(57)【要約】  本発明は、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において、吸入経路によって同時投与、逐次投与、または個別投与するための、選択的PDE4阻害剤(明細書中にて定義)とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの組み合わせ物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)式(I)
【化１】
2005511657.tif 000005
[式中、
R1は、H、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C2-C4)アルケニル、フェニル、-N(CH3)2、(C3-C6)シクロアルキル、(C3-C6)シクロアルキル(C1-C3)アルキル、または(C1-C6)アシルであり、このとき前記のアルキル基、フェニル基、またはアルケニル基は、最大2つまでの-OH基、(C1-C3)アルキル基、または-CF3基で、あるいは最大3つまでのハロゲンで置換されていてもよく；
R2とR3は、H、(C1-C14)アルキル、(C1-C7)アルコキシ(C1-C7)アルキル、(C2-C14)アルケニル、(C3-C7)シクロアルキル、(C3-C7)シクロアルキル(C1-C2)アルキル、飽和もしくは不飽和の(C4-C7)複素環(CH2)n基(式中、nは0、1、または2であり、酸素、イオウ、スルホニル、窒素からなる群のうちの1種または2種をヘテロ原子として含有する)、およびNR4(式中、R4は、Hまたは(C1-C4)アルキルである)からなる群から互いに独立的に選択されるか；あるいは式(II)
【化２】
2005511657.tif 000006
〔式中、aは1〜5の整数であり；bとcは、0または1であり；R5は、H、-OH、(C1-C5)アルキル、(C2-C5)アルケニル、(C1-C5)アルコキシ、(C3-C6)シクロアルコキシ、ハロゲン、-CF3、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2、または-SO2NR6R7(式中、R6とR7は、互いに独立的にHまたは(C1-C4)アルキルである)であり；Zは、-O-、-S-、-SO2-、-CO-、または-N(R8)-(式中、R8はHまたは(C1-C4)アルキルである)であり；Yは、最大2つまでの(C1-C7)アルキル基もしくは(C3-C7)シクロアルキル基で置換されていてもよい(C1-C5)アルキレンまたは(C2-C6)アルケニレンであり；このとき前記のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アルコキシアルキル基、または複素環基のそれぞれが、1〜14の、好ましくは1〜5の(C1-C2)アルキル基、CF3基、またはハロ基で置換されていてもよい〕で示される基であり；そして
R9とR10は、H、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリール、および(C6-C10)アリールオキシからなる群から互いに独立的に選択される]で示される選択的PDE4阻害剤、または前記阻害剤の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、(b)アドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの吸入組み合わせ物。
【請求項２】
R1が、メチル、エチル、またはイソプロピルである、請求項1記載の組み合わせ物。
【請求項３】
R3が、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C3-C7)シクロアルキル、(C3-C7)シクロアルキル(C1-C6)アルキル、またはH、-OH、(C1-C5)アルキル、(C2-C5)アルケニル、(C1-C5)アルコキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2、もしくは-SO2NR6R7〔式中、R6とR7は、互いに独立的にHまたは(C1-C4)アルキルである〕からなる群のうちの1種または2種で置換されていてもよいフェニルである、請求項1または請求項2に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-フェニル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(フラン-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-ピリジル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(4-ピリジル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(3-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-ベンジル-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-プロピル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3,9-ジシクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(1-メチルシクロヘキス-1-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-(tert-ブチル)-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-メチルフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-メトキシフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(チエン-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-(2-クロロフェニル)-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-ヨードフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-トリフルオロメチルフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；および
5,6-ジヒドロ-7-エチル-9-(4-フルオロフェニル)-3-(1-メチルシクロヘキス-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
ならびに前記化合物の医薬として許容されうる塩および溶媒和物から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン、ならびに前記物質の医薬として許容されうる塩および溶媒和物から選択される、請求項4記載の組み合わせ物。
【請求項６】
アドレナリン作動性β2受容体アゴニストが、サルメテロール、フォルメテロール、ならびに前記物質の医薬として許容されうる塩および溶媒和物から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であって、アドレナリン作動性β2受容体アゴニストが、サルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であるか；
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であって、アドレナリン作動性β2受容体アゴニストが、フォルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であるか；
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(tert-ブチル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であって、アドレナリン作動性β2受容体アゴニストが、サルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であるか；あるいは
式(I)の選択的PDE4阻害剤が、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(tert-ブチル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物であって、アドレナリン作動性β2受容体アゴニストが、フォルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物である；
請求項1記載の組み合わせ物。
【請求項８】
医薬として使用するための、請求項1〜7に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において吸入経路によって投与するための、請求項1記載の式(I)の選択的PDE4阻害剤、アドレナリン作動性β2受容体アゴニスト、および医薬として許容されうる賦形剤、希釈剤、もしくはキャリヤーを含んだ医薬組成物。
【請求項１１】
式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストが請求項2〜7のいずれか一項に記載した通りである、請求項10記載の医薬組成物。
【請求項１２】
閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において吸入経路によって2種の薬剤を同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための医薬の製造における、請求項1記載の式(I)の選択的PDE4阻害剤またはアドレナリン作動性β2受容体アゴニストの使用。
【請求項１３】
式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストが請求項2〜7のいずれか一項に記載した通りである、請求項12記載の使用。
【請求項１４】
閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療を必要とする哺乳類に、有効量の、請求項1記載の式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストを、吸入経路によって同時的、逐次的、もしくは個別的に投与することを含む、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療法。
【請求項１５】
式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストが請求項2〜7のいずれか一項に記載した通りである、請求項14記載の治療法。
【請求項１６】
閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において、請求項1記載の式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストを同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための吸入機器。
【請求項１７】
式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストが請求項2〜7のいずれか一項に記載した通りである、請求項16記載の吸入機器。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの吸入組み合わせ物、投与するための機器を含めた医薬組成物、およびこのような組み合わせ物の使用に関する。
【０００２】
選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの組み合わせ物は、閉塞性気道疾患および他の炎症性疾患〔特に、閉塞性気道疾患である喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、ならびに強められた気管支反射(heightened bronchial reflexes)、炎症、気管支過敏症、および気管支痙攣によって悪化する他の閉塞性気道疾患〕の治療に対して有用である。本発明の組み合わせ物は、COPDの治療に対して特に有用である。
【０００３】
本発明を使用して治療できる特定の疾患の例としては、呼吸器系疾患である喘息、急性呼吸窮迫症候群、慢性肺炎症性疾患、気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺(気道)疾患、珪肺症、および免疫システムの疾患(例えば、アレルギー性鼻炎や慢性副鼻腔炎)などがある。
【０００４】
3’,5’-環状ヌクレオチドであるホスホジエステラーゼ(PDE)は、構造的、生化学的、および薬理学的に互いに異なった少なくとも11種の系統に分類される広範なクラスの酵素を含む。それぞれの系統内の酵素は通常、アイソエンザイム(isoenzyme)またはアイソザイム(isozyme)と呼ばれる。このクラスにはトータルで15種を超える遺伝子産物が含まれ、こうした遺伝子産物のデファレンシャルスプライシングと翻訳後プロセシングからさらなる多様性が生じる。本発明は主として、第4系統のPDEの4種の遺伝子産物(すなわちPDE4A、PDE4B、PDE4C、およびPDE4D)に関する。これらの酵素は、PDE4アイソエンザイム系統(PDE4s)のイソ型またはサブタイプと総称されている。
【０００５】
PDE4sは、セカンドメッセンジャーとしての環状ヌクレオチド(アデノシン3’,5’-環状モノホスフェート(cAMP))の選択的で高親和性の加水分解を引き起こすこと、およびロリプラムによる阻害に対する選択性を示すことを特徴とする。ここ数年、PDE4sの選択的阻害剤が多数発見されており、その阻害から得られる有益な薬理学的効果が種々の疾患モデルにおいて示されている：例えば、Torphy et al.,Environ.Health Perspect.102 Suppl.10,79-84,1994；Duplantier et al.,J.Med.Chem.39120-125,1996；Schneider et al.,Pharmacol.Biochem.Behav.50211-217,1995；Banner and Page,Br.J.Pharmacol.114 93-98,1995；Barnette et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.273 674-679,1995；Wright et al.“Differential in vivo and in vitro bronchorelaxant activities of CP-80633,a selective phosphodiesterase 4 inhibitor,”Can.J.Physiol.Pharmacol.75 1001-1008,1997；Manabe et al.“Anti-inflammatory and bronchodilator properties of KF19514,a phosphodiesterase 4 and 1 inhibitor,”Eur.J.Pharmacol.33297-107,1997；およびUkita et al.“Novel,potent,and selective phosphodiesterase-4 inhibitors as antiasthmatic agents：synthesis and biological activities of a series of 1-pyridylnaphthalene derivatives,”J.Med.Chem.421088-1099,1999；を参照。
【０００６】
アドレナリン作動性β受容体は交感神経系において生じる。アドレナリン作動性β受容体には少なくとも2つのタイプがある。アドレナリン作動性β受容体は心臓において見られ、アゴニストであるエピネフリンとノルエピネフリンの作用によって心拍数を調整する上で主要な役割を果たす。アドレナリン作動性β2受容体は、多くの細胞タイプに関して肺中に存在し(例えば、気道平滑筋細胞、上皮細胞、および種々の炎症細胞)、アドレナリン作動性β2受容体アゴニストは有効な気管支拡張薬であり、気道平滑筋の弛緩を引き起こす。交感神経様作用アミンは、部分的に可逆の気道狭窄(例えば、COPDや喘息)を特徴とする慢性気道疾患の治療に対して長い間使用され、最初は静脈注射用エピネフリンの形で気管支拡張薬として使用された。その後、β1受容体よりβ2受容体に対して比較的非選択性である吸入β-アドレナリン作動薬(例えばイソプレナリン)が使用されるようになり、したがって気管支拡張薬の有効用量において頻脈を引き起こすようになった。ごく最近では、β2受容体に対してより選択性が高いが、作用時間の短い吸入β-アドレナリン作動薬(例えばサルブタモール)が使用されている。吸入β-アドレナリン作動薬であるフォルモテロール〔N-[2-ヒドロキシ-5-(1-ヒドロキシ-2-((2-(4-メトキシフェニル)-1-メチルエチル)アミノ)-エチル)フェニル]ホルムアミド〕とサルメテロールはどちらも、β2受容体に対して選択性であって作用時間が長い。
【０００７】
驚くべきことに、特定の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとを組み合わせ物は、閉塞性気道疾患と他の炎症性疾患の治療に対して、どちらかの薬剤のみによる治療よりも、また他の公知の組み合わせ物による治療よりも大きな利点をもたらす、ということが見出された。この組み合わせ物の利点は、疾患病理学に最も適したメカニズム(すなわち、アドレナリン作動性β2受容体アゴニズム)によって気道内腔の最適な制御をもたらすことにあり、このとき同時に不適切な炎症の効果的な抑制が果たされる。このように、咳、粘液産生、および呼吸困難を引き起こす不適切な気道神経反射(airway neural reflexes)を是正することによって疾患の症状が抑えられる。アドレナリン作動性β2受容体アゴニストと選択的PDE4阻害剤との組み合わせ物を吸入経路を介して投与することによって、それぞれの種類の薬剤の利点が、望ましくない末梢効果を生じることなく達成される。さらに、本発明の特定の組み合わせ物は予想外の相乗効果をもたらし、単独で使用されるそれぞれの種類の薬剤の許容最大量より大きな効能が得られる。
【０００８】
したがって本発明は、(a)式(I)
【０００９】
【化１】
2005511657.tif 000002
[式中、
R1は、H、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C2-C4)アルケニル、フェニル、-N(CH3)2、(C3-C6)シクロアルキル、(C3-C6)シクロアルキル(C1-C3)アルキル、または(C1-C6)アシルであり、このとき前記のアルキル基、フェニル基、またはアルケニル基は、最大2つまでの-OH基、(C1-C3)アルキル基、または-CF3基で、あるいは最大3つまでのハロゲンで置換されていてもよく；
R2とR3は、H、(C1-C14)アルキル、(C1-C7)アルコキシ(C1-C7)アルキル、(C2-C14)アルケニル、(C3-C7)シクロアルキル、(C3-C7)シクロアルキル(C1-C2)アルキル、飽和もしくは不飽和の(C4-C7)複素環(CH2)n基(式中、nは0、1、または2であり、酸素、イオウ、スルホニル、窒素からなる群のうちの1種または2種をヘテロ原子として含有する)、およびNR4(式中、R4は、Hまたは(C1-C4)アルキルである)からなる群から互いに独立的に選択されるか；あるいは式(II)
【００１０】
【化２】
2005511657.tif 000003
〔式中、aは1〜5の整数であり；bとcは、0または1であり；R5は、H、-OH、(C1-C5)アルキル、(C2-C5)アルケニル、(C1-C5)アルコキシ、(C3-C6)シクロアルコキシ、ハロゲン、-CF3、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2、または-SO2NR6R7(式中、R6とR7は、互いに独立的にHまたは(C1-C4)アルキルである)であり；Zは、-O-、-S-、-SO2-、-CO-、または-N(R8)-(式中、R8はHまたは(C1-C4)アルキルである)であり；Yは、最大2つまでの(C1-C7)アルキル基もしくは(C3-C7)シクロアルキル基で置換されていてもよい(C1-C5)アルキレンまたは(C2-C6)アルケニレンであり；このとき前記のアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アルコキシアルキル基、または複素環基のそれぞれが、1〜14の、好ましくは1〜5の(C1-C2)アルキル基、CF3基、またはハロ基で置換されていてもよい〕で示される基であり；そして
R9とR10は、H、(C1-C6)アルキル、(C1-C6)アルコキシ、(C6-C10)アリール、および(C6-C10)アリールオキシからなる群から互いに独立的に選択される]で示される選択的PDE4阻害剤、または前記阻害剤の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、(b)アドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの吸入組み合わせ物を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、医薬として使用するための、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの吸入組み合わせ物を提供する。
本発明はさらに、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの吸入組み合わせ物を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において吸入経路によって投与するための、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤、アドレナリン作動性β2受容体アゴニスト、および医薬として許容されうる賦形剤、希釈剤、もしくはキャリヤーを含んだ医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において吸入経路によって2種の薬剤を同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための医薬の製造における、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤またはアドレナリン作動性β2受容体アゴニストの使用を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療を必要とする哺乳類に、有効量の、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストを、吸入経路によって同時的、逐次的、もしくは個別的に投与することを含む、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、閉塞性気道疾患または他の炎症性疾患の治療において、上記式(I)の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストを同時投与、逐次投与、もしくは個別投与するための吸入機器を提供する。
【００１６】
選択的PDE4阻害剤は、他の全ての公知のPDEアイソエンザイムに対してより、PDE4アイソエンザイムに対して高い親和性を有する阻害剤である。本発明による選択的PDE4阻害剤の親和性は、他のPDEアイソエンザイムに対するその親和性と比較して、PDE4アイソエンザイムに対して少なくとも100倍高いのが好ましい。
【００１７】
式(I)の好ましい化合物は、R1が、メチル、エチル、またはイソプロピルである場合の化合物、およびR3が、(C1-C6)アルキル、(C2-C6)アルケニル、(C3-C7)シクロアルキル、(C3-C7)シクロアルキル(C1-C6)アルキル、またはH、-OH、(C1-C5)アルキル、(C2-C5)アルケニル、(C1-C5)アルコキシ、ハロゲン、トリフルオロメチル、-CO2R6、-CONR6R7、-NR6R7、-NO2、もしくは-SO2NR6R7〔式中、R6とR7は、互いに独立的にHまたは(C1-C4)アルキルである〕からなる群のうちの1種または2種で置換されていてもよいフェニルである場合の化合物を含む。
【００１８】
式(I)の好ましい個々の化合物としては、
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-フェニル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(フラン-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-ピリジル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(4-ピリジル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(3-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-ベンジル-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-プロピル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3,9-ジシクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(1-メチルシクロヘキス-1-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-(tert-ブチル)-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-メチルフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-メトキシフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(チエン-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
3-(2-クロロフェニル)-9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-ヨードフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-トリフルオロメチルフェニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；および
5,6-ジヒドロ-7-エチル-9-(4-フルオロフェニル)-3-(1-メチルシクロヘキス-2-イル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン；
ならびに上記化合物の医薬として許容されうる塩および溶媒和物がある。
【００１９】
式(I)の特に好ましい化合物としては、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン、9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(tert-ブチル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン、及び前記化合物の医薬として許容されうる塩と溶媒和物がある。
【００２０】
式(I)の化合物の合成がWO-A-96/39408に記載されている。
本発明の組み合わせ物において使用されるアドレナリン作動性β2受容体アゴニストは選択的アドレナリン作動性β2受容体アゴニストであるのが好ましい。すなわち、アドレナリン作動性β2受容体に対する親和性のほうが、他の全ての公知のアドレナリン作動性β受容体に対する親和性より高い。このような選択的アドレナリン作動性β2受容体アゴニストの親和性は、他のアドレナリン作動性β受容体に対する親和性と比較して、アドレナリン作動性β2受容体に対して少なくとも100倍大きい。
【００２１】
本発明において使用するための好ましいアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとしては、サルメテロール、フォルモテロール、および前記物質の医薬として許容されうる塩と溶媒和物がある。
【００２２】
特に好ましい組み合わせ物としては、
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(3-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記化合物の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、サルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物との組み合わせ物；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(3-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記化合物の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、フォルモテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物との組み合わせ物；
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(tert-ブチル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記化合物の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、サルメテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物との組み合わせ物；および
9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(tert-ブチル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジンまたは前記化合物の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物と、フォルモテロールまたは前記物質の医薬として許容されうる塩もしくは溶媒和物との組み合わせ物；
がある。
【００２３】
本発明に従って使用される選択的PDE4阻害剤またはアドレナリン作動性β2受容体アゴニストは、所望により、医薬として許容されうる塩または溶媒和物の形態で使用してもよい。このような塩は、酸付加塩であっても塩基性塩(base salt)であってもよい。
【００２４】
適切な酸付加塩は、毒性のない塩を形成する酸から作製され、こうした酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびパモン酸塩などが挙げられる。
【００２５】
適切な塩基性塩は、毒性のない塩を形成する塩基から作製され、こうした塩基性塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アルミニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、およびジエタノールアミン塩などが挙げられる。
【００２６】
適切な塩に関する概説に対しては、“Berge et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19,1977”を参照のこと。
本発明に従って使用される選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストの医薬として許容されうる溶媒和物、またはそれらの塩には、それらの水和物も含まれる。
【００２７】
本発明の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストは、１種以上の多形相にて存在してもよい。
本発明の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニスト(以後、‘本発明の化合物’と記載する)は1つ以上の不斉炭素原子を含有してよく、したがって2種以上の立体異性形にて存在する(例えば、R,R’フォルモテロールは1つの好ましい実施態様である)。このような化合物がアルケニル基またはアルケニレン基を含有している場合は、シス/トランス(またはZ/E)異性も生じることがある。本発明は、本発明の化合物のこうした個々の立体異性体、ならびに必要に応じて、これら立体異性体の個々の互変異性形、およびこれらの混合物を含む。
【００２８】
ジアステレオ異性体またはシス異性体とトランス異性体の分離は、従来の方法によって(例えば、本発明の化合物、または本発明の化合物の適切な塩もしくは誘導体の分別結晶、クロマトグラフィー、あるいはHPLCによって)果たすことができる。本発明の化合物の個々のエナンチオマーはさらに、光学的に純粋な対応する中間体から、あるいは分割によって(例えば、適切なキラル担体を使用しての、対応するラセミ化合物のHPLCによって)、あるいは対応するラセミ化合物と光学活性の適切な酸もしくは塩基(必要に応じて)との反応によって形成されるジアステレオ異性体塩の分別結晶によって得ることもできる。
【００２９】
本発明はさらに、本発明の化合物または前記化合物の医薬として許容されうる塩の、全ての適切な同位体変形(isotopic variations)も含む。本発明の化合物または前記化合物の医薬として許容されうる塩の同位体変形とは、少なくとも1つの原子が、原子番号は同じであるが、自然界に通常見出される原子量とは異なった原子量を有する原子で置き換えられている物質である、と定義される。本発明の化合物および前記化合物の医薬として許容されうる塩中に組み込むことのできる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素、および塩素の同位体(それぞれ、2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、および36Cl)がある。本発明の化合物および前記化合物の医薬として許容されうる塩の特定の同位体変形(例えば、3Hや14C等の放射性同位体が組み込まれている化合物)は、薬物および/または基質組織分布の研究に有用である。トリチウム化した(すなわち3H)同位体と炭素-14(すなわち14C)同位体は、調製が容易で検出しやすいので特に好ましい。さらに、重水素(すなわち2H)等の同位体で置き換えると、代謝安定性がより高くなることから、治療上の特定の利点(例えば、インビボ半減期の増大、または必要とされる用量の減少)が得られることがある。
【００３０】
本発明の組み合わせ物を使用して治療することができる疾患の種類としては、喘息、慢性または急性の気管支収縮、慢性気管支炎、末梢気道閉塞、気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性気管支炎を有するCOPD、肺気腫またはそれに関連した呼吸困難、および不可逆性で進行性の気道閉塞を特徴とするCOPDなどがあるが、これらに限定されない。
【００３１】
喘息
本発明の治療薬組み合わせ物によって治療可能な最も重要な呼吸器系疾患の1つは喘息、すなわち、世界中で見られ、間欠性で可逆の気道閉塞、気道過敏性、および炎症を特徴とする、益々一般的になっている慢性疾患である。喘息の原因はまだ解明されていないが、喘息の最も一般的な病理学的発現は気道の炎症であり、軽度の喘息に罹患した患者の気道の場合でも重大となることがある。この炎症は反射性の気道事象(reflex airway events)を促進し、この結果、血漿タンパク質の管外遊出、呼吸困難、および気管支収縮が起こる。気管支バイオプシーと気管支洗浄の研究に基づいて、喘息は、肥満細胞、好酸球、およびTリンパ球による患者の気道への浸潤を含む、ということが明確に示されている。アトピー性喘息患者における気管支肺洗浄(BAL)は、インターロイキン(IL)-3、IL-4、IL-5、およびTヘルパー2(Th-2)様のT細胞集団の存在を示す顆粒球/マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)が活性化されるということを示している。
【００３２】
本発明の治療薬組み合わせ物は、アトピー性喘息および非アトピー性喘息の治療に対して有用である。“アトピー”とは、普通の環境抗原に対するI型(即時)超過敏反応の発現における遺伝性素因を表わしている。最も一般的な臨床症状はアレルギー性鼻炎であり、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎、および食物アレルギーはそれほど頻繁には起こらない。したがって、本明細書で使用している“アトピー性喘息”とは、“アレルギー性喘息”(すなわち、過敏性の人におけるアレルギー性徴候である気管支喘息)と同義であると意図している。本明細書で使用している“非アトピー性喘息”とは、激しい運動、刺激性の粒子、および精神的ストレス等を含めた種々の因子によって引き起こされる他の全ての喘息(特に、本質的な又は“真性の”喘息)を表わしていると意図している。
【００３３】
慢性閉塞性肺疾患(COPD)
本発明の治療薬組み合わせ物はさらに、慢性気管支炎、および肺気腫もしくはそれに関連した呼吸困難を含めたCOPDまたはCOADの治療に対して有用である。COPDは、可逆性が低くて進行性の気道閉塞を特徴とする。慢性気管支炎は、大きな軟骨性気道(large cartilaginous airways)における粘膜下組織の粘液分泌腺の過形成と肥大に関連している。杯細胞過形成、粘膜・粘膜下炎症細胞の浸潤、水腫、線維形成、粘液栓、および平滑筋の増大の全てが終末細気管支および呼吸細気管支において見られる。末梢気道が、気道閉塞の主要な部位であることが知られている。気腫は、肺胞の壁の破壊と、肺の弾力性の低下を特徴とする。多くの危険因子が、COPDの発生に結びついていることも確認されている。喫煙とCOPDとの間の結びつきは充分に確立されている。他の危険因子としては、炭塵に対する曝露および種々の遺伝因子がある。「Sandford et al.,“Genetic risk factors for chronic obstructive pulmonary disease,”Eur.Respir.J.10 1380-1391,1997」を参照のこと。
【００３４】
COPDの発生は増大しつつあり、先進工業国の人々にとって経済的な負担が重大であることを示している。COPDはさらに、それ自体が、身体障害のない単なる慢性気管支炎から、慢性呼吸不全に罹患している重度の身体障害状態の患者まで、臨床的に広範囲のバリエーションをもたらす。
【００３５】
COPDは、喘息の場合と同様に、気道の炎症を特徴としているが、患者の気管支肺胞洗浄液と唾液中に見られる炎症細胞は、好酸球ではなくて好中球とマクロファージである。COPDの患者には、IL-8、LTB4、およびTNF-αを含めた炎症メディエイターのレベルの増大も観察され、このような患者の気管支の表面上皮と上皮下組織が、Tリンパ球とマクロファージによって浸潤されていることが見出されている。COPD患者に対する症状緩和は、β-アゴニストと抗コリン作用性気管支拡張薬を使用することによって得ることができるが、疾患の進行はそのままである。COPDはテオフィリンを使用して治療されているが、一つには好ましくない作用を生じる傾向があることから、それほど大きな成功を収めてはいない。ステロイドはCOPDに対する満足できる治療薬として大いに期待されたが、その通りにはならなかった。ステロイドは、抗炎症薬としては比較的効力が低いからである。
【００３６】
したがって、COPDとそれに関連した(およびそれに含まれた)気道閉塞疾患を治療するために本発明の治療薬組み合わせ物を使用することは、当業界において大きな進歩が得られることを意味している。本発明は、いかなる特定の作用モードにも、あるいは本発明の治療薬組み合わせ物を使用することによって所望の治療目的が得られているその方法についてのいかなる仮説にも限定されない。
【００３７】
気管支炎と気管支拡張症
本発明の治療薬組み合わせ物によってもたらされる上記の特定且つ多様な阻害活性によれば、本発明の組み合わせ物は、あらゆるタイプ、病因論、または病原論の気管支炎(例えば、短期ではあるが重度の経過を示し、冷気への曝露や刺激性物質の吸い込みによって引き起こされる急性気管支炎、または急性感染；夥しい粘液膿の排出を伴う、急性気管支炎の1つの形態であるカタル性気管支炎；急性気管支炎もしくは慢性全身的疾患の反復発作によって静止段階の後に幾分再発を起こしやすく、咳の発作、わずかな又は夥しい痰の吐き出し、および肺組織の二次的変化を特徴とする、長期に続く形態の気管支炎である慢性気管支炎；なかなか切れない痰のわずかな分泌を特徴とする乾性気管支炎；喘息に罹患している人において、気管支痙攣の徴候の発現とそれに続く呼吸管感染を特徴とする症候群である感染型喘息性気管支炎；喀痰を伴う咳に関連した気管支炎である湿咳性気管支炎)の治療に対して有用である。
【００３８】
アトピー性喘息もしくは非アトピー性喘息、COPD、または他の慢性炎症性気道疾患を治療する上での、本発明の治療薬組み合わせ物の有効性は、当業界に公知の多くの異なったモデル(下記のモデルを含む)を使用することによって実証することができる。
【００３９】
気管支拡張薬作用  −  cAMPは、平滑筋の弛緩に関与するだけでなく、気道平滑筋の増殖を全体的に阻害するという影響も及ぼす(どちらも、本発明のPDE4成分によるcAMPの増大によるものであってよい)。気道平滑筋の肥大と過形成はcAMPによって調節することができ、これらの条件は慢性喘息の一般的な形態学的特徴である。
【００４０】
インビトロにおける気管支鎮痙作用  −  モルモットの気管平滑筋の弛緩を生じさせる上での、本発明の治療薬組み合わせ物の能力は、下記のような試験手順にて示される。ソディウムペントタール(100mg/kg i.p.)を使用してモルモット(350〜500g)を致死させる。気管を解剖し、長さ2〜3cmの部分を切り取る。深さ3〜5mmの組織の環が得られるよう、交互の軟骨板にて気管を横断して切断する。環の近位部と遠位部を廃棄する。個々の環をステンレス鋼支持体上に垂直に取り付け、一方をオーガンバス(organ bath)の基部に固定し、他方をアイソメトリック・トランスデューサに取り付ける。環を37℃にてクレブス液(組成μM：NaHCO3 25；NaCl 113；KCl 4.7；MgSO4・7H2O 1.2；KH2PO4 1.2；CaCl2 2.5；グルコース 11.7)中に浸し、O2/CO2(95:5,v/v)の混合ガスを供給する。このようにして調製された環を、その場刺激によって収縮させる。鎮痙作用を確実に発揮させるためには、本発明の治療薬の試験組み合わせ物を生理的食塩水中に溶解し、累積濃度効果曲線が得られるよう、5分間隔で量を増やしつつオーガンバスに加える。
【００４１】
上記の試験モデルにおいては、本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.001〜1.0μMの範囲の濃度にて、モルモット気管の環調製物の、その場刺激による収縮を阻害する。
オゾンで誘発される気管支過敏性モデル
本発明の治療薬組み合わせ物が有害刺激に対する気道の反応増大(気管支過敏性としても知られている)を阻止する能力は、モルモットにおける肺反応性の作用に及ぼすこれら薬剤の影響を調べることで実証される。成体のモルモット(300〜600g)を、“Yeadon et al,1992,Pulm.Pharmacology,5,101-112”に記載の方法に従って前処理し、調製する。種々の刺激に対する気道の反応性を、基礎的状態において、および肺の構造が変わるような種々の介入行為の後においてモニターする。被検物質を、攻撃前の種々の時間にて気管内に、あるいはエアロゾルによって投与した。対照標準動物におけるオゾン前処理では、肺の反応性が3〜100倍となり、こうした肺の反応性は、本発明の治療薬組み合わせ物により用量に関係する形で阻止された。
【００４２】
上記の試験モデルにおいては、本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.001〜0.3mg/kg i.t.の範囲の用量において抗炎症活性を示す。
ヒト気管支の緩和  −  癌の手術時に切除されるヒトの肺のサンプルを、除去してから3日以内に入手する。小さな気管支(内径約2〜5mm)を摘出し、セグメントにカットし、1.8Mのジメチルスルホキシド(DMSO)と0.1Mのスクロースを抗凍結剤として含有するウシ胎子血清(FCS)を充填した2mlの液体窒素貯蔵アンプル中に入れる。アンプルをポリスチロールボックス(11×11×22cm)中に置き、−70℃に保持されたフリーザー中にて、約0.6℃/分の平均冷却速度で徐々に凍結させる。3〜15時間後に、アンプルを液体窒素(−196℃)中に移し、使用するまで液体窒素中に保存する。使用前に、組織を−70℃に30〜60分さらしてから、アンプルを37℃の水浴中に置くことによって2.5分以内で解凍する。次いで、気管支セグメントを、37℃にてKrebs-Henseleit液(μM：NaCl 118,KCl 4.7,MgSO41.2,CaCl2 1.2,KH2PO4 1.2,NaHCO3 25,グルコース11,EDTA 0.03)を含んだ皿の中に置くことによってすすぎ洗いし、環状にカットし、同じ大きさの張力に対して10mlのオーガンバス中に吊るし、約1gの先行加重をかけた状態で記録する。その場刺激を加えることにより(これは、気道サンプルの神経の活性化を誘発し、アセチルコリンや他の神経誘導されるメディエイターの放出により張力を生成させることが知られている)、張力のさらなる増大が引き起こされる。累積的に加えることで濃度応答曲線が得られ、このとき各濃度品は、それまでの濃度によって最大効果が得られたときに加える。気管支環の完全な緩和を起こさせるには、パパベリン(300μM)は濃度応答曲線の終わりに加える。これにより100%緩和の効果が得られるものと思われる。
【００４３】
上記の試験モデルにおいては、本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.001〜1.0μMの範囲の濃度においてヒト気管支環調製物の、濃度に関係した緩和をもたらし、このとき好ましい実施態様は5.0nM〜500nMの範囲の濃度において活性である。
【００４４】
カプサイトン誘発による気管支収縮の抑制  −実験前に餌と水を自由に摂取できる雄のダンキン・ハートレー系のモルモット(400〜800g)をナトリウム・フェノバルビタール(100mg/kg i.p.[腹腔内])で麻酔する。動物(加熱パッドで37℃に保持、直腸体温計によって調節)に対し、気管カニューレを介して空気と酸素の混合物(45:55 v/v)を通気する(約8ml/kg,1Hz)。呼吸ポンプと繋がっている差圧変換器に連結された呼吸気流計により、気管において通気をモニターする。気管と胸郭との間の圧力差を測定し、表示することができるように、胸郭内の圧力変化を、差圧変換器を使用して胸郭内カニューレにより直接モニターする。空気の流量と肺圧差の測定値から、それぞれの呼吸サイクルに対し、デジタル電子呼吸アナライザー(a digital electronic respiratory analyzer)を使用して、気道抵抗(R1cmH2O/l/s)とコンプライアンス(Cddyn)を算出する。圧力変換器を使用して、頚動脈から血圧と心拍数を記録する。
【００４５】
基礎耐性（basal resistance）とコンプライアンスに対する値が安定であるときは、カプサイシンの静脈内ボーラスによって急性の気管支収縮を生じさせる。カプサイシンを100%エタノール中に溶解し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈する。カプサイシンに対する反応が安定であるときに(10分間隔での2〜3回のこのような投与後であると考えられる)、本発明の治療薬の試験組み合わせ物を投与する。気管内もしくは十二指腸内点滴注入、または静脈内ボーラス注入の後に、1〜8時間にわたって気管支収縮の反転を見極める。気管支鎮痙活性を、
カプサイシン注入後の初期最大抵抗(RD)の抑制率(%)として表示する。ED50値は、カプサイシンによって誘発される抵抗増大量の50%減少を生じさせる用量を表わしている。作用の持続時間は、気管支収縮を50%以上減少させる時間(分)であると定義される。血圧(BP)と心拍数(HR)に及ぼす影響はED20値(すなわち、投与してから5分後の測定にて、BPまたはHRを20%減少させる用量)によって特徴づけられる。
【００４６】
上記の試験モデルにおいては、本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.001〜0.1mg/kg i.t.[intra tracheal]の範囲の用量にて気管支拡張薬活性を示す。さらに、気管内に供給された組み合わせ物は、気管支痙攣に対して少なくとも付加的な抑制効果を示し、それぞれの成分単独でも、観察された反応制御の50%以上を抑制することができる。
【００４７】
LPSにより誘発される肺好中球増加症  −  肺への好中球の補充と、肺における好中球の活性化は、COPDと重度の喘息に対する重要な病理学的特徴であると考えられる。したがって、動物においてこれらエンドポイントのどちらか又は両方を抑制できれば、本発明の有用性を裏付ける証拠となる。
【００４８】
雄のウィスター系アルビノラット(150〜250g)または雄のダンキン・ハートレー系モルモット(400〜600g)に対し、被検物質を単独もしくは組み合わせて使用して、吸入法または気管内(i.t.)点滴注入法によって短時間の一般的な麻酔で前処理する。化合物を投与してから1〜24時間後に、動物に対し、その後の1〜24時間にわたって重度の肺好中球増加症を誘発するに足る量の細菌性リポ多糖(LPS)の吸入エアロゾルで刺激する。気管支の洗浄液中の細胞を計数することによって、あるいは肺洗浄液または組織中の好中球産物を測定することによって好中球増加症を見極める。この試験システムにおいては、本発明の治療薬は一般に、0.0001〜0.1mg/kg i.t.の範囲の用量にて抗炎症活性を示す。予想外のことに、気管内に供給された組み合わせ物は、成分の1つが、それ自体に関しては大きな抗炎症効果を及ぼさないという事実にも関わらず、炎症に対して少なくとも付加的な効果を及ぼす。さらに、成分の1つの高用量の場合と同等の抗炎症効果を、本発明のように組み合わせて使用したときにはより少ない用量にて観察することができ、したがって全身性の望ましくない作用を最小限に抑えることができる。
【００４９】
モルモットのアレルギー性アッセイ  −  本発明の治療薬組み合わせ物が呼吸困難や気管支痙攣(すなわち、困難な又は苦しい呼吸、および肺抵抗の増大)の症候に対して、および炎症(すなわち、肺好中球増加症や肺好酸球増加症)の症候に対して及ぼす治療効果を評価するための試験は、ダンキン・ハートレー系モルモット(体重400〜600g)を使用する。
【００５０】
この試験において使用される卵アルブミン(EA)(グレードV)、結晶化・凍結乾燥した水酸化アルミニウム、およびマレイン酸メピラミン(mepyramine maleate)は市販されている。攻撃とそれに引き続く呼吸読み取り(respiratory readings)は、10×6×4インチの内部寸法を有する透明なプラスチックボックス中にて行う。ボックスのヘッド部分と本体部分は分離可能である。使用に際しては、この2つの部分をクランプによってしっかり保持し、軟質のゴムガスケットによってチャンバー間の気密シールを保持する。チャンバーのヘッドエンドの中心を通して気密シールにてネブライザーを挿入する。ボックスの各端部も出口を有する。呼吸気流計をボックスの1つの端部に挿入して、容積圧力変換器に連結し、次いでこの容積圧力変換器を適切なカプラーを介してダイノグラフ(a dynograph)に連結する。抗原をエアロゾルにして散布している間は、出口を開放状態にし、呼吸気流計をチャンバーから隔離する。次いで出口を閉じ、呼吸パターンの記録中に呼吸気流計とチャンバーを接続する。攻撃のため、抗原の塩水中3%溶液2mlを各ネブライザー中に入れ、10psiの圧力と8リットル/分の流量で作動する小さなダイヤフラムポンプからの空気でエアロゾルを発生させる。
【００５１】
塩水中に1mgのEAと200mgの水酸化アルミニウムを含有する懸濁液1mlを皮下におよびi.p.に注射することによってモルモットを過敏にする。モルモットは、12日の後過敏化(post-sensitization)と24日の後過敏化との間で使用する。反応のヒスタミン成分を除去するために、2mg/kgのメピアルミンによるエアロゾル攻撃の前に、モルモットをi.p.にて30分前処理する。モルモットを塩水中3%EAのエアロゾルに正確に1分曝露し、次いで呼吸プロフィールをさらに30分記録する。引き続き、1〜48時間にわたって肺の炎症をモルテム後（post mortem）に調べる。呼吸記録から、連続的な呼吸困難の持続時間を測定する。
【００５２】
本発明の治療薬の試験組み合わせ物は一般に、攻撃の0.5〜4時間前に、気管内にあるいはエアロゾルによって投与する。化合物の組み合わせ物は、塩水中または生体適合性の溶媒中に溶解させる。化合物の活性は、呼吸困難と気管支痙攣の症候の深刻度と持続時間を、および/またはビヒクル処理した対照標準群と比較したときの肺炎症の深刻度を低下させる能力に基づいて決定される。本発明の治療薬組み合わせ物の試験では、一連の用量に対して評価し、症候の持続時間を50%ほど抑える用量(mg/kg)として定義されるED50を求める。
【００５３】
抗炎症活性  本発明の治療薬組み合わせ物の抗炎症活性は、好酸球または好中球の活性化を阻止することで実証される。本アッセイにおいては、血液サンプル(50ml)は、0.06〜0.47×109L-1の範囲の好酸球数を有する非アトピー性ボランティアから採集する。静脈血を、5mlのクエン酸三ナトリウム(3.8%,pH7.4)を含有する遠心分離管中に入れる。
【００５４】
抗凝固処理血液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、カルシウムもマグネシウムも含有しない)で希釈し(1:1,v:v)、50mlの遠心分離管中にて15mlの等張性Percoll(密度1.082〜1.085g/ml,pH7.4)上に層状にする。遠心分離(30分、1000×g、20℃)の後、血漿/Percoll界面における単核球を慎重に吸引して廃棄する。
【００５５】
好中球/好酸球/赤血球ペレット(約5mlの体積)を35mlの等張性塩化アンモニウム溶液(NH4Cl,155mM;KHCO3,10mM;EDTA.0.1mM;0-4℃)中に穏やかに再懸濁させる。15分後、ウシ胎仔血清(2%,FCS)を含有するPBS中にて細胞を2回(10分、400×g、4℃)洗浄する。
【００５６】
好酸球と好中球を分離するには磁気細胞分離システムを使用する。このシステムは、懸濁液中の細胞を表面マーカーに従って分離することができ、永久磁石を含んでいて、この中に、磁化可能なスチールマトリックスを含むカラムを配置する。使用する前に、カラムをPBS/FCSで1時間平衡化し、次いで20mlのシリンジを使用して、氷冷したPBS/FCSで逆向きにフラッシングする。カラムの基部に21G皮下注射針を取り付け、針を通して1〜2mlの氷冷緩衝液を流出させる。
【００５７】
顆粒球を遠心分離した後、上澄み液を吸引し、細胞を100μlの磁気粒子(抗CD16モノクローナル抗体、超常磁性粒子に複合化)と共に穏やかに再懸濁させる。好酸球/好中球/抗CD16磁気粒子の混合物を氷上で40分インキュベートし、氷冷したPBS/FCSで5mlに希釈する。細胞懸濁液をカラムの頂部に徐々に導入し、蛇口を開いて細胞を徐々にスチールマトリックス中に移動させる。次いで、スチールマトリックス中に既に捕捉されている磁気標識された好中球をかき乱さないようにカラムの頂部に慎重に加えられるPBS/FCS(35ml)でカラムを洗浄する。標識されていない好酸球を50mlの遠心分離管中に採集し、洗浄する(10分、400×g、4℃)。このようにして得られるペレットを、使用前に細胞数と純度が評価できるように、5mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)中に再懸濁する。分離カラムを磁石から取り出し、好中球フラクションを溶出する。次いでカラムをPBS(50ml)と無水エタノールで洗浄し、4℃で保存する。
【００５８】
ミクロ細胞計数器(a micro cell counter)を使用して全細胞を計数する。サンプルに１滴の溶原性溶液を加え、30秒後に再び計数を行って赤血球の混入を評価する。シャンドン・サイトスピン2・サイトスピナー(Shandon Cytospin 2 cytospinner)(100μlサンプル、3分、500rpm)によりサイトスピン・スミアー(Cytospin smears)を調製する。これらの調製物を染色し、光学顕微鏡法によって細胞計数の差を求める(少なくとも500の細胞を調べる)。トリパンブルーの排除によって細胞の生存力を評価する。
【００５９】
好酸球または好中球をHBSS中に希釈し、ピペットで96ウェルのマイクロタイタープレート(MTP)中に1〜10×103細胞/ウェルにて移す。各ウェルは、100μlの細胞懸濁液;50μlのHBSS;10μlのルシゲニン;20μlの活性化刺激物(activation stimulus);および20μlの試験化合物;を含んだ200μlのサンプルを含有する。
【００６０】
サンプルを試験化合物またはビヒクルと共に10分インキュベートしてから、ジメチルスルホキシド中に溶解した活性化刺激物fMLP(1〜10μM)またはC5a(1〜100nM)を加え、次いで使用される最も高い溶媒濃度が1%(100μMの試験化合物にて)となるように緩衝液中に希釈する。MTPをかき混ぜて細胞と媒体との混合を容易にし、MTPを照度計中に配置する。各ウェルの全化学発光と時間的プロフィールを20分にわたって同時に測定し、得られる結果を、任意の単位として、あるいは試験化合物が存在しない場合にはfMLP誘発による化学発光のパーセントとして表示する。結果をヒルの式に適合させ、IC50値が自動的に算出される。
【００６１】
本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.0001μM〜0.5μMの範囲の濃度において上記試験法にて活性であり、好ましい実施態様は0.1nM〜100nMの範囲の濃度において活性である。
【００６２】
本発明の治療薬組み合わせ物の抗炎症活性はさらに、ラットの気道中への血漿浸出の抑制によって実証される。本アッセイでは、気管支組織を採取し、血漿漏出の程度を調べる。本アッセイは、COPD(これに限定されない)を含めた気道の他の慢性炎症性疾患にも同じように関係し、従ってそれに関してここでは繰り返し述べることはしない。
【００６３】
ウィスター系アルビノラット(150〜200g)またはダンキン・ハートレー系モルモット(450〜600g)をナトリウム・ペントバルビトンで麻酔し、静脈カニューレと動脈カニューレを取り付ける。血漿タンパク質と結合させるためのエバンスブルー色素を静脈内投与(300mg/kg)する。10分後に試験薬剤を気管内に投与し、そして10分後にカプサイシンを静脈内投与し(3ug/kg)、そして30分後に気管支組織を取り除き、ホルムアミド中に一晩抽出し、620nmにて吸光度を読み取る。幾つかの実験においては、エバンスブルーや炎症刺激物の前に本発明の化合物が投与されるように、投与の順序を逆転させた。
【００６４】
上記の試験モデルにおいては、本発明の治療薬組み合わせ物は一般に、0.001〜0.1mg/kg i.t.の範囲の用量にて抗炎症活性を示す。
上記の説明から、本発明の治療薬組み合わせ物は、炎症性または閉塞性の気道疾患、あるいは気道閉塞が関係する他の疾病を治療するのに有用である、ということがわかる。特に、気管支喘息の治療に対して有用である。
【００６５】
抗炎症活性および気道過敏性に及ぼす影響を考慮すると、本発明の治療薬組み合わせ物は、閉塞性もしくは炎症性気道疾患の治療(特に予防的治療)に対して有用である。したがって長期にわたる連続的且つ規則的な投与によって、本発明の化合物の組み合わせ物は、気管支収縮の反復または他の閉塞性もしくは炎症性気道疾患の結果として起こる症候性攻撃に対するより進んだ予防を可能にする上で有用である。本発明の化合物の組み合わせ物はさらに、このような疾患の基礎的状態を制御したり、改善したり、または逆転させるのに有用である。
【００６６】
気管支拡張薬活性を考慮すると、本発明の治療薬組み合わせ物は、例えば、慢性もしくは急性気管支収縮の治療において、および閉塞性もしくは炎症性気道疾患の対症療法に対して気管支拡張薬として有用である。
【００６７】
本発明が適用可能な閉塞性または炎症性気道疾患としては、喘息;塵肺;慢性好酸球性肺炎;慢性閉塞性の気道疾患または性肺疾患(COADまたはCOPD);および成人呼吸窮迫症候群(ARDS);ならびに他の薬物療法(例えば、アスピリン療法やβ-アゴニスト療法)の結果として起こる気道過敏性の悪化;などがある。
【００６８】
本発明の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストは、単独でも組み合わせても投与することができるが、一般には、適切な医薬用の賦形剤、希釈剤、またはキャリヤーとの混合物の形で投与される。
【００６９】
本発明の選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストは吸入によって投与するのが好ましく、乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末(単独もしくは混合物として、例えば乳糖との混合物)の形態で、あるいは加圧容器、ポンプ、噴霧器、アトマイザー(微細ミストを生成させるのに電気流体力学を使用するアトマイザーであるのが好ましい)、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で供給する〔この場合、適切な噴射剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A[商標])や1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA[商標])等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、Perflubron(商標)等のさらなるペルフッ素化炭化水素、または他の適切なガス)を使用する場合と使用しない場合がある〕のが適切である。加圧エアロゾルの場合、単位用量は、定量を供給するための弁を取り付けることによって決定することができる。加圧容器、ポンプ、噴霧器、アトマイザー、またはネブライザーは、例えば、分散、可溶化、もしくは放出を延長するためのエタノール混合物(所望により水性エタノール)または適切な薬剤と溶媒としての噴射剤とを使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含んでよい〔滑剤(例えばソルビタントリオレエート)をさらに含んでもよい〕。吸入器や通気器において使用するためのカプセル、ブリスター、およびカートリッジ(例えば、ゼラチンやHPMCから製造)は、本発明の化合物の粉末混合物〔適切な粉末ベース(例えば、乳糖や澱粉)、および性能変性剤(例えば、L-ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウム)〕を収容するように調製することができる。
【００７０】
吸入用の乾燥粉末製剤または懸濁液製剤として使用する前に、本発明の化合物を、吸入による供給に適したサイズに微細化する(一般には5ミクロン未満とされている)。微細化は、ある範囲の方法(例えば、スパイラルジェットミリング、流動床ジットミリング、または超臨界流体結晶化の使用)によって果たすことができる。
【００７１】
微細ミストを生成させるのに電気流体力学を使用するアトマイザーにおいて使用するための適切な溶液製剤は、１回の作動当たり本発明の化合物を1μg〜10mg含有してよく、作動体積は1μlから100μlまで変わってよい。代表的な製剤は、本発明の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール、および塩化ナトリウムを含んでよい。プロピレングリコールの代わりに別の溶媒(例えば、グリセロールやポリエチレングリコール)を使用することもできる。
【００７２】
エアロゾル製剤または乾燥粉末製剤は、それぞれの一定用量または“パフ(puff)”が、患者への供給のために本発明の化合物を1〜4000μg含有するように調製するのが好ましい。エアロゾルの場合の全体としての日用量は1μg〜20mgの範囲であり、単一用量にて投与することもできるし、あるいはより一般的には一日全体を通して分割用量にて投与することもできる。
【００７３】
使用する選択的PDE4阻害剤とアドレナリン作動性β2受容体アゴニストとの好ましい重量比は、検討しようとする個々の組み合わせにより異なる。これは、個々の化合物の効能が異なるからである。いずれにしても、医師が、個々の患者に最も適した各化合物の実際の用量を決め、用量は、個々の患者の年齢、体重、および反応によって変わる。
【００７４】
言うまでもないことであるが、本明細書の記載の治療はいずれも、治癒的治療、姑息的治療、および予防的治療を含む。
試験データ  −単離されたヒト好中球からのエラスターゼ放出の阻害
男性と女性の健康なボランティアからの静脈血(90ml)を3.8%(w/v)クエン酸ナトリウム溶液10ml中に入れ、8mlアリコートを15mlのポリプロピレン製遠心分離管〔それぞれの管が、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)中にデキストランを6%混合して得た混合物を4ml含有〕中に分散させた。デキストラン/血液を反転によって穏やかに混合し、室温で45分放置して赤血球を沈降させた。白血球含量の多い上澄み液からの16mlアリコートを、50mlのポリプロピレン製遠心分離管中にて10mlのフィコール・ハイパック・クッション(Ficoll-Hypaque cushions)上にオーバーレイし、管を21℃にて400gで35分遠心分離した。血漿、単核細胞層、およびフィコールを除去して、顆粒球含量の多いペレットを得た。これらのペレットを、先ず10mlの氷冷蒸留水中に45秒間再懸濁させて混入している赤血球を溶解させ、次いで2倍に濃縮した氷冷のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10mlを各管に加えてオスモル濃度を元に戻す。これらの懸濁液を再度、4℃にて200gで10分遠心分離して好中球のペレットを得た。上澄み液を取り除き、パスツールピペットを使用して、ペレットをトータルで10mlの氷冷HBSS中に穏やかに再懸濁した。得られた好中球懸濁液に対して、ベックマン・コールターAc.75ヘマトロジー分析装置を使用して白血球分画を行い、アッセイを行うまでは細胞を氷上にて保存した。アッセイの直前に好中球懸濁液のアリコートを取り出し、2U/mlのアデノシン・デアミナーゼを含有する氷冷HBSS中に4×106好中球/mlのカウントとなるように希釈した。
【００７５】
96ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートにて160μlのアッセイ体積を使用して、fMLP誘発によるエラスターゼ放出の阻止を行った。エラスターゼの放出は、合成基質MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAの開裂速度を測定することによって評価した。エラスターゼの放出を測定するために、アッセイウェルは、10%DMSO/90%HBSS中100μg/mlのサイトカラシンBを8μl、HBSS中に希釈した試験化合物を8μl、好中球懸濁液を40μl、およびHBSS中156μMのMeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNAを96μl含有した。アッセイプレートを37℃で10分インキュベートしてからHBSS中2μM fMLPを8μl加え、基質の開裂速度をλ=405nmにて37℃で3分行った。基礎的なエラスターゼ放出を、fMLPの代わりに8μlのHBSSを加えることによって測定した。下記の表1に記載のデータはIC50値、すなわちfMLPによって誘発されるエラスターゼ放出の50%抑制を達成するのに必要とされる活性薬剤の濃度(nMにて表示)である。組み合わせ実験では、アッセイに1000nMの9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン(C)を加え、フォルモテロール(F)またはサルメテロール(S)に関して濃度応答曲線を作成した。
【００７６】
【表１】
2005511657.tif 000004
β2アゴニスト(フォルモテロールまたはサルメテロール)とPDE4阻害剤〔9-シクロペンチル-5,6-ジヒドロ-7-エチル-3-(2-チエニル)-9H-ピラゾロ[3,4-c]-1,2,4-トリアゾロ[4,3-α]ピリジン〕とを組み合わせて施用すると、炎症前の好中球機能(pro-inflammatory neutrophil function)の相乗効果的な抑制をもたらすことが実証される。単離されたヒト好中球からの、fMLP誘発によるエラスターゼ放出の弱い(μM)抑制が、これらの薬物を使用する個別の処置によって達成され、組み合わせて施用することによって、抑制が強力な(nM)レベルにまで大幅に高められた。
【国際調査報告】
2005511657.tif 000007
2005511657.tif 000008
2005511657.tif 000009
2005511657.tif 000010
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