(57)【要約】本発明は、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質(GFP)の新規な操作型誘導体を提供する。この改変されたGFPは非同種細胞において30℃を超える温度で発現された場合にwtGFPと比較して強い蛍光を示し、約490nmで励起された場合、親タンパク質すなわちwtGFPに比較して強い蛍光を示す。好ましいタンパク質の例は、F64L-S175G-E222G-GFPである。この改変GFPは、哺乳類細胞中のGFPレポーターを低い発現レベルでも検出する手段および／またはwtGFPと比較して感受性を増強する手段を提供する。これは生細胞における細胞機能の研究において蛍光タンパク質の有用性を著しく向上させるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する、蛍光タンパク質。
【請求項２】
64位のアミノ酸FがL、I、V、AおよびGからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
175位のアミノ酸SがG、A、L、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１〜３に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
222位のアミノ酸EがG、A、V、L、I、F、S、T、NおよびQからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている請求項１〜３に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
F64L-S175G-E222G-GFPおよびF64L-S65T-S175G-GFPから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項８】
緑色蛍光タンパク質(GFP)に由来し、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
【請求項９】
緑色蛍光タンパク質(GFP)に由来し、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変タンパク質である蛍光タンパク質に融合された目的タンパク質を含む融合化合物。
【請求項１１】
緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１２】
配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
配列番号３および配列番号４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする、請求項１１または１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質に融合された目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子に作動可能なように連結された好適な発現制御配列を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを含むDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１７】
哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の宿主を培養し、それから該ヌクレオチド配列により発現されたポリペプチドを得ることを含む、本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の調製方法。
【請求項１９】
細胞において目的タンパク質の発現を測定する方法であって、
i）請求項１〜９のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入し、なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、目的タンパク質の発現を調節する発現制御配列の制御下にあり、
ii）該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに
iii）目的タンパク質の発現を測定する手段として、該緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の蛍光発光を検出する
ことを含む、方法。
【請求項２０】
目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べる方法であって、
i）目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、請求項１〜９のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入し(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、好適な発現制御配列の制御下にある)、
ii）該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに
iii）光学的手段により蛍光発光を検出することにより目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べる
ことを含む、方法。
【請求項２１】
細胞において1以上の異なる目的タンパク質の発現および／または局在性に対する1以上の試験物質の作用を比較する方法であって、
i）細胞内に、
ａ）所望により第１の目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、請求項１〜９のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、第１の発現制御配列の制御下にある)、および、所望により
ｂ）所望により異なる目的タンパク質に融合された、タンパク質レポーター分子をコードする少なくとも１つの異なる核酸分子(なお、該核酸分子は各々作動可能なように連結され、第2の発現制御配列の制御下にあり、該タンパク質レポーター分子は該緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の発光シグナルとはスペクトル的に区別される発光シグナルを有する、または発し得る)
を導入し、
ii）該細胞を試験物質の存在下および不在下で目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、
iii）該細胞における目的タンパク質の発現および／または局在性を光学的手段で蛍光発光を検出することにより測定し、さらに
iv）目的タンパク質の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を測定するために、試験物質の存在下および不在下で得られた蛍光発光を比較する
ことを含む、方法。
【請求項２２】
液体培地中の該細胞のサンプルが、検討される各試験物質ついて個別の容器に導入される、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光特性の改良された蛍光タンパク質GFPの新規なる変異体に関する。
【０００２】
オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用は多くの細胞および分子生物学的プロセスの研究に革命をもたらした。GFPにより研究者らは固有蛍光で細胞内タンパク質を標識することが可能になり、タンパク質の化学的標識を行う必要がなくなり、完全な生細胞における生物学的プロセスのアッセイ開発が可能となる。
【０００３】
米国特許第5491084号にはGFPの生物学的レポーターとしての使用が記載されている。GFPの生物学的レポーターとしての初期の適用(Chalfie et al.. Science, (1994), 263,802-5;Chalfie, et al.,Photochem.Photobiol., (1995), 62 (4), 651-6)では野生型(天然)GFP(wtGFP)を使用したが、これらの研究では哺乳類細胞においてレポーターとして使用するためのwtGFPの２つの領域の欠陥がすぐに明らかになった。第一に変温海洋生物由来のタンパク質であるため、37℃で培養された哺乳類細胞で発現させた場合には効率的なタンパク質折りたたみがなされず、弱い蛍光しか生じない。第二に、wtGFPのスペクトル特性は生細胞に損傷を与える可能性のある近紫外線領域の電磁放射線での励起を要するので細胞レポーターとしての使用に理想としては適さない。
【０００４】
このため、細胞内レポーターとしての使用により好適な特性を有する突然変異型のGFPを作出すべく多大な努力がなされてきた。
【０００５】
スペクトル特性が改変されたGFPの多くの突然変異型が記載されている。変異体GFP(Heim et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. 91,12501) は、タンパク質の励起および発光スペクトルを青色側へシフトさせるY66H突然変異を含む。しかしこのタンパク質は弱い蛍光性しかなく、有害な可能性のある紫外線励起を必要とする。
【０００６】
GFPのさらなる突然変異体(Heim et al, Nature, (1995), 373,663-664)は、wtGFPと比較して至適励起・発光波長が赤色側へシフトしており、25℃で組換えタンパク質として発現される場合wtGFPよりも4〜6倍明るいS65T突然変異を含む。しかし、この変異体は37℃で培養された宿主中で発現される場合には明るい蛍光を生じない。
【０００７】
Ehrig et al (FEBS Lett., (1995), 367,163-6)は、それぞれwtGFPの最大励起のうちの1つを欠いているGFPの2つの突然変異T203IおよびE222Gを記載している。E222G突然変異は395nmの近紫外線励起ピークを欠いており、475nmの励起ピークが481nmへと赤色側にシフトする。この突然変異タンパク質の発光ピークは506nmである。
【０００８】
WO96/27675にはランダムな突然変異誘発およびその後の明度に関する選択により得られた2つのGFP変異体が記載されているおり、それぞれ突然変異V163AおよびV163A+S175Gを含む。これらの変異体は植物細胞においてwtGFPよりも効率的な発現を示し、かつ、タンパク質折りたたみの熱耐性を増強することが示されている。二重突然変異体V163A+S175Gは単一V163A突然変異体だけを含む変異体よりも明るいことが認められたが、この突然変異体は望ましくない励起ピークの青色側へのシフトを示す。
【０００９】
cycle-3と呼ばれるさらなる突然変異体は、DNAシャッフリングによる分子進化により索出され(Crameri, A. et al, Nature Biotechnology,(1996), 14, 315-9)、Invitrogen Incから商業的に入手可能である。Cycle-3-GFPは3つの突然変異を含み(F99S+M153T+V163A)、wtGFPと比較して細胞全体の蛍光を約42倍増強する。しかし、この突然変異体はwtGFPの近紫外線励起極大を保持し、生細胞に用いるためのレポーターとしてはあまり適当ではない。
【００１０】
上記の突然変異はより低いエネルギー励起に適合し、生物学的レポーターの測定に一般に使用されている検出機器に適合する波長で発光するGFPの変異型を提供して、生物学的レポーターとしてのwtGFPのスペクトル的な欠陥のうちのいくつかを効果的に解決する。しかし、このような突然変異は、wtGFPまたはスペクトル的変異体が周囲よりも有意に高い温度での増殖を必要とする宿主で発現された場合、非効率的な折りたたみおよび発色団形成の問題を解決するものではない。
【００１１】
米国特許第6172188号には発色団の1位手前のアミノ酸が突然変異しており蛍光強度が増強されているGFP変異体が記載されている。このような突然変異としてはF64I、F64V、F64A、F64GおよびF64Lが挙げられ、F64Lが好ましい突然変異である。これらの突然変異体は励起・発光極大をシフトさせずにGFPの蛍光強度を著しく増強している。F64L-GFPは発色団成熟時間がより短いため37℃で約6倍の蛍光増強を生じることが示されている。
【００１２】
上記の単一突然変異体またはランダムに生じた突然変異の組合せに加えて、上記のものから慎重に選択された2以上の突然変異およびその他の突然変異を含み、哺乳類細胞において高感受性生物学的レポーターとしての使用に適した発現およびスペクトル特性を有するタンパク質を生成すべく個々の突然変異の有利な特性を組み合わせることを目指した様々なGFP突然変異体が作出されてきた。
【００１３】
Clontech Inc.から商業的に入手可能で、一般にEGFPと呼ばれる1つの突然変異体は突然変異F64LおよびS65Tを含む(Cormack, B. P. et al, Gene, (1996), 173,33-38)。これらの突然変異を組み合わせた場合、wtGFPよりも約35倍明るさが増し、そのスペクトル特性は通常用いられる蛍光励起(488nm)および発光フィルター(505nm〜530nm)でEGFPを励起および検出できる。EGFPは哺乳類系における発現のために至適化されており、好ましい哺乳類コドンを用いて構築されたものである。
【００１４】
米国特許第6194548号では蛍光および37℃における折りたたみ特性が改良され、少なくともF64LおよびV163AおよびS175Gの変異を含むGFPを開示している。F64L、S65TおよびV163A突然変異を含むさらなるGFP突然変異体も記載されている(Cubitt, A. B. et al, Methods in Cell Biology, (1999), 58,19-29)。
【００１５】
米国特許第6077707号にはF64L突然変異とY66H突然変異を組み合わせて含む青色蛍光タンパク質(BFP)が記載されており、米国特許第6194548号にはF64L、Y66H、Y145FおよびL236R置換を含むさらなるBFPが記載されている。
【００１６】
本発明は30℃を超える温度で非相同細胞において発現された場合、および約490nmにおいて励起された場合に、親タンパク質、すなわちwtGFPと比較して強い蛍光を示す、新規なる緑色蛍光タンパク質(GFP)導入誘導体を提供する。本発明のGFP突然変異体はより低い発現レベル、かつ／またはwtGFPよりも高い感受性で、哺乳類細胞においてGFPレポーターを検出する手段を提供する。これは生細胞における細胞融合を研究する上で蛍光タンパク質の有用性を著しく向上させた。本発明の多重変異GFPは、単離して研究した場合の個々の突然変異の特性からは予想できない蛍光特性を有する。さらに、驚くべきことにwtGFPと比較しても発色団領域にいずれの突然変異も含まない本発明のあるGFPは従前に記載されているGFP突然変異体と比較して高い蛍光を示す。
【００１７】
本発明の第１の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質が提供される。
【００１８】
適宜には、64位のアミノ酸FがL、I、V、AおよびGからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されてよく、それによりF64L、F64I、F64V、F64AまたはF64G置換が得られる。第１の態様の好ましい実施形態では、アミノ酸Fが64位においてLにより置換される。
【００１９】
適宜には、175位のアミノ酸SがG、A、L、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されてよく、それによりS175G、S175A、S175L、S175IおよびS175T置換が得られる。第1の態様の好ましい実施形態では、アミノ酸Sが175位においてGにより置換される。
【００２０】
65位のアミノ酸Sが置換される実施形態では、適宜にはG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され、それによりS65G、S65A、S65L、S65C、S65V、S65IまたはS65T置換が得られる。好ましくは、65位におけるアミノ酸置換はS65T置換である。
【００２１】
222位のアミノ酸Eが置換される実施形態では、適宜にはG、A、V、L、I、F、S、T、NおよびQからなる群より選択されるアミノ酸によって置換され、それによりE222G、E222A、E222V、E222L、E222I、E222F、E222S、E222T、E222NまたはE222Q置換が得られる。好ましくは222位におけるアミノ酸置換はE222G置換である。
【００２２】
適宜には、この新規なる蛍光タンパク質はその細胞を30℃以上、好ましくは32℃〜39℃、より好ましくは35℃〜38℃、および最も好ましくは約37℃の温度でインキュベートした場合、それらを発現する細胞中で強い蛍光を示す。
【００２３】
好ましくは、この第１の態様の蛍光タンパク質は配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する。
【００２４】
本発明の好ましいタンパク質は、GFPの配列番号２に関して、64位のアミノ酸FがLにより置換され、175位のアミノ酸SがGにより置換され、222位のアミノ酸EがGにより置換されているタンパク質であり、本明細書では配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するものとして示される。
【００２５】
本発明のもう1つの好ましいタンパク質は、GFPの配列番号２に関して、64位のアミノ酸FがLにより置換され、65位のアミノ酸SがTにより置換され、かつ175位のアミノ酸SがGにより置換されているタンパク質でおり、本明細書では配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものとして示される。
【００２６】
適宜には、蛍光タンパク質を得るために使用したGFPまたは機能的GFP類似体は、いずれの便宜な供給源から得てもよい。例えば、天然GFPはクラゲ属(Aequorea)の種、好ましくはオワンクラゲ(Aequorea victoria)に由来する。オワンクラゲ由来のwtGFPの発色団は、推定一次アミノ酸配列(配列番号２)の65〜67位にある。好ましい実施形態では、GFPはオワンクラゲ由来のものである。
【００２７】
本発明の改変タンパク質は、該タンパク質をコードする核酸配列に突然変異を導入することによって作出し得る。本明細書においてwtGFPをコードする遺伝子の好ましい配列はオワンクラゲ由来のものであり、Chalfie et al (Science, (1994), 263, 802-5)により公表され、配列番号１として開示されている(図１)。対応するアミノ酸配列は配列番号２で示されている(図２)。例えば、Prasher et al (Gene (1992), 111, 229)により記載され、WO97/11094で開示されている配列のようなGFP遺伝子のヌクレオチド(および推定アミノ酸)配列などの、別のGFP遺伝子配列を用いてもよい。さらに、哺乳類系における翻訳を改良すべく、蛍光タンパク質をコードする別の遺伝子配列にコンセンサスKozakヌクレオチド配列(Kozak, M., Cell (1986), 44, 283)または好ましい哺乳類コドンを組み込んでもよい。蛍光タンパク質に相当するヌクレオチド配列はまた、有用な制限酵素部位ならびに酵素および精製タグの標的部位などの付加的エレメントをコードしてもよい。Kozak領域、好ましくは哺乳類コドン、制限酵素部位、酵素部位および精製タグを組み込むための方法は当技術分野で十分公知であり、結果としてアミノ酸残基が組み込まれ、提供されている配列においてwtGFPのナンバリングと比較して蛍光タンパク質のアミノ酸残基のナンバリングが変化してもよい。
【００２８】
本明細書において使用したアミノ酸の略称はJ.Biol.Chem.(1968), 243, 3558に記載されているものである。
【００２９】
本発明の第2の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質と融合された目的タンパク質を含んでなり、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する、融合化合物が提供される。
【００３０】
本発明に関して「目的タンパク質」とは、ポリペプチドおよびペプチド断片も包含するものとする。このような目的タンパク質の例としては、NFκBおよびそのサブユニット、RAC1、PLCドメイン、MAPKAP2、PKC、チトクロームC、RHO、β-アクチン、STAT6、プロテインキナーゼCイソ型、LAMP1/2 TGN、ATP7A TGNおよびGLUT4が挙げられる。
【００３１】
本発明の第3の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３２】
好ましくは、第3の態様の核酸分子は、配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換体により改変されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする。
【００３３】
第3の態様の特定の実施形態では、該核酸分子は目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
好ましくは、該核酸分子はDNA配列を含む構築物である。
【００３５】
好ましくは、該核酸分子は配列番号３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする。
【００３６】
公知のように、単一のアミノ酸は1以上のヌクレオチドコドンによりコードされることがあることから、従って上記ヌクレオチド配列はそれぞれ同じペプチドをコードする別のヌクレオチド配列を作出すべく改変してもよい。従って、本発明の好ましい実施形態は従前に記載されたように好ましいタンパク質をコードする別のDNA配列を含む。好ましいタンパク質(およびそれらが得られる核酸配列)は付加残基、特にNおよびC末端アミノ酸、または5'もしくは3'ヌクレオチド配列を含んでもよいが、やはり本質的には本明細書に記載のとおりであると考えられる。
【００３７】
適宜には、この新規なる蛍光タンパク質をコードするこのDNA構築物は、確立された、例えばBeaucage and Caruthers,(Tetrahedron Letters (1981),22,1859-1869)により記載されているホスホラミダイト法またはMatthes et al.,(EMBO Journal(1984), 3, 801-805)により記載されている方法により合成作製してもよい。ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドを例えば自動DNA合成装置にて合成し、精製、アニーリング、連結および好適なベクターへクローニングする。
【００３８】
蛍光タンパク質をコードするDNA構築物はまた、組換えDNA法、例えばcDNAクローニングにより作製してもよい。例えば、Sambrook, J. et al(1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。
【００３９】
このDNA構築物はまた、例えば米国特許第4683202号またはSaiki et al(Science (1988), 239,487-491)に記載されている特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製してもよい。最近のPCR法の総説としては、PCR Protocols, (1990), Academic Press, San Diego, California, USAに見出せる。
【００４０】
蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は目的タンパク質をコードする遺伝子とフレーム内連結してもよく、適当な発現ベクターへ挿入すれば所望の融合タンパク質が生じる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または相補的オリゴヌクレオチドを用いて、目的タンパク質に相当する遺伝子配列を得るため蛍光タンパク質の5'または3'に相当するポリヌクレオチド配列を操作してもよい。あるいは、同様の技術を用いて、目的タンパク質をコードする遺伝子配列の挿入に先立ち、蛍光タンパク質配列の5'または3'に相当するポリヌクレオチド配列を発現ベクターの多重クローニング部位へと導入してもよい。蛍光タンパク質配列に相当するポリヌクレオチド配列は、クローニング部位、リンカー、転写および翻訳開始および／または終結シグナル、標識および精製タグを含むよう付加的なヌクレオチド配列を含めてもよい。
【００４１】
第4の態様では、本発明の核酸分子に作動可能なように連結された好適な発現制御配列を含む発現ベクターが提供される。本発明のDNA構築物は組換えベクターに挿入してもよく、そのベクターは組換えDNA法を便宜に行えるいずれのベクターであってもよい。どのベクターを選択するかはしばしばそれが導入される宿主細胞により決まる。このように、該ベクターは自己複製ベクター、すなわち例えばプラスミドのように、その複製が染色体複製に依存しない染色体外要素として存在するベクターであってもよい。あるいは、該ベクターは宿主細胞に導入された際に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれている染色体とともに複製されるものであってよい。
【００４２】
このベクターとしては、本発明の蛍光タンパク質をコードするDNA配列がDNAの転写に必要な付加的セグメントに作動可能なように連結されている発現ベクターであることが好ましい。一般に、発現ベクターはプラスミドもしくはウイルスDNA由来であるか、または双方の要素を含んでもよい。「作動可能なように連結される」とは、セグメントが、意図した目的に対して機能するように配置されていることを示し、例えば転写はプロモーターにおいて始まり、本発明の蛍光タンパク質をコードするDNA配列によって進行する。
【００４３】
プロモーターは蛍光タンパク質を発現するために好適な選択された宿主細胞において(例えば、細菌細胞、哺乳類細胞、酵母菌細胞または昆虫細胞)転写活性を示すいずれの最適なDNA配列であってもよい。プロモーターは宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってよい。
【００４４】
哺乳類細胞において本発明の蛍光タンパク質をコードするDNA配列の転写を指示する好適なプロモーターの例としては、CMVプロモーター(米国特許第5168062号、同第5385839号)、ユビキチンCプロモーター(Wulff, M. et al., FEBS Lett. (1990), 261,101-105)、SV40プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell Biol. (1981), 1, 854-864)およびMT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., Science (1983), 222, 809-814)がある。昆虫細胞での使用に好適なプロモーターの例としては、ポリヘドリンプロモーター(米国特許第4745051号; Vasuvedan et al., FEBS Lett., (1992) 311, 7-11)がある。酵母宿主細胞での使用に好適なプロモーターの例としては、酵母解糖遺伝子(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., (1980), 255, 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen., (1982), 1, 419-434)、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al., eds.), Plenum Press, New York, 1982)、またはTPl1(米国特許第4599311号)またはADH2-4c(Russell et al., Nature, (1983), 304, 652-654)プロモーターが挙げられる。
【００４５】
細菌宿主細胞での使用に好適なプロモーターの例として、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)のマルトース系アミラーゼ遺伝子、バチルス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、枯草菌(Bacillus subtilis)アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、またはバチルス・プミルス(Bacillus pumilus)キシロシダーゼ遺伝子、またはλファージPRもしくはPLプロモーター、または大腸菌(Escherichia coil)lac、trpもしくはtacプロモーターが挙げられる。
【００４６】
本発明の新規なる蛍光タンパク質をコードするDNA配列はまた、要すればヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al.,上記)または(真菌宿主に対して)TPl1(Alber and Kawasaki,上記)もしくはADH3(McKnight et al.,上記)ターミネーターのような好適なターミネーターに作動可能なように連結してもよい。このベクターはさらにポリアデニル化シグナル(例えば、SV40またはアデノウイルス5Elb領域由来のもの)、転写エンハンサー配列(例えば、SV40エンハンサー)および翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスVA RNAをコードするもの)のような要素を含んでもよい。
【００４７】
このベクターはさらに、内部リボソームへの侵入および1つの2シストロン性転写mRNA分子からの2つのタンパク質の発現を可能にするDNA配列を含んでもよい。例えば、脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入配列がある(Rees S, et al, BioTechniques(1996), 20, 102-110および米国特許第4937190号)。
【００４８】
組換えベクターはさらに、目的の宿主細胞中でのベクターの複製を可能にするDNA配列を含んでもよい。このような配列(宿主細胞が哺乳類細胞の場合)の例としては、SV40複製起点がある。
【００４９】
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクター複製を可能にする好適な配列の例としては、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製起点がある。
【００５０】
ベクターはまた、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ピューロマイシン、ネオマイシンまたはハイグロマイシンなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子のような選択マーカーを含んでもよい。
【００５１】
本発明の蛍光タンパク質をコードするDNA配列、プロモーターおよび所望によりターミネーターおよび／またはターゲッティング配列をそれぞれ連結するために用いる方法、ならびにそれらを複製に必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために用いる方法は当業者に十分公知である(例えば、Sambrook et al., 上記)。
【００５２】
本発明の第5の態様では、本発明の発現ベクターを含むDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【００５３】
本発明のDNA構築物または組換えベクターは本DNA構築物を発現可能で、細菌、酵母および高等真核細胞を含むいずれの細胞であってもよい宿主細胞中に適宜導入される(Unger, T.F., The Scientist (1997), 11(17), 20-23; Smith, C., The Scientist (1998), 12(22): 20; Smith, C., The Scientist (1998), 12(3), 18; Fernandez, J.M. & Hoeffler, J.P., Gene Expression Systems- using nature for the art of expression, Academic Press 1999)。
【００５４】
培養で本発明のDNA構築物を発現できる細菌宿主細胞の例としては、例えばバチルス種といったグラム陽性細菌、または大腸菌のようなグラム陰性細菌がある。細菌の形質転換はそれ自体公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより達成できる(Sambrook et al., 上記を参照)。
【００５５】
好適な哺乳類細胞株の例としては、HEK293およびHeLa細胞株、一次細胞、およびCOS(例えば、ATCC CRL 1650)、BHK(例えば、ATCC CRL 1632、ATCC CCL 10)、CHL(例えば、ATCC CCL39)またはCHO(例えば、ATCC CCL 61)細胞株が挙げられる。哺乳類細胞をトランスフェクトし、細胞内に導入されたDNA配列を発現させる方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol., (1982), 159, 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet., (1982), 1, 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1982), 79, 422-426; Wigler et al., Cell, (1978), 14, 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics, (1981), 7, 603, Graham and van der Eb, Virology (1973), 52, 456;およびNeumann et al., EMBO J., (1982), 1, 841-845に記載されている。
【００５６】
好適な酵母細胞の例としては、サッカロミセスspp.(Saccharomyces spp.)またはシゾサッカロミセスspp.(Schizosaccharomyces spp.)、特にサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)などの細胞が挙げられる。酵母細胞を異種DNAで形質転換し、それから異種ポリペプチドを生成させる方法は例えば米国特許第4599311号、同第4931373号、同第4870008号、同第5037743号および同第4845075号に記載されており、これらはすべて出典明示により本明細書の一部とする。形質転換細胞は、一般に薬剤耐性または例えばロイシンのような特定の栄養素の不在下での増殖能のような選択マーカーにより決定される表現型により選択される。酵母における使用に好ましいベクターとしては、米国特許第4931373号に開示されているPOT1ベクターがある。本発明の蛍光タンパク質をコードするDNA配列は、シグナル配列および所望により例えば上記のようなリーダー配列が先にきてもよい。好適な酵母細胞のさらなる例としては、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、例えばK.ラクティス(K. lactis); ハンゼヌラ(Hansenula)、例えばH.ポリモルファ(H. polymorpha); ピキア(Pichia)、例えばP.パストリス(P. pastoris)(Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., (1986), 132, 3459-3465;米国特許第4882279号参照)が挙げられる。
【００５７】
昆虫細胞の形質転換およびそこでの異種ポリペプチドの産生は米国特許第4745051号、同第4879236号、同第5155037号、同第5162222号、欧州特許EP 397485に記載されているように行えばよく、これらはすべて出典明示により本明細書の一部とする。宿主として用いるこの昆虫細胞株は、適宜にはハスモヨトウ近似種(Spodoptera frugiperda)またはイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)細胞のような鱗翅目細胞株であってよい(米国特許第S 5077214号参照)。培養条件は適宜には例えばWO89/01029もしくはWO89/01028または前述の参考文献のいずれかに記載されているものであってよい。
【００５８】
第6の態様では、本発明は、本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体を作製する方法を提供し、この方法は本発明のヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養し、それから該ヌクレオチド配列により発現されたポリペプチドを得ることを含む。
【００５９】
適宜には、上記の形質転換またはトランスフェクト宿主細胞は本発明のDNA構築物を発現できる条件下、好適な栄養培地中で培養し、その後細胞を本発明のスクリーニング法において用いる。あるいは、該細胞は破壊してよく、その後、細胞抽出物および／または上清の蛍光を分析し、かつ／または本発明のGFPもしくは機能的GFP類似体を精製するために用いてもよい。
【００６０】
細胞を培養するために用いる培地は、適当な添加物を含有する最小培地または完全培地など、宿主細胞の増殖に好適な従来のいずれの培地であってもよい。好適な培地は商業ソースから入手可能であるか、または公表されているプロトコールに従って調製してもよい(例えば、the American Type Culture Collectionのカタログ; Sambrook et al., 上記)。
【００６１】
例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)およびGFPを含む融合タンパク質を構築し、大腸菌で発現させることができる。GFPはpGEXプラスミドベクター(Amersham Pharmacia Biotech)中のGSTのC末端にフレーム内連結すればよい。標準的な大腸菌発現宿主を用いて融合タンパク質の組換え生産を行った後、グルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、タンパク質分解によりGSTタグを除去する。
【００６２】
本発明の第7の態様では、細胞において目的タンパク質の発現を測定する方法が提供される。この方法はi)本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入し(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、目的タンパク質の発現を調節する発現制御配列の制御下にある)、ii)該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに、iii)目的タンパク質発現を測定する手段として緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の蛍光発光を検出することを含む。
【００６３】
本発明の第8の態様では、目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べる方法であって、
i）目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、好適な発現制御配列の制御下にある)を細胞に導入し、
ii）該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに
iii）光学的手段により蛍光発光を検出することにより目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べることを含む方法が提供される。
【００６４】
本発明の蛍光タンパク質はまた、細胞中での2以上の異なる目的タンパク質の発現および／または輸送の調節に対する試験物質の作用を検出および比較する方法において使用してもよい。あるいは、目的タンパク質の発現および同時に試験物質に応答した発現制御配列の活性を比較する方法において用いてもよい。該蛍光タンパク質はまた、試験物質に応答した細胞内の2以上の発現制御配列の活性を比較する方法において用いてもよい。このような方法はプロセスに対するその作用が測定される試験物質の存在下および不在下で実施すればよい。例えば、検出可能なレポーター分子のあるものは内部標準として、また別のものは可変マーカーとして用いてもよく、これは、遺伝子の調節された発現は発現制御配列を、例えばF64L-S175G-E222G-GFPをコードするDNA構築物に融合させ、蛍光を測定し、それを構成的に発現されたスペクトル的に異なる蛍光分子の蛍光に対してノーマライズすることにより量的にモニタリングできるからである。例えばBFPのような構成的に発現されたスペクトル的に異なる蛍光分子は内部標準として働く。
【００６５】
このように、本発明の第9の態様では、
細胞において1以上の異なる目的タンパク質の発現および／または局在性に対する1以上の試験物質の作用を比較する方法であって、
i）細胞内に、
ａ）所望により第１の目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、第１の発現制御配列の制御下にある)、および、所望により
ｂ）所望により異なる目的タンパク質に融合された、タンパク質レポーター分子をコードする少なくとも１つの異なる核酸分子(なお、該核酸分子は各々作動可能なように連結され、第2の発現制御配列の制御下にあり、該タンパク質レポーター分子は該緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の発光シグナルとはスペクトル的に区別される発光シグナルを有する、または発し得る)
を導入し、
ii）該細胞を試験物質の存在下および不在下で目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、
iii）該細胞における目的タンパク質の発現および／または局在性を光学的手段で蛍光発光を検出することにより測定し、さらに
iv）目的タンパク質の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を測定するために、試験物質の存在下および不在下で得られた蛍光発光を比較する
ことを含む方法が提供される。
【００６６】
第9の態様の好ましい実施形態では、液体培地中の該細胞のサンプルは試験される試験物質各々ついて個別の容器に導入される。
【００６７】
好ましくは、第1および第2の発現制御配列は異なる。
【００６８】
適宜には、タンパク質レポーター分子は蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択されてよい。好ましい蛍光タンパク質としては、例えばBFPのような本発明の蛍光タンパク質の発光波長と比較してスペクトル的に区別できる発光波長を有するものである。好適な酵素レポーターとしては、基質中に検出可能な(例えば、発光または蛍光)シグナルを生じさせるのに好適なものである。好適な酵素／基質としては、ルシフェラーゼ／ルシフェリン；βガラクトシダーゼ／DDAOガラクトシド；βガラクトシダーゼ／フルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド；アルカリ性ホスファターゼ／Attophosなどがある。
【００６９】
本発明の方法において、本発明のDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトした細胞の蛍光は適宜には例えば分光光度計、蛍光計、蛍光顕微鏡、冷却電荷結合素子(CCD)画像装置(走査型画像装置または領域画像装置など)、蛍光活性化セルソーター、共焦点顕微鏡または走査型共焦点装置のような光学的手段により測定され、その培地中の細胞のスペクトル特性は光励起および発光の走査により測定し得る。
【００７０】
本発明の蛍光タンパク質には多くの付加的な適用があり、例えば以下のものがある。
i)少なくとも本発明の蛍光タンパク質をコードする発現ベクターを含むトランスフェクト細胞選択のための、無毒なマーカーとしての使用。その蛍光発光をトランスフェクト細胞の単離に使用してもよく、それにより選択のために抗生物質のような有毒分子を用いる必要性が克服される。
ii)固定化した生細胞におけるタンパク質標識としての使用。この新規なタンパク質は強い蛍光を示し、低濃度で存在するタンパク質の好適な標識となる。基質が必要なく、蛍光タンパク質の可視化も細胞を損傷しないため、動的な分析が行える。
iii)細胞内またはオルガネラでの融合のマーカーとしての使用。例えばF64L-S175G-E222G-GFPのような新規なタンパク質で1以上の細胞またはオルガネラを標識し、かつ他の細胞またはオルガネラを同じかまたは別の蛍光で標識することにより、ヘテロカリオン形成のような融合体をモニタリングできる。
iv)本発明の新規なタンパク質に融合されたタンパク質の輸送が可視化できる。特定のオルガネラへの細胞内タンパク質の輸送は目的タンパク質を例えばF64L-S175G-E222G-GFPのような蛍光タンパク質と融合させ、オルガネラを例えば蛍光タンパク質などの他の蛍光分子で標識することにより可視化できる。次いで特定のオルガネラ中の蛍光タンパク質のスペクトルのシフトにより輸送が検出される。
v)分泌マーカーとしての使用。本発明の蛍光タンパク質をシグナルペプチドまたは分泌されるペプチドと融合させることにより、生細胞において分泌を追跡できる。
vi)トランスジェニック動物における遺伝子レポーターまたはタンパク質タグとしての使用。新規なタンパク質の強い蛍光により、野生型GFPのような先行技術のタンパク質よりもシグナル-ノイズ比が著しく改善されたため、それらはタンパク質および遺伝子発現のタグとして好適である。
vii)細胞またはオルガネラの完全性マーカーとしての使用。オルガネラを標的として新規なタンパク質を発現させることにより、タンパク質漏出の計算が可能になり、細胞の完全性の目安として使用できる。
viii)トランスフェクションマーカーとして、またFACSソーティングと併用するマーカーとしての使用(例えば、実施例３に記載)。新規なタンパク質は明るさが増大しているため細胞検出およびソーティングの質が著しく改善できる。
ix)生理学的濃度付近で働くリアルタイムプローブとしての使用。本発明の新規なタンパク質は約37℃で細胞内で発現された場合にwtGFPよりも有意に明るく、約490nmの光で励起されるため、可視化に必要な濃度を低減できる。例えばF64L-S175G-E222G-GFPのような新規なタンパク質中へ導入された酵素の標的部位は、このため生細胞において低濃度で細胞内に存在することができる。これは、i)試験される細胞内プロセスに対するプローブの干渉を可能な限り小さくしなければならないこと、およびii)翻訳および転写装置が受けるストレスを最小限にとどめる必要があること、の2つの理由で重要である。
x)トランスポゾンベクターの突然変異は転写および翻訳融合において新規なタンパク質をマーカーとして用いて行える。トランスポゾンは新規なタンパク質をコードする微生物中で使用してよい。このトランスポゾンはプロモーターのスクリーニングに用いられる翻訳および転写融合を目的に構築してもよい。例えばF64L-S175G-E222G-GFPのような新規なタンパク質をコードするトランスポゾンベクターは、プラスミドおよび染色体のタグ付けを目的に用いてもよい。
xi)新規なタンパク質をバクテリオファージのゲノムへ導入することによる、細菌検出のためのレポーターとしての使用。新規なタンパク質、例えばF64L-S175G-E222G-GFPをファージのゲノムへ導入することにより診断ツールが設計できる。F64L-S175G-E222G-GFPは生体宿主中へのゲノムのトランスフェクションによってはじめて発現する。宿主の特異性はバクテリオファージにより規定される。
【００７１】
以下、実施例および図面を参照して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、wtGFPのヌクレオチド配列(Chalfie et al; Science, (1994), 263, 802-5)であり、本明細書では配列番号１と呼ぶ。
【図２】図２は、wtGFPの相当するアミノ酸配列(Chalfie et al., Science, (1994), 263, 802-5)であり、本明細書では配列番号２と呼ぶ。
【図３】図３は、F64L-S175G-E222G-GFPの推定アミノ酸配列であり、本明細書では配列番号３と呼ぶ。
【図４】図４は、F64L-S65T-S175G-GFPの推定アミノ酸配列であり、本明細書では配列番号４と呼ぶ。
【図５】図５は、本発明の突然変異体GFPの蛍光強度の平均を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の突然変異体GFPの相対的光分解を示すグラフである。
【図７】図７は、アゴニスト添加後のCHO-hir細胞中の細胞質から核へのP65-GFPの輸送に際しての核／細胞質蛍光強度比の増大を示すグラフである。
【実施例１】
【００７３】
GFP遺伝子のクローニングおよびテンプレートベクターの構築
本研究で用いたGFP遺伝子はClontech Laboratories.Inc. (Palo Alto, Ca, USA)から入手したプラスミドpGFP(Chalfie et al., Science, (1994) 263, 802-805; GenBank受託番号U17997)内に含まれていたものである。認知されているプロトコールに従って(Saiki et al., Science, (1988), 239, 487-491)この遺伝子をPfuポリメラーゼ(Promega, Madison, WI, USA)を用いてPCR増幅した。用いたプライマーの配列は、
GFP-1  5'-ggtacgggccgccaccatgagtaaaggagaagaacttttcac      配列番号５
GFP-2  5'-ggtacgggttaaccggttttgtatagttcatccatg            配列番号６
GFP-3  5'-ggtacgggccgccaccatgggatccaaaggagaagaacttttcac   配列番号７
であった。
【００７４】
プライマーGFP-1はGFP遺伝子の5'領域と相同性を示し、哺乳類系における翻訳の効率的な開始のための開始コドンの前に部分的Kozak部位(Kozak, M, Cell, (1986), 44, 283)を含む。プライマーGFP-2はGFP遺伝子の3'領域と相同性を示し、終結コドンの直前に付加的AgeI制限酵素部位を含み、GFPのC末端に融合することによりタンパク質のクローニングを容易にする。プライマーGFP-3はGFP遺伝子の5'領域と相同性を示すプライマーGFP-1と同様であるが、開始コドンの直後に付加的制限部位(BamHI)を含み、GFPのＮ末端に融合することによりタンパク質のクローニングを容易にする。PCR反応の結果として、GFP-1およびGFP-2ならびにGFP-3およびGFP-2を含む増幅産物の末端にTaqポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK)を用いて単一の3'-デオキシアデノシンを付け、製造業者の説明書に従いTAクローニングベクターpTARGET(Promega)へ連結した。CMVプロモーターおよび挿入配列に対して正しい方向かどうかは自動DNAシーケンシングにより判定した。
【実施例２】
【００７５】
GFP突然変異体の作出
本研究においては以下に示すGFP突然変異体を作出した：F64L-GFP、V163A-GFP、S175G-GFP、E222G-GFP、F64L-E222G-GFP、F64L-V163A-GFP、F64L-S175G-GFP、V163A-S175G-GFP、V163A-E222G-GFP、S175G-E222G-GFP、F64L-S175G-E222G-GFP、V163A-S175G-E222G-GFP、F64L-V163A-E222G-GFP、F64L-S65T-S175G-GFP、F64L-S65T-V163A-GFP。pTARGET(実施例１参照)内のGFP遺伝子の突然変異体(配列番号３)構築物は製造業者の説明書に従いQuikChange(商標)部位指定突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, Ca, USA)を用いて作出した。F64L、S65T、V163A、S175GおよびE222G単一突然変異体を作出するために用いたプライマー配列を表１に示した。多重突然変異GFP分子は一連の突然変異誘発反応により作出した。GFP突然変異体配列はすべて自動シーケンシングにより確認した。
【表１】2005502323.tif 000002
【実施例３】
【００７６】
個々の突然変異およびF64L、S65T、V163A、S175GおよびE222G突然変異の組合せが哺乳類細胞において発現された際にGFPに与える影響
トランスフェクションに使用するプラスミドDNAをすべてのGFPおよびEGFP構築物についてHiSpeedプラスミド精製キット(Qiagen, Westberg, NL)を用いて調製した。DNAを18メガオーム水(Sigma)を用いて100ng・μl-1に希釈し、トランスフェクションのため1μgを用いた。トランスフェクション当日に50〜80%の集密度となるよう、HeLa細胞を6ウェルプレートに5×104個／ウェルの密度でプレーティングし、一晩インキュベートした。各一時的トランスフェクション反応につきDNA：FuGene6試薬(Roche)1:3(1μg：3μl)を用い、3μlのFuGene6を87μlの血清フリーDMEM培地(Sigma)(ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン(GibcoBRL)含有)に加え、静かに軽くたたいて混合し、次いで10μl(1μg)の構築物DNAを加え、再び静かに混合した。このFuGene6:DNA複合体を室温で40分間インキュベートし、次いで培地を交換せずに直接細胞に滴下し、均一に分布するようにプレートを回した。
【００７７】
トランスフェクション24時間または48時間後に蛍光を測定した。要するに、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、トリプシン(GibcoBRL)を2滴加えて遊離させ、1mlの完全DMEM培地(ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミンおよびウシ胎児血清(Sigma)含有)に再懸濁させた。細胞を攪拌し、FACS Caliburフローサイトメーター(Becton Dickinson & Co., NJ, USA)にて488nmで励起し、発光は蛍光フィルターを530/30nm(515〜545nmの範囲)に設定して可視化し、細胞全体の蛍光特性を分析した。各トランスフェクションについて10,000件を採集し、各構築物について6〜10回の反復を行った。FACS分析による平均蛍光強度は幾何平均(対数目盛り上の蛍光平均)として得られ、これを図５に示した。
【実施例４】
【００７８】
大腸菌由来の蛍光タンパク質の精製
突然変異体F64L-S175G-E222G-GFP(実施例２)の遺伝子をBamHIおよびSalIを用いてpTARGETから切り取り、IPTG誘導型GST融合ベクターpGEX-6P1(Amersham Pharmacia Biotech)へサブクローニングした。GST-GFP遺伝子融合を有する発現ベクターを含む大腸菌JM109細胞(Promega)を30℃で100μg/mlのアンピシリンを含有する2xYTブロス中でOD600＝0.6となるまで増殖させた。IPTG(0.1mM)でタンパク質発現を誘発し、インキュベーションを16時間継続した。細胞を遠心分離によりペレットとし、PBSに最懸濁させ、超音処理により溶解させた(氷上で間欠冷却しながら20μmで10秒間のバースト4回)。細胞残渣を遠心分離により除去し、可溶性GST-GFP融合タンパク質を含む溶解物をグルタチオンセファロースカラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。次いでタンパク質を入れ替え、PD10カラム(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてPBSで溶出させた。タンパク質調製物の正確な分子量の単一バンドの存在は、4〜12％Bis-Tris NuPAGEゲル電気泳動(Invitrogen)を用いるSDS-PAGEにより確認した。タンパク質濃度および純度を評価するために、このタンパク質調製物について酸加水分解およびろ過、次にPharmaciaαプラスシリーズIIアナライザーを用いたイオン交換クロマトグラフィーによるアミノ酸分析を2回行った。
【００７９】
消失係数(表２)はUV/vis分光計(Unicam)で測定した。生じた量は(表２)、Patterson et al. (Biophysical Journal, (1997), 73, 2782-2790)により記載されている方法により測定した。精製されたGFP調製物および蛍光参照標準(Molecular Probes)に関し、それぞれの吸収極大において等しい光学密度のサンプルを10mMトリス塩酸(pH8)にて調製し、希釈した。蛍光発光はLS50B蛍光分光計(Perkin Elmer)を用いて490〜600nmの領域で測定し、GFP調製物の結果を直接蛍光標準(QY=0.85)と比較した。
【表２】2005502323.tif 000003
【００８０】
wtGFPに対する突然変異体F64L-S175G-E222G-GFPおよびF64L-E222Gの光分解の程度を評価するために、実施例３に概略を示した方法に従って50ngのDNAをHeLa細胞へトランスフェクトした。トランスフェクション当日に50〜80%の集密度となるようにHeLa細胞をViewPlate(商標)-96(Packard, Meriden CT, USA)中に5×103個／ウェルの密度でプレーティングした。トランスフェクション24時間後に、LEADSeeker(商標)細胞分析システム(Amersham Pharmacia Biotech)で細胞の生像を得、488nmのアルゴンレーザー(発光フィルター535〜45nm)を用いて高レーザーパワー(19.94mW)でブリーチした。断続的照射により260秒で32の個々の画像を撮影したが、図６に示したようにすべての蛍光タンパク質が著しい光分解を示した。
【実施例５】
【００８１】
NFκB輸送の測定
NFκBは転写アクチベーターであり、サイトカイン、リンホカインおよびいくつかの免疫抑制剤をはじめとする種々のインデューサーに応答するシグナル伝達経路の成分である。
【００８２】
ヒトNFκB P65サブユニット遺伝子(GenBank受託番号:M62399)を認知されているプロトコール(Saiki et al., Science, (1988), 239,487-491)に従ってPCR増幅した。使用したプライマー配列は、
NFκB-1  5'-ttttactcgagatggacgaactgttccccctca    配列番号 18
NFκB-2  5'-ttttgaagcttggagctgatctgactcagcagg    配列番号 19
であった。
【００８３】
P65サブユニットをベクターｐCORON1000(Amersham Pharmacia Biotech)中、CMVプロモーターの制御下でGFPのN末端(配列番号３)に融合させた。これをFuGene6試薬(Roche)および標準トランスフェクション法を用いてCHO-hir細胞へトランスフェクトし、P65-GFP構築物を含む安定な細胞株を作製した。
【００８４】
CHO-hir、P65-GFP細胞を96ウエルマイクロタイタープレートに播種し、ペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミン(GibcoBRL)を含有するDMEM培地(Sigma)中、集密度5×103細胞／ウェルで37℃にて一晩インキュベートした。アッセイを行う1時間前にこの培地を除去して100μlの血清フリーDMEM／ウェルで置換した。クレブス緩衝液中5μM DRAQ5(Biostatus)100μlを各ウェルに加え、37℃で15分間インキュベートした。次いでこのプレートを画像装置(LEADseeker細胞分析システム)に入れ、アゴニスト(40ng/mlのIL1βを50μl)添加後の様々な時点でウェルを画像処理した。アゴニスト添加後に細胞質から核へのP65-GFPの輸送が認められた。核／細胞質の蛍光比を図７に示す。
【図１】
2005502323.tif 000004
【図２】
2005502323.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月9日(2003.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換、ここで、65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する、蛍光タンパク質。
【請求項２】
64位のアミノ酸FがL、I、V、AおよびGからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項３】
175位のアミノ酸SがG、A、L、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
222位のアミノ酸EがG、A、V、L、I、F、S、T、NおよびQからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている、請求項１〜３に記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
F64L-S175G-E222G-GFPおよびF64L-S65T-S175G-GFPから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項６】
配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質。
【請求項７】
緑色蛍光タンパク質(GFP)に由来し、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
【請求項８】
緑色蛍光タンパク質(GFP)に由来し、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の改変タンパク質である蛍光タンパク質に融合された目的タンパク質を含む融合化合物。
【請求項１０】
緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換、ここで、65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
配列番号２の配列を有する野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
配列番号３および配列番号４からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質をコードする、請求項１０または１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光タンパク質に融合された目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子に作動可能なように連結された好適な発現制御配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含むDNA構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１６】
哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載の宿主を培養し、それから該ヌクレオチド配列により発現されたポリペプチドを得ることを含む、本発明の緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の調製方法。
【請求項１８】
細胞において目的タンパク質の発現を測定する方法であって、
i）請求項１〜８のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入し、なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、目的タンパク質の発現を調節する発現制御配列の制御下にあり、
ii）該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに
iii）目的タンパク質の発現を測定する手段として、該緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の蛍光発光を検出する
ことを含む、方法。
【請求項１９】
目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べる方法であって、
i）目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入し(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、好適な発現制御配列の制御下にある)、
ii）該細胞を目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、さらに
iii）光学的手段により蛍光発光を検出することにより目的タンパク質の細胞内および／または細胞外の局在性を調べる
ことを含む、方法。
【請求項２０】
細胞において1以上の異なる目的タンパク質の発現および／または局在性に対する1以上の試験物質の作用を比較する方法であって、
i）細胞内に、
ａ）所望により第１の目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された、請求項１〜８のいずれか一項に記載の緑色蛍光タンパク質(GFP)または請求項１〜８のいずれか一項に記載の機能的GFP類似体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子(なお、該核酸分子は作動可能なように連結され、第１の発現制御配列の制御下にある)、および、所望により
ｂ）所望により異なる目的タンパク質に融合された、タンパク質レポーター分子をコードする少なくとも１つの異なる核酸分子(なお、該核酸分子は各々作動可能なように連結され、第2の発現制御配列の制御下にあり、該タンパク質レポーター分子は該緑色蛍光タンパク質(GFP)または機能的GFP類似体の発光シグナルとはスペクトル的に区別される発光シグナルを有する、または発し得る)
を導入し、
ii）該細胞を試験物質の存在下および不在下で目的タンパク質の発現に好適な条件下で培養し、
iii）該細胞における目的タンパク質の発現および／または局在性を光学的手段で蛍光発光を検出することにより測定し、さらに
iv）目的タンパク質の発現および／または局在性に対する試験物質の作用を測定するために、試験物質の存在下および不在下で得られた蛍光発光を比較する
ことを含む、方法。
【請求項２１】
液体培地中の該細胞のサンプルが、検討される各試験物質ついて個別の容器に導入される、請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
米国特許第6077707号にはF64L突然変異とY66H突然変異を組み合わせて含む青色蛍光タンパク質(BFP)が記載されており、米国特許第6194548号にはF64L、Y66H、Y145FおよびL236R置換を含むさらなるBFPが記載されている。
米国特許第6054321号には、蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer)(ＦＲＥＴ)に有用であるＧＦＰが記載されており、非常に多数の可能な位置でのアミノ酸置換を列挙しており、多くの変異体の中でF64L、S65およびE222が特定されている。
ＦＲＥＴおよび蛍光寿命(fluorescence lifetime)(ＦＬＩＭ)アッセイに有用であるＧＦＰ変異体がWO00/08054に記載されている。そのようなアッセイは、天然では非常に特異性があり、ＦＲＥＴおよびＦＬＩＭに適当なタンパク質が、通常の蛍光アッセイに適当である必要はない。F64L、S65TおよびS175Gでの置換を有するＧＦＰ変異体は、膨大な一連の可能性ある変異体群の中で３つの可能な変異体として開示のみされている。
Brejc Katjusa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), 94, 2306-2311)は、野生型ＧＦＰのＸ線結晶構造を調べており、S65またはG222の単一の点での変異を有するＧＦＰを記載している。その論文は、野生型ＧＦＰの分光特性の解明に関連しており、なぜS65T変異がこれらの特性において絶大な効果を有するか、に関連している。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の第１の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換、ここで、65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質が提供される。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の第2の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質と融合された目的タンパク質を含んでなり、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換、ここで、65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する、融合化合物が提供される。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明の第3の態様では、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはいずれかの機能的GFP類似体に由来し、野生型緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換により改変されているアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、その改変された蛍光タンパク質が
i)F64位におけるアミノ酸置換
ii)S65位およびE222位からなる群から選択される位置における単一アミノ酸置換、ここで、65位のアミノ酸SがG、A、L、C、V、IおよびTからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている；および
iii)S175位におけるアミノ酸置換
を含んでなり、該改変GFPが野生型GFPと比較して異なる励起スペクトルおよび／または発光スペクトルを有する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。




【国際調査報告】
2005502323.tif 000061
2005502323.tif 000062
2005502323.tif 000063