(57)【要約】本発明は、カササギマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｓａｘａｔｉｌｉｓ）由来の新規ディスインテグリン、サキサチリンの遺伝子を含むリポソーム複合体、及びその複合体を生体内に移入することによって腫瘍を治癒及び予防するための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カチオン性リポソーム及び（ｂ）配列番号１のサキサチリン遺伝子を含有する発現ベクターを含む、がん成長を阻害するためのリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）。
【請求項２】
前記カチオン性リポソームは、ＤＭＤＫ及びコレステロールを含有するリポソーム、ＤＭＥＫ及びコレステロールを含有するリポソーム、ＤＯＴＭＡ及びコレステロールを含有するリポソーム、ＤＯ−Ｃｈｏｌ及びＤＯＰＥを含有するリポソーム並びにＤＯＴＡＰ及びコレステロールを含有するリポソームからなる群から選択される１つのリポソームである請求項１記載のリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）。
【請求項３】
前記発現ベクターはｐＡＡＶ−ＣＭＡ又はｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１である請求項１記載のリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）。
【請求項４】
（ａ）コレステロールをＤＯＴＡＰと混合し、水溶性媒体に分散させてカチオン性リポソームを作製し、配列番号１のサキサチリン遺伝子を真核細胞の発現ベクターに導入し、サキサチリンを発現させる発現ベクターを作製する段階；
（ｂ）前記カチオン性リポソームと前記発現ベクターを水溶性媒体で混合し、均質化してリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を作製する段階；及び
（ｃ）前記リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）をがん組織に導入する段階、
を含むサキサチリン遺伝子を用いることによってがん成長を阻害するための方法。
【請求項５】
前記水溶性媒体は、リン酸塩緩衝溶液又は水溶性デキストロース溶液である請求項４記載のサキサチリン遺伝子を用いることによってがん成長を阻害するための方法。
【請求項６】
真核細胞の発現ベクターがｐＡＡＶ−ＣＭＡ又はｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１である請求項４記載のサキサチリン遺伝子を用いることによってがん成長を阻害するための方法。
【請求項７】
前記リポソームと発現ベクターとの混合比率は、２：１〜２０：１（ｗ／ｗ）である請求項４記載のサキサチリン遺伝子を用いることによってがん成長を阻害するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん転移、血管新生及びがん組織の成長を阻害する活性を示す抗がん剤、及びその抗がん剤を使用することによってがんを治療するための方法に関する。より詳しくは、本発明は、韓国を発祥とするカササギマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｓａｘａｔｉｌｉｓ）由来の新規のディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）であるサキサチリン（ｓａｘａｔｉｌｉｎ）の遺伝子を含むがん細胞の成長を阻害するためのリポソーム複合体、及びその複合体を生体内に導入することによってがんを予防又は治療するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がんは、非常に複雑で多様な要因によって発病する疾患であり、現代人の死亡に係る主な原因の一つである。がんは、多様な要因によって正常細胞ががん細胞に形質転換され、がん細胞は正常細胞とは異なり成長が無制限に進行してがん組織を形成する。一定のサイズのがん組織は、自身に必要な栄養分を供給するために血管新生を誘導し、その組織は、血管新生によって形成された血管を通して転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）することになり、身体の或る臓器に付着し、成長する。特に、第一の個所から発生したがん細胞によるがん組織は、他の個所におけるがんの発生を阻害することができる一種の阻害因子を分泌することが知られている。初期段階のがんは、そのサイズが３ｍｍ以上である場合、臨床的な診断によって容易に観察することができ、この段階で外科的手術によって除去することができる。しかし、手術によって外科的にがんを除去することはできるが、その手術は、外科的に除去されないがん細胞が転移過程にある場合には、逆にがんの転移を促進する危険がある。従って、がん手術を受ける患者のほとんどが、幾つかの非常に特別な場合を除いて、抗がん剤治療や放射線治療を受けなければならないが、これは手術の後に起り得る転移による２次がんを予防するためである。
【０００３】
現在まで、非常に効果的な抗がん剤が開発され、臨床において使用されているが、大部分の場合、正常細胞とがん細胞を区別することができない細胞成長阻害剤である。がんの転移を遮断するとともにがん細胞の成長を阻害する治療剤は、未だ開発されておらず、使用に供されていない。
【０００４】
血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の血管から新しい血管を形成する一連の過程を意味し、栄養分と酸素を供給するための正常かつ必須な過程である。血管新生は、傷の回復、女性のメンス、増殖性網膜症、リウマチ関節炎、虚血性心血管疾患、がん等で観察することができる。血管新生は、がん細胞の成長及び転移過程で非常に特徴的に現れるため、がん組織の治療のための主な目標として知られている。コラーゲン、糖蛋白質及び異種細胞外マトリックス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）で構成された毛細管が、がん細胞から分泌されるｂＦＧＦなどの血管形成促進因子の効果によって形成され、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）が、インテグリンの効果によって毛細管の方に移動して毛細管に結合する。血管新生の過程において、細胞融合物質、αＶβ３とαＶβ５として知られているインテグリンが非常に重要である。インテグリンに選択的に拮抗するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のアミノ酸配列を有するディスインテグリン蛋白質で処理すると、血管新生は阻害され得ることが報告されている。
【０００５】
サキサチリンは、韓国から発祥した蛇の毒液から発見されたディスインテグリンであり、血管新生を阻害する効果を有する。最近、Ｅ．ｃｏｌｉで発現された組換えサキサチリンは、αＶβ３インテグリンが媒介したがん細胞の血管新生を阻害するが、ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＣＡＭ）内で正常な胚芽発生に必須である血管の生理的形成過程には影響を与えないことが報告されている。加えて、サキサチリン蛋白質を毎日接種することによって、がん細胞の成長と血管形成が阻害されたことが実証されている。しかし、このような方法には、毎日注射の煩雑と抗がん効果を維持するための一定濃度の保持が非常に難しいという問題点がある。この問題点を解消するために、現在、種々の抗がん治療の同時使用が行われている。しかし、最近脚光を浴びている遺伝子治療方法を適用させた結果、非常に簡便であるとともに長期間に亘って抗がん効果を現すという事実を新たに確認し、本発明の開発に踏み出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、サキサチリンの抗がん効果を長期間保持させる方法を開発すべく鋭意研究した結果、カチオン性リポソームとサキサチリン遺伝子のｃＤＮＡを混合して作製したリポソーム複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）をがん組織に処置して遺伝子治療を実施した場合、細胞の成長を長期間阻害することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な目的は、がん細胞の成長を阻害する物質を提供することである。
本発明の他の目的は、前記物質を利用してがん細胞の成長を阻害するための方法を提供することである。
【０００８】
前記の目的を達成するために、本発明はカチオン性リポソーム及び配列番号１のサキサチリン遺伝子を含む発現ベクターを含むがん細胞成長阻害用リポソーム複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を提供する。
【０００９】
本発明のカチオン性リポソームは、ＤＭＤＫ（リジン−アスパラギン酸−テトラデカノール）とコレステロールを含有するリポソーム、ＤＭＥＫ（リジン−グルタミン酸−テトラデカノール）とコレステロールを含有するリポソーム、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド）とコレステロールを含有するリポソーム、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール）とＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）を含有するリポソーム、及びＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）とコレステロールを含有するリポソームからなる群から選択されるものが好ましい。本発明のサキサチリン遺伝子は、配列番号１の塩基配列のみならず、その変異体及びその活性を有するセグメントを含む。
【００１０】
本発明の発現ベクターとして、如何なる慣用の発現ベクターも使用することができる。特に、真核細胞の発現ベクターとしてｐＡＡＶ−ＣＭＶ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１からなる群から選択されるものが好ましい。
【００１１】
加えて、本発明は、コレステロールとＤＯＴＡＰとを混合し、水溶性媒体に分散させてカチオン性リポソームを作製し、配列番号１のサキサチリン遺伝子を真核細胞の発現ベクターに導入することによって、サキサチリンを発現するための発現ベクターを作製する段階、前記カチオン性リポソームと前記発現ベクターとを水溶性媒体中で混合し、均質化してリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を作製する段階、及び前記リポプレックスをがん組織に注入する段階を含む、サキサチリン遺伝子を利用したがん細胞の成長阻害方法を提供する。
【００１２】
本発明は、添付の図面を参照して詳細に記述される実施態様の項目において説明されることになるが、当該図面は実例としてのみ付与されるものであり、故に本発明を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明のサキサチリン遺伝子を利用してがん細胞の成長を阻害するプロセスを、より詳細に段階別に分けて記述する。
【００１４】
第１段階：カチオン性リポソームの作製
コレステロールをＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイルオキシプロピル−２−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）と混合し、当該混合物を水溶性媒体に分散させてカチオン性リポソームを作製する。水溶性媒体として、得られたリポソームが安定化される媒体、例えばＰＢＳ、水溶性デキストロース溶液等が好ましく、使用することができる。
【００１５】
第２段階：発現ベクターの作製
サキサチリンを発現する発現ベクターを、サキサチリン遺伝子のｃＤＮＡを真核細胞の発現ベクターに導入して作製する。真核細胞の発現ベクターとしては、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ及びｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１からなる群から選択されるものが好ましい。
【００１６】
第３段階：リポプレックスの作製
前記カチオン性リポソームと発現ベクターとを水溶性媒体中で混合し、均質化してリポプレックスを作製する。水溶性媒体としては、得られたリポソームが安定化される媒体、例えばＰＢＳ、水溶性デキストロース溶液等が好ましく、使用することができる。リポソームの発現ベクターに対する混合比率は、２：１〜２０：１（ｗ／ｗ）である。
【００１７】
第４段階：リポプレックスの注入
前記リポソーム複合体をがん組織に注射する。
上記の方法によって処理されたサキサチリン遺伝子は、長期間がん組織の成長及び転移を効果的に阻害しながら、正常な組織に対しては有害効果を与えないことから、がんを効果的に予防・治療するために広く活用することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明は、記載の実施例を参照して詳細に記述される実施態様の項目において説明されることになるが、当該実施例は実例としてのみ付与されるものであり、本発明の範囲が、これらの本発明の実施例によって本発明の要旨のために限定されないことは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとっては明らかである。
【００１９】
実施例１：組換え蛋白質の発現及び濃縮
ＤＯＴＡＰ及びコレステロールを１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合した。当該混合物を、生理的塩溶液に均質化して分散し、ラメラ層構造を有するカチオン性リポソームを作製した。
サキサチリン遺伝子のｃＤＮＡを、図１の発現ベクターｐＡＡＶ−ＣＭＶとｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ，．Ｕ．Ｓ．Ａ）に導入して、サキサチリン発現ベクターｐＡＡＶ−ＣＭＶ−サキサチリン及びｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１サキサチリンをそれぞれ作製した。サキサチリン遺伝子のｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成した。５末端のプライマーとして、ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴを使用し、３末端のプライマーとして、ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応によって合成されたＤＮＡフラグメントを、制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、それをｐＡＡＶ−ＣＭＶベクター、及びＮ−末端にＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）エピトープをコードするｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１ベクターにライゲーションした（図２）。前記作製された各々の発現ベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αにそれぞれ導入して形質転換体を作製し、これを培養した。そこから得られた各発現ベクターを、前記カチオン性リポソームと１：１０（ｗ／ｗ）の比率で混合した。当該混合物を、５％（ｗ／ｖ）水溶性デキストロース溶液中に分散し、懸濁液を均質化してリポプレックスを作製した。当該リポプレックスを、安定化培地（ＤＭＥＭ（ダルベッコ修飾イーグル培地）、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５００Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）に加えて、３０分間室温で安定化させた。
【００２０】
真核２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）を、１０％（ｖ／ｖ）含有する安定化培地で、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下でインキュベートし、発現ベクターとしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１サキサチリンを含む前記安定化されたリポプレックスを注射した。培地を安定化培地に交換した後、前記細胞を同じ条件下で１０日間インキュベートした。培養後、前記２９３細胞の可溶化液（ｌｙｓａｔｅ）を、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体を使用するウェスタンブロットに付し、その結果、サキサチリンが正常に発現され、前記発現ベクターが真核細胞中で正常にサキサチリンを発現したことを確認した（図３）。
【００２１】
実施例２：サキサチリン遺伝子のがん細胞成長に対する阻害
実施例１で作製したｐＡＡＶ−ＣＭＶ−サキサチリン２５μｇを、２５０μｇのカチオン性リポソームを含有する５０μｌのＰＢＳに添加し、リポプレックス、ｌｉｐｏＡＣＳを作製した。
７週間飼育したＣ５７ＢＫ１６マウスの脊椎中間部位に、マウスの肺がん細胞であるＢ１６ＢＬ６細胞（５ｘ１０５）を皮下注射した。当該動物を飼育し、がん組織のサイズを５０〜１００ｍｍ３程度にし、３群に分けた。対照群に毎４日でＰＢＳを靜脈注射し、一方実験群にはｌｉｐｏＡＣＳ（２５μｇ／動物）を靜脈注射し、時間の経過に従って腫瘍のサイズを測定した（図４）。図４に示されているように、腫瘍体積の増加率は、発現されたサキサチリンの実験群においてかなり減少した。
【００２２】
実施例３：サキサチリンのがん転移阻害における効果
リポプレックス、ｌｉｐｏＡＣＳを、実施例２と同様なプロセスで作製した。対照群は、ＰＢＳを７週間飼育したＣ５７ＢＫ１６マウスの皮下に注射して、実験群は、ｌｉｐｏＡＣＳ（２５μｇ／動物）を注射して準備した。各群のマウスの尾静脈に、Ｂ１６ＢＬ６細胞（４ｘ１０４）（マウスの肺がん細胞）を毎５日で注射し、対照群のマウスが致死するまで２５日間飼育した。その後、肺腫瘍のコロニー数を計測した（表１及び図５を参照）。表１及び図５から明らかなように、実験群は、対照群に比べて８５〜９３％の転移阻害効果を示した。抗−サキサチリン抗体を使用するウェスタンブロットを、各実験群から得られた蛋白質について実施した。結果として、対照群ではサキサチリンが検出されなかったが、実験群ではサキサチリンが検出された。故に、前記実験群のがん転移に対する阻害効果は、リポプレックスに含有されるサキサチリン遺伝子の効果であった。
【００２３】
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【００２４】
実施例４：２９３細胞で発現されたサキサチリンのウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞成長阻害における効果
１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養したＢＣＥ細胞を、フラスコに、細胞数が４ｘ１０４／ｍｌになるように移し、ＦＢＳが無いＤＭＥＭ培地で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で１２時間培養した。その後、それを、ｐＡＡＶ−ＣＭＡ−サキサチリン発現ベクターによって２９３細胞で発現されたサキサチリンで処理した。２０分後、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを加え、当該混合物を、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で７２時間培養した。残存する細胞数を比較して成長阻害率を測定した。図６から明らかなように、ＢＣＥ細胞の成長は、加えたサキサチリンの量に比例して阻害された。２μｇ／ｍｌの濃度で９０％以上の成長阻害効果が認められた。
【００２５】
上記に説明したように、本発明は、サキサチリン遺伝子を用いてがん細胞の成長を阻害する方法であって、コレステロールをＤＯＴＡＰと混合し、当該混合物を水溶性媒体に分散させてカチオン性リポソームを作製し、サキサチリン遺伝子を真核細胞の発現ベクターに導入することによってサキサチリンを発現するための発現ベクターを作製する段階、前記カチオン性リポソーム及び前記発現ベクターを水溶性媒体中で混合し、均質化してリポプレックスを作製する段階、及び前記リポプレックスをがん組織に導入する段階を含む。
本発明によれば、長期間の安定な抗がん治療が、サキサチリン遺伝子を用いることによって達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】本発明に係る発現ベクターｐＡＡＶ−ＣＭＶの遺伝子構造を示す。
【図１Ｂ】本発明に係る発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１の遺伝子構造を示す。
【図２】サキサチリン遺伝子を図１の発現ベクターに挿入することによるサキサチリン発現ベクター（ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−サキサチリン及びｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１サキサチリン）の作製を示す。
【図３】サキサチリンの２９３細胞の中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示す写真図である。プラスミドはＤＯＴＡＰを基盤とするカチオン性リポソームを経て細胞に導入された。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２は陰性対照としての非導入培地を示し、レーン３はｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１サキサチリンを示す。
【図４】サキサチリン遺伝子のがん細胞成長阻害における効果を示す写真図である。写真図において、Ａは、マウスの肺がん細胞であるＢ１６ＢＬ６、及びＰＢＳで処理した対照群を表し、Ｂは、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−サキサチリン（２５μｇ／マウス）で処理した実験群を表す。
【図５】サキサチリン遺伝子のがん転移阻害における効果を示す写真図である。写真図において、Ｂ１６ＢＬ６細胞をネズミに注射した後の、Ａは、ＰＢＳを注射した対照群を表し、Ｂは、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−サキサチリンで処理された実験群を表す。
【図６】２９８細胞で発現されたサキサチリンによるＢＣＥ細胞の成長阻害を示す。図において、ＢＣＥ細胞は、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下で７２時間、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ１−サキサチリンでトランスフェクションした２９３細胞で発現されたサキサチリンで処理され、サキサチリン濃度に依存する増殖阻害を分析した。
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2005502667.tif 000029
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