(57)【要約】哺乳動物細胞において、干渉ＲＮＡ分子を産生する方法を提供する。ＨＩＶ発現の阻害を含む、発現された分子の療法的使用もまた、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞において、二本鎖干渉ＲＮＡ分子を産生する方法であって：
ａ）ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含んでなるベクターに、該ＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列を挿入し；そして
ｂ）該ＲＮＡ分子が発現可能であるように、哺乳動物細胞に該ベクターを導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
ＲＮＡ分子が小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１の方法。
【請求項４】
ＤＮＡ配列を別個のベクターに挿入する、請求項１の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ配列を同一ベクターに挿入する、請求項１の方法。
【請求項６】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項１の方法。
【請求項７】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１の方法。
【請求項８】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが哺乳動物Ｕ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１の方法。
【請求項９】
ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳動物細胞に導入する、請求項１の方法。
【請求項１０】
ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物細胞に導入する、請求項１の方法。
【請求項１１】
ターゲット遺伝子発現を阻害する方法であって：
哺乳動物細胞に１以上のベクターを導入する
ことを含んでなり、
１以上の該ベクターが、適切なプロモーター並びに二本鎖の小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする、ＤＮＡ配列を含んでなり、そのため、ｓｉＲＮＡ分子を発現可能であり、そして哺乳動物細胞において、ターゲット遺伝子発現のＲＮＡ干渉を開始し、それによって、ターゲット遺伝子発現を阻害可能である
前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ配列が別個のベクター中にある、請求項９の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ配列が同一ベクター中にある、請求項９の方法。
【請求項１５】
ベクターがプラスミドベクターである、請求項１１の方法。
【請求項１６】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１１の方法。
【請求項１７】
プロモーターがＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１１の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが哺乳動物Ｕ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ターゲット遺伝子がＨＩＶターゲット遺伝子である、請求項１１の方法。
【請求項２０】
ＨＩＶがＨＩＶ−１である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ＨＩＶターゲット遺伝子がＨＩＶ−１  ｒｅｖである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
ＨＩＶターゲット遺伝子がＨＩＶ−１  ｔａｔである、請求項２０の方法。
【請求項２３】
ＨＩＶターゲット遺伝子がＨＩＶ−１  ｒｅｖおよびＨＩＶ−１  ｔａｔ両方である、請求項２０の方法。
【請求項２４】
哺乳動物細胞がＨＩＶ感染ヒト細胞である、請求項１９の方法。
【請求項２５】
小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の発現および機能を試験する方法であって：
哺乳動物細胞に、ｉ）適切な第一のプロモーター並びにｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする、ＤＮＡ配列を含んでなる１以上のベクター、並びにｉｉ）ターゲット遺伝子および適切な第二のプロモーターを含んでなり、そのためｓｉＲＮＡ分子を発現可能であり、そしてターゲット遺伝子発現のＲＮＡ干渉を開始し、それによって、ターゲット遺伝子発現を阻害可能であるベクターを同時導入する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２６】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ配列が別個のベクター中にある、請求項２５の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ配列が同一ベクター中にある、請求項２５の方法。
【請求項２９】
第一のプロモーターがＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項２５の方法。
【請求項３０】
ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが哺乳動物Ｕ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［００１］本発明は、米国衛生研究所に授与された助成金第Ａ１  ２９３２９号のもとに、政府の援助で行った。米国政府は、本発明に特定の権利を有する可能性がある。
発明の分野
［００２］本発明はＲＮＡ干渉に関する。より具体的には、本発明は哺乳動物細胞において、干渉ＲＮＡ分子を産生する方法、およびこうして発現された分子の療法的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［００３］ＲＮＡ干渉は、動物および植物における、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシング過程であり、サイレンシングされる遺伝子に相同な二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡによって開始される（Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．ら、２０００；Ｆｉｒｅ，  Ａ．、１９９９；Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ａ．、２００１）。特に、合成ｓｉＲＮＡおよび内因性ｓｉＲＮＡが、ターゲティングされるｍＲＮＡの分解を指示することが知られる（Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．ら、２０００；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．Ｊ．ら、２００１；Ｃｌｅｍｅｎｓ，  Ｊ．Ｃ．ら、２０００；Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．ら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｕｉ−Ｔｅｉ，  Ｋ．ら、２０００）。
【０００３】
［００４］この強力な遺伝子技術は、通常、モデル生物におけるｄｓ  ＲＮＡの注入またはトランスフェクションを伴っている。ＲＮＡ干渉はまた、多様な生物において、ターゲティングされる遺伝子の発現の強力な阻害剤でもある（Ｗｉａｎｎｙ，  Ｆ．ら、２０００；Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ，  Ｊ．Ｒ．ら、１９９８；Ｆｉｒｅ，  Ａ．ら、１９９８；Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｍ．ら、２０００；Ｓｖｏｂｏｄａ，  Ｐ．ら、２０００）。いくつかのグループによる最近の研究（Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．ら、２００１；Ｓｉｊｅｎ，  Ｔ．ら、２００１）によって、小さいｄｓ干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、ＲＮアーゼＩＩＩ関連ヌクレアーゼ（ダイサー）（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．ら、２００１）、ヘリカーゼ・ファミリー（Ｄａｌｍａｙ，  Ｔ．ら、２００１；Ｃｏｇｏｎｉ，  Ｃ．ら、１９９９）、およびおそらくキナーゼ（Ｎｙｋａｎｅｎ，  Ａ．ら、２００１）およびＲｄＲＰ（Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．ら、２００１；Ｓｍａｒｄｏｎ，  Ａ．ら、２０００）を含むリボタンパク質複合体の一部であることが示唆されている。Ｌｉｇａｒｄｉらに提唱される機構（Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．ら、２００１）は、ｓｉＲＮＡオリゴマーの１つ（ターゲットＲＮＡに対してアンチセンス）がＲｄＲＰをプライミングし、より長いｄｓＲＮＡを生成し、これがその後、ＲＮアーゼＩＩＩ活性によって、さらなるｓｉＲＮＡ二重鎖に切断され、それによってターゲット・テンプレートからｓｉＲＮＡを増幅するというものである。
【０００４】
［００５］３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞において、本質的に配列非特異的であるインターフェロン反応を誘発しうる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。しかし、短い３’オーバーハングを持つ２１ヌクレオチド（ｎｔ）のｓｉＲＮＡ二重鎖は、培養哺乳動物細胞において、配列特異的方式でＲＮＡ干渉を仲介可能である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。３’ＵＵまたはＴＴオーバーハングを持つ１９〜２１塩基二重鎖が、哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡ反応を有効に引き出しうることを、２つのグループが立証している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．Ｊ．ら、２００１）。しかし、脊椎動物細胞において、ｓｉＲＮＡを療法試薬として用いる際の１つの限界は、短い、高度に規定されたＲＮＡがターゲット細胞に搬送される必要があることであり、これは、これまでのところ、合成二重鎖ＲＮＡを用いて、細胞に外因的に搬送することによってしか達成されていない（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．Ｊ．ら、２００１）。
【０００５】
［００６］本発明は、少なくとも上述の限界を克服する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
［００７］１つの側面において、本発明は、干渉ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入することによって、哺乳動物細胞において、そして好ましくはヒト細胞において、二本鎖干渉ＲＮＡ分子を産生する方法を提供する。
【０００７】
［００８］別の側面において、該方法は、ａ）適切なプロモーター、好ましくはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含んでなるベクターに、干渉ＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列を挿入し、そしてｂ）該ＲＮＡ分子が発現可能であるように、哺乳動物細胞に該ベクターを導入することを含んでなる。
【０００８】
［００９］好ましい態様において、本発明は、まず、ターゲット配列を選択することを含み、ターゲット配列は、好ましくは、干渉ＲＮＡが適切に機能するのに必要な、ターゲット配列および干渉ＲＮＡ間の塩基対形成のために接近可能である。ターゲット部位を同定する方法は、本明細書に記載するように、細胞抽出物において合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、そして／または天然ＲＮＡに対して部位選択アプローチを行って、実行可能である。最適ターゲット部位が同定されたら、干渉ＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作成するのに適した配列を合成可能である。
【０００９】
［００１０］ありうるターゲット部位には、細胞性遺伝子または感染性病原体遺伝子（ウイルス遺伝子、細菌遺伝子など）の転写産物上に見られるものが含まれる。
［００１１］別の好ましい態様において、産生されるＲＮＡ分子は小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子であり、一方、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列は、ｓｉＤＮＡである。
【００１０】
［００１２］別の好ましい態様において、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターは哺乳動物Ｕ６プロモーターであり、そしてより好ましくはヒトＵ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである。
【００１１】
［００１３］別の側面において、本発明は、ターゲット遺伝子発現を阻害する方法であって、哺乳動物細胞に１以上のベクターを導入することを含んでなり、１以上の該ベクターが、適切なプロモーター並びに干渉ＲＮＡ分子、好ましくはｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする、ＤＮＡ配列を含んでなる、前記方法を提供する。その後、好ましくはターゲット遺伝子の転写産物に特異的である、干渉ＲＮＡ分子を発現させ、そして哺乳動物細胞において、ターゲット遺伝子のタンパク質発現のＲＮＡ干渉を開始し、それによって、ターゲット遺伝子発現を阻害することが可能である。
【００１２】
［００１４］別の側面において、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子の発現および機能を試験する方法であって、哺乳動物細胞に、ｉ）適切な第一のプロモーター並びにｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする、ＤＮＡ配列を含んでなる１以上のベクター、並びにｉｉ）ターゲット遺伝子および適切な第二のプロモーターを含んでなるベクターを同時導入することを含んでなる、前記方法を提供する。その後、ｓｉＲＮＡ分子を発現させ、そしてターゲット遺伝子発現のＲＮＡ干渉を開始し、それによって、ターゲット遺伝子発現を潜在的に阻害することが可能である。したがって、ｓｉＲＮＡ分子の内因性発現および機能は、あるとすればＲＮＡ干渉の存在に基づいて、そしてより具体的には、ターゲット遺伝子発現の阻害いずれかによって、アッセイ可能である。
【００１３】
［００１５］したがって、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子の設計および選択される疾患ターゲットに対する該分子の特異性に基づいて、多くのありうる療法適用を提供する。例えば、本発明の１つの適用は、ＨＩＶの治療であり、選択されるＨＩＶターゲットの発現を阻害するようにｓｉＲＮＡ分子を設計し、こうしてＨＩＶ発現を阻害することが可能である。
【００１４】
［００１６］好ましい態様において、本発明は、ＨＩＶターゲット遺伝子発現を阻害する方法であって、１以上のベクターを哺乳動物細胞、好ましくはＨＩＶ感染ヒト細胞に導入することを含んでなる、前記方法を提供する。１以上の該ベクターは、適切なプロモーター並びにｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする、ＤＮＡ配列を含んでなり、該ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくはＨＩＶターゲット遺伝子の転写産物に特異的である。より好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、選択されるＨＩＶターゲット遺伝子の転写産物上の選択されるターゲット部位に特異的である。その後、ｓｉＲＮＡ分子を発現させ、そしてターゲット遺伝子発現のＲＮＡ干渉を開始し、それによって、ターゲット遺伝子発現を阻害することが可能である。
【００１５】
［００１７］より好ましい態様において、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。別の好ましい態様において、ＨＩＶゲノム中の異なる部位をターゲティングする多数のｓｉＲＮＡ構築物を発現させ、それによっていくつかの異なるＨＩＶターゲット遺伝子発現のＲＮＡ干渉を開始し、そしてこうして該ウイルスのありうる遺伝子耐性を回避することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
［００２６］本発明にしたがって産生され、そして／または用いられる、干渉ＲＮＡ分子、およびより好ましくはｓｉＲＮＡ分子には、当該技術分野に知られる種類が含まれる。干渉ＲＮＡ分子、および好ましくはｓｉＲＮＡ分子は、概して、そして好ましくは約１９〜２３塩基対を含有する、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである。該分子はまた、好ましくは３’オーバーハング、より好ましくは３’ＵＵまたは３’ＴＴオーバーハングを含有する。
【００１７】
［００２７］用語「導入」は、細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでＤＮＡを導入する多様な方法を含み、こうした方法には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、および感染が含まれる。干渉ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを細胞に導入するには、ベクターが有用でそして好ましい剤である。可能なベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、あるいはアデノウイルスベクターまたはアデノ関連ベクターなどの他のベクターが含まれる。
【００１８】
［００２８］１つの態様において、ＤＮＡ配列は別個のベクターに含まれ、一方、別の態様において、ＤＮＡ配列は同一ベクターに含まれる。ＤＮＡ配列が同一ベクターに含まれる場合、ＤＮＡ配列はまた、同一転写カセットに挿入可能でもある。
【００１９】
［００２９］ＤＮＡを細胞に導入する、別の搬送系もまた、本発明で使用可能であり、これには、例えば、リポソームとともに、当該技術分野に知られる他の搬送系が含まれる。
【００２０】
［００３０］適切なプロモーターには、干渉ＲＮＡ分子をコードする配列と、機能可能であるように会合したかまたは連結された、該ＲＮＡ分子の発現を促進するプロモーターが含まれる。こうしたプロモーターには、当該技術分野に知られるような、細胞性プロモーターおよびウイルスプロモーターが含まれる。１つの態様において、プロモーターはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターであり、該プロモーターは、好ましくは、干渉ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のすぐ上流に位置する。多様なウイルスプロモーターが使用可能であり、これには、限定されるわけではないが、当該技術分野に知られるように、ウイルスＬＴＲとともに、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびＣＭＶプロモーターが含まれる。
【００２１】
［００３１］好ましい態様において、本発明は、哺乳動物Ｕ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、およびより好ましくは、ヒト細胞において、短い規定されたリボザイム転写物の発現に先に用いられているヒトＵ６ｓｎＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを用いる（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，  Ｅ．ら、１９９７；Ｇｏｏｄ，  Ｐ．Ｄ．ら、１９９７）。Ｕ６  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターおよびその単純な終結配列（４〜６のウリジン）は、細胞において、ｓｉＲＮＡを発現させることが見出された。適切に選択された干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする配列を転写カセットに挿入し、該ＲＮＡ分子の内因性発現および機能を試験するのに最適な系を提供することが可能である。
【００２２】
［００３２］好ましい態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。しかし、本発明は、脊椎動物細胞または真核生物細胞の他の種類などの、他のターゲット細胞において実行可能であることも理解される。
【００２３】
［００３３］本発明にしたがって、ＨＩＶ−１  ｒｅｖ配列に対してターゲティングしたｓｉＲＮＡ二重鎖の有効な発現を立証した。ｒｅｖ−ＥＧＦＰ（増進緑色蛍光タンパク質）融合構築物を一過性同時トランスフェクションアッセイで用いると、発現のおよそ９０％の阻害が観察された。同時トランスフェクションアッセイにおいて、ＨＩＶに対して同じｓｉＲＮＡ発現構築物を試験すると、ＨＩＶ  ｐ２４抗原レベルに４対数の減少が生じた。
【００２４】
［００３４］ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを用い、ヒト細胞において、適切な２１塩基オリゴマーＲＮＡを発現させて、上述の結果を達成した。転写物の最初の塩基がｓｉＲＮＡの最初の塩基であり、そして転写物が、該遺伝子にコードされる６つのＵの列内で終結するように、プロモーターを設計する。Ｕ６＋１プロモーターは、トリホスフェートで転写を開始し、そして転写物にＵ６  ＲＮＡの最初の２７塩基が含まれていないならば、転写物はキャップされない（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，  Ｅ．ら、１９９７；Ｇｏｏｄ，  Ｐ．Ｄ．ら、１９９７）。したがって、その構造が、特定のあらかじめ規定された必要条件を緊密に模倣するであろう、ｓｉＲＮＡを作成可能であると考えられた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．Ｊ．ら、２００１）。
【００２５】
［００３５］上述のように、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする配列が、同一ベクター中にあることも、または別個のベクター中にあることも可能であるように、発現カセットを設計する。センス鎖およびアンチセンス鎖両方を含有するベクターは、２つを別個に同時トランスフェクションするより優れていると予測されたが、この場合はそうではなかった。同時トランスフェクションによって、転写物がｄｓＲＮＡを形成する機会が十分にあるように、２つの配列が並列するようである。発現系の興味深い特徴は、センスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマー両方を発現する細胞において、予期されなかった異常なサイズの産物が多量に集積することである（図５Ａ〜図５Ｄ）。電気泳動およびブロッティング前に、ＲＮＡをＲＮアーゼで前処理した実験によって、このより大きな転写物が、二本鎖であることが示唆される。ｄｓＲＮＡは単純な二重鎖の形である可能性があるし、また、共有結合している可能性がある。共有結合ｓｉＲＮＡは、細胞で発現させた際に有効であることが示されており、この結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏ搬送したｓｉＲＮＡを用いた場合の結果と、幾分、相反する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｃａｐｌｅｎ，  Ｎ．Ｊ．ら、２００１）。
【００２６】
［００３６］アンチセンスオリゴおよびリボザイムで観察されるように（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、１９９８；Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、２００１；同時係属米国出願第０９／５３６，３９３号、２０００年３月２８日出願）、ｓｉＲＮＡ塩基対形成のためのターゲット部位接近可能性に相異があるかどうかを確かめるため、ｓｉＲＮＡの２つのターゲット部位を試験した。１つの部位は、細胞抽出物において、天然ＲＮＡに対して塩基対形成するアンチセンスが接近可能な部位を同定するよう設計されたオリゴヌクレオチドライブラリースキャニング機構によって選択し（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、２００１）、一方、もう一方の部位は、ＨＩＶ−１  ｔａｔ配列と重複するｒｅｖ部分で、無作為に選択した。これらの２つの部位に対して塩基対形成するオリゴの接近可能性に顕著な相異があれば、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合体におけるｓｉＲＮＡ阻害活性に顕著な相異が生じることになる。ｒｅｖ−ＥＦＧＰターゲットに対する強度に相異があるにもかかわらず、ＨＩＶ−１同時トランスフェクションアッセイにおいて、どちらのｓｉＲＮＡも、強力な阻害剤であった。したがって、本発明は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において、ｓｉＲＮＡの機能的な細胞性発現を示す。
【００２７】
［００３７］興味深い結果は、アンチセンスＤＮＡオリゴマー部位接近可能性およびｒｅｖ−ＥＧＦＰ転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡの有効性に関係があることであった。より具体的には、部位ＩのｓｉＲＮＡに仲介されるｒｅｖ−ＥＧＦＰターゲットの阻害が比較的欠如していることが観察された。これらのオリゴマーは、部位ＩＩ  ｓｉＲＮＡと同等の量で発現されているようであるため、この結果は、これらのオリゴマーの発現が劣っていた結果ではなかった（図５Ａ〜図５Ｄ）。これらの異なる結果は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、ｓｉＲＮＡの増幅を制限すると立証された、ターゲット転写物末端に比較したｓｉＲＮＡターゲット部位の位置のためである可能性がある（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。しかし、部位Ｉは、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰ転写開始部位の３０１ｎｔ下流に位置し、これはｓｉＲＮＡを増幅するのに必要な最短距離をはるかに越えているため、この場合はあてはまらないようである。これらの結果は、異なる実験で、異なるターゲットを用いたためである可能性があった。ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合ｍＲＮＡの背景で、部位Ｉの相対接近可能性は、オリゴ−ＲＮアーゼＨ実験によって示されるように、制限される可能性がある（図２）。ＨＩＶ−１転写物において、部位Ｉは、ｔａｔおよびｒｅｖ転写物両方に、それとともに、単一スプライシング転写物およびスプライシングされていない転写物にも存在する。異なる転写物が部位Ｉを宿する複雑さを考慮すると、これらのうちどれが、部位ＩのｓｉＲＮＡに感受性であるかを言及することは不可能である。
【００２８】
［００３８］ｓｉＲＮＡを試験するためのターゲットｍＲＮＡ。ウイルス遺伝子発現をサイレンシングするためにｓｉＲＮＡアプローチを開発するための必要条件は、適切なヒト細胞アッセイ系を有することである。ｓｉＲＮＡをアッセイするため、ｒｅｖをＥＧＦＰ（増進緑色蛍光タンパク質）に融合させて、ｓｉＲＮＡ機能を監視するレポーター系を提供した（図１Ａ）。エクジソン誘導性ｐＩＮＤベクター系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合遺伝子を挿入することによって、ターゲットｍＲＮＡ発現の一時的な調節が可能になった（図１Ａ）。同時トランスフェクションアッセイ中、選択されるターゲット遺伝子またはターゲット融合遺伝子を発現するのに、別のベクター系およびプロモーターが使用可能であることが、当業者には容易に明らかであろう。
【００２９】
［００３９］誘導性の系を使用するため、昆虫ホルモン類似体ポナステロンＡに反応するように操作された、２９３／ＥｃＲ細胞株を用いた。ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰベクターをこれらの細胞にトランスフェクションし、その後、誘導剤を添加すると、早ければポナステロンＡ添加の３時間後、ＥＧＦＰ蛍光が観察され、そして１００時間より長く続いた。ポナステロンＡの非存在下では、ＥＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【００３０】
［００４０］図１Ａにおいて、ｒｅｖ−ＥＧＦＰターゲット中の２つのｓｉＲＮＡターゲット部位の相対的な位置を示し、ｐＮＬ４−３由来のＨＩＶ転写物におけるこれら２つのターゲット部位の位置も示す。
【００３１】
［００４１］ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合転写物におけるターゲット部位接近可能性。細胞抽出物および卵巣抽出物において、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンスＤＮＡおよびリボザイム両方による塩基対形成に接近可能な部位を同定可能であることが先に立証された（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、１９９８；Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、２００１；Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００１）。ｒｅｖ−ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ転写物を発現している細胞から調製した細胞抽出物において、半無作為１９量体ＤＮＡオリゴマーライブラリーを用いた（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、２００１）。全ｒｅｖ配列をスクリーニングするのにこのアプローチを用いると、単一のＴｄＰＣＲ産物のみが同定され（データ未提示）、この産物は、ｒｅｖのＡＵＧコドンから２１３ｎｔ下流に位置し、そしてｐＩＮＤ転写開始部位の４９４ｎｔ下流に位置する、配列５’ＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣ３’（配列番号１０）内に中心があった。この配列は、ＣＵＣハンマーヘッドリボザイム切断モチーフを宿するため、ＣＵＣ部位の後で切断するハンマーヘッドリボザイムもまた合成した。これによって、同一プロモーター系から発現されるリボザイムとｓｉＲＮＡの阻害活性の比較が可能になった。既定のメッセージのｓｉＲＮＡが仲介するターゲティングに相違があるかどうかを決定するため、部位Ｉと類似の総ＧＣ含量を有する、５’Ｇおよび３’Ｃを含む第二の２１ｎｔ部位を選択した。５’Ｇおよび３’Ｃの必要性は、Ｇで始まるｐＴＺＵ６＋１転写物の第一のヌクレオチドに基づく（図１Ｃおよび図１Ｄ）。第二のターゲット配列、５’ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ３’（配列番号１１）もまた、ｔａｔおよびｒｅｖに共通のエクソンに位置し、ｒｅｖ翻訳開始コドンの２０ｎｔ下流に位置し、そしてｐＩＮＤ転写開始シグナルの３０１ｎｔ下流に位置する。
【００３２】
［００４２］図１Ｂに、Ｕ６発現カセットの上流プロモーターおよび転写物部分とともに、予測される一次転写物の配列および構造の図式的提示を示す。図１Ｃにおいて、２１塩基のセンス挿入物およびアンチセンス挿入物の配列とともに、６Ｔの列およびＸｂａＩを示す。最初のＧは、マング・ビーン（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）処理したｐＴＺＵ６＋１ベクターのＳａｌＩ断片に由来した。Ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡポリメラーゼによって、６Ｔを２Ｔ（大文字）にプロセシングすることが可能である。図１Ｄにおいて、３’ＵＵオーバーハングを含む、センスおよびアンチセンス２１量体（Ｓ／ＡＳ（Ｉ）または（ＩＩ））の同時発現由来の推定上のｓｉＲＮＡを示す。
【００３３】
［００４３］２つのターゲット配列がアンチセンス塩基対形成に等しく接近可能であるかどうかを決定するため、２つのｓｉＲＮＡターゲット部位の各々に相補的な、２つの２１量体ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、そして細胞抽出物において、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合転写物との塩基対形成に対する接近可能性のプローブとして用いた。部位ＩＩは、その同族（ｃｏｇｎａｔｅ）オリゴとの塩基対形成に対して、非常に接近可能であることが立証された（図２）（オリゴなしの対照に比較して、ＲＴ−ＰＣＲ産物が８９％減少）。これは、部位Ｉのオリゴで得られた結果と対照的であり、部位Ｉのオリゴの場合は、対照に比較して、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ転写物が２７％減少した。これらの２つの部位が、アンチセンス塩基対形成に対する接近可能性に顕著な相異を有するため（図２）、これらは、ｓｉＲＮＡが仲介するターゲティングにおいて、ターゲット接近可能性が果たす役割に関する優れた試験を提供した。
【００３４】
［００４４］図２において、エチジウムブロミドで染色されたバンドは、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物（上部、６７３ｎｔ）またはベータアクチン（下部、３４８ｎｔ）ｍＲＮＡに相当する。レーンは左から右に：対照、オリゴ非添加、マイナス（−）またはプラス（＋）ＲＴ；部位Ｉを探査する（ｐｒｏｂｉｎｇ）オリゴヌクレオチド、（−）または（＋）ＲＴ；部位ＩＩを探査するオリゴヌクレオチド、（−）または（＋）ＲＴである。ターゲットｍＲＮＡの減少は、先に記載されるように（Ｓｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、１９９８）、内因性ＲＮアーゼＨ活性によって引き出される。
【００３５】
［００４５］部位Ｉまたは部位ＩＩをターゲティングするｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を、ｐＴＺＵ６＋１のＰｏｌ  ＩＩＩ  Ｕ６  ＳｎＲＮＡプロモーターの後に挿入した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。これらが同一ベクター中にあるかまたは異なるベクター中にあるように、転写カセットを構築した。別個のベクター中の構築物は、一組のセンスおよびアンチセンス対照を提供した。
【００３６】
［００４６］ターゲット遺伝子発現の減少。ｓｉＲＮＡ配列とともに、センス、アンチセンス、またはリボザイム対照をターゲットｒｅｖ−ＥＧＦＰ発現プラスミドとともに、２９３／ＥｃＲ細胞に同時トランスフェクションした。１６〜２０時間後、誘導剤ポナステロンＡを細胞培養に添加し、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合産物の誘導を生じた。細胞をさらに４８時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡解析および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を行った。ｒｅｖ配列中の部位ＩＩをターゲティングするセンスＲＮＡオリゴマーおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーの組み合わせは、対照に比較して、およそ９０％、ＥＧＦＰシグナルを減少させ、一方、部位ＩをターゲティングするセンスＲＮＡオリゴマーおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーの組み合わせは、蛍光を穏やかにしか減少させなかった（図３および図４）。部位ＩＩのｓｉＲＮＡに仲介される阻害は、センスＲＮＡオリゴマーおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマー両方が、同一プラスミドまたは異なるプラスミド主鎖から発現されるかどうかにかかわらず、同様であった（図１Ｂおよび図１Ｃを参照されたい）。各々Ｕ６プロモーターから発現される、センスのみ、アンチセンスのみ、または部位ＩＩをターゲティングするリボザイムを含む対照構築物は、ベクター主鎖対照に比較して、ＥＧＦＰ発現の有意な減少を生じなかった（図３および図４）。
【００３７】
［００４７］図３では、示すように、２９３／ＥｃＲ細胞を、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰおよび多様なｓｉＲＮＡ構築物で同時トランスフェクションした。本明細書に記載するように、ポナステロンＡ添加後、ＥＧＦＰ発現に関して細胞を顕微鏡で調べた。パネルＥは、ｒｅｖに無関係なセンス／アンチセンス構築物である対照でトランスフェクションした後の蛍光細胞を示す。他の種類の対照（Ｓ（ＩＩ）、ＡＳ（ＩＩ）、ベクター）も同様であった（Ａ、Ｂ、Ｄ）。パネルＣは、２９３／ＥｃＲ細胞をＳ／ＡＳ（ＩＩ）でトランスフェクションした際、蛍光細胞が〜９０％減少することを示す。パネルＦ〜Ｊは、同数の細胞が各視野に存在することを示すＤＡＰＩ染色画像である。少なくとも３回の独立した実験で、ターゲット遺伝子の特異的サイレンシングを確認した。
【００３８】
［００４８］図４では、本明細書に記載するように、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰおよびｓｉＲＮＡ構築物で、２９３／ＥｃＲ細胞を同時トランスフェクションした。ＦＡＣＳによってＥＧＦＰ発現に関して細胞を解析し、そしてｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰのみでトランスフェクションした細胞に比較して蛍光レベルを定量化した。データは、３回の別個の実験の平均±ＳＤである。接近可能部位ＩＩに向けられたセンス配列およびアンチセンス配列両方を含有するｓｉＲＮＡ構築物（Ｓ／ＡＳ（ＩＩ）またはＳ＋ＡＳ（ＩＩ））のみが、対照またはベクターのみに比較して、およそ９０％の減少を示した。ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰと同時トランスフェクションしたＵ６駆動ｓｉＲＮＡ構築物の多様な組み合わせを示す。Ｓ／ＡＳは、ベクターがセンスｓｉＲＮＡ配列およびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列両方を含むことを示し、一方、Ｓ＋ＡＳは、ｓｉＲＮＡ配列が別個のベクター中にあることを示す。Ｒｂｚは、部位ＩＩに対するハンマーヘッドリボザイムを示す。ターゲット遺伝子の特異的サイレンシングは、少なくとも３回の独立の実験において、確認された。
【００３９】
［００４９］２９３細胞におけるｓｉＲＮＡおよびターゲットの発現。ノーザンゲル解析を行って、２９３細胞においてＵ６  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系から転写されるｓｉＲＮＡの発現パターンおよびサイズを調べた。これらのノーザンゲル解析によって、適切なプローブへのハイブリダイゼーションにより監視されるように、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの強い発現が立証された（図５）。
【００４０】
［００５０］図５において、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＧＦＰおよび示すような多様なｓｉＲＮＡ構築物で一過性に同時トランスフェクションし、そして上述のようにポナステロンＡ誘導に供した２９３／ＥｃＲ細胞から、ＲＮＡ試料を調製した。ｓｉＲＮＡ用には１０％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で、ターゲット用には１％アガロース／ホルムアミドゲル上で、またはＲＮアーゼＡ／Ｔ１処理用には１０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で、総ＲＮＡを分離した。図５Ａ〜図５Ｄでは、部位Ｉおよび部位ＩＩのｓｉＲＮＡに関して、センス転写物またはアンチセンス転写物の３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズ産物は、長さ〜２３〜４６ｎｔであった。図５Ｅは、部位ＩＩに向けられるリボザイム（ＩＩ）転写物のハイブリダイゼーションの結果を示す。部位ＩＩに対するリボザイムを発現している細胞からＲＮＡを調製すると、リボザイム転写物に関して予期されるサイズ（〜７５ｎｔ）の転写物が検出された。リボザイムを検出するのに用いたプローブはまた、部位ＩＩに対するアンチセンスｓｉＲＮＡにも相補的であるため、これはまた、部位ＩＩをターゲティングするアンチセンスＲＮＡにもハイブリダイズした。
【００４１】
［００５１］対照ＲＮＡ（センスのみ、アンチセンスのみ、またはリボザイム）はすべて、予期されるサイズで検出された（図５Ａ〜図５Ｅ）。センス構築物およびアンチセンス構築物を同時に発現する細胞から調製したＲＮＡは、個々の短いＲＮＡ（〜２３ｎｔ）に関して予期されるサイズのハイブリダイズ産物を生じた。単量体サイズのＲＮＡに加えて、短いＲＮＡオリゴマーのサイズのおよそ２倍の強いハイブリダイゼーション産物（〜４６ｎｔ）が、明らかに見えた（図５Ａ〜図５Ｅ）。この産物は、センスおよびアンチセンス両方を発現している細胞から調製したＲＮＡでのみ検出され、そしてセンスプローブおよびアンチセンスプローブ両方とハイブリダイズした（図５Ａ〜図５Ｅ）。転写物を分離するのに用いたゲル系は、変性ゲルであったため、異常なサイズの産物がｄｓＲＮＡである可能性はないようであった。にもかかわらず、この可能性を試験するため、変性ゲル電気泳動およびブロッティング前に、ＲＮＡ試料をＲＮアーゼＡおよびＴ１の混合物で処理した。これらのＲＮアーゼはどちらも、一本鎖ＲＮＡを優先的に切断する。したがって、異常な産物が二本鎖であるならば、ヌクレアーゼ分解に完全に耐性であるはずである。２種類の解析を行った。第一の解析は、ＲＮＡ試料をＲＮＡ混合物で単純に処理することを伴い、一方、第二の解析は、ＲＮアーゼ処理前に試料を９５℃に加熱することを伴った（図５Ｇ）。
【００４２】
［００５２］図５Ｇでは、Ｓ／ＡＳ（Ｉ＋ＩＩ）を用いた併用トランスフェクション由来のＲＮＡを、ＲＮアーゼＡおよびＴ１の混合物で処理した。ＲＮアーゼ処理前に、試料を９０℃に加熱する（＋）かまたは加熱しなかった（−）。ＲＮアーゼで処理したが、加熱しなかったレーンのハイブリダイズ産物は、長さ〜２１ｎｔでありうる。この産物は、部位ＩＩをターゲティングするセンスｓｉＲＮＡプローブまたはアンチセンスｓｉＲＮＡプローブいずれを用いても観察された。
【００４３】
［００５３］完全に二本鎖を形成したＲＮＡは、切断に耐性であるはずであり、一方、熱処理後、ＲＮＡを迅速に冷却すると、鎖が分離し、そして該ＲＮＡはＲＮアーゼ処理に感受性になるであろう。得た結果（図５Ｇ）は、異常なサイズの産物が二本鎖であることと一致した。非加熱試料をＲＮアーゼ混合物で処理すると、他のＲＮＡより速く移動する産物が生じた。より速く移動するＲＮＡ種は、アンチセンスプローブおよびセンスプローブ両方にハイブリダイズした。対照的に、ＲＮアーゼ処理前に加熱した試料は、検出可能なハイブリダイズバンドを生じなかった。この産物がより速く移動するのは、二重鎖の非塩基対形成端がＲＮアーゼでトリミングされたためである可能性がある。これらの産物はまた、一本鎖ループのＲＮアーゼ切断に由来する可能性もあり、こうした切断は２つのＲＮＡをはずし、より迅速なゲル移動を可能にするであろう。重要なことに、大きい、異常なサイズの転写物は、センス転写物およびアンチセンス転写物両方を発現している細胞においてのみ生成され、そしてしたがって、ｄｓＲＮＡの形成に依存しているはずである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．ら、２００１；Ｃｌｅｍｅｎｓ，  Ｊ．Ｃ．ら、２０００）。異常なサイズの産物に加えて、異常なサイズの産物および１０６ｎｔのＵ６  ｓｎＲＮＡの間に移動する別のバンドが、部位ＩＩに対するアンチセンスｓｉＲＮＡに相補的なプローブでのみ検出された。この産物は、長さ〜６５ｎｔであり、そしてｓｉＲＮＡアンチセンスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）伸長産物に対する最初のダイサー切断反応の産物である可能性がある（Ｌｉｐａｒｄｉ，  Ｃ．ら、２００１；Ｓｉｊｅｎ，  Ｔ．ら、２００１）。最後に、部位ＩＩをターゲティングするリボザイムのＵ６＋１発現（図５Ｅ）は、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ発現阻害を生じなかった（図４）。
【００４４】
［００５４］ｓｉＲＮＡ複合体が、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの分解を指示するかどうかを決定するため、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ転写物に関して探査するノーザンハイブリダイゼーション解析を行った（図５Ｆ）。図５Ｆは、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合転写物のハイブリダイゼーション結果を示す。各実験で、内部対照として、ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよびＵ６ｓｎＲＮＡを探査した。これらのデータによって、部位ＩＩのセンスｓｉＲＮＡおよびアンチセンスｓｉＲＮＡの組み合わせを発現している細胞でのみ、融合転写物が選択的に破壊されることが立証された。部位ＩのｓｉＲＮＡは、豊富に発現されているが（図５Ａおよび図５Ｂ）、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ発現のわずかな阻害しか生じず（図４）、転写物はほとんど分解されなかった（図５Ｆ）。部位Ｉおよび部位ＩＩのｓｉＲＮＡの組み合わせは、部位ＩＩのｓｉＲＮＡのみよりも少ない阻害しか生じなかった。これは、投薬量効果、すなわち、これらのｓｉＲＮＡをコードするプラスミド各々の濃度が、単一部位の同時トランスフェクションに用いられるものの半分であることから生じると考えられる。最も興味深いことに、部位ＩのｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ複製の強力な阻害剤であった。
【００４５】
［００５５］発現されたｓｉＲＮＡによるＨＩＶの阻害。本発明の別の態様において、ＨＩＶ−１感染を阻害するために、ｓｉＲＮＡ発現系を構築した。上述の多様な構築物の潜在的な阻害活性を試験するため、ｓｉＲＮＡベクター各々（部位Ｉおよび部位ＩＩ）とともに対照構築物を、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３プロウイルスＤＮＡと一緒に、２９３細胞に同時トランスフェクションした。図６に示す間隔で、細胞培養から上清試料を抜き取り、そしてＨＩＶ−１  ｐ２４ウイルス抗原レベルを測定した。図６では、ｐＮＬ４−３プロウイルスＤＮＡを、多様なＵ６＋１駆動ｓｉＲＮＡ構築物と、プロウイルスＤＮＡ対Ｕ６構築物ＤＮＡの１：５の比で、同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、および示した時間で、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原アッセイのため、上清アリコットを抜き取った。用いた多様なｓｉＲＮＡ構築物を図６に示す。
【００４６】
［００５６］部位ＩＩのｓｉＲＮＡはこのアッセイにおいて、ＨＩＶ−１複製を強く阻害することが見出された。幾分予想外なことに、部位ＩのｓｉＲＮＡもまた、ＨＩＶ−１複製を強力に阻害した（ｐ２４抗原産生によって測定した場合）。部位Ｉおよび部位ＩＩのｓｉＲＮＡ構築物両方の組み合わせが最も強力であり、対照構築物に比較しておよそ４対数の阻害を提供した。ＨＩＶ−１のこうした強力な阻害は、先に、同時トランスフェクションアッセイを用いた、ＲＮＡに基づく他の抗ＨＩＶ−１剤では、観察されたことがなかった。ＨＩＶ−１自体と対比して、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合体に対しては、部位ＩのｓｉＲＮＡによる阻害活性が異なることについて、ありうる説明を本明細書で検討する。２つの異なるＨＩＶターゲットがどちらもｓｉＲＮＡの基質であるという観察は、ウイルスの遺伝的耐性を回避するため、多重ターゲティングを要する戦略に対して非常に楽観的な材料となる。
【実施例】
【００４７】
［００５７］本発明は、以下の実施例にさらに例示され、これらの実施例は限定することを意図しない。
（実施例１）
接近可能性アッセイ
［００５８］アンチセンス塩基対形成のターゲット配列の接近可能性を評価するため、ｒｅｖ−ＧＦＰを含有する安定な２９３細胞から調製した細胞抽出物に存在する内因性ＲＮアーゼＨ活性を利用した。本明細書に記載するように、いくつか重要でない修飾を含むＳｃｈｅｒｒ，  Ｍ．ら、１９９８のプロトコルにしたがって、２つのターゲット部位各々に相補的な２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、そして細胞抽出物中の接近可能性のプローブとして用いた。
【００４８】
［００５９］ＣＭＶ−ｒｅｖＧＦＰ遺伝子を含有する安定な２９３細胞を、１００ｍｍプレート中、５０〜９０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖させた。細胞スクレーパーを用いて細胞を採取し、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回リンスした。同体積の低張性膨張緩衝液（７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）および最終体積の１／１０の中和緩衝液（２１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１１６ｍＭ  ＫＣｌ、３．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に、細胞を氷上で再懸濁した。再懸濁した溶液を、氷水槽中、１５秒間３回超音波処理した。ホモジネートを２０，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を直ちに使用するか、または同体積のグリセロール保存緩衝液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４５％グリセロール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中のアリコットとして−８０℃で保存した。これらの凍結アリコットは、常に、凍結後、３ヶ月以内に用いた。
【００４９】
［００６０］細胞抽出物を、４μＭの各２１ｂｐアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（部位Ｉまたは部位ＩＩ）とともに、総体積３０μｌの切断緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ  ＤＴＴ）中、３７℃で１５分間インキュベーションした。フェノール抽出およびエタノール沈殿後、沈殿物を２０ＵのＤＮアーゼＩを用いて、３７℃で４５分間消化し、その後、フェノール抽出およびエタノール沈殿を行った。沈殿物をＤＥＰＣ水に再懸濁し、そしてＯＤ２６０吸収に関して監視した。
【００５０】
［００６１］製造者の指示にしたがって、５Ｕのモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍｏ−ＭＬＶ  ＲＴアーゼ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ニューヨーク）と、上述の３０μｌの抽出試料から調製した３００ｎｇ〜１μｇの総ＲＮＡを用いて、逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。
【００５１】
［００６２］第一鎖プライミングは、ｒｅｖ配列に相補的なオリゴの３’プライマー２０ｐｍｏｌまたはランダムヘキサマープライマー５０ｎｇで行った。内部対照として、β−アクチンを用いた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、１．５Ｕのｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび２μｌのＲＴ反応試料を含有する、総体積５０μｌ中、各組のプライマーのＰＣＲ反応を別個に行った。対照のサイクルを研究した後、９４℃３０秒間、６８℃３０秒間、および７２℃３０秒間を全部で２４〜３６サイクルのＰＣＲを行った。
【００５２】
［００６３］反応試料を１．２％アガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロミド染色によって視覚化し、その後、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＴＭ定量ソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて定量化した。
【００５３】
（実施例２）
構築物
［００６４］ＣＭＶ−ｒｅｖ−ＧＦＰのｒｅｖ−ＧＦＰ融合遺伝子を含有する、ＳａｃＩＩ（埋め込み）−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ（埋め込み）−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、図１ＡのｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＧＦＰ構築物を得た。
【００５４】
［００６５］ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築するため、ｐＴＺ  Ｕ６＋１ベクターを用いて、２つのカセットを調製した（図１Ｂ）（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，  Ｅ．ら、１９９７；Ｇｏｏｄ，  Ｐ．Ｄ．ら、１９９７）。一方のカセットは２１ｎｔセンス配列を宿し、そしてもう一方は、２１ｎｔアンチセンス配列を宿する。部位Ｉまたは部位ＩＩいずれかをターゲティングするように、これらの配列を設計した（図１Ａ）。２１量体各々の３’末端に６Ｔの列を挿入し、その後、ＸｂａＩ制限部位が続いた。６Ｔの列およびＸｂａＩ制限部位を含む２０ｎｔセンス配列またはアンチセンス配列（最初のＧを除く）を合成オリゴヌクレオチドから調製した（Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００１；Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、１９９９）。挿入物の最初のＧは、マング・ビーン・ヌクレアーゼによって平滑端にしたベクターのＳａｌＩ部位によって提供された。Ｕ６プロモーター配列のすぐ下流で、平滑端クローニングするため、センスではＢｓｒＢＩで、アンチセンスではＡｌｕＩで（部位Ｉ）、センスではＳｔｕ１で、そしてアンチセンスではＳｎａＢＩで（部位ＩＩ）、挿入物を消化した。ＳａｌＩ（平滑端化）−ＸｂａＩ消化ｐＴＺＵ６＋１ベクターに挿入するため、挿入物の３’端をＸｂａＩで消化して、望ましい転写単位を生成した（図１Ｃ）。
【００５５】
［００６６］センス配列およびアンチセンス配列両方が同一ベクター中にあるプラスミドを生成するため、センス配列を宿するｐＴＺＵ６＋１ベクターをＢａｍＨＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて埋め込む）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。センス配列を含有する消化断片をアンチセンスＡＳ（Ｉ）またはＡＳ（ＩＩ）構築物のＳｐｈＩ（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋め込む）−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングして、センスおよびアンチセンス両方の転写単位を生成した（Ｓ／ＡＳ（Ｉ）またはＳ／ＡＳ（ＩＩ））（図１Ｃ）。上記構築物各々のＤＮＡ配列を使用前に確認した。
【００５６】
（実施例３）
細胞培養
［００６７］１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．４ｍｇ／ｍｌのゼオシンを補充したＥＭＥＭ中、２９３／ＥｃＲ細胞を３７℃で増殖させた。トランスフェクション２４時間前、ゼオシンを含まない新鮮な培地を用いて、５０〜７０％集密で、２４ウェルまたは６ウェルプレートに蒔いた。ターゲットプラスミド（ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＧＦＰ）およびｓｉＤＮＡの同時トランスフェクションを、１：１の比で、製造者に記載されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰｌｕｓＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて行った。０．５ｍｇのｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＧＦＰおよび０．５ｍｇのｓｉＤＮＡおよび０．１ｍｇのｐＣＭＶ−ｌａｃＺ（転写効率用）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ中に配合し、６ウェル培養あたりで適用した。細胞を一晩インキュベーションし、そしてその翌日、５ｍＭポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＥＧＦＰの発現を誘導した。誘導２日後、トランスフェクション細胞を採取して、モジュラーフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、フロリダ州）を用いたＦＡＣＳによって、ＥＧＦＰ蛍光を測定した。蛍光ｂ−ガラクトシダーゼアッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、コネチカット州）を用いて、トランスフェクション効率を標準化した。ＥＧＦＰ発現を監視するのに蛍光顕微鏡画像化もまた行った。顕微鏡での視覚化のため、細胞を２４ウェルプレート中、カバーガラス上で増殖させた。各０．２５ｍｇのｒｅｖ−ＥＧＦＰ発現プラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡ（総量０．５ｍｇ）を用いて、カバーガラス上で同時トランスフェクションを行った。２日後、トランスフェクション細胞を４％ＰＦＡ中、室温で１５分間固定し、そしてＤＡＰＩを含有する退色防止試薬で処理した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡およびＤＥＩ−７５０ビデオカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて、１／８秒間の曝露時間、４０倍の倍率で、画像を収集した。ターゲット遺伝子の特異的サイレンシングを少なくとも３回の独立した実験で確認した。
【００５７】
（実施例４）
ノーザンブロッティング
［００６８］上述のように、ｐＩＮＤ−ｒｅｖ−ＧＦＰおよびｓｉＲＮＡで一過性に同時トランスフェクションし、そしてポナステロンＡ誘導に供した２９３−ＥｃＲ細胞からＲＮＡ試料を調製した。製造者の指示にしたがってＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  Ｂ）を用いて、総ＲＮＡ単離を行った。ｓｉＲＮＡ用には１０％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で、またはターゲット用には１％アガロース／ホルムアミドゲル上で、総ＲＮＡを分離し、そしてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にトランスファーした。ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程は、３７℃で行った。センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡを検出するため、放射標識２１量体ＤＮＡプローブを用いた。ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡもまた、内部標準として探査した。ｒｅｖ  ｍＲＮＡの部位ＩＩをターゲティングするリボザイムを検出するため、リボザイムコア全体および隣接配列に相補的な４２量体のプローブを用いた（このプローブはまた、部位ＩＩに対するアンチセンスｓｉＲＮＡオリゴマーも検出する）。異常なサイズの４６ｎｔ  ＲＮＡを性質決定するため、Ｓ／ＡＳ（Ｉ＋ＩＩ）由来の総ＲＮＡを、９０℃で５分間、あらかじめ加熱するか、または加熱せずに、ＲＮアーゼＡおよびＴ１の混合物で、３７℃で３０分間処理した。
【００５８】
［００６９］ｒｅｖ−ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを検出するため、ｒｅｖ−ＧＦＰ融合タンパク質のＥＦＰ  ｍＲＮＡに相補的な２５量体のプローブを用いた。
（実施例５）
ＨＩＶ−１抗ウイルスアッセイ
［００７０］ｓｉＲＮＡの抗ＨＩＶ−１活性を測定するため、ｓｉＤＮＡおよび感染性ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ、ｐＮＬ４−３を２９３細胞に同時トランスフェクションして、一過性アッセイを行った。トランスフェクション前、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充した２ｍｌ  ＥＭＥＭ中、６ウェルプレートで細胞を２４時間増殖させ、そして製造者に記載されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰｌｕｓＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いてトランスフェクションした。０．８μｇのｓｉＤＮＡまたは対照、および０．２μｇのｐＮＬ４−３からなるＤＮＡ混合物を陽イオン性脂質中に配合し、そして細胞に適用した。１日、２日、３日および４日後、上清を収集し、そしてＨＩＶ−１  ｐ２４抗原（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐ）に関して解析した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲ５０００  ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ）の補助で、ｐ２４値を計算した。トランスフェクション４日後、トリパンブルー色素排除カウントを用いて、細胞生存度もまた計算した。
【００５９】
［００７１］上記によって、本発明の有用性、とりわけ、多様な遺伝的適用および療法的適用のためにｓｉＲＮＡ転写物を設計し、そして試験する有用性が立証される。本発明はまた、哺乳動物細胞における、ｓｉＲＮＡの機能的発現を最初に立証すると考えられる。
【００６０】
［００７２］上記の結果はまた、ＨＩＶ−１阻害剤としてのｓｉＲＮＡの有用性も立証する。ＨＩＶ−１ゲノムの異なる部位をターゲティングするいくつかのｓｉＲＮＡ構築物を組み合わせることによって、ウイルスの遺伝的耐性を回避することが可能であり、それによって、ＨＩＶ−１感染の治療のため、強力な遺伝子療法アプローチが生成されるはずである。
【００６１】
［００７３］本発明の背景を解明し、そして本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書に引用した刊行物および他の資料は、これらが本明細書に援用されると個々に示されたのと同じ度合いに、本明細書に援用される。
【００６２】
［００７４］本発明は、本発明の好ましい態様の詳細に言及して開示されているが、本開示は、限定する意味よりも例示の意味で意図されており、これは本発明の精神および付随する請求項の範囲内の修飾が、当業者には容易に思い浮かぶであろうことが意図されるためである。
【００６３】
参考文献
【００６４】
【化１】
2005527198.tif 000002
【００６５】
【化２】
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【００６６】
【化３】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】［００１８］図１Ａは、ターゲットｒｅｖ−ＥＧＦＰ構築物の概略図を示す。［００１９］図１Ｂ（配列番号９）は、Ｕ６プロモーター構築物およびＵ６プロモーター駆動ｓｉＲＮＡ構築物の概略図を示す。図１Ｃ（ＡＳ（Ｉ）（配列番号１）、Ｓ（Ｉ）（配列番号２）、ＡＳ（ＩＩ）（配列番号３）、Ｓ（ＩＩ）（配列番号４））は、Ｕ６プロモーター構築物およびＵ６プロモーター駆動ｓｉＲＮＡ構築物の概略図を示す。［００２０］図１Ｄは、本発明の態様にしたがった、ｓｉＲＮＡ（Ｓ（Ｉ）（配列番号５）、ＡＳ（Ｉ）（配列番号６）、Ｓ（ＩＩ）（配列番号７）、ＡＳ（ＩＩ）（配列番号８））を示す。
【図２】［００２１］図２は、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ発現細胞から調製した細胞抽出物における、部位Ｉおよび部位ＩＩの接近可能性アッセイ由来のゲル写真を示す。
【図３】［００２２］図３は、ＥＧＦＰ発現に対するｓｉＲＮＡの影響の蛍光顕微鏡画像化から得られた写真を示す。
【図４】［００２３］図４は、本発明の態様にしたがった、ｓｉＲＮＡによるＥＧＦＰ発現の阻害の度合いを示す棒グラフである。
【図５】［００２４］図５Ａ〜５Ｇは、ノーザンゲル解析のオートラジオグラフを示す。
【図６】［００２５］図６は、本発明の態様にしたがった、ｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の阻害を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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