(57)【要約】精製大豆ホスファチジルセリンを用いて渦巻状物を作製する。渦巻状物は、少なくとも約75％の大豆ホスファチジルセリンおよび任意で生物活性充填物を含む。好ましい渦巻状物は、抗真菌剤であるアンフォテリシンBを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む脂質に基づく渦巻状物：
a．大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約75重量％含む精製された大豆に基づくリン脂質、および
b．多価陽イオン。
【請求項２】
空の渦巻状物である、請求項1記載の渦巻状物。
【請求項３】
リン脂質が大豆ホスファチジルセリンとホスファチジン酸の混合物である、請求項2記載の空の渦巻状物。
【請求項４】
以下を含む脂質に基づく充填された渦巻状物：
a．大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約75重量％含む精製された大豆に基づくリン脂質、
b．多価陽イオン、および
c．生物活性充填物。
【請求項５】
生物活性充填物が、タンパク質、小さいペプチド、ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助剤、生薬製品、ビタミン、および血管拡張剤からなる群より選択される少なくとも一つのメンバーである、請求項4記載の渦巻状物。
【請求項６】
生物活性充填物が、アンフォテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、ビタミンA、カバマゼピン、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン、テストステロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタミン、カンナビノイド、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン、エキノミシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド、タキサン、パクリタキセル、およびタキソテールからなる群より選択される少なくとも一つのメンバーである、請求項5記載の渦巻状物。
【請求項７】
生物活性充填物が、アンフォテリシンBであって、かつ多価陽イオンがCa++である、請求項6記載の渦巻状物。
【請求項８】
生物活性充填物がポリペプチドまたは抗原からなる群より選択される、請求項4記載の渦巻状物。
【請求項９】
多価陽イオンが亜鉛またはカルシウムである、請求項1記載の渦巻状物。
【請求項１０】
精製された大豆に基づくリン脂質が大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約80重量％含む、請求項1記載の渦巻状物。
【請求項１１】
精製された大豆に基づくリン脂質が大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約90重量％含む、請求項10記載の渦巻状物。
【請求項１２】
以下を含む、脂質に基づく渦巻状物：
a．モルで少なくとも約80％の大豆ホスファチジルセリン、
b．モルで約20％までの、ホスファチジルセリン以外の一つまたは複数の脂質の混合物、および
c．多価陽イオン。
【請求項１３】
ホスファチジルセリン以外の脂質の一つまたはそれ以上が負に荷電している脂質である、請求項12記載の渦巻状物。
【請求項１４】
負に荷電している脂質がホスファチジン酸である、請求項13記載の渦巻状物。
【請求項１５】
ホスファチジルセリン以外の脂質の一つまたはそれ以上がもう一つのリン脂質である、請求項12記載の渦巻状物。
【請求項１６】
ホスファチジルセリン以外の脂質の一つまたはそれ以上が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびホスファチジルエタノールアミンからなる群より選択される、請求項12記載の渦巻状物。
【請求項１７】
脂質および多価陽イオンを含む渦巻状組成物において、脂質の少なくとも約75重量％に大豆ホスファチジルセリンを用いることを含む改良。
【請求項１８】
脂質の重量の少なくとも約80％が大豆ホスファチジルセリンである、請求項17記載の改良された渦巻状物。
【請求項１９】
脂質の重量の少なくとも約90％が大豆ホスファチジルセリンである、請求項17記載の改良された渦巻状物。
【請求項２０】
多価陽イオンが、亜鉛、マグネシウム、またはカルシウムである、請求項17記載の改良された渦巻状物。
【請求項２１】
以下の段階を含む、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を作製する方法：
a．pH約10〜約12の水性培地において、小さい単層のリポソームを調製する段階であって、リポソームが（i）脂質二重層の少なくとも約75重量％の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層、および（ii）ポリエン薬剤の充填を有する段階；
b．リポソームを第一の水溶性ポリマーと混合して懸濁液を形成する段階；
c．第一および第二のポリマーが不混和性であり、それによって二相ポリマーシステムが形成される、第二の水溶性ポリマーを含む懸濁液にリポソーム／ポリマー懸濁液を加える段階；
d．多価陽イオンを二相ポリマーシステムに加えて、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を形成する段階；ならびに
e．大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を回収する段階。
【請求項２２】
リポソーム二重層が少なくとも約80％の大豆ホスファチジルセリンを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
段階（c）の第二のポリマーに加える段階が、注入によって行われる、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
第一のポリマーがデキストランおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも一つのメンバーである、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
第一のポリマーの濃度が2〜20％ w/wの範囲である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
第二のポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、フィコール、ポリビニルメチルエーテル、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される少なくとも一つのメンバーである、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
第二のポリマーの濃度が2〜20％ w/wの範囲である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
二相ポリマーシステムがデキストラン／ポリエチレングリコール、デキストラン／ポリビニルピロリドン、デキストラン／ポリビニルアルコール、デキストラン／フィコール、およびポリエチレングリコール／ポリビニルメチルエーテルからなる群より選択される少なくとも一つのメンバーである、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
多価陽イオンがCa2+、Mg++、またはZn2+である、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
Ca2+、Mg++、またはZn2+がCaCl2、MgCl2、またはZnCl2によって提供される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
大豆ホスファチジルセリン渦巻状物が、約1ミクロン未満の粒子径を有する、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
ポリエン薬剤がアンフォテリシンBである、請求項21〜31のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
大豆ホスファチジルセリンが渦巻状物の脂質成分の重量の少なくとも約75％である、リン脂質として精製大豆ホスファチジルセリンを用いることを含む、リン脂質に基づく渦巻状物を作製する方法。
【請求項３４】
大豆ホスファチジルセリンが渦巻状物の脂質成分の重量の少なくとも約80％である、請求項33記載の改良された方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を作製する方法：
a．pH約10〜約12の水性培地において、小さい単層のリポソームを調製する段階であって、リポソームが（i）脂質二重層の少なくとも約75％重量の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層、および（ii）ポリエン薬剤の充填を有する段階；
b．多価陽イオンを（a）のリポソームに加えて、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を形成する段階；
c．培地のpHをほぼ中性に調節する段階；ならびに
d．大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を回収する段階。
【請求項３６】
ポリエンがアンフォテリシンBである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
（i）大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約75％重量含むリン脂質、（ii）多価陽イオン、および（iii）ポリエン抗真菌剤を含む、脂質に基づく渦巻状物の有効な抗真菌剤量を患者に投与することを含む、真菌感染症を有する患者を治療する方法。
【請求項３８】
モルで少なくとも約90％のリン脂質が大豆ホスファチジルセリンである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
抗真菌剤がアンフォテリシンBである、請求項37または38記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が参照として本明細書に特に組み入れられる、2002年3月26日に提出された米国特許出願第10/105,314号および2002年11月26日に提出された米国特許出願第10/304,567号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非精製大豆PS（NPSPS）と比較して、精製大豆ホスファチジルセリン（PS）（PSPS）が渦巻状物（cochleate）を作製できること、PSPSから薬物-渦巻状物を調製する方法、および薬剤治療としてこの薬剤を充填した渦巻状物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
渦巻状輸送媒体は、広範囲の生物活性治療物質を輸送するために広く用いられている技術である。渦巻状輸送媒体は、単純な天然に存在する材料、例えばホスファチジルセリンおよびカルシウムから構成される安定なリン脂質-陽イオン沈殿物である。
【０００４】
渦巻状物の二重層構造は、会合した、または「渦巻を形成した」分子に分解からの保護を提供する。完全な渦巻状構造は一連の固体層であるため、渦巻状物の外層が苛酷な環境条件または酵素に曝露されても、渦巻状構造の内部に含まれる成分は実質的に無傷のままである。これには胃のおける消化からの保護が含まれる。
【０００５】
これらの独自の特性を利用して、渦巻状物は、重要だが処方することが難しい広い範囲の生物薬剤の経口生物学的利用率を媒介および促進するために用いられてきた。この薬剤には水溶解性の乏しい化合物、タンパク質、およびペプチド薬剤、ならびに大きな疎水性分子が含まれる。例えば、アンフォテリシンB、DNAワクチンおよび遺伝子治療のための大きいDNA構築物／プラスミド、ペプチド製剤、ならびにクロファジミンのような抗生物質の渦巻状物による経口輸送が実現している。
【０００６】
渦巻状物は、陽イオン含有緩衝液中に保存、または凍結乾燥して粉末化し、室温で保存して、投与前に液体によって再構成することができる。凍結乾燥は、渦巻状物の形態または機能に有害な影響を及ぼさない。渦巻状調製物は、陽イオン含有緩衝液において4℃で2年を超えて安定であること、および室温で凍結乾燥粉末として少なくとも1年安定であることが示されている。
【０００７】
渦巻状物は、トラッピングまたはハイドロゲル法のようないくつかの方法によって調製することができる。トラッピング法では、調製される材料を、主に負に荷電している脂質を含むリポソーム懸濁液に加える。カルシウム（他の多価陽イオンを用いることもできる）のような多価金属イオンを加えると、リポソームの崩壊および融合を誘発して脂質二重層から構成される大きいシートとなり、これは自然に渦巻状に巻きあがる。望ましければ、渦巻状物は、非渦巻状物を除去するために精製した後、多価金属イオンを含む緩衝液に再懸濁させることができる。
【０００８】
ハイドロゲル法、米国特許第6,153,217号により、経口投与を可能にする1ミクロン未満の粒子サイズを有するナノ渦巻状物を調製することができる。米国特許第6,153,217号に開示される工程は、小さい単層リポソームを第一のポリマーに加えた後に第一のポリマーと不混和性である第二のポリマーに注入して、水溶性二相ポリマーシステムを作製するために、水溶性二相ポリマーシステムを必要とする。ナノ渦巻状物は、多価陽イオンを二相システムに加えると形成される。ナノ渦巻状物は、薬物の経口輸送のために有用である。しかし、その特許には、渦巻状物の調製において精製大豆PSを用いることは開示されなかった。
【０００９】
大豆PSは、栄養補助剤として健康食品店で販売されている。非精製（40％）PSは、栄養補助剤として、および高齢者における脳機能の増強に有用な効果を有する成分として用いられ、かつ研究されている（Villardita C.ら、Clin. Trials J. 24、1987、84〜93）。
【００１０】
非精製大豆PS（NSPS）は、市販されかつ患者において研究されているが、NSPSは、渦巻状物を作製し、作製した渦巻状物を用いて薬剤を輸送するために研究および使用されたことはない。
【００１１】
意外にも、NPSPは渦巻状物を形成せず、渦巻状物の形成を可能とする割合である少なくとも約75重量％のPSに達するまで、PSの含有量においてNPSPを増強するために精製工程が必要であることが判明した。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
簡単に説明すると、本発明に従って、改良された脂質に基づく渦巻状物は、脂質源として精製大豆ホスファチジルセリンを用いることによって作製される。改良された渦巻状物は、大豆ホスファチジルセリンを少なくとも約75重量％の脂質量で含む。改良された渦巻状物は、空の、または充填された渦巻状物となりうる。充填された渦巻状物は、例えば、タンパク質、小さいペプチド、生物活性ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗生物質、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、トランキライザー、栄養補助剤、生薬製品、ビタミン、または血管拡張剤のような任意の生物活性材料または生物活性材料の組み合わせを含みうる。ポリエン抗真菌剤を本発明の大豆ホスファチジルセリンを材料とする渦巻状物に充填して、毒性がが低く費用効果の大きい改良された抗真菌剤を提供することは、本発明の実践において特に重要である。好ましいポリエン抗真菌剤には、アンフォテリシンBおよびナイスタチンが含まれる。
【００１３】
本発明の改良された脂質を材料とする渦巻状物は、大豆ホスファチジルセリンが渦巻状物の脂質成分の少なくとも約75重量％の量で用いられる任意の手段によっても作製することができる。
【００１４】
例えば、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物は、小さい単層リポソームをpH約10〜約12の水性培地において調製することによって作製され、このときリポソームは（i）脂質二重層の少なくとも約75％重量の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層および（ii）ポリエン薬剤の充填を有する。多価陽イオンを高いpHのリポソームに加えて、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を形成させる。次に、培地のpHをほぼ中性に調節し、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を回収する。用いられる好ましいポリエンは、アンフォテリシンBである。
【００１５】
大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を調製するもう一つの方法は、小さい単層リポソームをpH約10〜約12の水性培地において作製する、二相の水溶性ポリマーシステムを含み、このときリポソームは（i）脂質二重層の少なくとも約75％重量の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層、および（ii）ポリエン薬の充填を有する。リポソームを第一の水溶性ポリマーと混合し、懸濁液を形成させる。次に、この懸濁液を第二の水溶性ポリマーを含む懸濁液に加えるが、第一および第二のポリマーは不混和性であり、このため二相のポリマーシステムが形成される。多価陽イオンを二相のポリマーシステムに加えて、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を形成させ、次いでこれを回収する。
【００１６】
次に、大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を、真菌感染症を有する患者に投与する。本発明の大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物は、免疫力の低下した患者の全身性真菌感染症の治療であっても便利に経口投与される。本発明のホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物はまた、非経口投与、または他の投与手段によって投与される。好ましいポリエンはアンフォテリシンBである。
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる以下の用語は、下記に示す定義を有する。
【００１８】
「渦巻状物」は、空の、または充填することができる安定なリン脂質-陽イオン沈殿物である。
【００１９】
「空の渦巻状物」は、リン脂質および陽イオンのみを含む渦巻状物である。
【００２０】
「充填した渦巻状物」は、リン脂質-陽イオン構造内に一つまたは複数の生物活性化合物を有する渦巻状物である。
【００２１】
「大豆ホスファチジルセリン」は、大豆を材料とする組成物に由来するホスファチジルセリンである。
【００２２】
「ポリエン」は、任意のポリエン抗生物質または抗真菌剤を指す。好ましいポリエンには、ナイスタチンおよびアンフォテリシンBが含まれる。
【００２３】
本発明の実践にあたって、改良されたリン脂質に基づく渦巻状物は、大豆ホスファチジルセリンを渦巻状物の脂質成分の少なくとも約75重量％の量で用いることによって作製される。あるいは、大豆ホスファチジルセリンは、渦巻状物の脂質成分の約80重量％、90％またはそれ以上となりうる。好ましい態様において、リン脂質は実質的に100％の大豆ホスファチジルセリンである。
【００２４】
ホスファチジン酸は、本発明の改良された渦巻状物においてホスファチジルセリンの他にさらなるリン脂質が存在する場合に好ましいリン脂質である。ホスファチジン酸の他に本発明の改良された渦巻状物において用いることができる他のリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、およびホスファチジルグリセロールが含まれる。さらなるリン脂質の混合物も、大豆ホスファチジルセリンと組み合わせて同様に用いることができる。
【００２５】
大豆ホスファチジルセリン出発材料は、周知かつ標準的な精製技術に従って、いくつかの大豆リン脂質の混合物である大豆リン脂質組成物を精製することによって作製される。精製された大豆ホスファチジルセリンはまた、市販の製品でもある。
【００２６】
本発明の渦巻状物は、大豆ホスファチジルセリンが渦巻状物の脂質成分の少なくとも約75重量％の量で用いられる、標準的な渦巻状物調製技法によって作製される。渦巻状物は、空の、または生物活性物質を充填することができる。典型的に、標準的な周知の方法を用いてリポソームを形成し、次に多価化合物をリポソームと混合し、それによって渦巻状物が沈殿して形成される。
【００２７】
任意の多価化合物が、リポソーム出発材料から渦巻状物を沈殿させるために用いることができる。好ましくは、多価化合物は、例えばCa++、Zn++、およびMg++のような二価陽イオンである。好ましいこれらの陽イオン源には、カルシウム、亜鉛、およびマグネシウムの塩化物が含まれる。CaCl2は、特に好ましい二価陽イオン源である。
【００２８】
一つの態様において、本発明の大豆ホスファチジルセリン渦巻状物は、以下の段階を含む工程によって作製される：
（a）pH約10〜約12の水性培地において、小さい単層のリポソームを調製する段階であって、リポソームが（i）脂質二重層の少なくとも約75重量％の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層、および任意で（ii）一つまたは複数の生物活性化合物の充填を有する段階；
（b）多価陽イオンを（a）のリポソームに加えて、大豆ホスファチジルセリン渦巻状物を形成する段階；
（c）培地のpHをほぼ中性に調節する段階；ならびに
（d）大豆ホスファチジルセリン渦巻状物を回収する段階。
この工程によって作製された充填された渦巻状物は、好ましくは、薬剤（充填物）としてアンフォテリシンB、および多価陽イオンとしてカルシウムを含む。渦巻状物は、脂質成分としてまたは選択的にホスファチジルセリンの混合物として大豆ホスファチジルセリンを重量で実質的に100重量％、およびホスファチジン酸を約25重量％まで含みうる。
【００２９】
もう一つの態様において、本発明の改良された渦巻状物は、ナノ渦巻状物であり、かつ参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,153,217号に開示される方法を用いて調製することができる。大豆ホスファチジルセリン渦巻状物を作製するこの方法は以下の段階を含む：
（a）pH約10〜約12の水性培地において、小さい単層のリポソームを調製する段階であって、リポソームが（i）脂質二重層の少なくとも約75重量％の量で大豆ホスファチジルセリンを含む脂質二重層、および任意で（ii）一つまたは複数の生物活性化合物の充填を有する段階；
（b）リポソームを第一の水溶性ポリマーと混合して懸濁液を形成する段階；
（c）第一および第二のポリマーが不混和性であり、それによって二相のポリマーシステムが形成される第二の水溶性ポリマーを含む懸濁液中に、リポソーム／ポリマー懸濁液を加える段階；
（d）二相ポリマーシステムに多価陽イオンを加えて、大豆ホスファチジルセリン渦巻状物を形成する段階；ならびに
（e）大豆ホスファチジルセリン／ポリエン渦巻状物を回収する段階。
【００３０】
本発明の大豆ホスファチジルセリン渦巻状物を作製するために用いられる第一のポリマー（ポリマーA）および第二のポリマー（ポリマーB）は、水溶性の二相システムを形成することができる任意の生体適合性のポリマークラスとなりうる。例えば、ポリマーAは、デキストラン200,000〜500,000、ポリエチレングリコール（PEG）3,400〜8,000となりうるがこれらに限定されない；ポリマーBは、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリビニルアルコール（PVA）、フィコール30,000〜50,000、ポリビニルメチルエーテル（PVME）60,000〜160,000、PEG3,400〜8,000となりうるがこれらに限定されない。ポリマーAの濃度は、ポリマーの特性に応じて最終濃度として2〜20％ w/wの範囲となりうる。同じ濃度範囲をポリマーBに応用することができる。適した二相システムの例は、デキストラン／PEG、4〜10％ w/w PEG 3,400〜8,000中の5〜20％ w/wデキストラン200,000〜500,000；10〜20％ w/w PVP 10,000〜20,000中のデキストラン／PVP 10〜20％ w/wデキストラン200,000〜500,000；3〜15％ w/w PVA 10,000〜60,000中のデキストラン／PVA 3〜15％ w/wデキストラン200,000〜500,000；10〜20％ w/wフィコール30,000〜50,000中のデキストラン／フィコール10〜20％ w/wデキストラン200,000〜500,000；6〜15％ w/w PVME 60,000〜160,000におけるPEG/PVME 2〜10％ w/w PEG 3,500〜35,000である。
【００３１】
生物活性薬剤／薬物（「充填物」または薬物と呼ぶ）は、水性培地において疎水性、親水性、または両親媒性となりうる。薬物は、タンパク質、小さいペプチド、生物活性ポリヌクレオチド、抗ウイルス剤、麻酔剤、抗感染症剤、抗真菌剤、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド性抗炎症剤、栄養補助剤、生薬製品、ビタミン、非ステロイド性抗炎症剤、トランキライザー、または血管拡張剤となりうるが、これらに限定されない。例として、アンフォテリシンB、アシクロビル、アドリアマイシン、ビタミンA、カバマゼピン（cabamazepine）、メルファラン、ニフェジピン、インドメタシン、ナプロキセン、エストロゲン、テストステロン、ステロイド、フェニトイン、エルゴタミン、カンナビノイド、ラパマイシン、プロパニジド、プロポフォール、アルファジオン（alphadione）、エキノマイシン、硝酸ミコナゾール、テニポシド（teniposide）、タキサン、パクリタキセル、およびタキソテールが挙げられる。
【００３２】
薬物は、シクロスポリン、アンジオテンシンI、II、およびIII、エンケファリンおよびその類似体、ACTH、抗炎症ペプチドI、II、III、ブラジキニン、カルシトニン、β-エンドルフィン、ダイノルフィン（dinorphin）、ロイコキニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）、インスリン、ニューロキニン、ソマトスタチン、サブスタンスP、甲状腺放出ホルモン（TRH）ならびにバソプレッシンのようなポリペプチドとなりうる。
【００３３】
薬物は抗原となりうるが、タンパク質抗原に限定されない。抗原はまた、糖質またはDNAとなりうる。抗原性タンパク質の例には、インフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスのエンベロープ糖タンパク質、動物細胞膜タンパク質、植物細胞膜タンパク質、細菌膜タンパク質および寄生虫膜タンパク質が含まれる。
【００３４】
抗原は、起源となる粒子、細胞、組織、または生物から既知の方法によって抽出される。抗原の生物活性は維持される必要はない。しかし、場合によっては（例えば、タンパク質が膜融合もしくはリガンド結合活性を有する、または免疫系によって認識される複雑な構造を有する場合）、生物活性を維持することが望ましい。これらの場合では、膜タンパク質の生物活性を破壊しない洗浄剤を含む抽出緩衝液を用いる。適した洗浄剤には、コール酸塩、デオキシコール酸塩等のようなイオン性洗浄剤、またはTween、BRIG、もしくはTritonのような不均一なポリオキシエチレン洗浄剤が含まれる。
【００３５】
この方法を利用することによって、生物活性を保持しながら抗原、より詳しくはタンパク質をリポソームに再構成することができ、最終的に渦巻状物に効率よく会合させることができる。これによって、その全てが生物活性型の抗原の効率的な再構成に有害な影響を及ぼす可能性がある、有機溶媒、超音波処理、または極端なpH、温度、もしくは圧力が回避される。
【００３６】
本発明の改良された渦巻状物には、適当であれば複数の抗原分子、生物学的に関連する分子、または薬物処方による充填物が含まれうる。
【００３７】
小さいサイズの渦巻状物（薬物を含むまたは含まない）の形成は、リポソームを含む水溶性の二相ポリマー溶液に正に荷電している分子を加えることによって達成される。渦巻状物を作製する上記の方法において、正に荷電している分子は、多価陽イオンとなりえ、より具体的には、渦巻状物の形成を誘導できる任意の二価陽イオンとなりうる。好ましい態様において、二価陽イオンには、Ca++、Zn++、Ba++、およびMg++、または二価の陽イオンを形成することができる他の元素、または負に荷電している脂質とキレートを形成して架橋を形成することができる複数の正電荷を有する他の構造が含まれる。正に荷電している分子をリポソーム含有溶液に加えることはまた、水溶液から渦巻状物を沈殿させるためにも用いられる。
【００３８】
渦巻状構造を単離して、かつポリマー溶液を取り除くために、渦巻状沈殿物を、正に荷電している分子、より好ましくは二価陽イオンを含む緩衝液によって繰り返し洗浄する。正に荷電している分子を洗浄緩衝液に加えることによって、渦巻状構造が確実に洗浄段階の間維持され、かつそれらが沈殿物として留まるようになる。
【００３９】
渦巻状物が懸濁している培地は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、炭酸ナトリウムのような塩を含みうる。培地は、Tween80、BRIG、またはTritonのようなポリマーを含みうる。薬物-渦巻状物は、適当な薬学的に許容される担体（例えば、二価陽イオン含有緩衝液）に希釈することによって作製する。
【００４０】
渦巻状粒子は、腸溶性となりうる。渦巻状粒子は、ゼラチンカプセル内に入れることができ、このカプセルを腸溶コーティングすることができる。
【００４１】
当業者は、本発明を実践する治療を行うための最も有効かつ治療的な手段を決定することができる。例えば、「Goodman & Gillman's, The Pharmaceutical Basis for Therapeutics」、（補則6、第3版、Goodmanら編、マクミラン出版社、ニューヨーク、1980）を含む多数の典拠および参考文献を参照することができる。
【００４２】
生物活性充填物を含む本発明の改良された大豆ホスファチジルセリン渦巻状物は、患者に便利に経口投与され、それによって渦巻状物が血流に吸収されて、生物活性充填物が全身に輸送される。これは、アンフォテリシンBおよびパクリタキセルのような水に不溶性の薬剤にとって特に有利である。さらに、多くの疎水性薬物の毒性は、充填物としてアンフォテリシンBを含む大豆ホスファチジルセリン渦巻状物の場合において認められるように実質的に減少する。
【００４３】
本発明の好ましい態様において、ホスファチジルセリンを90重量％含む大豆リン脂質の混合物をクロロホルムに溶解して、次に、メタノールに溶解したアンフォテリシンBと混合する。混合物を薄膜に乾燥させた後、脱イオン水によって水和して、約10 mgリン脂質/mlの濃度とする。水和した懸濁液を、リポソームが100倍の顕微鏡レンズで見えなくなるまで超音波処理する。残っている任意のアンフォテリシンBの結晶は、NaOHのような塩基を加えることによって溶解する。渦巻状物は、CaCl2をリポソーム懸濁液に、脂質対Ca2+のモル比約1：1で徐々に加えることによって形成される。次に、pHを酸によって中性に調節する。
【００４４】
もう一つの好ましい態様において、ホスファチジルセリンを90重量％含む大豆リン脂質混合物をクロロホルムに溶解して、次に、メタノールに溶解したアンフォテリシンBと混合する。混合物を薄膜に乾燥させた後、脱イオン水によって水和して、約10 mgリン脂質/mlの濃度とする。水和した懸濁液を、リポソームが100倍の顕微鏡レンズで見えなくなるまで超音波処理する。残っている任意のアンフォテリシンBの結晶は、NaOHのような塩基を加えて、リポソーム混合物のpHを10〜12に上昇させることによって溶解する。リポソーム懸濁液を、例えばデキストラン-500,000のような第一の水溶性ポリマーと混合した後、例えばPEG-8000のような第二の水溶性ポリマーに注入するが、第一と第二のポリマーは互いに不混和性である。CaCl2を不混和性のポリマー懸濁液に攪拌しながら加えると、渦巻状物が形成される。渦巻状物を緩衝液によって洗浄して回収する。
【００４５】
以下の実施例は、本発明の実践を説明するが、その範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００４６】
実施例1
非精製大豆PSから空の渦巻状物を調製する試み
大豆PS（Leci-PS、Lucas-Meyer、40％PS）50 mgに、滅菌水5 mlを加えた。混合物をボルテックスミキサーにより十分に3分間攪拌してリポソームを形成した。リポソーム懸濁液1 mlに、CaCl2（0.1 M）0.1 mlを、脂質：Ca++のモル比1：1で滴下しながら加えた。位相差光学顕微鏡により、リポソーム凝集物の形成が示されるが、移動するいくつかの領域は、リポソームが泳ぎ回っていることを示唆している（図1B）。渦巻状物は認められなかった。この調製物において用いた脂質の組成分析を、ジオールカラムおよび勾配移動相を備えたHPLCで（A：CHCl3/MeOH/NH4OH 800/145/5、B：CHCl3/MeOH/H2O 600/340/50）を用いて行った。HPLCクロマトグラムは、大豆PSには低い割合のPSを有する11個より多い異なる化合物が含まれることを示した（図1A）。
【００４７】
実施例2
精製大豆PS（90％）からの空の渦巻状物の調製
精製大豆由来ホスファチジルセリン（ALC PS 90P）粉末を滅菌水に10 mg脂質/mlの濃度で分散させた。次に、懸濁液をボルテックスミキサーによって1分間攪拌した後、1分間超音波処理した。0.1 Mの塩化カルシウム（10 μl）を、脂質対カルシウムのモル比1：1でリポソーム懸濁液に徐々に加えると渦巻状物が形成され、これを4℃で遮光して保存した。空の渦巻状物の構造は、凍結割断後、透過型電子顕微鏡によって確認した。
【００４８】
凍結割断は以下のように実施した：各試料のアリコートをグリセロールと混合して、最終濃度25％（v/v）を得た。パスツールピペットを用いて、これらの懸濁液の小滴を平坦な金支持体のディスク上に滴下した。ディスクを液体フレオン中に沈めることによって試料を迅速に凍結させた。3〜4秒後、試料を、液体窒素に浸した標本テーブルに移してから、凍結割断装置（Balzars、BAF400）に挿入した。破断を、-110℃および＜2×10-6 mbarで行った後、直ちに白金によって斜角45°でシャドーイング、および90°での電子透過性の炭素バッキングの適用を行った。試料のレプリカを蒸留水に沈めることによって除去して、その後市販の漂白剤溶液によって洗浄した。洗浄したレプリカをグリッドに移した。Zeiss EM 10C透過型電子顕微鏡を用いて顕微鏡写真を得た。図2Bは、巻き上げられた二重層を特徴とする渦巻状円柱の形成を示す。図2Cは、同じ調製物に存在する渦巻状円柱の顕微鏡写真である。実施例1で用いたカラムおよび勾配を用いたHPLCによる脂質の分析は、PSが実施例1で用いられた脂質より高い純度を有することを示している（図2A）。PS濃度は約90％である。
【００４９】
実施例3
精製大豆PS（100％）からの空の渦巻状物の調製
精製大豆PS（ホスファチジルセリン）粉末を、滅菌水に10 mg脂質/mlの濃度で分散させた。次に、懸濁液をボルテックスミキサーによって1分間攪拌した後、1分間超音波処理した。塩化カルシウム（0.1 M）（10 μl）をリポソーム懸濁液に、脂質 対 カルシウムのモル比1：1で徐々に加えると渦巻状物が形成され、これを4℃で遮光して保存した。空の渦巻状物の構造を、実施例2に記載の技法を用いて、凍結割断後位相差光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡によって確認した。
【００５０】
光学顕微鏡は、渦巻状物の凝集物の形成を示している。渦巻状物は、EDTAを加えるとリポソームに変形する。
【００５１】
図3は、巻き上げられた二重層を特徴とする渦巻状円柱の形成を示す。
【００５２】
実施例4
90％PSおよび高pHトラッピング法を用いてカルシウムによって沈殿させたアンフォテリシンBローディング渦巻状物の調製
モル比10：1の大豆ホスファチジルセリン（ALC PS、90％）のクロロホルム溶液（10 mg/ml）およびAmB（アンフォテリシンB）のメタノール溶液（0.5 mg/ml）の混合物を丸底フラスコに入れて、Buchi rotavaporを用いて35℃で薄膜に乾燥させた。以下の段階は滅菌フードの中で実施した。乾燥した脂質被膜を、10 mg脂質/mlの濃度で脱イオン水で水和した。水和した懸濁液を窒素によってパージおよび密封した後、冷却バス超音波処理器において超音波処理した。超音波処理は、倍率100倍の顕微鏡下で明らかに見えるリポソームがなくなるまで10分間継続した。いくつかのAmB結晶は懸濁液に残っていた。AmBの結晶がこれ以上認められなくなるまで、NaOH（1 N）を加えることによって懸濁液のpHを上昇させた。渦巻状物を、CaCl2（0.1 M）を脂質 対 Ca2+のモル比1：1でリポソーム懸濁液に徐々に加えることによって形成させた後、4℃で遮光して保存した。1N HClを加えてpHを7に調節した。位相差技術を用いた光学顕微鏡は、EDTAを加えるとリポソームに開く特徴的な渦巻状物凝集体の形成を示した。
【００５３】
実施例5
大豆PS（90％）を用いたアンフォテリシンB充填ハイドロゲル-単離渦巻状物の調製
段階1：ALC PS 90P由来の小単層AmB充填小胞の調製
モル比10：1のALC PS（90％大豆ホスファチジルセリン）のクロロホルム溶液（10 mg/ml）およびAmBのメタノール溶液（0.5 mg/ml）の混合物を丸底フラスコに入れ、Buchi rotavaporを用いて35℃で薄膜に乾燥させた。以下の段階を滅菌フードにおいて行った。乾燥した脂質膜を10 mg脂質/mlの濃度で滅菌水によって水和した。水和した懸濁液を窒素によってパージおよび密封し、冷却バス超音波処理器において超音波処理した。超音波処理は、倍率100倍の顕微鏡下で明らかに見えるリポソームがなくなるまで10分間継続し、少量のAmB結晶が認められた。次いで結晶が消失するまで、NaOH（1 N）を加えることによって懸濁液のpHを10〜11に上昇させた。レーザー光散乱（N4プラス）により、AmBリポソームの平均直径が91.7±38.3 nmであることが示された。
【００５４】
段階2：AmB充填ハイドロゲル単離渦巻状物の調製
段階1で得られたリポソーム懸濁液を、3/1 v/vデキストラン／リポソームの懸濁液において40％ w/wデキストラン-500,000と混合した。次に、この混合物を、磁石によって攪拌しながらシリンジによって15％ w/w PEG-8,000[PEG 8000／（懸濁液A）]に注入すると、懸濁液Bが得られた。攪拌速度は800〜1,000 rpmであった。CaCl2溶液（100 mM）を、Ca2+/DOPSの最終モル比が1：1に達するように懸濁液に加えた。
【００５５】
攪拌を1時間継続した後、1 mM CaCl2および150 mM NaClを含む洗浄緩衝液を容積比1：1で懸濁液Bに加えた。懸濁液をボルテックスミキサーによって攪拌して、3000 rpm、2〜4℃で30分間遠心した。上清を除去した後、さらなる洗浄緩衝液を容積比0.5：1で加えた後、同じ条件で遠心した。得られたペレットを同じ緩衝液によって所望の濃度となるように再構成した。AmBを含む黄色のナノ渦巻状物が形成された。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図1Aは40％非精製大豆PSの多リン脂質組成物を示すHPLCクロマトグラムである。図1Bは、NSPS（40％PS）がカルシウム陽イオンによって濃縮された場合の、リポソームの凝集を示す位相差光学顕微鏡写真である。渦巻状物が形成されなかったことに注目されたい。
【図２】図2Aは、PSの高い含有量を示す精製PSPSのHPLCクロマトグラムである（Rt＝3.456）。図2Bは、PSPSによって形成された渦巻状物の断面を示す凍結割断後の電子顕微鏡写真である。二層形状に注目されたい。図2Cは、同じ調製物中に存在する渦巻状円柱の顕微鏡写真である。
【図３】巻き上げられた二重層として渦巻状円柱を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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