(57)【要約】本発明は、新規なタンパク質（BAA07892.2と称され、本明細書では核ホルモンレセプターリガンド結合ドメインと特定された）、並びに疾患の診断、予防および治療における前記タンパク質およびコード遺伝子由来の核酸配列の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチド：
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むかまたは前記アミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ii）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、前記のフラグメントであるポリペプチド；または
（iii）（ｉ）または（ii）の機能的等価物であるポリペプチド。
【請求項２】
LBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含む、請求項１の（ii）に記載のフラグメントであるポリペプチドであって、前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が配列番号：２に記載のアミノ酸配列の残基1507と1742を含むと定義され、前記フラグメントが“LBDモチーフ”残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有する前記ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１の（iii）に記載の機能的等価物であり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と相同であり、触媒性残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基を保有し、さらに核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を保有するポリペプチド。
【請求項４】
前記機能的等価物が、LBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と相同である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメーター[Blosum62マトリックス；ギャップ開放ペナルティー＝11およびギャップ伸長ペナルティー＝1]を用いて決定したとき、配列番号：２に記載のアミノ酸配列、または核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するそのフラグメントと80％を超える配列同一性、好ましくは85％、90％、95％、98％または99％を越える配列同一性を有する、請求項１−４のいずれかの項に記載のフラグメントまたは機能的等価物。
【請求項６】
配列番号：２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するそのフラグメントと顕著な構造相同性を示す請求項１−５のいずれかの項に記載の機能的等価物。
【請求項７】
配列番号：２の配列に由来する7つもしくはそれより多い（例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれより多い）アミノ酸残基からなる、請求項１の（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する請求項１、２または５に記載のフラグメント。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子。
【請求項９】
配列番号：１に記載の核酸配列を有するか、または重複等価物もしくはそのフラグメントである請求項８に記載の精製核酸分子。
【請求項１０】
配列番号：１のヌクレオチド4548から5255を含むか、またはその重複等価物である請求項８または請求項９に記載の精製核酸分子のフラグメント。
【請求項１１】
高いストリンジェンシー条件下で請求項８−１０のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子。
【請求項１２】
請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換されたホスト細胞。
【請求項１４】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドと特異的に結合し、さらに好ましくは前記ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を抑制するリガンド。
【請求項１５】
抗体である請求項１４に記載のリガンド。
【請求項１６】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現レベルまたは活性レベルを増加または低下させる化合物。
【請求項１７】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドと結合し、前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれをも誘発することがない請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
天然または改変された基質、リガンド、酵素、レセプターまたは構造的もしくは機能的摸倣体である請求項１６または１７に記載の化合物。
【請求項１９】
疾患の治療または診断で使用することを目的とする請求項１−７のいずれかの項に記載のポリペプチド、請求項８−１１のいずれかの項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４または１５に記載のリガンド、または請求項１６−１８のいずれかの項に記載の化合物。
【請求項２０】
患者の疾患を診断する方法であって、前記患者の組織で請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを評価するか、または請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性を評価し、さらに前記発現または活性レベルをコントロールレベルと比較することを含み、前記コントロールレベルと異なるレベルが疾患を示唆する前記疾患の診断方法。
【請求項２１】
in vitroで実施される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１４または請求項１５に記載のリガンドをリガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させ；さらに（ｂ）前記複合体を検出する工程を含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程を含む
ａ）患者由来の組織サンプルを、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体を形成し得るストリンジェントな条件下で核酸プローブと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルと前記プローブを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；さらに
ｃ）前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含い、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることが疾患を示唆する、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）患者の組織由来の核酸サンプルを、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体を形成し得るストリンジェントな条件下で核酸プライマーと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルと前記プライマーを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；
ｃ）前記サンプル化された核酸を増幅する工程；および、
ｄ）患者サンプルおよびコントロールサンプルの両方の増幅された核酸レベルを検出する工程；
を含み、コントロールサンプル中の増幅核酸レベルと顕著に異なる増幅核酸レベルが患者サンプルで検出されることは疾患を示唆する、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む請求項２０または請求項２１に記載の方法：
ａ）疾患について検査しようとする患者から組織サンプルを得る工程；
ｂ）請求項８−１１のいずれかの項に記載の核酸分子を前記組織サンプルから単離する工程；および、
ｃ）疾核酸分子中で患に関連する変異の存在を疾患の徴候として検出することによって患者を疾患について診断する工程。
【請求項２６】
核酸分子を増幅して増幅生成物を形成し、前記増幅生成物中で変異の有無を検出することをさらに含む請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記核酸分子をストリンジェントな条件下で前記核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二本鎖分子を形成させ、前記ハイブリッド二本鎖分子は疾患に関連する変異に対応するいずれかの部分でハイブリダイズしない核酸プローブ鎖部分を有するハイブリッドであり、および、
疾患関連変異の有無を表示するものとして前記プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の有無を検出することによって患者で変異の有無を検出する請求項２５または２６のいずれかの方法。
【請求項２８】
前記疾患が以下である請求項２０−２７のいずれかの項に記載の方法：
細胞増殖性疾患（新形成、癌および骨髄増殖症候群および血管形成を含む）、代謝性障害（肥満、骨粗しょう症、非インスリン依存性糖尿病、脂質代謝異常、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症を含む）、心脈管系疾患（高血圧、アテローム性硬化症、高インスリン血症、心不整脈を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（皮膚疾患、乾癬、アクネ、加齢、湿疹、創傷治癒を含む）、炎症（炎症性大腸疾患、気道の炎症、気腫、喘息、免疫不全、自己免疫疾患、多発性硬化症を含む）、神経系疾患（不安、抑うつ、神経変性疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病、脳損傷、卒中および痛みを含む）、感染（ウイルス感染を含む）、並びに核内ホルモンが関係するその他の病的状態。
【請求項２９】
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３０】
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保有するタンパク質の発現を目的とする請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項３１】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドを利用する細胞-細胞接着を行わせる方法。
【請求項３２】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４または１５に記載のリガンド、または請求項１６−１８のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むワクチン組成物。
【請求項３４】
以下の疾患の治療用医薬の製造で使用される請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４または１５に記載のリガンド、請求項１６−１８のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３２に記載の医薬組成物：
細胞増殖性疾患（新形成、癌および骨髄増殖症候群および血管形成を含む）、代謝性障害（肥満、骨粗しょう症、非インスリン依存性糖尿病、脂質代謝異常、甲状腺機能亢進、上皮小体機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症を含む）、心脈管系疾患（高血圧、アテローム性硬化症、高インスリン血症、心不整脈を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（皮膚疾患、乾癬、アクネ、加齢、湿疹、創傷治癒を含む）、炎症（炎症性大腸疾患、気道の炎症、気腫、喘息、免疫不全、自己免疫疾患、多発性硬化症を含む）、神経系疾患（不安、抑うつ、神経変性疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病、脳損傷、卒中および痛みを含む）、感染（ウイルス感染を含む）、並びに核内ホルモンが関係するその他の病的状態。
【請求項３５】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１２に記載のベクター、請求項１４または１５に記載のリガンド、請求項１６−１８のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３２に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者で疾患を治療する方法。
【請求項３６】
天然の遺伝子またはポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患に対して、前記対象者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物、または組成物がアゴニストである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
天然の遺伝子の発現またはポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患に対して、前記対象者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物または組成物がアンタゴニストである請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
患者の疾患の治療をモニターする方法であって、一定期間にわたって請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現もしくは活性レベル、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子の発現レベルを前記患者由来の組織でモニターすることを含み、前記期間にわたってコントロールレベルに向けて前記発現または活性レベルが変化することが前記疾患の軽減の徴候である、前記患者の疾患の治療をモニターする方法。
【請求項３９】
疾患の治療および／または診断で有効な化合物の特定方法であって、前記方法が、請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項１３に記載のホスト細胞を、前記ポリペプチドまたは核酸に対する結合親和性を保有すると思われる１つまたは２つ以上の化合物と接触させ、さらに前記核酸分子またはポリペプチドと特異的に結合する化合物を選別することを含む前記有効な化合物の特定方法。
【請求項４０】
ストリンジェントな条件下で請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；前記核酸分子の増幅に有用なプライマーを含む第二の容器；および疾患の診断を容易にすることを目的とする前記プローブおよびプライマーの使用のための指示書を含む疾患の診断に有用なキット。
【請求項４１】
ハイブリダイズしていないＲＮＡを消化するための薬剤を保持する第三の容器をさらに含む請求項４０のキット。
【請求項４２】
そのうちの少なくとも１つが請求項８−１１のいずれか１項に記載の核酸分子である核酸分子のアレイを含むキット。
【請求項４３】
請求項１−７のいずれかの項に記載のポリペプチドと結合する１つまたは２つ以上の抗体；および前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むキット。
【請求項４４】
請求項１−７のいずれか１項に記載のポリペプチドをより高レベルまたはより低レベルで発現するように、または前記ポリペプチドを発現しないように形質転換した遺伝子導入またはノックアウト非ヒト動物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の非ヒト遺伝子導入動物を候補化合物と接触させ、さらに前記動物の疾患に対する前記化合物の影響を決定することによって、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、本明細書において核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインとして特定された、BAA07892.2と称される、新規なタンパク質並びに疾患の診断、予防および治療における前記タンパク質およびそのコード遺伝子に由来する核酸配列の使用に関する。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、引用により完全に本明細書に含まれるものとする。
【０００２】
背景
薬剤の発見プロセスにおいて、機能ゲノム学（functional genomics）の時代の到来につれて根幹的な革命が現在進行している。“機能ゲノム学”という用語は、問題のタンパク質の機能をタンパク質配列帰属させるためにバイオインフォマティクスツールを利用するアプローチに適用される。そのようなツールは、配列データの生産速度が、これらタンパク質配列に機能を割り当てる研究室の能力をはるかに越えるために、ますます必要性を増している。
バイオインフォマティクスツールの潜在能力および精度が高まっているために、前記ツールは通常の生化学的特徴決定技術と急速に置き換えられつつある。実際、本発明の特定に用いた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や、高い信頼性をもつ結果を産出する能力を有する。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の研究機関および企業の組織がそれらを精査し、重要な発見が絶え間なく達成され続けている。しかしながら、更に新たな遺伝子およびそれらがコードするポリペプチドを研究および薬剤の発見のためのターゲットとして特定し特徴を決定する必要性は引き続き存在している。
最近、未知の機能をもつ配列を評価するための注目すべきツールが本発明の出願人によって開発された。このツールは、同時係属国際特許出願第PCT/GB01/01105号の主題であるデータベースシステム（バイオペンジウム（Biopendium）検索データベースと称される）である。このデータベースシステムは、独占的技術を用いて作製され、利用可能な全てのタンパク質または核酸配列の完全な比較から作製された情報を含む集積データリソースから成る。
【０００３】
別個のデータリソースからこれら配列データを一体化させたその背後の目的は、可能なかぎり多くのデータを、配列それ自体と各配列に関連する情報の両方に関して１つの完全なリソースにまとめることである。各配列と関係を有する全ての利用可能なデータ（入手可能な場合はコードされるタンパク質の三次元構造に関するデータを含む）を一緒に統合し、各配列について知られている情報の最大限の利用を可能にし、したがって最も多くの知見を含む予測がこれら配列の比較から入手することができる。前記データベースで作製され、各配列のエントリーに付随する注釈は、生物学的に関連がある事柄を前記配列情報に付与する。
このデータリソースは、配列のみをベースにしてタンパク質の正確な機能を予測することを可能にした。通常の技術を用いた場合、このような予測は、同じ機能群に属する他のタンパク質に対して高度な配列同一性（約20％−30％の同一性）を示すタンパク質についてのみ可能である。既知の機能を有する他の関連するタンパク質と配列相同性が低いタンパク質の場合正確な予測は不可能である。
本件では、その配列が公的に利用可能なデータベースにKIAA0097タンパク質として記録されているタンパク質（NCBI GenBankヌクレオチドアクセッション番号D43948および GenBankタンパク質アクセッション番号BAA07892.2）が、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン類の新規なメンバーとして関与する。
【０００４】
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインに関する導入部
核内ホルモンレセプター遺伝子スーパーファミリー（表１参照）は、標的遺伝子の転写を調節する構造的に関連するタンパク質をコードする。前記タンパク質には、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモン、ビタミン、並びにリガンドが未だ発見されていない他のタンパク質に対するレセプターが含まれる。核内レセプターは２つのキードメイン、DNA結合ドメイン（DBD）およびリガンド結合ドメイン（LBD）から構成されている。DBDは、前記レセプターがモノマー、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして特異的なDNA配列と結合するように指令する。DBDは、核内レセプターでのみ見出される特殊なタイプのジンクフィンガーである。DBDを有する核内レセプターは、PROSITEコンセンサス配列（PS00031）とのマッチングについて検索することによって容易に配列レベルで特定することができる。
リガンド結合ドメイン（LBD）は同系ホルモンと結合しこれと反応する。LBDと結合したリガンドは、すでに結合していた“核内レセプター補助リプレッサー”を排斥する構造的変化をひき起こす。続いて前記補助リプレッサーによって以前に占有されていた部位は空席になり、新しい“核内レセプター補助アクチベーター”で補充される。このリガンドによってひき起こされる補助アクチベーターによる補助リプレッサーの交換が、リガンド結合が標的遺伝子の転写活性化をもたらすメカニズムである。全てのリガンド結合ドメインはコンセンサス配列、“LBDモチーフ”（表２参照）を含み、前記モチーフは、補助リプレッサー結合および補助アクチベーター結合を仲介する。LBDは、今日まで全ての核内ホルモンレセプター標的薬剤のための結合部位であり、したがって新規なリガンド結合ドメインは重要な薬剤標的であるので、それらのの特定が所望される。リガンド結合ドメインは低い（約15％）同一性しか共有しないが、非常に類似する構造を有し、したがって、構造に基づく関係付けツール(structure-based relationship tool)（例えばゲノムスレッダー）のための理想的なターゲットである。
PROSITEのような基本的な検索ツールを用いて、DBDが存在することによって、さらに前記をもとに推測されたLBDによって、多くのタンパク質配列が核内ホルモンレセプターとして公的ドメインに注釈付けされている。このために、ゲノムスレッダーによって特定される、核内レセプターとして注釈されてない新規ないずれのLBDも完全にDBDを欠くであろうということが予期される。LBDを有するがDBDを欠くタンパク質の先例はDAX1によって提供される。したがって、我々は、これらDBDのないヒットを“核内ホルモンレセプター”ではなく“核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメイン”を含むものと注釈付けする。
【０００５】
【表１】
2005500011.tif 000002
【０００６】
下表２：“LBDモチーフ”。最上段の数字はモチーフ内の残基の位置を示す。文字は１文字コードによるアミノ酸を示す。１つの縦の欄内の文字は全てモチーフ内のその位置について許容される。例えば、L、I、A、V、M、F、YまたはWは“LBDモチーフ”の最初の位置を占めることができる。第4位と8位の間、および第9位と12位の間で見出される残基の数には変動があることに留意されたい。“LBDモチーフ”は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの681個の配列でアラインメントを実施し、残基の保存パターンを特定することによって構築された。
【０００７】
【表２】
2005500011.tif 000003
【０００８】
ＩＩ．核内ホルモンレセプターおよび疾患
核内ホルモンレセプターは、多様な生理学的機能において役割を果たすことが示された。それらの多くは疾患プロセスにおいて役割を有する（表３参照）
【０００９】
表３：核内ホルモンレセプターと疾患
【表３】
2005500011.tif 000004
【００１０】
したがって、核内ホルモンレセプターのLBDと結合する、リガンドによる核内ホルモンレセプターの変化は疾患の表現型を変化させる手段を提供する。したがって、新規な核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインの特定は、それらタンパク質が上記で特定した疾患や他の症状において役割を有する可能性があるために強く希求される。新規な核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインの特定はしたがって、疾患（特に表３で特定したような疾患）の治療および診断と密接な関係を有する。
【００１１】
発明
本発明は、BAA07892.2タンパク質が核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインとして機能するという発見を基にしている。
BAA07892.2タンパク質の場合、前記タンパク質配列の残基1507-1742を含む領域は、ヒトレチノイン酸レセプターガンマ（PDBコード3LBD）の残基4(GLN185)から残基234(MET415)と等価なフォールディングを採用することが見出された。ヒトレチノイン酸レセプターガンマは、核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインとして機能することが知られている。さらにヒトレチノイン酸レセプターガンマの“LBDモチーフ”残基、PHE251、LEU254、ASP258、GLN259、LEU262およびLEU263は、BAA07892.2ではそれぞれVAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583として保存されている。前記の関係は単にヒトレチノイン酸レセプターガンマとの関係ではなく、むしろ全体としての核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン類との関係である。したがって、ヒトレチノイン酸レセプターガンマ（3LBD）とBAA07892.2とのゲノムスレッダー（Genome Threader）（商標）アラインメントの参照によって、BAA07892.2のVAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583は“LBDモチーフ”残基を形成すると予想される。
等価なフォールディングおよび“LBDモチーフ”残基保存が組み合わされて、BAA07892.2のこの領域、したがってこの領域を含むタンパク質が核内ホルモンレセプターのリガンド結合ドメイン活性を有するという機能的注釈付けが可能である。
【００１２】
第一の特徴では、本発明はポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む；
（ii）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するそのフラグメントである；または
（iii）（ｉ）または（ii）の機能的等価物である。
好ましくは、前記ポリペプチドは、
（ｉ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列から成る；
（ii）核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を有するか、または（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するそのフラグメントである；または
（iii）（ｉ）または（ii）の機能的等価物である。
配列番号：２に記載の配列を有するポリペプチドは以下では“LBDS1ポリペプチド”と称する。
本発明の前記特徴にしたがえば、上記（ii）に記載の好ましいポリペプチドフラグメントは、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性に必要なものと予想される、LBDS1ポリペプチドの領域（以下では“LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域”と称する）を含むか、またはその変種であって“LBDモチーフ”（VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または同等な残基）を保有する。本明細書で定義されるように、LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDS1ポリペプチド配列の残基1507と残基1742の間に広がっていると考えられる。
本発明の前記特徴はまた、ポリペプチドのフラグメントおよび上記で定義したこれらポリペプチドフラグメントの変種を取り込んだ融合タンパク質を含むが、ただし前記融合タンパク質は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保有することを条件とする。
【００１３】
第二の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。好ましくは前記精製核酸分子は、配列番号：１（LBDS1ポリペプチドをコードする）に記載の核酸配列を有するか、または前記配列の重複等価物またはフラグメントである。好ましい核酸フラグメントは、上記（ii）に記載のポリペプチドフラグメント、好ましくはLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメントをコードするものであるか、上記に定義したこれらフラグメントの変種をコードするものである。
第三の特徴では、本発明は、本発明の第二の特徴の核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする精製核酸分子を提供する。
第四の特徴では、本発明は、本発明の第二または第三の特徴の核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。
第五の特徴では、本発明は、本発明の第四の特徴のベクターで形質転換されたホスト細胞を提供する。
第六の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドと特異的に結合し、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を抑制するリガンドを提供する。
第七の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるか、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
本発明の第七の特徴の化合物は、前記ポリペプチドの遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを増加（作働）させるか、または低下（拮抗）させる。重要なことには、LBDS1ポリペプチドのLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域として本明細書でそれぞれ定義された領域の機能を特定することによって、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインが関与する疾患の治療および／または診断に有効な化合物を特定することが可能なスクリーニング方法をデザインすることができる。
【００１４】
第八の特徴では、本発明は、診断または治療で使用するための本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第五の特徴のリガンド、または本発明の第六の特徴の化合物を提供する。前記分子はまた以下を含む疾患の治療を目的とする医薬の製造においても用いることができる：細胞増殖性疾患（腫瘍、癌および骨髄増殖症候群および血管形成を含む）、代謝性障害（肥満、骨粗しょう症、非インスリン依存性糖尿病、脂質代謝異常、甲状腺機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症を含む）、心臓血管疾患（高血圧、アテローム性硬化症、高インスリン血症、心不整脈を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（skin disorders）（皮膚疾患（dermatological disease）、乾癬、アクネ、加齢、湿疹、創傷治癒を含む）、炎症（炎症性大腸疾患、気道の炎症、気腫、喘息を含む）、免疫障害、自己免疫疾患、多発性硬化症、神経系疾患（不安、抑うつ、神経変性疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病、脳損傷、卒中および痛みを含む）、感染（ウイルス感染を含む）、並びに核内ホルモンが関係するその他の病的状態。
【００１５】
第九番目の特徴では、本発明は患者で疾患を診断する以下の工程を含む方法を提供する：本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベル、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性レベルを前記患者由来の組織で評価し、さらに前記発現または活性レベルをコントロールレベルと比較する工程であって、この場合前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆する。前記の方法は好ましくはin vitroで実施されるであろう。同様な方法は患者での疾患治療のモニタリングに使用することができる。この場合、時間の経過にしたがってポリペプチドまたは核酸分子の発現もしくは活性レベルがコントロールレベルに向かって変化するのは疾患の緩解の指標となる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドを検出する好ましい方法は以下の工程を含む：（ａ）本発明の第六の特徴のリガンド（例えば抗体）を生物学的サンプルとリガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；および、（ｂ）前記複合体を検出する工程。
本発明の第九番目の特徴に記載の方法には、当業者には明らかなように種々の異なる方法、例えば短いプローブによる核酸ハイブリダイゼーション法、点変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、および異常なタンパク質レベルを検出する抗体を用いる方法が存在する。同様な方法を短期または長期ベースで用いて、モニターされる疾患の治療を可能にすることができる。本発明はまた前記疾患診断方法で有用なキットを提供する。
【００１６】
第十番目の特徴では、本発明は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての本発明の第一の特徴のポリペプチドの使用を提供する。本発明はまた、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性をもつタンパク質の発現のために本発明の第二または第三の特徴に記載の核酸分子の使用を提供する。本発明はまた核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を発揮させる方法を提供し、前記方法は本発明の第一の特徴のポリペプチドを利用する。
第十一番目の特徴では本発明は医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を医薬的に許容できる担体と一緒に含有する。
第十二番目の特徴では、本発明は、疾患の診断または治療を目的とする医薬の製造で使用するために、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二のもしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を提供する。前記診断または治療される疾患は、例えば、細胞増殖性疾患（腫瘍、癌および骨髄増殖症候群および血管形成を含む）、代謝性障害（肥満、骨粗しょう症、非インスリン依存性糖尿病、脂質代謝異常、甲状腺機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症を含む）、心臓血管疾患（高血圧、アテローム性硬化症、高インスリン血症、心不整脈を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（skin disorders）（皮膚疾患（dermatological disease）、乾癬、アクネ、加齢、湿疹、創傷治癒を含む）、炎症（炎症性大腸疾患、気道の炎症、気腫、喘息を含む）、免疫障害、自己免疫疾患、多発性硬化症、神経系疾患（不安、抑うつ、神経変性疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病、脳損傷、卒中および痛みを含む）、感染（ウイルス感染を含む）、並びに核内ホルモンが関係するその他の病的状態である。
【００１７】
第十三番目の特徴では、本発明は患者の疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、本発明の第一の特徴のポリペプチド、または本発明の第二もしくは第三の特徴の核酸分子、または本発明の第四の特徴のベクター、または本発明の第六の特徴のリガンド、または本発明の第七の特徴の化合物を患者に投与することを含む。
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患の場合、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物はアゴニストでなければならない。逆に、前記天然の遺伝子の発現、または前記ポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現または活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患の場合、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物はアンタゴニストでなければならない。前記拮抗薬の例にはアンチセンス核酸分子、リボザイムおよびリガンド（例えば抗体）が含まれる。
第十四番目の特徴では、本発明は、本発明の第一の特徴のポリペプチドを高レベルで、または低レベルで発現させるために、または全く発現させないために形質転換した遺伝子導入または遺伝子ノックアウト非ヒト動物を提供する。前記遺伝子導入動物は、疾患の研究用モデルとして非常に有用であり、さらに前記疾患の治療または診断に有効な化合物の特定を目的とするスクリーニング方法で用いることができる。
【００１８】
本発明を利用するために用いることができる標準的な技術および方法の要旨は下記で提供される。本発明は、記載した特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に限定されないことは理解されよう。本明細書で用いられる専門用語は単に個々の実施態様を説明するためのものであり、前記用語によって本発明の範囲を限定しようとするものではないこともまた理解されよう。本発明の範囲は添付の請求の範囲の用語によってのみ限定される。
本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が用いられる。
本発明の実施では別に指示がなければ、分子生物学、微生物学、リコンビナントDNA技術および免疫学の通常の技術が用いられるであろう。前記技術は当業者の技術範囲内である。
前記のような技術は文献で完全に説明されている。特に適切な解説書の例には以下が含まれる：Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989)； DNA Cloning, Vol. I and II ( D.N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.)特にVol. 154 & 155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London)；Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, NY)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986)。
【００１９】
本明細書において用いる、“ポリペプチド”という用語は、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合した2つまたは3つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質（すなわちペプチド同族体）が含まれる。前記用語は、短鎖（ペプチドおよびオリゴペプチド）および長鎖（タンパク質）の両方を指す。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質の形態を有するものでもよいが、またプレ−、プロ−またはプレプロ−タンパク質であってプレ−、プロ−またはプレプロ−部分の切断によって活性化され、活性を有する成熟ポリペプチドを生じるタンパク質でもよい。そのようなポリペプチドでは、プレ−、プロ−またはプレプロ−配列はリーダー配列もしくは分泌配列であっても、または成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列であってもよい。
本発明の第一の特徴のポリペプチドは融合タンパク質の一部分を形成することができる。例えば、1つまたは2つ以上の付加アミノ酸配列を含むことがしばしば有利である。前記付加アミノ酸配列は、分泌もしくはリーダー配列、プロ−配列、精製を促進する配列、またはより高いタンパク質安定性（例えばリコンビナント形成時に）を付与する配列を含むことができる。あるいは、または前記に加えて、前記成熟ポリペプチドを別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を延長するための化合物（例えばポリエチレングリコール）を融合させることができる。
【００２０】
ポリペプチドは、天然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）によって、または当業者に周知の化学的改変技術によって改変された、20の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドに一般的に存在する公知の改変にはグリコシル化、脂質付加、硫化、γ−カルボキシル化（例えばグルタミン酸残基の）、ヒドロキシル化およびADP−リボシル化がある。他の可能な改変には、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、GPIアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解反応、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、タンパク質への転移RNA仲介アミノ酸付加（例えばアルギニル化）およびユビキチン付加が含まれる。
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチド内のいずれの場所に生じてもよい。実際、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端またはその両端の共有結合改変によるブロッキングは、天然に存在するポリペプチドおよび合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドにも存在してよい。
【００２１】
ポリペプチド内に生じる改変はしばしばポリペプチドが生成される方法の関数であろう。遺伝子組換えによって生成されるポリペプチドの場合、大部分の改変の性質および程度は、個々のホスト細胞の改変能力および問題のポリペプチドのアミノ酸配列に存在する改変シグナルによって決定されるであろう。例えば、グリコシル化パターンは種々のホスト細胞タイプ間で異なるであろう。
本発明のポリペプチドは任意の適切な様式で製造することができる。そのようなポリペプチドには、天然に存在する単離されたポリペプチド（例えば細胞培養から精製）、遺伝子組換えにより生成されたポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成により生成されたポリペプチド、または前記方法を併用して生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、LBDS1ポリペプチドと相同なポリペプチドであろう。２つのポリペプチドは、前記ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列に対して十分な同一性または類似性を有する場合、本明細書で用いられるように“相同である”と称される。“同一性”とは、アラインメントを実施した配列のどの特定の場所においても、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。“類似性”は、アラインメントを実施した配列のいずれの特定の場所においても、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。同一性および類似性の度合いは容易に計算できる（Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing. Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987；およびSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991）。
【００２２】
したがって、相同なポリペプチドには、LBDS1ポリペプチドの天然の生物学的変種（例えば前記ポリペプチドが由来した種における対立形質変種または地理的変種）および変異体（例えばアミノ酸置換、挿入または欠失を含む変異体）が含まれる。前記変異体は、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されてあるポリペプチドを含むことができ、さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝コードでコードされたものでもそうでなくてもよい。典型的な前記の置換は、Ala、Val、LeuおよびIle間で;SerとThr間で;酸性残基AspとGlu間で;AsnとGln間で、塩基性残基LysとArg間で;または芳香族残基PheとTyr間で生じる。特に好ましいものは、いくつか（すなわち5から10、1から5、1から3、1から2、または単に1つ）のアミノ酸が任意の組合せで置換されたまたは欠失または付加された変種である。特に好ましいものは、タンパク質の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。さらにこれに関して特に好ましいものは保存的置換である。
前記変異体にはまた、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドが含まれる。
【００２３】
典型的には、2つのポリペプチド間で80％を越える同一性（好ましくは特定領域で）が機能的等価物を示すと考えられる。好ましくは、本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドは、LBDS1ポリペプチドに関して、またはその活性なフラグメントに関して80％を越える配列同一性を有する。より好ましいポリペプチドは、LBDS1ポリペプチドまたはその活性なフラグメントに関してそれぞれ85％、90％、95％、98％または99％を越える同一性を有する。
本明細書の同一性のパーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメーター[Blosum62マトリックス；ギャップ開放ペナルティー＝11およびギャップ伸長ペナルティー＝1]を用いて決定されるとおりである。
本件では、LBDS1の好ましい活性フラグメントは、LBDS1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むもの、および残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基を有する“LBDモチーフ”を保有するものである。“等価な残基”とは、“LBDモチーフ”残基と等価である残基を意味するが、ただし核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持していることを条件とする。例えば、VAL1573はLEU、ILE、ALA、MET、PHE、TYRまたはTRPによって置換することができる。例えば、LEU1574はILE、ALA、VAL、MET、PHE、TYRまたはTRPによって置換することができる。例えば、ASP1578はGLUと置換することができる。例えば、LYS1579は、GLN、ASN、ARG、HIS、SERまたはTHRと置換できる。例えば、ALA1582は、LEU、ILE、VAL、MET、PHE、TYRまたはTRPと置換することができる。例えば、MET1583はLEU、ILE、ALA、VAL、PHE、TYRまたはTRPによって置換することができる。したがって本発明のこの特徴は、LBDS1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関して80％を越える同一性、好ましくは85％、90％、95％、98％または99％を越える同一性をそれぞれ有するポリペプチド、および、VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基をもつ“LBDモチーフ”を保有するものを含む。上記で考察したように、LBDS1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDS1ポリペプチド配列の残基1507と残基1742の間に広がっていると考えられる。
【００２４】
本発明の第一の特徴の機能的に等価なポリペプチドはまた、構造的アラインメント技術の１つまたは２つ以上を用いて特定されたポリペプチドであろう。例えば、バイオペンジウム（Biopendium）検索データベースを作製するために用いられた検索ツールの１つの特徴を形成するインファーマチカゲノムスレッダー（商標）（Inpharmatica Genome Treader）技術を用いて（同時係属国際特許出願PCT/GB01/01105を参照されたい）、LBDS1ポリペプチドと比較したとき、配列同一性は低いが、LBDS1ポリペプチド配列と顕著な構造的相同性を共有するがゆえに、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性をもつと予想される、現在はまだ知られていない機能を有するポリペプチドを特定することができる。
“顕著な構造的相同性”とは、インファーマチカゲノムスレッダー（商標）が、2つのタンパク質またはタンパク質領域が、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％および前記を越える確実性で構造的相同性を共有することを予測することを意味する。前記インファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）の前記確実性の値は以下のように計算される。既知の構造を有する配列をもっぱら使用して先ず初めに一組の比較をインファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）を用いて実施した。いくつかの比較は（構造を基準にして）関連することが判明しているタンパク質間で実施された。続いてニューラルネットワークを、ＣＡＴＨ構造分類（www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath）から得られる既知の関係と既知の非関係とを最も良く識別するために必要であった基準にしたがってトレーニングした。これによって0と1の間のニューラルネットワークスコアが得られた。しかしながら、一方で関連するタンパク質の数および無関係のタンパク質の数は公知であるので、前記ニューラルネットワークの結果を小群に分配し、正確な結果のパーセンテージを経験的に計算することが可能であった。このようにして、バイオペンジウム検索データベースにおける全ての真正の予測はニューラルネットワークスコアが付随しており、信頼百分率は、インファーマチカゲノムスレッダー（登録商標）がいかに良好なトレーニング／テストセットであるかを反映したものである。
【００２５】
LBDS1の構造的相同体は、LBDS1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と構造的相同性を共有し、“LBDモチーフ” 残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基を保有するはずである。そのような構造的相同体は、前記ポリペプチド配列と顕著な構造的相同性を共有し、さらに“LBDモチーフ”残基を保有するがゆえに、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を有すると予想される。
本発明の第一の特徴のポリペプチドにはまた、LBDS1ポリペプチドのフラグメント、LBDS1ポリペプチドのフラグメントの機能的等価物、およびLBDS1ポリペプチドのフラグメントの機能的等価物のフラグメントが含まれるが、ただし前記機能的等価物およびフラグメントは核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を保持するか、またはLBDS1ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
【００２６】
本明細書において用いる、“フラグメント”という用語は、LBDS1ポリペプチド、またはその機能的等価物のアミノ酸配列の一部分（全部ではなく）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。フラグメントは、前記配列に由来する少なくともn個の連続するアミノ酸を含まなければならない。さらに、個々の配列に応じて、nは7またはそれより大きい（例えば8、10、12、14、16、18、20またはそれより大きい）。小さなフラグメントは抗原決定基を構成することができる。
本発明のこの態様の好ましいポリペプチドフラグメントは、LBDS1ポリペプチドのそれぞれLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と本明細書で定義する領域を含むフラグメントである。これらの領域は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインと注釈付けされた領域である。
LBDS1ポリペプチドの場合、この領域は残基1507と残基1742の間に広がっていると考えられる。
このフラグメントの変種は、本発明のこの特徴の実施態様として包含されるが、ただしこれら変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保有することを条件とする。
ある場合には、“変種”という用語は本ポリペプチドフラグメントの伸長型または短縮型を含むことが意図される。
【００２７】
伸長型変種の場合、LBDS1ポリペプチド配列内のこれら境界のＣ末端および／またはＮ末端にさらに付加された残基が前記ポリペプチドフラグメントに含まれる場合、LBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域が正確に折り畳まれ、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの活性を示すであろうということは想像に難くない。例えば、LBDS1ポリペプチド配列、または相同な配列に由来する5、10、20、30、40または50またはそれより多いアミノ酸残基が付加されて、前記ポリペプチドフラグメントが正確に折り畳まれる能力を損なうことなく、LBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域の境界のC末端および／またはN末端のいずれか一方または両方に包含され、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン活性を示すことができる。
LBDS1ポリペプチドの短縮型変種の場合、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基をLBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域のＣ末端またはＮ末端の一方または両方で欠失させることができるが、ただし“LBDモチーフ”残基（VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583）または等価な残基は無傷のままで維持され、欠失は、前記残基のいずれかが欠失するほど前記ポリペプチド配列内に深く伸長することはない。
【００２８】
第二の場合には、“変種”という用語は、上記で述べたポリペプチドフラグメントの相同体を含み、前記相同体はLBDS1ポリペプチドの核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と顕著な配列相同性を保有し、さらに前記は“LBDモチーフ”残基（VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583）または等価な残基を保有するが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。
相同体には、LBDS1ポリペプチドのそれぞれLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と30％を越える同一性を保有するポリペプチド分子が含まれる。同一性パーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI(the National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されるデフォルトパラメーター[Blosum62マトリックス；ギャップ開放ペナルティー＝11およびギャップ伸長ペナルティー＝1]を用いて決定されるとおりである。好ましくは、本発明のこの特徴のポリペプチドフラグメントの相同体変種は、LBDS1ポリペプチドのLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関してそれぞれ80％を越える同一性を有する。より好ましくは、変種ポリペプチドは、LBDS1ポリペプチドのLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域に関してそれぞれ85％、90％、95％、98％または99％を越える同一性をそれぞれ有するが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。変種ポリペプチドはまた、上記で考察したポリペプチドフラグメントの短縮型相同体も含むが、ただし前記変種は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとしての活性を保持することを条件とする。
【００２９】
本発明の第一の特徴のポリペプチドフラグメントは、例えばインファーマチカゲノムスレッダー（商標）によって特定される、LBDS1ポリペプチド配列のLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって定義されるポリペプチドフラグメントの構造と構造的相同性を示すポリペプチドフラグメントであろう。したがって、LBDS1ポリペプチド配列のLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって定義されるポリペプチドフラグメントの構造的相同体であるポリペプチドフラグメントは、上記で定義されたように、前記ポリペプチドフラグメントによって採用されるフォールディングと同じフォールディングを採用するはずである。
LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域によって定義されるポリペプチドフラグメントの構造的相同体はまた、“LBDモチーフ” 残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583、または等価な残基を保持するはずである。
【００３０】
そのようなフラグメントは“独立的存在”、すなわち、他のアミノ酸もしくはポリペプチドの部分でもなく、融合もされていなくてもよく、それらフラグメントがその部分または領域を構成するより大きなポリペプチドの内部に含まれていてもよい。より大きなポリペプチドの内部に含まれている場合は、本発明のフラグメントは極めて好ましくは連続するただ1つの領域を形成する。例えばある種の好ましい実施態様は、前記フラグメントのアミノ末端に融合したプレ−および／またはプロ−ポリペプチド領域、および／または前記フラグメントのカルボキシ末端に融合した付加的領域を有するフラグメントに関する。しかしながら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペプチドの内部に含まれてもよい。
本発明のポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント（少なくとも１つの抗原決定基を含む）を用いてリガンド、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる。そのような抗体は、本発明のポリペプチドを発現しているクローンの単離もしくは特定に、または前記ポリペプチドのアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いることができる。前記抗体はまた、当業者には明らかなように他の利用の中で特に診断または治療補助としても用いられるであろう。
【００３１】
“免疫特異的”という用語は、前記抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドに対する親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に強い親和性を有することを意味する。本明細書で用いる“抗体”という用語は、完全な分子だけでなく問題の抗原決定基と結合することができるそのフラグメント、例えばFab、F(ab')2およびFvも意味する。したがって、そのような抗体は本発明の第一の特徴のポリペプチドと結合する。
ポリクローナル抗体が所望される場合は、選択される哺乳類（例えばマウス、ウサギ、ヤギまたはウマ）は、本発明の第一の特徴のポリペプチドで免疫することができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチドは、リコンビナントDNA技術によって誘導するか、または化学的に合成することができる。所望する場合には、前記ポリペプチドは担体タンパク質と結合させることができる。前記ポリペプチドと化学的に結合させることができる一般的に用いられる担体には、ウシ血清アルブミン、タイログロブリンおよびキーホールリンペットのヘモシアニンが含まれる。続いて前記担体結合ポリペプチドを用いて動物を免疫することができる。免疫動物から血清を採集し、公知の方法（例えばイムノアフィニティークロマトグラフィー）で処理する。
【００３２】
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もまた当業者は容易に製造できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法は周知である（例えば以下を参照されたい：G. Kohler & C. Milstein, Nature 256:495-497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Vole et al., 77-96 “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. (1985)）。
本発明の第一の特徴のポリペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体群を種々の特性、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、それらを誘導させた個々のポリペプチドの精製に特に有用である。また別には、問題のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を、例えば当分野で公知のＰＣＲ技術によってハイブリドーマから単離し、さらにクローニングし適切なベクターで発現させることができる。
キメラ抗体[非ヒト可変領域がヒトの定常領域と結合または融合されている（例えば以下を参照されたい：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439(1987)）]もまた有用であろう。
【００３３】
抗体は、例えばヒト化によって（例えば以下を参照されたい：Jones et al., Nature,321:522(1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534(1988); Kabat et al., J. Immunol., 147:1709(1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029(1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:34181(1991); Hodgson et al., Bio/Technology 9:421(1991)）改変して各個体での免疫原性を減少させることができる。本明細書で用いられる“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン中のＣＤＲアミノ酸および選択した他のアミノ酸がヒト抗体の等価なアミノ酸に代えて置換されている抗体分子を指す。したがって、ヒト化抗体はヒトの抗体と密接に類似するがドナー抗体の結合能力を有する。
また別の選択肢では、前記抗体は“二重特異性”抗体であってもよい。前記は２つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインは異なるエピトープに向けられている。
ファージディスプレー技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する結合活性をもつ抗体をコードする遺伝子を、関連抗体の保有についてスクリーニングされたヒトのリンパ球のPCR増幅V−遺伝子、または未感作ライブラリーのいずれかから選別することができる（J. McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554; J. Marks et al., (1992) Biotechnology 10:779-783）。前記抗体の親和性はまた鎖のシャッフリングによって改善することができる（T. Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628）。
上記の技術によって作製された抗体は（ポリクローナルであれモノクローナルであれ）、免疫アッセイ、放射能免疫アッセイ（RIA）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ELIZA）の試薬として用いることができるというさらに別の有用性を有する。前記の利用では、これら抗体は分析的に検出可能な試薬（例えば放射性同位元素、蛍光分子または酵素）で標識することができる。
【００３４】
本発明の第二および第三の特徴の好ましい核酸分子は、配列番号：２に記載のポリペプチド配列および機能的に等価なポリペプチドをコードするものである。前記機能的に等価なポリペプチドには、LBDS1ポリペプチドの活性なフラグメント、例えばLBDS1ポリペプチド配列のLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメントフラグメント、またはその相同体が含まれる。
これら配列ストレッチを包含する核酸分子は本発明のこの特徴の好ましい実施態様を構成する。
これらの核酸分子は、本明細書に記載する方法および応用で用いることができる。好ましくは本発明の核酸分子は、本明細書に開示する配列の連続する少なくともn個のヌクレオチドを含む。nは、個々の配列に応じて10またはそれより大きい（例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40またはそれより大きい）。
本発明の核酸分子はまた上記で述べた核酸分子と相補的な配列を含む（例えばアンチセンスまたはプローブとしての目的のために）。
本発明の核酸分子は、RNA（例えばmRNA）、またはDNA（例えばcDNA、合成DNAまたはゲノムDNAを含む）の形態をとることができる。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学合成によって、またはそれらを併用して得ることができる。前記核酸分子は、例を挙げれば、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成を用いる化学合成によって、ゲノムまたはcDNAライブラリーから、または生物体から分離することによって調製することができる。RNA分子は一般的にはDNA配列のin vitroまたはin vivo転写によって生成することができる。
【００３５】
核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAはコード鎖（センス鎖とも称される）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖とも称される）でもよい。
“核酸分子”という用語にはまたDNAおよびRNAの類似体（例えば改変骨格を含むもの）、並びにペプチド核酸（PNA）が含まれる。本明細書で用いられる“PNA”という用語はアンチセンス分子またはアンチジーン作用因子を指し、長さが少なくとも５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドがアミノ酸残基のペプチド骨格と結合されたものをいう。前記ペプチド骨格は好ましくはリジンで終わり、前記末端リジンは当該組成物に可溶性を付与する。ＰＮＡはＰＥＧ化（pegylated）されて細胞内での寿命が延長されてもよい[細胞内では、ＰＮＡは優先的に相補性一本鎖DNAおよびRNAと結合して転写物伸長を停止させる（P.E. Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）]。
配列番号：２またはその活性フラグメントをコードする核酸分子は、配列番号：１に示した核酸分子のコード配列と同一でもよい。これらの分子はまた、遺伝コードの縮退の結果として、配列番号：２またはLBDS1ポリペプチドの活性フラグメント（例えばLBDS1の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント）、またはその相同体をコードする多様な配列を有することができる。LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、LBDS1ポリペプチド配列の残基1507と残基1742の間に広がっていると考えられる。配列番号：１では、LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、したがってヌクレオチド4548から5255を含む核酸分子によってコードされる。この配列ストレッチを包含する核酸分子、および前記配列の相同体は、本発明のこの特徴の好ましい実施態様を構成する。
【００３６】
配列番号：２のポリペプチドをコードする前記核酸分子には、それ自体で成熟なポリペプチドのコード配列；成熟ポリペプチドおよび付加コード配列（例えばリーダー配列または分泌配列、例えばプロ−、プリ−またはプレプロ−ポリペプチド配列）のためのコード配列；前述の付加的コード配列を伴なう、または伴なわないが、さらに付加的な非コード配列（非コード5'および3'配列）を伴なう成熟ポリペプチドのコード配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記の非コード5'および3'配列は、例えば転写される非翻訳配列で、転写（終止シグナルを含む）、リボソーム結合およびmRNA安定性で役割を有するものである。前記核酸分子はまた、付加アミノ酸、例えば更なる官能性を提供するアミノ酸をコードする付加配列を含むことができる。
【００３７】
本発明の第二および第三の特徴の核酸分子にはまた、本発明の第一の特徴のポリペプチドのフラグメントまたは機能的等価物およびそのフラグメントが含まれる。
上記で考察したように、LBDS1ポリペプチドの好ましいフラグメントは、LBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメント、またはその相同体である。前記核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域は、配列番号：１のヌクレオチド4548から5255を含む核酸分子によってコードされる。
本発明の機能的に等価な核酸分子は、天然に存在する変種（例えば天然に存在する対立形質変種）であっても、または前記分子は天然に存在することが知られていない変種であってもよい。前記のような天然に存在しない核酸分子の変種は、突然変異誘発技術（核酸分子、細胞または生物に対して適用される技術が含まれる）によって達成できる。
このような変種の中では、特にヌクレオチドの置換、欠失または挿入によって前述の核酸分子と異なる変種が挙げられる。置換、欠失または挿入は１つまたは２つ以上のヌクレオチドを含むことができる。変種はコード領域または非コード領域またはその両方が変化していてもよい。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入をもたらすであろう。
【００３８】
本発明の核酸分子はまた、遺伝子生成物（ポリペプチド）のクローニング、プロセッシングおよび／または発現の改変を含む多様な理由で当分野で一般的に知られている方法を用いて作製することができる。ランダムフラグメント化によるDNAシャッフリングおよび遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アッセンブリーは、ヌクレオチド配列の作製に用いる技術に含まれる。位置特異的突然変異誘発を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの改変、コドンの優先性の変化、スプライシング変種の生成、変異の導入など、その他を実施することができる。
本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする核酸分子は異種配列に連結し、それによって結合核酸分子が融合タンパク質をコードすることができるようにしてもよい。前記のような結合核酸分子は本発明の第二または第三の特徴に包含される。例えば、本発明のポリペプチドの抑制物質のためのペプチドライブラリーをスクリーニングするために、前記のような結合核酸分子を用いて、市販の抗体によって認識される融合タンパク質を発現させることは有用であろう。融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチド配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作し、それによって前記ポリペプチドを異種タンパク質から切り離して精製することができるようにしてもよい。
【００３９】
本発明の核酸分子にはまた本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、したがってコード核酸分子とハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子が含まれる。そのようなアンチセンス分子（例えばオリゴヌクレオチド）は、当業者には理解されるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、前記と特異的に結合して前記の転写を妨げるようにデザインすることができる（例えば以下の文献を参照されたい：J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci., 10:435(1989); J. Okano, Neurochem. 56:560(1991); J. O' Connor, Neurochem. 56:560(1991); Lee et al., Nucleic Acids Res. 6:3073(1979); Cooney et al., Science 241:456(1988); Dervan et al., Science 251:1360(1991)）。
本明細書で用いられる“ハイブリダイゼーション”という用語は、２つの核酸分子が水素結合によって互いに結合することを指す。典型的には、１つの分子が固相支持体に固定され、他方は溶液中で遊離しているであろう。続いて２つの分子を水素結合に適した条件下で互いに接触させる。前記結合に影響する因子には以下が含まれる：溶媒のタイプおよび体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；攪拌；液相分子の固相支持体への非特異的結合を阻害する薬剤（デンハルト試薬、またはBLOTTO）；分子の濃度；分子の結合速度を増加させる化合物の使用（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）；およびハイブリダイゼーションの後の洗浄条件のストリンジェンシー度（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。
【００４０】
完全に相補的な分子と標的とのハイブリダイゼーションの抑制は、当業者に公知のハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる（例えばSambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。したがって、実質的に相同な分子は、文献（G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399-407; A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152:507-511）に開示されたように完全に相同な分子と標的分子との結合を種々のストリンジェンシー条件下で競合および抑制する。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の結合よりも非常に類似した分子の結合に適したハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液（50％のホルムアミド、5倍のSSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5倍のデンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/mLの変性せん断サケ精子DNA）中で42℃で一晩インキュベーションし、続いてろ液を0.1倍のＳＳＣで約65℃で洗浄すると定義される。低ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション反応が35℃で実施されることを含む（Sambrook et al.（上掲書）を参照されたい）。好ましくは、ハイブリダイゼーションに用いられる条件は高ストリンジェンシーを構成するものである。
【００４１】
本発明のこの特徴の好ましい実施態様は、LBDS1ポリペプチド（配列番号：２）をコードする核酸の全長に対して少なくとも80％同一である核酸分子、および前記のような核酸に対して実質的に相補的な核酸分子である。好ましい活性フラグメントは、LBDS1ポリペプチド配列のそれぞれLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域を含むフラグメントである。したがって、好ましい核酸分子は、LBDS1ポリペプチド配列の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域をコードする核酸分子の全長にわたって少なくとも80％同一であるものを含む。
本明細書に示す通り同一性パーセンテージは、BLASTバージョン2.1.3でNCBI（the National Center for Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって特定されたデフォルトパラメーターを用いて決定されるとおりである。
好ましくは、本発明のこの特徴の核酸分子は、配列番号：１に示された配列を有する核酸分子、この配列のヌクレオチド4548-5255を含む領域の全長に対して少なくとも80％同一の領域を含むもの、またはこれら核酸領域のいずれかと相補的である核酸分子である。この場合、前記の全長に対して少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％または99％同一の核酸分子が特に好ましい。これに関して、好ましい実施態様は、LBDS1ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００４２】
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出する方法を提供する：（ａ）二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸プローブを生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）形成された前記の全ての二重鎖を検出する工程。
本発明にしたがって利用することができるアッセイに関連して下記でさらに考察するように、上記で述べた核酸分子をRNA、cDNAまたはゲノムDNAのためのハイブリダイゼーションプローブとして用い、LBDS1ポリペプチドをコードする完全長のcDNAおよびゲノムクローンを単離し、さらに前記ポリペプチドをコードする遺伝子と高い配列類似性を有する相同遺伝子またはオルソロガス遺伝子のcDNAまたはゲノムクローンを単離することができる。
これに関しては、当分野で公知の他の技術の中で特に以下の技術を用いることができる。これらの技術は例示として下記で考察される。DNA配列決定および分析のための方法は周知で、当分野では一般的に利用可能であり、実際に本明細書で考察される本発明の実施態様の多くを実施するために用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、シークエナーゼ（US Biochemical Corp., Cleaveland, OH）、Taqポリメラーゼ（Prekin Elmer）、熱耐性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham, Chicago, IL）、またはポリメラーゼと読み取り保証エキソヌクレアーゼ（例えば市販（Gibco/BRL, Gaithersburg, MD）のELONGASE増幅キットで見出されるようなもの）のような酵素を利用することができる。好ましくは、配列決定プロセスは、例えばハミルトンマイクロラブ（Hamilton Micro Lab）2200（Hamilton, Reno, NV）、ペルチアサーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler）PTC200（MJ Research, Watertown, MA）およびＡＢＩカタリスト373および377DNAシークエンサー（Perkin Elmer）のような機器を用いて自動化することができる。
【００４３】
LBDS1ポリペプチドの機能と等価な機能を有するポリペプチド、特にLBDS1ポリペプチドのLBDS1核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン領域と同等の機能もつポリペプチドをコードする核酸分子を単離する方法の１つは、当分野で知られている標準的な方法を用いる、天然のプローブまたは人工的にデザインしたプローブによるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーの探索である（例えば以下の文献を参照されたい：”Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。特に有用なプローブは、適切なコード遺伝子（配列番号：１）、特に配列番号：１のヌクレオチド4548-5255の領域に由来する核酸配列に対応する、または前記配列と相補的な少なくとも15、好ましくは少なくとも30、さらに好ましくは少なくとも50の連続塩基を含むプローブである。
前記のようなプローブは分析的な検出が可能な試薬で標識して前記プローブの識別を容易にすることができる。有用な試薬には、放射性同位元素、蛍光染料、および検出可能な生成物の生成を触媒することができる酵素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。これらのプローブを用いて、当業者は、ヒト、哺乳類または他の動物から問題のタンパク質をコードするゲノムDNA、cDNAまたはRNAポリヌクレオチドの相補的なコピーを単離し、関連配列について、例えば前記のファミリー、タイプおよび／またはサブタイプに属するまた別のメンバーについて前記の供給源をスクリーニングすることができるであろう。
【００４４】
多くの事例で、単離されるcDNA配列は不完全で、ポリペプチドをコードする領域は短く（通常は５’末端で）切断されるているであろう。完全長のcDNAを得るために、または短いcDNAを伸長させるためにいくつかの方法が利用可能である。そのような配列は、部分的なヌクレオチド配列を用い、さらに上流の配列（例えばプロモーターおよび調節エレメント）を検出することを目的とする当分野で公知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、利用可能なある方法はcDNA末端迅速増幅法（RACE；例えば以下を参照されたい：Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85:8998-9002）によるものである。前記技術の最近の改変（例えばマラソン（Marathon）（商標）技術（Clontech Laboratories Inc.）を例示することができる）は、より長いcDNAの検索を顕著に単純化した。わずかに異なる技術（“制限部位”PCRと称される）では、普遍的プライマーを用いて既知の遺伝子座に近接する未知の核酸配列が検索される（G. Sarkar (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。逆ＰＣＲもまた、既知の領域にもとづく多様なプライマーを用いた配列の増幅または伸長に用いることができる（T. Triglia et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186）。使用できるまた別の方法は捕捉ＰＣＲで、前記は、ヒトおよび酵母の人工染色体DNAで既知配列に近接するDNAフラグメントのＰＣＲ増幅を含む（M. Lagerstrom et al. (1991) PCR Methods Applic. 1:111-119）。未知の配列を検索するために利用可能なまた別の方法はパーカーの方法である（J.D. Parker et al.(1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）。さらにまたゲノムDNA探索のためにPCR、入れ子（nested）プライマーおよびプロモーターファインダー（PromoterFinder）（商標）ライブラリー（Clontech, Palo Alto, CA）を用いてもよい。この方法ではライブラリーのスクリーニングが不要で、イントロン／エクソン結合部を見つける場合に有用である。
【００４５】
完全長cDNAをスクリーニングする場合、より大きなcDNAを包含するためにサイズ選別を実施したライブラリーを用いることが好ましい。さらにまた、遺伝子の5'領域を含む配列をより多く含むという点でランダムプライムライブラリーが好ましい。ランダムにプライミングされたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長cDNAを生成できない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、5'非転写調節領域に配列を伸長させるために有用であろう。
本発明のある実施態様では、染色体局在化のために本発明の核酸分子を用いることができる。この技術では、核酸分子は特異的に個々のヒト染色体上の特定の位置に対して標的化され、個々のヒト染色体上の特定の位置にハイブリダイズさせることができる。本発明の関連配列の染色体上へのマッピングは遺伝子関連疾患に関する配列の相関性確認において重要な工程である。いったん染色体の正確な位置に配列がマッピングされたら、前記配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出すことができる：V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（ジョンズホプキンス大学、ウェルヒメディカルライブラリーからオンラインで入手できる）。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を続いてリンケージ分析（物理的に近接する遺伝子の同時遺伝）によって特定する。これにより、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する者に貴重な情報が提供される。いったん疾患または症状の位置が遺伝的リンケージによって個々のゲノム領域でおおざっぱに決定されたら、前記領域にマッピングされるいずれの配列も、更なる解析のための関連または調節遺伝子となることができる。前記核酸分子はまた、正常な個体、キャリアー個体または罹患個体間で転座、逆位などによる染色体上の位置の相違を検出するために用いることができる。
【００４６】
本発明の核酸分子はまた組織分布解析のために貴重である。そのような技術は、ポリペプチドをコードするmRNAに検出によって組織中の前記ポリペプチドの発現パターンの決定を可能にする。これらの技術にはin situハイブリダイゼーションおよびヌクレオチド増幅技術（例えばPCR）が含まれる。これらの研究から得られる結果は、生物内での前記ポリペプチドの正常な機能を示唆する。さらに、変異遺伝子によってコードされるmRNAの発現パターンと正常mRNA発現パターンとの比較研究によって、変異ポリペプチドの疾患における役割に対する貴重な洞察が提供される。そのような不適切な発現は時間的、位置的または量的特性を有するかもしれない。
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、クローニングベクターでも発現ベクターでもよい。本発明のホスト細胞（前記は本発明のベクターよる形質転換、トランスフェクトまたは形質導入が可能である）は原核細胞でも真核細胞でもよい。
本発明のポリペプチドは、ホスト細胞内に含まれるベクター中の前記ポリペプチドをコードする核酸分子の発現によってリコンビナント形として調製することができる。前記のような発現方法は当分野では周知であり、以下の文献に多くが記載されている：Sambrook et al.（上掲書）およびFernandez & Hoeffler（1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Tronto）。
【００４７】
一般的には、要求されるホストでポリペプチドを製造するために核酸分子の維持、増殖または発現に適したいずれの系またはベクターも用いることができる。周知であり日常的である種々の技術のいずれによっても（例えば前掲書（Sambrook et al.）に記載されたようなもの）、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することができる。一般的には、コード遺伝子は制御エレメント（例えばプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、および場合によってオペレーター）の制御下に置かれ、それによって所望のポリペプチドをコードするDNA配列を形質転換ホスト細胞でRNAに転写させることができる。
適切な発現系の例には、例えば染色体系、エピソーム系およびウイルス由来系、例えば以下に由来するベクターが含まれる：細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばSV40）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、シュードレービーウイルスおよびレトロウイルス、または上記の組み合わせ、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するもの（例えばコスミドおよびファージミドを含む）。ヒトの人工染色体（HAC）もまた、プラスミドに包含させ発現させるには大きいDNAフラグメントをデリバーするために用いることができる。
【００４８】
特に適切な発現系には、リコンビナントバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物（例えば細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子のホスト細胞への導入は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Basic Methods in Molecular Biology (1986)および上掲書（Sambrook et al.））に記載された方法によって達成できる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、擦過ローディング、弾道導入または感染が含まれる（以下を参照されたい：Sambrook et al.（1989）上掲書；Ausbel et al.（1991）上掲書；Spector, Goldman & Leinward,（1998））。
【００４９】
コード核酸分子は、所望であれば、例えばシグナルペプチドまたはリーダー配列のようなコントロール配列を（例えば翻訳ポリペプチドの小胞体内、細胞質周囲間隙または細胞外環境への分泌のために）含んでいても含んでいなくてもよい。このシグナルは前記ポリペプチドにとって内因性であっても異種シグナルであってもよい。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングで細菌ホストによって取り除くことができる。
コントロール配列の他に、ホスト細胞の増殖に対して前記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましいことがある。調節配列の例は、化学的または物理的刺激（調節化合物の存在を含む）または多様な温度もしくは代謝条件に対して反応して遺伝子の発現を増加させたり低下させたりする配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5'および3'非翻訳領域である。これらは、ホスト細胞タンパク質と反応して、転写および翻訳を実行する。そのような調節配列は、その強さおよび特異性を変化させることができる。用いられるベクター系およびホストにしたがって、多くの適切な転写および翻訳エレメント（構成的および誘発性プロモーターを含む）を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘発性プロモーター、例えばBluescriptファージミド（Stratagene, La Jolla, CA）またはpSportl（商標）（Gibco BRL）プラスミドなどのハイブリッドlacZプロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞で用いることができる。植物細胞ゲノムに由来するプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、RUBISCOおよび貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルスに由来するプロモーターまたはエンハンサー（例えばウイルスプロモーターまたはリーダー配列）はベクターでクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。マルチコピー配列を含む細胞株の作製が必要な場合、SV40またはEBVをベースにしたベクターを適切な選別可能マーカーとともに用いることができる。
【００５０】
発現ベクターは、個々の核酸コード配列を適切な調節配列とともにベクター内に配置させることができるように構築される。前記コード配列の調節配列に対する位置および向きは、前記コード配列が調節配列の“制御下”で転写されるような位置および向きである（すなわちコントロール配列にてDNA分子と結合するRNAポリメラーゼは前記コード配列を転写する）。いくつかの事例では、前記配列を適切な向きで制御配列と結合させることができるように（すなわちリーディングフレームを維持するために）、前記配列を改変する必要があるであろう。
コントロール配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に核酸コード配列に連結させることができる。あるいは、コード配列は、コントロール配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクターへ直接クローニングすることができる。
長期に及ぶ高収量のリコンビナントポリペプチド生成のためには安定な発現が好ましい。例えば、問題のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメント並びに選別マーカー（同じベクターまたは別個のベクターに存在する）を含む発現ベクターを用いて形質転換させることができる。ベクターの導入に続き、選別培地に切り替える前に細胞を富裕培地で１−２日間増殖させることができる。選別マーカーの目的は、選別に対する耐性を付与することで、選別マーカーの存在によって、導入された配列を発現することができる細胞の増殖および回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【００５１】
発現のためのホストとして利用可能な哺乳類細胞株は当分野で公知であり、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection, ATCC）から入手可能な多くの不朽化細胞株が含まれる。前記には、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HeLa、ベイビーハムスター腎（BHK）、サル腎（COS）、C127、3T3、BHK、HEK293、ボウズ（Bowes）メラノーマおよびヒト肝細胞癌（例えばHepG2）細胞および多数の細胞株が含まれる。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料は、特にインビトロゲン（Invitrogen, San Diego, CA）からキットとして（”MaxBac”キット）市販ルートで入手できる。前記の技術は一般的に当業者に知られており、文献には完全に記載されている（Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)）。この系での使用に特に適切なホスト細胞には昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞が含まれる。
当分野で公知の多くの植物細胞培養および植物体遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例には米国特許第5,693,506号、5,659,122号および5,608,143号に記載されたものが含まれる。植物細胞培養における遺伝子発現のまた別の例も文献に記載されている（Zenk (1991) Phytochemistry 30:3861-3863）。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を形成することが可能な植物は全て利用することができ、それによって導入遺伝子を含む完全な植物が回収される。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実および他の樹木、マメ類および野菜の主要な種の全てを含む（ただしこれらに限定されない）全ての植物を培養細胞または組織から再生させることができる。
【００５２】
特に好ましい細菌ホスト細胞の例には連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセスおよびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）細胞が含まれる。
真菌での発現に特に適切なホスト細胞の例には酵母細胞（例えばビール酵母菌（S. cerevisiae））およびアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞株の回収に用いることができる当分野で公知の多くの選別系が存在する。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（M. Wigler et al.(1977) Cell 11:223-32）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（I. Lowy et al.(1980) Cell 22:817-23）の遺伝子が含まれ、前記はそれぞれtk-またはaprt±細胞で用いることができる。
さらにまた、抗代謝物質耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性を選別基準として用いてもよい。例えばジヒドロフォレートレダクターゼ（DHFR）はメトトレキセートに対する耐性を付与し（M. Wigler et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70）、nptはアミノグリコシド系ネオマイシンおよびG-418に耐性を付与し（F. Colbere-Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14）、さらにalsまたはpatはそれぞれクロロスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選別可能な遺伝子が報告されてあり、当業者にはそれらの例は明白であろう。
【００５３】
マーカー遺伝子の発現の有無は問題の遺伝子もまた存在することを示唆するが、問題の遺伝子の存在および発現を確認する必要がある。例えば、関連する配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、適切な配列を含む形質転換細胞はマーカー遺伝子機能が存在しないことによって識別することができる。また別には、マーカー遺伝子は、ただ１つのプロモーターの制御下で本発明のポリペプチドをコードする配列とともにタンデムに配置することができる。通常、誘発または選別に反応するマーカー遺伝子の発現は、タンデム遺伝子の発現も意味する。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現するホスト細胞は、当業者に知られている多様な方法で特定することができる。前記方法には、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）またはイムノアッセイ技術（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）および放射性イムノアッセイ（RIA））が含まれるが、ただしこれらに限定されない。イムノアッセイ技術は、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のためにメンブレン、溶液またはチップを用いる技術を含む（例えば以下を参照されたい：R. Hampton et al.(1990) Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN；およびD.E. Maddox et al.(1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216）。
【００５４】
多様な標識および結合技術が当業者に知られており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイで用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブの作製手段には、標識ポリヌクレオチドを用いるオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードする配列をベクターにクローニングしてmRNAプローブを作製することができる。そのようなベクターは当分野で公知で、市販ルートで入手可能であり、適切なRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3またはSP6）および標識ヌクレオチドを添加することによりin vitroでRNAプローブを合成するために用いることができる。これらの方法は、種々の市販キット（Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, MI); Promega (Madison, WI); U.S. Biochemical Corp., (Cleaveland, OH)）を用いて実施することができる。
適切なレポーター分子または標識（前記は検出を容易にするために用いることができる）には、放射性核種、酵素および蛍光、化学発光または色素原物質の他に補助因子、抑制物質、磁性粒子などが含まれる。
【００５５】
本発明の核酸分子はまた遺伝子導入動物（特にげっ歯類動物）の作製に用いることができる。そのような遺伝子導入動物は本発明のまた別の特徴を構成する。これは、体細胞の改変によって局部的に、または遺伝性改変を導入する生殖細胞系療法によって実施することができる。前記のような遺伝子導入動物は、本発明のポリペプチドの調製物質として有効な薬剤分子のための動物モデルを作製するために特に有用であろう。
ポリペプチドは、周知の方法によってリコンビナント細胞の培養から回収し精製することができる。前記周知の方法には、硫安またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性反応クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。高速液体クロマトグラフィーは精製に特に有用である。単離および精製の間にタンパク質が変性した場合には、タンパク質の再フォールディングのためによく知られている技術を用いて活性な構造を再生することができる。
【００５６】
所望の場合には、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、本発明のポリペプチドをコードする配列を結合させることにより特殊化したベクター構築物もまたタンパク質の精製を容易にするために用いることができる。そのような精製促進ドメインの例には、金属キレートペプチド（例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびFLAGS伸長／アフィニティー精製系（Immunex Corp., Seattle, WA）で用いられるドメイン）が含まれる。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に特異的なもの）を精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に包含させて、精製の促進に用いてもよい。そのような発現ベクターは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行するいくつかのヒスチジン残基と融合させた本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、IMAC（固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；J. Porath et al.(1992) Prot. Exp. Purif. 3:263-281）による精製を促進し、一方、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターについての考察は以下で提供される：D.J. Kroll et al.(1993) DNA Cell Biol. 12:441-453）。
【００５７】
ポリペプチドをスクリーニングアッセイで使用するために発現させる場合は、前記ポリペプチドを発現するホスト細胞の表面で前記ポリペプチドを生成させることが一般には好ましい。この場合、ホスト細胞はスクリーニングアッセイで使用する前に、例えば蛍光活性化細胞分類（FACS）またはイムノアフィニティー技術のような技術を用いて採集することができる。ポリペプチドが培養液中に分泌される場合は、前記培養液を回収して発現されたポリペプチドを回収および精製することができる。ポリペプチドが細胞内で生成される場合、ポリペプチドを回収する前に、先ず初めに細胞を溶解させねばならない。
本発明のポリペプチドを用いて、化合物ライブラリーを多様な任意の薬剤スクリーニング技術でスクリーニングすることができる。そのような化合物は、本発明のポリペプチドの遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを活性化（作働）させ、または抑制（拮抗）することができる。好ましい化合物は、本発明の第一の特徴のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるために有効であるか、または本発明の第一の特徴のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
アゴニストまたはアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーまたは天然生成物の混合物から単離することができる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは天然または改変された基質、リガンド、酵素、レセプターまたは構造的もしくは機能的模造物質であってよい。前記のスクリーニング技術の適切な概論のためには以下を参照されたい：Coligan et al.(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5。
【００５８】
おそらく良好なアンタゴニストと考えられる化合物は、本発明のポリペプチドと結合し、結合したときに前記ポリペプチドの生物学的作用を誘発しない分子である。潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドと結合し、それによって本発明のポリペプチドの活性を抑制または消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。このような態様で、前記ポリペプチドと正常な細胞の結合分子との結合が抑制され、その結果前記ポリペプチドの正常な生物学的活性が阻害される。
このようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは溶液中で遊離していても、固相支持体に固定されていても、細胞表面に保持されていても、または細胞内に存在していてもよい。一般に、このようなスクリーニングの方法は、前記のポリペプチドを発現している適切な細胞または細胞膜を用いることを含み、前記細胞または細胞膜をテスト化合物と接触させて、結合または機能的な反応の刺激もしくは抑制を観察する。続いて前記テスト化合物と接触させた細胞の機能的反応を、前記テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。前記のようなアッセイによって、テスト化合物が前記ポリペプチドの活性化によって発生するシグナルをもたらすか否かを、適切な検出系を用いて調べる。活性化の抑制物質は、一般的には既知のアゴニストの存在下でアッセイし、テスト化合物の存在下でアゴニストによる活性化の影響を観察する。
【００５９】
或いは、単純な結合アッセイを用いてもよい。この場合、テスト化合物のポリペプチド保持表面への付着が直接または間接的にテスト化合物と結合させた標識手段によって検出されるか、または標識競合物質を用いた競合を含むアッセイで検出される。別の実施態様では、競合薬剤のスクリーニングアッセイを用いることができる。この場合、ポリペプチドと特異的に結合することができる中和抗体がテスト化合物と結合について競合する。このようにして、前記抗体を用いて前記ポリペプチドに対して特異的な結合親和性を保有する一切のテスト化合物の存在を検出することができる。
前記ポリペプチドをコードする細胞内のmRNAの産生に対する添加テスト化合物の影響を検出するアッセイをデザインすることもできる。例えば、当分野で公知の標準的な方法でモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて分泌または細胞結合ポリペプチドレベルを測定するELISAを構築し、これを用いて適切に操作作製した細胞または組織におけるポリペプチド生成を抑制または強化する化合物の検索を実施できる。続いて、前記ポリペプチドと被検化合物との結合複合体の生成を測定することができる。
【００６０】
使用可能な薬剤スクリーニングのためのまた別の技術は、問題のポリペプチドと適切な結合親和性を有する化合物の高処理スクリーニングを提供する（国際特許出願WO84/03564を参照されたい）。前記方法では、多数の異なる小さなテスト化合物が固相基質上で合成される。続いて、前記を本発明のポリペプチドと反応させ洗浄することができる。ポリペプチドを固定する方法の１つは非中和抗体を使用することである。続いて、当分野で周知の方法を用いて結合ポリペプチドを検出することができる。精製ポリペプチドはまた、前述の薬剤スクリーニング技術で使用されるプレートに直接被覆させることができる。
本発明のポリペプチドを用いて、膜結合または可溶性レセプターを当分野で公知の標準的なレセプター結合技術により特定することができる。標準的な技術は、例えばリガンド結合および架橋アッセイであり、このアッセイでは、ポリペプチドは放射性同位元素で標識されているか、化学的に改変されているか、またはその検出もしくは精製を容易にするペプチド配列と融合されており、仮想的レセプター供給源（例えば細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物または体液）とインキュベートされる。結合有効性は、生物物理的技術、例えば表面プラズモン共鳴および分光測定法を用いて測定することができる。結合アッセイは、レセプターの精製およびクローニングのために用いることができるが、さらにポリペプチドとそのレセプターとの結合に競合する前記ポリペプチドの作動薬および拮抗薬を特定するためにも用いることができる。スクリーニングアッセイを実施する標準的方法は当分野では周知である。
【００６１】
本発明はまた、上記で述べたアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質、および／または酵素を特定する方法で有用なスクリーニングキットを含む。
本発明は、上記アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質および酵素、並びに上記で述べた方法によって発見される、本発明のポリペプチドの活性または抗原性を調節する他の化合物を含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、リガンドまたは化合物とともに適切な医薬担体を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、治療用もしくは診断用試薬として、ワクチンとして、または他の免疫誘発性組成物として下記で詳細に説明するように適切であろう。
本明細書で用いられる用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンドまたは化合物[Ｘ]を含む組成物は、組成物中のＸ＋Ｙ（Ｙは不純物）の合計の少なくとも85質量％がＸである場合は不純物を“実質的に含まない”。好ましくはＸは、組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも約90質量％を、より好ましくは少なくとも約95重量％、98質量％または99質量％を構成する。
【００６２】
医薬組成物は、好ましくは治療的に有効な量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンドまたは化合物を含む。本明細書で用いられるように“治療的に有効な量”とは、標的疾患または症状を治療、緩和もしくは予防するために、または検出可能な治療もしくは予防効果を示すために必要な治療薬剤の量を指す。いずれの化合物についても、治療的に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ（例えば新形成細胞培養アッセイ）または動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかで見積もることができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与ルートの決定にも用いることができる。続いて前記のような情報を用いて、ヒトで有用な投与量および投与経路を決定することができる。
ヒト患者に対する正確な有効量は、症状の重篤度、対象者の健康状態、年齢、体重および対象者の性別、食事、投与時間および回数、併用薬剤、反応の感受性および治療に対する耐性／反応性にしたがって左右される。前記の量は日常的検査および臨床医の判断で決定できる。一般には有効用量は0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。本組成物は個別にまたは他の薬剤、医薬またはホルモンと一緒に患者に投与することができる。
【００６３】
医薬組成物はまた、治療薬の投与のために医薬的に許容できる担体を含むことができる。そのような担体には、抗体および他のポリペプチド、遺伝子並びに他の治療薬剤（例えばリポソーム）が含まれるが、ただし担体はそれ自体で前記組成物を投与される個体で有害な抗体の産生を誘発せず、さらに不都合な毒性をもたらすことなく投与されることを条件とする。適切な担体は大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であろう。
それらの中には医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを用いることができる。医薬的に許容できる担体についての完全な考察は以下のテキストで見出すことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体はさらに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールを含むことができる。さらにまた、補助物質（例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）も前記組成物中に含まれていてもよい。そのような担体は、患者が摂取できるように前記医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、リキッド、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
【００６４】
いったん製剤化されたら、本発明の組成物は直接対象者に投与することができる。治療される対象者は動物で、特にヒトの患者が治療されるであろう。
本発明で用いられる医薬組成物は、多数の経路（経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜下腔内、心室内、経皮適用（例えばWO98/20734を参照）、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸的手段が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によって投与できる。遺伝子銃またはハイポスプレー（hypospray）もまた本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、本治療用組成物は、注射用物質（液体溶液または懸濁剤のいずれか）として調製できる。注射前に液体賦形剤中で溶液または懸濁剤とするために適した固体もまた調製できる。
本組成物の直接的デリバリーは一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内に注射によって達成されるか、または組織の間隙腔にデリバーされるであろう。前記組成物はまた病巣に投与してもよい。投薬治療は単回投与スケジュールでもマルチ投与スケジュールでもよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の症状で過剰である場合には、いくつかのアプローチを利用できる。あるアプローチは、上記のように対象者に抑制化合物（アンタゴニスト）を医薬的に許容できる担体とともに、前記ポリペプチドの機能抑制に有効な量で投与することを含む（前記担体による前記機能抑制は、例えばリガンド、基質、酵素、レセプターの結合を遮断するか、または第二のシグナルを抑制し、それによって異常な症状を緩和することによって達成される）。好ましくは、前記のような拮抗物質は抗体である。極めて好ましくは、そのような抗体は、その免疫原性を最少にするために先に記載したようにキメラおよび／またはヒト化抗体である。
【００６５】
また別のアプローチでは、問題のリガンド基質、酵素、レセプターに対する結合親和性を保持するポリペプチドの可溶形を投与することができる。典型的には、前記ポリペプチドは、関連部分を保持するフラグメントの形態で投与することができる。
また別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、発現遮断技術を用いて、例えば上記で述べたように（内部で生成されるかまたは別々に投与される）アンチセンス核酸分子を使用して抑制することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、5'領域または調節領域に対して相補的な配列またはアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）をデザインすることによって達成できる。同様に、抑制は“三重らせん”塩基対形成法を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために二重らせんが十分に開く能力を抑制するので有用である。三重DNAを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（J.E. Gee et al.(1994) In:B.E. Huber & B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。さらにまた相補的配列またはアンチセンス分子をデザインし、リボソームの結合を妨げて転写を阻害することによってmRNAの翻訳を遮断することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを投与してもよいし、またin vivoで発現させることによってin situで生成させることができる。
【００６６】
さらにまた、本発明のポリペプチドの発現は、そのコードmRNA配列に特異的なリボザイムを用いることによって妨げることができる。リボザイムは、天然または合成の触媒活性を有するRNAである（例えば以下を参照されたい：N. Usman et al., Curr. Opin. Struc. Biol.(1996) 6(4):527-533）。合成リボザイムをデザインして、選択した位置でmRNAを特異的に切断し、それによってmRNAから機能的ポリペプチドへの翻訳を妨げることができる。リボザイムは、通常RNA分子で見出されるような天然のリン酸リボース骨格および天然の塩基から合成することができる。或いは、リボザイムは、非天然の骨格（例えば2'-O-メチルRNA）から合成してリボヌクレアーゼによる分解から保護することができる。これらは改変塩基を含んでいてもよい。
RNA分子は細胞内安定性および半減期を高めるために改変することができる。可能な改変には、RNA分子の5'および／または3'末端へのフランキング配列の添加、または分子の骨格内でホスホジエステル結合に代わってホスホロチオエートまたは2'-O-メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限定されない。この概念はPNAの生成にも受け継がれ、さらに非慣用塩基（例えばイノシン、ケオシンおよびブトシン（アセチル−、メチル−、チオ−も同様に）、および改変された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンで、これらは内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないようなものである）の包含によってPNA分子の全てに前記概念は広げることができる。
【００６７】
本発明のポリペプチドおよびその活性の過小発現に関連する異常な状態を治療するためには、いくつかのアプローチがまた利用可能である。あるアプローチは、前記ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち上記で述べたアゴニスト）の治療的に有効な量を対象者に投与し、異常な状態を緩和することを含む。あるいは、本ポリペプチドの治療量を適切な医薬担体と併用して投与し、ポリペプチドの相対的な生理学的バランスを回復させてもよい。
遺伝子治療を用い、患者の関連する細胞による本ポリペプチドの内在性生成を行わせることができる。遺伝子治療は、不完全な遺伝子を修正した治療用遺伝子と置き換えることによって、前記ポリペプチドの不適切な生成を永久的に治療するために用いられる。
本発明の遺伝子治療はin vivoまたはex vivoで実施できる。Ex vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離および精製、治療用遺伝子の導入、および遺伝的に改変した細胞を患者に再導入することを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離および精製を必要としない。
治療用遺伝子は患者に投与するために典型的には“パッケージに封入”されている。遺伝子デリバリー担体はリポソームのような非ウイルス、または、例えばK.L. Berkner (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-66に記載されたアデノウイルスのような複製欠損ウイルスまたはN. Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:97-129および米国特許第5.252,479号に記載されたアデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであろう。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を複製欠損レトロウイルスベクターで発現させるために操作を施すことができる。この発現構築物を続いて単離し、前記ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージ細胞に導入することができる。その結果、前記パッケージ細胞は問題の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生することができるようになる。これらのプロデューサー細胞はin vivoで細胞を高等操作するために、さらにin vivoでポリペプチドを発現させるために患者に投与することができる（以下を参照されたい：Gene Therapy and Other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20（およびその中に引用された文献）, In “Human Molecular Genetics” (1996) T. Strachan & A.P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd.）。
【００６８】
別のアプローチは“裸のDNA”の投与で、この場合治療用遺伝子は直接血流または筋肉組織に注射される。
本発明のポリペプチドまたは核酸分子が疾患をひき起こす原因物質である場合には、本発明は、前記疾患をひき起こす原因物質に対する抗体を生成するワクチンとして用いることができる。
本発明のワクチンは予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染後の疾患を治療する）であろう。そのようなワクチンは免疫を付与する抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を通常は上記で述べた医薬的に許容できる担体と一緒に含む。前記担体には、それ自体で組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体が含まれる。さらにまた、これらの担体は免疫刺激剤（アジュバント）として機能してもよい。さらにまた、前記抗原または免疫原は、細菌の類毒素（例えばジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ピロリ菌（pyroli））および他の病原体と結合させることができる。
ポリペプチドは胃で分解されるので、ポリペプチドを含むワクチンは好ましくは非経口的に（例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）投与される。非経口投与に適した製剤には、水性および非水性滅菌注射溶液（前記は抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤および製剤を受容者の血液に対し等張にする溶質を含むことができる）および水性および非水性滅菌懸濁剤（前記は分散剤または粘稠剤を含むことができる）が含まれる。
【００６９】
本発明のワクチン製剤は単位用量またはマルチ用量容器で提供されてもよい。例えば封入アンプルおよびバイアルは凍結乾燥状態で保存でき、使用直前に滅菌された液状担体を添加することだけが必要である。投与量はワクチンの比活性に左右され、日常的な検査で容易に決定される。
本発明はまた診断薬としての本発明の核酸分子の使用に関する。本発明の核酸分子の特徴を有する、機能不全に付随する遺伝子の変異型の検出は、前記遺伝子の過小発現、過剰発現または位置的もしくは時間的発現の変化から生じる疾患の診断、または疾患に対する感受性の診断に付け加えることができるか、またはそれらを限定することができる診断ツールを提供する。前記遺伝子に変異を保有する個体は、多様な技術によってDNAレベルで検出することができる。
診断のための核酸分子は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から入手できる。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、PCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）または他の増幅技術を分析前に用いることによって、ゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい（以下の文献を参照されたい：Saiki et al., Nature 324:163-166(1986); Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26:301-334(1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35:117-126(1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8:291-294(1990)）。
【００７０】
ある実施態様では、本発明のこの特徴は、本発明のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現レベルを評価し、さらにコントロールの前記発現レベルと比較することを含む、患者で疾患を診断する方法を提供する（ここで前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆する）。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明の核酸分子と核酸プローブとの間でハイブリッド複合体を形成させることができるストリンジェント条件下で、患者由来の組織サンプルを前記プローブと接触させる工程；
ｂ）コントロールサンプルと前記プローブを工程ａ）で用いた条件と同じ条件下で接触させる工程；および、
ｃ）前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
この場合、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることは疾患を示唆する。
本発明のさらに別の特徴は以下の工程を含む診断方法を含む：
ａ）疾患について検査されるべき患者から組織サンプルを入手する工程；
ｂ）前記組織サンプルから本発明の核酸分子を単離する工程；および、
ｃ）疾患に関連する核酸分子内の変異の存在を検出することによって患者の疾患を診断する工程。
【００７１】
上記に記載した方法で核酸分子の検出を補助するために、増幅工程、例えばPCRの使用を含むことができる。
正常な遺伝子型と比較すると、増幅生成物におけるサイズの変化によって欠失および挿入が検出される。点変異は、増幅DNAを本発明の標識RNAとハイブリダイズさせるか、あるいは、本発明の標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって特定することができる。完全にマッチした配列は、リボヌクレアーゼによる消化によって、または溶融温度における差異を評価することによってミスマッチを有する二本鎖と区別することができる。患者に存在する変異の有無は、ストリンジェントな条件下でDNAを前記DNAとハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二重鎖分子を形成し（前記ハイブリッド二重鎖は、疾患に付随する変異に対応するいずれかの場所で前記核酸のハイブリダイズしていない部分を有する）、DNA鎖の対応する部分に存在する疾患関連変異の有無を示すものとして、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を検出することによって検出することができる。
前記のような診断は特に出生前検査および新生児検査においてすら有用である。
【００７２】
点変異およびリファレンス遺伝子と“変異”遺伝子間のその他の配列の相違は、他の周知の技術、例えば直接DNA配列決定または一本鎖構造多型性（Orita et al., Genomics, 5:874-879(1989)）によって特定できる。例えば、配列決定プライマーを二本鎖PCR生成物または改変PCRによって生成された一本鎖鋳型分子とともに用いることができる。配列決定は、放射能標識ヌクレオチドを用いる通常の方法によって、または蛍光タグを用いて自動配列決定方法によって実施される。クローン化DNAセグメントを、特異的DNAセグメントを検出するプローブとして用いることもできる。この方法の感受性は、PCRと併用したとき極めて強化される。さらに、点変異および他の配列の変動（例えば多形性）は、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをただ１つのヌクレオチドが異なる配列のＰＣＲ増幅に用いることによって上記のように検出することができる。
DNA配列の相違はまた、変性剤の存在下または非存在下でのゲル内電気泳動におけるDNAフラグメントの移動度変化によって、または直接DNA配列決定（例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1242）によって検出することができる。特定の場所における配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばリボヌクレアーゼおよびＳ１保護または化学切断法（Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401）によって明らかにすることができる。
【００７３】
通常のゲル電気泳動およびDNA配列決定の他に、例えばミクロ欠損、異数性、転座、逆位のような変異はまたin situ分析によっても検出できる（例えば以下を参照されたい：Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA(1993)）。すなわち、細胞内のDNAまたはRNA配列は、それらをメンブレン上に単離および／または固定しないで変異について分析することができる。蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、現在のところもっとも一般的に用いられている方法で、ＦＩＳＨに関する多数の概論が存在する（例えば以下を参照されたい：Trachuck et al., Science, 250:559-562(1990)；およびTrask et al., Genet. 7:149-154(1991)）。
本発明のまた別の実施態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブアレーを構築し、遺伝的変種、変異および多形性の効率的スクリーニングを実施することができる。アレー分析法はよく知られており汎用的に応用することができ、遺伝子発現、遺伝的連関および遺伝的多様性を含む分子遺伝学における多様な疑問に答えるために用いることができる（例えば以下を参照されたい：M. Chee et al., Science (1996) 274:610-613）。
【００７４】
ある実施態様では、前記アレーは以下の文献に記載された方法にしたがって調製し使用される（PCT出願WO95/11995（Chee et al.）；D.J. Lockhart et al.(1996) Nat. Biotech. 14:1675-1680；M. Schena et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619）。オリゴヌクレオチド対は２つから100万個を越える範囲でよい。前記オリゴマーは、光誘導化学反応を用いて基板上の指定領域で合成される。基板は紙、ナイロンまたは他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、ガラススライドもしくは他の任意の適切な固相支持体でよい。別の特徴では、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ特許出願（WO95/251116, Baldeschweiler et al.）に記載されたように化学的結合方法およびインクジェット適用装置を用いて基板表面で合成することができる。別の特徴では、ドット（スロット）ブロットに類似する“格子化（gridded）”アレーを用いてcDNAフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを配置し、さらに真空系、熱結合方法、ＵＶ結合方法、機械的または化学的結合方法を用いて基質表面に結合させることができる。アレー（例えば上記で述べたようなもの）は手動で、または利用可能な装置（スロットブロットまたはドットブロット装置）、材料（任意の適切な固相支持体）および機械（ロボットを含む））を用いて作製することができ、8、24、96、384、1536または6144個のオリゴヌクレオチド、または2つから100万個を越える範囲の任意の数を含むことができる（このことはアレー自体を商業的に入手可能な計測手段の有効利用に向くものとしている）。
【００７５】
上記で考察した方法の他に、対象者由来サンプルから、ポリペプチドまたはmRNAの異常な増加または低下レベルを決定することを含む方法によって疾患を診断することができる。発現低下または発現増加は、ポリヌクレオチドの定量のために当分野で周知の方法のいずれか、例えば核酸増幅（例えばＰＣＲ、RT-PCR、リボヌクレアーゼ保護、ノザンブロット法）および他のハイブリダイゼーション方法を用いてRNAレベルで測定することができる。
ホスト由来のサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は当分野でよく知られており、さらに上記でいくらか詳細に考察されている（放射能免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロットおよびELISAアッセイを含む）。本発明のこの特徴では以下の工程を含む診断方法が提供される：（ａ）上記に記載したリガンドを生物学的サンプルと、リガンド−ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程；および（ｂ）前記複合体を検出する工程。
例えばELISA、RIAおよびFACSのようなポリペプチドレベルを測定するためのプロトコルは、さらにポリペプチド発現レベルの変化または異常の診断の基礎を提供することができる。ポリペプチド発現の正常値または標準値は、正常な哺乳類対象体（好ましくはヒト）から得られた体液または細胞抽出物を、前記ポリペプチドと複合体形成に適した条件下で混合することによって確立することができる。標準的な複合体形成量は種々の方法、例えば分光測定方法によって定量することができる。
【００７６】
本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を前記ポリペプチドの発現を特徴とする症状または疾患の診断のために、または本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンドおよび他の化合物で治療されている患者をモニターするアッセイで用いることができる。診断の目的で有用な抗体は治療薬として上記で述べた態様と同じ態様で調製することができる。前記ポリペプチドのための診断アッセイは、前記抗体および標識を用いてヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のポリペプチドを検出する方法を含む。前記抗体は改変しまたは改変せずに用いることができ、さらにそれらをレポーター分子と共有結合または非共有結合によって結合させることによって標識することができる。当分野で公知の多様なレポーター分子を用いることができる（それらのいくつかは上記に記載されている）。
対象者、コントロールおよび生検組織由来の疾患サンプルで発現されたポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と対象者の値との間の偏差は疾患診断のためのパラメーターを確立する。診断アッセイを用いてポリペプチド発現の有無および過剰を識別し、治療期間中のポリペプチドレベルの調節をモニターすることができる。そのようなアッセイはまた、動物実験に、臨床試験にまたは個々の患者の治療モニタリングで個々の治療方法の有効性評価に用いることができる。
【００７７】
本発明の診断キットは以下を含むことができる：
（ａ）本発明の核酸分子；
（ｂ）本発明のポリペプチド；または
（ｃ）本発明のリガンド。
本発明のある特徴では、診断キットは、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器；核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器；および疾患の診断を容易にするために前記プローブおよびプライマーの使用についての指示書を含むことができる。前記キットはさらに、ハイブリダイズしていないRNAを消化するための試薬を入れた第三の容器を含むことができる。
本発明のまた別の特徴では、診断キットは核酸分子アレーを含み、前記核酸分子の１つが本発明の核酸であってよい。
本発明のポリペプチドを検出するために診断キットは以下を含むことができる：本発明のポリペプチドと結合する１つまたは２つ以上の抗体；および前記抗体とポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬。
【００７８】
そのようなキットは、以下のような疾患または疾患に対する感受性の診断に有用である：特に細胞増殖性疾患（腫瘍、癌および骨髄増殖症候群および血管形成を含む）、代謝性障害（肥満、骨粗しょう症、非インスリン依存性糖尿病、脂質代謝異常、甲状腺機能亢進、高カルシウム血症、高コレステロール血症、高脂血症を含む）、心臓血管疾患（高血圧、アテローム性硬化症、高インスリン血症、心不整脈を含む）、腎疾患（糸球体腎炎、腎血管性高血圧を含む）、皮膚疾患（skin disorders）（皮膚疾患（dermatological disease）、乾癬、アクネ、加齢、湿疹、創傷治癒を含む）、炎症（炎症性大腸疾患、気道の炎症、気腫、喘息を含む）、免疫障害、自己免疫疾患、多発性硬化症、神経系疾患（不安、抑うつ、神経変性疾患、アルツハイマー症、パーキンソン病、脳損傷、卒中および痛みを含む）、感染（ウイルス感染を含む）、並びに核内ホルモンが関係するその他の病的状態。
本発明の種々の特徴および実施態様を、特にLBDS1ポリペプチドを用いて実施例によってこれからより詳細に説明しよう。
細部の改変は本発明の範囲を逸脱することなく実施できることは理解されよう。
【００７９】
実施例１：BAA07892.2（LBDS1）
関係が離れている新規な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの検索を開始するために、原型となるファミリー内メンバー、ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインを選択する。より具体的には、前記検索は、タンパク質データバンク（PDB）（Research Collaboratory for Structural Bioinfomaticsによって運用されている）から得られた構造を用いて開始する。
選択した構造は、ホモサピエンスのレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインである（PDBコード3LBD；図１参照）。
3LBDの類縁体についてバイオペンジウム（Biopendium）の検索を実施し（ターゲットマイニングインターフェースを用いる）、4475のゲノムスレッダーの結果が得られる。この4475のゲノムスレッダーの結果には、典型的な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン（例えばホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマ-1の残基182-418の間で見出されるもの）（図２Ａの矢印参照）の例が含まれる。
核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことが判明しているタンパク質の中で、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けされていないタンパク質、BAA07892.2（LBDS1；図２Ｂの矢印参照）が現れる。インファーマチカゲノムスレッダーは、配列BAA07892.2（LBDS1）の領域（残基1507-1742の間）をホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインと類似の構造を有すると同定した。ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインと類似する構造を保有することは、BAA07892.2（LBDS1）の残基1507-1742は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインとして機能することを示唆する。ゲノムスレッダーはこれを71％の信頼度で明らかにしている。
【００８０】
3LBDの類縁体についてのバイオペンジウム（Biopendium）の（ターゲットマイニングインターフェースを用いる）検索によって、850のフォワードPSI-BLASTの結果が得られる。フォワードPSI-BLAST（図２Ｃを参照されたい）は前記関係を特定できない。インファーマチカゲノムスレッダーだけがBAA07892.2（LBDS1）を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと確認できる。
BAA07892.2（LBDS1）について公開ドメインデータベースで何が判明しているかを評価するために、重複配列ディスプレーページ（図３）を調査する。重複配列ディスプレーページは、Q14008と呼ばれるBAA07892.2（LBDS1）とほぼ同一の配列を明らかにする。Q14008はBAA07892.2（LBDS1）の部分配列であり、BAA07892.2の6個のN-末端残基のみを欠いている。
BAA07892.2（LBDS1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと確認するPROSITEヒットもPRINTSヒットも得られない。PROSITEおよびPRINTSは、類似するファミリーのタンパク質を表示することを支援するデータベースである。両データベースから核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインのヒットが返ってこないことは、PROSITEまたはPRINTSを用いた場合、BAA07892.2（LBDS1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むものとして同定できないことを意味する。
【００８１】
他のいずれかの公開ドメイン注釈付け手段が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインをBAA07892.2（LBDS1）が含むと注釈付けすることができるか否かを確認するために、BAA07892.2（LBDS1）タンパク質配列をインタープロ（InterPro）ウェブサイトでPFAMデータベース（Protein Family Database of Alignment and hidden Markov models、アラインメントと隠れたマルコフモデルに関するタンパク質ファミリーデータベース）に対して検索する（図４矢印１参照）。PFAM-Aマッチングは返さない。したがってPFAMでは、BAA07892.2（LBDS1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことが明らかにされない。
興味深いことには、PROSITEのPFスキャン（図４矢印２参照）によって二連核局在化シグナルがBAA07892.2（LBDS1）の残基550-567に確認される。核内ホルモンレセプターの典型的な（指標ではないが）特徴は二連核局在化シグナルを有することである。
続いてThe National Center for Biotechnology Information（NCBI）Genebankタンパク質データベースを、BAA07892.2（LBDS1）に関連する公開ドメインでさらに別の公知の情報があるか否かを調べた。これは、タンパク質および遺伝子配列寄託に関する米国の公開ドメインデータベースである（図５Ａ）。BAA07892.2（LBDS1）はホモサピエンスの配列で、そのGenebankタンパク質IDはBAA07892.2であり、長さは2038アミノ酸である。BAA07892.2（LBDS1）はKazusa DNA研究所（Kisarazu、日本）の科学者のグループによってクローン化された。この遺伝子について前記公開ドメインの情報は、前記遺伝子を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けしていない。
【００８２】
続いてスイスバイオインフォマティクス研究所、SIB（Swiss Institute of Bioinformatics）のSWISS-PROTタンパク質データベースを、BAA07892.2（LBDS1）の部分配列Q14008に関連する公開ドメインでさらに別の公知の情報があるか否かを調べた。これは、タンパク質および遺伝子配列寄託に関するスイスの公開ドメインデータベースである（図５Ｂ）。BAA07892.2（LBDS1）の部分配列Q14008はホモサピエンスの配列で、そのSWISS-PROTタンパク質ＩＤはQ14008であり、長さは2032アミノ酸である。Q14008はCH-TOG(結腸及び肝臓腫瘍過剰発現遺伝子)タンパク質と呼ばれる。Q14008、CH-TOGはCharrasseら（INSERM、モントペリエ、フランス）によってクローン化された。この遺伝子について前記公開ドメインの情報は、前記遺伝子を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けしていない。
したがって、全ての公開ドメインの注釈付けツールを用いて、BAA07892.2（LBDS1）は核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けされないであろうと結論することができる。インファーマチカゲノムスレッダーのみが前記タンパク質を核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと注釈付けすることができる。
【００８３】
ここで逆検索を実施する。BAA07892.2（LBDS1）を今度は問い合わせ配列としてバイオペンジウムで用いる（図６Ａ参照）。インファーマチカゲノムスレッダーは、BAA07892.2（LBDS1）の残基1507-1742はホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインと同じ構造を有すると信頼度71％で同定する（図６Ｂの矢印参照）。ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマ（3LBD）のリガンド結合ドメインは元々の問い合わせ配列であった。PSI−BLASTの正の繰返しはこの結果を返さない（図６Ｃ）。この関係を明らかにすることができるのはインファーマチカゲノムスレッダーだけである。
ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインの配列は、BAA07892.2（LBDS1）の配列アラインメントを観察するために前記に対して選択される。類似の構造を有すると確認されたタンパク質に対する問い合わせタンパク質のAlEyeアラインメント（図７）を観察することは、相同領域の可視化に役立つ。
ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインは“LBDモチーフ”を含み、前記モチーフは、今日まで注釈付けされた全ての核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインで見出されている。“LBDモチーフ”は核内ホルモンレセプターの補助アクチベーターおよび補助リプレッサーのリクルーティングに中心的に関与する。残基PHE251、LEU254、ASP258、GLN259、LEU262およびLEU263は、ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインにおいてこのモチーフを構成する（図７の四角枠を参照）。BAA07892.2（LBDS1）中の残基VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582およびMET1583は協調して、LBDモチーフの基準を満足する（図７の実線及び破線四角枠を参照）。このことは、BAA07892.2（LBDS1）はホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインと類似する核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むことを示している。
【００８４】
特定されたタンパク質が実際問い合わせタンパク質と関連することを担保するために、可視化プログラム“LigEye”（図８Ａ）および“iRasmol”（図８Ｂ）を用いる。これらの可視化ツールは、公知の小型の抑制性分子が公知のタンパク質構造の活性部位で相互作用するアミノ酸を表示することによって前記公知タンパク質構造の活性部位を同定する。これらの相互作用は、直接水素結合によるか、または疎水性相互作用による。このようにして、活性部位のフォールディング／構造が、同定された類似体と選択した公知の構造をもつタンパク質との間で保存されているか否かを知ることができる。ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインのLigEyeによる観察は、9-シスレチノイン酸と結合する14残基（図７の丸付き文字）を明らかにする。これらの14残基の3つのみ（ALA1556、LEU1591、LEU1725、図７の丸付き文字）がBAA07892.2（LBDS1）に正確に保存され、BAA07892.2（LBDS1）は、場合によっては特に9-シスレチノイン酸と結合しないことを示唆する。しかしながら、11個の疎水性残基が存在し、これらはホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメイン（PHE230、LEU233、ALA234、LEU268、LEU271、MET272、ILE275、PHE288、PHE304、LEU400およびILE412）のポケットに一列に並んでいる。BAA07892.2（LBDS1）において、これら11残基のうちの3つ（ALA1556、LEU1591、LEU1725、図７の丸付き文字）は完全に保存される。さらに5つの残基（ILE1552、VAL1555、ILE1592、PHE1595、LEU1739、図７の破線丸付き文字）は疎水的な性質において保存される。結合ポケットの輪郭を形成する11の疎水性残基のうち8つで疎水性が保存されていることは、BAA07892.2（LBDS1）は疎水性ステロイド様疎水性リガンドと結合することを示唆している。典型的には、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの結合ポケットは、非常に重要なアルギニン残基を含んでいる。前記アルギニンのグアニジニウム（guanidinium）基は結合する機能を果たし、ステロイド／ステロイド様リガンドに存在するヒドロキシルまたはカルボキシル基を安定化する。例えば、ホモサピエンスエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインのARG394はエストラジオールのAリングのフェノール類のヒドロキシル基と結合し、それを安定化する（Brzozowski Nature 1997 vol.389:p753-758）。LigEyeは、ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインのARG278がレチノイン酸のカルボキシラート基を安定化する。BAA07892.2（LBDS1）において、前記ARGは保存されないが、C-末端に向かっている1残基が置換されたARG1599（アステリスク）が存在する。BAA07892.2（LBDS1）のARG1599はステロイド様リガンドに存在するヒドロキシルまたはカルボキシル基と結合し、これを安定化する機能を果たす。このことは、実際インファーマチカゲノムスレッダーによって予測されたように、BAA07892.2（LBDS1）はホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマリガンド結合ドメインと類似の態様で折り畳まれることを示唆し、したがって核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むと確認される。
【００８５】
BAA07892.2（LBDS1）の逆最大化PSI-BLASTによって、BAA07892.2（LBDS1）と76.0％の配列同一性を有する（図６Ｃの矢印１参照）、CAB61894.1と呼ばれるBAA07892.2（LBDS1）のアフリカツメガエル類似体、XMAP215が特定される。また、BAA07892.2（LBDS1）の逆最大化PSI-BLASTによって、BAA07892.2（LBDS1）と45.0％の配列同一性を有する（図６Ｃの矢印２参照）、CAB55772.1と呼ばれるBAA07892.2（LBDS1）のキイロショウジョウバエ類似体、微小管結合蛋白質が特定される。
BAA07892.2（LBDS1）、アフリカツメガエルCAB61894.1（XMAP215）及びキイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）でアラインメントを実施し、AlEyeで観察する（図９）。AlEyeは、前記リガンドの結合ポケット（ILE1552、VAL1555、ALA1556、LEU1591、ILE1592、PHE1595、LEU1725およびLEU1739）の輪郭を形成すると予測されるBAA07892.2（LBDS1）の８つの疎水性残基は全てアフリカツメガエルCAB61894.1、XMAP215（図９を参照）で正確に保存されていることを明らかにしている。さらにまた、BAA07892.2（LBDS1）の“LBDモチーフ”とマッチングする6つの残基（VAL1573、LEU1574、ASP1578、LYS1579、ALA1582、MET1583）はすべて正確にアフリカツメガエルCAB61894.1、XMAP215で保存されている（図９参照）。さらに、予想されるリガンド結合ARG1599は正確にアフリカツメガエルCAB61894.1、XMAP215で保存されている（アステリスクが付されている、図９参照）。タンパク質の機能に本質的である残基は前記タンパク質の類似体で保存される。したがって、アフリカツメガエル類似体CAB61894.1（XMAP215）の予想されるBAA07892.2（LBDS1）の核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの機能に本質的であるすべての残基の絶対的な保存性は、核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むBAA07892.2（LBDS1）の注釈付けを強く支持する。
【００８６】
A1Eyeアラインメントはまた、BAA07892.2（LBDS1）とキイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）との保存された関係を示す。AlEyeは、BAA07892.2（LBDS1）の８つの疎水性残基のうち2つは（ILE1552およびVAL1555）、キイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）で正確に保存されていることを示す。8つのBAA07892.2（LBDS1）の疎水性残基のうち別の4つは（LEU1591、PHE1595、LEU1725、LEU1739）は、キイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）でその他の疎水性残基の代わりに保存的に用いられる。さらにまた、BAA07892.2（LBDS1）“LBDモチーフ”のLys1579は、キイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）で正確に保存されている。BAA07892.2（LBDS1）“LBDモチーフ”のその他の5つの残基は（VAL1573、LEU1574、ASP1578、ALA1582、MET1583）キイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）で保存的に置換されている。さらに、予測されるリガンド結合ARG1599はキイロショウジョウバエCAB55772.1（微小管結合蛋白質）で正確に保存されている（アステリスクが付されている、図９参照）。タンパク質の機能にとって必須の残基は前記タンパク質の類似体において保存されるであろう。したがって、キイロショウジョウバエ類似体CAB55772.1（微小管結合蛋白質）におけるBAA07892.2（LBDS1）の予測される核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインの機能に必須であろうと思われる15の残基のうちの4つの正確な保存（さらに9つの保存的な置換）は、BAA07892.2（LBDS1）が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むとの注釈付けを強く支持する。
【００８７】
また、BAA07892.2（LBDS1）の逆最大化PSI-BLASTによって、BAA07892.2（LBDS1）と95％の配列同一性を有する（図６Ｃの矢印３参照）、ホモサピエンス配列CAA63212.1が特定される。CAA63212.1のBAA07892.2（LBDS1）とのAlEyeアラインメントは、異なる2つの領域のみが存在することを明らかにする（図１０参照）。第1の相違は、CAA63212.1がBAA07892.2（LBDS1）の6つのN-末端アミノ酸を欠いていることである。第2の相違は、CAA63212.1が、BAA07892.2（LBDS1）と比較して、60のアミノ酸を除去する内部欠失を有することである。前記内部欠失は、cDNAが乳癌組織から得られるために（図１１の矢印参照）、スプライスバリアント又は疾病関連欠失を示している場合がある。興味深いことに、前記60のアミノ酸の欠失は、CAA63212.1が“LBDモチーフ”、ARG1599及び3つの予測される疎水性リガンド結合残基（LEU1591、ILE1592及びPHE1595）を欠いていることを意味する。したがって、CAA63212.1は、ステロイド様リガンドとの結合及び核内ホルモンの補助アクチベーターおよび補助リプレッサーのリクルーティングでコンピテントでないことが予測されるであろう。
【００８８】
Charrasseらによる関連する論文が存在する（Eur. J. Biochem. 1995 Dec 1;234(2)406-13）（図１２）。この論文は、BAA07892.2（LBDS1）部分配列Q14008、CH-TOGをコードするmRNAが、健康な大腸と比較して癌性の大腸組織で過剰発現していることを示している。さらに、BAA07892.2（LBDS1）部分配列Q14008、CH-TOGをコードするmRNAは、健康な大腸と比較して癌性の肝組織で過剰発現している。このことは、BAA07892.2（LBDS1）部分配列Q14008、CH-TOGのレベルと癌の状態との間の直接的な関係を明らかにしている。BAA07892.2（LBDS1）と癌の状態とを関連付けることは、前記症状の診断および／または治療のためにBAA07892.2（LBDS1）の遺伝子またはそのコードタンパク質を標的とする薬剤の開発のための道を作る。特に、前記遺伝子が核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを含むということを確認することは、（例えば核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメイン作動薬または拮抗薬の使用により）BAA07892.2（LBDS1）タンパク質に特異的な薬剤の開発を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】バイオペンジウムのターゲットマイニングインターフェースのフロントエンドを示す。データベースの検索はPDBコード“3LBD”を用いて開始する。
【図２】２Ａでは、3LBDを用いた検索に対するインファーマチカゲノムスレッダーの結果の選択が示されている。矢印は、ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマ-1（典型的な核内ホルモンレセプターリガンド結合ドメインを有する）を示している。２Ｂでは、3LBDを用いた検索に対するインファーマチカゲノムスレッダーの結果の選択が示されている。矢印は、BAA07892.2（LBDS1）を示している。２Ｃでは、3LBDを用いた検索に対するフォワードPSI-BLASTの結果の完全なリストが示されている。BAA07892.2（LBDS1）は特定されない。
【図３】BAA07892.2（LBDS1）に対する重複配列表示の結果のページである。Q14008と呼ばれる等価な配列が存在する（矢印を参照されたい）。
【図４】BAA07892.2（LBDS1）に対するインタープロPFAM検索結果を示す。矢印１を参照されたい。
【図５】５Ａは、BAA07892.2（LBDS1）に対するNCBIタンパク質の報告である。５Ｂは、Q14008と呼ばれるBAA07892.2（LBDS1）CH-TOGタンパク質と等価な配列に対するSWISS-PROTのエントリーを示す。
【図６】６Ａはバイオペンジウムデータベースのフロントエンドである。データベースの検索は問い合わせ配列としてBAA07892.2（LBDS1）を用いて開始する。６Ｂは、問い合わせ配列としてBAA07892.2（LBDS1）を用いた検索のインファーマチカゲノムスレッダーの結果の選択である。矢印は3LBDを指している。６Ｃは、問い合わせ配列としてBAA07892.2（LBDS1）を用いて得られた逆最大化PSI-BLASTの結果の選択である。１、２の番号を付与された矢印はアフリカツメガエルおよびキイロショウジョウバエのBAA07892.2（LBDS1）の類似体を指している。３の番号を付与された矢印はBAA07892.2（LBDS1）のホモサピエンス変異体を指している。
【図７】BAA07892.2（LBDS1）および3LBDのAlEye配列アラインメントを示す。
【図８】８Ａは3LBDに関するLigEyeで、9-シスレチノイン酸（REA420）とホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマ、3LBDのリガンド結合ドメインとの相互作用部位を示している。８Ｂは、3LBD、ホモサピエンスレチノイン酸レセプターガンマのリガンド結合ドメインのiRasMolによる解析図である。
【図９】BAA07892.2（LBDS1）とBAA07892.2（LBDS1）のアフリカツメガエル（CAB61894.1）およびキイロショウジョウバエ（CAB55772.1）類似体とのAlEye配列アラインメントを示す。
【図１０】BAA07892.2（LBDS1）とCAA63212.1、BAA07892.2（LBDS1）のホモサピエンス変異体とのAlEye配列アラインメントを示す。
【図１１】CAA63212.1、BAA07892.2（LBDS1）のホモサピエンス変異体に対するNCBIタンパク質の報告を示す。CAA63212.1はヒト乳癌細胞ライブラリー（矢印）に由来する。
【図１２】Charrasse et al., Eur. J. Biochem. 1995 Dec 1;234(2)406-13による文献の概要を示す。
【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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