(57)【要約】  本発明は、除草剤の新規標的としてのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼに関する。本発明はまた、除草活性を有する、１つ以上の上記酵素の阻害剤を同定する試験方法、該方法により同定された除草活性を有する阻害剤、および本発明阻害剤に基づいて望ましくない植物成長を防除する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草活性を有する化合物を同定する方法における、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素の使用。
【請求項２】
除草活性を有する物質を同定する方法であって：
ａ)酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素と、１つ以上の試験物質とを、該試験物質が該酵素の１つもしくは該酵素の１つをコードする核酸配列に結合する条件下で接触させるステップ；および
ｂ)該試験物質が、該酵素のうちの少なくとも１つの転写、翻訳、もしくは発現を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｃ)該試験物質が、該酵素のうちの少なくとも１つの活性を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｄ)該試験物質が、該酵素のうちの１つと結合するか否かを検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３】
ａ) 前記試験化合物を、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つを含む植物細胞溶解物で処理するか、または
ｂ) 前記試験化合物を、部分的または完全に精製されている、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つで処理し、
ｃ)その後、該酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性を、試験化合物で処理されていない少なくとも１つの該酵素の活性と比較して測定し、該酵素のうちの少なくとも１つの活性を低減またはブロックする化合物を選択する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トリプトファンアミノトランスフェラーゼを酵素として採用する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
トリプトファンまたはトリプトファン誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)L-トリプトファンの減少；または
ｂ)インドール-3-ピルビン酸の増加；または
ｃ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｄ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｅ)インドール-3-酪酸の増加；または
方法(ａ)〜(ｅ)のうちの少なくとも２つの組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インドール-3-ピルビン酸またはインドール-3-ピルビン酸誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)インドール-3-ピルビン酸の減少；または
ｂ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｃ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｄ)インドール-3-酪酸の増加；または
ｅ)方法(ａ)〜(ｄ)のうちの少なくとも２つの組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
インドール-3-アセトアルデヒドまたはインドール-3-アセトアルデヒド誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)インドール-3-アセトアルデヒドの減少；または
ｂ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｃ)方法(ａ)および(ｂ)のうちの２つの組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
酵素活性を分光学的に測定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記物質が、ハイスループットスクリーニングの形態で同定される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法により選択した化合物を、植物に施用して、除草活性を検証する、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２〜１０に記載の方法の１つにより同定された、除草活性または成長調節活性を有する化合物。
【請求項１２】
ｉ．請求項２〜１０に記載の方法の１つにより活性成分を同定すること、および
ｉｉ．この活性成分を、農薬組成物の製剤化に適した助剤と製剤化すること
を含む、農薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
望ましくない植生を防除および/または植物の成長を調節するための方法であって、請求項１１に記載の少なくとも１つの化合物または請求項１２に記載の方法により得られる農薬組成物の有効量を、植物、それらの環境および/または種子に施用することを含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載するように望ましくない植生を防除するため、および/または植物の成長を調節するための、請求項１１に記載の化合物の使用、または請求項１２に記載の方法により得られる農薬製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤の新規標的としてのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼ、該酵素のうちの１つ以上に対する除草活性な阻害剤を同定する試験方法、この方法により同定された除草活性な阻害剤、ならびに本発明による阻害剤に基づいて望ましくない植生を防除する方法に関する。
【０００２】
新規除草剤を見つけるためには、従来の手順によれば、候補活性成分を適切な試験植物に施用する。この方法の欠点は、試験のために比較的大量の物質を必要とすることである。さらに、物質を、試験する植物に直接施用する場合、最初のスクリーニングステップにおいてさえも非常に高い必要条件を満たさなければならない。なぜなら、細胞標的(一般的に、除草剤の作用部位としてのタンパク質または酵素)の活性の阻害または他のモジュレーションが必要とされるだけでなく、そもそも物質はまずこの標的に到達しなければならないからである。この最初のステップにおいてさえも、植物による摂取、様々な細胞壁および膜を通過する浸透性、所望の効果に到達するための持続性に関して、最終的に所望の標的酵素の活性の阻害/修飾が生じ得る前に、試験物質は高い必要条件を満たさなければならない。
【０００３】
これらの必要条件を考えると、第１に、新規活性成分の同定に関わる費用が連鎖的に上昇し、第２に、発見される活性成分がますます少なくなることは驚くべきことではない。
【０００４】
本発明の目的は、除草剤用の新規標的を提供することである。
【０００５】
驚くべきことに、L-トリプトファンからのインドール-3-酢酸の合成は、式Ｉの化合物の存在下でin vitroで阻害されることが分かった(実施例３および実施例４を参照)。
【化１】
2005527201.tif 000002
【０００６】
式Ｉの化合物は除草活性を有することから(実施例４を参照)、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼは、除草剤の標的として適している。
【０００７】
本発明者らは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼを、除草剤の新規標的として提供することによりこの目的を達成した。本発明においては、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を使用することに基づく、除草活性物質を同定する方法も提供する。
【０００８】
重要な植物ホルモンであるインドール-3-酢酸(オーキシン)の生合成はL-トリプトファンから出発する。L-トリプトファンの直接の前駆体はインドールである。L-トリプトファンから出発する合成経路は、全種の高等植物において以下の通りである：L-トリプトファンは、トリプトファンアミノトランスフェラーゼによりインドール-3-ピルビン酸に変換され、インドール-3-ピルビン酸は、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼによりインドール-3-アセトアルデヒドに変換される。次いで、インドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼは、インドール-3-アセトアルデヒドからインドール-3-酢酸への変換を触媒し、これは、次に、インドール-3-酪酸合成酵素によりインドール-3-酪酸に変換される。酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼは、一般的に、多酵素複合体の形態で存在する(Bartel, B. (1997), Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 51-66；Muller, A., Weiler, E.W., (2000), Planta 211, 855-863)。試験組織および試験種に応じて、その他のマイナーな生合成経路も説明されている(Normanly, J., Bartel, B. (1999), Current Opinion in Plant Biology 2, 207-213)。
【０００９】
式Ｉの2,ω-ジアミノカルボン酸化合物を生成するために、式II：
【化２】
2005527201.tif 000003
【００１０】
(式中、AおよびX-は一価の陰イオンまたは陰イオン等価物、例えば鉱酸のCl-、Br-または1/2SO42-、例えばCl-、Br-または1/2SO42-である)の化合物を、式III：
【化３】
2005527201.tif 000004
【００１１】
(式中、Halは塩素、臭素またはヨウ素である)の芳香族酸ハロゲン化物と反応させる。芳香族酸ハロゲン化物IIIが知られている；これらは、場合によっては、市販されているか、または公知方法によって調製できる。
【００１２】
化合物IIと化合物IIIとの反応は、塩基の存在下で実施することが好ましい。塩基は、反応の間に形成される鉱酸H-HalおよびH-Xを中和するように作用する。塩基は、中和する酸H-HalおよびH-Xのモル当たり、少なくとも等モル量で、特に１〜３モルの量で採用されることが好ましい。
【００１３】
化合物IIと化合物IIIとの反応は、溶剤または希釈液中で実施することが好ましい。この目的に適しているのは、水、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチルのエステル、ジクロロメタンまたはトルエンである。
【００１４】
反応温度は、酸塩化物IIIの安定性により予め決定されている特定の範囲内で異なり得る。プロセスは、0〜30℃の範囲内の温度にて実施されることが好ましい。
【００１５】
後処理は、慣例的な方法により、例えば、反応混合液を冷水で処理し、有機相を除去し、減圧下で乾燥した後に濃縮することにより、実施する。所望であれば、残った残査は、クロマトグラフィーまたは結晶化による慣習的な手法において任意の不純物と分離できる。
【００１６】
式IIの化合物は、まず、第１のステップにおいて、式IV： 
【化４】
2005527201.tif 000005
【００１７】
(式中、Sgは保護基である)の部分的に保護された2,ω-ジアミノカルボン酸またはその酸付加塩を、式V： 
【化５】
2005527201.tif 000006
【００１８】
(式中、Halは、塩素、臭素またはヨウ素である)の酸ハロゲン化物と反応させ；第２のステップにおいて、式VI： 
【化６】
2005527201.tif 000007
の得られた化合物を、適切な縮合剤の存在下で、式CH3NH2のアミンと反応させ、最終的に、保護基Sgを除去することによって、調製できる。
【００１９】
適切な保護基は、式VIの化合物中のNH-X結合の切断を生じない条件下で除去できるものである。適切な保護基は、ペプチド化学で知られている。これらは、特に、好ましくは酢酸を上回る酸強度を有する酸の作用により除去される保護基(例えば、tert-ブチルオキシカルボニル基、1-アダマンチルオキシカルボニル基、および2-(トリメチルシリル)エトキシカルボニル基)を含む。
【００２０】
化合物VIとアミンCH3NH2との反応のための適切な縮合剤は、遊離カルボキシル基を活性化可能な全ての試薬であり、縮合剤のほんの数例を挙げると、プロパンホスホン酸無水物(propanephosphonic anhydride)(PPPA, H. Wissmannら, Angew. Chem. 92, 129 (1980)；H.Wissmann, Phosphorus, Sulfur 30, 645 (1986)；M.Feigel, J. Am. Chem. Soc 108, 181 (1986))、N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ, B. Belleauら, J. Amer. Chem. Soc. 90, 1651 (1968))、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA, Shun-ichi-Yamadaら, J. Am. Chem. Soc. 94, 6203 (1972))、およびシアン化ジエチルホスホリル(DEPC, Shun-ichi-Yamadaら, Tetrahedron Lett. 18, 1595 (1973))、カルボジイミド(Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie [Methods in organic chemistry], Vol. 15/2, 103〜115頁, 第IV版, G. Thieme Verlag)等がある。これらの文献に記載の反応条件は、化合物VIとアミンHNR2R3との本発明による反応に適用でき、従って、これらの参考文献は参照により同様に組みこまれる。
【００２１】
得られる化合物VII：
【化７】
2005527201.tif 000008
【００２２】
(式中、Sgは上述した意味を有する)からの、保護基Sg(例えばtert-ブトキシカルボニル(BOC)基)の除去は、一般的に、酸を用いて、好ましくはトリフルオロ酢酸の助けを借りて、例えばB. Lundtら, Int. J. Pept. Protein Res., 12, 258 (1978)に記載の方法により、または例えばジオキサン中の2N 塩化水素を用いて、R. Andruszkieviczら, J. Med. Chem. 30, 1715 (1987)に記載の方法により実施され、良い収率で本発明の上記式(II)の中間体が生成する。
【００２３】
出発化合物として採用するカルボン酸ハロゲン化物、ならびにハロゲン化スルホニルIIIおよびVは公知であるか、または公知方法により調製できる。
【００２４】
化合物IV等の2-N-保護された2,ω-ジアミノ酸も同様に公知であり、市販されているか、または公知方法(例えば、N. Kucharczykら, Synth. Commun. 19, 1603 (1989)；M. Wakiら, Synthesis, 266 (1981)、およびLin-Hua Zhangら, J. Org. Chem. 62, 6918 (1997)の方法)により調製できる。
【００２５】
除草活性を有する化合物を同定する方法は以下のステップを含む：
ａ）酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素を、試験物質が該酵素の１つまたは該酵素の１つをコードする核酸配列に結合する条件下で、１つ以上の試験物質と接触させるステップ；ならびに
ｂ）該試験物質が、該酵素の少なくとも１つの転写、翻訳もしくは発現を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｃ）該試験物質が、上記酵素の少なくとも１つの活性を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｄ）該試験物質が、該酵素の１つと結合するか否かを検出するステップ。
【００２６】
ステップｂ)およびｃ)における転写、発現、翻訳または活性の低減またはブロッキングとは、試験物質が添加されていないという点が上記方法と異なる方法と比較して測定した転写、発現、翻訳または活性と比べた有意な低下のことである。
【００２７】
有意な低減は、少なくとも10％、有利には少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、特に好ましくは少なくとも50％、そして非常に好ましくは少なくとも70％〜100％の低減を意味すると理解される。
【００２８】
上記方法のステップｂ)による検出は、当業者には周知のブロッティング方法により実施できる。
【００２９】
上記方法のステップｄ)による検出は、タンパク質とリガンドとの相互作用を同定する技術を用いて実行できる。これに関して、本発明に関連するハイスループット方法(HTS)にも適している５つの好適な実施形態に特に言及しなければならないだろう：
１．質量の関数としての蛍光分子の平均拡散速度は、蛍光相関分光法(FCS)を介して、小さいサンプル容量で測定できる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 11753-11575)。FCSを採用して、酵素に結合する際の試験化合物の質量の変化を測定するか、またはこれに伴う拡散速度の変化を測定することで、タンパク質/リガンド相互作用を測定できる。アッセイ系は、蛍光分子で標識化した試験化合物の結合を測定するために直接設計できる。代替法として、蛍光分子で標識化した化学参照化合物が別の試験化合物により置き換えられるアッセイ系を設計できる(「置換アッセイ」)。このように同定された、酵素に結合している化合物は、阻害剤として適している。
【００３０】
２．蛍光偏光は、偏光で励起されて同様に偏光を発光する静穏発蛍光団の特徴を利用する。しかし、発蛍光団が励起状態の間に回転されれば、発光される蛍光の偏光は多かれ少なかれ失われる。それ以外は同一の条件(例えば、温度、粘度、溶剤)下では、回転は分子の大きさの関数であり、シグナルを介して発蛍光団結合残基の大きさに関する所見が得られる(Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300)。アッセイ系は、蛍光分子で標識化した試験化合物と酵素との結合を測定するように直接設計できる。代替法として、アッセイ系は、１．に記載した「置換アッセイ」の形態も取り得る。このように同定した、酵素に結合している化合物は、阻害剤として適している。
【００３１】
３．蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)は、適切な条件下での、２つの空間的に隣接する蛍光分子の間の放射のないエネルギー移動に基づいている。ドナー分子の発光スペクトルが、アクセプター分子の励起スペクトルと重なることを前提条件とする。酵素に蛍光標識を付け、試験化合物を結合させることで、FRETにより結合を測定できる(Cytometry 34, 1998, pp. 159-179)。代替法として、アッセイ系は、１．に記載した「置換アッセイ」の形態も取り得る。FRET技術の特に適切な実施形態は、Packard BioScienceから得られる「均一時間分解蛍光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)」(HTRF)である。このように同定された、酵素に結合している化合物は、阻害剤として適している。
【００３２】
４．飛行時間質量分析器(MALDI-TOF)と組み合わせた表面励起レーザ脱離/イオン化(SELDI)により、支持体上の分子の迅速な分析が可能になり、タンパク質/リガンド相互作用の分析に使用できる(Worralら, (1998) Anal. Biochem. 70:750-756)。好適な実施形態では、酵素を、適切な支持体上に固定化し、試験化合物とインキュベートする。１回以上の適切な洗浄ステップの後、酵素に更に結合した試験化合物分子が上記方法論により検出でき、従って阻害剤が選択できる。このように同定された、酵素に結合している化合物は、阻害剤として適している。
【００３３】
５．表面プラズモン共鳴の測定は、試験化合物が表面に固定化されたタンパク質に結合するときの、該表面での屈折率の変化に基づいている。表面における質量濃度の一定の変化に対する屈折率の変化が、事実上全てのタンパク質およびポリペプチドについて実質的に同一であるため、この方法は、原理上あらゆるタンパク質に適用できる(Lindbergら Sensor Actuators 4 (1983) 299-304；Malmquist Nature 361 (1993) 186-187)。測定は、例えば、Biacore(Freiburg)から入手可能な表面プラズモン共鳴に基づく自動分析器で、現時点で１日に384サンプルに及ぶスループットで実施できる。アッセイ系は、本発明において試験化合物とタンパク質との結合を測定するために直接設計できる。代替として、アッセイ系は、１．に記載した「置換アッセイ」の形態も取り得る。このように同定された、酵素に結合している化合物は、阻害剤として適している。
【００３４】
上記方法により同定された全ての物質は、その後、本発明の方法の別の実施形態で除草活性についてチェックできる。
【００３５】
ステップｄ)による検出の好適な実施形態は、試験化合物を、
ａ)酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つを含む植物細胞溶解物、または
ｂ)部分的または完全に精製されている酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つで処理すること、
ｃ)その後、該酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性を、試験化合物で処理していない該酵素のうちの少なくとも１つの活性と比較して測定し、該酵素のうちの少なくとも１つの活性を低減またはブロックする化合物を選択すること、
を含む。
【００３６】
ステップｂ)にて採用する部分的または完全に精製された酵素は、当業者が周知の手順(例えば、Truelsen, T.A. (Physiol. Plant. 28 (1973) 67-70)に記載)により、植物細胞から得られる。これに関して、冒頭に記載した代謝経路を介してオーキシン生合成が生じる任意の植物種が、酵素の単離のために使用できる。例を挙げると(ただし限定するものではない)、サヤインゲン(リョクトウ(Vigna radiata))、マメ(インゲンマメ(Phaseolus vulgaris))、またはエンドウマメ(エンドウ(Pisum sativum))等のマメ科(Leguminosae)(マメ科(Fabaceae))ファミリーの代表、およびトウモロコシ(ジー・メイス(Zea mays))等のイネ科(Gramineae)(イネ科(Poaceae))ファミリーの代表がある。マメ科ファミリーのその他の代表は、当業者に公知であり、例えば、Strasburger "Lehrbuch der Botanik" [Textbook of Botany], Sitte P., Ziegler, H., Ehrendorfer, F., Bresinsky, A., Gustav Fischer, Verlag, Stuttgartに記載されている。
【００３７】
ステップｃ)において化合物を同定するために、対象となる酵素の酵素活性を、反応時間の後に、阻害されていない酵素の活性と比較して測定する。このようにして、酵素活性の有意な低減を生じる化合物を選択する。
【００３８】
「反応時間」とは、活性に関する有意な所見が得られるまで活性アッセイを実行するのに必要な時間を指す。これは、アッセイに採用するタンパク質の比活性、使用する方法、ならびに使用する装置の感度に依存する。当業者は、反応時間の決定に精通している。測光法に基づくアッセイ系の場合、反応時間は通常>0〜120分である。
【００３９】
対象となる酵素を適切な基質とインキュベートし、基質の変換速度または得られる生成物の増加を分光的にモニタリングすることにより、活性は測定できる。
【００４０】
基質として採用できる物質の例は、トリプトファン、インドール-3-ピルビン酸、およびインドール-3-アセトアルデヒドである。さらに、放射性誘導体、または例えば分光測定を可能にする発色団または発蛍光団で修飾されたトリプトファン、インドール-3-ピルビン酸、およびインドール-4-アセトアルデヒド誘導体も本発明の方法で採用できる。
【００４１】
採用する基質に応じて、原理上、酵素活性を測定する３つの異なる方法がある：
変形１ａ)〜ｅ)：
方法Ｉのステップｃ)において、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素の酵素活性を測定するための基質としてトリプトファンを採用する場合、酵素活性は以下により測定できる：
ａ)L-トリプトファンの低減；または
ｂ)インドール-3-ピルビン酸の増加；または
ｃ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｄ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｅ)方法(ａ)〜(ｄ)のうちの少なくとも２つの組合せ。
【００４２】
変形２ａ)〜ｄ)：
方法Ｉのステップｃ)において、酵素であるインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される一方または両方の酵素の酵素活性を測定するための基質としてインドール-3-ピルビン酸を採用する場合、酵素活性は以下により測定できる：
ａ)インドール-3-ピルビン酸の低減；または
ｂ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｃ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｄ)方法(ａ)〜(ｃ)のうちの少なくとも２つの組合せ。
【００４３】
変形３ａ)〜ｃ)：
プロセスＩのステップｃ)において、インドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼの酵素活性を測定するための基質としてインドール-3-アセトアルデヒドを使用する場合、酵素活性は以下により測定できる：
ａ)インドール-3-アセトアルデヒドの低減；または
ｂ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｃ)方法(ａ)および(ｂ)の組合せ。
【００４４】
ここで、プロセス変形の選択だけではなく、問題となる変形で言及する方法の組合せは、アッセイで採用する酵素溶液の組成、および/または測定する酵素活性に依存する。
【００４５】
アッセイのために採用する酵素溶液が、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼを含む場合、以下の方法が可能である：１ａ)、１ｄ)、１ｅ)(ｅ＝ａ＋ｄ)、２ａ)、２ｃ)、２ｄ)(ｄ＝ａ＋ｃ)、および３ａ)、３ｂ)、３ｃ)(ｃ＝ａ＋ｂ)。
【００４６】
アッセイのために採用する酵素溶液が、トリプトファンアミノトランスフェラーゼおよびインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼを含む場合、以下の方法が可能である：１ａ)、１ｃ)、１ｅ)(ｅ＝ａ＋ｃ)、２ａ)、２ｂ)、２ｄ)(ｄ＝ａ＋ｂ)。
【００４７】
アッセイのために採用する酵素溶液が、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼを含む場合、以下の方法が可能である：２ａ)、２ｃ)、２ｄ)(ｄ＝ａ＋ｃ)、および３ａ)、３ｂ)、３ｃ)(ｃ＝ａ＋ｂ)。
【００４８】
アッセイのために採用する酵素溶液が、トリプトファンアミノトランスフェラーゼを含む場合、以下の方法が可能である：１ａ)、１ｂ)、１ｅ)(ｅ＝ａ＋ｂ)。
【００４９】
アッセイのために採用する酵素溶液が、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼを含む場合、以下の方法が可能である：２ａ)、２ｂ)、２ｄ)(ｄ＝ａ＋ｂ)。
【００５０】
アッセイのために採用する酵素溶液が、インドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼを含む場合、以下の方法が可能である：３ａ)、３ｂ)、３ｃ)(ｃ＝ａ＋ｂ)。
【００５１】
上記変形の好適な実施形態では、３つの酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼの混合物を、酵素活性を測定するために使用する。これは、上記したように、以下のアッセイ方法を可能にする：１ａ)、１ｄ)、１ｅ)(ｅ＝ａ＋ｄ)、２ａ)、２ｃ)、２ｄ)(ｄ＝ａ＋ｃ)、および３ａ)、３ｂ)、３ｃ)(ｃ＝ａ＋ｂ)。
【００５２】
上記１、２および３の適切な分光分析方法は、質量分光分析またはUV-VIS分光分析、LC/UV-VIS(液体クロマトグラフィー/UV-VIS分光分析)、またはUV-VIS分光分析である。変形１ｂ)、１ｄ)、１ｅ)、２ｄ)および３ｃ)のそれぞれに特に適しているのは、LC/MSもしくはHPLC/MS等の質量分光分析、または伝導率(conductivity)測定、NMR測定もしくは屈折率測定と組み合わせた様々なLC-もしくはHPLCに基づく方法である。なぜなら、異なる物質の同時測定が可能だからである。
【００５３】
好適な実施形態では、光度測定は、Simpson, R.M.ら(Planta 201 (1997) 71-77)、およびTruelsen, T.A.ら(Phsiol. Plant. (1972) 26, 289-295)に記載の方法に従い、質量分光分析による測定は、Simpson, R.M.ら(Planta 201 (1997), 71-77)に記載の方法に従う。
【００５４】
特に好適な実施形態では、トリプトファンおよび/もしくはインドール-3-ピルビン酸の増加もしくは低減、ならびに/またはインドール-3-酢酸および/もしくはインドール-3-酪酸の増加を、酵素活性を測定するために測光的に測定する。
【００５５】
光度測定は、例えば、波長λ＝328 nmにおけるインドール-3-ピルビン酸の増加または低減により検出できる(Simpson, R.M., Nonhebel, H.M., Christie, D.L. (1997), Planta 201, 71-77、Truelsen, T.A. (1972), Phsiol. Plant., 26, 289-295)。
【００５６】
インドール-3-酢酸の増加または低減は、蛍光(Ex＝254；Em=360 nm；Mazur H.ら, J.Appl. Phycology 13 (2001) 35-42の方法)により検出できる。
【００５７】
さらに、上記方法で同定された全ての酵素阻害剤が、in vivo活性試験で除草活性について試験できる。ここでは、対象となる物質を、対象となる有害な植物に施用して、除草活性について試験する。
【００５８】
以下、上記方法は全て、「本発明の方法」と称する。
【００５９】
本発明の方法は、個別の構成、および/または、有利に、共同的に、もしくは特に有利にハイスループットスクリーニングの構成で実施でき、従って、除草活性を有する化合物を同定するために使用できる。
【００６０】
本発明の方法において、いくつかの試験化合物を採用することも可能である。標的が、試験化合物のグループにより影響を受ける場合、個々の試験化合物を直接単離するか、または試験化合物のグループを多数のサブグループに分類する(例えば、化合物が複数の異なる成分から構成される場合)ことにより、アッセイ系における異なる試験化合物の数を減らすことができる。その後、本発明の方法を、個々の試験化合物、または試験化合物の対応するサブグループを用いて繰り返す。サンプルの複雑度に応じて、上記ステップを数回、好ましくは本発明の方法で同定したサブグループが少数の試験化合物または実際には１つの試験化合物のみを含むようになるまで、繰り返してもよい。
【００６１】
本発明はさらに、本発明の方法で同定された化合物に関する。これらの化合物は、以下、「選択化合物」と称する。これらは、1000 g/mol未満、好ましくは900 g/mol未満、好ましくは800 g/mol未満、特に好ましくは700 g/mol、さらに好ましくは600 g/mol未満の分子量、および1 mM未満のKi値を有する。
【００６２】
本発明の方法により同定された化合物は、当然、それらの農業的に有用な塩の形態でも存在し得る。
【００６３】
農業的に有用な塩の中でも適切なのは、主に、その陽イオンまたは陰イオンが、本発明の方法で同定された除草活性を有する化合物の除草活性に悪影響を与えないような、陽イオンの塩または酸の酸付加塩である。
【００６４】
さらに、選択化合物が、不斉置換されたα炭素原子を含む場合、それらはラセミ化合物、鏡像異性体混合物、純粋な鏡像異性体の形態で存在するか、または選択化合物がキラル置換基を含む場合にはそれらはジアステレオマー混合物の形態で存在し得る。
【００６５】
選択化合物は、化学合成により調製されたか、または微生物により産生された物質であり得、例えば、植物、動物または微生物等の細胞抽出物中に見いだされ得る。反応混合物は、細胞を含まない抽出物であり得、または細胞もしくは細胞培養物を含み得る。適切な方法は、当業者に公知であり、総括的に、例えば、Alberts, Molecular Biology the cell, 第３版(1994)、例えば第17章に記載されている。
【００６６】
可能性のある試験化合物は、例えば、cDNA発現ライブラリー等の発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小有機物質、ホルモン、PNAであり得る(Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880；Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245；Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198、および該文献中で引用されている参考文献)。
【００６７】
選択化合物は、望ましくない植生の防除、および特定の状況下での(例えば、ジャガイモの)落葉、または(例えば、綿花の)乾燥のために使用できる。さらに、植物ホルモンオーキシンの生合成の阻害剤は植物の成長に影響を与えうるため、選択化合物は、適切であれば、植物の成長を調節するためにも使用できる。選択化合物を含む農薬組成物は、非作物領域に対して、特に高い散布量にて、非常に良好な植生制御を生じる。コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、および綿花等の作物において、作物植物には重大な損害を負わせることなく、広葉雑草および雑草に対して作用する。この効果は、特に低い散布量にて認められる。選択化合物は、既に上記した有害な植物を防除するために使用できる。
【００６８】
対象の施用方法に応じて、選択化合物、またはそれらを含む農薬組成物は、望ましくない植物を排除するために、さらなる種類の作物植物においても有利に使用できる。適切な作物の例として以下のものがある：
新タマネギ(Allium cepa)、アナナス・コモサス(Ananas comosus)、ラッカセイ(Arachis hypogaea)、アスパラガス・オフィシナリス(Asparagus officinalis)、テンサイ種サトウダイコン(Beta vulgaris spec. altissima)、テンサイ種カチクビート(Beta vulgaris spec. rapa)、アブラナ属セイヨウアブラナ(Brassica napus var. napus)、アブラナ属スウェーデンカブ(Brassica napus var. napobrassica)、野生シロイヌナズナ(Brassica rapa var. silvestris)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、ピーカン(Carya illinoinensis)、シトラス・リモン(Citrus limon)、シトラス・シネンシス(Citrus sinensis)、アラビアコーヒー(Coffea arabica)(カネフォーラコーヒー(Coffea canephora)、リベリカコーヒー(Coffea liberica))、キュウリ(Cucumis sativus)、ギョウジシバ(Cynodon dactylon)、キャロットシード(Daucus carota)、アブラヤシ(Elaeis guineensis)、ワイルドストロベリー(Fragaria vesca)、ダイズ(Glycine max)、ワタ(Gossypium hirsutum)(キダチワタ(Gossypium arboreum)、シロバナワタ(Gossypium herbaceum)、ゴシピウム・ビティフォリウム(Gossypium vitifolium))、ヒマワリ(Helianthus annuus)、バラゴムノキ(Hevea brasiliensis)、オオムギ(Hordeum vulgare)、ホップ(Humulus lupulus)、サツマイモ(Ipomoea batatas)、クルミ(Juglans regia)、レンズマメ(Lens culinaris)、アマ(Linum usitatissimum)、トマト(Lycopersicon lycopersicum)、リンゴ(Malus spec.)、キャッサバ(Manihot esculenta)、アルファルファ(Medicago sativa)、バナナ(Musa spec.)、タバコ(Nicotiana tabacum)(ルスチカタバコ(N.rustica))、オリーブ(Olea europaea)、イネ(Oryza sativa)、ライマメ(Phaseolus lunatus)、インゲンマメ、ドイツトウヒ(Picea abies)、マツ種(Pinus spec.)、エンドウ、サクランボ(Prunus avium)、モモ(Prunus persica)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、フサスグリ(Ribes sylestre)、トウゴマ(Ricinus communis)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ライムギ(Secale cereale)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、ソルガム(Sorghum bicolor)(ホウキモロコシ(s. vulgare))、カカオノキ(Theobroma cacao)、アカツメグサ(Trifolium pratense)、コムギ(Triticum aestivum)、マカロニコムギ(Triticum durum)、ソラマメ(Vicia faba)、ブドウ(Vitis vinifera)、ジー・メイス。
【００６９】
さらに、選択化合物は、組換え方法を含む品種改良により除草剤の影響に耐える作物においても使用できる。
【００７０】
本発明はさらに、製剤化技術に適した助剤と共に選択化合物を製剤化することを含む、既に上記した農薬組成物を調製する方法に関する。
【００７１】
選択化合物は、例えば、直接スプレー可能な水溶液、粉末、懸濁液、また高濃縮水性、油性もしくはその他の懸濁液もしくはサスポエマルジョン(suspoemulsion)、または分散液、乳化可能濃縮物、エマルジョン、油分散液、ペースト、粉塵、散布用材料、または顆粒の形態で製剤化することができ、スプレー、噴霧、散布、拡散、または注ぎにより施用できる。使用形態は、意図する目的と選択化合物の性質に依存する；いずれの場合にせよ、選択化合物の分布を確実にするよう可能な限り細かくする。農薬組成物は、除草活性量の少なくとも１つの選択化合物、および農薬組成物を製剤化するために従来から使用されている助剤を含む。
【００７２】
エマルジョン、ペースト、または水もしくは油含有調剤、および分散可能濃縮物(DC)の調製のためには、選択化合物を油または溶剤に溶解または分散させてよく、均一化のためにさらなる製剤化助剤を添加することも可能である。しかし、選択化合物、そして適切であれば溶剤または油、および場合により追加の助剤からなる液体または固体濃縮物(水での希釈に適したもの)を調製することも可能である。言及すべきものとしては：乳化可能濃縮物(EC、EW)、懸濁液(SC)、可溶性濃縮物(SL)、分散性濃縮物(DC)、ペースト、丸剤、浸潤性粉末または顆粒がある(固体剤形は水に可溶または分散可能(浸潤可能)であること)。さらに、適切な粉末、顆粒または錠剤には、活性化合物の磨滅または早い放出を防止する固体コーティングをさらに施してもよい。
【００７３】
原則として、助剤という用語は、以下のクラスの物質を意味すると理解される：消泡剤、増粘剤、浸潤剤、固着剤、分散剤、乳化剤、殺菌剤、および/またはチキソトロープ(thixotrope)。上記薬剤の意味は当業者に公知である。
【００７４】
SL、EWおよびECは、対象となる構成物を単純に混合することで調製できるが、粉末は、特定の種類のミル(例えば、ハンマーミル)において混合または粉砕することにより調製される。DC、SCおよびSEは、追加の助剤または選択化合物を含み得る有機相を添加してSCからSEを調製可能な湿式粉砕法で慣例的に調製される。調製法は公知である。粉末、拡散用の物質、および粉塵は、活性物質を固体担体と混合または同時に粉砕することにより有利に調製できる。顆粒、例えば、コーティングされた顆粒、含浸顆粒、および均質顆粒は、選択化合物を固体担体に結合させることにより調製できる。調製のさらなる詳細は、当業者に公知であり、例えば以下の文献において記載されている：US 3,060,084、EP-A 707445(液体濃縮物に関する)、Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48、Perry's Chemical Engineer's Handbook, 第４版, McGraw-Hill, New York, 1963, 8〜57頁以下、WO 91/13546、US 4,172,714、US 4,144,050、US 3,920,442、US 5,180,587、US 5,232,701、US 5,208,030、GB 2,095,558、 US 3,299,566、Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961、Hanceら, Weed Control Handbook, 第８版, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989、およびMollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001。
【００７５】
当業者は、本発明の製剤に適した多様な不活性液体および/または固体担体、例えば、中度から高度な沸点の鉱油留分等の液体添加剤(ケロシン、ディーゼル油等)、さらにコールタール油、および植物もしくは動物起源の油、脂肪族、環状および芳香族炭化水素、例えば、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレンもしくはそれらの誘導体、アルキル化ベンゼンもしくはそれらの誘導体、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、ケトン、例えばシクロヘキサノン、または強極性溶剤、例えばアミン(N-メチルピロリドン等)、または水に精通している。
【００７６】
固体担体の例としては、鉱物土、例えば、シリカ、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、石灰岩、石灰、白亜、ボール粘度、黄土、粘土、白雲石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕合成物質、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、ならびに植物生成物、例えば穀物粉、樹皮粉、木粉および堅果粉、セルロース粉末、またはその他の固体担体がある。
【００７７】
当業者は、本発明の製剤に適した多様な表面活性物質(界面活性剤)に精通している。例えば、芳香族スルホン酸、例えば、リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、およびジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびアンモニウム塩、脂肪酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびアンモニウム塩、アルキルスルホネートおよびアルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、ラウリルエーテルスルフェート、および脂肪アルコールスルフェート、硫酸化ヘキサ-、ヘプタ-およびオクタデカノールの塩、脂肪アルコールグリコールエーテルの塩；スルホン化ナフタレンおよびその誘導体とホルムアルデヒドとの縮合物、ナフタレンの縮合物、またはナフタレンスルホン酸とフェノールおよびホルムアルデヒドとの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、またはノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、脂肪アルコール/エチレンオキシド縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、またはポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニン-亜硫酸廃液、またはメチルセルロース等である。
【００７８】
農薬組成物、または選択化合物は、発芽前または発芽後に施用できる。選択化合物が、特定の作物植物に寛容されにくい場合、スプレー装置により選択化合物をスプレーして、繊細な作物植物の葉があればそれとの接触を可能な限り小さくしつつ、その下で成長している望ましくない植物の葉または露出した土壌表面には選択化合物を到達させる施用技術を採用してもよい(ポストディレクテッド、レイ−バイ)。
【００７９】
選択化合物の施用率は、防除目的、季節、標的植物、および成長段階に応じて、0.001〜3.0、好ましくは0.01〜1.0 kg/haである。
【００８０】
本発明を、以下の限定しない実施例により、より詳細に例示する。
【００８１】
実施例１−軟白サヤインゲンからのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ(TATアーゼ)の酵素単離(Simpson, R.M., Nonhebel, H.M., Christie, D.L. (1997), Planta 201, 71-77の方法)
サヤインゲン(Vigna radiata)は、暗所でバーミキュライトにおいて６〜７日間成長させた。収穫時、植物の高さは約８cmである。
【００８２】
以下の全てのステップは４℃で実施する。100 gの新しく収穫した植物材料を、ミキサー中で、100 mlの抽出緩衝液(50 mM KH2PO4(pH 8.5)；0.5 mM EDTA；0.5 mM MnCl2；10 mM イソアスコルビン酸塩)と共に、４℃にて２ステップで各１分間均質化させる。その後、5 gのポリビニルポリピロリドンを添加し(植物材料/PVPP比  100:5)、混合物を５分間攪拌し、次いで、８層のガーゼに通してろ過する。ろ液を遠心分離(20 000 g、４℃、20分間；SL-250 Tローター−Sorvall Super T1遠心分離管)した後、上清を、硫酸アンモニウムで分別沈殿させる(60％、80％)。残った上清を捨て、ペレットを3 mlのカラム緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH 8.0)；0.1 M NaCl)で再懸濁させ、懸濁液を合計容量5.0 mlにし、平衡化PD10カラム(Amersham Pharmacia)を使用して混合液を脱塩する。用途に応じて、脱塩酵素溶液を、小分けにして-20℃にて冷凍するか、または所望により酵素アッセイに直接採用してもよい。
【００８３】
実施例２−酵素アッセイ
500μlのアッセイ緩衝液(0.1 Mボラックス(pH 8.5)；10 mMトリプトファン、0.5 mMヒ酸ナトリウム、0.5 mM EDTA、50μMピリドキサル・リン酸)、100μlの新しく調製した10 mMα-ケトグルタレート溶液および約50〜250μlの酵素溶液(5 mg/ml)を適切な容器中で使用した。アッセイは、水および10μlの活性成分溶液で1 mlにし(活性成分溶液の添加量は、混合液の合計容量の１〜５％であって、1 mMを超えないこと)、混合液を攪拌しながら60℃にて30分間インキュベートする。その後、150μlのメタノールで反応を停止し、サンプルを20 000 gにて５分間遠心分離する。以下の設備/パラメーターを使用して、上清をLCMSにより分析した(装置の型を提示すれば、全てのパラメーターを記載する必要はないであろう)：
装置：ポンプ Bio-Tek 522および520
カラム温度調節器 Bio-Tek 582
オートサンプラー Bio-Tek 560
UV検出器 Bio-Tek 535
質量検出器 Applied Biosystems Mariner
カラム：Phenomenex Aqua 3μ C18 125 A、150 x 2μm
流速：0.3 ml/分
移動相：緩衝液Ａ：0.2％酢酸
緩衝液Ｂ：メタノール
パワー勾配：0〜30分  75％〜50％直線勾配
緩衝液Ａ
30〜35分  50％緩衝液Ａ
35〜40分  75％〜50％直線勾配
緩衝液Ａ
40〜45分  75％緩衝液Ａ
UV検出器：  280 nm
評価のために必要とする保持時間は、表１にまとめた。
【表１】
2005527201.tif 000009
【００８４】
実施例３−化合物Ｉの除草活性
化合物Ｉの除草活性を、グリーンハウス実験により実証した：
使用した培養容器は、基質として約3.0％腐葉土と共にローム砂土を含むプラスチックポットである。試験植物の種子を、各種について個別に蒔いた。
【００８５】
発芽前処理として、水に懸濁または乳化させた活性成分を、微細噴霧ノズルを使用して、播種後に直接施用した。容器に、緩やかに水を注ぎ、発芽および成長を促し、その後、植物が根付くまで透明なプラスチックフードで覆った。このカバーにより、活性成分により悪影響を受けない限り試験植物の均一な発芽が生じる。
【００８６】
発芽後処理として、試験植物を、植物習性に応じて3〜15 cmの植物高さにまで成長させてから初めて、水に懸濁または乳化させた活性成分で処理した。このために、試験植物は、同じ容器に直接蒔いて成長させるか、または最初は苗として個別に成長させてから処理の数日前に試験容器に植え替えた。発芽後処理の施用率は、3 kg a.s./ha.とした。
【００８７】
種に応じて、植物を10〜25℃、または20〜35℃でそれぞれ保った。試験期間は２〜４週間にわたった。この期間、植物の世話をし、個々の処理に対する植物の応答を評価した。
【００８８】
0から100の段階を使用して評価した。100は、植物の発芽がないか、または少なくとも大気に当たる部分の完全な破壊を示し、0は、損傷がないか、または成長が通常過程通りであることを示す。
【００８９】
グリーンハウス実験で使用した植物は以下の種に属する：
【表２】
2005527201.tif 000010
【００９０】
1.0 kg a.s./haの施用率において、化合物Ｉは、ケノポジウム・アルバム、イヌビエ(Echinocloa crus-galli)、およびマルバアサガオに対して、非常に良好な発芽後除草効率を示した。
【００９１】
実施例４−インドール-3-酢酸(IEA、オーキシン)生合成の阻害剤を検索するための酵素アッセイ
酵素抽出物を得るために、液体窒素下で乳棒および乳鉢において粉砕したケノポジウム・アルバム(シロアカザ(common lambsquarters))の2 gの冷凍植物芽を、室温にて、3 mlの100 mN EPPS抽出緩衝液(5 mMジチオスレイトール、6μMピリドキサル・リン酸、10μMロイペプチン、10μM Pefabloc SC(pH 8.5))、およびスパチュラ一杯のポリビニルピロリドン中で、30分間緩やかに攪拌しながら解凍した。その後、植物材料を、４℃にて10分間遠心分離にかけ、上清をSephadex G-25カラム(5 mM EPPS溶出緩衝液(1 mMジチオスレイトール、6μMピリドキサル・リン酸、10μM Pefabloc SC(pH 8.5))で予め平衡化)上で脱塩した。得られた酵素抽出物(400μl)を、テストアッセイ(容量600μl)において、20μMピリドキサル・リン酸、80 mM EPPS抽出緩衝液、50μM L-トリプトファン、50μMα-ケトグルタレート、および50μMインドールの存在下、100μlのEPPS抽出緩衝液および6μlの活性成分溶液(10 mM化合物Ｉ含有DMSO)を添加し、37℃にて２時間インキュベートした。化合物Ｉを含まない対照は、対応量のDMSOで処理した。その後、反応を20μl 7.2N HClおよび3 mlの酢酸エチルを添加して止めた。インキュベーション無しの対照アッセイを氷上に載せ、すぐにHClおよび酢酸エチルで処理した。3 mlの酢酸エチルでの再抽出後、有機相(6 ml)を合わせ、窒素の流れの中で濃縮させ、サンプルをジアゾメタンでメチル化した。サンプル材料中に存在するインドール-3-酢酸を、このようにメチルインドール-3-酢酸(IEA-Me)に変換した。その後、IEA-Meの量を、モノクローナル抗体(IEA-Meに対する反応は100％)により免疫分析的に測定し；(Weiler E.W., Eberle J., Mertens R., Atzorn R., Feyerabend M., Jourdan P.S., Arnscheidt A., Wieczorek U., Immunology in Plant Science (Wang T.L.編), Society for Experimental Biology, Seminar Series 29, Cambridge University Press, Cambridge, 1986, pp. 27-58に掲載の方法)、酵素活性の測定値として使用した。化合物Ｉによるインドール-3-酢酸(IEA)合成反応の阻害を表２に示す。
【表３】
2005527201.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月5日(2004.5.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草活性を有する化合物を同定する方法における、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素の使用。
【請求項２】
除草活性を有する物質を同定する方法であって：
ａ)酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の酵素と、１つ以上の試験物質とを、該試験物質が該酵素の１つもしくは該酵素の１つをコードする核酸配列に結合する条件下で接触させるステップ；および
ｂ)該試験物質が、該酵素のうちの少なくとも１つの転写、翻訳、もしくは発現を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｃ)該試験物質が、該酵素のうちの少なくとも１つの活性を低減もしくはブロックするか否かを検出するステップ；または
ｄ)該試験物質が、該酵素のうちの１つと結合するか否かを検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３】
ａ) 前記試験化合物を、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つを含む植物細胞溶解物で処理するか、または
ｂ) 前記試験化合物を、部分的または完全に精製されている、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼのうちの少なくとも１つで処理し、
ｃ)その後、該酵素のうちの少なくとも１つの酵素活性を、試験化合物で処理されていない少なくとも１つの該酵素の活性と比較して測定し、該酵素のうちの少なくとも１つの活性を低減またはブロックする化合物を選択する、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トリプトファンアミノトランスフェラーゼを酵素として採用する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
トリプトファンまたはトリプトファン誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)L-トリプトファンの減少；または
ｂ)インドール-3-ピルビン酸の増加；または
ｃ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｄ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｅ)インドール-3-酪酸の増加；または
ｆ)方法(ａ)〜(ｅ)のうちの少なくとも２つの組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インドール-3-ピルビン酸またはインドール-3-ピルビン酸誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)インドール-3-ピルビン酸の減少；または
ｂ)インドール-3-アセトアルデヒドの増加；または
ｃ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｄ)インドール-3-酪酸の増加；または
ｅ)方法(ａ)〜(ｄ)のうちの少なくとも２つの組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
インドール-3-アセトアルデヒドまたはインドール-3-アセトアルデヒド誘導体を基質として採用し、前記ステップ(ｃ)の酵素活性が：
ａ)インドール-3-アセトアルデヒドの減少；または
ｂ)インドール-3-酢酸の増加；または
ｃ)方法(ａ)および(ｂ)の組合せ
により測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
酵素活性を分光学的に測定する、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記物質が、ハイスループットスクリーニングの形態で同定される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法により選択した化合物を、植物に施用して、除草活性を検証する、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
望ましくない植生を防除するための除草活性または成長調節活性を有する化合物の使用であって、該化合物が、酵素であるトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、インドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびインドール-3-アセトアルデヒドオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上の化合物を阻害する、前記使用。
【請求項１２】
除草活性または成長調節活性を有する化合物が農薬組成物の製剤化に適した助剤を用いて製剤化されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
式Ｉ：
【化１】
2005527201.tif 000012
の化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物の、望ましくない植生を防除するための使用。
【国際調査報告】
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