(57)【要約】本発明は、水溶液を受容するための容器（20，30）であって、該水溶液を受容するための内部チャンバー（20，30）を形成する外部リミット（21）により少なくとも部分的に形成されており、電圧を施用しその後放電が起こるときに電極として作用する少なくとも１つの領域（25，26，33，34）を含む容器に関する。少なくとも１つの電極（25，26，33，34）は、少なくとも１種の導電性材料をドープした少なくとも１種のプラスチック材料に基づき、導電性合成材料で作られている。したがって、上記の形態を有する容器（20，30）は、再生産するのが容易かつ経済的であり、また例えば、エレクトロポレーション又は有効エレクトロフュージョンにより生存細胞の効率的なトランスフェクションが可能となる。
2005526499.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液、並びに特に細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を受容するための容器（20，30）であって、前記溶液を受容するための内部チャンバー（22，32）を形成する外部リミット（21）により少なくとも部分的に形成され、電圧を施用しその後放電が起こるときに電極として作用する少なくとも１つの領域（25，26，33，34）を含んでおり、その際、少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、少なくとも１種の導電性物質がドープされたプラスチック材料を少なくともベースとする導電性合成材料で作られている前記容器。
【請求項２】
前記ドープが、炭素繊維、グラファイト、すす、カーボンナノチューブ及び／又は本質的に導電性である合成材料からなる、請求項１記載の容器。
【請求項３】
前記プラスチック材料中の前記ドープの全濃度が、１０〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜６０％ｗ／ｗ、より好ましくは４０〜６０％ｗ／ｗ、最も好ましくは５０〜６０％ｗ／ｗ、特に５５〜６０％ｗ／ｗである、請求項１又は２に記載の容器。
【請求項４】
前記プラスチック材料中の前記ドープの全濃度が、４０〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは５０〜８０％ｗ／ｗ、より好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗ、最も好ましくは７０〜８０％ｗ／ｗ、特に７４〜７６％ｗ／ｗである、請求項１、２又は３に記載の容器。
【請求項５】
前記プラスチック材料が、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド、若しくはこれらのポリマーの混合物であるか、又はこれらのポリマーの１種又は複数種を少なくともベースとする、及び／又は前記プラスチック材料が、本質的に導電性である合成材料である、請求項１〜４のいずれかに記載の容器。
【請求項６】
前記本質的に導電性である合成材料が、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリ−パラ−フェニレン、ポリ−パラ−フェニレンスルフィド、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリプロピレンなどであるか、又はこれらのポリマーの１種又は複数種を少なくともベースとする、請求項２〜５のいずれかに記載の容器。
【請求項７】
前記外部リミット（21，31）が、合成材料、好ましくは透明のプラスチック材料で作られている、請求項１〜６のいずれかに記載の容器。
【請求項８】
前記外部リミット（21，31）が、前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）がベースとするプラスチック材料と同じプラスチック材料で作られている、請求項７記載の容器。
【請求項９】
前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、前記外部リミット（21，31）に一体化されている、請求項１〜８のいずれかに記載の容器。
【請求項１０】
同じ材料で作られている少なくとも２つの電極（25，26，33，34）を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の容器。
【請求項１１】
少なくとも２つの電極（25，26，33，34）が異なる材料で作られている、請求項１〜１０のいずれかに記載の容器。
【請求項１２】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、ポリアミド、特に、２５〜４５％ｗ／ｗ、好ましくは３０〜４０％ｗ／ｗ、特に３３〜３７％ｗ／ｗの炭素繊維と、１５〜３５％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜３０％ｗ／ｗ、特に２３〜２７％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリアミド６６又はポリアミド６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１３】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、ポリアミド、特に、３０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは３５〜４５％ｗ／ｗ、特に３９〜４１％ｗ／ｗの炭素繊維と、２５〜４５％ｗ／ｗ、好ましくは３０〜４０％ｗ／ｗ、特に３４〜３６％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリアミド６６又はポリアミド６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１４】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、１５〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗの炭素繊維と、１〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは１５％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリカーボネートで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１５】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、３０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは４０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリエーテルエーテルケトンで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１６】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、２０〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは３０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリアミド、好ましくはポリアミド６６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１７】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、１５〜４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリプロピレンで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１８】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、３０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは４０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリフェニレンスルフィドで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１９】
前記外部リミット（21，31）が、前記溶液を供給するための少なくとも１つの開口部と、前記溶液を排出するための少なくとも１つの開口部とを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の容器。
【請求項２０】
１つのユニットを造るようにつながれた請求項１〜１８のいずれかに記載の容器（20，30）を少なくとも２つ、好ましくは６、１２、２４、４８、９６又はそれより多く含む、容器配列。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の容器又は容器配列を製造するための方法であって、前記容器（20，30）又は前記容器配列が二材射出成形により製造され、その際、はじめに外部リミット（21，31）が射出成形されて、１つのくぼんだ窓が形成され、続いて、ドープされたプラスチックで作られている導電性合成材料が前記少なくとも１つの窓の中に射出成形されるか、又ははじめに前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、前記ドープされたプラスチック材料から射出成形され、続いて、前記外部リミット（21，31）が前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）の周りに射出成形される前記方法。
【請求項２２】
特にエレクトロポレーション又はエレクトロフュージョンのため電流により、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を処理するための方法であって：
ａ）前記細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を、請求項１〜１９のいずれかに記載の少なくとも１つの容器（20，30）か又は請求項２０記載の容器配列の少なくとも１つの容器の内部チャンバー（22，32）中に移し、その際、前記容器（20，30）は、ドープされた合成材料で作られている少なくとも１つの電極（25，26，33，34）と、少なくとも１つの更なる電極（25，26，33，34）とを含み、そして
ｂ）電圧を前記電極（25，26，33，34）に施用し、前記容器（20，30）の前記内部チャンバー（22，32）中に電流の流れを発生させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記電流が、１２０Ａ／ｃｍ2、好ましくは８０Ａ／ｃｍ2までの電流密度に到達する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生理活性分子、特に核酸が前記溶液中に溶解され、前記生理活性分子の生存細胞への移動が、場の強さが２〜１０ｋＶ＊ｃｍ-1であり継続時間が１０〜２００μｓである電圧パルスにより達成される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生理活性分子の前記細胞への前記移動が、前記電圧パルスの後に間断なく流れ、電流密度が２〜１４Ａ＊ｃｍ-2、好ましくは５Ａ＊ｃｍ-2であり、継続時間が１〜１００ｍｓ、好ましくは５０ｍｓである電流の流れにより達成される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、水溶液、並びに特に細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を受容するための容器であって、前記溶液を受容するための内部チャンバーを形成する外部リミットにより少なくとも部分的に形成され、電圧を施用しその後放電が起こるときに電極として作用する少なくとも１つの領域を含む前記容器に関する。
【０００２】
発明の背景
例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質などの生理活性分子を生存細胞中に移すことは、これらの分子の生理的機能の分析のための重要な手段である。エレクトロポレーションは、外来分子を細胞中に移すのに好ましい方法であり、化学的方法とは対照的に、標的とする細胞の生物学的な構造や機能に不所望な変化を起こすことが少ない。エレクトロポレーションの間、外来分子は、短時間の電流の流れ、すなわちの放電コンデンサーのパルスにより、水溶液、好ましくは細胞に適合された緩衝液又は細胞培地から細胞中に導入され、それにより、細胞膜は、短い電気的パルスの影響で外来分子が透過できるようになる。溶液及び細胞懸濁液は、それぞれ、通常はいわゆるキュベット、すなわち頂部が開放しており、底部付近の側壁に配置され電圧を施用するのに役立つ向かい合って平行に配列された２つの電極を含んでいる、小さい容器中に提供される。一時的に現れる細胞膜中の「穴」を通して、生理活性分子ははじめに細胞質に到達し、そこで分子は、最終的には早くも、分析すべきそれらの機能を発揮する。一定の条件では、分子は続いて同様に細胞の核に入る。特定的には、ＤＮＡの動物細胞中への導入、いわゆるトランスフェクションに関して、トランスフェクションの効率は重要なパラメータとして細胞の生存率の影響を受けることから、これらの細胞の脆弱性のため、エレクトロポレーションの間に具体的な問題が生じることが多い。
【０００３】
同様に、一時的に施用される強い電界、すなわち、電流密度の高い、短いパルスにより、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を融合させることができる。このいわゆるエレクトロフュージョンの間に、はじめに例えば、不均一な交流電界により複数の細胞の膜が密に接触させられる。その後の電界パルスの施用により、膜の各部の相互作用がもたらされ、最後に細胞融合につながる。エレクトロポレーションのために使用されるものなどと同等の装置をエレクトロフュージョンのために同様に使用することができる。
【０００４】
関連技術の説明
これまでに説明したような容器は既知であり、主として、金属製の電極が挿入されたキュベットの形態でエレクトロポレーション又はエレクトロフュージョンに使用されている。この目的のために使用される容器は、主として、底部で閉鎖され頂部で開放されている小さい容器であり、その内部空間は平行かつ向かい合って配列された二対の側壁により造られている。この内部空間は、細胞懸濁液、すなわち、通常は、処理すべき細胞を懸濁した水性緩衝液又は細胞培地を受容するのに役立つ。このようなキュベットは主として、向かい合って配列された一対の側壁の底部付近に配置された、電圧を施用するための一対の電極を含む。放電の間、電流が両方の電極の間の細胞懸濁液を通って流れ、それにより核酸又は他の分子を細胞中に導入することが可能となり、あるいは選択した条件に依存して、細胞の融合につながる。これら電極は、主として金属で作られており、アルミニウムがしばしば使用される。しかし、放電の間に金属イオンが緩衝液中に放出され、それにより、低濃度で細胞の不所望な刺激を引き起こし、また高濃度では、細胞に対して毒性の作用をすることは、これらの既知の商業的に入手可能なキュベットの不都合な点である。例えば、アルミニウム製のキュベットを用いると、Ａｌ3+イオンの放出によるマイナスの効果が実証されるであろう（Loomis-Husselbee et al., Biochem J 1991, 277 (Pt 3), 883-885）。そのうえ、金属製電極を有するキュベットを用いると、不所望な沈殿が発生することがあり、このことは、電極からの金属イオンの放出によっても同様に発生する。この沈殿は、金属の水酸化物、又は金属イオンと緩衝溶液からの生物学的巨大分子との錯体である場合がある（Stapulionis, Bioelectrochem Bioenerg 1999, 48(1), 249-254）。最終的に、おそらく、高い抵抗の酸化されたアルミニウムの層が電流の流れにより電極から放出されるという理由で、キュベットの抵抗が放電の間に低くなることは、アルミニウム製キュベットの別の不都合な点である。更に、金属製電極を有するキュベットは、製造するのが困難であり、非常に費用がかかる。
【０００５】
ＵＳ６，００１，６１７には、細胞の培養のための装置が開示されており、この装置は細胞のエレクトロポレーション並びにエレクトロフュージョンのために使用することができる。この装置は、その上に細胞の層が付着し増殖することができる光学的に透明な底部を有する円形容器からなる。この容器の底部は、導電性材料で被覆された光学的に透明な非導電性材料を有する容器からなってもよく、又は完全に、光学的に透明で導電性の材料から作られることができる。導電性の底部は、金属製の帯状電極を介して接触し、壁領域において周囲に配置される。対電極として作用するため、同様の環状帯が提供される。この既知の装置の一つの欠点は、主として、付着性細胞のエレクトロポレーションのために提供され、このために適していることである。この装置を懸濁させた細胞のトランスフェクションのために使用することは限定的であり、単に低効率が許容される場合に可能であるに過ぎない。同様に壁領域において周囲に配置されている底部電極と対電極との環状の円形接触により、均一な電界を生じさせることができないので、すべての細胞について等しいトランスフェクションを行うことができない。使用される本質的に導電性のプラスチックが薄いコーティングとして提供されるとより高い抵抗を有するという事実は、この効果を大きくしている。したがって、表面の中心において底部に付着している細胞は、非常に低い効率でしかトランスフェクションすることができない。そのうえ、精巧な構成と、使用される本質的に導電性であるプラスチックが鋳型成形することができないという事実のため、この既知の容器の製造は非常に費用がかかる。
【０００６】
本発明の説明
したがって、本発明の目的は、現存する欠点を克服するため、簡単かつ高い費用効果で製造することができ、電流を使用して、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞の効率的な処理を可能とする、これまでに説明したような容器を創造することである。
【０００７】
本発明にしたがえば、この目的は、少なくとも１つの電極を、少なくとも１種の導電性物質がドープされたプラスチック材料を少なくともベースとする、導電性合成材料で作ることで解決される。金属イオンの放出を避けるため、ドープされたプラスチックで作られている導電性合成材料を使用する。したがって、Ａｌ3+イオンの放出の間などの例えば、生存細胞に対する毒性の効果を避けることができる。生じる生成物の医薬適合性も同様にこのようにして高められるので、例えば、半ビボの遺伝子治療のためのトランスフェクトされた一次細胞（primary cell）使用の可能性が支持される。プラスチックを導電性物質でドープする結果として、放電の間、両方の電極間の電流の流れを実現することができ、この電流の流れは広く使用されている金属電極を有するキュベットと等しい。驚くべきことに、エレクトロポレーションに関して、使用済みのドープされたプラスチック材料を使用すると、例えば、アルミニウム製電極を有するキュベットを使用する場合と比較して、トランスフェクション効率に関して良好な結果を達成できることが判明した。金属イオンの放出により引き起こされる毒性の効果を避けることにより、トランスフェクション効率の細胞死亡率に対する比は有意に高くなる。本発明にしたがった容器の更なる利点は、放電の間に溶液中に沈殿が生成されないことである。沈殿は細胞に付着して、それぞれ、更なる分析やトランスフェクトされた細胞の使用に障害を生じさせると考えられる。使用されるドープされたプラスチック電極に対して緩衝液の影響が少ないということは、本発明にしたがった容器のなお更なる利点であることは明らかである。放電のために電極の表面で非常に高い抵抗が発生し、この抵抗により、リン酸塩を含有するが塩化物を含有しない緩衝液をアルミニウム製キュベットに関して使用した場合、所与の出発電流では電流の劇的な減少が引き起こされることが実際に判明した。驚くべきことに、このことは、それぞれ本発明にしたがった容器と電極とを使用することにより避けることができる。したがって、本発明にしたがった容器は、単に溶液の導電性により影響を受けるに過ぎず、使用される緩衝液により悪影響を受けない。ドープされた合成材料は、本質的に導電性であるプラスチックと対照的に射出成形することができるので、本発明にしたがった容器は、一つの鋳型で二材射出成形を用いて射出成形することができる。したがって、本発明にしたがった容器は、簡単で費用効果の高いやり方で製造することができる。このドープされたプラスチック材料は、例えば、１．３〜１．５ｇ／ｃｍ3の密度、好ましくは１．３７又は１．５４ｇ／ｃｍ3の密度を有し、２３０〜３１０℃の融解温度を有していてもよい。好ましくは、ドープされたプラスチック材料は、２オーム×ｃｍ以下の比順方向抵抗及び１０4オーム以下の比入力抵抗を有する。
【０００８】
合成材料の導電性に関しては、ドープが炭素繊維、グラファイト、すす、カーボンナノチューブ及び／又は本質的に導電性である合成材料からなる場合に特に有利であることが分かった。ドープのプラスチック材料中の全体濃度は、１０〜８０％ｗ／ｗであるものとする。合成材料の導電性は、１０％より低いと充分ではなく、８０％を超えると合成材料を射出成形する可能性は極端に低くなる。本発明にしたがった容器を細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞のエレクトロポレーション又はエレクトロフュージョンに関して用いて、ドープの全体濃度が２０〜６０％ｗ／ｗ、より好ましくは４０〜６０％ｗ／ｗ、特に好ましくは５０〜６０％ｗ／ｗ、特に５５〜６０％ｗ／ｗであることは導電性に関して特に有利であることが示された。
【０００９】
幾つかの用途、特にＤＮＡを一次細胞の核にトランスフェクションは、充分に高い効率を達成するのに、溶液中において、それぞれ、特に高い電流及び電界強度が必要である。このような場合においては、プラスチック材料中のドープの全体濃度が４０〜８０％ｗ／ｗである場合に有利である。これにより、電極の高い導電性が保証されるので、溶液と容器の内部空間のそれぞれを通る充分に高い電流の流れ可能となる。本発明の有利な態様においては、ドープの濃度は、処理すべき細胞の用途とタイプに依存して、５０〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗ、より好ましくは７０〜８０％ｗ／ｗ、特に７４〜７６％ｗ／ｗであってもよい。この点に関して、ドープが８０％ｗ／ｗまでの高い濃度を有する場合であっても、材料の充分な射出成形可能性が保証される。この点では、ドープの特定的な混合物、例えば、炭素繊維及びグラファイトの使用は、成形可能性にプラスの影響を与え得る。
【００１０】
合成材料の射出成形可能性に関しては、プラスチック材料が、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド若しくはこれらのポリマーの混合物、又はこれらのポリマーの１種又は複数種を少なくともベースとする、及び／又は前記プラスチック材料が本質的に導電性である合成材料である場合に、特に有利であることが分かった。この点において、ポリアミド６６又はポリアミド６の使用が特に有利である。
【００１１】
合成材料自体に本質的に導電性である合成材料をドープする場合、本発明の都合のよい態様が提供され、ここで、本質的に導電性である合成材料は、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリ−パラ−フェニレン、ポリ−パラ−フェニレンスルフィド、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリプロピレンなどであるか、又は少なくともこれらのポリマーの１種若しくは数種をベースとする。
【００１２】
本発明の別の都合のよい態様においては、外部リミットは、合成材料、好ましくは透明のプラスチック材料で作られ、なぜなら容器全体を射出成形法を用いて製造することができるからである。この点において、外部リミットが、少なくとも１つの電極がベースとするプラスチック材料と同じプラスチック材料で作られている場合に有利であろう。この態様においては、二材射出成形を用いた合成材料の処理に関して利益が存在し得る。それによって、一方では、製造が簡単となり、一方では、製造コストが低減される。しかし、特別な用途のためには、外部リミットは他の材料からなってもよい。
【００１３】
本発明の特に都合のよい態様においては、少なくとも１つの電極が前記外部リミットの中に組込まれるので、容器を１つの鋳型で射出成形することができる。
本発明の好ましい態様においては、この容器は同じ材料で作られている少なくとも２つの電極を含む。殆どの用途は、容器及びキュベットを使用し、それらはそれぞれ、同じ材料からなる、向かい合って配列された平行な２つの電極を有する。これら２つの電極は、適する様式で接触しており、それにより、それぞれの要求に適合された電圧源と接続している。しかし、特別な場合においては、少なくとも２つの電極が異なる材料で作られていることも有利であり得る。これらの場合、アノード又はカソードは、ドープされた合成材料からなってもよく、それぞれの対電極は別の材料、例えば、ステンレス鋼又は本質的に導電性である合成材料からなってもよい。
【００１４】
請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の導電性合成材料で作られた電極を含む容器は、生存細胞のトランスフェクションに特に都合のよいことが分かった。これらの容器は、容易に加工することができる電極材料と組み合わさって、高い導電性を有する。
【００１５】
本発明の別の態様においては、外部リミットは、溶液を供給するための少なくとも１つの開口部と、溶液を排出するための少なくとも１つの開口部とを含む。本発明に従った容器は、それにより、溶液が内部チャンバーを通って連続的又は不連続的に流れる流通容器として使用することができる。
【００１６】
本発明にしたがった容器は、都合のよいことには、少なくとも２つの、好ましくは６、１２、２４、４８、９６又はそれより多くの、１つのユニット（すなわち、いわゆる「マルチウェル」）を造るようにつながれた容器を含む容器配列の形態に適している。本発明の特定の利点は、本発明にしたがった容器又は容器配列が、容器又は容器配列を二材射出成形により製造する方法であって、その際、はじめに外部リミットを射出成形して、１つのくぼんだ窓を形成し、続いて、ドープされたプラスチックで作られている導電性合成材料を少なくとも１つの窓の中に射出成形するか、又ははじめに前記少なくとも１つの電極を、ドープされたプラスチック材料から射出成形し、続いて、外部リミットを少なくとも１つの電極34）の周りに射出成形される前記方法を用いて製造できるということである。金属からなる電極をもち、それら電極を、容器の成形前か又は後に、成形された枠又は鋳型中に手動又は自動で配置しなければならない、容器又はキュベットの製造とは反対に、本発明は、非常に簡単でコスト効果の高い製造法を提供する。本発明にしたがった容器又は容器配列は、１つの鋳型で二段階法により射出成形できるので、それらの製造のコストは、エレクトロポレーション又はエレクトロフュージョン用キュベットの製造のための通常のコストと比べて有意に低い
都合のよいことには、本発明にしたがった容器又は容器配列は、電流による細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞の処理のための方法における使用に特に適する。その際、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞は、少なくとも１つの容器又は容器配列のうちの少なくとも１つの容器の内部チャンバー中に移され、ここで、前記容器は、ドープされた合成材料で作られている少なくとも１つの電極と、少なくとも１つの更なる電極とを含み、そしてここで、次いで電圧が前記電極に施用され、前記容器の内部チャンバー中に電流が発生する。この方法において、電流は、１２０Ａ／ｃｍ2まで、好ましくは８０Ａ／ｃｍ2までの電流密度に到達してもよく、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞は、懸濁液で、又は付着されたか、さもなければ固定された状態で提供されてもよい。
【００１７】
したがって、他の可能性のある用途に比べて、本発明にしたがった容器又は容器配列は、例えば、エレクトロポレーション、すなわち電流を用いて生理活性分子を生存細胞中に導入するための方法に適している。その際、生理活性分子、特に核酸は、前記溶媒中に溶解され、前記生理活性分子の生存細胞への移動は、電界強度が２〜１０ｋＶ＊ｃｍ-1であり、継続時間が１０〜２００μｓである電圧パルスにより達成される。続いて、前記電圧パルスの後に間断なく流れ、電流密度が２〜１４Ａ＊ｃｍ-2、好ましくは５Ａ＊ｃｍ-2であり、継続時間が１〜１００ｍｓ、好ましくは５０ｍｓである電流の流れを提供することができる。この方法において、細胞は例えば、懸濁液又は付着性細胞層として使用することができる。
【００１８】
本発明にしたがった容器又は容器配列は、例えば、エレクトロフュージョン（例えば、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞の電流を用いた融合のための方法）にも適している。ここで、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞は、例えば、水溶液中に適する密度で懸濁され、この懸濁液は、続いて本発明にしたがった容器又は容器配列中に移され、最後に電極に電圧が施用され、溶液を通る電流が発生する。別の態様では、例えば、付着性細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を融合することができ、同様に例えば、付着精細胞を、懸濁させた細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子又は小胞と融合することができる。
【００１９】
図面を参照しながら本発明を以下に詳細に説明する。
図１は、それぞれ、本発明を実証し、本発明にしたがった容器を試験するための実験アセンブリ１の透視図を示す。この実験アセンブリ１は、本発明にしたがった容器の構成と等しいものであり、スペーサー板２及びスペーサー板２の両側に対してプレスされた２つの電極３，４を含む。スペーサー板２は、２ｍｍの厚さを有するテフロン（登録商標）製の板であり、Ｕ字状に形成されたくぼみ５を有する。電極３，４は、少なくとも１種の導電性物質がドープされた合成材料からなる。この合成材料は、例えば、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド、又はこれらのポリマーの混合物、及び／又は本質的に導電性である合成材料であってもよい。スペーサー板２及び両方の電極３，４を含む３つの層は、ともに両側でサンドイッチのように銅板６，７によりプレスされる。この目的のため、銅板６，７を、万力のような装置（示さず）のねじ込み部８，９により他方に向かって動かす。上で述べた層をともにプレスすると、次いでくぼみ５の範囲において内部空間１０が形成され、この内部空間はそれぞれ溶液及び細胞を受容する能力を有する。図示したモデルにおいて、内部空間１０は、１００ｍｌの体積を受容することができる。内部空間１０は、更に、スペーサー板２の内部エッジ１１により底部及び両方の側部において、そして電極３，５により２つの残りの側部において形成される。銅板６，７は、慣用的なエレクトロポレーション装置、すなわち電圧源のばね接点に２つの線を介して電気的に接触される。電極３，４自体は、それらの全体の外部表面を介して銅板に直接接触しているので、最良の電気的接触が保証される。したがって、示すような例示的なアセンブリ１を用いて、電圧パルスを銅板６，７に施用すると、溶液と細胞懸濁液がそれぞれ充填された内部空間１０を通って電極３，４の間を電流が流れる。
【００２０】
図２は、ポリカーボネートと２０％炭素繊維及び１５％グラファイトとで作られた（ＰＣ＋ＣＦ＋Ｇｒ）、本発明にしたがった電極を用いた放電の電流の流れを、アルミニウム製電極の使用と比較して示す。このアプローチでは、２つの異なる緩衝液を通る電流の流れを測定した（溶液Ａ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１及び２５ｍＭ塩化カリウム；溶液Ｂ：１４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１）。１０００Ｖで継続時間４０μｓの第一の電圧パルスを常に施用し、続いて中断することなく、９０Ｖの出発電圧（Ｕstart）及び７５ｍＣの電荷を有する第二のパルスを施用する。第二のパルスのそれぞれの電流の流れをこの図に示す。驚くべきことに、本発明にしたがった合成材料製の電極を使用した場合に、アルミニウム製の慣用的な電極により達成できるのと同じ条件下で、そのスケールをもつ同様の電流の流れを達成できることが分かった（比較ａ及びｃ）。したがって、ドープされた合成材料は、高い電流密度を短い時間間隔で伝導するのに特に適している。塩化物を含まないリン酸塩緩衝液（溶液Ｂ）を用いると、塩化物を含有するリン酸塩緩衝液（溶液Ａ）の使用とは対照的に、放電の間に、徐々にアルミニウム製電極の表面で非常に高い抵抗が発生し、それにより、同じ出発電流で劇的な電流の流れの減少が引き起こされることが分かった（ｂ）。このマイナスの効果は、ドープされた合成材料を使用する場合には起こらない（ｄ）ので、通常使用されるキュベットとは反対に、本発明にしたがった容器又は電極は、塩化物を含まないリン酸緩衝液の使用にも適している。したがって、本発明にしたがった容器を用いると、緩衝液の選択は、慣用的な容器の使用に関するほど限定的ではない。
【００２１】
図３は、図１にしたがった実験アセンブリ１と比較して改変された、実験アセンブリ１２の透視図を示す。図１にしたがった実験アセンブリ１は、電極３，４が大きい表面で比較的高い圧力を用いて銅板６，７と接触している配列を示す。例えば慣用的なエレクトロポレーション装置に関して、電極の外側の接触は、通常、そのような大きな表面でそのような高い圧力で実現されることはないので、この実験アセンブリ１２においては、電極に接触している表面は小さく設計する。したがって、このアセンブリは、ばね接点による接触と等しいので、現実の実際の条件と等しい。この目的のため、約１．５ｍｍの直径を有する円形及びｖ字状に曲げられた線１３，１４を、電極３，４とそれぞれ隣接して配列された銅板６，７の間に配置した。続いて、図４は、図１及び３にしたがった実験アセンブリを使用する場合の電流の流れの比較を示す。
【００２２】
図４は、図１にしたがった実験アセンブリ１のための（ａ）、並びに図３にしたがった実験アセンブリ１２のための（ｂ）、炭素繊維２０％を含むポリカーボネート製の電極を用いた放電の電流の流れを示す。第二パルスの電流の流れを常に示す（１．パルス：１００Ｖ，４０μｓ；２．パルス：Ｕstart＝９０Ｖ，７５ｍＣ）。一定の結果は、明らかに電位は電極の内部に安定して分布するので、接触表面は導電性に関して制限因子ではないことを示している。
【００２３】
図５は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。本発明にしたがった容器の機能を生理的に測定するため、図１に説明した実験配列を用いてトランスフェクション実験を行った。この目的のため、適する緩衝液、例えばＰＢＳ（食塩加リン酸緩衝液）１００μｓ中にＣＨＯ細胞を懸濁させ、発現プラスミドｐＨ−２Ｋk（マウスＭＨＣクラスのＩタンパク質の重鎖をコードするＤＮＡベクター）を添加し、次いで、実験アセンブリの内部空間へと移した。次いで、細胞のエレクトロポレーションをパルスを２回施用することにより実施する（１．パルス：１０００Ｖ，１００μｓ；２．パルス：Ｕstart＝１０８Ｖ，１００ｍＣ）。続いて、細胞懸濁液を取り出し、適する培地、例えばＲＰＭＩ培地中に移し、３７℃、５％ＣＯ2で約２０時間培養した後回収した。付着しているＣＨＯ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．１％トリプシン＋２ｍＭエチレンジアミンテトラアセテートを用いて剥がした。抗体染色法（ＰＢＳ中１：１００アンチ−Ｈ−２Ｋｋ（Becton Dickinson）＋１：５０ベリグロビン（Aventis Behring），室温で１０分）を用いて、Ｈ−２Ｋkの発現が明らかとなった。死亡細胞は、０．２５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムにより染色した。分析は、フロー・サイトメトリー（FACScalibur, Becton Dickinson）中で実施した。図ａ）及びｂ）は、ドープされた合成材料（ＰＣ／ＣＦ／Ｇｒ＝ポリカーボネート＋２０％炭素繊維＋１５％グラファイト及びＰＥＥＫ−ＣＦ＝ポリエーテルエーテルケトン＋４０％炭素繊維）電極を用いると、アルミニウム製電極の使用と比較して、トランスフェクション効率に関して少なくとも同様な結果を達成することができることを示している。有意に低い死亡率のため、本発明にしたがった電極を使用する場合は、トランスフェクション効率の死亡率に対する比が良好であることから、慣用的な電極の使用と比較して有意な利点が達成される。
【００２４】
図６は、トランスフェクトされたＨＬ６０（ヒトリンパ腫細胞）のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。このアプローチの実現と条件は、エレクトロポレーションの間に電圧パルスを改変した（ここで：１．パルス：１０００Ｖ，７０μｓ；２．パルス：Ｕstart＝８１Ｖ，２２ｍＣ）ことを除いて、図５において説明したものと一致する。このアプローチにおいて、ドープされた合成材料で作られた電極を用いて結果が得られ、その結果はアルミニウム製電極を使用した場合の結果と少なくとも同様である。
【００２５】
図７は、３０％炭素繊維がドープされたポリアミド６６で作られた、本発明にしたがった電極を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ−細胞系）のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。５μｇのプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１に関して、１５０Ｖ及び５μｓのパルスにより、続いて、１０８Ｖの出発電圧及び８０ｍＣの電荷を有するパルスにより、フェノールレッドを用いずに１００μｌＲＰＭＩ培地中でエレクトロポレーションを実施した。４時間後に分析を実施した。この実験においては同様に、本発明にしたがったドープされた合成材料で作られた容器又は電極の使用により、慣用的なアルミニウム製の電極と比較して、トランスフェクション効率並びに生存率を有意に高めることができた。したがって、図５〜７に示した結果は、本発明にしたがった容器を使用した場合に、慣用的なキュベットと比較して、エレクトロポレーションにおいてトランスフェクション効率を有意に高めることができ、死亡率を有意に低減できることを明らかに証明している。このことは主として、驚くべきことに、本発明にしたがった電極を用いると、電極からの金属イオンの放出による既知の欠点とそれによる細胞への毒性の効果とを避けることができ、同様な電流の流れを保証することができるという事実により説明することができる。
【００２６】
図８は、４０％炭素繊維がドープされたポリフェニレンスルフィドで作られた、本発明にしたがった電極を用いてトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の、アルミニウム製の慣用的な電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図を示す。トランスフェクションは、５μｇ／１００μｌプラスミドＤＮＡを含む細胞培地中で行い、その際、このアプローチにおいては、ドープされた合成材料のやや低い導電性を補償するため種々の電圧パルスを施用した（ＰＰＳ／ＣＦについてのパルス：１０００Ｖ，１００μｓ；アルミニウムについてのパルス：５００Ｖ，１００μｓ）。６０時間の培養後、細胞をフロー・サイトメトリーで蛍光タンパク質の発現について試験した。死亡細胞は、このアプローチにおいて同様に０．２５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムにより染色した。結果は、本発明にしたがった容器が一般的に主としてヒト細胞にも適していることを示している。また、このアプローチにおいて、トランスフェクション効率の死亡率に対する比は、アルミニウム製の慣用的な電極の使用に関してよりも良好である。この効果は、施用する電圧を増加させることで、ドープされた合成材料の実質的に高い抵抗を補償することにより更に高めることができる。この測定により、ドープされた合成材料で作られた電極を使用する場合は、細胞懸濁液内の電気的条件を適合させることができ、トランスフェクション効率を更に高めることができる。
【００２７】
図９は、ＣＨＯ細胞培養物のアルミニウム製電極（ａ）及び４０％炭素繊維を含むポリフェニレンスルフィド製の電極（ｂ）を用いたエレクトロポレーション後２日間の顕微鏡写真を示す。このアプローチにおいても、ドープされた合成材料のやや低い導電性を、第一及び第二の電圧パルスを高くすることにより補償した（ＰＰＳ／ＣＦ：１０００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝１０８Ｖ，１００ｍＣ；アルミニウム：５００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝７６Ｖ，６０ｍＣ）。アルミニウム製電極を使用した場合は、沈殿が明らかに観察された。これらの一部をａ）に挿入した矢印で示す。これらの沈殿は細胞上に沈殿した。しかし、これらの沈殿は、ドープされた合成材料製の電極を使用した場合はみられないので、本発明にしたがった容器を使用することにより粒子の沈殿を明らかに避けることができる。この事実は細胞の生存率にプラスの効果を与え、細胞の更なる取り扱いのために有益である。エレクトロポレーション生成物の医薬適合性は、これにより高めることができるので、例えば、トランスフェクトされた一次細胞を半ビボの遺伝子治療のために使用する可能性は特に有利なものとなる。
【００２８】
図１０及び１１は、各々、異なるように処理された溶液中で培養した細胞（図１０：ＨＵＶＥＣ細胞；図１１：ＣＨＯ細胞）のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ドープされた合成材料製の種々の電極から、及びアルミニウム製電極から放電の間に放出され得る、存在し得る細胞損傷性成分の影響を分析しするため、またこれらの直接的な影響に加えて、パルス施用直後の細胞培養物への更なる影響を明らかにするために、本発明にしたがった容器に、細胞なしでＰＢＳのような簡単な緩衝液を充填し、順番に３回高電圧パルスに曝露した（アルミニウム：５００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝１１５Ｖ，１００ｍＣ；ドープされた合成材料：１０００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝９５Ｖ，１１２ｍＣ）。続いて、種々の電極によりパルス電圧をかけた溶液１００μｌを、４００μｌの培地（EGM-2 BulletKit/Clonetics）に添加した。ＨＵＶＥＣ細胞（１８時間後の値：細胞数１０5個,７２時間後の値：細胞数２×１０4個）及びＣＨＯ細胞（２０時間後の値：細胞数１０5個,７２時間後の値：細胞数２×１０4個）を、それぞれ、２４穴プレートのこれらの培地中に移した。脂肪細胞及び生存細胞の数をそれぞれ、３７℃及び５％ＣＯ2での種々の時間の培養後にフロー・サイトメトリーにより測定した。ＰＢＳ及びこれらの細胞と培養上清との混合物において１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート中１μｇ／ｍｌトリプシンを用いて細胞を剥がした後、脂肪細胞の測定のため０．２５μｌ／ｍｌヨウ化プロピジウムを添加した。生存細胞を染色するため、ＰＢＳ中０．２μＭカルボキシフルオレセインジアセテート−スクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）＋０．５％牛血清アルブミンを添加し、フロー・サイトメトリー分析の前に室温で２分培養した。一つのプローブで細胞全数を測定するため、規定された数のフロー−カウント・フルオロスフィア・ビーズ（Beckman Coulter）を添加した。これにより、ＦＡＣＳ中の細胞から区別することができる。計測された細胞数は、１つのウェル中の全体積まで外挿することができる。図１０及び１１に示す結果は、ドープされた合成材料で作られた電極の使用に関して、アルミニウム製電極と比較して、わずかに有利であることを示している。特に、４日後において、合成材料製電極を用いてパルスを施用した溶液は、ＣＨＯ細胞の生存及び増殖に関して有益である。ＨＵＶＥＣ細胞に関しては、使用されるプラスチック電極のアルミニウム製の慣用的な電極と比較したプラスの効果を２４時間後にはやくも観察することができる。したがって、これらの結果は、このアプローチにおいて電流を施用した後のマイナスの効果を調査したが、ドープされた合成材料で作られた電極の細胞損傷性成分の放出に関する良好な適合性を示している。毒性の金属イオンの放出を避けることにより、本発明にしたがった容器の生理的適合性が付加的に達成される。したがって、これらは、トランスフェクトされた細胞の更なる使用、例えば、半ビボの遺伝子治療のためのトランスフォームされた一次細胞の使用に関しては、慣用的な容器又はキュベットよりも有意に都合がよい。
【００２９】
図１２は、本発明にしたがった容器の１つの実施可能な態様の透視図を示す。示した容器２０は、一般的には、慣用的なキュベットのように形成される。この容器は、外部リミット２１により形成され、この外部リミットは、水溶液を受容するための能力を有する内部チャンバー２２を造る。例えば、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞をこの水溶液中に懸濁させることができる。水溶液又は懸濁液に加えて、この容器は、例えば、付着性細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞も含有することもできる。２つの平行な電極２５，２６は、外部リミット２１の２つの平行で向かい合って配列された側壁２３，２４に配置される。電極２５，２６はどちらも、本発明したがい少なくとも１種の導電性物質がドープされた合成材料で作られる。ドープは、例えば、炭素繊維、グラファイト、すす、カーボンナノチューブ又は本質的に導電性である合成材料、あるいはこれらの物質のうち１種又は複数種の組み合わせからなってもよい。外部リミット２１は、導電性でない透明なプラスチック材料からなる。すべての成分が射出成形できることにより、本発明にしたがった容器２０は、二材射出成形法を用いて製造することができる。この場合において、はじめに外部リミット２１が非導電性プラスチックを用いて射出成形された。射出成形可能であるドープされた合成材料は、同様に、射出成形チャネル２７，２８を通して、射出成形されくぼみのある窓（これらは見ることができない）を形成した。したがって、本発明にしたがった容器２０の非常に簡単で費用効果の高い製造が可能となる。キュベットのように形成されているそのような容器２０は、慣用的なエレクトロポレーション装置において使用するものとした場合に主として有益である。しかし、用途の種類に依存して、本発明にしたがった容器は、有意であるすべての実施可能な態様を含む。
【００３０】
図１３は、本発明にしたがった容器の実施可能な態様の透視図（ｂ）並びに（縦断面図ａ）を示す。示した容器３０は、同様にキュベットのように形成されている。この容器は、水溶液を受容する作用を果たす内部チャンバー３２を造る外部リミット３１により形成されている。２つの平行な電極３３，３４は、外部リミット３１の２つの平行で向かい合って配列された側壁２３，２４に配置される。電極３３，３４はどちらも、本発明したがい少なくとも１種の導電性物質がドープされた合成材料、例えば、ポリアミド６６又はポリアミド６で作られる。本発明の有利な態様においては、ドープは、例えば、炭素繊維及びグラファイトの混合物であってもよい。外部リミット３１は、導電性でない透明なプラスチック材料からなる。すべての成分が射出成形可能であることから、本発明にしたがった容器３０は、二材射出成形法を用いて製造することができる。したがって、はじめに外部リミット３１を非導電性プラスチックから射出成形することができる。同様に射出成形可能であるドープされた合成材料は、続いて、射出成形チャネル３７，３８を通して、射出成形されくぼみのある窓を形成してもよい。したがって、本発明にしたがった容器３０の非常に簡単で費用効果の高い製造がこのようにして可能となる。傾斜部３９は、容器３０の下半分に配置され、それにより、容器３０を、使用される装置、すなわちエレクトロポレータのそれぞれの受け要素の位置関係に適合させることができる。また、電極３３，３４の距離は、傾斜部３９の異なる設計により変更してもよいので、順方向抵抗を変化させることができる。
【００３１】
図１４〜１６は、互いに１．５ｍｍの距離を有する、図１３記載の本発明にしたがった電極を有するキュベットを用いてトランスフェクトした細胞のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。これらの容器を、電極間の距離が２ｍｍであるアルミニウム製電極を有するキュベットと直接比較して試験した。電極間の距離を２５％低減したことにより、断面あたり同じ導電性を効率的に達成するため、ドープされたプラスチックの材料の高い抵抗をアルミニウムに関して補償した。ポリマーキュベットに関する実験手順は、アルミニウムに関するものと一致し、その際、ブラス（Nucleofector（商標） I, amaxa GmbH, Cologne）製のばね接点を有するエレクトロポレータを使用した。いずれの場合も、細胞を受容するための溶液として、細胞特異的なNucleofector（商標）キット（amaxa GmbH, Cologne）を使用した。本発明にしたがったキュベットは、いずれの場合も、炭素繊維が約３８〜４２％ｗ／ｗ及びグラファイトが約３３〜３７％ｗ／ｗドープされたポリアミド（ＰＡ６又はＰＡ６６）からなる電極を含む（ドープの全体濃度：約７０〜８０％ｗ／ｗ）。
【００３２】
図１４は、本発明にしたがったポリマー電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＨＬ−６０細胞（ヒトリンパ腫細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ＤＮＡ（Clontech）２μｇを、ＨＬ−６０細胞（ATCC）を１０6個含む溶液１００μｌの各々のプローブに添加した。これらのプローブを含有する種々のキュベットに電圧パルスを２回施用し（１０００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝９０Ｖ，７５ｍＣ）、次いで、すぐにＬ−グルタミン酸及び２０％ウシ胎児血清（Gibco）を含有するIscove‘s modified Dulbecco's培地中で３７℃／５％ＣＯ2のインキュベータにて培養した。２４時間後に、細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム並びに２５，０００個のＡＰＣビーズ（Becton Dickinson）を各々のプローブに添加した。プローブあたりの細胞絶対数をベースとするヨウ化プロピジウムで染色した細胞及びトランスフェクトされた細胞のフロー・サイトメトリー（FASCalibur, Becton Dickinson）での測定はこのようにして実行可能であった。ここで、トランスフェクション効率を有意に高くすることができ、本発明にしたがったキュベットの使用により、アルミニウム製電極を有する慣用的なキュベットと比較して、死亡率をわずかに低下できることが判明した。
【００３３】
図１５は、本発明にしたがったポリマー電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＣＤ３+Ｔ−細胞の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ｐＨ−２Ｋk（マウス ＭＨＣ Ｉ 重質鎖）２μｇを、新しく単離されたＰＢＭＣを５×１０6個含有する溶液１００μｌの各々のプローブに添加した。これらのプローブを含有する種々のキュベットに間断なく電圧パルスを２回施用し（１０００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝９６Ｖ，５６ｍＣ）、次いで、１０％ウシ胎児血清（Gibco）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地中で３７℃／５％ＣＯ2のインキュベータにて直接培養した。２４時間後に、細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム並びに２５，０００個のＡＰＣビーズ（Becton Dickinson）を各々のプローブに添加した。また、フルオレセイン−イソチオシアネートで染色したアンチ−Ｈ−２Ｋk抗体（Becton Dickinson）と、ＡＰＣに結合しているヒトＴ−細胞−特異的ＣＤ３抗原に対する抗体（Becton Dickinson）とを用いて細胞を染色した。プローブあたりの細胞絶対数をベースとするヨウ化プロピジウムで染色した細胞及びトランスフェクトされたＴ−細胞のフロー・サイトメトリー（FASCalibur, Becton Dickinson）での測定はこのようにして実行可能であった。このようにしておよそ同様の結果を鉄製することができた。
【００３４】
図１６は、本発明にしたがったポリマー電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ ＤＮＡ（Clontech）２μｇを、ＨＵＶＥＣ細胞（ATCC）を６．８×１０5個含有する溶液１００μｌの各々のプローブに添加した。これらのプローブを含有する種々のキュベットに電圧パルス（１０００Ｖ，１００μｓ）を施用し、次いで、これらのプローブを内皮細胞用のＥＧＭ−２培地中で３７℃／５％ＣＯ2のインキュベータにて直接培養した。２４時間後に、細胞を回収し、ヨウ化プロピジウム並びに２５，０００個のＡＰＣビーズ（Becton Dickinson）を各々のプローブに添加した。プローブあたりの細胞絶対数をベースとするヨウ化プロピジウムで染色した細胞及びトランスフェクトされた細胞のフロー・サイトメトリー（FASCalibur, Becton Dickinson）での測定はこのようにして実行可能であった。ここで、アルミニウム製電極を有する慣用的なキュベットではなく本発明にしたがったキュベットの使用に関して、トランスフェクション効率を有意に高くすることができ、死亡率を低下できることが判明した。
【００３５】
図１７は、本発明にしたがった合成材料製の電極（ＰＡ６６及びＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後２４時間及び９６時間のＨＬ−６０細胞（ヒトリンパ腫細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図を示す。条件及び手順は、アルミニウム製キュベット並びに本発明にしたがったキュベットは、電極間の距離が２ｍｍであることを除いては、一般的には図１４に関して説明したものと一致する。ここで使用したキュベットは、各々更に炭素繊維を約３３〜３７％ｗ／ｗ及びグラファイトを約２３〜２７％ｗ／ｗがドープされたポリアミドで作られた電極を有する（ドープの全濃度：約５５〜６５％ｗ／ｗ）。ポリマー電極の高い抵抗を補償するため、ここでは、
異なるパルスパラメータを使用する（合成材料：１０００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝１０２Ｖ，７５ｍＣ及びアルミニウム：８００Ｖ，１００μｓ及びＵstart＝９０Ｖ，７５ｍＣ）。このアプローチにおいても、本発明にしたがったポリマー電極の使用により、トランスフェクション効率をわずかに高くすることができ、死亡率をわずかに低くすることができた。
【００３６】
使用した略語のリスト：
Ａ            アンペア
Ｃ            クーロン
ＣＨＯ        チャイニーズハムスター卵巣
ｃｍ          センチメートル
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
Ｇｅｗ．−％  重量パーセント
ｈ            時間
ＨＬ−６０    ヒトリンパ腫６０
ＨＵＶＥＣ    ヒト臍帯静脈内皮細胞
ｋＶ          キロボルト
ｍＣ          ミリクーロン
ｍＭ          ミリモル
ｍｓ          ミリ秒
ＰＡ          ポリアミド
ＰＢＭＣ      末梢血単核細胞
ＰＢＳ        食塩加リン酸緩衝液
ｐＨ          水素イオン濃度の負の対数
ＰＪ          ヨウ化プロビジウム
ＲＮＡ        リボ核酸
ＲＰＭＩ      ローズウェルパークメモリアルインスティテュート
μｇ          マイクログラム
μｌ          マイクロリットル
μｓ          マイクロ秒
Ｕ            電圧
ＵAnfang      電圧初期
Ｖ            ボルト
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明を実証するための実験アセンブリの透視図である。
【図２】図２は、炭素繊維を２０％及びグラファイトを１５％含むポリカーボネートで作られた、本発明にしたがった電極（ＰＣ＋ＣＦ＋Ｇｒは１．６５ｍｍの電極厚さを有する）を用いた放電の電流を、アルミニウム製電極の使用と比較して、それぞれ異なる緩衝液を用いて示す。溶液Ａ：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１及び２５ｍＭ塩化カリウム；溶液Ｂ：１４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１；縦軸：電流、１マスあたり１Ａ；横軸：時間、１マスあたり１０ｍｓ。
【図３】図３は、銅線を挿入することにより改変した、図１にしたがった実験アセンブリの透視図である。
【図４】図４は、炭素繊維を２０％含むポリカーボネートで作られた電極（電極厚さ２ｍｍ）を用いた、並びに図１（ａ）及び図３（ｂ）にしたがった実験アセンブリを用いた放電の電流を示す（縦軸：電流、１マスあたり１Ａ及び横軸：時間、１マスあたり１０ｍｓ）。
【図５】図５は、本発明にしたがった合成材料製の異なる電極を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）２５，０００個の細胞あたりにトランスフェクトされた細胞の数、ｂ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ＰＣ／ＣＦ／Ｇｒ＝ポリカーボネート＋２０％炭素繊維＋１５％グラファイト（電極厚さ１．６５ｍｍ）、ＰＥＥＫ／ＤＦ＝ポリエーテルエーテルケトン＋４０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）。
【図６】図６は、本発明にしたがった合成材料製の異なる電極を用いてトランスフェクトされたＨＬ−６０（ヒトリンパ腫細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）１５，０００個の細胞あたりにトランスフェクトされた細胞の数、ｂ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ＰＣ／ＣＦ／Ｇｒ＝ポリカーボネート＋２０％炭素繊維＋１５％グラファイト（電極厚さ１．６５ｍｍ）、ＰＥＥＫ／ＤＦ＝ポリエーテルエーテルケトン＋４０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）。
【図７】図７は、本発明にしたがった合成材料製の異なる電極を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ−細胞系）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）２５，０００個の細胞あたりにトランスフェクトされた細胞の数、ｂ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ＰＡ／ＣＦ＝ポリアミド６６＋３０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）。
【図８】図８は、本発明にしたがった合成材料製の異なる電極を用いてトランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）１５，０００個の細胞あたりにトランスフェクトされた細胞の数、ｂ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ＰＰＳ／ＣＦ＝ポリフェニレンスルフィド＋４０％炭素繊維。
【図９】図９は、ＣＨＯ細胞培養物（ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣細胞）のａ）アルミニウム製電極及びｂ）ポリフェニレンスルフィド＋４０％炭素繊維製の電極を用いたエレクトロポレーション後２日の顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、異なるように処理された溶液中で培養した後のＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞の数、ｂ）カルボキシフルオレセインジアセテート−スクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）により染色された生存細胞の数、ＰＡ／ＣＦ＝ポリアミド６６＋３０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）、ＰＣ／ＣＦ／Ｇｒ＝ポリカーボネート＋２０％炭素繊維＋１５％グラファイト（電極厚さ１．６５ｍｍ）。
【図１１】図１１は、異なるように処理された溶液中で培養した後のＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）のフロー・サイトメトリー分析の図を示す。ａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞の数、ｂ）カルボキシフルオレセインジアセテート−スクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ−ＳＥ）により染色された生存細胞の数、ＰＰ／ＣＦ＝ポリプロピレン＋２０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）、ＰＰＳ／ＣＦ＝ポリフェニレンスルフィド＋４０％炭素繊維、ＰＡ／ＣＦ＝ポリアミド６６＋３０％炭素繊維（電極厚さ１ｍｍ）。
【図１２】図１２は、本発明にしたがった容器の１つの実施可能な態様の透視図である。
【図１３】図１３は、キュベットの形態の本発明にしたがった容器の更なる態様の断面図（ａ）及び透視図（ｂ）である。
【図１４】図１４は、本発明にしたがった合成材料製の電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＨＬ−６０細胞（ヒトリンパ腫細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ｂ）トランスフェクトされた生存細胞の数、未処理＝それぞれ電圧パルスの施用なし。
【図１５】図１５は、本発明にしたがった合成材料製の電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＣＤ３+Ｔ−細胞の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。それぞれｐＨ２−Ｋkベクターがある場合又はない場合のａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ｂ）トランスフェクトされた生存細胞の数。
【図１６】図１６は、本発明にしたがった合成材料製の電極（ＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ｂ）トランスフェクトされた生存細胞の数、未処理＝それぞれ電圧パルスの施用なし。
【図１７】図１７は、本発明にしたがった合成材料製の電極（ＰＡ６６及びＰＡ６）を用いたエレクトロポレーション後のＨＬ−６０細胞（ヒトリンパ腫細胞）の、アルミニウム製電極と比較したフロー・サイトメトリー分析の図である。ａ）ヨウ化プロピジウムにより染色された死亡細胞のパーセント、ｂ）トランスフェクトされた生存細胞の数、未処理＝それぞれ電圧パルスの施用なし。
【符号の説明】
【００３８】
１  実験アセンブリ
２  スペーサー板
３  電極
４  電極
５  くぼみ
６  銅板
７  銅板
８  ねじ込み部
９  ねじ込み部
１０  内部空間
１１  内部エッジ
１２  実験アセンブリ
１３  銅線
１４  銅線
２０  容器
２１  外部リミット
２２  内部チャンバー
２３  側壁
２４  側壁
２５  電極
２６  電極
２７  射出成形チャネル
２８  射出成形チャネル
３０  容器
３１  外部リミット
３２  内部チャンバー
３３  電極
３４  電極
３５  側壁
３６  側壁
３７  射出成形チャネル
３８  射出成形チャネル
３９  傾斜部
【図１】
2005526499.tif 000003
【図２】
2005526499.tif 000004
【図３】
2005526499.tif 000005
【図４】
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2005526499.tif 000007
【図５】
2005526499.tif 000008
【図６】
2005526499.tif 000009
【図７】
2005526499.tif 000010
【図８】
2005526499.tif 000011
【図９】
2005526499.tif 000012
2005526499.tif 000013
【図１０】
2005526499.tif 000014
【図１１】
2005526499.tif 000015
【図１２】
2005526499.tif 000016
【図１３】
2005526499.tif 000017
2005526499.tif 000018
【図１４】
2005526499.tif 000019
【図１５】
2005526499.tif 000020
【図１６】
2005526499.tif 000021
【図１７】
2005526499.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月25日(2004.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液、並びに特に細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を受容するための容器（20，30）であって、前記溶液を受容するための内部チャンバー（22，32）を形成する外部リミット（21）により少なくとも部分的に形成され、電圧を施用しその後放電が起こるときに電極として作用する少なくとも１つの領域（25，26，33，34）を含んでおり、その際、少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、少なくとも１種の導電性物質がドープされたプラスチック材料を少なくともベースとする導電性合成材料で作られており、前記プラスチック材料中の前記ドープの全濃度が４０〜８０％ｗ／ｗである前記容器。
【請求項２】
前記ドープが、炭素繊維、グラファイト、すす及び／又はカーボンナノチューブからなる、請求項１記載の容器。
【請求項３】
前記プラスチック材料中の前記ドープの全濃度が、４０〜６０％ｗ／ｗ、好ましくは５０〜６０％ｗ／ｗ、特に５５〜６０％ｗ／ｗである、請求項１又は２に記載の容器。
【請求項４】
前記プラスチック材料中の前記ドープの全濃度が、５０〜８０％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗ、最も好ましくは７０〜８０％ｗ／ｗ、特に７４〜７６％ｗ／ｗである、請求項１又は２に記載の容器。
【請求項５】
前記プラスチック材料が、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフェニレンスルフィド、若しくはこれらのポリマーの混合物であるか、又はこれらのポリマーの１種又は複数種を少なくともベースとする、及び／又は前記プラスチック材料が、本質的に導電性である合成材料である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の容器。
【請求項６】
前記本質的に導電性である合成材料が、ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリ−パラ−フェニレン、ポリ−パラ−フェニレンスルフィド、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリプロピレンなどであるか、又はこれらのポリマーの１種又は複数種を少なくともベースとする、請求項５記載の容器。
【請求項７】
前記外部リミット（21，31）が、合成材料、好ましくは透明のプラスチック材料で作られている、請求項１〜６のいずれかに記載の容器。
【請求項８】
前記外部リミット（21，31）が、前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）がベースとするプラスチック材料と同じプラスチック材料で作られている、請求項７記載の容器。
【請求項９】
前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、前記外部リミット（21，31）に一体化されている、請求項１〜８のいずれかに記載の容器。
【請求項１０】
同じ材料で作られている少なくとも２つの電極（25，26，33，34）を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の容器。
【請求項１１】
少なくとも２つの電極（25，26，33，34）が異なる材料で作られている、請求項１〜１０のいずれかに記載の容器。
【請求項１２】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、ポリアミド、特に、２５〜４５％ｗ／ｗ、好ましくは３０〜４０％ｗ／ｗ、特に３３〜３７％ｗ／ｗの炭素繊維と、１５〜３５％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜３０％ｗ／ｗ、特に２３〜２７％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリアミド６６又はポリアミド６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１３】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、ポリアミド、特に、３０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは３５〜４５％ｗ／ｗ、特に３９〜４１％ｗ／ｗの炭素繊維と、２５〜４５％ｗ／ｗ、好ましくは３０〜４０％ｗ／ｗ、特に３４〜３６％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリアミド６６又はポリアミド６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１４】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、１５〜４０％ｗ／ｗの炭素繊維と、１〜４０％ｗ／ｗのグラファイトとがドープされたポリカーボネートで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１５】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、４０〜５０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリエーテルエーテルケトンで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１６】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、４０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリアミド、好ましくはポリアミド６６で作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１７】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、４０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリプロピレンで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１８】
少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、４０〜５０％ｗ／ｗの炭素繊維がドープされたポリフェニレンスルフィドで作られている、請求項１〜１１のいずれかに記載の容器。
【請求項１９】
前記外部リミット（21，31）が、前記溶液を供給するための少なくとも１つの開口部と、前記溶液を排出するための少なくとも１つの開口部とを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の容器。
【請求項２０】
１つのユニットを造るようにつながれた請求項１〜１８のいずれかに記載の容器（20，30）を少なくとも２つ、好ましくは６、１２、２４、４８、９６又はそれより多く含む、容器配列。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の容器又は容器配列を製造するための方法であって、前記容器（20，30）又は前記容器配列が二材射出成形により製造され、その際、はじめに外部リミット（21，31）が射出成形されて、１つのくぼんだ窓が形成され、続いて、ドープされたプラスチックで作られている導電性合成材料が前記少なくとも１つの窓の中に射出成形されるか、又ははじめに前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）が、前記ドープされたプラスチック材料から射出成形され、続いて、前記外部リミット（21，31）が前記少なくとも１つの電極（25，26，33，34）の周りに射出成形される前記方法。
【請求項２２】
特にエレクトロポレーション又はエレクトロフュージョンのため電流により、細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を処理するための方法であって：
ａ）前記細胞、細胞の誘導体、亜細胞性粒子及び／又は小胞を、請求項１〜１９のいずれかに記載の少なくとも１つの容器（20，30）か又は請求項２０記載の容器配列の少なくとも１つの容器の内部チャンバー（22，32）中に移し、その際、前記容器（20，30）は、ドープされた合成材料で作られている少なくとも１つの電極（25，26，33，34）と、少なくとも１つの更なる電極（25，26，33，34）とを含み、そして
ｂ）電圧を前記電極（25，26，33，34）に施用し、前記容器（20，30）の前記内部チャンバー（22，32）中に電流の流れを発生させることを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記電流が、１２０Ａ／ｃｍ2、好ましくは８０Ａ／ｃｍ2までの電流密度に到達する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
生理活性分子、特に核酸が前記溶液中に溶解され、前記生理活性分子の生存細胞への移動が、場の強さが２〜１０ｋＶ＊ｃｍ-1であり継続時間が１０〜２００μｓである電圧パルスにより達成される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生理活性分子の前記細胞への前記移動が、前記電圧パルスの後に間断なく流れ、電流密度が２〜１４Ａ＊ｃｍ-2、好ましくは５Ａ＊ｃｍ-2であり、継続時間が１〜１００ｍｓ、好ましくは５０ｍｓである電流の流れにより達成される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【国際調査報告】
2005526499.tif 000023
2005526499.tif 000024
2005526499.tif 000025
2005526499.tif 000026
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2005526499.tif 000028