(57)【要約】本発明は、増幅せずに放射性分子の群をスクリーニングする方法、得られる分子群の産物、および特定の組織または特定の器官に選択的に結合し得る分子を同定するための該方法の使用に関する。本発明の方法は、新規な治療用化合物および医療用イメージングのための造影剤の開発のため、ならびに薬剤のスクリーニングのために有用である。分子の群をスクリーニングする該方法は、次の工程を含むことを特徴とする：(1)  少なくとも1つの動物に、適切な放射性同位体を用いて各分子が予め標識された分子の群を投与し；(2)  動物の少なくとも1つを屠殺し、そして採取された組織または器官の切片から、適切なイメージング装置を用いて、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し；(3)  放射性シグナルが検出される組織または器官の切片を選択し；(4)  工程3で選択される組織または器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し；そして(5)  工程4で得られる放射性画分からの分子を、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により特徴付ける。本方法の変形によると、工程2では、可能であれば、投与される分子の放射性の生体内分布は、細胞および組織または器官の切片からなる群から予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置により分析される。結果として、該変形は動物を屠殺する必要がない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の工程：
(1)  少なくとも1つの動物に、適切な放射性同位体を用いて各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  動物の少なくとも1つを犠牲にし、そしてサンプルが採取される組織または器官の切片を用い、適切なイメージング装置により、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し、
(3)  放射性シグナルが検出される組織または器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される組織または器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、そして
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により該分子を特徴付ける
を含むことを特徴とする、分子のライブラリをスクリーニングする方法。
【請求項２】
少なくとも次の工程：
(1)  少なくとも1つの動物に、適切な放射性同位体を用いて各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  細胞および組織または器官の切片からなる群から予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置により、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し、
(3)  放射性シグナルが検出される細胞または組織もしくは器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される該細胞または組織もしくは器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、そして
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により該分子を特徴付ける
を含むことを特徴とする、分子のライブラリをスクリーニングする方法。
【請求項３】
(1)  少なくとも1つの動物に、適切な放射性同位体を用いて各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  動物の少なくとも1つを犠牲にし、そして動物の種々の組織の切片のサンプルを採取して、適切なイメージング装置を用いてこれらを分析することにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し、
(3)  放射能が検出される組織または器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される該組織または器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により分子を特徴付け、
(6)  工程(4)で単離される分子とターゲット分子との間の結合を許容する条件の下で、工程(5)で得られる分子を、工程(2)に従って選択され、採取される組織または器官のサンプルと接触させて複合体を形成し、そして
(7)  該複合体から該ターゲット分子を単離する
ことを含む、分子のライブラリを用いて器官または組織で選択的に発現するターゲット分子を同定し、研究する方法。
【請求項４】
(1)  少なくとも1つの動物に、分子中に存在する原子をその放射性同位体の1つで置換することにより各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  細胞および組織または器官の切片からなる群より予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置により、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し、
(3)  放射能が検出される細胞または組織もしくは器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される該細胞または組織もしくは器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により分子を特徴付け、
(6)  工程(4)で単離される分子とターゲット分子との間の結合を許容する条件の下で、工程(5)で得られる分子を、工程(2)に従って選択され、採取される細胞または組織もしくは器官のサンプルと接触させて複合体を形成し、そして
(7)  該複合体から該ターゲット分子を単離する
ことを含む、分子のライブラリを用いて器官または組織で選択的に発現するターゲット分子(または受容体)を同定し、研究する方法。
【請求項５】
工程(1)中に、放射性分子のライブラリが、好ましくは腹腔内(I.P.)または静脈内(I.V.)で動物に注入されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
方法が、工程(2)に先立って、動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析するための工程(1')を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
放射性同位体が、トリチウム(3H)、カーボン14 (14C)、カーボン11 (11C)、ヨウ素131 (131I)、ヨウ素125 (125I)、ヨウ素124 (124I)、ヨウ素123 (123I)、リン32 (32P)、フッ素18 (18F)、硫黄35 (35S)、テクネチウム99 (99mTc)、インジウム113 (113In)、銅64 (64Cu)、臭素76 (76Br)、窒素13 (13N)および酸素15 (15O)からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【請求項８】
工程(2)において、放射性の生体内分布が、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類を検出するのに適するイメージング装置を組み込んだ検出装置により視覚化されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法。
【請求項９】
放射性分子が混合物の形態で注入されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
工程(1)に先立って、標識分子のライブラリが：
−化学的または酵素による経路を介する該分子の混合物の合成、および
−放射性同位体を用いる該分子の標識
により調製されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１１】
工程(1)〜(5)が、工程(1)で投与される量が異なり、工程(2)による分子の放射性の分布の分析が動物により異なる時間で行われるいくつかの動物に対して一斉に行われることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１２】
工程(4)による器官と会合する放射性分子の単離が、次の工程：
−放射性が検出された組織または器官を取り出し、
−適切な緩衝液中で該組織または器官を粉砕し、
−各粉砕された物質を遠心分離して溶液を回収し、
−溶液をろ過し、
−pHを調整し、そして
−分画により分離して放射性画分を回収する
に従って行われることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１３】
工程(5)において、質量分析法による分析が、タンデム質量分析(MS/MS)と組み合わさることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
工程(1)によるライブラリの分子が、次の一般式：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
(式中、YaaおよびYaa'は、20の天然アミノ酸が存在する位置を表す)
を有することを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
−適切な放射性同位体で各分子が予め標識された分子の少なくとも1つのライブラリ、
−放射性標識物質を検出する手段、および
−検出された放射性標識物質を分析する手段
を含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1つに記載の方法を行うためのキット。
【請求項１６】
次の式：
プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2
を有するペプチドに相当することを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法を用いて得ることができる物質。
【請求項１７】
放射性同位体で標識されることを特徴とする、請求項16に記載のペプチド。
【請求項１８】
請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて選択される分子を含み、この分子の特定部位への生体内分布が該方法を用いて同定されていることを特徴とする、興味のある分子を特定部位にターゲッティングさせるベクター。
【請求項１９】
分子が、請求項16によるペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2であることを特徴とする、請求項18に記載のターゲッティングベクター。
【請求項２０】
(i)  部位に特異的な分子に結合した、該部位を標的とする興味のある分子であって、この生体内分布が請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて同定された分子、および(ii)  少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする部位特異的組成物。
【請求項２１】
部位に特異的な分子が、請求項16によるペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2であることを特徴とする、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
医療用イメージングで用いることを意図する組成物を製造するための、請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて選択される標識分子の使用。
【請求項２３】
標識分子が請求項17に記載のペプチドであることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
標識分子が適切な造影剤と結合することを特徴とする、請求項22または請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
少なくとも：
(1)  興味のある分子を、放射性コンジュゲートを得るように、請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて選択される、ターゲットに特異的な放射性標識分子と結合させ、
(2)  少なくとも1つの動物に、工程(1)で得られるコンジュゲートを投与し、そして
(3)  生物学的サンプルを用いて、該生物学的サンプルの少なくとも1つのターゲットと、該放射性標識分子と結合した興味のある分子との結合をインビトロで分析する
を含むことを特徴とする、興味のある分子について少なくとも1つのターゲットを同定する方法。
【請求項２６】
標識分子が請求項17に記載のペプチドであることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
(1)  請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いてその生体内分布が同定された標識分子を、少なくとも1つの動物に投与し、
(2)  動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、工程(1)で投与される放射性分子の生体内分布の第一の分析を行い、
(3)  未標識分子のライブラリを投与し、
(4)  動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、放射性分子の生体内分布の第二の分析を行い、
(5)  放射性標識分子の分布の第一の分析との比較によって、少なくとも1つの未標識分子による標識分子の置換の動態を確立し、そして
(6)  反復分画とクロマトグラフィーおよび／または質量分析のような適切な分析技術による該分子の特徴づけとにより、放射性標識分子の動態を変えた少なくとも1つの未標識分子を検出する
を含むことを特徴とする、競合による、未標識分子のインビボスクリーニング方法。
【請求項２８】
(1)  請求項1〜14のいずれか1つに記載の分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いてその生体内分布が同定された標識分子を、少なくとも1つの動物に投与し、
(2)  細胞および組織または器官の切片からなる群より予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置により、工程(1)で投与される放射性分子の生体内分布の第一の分析を行い、
(3)  未標識分子のライブラリを投与し、
(4)  細胞および組織または器官の切片からなる群より予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置により、放射性分子の生体内分布の第二の分析を行い、
(5)  放射性標識分子の分布の第一の分析との比較によって、少なくとも1つの未標識分子による標識分子の置換の動態を確立し、そして
(6)  反復分画とクロマトグラフィーおよび／または質量分析のような適切な分析技術による該分子の特徴づけとにより、放射性標識分子の動態を変えた少なくとも1つの未標識分子を検出する
を含むことを特徴とする、競合による、未標識分子のインビボスクリーニング方法。
【請求項２９】
工程(1)による標識分子が、請求項17に記載のペプチドであることを特徴とする、請求項27または請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも請求項16によるペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2、および少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬品。
【請求項３１】
抗高血圧医薬品を製造するための、請求項16によるペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅せずに多様な放射性分子のライブラリをスクリーニングする方法、得られる分子ライブラリの産物、および特定の組織または特定の器官に選択的に結合し得る分子を同定するための該方法の使用に関し、これらは、新規な治療用化合物および医療用イメージングのための造影剤の開発のため、ならびに薬剤のスクリーニングのために有用である。
【背景技術】
【０００２】
新規な薬剤のスクリーニングの関係において、化学合成により得られるか、または生物界に由来する化合物(天然物)は、通常、インビトロ試験により評価される。これらのスクリーニングの主要な機能は、治療上の興味のターゲット(受容体、酵素など)のいずれとも高い親和性で相互作用し得る化合物を同定すること、または比較的不活性であるが最適化プログラムに入る化合物を単離することである。これらのスクリーニングは、何千の非常に原始の化合物の検出を可能にするが、これらのわずかなフラクションのみが動物実験、すなわち人体の健康に有用である物質を首尾よく得るのに不可避な工程の主題となる。これら全てのインビトロスクリーニング試験において、代謝安定性または生体内分布および排出特性のような、動物で試験される物質の結果として必須のパラメータが考慮されないという事実は、このストラテジーの失敗の大部分を説明する。人体の健康に有用な物質の開発におけるよりよい有効性の探索は、新規なスクリーニング方法の開発を必要とする。
【０００３】
インビボ選択の工程を含むスクリーニング方法が示されている。例えばR. PASQUALINIら(Nature、1996、380、364〜366)は、ファージディスプレイにより作製されたペプチドのライブラリをマウスに注射することを記載している；この技術を用いて、この文献の著者らは、ある器官に特異的に結合するリガンドを、従来の増幅後に同定することができることを示している。しかしながら、このアプローチの成功は、インビボで選択されるファージのタンパク質により提示されるペプチド配列にアクセスするために、インビボで選択される少数のファージの再増幅の可能性に本質的に依存する。
【０００４】
この文書に記載される方法は、その著者らによると、ファージディスプレイ以外の原理に基づくライブラリに適用可能であるはずである；この場合、結合後に組織中で化合物を同定する能力のみが要求される；しかしながら、PASQUALINIらは、化学分子をスクリーニングするためには、核酸配列のような増幅工程を許容するタグが必須であると明記している。
【０００５】
よって、R. PASQUALINIらの文献(Nature、1996、上記)に定義される技術は、腫瘍に特異的に結合し得るペプチドを選択することを可能にする；例えば、このようなペプチドがドキソルビシンに結合している場合、該ペプチドは、腫瘍についてのこの薬剤の有効性を上昇させ、かつ該薬剤の毒性も減少させる。このような使用は、特に、W. Arapら(Science、1998、279、377〜380)による文献に記載されている。
【０００６】
La Jolla Cancer Research Foundationの名称でのPCT国際出願WO 97/10507において、発明者のE. RUOSLAHTIおよびR. PASQUALINIは、それ自体を選択された器官または組織に特異的に向けることができる分子を得る方法を記載しており、該方法は次の工程を含む：
−個体にファージライブラリを投与し、
−選択された器官または組織のサンプルを採取するかまたは回収し、
−ファージを増幅させ、そして
−選択された器官または組織に到達し得る分子を同定する。
上記の種々の分子が、担体のようなタグに結合し得ることが明記されている。
【０００７】
このPCT国際出願では：
・「ライブラリ」の用語は、有機分子、ペプチド、タンパク質または核酸のような分子の集団を意味する。
・ライブラリを構成する分子に結合したタグは、いくつかの分子に共通のタグ、または特異的なタグであり得る。この出願に記載のタグは、特に：プラスチックマイクロビーズ、オリゴヌクレオチド、バクテリオファージまたはビオチンもしくはヘマグルチニンのような分子である。
【０００８】
そのターゲット器官に到達する分子の同定は、例えば、質量分析単独、またはガスクロマトグラフィーとの組み合わせにより行うことができる；ターゲット器官について高速液体クロマトグラフィーも行うことができ、また選択的抽出方法も用いることができる。
【０００９】
例として、ライブラリが、PCRにより同定し得るオリゴヌクレオチドからなる特異的タグに結合する有機化学分子の集団を含む場合、「寄生性」PCRを低減するために、サンプルからゲノムDNAを除去するのが好ましいことが記載されている。
また、通常、充分な数のファージがターゲット器官に到達し、これが増幅後にこれらを同定し、次いでペプチド配列を同定することを効率的に可能にすることも記載されている。
より具体的には、実施例はペプチドを含有するファージライブラリのスクリーニング、および脳、腎臓または腫瘍に到達するペプチドの同定に関する。
【００１０】
しかしながら、E. RUOSLAHTIのチームにより記述された方法は、本質的にペプチドに限定され、多くの問題点を有する。
特に：
−ファージ表面でのペプチドの提示は、提示されるペプチド配列と可能性のあるターゲットとの間の相互作用を必ず減ずる空間的および立体的拘束を課す。さらに、ファージは種々の組織中に拡散しうる能力が乏しく、そしてこのタイプの粒子に対して向けられるインビボ排出機構が存在することは、ファージディスプレイアプローチへのかなりの制限を構成する；
【００１１】
−インビボスクリーニング工程で同定されるのは、ファージである。しかしながら、ファージの結合は、ファージにより保持される配列を持つペプチドがファージの分布特性を保存するという保証にはならない。この状況は、ファージとペプチド単独との間のサイズの違いを考慮した場合に、より可能性がある。よって、実際には、多数のファージがスクリーニングにより同定され得るが、単一のペプチドがファージの分布特性を有している保証にはならない；
【００１２】
−ファージの抽出後、細菌のトランスフェクションによりこれらは再増幅されなければならない；この拘束は、この方法に更なる工程を導入する；
−ファージは多くの非特異的相互作用を発生するので、E. RUOSLAHTIのグループにより記載された方法は、インビボ選択のいくつかの工程(通常3工程)を含まなければならない；このことは、この方法を行うことを非常に面倒にし、そしてインビボスクリーニングが異なる動物の使用を含み、それによりかなりの偏りを導入し得る変動を含むという問題点を有する；
【００１３】
−この方法により、化合物の代謝および薬物動力学(分布および排出)のデータを考慮に入れることは可能でない。なぜなら、インビボスクリーニング工程は、化合物自体ではなくファージについて行われるからである；
−この方法は、ペプチド自体ではなく、選択されたファージの生体内分布の選択性を決定する；これは、E. RUOSLAHTIのグループが、その生体内分布を確立するために、ファージを認識する抗体を用いているという事実のためである。ペプチドの生体内分布をモニターする方法は他にない。
【００１４】
結果として、これらの問題点に関し、E. RUOSLAHTIのグループにより記載された方法は、人体の健康に有用な分子の開発の分野において価値が乏しい。
【００１５】
インビボ工程を用いるその他の方法も提案されている：
−米国特許第5,770,455号は、コンビナトリアルケミストリーにより得られるライブラリ産物の合成方法を記載している。これらの方法が、新規なリガンドを迅速に見出すための効果的な手段を構成することが明記されている。
【００１６】
コンビナトリアルケミストリーによる合成についてのいくつかのストラテジーが記述されており(空間的アドレス可能な(spatially-addressable)ストラテジー、スプリット−ビードストラテジー、およびリコンビナントストラテジー)、これらは合成の条件の点で異なっている：反応管の形状、ポリマーのタイプ、物理的定数の制御(時間、温度、固相または液相処理、混合物のタイプ、およびライブラリの種々の構成要素の構造を決定する方法)。
【００１７】
この文献で提案されているタグは、各物質について特異的である(「識別(identifier)タグ」)。
よって、実行するのが困難であるという主要な問題点を有する方法は；
−PCT国際出願WO 99/56789号は、コンビナトリアルケミストリーにより得られるライブラリを用いる造影剤の選択を記述している。より具体的には、ライブラリの各物質は検出可能な標識を含む。所望の分布プロフィールまたは所望の排出プロフィールを有する標識のみがインビボにおいて同定されることが明記されている。標識は、サンプルを採取することなく、かつ動物を犠牲にすることなく検出されることが可能でなければならない。特に適切な標識は、発色団、重原子、放射性タグおよび磁性粒子である。しかしながら、分子のライブラリは、互いに区別されることが可能であるはずの複数の標識を含まなければならない。この明細書にもかかわらず、このPCT出願WO 99/56789は、これは理想的な状況であり、実現が難しいことを認めている。特に、ライブラリの異なる構成要素：異なる標識の比は、1：1〜1：1000の間、1：1〜1：200の間、1：1〜1：50の間、および1：1〜1：25の間の比で、理想的に1：1であるべきであるが、10000：1のように低くなり得ると認めている。
【００１８】
このような場合、すなわちライブラリの種々の構成要素が全て独特のタグを有しているわけではない場合に、所望のプロフィールに一致するライブラリの構成要素を同定するために、標識の間接的検出技術が提案されている。さらに、この出願において、好ましくは生物学的流体(血液、尿、髄液、胆汁など)中で標識を検出することが推奨されている。この点に関して、標識は増幅可能であるのが好ましく(オリゴヌクレオチド、ファージ)、これは、ライブラリの各構成要素が独特の様式でタグを付加されているのが最良であることを意味する。よって、これは上記で開示の技術、およびそれらの問題点に帰着する。
【００１９】
この出願において記載された技術は、増幅を伴って独特のタグが付加される場合、または受容体への特異的結合による間接的検出技術を用いる場合にのみ効率的に適用することができる。
【００２０】
上記の全ての技術において、スクリーニングされる化合物は、その後の同定のためのタグと結合している。しかしながら、このようなタグの存在は、スクリーニングされる化合物とそのターゲットとの間の相互作用を立体障害により妨げ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
つまり、本出願人は、従来技術の方法に比べてよりよく実際的な必要性を満足する方法、特に：
−スクリーニングされる化合物自体の生体内分布を直接分析することにより、数千の化合物を含み得る混合物から、生きている動物の組織または器官をターゲットとし得る分子を選択し、そして
−それらの医療用イメージングにおける使用、または治療の目的のために、特定の特性を有する分子を同定する
ことを可能にする方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
研究した分子のライブラリによると、(例えばコンビナトリアルケミストリーにより得られる)多様な分子のライブラリ、または(例えばペプチドライブラリの場合に)生体分子のライブラリのことをいう。
【００２３】
より具体的には、本発明の主題は：
(1)  少なくとも1つの動物に、限定されないが、特に、分子中に存在する原子をその放射性同位体の1つで置換することにより各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  動物の少なくとも1つを犠牲にし、そして組織または器官の切片を用いてサンプルを採取して、適切なイメージングまたは放射性イメージング装置を用いて投与された分子の放射性の生体内分布を分析する。ここで、用いられる放射性イメージング装置は、特に、検出される放射性原子に応じて選択されるβ-イメージャーである。例えば、該組織もしくは器官の切片上に存在するβ--粒子(3H、14C、32P、35S、125I、99Tc)を放射するか、またはβ+-粒子(18F)を放射する放射性標識物質を検出し得るβ-イメージャーを挙げることができる。
【００２４】
(3)  放射性シグナルが検出される組織または器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される該組織または器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、そして
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により分子を特徴付ける
を含む、分子のライブラリをスクリーニングする方法である。
【００２５】
変形として、可能である場合、工程(2)は、細胞および組織または器官の切片からなる群から予め抽出され、かつ選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロでの適切なイメージング装置により、予め少なくとも1つの動物に投与された分子の放射性の生体内分布を分析することを含む。したがって、この変形は動物を犠牲にすることを必要としない。つまり、ヒトに適した条件下でヒトに用いるのにも適している。
【００２６】
本発明の目的のために、「動物」の用語は、一般に容認される分類に従って、非ヒト動物およびヒトの両方を含む。
【００２７】
本発明によるスクリーニング方法の有利な実施形態によると、工程(2)に先立って、該方法は、動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類(nature)を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置(18F、11C、64Cu、76Br、124I、13N、15O：陽電子射出断層撮影、PET；99mTc、123I：ガンマ-カメラ)を用いる外部イメージングに付すことにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析するための工程(1')を含む。
【００２８】
トリチウムで放射性標識された化合物のライブラリのインビボスクリーニングは、動物を犠牲にしなければならないことを意味する。実際に、トリチウム核からのβ-電子の検出は、組織切片を用いてのみ行うことができる。なぜなら、数μm上方では、これらの電子はもはや検出されないからである。このことは、なぜ工程(1')がある特定の放射性原子についてのみ行うことができるかを説明する。
【００２９】
本発明による方法の工程(1)中に、各ライブラリまたは放射性分子の群は、1または複数の動物に、好ましくは腹腔内(I.P.)または静脈内(I.V.)で注入される。次いで、種々の分子が組織または器官を標的とする能力は、種々の器官または組織内の放射性を検出することにより視覚化される[工程(1')および(2)]。検出の形態は、分子の放射性標識を行うために選択された放射性原子の種類、特に放射性トレーサーにより放射される放射線の種類に依存する。観察を行う時間は変動パラメータである。
【００３０】
工程(1')は、多くの利点を有する：
−生きている動物に対して試験を行うことを可能にし、よって薬物動力学のデータ、ならびに生物学的利用能、毒性および代謝特性がそれらのその後の使用に影響を及ぼさないリガンドの同定に関するデータを得ることを可能にする；
−よって、特に細胞培養に対するインビトロ工程だけを含む方法に比べて明白な有利性を示す；
【００３１】
−さらに、投与される分子の分布を迅速に視覚化し、それらの動態を追跡することを可能にする。したがって、工程(2)に従って、観察をどの時点まで行うことができるか、および組織の分析を行うのに最適な時間がいつかということを決定するように放射性分子の排出の動態を算出することが可能である。結果として、工程(2)による生体内分布の分析を行う時間は、注入される分子の種類および生体内でのそれらの寿命によって変動する。よって、放射性を10分〜48時間の間で観察することが可能である。
【００３２】
−これは、ある特定の放射性原子により放射される充分にエネルギーのある放射線の検出に基づく。特に、陽電子射出断層撮影法(PET)は、ラットもしくはマウス、またはある特定の霊長類のような動物の全ての区画において、化合物の分布の外部イメージングを得ることを可能にする。
【００３３】
本発明は：
−工程(2)が、適切なイメージング装置によりインビトロで、細胞および組織または器官の切片からなる群より予め抽出され選択された生物学的サンプルを用いて、投与される分子の放射性の生体内分布を分析することを含むその変形において、および
−該方法が工程(1') (インビボ分析)を含むその変形において
本発明の方法を行うことを包含する。
【００３４】
この点に関し、ヒトにおいて、本発明による方法は、最初に非ヒト動物において行われた本発明による方法により予め選択された分子のライブラリを用いる場合に、診療の目的を有し得る。
【００３５】
本発明による方法の有利な実施形態によると、工程(2)において、放射性の生体内分布が、選択された放射性同位体により放射される粒子の種類を検出するのに適するイメージング装置を組み込んだ検出装置により視覚化される。
【００３６】
放射性の検出に基づいて化合物の生体内分布を分析する工程は：
A：生体内に分配され得る化合物の存在または不在。
B：例えば脳のような特定の器官をターゲットとし得る化合物を同定するつもりである場合、ターゲッティングの選択性の基準。
C：非常に毒性の高い化合物の存在；次いで該ライブラリまたは群は、毒性化合物を迅速に排除するように排出されるか、またはより分離した(discrete)混合物の形態に再合成される。
に従ってライブラリまたは群を迅速に選択するのを可能にする。
【００３７】
インビボ選択工程、およびより具体的には工程(1')は：
−第一に、その後の研究の主題になるであろう化合物の数を大きく減少させる目的。実際、生体により迅速に排出されるか、または迅速に代謝されて排出される全ての分子は、もはやその後続いて考慮されない；
−第二に、生体内で保持される少数の化合物について、それらの生体内分布に関する情報を得て、例えば腫瘍のような特定の組織についてのみ研究を集中させる目的
の二重の目的を有する。
【００３８】
工程(3)〜(5)は、所定の組織または器官に存在する放射性化合物の化学的な同定に関する。これらの工程は、まず、観察される放射性が初めの群に存在する分子の存在のみによることを示す。
【００３９】
より具体的には、工程(4)は、特に、放射性検出器を備える装置における適切なクロマトグラフィーを用いて、放射性を含む種々の画分を単離することを可能にする。これらの画分は、次いで、放射活性物質の化学構造を決定するために、質量分析に付される(工程(5))。よってこの工程(5)は、単離された物質が初めのライブラリまたは群に含まれていたかを正式に確認することを可能にする。
【００４０】
さらに、(i) 所定の組織または器官に存在する放射性化合物のより感度の高い検出のための適切なイメージング装置を用いる工程、および(ii) 特に質量分析法による分析工程の組み合わせにより、該化合物の検出および同定の両方について質量分析法のみを用いる方法に比べて、本発明による方法の検出感度がかなり増大する。
【００４１】
言い換えると、特に質量分析法による分析(工程3〜5)に先立つ、放射性シグナルの検出の組み合わせ(特に工程2)は、検出の感度をかなり(フェントモル(10-15M)/mm2のオーダーで)増加させる。用いられる放射性イメージング装置、特にβ-イメージャーは、検出される放射性原子に応じて選択される。例えば、Biospace社からのβ-イメージャーは、トリチウムの場合に、フェントモル/mm2のオーダーの濃度で組織切片に存在するβ--粒子を放射する放射性標識物質を検出することを可能にする。この放射性イメージング装置は、トリチウムのものよりも少し低い値の検出閾値でβ--粒子を放射する種々のタイプの放射性原子を検出することを可能にする。
【００４２】
放射性原子に応じて、次の検出閾値を定義することができる(分当たりのカウントまたはcpm)：
3H: 0.07 cpm/mm2
35S、14C、33P: 0.01 cpm/mm2
32P: 0.1 cpm/mm2
【００４３】
したがって、本発明の方法は、2つの必須の特性：代謝安定性および生体内分布を有する化合物の同定を可能にする。これらの工程は、特に、種々の組織に存在する化合物を、それらの化学構造を特徴付けることを目的として、抽出することを可能にする。放射性分子の使用の選択は非常に重要である。なぜなら、放射性のモニタリングは、抽出、またはさらに精製工程の間じゅう、興味のある化合物の存在をモニタリングするための非常に感度の高い方法を構成するからである。
【００４４】
(特に抽出により)種々の単離工程が一旦行われると、化合物の化学構造は、質量分析法またはHPLCのようないずれの適切な分析方法により同定される。
より具体的には、放射性分子は、多数の化合物をスクリーニングすることができるように、混合物の形態で注入される。所定の時間における標識の強度は、特定の部位に対する化合物の親和性に依存し、これはその薬物動力学により調節される。よって、スクリーニング実験は、異なる時間に行うのが好ましい。これにより、薬物動力学を確立すること、およびこれらの化合物について考えられるその後の使用を評価することが可能になる。
【００４５】
器官または組織中の放射性分子の存在の検出のために用いられる観察技術は：
−フッ素18またはγ線−放射テクネチウム99のような陽電子射出放射性原子の場合、このタイプの放射線を検出するのに適切なカメラを組み込んだ検出装置を用いて、生きている動物に対する分析を行うか、または
−動物を犠牲にした後の検出を行い、組織切片を用いて放射性の検出を行う
のいずれかを可能にする。
全ての場合において、良好な分析のためには、少なくとも1の動物が犠牲にされる。
【００４６】
用いることができる動物の種類に関しては制限がない。実際問題として、薬理学において一般に用いられる全ての動物が、研究の対象であり得る。
【００４７】
本発明によると、工程(1)に先立って、標識分子のライブラリは：
−化学的または酵素による経路を介する該分子の混合物(L-またはD-ペプチド、ペプチド擬態物(pseudopeptides)、核酸、脂質、有機化合物)の合成(コンビナトリアル合成)、および
−トリチウム(3H)、カーボン14 (14C)、ヨウ素131 (131I)、ヨウ素125 (125I)、リン32 (32P)、フッ素18 (18F)、硫黄35 (35S)、テクネチウム99 (99Tc)、またはインジウム113 (113In)のような放射性同位体での該分子の標識
により調製される。
【００４８】
より具体的には、放射性分子の大集団の合成は、生体ポリマーまたは生体分子(ペプチド、ペプチド擬態物、ヌクレオチド、ヌクレオチド−ペプチド混合ポリマー)の場合はコンビナトリアル合成により行われる。ペプチドの場合、文献に記載されるデコンボリューションアプローチ(混合物の種々の分子を分離するための反復分画)は、興味のある分子の同定を促進する。大量並列固相合成(mass parallel solid-phase synthesis)により得られる非ペプチド分子は、それらが放射性原子を組み込むために修飾することができるものであるという条件の下で、本発明による方法に用いることができる。
【００４９】
上記の分子は固相で合成されるので、放射性原子の導入は比較的容易である。ペプチドの場合、例えば、固相合成により、N-末端のアミン末端が遊離であり得るペプチドが得られるが、一方、これらのポリマーの側鎖にある全ての反応性官能基はまだ保護されている。よって、これらの特性は、特に、アミン官能基をアシル化してこのようなアミン官能基を有する化合物がトリチウムで放射性標識されることを許容する、スクシンイミドプロピオネートまたは無水酢酸のように市販で入手可能な多数のトリチウムの放射性標識誘導体を用いて、固体支持体にまだグラフトされているポリマーのN-末端アミン官能基の単純なアシル化により、放射性原子を有する基を非常に選択的に導入することを可能にする。類似の化合物は、アミン官能基のアシル化により14Cを導入することを可能にする。18Fまたは99mTcを用いるペプチドの放射性標識は、例えばA. HEPPELERら(Curr. Med. Chem.、2000、7、971〜994)に記載のようにして行うことができる。
【００５０】
これらの生体ポリマーの合成は、インビボスクリーニング工程の後に特定の放射性原子を受け取ることができるように設計することもできる。つまり、全ての構成要素が、非放射性ヨウ素を用いてヨウ素化したチロシンを組み込み、かつN-末端がトリチウムで標識されているペプチドのライブラリを合成することができる。インビボスクリーニングの後、興味のある分子を再合成することができるが、このときにはチロシンに放射性ヨウ素が結合する。スクリーニング工程の間にヨウ化チロシンは既に存在するので、最終の放射性分子は必ず、全ての生物学的活性を保存する。この例は、非放射性の原子を有するシントンが組み込まれているが、スクリーニングが一旦行われるとそれらの放射性同位体で置換することができる種々のタイプの生体ポリマーに適用することができる。このようなストラテジーは、テクネチウム99またはフッ素18に特にあてはまる。
【００５１】
正しく放射標識された天然起源の分子も、同じアプローチを用いてスクリーニングすることができる。つまり、全ての分子が種々の放射性同位体(例えば3H、14C、32P、35S)で放射性標識された微生物の抽出物をスクリーニングすることが可能である。放射性標識バイオマスは、これらの微生物が放射性標識栄養分の存在下で培養された場合に得ることができる。毒のような天然抽出物(M. TAKEDAら、Toxicon、1974、12、633〜641；E. KOCHVA、Toxicon、1982、20、3、615〜636)は、例えば動物が放射性アミノ酸を与えられる条件において、毒腺で産生される毒の中にそれらの組み込みを許容するために、放射性標識の形態で得ることができる。天然物の放射性標識のストラテジーは、本発明によるスクリーニング方法で用い得る放射性標識物質を大量生産するために、開発することができる。
【００５２】
有利には、工程(1)で投与される量が異なり、工程(2)による分子の放射性の分布の分析が動物により異なる時間で行われる工程(1)〜(5)を、いくつかの動物に対して一斉に行う。
【００５３】
驚くべきことに、このような方法は、特異的タグが存在しなくても、または化合物を予め増幅する必要性なしに、分子のライブラリからなる混合物に含まれる1以上の分子と、器官または組織中に位置する1以上の特異的部位との間の特異的相互作用の存在を確立することを可能にする。
【００５４】
本発明による方法は、特に、次の利点を有する：
−ペプチド配列に限定されないが、全てのタイプの分子、特にコンビナトリアルケミストリーにより得られる分子、および特に生体ポリマーまたは生体分子、さらに非ペプチド分子ならびに天然物質、特に植物抽出物に関係する；
【００５５】
−放射性標識は拘束を構成しない。なぜなら、多くの放射性標識方法が、化学的または酵素的な合成により得られる化合物の種々のファミリーに関して文献に記述されているからである。さらに、天然物質の場合、興味のある化合物を産生する生物のタイプにより、放射性生合成化合物が産生されるようなストラテジーを設定することができる。このようなストラテジーは、考慮される生物の代謝サイクルに入ることができる放射性分子の導入に基づく。例えば、M. TAKEDAら(上記)またはE. KOCHVAら(上記)に記載されるようなペプチドの放射性標識方法が挙げられる；
【００５６】
−組織の浸透を促進することにより、(ファージに対するような)小分子のライブラリを用いるインビボスクリーニングは、生体中に存在する全ての受容体のより効率的なスクリーニングを許容する。よって、このタイプのスクリーニングを用いると、考慮するライブラリに含まれる分子多様性のより良好な利用が可能である。生体からファージを排出するクリアランスの現象は、もはや重要な限定を構成しない；
【００５７】
−化合物の化学的同一性は、種々の工程のスクリーニングにおいて同じであり、これは、上述したように、E. RUOSLHATIのチームにより開発された方法には当てはまらない；
−スクリーニングされる化合物の生体内分布を直接観察することができる；
−立体障害によりスクリーニングされる物質とそのターゲットとの相互作用を妨げ得るタグの存在を回避する；
【００５８】
−増幅工程を必要としない；そして
−スクリーニングされる化合物の代謝および薬物動力学(分布および排出)の研究が可能である。
【００５９】
驚くべきことに、合成物質のライブラリまたは群の放射性標識、コンビナトリアルケミストリー、動物(場合により非ヒトまたはヒト)における放射性を観察する技術、および組織または器官からの分子を、それらが質量分析またはその他の適切な分析方法によって分析されるように単離する方法(例えば抽出)を組み合わせることにより、その生物学的利用能、毒性および代謝特性がそれらのインビボでのその後の使用に影響を及ぼさないリガンドを同定することが効率的に可能である。これは、放射性よりも高性能のタグが、タグを付された分子を効率的に検出可能にする唯一のものであると考えられる従来技術に開示のものとは異なる。非常にエネルギーの高いタイプの放射線放出物であって、動物の寿命に影響を与えないように半減期が非常に短いものを用いた場合は、実際に、生きている動物において放射性物質を観察することができる。したがって、このタイプのトレーサーは、エネルギーがより低いトレーサーに比較して非常に有利であるが、これらのトレーサーの短い寿命は、エクスビボ分析と両立しがたい可能性がある。この場合、トリチウムのような長寿命のトレーサーは、動物の外部での観察に用いることはできないが、非常に有利であることが示され、このタイプのトレーサーは安全性の点で比較的制限がないので、ますますそうである。
【００６０】
単離された器官または細胞についてのスクリーニングとは異なり、生きている動物について行う工程を含むスクリーニングは、遺伝子発現が細胞培養系において修飾される限りは、リガンドにより標的にされる受容体の機能的な完全性を保証する。最後に、抗体の使用に基づくターゲッティングアプローチに比べると、本発明による方法は低分子量(平均1000 Da)の分子を用いて行うことができる。抗体に比較して、この特性は、より良好な組織浸透およびそれによる組織または器官で選択的に発現される受容体の能力の範囲のより良好な活用を包含する。
【００６１】
さらに、研究される化合物のサイズによると、これらは宿主の部分において免疫応答を誘導しない。
【００６２】
本発明による方法の有利な実施形態によると、工程(4)による該器官と会合する放射性分子の単離は、次の工程に従って行われる：
−放射性が検出された器官を取り出し、
−適切な緩衝液中で該器官を粉砕し、
−各粉砕された物質を遠心分離して溶液を回収し、
−溶液をろ過し、
−pHを調整し、
−分画により分離して放射性画分を回収する。
【００６３】
より具体的には、ペプチドの場合、この単離工程は、粉砕された物質の遠心分離、溶液の回収および後者のろ過後に：
−ろ液を酸性化し、
−疎水性基をグラフトしたシリカを含むカラムにろ液を通して「逆相」溶出技術を導入する；ここで、ライブラリまたは群の化合物の正電荷もしくは負電荷の存在により、イオン交換を含むクロマトグラフィー法を有利に導入することができる、
−分画により溶出物を回収し、そして
−放射性物質を含む画分を選択し、
−放射性画分を減圧下に濃縮し、
−もとのライブラリのものより大きい分子量の物質を保持し得るろ過メンブレンを通してろ過し、
−ろ液を濃縮し、そして
−逆相担体を充填したカラムを用いる高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によりサンプルを分析する；分離カラムの出口において、放射性物質の存在は、通常の放射性検出器を用いて検出される。
【００６４】
本発明による方法の別の有利な実施形態によると、工程(5)において、質量分析法による分析は、タンデム質量分析(MS/MS)と関連する。
【００６５】
本発明による方法のさらに別の有利な実施形態によると、工程(1)によるライブラリの分子は、次の一般式を有する：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
(式中、YaaおよびYaa'は、20の天然アミノ酸が存在する位置を表す)。
【００６６】
このような方法は、種々の用途が考えられる。特に：
−医療用イメージングのための新規な造影剤の開発；なぜなら、スクリーニングされる化合物は最初から放射性原子を有し、一旦選択されると、分子は医療用イメージングを行うためにそのまま用いられるか、または適切な技術によるインビボ観察に影響を及ぼさない造影剤の添加により修飾されることができる。この点に関して、全ての分子がフッ素19原子を有するトリチウム化された分子のライブラリまたは群は、特に有利である。一旦、インビボスクリーニングにより選択が行われると、このときにはフッ素18を結合して同定された分子を合成することができ、これにより適切な断層撮影機を用いて陽電子の検出に基づくイメージングのための造影剤として分子を用いることが可能である；
【００６７】
−治療用の使用のための化合物の製造；実際に、生物内の非常に精密な部位に結合するそれらの能力の他にも、同定された分子のいくつかは特定の生物学的活性を有し、それにより治療用化合物の開発のための基礎として役に立つことができる；
【００６８】
−医薬またはその他のいずれの興味のある分子のターゲッティング(医薬と選択された分子との化学的結合による特定部位への送達)。特定の組織または器官に興味のある物質をターゲッティングするために、この興味のある物質を本発明による方法により同定された分子に化学的に結合させ、それにより組織空間、次いで特定部位に送達し得ることを想定することが、実際に可能である；
−所定の組織または器官で選択的に発現される新規な受容体の同定
を挙げることができる。
【００６９】
本発明による方法は、所定の組織または器官で選択的に発現される新規な受容体の同定を可能にする。この種の情報およびこの種の同定は、新規な治療用ストラテジーを開発するために非常に貴重であろう。同じ工程での、選択リガンドおよびまだ同定されていないその関連する選択受容体の両方の特徴づけは、この受容体に特異的なリガンドをグラフトさせたアフィニティカラムを開発することによりこの受容体を単離するという非常に貴重な長所を示す。この同じリガンドが、最初の構造を示し、これに基づいて、特に治療用途の目的のためにその他のリガンドが設計される。
【００７０】
よって、このような方法は、種々の病理を研究することも可能にする。実際、正常な個体においてはほとんど、または全く発現されないある特定の受容体の過剰発現となる病理は、本発明による方法を用いて直ちに検出することができる。つまり、正常な動物と病気の動物との間の選択的標識の実証は、診断、治療、イメージングおよび患部の組織または器官に対する医薬のターゲッティングの点で非常に有用である。例として、このアプローチは、動物の正常な組織または器官を標識せずに、原発腫瘍または続発性腫瘍に選択的に結合し得る化学物質を同定する能力に関係する。
【００７１】
この点において、同じライブラリを正常な動物に注入することは、違いによって、病理に特異的な受容体の発現を特徴付ける手段であり、よって、同じ理由により、所定の病理に特異的なマーカーを明らかにする手段であるべきであることが注目される。
【００７２】
好ましくは、該分子またはリガンドの合成は、それら自体で知られている技術を用いて、例えばトリチウム化無水酢酸を用いる、固体担体に結合したペプチドのNH2-末端官能基のアセチル化によりN-末端の位置にCT3-CT2-CO基を導入して、固相で行われる。
【００７３】
本発明の主題は、
−限定されないが、特に、分子に存在する原子をその放射性同位体の1つで置換することにより各分子が予め標識された標識分子の少なくとも1つのライブラリ、
−特に、器官および組織の切片について検出される放射線を検出するのに適するイメージング装置からなる群より選択される、放射性標識された物質を検出するための手段、ならびに
−HPLCおよび／または質量分析のように、検出された放射性標識物質を分析する手段
を含む、本発明によるスクリーニング方法を行うためのキットでもある。
【００７４】
本発明の主題は、
(1)  少なくとも1つの動物に、限定されないが、特に、分子中に存在する原子をその放射性同位体の1つで置換することにより各分子が予め標識された分子のライブラリを投与し、
(2)  動物の少なくとも1つを犠牲にし、そして動物の種々の組織の切片のサンプルを採取して、上記で定義したような適切なイメージング装置を用いてこれらを分析することにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析し、
【００７５】
(3)  放射性シグナルが検出される組織または器官の切片を選択し、
(4)  工程(3)で選択される該組織または器官の切片から、抽出および／またはクロマトグラフィー技術のような適切な技術により放射性画分を単離し、
(5)  工程(4)で得られる放射性画分を用いて、クロマトグラフィーおよび／または質量分析法のような適切な分析技術により該分子を特徴付け、
【００７６】
(6)  工程(4)で単離される分子とターゲット分子との間の結合を許容する条件の下で、工程(5)で得られる分子を、工程(2)に従って選択され、採取される組織または器官のサンプルと接触させて複合体を形成し、そして
(7)  該複合体から該ターゲット分子を単離する
ことを含む、分子のライブラリを用いて器官または組織で選択的に発現するターゲット分子(または受容体)を同定し、研究する方法でもある。
【００７７】
変形として、可能であれば、工程(2)は、細胞および組織または器官の切片からなる群より予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用いて、インビトロで適切なイメージング装置を用いることにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析することを含む。従って、この変形は、動物を犠牲にする必要がない。
【００７８】
本方法の有利な実施形態によると、該方法は、工程(2)に先立って、動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体(18F、11C、64Cu、76Br、124I、13N、15O：陽電子射出断層撮影、PET；99mTc、123I：ガンマ−カメラなど)により放射される粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析するための工程(1')を含む。
【００７９】
本方法の工程(7)は、特に、同定された化合物の特性をより正確に研究することを可能にする。インビボスクリーニングを用いて選択された各化合物は、その生体内分布特性を明らかにするために、スクリーニングに用いたのと同じ方法により再び合成され、放射性標識され、研究される。
【００８０】
本発明の主題は、興味のある分子を特定の組織空間および／または部位にターゲッティングさせるベクターであり、これは上記で定義したような分子のライブラリのスクリーニング方法を用いて選択された分子を含み、この分子の該部位への生体内分布が該方法を用いて同定されたことを特徴とする。
【００８１】
本発明の主題は、(i)  部位に特異的な分子に結合した、該部位を標的にする興味のある分子であって、この生体内分布が上記で定義したような分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて同定された分子、および(ii)  少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする部位特異的組成物でもある。
【００８２】
本発明の主題は、医療用イメージングで用いることを意図した組成物を製造するための、上記で定義したような分子のライブラリのスクリーニング方法を用いて選択された標識分子の使用でもある。
該使用の有利な実施形態によると、標識分子は適切な造影剤と結合する。
【００８３】
本発明の主題は、少なくとも：
(1)  興味のある分子を、放射性コンジュゲートを得るように、上記で定義したような分子のライブラリをスクリーニングする方法を用いて選択される、ターゲットに特異的な放射性標識分子と結合させ、
(2)  少なくとも1つの動物に、工程(1)で得られるコンジュゲートを投与し、そして
(3)  生物学的サンプルを用いて、該生物学的サンプルの少なくとも1つのターゲットと、該放射性標識分子と結合した興味のある分子との結合をインビトロで分析する
を含むことを特徴とする、興味のある分子について少なくとも1つのターゲット(例えば受容体)を同定する方法でもある。
【００８４】
本発明の主題は、競合による、未標識分子のインビボスクリーニング方法でもあり、該方法は：
(1)  上記で定義したような分子のライブラリのスクリーニング方法を用いてその生体内分布が同定された標識分子を、少なくとも1つの動物に投与し、
(2)   動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射された粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、工程(1)で投与される放射性分子の生体内分布の第一の分析を行い、
【００８５】
(3)  未標識分子のライブラリを投与し、
(4)  動物の少なくとも1つを、特に、選択された放射性同位体により放射された粒子の種類を検出するのに適するカメラを組み込んだ検出装置を用いる外部イメージングに付すことにより、放射性分子の生体内分布の第二の分析を行い、
【００８６】
(5)  標識分子の分布の第一の分析との比較によって、少なくとも1つの未標識分子による標識分子の置換の動態を確立し、そして
(6)  反復分画(デコンボリューション法)とクロマトグラフィーおよび／または質量分析のような適切な分析技術による該分子の特徴づけとにより、標識分子の動態を変化させた少なくとも1つの未標識分子を検出する
を含むことを特徴とする。
【００８７】
変形として、可能であれば、工程(2)および(4)は、細胞ならびに組織および器官の切片からなる群より予め抽出され、選択された生物学的サンプルを用い、適切なイメージング装置をインビトロで用いて、投与される分子の放射性の生体内分布を分析することを含む。
【００８８】
本発明の主題は、一般式：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
(式中、YaaはArgを表し、Yaa'はLeuを表す)
の分子のライブラリの化合物でもあり、これは上記で定義したような分子のライブラリのスクリーニング方法を用いて得ることができる。
【００８９】
驚くべきことに、この本発明による方法を用いて選択された式：
プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2
の化合物は、特に次の特性を有する：
−インビボで、ジンクペプチダーゼACE (アンジオテンシンI変換酵素)およびNEP (中性エンドペプチダーゼまたはネプリリシン(neprilysin))の潜在的な阻害剤であり、したがって心臓血管の病理での使用を見出す；
【００９０】
−血液脳関門を横切ることができ、結果として、上記で定義したような使用、特に標識されている場合、(1)  医療用イメージング、(2)  大脳の空間において興味のある分子をこのペプチドに結合させることにより興味のある分子をターゲッティングさせる方法、(3)  脳で特異的に発現される分子のスクリーニング方法において用いられ得る。
【００９１】
異なる一般式のその他のホスフィン酸ペプチドは、すでに記載されている(フランス特許出願第89 14978号；フランス特許出願第91 05403号；フランス特許出願第95 01328号；フランス特許出願第98 08464号)。これらのいくつかは(フランス特許出願第98 08464号参照)、ACEについての阻害活性を示す。しかしながら、驚くべきことに、従来技術によるとACEおよびNEPの混合阻害剤としてふるまうほとんどの化合物の化学構造は、それらのC-末端に遊離のカルボキシレート基を有し、これは阻害剤とこれらの2つのペプチダーゼとの間の強い相互作用を得るために必須の基であると考えられている(Braletら、Tips、2001、22、3、106〜109；Weber、The Lancet、2001、358、1525〜1532；Fink、Exp. Opin. Ther. Patents、1996、6、11、1147〜1164)。しかしながら、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2は、この混合活性を効果的に示すが、そのような基を有さない。
【００９２】
該ペプチドは、上記で定義したように、主に：
−医薬、
−特に大脳空間において、興味のある分子を標的にするベクター、
−医療用イメージングにおける部位特異的組成物、
−少なくとも1つのターゲット(例えば受容体)を同定する方法における使用、
−競合による未標識分子の直接インビボスクリーニング方法における使用
として用いられる。
【００９３】
より具体的には、本発明の主題は、少なくとも化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2、および少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする医薬でもある。
【００９４】
本発明の主題は、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2からなることを特徴とする、ターゲッティングのため、または医薬の標的を定めた(targeted)移動のためのベクターでもある。
【００９５】
本発明の主題は、トリチウム(3H)、カーボン14 (14C)、カーボン11 (11C)またはリン32 (32P)からなる群より選択される放射性同位体で標識された上記で定義したような化合物(プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2)でもある。
【００９６】
本発明の主題は、放射性同位体で標識され、任意に別の化合物に結合していてもよい上記で定義したような化合物(プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2)、および少なくとも1つの医薬的に許容される医薬添加物を含むことを特徴とする医療用イメージングを意図する組成物でもある。
【００９７】
本発明の主題は、医療用イメージングに用いることを意図する組成物を製造するための、上記で定義したような標識化合物の使用でもある。
【００９８】
本発明の主題は、放射性標識分子が放射性標識プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2ペプチドであることを特徴とする、興味のある分子についての少なくとも1つのターゲットを同定する方法でもある。
この場合、ターゲットは、好ましくは大脳空間に位置する。
【００９９】
本発明の主題は、放射性標識分子が放射性標識プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2ペプチドである、上記で定義したような、競合による未標識分子のインビボスクリーニング方法でもある。
【０１００】
上記の条件の他にも、本発明は、本発明による方法の実施例および添付の図面について言及する次の記載から明らかになるその他の条件を含む。該図面において：
−図1は、400 (PheおよびLeu残基に存在する不斉中心によるジアステレオ異性体を数えた場合は1600)の異なる分子の合成となる、一般式：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
(式中、YaaおよびYaa'は、20の天然アミノ酸が存在する位置を表す)
のライブラリの質量の理論分布を例示する。
【０１０１】
−図2は、一般式：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
のライブラリの実験的質量スペクトルを示す。
−図3は、ホスフィン酸ペプチド：
プロピル-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2
(質量595の化合物の選択)のフラグメンテーションの間にMS/MSスペクトルで観察された化学構造の例を表す。
【０１０２】
−図4は、ペプチド：プロピル-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2のMS/MSスペクトルを例示する。
−図5は、一般式：
プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2
に相当するホスフィン酸ペプチドのライブラリを含む溶液を投与されたマウスの全身の矢状断の、β-イメージャーで得られたオートラジオグラフを表す。ここで、該動物は注入後1時間で犠牲にされた。
【０１０３】
−図6〜8は、ホスフィン酸ペプチドのライブラリのI.P.注入後の、種々の器官(腎臓、肺および心臓)の抽出物の質量スペクトルを表す。
−図9および10は、ペプチド：プロピル-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2をMS/MSスペクトル付したときに得られるフラグメントを表す。
−図11〜13は、質量595の物質を選択して、MS/MSフラグメンテーション実験において腎臓、肺および心臓抽出物から得られるフラグメンテーションピークを例示する。これらの図は、これらの3つの器官の抽出物中に物質：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2が存在することを示す。
【０１０４】
−図14〜19は、純粋な形態(4つのジアステレオマー、図13)であって、種々の器官の抽出物(肺、心臓、肝臓、腎臓および脳)中のペプチド：プロピル-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2に対応するHPLCスペクトルを例示する。
−図20は、ペプチド：プロピル-3H-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2を投与され、該物質の注入1時間後に犠牲にされたマウスから得られた器官の種々の切片のオートラジオグラフィ画像を示す。また、
【０１０５】
−図21は、マウスにペプチド：プロピル-3H-NH-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2を注入した後に得られた器官の種々の切片のオートラジオグラフィ画像を示す。動物は、物質の注入1時間後に犠牲にされた。
−図22は、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2によるACE阻害を説明する。
−図23は、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2によるNEP阻害を説明する。
図24は、一般式：
プロピル-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa'-NH2
のサブライブラリ(各ライブラリの濃度は500 nM)によるACE阻害を説明する。
−図25は、一般式：
プロピル-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa'-NH2
のサブライブラリ(各ライブラリの濃度は250 nM)によるNEP阻害を説明する。
【０１０６】
−図26は、抽出による放射性標識物質の単離のプロトコルを説明する。
−図27、28および29は、それぞれ、マウスの腎臓、肺および脳における放射性標識化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 (pro-Arg)の生体内分布を説明する。これらの図は、この化合物について放射性イメージング装置(Biospace社からのβ-イメージャー)および質量分析(Electrospray、Quatro、MicroMass)を組み合わせることにより、ホスフィン酸ペプチドの検出感度を比較することを可能にする。
【実施例】
【０１０７】
実施例1：トリチウムで放射性標識したホスフィン酸ペプチド擬態物のライブラリまたは群
−ホスフィン酸ペプチド擬態物のライブラリの合成および放射性標識
a) ライブラリの放射性標識
ホスフィン酸ペプチドライブラリの合成は、発表されたプロトコルに基づく(A. Yiotakisら、J. Org. Chem.、1996、61、19、6601〜6605；J. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1995、270、37、21701〜21706；J. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1996、271、32、19606〜19611；V. DIVEら、PNAS、1999、96、4330〜4335)。ライブラリをRink-amide樹脂を用いて固相上で(上記のJ. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1996およびV. Diveら、PNAS、1999)、スプリット＆コンバインプロトコル(split & combine protocol) (上記のJ. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1995およびJ. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1996)を用いて合成する。合成プロトコルの最後に、樹脂上のペプチドの一般構造は：
Fmoc-NH-Yaa-NH-(R,S)Phe(PO(Oad)-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-CONH-R
の型であった。
YaaおよびYaa'は20の異なるアミノ酸で置換される位置を示し、Rは樹脂を表す。
【０１０８】
遊離のN-末端官能基を発生させて、N-末端官能基のアシル化により放射性反応物が結合するのを許容するために、Fmoc基を切断する。ホスフィン酸ペプチドを、その遊離のN-末端官能基に、97 Ci/mmolの比放射能を有するN-スクシンイミジル-T5 プロピオネートを結合させることにより放射性標識した。16.6μmolのホスフィン酸ペプチド(607の平均分子質量、脱保護後の最終ペプチド10 mgに相当)当たり10.3 nmolのN-スクシンイミジル-T5 プロピオネートをペプチドに結合させ、これはライブラリ当たり1 mCiの放射能の結合に相当する。
【０１０９】
アシル化反応は、過剰の冷N-スクシンイミジル プロピオネートを用いて完了する。樹脂をリンス後、ホスフィン酸ペプチドを、脱保護および切断の通常のプロトコルを用いて切断する(上記のJ. Jiracekら、J. Biol. Chem.、1996およびV. Diveら、PNAS、1999)。切断溶媒を蒸発の繰返しにより除去する。乾燥させたペプチドを、DMSO 50μl、1M NaHCO3 15μlおよびPBS 50μl中に採取する。溶液のpHを、1M NaHCO3溶液で7に調整する。最終容量をPBSで500μlに調整する。この溶液を、動物に投与する注射に用いる。ライブラリの質量スペクトル(図2)およびこのライブラリについての種々のMS/MSフラグメンテーション実験により、理論的に期待される全ての化合物の非常に良好な典型であることが示される。
【０１１０】
b) 得られたライブラリの特徴付け
このようにして、トリチウムで放射性標識されたホスフィン酸ペプチドのライブラリを得る。上記で定義したようなプロトコルに従って合成されたライブラリの一般式は、プロピル-3H-NH-Yaa(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2 (ここで、YaaおよびYaa'は、20のアミノ酸の等モル混合物が存在する位置を表す)である。つまり、このライブラリは400の化合物を含み、これらの構造中の2つの不斉中心の存在を考慮に入れると、表向きは1600の化合物を含む。化合物を、その構造中に5つのトリチウム原子を結合したC3H3-C3H2-COOHの型のトリチウム化プロピル酸の結合によりN-末端において放射性標識した。
【０１１１】
図1は、一般式：プロピル-NH-Yaa(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2のライブラリの質量の理論分布を説明する。
ライブラリ中に含まれる種々のホスフィン酸ペプチドの質量に相当する理論的包絡線が、この図に示される。この包絡線は、連続していないが明らかに解析不能のピークからなることが注目され、このことはこのライブラリの物質の種々の質量の群による分布を反映している。
【０１１２】
図2は、一般式：プロピル-NH-Yaa(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2のライブラリの実験的質量スペクトル(ES-MS = エレクトロスプレー質量分光法)を示す。
【０１１３】
理論的包絡線(図1)をライブラリに対応する実験的質量スペクトル(図2)と比較すると、理論データが実験データと非常によく一致することが注目される。この合致は、全てのホスフィン酸ペプチドがこのライブラリの非常によい典型であることを示す。MSスペクトルにおいて観察されるピークのフラグメンテーションについてのMS/MS実験は、このライブラリにおいて理論的に予想されるホスフィン酸ペプチドの存在を示すことを可能にする。
【０１１４】
質量分析によるホスフィン酸ペプチドの特徴付け
ペプチド化学において従来用いられているCH3-COではなく、CH3-CH2-CO型の保護基の選択は、質量分析による分子の特徴づけにおいて有用であることが見出された。このライブラリ中の各ホスフィン酸ペプチドを、それぞれ、N-およびC-末端の位置に存在するアミノ酸残基の種類により特徴付ける。このライブラリは、全く同じ質量および同じアミノ酸含量であるが、以下に説明するようなそれらの配列のみが異なるペプチドの組の存在により特徴付けられる。
【０１１５】
例えば、次の2つのペプチドは、それらの質量によっては互いに区別することができず、同一である：
プロピル-Asp-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2
プロピル-Ala-Phe(PO2-CH2)Leu-Asp-NH2
【０１１６】
ある特定の数のホスフィン酸ペプチドについて行われるMS/MSフラグメンテーション法は、少なくとも2つのペプチドが同じ質量の場合であっても、化合物の化学構造を明白に同定することが可能であると結論付けることを可能にする。この特性は、この型のホスフィン酸ペプチドのフラグメンテーションの形態のためであり、これは特に、N-末端の位置の残基の種類を同定することを可能にする。
【０１１７】
図3は、ホスフィン酸ペプチド：プロピル-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2をフラグメント化したときのMS/MSスペクトルで観察される化学構造の例を示す。
図4は、ペプチド：プロピル-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2のMS/MSスペクトルを示す。
【０１１８】
これらの図3および4に示すように、N-末端の位置での残基は、常に、プロポキシド基(pro-Phe-CO+、図3および4のピークD)を有する単位(entity)の形でみられる。よって、MS/MSスペクトルにおけるこの単位の観察により、ほとんどの場合、ペプチドのN-末端の位置でのアミノ酸、および結果としてC-末端の位置の残基の種類の同定が可能であり、ここでペプチドの質量は既知である。その他の種も系統的に観察される(pro-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu CO+、図3および4のピークC)；この観察は、配列のN-末端の位置での残基の種類を確証する(本実施例ではPhe残基)。
【０１１９】
このライブラリに存在するホスフィン酸ペプチドのフラグメンテーションの形態のこれらの特徴は、プロポキシド基の導入に起因する。これらの特徴のおかげで、いくつかのホスフィン酸ペプチドが同じ質量である場合であっても、該化合物の化学構造を同定することが可能である。
【０１２０】
ホスフィン酸ペプチドをフラグメント化するときのMS/MSスペクトルでの質量120におけるピーク(図3および4のピークE)の存在が、注目される。ホスフィン酸ペプチドの特徴であるこのピークの観察は、器官抽出物中のホスフィン酸ペプチドの存在を検出するために非常に有用である。
【０１２１】
−動物へのライブラリの注入およびトリチウム化ペプチドの生体内分布の観察
a) 動物への得られたライブラリの注入
実験に使用したマウスは、雌性Balb/Cマウスである。ライブラリのホスフィン酸ペプチド(10 mg、0.8〜1 mCiの範囲の放射能)を、DMSO 10%を含むPBS溶液に溶解する。このライブラリ中に400の分子の存在が考えられるならば、注入される各物質の量は、動物当たり25μgのオーダーであり、20 gの重量のマウスについて1.25 mg/kgの投与量に相当する。単一物質の注入の場合、100〜150μCiの範囲の全放射能について、用いた投与量は20 mg/kgであった。注入は種々の時間で行った(5分、1時間、3時間および24時間)。
【０１２２】
b) 器官切片の調製
動物を犠牲にした直後に、種々の器官または組織を回収し、PBS溶液中でリンスし、-70℃に冷却したヘプタン(ヘプタンおよびドライアイスの共融混合物)に浸漬する。厚み25μmの凍結組織切片を、ミクロトームを用いて-20℃で作製する。乾燥後、切片をβ-イメージャーで分析する。
【０１２３】
c) 結果
* β-イメージャーでの切片の分析
放射性標識ホスフィン酸ペプチドのライブラリは、マウスの腹腔内に、上記のプロトコルに従って注入される。
ある一定の時間(1時間または15分)経過後に、動物を犠牲にする。全身の切片を作製して、トリチウムのβ-放射線を検出し得る装置であるβ-イメージャーでのオートラジオグラフィにより分析する。これらの実験は、ライブラリの注入の15分および1時間後の両方において、種々の器官で放射能が観察されることを示す。図5は、ホスフィン酸ペプチドのライブラリを含む溶液を投与され、注入1時間後に犠牲にされたマウスの全身の矢状断の、β-イメージャーで得られるオートラジオグラフを示す。
【０１２４】
肝臓および腎臓以外は、例えば心臓および肺で放射能が観察される。さらに、その後動物が犠牲にされた実験により、このライブラリが動物において、観察期間の間で死亡または毒性を誘導するいずれの化合物も有さないことが確かめられる。よって、これらの実験の間、動物の生命機能が維持されたと結論付けることができる。この性状は、同定された化合物が生理的に発現された「受容体」と相互作用するはずであることを保証するので、重要である。
【０１２５】
−ホスフィン酸ペプチドの抽出
a) プロトコル
動物を犠牲にした後に器管を迅速に回収し、4℃でPBS溶液中に入れる。数分後に、4℃でPBS 2 mlを含むポッター(Potter)ホモジェナイザーに器官を移し、次いで手動で粉砕する。粉砕された物質を、PBS 15 mlを含む遠心管に移す。4000 rpmで30分間の遠心分離後に、上相を細胞ペレットから分離し、0.45μmのフィルタを通す。酸性化後のこのろ液を、TFA 0.1%を含む水性溶液中で予めリンスした、C18相5 gを含むカートリッジにのせる。
【０１２６】
溶出プロトコルは、まず、TFA 0.1%を含有する水20 ml、次いでアセトニトリル 50%およびTFA 0.1%を含有する水溶液30 ml、次いで80%アセトニトリルおよびTFA 0.1%を含有する水溶液20 mlを通過させることである。
C18カートリッジを出た溶出液は、2 mlの画分で回収する。放射能のカウントにより、放射性標識ホスフィン酸ペプチドを含む画分の同定が可能である。
放射性画分を減圧下に濃縮し、物質を水中に採取し、次いで種々の溶液を、5000 Daを超える分子量を有する物質を保持するろ過メンブレンを通過させる。このようにしてろ過された溶液を、減圧下に100μlの容積に濃縮する。
【０１２７】
次いで、これらのサンプルは、放射性ホスフィン酸ペプチドを観察するために、放射能を検出するシステムと連結した高性能クロマトグラフィー、または質量分析のいずれかにより容易に分析される。
【０１２８】
この工程は、最初のライブラリに含まれ、ある特定の器官に分布され得るホスフィン酸誘導体の存在を明らかにする。これらの器官に保持されたホスフィン酸誘導体を同定可能とするために、抽出手法の工程を通してライブラリの化合物の存在を監視するように、特に上述したような放射能の検出を用いてホスフィン酸誘導体を抽出する種々のプロトコルを試験した。分画プロトコルの使用により、放射能検出と連結したHPLCおよび質量分析の両方によりこれらの抽出液を分析することが可能である。質量分析の最適な使用、特に本方法の感度は、分析に付されるサンプルの質に基づく。よって、サンプルを調製するプロトコルは、この工程において非常に重要であるが、ライブラリの物質が有する化学官能基により変動し得る。例えばホスフィン酸ペプチド擬態物の場合、0.1% TFA を含むH2Oでリンスした後に、ライブラリの全てのホスフィン酸ペプチド擬態物は50% CH3CNで溶出され得るが、その後の分析に影響し得る多くの内因性の物質は80% CH3CNで溶出される。
【０１２９】
b) i.p.注入によりホスフィン酸ペプチドのライブラリを投与された動物に由来する器官抽出物の質量スペクトル分析
種々の器官および組織（腎臓、肝臓、肺、心臓、脳、腫瘍）から調製した種々の抽出物の質量スペクトルの分析は、これらの種々の抽出物の質量スペクトルにおいて腎臓以外ではホスフィン酸ペプチドに特異的なシグナルが見られないことを示す。
これらの結果を図6〜8に示す。
【０１３０】
図6は、腎臓の抽出物の質量スペクトルを示す。ここで、ホスフィン酸ペプチドの特徴であるピークが多く存在することが観察される（図2と比較されたい）。
図7は、肺の抽出物の質量スペクトルを示す。ここで、ホスフィン酸ペプチドの特徴であるピークが存在しないことが観察される。
図8は、心臓の抽出物の質量スペクトルを示す。ここで、ホスフィン酸ペプチドの特徴であるピークが存在しないことが観察される。
【０１３１】
しかしながら、質量スペクトル分析により得られる結果とHPLCにより得られる結果が相違することが観察される。実際に、ホスフィン酸ペプチドの特徴であるピークの存在が、肺および心臓から生じた抽出物中にHPLCにより検出される。この相違は、質量分析では、探索される物質に対応し得る質量ピークが、抽出工程後もまだ存在する、器官に含まれる内在性の化合物から生じる質量ピークによりマスクされ得るという事実から生じる。これらの結果に基づき、種々の抽出物中のホスフィン酸ペプチドの存在を証明するために、タンデムMS/MSフラグメンテーション質量分析を系統的に行う。
【０１３２】
このMS/MS質量分析法は、所定の質量でのペプチドのフラグメント化、それによりMS/MSスペクトルにおいて、このようなペプチドのフラグメントのみを明らかにすることを可能にする（スペクトルのシグネチャー）。よって、これらの実験は、この物質がMSスペクトルに現れなくても、物質の存在を証明するためにより効率的であることを証明する。
【０１３３】
このMS/MS質量分析は、肺および心臓でのホスフィン酸ペプチド、すなわち、プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の存在を同定することを可能にする。このペプチドは、腎臓および肝臓にも現れる。しかしながら、これらの器官では、その他のホスフィン酸ペプチドも観察される。図9および10は、ペプチド：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2をMS/MSスペクトルに付したときに観察されるフラグメントを示す。腎臓（図11）、肺（図12）および心臓（図13）抽出物中のペプチド：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の特徴であるフラグメンテーションピークの観察により、このペプチドがこれらの器官に存在すると結論付けることが可能になる。
【０１３４】
ペプチドライブラリのスクリーニングのためのこのアプローチを用いる、物質：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の選択は、その生体内分布特性を詳細に確立するために、純粋な形態で調製されたこのペプチドに導いた。
【０１３５】
純粋な形態で注入された放射性標識プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2ペプチドの生体内分布の研究は、オートラジオグラフィにより得られる種々の器官のイメージにより証明されるように、この化合物がマウス(20 mg/kg、100 μCi、物質のI.P.注入1時間後に犠牲にされたマウス)の種々の組織に効率的に分布され得ることを示す。この物質は、心臓、脳、肝臓、肺および腎臓で観察される。非常に有利には、このペプチドは、脳で観察されるので、血液-脳関門を横切ることができることが認められる。同じ抽出の手順および構造分析により、オートラジオグラフィで観察される全ての放射能が、無傷の形態のペプチド：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の存在と一致することが証明される(図20)。
【０１３６】
図14〜19は、放射能の検出を伴うHPLCスペクトルを示し、純粋なトリチウム化物質：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2、およびペプチド：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 (20 mg/kg、100 μCi)を投与され、該物質の注入1時間後に犠牲にされたマウスからの種々の器官の抽出物に相当する。
【０１３７】
ペプチド：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の、第一に心臓および肺のような特定の器官をターゲットとし、第二にこれらの器官に集積する能力を示すために、ネガティブコントロールとして同じ条件下で別の分子を用いた。これは上記のライブラリの別の分子、すなわちプロピル-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2であった。
【０１３８】
化合物：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2に用いたもののような同じ実験条件下でのこの生体内分布の研究は、その心臓および肺への集積能力、ならびに脳への出現能力の点の両方で、化合物：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2が、ペプチド：プロピル-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2とは、明らかに区別されることを示す。
【０１３９】
図21は、ペプチド：プロピル-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2 (20 mg/kg、100μCi)を投与され、該物質の注入1時間後に犠牲にされたマウスから調製した種々の器官のオートラジオグラフィのイメージを示す。
【０１４０】
実施例2：ホスフィン酸ペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の可能なターゲットの特性および同定
特に脳におけるホスフィン酸ペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の特異的生体内分布は、この化合物がアンギオテンシンI-変換酵素(ACE)および／または中性エンドペプチダーゼ(NEP、ネプリリシン)型のジンクペプチドと相互作用し得ることを提唱する仮定に導く。実際に、通常、ホスフィン酸ペプチドはジンクプロテアーゼまたはペプチダーゼと特異的に相互作用する能力を有する(フランス特許出願第98 08464号参照)。さらに、これらの2つのジンクペプチダーゼはホスフィン酸物質であるプロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2について観察されるものに影響しない生体内分布を有することが知られている(Cadwellら、Science、1975、191、1050〜1051；Roquesら、Tips、1990、11、245〜249)。
【０１４１】
この理由のために、ホスフィン酸ペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の阻害能力を、これらの2つのペプチダーゼの精製された形に関して評価した(Diveら、PNAS、1999、96、4330〜4335に従う、Ki値の測定)。図22および23に示すように、このペプチドは、アンギオテンシン変換酵素およびNEPに関して、それぞれ30 nMおよび100 nMに等しいIC50値を有し、15 nMおよび30 nMの阻害定数Ki値に相当する。よって、この化合物は、これらの2つのペプチダーゼに関して非常に効力のある阻害剤として作用する。
【０１４２】
これらの2つのペプチダーゼは比較的非選択的であると考えられているので、インビボスクリーニングの後に、ペプチド：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2だけがこのスクリーニング法により同定されたことは驚くべきことであろう。
【０１４３】
ACEおよびNEPに関して、最初のライブラリ中に含まれる種々の分子の阻害特性をよりよく知るために、一般式：
プロピル-NH-Aaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa-NH2
(ここで、Aaaと記された位置は特定のアミノ酸を含むが、Yaaの位置では20の天然アミノ酸の混合物が現れる)の別個の混合物を含むサブライブラリの阻害能力を評価した。
【０１４４】
図24は、位置Aaaでの残基の種類により、ACEに関して上記の一般式に相当するホスフィン酸ペプチドの混合物のパーセント阻害を示す。この図に報告される結果は、これらのサブライブラリに存在する多くのホスフィン酸ペプチドが、ACEの効力のある阻害剤であるように見えることを非常に明確に示す。有利には、位置Aaaでの残基のうち、ACEに関して化合物の阻害能力を最適化するものは、残基His、ArgおよびTyrであることがわかる。
【０１４５】
NEPについて同じライブラリを試験した場合(図25)、サブライブラリ中に含まれる多くのペプチドも、NEPの非常に効力のある阻害剤として作用するはずであることが明らかになる。位置Aaaでのアミノ酸のいくつかの種類は酵素-阻害剤相互作用を最適化することが注目される。
【０１４６】
これらのインビトロデータに基づいて、物質：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2が、これらの2つのペプチダーゼに関してライブラリ中に含まれるインビトロで最も効力のある阻害剤とは明らかに一致しないことがわかる。
これは、本発明の方法の利点を明確に示す。実際、インビトロスクリーニングのみの基づくと、例えば実際に効果的な化合物のみを選択することが不可能である。特に、インビトロ試験を用いて、効力のある阻害剤として作用する能力を有するライブラリの多くの化合物が選択されるが、インビボ工程を含む本発明による方法は、インビボで作用し得る化合物のみをこのようにして選択する限り、より選択的である。
【０１４７】
化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2がインビボでACEおよびNEPペプチダーゼを効果的に阻害する能力に基づいて、このような物質を心臓血管異常において用いることが期待される。
特にこれらの2つのジンクペプチダーゼを発現することが知られている領域での化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2の代謝安定性およびその良好な生体内分布は、この物質が、これらの2つのペプチダーゼをインビボで阻害するための優れた能力を有するであろうという予測に導く。結果として、このような物質はヒトの心臓血管異常において重要な使用を見出す。
【０１４８】
実施例3：本発明による方法の工程(2)および(3)〜(5)の組み合わせの重要性
−本発明による方法の注意
トリチウムで放射性標識された化合物のライブラリを動物に注入した後に、本発明による方法は、生物学的サンプル、より具体的にはそこからサンプルを採取する組織または器官の切片を用いて、適切な放射性イメージング装置を用いて該凍結組織または器官の切片の放射性シグナルを検出することにより、投与される分子の放射性の生体内分布を分析することを含む。
【０１４９】
考慮する組織に存在する化合物について同定するために、放射性シグナルを示す器官または組織のみがその後に分析される限りは、放射性シグナルを検出するために用いられる方法の感度が、ここでは中心的な役割を演じる。
【０１５０】
−トリチウム放射性イメージングおよび質量分析の相対的感度の比較
この比較を確立するために、トリチウム-放射性標識ホスフィン酸化合物：プロピル-Arg-Phe(PO2-CH2)Ala-Ala-NH2 (pro-Arg) (68 mCi/mmolの比放射能) 500μgをマウスに注入した。該物質の注入1時間後に、その生体内分布を、凍結組織切片を用いて放射能の検出により研究した。放射能を含む器官を、質量分析による分析を可能にするような組織抽出物を調製するために、図26に示す抽出プロトコルに従って処理した。これらの2つの方法の、動物に注入されたホスフィン酸化合物の存在を検出する能力の比較は、多様な放射性分子のライブラリを用いて、器官または組織に存在する放射性化合物の検出および同定の問題を解決することができるのは、本発明による方法の工程の組み合わせであることを示すことを可能にする。
【０１５１】
* 腎臓(図27)：
β-イメージャー：放射性写真は、この器官に放射性標識化合物が存在することを示す(これらのイメージにおいて、それぞれ濃灰色および淡灰色で放射能の最大および最小の強度を示す)。
物質(68 mCi/mmol)のシグナルおよび比放射能の積分に基づいて、腎臓mm2当たりに存在する物質の量を決定することができる。
【０１５２】
切片において、観察される放射性シグナルは14.5 pCi/mm2であり、物質0.2 pmol/mm2 (127 pg/mm2)を示す。腎臓全体の容積についてこの量を積分することにより、腎臓に存在する物質の全量が、注入された線量の15％ (75μg)に相当すると決定することができる。
【０１５３】
質量：物質を、上記と同様の条件下で処理された動物からの粉砕された腎臓から抽出し(抽出プロトコルは図26に記載)、その後、画分を濃縮して乾燥し、物質を溶媒100μl (水／ギ酸；50:50)中に採取する。抽出が定量的である場合、サンプルの理論濃度は、1.5 mMのオーダーであるべきである。この有効な仮定に基づいて、この100倍希釈溶液(15μM)の1マイクロリットルの注入が、質量分析計(Electrospray, Quatro, Micromass)に導入された物質15 pmolに相当することを予測することができる。
この量は、質量分析の感度に影響を全く及ぼさない。
【０１５４】
図27は、596ダルトン(M+H)の分子量に相当する質量ピークを特徴として、このサンプル中の物質の存在を観察することが完全に可能であることを実際に確証する。この質量スペクトルにおいて、他のシグナルと比較すると、596 Daでのピークが最大強度を有し、このことが、注入されたホスフィン酸ペプチドがこの物質と共に抽出された内在性物質に比較して主として大多数であると結論付けることを可能にする。物質の化学的特徴は、サンプルが、この化合物がフラグメント化されるのを許容するMS/MSモードに切り替えられたときに、フラグメントA、BおよびCが観察されることにより確認される。
【０１５５】
肺(図28)：
β-イメージャー：放射線写真は、肺にはより少量の物質があることを示す：この器官での放射能2.6 pCi/mm2に比べて、腎臓で14.5 pCi/mm2、すなわち注入された線量の2.2%。
質量：理論濃度22μMでの肺のサンプルの溶液を質量分析に付した。このサンプルの1マイクロリットルの注入は、腎臓において行われた実験と比較して、物質pro-Argの非常に良好な観察を含むことができた。図28のMSスペクトルは、これが検出限界内にあり、pro-Argに相当するシグナルがこのスペクトルで観察されるノイズのオーダーであることを示す。しかしながら、フラグメンテーション(MS/MS実験)を用いて、物質が存在すると結論付けることができ、ここで、予想されるフラグメント(A、BおよびC)は、MS/MSスペクトルではっきりと観察される。
【０１５６】
脳(図29)：
β-イメージャー：放射性写真は、脳の非常に局在化された領域での非常に弱い放射性標識を示す：腎臓での14.5 pCi/mm2に比較して0.35 pCi/mm2。このときには、放射性標識に関与する脳の容積が精密に測定されないので、脳に存在する物質の全量は、評価するのが困難である。
【０１５７】
質量：脳からの物質の抽出後、我々の物質を含有していると思われる全画分を質量分析計に注入したが、596にピークを観察することができなかった。フラグメンテーション実験は、ピークA、BおよびCを検出すること、よって脳に無傷の物質が存在することを確認することを可能にする。しかしながら、これらの実験は検出閾値の限界である。
【０１５８】
図27〜29に示される結果は、組織中で放射性標識ホスフィン酸ペプチドを検出する際の放射性イメージング装置／質量分析の組み合わせの役割を証明する。実際に、脳(図29)の場合、質量分析のみでは検出の限界であったが、放射性イメージング装置によりホスフィン酸ペプチドの存在が明らかにされたことが注目される。これらのデータは、放射性物質の最も高感度な検出のための放射性イメージング装置を用いる器官または組織中の放射性物質の検出の工程の後に、質量分析による分析の工程を組み合わせる必要性を示し、このことは放射性イメージングを用いて脳において検出される物質の化学的特徴を確立することを可能にする。
【０１５９】
実際に、非常に効果的ではあるが、質量分析は、組織の種類によっては非常に少量の物質の完全な精製を必要とし、このことは、種々の器官に含まれる内在性物質が非常に多量に存在することから、達成するのが非常に困難な目標である。注入された物質に関する質量の範囲(200〜800 Da)での内在性物質の存在は、質量分析の相対的感度に対して、別の非常に重要な結果を有する。質量分析の感度は、実際に、分析されるサンプルの純度により左右される。分析されるサンプル中の塩またはその他の不純物の存在は、質量分析の理論感度において数オーダーの大きさの減少をもたらし得る。
【０１６０】
同定することが望まれる物質の単離を目的とするいずれの処理も必要としない放射性シグナルの検出工程の使用は、選択された放射性物質の良好な分析工程と組み合わされた、最適な手法でこれらの物質の検出を可能にする適切な放射性イメージング装置により行われるが、種々の器官または組織での物質の検出の感度の点から望ましい性能レベルを得ることを可能にする。
【０１６１】
実施例4：陽電子射出断層撮影法による、フッ素18で放射性標識された化合物の混合物の生体内分布の分析(本発明による方法の工程(1')の存在)
材料および方法
動物：任意に給餌され、通常の動物の飼育箱(調節雰囲気、日／夜の期間は12／12)で飼育された200 gの体重のウィスターラット(Janvier)に対して実験を行った。ラットに、誘導期についてO2ガス混合物中の3.5％イソフルランで麻酔をかけ、完全な獲得の間、2％の麻酔を保持する。種々のトレーサーの混合物(共注入のための)は、4匹の動物について30秒未満の期間にわたって300μlのボーラスの形態を静脈内に注入する。
PET：4匹のラットを、EXACT HR+カメラ(Siemens) (同時の近接した63の断面図、横方向に4.5 mm、軸方向に4.1 mmの中心から1 cmで測定される二次元モードでの分解能)の所定位置におく。511 keVのガンマ線についての組織および支持体の減衰の訂正は、68Ge-68Ga光源での透過スキャン(15分)を用いて得られる。トレーサーの注入後の動的な分析は、102フレーム(25×0.2分；19×0.3分；20×0.5分；38×1分)の獲得により行う。
【０１６２】
トレーサー：[18F]FDGは、グルコース消費についての代謝マーカーである。[18F]F-A85380は、α2β4ニコチン酸のアゴニストである。2匹のラットに2つのトレーサーの混合物(1：1)を与える一方、他の2匹のラットには2つのトレーサーのうち単に1つを与える。全ての動物について、ラピッドIV (ボーラス)により投与された全線量は、容量400μlの水溶液中の1.4 × 107 Bqである。
【０１６３】
データ分析：興味のある領域は、CAPPソフトウェアを用いて追跡され、放射能の濃度は組織のml当たりのBqで表す。
【０１６４】
結果：
動物への放射性物質の混合物の注入後の陽電子射出断層撮影は、このような混合物中の例えば脳または心臓にさえ到達し得る物質の存在を迅速に探索することを可能にする。このような基準に基づいて、選択された生体内分布基準を満たすもののみを選択するために、混合物を迅速に分類することができる。
【０１６５】
よって、本方法の他の工程と組み合わせたこの工程は、非常に低い検出の閾値で放射性標識物質を検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図1は、400 (PheおよびLeu残基に存在する不斉中心によるジアステレオ異性体を数えた場合は1600)の異なる分子の合成となる、一般式：プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2(式中、YaaおよびYaa'は、20の天然アミノ酸が存在する位置を表す)のライブラリの質量の理論分布を例示する。
【図２】図2は、一般式：プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2のライブラリの実験的質量スペクトルを示す。
【図３】図3は、ホスフィン酸ペプチド：プロピル-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2(質量595の化合物の選択)のフラグメンテーションの間にMS/MSスペクトルで観察された化学構造の例を表す。
【図４】図4は、ペプチド：プロピル-3H-Phe-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2のMS/MSスペクトルを例示する。
【図５】図5は、一般式：プロピル-3H-NH-Yaa-(R,S)Phe(PO2-CH2)(R,S)Leu-Yaa'-NH2に相当するホスフィン酸ペプチドのライブラリを含む溶液を投与されたマウスの全身の矢状断の、β-イメージャーで得られたオートラジオグラフを表す。ここで、該動物は注入後1時間で犠牲にされた。
【０１６７】
【図６】図6は、ホスフィン酸ペプチドのライブラリのI.P.注入後の、種々の器官(腎臓、肺および心臓)の抽出物の質量スペクトルを表す。
【図７】図７は、ホスフィン酸ペプチドのライブラリのI.P.注入後の、種々の器官(腎臓、肺および心臓)の抽出物の質量スペクトルを表す。
【図８】図8は、ホスフィン酸ペプチドのライブラリのI.P.注入後の、種々の器官(腎臓、肺および心臓)の抽出物の質量スペクトルを表す。
【図９】図9は、ペプチド：プロピル-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2をMS/MSスペクトル付したときに得られるフラグメントを表す。
【図１０】図10は、ペプチド：プロピル-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2をMS/MSスペクトル付したときに得られるフラグメントを表す。
【０１６８】
【図１１】図11は、質量595の物質を選択して、MS/MSフラグメンテーション実験において腎臓、肺および心臓抽出物から得られるフラグメンテーションピークを例示する。
【図１２】図12は、質量595の物質を選択して、MS/MSフラグメンテーション実験において腎臓、肺および心臓抽出物から得られるフラグメンテーションピークを例示する。
【図１３】図13は、質量595の物質を選択して、MS/MSフラグメンテーション実験において腎臓、肺および心臓抽出物から得られるフラグメンテーションピークを例示する。
【図１４−１９】図14〜19は、純粋な形態であって、種々の器官の抽出物(肺、心臓、肝臓、腎臓および脳)中のペプチド：プロピル-3H-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2に対応するHPLCスペクトルを例示する。
【図２０】図20は、ペプチド：プロピル-3H-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2を投与され、該物質の注入1時間後に犠牲にされたマウスから得られた器官の種々の切片のオートラジオグラフィ画像を示す。
【図２１】図21は、マウスにペプチド：プロピル-3H-NH-Tyr-Phe(PO2-CH2)Leu-Pro-NH2を注入した後に得られた器官の種々の切片のオートラジオグラフィ画像を示す。動物は、物質の注入1時間後に犠牲にされた。
【０１６９】
【図２２】図22は、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2によるACE阻害を説明する。
【図２３】図23は、化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2によるNEP阻害を説明する。
【図２４】図24は、一般式：プロピル-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa'-NH2のサブライブラリ(各ライブラリの濃度は500 nM)によるACE阻害を説明する。
【図２５】図25は、一般式：プロピル-NH-Yaa-Phe(PO2-CH2)Leu-Yaa'-NH2のサブライブラリ(各ライブラリの濃度は250 nM)によるNEP阻害を説明する。
【図２６】図26は、抽出による放射性標識物質の単離のプロトコルを説明する。
【図２７】図27は、マウスの腎臓における放射性標識化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 (pro-Arg)の生体内分布を説明する。
【図２８】図28は、マウスの肺における放射性標識化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 (pro-Arg)の生体内分布を説明する。
【図２９】図29は、マウスの脳における放射性標識化合物：プロピル-NH-Arg-Phe(PO2-CH2)Leu-Ala-NH2 (pro-Arg)の生体内分布を説明する。
【図１】
2005534000.tif 000002
【図２】
2005534000.tif 000003
【図３】
2005534000.tif 000004
【図４】
2005534000.tif 000005
【図５】
2005534000.tif 000006
【図６】
2005534000.tif 000007
【図７】
2005534000.tif 000008
【図８】
2005534000.tif 000009
【図９】
2005534000.tif 000010
【図１０】
2005534000.tif 000011
【図１１】
2005534000.tif 000012
【図１２】
2005534000.tif 000013
【図１３】
2005534000.tif 000014
【図１４】
2005534000.tif 000015
【図１５】
2005534000.tif 000016
【図１６】
2005534000.tif 000017
【図１７】
2005534000.tif 000018
【図１８】
2005534000.tif 000019
【図１９】
2005534000.tif 000020
【図２０】
2005534000.tif 000021
【図２１】
2005534000.tif 000022
【図２２】
2005534000.tif 000023
【図２３】
2005534000.tif 000024
【図２４】
2005534000.tif 000025
【図２５】
2005534000.tif 000026
【図２６】
2005534000.tif 000027
【図２７】
2005534000.tif 000028
【図２８】
2005534000.tif 000029
【図２９】
2005534000.tif 000030
【国際調査報告】
2005534000.tif 000031
2005534000.tif 000032
2005534000.tif 000033
2005534000.tif 000034
2005534000.tif 000035
2005534000.tif 000036
2005534000.tif 000037
2005534000.tif 000038
2005534000.tif 000039
2005534000.tif 000040