(57)【要約】プリオンを不活性化する方法であって、該方法は、プリオンを含む基体を所定の時間、超高圧の１つ以上のパルスに晒すことからなる。圧力は１秒間で少なくとも４８０ＭＰａであることが好ましい。基体とプリオンは、プリオンが不活性化される高温に断熱的に加熱される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体に存在するプリオンを不活性化する方法であって、該方法は、前記プリオンを含む基体を初期温度から最高で４００℃の最終温度に断熱的に加熱するために所定の時間少なくとも１つの超高圧パルスにプリオンを含む基体を晒すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記最終温度が、４００℃までの範囲内にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記最終温度が、４０℃乃至２００℃の範囲内にあることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記最終温度が、４０℃乃至１４５℃の範囲内にあることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記超高圧が、少なくとも４８０ＭＰａであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記超高圧が、４８０ＭＰａ乃至９７０ＭＰａの範囲内にあることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記超高圧が、４８０ＭＰａ乃至８３０ＭＰａの範囲内にあることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記初期温度が、室温であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記初期温度が、４０℃であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記基体が、複数のパルスの超高圧に晒されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオンを不活性化する方法に関し、特にプリオンが存在する基体（substrate）を超高圧に晒すことによってプリオンを不活性化する方法および好ましい態様では、食品中のプリオンを当該食品を超高圧に晒すことによって不活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオンは、動物の脳に存在する異常性（aberrant）タンパク質である。染体異常性プリオンが存在すると正常なタンパク質が再構成されてしまう。この正常なタンパク質が修飾されると脳にアミロイドが沈着（プラーク）する。通常の酵素作用ではこのプラークは除去されない。その結果、いくつかの形態で動物および人間の双方に影響を与え、神経を衰弱させる病気にかかる。この病気の自然感染は、今のところ羊およびヤギ（スクラピー）ならびに鹿およびエルク（慢性消耗病）に限定されている。羊は、汚染された屠体飼料となってミンク（感染性ミンク脳症）および畜牛（狂牛病）にスクラピーを非自然感染させ、同じ媒体が種々の外来の動物園にいる有蹄動物、家庭または動物園にいるネコ科の動物および動物園にいる霊長類に病気を感染させている。屠体からは可能な限り多くの肉が作業者の手によって取り除かれるが、頭部および脊髄を含み、機械的に再生された肉のペーストを産するために圧縮工程に付され、この再生肉は、ホットドッグ、ソーセージ、ミートパティー、ランチョンミート、ビーフシチュー、ピューレ仕立てのベビーフードなどの種々のプレクック肉製品に加えられることが許可されていた。現在、これら動物の中枢神経系組織はこの公示されていない媒体を介して人間の食物連鎖中に入り込み、これらは人間の感染の原因になる可能性が高いことは明らかである。
【０００３】
プリオンを不活性化するのは極めて困難である。現在、世界保健機構（the World Health Organization）は、プリオンを不活性化するために１Ｎの水酸化ナトリウムリム溶液中で１３４℃の温度にプリオンを晒すことを推奨している。この方法は効果的ではあるが、食品、薬品、血液および輸血用血液、動物および医薬品抽出物中のプリオンを不活性化するには実際的ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明はプリオンを不活性化する方法を提供し、特に食品、薬品、血液および輸血用血液、動物飼料、ペットフード、ワクチン、細胞培養栄養物および医薬品抽出物・医薬品などの基体中とこれに含まれるプリオンを、断熱的（adiabatically）に初期温度から４００℃の最終温度にまで加熱するために予め定められた時間、基体を超高圧に晒すことによってプリオンを不活性化する方法を提供する。本発明の好ましい態様では、基体は、各所定の時間、マルチプルパルスの超高圧に晒される。この超高圧パルスは、人間の基体の摂取または使用において障害とならないレベルにまでプリオンを効果的に不活性化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、プリオンが存在し得る非常に広範囲の基体に適用可能である。そのような基体としては、食物、医療品、血液、輸血用血液、動物用飼料、ペットフード、細胞培養栄養物および医薬品抽出物および医薬品などが挙げられる。本発明は、あらゆる基体に適用可能であるが、本発明は比較的圧縮し難い基体で最も良好に作用する。プリオンは、それを所定の時間、超高圧に晒すことによって不活性化される。
【０００６】
ここで言う「プリオンの不活性化」とは、プリオンの複製能（伝染力）の部分的または総合的な破壊を意味する。バイオアッセイよりかなり迅速に行うことができるプリオンタンパク質（PrPSC）のためのテストは、伝染力に関し信頼できる指標である。基体が晒される超高圧は、非常に短いパルス、非常に長いパルスまたはそれらのマルチプルパルスである。マルチプルパルスが採用される場合、各パルス間では基板上の圧力は、大気圧までまたは大気圧に近い圧力にまで減少させることが好ましい。圧力を加えることによって瞬間的かつ均一に食物の温度をプリオンを不活性化するのに望ましい最終温度にまで上昇させる。基体は、その初期温度と圧力の増加によって生じる断熱的加熱との組み合わせによって最終温度にまで上昇する。当然のことながら圧力は急速に増加させることが好ましいが、必要に応じて時間をかけて圧力を加えてもよい。また加熱のために基体が入れられる容器は、殆ど熱損出が生じないように適度に断熱されていることが好ましい。これにより断熱加熱の結果、温度が最大限に上昇する。
【０００７】
最終温度は、最大で４００℃であることが好ましく、４０℃から２００℃の範囲であることがより好ましく、４０℃から１４５℃の範囲であることが最も好ましい。使用される圧力は、変えることも可能である。基体に加えられる超高圧は、少なくとも４８０ＭＰａであることが好ましく、好ましくは４８０ＭＰａ乃至９７０ＭＰａの範囲内であり、より好ましくは４８０ＭＰａから８３０ＭＰａの範囲である。
【０００８】
初期温度は、２５℃程度の室温であってもよい。基体を例えば７０℃以上程度の室温より高い温度の初期温度に予備加熱してもよい。当然のことながら、室温より高い温度に基体を予備加熱すると基体が室温から圧力を加えた場合より、最終温度は高くなる（予備加熱と断熱加熱の結果から）。
【０００９】
加圧および減圧時に生じる断熱加熱および冷却は、基体の熱への露出を最小限にし（熱への長時間の露出は、例えば食品の風味、質感、色その他の特性が損傷を受ける原因となる）、上述したように実施した場合、超高圧に晒すことによって充分にプリオンを不活性化することができる。基体は、例えば加圧容器に入れられる前にウォーターバス中で予備加熱してもよい。また基体を市販されているピレート熱交換器または表面熱交換器で予備加熱することができ、またヒーターを備えた加圧容器中で加熱することも可能である。加圧容器に加熱および冷却能力を有する加圧装置は、例えばABB Autoclave Systems、Flow IndustriesおよびEngineer Pressure Systemsより入手可能である。
【００１０】
各加圧サイクル中、断熱的加熱（および圧力の開放を伴う冷却）の原理は、基体の温度を約３０乃至４０℃増加させる（または減少させる）（８３０ＭＰａを超える圧力の場合より高くなる）。実際の増分（increment）は、初期温度と加えられる圧力の量との関数である。例えば、４００ＭＰａの圧力が９９℃に予備加熱された基体を加圧するために使用した場合、断熱的熱増加は、約２５℃であり、６９０ＭＰａの圧力の場合、温度の増加は、約３２℃である。従って、予備加熱された基体に超高圧を加えることによって基体の温度は初期温度よりかなり高い不活性温度になる。断熱的温度上昇を考慮すると、基体の高温への露出を最小限にすることができ、直ぐに制御することができる。従って長期および過剰に高滅菌温度に晒されることに原因する損傷を防ぐことができ、基体の風味、質感、色その他の特性を最小限にまたは全く変えることなく保護することができる。予備加熱温度および圧力は、高圧および高温に最小限、露出することによって基体中のプリオンを不活性化する時間と温度の組み合わせに到達するように本発明に従って選択されなければならない。
【００１１】
ここに開示した方法のための加圧は、必要な高圧および高温を供給することができる市販の装置を用いて行われる。加圧する前に食物は、通常、プラスチックバッグ、缶その他の容器などの好適な容器内に密封されるか、または熱交換器を介してばらばらの状態で加圧容器内に供給され、加圧工程後、防腐処置をして滅菌容器内にパッケージしてもよい。
【００１２】
高圧を加える前に、基体が入れられる容器および加圧容器から空気を取り除くことが好ましい。工程中に空気が存在すると、食物中の風味に関与する化合物が酸化してしまう場合がある。さらに空気は高圧に晒されると圧縮するので、容器中に空気が存在すると効率の損失につながり、従って断熱的温度の上昇が抑えられてしまう。また空気は、プラスチック製のパッケージ材料と反応するので、これを焦がしたり、燃やしてしまう場合もある。
【実施例】
【００１３】
ここに記載した次の実施例は、本発明の利用方法を例示するためのものである。これら実施例は、その範囲を定めるものではなく、プリオンが存在する広範囲の基体への利用可能性を減じるものでもない。
【００１４】
圧力/温度試験 
各サンプルを試験するために次のように梱包した。予備処理されたサンプルを最初に５ｃｍ×８ｃｍラミネートプラスチックホイルパウチ（０．７５ｍｍナイロン＋２．２５ｍｍポリエチレン）内に詰めインパルスシーラーを用いて真空密封し、５ｃｍ×８ｃｍの金属被覆されたパウチ（１２ミクロンポリエステル外層、１５ミクロンナイロン、１２．５ミクロンアルミニウムホイル、１０２ミクロンポリプロピレン内層）内に再度詰めインパルスシーラーを用いて再度真空密封した。このパウチを２００mlの高密度ポリエチレンボトル（直径：４．２ｃｍ、長さ：９．３ｃｍ）内に入れ、９５℃に熱せられたひまし油をボトルに加えてすべての空気を取り除き、ボトルをボトルキャップで密封した。ボトルとその内容物をダイアフラムを有する金属シリンダー内に入れるまで９５℃のウォーターバス内に置いた。ボトルとその内容物を９５℃のウオーターバスに最短で１５分保持して温度を平衡させた。
【００１５】
加圧容器には０．７リットルの大きさの加圧チャンバーを有するものを用いた。容器は、最終圧力に応じて２０乃至３０秒加圧し、１０乃至２０秒減圧する。この容器は、９５℃に設定された外部ヒーターを有する。容器を６９０ＭＰａ、１０００ＭＰａおよび１２００ＭＰａの圧力に作動させた。ひまし油をサンプル容器が挿入された後チャンバーの残りの部分を満たすために使用する。ひまし油は、９５℃に予備加熱され、これを各試験の前に加えた。（チャンバー中のひまし油は、９５℃未満に冷めてしまうので、各試験ごとに取り除く。）製品サンプルを含むボトルは、金属シリンダー内に入れられ、次にこの金属シリンダーを加圧チャンバー内に入れた。金属シリンダー（直径：８ｃｍ、長さ：１８ｃｍ）は、ステンレススチールからなり、ネジ止め式のトップキャップと硬いキャップベースを有する内部織物ダイアフラムを有する。シリンダーの側壁にはダイアフラムの内容物に流体圧力が作用するように大きな開口部が設けられている。シリンダーのサイズは、容器チャンバー内に容易に収まるサイズである。シリンダーキャップは、熱電対導線（thermal couple lead wire）に差し込むためのアタッチメントを有する。製品サンプル容器をネジ止め式キャップを有する高密度ポリエチレンボトルに入れ、次にこのボトルをダイアフラムに入れた。ボトルがダイヤフラム内のすべての空気と置き換わるために挿入された後、熱湯（９５℃）をダイアフラムに加えた。シリンダーキャップをネジ止めし、シリンダーを予め９５℃のひまし油が加えられた容器チャンバーに入れる。容器チャンバーにふたをし、ダイアフラムチャンバー内に延びた熱電対を接続し、容器のヨークを蓋に移動させて圧力を維持する。容器圧力と温度をコンピューターで２秒ごとに測定し、記録する。下記の記録された試験の場合、パルス圧力を６０秒間加え、パルスとパルスの間に３０秒常圧を加えた。
【００１６】
プリオンを含む材料は、ハムスターに適合した羊スクラピー菌種株２６３Ｋで大脳接種したあと病気の末期で殺されたハムスターの脳全体から得て、使用するまで−７０℃で保存した。このスクラピーの菌株は、物理的および化学的不活性化工程に対するそのプリオンの例外的抵抗力および高感染力力価（脳１グラムにつき約１０１０ＬＤ５０）のため広く用いられている。全ハムスターの脳を均質化し、それ自身で対照として試験した。またそれを血漿に注入し、試験した。さらにすべてのハムスターの脳を解凍し、機械的なホモジェナイザーを有する密閉容器を用いて市販の肉製品（ホットドッグ）と脳１部と肉９９部（１重量％）の比で均質化し、肉１グラムにつき約１０８ＬＤ５０の予め設定した感染レベルを得た。サンプルを別個の水密なプラスチックの袋に分け、３または１０回の一分間パルスで種々の圧力に晒した。１つのサンプルには５分間、単一のパルスを与えた。
【００１７】
血漿（plasma）サンプルを肉のサンプルと同様に調整した。新鮮な冷凍プラスマを分けて利用した。この新鮮なプラスマを浄化した１０％スクラピー接種したハムスター脳の懸濁液とプラスマ９０mlに対して１０mlの比で混合した（１：９の希釈）。予想された感染投入量（infectivity input）は、１ml当たり約１０８ＬＤ５０であった。これを３mlずつ試験袋に分けた。
【００１８】
活性の減少の測定および感染力の検出を行うために利用した材料および方法を以下に示す。
【００１９】
PrPSC（プリオンタンパク質）を検出するためのウエスタンブロッティング試験 
２０乃至４０mgに分けられた解凍されたサンプルを充分な量のトリス緩衝生理食塩水に加えて１０w/v％の懸濁液を得る。組織を繰り返しピペットで採取し、冷凍/解凍を２回行い、超音波処理にて崩壊させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）を次のように行う。各サンプル１００μlをプロティナーゼＫで培養し、同量の２倍濃縮ＳＤＳサンプル緩衝液と混合する。希釈されていないおよび連続希釈された（ハーフ−ログ（half-log）工程で）サンプルを滴定し、プリオンタンパク質の検出のために希釈終点を測定する。ＳＤＳ／サンプル混合物１５μlを１２％ポリアクリルアミドに充填し、電気泳動させ、電荷/サイズ分離された（charge/size-separated）タンパク質をニトロセルロースペーパーに移す。プリオンタンパク質は標識アンチ−プリオン抗体によって検出される。
【００２０】
感染力の検出のためのバイオアッセイ 
０．３乃至０．５μlに分けられた解凍サンプルを充分な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えて１０w/v％の懸濁液を得て、均質化し、ＰＢＳで１−ログ（one-log）工程で連続希釈する。サンプルを数群のハムスターに次のように接種する。各サンプル（希釈されているまたは希釈されていない）を各ハムスターの右大脳半球に接種する。接種後、１年間ハムスターのスクラピーの臨床的症状を観察し、すべての死亡したハムスターの脳にPrPSCが診断的にみて存在しているかを標準的なウエスタンブロット法を用いて検査する。下記の表中、ＮＤはプリオンが検出されなかったことを意味する。
【００２１】
結果を下記表１に示す。
【００２２】
【表１】
2005533495.tif 000002
【００２３】
上記表から明らかなとおり、良好な相関関係がウエスタンブロットと感染力クリアランスの間に存在する。１２００ＭＰａに加圧されたサンプルは、３または１０回の６０秒パルスに拘わらず、完全に不活性化された。マルチプルパルスは単一のパルスを５分間加えた場合と同等またはそれより良好な結果が得られた。また結果は、１０００ＭＰａに加圧されたサンプルは、１０回のパルスで１２００の圧力が加えられたサンプルと同等に不活性化されたが、３回のパルスのサンプルほど不活性化されなかった。６９０ＭＰａに加圧されたサンプルは、一部しか不活性化されなかった。
【００２４】
本発明の好ましい態様を例示および説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更が可能なことは明らかである。
【国際調査報告】
2005533495.tif 000003