(57)【要約】本発明は、哺乳動物細胞を培養する培地および方法であって、それによって細胞に産生されるタンパク質のシアル酸付加が増加する、前記培地および方法を提供する。培地は、Ｎ−アセチルマンノサミン、および所望によりガラクトースを含有することも可能である。培地はまた、フルクトースおよびマンノースを含んでなることも可能である。あるいは、培地は、ガラクトースおよびフルクトースを含有し、そして所望により、マンノースおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンもまた含んでなることも可能である。該方法は、細胞を３７℃未満の温度で培養することを含めて、細胞に産生されるタンパク質の量または質を増加させるように、他の細胞培養法とともに実施することも可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞により産生されるタンパク質のシアル酸含量を調節する方法であって、ガラクトースおよびフルクトースを含んでなる培地中で細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
培地がマンノースをさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
培地がＮ−アセチルマンノサミンをさらに含んでなる、請求項２の方法。
【請求項４】
培地が血清不含である、請求項１の方法。
【請求項５】
培地が血清不含である、請求項２の方法。
【請求項６】
ガラクトース、マンノース、およびフルクトースの濃度が、各々、約１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項２の方法。
【請求項７】
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭである、請求項３の方法。
【請求項８】
タンパク質が、分泌される組換えタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項９】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１の方法。
【請求項１０】
細胞が約２９℃〜約３６℃の温度で培養される、請求項１の方法。
【請求項１１】
ガラクトースおよびフルクトースを含んでなる、哺乳動物細胞を培養するための培地。
【請求項１２】
マンノースをさらに含んでなる、請求項１１の培地。
【請求項１３】
Ｎ−アセチルマンノサミンをさらに含んでなる、請求項１２の培地。
【請求項１４】
ガラクトース、マンノース、およびフルクトースの濃度が、各々、約１ｍＭ〜約１０ｍＭである、請求項１２の培地。
【請求項１５】
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭである、請求項１３の方法。
【請求項１６】
血清不含である、請求項１１の培地。
【請求項１７】
血清不含である、請求項１２の培地。
【請求項１８】
血清不含である、請求項１３の培地。
【請求項１９】
タンパク質のシアル酸含量を調節する方法であって、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびガラクトースを含んでなる培地中で、当該タンパク質を産生する哺乳動物細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【請求項２０】
培地がフルクトースおよびマンノースをさらに含んでなる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
培地中のフルクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり、そして培地中のマンノースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
細胞が約２９℃〜約３５℃の温度で培養される、請求項１９の方法。
【請求項２３】
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭであり、そして培地中のガラクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである、請求項１９の方法。
【請求項２４】
タンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１９の方法。
【請求項２５】
タンパク質が、組換えタンパク質である、請求項１９の方法。
【請求項２６】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１９の方法。
【請求項２７】
哺乳動物細胞を培養する培地における、ガラクトースおよびＮ−アセチルマンノサミンの培地との組み合わせ。
【請求項２８】
培地がフルクトースおよびマンノースをさらに含んでなる、請求項２７の培地。
【請求項２９】
培地中のフルクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり、そして培地中のマンノースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである、請求項２８の培地。
【請求項３０】
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭであり、そして培地中のガラクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである、請求項２７の培地。
【請求項３１】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２７の培地。
【請求項３２】
血清不含である、請求項２７の培地。
【請求項３３】
タンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養することによってタンパク質を産生する方法において、Ｎ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、約２９℃〜約３６℃の温度で、哺乳動物細胞を培養することを含んでなる改善。
【請求項３４】
培地がガラクトースをさらに含んでなる、請求項３３の方法。
【請求項３５】
培地がフルクトースおよびマンノースをさらに含んでなる、請求項３４の方法。
【請求項３６】
培地中のガラクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり、培地中のマンノースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり、そして培地中のフルクトースの濃度が約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭである、請求項３５の方法。
【請求項３７】
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭである、請求項３３の方法。
【請求項３８】
培地が血清不含である、請求項３３の方法。
【請求項３９】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３３の方法。
【請求項４０】
タンパク質が、分泌される組換えタンパク質である、請求項３３の方法。
【請求項４１】
組換えタンパク質のシアル酸含量を調節する方法であって、フルクトース、ガラクトース、マンノース、およびＮ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、約２９℃〜約３６℃の温度で、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養することを含んでなり、
培地中のフルクトースの濃度が約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭであり、
培地中のガラクトースの濃度が約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭであり、
培地中のマンノースの濃度が約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭであり、そして
培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭである、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、培養細胞により産生されるタンパク質のシアル酸付加を調節する方法および培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質は、多様な診断適用、薬理学的適用、農業適用、栄養学的適用、および研究適用に有用である。タンパク質、特に療法タンパク質を産生するコストが高いことを考慮すると、タンパク質の産生効率または機能および安定性のわずかな増加であっても、有益でありうる。タンパク質の機能および安定性、そしてしたがって有用性は、糖タンパク質を形成する、タンパク質への糖残基の翻訳後付加により影響を受ける可能性もある。例えば、糖タンパク質に付着した多糖への末端シアル酸残基の付加は、一般的に、血流中のタンパク質の存続期間を増加させ、そして特定の場合、いくつかの糖タンパク質の溶解度、熱安定性、プロテアーゼ攻撃に対する耐性、抗原性、および比活性にもまた影響を及ぼしうる。例えば、ＧｕおよびＷａｎｇ（１９９８），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ５８（６）：６４２−４８；Ｍｏｒｅｌｌら（１９６８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４３（１）：１５５−５９を参照されたい。したがって、糖タンパク質、特に、薬理学的適用に使用しようとする糖タンパク質のシアル酸含量を増加させることが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
本発明は、タンパク質、所望により、分泌される組換えタンパク質を産生し、そして該タンパク質のシアル酸含量を調節するか、または所望により、シアル酸含量を増加させるように、哺乳動物細胞を培養する培地および方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞によるタンパク質の産生および／またはシアル酸付加を増加させる方法であって、ガラクトースおよびフルクトースを含んでなる培地中で細胞を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。培地は血清不含であることも可能であり、そしてまた、Ｎ−アセチルマンノサミンおよび／またはマンノースを含んでなることも可能である。ガラクトース、マンノース、およびフルクトースの濃度は、各々、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭであることも可能である。Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度は少なくとも約０．８ｍＭ、所望により、少なくとも約２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、または２０ｍＭであることも可能である。タンパク質は、分泌される組換えタンパク質であることも可能であり、そして哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であることも可能である。細胞を約２９℃〜約３５℃の温度で培養することも可能である。
【０００４】
別の態様において、本発明は、ガラクトースおよびフルクトース、並びに所望により、Ｎ−アセチルマンノサミンおよび／またはマンノースを含んでなる、哺乳動物細胞を培養するための培地、所望により血清不含培地を提供する。ガラクトース、マンノース、およびフルクトースは、各々、約０．１ｍＭ〜約４０ｍＭ、各々、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、各々、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または各々、約１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度であることも可能である。Ｎ−アセチルマンノサミンは、少なくとも約０．８ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、または２０ｍＭの濃度であることも可能である。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、タンパク質のシアル酸含量を調節する方法であって、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびガラクトースを含んでなる培地中で、タンパク質を産生する哺乳動物細胞を培養することを含んでなる、前記方法を含む。培地はフルクトースおよびマンノースをさらに含んでなることも可能である。所望により、フルクトースおよびマンノースは、各々、約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭの濃度で存在することも可能である。フルクトースおよびマンノースは、同じ濃度であることも、または異なる濃度であることも可能である。細胞を約２９℃〜約３７℃の温度、所望により約２９℃〜約３６℃の温度、または約３０℃〜約３５℃の温度で培養することも可能である。培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度は少なくとも約０．８ｍＭであることも可能であり、そして培地中のガラクトースの濃度は約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであることも可能である。タンパク質が、分泌タンパク質および／または組換えタンパク質であることも可能であり、そしてＣＨＯ細胞で産生されることも可能である。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、ガラクトースおよびＮ−アセチルマンノサミン、並びに所望により、フルクトースおよびマンノースもまた培地と組み合わされる、哺乳動物細胞を培養する培地との組み合わせを含んでなる。フルクトースは約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭの濃度であることも可能であり、そしてマンノースは約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭの濃度であることも可能である。Ｎ−アセチルマンノサミンは少なくとも約０．８ｍＭの濃度であることも可能であり、そしてガラクトースは約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭの濃度であることも可能である。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であることも可能であり、そして培地は血清不含であることも可能である。
【０００７】
さらに、本発明は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養することによってタンパク質を産生する改善法であって、Ｎ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、約２９℃〜約３５℃の温度で、哺乳動物細胞を培養することを含んでなる、前記改善法を提供する。培地はまた、ガラクトース、並びに所望により、フルクトースおよびマンノースもまた含んでなることも可能である。ガラクトース、マンノースおよびフルクトースの濃度は、各々、約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであることも可能である。ガラクトース、マンノースおよびフルクトースの濃度は、互いに同じであることも、または異なることも可能である。Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度は少なくとも約０．８ｍＭであることも可能であり、そして培地は血清不含であることも可能である。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であることも可能であり、そしてタンパク質は、分泌される組換えタンパク質であることも可能である。
【０００８】
最後に、本発明は、組換えタンパク質のシアル酸含量を調節する方法であって、フルクトース、ガラクトース、マンノース、およびＮ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、約２９℃〜約３５℃の温度で、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養することを含んでなり、培地中のフルクトース、ガラクトース、およびマンノースの濃度が、各々、約１．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり、そして培地中のＮ−アセチルマンノサミンの濃度が少なくとも約０．８ｍＭである、前記方法を提供する。フルクトース、マンノースおよびガラクトースの濃度は、互いに同じであることも、または異なることも可能である。
【０００９】
詳細な説明
定義
抗体は、本明細書において、各々、少なくとも１つ、または所望により、少なくとも２つの可変抗体免疫グロブリンドメインを含んでなる、タンパク質またはタンパク質複合体である。抗体は、一本鎖抗体、二量体抗体、または限定されるわけではないが、ヘテロ二量体抗体および四量体抗体を含む、いくつかのより高次のタンパク質複合体であることも可能である。
【００１０】
定常抗体免疫グロブリンドメインは、ヒトまたは動物起源のＣＬ、ＣＨｌ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４ドメインと同一かまたは実質的に類似の免疫グロブリンドメインである。例えば、ＨａｓｅｍａｎｎおよびＣａｐｒａ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ監修，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第２版中，  ２０９，  ２１０−２１８（１９８９）を参照されたい。抗体免疫グロブリンドメインは、少なくとも長さ１０アミノ酸、所望により、少なくとも長さ１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０アミノ酸である。
【００１１】
抗体のＦｃ部分には、ヒトまたは動物免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３、あるいはこれらに実質的に類似の免疫グロブリンドメインが含まれる。考察に関しては、ＨａｓｅｍａｎｎおよびＣａｐｒａ、上記、２１２−２１３を参照されたい。
【００１２】
糖タンパク質は、本明細書において、特に１以上の糖残基の付加を含む、１以上の炭水化物の付加によって修飾されているタンパク質である。
オリゴ糖または多糖は、共有化学結合によって連結される２以上の糖残基の鎖である。
【００１３】
シアル酸付加は、本明細書において、糖タンパク質であってもよいタンパク質へのシアル酸残基の付加である。
用語、シアル酸は、本明細書において、カルボキシル基を含む、９以上の炭素原子を含有する糖のファミリーを含む。シアル酸のすべての既知の天然型を含む一般的な構造を以下に示す。
【００１４】
【化１】
2005532813.tif 000002
【００１５】
単一分子上の多様な位のＲ１基は、互いに同一であることも、または異なることも可能である。Ｒ１は、水素またはアセチル基、ラクチル基、メチル基、硫酸基、リン酸基、無水基、シアル酸基、フコース基、グルコース基、またはガラクトース基であることも可能である。Ｒ２は、Ｎ−アセチル基、Ｎ−グリコリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、Ｎ−グリコリル−Ｏ−アセチル基、またはＮ−グリコリル−Ｏ−メチル基であることも可能である。Ｒ３は、糖タンパク質の背景において、オリゴ糖中の先行する糖残基を示し、これにシアル酸が付着する。Ｒ３は、ガラクトース（その３位、４位、または５位で連結される）、Ｎ−アセチル−ガラクトース（その６位で連結される）、Ｎ−アセチル−グルコース（その４位または６位で連結される）、シアル酸（その８位または９位で連結される）、または５−Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸であることも可能である。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  第１５章，  Ｖａｒｋｉら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９９）。４０を越えるシアル酸の型が天然に発見されている。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  第１５章，  Ｖａｒｋｉら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９９）。シアル酸の一般的な型は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）であり、ここでＲ１はすべての位で水素であり、そしてＲ２はＮ−アセチル基である。
【００１６】
実質的に類似のタンパク質は、アミノ酸配列において、互いに少なくとも８０％、所望により、少なくとも９０％同一であり、そして改変されていないタンパク質の生物学的活性を、維持するかまたは望ましい方式で改変する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを、視覚的検査および数学的計算によって決定することも可能であり、またはより好ましくは、コンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することによって、比較を行う。典型的なコンピュータプログラムは、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）、ウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７）である。「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）のＧＣＧ実行、並びにＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（１９８６），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の匹敵する比較マトリックス；（２）アミノ酸配列の各ギャップに対する３０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに１のペナルティ、またはヌクレオチド配列の各ギャップに対する５０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに３のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし；および（４）長いギャップに対する最大ペナルティなし、が含まれる。比較のためＧＡＰによって並列される２つのタンパク質の領域は、少なくとも長さ１０アミノ酸、所望により、少なくとも長さ２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸である。配列比較の当業者に使用される他のプログラムを使用することもまた可能である。当業者は、選択するパラメーターが同一性パーセントに影響を及ぼす可能性もあり、そして配列が類似でない場合に、より影響を及ぼすであろうことを認識するであろう。
【００１７】
可変抗体免疫グロブリンドメインは、ヒトまたは動物起源のＶＬまたはＶＨドメインと同一かまたは実質的に類似の免疫グロブリンドメインである。可変抗体免疫グロブリンドメインは、少なくとも長さ１０アミノ酸、所望により、少なくとも長さ１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、または９０アミノ酸である。
【００１８】
説明
タンパク質への炭水化物の付加（本明細書において、タンパク質のグリコシル化と称する）およびそれに続くこれらの炭水化物のプロセシングは、タンパク質のフォールディング、安定性、および機能特性に影響を及ぼしうる。Ｌｏｄｉｓｈら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第１７章，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  ニューヨーク（２０００）。例えば、赤血球凝集素前駆体タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化（以下に記載）に必要なオリゴ糖前駆体の産生に干渉する抗生物質であるツニカマイシンの存在下で、適切にフォールディングできない。同上。さらに、フィブロネクチンの非グリコシル化型は、通常、線維芽細胞から分泌されるが、これは、グリコシル化フィブロネクチンよりも迅速に分解される。Ｌｏｄｉｓｈら、上記。
【００１９】
分泌されるタンパク質および細胞表面タンパク質の大部分は、少なくとも１つの炭水化物鎖を含有する；さらに、多くの細胞質タンパク質および核タンパク質もまた、グリコシル化されている。Ｌｏｄｉｓｈら、上記；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  第１３章，  Ｖａｒｋｉら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９９）。タンパク質をグリコシル化することが可能な酵素セットが、小胞体およびゴルジ体内に位置し、分泌タンパク質および細胞表面タンパク質は、その経路上で、これらの細胞内小器官を通過して細胞膜へ、そしてさらにその先に向かう。類似の機能を遂行可能な核酵素および／または細胞質酵素の同定はまだ不明確なままである。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，  第１３章，  Ｖａｒｋｉら監修，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９９）。
【００２０】
タンパク質グリコシル化は複雑でそして変化するプロセスであるが、タンパク質の炭水化物修飾は、大まかに２つの種類、Ｏ連結グリコシル化およびＮ連結グリコシル化に分けられる。これらはどちらも、タンパク質内の特定のアミノ酸にオリゴ糖を付加することを伴う。Ｏ連結多糖は、ヒドロキシル基、通常、セリン残基またはスレオニン残基いずれかのヒドロキシル基に連結される。Ｏ−グリカンは、すべてのセリン残基およびスレオニン残基に付加されるわけではなく、そしてどのセリンおよびスレオニンがグリコシル化されるかを決定する基準は、完全には解明されていない。Ｏ−グリカンは、通常、１つまたは２つの分枝を含んでなり、そして１〜４の異なる種類の糖残基を含んでなり、これらは１つずつ付加される。しばしば、末端残基はシアル酸である。対照的に、Ｎ連結多糖は、アスパラギンのアミド窒素に付着する。２つのトリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸いずれかである）いずれか１つの一部であるアスパラギンのみが、グリコシル化の標的である。Ｎ連結グリコシル化の最初の工程は、３つのグルコース残基、９つのマンノース残基、および２つのＮ−アセチルグルコサミン残基からなる、複雑な、あらかじめ形成された、枝分かれしたオリゴ糖の付加を伴う。このオリゴ糖は、複雑で、そして変化する一連の工程によってさらにプロセシングされ、多様な糖残基の除去および付加を生じる。最終産物において、多糖の各分枝上の末端残基は、常にではないが、シアル酸であることも可能である。Ｌｏｄｉｓｈら、上記。Ｎ−グリカンは、１〜５の分枝を有することも可能である。Ｖａｒｋｉら、上記。
【００２１】
先の研究によって、図１に例示するように、タンパク質へのシアル酸付加につながる生合成経路ネットが解明されている。ＧｕおよびＷａｎｇ、上記；ＣｏｒｆｉｅｌｄおよびＳｃｈａｕｅｒ、上記。非常に多様な分子が、シアル酸合成および糖タンパク質へのシアル酸付着の多様な段階に関与し、関与する多くの分子のいくつかのみを挙げると、これらには、グルコース、マンノース、フルクトース、およびガラクトースなどの糖、ＡＴＰおよびＣＴＰなどのヌクレオチド、並びに関与する多くの生合成工程を触媒するのに必要な多くの酵素が含まれる。図１はまた、この経路ネット中、負のフィードバック阻害が起こることが知られる２つの点（矢じりの付いた点線）も例示する。さらに、ＧｕおよびＷａｎｇ（上記）は、培地にＮ−アセチルマンノサミンを添加すると、培養細胞に産生されるタンパク質のシアル酸付加の増加が生じることを報告した。しかし、Ｎ−アセチルマンノサミンは高価であるため、その商業的有用性は、現在、限定されており、そしてしたがって、同様の効果またはより優れた効果を持つ培養条件または他の培地添加剤が必要とされる。
【００２２】
したがって、本発明は、細胞培養物により産生される糖タンパク質のシアル酸付加を増加させる方法であって、細胞培養物にＮ−アセチルマンノサミンおよびガラクトースを添加することを含んでなる、前記方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、細胞培養物に産生される糖タンパク質のシアル酸付加を増加させる方法であって、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトース、フルクトース、およびマンノースを含んでなる培地中で細胞を培養することを含んでなる、前記方法を提供する。あるいは、ガラクトースおよびフルクトース、並びに所望により、Ｎ−アセチルマンノサミンおよび／またはマンノースもまた含んでなる培地中で、細胞を培養することによって、シアル酸付加が増加しうる。さらに別の態様において、本発明は、タンパク質を産生する改善法であって、Ｎ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、３７℃未満、所望により約２９℃〜約３６℃または約２９℃〜約３５℃、または約３０℃〜約３３℃の温度で、該タンパク質を発現する哺乳動物細胞を培養することを含んでなる、前記改善法を含む。別の側面において、本発明は、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトース、並びに所望により、フルクトースおよび／またはマンノースもまた含んでなる、哺乳動物細胞用の培地を提供する。Ｎ−アセチルマンノサミンの濃度は、少なくとも約０．８ミリモラー（ｍＭ）、所望により、少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約２０ｍＭであることも可能であり、そしてガラクトースの濃度は、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、所望により、約２ｍＭ〜約４ｍＭ、または約２．５ｍＭ〜約３．５ｍＭであることも可能である。フルクトースおよびマンノースが存在する場合、その濃度は、互いに、そしてガラクトースおよびＮ−アセチルマンノサミンの濃度と、同じであることも、または異なっていることも可能である。フルクトースおよびマンノースの濃度は、各々、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、所望により、各々、約２ｍＭ〜約４ｍＭ、または各々、約２．５ｍＭ〜約３．５ｍＭであることも可能である。
【００２３】
あるいは、本発明は、フルクトースおよびガラクトース、並びに所望により、マンノースおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンもまた含んでなる、哺乳動物細胞用培地を提供する。フルクトース、ガラクトース、およびマンノースは、各々、各約０．１ｍＭ〜各約４０ｍＭ、所望により、各約０．５ｍＭ〜各約２０ｍＭ、各約１．０ｍＭ〜各約１０ｍＭ、または各約１ｍＭ〜各約５ｍＭで存在することも可能である。フルクトース、ガラクトース、およびマンノースは、同じ濃度または異なる濃度で存在することも可能である。Ｎ−アセチルマンノサミンは少なくとも約０．８ミリモラー（ｍＭ）、所望により少なくとも約２ｍＭ、少なくとも約３ｍＭ、少なくとも約４ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭ、または少なくとも約２０ｍＭの濃度で存在することも可能である。
【００２４】
さらに、本発明は、各約０．１ｍＭ〜各約４０ｍＭ、所望により、各約０．５ｍＭ〜各約２０ｍＭ、各約１．０ｍＭ〜各約１０ｍＭ、または各約１ｍＭ〜各約５ｍＭの濃度で存在することも可能である、フルクトース、ガラクトース、および所望によりマンノースを含んでなる、哺乳動物細胞用の培地を含む。フルクトース、ガラクトース、およびマンノースは、同じ濃度または異なる濃度で存在することも可能である。
【００２５】
１つの側面において、本発明は、哺乳動物細胞を培養する方法であって、タンパク質を産生するよう遺伝子操作されている哺乳動物細胞を、培養物中で増殖させ、そして培養物にＮ−アセチルマンノサミン、ガラクトース、および所望により、フルクトースおよび／またはマンノースもまた添加することを含んでなる、前記方法を提供する。別の側面において、本発明は、タンパク質を産生するよう遺伝子操作されている哺乳動物細胞を、Ｎ−アセチルマンノサミンを含んでなる培地中、３７℃未満の温度で培養する方法を提供する。遺伝子操作された細胞の１つの種類は、該タンパク質をコードする組換えベクターで形質転換されている細胞である。該タンパク質は、強いウイルスプロモーター（例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターいずれか）の調節下で、または誘導性プロモーター（例えばメタロチオネイン・プロモーターまたは例えばＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８９：５５４７−５１に記載されるようなテトラサイクリン応答性プロモーター）の調節下で、発現させることも可能である。典型的には、細胞は、該タンパク質を天然には発現しないか、または非常に低レベルでしか該タンパク質を発現しない（遺伝子操作の非存在下）。
【００２６】
タンパク質は、一般的に、少なくとも長さ１０アミノ酸、所望により、少なくとも長さ１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００アミノ酸のポリペプチドであると理解される。本発明の方法および培地を用いて産生されるタンパク質は、分泌タンパク質であることも可能である。
【００２７】
本発明の方法および培地を用いて、ほぼいかなるタンパク質のシアル酸付加を増加させることも可能であり、そして、本発明の方法および培地は、発現が例えばウイルスプロモーターなどの強いプロモーターの調節下にあるポリペプチド、および／またはアデノウイルス三分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー要素を有するメッセージ上にコードされるポリペプチドには、特に好適である。タンパク質産生に使用可能な有用な発現ベクターの例が、国際出願ＷＯ  ０１／２７２９９、およびｐＤＣ４０９ベクターを記載するＭｃＭａｈａｎら（１９９１），  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１に開示される。
【００２８】
一般的に、本発明の方法は、組換えポリペプチド産生を誘導するのに有用である。本発明の方法および培地を用いて産生可能なタンパク質には、以下のタンパク質の１つのすべてまたは一部と同一かまたは実質的に類似のアミノ酸配列を含んでなるものが含まれる：Ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ  ９４／２８３９１に記載されるようなもの）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号に記載されるようなもの）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、レプチン、ＩＬ−２、アンギオポエチン−２（本明細書に援用される、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：５５−６０に記載されるようなもの）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＷＯ  ０１／３６６３７に記載されるようなＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＷＯ  ９７／０１６３３に記載されるようなＴＲＡＩＬ）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（豪州特許第５８８８１９号に記載されるようなＧＭ−ＣＳＦ）、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（本明細書に援用される、米国特許第６，２０４，３６３号に記載される）、上皮増殖因子、ケラチン生成細胞増殖因子、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）増殖および発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン、γインターフェロン、およびコンセンサス・インターフェロンを含むインターフェロン類（どちらも本明細書に援用される、米国特許第４，６９５，６２３号および第４，８９７，４７１号に記載されるようなもの）、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子類、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、並びに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋの多様なリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼのリガンド、またはＬＥＲＫＳなど）。本発明の方法にしたがって産生可能なタンパク質の説明は、例えば、すべて本明細書に援用される、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｃｈ，  Ｖｏｌ．ＩＩ（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ監修，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  マサチューセッツ州ケンブリッジ，  １９８８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク，  １９９３）；およびＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ，  １９９１）に見出すことも可能である。
【００２９】
本発明の方法および培地を用いて産生可能なさらなるタンパク質には、上述のタンパク質いずれかの受容体のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるタンパク質、上述のタンパク質いずれかのこうした受容体に対するアンタゴニスト、および／またはこうした受容体またはアンタゴニストに実質的に類似のタンパク質が含まれる。これらの受容体およびアンタゴニストには：腫瘍壊死因子受容体の両方の型（米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号に記載されるような、ｐ５５およびｐ７５と称されるＴＮＦＲ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型およびＩＩ型：すべて本明細書に援用される欧州特許第０  ４６０  ８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号、および米国特許第５，７６７，０６４号に記載される）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（本明細書に援用される米国特許第６，３３７，０７２号に記載されるものなど）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（すべて本明細書に援用される米国特許第５，９８１，７１３号、第６，０９６，７２８号、および第５，０７５，２２２号、第５，７６７，０６４号に記載されるものなど）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０  ３６７  ５６６号および米国特許第５，８５６，２９６号に記載されるようなもの）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子の受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＷＯ  ０１／３６６３７および米国特許第６，２７１，３４９号に記載されるＲＡＮＫ）、オステオプロテジェリン（例えば、本明細書に援用される米国特許第６，０１５，９３８号に記載される）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、およびＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの、死ドメインを含んでなる受容体が含まれる。
【００３０】
本発明の方法および培地を用いて産生可能なさらなるタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）またはそれらのリガンドのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含んでなるタンパク質、あるいはこれらのいずれかに実質的に類似のタンパク質が含まれる。こうした抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｋｉｋｕｔａｎｉら監修，  日本・神戸，  １９９６）に開示される。続くワークショップに、類似のＣＤタンパク質が開示される。こうした抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド等）が含まれる。ＣＤ抗原のいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０も含む、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドがそうであるように、しばしば、ＴＮＦファミリーのメンバーである。したがって、本発明を用いて、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーを産生することもまた可能である。
【００３１】
本発明の方法および培地を用いて、酵素的に活性であるタンパク質またはそのリガンドを産生することもまた可能である。例には、以下のタンパク質またはそのリガンドの１つのすべてまたは一部を含んでなるタンパク質、あるいはこれらの１つに実質的に類似のタンパク質が含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、多様なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、上述の酵素いずれかのリガンド、並びに多くの他の酵素およびそのリガンド。
【００３２】
本発明の方法および培地を用いて、国際出願ＷＯ  ０１／８３５２５およびＷＯ  ００／２４７８２に記載されるものなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の標的タンパク質に結合し、そしてその活性を修飾するよう選択されたキメラタンパク質、および抗体またはその部分、およびキメラ抗体、すなわち１以上のネズミ可変抗体免疫グロブリンドメインにカップリングしたヒト定常抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体、その断片、または実質的に類似のタンパク質を産生することもまた可能である。本発明の方法を用いて、抗体および細胞傷害性物質または発光物質を含んでなるコンジュゲートを産生することもまた可能である。こうした物質には：メイタンシン誘導体（ＤＭ１など）；エンテロトキシン（ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンなど）；ヨウ素同位体（ヨウ素−１２５など）；テクニウム同位体（Ｔｃ−９９ｍなど）；シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８など）；およびリボソーム不活性化タンパク質（ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン、またはサポリン−Ｓ６など）が含まれる。本発明の方法および培地を用いて産生可能な、抗体、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択キメラタンパク質、あるいは抗体／サイトトキシン・コンジュゲートまたは抗体／発光団コンジュゲートの例には、限定されるわけではないが、上述のタンパク質および／または以下の抗原のいずれかを含むタンパク質のいずれか１つまたは組み合わせいずれかを認識するものが含まれる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−βおよびその類似体（米国特許第５，２７２，０６４号および第５，１４９，７９２号に記載されるものなど）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３Ｂ１号に記載されるものを含む）、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞増殖因子、オステオプロテジェリン・リガンド、インターフェロン・ガンマ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１、およびｚＴＮＦ４としても知られる；ＤｏおよびＣｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  １３（１）：１９−２５を参照されたい）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌患者の血清に上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳癌、結腸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、および／または腎臓癌細胞上、並びに／あるいは黒色腫、神経膠腫、または神経芽細胞腫細胞、腫瘍の壊死中心上で発現される癌関連エピトープまたはタンパク質、インテグリン・アルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ��インテグリン類、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）アドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（因子ＶＩＩａ組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ  Ｉ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）。
【００３３】
本発明の方法および培地を用いて、抗イディオタイプ抗体であるタンパク質、あるいは実質的に類似のタンパク質のすべてまたは一部を生産することもまた可能であり、これらには：腫瘍抗原ｇｐ７２を標的とする抗体；ガングリオシドＧＤ３に対する抗体；ガングリオシドＧＤ２に対する抗体；またはこれらに実質的に類似の抗体に対する抗イディオタイプ抗体が含まれる。
【００３４】
本発明の方法および培地を用いて、上述のタンパク質または実質的に類似のタンパク質いずれかを含んでなる組換え融合タンパク質を産生することもまた可能である。例えば、本発明の方法および培地を用いて、上述のタンパク質の１つに加えて、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分などの多量体化ドメインを含んでなる組換え融合タンパク質、または実質的に類似のタンパク質を産生することも可能である。例えば、ＷＯ  ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙら（１９９３），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９３），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙら（１９９４），  Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎら（１９９９），  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７：２５５−６４を参照されたい。こうした組換え融合タンパク質の中に特に含まれるのは、ＴＮＦＲまたはＲＡＮＫの少なくとも部分を抗体のＦｃ部分に融合させたタンパク質（ＴＮＦＲ：ＦｃまたはＲＡＮＫ：Ｆｃ）である。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、米国特許第５，３９５，７６０号の図２Ａのアミノ酸１〜１６３、１〜１８５、または１〜２３５に実質的に類似のアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲの細胞外ドメインに融合した抗体のＦｃ部分を含んでなる。ＲＡＮＫ：Ｆｃは、ＷＯ  ０１／３６６３７に記載される。
【００３５】
本発明を実施するのに適した細胞には、タンパク質をグリコシル化可能ないかなる細胞株も含まれ、好ましくは、タンパク質を発現するよう遺伝子操作されている哺乳動物細胞株が含まれるが、本発明を用いて、非組換えタンパク質を産生することもまた可能である。好ましくは、細胞は均質な細胞株である。多くの適切な細胞株が当該技術分野に知られる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、骨髄腫細胞（例えばＮＳＯ細胞、ＮＳ１細胞）、またはＷＩ３８細胞を使用することも可能である。抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を用いて、本発明を実施することもまた可能である。上述の細胞由来の細胞株もまた、本発明を実施するのに適している。
【００３６】
特に好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞であり、この細胞は、組換えタンパク質、例えばサイトカイン、凝固因子、および抗体を産生するのに広く用いられている（Ｂｒａｓｅｌら（１９９６），  Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら（１９９１），  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄら（１９９０），  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４５：３０１１−３０１６）。ＤＸＢ１１またはＤＧ−４４などのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損突然変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）は、これらの細胞において、効率的なＤＨＦＲ選択可能および増幅可能遺伝子発現系が、高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするため、有用である（Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０），  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：５２７−５６６）。さらに、これらの細胞は、接着培養物または懸濁培養物として操作するのが容易であり、そして比較的優れた遺伝子安定性を示す。ＣＨＯ細胞およびこれらで発現される組換えタンパク質は、広範に性質決定されており、そして監督官庁によって臨床的商業的な製造における使用に関して認可されてきている。
【００３７】
本発明にしたがって、抗体または組換えタンパク質であることも可能な、目的のタンパク質の産生を促進する条件下で哺乳動物宿主細胞を培養する。哺乳動物細胞培養用の基本的な細胞培地処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、当該技術分野に周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ｐ．６９−８４，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９８７）を参照されたい。当業者は、これらの基本的培地処方に、培養しようとする宿主細胞の必要性に応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝剤、抗生物質、脂質、微量元素等の構成要素を添加するであろう。当業者はまた、細胞増殖、細胞生存度、および／または特定の培養細胞における組換えタンパク質産生を最大にするために開発された、多くの個別化培地処方の１つの使用を選択することも可能である。本発明記載の方法を、商業的に入手可能な細胞培地と組み合わせて用いるか、または特定の細胞株で使用するために個別に配合された細胞培地と組み合わせて用いることも可能である。培地は、血清および／またはタンパク質を含有することもまたしないことも可能である。適切な商業的培地には、とりわけ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションまたはＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓとともに他の製造供給元から得ることも可能な、ＲＰＭＩ  １６４１培地、ダルベッコの修飾イーグル培地、最少必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地およびＦ１２培地、マッコイの５Ａ培地、レイボビッツのＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンザス州レネクサから入手可能）などの血清不含培地、が含まれる。
【００３８】
当業者はまた、細胞増殖、細胞生存度、および／または特定の培養宿主細胞における組換えポリペプチド産生を最大にするために開発された、多くの個別化培地処方の１つの使用を選択することも可能である。本発明記載の方法を、商業的に入手可能な細胞培地と組み合わせて用いるか、または特定の細胞株で使用するために個別に配合された細胞培地と組み合わせて用いることも可能である。例えば、ポリペプチド産生増加を支持することも可能な強化培地は、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８の比、あるいは１：１５までの比またはそれより高い比で組み合わされた、例えばＤＭＥＭ培地およびハムのＦ１２培地などの、２以上の商業的培地の混合物を含んでなることも可能である。あるいは、またはさらに、培地は、アミノ酸またはペプトンなどの栄養素の添加によって強化することも可能であり、そして／または培地（または以下に記載するものを例外としたその構成要素の大部分）を、通常の推奨される濃度より高い濃度で、例えば２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、またはそれより高い濃度で用いることも可能である。本明細書において、「１Ｘ」は、標準濃度を意味し、「２Ｘ」は、標準濃度の２倍を意味する、などである。これらの態様のいずれにおいても、塩など、モル浸透圧濃度に実質的に影響を及ぼしうる培地構成要素の濃度を、培地の浸透圧モル濃度が許容しうる範囲の外に属するように増加させることは不可能である。したがって、培地は、１Ｘでのみ存在可能な塩以外、すべての構成要素に関して、例えば８Ｘであることも可能である。強化培地は、血清不含および／またはタンパク質不含であることも可能である。この背景において、「タンパク質不含」は、インスリンまたはインスリン様増殖因子などの、少なくとも１５アミノ酸のタンパク質を含まないことを意味する。「タンパク質不含」培地は、一般的に用いられる培地添加剤である、ペプトン（酵母、ダイズ（ｓｏｙ）、または他の供給源由来）に見られるものなどの加水分解タンパク質を含有することも可能である。さらに、培養物が維持される間、培地に定期的に補充して、例えばビタミン、アミノ酸、および代謝前駆体など、枯渇しうる培地構成要素を補給することも可能である。当該技術分野に知られるように、異なる培地および温度は、異なる細胞株に対して、いくぶん異なる影響を有する可能性もあり、そして同じ培地および温度が、すべての細胞株には適さない可能性もある。
【００３９】
本発明の方法は、組換えタンパク質産生を誘導するのに有用である。組換えタンパク質は、遺伝子操作プロセスによって産生されるタンパク質である。用語「遺伝子操作」は、細胞に望ましいタンパク質の発現を改変させるように、組換えポリヌクレオチド分子に細胞を感染させるか、該分子で細胞をトランスフェクションするか、形質転換するか、または細胞に該分子を形質導入することを指す。いくつかの態様において、こうした組換えポリヌクレオチド分子は、適切な制御配列に機能可能であるように連結した目的のタンパク質をコードする核酸を含んでなり、こうした制御配列は、目的のタンパク質をコードする核酸を挿入する「発現ベクター」の一部である。
【００４０】
目的のタンパク質を発現するよう細胞および／または細胞株を遺伝子操作する方法およびベクターが当業者に周知であり；例えば、多様な技術がＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク，  １９８８，  および四半期の改訂）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）；およびＫａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  １９９０，  ｐｐ．１５−６９に例示される。陽イオン性脂質試薬、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ−２０００、またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ−ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入可能）などの商業的に入手可能な試薬を用いたさらなるプロトコルを用いて、細胞をトランスフェクションすることも可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７。さらに、エレクトロポレーションまたは核酸でコーティングされた微粒子銃での照射を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ−ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ（１９９２），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１０（９）：１０３６−４０におけるものなどの方法を用いて、細胞をトランスフェクションすることも可能である。遺伝子操作技術には、限定されるわけではないが、発現ベクター、標的化相同組換えおよび遺伝子活性化（例えばＣｈａｐｐｅｌに対する米国特許第５，２７２，０７１号を参照されたい）による細胞の形質転換、および操作した転写因子によるトランス活性化（例えばＳｅｇａｌら（１９９９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６（６）：２７５８−６３を参照されたい）が含まれる。
【００４１】
組換え細胞の同定を容易にするため、選択可能マーカーをコードする遺伝子が、しばしば用いられ、そしてしたがって、しばしば発現ベクター中に含まれる。形質転換体の選択は、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）選択スキームまたは細胞傷害性薬剤に対する耐性などの方法を用いて行うことも可能である。Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０），  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：４８７−５１１。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、例えば、ＤＨＦＲが欠損したＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１であることも可能である。ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０。選択可能マーカーの他の例には、Ｇ４１８およびハイグロマイシンＢなどの抗生物質への耐性を与えるものが含まれる。
【００４２】
制御配列は、典型的には、哺乳動物、微生物、ウイルス、および／または昆虫遺伝子由来である。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、およびエンハンサー、リボソーム結合部位（例えばＫｏｚａｋ（１９９１），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１９８６７−１９８７０を参照されたい）、転写終結および翻訳終結を調節可能な配列、ポリアデニル化シグナル（例えばＭｃＬａｕｃｈｌａｎら（１９８８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：５３２３−３３）、並びにマトリックスおよび足場付着部位（Ｐｈｉ−Ｖａｎら（１９８８），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １０：２３０２−０７；Ｓｔｉｅｆら（１９８９），  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：３４２−３５；Ｂｏｎｉｆｅｒら（１９９０），  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：２８４３−４８を参照されたい）が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が、タンパク質コード配列に機能的に関連するならば、機能可能であるように連結されている。こうした配列は、これらがタンパク質コード配列に機能上関連するならばシスにまたはトランスに存在することも可能である。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列が、タンパク質コード配列の転写を調節するならば、該タンパク質コード配列に機能可能であるように連結されている。プロモーターなどの、発現を制御可能な多くの配列は、シスで存在する際にその効果を発揮するが、これは常に当てはまるわけではない。例えば、トランスで存在する非コードＲＮＡは、遺伝子発現を下方制御するかまたは増進することも可能である。例えばＳｔｏｒｚ（２００２），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１２６０−６３を参照されたい。
【００４３】
通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来である。例えば、ヒトＣＭＶ極初期遺伝子１のプロモーター／エンハンサーを使用することも可能である。例えば、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（１９９４），  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４０：６９１−９８を参照されたい。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシング、およびポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝要素を提供することも可能である。ウイルス初期および後期プロモーターは、どちらもウイルス複製起点をも含有しうる断片として容易にウイルスゲノムから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８；Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０），  Ｍｅｔｈ．  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：４８７−５１１）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に渡るおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片を使用することもまた可能である。
【００４４】
適切な天然または異種シグナルペプチド（リーダー配列）をコードする配列を発現ベクターに取り込んで、組換えタンパク質の細胞外分泌を促進することも可能である。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えタンパク質を産生しようとする宿主細胞の種類に応じる。哺乳動物宿主細胞で機能するシグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８，  １９８４に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６号に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；および欧州特許第４６０，８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【００４５】
哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示された、さらなる調節配列には、ＣＨＯ細胞由来の発現増大配列要素（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中，  ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）；米国特許第６，３１２，９５１Ｂ１号；米国特許第６，０２７，９１５号；米国特許第６，３０９，８４１Ｂ１号）並びにアデノウイルス２由来の三分割リーダー（ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら（１９８２），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７：１３４７５−１３４９１）などの要素が含まれる。ウイルス起源の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって、二シストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることが可能になる（ＯｈおよびＳａｒｎｏｗ（１９９３），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：２９５−３００；Ｒａｍｅｓｈら（１９９６），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：２６９７−２７００）。選択可能マーカー（例えばＤＨＦＲ）遺伝子が続く、二シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション可能性および異種ｃＤＮＡの発現を改善することが示されてきている（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：４８７−５１１）。二シストロン性ｍＲＮＡを使用する典型的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１５０−１６１（１９９７）に記載されるｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、およびＭｏｒｒｉｓら，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ中，  ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００４６】
タンパク質産生に使用可能な有用な発現ベクターの例は、ＷＯ  ０１／２７２９９に開示されるもの、およびＭｃＭａｈａｎら（１９９１），  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１に記載されるｐＤＣ４０９ベクターである。別の有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴがＭｏｓｌｅｙら（１９８９），  Ｃｅｌｌ  ５９：３３５−３４８に記載されている。哺乳動物宿主細胞において用いるための他の発現ベクターを、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０（１９８３））に開示されるように構築することも可能である。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系を、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５（１９８６））に記載されるように構築することも可能である。Ｃｏｓｍａｎら（１９８４），  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載される有用な高発現ベクター、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４はＡＴＣＣ  ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターが、欧州特許第Ａ  ０  ３６７  ５６６号およびＷＯ  ０１／２７２９９に記載される。ベクターはレトロウイルス由来であることも可能である。天然シグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるＩＬ−７のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８（１９８４））に記載されるＩＬ−２受容体のシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６号に記載されるＩＬ−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチド；および欧州特許第４６０，８４６号に記載されるＩＩ型ＩＬ−１受容体シグナルペプチドなどの、異種シグナル配列を付加することも可能である。
【００４７】
哺乳動物細胞に適した培養条件が当該技術分野に知られる。例えばＡｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｄ．  Ｒｉｃｋｗｏｏｄ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９２）を参照されたい。哺乳動物細胞を、懸濁中で、または固体支持体に付着させながら、培養することも可能である。さらに、哺乳動物細胞を、例えば、流動層バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、充填層バイオリアクター、繊維層（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｂｅｄ）バイオリアクター、ローラーボトル、振盪フラスコ、または攪拌タンク・バイオリアクター中で、マイクロキャリアーを伴いまたは伴わずに培養してもよく、そしてバッチ培養、流加培養、連続培養、半連続培養、または灌流培養方式で、操作することも可能である。
【００４８】
本発明の方法および培地を、他の方法および培地添加剤、特にタンパク質の産生またはシアル酸付加を増加させるものと組み合わせることも可能である。例えば、約２９℃〜約４０℃、所望により約２９℃〜約３７℃、約２９℃〜約３６℃、約２９℃〜約３５℃、または約３０℃〜約３３℃の温度で細胞を増殖させることも可能である。さらに、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトース、フルクトース、およびマンノース以外の物質を培地に添加することも可能である。こうした物質には、限定されるわけではないが、ヒストン・デアセチラーゼ阻害剤、ブチレート、トリコスタチン、カフェイン、およびヘキサメチレン・ビスアセトアミドが含まれる。
【００４９】
本発明にしたがった方法を用いて、単相および多相培養法両方において、タンパク質の力価および／またはシアル酸付加を増加させることも可能である。単相法では、細胞を培養環境に接種して、そして単一産生相中、開示した方法および培地を使用する。多段階法では、細胞を２以上の別個の相で培養する。例えば、細胞をまず、細胞増殖および生存度を最大にする環境条件下の増殖相で培養し、次いで、タンパク質の産生および／またはシアル酸付加を増加させる条件下の産生相に移すことも可能である。多相法において、少なくとも産生相中、本発明にしたがった方法および培地を使用する。
【００５０】
以下に示す実施例は、包括的であることまたは本発明の範囲を限定することを意図しない。当業者は、上記解説を考慮して、修飾および変型が可能であることを理解するであろうし、そしてこうした修飾および変型は、本発明の範囲内であることが意図される。上記および下記両方の、本明細書に引用される参考文献はすべて、本明細書に完全に援用される。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
多様な糖およびその組み合わせがＴＮＦＲ：Ｆｃのシアル酸付加を誘導する能力の比較
以下の実験を行って、細胞培地に添加された、どの炭水化物または炭水化物の組み合わせが、細胞により産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃの最大のシアル酸付加を誘導することが可能であるかを決定した。細胞培養物により産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃが、陰イオン交換カラムから高塩濃度でのみ溶出する割合を測定することによって、シアル酸付加の相対的な度合いを決定した。より多くのシアル酸を含むタンパク質は、陰イオン交換カラムからの溶出に、より高い塩濃度を必要とするため、これは、シアル酸付加の度合いのおおまかな測定値を提供する。
【００５２】
ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＳＴＭ（水中の分画ダイズ油および分画卵リン脂質の無菌エマルジョン）、インスリン様増殖因子−Ｉ、およびブチレートを含み、そして添加される炭水化物をまったく含まない（「対照」と標示）か、または図２に示す炭水化物添加剤を各々４ｍＭの濃度で含む、血清不含培地３０ｍｌを含有する１２フラスコ各々に、ＴＮＦＲ：Ｆｃを産生するよう遺伝子操作されたＣＨＯ細胞株、約２．０ｘ１０６細胞を接種した。１分あたり１５０回転で振盪しながら、培養物を３０℃で７日間インキュベーションした。増殖７日後に培地からＴＮＦＲ：Ｆｃを採取し、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって前精製した。その後、２８０ナノメートルの吸光度を測定することによって、精製したＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質濃度を決定した。２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．２に希釈することによって、ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の濃度を約０．２５ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００５３】
陰イオン交換カラム（直径４．６ｍｍおよび高さ５０ｍｍ）に以下のように流した。０．２５ｍｇ／ｍｌダイズ・トリプシン阻害剤および０．５ｍｇ／ｍｌラクトアルブミン（どちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ミズーリ州セントルイスから得た）を含有する２つの対照タンパク質の混合物を用いて、実験試料を流す前および流した後両方で、カラムを較正した。この混合物の２００μｌまでの試料をカラムに適用し、そして２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．２（緩衝液Ａ）および２０ｍＭイミダゾール、０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２（緩衝液Ｂ）間の直線勾配を、０．８ｍｌ／分の速度でカラムに流した。２２．１分で勾配は完了し、そしてカラムは１００％緩衝液Ｂを含有した。２８０ナノメートルの吸光度を監視することによってタンパク質溶出を決定し、そして時間（装填時間に比較した時間）に対するこれらの測定値のグラフを、カラムから溶出したタンパク質として、自動的に記録した。ラクトアルブミンはダイズ・トリプシン阻害剤より前に溶出した（１５．４分に比較して、約１１．２分）。作業工程の間に、０．２ｍｌ  ２Ｍ  ＮａＣｌを注入し、その後、緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂの交互の洗浄を２セット行い、その後、緩衝液Ａで最後の洗浄を行うことによって、カラムを清浄にした。
【００５４】
ＴＮＦＲ：Ｆｃの２００μｌまでの体積（約０．２５ｍｇ／ｍｌ）を陰イオン交換カラムに装填し、そして上に説明するように、直線勾配をカラムに流した。ダイズ・トリプシン阻害剤の後に溶出するＴＮＦＲ：Ｆｃピークの部分は、高塩で溶出すると見なされた。曲線下の総面積と、ダイズ・トリプシン阻害剤の後に溶出する曲線下の面積を比較することによって、高塩で溶出するＴＮＦＲ：Ｆｃの割合を決定した。各場合で、別個の実験において、マンノース、フルクトース、ガラクトース、またはＮ−アセチルマンノサミンを含まずに増殖させた細胞培養物に産生されたＴＮＦＲ：Ｆｃのバッチからの同様の割合と、この数字を比較した。
【００５５】
結果を図２に示す。添加される糖を含まない本実験由来の対照培養物は、１００％よりごくわずかしか高くない事実によって、ＴＮＦＲ：Ｆｃのシアル酸付加は、バッチ間でほぼ一定でありうることが示される。これらのデータはまた、Ｎ−アセチルマンノサミン、フルクトース、マンノース、およびガラクトース（各４ｍＭの濃度）中で増殖させた培養物が、試験したあらゆる組み合わせのＴＮＦＲ：Ｆｃシアル酸付加のうち、最高レベルを生じたことも示す。さらに、糖の以下の組み合わせで増殖させた培養物由来のＴＮＦＲ：Ｆｃもまた、シアル酸付加の増加を示した：（１）ガラクトースのみ；（２）フルクトースおよびガラクトース；（３）フルクトース、ガラクトース、およびマンノース；並びに（４）Ｎ−アセチルマンノサミンおよびガラクトース。
【００５６】
（実施例２）
Ｎ−アセチルマンノサミンおよび糖の最適濃度を決定するための、応答曲面のサンプリング
本実験を行って、ＴＮＦＲ：Ｆｃのシアル酸付加を増加させるための、増殖培地中のＮ−アセチルマンノサミンおよびフルクトース、マンノース、並びにガラクトースの最適濃度を決定した。本実験はまた、最低濃度のＮ−アセチルマンノサミンで、ＴＮＦＲ：Ｆｃの最大のシアル酸付加を達成する組み合わせを決定することも目指す。
【００５７】
ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤＳＴＭ（水中の分画ダイズ油および分画卵リン脂質の無菌エマルジョン）、インスリン様増殖因子−Ｉ、およびブチレートを含み、図３に示す培地添加剤を含む、すなわち、多様な濃度のＮ−アセチルマンノサミンおよび／または等モル量のフルクトース、ガラクトース、およびマンノースを含有する糖カクテルを含む、血清不含培地３０ｍｌを含有する１３フラスコ各々に、実施例１で用いたのと同じＣＨＯ細胞株、約２．０ｘ１０６細胞を接種した。
【００５８】
培地添加剤濃度の組み合わせを選択して、応答曲面をサンプリングした。例えばＯｅｂｅｒｇおよびＤｅｍｉｎｇ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇ．  Ｐｒｏｃｅｓｓ，  Ａｐｒｉｌ，  ２０００：５３−５９を参照されたい。２つ組培養物５つを用いて、図３の中心点のデータを生じ、そして８つの他の培養物は各々、図３の８つの軸方向の点の１つのデータを生じた。１分あたり１５０回転で振盪しながら、３０℃で７日間増殖させた後、培地からＴＮＦＲ：Ｆｃを採取し、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって前精製した。組換えタンパク質１モルあたりのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）のモル数を以下のように決定した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後、２８０ナノメートルの吸光度を読み取ることによって、ＴＮＦＲ：Ｆｃの濃度を測定し、そしてリン酸緩衝生理食塩水に希釈することによって、タンパク質濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した。シアリダーゼ（米国カリフォルニア州ナバトのＧｌｙｋｏ，  Ｉｎｃ．から得た）を、２ｘインキュベーション緩衝液（２００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）中、１ｍＵ／μｌ（１ユニットは、ｐＨ５および３７℃で、１分あたりに１μｍｏｌのＮＡＮＡを切断するのに必要な酵素量）に希釈した。ＴＮＦＲ：Ｆｃおよびシアリダーゼ（各１０μｌ）を混合し、そして３７℃で４時間インキュベーションした。その後、３０μｌの水を添加することによって、混合物をＴＮＦＲ：Ｆｃ  ０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用い、パルスアンペロメトリック検出を用いて流出を監視して、遊離したシアル酸を検出し、そして定量化した。パルスアンペロメトリック検出は、クリーニングパルス（電極を汚してそして正確な読み取りを妨げる解析物を除去する）とともに、ＮＡＮＡを検出するのに適したポテンシャルの検出パルスを撒き散らす電極を利用する。例えば米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの商業的供給元から購入した、既知の量のＮＡＮＡを用いて、実験試料を測定する前および測定した後、両方で、この系を較正した。高性能陰イオン交換クロマトグラフィーおよびパルスアンペロメトリック検出を行う系を、米国カリフォルニア州サニーベールのＤｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。
【００５９】
図３に示す結果は、データの統計解析およびグラフ提示用のコンピュータソフトウェア（ＪＭＰ（登録商標）、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国ノースカロライナ州ケリーから入手可能）を用いてプロットされた。最高レベルのＴＮＦＲ：Ｆｃシアル酸付加は、各３ｍＭのフルクトース、ガラクトース、およびマンノース、並びに５ｍＭをわずかに越えるＮ−アセチルマンノサミンで観察された。しかし、３ｍＭのフルクトース、ガラクトース、およびマンノースを、３ｍＭよりわずかに少ないＮ−アセチルマンノサミンを含有する培養物に添加すると、シアル酸付加のレベルは、約５ｍＭのＮ−アセチルマンノサミンを用いた際に見られるものとほぼ同等であった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、糖タンパク質のシアル酸付加につながる代謝経路ネットを示す。ＣｏｒｆｉｅｌｄおよびＳｃｈａｕｅｒ（１９７９），  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ  ３５：２１３−２６；ＧｕおよびＷａｎｇ（１９９８），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ５８（６）：６４２−４８。本発明で使用する分子を四角で囲む。点線を含んでなる矢印に隣接するマイナス記号によって、負のフィードバックを示す。
【図２】図２は、示した添加剤を含む培地中で増殖させた培養物によって、抗体のＦｃ領域に融合させた腫瘍壊死因子受容体の細胞外領域（米国特許第５，３９５，７６０号に記載されるＴＮＦＲ：Ｆｃ）が産生される際の、陰イオン交換カラム上のＴＮＦＲ：Ｆｃの高塩溶出の割合を比較する。すべての試料は、添加剤を含まずに増殖させた培養物に産生されるもの（「対照」と標示）を含めて、別個の実験において、培地添加剤を含まずに増殖させた培養物に産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃの単一バッチに比較される。
【図３】図３は、ＪＭＰコンピュータソフトウェア（本明細書に記載）を用いて作成した等高線プロットであり、示した濃度のＮ−アセチルマンノサミンおよび糖（フルクトース、ガラクトース、およびマンノース）を含む培地中で増殖させた培養細胞により産生されるＴＮＦＲ：Ｆｃ  １モルあたりのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）モル数を示す（太字で示し、そしてこの実験でサンプリングした各々のデータポイントの隣に四角で囲み、そして各々の等高線の一部となるように標識付けした）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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