中の任意のものが、生体内又は生体外のどちらか有利な方法で、同じようにペイントされることができる。種類が異なる細胞で使用可能な細胞の例として、リンフォカイン活性化キラー細胞、単球、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞の他、幹細胞及び前駆細胞を挙げることができる。前記幹細胞及び前駆細胞として、例えば、造血性幹細胞、間葉幹細胞、胚幹細胞、角化細胞、内皮細胞、島細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、筋肉細胞及び神経細胞がある。なお、これらは限定することを意図するものではない。
【００４８】
上記のように、１ステップ式又は２ステップ式の蛋白質移行方法は、細胞の自己刺激作用を目的として、当該細胞の表面に、外因性蛋白質を発現させる方法が好ましい。細胞をコーティングするための蛋白質ペイントとして、脂質化された形態で産生され、細胞膜と一体化する能力を有する蛋白質(例えば、組換えグリコシル・ホスファチジルイノシトールで修飾された蛋白質)、又は、細胞膜と一体化する能力を有する第２蛋白質に結合できる蛋白質(例えば、膜を一体化するパルミチン酸化された蛋白質Ａに結合可能で、免疫グロブリンＦｃで修飾された組換え蛋白質、又は、膜と一体化するキレート脂質であるＮＴＡ−ＤＴＤＡに結合可能なＨｉｓ6タグ付き蛋白質)が、本発明の細胞をコーティングするための蛋白質ペイント(protein paint)として使用されるのに好適である。この明細書で用いられる「外因性蛋白質(extrinsinc protein)」は、上記の蛋白質移送法を用いて細胞の表面に移行する融合蛋白質を意味している。
【００４９】
細胞をペイントするために使用される蛋白質の量は、先に説明したとおりである。
遺伝子導入法についても、本発明の細胞の表面で自己刺激能力を有する外因性蛋白質を発現するために、本発明に基づいて使用可能である。これら蛋白質をエンコードする遺伝子配列は、多くのトランスフェクション・モダリティの中の任意の１つにより、生体外で、細胞の中へ導入されることができる。このようにトランスフェクトされたこれら細胞は、当該分野で広く知られた方法に基づいて、治療用細胞として患者に投与されることができる。「遺伝子配列」は、特定蛋白質(defined protein)のコーディング配列と、関連する調節配列、及び他の非コーディング配列とを含むポリヌクレオチドを意味する。ｃＤＮＡクローン形態の遺伝子配列は、多様な遺伝子で商業的に入手可能である。さらに、商業的又はその他の供給源から容易に入手できないｃＤＮＡについては、それらヌクレオチド配列に関する知識を利用し、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応法により、それらのｃＤＮＡｓを容易に再産生することができるし、関連のある遺伝子配列をプライマーに組み込むことができる。
【００５０】
当該分野のトランスフェクション法は、治療用遺伝子を送達するためのベクターの宿主と、所定の遺伝子に付加されることができる転写及び翻訳調節要素の宿主と、これらのベクターを産生及び使用する方法と、治療用遺伝子の有効性及び毒性をモニターする方法とを包含するものである。注目すべきことは、当該分野で知られている誘導性プロモータが、トランスフェクトされた遺伝子の発現を調節するために用いられ、エンコードされた蛋白質の量が調節されることである。この点において、経口投与薬で調節可能な誘導性プロモーターが特に有用である。実験的変形性関節症の治療のために、トランスフェクトされた細胞をこのようにして治療用細胞として使用した報告例がある[Pelletier, Arthritis and Rheumatism, 40:1012-1019(1997)参照]。ここでは、トランスフェクトされた滑膜細胞が、患部の関節に再注入して戻される。これについては、トランスフェクトされた島細胞を用いる自己免疫性糖尿病の治療でも記載されている[Yasuda, J. of Clinical Investigation, 102:1807-1814(1998)]。
【００５１】
本発明のさらに別の実施例では、遺伝子導入は、リガンドだけでなく、本発明の細胞上のレセプターをエンコードする遺伝子を導入するために用いられ、前記レセプターは、細胞上の天然リガンド又は外因性リガンドとの結合能力によって選択される。
【００５２】
本発明の組成物及び方法によってもたらされる他の著しい進歩は、治療用細胞を患者に注入した後、コーティング又は遺伝子導入によって移行した蛋白質で調節された刺激効果がしばらく持続されることである。蛋白質移行が、蛋白質を移動させるために使用される場合、細胞の刺激は、例えば細胞分裂の繰返しによって希釈が生じる。その結果、細胞の刺激は、時間の経過と共に次第に低下する。長時間のトリガリングが好ましくないこともあるので、この進行的減少は有利となる場合が数多くある。遺伝子導入が、外因性遺伝子の発現のために使用される場合、適当な発現ベクターが選択されると、発現は長時間に亘って維持される。これは、当該分野の専門家には広く知られていることである。
【００５３】
また、２以上の蛋白質リガンドは、単細胞をコートするために使用されることができる。この様にして、２又は３以上のシスシグナリング蛋白質(例えば、免疫調節蛋白質)が、細胞表面に移行されることができる。共刺激体の場合、そのような蛋白質の組合せは、最も大きな免疫学的効果を有するように選択され、追加又は相乗的な利点を有する組合せが選択され、これらは、本発明の組成物及び方法に基づいて使用されることができる。また、蛋白質の移行によって定量的制御が行われると、細胞へ移行される蛋白質の量は、ペイントされる細胞と接触させるために用いられる蛋白質の量によって決定され、予め決められた比率の蛋白質のペイントが行われる。
【００５４】
本発明の方法の他の利点は、同じ細胞表面上のリガンドとそのレセプターの強制的近接性(enforced proximity)によってもたらされる。特定のリガンド・レセプター対、例えば共刺激体Ｂ７−１とそのレセプターＣＤ２８の場合、オフレートが速く、細胞間のトランス共刺激性シグナリングが制限される傾向にある。これに対して、本発明の細胞は、リガンドとレセプターが同じ細胞表面に固定されるという特徴がある。このため、質量作用の法則により、固定された(locked-in)結合性蛋白質(binding partners)は安定化され、持続的近接性(sustained proximity)に強制される傾向を有する。それゆえ、本発明は、リガンドとレセプターのシグナリングについて、全く新規な形態及び動力学を提供するものである。
【００５５】
本発明の方法は、生体内又は生体外のどちらでも実行されることができる。生体外の方法では、所望の細胞が、患者の血液又は組織のサンプルから単離され、外因性蛋白質でペイントされるか、又は自己刺激能力をもつ所定の蛋白質をコード化する遺伝子でトランスフェクトされ、次に、患者に再注入される。生体外のステップにおいて、本発明の細胞を、例えば、サイトカイン治療及び細胞数の増殖等の追加操作を行なうことは可能である。生体内の方法では、患者に融合蛋白質を注入することを含んでおり、該融合蛋白質は、蛋白質を生体内の所定細胞に付着するホーミング要素と、シス型の同じ細胞上のレセプターをトリガするリガンド要素の両要素を含んでいる。望ましいホーミング要素は、免疫グロブリン蛋白質のＦｖドメイン、又は標的細胞上の類似の表面レセプターに十分な親和性をもつサイトカインである。また、例えば免疫グロブリンｉｇＧｌ分子のような免疫グロブリン分子のＦｖ領域(ｓｃＦｖ)を含む単一ポリペプチド鎖誘導体を、第１ドメインとして用いられることができる。ｓｃＦｖの具体例として、サイトカインに特異性をもつもの、また、その他のレセプター(例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕ)、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、前立腺特異抗原(ＰＳＡ)、ＣＤ３３及びＩＲＭ１に特異性をもつものを挙げることができる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕレセプターは、乳房や卵巣の上皮性悪性腫瘍で発見されるので、癌細胞の標的としても好ましい。ＣＥＡは、結腸癌を含む消化管腫瘍で強く発現されるが、これは免疫阻害特性によるものである。ＰＳＡは、多くの上皮性前立腺癌によって強く発現される。ＣＤ３３とＡＩＲＭ１は、骨髄単球性系統の細胞で発現されるシアロ付着因子(sialoadhesin)ファミリーのメンバーである。慢性骨髄性白血病細胞上のＣＤ３３又はＡＩＲＭ１が抗体とライゲーションすると、細胞増殖及び細胞生存が減少する。この明細書で使用される「ホーミング要素(homing element)」という語は、特異的細胞上のレセプターに結合可能で、患者に投与されると、所定細胞に付着することができる蛋白質又はその他の分子を意味する。
【００５６】
細胞の種類、蛋白質リガンド、蛋白質レセプター、蛋白質及び遺伝子導入法、生体外及び生体内、その他の送達技術に関する前記記載は全て、ここに開示される発明の全ての実施例に対して等しく適用される。
【００５７】
本発明は、細胞のレセプター活性閾値及びその他の機能的特性を決定することをさらに対象としている。例えば、Ｔ細胞の場合、Ｔ細胞は、様々な共刺激体でペイントされることができ、ＴＣＲ活性閾値に対するそれらの夫々の効果が比較されることができる。さらに、共刺激体がペイントされたＴ細胞は、異なるＴ細胞調節剤(modulatory agents)の相対活性を評価するために、細胞試薬として使用される。他の実施例として、Ｔ細胞は、同一細胞上のＴＣＲをトリガすることができる膜結合性(membrane-incorporating)主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)蛋白質：ペプチド抗原(又は脂質抗原)共役体(conjugates)でペイントされることができる。次には、これら抗原で自己刺激されたＴ細胞は、ＴＣＲ上の外因性物質の効果、抗刺激性レセプターの活性閾値、さらには他のＴ細胞の数多くの生理学的評価項目の任意の一項目を調べるために使用されることができる。
【００５８】
本発明は、本発明の細胞の自己刺激技術を使用して疾患を治療する方法をさらに対象としている。これらの方法は一般的には、上記の方法に基づいて細胞を生体外で調製し、調整された有効量の細胞を患者に投与するか、又は生体内に存在する細胞を自己刺激する融合蛋白質を投与することを含んでいる。生体外の方法の場合、細胞は、脂質化蛋白質又は膜結合性蛋白質共役体でコートされる。これら細胞の有効量が、患者に投与される。生体内の方法の場合、１又は２種以上の融合蛋白質が患者に投与される。投与される量は、この蛋白質の有効量が有効量の細胞に対して移行するのに十分な量である。
【００５９】
投与は、例えば静脈注射のように、当該分野で既知の任意の手段によって行われる。この明細書に記載された自己刺激性細胞は、本発明の方法に基づいて投与するために、適当な薬学的担体の中に被包されることができる。「適当な薬学的担体(suitable pharmaceutical carrier)」については上記の通りである。
【実施例】
【００６０】
本発明の実施例は、本発明の説明を目的とするものであり、発明を多少なりとも限定するものと解釈されるべきではない。
【００６１】
＜実施例１＞
パルミチン酸化蛋白質を使用して、Ｂ７−１・Ｆｃγ1融合蛋白質を細胞に移行させる方法について、以下の実験を挙げて説明する。
蛋白質Ａのパルミチン酸化(Palmitation)
組換え蛋白質Ａ[Calbiochem, La Jolla, Ca]は、文献[Kim and Peacock, J. Immunol Methods, 158:57(1993)]に記載されているように、パルミチン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミド・エステル(N-hydroxysuccinimide ester)[Sigma, St. Louis, MO]で誘導体化された。簡単に説明すると、パルミチン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミド・エステルのストック溶液として、蛋白質Ａを濃度約１.５ｍｇ／ｍｌで含む溶液を調製した。該溶液は、蛋白質１ｍｌ当たりエステル約１０μｇの割合で混合し、室温で絶えず混合しながら約１８時間培養した。脂質誘導体化された蛋白質Ａは、３０ｍｌのSephadex G-25(Sigma)カラムを使用し、文献[Huang, et al., J. Biol. Chem., 225:8015(1980)]に記載のとおり精製した。この明細書で「ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ」として記載される蛋白質生成物は、ビシンコニン酸キット[Bio-Rad, Richmond, CA]を使用して定量化し、濾過滅菌した後、使用するまで４℃で保存した。
【００６２】
ｐａｌ−ｐｒｏｔＡの膜結合(membrane incorporation)
Daudi EL-4細胞、ＪＹ細胞及びＫ５６２細胞(３−７×１０6／ｍｌ)を、夫々別々に、ＲＰＭＩ １６４０培地[BioWittaker, Walkersville, MD]で３回洗浄した後、同培地の中で再懸濁した。様々な濃度のｐａｌ−ｐｒｏｔＡ(又はネガティブコントロールとして誘導体化されていない蛋白質Ａ)を細胞懸濁液に加え、その混合物を、４℃で絶えず混合しながら約２時間培養した。ｐａｌ−ｐｒｏｔＡの細胞表面への結合を評価するために、緩衝液(０.２５％ＢＳＡ/０.０１％/ＰＢＳ)で２回洗浄し、その後、同緩衝液で希釈された１００μｇ/ｍｌのＦＩＴＣヒトＩｇＧ(Sigma)１００μｇと共に、氷上で１時間培養した。細胞を、前記緩衝液の中で２回洗浄し、ＦＡＣＳｔａｒ(登録商標)フローサイトメータ[Becton Dickinson, Mountain View, CA]で分析した。
【００６３】
第１組の最適化実験において、ＦＩＴＣ共役ヒトＩｇＧで検出された４つの細胞株(図１Ａ)の中で、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡの有効な一体化が立証された。ネガティブコントロールとして用いた誘導体化されていない蛋白質Ａは、同じ細胞に結合する能力を欠いていた。ＦＡＣＳｔａｒ分析で得たデータを、蛍光強度とＥＬ−４細胞数の関係として、任意単位の対数(log10)目盛でプロットした。膜への一体化は、図１Ｂに示されるように、投与量に依存し、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ約３３μｇ／ｍｌでプラトーに達した。ＥＬ−４細胞は、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ約３３μｇ／ｍｌで、所定時間培養し、上記のように処理した。ｐａｌ−ｐｒｏｔＡの結合は、図１Ｃに示されるように、細胞への添加後、速やかに行われ、約１時間でプラトーに達した。このデータは、数多くの異なる細胞株についても、本発明の蛋白質移行法に使用できることを示しており、また、脂質化蛋白質は、かなり迅速に細胞に組み込まれることを示している。
【００６４】
組換えＢ７−１・Ｆｃγ1の調製
発現プラスミドｐＣＤＭ８／Ｂ７Ｉｇは、Ｆｃγ1にインフレームで結合した完全なヒトＢ７−１細胞外ドメインをエンコードするもので、American Type Culture Collection[Manassas, VA]から入手した。Ｂ７−１・Ｆｃγ1をエンコードする配列は、Ｘｂａｌで消化し、クレノウ・フラグメントで充填し、その後、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＣＤＭ８／Ｂ７Ｉｇから移動させた。移動したフラグメントは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及び充填されたＢａｍＨＩ部位で、ＥＢＶエピソーム発現ベクターｐＲＥＰ７β[Invitrogen, San Diego, CA]にサブクローニングされる。プラスミドは、２９３細胞(ヒト腎細胞株；American Culture Collection)にトランスフェクトされ、ハイグロマイシンＢ耐性コロニーが、１０ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン及び２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された無血清UltraCulture培地[BioWittaker]の中で選択された。分泌されたＢ７−１・Ｆｃγ1は、蛋白質Ａアガロース[Life Technologies, Germantown, MD]親和性クロマトグラフィーによって条件培地(conditioned medium)から精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。蛋白質は１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの中を移動し、図２に示されるように、還元条件(レーン２)と非還元条件(レーン３)の下で、約８０ｋＤＡの支配的単一バンドとして、クマシーブルーで可視化された。これは、ヒトＢ７−１特異性のｍＡｂ、ＢＢ−１には強く結合するが、対照Ａｂには結合されない組換え蛋白質を用いて、ＥＬＩＳＡによって確認された(データは示さず)。
【００６５】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1蛋白質の移行
ｐａｌ−ｐｒｏｔＡが予めコートされた細胞を１回洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地(３−７×１6細胞／ｍｌ)の中で再懸濁した。ｐＲＥＰ７ＢでトランスフェクトされたＫ５６２細胞(Ｋ５６２／ＲＥＰ７ｂ)は、３３μｇ／ｍｌの蛋白質Ａで２時間、３３μｇ／ｍｌのＦｃγ1融合蛋白質で１時間、第１ＡｂとしてのＢＢ−１、第２ＡｂとしてのＦＩＴＣ共役ゴート抗マウスＩｇＧを連続的に培養した。蛋白質送達をモニターするために、１０6細胞を上記と同じ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの緩衝液中で、１μｇのヒトＢ７特異性ｍＡｂ ＢＢ−１[PharMingen, San Diego, CA]と共に氷上にて１時間培養した。細胞は、１回洗浄し、第２Ａｂとして、１００倍に希釈された１００μｌのＦＩＴＣ共役ゴートＦ(ａｂ')2抗マウスＩｇ[Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN]と共に氷上で１時間免疫染色された。細胞を１回洗浄し、ＰＢＳの中で再懸濁し、ＦＡＣＳｔａｒフロー・サイトメータで分析した。
【００６６】
図３Ａは、Ｋ５６２細胞がｐａｌ−ｐｒｏｔＡで予めコーティングされているとき、二次的に添加されたＢ７−１・Ｆｃγ1が細胞表面に付着されたことを示しており、これは、細胞を抗Ｂ７−１ ＢＢ−１ｍＡｂ及びＦＩＴＣ共役ゴートの抗マウスＩｇＧで免疫染色することによって検出されたものである。対照Ｆｃ融合蛋白質(ＣＤ２８・Ｆｃγ1)をＢ７−１・Ｆｃγ1と置き換えた場合、ＢＢ−１結合は全く観察されず、ＢＢ−１ ｍＡｂのＢ７−１特異性を立証している。誘導体化されていない蛋白質ＡをＢ７−１・Ｆｃγ1と置き換えた場合、ＢＢ−１結合は全く観察されず、融合蛋白質の結合については、脂質の固定に依存することを示している。
【００６７】
細胞表面に外生的に(exogenously)一体化されたＢ７−１・Ｆｃγ1の定量
ヒトＢ７−１・Ｆｃγ1を、ヨウ素ビーズ[Pierce, Rockford]を使用し、製造業者のプロトコルに基づいてヨウ化し、標識蛋白質を、Sephadex G-25カラム[Pharmacia, Piscataway, NJ]で精製した。標識されていないＢ７−１・Ｆｃγ1を添加することにより、特異性を、２.１×１０6ｃｐｍ／μｇに調整した。蛋白質の移行は、前述のとおり行ない、標識蛋白質と置き換えた。実験は全て２回行なった。非特異性結合を制御するために、標識されていないヒトＩｇＧ(Sigma)を過剰に添加し、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の蛋白質Ａへの結合を特異的に阻止した。洗浄を繰り返して行なった後、ガンマカウンター[1272 Clinigamma; LKB Instruments, Gaithersburg, MD]を用いて、細胞ペレットのカウントを決定した。Ｂ７−１・Ｆｃγ1の特異的結合後のカウントは、ヒトＩｇＧで得られた非特異的カウントを差し引くことによって算出した。単細胞の分子の平均数は、式Ａ×Ｂ-1×Ｃ-1×ＮAによって計算した。なお、前記式中、Ａは細胞ペレット中の定められた放射活性(ｃｐｍ)、Ｂはｃｐｍ／ｍｏｌで表した標識蛋白質の比活性、Ｃは細胞ペレット中の細胞数、ＮAはアボガドロ定数である。
【００６８】
図３Ｂに示されるように、Ｋ５６２細胞が過剰のｐａｌ−ｐｒｏｔＡ(３３μｇ／ｍｌ)で予めコーティングされているとき、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の表面状態は、添加されたＢ７−１・Ｆｃγ1の濃度に依存した。表面Ｂ７−１のエピトープレベルは、３３μｇ／ｍｌでプラトーに達し、エピトープ密度は、Ｂ７−１がトランスフェクトされたＫ５６２細胞のものと同様であった(データは示さず)。ペイントされた１細胞あたりのＢ７−１・Ｆｃγ1の平均数は、125Ｉ標識Ｂ７−１・Ｆｃγ1を使用して決定した。表１に示されるように、ペイント工程中に試薬濃度が増したので、Ｋ５６２細胞は、増加した量のＢ７−１・Ｆｃγ1を取り込んだ。
【００６９】
【表１】
2005533516.tif 000002
【００７０】
使用した最低濃度(０.０３３μｇ／ｍｌ)では、約４６０の分子が、各々のＫ５６２細胞に固定された。最高濃度(３.３μｇ／ｍｌ)では、約４６００００のＢ７−１・Ｆｃγ1の分子が結合された。総合すれば、これらのデータは、Ｂ７−１・Ｆｃγ1が定量的にｐａｌ−ｐｒｏｔＡに適用可能であることを示している。
【００７１】
増殖アッセイ
Ficolle密度遠心法により、新鮮な全血からＰＢＭＣを単離した。Ｔ細胞は、Lympho-kwik[one lambda, Canoga Park, CA]で２度処理し、精製した。Ｔ細胞の純度は、アクセサリー細胞が不存在下で、フィトヘムアグルチン(「ＰＨＡ」)又はＰＭＡに対する増殖反応の欠如によって確認された。ヒトＣＤ３特異的ｍＡｂ ＨＩＴ３ａ[PharMingen]は、所定濃度で９６ウェルプレートに付着され、この形態にて、第１活性化シグナルをＴ細胞に供給するために用いられた。或はまた、第１シグナル源として、ＰＨＡを可溶形態で使用することもできる。ネガティブコントロール・ベクターｐＲＥＰ７β(Ｋ５６２／ｐＲＥＰ７β)でトランスフェクトされたＫ５６２細胞は、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡで予めコートされ、Ｂ７−１・Ｆｃγ１で二次コートされる。各々の増殖アッセイのために、１×１０5のＴ細胞を、４×１０4のＢ７−１・Ｆｃγ1でコーティングし、且つマイトマイシンＣで処理されたＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞と共に、３７℃で６０時間培養した。ウェルには、培養中の最後の１６時間、１μＣｉ[3Ｈ]チミジンでパルスを与えた。細胞を取り出し、Betaplateの液体シンチレーションカウンタで計数した。
【００７２】
増殖アッセイにおいて、ＰＨＡと、Ｂ７−１・Ｆｃγ1がコートされたＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞(即ち、ｐＲＥＰ７β ＥＢＶエピソーム発現ベクターでしっかりとトランスフェクトされたＫ５６２細胞)を使用して、夫々、第１シグナルと第２シグナルをＴ細胞に供給した。Ｋ５６２／ＲＥＰ７β細胞は、検出可能なＢ７−１が欠如しており(データは示さず)、Ｋ５６２／Ｂ７−１でトランスフェクトされた細胞(即ち、ヒトＢ７−１ ｃＤＮＡ配列を含むｐＲＥＰ７βベクターで安定にトランスフェクトされたＫ５６２細胞)を使用する実験のために好適なネガティブコントロールを提供する。Ｋ５６２／Ｂ７−１でトランスフェクトされた細胞及びＢ７−１・Ｆｃγ1でコートされたＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞の表面Ｂ７−１レベルは免疫染色によって決定され、平均蛍光強度は、夫々、５５０ｎｍと４５０ｎｍであった。図４Ａに示されるように、最適以下(sub-optimal)のＰＨＡ濃度(＜０.５μｇ／ｍｌ)の存在下で、Ｂ７−１・Ｆｃγ1でコートされたＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞は、Ｔ細胞の増殖を著しく高めたが、Ｋ５６２／ＲＥＰ７β細胞はそうではなかった。共刺激作用は、Ｋ５６２／Ｂ７−１でトランスフェクトされた細胞で達成されたものと同様であった。観察された共刺激のＢ７−１・Ｆｃγ1／ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ依存性は、(誘導体化されていない)蛋白質ＡとＢ７−１・Ｆｃγ1の組合せ、又はｐａｌ−ｐｒｏｔＡと対照ＣＤ８・Ｆｃγ1の組合せで処理された細胞は、Ｔ細胞の増殖を促進しなかったことにより確認された。より高濃度のＰＨＡ(＞１μｇ／ｍｌ)の存在下では、Ｋ５６２／ＲＥＰ７β細胞も、Ｔ細胞の増殖を促進したが、Ｂ７−１陽性細胞よりその増殖度は少なかった。
【００７３】
細胞に関連づけされたＢ７−１・Ｆｃγ1の共刺激機能をさらに確認するために、プレート結合された抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂを、より生理学的な第１シグナルとしてＰＨＡと置換した増殖アッセイを行なった。このセッティングにおいて、最適以下濃度の抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ(＜１０μｇ／ｍｌ)の存在下にて、図４Ｂに示されるように、細胞に関連づけされたＢ７−１・Ｆｃγ1は、トランスフェクトされた細胞上で同レベルで発現した天然Ｂ７−１よりも、さらに効果的に共刺激を示した。ここでもまた、ネガティブコントロールのＦｃ融合蛋白質として使用されたＣＤ８・Ｆｃγ1は、同じ条件下で共刺激を示さなかった。総合すれば、これらの結果は、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡを通じて膜に結合されたＢ７−１・Ｆｃγ1は、Ｔ細胞の増殖を効果的に共刺激することを示している。
【００７４】
アクセサリー細胞の効果的な減少は、共刺激源の不存在下で、ＰＭＡ又はＰＨＡに対する反応の欠如を示すことにより、すべてのＴ細胞調製物において立証されている。図４Ａ及び図４Ｂのプロットされた値は、３つの試料の平均値とＳＥｓ(標準誤差)である。データは、同様な結果をもつ少なくとも３回の独立した実験の結果を表している。
【００７５】
細胞に関連づけされた(cell-associated)Ｂ７−１・Ｆｃγ1§ｓの共刺激活性の濃度依存性
効果的な共刺激体蛋白質移行法について、Ｂ７−１共刺激の定量性を評価した。この目的のために、Ｔ細胞の増殖アッセイを、様々な濃度のＢ７−１・Ｆｃγ1がペイントされたＫ５６２／ＲＥＰ７Ｂを使用して行なった。Ｂ７−１・Ｆｃγ1を介在した共刺激の濃度依存性は、図５Ａに示されるように、ＰＨＡの一定の最適以下濃度(０.２５又は０.１５μｇ／ｍｌ)が第１シグナルの供給源として用いられた時に容易に立証されることができた。例えば、ＰＨＡ０.１５μｇ／ｍｌの存在下で、Ｔ細胞の増殖は、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の閾値濃度(０.１μｇ／ｍｌ)に達するとすぐに観察され、増殖レベルは、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の濃度の増加と共に上昇し、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の濃度が約３.３μｇ／ｍｌのプラトーに達するまで上昇し続けた。低濃度のＰＨＡ(０.２５μｇ／ｍｌ)の存在下で、Ｔ細胞の増殖は、Ｂ７−１・Ｆｃγ1が高閾値濃度(１μｇ／ｍｌ)に達した時、共刺激体の閾値は、第１シグナルの強度によって調節されることを示すことが観察された。
【００７６】
図５Ｂに示されるように、ＰＨＡの代わりに、抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂを第１シグナルの供給源として使用した場合にも、同様な結果が得られた。この場合にも、一定の最適以下濃度のプレート結合された抗ＣＤ３ ｍＡｂ(０.３７又は１.１μｇ／ｍｌ)の存在下で、共刺激は、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の閾値濃度に達した後の場合にだけ観察され、また、増殖は投与量に依存してさらに増加することが観察された。それゆえ、最適以下の第１シグナルの存在下では(ＰＨＡ又は抗ＣＤ３ ｍＡｂのどちらの場合も)、Ｂ７の閾値レベルは、Ｔ細胞を増殖させるのに必要であり、Ｔ細胞の増殖の程度は、共刺激体のレベルによって決定される。
【００７７】
分泌されたサイトカインのＥＬＩＳＡ測定と、個々のサイトカイン応答についてのＢ７−１共刺激閾値の階層の決定
プレート結合されたＨＩＴ３Ａ又はＰＨＡのどちらかを第１シグナル源として使用し、４８ウエルプレートの中で、合計１０6のＴ細胞を、５×１０5の処理済みＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞(Ｂ７−１・Ｆｃγ1陽性又は陰性)と共に培養した。４８時間後に浮遊物を回収した後、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトＩＦＮ−γ及びＩＬ−２に対するＥＬＩＳＡ検査を、製造業者のプロトコール[Genzyme, Cambridge, MA]に基づいて実施した。より具体的に説明すると、ＥＬＩＳＡを使用して、様々な濃度でペイントされたＢ７−１・Ｆｃγ1と一定の最適以下濃度の一次刺激体(primary stimulus)に反応するＴ細胞のサイトカイン分泌を測定した。ＰＨＡ投与量が一定のとき、最小及び最大のサイトカイン応答を引き出すＢ７−１・Ｆｃγ1の濃度は、図６Ａに示されるように、一般的な階層がＩＦＮ−γ＜ＩＬ−２であるＩＦＮ−γとＩＬ−２とは異なる。サイトカイン応答に関する同様な階層は、図６Ｂに示されるように、抗ＣＤ３ ｍＡｂ(３.３μｇ／ｍｌ)が第１シグナル源として使用された場合に観察された。例えば、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の濃度が０.３３μｇ／ｍｌのとき、ＩＦＮ−γのアウトプットは最大応答の６０％であったが、ＩＬ−２のアウトプットは、基礎レベル(basal levels)を超える増加を示さなかった(図６Ｂ)。
【００７８】
Ｂ７−１の共刺激閾値に関して観察された階層ＩＦＮ−γ＞ＩＬ−２は、ＴＣＲ活性閾値について記載した順序に一致する。Ｂ７−１のレベルは、Ｔ細胞の増殖反応の程度を調節できることを立証したが、活性化されたＴ細胞によって産生されるサイトカインの比率を変えることにより、Ｂ７−１のレベルもまた、免疫応答の質を決定することができる。
【００７９】
細胞間サイトカイン産生の分析と、単細胞レベルでのサイトカイン応答に関する階層的共刺激閾値の証拠の評価
バルクＴ細胞集団でのＥＬＩＳＡ結果を実証するために、マルチパラメータ流動細胞分析を行なって、個々の細胞内の細胞間ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２のレベルを評価した。合計１０6のＴ細胞を、４８ウェルプレートの中で、５×１０5のＢ７−１・Ｆｃγ1がコートされたＫ５６２／ＲＥＰ７β細胞と共に４８時間培養した。この場合もまた、プレートに結合されたＨＩＴ３Ａ又はＰＨＡのどちらかを第１シグナル源として使用した。モネシン[sigma]を、最終濃度が３μｍになるまで添加し、その混合物をさらに６時間培養して、細胞内にサイトカインを蓄積した。その後細胞を回収し、１００μｌの固定化溶液[４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ(ｐＨ７.４)]の中の氷上で２０分間培養することによって固定化させた。次に、染色用緩衝液(０.１％サポニン／１％加熱不活性化ＦＣＳ／０.１％アジ化ナトリウム／ダルベッコのＰＢＳ)で２回洗浄した。細胞間サイトカインに対する免疫染色は、０.５μｇのＦＩＴＣ-抗-ＩＦＮ-γと０.５μｇのＰＥ-抗ＩＬ-２Ａｂｓ[PharMingen]を含有する１００μｌの染色緩衝液で、氷上にて１時間培養することによって行なった。その後、細胞をサポニンを含まない染色緩衝液で１回洗浄した。Ｔ細胞は、前方散乱光パラメータ／側方散乱光パラメータを使用してゲーティングされ(gated)、夫々、２〜５×１０4の細胞が分析された。
【００８０】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1の濃度が低い時は、Ｔ細胞の応答は、ＩＦＮ-γ単独のプロデューサで支配されたが、Ｂ７−１・Ｆｃγ1の濃度が高くなると、相当数のＩＦＮ-γとＩＬ-２との２つのプロデューサが出現した(図７)。相対的に少ないＩＬ-２単独のプロデューサは、Ｂ７−１・Ｆｃγ1が高濃度の時でも観察された。これらの結果は、バルクＴ細胞のサイトカイン応答データと一致しており、ＩＦＮ-β応答は、ＩＬ-２応答よりもＢ７-１共刺激体の必要性が少ないことを示している。
【００８１】
＜実施例２＞
膜が結合された蛋白質Ａに対する温度の影響を調べた。Ｔ細胞を準備するために、移行した蛋白質は、生体内で細胞結合状態が維持されなければならず、これには、共刺激体の安定した結合が少なくとも数時間持続する必要がある。脂質化蛋白質が細胞膜へ移行する反応温度は、蛋白質が膜上で長時間保持するのに大きな影響を与えることがわかった。蛋白質移行反応は４℃、２５℃及び３７℃で行ない、パルミチン酸化された蛋白質ＡはＫ５６２細胞へ移行した。ｈＢ７−１・Ｆｃは、125Ｉの標識が付されて、実施例１と同じ方法で、蛋白質Ａがコートされた細胞へ移行した。エンドサイトーシスの干渉が４℃以上の温度で起こる可能性があるので、これを防止するために、細胞は、移行反応前に代謝阻害剤のアジ化ナトリウム及び２−デオキシグルコースで処理した。
【００８２】
移行した蛋白質が細胞膜上で長時間保持されているかどうかを調べるために、細胞を十分に洗浄して、結合されていない蛋白質を取り除き、その後、１０％ウシ胎仔血清が含まれるＤＭＥＭ培地の懸濁環境下で、３７℃で最長３日間培養した。数回の間隔で、懸濁液のアリコートを採取し、細胞をペレット化した。細胞ペレット内に残存している放射性ラベルの量を、アリコート中の放射活性カウントの合計量と比較した。この２つの比は、移行蛋白質が細胞上にまだ保持されている相対部分として算出された。図８に示されるように、蛋白質移行の反応温度が高いほど、長時間の保持率は向上し、反応温度と保持時間との間に直接関係があることを示している。さらに重要なことは、移行温度を４℃から３７℃に上げることにより、移行した蛋白質は、(最初の６時間の後)有意的な損失を伴わずに、３７℃の生理的温度で３日間、膜の結合状態が維持されることである。
【００８３】
＜実施例３＞
インディアナポリスのHarlen(米国)から購入したＣｍＨ／ＨｅＮマウスについて、Avranham Hochberg, Hadassah University Hospitalから入手したＴ−５０細胞株から生成された細胞ワクチンで免疫した。ワクチンは、パルミチン酸化された蛋白質Ａと、ｍＢ７−１・Ｆｃ、ｍ４＝１ＢＢＬ・Ｆｃ及びｈＣＤ４０Ｌ・Ｆｃ融合蛋白質を使用し、実施例１に概略的に説明した方法に基づいて調製した。細胞には、４０×１０6の細胞につき蛋白質Ａ４０μｇの比率で、３７℃にて、脂質化蛋白質のコーティングを形成した。細胞は、次に、４×１０7の細胞につき蛋白質合計４０μｇの比率で、４℃にて、３種類の融合蛋白質の等量混合物と共に培養した。細胞ワクチンをマウスに皮下注射した。投与量は、１回の注入が１０6の細胞である。注入は週に１回行ない、３週間続けた。最後の注入の１週間後、マウスは、１０6の野生型Ｔ−５０腫瘍細胞でチャレンジさせられ、後側の横腹に皮内注射した。図９に示すように、細胞ワクチンは、免疫された動物の生存率を向上させた。図９中、白丸は、処理されていない対照群(ｎ＝６)、四角は、蛋白質Ａの移行によって生成された対照ワクチンが投与された他の対照群(ｎ＝５)、黒丸は、免疫共刺激蛋白質Ｂ７−１、４−１ＢＢＬ及びＣＤ４０Ｌを蛋白質Ａと共に蛋白質移行させて生成した細胞ワクチンが投与されたテスト群(ｎ＝６)である。
【００８４】
＜実施例４＞
ＤＢＡ／２Ｊマウスを、メインのThe Jackson Laboratoryから購入した。マウスに、致死量のＬ５１７８Ｙ−Ｒ腫瘍細胞を皮内接種し、腫瘍接種後第５、６及び７日目に治療のために細胞ワクチンを皮下注射した。ここでは、実施例３と同じ細胞ワクチンを使用し、注射１回当たり１０6の細胞を投与した。図１０は、細胞ワクチンにより、治療を受けた動物の生存率が向上したことを示している。図１０において、白丸は、治療を受けていない対象群(ｎ＝８)、四角は、蛋白質Ａの移行によって生成された対照ワクチンの投与を受けた別の対照群(ｎ＝８)、黒丸は、脂質化蛋白質Ａと共に免疫共刺激性蛋白質を使用して蛋白質移行によって生成された細胞ワクチンの投与を受けたテスト群(ｎ＝８)である。
【００８５】
＜実施例５＞
パルミチン酸化蛋白質Ａと、ＦａｓＬ・Ｆｃ、Ｂ７−１・Ｆｃ、４−１ＢＢＬ・Ｆｃ及びＣＤ４０Ｌ・Ｆｃの融合蛋白質を使用し、これらを生体内で、脂質化蛋白質Ａを３部、各々の融合蛋白質を１部の割合で混合することにより、ワクチンを生成した。次に、蛋白質混合物を、蛋白質の合計で４μｇを腫瘍内の腫瘍部位に注入した。その後、ワクチンを、腫瘍へ直接注入した。ワクチン内の免疫共刺激蛋白質は、原位置の(in situ)腫瘍細胞の免疫原性特性を変化させた。
【００８６】
ＤＢＡマウスに、致死量のＬ５１７８Ｙ−Ｒ腫瘍細胞を皮内接種した。腫瘍塊の大きさが約５０ｍｍ2まで成長したとき、癌ワクチンを腫瘍部位へ直接注入した。ワクチンは、本発明の方法に基づいて、パルミチン酸化された蛋白質Ａと予め組み合わせられており、これにより、共刺激体が原位置の腫瘍細胞上で固定化する能力が付与される。図１１に示されるように、間接的に脂質化された共刺激因子で処理されたマウスの寿命は、有意的な延びを示した。図１１中、白丸は、無処理対象群(ｎ＝６)、四角は、脂質化蛋白質Ａだけが注入された別の対照群(ｎ＝７)、黒丸は、脂質化蛋白質Ａと共に免疫共刺激融合蛋白質が注入されたテスト群(ｎ＝７)である。
【００８７】
＜実施例６＞
ＦａｓＬ用の融合蛋白質を生成するために、ＡＴＣＣから入手したヒトＦｃγ１ドメインのコーディング配列を、報告された融合方法[Immunity, 5:163, 1996]に基づいて、ＦａｓＬの細胞外ドメインのコーディング配列のＮ−末端で融合させた。精製された融合蛋白質は、十分に機能的であり、これは、蛋白質Ａがコートされた細胞へ取り込まれた時に行なった標準のキリングアッセイ(killing assay)によってわかった。ＦａｓＬは、細胞表面蛋白質であり、例えば活性化Ｔ細胞のような他の細胞の表面に存在するＦａｓ等の他の蛋白質に結合する。ＦａｓＬがＦａｓと結合するとき、Ｆａｓを発現する細胞は、アポトーシスを起こす。なお、ＦａｓＬ・Ｆｃ融合蛋白質は、脂質化蛋白質Ａを通じて細胞表面に移行した後も、そのアポトーシス活性を維持したことは注目すべきことである。
【００８８】
Ｆｃ−ｈＦａｓＬ融合蛋白質が、細胞表面に固定された後、機能的であるかどうかをより具体的に判断するために、標準ＪＡＭアッセイを行なった。エフェクタ細胞は、パルミチン酸化蛋白質Ａ(ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ)でペイントされ、次にＦｃ融合蛋白質がペイントされたＣＨＯ細胞である。標的細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞であり、Ｆａｓを構成的に発現するので、Ｆａｓ／ＦａｓＬが介在したアポトーシスの影響を受け易い。標準のＪＡＭアッセイを、P. Matzinger[J. Immunol. Methods, 145:185-192, 1991]に記載されたプロトコルに基づいて行なった。簡単に説明すると、２×１０4の３Ｈ−チミジン−標識の標的Ｊｕｒｋａｔ細胞を、実施例１と同じように、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡが予めコートされた２×１０5のＣＨＯ細胞(ＡＴＣＣより入手)と共培養し(co-incubated)、次に、３０μｇ／ｍｌのＦｃ−ｈＦａｓＬ融合蛋白質又は対照融合蛋白質でペイントした。この細胞を、５％ＣＯ2の加湿されたインキュベータ内で、２００μｌのＲＰＭＩ−１０が入った９６ウェルプレートで３７℃にて１８時間共培養した。ＪＡＭテストのサンプル採取のために、細胞とそれらの培地を、ハーベスター(実施例１で増殖アッセイに使用)を使用してガラスファイバーフィルタの中に吸引した。特異的死亡率％は、(Ｓ−Ｅ)／Ｓ×１００に基づいて算出した。なお、Ｓ＝エフェクタ細胞無しの自然放出、Ｅ＝エフェクタ細胞の存在下での実験的放出である。
【００８９】
結果は図１２に示されている。ｐａｌ−ｐｒｏｔＡ及びＦｃ−ｈＦａｓＬがペイントされたＣＨＯ細胞をエフェクタ細胞として使用したものは、有意的な死亡が観察された。ネガティブコントロールとして、ＣＨＯ細胞がｐａｌ−ｐｒｏｔＡ及び対照Ｆｃ融合蛋白質(ｈＣＤ８０−Ｆｃ又はｈＣＤ２８−Ｆｃ)がペイントされたものは、特異的な死亡は観察されなかった。Ｆｃ−ｈＦａｓＬの表面固定の依存性は、ＣＨＯ細胞がパルミチン酸化されていない蛋白質Ａ及びＦｃ−ＦａｓＬがペイントされたネガティブコントロールによって確認された。死亡の特異性については、死亡が、ＦａｓＬを中和するｍＡｂ ＮＯＫ−１によって完全に阻止されたのに対し、対照Ａｂでは死亡が阻止されなかったことによって確認された。
【００９０】
これらの結果をまとめると、Ｆｃ−ｈＦａｓＬは、ｐａｌ−ｐｒｏｔＡを通じて細胞表面に移行した後、Ｆａｓ陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞内にアポトーシスを引き出す機能を持続することを示している。
【００９１】
上記の実施例は、本発明の方法の有効性を示すものである。脂質化蛋白質を使用することにより、融合蛋白質の細胞への移行は、生体外でも、又は生体内の原位置のまま(in situ)でも可能である。なお、これらの融合蛋白質は、移行後も、免疫調節機能を持続したことは注目すべきことである。実施例では、この機能は、免疫後のチャレンジに対しても、先に存在していた腫瘍に対しても持続されることを示している。この方法は、生体内と生体外の両方に有効である。
【００９２】
＜実施例７＞
以下の実施例では、Ｂ７−１・Ｆｃγ1とパルミチン酸化された蛋白質Ａの共役体がペイントされたマウス脾臓Ｔ細胞は、ＴＣＲの一次抗ＣＤ３ ｍＡｂのトリガリングに応答して、増殖能力が向上することを示している。
【００９３】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役と、Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬ：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役の膜結合
本発明は、純粋且つ均一なＢ７−１+又は４−１ＢＢＬ+のＴ細胞を生体外で産生するために、上記方法を始めてＴ細胞に適用したものである。マウスＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞を、ＤＢＡ／２Ｊマウス[Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME]の脾臓から精製し、パルミチン酸化された蛋白質Ａと、Ｆｃγ1−誘導体化されたＢ７−１、４−１ＢＢＬ及びＣＤ２８蛋白質(Ｂ７−１・Ｆｃγ1、Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬ及びＣＤ２８・Ｆｃγ1)とで、逐次的２段階にて、別々にペイントした。具体的には、精製された細胞を、パルミチン酸化された蛋白質Ａと混合し、ＤＭＥＭ１ｍｌあたり１０6の細胞につき３０μｇを、３７℃で１時間混合した。その細胞を洗浄し、再び、Ｂ７−１・Ｆｃγ1、Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬ又はＣＤ２８・Ｆｃγ1(ネガティブコントロールとして)と混合し、ＤＭＥＭ１ｍｌあたり１０6の細胞につき３０μｇを、４℃で０.５時間混合した。パルミチン酸化された蛋白質Ａの調製は上記のとおりである。Ｂ７−１・Ｆｃγ1、Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬ及びＣＤ２８・Ｆｃγ1の産生についても、以前に報告されている[Zheng, et al. Cancer Res., 61:8127(2001)]。
【００９４】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1がペイントされたＴ細胞について、一次Ａｂとしてのラット抗マウスＢ７−１ ｍＡｂ １Ｇ１０と、二次ＡｂとしてのＦＩＴＣ標識ゴート抗ラット共役[BD Pharmingen, San Diego, CA]とで免疫染色した後、フローサイトメトリーによって分析した。ネガティブコントロール・ラットＩｇＧ2aアイソタイプコントロールｍＡｂについてもBD Pharmingenより入手した。ラットＡｂは、蛋白質Ａに結合しないことは注目すべきである。細胞は、ＦＡＣＳＡＮ[Becton Dickinson, Mountain View, CA]で分析され、事象は生細胞上でゲーティングされた。
【００９５】
図１３Ａ(左側パネル)に示されるように、Ｂ７−１は、ＣＤ４+又はＣＤ８+のどちらの場合も、処理された細胞に対する有意的な陽性を示した。これに対し、Ｂ７−１エピトープは、処理されていない脾臓Ｔ細胞には検出されなかったし、パルミチン酸化された蛋白質Ａが欠如するか又は天然(パルミチン酸化されていない)蛋白質Ａが存在するときにＢ７−１・Ｆｃγ1融合蛋白質に曝露された細胞にも検出されなかった(データは示さず)。
【００９６】
このＴ細胞共刺激体ペイント方法の一般性を確認するために、上記の実験において、Ｂ７−１・Ｆｃγ1に代えてＦｃγ1・４−１ＢＢＬを使用した。４−１ＢＢＬがペイントされたＴ細胞は、ビオチン標識Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬで生成された。これは、その後で、蛍光タグ[BD Pharmingen, San Diego, CA]として使用したアビジン−ＦＩＴＣ共役を用いて検出された。図１３Ａ(右側パネル)に示されるように、ペインティング工程の後、ＣＤ４+Ｔ細胞とＣＤ８+Ｔ細胞の両方に対して、有意的レベルの４−１ＢＢＬリガンドエピトープが検出された。
【００９７】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役と、Ｆｃγ1・４−１ＢＢＬ：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役とでペイントされたマウス脾臓Ｔ細胞の増殖の促進
精製されたマウスＣＤ４+又はＣＤ８+脾臓Ｔ細胞を、Jackson Laboratory[Bar Harbor, ME]から購入したＤＢＡ／２Ｊの脾臓から調製した。細胞は、生体外で、Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役、又はＦｃγ1・４−１ＢＢＬ：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役でペイントされ、その後、最適以下の量のプレート結合されたラット抗マウスＣＤ３ ｍＡｂが入ったウェル(アクセサリー細胞は無し)の中でプレーティングされた。具体的には、Ｂ７−１又は４−１ＢＢＬでペイントされたマウスＴ細胞は、９６ウェルの平底プレートの中でプレーティングした。なお、前記プレートは、透析された(dialyzed)ラット抗マウスＣＤ３ ｍＡｂ[TK3; Serotec Ltd, Oxford, UK]を１μｇ／１ｍｌの割合で使用し、３７℃で３時間プレコートされている。細胞は、１ウェルにつき、ＲＰＭＩ １１６４培地に１０5の細胞で播種した。前記培地には、１０％ウシ胎仔血清、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ β−ＭＥが加えられている。４８時間後、培地に、3Ｈ−チミジンを１ウェル当たり１μＣｉ加え、６４時間後に細胞を回収した。3Ｈ−チミジンの結合は、β−Counterで分析した。
【００９８】
図１３Ｂに示されるように、Ｂ７−１がペイントされたＣＤ４+Ｔ細胞及び４−１ＢＢＬがペイントされたＣＤ８+Ｔ細胞を含み、様々な共刺激体がペイントされたＴ細胞は、全ては著しい増殖を示した(図２)。これに対し、例えば抗ＣＤ３ ｍＡｂで処理されたペイントされていないＴ細胞、Ｆｃγ1誘導体化されたマウスＣＤ２８でペイントされたＴ細胞(共刺激体でない対照)、パルミチン酸化された蛋白質Ａに代えて自然(脂質化されていない)蛋白質Ａで処理されたＴ細胞、共刺激体でペイントされたが抗ＣＤ３ ｍＡｂが不存在のＴ細胞を含む種々の対照については、殆ど増殖は認められなかった。
【００９９】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役でペイントされたマウスＥＬ−４Ｔ細胞のＩＬ−２産生の促進
精製されたＴ細胞調製物にある汚染物質ＡＰＣは、観察された増殖反応に無関係であることをさらに確認するために、均質なＥＬ−４Ｔリンパ腫株を試験した。ＥＬ−４細胞は、培地中で自然増殖するので、ＩＬ−２の分泌を、刺激の代替読み出し手段として使用した。ＥＬ−４細胞を、Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａの共役体でペイントし、９６ウェルの平底プレートの中でプレーティングした。前記プレートには、プレート結合された抗ＣＤ３ ｍＡｂ(図示せず)又はコンカナバリンＡのどちらかが、マイトジェン(mitogen)として、量を少なくして含まれている。条件培地は、１２時間後に取り出しで、市販のＥＬＩＳＡキット[R&D Systems, Minneapolis, MN]を使用し、製造業者のプロトコルに基づいてＩＬ−２を分析した。図１４Ａに示されるように、Ｂ７−１でペイントされたＥＬ−４細胞は、これらの最適以下のマイトジェン刺激条件下で、ペイントされていないコントロール細胞と比べて、より多くのＩＬ−２を分泌した。
【０１００】
精製されたヒトＴ細胞であって、Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体でペイントされた細胞の増殖の促進
この結果をマウス細胞の他にも拡大するために、ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を、健康なドナーの末梢血から調製した。Ｔ細胞は全て、製造業者のインストラクション[Miltenyi Biotec, Auburn, CA]に基づいて、磁気分離によって精製した。これらの細胞は、Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体でペイントされ、最適以下の抗ＣＤ３刺激の下で増殖を評価した。具体的に説明すると、プレートは、アジドを含まないマウス抗ヒトＣＤ３ ｍＡｂ[HIT3A; BD Pharmingen]を０.３μｇ／ｍｌ用いて、プレコートされた。
【０１０１】
図１４Ｂに示すように、Ｂ７−１がペイントされたヒトＣＤ４+Ｔ細胞は、それらのマウスの対応物と同様、抗ＣＤ３ ｍＡｂに依存する形で、顕著な増殖を示したが、ペイントされていない細胞や、対照がペイントされていない細胞は、ほとんど増殖を示さなかった。
【０１０２】
Ｂ７−１がペイントされたマウス脾臓Ｔ細胞の増殖促進のＣＤ２８依存性
Ｂ７−１がペイントされたマウス脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞に観察された共刺激性効果は、同じＴ細胞上でＢ７−１の類似レセプター、ＣＤ２８との結合に依存することを確認するために、共刺激体をペイントした後、ＣＤ２８-/-Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス[the Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEから購入]から精製した脾臓Ｔ細胞の増殖能力を評価した。細胞を処理し、上記の通り分析した。但し、ＣＤ２８-/-ＣＤ４+Ｔ細胞については、１２時間後3Ｈ−チミジンでパルスを与え、２４時間後に回収した点が異なる。
【０１０３】
図１５に示されるように、Ｂ７−１がペイントされたＣＤ２８-/-ノックアウト脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞は、野生型のＣＤ２８産生細胞の活発な増殖と比べて、増殖は認められなかった。ＣＤ２８-/-ノックアウト脾臓Ｔ細胞の生存可能性(viability)は、第２共刺激体４−１ＢＢＬでペイントされた後も良好な増殖を示したことによって確認されたことは注目されるべきである。
【０１０４】
＜実施例８＞
以下の実施例は、共刺激体がペイントされたＴ細胞は、生理学的な抗原刺激に対する増殖反応を向上させることを明らかにするものである。
【０１０５】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体のＤＯ１１.１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞表面での膜結合
ＯＶＡ323-339ペプチド抗原特異性を有するＤＯ１１.１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、一般的には、それらの増殖反応のためのアクセサリー細胞からの共刺激体シグナリングに依存する。発明者は、これらのＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の共刺激体ペインティングが、細胞間のトランス共刺激に対するアクセサリー細胞の依存性を回避できるかどうかを調べた。この目的のために、発明者は、精製された脾臓Ｔ細胞と、同系ＡＰＣ細胞株ＰＲＯ−ＩＡdを、前述したＢ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体と、別々にペイントした。図１６Ａに示されるように、両方の細胞集団とも、この処理の後、Ｂ７−１エピトープは相当レベルにあることを示した。
【０１０６】
Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体でペイントされたＤＯ１１.１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の特異性類似抗原に対する増殖の促進
Ｂ７−１でペイントされたＤＯ１１.１０ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞(天然ＰＲＯ−ＩＡd細胞と共に培養)について、ＯＶＡ323-339ペプチド抗原の濃度増加に対する増殖応答を、同じソース(Ｂ７−１・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体でペイントされたＰＲＯ−ＩＡd細胞と共に培養)のペイントされていないＴ細胞と比較した。両方の培地には、同数のＴ細胞が存在している。図１６Ｂに示されるように、抗原によって駆動される(antigen-driven)増殖は、Ｂ７−１がＴ細胞上に直接発現したときに、アクセサリー細胞と比べて、著しく向上した。
【０１０７】
＜実施例９＞
以下の実施例は、共刺激体がペイントされたＴ細胞の培地で観察された増殖促進に、自己刺激が大いに貢献することを明らかにするものである。
【０１０８】
シス自己刺激とトランス細胞間の共刺激の区別：マイトマイシンＣの阻害による細胞混合実験
共刺激体がペイントされた共刺激レセプター産生Ｔ細胞の同質集団(homogeneous population)の中に、共刺激について、トランス細胞間共刺激と、シス自己刺激の２つのモードが考えられる。この２つのモードを定量的に比較するために、発明者は、図１７Ａに示されるように、細胞混合に基づく実験法を考案した。マウス脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の調製物を２つに分け、半分は、増殖できないようにするためにマイトマイシンＣで処理し、残りの半分は、そのような処理をしなかった。次に、マイトマイシンで処理した細胞集団と処理しなかった細胞集団の夫々の半分について、共刺激体・Ｆｃγ1：パルミチン酸化された蛋白質Ａ共役体でペイントをした。
【０１０９】
これら４種類の細胞集団について、３種類の異なる細胞混合物Ａ、Ｂ及びＣを設定した。これら混合物の各々は、同数のマイトマイシンＣ不活性細胞と、処理していない活性細胞とを含んでいる。混合物Ａは、共刺激体がペイントされた不活性細胞と、ペイントされていない活性細胞とからなる。この混合物における増殖は、トランス細胞間の共刺激だけを示した。これに対し、混合物Ｂでは、増殖は、共刺激体がペイントされた活性細胞である。それゆえ、混合物Ｂの増殖は、細胞間トランス共刺激とシス自己刺激の両方から生じることがある。シス自己刺激のレベルは、混合物Ａ(シスのみ)の増殖から混合物Ｂ(トランス＋シス)の増殖を差し引くことによって算出することができる。
【０１１０】
図１７Ｂに示されるように、最適以下レベルの抗ＣＤ３ ｍＡｂ刺激が用いられた条件では、Ｂ７−１及び４−１ＢＢＬでペイントされたマウスＣＤ４+Ｔ細胞の両方について、混合物Ｂの方が、混合物Ａよりも実質的に多くの増殖が観察され、両方の共刺激体に対して実質的な自己刺激を示した。混合物Ｃは、マイトマイシンで処理された細胞でもなく、処理されていない細胞でもない対照であり、この培養システムにおける増殖の共刺激から独立したレベルのバックグラウンドレベルを提供した。図１７Ｃに示されるように、類似のヒトＣＤ４+Ｔ細胞共培養システムにおいて、有意的レベルのシス自己刺激が観察された。
【０１１１】
シス自己刺激とトランス細胞間共刺激の区別：ＣＦＳＥラベリングによる細胞混合実験
マイトマイシンＣの処理により、トランス細胞間共刺激が妨げられる可能性があり、これを除外するために、発明者は、代謝阻害剤を完全に排除した細胞混合プロトコルを考案した。この第２の細胞混合実験のために、発明者は、ＣＦＳＥラベリングを考えた。これは、ＣＦＳＥ蛍光の減少を追跡することによって増殖の定量が可能となり、それぞれの連続する細胞分裂が半減する。ＣＦＳＥラベリングについては、マウス脾臓ＣＤ４+Ｔ細胞は、８３ｎＭのＣＦＤＡＳＥ[Molecular Probes, Eugene, OR]が含まれるＰＢＳ中で、１ｍｌ当たり２.５×１０6の細胞で、室温にて３分間懸濁させた。反応は、ウシ胎仔血清を１０％まで加えた時に終了した。細胞は、使用前に、１０％ウシ胎仔血清、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０ｍＭ β−ＭＥが添加されたＲＰＭＩ １１６４培地にて２回洗浄した。
【０１１２】
ＣＦＳＥ実験に関する細胞混合スキームは、図１８Ａに示されている。この場合、混合物Ａは、ＣＦＳＥ標識細胞と、同数の共刺激体でペイントされた非標識細胞とからなり、最適以下レベルの抗ＣＤ３ ｍＡｂが入れられたウェルの中でプレーティングされている。それゆえ、この混合物の中でのＣＦＳＥラベリングの減少は全て、トランス細胞間共刺激を表すものである。混合物Ｂでは、共刺激体がペイントされるのはＣＦＳＥ標識細胞でああるから、トランス細胞間共刺激とシス自己刺激の両方があり得る。また、マイトマイシンＣ実験の場合と同じように、混合物Ｂ(トランス＋シス)とＢ(シスのみ)の増殖の差が、シス自己刺激の程度を示している。
【０１１３】
図１８Ｂに示されるように、６４時間のフローサイトメトリーでは、混合物Ｂは混合物Ａと比べて、ＣＦＳＥ蛍光細胞は実質的に少ないことから、その共培養物の中では、実質的にシス自己刺激であることが立証される。前述した様に、混合物Ａと混合物Ｃ(共刺激体が完全に欠如している)との比較により、実質的にトランス細胞間共刺激であることが立証される。このように、２種類の独立した細胞混合実験により、基本的なトランス細胞間共刺激と共に、有意義な自己刺激が立証される。
【０１１４】
＜実施例１０＞
以下の実験は、共刺激体がペイントされたＴ細胞の増殖反応に対する自己刺激の相対的な寄与は、Ｔ細胞を希釈することによって増すことを明らかにするものである。
【０１１５】
自己刺激現象をさらに確認するために、発明者は、細胞希釈分析を行なった。培地を希釈すると、細胞接触依存性であるトランス細胞間共刺激は、シス自己刺激と比べて、作用が著しく低下するはずだからである。図１９は、これは事実であることを示している。具体的に説明すると、末梢血から得たヒトＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、上記の如く、細胞混合物Ａ、Ｂ及びＣを生成した。混合物は、１ウェル当たり３×１０5細胞、又はその半分の濃度で１ウェル当たり１.５×１０5細胞でプレーティングした。この２倍希釈により、細胞混合物Ａ(トランス)の増殖活性は約５倍低下し、一方、細胞混合物Ｂ(トランス＋シス)は約１.３倍の低下に過ぎなかった。このように、トランス共刺激は、シス共刺激と比べて、細胞密度に優先的に反応する。この結果から、共刺激体がペイントされたＴ細胞は、シスモードとトランスモードの両方にシグナル伝達することができるが、それらシグナル伝達の相対的優先順序は(relative dominance)は、実験的設定条件に依存することはより明白である。
【０１１６】
上記の実施例は、本発明の自ら共刺激された細胞(異なる共刺激体；異なるスペシーズの細胞；異なるＴ細胞サブセットの細胞；一次細胞群と細胞株の両方)の一般性を明らかにするものであり、このクラスにおける機能的な自己共刺激細胞のシリーズに対してさらなる追加実験の必要性はないと考えられる。さらに、データは、蛋白質リガンドがペイントされた本発明の細胞は、自らを刺激することを示しており、その自己刺激は、ペイントされた蛋白質リガンドが、同じ細胞上の隣接する類似レセプターに結合することによって行なわれることを示している。
【０１１７】
本発明の実施例を例示を目的として説明したが、当該分野の専門家であれば、請求の範囲に規定された発明から逸脱することなく、本発明の詳細に関して多くの変更を成し得るであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】実施例１の方法に係るもので、脂質化蛋白質による細胞のコーティングの効果を示す図である。
【図１Ｂ】実施例１の方法に係るもので、脂質化蛋白質による細胞のコーティングの効果を示す図である。
【図１Ｃ】実施例１の方法に係るもので、脂質化蛋白質による細胞のコーティングの効果を示す図である。
【図２】実施例１の記載に基づいて調製された組換えＢ７−１・Ｆｃγ1のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図３Ａ】実施例１に記載されるように、本発明の方法が、融合蛋白質の移行を達成することを示す図である。
【図３Ｂ】実施例１に記載されるように、本発明の方法が、融合蛋白質の移行を定量的に達成することを示す図である。
【図４Ａ】実施例１に記載されるように、ＰＨＡを第１シグナルとして使用し、(表示された)様々な蛋白質の存在下でＴ細胞の増殖の刺激を示す図である。
【図４Ｂ】実施例１に記載されるように、抗ＣＤ３ ｍＡｂを第１シグナルとして使用し、(表示された)様々な蛋白質の存在下でＴ細胞の増殖の刺激を示す図である。
【図５Ａ】実施例１に記載されるように、ＰＨＡを第１シグナルとして使用し、Ｔ細胞の増殖に対するＢ７−１閾値濃度を示す図である。
【図５Ｂ】実施例１に記載されるように、抗ＣＤ３ ｍＡｂを第１シグナルとして使用し、Ｔ細胞の増殖に対するＢ７−１閾値濃度を示す図である。
【図６Ａ】実施例１に記載されるように、ＰＨＡを第１シグナルとして使用し、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−２の産生に対するＢ７濃度閾値の比較を示す図である。
【図６Ｂ】実施例１に記載されるように、抗ＣＤ３ ｍＡｂを第１シグナルとして使用し、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−２の産生に対するＢ７濃度閾値の比較を示す図である。
【図７】実施例１に記載されるように、ＩＦＮ−γ対ＩＬ−２に対するＢ７−１濃度閾値の単細胞比較分析を示す図である。
【図８】実施例２に記載されるように、蛋白質の移行中における移行蛋白質の安定性に対する反応温度の影響を示す図である。
【図９】実施例３に記載されるように、免疫後の腫瘍チャレンジからの患者保護について、本発明の癌ワクチンの有効性を示す図である。
【図１０】実施例４に記載されるように、予め存在する腫瘍の治療について、本発明の癌ワクチンの有効性を示す図である。
【図１１】実施例５に記載されるように、共刺激体の腫瘍内注入による本発明の癌ワクチンの有効性を示す図である。
【図１２】実施例６に記載されるように、ＪＡＭアッセイの結果を示す図である。
【図１３Ａ】実施例７の方法に係るもので、ＣＤ４+ラットＴ細胞とＣＤ８+ラットＴ細胞の両細胞に異なる２種類の共刺激体をペインティングしたときの効果と、共刺激体がペイントされたＴ細胞の増殖能力の向上を示す図である。
【図１３Ｂ】実施例７の方法に係るもので、ＣＤ４+ラットＴ細胞とＣＤ８+ラットＴ細胞の両細胞に異なる２種類の共刺激体をペインティングしたときの効果と、共刺激体がペイントされたＴ細胞の増殖能力の向上を示す図である。
【図１４Ａ】実施例７の方法に係るもので、共刺激体をペインティングした後、マウスＴ細胞株(ＥＬ−４)と精製ヒトＴ細胞の増殖能力の向上を示す図である。
【図１４Ｂ】実施例７の方法に係るもので、共刺激体をペインティングした後、マウスＴ細胞株(ＥＬ−４)と精製ヒトＴ細胞の増殖能力の向上を示す図である。
【図１５】実施例７の方法に係るもので、Ｂ７−１共刺激でペイントされたＴ細胞に観察された増殖促進のＣＤ２８依存性を示す図である。
【図１６Ａ】実施例８の方法に係るもので、共刺激体のペインティングにより、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、それらの特異的類似ペプチド抗原に対する増殖反応を促進させることを示す図である。
【図１６Ｂ】実施例８の方法に係るもので、共刺激体のペインティングにより、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、それらの特異的類似ペプチド抗原に対する増殖反応を促進させることを示す図である。
【図１７Ａ】実施例９の方法に係るもので、(マイトマイシンＣで阻害された細胞を利用する)細胞混合実験によって、自己による共刺激が、共刺激体がペイントされた細胞の増殖促進に寄与する主たる要因であることを示す図である。
【図１７Ｂ】実施例９の方法に係るもので、(マイトマイシンＣで阻害された細胞を利用する)細胞混合実験によって、自己による共刺激が、共刺激体がペイントされた細胞の増殖促進に寄与する主たる要因であることを示す図である。
【図１７Ｃ】実施例９の方法に係るもので、(マイトマイシンＣで阻害された細胞を利用する)細胞混合実験によって、自己による共刺激が、共刺激体がペイントされた細胞の増殖促進に寄与する主たる要因であることを示す図である。
【図１８Ａ】実施例９の方法に係るもので、(ＣＦＳＥが標識された細胞を利用する)細胞混合実験によって、自己による共刺激が、共刺激体がペイントされた細胞の増殖促進に寄与する主たる要因であることを示す図である。
【図１８Ｂ】実施例９の方法に係るもので、(ＣＦＳＥが標識された細胞を利用する)細胞混合実験によって、自己による共刺激が、共刺激体がペイントされた細胞の増殖促進に寄与する主たる要因であることを示す図である。
【図１９】実施例１０の方法に係るもので、共刺激体がペイントされたＴ細胞の培養において、細胞が希釈されると、シス自己共刺激は、細胞間トランス共刺激よりも、相対的寄与は増加することを示す図である。
【図１Ａ】
2005533516.tif 000003
【図１Ｂ】
2005533516.tif 000004
【図１Ｃ】
2005533516.tif 000005
【図２】
2005533516.tif 000006
【図３Ａ】
2005533516.tif 000007
【図３Ｂ】
2005533516.tif 000008
【図４Ａ】
2005533516.tif 000009
【図４Ｂ】
2005533516.tif 000010
【図５Ａ】
2005533516.tif 000011
【図５Ｂ】
2005533516.tif 000012
【図６Ａ】
2005533516.tif 000013
【図６Ｂ】
2005533516.tif 000014
【図７】
2005533516.tif 000015
【図８】
2005533516.tif 000016
【図９】
2005533516.tif 000017
【図１０】
2005533516.tif 000018
【図１１】
2005533516.tif 000019
【図１２】
2005533516.tif 000020
【図１３Ａ】
2005533516.tif 000021
【図１３Ｂ】
2005533516.tif 000022
【図１４Ａ】
2005533516.tif 000023
【図１４Ｂ】
2005533516.tif 000024
【図１５】
2005533516.tif 000025
【図１６Ａ】
2005533516.tif 000026
【図１６Ｂ】
2005533516.tif 000027
【図１７Ａ】
2005533516.tif 000028
【図１７Ｂ】
2005533516.tif 000029
【図１７Ｃ】
2005533516.tif 000030
【図１８Ａ】
2005533516.tif 000031
【図１８Ｂ】
2005533516.tif 000032
【図１９】
2005533516.tif 000033
【国際調査報告】
2005533516.tif 000034