(57)【要約】治療、診断及び薬理ゲノミクス適用に使用できる、新規ヒトポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に開示されたヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードし；かつ
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列又はその相補体にハイブリダイズする、
ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項３】
該ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ中に存在する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードする、単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１月２４日に提出され、本明細書にその全体が援用される米国仮出願第６０／２６４,０４９号の利益を主張する。
１．序論
本発明は、哺乳動物リパーゼと配列相同性を共有する新規ヒトリパーゼタンパク質をコードする、新規ヒトポリヌクレオチドの発見、同定及び性質決定に関する。本発明は、前記ポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド及びペプチド、コードされるタンパク質及びペプチドに対する抗体、並びに開示された遺伝子を欠失するか又は過剰発現する遺伝的に操作された動物、該タンパク質のアンタゴニスト及びアゴニスト、並びに診断、薬剤スクリーニング、臨床試験モニタリング、疾患又は障害の処置、及び美容又は栄養価のある薬剤への応用に使用できる、開示された遺伝子にコードされるタンパク質の発現又は活性を調節する他の化合物を含む。
２．発明の背景
リパーゼは、体内の分解、成熟及び分泌経路の１部として脂質基質を切断する。リパーゼはとりわけ発生の調節、細胞内プロセスの調節、消化、シグナル伝達及び感染症に関連する。
３．発明の概要
本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド及びこのタンパク質の対応するアミノ酸配列の発見、同定及び性質決定に関する。本明細書に初めて記載される新規ヒトリパーゼ（ＮＨＬ）は、他の動物リパーゼ、特にフォスフォリパーゼＢと構造的相同性を共有する。
【０００２】
本明細書に記載される新規ヒト核酸（ｃＤＮＡ）配列は、長さ１４５８アミノ酸（配列番号２を参照されたい）のタンパク質／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。
【０００３】
本発明はまた、前記ＮＨＬのアゴニスト及びアンタゴニスト（天然ＮＨＬと競合する小型分子、大型分子、変異体ＮＨＬ、又はその一部を含む）、ペプチド、及び抗体、並びに前記ＮＨＬの発現を阻害するのに使用できるヌクレオチド配列（例えばアンチセンス及びリボザイム分子、並びにオープンリーディングフレーム又は制御配列置換構築物）、又は前記ＮＨＬの発現を促進させるのに使用できるヌクレオチド配列（例えば前記ポリヌクレオチドを強力なプロモーター系の制御下に置く発現構築物）、並びにＮＨＬ配列を発現するトランスジェニック動物、又は機能するＮＨＬを発現しない「ノックアウト」（条件的であってもよい）を含む。ノックアウトマウスはいくつかの方法で作製することができ、そのうちの１つは、前記ＮＨＬのうち少なくとも１つについてのネズミ相同体中にジーントラップ変異を含むマウス胚性幹細胞（「ＥＳ細胞」）株の使用を含む。配列番号１〜２に記載されるユニークなＮＨＬ配列を「ノックアウト」することにより特定遺伝子の形質発現を同定する方法、及びこれまで未知であった遺伝子の機能を特定する方法を提供する。さらに、配列番号１〜２に記載されるユニークなＮＨＬ配列が「ノックアウト」されている動物は、以前は免疫系により「自己」とみられており、したがって顕著な抗体反応が誘発されなかった同種タンパク質及びオルソロガスなタンパク質に対する抗体を誘発するユニークな供給源を提供する。この目的のために、前記ＮＨＬのネズミ相同体においてジーントラップされたノックアウトＥＳ細胞が作製されている。
【０００４】
さらに、配列番号１〜２に記載されるユニークなＮＨＬ配列は、タンパク質コード配列の同定及びユニークな遺伝子の特定染色体へのマッピングに有用である。こうした配列は、ゲノム配列のみからバイオインフォマティクスにより推定されるスプライス部位とは全く異なる、実際の、生物学的に証明された、したがって意味のあるエクソンスプライス部位を同定する。本発明の配列は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析用の追加ＤＮＡマーカーとして、及び法医生物学においても有用である。
【０００５】
さらに、本発明はまた、前記ＮＨＬ及び／又はＮＨＬ産物の精製された調製物、あるいはＮＨＬを発現する細胞を利用して、ＮＨＬ発現及び／又はＮＨＬ活性を調節する化合物、すなわちアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する化合物を同定するための方法にも関する。こうした化合物は、生物学的障害又は平衡異常に関連する非常に多様な症状のいずれかの処置用の治療薬としても使用できる。
４．配列表及び図面の説明
配列表は、前記ＮＨＬアミノ酸配列をコードする配列を提供する。
５．発明の詳細な説明
本明細書に初めて記載されるＮＨＬは、ヒト胎児脳、下垂体、脊髄、胸腺、リンパ節、骨髄、前立腺、精巣、甲状腺、副腎、小腸、子宮、胎盤、乳腺、膀胱、頸部、心膜、胎児腎臓、胎児肺及び９週胚細胞で発現し得る新規タンパク質である。
【０００６】
前記ＮＨＬ配列は、ヒトゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＣ０７４０１１）を、ヒト甲状腺及び脳のｍＲＮＡから調製し単離されたｃＤＮＡ（Edge Biosystems、メリーランド州ゲーサーズバーグ）と共に用いて得た。本発明は、配列表に提示されるヌクレオチド、こうしたヌクレオチドを発現する宿主細胞、こうしたヌクレオチドの発現産物、及び：（ａ）前記遺伝子の哺乳動物相同体（具体的に記載されるＮＨＬを含む）をコードするヌクレオチド、及びＮＨＬ産物；（ｂ）機能性ドメインに相当するＮＨＬの１つ以上の部分をコードするヌクレオチド、及びそれらのヌクレオチド配列に特定されるポリペプチド産物（いずれかの活性ドメインの新規領域が含まれるが、これらに限定されない）；（ｃ）前記ＮＨＬの少なくとも１つのドメインの全部又は一部が欠失又は置換した遺伝子工学的に操作した変異体又は天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、及びそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド産物、これらにはシグナル配列の全部又は一部が欠失した可溶性タンパク質及びペプチドが含まれるが、これらに限定されない；（ｄ）別のペプチド又はポリペプチドに融合した、ＮＨＬのコード領域の全部又は一部、あるいはそのドメインの１つ（例えば受容体又はリガンド結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自己結合ドメインなど）を含む、キメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド；又は（ｅ）前記ポリヌクレオチドの治療的又は診断的誘導体、例えば配列表に初めて開示された配列を含むオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡ、又は遺伝子治療用構築物を含む。
【０００７】
上に論じられるように、本発明は：（ａ）配列表に提示されるヒトＤＮＡ配列（及び該配列を含むベクター）を含み、そしてさらに、配列表に提示されるＤＮＡ配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃での洗浄（Ausubel F.M. et al. eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc.，及びJohn Wiley & Sons, Inc., New York, p.2.10.3）という条件下でハイブリダイズし、そして機能的に同等な発現産物をコードする、隣接するＮＨＬオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は配列表に初めて記載される隣接するエクソンスプライス部位をコードするあらゆるヌクレオチド配列を意図する。さらに意図されるのは、配列表に提示されるアミノ酸配列をコードしそして発現するＤＮＡ配列の相補体に、中程度にストリンジェントな条件下、例えば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄（Ausubel et al., 1989、上記）でハイブリダイズし、しかも機能的に同等なＮＨＬ産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列である。ＮＨＬの機能的同等物は、他の種に存在する天然ＮＨＬ、及び天然に存在するか又は操作されている（部位特異的突然変異誘発、遺伝子シャッフリング、例えば、米国特許第５,８３７,４５８号に記載されるような定方向進化による）突然変異ＮＨＬを含む。本発明はまた、開示されたＮＨＬポリヌクレオチド配列の縮重核酸変異体も含む。
【０００８】
さらに意図されるのは、ＮＨＬ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド、又は配列表のヌクレオチド配列の対応する領域と約９９、９５、９０又は約８５パーセント相同若しくは同一であるポリヌクレオチド配列（例えば標準デフォルト設定を用いたＧＣＧ配列解析パッケージを用いた、ＢＬＡＳＴ配列比較解析で測定されるようなもの）にコードされる、その機能的同等物である。
【０００９】
本発明はまた、前記ＮＨＬ遺伝子ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、したがってその相補体である、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含む。こうしたハイブリダイゼーション条件は、上述のように、非常にストリンジェントであっても、又はそれほど非常にストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「ＤＮＡオリゴ体」）である場合、それらの分子は本明細書の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、一般に約１６〜約１００塩基、約２０〜約８０塩基、若しくは約３４〜約４５塩基の長さのもの、又はここに示すサイズの任意の変更又は組み合わせである。それらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの単離、並びにクローニングテンプレート及び配列決定テンプレートの調製などを行うことができる。
【００１０】
あるいは、こうしたＮＨＬオリゴヌクレオチドは、ライブラリーをスクリーニングし、そして（特に、マイクロアレイ又は高処理「チップ」形式を用いて）遺伝子発現パターンを評価するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。さらに、一連の前記ＮＨＬオリゴヌクレオチド配列、又はその相補体を、前記ＮＨＬ配列の全部又は一部を提示するのに使用できる。配列番号１〜２のうち１つ以上の配列の少なくとも一部に初めて開示されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列は、固体支持マトリックス／基板（樹脂、ビーズ、膜、プラスチック、ポリマー、金属又は金属被覆基板、結晶性基板又は多結晶質基板など）と共にハイブリダイゼションプローブとして用いることができる。特に注目されるのは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド又は対応するオリゴペプチド及びポリペプチドの空間的にアドレス可能なアレイ（即ち、遺伝子チップ、マイクロタイタープレートなど）であり、空間的にアドレス可能なアレイ上に存在する少なくとも１つのバイオポリマーは、配列番号１〜２のうち少なくとも１つの配列に初めて開示されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、又はそれらにコードされるアミノ酸配列を含む。バイオポリマーを固体支持マトリックスに付着させる方法又は固体支持マトリックス上で合成する方法、及びその上で結合研究を実施する方法は、とりわけ米国特許第５,７００,６３７号、第５,５５６,７５２号、第５,７４４,３０５号、第４,６３１,２１１号、第５,４４５,９３４号、第５,２５２,７４３号、第４,７１３,３２６号、第５,４２４,１８６号及び第４,６８９,４０５号に開示されており、これらの開示は本明細書にその全体が援用される。
【００１１】
配列番号１〜２に初めて開示された配列を含むアドレス可能なアレイを用いて、遺伝子の時間的且つ組織特異的発現を同定し、性質決定することができる。これらアドレス可能なアレイは、生産技術の限度内ではあるが、所望の特異性を付与するのに十分な長さのオリゴヌクレオチド配列を取り込む。これらプローブの長さは、約８〜約２０００ヌクレオチドの範囲内である。好ましくはプローブは配列番号１〜２に初めて開示された配列由来の６０ヌクレオチドから成り、より好ましくは２５ヌクレオチドから成る。
【００１２】
例えば、一連の前記オリゴヌクレオチド配列又はその相補体をチップ形式で用いて前記配列の全部又は一部を再現することができる。オリゴヌクレオチド、典型的には長さ約１６〜約４０（又はこの範囲内のいかなる整数でもよい）のヌクレオチドは、互いに部分的に重複していてもよく、及び／又は配列は、重複しないオリゴヌクレオチドを用いて提示されてもよい。したがって、前記ポリヌクレオチド配列は、典型的には、各々、本明細書の配列表に初めて開示された、少なくとも長さ約８ヌクレオチドのうち、少なくとも約２又は３の別個のオリゴヌクレオチド配列を含むはずである。こうしたオリゴヌクレオチド配列は、配列表の配列内に存在するいかなるヌクレオチドから始まることもでき、そして前記配列に関して、センス（５’から３’）方向、又はアンチセンス方向、いずれにも進行することができる。
【００１３】
マイクロアレイに基づく解析により広範なパターンの遺伝子活性の発見が可能となり、遺伝子機能の新たな理解を提供し、転写過程及び生物機構についての新規且つ予想外の洞察を生ずる。配列番号１〜２に初めて開示された配列を含むアドレス可能なアレイの使用は、特定経路に伴う転写の変化について詳細な情報を提供し、潜在的に新規成分又は遺伝子機能の同定をもたらして新規表現型としてそれら自体を明らかにする。
【００１４】
配列番号１〜２に初めて開示された配列から成るプローブを用いて薬剤発見のための新規分子標的の同定、選択及び確認をすることもできる。これら非反復配列の使用により、薬剤標的の直接の確認、及び薬剤が意図する標的とは異なる経路を介して調節される遺伝子発現における薬剤依存的変化の認識が可能となる。したがって、これら非反復配列もまた薬剤作用及び毒性を明確にしモニタリングする上で有用である。
【００１５】
有用性の例として、配列番号１〜２に初めて開示された配列をマイクロアレイ又は他のアッセイ形式に用いて、特定の病状を有する患者からの遺伝子材料の採集物をスクリーニングすることができる。配列番号１〜２に初めて開示された配列を用いて、当該技術分野において公知のコンピュータソフトウエアで以前に採集した遺伝子のデータベースと開示配列とを比較することにより、in silicoでこうした調査を実施することもできる。
【００１６】
したがって、配列番号１〜２に初めて開示された配列を、特定の疾患に関連する変異を同定するために、及び診断又は予後アッセイとして用いることができる。
現在記載されている配列はヌクレオチド配列を用いて明確に記載されているが、各配列を、種々の付加的な構造特性のいずれか又はそれらの組合せを用いて独自に記載することができることを認識すべきである。例えば、所定の配列を、その配列の所定の領域内に存在するヌクレオチドの最終的な組成物により、配列番号１〜２に初めて開示された１つ以上の特定のオリゴヌクレオチドの存在と共に記載することができる。あるいは、制限酵素による消化部位の相対的な位置を特定する制限地図、又は種々のパリンドローム配列若しくは他の特定オリゴヌクレオチド配列を用いて所定の配列を構造的に記載することができる。このような制限地図は、典型的には広く有用なコンピュータプログラム（例えば、ウィスコンシン大学ＧＣＧ配列解析パッケージ、SEQUENCHER3.0、Gene Codes Corp.、ミシガン州アナーバーなど）により作られるが、所望により、１つ以上の更なる配列又は開示配列中に存在する１つ以上の制限部位に対する配列の相対位置により記載することができる配列中に存在する１つ以上の不連続のヌクレオチド配列と共に用いることができる。
【００１７】
オリゴヌクレオチドプローブに関しては、非常にストリンジェントな条件は、例えば、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での洗浄を指す。これらの核酸分子は、例えばＮＨＬ遺伝子制御に有用なＮＨＬ遺伝子アンチセンス分子をコードしていてもよく、又はアンチセンス分子として作用してもよく、及び／又はＮＨＬ遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして作用してもよい。ＮＨＬ遺伝子制御に関しては、生物学的機能を制御するのにこうした技術を使用できる。さらに、こうした配列は、やはりＮＨＬ遺伝子制御に有用であるリボザイム及び／又は三重らせん配列の一部として使用できる。
【００１８】
阻害アンチセンス又は二本鎖オリゴヌクレオチドは、さらに、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２,６−ジアミノプリンを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群より選択される、少なくとも１つの修飾糖部分も含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール、又はそれらの類似体を含むが、これらに限定されない群より選択される、少なくとも１つの修飾ホスフェート骨格を含むであろう。
【００２１】
さらに別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、該ハイブリッドでは、通常のβ−単位とは対照的に、鎖は互いに平行に走る（Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641）。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330）である。あるいは、二本鎖ＲＮＡを用い、標的ＮＨＬの発現及び機能を崩壊させることができる。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知の標準的な方法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（例えばBiosearch、Applied Biosystemsなどから市販のもの）の使用によって合成できる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al.（1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209）の方法によって合成でき、そしてメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体の使用（Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451）などによって調製できる。
【００２３】
低ストリンジェント条件は、当業者に周知であり、そして予測可能であるように、ライブラリー及び標識配列が由来する特定の生物に応じて異なるであろう。こうした条件に関する手引きには、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual（及びその定期的な改訂版）， Cold Spring Harbor Press, N.Y.；及びAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。
【００２４】
あるいは、適切に標識されたＮＨＬヌクレオチドプローブを用いて、適切にストリンジェントな条件を用い、又はＰＣＲによって、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定及び性質決定は、多型（ヌクレオチド反復、マイクロサテライト対立遺伝子、一ヌクレオチド多型、又はコード一ヌクレオチド多型を含むが、これらに限定されるわけではない）を同定し、既定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造を決定し、そして診断試験を計画するのに役立つ。例えば、ヒト遺伝子のイントロン／エクソン境界に隣接する領域由来の配列を用いて、エクソン、イントロン、スプライシング部位（例えばスプライシングアクセプター及び／又はドナー部位）などの内部での突然変異を検出する増幅アッセイで用いるためのプライマーを設計することができ、診断法及び薬理ゲノミクスに使用できる。
【００２５】
例えば、本発明の配列は、特定の個人を同定するための制限断片長多型（ＲＦＬＰ）解析に用いることができる。この技術では、個人のゲノムＤＮＡは１種以上の制限酵素で消化され、サザンブロットで探索されて、（本明細書に援用される米国特許第５,２７２,０５７号に一般に記載されているように）同定用のユニークなバンドを生ずる。更に、本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定遺伝子座を標的とするポリヌクレオチド試薬、例えばＰＣＲプライマーの提供に用いることができ、例えばもう１つの「同定マーカー」（即ち特定の個人に独特のもう１つのＤＮＡ配列）を提供することによりＤＮＡに基づく法医同定の信頼性を高めることができる。実際の塩基配列情報は、制限酵素が産生する断片により形成されるパターンの正確な代替物として同定に用いることができる。
【００２６】
さらに、本明細書に開示されたＮＨＬ産物内のアミノ酸配列に基づいて設計された、２つの縮重又は「ゆらぎ」オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを実行することにより、目的の生物由来の核酸からＮＨＬ相同体を単離できる。反応のためのテンプレートは、ＮＨＬ遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られる、又は発現すると推測される、ヒト又は非ヒト細胞株又は組織から調製された、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び／又はｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡであってもよい。ＰＣＲ産物は、サブクローニングし、配列決定をして、増幅された配列が所望のＮＨＬ遺伝子の配列を表すことを確実にすることができる。その後、ＰＣＲ断片を用いて、多様な方法によって、全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用できる。あるいは、標識断片を用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングを介し、ゲノムクローンを単離することができる。
【００２７】
ＰＣＲ技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに使用できる。例えば、ＲＮＡは、標準的な方法にしたがい、適切な細胞又は組織供給源（すなわち、ＮＨＬ遺伝子を発現することが知られる、又は発現すると推測されるもの、例えば精巣組織）から単離できる。逆転写（ＲＴ）反応は、第一鎖合成のプライミングのための、増幅断片の５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡに対して行うことが可能である。その後、生じたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いて「テール化」し、ハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化し、そしてその後、第二鎖合成を相補的プライマーでプライミングすることができる。このように、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列を単離することが可能である。使用できるクローニング戦略の概説には、例えばSambrook et al.,1989、上記を参照されたい。
【００２８】
突然変異体ＮＨＬ配列をコードするｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲを用いることによって単離することが可能である。この場合、第一のｃＤＮＡ鎖は、突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子を有すると推定される個体において、発現されることが知られる又は発現されることが推測される組織から単離されたｍＲＮＡに、オリゴｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そして逆転写酵素で新規鎖を伸長させることによって、合成することが可能である。その後、ｃＤＮＡの第二鎖は、正常配列の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成する。これらの２つのプライマーを用い、その後、ＰＣＲを介して産物を増幅し、所望により、適切なベクターにクローニングし、そして当業者に周知の方法を通してＤＮＡ配列解析に供する。突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子のＤＮＡ配列を、対応する正常ＮＨＬ対立遺伝子と比較することによって、突然変異体ＮＨＬ遺伝子産物の機能の損失又は改変に関与する、単数又は複数の突然変異を確かめることが可能である。
【００２９】
あるいは、突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子を有すると推測される、又は有することが知られる個体（例えば、肥満、高血圧、結合組織異常、不妊などのＮＨＬ関連表現型を発現している個人）から得たＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリーを構築することができ、あるいは突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子を発現することが知られる、又は発現すると推測される組織由来のＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。その後、正常ＮＨＬ遺伝子、又はいかなるものでもよい適切なその断片を標識して、こうしたライブラリーにおいて、対応する突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子を同定するプローブとして用いることもできる。その後、突然変異体ＮＨＬ配列を含むクローンを精製して、当業者に周知の方法にしたがい配列解析に供することができる。
【００３０】
さらに、例えば、突然変異体ＮＨＬ対立遺伝子を有すると推測される、又は有することが知られる個体における、こうした突然変異対立遺伝子を発現することが知られる、又は発現すると推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築することができる。この方式では、推定上の突然変異組織によって作製される遺伝子産物を発現させ、そして以下に記載されるように、正常ＮＨＬ産物に対して作製された抗体と組み合わせた標準的抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングすることが可能である。スクリーニング技術に関しては、例えば、Harlow E. and Lane, eds.， 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。
【００３１】
さらに、スクリーニングは、例えばアルカリホスファターゼ−ＮＨＬ融合タンパク質又はＮＨＬ−アルカリホスファターゼ融合タンパク質などの標識ＮＨＬ融合タンパク質でスクリーニングすることにより達成することができる。ＮＨＬ突然変異が、（例えばミスセンス又はフレームシフト突然変異の結果として）改変された機能を有する発現産物を生じる場合、ＮＨＬに対するポリクローナル抗体は、対応する突然変異体ＮＨＬ発現産物と交差反応する可能性がある。こうした標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンは、当該技術分野に周知の方法にしたがって精製し、そして配列解析に供することができる。
【００３２】
本発明はまた、（ａ）前述のＮＨＬコード配列及び／又はその相補体（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現を指示する制御配列と機能的に結合した前述のＮＨＬコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（例えば、本明細書に援用する米国特許第５,８６９,３３６号に記載されるようなバキュロウイルス）；（ｃ）宿主細胞において、コード配列の発現を指示する制御配列と機能的に結合した前述のＮＨＬコード配列のいずれかを含む、遺伝的に操作された宿主細胞；及び（ｄ）外因的に導入された制御配列の制御下に内因性ＮＨＬ配列を発現する（すなわち遺伝子活性化）遺伝的に操作された宿主細胞、を含む。本明細書において、制御配列には、誘導性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び発現をドライブし、制御することが当業者に公知の他の配列が含まれるが、これらに限定されるわけではない。こうした制御配列には、サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極初期遺伝子、制御可能ウイルス配列（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター）、ＳＶ４０アデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α−接合因子のプロモーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
本発明はまた、抗体及び抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ断片を含む）、ＮＨＬのアンタゴニスト及びアゴニスト、並びにＮＨＬ配列の発現を阻害する化合物若しくはヌクレオチド構築物（転写因子阻害剤、アンチセンス及びリボザイム分子、又はオープンリーディングフレーム配列若しくは制御配列置換構築物）、又はＮＨＬの発現を促進させる化合物若しくはヌクレオチド構築物（例えばＮＨＬコード配列が、プロモーター、プロモーター／エンハンサーなどの発現調節配列と機能的に結合した発現構築物）を含む。
【００３４】
あるいは、ＮＨＬをコードする遺伝子は、ＮＨＬの発現を直接的若しくは間接的に活性化する転写因子を提供すること又は過剰発現させることにより活性化され得る（例えば、本明細書に援用される米国特許出願第０９／２２９,００７号を参照されたい）。
【００３５】
本発明はまた、抗体及び抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ断片を含む）、ＮＨＬのアンタゴニスト及びアゴニスト、並びにＮＨＬ遺伝子の発現を阻害する化合物若しくはヌクレオチド構築物（転写因子阻害剤、アンチセンス及びリボザイム分子、又は遺伝子若しくは制御配列置換構築物）、又はＮＨＬの発現を促進させる化合物若しくはヌクレオチド構築物（例えばＮＨＬコード配列が、プロモーター、プロモーター／エンハンサーなどの発現調節配列と機能的に結合した発現構築物）を含む。
【００３６】
ＮＨＬ又はＮＨＬペプチド、ＮＨＬ融合タンパク質、ＮＨＬヌクレオチド配列、抗体、アンタゴニスト及びアゴニストは、疾患の診断のため、突然変異体ＮＨＬ又は不適切に発現されたＮＨＬを検出するのに有用である可能性がある。ＮＨＬタンパク質又はペプチド、ＮＨＬ融合タンパク質、ＮＨＬヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、並びに遺伝的に操作された細胞及び動物は、体内でＮＨＬの正常機能を混乱させる症候的発現又は表現型発現の処置に効果的な薬剤のスクリーニング（又はコンビナトリアルライブラリーの高処理スクリーニング）に使用できる。操作された宿主細胞及び／又は動物の使用は、こうした系がＮＨＬの内因性受容体に結合する化合物を同定できるだけでなく、ＮＨＬ介在活性又は経路を誘発する化合物もまた同定できるという点で有利である。
【００３７】
最後に、ＮＨＬ産物は、治療剤として用いることが可能である。例えば、ＮＨＬに相当するＮＨＬペプチド／ドメインのような可溶性誘導体、ＮＨＬ融合タンパク質産物（特に、ＮＨＬ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＬ、又はＮＨＬのドメインの融合体）、ＮＨＬ抗体及び抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂ断片を含む）、アンタゴニスト又はアゴニスト（ＮＨＬ介在経路中の下流標的を調節する又は該標的に作用する化合物を含む）を用い、疾患又は障害を直接処置することが可能である。例えば、有効量の可溶性ＮＨＬ、又はＮＨＬ−ＩｇＦｃ融合タンパク質又はＮＨＬを模倣する抗イディオタイプ抗体（又はそのＦａｂ）の投与は、内因性ＮＨＬ受容体を活性化するか、又は効果的に中和することができる。こうしたＮＨＬ産物をコードするヌクレオチド構築物を用いて、宿主細胞がこうした産物をin vivoで発現するように遺伝的に操作することができ；これらの遺伝的に操作された細胞は、体内で「バイオリアクター」として機能し、ＮＨＬ、ＮＨＬペプチド、又はＮＨＬ融合タンパク質を、連続した供給で、体に搬送する。機能するＮＨＬ、突然変異体ＮＨＬ、並びにアンチセンス及びリボザイム分子をコードするヌクレオチド構築物はまた、ＮＨＬ発現を調節するための「遺伝子治療」アプローチに使用することもできる。したがって、本発明はまた、生物学的障害を処置するための医薬製剤及び方法も含む。
【００３８】
本発明の多様な態様は、以下のサブセクションにより詳細に記載される。
５．１．ＮＨＬ配列
前記ＮＨＬのｃＤＮＡ配列（配列番号１）及び対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）を配列表に示す。ＮＨＬ ＯＲＦをコードするエクソンは見かけ上ヒト２番染色体上に存在するようである。したがって、前記配列はヒトゲノムのコード領域、特に２番染色体のマッピングに有用である。
【００３９】
Ｃ／Ｔ多型が、配列番号１の３９５３位のヌクレオチドで表される配列領域に同定された。この多型は配列番号２の対応する１３１８位のアミノ酸にＡｌａ又はＶａｌをもたらし得る。
【００４０】
前記新規ヒトポリヌクレオチド配列は、数ある中で、例えばポリヌクレオチドシャッフリング又は関連する方法論を用いた、前記新規配列により少なくとも部分的にコードされるタンパク質の分子突然変異誘発／進化に使用することができる。こうしたアプローチは、本明細書にその全体が援用される米国特許第５,８３０,７２１号及び第５,８３７,４５８号に記載されている。
【００４１】
ＮＨＬ遺伝子産物は、トランスジェニック動物においても発現され得る。ミミズ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、トリ、ヤギ、及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル及びチンパンジーを含むがこれらに限定されない任意の種の動物を用いてＮＨＬトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４２】
当該技術分野に公知の任意の技術を用いて動物にＮＨＬトランスジーンを導入し、トランスジェニック動物のファウンダー株を作製することができる。こうした技術は前核マイクロインジェクション（Hoppe, P.C.及びWagner, T.E.、1989、米国特許第４,８７３,１９１号）；レトロウイルスが介在する生殖細胞系へのジーントランスファー（Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152）；胚性幹細胞のジーンターゲティング（Thompson et al., 1989, Cell 56: 313-321）；胚のエレクトロポレーション（Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803-1814）；及び精子が介在するジーントランスファー（Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717-723）などを含むが、これらに限定されるものではない。これらの技術の概観として、本明細書にその全体が援用される、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229を参照されたい。
【００４３】
本発明は、ＮＨＬトランスジーンをその細胞全部に有するトランスジェニック動物、及びトランスジーンを全部ではないがある種の細胞に有する動物、即ちモザイク動物又は体細胞トランスジェニック動物を提供する。トランスジーンは単一トランスジーンとして統合されるか又はコンカテマー、例えば頭部同士のタンデム型で又は頭部と尾部のタンデム型で統合され得る。トランスジーンは、例えばLasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236の教示に従うことにより、特定細胞種に選択的に導入してそれを活性化することもできる。こうした細胞種特異的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定細胞種に依存し、当業者には明らかであろう。
【００４４】
ＮＨＬトランスジーンが内在性ＮＨＬ遺伝子の染色体部位に統合されることが所望される場合は、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡潔に言えば、こうした技術が利用される場合、染色体配列の相同組換えを介した内在性ＮＨＬ遺伝子のヌクレオチド配列への統合及びその機能の破壊のために、内在性ＮＨＬ遺伝子と相同性のある、ある種のヌクレオチド配列を含むベクターが設計される（即ち「ノックアウト」動物）。
【００４５】
例えばGu et al., 1994, Science, 265: 103-106の教示に従うことにより、トランスジーンを特定細胞種に選択的に導入し、それによりその細胞種においてのみ内在性ＮＨＬ遺伝子を不活性化することができる。こうした細胞種特異的な不活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定細胞種に依存し、当業者には明らかであろう。
【００４６】
一度トランスジェニック動物が作製されれば、組換えＮＨＬ遺伝子の発現は、標準技術を用いてアッセイすることができる。最初のスクリーニングは、サザンブロット解析又はＰＣＲ技術によりなされ、動物組織を解析してトランスジーンの統合が起こっているか否かをアッセイすることができる。動物から得た組織サンプルのノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション解析及びＲＴ−ＰＣＲを含むがこれらに限定されない技術を用いて、トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルを評価することもできる。ＮＨＬ遺伝子発現組織のサンプルは、ＮＨＬトランスジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。
【００４７】
本発明は「ノックイン」動物を提供する。ノックイン動物とは、ゲノム中に自然には存在しない異種遺伝子又はコード配列をゲノムに取り込むよう遺伝子操作されている動物である。例えば、ヒト遺伝子を用いてマウス中のネズミオルソログを置換する場合をいう。このようなノックイン動物は、とりわけヒト薬剤標的のin vivo研究、試験及び評価、並びに同時に制御される化合物に有用である。
【００４８】
５．２．ＮＨＬ及びＮＨＬポリペプチド
ＮＨＬ、ＮＨＬポリペプチド、ＮＨＬペプチド断片、ＮＨＬの突然変異体、短鎖型又は欠失型、及び／又はＮＨＬ融合タンパク質を、多様な使用のために調製することができる。これらの使用には、抗体の生成、治療薬としての使用（炎症、増殖異常、感染症、凝固障害、がんなどの治療用）、診断アッセイの試薬としての使用、ＮＨＬに関連する他の細胞内遺伝子産物の同定、精神的、生物学的又は医学的障害及び疾患の治療処置に有用な医薬的試薬として使用できる化合物に関してスクリーニングするためのアッセイ試薬としての使用が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４９】
とりわけその医学的重要性により、前記ＮＨＬと同様の機能を有するリパーゼは、本明細書にその全体が援用され、さらに前記ＮＨＬにも適用可能なさまざまな用途を記載する、米国特許第５,８５８,７５５号、第５,７３１,２８０号、第６,１５６,５５２号、６,３２６,１８２号、第６,３３７,１８７号に例示されるように、他者により研究されている。
【００５０】
配列表は、前記ＮＨＬポリヌクレオチドにコードされるアミノ酸配列を開示する。ＮＨＬをコードするＯＲＦは、ＤＮＡ配列背景において翻訳開始部位と一致するイニシエーターメチオニンを、及び前記ＮＨＬが膜結合タンパク質（又はおそらく分泌タンパク質）であることを示すデータと一致するシグナル配列を示す。典型的には、このようなシグナル配列は、膜タンパク質又は分泌タンパク質の成熟型から切断又はプロセッシングされる。
【００５１】
本発明のＮＨＬアミノ酸配列は、配列表に提示されるアミノ酸配列、並びにその類似体及び誘導体を含む。さらに、他の種由来の対応するＮＨＬ相同体が本発明に含まれる。実際、上述のＮＨＬヌクレオチド配列にコードされるいかなるＮＨＬも本発明の範囲内であり、配列表に提示されるアミノ酸配列のすべて又はいずれかの新規部分をコードする、いかなる新規ポリヌクレオチド配列も同様である。遺伝暗号の縮重性が周知であり、したがって、配列表に提示される各アミノ酸は、該アミノ酸をコードすることが可能な周知の核酸「トリプレット」コドン、又は多くの場合、コドン類の一般的代表例である。こうしたものとして、本明細書において意図されるように、配列表に提示されるアミノ酸配列は、遺伝暗号と併せて考えた場合（例えば、本明細書に援用する“Molecular Cell Biology”, 1986, J. Darnell et al. eds.， Scientific American Books, New York, NYの第１０９頁の表４−１を参照されたい）、こうしたアミノ酸配列をコードすることが可能な核酸配列の多様な順列及び組み合わせのすべてのうちの一般的代表例である。
【００５２】
本発明はまた、いくつかの規準のうちのいずれかにより判断して、本明細書に記載されるヌクレオチド配列にコードされるＮＨＬと機能的に同等であるタンパク質も包含し、これらの規準はＮＨＬの基質に結合し切断する能力、あるいは同一の又は相補的下流経路を達成する能力、あるいは細胞内代謝（例えばタンパク質分解活性、イオン流動、チロシンリン酸化など）の変化を含むが、これらに限定されるわけではない。こうした機能的に同等なＮＨＬタンパク質は、上述のＮＨＬヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加物又は置換物であるが、サイレント変化を生じ、したがって、機能的に同等な発現産物を産生するものを含むが、これらに限定されるわけではない。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ；そして陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。
【００５３】
多様な宿主発現ベクター系を用いて、本発明のＮＨＬヌクレオチド配列を発現させることが可能である。本発明の例におけるように、ＮＨＬペプチド若しくはポリペプチドが可溶性又は分泌型分子と考えられる場合、ペプチド又はポリペプチドを培地から回収することが可能である。こうした発現系はまた、ＮＨＬ又は機能的同等物をin situで発現する、操作された宿主細胞も含む。こうした発現系からのＮＨＬの精製又は濃縮は、適切な界面活性剤及び脂質ミセル、並びに当業者に周知の方法を用いて達成することが可能である。しかしながら、こうした操作された宿主細胞自体は、ＮＨＬの構造的機能的特性を保持するだけでなく、生物学的活性を評価することが重要である状況、例えばある種の薬剤スクリーニングアッセイで用いることが可能である。
【００５４】
本発明の目的のため使用できる発現系には、ＮＨＬヌクレオチド配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌）などの微生物；ＮＨＬヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス属、ピヒア属）；ＮＨＬヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＮＨＬヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、又は組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいはＮＨＬヌクレオチド配列及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
細菌系において、発現されるＮＨＬ産物に意図される使用に応じ、いくつかの発現ベクターを好適に選択することが可能である。例えば、ＮＨＬの医薬組成物又はＮＨＬを含む医薬組成物の生成のために、あるいはＮＨＬに対する抗体を作製するために、多量のこうしたタンパク質を産生しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいことがある。こうしたベクターには、融合タンパク質が産生されるように、ＮＨＬコード配列を、個々に、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター内に連結することが可能である、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509）などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。ｐＧＥＸベクター（Pharmacia又はAmerican Type Culture Collection）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、異種ポリペプチドを発現するのに使用できる。一般的に、こうした融合タンパク質は可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解された細胞から容易に精製することが可能である。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的発現産物が、ＧＳＴ部分から遊離できるように、トロンビン又はＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよう設計されている。
【００５６】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種ポリヌクレオチド配列を発現するのにベクターとして用いられる。該ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞内で増殖する。ＮＨＬコード配列は、個々に、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことが可能である。ＮＨＬコード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化及び非閉塞性組換えウイルス（すなわちポリヘドリン遺伝子にコードされるタンパク質性コートを欠失するウイルス）の産生が生じるであろう。これらの組換えウイルスを、その後、スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させるのに用い、該細胞において、挿入配列が発現される（例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith、米国特許第４,２１５,０５１号を参照されたい）。
【００５７】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のＮＨＬヌクレオチド配列は、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター及び三分割（tripartite）リーダー配列に連結することができる。その後、このキメラ配列を、in vitro又はin vivo組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１又はＥ３領域）における挿入は、生存可能であり、そして感染した宿主においてＮＨＬ産物を発現することが可能な組換えウイルスを生じるであろう（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659を参照されたい）。特定の開始シグナルもまた、挿入されたＮＨＬヌクレオチド配列の効率的な翻訳に必要とされる可能性がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が含まれる。それ自体の開始コドン及び隣接配列を含む、全ＮＨＬ遺伝子又はｃＤＮＡが、適切な発現ベクターに挿入される場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要とされない可能性がある。しかしながら、ＮＨＬコード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む、外因性翻訳調節シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするため、所望のコード配列のリーディングフレームと位相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、多様な起源のものでもよく、天然でも合成でもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー配列、転写ターミネーターなどを含むことによって、促進させることが可能である（Bitter et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544を参照されたい）。
【００５８】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、又は特定の望ましい方式で発現産物を修飾し、そしてプロセシングする、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこうした修飾（例えば糖鎖形成）及びプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能に重要である可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質及び発現産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的且つ特異的な機構を有する。適切な細胞株又は宿主系を選択し、発現される異質のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にすることができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、糖鎖形成及び発現産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用できる。こうした哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８及び特にヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
組換えタンパク質の長期の高収率産生のため、安定な発現が好ましい。例えば、上述のＮＨＬ配列を安定して発現する細胞株を設計することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりむしろ、適切な発現調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡ、及び選択可能マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。異種ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、栄養強化培地中で１〜２日間増殖させ、その後選択培地に移すことができる。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が染色体にプラスミドを安定して組み込み、そして増殖巣を形成するまで増殖することを可能にする。続いて該増殖巣をクローニングし、そして細胞株へと発展させることができる。この方法は、ＮＨＬ産物を発現する細胞株を操作するのに、好適に用いることが可能である。こうした操作細胞株は、ＮＨＬ産物の内因性活性に影響を与える化合物をスクリーニングし、評価するのに、特に有用である可能性がある。
【００６０】
いくつかの選択系を用いてもよく、選択系には単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22: 817）遺伝子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの選択系はそれぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-又はａｐｒｔ-細胞で使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性を、以下の遺伝子：メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；アミノ配糖体Ｇ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)に関する選択の基礎として使用することができる。
【００６１】
あるいは、いかなる融合タンパク質も、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによって、容易に精製することが可能である。例えば、Janknecht et al.により記載される系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976）。この系では、配列のオープンリーディングフレームが、翻訳された際に、６つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグに融合するように、目的の配列をワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物を、Ｎｉ2+・ニトリロ酢酸−アガロースカラム上に装填し、ヒスチジンタグ化タンパク質を、イミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
【００６２】
また、本発明に含まれるのは、ＮＨＬを標的器官に向け、及び／又は細胞膜を通る細胞質ゾルへの輸送を促進させる融合タンパク質である。ＮＨＬを抗体分子又はそのＦａｂ断片に結合させることにより、特定のエピトープを有する細胞を標的とするために用いることができる。適切なシグナル配列をＮＨＬに付着させてもＮＨＬは細胞内の所望の位置に輸送される。あるいは、ＮＨＬ又はその核酸配列のターゲティングはリポソーム又は脂質複合体に基づく送達システムを用いて達成される。このような技術は"Liposomes: A Practical Approach", New, R.R.C. ed., Oxford University Press, New York並びに米国特許第４,５９４,５９５号、第５,４５９,１２７号、第５,９４８,７６７号及び第６,１１０,４９０号に記載されており、それぞれの開示は本明細書にその全体が援用される。さらに包含されるのは新規タンパク質構築物であり、それらは標的部位又は所望の器官へのＮＨＬの輸送を促進させような方法で遺伝子操作されている。該タンパク質構築物は、標的部位又は所望の器官で、ＮＨＬが機能活性を発現し得る細胞膜及び／又は核を通る。この目的は、ＮＨＬを、ターゲティング特異性を提供するサイトカイン又は他のリガンドに、及び／又は細胞膜の通過を促進させるためにタンパク質形質導入ドメイン（これら形質導入配列の例として本明細書に援用される、米国特許出願第６０／１１１,７０１号及び第６０／０５６,７１３号を通常参照されたい。）にカップリングさせることにより達成することができる。また、随意、核局在を含むように遺伝子操作することもできる。
【００６３】
５．３．ＮＨＬ産物に対する抗体
ＮＨＬの１つ以上のエピトープ、又はＮＨＬの保存された変異体のエピトープ、又はＮＨＬのペプチド断片を特異的に認識する抗体もまた、本発明に含まれる。こうした抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
本発明の抗体は、例えば、生物学的試料におけるＮＨＬの検出に使用でき、したがって、診断又は予後技術の一部として利用でき、それにより異常な量のＮＨＬに関して患者を調べることができる。こうした抗体はまた、例えば、化合物スクリーニング計画と組み合わせて、ＮＨＬ発現産物の発現及び／又は活性に対する試験化合物の影響を評価するのに利用できる。さらに、こうした抗体は、遺伝子治療と組み合わせて、例えば、患者への導入前に、正常及び／又は操作ＮＨＬ発現細胞を評価するのに使用できる。こうした抗体は、さらに、異常なＮＨＬ活性を阻害するための方法として使用できる。したがって、こうした抗体は、処置法の一部として利用できる。
【００６５】
抗体の産生のため、多様な宿主動物を、ＮＨＬ、ＮＨＬペプチド（例えばＮＨＬの機能ドメインに相当するもの）、短鎖型ＮＨＬポリペプチド（１つ以上のドメインが欠失しているＮＨＬ）、ＮＨＬの機能的同等物又はＮＨＬの突然変異体の注入により免疫することができる。こうした宿主動物には、いくつかのみを挙げると、ブタ、ウサギ、マウス、ヤギ及びラットが含まれるが、これらに限定されるわけではない。宿主種に応じ、多様なアジュバントを用いて免疫応答を増加させることができる。アジュバントには、フロイントのアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどの無機塩、キトサン、リゾレシチン、プルロニックポリオール（pluronic polyol）などの界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、並びにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、キーホールリンペットヘモシアニン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、オボアルブミン、コレラ毒素又はそれらの断片などの分子と組み合わせて、及び／又はカップリングすることによって、免疫反応を促進させることが可能である。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清由来の抗体分子の不均一な集団である。
【００６６】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、連続して培養される細胞株による抗体分子の産生を提供するいかなる技術によっても得ることができる。これらには、Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ技術（1975, Nature 256: 495-497；及び米国特許第４,３７６,１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72； Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれらのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、in vitro又はin vivoで培養することができる。in vivoでｍＡｂが高力価で産生されるため、この方法は現在好ましい産生法である。
【００６７】
さらに、適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のため開発された技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454）を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が、異なる動物種に由来する分子、例えばネズミｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子である。こうした技術は、本明細書にその全体を援用する、米国特許第６,０７５,１８１号及び第５,８７７,３９７号、並びにそれらのそれぞれの開示に記載される。また、本明細書に含まれるのは、本明細書にその全体を援用する米国特許第６,１５０,５８４号及びその開示に記載されるように、完全にヒト化したモノクローナル抗体の使用である。
【００６８】
あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載される技術（米国特許第４,９４６,７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883;及びWard et al., 1989, Nature 341: 544-546）を適用して、ＮＨＬ発現産物に対する一本鎖抗体を産生することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖断片を連結し、一本鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。
【００６９】
特定のエピトープを認識する抗体断片を、既知の技術によって生成することができる。例えば、こうした断片には：抗体分子のペプシン消化によって産生することが可能であるＦ（ａｂ’）2断片、及びＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することが可能であるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にすることができる。
【００７０】
ＮＨＬに対する抗体は、続いて、当業者に周知の技術を用いて、既定のＮＨＬを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成するのに利用できる（例えばGreenspan & Bona, 1993, FASEB J 7(5): 437-444;及びNissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429-2438を参照されたい）。例えば、ＮＨＬドメインに結合し、コグネイト受容体へのＮＨＬの結合を競合的に阻害する抗体を用いて、ＮＨＬを「模倣する」、したがって、受容体に結合し、及び活性化し又は中和する抗イディオタイプ抗体を生成することができる。こうした抗イディオタイプ抗体又はこうした抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片は、ＮＨＬシグナル伝達経路に関与する治療措置で使用できる。
【００７１】
さらに、哺乳動物ＮＨＬが高度に関連していれば、前記ノックアウトマウス（ＮＨＬが全くみられず、したがってＮＨＬに対して全く寛容化されていない）はユニークな有用性を有する。開示された哺乳動物ＮＨＬに対する抗体の産生に有利に適用できるからである（即ち、ＮＨＬはＮＨＬノックアウト動物において免疫原性であろう）。
【００７２】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様による範囲に限定されるものではなく、この範囲は本発明の個々の態様の単なる例示として示したにすぎないのであって、機能的に同等の方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際、当業者には、前述の説明から、本明細書に示されそして記載されるものの他に、本発明の多様な改変も明らかになるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に含まれるものと意図される。すべての引用される刊行物、特許、及び特許出願の全体を、本明細書に援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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