(57)【要約】オリゴベースのマイクロアレイを調べる新規の標識ｃＲＮＡ方法を開示する。該ポリヌクレオチド鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むランダムプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡへ逆転写される。このｃＤＮＡは次に、標識前駆体の存在下でのインビトロでの転写を経由する標識ＲＮＡの合成の鋳型として用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の試料中および第２の試料（第１の試料および第２の試料は、１またはそれ以上の細胞由来の多数の異なるｍＲＮＡをそれぞれ含有する）中の少なくとも１つの当該ｍＲＮＡの存在または量を比較する方法であって、
（ａ）該試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを（i）ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより、ファーストストランドｃＤＮＡを合成すること；
（ｂ）ファーストストランドｃＤＮＡを（i）セカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成すること；
（ｃ）該２本鎖ｃＤＮＡを単離および精製すること；
（ｄ）該精製２本鎖ｃＤＮＡを鋳型由来のＤＮＡ転写が生じるのに十分な条件下でのインビトロでの転写の対象としすること（該ｃＲＮＡが生成される）；
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成されたｃＲＮＡを第１の標識で標識すること；
（ｆ）ステップ（ａ）〜（ｄ）を該第２の試料で繰り返すこと；
（ｇ）ステップ（ｆ）で生成されたｃＲＮＡを該第１の標識と区別可能な第２の標識で標識すること；
（ｈ）該第１の標識で標識された第１のｃＲＮＡを当該ｍＲＮＡの該第１のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させることにより、第１の試料中の該ｍＲＮＡを検出および測定すること；および該プローブと該第１のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出すること；
（i）該第２の標識で標識された第２のｃＲＮＡを当該ｍＲＮＡの該第２のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能な該ポリヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させることにより、第２の試料中の該ｍＲＮＡを検出または測定すること；および該プローブと該第２のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出すること；および
（ｊ）該第１の試料中の検出または測定された当該ｍＲＮＡのレベルを該第２の試料中の検出または測定されたｍＲＮＡのレベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
該試料が細胞由来の全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該細胞が原核細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該原核細胞が酵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該細胞が真核細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該真核細胞が哺乳類細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該試料が１×１０６細胞またはそれ未満の細胞由来の全ＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該試料が少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡポリメラーゼがE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
プライマーがそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該ｍＲＮＡがポリアデニル化末端をさらに含み、かつｍＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ（ｄＴ）プライマーと組み合わせてＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該オリゴ（ｄＴ）プライマーが固体支持体の表面と安定的に関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の標識および第２の標識が、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標識が蛍光である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光標識が、フルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはローダミン１１０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１の一定分量の第１のｃＲＮＡが第１の発光スペクトルを有する第１のフルオロフォアで標識され、かつ第２の一定分量の第２のｃＲＮＡが第１の発光スペクトルのものとは異なる第２の発光スペクトルを有する第２のフルオロフォアで標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
第１のフルオロフォアがＣｙ３であり、かつ第２のフルオロフォアがＣｙ５である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｈ）および（i）において、該第１の標識で標識された第１のｃＲＮＡを該ポリヌクレオチドプローブと接触せること、および該第２の標識で標識された第２のｃＲＮＡを該ポリヌクレオチドプローブと接触させることを同時に実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該第１の試料が異常である細胞由来のｍＲＮＡを含有し、かつ該第２の試料が正常細胞由来のｍＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該第１の試料が薬物処理された細胞由来のｍＲＮＡを含有し、かつ該第２の試料が無処理の細胞由来のｍＲＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該検出または測定ステップ（ｈ）および（ｉ）が、該第１のｃＲＮＡおよび第２のｃＲＮＡを配列上の予め選択された部位に位置する１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分な条件下で接触させること、および該ポリヌクレオチドプローブよ該ｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することを含む方法により実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
配列が少なくとも１つの表面を有する支持体および少なくとも１００の異なるポリヌクレオチドプローブ（それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブが異なるヌクレオチド配列を含み、かつ該表面上の異なる、選択された位置の支持体の表面に接着され得る）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
異なるポリヌクレオチドプローブのそれぞれのヌクレオチド配列が４０〜８０ヌクレオチド長の範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドプローブがｃＤＮＡ配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
配列が少なくとも２，０００の異なる配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチドプローブが少なくとも１０，０００の異なるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
配列が１ｃｍ２当たり少なくとも１，０００のポリヌクレオチドプローブを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が当該細胞のゲノム中の少なくとも５０％の遺伝子に特異的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
多数の異なるｍＲＮＡを含有する試料から少なくとも１つのｃＲＮＡを合成する方法であって、
（ａ）該試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを（i）ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより、ファーストストランドｃＤＮＡを合成すること；
（ｂ）ファーストストランドｃＤＮＡを（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマー（ここで、該第２のランダムプライマーはセカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的である）および（ii）ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを合成すること；
（ｃ）該２本鎖ｃＤＮＡを単離および精製すること；および
（ｄ）該精製２本鎖ｃＤＮＡを鋳型由来のＤＮＡ転写が生じるのに十分な条件下でのインビトロでの転写の対象とすること（該ｃＲＮＡが生成される）、
を含む方法。
【請求項３５】
該試料が細胞由来の全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを含有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該細胞が原核細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該原核細胞が酵母細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該細胞が真核細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
該真核細胞が哺乳類細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該試料が１×１０６細胞またはそれ未満の細胞由来の全ＲＮＡを含有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
該試料が少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
該ＤＮＡポリメラーゼがE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
プライマーがそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
該ｍＲＮＡがポリアデニル化末端をさらに含み、かつ該ｍＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ（ｄＴ）プライマーと組合せてＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマーと逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４９】
該オリゴ（ｄＴ）プライマーが固体支持体の表面と安定的に関連する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
転写ｃＲＮＡを標識で標識することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
標識が蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
標識が蛍光である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
蛍光標識がフルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはローダミン１１０である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
インビトロでの転写ステップの後、該試料中の標的ｍＲＮＡの存在または非存在を測定することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５５】
インビトロでの転写ステップの後、該試料中の標的ｍＲＮＡへの薬物処理の作用を測定することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５６】
ｍＲＮＡが少なくも１つの当該細胞から抽出され、かつ（ｅ）ステップ（ｄ）で生成されたｃＲＮＡを配列上の予め選択された部位に位置する１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドを含有する配列と、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させること；および（ｆ）該１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドと該ｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５７】
配列が少なくとも１つの表面を有する支持体および少なくとも１００の異なるポリヌクレオチドプローブ（それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブが異なるヌクレオチド配列を含み、かつ該表面の異なる、選択された位置の支持体の表面に接触する）を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
異なるポリヌクレオチドプローブのそれぞれのヌクレオチド配列が４０〜８０ヌクレオチド長の範囲である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリヌクレオチドプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドプローブがｃＤＮＡ配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
配列が少なくとも２，０００の異なる配列のポリヌクレオチドプローブを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
ポリヌクレオチドプローブが少なくとも１０，０００の異なるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
配列が１ｃｍ２当たり少なくとも１，０００のポリヌクレオチドプローブを有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が当該細胞のゲノム中の少なくとも５０％の遺伝子に特異的である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
２本鎖デオキシリボ核酸分子を１本鎖リボ核酸分子から生成する方法であって、
（ａ）該リボ核酸分子を（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること（これにより、第１のデオキシリボ核酸分子が生成される）；
（ｂ）該第１のデオキシリボ核酸分子を（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼと鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること（これにより、第２のデオキシリボ核酸分子が生成される）；および
（ｃ）生じた２本鎖デオキシリボ核酸分子を単離および生成すること（該２本鎖デオキシリボ核酸分子が生成される）
を含む方法。
【請求項６６】
該１本鎖リボ核酸分子がｍＲＮＡである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該デオキシリボ核酸分子がｃＤＮＡである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
ＤＮＡポリメラーゼがE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
プライマーがそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
該方法が該２本鎖デオキシリボ核酸分子をベクターに導入することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
該１本鎖リボ核酸分子がポリアデニル化末端をさらに含み、かつ該リボ核酸分子が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むオリゴ（ｄＴ）と組み合わせてＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触される、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
該１本鎖リボ核酸分子がｍＲＮＡである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
該デオキシリボ核酸分子がｃＤＮＡである、請求項７４による方法。
【請求項７７】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＴ３  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＲＮＡポリメラーゼがＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
プライマーがそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である、請求項７４に記載の方法。
【請求項８１】
該方法が該２本鎖デオキシリボ核酸分子をベクターに導入することをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項８２】
該オリゴ（ｄＴ）プライマーが固体支持体の表面と安定的に関連する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８３】
５’濃縮ｃＤＮＡライブラリーをｍＲＮＡ分子の試料から生成する方法であって、
（ａ）該ｍＲＮＡを（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること（これにより、ｃＤＮＡ分子の第１群が生成される）；
（ｂ）ｃＤＮＡ分子の該第１群を（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼと鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること（これにより、ｃＤＮＡ分子の第２群が生成される）；および
（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡ分子の該第２群を単離すること（該５’濃縮ライブラリーが生成される）、
を含む方法。
【請求項８４】
（ａ）それぞれの第１のプライマーが１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列（該３’末端配列が該３’末端配列のそれぞれの位置にランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣヌクレオチドを含む）を含む；およびそれぞれの第１のプライマーが１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列（該５’末端配列がＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む）を含む、第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物；
（ｂ）それぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマーが１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列（該３’末端配列が該３’末端配列のそれぞれの位置に存在するＴヌクレオチドを含む）を含む；およびそれぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマーが１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列（該５’末端配列がＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む）を含む、オリゴ（ｄＴ）プライマーの混合物；および
（ｃ）それぞれの第２のプライマーが１０〜５０ヌクレオチドの配列（該配列は該配列のそれぞれの位置にランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣヌクレオチドを含む）を含む、第２のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物
を１またはそれ以上の容器内に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的試料からｃＤＮＡおよびｃＲＮＡを産生する新規の方法に一部関与する。生物学的試料中のｍＲＮＡの存在または量を比較する方法もまた含まれる。本発明はまた、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むランダムオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【０００２】
発明の背景
遺伝子発現は、発生、分化、老化、発癌、および多くの他の臨床的に重要なプロセスを含む広範な生物学的現象を理解するのに重要である。最近、遺伝子発現での変化を用いて、新たな薬物候補の活性も評価され、かつ薬物発達の新たな標的も同定されてきた。後者の目的は、遺伝子の発現または特定薬物により作用されることが知られている遺伝子の発現を、該同一薬物にさらされた場合の未知の機能の他の遺伝子の発現特性と相互作用させることにより成し遂げられる。薬物に応答して同一パターンの制御またはサインを表す未知の機能の遺伝子は、医薬発達の新規標的を表す可能性がある。
【０００３】
一般に、遺伝子およびそのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物のタンパク質産物の発現レベルは、前者を測定することが後者について信頼性のある情報を提供するように、相関する。多くの場合、タンパク質よりＲＮＡのレベルを測定することの方が技術的に容易であるので、ｍＲＮＡレベルの変化を普通に利用して、異なる細胞および組織、または疾病または発生の異なるステージにあるかまたは異なる刺激にさらされた同一細胞および組織での遺伝子発現を評価する。転写レベルでの遺伝子発現を評価する特に有用な方法の１つは、ＤＮＡマイクロアレイを利用する（Ramsay, Nature Biotechnol. 16: 40-44, 1998; Marshall and Hodgson, Nature Biotechnol. 16: 27-31, 1998; Lashkari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94: 130-157, 1997; DeRisi et al., Science 278: 680-6, 1997)。
【０００４】
哺乳類細胞は、１×１０５〜３×１０５と同数の異なるｍＲＮＡ分子を含有し、与えられた細胞内でいずれかが多量に（または頻繁に）変化する。最も多量のｍＲＮＡは典型的には細胞当たり何千ものコピー数で存在するが、一方で他のものは細胞当たりわずか１コピーまたはそれ未満で存在し得る。転写レベルでの遺伝子発現を解析する技術は典型的には、１０〜１００μｇのｍＲＮＡ、または１０７〜１０９哺乳類細胞で見られ得るのと同量のｍＲＮＡを必要とする。多くの場合、該組織からこの数の細胞を得ることは非現実的である。例えば、血液試料は典型的には、１ｍｌ当たり１０６個の有核細胞を含有する。故に、解析のため１０９細胞を得ることは１０００ｍｌの血液試料を得ることを必要とし、たいていの場合明らかに非現実的である。
【０００５】
様々な方法が、試料中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸量の増幅についての文献で記載されてきた。これらの間で、最も広く実施されているものは、参考により本明細書に取り込まれる米国特許番号４，６８３，１９５および米国特許番号４，６８３，２０２に記載される、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。手短に言えば、ＰＣＲは、短いオリゴヌクレオチドプライマーにそれぞれの鎖をアニーリングすることにより、変性された標的核酸の相補鎖を増幅することからなり、ここで、プライマーは該配列に隣接するように選択される。プライマーはポリメラーゼ酵素により続いて伸長され、プライマーに相補的なそれ自体である伸長産物を生じ、そして故に標的配列の別コピーの合成の鋳型として働く。変性、プライマーのアニーリング、およびプライマーの伸長のそれぞれの連続サイクルが、標的の指数関数的蓄積という結果になる前のサイクルで合成された標的の量を本質的に２倍にする。
【０００６】
ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡを２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに増幅すると、ポリアデニ化（ポリ（Ａ）＋）フラクションがまず選択され、続いてｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーが逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて作られる。この反応の産物が続いて、ランダムな起爆剤を用いて直接的に増幅され得る（Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York）。
【０００７】
ｃＤＮＡは、タンパク質の合成をコードする情報を含有するが、ゲノムＤＮＡに存在する介在イントロンを欠くデオキシリボ核酸である。ｃＤＮＡおよび／またはそれらのライブラリーの合成および／または使用は、バイオテクノロジーおよび関連分野の様々な異なる用途で重要な働きを示す。ｃＤＮＡおよび／またはそれらのライブラリーが利用されるものでの用途は、遺伝子発見、異なる遺伝子発現の解析等を含む。様々なプロトコールを発展させて、ｃＤＮＡおよびそれらのライブラリーを調製した。かかる方法は絶えず修正されている。
【０００８】
ＰＣＲ方法は、当分野でよく知られるいくつかの限界で一般に苦しむ。米国特許番号５，７１６，７８５およびInnis et al., eds. (1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, Calif.)を、限界の再考および考察のため参照されたい。かかる限界の１つは、通常用いられるＴａｑのような熱安定性ポリメラーゼ酵素の乏しい忠実性から生じる。このことはあるサイクルから次のサイクルへと広められるヌクレオチド塩基の誤取り込みという結果となる。かかる誤取り込みは、１０００塩基の取り込み当たり１度も生じ得ると推定される。第２の限界は、異なるｃＤＮＡが異なる効率で増幅されることであり、このことは増幅産物中のいくつかのｃＤＮＡ配列の発現および他の過剰発現という結果となる。効率の若干の差でさえ、たった３０サイクルの増幅後、産物中のこれらのｃＤＮＡの発現において何１０００倍の差という結果となり得る。
【０００９】
ｍＲＮＡ合成および増幅の代わりの方法は逆転写として知られ、および参考により本明細書に取り込まれる米国特許番号５，７１６，７８５において記載される。ＰＣＲとは異なり逆転写は幾何学的増幅という結果にならないが、むしろ比例増幅という結果になる。逆転写では、３’末端でバクテリアファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターで伸長されたオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、ｃＤＮＡ合成のためポリ−Ａ＋ｍＲＡＮ群を準備する。ファーストストランドｃＤＮＡの合成後、セカンドストランドｃＤＮＡはGubler and Hoffman法（Gene 25:263-69, 1983）を用いて作られる。ＲＮＡポリメラーゼの添加は、逆転写およびポリ−Ａ＋ＲＮＡに対するアンチセンスであるｍＲＮＡの比例増幅という結果になる。この方法はいくつかの限界を有する。それはＰＣＲほど高感度でなく、かつ同量の物質を生成するために非常に多くのｍＲＮＡ試料を必要とし、そして従って低効率を表す。
【００１０】
さらに、通常の逆転写法がｍＲＮＡの末端キャップ部位への逆転写を達成できないため、通常の逆転写はｍＲＮＡ由来の全長ｃＤＮＡを産生できない。
【００１１】
逆転写の現在の技術は、ｍＲＮＡの安定的２次構造のため反応が未熟に終わるという技術的な限界を有するし、そしてそれ故に５’末端を含む転写ユニット全体を覆う完全な転写の確率が非常に低くなる。多くの場合、５’の情報は非常に興味深い。この技術的限界はライブラリーの質に影響する。プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いて３’末端のポリ−Ａから合成される最もクローン化されたｃＤＮＡは、３’末端のみを有し、かつ合成の未熟な終結のため全長ｍＲＮＡを覆っていない。幾度かの試みがなされてこの問題を乗り越えた。これらの技術のいくつかは、ファーストストランドの合成効率をある程度増加させるのに効果的である一方で、全長ｃＤＮＡを効果的に得るには依然十分でない。特に、何ｋｂｐまたはそれ以上の長いｍＲＮＡの逆転写について低効率を特に示す。
【００１２】
マイクロアレイ技術を用いる多くのｍＲＮＡの転写物の平行定量は、遺伝子発現の制御で関与する細胞プロセスへの詳細な見識を提供することを約束する。このことは、細胞で作用するシグナル伝達ネットワークおよび分子基盤の新たな理解、および疾病の分類を可能とする。ラージスケールのフォーマットで遺伝子発現を同時にモニターするＤＮＡマイクロアレイの能力は、育成に対する元来の役割についての単純構造が、生きている生物の遺伝子発現の機能的理解により取って代わられる、ポストゲノム時代での先導を助ける。現在では、高密度のＤＮＡマイクロアレイは、研究者が大規模な平行方法で遺伝子発現の変化を迅速および正確に定量することを可能とする。マイクロアレイ技術は、薬物標的の同定から予測毒物性への多くの生物学的学問分野において人気を得る、迅速に発達する範囲である。過去２、３年にわたって、この形の遺伝子発現解析の実行に利用可能な方法および技術の数で劇的な増加があった。スライドタイプ、析出方法、ロボット工学、および走査型設備のような技術および関連する周辺装置は、普遍的改善を行われ、頑強さおよび使いやすさという点で技術を前へ運ぶことを助ける。
【００１３】
マイクロアレイは、固定化されたものに基づき２つのグループに分けられることができる：Ａ）ｃＤＮＡまたはＢ）オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）。オリゴに基づくマイクロアレイのため、センスオリゴを利用することができる（すなわち、研究が望まれるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと同一極性を有するオリゴ）。このことは、オリゴデザインおよびｃＤＮＡ記録に一致するオリゴを容易に作成する。プローブ混合物は、センスオリゴにハイブリダイズできるように、アンチセンス極性で続いて作成されなければならない。アンチセンスプローブ混合物は、以下のように一般に作成される：与えられた組織由来の全ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）標本は、５’末端でぶらさがるＴ７プロモーターを有するオリゴ−ｄＴプライマーおよび逆転写酵素を用いる逆転写の対象とされる。セカンドストランドｃＤＮＡ合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼを用いる古典的な方法で実行される。次に、２本鎖ｃＤＮＡ混合物は、ヌクレオチド標識、すなわちビオチン標識を生成するビオチン化ヌクレオチド、アンチセンス、ｃＲＮＡプローブ混合物を含む、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写される。ｃＲＮＡプローブ混合物を、ｃＤＮＡ配列の収集物を表すセンス方向のオリゴを含有するオリゴマイクロアレイにハイブリダイズする。ビオチン標識の実施例において、３ステップサンドウィッチ検出法は、例えば、ビオチンに結合するストレプトアビジン、ストレプトアビジンに対する１次抗体、および１次抗体に対する蛍光標識２次抗体、すなわちＣｙ３を、それぞれのステップ間で非常に緊縮洗浄と共に含むように、適応され得る。特異的なＣｙ３シグナルの蛍光が共焦点スキャナーで検出され、そしてデジタル化される。これらの最初のデータは次にバックグランド対照および内部標準を用いて標準化される。同一の一般的方法はまた、Ｃｙ３または他の普通に用いられるフルオロフォア標識で直接標識されるｃＲＮＡと共に用いられる。この場合、より長いオリゴ（５０〜６０ｍｅｒ）が用いられる。上述されるサンドウィッチ法に伴い感度は高くなり、そして３０ｍｅｒを用いることができる。
【００１４】
ｃＲＮＡプローブを合成する現在の方法は、逆転写のためのオリゴ−ｄＴ−Ｔ７プライマーの使用を条件とする。このプライマーは、ほとんどのｍＲＮＡのポリ−Ａテールにハイブリダイズすることを意図される。しかしながら、このやり方での問題は２要素である：１）ポリ−Ａテールを有さないｍＲＮＡがあること；２）長い３’ＵＴＲを有するｍＲＮＡがあること。そしてそれ故、逆転写酵素は全ｍＲＮＡをコピーする困難さを有し得るし、かつ非コード配列を主に表す切断ｃＤＮＡを産生し得る。
【００１５】
従って、制限された量のｍＲＮＡからの高程度の合成および増幅を成し遂げうる方法、および他の合成および増幅方法によりしばしば誘導される配列および発現に関して非忠実性を同時に避ける方法である、核酸、特にｍＲＮＡの合成および増幅の改善された方法に関する分野での必要性が存在する。
【００１６】
発明の概要
ある態様において、本発明は３ステップを含む、１本鎖リボ核酸分子由来の２本鎖分子の産生方法を提供する。第１のステップは、リボ核酸分子をＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび逆転写酵素を含有する１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型由来の酵素的デオキシリボ核酸合成を生じるのに十分な条件下で接触させることを含み、それにより第１のデオキシリボ核酸分子が生成される。第２のステップは、該第１のデオキシリボ核酸分子をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと、鋳型由来の酵素的デオキシリボ核酸分子合成を生じるのに十分な条件下で接触させることを含み、それにより第２のデオキシリボ核酸分子が生成される。第３のステップは生じた２本鎖デオキシリボ核酸分子を単離および精製することを含み、上記の２本鎖デオキシリボ核酸分子が生成される。
【００１７】
ある実施態様において、２本鎖ＤＮＡ分子を生成するために用いられる１本鎖リボ核酸分子はｍＲＮＡである。別の実施態様において、当該ＲＮＡから生成される分子はｃＤＮＡである。様々な実施態様において、用いられるＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼである。他の実施態様において、用いられたＤＮＡポリメラーゼは、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、当該ｍＲＮＡの逆転者により生成される２本鎖ＤＮＡはベクターに導入される。ある実施態様において、プライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。
【００１８】
本発明の別の態様は、多数の異なるｍＲＮＡを含有する試料から少なくとも１つのｃＲＮＡを合成する方法を提供する。ファーストストランドｃＤＮＡは、試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素と、逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより合成される。次に、２本鎖ｃＤＮＡが、ファーストストランドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しないが、セカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的である第２のランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触されることにより合成される。生じる２本鎖ｃＤＮＡは単離および生成され、そして次に鋳型由来のＲＮＡ転写が生じるのに十分な条件下でのインビトロの転写の対象とされ、上記ｃＲＮＡが生成される。
【００１９】
ある実施態様において、２本鎖ＤＮＡ分子を生成するために用いられる１本鎖リボ核酸分子はｍＲＮＡである。別の実施態様において、当該ＲＮＡから生成される分子はｃＤＮＡである。様々な実施態様において、用いられるＲＮＡポリメラーゼはＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６ポリメラーゼである。他の実施態様において、用いられるＤＮＡポリメラーゼは、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、当該ｍＲＮＡの逆転者により生成される２本鎖ＤＮＡはベクターに導入される。ある実施態様において、プライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。様々な実施態様において、試料は細胞由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する。別の実施態様において、細胞は原核酵母細胞、有核哺乳類細胞および／またはヒト細胞である。ある実施態様において、試料は１×１０６細胞またはそれ未満由来の全ＲＮＡを含有する。別の実施態様において、試料は少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する。
【００２０】
本発明の別の態様は、第１および第２の試料が１またはそれ以上の細胞由来の多数の異なるｍＲＮＡをそれぞれ含有する、第１の試料および第２の試料中の少なくとも１つの当該ｍＲＮＡの存在または量を比較する方法を開示する。ファーストストランドｃＤＮＡは、試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを、ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素と、逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより合成される。次に、２本鎖ｃＤＮＡが、ファーストイストランドｃＤＮＡを、セカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しない第２のランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触されることにより合成される。生じる２本鎖ｃＤＮＡは単離および精製され、そして次に鋳型由来のＲＮＡ転写が生じるのに十分な条件下でのインビトロの逆転写の対象とされ、上記ｃＲＮＡが生成される。第１の試料由来のｃＲＮＡは、第１の標識で標識される；第２の試料を用いて生成されるｃＲＮＡは、第１の標識と区別可能な第２の標識で標識される。第１の試料中の該ｍＲＮＡは、第１の標識で標識された第１のｃＲＮＡを、該ｍＲＮＡの第１のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させること；そして該プローブと該第１のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することにより、検出または測定される。第２の試料中の該ｍＲＮＡは、第２の標識で標識された第２のｃＲＮＡを、該ｍＲＮＡの第２のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させること；そしてプローブと第２のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することにより検出および測定される。第１の試料中の検出および測定された当該ｍＲＮＡのレベルが、第２の試料中の検出または測定された当該ｍＲＮＡのレベルと比較される。
【００２１】
ある実施態様において、２本鎖ＤＮＡ分子を生成するために用いられる１本鎖リボ核酸分子はｍＲＮＡ分子である。別の実施態様において、当該ＲＮＡから生成される分子はｃＤＮＡである。様々な実施態様において、用いられるＲＮＡポリメラーゼはＴ３、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼである。他の実施態様において、用いられるＤＮＡポリメラーゼは、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、当該ｍＲＮＡの逆転写により産生される２本鎖ＤＮＡは、ベクターに導入される。ある実施態様において、プライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。様々な実施態様において、試料は細胞由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する。別の実施態様において、細胞は原核酵母細胞、有核哺乳類細胞および／またはヒト細胞である。ある実施態様において、試料は１×１０６細胞またはそれ未満由来の全ＲＮＡを含有する。別の実施態様において、試料は少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する。
【００２２】
別の態様において、本発明はｍＲＮＡ分子の試料由来の５’濃縮ｃＤＮＡライブラリーを生成する方法を提供する。ｍＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素と、鋳型由来の酵素的デオキシリボ核酸合成を生じるのに十分な条件下で接触させ、それによりｃＤＮＡ分子の第１の群を生成する。ｃＤＮＡ分子の第１の群を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含まない第２のランダムプライマーと、鋳型由来の酵素的デオキシリボ核酸分子を生じるのに十分な条件下で接触させ、それによりｃＤＮＡ分子の第２の群を生成する。２本鎖ｃＤＮＡ分子のこの第２の群は、５’濃縮ライブラリーを生成するために単離される。ある実施態様において、ｍＲＮＡはポリアデニル化末端を含有する。別の実施態様において、ｍＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上の第１のランダムプライマーオリゴヌクレオチドプライマー、およびＲＮＡポリメラーゼプライマーを含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを含むプライマー混合物と接触させる。さらなる実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは固体支持体の表面と安定的に関連する。さらに別の実施態様において、第１および第２の標識は蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識である。さらなる実施態様において、蛍光標識はフルオレッセインイソチオシアネート、リサミン（lissamine）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはローダミン１１０である。別の実施態様において、第１の一定分量の第１のｃＲＮＡは、第１の発光スペクトルを有する第１のフルオロフォアで標識され、および第２の一定分量の第２のｃＲＮＡは、第１の発光スペクトルのものとは異なる第２の発光スペクトルを有する第２のフルオロフォアで標識される。別の実施態様において、第１のフルオロフォアはＣｙ３であり、かつ第２のフルオロフォアはＣｙ５である。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、それぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマーが、それぞれの位置でランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣヌクレオチドを含有する１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列、およびそれぞれの位置に存在するＴヌクレオチドを含む１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列を含有する、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、オリゴ（ｄＴ）プライマーの混合物を含み；かつＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列および第２のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物も含む１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列を含有するそれぞれの第１のプライマー、それぞれの位置でランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣヌクレオチドを含む１０〜５０ヌクレオチドの配列を含有するそれぞれの第２のプライマーである、第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を１またはそれ以上の容器内に含むキットを開示する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、全長を覆うｍＲＮＡ、特にｃＤＮＡの５’領域の逆転写が可能であり、そしてそれ故たとえ長鎖ｍＲＮＡが鋳型として用いられても、全長ｃＤＮＡの提供が可能な方法を提供する。本発明はまた、マイクロアレイ技術を含む様々な方法で使用する標識ｃＲＮＡ分子を生成するための２本鎖ｃＤＮＡ分子のインビトロでの転写方法を提供する。
【００２５】
本発明は、核酸合成のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するランダムオリゴヌクレオチドプライマーに関与する。本発明はさらに、配列および転写物の発現についての忠実性を保持する、細胞群中での核酸配列の合成のため本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの使用方法に関与する。
【００２６】
さらに特異的には、本発明はｍＲＮＡの準備のために用いられる方法において変化を取り込む。Ｔ７プロモーターとの結合においてオリゴ−ｄＴプライマーのみを用いる代わりに、それらの５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する、長さを変えたものであるランダムオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、ヘキサマーまたはナノマー）を利用する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを単独でまたはオリゴ−ｄＴプライマーとの組合せで含有するこれらのランダムプライマーを用いることは、オリゴ−ｄＴプライマーのみを用いる方法と比較して鋳型ｍＲＮＡの５’末端に向かうプローブの範囲を増加する。
【００２７】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、および後のセカンドストランドｃＤＮＡ合成を含む本発明のランダムプライマーの使用は、異なる長さおよび異なる開始位置および停止位置のｃＤＮＡのライブラリーを生成する。このことは、ｍＲＮＡ群を完全に覆うタイル張りのネットワークの生成という結果となる；特に、生成されるｃＤＮＡは、個々のｍＲＮＡ配列のほとんど全長にわたる範囲を提供する。これらのｃＤＮＡの次のインビトロでの転写は、直接標識ｃＲＮＡプローブまたはビオチン−標的ｃＲＮＡプローブのいずれかの完全、全範囲のセットを生成する。本発明は、従来のチップオリゴデザイン、ハイブリダイゼーション、または検出プロトコールでの変化を全く必要としない。従って、それは従来の方法の合理化改善である。
開示の明瞭さのためであり、制限されるためでない本発明の詳細な説明は、以下のセクションのセットに分けられる。
【００２８】
オリゴヌクレオチド
本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、ランダムプライマーまたはオリゴ（ｄＴ）プライマー）は、任意の適当なサイズのものでりえ、そして好ましくは４〜５０ヌクレオチド長である。本明細書において使用される様に、用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」は、約１０〜約１００ヌクレオチド長の１本鎖ヌクレオチド多量体を表す。本明細書において使用される様に、用語「ポリヌクレオチド」は、約１０００ヌクレオチド長までの、約１００ヌクレオチド長より長いヌクレオチド単量体からなる１本鎖ポリマーまたは２本鎖ポリマーに言及する。
【００２９】
オリゴ（ｄＴ）プライマーは従属方法での使用のため、ｍＲＮＡのポリＡテールへの効果的なハイブリダイゼーションを提供するために十分長い。一般に、オリゴ（ｄＴ）プライマーの長さは、約１０〜５０ｎｔ長の範囲にあり、好ましくは約１０〜３０ｎｔ長であり、そしてさらに好ましくは約２０〜２５ｎｔ長である。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー配列のそれぞれの位置に存在するＴヌクレオチドを含有する。多くの実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーを固体支持体の表面に安定的に付着させる。固体支持体は当業者に既知の便利な固体支持体のいずれかであり得る。様々な異なる固相が従属方法での使用に適当であり、かかる相は当分野において既知でありかつ市販されている。当該特異的固相は、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、シート、ビーズ、電磁ビーズ等を含むがこれらに制限されない重合体支持体を含む。「安定的に付着させる」により、オリゴ（ｄＴ）プライマーが、少なくとも鋳型由来の核酸合成の条件下で固体支持体の表面と関連したままであることを意味する。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、固相に共有結合または非共有結合し得る。オリゴ（ｄＴ）プライマーを、ｍＲＮＡ分子が鋳型分子として働くｍＲＮＡと鋳型由来の酵素的デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させる。
【００３０】
ランダムオリゴヌクレオチドプライマーは従属方法で使用するため、相補的な核酸への効果的なハイブリダイゼーションを提供するために十分長い。「ランダムオリゴヌクレオチドプライマー」または「ランダムプライマー」により、第１のハイブリッドの1本鎖ＲＮＡと比べてランダムな塩基配列のプライマー、すなわち、使用に先立って第１のハイブリッドまたは２本鎖のｍＲＮＡ成分にハイブリダイズすることが確実に知られていないプライマーを意味する。言い換えると、ランダムプライマーは、ランダムプライマーとの接触に先立ちハイブリッドのＲＮＡの１本鎖位置の相補的領域を有する確実さで知られていない配列を有する。ランダムプライマーは、ｍＲＮＡ成分の相補的領域への効果的ハイブリダイゼーションを提供するために十分長く、ランダムプライマーは典型的には、約４〜５０ｎｔの範囲であり、好ましくは約１０〜３０ｎｔ、そしてさらに好ましくは約２０〜３０ｎｔ長である。プライマーは、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩヌクレオチドのランダムな配列を含有し、上記のそれぞれのランダムプライマーは配列のそれぞれの位置にランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＩヌクレオチドを含有する。好ましい実施態様において、ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＩＴＰ、またはリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、すなわち、ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、またはｒＩＴＰである。当該特異的プライマーは、約５〜１５、好ましくは、ある実施態様において制限酵素切断部位に融合される約６〜９ｎｔ、またはさらに好ましくはＲＮＡポリメラーゼプロモーターに融合される約５〜２０ｎｔ、好ましくは例えば、３’（Ｎ）９ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ５’（Ｎは任意のヌクレオチドである）の約８〜１６ｎｔを有するものを含む。ヘキサマーオリゴヌクレオチドまたはナノマーオリゴヌクレオチドは、ランダムプライマーの好ましい実施態様である。別の好ましい実施態様において、本発明のプライマーはキット内にある。
【００３１】
オリゴヌクレオチドプライマーは必要な反応を準備する能力が依然ある限り、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物また誘導体またはそれらの修飾核酸バージョンであり得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩バックボーンで修飾され得るし、かつ必要な増幅反応を準備する能力が依然ある限り、他の付加基または標識を含み得る。本明細書で用いられる様に用語「核酸」は、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであるヌクレオチドからなるポリマーを意味する。本明細書で用いられる様に用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ］は、リボヌクレオチドからなるポリマーを意味する。ＲＮＡは、１本鎖または２本鎖であり得る。好ましい実施態様において、１本鎖ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で用いられる様に用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリマーを意味する。デオキシリボ核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。好ましい実施態様において、ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。
【００３２】
好ましい実施態様において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーはＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する。好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端にあり得る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、当分野で既知のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のいずれかであり得る。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり；Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、該プロモーターからＲＮＡ合成をそれぞれ開始し得る。
【００３３】
ある実施態様において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーは１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列を含有し、該３’末端配列は該３’末端配列のそれぞれの位置にランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、またはＩヌクレオチドを有する；および１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列を含有し、該５’末端配列はＲＮＡポリメラーゼプロモーター（すなわち、当分野で既知のＲＮＡポリメラーゼプロモーターのいずれか）を有する。さらに好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。
【００３４】
別の実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列を含有し、該３’末端配列は該３’末端配列のそれぞれの位置に存在するＴヌクレオチドを有する；および１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列を含有し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（すなわち、当分野で既知のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のいずれか）を有する。さらに好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。
【００３５】
別の実施態様において、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーは１０〜５０ヌクレオチド配列を含有し、該配列は該配列のそれぞれの位置でランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、またはＩヌクレオチドを有する。
【００３６】
別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ水酸化メチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキヨシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む少なくとも１つの修飾塩基部分を含有しうるが、これらに制限されない。
【００３７】
別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーはアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含有するが、これらに制限されない。
【００３８】
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドプライマーはホスホロチオネート、ジチオリン酸、ホスホルアミドチオエート、ホスホラミデイト、ジホスホラミデイト、メチルホスホン酸、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸塩バックボーンを含有する。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、非特異的核酸切断化学物質、酵素、または部位特異的制限酵素を用いる大きな核酸フラグメントの切断によりもたらされ得るか；または当分野で既知の標準的方法、例えば、自動ＤＮＡ合成機（Biosearch, Applied Biosystemsから市販されているような）および標準的ホスホラミデイト化学反応の使用により合成され得る。ホスホロチオネートオリゴヌクレオチドは、Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209-3221)に記載の方法により合成され得るし、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチドは、細孔性ガラス（controlled pore glass）ポリマー支持体(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)等の使用により調製され得る。
【００４０】
必要なオリゴヌクレオチドが合成されると、それが当分野において既知の方法により合成および処理された固体支持体から切り裂かれて、任意の保護基を取り除かれる。オリゴヌクレオチドは次に、抽出およびゲル精製を含む当分野で既知のいずれかの方法により精製され得る。オリゴヌクレオチドの濃度および純度は、アクリルアミドゲル上で分離されたオリゴヌクレオチドを調べることにより、または分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより測定され得る。
【００４１】
核酸産物の標識方法
合成ＲＮＡ（すなわちｃＲＮＡ）のような核酸合成または増幅産物は、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、および：フルオロフォア；キミルミネッセンス；酵素マーカーのような放射性標識を含む当分野で既知の検出可能なマーカーで標識され得る。好ましい実施態様において、標識は蛍光である。
【００４２】
典型的に、標識として用いられ得る適当なフルオロフォア部分は: ４−アセトアミド−４’−イソチオシオン酸塩スチルベン−２，２ジスルホン酸アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシオン酸塩、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３−（ビニルスルホニル)フェニル］ナフタルイミド−３，５二硫酸塩（ルシファーイエローＶＳ）、−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、アントラニルアミド、ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、シアノジン（cyanosine）、４’，６−ジアミニジノ（diaminidino）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Bromopyrogallol Red）、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシオン酸塩フェニル)−４−メチルクマリン、ジエチレントリアミン５酢酸塩、４，４’−ジイソチオシオン酸塩ジヒドロ−２，２’−ジスルホン酸、４，４’−ジイソチオシオン酸塩スチルベン−２，２’−ジスルホン酸、５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロライド（ＤＮＳ，ダンシルクロライド）、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニルー４’−イソチオシオン酸塩（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体：エオシン、エオシンイソチオシオン酸塩；エリトロシンおよび誘導体：エリトロシンＢ、エリトロシンイソチオシオン酸塩、エチジウム；フルオレッセインおよび誘導体：５−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−yl)アミノフルオレッセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）、フルオレサミン、ＩＲＩ１４４、ＩＲ１４４６、マラカイトグリーンイソチオシオン酸塩、４−メチルウンベリフェリル、オルトクレゾールフタレイン、ニトロチオシン、パラローザニリン、フェノールレッド、Ｂ−フィコエリトリン、ｏ−フタルジアルデヒド（phthaldialdehyde）；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸塩、スクシンイミジル１−ピレン酪酸塩、リアクティブレッド４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシオン酸塩、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１スルホニルクロライド誘導体（Texas Red）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシオン酸塩（ＴＲＩＴＣ）、リボフラビン、ロゾール酸、テルビウムキレート誘導体を含む群から選択されるが、これらに制限されない。
【００４３】
好ましい実施態様において、合成ｃＲＮＡは標識、すなわち、当分野で既知および本明細書で記載される様ないずれかの標識で標識される。他の好ましい実施態様において、合成ｃＲＮＡは標識で標識され、ここで標識は蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識であり、さらに好ましくは標識は蛍光である。本発明の好ましい標識方法は、フルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０のようなフルオロフォアでのものであり、特に好ましくはＣｙ３およびＣｙ５でのものである。
【００４４】
フルオロフォアに加えて、中でもキミルミネッセンスおよび酵素がまた標識として用いられる。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、アルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼのような特定の化学反応が行われる際の検出可能なシグナルを産生する酵素マーカーで標識され得る。かかる酵素マーカーは増幅プロセスの変性ステップを切り抜けるために、好ましくは熱安定性である。
【００４５】
オリゴヌクレオチドはまた、ハプテンまたは標識アビジン分子またはストレプトアビジンが結合し得るビオチン、または標識抗ジゴキシゲニン抗体が結合し得るジゴキシゲニンのような分子に共有結合したヌクレオチドを取り込むことにより直接的に標識される。
本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成の間で標識部分で標識され得るか、または標識は合成後に当分野で既知の方法により付着され得る。
【００４６】
ＲＮＡの標識
ある実施態様において、本発明の合成ＲＮＡ（すなわちｃＲＮＡ）は合成の間で標識されて、引き続いてのステップでの検出を促進する。ＲＮＡは、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈのような放射性標識およびフルオロフォア；キミルミネッセンス；または酵素マーカー等を含む当分野で既知の検出可能なマーカーのいずれかで標識されるが、これらに制限されない。
【００４７】
ＲＮＡの標識は好ましくは、インビトロでの転写反応混合物中に１またはそれ以上の標識ｄＮＴＰを含むことにより成し遂げられる（実施例１参照）。ＮＴＰは、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈのようなラジオアイソトープで直接的に標識され得る。放射性標識ＮＴＰは、New England Nuclear （Boston, Mass）およびAmershamを含むいくつかの製造元から入手可能である。ＮＴＰはＣｙ３またはＣｙ５のような蛍光標識で直接的に標識され得る。ある実施態様において、ビオチン化ＮＴＰまたはアリルアミン誘導ＮＴＰは、インビトロでの転写反応の間で取り込まれ、そして結果として生じたｃＲＮＡはその後、例えば、フルオロフォア結合アビジン（ビオチンの場合）またはフルオロフォアのＮＨＳエステル（アリルアミンの場合）の添加により直接的に標識される。別の実施態様において、蛍光標識ＮＴＰは、結果として生じるｃＲＮＡを直接的に蛍光標識するインビトロでの転写反応の間で取り込まれ得る。
【００４８】
典型的に、標識として用いられ得るフルオロフォア部分が本明細書において以後記載される。本発明の方法における好ましい標識は、フルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０のようなフルオロフォアであり、特に好ましくは、Ｃｙ３およびＣｙ５である。
【００４９】
フルオロフォアだけでなく中でもキミルミネッセンスおよび酵素が、標識として用いられ得る。さらに別の実施態様において、ＲＮＡは、アルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼのような特定の化学反応が行われると検出可能なシグナルを産生する酵素マーカーで標識され得る。かかる酵素マーカーは、増幅プロセスの変性ステップを切り抜けるために好ましくは熱安定性である。
【００５０】
ＲＮＡはまた、ハプテンまたは標識アビジン分子が結合し得るビオチン、または標識抗ジゴキシゲニン抗体が結合し得るジゴキシゲニンのような分子に共有結合するヌクレオチドを取り込むことにより非直接的に標識され得る。ＲＮＡは、化学合成の間で標識部分で標識され得るか、または標識は合成後当分野で既知の方法により付着され得る。
【００５１】
ＲＮＡの標識は好ましくは、ＮＨＳエステルで蛍光標識されるｃＲＮＡを調製することにより成し遂げられる。最も好ましくは、ＲＮＡの標識は、アリルアミン誘導ＵＴＰがインビトロでの転写の間で取り込まれるツーステップ方法で成し遂げられる。インビトロでの転写反応に続き未取り込みのヌクレオチドが取り除かれ、アリルアミン含有ＲＮＡは、Ｃｙ３またはＣｙ５のＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステルに結合される。
【００５２】
蛍光標識ｃＲＮＡを調製するこのツーステップ方法は比較的安価でありかつＤＮＡマイクロアレイへの２色ハイブリダイゼーションでの使用に適当である。第１のステップにおいて、アミノアリル（ＡＡ）標識核酸はＡＡ−ヌクレオチドの取り込みにより調製される。ＡＡ−ＵＴＰ（Sigma A-5660）は、ｃＲＮＡの標識に用いられ得る。ＡＡ−ｃＲＮＡは、全ＵＴＰの５０〜１００％で置換されたＡＡ−ＵＴＰと共にAmbion MegaScriptＴ７  ＲＮＡポリメラーゼインビトロ転写キットを用いて調製される。ＡＡ−核酸の誘導体化に先立ちＴｒｉｓのようなアミン含有バッファーの全痕跡を取り除くことが必要である。酵素反応で調製されたＡＡ−核酸は好ましくは、適当なQIAGENカラム：RNeasy Mini kit（ＲＮＡ用）またはQIAquick PCR Purification kit（ＤＮＡ用）（QIAGEN Inc.--USA, Valencia, Calif.）上できれいにされる。QIAGENカラムにたいして、試料は２度適用される。洗浄のため、好ましくは８０％  ＥｔＯＨがQIAGENキットで提供されるバッファーに代わる。試料は、５０μｌの７０℃  Ｈ２Ｏで２つに溶出される。または（しかしほとんど好ましくはない）、試料は希釈とMicrocon-30フィルターでの濃縮とのサイクルを繰り返すことによりきれいにされ得る。
【００５３】
第２のステップにおいて、ＡＡ−核酸はＮＨＳ−エステル、好ましくはＣｙ３またはＣｙ５で誘導体化される。好ましくは、２〜６μｇのＡＡ−標識核酸がマイクロチューブに等分され、Ｈ２Ｏで全容量１２μｌに調整される。ＮＨＳ−エステルは、無水ＤＭＳＯ中の１５ｍＭの濃度（１３μｌ中の２００ｎｍｏｌ）で溶解される。２７μｌの０．１Ｍ  炭酸ナトリウム、ｐＨ９が加えられる。１２μｌのdye mix（〜６０ｎｍｏｌ  ダイーＮＨＳエステルを含有する）が次に、ＡＡ−標識核酸（〜６〜２０ｐｍｏｌの１ｋｂ分子）に直接添加される。試料は次に、暗所で２３℃で１時間インキュベーとされる。カップリング反応は、５μｌの４Ｍ  ヒドロキシルアミン溶液の添加により停止される。インキュベーションは、２３℃で追加０．２５時間の間続けられる。ダイカップリング核酸は、RNeasy Mini kitまたはQIAquick PCR Purification kit（QIAGEN Inc.--USA, Valencia, Calif.）上の未取り込みのダイと分けられる。試料は上述の様に、バッファーの代わりに８０％  ＥｔＯＨで洗浄され、そして５０μの７０℃  Ｈ２Ｏで２つに溶出される。
【００５４】
標識核酸のスペクトルは、好ましくは、２２０ｎｍ〜７００ｎｍ測定される。核酸の回復率およびダイ取り込みのモル濃度は、吸光係数および１ｍａｘにおける吸光度から測定される。核酸の回復は典型的には〜８０％である。ヌクレオチド当たり取り込まれたダイのモルパーセントは、全ヌクレオチドの１．５〜５％の範囲である。
【００５５】
好ましい実施態様において、インビトロで転写されるＲＮＡは、上記のようにビオチン（実施例１を参照）または他の標識で標識される。最も好ましくは、標識は蛍光であり、かつ標識は当分野で通常用いられる方法により、ならびにビオチン標識ついての実施例１で記載される方法により取り込まれる。
【００５６】
しばしば、おそらく異なる組織またはおそらく異なる刺激にさらされた同一組織（すなわち、病気の組織試料の正常組織試料との比較または薬物処置組織の無処置組織との比較）に由来する細胞の２つの異なる群での遺伝子発現の比較が望まれる。かかる比較は、第１のフルオロフォアを有する一方の群由来のＲＮＡおよび第２のフルオロフォアを有する他の群由来のＲＮＡを標識することにより容易にし、ここで２つのフルオロフォアは異なる発光スペクトルを有する。さらに、Ｃｙ３およびＣｙ５が２つの異なる群の細胞間の遺伝子発現の比較で用いる特に好ましいフルオロフォアである。
【００５７】
ＲＮＡの調製方法
本発明の方法は、真核細胞および原核細胞（すなわち、酵母細胞）両方に由来する核酸配列に適用可能であるが、それらは好ましくは真核細胞で用いられ、さらに好ましくは哺乳類細胞で、そして最も好ましくはヒト細胞で用いられる。ＤＮＡまたはＲＮＡの供給源として働き得る多くの細胞は、当業者にとって容易に明らかである中でも、有核血液細胞、確立細胞株、腫瘍細胞、および組織生検標本である。
【００５８】
本発明の合成方法はＤＮＡを合成することができるが、好ましくは方法を利用して細胞群からＲＮＡ（すなわちｃＲＮＡ）を合成する。全細胞ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはポリ（Ａ）＋ＲＮＡが用いられ得る。全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は良く知られており、かつ一般的にSambrook et al. (1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)およびAusubel et al., eds. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York)に記載される。
【００５９】
ＲＮＡは、細胞の可溶化物およびそれらの中に含有されるタンパク質の変性を含む方法により真核細胞から単離され得る。該細胞は、野生型細胞、薬物にさらされた野生型細胞、病気の細胞、修飾細胞、および薬物にさらされた修飾細胞を含む。
【００６０】
追加のステップを利用してＤＮＡを取り除くことができる。細胞可溶化物は、以下の核およびそれ故大部分の細胞ＤＮＡを取り除くためのマイクロ遠心分離により非イオン系洗剤で成し遂げられ得る。ある実施態様において、ＲＮＡは、様々なタイプの該細胞から、グアニジンチオシアネート可溶化物を用いて、ＤＮＡからＲＮＡを分離するための以下のＣｓＣｌ遠心分離により抽出される。（Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースでのセレクションにより選択される（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。または、ＤＮＡとのＲＮＡの分離は、例えば、熱フェノールまたはフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールでの有機抽出により成し遂げられることができる。
【００６１】
必要なら、ＲＮａｓｅ阻該物質が可溶化バッファーに加えられ得る。同様に、ある細胞タイプのため、タンパク質変性／切断ステップをプロトコールに加えることが必要である。
【００６２】
多くの応用のため、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のような、他の細胞ＲＮＡに関するｍＲＮＡを選択的に濃縮することが必要である。たいていのｍＲＮＡは、その３’末端でポリ（Ａ）テールを含有する。このことはそれらが、例えば、セルロースまたはSephadex［登録商標］のような固体支持体に共役されたオリゴ（ｄＴ）またはポリ（Ｕ）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮されることを可能とする（Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New Yorkを参照）。結合すると、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは２ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１％  ＳＤＳを用いてアフィニティーカラムから溶出される。
【００６３】
ＲＮＡ試料は、それぞれの異なるｍＲＮＡ分子が異なるヌクレオチド配列を有する、多数の異なるｍＲＮＡ分子を含有することができる。特定の実施態様において、ＲＮＡ試料中のｍＲＮＡ分子は少なくとも１００の異なるヌクレオチド配列を含有する。さらに好ましくは、ＲＮＡ試料のｍＲＮＡ分子は、少なくとも５００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００の異なるヌクレオチド配列を含有する。別の特定の実施態様において、ＲＮＡ試料は哺乳類のＲＮＡ試料（すなわち、ヒトＲＮＡ試料）であり、哺乳類ＲＮＡ試料のｍＲＮＡ分子は約２０，０００〜３０，０００の異なるヌクレオチド配列を含有する。
【００６４】
特定の実施態様において、細胞由来の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡが本発明の方法で用いられる。ＲＮＡの供給源は、植物または動物、ヒト、哺乳類、霊長類、非ヒト動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリ、酵母、真核細胞、原核細胞等の細胞であり得る。特定の実施態様において、本発明の方法は１×１０６細胞またはそれ未満の細胞由来の全ｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを含有する試料と共に用いられる。
【００６５】
２本鎖ｃＤＮＡ合成方法
広義において、従属発明は１本鎖核酸分子から２本鎖核酸分子を調製する方法、そして特異的には１本鎖リボ核酸分子から２本鎖デオキシリボ核酸分子を調製する方法に向く。一般に、１本鎖リボ核酸分子はポリＡテールを有するｍＲＮＡ分子であり、一方２本鎖デオキシリボ核酸分子はｃＤＮＡ分子である。しかしながら、ｍＲＮＡ分子は、ポリＡテールを含有することを必要としない。特に従属発明は、配列情報を含む２本鎖ｃＤＮＡ分子を、それらが作成されるもの由来の鋳型ｍＲＮＡの５’末端から生成する方法を指示する。従属方法により用意されるｃＤＮＡ分子の長さは典型的には、約０．５〜３．０ｋｂ、普通は約１．０〜２．０ｋｂおよびより普通は約１．０〜１．５ｋｂの範囲にある。
【００６６】
従属方法の第１のステップは、ファーストデオキシリボ核酸ストランド（すなわち、ｃＤＮＡ）を作成することである。ファーストＤＮＡストランドは、最初の１本鎖ＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡから作成される。このステップは一般に、最初のＲＮＡをプライマーおよび逆転写酵素と、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下で接触されることにより成し遂げられる。本明細書において用いられる様に用語「十分に」および「貢献する」は、多量であることはないが必要または要求を満たすことができる量または条件、すなわち、本発明の方法、手順またはプロトコールが生じるのを可能とする事情、状況または環境に言及する。好ましい実施態様において、この第１のステップは１本鎖ＲＮＡ分子、すなわちｍＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上の第１のランダムプライマーおよび逆転写酵素と、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下で接触させることを含み、ここでｍＲＮＡ分子は鋳型分子として働く。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、こららのプロモーターからＲＮＡ合成またはＤＮＡ合成をそれぞれ開始する。さらなる実施態様において、最初の１本鎖ＲＮＡ分子がポリアデニル化末端を含有するところで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上のランダムプライマーは、ｍＲＮＡにＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーと組合せて、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下で接触する。別の実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、固体支持体の表面と安定的に関連する。
【００６７】
好ましい実施態様において、最初の１本鎖ＲＮＡ、すなわちｍＲＮＡの、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上の第１のランダムプライマーのみ、またはＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーと組み合わせて、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下での接触は、ファーストデオキシリボ核酸分子、すなわちファーストストランドｃＤＮＡを生成する。別の実施態様において、本発明の方法において用いられるプライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。適当なオリゴヌクレオチドプライマーは本明細書において記載され、かつ技術者により必要なように修飾され得る。
【００６８】
第１のステップで鋳型として働く最初のｍＲＮＡは、試料が生理的供給源から典型的にもたらされる、様々な異なる試料中に存在し得る。生理的供給源は、酵母のような単細胞生物、および多細胞生物由来の生理的供給源が多細胞生物の特定の器官または組織から、またはそれら由来の単離細胞からもたらされる、植物および動物、特に哺乳類を含む多細胞生物からもたらされる供給源を含む該生理的供給源と共に、様々な真核生物供給源からもたらされ得る。もたらされるもの由来の生理的供給源から解析されるべきＲＮＡ試料を得る際、生理的供給源は、組織の均一化、細胞単離および核酸抽出等を含み得るプロセッシングステップである、多くの異なるプロセッシングステップの対象とされ得る。ここでかかるプロセッシングステップは当業者に既知である。細胞、組織、器官または生物全体からＲＮＡを単離する方法は当業者に既知であり、かつ本明細書およびManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)(1989)に記載される。
【００６９】
ｍＲＮＡおよびプライマーに加えて、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびプライマー伸長に必要な他の試薬が存在する。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼは既知のＲＮＡポリメラーゼのいずれかであるが、最も好ましくはＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡ  ポリメラーゼである。他の実施態様において、逆転写またはファーストストランドＤＮＡ合成バッファー、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＩＴＰの混合物、およびヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏが存在する。ファーストストランドｃＤＮＡ合成の実例方法は、実施例１で提供される。試薬が結合される順番は要求通り修飾され得るし、かつそこで記載される実例方法の全体は技術者により修飾され得る。
【００７０】
セカンドストランドｃＤＮＡ合成は、実施例１において説明されるように当分野で既知のいずれかの方法により実行される。好ましい実施態様において、従属方法の第２のステップは、第１のデオキシリボ核酸分子を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しない第２のランダムプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼと、鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させることであり、それにより第２のデオキシリボ核酸分子が生成され、２本鎖デオキシリボ核酸分子（ｃＤＮＡ）を結果として生じる。別の実施態様において、２本鎖デオキシリボ核酸分子が、当分野で既知でありかつ実施例１において説明されるいずれかの方法により単離および生成され得る。特定の実施態様において、セカンドストランドｃＤＮＡ合成に用いられるＤＮＡポリメラーゼは、当分野で既知のいずれかのＤＮＡポリメラーゼであり、そしてより好ましくはE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、本発明の方法において用いられるプライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。適当なオリゴヌクレオチドプライマーは本明細書において記載され、かつ技術者により修飾され得る。他の実施態様において、セカンドストランドＤＮＡ合成バッファー、ＤＮＡリガーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＩＴＰの混合物、ＲＮａｓｅ  Ｈ（いずれかの残存ＲＮＡ分子を分解するため）、およびヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏが存在する（実施例１を参照）。
【００７１】
ファーストストランドＤＮＡの、第２のランダムプライマーと鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成に十分な条件下での接触は、異なる長さおよび異なる開始位置および停止位置を有する２本鎖ｃＤＮＡ分子の生成という結果となる。ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの５’末端の遺伝子情報を含むｃＤＮＡ分子中の２本鎖ｃＤＮＡ分子が特に興味深い。２本鎖ｃＤＮＡ分子の長さは典型的には、約５００〜３０００ｎｔの範囲であり、好ましくは約１０００〜２０００ｎｔ、そしてさらに好ましくは約１５００〜２０００ｎｔの範囲である。
【００７２】
別の実施態様において、本発明は、ｍＲＮＡ分子試料から５’濃縮ｃＤＮＡライブラリーを生成する方法を指示し、該方法は：（ａ）該ｍＲＮＡを（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と、鋳型由来の酵素デオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること、それによりｃＤＮＡ分子の第１の群が生成されること；（ｂ）ｃＤＮＡ分子の該第１の群を（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しない第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼプロモーターと、鋳型由来のデオキシリボ核酸合成が生じるのに十分な条件下で接触させること、それにより２本鎖ｃＤＮＡ分子の該第２の群が生成されること；および（ｃ）２本鎖ｃＤＮＡ分子の該第２の群を単離することを含有し、上記該５’濃縮ライブラリーが生成される。「５’濃縮」により、ライブラリー中のｃＤＮＡの重要な群が、ｃＤＮＡがもたらされるもの由来のｍＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列情報を含有することを意味する。従属発明の５’濃縮ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも５、普通は少なくとも５０、そしてより普通には少なくとも１００の異なるｃＤＮＡ（すなわち、互いに配列の異なるｃＤＮＡ）を含有し、ここでライブラリー中の異なるｃＤＮＡの数は１０，０００と同じかまたはより大きい。ライブラリーのｃＤＮＡ成分の重要な部分は、それらがもたらされたもの由来の対応ｍＲＮＡの５’配列情報を含み、ここで対応するｍＲＮＡ由来の５’配列情報を含むライブラリー中の異なるｃＤＮＡのパーセンテージは少なくとも約１０％、普通は少なくとも約２０％、そしてより普通には少なくとも約２５％であり、ここでパーセンテージはある実施態様において４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上を含む３０％と同じかまたはそれ以上であり得る。第１のステップで鋳型として働く最初のｍＲＮＡは様々な異なる試料中に存在し、試料は典型的には生理的試料からもたらされる。好ましい実施態様において、生理的供給源は原核生物の組織または細胞（すなわち、酵母細胞）および真核生物の組織または細胞である。より好ましい実施態様において、試料供給源は哺乳類の組織または細胞であり、そして最も好ましくは試料供給源はヒトの組織または細胞である。別の実施態様において、試料は本明細書で記載される組織または細胞由来の全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、試料は１×１０６細胞またはそれ未満の細胞由来の全ＲＮＡを含有し、かつ試料は少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、これらのプロモーターからＲＮＡ合成またはＤＮＡ合成をそれぞれ開始する。特定の実施態様において、セカンドストランドｃＤＮＡ合成に用いられるＤＮＡポリメラーゼは当分野で既知のＤＮＡポリメ���ーゼのいずれかであり、そしてより好ましくは、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、本発明の方法において用いられるプライマーは、それぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。適当なオリゴヌクレオチドプライマーが本明細書において記載され、かつ技術者により修飾されることができる。さらなる実施態様において、最初の１本鎖ＲＮＡ分子がポリアデニル化末端を含有するところで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上のランダムプライマーは、ｍＲＮＡにｍＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーと組み合わせて鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下で接触する。別の実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは固体支持体の表面と安定的に関連する。別の実施態様において、２本鎖ｃＤＮＡ分子の第２の群が以下に記載される様にベクターに導入され得る。
【００７３】
別の実施態様において、結果として生じた単離２本鎖ｃＤＮＡは次に、要望通りの増幅および引き続いての使用のため当業者によく知られた方法を用いて適当なベクターに結合され得る。適当なベクターは、ウイルスベクター、ファージミドベクターおよびプラスミドベクターを含む。一般的にこのステップは、ベクターの２本鎖ｃＤＮＡとの、ベクターとのｃＤＮＡのライゲーションが生じるのに十分な条件下での接触を含む。典型的には、ベクターおよびｃＤＮＡは処理されて、少なくとも１つ、そして好ましくは２つの異なる制限酵素部位を有する相補的または「付着末端」を生成するであろう。この前もっての処置ステップは、必要な制限酵素部位などを導入するためにベクターおよび／または２本鎖ｃＤＮＡの末端上へのリンカー配列またはアダプター配列のライゲーションをさらに含み得る。
【００７４】
ｃＲＮＡ合成方法
好ましい実施態様において、本発明は多数の異なるｍＲＮＡを含有する試料から少なくとも１つのｃＲＮＡを合成する方法を提供し、該方法は：（ａ）該試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを（i）ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と、逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させること；（ｂ）ファーストストランドｃＤＮＡを（i）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しない、ここで該第２のランダムプライマーはセカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的である第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触させること；（ｃ）該２本鎖ｃＤＮＡを単離および生成すること；および（ｄ）該精製２本鎖ｃＤＮＡを鋳型由来のＤＮＡ転写が生じるのに十分な条件下のインビトロでの転写の対象とすることを含有し、上記ｃＲＮＡが生成される。
【００７５】
インビトロでの転写は、当分野で既知のいずれかの方法、すなわち実施例１；Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New Yorkより成し遂げられ得る。２本鎖ｃＤＮＡをインビトロでの転写の対象とすることに先立ち、当業者に良く知られたいずれかの方法（Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York）および本明細書において記載される方法を用いて２本鎖ｃＤＮＡ分子をベクターに導入する必要があり得る。
【００７６】
好ましい実施態様において、生理的供給源は原核生物の組織または細胞（すなわち、酵母細胞）および真核生物の組織または細胞である。さらに好ましい実施態様において、試料供給源は哺乳類の組織または細胞であり、そして最も好ましくは試料供給源はヒト組織または細胞である。別の実施態様において、試料は本明細書に記載の組織または細胞由来の全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、試料は最大１×１０６細胞由来の全ＲＮＡを含有し、かつ試料は少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、かつＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてこれらのプロモーターからＲＮＡ合成またはＤＮＡ合成をそれぞれ開始する。特定の実施態様において、セカンドストランドｃＤＮＡ合成のため用いられるＤＮＡポリメラーゼは、当分野で既知のＤＮＡポリメラーゼのいずれかであり、そしてさらに好ましくは、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、本発明の方法で用いられるプライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。適当なオリゴヌクレオチドプライマーは本明細書おいて記載され、かつ技術者により修飾され得る。さらなる実施態様において、最初の１本鎖ＲＮＡ分子がポリアデニル化末端を含有するところで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上のランダムプライマーがＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）と組合せてｍＲＮＡを、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じるのに十分な条件下で接触する。別の実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは固体支持体の表面と安定的に関連する。
【００７７】
好ましい実施態様において、合成ｃＲＮＡは、標識、すなわち、当分野で既知および本明細書において記載される任意の標識で標識される。他の好ましい実施態様において、合成ｃＤＮＡは標識で標識され、ここで標識は蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識である。さらに好ましくは、標識は蛍光である。本発明の方法の好ましい標識はフルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０のようなフルオロフォアであり、特に好ましくはＣｙ３およびＣｙ５である。
【００７８】
別の実施態様において、本発明は試料由来の標的ｍＲＮＡの存在または非存在を測定およびインビトロでの転写ステップおよびｃＲＮＡ生成の後の試料中の標的ｍＲＮＡへの薬物標的の作用を測定する方法を提供する。
【００７９】
別の実施態様において、本発明は、ｍＲＮＡが少なくとも１つの該細胞から抽出される方法を指示し、および（ｅ）上述のステップ（ｄ）で生成されたｃＲＮＡを配列のあらかじめ選択された部位に位置する１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させること；および（ｆ）該１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドと該ｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することをさらに含有する。調製方法およびマイクロアレイの使用方法は本明細書において記載される。
【００８０】
生物学的応答の特性を測定する方法
ある実施態様において、本発明は、第１の試料および第２の試料中の少なくとも１つの該ｍＲＮＡの存在または量を比較する方法を指示し、該第１の試料および第２の試料は、１またはそれ以上の細胞由来の多数の異なるｍＲＮＡをそれぞれ含有し、該方法は：（ａ）該試料中の少なくとも１つのｍＲＮＡを、（i）ファーストストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにｍＲＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上の第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ii）逆転写酵素と、逆転写酵素活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより合成すること；（ｂ）ファーストストランドｃＤＮＡを（i）セカンドストランドｃＤＮＡ合成を準備するためにファーストストランドｃＤＮＡ中の配列に十分に相補的であるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しない第２のランダムプライマー、および（ii）ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡポリメラーゼ活性が生じるのに十分な条件下で接触させることにより２本鎖ｃＤＮＡを合成すること；（ｃ）該２本鎖ｃＤＮＡを単離および精製すること；（ｄ）該精製した２本鎖ｃＤＮＡを、鋳型由来のＤＮＡ転写が生じるのに十分な条件下でインビトロでの転写の対象とし、上記ｃＲＮＡを生成すること；（ｅ）ステップ（ｄ）で生成されたｃＲＮＡを第１の標識で標識すること；（ｆ）ステップ（ａ）〜（ｄ）を該第２の試料で繰り返すこと；（ｇ）ステップ（ｆ）で生成されたｃＲＮＡを該第１の標識と区別可能な第２の標識で標識すること；（ｈ）第１の試料中の該ｍＲＮＡを、該第１の標識で標識された第１のｃＲＮＡを、該ｍＲＮＡの該第１のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させることにより検出または測定すること；および該プローブと該第１のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出すること；（i）第２の試料中の該ｍＲＮＡを、該第２の標識で標識された第２のｃＲＮＡを、該ｍＲＮＡの該第２のｃＲＮＡにハイブリダイズ可能な該ポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションを助ける条件下で接触させることにより検出または測定すること；および該プローブと該第２のｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出すること；および（ｊ）該第１の試料で検出または測定された該ｍＲＮＡのレベルを、該第２に試料で検出または測定された該ｍＲＮＡのレベルと比較すること、を含有する。
【００８１】
第１のステップにおいて鋳型として働く最初のｍＲＮＡは、試料が生理的試料から典型的にもたらされる、様々な異なる試料に存在し得る。好ましい実施態様において、生理的供給源は原核生物の組織または細胞（すなわち、酵母）および真核生物の組織または細胞である。より好ましい実施態様において、試料供給源は哺乳類の組織または細胞であり、そして最も好ましくは試料供給源はヒトの組織または細胞である。別の実施態様において、試料は本明細書に記載される組織または細胞由来の全ＲＮＡまたは全ｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、試料は１×１０６細胞またはそれ未満の細胞由来の全ＲＮＡを含有し、および試料は少なくとも１０，０００の異なるｍＲＮＡを含有する。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列であり、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、これらのプロモーターからＲＮＡ合成またはＤＮＡ合成をそれぞれ開始する。特定の実施態様において、セカンドストランドｃＤＮＡ合成のために用いられるＤＮＡポリメラーゼは、当分野で既知のいずれかのＤＮＡポリメラーゼであり、そしてさらに好ましくはE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施態様において、本発明の方法で用いられるプライマーはそれぞれ４〜５０ヌクレオチド長である。適当なオリゴヌクレオチドプライマーが本明細書のおいて記載され、および技術者により修飾され得る。さらなる実施態様において、最初の１本鎖ＲＮＡ分子がポリアデニル化末端を含有するところで、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する１またはそれ以上のランダムプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）と組合せてｍＲＮＡを、鋳型由来の酵素ＤＮＡ合成が生じる条件下で接触する。別の実施態様において、オリゴ（ｄＴ）プライマーは固体支持体の表面と安定的に関連する。
【００８２】
好ましい実施態様において、合成第１ｃＲＮＡおよび第２のｃＲＮＡは標識、すなわち、当分野で既知および本明細書において記載されるいずれかの標識で標識される。他の好ましい実施態様において、合成第１ｃＲＮＡおよび第２ｃＲＮＡは、蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識である標識で標識される。好ましくは、標識は蛍光である。本発明の方法において好ましい標識はフルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０のようなフルオロフォアであり、特に好ましくはＣｙ３およびＣｙ５でのものである。
【００８３】
好ましい実施態様において、第１の一定分量の第１ｃＲＮＡは、第１の発光スペクトルを有する第１のフルオロフォアで標識され、かつ第２の一定分量の第２のｃＲＮＡは第１の発光スペクトルのものとは異なる第２の発光スペクトルを有する第２のフルオロフォアで標識される；より好ましくは、第１のフルオロフォアはＣｙ３であり、かつ第２のフルオロフォアがＣｙ５である。
【００８４】
別の実施態様において、上述のステップ（ｈ）および（ｉ）において、該第１の標識で標識された第１のｃＲＮＡを該ポリヌクレオチドプローブと接触させる；および該第２の標識で標識された第２のｃＲＮＡを該ポリヌクレオチドプローブと接触させるステップが同時または連続して実行される方法を指示する。用語「同時に」は、同一時間で生じる２つの出来事に言及し、かつ用語「連続して」は、特定順序で続いて起こることおよび次に起こることに言及する。
【００８５】
好ましい実施態様において、第１の試料は、異常細胞由来のｍＲＮＡを含有し、かつここで該第２の試料は正常細胞由来のｍＲＮＡを含有する；または第１の試料は薬物処理された細胞由来のｍＲＮＡを含有し、かつここで該第２の試料は無処理の細胞由来のｍＲＮＡを含有する。ここでこれらの細胞由来の該ｍＲＮＡの該レベルが比較され得る。
【００８６】
別の実施態様において、本発明は、ステップ（ｈ）および（ｉ）において、該ファーストおよびセカンドｃＲＮＡを配列のあらかじめ選択された部位に位置する１またはそれ以上の種のポリヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼーションが生じるのに十分な条件下で接触させること；および該ポリヌクレオチドプローブと該ｃＲＮＡとの間で生じるいずれかのハイブリダイゼーションを検出することを含有する方法により実行される方法を指示する。
【００８７】
方法は、多種多様の撹乱に対する生物学的システムの応答を測定する能力を利用する。生物学的応答を測定する典型的な方法は本明細書において記載される。当業者は、本発明が生物学的システムの応答を測定する以下の特定の方法に制限されないことを理解する。特に、該ｃＲＮＡの存在（およびそれ故試料中の該ｍＲＮＡ）が、ノーザンブロットまたはプローブとしてビーズが結合したオリゴヌクレオチドを用いること、またはポリヌクレオチドマイクロアレイの使用を含むがこれらに制限されない方法により検出または測定され得る。別の実施態様において、本発明の合成された標識ｃＲＮＡプローブは、ドットブロット解析、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、およびアンチセンスＲＮＡ研究を含むがこれらに制限されない様々な他の方法を利用し得る。
【００８８】
ドットブロット解析：ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ，またはオリゴを利用する任意のタイプのドットブロット実験のため、当業者は本発明を用いて、全長範囲のｃＲＮＡプローブを合成し得る。ゲノムＤＮＡについて、この方法を用いて、「これより少ないが、他の生物由来のエクソンに類似するこの生物に存在するエクソンがあるか」のような進化型の質問をし得る。
【００８９】
ディファレンシャルハイブリダイゼーション：細胞タイプまたは組織間の発現差を研究する際、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを利用することが時として有用である。バクテリアファージプラークとして表されるｃＤＮＡライブラリーは、比較することが望まれる細胞タイプまたは組織から、本発明の方法によりｃＲＮＡでハイブリダイズ、合成、標識され得る。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲおよびアンチセンスＲＮＡ研究：ある組織由来のｍＲＮＡプールの逆転写反応は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する本発明のランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いて準備され得る。次のステップであるＰＣＲでランダムＴ７プライマーを用いる具体例および非制限の実施例において、望まれるｍＲＮＡの５プライ末端およびプライマーに相補的であるＴ７プロモーターに向く遺伝子特異的な上方プライマーを用いる。緊縮条件下（長い（２７〜３０ｍｅｒ）の上方プライマー、高いアニーリング温度、または好ましくはタッチダウンＰＣＲプロトコール）で用いられると、最適な遺伝子の全長ｃＤＮＡを単離することができる。加えて、このｃＤＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いるアンチセンス方向でインビトロで転写される準備ができている。アンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ研究において、ａ）アンチセンスＲＮＡの二次構造測定での使用；ｂ）インサイツハイブリダイゼーションのためのアンチセンスＲＮＡプローブとして放射性またはビオチンで直接的に標識される使用；ｃ）通常の方法により生成される対応するセンスｍＲＮＡとの２本鎖のＲＮＡ干渉実験での使用；ｄ）他のアンチセンスＲＮＡ実験のため用いられることができる。さらに、単一の逆転写反応が、上方プライマーを変えることにより複数の異なる遺伝子のため用いられ得る。これは特に、研究下の組織または細胞タイプがまれだと、有用である。
【００９１】
本発明のある特定の実施態様において、１またはそれ以上の標識がインビトロでの転写ステップの間でＲＮＡへ導入されて、本明細書において記載される様に、遺伝子発現プロファイルを促進する。遺伝子発現はいくつかの方法のうちいずれかでプロファイルされ得る。好ましい方法は、ＤＮＡマイクロアレイを、上述のように生成された標識ＲＮＡ転写物で探索することである。ＤＮＡマイクロアレイまたはチップは、固体支持体上の定義されたパターンで配置されるＤＮＡフラグメントまたは合成オリゴヌクレオチドの顕微鏡アレイであり、ここで、それらは標準的ハイブリダイゼーション方法による解析に敏感に反応する（Schena, BioEssays 18: 427, 1996）。
【００９２】
マイクロアレイのＤＮＡは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、全長配列クローンから、または発現配列標的（ＥＳＴ）として既知の特に配列決定されたｃＤＮＡからもたらされ得る。かかるＤＮＡ分子を得る方法は、一般に当分野で既知である（例えば、Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New Yorkを参照）。または、オリゴヌクレオチドは、ホスホラミデイトベースの合成のような通常の方法により合成され得る。
【００９３】
遺伝子発現プロファイルは、疾患のスクリーニング、診断、ステージ決定、治療応答のモニタリング、ならびに薬物および病原の遺伝標的を同定する目的のためなされ得る。
【００９４】
ＤＮＡアレイを用いる転写物アッセイ
本発明の方法は遺伝子発現プロファイルの解析に特に有用である。発現プロファイルのため、ＤＮＡマイクロアレイは典型的には、本発明の方法（すなわち、２本鎖ＤＮＡの生成、少なくとも１つのｃＲＮＡ分子の合成、少なくとも１つの合成ｃＲＮＡ分子の標識、５’濃縮ｃＤＮＡライブラリーの生成）を用いて遺伝子発現プロファイルを解析することが望まれる細胞から抽出およびｃＲＮＡに合成されるｍＲＮＡを用いて検索される。いずれかの該２試料間の比較を容易にするため、ｍＲＮＡは典型的には、上述の様に異なる波長で放出する蛍光ダイで別々に標識される。
【００９５】
本発明のある実施態様は、遺伝子の転写比の測定に基づく。転写比は、核酸または核酸模倣プローブの配列へのハイブリダイゼーション技術により測定されることができる。しかしながら測定された結果は、ＤＮＡ発現比（ＲＮＡ分解比での差がない）を普通に示すＲＮＡ存在比を表す値を含む、絶対的な転写物の相対量または応答データのいずれかである。
【００９６】
様々な本発明の代わりの実施態様において、翻訳状態、活性化状態のような転写状態以外の生物学的状態の態様、または混合態様が測定されることができる。好ましくは、転写状態の測定は、本明細書において記載される転写物配列へのハイブリダイゼーションによりなされる。転写状態の測定のある他の方法もまた、本明細書において記載される。
【００９７】
好ましい実施態様において、本発明は「転写物配列」（本明細書において「マイクロアレイ」としても言及される）を使用する。転写物配列は、生物学的試料の転写状態の解析、および該薬物の段階的レベルまたは該生物学的経路への段階的撹乱にさらされた生物学的試料の転写状態の測定に利用されることができる。
【００９８】
ある実施態様において、転写物配列は、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能な標識ポリヌクレオチド（例えば、本発明の方法により合成される蛍光標識ｃＲＮＡ）をマイクロアレイにハイブリダイズすることにより生成される。マイクロアレイは、細胞または生物のゲノム中の遺伝子、好ましくはたいていの遺伝子またはほとんどすべての遺伝子の多くの産物への結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位の順番配列を有する表面である。マイクロアレイは多くの方法で作成される。しかしながら生成されたマイクロアレイは、ある好ましい特徴を共有する。特に配列は再生可能であり、与えられた配列の複数のコピーが生成および互いに容易に比較されることを可能とする。好ましくは、マイクロアレイは一般には５ｃｍ２より小さいものであり、およびそれらは結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）の条件下で適当な材料から生成される。与えられた結合部位またはマイクロアレイの結合部位の特徴的なセットは特に、細胞の単一遺伝子の産物に結合する。特定のｍＲＮＡ当たり１より多くの物理的結合部位（以下「部位」）が存在するが、明確さのため、以下の考察が単一部位が存在することを推測する。
【００９９】
ある実施態様において、マイクロアレイはポリヌクレオチドプローブの配列であり、配列は少なくとも１つの表面および少なくとも１００の異なるポリヌクレオチドプローブを有する支持体を含有し、それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブは異なるヌクレオチド配列を含有し、かつ表面上の異なる位置の支持体の表面に接触する。好ましくは、それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、４０〜８０ヌクレオチド長である。より好ましくは、それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、５０〜７０ヌクレオチド長の範囲である。なおより好ましくは、それぞれの異なるポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、５０〜６０ヌクレオチド長の範囲である。
【０１００】
特定の実施態様において、配列は、少なくとも２，０００、４，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、５０，０００、８０，０００、または１００，０００の異なるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドプローブを含有する。
【０１０１】
別の実施態様において、配列中のそれぞれのポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、特定の標的ポリヌクレオチド配列に特異的である。さらに別の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、細胞または生物の発現ポリヌクレオチド配列を含有する。特定の実施態様において、細胞または生物は哺乳類細胞または生物である。別の特定の実施態様において、細胞または生物はヒト細胞または生物である。
【０１０２】
特定の実施態様において、配列の異なるポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、細胞または生物のゲノム中の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％に特異的である。最も好ましくは、配列の異なるポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、細胞または生物のゲノム中の全遺伝子に特異的である。
【０１０３】
特定の実施態様において、配列のポリヌクレオチドプローブは、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００の異なるポリヌクレオチド配列、少なくとも８０，０００、または少なくとも１００，０００の異なるポリヌクレオチド配列に特異的かつ区別可能にハイブリダイズする。
【０１０４】
他の特定の実施態様において、配列のポリヌクレオチドプローブは、遺伝子の少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または細胞または生物のゲノムの遺伝子転写物に特異的かつ区別可能にハイブリダイズする。最も好ましくは、配列のポリヌクレオチドプローブは、遺伝子、または細胞または生物の全ゲノムの遺伝子転写物に特異的かつ区別可能にハイブリダイズする。
【０１０５】
特定の実施態様において、配列は、１ｃｍ２当たり少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも１，０００、または少なくとも２，５００のプローブを有し、好ましくは、全部または少なくとも２５％または５０％が互いに異なる。別の実施態様において、配列は、潜在的に指定可能な配列である（それぞれの位置のポリヌクレオチドの配列が既知であるという点で）。
【０１０６】
別の実施態様において、配列中のそれぞれのポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。別の実施態様において、ＤＮＡ配列は、１本鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、例えば、ｃＤＮＡ配列または合成配列であり得る。好ましい実施態様において、配列中のそれぞれのポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、オリゴデオキシリボヌクレオチド配列である。
【０１０７】
細胞のＲＮＡに相補的なｃＲＮＡが合成かつ適当なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイにハイブリダイズすると、特定の遺伝子に対応する配列中の部位へのハイブリダイゼーションレベルが遺伝子から転写されたｍＲＮＡが細胞中に行き渡ることを示すことは、当業者により理解されるだろう。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能な（例えばフルオロフォアでの）標識ｃＲＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズすると、細胞で転写されない遺伝子に対応する配列の部位（すなわち、遺伝子産物に特異的に結合可能である）は、ほとんどまたは全くシグナルを有さず（例えば、蛍光シグナル）、そしてコード化ｍＲＮＡが行き渡る遺伝子は比較的強いシグナルを有する。
【０１０８】
好ましい実施態様において、２つの異なる細胞由来のｃＲＮＡは、マイクロアレイの結合部位へハイブリダイズする。薬物応答のモニタリングの場合、一方の生物学的試料が薬物にさらされ、同一タイプの別の生物学的試料は薬物にさらされない。経路応答の場合、一方の細胞は経路撹乱にさらされ、同一タイプの別の細胞は経路応答にさらされない。２つの細胞タイプのそれぞれに由来するｃＲＮＡは、それらが区別され得るように異なって標識をされる。ある実施態様において、例えば、薬物処理された（または経路撹乱にさらされた）細胞由来のｃＲＮＡがフルオレッセイン標識ＮＴＰを用いて合成され、かつ薬物にさらされていない第２の細胞由来のｃＲＮＡがローダミン標識ＮＴＰを用いて合成される。２つのｃＲＮＡが混合されマイクロアレイにハイブリダイズすると、それぞれのｃＲＮＡセットからのシグナルの相対強度が配列のそれぞれの部位、および検出された多量の特定のｍＲＮＡのいずれかの相対差について測定される。
【０１０９】
上述された例において、薬物処理された（または経路撹乱された）細胞由来のｃＲＮＡはフルオロフォアが刺激されると緑の蛍光を発し、無処理の細胞由来のｃＲＮＡは赤の蛍光を発する。結果として、薬物処理が細胞中の比較的多量の特定のｍＲＮＡに直接的または非直接的のいずれかで作用しない場合、ｍＲＮＡは細胞の両方および逆転写で同様に広く行き渡り、赤の標識ｃＲＮＡおよび緑の標識ｃＲＮＡは同様に広く行き渡る。マイクロアレイにハイブリダイズすると、ＲＮＡの該種に対する結合部位は、両フルオロフォア（および組合せで茶色に見える）の特徴波長を放出する。対照的に、薬物にさらされた細胞が直接的または非直接的に薬物で処理されると、細胞中のｍＲＮＡの行き渡りが増加し、赤の蛍光に対する緑の蛍光の割合は増加する。薬物がｍＲＮＡの広がりを減少すると、割合は減少する。
【０１１０】
２色蛍光の使用および緑の発現の変化を定義するための検出スキームは、例えば、Schena et al., 1995, Science 270:467-470において記載され、これは本明細書において全体として参考により取り込まれる。２つの異なるフルオロフォアで標識されたｃＲＮＡを用いる利点は、２つの細胞状態のそれぞれの配列遺伝子に対応するｍＲＮＡレベルの直接的および非直接的に制御された比較がなされ、かつ実験条件（例えば、ハイブリダイゼーション条件）での若干の差に帰するバリエーションが引き続いての解析に作用しないことである。しかしながら、単細胞由来のｃＲＮＡを使用、および例えば、薬物処理された細胞または経路撹乱された細胞および無処理細胞中の特定のｍＲＮＡの絶対量を、例えば比較することも可能であることが認識される。
【０１１１】
好ましい実施態様において、２つの異なる細胞由来のｃＲＮＡがマイクロアレイの結合部位にハイブリダイズする。この実施態様において、一方の生物学的試料は病気の組織または細胞由来であり、かつ同一タイプの他の生物学的試料は正常な病気でない組織または細胞由来である。本明細書において記載される様に、これらの試料は、あり実施態様において標識され、そして２色蛍光標識および緑の発現での変化を定義するための検出スキームの対象とされ得る。従って、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する本発明のランダムオリゴヌクレオチドを用いる標識ｃＲＮＡ分子の合成は診断方法において用いられることができる。ここで、合成されたｃＲＮＡ配列は、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌を含むが、これらに制限されない感染性疾疾病因子の配列（例えば、ゲノム）に相補的であり、それにより、患者由来の核酸の試料中の感染因子の存在を診断する。標的核酸は、ゲノムまたはｃＤＮＡまたはｍＲＮＡまたは合成、ヒトまたは動物、または微生物のもの等であり得る。疾病または疾患の診断または予後において使用され得る別の実施態様において、標的配列は野生型ヒトゲノム配列またはＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列、ヒト疾病または疾患の存在に関与するか、または任意で配列を変異され得るものの変異である。かかる実施態様において、変異は挿入、置換、および／または１またはそれ以上のヌクレオチドの欠損、または転座であり得る。
【０１１２】
マイクロアレイの調製
マイクロアレイは当分野で既知であり、かつ遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ。ｃＲＮＡ、ポリペプチド、およびそれらのフラグメント）に対して配列において対応するプローブが既知の位置で特異的にハイブリダイズするかまたは結合し得るものへの表面からなる。ある実施態様において、マイクロアレイはそれぞれの位置が遺伝子によりコード化される産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）の別の結合部位を表し、かつ結合部位が生物のゲノムの遺伝子の多くまたはほとんど全ての産物に存在する配列（すなわち、基質）である。好ましい実施態様において、「結合部位」（以後「部位」）は、特定の同族ｃＲＮＡが特異的にハイブリダイズし得るものへの核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、全長ｃＲＮＡ、全長より短いｃＲＮＡ、または遺伝子フラグメントであり得る。
【０１１３】
ある実施態様において、マイクロアレイは標的生物のゲノム中の全てまたはほとんど全ての遺伝子の産物に対する結合部位を含有する。このマイクロアレイは、ゲノムの少なくとも約５０％の遺伝子、しばしば約７５％、さらにしばしば少なくとも８５％、なおさらにしばしば約９０％より多く、最もしばしば少なくとも約９５％に対応する結合部位を有する。
【０１１４】
しかしながらかかる包括性は、必ずしも必要ではない。別の実施態様において、マイクロアレイはヒト遺伝子の産物に対する結合部位を含有する。このマイクロアレイは、ゲノムの少なくとも約５〜１０％の遺伝子、好ましくは約１０〜１５％、そしてより好ましくは少なくとも約４０％の遺伝子に対応する結合部位である。
【０１１５】
好ましくは、マイクロアレイは該薬物の動き、該疾病、または該生物学的経路に関係する遺伝子の結合部位を有する。「遺伝子」は、ｍＲＮＡが生物（例えば、単細胞なら）または多細胞生物中のある細胞において転写されるもの由来の好ましくは少なくとも５０、７５、または９９アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として定義される。ゲノム中の遺伝子の数は、生物により、またはゲノムのよく特徴付けられた部分由来の外挿により発現されるｍＲＮＡの数から推定され得る。該生物のゲノムが配列決定されると、ＯＲＦの数が測定され、かつｍＲＮＡコード領域がＤＮＡ配列の解析により同定され得る。例えば、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムは完全に配列決定され、９９アミノ酸より長い約６２７５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有すると報告されている。これらのＯＲＦの解析は、特定のタンパク質産物であり得る５８８５のＯＲＦが存在することを示す（Goffeau et al., 1996, Science 274:546-567, which is incorporated by reference in its entirety）。対照的に、ヒトゲノムは、約１０５遺伝子を含有すると予測される。
【０１１６】
マイクロアレイのための核酸の調製
上で示した様に、特定の同族ｃＲＮＡが特異的にハイブリダイズするものへの「結合部位」は普通は、核酸または結合部位で接着した核酸類似体である。ある実施態様において、マイクロアレイの結合部位は、生物のゲノムのそれぞれの遺伝子の少なくとも一部に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより）、またはクローン配列由来の遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得られる。ＰＣＲプライマーは、特徴あるフラグメント（すなわち、連続同一配列のより多い塩基をマイクロアレイのいずれかのフラグメントとも共有しないフラグメント）の増幅を結果として生じるゲノムまたはｃＤＮＡの既知の配列に基づき選択される。コンピュータープログラムは、必要な特異性および最適な増幅特性を有するプライマーのデザインで有用である。例えば、Oligo version 5.0 (National Biosciences)を参照されたい。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、オリゴ−ｄＴプライマーｃＤＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズされると、全長未満のプローブが効果的に結合するように、時として遺伝子の３’末端に近いセグメントを増幅することが望まれる。典型的には、マイクロアレイのそれぞれの遺伝子フラグメントは約５０ｂｐから約２０００ｂｐの間であり、より典型的には約１００ｂｐから１０００ｂｐの間であり、そしてより普通には約３００ｂｐから約８００ｂｐ長の間である。
【０１１７】
ＰＣＲ法は良く知られており、かつ例えば、Innis et al., eds., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego, Califにおいて記載され、これは全体として参考により本明細書において取り込まれる。コンピューター制御のロボットシステムは核酸の単離および増幅に有用であることは明らかである。
【０１１８】
マイクロアレイのため核酸を生成する任意の方法は、例えば、Ｎ−ホスホン酸塩またはホスホラミデイト化学反応を用いる合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものである（例えば、Froehler et al., 1986, Nucleic Acid Res 14:5399-5407）。合成配列は、長さ約１５から約１００塩基の間であり、好ましくは約２０から約５０塩基の間である。
【０１１９】
ある実施態様において、合成核酸は非天然の塩基、例えば、イノシンを含む。与えられた配列の特定の塩基が未知であるか、または多型であるところで、イノシンまたは５−ニトロインドールのような普遍塩基が置換され得る。加えて、オリゴヌクレオチドのリン酸塩バックボーン上の変化を、例えば、チオレーションまたはメチレーション、またはリン酸塩バックボーンよりペプチドを使用することににより変動させることが可能である。かかる修飾を行うことは当分野の訓練を受けたものの技術の範囲内である。
【０１２０】
上で示した様に、核酸類似体をハイブリダイゼーションの結合部位として用い得る。適当な核酸類似体の実施例は、ペプチド核酸である（例えば、Egholm et al., 1993, Nature 365:566-568および米国特許番号５，５３９，０８３を参照）。
【０１２１】
代わりの実施態様において、結合（ハイブリダイゼーション）部位は、プラスミド、遺伝子のファージクローン、ｃＤＮＡ（例えば、発現配列標識）、またはそれらの挿入から作られる（Nguyen et al., 1995, Genomics 29:207-209）。さらに別の実施態様において、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０１２２】
固体表面への核酸の接着
核酸または類似体が、ガラス、シリコン、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル）ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、セルロースアセテートまたは他の物質から作られうる、固体支持体に接着される。一般に、非多孔性支持体、および特定のガラスが好ましい。固体支持体はまた、それに加えてオリゴヌクレオチドの結合を増強、またはそれに加えて望んでいない物質の非特異的結合を減少するためにかかる方法で処理され得る。好ましくは、ガラス支持体はポリリジンまたはシランで処理されて、スライドへのオリゴヌクレオチドの接着を促進する。
【０１２３】
固体支持体上のＤＮＡを固定化する方法は、直接接着、マイクロピペッティング（Yershov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93(10):4913-4918）、または配列中の特定の支持体に与えられたオリゴヌクレオチドを向かせる制御された電場の使用（米国特許番号５，６０５，６６２）を含み得る。ＤＮＡは典型的には、１ｃｍ２当たり１００から１０，０００密度のオリゴヌクレオチド、好ましくは１ｃｍ２当たり約１０００密度のオリゴヌクレオチドで固定される。
【０１２４】
表面へ核酸を接着させる好ましい方法は、Schena et al., 1995, Science 270:467-470により一般に記載される様に、ガラスプレート上へのプリンティングによるものである。この方法は本質的には、ｃＤＮＡのマイクロアレイの調製に有用である。DeRisi et al., 1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, Genome Res. 6:639-645;およびSchena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(20):10614-19もまた参照されたい。
【０１２５】
固体支持体上への事前製造されたオリゴヌクレオチドの固定の好ましい代わりにおいて、支持体上でのオリゴヌクレオチドの直接的合成が可能である（Maskos et al., Nucl. Acids Res. 21: 2269-70, 1993; Fodor et al., Science 251: 767-73, 1991; Lipshutz et al., 1999, Nat. Genet. 21(1 Suppl):20-4）。固体支持体上でのオリゴヌクレオチドを直接的に合成する方法の間で、特に好ましい方法は、フォトリソグラフィー（Fodor et al., Science 251: 767-73, 1991; McGall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93: 13555-60, 1996）および圧電プリンティング（Lipshutz et al., 1999, Nat. Genet. 21(1 Suppl):20-4）を含み、最も好ましくは圧電方法である。
【０１２６】
ある実施態様において、高密度のオリゴヌクレオチド配列が利用される。技術は、定義された配列に相補的な何千ものオリゴヌクレオチドを含有する配列を、表面上の定義された遺伝子座で組織内での合成のためのフォトリソグラフィー技術（Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:1675-80；米国特許番号５，５７８，８３２；米国特許番号５，５５６，７５２；および米国特許番号５，５１０，２７０；それぞれ全体として参考により取り込まれる）または迅速合成および定義されたオリゴヌクレオチドの析出（Lipshutz et al., 1999, Nat. Genet. 21(1 Suppl):20-4.）のための他の方法を用いて生成することで知られている。
【０１２７】
これらの方法を用いる場合、既知配列のオリゴヌクレオチド（例えば、２０ｍｅｒ）が、誘導体化されたガラススライドのような表面上で直接的に合成される。普通は、生成された配列は、それぞれの標的転写物に対する複数のプローブを含有する。オリゴヌクレオチドプローブは選択されて、選択的スプライスされたｍＲＮＡに向くか、または様々なタイプの対照として働き得る。
【０１２８】
マイクロアレイを作成する別の好ましい方法は、例えば、全体として参考により本明細書に取り込まれる米国特許番号６，４１９，８８３に記載される様に、固相上でオリゴヌクレオチドの直接的に合成するためにインクジェットプリンティング方法の使用によるものである。
【０１２９】
例えば、マスキング（Maskos and Southern, 1992, Nuc. Acids Res. 20:1679-1684）によるマイクロアレイを作成する他の方法がまた、用いられ得る。主に、いずれかのタイプの配列、例えば、ナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）が用いられ得るが、当分野の技術者により認識されるように、ハイブリダイゼーション量がより小さくなるため非常に短い配列が好ましい。
【０１３０】
マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特定の配列部位「特異的に結合する」または「特異的にハイブリダイズする」、すなわち、プローブが相補的な核酸配列を有する配列アレー部位にハイブリダイズ、二量体形成、または結合するが、非相補的核酸配列を有する部位へはハイブリダイズしないように最適に選択される。本明細書において使用される様に、一方のポリヌクレオチド配列は、より短いポリヌクレオチドが２５塩基未満または同等であると、標準的塩基対規則を用いるミスマッチがないか、またはより短いポリヌクレオチドが２５塩基より長いと、５％ミスマッチに過ぎない場合、別のものへの相補性を考慮される。好ましくは、ポリヌクレオチドは、完全に相補的である（すなわち、ミスマッチがない）。特定のハイブリダイゼーション条件が、負の対照を含むハイブリダイゼーションアッセイの実行により特異的ハイブリダイゼーションを結果として生じることは、容易に示される（例えば、Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639-645, and Chee et al., 1996, Science 274:610-614を参照）。
【０１３１】
最適なハイブリダイゼーション条件は、長さ（例えば、オリゴマー体２００塩基より大きいポリヌクレオチド）および標識プローブ、固定ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのタイプ（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）に依存する。核酸に特異的（すなわち、緊縮）ハイブリダイゼーション条件のための一般的なパラメーターは、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)およびAusubel et al. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, Media, Pa., and Wiley-Interscience, New York)に記載される。Schena et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614-19)のｃＤＮＡマイクロアレイが用いられると、典型的なハイブリダイゼーション条件は、０．２％ＳＤＳを添加した５３３  ＳＳＣ中での６５℃、４時間ハイブリダイゼーションであり、低緊縮洗浄バッファー（０．２％ＳＤＳを添加した１×ＳＳＣ）、２５℃での洗浄が後に続き、高緊縮洗浄バッファー（０．２％ＳＤＳを添加した０．１×ＳＳＣ、２５℃、１０分間の洗浄が続く（Schena et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10614-19）。有用なハイブリダイゼーション条件はまた、例えば、Tijssen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam and New York,およびKricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, Califにおいて提供される。
【０１３２】
異なる標識ｍＲＮＡ試料の同時ハイブリダイゼーションが好ましいが、単一標識を用いること、および同時よりむしろ連続してハイブリダイゼーションを実行することも可能である。
【０１３３】
単一検出およびデータ解析
蛍光標識されたプローブを用いると、蛍光は転写物配列のそれぞれの部位での蛍光放出は、好ましくは共焦点レーザー顕微鏡スキャニングにより検出され得る。ある実施態様において、適当な励起ラインを用いる別のスキャンは、用いられる２つのフルオロフォアのそれぞれについて実行される。代わりに、レーザーを用いて、２つのフルオロフォアに特異的な波長での同時標本照明を可能とし得るし、２つのフルオロフォアからの放出は同時に解析され得る（例えば、Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639-645を参照、これは全目的のため全体として参考により取り込まれる。）。好ましい実施態様において、配列はコンピューター制御Ｘ−Ｙステージでのレーザー蛍光スキャナーでスキャンされる。２つのフルオロフォアの配列励起は複数のラインで成し遂げられ、混合ガスレーザーおよび放出された光は波長で分けられ、２つの光電子倍増管で検出される。蛍光レーザースキャニング装置はShalon et al., 1996, Genome Res. 6:639-645および本明細書において前述の他の参考文献において記載される。または、Ferguson et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:1681-1684により記載されるファイバー光学バンドルを用いて、多数の部位でのｍＲＮＡの高レベルを同時にモニターし得る。
【０１３４】
シグナルは記録され、好ましい実施態様において、例えばデジタルボードに対して１２ビットアナログを用いて、コンピューターにより解析される。ある実施態様において、スキャンされたイメージは、グラフィックプログラム（例えば、Hijaak Graphics Suite）と用いてデスペックルされ、そして次にそれぞれの部位でのそれぞれの波長での平均ハイブリダイゼーションの表計算を行うイメージグリッディングプログラムを用いて解析される。必要なら、２つの蛍光についてのチャンネル間で「クロストーク」（またはオーバーラップ）について実験的に測定された訂正がなされ得る。転写物配列上の任意の特定のハイブリダイゼーション部位のため、２つのフルオロフォアの放出の割合が測定され得る。割合は、同族遺伝子の絶対的発現レベルには依存しないが、発現が薬物投与、遺伝子欠損、または他の処理された事項により有意に測定される遺伝子にとって有用である。
【０１３５】
本発明の方法によると、２つの生物学的試料中の比較的多量なｍＲＮＡは、撹乱および測定された大きさとして（すなわち、多量さは、処理されたｍＲＮＡの２供給源において異なる）、または混乱でないとして（すなわち、比較的多量さは同一である）記録される。様々な実施態様において、少なくとも２５％の因子であるＲＮＡの２供給源間の差（一方の供給源由来のＲＮＡが他の供給源より一方の供給源で２５％より多い）、より普通には約５０％、なおよりしばしば約２（多数性として２度）、３（多数性として３度）または５（多数性として５度）の因子により、撹乱として記録される。
【０１３６】
好ましくは、陽性または陰性としての撹乱の同定に加えて、撹乱の大きさを測定することは有利である。このことは、上述される様に、異なる標識のため用いられた２つのフルオロフォアの放出の割合を測定することにより、または当業者に容易に明らかな類似の方法により実行され得る。
【０１３７】
ある実施態様において、異なる蛍光でそれぞれ標識された２試料は同時にハイブリダイズし、異なる発現測定を可能とする。いずれかの試料が配列中の与えられた場所にハイブリダイズしないと、蛍光は見られない。１つのみが与えられた場所にハイブリダイズすると、結果として生じる蛍光の色は、ハイブリダイズする試料を標識するために用いられた蛍光のものに対応する（例えば、試料をＣｙ３で標識したなら緑、または試料をＣｙ５で標識したなら赤）。両試料は同一の場所にハイブリダイズし、中間色が生成される（例えば、試料がフルオレッセインおよびローダミンで標識されたなら黄色）。次に、当分野で既知のパターン認識およびデータ解析の方法を適用し、試料間の遺伝子発現の差を定量することが可能である。パターン認識およびデータ解析の方法は、例えば、米国特許番号６，２０３，５６９および米国特許番号６，２７１，００２において記載され、これらは全体として参考により本明細書において取り込まれる。
【０１３８】
ヌクレオチド配列の合成のためのキット
従属発明により提供される別の態様は、従属方法を実行するためのキットである。特定の実施態様において、キットは１またはそれ以上の容器を含有する：（ａ）第１のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物、それぞれの第１のプライマーは１０〜５０ヌクレオチドプライマーの３’末端配列を含有し、該３’末端配列は該３’末端配列のそれぞれの位置にランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、またはＣヌクレオチドを有する；およびそれぞれの第１のプライマーは１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列を有し、該５’末端配列はＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する；（ｂ）オリゴ（ｄＴ）プライマーの混合物、それぞれのオリゴ（ｄＴ）プライマーが１０〜５０ヌクレオチドの３’末端配列を含有し、該３’末端配列が該３’末端配列のそれぞれの位置で存在するＴヌクレオチドを有する；およびオリゴ（ｄＴ）プライマーが１０〜５０ヌクレオチドの５’末端配列を有し、該５’末端配列がＲＮＡポリメラーゼプロモーター含有する；および（ｃ）第２のランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物、それぞれのプライマーが１０〜５０ヌクレオチドの配列を有し、該配列は該配列のそれぞれの位置でランダムに存在するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば凍結乾燥のような任意の型、または溶液（例えば、蒸留水または緩衝化溶液）等であり得る。同一反応での使用のためのオリゴヌクレオチドは、単一容器内で結合され得るし、別の容器内で結合され得る。
【０１３９】
別の実施態様において、キットは該ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを別々の容器に含有する。別の実施態様において、キットは２本鎖ｃＤＮＡのインビトロでの転写のためのＲＮＡポリメラーゼを含有する。さらに好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１４０】
別の実施態様において、キットはＤＮＡポリメラーゼを別々の容器に含有する。さらに好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはE.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩ、E.coli  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、またはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１４１】
別の実施態様において、キットは、逆転写またはファーストストランドＤＮＡ合成のためのバッファー、ＤＮＡ合成のためのバッファー、２本鎖ｃＤＮＡのインビトロでの転写のためのバッファー、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅ（すなわち、ＲＮａｓｅ  Ｈ）を含有する。
【０１４２】
別の実施態様において、キットはデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩分子（ｄＮＴＰ）およびリボヌクレオチ三リン酸塩分子（ｒＮＴＰ）を含有する。さらに好ましくは、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰであり、およびｒＮＴＰはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰおよびｒＧＴＰである。好ましい実施態様において、ｄＮＴＰおよびｒＮＴＰは、すなわち、当分野で既知でありかつ本明細書で記載されるような標識のいずれかで標識される。他の好ましい実施態様において、標識は蛍光標識、放射性標識、酵素標識、ハプテン標識、ビオチン標識、またはジゴキシゲニン標識であり、さらに好ましくは、標識は蛍光である。好ましい標識は、フルオレッセインイソチオシアネート、リサミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびローダミン１１０のようなフルオロフォアであり。特に好ましくはＣｙ３およびＣｙ５である。
【０１４３】
キットは任意で、逆転写、またはファーストストランドｃＤＮＡ合成およびセカンドストランドｃＤＮＡ合成を実行するための一連の使用法；ならびに２本鎖ｃＤＮＡのｃＲＮＡへのインビトロでの転写を実行するための一連の使用法をさらに含有する。指示書は、添付文書および／またはキットの包装またはそれらの要素と関連し得る。
【０１４４】
キットは任意で、対照核酸、および／またはミクロアレイ、および／または蛍光標識ＲＮＡから蛍光の放出を刺激および検出する方法、および／または発現特性予測およびコンピューターシステムのメモリーにロードされ得る解析ソフトウェアをさらに含有する。
【０１４５】
解析キットの実施
好ましい実施態様において、本発明の方法は、ＲＮＡを含有する本発明のランダムオリゴヌクレオチドプライマー、およびマイクロアレイを含有するキットの使用により実施される。かかるキットに含有されるマイクロアレイは、プローブが固相の既知の位置でハイブリダイズされるかまたは結合されるものに対する固相、例えば、表面を含有する。好ましくは、これらのプローブは、既知の核酸、異なる配列を、ＲＮＡ種またはそれら由来のｃＤＮＡ種にハイブリダイズ可能なそれぞれの核酸と共に含有する。特に、本発明のキットに含有されるプローブは、活性がキットにより測定される特定のタンパク質の撹乱に応答して増加または減少することが既知のＲＮＡ種由来の核酸配列に特異的にハイブリダイズ可能な核酸である。本発明のキットに含有されるプローブは好ましくは、活性がキットにより測定される特定のタンパク質に対する撹乱に応答して増加しないＲＮＡ種にハイブリダイズする核酸を実質的に含む。
【０１４６】
別の好ましい実施態様において、本発明のキットは、発現特性予測およびコンピューターシステムのメモリーにロードされ得る解析ソフトウエアをさらに含有する。かかるシステムの実施例は、全体として参考により本明細書に取り込まれる米国特許番号６，２７１，００２の参考において記載される。好ましくは、本発明のキットに含有される発現特性解析ソフトウエアは、米国特許番号６，２７１，００２の参考において記載される発現特性解析ソフトウエア５１２と本質的に同一である。
【０１４７】
本発明の解析方法を実施する代わりのキットは、当業者に明らかであり、かつ添付の請求の範囲内に包含されることを意図する。特に、添付の請求の範囲は、当業者に容易に明らかとなる本発明の方法を実施する代わりのプログラム構造物を含むことを意図する。
【０１４８】
本発明は、以下の実施例の参考によりさらに定義される。上述の詳細な説明および以下の実施例は例示のみであり、かつ本発明の範囲の制限としてとられるべきではないことは理解される。物質および方法の両方への多くの修飾は、目的および本発明の関心から逸脱することなく実施され得ることは当業者にとって明らかであろう。さらに、本明細書において上述された全ての特許、特許出願および公報は、参考により本明細書に取り込まれる。
【０１４９】
実施例
実施例１
標識プロトコール
１．ファーストストランドｃＤＮＡ合成
４０μｌの反応で、１本鎖ＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ配列）を、最大５μｇのｍＲＮＡ（または、最大３０μｇ全ＲＮＡ）からファーストストランドｃＤＮＡへ転換する。ベストの結果のため、高品質のＲＮＡおよびヌクレアーゼフリーの試薬および材料を用いる。ＲＮＡを、当分野で既知および本明細書において記載されたいずれかの方法により単離することができる。プライマーは本明細書において記載された様にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するランダムオリゴヌクレオチドプライマーである。ランダムプライマーを単独で、または最大２μｇの全プライマーであるＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するオリゴ（ｄＴ）プライマーと組合せて用いることができる。手順はＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有さない逆転写酵素を要求することに注意されたい。
【０１５０】
１）以下を１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに加える：
【表１】
2005502340.tif 000002
【０１５１】
２）６８℃で１０分間加熱。氷水で冷却する。軽くスピンダウンして、氷上に置く。
３）別のチューブに、以下の構成成分（すなわち、GIBCO BRL/RocheのSuperScript II逆転写酵素およびバッファー）を混合。セカンドストランド合成に干渉するので、ヌクレアーゼ阻害剤を用いてはいけない。５×ファーストストランドバッファーは２５０ｍＭ  Tris-Hcl（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む。水の容量は、ステップ６で加えられたSuperScript IIの量に依存する。
【０１５２】
【表２】
2005502340.tif 000003
【０１５３】
４）そっとボルテックスして、チューブの内容物を混合し、軽くスピンして、ステップ２のプライマー／ＲＮＡ混合物に加える。
５）チューブを４２℃に２分間置く。
６）SuperScript II RT (GIBCO BRL/Roche)を添加；SuperScript II RTの量は最初のＲＮＡの量で変える（ｍＲＮＡ１μｇにそれぞれ２００ユニットのSuperScript II RTを使用）。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
７）４２〜５０℃で１時間インキュベート。より高い温度が２次ＲＮＡ構造を溶解する。
８）氷上で冷却して反応を止め、そしてセカンドストランド合成を直ちに続ける。
【０１５６】
２．セカンドストランドｃＤＮＡ合成
セカンドストランド反応の生産は典型的には、合成されたファーストストランドｃＤＮＡの量と８０％より多く関係する。
１）氷上で、以下の試薬をこの順序でファーストストランド反応液に加える。
１０×セカンドストランドバッファーの組成については、New England Biolabsのカタログ（ＤＮＡリガーゼバッファーについても同じ）を参照。
【０１５７】
【表４】
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【０１５８】
２）そっと混合し、軽くスピンダウンし、そして１６℃で２〜３時間インキュベートする。
３）温度を上昇することなく、４μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｌ）を添加し、１６℃で５分間インキュベートする。
４）１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡで反応を止め、そしてｃＤＮＡ精製を直ちに続ける。
ＲＮＡを３０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨ／２ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により壊す。６５℃で１０分間インキュベート。３０μｌの１Ｎ  ＨＣｌおよび３０μｌの１Ｍ  Tris、ｐＨ７で中和する。
【０１５９】
３．ｃＤＮＡ精製
１）同量のフェノールクロロホルムイソアミルアルコール（２５：２４：１；ｐＨ８）を添加。ボルテックスし、室温で２分間最大スピードにて遠心する。注意して上層をとり、清潔な１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移す。
２）同量のクロロホルムで抽出し、フェノールの痕跡を取り除く。上層を新しい１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに移す。
３）１／１０量の酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）、１μｌのグリコーゲン（１０μｇ／μｌ）および２．５倍量の冷やした１００％エタノールを添加。ボルテックスし、−２０℃で少なくとも１時間、好ましくはオーバーナイト置く。
４）１３Ｋで６０分間４℃で遠心。
５）上清を取り除き、２００μｌの冷やした７０％エタノールをペレットに加える。注意してデカントし、上清を取り除く。
６）２本鎖ｃＤＮＡペレットを室温で１０分間空気乾燥する。
７）ペレットを５０μｌのMilliQフィルター水に再懸濁する。
８）２本鎖ｃＤＮＡをMicro-Spinカラムを用いて精製する。
９）スピードバックでフロースローを７．５μｌに凍結乾燥するか、またはステップ１０により速める。
【０１６０】
１０）試料を５０μｌの最終容量にヌクレアーゼフリーの水で調節する。５μｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ  ｐＨ５．２）、１μｌの供給グリコーゲン溶液（１０μｇ／μｌ）、および１２５μｌの氷冷１００％エタノールを添加する。ボルテックスし、−２０℃で少なくとも１時間、好ましくはオーバーナイトで沈殿させる。
１３Ｋで６０分間４℃で遠心する。上清を取り除きいて、２００μｌの氷冷７０％エタノール（ヌクレアーゼフリー水で希釈）をペレットにそっと加える。
上清をそっと取り除き、２本鎖ｃＤＮＡペレットを室温で１０分間、清潔かつごみのない環境で完全に空気乾燥する。
ペレットを７．５μｌのヌクレアーゼフリーの水に、何度かピペッティングで吸い上げて吐き出すことで再懸濁する。
１１）試料を氷上に置き転写方法を続けるか、または試料を−８０℃で長期間保存する。
【０１６１】
４．インビトロでの転写
本プロトコールで、上で合成された２本鎖ｃＤＮＡからビオチン標識ｃＲＮＡプローブを生成する。Ambion Inc.（カタログ番号１３３４）のＴ７  MEGAscript［登録商標］のような高産出転写を用いることもできる。製造元の指示を参照されたい。ビオチン標識は例示のみを意味し、かつ本発明を制限することを意味しない。方法を当業者は修飾でき、本明細書において記載するいずれかの標識に導入し得る。さらに、２本鎖ｃＤＮＡをインビトロでの転写に適当なベクターに導入する必要があり得る。これを、当業者によく知られているかまたは本明細書において記載されたいずれかの適当な方法およびいずれかの適当なベクターにより成し遂げることができる。
【０１６２】
１）以下のMEGAscript［登録商標］試薬をステップ１１の２本鎖ＤＮＡ試料に加える。室温で続けて、転写バッファー中のスペルミジンとのＤＮＡの沈殿を避ける。翻訳混合液に加える前、Ｔ７酵素混合液を氷上で保つ。
【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
２）４時間３７℃でインキュベートする。
３）転写混合液の容量を水を用いて４０μｌの最終容量に調整する。
４）Micro-Spinカラム（添付）の１つを用いて精製する。
５）フロースローをヌクレアーゼフリー水で５０μｌの最終容量に調整する。ハイブリダイゼーションに直ちに用いないなら、プローブを−８０℃で保つ。
６）AmbionのMEGAscript［登録商標］キットでの最終産生量は典型的には、１μｇのｍＲＮＡ当たり２５〜３５μｇのｃＲＮＡ転写物である。
【０１６５】
他の実施態様
特定の実施態様が本明細書において開示されたが、これは例示のみの目的のための例により示され、以下の添付の請求項について制限することを意図しない。特に、本発明者は、様々な置換、変換、および修飾が請求項により定義される本発明の精神および範囲を逸脱することなく本発明になされることを予測する。他の態様、利点、および修飾が以下の請求項の範囲内にあることを考慮する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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