(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのポリマー、好ましくはポリ（アルキルシアノアクリレート）及び少なくとも１つの正帯電多糖類、好ましくは低分子量のキトサンを主成分とするナノ粒子からなる目的となる物質、及び前記ナノ粒子のレベルに接着又は組み込まれるアニオン性の、又はアニオン性領域を含む目的となる物質の送達及びベクター化システムを対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子からなるタイプの、治療又は診断目的となる物質のベクター化及び送達システムであって、前記ナノ粒子が、均一サイズの分布を示し、かつ（ｉ）少なくとも１つのポリマー及び（ｉｉ）少なくとも１つの非毒性の正帯電多糖類を含むことを特徴とするシステム。
【請求項２】
前記物質は、前記ナノ粒子のレベルで内部移行又は吸着されることを特徴とする請求項１に記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項３】
目的となる物質は、アニオン性であるか、アニオン性領域を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項４】
ポリマーは、直鎖又は分岐アルキル基が１から１２個の炭素原子を含むポリ（アルキルシアノアクリレート）であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項５】
正帯電多糖類は、キトサン、又はその誘導体の１つであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項６】
正帯電多糖類、特にはキトサン又はその誘導体の１つは、１０００００Ｄａ未満、好ましくは３００００Ｄａ未満の分子量を有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項７】
ナノ粒子は、目的となる物質の複合体を形成するのに適した少なくとも１つの化合物を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項８】
目的となる物質の複合体を形成するのに適した化合物は、環状オリゴ糖、好ましくは、中性又は帯電、天然、連結若しくは重合又は化学修飾されたシクロデキストリンであることを特徴とする請求項７に記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項９】
目的となる物質は、ＤＮＡ又はオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチド、特にアンチセンス、又は干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク、化合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項１０】
ナノ粒子は、１０〜３００ｎｍの均一な直径を有することを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システム。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の目的となる物質のベクター化及び送達システムの組成中に入るナノ粒子の調製方法であって、ナノ粒子懸濁液を得るために、正帯電多糖類の存在下でモノマーの１を超える酸性ｐＨの重合を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
多糖類は、重合の初めに添加されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酸性ｐＨは、３を超えることを特徴とする請求項１１又は１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
重合は、多糖類又は重合の水性媒体のＯＨ基に対して固定される、ＳＯ２又はヒドロキノンのような重合遅延化合物の存在下で行われることを特徴とする請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
多糖類の量は、懸濁液の重量に対して好適には、０．０１％〜５％であり、かつ好ましくは０．１％〜１％であることを特徴とする請求項１１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ｐＨ１〜５のクエン酸溶液中に、ＳＯ２を含み、かつ非イオン界面活性剤、場合によりシクロデキストリン及び低分子量（５０００又は１００００Ｄａ）のキトサンを含むポリイソヘキシルシアノアクリレートを添加することを含むことを特徴とする請求項１１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
多糖類と同時に、目的となる物質を添加することを含むことを特徴とする請求項１１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ナノ粒子形成後に、目的となる物質を添加することを含むことを特徴とする請求項１１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１から１８のいずれかに記載の方法によって得ることができるナノ粒子懸濁液であって、懸濁液の重量に対して０．０１％〜５％、特には０．１％〜１％の正帯電多糖類を含むことを特徴とする懸濁液。
【請求項２０】
懸濁液の重量に対して０．５％〜５０％の目的となる物質を含むことを特徴とする請求項１９に記載のナノ粒子懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に予防、治療又は診断目的の薬剤の分野において使用される有効成分の送達に関する。本発明は特には、少なくとも１つのポリマー、好ましくはポリ（アルキルシアノアクリレート）及び少なくとも１つの正帯電多糖類、好ましくは低分子量のキトサンを主成分とするナノ粒子からなる目的となる物質、及び前記ナノ粒子のレベルで接着又は組み込まれるアニオン性の、又はアニオン性領域を含む目的となる物質の送達及びベクター化システムを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
有効成分の新規送達又は放出システムの開発は、治療上、最適な速度及び薬量での作用部位への特に薬理学的な有効成分の制御された送達を第１の目的とする（Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ、１９９４）。生体中の有効成分分布の変調によって得ることができる治療係数の改良を挙げることもできる。有効成分を送達システムに関連させることにより、特に作用部位での送達、又は作用部位のターゲティング後の制御された放出が特に可能になる。有効成分の存在が望ましくない区画中で有効成分の量が減少することにより、前記有効成分の効率を増大すること、毒性の副作用を減少させること、更にはその活性を修飾又は修復することさえ、可能になる。
【０００３】
送達の主要な問題の一つは、分子生物学への応用、及び特にはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ペプチド、全く負に帯電したタンパクのような有効成分への応用である。遺伝病における分子生物学の基本を理解することにより、機能不全遺伝子を変調すること又は置き換えることが可能になる。臨床実務における定型遺伝子治療の発達は、反復した全身投与の可能性、ターゲットに到達し、かつインビボで細胞を有効にトランスフェクトする能力（Ｆｅｌｇｎｅｒ、１９９０、Ｋａｂａｎｏｖ及びＡｌａｋｈｏｖ、１９９３、Ｃｒｏｏｋ、１９９５、Ｄｏｕｇｌａｓ及びＣｕｒｉｅｌ、１９９５、Ｌａｓｉｃ及びＴｅｍｐｌｅｔｏｎ、１９９６）、並びに工業的規模で転位することが可能であろうベクターを製造する可能性に左右される。リン酸カルシウムによるＤＮＡの共沈及び電気穿孔法のような、現在まで使用されたインビトロトランスフェクション技術は、インビボでの応用が困難に見えるアプローチである（Ｆｙｎａｎら、１９９３）。
【０００４】
現在、インビボトランスフェクションに使用するシステムは、ＤＮＡ又はＯＤＮの自然の負電荷を考慮する。それらは、ウイルス系（Ｍｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３）か、カチオン性脂質のような非ウイルス構成（Ｌｅｄｌｅｙ、１９９４、Ｚｅｌｐｈａｔｉ及びＳｚｏｋａ、１９９６）である。ウイルスベクターは、インビトロトランスフェクションの点では、非常に有効であるが、その免疫原性のために、インビボでは制限を有する（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９０、Ｄｏｕｇｌａｓ及びＣｕｒｉｅｌ、１９９５、Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ、１９９７）。非ウイルスベクターの中で、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）のようなカチオン性脂質（Ｂｅｈｒら、１９８９）は、良好なトランスフェクション性を有するが、それらのインビボでの応用は、それらの毒性、補体の活性化、並びに肝臓及び肺の高い向性によって限定される。
【０００５】
１９８０年代末にポリ（１−リジン）によって行われた研究（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７）から、幾つものカチオン性ポリマーが、非ウイルストランスフェクションベクターとして研究された。これらのベクターには、ポリエチレンイミン（Ｂｏｕｓｓｉｆら、１９９５、Ｒｅｍｙら、１９９８）、ポリブレン（Ｍｕｍｐｅｒら、１９９６）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）（Ｔａｎｇら、１９９６）を含む。
【０００６】
現在まで、ポリマーによるトランスフェクションの効率は、比較的低く、かつ多くのこれらのカチオン性ポリマーは、相対毒性を示し、反復した静脈内投与の可能性が低かった。有効成分、特にＤＮＡにより直接使用されるポリマーは、そのトランスフェクション効率によって限定され、大量の有効成分を消費し、従ってそれ自体が毒性である大量のポリマーを使用することを余儀なくさせる。特にインビボでの遺伝子の送達に使用するコロイド系は、ポリマー及び有効成分をより節約する。
【０００７】
有効成分を送達するコロイド系には、リポゾーム、マイクロエマルジョン、ナノカプセル、ナノスフェア、微小粒子及びナノ粒子を含む。ナノ粒子は、ターゲティング、分布変調、及び配合の柔軟性の利点を有し、かつ追求する目的に適したように、設計かつ作成され得るポリマー構造を有する。それらは、制御された放出を確実に行う適性のために以上に定義した意味でのより良い治療係数、作用部位への特異的送達又は標的にされた送達を得るために特に有望であることが明らかになり、他の器官のレベルでの効率増大及び毒性の副作用の減少を同時に可能にする。
【０００８】
これらの中で、欧州特許第０００７８９５号明細書（米国特許第４３２９３３２号明細書及び米国特許第４４８９０５５号明細書）及び欧州特許第００６４９６７号明細書（米国特許第４９１３９０８号明細書）に記載されたポリ（アルキルシアノアクリレート）は、その生侵食が、他の生分解性ポリマーと較べて速く観察され、かつ治療又は診断用途に適合できる期間中に行われるので、特に興味深い。ナノ粒子は、直径が１０ｎｍから１０００ｎｍの間で変化するコロイドベクターである。これらの粒子は、生物活性物質が表面に吸着される、カプセルに入れられる又は捕捉される巨大分子によって形成される。ナノ粒子又はナノスフェアは、「ナノペレット」及びナノカプセルという用語でＢｉｒｒｅｎｂａｃｈ及びＳｐｅｉｓｅｒ（１９７６）によって記載され、かつＫｒｅｕｔｅｒ及びＳｐｅｉｓｅｒ（１９７６）によって「アジュバント」と、かつＫｒｅｕｔｅｒ（１９８３）によって「活性物質送達システム」と形容された。
【０００９】
オリゴヌクレオチドの安定性を増大させ、細胞中の浸透を増大させ、かつ非特異的分布を回避する目的で、ナノ粒子のような粒子ベクターの使用は、最も有望なアプローチとして考えられている。しかしながら、その使用は、有効成分をナノ粒子に固定するために使用される物質の毒性によって限定された。
【００１０】
最も研究されたポリマーナノ粒子は、ポリイソヘキシルシアノアクリレート（ＰＩＨＣＡ）である。しかしながら、これらのナノ粒子は、表面に負電荷を有するので、ナノ粒子に対するイオン対生成によるＯＤＮの結合を容易にするために、カチオン性コポリマー（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン）又はカチオン性疎水性洗剤（臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ））が、ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）に組み合わされた。このようにして、ＯＤＮは、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）のような疎水性カチオンを含むＰＡＣＡのナノ粒子に有効に結合された（Ｃｈａｖａｎｙら、１９９２）。ＣＴＡＢは、毒性の問題を有し、Ｚｏｂｅｌら、１９８７は、ＣＴＡＢを、ナノスフェア形成前に重合媒体中に導入されたＤＥＡＥデキストランと替えた。ＤＥＡＥデキストランは、同様に毒性であることが明らかになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＤＮＡ、ＯＤＮ、ペプチド、タンパクのような有効成分の送達にとって理想的なナノ粒子ベクターは、
−  物理化学的特性を考慮して、目的となる分子と複合体を形成できるべきであり、かつ有効成分を固定するために選択する物質は、電荷及び毒性データに適合すべきであり、
−  血液循環への輸送中に有効成分を分解から保護できるべきであり、
−  生体適合性（非毒性、非免疫原性、かつ好ましくは生分解性）であるべきであり、
−  有効成分を十分な量でターゲット組織のレベルに送達できるべきであり、かつ
−  細胞型を特異的にターゲットとすることができるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、ポリマー、特に１つ又は幾つかの正帯電多糖類に結合された、ポリ（アルキルシアノアクリレート）のナノ粒子の使用により達成される。
【００１３】
従って本発明は、ナノ粒子からなるタイプの、治療又は診断目的となる物質のベクター化及び送達システムであって、前記ナノ粒子が、均一サイズの分布を示し、かつ（ｉ）少なくとも１つのポリマー及び（ｉｉ）少なくとも１つの非毒性の正帯電多糖類を含むことを特徴とするシステムを対象とする。
【００１４】
本発明によるシステムにおいて、目的となる物質は、前記ナノ粒子のレベルで内部移行又は吸着される。
【００１５】
本発明によるベクター化及び送達システムは、アニオン性の、又はアニオン性領域を含む目的となる物質に特に適している。
【００１６】
好ましくは、ポリマーは、直鎖又は分岐アルキル基が１から１２個の炭素原子を含むポリ（アルキルシアノアクリレート）である。
【００１７】
本発明のナノ粒子の組成中に入る多糖類は、ＣＴＡＢ又はＤＥＡＥデキストランのような先行技術において提案された物質とは異なり、非毒性である。
【００１８】
このように、本発明は特には、直鎖である正帯電多糖類に関し、好ましくはキチン誘導体が、かつ非常に好ましくはキトサン、又は正に帯電するのでその誘導体が問題になる。
【００１９】
キチンは、セルロースに次いで自然において豊富に見出される多糖類である。骨格は、高いアセチル化度を有するβ１−４−グルコサミン糖から構成される。この構造は、セルロースのそれと近く、相違点は、ヒドロキシル基をアミノ基と替えることである（Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９２）。これらのポリカチオン性バイオポリマーは、甲殻類及び昆虫の外骨格となるが、ある種のキノコ中にも同様に存在する（Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９２）。キトサンという名称のキチンの主要な誘導体は、通常アルカリ脱アセチル化によって得られる。２つのタイプのポリマー（キチン及びキトサン）は、希釈した酸の溶液中での溶解性又は不溶性によって区別される（Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９２）。
【００２０】
キトサンは、その非毒性（Ｋｎａｐｃｚｙｋら、１９８４）、生体適合性（Ｃｈａｎｄｙ及びＳｈａｒｍａ、１９９０、Ｈｉｒａｎｏら、１９９０）及び生分解性（Ｓｔｒｕｓｚｃｚｙｋら、１９９１）のような好適な生物学的特性により、薬剤及び生物医学分野において大いに研究された。医学分野で、キトサンは、低コレステロール血症活性（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９７９）、瘢痕化特性（Ｂａｌａｓｓａ及びＧｒｏｖｅ、１９７２）、並びに抗酸及び抗潰瘍活性（Ｈｉｌｌｙａｒｄら、１９６４）のような、興味深い薬理学的特性を有するように記載された。更に、そのポリカチオン特性により、哺乳類細胞としっかりと結合する能力が与えられ、その止血活性（Ｆｒａｄｅｔら、１９８６）及び殺精子活性（Ｓｍｉｔｈ、１９８４）に関して使用する潜在力を可能にする。
【００２１】
本発明で使用する多糖類の分子量は、均一、かつ投与を容易にするために十分に小さいサイズのナノ粒子を得るために、注意深く選択された。このように、これらの多糖類、及び特にはキトサン又はその誘導体は、１０００００Ｄａ未満、好ましくは３００００Ｄａ未満の分子量を有する。５０００、１００００及び３００００Ｄａのキトサンが、本発明の枠内で合成された。
【００２２】
キトサン誘導体の例として、ペギレートされたキトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｐｅｇｇｙｌｅ）、すなわちポリエチレングリコールを移植したキトサン、又はがん細胞のターゲティングのために葉酸によって機能化されたキトサンを挙げることができる。
【００２３】
本発明による送達及びベクター化システムによって、ナノ粒子中の正帯電多糖類の量に応じて目的となる物質の送達を変調することが可能になる。この電荷の変調は、ＣＴＡＢのような洗剤、又はＤＥＡＥデキストランのようなコポリマーの毒性のために、先行技術では不可能であった。このように、本発明のシステムにおいて、多糖類の量は、ポリマーの量に対して０．１〜１％である。
【００２４】
本発明のナノ粒子は、目的となる物質の複合体を形成するのに適した少なくとも１つの化合物を含んでも良い。例えば、第２７７５４３５号で公開された仏国特許に記載された化合物のことである。好適には、活性物質の複合体を形成するのに適した化合物は、環状オリゴ糖、好ましくは、中性又は帯電、天然、連結若しくは重合又は化学修飾されたシクロデキストリンである。アルキル、アリール、アリールアルキル、グリコシド基による１つ又は幾つかのヒドロキシプロピルの置換によって、又はアルコール若しくは脂肪酸のエステル化によって化学修飾されたシクロデキストリンのことであっても良い。
【００２５】
本発明によるベクター化及び送達システムは、アニオン性の、又はアニオン性領域を含む目的となる物質に特に適している。このように、帯電してないか、正に帯電したが、本発明による正帯電ナノ粒子への結合を可能にする負電荷を全体として又は部分的に与えるように修飾された目的となる物質のことであっても良い。目的となる物質は、共有結合的に、又は非共有結合的にナノ粒子に対して固定される。
【００２６】
例えばＤＮＡ又はオリゴデオキシリボヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチド、特にアンチセンス、又は干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク、化合物を挙げることができる。核酸は、アニオン性物質であるが、ある種のペプチド、ポリペプチド又はタンパクは、同様にアニオン性であるか、又は負帯電領域を含む。本発明のナノ粒子に結合され得る、目的となる物質の例として、そのｐＨを超えるｐＨのインスリン、カルシトニン、トリプトレリンを挙げることができる。
【００２７】
本発明によるナノ粒子は、キトサンの分子量及び使用する濃度に応じて１０〜３００ｎｍの均一な直径を有する。それらは、仏国特許第２７７５４３５号明細書、並びに以下の実験の部に記載したタイプの乳化重合技術によって調製され得る（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７９）。
【００２８】
本発明は、正帯電多糖類の存在下でモノマーの１を超える酸性ｐＨの重合を含むこれらのナノ粒子の調製方法を特に対象とする。
【００２９】
好ましくは、多糖類は、重合の初めに添加され、酸性ｐＨは、３を超える。この方法の非常に好ましい実施形によれば、重合は、多糖類又は重合の水性媒体のＯＨ基に対して固定される、ＳＯ２又はヒドロキノンのような重合遅延化合物の存在下で行われる。
【００３０】
上記方法によって、正電荷が添加する多糖類の量に左右される、ポリマー及び多糖類のナノ粒子懸濁液が得られる。多糖類の量は、懸濁液の重量に対して好適には、０．０１％〜５％であり、かつ好ましくは０．１％〜１％である。
【００３１】
目的となるカチオン性物質は、上記方法のあらゆる時間に添加することができる。実際、酸性ではあるが、１を超えるｐＨでの重合により、過度に酸性のｐＨに敏感な目的となる物質を方法の初めから導入することが可能になる。目的となる物質の量は、好適には懸濁液の重量に対して０．５％〜５０％である。
【００３２】
特殊な例として、次の方法を挙げることができる。
【００３３】
０〜２００００ｐｐｍのＳＯ２を含む１００μｌのポリイソヘキシルシアノアクリレートを、１％の非イオン界面活性剤、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）１８８、及び場合により０．５％のシクロデキストリンを含み、かつ低分子量（５０００又は１００００Ｄａ）の０．２％のキトサンを含む（１から５まで変化するｐＨで）クエン酸溶液中に添加する。
【００３４】
正帯電ナノ粒子を得るためのキトサンの使用は、既に先行技術に記載されていた（Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｃ．ら、２０００）ことを想起させるかもしれない。しかしながら先行技術の方法は、有効成分が安定しない非常に酸性のｐＨの重合媒体のｐＨ（ｐＨ１）で行われる。
【００３５】
本発明による方法において、重合媒体のｐＨは、有効成分が安定する２．５〜５である。更に、Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｃ．らによって記載された方法は、３００００Ｄａを超える分子量のキトサンを利用する。しかるに、１００００Ｄａを超える分子量のキトサンの使用は、毒性を有する（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｓ．Ｃ．Ｗ．ら、１９９９）。反対に、本発明によるナノ粒子は、低分子量（５０００及び１００００Ｄａ）のキトサンを含み、このことにより、単分散サイズの分布を有するナノ粒子を得ることが更に可能になり、かつ従ってより良い寛容性を有する。
【００３６】
Ｙａｎｇ  Ｓ．Ｃらによって記載された方法は、０．２５％未満のキトサン濃度で、得られるナノ粒子が不安定なので、重合媒体中に存在するキトサン濃度によって限定される。本発明による方法は、０．２５％未満のキトサン濃度に対して安定したナノ粒子を得ることを可能にする。
【００３７】
本発明による目的となる物質のベクター化及び送達システムは、ナノ粒子懸濁液の形状、又はナノ粒子の凍結乾燥物の形状を呈することができる。それは、目的となる物質の変性無しでの静脈内、経口、局所投与を可能にする。
【００３８】
本発明のその他の利点及び特徴は、本発明のナノ粒子調製、及びそのオリゴヌクレオチド輸送能力に関し、かつ添付図面の参照がなされる、以下に続く実施例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
実施例１：  様々な細胞系統に対する様々な分子量のキトサン及びＣＴＡＢの比較毒性の研究。
【００４０】
１）材料及び方法。
【００４１】
ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ−１細胞（接着細胞）は、ピューロマイシン無しで、培地中でウェル当たり１０００００の細胞で６ウェルプレートに植え付け、かつＩＷ３５細胞（懸濁細胞）は、ウェル当たり７５００００の細胞の割合で１２ウェルプレートに植え付ける。その他のＣＥＭ  ４ＦＸ懸濁細胞は、同様にテストして、９６ウェルプレート中にウェル当たり１００００の細胞で植え付ける。
【００４２】
２つの最初の細胞型に関して、細胞は、そのトランスフェクションの２４時間前に植え付ける。媒体は、その時除去し、かつ１００μＬのテストする複合体の溶液を、９００μＬの媒体中で細胞と接触させる。
【００４３】
様々な濃度のＣＴＡＢ及び幾つかの分子量のキトサンをテストした。
【００４４】
２つの基準が使用され、一方で培地中の、かつ他方で１００μＬのＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む培地中の細胞に対応する。２４時間のインキュベーション後、細胞毒性測定を、ホルマザンへのＭＴＴ［臭化３−（４，５ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、ＳＩＧＭＡ］の酸化により生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の活性を測定するテストによって行う。生成されるホルマザンの量は、代謝的活性の生細胞数に正比例する。細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ１ｍｌの媒体を添加する。次に細胞を、３７℃で１００μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍｌ）により３時間インキュベートする。次に１ｍＬの溶解溶液（１０％のＳＤＳ、１０ｍＭのトリス）を各ウェルに添加する。細胞を３７℃で一晩、インキュベートする。媒体を均質化し、かつ光学濃度を、５６０ｎｍで読み取る（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲＸ）。
【００４５】
２）結果。
【００４６】
様々な細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１、ＩＷ  ３５及びＣＥＭ  ４ＦＸ）に対する様々な調製物の毒性を、正帯電分子の濃度に応じて表す（図１〜４）。ＥＷＳ−Ｆｌｉ１有り又は無しのＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（接着細胞）に関して（図１〜２）、５又は１０ＫＤａのキトサンと比較してＣＴＡＢの高い毒性が確認される。更に、５ＫＤａのキトサンは、毒性でなく、かつ細胞生存度を増進させる。
【００４７】
懸濁細胞（ＩＷ３５及びＣＥＭ  ４ＦＸ）に関して（図３及び４）、２つのタイプのキトサン５及び１０ＫＤａは、非常に低い濃度に関して高い毒性を有するＣＴＡＢと比較して高い毒性を有さない。
【００４８】
実施例２：様々な分子量のキトサンの存在下での正帯電ナノ粒子の配合。
【００４９】
ナノ粒子を、乳化重合技術によって調製する（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７９）。ＳＯ２を含む１００μＬのポリイソヘキシルシアノアクリレート［Ｍｏｎｏｒｅｘ（登録商標）」を、１％の非イオン界面活性剤、ポロキサマー１８８を含み、０．５％のシクロデキストリンを含むか、含まず、かつ低分子量（５０００又は１００００Ｄａ）の０．２％のキトサンを含む、ｐＨ＝３に希釈したクエン酸溶液中に添加する。重合時間は、６時間である。重合後、サイズを、ＭｉｌｌｉＱ水中での粒子希釈後に測定し、かつゼータ電位は、ＮａＣｌ  １ｍＭ中での粒子の希釈後に測定した。下記の表１は、キトサンの分子量に応じたナノ粒子のサイズ及びゼータ電位を報告している。
【００５０】
【表１】
2005533078.tif 000002
【００５１】
粒子の直径は、キトサンの分子量に応じて変化しない。多分散性係数の値が証明するように、０．２％の濃度で使用するキトサンの分子量がどのようなものであれ、非常に小さくかつ単分散のナノ粒子が得られる。
【００５２】
これらの粒子のゼータ電位は、正であり、かつ電荷は、キトサンの分子量と無関係である。
【００５３】
実施例３：キトサン及びＣＴＡＢの帯電ナノ粒子の比較毒性の研究。
【００５４】
１）材料及び方法。
【００５５】
ＣＥＭ  ４ＦＸ懸濁細胞を、９６ウェルプレート中にウェル当たり１００００の細胞の割合で植え付けた。ＣＴＡＢ又はキトサン５ＫＤａ及び１０ＫＤａの添加による正電荷を有する、様々な濃度のナノ粒子をテストした。
【００５６】
２つの基準が使用され、一方で培地中の、かつ他方で１００μＬのＮａＣｌ  １５０ｍＭを含む培地中の細胞に対応する。２４時間のインキュベーション後、細胞毒性測定を、ホルマザンへのＭＴＴの酸化により生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素の活性を測定するテストによって行う。生成されるホルマザンの量は、代謝的活性の生細胞数に正比例する。細胞をＰＢＳで洗浄し、かつ１ｍｌの媒体を添加する。次に細胞を、３７℃で１００μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍｌ）により３時間インキュベートする。次に１ｍＬの溶解溶液（１０％のＳＤＳ、１０ｍＭのトリス）を各ウェルに添加する。細胞を３７℃で一晩、インキュベートする。媒体を均質化し、かつ光学濃度を、５６０ｎｍで読み取る（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＭＲＸ）。
【００５７】
２）結果。
【００５８】
ＣＥＭ  ４ＦＸ細胞系統に関して、キトサン５及び１０ＫＤａナノ粒子は、１０μｇ／ｍＬからのみ毒性を示し、他方でＣＴＡＢの帯電ナノ粒子は、１μｇ／ｍＬから毒性である（図５）。
【００５９】
実施例４：オリゴヌクレオチドの帯電ナノ粒子の配合。
【００６０】
オリゴヌクレオチドは、正帯電表面と相互作用することが可能な負帯電巨大分子である。
【００６１】
我々は、ＥＦ３００８ＡＳアンチセンスオリゴヌクレオチドとのＮＰ／キトサンの複合体の配合を研究した。
【００６２】
アンチセンスＯＮは、プロテイン翻訳を抑制するために、ターゲット細胞メッセンジャーｓＲＮＡにより選択的にハイブリダイズできる核配列である。これらのＯＮは、ターゲットｍＲＮＡで、局所的に従来のワトソン−クリックタイプの相互作用によって二本鎖領域を形成する。
【００６３】
１）材料及び方法。
【００６４】
ナノ粒子の原液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、最終濃度で１０ｍＭで、ｐＨ−７のトリス−ＨＣｌ緩衝液中で、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で希釈する。キトサンナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの吸着は、約３０秒間溶液を渦動させた後に、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、３０分間、外界温度で行う。次に複合体を、３０分外界温度でインキュベートする。
【００６５】
ＣＴＡＢ−ＯＤＮのナノ粒子複合体形成は、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、（５μｇのＮＰに対して３μモルのＣＴＡＢの割合で）ＣＴＡＢ及びＯＤＮの存在下で行う。ＯＤＮは、外界温度で攪拌して２時間後に、ＮＰ−ＣＴＡＢに対して吸着される。複合体の調製は、２００μＬの最終体積中で行う。
【００６６】
様々な量（２０、５０、１００、１２５、１５０及び２００μｇ）のＯＤＮ  ３０  ｍｅｒ（ＥＦ３００８ＡＳ）を１００μｇのＮＰ−キトサン５ＫＤａ、ＮＰ−キトサン５〜１０ＫＤａと混合する。
【００６７】
ＯＤＮの帯電ナノ粒子は、ＯＤＮ単独と同様に、３５０００の毎分回転数で（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ８０、ＴＷ５０ロータ、１）、３０分間４℃で遠心分離する。ＮＰに吸着したＯＤＮの量を、上清中の遊離ＯＤＮ量を測定して計算した（図６）。
【００６８】
２）結果。
【００６９】
０．２／１及び０．５／１のＯＮ／ＮＰ比で、キトサン５ＫＤａナノ粒子に対するＥＦ３００８ＡＳアンチセンスＯＮの約１００％の吸着が得られる。キトサン５〜１０ＫＤａナノ粒子に関して、０．２／１のＯＮ／ＮＰ比で、１００％の吸着が得られ、０．５／１のＯＮ／ＮＰ比に移る時、吸着率は８０％である。これら２つのＯＮ／ＮＰ比（０．２／１及び０．５／１）に関して、ＣＴＡＢナノ粒子に対するＯＮの吸着は、最大で１０％に位置付けられる。１／１のＯＮ／ＮＰ比で、キトサン５ＫＤａナノ粒子により８０％のオリゴヌクレオチド吸着率が得られることに注意することは、重要である（図６）。
【００７０】
実施例５：ＮＰに対して吸着されたＯＤＮの保護の研究。
【００７１】
１）材料及び方法。
【００７２】
単独及びＮＰキトサンに結合した完全なＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳを、補体除去した（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅ）ウシ新生仔の１０％の血清中で測定した。種々の複合体を、補体除去したウシ新生仔の１０％の血清によって１２０μＬのＮａＣｌ  １５０ｍＭ中でインキュベートした。様々なインキュベート時間で、１５μＬの試料を採取し、同じ体積のホルムアミド／水（４／１）、０．０１％のブロモフェノールブルー、及び０．０１％のキシレンシアノールの溶液に混合し、かつ−２０℃で凝固させる。ＮＰは、ＮａＯＨにより、ｐＨ＝１２、２時間、３７℃で分解する。その時フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）への二重抽出によってＯＤＮを回収し、かつ次に３０分間、−２０℃で、２％の過塩素酸リチウムを含む１０体積のアセトン中に沈殿させる。
【００７３】
次にＯＤＮを５μＬのホルムアミド／水（４／１）、０．０１％のブロモフェノールブルー、及び０．０１％のキシレンシアノールの溶液中に再び取り、５分間、９５℃で加熱し、次に氷の中に置く。それらを、２０％のポリアクリルアミド、７Ｍの尿素及びＴＢＥ  １Ｘの変性ゲルに対して分析する。ゲルは、ホスホイメージャ（Ｓｔｏｒｍ  ８４０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）でスキャンする。ＯＤＮの分解を、無傷のＯＤＮ及び分解ＯＤＮに対応する帯域の信号報告を行って数量化する。
【００７４】
２）結果。
【００７５】
図７は、ＮＰ−キトサンによるＯＤＮ  ３０  ｍｅｒの良好な保護があることを示す。
【００７６】
実施例６：ＯＤＮの帯電ＮＰ−キトサンによるヒト細胞のトランスフェクション。
【００７７】
１）材料及び方法。
【００７８】
ａ）細胞の調製。
【００７９】
ＣＥＭ４ＦＸヒト細胞を使用した。５０００００の懸濁細胞を、１０％のＳＶＦ（ウシ胎児血清）を含む８５０μｌのＲＰＭＩ媒体中の１２ウェルプレート（ＴＰＰ、スイス）中に植え付ける。
【００８０】
ｂ）細胞のトランスフェクション。
【００８１】
予め調製した１５０μｌのナノ粒子懸濁液を、２４時間細胞と接触させる。
【００８２】
ｃ）細胞の固定。
【００８３】
次に細胞を、蛍光観察を行い得る前に固定する。ナノ粒子の存在下での２４時間の細胞インキュベーション後に、１μｇのヨウ化プロピジウムを、各ウェルに添加する。それにより、死細胞を赤く着色して、認めることが可能になる。
【００８４】
次に細胞を、１０００回転／分で５分間、遠心分離する。上清を採取し、かつ細胞をＰＢＳによりもう一度洗浄する。４％のホルムアルデヒドを含む２００μｌのＰＢＳを、その時に添加し、かつ細胞を、外界温度で３０分間置く。次に細胞をＰＢＳ  ０．１Ｘで２回洗浄する。滅菌水によるもう一つの洗浄を同様に行い、終了する。２０μＬのポリリジンを最後に添加する。細胞の観察を、４８０ｎｍのフィルタを備えた顕微鏡で行う。
【００８５】
２）結果。
【００８６】
図８、９及び１０の各観察を、７塩基及び１１塩基の２つのタイプのオリゴヌクレオチドに関して行った。
【００８７】
キトサン５ＫＤａ−ＯＤＮナノ粒子存在下での細胞は、非常に蛍光性であり、かついかなる毒性も目に見えない。キトサン５ＫＤａ−Ｃｙｄ−ＯＤＮナノ粒子配合の存在下で、それらは、同様に蛍光性であるが、幾つかの死細胞が見える。
【００８８】
キトサン１０ＫＤａ−Ｃｙｄ−ＯＤＮナノ粒子は、同様に良好な蛍光を有するが、５ＫＤａ−Ｃｙｄ−ＯＤＮナノ粒子より僅かに高い毒性も有する。３０ＫＤａ−Ｃｙｄ−ＯＤＮナノ粒子の存在下で、細胞は、同様に非常に蛍光性であるが、死細胞数は、前の２つの場合よりも更に高い。
【００８９】
ＣＴＡＢ−Ｃｙｄ−ＯＤＮナノ粒子の存在下でインキュベートする細胞の場合に、蛍光は低く、かつ毒性は非常に高い。ＣＴＡＢ−ＯＤＮ複合体は、いかなる細胞蛍光も示さない。
【００９０】
サイトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｅ）−ＯＤＮの存在下でインキュベートする細胞の場合に、いかなる細胞蛍光も観察されない。
【００９１】
実施例７：プラスミド−ＮＰ−キトサン複合体によるＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１細胞のインビトロトランスフェクション。
【００９２】
１）材料及び方法。
【００９３】
ａ）ローダミンに結合したプラスミド。
【００９４】
１０μｇのβ−ガラクトシダーゼプラスミドは、赤色蛍光体オレゴングリーン５４６［ＵＬＹＳＩＳ（登録商標）核酸ラベリングキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ］によって標識を付ける。この蛍光体は、赤色蛍光を与える（Ｅｘ／Ｅｍは、５５５／５７０である）。
【００９５】
１μｇの標識を付けたプラスミド、及び３μｇの標識を付けないプラスミドを、２００μＬのＮａＣｌ中で１５０ｍＭでＮＰ−キトサンに混合し、かつ渦動させ、次に３０分間外界温度でインキュベートする。６０〜７０％の融合に達するために、ＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１接着細胞を、トランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレート（ＴＰＰ、スイス）中に植え付ける。
【００９６】
トランスフェクションの３０分前に、細胞をウェル当たり２ｍＬのＰＢＳ  １Ｘにより洗浄し、次に２％のＳＶＦを含む８００μＬのＤＭＥＭを各ウェルに添加する。複合体（２００μＬ）を、１６時間、３７℃でＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１細胞と接触させる。蛍光細胞の画像を、写真中に示す（図１１Ｂ及び１１Ｄ）。
【００９７】
２）結果。
【００９８】
キトサンナノ粒子に結合される時、細胞蛍光が観察される（図１１Ｂ及び１１Ｄ）。
【００９９】
実施例８：ＮＰ−キトサン５ＫＤａによってベクター化されるｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドによるβ−ガラクトシダーゼのインビボ発現の誘導。
【０１００】
１）材料及び方法。
【０１０１】
ａ）動物の治療。
【０１０２】
ＥＷＳ−Ｆｌｉ１細胞は、発がん遺伝子ＥＷＳ−Ｆｌｉ１によるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のトランスフェクションによって得られる。それらを次に培養する。細胞が７０％の融合に達した時、６．５×１０６の細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳ中で懸濁される。その後これらの細胞をヌードマウスに１．３×１０６の細胞／マウスの割合で皮下接種する。細胞接種の７日後（腫瘍は肉眼で見えるようになる）、動物を、１０μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドに結合した１００μｌのＮＰ−キトサン５ｋＤａ（６０μｇ）か、１００μｌのｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（１０μｇ）によって治療する。治療の２４時間後、腫瘍を、Ｇｌｙｏ−Ｆｉｘｘ（Ｓｈａｎｄｏｎ）中に浸漬した後、組織学研究のために採取する。
【０１０３】
ｂ）免疫組織化学技術による腫瘍中のＧＦＰの発現検出。
【０１０４】
腫瘍断片を、パラフィン中に流し、かつヘマテイン−エオシン−サフラニン溶液によって標識を付ける。β−ｇａｌタンパクは、抗β−ｇａｌ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１：３０）によって４μｍの腫瘍断片の切片に対して検出し、かつカウンターマーキング（ｃｏｎｔｒｅ  ｍａｒｑｕａｇｅ）の後に、Ｐｏｗｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）が続き、試料は、ＣＤＤカメライメージングシステムカメラ（Ｓｏｎｙ）に結合した顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で観察する。
【０１０５】
２）結果。
【０１０６】
２４時間後のβ−ｇａｌ活性は、動物が、ＮＰ−キトサン５ｋＤａに結合されたｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドによりトランスフェクトされる時にのみ観察され（図１２Ｂ）、他方、動物がｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド単独によってトランスフェクトされる時、β−ｇａｌ活性には気が付かない（図１２Ａ）。
【０１０７】
実施例９：ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１細胞中のキトサン５及び１０ＫＤａナノ粒子によってベクター化されるアンチセンスＯＤＮの細胞内浸透。
【０１０８】
１）材料及び方法。
【０１０９】
ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１細胞を、ウェル当たり１０００００の細胞の割合で薄板［４ウェルｌａｂｔｅｋ（登録商標）、Ｎｕｎｃ  Ｉｎｃ．］に取り付けられた培養チャンバ中で、ピューロマイシン無しで培地中にトランスフェクションの２４時間前に植え付けられる。細胞を、ＰＢＳですすぎ、かつ５：１、１０：１及び２０：１の質量比でＮＰ−キトサン：ＯＤＮ−ＦＩＴＣの様々な複合体の存在下で、２．５％のＳＶＦ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを追加した４００μｌのＯＰＴ１−ＭＥＭ１媒体中で２４時間インキュベートする。これらの複合体は、１００μｌの最終体積に対して、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ中で調製する。２つの基準が使用され、一方で遊離ＯＤＮ  Ａｓ−ＦＩＴＣ（１μｇ）でインキュベートした細胞に、かつ他方で１ｎモルのフルオレセイン（Ａｌｄｒｉｃｈ）によってインキュベートした細胞に対応する。ＯＤＮ  ＡＳ−ＦＩＴＣの細胞中への浸透は、倒立顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ／Ｅに取り付けるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＮＴ装置（Ｌｅｉｃａ）を用いた共焦点顕微鏡によって視覚化する。
【０１１０】
２）結果。
【０１１１】
いかなる蛍光細胞も観察されなかった。ＦＩＴＣ単独及びＯＤＮ  ＡＳ−ＦＩＴＣによるインキュベーション後に。図１３Ａ及び１３Ｂの画像は、ＮＰ−キトサン５ＫＤａ：ＯＤＮ  ＡＳ−ＦＩＴＣ、及びＮＰ−キトサン１０ＫＤａ：ＯＤＮ  ＡＳ−ＦＩＴＣ複合体によって（５：１）の比率でそれぞれインキュベートした細胞の場を示す。それらは、ＯＤＮ−ＦＩＴＣがＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化される時、蛍光はサイトゾル中に分散し、かつＮＰ−キトサン１０ｋＤａの場合に核のレベルで濃縮されることを示している。図１４Ａ及び１４Ｂのグラフは、細胞の様々なＺ平面中で記録された蛍光の強さの和を示す。０〜１μｍの深さに関して、蛍光は、細胞の頂端膜のレベルに位置する。８〜９μｍの深さは、その基底膜に対応する。１〜８μｍの間で、蛍光は細胞内のレベルで局所化される。これらのグラフは、ＮＰ−キトサン：ＯＤＮ比が５：１で２つのタイプのＮＰ−キトサンに関して、蛍光が、ＯＤＮ−ＦＩＴＣを含む培地に曝された頂端膜中よりも細胞の基底膜レベルで低いことを示している。ＮＰ−キトサン：ＯＤＮ比（５：１）での２つのタイプのＮＰ−キトサンに関して、蛍光は、細胞内分画中に大部分が局所化される。これらのグラフは、ＯＤＮ  ＡＳが細胞中に浸透することを確認している。細胞内部での蛍光の強さは、ＯＤＮ−ＦＩＴＣがＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化される時により大きい。蛍光の細胞局所化は、２つのタイプのＮＰ−キトサンに関する比（５：１）とＮＰ−キトサン：ＯＤＮ比（１０：１）及び（２０：１）に関して同じである。
【０１１２】
実施例１０：皮下形状のユーイング肉腫が現れた、ヌードマウスへのＮＰ−キトサンの腫瘍内投与後の腫瘍成長の抑制。
【０１１３】
１）材料及び方法。
【０１１４】
生後６〜８週間の３５匹の雌ヌードマウスに５グレイで放射線を照射する。放射線照射の２４時間後、マウスは、ＰＢＳ中の５×１０６の細胞／ｍｌで２００μｌのＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の懸濁液を右脇腹中に皮下から受ける。１４〜２１日後、動物に腫瘍が現れた。７匹の動物の４グループを構成する（ＰＢＳグループ、ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳグループ、ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳグループ、及び対照ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮグループ）。グループは、無作為化され、かつ治療は、腫瘍が２ｍｍ３に達した時に開始する。治療は、２日の間隔を置いた生成物の５回の腫瘍内投与からなる。治療の効率は、基準に対する治療した動物の腫瘍成長の測定によって評価する。腫瘍成長は、腫瘍体積（ＶＴ）によって評価する。ＶＴは、次のように計算する：ＶＴ（ｍｍ３）＝ａ２ｘｂ／２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の最小及び最大直径を表す）。結果の統計分析は、情報処理ソフトウェアＳｔａｔＶｉｅｗ（登録商標）（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＵＳＡ）を用いて行う。
【０１１５】
２）結果。
【０１１６】
腫瘍成長の抑制結果（図１５）は、動物をＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ及びＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳによって治療する時の成長の抑制を示している。しかしながら、ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳを受けた動物に対して、動物をＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳによって治療する時の、より大きな成長抑制に気が付く。ＰＢＳ又は対照ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮを受けた基準動物は、腫瘍成長の低い抑制を示している。
【０１１７】
実施例１１：皮下形状のユーイング肉腫が現れたマウスへの静脈内治療投与後の腫瘍成長の抑制。
【０１１８】
１）材料及び方法。
【０１１９】
生後６〜８週間の３６匹の雌ヌードマウスに５グレイで放射線を照射する。放射線照射の２４時間後、マウスは、ＰＢＳ中の５×１０６の細胞／ｍｌで２００μｌのＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の懸濁液を右脇腹中に皮下から受ける。１０〜２０日後、動物に腫瘍が現れた。６匹の動物の６グループを構成する［ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ／ＮＰ）、ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ）、対照ＯＤＮ（ＯＮ  ＣＯＮ）、対照ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ（ＯＮ  ＣＯＮ／ＮＰ）、ＮＰ−キトサン５ｋＤａ（ＮＰ）、及び０．９％でのＮａＣｌ（ＮａＣｌ）グループ］。グループは、無作為化され、かつ治療は、腫瘍が１０〜４０ｍｍ３に達した時に開始する。治療は、２又は３日の間隔を置いた生成物の５回の静脈内投与からなる。治療の効率は、基準グループに対する治療された動物グループの１４日目の腫瘍体積の寸法及び１日目の腫瘍体積の寸法の間の比率の平均によって１５日後に評価する。腫瘍体積は、実施例１０のように評価する。
【０１２０】
２）結果。
【０１２１】
腫瘍成長の結果（図１６）は、動物をＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳグループ）及びＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ／ＮＰ）によって治療する時の成長の抑制を示している。しかしながら、ＮＰ−キトサン無しのＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳグループ）を受けた動物に対して、動物をＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ／ＮＰグループ）によって治療する時の、より大きな腫瘍成長抑制に気が付く。ＮａＣｌ、ＮＰ−キトサンのみ（ＮＰグループ）、又はＮＰ−キトサン有り又は無しの対照ＯＤＮ（それぞれＯＮ  ＣＯＮ／ＮＰ及びＯＮ  ＣＯＮグループ）を受けた対照グループの動物は、腫瘍成長の低い抑制を示している。
【０１２２】
実施例１２：ＧＦＰタンパクの発現抑制、及びナノ粒子によってベクター化されたｓｉＲＮＡによるインビボでのＧＦＰタンパクのｍＲＮＡの発現抑制。
【０１２３】
１）材料及び方法。
【０１２４】
単層培養でＧＦＰによってトランスフェクトされたＨｅＬａ接着細胞（ＨｅＬａ−ＧＦＰ）は、７０％の融合に達した時に採取し、かつの１×１０７の細胞／ｍｌの割合でＰＢＳ中で懸濁に戻す。次に細胞は、２×１０６の細胞／マウスの割合でヌードマウスの右脇腹中に皮下投与される。細胞接種の７日後、動物を異なるグループに分け、かつ次のように、異なる調製物の腫瘍内投与によって治療する。
【０１２５】
グループ１（ｓｉＲＮＡの１０μｇのターゲット二本鎖ＯＮ  ＧＦＰを含む１００μｌの調製物）、グループ２（１００μｌの対照ｓｉＲＮＡのみ）、グループ３（１０μｇのＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化された１００μｌの対照ｓｉＲＮＡ）、グループ４（１００μｌのＧＦＰアンチセンスＯＮのみ）、グループ５（ＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化された１００μｌのＧＦＰアンチセンスＯＮ）。治療の２４時間後、腫瘍を採取し、かつ２つの部分に分割する。組織学研究のための部分は、ＧｌｙｏＦｉｘｘ（Ｓｈａｎｄｏｎ）溶液中に浸漬し、かつノーザンブロットに使用する部分は、液体窒素中で保存する。
【０１２６】
ａ）免疫組織化学技術による腫瘍中のＧＦＰの発現検出。
【０１２７】
腫瘍断片を、パラフィン中に流し、かつヘマテイン−エオシン−サフラニン溶液によって標識を付ける。ＧＦＰは、抗ＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（１：３０）によって４μｍの切片に対して検出し、かつカウンターマーキングの後に、Ｐｏｗｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣＡ）が続き、試料は、ＣＤＤカメライメージングシステムカメラ（Ｓｏｎｙ）に結合した顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で観察する。
【０１２８】
ｂ）ノーザンブロット法による腫瘍中のＧＦＰのｍＲＮＡの発現検出。
【０１２９】
腫瘍断片を、０℃で４００μｌのグアニジンチオシアネート４Ｍ、２５ｍＭのクエン酸Ｎａ（ｐＨ７）、０．５％のサルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）、及び０．１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む溶液中で破砕した。均質化後に、ＲＮＡを次のようにフェノール中で抽出した。４０μｌの酢酸Ｎａ  ２Ｍの溶液（ｐＨ４）を、４００μｌのフェノール飽和Ｈ２Ｏ、及び１２０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）に添加する。混合物は、１３００の毎分回転数で１５分間、遠心分離する。３００μｌの水相は、３００μｌのイソプロパノールにより−２０℃で沈殿する。このようにして得た残渣は、７０％のエタノールにより洗浄する。乾燥後、残渣を１０μｌの蒸留Ｈ２Ｏにより、取り戻す。２μｇのＲＮＡ全体の電気泳動は、６．３％のホルマリンを含むＭＯＰＳ緩衝液中でアガロースゲル１％に対して行った。ＲＮＡを、ＳＳＣ緩衝液（１０Ｘ）中のニトロセルロース膜（ＢＡ−Ｓ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｈｕｅｌｌ）上に移した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、Ｐｒｉｍｅ−ａ−ｇｅｎｅラベリングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びα３２−Ｐ  ｄＣＴＰ  ３００  ｃｉ／ｍＭ（ＩＣＮ、フランス）によって標識を付けた７７０ｐｂのＧＦＰのｃＤＮＡ断片により、ノーザンブロット法によって検出する。洗浄後、ニトロセルロース膜を、ホスホイメージャＳｔｏｒｍ  ８４０によって分析した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）。
【０１３０】
２）結果。
【０１３１】
ＧＦＰの合成抑制は、図１７（Ｄ）に示すように、ｓｉＲＮＡがＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化された時にのみ観察された。他の全ての場合において、ＧＦＰの抑制には気が付かない（図１７Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥ）。ＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化したｓｉＲＮＡのアンチセンス活性を、ノーザンブロット法によって確認する。ｓｉＲＮＡをナノ粒子によってベクター化する時、２４時間後に５０％のＧＦＰのｍＲＮＡの合成抑制に気が付く（図１８）。これらの結果は、ナノ粒子によってベクター化されるｓｉＲＮＡが、インビボでＧＦＰの発現遺伝子に干渉することを証明している。
【０１３２】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１細胞に対する様々な調製物の毒性を表す。
【図２】ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に対する様々な調製物の毒性を表す。
【図３】ＩＷ  ３５細胞に対する様々な調製物の毒性を表す。
【図４】ＣＥＭ  ４ＦＸ細胞に対する様々な調製物の毒性を表す。
【図５】２４時間のインキュベーション後のＣＥＭ４ＦＸ細胞に対するＮＰ  キトサン５ＫＤａ及び５〜１０ＫＤａ、並びにＮＰ  ＣＴＡＢの毒性を表す。
【図６】キトサン５ＫＤａナノ粒子及びＣＴＡＢナノ粒子に対するＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳの吸着を表す。
【図７】ＯＮ  ＥＦ３００８ＡＳの安定性を表す。
【図８】ＣＥＭ４ＦＸ細胞中のＯＮ  １１  ｍｅｒ（Ｄ）及びＯＮ  ７  ｍｅｒ  ＯＰＣ（Ｂ）とのキトサン５ＫＤナノ粒子を示す。
【図９】ＩＷ  ３５細胞中のＯＮ  １１  ｍｅｒ  Ｆｌｕｏとのキトサン５ＫＤナノ粒子を示す。
【図１０】ＯＮ  ＥＦＡＳ  ３０−ｍｅｒとのキトサン５ＫＤａ（Ａ）及び５〜１０ｋＤａ（Ｂ）のナノ粒子を示す。
【図１１】プラスミド−ＮＰ−キトサン複合体によるＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＷＳ−Ｆｌｉ１細胞のインビトロトランスフェクションの際に、ローダミンで標識を付けたプラスミド浸透を表す。
【図１２】抗β−ｇａｌ抗体による免疫マーキング後にヌードマウスに対し移植したＮＩＨ−３Ｔ３  ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１細胞中のβ−ｇａｌの発現を表す。（Ａ）１０μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドによるトランスフェクション、（Ｂ）６０μｇのＮＰ−キトサン５ｋＤａに結合された１０μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミドによるトランスフェクション。
【図１３】共焦点顕微鏡検査による観察後に、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＥＷＳ／Ｆｌｉ−１細胞中のＮＰ−キトサン＜５ｋＤａ（Ａ）及びキトサン５〜１０ｋＤａ（Ｂ）によりベクター化されたＯＮ  ＥＦ３００８ＡＳ−ＦＩＴＣの局所化を表す。
【図１４】共焦点顕微鏡レーザーによる細胞の場の走査後に、ＮＰ／キトサン＜５ｋＤａ（Ａ）及びキトサン５〜１０ｋＤａ（Ｂ）によりベクター化されたＯＮ  ＥＦ３００８ＡＳ−ＦＩＴＣの細胞内局所化を表す。
【図１５】皮下形状のユーイング肉腫が現れた、放射線を照射したヌードマウスへのＰＢＳ、ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ、対照ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ、及びＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳの腫瘍内投与後の腫瘍成長の抑制を表す。
【図１６】皮下形状のユーイング肉腫が現れた、放射線を照射したヌードマウスへのＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ／ＮＰ）、ＯＤＮ  ＥＦ３００８ＡＳ（ＯＮ  ＡＳ）、対照ＯＤＮ（ＯＮ  ＣＯＮ）、対照ＮＰ−キトサン５ｋＤａ  ＯＤＮ（ＯＮ  ＣＯＮ／ＮＰ）、ＮＰ−キトサン５ｋＤａ（ＮＰ）、及びＮａＣｌの静脈内注射後の腫瘍成長の抑制を表す。
【図１７】免疫組織化学技術による腫瘍中のＧＦＰタンパクの発現検出を表す：Ａ（腫瘍切片）、Ｂ（アンチセンスｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後の腫瘍切片）、Ｃ（対照ｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後の腫瘍切片）、Ｄ（ＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化されたアンチセンスｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後の腫瘍切片）、Ｅ（ＮＰ−キトサン５ｋＤａによってベクター化された対照ｓｉＲＮＡの腫瘍内投与後の腫瘍切片）。
【図１８】ノーザンブロット法によるＧＦＰタンパクのｍＲＮＡ合成の抑制検出を表す。ＧＦＰ  ｍＲＮＡは、２８ｓ  ｍＲＮＡによって規格化された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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