(57)【要約】化合物(-)N-(-)_Nフェニルカルバモイルエセロリンを活性成分として使用する、アルツハイマー病などの認知障害の結果生じる疾患の治療用の組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式
2005526806.tif 000008
で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩からなる群より選択される活性成分を含む組成物を認知障害患者に投与する段階を含む、老化またはアルツハイマー病に関連した認知障害を示す疾患状態の患者の治療法であって、活性成分およびその塩を、疾患状態の進行の遅延に有効な量で投与する、治療法。
【請求項２】
活性成分を経口投与する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組成物が、薬学的に許容される担体を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
化学式
2005526806.tif 000009
で表される活性成分、およびその塩を含む組成物を認知障害患者に投与する段階を含む、老化またはアルツハイマー病に関連した認知障害を示す疾患状態の患者の治療法であって、組成物を経口投与して活性成分を0.5 mg〜10 mg/kg/日の用量で患者に提供する、治療法。
【請求項５】
活性成分を1〜5 mg/kg/日の量で投与する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
組成物が、20 mg〜500 mgの活性成分を含む単位経口剤型の形状である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
化学式
2005526806.tif 000010
で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩、ならびに体内投与に適した薬学的に許容される担体からなる群より選択される活性成分を含む、認知障害患者の治療用の組成物であって、活性成分が、疾患の進行の遅延に適した量で存在する、組成物。
【請求項８】
組成物が、患者への約0.5〜10 mg/kg/日の経口投与に十分な量の活性成分を含む、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
活性成分が、患者への約1〜5 mg/kg/日の投与に十分な量で含まれる、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
活性成分として、化学式
2005526806.tif 000011
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩、および経口投与に適した薬学的に許容される担体を含む、経口投与用の単位剤型中の組成物であって、活性成分が約20〜300 mgの量で存在する、組成物。
【請求項１１】
経口投与剤型が、錠剤またはカプセル剤である、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
活性成分を50 mg〜200 mgの量で含む、請求項11記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、アルツハイマー病などの認知障害の結果生じる疾患の、このような疾患の進行を遅らせる影響を改良する治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
これまでアルツハイマー病などの認知障害の治療に有用な化合物には、米国特許第5,409,948号（1995年4月25日）に記載された、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性に基づく、ドネペジル、リバスチグミン、およびガランタミンなどがあった。また、以下の構造をとる、負の光学的エナンチオマー(-)N-(-)_Nフェニルカルバモイルエセロリンであるフェンセリン、およびその塩、別のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、認知障害の治療に臨床的に使用されている。
2005526806.tif 000002
【０００３】
これらの化合物は、すべて抗コリンエステラーゼ阻害剤であることから、そのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性に起因する望ましくない副作用を生じるという重大な欠点がある。このような望ましくない副作用は、アセチルコリンエステラーゼの抑制によって生じる毒性と関連する。こうした化合物は、長期投与されると治療可能比（毒性と治療効果の比）が低くなることから、コリン作動性の低下に関連したいくつかの病理学的状態を生じる。したがって、認知障害の治療が長期に及ぶという性質から、有効でかつアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の使用に伴う毒性副作用を生じない薬剤の提供が長らく望まれてきた。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明によれば、以下の化学式で表される化合物、またはこの薬学的に許容される塩は、アルツハイマー病などの認知障害、および老化に関連する認知障害の患者を、抗コリンエステラーゼ阻害剤の毒性プロファイルに起因する副作用を伴うことなく治療するのに使用可能なことがわかっている。
2005526806.tif 000003
【０００５】
本発明は、化学式IIの化合物、またはその薬学的に許容される塩、および同化合物を患者に投与するための組成物を経口投与することによって、認知障害の患者を治療する方法に関する。
【０００６】
詳細な説明
本発明によれば、化学式IIで表される化合物、およびその薬学的に許容される塩は、認知障害患者の治療に有効であること、ならびにフェンセリン、リバスチグミン、ドネペジル、およびガランタミンなどの化合物に関連した抗コリンエステラーゼ活性に起因する毒性副作用を生じることなく、患者に経口投与可能なことがわかっている。この事実は、(+)9-N-フェニルカルビノールエセロリンである化学式IIの化合物が、化学式Iの化合物であるフェンセリンの非天然の(+)異性体であり、かつ抗コリンエステラーゼ活性がほとんどないことを考えれば特に驚くべきことである。実際にはフェンセリンとは異なり、化学式Iで表される化合物、およびその塩は、たとえあるにせよ極めて低い抗コリンエステラーゼ阻害活性を有する。したがって、抗コリンエステラーゼ薬剤の投与時に生じる悪心、嘔吐、めまい、振戦、徐脈などの毒性作用は、本発明の方法ではみられない。
【０００７】
本発明によれば、フェンセリンの(+)エナンチオマーが、老化またはアルツハイマー病と関連する認知障害の進行の強力な阻害剤であることがわかっている。化学式IIで表される化合物については、Pei, Greigら、「Inhibition of Human Acetylcholineesterase」、Med Cem Research Acad.（1995）5：265-270に開示されている。この論文では、その負のエナンチオマーであるフェンセリンとは異なり、化学式IIで表される化合物のヒトアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性が極めて低いことが示された。しかし、これにもかかわらず、本発明によれば、化学式IIで表される化合物が、毒性があると考えられるアミロイド-βペプチド（Aβ）レベルの減少に強力な作用をもつこと、ならびに同Aβタンパク質が、主にAβおよび神経原繊維の凝集体からなる老人斑の出現を特徴とする、記憶喪失に至る進行性神経変性状態を緩和させることがわかっている。Aβは40〜42残基のペプチドであり、695〜770残基を含むより大きなタンパク質βAPPに由来する。βAPPは、認知障害の病理学的特徴となりうるAβタンパク質に変換される。
【０００８】
本発明の一部として、化学式IIで表される化合物、およびその薬学的に許容される塩が、フェンセリンと同様に、βAPPタンパク質を操作して、非アミロイド生成性の副産物を産生することによってAβタンパク質の産生を低下させうることがわかっている。化学式IIで表される化合物が、その負のエナンチオマーであるフェンセリンとは異なり、強力な抗コリンエステラーゼ阻害剤ではないという事実を考えると、これは抗コリンエステラーゼ阻害活性に起因する副作用を生じない。(+)エナンチオマー型がアセチルコリンエステラーゼのそれほど強力な阻害剤ではないことは、「アセチルコリンエステラーゼ活性の50%を阻害するために必要な化合物の濃度は、(-)-フェンセリンの場合は22 nMであったが、(+)-フェンセリンの場合は25,000 nMを超えても不活性であった」という記述を含むShawらの論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）、98（13）、7605-7610）で報告された結果からわかる。したがってShawらの論文に開示された手順および結果によれば、フェンセリンの負のエナンチオマーとは異なり、化学式IIで表される化合物およびその塩は、アセチルコリンエステラーゼの有効な阻害剤ではない。
【０００９】
本発明によれば、化学式IIで表される(+)エナンチオマーは、アルツハイマー病、認知障害に関連した他の任意の痴呆症を含む、加齢性記憶障害における軽度の認知障害（minimal cognitive impairment）の治療に有効である。また、認知障害治療用の他の治療薬の使用とは異なり、化学式IIで表される化合物、およびその塩は、これらに抗コリンエステラーゼ活性がないという事実のために、より効果的であり、また抗コリンエステラーゼ阻害剤に関連する悪心、下痢、嘔吐、めまい、および徐脈などの毒性副作用を有しない。化学式IIで表される化合物、および/またはその塩が、コリンエステラーゼに影響を及ぼさないという事実から、本発明の化合物を、毒性副作用の危険性を伴わずに、治療で良好な結果を得るために高用量で患者に投与することができる。
【００１０】
本発明の治療法は、認知障害を示す、また老化またはアルツハイマー病に関連した症状のみられる患者を対象とする。このような認知障害を示す患者の多くでは、現れた症状がアルツハイマー病または老化過程に直接結びつくか否かについて確定診断を下すことは困難である。したがって本発明の方法は、老化またはアルツハイマー病に関連した認知障害の症状を示す疾患状態にある、特に50歳以上の患者に適用できる。
【００１１】
治療薬の用量は通常、投与経路、治療する患者の年齢、体重、および認知障害に関する状態によって変わる。一般に0.5 mg〜10 mg/kg/日の用量の、化学式IIで表される化合物および/またはその塩の患者への経口投与が有益な作用をもたらす。本発明によれば、1日当たり1.0 mg/kg〜5.0 mg/kgの経口用量の使用が一般に好ましく、1日当たり1 mg/kg〜2 mg/kgの用量が特に好ましい。化学式IIで表される化合物および/またはその塩は、1日に1〜4回、上記の用量で経口投与することができる。アルツハイマー病などの認知障害、および他の加齢性認知障害の任意の治療では、患者の生涯にわたる長期治療（継続治療）が必要な点に注意することが重要である。このように、こうした認知疾患に伴う認知障害の悪化、およびこのような認知障害の症状は安定化し、回復し、一部の症例では改善に向かう。このような疾患に起因する認知障害は、患者の生涯にわたって進行する。本発明の治療によって、このような認知障害の進行は食い止められる。したがって本発明の方法は、このような疾患状態の進行を緩和する手段となる。
【００１２】
化学式IIで表される化合物および/またはその塩がもつ、認知能力を改善する能力は、さまざまな既知の手段で評価可能である。このような手段には、「簡易知能試験（Mini, Mental State Examination）」や、「臨床痴呆評価（Clinical Dementia Rating）」、ならびに「アルツハイマー病評価スケール（Alzheimer's Disease Assessment Scale；ADAS-cog）」などの、このような疾患状態の進行を測定する標準試験がある。ADAS-cogは、記憶要素、定位、保持、推論、言語、および実行を含む認知能力を測定する多項目器具（multi-item instrument）である。ADAS-cogのスコア範囲は0〜70であり、高スコアほど認知障害の程度が高い。高齢健常者のスコアは0〜1と低い場合があるが、非痴呆成人のスコアが、より高くなることは異常ではない。ADAS-cog試験で測定する場合は、治療前と治療中の長期間にわたる変化を測定し、この疾患の進行を判定し、評点を未治療患者と比較する。本発明の方法で治療を行った患者の場合、治療された患者が治療中に、未治療患者と比較して、この試験において同じかまたは良好なスコアを示すことがわかっている。また、本発明の方法が全般的な結果を臨床的に生じる能力は、「変化についての臨床的インタビューに基づく印象（Clinical Interview Board Impression Of Change；CIBIC試験）」で評価可能である。同試験では、患者にインタビューを行って、患者の機能（一般認識機能、行動機能、および日常生活動作など）を調べる介護者ならびに医師から結果を得る。CIBICのスコアは、7点のカテゴリー評価範囲としてスコア化される。1点は「著しく改善」、4点は「変化なし」、7点は「著しく悪化」をそれぞれ意味する。本発明による治療中、大半の患者は4点を示し、一部はこれより良いスコア（すなわち低いスコア）を示す。一方、同じ任意の時期に同じ評価を示す非治療患者に関しては、その大半は、より高いスコア（4を上回るスコア）を得ており、これは状態の悪化を意味する。
【００１３】
化学式IIで表される化合物は、(+)エセロリンから以下の反応式を経て得られる：
2005526806.tif 000004
（式中R1はフェニルを示す）。
【００１４】
本発明の過程によれば、化学式IIIで表されるフィゾスチグミン化合物またはその塩は、化学式IIIで表される(-)フィゾスチグミン化合物をアルカリ金属水酸化物により水性反応溶媒中で加水分解することで、反応して化学式IVで表される(-)エセロリン化合物となる。次に、この水性反応溶媒から、化学式IVで表されるエセロリン化合物を純粋な状態で分離する。
【００１５】
精製後のエセロリンを次に、水混和性有機溶媒を含む無水反応溶媒中で、強い有機塩基で処理する。処理後のエセロリン化合物を次に、反応溶媒から分離することなく、化学式Vで表されるイソシアネートと反応させる。この反応は、化学式Vで表されるイソシアネート化合物を、反応溶媒中のエセロリン化合物と混合して、化学式IIで表されるエナンチオマーを形成させるように進む。この後、水を添加して反応を止めることで、化学式IIIで表される(+)フェンセリン化合物を純粋な状態で容易に分離できる。このほか、水を反応混合物に添加したり、反応混合物を水に添加することができる。一般には、反応混合物を水に加えることが好ましい。
【００１６】
本発明によれば、任意の薬学的に許容される、化学式IIで表される化合物の酸付加塩（acid addition salt）を、本発明の治療法および組成物に使用することができる。「薬学的に許容される塩」という表現は酸付加塩を意味する。「薬学的に許容される酸付加塩」という表現は、化学式IIで表される化合物の任意の無毒性の有機酸付加塩または無機酸付加塩を意味する（好ましい塩は酒石酸塩である）。適切な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウム、および硫酸水素カリウムなどの酸金属塩などがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸には、モノカルボン酸、ジカルボン酸、およびトリカルボン酸などがある。例示的なこのような酸には例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、ならびにp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、および2-ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸などがある。
【００１７】
本発明によれば、上記の化学式Iで表される化合物、もしくはこの薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される経口投与または経皮投与に有用である（経口投与が好ましい）。経口投与または経皮投与される、これらの本発明の薬学的組成物は、化学式Iで表される化合物、またはこの薬学的に許容される塩を、適合性のある薬学的に許容される担体材料とともに含む。任意の従来の担体材料が使用可能である。担体材料は、このような投与に適した、有機または無機の不活性担体材料とすることができる。適切な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどがある。また、このような薬学的調製物は、他の薬学的に活性のある薬剤を含む場合がある。香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤などの他の添加剤を、許容される薬学的調剤実践に従って添加することができる。
【００１８】
化学式IIで表される化合物および/またはこの薬学的に許容される塩を、本発明の好ましい態様に従って、経口単位投与剤型で投与することができる。上記の任意の従来の経口単位投与剤型を用いることができる。好ましい単位投与剤型は錠剤またはカプセル剤である。所望の作用効果を得るための1日量は、約20〜300 mgの活性成分を含む経口単位投与剤型で得られる（約50〜150 mgを含む経口単位投与剤型が特に好ましい）。上記担体の他に、このような経口投与剤型は通常、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、およびグライダント（glydant）などの従来のレシピエントを含む。また、このような経口単位投与剤型の調剤に用いる任意の従来の方法を本発明で使用することができる。
【００１９】
薬学的調製物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤などの経口投与用の固体を含む、任意の従来の経口単位投与剤型中に作製することができる。薬学的調製物は無菌化可能であり、かつ/または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧保持用塩類、および/または緩衝剤などの補助剤を含む場合がある。
【００２０】
本発明を、例示する目的のみであって排除する意図のない以下の実施例で詳述する。
【００２１】
実施例
実施例1
アルゴン雰囲気下で、50 wt%の水酸化ナトリウム溶液（67.7 g、0.8462 mol）を、脱気したDI水（300 mL）中のサリチル酸フィゾスチグミンの(+)エナンチオマー（100 g、0.2418 mol）のスラリーに45℃で滴下する。添加中は温度を45〜55℃に保つ。約3時間後、45℃で黄色い溶液を25〜30℃に冷却し、tert-ブチルメチルエーテル（300 mL）を添加する。水相のpHを、メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液（54 gのNa2S2O5、250 mLの水）で9.1に調節する。この混合物を30分間攪拌し、相を落ち着かせた後に分離する。水相をtert-ブチルメチルエーテル（各300 mL）で2回（各30分）抽出する。有機層を合わせ、20 wt%の塩化ナトリウム溶液（各200 mL）で3回洗浄した後に、硫酸マグネシウム（150 g）を用いて一晩乾燥させる。このスラリーをセライト（Celite）で濾過し、濾過ケーキをtert-ブチルメチルエーテルで洗浄する。濾液を25〜29インチの真空下で300 mLに濃縮し、残分をジエトキシメタン（各300 mL）で2回、共蒸留する。残分をジエトキシメタン（300 mL）で希釈し、50℃に加熱する。得られた軽い（light）スラリーを5℃に冷却し、45分間の攪拌後に、約300 mLに濃縮する。冷ヘプタン（300 mL）を滴下し、スラリーを20分間攪拌し、冷ヘプタン（125 mL）を加えて容積を増す。約2時間の攪拌後、スラリーをブフナー漏斗で濾過する。回収した固体を冷ヘプタン（200 mL）で洗浄し、一晩真空乾燥する。(+)エセロリン塩基（35.6 g）が白色固体として得られる（収率67.4%、純度98.3%）。
【００２２】
実施例2
(+)エセロリンエナンチオマー（50 g、0.299 mol）を、アルゴン雰囲気下で400 mLの無水ジメトキシエタンに溶解する。ヘキサンに溶解した触媒量の2.5 M n-ブチルリチウム（6.4 mL、16 mmol）を1分以内に添加し、この溶液を10分間攪拌する。フェニルイソシアネート（27.269 g、0.2286 mmol）を、20〜23℃の温度を保ちながら32分間かけて添加する。この反応溶液を室温で2時間20分攪拌後に、添加漏斗（addition funnel）に移す。この反応溶液を、49分間かけてDI水（630 mL）とジメトキシエタン（42 mL）の混合物中に、激しく攪拌しながら添加する。得られたスラリーを30分間攪拌した後にブフナー漏斗（Whatman #3濾紙）で濾過する。固体残分をDI水（各100 mL）で4回、そしてヘプタン（100 mL）で1回洗浄した後に、45℃で、29インチを上回る真空下で9時間乾燥させる。N-フェニルカルボナモイルエセロリンの(+)エナンチオマー（74.4 g）が赤みがかった固体として得られる（収率96.2%、純度95.1%）。
【００２３】
実施例3
アルゴン雰囲気下で、無水エタノール（131 mL）とDI水（3.3 mL）の混合物中の酒石酸溶液（17.12 g、0.114 mol）を、32分間かけて、無水エタノール（126 mL）とDI水（3.1 mL）の混合物中に上記手順で調製したN-フェニルカルバノイルエセロリンの(+)エナンチオマーのスラリー（35 g、0.1037 mol）に添加する。約60〜75%の酒石酸溶液を添加した後に、反応溶液にフェンセリン酒石酸（72 mg）を播いた。この反応混合物を19時間15分間、室温で攪拌後に、イソプロパノール（490 mL）と水（12 mL）の混合液を30分間かけて添加する。このスラリーを3.5時間攪拌し、ブフナー漏斗（Whatman #3濾紙）で濾過した。白色残渣をイソプロパノール（100 mL）で2回洗浄後に、45℃、29インチで19時間乾燥させ、酒石酸N-フェニルカルバノイルエセロリンの(+)エナンチオマーの酒石酸塩（38.62 g）を得た（収率76%、純度99.4%、白色固体）。
【００２４】
実施例4
実施例2で調製された化学式Iの(+)エナンチオマーを、フェンセリンに対して、βAPPレベルの制御、およびβ-APPタンパク質に由来する生じた毒性アミロイドタンパク質（Aβタンパク質）に関して、Shawら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA（2001）、98（13）、7605-7610に記載された手順で試験した。以下に示す試験が、フェンセリンの(+)エナンチオマー、ならびにフェンセリンそのものを含んでいたために、フェンセリンとその(+)エナンチオマーを、β-APPタンパク質およびAβタンパク質を減少させる作用について並行して試験した部分が7506〜7507ページとは異なる。この試験を実施するためのShawらの方法を以下に要約する。
【００２５】
薬物処理
SK-N-SH神経芽腫細胞を3×106細胞の濃度になるようにディッシュ（60 mm）で培養し、SH-SY-5Y神経芽腫細胞を3×105細胞の濃度になるようにディッシュ（100 mm）にプレーティングした。この細胞を完全培地（DMEM中、10% FBS、2 mM グルタミン）中で3〜4日間、70%コンフルエントになるまで成長させた。実験を開始する際に、使用済みの培地を除去し、0、5、または50 μMの(-)-フェンセリンまたは(+)-フェンセリンを含む新鮮な培地（DMEM＋0.5% FBS）と交換し、細胞を37℃で5% CO2雰囲気下で指定の時間インキュベートした。
【００２６】
溶解物の調製
各時点で使用済みの培地を回収し、後の分泌性βAPPレベルの解析用に-70℃で保存した。細胞溶解物は、以前に報告されたように調製した（Lahiriら、1997および1998）。上清中のタンパク質のレベルを、ブラッドフォード（Bradford）タンパク質アッセイ法（BioRad、Mellville、NY）で解析した。
【００２７】
ウェスタンブロット
各試料に由来する15 μgのタンパク質を、1×NuPAGE MOPS SDSランニング緩衝液（NOVEX、San Diego、CA）中の10% NuPAGE Bis-Trisゲルにロードし、タンパク質を200 Vで45分間かけて分離した。次にゲルを、25 Vで1.5時間かけてニトロセルロースにトランスファーした。非特異的な結合をブロックし、各ブロットを2時間、22C11抗βAPP N末端抗体（2.5 μg/mL、Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）、または抗活性化ERK抗体（25 ng/mL、Promega、Madison、WI）でプロービングした。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗マウスIgG、または抗ウサギIgGを二次抗体として用いた。試料が等量ローディングされたことは、ポンソー（Ponceau）S染色法（Sigma、St. Louis、MO）で判定した。ブロットの化学発光の濃度測定による定量は、CDカメラおよびNIH-IMAGE（バージョン4.1）を用いて行った。
【００２８】
乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ法
細胞の生存能および完全性のマーカーとして、培養上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の測定を、以前に記載の手順（Lahiriら、1997および1998）で行った。
【００２９】
全Aβアッセイ法
SH-SY-5YおよびSK-N-SH培養試料中の全Aβペプチドレベルを高感度ELISA（Suzukiら、1994）でアッセイした。全Aβの測定には、全種類のAβペプチド（Aβ1〜40）およびAβ1〜42の捕捉抗体としてAβの1〜40残基に対するウサギポリクローナル抗体、およびAβの17〜25残基に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ法でAβペプチドレベルを検出し、その値を6回の独立したアッセイ法の平均値として表した。
【００３０】
結果
この試験の結果を図1〜3に示す。図1は、βAPPレベルの減少が、さまざまな用量（0.5 μM〜50 μM）のフェンセリンを用いてさまざまな時間間隔で測定された対照であることが証明されうることを示す。上述のShawら（上述）の文献の7507ページの2段目の最上部の図と同じタイプのグラフである図1からわかるように、図1は、対照と比較時に、高用量のフェンセリンの使用が、SK-N-SH細胞中のβAPPレベルを減少させることを示している。いずれの場合において、16時間後であっても、βAPPタンパク質のレベルは、フェンセリン使用によって減少していた。図2は、Aβタンパク質のレベルが、フェンセリンを使用することで、対照と比較して、特に10時間後に実質的に減少したことを示している。図3は、フェンセリンの(+)エナンチオマーと、フェンセリンの(-)エナンチオマーの比較を示す。このグラフからわかるように、フェンセリンの正負の両方の鏡像異性体は、対照と比較したβAPPレベルの減少、ならびにAβタンパク質レベルの対照からの減少に有効である。したがって、抗コリンエステラーゼ活性のない(+)-フェンセリン鏡像異性体は、β-APPおよびAβタンパク質に関して、SK-N-SH細胞中において、(-)鏡像異性体であるフェンセリンそのものと類似の作用をもつ。
【００３１】
実施例5
インビボ試験法
(-)-フェンセリンを齧歯類の腹腔内に投与（生理食塩液中に1 ml/kg）すると、5 mg/kgの用量で細かい振戦が認められる。振戦は、典型的な中枢（すなわち脳）コリン作動性の過剰刺激（過駆動状態）作用である。このような振戦は約1時間続いた。振戦は、末梢性の過剰刺激（特に流涙や唾液増加）の症状とともに、7.5 mg/kgの(-)-フェンセリンの用量で認められた。20 mg/kgの(-)-フェンセリンの用量では、齧歯類は、重度の振戦および末梢の副作用（特に唾液増加による呼吸困難）によって能力低下状態となり、処置した5匹のうち2匹は瀕死の際に安楽死させた。しかし、同じ20 mg/kgの用量の(+)-フェンセリンを投与すると、個体には症状は何も認められなかった（わずかな振戦が認められ、外見は溶媒処置、非処置と同様であった）。
【００３２】
インビボ試験の結果
(-)-フェンセリンは、齧歯類（ならびにヒト）の学習および行動を、抗コリンエステラーゼとしての作用を介して改善し、コリン作動性の神経伝達物質であり、アルツハイマー病の脳では不足するアセチルコリンの量を増加させる。神経伝達物質であるアセチルコリンには、心拍数（迷走神経を経由）、胃の運動性、発汗、唾液増加、流涙などを制御する、脳以外で多くの機能がある。このような作用の刺激、ならびに脳のコリン作動系の過剰刺激を介して、典型的な抗コリンエステラーゼ（例えば抗コリンエステラーゼ薬物：リバスチグミンやガランタミン、ならびに高用量のフェンセリン）の毒性が生じる。しかし一方で、上記からわかるように、(+)-フェンセリンには抗コリンエステラーゼ活性がないので、コリン作動作用がない。したがってこれを(-)フェンセリンと比較して高用量で投与することができる。
【００３３】
実施例6
カプセル剤を、以下を活性成分（「活性成分」）として、化学式Iで表される化合物の酒石酸塩を用いて調製する：
2005526806.tif 000005
正味のカプセル充填重量は約260 mg。
【００３４】
実施例7
1．100 mgの「活性成分」を含む硬ゼラチンカプセル：
2005526806.tif 000006
【００３５】
手順：
「活性成分」を、ゼラチン、マルトデキストリン、dl-a-トコフェロール、およびアスコルビン酸ナトリウムの溶液中で湿式粉砕する。
湿式粉砕後の懸濁液を噴霧乾燥する。
噴霧乾燥後の粉末を、微結晶セルロースおよびステアリン酸マグネシウムと混合する。
各260 mgの同混合物を、適切な大きさおよび色の硬ゼラチンカプセル中に充填する。
【００３６】
実施例8
2．150 mgの「活性成分」を含む錠剤：
2005526806.tif 000007
【００３７】
手順：
活性成分を無水ラクトースおよび微結晶セルロースと混合する。
同混合物を水中で、ポリビニルピロリドン、dl-a-トコフェロール、およびアスコルビン酸ナトリウムの溶液/分散液で顆粒化する。
この顆粒状材料をステアリン酸マグネシウムと混合後に、粒を250 mgの重量で圧縮する。
核を上記組成の溶液/懸濁液で被膜コーティングする。
【００３８】
実施例9
この実施例は、酒石酸塩としての化学式Iの(+)エナンチオマーの有効性を測定することができる手順を示す。
【００３９】
無作為化二重盲検プラセボ対照試験を実施して、アルツハイマー病（PAD）患者と類似の症状があると診断された患者60人を対象に12週間にわたって毎日投与して、酒石酸(+)フェンセリンの有効性、または実施例6における生成を測定する。この試験では、一次言語が英語で、50〜85歳の男女の患者で構成される計60人のPAD適格患者を対象とした。
【００４０】
試験計画
全体の試験計画
一般的事項
40人の患者が、2週間にわたるPTおよび50 mgのBID用量レベルを受ける。この時点で、用量を100 mg BIDに増加する（この状態で最終の10週間を維持する）。同時に、プラセボ薬が割り当てられた20人の患者は、マッチさせたプラセボカプセル剤を全12週間の試験期間に与えられる。十分な数の患者候補を対象にスクリーニングを行い、60人の適格症例の参加を確保する。
【００４１】
全試験参加者を対象に、以下に示す標準有効性試験で、試験前（第1レベル）に、および定期的に評価を行った；
・NPI（神経精神医学項目）
・CGIC（臨床医による全般的な変化の印象）
・ADAS-cog（アルツハイマー病評価尺度-認知サブスケール）
・MMSE（簡易知能試験（Mini-Mental State Exam）
・CANTAB（ケンブリッジ神経心理試験自動化バッテリー（Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery））
・ADCS-ADL（日常生活活動）
【００４２】
12週間の試験終了時、処置群の患者は、上記試験のすべてに関して、少なくとも処置前の第1レベルと同じ程度のレベルを維持する。患者の約30%では、12週間の期間の最後におけるこのレベルに改善が見られる。一方で、非処置患者に関しては、上記試験で測定された第1レベルを超える改善は認められず、この対照群の患者の大半は、第1レベルからの低下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本出願に付随して以下を参照する。
【図１】フェンセリンが、分泌性および細胞性のβAPP量を濃度依存的に減少させることを示す。
【図２】βAPPに及ぼすフェンセリンの作用が、Aβタンパク質量の減少と解釈されることを示す。
【図３】フェンセリンの正の異性体が、βAPPおよびAβタンパク質の産生を、フェンセリンと同様の様式で低下させることを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式II2005526806.tif 000012
で表される化合物、およびその薬学的に許容される塩、ならびに体内投与に適した薬学的に許容される担体からなる群より選択される活性成分を含む、認知障害患者の治療用の組成物であって、活性成分が、疾患の進行の遅延に適した量で存在する、組成物。
【請求項２】
患者への約0.5〜10 mg/kg/日の経口投与に十分な量の活性成分を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
活性成分が、患者への約1〜5 mg/kg/日の投与に十分な量で含まれる、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
20 mg〜500 mgの活性成分を含む単位経口剤型の形状である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
活性成分として、化学式II2005526806.tif 000013
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩、および経口投与に適した薬学的に許容される担体を含む、経口投与用の単位剤型中の組成物であって、活性成分が約20〜300 mgの量で存在する、組成物。
【請求項６】
経口投与剤型が、錠剤またはカプセル剤である、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
活性成分を50 mg〜200 mgの量で含む、請求項6記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】技術分野  本発明は、アルツハイマー病などの認知障害の結果生じる疾患の、このような疾患の進行を遅らせる影響を改良する治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】発明の背景  これまでアルツハイマー病などの認知障害の治療に有用な化合物には、米国特許第5,409,948号（1995年4月25日）に記載された、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性に基づく、ドネペジル、リバスチグミン、およびガランタミンなどがあった。また、以下の構造をとる、負の光学的エナンチオマー(-)N-(-)_Nフェニルカルバモイルエセロリンであるフェンセリン、およびその塩、別のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が、認知障害の治療に臨床的に使用されている。2005526806.tif 000014
【０００３】  これらの化合物は、すべて抗コリンエステラーゼ阻害剤であることから、そのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性に起因する望ましくない副作用を生じるという重大な欠点がある。このような望ましくない副作用は、アセチルコリンエステラーゼの抑制によって生じる毒性と関連する。こうした化合物は、長期投与されると治療可能比（毒性と治療効果の比）が低くなることから、コリン作動性の低下に関連したいくつかの病理学的状態を生じる。したがって、認知障害の治療が長期に及ぶという性質から、有効でかつアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の使用に伴う毒性副作用を生じない薬剤の提供が長らく望まれてきた。
【発明の開示】
【０００４】発明の概要  本発明によれば、以下の化学式で表される化合物、またはこの薬学的に許容される塩は、アルツハイマー病などの認知障害、および老化に関連する認知障害の患者を、抗コリンエステラーゼ阻害剤の毒性プロファイルに起因する副作用を伴うことなく治療するのに使用可能なことがわかっている。2005526806.tif 000015
【０００５】  本発明は、化学式IIの化合物、またはその薬学的に許容される塩、および同化合物を患者に投与するための組成物を経口投与することによって、認知障害の患者を治療する方法に関する。
【０００６】詳細な説明  本発明によれば、化学式IIで表される化合物、およびその薬学的に許容される塩は、認知障害患者の治療に有効であること、ならびにフェンセリン、リバスチグミン、ドネペジル、およびガランタミンなどの化合物に関連した抗コリンエステラーゼ活性に起因する毒性副作用を生じることなく、患者に経口投与可能なことがわかっている。この事実は、(+)9-N-フェニルカルビノールエセロリンである化学式IIの化合物が、化学式Iの化合物であるフェンセリンの非天然の(+)異性体であり、かつ抗コリンエステラーゼ活性がほとんどないことを考えれば特に驚くべきことである。実際にはフェンセリンとは異なり、化学式Iで表される化合物、およびその塩は、たとえあるにせよ極めて低い抗コリンエステラーゼ阻害活性を有する。したがって、抗コリンエステラーゼ薬剤の投与時に生じる悪心、嘔吐、めまい、振戦、徐脈などの毒性作用は、本発明の方法ではみられない。
【０００７】  本発明によれば、フェンセリンの(+)エナンチオマーが、老化またはアルツハイマー病と関連する認知障害の進行の強力な阻害剤であることがわかっている。化学式IIで表される化合物については、Pei, Greigら、「Inhibition of Human Acetylcholineesterase」、Med Cem Research Acad.（1995）5：265-270に開示されている。この論文では、その負のエナンチオマーであるフェンセリンとは異なり、化学式IIで表される化合物のヒトアセチルコリンエステラーゼ阻害剤としての活性が極めて低いことが示された。しかし、これにもかかわらず、本発明によれば、化学式IIで表される化合物が、毒性があると考えられるアミロイド-βペプチド（Aβ）レベルの減少に強力な作用をもつこと、ならびに同Aβタンパク質が、主にAβおよび神経原繊維の凝集体からなる老人斑の出現を特徴とする、記憶喪失に至る進行性神経変性状態を緩和させることがわかっている。Aβは40〜42残基のペプチドであり、695〜770残基を含むより大きなタンパク質βAPPに由来する。βAPPは、認知障害の病理学的特徴となりうるAβタンパク質に変換される。
【０００８】  本発明の一部として、化学式IIで表される化合物、およびその薬学的に許容される塩が、フェンセリンと同様に、βAPPタンパク質を操作して、非アミロイド生成性の副産物を産生することによってAβタンパク質の産生を低下させうることがわかっている。化学式IIで表される化合物が、その負のエナンチオマーであるフェンセリンとは異なり、強力な抗コリンエステラーゼ阻害剤ではないという事実を考えると、これは抗コリンエステラーゼ阻害活性に起因する副作用を生じない。(+)エナンチオマー型がアセチルコリンエステラーゼのそれほど強力な阻害剤ではないことは、「アセチルコリンエステラーゼ活性の50%を阻害するために必要な化合物の濃度は、(-)-フェンセリンの場合は22 nMであったが、(+)-フェンセリンの場合は25,000 nMを超えても不活性であった」という記述を含むShawらの論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）、98（13）、7605-7610）で報告された結果からわかる。したがってShawらの論文に開示された手順および結果によれば、フェンセリンの負のエナンチオマーとは異なり、化学式IIで表される化合物およびその塩は、アセチルコリンエステラーゼの有効な阻害剤ではない。
【０００９】  本発明によれば、化学式IIで表される(+)エナンチオマーは、アルツハイマー病、認知障害に関連した他の任意の痴呆症を含む、加齢性記憶障害における軽度の認知障害（minimal cognitive impairment）の治療に有効である。また、認知障害治療用の他の治療薬の使用とは異なり、化学式IIで表される化合物、およびその塩は、これらに抗コリンエステラーゼ活性がないという事実のために、より効果的であり、また抗コリンエステラーゼ阻害剤に関連する悪心、下痢、嘔吐、めまい、および徐脈などの毒性副作用を有しない。化学式IIで表される化合物、および/またはその塩が、コリンエステラーゼに影響を及ぼさないという事実から、本発明の化合物を、毒性副作用の危険性を伴わずに、治療で良好な結果を得るために高用量で患者に投与することができる。
【００１０】  本発明の治療法は、認知障害を示す、また老化またはアルツハイマー病に関連した症状のみられる患者を対象とする。このような認知障害を示す患者の多くでは、現れた症状がアルツハイマー病または老化過程に直接結びつくか否かについて確定診断を下すことは困難である。したがって本発明の方法は、老化またはアルツハイマー病に関連した認知障害の症状を示す疾患状態にある、特に50歳以上の患者に適用できる。
【００１１】  治療薬の用量は通常、投与経路、治療する患者の年齢、体重、および認知障害に関する状態によって変わる。一般に0.5 mg〜10 mg/kg/日の用量の、化学式IIで表される化合物および/またはその塩の患者への経口投与が有益な作用をもたらす。本発明によれば、1日当たり1.0 mg/kg〜5.0 mg/kgの経口用量の使用が一般に好ましく、1日当たり1 mg/kg〜2 mg/kgの用量が特に好ましい。化学式IIで表される化合物および/またはその塩は、1日に1〜4回、上記の用量で経口投与することができる。アルツハイマー病などの認知障害、および他の加齢性認知障害の任意の治療では、患者の生涯にわたる長期治療（継続治療）が必要な点に注意することが重要である。このように、こうした認知疾患に伴う認知障害の悪化、およびこのような認知障害の症状は安定化し、回復し、一部の症例では改善に向かう。このような疾患に起因する認知障害は、患者の生涯にわたって進行する。本発明の治療によって、このような認知障害の進行は食い止められる。したがって本発明の方法は、このような疾患状態の進行を緩和する手段となる。
【００１２】  化学式IIで表される化合物および/またはその塩がもつ、認知能力を改善する能力は、さまざまな既知の手段で評価可能である。このような手段には、「簡易知能試験（Mini, Mental State Examination）」や、「臨床痴呆評価（Clinical Dementia Rating）」、ならびに「アルツハイマー病評価スケール（Alzheimer's Disease Assessment Scale；ADAS-cog）」などの、このような疾患状態の進行を測定する標準試験がある。ADAS-cogは、記憶要素、定位、保持、推論、言語、および実行を含む認知能力を測定する多項目器具（multi-item instrument）である。ADAS-cogのスコア範囲は0〜70であり、高スコアほど認知障害の程度が高い。高齢健常者のスコアは0〜1と低い場合があるが、非痴呆成人のスコアが、より高くなることは異常ではない。ADAS-cog試験で測定する場合は、治療前と治療中の長期間にわたる変化を測定し、この疾患の進行を判定し、評点を未治療患者と比較する。本発明の方法で治療を行った患者の場合、治療された患者が治療中に、未治療患者と比較して、この試験において同じかまたは良好なスコアを示すことがわかっている。また、本発明の方法が全般的な結果を臨床的に生じる能力は、「変化についての臨床的インタビューに基づく印象（Clinical Interview Board Impression Of Change；CIBIC試験）」で評価可能である。同試験では、患者にインタビューを行って、患者の機能（一般認識機能、行動機能、および日常生活動作など）を調べる介護者ならびに医師から結果を得る。CIBICのスコアは、7点のカテゴリー評価範囲としてスコア化される。1点は「著しく改善」、4点は「変化なし」、7点は「著しく悪化」をそれぞれ意味する。本発明による治療中、大半の患者は4点を示し、一部はこれより良いスコア（すなわち低いスコア）を示す。一方、同じ任意の時期に同じ評価を示す非治療患者に関しては、その大半は、より高いスコア（4を上回るスコア）を得ており、これは状態の悪化を意味する。
【００１３】  化学式IIで表される化合物は、(+)エセロリンから以下の反応式を経て得られる：2005526806.tif 000016
（式中R1はフェニルを示す）。
【００１４】  本発明の過程によれば、化学式IIIで表されるフィゾスチグミン化合物またはその塩は、化学式IIIで表される(-)フィゾスチグミン化合物をアルカリ金属水酸化物により水性反応溶媒中で加水分解することで、反応して化学式IVで表される(+)エセロリン化合物となる。次に、この水性反応溶媒から、化学式IVで表されるエセロリン化合物を純粋な状態で分離する。
【００１５】  精製後のエセロリンを次に、水混和性有機溶媒を含む無水反応溶媒中で、強い有機塩基で処理する。処理後のエセロリン化合物を次に、反応溶媒から分離することなく、化学式Vで表されるイソシアネートと反応させる。この反応は、化学式Vで表されるイソシアネート化合物を、反応溶媒中のエセロリン化合物と混合して、化学式IIで表されるエナンチオマーを形成させるように進む。この後、水を添加して反応を止めることで、化学式IIIで表される(+)フェンセリン化合物を純粋な状態で容易に分離できる。このほか、水を反応混合物に添加したり、反応混合物を水に添加することができる。一般には、反応混合物を水に加えることが好ましい。
【００１６】  本発明によれば、任意の薬学的に許容される、化学式IIで表される化合物の酸付加塩（acid addition salt）を、本発明の治療法および組成物に使用することができる。「薬学的に許容される塩」という表現は酸付加塩を意味する。「薬学的に許容される酸付加塩」という表現は、化学式IIで表される化合物の任意の無毒性の有機酸付加塩または無機酸付加塩を意味する（好ましい塩は酒石酸塩である）。適切な塩を形成する例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウム、および硫酸水素カリウムなどの酸金属塩などがある。適切な塩を形成する例示的な有機酸には、モノカルボン酸、ジカルボン酸、およびトリカルボン酸などがある。例示的なこのような酸には例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、ならびにp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、および2-ヒドロキシエタンスルホン酸などのスルホン酸などがある。
【００１７】  本発明によれば、上記の化学式Iで表される化合物、もしくはこの薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される経口投与または経皮投与に有用である（経口投与が好ましい）。経口投与または経皮投与される、これらの本発明の薬学的組成物は、化学式Iで表される化合物、またはこの薬学的に許容される塩を、適合性のある薬学的に許容される担体材料とともに含む。任意の従来の担体材料が使用可能である。担体材料は、このような投与に適した、有機または無機の不活性担体材料とすることができる。適切な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどがある。また、このような薬学的調製物は、他の薬学的に活性のある薬剤を含む場合がある。香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤などの他の添加剤を、許容される薬学的調剤実践に従って添加することができる。
【００１８】  化学式IIで表される化合物および/またはこの薬学的に許容される塩を、本発明の好ましい態様に従って、経口単位投与剤型で投与することができる。上記の任意の従来の経口単位投与剤型を用いることができる。好ましい単位投与剤型は錠剤またはカプセル剤である。所望の作用効果を得るための1日量は、約20〜300 mgの活性成分を含む経口単位投与剤型で得られる（約50〜150 mgを含む経口単位投与剤型が特に好ましい）。上記担体の他に、このような経口投与剤型は通常、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、およびグライダント（glydant）などの従来のレシピエントを含む。また、このような経口単位投与剤型の調剤に用いる任意の従来の方法を本発明で使用することができる。
【００１９】  薬学的調製物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤などの経口投与用の固体を含む、任意の従来の経口単位投与剤型中に作製することができる。薬学的調製物は無菌化可能であり、かつ/または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧保持用塩類、および/または緩衝剤などの補助剤を含む場合がある。
【００２０】  本発明を、例示する目的のみであって排除する意図のない以下の実施例で詳述する。
【００２１】実施例実施例1  アルゴン雰囲気下で、50 wt%の水酸化ナトリウム溶液（67.7 g、0.8462 mol）を、脱気したDI水（300 mL）中のサリチル酸フィゾスチグミンの(+)エナンチオマー（100 g、0.2418 mol）のスラリーに45℃で滴下する。添加中は温度を45〜55℃に保つ。約3時間後、45℃で黄色い溶液を25〜30℃に冷却し、tert-ブチルメチルエーテル（300 mL）を添加する。水相のpHを、メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液（54 gのNa2S2O5、250 mLの水）で9.1に調節する。この混合物を30分間攪拌し、相を落ち着かせた後に分離する。水相をtert-ブチルメチルエーテル（各300 mL）で2回（各30分）抽出する。有機層を合わせ、20 wt%の塩化ナトリウム溶液（各200 mL）で3回洗浄した後に、硫酸マグネシウム（150 g）を用いて一晩乾燥させる。このスラリーをセライト（Celite）で濾過し、濾過ケーキをtert-ブチルメチルエーテルで洗浄する。濾液を25〜29インチの真空下で300 mLに濃縮し、残分をジエトキシメタン（各300 mL）で2回、共蒸留する。残分をジエトキシメタン（300 mL）で希釈し、50℃に加熱する。得られた軽い（light）スラリーを5℃に冷却し、45分間の攪拌後に、約300 mLに濃縮する。冷ヘプタン（300 mL）を滴下し、スラリーを20分間攪拌し、冷ヘプタン（125 mL）を加えて容積を増す。約2時間の攪拌後、スラリーをブフナー漏斗で濾過する。回収した固体を冷ヘプタン（200 mL）で洗浄し、一晩真空乾燥する。(+)エセロリン塩基（35.6 g）が白色固体として得られる（収率67.4%、純度98.3%）。
【００２２】実施例2  (+)エセロリンエナンチオマー（50 g、0.299 mol）を、アルゴン雰囲気下で400 mLの無水ジメトキシエタンに溶解する。ヘキサンに溶解した触媒量の2.5 M n-ブチルリチウム（6.4 mL、16 mmol）を1分以内に添加し、この溶液を10分間攪拌する。フェニルイソシアネート（27.269 g、0.2286 mmol）を、20〜23℃の温度を保ちながら32分間かけて添加する。この反応溶液を室温で2時間20分攪拌後に、添加漏斗（addition funnel）に移す。この反応溶液を、49分間かけてDI水（630 mL）とジメトキシエタン（42 mL）の混合物中に、激しく攪拌しながら添加する。得られたスラリーを30分間攪拌した後にブフナー漏斗（Whatman #3濾紙）で濾過する。固体残分をDI水（各100 mL）で4回、そしてヘプタン（100 mL）で1回洗浄した後に、45℃で、29インチを上回る真空下で9時間乾燥させる。N-フェニルカルボナモイルエセロリンの(+)エナンチオマー（74.4 g）が赤みがかった固体として得られる（収率96.2%、純度95.1%）。
【００２３】実施例3  アルゴン雰囲気下で、無水エタノール（131 mL）とDI水（3.3 mL）の混合物中の酒石酸溶液（17.12 g、0.114 mol）を、32分間かけて、無水エタノール（126 mL）とDI水（3.1 mL）の混合物中に上記手順で調製したN-フェニルカルバノイルエセロリンの(+)エナンチオマーのスラリー（35 g、0.1037 mol）に添加する。約60〜75%の酒石酸溶液を添加した後に、反応溶液にフェンセリン酒石酸（72 mg）を播いた。この反応混合物を19時間15分間、室温で攪拌後に、イソプロパノール（490 mL）と水（12 mL）の混合液を30分間かけて添加する。このスラリーを3.5時間攪拌し、ブフナー漏斗（Whatman #3濾紙）で濾過した。白色残渣をイソプロパノール（100 mL）で2回洗浄後に、45℃、29インチで19時間乾燥させ、酒石酸N-フェニルカルバノイルエセロリンの(+)エナンチオマーの酒石酸塩（38.62 g）を得た（収率76%、純度99.4%、白色固体）。
【００２４】実施例4  実施例2で調製された化学式Iの(+)エナンチオマーを、フェンセリンに対して、βAPPレベルの制御、およびβ-APPタンパク質に由来する生じた毒性アミロイドタンパク質（Aβタンパク質）に関して、Shawら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA（2001）、98（13）、7605-7610に記載された手順で試験した。以下に示す試験が、フェンセリンの(+)エナンチオマー、ならびにフェンセリンそのものを含んでいたために、フェンセリンとその(+)エナンチオマーを、β-APPタンパク質およびAβタンパク質を減少させる作用について並行して試験した部分が7506〜7507ページとは異なる。この試験を実施するためのShawらの方法を以下に要約する。
【００２５】薬物処理  SK-N-SH神経芽腫細胞を3×106細胞の濃度になるようにディッシュ（60 mm）で培養し、SH-SY-5Y神経芽腫細胞を3×105細胞の濃度になるようにディッシュ（100 mm）にプレーティングした。この細胞を完全培地（DMEM中、10% FBS、2 mM グルタミン）中で3〜4日間、70%コンフルエントになるまで成長させた。実験を開始する際に、使用済みの培地を除去し、0、5、または50 μMの(-)-フェンセリンまたは(+)-フェンセリンを含む新鮮な培地（DMEM＋0.5% FBS）と交換し、細胞を37℃で5% CO2雰囲気下で指定の時間インキュベートした。
【００２６】溶解物の調製  各時点で使用済みの培地を回収し、後の分泌性βAPPレベルの解析用に-70℃で保存した。細胞溶解物は、以前に報告されたように調製した（Lahiriら、1997および1998）。上清中のタンパク質のレベルを、ブラッドフォード（Bradford）タンパク質アッセイ法（BioRad、Mellville、NY）で解析した。
【００２７】ウェスタンブロット  各試料に由来する15 μgのタンパク質を、1×NuPAGE MOPS SDSランニング緩衝液（NOVEX、San Diego、CA）中の10% NuPAGE Bis-Trisゲルにロードし、タンパク質を200 Vで45分間かけて分離した。次にゲルを、25 Vで1.5時間かけてニトロセルロースにトランスファーした。非特異的な結合をブロックし、各ブロットを2時間、22C11抗βAPP N末端抗体（2.5 μg/mL、Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）、または抗活性化ERK抗体（25 ng/mL、Promega、Madison、WI）でプロービングした。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた抗マウスIgG、または抗ウサギIgGを二次抗体として用いた。試料が等量ローディングされたことは、ポンソー（Ponceau）S染色法（Sigma、St. Louis、MO）で判定した。ブロットの化学発光の濃度測定による定量は、CDカメラおよびNIH-IMAGE（バージョン4.1）を用いて行った。
【００２８】乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ法  細胞の生存能および完全性のマーカーとして、培養上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の測定を、以前に記載の手順（Lahiriら、1997および1998）で行った。
【００２９】全Aβアッセイ法  SH-SY-5YおよびSK-N-SH培養試料中の全Aβペプチドレベルを高感度ELISA（Suzukiら、1994）でアッセイした。全Aβの測定には、全種類のAβペプチド（Aβ1〜40）およびAβ1〜42の捕捉抗体としてAβの1〜40残基に対するウサギポリクローナル抗体、およびAβの17〜25残基に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ法でAβペプチドレベルを検出し、その値を6回の独立したアッセイ法の平均値として表した。
【００３０】結果 この試験の結果は、以下のように、βAPPレベルの減少が、さまざまな用量（0.5 μM〜50 μM）のフェンセリンを用いてさまざまな時間間隔で測定された対照であることが証明されうることを示す。1）対照と比較時に、高用量のフェンセリンの使用が、SK-N-SH細胞中のβAPPレベルを減少させた。いずれの場合において、16時間後であっても、βAPPタンパク質のレベルは、フェンセリン使用によって減少していた。2）Aβタンパク質のレベルが、フェンセリンを使用することで、対照と比較して、特に10時間後に実質的に減少した。そして、3）フェンセリンの正負の両方の鏡像異性体は、対照と比較したβAPPレベルの減少、ならびにAβタンパク質レベルの対照からの減少に有効である。したがって、抗コリンエステラーゼ活性のない(+)-フェンセリン鏡像異性体は、β-APPおよびAβタンパク質に関して、SK-N-SH細胞中において、(-)鏡像異性体であるフェンセリンそのものと類似の作用をもつ。
【００３１】実施例5インビボ試験法  (-)-フェンセリンを齧歯類の腹腔内に投与（生理食塩液中に1 ml/kg）すると、5 mg/kgの用量で細かい振戦が認められる。振戦は、典型的な中枢（すなわち脳）コリン作動性の過剰刺激（過駆動状態）作用である。このような振戦は約1時間続いた。振戦は、末梢性の過剰刺激（特に流涙や唾液増加）の症状とともに、7.5 mg/kgの(-)-フェンセリンの用量で認められた。20 mg/kgの(-)-フェンセリンの用量では、齧歯類は、重度の振戦および末梢の副作用（特に唾液増加による呼吸困難）によって能力低下状態となり、処置した5匹のうち2匹は瀕死の際に安楽死させた。しかし、同じ20 mg/kgの用量の(+)-フェンセリンを投与すると、個体には症状は何も認められなかった（わずかな振戦が認められ、外見は溶媒処置、非処置と同様であった）。
【００３２】インビボ試験の結果  (-)-フェンセリンは、齧歯類（ならびにヒト）の学習および行動を、抗コリンエステラーゼとしての作用を介して改善し、コリン作動性の神経伝達物質であり、アルツハイマー病の脳では不足するアセチルコリンの量を増加させる。神経伝達物質であるアセチルコリンには、心拍数（迷走神経を経由）、胃の運動性、発汗、唾液増加、流涙などを制御する、脳以外で多くの機能がある。このような作用の刺激、ならびに脳のコリン作動系の過剰刺激を介して、典型的な抗コリンエステラーゼ（例えば抗コリンエステラーゼ薬物：リバスチグミンやガランタミン、ならびに高用量のフェンセリン）の毒性が生じる。しかし一方で、上記からわかるように、(+)-フェンセリンには抗コリンエステラーゼ活性がないので、コリン作動作用がない。したがってこれを(-)フェンセリンと比較して高用量で投与することができる。
【００３３】実施例6  カプセル剤を、以下を活性成分（「活性成分」）として、化学式Iで表される化合物の酒石酸塩を用いて調製する：2005526806.tif 000017
正味のカプセル充填重量は約260 mg。
【００３４】実施例71．100 mgの「活性成分」を含む硬ゼラチンカプセル：2005526806.tif 000018
【００３５】手順：「活性成分」を、ゼラチン、マルトデキストリン、dl-a-トコフェロール、およびアスコルビン酸ナトリウムの溶液中で湿式粉砕する。湿式粉砕後の懸濁液を噴霧乾燥する。噴霧乾燥後の粉末を、微結晶セルロースおよびステアリン酸マグネシウムと混合する。各260 mgの同混合物を、適切な大きさおよび色の硬ゼラチンカプセル中に充填する。
【００３６】実施例82．150 mgの「活性成分」を含む錠剤：  組成：  錠剤核：2005526806.tif 000019
【００３７】手順：活性成分を無水ラクトースおよび微結晶セルロースと混合する。同混合物を水中で、ポリビニルピロリドン、dl-a-トコフェロール、およびアスコルビン酸ナトリウムの溶液/分散液で顆粒化する。この顆粒状材料をステアリン酸マグネシウムと混合後に、粒を250 mgの重量で圧縮する。核を上記組成の溶液/懸濁液で被膜コーティングする。
【００３８】実施例9  この実施例は、酒石酸塩としての化学式Iの(+)エナンチオマーの有効性を測定することができる手順を示す。
【００３９】  無作為化二重盲検プラセボ対照試験を実施して、アルツハイマー病（PAD）患者と類似の症状があると診断された患者60人を対象に12週間にわたって毎日投与して、酒石酸(+)フェンセリンの有効性、または実施例6における生成を測定する。この試験では、一次言語が英語で、50〜85歳の男女の患者で構成される計60人のPAD適格患者を対象とした。
【００４０】試験計画全体の試験計画一般的事項  40人の患者が、2週間にわたるPTおよび50 mgのBID用量レベルを受ける。この時点で、用量を100 mg BIDに増加する（この状態で最終の10週間を維持する）。同時に、プラセボ薬が割り当てられた20人の患者は、マッチさせたプラセボカプセル剤を全12週間の試験期間に与えられる。十分な数の患者候補を対象にスクリーニングを行い、60人の適格症例の参加を確保する。
【００４１】  全試験参加者を対象に、以下に示す標準有効性試験で、試験前（第1レベル）に、および定期的に評価を行った；・NPI（神経精神医学項目）・CGIC（臨床医による全般的な変化の印象）・ADAS-cog（アルツハイマー病評価尺度-認知サブスケール）・MMSE（簡易知能試験（Mini-Mental State Exam）・CANTAB（ケンブリッジ神経心理試験自動化バッテリー（Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery））・ADCS-ADL（日常生活活動）
【００４２】  12週間の試験終了時、処置群の患者は、上記試験のすべてに関して、少なくとも処置前の第1レベルと同じ程度のレベルを維持する。患者の約30%では、12週間の期間の最後におけるこのレベルに改善が見られる。一方で、非処置患者に関しては、上記試験で測定された第1レベルを超える改善は認められず、この対照群の患者の大半は、第1レベルからの低下を示す。
【国際調査報告】
2005526806.tif 000020