(57)【要約】本発明は、10-30塩基対長の二本鎖RNAであらゆる可能配列を発現のすべての可能な配列を発現できるプラスミドまたはウイルスのベクターに基づいたDNAライブラリー、に関する。本ライブラリーにおいては、各二本鎖RNAは単一のヘアピン型RNA分子によって、或いは、異なる３’-突出端を備えた2つの別々のRNA分子によって形成される。このようなDNAライブラリー中の各メンバーは前述のように、あらゆる二本鎖RNAのコンポーネントをコードする。このライブラリーは、標的遺伝子に関する知識なしに、特定の表現型を誘導する二本鎖ＲNAを選別するために、使用することができる。本発明はさらにこのDNAライブラリーの作製方法に関する。
2005529624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ部位をコードするＤＮＡ領域の配列が核酸のあらゆるヌクレオチドの位置にランダムに配され、それらのＲＮＡの二本鎖の両鎖が一種類のＤＮＡライブラリーにより産生されるような生細胞中の１０から３０塩基のうち、あらかじめ定められた長さの二本鎖ＲＮＡのライブラリーを生産するためのＤＮＡライブラリー。
【請求項２】
二本鎖ＲＮＡ部位をコードするＤＮＡ領域の配列が核酸の少なくとも１９のヌクレオチドの位置でランダムに配され、それらのＲＮＡの二本鎖の両鎖が一種類のＤＮＡライブラリーにより産生されるような生細胞中の１９から３０塩基のうち、あらかじめ定められた長さの二本鎖ＲＮＡのライブラリーを生産するためのＤＮＡライブラリー。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡ部位をコードするＤＮＡ領域の配列が核酸に少なくとも１５のヌクレオチドの位置でランダムに配され、それらのＲＮＡの二本鎖の両鎖が一種類のＤＮＡライブラリーにより産生されるような生細胞中の１５から３０塩基のうち、あらかじめ定められた長さの二本鎖ＲＮＡのライブラリーを生産するためのＤＮＡライブラリー。
【請求項４】
二本鎖ＲＮＡ部位をコードするＤＮＡ領域の配列が核酸に少なくとも４、７または１０のヌクレオチドの位置にランダムに配され、それらのＲＮＡの二本鎖の両鎖が一種類のＤＮＡライブラリーにより産生されるような生細胞中の１０から３０塩基のうち、あらかじめ定められた長さの二本鎖ＲＮＡのライブラリーを生産するためのＤＮＡライブラリー。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡ部位をコードするＤＮＡ領域の配列が核酸の4から全てのヌクレオチドの位置にランダムに配され、それらのＲＮＡの二本鎖の両鎖が一種類のＤＮＡライブラリーにより産生されるような生細胞中の１０から３０塩基のうち、あらかじめ定められた長さの二本鎖ＲＮＡのライブラリーを生産するためのＤＮＡライブラリー。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーであって、その二本鎖ＲＮＡ分子が、その片側または両側に一本鎖領域を含むもの。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーであって、それぞれのＤＮＡライブラリーが二本鎖ＲＮＡの転写のための一のプロモーターと、二本鎖ＲＮＡの翻訳のための一のターミネーターを有し、そのＲＮＡがヘアピンタイプの二本鎖ＲＮＡを形成するもの。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーであって、それぞれのＤＮＡライブラリーが二本鎖ＲＮＡの構成部の転写のため少なくとも二のプロモーターと、二本鎖ＲＮＡの構成部の翻訳のための少なくとも二のターミネーターを有し、そのＲＮＡが二の解離状態のＲＮＡ分子であって、二本鎖領域について互いに相補的であるもの。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーであって、プラスミドベクターによって構築されたＤＮＡライブラリー。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーであって、ウィルスベクターによって構築されたＤＮＡライブラリー。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーで、そのライブラリーのランダムさが、そのランダムなＤＮＡのヌクレオチドをベクターにクローニングする前に、ソースからの全ＲＮＡ調製または全ｍＲＮＡ調製とのハイブリダイゼーションによって、ソースＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを続いてベクターに入れるように、修飾されているものであって、ソースが細胞、細胞株、組織または生物であるもの。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーを含むキット。
【請求項１３】
請求項１ないし６および８ないし１０のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーを、変異したＨ１プロモーターの一組をその２つのプロモーターの間に挿入されたＤＮＡからのＲＮＡの発現を動かすために両側に組み込んだものであって、その変異したＨ１プロモーターが野生型Ｈ１プロモーターと少なくとも配列が転写開始部位の直後の５残基領域において異なるもの。その変異したＨ１プロモーターの５残基はＡＡＡＡＡである。
【請求項１４】
請求項１ないし１２のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーから得られるＲＮＡライブラリーであって、生産される二本鎖ＲＮＡの長さが１０から３０ヌクレオチドの範囲にあるもの。
【請求項１５】
請求項１ないし１２のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーについて、そのライブラリーを一過的または恒常的に細胞中に混合物として導入する方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１２のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーを用いて生物的機能を有する二本鎖ＲＮＡを探索する方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１２のいずれかに記載のＤＮＡライブラリーを用いて新規遺伝子を探索する方法。
【請求項１８】
請求項１５乃至１７のいずれかに記載の方法によって得られる新規遺伝子。
【請求項１９】
請求項１５乃至１７のいずれかに記載の方法によって得られる遺伝子の新規機能。
【請求項２０】
請求項１５乃至１７のいずれかに記載の方法で得ることのできる薬剤の構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、10-30塩基対長の二本鎖RNAであらゆる可能配列を発現のすべての可能な配列を発現できるプラスミドまたはウイルスのベクターに基づいたDNAライブラリー、に関する。本ライブラリーにおいては、各二本鎖RNAは単一のヘアピン型RNA分子によって、或いは、異なる３’-突出端を備えた２つの別々のRNA分子によって形成される。このようなDNAライブラリー中の各メンバーは前述のように、あらゆる二本鎖RNAの構成要素をコードする。このライブラリーは、標的遺伝子に関する知識なしに、特定の表現型を誘導する二本鎖ＲNAを選別するために、使用することができる。本発明はさらにこのDNAライブラリーの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーRNA(mRNA)は、蛋白質の合成において、情報を媒介するものとして、理解されている。mRNA はRNAポリメラーゼによって、DNA鋳型より転写される。その後リボソームで、翻訳タンパク質分子を生成する。近年、タンパク質分子へまったく翻訳されないRNA分子の多くの遺伝子が転写されることが報告され、実証されている（Okazak; y等、Al、 ネイチャー、20(6915):563-573(2002)）。翻訳されないRNAの一部は配列特異な方法で、mRNAの分解を引き起こし、mRNAの機能を調節する機能を有することが発見された(Ambros V，cell； 113 ( 6 ) : 673-676 ( 2003 ) )。 これは二本鎖RNAまたは合成されたsiRNAは、広範囲の生物の中で、相同mRNAの分解を引き起こすことができるという近年の発見とよく一致する。長い二本鎖RNAは、哺乳動物の細胞の中にいるRNA合成に対して、強い非特異性の抑制を引き起こすことが知られるが、siRNAについてはこのような障害を避け、シーケンス同一性を共有する標的遺伝子に対する、強い抑制を維持することができる(Elbashir SMなど，Nature； 411 ( 6836 ) : 494-498  ( 2001 ) )。以上より、siRNAは機能性遺伝学において、遺伝子を毀す主要なツールとされている。さらに、 siRNAは疾病に関連する遺伝子の活性を下げることにより、その疾病を治療する薬剤としてもちいられる可能性がある。
【０００３】
siRNAは一般的には1９-２５の塩基対二本鎖RNAで、単一のヘアピンRNA分子、或いは、異なる３’-突出端の２つの別個のRNA分子によって形成される。siRNAは化学合成による方法、もしくはDNAベクターからプロモーターの駆動により発現する方法、またはRNA酵素III(Dicer)で、長い二本鎖RNAを切断して得る方法という三種類の方法のいずれかにより作製される。これまでに用いられるsiRNAは予想される遺伝子のセグメントを標的として、設計された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、各のライブラリーがある一定の長さをもつ二本鎖RNAにあらゆる置換（パーミューテーション：置換の定義については後述）を含むものよりなる、ＤＮＡライブラリーに関する。このようなDNAライブラリーは、容易に形成され、すべての異なる配列のsiRNAを生産するために用いられる。そして、このライブラリーは、標的遺伝子によらずに、独立したやり方で、特定の表現型と関係するRNA(およびsiRNA)をハイスループットにスクリーニングする方法を提供する。より明確に言えば、このようなライブラリーによってコードされたsiRNAは、個別または複雑な混合物のいずれのスクリーニングにも、それ自身または標的遺伝子の配列を知ることなく用いることができる。この方法はsiRNAを用いる場合の以下の２つの主要な問題点を克服できる。すなわち、
1)   生物のトランスクリプトームについての情報が不十分である。近年、マウスのトランスクリプトーム解析により、最もよく理解されている動物についてすら、トランスクリプトームに関する知識は、非常に不完全であることが示された。人間および他の動物のトランスクリプトームに関しては、さらによく知られていない。我々のライブラリーを用いれば、標的配列についての情報は不要であり、どのような生物であっても全ゲノムのsiRNAのスクリーニングを短時間で行うことができる。
2) siRNAのコストが非常に高い。どのような調製法によっても、ある生物のすべての既知mRNAを標的とするsiRNAを調製すれば、作製コストは非常に高い。どのような生物にも用いることのできる、すべての置換ＳｉＲＮＡを含む複製可能なＤＮＡライブラリーは、siRNAの生産コストを最低限に減らすことができる。
【０００５】
従って、ある側面からは、本発明は生細胞中で、10-30の範囲であらかじめ決定された長さの塩基対の二本鎖RNA分子ライブラリーを生産するDNAライブラリーに関する。この生産方法では、二本鎖ＲＮＡの二本鎖部位をコードするＤＮＡ領域が４から全ての核酸にランダムにあり、そこでは前述の二本鎖ＲＮＡのいずれの鎖とも、一種類のライブラリーより生産される。本発明はこのようなDNAライブラリーを含むキットを提供する。
【０００６】
また別の側面からは、本発明はこのようなDNAライブラリーを調製する方法を提供するものである。
【０００７】
また、別の側面からは、このようなDNAライブラリーから得られたRNAライブラリーに関するものである。
【０００８】
以下の詳細な説明および付属の請求項より、本発明のさらなる側面及び長所について説明する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
小さな干渉ＲＮＡ (siRNA)は、3'-UUかTT、あるいは他の単一なストランド突出端に挟まれた19-21ntの二本鎖領域をもっている短い二本鎖RNAを定義する用語として最初に用いられた。近年、オリジナルのsiRNAの様々な変異体 (ヘアピン型など)が導入された。このようなsiRNAはさまざまな生物の細胞中で、そのsiRNAの二本鎖領域と同一のシーケンスをもつ遺伝子の発現を減少するために使用される。より長い二本鎖DNAとRNAが本発明の方法によって生産することができる一方、生細胞をトランスフェクションに用いるためには、３０以上の塩基配列は免疫応答やそのほかの有害な副作用を生じさせるおそれがあるため、本発明のライブラリーは長さの１０−３０の塩基対の二本鎖のDNAとRNAに限定される。
【００１０】
siRNAは初期においては化学合成により作製された。しかし、現在はＴ７プロモーターなどのウイルスプロモーター或いはH 1やU6のようなミクロRNAプロモーターを採用して、フリーの状態、或いはプラスミドの中で、酵素によってsiRNAを生成するいくつかの方法が紹介されている。
【００１１】
本発明は、ランダムsiRNAをコードできるDNAライブラリーを構築する方法を提供する。本ライブラリーが先行技術と異なる点は、先行技術中では遺伝子の既知配列に基づいてsiRNAを設計しなければならなかったところ、本発明のライブラリーを用いれば、完全にランダムの異なるsiRNAをスクリーニングし、それぞれのＳｉＲＮＡに関連する表現系を探し、de novoでそれぞれのsiＲＮＡに関連する遺伝子を特定することができる（対応するシーケンス、或いはターゲット遺伝子のシーケンスが未知でよい）。
【００１２】
単一のランダム領域を持つDNAライブラリーの構築
完全にランダムなＤＮＡライブラリーを、あらゆる置換配列のsiRNAをコードするプラスミドまたはウィルスベクターに基づいて作製しようという試みは、ＤＮＡライブラリーの各々のメンバーが相異なる完全な二本鎖ＲＮＡを発現することを確認するものである。ベクターに基づいてsiRNA(短い二本鎖RNA)を作る既存の方法にはこれを超えるものはない。
【００１３】
本発明は、ランダム領域を一箇所のみに設けたランダムDNAライブラリーの構築について、説明する。本発明においては、各プラスミド中の、二つのプロモーターが反対の方向からこの領域を転写することにより、相補的な 二本鎖RNAを生成する。二箇所のターミネーターがランダム領域の両末端に設けられ、両方向から、特定の長さを持つRNAを得ることができる。このアプローチの利点は、二本鎖領域のシステムを用いることで、後述のような、それぞれの相補的区域を個別のプラスミドを用いてクローニングするという煩雑な手順を省くことができるということである。このようなシステムで、使用できるプロモーターとしてRNAポリメラーゼIIIプロモーターH1あるいはU6が例としてあげられる。RNAポリメラーゼIIIについては、転写を適切に終らせる為に TTTTTという配列が必要である。このRNAポリメラーゼで、両方向から同じ領域の発現を行うために、TTTTTをランダム領域の両端に挿入しなければならない。しかしながら、そのためには次の問題がある。すなわち、ランダム領域の最初の正確な地点から、適切な転写を行うために、RNAポリメラーゼIIIプロモーターはランダム領域に隣接して設けられる必要があるが、それらのプロモーターは反対方向のTTTTTターミネーターに対応するAAAAA伸長を含んでいない。これを可能にする唯一の方法はRNAポリメラーゼIIIプロモーターを変異させて、AAAAA伸長を挿入することであるが、AAAAA伸長の挿入が転写の開始および転写の割合に対して、どのように影響するかは知られていない。下記に示されるように、我々はRNAポリメラーゼIII H1プロモーターを変異させて、それに、このプロモーターの末端にAAAAA伸長を挿入する。変異したプロモーターは適切な転写開始をもたらし、有効なsiRNAを生み出す。したがって、我々はまずターミネーションシグナルをランダム領域の両側に置くプラスミドライブラリーを構築するところから始める。（図１）
【００１４】
ウミシイタケルシフェラーゼに対するデュアルH1プロモーターベクターの構築
二つの変異したRNAポリメラーゼIIIプロモーターを有するプラスミドであって、各プロモーターに、別のプロモーターのための転写ターミネーターシーケンスを挿入されたプラスミドを、ウミシイタケルシフェラーゼを標的とするsiRNAについて構築した(図２)。このようなプラスミドが、単一の19 bpのターゲット配列から、効果的なsiRNAの二本鎖体をうまく生産することができたという発見は重要であり、単一のランダム領域を持って、完全にランダムなsiRNAライブラリーを構築する基礎を形成する可能性を示す。
【００１５】
H 1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターの変異およびサンプルとするプラスミドの構築について、詳細を以下に述べる。
【００１６】
1. pBluescript II KS-H1ベクター(Brummelkamp TRら、Science (296(5567): 550-553(2002))のＢｇｌＩＩサイトのすぐ上流の３残基を削除する。そして、次のプライマーを用いて、もとのベクターのEcoR I-Bgl II(H 1プロモーター)の間の断片を増幅する。
5'プライマー:  GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCG
3'プライマー:GAAGATCTGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC
(変異１： 後述のとおりAAAAA 配列を挿入した場合にも、転写が適切な位置からスタートするために、ちょうどBgl IIサイトの上流にある3つのヌクレオチドを削除する)。
【００１７】
PCR製品のEcoR I-Bgl II断片をオリジナルのpBluescript II KS―H 1(Brummelkamp TR等、上に引用された)ベクターにクローニングする。シーケンシングにより配列を確認した。
修飾された配列
001 TCCAGGNANC GCGGGCCCAG TGTCACTAGG CGGGAACACC CAGCGCGCGT
051 GCGCCCTGGC AGGAAGATGG CTGTGAGGGA CAGGGGAGTG GCGCCCTGCA
101 ATATTTGCAT GTCGCTATGT GTTCTGGGAA ATCACCATAA ACGTGAAATG
151 TCTTTGGATT TGGGAATCTT ATAAGTTCTG TATGAGACAG ATCTTCAATA
201 TTGGCCATTA GCCATATTAT TCATTGGTTA TATAGCATAA ATCAATATTG
251 GCTATTGGCC ATTGCATACG TTGTATCTAT ATCATAATAT GTACATTTAT
301 ATTGGCTCAT GTCCAATATG ACCGCCATGT TGGCATTGAT TATTGACTAG
351 TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT AGTTCATAGC CCATTATGGG
401 AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CTGACCGCCC
451 AACGACCCCC GCCCATTGAC GTCAATAATG ACGTATGTTC CCATAGTAAC
【００１８】
2.変異させた二つのH 1プロモーターを含むベクターの構築(以下、pDHと呼び、二重のH 1プロモーターを有するプラスミドを代表する)。以下のプライマーで、上記改変ベクターの中のEcoR I-Bgl II断片を増幅する。
5' プライマー:ACGCGTCGACGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCG
3' プライマー:CCCAAGCTTGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC
【００１９】
上記のPCR産物中のSal IHind III断片を、上記改変ベクターに逆方向でクローン化する。プラスミドDNAをBgl II+SAL I消化による切断によって検証する。正しいクローンは〜1000bpの断片を有するはずである。その結果、チェックされた10のクローンはすべてが正しいクローンであった(pDHは実際には２つの短縮型H 1プロモーターを有することに留意。続くクローニングプロセスのためである。このプロモーターの欠損部分は後のクローニングプロセスの間に再構築される)。
【００２０】
3.ウミシイタケルシフェラーゼのターゲット配列をpDHの中に入れてpDHRLを形成する。ウミシイタケルシフェラーゼのmRNAのnt 82-100に対応する配列を、テストDNAとして使用する。ウミシイタケルシフェラーゼのこの部位を標的とするsiRNAは活性があることが知られている(Brummelkamp TR等、上掲)。２つのoligoDNAを合成し、お互いにアニールさせて二本鎖DNAを作る。
5’GGGGAAGATCTAAAAAAATAAATGAATCAAGAACATTTTTAAGCTTGGGG
5’CCCCAAGCTTAAAAATGTTCTTGATTCATTTATTTTTTTAGATCTTCCCC
【００２１】
上記の二本鎖DNAをBgl II-Hind III酵素で切断し、pDHのBgl II-Hind 部位にクローニングした。DNA断片がプラスミドに正確に挿入されたことは、Bgl II+Sal I消化による切断によって行った。正しいクローンは〜250bP断片を生じるはずである。テストされた3つのクローンはすべてが正しい挿入片を有することが示された(図２)。
【００２２】
pDHRLによるルシフェラーゼ発現の有効な阻害。前記の3つのクローン（クローン1、クローン2、クローン3）はそれぞれ1.2μgと0.6μgの量で、２４穴プレート上で、ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドおよびホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドとともにHEK293細胞へトランスフェクションした。48時間後に、ウミシイタケルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼの活性を測定する(図２ C)。その結果、変異プロモーターによって、このプラスミドが標的遺伝子ウミシイタケルシフェラーゼの発現を、非常に有効に阻害した。この結果は、本発明で構築された二重のプロモーター/二重のターミネータープラスミド中の変異Ｈ１プロモーターから、siRNAが効率よく生産されることを示した。具体的にはこの結果から、この変異H1プロモーターで、RNA ポリメラーゼIIIによるRNAの転写が適切に開始されて終結することが示唆される。これによって、遺伝子発現の顕著な干渉と抑制をもたらす適当な長さの二本鎖RNAが効率的に生産される。
【００２３】
あらゆる配列のsiRNAをコードするライブラリーの構築するためのランダムDNAのpDHへクローニング
すべてのsiRNA置換配列をコードできるランダムDNAライブラリーの構築は、抗ルシフェラーゼ siRNAをコードするプラスミドpDHRLを構築するのと同様に行うことができるが、ただ一つの違いはこの配列のランダムな性質を保つために、テスター配列の第二鎖を酵素を用いて作ることである。二つの既知配列の中に挿入された19、20と21ntのランダム化領域を有する３種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
19merランダム化領域
GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG
20merランダム化領域
GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG
21merランダム化領域
GGGGAAGATCTAAAAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN TTTTTAAGCTTGGGG
【００２４】
上記したオリゴヌクレオチドとプライマーCCCCAAGCTTAAAAAをアニ−ルさせ、適切なバッファー中1 mＭ濃度のdNTPの存在下で、klenow断片で二本鎖にした(特記しない限り、DNAオリゴヌクレオチド以外のすべての化学薬品はNew England Biolabs Inc社から購入した)。得られた二本鎖オリゴヌクレオチドをBgl II-Hind III酵素で切断し、pDHのBgl II-Hind III部位へクローニングしてpDH-ライブラリーAを生成した。pDH-ライブラリーAの品質は、まず41のクロ-ンの長さによって評価した。ここで単一のクローン、10個のクローンのプール、および30個のクローンのプールからプラスミドDNAを調製し、制限酵素により切断した。その結果、すべてのクローンが同じ長さのインサートをもっていた（図１Ｂ）。上記１０個のクローンについてプラスミドを個々に調製し配列を決定した。予想通りに、配列決定したクローンは予期された１９の塩基対を含んでいた。これらの配列は期待されるランダム性を示した。（以下を参照）
AAAGGGTTTACGTGGTTGG
AATCGTCTTATTTGCATGC
AATTGACATGTGAGCTTGG
AGTAGCTTGTTGAGGTTGG
CAGCATCACTGTATGTGTC
CTATCTTCGTGGAGGTTGG
CTATGAAGGTGGTGATGCG
CTTAATTGGTGGTGGTAGG
TGGCTGTATGTGAGTGGCT
TTAATCTCTGGTGTCCTAA
TTGTAGGGACTTGGATGAT
【００２５】
外来遺伝子のエピトープ発現のためには、プラスミドベクターのほかに、様々なタイプのウイルスベクターがある。ウイルスベクターを構築するクローニング技術は、よく知られている。当業者ならばだれでも、プラスミドと同様の発現機能を持つウイルス構築体を作ることができる。上記のＤNAライブラリー作製に関する開示から、ウイルスベクター中にDNAライブラリーを作ることも可能になる。
【００２６】
配列が逆方向の一対のランダム化領域を含むDNAライブラリーの構築
pDHRLおよびpDHライブラリーAで代表されるような二つのプロモーターおよび二つのターミネーターがあるベクターは、本発明の好ましい実施形態ではあるが、siRNAのすべてのあらゆる置換配列をコードできるＤNAライブラリーを構築する別の方法は、一旦siRNAのすべての置換配列をコードできるＤNAライブラリーの概念が示されれば自明のこととなる。このような方法の一つは、すべての置換配列のヘアピン型siRNAをコードするプラスミドライブラリーを構成することである。例として、このようなライブラリーは下記の手順によって作ることができる。
【００２７】
1.二つの所定配列(P1とP2)の間に19ntのランダム化された配列からなる完全ランダム化領域を有し、5'末端がリン酸化されているライブラリーオリゴヌクレオチドを合成した。ヘアピン形成オリゴヌクレオチドは、5'末端がリン酸化され3'突出端がP1領域と相補的な配列を有するよう合成した。上記ライブラリーオリゴヌクレオチドとヘアピンDNAをアニールさせ、T4 DNAリガーゼで連結し、klenow断片を用いて二本鎖にした(図３)。
【００２８】
2.上記伸長混合物を精製し、BamH I酵素で切断し、二本鎖のアダプターに連結した。このアダプターは一方の端に付着端を有し、以後のプライミング部位となる3'突出鎖(P3)を有する。連結後、このDNAは分子の大きさによって選択され、ライブラリーオリゴヌクレオチドとヘアピンのオリゴヌクレオチド及びアダプターリンカーを含む全長断片だけを集める。
【００２９】
3.純化された全長断片とプライマー3(プライミング部位P3と相補的である)をアニールさせ、鎖置換性DNAポリメラーゼであるファージ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用してDNA断片ALPHAの合成を行った。各DNA断片ALPHAは、配列の両端にある完全二本鎖アダプターリンカー、逆方向に配置されたランダム配列の全く同じコピー２つからなり、この２つのコピーは、線形化されたヘアピンリンカー配列の二本鎖型によって連結されている。
【００３０】
4.ついでDNA断片ALPHAをそのアダプターリンカーの適切な部位で切断して、さらなる操作の為にプラスミド（αプラスミド）へ連結することができる。
【００３１】
5. αプラスミドは、まずSam IとBpm Iで切断されklenow断片で二本鎖とされた後連結される。生じたプラスミドを大腸菌の中で増殖させたのち、二つのランダム化領域間の余分な配列を除き、将来のsiRNAヘアピンの中でループを形成するように9nt鎖(TTCAAGAGA)を残すよう、挿入断片をBcg  I酵素で切断する（図３）。
【００３２】
6.その後は、挿入体をプラスミドからHind IIIとBgl IIでそっくり切り出し、pBluescript-H1ベクターへ挿入してライブラリーを形成することができる。このライブラリーはsiRNAのすべての置換配列をヘアピン型でコードしている。この場合プラスミドは、細胞の中でヘアピンRNAを形成する為に、一つのプロモーターと一つのターミネーターを持っていればよい。
【００３３】
上記クローニングプロトコルを図４に示すように少し改変することよって、２つの野生型H 1プロモーターおよび２つの転写ターミネーターを持つDNAライブラリーを作ることができる。その場合このDNAライブラリーの各メンバーはある二本鎖RNAの２つの鎖を別々にコードする。この改変は、図４に示すように、DNAライブラリーの二つの逆方向のランダム化された領域の間に、第２のプロモーターとTTTTTターミネーターを挿入することを含んでいる。上記の内容と図１−３の詳細な開示によって、この別法は当業者にとっては自明のことである。
【００３４】
強調しなければならないのは、ライブラリーが酵素処理されるので、制限酵素部位を含んでいるsiRNAはすべて失われることである。これは、１種の制限酵素を使用すると、約0.025%のsiRNAが失われることになる。したがってその意味では、２つのプロモーターおよび２つのターミネーターに基づく本発明の好ましい態様のほうが、プロトコルで使用する酵素の数の違いにより、siRNAのロスがより少なく、上記のヘアピンライブラリープロトコルからのライブラリーと比べて、より完全なライブラリーになるであろう。理論上ライブラリーは約2.75×1011種類の置換配列を含んでいるので、制限酵素の使用によるsiRNA種類の損失が、ライブラリーの品質に対して、および何らかの特定の遺伝子に対して活性のあるsiRNAの選別に対して与える影響は、ほとんど無視できる程度であろう。本発明のテキストにある「siRNAのすべての置換配列（パーミューテーション）」は、この影響を考慮し含むものと理解されるべきである。ライブラリーの構築において、制限酵素を使用しないようにすれば、さらにこの影響を除くことができる。もう一つの注意しなければならないのは、上記の配列と制限酵素はプラスミドを構築するのに使用できるセットの単なる例であることである。当業者ならば上に開示された原理に従って、異なる制限酵素とそれに対応するオリゴヌクレオチド配列を容易に選択して、プラスミドやウイルスベクター中での構築を行うことができる。
【００３５】
細胞特異的、組織特異的或いは種類特異的な二本鎖RNAをコードするDNAライブラリーの作製
ある特定な長さの二本鎖RNAのすべての置換配列をコードするランダムDNAライブラリーの開示から、細胞特異的、組織特異的或いは種特異的な二本鎖RNAをコードできるDNAライブラリーを設立する方法は、当業者にとって自明である。このようなDNAライブラリーを構築する一つの例を下に示す。
【００３６】
19 ntのランダム領域を有する１種のオリゴヌクレオチドを、ある細胞型から精製されたmRNAとハイブリダイズさせる。このmRNAは 、Poly(A)ポリメラーゼによってmRNAの末端へ付加したビオチンを介して、ストレプトアビジンで被覆した固体の担体（例えば、プラスチックビーズ）に固定される。mRNAを固定するのは、他の方法でも行える。ハイブリダイゼーション後、すべての未結合のDNAオリゴヌクレオチドを洗い落とし、結合したサブランダムのオリゴヌクレオチドを集め、完全ランダムDNAオリゴヌクレオチドについて述べたのと同じ方法によって、ベクターへクローニングする。このプロセスによるライブラリーには、mRNA源の配列と同じ二本鎖RNAをコードできる分子が、非常に多くなるであろう。
【００３７】
ここではクローニング手順はすべて単一のプラスミドベクターを用いることに関連して記述されたが、その原理はすべてのタイプのプラスミドに適用され、これらＤＮＡライブラリーの変異プロモーター、ターミネーターとコード領域を含むカセットは、異なるタイプのプラスミドの間でのトランスファーが可能であることを指摘しておかなければならない。さらに留意すべきは、すべてのクローニング手順は、単一タイプのプロモーター、即ちＨ１プロモーターに関連して記述されたが、その原理はRNAポリメラーゼIIIタイプのプロモーターすべてに適用されることである。
【００３８】
プラスミドベクターに代わる外来遺伝子エピトピック発現用のベクターは、様々なタイプのウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築するためのクローニング戦略は周知であり、この分野にかなりの知識をもつ者は誰でも、プラスミドと同様の発現機能を実行できるウイルス構造体を構築できる。上記DNAライブラリーの開示によって、ウイルスベクターの中でこのようなライブラリーをつくることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は長さ10-30塩基対の二本鎖RNAで二本鎖のすくなくとも一方は一本鎖突出端となっている二本鎖ＲＮＡを生産できるDNAライブラリーに関する。本発明はまたこのようなDNAライブラリーを生産する方法に関する。最も頻繁に用いられる二本鎖RNAは、長さ1９-２１塩基対で通常すくなくとも一方の鎖にTT或いはUU突出端があるsiRNAであると考えられる。したがって本発明の利点は、他の方法により生成されたsiRNAと比べて議論される。
【００４０】
実際のところ、基本構造にたいする要件(19-2１塩基対の二本鎖領域、3'単一の鎖の突出(通常はTT或いはUUであるが、これに限らない))を満たす短い二本鎖RNAは１/３から１/５にすぎない。siRNAで、３００００個のヒトの遺伝子をノックダウンするには、９０，０００−１５０，０００のsiRNAを合成しなければならず、その費用は１８００〜３０００万USドルになる。
【００４１】
他の生物に関しても、すべての遺伝子に対して全域にわたるsiRNAを生産するには、同じぐらいの費用を配分する必要がある。本発明は、プラスミド中にコードされるsiRNAライブラリーを生産できる。このライブラリーには理論的にsiRNA(19塩基対の二本鎖と突出端)のすべての置換配列（419=2.75Ｘ1011）が含まれ（他の長さの二本鎖RNAライブラリーの大きさは同様な方法で容易に計算できる）、適切なプロモーターを見つけることができる生物ならどんなものにも使用できる。このようなライブラリーを作るコストは、すべてのsiRNAを化学合成するコストからみればほんのわずかである。言いかえれば、これは哺乳類および哺乳類以外のシステムの任意の遺伝子を、沈黙させることのできる試薬を含み、2.75Ｘ1011の複雑さを備えたライブラリーである。このライブラリーは、広範囲ハイスループットゲノムワイドの機能のゲノミクス、薬剤ターゲットのスクリーニング、核酸医薬の開発に対して、非常に強力なツールボックスである。
【００４２】
このライブラリーの複雑さは、ライブラリーオリゴヌクレオチドに対して、１段階のオリゴヌクレオチドの選択を導入することで、さらに劇的に縮小することができる。そのようなアプローチにより、遺伝子、細胞/組織、あるいは生物特異的なsiRNAをコードでき、複雑さがはるかに低い(102-108)ライブラリーを、ライブラリーの有用性を損なうことなく、つくることができる。そのような複雑さの低いライブラリーの部分、或いはすべての配列をいろいろな配列決定法で決定することができる。ヒト、マウスあるいはラットのような生物における各遺伝子の既知のsiRNAエンコーダを含むプラスミドコレクションの生成を可能にする。
【００４３】
上記は、ほとんどプラスミドシステムに基づくものであるが、同じ原理を使用して、ウイルスベクター中に、同様なライブラリーやコレクションを容易に確立することができる。
【００４４】
例として本発明に関するキークラスを二、三ここにリストする。
(1)このライブラリーから、標準の篩別（オートメーション化でもいい）により、任意の遺伝子のsiRNAをコードするプラスミドの完全コレクションを選択することができる。
(2)本発明によって、任意所定細胞タイプ、組織及び生物の為のsiRNAをコードするプラスミドの完全コレクションを選択することができる。
(3)その後、siRNAをコードするプラスミドの完全コレクションは、遺伝子発現をノックダウンする個々の能力について容易に評価することができる。
(4)最も強力な点は、このようなDNAライブラリーは標的遺伝子の配列あるいはsiRNAの配列を前もって知ることなく、表現型に基づいて標的遺伝子の篩別をするのに使用することができることである。したがって当業者は標的遺伝子の偏った予備選択を避けることができる。これは機能の注釈と薬剤ターゲットの篩別をするのに最も重要な方法になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は特定の長さよりなる、あらゆる置換を含む二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡライブラリーの例である構造を示す。例1は19塩基よりなるあらゆる塩基対の二本鎖領域と３’末端のPoly U突出端を含む二本鎖RNAをコードすることができるDNAライブラリーを示す。Aに、クローニングの概略を示す。Bでは、このライブラリーの品質を実験により示すものである。アガロースゲル中で、単一クローン(1X)、10個のクローン(10X)のプールおよび30個のクローンのプールが、酵素切断の後に、予期された単一なバンドとして示されている。これはライブラリーのほとんどのクローンが、期待されたインサート断片を含むことを示す。同様の方法により、異なる長さ(10-30の塩基対)の二本鎖RNAをコードするDNAライブラリー、およびDNAの部分配列 (4-30 nt)をランダムに有するDNAライブラリーを得ることができる。
【図２】図２はプラスミドの構造を示す。これはRNAのコード領域の相補鎖の両側にある２つのプロモーターおよび２つのターミネーターが、標的遺伝子の発現を有効に抑制できることを示す。今日の科学的知見では、このような抑制は、このようなプラスミドを用いて二本鎖RNAを効率的に生産することによってのみなされる。したがって、このプラスミドは生細胞中で、二本鎖RNAを有効に生産するという結論づけられる。Aはクローニングの概略を示す。Bは設計したセグメントが、プラスミドに挿入されたことをゲル分析より証明する。Cは、生じたプラスミドが、標的遺伝子ウミシイタケルシフェラーゼに対する効果的な抑制を引き起こしたことが、細胞の分析により、証明される。
【図３】図３は、特定の長さの二本鎖RNAのすべての置換配列をコードできるDNAライブラリーを生成する代替方法の一例を示す。Aに、クローニングの概略を示す。Bは、A中の異なるセグメントのシーケンスを、制限酵素サイトに下線を付して示す。同じ手法は、異なる長さ(10-30の塩基対)の二本鎖RNAをコードするDNAライブラリーまたは部分配列 (4-30 nt)をランダムに含むDNAライブラリーの作製に同様に使用される。
【図４】図４は、あらゆる置換配列の特定の長さの二本鎖RNAをコードできるDNAのライブラリーの代替作製方法を示す。Aでは、クローニングの概略を示す。Bは、Aにある異なるセグメントのシーケンスを、制限酵素サイトに下線を付して示す。同じ手法は、異なる長さ(10-30の塩基対)の二本鎖RNAをコードするDNAライブラリーおよびDNAの部分配列(4-30 nt)をランダムに有するDNAライブラリーの作製に同様に使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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