(57)【要約】キメラタンパク質は、哺乳類又は植物のチトクロムＰ４５０由来のヘム領域、及び、一般的に電子伝達領域を含有する、巨大菌のＰ４５０ＢＭ３由来のスカフォールド領域を含む。上記タンパク質は、野生型の哺乳類又は植物Ｐ４５０の膜結合部を含まず、このため水溶性である。上記タンパク質は、酵素として、上記野生型の哺乳類又は植物Ｐ４５０の基質に対して活性であり、電子は電子伝達部、例えばＦＡＤ又はＦＭＮ等の上記スカフォールド領域の一部に移動される。上記タンパク質は、上記ヘム領域の基質特異性を分析するのに、又は、分析対象物である基質を検出するのに有用である。
2005527183.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スカフォールド領域及びモノオキシゲナーゼヘム含有領域を含み、前記スカフォールド領域はＢＭ３由来であり、前記ヘム含有領域は植物又は動物のＰ４５０酵素に由来する
ことを特徴とする水溶性キメラタンパク質。
【請求項２】
電子を前記ヘム含有領域に移動させることができる電子伝達領域を不可欠に更に含む
ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記電子伝達領域は、好ましくはＢＭ３由来の、フラボタンパク質である
ことを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ヘム含有領域はヒトＰ４５０酵素、好ましくは２Ｅ１に由来する
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ヘム含有領域は野生型Ｐ４５０酵素又はその活性型（モノオキシゲナーゼ）変異体の連続する少なくとも２００残基を含み、このうち２０残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ヘム含有領域は、前記野生型Ｐ４５０酵素のＣ末端を含有する、又は、前記Ｃ末端から５０残基だけ内側から、少なくとも２５０個の、好ましくは少なくとも３００個の残基を含む
ことを特徴とする請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記野生型Ｐ４５０酵素に関して、１０残基だけ、好ましくは５残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする請求項５又は６に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記スカフォールド領域が、野生型ＢＭ３タンパク質又はその変異体のＮ末端から少なくとも２５残基、好ましくは少なくとも５０残基を含み、このうち１０残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項９】
スカフォールド領域及びモノオキシゲナーゼヘム含有領域を含み、前記スカフォールド領域はＢＭ３由来であり、前記ヘム含有領域は植物又は動物のＰ４５０酵素に由来するキメラタンパク質が、反応混合物中で酸素の存在下に基質と接触しており、前記基質が酸化されて酸化物を生成する
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が、電子を前記ヘム含有領域に移動させることができる電子伝達領域を不可欠に更に含み、電子を前記ヘム含有領域に移動させる行程において、前記電子伝達領域がその酸化形態に変えられる
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記電子伝達領域が、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又は電極からの電子の移動によってその還元形態に戻される
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質が分析対象物であり、前記酸化反応の程度を測定し、これによって前記反応混合物中の分析物の存在又は濃度を決定する
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
電子の移動がＮＡＤ（Ｐ）Ｈからであり、前記酸化反応の程度がＮＡＤ（Ｐ）＋産生を監視することによって決定される
ことを特徴とする請求項１１及び１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化反応の程度が酸素消費を監視することによって決定される
ことを特徴とする請求項１１及び１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質を合成するために形質転換された細菌。
【請求項１６】
大腸菌である
ことを特徴とする請求項１５に記載の細菌。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質を発現させることができる遺伝子を含むプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、互いに異なる供給源由来の触媒領域及びスカフォールド領域を含むキメラタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）は生物分析分野と深い関連がある（非特許文献１）。Ｐ４５０は、今日使用されている薬剤のほとんどの代謝に重要な組織の全てに存在する酵素で、一大ファミリーを形成しており、薬剤の開発と発見の過程で重要な役割を果たしている（非特許文献２、３）。Ｐ４５０は、酸素分子の原子２つのうち１つが様々な基質（Ｒ）の広範囲の場所に挿入されるのを触媒し、同時にもう１つの酸素原子を下記の反応に従って水に還元する反応を引き起こす。
ＲＨ＋Ｏ２＋２ｅ−＋２Ｈ＋→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ
【０００３】
Ｐ４５０はこのように重要であるにも関わらず、電極表面との相互作用が小さいことや、哺乳類のＰ４５０が生体膜と結合することに関わる問題があるため、Ｐ４５０を生物分析分野に応用するのは困難である。それでもやはり、新規の潜在的な薬剤の代謝的変換又は毒性の傾向を高速で大量にスクリーニングするための電極を作成できれば、この酵素を素晴らしく応用できる可能性がある。
【０００４】
この目的を達成するために、「取り扱いにおいて安定で可溶性のヒトＰ４５０酵素の能力」という問題に焦点を合わせる必要がある。
【０００５】
チトクロムＰ４５０ＢＭ３は、触媒として自給自足できる可溶性の脂肪酸モノオキシゲナーゼであり、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から単離された（非特許文献４、５）。この酵素が多領域構造を有していること、すなわち１０４８残基からなる１１９ｋＤａのポリペチド鎖１つに融合している３つの領域、ＦＡＤ１つ、ＦＭＮ１つ及びヘム領域１つからなっている点が特に興味深い。更に、Ｐ４５０ＢＭ３は、細菌由来であるにも関わらず、ミクロソームに存在する真核生物のＰ４５０に代表される、クラスＩＩのＰ４５０酵素に分類される（非特許文献６）。Ｐ４５０ＢＭ３は、その配列の３０％がミクロソームの脂肪酸ｗ−ヒドロキシラーゼと同一で、３５％がミクロソームのＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼと同一であり、他の細菌Ｐ４５０とは２０％の相同性を有するのみである（非特許文献６）。上記の特徴は、Ｐ４５０ＢＭ３を哺乳類のＰ４５０の代替として使用できる可能性を示唆しており、このことは最近、ウサギＰ４５０２Ｃ５の構造が解明された際に実証された（非特許文献７）。
【０００６】
哺乳類Ｐ４５０酵素は膜に結合している。この酵素をそのままの形でその生理学的供給源から単離し、試験系に用いることは難しい。哺乳類Ｐ４５０酵素（ＣＹＰ）の例を表Ｉに示す。
【０００７】
【表１】
2005527183.tif 000003
【０００８】
Ｐ４５０２Ｅ１（又はＣＹＰ２Ｅ１）は、多種の哺乳類の肝臓やその他の組織に存在するミクロソームの酵素であり、ベンゼン、アセトン、クロロホルム、エタノール及びその他のアルコール、多くのＮ−ニトロソアミン類、小分子のハロゲン化炭化水素類及びビニルモノマー類、並びに、アセトアミノフェン及びクロルゾキサゾン等の薬剤を含む５０を超える化合物の酸化を触媒することが分かっている（非特許文献８）。Ｐ４５０２Ｅ１は、その基質としてエタノール及び発がん物質である疑いのある多種の物質が挙げられるため、アルコール中毒及び化学的発がんと関連しているのではないかということで、非常に重要な物質であると考えられていた（非特許文献９）。Ｐ４５０２Ｅ１の上記以外の基質を表ＩＩに示す。
【０００９】
表ＩＩ
＜チトクロムＰ４５０２Ｅ１の基質（Ｌｉｅｂｅｒ、１９９７）＞
（アルコール、アルデヒド、ケトン及びニトリル）
アセトアルデヒド、ブタノール、２−ブタノール、エタノール、グリセロール、イソプロパノール、メタノール、プロパノール、ペンタノール、１−フェニルエタノール（アセトフェノンに対して）
（芳香族化合物）
アセトアミノフェン（タイレノール）、アニリン、ベンゼン、ブロモベンゼン、カフェイン（テオフィリン及びテオブロミンに対して）、カサイシン（Ｃａｓａｉｃｉｎ）、クロルゾキサゾン（パラフォン（Ｐａｒａｆｏｎ））、３−ヒドロキシピリジン、イソニアジド、フェノール、ピリジン、ｐ−ニトロフェノール、ピラゾール、スチレン、タモキシフェン、テオフィリン（８−水酸化）（高濃度にて）、トルエン
（エーテル）
ジエチルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル、１，１，２，３，３，３−ヘキサフルオロプロピルメチルエーテル
（脂肪酸）
アラキドン酸（ｗ−１及びｗ−２水酸化）、ラウリン酸（ｗ−１水酸化）
（ハロゲン化及び非ハロゲン化アルカン及びアルケン）
アセト酢酸塩、アセトール、アセトン、アセトニトリル（＋カタラーゼ）、アクリロニトリル、１，３−ブタジエン、クロロホルム（グルタチオン複合体に対して）、クロロホルム（低親和性成分）、クロロメタン、ジブロモエタン、１，１−ジクロロ−２，２，２−トリフルオロエタン、２，２−ジクロロ−１，１，１−トリフルオロエタン、ジクロロメタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、エンフルラン、１，２−エポキシ−３−ブテン、エタン、カルバミン酸エチル、二塩化エチレン、ハロタン、ヘキサン、β，β−イミノジプロピオニトリル、メトキシフルラン、ギ酸メチル、塩化メチレン、Ｎ−メチルホルムアミド、ペンタン、セロフルラン（Ｓｅｒｏｆｌｕｒａｎｅ）、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロエタン（ＴＲＩ）、１，１，２，２−テトラフルオロ−１−１（２，２，２−トリフルオロエトキシ）エタン、チオアセトアミド、チラパザミン（Ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）、１，１，１−トリクロロエチレン、トリクロロエチレン、塩化ビニル、臭化ビニル
（ニトロソアミン、アゾ化合物）
アゾキシメタン、Ｎ，Ｎ−ジエチルニトロソアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルニトロソアミン、メチルアゾキシメタノール、Ｎ−ニトロソ−２，２−ジメチルモルフォリン、Ｎ−ニトロソメチルベンジルアミン、Ｎ−ニトロソピロリジン、Ｎ−ニトロソビス（２−オキソプロピル）アミン
（還元可能な基質）
ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、四塩化炭素、クロム［Ｃｒ（ＶＩ）］、クミルヒドロペルオキシド、１３−ヒドロペルオキシ−９，１１−オクタデカジエン酸、１５−ヒドロペルオキシ−５，８，１１，１３−エイコサテトラエン酸、酸素
【００１０】
Ｐ４５０酵素の可溶化を、この酵素の膜への固定に関係すると考えられる推定Ｎ末端領域の端を切ることよって行うことを試みたグループがある。しかしタンパク質は依然として膜に結合していることから、よりたくさんの膜との相互作用が存在することが示唆された。しかしながら、最近、アメリカのＪｏｎｅｓと同僚ら（非特許文献１０）が、可溶性で機能的な、ヒトＰ４５０２Ｃ９が約５０％及び可溶性の細菌Ｐ４５０ｃａｍが約５０％のキメラを構築して発現させることに成功した。上記酵素は、ヒトＰ４５０２Ｃ９に特徴的な４−クロロトルエンの酸化を、分子酸素を用いて、細菌Ｐ４５０ｃａｍの生理学的な電子伝達の相手から供給される還元当量で触媒することが分かった。大腸菌において発現させることに成功した人工Ｐ４５０酵素の例を表ＩＩＩに示す。
【００１１】
【表２】
2005527183.tif 000004
【００１２】
２Ｅ１は、非特許文献１１がクローニングして発現させた。
【非特許文献１】Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｓｏｔｓｏｕ，Ｇ．Ｅ．，Ｆａｉｒｈｅａｄ，Ｍ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２００１）Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎ：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  Ｄｅ  Ｃｕｙｐｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．（Ｅｄｓ），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献２】Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５，７６７−７７４．
【非特許文献３】Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｆ．Ｐ．（１９９９）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９，１−１７．
【非特許文献４】Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８６）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａ１１ｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  １１９，０００−Ｄａｌｔｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１６），７１６０−７１６９．
【非特許文献５】Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０ＢＭ３，  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｎｏｏｘｉｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（１４），６６８３−６６９０．
【非特許文献６】Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｈａｓｅｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９３）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐ４５０ＢＭ−３，  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，７３１−７３６．
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｏｓｍｅ，Ｊ．，Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．，ＭｃＲｅｅ，Ｄ．Ｅ．（２０００）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５，１２１−１３１．
【非特許文献８】Ｌｉｅｂｅｒ，Ｃ．Ｓ．（１９９７）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１：ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．７７（２），５１８−５３８．
【非特許文献９】Ｇｉｌｌａｍ  Ｅ．Ｍ．Ｊ．，Ｇｕｏ  Ｚ．，Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ  Ｆ．Ｐ．（１９９４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１２，５９−６６．
【非特許文献１０】Ｓｈｉｍｏｊｉ，Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｈ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｌ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｐ．（１９９８）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｐ４５０：ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｃｈｉｍｅｒａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，８８４８−‘５２．
【非特許文献１１】Ｕｍｅｎｏ，Ｍ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，．Ｓ．，Ｇｅｌｂｏｉｎ，Ｈ．Ｖ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．（１９８８）“Ｈｕｍａｎ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐ４５０２Ｅ１：ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，９００６−９０１３．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の水溶性キメラタンパク質は、スカフォールド領域及びモノオキシゲナーゼヘム含有領域を含んでおり、上記スカフォールド領域はＢＭ３に由来し、上記ヘム領域は植物又は動物のＰ４５０酵素に由来する。
【００１４】
本発明において上記ヘム領域は、植物又は動物の、通常は哺乳類のＰ４５０酵素から、例えばこの生理学的な酵素の膜結合部位を切断することによって得られる。この部位は疎水性であり、Ｐ４５０を非水溶性にしている。このことから、この部位を切断するとＰ４５０を可溶化できる。上記ヘム領域を、自給自足できる細菌性酸化還元タンパク質ＢＭ３由来のスカフォールド領域と融合させると、植物又は動物のＰ４５０から膜結合部位を切断することによって現れた疎水部分を更に覆うことができ、かつ、他の電子伝達部位と相互作用する領域を与えることができる。
【００１５】
好ましくは、上記キメラタンパク質は電子伝達領域を不可欠に含んでおり、この領域は上記キメラタンパク質に機能的コンホメーションにおいて融合している部位である。一般的に、この電子伝達部位は、ＢＭ３タンパク質由来の生理学的領域を含む。また、一般的に、上記電子伝達領域はフラボタンパク質である。上記スカフォールド領域は、好ましくは、野生型ＢＭ３のＮ末端領域又はこれに近接する位置から少なくとも２００残基を、より好ましくは少なくとも５００残基を含む。
【００１６】
上記スカフォールド領域は、ＢＭ３の野生型ヘム領域、すなわち４７１番目までの残基を含んではならない。好ましくは、上記スカフォールド領域は、ヘムレダクターゼ領域のＦＭＮ部分を含む４７２〜６５２番目の残基由来の部分と、ＦＡＤ領域を含む６５２番目の残基からおよそＮ末端までの部分を含む。
【００１７】
植物又は動物のＰ４５０の上記ヘム含有領域は、一般的に、少なくとも２００個の連続する野生型Ｐ４５０酵素由来残基を含み、ここにはヘム結合残基及び触媒残基が位置している。上記触媒残基及びヘム結合残基は、野生型酵素のＣ末端又はその近傍に存在することが一般的に分かっている。好ましくは、上記ヘム領域は、野生型Ｐ４５０酵素のＣ末端又はその近傍から少なくとも２００個の連続する残基を含む。上記ヘム領域は、好ましくは２５０個より多くの、より好ましくは３００個より多くの連続する残基を含む。好ましくは、上記ヘム領域は、上記表Ｉに記載されているＣＹＰのうちの１つに由来する。表ＩＩＩに記載のＣＹＰがクローニングされているので、これらのＣＹＰのうちの１つに由来する領域を用いることが好ましい。最も好ましくは、上記ヘム領域は２Ｅ１に由来する。
【００１８】
上記野生型酵素は突然変異していることが望ましいかもしれない場合がある。例えば、上記スカフォールド領域に適切な融合特性を与えるために、又は、上記酵素の活性及び／若しくは基質結合特性に与える変異の効果を分析して調べるために、活性部位に変異を導入することが望ましいかもしれない。本発明は主に生理学的な（すなわち野生型の）酵素の結合部位の調査に用いられることから、変異させたり除去したりする残基は少ない方が好ましく、かつ、変異させた残基はいずれも保存的に置換されることが好ましい。好ましくは、上記野生型酵素に関して２０残基だけが変異されていることであり、より好ましくは１０個未満の残基が、最も好ましくは５個未満の残基が除去されている又は変えられていることである。
【００１９】
本発明において、上記キメラタンパク質が上記触媒モノオキシゲナーゼ領域の基質と、反応混合物中で、酸素の存在下に接触しており、このため上記基質が酸化されて酸化物を生成するような新規の方法も提供される。この方法は、上記反応の生成物を確認することによって、又は、上記ヘム含有領域から電子伝達領域への電子の移動を監視することによって、又は、酸素消費量を監視することによって監視されてよい。上記電子の移動は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを反応混合物中に含めることによって、又は、ＮＡＤ（Ｐ）＋産生を、例えば本発明者らが同時係属中のＷＯ−Ａ−０１５７２３６に記載するアッセイを用いて監視することによって監視されてよい。また、上記電子の移動は、上記キメラタンパク質の上記電子伝達領域へ若しくはこの領域から電子を移動させることのできる電極を用いることによって、又は、電子伝達中間成分を用いることによって監視されてよい。この方法は、先行するイギリス出願０１１９０４２．０に基づいて２００２年８月３日に出願した、本発明者らが同時係属中のＰＣＴ出願の中に記載され請求されている。ＢＭ３−２Ｅ１又はその他の哺乳類キメラについてではなく、野生型ＢＭ３についてではあるが、この方法を下記の実施例で説明する。
【００２０】
本発明の方法は、分析対象物、すなわち上記基質の存在又は濃度を監視するために用いてよい。上記方法はまた、対象である基質の代謝を監視するために用いてもよい。上記基質は、上記表ＩＩに記載されている化合物のうちのいずれであってもよい。
【００２１】
本発明を関連する図によって説明する。
【００２２】
図１は、Ｐ４５０ＢＭ３を作成して、（Ａ）本発明者らが２００２年８月３日の出願の中で請求しているように、電子伝達タンパク質フラボドキシンとの融合を通じて電気化学的に接近できるＰ４５０触媒領域を形成すること、及び、（Ｂ）ヒト膜結合Ｐ４５０２Ｅ１を、触媒として自給自足できるＰ４５０ＢＭ３の上記スカフォールド領域において選択した部分と融合させることによって、すなわち本発明によって、可溶化すること、を示す。
【００２３】
図２は、（Ａ）アラキドン酸結合ＢＭＰ（ＢＭＰ−Ｓ）の、すなわち図１ＡのＢＭ３−ＦＬＤキメラの、フラボドキシンセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）による、４５０ｎｍにおいてストップフロー分光測定法により測定した、一酸化炭素存在下での還元、及び、（Ｂ）ＦＬＤｓｑとＢＭＰ−Ｓとの間の反応のイオン強度（Ｉ）の平方根に対する限定擬一次速度定数（ｋｌｉｍ）の値、を示す。
【００２４】
図３は、Ｐ４５０のＢＭＰとＦＬＤとの複合体の３Ｄモデルである。（Ａ）は結合した複合体の側面である。ファン・デル・ワールス表面は、ＤｅｌＰｈｉを用いて計算した静電電位を示しており、正の電位は最も濃い色で、負の電位は中程度に濃い色で、中性の電位は白で示す（輪郭の縮尺は±５Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。（Ｂ）はＡと同じ方向から見た複合体のリボン図解である。Ｐ４５０ＢＭＰを薄い色で左側に、ＦＬＤを濃い色で右側に、ＦＭＮをＦＬＤの下部を満たす空間に、ヘムをＢＭＰの中央を満たす空間に示す。（Ｃ）は開いた状態の複合体の概観を、Ａと同じ方向から見たものではあるが、±９０度回転させて開くことによって２つのタンパク質間の境界面を見えるように示す。これらの図は、Ｇｉｌａｒｄｉ  Ｇ．ら（２００２）に色付きで示されている。
【００２５】
図４について、（Ａ）はＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のモデル構造を示すもので、ＢＭＰ領域を薄い色のリボンで、ＦＬＤ領域を濃い色のリボンで、ヘムをＢＭＰ領域の中央を満たす空間に、システイン４００を薄い色でヘム近傍を満たす空間に、ＦＭＮを薄い色でＦＬＤの上部を満たす空間に、ＢＭＰとＦＬＤの間の連結ループをモデルの下部に示す。（Ｂ）は、ＢＭＰの遺伝子とＦＬＤの遺伝子を融合してＢＭＰ−ＦＬＤキメラを作成するための分子生物学的アプローチを示す。ＮＩａＩＩＩ制限部位は、オリゴヌクレオチド指定突然変異（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって導入した。これらの図は、Ｇｉｌａｒｄｉら（２００２）に色付きで示されている。
【００２６】
図５は、ガラス質炭素電極における、ネオマイシンの不在下（１、細線）及び存在下（２、太線）での、ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のサイクリックボルタモグラムを示す。一酸化炭素を添加した場合に、ピークが高電位に偏移している（３、点線）。電位は飽和カロメル電極に対して記載している。
【００２７】
図６は、上部にクローニングを示す。２Ｅ１−ＢＭ３のキメラ２Ｅ１−ＢＭ３／１を発現させるための１つ目のプラスミドｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３を構築するのに用いた方法である。出発プラスミドは、Ｐ４５０ＢＭ３の遺伝子（Ｈ＝ヘム領域、Ｒ＝レダクターゼ領域）及びヒト２Ｅ１をそれぞれ含む、ｐＴ７ＢＭ３Ｚ及びｐＣＷ２Ｅ１である。断片Ｉ（ＦＲＩ、ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ）、断片ＩＩ（ＦＲＩＩ、ＫｐｎＩ−ＡｖｒＩＩ）及び断片ＩＩＩ（ＦＲＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ−ＥｃｏＲＩ）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋／−）ベクターにクローニングし、プラスミドＢＳＩ、ＢＳＩＩ及びＢＳＩＩＩをそれぞれ得る。制限部位は、ＰＣＲ法により変異原性オリゴヌクレオチドを用いて導入した。１つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラの遺伝子は、断片Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩを連結させることによって作成した。図の下部に、２Ｅ１−ＢＭ３キメラの発現を、すなわち２Ｅ１−ＢＭ３キメラの発現を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。矢印は２Ｅ１−ＢＭ３キメラの位置（１１８ｋＤａ）を示す。レーン１及び８は、分子量マーカー（下から）５３、７６、１１６、１７０、２１２ｋＤａを示す。レーン２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ細胞の溶解物を示す。レーン４は、ｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３プラスミドで形質転換し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ細胞（２８℃において２０時間増殖させた細胞）の溶解物を示す。レーン５はレーン３及び４と同じものを示すが、１０，０００ｇで遠心分離して膜画分及び封入体を除去した後のものである。レーン６はレーン３及び４と同じものを示すが、１００，０００ｇで遠心分離した後のものである。レーン７は、１００，０００ｇで遠心分離した後の沈殿物を示す。
【００２８】
図７は、大腸菌細胞の清浄にした溶解物の、亜ジチオン酸ナトリウムで還元して一酸化炭素を気泡注入した後における吸収スペクトルを示す。点線は形質転換していないもの、細線はＢＭＰ−ＦＬＤプラスミドによって形質転換したもの、太線は１つ目のプラスミド２Ｅ１−ＢＭ３によって形質転換したもの（２Ｅ１−ＢＭ３／１）について示す。
【００２９】
図８は、実施例中で作成した２種の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／１及び２Ｅ１−ＢＭ３／２）の構造を図示する。
【００３０】
図９−ａ〜ｃは、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ、すなわち図８で説明したキメラの作成に用いたクローニングの行程を示す。
【００３１】
図１０は、ヘム基を酸化形態、還元形態及び一酸化炭素存在下における還元形態で持つ、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／２）の紫外−可視スペクトルを示す。
【００３２】
図１１は、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／２）のラウリン酸存在下における紫外−可視スペクトルの差を示す。ここで、ラウリン酸の濃度を増加させていった場合の、３９０ｎｍ（高スピンヘム鉄）における吸光度の増加、及び、４２０ｎｍ（低スピンヘム鉄）における減少を示している。
【００３３】
図１２は、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラのラウリン酸存在下における酸素消費量を示す。
【００３４】
図１３は、ヒトＣＹＰ２Ｅ１の、Ｕｍｅｎｏら（１９８８）による、イントロンを含まない配列を示す。
【００３５】
図１４は、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする遺伝子を含む５ｋｂのＤＮＡ断片が、Ｆｕｌｃｏとその同僚らによって単離され、その配列が決定された（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。この塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＭＢＬデータバンクに受託番号Ｊ０４８３２で提出された。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。
【００３６】
３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。Ｔ７ＲＮＡφ１０プロモーターから始まるｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造の５’調節領域についても示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。また、ヘム領域とレダクターゼ領域との間のＡｒｇ４７１〜Ｌｙｓ４７２の従来の境界、及び、ＦＭＮ領域とＦＡＤ領域との間のＡｓｐ６５２〜Ｍｅｔ６５３の境界についても示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
付随する実施例により、本発明を更に詳しく説明する。
【００３８】
＜材料と方法＞
（Ｐ４５０ＢＭ３ヘム領域（ＢＭＰ）とフラボドキシン（ＦＬＤ）との間の電子伝達測定）
吸光度の測定は全て、ヒューレット・パッカード社製８４５２ダイオード・アレイ・スペクトロフォトメーターを用いて行った。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来の野生型フラボドキシン（ＦＬＤ、４．９μＭ）を５ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．３）に溶解したものを、２．５μＭのデアザリボフラビン（ｄｅａｚａｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）（ｄＲｆ）及び０．８５ｍＭのＥＤＴＡ（犠牲電子供与体）の存在下で、そのセミキノン体に光還元した（ＦＬＤｓｑ、結果を記載している部分における反応式［１］及び［２］）。アラキドン酸結合ＢＭＰの還元を行った後、一酸化炭素雰囲気下で、４５０ｎｍでの吸光度を長さ１ｃｍのセルを備えたＨｉ−Ｔｅｃｈ社ＳＦ−６１ストップフロー装置を用いて２３℃において監視し、速度を測定した。アラキドン酸結合ＢＭＰの典型的な濃度は１μＭであり、ＦＬＤの典型的な濃度は２〜２０μＭに変化した（結果を記載している部分における反応式［３］）。全ての溶液について、アルゴンを気泡注入する特別の処置を行うことにより、嫌気状態にした。この方法は、Ｈｅｅｒｉｎｇ−Ｈａｇｅｎ（１９９６）の方法に基づく。
【００３９】
（ＢＭＰ−ＦＬＤキメラの構築と発現）
ＢＭＰ−ＦＬＤ融合複合体を、ＮｌａＩＩＩ部位を、ｐＴ７ＢＭ３ＺにおけるＰ４５０ＢＭ３レダクターゼ遺伝子のループの３’末端（Ｌｉら（１９９１））、及び、ｐＴ７ＦＬＤ遺伝子の５’末端（Ｋｒｅｙら（１９８８）、Ｖａｌｅｔｔｉら（１９９８））に導入することによって構築した。この構築は、表ＩＶに記載している配列番号１及び２の変異原性オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ法によって行った。上記２つの遺伝子は、ＮｌａＩＩＩエンドヌクレアーゼで消化した後、連結段階に供した。野生型（ｗｔ）Ｐ４５０ＢＭ３及びＢＭＰ−ＦＬＤキメラの発現及び精製を公知の手順によって行った（各々、Ｌｉら（１９９１）及びＳａｄｅｇｈｉら（２０００ａ））。
【００４０】
（ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における電子伝達の測定）
４μＭのＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質を、５μＭのデアザリボフラビン及び５μＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、完全嫌気状態において、定常状態で光還元した。光照射は１００Ｗのランプを用いて行った。レーザー閃光光分解を以前に記載されている通りに行った（Ｈａｚｚａｒｄら（１９９７））。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質（５μＭ）を、１００μＭのデアザリボフラビン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、一酸化炭素で飽和させた１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）中で、完全嫌気状態において保持した。
【００４１】
（ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における電気化学実験）
電気化学実験は全て、ＧＰＥＳソフトウェアで制御したＡｕｔｏｌａｂ  ＰＳＴＡＴ１０（Ｅｃｏ  Ｃｈｅｍｉｅ社、ユトレヒト、オランダ）を用いて行った。階段状サイクリックボルタンメトリーを、カウンターとして白金線を備えたガラス質炭素ディスクを動作電極として用いたハーゲンセル（Ｈａｇａｎ  ｃｅｌｌ）中で行った（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。この動作電極を、以前に記載されている通りに活性化して研磨した（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。参照電極には、＋２４６ｍＶ  ｖｓ．  ＮＨＥ（標準水素電極）の電位を有する飽和カロメルを用いた。測定は全て、完全嫌気状態において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）中におけるタンパク質の濃度を３０μＭとして、７℃において行った。
【００４２】
（ＢＭ３キメラの紫外−可視スペクトル）
５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）中の５．４ｎｍｏｌのＰ４５０ＢＭ３を、亜ジチオン酸ナトリウム飽和溶液を１μＬ添加することによって還元した。その後、一酸化炭素による気泡注入を約１分間穏やかに行った。
【００４３】
（分子模型）
模型の実験と計算は全て、Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳｌ社製ソフトウェアをＳＧＩ社製Ｉｎｄｉｇｏ２ワークステーションＩＲＩＸ６．２にインストールしたものを用いて行った。表面静電電位は、ＤｅｌＰｈｉ２．０モジュールを用いてＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ環境において計算した。ＤｅｌＰｈｉの計算は、誘電定数を溶質について２．０、溶媒について８０とし、１００ｍＭのイオン強度で行った。溶媒半径は１．４Å、イオン半径は２．０Åに設定した。ポアゾン−ボルツマンの演算法を、非線形の状態において、反復の限界を２０００及び収束の限界を０．００００１で、タンパク質を中心とする分解能１．０Å以下の格子（ｇｒｉｄ）に適用した。分子表面と格子境界との間の距離の最小値は１５．０Åであった。形式電荷のみを考慮に入れた。Ｃ末端及びＮ末端、及び、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＬｙｓ側鎖は完全にイオン化されているものとし、ＦＭＮリン酸塩及びヘム鉄（ＦｅＩＩ）ついても計算に含んだ。溶媒暴露（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）は、Ｃｏｎｎｏｌｌｙの演算法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３））により、半径１．４Åのプローブを用いて計算した。タンパク質データバンク（ｐｄｂ）ファイルとしては、酸化型ＦＬＤ（Ｗａｔｔら（１９９１））、Ｐ４５０ｔｅｒｐ（Ｈａｓｅｍａｎｎら（１９９４））、Ｐ４５０ｃａｍ（Ｐｏｕｌｏｓら（１９８６））、Ｐ４５０ｅｒｙＦ（Ｃｕｐｐｖｉｃｋｅｒｙ、Ｐｏｕｌｏｓ（１９９５））、及び、Ｐ４５０ＢＭ３のヘム領域（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら（１９９３）；Ｌｉ、Ｐｏｕｌｏｓ（１９９７）；Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））を用いた。上記ヒトＰ４５０２Ｅ１の模型を、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ  ９５．０（Ｂｙｏｓｉｍ／ＭＳＩ）のアプリケーションＨｏｍｏｌｏｇｙを用いて構築し、仮模型（ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｍｏｄｅｌ）を最終的に精錬し、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのモジュールＤｉｓｃｏｖｅｒに供してエネルギーを最小化した。
【００４４】
（２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（１）の構築と発現）
２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（１）の構築に用いたＤＮＡ断片を、Ｐ４５０ＢＭ３のためのプラスミドｐＴ７ＢＭ３Ｚ（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））及びＰ４５０２Ｅ１のためのプラスミドｐＣＷ２Ｅ１（Ｇｉｌｌａｍら（１９９４））から得た。適切な制限部位を、部位指定突然変異により、ＰＣＲ酵素ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及び変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて挿入した。配列番号３〜８を表ＩＶに示す。適切な制限部位を持つ増幅ＰＣＲ断片を、図６に示す方法によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋／−）増幅ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。ｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）における誘導発現のためのＴ７プロモーターによって調整しながら発現させた。ＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）で一晩培養したものを１ｍＬ用いて、１００ｍＬのＬＢ−アンピシリンを接種した。上記は、３７℃において、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が１になるまで増殖させた。次に、この培養物を用いて９ＬのＬＢ−アンピシリンを接種し、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）及び更なるアンピシリンをＯＤ６０００．４〜０．６の時点で添加した。その後、細胞増殖を２８℃において２１時間継続した。細胞を５０００ｒｐｍで１５分間４℃において遠心分離することにより回収し、細胞沈殿物を１００ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）（バッファーＡ）に再度懸濁した後、もう一度沈殿させた。細胞をバッファーＡ中に、細胞１ｇ当たり１ｍＬのバッファーとなるように再度懸濁し、超音波をかけて溶解した後、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。洗浄した細胞溶解物を３８，０００ｒｐｍで１時間超遠心し、膜画分をサイトゾル（可溶性画分）から分離した。その後この可溶性画分を、あらかじめバッファーＡで平衡にしておいたＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（ファルマシア社）上に載せた。２Ｅ１−ＢＭ３キメラを１００〜５００ｍＭ勾配のリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）で溶出した。
【００４５】
（２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２）の構築と発現）
２Ｅ１−ＢＭＲを、既存のクローンを制限酵素で消化して簡単に、すなわち変異原性ＰＣＲを要さずに（従ってプライマーを要さずに）作成した。行ったクローニングの行程を図９−ａ〜ｃに説明する。構築の工程は以下のように行った。
【００４６】
（第１段階：ｐＥＴ３０ｂ２Ｅ１）
ｐＣＷ２Ｅ１（赤、図中）から開始した。ここから、野生型２Ｅ１を市販のｐＥＴ３０ｂベクターへ移動させた。このｐＣＷ２Ｅ１は最初から２１個のアミノ酸を欠失している（Ｎ末端修飾と称する）。
【００４７】
（第２段階：ｐＥＴ２Ｅ１−ＢＭ３／２）
ｐＥＴ３０ｂ２Ｅ１構造を鋳型として用いて、ｐＴ７２Ｅ１ＢＭ３のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を挿入した。ｐＴ７２Ｅ１ＢＭ３中に含まれるＢＭＲを添加することによって、この断片をｐＥＴ３０ｂ２Ｅ１における２Ｅ１遺伝子の一部と本質的に置き換えた。こうしてｐＥＴ２Ｅ１／ＢＭ３／２構造が得られた。理論上、これで発現の準備ができたことになるであろう。実際は、封入体を与える。
【００４８】
（第３段階：ｐＣＷ２Ｅ１−ＢＭ３／２）
発現をより良好にするために、２Ｅ１−ＢＭ３／２構造を、初期のｐＣＷ２Ｅ１を起源とするｐＣＷベクターにサブクローニングした。このサブクローニングは、ＢａｍＨＩによる切断とＣ末端における平滑末端連結とを組み合わせることによって行った。このクローンを１つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラの場合と同様に発現させた。
【００４９】
（基質の存在下における２Ｅ１−ＢＭ３／２キメラの酸素消費）
１００ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）９４０ｍＬを酸素電極チャンバー（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製Ｏｘｙｇｒａｐｈ  ｓｙｓｔｅｍ）に添加し、１０分間２５℃において撹拌した（５０ｍＭ炭酸カリウム溶液に溶解した５００ｍＭのラウリン酸を共存させて又は共存させずに）。次に、同様のリン酸バッファー中に含まれた状態のタンパク質５０ｍＬをハミルトンシリンジによって添加し（最終タンパク質濃度０．４ｍＭ）、その混合物を３分間撹拌した。その後、ＮＡＤＰＨ５ｍＬを添加し（最終濃度７５ｍＭ）、酸素濃度を、酸素消費が停止するまで測定した。ＮＡＤＰＨ５ｍＬを更に添加し（最終濃度７５ｍＭ）、酸素濃度を、酸素消費が停止するまで測定した。
【００５０】
＜結果＞
（人工酸化還元鎖の作成）
Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のフラボドキシン（ＦＬＤ）、及び、巨大菌由来のチトクロムＰ４５０ＢＭ３（ＢＭＰ）のヘム領域が、共有結合による多領域構造構築に用いる電子伝達モジュール及び触媒モジュールとして適しているかどうかを試験した。個々のタンパク質間における電子伝達（ＥＴ）をストップフロー分光光度法によって調べた。フラボドキシン（ＦＬＤｑ）を、嫌気的に、定常状態においてセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）に還元した。この還元は、ストップフロー装置の１つのシリンジ中で、ＥＤＴＡ存在下での光照射により生成したデアザリボフラビン（ｄＲｆＨ）のセミキノンラジカルを用いて行った。行った反応のスキームを以下の反応式に要約する（Ｓａｄｅｇｈｉら（１９９９））。
【００５１】
【化１】
2005527183.tif 000005
【００５２】
擬一次飽和条件下では、ＦＬＤｓｑ／（ＢＭＰ−Ｓ）ｏｘ酸化還元対のＥＴの経過は、４５０ｎｍにおける吸光度の増加を示した（図２Ａ）。このことは、４５０ｎｍにおける吸光度を左右する一酸化炭素付加体を迅速に形成する（ＢＭＰ−Ｓ）ｏｘの還元と一致する。擬一次速度定数（ｋｏｂｓ）を、データ値を単純指数の成分に合わせることによって計算した。ＦＬＤｓｑの濃度が２〜２０μＭで変化する場合、ｋｏｂｓは、２つのタンパク質間での複合体の形成と一致して飽和することが分かった。ＦＬＤｓｑの濃度に対するｋｏｂｓのデータ値を双曲関数に合わせることにより、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．３）中においてイオン強度２５０ｍＭで、限定速度定数ｋｌｉｍ４３．７７±２．１８ｓ−１、及び、見かけの解離定数Ｋａｐｐ１．２３±０．３２μＭを得た。
【００５３】
効率のよいＥＴを得るための重要な要因は、酸化還元対間におけるＥＴコンピテント複合体の形成である。ＢＭＰとＦＬＤとの間の複合体の形成における静電気力の効果を、タンパク質溶液のイオン強度を変化させることによって調べた。得られたＫｌｉｍ値をイオン強度Ｉの平方根に対して示したが、これは図２Ｂに示すように円錐形となる傾向を示した。これは通常、複合体の形成に関わる疎水的及び静電的相互作用によるものである（Ｓａｄｅｇｈｉら（２０００ｂ））。このことは、図３に示すように２つのタンパク質の表面電位を計算することによって確認された。
【００５４】
選択したタンパク質モジュールの３Ｄ構造が有用であるため、可能性のある複合体の３Ｄモデルの構築に用いる計算方法が使用できる。このようなモデルの構造は、本研究において、ここに記載する共有結合による集合体を合理的に設計するために重要である。
【００５５】
上記ＦＬＤ／ＢＭＰ複合体のモデル（図３Ｂ）を、ＦＬＤの３Ｄ構造を短小化Ｐ４５０ＢＭ３の３Ｄ構造に重ね合わせることによって作成した（Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））。この複合体の酸化還元中心間の距離は１８Åであり、上記短小化Ｐ４５０ＢＭ３の構造におけるものと同程度であった（Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））。しかしながら、ＦＬＤのＦＭＮ領域が、近接したＢＭＰ表面の、ヘムの配位子であるシステイン４００周辺の正に荷電しているくぼみに結合している場合は、代替モデルを用いることも可能である。このモデルは、１２Å未満という近い距離に２つの補因子を有している。上記の可能性のある２つのモデルは、天然Ｐ４５０−レダクターゼ複合体についても仮定されている、上記ＥＴコンピテント複合体の形成及び再編成を伴う動的現象の存在を示しているのかもしれない（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００））。
【００５６】
上記ＥＴコンピテント複合体のモデルを用いて、ＢＭＰ−ＦＬＤの共有結合による複合体を形成した。この形成は、図４Ｂに示す遺伝子融合で導入した順応性のある接続ループを結合させることによって行った。この方法は、２つの酸化還元領域を動的形態に保つという利点がある。ＢＭＰ−ＦＬＤシステムの融合は、ＤＮＡレベルで、ＢＭＰ遺伝子（１〜４７０残基）とＦＬＤ遺伝子（１〜１４８残基）とをＰ４５０ＢＭ３のレダクターゼ領域の天然ループ（４７１〜４７９残基）を通して結合させることによって行った。この融合タンパク質の３Ｄモデルを図４Ａに示す。遺伝子融合は、図４Ｂに示すように、関連するＤＮＡ配列を合成ＮｌａＩＩＩ制限部位と連結させることによって行った。
【００５７】
融合遺伝子は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣＩのポリペプチド１本鎖において非相同的に発現した。精製したキメラタンパク質の吸収スペクトルは、ヘムとＦＭＮが１：１の割合で組み込まれていることを示唆した。また、還元されたタンパク質は、４５０ｎｍにおける吸光度が特徴的な一酸化炭素付加体を形成できただけでなく、４１９ｎｍから３９７ｎｍという低スピンから高スピンへの予想された偏移を示す基質（アラキドン酸）へ結合できたが、このことはこの共有結合による複合体が確かに機能的Ｐ４５０であることを示している。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質の完全な二次構造をＣＤ光度法によって確認したが（データは図示せず）、おそらく人工ループを添加したために、α−ヘリックス含量がＢＭＰと比較して２％までの範囲で増加していた。光度法によるデータは、上記融合タンパク質が確かに、可溶性で折りたたみ構造を持った機能的タンパク質として発現していることを示す（Ｓａｄｅｇｈｉら（２０００ａ））。
【００５８】
上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質において、ＦＭＮ含有領域からヘム含有領域への分子内部でのＥＴが基質存在下で起こるかどうかを、定常状態の条件下で調べた。フラビン領域を、デアザリボフラビンによって、ＥＤＴＡの存在下、嫌気状態において光還元した。続いて起こるフラビン領域からヘム領域へのＥＴを、ヘムの吸光度を３９７ｎｍから４５０ｎｍに移動させて、一酸化炭素飽和雰囲気下で追跡した。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質における分子内部でのＥＴの速度を、トランジェント吸光光度法によって調べた。実験設備において、ＦＭＮからヘムへのＥＴが、ＦＬＤｓｑの５８０ｎｍにおける吸光度が減少したことによって分かった。ＥＴの速度を測定したところ、３７０ｓ−１であった。この値は、ＦＡＤ領域を除去した短小化Ｐ４５０ＢＭ３の、タンパク質内部でのＦＭＮ領域からヘム領域へのＥＴを測定した値（２５０ｓ−１）と同程度である（Ｈａｚｚａｒｄら（１９９７））。これらの結果は、上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質の機能が生理学的タンパク質の機能と同等であることを示すもので、極めて心強いものである。
【００５９】
上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質についての予備的な電気化学的実験を、ガラス質炭素電極を用いて行った。上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質とＢＭＰとのサイクリックボルタモグラム（ｃｖ）を図５に示す。むき出しのガラス質炭素電極上のＰ４５０ＢＭ３酵素には電流は観察されなかったが、上記ＢＭＰ−ＦＬＤは測定可能な規模の酸化還元活性を示している（図５、細線）。特に、上記ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質と電極との間に、ネオマイシンの存在下でより多い電流が測定されたことから（図５、太線）、この間の相互作用が向上している。ネオマイシンは正に荷電したアミノグリコシドであり、負に荷電したＦＬＤと負に荷電した電極表面との間の静電的反発を克服すると考えられている（Ｈｅｅｒｉｎｇ、Ｈａｇｅｎ（１９９６））。ネオマイシンの存在下でＢＭＰ−ＦＬＤについて観察された電流の増加は、ＦＬＤが電極とＢＭＰとの間の電気化学的な接触を補助しているという仮説を裏付けるものである。現在、酸化試験で確認される電流の低下と電気化学的セル内で漏出した酸素量とが一致するというように、電気化学的に完全に可逆とするための試みがなされている。この結果はＰ４５０ヘムの電気化学的応答と一致しているということが、一酸化炭素を添加した後のｃｖにおける高い電位での偏移によって裏付けられる（図５、点線）。
【００６０】
この節で示したデータは、ＢＭＰ触媒モジュールとＦＬＤ電子伝達モジュールとの間における非生理学的な電子伝達が実際に可能であること、及び、共有結合している多領域構造ＢＭＰ−ＦＬＤがよりよい電気化学的特性を示すことを証明している。
【００６１】
（ヒト／細菌Ｐ４５０酵素２Ｅ１−ＢＭ３の組み立て、２Ｅ１−ＢＭ３／１）
この節では、巨大菌由来Ｐ４５０ＢＭ３とヒトＰ４５０２Ｅ１とのヒト／細菌キメラＰ４５０（２Ｅ１−ＢＭ３）を設計、構築及び発現させて、可溶性構造を得ることについて報告する。このキメラを、ヒトＰ４５０２Ｅ１の一部とＰ４５０ＢＭ３の一部とを、上記２つのタンパク質の３Ｄ構造／モデルの合理的設計の手法に従って、図１Ｂのスキームに示すように融合することにより得た。可溶性チトクロムＰ４５０ＢＭ３のヘム領域及び短小化形態の３Ｄ構造はＸ線タンパク質結晶学によって公知であるが（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら（１９９３）；Ｌｉ、Ｐｏｕｌｏｓ（１９９７）；Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａら（１９９９））、ヒト２Ｅ１酵素は膜に結合しており、構造についての情報は何も得られていない。この理由から、２Ｅ１の触媒要素を保持していて、かつ、ＢＭ３の可溶性部分で置き換えられることで２Ｅ１の膜結合Ｎ末端部分が除去されているキメラの合理的設計を補助するために、Ｐ４５０２Ｅ１の３Ｄモデルを構築した。この３Ｄモデルの設計に用いた方法は以下の通りである。（１）Ｘ線構造が公知である関連のあるタンパク質４種（Ｐ４５０ｔｅｒｐ、Ｐ４５０ｃａｍ、Ｐ４５０ｅｒｙＦ、及び、Ｐ４５０ＢＭ３のＢＭＰ領域）を選択し、構造が保存された領域（ＳＣＲ）を用いて、それらの配列をＰ４５０２Ｅ１の配列と共に並べた。（２）構造が変わり得る領域（ＶＲ）の配位を、相同性の程度により各ＶＲに対してそれぞれ異なる鋳型を用いて割り当てた（ＶＲの長さが異なる場合は、ループを調査することにより配位を割り当てた）。（３）可能性のある初期の側鎖のコンホメーションを調査し、より順応性のあるＮ末端及びＣ末端領域の配位を任意に割り当てた。（４）正確でない立体の接触（隆起）を、関連する回転異性体を手作業で正しい向きにすることによって修正した。（５）上記モデルを精錬してエネルギーを最小化した。
【００６２】
上記３Ｄモデルの性質を、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９３）；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｅｃｈ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ：８４００）を用いて、解像度２．５Åで調べた。ラマチャンドランプロットの統計により、上記残基の９２．４％が上記プロットの最も好ましい領域にあることが分かった。また、全体のＧ因子、すなわち上記モデルの立体化学的特性（ねじれ角及び共有結合の幾何配置）の性質の尺度は、−０．５１であった。これらのパラメーターは、本研究における目標を設定するため、すなわちＰ４５０ＢＭ３と融合するヒト２Ｅ１酵素の残基を同定して可溶化を達成するために、現在の２Ｅ１モデルが適切であることを示唆する。上記モデルは現在更に改良が進んでおり、これにより、基質結合特性及び触媒特性に関連する将来の詳細な構造／機能研究が可能になるであろう。
【００６３】
上記野生型Ｐ４５０２Ｅ１のモデルから得られた情報を、アイソザイムについての以前の研究（Ｓｈｉｍｏｊｉら（１９９８）；Ｐｅｒｎｅｃｋｙ（１９９５）；Ｎｅｌｓｏｎ、Ｓｔｒｏｂｅｌ（１９９８）；Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９９８））と共に上記キメラチトクロムＰ４５０、２Ｅ１−ＢＭ３を設計するために用いた。これを基にして、Ｐ４５０ＢＭ３のＮ末端の最初の５４残基（断片Ｉ）、Ｐ４５０２Ｅ１の８１番目の残基からＣ末端までの配列（断片ＩＩ）、及び、Ｐ４５０ＢＭ３のレダクターゼ領域全部（断片ＩＩＩ）を、ＤＮＡレベルで、上記可溶性２Ｅ１−ＢＭ３キメラの作成のために融合させる部分として選択した。この目的のために、親であるＰ４５０のＢＭ３遺伝子及び２Ｅ１遺伝子を、プラスミドｐＴ７ＢＭ３Ｚ及びｐＣＷ２Ｅ１から、表Ｉに記載の適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、図６で説明している方法によって増幅した。
【００６４】
断片Ｉを、上記Ｐ４５０ＢＭ３遺伝子の全配列を含むｐＴ７ＢＭ３プラスミドから分離した。ＢａｍＨＩ制限部位及びＫｐｎＩ制限部位をそれぞれその末端に挿入した。断片ＩＩを上記ヒトＰ４５０２Ｅ１遺伝子の配列を含むｐＣＷ２Ｅ１ベクターから分離し、ＫｐｎＩ制限部位及びＡｖｒＩＩ制限部位をその末端に挿入した。ＫｐｎＩで消化した断片を、あらかじめＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。断片ＩＩＩを、断片Ｉの場合に使用したのと同じｐＴ７ＢＭ３ベクターから分離した。ＡｖｒＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位をその末端に挿入し、ＥｃｏＲＩで消化した断片を、あらかじめＥｃｏＲＶ酵素及びＥｃｏＲＩ酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。
【００６５】
ＰＣＲ法によって増幅した後、３つの断片を、それぞれのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから、設計した制限部位（それぞれ、断片ＩについてＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ、断片ＩＩについてＫｐｎＩ／ＡｖｒＩＩ、断片ＩＩＩについてＡｖｒＩＩ／ＥｃｏＲＩ）を用いて分離した。断片ＩＩ及びＩＩＩの配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに途中で連結した。上記３つの断片を共に含む１３５０塩基対の構造全体を、最終的にｐＴ７ベクターに連結し、大腸菌における誘導発現のためのｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３プラスミドを得た。
【００６６】
上記２Ｅ１−ＢＭ３キメラ２Ｅ１−ＢＭ３／１を、可溶性の形態で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ細胞を用いて発現させることに成功した。発現実験の結果を図６に示す。図６中矢印で示した１１８ｋＤａの２Ｅ１−ＢＭ３の発現をレーン３に示す。上記２Ｅ１−ＢＭ３キメラが細胞溶解物を超遠心した後の可溶性画分（レーン５及び６）に存在し、かつ、不溶性膜画分（レーン７）には存在しないということから、上記タンパク質が確かに可溶性であり、正しいサイズであることが分かる。高温（３７℃）で増殖させると封入体が生成することが分かったため、至適増殖温度は２８℃であることが分かった。清浄にした溶解物を還元するために亜ジチオン酸ナトリウムを添加し、一酸化炭素を添加する際に紫外−可視スペクトルを測定した。その結果を図７に示す。正しく折りたたまれていてかつ活性型のＰ４５０酵素に特有の４５０ｎｍにおける吸光度を、上記２Ｅ１−ＢＭ３キメラを発現している大腸菌細胞由来の清浄にした溶解物について測定した（図７、太線）。４５０ｎｍにおける同程度の吸光度が、上記ＢＭＰ−ＦＬＤキメラが前の段階に記載しているように発現しているポジティブコントロールの実験においても見られた（図７、細線）。また、非形質転換大腸菌細胞溶解物についてのネガティブコントロールの実験においては、同じ実験条件で４５０ｎｍにピークを示さなかった（図７、点線）。これらのことは、大腸菌は内性Ｐ４５０酵素を発現しておらず、かつ、２Ｅ１−ＢＭ３／１キメラが確かに折りたたみ構造の形態かつ活性型の形態で発現している、という公知の事実と一致する。これらの結果により、２Ｅ１−ＢＭ３キメラは、確かに可溶性の形態で大腸菌のサイトゾルにおいて発現しており、かつ、活性型のＰ４５０酵素のフィンガープリントを示すということが示唆される。
【００６７】
（２Ｅ１−ＢＭ３／２）
図１０に示す、酸化形態、還元形態及び一酸化炭素で還元した形態の紫外−可視スペクトルによって正しく理解できるように、上記キメラの２つ目のものは補因子のヘム、ＦＡＤ及びＦＭＮをより容易に含む。濃さがわずかに減少している。４５５〜４８５ｎｍにおける肩状の部分は、フラビンが還元されているため、もはや存在しない。一酸化炭素を気泡注入した後では、ソーレーピークは完全に４４９ｎｍにシフトしている。挿入物において、５００〜６００ｎｍの領域は拡大している。亜ジチオン酸塩による還元後、５３５ｎｍ及び５６８ｎｍにおいてはっきりとしたバンドが確認できる。タンパク質／一酸化炭素複合体の形成後、上記２本のバンドは、５５０ｎｍまでのより広いバンドによって置き換えられる。
【００６８】
最も示唆的なピークは、一酸化炭素によって還元されて複合体になったヘムに対する４５０ｎｍにおける遷移、及び、上記酸化型タンパク質中のＦＡＤ及びＦＭＮに特有の４５５〜４８５ｎｍにおける肩状の部分（上記還元型ＦＡＤ及び還元型ＦＭＮのスペクトルから予想されるように、これらの肩状の部分は上記還元型タンパク質においては消滅している）である。また、図１１のスペクトルの差は、上記キメラがこの基質に容易に結合することを示す。図中、矢印はラウリン酸の濃度を増加させたことによる効果を示す。ラウリン酸存在下における上記２Ｅ１−ＢＭ３／２キメラの酸素消費を試験した結果から、このキメラが分子酸素と活発に反応して、基質を水酸化物に変えるということが分かる。この結果は、１回目のＮＡＤＰＨの添加（７５ｎｍｏｌ）については、毎分２．９ｎｍｏｌの酸素が基質の非存在下で消費され（２２分間で６３ｎｍｏｌの消費）、毎分３．８ｎｍｏｌの酸素が５００ｍＭのラウリン酸の存在下で消費された（１６．５分間で６２ｎｍｏｌの消費）ことを示す。２回目のＮＡＤＰＨの添加（７５ｎｍｏｌ）については、毎分１．４５ｎｍｏｌの酸素が基質の非存在下で消費され（４０分間で５８ｎｍｏｌの消費）、毎分１．８ｎｍｏｌの酸素が５００ｍＭのラウリン酸の存在下で消費された（３３分間で５５ｎｍｏｌの消費）ことを示す。
【００６９】
これらのデータ及び野生型ＢＭ３の公知の構造から、ＦＡＤ及びＦＭＮは、ヘムレダクターゼ部分を含む上記キメラに含まれる一部としてスカフォールド領域に貢献しているＢＭ３に結合していることが想定される。更に、ヘムは２Ｅ１成分に結合しているということが予想される。
【００７０】
＜結論＞
要するに、細菌Ｐ４５０ＢＭ３及びヒト２Ｅ１に対する分子Ｌｅｇｏアプローチの可能性が証明された。非生理学的な２者間の、Ｐ４５０モジュールを含む効果的な電子伝達が首尾よく達成され、その遺伝子融合キメラタンパク質の活性型での発現に成功した。また、ヒトＰ４５０２Ｅ１を可溶化することができ、その還元型は一酸化炭素存在下で、４５０ｎｍにおける特有の、折りたたみ構造のＰ４５０酵素に特徴的な吸収ピークを示した。
【００７１】
この結果は、生物分析分野のための生体−分子ツールの構築へ続く段階を表しており、例えば、将来バイオレメディエーション的、薬理学的及びバイオセンシング的に応用するための人工酸化還元鎖に使用できる新規Ｐ４５０触媒モジュールを提供するものである。
【００７２】
ＢＭ３−ＦＬＤキメラの構築、及び、電極への電子伝達に関連する方法におけるこのキメラの使用の構築に成功したこと、並びに、ＢＭ３スカフォールドを有する活性型可溶性哺乳類ＣＹＰキメラの形成に成功したことから、哺乳類ＣＹＰ由来のヘム領域、ＢＭ３由来のスカフォールド部分、及び、電子を移動させて電極を形成するのに適切な電子伝達部分を含むキメラを構築できることが信じられる。
【００７３】
【表３】
2005527183.tif 000006
【００７４】
＜参照文献＞
Ｂａｒｎｅｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ｐ．Ａｒｌｏｔｔｏ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９９１）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  １７  ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８８：５５９７−５６０１．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．（１９８３）Ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，７０９−７１３．
Ｃｏｓｍｅ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（２０００）．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ５  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ，  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５（４）；２５４５−２５５３．
Ｃｕｐｐｖｉｃｋｅｒｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐ４５０ｅｒｙＦ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（２），１４４−１５３．
Ｄａｒｗｉｓｈ，Ｋ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．（１９９１）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．，４，７０１−７０８．
Ｄｏｒａｙ，Ｂ．，Ｃ．Ｄ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｋｅｍｐｅｒ（１９９９）．“Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｉｎｋｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ２．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１２１８０−１２１８６．
Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｗ．，Ｐ．Ｙ．Ｈａｙｈｕｒｓｔ，Ｔ．Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ，Ｇ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｈａｒｌｏｗ，Ｋ．Ｒｏｗｌａｎｄ−ｙｅｏ；Ｃ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｍａｈｌｉｎｇ，Ｃ．Ｋ．Ｌｉｍ，Ｃ．Ｒ．Ｗｏｌｆ，Ｍ．Ｇ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．Ｓ．Ｌｅｎｎａｒｄ，Ｇ．Ｔ．Ｔｕｃｋｅｒ（２０００）．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｓｅｒｉｎｅ  ３０４  ｉｓ  ｎｏｔ  ａ  ｋｅｙ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｄ６．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３４５：５６５−５７１．
Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｔｓｏｔｓｏｕ，Ｇ．Ｅ．，Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｆａｉｒｈｅａｄ，Ｍ．，Ｇｉａｎｎｉｎｉ，Ｓ．（２００２）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｇｏ：ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃ．１７，１３３−１４５．
Ｇｉｌｌａｍ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．，Ｔ．Ｂａｂａ，Ｂ．Ｒ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｏｈｍｏｒｉ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ（１９９３）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ３Ａ４  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０５（１）：１２３−１３１．
Ｇｉｌｌａｍ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．，Ｒ．Ｍ．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｙ．Ｆ．Ｕｅｎｇ，Ｔ．Ｓｃｈｉｍａｄａ，Ｐ．Ｅ．Ｂ．Ｒｅｉｌｙ，Ｔ．Ｋａｍｔａｋｉ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ（１９９７）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０３Ａ７  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ５’ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｆｏｒｍａｔ  ｗｉｔｈ  ＮＡＤＰＨ−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３４６（１）：８１−９０．
Ｇｉｌｌａｍ  Ｅ．Ｍ．Ｊ．，Ｇｕｏ  Ｚ．，Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ  Ｆ．Ｐ．（１９９４）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１２，５９−６６．
Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｆ．Ｐ．（１９９９）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３９，１−１７．
Ｈａｎｎａ，Ｉ．Ｈ．，Ｊ．Ｒ．Ｒｅｅｄ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｐ．Ｆ．Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（２０００）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｂ６  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３７６（１）：２０６−２１６．
Ｈａｓｅｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｉｓｅｎｏｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９４）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ｔｅｒｐ  ａｔ  ２．３Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３６，１１６９−１１８５．
Ｈａｚｚａｒｄ，Ｊ．Ｔ．，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊ，Ｓ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｔｏｌｌｉｎ，Ｇ．（１９９７）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＦＭＮ  ａｎｄ  ｈａｅｍ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＢＭ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，７９２２−７９２６．
Ｈｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ａ．，Ｈａｇｅｎ，Ｗ．Ｒ．（１９９６）Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ａｔ  ｃａｒｂｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｆｌａｖｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４０４，２４９−２６０．
Ｈｏｓｎｙ，Ｇ．，Ｌ．Ｊ．Ｒｏｍａｎ，Ｍ．Ｈ．Ｍｏｓｔａｆａ，Ｂ．Ｓ．Ｓ．Ｍａｓｔｅｒｓ（１９９９）．“Ｕｎｉｑｕｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ４Ａ５．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３６６（２）：１９９−２０６．
Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９８）ＮＡＤＰＨ−ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｎｄ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，６１０６−６１１３．
Ｋｒｅｙ，Ｇ．Ｄ．，Ｖａｎｉｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｓｗｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．（１９８８）Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１５４３６−１５４４３．
Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９３）ＰＲＯＣＨＥＣＫ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｔｏ  ｃｈｅｃｋ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２６，２８３−２９１．
Ｌｉ，Ｈ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．，（１９９７）Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＢＭ−３  ｈａｅｍ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  ｐｌａｍｉｔｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒ．Ｂｉｏｌ．，４，１４０−１４６．
Ｌｉ，Ｈ．，Ｄａｒｗｉｓｈ，Ｋ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．（１９９１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＢＭ３  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１１９０９−１１９１４．
Ｌｉｃａｄ−Ｃｏｌｅｓ，Ｅ．，Ｋ．ＨＥ，Ｈ．Ｙｉｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｏｒｒｅｉａ（１９９７）．“Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ１１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｐｕｒｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．”  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３３８（１）：３５−４２．
Ｌｉｅｂｅｒ，Ｃ．Ｓ．（１９９７）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１：ｉｔｓ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．７７（２），５１８−５３８．
Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８６）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  １１９，０００−Ｄａｌｔｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（１６），７１６０−７１６９．
Ｎａｒｈｉ，Ｌ．Ｏ．，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８７）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ＢＭ３，  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｎｏｏｘｉｇｅｎａｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２（１４），６６８３−６６９０．
Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｔｒｏｂｅｌ，Ｈ．Ｗ．（１９９８）Ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６３，６０３８−６０５０．
Ｐｅｒｎｅｃｋｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｏｌｋｅｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｂｅｓｔｅｒｖｅｌｔ，Ｌ．Ｌ．，Ｃｏｏｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９５）Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ，  ａｇｇｒｅａｇｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１８（２），４４６−４５６．
Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．（１９９５）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５，７６７−７７４．
Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．，Ｆｉｎｚｅｌ，Ｂ．Ｃ．，Ｈｏｗａｒｄ，Ａ．Ｊ．（１９８６）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｆｒｅｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２５，５３１４−５３２２．
Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｈａｓｅｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．（１９９３）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐ４５０ＢＭ−３，  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１，７３１−７３６．
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｔ．Ｈ．，Ｆ．Ｊｕｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｍ．Ｗｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｒａｕｃｙ，Ｂ．Ｋｅｍｐｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｂｏｒｎｈｅｉｍ，Ｃ．Ｈａｓｓｅｔｔ，Ｃ．Ｊ．Ｏｍｉｅｎｃｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９５）．“Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＆  ｒａｂｂｉｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０’ｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２Ｃ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３２３（１）：８７−９６．
Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｔ．，Ｗｅｎ，Ｌ−Ｐ，Ｆｕｌｃｏ，Ａ．Ｊ．（１９８９）“Ｃｏｄｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，  ５’ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐ４５０  ＢＭ３，  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０：ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１９），１０９８７−１０９９５．
Ｓａｄｅｇｈｉ，．Ｓ．Ｊ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（１９９９）Ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｓ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｐ４５０  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  ｉｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｒｅｄｏｘ  ｃｈａｉｎｓ．Ｉｎ：Ｇｈｉｓｌａ，Ｓ．，Ｋｒｏｎｅｃｋ，Ｐ．，Ｍａｃｈｅｒｏｕｘ，Ｐ．，Ｓｕｎｄ，Ｈ．（Ｅｄｓ．），Ｆｌａｖｉｎｓ  ａｎｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔ．Ｐｕｂｌ．，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐｐ．１６３−１６６．
Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｆａｎｔｕｚｚｉ，Ａ．，Ｖａｌｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２０００ａ）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｒｅｄｏｘ  ｃｈａｉｎｓ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｅｇｏ，Ｆａｒａｄａｙ  Ｄｉｓｃｕｓｓ．，１１６，１３５−１５３．
Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．，Ｖａｌｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｃｕｎｈａ，Ｃ．Ａ．，Ｒｏｍａｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｏａｒｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２０００ｂ）Ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ５５３  ｆｒｏｍ  Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５（６），７３０−７３７．
Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｔｓｏｔｓｏｕ，Ｇ．Ｅ．，Ｆａｉｒｈｅａｄ，Ｍ，，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．Ｔ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２００１）Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎ：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｄｅ  Ｃｕｙｐｅｒ，Ｍ．，Ｂｕｌｔｅ，Ｊ．（Ｅｄｓ），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
Ｓａｇａｒａ，Ｙ．，Ｈ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｍ．Ｒ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９９３）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０Ｃ１７  ｌａｃｋｉｎｇ  ｉｔｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｃｈｏｒ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０６（１）：２７２−２７８．
Ｓａｎｄｈｕ，Ｐ．，Ｔ．Ｂａｂａ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ（１９９３）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０２Ｃ１０（２Ｃ９）ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０６（２）：４４３−４５０．
Ｓａｎｄｈｕ，Ｐ．，Ｚ．Ｇｕｏ，Ｔ．Ｂａｂａ，Ｍ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｈ．Ｔｕｋｅｙ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ（１９９４）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０１Ａ２  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｉｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３０９（１）：１６８−１７７．
Ｓｃｈｉｍａｄａ，Ｔ．，Ｒ．Ｍ．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｉ．Ｈ．Ｈａｎｎａ，Ｔ．Ｒ．Ｓｕｔｔｅｒ，Ｆ．Ｐ．Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｇｉｌｌａｍ（１９９８）．“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０１Ｂ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３５７（１）：１１１−１２０．
Ｓｃｈｕｍｙａｎｔｓｅｎａ，Ｖ．Ｖ．，Ｔ．Ｖ．Ｂｕｌｋｏ，Ｎ．Ｎ．Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ  Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｒ．Ｄ．Ｓｃｈｍｉｄ，Ｔ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ａ．Ｉ．Ａｒｃｈａｋｏｖ（１９９９）．“Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｂ４：ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２６３：６７８−６８０．
Ｓｅｖｒｉｏｕｋｏｖａ，Ｉ．Ｆ．，Ｈａｚｚａｒｄ，Ｊ．Ｔ．，Ｔｏｌｌｉｎ，Ｇ．，Ｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．Ｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  ＦＭＮ  ｔｏ  Ｈｅｍｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ＢＭ−３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（５１），３６０９７−３６１０６．
Ｓｈｉｍｏｊｉ，Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｈ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｌ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｐ．（１９９８）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｐ４５０：ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｃｈｉｍｅｒａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，８８４８−‘５２．
Ｓｏｕｃｅｋ，Ｐ．（１９９９）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ａ６  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３７０（２）：１９０−２００．
Ｓｔｒｏｂｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ．Ｒ．Ｈａｌｐｅｒｔ（１９９７）．“Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０２Ｂ２：Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１１６９７−１１７０６．
Ｓｕｅｙｏｓｈ，Ｔ．，Ｌ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ｒ．Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｖ．Ｊｕｖｏｎｅｎ，Ｍ．Ｎｅｉｇｉｓｈｉ（１９９５）．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｐ４５０  ２ａ−４  ｔｏ  ａ  ｓｔａｂｌｅ，  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３２３（１）：２６５−２７１．
Ｓｚｋｌａｒｚ，Ｇ．Ｄ．，Ｙ．Ａ．ＨＥ，Ｊ．Ｒ．Ｈａｌｐｅｒｔ（１９９５）．“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｂ１．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（１４３１２−１４３２３）．
Ｔｓｏｔｓｏｕ，Ｇ．Ｅ．，Ｃａｓｓ，Ａ．Ｅ．Ｇ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（２００２）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＢＭ３  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１７，１１９−１３０．
Ｕｍｅｎｏ，Ｍ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｗ．，Ｙａｎｇ，．Ｓ．，Ｇｅｌｂｏｉｎ，Ｈ．Ｖ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．Ｊ．（１９８８）“Ｈｕｍａｎ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｐ４５０２Ｅ１：ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ，  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７，９００６−９０１３．
Ｖａｌｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｓａｄｅｇｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｍｅｈａｒｅｎｎａ，Ｙ．，Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｇ．（１９９８）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｄｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ａｓ  ｂｉｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ：ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１３，６７５−６８５．
Ｗａｔｔ，Ｗ．，Ｔｕｌｉｎｓｋｙ，Ａ．，Ｓｗｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｗａｔｅｎｐａｕｇｈ，Ｋ．Ｄ．（１９９１）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｆｌａｖｏｄｏｘｉｎ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｔｈｒｅｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅｓ  ａｔ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１８，１９５−２０８．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．，Ｃｏｓｍｅ，Ｊ．，Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｖ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ｆ．，ＭｃＲｅｅ，Ｄ．Ｅ．（２０００）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５，１２１−１３１．
Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｔ．，Ｊ．Ｓａｄｌｅｉｒ，Ｔ．Ｄｏｗｎｓ，Ｔ．Ｔｒｉａｎｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｍ．Ｊ．Ｈｅａｄｌａｍ，Ｒ．Ｃ．Ｔｕｃｋｅｙ（１９９８）．“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ｓｃｃ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−４６２．”Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３５３（１）：１０９−１１５．
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、Ｐ４５０ＢＭ３を作成して、（Ａ）本発明者らが２００２年８月３日の出願の中で請求しているように、電子伝達タンパク質フラボドキシンとの融合を通じて電気化学的に接近できるＰ４５０触媒領域を形成すること、及び、（Ｂ）ヒト膜結合Ｐ４５０２Ｅ１を、触媒として自給自足できるＰ４５０ＢＭ３の上記スカフォールド領域において選択した部分と融合させることによって、すなわち本発明によって、可溶化すること、を示す。
【図２】図２は、（Ａ）アラキドン酸結合ＢＭＰ（ＢＭＰ−Ｓ）の、すなわち図１ＡのＢＭ３−ＦＬＤキメラの、フラボドキシンセミキノン体（ＦＬＤｓｑ）による、４５０ｎｍにおいてストップフロー分光測定法により測定した、一酸化炭素存在下での還元、及び、（Ｂ）ＦＬＤｓｑとＢＭＰ−Ｓとの間の反応のイオン強度（Ｉ）の平方根に対する限定擬一次速度定数（ｋｌｉｍ）の値、を示す。
【図３】図３は、Ｐ４５０のＢＭＰとＦＬＤとの複合体の３Ｄモデルである。（Ａ）は結合した複合体の側面である。（Ｂ）はＡと同じ方向から見た複合体のリボン図解である。Ｐ４５０ＢＭＰを薄い色で左側に、ＦＬＤを濃い色で右側に、ＦＭＮをＦＬＤの下部を満たす空間に、ヘムをＢＭＰの中央を満たす空間に示す。（Ｃ）は開いた状態の複合体の概観を、Ａと同じ方向から見たものではあるが、±９０度回転させて開くことによって２つのタンパク質間の境界面を見えるように示す。
【図４】図４について、（Ａ）はＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のモデル構造を示すもので、ＢＭＰ領域を薄い色のリボンで、ＦＬＤ領域を濃い色のリボンで、ヘムをＢＭＰ領域の中央を満たす空間に、システイン４００を薄い色でヘム近傍を満たす空間に、ＦＭＮを薄い色でＦＬＤの上部を満たす空間に、ＢＭＰとＦＬＤの間の連結ループをモデルの下部に示す。（Ｂ）は、ＢＭＰの遺伝子とＦＬＤの遺伝子を融合してＢＭＰ−ＦＬＤキメラを作成するための分子生物学的アプローチを示す。
【図５】図５は、ガラス質炭素電極における、ネオマイシンの不在下（１、細線）及び存在下（２、太線）での、ＢＭＰ−ＦＬＤ融合タンパク質のサイクリックボルタモグラムを示す。一酸化炭素を添加した場合に、ピークが高電位に偏移している（３、点線）。電位は飽和カロメル電極に対して記載している。
【図６】図６は、上部にクローニングを示す。２Ｅ１−ＢＭ３のキメラ２Ｅ１−ＢＭ３／１を発現させるための１つ目のプラスミドｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３を構築するのに用いた方法である。図の下部に、２Ｅ１−ＢＭ３キメラの発現を、すなわち２Ｅ１−ＢＭ３キメラの発現を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。矢印は２Ｅ１−ＢＭ３キメラの位置（１１８ｋＤａ）を示す。レーン１及び８は、分子量マーカー（下から）５３、７６、１１６、１７０、２１２ｋＤａを示す。レーン２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ細胞の溶解物を示す。レーン４は、ｐＴ７２Ｅ１／ＢＭ３プラスミドで形質転換し、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｌ細胞（２８℃において２０時間増殖させた細胞）の溶解物を示す。レーン５はレーン３及び４と同じものを示すが、１０，０００ｇで遠心分離して膜画分及び封入体を除去した後のものである。レーン６はレーン３及び４と同じものを示すが、１００，０００ｇで遠心分離した後のものである。レーン７は、１００，０００ｇで遠心分離した後の沈殿物を示す。
【図７】図７は、大腸菌細胞の清浄にした溶解物の、亜ジチオン酸ナトリウムで還元して一酸化炭素を気泡注入した後における吸収スペクトルを示す。点線は形質転換していないもの、細線はＢＭＰ−ＦＬＤプラスミドによって形質転換したもの、太線は１つ目のプラスミド２Ｅ１−ＢＭ３によって形質転換したもの（２Ｅ１−ＢＭ３／１）について示す。
【図８】図８は、実施例中で作成した２種の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／１及び２Ｅ１−ＢＭ３／２）の構造を図示する。
【図９−ａ】図９−ａは、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ、すなわち図８で説明したキメラの作成に用いたクローニングの行程を示す。
【図９−ｂ】図９−ｂは、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ、すなわち図８で説明したキメラの作成に用いたクローニングの行程を示す。
【図９−ｃ】図９−ｃは、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ、すなわち図８で説明したキメラの作成に用いたクローニングの行程を示す。
【図１０】図１０は、ヘム基を酸化形態、還元形態及び一酸化炭素存在下における還元形態で持つ、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／２）の紫外−可視スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラ（２Ｅ１−ＢＭ３／２）のラウリン酸存在下における紫外−可視スペクトルの差を示す。
【図１２】図１２は、２つ目の２Ｅ１−ＢＭ３キメラのラウリン酸存在下における酸素消費量を示す。
【図１３−ａ】図１３−ａは、ヒトＣＹＰ２Ｅ１の、Ｕｍｅｎｏら（１９８８）による、イントロンを含まない配列を示す。
【図１３−ｂ】図１３−ｂは、ヒトＣＹＰ２Ｅ１の、Ｕｍｅｎｏら（１９８８）による、イントロンを含まない配列を示す。
【図１４−ａ】図１４−ａは、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。Ｔ７ＲＮＡφ１０プロモーターから始まるｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造の５’調節領域についても示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。
【図１４−ｂ】図１４−ｂは、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。
【図１４−ｃ】図１４−ｃは、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。また、ヘム領域とレダクターゼ領域との間のＡｒｇ４７１〜Ｌｙｓ４７２の従来の境界についても示す。
【図１４−ｄ】図１４−ｄは、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。また、ＦＭＮ領域とＦＡＤ領域との間のＡｓｐ６５２〜Ｍｅｔ６５３の境界についても示す。
【図１４−ｅ】図１４−ｅは、巨大菌Ｐ４５０ＢＭ３の配列を示す。Ｐ４５０ＢＭ３をコードする部分に加えて、ｐＴ７Ｂｍ３Ｚ構造上のＰ４５０ＢＭ３遺伝子に対するいくつかの５’調節領域（Ｄａｒｗｉｓｈら（１９９１））を図に示す。３，１４７ｂｐからなるオープンリーディングフレームを示す。各塩基トリプレットの上の数字は、初めのＭｅｔを０と数えたアミノ酸の通し番号である（Ｔｈｒは、Ｐ４５０ＢＭ３のＮＨ２末端においてプロテインシークエンスによって検出された最初の残基である（Ｒｕｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９８９））。）。上記配列の右側に、塩基の通し番号を（開始コドンから始まって６０塩基毎に）示す。上記遺伝子に特有の制限部位を、下線を付して、対応する塩基の上に示す。
【図１】
2005527183.tif 000007
【図２】
2005527183.tif 000008
【図３】
2005527183.tif 000009
【図４】
2005527183.tif 000010
【図５】
2005527183.tif 000011
【図６】
2005527183.tif 000012
【図７】
2005527183.tif 000013
【図８】
2005527183.tif 000014
【図９−ａ】
2005527183.tif 000015
【図９−ｂ】
2005527183.tif 000016
【図９−ｃ】
2005527183.tif 000017
【図１０】
2005527183.tif 000018
【図１１】
2005527183.tif 000019
【図１２】
2005527183.tif 000020
【図１３−ａ】
2005527183.tif 000021
【図１３−ｂ】
2005527183.tif 000022
【図１４−ａ】
2005527183.tif 000023
【図１４−ｂ】
2005527183.tif 000024
【図１４−ｃ】
2005527183.tif 000025
【図１４−ｄ】
2005527183.tif 000026
【図１４−ｅ】
2005527183.tif 000027
【配列表】
2005527183000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月17日(2003.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スカフォールド領域及びモノオキシゲナーゼヘム含有領域を含み、前記スカフォールド領域は、電子を前記ヘム含有領域に移動させることができる電子伝達領域を不可欠に含んでいてかつＢＭ３由来であり、前記ヘム含有領域は植物又は動物のＰ４５０酵素に由来する
ことを特徴とする水溶性キメラタンパク質。
【請求項２】
前記電子伝達領域は、好ましくはＢＭ３由来の、フラボタンパク質である
ことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記ヘム含有領域はヒトＰ４５０酵素、好ましくは２Ｅ１に由来する
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ヘム含有領域は野生型Ｐ４５０酵素又はその活性型（モノオキシゲナーゼ）変異体の連続する少なくとも２００残基を含み、このうち２０残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ヘム含有領域は、前記野生型Ｐ４５０酵素のＣ末端を含有する、又は、前記Ｃ末端から５０残基だけ内側から、少なくとも２５０個の、好ましくは少なくとも３００個の残基を含む
ことを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記野生型Ｐ４５０酵素に関して、１０残基だけ、好ましくは５残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする請求項４又は５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記スカフォールド領域が、野生型ＢＭ３タンパク質又はその変異体のＮ末端から少なくとも２５残基、好ましくは少なくとも５０残基を含み、このうち１０残基だけが除去又は変えられている
ことを特徴とする前記いずれかの請求項に記載のタンパク質。
【請求項８】
スカフォールド領域及びモノオキシゲナーゼヘム含有領域を含み、前記スカフォールド領域はＢＭ３由来であり、前記ヘム含有領域は植物又は動物のＰ４５０酵素に由来するキメラタンパク質が、反応混合物中で酸素の存在下に基質と接触しており、前記基質が酸化されて酸化物を生成する
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、電子を前記ヘム含有領域に移動させることができる電子伝達領域を不可欠に更に含み、電子を前記ヘム含有領域に移動させる行程において、前記電子伝達領域がその酸化形態に変えられる
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記電子伝達領域が、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ又は電極からの電子の移動によってその還元形態に戻される
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質が分析対象物であり、前記酸化反応の程度を測定し、これによって前記反応混合物中の分析物の存在又は濃度を決定する
ことを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
電子の移動がＮＡＤ（Ｐ）Ｈからであり、前記酸化反応の程度がＮＡＤ（Ｐ）＋産生を監視することによって決定される
ことを特徴とする請求項１０及び１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酸化反応の程度が酸素消費を監視することによって決定される
ことを特徴とする請求項１０及び１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質を合成するために形質転換された細菌。
【請求項１５】
大腸菌である
ことを特徴とする請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質を発現させることができる遺伝子を含むプラスミド。
【国際調査報告】
2005527183.tif 000028
2005527183.tif 000029
2005527183.tif 000030
2005527183.tif 000031