(57)【要約】本発明の方法および構成物はトランスジェニック動物における心臓特異的発現を改変する際に使用される。本発明の構成物には、単離された核酸分子、発現カセット、動物細胞、トランスジェニック動物、およびトランスジェニックマウスが含まれる。本発明のトランスジェニック動物は、目的のヌクレオチド配列の誘導性の心臓特異的発現を示す。本発明の方法により、目的のヌクレオチド配列の心臓特異的発現を改変したトランスジェニック動物を発生させることができる。特に、本発明はトランスジェニック動物の心臓障害に対する罹患性を改変するための方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は抗心臓障害化合物を同定する際に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の配列を含むヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項２】
目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、発現カセット。
【請求項３】
請求項２に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の発現カセットを使用して安定して形質転換される、宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が心臓特異的転写を開始することができる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記心臓特異的転写が心室特異的である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記心臓特異的転写が誘導性である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号１に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子であって、ここで該ヌクレオチド配列は心臓組織において転写を開始することができる、単離された核酸分子。
【請求項１０】
目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項９に記載の単離された核酸分子を含む、発現カセット。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の発現カセットを用いて安定して形質転換された、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が動物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記転写が心室特異的である、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
前記転写が誘導性である、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
トランスジェニック動物であって、
（Ａ）配列番号１に記載の配列を含むヌクレオチド配列と、
（Ｂ）配列番号１に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は心臓組織において転写を開始することができる、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子と作動可能に連結している目的のヌクレオチド分子を含む、そのゲノム中に少なくとも一つの安定して組み込まれた発現カセットを含む、トランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記転写が心室特異的である、請求項１６に記載の動物。
【請求項１８】
前記転写が誘導性である、請求項１６に記載の動物。
【請求項１９】
前記トランスジェニック動物が目的のヌクレオチド配列の改変された発現を示す、請求項１６に記載の動物。
【請求項２０】
前記動物がマウス、ウサギ、イヌ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジー、およびウシからなる群から選択される、請求項１６に記載の動物。
【請求項２１】
目的の前記ヌクレオチド配列が心筋成分をコードする、請求項１６に記載の動物。
【請求項２２】
トランスジェニックマウスであって、
（Ａ）配列番号１に記載の配列を含むヌクレオチド配列および、
（Ｂ）配列番号１に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は心臓組織において転写を開始することができる、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する核酸分子と作動可能に連結している目的のヌクレオチド分子を含み、そのゲノム中に少なくとも一つの安定して組み込まれた発現カセットを含む、トランスジェニックマウス。
【請求項２３】
前記転写が心室特異的である、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２４】
前記転写が誘導性である、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２５】
前記マウスが目的のヌクレオチド配列の改変された発現を示す、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２６】
目的の前記ヌクレオチド配列が心筋成分をコードする、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２７】
目的の前記ヌクレオチド配列が、
（Ａ）配列番号５に記載の配列を有しているヌクレオチド配列および、
（Ｂ）配列番号６に記載の配列を有しているアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２８】
目的の前記ヌクレオチド配列が、
（Ａ）配列番号５に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該配列が心臓ミオシン重鎖と会合することができるポリペプチドをコードしている、ヌクレオチド配列、および
（Ｂ）配列番号６に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドは心臓ミオシン重鎖と会合することができる、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のマウス。
【請求項２９】
目的の前記ヌクレオチド配列が、
（Ａ）配列番号７に記載の配列を有するヌクレオチド配列、および
（Ｂ）配列番号８に記載の配列を有するアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列、からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のマウス。
【請求項３０】
目的の前記ヌクレオチド配列が、
（Ａ）配列番号７に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該配列はキナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列、および
（Ｂ）配列番号８に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列であって、ここで該ポリペプチドはキナーゼ活性を保持している、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のマウス。
【請求項３１】
マウスにおける目的のヌクレオチド配列の発現を改変する方法であって、
（Ａ）配列番号１に記載の配列を含む、ヌクレオチド配列、および
（Ｂ）配列番号１に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は心臓組織における転写を開始することができる、ヌクレオチド配列、
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に作動可能に連結される、目的のヌクレオチド配列を含む、そのゲノム中に少なくとも一つの安定して組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニックマウスを提供する方法。
【請求項３２】
前記発現が誘導性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記発現が心室特異的である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記発現がマウスの心臓障害に対する罹患性を改変する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記心臓障害が心筋障害である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記心筋障害が家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症、産褥性心筋症、および拘束型心筋症からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗心臓障害化合物を同定する方法であって、
（Ａ）ゲノムが、
（Ｉ）配列番号１に記載の配列を含むヌクレオチド配列と、
（ＩＩ）配列番号１に記載の配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、ここで該ヌクレオチド配列は心臓組織における転写を開始できる、ヌクレオチド配列
からなる群から選択されたヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に作動可能に連結した目的のヌクレオチド配列を含む、少なくとも一つの安定して組み込まれた発現カセットを含む、第一のおよび第二のトランスジェニックマウスを提供する工程、
（Ｂ）該第一のマウスに化合物を投与する工程、
（Ｃ）該第一のマウスおよび該第二のマウスの両方を一定期間飼育する工程、ならびに
（Ｄ）該第二のマウスと比較して、該第一のマウスにおける心臓障害表現型の調節のために該第一のマウスをモニターする工程、
を含む、抗心臓障害化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への参照文献）
この出願は２００２年７月３日に出願された米国仮特許出願第６０／３９３，５２５に対する優先権およびその利益を主張する。この特許出願は、本明細書にその全てが参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は組織特異的な遺伝子発現の制御の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
心臓異常または心臓機能不全によって現れる様々なヒトの疾患および状態が、心不全に至ることがある。心不全は心臓が体の循環の必要性に見合う十分量の血液を供給できない生理状態である。遺伝的に多様なヒトにおけるこのような疾患および状態の研究は、難しくかつ予測不能である。そのため、潜在的治療標的の同定に加え、心臓の疾患および状態の機構ならびに原因の研究を容易にするモデル系が必要となる。
【０００４】
トランスジェニック動物技術の発達は、生体内の複雑な系についてのより完全な情報の獲得にとって重要な進展をもたらしてきた。生体内で遺伝子の発現を操作することにより、特定の系におけるそのような遺伝子の役割についての洞察を得ることができ、また遺伝的に調節された環境における系の面を研究することができる。
【０００５】
成功した遺伝子導入実験は多数の大型および小型動物種において行われてきたが、マウスは心臓血管研究のために選択される動物であった。例えば、米国特許第６，３５３，１５１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。心臓特異的遺伝子導入が特定タンパク質（またはその変異型）の存在または不在と分子、細胞、および生理の各レベルにおける正常または異常な心機能との間の構造−機能相関を確立するために使用されてきた。しかし、心臓特異的プロモーターを用いてさえ、特に低蓄積量の強力な生物学的シグナル伝達タンパク質の研究が心臓血管の構造、代謝および機能における多面発現性効果を有することがある場合には、遺伝子導入は鈍い道具である。例えば、マウスのα−ミオシン重鎖プロモーターは発達中の心房に加え、初期心臓管において転写が開始され、このように発達中におけるマウスのα−ミオシン重鎖プロモーターからの導入遺伝子の発現は後期の表現型を混乱させる可能性がある。
【０００６】
そのため、多数の研究室は条件的または誘導性の遺伝子導入系の開発に向けて努力してきた。最も広く用いられる条件的系の一つはテトラサイクリンに基いたバイナリ−系であり、これはテトラサイクリンまたはその類似体の添加あるいは除去により発現を可逆的に誘導するために細胞および動物の両方において広く使われてきた（Ｂｕｊａｒｄ（１９９９）。Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１：３７２−３７４；Ｆｕｒｔｈら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９３０２−９３０６；ＭａｎｓｕｙとＢｕｊａｒｄ（２０００）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：５９３−５９６（本明細書中でそれらの全てが参考として援用される）を参照のこと）。
【０００７】
上述のテトラサイクリン標的遺伝子誘導／不活化系の潜在的な長所にも関わらず、心臓における成功例は殆ど報告されていない。心臓血管系からのデータの不足は、上述のバイナリ−系が心臓組織においてははっきりせず、ルーチンな成功を妨げていることを意味する。その上、これらの系は、制御された心臓特異的遺伝子導入実験に適したトランスジェニックの作業対を得るために多数のトランスジェニック系統の開発が必要になる。さらに、宿主動物が標的導入遺伝子または応答構築物を含まないときでさえ、その動物ではある種のアクチベーター導入遺伝子構築物は心臓障害の表現型を誘導する。標的導入遺伝子の不在にも関わらず心臓障害の表現型が出現することは、これらの動物が心臓障害および心臓疾患のトランスジェニックモデルとしての使用にはより理想的でないということになる。
【０００８】
このように、調節可能なトランスジェニックモデル系の開発は、心臓疾患および状態の研究時における使用のために望ましい。発達のあらゆる段階において標的導入遺伝子の発現を制御することができる、調節された心臓特異的導入遺伝子発現系を開発することが重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
異種由来のヌクレオチド配列の心臓特異的発現のための構成物および方法が提供される。本発明の構成物は、誘導性の心臓特異的プロモーターのための新規ヌクレオチド配列、発現カセット、ベクター、宿主細胞、動物細胞、および動物、特に本発明のヌクレオチド配列を含むトランスジェニックマウスを含む。本発明の発現カセット、ベクター、宿主細胞、動物細胞、および動物は、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。ある実施形態では、プロモーターは心臓特異的転写、特に心室特異的転写を開始することができる。本発明の動物およびトランスジェニックマウスでは、目的のヌクレオチド配列の発現は、特に心臓組織で改変される。ある実施形態では、目的のヌクレオチド配列の発現は心室特異的である。ある実施形態では、目的のヌクレオチド配列の発現は誘導性である。ある実施形態では、トランスジェニックマウスのゲノムは、心筋成分をコードしている目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結している、心室特異的転写を開始することができる誘導性のプロモーターを含む。本発明のヌクレオチド配列に作動可能に連結した目的のヌクレオチド配列を含むトランスジェニックマウスは、目的のヌクレオチド配列の改変した誘導性発現を示す。ある実施形態では、トランスジェニックマウスのゲノムは、ＥＬＣ１ａをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、トランスジェニックマウスのゲノムはＧＳＫ−３βの構成的に活性な型をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結した本発明のヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本発明は力強い誘導性があり漏出が最小限である応答座を含む。その応答座は配列番号１に記載されている。本発明の応答座はマウスのα−ミオシン重鎖プロモーター配列に由来した。ヌクレオチド−３０００とヌクレオチド−４０の間のヌクレオチド配列が五つの転写調節カセットと置換する。その結果得られる応答座はコピー数に依存し、位置には依存しない座であり、目的の様々な導入遺伝子を挿入することができる。誘導されないときには、これらの導入遺伝子は発現しない。誘導されるときには、導入遺伝子は非常に活性がある。その後これらの遺伝子は誘導性の系を用いて発現を停止することができる。
【００１１】
動物において目的のヌクレオチド配列の発現を改変するための方法が提供される。心筋疾患を含むが、これに限定されない、動物の様々な心臓障害に対する罹患性は本発明の方法により改変されてよい。心筋障害は、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症、産褥性心筋症、および拘束型心筋症を含むが、それらに限定されない。ある実施形態では、動物は心臓障害に対する罹患性が増加している。ある実施形態では、動物は心臓障害に対する罹患性が低下している。動物における組織特異的転写、特に心臓組織特異的転写を開始することができるヌクレオチド配列を有するプロモーターを含んでいる発現カセットが開発される。そのプロモーターは、目的の異種由来のヌクレオチド配列に作動可能に連結している。目的の異種由来のヌクレオチド配列に作動可能に連結している、心臓特異的発現を開始することができる本発明のヌクレオチド配列を含む発現カセットはトランスジェニック動物を作製するために使われる。そのトランスジェニック動物のゲノムは、目的のプロモーターおよびヌクレオチド配列を含む、少なくとも一つの発現カセットを組み込んでいる。プロモーター誘導時に目的のヌクレオチド配列は、心臓組織で優先的に発現する。目的のヌクレオチド配列の誘導性発現は検出可能なレベルで起こる。ある実施形態では、目的のヌクレオチド配列は、α−ミオシン重鎖、β−ミオシン重鎖、ミオシンの必須軽鎖−１（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ−１）、アクチン、カテコールアミン受容体、およびグリコーゲンシンターゼ３−βといった心筋成分をコードするが、それらに限定されない。
【００１２】
抗心臓障害化合物を同定するための方法が提供される。ある実施形態では、目的の異種由来のヌクレオチド配列に作動可能に連結している本発明のヌクレオチド配列を含み、少なくとも一つの安定して組み込まれている発現カセットをゲノムが含む、少なくとも二つのトランスジェニックマウスが提供される。化合物は第一のマウスに投与される。第一および第二のマウスは一定期間飼育される。心臓障害の表現型は両方のマウスでモニターされる。心臓障害の表現型は、死亡率、心筋細胞の錯綜配列（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｓａｒｒａｙ）、間質性線維症（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、収縮不全、拡張不全、左心室肥大、心臓重の異常（ｃａｒｄｉａｃ  ｍａｓｓ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）、右心室排出管閉塞、形態変化、細胞変性および過収縮性を含むが、それらに限定されない。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は動物における導入遺伝子の誘導性の心臓特異的発現を提供する。本発明の構成物は、単離された核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞、および本発明の単離された核酸分子を含むトランスジェニック動物を含む。本発明は動物における目的のヌクレオチド配列の発現を改変するための方法を提供する。目的のヌクレオチド配列の発現はトランスジェニック動物の心臓障害に対する罹患性を改変することができる。さらに、本発明は抗心臓障害化合物を同定するための方法を提供する。
【００１４】
本発明は、制御可能な心臓特異的プロモーター（配列番号１）を使用する組成物および方法、ならびに使用方法に関する。本発明の動物細胞または動物は目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号１に記載の心臓特異的プロモーターを含む発現カセットを用いて安定して形質転換される。そのプロモーター配列は、組織特異的、特に心臓特異的な発現パターンで作動可能に連結された配列を発現するために有用である。ある実施形態では、プロモーターは誘導性である。
【００１５】
本発明のヌクレオチド配列を含むプラスミドは、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｍａｎａｓｓａｓ）の特許寄託機構に    年    月    日に寄託し、特許寄託第          号として割り当てられた。これらの寄託物は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下に維持されることになる。これらの寄託は単に当業者の便宜としてなされたものであって、寄託物が米国特許法第１１２条の下で要求されることを認めるものではない。
【００１６】
動物全体において通常使用される場合、誘導性の発現はバイナリー系に依存して２つの導入遺伝子を必要とする。２つの導入遺伝子はアクチベータ−発現カセットおよび応答プロモーターに作動可能に連結した目的の標的ヌクレオチド配列を含む標的発現カセットである。そのような動物は、「二重」トランスジェニック動物の作製、例えば一方は選択されたタンパク質をコードしている標的導入遺伝子を含み、もう一方はアクチベーター導入遺伝子を含む、２系統のトランスジェニック動物を交配することにより、提供することができる。二重トランスジェニック系は細胞培養においても使用される。細胞培養系では、二重トランスジェニック細胞はいくつかの方法のいずれかにより産生される。その細胞は、二重トランスジェニック動物から単離されてもよいし、２つの導入遺伝子が細胞に形質転換されてもよい。その導入遺伝子は同時または連続して細胞に形質転換されてよい。
【００１７】
そのようなバイナリー系の一例はバクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記述については、例えばＬａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：６２３２−６２３６を参照。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系では、アクチベーター導入遺伝子がリコンビナーゼをコードしている。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を制御するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードしている導入遺伝子および選択された標的タンパク質をコードしている導入遺伝子の両方を含む動物が必要とされる。リコンビナーゼ系のもう一例はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。
【００１８】
最も広く使用されている誘導性系の一つはテトラサイクリンに基いたバイナリー系である。これはテトラサイクリンまたはその類似体の添加あるいは除去により発現を可逆的に誘導するために細胞および動物の両方において使われてきた（Ｂｕｊａｒｄ（１９９９）。Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１：３７２−３７４；Ｆｕｒｔｈら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９３０２−９３０６；ＭａｎｓｕｙとＢｕｊａｒｄ（２０００）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：５９３−５９６（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。テトラサイクリン類似体としては、ドキシサイクリン；デメクロサイクリン；オキシテトラサイクリン；ミノサイクリン；オートクレーブされたクロロテトラサイクリン；ビブラマイシン；リメサイクリン；ＤＭＧ−ミノサイクリン；ＣＭＴ−５、ＣＭＴ−３およびＣＭＴ−８のような化学修飾されたテトラサイクリン；Ｃｏｌ３；ならびにＧＡＲ−９３６および９−（Ｎ−Ｎ−ジメチルグリシルアミド）６ジメチル６デオキシテトラサイクリンのようなグリシルサイクリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１９】
テトラサイクリンに基いた系では、２つの導入遺伝子は１）転写アクチベータータンパク質ＶＰ１６に連結したｔｅｔに制御されたトランスアクチベーター（ｔＴＡ）配列を駆動する心臓特異的プロモーター、および２）５から７コピーのｔｅｔオペロン（ｔｅｔＯ）に連結したサイトメガロウイルス最小プロモーターからなる応答プロモーター、である。心臓特異的発現に対して、α−ミオシン重鎖プロモーターといった心臓特異的プロモーターは、ｔＴＡタンパク質の発現を制御する。このとき、応答プロモーターは、条件的に制御されることとなる標的導入遺伝子に作動可能に連結している。テトラサイクリンまたはその類似体の存在下において、ｔＴＡタンパク質はその薬物と結合し、標的導入遺伝子の転写は応答プロモーターのみから見られる。その薬物が系内に存在しない場合は、ｔＴＡはｔｅｔＯ配列と結合し、それによりＶＰ１６トランスアクチベータータンパク質が最小プロモーターに駆動された発現を上昇させることができる。ある実施形態では、本発明の単離された核酸分子は誘導性の心臓特異的応答プロモーターである。
【００２０】
「誘導性」とは、化学刺激が作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列の発現を少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、さらに好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、またはそれ以上の単位で改変することを意図している。この差は発現レベルの上昇または減少であってよい。発現レベルのアッセイ方法は本明細書の別項に記載される。化学刺激は投与、または除去することができる。様々な化学刺激は当業者により公知である。ある実施形態では化学刺激はテトラサイクリンまたはその類似体である。
【００２１】
「安定して形質転換された」とは、動物細胞の核ゲノムまたはその動物の少なくとも１つの細胞の核ゲノムが少なくとも１コピーの導入遺伝子を組み込んでいることを意図する。本発明のトランスジェニック動物は、目的のヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの安定して形質転換される細胞を含む。ある実施形態では、トランスジェニック動物の生殖系列細胞のゲノムは目的のヌクレオチド配列を含む。本発明は、単離された、または実質的に精製された核酸分子もしくはタンパク質構成物を含む。「単離された」または実質的に「精製された」核酸分子もしくはその生物学的に活性のある部分は、他の細胞物質も、培養培地（組換え技術により産生されたとき）も実質的に質的に含まず、化学的に合成されたときには化学的前駆体もその他の化学物質も実質的に含まない。好ましくは「単離された」核酸分子は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおける核酸に本来隣接する配列、すなわちその核酸の５’末端および３’末端に位置する配列（好ましくはポリペプチドコード配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離された核酸分子はその核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に本来隣接する核酸分子の、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含み得る。
【００２２】
プロモーター領域の単離方法は当業者に周知である。「単離された」とは、プロモーター配列が決定されて分子的手法で抽出されることができるか、化学的方法で合成されることができることを意図する。いずれの場合でも、そのプロモーターはそのネイティブな状態においてその隣接する配列の少なくとも一方から除去される。
【００２３】
開示されたヌクレオチド配列の断片および改変体も本発明により含まれる。「断片」とは、そのヌクレオチド配列の一部分を意図する。ヌクレオチド配列の断片は、生物学的活性を保持し、かつ発現、特に心臓特異的発現、より具体的には心室特異的発現、さらに具体的には誘導性の心臓特異的発現を駆動することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列の断片は、一般に生物学的活性を保持していない。このように、ヌクレオチド配列の断片は配列番号１の少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、３９５０、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、４９５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、４９５０、５０００、５０５０、５１００、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０、５５００、５５５０、５６００、５６５０、５７００、約５７３５までのヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
このように、誘導性の心臓特異的プロモーターは誘導性の心臓組織特異的プロモーターの生物学的に活性のある一部をコードしていてもよいし、以下に開示した方法を用いてハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲプライマーとして使用できる断片であってもよい。誘導性の心臓組織特異的プロモーターの生物学的に活性のある一部は、本明細書で開示されるプロモーターヌクレオチド配列の一部を単離し、プロモーターの一部の活性を調査することにより調製され得る。誘導性の心臓特異的プロモーターの断片である核酸分子は、配列番号１の、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、３９５０、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、４９５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、４９５０、５０００、５０５０、５１００、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０、５５００、５５５０、５６００、５６５０、５７００、約５７３５までのヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
「改変体」とは、実質的に類似の配列を意図する。ヌクレオチド配列に対して、天然に存在する改変体は周知の分子生物学的技術、例えば下記に概説されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術の使用により同定され得る。改変体のヌクレオチド配列は、例えば部位指向性変異誘発を使用して作製されるもののような、合成されたヌクレオチド配列も含む。概して、本発明の特定のヌクレオチド配列の改変体は、デフォルトパラメーターを用いて本明細書中の別項で記述された配列アラインメントプログラムにより決定されたときに、その特定のヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、および好ましくは９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。変異誘発およびヌクレオチド配列改変の方法は当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｏｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ならびにそれらに引用された参考文献を参照のこと。
【００２６】
改変体のヌクレオチド配列は、ＤＮＡシャッフリングといった変異誘発技術および遺伝子組換え手法由来の配列も含む。このような手法を用いて、本明細書で開示されたプロモーター配列を含む、１つ以上の異なったプロモーター配列は、望まれた特性を有する新規のプロモーター配列を作成するために操作されることができる。この方法では、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが、実質的な配列同一性を有し、かつインビトロおよびインビボで相同組換えされることができる配列領域を含む関連した配列ポリヌクレオチドオの集団から作製される。そのようなＤＮＡシャッフリングの戦略は、当該分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４５０４−４５０９、Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｍｉｙａｚａｋｉ（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：Ｅ１３９−９；Ｓｏｎｇら（２００２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８：６１４６−５１；Ｈａｙｅｓら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９９：１５９２６−３１；Ｃｏｃｏら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：３５４−９；Ｋｉｋｕｃｈｉら（２００２）Ｇｅｎｅ  ２４３：１３３−７；および米国特許第５，６０６，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照のこと。
【００２７】
以下の用語が、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を記述するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウインドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、および（ｅ）「実質的同一性」。
【００２８】
（ａ）本明細書で使用されるように、「参照配列」は、配列比較のための基礎として使われる規定された配列である。参照配列は、例えば全長ｃＤＮＡ、遺伝子配列、全ｃＤＮＡ、または遺伝子配列のセグメントとして、特定化された配列の一部、または全体であり得る。
【００２９】
（ｂ）本明細書で使用されるように、「比較ウインドウ」はポリヌクレオチド配列の連続して特定化したセグメントに対する参照を作製する。ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列は２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加も欠失も含まない）に比較して付加または欠失（つまりギャップ）を含み得る。概して、比較ウインドウは長さが少なくても２０の連続したヌクレオチドであり、必要に応じて３０、４０、５０、１００以上の長さであり得る。当業者にはポリヌクレオチド配列におけるギャップの含有による参照配列に対しての高い類似性を避けるため、ギャップペナルティーが代表的には導入され、一致の数から差し引かれることが理解される。
【００３０】
比較のための配列アラインメントの方法は当該分野で周知である。このように、いずれの２配列間の配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて実行され得る。具体的には、そのような数学的アルゴリズムの非限定的例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈら（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２の局部的ホモロジーアルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３のホモロジーアラインメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：２４４４−２４４８の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ−ｆｏｒ−ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−ｍｅｔｈｏｄ）；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４のアルゴリズム；ならびにＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のような改変がある。
【００３１】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューターによる実行は、配列同一性を決定するための配列の比較のために使用され得る。本発明の目的のため、本明細書で開示される配列に対する配列同一性のパーセンテージの決定のために、ヌクレオチドまたはタンパク質の配列比較はデフォルトパラメーターを用いたＧＣＧプログラムのＧＡＰ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．００以降）または同等のいずれのプログラムを使用して行われる。「同等のプログラム」とは、任意の問題の２配列に対して、ヌクレオチド残基およびアミノ酸残基の同一の一致を有するアラインメントを生成し、好ましいプログラムによって作製された対応するアラインメントに比較されたときに同一の配列同一性のパーセンテージを生成する、任意の配列比較プログラムが意図される。
【００３２】
配列比較プログラムとしては、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より入手可能）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）から入手可能）内のＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプログラムを使用するアラインメントはデフォルトパラメーターを使用して実行され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０、Ｈｕａｎｇら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；ならびにＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３３１に詳述されている。ＡＬＩＧＮプログラムは上述のＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリズムを基にしている。アミノ酸配列を比較するときには、ＰＡＭ  １２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティー（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）が１２、ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）が４が、ＡＬＧＩＮプログラムと共に用いられ得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）上述のアルゴリズムに基いている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対しホモロジーを有するヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質またはポリペプチドに対しホモロジーを有するアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９に記載されたようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０内）が使用され得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０内）が分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を行うために使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）上述を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用するときには、それぞれのプログラム（例えばヌクレオチド配列ならばＢＬＡＳＴＮ、タンパク質ならばＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。アラインメントは点検により手動でも実行され得る。
【００３３】
（ｃ）本明細書で使用されるように、２つの核酸配列または２つのポリペプチド配列の文脈での「配列同一性」あるいは「同一性」は、特定された比較ウインドウにわたって一致が最大になるようアラインメントしたときに、２つの配列において同一である残基を参照にする。配列同一性のパーセンテージはタンパク質を参照して使用されるときには、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが多く、アミノ酸残基は類似した化学特性（例、電荷または疎水性）を有するその他のアミノ酸残基と置換され、そのため分子の機能特性を変えないことが認識される。配列が保存的置換で異なるとき、配列同一性のパーセンテージは置換の保存的性質に対して補正するため上方修正され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」あるいは「類似性」を有すると言われる。この修正を行うための方法は、当業者に周知である。代表的には、これは保存的な置換を完全な不一致ではなく部分的な一致としてスコアリングし、そうすることにより配列同一性のパーセンテージを上昇させることを含む。このように、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を与え、非保存的置換がスコア０を与えるとすると、保存的置換は０および１の間のスコアを与える。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
【００３４】
（ｄ）本明細書で使用されるように、「配列同一性のパーセンテージ」は比較ウインドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定された値を意味し、ここで比較ウインドドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントに対して参照配列（付加も欠失も含まない）を比較した際に、付加あるいは欠失（すなわちギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、一致した位置の数を得るために同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数を決定し、比較ウインドウ内の全位置数で一致した位置の数を割り、配列同一性のパーセンテージを得るためその結果に１００を掛けることで計算される。
【００３５】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準パラメーターを用いて上述のアラインメントプログラムの１つを利用して参照配列に対して比較して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの数値がコドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮に入れることにより２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調節され得ることを認識される。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００３６】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の証拠は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。一般に、ストリンジェントな条件は、決められたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、別の状況で本明細書中に示されるようにストリンジェンシーの望まれた程度に依存して、Ｔｍ値より約１℃から２０℃低い幅の温度を含む。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、実質的に同一である。これは、例えば、核酸の１コピーが遺伝暗号により許される最大のコドン縮重を用いて作製される場合に起こり得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるという証拠は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが第二の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応を起こし得る場合である。
【００３７】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドの場合の用語「実質的な同一性」は、ペプチドが参照配列に対して特定された比較ウインドウにわたって参照配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含むことを表す。好ましくは、最適アラインメントはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて構築される。２つのペプチド配列が実質的に同一であることの証明は、１つのペプチドが第二のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応することである。このように、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ペプチドは実質的に第二のペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似性を有する」ペプチドは、同一でない残基の位置が保存的なアミノ酸変化によって異なり得る以外には上述のような配列を共に持つ。
【００３８】
本明細書に開示されるヌクレオチド配列は細胞、組織、および動物の対応する配列を同定するために使われ得る。この場合、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションおよびその他の方法が、本明細書に記載の配列に対する配列相同性に基いて、そのような配列を同定するために使われ得る。これらの技術は、動物または動物細胞における本発明のプロモーター配列の存在を決定するための診断アッセイとして用い得る。
【００３９】
ＰＣＲ法では、オリゴヌクレオチドプライマーが目的の任意の動物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来の対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応に使用するために設計され得る。ＰＣＲプライマーの設計法およびＰＣＲクローニング法は、一般に当該分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）に開示されている。Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９０）ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）も参照のこと。公知のＰＣＲ法は、対になったプライマー、ネストプライマー、単一の特定プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ハイブリダイゼーション技術では、既知のヌクレオチド配列の全てあるいは一部が、選ばれた生物由来のクローニングされたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（つまりゲノムライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリー）に存在するその他の対応するヌクレオチド配列に対し選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、またはその他のオリゴヌクレオチドであってよく、３２Ｐといった検出可能な基または任意の他の検出可能なマーカーで標識され得る。このように、例えば、ハイブリダイゼーション用のプローブは本発明のプロモーター配列に基いた合成オリゴヌクレオチドを標識することにより作製され得る。ハイブリダイゼーション用プローブの調製法ならびにｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築法は一般に当該分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）に開示されている。
【００４１】
例えば、本明細書に開示された全プロモーター配列、または１つ以上のその一部は、対応するプロモーター配列に対し特異的にハイブリダイズできるプローブとして使用され得る。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを行うため、そのようなプローブは誘導性の心臓特異的プロモーター配列の中で特徴があり、かつ好ましくは少なくとも長さが約１０ヌクレオチドであり、最も好ましくは長さが少なくとも約２０ヌクレオチドである配列を含む。そのようなプローブは選ばれた動物由来の対応するプロモーター配列をＰＣＲによって増幅するために使われ得る。
【００４２】
ハイブリダイゼーション技術としては、プレートで培養したＤＮＡライブラリー（プラークかコロニーかのどちらでも可。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。）のハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる。
【００４３】
そのような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われ得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが他の配列に対してよりも検出可能に強度に（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）その標的配列にハイブリダイズする条件を意図する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり異なる環境で異なってよい。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを調節することにより、プローブに対し１００％の相補性を有する標的配列が同定され得る（ホモロガスプロービング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。あるいは、ストリンジェントな条件は類似性がより低くても検出されるように配列のいくつかの不一致を許容するように調整されうる（ヘテロロガスプロービング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。一般に、プローブは長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、好ましくは長さが５００ヌクレオチド未満である。
【００４４】
通常、ストリンジェンシー条件は、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオンであり、通常は約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３、短いプローブ（すなわち１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、長いプローブ（すなわち５０ヌクレオチドより長い）に対しては少なくとも約６０℃の温度である条件である。ストリンジェンシー条件はホルムアミドといった不安定化剤の添加によってもなされ得る。例示的ストリンジェンシーの低い条件としては、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液溶液を使用しての３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）中での５０〜５５℃での洗浄がある。例示的なストリンジェンシーが中程度の条件としては、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーションおよび０．５Ｘ〜１Ｘ  ＳＳＣ中での５５〜６０℃での洗浄がある。例示的なストリンジェンシーが高い条件としては、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１Ｘ  ＳＳＣ中での６０〜６５℃での洗浄がある。一般に、ハイブリダイゼーションの長さは約２４時間未満で、通常は約４〜１２時間である。
【００４５】
特異性は代表的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的な因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関し、Ｔｍ値はＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の等式：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％  ホルムアミド）−５００／Ｌから概算され得る。式中、Ｍは１価の陽イオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、％  ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液のホルムアミドのパーセンテージ、およびＬは塩基対単位でのハイブリッドの長さである。Ｔｍ値は、相補的な標的配列のうちの５０％が（ある定められたイオン強度および温度下で）完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍ値は不一致１％につき約１℃の割合で減少する。このように、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件は望まれた同一性の配列にハイブリダイズするよう調節され得る。例えば、約９０％の同一性を有する配列を想定すると、Ｔｍ値は１０℃減少し得る。一般に、ストリンジェンシー条件は、定められたイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその相補鎖に対する熱融解点（Ｔｍ値）より約５℃低いように選択される。しかし、厳しいストリンジェンシー条件はＴｍ値より１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得、中程度のストリンジェンシー条件は熱融解点（Ｔｍ値）より６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得、低いストリンジェンシー条件は熱融解点（Ｔｍ値）より１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得る。上述の等式、ハイブリダイゼーションと洗浄組成、および望まれたＴｍ値を用いて、当業者にはハイブリダイゼーション溶液および／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が固有に記述されることは理解できる。望まれた不一致の程度によりＴｍ値が４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）になる場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｉｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓの第一部、第二章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第２章（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見られる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。このように、プロモーター活性を有し、本明細書に開示された誘導性の心臓特異的プロモーター配列、またはその断片に対してストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする単離された配列は本発明により含まれる。このような配列は、開示される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％〜９９％以上の相同性を持ち得る。このように、配列の配列同一性は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有して、範囲を取り得る。
【００４６】
目的の任意のヌクレオチド配列は、本発明のプロモーターに作動可能に連結され、心臓組織に発現され得ることは認識される。「心臓組織」としては、肺動脈心筋（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）といった、心臓に発生的に関連した組織が挙げられるが、それに限定されない心臓より得られる任意の組織も意図する。「心室組織」とは心臓の心室のいずれか側の任意の部分から得られた任意の組織も意図する。
【００４７】
本発明の目的のための目的のヌクレオチド配列の一般的なカテゴリーとしては、例えばジンクフィンガーといった情報に関する遺伝子、キナーゼといった伝達に関する遺伝子、およびヒートショックタンパク質といったハウスキーピングに関する遺伝子が挙げられる。例えば、目的のヌクレオチド配列としては、セリン−トレオニンキナーゼ、カリウムチャンネル遺伝子、一酸化窒素シンターゼ、糖タンパク質受容体、クラス１ＨＬＡ、クラス２ＨＬＡ、カテプシンＢ、システインアミノペプチダーゼ、酸性ゼラチナーゼ（ａｃｉｄ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、トリプシン様エンドペプチダーゼ、キモトリプシン様エンドペプチダーゼ、中性ゼラチナーゼ、アンギオテンシンＩＩ受容体）、心筋筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ、トロポニンＴ、トロポニンＩ、α−トロポミオシン、ＴＧＦ−β１、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＧＳＫ−３β、プロレニン、レニン、ミオシン結合タンパク質Ｃ、イオンチャンネル遺伝子、レチノイン酸受容体、αミオシン重鎖、βミオシン重鎖、ミオシン必須軽鎖、アクチン、サルコメア成分、シャぺロニン、アポトーシス経路の構成成分、および細胞骨格の構成成分（デスミンが挙げられるが、これらに限定されない）をコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明のプロモーターにより発現される目的のヌクレオチド配列は、心臓の表現型を変えるために使用され得る。心臓組織の様々な目的の表現型としては、肥大症；心室中隔肥大といった形態；左心室端収縮期長または左心室端拡張期長；乳頭筋長；左心室動脈管閉塞；サルコメアの構造、とくに家族性肥大型心筋症の原因となる改変；ミオシンアイソフォーム発現の改変、特に心臓障害に対する罹患性の改変の原因となるもの；筋原線維機能；心臓障害の罹患性；抗心臓障害化合物に対する応答性；受容体の発現；心拍数；心室収縮期圧、心室拡張期圧；大動脈収縮期圧；大動脈拡張期圧；収縮性；間隙性線維症（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）；心筋細胞の錯綜配列（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｓａｒｒａｙ）；Ｃａ２＋感受性；カテコリン（ｃａｔｅｃｈｏｌｉｎｅ）感受性；αアドレナリン感受性；βアドレナリン感受性；アンギオテンシン変換酵素阻害剤感受性；アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）感受性；リドカイン感受性；糖タンパク受容体アンタゴニスト感受性；アナボリックステロイド感受性；細胞死；細胞型塑性などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
これらの結果は、心臓組織における異種産物の発現または内因性産物の上昇した発現を提供することにより成し遂げられ得る。あるいは、その結果は１つ以上の内在性産物、特に心臓組織における酵素および補因子の発現の減少を提供することにより成し遂げられ得る。これらの変化により、トランスジェニック動物の表現型が変化する。例えば、本発明のプロモーター配列はＥＬＣ１ａ（必須軽鎖１、心房アイソフォーム）を心室において優先的に発現させ、ＥＬＣ１アイソフォームの発現パターンを改変するために使用され得る。１つの実施形態では、本発明のプロモーター配列は、ＧＳＫ−３βといったセリン−トレオニンキナーゼまたはＧＳＫ−ＣＡといった構成的に活性型のＧＳＫ−３βを発現させるために使用され得る。あるいは、本発明のプロモーター配列は、心臓タンパク質のコード配列に相補的なアンチセンスｍＲＮＡを産生し、タンパク質の産生を阻害し、異種のヌクレオチド配列の発現を改変するために使われ得る。あるいは、本発明のプロモーター配列は、短い干渉ＲＮＡを産生するために使用され得る。
【００５０】
異種ヌクレオチド配列の産物としては、構造タンパク質、酵素、補因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質などが挙げられる。
【００５１】
上述のように、本明細書中に開示されたプロモーターの１つに作動可能に連結された異種ヌクレオチド配列は、標的遺伝子に対するアンチセンス配列であり得る。このように、これらのプロモーターを用いて、標的とされた配列に対するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的なアンチセンス構築物が構築され得る。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするために構築される。アンチセンス配列の改変は、その配列が対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を干渉する限りにおいて、なされ得る。このようにして、対応するアンチセンス配列に対して７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％の配列同一性を有するアンチセンス構築物が使用され得る。さらに、アンチセンスヌクレオチドの一部は、標的遺伝子の発現を破壊するために使用され得る。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、またはそれ以上の配列が、使用され得る。このように、本明細書中に開示されたプロモーター配列は、心臓組織においてネイティブのタンパク質の発現を減少または阻害するためにアンチセンスＤＮＡ配列に作動可能に連結され得る。
【００５２】
「プロモーター」または「転写開始領域」とは、ＲＮＡ合成を特定のコード配列に対する適切な転写開始部位で開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩを直接結合できるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域を意図する。さらにプロモーターは、一般にＴＡＴＡボックスの上流すなわち５’側に位置し、上流プロモーターエレメントと呼ばれる、転写開始率に影響を与える他の認識配列を含み得る。本明細書中に開示されたプロモーター領域に対するヌクレオチド配列が同定されて、５’非翻訳領域におけるさらなる調節エレメントの単離および同定が、当該技術分野の技術水準内にあることが認識される。このように、本明細書中に開示されたプロモーター領域は一般に、コード配列の組織的および一時的発現を担うもののような上流調節因子、エンハンサーなどを含むことによってもさらに定義される。このようなエレメントは代表的には、５’非翻訳領域を通じて目的のコード領域に連結され、さらに遺伝子発現を修飾し得る。同様に、心臓組織といった望まれた組織における発現を可能にするプロモーターエレメントが、心臓特異的発現を確認するため他のコアプロモーターを用いて同定、単離および使用され得る。その５’非翻訳領域が細胞特異性に影響を与えない遺伝子に対して、５’非翻訳リーダーの代用源がこれらのプロモーターエレメントとともに使用され得る。
【００５３】
本発明の調節配列が、目的の異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されて発現ベクターに挿入された場合、この発現ベクターで安定して形質転換された動物の心臓組織において、目的のヌクレオチドの誘導性の心臓特異的発現を可能にする。「心臓特異的」とは、少量の発現が他の組織型、特に発生的に心臓組織と関連ある組織において見られるものの、異種配列の発現が心臓組織において最も豊富であることを意図する。目的の異種ヌクレオチド配列の心臓特異的発現レベルは、非心臓組織における目的のヌクレオチド配列の発現レベルよりも少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上である。「心室特異的」とは、少量の発現が他の組織型において見られるものの、異種配列の発現が心室組織において最も豊富であることを意図する。目的のヌクレオチド配列の心室特異的発現レベルは、非心室組織における目的の異種ヌクレオチド配列の発現レベルよりも少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上である。１つの実施形態では、心房組織においてネイティブに発現された異種ヌクレオチド配列の心室特異的発現が、望まれ得る。心室特異的プロモーターからの異種ヌクレオチド配列の発現は、そのネイティブなプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の心房における発現に影響を与えなくてもよい。「心房特異的」とは、少量の発現が他の組織型において見られるものの、異種配列の発現が心房組織において最も豊富であることを意図する。異種ヌクレオチド配列の心房特異的発現レベルは、非心房組織における異種ヌクレオチド配列の発現レベルよりも少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上である。
【００５４】
「異種ヌクレオチド配列」とは、プロモーター配列とともに天然に存在しない配列のことを意図する。このヌクレオチド配列はプロモーター配列に対し異種であるが、動物宿主に対しては同種、ネイティブ、異種、または外来であってよい。
【００５５】
そのプロモーターは、形質転換動物の心臓組織における表現型の変化を引き起こす発現を上昇または減少させるために、ネイティブなコード配列とともに使用され得ることが認識される。
【００５６】
本発明の単離されたプロモーター配列は、異種ヌクレオチド配列の発現レベルの範囲を提供するために改変され得る。このように、全プロモーター領域よりも短い領域が使用され得、誘導性の心臓特異的発現を駆動する能力が保持され得る。しかし、ｍＲＮＡの発現レベルは改変され得、通常はプロモーター配列の一部の欠失により減少させ得ることが認識される。一般に、単離されたプロモーター配列の少なくとも約２０ヌクレオチドがヌクレオチド配列の発現を駆動するために使用される。
【００５７】
転写レベルを上昇させるために、または組織特異性を改変するため、エンハンサーおよび／または組織特異的エレメントは、本発明のプロモーター領域とともに使用され得ることが認識される。例えば、その他の心臓特異的プロモーター由来の定量的または組織特異的上流因子は、心臓特異的転写を増加するために本発明のプロモーター領域と連結され得る。そのようなエレメントは、特徴付けられている。例えば、マウスのＴＩＭＰ−４プロモーター（Ｒａｈｋｏｎｅｎら（２００２）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５７７:４５−５２）、Ａ型およびＢ型ナトリウム排泄増加性ペプチドプロモーター（Ｇｒｅｐｉｎら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４:３１１５−２９）、ヒト心臓トロポニンＩプロモーター（Ｄｅｌｌｏｗら（２００１）Ｃａｒｄｏｐｃａｓｃ．Ｒｅｓ．５０：３−６）、マウスＳ１００Ａ１プロモーター（Ｋｉｅｗｉｔｚら（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４９８：２０７−１９）、サケ心臓ペプチドプロモーター（Ｍａｊａｌａｈｔｉ−Ｐａｌｖｉａｉｎｅｎら（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１：７３１−７４０）、ＧＡＴＡ応答エレメント（Ｃｈａｒｒｏｎら（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９：４３５５−４３６５）などがあり、本明細書中に参考として援用される。
【００５８】
その他のエンハンサーが、心臓組織に加え、とりわけ、骨格組織、ＣＮＳ組織、肺組織、唾液腺組織、涙腺組織および血管組織といったその他の組織における発現を駆動することで組織特異性を改変することは当該分野で公知である。これらは、例えば、アクアポリン−５プロモーター（Ｂｏｒｏｋら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６５０７−１４、これは本明細書中で参考として援用される）からの上流因子を含む。このプロモーターは、心臓特異的発現に加えて肺特異的発現および唾液腺特異的発現を与える。別の例としては、ヒトα−骨格アクチンプロモーターからの上流エレメントが挙げられる。このプロモーターは、心臓特異的発現に加え、骨格筋における発現を与える。
【００５９】
本発明の単離されたプロモーター配列の改変は、異種のヌクレオチド配列の発現の幅を提供し得る。このように、プロモーター配列は、弱いプロモーターまたは強いプロモーターであるように改変される。一般に、「弱いプロモーター」とは、低レベルでのコード配列の発現を駆動するプロモーターを意図する。「低レベル」とは、約１／１０，０００〜約１／１００，０００〜約１／５００，０００の転写物レベルを意図する。逆に、強いプロモーターは高レベル、すなわち約１／１０〜約１／１００から約１／１０００の転写物レベルでのコード配列の発現を駆動する。
【００６０】
本発明で開示される心臓特異的プロモーターのヌクレオチド配列、ならびにその改変体および断片は、望まれた表現型応答を達成するように発現が制御されるべき異種ヌクレオチド配列と作動可能に連結された場合に、任意の動物の遺伝子操作において有用である。「作動可能に連結された」とは、異種ヌクレオチド配列の転写がプロモーター配列の影響下にあることを意図する。このようにして、本発明のプロモーターのヌクレオチド配列は、目的の動物、より具体的には動物の心臓における発現のための異種ヌクレオチド配列に伴って発現カセット内に提供され得る。
【００６１】
そのような発現カセットは、その発現が本明細書中に開示される心臓特異的プロモーターによって制御されるべき目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、本発明のプロモーターヌクレオチド配列、またはその改変体もしくは断片の１つを含む転写開始領域を含む。このような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるべきヌクレオチド配列の挿入のため、少なくとも１つの制限酵素部位とともに提供される。加えて、発現カセットは、選択マーカー遺伝子を含み得る。
【００６２】
発現カセットは、５’から３’の転写方向で、転写開始領域および翻訳開始領域、ならびに目的の異種ヌクレオチド配列を含む。転写開始および制御のための部位を含むことに加え、発現カセットには転写終止に必要な配列および、転写領域には翻訳のためのリボゾーム結合部位も含まれ得る。その他の発現のための調節制御エレメントにはポリアデニル化シグナルとともに開始および終止コドンが含まれる。当業者は発現ベクター内に有用な複数の調節配列に気付くと思われる。このような調節配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
【００６３】
異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本発明のプロモーター配列を含む発現カセットには、遺伝子が生物に同時形質転換されるように少なくとも１つの追加のヌクレオチド配列も含み得る。あるいはこの追加の配列は、別の発現カセット上に提供され得る。
【００６４】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドが作動可能に連結され得る調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指示するためのプロモーターを含む。これらとしては、バクテリオファージλ由来の左方向プロモーター（ｌｅｆｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃプロモーター、ＴＲＰプロモーター、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、ＣＭＶの即時性初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、アデノウイルス初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルス末端反復配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
転写を促進する制御領域に加え、発現ベクターには、レプレッサー結合部位およびエンハンサーといった、転写を修飾する領域も含み得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時性初期エンハンサー（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【００６６】
適切である場合は、その発現が本発明のプロモーター配列の制御下にあるべき異種のヌクレオチド配列およびいかなる追加のヌクレオチド配列も、形質転換動物における上昇された発現に対し最適化され得る。つまり、これらのヌクレオチド配列は、マウスにおける改善された発現のためのマウス特異的コドンといった、改善された発現のための種特異的コドンを用いて合成され得る。種特異的ヌクレオチド配列を合成するための方法は当該分野において利用可能である。例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（Ｓｕｐｐｌ．）、２１１１−２１１８；Ｂｕｔｋｕｓ（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ．２５：Ｓ２８−３３；およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。これらは、本明細書中で参照される。
【００６７】
追加の配列改変は、細胞宿主における遺伝子発現を上昇させることが公知である。これらの配列修飾としては、偽ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子配列に対して害があると考えられうるその他の十分に特徴付けられた配列をコードする配列の除去を含む。異種ヌクレオチド配列のＧＣ含量は、宿主細胞において発現される既知遺伝子を参照にして計算されるように、所定の細胞宿主に対する平均レベルに調整され得る。可能な場合は、配列は予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるために改変される。
【００６８】
発現カセットは、さらに発現カセット構築物内に５’リーダー配列を含み得る。このようなリーダー配列は翻訳を増加させるために機能し得る。翻訳リーダーは当該分野で公知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０）；ポチウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）リーダー、例えばＴＥＶ（タバコエッチウイルス）リーダー（Ａｌｌｉｓｏｎら（１９８６））；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ  Ｄｗａｒｆ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ））（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４）を含む。翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を上昇させることが公知の他の方法は、例えばイントロンなども利用し得る。
【００６９】
特定の細胞内小器官、特にミトコンドリア、核、小胞体またはゴルジ体に向かう、または細胞表面または細胞外に分泌される、異種ヌクレオチド配列の発現産物を有することが望まれる例では、発現カセットがさらに輸送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に対するコード配列を含み得る。このような輸送ペプチドは当該分野で周知であり、アシルキャリアータンパク質、ルビスコ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニット、およびその類似のものの輸送ペプチドを含むが、それらに限定されない。
【００７０】
発現カセットを調製する際、様々なＤＮＡ断片は、適切な方向でかつふさわしい場合、適切なリーディングフレームで、ＤＮＡ配列を提供するよう操作され得る。この末端に対して、アダプターまたはリンカーがＤＮＡ断片を結合させるように使用され得、もしくは、その他の操作が、便利な制限酵素部位、不必要なＤＮＡの除去、制限酵素部位の除去、またはその同様のものを提供するために含まれ得る。この目的のため、インビトロ変異誘発；プライマー修復；制限；アニーリング；置換、例えばトランジションおよびトランスバージョン；またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
【００７１】
レポーター遺伝子または選択マーカー遺伝子は、発現カセットに含まれ得る。当該分野で公知の適切なレポーター遺伝子の例としては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の中に見ることができ、これは参考として援用される。
【００７２】
形質転換細胞または組織の選抜のための選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性を付与する遺伝子を含み得る。適切な選択マーカー遺伝子の例としては、クロラムフェニコール（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９２）；メトトレキサート（Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３；Ｍｅｉｊｅｒら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７−８２０）；ハイグロマイシン（Ｗａｌｄｒｏｎら（１９８５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３−１０８；Ｚｈｉｊｉａｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２１９−２２７）；ストレプトマイシン（Ｊｏｎｅｓら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６−９１）；スペクチノマイシン（Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄら（１９９６）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：１３１−１３７）；ブレオマイシン（Ｈｉｌｌｅら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１−１７６）；スルホンアミド（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕら（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７−１３６）；ピューロマイシン（Ａｂｂａｔｅら（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：３３６−４０）；シトシンアラビノシド（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓら（２００２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：４５２−４６２）；６−チオグアニン（Ｔｕｃｋｅｒ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３７４５−４６）に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
遺伝子組換え事象の回収時において有用性を供しうるが、最終産物には必要とされなくてよいその他の遺伝子には、例えば、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ（ｂ−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７）；ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｗａｎｇら（２００１）Ａｎｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：１０１−１１０；Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質；Ｙａｎｇら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８２１２−６）；ＣＡＴ；およびルシフェラーゼ（Ｒｉｇｇｓら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５（１９）：８１１５；Ｌｕｃｈｒｓｅｎら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３９７−４１４）といった例が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
発現ベクターに有用な、任意の調節配列またはその他の配列は、トランスジェニック配列の一部を形成し得る。すでに含まれていない場合は、トランスジェニック配列は、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを含む。１つの実施形態では動物細胞が、目的のヌクレオチド配列を含む、安定して形質転換される少なくとも１つの発現カセットを含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る、受精卵または胚性幹細胞であり得る。代わりに宿主細胞が、細胞の特定の部分集団を生じさせる幹細胞またはその他の初期組織前駆細胞であってよく、動物におけるトランスジェニック組織を作製するために使用され得る。相同性組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３も参照のこと。そのベクターは（例えばエレクトロポレーションで）胚性幹細胞系列に導入され、導入遺伝子がゲノムと再結合した細胞が選抜される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと。）。その後、選抜された細胞は、凝集キメラ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｃｈｉｍｅｒａ）を形成するために動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。その後、キメラ胚は里親動物の適切な偽妊娠メスに移植され、出産まで妊娠が継続され得る。生殖細胞中に組換えＤＮＡを有する子孫は、その動物の全細胞が導入遺伝子の生殖細胞系列での伝達によって組換えＤＮＡを含む動物を交配するために使用され得る。相同性組換えベクターおよび相同性組換え動物の構築法は、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ  ９０／１１３５４号；同第ＷＯ  ９１／０１１４０；および同第ＷＯ  ９３／０４１６９号に詳述されている。これらはその全てが参考として援用される。
【００７５】
遺伝学的に操作された宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物は、好ましくは哺乳類（例えば、マウス）であり、その中で１つ以上のその動物の細胞は導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、細胞のゲノムに統合される外因性ＤＮＡである。その細胞からトランスジェニック動物は発生し、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織において、その細胞は成熟した動物のゲノム中に保持される。本発明のトランスジェニック動物は心臓成分の機能の研究ならびに心臓障害の表現型のモジュレーターの同定および評価のために有用である。
【００７６】
胚操作およびマイクロインジェクションを介したトランスジェニック動物（具体的にはマウスといった動物）の作製方法は、当該分野で慣用的であり、例えば米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）に記載されている。これらはその全てが参考として援用される。
【００７７】
類似の方法が、その他のトランスジェニック動物の作製に使用される。トランスジェニック動物は、核酸を、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルスによる感染により受精卵のオス生殖核に導入し、受精卵を偽妊娠させた里親雌動物において発達させることにより作製され得る。トランスジェニック創始動物は、そのゲノム中の導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞におけるトランスジェニックｍＲＮＡの発現に基き同定され得る。その後、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖するために使われ得る。さらに、導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、その他の導入遺伝子を有するその他のトランスジェニック動物と交配され得る。トランスジェニック動物には、動物全体またはその動物の組織が本明細書中に記載の相同組換え宿主細胞を用いて作製されてきた動物も含まれる。
【００７８】
本明細書中に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３ならびにＰＣＴ出願特許第ＷＯ  ９７／０７６６８および同第ＷＯ  ９７／０７６６９に記載されている方法に従っても作製され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば体細胞）が単離され、成長サイクルから外れてＧ０期に入るように誘導され得る。その後、休止細胞は、例えば電気パルスの使用により、休止細胞が単離されたものと同一種の動物由来の除核卵と融合され得る。その後、再構築卵は桑実胚または胎盤胞に発達するよう培養され、里親動物の偽妊娠メスに移植される。この里親メス動物から生まれた子孫は、細胞（例えば体細胞）が単離された動物のクローンである。
【００７９】
トランスジェニック動物のその他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、およびラットが含まれる。トランスジェニックウサギの提供方法は、Ｍａｒｉａｎら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１６８３−１６９２およびＪａｍｅｓら（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０１：１７１５−１７２１に記載され、本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明は動物における目的のヌクレオチド配列の発現改変法、特に目的のヌクレオチドの心臓特異的発現改変法を提供する。その方法では、目的のヌクレオチド配列は、配列番号１に示したヌクレオチド配列のような誘導性の心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されている。目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された心臓特異的プロモーターを含む発現カセットは、動物を形質転換するために使用される。動物形質転換法は当該分野で公知であり、本明細書の別項に概説されている。トランスジェニック動物は、サザンブロット、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーション法を含むが、これらに限定されない当業者に周知の方法によって同定される。望まれた誘導性の心臓特異的発現パターンを有する一重トランスジェニック動物は、ＲＮＡドットブロット、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロットおよびタックマン解析を含むが、これらに限定されない当業者に周知の方法によって同定され。望まれた発現パターンを有する一重トランスジェニック動物は、本明細書の別項に記載のαＭＨＣ−ｔＴＡ構築物（これらに限定されない）といったアクチベーター導入遺伝子を含むトランスジェニック動物と交雑される。この方法は、目的のヌクレオチド配列の改変された発現を示す、安定して形質転換されたトランスジェニック動物を産生する。
【００８１】
「改変された心臓特異的発現」とは、本発明のトランスジェニック動物のトランスジェニック細胞または心臓組織における、異種ヌクレオチド配列の発現レベルが、非トランスジェニック動物の非心臓細胞または心臓組織と、少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％またはそれ以上異なることを意図する。この差とは、発現レベルの上昇または減少であり得る。
【００８２】
発現レベルの決定方法は当該分野において公知であり、定性的ウェスタンブロット解析、免疫沈降、放射線医学的アッセイ、ポリペプチド精製、分光光学的解析、アクリルアミドゲルのクマ−シー染色、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ、二次元ゲル電気泳動、マイクロアレイ解析、インサイチュハイブリダイゼーション、化学発光、銀染色、酵素アッセイ、ポンソーＳ染色、多重ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、比色分析、イムノラジオメトリックアッセイ、陽電子放射断層撮影法、ノーザンブロット解析、蛍光定量アッセイ、およびＳＡＧＥを含むが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｉｇａｎら（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＳｕｎら（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１５７２−１５７９を参照のこと。これらは本明細書中で参照として援用される。ＧＳＫ−３βおよびＥＬＣ１アイソフォームの発現解析は、本明細書中の別項に記載される。
【００８３】
ＧＳＫ−３βは、発生、分化および増殖を含むが、これらに限定されない細胞プロセスに影響を与え得るセリン／トレオニンキナーゼである。セリン９で脱リン酸化された場合、ＧＳＫ−３βのキナーゼ活性は構成的に活性がある。構成的に活性型のＧＳＫ−３βであるＧＳＫ−ＣＡ（配列番号８）をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）は本明細書の別項に記載されているように本発明のプロモーターに作動可能に連結された。
【００８４】
「キナーゼ活性」とは、アミノ酸、ポリペプチド、またはタンパク質（これらに限定されない）といった基質のリン酸化を意図する。本発明は、リン酸化の特定の機構に依存していないことが認識される。逆に、本発明のマウスのＧＳＫ−３βキナーゼ活性は、それらのリン酸化がどのように増加したかまたは達成されたかに依存せず、基質のリン酸化を増加させる。
【００８５】
キナーゼ活性アッセイ法は当該分野で公知であり、ホスホセリンまたはホスホトレオニンといったホスホアミノ酸に対する抗体との免疫沈降；蛍光偏光；放射性同位体とのフィルター結合アッセイ、シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）、結合体化抗体を用いた９６ウェルアッセイ；時間分離蛍光アッセイ（ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、薄層クロマトグラフィー；免疫沈降および免疫複合体アッセイ；非トリクロロ酢酸ホスホアミノ酸決定法（ｎｏｎ−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）；タンパク質キナーゼアッセイ；ＳＡＰＫ／Ｊｕｎキナーゼ活性アッセイ；ならびにチロシンキナーゼ活性アッセイを含むが、これらに限定されない。米国特許出願第２００３００３６１０６号；米国特許第５４４７８６０号；Ｗａｌｋｅｒ，Ｊｏｈｎ編（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  ｖ．２；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。これらは本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００８６】
ＥＬＣ１ａ（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）は、本明細書中の別項に記載されたように本発明のプロモーターに作動可能に連結された。ＥＬＣ１ａは、ミオシンの必須軽鎖１という豊富な収縮性ポリペプチドの心房アイソフォームである。様々なＥＬＣ１アイソフォームは心筋収縮性に影響を与える。ＥＬＣ１ａといったミオシンの必須軽鎖はミオシン重鎖の首部と会合する。ＥＬＣ１ａは心臓ミオシン重鎖と会合し得る。ＥＬＣ１ａはアクチンと相互作用すると考えられ、ミオシン−アクチン架橋サイクリングに影響を与え得る。さらに、ＥＬＣ１ａは心臓の収縮機能および拡張機能を調節し得る。Ｓａｎｂｅら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：３２６８２−３２６８６を参照のこと。これは本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００８７】
心臓ミオシン重鎖とのＥＬＣ１ａの会合の解析方法は当業者に公知であり、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、超遠心、免疫沈降、共免疫沈降、架橋、酵母のツーハイブリッドアッセイ、アフィニティークロマトグラフィーを含むが、それらに限定されない。例えば、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊｏｈｎ編（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  ｖ．２；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。これらは本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００８８】
目的のヌクレオチド配列の改変された心臓特異的発現を示すトランスジェニック動物は、心臓の機能に影響を与える化合物を同定するアッセイを実行するために有用である。その異種ヌクレオチド配列の改変された心臓特異的発現は、心臓障害に対する改変された罹患性をもたらし得る。
【００８９】
「心臓障害」は、心臓または心臓組織に関与する任意の障害または状態である。心臓に関与する障害としては、心臓肥大症，左側心不全（ｌｅｆｔ−ｓｉｄｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）および右側心不全（ｒｉｇｈｔ−ｓｉｄｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）を含むが、これらに限定されない心不全；狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心臓疾患、および急性心臓死を含むが、これらに限定されない虚血性心臓疾患；全身性（左側）高血圧性心臓疾患（ｓｙｓｔｅｍｉｃ（ｌｅｆｔ−ｓｉｄｅｄ）ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）および肺性（右側）高血圧性心臓疾患（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ（ｒｉｇｈｔ−ｓｉｄｅｄ）ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含むが、これらに限定されない高血圧性心臓疾患；石灰化大動脈狭窄（ｃａｌｃｉｆｉｃ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、先天的な大動脈の二尖弁の石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｙ  ｂｉｃｕｓｐｉｄ  ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ）および僧帽弁環状石灰化（ｍｉｔｒａｌ  ａｎｎｕｌａｒ  ｃａｌｆｉｃａｔｉｏｎ）といった石灰化、僧帽弁の筋腫変性（僧帽弁逸脱症）、リウマチ熱およびリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非感染疣贅（例えば、非細菌性血栓性心内膜炎および全身エリテマトーデスの心内膜炎（Ｌｉｂｍａｎ−Ｓａｃｋｓ病））、カルチノイド心疾患、ならびに人工弁の合併症；心筋疾患（例えば、拡張型心筋症；肥大型心筋症、拘束型心筋症、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない）；心膜疾患（心膜滲出および心膜血腫および心膜炎（急性心膜炎および治癒した心膜炎が挙げられるが、これらに限定されない）およびリウマチ性心疾患が挙げられるが、これらに限定されない）；ブロック症候群、腫瘍性心疾患（原発性心臓腫瘍（例えば、粘液腫、脂肪腫、乳頭線維弾性種（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｉｂｒｏｅｌａｓｔｏｍａ）、横紋筋腫および肉腫））、ならびに非心臓新生物、先天的心臓疾患の影響（左右短絡−−遅発性チアノーゼ（例えば、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、動脈管、および房室中隔欠損症が挙げられるが、これらに限定されない）、左右シャント−−早発性チアノーゼ（例えば、ファロー四徴症、大血管転位症、総動脈幹、三尖弁閉鎖症、および総肺静脈還流異常症が挙げられるが、これらに限定されない）、閉塞性先天性異常（例えば、大動脈の縮窄症、肺動脈弁狭窄および閉鎖症、ならびに大動脈狭窄症および閉鎖症が挙げられるが、これらに限定されない））；心臓移植に関与する障害；心臓気絶（ｖｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ）；動脈性高血圧；産辱性心筋症；アルコール性心筋症；上室性頻拍症；徐脈；心房粗動；胎児水腫；期外収縮不整脈；胎児心臓不整脈；心内膜炎；心房性細動；突発性拡張型心筋症；シャーガス病による心臓疾患（Ｃｈａｇａｓ’  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）；ＱＴ延長症候群（ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ならびにブルガダ症候群（Ｂｒｕｇａｄａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
心筋症は、心筋組織が関与する任意の障害または状態である。心筋組織が関与する障害としては、心筋疾患（拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、心臓気絶、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない）；リウマチ熱；横紋筋腫；肉腫；先天性心臓疾患（左右短絡−−遅発性チアノーゼ（例えば、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、動脈管、および房室中隔欠損症が挙げられるが、これらに限定されない）、左右シャント−−早発性チアノーゼ（例えば、ファロー四徴症、大血管転位症、総動脈幹、三尖弁閉鎖症、および総肺静脈還流異常症が挙げられるが、これらに限定されない）、閉塞性先天性異常（例えば、大動脈の縮窄症、肺動脈弁狭窄および閉鎖症、ならびに大動脈狭窄症および閉鎖症））；心臓移植に関与する障害；産辱性心筋症；アルコール性心筋症；上室性頻拍症；徐脈；心房粗動；胎児水腫；期外収縮不整脈；胎児心臓不整脈；心内膜炎；心房性細動；突発性拡張型心筋症；シャーガス病による心臓疾患（Ｃｈａｇａｓ’  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）；ＱＴ延長症候群（ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ならびにブルガダ症候群（Ｂｒｕｇａｄａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
「改変された罹患性」とは、本発明のトランスジェニック動物が心臓障害の表現型を示す範囲内において、本発明のトランスジェニック動物が非トランスジェニック動物とは異なることを意図する。心臓障害の表現型は、胚、出生後、成体、および寿命に近い動物としての時期を含むが、これらに限定されない発達の任意の段階においても存在し得る。１つの実施形態において、心臓障害の表現型は、食餌、運動、化学処置、または外科的処置といった外部刺激により誘導され得る。
【００９２】
心臓障害の表現型としては、肥大症；心室中隔肥大症といった形態異常、左心室の収縮末期ｄＰ／ｄｔｍａｘまたは拡張末期径（τ）；乳頭筋径；左心室拍出血管閉塞（ｌｅｆｔ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｏｕｔｆｌｏｗ  ｔｒａｃｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）；心室中部肥大症（ｍｉｄｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）；尖端肥大症（ａｐｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）；非対称性肥大症（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）；サルコメアの構造；筋原線維の機能；受容体の発現；心拍数；心室収縮期圧、心室拡張期圧；大動脈収縮期圧；大動脈拡張期圧；収縮性；腸線維症；心筋細胞の錯綜配列；Ｃａ２＋感受性；カテコリン（ｃａｔｅｃｈｏｌｉｎｅ）感受性；α−アドレナリン感受性（α−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）；β−アドレナリン感受性（ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）；ドブタミン感受性；チロキシン感受性；アンギオテンシン変換酵素阻害剤感受性；アミオダロン（ａｍｉｏｄａｒｏｎｅ）感受性；リドカイン感受性；糖タンパク受容体アンタゴニスト感受性；アナボリックステロイド感受性；カルニチン輸送における異常；左心室拡張、左心室駆出率の減少；左心房拡張；利尿剤感受性；ボレミア（ｖｏｌｅｍｉａ）；虚血；白血球流動特性（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｆｌｏｗ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）；多形核白血球（ＰＭＮ）膜流動性；ＰＭＮ細胞質ゾルＣａ２＋含有量；高度の心室中隔欠損（ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）；ロゼット形成阻害効果（ｒｏｓｅｔｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）；収縮力の伝達；心筋線維の錯綜配列、増加された房の硬直性（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、弛緩障害（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）、小血管障害（ｓｍａｌｌ−ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、呼吸困難、アンギナ、前失神、頻脈、失神などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：１３１２−１３１６およびＷｉｇｌｅら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１６８０−１６９２を参照のこと。本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００９３】
心臓障害の表現型の測定法は当該分野で公知であり、心エコー検査、経食道超音波心臓図検査、運動試験、尿／カテコールアミン解析、ＥＩＡ、光学顕微鏡による検査（ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、心臓カテーテル法、動的心電図検査（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｐｒａｐｈｙ）、ＭＲＩ、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、陽電子放射断層撮影法、血管造影法、核磁気共鳴スピンエコー、短軸ＭＲＩ（ｓｈｏｒｔ−ａｘｉｓ  ＭＲＩ）走査法、ドップラー速度記録（Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）、ドップラーカラー血流画像法、負荷タリウム検査（ｓｔｒｅｓｓ  ｔｈａｌｌｉｕｍ  ｓｔｕｄｙ）、超音波心臓検査（ｃａｒｄｉａｃ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、胸部Ｘ線撮影、酸素消費テスト、電気生理学的検査、聴診、ＥＭスキャン、重量分析、Ｈ＆Ｅ染色、除膜線維解析（ｓｋｉｎｎｅｄ  ｆｉｂｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、透過型電子顕微鏡による検査（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、免疫蛍光解析、トリクローム染色、二次元心エコー図、胎児心拍記録法、ベースライン時におけるＭモード心エコー検査（ｂａｓｅｌｉｎｅ  Ｍ−ｍｏｄｅ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ）、心筋乳酸生産量アッセイを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：１３１２−１３１６；Ｓｏｈａｌら（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．８９：２０−２５；Ｎａｇｕｅｈら（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：１３４６−１３５０；Ｓａｎｂｅら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２６８２−３２６８６；Ｓａｎｂｅら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１０８５−２１０９４、およびＷｉｇｌｅら（１９９５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１６８０−１６９２を参照のこと。本明細書中にその全てが参考として援用される。
【００９４】
１つの実施形態では、本発明のトランスジェニック動物は抗心臓障害化合物を同定するために使用され得る。「抗心臓障害」化合物は心臓障害の表現型を調節する。調節は、心臓障害の表現型の増加または減少であり得る。抗心臓障害化合物は、非処理効果または偽薬処理効果と比較して、少なくとも１％、５％、好ましくは１０％、２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、さらに好ましくは７０％、８０％、９０％、または１００％の割合で心臓障害の表現型を調節する。心臓障害のアッセイ法は本明細書中の別項で記載される。当該分野で公知の心臓障害の表現型の任意のアッセイ法は、本発明のトランスジェニック動物に対する目的の化合物の効果を検査するために使用され得る。
【００９５】
抗心臓障害化合物を同定するために、本発明の多重トランスジェニック動物、例えば、少なくとも第一および第二のトランスジェニック動物が供給される。用語「第一の」、「実験」または「試験」トランスジェニック動物は、目的の化合物が投与されるトランスジェニック動物を指す。用語「第二の」、「コントロール」トランスジェニック動物は、偽薬を投与されるトランスジェニック動物を指す。１つの実施形態では、第一のおよび第二のトランスジェニック動物は純系で、齢、性別が同じで、類似の環境条件にさらされる。１つの実施形態では、１匹より多い動物が第一のトランスジェニック動物になり得る。１つの実施形態では、１匹より多い動物が第二のトランスジェニック動物になり得る。
【００９６】
目的の化合物または偽薬を投与後、第一および第二のトランスジェニック動物は一定期間飼育される。一定期間は心臓障害の表現型の解析に適切な、前もって決められた期間を有する。このような期間は、３０秒；１、５、１０、３０、または６０分；８、１２、２４、３６、または４８時間；３、４、５、６、または７日；２、３、または４週間；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月；最大３年を含むが、これらの期間に限定されない。心臓障害の表現型を監視することは、連続で；単一の間隔で；または複数の間隔（例えば、時間、日、週、月の間隔で）で行われ得るが、これらの間隔に限定されない。当該分野で公知の心臓障害の表現型の任意のアッセイ法は、本発明のトランスジェニック動物に対する目的の化合物の効果を監視するために使用され得る。
【００９７】
用語「投与」はその最も広い意味で使用され、本発明のトランスジェニック動物に化合物を導入する任意の方法を含む。用語「投与」は、例えば、外因的に被験体に導入されたポリヌクレオチドのインビボにおける転写または翻訳によるような、ポリペプチドまたはポリペプチドのインビボでの産生を含む。このように、被検体において外因性の組成物から産生されるポリペプチドまたは核酸は、用語「投与」に含まれる。
【００９８】
「化合物」は、核酸分子、ペプチド、ペプチド模倣物、脂質、抗体、受容体阻害剤、リガンド、ステロール、ステロイド、ホルモン、キナーゼ、キナーゼ阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、イオンチャンネルモジュレーター、利尿剤、酵素、酵素阻害剤、炭水化物、デアミナーゼ、デアミナーゼ阻害剤、Ｇタンパク質、Ｇタンパク質受容体阻害剤、ＡＣＥ阻害剤、ホルモン受容体モジュレーター、アルコール、逆転写酵素阻害剤、神経伝達物質阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、ジギタリス、神経伝達物質受容体モジュレーター、陰性強心剤、β遮断薬、Ｃａ２＋アンタゴニスト、ジソピラミド、抗不整脈薬剤、ホルモン、フレカイニド、血管拡張剤を含むが、これらに限定されない。化合物には、薬学的に受容可能な担体も含み得る。
【００９９】
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に受容可能な担体」は、溶媒、散布媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などの任意の薬学的投与と適合する任意のかつ全てのものを意図する。薬学的活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性物質と適合しない場合を除き、このような媒体は本発明の組成物において使われ得る。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込まれる。本発明の製薬的構成物は、その意図された投与経路と適合するように組み立てられる。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所的投与）、経粘膜投与、および経直腸投与が含まれる。非経口、皮内、もしくは皮下への適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒といった滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンといった抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムといった抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸といったキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩といった緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖といった張度調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸もしくは水酸化ナトリウムといった酸または塩基により調節され得る。非経口調製物には、アンプル、使い捨ての注射器、またはガラスあるいはプラスチックで作られた複数回の用量のバイアル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ  ｖｉａｌｓ）中に含まれ得る。
【０１００】
注射用途に適切な製薬的な組成物としては、滅菌済みの、注射可能な溶液あるいは分散剤の即時調製のための、滅菌済水溶液（水溶性の場合）、または分散剤および滅菌済粉末が挙げられる。静脈投与のために、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒｅＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合では、組成物は滅菌済みでなければならず、容易な注射可能性が存在する範囲で液体であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌といった微生物の汚染作用が防止されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散物であり得る。適切な流動性が、例えば、レシチンといったコーティングの使用、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）により達成され得る。多くの場合では、組成物中には、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、および塩化ナトリウムといった等張剤を含有することが好ましい。注射可能な組成物の長期的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンといった、吸収を遅延させる薬剤をその組成物に含有することにより達成される。
【０１０１】
滅菌済みの注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、カルボキシペプチダーゼタンパク質または抗カルボキシペプチダーゼ抗体）を必要量、適切な溶媒に単一あるいは上述の成分の組み合わせで、必要ならばフィルター滅菌後に、組み込むことにより調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒体および上述のものから選ばれる所望のその他の成分を含む滅菌済みのビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌済みの注射可能な溶液の調製のための滅菌済粉末の場合は、好ましい調製法は減圧乾燥および凍結乾燥である。凍結乾燥は、前もってフィルター滅菌されたその溶液から、活性成分および任意の追加の望ましい成分の粉末を産生する。
【０１０２】
経口組成物は一般に、不活性な希釈液または摂食可能な担体を含有する。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮され得る。経口投与のため、薬剤は、胃の中で説けないように腸溶性の形態で含まれるか、または公知の方法により胃腸管の特定領域で放出されるようにさらに被覆もしくは混合され得る。経口治療投与の目的のため、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物は、うがい薬としての使用のため流体担体を用いても調製され得る。この場合、流体担体内の化合物は経口で適用され、うがいされ（ｓｗｉｓｈｅｄ）、喀出されるか嚥下される。製薬的に適合できる結合剤および／または補助物質は、組成物の一部として含有され得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の任意の構成成分、または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンといった結合剤；デンプンやラクトースのような賦形剤、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、コーンスターチ）；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅ）といった滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素といったグリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）；ショ糖またはサッカリンといった甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料といった矯味矯臭剤。
【０１０３】
吸入による投与のため、化合物は、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。この容器あるいはディスペンサーは、適切なプロペラント（例えば、二酸化炭素のようなガス）または噴霧器を含む。
【０１０４】
全身投与は、経粘膜または経皮的な方法によってもなされ得る。経粘膜または経皮的投与のため、浸透させる障壁に適切な浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）が、処方物で使用される。そのような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のために界面活性剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐薬の使用により達成される。経皮的投与のため、活性化合物は、当該分野で周知のように軟膏、ゲル、またはクリームに処方される。
【０１０５】
化合物は、坐薬（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドといった従来の坐薬基剤を用いて）または直腸への到達のため停滞浣腸の形態でも調製されうる。
【０１０６】
１つの実施形態では、活性化合物は、移植およびマイクロ被包性放出システムを含む制御放出製剤といった、身体からの急速な除去に対して化合物を保護し得る担体とともに調製される。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸といった、生分解性の生体適合性ポリマーが、使用され得る。そのような処方物の調製法は、当業者に明らかである。物質は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を得ることができる。リポソーム懸濁剤（ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体を使用して感染細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬学的に受容可能な担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１０７】
投薬量の投与および画一性の容易性のため、投薬単位形態で経口または非経口の組成物を処方することは、特に有利である。本明細書中に使われているような「投薬単位形態」は、処置される被験体の単位投薬量として適合した、物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる製薬的担体と会合して、所望の治療効果を産生するように計算された、前もって決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の仕様は、活性化合物および達成されるべき特定の治療効果の独特な特徴、ならびに個体の治療のためのそのような活性化合物の調合についての当該分野に固有の限界によって規定され、直接それらに依存する。
【０１０８】
本発明の方法によって同定される抗心臓障害化合物は、ヒト個人の治療に使用され得る。
【０１０９】
以下の例は、実例として提供され、限定として提供されるものではない。
【実施例１】
【０１１０】
本発明の誘導性心臓特異的プロモーターの作製
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５）４：３９７−４０５（本明細書中で参考として援用される）に記載の改変αプロモーターが、本発明の最小プロモーターを作製する開始点として使用された。全ての制限エンドヌクレアーゼを、Ｒｏｃｈｅ  ＢｉｏＰｈａｒｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）より購入した。制限酵素反応を、標準のプロトコールに従って実行した。２つの断片を、改変αプロモーターから切除した。
【０１１１】
約７００ｂｐのＳｍａＩ−ＳｐｈＩ断片を、ＰＣＲにより増幅した。およそ２４５６位から始まるＴＡＴＣ配列が、ＴＴＧＡ配列に置換された。約１．７ｋｂのＳｐｈＩ−ＮｄｅＩセグメントが改変された。配列ＴＡＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣ（配列番号３）から、配列ＴＧＣＡＴＧＣＣＣＴＧＡ（配列番号２）に置換した。配列番号３の挿入により、追加のＳｐｈＩ制限酵素部位が導入され、４１０６位付近の２つのＧＡＴＡ部位が改変された。７回反復された配列番号４を含む約３００塩基対の断片を、４２８２位付近のＳｐｈＩ−ＮｄｅＩセグメントに挿入した。７回反復結合部位は４２８２位から始まる位置に挿入される。反復は配列ＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧ（配列番号４）からなった。
【０１１２】
小さな方の断片は、全長プロモーターに戻される前にともにライゲーションされた。まずＳｍａＩ−ＳｐｈＩ断片が、ＳｐｈＩおよびＮｄｅＩで切断され、５１０ｂｐのＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ断片は、ベクターにライゲーションされた。その結果得られるクローンはＳｐｈＩ部位で開かれており、改変されたＳｐｈＩ−ＮｄｅＩセグメントのＳｐｈＩ消化から得られる約１４６０ｂｐのＳｐｈＩ断片を付加した。方向性はＰＣＲにて調査した。クローンを次にＳｍａＩおよびＮｄｅＩで消化した。元のαプロモーターの野生型配列を、ＳｍａＩ−ＮｄｅＩ断片に置換した。野生型配列を、部分Ｓｍａ消化とともに完全Ｎｄｅ消化を行うことによって除去した。誘導性の心臓特異的な、完全なＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯプロモーター配列は、改変された塩基を確認するために配列決定した。配列番号１に記載する。
【実施例２】
【０１１３】
ＥＬＣ１ａ発現カセットの作製
ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ誘導性プロモーター領域（配列番号１）を含むプラスミドを、制限酵素ＳａｌＩを用いて消化し、線状化した。９１４２塩基対の断片がアガロースより精製された。マウスＥＬＣ１ａのｃＤＮＡ（Ｆｅｗｅｌｌら（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６３０−２６３９。その全体が参考として援用される）をＳａｌＩで消化し、ＥＬＣ１ａ遺伝子（配列番号５）をコードする６２７塩基対のｃＤＮＡ断片は、アガロースから精製された。そのＥＬＣ１ａ断片を、ラピッドライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ’Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によりＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ誘導性プロモーター領域にライゲーションした。ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ誘導性プロモーターに連結されたＥＬＣ１ａを含むプラスミドを、ＮｏｔＩで消化した。９７６９塩基対の最終断片は、アガロースにより精製され、インジェクションに使われた。
【実施例３】
【０１１４】
ＧＳＫ−３βＣＡ発現カセットの作製
マウスグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）の全長ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＣ００６９３）は、Ｆｖｂ／Ｎマウスの心室より単離されたポリＡ＋ＲＮＡをテンプレートとして使って逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲにより合成された。ＳａｌＩ部位を末端に有するプライマーを、ＧＳＫ３β  ｃＤＮＡの３’および５’非翻訳領域に作製した。５’プライマーは、ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣＧＡＣ（配列番号９）であり、３’末端は、ＧＴＣＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧ（配列番号１０）であった。３’末端プライマーには、血球凝集素エピトープタグ配列をＧＳＫ−３βｃＤＮＡに導入するようにこのタグ配列を含めだ。ＧＳＫ−３βの構成的な活性型を作製するために、アミノ酸コード領域の９位のセリンをＰＣＲによってアラニンに変異させた（ＴＣＣ→ＧＣＧ）。変異されたＧＳＫ−３β（Ｓ９Ａ）を、プラスミドベクターにライゲーションし、配列決定した。ＧＳＫ−３βＳ９Ａ（ＧＳＫ−３βＣＡ；配列番号７）を含むプラスミドを、ＳａｌＩにより消化した。ＧＳＫ−３βＣＡの１３１８ｂｐの断片を精製し、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ誘導性プロモーターカセットの断片にライゲーションし、これをＳａｌＩで消化し、アガロースより精製した。１０４６０塩基対の最終断片をアガロースから精製し、インジェクションに使用した。
【実施例４】
【０１１５】
トランスジェニックマウスの作製
本明細書中に上述した発現カセットは、ＮｏｔＩによってベクター配列から消化されて、アガロースから精製した。発現カセットを、Ｈｏｇａｎら  １９８６  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｐ８９−１９７。その全体が参考として援用される。）に記載されているように、マイクロインジェクション用に調製した。過排卵されたＦｖｂ／Ｎメス由来の単一の細胞胚を、マイクロインジェクションで使用した。マイクロインジェクションに供され生き残った胚を、偽妊娠しているＣＢＡ／Ｂ６里親メスに移植した。創始マウスをポリメラーゼ連鎖反応によって同定し、尾の切断により得られるＤＮＡを利用したゲノミックサザンブロットにより確認した。安定したトランスジェニック系統を、創始マウスと非トランスジェニックの同腹仔と交配することにより作製した。その結果出生した子孫を、ＰＣＲによってスクリーニングした。安定したトランスジェニック系統を、誘導性の発現パターンに関して選抜した（図１、パネルＡ。本明細書の別項に記載）。トランスジェニックマウス由来の複数の組織を、発現に対してスクリーニングした（図１、パネルＢ）。
【０１１６】
所望の発現パターンを示す安定したトランスジェニック系統を、ＳａｌＩ制限酵素部位でマウスα−ＭＨＣプロモーターに作動可能に連結された、元のテトラサイクリン制御トランスアクチベーター構築物（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：５１６−５２０。その全体が参考として援用される。）を有するトランスジェニック系統と交配した。
【０１１７】
二重トランスジェニック系統を、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ遺伝子座におけるホモ接合体に対し交配した。
【実施例５】
【０１１８】
本発明のプロモーターからのＥＬＣ１ａの発現を、いくつかの方法により検出した。非トランスジェニック系統由来のマウスおよび３系統のトランスジェニック系統を、ＣＯ２窒息によって安楽死させた。３系統のトランスジェニック系統は、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ発現カセットを含んだ。心房および左心室組織を、非トランスジェニックマウス系統から新鮮に単離した。左および右心室組織は、３系統のトランスジェニックマウス系統より新鮮に単離した。
【０１１９】
ＥＬＣ１ａ発現をＲＮＡドットブロットによって解析した。組織サンプルを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ  Ｏｈ）中でホモジナイズした。全ＲＮＡを、製造者の指示に従って抽出した。各組織由来のＲＮＡ５μｇを、ニトロセルロースにブロットし、ＥＬＣ１ａ特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。データは、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素）発現を用いて標準化された。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で集められた。得られた結果は、図１Ａに示される。
【０１２０】
ＥＬＣ１ａ発現を、ウェスタンブロット解析によっても解析した。筋原線維タンパク質を当業者に公知の方法により単離した（Ｓａｎｂｅら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１０８５−２１０９４およびＭｃＡｕｌｉｆｆｅら（１９９０）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．６６：１２０４−１２１６。本明細書中でこの全てが参考として援用される。）。タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、１２０Ｖで約３時間、電気泳動した。タンパク質を、４℃で一晩、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ））に移した。メンブレンを、ＥＬＣ１ａに対するウサギポリクローナル抗血清（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてプローブした。得られた結果は、図１Ｂに示される。
【０１２１】
複数の組織におけるＥＬＣ１ａ発現を、ウェスタンブロット解析によって解析した。心房組織を、非トランスジェニックマウスから単離した。左心室、右心室、心房、横隔膜、ヒラメ筋、上腕二頭筋、脛骨筋、咬筋、舌、胃、小腸、大動脈、肺、肝臓、脾臓の組織が、ＥＬＣ１ａ発現カセットを有するトランスジェニックマウスから切り出された。ウェスタンブロットは、上述のように実施された。得られた結果は、図１Ｃに示される。
【実施例６】
【０１２２】
ＥＬＣ１ａ発現に対するドキシサイクリンの影響
非トランスジェニックマウスおよび複数のトランスジェニック系統由来のマウスが、慣用的実験動物取り扱い法に従って飼育された。トランスジェニック系統は、ｔＴＡアクチベーター一重導入遺伝子系統、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ一重導入遺伝子系統、二重ｔＴＡアクチベーター／ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ応答系統、および二重ｔＴＡアクチベーター／ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａホモ応答系統であった。採取３週間前、ヘテロ性都合性およびホモ接合性のＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ二重トランスジェニックマウスの食餌に、６２５ｍｇ／ｋｇ食餌のドキシサイクリンを追加した。心房および左心室のタンパク質を、非トランスジェニックマウスから得た。筋原線維タンパク質が、２系統の一重トランスジェニック系統、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａヘテロ接合性およびホモ接合性二重トランスジェニック系統、ならびにドキシサイクリン投与のＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａヘテロ接合性およびホモ接合性二重トランスジェニック系統から得られた。タンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲルを、本明細書中に記載されたように電気泳動した。ゲルをクマーシー染料で染色した。ＥＬＣ１−ｖがトランスジェニックＥＬＣ１−ａに置き換えられたパーセンテージを、電気泳動解析およびマッキントッシュＧ４コンピューター上のＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いた定量化により決定した。このような実験から得られた結果は、図２のパネルＡに示される。
【実施例７】
【０１２３】
ＥＬＣ１ａ発現に対するドキシサイクリンレベルの影響
ｔＴＡアクチベーター一重トランスジェニック系統、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ一重トランスジェニック系統、ならびにＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａヘテロ接合性およびホモ接合性二重トランスジェニック系統由来のマウスは、慣用的実験動物取り扱い法に従って飼育された。ヘテロ接合性ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ二重トランスジェニックマウスの食餌に、採取３週間前から、０、１００、２００または６２５ｍｇ／ｋｇ食餌のドキシサイクリンを追加した。
【０１２４】
心房および左心室のタンパク質が、非トランスジェニックマウスから得られた。筋原線維タンパク質が、２系統の一重トランスジェニック系統、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａヘテロ接合性およびホモ接合性二重トランスジェニック系統、ならびにドキシサイクリン投与のＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａヘテロおよびホモ二重トランスジェニック系統から得られた。タンパク質を、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲルを、本明細書中に記載されたように電気泳動した。ゲルをクマーシー染料で染色した。ＥＬＣ１−ｖがトランスジェニックＥＬＣ１ａに置き換えられたパーセンテージを、電気泳動解析およびマッキントッシュＧ４コンピューター上のＮＩＨ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いた定量化により決定した。このような実験から得られた結果は、図２のパネルＢに示される。
【実施例８】
【０１２５】
トランスジェニックマウスの寝室組織におけるＧＳＫ−ＣＡ発現の検出
実施例３で記述したように、セリン／トレオニンキナーゼＧＳＫ−３βの構成的に活性型をコードするヌクレオチド配列を、標準の分子生物学技術を使って本発明のＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯプロモーターを含む発現カセットにクローン化した。ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＧＳＫ−ＣＡ発現カセットを、実施例４に記載したようにトランスジェニックマウスを作製するために使用した。本明細書中の別項で記載されたように（実施例４を参照のこと）、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＧＳＫ−ＣＡ一重トランスジェニックマウスを、二重トランスジェニックマウスを作製するためにｔＴＡアクチベーター一重トランスジェニックマウスと交配させた。
【０１２６】
オスで齢が一致した、非トランスジェニックマウスおよび６匹の二重トランスジェニックマウスを、６週間、ドキシサイクリン無含有またはドキシサイクリン含有の食餌により維持した。６週間目、ドキシサイクリンを二重トランスジェニックマウスのうちの３匹の食餌から取り除いた。７週間目、筋原線維タンパク質が、上記８匹の動物から本明細書中の別項に記載したように採取された。タンパク質を、本明細書中の別項に記載するようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動した。タンパク質を、４℃で一晩、ＰＶＤＦメンブレンに移した。メンブレンを、抗ＧＳＫ−３β抗血清（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＪ）または抗ＨＡ抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）のどちらかを用いてプローブした。このような実験から得られた結果は、図３のパネルＤに示される。
【実施例９】
【０１２７】
マウス肥大症応答の調査
齢の一致したオスの非トランスジェニックマウスの２つのコホートを確立した。大動脈弓横行部狭窄（ＴＡＣ）処置を一方のコホートに実施し、第二のコホートには偽処置を実施した。ＴＡＣおよび偽ＴＡＣ処置は当業者に公知である（Ｄｏｒｎら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｈ４００−５。本明細書中で参考として援用される）。ＴＡＣコホートと偽コホート由来のマウスを、処置時ならびに処置１、２、３、４、５、６および７週後に解析した。
【０１２８】
タイムポイントで解析した各マウスの全体重を決定した。マウスをＣＯ２安楽死させて、左心室を取り出した。左心室重を決定した。全体重に対する左心室重の比を、各タイムポイントで決定された。このような実験から得られた結果は、図３のパネルＢで示される。
【実施例１０】
【０１２９】
肥大症応答におけるＧＳＫ−ＣＡの効果の決定
４〜６匹の１２週齢のオスのマウスからなる９つのコホートを、確立した。偽ＴＡＣ処置を、非トランスジェニックマウス、ｔＴＡアクチベーター一重トランスジェニックマウス、ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＧＳＫ−ＣＡ一重トランスジェニックマウス、およびｔＴＡアクチベーター／ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＧＳＫ−ＣＡ二重トランスジェニックマウスに実施した。ＴＡＣ処置を、非トランスジェニックコホートおよび二重トランスジェニックコホート由来のマウスに実施した。処置２週間後、実験が終了した。終了後、左心室重／全体重比を決定した。
【０１３０】
異なるプロトコール（プロトコール２）を、非トランスジェニックコホートおよび二重トランスジェニックマウスの２つのコホートの、３つのコホートにおいて実施した。二重トランスジェニックマウスの食餌には、ＴＡＣ処置前の４週間、６２５ｍｇ／ｋｇ食餌のドキシサイクリンを追加した。ＴＡＣ処置を３つのコホートに実施した。ドキシサイクリンを、１つの二重トランスジェニックコホートの食餌中で維持した。ＴＡＣ処置１週間後、ドキシサイクリンを第二の二重トランスジェニックコホートの食餌から取り除いた。実験はＴＡＣ処置７週間後、終了した。左心室重／全体重比を、３つのコホートに対して決定した。
【０１３１】
このような実験からの結果は、図３のパネルＣに示される。
【実施例１１】
【０１３２】
抗心臓障害化合物の同定法
このアッセイは、様々な心臓障害の表現型に対して使用され得る。目的のヌクレオチド配列を、本発明のプロモーターを含む発現ベクターにクローン化する。目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本発明のプロモーターＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯを含む発現カセットを、制限酵素を使用して消化する。制限酵素反応産物を、アガロースゲルで電気泳動し、発現カセットをアガロースから精製する。発現カセットを当業者に公知の任意の方法に従って、マイクロインジェクション用に調製する。発現カセットを、トランスジェニックマウスを提供するために使用する。導入遺伝子の存在は、サザンブロット解析を用いて確認される。一重トランスジェニックマウスを、ｔＴＡアクチベーター導入遺伝子および目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む二重トランスジェニック動物を作製するために、ｔＴＡアクチベーター導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスに交配する。
【０１３３】
齢の一致した二重トランスジェニックマウスの２つのコホートを、確立する。ドキシサイクリンを、目的のヌクレオチド配列の発現を制御するために使用する。一方のコホートの食餌には、目的の化合物を追加する。第二のコホートの食餌には、偽薬を追加する。２つのマウスコホートを、適切な期間飼育し、実験を終了する。マウスを、本明細書の別項で記載された左心室重／体重比を使用して、肥大症といった心臓障害の表現型に対してモニターする。各コホートのマウスによって示される心臓障害の表現型を比較する。
【０１３４】
明細書中に記述した全ての刊行物、特許、特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されるかのように同一の範囲で、本明細書中に参考として援用される。
【０１３５】
前述の発明は、理解の明快化の目的のため、実証および例示により幾分詳細に記述されてきたが、特定の変更および改変が、添付される特許請求の範囲内で実行され得ることは明確である。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、本発明のヌクレオチド配列（配列番号１）に作動可能に連結された必須軽鎖−１（ＥＬＣ１ａ、配列番号５）遺伝子の心房型の心室特異的発現を描写したものである。パネルＡは非トランスジェニック（ＮＴＧ）コントロールマウスおよび３系統のトランスジェニックマウスから単離されたＲＮＡのドットブロット解析の結果を示したものである。５μｇのＲＮＡをニトロセルロースフィルターにブロットした。フィルターを、ＥＬＣ１ａ特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）発現が、データを標準化するために使われた。レーン１および２はそれぞれ、心房および左心室の組織から単離したＲＮＡを含む。レーン３、５、および７は、左心室（ＬＶ）組織から単離されたＲＮＡを含む。レーン４，６および８は右心室（ＲＶ）組織から単離したＲＮＡを含む。３つのトランスジェニック系統はアクチベーター構築物を含まない。パネルＢは、非トランスジェニックマウスおよび三系統のトランスジェニックマウスにおけるタンパク質発現のウェスタン解析の結果を示したものである。レーン１および２は、非トランスジェニックマウスの心房（レーン２）および心室（レーン１）組織由来のタンパク質を含む。レーン３、５、および７は３つのトランスジェニック系統の左心室（ＬＶ）組織由来のタンパク質を含む。レーン４、６、および８は３つのトランスジェニック系統の右心室（ＲＶ）組織由来のタンパク質を含む。パネルＣは非トランスジェニックマウス由来の心房組織（レーン１）および１つのトランスジェニック系統由来の様々な組織のウェスタン解析の結果を示したものである。各レーンは以下の組織由来の３０μｇのタンパク質を含む。レーン２、左心室（ＬＶ）；レーン３、右心室（ＲＶ）、レーン４、心房（Ａｔ）；レーン５、横隔膜（Ｄｉａ）；レーン６、ヒラメ筋（Ｓｏｌ）；レーン７、上腕二頭筋（Ｂｉ）；レーン８、脛骨筋（Ｔｉｂ）；レーン９、咬筋（Ｍａｓｓ）；レーン１０、舌（Ｔｏｎ）；レーン１１、胃（Ｓｔｏ）；レーン１２、小腸（Ｓ．ｉｎｔ）；レーン１３、大動脈（Ａｏ）；レーン１４、肺；レーン１５、肝臓（Ｌｉｖ）；およびレーン１６、脾臓（Ｓｐｌ）。肺組織は、心房組織由来で、かつ肺静脈および肺細静脈の部分集団の周辺の心房様細胞の薄い層からなる、肺心筋層を含む。
【図２】図２は筋フィラメントタンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示したものである。ゲルをクーマシー染色した。心室（ＥＬＣ１ｖ）および心房（ＥＬＣ１ａ）の各アイソフォームの移動パターンはゲル右側の矢印で示した。遺伝子導入された心房アイソフォームがネイティブのＥＬＣ１ｖアイソフォームから置換したパーセンテージを、各レーンの下に示した。パネルＡはドキシサイクリン（６２５ｍｇ／ｋｇ  餌（ｃｈｏｗ））の存在または非存在下における複数のマウス系統由来の結果を示したものである。レーン１は分子量マ−カーを含み、ゲルの左側にサイズが示されている。レーン２および３はそれぞれ、非トランスジェニックコントロールの心房組織および左心室組織から単離されたタンパク質を含む。レーン４から９はいくつかのトランスジェニック系統の心室組織から単離されたタンパク質を含む。レーン４に相当するトランスジェニック系統はアクチベータ−構築物（ｔＴＡ）を含む。レーン５に相当するトランスジェニック系統はＥＬＣ１ａ遺伝子に作動可能に結合された本発明の応答構築物（ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ）を含む。レーン６に相当する二重トランスジェニック系統はＥＬＣ１ａ遺伝子に作動可能に連結されたアクチベーター構築物（ｔＴＡ）および応答構築物（ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ；）の両方を含む。ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａホモ接合体トランスジェニック系統由来のタンパク質をレーン７にロードした。レーン８および９はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）（食餌１キロ当たり６２５ｍｇ）を投与した動物由来のタンパク質を含む。二重トランスジェニック系統はレーン８に相当する。レーン９はＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａホモ接合体トランスジェニック系統由来のタンパク質を含む。図２のパネルＢはマウスの食餌中のドキシサイクリン滴下の結果を示したものである。レーン１は分子量マーカーを含む。レーン２および３は非トランスジェニックコントロールマウスの心房および左心室由来のタンパク質を含む。レーン４に相当するトランスジェニック系統はアクチベータ−構築物（ｔＴＡ）を含む。レーン５に相当するトランスジェニック系統はＥＬＣ１ａ遺伝子に作動可能に結合された応答構築物（ＭＨＣｍｉｎＴｅｔＯ−ＥＬＣ１ａ）を含む。二重トランスジェニック系統はレーン６に相当する。レーン７から９はヘテロ接合体の二重トランスジェニックマウスから得られたタンパク質を含む。マウスは心室組織の採取に先立ち三週間指示通りのレベルのドキシサイクリンを与えられた。レーン７は１００ｍｇ／ｋｇ  餌のドキシサイクリン投与群；レーン８は２００ｍｇ／ｋｇ  餌のドキシサイクリン投与群；レーン９は６２５ｍｇ／ｋｇ  餌のドキシサイクリン投与群である。
【図３】図３は活性型のＧＳＫ−３βを発現している動物における肥大性反応制御の解析結果を図示したものである。実験の詳細は本明細書の別項に記述する。Ｃ末端に血球凝集素エピトープを融合した、構成的に活性型のＧＳＫ−３βをコードしている核酸分子は本発明のプロモーターに作動可能に連結された。パネルＡは様々なプロトコール型を図示したのものである。プロトコール１に供される動物はドキシサイクリン処理を行わなかった。プロトコール２に供される動物は、ＴＡＣに先立ち四週間ドキシサイクリンを与えられた。ＴＡＣ処理後、ドキシサイクリンは中止されるかそのまま維持された。パネルＢはＴＡＣ処理または偽薬処理のいずれかを行った動物の体重に対する左心室重量の割合のタイムコースを図示したものである。パネルＣはいくつかのマウスコホートからの体重に対する左心室重量比を図示したものである。レーン１から４は、非トランスジェニックマウス（レーン１）、ｔＴＡアクチベーター構築物を含むマウス（レーン２）、ＧＳＫ−ＣＡ（構成的に活性なＧＳＫ−３β）応答構築物を含むマウス（レーン３）、ならびにｔＴＡアクチベーター構築物およびＧＳＫ−ＣＡ応答構築物を二重トランスジェニックマウス由来（レーン４）の左心室：体重比を含む。レーン５はＴＡＣ処理二週間後に非トランスジェニックマウスの左心室：体重比を図示したものである。レーン６はＴＡＣ処理二週間後に二重トランスジェニックマウスの左心室：体重比を図示したものである。レーン７から９はＴＡＣ処理七週間後にマウスの左心室：体重比を図示したものである。レーン７は非トランスジェニックマウス由来の結果を図示したものである。レーン８はドキシサイクリンを維持された二重トランスジェニックマウス由来の結果を図示したものである。レーン９はＴＡＣ処理一週間後にドキシサイクリンを中止した二重トランスジェニックマウス由来の結果を図示したものである。パネルＤはプロトコール２のマウスのＧＳＫ−３β発現のウェスタンブロット解析の結果を示したものである。タンパク質サンプルは抗ＧＳＫ−３β抗体か抗血球結集素抗体を用いて調べられた。レーン１および２はドキシサイクリンの不在および存在下における非トランスジェニックマウスから得られた結果を図示したものである。レーン３から５は食餌にドキシサイクリンを投与し続けた、３匹の二重トランスジェニックマウスから得た結果を図示したものである。レーン６から８はドキシサイクリンを中止した３匹の二重トランスジェニックマウスから得た結果を図示したものである。
【配列表】
2005532066000001.app
【国際調査報告】
2005532066.tif 000002