(57)【要約】  本発明は、下記式（Ｉ）［式中、Ｒaは、糖部分、アリールアミノ基、または少なくとも一つのアミノ基を含むアルキル基を表し、Ｒbは、ハロゲン原子、ハロゲノアルキル基、ニトロ基、またはＲおよびＲ′が、互いに独立してアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、Ｒ1は、Ｈ、またはＣＯＯＨ基の保護基を表し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立してＨ、またはＯＨ基の保護基を表す］を有する化合物に関する。本発明は、癌の処置のための医薬組成物における当該化合物の使用にも関する。
2005511550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2005511550.tif 000034
［式中、
Ｒaは、糖部分、アリールアミノ基、または少なくとも一つのアミノ基を含む、１〜１０炭素原子のアルキル基を表し、
Ｒbは、ハロゲン原子、１〜５炭素原子のハロゲノアルキル基、ニトロ基、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、
Ｒ1は、Ｈ、またはＣＯＯＨ基の保護基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立してＨ、またはＯＨ基の保護基を表す］
を有する化合物。
【請求項２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨを表す、式（Ｉ）で示される、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒaが、下記式：
【化２】
2005511550.tif 000035
［式中、Ｒcは、ヒドロキシル、または−Ｎ（ＣＨ3）2のようなアミノ基を表す］
で示されるグルコースメチルアセタールなどのグルコース誘導体から選ばれる、糖部分；または
アリールアミノ基、より具体的には下記式：
−ＨＮ−Ｃ6Ｈ4Ｒd
［式中、Ｒdは、ハロゲン原子、またはニトロ基を表す］
を有する基、たとえば４−ニトロアニリンまたは４−フルオロアニリンから選ばれるアリールアミノ基；または
少なくとも一つのアミノ基を含む、５〜１０炭素原子のアルキル基、より具体的には鎖中に二つの窒素原子を含む直鎖アルキル鎖、たとえば［（ジメチルアミノ）エチル］Ｎ−メチルアミノ）エチル基
を表す、式（Ｉ）で示される、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒbが、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表す、式（Ｉ）で示される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
下記式：
【化３】
2005511550.tif 000036
2005511550.tif 000037
［式中、Ｒbは、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、
Ｒ5は、ＨまたはＣＨ3を表す］
を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
下記式：
【化４】
2005511550.tif 000038
を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
請求項２〜６に記載の式（Ｉ）の化合物の少なくとも１つ、またはその塩を、適切な医薬担体とともに含む医薬組成物。
【請求項８】
下記化合物：
【化５】
2005511550.tif 000039
2005511550.tif 000040
［式中、
Ｒbは、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して、１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、
Ｒ5は、ＨまたはＣＨ3を表す］
のうち少なくとも１つを含む、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも下記化合物：
【化６】
2005511550.tif 000041
を含む、請求項７または８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口投与、または注射、たとえば静脈内経路による投与に適した形態での、請求項７〜９のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物の投与量が、約５日間にわたる約１００〜約２００mg/m2／日に含まれることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
肺癌、精巣癌、カポジ肉腫、リンパ腫および白血病などの癌の処置用薬物の製造のための、請求項２〜６のいずれか一項記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６記載の化合物を調製する方法であって、下記の工程：
下記の式Ａで示される化合物をホスゲンによる処理によってアミン活性化して、下記式Ｂ：
【化７】
2005511550.tif 000042
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
Ｒbは、請求項１に定義したとおりである］
で示される化合物を得る工程と、
上で得られた化合物Ｂを下記式Ｃ：
【化８】
2005511550.tif 000043
［式中、Ｒaは、請求項１に定義したとおりである］
で示される化合物とカップリングさせて、下記の化合物Ｄ：
【化９】
2005511550.tif 000044
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
ＲaおよびＲbは、請求項１に定義したとおりである］
の化合物を得る工程と、
化合物ＤのＯＨ基を、たとえばＲ2、Ｒ3およびＲ4がter−ブチルジメチルシリル基を表すときに、ＨＦ／ピリジンで脱保護して、下記の化合物Ｅ：
【化１０】
2005511550.tif 000045
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
ＲaおよびＲbは、請求項１に定義したとおりである］
を得る工程と、
式Ｅの化合物のＣＯＯＨ基を、たとえばＲ1がベンジル基を表すときに、パラジウム上のシクロヘキサジエンで脱保護して、下記の化合物Ｆ：
【化１１】
2005511550.tif 000046
［式中、ＲaおよびＲbは、請求項１に定義したとおりである］
を得る工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
Ｒ1が、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、および／または
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表す、式（Ｉ）に対応する、請求項１３記載の方法における中間生成物として用いられる、請求項１記載の化合物。
【請求項１５】
下記式Ｄ：
【化１２】
2005511550.tif 000047
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
ＲaおよびＲbは、請求項１に定義したとおりである］、
下記式Ｅ：
【化１３】
2005511550.tif 000048
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
ＲaおよびＲbは、請求項１に定義したとおりである］
を有する、請求項１４記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エトポシドの新規誘導体、およびエトポシドから誘導される化合物の誘導体、ならびに癌の処置用の医薬組成物におけるその使用に関する。
【０００２】
ヒトβ−グルクロニダーゼは、必須の分解酵素であって、コンドロイチン硫酸およびヒアルロン酸のようなリソソームのグリコシルアミノグリカンに存在するグルクロノシルＯ結合を切断する、エキソグリコシダーゼである。
【０００３】
加えて、ヒトβ−グルクロニダーゼは、いくつかの内因性物質の脱抱合に役割を果たしている。血漿および細胞外コンパートメント内でのこの酵素の活性は、それがリソソーム内にほとんど完全に局在することから、非常に低い。しかし、腫瘍組織内でのβ−グルクロニダーゼの活性が上昇していることが、長く観察されており、様々な著者によって報告されている［Fishman, W.H. & Anlyan, A.J., J. Biol. Chem. 169, 449 (1947)；Anghileri, L.J. & Miller, E.S., Oncology, 25, 1932 (1971)；Fishman, W.H. et al., Cancer, 12, 240 (1959)；Young, C.W. et al., Cancer, 38, 1887, (1976)；Warenius, H.M. et al., Br. J. Cancer, 45, 27 (1982)；Boyer & Tannock, Adv. Cancer Res., 60, 269 (1993)；Ruben, D.、米国特許第5,340,803号明細書］。
【０００４】
同様に、関節リウマチのようないくつかの炎症性疾患では、酵素レベルの上昇が注目されている［Caygil, J.C. & Pitkeathy, D.A., Ann. Rheum. Dis., 25, 137 (1966)；Weissman et al., J. Exp. Med., 134, 521 (1971)］。
【０００５】
にもかかわらず、腫瘍内のβ−グルクロニダーゼの上昇した濃度を利用する薬物へのグルクロニドプロドラッグの活性化を選択的に誘導することは、広く用いられてはいない。アニリンマスタードによる僅か数例のみが、報告されているにすぎない［Connors, T.A. & Whisson, M.E., Nature, 210, 866 (1966)；Connors, T.A. et al., Biochem. Pharmacol., 22, 1971 (1973)；Double, J.A., Workmn, P.A., Cancer Treat. Rep., 61, 909 (1977)］。
【０００６】
1995年に、いくつかの腫瘍組織内のβ−グルクロニダーゼレベルの再調査が、Bossletらによって着手された［Tumor Targeting, 1, 45 (1995)］。それは、ヒトの癌の壊死領域が、リソソームβ−グルクロニダーゼが高い局所濃度で細胞外に放出される部位であることを、酵素組織化学によって明瞭に示した。免疫化学によって実施されたこの研究は、この酵素の放出を担当する細胞が主として急性および慢性炎症細胞であることも立証した。その後、同じ著者らは、腫瘍選択的プロドラッグの単剤療法を可能にする機序を解明した［Bosslet et al., Cancer Res., 58, 1195 (1998)］。ＩＨＣの調査によれば、細胞外β−グルクロニダーゼは、壊死領域内で濃縮された単球および顆粒球に由来するが、腫瘍細胞には全く（または僅かな程度にしか）由来しない。さらに、酵素組織化学の研究によってマウスの異種移植片で検出され得る酵素活性は、ヒトβ−グルクロニダーゼに対して選択的なモノクローナル抗体では染色されず、したがって、ヒト起源ではない。
【０００７】
これらのデータを考慮して、関連した結果が、ドキソルビシンのグルクロニドプロドラッグである、ＨＭＲ１８２６を用いて広い一群の腫瘍で観察されている［Florent, J.C. et al., J. Med. Chem., 41, 3572 (1998)］。そのようなヒト腫瘍におけるプロドラッグ単剤療法は、標準的な化学療法に対比して、より優れた治療効果を生じる。その後、気管支癌におけるドキソルビシン取込みの増大が、単離かつ潅流されたヒト肺モデルについて観察された。ＨＭＲ１８２６による肺潅流後のドキソルビシンのレベルは、ドキソルビシン自体による潅流後より約７倍も高かった［Murdter, T.E. et al., Cancer Res., 57, 2440 (1997)］。
【０００８】
次の実験も、膵臓癌におけるα−グルクロニダーゼ活性のレベルの上昇を示した。これは、特に抗癌剤のグルクロニドプロドラッグを用いることによる膵臓癌の処置の際の、薬物標的化における潜在的な役割を表している可能性がある。
【０００９】
これらのすべての例に基づく証拠は、グルクロニドプロドラッグを用いるこのアプローチが、ヒトの腫瘍における制癌薬の送達を増大させるのに役立ち得ることを示す［de Groot et al., Current Medicin. Chem., 8, 1093 (2001)］。
【００１０】
これらの観察に基づいて、グルクロニドプロドラッグ合成計画が開始され、この計画で調査された細胞毒性化合物には、ポドフィロトキシンプロドラッグを含んだ。
【００１１】
エポトシドすなわちＶＰ−１６は、薬物、ＤＮＡおよびトポイソメラーゼIIを含む三成分複合体の安定化によってその抗腫瘍活性を発揮する、半合成化合物である。エトポシドの確立された適用は、精巣癌および小細胞肺癌であって、神経芽細胞腫の処置のための小児科での使用も周知である。エトポシドは、白血病という癌およびカポジ肉腫にも適用される。
【００１２】
臨床的使用が広く普及しているにもかかわらず、その非常に乏しい水溶性に起因する限界が存在する。トゥイーン８０、ポリエチレングリコールおよびエタノールとの配合物は、急性死を招く。この問題を解決するため、1990年代には、Bristol-Myers Squibbのグループが適切なプロドラッグを発見するための計画を開始した。これは、リン酸エトポシドのＢＭＹ−404811の開発へと導いた［Saulnier et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 2567］。リン酸エトポシド（エトポホス）は、in vivoで急速に親薬物へと転換され、そのため、エトポシド自体と同じプロフィールで臨床に導入されている。このために、フェノール官能基のエステル化は、活性ばかりでなく毒性も有意に低下させるものの、両者は、酵素による切断によってほとんど回復する。これは、この種のプロドラッグによる選択性には、顕著な利得が全くなかったことを示す。
【００１３】
【化１４】
2005511550.tif 000003
【００１４】
この発見と同時に、Bristol-Myersのグループは、アミノ誘導体、すなわちＮＫ６１１を開発した。この化合物［Rassmann et al., Invest. New Drugs, 1996, 14, 379-368］は、第Ｉ相評価試験を現在実施中であり、さらに第II相に入ることが期待されている。
【００１５】
Ｃ−４で導入されるその他の修飾は、糖部分が（ＮＰＦにおける）４−フルオロアニリンのようなアリールアミノ基で［Lee et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 364］、またはジメチルエチルアミノ側鎖（ＴＯＰ５３）［Utsugi et al., Cancer Rec., 1996,56, 2809］で置き換えられた化合物をその他のグループが見出すことへと導いた。両誘導体は、ともに、現在は臨床試験下にある。
【００１６】
【化１５】
2005511550.tif 000004
【００１７】
適切な酵素性加水分解による代謝回転を得るために、Katzenellenbogenの提唱［Carl, P.L. et al., J. Med. Chem., 24, 479 (1981)］、すなわち以下のもののグルクロニドプロドラッグ：アントラサイクリン［Andrianomenjanahary, S. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2, 1093 (1992)；Gesson, J.P. et al., Anti-Cancer Drug Design, 9, 409 (1994)；Azoulay, M. et al.、同2,955 (1998)；Schmidt, F. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 1071 (1997)；Florent, J.C. et al., J. Med. Chem., 41, 3572 (1998)；Desbene, S. et al., Anti-Cancer Drug Design, 13, 955 (1998)］、フェノール性ナイトロジェンマスタード［Lougerstay-Madec, R. et al.、同13, 996 (1998)］、Ｍ．Ｄ．Ｒ．モジュレーター［Desbene, S. et al.、同14, 93 (1999)］、５−フルオロウラシル［Lougerstay-Madec, R., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1369 (1999)］、およびより最近にはタキソール［Schmidt, F. et al., Eur. J. Org. Chem. 2129 (2001)］を用いて、本発明者らが以前に開発した概念に従って、３つのコンパートメントのプロドラッグが本発明者らによって設計されている。
【００１８】
本発明中に記載された自壊型（self-immolative）スペーサーは、ナイトロジェンマスタードプロドラッグを製造するのに既に報告されたもの［Schmidt, F. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 1071 (1997)］と同じである。
【００１９】
本発明者らは、エトポシド、および先に述べたＮＫ６１１、ＮＰＦおよびＴＯＰ５３のような誘導体化合物を、最終プロドラッグの空間的構成に関連する特定の問題に遭遇することなしに、該スペーサーを介してグルクロニド部分に結合させ得るとの証拠を初めて与える。
【００２０】
このスペーサーの使用は、それがグルクロニド部分へのβ−グルクロニダーゼの容易な接近を可能にするため好都合である。したがって、グルクロニド−スペーサー−エトポシドは、グリコシル部分が接近可能性を欠くグリコシル−エトポシドのようなスペーサー欠如化合物［EP 0 423 747 A］に比して、β−グルクロニダーゼに対してはるかに優れた基質である。そのため、そのようなスペーサー欠如化合物のプロドラッグ活性は、加水分解後のエトポシド放出の速度があまりにも低いために著しく損なわれる。
【００２１】
さらに、本発明者らは、以下に示すとおり酵素性加水分解が起こると直ちに、スペーサーの自壊的分解が起こり、エトポシドと環化されたスペーサーとの放出が観察されることを立証している。
【００２２】
【化１６】
2005511550.tif 000005
【００２３】
本発明の目的は、エトポシド、およびＮＫ６１１、ＮＰＦ、ＴＯＰ５３その他の４−置換４−epi−４′−デメトキシポドフィロトキシン誘導体の、抗腫瘍活性が賦与された新規プロドラッグ、その製造法およびその使用を提供することである。
【００２４】
より具体的には、本発明の目的は、エトポシドおよび誘導体の水溶性プロドラッグを提供することである。これらのプロドラッグは、血漿中で安定的であって、β−グルクロニダーゼという酵素の上昇したレベルに起因して、エトポシドまたは誘導体を腫瘍の壊死領域に選択的に送達する。
【００２５】
好都合にも、本発明のプロドラッグは、腫瘍内では選択的な活性を有するが、正常組織における副作用は最小限である。
【００２６】
本発明は、下記式（Ｉ）：
【００２７】
【化１７】
2005511550.tif 000006
【００２８】
［式中、Ｒaは、糖部分、アリールアミノ基、または少なくとも一つのアミノ基を含む、好都合には１〜１０炭素原子を有するアルキル基を表し、
Ｒbは、ハロゲン原子、好都合には１〜５炭素原子を有するハロゲノアルキル基、ニトロ基、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して、好都合には１〜５炭素原子を有するアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、
Ｒ1は、Ｈ、またはＣＯＯＨ基の保護基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立してＨ、またはＯＨ基の保護基を表す］
を有する化合物に関する。
【００２９】
より具体的には、本発明は、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨを表す、式（Ｉ）の先に記載したような化合物に関する。
【００３０】
より具体的には、本発明は、Ｒaが、下記式：
【００３１】
【化１８】
2005511550.tif 000007
【００３２】
［式中、Ｒcは、ヒドロキシル、または−Ｎ（ＣＨ3）2のようなアミノ基を表す］
を有するグルコースメチルアセタールなどのグルコース誘導体から選ばれる、糖部分；または
アリールアミノ基、より具体的には下記式：
−ＨＮ−Ｃ6Ｈ4Ｒd
［式中、Ｒdは、ハロゲン原子、またはニトロ基を表す］
を有する基、たとえば４−ニトロアニリンまたは４−フルオロアニリンから選ばれるアリールアミノ基；または
少なくとも一つのアミノ基を含む、５〜１０炭素原子のアルキル基、より具体的には鎖中に二つの窒素原子を含む直鎖アルキル鎖、たとえば［（ジメチルアミノ）エチル］Ｎ−メチルアミノ）エチル基
を表す式（Ｉ）で示される、先に記載したような化合物に関する。
【００３３】
より具体的には、本発明は、Ｒbが、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表す、式（Ｉ）の先に記載したような化合物に関する。
【００３４】
本発明による好適化合物は、下記式：
【００３５】
【化１９】
2005511550.tif 000008
2005511550.tif 000009
【００３６】
［式中、Ｒbは、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、
Ｒ5は、ＨまたはＣＨ3を表す］
を有する。
【００３７】
本発明による、さらに特別に好適な化合物は、下記式を有する：
【００３８】
【化２０】
2005511550.tif 000010
【００３９】
先に述べたように、本発明の化合物は、生物内で下記式：
【００４０】
【化２１】
2005511550.tif 000011
【００４１】
［式中、Ｒaは、先に定義されている］
の薬物を遊離することができるプロドラッグとして作用するための特異性を示す。
【００４２】
本発明によるプロドラッグは、下記の特徴を有する：
−それらは、高度に毒性が減弱されること、
−E. coliからのβ−グルクロニダーゼによる酵素性加水分解動態のin vitroでの決定は、該加水分解が、該プロドラッグの治療的使用と両立できる期間内に実施されることを示すこと、
−このプロドラッグは、安定的である（リン酸緩衝液中、３７℃で２４時間後に、プロドラッグの９０％を超える量が残留する）こと、
−このプロドラッグは、水性溶媒に可溶であって、その溶解度は、約２０mg/ml（すなわち、その溶解度が０．１mg/mlであるエトポシドよりはるかに可溶性である）こと。
【００４３】
本発明は、先に定義したような式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物、より詳しくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨを表す、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物、またはその塩を適切な製剤担体を伴って含む医薬組成物にも関する。
【００４４】
より具体的には、本発明は、先に定義したような医薬組成物であって、下記の化合物：
【００４５】
【化２２】
2005511550.tif 000012
2005511550.tif 000013
【００４６】
［式中、Ｒbは、ＮＯ2、Ｆ、Ｃｌ、ＣＦ3、またはＲおよびＲ′が、互いに独立して、１〜５炭素原子のアルキル基を表す、基−ＮＲ（ＣＯＲ′）を表し、Ｒ5は、ＨまたはＣＨ3を表す］
の少なくとも一つを含む、医薬組成物に関する。
【００４７】
本発明による好適な医薬組成物は、少なくとも下記の化合物を含むものである：
【００４８】
【化２３】
2005511550.tif 000014
【００４９】
好都合には、本発明による医薬組成物は、経口投与、または注射、たとえば静脈内経路による投与に適した形態である。
【００５０】
本発明による好適な医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物の投与量が、約５日間にわたり、約１００〜約２００mg/m2／日（エトポシド等価量に基づくとき）を含むことを特徴とする。
【００５１】
本発明は、肺癌、精巣癌、カポジ肉腫、リンパ腫および白血病のような癌の処置用薬物の製造のための、先に定義したような式（Ｉ）の化合物の使用、より具体的には、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨを表す、式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物、またはその塩の使用にも関する。
【００５２】
本発明は、式（Ｉ）の先に定義したような化合物を調製する方法であって、下記の工程：
下記式Ａ：
【００５３】
【化２４】
2005511550.tif 000015
【００５４】
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
Ｒbは、先に定義したとおりである］
の化合物をホスゲンによる該化合物Ａの処理によってアミン活性化して、下記の式Ｂ：
【００５５】
【化２５】
2005511550.tif 000016
【００５６】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲbは、先に定義したとおりである］
の化合物を得る工程と、
上で得られた化合物Ｂを、下記式Ｃ：
【００５７】
【化２６】
2005511550.tif 000017
【００５８】
［式中、Ｒaは、先に定義したとおりである］
の化合物とカップリングさせて、下記式Ｄ：
【００５９】
【化２７】
2005511550.tif 000018
【００６０】
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
ＲaおよびＲbは、先に定義したとおりである］
の化合物を得る工程と、
化合物ＤのＯＨ基を、たとえばＲ2、Ｒ3およびＲ4がter−ブチルジメチルシリル基を表すときに、ＨＦ／ピリジンで脱保護して、下記の化合物Ｅ：
【００６１】
【化２８】
2005511550.tif 000019
【００６２】
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
ＲaおよびＲbは、先に定義したとおりである］
を得る工程と、
式Ｅの化合物のＣＯＯＨ基を、たとえばＲ1がベンジル基を表すときに、パラジウム上のシクロヘキサジエンで脱保護して、下記の化合物Ｆ：
【００６３】
【化２９】
2005511550.tif 000020
【００６４】
［式中、ＲaおよびＲbは、先に定義したとおりである］
を得る工程
を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００６５】
本発明は、上記の方法における中間生成物として用いられる、式（Ｉ）の先に定義した化合物であって、その化合物が
Ｒ1が、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、および／または
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表す、式（Ｉ）の化合物に対応するものである化合物にも関する。
【００６６】
本発明は、より具体的には、下記式Ｄ：
【００６７】
【化３０】
2005511550.tif 000021
【００６８】
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＯＨ基の保護基、たとえばter−ブチルジメチルシリルまたはアセタート基を表し、
ＲaおよびＲbは、先に定義したとおりである］、
下記式Ｅ：
【００６９】
【化３１】
2005511550.tif 000022
【００７０】
［式中、Ｒ1は、ＣＯＯＨ基の保護基、たとえばベンジルまたはメチル基を表し、
ＲaおよびＲbは、先に定義したとおりである］
を有する、先に定義した中間生成物として用いられる化合物に関する。
【００７１】
式（Ｉ）の化合物の合成、およびその特性の研究に関する詳細な説明中に、本発明をさらに説明する。
【００７２】
本発明によるプロドラッグの合成は、塩基性条件下でのエトポシド構造またはその誘導体の感受性に適合する保護基の使用を必要とした。僅かに塩基性の条件下でさえ、ポドフィロトキシン誘導体中に存在するような、トランス融合したラクトンは、容易にエピマー化されて、抗腫瘍活性を欠く、シス融合したピクロポドフィリン類似体を与えることが周知である［Gensler, W.; Gatsonis, C.J. J. Chem. Soc., 1966, 31, 3224-3227、Aso Y.; Hayashi, Y.; Yoshioka, S.; Takeda, Y.; Kita, Y.; Nishimura, Arata, Y., Chem. Pharm. Bull., 1989, 37, 422-424］。
【００７３】
【化３２】
2005511550.tif 000023
【００７４】
そのため、この問題を回避するために、プロドラッグ（１ａ）の合成は、次のとおりに達成した。
【００７５】
【化３３】
2005511550.tif 000024
【００７６】
中間体（２）に存在するようなヒドロキシルおよびカルボキシル保護基［Desbene, S., Dufat-Trinh van, H., Michel, S., Tillequin, F., Koch, M., Schmidt, F., Florent, J.-C., Monneret, C., Straub, R., Czech, J., Gerken, M., Bosslet, K., Anti-cancer Drug Design, 1999, 14, 93-106］を除去し、次いで、ヒドロキシル基に対してはＴＢＤＭＳエーテルとして、カルボン酸に対してはベンジルエステルとして再保護して、（３）および（４）を逐次得た。
【００７７】
次の工程は、ホスゲンでの処理による４のアミン活性化を含んだ。制御された条件下でのエトポシドとの、（５）のその後のカップリング（エトポシド，１当量；塩化カルバモイル、１．２５当量；およびＤＭＡＰ＞２当量）は、保護されたプロドラッグ（６）へと導いた。
【００７８】
【化３４】
2005511550.tif 000025
【００７９】
その後、グルクロニド部分の脱保護を達成して、（６）をプロドラッグ（１ａ）へと転換した。ＴＢＤＭＳ基は、ＨＦ／ピリジンで除去して、（７）を得て、ベンジルエステルは、パラジウム上のシクロヘキサジエンで除去した［Jeffrey, P., MacCombie, S., J. Org. Chem., 1982, 47, 587-590；Desiel, R., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 4371-4372］。エトポシドから出発した全体の収率は、１５％である。
【００８０】
【化３５】
2005511550.tif 000026
【００８１】
生物学的活性
溶解度
水中、および匹敵する条件下で、プロドラッグ（１ａ）は、対応する薬物に比べ約２００倍もより可溶性である。すなわち、エトポシドの溶解度は約０．１mg/mlであるが、（１ａ）の溶解度は約２０mg/mlである。
【００８２】
細胞毒性
Ｌ１２１０細胞系では、プロドラッグ（１ａ）は、５０．２μMというＩＣ50を与えた。β−グルクロニダーゼによる加水分解の後、増大した細胞毒性は、０．９３μMというＩＣ50によって得られ、エトポシド自体の値（０．８３４μM）に密接に関連した。これは、このプロドラッグが、約５０という係数（factor）で毒性が減弱したことを示す。
【００８３】
安定性
（１ａ）の安定性を２４時間、pH７の緩衝液中でＨＰＬＣ測定によって追跡した。このプロドラッグの９０％以上が、その時間の後に回収されて、プロドラッグ（１ａ）がin vitroで安定であることを意味した。
【００８４】
薬物放出の動態
プロドラッグ（１ａ）（５００μg/ml）を、E. coliのβ−Ｄ−グルクロニダーゼ（２０μg/ml）とともにインキュベートした。アリコートサンプルを様々な時間にＨＰＬＣによって分析した（図１：プロドラッグ（１ａ）の酵素性切断）
【００８５】
曲線の検査は、プロドラッグ（１ａ）が、急速加水分解されて、検出された唯一の生成物がエトポシド（１）および環化されたスペーサーであったことを示す。なおもエトポシドに付着するスペーサーを含有する中間体は、全く認められなかった。これは、急速な酵素性切断（（１ａ）の半減期は＜２５分である）、およびスペーサーの急速な切断と一致する。
【００８６】
放出された化合物が、実際にエトポシドであり、記載された手順［Meresse, P., Bertounesque, E., Imbert, T., Monneret, C., Tetrahedron, 1999, 55, 12805-12818］を追って合成されたピクロエトポシドではないことも想定される。保持時間の比較によるＨＰＬＣ検査は、合成すべての間、トランス融合したラクトンが、シス融合したラクトンへとエピマー化されなかったという事実と一致した。
【００８７】
実験
融点（ｍｐ）は、コフラーベンチ上で採択し、未補正である。旋光性は、Perkin-Elmer 241という旋光計（５８９nm）で得た。比旋光度（［α］D）は、°/dmで報告し、濃度（ｃ）は、特定の溶媒中でのg/100mlで与えた。赤外スペクトルは、Perkin-Elmer 1600 FTIRという分光計で記録した（cm-1で示されるν）。1Ｈ−ＮＭＲ（３００MHz）および13Ｃ−ＮＭＲ（７５MHz）のスペクトルは、Bruker AC300という分光計で記録した（ppmで示される化学シフトδ、およびHzで示されるJ）。化学イオン化（ＣＩ−ＭＳ；ＮＨ3、陽イオンモード）またはＦＡＢ（陽イオンモード）質量スペクトルは、Nermag R 10-10Cという分光計で記録した。電子スプレーイオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）は、２，０００の電荷質量（m/z）範囲を有する四重極機器を用いて達成した。用いたNermag R 10-10質量分析計は、分析用大気圧電子スプレー源を装備していた。クロマトグラフィーは、シリカゲルで実施した（Merck 60（２３０〜４００メッシュ））。
【００８８】
ＮＭＲ記載には、下記の命数法を選んだ：「ａ」は芳香族に対して、［ｅ］はエトポシドに対して、「ｇ」はグルコースに対して、「Ｇ」はグルクロン酸に対して）。
【００８９】
【化３６】
2005511550.tif 000027
【００９０】
２−メチルアミノ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドウロン酸（３）
０℃のアセトン５０ml中の（２）（２g、４．１３mmol）の溶液に、１N  ＮａＯＨ水溶液（５０ml）を滴加した。０℃で５分間撹拌した後、混合物を、pH４の１N  ＨＣｌで中和し、蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ：８０／２０）によって精製した。固体を、沸騰メタノール中で加熱し、濾過してシリカを除去した。蒸発させた後、（３）を輝橙色固体として得た（１００％）。
【００９１】
【表１】
2005511550.tif 000028
【００９２】
［２−メチルアミノ−４−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−β−Ｄ−グルコピラノシド］ウロン酸ベンジル（４）
ＤＭＡＰ（０．１g）を、ピリジン２０ml中の（３）（１．８７g、５．４３mmol）の溶液に加えた。混合物を０℃に冷却し、ＴＢＳトリフラート（１２ml、５２．３mmol）を滴加した。室温４８時間後、混合物を蒸発させ、残渣をトルエン（２００ml）にとった。不溶性のピリジニウム＝トリフラートを濾去し、濾液を蒸発させた。黄色の樹脂として得られた生成物（３．６４g、５．３１mmol）を、いかなる精製もなしに次の工程に用いた。次いで、ＣＨ2Ｃｌ2２０ml中のＤＭＡＰ（０．３g、２．４５mmol）の溶液を加えた。０℃に冷却した後、ベンジルアルコール（０．５ml、４．９mmol）およびＤＣＣ（１．０９g、５．３１mmol）を逐次加えた。室温１２時間後、混合物を蒸発させ、シクロヘキサン（２５０ml）に注いだ。不溶性の尿素を濾去した。濾液を蒸発させ、連続する２回のクロマトグラフィー、すなわち最初はＣＨ2Ｃｌ2、２回目はＣＨ2Ｃｌ2／シクロヘキサン：５／１によって精製した。化合物（４）を黄色の樹脂として単離した（１．８３g、（３）から４４％）。
【００９３】
【表２】
2005511550.tif 000029
【００９４】
［２−（Ｎ−クロロホルミル−Ｎ−メチルアミノ）−４−ニトロフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−β−Ｄ−グルコピラノシド］ウロン酸ベンジル（５）
０℃のＣＨ2Ｃｌ2２０ml中の（４）（３５０mg、０．４５mmol）の溶液に、トルエン中のホスゲン（７００μl、１．３５mmol）の溶液を加えた。次いで、トリエチルアミン（１．１３ml、８．１６mmol）を滴加した。０℃で３０分後、反応を水１０mlで停止させた。有機相を、分離し、食塩水１０mlで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン：１／１３）によって精製して、（５）を無色の粘稠な油として得た（３５２mg、９３％）。
【００９５】
【表３】
2005511550.tif 000030
【００９６】
［４−ニトロフェニル−２−［（エトポシド−４′−Ｏ−カルボニル）メチルアミノ］−２，３，４−トリ−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−β−Ｄ−グルコピラノシド］ウロン酸ベンジル６
ＤＭＡＰ（１２４．５mg、１．０３５mmol）を、ＣＨ2Ｃｌ2（１０７ml）中の（５）（０．５１g、０．６０９mmol）およびエトポシド（２８７mg、０．４８７mmol）の溶液に加えた。トリエチルアミン（０．１４ml、１．０３５mmol）を滴加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。蒸発させた後、残渣をクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＣＮ：８／２）によって精製した。プロドラッグ（６）を白色固体として単離した（０．３９g、５７％）。
【００９７】
【表４】
2005511550.tif 000031
【００９８】
［４−ニトロフェニル−２−［（エトポシド−４′−Ｏ−カルボニル）メチルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシド］ウロン酸ベンジル（７）
０℃のピリジン（２．６５ml）中の（６）（２２３．２mg、０．１６mmol）の溶液に、ＨＦ／ピリジン（２．６５ml、７０％）を滴加した。混合物を、０℃で４時間、次いで室温で１０時間撹拌した。蒸発させた後、残渣を、ＣＨ2Ｃｌ2２００mlに溶解し、水洗し、水相をＣＨ2Ｃｌ2で抽出した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、化合物をクロマトグラフィー（ＡｃＣＮ）によって精製した。生成物（７）をベージュ色の固体として得た（１５０mg、８９％）。
【００９９】
【表５】
2005511550.tif 000032
【０１００】
［４−ニトロフェニル−２−［（エトポシド−４′−Ｏ−カルボニル）メチルアミノ］−β−Ｄ−グルコピラノシド］ウロン酸（１ａ）
木炭担持パラジウム（１３７mg、１０％）および１，４−シクロヘキサジエン（０．５４ml、５．７mmol）を、（７）（６３．６mg、０．０６mmol）のエタノール溶液に加えた。混合物を４５℃で１５時間撹拌した。セライト越しに濾過し、蒸発させた後、粗生成物をクロマトグラフィー（ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ：９０／１０）によって精製した。プロドラッグ（１ａ）をベージュ色の粉末として単離した（１７mg、２９％）。
【０１０１】
【表６】
2005511550.tif 000033
【０１０２】
in vitro細胞毒性
ＭＴＡアッセイを用いて、Ｌ１２１０（マウス白血病細胞系）細胞に対して細胞毒性を試験した。
【０１０３】
１０％ウシ胎児血清、２mMのＬ−グルタミン、１００単位／mlのペニシリン、１００g/mlのストレプトマイシン、および１０mMのＨＥＰＥＳ緩衝液（pH＝７．４）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）中で、Ｌ１２１０細胞を培養した。細胞毒性は、ミクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＡ）によって測定した。傾斜濃度の薬物（９回連続希釈各３回測定）に４８時間、細胞を接触させた。結果は、ＩＣ５０、すなわち処理細胞の光学密度を非処理対照の光学密度に対して５０％減少させる濃度として表した。
【０１０４】
細胞周期分析のために、Ｌ１２１０細胞（５ｘ１０5細胞／ml）を、様々な濃度の薬物とともに２１時間インキュベートした。次いで、細胞を、７０％エタノール（v/v）によって固定し、洗浄し、１００μg/mlのＲＮａｇｅおよび５０μg/mlのヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ中、２０℃で３０分間インキュベートした。各サンプルについて、10,000細胞を、ＸＬＭＣＬフローサイトメーター（Beckman Coulter、フランス）にて分析した。
【０１０５】
ＨＰＬＣ条件
６０％リン酸緩衝液（０．０２M、pH３）および４０％アセトニトリルのイソクラティク条件（１ml／分）を用い、２５４mmでのＵＶ検出を行う逆相フェニル分析カラム（Spherisorb２５０ｘ４．６）により、短時間の遅延での優れた分離が得られた。これらの条件を用いて、エトポシド、プロドラッグおよび環化スペーサーの保持時間は、それぞれ４．９、３．４および５．８分であった。
【０１０６】
緩衝溶液中での化合物の安定性
０．０２Mリン酸緩衝液（pH７．２）中５００μl/mlのプロドラッグ（１ａ）の溶液を、３７℃で様々な時間インキュベートした。様々な時間にアリコート（１００μl）を採取し、溶離液（３００μl）で希釈した後、ＨＰＬＣによって分析した。
【０１０７】
E. coliのβ−Ｄ−グルクロニダーゼによる酵素性切断
０．０２Mリン酸緩衝液（pH７．２）中５００μg/mlのプロドラッグ（３）および２０μg/mlのE. coliβ−Ｄ−グルクロニダーゼの溶液を３７℃でインキュベートすることによって、加水分解を調べた。様々な時間にアリコート（１００μl）を採取し、溶離液３００μlで希釈した後、ＨＰＬＣによって分析した。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】プロドラッグ（１ａ）の酵素性切断を示す図である。
【図１】
2005511550.tif 000049
【国際調査報告】
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2005511550.tif 000051
2005511550.tif 000052