(57)【要約】感染した蛋白質の集合形態、即ち、PrP、アミロイド及びタウが、正常な形態の蛋白質の存在下で選択的に結合される。これは、ポリイオン結合因子、即ちデキストラン硫酸或いはペントサン（アニオン）、或いはポリアミン化合物、即ちpDADMAC（カチオン）を、選択的な結合条件下で用いることによってなされる。該選択的結合条件は、若干アルカリ性ｐＨのｎ−ラウロイル・サルコシンの使用を含む。その後、感染した蛋白質の集合形態は分析される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の集合していない形態の存在内において、蛋白質の集合した異常形態を選択的に結合させる工程であって、
該工程は選択的な結合状態下で、異常な形態及び正常な形態をともに含む材料をポリイオン材料である結合因子と接触させる工程を備え、
該ポリイオン材料はサンプル内に存する前記蛋白質の前記集合形態に対して結合親和性を備えることを特徴とする工程。
【請求項２】
前記選択的な結合状態が、溶液中に競合因子を含み、
該競合因子がイオン基を備え、
該イオン基が前記ポリイオン材料よりも、蛋白質の異常形態に対して低い結合親和性を有することを特徴とする請求項１記載の工程。
【請求項３】
前記結合因子が、プロテアーゼ抵抗性であることを特徴とする請求項１又は２記載の工程。
【請求項４】
プロテアーゼが前記結合の間存在し、或いは、
前記蛋白質が結合の後にプロテアーゼの作用を受けることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の工程。
【請求項５】
前記結合因子が、多数のアニオン基を有するポリアニオン材料である、或いは、
多数のカチオン基を有するポリカチオン材料であることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の工程。
【請求項６】
前記ポリイオン材料が、多数のアニオン基を有し、該アニオン基が硫酸基、カルボキシル基或いは燐酸基である、或いは
多数のカチオン基を有し、該カチオン基がアミノ基、イミン基或いは４級のアンモニア基であることを特徴とする請求項５記載の工程
【請求項７】
前記ポリイオン材料がポリアニオン・ポリグリコシドであることを特徴とする請求項６記載の工程。
【請求項８】
前記ポリアニオン・ポリグリコシドがポリスルホン化ポリグリコシドであることを特徴とする請求項７記載の工程。
【請求項９】
前記ポリアニオン・ポリグリコシドがポリアニオン・ペントサン誘導体或いはデキストラン誘導体であることを特徴とする請求項８記載の工程。
【請求項１０】
前記ポリスルホン化ポリグリコシドがペントサン・ポリ硫酸塩（ＰＰＳ）或いはデキストラン硫酸塩であることを特徴とする請求項９記載の工程。
【請求項１１】
前記ポリイオン材料が、臭化ヘキサジメチリン、ＰＡＭＡＭデンドリマ、ポリＬ−リシン、ｐＤＡＤＭＡＣ或いはポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項５記載の工程。
【請求項１２】
前記競合因子が、ポリイオン材料よりも低いイオン基の密度を有することを特徴とする請求項１乃至１１いずれかに記載の工程。
【請求項１３】
前記競合因子が、アニオンであることを特徴とする請求項１２記載の工程。
【請求項１４】
前記競合因子が、アニオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１３記載の工程。
【請求項１５】
前記競合因子が、脂肪酸のアミノ酸アミドであることを特徴とする請求項１３記載の工程
【請求項１６】
前記競合因子が、ｎ−ラウロイルサルコシンであることを特徴とする請求項１５記載の工程。
【請求項１７】
ｐＨが蛋白質の異常形態への前記結合因子の前記結合を促すことを特徴とする請求項１乃至１６いずれかに記載の工程。
【請求項１８】
前記ｐＨが８から９の間であることを特徴とする請求項１７記載の工程。
【請求項１９】
前記ｐＨが８．２から８．６の間であることを特徴とする請求項１８記載の工程。
【請求項２０】
界面活性剤が存在し、前記蛋白質の異常形態への前記結合因子の結合を促すことを特徴とする請求項１乃至１９いずれかに記載の工程。
【請求項２１】
前記異常な蛋白質の集合体へ結合した後の前記結合因子が、固定された捕捉因子によって捕捉されることを特徴とする請求項１乃至２０いずれかに記載の工程。
【請求項２２】
前記捕捉因子がレクチン或いは前記結合因子とともに反応する抗体であることを特徴とする請求項２１記載の工程。
【請求項２３】
選択的に結合可能なタグ部分が前記結合因子にもたらされ、
前記捕捉因子が前記タグ部分と結合することを特徴とする請求項２１記載の工程。
【請求項２４】
前記結合因子が、前記蛋白質の異常形態に曝される前に、固形培地に固定されることを特徴とする請求項１乃至２０いずれかに記載の工程。
【請求項２５】
前記培地が基質であって、該基質上を前記結合因子が覆うことを特徴とする請求項２４記載の工程。
【請求項２６】
前記結合因子が選択的に結合可能なタグ部分にもたらされるとともに、前記タグ部分によって、前記固形培地に固定されることを特徴とする請求項２４記載の工程。
【請求項２７】
前記結合可能なタグ部分が、ビオチン、フルオレセイン、ジニトロフェノール、ディグオキシレニン、核酸、核酸類似配列或いは（Ｈｉｓ）６であることを特徴とする請求項２３又は２６記載の工程。
【請求項２８】
前記結合因子が固体内に配され、該固体が前記結合力を備える表面を有することを特徴とする請求項１乃至２０記載の工程。
【請求項２９】
前記表面が、ポリマからなり、
該ポリマがイオン基を有し、該イオン基がポリマ構造内で共有結合している若しくは前記ポリマの表面群の変化によって生成されることを特徴とする請求項２８記載の工程。
【請求項３０】
サンプル内の蛋白質の異常な集合体の存在を分析する工程であって、
前記工程が、前記結合因子に結合した蛋白質の存在或いは量を見定める請求項１乃至２９いずれかに記載される前記蛋白質の異常形態を結合させる工程を備えることを特徴とする工程。
【請求項３１】
前記結合が、蛋白質の集合体に対する免疫学的検定方法を施すことによって定性的或いは定量的に見定められることを特徴とする請求項３０記載の工程。
【請求項３２】
蛋白質の異常な集合体の結合が、正常な非集合蛋白質の存在内で選択的に行われ、
結合した蛋白質の集合体が結合していない正常な蛋白質から分離され、
前記結合の存在或いは量の決定がなされることを特徴とする請求項３０又は３１記載の工程。
【請求項３３】
前記異常な蛋白質がＰｒＰｓｃであり、前記正常な形態がＰｒＰｃであることを特徴とする請求項１乃至３２いずれかに記載の工程。
【請求項３４】
ＰｒＰｓｃを脂肪酸のアミノ酸アミドの存在する場にある結合因子と選択的に結合させる段階を備えることを特徴とするＰｒＰｃからＰｒＰｓｃを分離する工程。
【請求項３５】
前記結合因子がポリイオン材料であることを特徴とする請求項３４記載の工程。
【請求項３６】
前記脂肪酸のアミノ酸アミドがＮ−ラウロイルサクロシンであることを特徴とする請求項３４又は３５記載の工程。
【請求項３７】
請求項３４乃至３６いずれか１つの工程が、８から９のｐＨで行われることを特徴とする工程。
【請求項３８】
ポリアニオン・ポリグリコシド、ヘキサジメチリンである結合因子或いは結合可能なタグ部分に対して結合するポリカチオン結合因子であって、
前記結合可能なタグ部分を固形培地上の捕捉因子に結合させることによって、前記結合因子が固形培地に固定されることを特徴とする結合因子。
【請求項３９】
前記結合因子が、ポリスルホン化ポリグリコシドであることを特徴とする請求項３８記載の選択的な結合因子。
【請求項４０】
前記結合因子がポリアニオン・ペントサン誘導体或いはデキストラン誘導体であることを特徴とする請求項３８記載の選択的な結合因子。
【請求項４１】
前記結合因子が、ポリカチオン材料であり、該ポリカチオン材料が臭化ヘキサジメチリン、ＰＡＭＡＭデンドリマ、ポリＬ−リシン、ｐＤＡＤＭＡＣ或いはポリエチレンイミンから選択されることを特徴とする請求項３８記載の選択的な結合因子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プリオンタンパク質ＰｒＰｃの異常型又は不良型、及び正常型では凝集性を示すことがないタンパク質の凝集性の異常型タンパク質を捕捉するための選択的な条件の元で、一般的には、ペントサンポリ硫酸、デキストラン硫酸若しくは他のポリアニオン性ポリグリコシドを含むポリアニオン物質、又はポリブレン、ポリアミドアミンデンドリマー若しくはポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）を含むポリカチオン物質などのポリイオン物質であるプロテアーゼ抵抗性を有する結合因子の使用に関連する。
【０００２】
感染性海面状脳症、即ちＴＳＥｓと呼ばれるプリオン病は、近年になって認識された。牛海綿状脳症（ＢＳＥ）は1985年に初めて報告された。最初の変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣJD）の症例は1996年になって報告された。ｖＣＪＤは、ＢＳＥを含む牛肉の消費が原因と考えられている致命的な神経変性病である。人間では、感染から臨床症状までの潜伏期間が長い。
【０００３】
プリオン病の原因となる因子である、プリオンの同定された唯一の構成要素は、ＰｒＰｃの異常イソ型であるＰｒＰＳｃである（ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰresと呼ばれており、ＰｒＰｃはＰｒＰSenと呼ばれている。）。以前は、プロテアーゼ抵抗性を比較的有しているという点で、ＰｒＰＳｃはＰｒＰｃと区別されるものであるとみなされていた。しかしながら、近年、ＰｒＰＳｃのプロテアーゼ感受性型が存在することが、即ち、プロテアーゼ感受性であるＰｒＰの感染性型が存在していることが報告された。
【０００４】
感染性であるがプロテアーゼ感受性であるＰＲＰＳＣは凝集することができる（即ち、自然に凝集する）が、依然として凝集していないか、少なくとも一部が凝集しただけである。
【０００５】
本明細書では、プロテアーゼ非感受性型及びＰｒＰＳｃのプロテアーゼ感受性型と、部分的プロテアーゼ分解で残ったＰｒＰＳｃの核部分（技術的には、ＰｒＰ２７−３０と呼ばれる）の双方は、これらのうちの特定の一つが意味された箇所以外は、ＰｒＰＳｃとする。「凝集タンパク質」なる用語は、凝集性の抗プロテアーゼＰｒＰＳｃと、ＰｒＰＳｃ又は他のタンパク質の感染性の非凝集型又は一部凝集型に加えて、他のタンパク質の類似型の両方の意味を含み、さらに新たに観察されたプロテアーゼ感受性の感染性ＰｒＰＳｃの意味をも含む。
【０００６】
ＰｒＰＣは機能不明のＧＰＩ固着性の糖タンパク質である。プリオン病のための他のマーカーが示唆されてきたが、ＰｒＰＳｃは、必須のプリオン構成要素だけでなく、この一群の病気のために容認された唯一信頼でき、しかも普遍的なマーカーである。
【０００７】
ＰｒＰＳｃの存在を評価するための現在有用な方法は、サンプルを、ＰｒＰｃを破壊するために十分な期間プロテナーゼKによるタンパク質加水分解に供し、次いで、ＰｒＰＣ存在下でＰｒＰＳｃ選択性でない抗体を使用したイムノアッセイによって、残存するＰｒＰＳｃの存在を測定することである（Serban et AL., Neurology, Vol. 40, No.1, Jan 1990）。タンパク質加水分解工程では、プロテアーゼの使用は、元来、捕捉因子又は検出因子としての抗体の存在を排除する。抗体が導入される前に、プロテアーゼは除去又は失活されなければならない。この方法における制限を回避するために好ましい。
【０００８】
このアッセイは、偽陽性を避けるためにＰｒＰｃの完全な除去と、偽陰性を避けるためにＰｒＰＳｃを分解することのない条件に依存する。選択的なタンパク質分解におけるこのような条件は、アッセイされるサンプルのそれぞれのタイプ毎に構築されなければならない。結果としてもたらされるアッセイの感度は制限される。例えば、ウシの脳組織のアッセイにおいて、感度は動物がＢＳＥの臨床的に顕著な症状を示したときに信頼性の有る陽性の結果が得られるというようなものである。従って、このアッセイは、１０４〜１０５のプリオン感性性のユニットに対応する１μｇ／ｍLの領域に検出限界を有している。
【０００９】
プリオン病のためのより高感度で、より特異的な診断テストが必要とされている。血液又は他のサンプル型を使用する死前テストは、特定の動物の疾病状況を評価するために、特に要求されている。そのような方法がない状態では、いったん感染した動物が群内で確認されれば、動物の大規模な屠殺が必要とされる。また、人口母集団をスクリーニングし、献血された血液、外科的処置並びに器官及び組織の移植からの潜在的感染から個人を保護するための診断テストが開発されることは重要なことである。
【００１０】
米国特許第5977324号および米国特許第6221614号の双方ともに、リンタングステン酸（PTA）を使用するＰｒＰＳｃの結合方法について記載されている。ＰＴＡはＰＲＰＳＣ以外の多くの種類の蛋白質と結合して沈殿物を形成する非特異性の蛋白質沈殿剤である。サンプル中の蛋白質の濃度は、ＰＴＡを使用する回収に大きく影響する。
【００１１】
プラスミノーゲンはＰＲＰＣに関してＰｒＰＳｃを選択的に結合することが報告されており、診断のアッセイでの使用が提案された（Fischer et al. Nature, 2000, Nov 23,408 (6811): 479-83）。しかしながら、この方法は、十分に有用であると実際上立証されていない。プラスミノーゲンは、関連する明細書である米国特許公開第2002/0004586号公報において、選択的にＰｒＰＳｃを結合する因子であると特定される。
【００１２】
米国特許第6419916号公報及び関連する明細書によれば、ポリアミン合成物であるSUPERFEＣT（商品名）（PAMAMデンドリマーの加熱誘導される分解によって製造された枝分かれポリアミン混合物である。）及び他の同様の枝分かれポリアミンが、インビトロにおける細胞からＰｒＰＳｃを除去することができる。このメカニズムは不明瞭である。このような化合物は、露出した負電荷を帯びた成分を備えたアミロイドとして配列したＰｒＰＳｃに直接的に結合することができ、また、酸性条件下における構造変化を誘導することが推察される。この効果は、ＰｒＰＳｃが除去されるので、ＰｒＰｃの結合及び既存のＰＲＰＳＣの合成を阻害することを単に伴わないと考えられる。もし、ｐＨが４未満ならば、ポリアミンはＰｒＰＳｃをプロテアーゼ感受性にすることが分かる。インビトロのＰｒＰＳｃ除去実験における酸性セル・コンパートメントで、ポリアミンが作用することが推定される。
【００１３】
このようなポリアミンがＰｒＰＳｃと結合すると結論を下すことは推論的であることが、本研究から導かれる。多くの他の可能性が提案される。ＰｒＰＣ上のＰｒＰＳｃの結合の選択性が存在しないことが示されるか或いは示唆される。さらに、プロテアーゼ攻撃を可能にするためにＰｒＰＳｃの配列を変化する作用を単に果たすだけであり、生じた結合が一時的であると推定することはできない。さらに、ポリアミンの作用は、低pH値を要求するように思われる。実際には、本研究では、このようなデンドリマー・ポリアミンが、このような低pH値でＰｒＰＳｃと結合しないことが示されている。
【００１４】
ペントサンポリサルフェート（ポリ−ｂ−キシロース−２，３−ジスルホネート、PPS）は、一群の高分子量ポリスルホン化ポリグルコシド（ＰＧｓ）（分子量8,000〜12,000）のうちの一つである。ブナ材から製造され、ヘパリンさらにPGに類似した抗凝血剤として長年使用されてきたのは安価な合成物である。PPSおよび他のポリアニオンを含むPGsは、ＰｒＰＣおよび組換ＰｒＰ（reｃＰｒＰ）の両方と結合することが知られている（例えば、Brimacombe DB et al, Biochem J, 1999 Sep 15; 342 pt 3,605-13参照）。従って、ＰＰＳはＴＳＥ病の予防又は治療の潜在的な治療剤として提案された。インビボ又はインビトロにおける既存のＰＲＰＳＣを除去することを示してはいない。
【００１５】
製造工程では、ペントサンと呼ばれるキシロース（５員環の糖）の可溶性糖ポリマーを生産するために、ブナ材のおがくずが抽出処理される。その後、このポリマーは、クロロスルホン酸及びピリジンの混合物を使用した硫酸化反応に供され、全ての糖環の水酸基の４つのうちの３つにおいて、加えられた硫酸エステルを有するようになる。その結果、全硫酸塩含有量は、ヘパリンの硫酸塩含有量である約３０〜３５％を越える約５０〜５５重量％となる。このような高度のスルホン化と近似した他の唯一の同様の分子は、硫酸デキストラン（４０〜４５％）である。ペントサンは、３．５〜７．０Ｋという非常に低い分子量を有する。
【００１６】
ＰＲＰＣの結合に関するＰＲＰＳＣのポリアニオン又はポリカチオンによる結合のための選択性は報告されていない。驚くべきことに、ポリイオン物質がＰｒＰＳｃのような凝集性の変異タンパク質と結合する条件を明らかにした。さらに、このようなポリアニオンは異常型には結合し、ＰｒＰｃのような非凝集性の正常型には結合しない条件を明らかにした。その結合は十分強固であり、十分に選択的である好ましい条件は、凝集性変異タンパク質（例えば、ＰｒＰＳｃ）の存在するためのアッセイにおいて有用であった。
【００１７】
従って、本発明の第一の態様、即ち、非凝集性の正常型タンパク質の存在下において、凝集性の異常型タンパク質の選択的な結合のための方法が提供される。本発明は、選択的な結合条件下における、前記異常及び正常型を含む物質と、サンプル中に存在する前記凝集型タンパク質との結合活性を有するポリイオン物質との接触からなる。結合条件は、溶液中に競合因子の存在を含むことができ、この競合因子は、ポリイオン物質よりも、異常型タンパク質に対するより劣った結合活性を有する。
【００１８】
ポリイオン物質は、溶液中に存在していてもよく、またイオン性表面基を有するような表面に提供されても構わない。後者の場合、この表面は、ポリマー構造内で共有結合されるか、又はポリマーの表面基の修飾によって調製された前記イオン基を有するポリマーの表面に存在することができる。好適なポリアニオンポリマーの一例は、ビーズ又はシートとして入手可能である、パーフルオロ化され、スルホン化された炭化水素ポリマーであるナフィオンである。ポリカチオンポリマーも使用することができる。
【００１９】
もう一つの方法としては、この表面は、前記イオン基を提供する基質の上にコートされたものであるか、或いは基質への結合のいずれかである。このような表面基を有する好適なポリマーの一例は、無水マレイン酸で界面活性化され、表面カルボキシル基又はポリカチオン物質を生成するためにＴＲＩＳで誘導体化された非イオン性プラスチックである。ポリカチオン又はポリアニオンは、ポリスチレンのようなポリマー上に、代わりに受動的にコートされることができる。
【００２０】
ポリアニオン物質に関しては、溶液中で使用する場合でも、または固体の表面にコートする場合でも、ポリアニオン物質は好ましくはポリアニオン性のポリグルコシドである。
【００２１】
一般に、競合因子は、ポリイオン物質に比べて、より小さいイオン基の密度を有する。理論に拘束されることなく、ここで詳述される研究結果は、同種の非凝集性の正常型タンパク質に比べて、イオン基との相互作用のための結合部位をより多く有する凝集性の異常型タンパク質からもたらされると思われる。１或いは少数のイオン基を有する競合因子は、一定の結合活性で、凝集性又は非凝集性のタンパク質のいずれかと相互作用することができる。しかし、非凝集型に比べて凝集型に対する高い結合活性の結果、ポリイオン物質は、多くのイオン基を介して同時に凝集型タンパク質と結合することができる。
【００２２】
感染したウシの脳による本発明者らの実験結果は、固定化されたポリアニオン（例えば、硫酸デキストラン）及びポリカチオン（例えば、ポリエチレンイミン）が、脳ホモジネート液中の異常型プリオンタンパク質ＰｒＰＳｃを捕捉することができるということを示唆する。抗プリオンタンパク質抗体／酵素接合を使用して得られたシグナルは、最適なポリアニオン捕捉表面に比べて最適なポリカチオン捕捉表面では約３〜５倍高い。
【００２３】
いずれの場合においても、非特異的な抗プリオンタンパク質抗体を使用する際、界面活性剤であるサルコシル（N−ラウロイル−サルコシン）は、異常タンパク質の捕捉の特異性を向上するとともに、正常プリオンタンパク質由来のシグナルを除去するのに有用な競合因子として、作用することができる。さらに、トリプシンを有するサンプルの部分的分解は、ポリカチオン又はポリアニオン化合物のいずれかを使用した場合、実質的にＰｒＰＳｃ由来のシグナルを増加させるが、特異性には影響しない（採用された条件では、トリプシンは、プロテナーゼKに対して観察されたように、ＰｒＰｃを優先的に分解するよりもむしろＰｒＰＳｃのポリイオン結合の阻害剤を除去していることが示唆される。）
【００２４】
科学論文では、ＰｒＰＳｃが、自然にヘパランのようなポリアミンと結合することが報告されている。これら負帯電したポリマーは、ＰｒＰＳｃ構造の正帯電した部分と相互作用を、また、凝集タンパク質と多用な相互作用をするものと考えられる。
【００２５】
硫酸デキストラン又はペントサンポリサルフェートのようなポリアニオンが、通常のヘパランに比べてより高い結合活性でＰｒＰＳｃ構造に結合することができ、従って、内在性化合物を置換することができる。従って、表面へ固定化された高度に負電荷を帯びたポリマーは、異常プリオンタンパク質を特異的に捕捉することができる。正常なプリオンタンパク質は凝集せず、内在性ヘパリン又は硫酸デキストランのようなポリアニオンとの高親和性の相互作用はない。選択されたアッセイ条件の元で、界面活性剤であるサルコシルのような低親和性アニオンの存在は、低親和性ＰｒＰｃ相互作用部位のために固定化されたポリアニオンと競合することによって、捕捉の特異性をさらに向上する。
【００２６】
対照的に、ポリカチオンはＰｒＰＳｃ構造由来の内在性ヘパランを置換し得ない。その代わりに、ヘパランのフリーの負電荷とのイオン相互作用を形成するために内在性ヘパラン／ＰｒＰＳｃ凝集体との錯体を直接的に形成しなければならない。従って、自然のこの配置では、無傷のヘパラン／ＰｒＰＳｃ錯体は、固定化されたポリカチオンに強固に結合する一方、自然でない固定化されたポリアニオンの場合、「置換された」ＰｒＰＳｃ構造が代わりに捕捉される。内在性ヘパランのためのポリアニオンによる競合は、１００％の効果は示さず、そして、ＰｒＰＳｃ凝集体の全ては負電荷のポリマーによる結合ではないという点で、最適なポリカチオン捕捉表面で得られた高いシグナルのための理由が提供される。
【００２７】
凝集性タンパク質が、自然のヘパリンによって自然に結合すると予測されない場合、例えば、サンプルが血液、血清又は組織ではない同種のものである場合、アニオン捕捉因子が望ましいと考えられる。
【００２８】
上述したイオン相互作用に加えて、ＰｒＰＳｃ凝集体の他の領域と、使用されたポリマーとの間で、付加的な疎水結合が存在すると考えられる。これは、結合の相互作用をより高めることができる。
【００２９】
分子の個々の結合部位と、結合因子との間の結合力を意味する「親和力」とは対照的に、「結合活性」という用語は、多価結合因子と多数の結合部位を有する分子の全体的な結合力を表わす通常の意味で使用される。
【００３０】
もし、競合因子が使用される場合、競合因子は、好ましくは、ｎ−ラウロイルサルコシンのような脂肪酸のアミノ酸アミドである。このような物質は界面活性という特性を有するが、このような状況では、これらの末端ＣＯＯ−基を介する1価の結合因子として、又はミセル形成を介する部分的に多価の因子として作用することができる。従って、本発明の第一の態様、即ち、非凝集性の正常型タンパク質の存在下において、凝集性の異常型タンパク質の選択的な結合のための方法が提供される。本発明は、選択的な結合条件下における、前記異常及び正常型を含む物質と、サンプル中に存在する前記凝集型タンパク質との結合活性を有するポリイオン物質との接触からなる。結合条件は、溶液中に競合因子の存在を含むことができ、この競合因子は、ポリイオン物質よりも、異常型タンパク質に対するより劣った結合活性を有する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、非凝集性の正常型タンパク質の存在下における凝集性の異常型タンパク質の選択的な結合に関する方法を提供する。本発明は、例えば、前記異常型の選択的な結合の提供といった条件下における、前記異常型と正常型の双方を含む物質と、ポリアニオン性のポリグルコシドとを接触させる条件からなる。
【００３２】
本発明の様々な観点における好適な実施例において、前記蛋白の異常形状はＰｒＰＳｃであり、前記蛋白の通常形状はＰｒＰｃである。しかしながら、全ての形状において本発明は、異常な蛋白の凝集形状への特異的結合に、広く適用される。
【００３３】
使用可能なポリカチオニック選択的結合因子は、ポリリシン、ポリアミドアミンを含む、ポリエチレン・イミン、ポリアミン、例えば、ポリ（デアリル・ジメチル・アンモニウム）及び、１，５‐ジメチル‐１，５‐デアザウンデカメチレン・ポリメチオブロミド（ヘキサジメチリン・ブロミド、若しくはポリブレンとしても知られる）等のような、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリ４級アミンを含有する。
【００３４】
好適なポリアニオニック・ポリグリコシドは、ポリ硫酸化された、ポリグリコシドである。しかしながら、例えば、カルボキシル酸残基、もしくは硫酸基などのような、他のイオンニック部位は、ウェルもしくはその代わりに使用され得る。
【００３５】
むしろ、ポリ硫酸化ポリグリコシドは、ペントサン・ポリ硫酸、若しくは、デキストラン硫酸である。他のポリアニオニック・ペントサン、若しくは、デキストラン誘導体は、ポリアニオニック・ポリグリコシドとして、使用される。硫酸化（若しくは他のアニオニック基）の高レベルは好ましい。
【００３６】
カラギーナン、デキストラン及びペントサンの硫酸化レベルは高い。仮に、潜在的硫酸化の低割合が硫酸基により起きたとしても、構成物はＰｒＰＳｃにおける結合部位に、選択的に、相互作用しないことが証明された。
【００３７】
適したアニオニック選択的結合因子は以下のものを含有する。
ペントサン・ポリ硫酸（分子量 3500-5000）、デキストラン硫酸５００（分子量  500000）、イオタ・カラギーナン及びカラギーナン、例えば、フコダイン、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸ポリ硫酸、コロミン酸（バクテリアのポリシアリック酸）、カラギーナン・タイプiii及iv、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、フルセラーラン、市場に流通している硫酸化ポリサッカライド、例えば、ポリソルベート、シゾフィラン、キサンタンガム、澱粉、セルロース構成物、ペクチン、胃粘膜、セラトニア、アガー、アカシアガム、硫酸化グリコシド  1，硫酸化グリコシド  ２，Ｎ−アセチル−Ｄグルコサミン、若しくはデルマタン硫酸Ｌイズロン酸などのような、κ‐カラギーナン、ヘパリン及びヘパラン、デキストラン硫酸８（分子量 8000）、硫酸化ポリグリコシドなど。
【００３８】
多イオン性物質は、非選択的条件下において、改変型、若しくは変異蛋白の凝集形状と、通常蛋白の非凝集形状の双方に結合する能力と同様に、適した条件下において、選択的に凝集形状に結合する能力を有することとなるよう、選択される。
【００３９】
所望の選択性は、反応条件の適した修正、特に、競合因子の存在及び濃度、ｐＨ値と、洗浄剤により、得られる。むしろ、ｐＨ値は、前記選択的結合を供給する為、選択される。
【００４０】
ｐＨ値は、好ましくは、５．６〜９、例えば、７〜９、より好ましくは、８〜９、例えば、８．２〜８．６、特に、８．４が、洗浄液として使用するのに、最適である。適した緩衝液は、リン酸緩衝液とトリス緩衝液を含有する。
【００４１】
塩濃度は、２５０ｍM以下であることが望ましく、さらに低濃度、例えば１００ｍM以下であることが、より好ましい。
【００４２】
むしろ、洗浄液が存することにより、洗浄によるもの、若しくは、競合因子として活動することのどちらかにより、前記選択結合を促進する。
【００４３】
特に、洗浄剤は、本目的の為、脂肪酸のアミノ酸アミドであること、例えば、Ｎ−ラウロイル・サルコシン、若しくは、他の脂肪酸サルコシンであることが、好ましい。このような洗浄／競合因子の存在は、選択的結合因子がポリアニオニックであるとき、特に、好ましい。
【００４４】
好ましくは、本洗浄液の濃度は、少なくとも、０．０５重量％、より好ましくは、少なくとも、０．１重量％以上、さらに好ましくは、少なくとも、０．２重量％、例えば、０．２〜２重量％、さらに好適例は、０．５〜１．５重量％であることが望ましい。
【００４５】
同様の効果を有する、他の洗浄液は、ＣＨＡＰＳ，Ｂｒｉｊ，オクチル‐β‐グルコシド，Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含むものが、使用され得る。しかしながら、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が高濃度であることは、望ましいことではない。
Ｎ−ラウロイルサルコシン（若しくは同様のもの）と他の洗浄剤との組合せは適しており、０．５〜２％含まれているのが好ましい。例えば、約１％サルコシン洗浄剤が含まれている例、例えば、０．５〜２％、
上で列記したものの内の１つ、特に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０が約１％含まれているものがあげられる。
【００４６】
トリプシン、キモトリプシン、プロテナーゼK、若しくはその他、プロテアーゼ様のものは、ポリアニオニックか、ポリカチオニック選択的結合因子のどちらか一方へ、凝集蛋白が結合することによってできた、未知の物質による妨害を防ぐのに役立つ。このことは、特に、ＰｒＰＳｃ陽性脳サンプルがＰｒＰＳｃ陰性脳で希釈されるというケースでは、サンプルは比較的高濃度の他の蛋白質を含有することとなる。付加した基質の反応抑制は、Dnase及びそれに類するものを含む、他の分解酵素を含有することにより、得られる。
【００４７】
前記異常型蛋白質集合体との結合後の選択的結合因子は、固定化捕捉因子によって捕捉される。そして、前記選択的結合因子及び前記捕捉因子との間で形成される複合体の存在が確認され、その量が定量される。
【００４８】
前記捕捉因子はレクチン（結合因子は適応するものであり、例えばポリグリコシドである）、或は前記選択的結合因子と反応する抗体である。前記選択的結合因子には、選択的に結合可能なタグ部分が存在し、前記捕捉因子はそのタグ部分と結合する。
【００４９】
任意に、或は、選択的結合因子は、前記サンプルにさらされる前に固形培地に固定される。該選択的結合因子には、選択的に結合可能なタグ部分が備わり、該タグにより前記固形媒質に固定される。
【００５０】
結合可能なタグ部分が存在する場所として、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシン、ヒスチジン（ＨＩＳ）６である。
【００５１】
選択的結合因子は、結合可能なタグを介してというよりむしろ、直接的に、固形物質に固定される。例えばＰＧ'sは、共有結合により直接、結合し、ＰＧのヒドロキシル基を残した状態で、例えば、エポキシ或はビニル・スルホン基由来の固定相を利用する。
【００５２】
本発明の各側面おいて、異常型蛋白質の結合が、選択的結合因子の固定或は捕捉の前に起ころうと或は後に起ころうと、該固定化された選択的結合因子／異常型蛋白質複合体は、正常型蛋白質を取り除くために、好適に洗浄段階へと進む。該段階は、選択性を改善するものである。該洗浄段階は、好ましくは、前記競合因子を含有する溶液を用いて実行される。該溶液は、界面活性剤であり、該界面活性剤は、好ましくは、洗浄力を有し、そうでなければ選択的結合を促進する界面活性剤からなる。これは、好ましくは、脂肪酸のアミノアミド、例えばｎ−ラウロイル・サルコシン或は、他の脂肪酸サルコシン等である。洗浄段階のサルコシン界面活性剤の濃度は、好ましくは、少なくとも０．０５％、より好ましくは、少なくとも０．１％、さらに好ましくは、少なくとも０．２％であり、例えば、０．２〜２％、好ましくは０．５％〜１．５％である。また、好ましくは、他の界面活性剤として、その洗浄液が緩衝液によりｐＨを５．６〜８．４の範囲に調整されたものが挙げられる。
【００５３】
ＰｒＰＳｃ（或は他の異常蛋白質）の前記結合は、定性的或は定量的に決定される。該決定は、結合ＰｒＰＳｃを非結合ＰｒＰｃ（或は他の正常型蛋白質）から分離した後、ＰｒＰＳｃ（或は他の蛋白質集合体）のための免疫学的検定をおこなうことにより行われる。
【００５４】
また、任意に正常型蛋白質が取り除かれた後、蛋白質の集合体が選択的に結合し、さらに、ポリアニオン物質、例えばポリグリコシドアニオン（対応してタグ或は検知可能ラベルで標識された）は、既に結合した蛋白質の集合体とサンドイッチ（例えばポリグリコシド−蛋白質集合体―ポリグリコシドラベル）を形成するために、結合する可能性がある。次に、該サンドイッチは、定量或は検出される。サンドイッチ形成の２段階目において、選択的結合条件は、必要ではない可能性がある。
【００５５】
上記のごとく、選択的結合因子は、作り変えられた蛋白質との接触の前、或は後に、固体物質に固定される。次にアッセイから正常型蛋白質を取り除くため、固体物質からの前記サンプルの分離が行われ、次の測定のために、作り変えられた蛋白質のみを残す。
【００５６】
本文において、固体サポート物質は、マイクロタイター・プレート、計量棒及び層流装置等の微視的な或は、ハンドラベル可能な物質を含むだけではなく、マイクロビーズ及び超常磁性マイクロビーズをも含む。該マイクロビーズ及び超常磁性マイクロビーズは、濾過或は磁気性の捕捉により分離される。ビオチン或は他のタグは、基本的な化学的方法で、硫酸デキストラン或はＰＰＳ或は類似物質と接合される。ＰＰＳにおける糖のバックボーン残基或は残留物の１０のうち１は、ウロン酸メチルエステルであり、これは、そのカルボキシル残基を介してカップリングするための１つの手段となる。カップリングのための他の既知の方法は、ヒドロキシル基（４のうち１は、硫酸反応後も自由である）或は、末端部の還元糖を介するものである。ビオチンは、便利な結合可能タグである。該結合可能タグは、ポリアニオニック物質、或は、他の選択的結合因子が、アビジンから誘導された固体物質と或はストレプトアビジン、中性アビジン（neutravidin）或はカプトアビジン（captavidin）であるような結合特性を持つ物質と結合するために用いられる。
【００５７】
結合可能タグ部としての使用に適した他の分子は、すべての物質を含む。該物質とは、ポリイオン物質と容易に結合し、適切な捕捉因子による捕捉に役立つものである。例えば、フルオレセインであるような１つの分子は、ＰＰＳ或は、類似分子に結合する。該結合は、カルボジイミドＥＤＣ（１―エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の存在下で、ウロン及びペントサンポリ硫酸塩の側鎖を用いてアミノフルオレセイン誘導体に反応を起こさせることによりなしえる。また、前記フルオレセインであるような１つの分子は、適切で容易に利用可能な抗体によって、捕捉され、それ自体は、固体物質に固定される。この方法の抗体捕捉に適した他のタグは、ジ二トロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシン、核酸、核酸類似連鎖及び（Ｈｉｓ）６を含む。抗体とは違った結合因子もまた使用されうる。例えば、補足的な核酸或は核酸類似連鎖が挙げられる。
【００５８】
或は、しかしながら、捕捉因子は使用される。該捕捉因子は、タグ部を介してというよりむしろポリイオニック物質それ自体と選択的に結合する。例えば、ポリグリコシド、適切なレクチン或は、抗体によって結合する。ＰＰＳと結合するための抗体は、例えばＪ.Immunol.method1990, 1, 24,126（1）;39-49 においてKongtawelertらによって開示されている。そのような抗体を、固定するための基本的な技術は、当業者には、知られるところである。
【００５９】
集合した作り変えられた蛋白質の存在或は、量を決定するための、或は、該作り変えられた蛋白質を集合させるため、既知の或は、将来考案される方法は、使用されることが可能である。該作りかえられた蛋白質として、ＰｒＰＳｃ（ＰｒＰｃのような正常型を取り除くための選択を必要としない）が挙げられる。前記方法は、集合している該作り変えられた蛋白質の存在や量を決定するために使用される。該作り変えられた蛋白質が、選択的結合因子により選択的に結合され、結合していない正常型蛋白質がそこから分離する。該分離は、結合した部分の固定と残りの非結合部を洗浄することにより生じる。前記方法は、既知のELISA、RIA、IRMA及び免疫学的検定法の他の形態をも含む。例えば、Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットで具現化され、serbanらによって開示された方法が挙げられる。
【００６０】
用いるアッセイの形態によっては、そのアッセイ以前の選択的結合因子から、捕捉された異常型蛋白質を溶出することが必要とされる、或は望ましい。そのような溶出段階を踏む時、チオシアン酸グアニジンであるようなカオトロープ（Chaotrope）が、少なくとも１Ｍ、好ましくは２〜６Ｍ例えば、４〜６Ｍの濃度で存在することが望ましい。或は、カオトロープは、ウレアを含んで使用されてもよい。
【００６１】
さらに、より大きな結合力を持つ競合因子は、置換するために用いられる。該置換によって、蛋白質が選択的結合因子からはずされる。ナトリウムドデシル硫酸塩は、競合因子として用いることに適しており、好ましくは、０．５〜１重量％、より好ましくは、０．７５重量％以上で用いられる。
【００６２】
本発明に関して、選択的に結合され、決定される蛋白質は、βアミロイド蛋白質及びタウ蛋白質を含む。該タウ蛋白質は、アルツハイマー病でプラークを形成する。
【００６３】
以下の理論によって結合されない場合には、本発明においてＰＰＳ及び類似分子は機能する。該機能とは、関連した蛋白質において負の硫酸基の組が、正のアミノ酸（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）の組と結合することによりあるいは、結合部における蛋白質のポリヒスチジン金属を介して行われるものである。集合体との結合は、集合している蛋白質によって提供される結合部が増加することにより、強められる。適当なアニオニック界面活性剤は、集合していない形態と結合するためにより効果的に競合する。該競合は、選択性を強めるものである。集合しているプリオンと結合するための結合力によって得られる選択性は、少なくとも正常型蛋白質のための選択性の３倍であり、好ましくは少なくとも１０：１である。
【００６４】
さらに言えば、本発明は、ＰｒＰｃからＰｒＰＳｃを分離する過程を含んでいる。該過程は、脂肪酸のアミノ酸アミドの存在下で、選択的にＰｒＰＳｃを結合因子と結合させることを含む。そのような結合のための、好ましい条件は、上記に示したとおりであり、その結合した蛋白質は記載どおりにアッセイされる。
【００６５】
本発明は、添付した図を参照し以下の例によって更に記載し説明される。図１は実施例９における希釈曲線を示す。
【００６６】
（実施例１：ビオチン化ペントサンポリ硫酸及び後の結合力捕捉を用いて行う変異プリオン蛋白質からの正常プリオンの分離）
（概論）
ビオチンは、基本的化学的方法によりペントサンポリ硫酸と接合された。そのビオチン化ペントサンポリ硫酸は、脳ホモジネート液における変異プリオン蛋白質と結合することが可能となった。また、その結合の後、ペントサンポリ硫酸／プリオン複合体は、捕捉された。該捕捉は、ストレプトアビジンから誘導された超常磁性ビーズを用いて行われた。その捕捉を受けた変異プリオンは、次に該ビーズから溶出し、免疫反応に基づいたBio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットを用いて検出された。現状においてのキットは、正常プリオンと変異プリオン蛋白質を識別できないため両方の蛋白質にシグナルを検出した。２つのＢＳＥ感染及び２つの感染していないウシ脳のバンクは、検査され、使用された。該バンクは、記載した特定の条件において、ペントサンポリ硫酸が特別に脳ホモジネート液からの変異プリオン蛋白質を捕捉するために、使用可能なことを表した。
【００６７】
（方法）
超常磁性ビーズの調整
使用直前に、ストレプトアビジン超常磁性ビーズ（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｓ−２４１５）４００μＬが、磁気性捕捉により洗浄される該洗浄は、連続的３回、１ｍＬ容量づつのTBST（５０ｍＭ  Tris，１５０ｍＭ  NaCl、ｐｈ７．５、０．５％（ｖ/ｖ）Tween２０［シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.P-7949］）において行われた。
ビーズは、最後に４００μＬのＴＢＳＴにおいて再度懸濁された。
１００μＬの分取は、４つのチューブに調整され、液体が取り除かれた後、ビーズが使用可能となる。
【００６８】
脳ホモジネート液の調整
１．ＢＳＥ感染及び非感染の牛の脳組織、３００−５００ｍｇを、ＢＳＥ精製キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）付属の、細砕ビーズを含む、細砕チューブへ加えた。本キットのこれらのチューブ内に予め入っていた溶液は、使用前に、吸引・廃棄した。
２．細砕後、５０％（ｗ／ｖ）の脳ホモジネート液を作成する為、一定量の１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを、それぞれのチューブへ加えた。
３．チューブは、細砕機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、速度６．５の設定で、４５秒間、細砕した。
４．ホモジネネートは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１：１の割合で、希釈された。
５．各ホモジネート液５０μＬ容量は、別々にチューブに収められた。
変異プリオン蛋白質の特異的捕捉
次に２０％ラウロイル・サルコシン（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｌ−９１５０）１０μＬは、ホモジネート液の入った各チューブに加えられ、混合された。
次に、ビオチン化ペントサンポリ硫酸（蒸留滅菌水内で１０μｇ／ｍＬ）５０μＬは、各チューブに加えられ混合され、室温で３０分間インキュベートされた。
次に、各反応は、洗浄後のストレプトアビジン超常磁性ビーズのチューブに加えられ、室温で３０分間インキュベートされた。
次に該ビーズは、ＴＢＳＴ１ｍＬ容量中で磁気性捕捉によって洗浄された。
【００６９】
変異プリオン蛋白質の溶出と免疫検出
最終的に、最後の洗浄の後、各反応からのビーズは、１０μＬのＣｌ（Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットに提供されている）を用いて再懸濁された。
２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５μＬは、各ビーズの懸濁液に加えられ、混合された。
１Ｍグアニジンチオシアネート（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｇ−９２７７）の５μＬは、各ビーズの懸濁液に加えられ、混合された。
反応液は、５分間１００℃で熱せられた。
次に、Ｒ６（Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットに提供されている）１００μＬが加えられ混合された。
次に、各溶出液の１００μＬがBio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットにおいて使用された。Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットは、前記プロトコルとこのキットに備わった試液を用いるものである。簡潔には、本キットは、正常及び／又は変異プリオン蛋白質の免疫捕捉と抗体と接合した西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを用いた免疫検出を備えている。
【００７０】
（結果）
マイクロタイター・プレート基盤のPlatelia（登録商標）  アッセイにおいて、免疫検出を行った後、各ウェル内のシグナルは、ELISAリーダーを用いて４５０ｎｍの波長で測定される。
2005519088.tif 000002
変異プリオンを含む２つのＢＳＥ感染ホモジネート液からのシグナルは、明確に、非感染の正常脳ホモジネート液からのシグナルより高い。
【００７１】
（考察）
Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットは、正常プリオンと変異プリオンとを識別できない。一般的に、変異プリオン蛋白質のための特異性が生じることは、それ以前に行われるプロテアーゼＫによるサンプルの分解によってなし得るのである。該蛋白分解酵素は、プロテアーゼ感受性の正常プリオン蛋白質を消すこととなる。サンプル内のどのような変異プリオン蛋白質もプロテアーゼ分解から、正常プリオンより影響を受けないため、その場に留まり、Platelia（登録商標）アッセイによって検出される。本実験では、サンプルのプロテアーゼ分解の第２の方法を示す。我々は、定義された条件を用いた。該定義された条件とは、溶液内のビオチン化ペントサンポリ硫酸が特別にサンプル内で変異プリオン蛋白質と結合可能である。変異プリオン／ペントサンポリ硫酸複合体は、次に、ストレプトアビジン超常磁性ビーズを用いて捕捉される。洗浄後、変異プリオン蛋白質は、次に溶出し、免疫アッセイにおいて検出される。正常プリオン蛋白質は、このプロトコルで捕捉されず、洗浄され、それゆえ、この免疫アッセイにおいては、検出されない。我々は、この技術を用いることにより２つのＢＳＥ感染ウシ脳内において、変異プリオン蛋白質を正確に検出し、２つの正常ウシ脳内では、何ら検出されなかったこと示す。
【００７２】
（実施例２：固定ビオチン化ペントサンポリ硫酸を用いて行われる変異プリオン蛋白質からの正常プリオンの分離）
（概論）
ビオチンは、基本的な化学的方法によってペントサンポリ硫酸と接合された。そのビオチン化ペントサンポリ硫酸は、ストレプトアビジン由来の超常磁性ビーズを覆うために用いられた。そのビオチン化ペントサンポリ硫酸に覆われたビーズは、次に確実に脳ホモジネート液からの変異プリオン蛋白質を捕捉するために用いられた。その捕捉された変異プリオン蛋白質は次に、該ビーズから溶出し、免疫に基づくBio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットを用いて検出された。現状においてのキットは、正常プリオン蛋白質と変異プリオン蛋白質を識別することができないため、両方の蛋白質にシグナルを与える。３つのＢＳＥ感染及び３つの感染していないウシ脳のバンクは、検査され、使用された。該バンクは、記載した特定の条件において、ペントサンポリ硫酸が特別に変異プリオン蛋白質を脳ホモジネート液から捕捉可能なことを表す。
【００７３】
（方法）
ペントサンポリ硫酸で覆われた磁気性ビーズの調整
使用直前に、ストレプトアビジン超常磁性ビーズ（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｓ−２４１５）６００μＬが、磁気性捕捉により洗浄される。該洗浄は、連続的に３回、１ｍＬ容量づつのＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、ｐｈ７．５、０．５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０［シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.P-7949］）において行われた。
ビーズは、最後に４００μＬのＴＢＳＴにおいて再度懸濁される。そして、ＴＢＳ内の１０ｍｇ／ｍＬビオチン化ペントサンポリ硫酸の６０μＬが加えられた。該ビーズは、室温で1時間、暗室で放置された。該放置は、該ペントサンポリ硫酸がビーズを覆うことを可能にするため、穏やかに振動を加えつつ行われた。
ビーズが覆われた後、ビーズは磁気性捕捉によって洗浄された。該洗浄は、３つの連続的な１ｍＬ容量の５％（ｗ／ｖ）ウシアルブミン（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ａ−７９０６）、ｐｈ８．４リン酸緩衝液によって行われ、最後に６０μＬの同じ緩衝液中で再懸濁された。その後、ビーズは、使用可能となる。
【００７４】
脳ホモジネート液の調整
各脳組織の３００−５００ｍｇがＢＳＥ精製キット（Bio-Rad）付属の細砕ビーズが入った細砕チューブに加えられた。キット内の本来の３つのチューブに入れられた液体は、使用される前に吸引され廃棄される。
均質化後の５０％（ｗ／ｖ）の脳ホモジネート液を生成するために算出された容量１５０ｍＭのＮａＣｌが各チューブに加えられる。
そのチューブは、細砕機（Bio-Radから購入される）において、４５秒間スピード６．５で均質化される。
該ホモジネネートは、５％（ｗ／ｖ）ウシ・アルブミン、ｐＨ８．４の５０ｍＭリン酸緩衝液を用いて５倍量で溶出する。
各ホモジネート液４５μＬ容量は、別々にチューブに収められる。
５μＬ（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｌ−５７５０）が、各チューブに加えられ、完全に混合された。
４５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ウシ・アルブミン、ｐＨ８．４の５０ｍＭリン酸緩衝液が、各チューブに加えられ混合された。
５０μＬの２０％（ｗ／ｖ）Ｎラウロイル・サルコシン（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｌ−９１５０）が加えられ混合された。
【００７５】
変異プリオン蛋白質の特異的捕捉
調整済みのペントサンポリ硫酸でおおわれた超常磁性ビーズの１０μＬを各希釈脳ホモジネート液に加え、振動させつつ暗室に室温で１時間放置した。
各反応液は、３つのＴＢＳの１００μＬ容量を用いて磁気性捕捉により洗浄された。
【００７６】
変異プリオン蛋白質の溶出と免疫検出
各反応からのビーズは、１０μＬのＣｌ（Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットに提供されている）を用いて再懸濁された。
０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ５μＬは、各ビーズの懸濁液に加えられ、混合された。
１Ｍグアニジンチオシアネート（シグマ−アルドリッチ社（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、Ｇ−９２７７）の５μＬは、各ビーズの懸濁液に加えられ、混合された。
反応液は、５分間１００℃で熱せられた。
次に、Ｒ６（Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットに提供されている）１００μＬが加えられ混合された。
次に、１００μＬを、Bio-Rad Platelia BSE検出キットのサンプルとして使用した。
該キットの使用に際しては、該キットのプロトコルに従い、且つ、該キットの付属品を用いて行った。要するに、該キットは、通常のプリオン蛋白、及び／又は、変異プリオン蛋白の免疫応答反応と、西洋ワサビのペルオキシダーゼが接合した抗体による免疫検出反応を含む。
【００７７】
（結果）
マイクロタイター・プレートにおけるPlatelia（登録商標）アッセイにおいて、免疫検出を行った後、各ウェル内のシグナルは、アッセイにELISAリーダーを用いて４５０ｎｍの波長で測定される。
2005519088.tif 000003
変異プリオン蛋白質を含む３つのＢＳＥ感染脳ホモジネート液からのこのシグナルは、明確に非感染の正常脳ホモジネート液におけるものより高い。
【００７８】
（考察）
Bio-Rad Platelia（登録商標）BSE検定キットは、正常プリオン蛋白質と変異プリオン蛋白質とを識別できない。一般的に、変異プリオン蛋白質のための特異性が生じることは、それ以前に行われる蛋白質分解酵素Ｋによるサンプルの分解によってなし得るのである。該蛋白分解酵素は、プロテアーゼ感受性の正常プリオン蛋白質を消すこととなる。サンプル内のどのような変異プリオン蛋白質もプロテアーゼ分解から、正常プリオンより影響を受けないため、その場に留まり、ＰｌａｔｅｌｉａＴＭ  アッセイによって検出される。本実験では、サンプルのプロテアーゼ分解の第２の方法を示す。我々は、定義された条件を用いた。該定義された条件とは、ペントサンポリ硫酸がサンプルから変異プリオン蛋白質を確実に捕捉できる条件である。この捕捉された変異プリオン蛋白質は、溶出し、免疫アッセイにおいて検出される。正常プリオン蛋白質は、ペントサンポリ硫酸で捕捉されず、洗浄され、それゆえ、この免疫アッセイにおいては、検出されない。我々は、この技術を用いることにより３つのＢＳＥ感染ウシ脳内において、変異プリオン蛋白質を正確に検出し、３つの正常ウシ脳内では、何ら検出されなかったこと示す。
【００７９】
（実施例３：  ＰＰＳのビオチン化）
（方法の原理）
通常、ペントサン硫酸のポリキシロース主鎖における１０の糖基の内の１は、ウロン酸残基によって置換される。次に、カルボキシル基の内のメチルエステルにより置換され、分子中に多数のフリー・カルボキシル基が存在することとなる。そして、活性エステルを形成する為、カルボジイミドに誘導され得る。次に、これらはアミド結合を形成する為、アミノ酸に置き換えられる。本実施例では、ＥＤＣとＮＨＳは、活性エステルを形成する為、選択され、ビオチン・ヒドラジドはアミノ種として選択される。
２つの反応は以下の条件で実施される。
１つ目は、ビオチン・ヒドラジドは存する一方、ＮＨＳは付加されていない条件。
２つ目は、ＮＨＳ/ＥＤＣがＰＳ及びビオチン・ヒドラジドと同時に反応する条件。
【００８０】
（材料）
・  ペントサン硫酸（ノートン・ヘルスケア）  Stephen Dealler氏より贈与
ビオチン・ヒドラジド  １００ｍｇ
（Pierce#21339、 分子量 ２５８．３３、 バッチAH41461）
ＥＤＣ  １ｇ  （１−エチルー３−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド・メチオジド）（シグマ社製、#16,534-4）
ＮＨＳ  ５ｇ
（N−ヒドロキシ・スクシンイミド）（シグマ社製、#H7377、分子量１１５．１）
透析チューブ（分画分子量  ３．５ｋ、Pierce#68035）
ＤＭＳＯ（シグマ社製）
【００８１】
（方法）
２の反応を、ＮＨＳを含め行う場合と、ＮＨＳなしで行う場合の２つのパターンで、実施した。
ビオチン・ヒドラジド１００ｍｇを、ガラス瓶中のＤＭＳＯ ６ｍｌで、溶解させる。この際、加温、及び/又は、超音波処理が必要とされる。終濃度は１６．７ｍｇ／ｍｌ、もしくは６５ｍＭとなる。ペントサン硫酸１００ｍｇを、ＤＭＳＯと水の混合液（５０：５０）１０ｍｌに溶解させる。これは通常のプラスチック製コンテナ内で実施可能である。ＥＤＣ  １００ｍｇを、ＤＭＳＯ  １ｍｌのガラスバイアル中で、溶解させる。
この際、加温が必要とされる。ＮＨＳ（約４０−５０ｍｇ）を、１．０ｍｌの水で溶解させる。
反応は、直径１２ｍｍのｐＨ電極を装備した、マグネット・スターラー上で、小型の円錐形のマグネット・スターラー・バー（直径約１０ｍｍ）を用いて、円錐形底面を有する一般のポリスチレン・コンテナ中で行われる。
【００８２】
（実施例３ａ：  ＮＨＳ非存在化における反応）
反応用容器に、ペントサン硫酸溶液  ５．０ｍｌを注入し、そこにビオチン・ヒドラジド溶液  １．０ｍｌを加えた後、充分攪拌し、ｐＨ値を測定する。ｐＨ値は、７〜８であることが望ましい。次に、攪拌しながら、ＥＤＣ溶液  ０．２ｍｌを加える。ｐＨ値を調整は、１規定の塩酸溶液を、１０μＬずつ、ガラスシリンジ及びガラス針から滴下することにより行う。滴下するごとに、ｐＨ値を測定する。ｐＨ値が、５〜６の範囲となるまで、塩酸の滴下を続ける。これは、水酸化イオン（ＯＨ−）を生じさせるのに、必要である。反応溶液は、全体を通して、無色透明でなければならない。仮に、ビオチン・ヒドラジドの白い沈殿物が形成されたとすれば、DMSOの濃度が、５０％以上になるまで、増加させることが必要となる。その後、該反応溶液を、室温で２〜３時間、放置する（若しくは、必要に応じて、一晩放置することも可能）。
【００８３】
該反応混合物の最終ｐＨ値を記録する。そして、DMSOの濃度が、２５％以下にまで希釈する為、同量の１モルの塩化ナトリウムを加え、ヒドラジドのイオン結合を置換し、全内容物を、長さ３５ｃｍ、平面幅２．２ｃｍの透析チューブに移す。DMSOの濃度は、透析チューブへの損傷を避ける為、２５％にまで削減することに留意する。
また該チューブについて使用前、針穴があるか否かを確認する為、水でテストし、針穴で膨張しない様、全容量の三分の一程度とする。
２Lの水に対し、一晩、透析し、これを数回繰り返す。透析を行えば、それだけペントサン硫酸は、その強い陰イオン電荷の効力による非共有イオン結合により、強固に塩基性イオンの状態を保つ。透析後の溶液を凍結乾燥し、乾燥重量を記録する。最終産物として、堅固な白い固形物が得られるはずである。収率は様々であるが、通常は５０−６０％である。収率のロスのほとんどは、透析中に起こる。ペントサン硫酸の分子量の異種性及び分子量３５００以下の種の損失がその原因である。
【００８４】
（実施例３ｂ：  ＮＨＳ存在化における反応）
この反応は、反応を開始させるＥＤＣ反応液の添加に先立ち、ＮＨＳ  １．０ｍｌ（４４ｍｇ）を反応用瓶へ付加することを除いては、基本的に、前記の場合と同様の手法で実行される。初期のｐＨ値は、６〜７の範囲にあり、１規定の塩酸溶液により、約５〜６の範囲にまで調節されることとなる。
【００８５】
（品質管理）
乾燥重量から回収率を算出した後、水で１０ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、２００ｎｍから４００ｎｍのスペクトルを測定した。ピークは、２６０ｎｍと２８０ｎｍに表れなければならないが、どちらか一方、もしくは双方にピークが偏っている必要はない。
この吸光度は、スルホン化段階において、分子中に取り込まれた、ピリジン残基によるものである。これらは、例えばクロマトグラフィー中、ペントサン硫酸の濃度を観測するのに使用される。ペントサンは、２６０ｎｍにおける紫外線吸収、若しくは、より低い濃度においては、トリジンブルー・メタクロマシア（metachromasia）・アッセイにより、観測されうる。
【００８６】
（実施例４：  血漿からプリオン蛋白の除去）
・  変異プリオン蛋白の除去
１．１００μＬのペントサン・ポリ硫酸塩でコートした超常磁性ビーズを、新鮮なヒトの血漿に注入された、２つのＰｒＰＳｃのそれぞれに加えた。双方とも室温で１時間、振動培養した。
２．ビーズはその後、磁石により血漿から取り除かれた。この上清は、残存する血漿とともに、その後、変異プリオン蛋白の存否について分析された。
・  前記サンプル中における変異プリオン蛋白の分析
１．前記２つの血漿サンプルは、プロテナーゼＫにより処理された。該状況は、通常のプリオン蛋白は分解することはできるが、変異プリオン蛋白は分解することはできないものである。これらの状況は実験により簡単に決定される。プロテナーゼＫにより処理されたサンプルは、免疫応答を利用するBio-Rad Platelia BSE検出キットを使用して、変異プリオン蛋白の存否を確認した。
【００８７】
（結果）
マイクロウェル・プレート・ベースのPlateliaアッセイで免疫検出反応を実行した後、個々のウェルにおけるシグナルを、４５０ｎｍの波長において、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーで、測定した。変異プリオン蛋白は、ペントサン・ポリ硫酸塩で処理されていない、変異プリオン蛋白が混入された血清サンプル中において、直ちに検出できた。これとは対照的に、ペントサン・ポリ硫酸塩で処理されたサンプルでは、該サンプル中に存する変異プリオン蛋白の存在を証明するシグナルは検出されなかった。
【００８８】
（考察）
この実験は「ペントサン・ポリ硫酸塩は、興味あるサンプルから変異プリオン蛋白を効果的に除去するのに使用され得る」ということを証明した。
【００８９】
（実施例５：  ペントサン・ポリ硫酸塩が、変異プリオン蛋白に、特異的に結合し得る為の洗浄条件の分析）
【００９０】
（序論）
ビオチンを、通常の化学反応により、ペントサン・ポリ硫酸塩に接合させた。ビオチン化されたペントサン・ポリ硫酸塩は、ストレプトアビジン由来の超常磁性ビーズをコートするのに使われた。コートされたビーズは、それから洗浄の条件を設定する為、使用された。ここで、洗浄の条件とは、ペントサン・ポリ硫酸塩が変異プリオン蛋白に結合するが、通常の細胞性プリオン蛋白には結合しない状況のことをいう。
【００９１】
（方法）
ペントサン・ポリ硫酸塩をコートされた磁気的ビーズの準備
１．ストレプトアビジン超常磁性ビーズ（シグマ社製、S-2415）の６００μＬを、１ｍＬ  ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）で、３回連続して、磁気的捕捉により、洗浄した。
２．ビーズは、最終的に、５％  ウシ・アルブミン（以下、ＢＳＡ）（シグマ社製、Ａ-7906）を含む５４０μＬのＴＢＳと、ＴＢＳで１０ｍｇ／ｍＬとしたビオチン化されたペントサン硫酸  ６０μＬで、再浮遊させた。ビーズは、室温で１時間、緩やかに振動させながら培養され、ペントサン硫酸をビーズにコートさせた。
３．コーティングの後、ビーズは、５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ  ８．４）、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの１ｍＬで、３回連続して、磁気的捕捉により、洗浄され、最終的に同一緩衝液６０μＬで、再浮遊させた。ビーズはその後、再利用された。
【００９２】
・  脳のホモジネート液の準備
１．ＢＳＥ感染及び非感染の牛の脳組織、３００−５００ｍｇを、ＢＳＥ精製キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）付属の、細砕ビーズを含む、細砕チューブへ加えた。本キットのこれらのチューブ内に予め入っていた溶液は、使用前に、吸引・廃棄した。
２．細砕後、５０％（ｗ／ｖ）の脳ホモジネート液を作成する為、一定量の１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを、それぞれのチューブへ加えた。
３．チューブは、細砕機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、速度６．５の設定で、４５秒間、細砕した。
４．ホモジネート液は、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．４）で、５倍希釈された。
５．それぞれのホモジネート液  ４５μＬを、セパレート・チューブ（遠心チューブ）に移し変えた。
６．２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム：sodium dodecyl sulfate）（シグマ社製、L-5750）を、それぞれのチューブに付加し、充分に混ぜる。
７．４５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ８．４）は、それからそれぞれのチューブに加えられ、混合された。
８．様々な洗浄濃度において、５０μＬのＮ−ラウロイル・サルコシン（シグマ社製、L-9150）は、あらゆるサンプルに加えられ、混合された。１セット（１つのＢＳＥに感染した脳と、１つのＢＳＥに非感染の脳とからなる）は、Ｎ−ラウロイル・サルコシンを加えなかった。
【００９３】
（プリオン蛋白の捕捉）
１．１０μＬのペントサン・ポリ硫酸塩でコートした超常磁性ビーズを、それぞれ希釈された脳のホモジネート液に注入され、室温で１時間、振動培養した。
２．それぞれの反応は、その後、１００μＬのＴＢＳで、３回、磁力捕捉により洗浄した。
【００９４】
（プリオン蛋白の溶出及び免疫検出）
１．それぞれの反応からのビーズは、Ｃ１（Bio-Rad Platelia BSE検出キット付属品）１０μＬ中で、再浮遊された。
２．５μＬの０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳはそれぞれのビーズ・サスペンションに加えられ、混合された。
３．５μＬの１Ｍ  グアニジン・チオシアネート（シグマ社製、G-9277）はそれぞれのビーズ・サスペンションに加えられ、混合された。
４．反応は１００℃、５分で行われた。
５．１００μＬのＲ６（Bio-Rad Platelia BSE検出キット付属品）は、それから加えられ、混合された。
６．それぞれの溶出液  １００μＬを、Bio-Rad Platelia BSE検出キットのサンプルとして使用した。該キットの使用に際しては、該キットのプロトコルに従い、且つ、該キットの付属品を用いて行った。要するに、該キットは、通常のプリオン蛋白、及び／又は、変異プリオン蛋白の免疫応答反応と、西洋ワサビのペルオキシダーゼが接合した抗体による免疫検出反応を含む。
【００９５】
（結果）
マイクロウェル・プレート・ベースのPlateliaアッセイで免疫検出反応を実行した後、個々のウェルにおけるシグナルを、４５０ｎｍの波長（ＯＤ４５０）において、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーで、測定した。
2005519088.tif 000004
Ｎ−ラウロイル・サルコシンの全ての濃度において、ＢＳＥ感染脳とＢＳＥ非感染脳との間に差異が見られた。０．２％のＮ−ラウロイル・サルコシンは、洗浄用として最も適した濃度であり、ペントサン硫酸が結合するのを可能とし、通常のプリオン蛋白と結合若しくは捕捉することなく、変異プリオン蛋白を捕捉する。Ｎ−ラウロイル・サルコシン非存在化においては、たとえSDS洗浄が存在したとしても、変異プリオン蛋白に結合するペントサン・ポリ硫酸塩と、通常のプリオン蛋白に結合するペントサン硫酸との間に、差異は見られなかった。このような状況のもと、ペントサン・ポリ硫酸塩は、通常のプリオン蛋白と変異プリオン蛋白の双方に結合する。
【００９６】
（考察）
１．上記の条件下における、変異プリオン蛋白に対するペントサン・ポリ硫酸塩の特異的結合は、Ｎ−ラウロイル・サルコシン、若しくは、同様の洗浄剤の存在に依る。洗浄剤非存在下では、ペントサン・ポリ硫酸塩は、変異プリオン蛋白と通常のプリオン蛋白の双方に結合する。
【００９７】
（実施例６：  ペントサン・ポリ硫酸塩が、変異プリオン蛋白に、特異結合なし得る為のｐH値条件の分析）
（序論）
ビオチンは、通常の化学反応により、ペントサン・ポリ硫酸塩に接合した。ビオチン化されたペントサン硫酸は、ストレプトアビジン由来の超常磁性ビーズをコートするのに使われた。コートされたビーズは、それからｐH値の条件を設定する為、使用された。ここでｐH値の条件とは、ペントサン・ポリ硫酸塩が変異プリオン蛋白に結合するが、通常の細胞性プリオン蛋白には結合しない状況のことをいう。
【００９８】
（方法）
・  ペントサン硫酸をコートされた磁気的ビーズの準備
１．ストレプトアビジン超常磁性ビーズ（シグマ社製、S-2415）１ｍLは、ＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．５）１ｍＬで３回、磁気的捕捉による洗浄を行った。
２．それぞれのビーズは、最終的に、５％  ウシ・アルブミン（以下、ＢＳＡ）（シグマ社製、Ａ-7906）を含む１ｍＬのＴＢＳと、ＴＢＳで、１０ｍｇ／ｍＬとしたビオチン化されたペントサン・ポリ硫酸塩  １００μＬで、再浮遊させた。ビーズは、室温で１時間、緩やかに振動させながら培養され、ペントサン・ポリ硫酸塩をビーズにコートさせた。
３．コーティングの後、それぞれのビーズは、５０ｍＭ  リン酸緩衝溶液（ｐＨ  ８．４）、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡの１ｍＬで、３回、磁気的捕捉による洗浄を行った。
４．それぞれのビーズは、それから、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む、ｐＨ値  ５．５，７．５、８．４と、９．６の全緩衝用溶液で、再浮遊させた。
【００９９】
・  様々なｐH値の緩衝溶液中における脳のホモジネート液の準備
１．ＢＳＥ感染及び非感染の牛の脳組織、３００−５００ｍｇを、ＢＳＥ精製キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）付属の、細砕ビーズを含む、細砕チューブへ加えた。本キットのこれらのチューブ内に予め入っていた溶液は、使用前に、吸引・廃棄した。
２．細砕後、５０％（ｗ／ｖ）の脳ホモジネート液を作成する為、一定量の１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを、それぞれのチューブへ加えた。
３．チューブは、細砕機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で、速度６．５の設定で、４５秒間、細砕した。
４．それぞれのホモジネート液  ５０μＬは、５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む、ｐＨ値  ５．５，７．５、８．４と、９．６の全緩衝用溶液で、５倍希釈された。
５．それぞれのホモジネート液  ４５μＬを、セパレート・チューブに移し変えた。
６．２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム：sodium dodecyl sulfate）（シグマ社製、L-5750）を、それぞれのチューブに付加し、充分に混ぜた。
７．５％（ｗ／ｖ）ウシ・アルブミン（ＢＳＡ）を含む、初期の希釈緩衝用溶液と同じｐＨ値の緩衝用溶液、４５０μＬが、その後、チューブに加えられ、混合された。
８．２０％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイル・サルコシン（シグマ社製、L-9150）５０μＬは、その後、チューブに加えられ、混合された。
【０１００】
・  脳のホモジネート液のビーズ捕捉
１．対応するｐＨ値の緩衝用溶液中の、１０μＬのペントサン・ポリ硫酸塩でコートした超常磁性ビーズを、それぞれ希釈された脳のホモジネート液に注入され、室温で１時間、振動培養した。
２．それぞれの反応は、その後、１００μＬのＴＢＳで、３回、磁力捕捉により洗浄した。
【０１０１】
・  変異プリオン蛋白の溶出及び免疫検出
１．それぞれの反応からのビーズは、Ｃ１（Bio-Rad Platelia BSE検出キット付属品）１０μＬ中で、再浮遊された。
２．５μＬの０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳはそれぞれのビーズ・サスペンションに加えられ、混合された。
３．５μＬの１Ｍ  グアニジン・チオシアネート（シグマ社製、G-9277）はそれぞれのビーズ・サスペンションに加えられ、混合された。
４．反応は１００℃、５分で行われた。
５．１００μＬのＲ６（Bio-Rad Platelia BSE検出キット付属品）は、加えられ、混合された。
６．それぞれの溶出液  １００μＬを、Bio-Rad Platelia BSE検出キットのサンプルとして使用した。該キットの使用に際しては、該キットのプロトコールに従い、且つ、該キットの付属品を用いて行った。要するに、該キットは、通常のプリオン蛋白、及び／又は、変異プリオン蛋白の免疫応答反応と、西洋ワサビのペルオキシダーゼが接合した抗体による免疫検出反応を含む。
【０１０２】
（結果）
マイクロウェル・プレート・ベースのPlateliaアッセイで免疫検出反応を実行した後、個々のウェルにおけるシグナルを、４５０ｎｍの波長（ＯＤ４５０）において、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダーで測定した。
2005519088.tif 000005
【０１０３】
ｐＨ値７．５及びそれ以下では、ペントサン・ポリ硫酸塩をコートされたビーズは、通常のプリオン蛋白と変異プリオン蛋白の双方に結合した。ｐＨ値９．６及びそれ以上では、ペントサン・ポリ硫酸塩をコートされたビーズは、通常のプリオン蛋白と変異プリオン蛋白の双方とも結合しなかった。ｐＨ値８．４では、ペントサン・ポリ硫酸塩をコートされたビーズは、変異プリオン蛋白を捕捉するが、通常のプリオン蛋白を捕捉しなかった。このｐＨ値では、ペントサン・ポリ硫酸塩は、変異プリオン蛋白に特異的に結合することが示された。
【０１０４】
（考察）
上記試験状況下における、変異プリオン蛋白に対するペントサン・ポリ硫酸塩の特異的結合は、ｐＨ値に依存する。ｐＨ値８．４では、ペントサン・ポリ硫酸塩は、変異プリオン蛋白に結合するが、通常のプリオン蛋白には結合しない。ｐＨ値７．５及びそれ以下では、通常のプリオン蛋白と変異プリオン蛋白はともに結合され、ｐＨ値９．６及びそれ以上では、通常のプリオン蛋白と変異プリオン蛋白はともに結合しなかった。従って、変異プリオン蛋白に対するペントサン・ポリ硫酸塩の特異的結合は、これらの条件下においては、ｐＨ値８．４付近が最適であると結論付けられた。
【０１０５】
実施例７：PrPCの結合を選択的に抑制するための低電荷密度競合ポリアニオンを使用する高電荷密度ポリアニオンリガントに対するPrPres（PrPSc）の特異的捕捉の証明
（背景）
PrPは、固定されるポリアニオンと結合されうる。捕捉緩衝液に競合ポリアニオンが存在しない場合に於いて、PrPres及びPrPScは捕捉される。PrPresの捕捉のための特異性は、捕捉緩衝液に於いて、捕捉ポリアニオンよりも低電荷密度のポリアニオンが含有されることによって達成される。このような例に於いては、硫酸デキストランが高電荷密度捕捉として使用され、N−ラウロイル・サルコシン（マルチ分子の洗浄性のミセルを形成する）及びペントサン・ポリ硫酸塩又はフコイダンが弱性電荷密度競合ポリアニオンとして使用される。
【０１０６】
（方法）
１．マクスソルプ・マイクロタイター・ウェル（Maxisorp microtitre wells）は、標準的な手法により硫酸デキストランでコートされた。
２．１ｍｇの脳が含有される脳ホモジネート液  １００μｌ、トリス（Tris）ｐH８．３  ５０ｍM、BSA  １％（ｗ／ｖ）、トリトン（Triton）X−１００  １％（ｖ／ｖ）が、コートされたウェルへ添加された。幾つかの場合に於いて、この捕捉緩衝液はまた、１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイル・サルコシン、フコイダン、硫酸デキストラン、又は、各濃度のポリ硫酸ペントサンが含有された。
３．プリオン・プロテインの捕捉を促すための２時間の培養の後、ウェルはトリスｐH８．３  ５０ｍM、BSA  １％（ｗ／ｖ）、トリトンX−100  １％（ｖ／ｖ）で３回洗浄された。
４．次いで、ウェルは、PBSで３回洗浄された。
５．５Mのグアニディアム・ティオクヤネート（guanidinium thiocyanate）１００μｌが、各ウェルに添加され、４℃で5分間培養された。
６．ウェルは、PBSで３回洗浄され、次に、Bio-rad Platelia（登録商標）のBSE検出キットのプロトコルに従って、このキットに付属されるアンチ−プリオン・プロテイン接合体で捕捉されたプリオン・プロテインが検出された。
７．生じるシグナルがOD450に於いて、ELISAリーダにより測定された。
【０１０７】
（結果）
2005519088.tif 000006
【０１０８】
考察
捕捉緩衝液に競合ポリアニオンが存在しない場合に於いて、全体のシグナルは低く、感染又は非感染脳からのシグナルに於ける差異は無い、つまり、PrPresの特異的捕捉が存在しない。しかしながら、感染脳からのシグナルは、捕捉緩衝液の競合ポリアニオンを含有することにより増加しており、非感染又は感染していない脳に対応するシグナルは、抑制されている。この実施例に於いて、感染脳及び非感染脳間の最適な分化は、捕捉緩衝液に於いてＮ−ラウロイル・サルコシン  １％（ｗ／ｖ）の使用により達成される。加えて、感染脳及び非感染脳間の分化は、フコダイン又はポリ硫酸ペントサンにより達成される。ポリ硫酸ペントサンによる分化は、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの捕捉緩衝液に於いて、競合ポリアニオン、ポリ硫酸ペントサンの濃度を増加させることにより増加している。コントロールとして、もし捕捉緩衝液に硫酸デキストランが含有されていれば、予測どおりに、シグナルは、競合すること及び、固定する硫酸デキストランに対するPrPの結合を抑制することで、バックグランドに対して削減される
【０１０９】
実施例８：表面コートされる高電荷密度ポリアニオンに対するPrPresの特異的捕捉の証明
（背景）
この実験に於いて、PrPresがポリアニオンの表面へ特異的に捕捉されたことが証明された。この場合、表面は、誘導された無水マレイン酸ポリスチレンにより供給された。非電荷ポリソープ及びマキシソープ・ウェルがコントロールとして使用された。他の実験に於いても、これらの非電荷表面がポリアニオン硫酸デキストランを伴い誘導されて、PrPresと結合したことが証明された。
【０１１０】
（方法）
１．ポリスチレン・マイクロプレート・ウェル（Perbio Science UK Ltd.,Cheshire）を活性化させた無水マレイン酸は、TBS５％（ｗ／ｖ）BSA、室温で60分間で誘導された。このことによって、樹脂に表面が電荷されたカルボキシル基が生成された（生成資料を参照）。非電荷コントロールとして、ポリソープ及びマキシソープ・ウェル（Nunc）が分析された。更に、マキシソープ・ウェルもまた、実施例９に於いて記載される手法を利用することにより、ポリアニオン硫酸デキストラン・リガンドによりコートされた。
２．１ｍｇの感染脳又は非感染脳、トリス（Tris）ｐH８．３  ５０ｍM、BSA  １％（ｗ／ｖ）、トリトン（Triton）X−１００  １％（ｖ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイル・サルコシンが含有される脳ホモジネート  １００μｌ、が、コートされたウェルへ添加された。
３．プリオンの捕捉を促すために２時間の培養の後、ウェルはトリスｐH８．３  ５０ｍM、１％（ｗ／ｖ）のＮ−ラウロイル・サルコシンで３回洗浄された。
４．次いで、ウェルは、PBSで３回洗浄された。
５．５Mのグアニディアム・ティオクヤネート（guanidinium thiocyanate）１００μｌが、各ウェルに添加され、４℃で5分間培養された。
６．ウェルは、PBSで３回洗浄され、次に、Bio-rad Platelia（登録商標）のBSE検出キットのプロトコルに従って、このキットに付属されるアンチ−プリオン・プロテイン接合体で捕捉されたプリオン・プロテインが検出された。
７．生じるシグナルがOD450に於いて、ELISAリーダにより測定された。
【０１１１】
（結果）
2005519088.tif 000007
【０１１２】
（考察）
この実験の条件下において、陰イオンのポリスチレン表面は、特異的にPrPresを捕捉する。非荷電プラスチックは、ポリアニオン系リガンドでコードされない限りこの効果を有さない。
【０１１３】
実施例９：ネガティブ・サンプルにおける、ポジティブ・ブレイン・サンプルの希釈の効果の研究。
（材料）
ポジティブ・サンプル：PrPSCが陽性であると知られている、脳のホモジネート液の２５％の検査液
ネガティブ・サンプル：PrPSCが陰性であると知られている、脳のホモジネート液の２５％の検査液
【０１１４】
（準備）
マキシソープ・プレートは、以下のコーティング・プロトコルでコートされた。pH７.４のカーボネート緩衝液中の１ｍｇのポリブレンが、プレートに被覆され、一晩中放置され、３回洗浄された。次に該プレートは、PBS中の１ｍｇの硫酸デキストランでコートされた。
６時間後、プレートはPBSで３回洗浄され、次に４００μＬの５％のBSA溶液を添加することにより、５％のBSAでブロックされ、３０分間放置された。次にプレートは、３回洗浄され、乾燥された。
【０１１５】
（サンプルの準備）
ネガティブ・ブレインにおけるサンプル希釈の準備
2005519088.tif 000008
水におけるサンプル希釈の準備
2005519088.tif 000009
【０１１６】
（分析を行う前のサンプルの準備）
４０μＬのサンプルが、６０μＬの水、２５μＬの捕捉緩衝液、２５０ｍＭのトリスpH８.４、５％のBSA、５％のトリトンX−１００、５％のサーコシル、１.２５ｍｇ/mlのトリプシンと混合された。
分析は、以下の分析プロトコルに沿って実行された。
１．１００μＬのサンプルをプレートに加え、室温で１２０分間培養する。
２．５０ｍＭのトリスpH８.４及び１％のサーコシルで３回洗浄し、PBSで３回洗浄した。
３．２０％のPEGに１００μＬの４MGuSCNに加え、２℃から８℃で１０分間培養する。
４．PBSで３回洗浄する。
５．１００μＬのバイオラド社（Bio-Rad）のプラテリア（Platelia）（登録商標）の酵素抗体接合体を加え、２℃から８℃で６０分間培養する。
６．バイオラド社（Bio-Rad）のプラテリア（Platelia）（登録商標）洗浄で５回洗浄する。
７．１００μＬのBio-Rad社のBSE検出キットの基質を加え、暗所で３０分間暗室で放置した。
８．１００μＬのBio-Rad社のBSE検出キットの反応停止溶液を加え、読み取る。
【０１１７】
（プレートのレイアウト）
2005519088.tif 000010
【０１１８】
得られた結果を以下に示す
脳の１０ｍｇの希釈
−ve脳におけるホモジネート
2005519088.tif 000011
脳の１０ｍｇの希釈
水におけるホモジネート
2005519088.tif 000012
要約
2005519088.tif 000013
これらの結果が、図１で示される。図１では、水及びネガティブ脳夫々を伴うポジティブ脳の希釈が希釈曲線として示されている。２つの曲線は基本的に同じであり、ネガティブ脳材料の存在によってアッセイが影響を受けることがないことを証明している。
【０１１９】
実施例１０：アルツハイマーの脳及び同年齢の正常な対照群の脳における凝集タウ蛋白質の捕捉
規定の条件の下、正常な非凝集プリオンが捕捉されないために、多様な選択的な捕捉因子が、凝集病原性のプリオン蛋白質の捕捉に特異的であることが示される。凝集プリオン蛋白質は、広範囲のベータ・プリーテッド・シート構造を有するが、大部分の正常なプリオンは、構造がアルファ・ヘリックスである。
この例は、アルツハイマー病で見られるタウ集合体のような、凝集他のベータ・プリーテッド・シート蛋白質を、同様に選択的に捕捉することができることを示す。
【０１２０】
（方法）
１．アルツハイマーの脳及び同齢の正常な対照群の脳の２５％（ｗ／ｖ）ホモジネート液が、蒸留水で準備した。
２．４μＬの脳を捕捉緩衝液（５０ｍＭ トリス pH８.４,１％（ｖ／ｖ） トリトン X-100, １％（ｖ／ｖ） N-ラウロイル サルコシン, １％（ｖ／ｖ） BSA）で１００μＬまでにした。
３．２５μＬの脳を、２５μgのトリプシンを含む捕捉緩衝液で１００μＬまでにした
４．上記段階２及び３で準備された２つの１００μＬのサンプルが、デキストラン硫酸塩でコーティングが施されたマイクロタイター・ウェルに加えられ、室温で２時間培養された。
５．次にウェルは、５０ｍＭ トリス pH８.４, １％（ｖ／ｖ） N-ラウロイル・サルコシンで３回洗浄された。
６．サンプルは、PBS ０.１％（ｖ／ｖ）Tween２０において、抗タウ蛋白質モノクローナル抗体で培養された。
７．１時間後、室温のウェルは、PBS ０.１％（ｖ／ｖ）Tween２０で３回洗浄された。
８．固定された一次抗体が、標準的な方法で抗マウスIgG西洋わさびペルオキシダーゼ接合体が検出された。
【０１２１】
（結果）
抗タウ蛋白質抗体との結果
2005519088.tif 000014
【０１２２】
（考察）
大部分の高齢者の脳は、凝集タウを含むが、アルツハイマー病では、同齢の対照群よりも多くの集合体が存在していることが既知である。選択的な捕捉因子は、これら集合体を捕捉する。
この例において、トリプシン消化は、蛋白質の結合を増加し、シグナルを減少するが、この条件下では、シグナルをバックグラウンドにまで減少しない。治療を行わないシグナルに対するトリプシンを用いた治療後のシグナルの割合は、対照群よりもアルツハイマーの脳において高い。
このことは、アルツハイマーの脳に於いては、同齢の対照群と比較して、よりプロテアーゼ抵抗性を有するタウ蛋白質凝集体が存在することが証明される。
【０１２３】
（実施例１１  ＰＲＰｓｃ陽性サンプルに対するトリプシン滴定の効果）
（方法）
硫酸デキストラン・コーティングされたプレート：
臭化ヘキサジメチレン１ｍｇ（ポリブレン）（ｐH７．４の１０ｍｇ/ｍｌ炭酸塩緩衝液１００μｌ）がマキシソーブ・プレートにコーティングされ、室温で一晩静置された。
各プレートは、その後、ＰＢＳで３回洗浄され、硫酸デキストラン１ｍｇ（MW５０００００）（ＰH８．６のＴＲＩＳ緩衝液ストック溶液１０ｍｇ/ｍｌ）でコーティングされ、室温で４時間静置された。
プレートは、その後、ＰＢＳで３回洗浄され、そしてＴＢＳ内で５％ＢＳＡ溶液３００μｌでブロッキングされ、室温で３０分間静置された。
プレートは、その後、ＰＢＳで３回洗浄された。
【０１２４】
（捕捉緩衝液）
５％ＢＳＡ、５％サルコシル、５％ＴＲＩＴＯＮを含む２５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液。
【０１２５】
（サンプル）
弱陽性及び強陽性を示す脳ＢＩ6３及びＳＶ１０（２５％ホモジネート）は、アッセイでサンプルを提供するため以下のように処理された。
脳ホモジネート２５μｌに、捕捉緩衝液２５μｌ、ｐH８．４のＴＲＩＳ２５０ｍＭ、５％のＴＲＩＴＯＮX−１００、５％のサルコシル６５μｌを混合する。
このサンプルに、多様な濃度のトリプシン１０μｌが加えられた。
洗浄緩衝液
ｐＨ８．４のＴＲＩＳ５０ｍＭに１％のサルコシルを加える。
【０１２６】
（方法）
アッセイプロトコル
１  サンプル１００μｌをプレートに加え、室温で１２０分間培養する。
２  ｐＨ８．４のＴＲＩＳ５０ｍＭと１％サルコシルを用いて３回洗浄し、ＰＢＳで3回洗浄する。
３  （２０％ＰＥＧに）４MGｕSCN１００μｌを加え、２〜８℃で１０分間培養する。
４  ＰＢＳを用いて３回洗浄する。
５  バイオラド社製プラテリア（登録商標）酵素抗体接合１００μｌを加え、２〜８℃で１０分間培養する。
６  バイオラド社製プラテリア（登録商標）洗浄液で５回洗浄する。
７  バイオラド社製プラテリア（登録商標）基質１００μｌを加え、暗所で３０分間培養する。
８  バイオラド社製プラテリア（登録商標）停止液１００μｌを加え、読み取る。
【０１２７】
（結果）
５ｍｇの陽性脳Ｂｉ６３
2005519088.tif 000015
５ｍｇの陽性脳ＳＶ１０
2005519088.tif 000016
【０１２８】
（結論）
トリプシンの存在によって、シグナルが増加した。また、多様な濃度の異なるトリプシンは、アッセイに有害な影響を及ぼすことなく使用することができる。
【０１２９】
（実施例１２：ポリカチオンによるＰＲＰｓｃの特異的結合の実証）
（方法）
この実施例は、ＰＲＰｓｃの特異的捕捉のため様々なポリカチオンが使用されることを実証する。リガンドは、ポリスチレン・マイクロプレートに受動的にコーティングされるか、もしくは無水マレイン酸プレートの適切な箇所へと積極的にコーティング（すなわち結合）されるかのどちらかであった。
【０１３０】
（選択的結合因子固定化）
すべての選択的結合因子が１６〜２５℃の濃度１０μｇ/ｍｌのｐＨ９．６炭酸塩緩衝液５０ｍＭで一晩かけて固定化される。固定化後、ウェルはＰＢＳで３回洗浄され、その後、ＰＢＳに３０分浸漬された５％（ｗ/ｖ）ＢＳＡでブロッキングされる。ブロッキング後、使用前に、ウェルはＰＢＳで２回洗浄される。ＰAMAデンドリマー・スターバスト、ポリエルリジン、ポリエチレンイミンがマキシソープ及び無水マレイン酸マイクロプレート上にコーティングされる。この一方で、ポリブレン及びｐＤＡＤＭＡＣは、このマキシソープ・プレート上のみにコーティングされる。
【０１３１】
ＰＲＰｓｃの捕捉
１  ＢＳＥ感染したウシ及びＢＳＥ感染していないウシの脳が、商業的に定義されたプロトコルに従って蒸留水内で均質化される。
２  均質化された脳０．５ｍｇは、リガンドでコーティングされたウェルにおいて捕捉される。このウェルの総量は、１００μｌでｐＨ８．３のＴＲＩＳ５０ｍM、1%（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、1%（ｖ/ｖ）ＴＲＩＴＯＮＸ―１００、1%（ｗ/ｖ）ＢＳＡ、０．５ｍｇ/ｍｌのトリプシン（豚の膵臓）からなる
３   １８〜２５℃で２時間捕捉した後、ウェルはｐＨ８．３のＴＲＩＳ５０ｍM、1%（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンを用いて３回洗浄される。
４  ウェルは、その後ＰＢＳで３回洗浄され、４〜８℃の１００μｌの４Mグアニジニウム・チオアシン酸、２０％のＰＥＧ８０００を用いて１０分間培養される。
５  ウェルは、ＰＢＳを用いて3回洗浄され、その後、アンチプリオン・モノクローナル抗体ホースラディシュ・ペルオキシターゼ接合を用いて培養される。
６  ６０分後、ウェルは加えられたＰＢＳ０．１％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０及び１００μｌのＴＭＢ基質を用いて５回洗浄される。
７  ３０分後、各反応のOD４５０が、測定され、記録される。（以下の表参照）
【０１３２】
（結果）
2005519088.tif 000017
＊アルドリッヒ  40903−0−mw  400,000  −  500,000
【０１３３】
（考察）
ｐＤＡＤＭＡＣ及びＰAMAデンドリマー・スターバスト・ポリカチオンは、受動的にポリスチレン・マイクロプレートにコーティングされる時、ＰＲＰｓｃ特有のリガンドとして十分に機能する。ｐＤＡＤＭＡＣはこの結合因子の連続においてもっともよく機能する。ポリエチレンイミンは、アミノ基を通じて無水マレイン酸マイクロプレート上に固定化されるとき、ある程度機能する。
この実験は、使用される既定の捕捉緩衝液条件のもとで、感染脳からＰＲＰｓｃを明確に捕捉するために、多様なポリカチオンが使用されることが可能であると例証する。これらの因子は、受動的にもしくは積極的にポリスチレン表面に固定可能である。他の実験は、捕捉緩衝液中の１％（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンの存在によって、陽性脳２０ｍｇからの最大シグナルが達成可能であると例証した。Ｎ−ラウロイルサルコシンがなければ、シグナルは減少する。これは、捕捉因子が定義された緩衝液条件のもとで最大に機能することを示す。
【０１３４】
（実施例１３：アルツハイマーの脳において凝集したβアミロイド及びタウの捕捉及びポリカチオニック結合因子による標準年齢に適合するコントロール）
（背景）
ｐＤＡＤＭＡＣは、定義された条件のもとで、凝集した病原プリオン蛋白の捕捉に特有であると示されてきた。通常の非凝集プリオンは、捕捉されない。凝集プリオン蛋白が、広範囲にわたりβシート構造を有するのに対し、通常のプリオンはほとんどαへリックス構造である。結合因子は、アルツハイマー病において見られるようなβアミロイドやタウの集合のような他の集まったβシート蛋白を認識すると主張される。以下の実験は、この仮説を調べるために実行された。
【０１３５】
（方法）
１  ２５％（ｖ/ｗ）のアルツハイマーのホモジネート及び年齢に適合するコントロール脳が蒸留水中で調製された。
２  ８０μｌの脳ホモジネートは、捕捉緩衝液（ｐH８．３のＴＲＩＳ５０ｍＭ、1%（ｖ/ｖ）ＴＲＩＴＯＮ−X１００、1%（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、１％（ｗ/ｖ）BSA）中で１００μｌ作成され、ポリカチオニック・コーティングされたマイクロウェルに加えられた。このマイクロウェルは、ウェルをポリ（ジアリルジメチル塩化アンモニウム）（ｐＤＡＤＭＡＣ）でコーティングすることによって形成される。（アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー・インク、カタログ番号40、903−0）
３  室温で2時間培養した後、ウェルは、５０ｍＭ ｐH8.4のＴＲＩＳｐＨ８．４、1%（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンで3回洗浄され、その後ＰＢＳ0.1％（v/v）ＴＷＥＥＮ２０内のアンチ・タウモノクローナル抗体を用いて培養される。
４  室温で1時間静置した後、ウェルはＰＢＳ０．１％（ｖ/ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を用いて3回洗浄される。
５  固定化された一次抗体が標準化された手法に従うアンチマウスＩｇＧ西洋ワサビ・ペルオキシターゼ接合を用いて検出された。
【０１３６】
（結果）
2005519088.tif 000018
【０１３７】
（考察）
ポリカチオニック結合因子は、タウ凝集体の捕捉を可能にする。捕捉されたタウがアンチタウ抗体を用いて検出されるとき、アルツハイマー病の脳は、すべて高い陽性シグナルを示したが、陰性コントロール脳は低レベルの陰性シグナルを示した。結論として、特定の条件の下でのポリカチオンを用いての捕捉は、アルツハイマー病の脳をアルツハイマーでない脳と分離することを可能にする。
【０１３８】
実施例１４：ＰＲＰｓｃの捕捉のマトリクス阻害においての異なるプロテアーゼ及びDNASEの効果
背景
ポリカチオン・コーティングされたプレートに対するＰＲＰｓｃの捕捉の有効性について、異なるプロテアーゼの効果が調べられる。このプレートは、ウェルをポリ（ジアリルジメチル塩化アンモニウム）（ｐＤＡＤＭＡＣ）でコーティングすることによって形成される。（アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー・インク、カタログ番号40、903−0）
【０１３９】
方法
１  脳ホモジネート８０μｌが、異なるプロテアーゼ及び/又はDNASEを含む２０ｍｌの捕捉緩衝液（ｐＨ８．３のＴＲＩＳ２５０ｍＭ、５％（ｖ/ｖ）ＴＲＩＴＯＮＸ−１００、５％（ｗ/ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、５％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ）を加えることによって作成された。
２  ホモジネートは、その後ポリカチオニック・コーティングされたマイクロウェルに加えられた。
３  室温で２時間培養した後、ウェルはＰＢＳを用いて６回洗浄された。
４  １００μｌの４Mグアニジン・チオシアネート、２０％（ｗ/ｖ）のＰＥＧが各ウェルに加えられた。
５  室温で１０分培養した後、ウェルはＰＢＳを用いて３回洗浄される。
６  １００μｌのアンチプリオン蛋白ホースラディシュ・ペルオキシターゼ接合（ＰＢＳ０．１％（ｖ/ｖ）ＴＷＥＥＮ２０及び５％（ｗ/ｖ）ＢＳＡ において１：１５００に希釈された）が加えられた。
７  室温で1時間静置した後、ウェルは、ＰＢＳ０．１％（ｖ/ｖ）ＴＷＥＥＮ２０を用いて５回洗浄される。
８  固定化された接合は、以下の標準プロトコルに従うTMB溶液を用いて検出された。
【０１４０】
（結果）
捕捉緩衝液におけるキモトリプシン、トリプシン、DNASE、プロテイナーゼKの効果をアセスする
2005519088.tif 000019
【０１４１】
捕捉緩衝液中のトリプシン及びキモトリプシンを滴定する
2005519088.tif 000020
【０１４２】
（考察）
特定条件のもとでポリカチオニックリガンドがＰＲＰｓｃの接合に特有であることを例証してきた。しかしながら、シグナルはマトリクス効果によって減少しうる。このマトリクス効果は脳ホモジネートの構成要素に由来する。この構成要素は結合に干渉し、シグナルを減少させる。このマトリクス効果が減少し、また感染脳からのシグナルがプロテアーゼの使用により増加することは可能である。この研究によって、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫは、マトリクス阻害の除去に有効である。また（調べられた濃度において）プロナーゼは少し効果がある。６．２５〜１．１５ｍｇ/ｍｌの濃度のトリプシンは、一様に有効であるのにたいし、キモトリプシンは濃度が増すにつれより有効となる。DNASEは、例証可能であるが、マトリクス阻害にはわずかにしか有効でない。
【０１４３】
（実施例１５：ｐＨ及び塩分がもたらすプリオン蛋白質のpDADMAC捕捉への影響）
（背景）
ｐＨ及び塩分濃度が、PrPScのポリカチオンで覆われたプレート（ポリ（ジアリルジメチル  アンモニウム  クロリド）でウェルを被膜することによって形成される）（pDADMAC）（アルドリッチ・ケミカル・カンパニ（Aldrich Chemical Company Inc）、カタログ番号４０，９０３−０）への捕捉の有効性に影響を与えることが調査された。
【０１４４】
（方法）
１．８０μＬの脳ホモジネート液が２０μＬの捕捉緩衝液（２５０ｍＭ  トリス：ｐＨ、５％（v/v）トリトン  Ｘ−１００、５％（w/v）Ｎ−ラウロイル・サルコシン、５％（w/v）ＢＳＡ及び６．２５ｍｇ／ｍｌのトリプシンに対する表を参照）の添加よって、１００μＬとされる。該捕捉緩衝液は、様々な濃度の塩分を含み、ｐＨが調整されている。
２．ホモジネート液は、その後、ポリカチオンで被膜されたマイクロウェルに加えられる。
３．室温で２時間暗室での放置の後、ウェルはＰＢＳで６回洗浄される。
４．１００μＬの４Ｍグアニダイン（Guanidine）・チオシアネート、２０％（w/v）ＰＥＧが各ウェルに加えられる。
５．室温で１０分間暗室での放置の後、ウェルは３度ＰＢＳで洗浄される。
６．１００μＬの抗プリオン蛋白質セイヨウワサビ・ペルオキシターゼ結合体（これは、ＰＢＳ  ０．１％(v/v)  Tween20及び５％(w/v)ＢＳＡ内で１：１５００で希釈されている）が加えられる。
７．室温で１時間後、ウェルは５回、ＰＢＳ  ０．１％（v/v）Tween20で洗浄される。
８．固定された結合体は、標準プロトコルに従うＴＭＢ溶液で検知される。そして、反応のＯＤ４５０が計測される。
【０１４５】
（結果）
（ｐＨの影響）
2005519088.tif 000021
【０１４６】
（塩分の影響）
2005519088.tif 000022
【０１４７】
（考察）
捕捉緩衝液のｐＨが低下すると、感染していない脳からの信号が増加する一方で、感染した脳からの信号は低下する。８．０以上のｐＨにおいて、最適な陽陰信号比が得られる。
捕捉緩衝液内の塩分濃度が増加すると、感染した脳からの信号は漸進的に減少する。このことは、低い塩分濃度或いは塩分がない状態であることが、PrPSc捕捉に対する最適条件であることを示している。
【０１４８】
（実施例１６：Ｎ−ラオロイル・サルコシンとプロテアーゼの濃度変化が、PrPScのpDADMAC捕捉へ与える影響）
（背景）
トリプシンの存在或いは不存在におけるＮ−ラウロイル・サルコシン濃度が、ポリカチオンで被膜されたプレート（ポリ（ジアチルジメチル  アンモニウム  クロリド）でウェルを被膜することによって形成される）（pDADMAC）（アルドリッチ・ケミカル・カンパニ（Aldrich Chemical Company Inc）、カタログ番号４０，９０３−０）へのPrPScの捕捉の効果への影響が調査された。
【０１４９】
１．８０μＬの感染した脳のホモジネート液が２０μＬの捕捉緩衝液（２５０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．３、５％（v/v）トリトン  Ｘ−１００、５％（w/v）ＢＳＡ）に添加よって、１００μＬとされる。該捕捉緩衝液は、プロアテーゼ及びＮ−ラウロイル・サルコシンの異なる濃度を有する。
２．ホモジネート液は、その後、ポリカチオンで被膜されたマイクロウェルに加えられる。
３．室温で２時間の培養の後、ウェルはＰＢＳで６回洗浄される。
４．１００μＬの４Ｍグアニダイン（Guanidine）・チオシアネート、２０％（w/v）ＰＥＧが各ウェルに加えられる。
５．室温で１０分間の培養の後、ウェルは３度ＰＢＳで洗浄される。
６．１００μＬの抗プリオン蛋白質セイヨウワサビ・ペルオキシターゼ結合体（これは、ＰＢＳ  ０．１％(v/v)  Tween20及び５％(w/v)ＢＳＡ内で１：１５００で希釈されている）が加えられる。
７．室温で１時間後、ウェルは５回、ＰＢＳ  ０．１％（v/v）Tween20で洗浄される。
８．固定された結合体は、標準プロトコルに従うＴＭＢ溶液で検知される。
【０１５０】
（結果）
2005519088.tif 000023
【０１５１】
（考察）
Ｎ−ラウロイル・サルコシンが存在しない場において、低濃度のトリプシンであるとき、感染した脳からの信号はない。高濃度トリプシンに対しては、しかしながら、Ｎ−ラウロイル・サルコシンが存在しなくとも、ある程度の信号が得られた。
【０１５２】
本発明は特定の好適な実施形態を用いて説明されてきたが、本発明の要旨内において、多くの変更形態及び応用形態が可能である。同じ結果を得るための同じ方法を実施するような、本発明の請求項で述べられるいかなる変更形態も、本出願によって守られるべき技術範囲となる。
本明細書において、明確には示されていないが、「或いは・又は（or）」との用語は、述べられている状態が「いずれか」或いは「両方」の条件であるときにおいて、真の値を返す分岐条件子の意味で用いられており、単一の条件を要求する「排他的な分岐条件子(exclusive or)」と対立するものとなる。用語「〜からなる（comprising）」は、「〜から構成される（consisting of）」という意味よりもむしろ、「〜を有する（including）」の意味で用いられている。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】実施例９の結果を示す図である。
【図１】
2005519088.tif 000024
【国際調査報告】
2005519088.tif 000025
2005519088.tif 000026
2005519088.tif 000027
2005519088.tif 000028
2005519088.tif 000029
2005519088.tif 000030