(57)【要約】本発明は、４次元パラメーターを用いたDNAチップ上での核酸ハイブリダイゼーションの検出のための方法を提供するためのものである。DNAチップ上でのハイブリダイゼーションを検出するための３Dパラメーターを用いる従来の方法に基づいて、本発明は、ハイブリダイゼーション温度の上昇で生じた二本鎖オリゴ核酸において蛍光標識の蛍光強度の変化を走査することにより融解温度を決定するために温度を４番目のパラメーターとして導入する。チップ上で基準となる各プローブの本来の融解温度と測定された融解温度を比較することは、サンプル中の一本鎖核酸の本来の特性の理解を得るために用いられる。この装置は、DNAチップを内蔵した透明なガラスチャンバーから構成され、その中には温度センサー及び熱循環装置を有する。本発明は、複雑なサンプル中において遺伝子を検出するための独特で高感度あり操作が容易な方法を提供する。本発明で用いられる装置は単純であり、低コストで各種のDNAチップと組み合わせて用いることができる。
2005519642.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４次元パラメーターを用いたDNAチップ上の核酸ハイブリダイゼーションの検出方法であって、
（１）温度調節チャンバー内にDNAチップを置き、
（２）一本鎖標的ポリヌクレオチド配列と、二本鎖挿入用蛍光色素を含む反応液とを、前記温度調節チャンバー内に置かれたDNAチップに注入し、チップ上のプローブと、一本鎖標的ポリヌクレオチド配列がハイブリダイズするように、アニーリング温度（Th）まで温度を下げ、その結果、蛍光色素によって、二本鎖核酸の標識が行われ、
（３）０．００１から１℃／秒の速度でＴｈから１００℃の範囲で装置内の温度を上昇させ、その間、前記チップは、蛍光強度Fを得るためにΔＴ℃上昇する毎にスキャナーによって走査され、
装置内の温度が融解温度Ｔｍに達する時、二本鎖は分離し、蛍光色素は緩衝液中に拡散し、蛍光強度が急激に失われ、
チップ上の全プローブの蛍光強度の走査により、滑らかに続く二本鎖核酸鎖の解離曲線上或いは、その微分曲線上の変わり点を記録し、この微分曲線は、曲線の頂点で二本鎖DNAのTm値を示しており、
上記Ｔｍ値と、計算された既知の塩基配列のＴｍ値とを比較することにより、表面のプローブとハイブリダイズする一本鎖標的ポリヌクレオチド配列の特性が分かる、
からなる過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
蛍光色素のない緩衝液で余分な標的ポリヌクレオチド鎖及び反応液を除去するためにアニーリング温度での洗浄過程が、前記過程（２）に含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アニーリング温度Ｔｈが、４から８９℃であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記融解温度Tｍが、８から１００℃であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記温度上昇速度が、０．０１−１℃／秒であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
二本鎖挿入用蛍光色素の反応液がモレキュラープローブ（Molecular Probe）社製のサイバーグリーン（SYBR Green）I、サイバーグリーン２或いはサイバーゴールド（SYBR Gold）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡチップのための容器（１）と、ＤＮＡチップ（２）と、温度調節熱循環装置（３）と、緩衝液入力口（５）と、出口（７）を含む４次元パラメーターを用いたDNAチップ上での核酸ハイブリダイゼーションを検出するための装置であって、前記ＤＮＡチップ（２）が、前記温度調節熱循環装置（３）に接続される前記容器内（１）に置かれることを特徴とする装置。
【請求項８】
前記温度調節熱循環装置（３）が、温度センサー（４）、熱循環装置（８）及び温度調節装置（６）を含み、また該温度センサー（４）が該温度調節装置（６）と接続し、該温度調節装置（６）が熱循環装置（８）と接続されることを特徴とする請求項７記載の装置。
【請求項９】
DNAサンプルを分析、分離するために用いることができる、４次元パラメーターを用いたDNAチップ上で核酸ハイブリダイゼーションを検出するための請求項７記載の装置。
【請求項１０】
RNAサンプルを分析、分離するために用いることができる、４次元パラメーターを用いたRNAチップ上で核酸ハイブリダイゼーションを検出するための請求項７記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、４次元パラメーターを用いたDNAチップ上での核酸ハイブリダイゼーションを検出するための特定の方法及び装置に重点を置いた遺伝子検出技術に関する。
【０００２】
（発明の背景）
１９５３年に、ワトソンとクリックが二本鎖DNAの概念を提案した。
彼らは、以下の４つの重大な発見をした（１）DNA分子は逆方向を有する平行の二本鎖ポリ核酸鎖から構成される。（２）４つの塩基の組み合わせに関して法則が存在する。チャーガフ（Chargaff）等が、クロマトグラフにより多くの生物からDNA分子の塩基組成を分析し、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の塩基数は等しく、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の塩基数もまた等しいことを発見した。よって彼らは４種類の可能性のある塩基対Ａ−Ｔ、Ｔ−Ａ、Ｇ−Ｃ及びＣ−Ｇを提案した。（３）二本鎖の結合は水素結合を通して行われ、塩基対の表面は軸を通過し、軸に対しておおよそ垂直となる。Ａ−Ｔ対の間には２つの水素結合が形成され、Ｇ−Ｃ対の間には３つの水素結合が形成される。一方、塩基の疎水性の力は、DNAの二重らせんを安定させるためにも貢献する。（４）全ての塩基対がこれら法則に従うので、各鎖は任意の配列を有することができる。しかしながら、一度１つの鎖の配列が決定したならば、もう一方の鎖の配列は対応するヌクレオチド配列を持たなければならない。
【０００３】
ＤＮＡの二重らせんは、水素結合と疎水性の力の両方により維持されるため、それらの結合を破壊できるような加熱、ｐＨ、有機溶剤等は、二本鎖DNAを変性させ、一本鎖DNAにする。
変性した一本鎖DNAが、塩基対の結合を通してアニーリングすることは、ハイブリダイゼーションと呼ばれる。ハイブリダイゼーションは、相同なDNA分子、及び、相同なＤＮＡとＲＮＡ分子の間でも起きる。
ハイブリダイゼーションの間、２本の相補的な一本鎖DNA鎖が非共有結合を通して二本鎖ハイブリッドを形成する。一本鎖の塩基配列が既知である場合、ハイブリダイゼーションによって、未知のサンプルDNAにおいて既知の塩基配列に相補的なDNA配列の存在を検出することができる。
【０００４】
上記の原理に基づき、数多くの遺伝子関連製品が開発され、その中で遺伝子センサーには多くの応用例がある。
【０００５】
近年、DNAセンサー（DNA或いは核酸センサー）の研究は、開発競争の激しい研究分野となった。単純で速く、低コストの検出方法である遺伝子センサーには、分子生物学、医学分析及び環境モニタリングの分野において、多くの潜在的な応用の見込みがある。また遺伝子センサーは、塩基配列分析、変異検出、遺伝子検出及び臨床診断に加え、DNA薬品の研究、蛋白質と蛋白質の相互作用に応用することもできる。
【０００６】
非均一なシステムにおけるDNA配列の分析のための遺伝子解析法は、現在、DNAハイブリダイゼーションを通して行われているものである。ハイブリダイゼーションは、相同なDNA分子及び相同なＤＮＡとＲＮＡ分子の間でも起きる。
ハイブリダイゼーションの間、２本の相補的な一本鎖DNA鎖が非共有結合を通して二本鎖ハイブリッドを形成する。一本鎖の塩基配列が既知である場合、ハイブリダイゼーションによって、未知のサンプルDNAにおいて既知の塩基配列に相補的なDNA配列の存在を検出することができる。
液相中の求められるDNA分子の存在を検出するために最もよく用いられる方法は、既知の塩基配列情報を持つ一本鎖DNAを固体物質の表面上に固定し、サンプル緩衝液中に含まれる相補的な配列を持つ一本鎖DNAとハイブリダイズさせる方法である。
【０００７】
近年、このような研究はますます進んでおり、ハイブリダイゼーションによるDNA検出は重要な価値がある。主な応用分野は、臨床診断、法医科学、食品産業、生化学、環境保護等である。
遺伝子の検出方法がビオチン、ジゴキシン及び蛍光性色素等の非放射性標識の使用の応用によってより便利で安全になる。
特にPCR技術の応用は、この方法をより高感度にすることができる。
【０００８】
従来技術のDNAハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション信号を検出するために、生体内でのハイブリダイゼーションを検出することができ、かつ高い感度を達成できるDNAを標識する手順を必要とする。例えば、PCR技術ならばｎｍｏｌ／ｌの範囲の検出限界を達成することができる。
またバイオインフォマティクスは、特定のDNA配列をDNAの複雑な混合物から検出するための方法を提供する。短波長の蛍光と共焦点顕微鏡の利用により、蛍光標識は、微量のDNA分子の検出のための通常の方法となっている。
現行の蛍光標識の方法として、DNAチップ（遺伝子チップ又は、DNAマイクロアレイ）は、例えばアフィメトリックス・ジーン・チップ（Affymetrix Gnene Chip）社製のＸＹＺ３次元パラメーターのみを含む。これらチップ上で、オリゴ核酸プローブは、ガラス表面に固定され、これらの塩基組成及び鎖の長さはＸＹＺ３次元のパラメーターで表記することができる。
一本鎖標的ポリヌクレオチド配列は、蛍光色素によって直接、標識され、チップ上のプローブにハイブリダイズされ、二本鎖DNAを形成する。その後、サンプル情報を得るためにスキャナーを使って検出される。
米国特許第5,445,934号及び第5,744,305号で、DNAチップ上の高密度のDNAプローブを加工するためにフォトリソグラフィを用いる技術及び装置が開示された。そのような装置においては、チップ上の全ての固定されたプローブとサンプル緩衝液中の他のDNA分子の間のハイブリダイゼーションは同じ温度で行われる。
プローブの長さと塩基組成（GC含有量）が相違するため、プローブとその標的の５０％が分離する温度を表すＴｍ（融解温度）も相違する。従って最も好ましいハイブリダイゼーション温度は、各プローブで相違する。ハイブリダイゼーション温度が一致しないため、結果の正確性が保証できず、塩基1つ分の不一致を検出することができない。
上記問題を解決するため、米国特許第6,238,868号には、ハイブリダイゼーションの処理を加速するために電磁場をフリーパラメーターとして導入するマイクロアレイの形式が記載されている。
しかしながら、その技術は複雑であり、コストが非常に高く、サンプル中の標的DNA配列の標識化或いは蛍光色素と他のレポータープローブとのハイブリダイズを必要とする。
結論として、結果の正確性を保証することはできず、ハイブリダイゼーションのマイクロアレイへの応用を制限した。
【０００９】
近年、研究者の中には、遺伝子配列を分析するために非標識方法を用い始めた者もいる。最も好評な方法は、DNAバイオセンサーシステムである。
これらDNAセンサーは、以下の３つに分類することができる。（１）１つ目は、光学バイオセンサーである。そしてこれは、さらに３つに分類できる。蛍光光学ファイバー遺伝子センサー、表面増強ラマン遺伝子プローブ及び表面プラズモン共振遺伝子センサーである。（２）２つ目は、電気化学バイオセンサー、（３）３つ目は圧電遺伝子バイオセンサーである。
これらセンサーの特異性と感度の更なる情報が待たれる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は、４次元パラメーターを用いて、ＤＮＡチップ上でのＤＮＡハイブリダイゼーションの検出方法を提供することである。３次元パラメーターを用いたＤＮＡチップ上のＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するための従来の方法に基づき、本発明では、ハイブリダイゼーション温度の上昇により生じた二本鎖オリゴ核酸の蛍光標識の蛍光強度の変化を走査することにより、融解温度を決定するために温度を第４のパラメーターとして導入し、標準の融解温度と比べることによって一本鎖標的ポリヌクレオチド配列の特性を判断することができる。この方法は単純、正確、高感度な独特のものである。
【００１１】
本発明の別の目的は、４次元パラメーターを用いたDNAチップ上でのDNAハイブリダイゼーションを検出するための装置を提供することである。この装置は単純で、低コストであり、ハイブリダイゼーション温度が不一致であっても高密度のマイクロアレイからの結果の正確性を保証することができる。
【００１２】
本発明は以下の方法を通して得られ、４次元パラメーターを用いるDNAチップ上の核酸ハイブリダイゼーションを検出するための方法は以下の手順を含む。
（１）温度調節チャンバー内にDNAチップを置き、
（２）一本鎖標的ポリヌクレオチド配列と、二本鎖挿入用蛍光色素を含む反応液を、前記温度調節チャンバー内に置かれたDNAチップに注入し、チップ上のプローブと、一本鎖標的ポリヌクレオチド配列がハイブリダイズするように、アニーリング温度（Th）まで温度を下げる。その結果、蛍光色素によって、二本鎖核酸の標識が行われる。
（３）０．００１から１℃／秒の速度でＴｈから１００℃の範囲で装置内の温度を上昇させる。その間、前記チップは、蛍光強度Fを得るためにΔＴ℃（１秒経過ごとの温度差として定義される）上昇する毎にスキャナーによって走査され、装置内の温度が融解温度Ｔｍに達する時、二本鎖は分離し、蛍光色素は緩衝液中に拡散し、蛍光強度が急激に失われる。
チップ上の全プローブの蛍光強度の走査により、滑らかに続く二本鎖核酸鎖解離曲線上或いはその微分曲線上の変わり点を記録し、この微分曲線は、曲線の頂点で二本鎖核酸のTm値を示している。上記Ｔｍ値と、計算された既知の塩基配列のＴｍ値とを比較することにより、表面のプローブとハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチド単一鎖の特性が分かる。
【００１３】
好ましい実施の形態において、余分な標的ポリヌクレオチド鎖及び反応緩衝液を除去するために、蛍光色素が含まれない緩衝液を用いたアニーリング温度での洗浄過程は、また前記過程（２）に含まれる。
好ましい条件は以下の通りである。
アニーリング温度Ｔｈが、４から８９℃であり、融解温度Tｍが、８から１００℃であり、温度上昇速度が、０．０１−１℃／秒である。
【００１４】
蛍光色素の上記反応緩衝液は、米国のモレキュラープローブ（Molecular Probe）社製のサイバーグリーン（SYBR Green）I、サイバーグリーン２或いはサイバーゴールド（SYBR Gold）から一種類選択される。
【００１５】
本発明の別の目的は、以下の手順を用いることにより達成される。４次元パラメーターを用いた遺伝子チップ上での核酸ハイブリダイゼーションを検出するための装置がＤＮＡチップのための容器と、ＤＮＡチップと、温度調節熱循環装置と、緩衝液入力口と、出口を含む。前記ＤＮＡチップは、前記温度調節熱循環装置に接続される前記容器内に置かれる。
【００１６】
上記温度調節循環装置は、温度センサー、熱循環装置及び温度調節装置から構成され、該温度センサーは温度調節装置と接続し、温度調節装置が熱循環装置と接続する。
【００１７】
本発明は、４次元パラメーターを用いるDNAチップ上での核酸ハイブリダイゼーションを検出するための装置の使用の実用的応用例を更に提供する。
【００１８】
装置は、４次元パラメーターを用いたDNAチップ上で核酸ハイブリダイゼーションを検出するための装置でありDNAサンプルを分析、分離するために用いることができる。
【００１９】
装置は、４次元パラメーターを用いるDNAチップ上で核酸ハイブリダイゼーションを検出するための装置であり、RNAサンプルを分析、分離するために用いることができる。
【００２０】
本発明は、従来技術に比べて、以下の利点がある。
１．３次元パラメーターを用いたＤＮＡチップ上のＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するための従来の方法に基づき、本発明では、ハイブリダイゼーション温度の上昇により生じた二本鎖オリゴ核酸の蛍光標識の蛍光強度の変化を走査することにより、融解温度を決定するために温度を第４のパラメーターとして導入し、標準の核酸の融解温度と比べることによって標的ポリヌクレオチド単一鎖の特性を判断することができる。この方法は単純、正確、高感度な独特のものである。
２．本発明は、ハイブリダイゼーション温度の不一致により生じる、結果が正確であるかどうかという問題を解決するために温度走査方法を導入し、結果が正しいかどうかを、単純かつ明確に判断できる手段を提供する。
３．本発明で用いられる標識ポリヌクレオチド配列は、標識化の手順も別の蛍光標識化レポータープローブも必要とせず、実験操作は単純である。
４．本発明の装置は単純であり、コストを下げるために市販のチップとあわせて利用することができる。ハイブリダイゼーション温度が一致しなくても、本発明は、高密度のマイクロアレイ分析からの結果の正確性を保証する。
【００２１】
（実施の形態の説明）
図１は、４次元パラメーターの利用によるＤＮＡチップ上の核酸ハイブリダイゼーションの検出装置を示している。図示されるように、この装置９は、透明なガラスチャンバー１、市販のＤＮＡチップ２、温度調節熱循環装置３、緩衝液入力口５及び緩衝液出口７が含まれている。また、前記温度調節熱循環装置３は、温度センサー４、熱循環装置８及び温度調節装置６を含む。前記温度調節装置６は温度調節コンピュータである。前記温度センサー４と前記温度調節装置６は接続され、前記温度調節装置６と前記熱循環装置８は接続される。温度調節コンピュータ６は、温度センサー４及び熱循環装置８により、ガラスチャンバー１内の緩衝液及びＤＮＡチップ２の温度を調節するようにプログラムされている。
【００２２】
本発明に基づき、一本鎖標識オリゴ及び二本鎖挿入用蛍光色素を含むサイバーグリーンIは、ハイブリダイゼーション緩衝液中で混合され、ガラス反応チャンバー１に加えられる。チャンバー１内の温度は急速にアニール温度（Ｔｈの温度範囲は４−８９℃）へ下げられ、チャンバーは、余分なオリゴ及び反応緩衝液を除去するためにリン酸緩衝液で洗浄される。チャンバー内の温度を０．０１℃／秒の速さでＴｈから１００℃へ上昇させるために、熱循環装置８を使用し、その間蛍光強度Ｆを得るために０．０１℃の昇温毎に、スキャナーによってＤＮＡチップ２が走査される。
Ｔｈが十分低く保たれている限り、サンプル中の一本鎖核酸鎖がチップ上のプローブと二重らせんを形成し、高濃度のサイバーグリーンI色素の二本鎖への挿入を生じる。４７０−４９０nmのレーザーによって励起され、５３０nmの波長の特定の蛍光を発する。
温度が二本鎖核酸鎖の融解温度Ｔｍ（Ｔｍの範囲は８−１００℃）に上昇した時、二本鎖は融解し、結果としてチップ２上の対応するプローブから一本鎖標的ポリヌクレオチド鎖が離れ、サイバーグリーンIが緩衝液中を拡散し蛍光信号の急激な低下が引き起こされる。DNAチップを走査することにより得られる解離温度曲線（Ｆ−Ｔ）（図２Ａ）或いは微分融解曲線（ｄＦ／ｄＴ−Ｔ）（図２Ｂ）上の変わり点は、融解温度Ｔｍを定義する。
図２Ａ中のＦはプローブの蛍光強度を示し、Ｔは温度を示し、曲線１は塩基配列が不一致の二重らせんの解離曲線で、曲線２は塩基配列が完全に一致する解離曲線である。図２Ｂ中のｄＦ／ｄＴはプローブの蛍光強度の温度に対する微分であり、Ｔは温度を示す。
曲線３は、塩基配列が不一致の二重らせんの解離曲線であり、Ｔｍは曲線の頂点での温度、すなわち融解温度である。曲線４は、塩基配列が完全に一致する解離曲線を示し、Ｔｍｐは頂点での温度、すなわち融解温度であり、そのプローブ本来の融解温度を示す。Ｔｍｐは、塩基配列が完全に一致する標準のサンプルをプローブに対し用いることにより得ることができる。ＴｍがＴｍｐより低い時、二本鎖の間の結合力は、塩基配列が完全に一致する時の結合力より小さいので、標的ポリヌクレオチドとプローブの間に塩基配列の不一致が存在すると判断することができる。ＴｍがＴｍｐと同一である場合のみ、完全に塩基配列が一致していると判断することができる。
【００２３】
（産業上の利用の可能性）
本発明は、特定のＤＮＡ塩基配列が核酸サンプル中に存在するかどうかを検出するために用いることができる。
【００２４】
二本鎖サンプル核酸を９４℃以上に加熱することにより、DNA分子は一本鎖に変性する（或いは別の方法で一本鎖が得られる）。生じた一本鎖ＤＮＡ及び反応緩衝液を本発明の装置内に注入する。温度走査方法によりチップ上の各標的とプローブのペアの融解温度Ｔｍ値が決定される。
標的とプローブの塩基配列が完全に一致すれば、その２本の鎖の間の結合力は最大となり、融解温度Ｔｍ値も最高となり、プローブ本来のＴｍｐと同一となる。
標的とプローブの間に１（又は２）以上不一致が存在する場合、結合力は減少し、対応する融解温度Ｔｍ値がＴｍｐより低くなる。
言い換えれば、結果が信頼できるかどうかを判断するための基準は、Ｔｍ値を各プローブの本来のＴｍｐと比較することによりわかる。
従って、この方法は、チップ上のプローブに対応する標的オリゴがサンプル核酸に存在するかどうかを教える。
【００２５】
本発明は、またサンプルにおいて、異なるDNA分子を分離するために用いることができる。
一本鎖標的核酸鎖と反応緩衝液を、本発明で記載されているチャンバー内に注入し、単一Ｔｍｐを有する、プローブを含んだチップのみを選択する。温度走査は、その後チップ上の様々な箇所で標的とプローブオリゴのＴｍを観測するために用いられる。
Ｔｍ値がＴｍｐより低い場合、洗浄した緩衝液を廃棄する。従って本来のＴｍｐと等しい或いは高い時に抽出された緩衝液は、チップ上のプローブに対して完全に一致するこれら標的DNA分子を含むべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の装置を示す構造図である。
【図２Ａ】
本発明の装置を用いてＤＮＡチップを走査して得られた解離温度曲線（Ｆ〜Ｔ）である。
【図２Ｂ】
本発明の装置を用いてＤＮＡチップを走査して得られた微分解離温度曲線（ｄＦ/ｄＴ〜Ｔ）である。
【図１】
2005519642.tif 000003
2005519642.tif 000004
【国際調査報告】
2005519642.tif 000005
2005519642.tif 000006