(57)【要約】ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法が開示される。１つの実施態様において、本発明は、（ａ）ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）で形質導入するステップであって、ＧＤＮＦ遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および（ｂ）形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法であって、
（ａ）ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）で形質導入するステップであって、ＧＤＮＦ遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および
（ｂ）形質導入された細胞を、ＧＤＮＦが発現させられる患者の脳に移植するステップ
を含む方法。
【請求項２】
患者のＧＤＮＦ応答性ニューロン系が上方制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害がパーキンソン病である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＤＮＦ応答性ニューロン系がドーパミン作動性の系である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記障害が、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および脳卒中からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
誘導可能なプロモーターシステムがマウスのホスホグリセリン酸キナーゼ１／ｔＴＡ１システムである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ヒト神経細胞がニューロスフェアとして成長させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が死後胎児脳組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
移植された細胞が遊走し、患者の脳に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が脳の被殻に移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が脳の被殻の尾側半分に移植される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
形質導入された細胞はさらなる異種増殖因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
誘導可能なプロモーターと、ＧＤＮＦをコードする配列とを含む、請求項１に記載される方法に有用なウイルスベクター。
【請求項１４】
レンチウイルス型である、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ｔＴＡ１に機能的に接続されたマウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーターと、ウッドチャック肝炎ウイルスの翻訳後シス作用調節エレメントとを含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ドキシサイクリンの投与が、ＧＤＮＦの発現を活性化しうる、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ドキシサイクリンの投与が、ＧＤＮＦの発現を不活性化しうる、請求項１５に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／３７５，５８７号（２００２年４月２５日出願；これは本明細書中に参考として組み込まれる）に対する優先権を主張する。
連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述
【発明の背景】
【０００２】
神経栄養因子および神経学的病気
ヒト脳における特定の細胞群の変性は、多くの破壊的な疾患、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病、ハンチントン（Huntington）病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多くの他の障害などを生じさせている。そのような変性はまた、神経毒化学兵器および戦争に関連した頭部傷害のひろがりにより、軍にとって非常に重要な関心事でもある。ＰＤは、６０歳以上の１００人に１人が、すなわち、およそ１５０万人のアメリカ人が罹患しており、合衆国では１年あたり推定で２５０億ドルの費用がかかっている。治療は、主として、ドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡを投与することからなる。Ｌ−ＤＯＰＡはその障害の初期段階では非常に効果的であり、しかし、後期では重篤な副作用を生じさせ、最終的にはもはや作用しない。より新しい様々な薬剤が、ドーパミンの効き目を高めるために作製途上にあり、代わりの神経外科的方法もまた開発途上にある。この場合、特定の脳領域が傷つけられるか、または刺激されるかのいずれかであり、これにより、多くの場合、劇的な急性の臨床的効果がもたらされている（パーキンソン病研究グループのための深部脳刺激、２００１）。しかしながら、執行機能における様々な変化もまた生じ得ることがあり（ジャハンシャヒら、Ｂｒａｉｎ、１２３（Ｐｔ．６）：１１４２〜１１５４、２０００）、進行中のニューロン変性に直面しているこれらの患者に関する長期間の予後は未だ知られていない。
胎児組織に由来するドーパミンニューロンの移植もまたＰＤでは非常に有望であることが示されている。この場合、新しいドーパミンニューロンが患者の被殻に組み込まれ、ドーパミンの新しい供給源を提供し、これにより、場合により、臨床的改善がもたらされている（ダンネットおよびビョークルンド、Ｎａｔｕｒｅ、３９９：Ａ３２〜Ａ３９、１９９９）。移植により、実際には、疾患の経過時に失われたニューロンが入れ替わるが、しかし、新しいドーパミンニューロンは、被殻において異所的に置かれるので、臨床的回復のためには最適でないことがある。擬似手術を含んだ大規模な患者群に対する最近の研究では、若年者の患者は移植片に応答するが、効果は高齢者の患者ではあまり劇的でなく、場合により、ジスキネジアを含む様々な副作用が、Ｌ−ＤＯＰＡが存在しない場合でさえ存在したことが示されている（フリードら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４４：７１０〜７１９、２００１）。しかしながら、これらの副作用が、以前に行われた多くのプロトコルに対して非常に異なるプロトコルが使用されたこの研究においてなぜ認められたかに関して少し議論されている（イサクソンら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、４：５５３、２００１）。薬物、神経外科的方法および移植は、ＰＤ患者のために生活の質を改善するための本当の機会を表す一方で、他の様々な代替法がある。最も注目される期待は、ドーパミンニューロンの喪失を防止すること、または、既存の細胞に新しいプロセスを生じさせるようにすることであると考えられる。この方法では、症状でなく、疾患が治療される。神経栄養因子は、近い将来にこれを達成する方法を提供し得る可能性が非常にある。
原型的な神経栄養因子は神経増殖因子（ＮＧＦ）であり、これは、発達中の交感神経ニューロンおよび後根神経節ニューロンの生存および分化を調節することが示されていた（レビ−モンタルチニおよびアンゲレッティ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、７：６５３〜６５９、１９６３）。１９６３年におけるその発見以降、類似するが、それにもかかわらず、特異的な作用を有する非常に多数の新しい神経栄養因子が見出されている。２つの構造的および機能的に関連するファミリーが明らかにされている。これらは、（ｉ）ＮＧＦスーパーファミリー（これには、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＮＴ−６が含まれる）；および（ｉｉ）神経膠細胞系統由来神経栄養ファミリー（ＧＤＮＦ）（これには、ＧＤＮＦ、ペルセフィンおよびニュールツリンが含まれる）である。ＧＤＮＦファミリーは、ドーパミンニューロンに対する神経保護作用が明らかにされており、神経突起の生長をインビトロ（リンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：１１３０〜１１３２、１９９３）および損傷後のインビボ（ベックら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３３９〜３４１、１９９５；トマクら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３：３３５〜３３９、１９９５；ビョークルンドら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、４：１８６〜２００、１９９７）の両方で高める。本発明者らは、ＧＤＮＦもまた、ラットのＰＤモデルに移植された胚性ドーパミンニューロンからの神経繊維の生長を高めることができることを以前に示している（シンクレアら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、７：２５４７〜２５５２、１９９６）。無傷のドーパミン作動系の調節を介して、ＧＤＮＦはまた、乱用された薬物に対する順応において役割を有することがあり（メッセルら、Ｎｅｕｒｏｎ、２６：２４７〜２５７、２０００）、そして、その受容体として、多数の他の神経伝達物質系に影響を同様に及ぼし得ることが脳全体で見出されている（ゴールデンら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３９８：１３９〜１５０、１９９８）。これは、ＧＤＮＦはまた、他のニューロンを様々な異なるモデルにおいて細胞死から保護することができるためであると考えられる。
ＰＤに対するＧＤＮＦの関連性がさらに、ドーパミンニューロンを選択的に除くことによりヒトにおいてパーキンソン病様症状を生じさせる独特の毒素１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を伴う研究を通して明らかにされていた（ラングストン、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．、１００：４９〜５４、１９８４）。ＧＤＮＦは、脳の実質組織に直接的に注入されたとき、マウスおよびサルの両方のモデルにおいてＭＰＴＰの毒性から保護することが示されている（トマクら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３（６５１２）：３３５〜３３９、１９９５；ガッシュら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：２５２〜２５５、１９９６）。これらの勇気づけられる研究により、ＧＤＮＦがボーラス注射でＰＤ患者の脳室に直接的に注入される近年の臨床試験がもたらされた。しかしながら、その結果は非常に失望すべきものであり、ＰＤに対する評価スコアの低下をもたらさず、いくつかの副作用を伴い、また、ドーパミン繊維の回復の証拠が死後の線条体にはほとんど見られなかった（コルドワーら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４６：４１９〜４２４、１９９９）。このように効果がないことに対する理由は、ＧＤＮＦが脳内に浸透しないことによる可能性が非常に高いと考えられた。
何年も前に、ＮＧＦ（これは類似するサイズである）は、脳室内注射後の脳の実質組織への浸透が非常に悪いことが示されていた（ラプチャクら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、５４：４４５〜４６０、１９９３）。従って、ＧＤＮＦが実際に被殻などの深部構造部に到達する可能性は非常に低かった。
【０００３】
治療遺伝子のための送達媒介因子としてのウイルス
脳細胞を形質導入するための様々な操作された複製欠陥ウイルスの使用が確立されている。これらは、ＧＤＮＦを様々なプロモーターのもとで生じさせるために改変されている（ビョークルンドら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、８８６：８２〜９８、２０００に総説される）。ほぼどの研究でも、ＧＤＮＦは、ドーパミンニューロンを保護すること、および、神経繊維の生長を高めることの両方が見出されていた。本発明者らの共同研究者らは、安全かつ非毒性であり、導入遺伝子を長期間にわたって発現する自己不活性化型のｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦを開発してきた（デグロンら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１１：１７９〜１９０、２０００）。さらに、この同じウイルスは、ドーパミン作動性発現の年齢により誘導される減少を逆転させること、および、アカゲザルの線条体への直接的な注入の後におけるＭＰＴＰの毒性を防止することが示されていた（コルドワーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０：７６７〜７７３、２０００）。そのため、このウイルスは、ＰＤ患者の脳へのＧＤＮＦに対する送達システムとしての可能性が大きいことを表している。
【０００４】
エクスビボ遺伝子治療および誘導可能なウイルスベクター
代わりの方法はエクスビボ（ex vivo）遺伝子治療である。繊維芽細胞、星状膠細胞または他の細胞株が、目的の遺伝子の最初に形質導入され、その後、脳に移植される（総説については、ガゲ、Ｎａｔｕｒｅ、３９２（増刊）：１８〜２４、１９９８を参照のこと）。腫瘍形成性であり得る細胞、または免疫応答を誘導する可能性を有し得る細胞を、透過性膜からのタンパク質の拡散を可能にしながら、その逃避および検出を妨げるカプセルに入れることができる（ツェングおよびアエビシャー、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、１２７：１８９〜２０２、２０００）。そのようなカプセル化された細胞から放出されるＧＤＮＦは、老齢ラットにおいて、機能を回復させることができ、また、ドーパミンの代謝を増大させることができる（エメリッヒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、７３６：９９〜１１０、１９９６）。しかしながら、ヒト臨床試験の場合、可能ならば、永続的な留置デバイスから脱却することに対する利点が存在する。さらに、ＧＤＮＦのカプセル送達は依然として、より広い領域にわたる拡散送達ではなく、タンパク質送達の点状の供給源である。理想的には、細胞が脳に移植され、所望される標的領域内を遊走し、ＧＤＮＦを変性中の神経繊維または神経細胞の環境で放出する。この技術は、（ｉ）どの宿主ニューロンも遺伝子的に改変されないこと、（ｉｉ）細胞は生きているウイルスを保有しないこと、および（ｉｉｉ）ＧＤＮＦの正確な放出速度を移植前にインビトロで明らかにすることができる点で、上記で強調された様々な問題を克服する。しかしながら、ＧＤＮＦ放出を調節できることがこれらの研究では不可欠である。
移植後のＧＤＮＦ放出の制御は依然として重大な事項である。どの臨床的送達試験においても、望ましくない副作用が生じた場合、またはＧＤＮＦの最大作用が明らかにされた場合、目的とする遺伝子を停止させ、それにより遺伝子調節を可能にする方法が存在しなければならない。さらに、そのような方法では、経時的なＧＤＮＦ放出の調節、および脳に送達される正確な量の調節が、通常の薬物送達と同様な様式で可能になる。遺伝子の制御された調節を可能にする様々な誘導可能な遺伝子発現システムが今や開発されている（ブラウおよびロッシ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：７９７〜７９９、１９９９）。テトラサイクリン誘導可能なエレメントを含むウイルス構築物が最近では試験されている。目的とする遺伝子は、インビトロではドキシサイクリン（テトラサイクリンのアナログ）を培養培地に投与するか、またはインビボでは飲料水に投与した後、構築物の設計に依存してオンまたはオフが切り換えられる。これらのシステムは、インビトロで繊維芽細胞におけるニューロトロフィンおよびＧＦＰの産生を調節すること（ブレシュら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、５９：４０２〜４０９、２０００）、ＰＤの齧歯類モデルに移植された後においてインビトロおよびインビボでの細胞株からのＧＡＢＡの放出を調節すること（ベルストックら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、６０（３）：３０２〜３１０、２０００；ベールストックら、Ｓｃｏ．Ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００１）、および、ヒトＨＥＫ２９３細胞株におけるＧＦＰ産生を調節すること（カフリら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１：５１６〜５２１、２０００）が示されている。さらに、インビボでのＮＧＦの制御された放出は、傷害を受けたコリン作動性ニューロンの生存および生長を調節することが示されている（ブレシュら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８：９５４〜９６０、２００１）。
【０００５】
エクスビボ遺伝子治療のための神経幹細胞
中枢神経系（ＣＮＳ）の発達時には、成熟した脳のニューロン、星状膠細胞および稀突起神経膠細胞を生じさせる脳室壁を裏打ちする神経上皮細胞の広範囲にわたる増殖が存在する（ヤコブソン、「神経細胞の胎芽細胞、組織発生および系譜」、発生神経生物学（ヤコブソン編）、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ；Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）。これらの細胞は培養状態で単離することができ、また、単層物、または「ニューロスフェア」と呼ばれる自由浮動性凝集物のいずれかとして成長させることができる（ガゲ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：１４３３〜１４３９、２０００；マッケイ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：６６〜７１、１９９７；レイノルズおよびワイス、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１７５：１〜１３、１９９６；シェフラーら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３４８〜３５７、１９９９）。ニューロスフェアは、おそらくは、少数の「真」の幹細胞と、多くのより拘束された始原細胞とからなると考えられる（スベンドセンら、、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３５７〜３６４、１９９９；スベンドセンおよびカルドウエル、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、１２７：１３〜３４、２０００）。ニューロスフェアは長期間にわたって培養状態で成長させることができ、また、移植を生き残る能力を保持するので、ニューロスフェアは細胞治療のための理想的な組織供給源である（スベンドセンおよびスミス、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：３５７〜３６４、１９９９）。
ＮＧＦを過剰発現する遺伝子組換えマウスから得られたニューロスフェアは、移植後、生物学的に活性なＮＧＦを分泌する（カーペンターら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１４８：１８７〜２０４、１９９７）。ヒト神経前駆体細胞もまた、テトラサイクリン誘導可能なチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子を駆動させるアデノウイルスベクターで感染させられている。著者らはインビトロおよび移植後のインビボの両方での遺伝子の調節を報告していたが、その反応効果は一時的であった（コルチら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２３４９〜３５４、１９９９）。これは、ＴＨの非特異的な発現が多くの場合には機能的に関連しているためであると考えられる。
別の研究では、類似するヒト神経前駆体が、不死化因子を駆動させるテトラサイクリン誘導可能なシステムで感染されられている（サーら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：５７４〜５８０、１９９７）。ごく最近には、不死化細胞株が、ＧＤＮＦを放出させるために改変され、ＰＤのマウスモデルに関連する変化のいくつかを逆転させることが示された（アケルドら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２１：８１０８〜８１１８、２００１）。
【０００６】
ニューロスフェアの移植
これらのインビトロ研究と平行して、本発明者らは、移植された神経細胞の運命に関する３報の論文を発表している。最初の論文では、発達中の脳に由来するラット細胞およびヒト細胞の両方から得られた細胞の移植は、細胞を追跡するための良好なマーカーがこの段階では利用できないが、初代胎児組織を使用したときに見られる移植片と類似する大きい移植片を生じさせないことが示された（スベンドセンら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３７：３７６〜３８８、１９９６）。他のグループからのその後の研究では、ヒト細胞を移植した後、多くの遊走する細胞をとともに、類似する小さい散在性の移植片が示されていた（ベスコビら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１５６：７１〜８３、１９９９；フリッカーら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：５９９０〜６００５、１９９９）。本発明者らの次の移植片論文では、特定のヒトマーカーが使用され、大部分の細胞が、ＰＤの齧歯類モデルに移植された後、注入部位から遊走し、星状膠細胞に成熟したことが示された。しかしながら、少数の細胞が、少数の動物では、ドーパミンニューロンに分化し、回転欠落を逆転させた（スベンドセンら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１４８：１３５〜１４６、１９９７）。本発明者らの最も最近の論文では、本発明者らは、ヒトニューロスフェア培養物を移植するときの最適な細胞密度を明らかにしており、また、移植片からの広範囲にわたる軸索の生長を明らかにするために、ヒト特異的な神経フィラメントマーカーを使用している（オステンフェルドら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１６４：２１５〜２２６、２０００）。
【発明の概要】
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴う脳障害を治療する方法であって、（ａ）ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）で形質導入するステップであって、ＧＤＮＦ遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および（ｂ）形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップ、を含む方法である。
本発明の好ましい態様において、患者は、パーキンソン病患者、ＡＬＳ患者、脳卒中患者およびハンチントン病患者からなる群から選択される。本発明の別の好ましい態様において、誘導可能なプロモーターは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１／ｔＴＡ１システムの一部である。
本発明の別の目的、利点および特徴が下記に記載される。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、パーキンソン病（ＰＤ）に対する候補治療剤である。ＧＤＮＦは、ＰＤの様々なモデルにおいてドーパミンニューロンの喪失を防止することができ、また、勇気づける臨床結果および良好な安全性プロフィルを最近の小規模な臨床試験において示している。ＧＤＮＦは大きいために、血液脳関門を横断することができず、従って、新規な送達方法を開発する必要がある。さらに、ＧＤＮＦは一部の神経系に対する望ましくない作用を有し得るので、その送達では、脳の特定の領域を標的化する必要がある。
【０００９】
１つの実施態様において、本発明は、パーキンソン病などの、ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴う神経学的疾患を治療する方法であって、（ａ）ヒト神経幹細胞を神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）で形質導入するステップであって、ＧＤＮＦ遺伝子は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にあるステップ、および（ｂ）形質導入された細胞を患者の脳に移植するステップ、を含む方法である。ＧＤＮＦが発現させられ、ＧＤＮＦ応答性ニューロン系が上方制御（up-regulate）される。
本発明は、新規な継代培養法を使用して成長させられた遺伝子操作されたヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）を、脳の特定の領域へのＧＤＮＦの標的化された送達のためのビヒクルとして使用することに基づいている。ＧＤＮＦの放出は誘導可能なプロモーターシステムの制御下にある。細胞を大量に成長させることができ、放出されたＧＤＮＦは、パーキンソン病において死亡することが知られているドーパミンニューロンに対する生物学的作用を有する。
【００１０】
出願人は、本発明の様々な局面を下記で議論している。
神経幹細胞：本発明者らは、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）の成長、分化および移植のための技術を改良している。（スベンドセンら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８５（２）：１４１〜１５２、１９９８；スベンドセンら、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、９（３）：４９９〜５１３、１９９９；これらはともに参考として組み込まれる）。好ましくは、細胞はヒトＥＳ細胞に由来しない。その代わり、神経幹細胞は死後胎児脳組織の胎芽帯域に由来する。本発明者らは、組織を、ＮＩＨにより資金提供されるＢｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、米国）から集めた。これらの細胞の利点は、細胞が、神経組織のみを生じさせることに拘束され、奇形腫または他の組織タイプを生じさせないということであり、このことは、現在、より原始的なＥＳ細胞誘導体に関して大きな関心事である。流産組織を提供し得る病院または健康管理センターなどの数多くの異なる場所から細胞を得ることが可能である。
最近、本発明者らは、ｈＮＳＣを、ＥＧＦ／ＬＩＦの存在下で長期間にわたって、「ニューロスフェア」と呼ばれる凝集物として維持することができ、また、ｈＮＳＣは、新規な継代培養法を使用して３０回〜１００回の集団倍化の間、安定な成長期に達し得ることを示している。この方法では、酵素を使用するのではなく、スフェア体をより小さいセグメントに「切り刻み」、それにより細胞／細胞の接触および幹細胞「ニッチ」を維持することを伴う。これにより、複雑な補充物を培地に添加することなく、長期間の成長が可能になり、また、凍結および貯蔵することができる一致した表現型を有する細胞の産生が可能になる。本発明者らの方法では、これらの細胞は移植後に腫瘍を形成しない。これらの細胞は、短い距離または長い距離を遊走し、長期間にわたって生存し、また、星状膠細胞およびニューロンの両方を生じさせる。図１には、より詳細には下記で議論されるが、ニューロスフェアを生じさせるための好ましい方法が記載される。
【００１１】
種々の前分化方法を使用して、本発明者らは、ｈＮＳＣに由来する細胞の表現型をニューロンまたは神経膠細胞のいずれかに向かわせ、かつ、その遊走を制御することを可能にしている。本発明者らは、今回、（ｉ）外来因子の広範囲にわたる試験、（ｉｉ）完全な核型分析、および（ｉｉｉ）完全なマイクロアレイ遺伝子分析を受けているこれらの細胞のバンクを確立している。これらの細胞は公然と、クローンティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）から入手することができる。当業者は、以前に発表された論文（例えば、スベンドセンら、上記、１９９８）を使用してこれらの細胞を成長させることができる。
【００１２】
パーキンソン病（ＰＤ）および幹細胞。ＰＤに対する従来の幹細胞法は、ドーパミンニューロンを幹細胞から生じさせることに集中している。これは、３００名を超えるＰＤ患者に、今では、胎児組織に由来する初代ドーパミンニューロンが移植されているという事実に基づいている。しかしながら、初代ヒト胎児組織に由来するドーパミンニューロンを線条体に異所的に移植することは、ヒトにおけるＰＤの症状を緩和するために十分でない場合があることは今や明らかである。実際、これらの細胞は、抑制することが困難である「オフ」ジスキネジアを誘導する場合がある。推論的ではあるが、これらは、何らかの遠心性神経接合部によって制御されない移植片内のドーパミンニューロンの小さい「ホットスポット」を介する線条体におけるドーパミンの制御されない放出のためである可能性がある。ドーパミンニューロン移植片を純化し続けることは明らかに重要ではあるが、霊長類におけるさらなる研究が、現在では、臨床に戻す前に必要である。胎児脳組織に由来する神経幹細胞はドーパミンニューロンを容易に作製しないので、ヒトＥＳ細胞は、これらの研究のためのドーパミンニューロンの最も良い供給源であると考えられる。
神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）。ＧＤＮＦは、培養皿におけるドーパミンニューロンに対するその栄養作用によって発見された。それ以降、ＧＤＮＦは、ＰＤの様々なモデルにおいてドーパミンニューロンの変性を防止し、移植されたドーパミンニューロンを支援するために、非常に多数の研究で使用されている。本発明者らは、メドトロニクス（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓ）ポンプを使用して直接、高濃度のＧＤＮＦを５名のＰＤ患者の被殻に注入することを伴った英国での臨床試験を完了したところである。ギルら、２００３（下記）。オープン試験であったが、これらの患者における著しい臨床的改善、ジスキネジアの減少、および、脳におけるドーパミン貯蔵の著しい増大が認められている。２年目の時点で、すべての患者はこの高用量によく耐えており、引き続き改善している。この方法に関する問題は、ポンプを取り付けることが複雑であること、ＧＤＮＦを、毎月、再充填しなければならないこと、注入される脳領域が小さいこと、および、長期間の送達での感染の可能性があるということである。さらに、ＧＤＮＦの費用が長期間では非常に大きくなり得る。
【００１３】
ウイルスベクターを使用するＧＤＮＦ送達。ＧＤＮＦのポンプ送達に対する１つの代替法では、この増殖因子を放出させるための（インビボでの）宿主細胞のウイルス改変を伴う。直接的な遺伝子治療は注目される考えである一方で、重大な実施上の問題および安全性の問題が依然として存在し、そのような問題には、
・インビボ送達後の遺伝子投薬を正確に制御することができないこと
・最近の報告からは非常に重要であり得る正確な遺伝子挿入部位を制御することができないこと
・変性中の細胞に目的とする遺伝子を強制的に発現させることは、疾患が進行するに従い様々な問題を生じさせるかもしれないこと
・生きたＨＩＶまたは他のウイルスタイプを直接的に注入することに関する安全性の問題
が含まれる。
本発明の方法は、目的とする増殖因子を産生させるために細胞を培養皿（エクスビボ）において改変し、その後、これらの細胞を脳に移植することである。この方法に関して、
・細胞を移植前に遺伝子投薬（タンパク質放出）について選択することができる；
・正確な挿入部位を、クローン化された細胞から実証し、ガン遺伝子との干渉について調べることができる；
・健全なエクスビボ細胞がタンパク質送達をもたらし、宿主細胞を変性させない；
・ウイルス感染がインビトロで行われ、その後、ウイルスの非存在下での大規模な拡大培養が行われるので、生きたウイルスが宿主に移行する危険性が全くない。
エクスビボ遺伝子治療に関する１つの問題は、これまでは、使用されたエクスビボ細胞のタイプであった。自家の繊維芽細胞が理想的であるようであるが、様々な問題が存在する。細胞を、遺伝子発現、外来性因子および純度について試験するために、大規模で、費用のかかる培養作業を必要とするそれぞれの患者から個々に製造しなければならない。移植されたとき、繊維芽細胞は「瘢痕」様構造を形成して、構造部を満たすために遊走しないか、または宿主ＣＮＳにも組み込まれない。星状膠細胞は別の細胞供給源であり得る。しかしながら、拡大培養後、ヒト星状膠細胞は、移植後、その柔軟性の多くを失い、そしてまた、良好な組み込みパターンおよび遊走パターンを伴わない神経膠細胞瘢痕構造を形成することが知られている。
【００１４】
本発明者らは、下記の理由から、ヒト神経幹細胞がエクスビボ遺子治療のための理想的なビヒクルであり得ることを本発明で提案している。
・非常に多数の神経幹細胞を成長させることができる；
・神経幹細胞は、遊走および組み込みが可能である未成熟な星状膠細胞を生じさせる；
・神経幹細胞が培養で分裂するので、神経幹細胞にウイルスを容易に感染させることができる；
・これらの細胞を脳に移植することに成功した多数の文献が存在する。
ヒト神経幹細胞を遺伝子治療法を組み合わせることにより、基礎科学を臨床に移す実際の機会がもたらされる。この場合、細胞が、様々な治療用タンパク質に対するミニポンプとして使用される。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法は、ＧＤＮＦ遺伝子がウイルスシステムにおける誘導可能なプロモーターの制御下にあるベクターを作製することによって行われる。好ましくは、本発明者らが下記に開示するウイルス構築物が使用される。本発明者らの誘導可能な構築物は、以前に詳しく発表されたレンチウイルスシステムに基づいている（デグロンら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、１１：１７９〜１９０、２０００；これは参考として組み込まれる）。「マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１／ｔＴＡ１システム」が参照されるとき、デグロンらおよび下記に記載されるプロモーターシステムが参照されている。当然のことではあるが、代わりの誘導可能なプロモーター（例えば、下記に記載されるプロモーターなど）を導入することによって、このシステムを改変することができる。
その後、ヒト神経幹細胞が、好ましくは下記の方法および材料に記載されるように、ＧＤＮＦベクターで形質導入される。
【００１６】
臨床への移行。ｈＮＳＣに関する我々の知識の基礎は今や、臨床的応用を記載することができるところに達している。本発明の主要な特徴は、治療用タンパク質に対する置換ビヒクルおよび「ミニポンプ」の両方として作用することができる細胞を生じさせるために、遺伝子治療を幹細胞治療と組み合わせることである。このことは、様々な神経学的障害を治療することに対する新しい非常に強力な方法を表している。細胞が、上記に記載されたように作製され、ＰＤ患者の被殻に移植される。
ＰＤ患者は、典型的には、ドーパミンニューロンを経時的に中脳から局所解剖学的様式で失っている。最初に死亡する細胞は、ＰＥＴ走査法によって明らかにされるように被殻の尾側領域を神経支配する細胞である（ギルら、下記、２００３）。本発明者らは、患者における被殻の尾側半分を、この領域に一様に分散されたおよそ４カ所の部位を使用して標的化することを考えている。ヒト試験のための定位固定法、ＰＥＴ技術および他の方法が、ギルら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２００３年３月３１日、２００３、１２６６９０３３に詳しく記載されている。
誘導可能なプロモーターシステムが本発明において使用され得る方法が２つある。第１の方法は「オン」形式においてであり、この場合、患者へのドキシサイクリンの投与（これは血液脳関門を浸透する）により、ＧＤＮＦ遺伝子構築物が活性化され、移植された幹細胞からのＧＤＮＦ放出が誘導される。ＧＤＮＦが最初の患者集団において安全であることが見出された場合、患者へのドキシサイクリンの投与により、ＧＤＮＦ発現が停止される第２の類似する「オフ」システムが設計される。本発明者らは、ＧＤＮＦの長期間の発現が毒性でなく、従って、ＧＤＮＦの長期間の発現は、ＧＤＮＦ発現を維持するために、患者が継続してドキシサイクリンを服用することを要求しない「オフ」システムに有利であることを本発明者らの最初の臨床試験から予測している。
この場合、細胞が主の脳に組み込まれ、ＧＤＮＦを放出する。ＧＤＮＦは、周りのドーパミン繊維によって取り込まれ、脳幹の細胞体に輸送される。動物研究に基づいて、これにより、３つのことが行われるはずである：（ｉ）ドーパミンニューロンの継続中の死が防止される；（ｉｉ）局所的な神経繊維の生長が誘導される；そして（ｉｉｉ）ドーパミン産生が上方制御される。まとめると、このことは、パーキンソン病の実際の「治療」を表し、さらに、ドーパミンニューロンのさらなる変性を防止する。
本発明者らは、幹細胞移植により、（１）増殖因子の構成的な放出および考えられる毒素（例えば、グルタミン酸など）の構成的な取り込みによる、ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴うＰＤおよび他の疾患における非正常なニューロンおよび死に向かっているニューロンに対する栄養的および構造的な支援、そして（２）誘導可能な構築物によるＧＤＮＦの放出、がもたらされると考えられる。ＰＤにおける細胞結果は３つに分けることができる：（１）終端からのドーパミン放出の直接的な調節によるドーパミン作動系の上方制御；（２）黒質における残存ドーパミンニューロンからのその場所でのドーパミン繊維の局所的な出芽；（３）黒質における細胞体へのＧＤＮＦの逆輸送による残存ドーパミンニューロンの長期間の保護。本発明者らは、他の疾患系（ＡＬＳ、脳卒中、ＨＤ）において同様な応答を予想している。
【００１７】
他の神経学的疾患：ＰＤは幹細胞遺伝子治療のための明らかな直接の目標であるが、本発明のこの方法は、ＧＤＮＦに応答する細胞の喪失を伴う数多くの他の脳障害に適用することができる。これらのなかで、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）および脳卒中が、最も可能性のある目標である。ＧＤＮＦ転写物を他の増殖因子転写物（例えば、ＧＤＮＦに対して、異なる作用ではあるが、相補的な作用を有し得る毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）など）で置き換えることは困難ではない。従って、ｈＮＳＣの二重感染は、より複雑な障害を治療するために増殖因子のカクテルをもたらす。ハンチントン病（ＨＤ）、脳卒中および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において死亡するニューロンはすべて、ＧＤＮＦ治療に応答することが示されている。しかしながら、ＧＤＮＦを他の増殖因子と組み合わせることは、ある種の障害についてはより良好であり得ることもまた考えられる。例えば、ＣＮＴＦは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において死亡する運動ニューロンに対する強力な作用を有することが示されており、従って、ＧＤＮＦと組み合わせることは非常に有益であり得る。
【実施例】
【００１８】
材料および方法
ウイルス構築物。１つの一般的な誘導可能なシステムでは、テトラサイクリンのトランス活性化因子（ｔＴＡ）を駆動させる構成的プロモーターを伴う。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の非存在下では、ｔＴＡは、標的遺伝子をその後で駆動させる最少プロモーターの上流に位置する誘導可能なプロモーター（ｔｅｔＯ）に結合する（ゴッセンおよびブジャルド、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１、１９９２）。ＤＯＸはｔＴＡと結合し、従って、遺伝子の転写を妨げる。別のシステムは、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子の活性化を可能にする逆のｔｅｔ調節型システムである。この場合、ｒｔＴＡと呼ばれるｔＴＡの変異型形態が発現される。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンが存在するときにｔｅｔＯおよび遺伝子発現を活性化するだけである（ゴッセンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９、１９９５）。誘導可能な遺伝子発現のためのより近年の方法では、ｔＴＡ−ＫＲＡＢ抑制システムが利用される（フロインドリーブら、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、１：４〜１２、１９９９）。このｔｅｔ−ｏｎシステムでは、ｒｔＴＡが活性なリプレッサーＫＲＡＢに結合する。テトラサイクリン誘導可能なシステムのほかに、グルココルチコイドを伴う他の誘導可能なシステムを遺伝子調節のために使用することができる。例えば、昆虫ステロイドホルモンのエクジソン、および、活性化ドメインに融合されたエクジソン受容体により、哺乳動物細胞および遺伝子組換えマウスにおける誘導可能な遺伝子発現システムがもたらされている（ノら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１、１９９６）。また、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、および活性化ドメインに融合されたヒトプロゲステロン受容体の変異体が、誘導可能な遺伝子発現のために使用されている（ワンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：８１８０６〜８１８８４、１９９４）。
好ましくは、本発明者らの誘導可能なレンチウイルス構築物は、以前に詳しく記載された既に発表されている非誘導型システム（デグロンら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．、１１：１７９〜１９０、２０００；これは参考として組み込まれる）に基づいており、図２に概略的に示される。このシステムでは、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター（強い構成的プロモーター）により、ｌｅｎｔｉ−ｔＴＡ構築物におけるｔＴＡ１が駆動される。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の翻訳後シス作用調節エレメントが含まれ、これは、導入遺伝子の発現を著しく高めることが示されている（デグロンら、上記、２０００）。ドキシサイクリンの非存在下では、ｔＴＡ１が、目的とする遺伝子（この場合、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ構築物におけるＧＤＮＦ、またはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物におけるＧＦＰ）を駆動させる最少プロモーターの上流に存在するｔｅｔＯに結合する。ＤＯＸの存在下では、ｔＴＡが結合し、導入遺伝子を活性化させない。
当業者は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｌ１９０６３および同Ｌ１５３０６またはリンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０（５１１１）：１１３０〜１１３２、１９９３）（これらはともに参考として本明細書中に組み込まれる）を参照してＧＤＮＦ遺伝子配列を容易に作製することができる。
【００１９】
細胞成長およびレンチウイルス感染。ヒト神経始原体細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｎ２（１％）およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）が補充されたＤＭＥＭ／ハムＦ１２においてニューロスフェアとして維持される。ニューロスフェアは、図１に概略されるように、また、以前の記載（スベンドセンら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｍｅｔｈ．、８５：１４１〜１５３、１９９８）のように１０日毎に切り刻まれる。レンチウイルス粒子が、１％ウシ胎児血清アルブミンを含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水に懸濁された。レンチウイルス感染は、スフェア体あたり２５ｎｇのｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰまたはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦおよび７５ｎｇのｌｅｎｔｉ−ｔＴＡを用いて６時間であった。
免疫細胞化学。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰまたはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦを感染させたニューロスフェアを、ＡＣＣＵＴＡＳＥを使用して解離させ、ポリ−Ｌ−リシン（０．０１％）およびラミニン（０．００１％）で被覆されたガラス製カバーガラスに載せた。細胞を、Ｂ２７分化培地において７日間、カバーガラスあたり３０，０００個で置いた。４％パラホルムアルデヒドによる２０分間の固定、およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水による洗浄の後、細胞を、ｆｉｔｃコンジュゲート化二次抗体（ヘキスト）を用いて、ネスチン（ウサギ、ケミコン、１：２００）、β−チュブリン（マウス、シグマ、１：６０００）、ＧＦＡＰ（ウサギ、ダコ、１：３０００）またはＧＤＮＦ（ヤギ、Ｒ＆Ｄシステムズ、１：２０００）について染色した。
【００２０】
ＧＦＰ調節。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ感染の後、代表的なニューロスフェアにおけるＧＦＰ発現が蛍光写真によって明らかにされ、位相差写真が同時に撮影された。このスフェア体は、その後、ドキシサイクリン（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地において４８時間培養され、再び蛍光および位相差の両方のもとで写真撮影された。ドキシサイクリンが培地から４８時間にわたって除かれた。このウォッシュアウトの後、写真が再び蛍光および位相差の両方のもとで撮影された。
ＧＤＮＦの定量および調節。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染の後、ＧＤＮＦのレベルおよび調節が評価された。ニューロスフェア（ｎ＝３）を、ＡＣＣＵＴＡＳＥを用いて個々に解離し、２つのウエルに二等分した。一方のウエルはＢ２７分化培地で維持され、もう一方のウエルは、ドキシサイクリン（１０００ｎｇ／ｍｌ）を含むＢ２７分化培地で維持された。６つのウエル（３つのニューロスフェアがＤＯＸ非含有培地およびＤＯＸ含有培地に分けられた）から、１ｍｌの上清が１０日間にわたって２日毎に集められた。ＤＯＸ含有置床培地またはＤＯＸ非含有置床培地が４８時間毎に補充され、１ｍｌのサンプルはその後の分析のために−２０℃で保存された。ＧＤＮＦは、サンプリングされた培地およびｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ感染ニューロスフェアの培地において、製造者の説明書に従ってＧＤＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（プロメガ）を使用して測定された。それぞれの採取日について、本発明者らは、ＤＯＸ非添加群におけるＧＤＮＦレベルの百分率として、ＤＯＸ添加群におけるＧＤＮＦレベルを報告する。解離および置床の後２日目での採取について、本発明者らは、ＤＯＸ添加およびＤＯＸ非添加に分けられたそれぞれの個々のスフェア体に対するＧＤＮＦレベルを報告する。
【００２１】
ＧＤＮＦの機能的作用。初代腹側中脳をＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットのＥ１４胚から切除し、ポリリシンおよびラミニンで被覆されたカバーガラスに載せた。細胞を、基本Ｎ２（１％）培地（ｎ＝３）、野生型ニューロスフェアから得られた上清（ｎ＝３）、または、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアから得られた上清（ｎ＝３）のいずれかにおいて７日間培養した。４％パラホルムアルデヒドによる２０分間の固定、およびリン酸塩緩衝化生理的食塩水による洗浄の後、細胞培養物を、ｆｉｔｃコンジュゲート化二次抗体（ヘキスト）を用いて、チロシンヒドロキシラーゼ（マウス、ケミコン、１：２００）について染色した。細胞を蛍光顕微鏡で調べ、群あたり３つのカバーガラスのそれぞれからの４つの視野を分析した。蛍光デジタル画像を、ＳＰＯＴカメラ画像分析システムを使用するデジタルビデオカメラを用いて得た。ＴＨ陽性細胞の数を、１２個の無作為に選択された視野においてＴＨについて免疫反応性の細胞を計数することによって定量した。神経突起の長さおよび細胞体のサイズを、１２個の無作為に選択された視野においてＴＨ陽性細胞について、μｍおよび半径をそれぞれ測定するためにメタモルフ（ｍｅｔａｍｏｒｐｈ）を使用することによって定量した。
【００２２】
結果
レンチウイルス感染。ニューロスフェア内の細胞はレンチウイルス構築物によって効率よく感染させられた。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物は、始原体細胞、ニューロンおよび星状膠細胞を含む、ニューロスフェア内のすべての細胞タイプに感染することができた（図３Ａ〜図３Ｃ）。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ構築物もまた、ニューロスフェア内の細胞に感染することができた（図３Ｄ）。両方のレンチウイルス構築物の場合、感染は細胞の健康状態に影響しなかった。このことは、非感染細胞と比較したとき、感染細胞の正常な細胞形態学によって示された。ニューロスフェア内の細胞は、ＧＦＰおよびＧＤＮＦを感染後少なくとも数ヶ月間にわたって発現し続けた。
【００２３】
ＧＦＰの調節。ＧＦＰは、ＧＤＮＦとは異なり、生細胞で見ることができるタンパク質である。従って、本発明者らは、最初に、ヒト細胞のレンチウイルス感染および遺伝子発現の調節の本発明者らの方法を最適化するためにｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物を使用した。ニューロスフェアにｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物およびｌｅｎｔｉ−ｔＴＡ構築物を同時感染させると、大きい割合のＧＦＰ発現細胞をもたらした（図４Ｄ）。ＧＦＰ発現ニューロスフェアをドキシサイクリンの存在下で４８時間成長させたとき、ＧＦＰはほぼ完全に停止させられた（図４Ｅ）。ＧＦＰのこの厳格な調節をさらに特徴づけるために、ドキシサイクリンを４８時間除いた。この簡単なウォッシュアウトの後、ＧＦＰの活発な発現が再開された（図４Ｆ）。正常な細胞形態学をレンチウイルス感染の後に相補することにより、ＧＦＰ発現ニューロスフェアの位相差写真は、感染が細胞の健康状態に影響しなかったことを示しており、このことは、長期にわたるニューロスフェアの継続した正常な成長、および、典型的な健全な外見によって明らかにされる（図４Ａ〜図４Ｃ）。
【００２４】
ＧＤＮＦの定量および調節。可視的なＧＦＰレポーターを使用してヒト神経細胞のレンチウイルス感染および調節が最適化されたので、本発明者らは、次に、ニューロスフェアにｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ構築物およびｌｅｎｔｉ−ｔＴＡ構築物を同時感染させた。本発明者らは、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦを有するニューロスフェアが、１つのニューロスフェアについては２４時間後に６ｎｇ〜２３ｎｇの範囲にある高い濃度で、ＧＤＮＦを培地に放出することを見出した（図５Ａ）。ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰを感染させたニューロスフェアは、高感度な検出方法を用いた場合でさえ、測定のために十分な高いレベルでＧＤＮＦを放出しなかった（図５Ａ）。個々のニューロスフェアから放出されたＧＤＮＦレベルの範囲は、最大の遺伝子発現を有する個々のニューロスフェアを選択および拡大培養することができる可能性を示唆している。興味深いことに、ＧＤＮＦ調節の程度は、ＧＤＮＦレベルが異なるにもかかわらず、ニューロスフェア間で類似していた。２日間のＤＯＸ処理の後、ＧＤＮＦレベルの減少範囲は、ＤＯＸを伴わない細胞と比較した場合、５６％〜６８％であり、減少の平均値は６４％であった。ＧＤＮＦレベルは２日間のドキシサイクリン処理の後に低下し、ＧＤＮＦタンパク質の長い半減期のために時間依存的な様式で低下し続けた。１０日間のＤＯＸ処理によって、ＤＯＸを伴わない細胞と比較して、ＧＤＮＦレベルのほぼ９０％の減少が認められた（図５Ｂ）。
【００２５】
ＧＤＮＦは機能的作用を有する。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦを感染させたニューロスフェアは高レベルのＧＤＮＦを放出することが示されたので、本発明者らは次に、ドーパミンニューロンに対するこれらのニューロスフェアの機能的作用を明らかにした。初代ドーパミンニューロンを、基本培地、野生型ヒトニューロスフェアから得られた上清、または、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアから得られた上清のいずれかにおいて培養した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）が、ドーパミン作動性ニューロンに対するマーカーとして使用される。ＴＨ陽性細胞の数は、培養物が、野生型ヒトニューロスフェアから得られた上清またはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアから得られた上清において成長させられたとき、基本培地において成長させられた培養物と比較して、著しく増大していた（ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。このことは、ＧＤＮＦによってさらに増大させられない細胞数に対する馴化培地の全体的な作用を示唆している。しかしながら、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアは、培養されたドーパミンニューロンの神経突起の長さに著しく影響を及ぼしている（図６Ｂ）。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ上清において成長させられたドーパミンニューロン培養物は、基礎培地および野生型上清の両方と比較して、神経突起の生長を著しく増大させていた（ｐ＜０．０００１）。このことはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアの機能的な作用を明らかにしている。野生型上清において成長させられた培養物の神経突起の長さは、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ上清において成長させられた培養物の神経突起の長さよりもはるかに小さく、しかしながら、長さは、基本培地における培養物と比較して増大している（ｐ＜０．０００１）。再度ではあるが、このことは馴化培地の作用のいくつかを明らかにしている。さらに、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアは、培養されたドーパミンニューロンの細胞体サイズに著しい影響を及ぼしている（図６Ｃ）。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ上清において成長させられたドーパミンニューロン培養物は、基礎培地および野生型上清の両方と比較した場合、著しく増大した細胞体サイズを有していた（ｐ＜０．０００１）。再度ではあるが、このことは、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアの機能的な作用を明らかにしている。野生型上清において成長させられたニューロンの細胞体サイズは、基本培地における培養物と比較して増大しておらず、このことは馴化培地の作用を示唆していない。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアの機能的な作用は、野生型ニューロスフェアと比較した場合、図６Ｄおよび図６Ｅにおけるドーパミンニューロンの増大した神経突起長さおよび細胞体サイズによって明瞭に明らかにされる。ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェアから放出されたＧＤＮＦが培養ドーパミンニューロンに対して強力な作用を有するという事実は、これらの細胞がインビトロで生理学的関連レベルでＧＤＮＦを放出していることを明らかにしている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ニューロスフェアの好ましい調製の略図である。
【図２】図２は、ＧＤＮＦまたはレポーター遺伝子の調節可能な発現を提供するレンチウイルス構築物の略図である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは本発明の好ましいウイルス構築物により感染させられたヒト神経細胞の顕微鏡写真である。図３Ａ〜図３Ｃは、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物を感染させた始原体細胞、ニューロンおよび星状膠細胞をそれぞれ表す。図３Ｄは、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ構築物を感染させた細胞を例示する。
【図４】図４は、ＧＦＰの調節を例示する１組の写真である。図４Ａ〜図４Ｃは、ニューロスフェアの経時的な継続した正常な成長を明らかにする。図４Ｄは、大きな割合のＧＦＰ発現細胞をもたらす、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ構築物によるニューロスフェアの感染を表す。図４Ｅは、ＧＦＰ発現ニューロスフェアがドキシサイクリンの存在下で４８時間成長させられたとき、ＧＦＰがほぼ完全に停止させられたことを明らかにする。ドキシサイクリンが、その後、４８時間にわたって除かれると、図４Ｆにより例示されるように、ＧＦＰの活発な発現が再開される。
【図５】図５Ａ及びＢはｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦを感染させたヒトニューロスフェアからのＧＤＮＦが時間依存的様式で調節されることを例示する１組の棒グラフである。図５ＡはＧＤＮＦレベルを表す。図５Ｂは、ドキシサイクリンの存在下でのＧＤＮＦレベルを表す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、基礎培地、野生型上清およびｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ上清におけるＴＨ陽性細胞の数、ＴＨ陽性の神経突起の長さ、およびＴＨ陽性の細胞体の面積をそれぞれ明らかにする。図６Ｄおよび図６Ｅは、野生型ニューロスフェア（図６Ｄ）と比較して、ｉｎｄｌｅｎｔｉ−ＧＤＮＦ感染ニューロスフェア（図６Ｅ）の機能的作用を明らかにする。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【国際調査報告】
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