(57)【要約】本発明は活性成分として炎症及び免疫過程に関与する遺伝子の発現を調節する向精神作用のないカンナビノイド誘導体を含む医薬組成物に関するものである。炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターの転写の調節は、急性及び慢性炎症、自己免疫疾患及び関連疾患、痛み、感染症、肝疾患、心血管傷害、消化器傷害、神経変性疾患を含む中枢及び末梢神経系の傷害、呼吸器疾患、腎臓疾患、手術後の傷害、組織拒絶及びある種の癌に対して治療上有用な適用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まない、下記一般式（Ｉ）の化合物及びこれらの医薬として受容しうる塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物の、炎症誘導性メディエーターＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の少なくとも一つの転写を減少させるための使用：
【化１】
2005526768.tif 000010
［式中、点線は、任意のＣ１−Ｃ２又はＣ６−Ｃ１の二重結合を示し、式中：
Ｒ１は、
ａ）Ｒ’〔このＲ’は、
Ａ）１‐８個の炭素原子を含み、任意に１‐３個の異種原子によって中断されている、直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の炭素側鎖、及び
Ｂ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は、１個又は２個の環状構造を含む５‐２０個の原子を有し、各環は３‐８個の炭素を含み、任意に１‐４個の異種原子によって中断され、さらに任意に１又はそれ以上の、
ｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキシ、
ｉｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキルチオ、
ｉｖ）ハロゲン、
ｖ）カルボキシル、
ｖｉ）−ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ４アルキル（式中のアルキルは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和であり得る）、
ｖｉｉ）ケト、
ｖｉｉｉ）ニトロ、
ｉｘ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は１個又は２個の環状構造を含む５‐２０個の原子を有し、各環は３‐８個の炭素を含み、任意に１‐４個の異種原子で中断され、さらに任意に上記ｉ）−ｖｉｉｉ）に規定した中から選択される１又はそれ以上の基によって置換されている）
からなる群から選択される基によって置換されている）
からなる群から選択される〕、
ｂ）上記Ｒ’において規定した置換基の少なくとも一つで置換されたアミン又はアミド、
ｃ）上記Ｒ’において規定した置換基の一つで任意に置換されているチオール、スルフィド、スホキシド、スルホン、チオエステル又はチオアミド、及び
ｄ）ヒドロキシル又はエーテル−ＯＲ’〔式中のＲ’は、上記に定義したものである〕
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
ａ）ハロゲン、
ｂ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、及び
ｃ）−ＯＲ〔式中のＲは、
Ａ）−Ｒ’’（このＲ’’は、水素、或いは、任意に末端に−Ｒ’’’または−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’基（式中のＲ’’’は、水素又は直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）を有する、直鎖、分枝若しくは環状、飽和若しくは不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）、及び
Ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’（式中のＲ’’’は上記に定義したものである）
からなる群から選択される〕
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
ａ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１２アルキル、
ｂ）−ＯＲａ〔式中のＲａは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ２−Ｃ９アルキルであり、この末端炭素でフェニル基により置換されてもよい〕、及び
ｃ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ７アルキル−ＯＲ’’’〔式中のＲ’’’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択される］。
【請求項２】
活性成分として、（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まない、一般式（Ｉ）の化合物及びこれらの医薬として受容しうる塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物の、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６並びにサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの転写を増加させるための使用：
【化２】
2005526768.tif 000011
は（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、そして本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まず、式中点線は任意のＣ１−Ｃ２又はＣ６−Ｃ１の二重結合を示し、そして式中：
Ｒ１は下記の群から選択されている
Ｒ１は、
ａ）Ｒ’〔このＲ’は、
Ａ）１‐８個の炭素原子を含み、任意に１‐３個の異種原子によって中断されている、直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の炭素側鎖、及び
Ｂ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は、１個又は２個の環状構造を含む５‐２０個の原子を有し、各環は３‐８個の炭素を含み、任意に１‐４個の異種原子によって中断され、さらに任意に１又はそれ以上の、
ｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキシ、
ｉｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキルチオ、
ｉｖ）ハロゲン、
ｖ）カルボキシル、
ｖｉ）−ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ４アルキル（式中のアルキルは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和であり得る）、
ｖｉｉ）ケト、
ｖｉｉｉ）ニトロ、
ｉｘ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は１個又は２個の環状構造を含む５‐２０個の原子を有し、各環は３‐８個の炭素を含み、任意に１‐４個の異種原子で中断され、さらに任意に上記ｉ）−ｖｉｉｉ）に規定した中から選択される１又はそれ以上の基によって置換されている）
からなる群から選択される基によって置換されている）
からなる群から選択される〕、
ｂ）上記Ｒ’において規定した置換基の少なくとも一つで置換されたアミン又はアミド、
ｃ）上記Ｒ’において規定した置換基の一つで任意に置換されているチオール、スルフィド、スホキシド、スルホン、チオエステル又はチオアミド、及び
ｄ）ヒドロキシル又はエーテル−ＯＲ’〔式中のＲ’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
ａ）ハロゲン、
ｂ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、及び
ｃ）−ＯＲ〔式中のＲは、
Ａ）−Ｒ’’（このＲ’’は、水素、或いは、任意に末端に−Ｒ’’’または−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’基（式中のＲ’’’は、水素又は直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）を有する、直鎖、分枝若しくは環状、飽和若しくは不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）及び
Ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’（式中のＲ’’’は上記に定義したものである）
からなる群から選択される〕
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
ａ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１２アルキル、
ｂ）−ＯＲａ〔式中のＲａは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ２−Ｃ９アルキルであり、この末端炭素でフェニル基により置換されてもよい〕、及び
ｃ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ７アルキル−ＯＲ’’’〔式中のＲ’’’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択される］。
【請求項３】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項４】
Ｒ１が２−メルカプトイミダゾールであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項５】
Ｒ１がイミダゾールであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項６】
Ｒ１がピラゾールであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項７】
Ｒ１が４−メチルピペリジンであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
Ｒ１が４−ピペリジノ−ピペリジンであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３が１，１−ジメチルへプチルであり、Ｃ６及びＣ１の間に二重結合がある請求項１及び２のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
前記医薬組成物が、さらに医薬として受容しうる希釈剤又は担体を含む請求項１から８のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬組成物の希釈剤が、医薬品として受容しうる共溶媒、天然または合成のイオン性又は非イオン性界面活性剤を使用して調製されたミセル溶液又はエマルジョン、或いはそのような共溶媒とミセル又はエマルジョンとの組み合わせを含有する水性共溶媒溶液を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬組成物の担体が、エタノール、界面活性剤及び水の溶液を含有する請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬組成物の担体が、トリグリセリド、レクチン、グリセロール、乳化剤及び水を含有するエマルジョンである請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、単位投与形態になっている請求項１から８のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬組成物が経口投与に適する請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬組成物が非経口投与に適する請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれか一つに記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節して、疾患又は傷害を予防、緩和又は治療する方法。
【請求項１７】
ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３のいずれかの異常生産により特徴付けられる疾患が、炎症性及び免疫傷害、痛み、アレルギー性炎症、類肉腫症、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症及び結核のような単球浸潤を特徴とする疾患、動脈硬化、リウマチ性関節炎、血管炎、間質性肺疾患、炎症性肺疾患、喘息、炎症性内臓疾患、膵炎、炎症性皮膚病、骨の炎症、腫瘍の増殖又は転移、免疫仲介性又は外傷後の炎症を伴う神経疾患、炎症性脱ミエリン神経病、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性疾患、細菌、寄生虫又はウイルス感染、敗血症、腎臓疾患、糖尿病性腎臓病、肝傷害、心血管外科、移植又は臓器若しくは組織置換及び人工的代用物移植における手術後合併症、移植拒絶からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、経口的に、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、傷害部位内に、皮下に、経皮的に、髄膜内に、直腸内にそして鼻内に投与される請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節することによって疾患又は傷害を予防、緩和又は治療するための医薬品を調製するための、請求項１から８のいずれか一つに記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３のいずれかの異常生産により特徴付けられる疾患が、炎症性及び免疫傷害、痛み、アレルギー性炎症、類肉腫症、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症及び結核のような単球浸潤を特徴とする疾患、動脈硬化、リウマチ性関節炎、血管炎、間質性肺疾患、炎症性肺疾患、喘息、炎症性内臓疾患、膵炎、炎症性皮膚病、骨の炎症、腫瘍の増殖又は転移、免疫仲介性又は外傷後の炎症を伴う神経疾患、炎症性脱ミエリン神経病、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のような神経変性疾患、細菌、寄生虫又はウイルスの感染、敗血症、腎臓疾患、糖尿病性腎臓病、肝傷害、心血管外科、移植又は臓器若しくは組織置換及び人工的代用物移植における手術後合併症、移植拒絶からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分として、炎症及び免疫過程に関与する遺伝子の発現を調節する向精神作用のないカンナビノイド誘導体を含む医薬組成物に関するものである。炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターの転写を調節することは、急性及び慢性炎症、自己免疫疾患及び関連疾患、痛み、感染、肝臓疾患、心臓血管障害、消化器障害、神経変性疾患を含む中枢及び末梢神経系の障害、呼吸器疾患、腎臓疾患、手術後の合併症、組織拒絶反応並びにある種の癌を予防及び治療するのに有用な治療上の適用である。
【背景技術】
【０００２】
カンナビノイド
Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ調製物は、古くから種々の病気を治療するための薬剤として知られている。マリハナの活性成分としてテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）が同定されたことにより、薬物化学者は、多数のカンナビノド類似体の開発に駆り立てられた。これら新規化合物は、臨床上好ましくない作用を持たずに、ＴＨＣの治療上有用な性質を発現するように設計された。治療的な適用の可能性は、古典的なものとしては、抗嘔吐、鎮痛、抗緑内障及び食欲増進等の既知のマリハナ自身の特性による。より最近では、向精神作用のないカンナビノイドの神経保護剤及び抗炎症剤としての役割が認識された。多様なカンナビノイドの効果は、一般的には、種々の型の受容体の活性化及び阻害によると考えられている。しかし、カンナビノイド誘導体の一部の治療効果を基礎付ける機序は不明のままである。
【０００３】
向精神作用のない治療薬にとって重要な天然リガンドが発見されて以来、いくつかの合成カンナビノイド誘導体が調製された。そのような化合物の広範なファミリーは、例えば米国特許番号４，１７９，５１７、４，８７６，２７６、５，５３８，９９３、５，６３５，５３０、６，０９６，７４０及び国際特許出願ＷＯ  ０１／９８２８９の実施例に開示されている。この化合物ファミリーの重要な一員は、１，１−ジメチルヘプチル−（３Ｓ，４Ｓ）−７−ヒドロキシ−Δ６−テトラヒドロカンナビノールであり、米国特許４，８７６，２７６に開示され、その中ではＨＵ−２１１と命名されている。ＨＵ−２１１は後に慣用化学名デキサナビノールと命名された。デキサナビノールの（後にはその誘導体の）神経保護作用は、部分的にＮＭＤＡ受容体を阻害する能力によるものであった。さらにこれら化合物は、ＮＭＤＡを阻害する能力と関係なく、抗酸化的及び抗炎症的性質を共有していると思われていた。この抗炎症作用は、酵素シクロオキシゲナーゼ−２（COX-2）によって生産されるＰＧＥ２の分泌を減少させる能力と関係していた。ＣＯＸ−２は、アラキドン酸（ＡＡ）の、炎症的性質を示し、炎症に関与することが知られているプロスタグランジン（ＰＧ）及びその他のエイコサノイドへの代謝に関与しているシクロオキシゲナーゼのイソ型の一つである。最も一般的なＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬）は、酵素の活性部位を修飾することによりＣＯＸ活性を阻害し、それによりＡＡ基質のＰＧＥ２への変換を阻害する（Hinz B.et al.,J.Pharm.Exp.Ther.300:367-375,2002）。
【０００４】
さらに、デキサナビノール及び後のその類似体は、国際特許出願ＷＯ  ９７／１１６６８及びＷＯ  ０１／９８２８９に開示されているように、ＴＮＦ−αの生成又は作用を阻害できることが発見されたデキサナビノールは、頭部傷害モデルにおいて、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡのレベルに影響を与えなかったので、このサイトカインの阻害は転写後の段階において生じることが示された（Shohami E.et al.,J.Neuroimmuno.72:169-77,1997）。ヒトＴＮＦ−αは、最初２７ｋｄ膜貫通前駆タンパクに翻訳され、これがＴＮＦ−α変換酵素（TACE）により分泌型１７ｋｄタンパクへと切断される。ＲＴ−ＰＣＲ実験により、Ｓｈｏｓｈａｎｙ等は、デキサナビノールはＴＮＦ−α  ｍＲＮＡに優位な影響を与えないが、ＴＡＣＥ  ｍＲＮＡのレベルを有意に低下させることを報告し、この薬物が分泌抑制のレベルで作用するという説を支持した。
【０００５】
炎症
炎症は、生物の防御に関係する最も重要な過程の一つである。しかし、脳のような一部の器官で損傷に応答して生じた場合、又は自己免疫疾患におけるように不適切である場合には、炎症は有害であり、したがって薬理的治療を必要とする。炎症反応は、多様な血管及び細胞の反応を生じる多数のエフェクター機構が関与する。血管拡張、毛細血管透過性亢進、走化性、細胞の活性化、痛み、そして最終的修復は、いくつもの特殊なメディエーターの局所的生成と放出によって仲介される。サイトカイン、ケモカイン、アラキドン酸誘導体（プロスタグランジン、トロンボキサン及びロイコトリエン）、酸素及びおそらく窒素ラジカルは、この複雑で高度にバランスが取れている過程において調節的役割を果たしている。そのタンパクの生成が炎症に至る種々の経路に関係することが示されている遺伝子を選択して次に示す：ＣＯＸ−２、ＩＬ−２、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１０及びＳＯＣＳ。
【０００６】
種々の病態におけるこれら炎症メディエーターの関与は、詳細に調査されている（Frangogianis N.G.et al.,Cardio.Res.53:31-47,2002;Gerard C.et al., Nature Immuno.2:108-15,2001;Nathan C.,Nature 420:846-852,2002;Quan N.et al.,Histol.Histopathol.17:273-88,2002）。これら炎症性メディエーターの影響を阻害する種々の方法には、従来の小型分子の薬物による方法に加えて、そのリガンド又は受容体のいずれかに対して作用する、抗体、ペプチド擬似体（peptidic mimetics or decoys）、オリゴヌクレオチド、アンチセンス又は３重螺旋の形成のいずれかの調製がある。ＣＯＸ−２のみの選択的阻害は、例えば米国特許番号５，７８３，５９７、５，８４０，７４６及び６，０２５，２５３に開示されているが、これは、炎症、神経変性疾患及び血管性障害の緩和、予防又は治療のための小型分子を提供するものである。米国特許６，３４４，３２３には、ＣＯＸ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用法が開示されており、米国特許５，７７６，５０２には、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパクに結合する分子を使用して、炎症メディエーターを含む種々の遺伝子の転写を調節する方法が開示されている。抗体又はペプチドの使用は米国特許６，２７７，９６９に例示されており、これは、ヒトＴＮＦ−αの関係する病気の診断と治療のためのヒトＴＮＦ−αに対する抗体及びそのペプチドが開示されている。
【０００７】
この分野の進歩にもかかわらず、炎症性疾患の有効な治療に対する医学的要求は満たされないままとなっている。炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターは、他方を調節する性質を含む、多形質発現性効果を持っている。従って、前記のサイトカイン、サイトカイン調節物質、ケモカインおよび「炎症誘導性」酵素が、それらが有害であったり有益であったりする数多くの疾患に関与していることは驚くことではない。適切に調節されてハランスが取れている場合には、これらの物質は防御機構を活性化して宿主を防御するので、それらの完全な阻害は望ましいことではない。しかし、炎症が不適切でありこれらメディエーターの発現が非常に乱れているならば、組織傷害を生じるであろう。生理的に有用な効果を完全に阻害することなく、選択的且つ同時に炎症誘導性メディエーターを下方調節し抗炎症的メディエーターを上方調節する化合物は、広範囲な病態に対して明らかな治療上の有用性を有するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要約
本発明は、活性成分として、向精神作用のないカンナビノイド及びその誘導体を含む医薬組成物であって、今回予想外に、炎症機序に関与する遺伝子の直接若しくは間接的調節物質として作用することが開示された医薬組成物に関するものである。本発明は、本質的にかなりの向精神作用を除去した合成若しくは天然のカンナビノイドを包含する。ＨＵ−２１１としても知られているデキサナビノールの向精神作用のない合成誘導体が現在望ましいものである。
【０００９】
驚くことに、今回、望ましい化合物により発現されるＰＧＥ２阻害作用が、ＣＯＸ−２酵素活性のレベルで生じるのではなく遺伝子調節のレベルで生じることを開示する。したがって、一部の向精神作用のない新規カンナビノイドは、これまでに想像されていなかった方法により、急性及び慢性の炎症、自己免疫疾患及び関連疾患、痛み、感染、肝臓疾患、心臓血管障害、消化器障害、神経変性疾患を含む中枢及び末梢神経系の障害、呼吸器疾患、腎臓疾患、手術後の合併症、組織拒絶反応及びある種の癌の予防及び治療に有用である。本発明の化合物は、炎症誘導性メディエーターの下方調節若しくは抗炎症性メディエーターの上方調節により又は同時に両作用を持つことによって、遺伝子転写のレベルに作用するという事実が、当該化合物による広範囲の病気の治療の基礎となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、炎症誘導性メディエーターであるＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の少なくとも一つを減少させるための医薬組成物であって、活性成分として、（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まない、一般式（Ｉ）の化合物、及びこれらの医薬として受容し得る塩、エステル又は溶媒和物を含む医薬組成物を包含する。
【化１】
2005526768.tif 000002
［式中、点線は任意のＣ１−Ｃ２又はＣ６−Ｃ１の二重結合を示し、式中：
Ｒ１は、
ａ）Ｒ’〔このＲ’は、
Ａ）１−８個の炭素原子を含み、任意に１−３個の異種原子によって中断されている、直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の炭素側鎖、及び
Ｂ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は、１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子によって中断され、さらに任意に１又はそれ以上の、
ｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキシ、
ｉｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキルチオ、
ｉｖ）ハロゲン、
ｖ）カルボキシル、
ｖｉ）−ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ４アルキル（式中のアルキルは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和であり得る）、
ｖｉｉ）ケト、
ｖｉｉｉ）ニトロ、
ｉｘ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子で中断され、さらに任意に上記ｉ）−ｖｉｉｉ）に規定した中から選択される１又はそれ以上の基によって置換されている）
からなる群から選択される基によって置換されている）
からなる群から選択される〕、
ｂ）上記Ｒ’において規定した置換基の少なくとも一つで置換されたアミン又はアミド、
ｃ）上記Ｒ’において規定した置換基の一つで任意に置換されているチオール、スルフィド、スホキシド、スルホン、チオエステル又はチオアミド、及び
ｄ）ヒドロキシル又はエーテル−ＯＲ’〔式中のＲ’は、上記に定義したものである〕
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
ａ）ハロゲン、
ｂ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、及び
ｃ）−ＯＲ〔式中のＲは、
Ａ）−Ｒ’’（このＲ’’は、水素、或いは、任意に末端に−Ｒ’’’または−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’基（式中のＲ’’’は、水素又は直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）を有する、直鎖、分枝若しくは環状、飽和若しくは不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）、及び
Ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’（式中のＲ’’’は上記に定義したものである）
からなる群から選択される〕
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
ａ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１２アルキル、
ｂ）−ＯＲａ〔式中のＲａは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ２−Ｃ９アルキルであり、この末端炭素でフェニル基により置換されてもよい〕、及び
ｃ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ７アルキル−ＯＲ’’’〔式中のＲ’’’派上記に定義したものである〕
からなる群から選択される］。
【００１１】
また本発明は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６並びにサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの転写を増加させるための、既に定義した一般式（Ｉ）の化合物を活性成分として含む医薬組成物を包含する。
【００１２】
現在、より望ましい化合物は、Ｒ２がヒドロキシまたは低級アシルオキシであり、Ｒ３がジメチルヘプチル又は少なくとも合計７個の炭素原子を持つジメチルアルキル基である化合物である。
【００１３】
本発明の現在望ましい態様によると、Ｒ１は、イミダゾリル、イミダゾリニル、モルホリノ、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、トリアゾリル、テトラゾリルからなる群から選択される複素環部分であって、それらの各環状部分が、任意にさらに、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシ、ニトロ、飽和若しくは不飽和の環状部分又は芳香族部分又は複素環部分からなる群から選択される少なくとも一つの基で置換されており、それらの各環が、３−８の炭素を含み、任意に１−４異種原子で中断され、当該異種原子が、それぞれ独立にＮ、Ｏ、  Ｓからなる群から選択され、それらの各環がさらに、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシまたはニトロからなる群から選択される１またはそれ以上の基により置換され、そのＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオが飽和及び不飽和の直鎖、分枝及び環状構造を含むことが意図されている、複素環部分である。
【００１４】
本発明のより望ましい態様によると、Ｒ１は、ヒドロキシル、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、テトラヒドロピリジン、ピラゾリン、オキサゾリン、ピロリジン、イミダゾリン、２−チオ−イミダゾール、２−メチルチオ−イミダゾリン、４−メチル−２−イミダゾリン、４，４−ジメチル−２−イミダゾリン、メチルスルフィド、メチルスルホキシド、アセトアミド、ベンズアミド、シアノ、１，２，４−トリアゾール、１，３，４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、１，２，３，５−テトラゾール、チオフェン、フェニル、モルホリン、チオモルホリン、チアゾリジン、グリセロール、ピペラジン、４−ピペリジノピペリジン、４−メチルピペリジン及びテトラヒドロピランからなる群から選択される。
【００１５】
本発明のさらにより望ましい態様によると、Ｒ１は、その置換基が、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、イミダゾリル、イミダゾリニル、モルホリノ、ピペリジル、ペペラジニル、ピラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、トリアゾリル、及びテトラゾリルからなる群から選択される、モノ又はジ−置換アミンであって、各環状部分が、さらに任意にＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキ、ニトロ、飽和若しくは不飽和の環状部分又は芳香族部分又は複素環部分からなる群から選択される少なくとも一つの基で置換されており、各環が３−８の炭素を含み、任意に１−４の異種原子によって中断され、当該異種原子は、それぞれ独立にＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択され、各環はさらにＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシまたはニトロからなる群から選択される１またはそれ以上の基により置換され、そのＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオが飽和及び不飽和の直鎖、分枝及び環状構造を含むことが意図されている、モノ又はジ−置換アミンからなる群から選択される。
【００１６】
その他の現在望ましい態様によると、活性成分として、一般式（Ｉ）〔式中Ｒ２はＯＨ、Ｒ３は１，１−ジメチルペプチルであり、Ｃ６とＣ１の間に二重結合があり、そしてＲ１がヒドロキシル、２−メルカプトイミダゾール、イミダゾール、ピラゾール、４−メチル−ピペリジン、及び４−ピペリジノ−ピペリジンからなる群から選択されている〕の化合物を含む、炎症誘導性メディエーターＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、  ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の少なくとも一つの遺伝子発現を下方調節し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６並びにサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの遺伝子発現を上方調節する医薬組成物が開示される。
【００１７】
医薬組成物は、活性成分に加えて、生理的に受容され安定な製剤を製造するために必要な、一般的な医薬として受容される担体、希釈剤及び賦形剤を含むことができる。
【００１８】
医薬組成物を、経口、非経口、静脈内、筋肉内、傷害部位内、皮下、経皮、脊髄内、舌下又は鼻内を含む、一般的で適切な経路により投与することができる。
【００１９】
予防、緩和及び治療のための薬物として、それを必要とする患者に使用する前に、医薬組成物は、単位用量に製剤化されるであろう。活性成分の用量選択は、求める治療効果、投与経路及び目的とする治療期間による。
【００２０】
本発明のその他の態様は、患者に活性成分として先に定義した一般式（Ｉ）の化合物を含む治療有効量の医薬組成物を投与することにより、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節して患者を予防、緩和又は治療する方法を提供する。
【００２１】
本発明のその他の態様は、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節することにより、病気を予防、緩和又は治療するための薬品の製造に、実質的に明細書に示した一般式（Ｉ）の化合物を使用することに関する。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の少なくとも一つの遺伝子発現の減少を生じさせるために有効な組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６、サイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの遺伝子発現の増加を生じさせる。作用機構は、遺伝子発現の直接の調節によるか間接的なフィードバック機構によるであろう。本発明の化合物が、免疫調節及び／又は抗炎症シグナリングカスケードに関与することが知られている限定された遺伝子のセットについて遺伝子発現に対する影響を試験されたことに気付くであろう。マイクロアレイに認められるような大量の遺伝子のセットに対するこれらの向精神作用のないカンナビノイド誘導体の影響をアッセイすることにより、ここに開示された新しい遺伝子調節作用が関与する追加の遺伝子が明らかにされるであろう。
【００２３】
本発明は、分枝の３及び４位における絶対立体化学（３Ｓ，４Ｓ）によって特徴付けられるＴＨＣ−型化合物に関するものであり、それは天然系の（３Ｒ，４Ｒ）立体配置とは反対である。（３Ｒ，４Ｒ）立体配置の天然化合物は、好ましくない向精神性の「カンナビス」型効果を発生し、その他の治療上興味のある効果の使用の妨げとなる。（３Ｓ，４Ｓ）立体配置である本発明の化合物は、本質的に好ましくない向精神作用は除かれており、したがって種々の疾患や障害の治療に使用することができる。したがって、以下の明細書及び請求項において、用語「本質的に含まない」とは（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーに存在する好ましくない向精神作用が実質的に除かれた光学的に高純度の（３Ｓ，４Ｓ）化合物のことを定性的に示す。意図とする治療用エナンチオマーの光学的純度の最小受容度の定量的基準は、反対エナンチオマーの薬理学的強度により規定される。反対エナンチオマーの向精神作用が強ければ、それに応じて要求される光学純度は厳密になる。したがって、「本質的に含まない」の定量的意味は、各エナンチオマー対の性質に依存する。それぞれ（３Ｒ，４Ｒ）及び（３Ｓ，４Ｓ）配置のエナンチオマー対ＨＵ−２１０及びＨＵ−２１１は、そのような状態の極端な例であり、ＨＵ−２１０はマリハナの活性主成分である天然Δ９−ＴＨＣの１００倍の向精神作用を有している。ＨＵ−２１０の非常に強い好ましくない向精神作用により、ＨＵ−２１１は少なくとも９９．８％のエナンチオマー純度でなければならない（Mechoulam R. et al., Tetrahedron Asymmetry 1(5): 315-8, 1990）。
【００２４】
本明細書において、用語「プロドラッグ」は、例えば血中における加水分解により、インビボにおいて式（Ｉ）の親化合物に速やかに変換される化合物を表す。式（Ｉ）の化合物の一部は、医薬品として受容しうる塩及びエステルをさらに形成することができる。「医薬品として受容しうる塩及びエステル」は、医薬品として受容され薬理学的に望ましい性質を持つ塩及びエステルを意味する。そのような塩は、アミノ酸を含む、無機酸若しくは有機酸、又は無機塩基若しくは有機塩基から誘導され、いずれにしても毒性がなくて望ましくないものではない。本発明は、式（Ｉ）の化合物及びその塩の溶媒和物、例えば水和物もその範囲内に含む。これらの医薬品形態の全てが、本発明の範囲内に含まれるべきものである。
【００２５】
本明細書において、「阻害、減少、又は減少効果」は、問題の作用を少なくとも２０％、望ましくは４０％、より望ましくは６０％、最も望ましくは８０％以上減弱する能力のことである。
【００２６】
本明細書において、「増強又は増加効果」は、問題の作用を少なくとも２倍、望ましくは３倍、より望ましくは４倍、最も望ましくは５倍以上増強する能力のことである。
【００２７】
本明細書及び続く請求項において、「予防的に有効な」とは、副作用を避けながら病気発生のリスクを防止、減少又は根絶する目的を達成する化合物の量を定めることを意図している。用語「治療的に有効」は、障害をさらに放置できず患者が無症状でなくなった場合に、副作用を伴わずに、病気を緩和し、病気の進行を遅らせる化合物の量を定めることを意図している。本発明の組成物は予防的であると同時に治療的である。
【００２８】
治療対象としての「個体」又は「患者」には、この治療によって有効な治療効果を示す疾患に罹患しているヒト又は哺乳動物を含む。
【００２９】
この明細書及び続く請求項を通して、アルキル置換基は飽和若しくは不飽和、直鎖、分枝、又は環状であり、後者はアルキル鎖の炭素数が３以上の場合のみである。
【００３０】
本発明の化合物により影響を受ける遺伝子を以下に示し、当該遺伝子が病気の進行に関係している病気を簡単に説明する。
【００３１】
ＣＯＸ−２
いくつかの器官、特に腎臓及び消化器（GI）系、におけるその特別な生理機能に加えて、プロスタグランジンは、しばしば炎症過程において主要な役割を果たすことが知られている。それらは、関節炎疾患における痛み、浮腫及び血管透過性のメディエーターとして関与し、結腸直腸癌の病理生理に関与していると考えられている。プロスタグランジンの生合成は、シクロオキシゲナーゼ（COX）の作用に依存しており、最近、１型シクロオキシゲナーゼ（COX-1）と２型シクロオキシゲナーゼ（COX-2）としてヒトに存在することが認められた。両酵素は、プロスタグランジンの合成に関係し、ＣＯＸ−１は構成的であり、ＣＯＸ−２はマイトジェン、エンドトキシン、ホルモン、サイトカイン、ストレス状態及び増殖因子を含む多数の物質により誘導される。プロスタグランジンは、生理的役割と病理的役割の両方の役割を有しているが、構成的なＣＯＸ−１は、例えばＧＩ系における重要な生理的機能を担い、一方誘導的ＣＯＸ−２は主として炎症組織におけるプロスタグランジンの病理的影響の原因であると考えられている。しかし、最近の薬理学的な研究によると、ＣＯＸ−２は炎症組織にのみ専ら発現しているわけではなく、いくつかの器官には構成的に存在し、そこではＣＯＸ−１と協調してホメオスターシスを維持していることが示された。したがって、ＣＯＸ−２の完全な阻害は望ましくないであろう。それでもなお、ＣＯＸ−２の選択的阻害薬は、その抗炎症、解熱及び鎮痛作用のために、プロスタグランジンの病態生理学的な影響を治療するのに有用であることが期待される。実際にＣＯＸ−２阻害薬は、既に市場に存在し、広範囲の治療上の利益をもたらしている。ＣＯＸ−２阻害薬は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、眼炎、急性及び慢性月経痛、ヘリコバクターピロリ菌による胃炎に有効であることが既に認められている。さらに、選択的阻害薬は、乳癌及び結腸直腸癌のような癌に対して抗癌効果を持つ可能性があり、ポリープ及び血管新生の治療に有用である十もわれ、脊髄損傷、脳虚血、又はアルツハイマー病及びパーキンソン病のような神経変性疾患、又はＡＩＤＳ随伴性痴呆により生じる神経学的傷害は、魅力的な治療対象候補であろう。ＣＯＸ−２阻害の積極的役割が肝硬変のような慢性肝臓病において提示されている。最近の知見は、ＣＯＸ−２は全身性プロスタサイクリン合成の主要な源泉であり、その生成の増加が、不安定狭心症、重症動脈硬化のような血小板活性化の徴候のある患者、及び血管再建術中の患者において認められたことを示している。
【００３２】
ＩＬ−１β
インターロイキン−１β（IL-1β）は、広範囲の病気に関係付けられている強力な炎症誘導性サイトカインである。ＩＬ−１βを発現することが知られている細胞は、アストロサイト、副腎皮質細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び単球、内皮細胞、角質細胞、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、トロホブラスト、並びにＴ細胞プラス繊維芽細胞である。ＩＬ−１βは、例えば敗血症ショック、ＩＢＤ、膵炎、潰瘍性結腸炎、肺炎及び損傷治癒に伴って生じるいくつかの炎症障害における重要な因子である。ＩＬ−１βは、リウマチ性関節炎、骨関節炎、滑液炎症及び歯周病のような結合組織の破壊に至る炎症にも関係している。さらに、ＩＬ−１βは、中枢神経系（CNS）の病態にも関係し、ニューロン損失を悪化すると考えられている。そのレベルは、脳外傷、ＡＬＳ、ＡＤ、ＰＤ及び神経性無食欲症において上昇する。しかし、ＩＬ−１βの効果がどのように仲介されるかについては不明のままである。中枢神経系に常在する細胞に対するＩＬ−１βの直接の細胞毒性作用の結果として悪化するのか、ＩＬ−１βの生産に応答して脳に動員された白血球による二次的な第三者傷害の結果として悪化するのかのいずれかであろう。ＩＬ−１βの不適切な生産は、アレルギー、全身性エリトマトーデス（SLE）、乾癬、移植片対宿主病、及びＭＳのような免疫疾患にも認められている。ゴーシュ病（GD）の患者では、ＩＬ−１βは上方調節されており、この過剰発現はＧＤの臨床症状の一部の病理生理に関係すると推測されている。インスリン依存性糖尿病に至る膵臓のベータ−細胞破壊の促進は、ＩＬ−１に対する依存性を示す。他の種々なサイトカインの生産並びに他の細胞因子の調節に影響するＩＬ−１βの後天的発現は、良性腫瘍における重症のしばしば致死的な悪性腫瘍への進行、動脈硬化及びその他の心血管系疾患、感染性疾患、腎臓及び肝臓の機能不全、急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流傷害及び多臓器不全に関係付けられている。ＩＬ−１βの関与が認められている数多くの病気は、重要な炎症誘導性メディエーターとしてのＩＬ−１βの中心的な役割を支持する。
【００３３】
ＩＬ−２
ＩＬ−２遺伝子の誘導は、休止細胞をエフェクター細胞にするのに必要なＴ細胞の活性化において、重要な現象である。ＣＤ２８のような共役刺激受容体の関与を伴うリガンドのＴ細胞受容体への結合に続いて、一連の細胞質シグナリング分子が、一部の転写因子を、核中のＩＬ−２プロモーター領域に存在するそれらの対応部位に会合させる。ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ及びＮＥＡＴを含むこれら転写因子は、それぞれ異なるシグナリング経路により調節されており、これらは協調してＩＬ−２遺伝子の十分な活性化を発現させるように作用する。ＩＬ−２遺伝子調節の同様の様式は、酢酸ホルボールミリステート（PMA）及びカルシウムイオノホアを用いるＴ細胞活性化によっても認められる。シクロスポリンＡのような免疫抑制薬は、ＩＬ−２遺伝子の転写を強力に阻害し、治療物質として寄与することはよく知られている。サイトカインＩＬ−２の生産を阻害することができる化合物は、Ｔ細胞活性化が重要な役割を演じている疾患、特に関節炎、リウマチ性疾患、全身性エリトマトーデス、重症筋無力症、炎症性内臓疾患、慢性肝臓疾患、心不全、多発性硬化症、炎症性脱ミエリン神経疾患、乾癬、１型糖尿病、寄生虫感染、葡萄膜炎及びその他の眼の炎症、シェーグレン症候群、糸球体腎炎及び移植拒絶のような自己免疫的要素を含む病因を有する炎症病態、の治療に重要な免疫抑制薬となる可能性がある。
【００３４】
ＩＬ−６
インターロイキン−６（IL-6）は、免疫系及び造血系の調節に重要である。このサイトカインファミリーは、その多様性により、多様な生物学的機能に基づく種々の別名を有する。ＩＬ−６は、Ｂ細胞を増殖させて、抗体形成細胞に分化させ、その一方で、ＩＬ−４依存ＩｇＥ合成及びＴ細胞活性化、増殖及び分化を補助する。ＩＬ−６は、ＩＬ−３と共同して作用して、多分化能造血前駆細胞の増殖を誘導する。さらに、このサイトカインは、急性期タンパクの発現を誘導する。ＩＬ−６は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、単球、マクロファージ、肝細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、角質細胞及び多数の腫瘍細胞系によって分泌される。脂肪細胞、骨髄ストローマ細胞、メサンギウム細胞及び中枢神経系のある種の細胞も、このサイトカインを生産する。ＩＬ−６の生産は、一般的に細胞活性化と相関する。ＩＬ−６は、炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターのいずれとしても記述されており、そのレベルは多数の疾患、ＲＡ及びその他の型の関節炎、ＳＬＥ、潰瘍性結腸炎、Ｃｒｏｈｎ病、膵炎、糖尿病、ＭＳ、乾癬のような炎症性及び自己免疫疾患において；ＨＩＶ、細菌感染及び敗血症、ウイルス及び細菌性脳脊髄膜炎のような感染性疾患において；転移型黒色腫、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、転移型腎細胞癌、前立腺腫瘍のような腫瘍性疾患において；糸球体腎炎、腎臓疾患及び血液透析のような腎不全及び透析において；慢性肝臓病、アルコール性肝硬変、肝炎及び肝臓切除のような肝臓疾患において；腎臓、骨髄又は肝臓移植において；ＡＤ、火傷被災者及び心筋梗塞に罹患した患者において変動している。ＩＬ−６は、外傷による傷害重症度の初期マーカーと考えられている。ＩＬ−６作用の性質は発現の時期と場所に依存しており、根本的には、このサイトカインが炎症誘導性又は抗炎症性物質として作用するか否かによって影響を受ける。しかし、最近の研究は、サイトカイン調節の総合的バランスの中においてＩＬ−６は、保護的サイトカインと考えるべきであることを示している。この重要なサイトカインの適切な調節は、明らかに有用な治療効果をもたらすだろう。
【００３５】
ＩＬ−１０
インターロイキン−１０（IL-10）は、活性化されたマクロファージ、単球、多形核白血球及び好酸球による炎症誘導性サイトカイン及びケモカインの生産を下方調節する。最近、この下方調節の一部は、ＳＯＣＳ分子（サイトカインシグナリングのサプレッサー）レベルの上昇によって行われていることが示された。したがって、ＩＬ−１０は、免疫及び炎症反応を抑制する役割をする抗炎症サイトカインである。ＩＬ−１０がヘルパーＴ１（Th1）型応答およびＴｈ２仲介炎症反応の両者を調節し得るという証拠がある。ＩＬ−１０は、これに限定はしないが、リウマチ関節炎、虚血−再潅流傷害、動脈硬化、乾癬、天疱瘡、アレルギー性接触過敏反応、葡萄膜炎、臓器移植、外傷、感染及び敗血症、炎症性内臓疾患、急性膵炎、喘息、腎毒性腎炎及びある種の悪性疾患を含む種々の急性及び慢性の炎症並びに自己免疫現象に対して有用な効果を有する。
【００３６】
ｉＮＯＳ
酸化窒素（NO）は、宿主の防御、炎症及び免疫における多くの生理的機能に必要な短命の分子である。ＮＯは、酸化窒素合成酵素（NOS）により合成され、種々の病理的炎症状態において過剰生産される。ＮＯＳの三種の異なるイソフォームが同定されている：神経型（nNO S）、内皮型（eNOS）、及び誘導型（iNOS）。ｎＮＯＳ及びｉＮＯＳによるＮＯの過剰生産は、急性及び慢性の神経変性疾患、痙攣、痛み、敗血性ショック、喘息、炎症による組織傷害、Ｃｒｏｈｎ病、ＳＬＥ、骨関節炎、リウマチ性関節炎、同種移植片拒絶及びある種の癌を含む多数の臨床的異常において報告されている。ｉＮＯＳは、エンドトキシン又は炎症誘導性サイトカインにより誘導されるが、翻って後者の発現を調節する。ｎＮＯＳ又はｉＮＯＳの選択的阻害は、種々の疾患の新規治療方法を提供することが期待される。
【００３７】
ＭＣＰ−１
単球誘引タンパク−１（MCP-1）は、Ｃ−Ｃファミリーの炎症誘導性ケモカインであり、主として、単球、マクロファージ、好塩基球、マスト細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の動員と活性化を担当している。傷害部位へ動員された活性化単球は、逆にＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、酸化窒素及びプロスタグランジンのような炎症性物質を分泌する。ＭＣＰ−１は、損傷治癒のような好ましい過程に関与し得るが、過剰に発現すると非常に多数の炎症性及び自己免疫疾患の病態生理に関与するようになる。ＭＣＰ−１は、急性又は慢性の炎症により種々の臓器を冒す多数の疾患に関係付けられている。ＭＣＰ−１が作用する病理的部位は、リウマチ性関節炎及び種々の型の骨性炎症のような障害を有する骨格；腎炎、腎炎症候群、及び糸球体腎炎を特徴とするネフローゼを有する腎臓、葡萄膜炎の眼、硝子体網膜疾患、増殖性糖尿病性網膜症、及びその他の眼の炎症を有する眼；アテローム性動脈硬化症の初期段階、再狭窄、および心筋梗塞に伴う炎症反応においてＭＣＰ−１が関与している心血管系；歯槽炎、喘息、及び肺繊維症又はアレルギー性炎症を有する呼吸器系；潰瘍性結腸炎及びＣｒｏｈｎ病を共に含む炎症性内臓疾患（IBD）を有する消化器系である。種々の型の病態においてＭＣＰ−１上方調節が認められる神経系も重要な標的である。中枢神経系において、ＭＣＰ−１レベルの上昇が、頭部外傷及び脳出血などの脳虚血に伴って、並びに実験的自己免疫脳脊髄膜炎（EAE）又は多発性硬化症（MS）に見られるような免疫仲介炎症において、並びにアルツハイマー病（AD）のような神経変性疾患に伴う炎症性の現象において観察されている。同様に、ＭＣＰ−１は、単核細胞浸潤を特徴とする末梢神経系（PNS）疾患及び関連する脱ミエリン疾患にも関与している。更に、ＭＣＰ−１は、血管炎、血管新生、腫瘍の増殖及び転移、移植片拒絶、ある種の細菌、寄生虫又はウイルスの感染、乾癬、天疱瘡及び関連疾患、皮膚の遅発型過敏反応、ホジキン病及び類肉腫症、Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫及び結核を含む単球の著しい浸潤を特徴とする多くの慢性疾患に関与している。ＭＣＰ−１は、例えば、血管再建、アテローム切除、循環回復術、移植、臓器置換、組織置換及び人工的代用物移植のような外科的介入の後に傷害が生じる場合にも非常に重要である。したがって、ＭＣＰ−１生産及びそれによる炎症性及び自己免疫性疾患における標的組織への白血球の動員を阻害することは非常に有効な治療処置であろう。
【００３８】
ＳＯＣＳ
サイトカインは、特定の細胞表面受容体に結合することにより、その生物活性を発揮し、その受容体が、細胞内シグナル伝達カスケードを開始して、生理的結果を生じさせる。その多様な生物学的役割にもかかわらず、多くの共通のテーマは、サイトカインシグナル伝達で明らかとなる。受容体が多量体化すると、Ｊａｎｕｓキナーゼ（JAK）が活性化され、他の蛋白との間で、転写のシグナル伝達物質及び活性化物質（STAT）をリン酸化する。次いで、リン酸化されたＳＴＡＴの二量体は核へ移動し、そこで標的遺伝子の認識部位に結合して転写を増強する。そのシグナリング経路は、適時に生物学的応答を確実に止めるためにネガティブにも調節される必要がある。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングを阻害するタンパクには少なくとも３ファミリーが存在し、サイトカインシグナリングサプレッサー（SOCS）はその一つに属している。ＳＯＣＳタンパクは、多くのサイトカインにより開始されるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を調節する古典的ネガティブフィードバックループの重要な要素である。サイトカインによる活性化に続いて、細胞はサイトカインの生物学的活性を仲介するのに重要な遺伝子の転写を増加させるのみならず、サイトカインの生物学的活性を制限するＳＯＣＳタンパクをコードする遺伝子の転写も増加させる。現在までに少なくとも７種のＳＯＣＳタンパクが同定されており、それらの活性は現在解明されている。ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３は、有効性は異なるが、ＩＬ−６、成長ホルモン（GH）、ＩＬ−１０及びＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカインのほぼ同じセットにより誘導される。逆に、ＳＯＣＳ−１は、ＩＬ−６、ＧＨシグナリング、ＩＬ−２、ＩＬ−４、インターフェロン（IFN）α、β及びγ、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ及びトロンボポエチンを阻害する。ＳＯＣＳ−３は、レプチン、ＧＨ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γを下方調節する。したがって、一つのサイトカインによるＳＯＣＳタンパクの誘導は、交差阻害の現象により、最初の誘導物質と異なる別のサイトカインの応答も減弱する。これらのタンパクは、炎症及び造血の免疫応答及びホルモン応答の重要な調節物質となる可能性がある。
【００３９】
ＴＮＦ−α
腫瘍壊死因子（TNF）は、炎症過程において中心的役割を果たしている。炎症性の要素のある全ての疾患において、共通する過程は、感染性、化学的又は環境物質によって生じる最初の傷害が、標的器官における局在性組織壊死を生じる、ことである。この傷害の結果として、組織固定マクロファージ及び循環する単球は傷害部位へ移動し、活性化され、さらに細胞傷害を生じるか又は炎症性産物の誘導を生じる産物を分泌して、応答を増幅する。ＴＮＦ−αは、主に単球及びマクロファージにより生産されるサイトカインである。その生理的効果のほかに、ＴＮＦ−αは、細胞障害性を有するとともに、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、マクロファージ炎症性タンパク（MIP）−２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及び接着分子を誘導して炎症過程を調節する。高いレベルのＴＮＦ−αは、敗血症ショック症候群、Ｃｒｏｈｎ病を含む自己免疫及び炎症過程、脳外傷、種々の血栓、動脈硬化、血管炎、ＩＢＤ、ＭＳ、ＥＡＥ、ＳＬＥ、ＡＤ、ＰＤ、ＡＩＤＳ痴呆、接触皮膚炎、混合結合組織病、関節炎、臓器特異的毒性反応、敗血症及び再潅流の間の肝傷害、慢性炎症性肺疾患、筋肉消耗及び悪液質に関与する。ＴＮＦ−α阻害の治療的意義は非常に大きいが、しかし、ＴＮＦ−αは正常な生理的及び修復過程に関与していることに留意する必要があり、このサイトカインを完全に除去することは有害であろう。
【００４０】
ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターの遺伝子を調節することによる、その抗炎症特性及び免疫調節特性のために、本発明による組成物は、それら病因又は病原に関係する炎症または自己免疫機構を含む適応症の治療に有用であると認識されるであろう。そのような病気又は疾患の体表的なものは、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、シェーグレン症候群、１型糖尿病、遅発性２型糖尿病、類肉腫症；関節炎、リウマチ性関節炎、骨関節炎及びリウマチ性疾患を含む骨格及び結合組織の病気；葡萄膜炎、硝子体網膜疾患、増殖性糖尿病性網膜症、アレルギー性結膜炎を含む眼の炎症関連疾患；脂質ペルオキシソーム及び脂質過酸化の異常及び／又は酸化的ストレスが関係する代謝性疾患；乾癬、天疱瘡及び関連症候群、遅発性過敏症及び接触皮膚炎を含む皮膚の病気；嚢胞繊維症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギー性鼻炎又は肺炎、特発性肺繊維症、結核、及び歯槽炎を含む呼吸器疾患；自己免疫性腎炎、腎虚血、腎炎、腎炎症候群及び糸球体腎炎が特徴であるネフローゼを含む腎臓疾患；自己免疫性肝炎、肝硬変、肝炎及び劇症肝不全のような急性及び慢性の肝臓疾患；炎症性内臓疾患、潰瘍性結腸炎、Ｃｒｏｈｎ病及び胃炎、内臓特に結腸のポリポーシス及び癌、を含む消化器系の病気；ある種の細菌、ウイルス及び寄生虫侵入による感染症及び外傷による敗血症；及び移植片拒絶を含めて、血管再建、循環回復術、人工的代用物移植及び臓器移植の後の手術後の傷害である。
【００４１】
作用部位が中枢又は末梢神経系である場合には、活性成分として、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターの遺伝子を調節する化合物を含む医薬組成物は、神経保護薬として作用する。その神経保護特性のために、本発明による組成物は、限定はしないが、脳出血、頭部外傷及び脊髄損傷を含む虚血又は外傷性の損傷による急性の神経学的障害の治療に有用であることは理解されるであろう。本発明の組成物はまた、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ痴呆、ハンチントン舞踏病、筋無力性側索硬化症、ケネディー症候群、運動ニューロン疾患及びプリオン関連神経変性のような徐々に選択的にニューロンが損失することを特徴とする、脱ミエリン疾患及びある種の慢性変性疾患に有効であり得る。
【００４２】
その鎮痛特性のために、本発明の組成物は、末梢性、内臓性、神経性、炎症性及び関連性の痛みを含む、痛みの治療に有用であろう。
【００４３】
本発明の組成物は、心臓血管系の予防、及び／又はアテローマ、動脈硬化、及びその関連疾患、再梗塞、血管再建、心筋虚血及び心筋梗塞の治療に有効であり得る。
【００４４】
本発明のその他の特徴は、ポリープ、腫瘍増殖、血管新生及び乳癌及び結腸癌を含むある種の癌の転移発癌過程の化学的防御性能を開示化合物が有する点である。
【００４５】
炎症誘導性メディエーター、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−αおよびＭＣＰ−１の少なくとも一つの遺伝子発現を下方調節する本発明の医薬組成物は、活性成分として、（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まない、一般式（Ｉ）の化合物、及びこれらの医薬として受容しうる塩、エステル又は溶媒和物を含む：
【化２】
2005526768.tif 000003
［式中、点線は任意のＣ１−Ｃ２又はＣ６−Ｃ１の二重結合を示し、式中：
Ｒ１は、
ａ）Ｒ’〔このＲ’は、
Ａ）１−８個の炭素原子を含み、任意に１−３個の異種原子によって中断されている、直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の炭素側鎖、及び
Ｂ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は、１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子によって中断され、さらに任意に１又はそれ以上の、
ｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキシ、
ｉｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキルチオ、
ｉｖ）ハロゲン、
ｖ）カルボキシル、
ｖｉ）−ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ４アルキル（式中のアルキルは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和であり得る）、
ｖｉｉ）ケト、
ｖｉｉｉ）ニトロ、
ｉｘ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状基は１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子で中断され、さらに任意に上記ｉ）−ｖｉｉｉ）に規定した中から選択される１又はそれ以上の基によって置換されている）
からなる群から選択される基によって置換されている）
からなる群から選択される〕
ｂ）上記Ｒ’において規定した置換基の少なくとも一つで置換されたアミン又はアミド、
ｃ）上記Ｒ’において規定した置換基の一つで任意に置換されているチオール、スルフィド、スホキシド、スルホン、チオエステル又はチオアミド、及び
ｄ）ヒドロキシル又はエーテル−ＯＲ’（式中のＲ’は、上記に定義したものである）
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
ａ）ハロゲン、
ｂ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、及び
ｃ）−ＯＲ〔式中のＲは、
Ａ）−Ｒ’’（このＲ’’は、水素、或いは、任意に末端に−Ｒ’’’または−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’基（式中のＲ’’’は、水素又は直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）を有する、直鎖、分枝若しくは環状、飽和若しくは不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）
Ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’（式中のＲ’’’は上記に定義したものである）
からなる群から選択される〕
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
ａ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１２アルキル、
ｂ）−ＯＲａ〔式中のＲａは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ２−Ｃ９アルキルであり、この末端炭素でフェニル基により置換されてもよい〕、及び
ｃ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ７アルキル−ＯＲ’’’〔式中のＲ’’’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択される］
【００４６】
抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６並びにサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの遺伝子発現を上方調節する本発明の医薬組成物は、活性成分として、（３Ｓ，４Ｓ）の立体配位を有し、本質的に（３Ｒ，４Ｒ）エナンチオマーを含まない、一般式（Ｉ）の化合物及びこれらの医薬として受容し得る塩、エステル又は溶媒和物を含む：
【化３】
2005526768.tif 000004
［式中点線は任意のＣ１−Ｃ２又はＣ６−Ｃ１の二重結合を示し、式中：
Ｒ１は、
ａ）Ｒ’〔このＲ’は、
Ａ）１−８個の炭素原子を含み、任意に１−３個の異種原子によって中断されている、直鎖又は分枝、飽和又は不飽和の炭素側鎖、及び
Ｂ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は、１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子によって中断され、さらに任意に１又はそれ以上の、
ｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、
ｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキシ、
ｉｉｉ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルコキルチオ、
ｉｖ）ハロゲン、
ｖ）カルボキシル、
ｖｉ）−ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ４アルキル（式中のアルキルは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和であり得る）、
ｖｉｉ）ケト、
ｖｉｉｉ）ニトロ、
ｉｘ）飽和又は不飽和の環状部分、芳香族部分又は複素環部分（環状部分は１個又は２個の環状構造を含む５−２０個の原子を有し、各環は３−８個の炭素を含み、任意に１−４個の異種原子で中断され、さらに任意に上記ｉ）−ｖｉｉｉ）に規定した中から選択される１又はそれ以上の基によって置換されている）
からなる群から選択される基によって置換されている）
からなる群から選択される〕、
ｂ）上記Ｒ’において規定した置換基の少なくとも一つで置換されたアミン又はアミド、
ｃ）上記Ｒ’において規定した置換基の一つで任意に置換されているチオール、スルフィド、スホキシド、スルホン、チオエステル又はチオアミド、及び
ｄ）ヒドロキシル又はエーテル−ＯＲ’〔式中のＲ’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択され；
Ｒ２は、
ａ）ハロゲン、
ｂ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキル、及び
ｃ）−ＯＲ〔式中のＲは、
Ａ）−Ｒ’’（このＲ’’は、水素、或いは、任意に末端に−Ｒ’’’または−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’’’基（式中のＲ’’’は、水素又は直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）を有する、直鎖、分枝若しくは環状、飽和若しくは不飽和のＣ１−Ｃ６アルキルである）及び
Ｂ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ’’’（式中のＲ’’’は上記に定義したものである）
からなる群から選択される〕
からなる群から選択され；
Ｒ３は、
ａ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ１２アルキル、
ｂ）−ＯＲａ〔式中のＲａは、直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ２−Ｃ９アルキルであり、この末端炭素でフェニル基により置換されてもよい〕、及び
ｃ）直鎖、分枝又は環状、飽和又は不飽和のＣ１−Ｃ７アルキル−ＯＲ’’’〔式中のＲ’’’は上記に定義したものである〕
からなる群から選択される］。
【００４７】
現在、より望ましい化合物は、式中Ｒ２がヒドロキシ又は低級アシルオキシであり、Ｒ３がジメチルヘプチルまたは合計少なくとも７個の炭素を有するジメチルアルキル基である化合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の現在望ましい態様によると、Ｒ１はイミダゾリル、イミダゾリニル、モルホリノ、ピペリジル、ピペラジニル、ピラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、トリアゾリル、テトラゾリルからなる群から選択される複素環部分であって、それら各環状部分が、任意にさらに、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシ、ニトロ、飽和若しくは不飽和の環状部分又は芳香族部分又は複素環部分からなる群から選択される少なくとも一つの基で置換されており、それらの各環は、３−８の炭素を含み、任意に１−４の異種原子で中断され、当該異種原子は、それぞれ独立にＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択され、それらの各環はさらにＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシまたはニトロからなる群から選択される１またはそれ以上の基により置換され、そのＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオは飽和及び不飽和の直鎖、分枝及び環状構造を含む、複素環部分である。
【００４９】
本発明のより望ましい態様によると、Ｒ１はヒドロキシル、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、テトラヒドロピリジン、ピラゾリン、オキサゾリン、ピロリジン、イミダゾリン、２−チオ−イミダゾール、２−メチルチオ−イミダゾリン、４−メチル−２−イミダゾリン、４，４−ジメチル−２−イミダゾリン、メチルスルフィド、メチルスルホキシド、アセトアミド、ベンズアミド、シアノ、１，２，４−トリアゾール、１，３，４−トリアゾール、１，２，３，４−テトラゾール、１，２，３，５−テトラゾール、チオフェン、フェニル、モルホリン、チオモルホリン、チアゾリジン、グリセロール、ピペラジン、４−ピペリジノピペリジン、４−メチルピペリジン及びテトラヒドロピランからなる群から選択されている。
【００５０】
本発明のさらにより望ましい態様によると、Ｒ１は、その置換基が、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、イミダゾリル、イミダゾリニル、モルホリノ、ピペリジル、ペペラジニル、ピラゾリル、ピロリル、ピロリジニル、トリアゾリル、及びテトラゾリルからなる群から選択される、モノ又はジ−置換アミンであって、各環状部分が、さらに任意にＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキ、ニトロ、飽和若しくは不飽和の環状部分又は芳香族部分又は複素環部分からなる群から選択される少なくとも一つの基で置換されており、各環が３−８の炭素を含み、任意に１−４の異種原子によって中断され、当該異種原子は、それぞれ独立にＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択され、その各環はさらにＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、ケト、カルボキシまたはニトロからなる群から選択される１またはそれ以上の基により置換され、そのＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオが、飽和及び不飽和の直鎖、分枝及び環状構造を含むことが意図されている、モノ又はジ−置換アミンからなる群から選択される。
【００５１】
その他の現在望ましい態様によると、活性成分として、一般式（Ｉ）〔式中Ｒ２はＯＨ、Ｒ３は１，１−ジメチルペプチルであり、Ｃ６とＣ１の間に二重結合があり、そしてＲ１がヒドロキシル、２−メルカプトイミダゾール、イミダゾール、ピラゾール、４−メチル−ピペリジン、及び４−ピペリジノ−ピペリジンからなる群から選択されている〕の化合物を含む、炎症誘導性メディエーターＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１の少なくとも一つの遺伝子発現を下方調節し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６並びにサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３の少なくとも一つの遺伝子発現を上方調節する医薬組成物が開示される。
【００５２】
特別な関心のある医薬組成物は、活性成分として、国際特許出願ＷＯ  ０１／９８２８９にデキサナビノールとしても知られているＨＵ−２１１、ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５、ＰＲＳ−２１１，２２０、ＰＲＳ−２１１，２５１及びＰＲＳ−２１１，２５７として既に開示されている式（Ｉ）に属する化合物を含んでいる。
【００５３】
新規組成物は、活性成分に加えて、生理的に受容することができ且つ安定な製剤を作るために必要な、一般的な医薬として受容しうる担体、希釈剤及び賦形剤を含む。本発明の化合物の一部は疎水性の特徴を有し、実際に水に不溶であり、ｌｏｇＰ値として表現される高いオクタノール／水分配係数で示されるように高い親油性を有するので、受容しうる投与形態に調製するための製剤手法が適用されるであろう。本発明の化合物を治療上有効にそして簡便に投与することが本発明の不可欠の部分である。
【００５４】
水溶性の化合物に関し、標準的な製剤が使用できるであろう。錠剤、カプセル、ソフトゲルなどのような経口投与用の固体組成物は、活性成分と医薬として受容しうる成分、例えば、医薬として受容しうる希釈剤として、トウモロコシ澱粉、乳糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、デキストラン、グリセロール、ポリグリコール酸グリセリド、コハク酸トコフェリールポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリエトキシル化キャスター油、非イオン性界面活性剤、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ジカルシウム及びゴムと混合して調製することができる。持続作用型又は持続放出型の投与形態を提供するために、錠剤又はピルをコーティングするか、あるいは当業者に既知の医薬として受容しうる物質、例えば、微結晶セルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）のようなセルロース誘導体と混合する。その他の固形組成物としては、直腸投与用に坐剤として調製されるものがある。液体形態は、経口投与用又は注射用に調製することができる。この注射用という用語は、限定はしないが、皮下、経皮、静脈内、髄膜内、傷害部位内、腫瘍の近傍又はその中に、及びその他の非経口投与経路を含む。液体組成物は、有機溶媒、非限定的に、懸濁剤としてのシクロデキストリン、食用油を用いた香り付乳剤、トリグリセリド及びリン脂質を含む水性又は油性懸濁液、並びにエリキシル及び類似の医薬用担体とともに若しくはこれらを含まない水溶液を含む。更に、本発明の組成物は、鼻内などに投与するためにエアロゾルとして製剤化することができる。本発明の局所用医薬組成物は、限定はしないが、プロピレングリコール、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリソルベート、界面活性剤、ヒドロゲル、ワセリン、又はその他の当業者に既知の賦形剤を含む医薬として受容しうる賦形剤を使用して、溶液、ローション、ゲル、クリーム、軟膏、乳剤又は貼付膜として製剤化することができる。
【００５５】
それらを医薬品として使用するに先立って、一般的には医薬組成物を単位投与量に製剤化するであろう。ヒトに対する活性用量は、１日に１−４回の投与方法で、一般的に体重ｋｇ当り０．０５ｍｇから約５０ｍｇの範囲である。望ましい投与量の範囲は０．１ｍｇから約２０ｍｇの範囲である。しかし、投与量は、治療する病気、その重症度、投与の方法及び頻度、患者の年齢、体重、性及び医学的状態、禁忌などによって担当医により決定されることは、当業者には明らかである。用量は、一般的に、化合物が全身的に投与されるより局所的に投与されるほうが少なく、急性治療よりは予防又は慢性治療のほうが少ないであろう。
【００５６】
本発明のその他の態様は、活性成分として既に規定した一般式（Ｉ）の化合物を含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することにより、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節して患者を予防し、緩和し又は治療する方法を提供する。
【００５７】
本発明のその他の態様は、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３から選択される炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターを調節することにより、病気を予防し、緩和し又は治療する医薬品を製造するために、実質的に明細書に示した一般式（Ｉ）の化合物を使用することに関する。
【００５８】
本発明の原理は以下の実施例においてより十分に理解されるであろうが、これらは非限定的なものであると解釈されるべきである。
【実施例】
【００５９】
＜生理学的実施例＞
特記しない限り試験化合物は次のように調製される：インビトロアッセイのためには、化合物は最初にＤＭＳＯに溶解し、次いでアッセイ用緩衝液、一般的には組織培養培地で段階的に希釈し、最終的な濃度を０．１％ＤＭＳＯにする。インビボアッセイのためは、試験化合物は最初にクレモホール：エタノール（それぞれ７０重量％及び３０重量％（ｗ／ｗ））に溶解し、さらに生理的緩衝液、一般的には生理食塩液、で適当な用量になるように１：２０に希釈する。または、化合物を最初にＰＥＧ：エタノール（１：１）に溶解し、次いでＩｎｔｒａｌｉｐｉｄで希釈することができる。このように、媒体は適当な緩衝液で希釈された最初の「溶媒」である。
【００６０】
この研究の間、われわれは炎症過程に直接的に、例えばサイトカイン及びケモカイン、又は間接的に、例えばサイトカインシグナリング経路又は転写の調節物質、に関与する遺伝子に対して注目した。これらの遺伝子は、サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ケモカインＭＣＰ−１及び酵素ＣＯＸ−２のような炎症誘導性メディエーター、或いは抗炎症性サイトカインＩＬ−１０、保護的サイトカインＩＬ−６又はサイトカインシグナリングサプレッサーＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３のような上流調節物質といった抗炎症性メディエーターのいずれかをコードしている。遺伝子発現はＲＮＡレベルの定量により評価したが、可能な場合は直接のタンパク定量によった。実験系又は試験する遺伝子がなにであれ、定量は以下の方法に従った。
【００６１】
〔Ａ−３環系デキストロカンナビノイドの遺伝子発現に対する影響〕
（実施例１）
ＲＮＡ調製及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ．
全ＲＮＡは、ＳＶ全ＲＮＡ単離システム（Promega）を使用して調製した。細胞又は組織は分解緩衝液中でホモジナイズした。分解物をＲＮＡ単離カラムに移し、ＤＮＡ分解酵素で処理し、洗いそしてキットの説明書にしたがって溶出した。ＲＮＡ濃度はＧｅｎｅＱｕａｎｔ  ＩＩ（Phamacia-Amersham）を使用して測定した。相補的ＤＮＡ（cDNA）を全ＲＮＡからＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ逆転写酵素（Life Technologies）を使用して合成した。キット説明書に従い、全ＲＮＡの２μｇに、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、８単位の逆転写酵素及びその他の反応成分を加えて最終容量を２０μｌとした。反応混合物を４２℃で４５分間インキュベートし、７０℃で１５分間不活化した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、１５μｌの合計反応液中に、１μｌのｃＤＮＡ、３００ｎＭの適当な上流及び下流プライマー（下記参照）並びに緩衝液、ヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼ及びｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ（Syber Green master mix, Applied Biosystems）を含有する７．５μｌの反応混合物を含む。遺伝子増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システム（Applied Biosystems）を使用して行った。増幅は１０分間９５℃の一段階、その後の４０サイクルの２段階ループ（２０秒９５℃、及び１分間６０℃）を含む。各アニーリング段階の間に、増幅産物の量を二重鎖ＤＮＡに結合する色素、ｓｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎの蛍光により測定した。ベースライン信号を超える蛍光の増加が最初に検出されるＰＣＲサイクルを示す閾値サイクル（ＣＴ）を各産物について測定した。ＣＴにおけるＰＣＲサイクルの１回の遅れは、出発鋳型分子の２倍の減少となり、その逆も言える。特定の遺伝子産物のＣＴの変化は、対照遺伝子シクロフィリンＡ又はＧＡＰＤＨのＣＴの変化に対して正規化される。結果は、不活化細胞系または「媒体処置」動物のような適当な対照に対する試験系における遺伝子発現の増加倍数として表示される。全ての場合に、結果は、参照用研究室保存遺伝子のいずれか一つに対しても正規化される。
【００６２】
【化４−１】
2005526768.tif 000005
【化４−２】
2005526768.tif 000006
【００６３】
（実施例２）
ＥＬＩＳＡを使用するタンパクの定量
液状検体、組織培養上清又は体液、の中の所与タンパクの量を定量するために使用する技術は、固相酵素免疫アッセイ（ELISA）法に基づいている。アッセイは、市販又は研究室で作成したもので行うことができ、ＥＬＩＳＡプレートウエルの底に結合した特異的抗体によって目的のタンパクを捕捉することに基づいている。結合しない物質を洗い去り、次いで捕捉したタンパクは一般的に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）又はアルカリホスファターゼ（ALP）で標識した第二抗体に暴露する。再び結合しない物質を洗い去り、次いで検体を適当な基質とインキュベートして、発色反応をする。反応を停止し、分光光度計の適当な波長において値を読み取る。検体は少なくとも２回試験し、組換え標的タンパクを連続希釈した適当な標準曲線に各プレートを当てはめる。検体中のタンパクの濃度は標準曲線から計算する。
【００６４】
（実施例３）
ＬＰＳ活性化マクロファージ中及びＬＰＳ注射マウス脳中におけるＣＯＸ−２遺伝子発現の定量
われわれは以前に、デキサナビノール及びその類似体がインビトロにおいてＬＰＳ活性化マウスマクロファージ（RAW 264.7）細胞における分泌ＰＧＥ２のレベルを減少させることを示した（WO 01/98289）。ＰＧＥ２の分泌阻害に対するＩＣ５０が測定され、デキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０について、それぞれ１０μＭ、１０μＭ、４μＭ及び８μＭであることが認められている。比較用の既知の抗炎症薬、セレコキシブ、ロフェコキシブ及びＮＳ−３９８におけるＰＧＥ２の分泌阻害に対するＩＣ５０は、同じ実験条件において、それぞれ５ｎＭ、１００ｎＭ及び１００ｎＭであった。そこでわれわれはＰＧＥ２の分泌レベルで観察されたこの現象は、ＣＯＸ−２酵素活性の直接的阻害によるものと考えた。この仮説を検討するために、我々は今回、インビトロにおいて、その基質に対する組換えＣＯＸ−２の酵素活性を、デキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０の存在下で試験した。アッセイは、真の酵素活性をインビトロで再現するものであり、１０μＭまでの試験化合物を、精製ＣＯＸ−２とともに５分間プレインキュベートし、次いで天然基質ＡＡを加え、反応を２分間進行させた。塩酸を使用して酵素の触媒作用を停止し、飽和塩化第一スズを加えてＰＧＨ２産物をＰＧＦ２αにして安定化した。ＰＧＦ２αの濃度を酵素免疫法（EIA）で測定した、標準曲線を作成し、結果をこの標準曲線から求めた。ＶＩＯＸＸ（登録商標）、インドメタシン及びＮＳ−３９８のような古典的ＣＯＸ−２阻害薬はこのアッセイにおいて強力にＣＯＸ−２酵素活性を阻害したが、デキサナビノール及びその類似体には阻害効果は認められなかった。このため、われわれはデキサナビノール及びその類似体がＣＯＸ−２遺伝子発現に対して予想しなかった影響を与えているか否かを試験することにし、この目的のためにＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００６５】
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ、マウス細胞系（ATCC # TIB 71）、を１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むように調節した４ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ダルベッコ修正イーグル培地（DMEM）中で増殖した。細胞を組織培養フラスコ中で増殖し、２４ウエル組織培養プレートに適当な濃度で接種した。１ミリリットル中０．５ｘ１０６ＲＡＷ細胞を、２μｇ／ｍｌのリポ多糖Ｅ．ｃｏｌｉ０５５：Ｂ５（DIFCO Laboratories）で刺激した。特記しない限り、マウスマクロファージは１時間前に対照又は１０μＭのデキサナビノール若しくはその類似体で前処理し、その後ＬＰＳで活性化した。活性化の２．５時間後に細胞からＲＮＡ検体を抽出し、ＣＯＸ−２遺伝子発現レベルを既述のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【００６６】
この実験の結果は、シクロスポリンＡ発現に対して正規化した後、非活性化マクロファージに対するＣＯＸ−２活性化倍数として示す。細胞を媒体のみで処理した場合に、ＣＯＸ−２発現の６倍増加が観察されている。活性化を１０μＭデキサナビノールの存在下で行った場合には、ＣＯＸ−２のＲＮＡレベルの６７％の減少を認める。この濃度において、３類似体（ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２００）は全て、少なくとも５０％の阻害を生じる。ＣＯＸ−２酵素活性がこれらの化合物により直接影響されないという事実と合せると、これらの結果は、最初に測定したＰＧＥ２濃度は以前考えられていたような酵素活性の阻害によるのではなく、ＣＯＸ−２遺伝子発現の減少の結果として減少したことを示している。しかし、この段階においては、ＣＯＸ−２遺伝子調節がわれわれの化合物により直接行われているのか、フィードバック機構によりＣＯＸ−２に二次的影響を持つほかの遺伝子を調節した間接的結果なのかは、分からない。
【００６７】
本発明の化合物の遺伝子転写調節効果が、生きた動物の生理的結果として認められるかを試験するために、われわれはＰＢＳ又は１００ｎｇ  ＬＰＳをマウス脳の脳室内（i.c.v.）にインビボ注射した。各処置群は、少なくとも５匹のＣ５７／ＢＬ雄マウス（６−８週齢、平均体重２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）で構成した。マウスは、３５ｍｇ／ｋｇのペンタール及び８ｍｇ／ｋｇのキシラジンの混合物で麻酔した。ＬＰＳを生理食塩液に２０ｎｇ／μｌの濃度で溶解し、５μｌをシリンジポンプと脳注入カニューレを使用して１μｌ／ｍｉｎの速度で注入した。それぞれの注射後、逆流を防ぐためにカニューレを１分以上その場に止めた。クレモホール：エタノール媒体の対照、デキサナビノール及びその類似体（２０ｍｇ／ｋｇ）を、処置群に、ＬＰＳのｉ．ｃ．ｖ．注射と同時にｉ．ｐ．（０．１ｍｌ／１０ｇ体重）注射した。ＬＰＳ注射の６時間後、動物に１００ｍｇ／ｋｇペントバルビトンをｉ．ｐ．注射して屠殺し、その脳を取り出し、次段階まで−８０℃で保存した。ＲＮＡをそれぞれの全脳から抽出し、ＣＯＸ−２遺伝子発現レベルを既述のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。この実験結果はＰＢＳ注射脳に対するＬＰＳ注射脳におけるＣＯＸ−２の活性化倍数として表す。媒体のみで処置したＬＰＳ注射脳は、ＣＯＸ−２  ＲＮＡレベルの５．３倍の増加を示し、２０ｍｇ／ｋｇデキサナビノールで処置したマウスは、ＣＯＸ−２活性化レベルで５３％の減少を示す。
【００６８】
これらの実験結果から、本発明の活性成分は、インビトロ及びインビボのいずれにおいてもＣＯＸ−２  ＲＮＡの減少に有効であることは明白である。したがって、この化合物は広範囲のＣＯＸ−２関連疾患に治療上有効であろう。
【００６９】
（実施例４）
ＬＰＳ活性化マクロファージにおける分泌及び遺伝子発現の定量
ＣＯＸ−２が、本発明の化合物によりその転写に影響を受ける唯一の遺伝子であるか否かを試験するために、他の遺伝子についても活性化マクロファージの前記モデルにおいてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ここでの試験は、２０μＭまでの用量のＰＲＳ−２１１，０９２を使用して行った。ＴＮＦ−α及びＭＣＰ−１のレベルは、休止マクロファージに比較して活性化マクロファージではそれぞれ１９倍及び５５倍上昇したが、ＰＲＳ−２１１，０９２は試験した用量ではこれらの遺伝子のいずれの発現レベルにも影響を与えなかった。ｉＮＯＳ及びＩＬ−１βのレベルは、活性化マクロファージにおいてそれぞれ２６６倍及び１８，９６０倍と著しく上昇した。ＰＲＳ−２１１，０９２は、用量依存的に遺伝子発現を阻害し、ＩＣ５０はｉＮＯＳに対して４μＭそしてＩＬ−１βに対して１７．５μＭであった。この実験において、ＣＯＸ−２遺伝子発現は活性化により７０倍増加し、この条件下においてＰＲＳ−２１１，０９５の用量依存効果は、２１．５μＭのＩＣ５０であった。
【００７０】
さらに、ＩＬ−１βの遺伝子発現の減少はＩＬ−１β分泌の減少と相関することが確認された。デキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２及びＰＲＳ−２１１，２２０のＩＬ−１β分泌の抑制に対するＩＣ５０は、それぞれ６μＭ、３μＭ及び４μＭである。ＰＲＳ−２１１，０９５は１０μＭの１濃度で試験し、ＩＬ−１β分泌を７０％阻害することが認められ、同様にＰＲＳ−２１１，０９２及びＰＲＳ−２１１，２２０は同じ濃度においていずれも７６％の阻害を生じることが認められた。
【００７１】
これらの実験結果から、本発明の活性成分はＣＯＸ−２  ＲＮＡレベルに対する影響のみならずＩＬ−１β及びｉＮＯＳのようなその他の炎症関連遺伝子のＲＮＡレベルを特異的に減少させる点でも有効であることは明らかである。予想通り、遺伝子発現に対する影響は、当該炎症メディエーターの分泌の減少と相関する。ＣＯＸ−２がその転写の影響を受ける唯一の遺伝子ではないという事実は、発明の化合物に、かつて一つのメディエーターを阻害するように設計された古典的抗炎症治療薬に対する顕著な利点を付与する。複数の炎症メディエーターの発現及び分泌を減少することができる化合物は、一つの標的に対する古典的抗炎症治療法に代って現在使用されている併用治療法を一分子でまかなう。
【００７２】
（実施例５）
ＬＰＳ注射マウス脳におけるＩＬ−１β発現及び活性化ミクログリアの定量
マウスの脳内のＬＰＳの局所ｉ．ｃ．ｖ．投与は、種々のサイトカイン及びケモカインが関係する広範囲の炎症反応及びカスケードを刺激する。実施例３及び４において得られた結果に従い、炎症反応に関係するその他の遺伝子に対する本発明の活性化合物の影響を評価することにした。特に、われわれは炎症誘導性ＩＬ−１βサイトカインの発現に対するデキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２の影響をともに２０ｍｇ／ｋｇで試験した。プロトコールは若干の変更をしたが基本的には前記と同じであった。マウス脳に注射したＬＰＳの量を２５０ｎｇに増加し、動物はＬＰＳ及び治療薬注射後２４時間に屠殺し、ｍＲＮＡ分析は前記のように実施した。さらに、一部の動物は、免疫組織化学的分析のために、ＬＰＳ及び治療薬注射後７２時間に屠殺した。この目的のために、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウムのｉ．ｐ．注射により動物を安楽死させた後に、脳を取り出し、少なくとも７２時間４％ホルムアルデヒド中で固定した。次いで脳をＰＢＳで洗い、クリオプロテクションのために３０％スクロースのＰＢＳ溶液中に移し、沈むまで置いた。脳がスクロース中に沈んだ後、それをクリオスタット急速凍結技術（−６０℃）を使用して凍結した。脳を完全な海馬のレベルで凍結切片（１８μｍ）を作成した。免疫組織化学染色を、活性化ミクログリア細胞を検出するために、ポリクロナールラット抗−マウスＦ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）及びヤギ抗−ラット−ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ、米国）を使用して行った。切片を、自動化免疫染色システム（Ｖａｎｔａｎａ、フランス）の３，３−ジアミノベンチジン４塩酸（DAB）クロマーゲン検出キットを使用して染色した。定量的分析は、海馬のレベルにおける免疫反応性細胞／ｍｍ２の数を計数することにより行った。
【００７３】
統計解析
結果は平均±ＳＤとして表した。データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）次いでポストホックＦｉｓｈｅｒ検定及びｔ−検定により解析した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とした。
【００７４】
ＬＰＳ注射の２４時間後に、シクロフィリンに対して正規化したＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルの上昇を認めた。ＬＰＳを注射した動物では、生理食塩液注射動物よりも１８倍高いＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルである。ＬＰＳ注射と同時に２０ｍｇ／ｋｇのＰＲＳ−２１１，０９２を投与すると、その媒体に比べ、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ活性化倍率は５６％減少した。
【００７５】
グリア細胞マーカーの免疫化学的分析により、ＬＰＳのｉ．ｃ．ｖ．注射は海馬に限局した大きなグリア細胞腫を生じることが示された。模造手術動物は活性化ミクログリアのない基線を示したが、ＬＰＳ  ｉ．ｃ．ｖ．注射動物は平均で４８８免疫活性細胞／ｍｍ２であった。それぞれ、媒体のみ投与の対照動物と比較して、２０ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，０９２の投与は活性化ミクログリアの数を６４％有意に減少し、２０ｍｇ／ｋｇのデキサナビノールは４０％の減少をもたらした。
【００７６】
まとめると、これらの結果は、本発明の活性化合物が、マクロファージなどの免疫系の活性化細胞のインビトロモデルのみならず、神経炎症のインビボモデルにおいて、炎症性メディエーターの調節を介して作用することを示す。この効果は、可溶性炎症メディエーターの遺伝子発現の調節によるばかりでなく、炎症過程に関与する活性化細胞の数の有意な減少によっても現れる。
【００７７】
（実施例６）
活性化Ｔ細胞における遺伝子発現及びタンパク分泌の定量
ＩＬ−２遺伝子の誘導は、休止細胞をエフェクター細胞にするために必要なＴ細胞活性化を証明する現象である。類似のＩＬ−２遺伝子調節様式がＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート）及びカルシウムイオノホアによるＴ細胞活性化により得られる。
【００７８】
ヒト急性リンパ腫Ｔ細胞系Ｊｕｒｋａｔ（ATCC # TIB 152）を、Ｔ細胞活性化に対するデキサナビノール及びその類似体の免疫抑制作用の可能性を試験するために使用した。このＪｕｒｋａｔ細胞を１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むように調製した２ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖した。細胞を組織培養フラスコ中で増殖し、２４ウエル組織培養プレートに適当な濃度で接種した。１ミリリットル中２ｘ１０６個の細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma）及び１μＭ  Ａ２３１８７カルシウムイオノホア（Sigma）を使用して刺激した。既知の免疫抑制薬、シクロスポリンＡ（Sandoz）を陽性対照として使用した。対照及び試験化合物は刺激の１時間前に所定の濃度で加えた。活性化の６時間後にＲＮＡ検体を細胞から抽出し、ＩＬ−２遺伝子発現レベルを既述のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【００７９】
図１Ａは、この実験の結果を、非活性化Ｔ細胞に対するＩＬ−２の活性化倍数として示している。これらの結果はシクロフィリンＡ発現に対して正規化した後にプロットする。デキサナビノール及びその類似体は用量に相関してＩＬ−２遺伝子発現を阻害し、試験した最大用量、１０μＭにおいて最大の阻害活性を示した。この濃度において、ＰＲＳ−２１１，００７としても知られるデキサナビノールはＩＬ−２活性化を４１％減少し、ＰＲＳ−２１１，０９２は６９％減少し、ＰＲＳ−２１１，０９５は７０％減少し、ＰＲＳ−２１１，２２０は８４％（示さず）減少した。シクロスポリンＡは１０ｎＭにおいてＩＬ−２の転写を完全に阻害し、１ｎＭにおいて５０％阻害した。
【００８０】
ＩＬ−２分泌
平行して、活性化２４時間後に各ウエルの上清を採取し、ＥＬＩＳＡにより分泌されたＩＬ−２の存在を分析した。アッセイの原理は既に記述したとおりである。第二抗体にＨＲＰを結合し、基質を添加した後、ペルオキシダーゼ触媒による変色を酸性にすることにより停止する。４５０ｎｍにおいて測定する吸光度は検体又は標準中に存在するＩＬ−２の濃度に比例する。標準曲線は組換えＩＬ−２標準物質の濃度を吸光度に対してプロットすることにより得る。次いで実験検体中のＩＬ−２濃度を標準曲線を使用して測定する。
【００８１】
結果は図１Ｂに示されており、分泌されたＩＬ−２の量（ng/ml）は治療群ごとにプロットされている。活性化細胞が媒体のみで処置された場合に、ＩＬ−２分泌の最大レベルは８．７３ｎｇ／ｍｌである。遺伝子発現の阻害に相関して、デキサナビノール及びその類似体ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０は用量依存的にＩＬ−２の分泌を阻害し、そのＩＣ５０はそれぞれ８μＭ、０．４μＭ、１μＭ及び２μＭであった。比較用の陽性対照シクロスポリンＡでは、同じ実験条件において、０．０６ｎＭのＩＣ５０で増殖培地中のＩＬ−２濃度を抑制した。
【００８２】
まとめると、これらの結果は、活性化Jurkat T細胞において示すように、デキサナビノール及びその類似体が、直接的に又は間接的に、RNAのレベル及び分泌のレベルのいずれにおいても、IL-2を下方調節することを示している。このことは、本発明の化合物は、T細胞による疾患に対して有益な治療効果を持つ可能性があることを意味する。
【００８３】
ＣＯＸ−２遺伝子発現
さらに、われわれはこの実験システムを使用して、ＣＯＸ−２遺伝子発現に対するデキサナビノール及びその類似体の影響を試験した。ＰＭＡ及びカルシウムイオノホアによるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化により上昇したＣＯＸ−２遺伝子発現を認めた。ＣＯＸ−２に対する試験化合物の影響を、ＩＬ−２について既に記述したように評価した。図２は非活性化Ｔ細胞に対するＣＯＸ−２活性化倍数としてこの実験結果を示している。結果はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した後にプロットしている。ＣＯＸ−２遺伝子発現はＰＲＳ−２１１，００７としても知られているデキサナビノール及びその類似体ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０によりそれぞれ８８％，８７％，８５％及び９２％阻害されることが認められた。陽性対照のシクロスポリンＡはこのアッセイにおいても非常に強力であった。ＣＯＸ−１  ＲＮＡレベルは実験を通して変化せず（データは示さず）、デキサナビノール及びその類似体の作用の特異性を支持した。
【００８４】
これらの実験結果から、本発明の活性成分は、マクロファージでなくＴ細胞からなる、インビトロシステムにおける他の細胞において、ＣＯＸ−２  ＲＮＡレベルを減少させるのに有効であることが確認された。さらに、ＩＬ−２について示されているようにＲＮＡの減少はタンパク分泌の減少と相関しているので、これらの結果は、本発明の化合物の効果は遺伝子発現のレベルにおける下方調節に限定されないことを立証している。したがって、この化合物は多様なＣＯＸ−２及びＩＬ−２関連疾患において治療上有用である可能性がある。
【００８５】
（実施例７）
活性化マスト細胞における遺伝子発現及びタンパク分泌の定量
マスト細胞は多様な機能を持つ骨髄由来細胞であり、活性化に際して多数の強力な炎症性メディエーターを放出する。放出は、予め造られた顆粒から脱顆粒の過程によるか、又は刺激に誘導されて新規に合成することにより行われる。マスト細胞により放出される分子は、ヒスタミンのような生体アミン、ケモカイン、サイトカイン、酵素、成長因子、ペプチド、アラキドン酸産物及びプロテオグリカンである。マスト細胞は痛み信号の発生にも重要な役割を果たしていることが知られている点にも注目すべきである。
【００８６】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ATCC # CRL-2256）を、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１  ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム及び１５％熱不活化ウシ胎児血清を含むように調製したＥａｒｌｅ’ｓ  ＢＳＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加ＥＭＥＭ培地中で増殖する。細胞を組織培養フラスコ中で増殖し、２４ウエル組織培養プレートに適当な濃度で接種する。１ミリリットル中２ｘ１０５個の細胞を接種する。終夜インキュベートした後、接種した細胞を３０分間試験化合物及び対照とプレインキュベートし、次いで１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Sigma）及び１μＭ  Ａ２３１８７カルシウムイオノホア（Sigma）で刺激する。脱顆粒過程は、分析及び監視する分子のレベルによって、種々の時間で３７℃で行う。ＲＮＡ調製のために３０分後に細胞を採取し、一方ヘキソアミニダーゼ及びＰＧＥ２分泌、並びにＩＬ−４及びＴＮＦ−α遺伝子発現及び分泌の分析のために、刺激の２時間半後に上清を採取する。ＣＯＸ−２遺伝子発現に関しては、ＲＮＡを刺激の１時間後に採取する。Ｓｒｃファミリー阻害薬ＰＰ２又はＰＫＣ阻害薬ＧＦ１０９２０３Ｘ（両者ともＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を陽性対照として使用する。対照及び試験化合物を刺激の前に所定の濃度で加える。調べる物質の濃度は市販のＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ又は酵素アッセイにより測定する。阻害は媒体処理細胞に対して計算する。平行して、活性化後予め定めた適当な時点において細胞からＲＮＡ検体を抽出し、前記のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現レベルを分析する。分析では、遺伝子発現を正規化するために構成的に発現するＣＯＸ−１を使用する。
【００８７】
（実施例８）
中大脳動脈結紮後の脳組織における遺伝子発現の定量
マウスにおける一過性ＭＣＡｏ
このモデルは発作時に認められる脳虚血に対応する。マウス（Ｃ５７／ＢＬ、雄、平均体重２５ｇｒ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）を３０％酸素及び７０％窒素のハロタンで麻酔した（麻酔容器中４％で導入し、フェイスマスク中１−２％で維持）。首の皮膚に中心切開を入れ、下の組織を剥離した。右総頚動脈（ＣＣＡ）及びその外頚動脈（ＥＣＡ）及び内頚動脈（ＩＣＡ）との吻合部を剥離によって露出した。次いでＥＣＡの分枝、後頭動脈及び上甲状腺動脈、を焼灼した。次いでＣＣＡに５−０シルク縫合材（Ａｓｓｕｔ，スイス）を巻いてＣＣＡを一過性に閉じた。ナイロン縫合材を２ｃｍの長さに切り、１％ポリ−Ｌ−リシン溶液に浸し、次いでオーブン（６０℃）中で６０分乾燥した。この糸片の先端を焔で丸めた。ＥＣＡを同じタイプの縫合材で永続的に結紮した。第３の閉鎖、今度は一過性、をＩＣＡに５−０シルク縫合材で行った。ＥＣＡに小さな穴を開け、翼状突起口蓋骨動脈に入らないようにして、ナイロン糸をＩＣＡに挿入する。若干の抵抗を感じるまで、糸を１１ｍｍ挿入する。次いで５−０シルク縫合糸を結んで糸を固定する。糸の１ｃｍを外に残して切断した。皮膚の創を５−０縫合材で閉じる。
【００８８】
手術の後、動物をケージの中で覚醒させた。手術開始１時間後に、ＭＣＡ結紮の成功を確証するために、臨床的に試験した。評価システムはＢｅｌａｙｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，（Storoke 27:1616-23,1996;Brain Res.833:181-90,1999）による研究に基づいている。二つの試験から構成されている：姿勢反射試験及び前肢移動試験。姿勢反射は動物の尾を持って吊り下げて評価した、一方前肢移動試験は動物を腹位に維持して行った。表１に試験及びスコアリングシステムをまとめる。
【表１】
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＊  スコアーは次の通り：０  欠陥を認めない、１  吊り下げ試験の間足を屈曲、２  側方伸展の消失。
＃  スコアーは次の通り：０  完全  直ちに移動、１  不完全又は遅い移動（＞２秒）、２  移動なし。
【００８９】
合計スコアー８から１２の動物のみを試験に組み込んだ。手術の開始９０分後に、選別した動物を同じ方法で再度麻酔し、次いで首の切開を再度開き、ナイロン糸をＩＣＡから引き出す。次いで皮膚の切開を５−０シルク縫合材で閉じる。対照及び試験化合物（ＰＲＳ−２１１，００７としても知られているデキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０）をこの手術の終了１分前に投与する。全ての投与は（ＰＲＳ−２１１，２２０  ０．５ｍｇ／ｋｇ以外は）ｉ．ｖ．５ｍｇ／ｋｇであった。媒体は５ｍｌ／ｋｇを投与する。各投与群は６から８匹の動物で構成する。薬物はＰＥＧ−エタノールに溶解し、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（Pharmacia Upjohn）で希釈する。１８時間後ペントバルビトンナトリウム１００ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射により動物を屠殺した。次いで脳を取り出し、脳の同側半分から全ＲＮＡを調製した。遺伝子発現レベルを既述のようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果は模造手術動物に対する活性化倍数として示す。遺伝子発現は自家保存遺伝子シクロフィリンに対して正規化した。
【００９０】
ＭＣＡｏ脳におけるＣＯＸ−２遺伝子発現
デキサナビノール及びその類似体は、発作後の脳傷害の軽減並びにラット及びマウスの中大脳動脈結紮（ＭＣＡｏ）モデルにおける傷害の改善に有効であることが既に示されていた。この実験の目的は、これらの機能改善が新規に同定された作用機構により生じることを確認することである。したがって、ＣＯＸ−２  ＲＮＡレベルをＭＣＡｏの１８時間後に評価した。試験した全ての遺伝子について得られた結果を図３に示す。媒体のみを投与した動物は模造手術動物に対してＣＯＸ−２遺伝子発現で５倍の活性化を示した。デキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２の投与は、媒体投与群に比較して、それぞれ３８％及び４８％、この傷害を明らかに減少させた（図３Ａ）。
【００９１】
ＭＣＡｏ脳におけるＭＣＰ−１遺伝子発現
ケモカインは、白血球の特殊な部分集団を誘引し、活性化する低分子量の、分泌タンパクである。単球誘引タンパク−１（MCP-1）は単球に対して高度に特異性があり、単球を傷害部位へ動員し、活性化し、炎症性物質を分泌させる。ＭＣＡｏの後にＭＣＰ−１  ＲＮＡレベルが増加することは既に報告されていた（Che et al.,Brain Research 902:171-7,2001）。免疫組織化学試験により、虚血ニューロン（虚血手術の１２時間後）及びアストロサイト（手術の２日後）はいずれもＭＣＰ−１を発現した。ＭＣＡｏの１８時間後のマウス脳におけるＭＣＰ−１  ＲＮＡレベルに対するデキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２投与の影響を、われわれは試験した。媒体投与動物は模造手術動物に対してＭＣＰ−１遺伝子発現の１６倍増加を示した。デキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２投与により、媒体投与及び非投与群に比較して、それぞれ４１％及び６３％減少した（図３Ａ）。
【００９２】
ＭＣＡｏ脳におけるＩＬ−２遺伝子発現
デキサナビノール及びその類似体が、活性化Ｔ細胞の遺伝子発現及び分泌の両レベルにおけるＩＬ−２の減少に有効であることは既に示された。したがって、われわれはインビボにおけるその影響を確証するために、ＭＣＡｏ１８時間後のマウス脳におけるＩＬ−２  ＲＮＡレベルを評価した。媒体のみを投与した動物は模造手術動物に対してＩＬ−２遺伝子発現の４倍の活性化を示した。デキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２は、媒体投与群に比較して、それぞれ１７７％及び１３０％、明らかに減少させた（図３Ａ）。
【００９３】
ＭＣＡｏ脳におけるＩＬ−１０遺伝子発現
ＩＬ−１０は、既述の炎症誘導性遺伝子と緊密に関係する強力な抗炎症性サイトカインである。さらに、ＭＣＡｏ後のラット脳においてＩＬ−１０遺伝子発現のレベルが上昇すること（Zhai et al,J.Neurol.Sci.15211,9-24,1997）及びＩＬ−１０投与は局所発作後のラット脳傷害を軽減すること（Sperat et al,Neurosci.Lett.251:189-92,1998）は既に報告されている。われわれは、この現象をＭＣＡｏマウスモデルにおいて再現できること及びわれわれの化合物がこの抗炎症性サイトカインの発現に対してさらに強い影響を与えることを調べることにした。われわれはＭＣＡｏの１８時間後のマウス脳におけるＩＬ−１０  ＲＮＡレベルに対するデキサナビノール及びその類似体の効果を試験した。媒体投与動物は模造手術動物に対してＩＬ−１０遺伝子発現の３５倍増加を示した。デキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，０９２の投与により、媒体投与及び非治療群に比較して、それぞれ４．４倍及び２．３倍さらに増加した（図３Ｂ）。
【００９４】
さらに、例えばサイトカイン、接着分子、又は転写因子をコードする多数の遺伝子が脳虚血において異常な発現レベルを示すことが報告されている。この試験において調べた合計２４種の遺伝子のうち前記４遺伝子のみが本発明の化合物により影響を受けた。驚くべきことに、このモデルにおいてＩＬ−１β、ＩＬ−６及びｉＮＯＳの遺伝子発現は、少なくとも分析した時点においてデキサナビノール又はＰＲＳ−２１１，０９２により変化しなかった。
【００９５】
これらの実験結果から、われわれは、本発明の活性成分は３種の重要な炎症誘導性メディエーター、ＣＯＸ−２，ＩＬ−２及びＭＣＰ−１のインビボＲＮＡレベルの減少に有効であり、一方抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のＲＮＡレベルを増加することを、確認した。したがって、この化合物は免疫／炎症が関係する広範囲の疾患に治療上有効である可能性がある。さらに、本発明の化合物は、それらが調節する炎症関連遺伝子、並びにそれらが作用する細胞標的又は組織に関し、特異的であることに注目すべきである。
【００９６】
（実施例９）
ＣｏｎＡ注射後のマウスの肝臓及び脾臓における遺伝子発現の定量
Ｔ細胞仲介傷害のＣｏｎＡモデル
ヒトにおけるＴ細胞仲介致命的肝傷害の最も一般的な原因はＢ型若しくはＣ型肝炎ウイルス感染及び自己免疫肝炎である。Ｔ細胞刺激性植物レクチン、コンカナバリンＡ（ConA）の静脈内注射により誘発されるマウスの急性肝不全を含めて、種々の自己免疫肝傷害モデルが開発されてきた。ＣｏｎＡは、肝臓静脈洞に高い親和性を有している。マウスにＣｏｎＡを投与するとＴ細胞を活性化し、肝臓に集まり、肝傷害を調節するサイトカイン（IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ、IL-2）を放出する。シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６のような免疫抑制薬の投与により、ＣｏｎＡ注射による肝傷害は完全に阻止されるので、このモデルにおいてＴ細胞活性化が主役であることを示している。ＰＭＡ及びカルシウムイオノホアにより活性化されたヒトＴ−リンパ球（Ｊｕｒｋａｔ細胞系）がデキサナビノール及びその類似体（ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０）により阻害されることを、われわれは示した。したがって、Ｔ細胞誘発サイトカイン発現レベルの調節及びＣｏｎＡモデルによる肝臓の炎症性傷害の減弱に対するこれらの化合物の能力をインビボにおいて試験することにした。
【００９７】
各実験群は少なくとも２０匹のＢＡＬＢ／ｃ純系雌マウス（平均体重２５ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）を含んでいた。陰性対照群はＣｏｎＡの代わりに生理食塩液を注射したマウスであった。ＣｏｎＡ（Sigma）の注射は生理食塩液中１５ｍｇ／ｋｇの用量で尾の基部のｉ．ｖ．に行った。特記しない限り、治療薬投与はＣｏｎＡの３０分前に５ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｖ．注射した。化合物をクレモホール：エタノールに溶解し、さらに注射の前に生理食塩液で希釈し、媒体のみを内部対照として含めた。分析はＣｏｎＡ注射後予定した時間に実施した。
【００９８】
治療薬投与の影響は三つのレベルで監視した。第一に、ＣｏｎＡ注射後予定した時点において、眼窩後方の穿刺により、血液検体（２００−４００μｌ）を採取した。短時間遠心分離（５０００ｒｐｍ２分間）した後、血清を回収し、−８０℃で保存しておき、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン濃度及び肝傷害の指標としての肝臓からのアミノ転移酵素放出を測定した。
【００９９】
平行して、目的の器官におけるサイトカイン濃度も測定した。この目的のために、ＣｏｎＡ注射後予定した時点において、頚椎脱臼によりマウスを屠殺した。脾臓と肝臓を取り出した。肝臓の一部を組織検査のために４％ホルムアルデヒドで固定し、他の部分はタンパク又はＲＮＡ抽出のために−８０℃で保存した。脾臓は重量を測り、脾臓の小部分を４％ホルムアルデヒドで固定し、他の大部分は次の方法により培養する。各脾臓を５ｍｌシリンジの太い端を使って細胞濾過器を通して４ｍｌのＲＰＭＩ培地中に搾り出す。大きな組織片は重力沈降により除去し、上清を採取した。細胞を３回５ｍｌの赤血球分解緩衝液（Boehringer）で洗い、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むように調製した２ｍＭ  Ｌ−グルタミン添加４ｍｌ  ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、６ウエル培養皿に接種した。細胞を２４時間インキュベートし、上清中のサイトカイン濃度を既述のようにＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１００】
ＣｏｎＡ傷害肝臓からのＡＬＴ放出
アラニンアミノ転移酵素（ALT）は主に肝臓に認められる酵素であり、種々のヒトの病態、特に肝炎及び肝硬変、において肝臓が傷害されているか、侵されているかを調べるために測定される。血流への放出のレベルは肝臓傷害の重症度と一次的に相関するので、診断にも、治療効果を監視するためにも使用することができる。ＣｏｎＡ注射後の血漿ＡＬＴ放出の時間経過は文献から８時間がピークであることが知られている。この時点において測定されたＡＬＴ濃度は約１７００単位／ｌであり、ＣｏｎＡ注射の３０分前に５ｍｇ／ｋｇのＰＲＳ−２１１，０９２を投与した場合には、ＡＬＴ濃度が５７％有意に減少した。われわれは、ＰＲＳ−２１１，０９２の有効性の時間枠を予備的に評価するために、このアッセイを使用し、化合物を傷害誘導後３０分又は６０分に投与した。この両時点において、ＰＲＳ−２１１，０９２はやはりＡＬＴ濃度をそれぞれ６１％及び５１％、有意に減少した。ＦＫ−５０６を陽性対照として、１ｍｇ／ｋｇの用量で使用し、前記の３時点で注射した場合、ＡＬＴ濃度をそれぞれ９２％、９３％及び８６％減少した。このように、試験化合物は、肝傷害の明確な指標であるＡＬＴの減少により評価して、肝傷害に対して重要にして有益な効果を有している。この治療効果は、傷害の少なくとも１時間後に投与した場合であっても維持されている。
【０１０１】
ＣｏｎＡモデルの肝臓及び脾臓におけるＩＬ−２遺伝子発現及び分泌
ＣｏｎＡ注射マウスの肝臓におけるＩＬ−２発現の誘導及びそのモデルにおける免疫抑制薬の効果は既に報告されている（Okamoto T.and Kobayashi T.,Jpn.J.Pharmacol.77:261-3,1998）。炎症誘導性のＩＬ−２の発現レベルは４時点：ＣｏｎＡ注射後１５分、１、４及び８時間で肝臓において評価された。化合物の効果は媒体と比較され、媒体投与動物は生理食塩液投与動物に類似した結果を生じるという事実によって評価されるように、媒体は遺伝子発現に対して影響しなかった（データは示さず）。ＩＬ−２遺伝子発現の増加は１時間以降にのみ検出された（図４Ａ）。この時点において、媒体投与動物は生理食塩液注射動物に対してＩＬ−２  ＲＮＡの４２８倍増加を示した。ＰＲＳ−２１１，０９２の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与はこの結果を３７％減少した。分析をＣｏｎＡ注射後４及び８時間後に行う場合には、ＩＬ−２発現の増加はそれぞれ８１７及び５４９倍であり、試験化合物はこの効果をそれぞれ５６％及び５３％減少する。ＰＲＳ−２１１，０９２の効果は１時間以降の時点全てにおいて統計的に有意である。
【０１０２】
同様に、ＩＬ−２遺伝子発現のレベルをＣｏｎＡ注射マウスの脾臓において、傷害後１及び４時間後に評価した。この臓器においては、媒体投与動物は生理食塩液注射動物に対して各時点においてＩＬ−２  ＲＮＡのレベルのそれぞれ３０９倍及び９９７倍増加を示した。ＰＲＳ−２１１，０９２の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与は、傷害の１時間後に試験した場合にこの結果を４６％減少し、そして傷害の４時間後に試験した場合には３２％減少した。
【０１０３】
平行して、脾臓を取り出し、脾臓細胞を２４時間培養して分泌レベルの評価を行った。生理食塩液注射動物は検出限界以下のＩＬ−２バックグラウンド濃度を生じ、媒体のみを投与したＣｏｎＡ注射動物は１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２を生じたが、ＰＲＳ−２１１，０９２を投与したＣｏｎＡ注射動物は０．６ｎｇ／ｍｌを生じ、脾臓細胞からの分泌を４０％減少させた。さらに、血漿中のＩＬ−２の濃度を評価したところ、ＰＲＳ−２１１，０９２は、媒体投与の濃度０．８８ｎｇ／ｍｌから０．５２ｎｇ／ｍｌへ減少、つまり４１％減少、に成功した。このインビボモデルにおいて、ＩＬ−２  ＲＮＡレベルの減少が支持され、タンパク分泌の減少と相関することが示される。このことは既に活性化Ｔ細胞のインビトロモデルで示した。
【０１０４】
ＣｏｎＡモデルの肝臓におけるＭＣＰ−１遺伝子発現
既述のＣｏｎＡ注射後４時点において動物を屠殺し炎症誘導性ＭＣＰ−１発現のレベルを肝臓において評価した。ＭＣＰ−１遺伝子発現の増加は１時間後から検出された（生理食塩液注射動物に対して４０倍増加）が、この時点では５ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，０９２の投与による影響はなかった（図４Ｂ）。ＣｏｎＡ注射の４及び８時間後、ＭＣＰ−１発現の増加はそれぞれ１１１及び２８７倍であり、試験化合物はこれをそれぞれ２９％及び５５％減少する。ＰＲＳ−２１１，０９２の効果は両時点において統計的に有意である。
【０１０５】
ＣｏｎＡモデルの肝臓におけるＴＮＦ−α遺伝子発現
主に活性化マクロファージにより生産されるサイトカインであるＴＮＦ−αは、肝臓再生のような有用な面と、ヒト肝細胞における直接的細胞障害特性のような有害な面の両面の影響を有する。ＴＮＦ−αは、免疫仲介肝炎において極めて重要な因子であることが示されており、アルコール性肝傷害、劇症肝不全及びウイルス性肝炎の患者における肝毒性のメディエーターでもある。これらの疾患の殆どにおいて、ＴＮＦ−αの濃度は患者生存率と逆相関している。
【０１０６】
動物を既述の４時点において屠殺し、肝臓における炎症誘導性であるＴＮＦ−αの発現レベルを評価した。ＴＮＦ−α遺伝子発現の増加は直ちに、ＣｏｎＡ注射後１５分に検出され（生理食塩液注射動物に対して２１倍増加）、既にこの時点において５ｍｇ／ｋｇＰＲＳ−２１１，０９２の投与は３２％の阻害効果を示す。ＣｏｎＡ注射の１、４及び８時間後、ＴＮＦ−α発現の増加はそれぞれ、１６２、８１及び３８倍である。試験化合物はこの効果を２７％及び１７％減少しその後同じレベルのＴＮＦ−α発現を維持する（図４Ｃ）。
【０１０７】
さらに、インビボにおいて観察されたＴＮＦ−α遺伝子発現の減少は実際にＴＮＦ−α分泌の減少と相関していることを、インビトロにおいて確認された。この目的のために、ＬＰＳ活性化マクロファージの既述実験システムを使用した。デキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２、ＰＲＳ−２１１，０９５及びＰＲＳ−２１１，２２０のＴＮＦ−α分泌阻害に対するＩＣ５０は全て１０から２０μＭの間にある。
【０１０８】
ＣｏｎＡモデルの肝臓におけるＩＬ−１β遺伝子発現
動物を既述の４時点において屠殺し、肝臓における炎症誘導性ＩＬ−１β発現のレベルを評価した。ＩＬ−１β遺伝子発現の増加は直ちに、ＣｏｎＡ注射後１５分に検出され（生理食塩液注射動物に対して１４倍増加）、この時点において５ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，０９２の投与は６４％の増強効果を示す（図４Ｄ）。ＣｏｎＡ注射の１、４及び８時間後、ＩＬ−１β発現の増加はそれぞれ、３５、２０及び１５倍である。試験化合物は、この効果をそれぞれ５２％、４６％及び２７％減少した。ＰＲＳ−２１１，０９２の効果は全ての時点において統計的に有意である。サイトカインの調節効果はある場合には時間に依存した現象である。所与の条件下に、ある時点においてサイトカインの存在は有利であるが、他方異なる時間枠においては有害となる。試験化合物の総体的肝臓保護作用を支持する試験末期におけるＡＬＴの減少に示されるように、ＩＬ−１βが最初に上方調節されるという事実は、例えばＳＯＣＳ−１を誘導し、その後その阻害により持続されるといった初期のポジティブ効果を有する。
【０１０９】
ＣｏｎＡモデルの肝臓及び脾臓におけるＩＬ−６遺伝子発現
ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルにおいてＩＬ−６の両方向性の役割が示された。一部の試験ではＩＬ−６生産は肝炎の発生に関与するとの主張を支持し、他方別の試験では主に肝臓保護作用を示した。これらの矛盾する知見は、中和抗体を使用して経時試験を実施した際に解決された。この試験の結果は、病気の初期相にＩＬ−６が存在することは強力な肝臓保護効果を誘起するためには重要であるが、このサイトカインの継続した高濃度は肝臓に対して有害であることを示している（Tagawa Y-I et al.,J.Leukoc.Biol.67:90-6,2000）。
【０１１０】
動物を既述の４時点において屠殺し、肝臓における保護的ＩＬ−６サイトカイン発現のレベルを評価した。ＩＬ−６遺伝子発現の増加は直ちに、ＣｏｎＡ注射後１５分に検出され（生理食塩液注射動物に対して４倍増加）、この時点において５ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，０９２の投与は４７０％の増強効果を示す（図４Ｅ）。ＣｏｎＡ注射の１、４及び８時間後、ＩＬ−６発現の増加はそれぞれ、９０、３８及び１０倍である。試験化合物は継続してＩＬ−６遺伝子発現増強効果を示したが、傷害１時間後には３８％に減少した。４時間後にはＰＲＳ−２１１，０９２はＣｏｎＡ誘発ＩＬ−６過剰発現を３１％減少し、肝傷害誘発８時間後に行った分析では有効性は消失した。ＰＲＳ−２１１，０９２の効果は全ての時点において統計的に有意であった。ＩＬ−１βの場合に認められたように、ＰＲＳ−２１１，０９２はＩＬ−６発現に対して両方向性の効果を示す。ＩＬ−６が保護的メディエーターとして作用するときは最初に上方調節され、その後肝障害性的な役割が大きくなると抑制されるという事実は、試験化合物の総合的肝臓保護作用を支持している。
【０１１１】
ＣｏｎＡ注射マウスの脾臓を使用して実施した予備的試験は、肝臓において観察した状況に類似して、ＩＬ−６遺伝子発現はＰＲＳ−２１１，０９２の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与により最初傷害後１時間は上方調節することを示す。ここでも、このサイトカインが主に保護的メディエーターとして作用するときのＩＬ−６上方調節は、試験化合物の総合的抗炎症及び肝臓保護作用と一致する。
【０１１２】
ＣｏｎＡモデルの肝臓及び脾臓におけるＩＬ−１０遺伝子発現、及び分泌
ＣｏｎＡモデルのマウス肝臓傷害における抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の役割については既に報告されており、抗−ＩＬ−１０抗体の投与は肝臓傷害を悪化することが示されている（Kato et al,Hepatology Research20:232-43,2001）。動物にＰＲＳ−２１１，０９２の５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．投与し、ＣｏｎＡで肝傷害を誘発した後１５分、１、４又は８時間後に安楽死させた。媒体投与動物は全ての試験時点において、ＩＬ−１０肝臓又は脾臓のＲＮＡレベルを生理食塩液投与動物に対して平均９倍の増加を示した。化合物投与動物は傷害１５分後に脾臓のＩＬ−１０遺伝子発現をさらに１．５倍増加し、傷害１時間後には３．２倍増加した。肝臓においては８時間後にのみ約１．４倍の同様な増加が認められ、ＩＬ−１０は最初に脾臓において上方調節され、次いで肝臓において上方調節されることを示している。平行して臓器全体のＲＮＡを定量するために、傷害１時間後に脾臓を取り出し、脾臓細胞を２４時間培養し、分泌レベルの評価をした。生理食塩液注射動物は検出限界以下のバックグラウンドレベルのＩＬ−１０であり、媒体投与のＣｏｎＡ注射動物は３３１ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０を生じたが、ＰＲＳ−２１１，０９２投与のＣｏｎＡ注射動物は５４９ｐｇ／ｍｌ、１．７倍の脾臓細胞分泌を生じ、これは脾臓におけるＲＮＡ発現の増加と相関した。最後に、ＣｏｎＡ注射１時間後の血漿中ＩＬ−１０のレベルを測定し、ＰＲＳ−２１１，０９２の５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与により、この抗炎症性サイトカインのレベルが、媒体投与動物の４９３ｐｇ／ｍｌからＰＲＳ−２１１，０９２投与動物の７２６ｐｇ／ｍｌへと有意に（ｐ＝０．０３）増加した。この１．５倍の増加は、この早い時点における脾臓に認められた遺伝子発現の増加とも相関している。このインビボモデルにおいて、ＩＬ−１０  ＲＮＡレベルの増加が支持され、タンパク分泌の増加と相関することが示される。
【０１１３】
これらの実験結果から、第二のインビボモデルにおいて、本発明の活性成分は炎症誘導性メディエーターのＲＮＡレベルを減少させるのに有効であり、他方抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のＲＮＡレベルを増加させることが確認された。したがって、本発明の化合物は免疫／炎症が関係する広範囲の疾患に治療上有効である可能性があることを一層支持している。
【０１１４】
ＣｏｎＡモデルにおけるサイトカインシグナル伝達に関与する遺伝子の発現
この試験の目的は、本発明の活性化合物が抗炎症性及び炎症誘導性のメディエーターの有効な調節物質であるという知見以外の共通機構があるか否かを調べることである。近年、サイトカインシグナル伝達の解明において進歩が見られる。この研究により、このシグナリング経路の陽性調節物質としてＪａｎｕｓキナーゼ（JAK）及びシグナル伝達物質及び転写活性化物質（STAT）を；陰性調節物質としてサイトカインシグナリングサプレッサー（SOCS）、活性化ＳＴＡＴの阻害タンパク（PIAS）及びＳＨ−２含有ホスファターゼを認識するようになった。この試験において、われわれは既述のように、ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３のレベルに対するＣｏｎＡ誘発肝臓傷害の影響を調べた。ＳＯＣＳ−１及びＳＯＣＳ−３はいずれも肝臓において重要な役割を有している。ＳＯＣＳ−１欠失マウスは三つの大きな異常を示す：リンパ球減少症、肝臓、心臓、肺及び皮膚を含む臓器のマクロファージ浸潤、及び重症の肝臓脂肪変性。他方、ＳＯＣＳ−３はＧＨによって肝臓に誘導される主なＳＯＣＳ遺伝子である。したがって、われわれは、ＰＲＳ−２１１，０９２が遺伝子発現の陰性調節物質の発現に対して影響するか否かを試験した。
【０１１５】
図４Ｆ及び４Ｇから見て取れるように、遺伝子発現に対する影響のパターンはＰＲＳ−２１１，０９２のサイトカイン自体に対する影響の鏡像である。ＰＲＳ−２１１，０９２は肝傷害後の時間にしたがってＭＣＰ−１発現を殆ど直線的傾斜で減少したが、対称的にＳＯＣＳ−１遺伝子発現の傾斜を増加した。同様にＰＲＳ−２１１，０９２投与によるＳＯＣＳ−３の増加パターンは、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の減少の鏡像である。サイトカインシグナル伝達の調節物質の調節に対する試験化合物の活性を示すこれらの結果は、本発明の活性化合物は炎症過程に関与する遺伝子の転写の調節を介して作用することを支持している。
【０１１６】
さらに、下流で調節されたサイトカイン及びケモカインを使用して得られた結果を総合すると、次のような観察をすることができる。図４に示されたグラフから、一般的に言ってＰＲＳ−２１１，０９２は、ＣｏｎＡモデルにおける肝傷害の過程において活性化される炎症関連遺伝子、又はその調節物質の発現を明らかに調整する効果を有することが解かる。ＰＲＳ−２１１，０９２は、陽性炎症性メディエーターの発現を下方調節し、陰性メディエーターの発現を上方調節する。試験したサイトカイン及びケモカインはしばしば互いに協調してそして交差調節して最終的生理的作用を生じる。上記遺伝子調節の最終的効果を、肝傷害の生物学的指標、例えばＡＬＴ、ＳＡＡ−３及びヘパトグロビンにより試験した際、総合的最終結果は実際の肝保護であると結論付けられる。
【０１１７】
ＣｏｎＡモデルにおける急性期応答に関与する遺伝子の発現
急性期応答は、急性炎症、感染及び外傷の際に見られる先天的身体防御であり、急性期タンパク（APP）と呼ばれるある血中タンパクの生産の変化と関係する。既述のように活性化マクロファージ及びその他の白血球はＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６のような炎症誘導性サイトカインを放出する。これらのサイトカインは翻って肝細胞を刺激して、Ｃ−反応性タンパク（CRP）、マンノース結合レクチン（MBL）、ヘパトグロビン及び血清アミロイドＡ（SAA）のような急性期タンパクを合成しそして分泌する。急性期タンパクレベルの測定は、先天的応答の重症度を監視し、かくして病気の予後を見るために使用される。この試験の目的は、遺伝子発現及び分泌のレベルにおいて、肝臓内の抗炎症性および炎症誘導性のメディエーターの調節が、実際に陽性ＡＰＰの適当な下方調節を生じるか否かを調べることである。この試験においてＳＡＡ−３及びヘパトグロビンのレベルに及ぼすＣｏｎＡ誘発肝傷害の影響を調べ、既述のようにＰＲＳ−２１１，０９２が急性期タンパクの発現に対して影響するか否かを試験した。
【０１１８】
ＣｏｎＡ注射の３０分前に５ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，０９２、１ｍｇ／ｋｇ  ＦＫ−５０６又は媒体を投与したところ、肝臓傷害の誘導後４及び８時間に試験したＡＰＰに対して次のような効果があった。ＰＲＳ−２１１，０９２は、肝臓におけるＳＡＡ−３の遺伝子発現のレベルを、それぞれの時点において、５５％及び４８％減少し、ヘパトグロビンを５６％及び６６％減少した。陽性対照のＦＫ−５０６は傷害４及び８時間の両時点の平均でＳＡＡ−３及びヘパトグロビンの遺伝子発現をそれぞれ９７％および７８％減少した。これらの結果は、本発明の活性化合物の炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターのサイトカインネットワークの遺伝子発現に対する調節効果が、ＡＰＰ、ＳＡＡ−３及びヘパトグロビンの有意な減少によって認められるような総合的治療上の利益をもたらすことを、更に強調している。
【０１１９】
（実施例１０）
ＨｅｐＧ２細胞系におけるアポトーシスの抑制を介する肝臓保護
この試験の目的は、本発明の活性化合物の肝臓保護効果が肝臓系統の細胞におけるアポトーシスの阻害により達成されるか否かを評価することである。カスパーゼ及びポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク分解切断はアポトーシスの既知マーカーであり、ＨｅｐＧ２細胞において免疫ブロット又は免疫組織化学により調査されている。アポトーシスはＴＮＦ−α、抗−ＣＤ９５又はエタノールのいずれかによりこの細胞に誘発される。
【０１２０】
ＨｅｐＧ２（ATCC # HB-8065）はヒト肝細胞癌腫細胞であり、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１．５ｇ／ｌ重炭酸ナトリウムを添加したイーグル最小必須培地中で増殖する。合計１ｘ１０６細胞／ウエルを６−ウエルプレートに接種し、抗−ＣＤ９５（０．５ｍｇ／ｍｌ）又はＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれか、及びシクロヘキシイミド（１０ｍｇ／ｍｌ）で処理した。エタノール誘発アポトーシスについては、誘発物質の範囲を１００から４００μＭとし、細胞をこの条件下に２４時間培養すべきである。試験化合物及び対照は、特記しない限り、アポトーシスの誘発前１時間に細胞に加えた。ＴＮＦ−α又は抗−ＣＤ９５誘発の場合は６時間後、エタノール誘発の場合は２４時間後、細胞を冷ＰＢＳで洗い、３ｍｇ／ｍｌロイペプチン、３ｍｇ／ｍｌアプロチニン、３ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ及び２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの中で分解する。遠心分離（１０分間、１３，０００ｒｐｍ、４℃）の後、細胞分解物をナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）に転写する。膜をＴｒｉｓ緩衝生理食塩液中５％粉末ミルクでブロックし、次いで１ｍｇ／ｍｌの抗−切断カスパーゼ−３、抗−切断カスパーゼ−７又はそのタンパクの全長型を認識する抗体のいずれかと共に１時間インキュベートする。次いで膜を４回Ｔｒｉｓ−緩衝生理食塩液／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗い、それぞれのペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に１時間インキュベートする。よく洗った後に、結合した抗体を化学ルミネセンス染色により増強して検出する。
【０１２１】
（実施例１１）
活性化Ｔ細胞におけるＩＬ−２関連転写因子の阻害
我々は、ＩＬ−２遺伝子発現及び分泌が本発明の活性化合物によりインビトロ、ＰＭＡ／カルシウムイオノホアによる活性化Ｔ細胞、と、インビボ、神経保護を測定するためのＭＣＡｏモデル及び肝保護を測定するＣｏｎＡ誘発肝傷害モデル、のいずれにおいても阻害されることを明確にした。ＩＬ−２は転写のレベルにおいて厳密に調節されている。この試験の目的は、試験化合物がＩＬ−２プロモーターの調節に関係する転写因子の一部に影響するか否かを調べることである。
【０１２２】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に、ＮＦ−ＡＴ（Clontech cat# S2088）またはＡＰ−１（Clontech cat# S2087）転写配列のいずれかにより調節されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドと、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを共に導入した各場合において、二つの異なる系を確立した。遺伝子導入は陽イオン脂質試薬法（Dimeri-C,Invitrogen Life Technologies）を使用して行った。安定クローンを単離するために、遺伝子導入ヒトＴ細胞を４週間ゲンタミシン選別にかけて、陽性クローンを同定した。ルシフェラーゼを調節する種々の転写配列を導入した安定クローンをＪｕｒｋａｔ細胞について既述したように、３００μｇ／ｍｌゲンタミシンを加えて増殖した。実験日に、各レポーターを含む細胞を１０６細胞／ｍｌ／ウエルで２４ウエルプレートに接種した。試験化合物をＤＭＳＯに再懸濁し、ＤＭＳＯの最終濃度が０．１％になるようにして予め定めた用量で、細胞活性化の１時間前に加えた。シクロスポリンＡを１００ｎＭの用量で陽性対照として使用した。次いで細胞を１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ及び２μＭカルシウムイオノホアで６時間刺激した。実験終了時に、細胞を回収し、ＰＢＳで洗い、５０μｌのルシフェラーゼ分解緩衝液（Promega）中で氷冷しながら１５分間分解した。細胞分解物を５分間４℃で高速遠心分離して細胞破片を除いた。ルシフェラーゼ活性は、１０μｌの透明細胞分解物と９０μｌルシフェリン基質（Promega）を入れた、黒色９６ウエルプレート中で測定した。発光を直ちに適当な計測器（X-flour,Tecan）で測定した。
【０１２３】
結果を図５に示す。図５において、細胞の活性化によりＮＦ−ＡＴ誘導ルシフェラーゼ発現の顕著な増加（６０発光単位（ＬＵ）から２４４９  ＬＵ）を生じることが認められる。試験化合物による細胞の処理は、ＮＦ−ＡＴ誘導ルシフェラーゼ発現の用量依存的な減少を生じた。ＰＲＳ−２１１，０９２は１．５μＭのＩＣ５０を有し、ＰＲＳ−２１１，２２０は３．９μＭのＩＣ５０を有した。この実験条件において、１００ｎＭのシクロスポリンＡは完全な阻害を生じた。同様に、ＡＰ−１レポーターを安定的に導入した細胞に対する１０μＭ  ＰＲＳ−２１１，０９２の活性を試験した。細胞活性化によりＡＰ−１誘導ルシフェラーゼ発現は１８２  ＬＵから１９３９１  ＬＵへ増加したが、ＰＲＳ−２１１，０９２もシクロスポリンＡもこの結果に影響しなかった。これらの結果は、本発明の活性化合物は炎症過程に関与する遺伝子の転写の調節することにより作用することを一層支持している。
【０１２４】
（実施例１２）
ＤＮＡアレイ
種々の検体中の相対的ＲＮＡ転写レベルを比較するＤＮＡアレイ技術は、遺伝子調節研究において、最も一般的には特異な遺伝子発現を測定するために広く使用されている。この試験の目的は、多数の遺伝子の調節に対するデキサナビノール及びその類似体の影響を予備的にスクリーニングすることである。この技術は数百（マクロアレイ）から数千（マイクロアレイ）の配列特異的ＤＮＡフラグメントをガラススライド又は膜のような固相マトリックスにスポットすることに基づいている。試験組織又は細胞から得たＲＮＡ検体をｃＤＮＡに逆転写し、標識してアレイとハイブリッド形成させる。一つのスポットとハイブリッド形成した標識転写物の数は放射活性、蛍光又は化学発光の信号に変換されて適当な装置により検出される。各スポット上の信号の定量化により、特異的な遺伝子の発現レベルが測定される。われわれは、サイトカイン又はケモカインアレイのような生物学的調節経路を示す遺伝子ファミリーからそれぞれ構成される、ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｉｎｃ．によって製造され市販されている、膜を使用する集中的マクロアレイを使用した。媒体又は試験化合物を投与したＭＣＡｏ後のマウス脳のｃＤＮＡ検体を、ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ説明書に従い、ビオチンで標識し、アレイ膜にハイブリッド形成させ、化学発光検出装置を使用して検出した。薬物投与と対照の間で異なる発現をした遺伝子は、既述のようにリアルタイム定量ＰＣＲを使用して確認試験をおこなった。
【０１２５】
［Ｂ−種々の病気の動物モデルに対する三環性デキストロカンナビノイドの影響］
（実施例１３）
カラゲナン誘発足蹠浮腫における化合物の効果
この試験の目的は、１％カラゲナンを動物の後足に注射することにより誘発される足蹠浮腫における化合物の抗炎症作用をインビボにおいて試験することである。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（平均体重２０ｇｒ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）を、キシラジン及びペントバルビトンを併用して、それぞれ滅菌生理食塩液で希釈して１５及び６ｍｇ／ｋｇとしたものをｉ．ｐ．投与することにより麻酔する。麻酔したマウスの片側（右）の足蹠の足底の皮下に滅菌水に溶解した１％ｗ／ｖカラゲナンの０．０５ｍｌを注射する。反対側（左）の足には、通常の生理食塩液の０．０５ｍｌを注射してもその後の厚さ及び容積の測定値に影響しないことが示されたわれわれの実験により確認した文献のデータにしたがって、注射しない。既知抗炎症対照薬を含む試験化合物はクレモホール：エタノールに溶解し、さらに注射前に滅菌生理食塩液で１：２０又は１：５０に希釈し、カラゲナン注射の直前にｉ．ｐ．注射する。注射３時間後に動物を前記方法に従って再び麻酔する。足蹠の厚さをダイアル厚さ計（Ｓｐｒｉｎｇ−ｄａｉｌ，常低圧計、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、ＴＧ／Ｌ−１、０．０１ｍｍ）を使用して測定し、足蹠容積はプレチスモメーター（モデル＃７１５０、Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、イタリア）を使用して測定する。足蹠浮腫は、同じ動物の投与右足と非投与左足の差、立方ミリメーターで表示したΔ足蹠容積（ΔＰＶ）又はミリメーターで表示したΔ足蹠の厚さ（ΔＰＴ）として表示する。各群は少なくとも１０動物で構成する。結果はさらに各投与群のΔＰＶ及びΔＰＴを０ｍｇ／ｋｇ（媒体のみ）に対して正規化することができる。試験終了時に、動物に１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンをｉ．ｐ．注射して安楽死させる。
【０１２６】
ΔＰＶ及びΔＰＴの種々の投与群の間の差は分散分析（ＡＮＯＶＡ）次いでポストホックＦｉｓｈｅｒ検定により解析した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とした。
【０１２７】
結果を図６に示すが、媒体に対して正規化した足蹠の厚さの％抑制を試験化合物の用量に対してプロットする。デキサナビノールは０．２から０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量において足蹠の厚さを約２９％減少させた。ＰＲＳ−２１１，０９２は非常に低い用量の０．２５ｍｇ／ｋｇにおいて足蹠の厚さを約２２％減少させる。ＰＲＳ−２１１，２２０はさらに低い用量０．１ｍｇ／ｋｇにおいて足蹠の厚さを３１％とさらに減少させる。これらの結果は媒体投与の動物に比較して統計的に有意である。これらの用量において、セレコキシブ及びデキサメタゾン（ＤＸＭ）のような既知抗炎症薬は、０．１ｍｇ／ｋｇにおいて足蹠の厚さをそれぞれ２４％及び２６％減少させ、０．２５ｍｇ／ｋｇにおいて２８％及び３１％、０．５ｍｇ／ｋｇにおいていずれも３３％減少させた。これらの市販薬物は補充的な保護的薬物を併用せずには長期使用できないような厳しい副作用を示すことを留意すべきである。このファミリーの化合物は副作用がないという利点があるので、本発明の化合物がこれらの薬物に比肩する抗炎症作用を示すことから、それらを既存の抗炎症薬に置き換える興味ある候補にすることを奨励する。これらの結果は、親／抗−炎症性メディエーターの調節を介して作用する本発明の活性化合物が、炎症性化合物による広範囲のヒトの病気にかかわる抗炎症効果を有することを支持している。
【０１２８】
（実施例１４）
癌の化学防御における化合物の効果
インビトロ
われわれの試験化合物の存在下における増殖能力についていくつかの腫瘍由来細胞系の細胞を試験した。膵臓腫瘍細胞系をＡＴＣＣから入手した。Ｐａｎｃ−１（ATCC # CRL-1469）を４ｍＭグルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸塩、抗生物質（ペニシリン、ニスタチン及びストレプトマイシン）及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で培養した。Ａｓｐｃ−１（ATCC # CRL-1682）を２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸塩、抗生物質（ペニシリン、ニスタチン及びストレプトマイシン）及び２０％熱不活化ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ中で培養した。細胞を２４ウエルプレート（１０５細胞／ｍｌ／ウエル）に接種し、終夜増殖した。細胞を試験化合物（１−１００μＭ）又は媒体（ＤＭＳＯの最終濃度０．１％）と共にインキュベートした。細胞の生存能力を２４時間後に標準的なクリスタルバイオレット染色を使用して測定した。培地をウエルから除去して、細胞にＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドを１ｍｌ／ウエル加えて固定した。固定後、細胞をＰＢＳで３回洗い、各ウエルに０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットの２５０μｌを加えて、３０分間室温にてゆっくりと動かしながらプレートをインキュベートした。染色した細胞を２回蒸留水で３回洗い、各ウエルに１０％酢酸の２５０μｌを加えて色素を抽出した。プレートを１５分間室温で振動し、測定のためにその１００μｌずつを９６ウエルの２ウエルに移した。細胞の光学密度（ＯＤ）はＥＬＩＳＡ測定器の６２０ｎｍで測定し、結果は％生存細胞として示す。非処理細胞の吸光度を１００％とする。Ａｓｐｃ−１細胞増殖は１５μＭまでのデキサナビノールの存在により影響を受けなかったが、他方Ｐａｎｃ−１細胞増殖は同じ濃度において２６％阻害されたことが実験結果から示される。ＩＣ５０（細胞増殖を５０％阻害する用量）が測定された。
【０１２９】
さらに、細胞がアポトーシス機構によって死亡したか否かを調べるために、細胞に活性化カスパーゼ−３の染色をする。ウエルから培地を除き、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドの１ｍｌを加えて１０分間細胞を固定する。細胞をＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗い、２０分間冷メタノールで透過性にする。細胞を２回ＰＢＳ−Ｔで洗い、１ｍｌ固定溶液（３％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ）と３０分間インキュベートする。第一抗体（ウサギ抗−切断カスパーゼ３（ａｓｐ１７５）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、固定液で１：５０に希釈）を加えて、細胞を６０分間３７℃でインキュベートする。細胞を２回ＰＢＳ−Ｔで洗う。第二抗体（ＨＲＰ結合抗−ウサギＩｇＧ、固定液で１：２００に希釈）をウエルに加えて、６０分間室温でインキュベートする。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗い、フルオレッセインチラミド試薬（ＮＥＮ、増幅希釈液で１：５０に希釈）と１０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−Ｔで２回洗い、信号を蛍光又は共焦点顕微鏡により可視化する。活性化カスパーゼ−３を測定するとともに、デキサナビノール及びその類似体を投与した細胞中のアポトーシス関連遺伝子の発現を非処理細胞と比較する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの方法は既述の通りである。各遺伝子について、特異的ＰＣＲプライマー対を設計し、反応をＡＢＩプロトコールにしたがって行う。各遺伝子の発現レベルの定量化を自家保存遺伝子に対して正規化し、非投与細胞のＲＮＡ検体と比較する。
【０１３０】
インビボ
デキサナビノール及びその類似体がインビトロにおいて腫瘍細胞増殖を阻害することをされわれは示したので、われわれの化合物がインビボにおいて有効であるか否かを試験することとした。この目的のために、腫瘍細胞ＬｏＶｏ（結腸直腸腫瘍由来；ＡＴＣＣ  ＃  ＣＣＬ−２２９）を４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で増殖した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを使用して回収し、剥離した細胞をＰＢＳで洗い、そして計数した。予め定めた量（１ｘ１０６細胞、０．１２ｍｌ／動物の一定容量中）を雄ＣＤ−１ヌードマウス（平均体重２０−２５ｇｒ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）の右大腿骨関節の上にｓ．ｃ．注射した。各投与群は少なくとも７動物で構成した。各動物を毎日臨床的に観察した。腫瘍の増殖も毎日監視し、週に１回実際に測定した。腫瘍が適当な大きさに達したときに、媒体、５ｍｌ／ｋｇ／ｄａｙ、又はわれわれの試験化合物、２．５から１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲で動物に投与する。
【０１３１】
４０匹の移植マウスのうち３６匹で腫瘍移植後５から６週間以内に見て分かる腫瘍が生じた。すべての動物に腫瘍移植後３６日目から４２日目に最初の投与を行い、８週間投与を継続した。各投与群において１匹の動物が投与５から７週目の間に死亡した。結果は、基準の開始日１と比較した各投与日における腫瘍の増殖パーセントとして示す。結果は図７に示すが、デキサナビノールの有効性は試験した範囲の用量に逆比例することを、われわれは見ることができる。２．５ｍｇ／ｋｇ（■）は５ｍｇ／ｋｇ（▲）よりも有効であるらしく、それは１０ｍｇ／ｋｇ（ｘ）よりもよいが、１０ｍｇ／ｋｇ（ｘ）は、あるとしても、媒体（◆）と比較して非常に弱い効果である。投与終了時に、２．５ｍｇ／ｋｇデキサナビノールは腫瘍の増殖を８９％減少させ、５ｍｇ／ｋｇで６１％そして１０ｍｇ／ｋｇで２１％の減少であった。これらの実験結果は、親／抗−炎症性メディエーターの調節を介して作用する本発明の活性化合物はある種の腫瘍に対して治療上有効である可能性を強く示している。
【０１３２】
（実施例１５）
神経変性疾患の治療：ＭＰＴＰモデル
パーキンソン病（PD）は、震顫、緩慢な行動、硬直及びバランスの悪化によって特徴付けられる神経変性疾患である。全てではないが、これらの傷害の殆どは緻密な黒質（SNpc）におけるドーパミン作動性ニューロン及び線条体におけるその投影神経線維の消失により生じる線条体のドーパミン含量の著しい減少による。１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（MPTP）はよく知られた神経毒であり、ヒトを含むいくつかの動物種において線条体内のドーパミン含量の消失及び黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンの数の減少を生じることがある（Turski L.et al,Nature 349:573,1991）。神経炎症現象がこのモデルで観察される。この試験の目的は、ＭＰＴＰ誘発ドーパミン作動性神経毒性の進展に対する、炎症誘導性及び抗炎症性のメディエーターの遺伝子調節に関与する化合物の影響を調べることである。この試験は二つの時間枠において行う。短時間モデルにおいて、神経学的結果が評価される、すなわち免疫反応性細胞の数に対する試験化合物の影響を測定することにより評価する。長期間モデルにおいては、種々の投与の後にロータロッドシステムにおいて評価する。
【０１３３】
動物処置及び方法：神経学的結果を見るための短時間モデル
マウス（Ｃ５７／ＢＬ雄マウス、平均体重３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）に、１日目にＭＰＴＰ（Sigma、USA）（２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇ）の生理食塩液（Ｔｅｖａ  Ｍｅｄｉｃａｌ、イスラエル）溶液を２時間間隔で４回ｉ．ｐ．に注射投与した。試験化合物及び媒体対照（クレモホール：エタノール、生理食塩液希釈）は５ｍｌ／ｋｇの投与容量で最初のＭＰＴＰ投与の直前に１回ｉ．ｐ．注射した。デキサナビノールは１０，２０及び３０ｍｇ／ｋｇで試験し、ＰＲＳ−２１１，２２０は０．５、１及び５ｍｇ／ｋｇで試験した。各投与群は少なくとも７匹の動物で構成した。ＭＰＴＰ投与の７日後に、１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビトンナトリウム（ＣＴＳ、イスラエル）のｉ．ｐ．投与により安楽死させ、そしてその脳を取り出し、免疫組織化学を使用してチロシン水酸化酵素（ＴＨ）を検出した。
【０１３４】
ＳＮｐｃのレベルにおけるＴＨ免疫反応性
脳を４％ホルムアルデヒド中に沈めて少なくとも７２時間固定した。次いで脳をＰＢＳで洗い、ＰＢＳ中３０％スクロースに移し、沈むまで置いた。脳がスクロース中に沈んだ後、クリオスタット特殊高速凍結技術を使用して凍結した（−６０℃）。脳を線条体のレベル及び黒質（ＳＮ）のレベルにおいて凍結薄切（２０μｍ）した。免疫組織化学染色はウサギ抗−チロシン水酸化酵素（１：２５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）を使用して行った。スライドを自動化免疫染色システム（Ｖａｎｔａｎａ、フランス）の３，３−ジアミノベンジジン４塩酸塩（ＤＡＢ）クロマーゲン検出キットを使用して染色した。定量分析はＳＮｐｃの最も広い領域においてＴＨ−免疫反応細胞数／ｍｍ２を計数して行った。
【０１３５】
統計解析
結果を平均±ＳＤとして表示する。データは分散分析（ＡＮＯＶＡ）次いでポストホックＦｉｓｈｅｒ検定を使用して解析する。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とする。
【０１３６】
結果は図８Ａに示したが、ＭＰＴＰ注射は生理食塩液注射動物に比較してＳＮｐｃレベルにおいてＴＨ−ＩＲ細胞の数を約６５％減少する結果であった。試験化合物を動物に投与した結果用量依存的にＴＨ−ＩＲ細胞の保存を生じる。パーセント保存は救命細胞数（薬物投与−ＭＰＴＰ）を最大救命可能細胞数（生理食塩液−ＭＰＴＰ）で割って計算する。最善の救命はデキサナビノールの２０ｍｇ／ｋｇで観察され、ＴＨ−ＩＲ細胞の約２５％を保存し、３０ｍｇ／ｋｇに用量を増加すると有意な効果はなく、そしてＰＲＳ−２１１，２２０の５ｍｇ／ｋｇはＴＨ−ＩＲ細胞の約５０％を保存した。媒体のみではＴＨ−ＩＲ保存に対して影響がなかった。試験化合物のこの２用量はさらに機能的結果の測定に使用した。
【０１３７】
動物処置及び方法：機能的結果のための長期間モデル
マウス（Ｃ５７／ＢＬ雄マウス、平均体重３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）にＭＰＴＰ（Ｓｉｇｍａ、米国）（４０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇ）を生理食塩液に溶解して２週間間隔で４回ｉ．ｐ．投与した。試験化合物及び対照は最初のＭＰＴＰ投与の直前に５ｍｌ／ｋｇの投与容量で１回ｉ．ｐ．投与した。デキサナビノールは２０ｍｇ／ｋｇで試験し、ＰＲＳ−２１１，２２０は５ｍｇ／ｋｇで試験した。各投与群は少なくとも１４匹の動物で構成した。
【０１３８】
ＭＰＴＰ注射７日後に、Ｒｏｚａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Rozas G.et al.,J.of Neuroscience Methods83:165-75,1998）により記述されているロータロッド装置を使用して機能試験を行った。総合的運動能力を測定するロータロッドシステムにおける動物の能力は、ＰＤにおいて一般的に侵される機能の遂行能力を反映する。動物は実験開始の前４日間訓練した。その仕事は、加速する棒上に落ちることなく１２分間留まることである（各速度３分間）。試験した速度は：１５、１９、２３及び２７ｒｐｍである。動物の棒上の成績は次のようにスコアをつけた：動物は各速度の棒上で完全に歩いた場合に最大３点（毎分１点）を得ることができる。したがって、１匹の動物は最大１２点のスコアを獲得することができる（各速度３点ずつ）。歩かずに回転する棒に掴まって動物ごと回転するときは３回転ごとに０．５点を減点した。最初の３回転はスコアに影響しない。試験開始５２日後に、動物に１００ｍｇ／ｋｇペントバルビトンナトリウム（ＣＴＳ、イスラエル）をｉ．ｐ．投与して安楽死させた。
【０１３９】
結果を図８Ｂに示したが、ＭＰＴＰ注射を追加するごとに動物のロータロッド試験遂行能力の一層の減少を生じることを、われわれは見ることができる。この傾向は最初のＭＰＴＰ注射後の最初の試験おいて既に観察することができるが、動物の能力に対するＭＰＴＰの影響が統計的に有意になるのは第３回以降である。事実最初の２回において、われわれはいずれの薬物投与群にも動物のロータロッドスコアに対する影響を認めなかった（データは示さず）。続く回において、媒体は効果がなかったが、デキサナビノール２０ｍｇ／ｋｇは４回目において陽性の傾向を示し、ＰＲＳ−２１１，２２０５ｍｇ／ｋｇはその後のいずれの回においても機能成績において媒体に比較して統計的に有意の改善を生じた。
【０１４０】
この試験において測定したパラメーターは死亡率であり、これはこのモデルにおいて比較的高かった。生理食塩液のみを投与し、ＭＰＴＰを投与していない動物は、予想されたように、死亡率０％であった（０／１４動物）。しかし、ＭＰＴＰ注射動物は試験期間中に６９％死亡率（１１／１６動物）を示し、モデルの厳しさを反映していた。２０ｍｇ／ｋｇデキサナビノール投与はこの数値を劇的に１１％死亡率（１／９動物）に減少させ、他方５ｍｇ／ｋｇ  ＰＲＳ−２１１，２２０の投与はさらに有効であり、０％死亡率（０／７動物）であった。
【０１４１】
この試験の結果を総合して、親／抗−炎症性メディエーターの調節を介して作用する本発明の活性化合物は神経変性疾患の神経炎症性成分に対して治療上有効である可能性を示している。これらの化合物の効果は、主に死亡率に対するのみでなく、ＴＨ−ＩＲ細胞救命についてもあるレベル以上であり、また生存者の機能能力についても著しい。
【０１４２】
（実施例１６）
末梢の有害な痛み：ホルマリン試験
末梢神経系により仲介される痛みを、皮下（末梢）の痛みの代わりに「ホルマリン試験」において試験する（Tjolson A.et al,Pain51:5-17,1992）。最初に試験化合物をｉ．ｐ．注射する。次いで、試験化合物投与の９０分後にホルマリンをマウス足蹠の足底面にｓ．ｃ．注射する。ホルマリン投与後直ちに（５分ごとに１時間）、動物がホルマリン注射足蹠を舐める回数により評価する。
【０１４３】
（実施例１７）
神経痛：機械的神経痛の減弱
この試験の目的は、神経痛の動物モデルにおけるわれわれの化合物の潜在的鎮痛効果を評価することである。末梢性単一病を坐骨神経の慢性結紮によりラットの右後肢に誘発した（Bennet G.J.and XieY-K.Pain33:87-107,1988）。機械的神経痛の発生を確立した行動試験を使用して監視した（Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント）。
【０１４４】
手術前の基準値は二回の手術前値の平均として確認した。基準値を確立した後に、動物に外科手術を施し、右坐骨神経を４本のクロム酸ネコ腸結紮糸で結紮した。手術後１１日目に機械的神経痛を発生した動物を、手術前の値に基づいて種々の投与群に任意に割りつけた。
【０１４５】
試験計画は無作為化し、薬物か媒体かいずれを投与したか隠した方式で実施する。動物、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、を試験前に行動試験装置に慣れさせる。試験日に、動物に２．５ｍｌ／ｋｇの用量で試験化合物の一つを１回投与する。１５及び１８０分後に後肢足蹠の底面に下から一連のＶｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメント（試験前に予め調整）を適用する。フィラメントは最も弱い力（０．３７ｇ又はフィラメントハンドルｎｏ．３．６１）から始めて強くする方向に適用し、引っ込め閾値を同側及び反対側後肢足蹠について評価する。足底中央にフィラメントをちょうど曲がり始めるまで押し付ける；これを約１  Ｈｚの頻度で約８−１０回繰り返す。引っ込め閾値は、反射的引っ込め反応（すなわち、単純な足蹠の動き）を生じる２回以上のＶｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントの最も弱い力をグラムで測ったものと定義する。
【０１４６】
（実施例１８）
内臓痛
三環性デキストロカンナビノールの内臓痛を減弱する能力を酢酸誘発モデルを使用して試験する。ＩＣＲ雄マウス（平均体重３０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）に予め媒体（クレモホール：エタノール７０：３０ｗ／ｗ、次いで生理食塩液で１：２０に希釈、５ｍｌ／ｋｇ）、又は試験化合物をｉ．ｖ．投与する。各投与グループは少なくとも５匹のラットから成っている。１５分後、マウスに０．６％酢酸水溶液の１０ｍｌ／ｋｇをｉ．ｐ．注射し、酢酸注射５分後から５分間のライシング回数を数える。ライシングは体の伸展及び後肢の伸展に伴う腹部筋肉の緊張と考えられる。結果は平均ライシング回数±ＳＥＭとして示す。データは分散分析（ANOVA）続いてＴｕｋｅｙのポッストホック検定を使用して解析した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とした。
【０１４７】
（実施例１９）
Ｉ型糖尿病：ＮＯＤマウスモデル
この試験の目的は、非肥満糖尿病（NOD）マウスを作成し、ヒトインスリン依存性糖尿病に類似する実験条件におけるデキサナビノール及びその類似体の保護作用を試験することである。
【０１４８】
ＮＯＤ／Ｉｔ雌マウス（試験開始時７０−８０日齢、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）の体重を１日目に測定する。初期値グルコースレベルを尾の先端を切って採取した１滴の血液を使用して適当なグルコスティック（Elite、Bayer）のグルコメーターで測定する。次いでマウスに生理食塩液で希釈したシクロホスファミド（Sigma）を３００ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．注射する。動物の尿中へのグルコースの出現を尿マルチスティック（Bayer）を使用して２日ごとに監視する。この検査により動物が糖尿を示したときに、終夜絶食後２日続けて血液中のグルコースのレベルを再評価する。その血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌを超えている場合に動物は糖尿病であると定義する。糖尿病と診断された３日後、動物に１００ｍｇ／ｋｇペントバルビトンをｉ．ｐ．注射して屠殺する。脾臓及び膵臓を取り出し、脾臓中のＴ細胞分類のＦＡＣＳ分析及び膵臓の組織病理学的及び免疫病理学的評価を含む試験を行う。
【０１４９】
組織病理学的評価は、各動物の１０個のランゲルハンス島について実施し、次の方法にしたがってスコアをつける（Sempe P.et al,Eur.J.Immunol.211,163-9,1991）。傷害の程度は単核細胞の浸潤のレベルにっしたがってスコアをつける：０−浸潤なし、１−細管周囲浸潤、２−島周囲浸潤、３−島内浸潤、４−β細胞破壊を伴う島内浸潤。各動物の膵臓の平均スコアは合計スコアを調べた島の数で割って計算する。
【０１５０】
（実施例２０）
腎虚血
この試験の目的は、ラットにおける急性腎虚血モデルにおけるデキサナビノール及びその類似体の腎保護作用を試験することである。
【０１５１】
雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（平均体重２５０ｇｒ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）をキシラジン及びペントバルビトンそれぞれ８及び３５ｍｇ／ｋｇの併用ｉ．ｐ．投与により麻酔する。そこで４５分の虚血が左右両腎に誘発される。麻酔動物を背位に固定する。腹部の毛を剃り、７０％エタノールで清拭する。正中切開を行い（２−３ｃｍ長）、そして白線に切開を入れて開腹する。小腸を静かに反対側に移して腎臓を露出する。この間に小腸は湿った（３７℃に暖めた生理食塩液）滅菌スポンジで覆う。腎動脈を周囲の脂肪から剥離して露出し、腎門において腎静脈と共に動脈ミクロクリップ（ＦＳＴカナダ）により閉塞する。動脈閉塞後直ちに青白くなった腎臓は虚血と考えられる。両側の腎臓が虚血を示した動物のみをこの試験に含めた。虚血手術の間に小腸を腹腔に戻す。傷を湿ったスポンジ（暖めた生理食塩液を流して湿りを維持する）。さらに、直腸温度を監視し、３７℃−３８℃を維持する。直腸温度はサーミスタ（ＹＳＩ米国モデル４００）及び測定装置（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒモデル８４０２−００）を使用して測定する。
【０１５２】
虚血開始４５分後、動脈クリップを取り去る。再潅流は腎臓の色がピンクに回復することにより確認する。次いで、傷を３−０シルク縫合糸（Ａｓｓｕｔ、スイス）で二層（腹壁及び皮膚）に閉じる。虚血手術後１、３及び７日に、エーテル麻酔箱中で軽く麻酔し、眼窩後部静脈洞に穿刺して血液検体を採取する。血液をエッペンドルフ管に入れ、遠心分離する（４０００ｒｐｍ５分間）。血清を分離し、クレアチニンの血中レベル及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）の測定まで−２０℃に保った。試験の終了時に、動物をペントバルビトンナトウム１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．により安楽死させた。腎臓を取り出し、重量を測り、さらに使用することができるように４％ホルムアルデヒド溶液中に保存する。
【０１５３】
薬物は、虚血手術の終了直後に、１群当り１０匹の動物の大腿静脈に５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．投与する。結果は虚血（媒体投与）及びシャム（同じ手法で、腎動脈閉塞をしない）と比較する。
【０１５４】
統計解析
ＢＵＮ及びクレアチニンの血中レベルはＡＮＯＶＡに続いてＤｕｎｃａｎのポストホック検定を使用して比較する。
【０１５５】
（実施例２１）
炎症性腸疾患：酢酸誘発モデル
この試験の目的は、ラットにおける酢酸誘発炎症性腸疾患の盲検試験における試験化合物の活性を評価することである。
【０１５６】
雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１０週齢、２００−２５０ｇｒ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）にケタミン：ロンプン併用（それぞれ１００：１０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射により軽く麻酔する。ポリエチレンカテーテル（外径１．７ｍｍ）を直腸を介して結腸に５ｃｍ挿入する。５％酢酸の２ｍｌをゆっくりと結腸に注入する。１５秒後３ｍｌの生理食塩液で洗い、１５秒後さらに３ｍｌの生理食塩液で洗う。その直後に、各群の動物に適当な薬物の一つを投与する。投与は全て１日１回７日間行う。動物を１週間臨床的に観察する。この期間中、次のパラメーターを毎日観察し、記録する：体重、排泄物中の血液の存在及び排泄物粘度。これらの所見を表１にしたがってスコア化する（Murthy S.N.et al,Dig.Dis.Sci.38:1722-34,1993）。
2005526768.tif 000008
＃  ＤＡＩ−（体重減少、排泄物粘度、及び出血）／３．
＊  正常排泄物−形の整ったペレット状；ゆるい排泄物−肛門に張り付かない程度のペースト状排泄物；及び下痢−肛門に張り付く液状の排泄物。
【０１５７】
疾患誘発後７日に動物をペントバルビタール１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．投与により屠殺する。結腸全体を取り出し、たてに切り開き拡大鏡で検査し、認められる傷害を記録し、表２にしたがってスコア化する（Wong et al,J. Pharm.Exp.Ther.274:475-80、1995）。
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【０１５８】
統計解析
臨床的成績を分散分析（ANOVA）次いでＤｕｎｃａｎポストホック検定を使用して解析する。肉眼病理所見を評価するためにノンパラメトリック検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を使用する。
【０１５９】
（実施例２２）
実験的自己免疫疾患：ＣＩＡ、ＥＡＥ及びＤＴＨ
自己免疫疾患は炎症性サイトカインのレベル上昇と関係する。最も一般的に研究されているげっ歯類モデルは実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、ヒトの多発性硬化症のモデル、実験的自己免疫性関節炎、ヒトのリウマチ性関節炎のモデル、及び遅発型過敏症（DTH）、ヒトのアレルギー反応のモデル、である。ＥＡＥは、塩基性起脳炎タンパクとしても知られている中枢神経系のミエリン塩基性タンパクに対する動物の感作により生じる。実験的自己免疫性関節炎は完全フロイントアジュバント中のコラーゲンで免疫することにより動物に誘発される：したがってこのモデルはコラーゲン誘発関節炎（CIA）と命名されている。遅発型過敏症は厳密な計画に従ったジニトロフルオロベンゼンの適用により誘発され、したがって作成されたモデルはヒトのアレルギー性接触皮膚炎に相当する。この試験の目的は、これらの３種の自己免疫疾患モデルの臨床症状を阻止するか又は減弱するわれわれの化合物の能力を試験することである。
【０１６０】
コラーゲン誘発関節炎
成熟ＤＢＡ／１雄マウス（平均体重２０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）、投与群当り少なくとも８匹をこの試験使用する。ウシ２型コラーゲンを４℃で終夜攪拌して２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０５Ｍ酢酸に溶解する。このコラーゲン溶液をさらに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の同量と乳化する。各動物に０．１ｍｌ  ＣＦＡ乳液中の１００μｇ  ２型コラーゲンを投与する。コラーゲンは尾の基部にｓ．ｃ．投与する。開始後２１日に、不完全フロイントアジュバント中の１００μｇコラーゲンの皮内ブースター注射をマウスにする。
【０１６１】
それぞれの後肢足蹠の容積をプレチスモメーター（Ｈｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｌ、イタリア）を使用して測定し、厚さをダイアル式、定圧ケージ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、日本）を使用して測定する。測定はコラーゲン投与の前及び指定した追跡期間の間２日ごとに実施した。全て薬物は腹腔内に投与する。投与期間終了時に動物にペントバルビタール１００ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．投与して屠殺する。
【０１６２】
統計解析
種々の投与群間の足蹠浮腫の重症度の差は分散分析ＡＮＯＶＡに次いでポッストホックｔ−検定を使用して比較する。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とする。
【０１６３】
実験的自己免疫性脳脊髄炎
自己免疫性脳脊髄炎の動物モデルは、誘発の方法、動物の系統及び疾患を誘発するために使用する抗原によって種々有ることが当業者には知られている。ＥＡＥにおける試験化合物の影響を、誘発後約１０日で臨床症状の発現により発症が観察されるＬｅｗｉｓラットを使用して試験する。病気は進行し、臨床スコアは増加し、疾患の誘発後１５日頃にピークとなり、自然の回復が１８日目頃に観察される。動物（試験化開始時に群当り少なくとも１０匹）は１２時間照明／１２時間消灯の下に、２２℃の恒温において、餌と水は自由に摂取させて飼育する。ＥＡＥはこれらの動物に精製モルモットミエリン塩基性タンパクを完全フロイントアジュバントに乳化して免疫することにより誘発する。モルモットミエリン塩基性タンパク（MBP）はクロロホルム／エタノールで脱脂した脊髄ホモジネートから調製し、タンパクをイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。各動物に精製タンパクの５０μｇを投与する。ＭＢＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の溶液を同量の４ｍｇ／ｍｌのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む完全フロイントアジュバントで乳化し、各動物に１００μｌ（各後肢足蹠に５０μｌ）を投与する。
【０１６４】
動物を、発症（〜疾患誘発後１０日）から開始して連続３日間、試験化合物又は媒体対照を容量５ｍｌ／ｋｇで静脈内に投与して治療する。メチルプレドニゾロンを陽性対照として使用し、ＭＢＰ注射による疾患誘発の日から開始して連続５日間毎日２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．投与する。結果は臨床スコアとして記録する；スコア０は臨床兆候のない正常動物を示す、１は尾の麻痺を示し、２は麻痺を示し、３は四肢麻痺示し、４は完全な身体麻痺を示しそして５は死を示す。
【０１６５】
統計解析
種々の投与群間の臨床成績の重症度の差は分散分析（ＡＮＯＶＡ）に次いでポストホックＦｉｓｈｅｒ検定により解析した。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意とする。
【０１６６】
マウスモデルの遅発型過敏症
成熟雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（平均体重２０ｇ、Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）の剃毛した腹部皮膚上にアセトンに溶解した０．１５％ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）の３０μｌを０日目及び１日目に適用して感作した。６日目に動物の耳にＤＮＦＢの１０μｌを適用してチャレンジした。反対側の耳にはチャレンジをしなかったが、１０μｌのアセトンを適用した。試験化合物は０から１５ｍｇ／ｋｇに増量する用量でｉ．ｐ．２回投与した、１回目の注射はＤＮＦＢチャレンジの直後（６日目）そして２回目の注射はチャレンジの１６時間後（７日目）であった。各投与群は少なくとも７匹で構成した。デキサメタゾン（ＤＸＭ）を陽性対照として使用した。耳の厚さをチャレンジの２４時間後に（そして７日目の二回目投与に６時間後に）ダイアル厚さ計（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、日本）を使用して測定した（０．０１ｍｍ単位で）。
【０１６７】
結果は、ＤＮＦＢ非投与反対側耳の厚さに対するＤＮＦＢ投与耳の厚さとして分析する。試験化合物の影響は、適当な媒体のみを投与することにより生じた反応に対する投与群の動物に生じた反応の平均を比較することにより評価する。
【０１６８】
本発明を説明するのみのために種々の特殊な態様を記述してきたが、その特別に開示した態様は制限するものと考えるべきではない。ここに開示した出願に基づいて当業者にとってはその他の多くの態様が存在するであろう、そして本発明の権利は本発明の精神及び付属する請求項に定義された範囲によってのみ制限されるものであると出願人は考える。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
本発明の理解を助けると共に実施例中に示されているデータを補うために、以下の図をここに提示する：
【図１】図１は、ＰＭＡ及びカルシウムイオノホアにより活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ−２に対する種々の用量のデキサナビノール及びその類似体の影響を示す。パネルＡにおいて、下方調節効果はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＩＬ−２遺伝子発現レベルで測定した。パネルＢにおいて、下方調節効果はＩＬ−２分泌のレベルで測定された。
【図２】図２は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した、ＰＭＡ及びカルシウムイオノホアにより活性化されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＯＸ−２遺伝子発現に対する１０μＭのデキサナビノール及びその類似体の下方調節効果を示す。
【図３】図３は、測定の１８時間前にＭＣＡｏが実施されたマウスの脳における遺伝子発現に対するデキサナビノール及びその類似体の影響を示す。パネルＡにおいて、下方調節効果は炎症誘導性メディエーターＣＯＸ−２、  ＭＣＰ−１及びＩＬ−２について測定した。パネルＢにおいて、上方調節効果は抗炎症的ＩＬ−１０について測定した。
【図４】図４は、ＣｏｎＡによる肝傷害の誘発からの時間による種々の炎症関連遺伝子の発現に対するＰＲＳ−２１１，０９２（▲）の影響を媒体（■）と比較して示す。Ａ：ＩＬ−２；Ｂ：ＭＣＰ−１；Ｃ：ＴＮＦ−α；Ｄ：ＩＬ−１β；Ｅ：ＩＬ−６；Ｆ：ＳＯＣＳ−１；及びＧ：ＳＯＣＳ−３．
【図５】図５は、活性化されたＴ細胞におけるＮＦ−ＡＴにより促進されたルシフェラーゼの発現に対する種々の用量のＰＲＳ−２１１，０９２及びＰＲＳ−２１１，２２０の影響を示す。
【図６】図６は、カラゲニン誘発足浮腫における足の厚さに対する、種々の用量のデキサナビノール、ＰＲＳ−２１１，０９２及びＰＲＳ−２１１，２２０並びにセレコキシブ及びデキサメタゾン（ＤＸＭ）の影響を基剤と比較して示す。
【図７】図７は、インビボに移植したＬｏＶｏ結腸直腸がん細胞の腫瘍増殖に対する種々の用量のデキサナビノールの影響を示す。
【図８】図８は、神経変性のＭＰＴＰモデルにおけるデキサナビノール及びＰＲＳ−２１１，２２０のインビボの効果を示す。パネルＡにおいて神経学的結果を短期試験において測定する。パネルＢにおいて機能的結果を長期試験においてロータロッド試験を用いて測定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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