(57)【要約】本発明は、ハイドロラーゼ、およびハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドに関するものである。さらに、本発明は、それらのハイドロラーゼ酵素の速度論的分割における用途に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号１に記載の配列及び配列番号１に対して少なくとも約５０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項２】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号３に記載の配列及び配列番号３に対して少なくとも約５０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項３】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号５に記載の配列及び配列番号５に対して少なくとも約６０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項４】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号７に記載の配列及び配列番号７に対して少なくとも約６０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項５】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号９に記載の配列及び配列番号９に対して少なくとも約９０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項６】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号１１に記載の配列及び配列番号１１に対して少なくとも約５０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項７】
ハイドロラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする単離された核酸であって、配列番号１３に記載の配列及び配列番号１３に対して少なくとも約５０％の同一性を持つ配列から構成される群から選択された配列を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の核酸に対して相補的な、単離された核酸。
【請求項９】
配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３から構成される群から選択された核酸配列を持つ核酸に対して高厳密性の条件でハイブリッド形成する、単離された核酸。
【請求項１０】
配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３から構成される群から選択された核酸配列を持つ核酸に対して中厳密性の条件でハイブリッド形成する、単離された核酸。
【請求項１１】
配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３から構成される群から選択された核酸配列を持つ核酸に対して低厳密性の条件でハイブリッド形成する、単離された核酸。
【請求項１２】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも５５％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１３】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも６０％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１４】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも６５％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１５】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも７０％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１６】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも７５％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１７】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも８０％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１８】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも８５％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項１９】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項２０】
配列比較アルゴリズムで決定される、配列番号１、３、５、７、９、１１あるいは１３で示された核酸に対して少なくとも９５％の相同性を有する配列を持つ、単離された核酸。
【請求項２１】
配列比較アルゴリズムがデフォルト パラメーターを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８である、請求項１２−２０のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項２２】
配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３、ならびに前記配列に対して相補的な配列から構成される群から選択された配列の少なくとも１０の連続した塩基を含む、単離された核酸。
【請求項２３】
配列番号２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号６に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製したポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号８に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号１０に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１２に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１４に示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３０】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３１】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約５５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３２】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３３】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約６５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３４】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３５】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約７５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３６】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３７】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３８】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項３９】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項４０】
配列比較アルゴリズムあるいはデフォルト パラメータを備えたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８での分析で決定される、配列番号２、４、６、８、１０、１２あるいは１４で示されたアミノ酸配列に対して少なくとも約９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４から構成される群から選択された配列を含む、精製ポリペプチド。
【請求項４２】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４３】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項４４】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、精製された抗体。
【請求項４５】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１０の連続したアミノ酸を持つポリペプチドに特異的に結合する、精製された抗体。
【請求項４６】
抗体が多クローン性である、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４７】
抗体が多クローン性である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４８】
抗体が単クローン性である、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４９】
抗体が単クローン性である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５０】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドを生成する方法であって、
該ポリペプチドの発現を許容する条件下で該ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ導入する工程、及び
該ポリペプチドを回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項２３−２９のいずれかに記載のペプチドの少なくとも１０のアミノ酸を含むポリペプチドを生成する方法であって、
該ポリペプチドの発現を許容する条件下で、プロモーターへ動作可能に結合した該ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ導入する工程、及び
該ポリペプチドを回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５２】
変異体の生成方法であって、
（ａ）請求項１−７のいずれかに記載の核酸を得る工程、及び
（ｂ）該核酸配列中の１つ又は複数のヌクレオチドを別のヌクレオチドへ修飾する、該核酸配列中の１つ又は複数のヌクレオチドを欠失させる、あるいは該核酸配列に１つ又は複数のヌクレオチドを追加する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
エラープロ−ンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、有性ＰＣＲ突然変異誘発、生体内での突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、連続的全体突然変異誘発、指数関数的な全体突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再集合、遺伝子部位飽和突然変異誘発、及びその組み合わせから構成される群から選択された方法によって修飾が導入される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１−７のいずれかに記載の核酸の核酸配列、あるいは請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列を格納したコンピュータ読み取り可能媒体。
【請求項５５】
プロセッサ及びデータ記憶装置を含むコンピュータシステムであって、該データ記憶装置が、請求項１−７のいずれかに記載の核酸の核酸配列あるいは請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列を格納していることを特徴とするシステム。
【請求項５６】
さらに配列比較アルゴリズム、及び少なくとも１つの基準配列を格納するデータ記憶装置を含む、請求項５５に記載のコンピュータシステム。
【請求項５７】
配列比較アルゴリズムが多形性を表示するコンピュータプログラムを含む、請求項５６に記載のコンピュータシステム。
【請求項５８】
さらに、前記配列の特徴を識別する識別子を含む、請求項５５に記載のコンピュータシステム。
【請求項５９】
基準配列と第一配列とを比較する方法であって、
（ａ）配列を比較するコンピュータプログラムの使用を通じて第一配列と基準配列を読む工程、及び
（ｂ）該コンピュータプログラムで第一配列と基準配列間の差違を決定する工程
を含み、前記第一配列が、請求項１−７のいずれかに記載の核酸の配列、あるいは請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列であることを特徴とする方法。
【請求項６０】
第一配列と基準配列との差違の決定が、多形性を識別することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
配列の特徴を識別する方法であって、
（ａ）配列の特徴を識別するコンピュータプログラムの使用を通じて配列を読む工程、及び
（ｂ）該コンピュータプログラムで配列の特徴を識別する工程
を含み、該配列が、請求項１−７のいずれに記載の核酸配列、あるいは請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列であることを特徴とする方法。
【請求項６２】
請求項２３−２９のいずれかに記載の精製ポリペプチドであって、該ペプチドが熱に対して安定しており、耐熱性であり、かつエステルの加水分解に触媒作用を及ぼす酵素であり、かつ、該酵素が、約６０℃から１０５℃までの温度にさらされた後に活性を復元あるいは回復することができる酵素であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項６３】
エステルの加水分解に触媒作用を及ぼす方法であって、エステルを含むサンプルと請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項４３に記載の核酸によってコードされ、かつハイドロラーゼ活性を保持する機能的なポリペプチドを識別するためのアッセイ方法であって、
（ａ）請求項４３に記載の核酸によってコードされるポリペプチドと、基質分子とを、該ポリペプチド又は断片又は変異体を機能性することを許容する条件下で接触させる工程、及び
（ｂ）基質レベルの低下又は該ポリペプチドと基質との間の反応における特定の反応生成物のレベルの上昇を検出する工程
を含み、該基質レベルの低下あるいは反応生成物レベルの上昇が、機能的なポリペプチド、断片又は変異体を示すことを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項２２に記載の核酸を含む核酸プローブであって、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３からなる群より選ばれる核酸配列の核酸標的領域と、中度から高度の厳密性条件でハイブリダイズし、検出可能な標的である二重プローブを形成することを特徴とするプローブ。
【請求項６６】
核酸がＤＮＡである請求項６５に記載のプローブ。
【請求項６７】
核酸が、核酸標的領域に少なくとも５５％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも６０％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも６５％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも７０％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも７５％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも８０％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも８５％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも９０％相補的な核酸配列、核酸標的領域に少なくとも９５％相補的な核酸配列及び核酸標的領域に少なくとも９９％相補的な核酸配列からなる群より選ばれる配列を有する、請求項６５に記載のプローブ。
【請求項６８】
核酸が核酸標的領域に完全に相補的である、請求項６５に記載のプローブ。
【請求項６９】
オリゴヌクレオチドが長さ１５−５０の塩基である、請求項６５に記載のプローブ。
【請求項７０】
検出可能なアイソトープラベルを更に含む、請求項６５に記載のプローブ。
【請求項７１】
蛍光分子、化学ルミネセンス分子、酵素、補助因子、酵素基質及びハプテンからなる群から選択した、検知可能な非アイソトープラベルを更に含む、請求項６５に記載のプローブ。
【請求項７２】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドを含む酵素製剤であって、該製剤が液体であることを特徴とする製剤。
【請求項７３】
請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドを含む酵素製剤であって、該製剤が乾物であることを特徴とする製剤。
【請求項７４】
エステルのエナンチオマー混合物を分割する方法であって、
（ａ）請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドとエステル混合物とを接触させて、エステルをアルコールへ加水分解する工程、及び
（ｂ）（ｉ）１つのエナンチオマーに富むエステルの混合物及び／又は（ｉｉ）反対のエナンチオマーに富むアルコールの混合物を回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７５】
エステルが第２級アルコールのＣ１−Ｃ６アルカノエートエステルである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
エステルがアセテートである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
第２級アルコールが、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン、３−ブチン−２−オール、１−メトキシ−２−プロパノール及び３−ヒドロキシテトラヒドロフランから構成される群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
アルコールのエナンチオマー混合物を分割する方法であって、
（ａ）アルコール混合物と、アシル供与体及び請求項２３−２９のいずれかに記載のポリペプチドとを接触させてアルコールをエステル化する工程、及び
（ｂ）（ｉ）１つのエナンチオマーに富むエステルの混合物及び／又は（ｉｉ）反対のエナンチオマーに富むアルコールの混合物を回収する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７９】
第２級アルコールが、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン、３−ブチン−２−オール、１−メトキシ−２−プロパノール及び３−ヒドロキシテトラヒドロフランからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
アシル供与体がビニルアセテートである、請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願書は、２０００年１２月１日付の米国特許仮出願第６０／２５０，９７６号の利益を主張するものである。
発明の背景
発明の分野
この発明は、一般的に酵素に関するもので、特に、加水分解酵素活性を有する酵素に関するものである。また、本発明はハイドロラーゼ酵素の速度論的分割における用途に関連するものでもある。
【０００２】
発明の背景
ハイドロラーゼ（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）は、加水分解反応の触媒となる酵素である。よって、ハイドロラーゼは、化合物の共有結合を切断し、結合部全体に水分子を挿入することにより、化合物（すなわち基質）を分解する役目をする。一般にハイドロラーゼ酵素に分類されるものにはエステル結合、炭素−窒素結合、ペプチド結合、グリコシド結合、エーテル結合、酸無水化物などに作用するものが含まれる。
エステラーゼおよびリパーゼは、エステルを加水分解し、有機酸（リパーゼの場合は脂肪酸）とアルコールを生成する触媒となるハイドロラーゼ酵素である。数多くのエステラーゼおよびリパーゼが知られ、また、バクテリア、酵母のほか、より高等な動物や植物など、広範な種類の生物体に発見されている。リパーゼの主な産業用途には、洗剤業界（洗濯の染みに含まれている脂肪質を除去が簡単な親水性物質に分解するために採用）、廃棄物処理システム、製薬産業（消化剤として利用）、さらに食品・飲料業界（チーズの製造、チーズの熟成や風味付け、ベーカリー製品の硬化防止剤、天然バター風味のマーガリンその他のスプレッドの生産などに使用）などがある。
ごく最近、ハイドロラーゼ、特に、エステラーゼおよびリパーゼは、化学合成に幅広く利用されるようになってきた（Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒ ａｎｄ Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ， Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｒｅｇｉｏ−ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ， Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９９； Ｆａｂｅｒ， Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３ ｅｄ．； Ｓｐｒｉｎｇｅｒ： Ｂｅｒｌｉｎ， １９９７； Ｄｒａｕｚ ａｎｄ Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； ＶＣＨ： Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９９５； Ｖｏｌ． １ ＆ ２； Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ： Ｏｘｆｏｒｄ， １９９４）。
これらの酵素は、精巧な立体特異性を示すことがよくあるため、一つのエナンチオマー基質が、他と比較して急激に反応する。ラセミ出発物質の一つのエナンチオマーによる他のエナンチオマーに対するこのような選択反応は、「速度論的分割」と呼ばれ、出発物質、生成物、またはその両方が、鏡像異性的に活性化された形態で単離されるようになる。 Ｃｈｅｎ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０４：７２９４（１９８２）には、エナンチオマーの酵素による速度論的分割の定量分析の方法が説明されている。
【０００３】
加水分解またはエステル転移反応による１，０００を越えるアルコール類、カルボン酸、およびラクトンの速度論的分割には、リパーゼおよびエステラーゼが使用されてきており、また、リパーゼの利用が関連したいくつかの生体内変換は既に工業規模で実施されている。酵素を用いた分解法の成功が普及しているにもかかわらず、多数の重要な合成基本要素は、この方法では分解が困難なままになっている。Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ等、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５６：２６５６（１９９１）では、最も効率よく分解された基質は、大きさに著しい差異のある置換基を有するものであると教えている。それに反して、現時点で利用可能な酵素では、大きさの類似した置換基を有する基質に対するエナンチオ選択性が乏しいことが示されている。このため、新しいハイドロラーゼ酵素、特に、現時点では分解が困難な基質に対して高いエナンチオ選択性を示すハイドロラーゼ酵素技術の必要性が残ったままとなっている。
【０００４】
発明の概要
本発明では、加水分解酵素活性のあるポリペプチドが提供される。本発明のハイドロラーゼ酵素は、従来は分解が困難であったものを含め、アルコールまたはエステル基質のエナンチオマー混合物を分解する能力がある。また、本発明では、加水分解酵素活性のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
したがって、最初の一面として、本発明では、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３（これ以降「グループＡ核酸配列」とする）に示した配列を持つ単離された核酸、ならびに配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示した配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を持ち、加水分解酵素活性のあるポリペプチドをコードする上記核酸の変異体が提供される。また本発明では、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示した核酸配列と実質的に同一であるかそれを相補する核酸配列が提供される。
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列に示した配列、それと実質的に同一な配列、およびそれを相補する配列の、少なくとも１０連続の塩基のある単離された核酸である。
また別の一面において、本発明では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示した配列のあるポリペプチドをコードする単離された核酸、ならびに配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示す配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を持ち、かつ加水分解酵素活性のあるポリペプチドをコードする上記核酸の変異体が提供される。
本発明の別の面は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４（これ以降「グループＢアミノ酸配列」とする）に示した配列、またはそれと実質的に同一な配列、またはその機能を持つ断片（官能基の性質を持つ断片）のあるポリペプチドをコードする単離された核酸である。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列で示した配列、またはそれと実質的に同一な配列の、少なくとも１０連続のアミノ酸のあるポリペプチドをコードする単離された核酸である。
【０００５】
また別の一面において、本発明では、グループＢアミノ酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列を持つ精製ポリペプチドが提供される。各種の実施例において、精製ポリペプチドには、グループＢアミノ酸配列に示した配列に対して少なくとも５０％の配列同一性があり、加水分解酵素活性がある。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列に示した配列を持つポリペプチドに特異的に結合された、単離または精製された抗体、およびそれと実質的に同一な配列である。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列のポリペプチドのうちどれか一つの少なくとも１０連続のアミノ酸を持つポリペプチドと特異的に結合する、単離または精製された抗体、もしくはその結合断片、ならびにそれと実質的に同一な配列である。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列を持つポリペプチドの生成方法である。この方法には、ポリペプチドを宿主細胞内にコードする核酸の導入（ここで、核酸は操作が可能なようにプロモーターにリンクされている）、および核酸の発現ができるような条件下での宿主細胞の培養が含まれる。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列に示した配列およびそれと実質的に同一な配列の少なくとも１０のアミノ酸を持つポリペプチドの生成方法である。この方法には、ポリペプチドを宿主細胞内にコードする核酸の導入（ここで、核酸は操作が可能なようにプロモーターにリンクされている）、および核酸の発現ができるような条件下での宿主細胞の培養（これにより、ポリペプチドが生成される）が含まれる。
本発明の別の面は、変異体の生成方法で、この方法には、グループＡ核酸配列に示した配列、それと実質的に同一な配列、グループＡ核酸配列の配列を相補する配列、上記の配列の少なくとも３０連続のヌクレオチドで構成される断片を有する核酸の取得、ならびに、配列内にある１つまたは複数のヌクレオチドの異なるヌクレオチドへの交換、配列内にある１つまたは複数のヌクレオチドの削除、または配列内への１つまたは複数のヌクレオチドの追加が含まれる。
【０００６】
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列、またはグループＢアミノ酸配列に示したポリペプチド配列、およびそれと実質的に同一な配列を格納するコンピュータ読み取り可能媒体である。
本発明の別の面は、プロセッサおよびデータ記憶装置を含めたコンピュータシステムで、このデータ記憶装置には、グループＡ核酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列、またはグループＢアミノ酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列を持つポリペプチドが格納される。
本発明の別の面は、最初の配列を基準配列と比較する方法で、ここにおいて最初の配列は、グループＡ核酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列を持つ核酸、またはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドコードである。この方法には、配列を比較するコンピュータプログラムを使用した最初の配列と基準配列の読み取り、そのコンピュータプログラムによる最初の配列と基準配列の差異の判断が含まれる。
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列、またはグループＢアミノ酸配列に示した配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの特徴を特定する方法で、これには配列内の特徴を特定するコンピュータプログラムの使用による配列の読み取り、およびそのコンピュータプログラムによる配列内の特徴の特定が含まれる。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列の断片または変異体、およびそれと実質的に同一な配列を特定するための試験法で、この試験法がグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列をポリペプチドの酵素機能を確保する。この試験法には、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、もしくはポリペプチドの断片または変異体が機能するような条件下でポリペプチド断片または変異体を基質分子と接触させること、ならびにポリペプチドと基質の間の反応によっておこる基質レベルの減少または特定の反応生成物の増加を検出し、それによってその配列の断片または変異体を特定することが含まれる。
別の面で、本発明では、エステルのエナンチオマー混合物を分解するプロセスが提供される。このプロセスは、エステル混合物と本発明のハイドロラーゼ酵素との接触と、一方のエナンチオマーにエステル含有量の多い混合物、および他方のエナンチオマーにアルコール含有量の多い混合物、もしくはそのいずれかの回収で構成される。
【０００７】
詳細な説明
本発明は、ハイドロラーゼと、それをコードするポリヌクレオチドに関するものである。本書で使用するとき、「ハイドロラーゼ」という用語は、結合部全体に水分子を挿入して共有結合を切断する触媒の働きをする能力のある酵素を意味する。「ハイドロラーゼ」という用語には、エステラーゼ活性のある酵素、すなわち、エステル基を有機酸とアルコールに加水分解する能力のある酵素の意味も含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、エステラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするものと特定された。
本書で参照した特許および科学文献は、技術分野の熟練者が入手できる知識を確立するものである。本書に引用された発行済み特許、出願書、および参考文献は、参照による組込みが具体的かつ個別に示されるような程度において、参照により本書に組込まれる。不一致がある場合には、本開示を優先する。
本発明の目的において、下記の定義が使用される。
定義
本書で使用するとき、「速度論的分割」という用語は、キラル試薬または触媒に接触した際の２つのエナンチオマーが反応する速度の差異に依存した、エナンチオマーを分解するための技術を意味する。「酵素を用いた速度論的分割」では、キラル触媒は酵素である。
本書で使用するとき、「核酸」または「核酸配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのいずれかの断片、ゲノムまたは合成によるＤＮＡまたはＲＮＡ（一本鎖または二本鎖が考えられ、センス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得る）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、もしくは何らかのＤＮＡに似たまたはＲＮＡに似た物質（天然または合成）を意味する。
特定のポリペプチドまたはタンパク質の「コード配列」、ならびに、それを「コードするヌクレオチド配列（そのヌクレオチド配列の符号化）」とは、該当する制御配列の制御下に置かれたときに、そのポリペプチドまたはタンパク質に転写・翻訳される核酸配列である。
【０００８】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関連するＤＮＡのセグメントを意味し、これには、コード領域前後の領域（リーダーおよびトレーラー）が含まれ、また、該当する場合には、個別のコードセグメント（エキソン）間にある介在配列（イントロン）も含まれる。
本書で使用するとき、「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列、あるいはそれらの断片、部分、またはサブユニット、ならびに自然発生的な分子または合成分子を意味する。
本書で使用するとき、「ポリペプチド」という用語はペプチド結合または修飾ペプチド結合、つまりペプチドアイソスターによりお互いに結合したアミノ酸を意味し、遺伝子符号化された２０のアミノ酸以外の修飾アミノ酸が含まれることもある。ポリペプチドは、翻訳後の処理などの自然過程によって、またはこの技術分野でよく知られている化学修飾法のいずれかによって修飾され得る。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端などを含めた、ポリペプチドのどの部位でも発生することがある。任意のポリペプチドの複数部位において、同一または異なった程度で、同じ種類の修飾が存在しうることが認識されるであろう。また、任意のポリペプチドには、数多くの種類の修飾がなされうる。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、リピドまたはリピド誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差結合による環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有交差結合の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩ アンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル、酸化、ペルギュレーション（ｐｅｒｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、ならびにアルギニル化などの、転移ＲＮＡ を媒介としたアミノ酸のタンパク質への添加などがある（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ． Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）； Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． １−１２（１９８３）を参照）。
【０００９】
本書で使用するとき、「単離」という用語は、本来の環境から取り出された（例：自然発生的な場合は自然環境）物質を意味する。例えば、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生きた動物内に存在する場合は単離されていないが、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、自然系内で共存する一部または全ての物質から隔てられたものは単離されている。このようなポリヌクレオチドがベクターの一部であること、またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドが組成の一部であること（あるいはその両方）も可能で、その場合でも、そうしたベクターや組成が自然環境の一部ではないという点で単離されているといえる。
本書で使用するとき、「精製」という用語では、完全な純度を要求するものではなく、むしろ、相対的な定義が意図されている。ライブラリから得られた個別の核酸は、電気泳動的に均一となるように、従来の方法で精製されている。これらのクローンから得られた配列は、ライブラリからも、ヒト全ＤＮＡからも、直接的には得られない。本発明の精製核酸は、生物体内のゲノムＤＮＡの残部から、少なくとも１０４〜１０６倍に精製したものである。ところが、「精製」という用語には、ゲノムＤＮＡの残部から、もしくはライブラリまたはその他の環境内にある他の配列から、少なくとも１桁倍、一般的には２、３桁倍、さらに一般的には４、５桁倍に精製された核酸も含まれる。
本書で使用するとき、「組換え」という用語は、核酸が、その自然環境内においては隣接していない「バックボーン」核酸と隣接するという意味である。さらに、「濃縮」核酸とは、核酸の数の５％以上が、核酸バックボーン分子の集団に挿入されることを表す。本発明によるバックボーン分子には、発現ベクターなどの核酸、自己複製核酸、ウイルス、核酸の組込み、ならびに所定の核酸の維持または操作に使用されるその他のベクターまたは核酸が含まれる。一般には、濃縮核酸は、１５％以上の数の核酸が組換え体バックボーン分子の集団に挿入されることを表す。より一般的には、濃縮核酸は、５０％以上の数の核酸が組換え体バックボーン分子の集団に挿入されることを表す。一つの実施例において、濃縮核酸は、９０％以上の数の核酸が組換えバックボーン分子の集団に挿入されることを表す。
【００１０】
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡセグメント技術により生成、すなわち、希望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因的ＤＮＡ構造により形質転換した細胞から生成したポリペプチドまたはタンパク質のことである。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質とは、化学合成により準備されたもののことである。また、固体の化学的ペプチド合成方法は、本発明のポリペプチドまたは断片の合成にも使用できる。こうした方法は、１９６０ 年代初期以来、この技術分野で知られており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒ． Ｂ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４， １９６３； また、Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ． Ｍ． ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｊ． Ｄ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， ｐｐ． １１−１２ も参照）、最近では、市販の実験用ペプチド設計・合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）にも採用されている。こうした市販の実験用キットは、Ｈ． Ｍ． Ｇｅｙｓｅｎ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８１：３９９８（１９８４）の内容を広く利用したもので、すべて単一のプレートに連結された多数の「ロッド」または「ピン」の先端で、ペプチドの合成が成される。このシステムが利用されるとき、ロッドまたはピンのプレートは裏返しされ、該当するアミノ酸をピンまたはロッドの先端に付着または定着させるための溶液を含んだ対応するウェルまたはリザーバーのある第２のプレートに挿入される。こうしたプロセス手順、すなわちロッドやピンの先端を裏返して該当する溶液に挿入する手順を繰り返すことにより、アミノ酸が希望のペプチドに組み立てられる。さらに、市販されている多数のＦＭＯＣ ペプチド合成システムが利用できる。例えば、ポリペプチドまたは断片の組立ては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． 製Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａ 自動ペプチド合成装置を使用して、堅実に遂行できる。こうした装置では、直接合成するか、その他の既知技術を使用して結合しうる一連の断片を合成するかのいずれかにより、本発明のペプチドをすぐに利用できる。
プロモーター配列は、プロモーターにおいて転写を開始するＲＮＡ ポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写する際に、コード配列に「操作が可能なようにリンク」されている。
【００１１】
「プラスミド」は、大文字および数字（あるいはそのいずれか）の前および後（あるいはそのいずれか）に付ける小文字の「ｐ」で指定される。本書の出発プラスミドは、市販されているか、制限されることなく公に入手できるか、入手可能なプラスミドを元にして公表されている手順に従い生成可能であるかのいずれかである。さらに、本書に記載したものに相当するプラスミドは、この技術分野で知られており、通常の熟練者にとって明白なものである。
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの特定の配列にのみ作用する制限酵素を用いたＤＮＡの触媒作用による切断を意味する。本書で使用されている各種の制限酵素は市販されているもので、それらの反応条件、補助因子、およびその他の要件は、通常の熟練者が心得ている形で使用されている。分析の目的では、一般に１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片と、約２０μｌの緩衝液に入れた約２単位の酵素とが使用される。プラスミド生成のためにＤＮＡ断片を単離する目的では、一般に５〜５０μｇのＤＮＡが、多目の液に入れた２０〜２５０単位の酵素で消化される。特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および基質の量は、製造会社により指定されている。培養時間は、３７℃で約１ 時間が通常使用されるが、供給業者の使用説明書に従い異なることもある。消化の後、ゲル電気泳動を実施して、希望の断片を単離することもできる。
「オリゴヌクレオチド」は、単一の鎖のあるポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的ポリデオキシヌクレチド鎖のいずれかを意味し、化学的に合成したものでもよい。このような合成オリゴヌクレオチドには５’リン酸塩はないため、キナーゼが存在する場合は、リン酸塩をＡＴＰに追加することなく他のオリゴヌクレオチドに連結されることはない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸されていない断片には連結する。
２つの核酸またはポリペプチドについての文脈での「実質的に同一」という句は、対応が最大になるように比較・位置合わせした上で、既知の配列比較アルゴリズムのどれかを使用して、または目視検査により測定したとき、それぞれ、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の核酸またはアミノ酸の残基同一性を有する２つ以上の配列を意味する。一般に、少なくとも約１００の残基の領域に実質的な同一性が存在し、最も一般的には、少なくとも約１５０〜２００の残基で配列は実質的に同一である。一部の実施例においては、配列は、コード領域の全長において実質的に同一である。
【００１２】
さらに、「実質的に同一」なアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の同類置換または非同類置換、欠失、または挿入により、基準配列とは異なる配列であるが、ポリペプチドの機能的な特性が本質的に保持されている場合に限る。一般に、こうした置換、欠失、または挿入は、分子の活性部位で起こることはないが、一部の例では置換、欠失、または挿入が活性部位で起こることがある。例えば、アミノ酸の同類置換では、１つのアミノ酸が同じ部類の他のものと置き換わる（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなどの１つの疎水性アミノ酸の他との置換、またはアルギニンのリジン、グルタミン酸のアスパラギン酸、グルタミンのアスパラギンとの置換といった１つの極性アミノ酸の他との置換などがその例）。 １つ以上のアミノ酸を、例えば、ハイドロラーゼポリペプチドから欠失させて、生物活性を著しく変化させることなく、ポリペプチドの構造を修飾することができる。例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端のあるアミノ酸でハイドロラーゼ生物活性には必要でないものは、除去することができる。本発明の修飾ポリペプチド配列は、ハイドロラーゼ生物活性について、数々の方法で検査することができ、この方法には、修飾ポリペプチド配列にハイドロラーゼ基質を接触させ、修飾ポリペプチドによって、試験法における特定の基質が減少するかどうか、または機能的ハイドロラーゼ ポリペプチドと基質との酵素性の反応によりバイオプロダクトが増大するかどうかを判断するなどがある。
本書で使用するとき、「断片」は、自然発生的なタンパク質の一部として同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有し、それに関連するタンパク質の機能的活性のうち少なくとも１つを維持するポリペプチドを意味する。この例としては、切断によって修飾し著しく高い活性のある成熟酵素を生成できる、低活性のプロタンパクといった「プロ体」分子がある。
「ハイブリッド形成」とは、核酸鎖が塩基対形成により相補鎖と結合するプロセスを意味する。ハイブリッド形成反応は、低濃度で存在するようなサンプルでも、目的とする特定の配列を識別することができるように、高感度で選択的とすることができる。適した厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリッド形成溶液における塩またはホルムアミドの濃度により、またはハイブリッド形成温度により決定でき、またこの技術分野でよく知られている。特に、厳密性は、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増大、ハイブリッド形成温度の上昇によって高めることができる。
【００１３】
例えば、高厳密性の条件下でのハイブリッド形成は、約 ５０％ホルムアミドで、約３７℃〜４２℃で起こり得る。ハイブリッド形成は、低厳密性の条件下では、約３５％〜２５％のホルムアミド、約３０℃〜３５℃で発生し得る。特に、ハイブリッド形成は、高厳密性の条件下で、４２℃、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、および２００ ｎ／ｍｌのせん断・変性させたサケ精液ＤＮＡで起こり得る。ハイブリッド形成は、低厳密性の条件では、上述の条件で３５％ホルムアミドで低めの温度３５℃で起こり得る。特定レベルの厳密性に対応する温度範囲は、当該核酸のプリン−ピリミジン比を算出し、それに従い温度を調節することにより、さらに狭めることができる。上記の範囲および条件に関する変動は、この技術分野でよく知られている。
本書では、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」や「だいたい（ｒｏｕｇｈｌｙ）」や「付近（ａｒｏｕｎｄ）」や「周辺（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ）」の意味で使用している。「約」という用語が数値的な範囲と共に使用されているとき、記載した数値の上下限を拡張することによりその範囲が修正される。一般に、「約」という用語は、本書では数値を記載した値の上下２０％の変動で修正するものとして使用されている。例えば、「約５０％」は、５０％−（０．２）ｘ（５０）と５０％＋（０．２）ｘ（５０）の間のあらゆる値、つまり４０％〜６０％の範囲を意味する。
「変異体」という用語は、一つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン、またはアミノ酸残基（それぞれ）で修飾されながらも、本発明のハイドロラーゼの生物活性が維持されているような、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。変異体は、例えば、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、有性ＰＣＲ 突然変異誘発、生体内での突然変異誘発、カセット式突然変異誘発、連続的全体突然変異誘発、指数関数的な全体的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再集合、遺伝子部位飽和変異誘発（ＧＳＳＭ）、およびその任意の組み合わせなどの方法を含めた数多くの方法で生成できる。一部の実施例において、変異体は、イノシンなどの非天然ヌクレオチドで構成される。一部の実施例において、修飾は繰り返される。
【００１４】
一面において、本発明では、合成遺伝子再集合という非確率的な方法が提供されているが、これは核酸基本要素が無作為にはシャフリング、鎖状化、キメラ化されず、非確率的に集合することを除けば、確率的シャフリングといくらかの関連性がある。
合成遺伝子再集合法は、シャフリングされるポリヌクレオチド間の高レベルな相同性の存在には依存しない。本発明は、１０１００より多い異なるキメラから構成される子孫分子のライブラリ（または集合）の非確率的な生成に使用可能である。おそらくは、合成遺伝子再集合は、１０１０００より多い異なる子孫キメラから構成されるライブラリの生成にも使用可能である。
こうして、一面において、本発明では、計画に選択された全体的な集合順序を持つ最終的なキメラ核酸分子の集合を生成する非確立的な方法が提供されており、この方法は、相互に適合性のある連結可能な端部を持つ有用な、多数の特定の核酸基本要素を計画に生成する手順と、計画な全体的な集合順序が達成されるように、これらの核酸基本要素を集合させる手順から構成される。
組み立てられる核酸基本要素の相互に適合性のある連結可能な端部は、それらによって、予め定められた順序どおりに基本要素が連結されるようにされている場合に、このタイプの順序化された集合に対して「有用」であると考えられる。こうして、一面において、核酸基本要素を連結する全体的な集合順序は、連結可能な端部の設計により指定され、また、２つ以上の集合手順が使用される場合には、核酸基本要素を連結できる全体的な集合順序は、集合手順の順次に指示により指定することもできる。本発明の一つの実施例において、アニーリングを施した組立て部品は、リガーゼ（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなど）などの酵素を用いて処理され、基本要素の共有結合が達成される。
別の実施例において、核酸基本要素の設計は、最終的なキメラ核酸分子の子孫集合を生成するための基礎としての役目をする一組の先駆体の核酸鋳型の配列を分析することで獲得される。こうして、これらの先駆体の核酸鋳型は、突然変異誘発、つまりキメラ化またはシャフリングされることになる核酸基本要素の設計を支援する配列情報源としての役目をする。
【００１５】
一つの例証において、本発明では、関連性のある遺伝子群およびその符号化された関連生成物群のキメラ化が提供されている。特定の例証において、符号化された生成物は酵素である。本発明のハイドロラーゼは、本書で説明した方法に従い変異誘発可能である。
こうして、本発明の一面によれば、多数の先駆体の核酸鋳型（グループＡ核酸配列のポリヌクレオチドなど）の配列は、１つ以上の境界点を選択するために位置合わせでき、その境界点は、相同性のある領域に定めることができる。境界点は、生成されることになる核酸基本要素の境界線を定めるために使用される。こうして、先駆体分子内で識別・選択された境界点は、子孫分子の集合において潜在的なキメラ化の地点としての役割を果たす。
一般に、有用な境界点は、少なくとも２つの先駆体の鋳型で共有されている相同性のある（少なくとも１つの相同性のヌクレオチド塩基で構成される）領域であるが、境界点は、少なくとも先駆体の鋳型の半分、少なくとも先駆体の鋳型の３分の２、少なくとも先駆体の鋳型の４分の３、および望ましくは先駆体の鋳型のほぼ全部で共有されている相同性のある領域でもありうる。さらに望ましく、なおかつ有用な境界点は、先駆体の鋳型全体で共有されている相同性の領域である。
一つの実施例においては、網羅的なライブラリを生成するために、遺伝子再集合プロセスは徹底的に実施される。言い換えれば、核酸基本要素について考えられる全ての順序付けられた組み合わせが、最終的なキメラ核酸分子の集合で表示される。同時に、各組み合わせにおける集合順序（すなわち、最終的な各キメラ核酸の５’から３配列における各基本要素の集合の順序）は、計画なもの（または非確率的なもの）である。この方法の非確率的な性質のため、望まれない副産物の可能性が大幅に低減される。
別の実施例において、この方法では、例えば系統的に区画化されたライブラリを生成するために、体系的に（一つずつなど）スクリーニング可能な区画を用いて、遺伝子再集合プロセスが体系的に実施されるとしている。言い換えれば、本発明では、特定の核酸基本要素を選択的かつ慎重に用い、また順次的な手順の集合反応を選択的かつ慎重に用いることにより、実験的な設計が達成可能となり、特定の子孫生成物の集合が複数の反応槽の各々で生成されるとしている。これにより、体系的な試験およびスクリーニング手順の実施が可能となる。こうして、潜在的に非常に多数の子孫分子を小規模のグループ内で体系的に検査することができる。
【００１６】
特に、先駆体分子内で相同性のレベルが低いときにも、高い柔軟性があると同時に徹底的かつ体系的な方法でのキメラ化を実施できる能力があるため、本発明では、多数の子孫分子で構成されるライブラリ（または集合）の生成が提供されている。本発明の遺伝子再集合は非確率的な性質があることから、生成された子孫分子は、計画に選択された全体的な集合順序を有する最終的キメラ核酸分子のライブラリで構成されることが望ましい。特定の実施例において、そのような生成されたライブラリは、１０３〜１０１０００より多い異なる子孫分子の種から構成される。
一面において、前述のとおりに生成された最終的キメラ核酸分子の集合は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成されている。１つの実施例によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、人工遺伝子でもありうる。他の実施例によれば、このポリヌクレオチドは、遺伝子経路であり、人工の遺伝子経路でもありうる。本発明では、本発明で生成される１つ以上の人工遺伝子が、真核生物体（植物を含む）内で操作可能な経路などの人工の遺伝子経路に組込み可能である。
別の例証において、基本要素が生成される手順は合成によるものであることから、後で生体外プロセス（突然変異誘発によるなど）または生体内プロセス（宿主生物体の遺伝子スプライシング能力の利用によるなど）で、任意に除去が可能なヌクレオチド（例えば、コドンまたはイントロンまたは制御配列でありうる１つ以上のヌクレオチドなど）の設計および導入が可能となる。多くの例において、有用な境界点の生成といった潜在的な利益に加え、その他数多くの理由からも、これらのヌクレオチドの導入は望ましいことが認識される。
こうして、他の実施例によれば、本発明では、核酸の基本要素はイントロンの導入に使用できる。よって、本発明では、機能性イントロンを本発明の人工遺伝子に導入しうる。また、発明では、機能性イントロンを本発明の人工の遺伝子経路に導入しうる。よって、本発明では、１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンを含有する人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドが生成される。
【００１７】
また、本発明では、１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンを含有する人工の遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドも生成される。人工的に導入されたイントロンは、天然のイントロンが遺伝子スプライシングにおいて機能的に役割を果たすのと同じ様に、遺伝子スプライシングのための１つまたは複数の宿主細胞において機能的であることが望ましい。本発明では、組換えおよびスプライシング（またはそのいずれか）のための宿主生物体に導入されることになる、イントロン含有の人工ポリヌクレオチドを生成するプロセスが提供されている。
本発明を利用して生成した人工遺伝子は、他の核酸との組換え用の基質としての役割を果たすこともできる。同様に、本発明を利用して生成した人工の遺伝子経路は、他の核酸との組換え用の基質としての役割を果たすこともできる。望ましい例において、組換えは、イントロン含有の人工遺伝子と、組換えの相手としての役割をする核酸との間の相同性の領域により促進されるか、その領域で発生する。特に望ましい例において、組換えの相手は、人工遺伝子または人工の遺伝子経路を含む、本発明により生成された核酸でもありうる。組換えは、人工遺伝子内の１つ（または複数）の人工的に導入されたイントロンの部位に存在する、相同性の領域により促進されるか、その領域で発生する。
本発明の合成遺伝子再集合法では、それぞれに２つの連結可能な端部のある多数の核酸基本要素を利用することが望ましい。それぞれの核酸基本要素の２つの連結可能な端部としては、２つのブラントエンド（平滑断端）（つまり、それぞれに ０ ヌクレオチドのオーバーハングがあるもの）、または望ましくは１つのブラントエンドと１つのオーバーハング、またはさらに望ましくは２つのオーバーハングが考えられる。
この目的に役立つオーバーハングには、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングがある。こうして、核酸基本要素には、１つの３’オーバーハングまたは、その代わりに１つの５’オーバーハング、またはその代わりに２つの３’オーバーハング、またはその代わりに２つの５’オーバーハングを持つことが考えられる。核酸基本要素が集合して最終的キメラ核酸分子を形成する全体的な順序は、無作為にではなく、計画で実験的な設計により決定される。
【００１８】
望ましい１つの実施例によれば、核酸基本要素は、２つの一本鎖の核酸（一本鎖のオリゴともいう）を化学合成し、それらをアニールして二本鎖核酸基本要素が形成されるようにそれらを接触させることで生成される。
二本鎖核酸基本要素は、様々なサイズが考えられる。これらの基本要素のサイズは、小さくも大きくもできる。基本要素として望ましいサイズは、１つの塩基対（オーバーハングは含まない）から、１００，０００個の塩基対（オーバーハングは含まない）までの範囲である。その他の望ましいサイズの範囲も提供されており、それは下限が１ｂｐ〜１０，０００ｂｐ（この間のすべての整数値を含む）で、上限が２ｂｐ〜１００，０００ ｂｐ（この間のすべての整数値を含む）の値である。
二本鎖核酸基本要素を生成可能な、本発明にとって有用な数多くの方法が存在し、それらは、この技術分野で知られており、熟練者により簡単に実施可能なものである。
１つの実施例によれば、二本鎖核酸基本要素は、まず２つの一本鎖核酸を生成し、それらをアニールして二本鎖核酸基本要素を形成できるようにすることで生成される。二本鎖核酸基本要素の２つの鎖は、オーバーハングを形成するもの以外では、各ヌクレオチドで相補鎖であることが考えられ、よって、オーバーハング以外にはミスマッチは含まれていない。別の実施例によれば、二本鎖核酸基本要素の２つの鎖は、オーバーハングを形成するもの以外では、各ヌクレオチドよりも少ない数において相補鎖である。こうして、この実施例によれば、二本鎖核酸基本要素は、コドンの縮重の導入に使用できる。コドンの縮重は、本書で説明した部位親和性のある突然変異誘発を使用、１つまたは複数のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットを使用、またはその代わりに１つまたは複数のＮ，Ｎ，Ｎカセットを使用して、導入することが望ましい。
本発明の生体内での組換え方法は、特定のポリヌクレオチドまたは配列の、未知混成体または対立形質のプールに対して盲目的に実施できる。ただし、特定のポリヌクレオチドの実際のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を知る必要はない。
【００１９】
混成遺伝子の母集団内で組換えを使用するアプローチは、例えば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡおよび成長ホルモンといった、有用な任意のタンパク質の生成に役立ちうる。このアプローチは、特異性または活性の変化したタンパク質の生成に使用しうる。また、このアプローチは、例えば、プロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の３１非翻訳領域または５１非翻訳領域といった、混成核酸配列の生成に役立ちうる。こうして、このアプローチは、発現率の高い遺伝子の生成に使用しうる。また、このアプローチは、反復ＤＮＡ配列の研究にも有用である。最後に、このアプローチは、リボザイムまたはアプタマーの突然変異にも有用である。
本発明が本書で説明している一面では、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの非常に複雑な線形配列の定方向への分子の進化が完全な組換えとなるような、還元的再集合、組換え、および選択の反復的な繰り返しの使用が指示されている。
生体内での分子のシャフリングは、変異体の供給において有用で、細胞の自然の性質を利用して多量体の組換えを実施することができる。生体内での組換えが分子の多様性に対する主要な天然経路を提供してきた一方、遺伝子組換えは、１）相同性の認識、２）組換えキアズマの生成につながる鎖の切断、鎖の侵入、および代謝ステップ、そして最後に３）キアズマの個々の組換え分子への分解、などが関連する比較的複雑なプロセスのままである。キアズマの形成には、相同配列の認識を必要とする。
別の実施例において、本発明には、少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドおよび１つの第２のポリヌクレオチドから混成ポリヌクレオチドを生成する方法が含まれている。本発明は、少なくとも１つの部分的配列相同性の領域を共有する少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドおよび１つの第２のポリヌクレオチドを適した宿主細胞に導入することにより、混成ポリヌクレオチドの生成に使用できる。部分的な配列相同性のある領域は、配列再編成となるプロセスを促進し、混成ポリヌクレオチドが生成される。本書で使用するとき、「混成ポリヌクレオチド」という用語は、本発明の方法による任意のヌクレオチド配列をいい、少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列からの配列が含まれている。こうした混成ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子間の配列組込みを促進する分子間の組換え現象の結果である場合もありうる。さらに、こうした混成ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変化させる反復配列を利用した分子内の還元的再集合プロセスからのものでもありうる。
【００２０】
本発明では、生物活性ハイブリッドポリペプチド（混成ハイドロラーゼなど）を符号化しうる混成ポリヌクレオチドを生成する手段が提供されている。一面において、最初のポリヌクレオチドは、生物活性ポリペプチドをコードする。本発明の方法では、結果としての混成ポリヌクレオチドによりポリペプチドが符号化され、本来の生物活性ポリペプチドに由来する活性が示されるように、元のポリヌクレオチドの配列を統合するような細胞の過程の利用により、新しい混成ポリペプチドを生成する。例えば、元のポリヌクレオチドは、異なった微生物からの特定の酵素を符号化できる。１つの生物体または変異体からできた第１のポリヌクレオチドにより符号化された酵素は、例えば、高塩分といった特定の環境条件下で効果的に機能することがある。異なる生物体または変異体からの第２のポリヌクレオチドにより符号化された酵素は、極度の高温といった異なる環境条件下で効果的に機能することがある。第１ と第２の元のポリヌクレオチドからの配列を含む混成ポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドにより符号化された両方の酵素の性質を示す酵素を符号化しうる。こうして、混成ポリヌクレオチドにより符号化された酵素は、第１と第２のポリヌクレオチドにより符号化されたそれぞれの酵素により共有される環境条件下（高塩分および極度の温度など）で効果的に機能しうる。
本発明のポリヌクレオチドで符号化された酵素には、エステラーゼなどのハイドロラーゼが含まれるが、これに限られない。本発明の方法による混成ポリペプチドは、元の酵素では示されなかった特化された酵素活性を示すことがある。例えば、ハイドロラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドの組換えおよび還元的再集合（またはそのいずれか）の後、混成ポリヌクレオチドにより符号化される結果としての混成ポリペプチドは、それぞれの元の酵素から獲得された特別なハイドロラーゼ活性、つまりハイドロラーゼが作用する結合のタイプや、ハイドロラーゼが機能する温度についてスクリーニングをすることができる。こうして、例えば、ハイドロラーゼは、混成ハイドロラーゼと元のハイドロラーゼを区別する化学機能を確認するためにスクリーニングをすることができる。これには、（ａ）アミド（ペプチド結合）、つまり、プロテアーゼ、（ｂ）エステル結合、つまり、エステラーゼおよびリパーゼ、（ｃ）アセタール、つまり、グリコシダーゼのほか、例えば、混成ポリペプチドの機能する部位での温度、ｐＨまたは塩濃度などがある。
【００２１】
最初のポリヌクレオチドの資源としては、個別の生物体から単離したもの（「単離体」）、定義済みの培養液内で成長した生物体の集合（「集積培養」）、または未培養の生物体（「環境サンプル」）などが考えられる。環境サンプルから新しい生理活性をコードするポリヌクレオチドを引き出すために、培養に依存しない方法を使用することが最も望ましい。これは、それにより生物多様性の未利用の資源を利用することができるためである。
「環境的ライブラリ」は、環境サンプルから生成され、適した原核生物宿主内で増殖可能なクローニングベクター内で達成された自然発生的な生物体の集団ゲノムを表す。クローン化ＤＮＡは、最初に環境サンプルから直接抽出されるため、ライブラリは、純粋培養で成長しうる原核生物の極一部には限定されない。さらに、これらのサンプルで提示される環境ＤＮＡの正規化によって、元のサンプルに存在するあらゆる種からのＤＮＡをより均等に表現しうることにもなる。このことにより、優先種と比較して数桁も低く表現されている場合もあるサンプルの微量成分から、目的とする遺伝子を見つける効率を劇的に高めることができる。
例えば、１つまたは複数の未培養微生物から生成された遺伝子ライブラリは、当該の活性についてスクリーニングされる。当該の生理活性分子をコードする潜在的な経路は、まず、原核細胞内で遺伝子発現ライブラリの形態で捕捉される。当該の活性をコードするポリヌクレオチドは、このようなライブラリから単離され、宿主細胞に導入される。宿主細胞は、組換えおよび還元的再集合（またはそのいずれか）を促進する条件下で成長し、新しい活性または強化された活性を持つ潜在的に活発な生体分子が生成される。
ポリヌクレオチドを準備する微生物としては、真正細菌および古細菌などの原核微生物、および菌類などの下等真核微生物、一部の藻類や原生動物が含まれる。ポリヌクレオチドは、環境サンプルからも単離することができ、その場合は核酸を、生物体を培養することなく回収することも、または１つまたは複数の培養された生物体から回収することもできる。一面において、こうした微生物としては、超好熱菌、好冷菌、低温菌、好塩菌、好圧菌、および好酸菌などの極限環境微生物が考えられる。極限環境微生物から単離した酵素をコードするポリヌクレオチドが特に望ましい。このような酵素は、陸上の温泉および深海の熱水噴出口の１００℃を越える温度でも、北極の海域の０℃より低い温度でも、死海の飽和食塩水環境でも、炭の沈殿内や地熱による硫黄含有量の多い泉内のｐＨ値がほぼ０の場合でも、または下水汚泥での１１を越えるｐＨ値でも機能すると考えられる。例えば、極圏環境生物体からクローニングし発現したいくつかのエステラーゼおよびリパーゼでは、広範囲の温度およびｐＨ値全体で高い活性が示される。
【００２２】
上記に説明したとおりに選択・単離したポリヌクレオチドは、適した宿主細胞に導入される。適した宿主細胞としては、組換えおよび還元的再集合またはいずれかを促進する能力のある任意の細胞である。選択されたポリヌクレオチドは、適切な制御配列を含むベクター内に既にあるものが望ましい。宿主細胞としては、哺乳類の細胞などの高等な真核細胞、または、酵母菌などの下等真核細胞が考えられ、もしくは、望ましい宿主細胞としては、バクテリアの細胞などの原核細胞が考えられる。この構造の宿主細胞へ導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ 媒介のトランスフェクション、またはエレクトロポーレーションにより達成できる（Ｄａｖｉｓ等、１９８６）。
適切な宿主の代表的な例として、大腸菌、ストレプトマイセス、ネズミチフス菌などのバクテリアの細胞、酵母などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２やスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫の細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物の細胞、アデノウイルス、ならびに植物細胞が挙げられる。適切な宿主の選択は、本書の内容に基づき、この技術分野の熟練者の範疇にあるとみなされる。
組換えタンパク質の発現に採用可能な、各種の哺乳類の細胞培養システムに特に関連して、哺乳類の発現システムの例には、“ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＳＶ４０ ｍｕｔａｎｔｓ”（Ｇｌｕｚｍａｎ， １９８１）に記載のあるサル腎臓の繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、ならびに例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ株細胞など、適合性のあるベクターが発現可能なその他の株細胞が含まれる。哺乳類の発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーのほか、必要とされる任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスの供与体および受容体部位、転写性末端配列、および５′フランキング非転写配列を構成することになる。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列およびポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝因子を提供するためにも使用されうる。
【００２３】
所定のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、形質転換体または増幅遺伝子を選択しつつ、プロモーターの活性化のために必要に応じて修飾した従来の培養液内で培養が可能である。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞でそれまでに使用したものであり、通常の熟練者にとって明白なものである。特定の酵素活性を持つものとして識別されるクローンは、強化された活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列の識別に配列決定することもできる。
別の面で、本発明の方法は、１つまたは複数のオペロンまたは遺伝子群、あるいはその一部からの生化学経路をコードする新しいポリヌクレオチドの生成に使用できることが想定される。例えば、バクテリアや多くの真核生物には、その遺伝子の生成物が関係するプロセスに関連した遺伝子を調節するための強調機構がある。遺伝子は、単一の染色体上で「遺伝子群」と呼ばれる構造で集積し、単一制御配列の制御の下で、群全体の転写を開始する単一のプロモーターを含めて、まとめて転写される。このように、遺伝子群は、一般にその機能において同一または関連性のある隣接した遺伝子の集合である。遺伝子群により符号化される生化学経路の例は、ポリケチドである。ポリケチドは、生理活性の非常に豊富な資源である分子で、これには抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシンなど）、抗がん剤（ダウノマイシン）、免疫抑制薬（ＦＫ５０６およびラパマイシン）、および獣医用製品（モネンシン）がある。多くのポリケチド（ポリケチド合成酵素により生成）は、治療薬として貴重である。ポリケチド合成酵素は、長さや機能性および環化のパターンの異なる非常に多様な炭素鎖の生合成に対して触媒の役目をする複合作用酵素である。ポリケチド合成酵素遺伝子は、遺伝子群に該当し、またポリケチド合成酵素のうち少なくとも１つのタイプ（指定タイプＩ）には、大規模の遺伝子および酵素があり、これらの遺伝子／タンパク質の遺伝子操作および生体外での研究を複雑なものにしている。
【００２４】
遺伝子群ＤＮＡは、異なる生物体から単離したり、ベクター、特に結合された遺伝子群からの検出可能なタンパク質またはタンパク質に関連した配列活性の生成を制御・調整可能な発現制御配列を含むベクターに連結することができる。こうした遺伝子群との併用には、外来性のＤＮＡの導入に対して例外的に大きな容量を持つベクターを使用することが特に適切であり、本書では、大腸菌のＦ因子（または稔性因子）を含めて例として説明している。大腸菌のＦ因子は、接合時にそれ自体の高頻度転移に影響を及ぼすプラスミドであり、混成の微生物サンプルからの遺伝子群などの大規模なＤＮＡ断片を実現し、安定して増殖するために理想的である。特に望ましい実施例は、「フォスミド」または細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターと呼ばれるクローニングベクターの使用である。これらは、ゲノムＤＮＡの大規模なセグメントを安定して組み込むことのできる大腸菌Ｆ因子に由来するものである。混成の未培養環境サンプルからのＤＮＡに組み込むとき、大規模なゲノム断片を安定した「環境ＤＮＡライブラリ」の形態で実現可能となる。本発明で使用する別のタイプのベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、本来、ゲノムＤＮＡの大規模なセグメントをクローン・増殖するように設計されていたものである。コスミドベクターへのクローニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に詳細に説明されている。いったん適切なベクターに結合されると、異なるポリケチド合成酵素遺伝子群を含む２つ以上のベクターを、適した宿主細胞に導入することができる。遺伝子群により共有されている部分的配列相同性の領域では、プロセスが促進され、配列再編成が起こり、混成遺伝子群が出来上がる。こうして、新しい混成遺伝子群は、元の遺伝子群にはなかった強化された活性についてスクリーニングができる。
したがって、１つの実施例において、本発明は、下記の手順により、生物活性の混成ポリペプチドを生成し、そのようなポリペプチドを強化された活性についてスクリーニングする方法に関連する。
【００２５】
１）少なくとも操作可能な連鎖のある第１のポリヌクレオチドおよび操作可能な連鎖のある第２のポリヌクレオチド、上記の少なくとも１つの部分的配列相同性の領域を共有する少なくとも第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを適した宿主細胞に導入する手順
２）配列再編成を促進し、操作可能な連鎖のある混成ポリヌクレオチドが生成されるような条件下での宿主細胞を培養する手順
３）混成ポリヌクレオチドにより符号化された混成ポリペプチドを発現する手順
４）強化された生物活性の識別を促進するような条件下で混成ポリペプチドをスクリーニングする手順
５）混成ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する手順
各種の酵素活性についてのスクリーニング方法は、この技術分野の熟練者には知られており、本明細書全体で論じている。こうした方法を、ポリペプチドおよび本発明のポリヌクレオチドの単離時に採用することもできる。
使用できる発現ベクターの代表例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルス性ＤＮＡ（ワクシニア、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病、およびＳＶ４０の誘導体など）、Ｐｌベースの人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、ならびに、その他目的とする特定の宿主に固有の任意のベクター（バシラス属、アスペルギルス属、および酵母など）が挙げられる。こうして、例えば、ポリペプチドの発現のために、ＤＮＡを多様な発現ベクターのどれにでも含めることができる。このようなベクターには、染色体の、非染色体性の、および合成によるＤＮＡ配列が含まれる。多数の適したベクターが、この技術分野の熟練者に知られており、市販されている。下記のベクターが、例として挙げられる。細菌性としてはｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、λ−ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、真核生物としては、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。ただし、複製可能であり、宿主内で生存可能である限り、その他のプラスミドまたはその他のベクターのうち、任意のものを使用することができる。本発明では、低複製数または高複製数のベクターを採用できる。
【００２６】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ＲＮＡ合成を指示する適切な発現制御配列（プロモーター）によって操作可能なようにリンクされている。特定の名称を持つ細菌性のプロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬ、ｔｒｐなどが含まれる。真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ 前初期、ＨＳＶ チミジンキナーゼ、初期および後期のＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉなどがある。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分にこの技術分野での通常の熟練レベル内にある。発現ベクターには、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターも含まれる。また、ベクターには、発現の増幅用の適切な配列も含まれうる。プロモーター領域は、クロラムフェニコール転移酵素（ＣＡＴ）ベクターまたはその他のベクターを選択マーカーを使用して、希望の任意の遺伝子から選択できる。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、もしくは大腸菌のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などといった、形質転換した宿主細胞の選択についての表現形質を提供するための、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子が含まれていることが望ましい。
生体内での再集合は、「分子間」プロセスに焦点があてられており、まとめて、「組換え」と呼び、バクテリアにおいては、一般に「ＲｅｃＡに依存した」現象としてみられる。本発明は、配列を組み換え直し、集合し直すための宿主細胞の組換えプロセス、または欠失によって細胞内の準反復配列の複雑さを低減するための還元的プロセスの媒介となる細胞の能力に依存することができる。この「還元的再集合」プロセスは、「分子内の」ＲｅｃＡに依存しないプロセスにより発生する。
したがって、本発明の別の面では、新しいポリヌクレオチドは、還元的再集合プロセスにより生成できる。この方法には、連続的な配列（本来の符号化用配列）が含まれる構成物を生成し、それを適切なベクターに挿入し、さらにその後、それを適切な宿主細胞に導入することが関連する。個別の分子の再集合は、相同性の領域を処理する構成物内の連続的な配列間で、または準反復単位間の組み合わせプロセスにより起こる。再集合プロセスによって、反復配列の複雑さおよび範囲が再組み合わせられ、また低減され（またはそのいずれか）、新しい分子種が生成されることになる。再集合の割合を高めるために、様々な処理を適用しうる。これには、紫外線、またはＤＮＡに有害な化学物質による処理、および「遺伝的不安定性」のレベルを高めた宿主細胞株の使用（またはそのいずれか）などがある。こうして、再集合プロセスには、それ自体の進化を指示する相同的組換えまたは準反復配列の自然の性質も関連しうる。
【００２７】
反復または「準反復」した配列は、遺伝的不安定性の役割を果たす。本発明において、「準反復体」とは、元の単位構造には制限されない反復体である。準反復単位は、構成物内の一連の配列または類似した配列の連続単位として提示できる。いったん連結されると、連続的な配列間の結合は本質的に不可視となり、これで、結果として生じる構成物の準反復の性質は、分子レベルで連続的となる。細胞が結果としての構成物の複雑さを低減するように機能する欠失プロセスは、準反復配列間で作用する。準反復単位では、鋳型のレパートリーが事実上無制限に提供されるが、この鋳型においてズレが生じることがある。こうして、準反復体が含まれる構成物により、欠失（および潜在的に挿入）イベントが準反復単位内の実質的にどこででも発生しうるような、分子の十分な弾性が効果的に提供される。
例えば頭−尾、またはその逆のように、準反復配列がすべて同一の向きに連結されるとき、細胞は、個別の単位を区別できない。したがって、還元プロセスは配列全体で発生しうる。対照的に、例えば、その単位が頭−尾でなく頭−頭であるときは、反転により、欠失の形成が離散した単位の喪失に対して有利に働くように、隣接する単位の終点が描写される。そのため、本発明の方法では、配列は、同一の向きであることが望ましい。準反復配列が無作為の向きであると、再集合の効率が失われることになり、一方、配列が一貫した向きであると、最高の効率が得られることになる。ただし、同じ向きの近接した配列が少なければ効率は低下するが、新しい分子の効果的な回復については十分な弾性が得られうる。構成物は、高い効率を得ることのできる同一の向きの準反復配列で生成できる。
配列は、下記を含めた様々な方法を使用して、頭−尾の向きで組立て可能である：
ａ）一本鎖であるとき、向きを提供してくれるポリＡの頭およびポリＴの尾が含まれるプライマーが利用できる。これは、プライマーの最初の少数塩基をＲＮＡから生成し、それゆえＲＮＡｓｅＨから簡単に除去できるようにすることで達成できる。
ｂ）固有の制限切断部位のあるプライマーが利用できる。複数の部位、一揃いの固有の配列、および反復的な合成および連結の手順が必要となる。
ｃ）プライマーの内側の少数塩基はチオール化でき、適切な尾のある分子の生成に使用されるエキソヌクレアーゼ。
【００２８】
再集合配列の回復は、還元型の反復的な指標（ＲＩ）のあるクローニングベクターの識別に依存している。その後で、再集合した符号化用の配列が、増幅により回復できる。生成物は、再クローン化・発現される。還元型ＲＩのあるクローニングベクターの回復は、以下により影響を受ける。
１）構成物の複雑さが低減されたときにのみ、安定して維持されるベクターの使用。
２）物理的な手順により、短くなったベクターの物理的な回復。この場合には、クローニングベクターは、標準的なプラスミド単離手順およびアガロース ゲルで細分されたサイズ、または標準的な手順を使用した低分子量の切り取りのあるカラムを用いて回復される。
３）挿入サイズが減少する際に、選択可能な断続的な遺伝子が含まれるベクターの回復。
４）発現ベクターおよび適切な選択への直接選択法の使用。
関連した生物体からの配列（遺伝子など）の符号化では、高い度合いの相同性が示され、非常に多様なタンパク質生成物が符号化されることがある。これらのタイプの配列は、準反復体として、本発明において特に役立つ。ところが、下記に説明する例では、ほとんど同一の符号化配列（準反復体）の再集合が示されているが、このプロセスは、このようなほとんど同一の反復体に限定されるものではない。
下記の例では、本発明の方法を立証している。他と異なる３つの種から引き出した核酸配列（準反復体）の符号化が説明されている。各配列により、はっきりと異なる特性のあるタンパク質１組が符号化される。それぞれの配列は、配列内の固有の位置にある単一または少数の塩基対で異なっている。準反復配列は、連結された分子の母集団内で、可能性のあるあらゆる順列および組み合わせが出来上がるように、別個または集合的に増幅され、無作為な集合体に連結される。準反復単位の数は、集合条件により制御できる。構成物内の準反復単位の平均数は、反復的な指標（ＲＩ）として定義される。
【００２９】
いったん形成されると、構造物のサイズは、公表済みの手順によりアガロース ゲルで細分され、クローニングベクターに挿入、適切な宿主細胞に形質移入してもしなくてもよい。その後、細胞は増殖され、「還元的再集合」が実現する。還元的再集合プロセスの割合は、希望に応じたＤＮＡ損傷の導入により、促進させることもできる。ＲＩの低減が、「分子内の」のメカニズムによる反復配列間での欠失の形成を媒介とするか、または「分子間」のメカニズムによる組換えに似たイベントを媒介とするかは、重要ではない。最終的な結果は、考えられるすべての組み合わせへの分子の再集合である。
任意に、結合またはその他の方法で相互作用をする能力を有する個別のシャフリング済みライブラリ メンバを識別する、もしくは、例えば、タンパク質性受容体、オリゴ糖、ヴィロン（ｖｉｒｏｎ）、またはその他所定の化合物または構造などの所定の高分子と特定の反応（酵素の触媒としての領域）の触媒の役目をするためのシャフリング済みプールのライブラリ メンバをスクリーニングする手順を、方法に追加することもできる。
そのようなライブラリから特定したポリペプチドは、治療、診断、研究および関連した目的（触媒、水溶液の浸透圧向上のための溶質、それに類するものなど）に使用でき、さらに（または）１ 回または複数回のシャフリングおよび選択（またはそのいずれか）の追加サイクルを前提とすることもできる。
別の面で、組換えまたは再集合の前またはその途中において、本発明の方法により生成されたポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドへの突然変異の導入を促進するエージェントまたはプロセスを前提できることが想定される。こうした突然変異を導入することにより、結果としての混成ポリヌクレオチドおよびそれをもとに符号化したポリペプチドの多様性が向上されることになる。突然変異誘発を促進するエージェントまたはプロセスには、以下があるがこれらに制限されない：（＋）−ＣＣ−１０６５、または、（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）などの合成類似体（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｈｕｒｌｅｙ，（１９９２）を参照）、ＤＮＡ合成を抑制する能力のあるＮ−アセチル化または脱アセチル化した４′−ｆｌｕｒｏ−４−アミノビフェニル付加体（例えば、ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌ等、（１９９２）を参照）、もしくは、ＤＮＡ合成を抑制する能力のあるＮ−アセチル化または脱アセチル化した４−アミノビフェニル付加体（これも、ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌ等、（１９９２）を参照、ｐｐ． ７５１−７５８）、三価クロム、三価クロム塩、ＤＮＡ複製を抑制する能力のある多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）ＤＮＡ付加体（この例としては、７−ブロモメチル−ベンズ［ａ］アントラセン（「ＢＭＡ」）、トリス（２，３−ジブロモプロピル）リン酸塩（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９−１０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、白金（ＩＩ）ハロゲン塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ ［４，５−ｆ］−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）、およびＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｆ］−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＰｈＩＰ」）など）。ＰＣＲ増幅を減速または停止する特に望ましい手段は、紫外光（＋）−ＣＣ−１０６５および（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）から構成される。特に、含まれる手段は、ＤＮＡ付加体、またはポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールからのＤＮＡ付加体で構成されるポリヌクレオチドであり、これは、その後のプロセスをする前に、ポリヌクレオチドから構成される溶液の加熱を含むプロセスにより、遊離または除去の可能なものである。
【００３０】
別の面で、本発明では、本発明による条件下で野生型タンパク質をコードする二本鎖の鋳型ポリヌクレオチドで構成されるサンプルを処理することで、生物活性を有する組換えタンパク質を生成する方法が得られ、ハイブリッドまたは再集合ポリヌクレオチドが生成される。
また、本発明では、独自のコドン プライマー（縮重 Ｎ，Ｎ，Ｎ配列を含む）を使用して、点突然変異をポリヌクレオチドに導入し、これにより子孫ポリペプチドの集合が生成されるが、そこで、広範囲の単独なアミノ酸置換は、それぞれのアミノ酸位置で表現される（遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ））。使用されているオリゴは、互いに近接する第１の相同配列、縮重Ｎ，Ｎ，Ｎ配列、および第２の相同配列（望ましいものの必須ではない）から構成される。そのようなオリゴの使用による下流での子孫翻訳生成物には、ポリペプチドに沿ったそれぞれのアミノ酸部位で考えられる全てのアミノ酸変化が含まれるが、これは、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列の縮重には２０のアミノ酸すべてのコドンが含まれているためである。
一面において、このような１つの縮重オリゴ（１つの縮重Ｎ，Ｎ，Ｎカセットから成る）が、親ポリヌクレオチド鋳型におけるそれぞれの最初のコドンを従属させ、完全なコドンの置換をするために使用される。別の面で、同一のオリゴ内であるかどうかによらないが、少なくとも２つの縮重Ｎ，Ｎ，Ｎカセットが、親ポリヌクレオチド鋳型における少なくとも２つの最初のコドンを従属させ、完全なコドンの置換をするために使用される。こうして、２つ以上のＮ，Ｎ，Ｎ配列が、２つ以上の部位でアミノ酸突然変異を導入するために、１つのオリゴ内に含まれうる。この多数のＮ，Ｎ，Ｎ配列は、直接的に近接するものでもよく、また１つまたは複数の追加ヌクレオチド配列ごとに別個のものでもよい。別の面で、付加および欠失の導入に有用なオリゴは、単独でか、またはＮ，Ｎ，Ｎ配列を含むコドンと組み合わせて使用でき、アミノ酸の付加、欠失、および置換（またはそのいずれか）の任意の組み合わせまたは順列が導入される。
特定の例証において、近接したＮ，Ｎ，Ｎトリプレット、つまり縮重（Ｎ，Ｎ，Ｎ）ｎ配列を含むオリゴを使用して、２つ以上の近接したアミノ酸位置を、同時進行的に突然変異誘発することが可能である。
【００３１】
別の面で、本発明では、Ｎ，Ｎ，Ｎ配列よりも縮重度合いの低い縮重カセットが使用される。例えば、一部の例においては、（オリゴ内でなど）一つのみのＮで構成される縮重トリプレット配列を使用することが望ましいこともある。ここで、このＮはトリプレットの第１、第２、第３のどの位置でもよい。その任意の組み合わせおよび順列を含めたその他の塩基を、トリプレットの残りの ２つの位置で使用できる。別の方法として、一部の例においては、（オリゴ内でなど）縮重Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット配列、Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、またはＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を使用することが望ましいこともある。
ただし、本発明で説明したとおりに、縮重トリプレット（Ｎ，Ｎ，Ｇ／ＴまたはＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列など）を使用することが、いくつかの理由から有利であることが認識される。一面において、本発明では、可能性のあるアミノ酸すべて（合計２０のアミノ酸について）をポリペプチドのあらゆるアミノ酸位置に置換する手段が、体系的に且つかなり容易に提供されている。こうして、１００のアミノ酸ポリペプチドについては、本発明では、２０００の異なる種（つまり、位置ごとに可能性のある２０のアミノ酸×１００アミノ酸位置）を、体系的に且つかなり容易に生成する方法が提供されている。縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／ＴまたはＮ，Ｎ，Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴの使用により、可能性のある２０のアミノ酸をコードする３２の別個の配列が提供されていることが認識される。こうして、そのような１つのオリゴを使用して、親のポリヌクレオチド配列の飽和突然変異誘発がなされる反応槽内で、２０の異なるポリペプチドをコードする３２の異なる子孫ポリヌクレオチドが生成される。それとは対照的に、非縮重オリゴを部位特異的突然変異誘発に使用すると、反応槽当たりわずか１つの子孫ポリペプチド生成物ができるだけである。
また、本発明では、公開されている縮重プライマーと組み合わせて任意に使用できる非縮重オリゴの使用についても用意している。一部の状況下で、作業中のポリヌクレオチドにおいて特定の点突然変異を生成するために、非縮重オリゴを使用することが有利であることが認識される。これにより、特定のサイレント点突然変異、該当するアミノ酸変化につながる点突然変異、ならびに停止コドンの生成および対応するポリペプチド断片の発現の原因となる点突然変異などを生成する手段が提供される。
【００３２】
こうして、本発明の望ましい実施例において、それぞれの飽和突然変異誘発反応槽には、親のポリヌクレオチド内で突然変異誘発されたコドン位置に対応する１つの特定のアミノ酸位置で２０のすべてのアミノ酸が表現されるように、少なくとも２０の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドが含まれる。それぞれの飽和突然変異誘発反応槽で生成された３２倍縮重の子孫ポリペプチドには、クローン増幅（発現ベクターを使用して適切な大腸菌宿主にクローニングするなど）をしたり、発現スクリーニングをすることができる。個別の子孫ポリペプチドがスクリーニングにより識別され好ましい特性の変化が現れたとき（親のポリペプチドとの比較時）、そのポリペプチドは配列決定され、そこに含まれる対応するものとして好ましいアミノ酸置換を識別することができる。
本書で公開した飽和突然変異誘発を用いて、親のポリペプチド内のあらゆるアミノ酸位置を突然変異誘発し、２つ以上のアミノ酸位置で好ましいアミノ酸変化を識別できることが認識される。それらの好ましいアミノ酸置換のすべてまたはその一部の組み合わせを含む１つまたは複数の新しい子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の好ましいアミノ酸変化が、ポリペプチド内の３つのアミノ酸位置のそれぞれで識別された場合、順列には、各位置において３通りの可能性（元のアミノ酸から変化のないものと、それぞれ２つの好ましい変化）および３つの位置が含まれる。こうして、３×３×３つまり合計２７通りの可能性があり、以前に検査済みの単一の点突然変異６つ（つまり、３つの位置ごとに２つずつ）と、位置に変化のないものを合計した７つがこれに含まれる。
また別の一面で、部位飽和型突然変異誘発は、スクリーニングとの併用のほかに、シャフリング、キメラ化、組換え、およびその他の突然変異誘発過程との併用ができる。本発明では、飽和突然変異誘発を含めた任意の突然変異誘発過程の反復的な使用について用意されている。一つの例証において、任意の突然変異誘発過程の反復使用は、スクリーニングと組み合わせて使用される。
【００３３】
こうして、非限定的な例証において、本発明では、追加の突然変異誘発プロセスとの組み合わせでの飽和突然変異誘発の使用についても用意しており、このプロセスでは、混成ポリヌクレオチドが組換えおよび還元的再集合によって生成されるように、２つ以上の関連性のあるポリヌクレオチドが適した宿主細胞に導入される。
さらに、遺伝子配列全体に沿った突然変異誘発の実施について、本発明では、突然変異誘発を、ポリヌクレオチド配列内の任意の塩基数と置き換えるために使用できるとし、ここで、突然変異誘発される塩基の数は、１５から１００，０００までの各整数値であることが望ましい。こうして、分子に沿った各位置を突然変異誘発させる代わりに、各塩基または離散的な数の塩基（合計 １５〜１００，０００となる部分集合が望ましい）に対して突然変異誘発を起こさせることができる。ポリヌクレオチド配列に沿った各位置または位置グループの突然変異誘発には、別個のヌクレオチドが使用されることが望ましい。突然変異誘発される３位置で構成されるグループは、コドンでもよい。突然変異は、非相同的なカセットを含む変異原性のプライマー（変異原性カセットとも呼ばれる）を使用して導入することが望ましい。望ましいカセットは、１〜５００の塩基を持つことができる。そのような非相同的なカセットでの各ヌクレオチド位置は、Ｎ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｇ、またはＥで、ここでＥは、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ 以外の任意の塩基である（Ｅをデザイナーオリゴと呼ぶこともできる）。
一般的な意味で、飽和突然変異誘発は、突然変異誘発される定義済みのポリヌクレオチド配列（ここで、突然変異誘発される配列の長さは、約１５〜１００，０００塩基分が望ましい）内での、完全な一揃いの変異原性カセット（ここで、各カセットの長さは、約１〜５００塩基分が望ましい）の突然変異誘発で構成される。こうして、突然変異のグループ（１〜１００の突然変異の範囲で）が、突然変異誘発される各カセットに導入される。１ラウンドの飽和突然変異誘発の適用中に、１つのカセットに導入される突然変異のグループは、第２のカセットに導入される突然変異の第２のグループとは、異なるものでも同じものでもよい。こうしたグループ化は、欠失、付加、特定のコドンのグループ化、および特定のヌクレオチドカセットのグループ化により例証されている。
【００３４】
突然変異誘発される定義済みの配列には、全遺伝子、経路、ｃＤＮＡ、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）全体、およびプロモーター全体、エンハンサー、リプレッサー／トランス活性化因子、複製起点、イントロン、オペレーター、または任意のポリヌクレオチド官能基などがある。一般に、この目的での「定義済みの配列」としては、１５塩基のポリヌクレオチド配列、および長さが１５〜１５，０００塩基分（この発明では、この間のすべての整数値を特に指定する）のポリヌクレオチド配列の任意のポリヌクレオチドが考えられる。コドンのグループの選択にあたっての考慮事項には、縮重変異原性カセットにより符号化されるアミノ酸のタイプなどがある。
変異原性カセットに導入できる突然変異のグループ化についての特定の望ましい例証において、本発明では特に、各位置で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０のアミノ酸用にコードする縮重コドンの置換（縮重オリゴを使用）、ならびにそれにより符号化されるポリペプチドのライブラリが用意されている。
本発明の一面は、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちどれか１つの配列、それに対して相補的な配列、またはグループＡ核酸配列（またはそれに対して相補的な配列）のうちどれか一つの配列のうち、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００の連続塩基から成る断片で構成される単離された核酸である。単離した核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどのＤＮＡで構成されうる。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖のどちらでもよく、また一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖のどちらでもよい。別の方法として、単離された核酸はＲＮＡで構成することもできる。
下記にさらに詳細に説明するとおり、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちどれか１つの単離された核酸を、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちどれか１つのポリペプチド、もしくはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちどれか１つのポリペプチドのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片の準備に使用することもできる。
【００３５】
したがって、本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列、それと実質的に同一な配列のポリペプチドのうちどれか１つ、またはグループＢアミノ酸配列のポリペプチドのどれか１つのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から成る断片をコードする単離された核酸である。これらの核酸のコード配列は、遺伝暗号の重複性または縮重の結果として、グループＡ核酸配列の核酸のうちどれか１つ、またはその断片のコード配列と同一でもよく、またグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの１つ、およびグループＢアミノ酸配列のポリペプチドの１つのうち、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸を持つ断片をコードする異なったコード配列でもよい。遺伝暗号は、この技術分野の熟練者にはよく知られており、例えば、Ｂ． Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ ＶＩ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９７の２１４ ページにて入手可能であり、その開示内容を参照により本書に組み込む。
グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つをコードする単離された核酸には、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の １つのコード配列のみ、ならびにリーダー配列またはプロタンパク質配列などの追加コード配列、ならびにイントロンまたはコード配列の非翻訳配列５’および３’（またはそのいずれか）などの非翻訳配列などが含まれるがこれに限定されない。こうして、本書で使用するとき、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語には、ポリペプチド用のコード配列のみを含むポリヌクレオチドのほか、追加コードおよび非翻訳配列（またはそのいずれか）を含むポリヌクレオチドも含まれる。
別の方法として、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の核酸配列は、部位特異的突然変異誘発、またはこの技術分野の熟練者にとって馴染みあるその他の技術などの従来の技術を使用して突然変異誘発し、サイレント変化をグループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリヌクレオチドに導入することもできる。本書で使用するとき、「サイレント変化」には、例えば、ポリヌクレオチドにより符号化されるアミノ酸配列を変化させることのない変化が含まれる。このような変化は、宿主生物体で頻繁に発生するコドンまたはコドン対を導入することにより、ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞によって生成されるポリペプチドのレベルを高める目的で望ましいといえる。
【００３６】
本発明は、ヌクレオチド変化を持つポリヌクレオチドにも関連し、その結果、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド内でのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断が起こる。こうしたヌクレオチド変化は、部位特異的突然変異誘発、無作為な化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失、およびその他の組換えＤＮＡセグメント技術などの技術を使用して導入することができる。別の方法として、こうしたヌクレオチド変化は、本書で提供した高厳密性、中程度の厳密性、または低厳密性の条件下で、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の（またはそれに対して相補的な配列）の配列のどれか１つのうち、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００連続塩基配列で構成されるプローブに特異的にハイブリッド形成する核酸を識別することで単離した、自然発生的な対立形質変異体でもよい。
グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の単離された核酸、それに対して相補的な配列、またはグループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のどれか１つ、またはそれに対して相補的な配列のうち、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００の連続塩基で構成される断片を、本発明の核酸配列のある生物体または核酸の獲得元である生物体が含まれているかどうかを判断するプローブとして土質見本などの生体サンプルに使用することもできる。そうした手順において、核酸の単離元である生物体を潜在的にかくまう生体サンプルが得られ、サンプルからは核酸が得られる。核酸は、プローブが、内部に存在する任意の相補配列に対して特異的にハイブリッド形成することのできるような条件下で、プローブと接触する。
必要に応じて、プローブが相補配列に対して特異的にハイブリッド形成することのできるような条件は、相補配列が含まれることがわかっているだけでなく、相補配列が含まれない配列を制御するようなサンプルからの相補配列と接触するようにプローブを配置することで、決定することができる。ハイブリッド形成バッファの塩濃度、ハイブリッド形成バッファのホルムアミド濃度、またはハイブリッド形成温度などのハイブリッド形成の条件は、プローブが相補的な核酸に対して特異的にハイブリッド形成できるような条件を特定するために変化させることができる。
【００３７】
サンプルに核酸の単離元の生物体が含まれている場合には、プローブの特異的なハイブリッド形成が検出される。ハイブリッド形成は、検出可能な生成物を形成する触媒能力のある放射性同位元素、蛍光色素、または酵素などの検出可能なエージェントを用いて、プローブにラベル付けをすることで検出することもできる。
ラベル付けしたプローブを使用して、サンプル内の相補的核酸の存在を検出する数多くの方法が、この分野の熟練者にとってよく知られている。これらには、サザンブロット法、ノーザンブロット法、集落ハイブリッド形成手順、およびドット ブロットなどがある。これらの各方法の手順については、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ５０３ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に提供されており、この開示内容全体を参照することで、本書に組み込む。
別の方法として、２つ以上のプローブ（核酸サンプル内に存在する任意の相補配列に特異的にハイブリッド形成する能力のあるものを少なくとも１つ）を、増幅反応に使用し、サンプルに本発明の核酸配列のある生物体（核酸の単離元の生物体など）が含まれているかを判断することもできる。一般に、プローブは、オリゴヌクレオチドを意味する。一つの実施例において、増幅反応は、ＰＣＲ 反応を意味することがある。 ＰＣＲ プロトコルについては、前記のＡｕｓｕｂｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋに説明されている。別の方法として、増幅は、リガーゼ連鎖反応、３ＳＲ、または鎖置換反応を意味することもある（Ｂａｒａｎｙ， Ｆ．， “Ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＰＣＲ Ｗｏｒｌｄ，”ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：５−１６， １９９１； Ｅ． Ｆａｈｙ等、“Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）： Ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＣＲ，”ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：２５−３３， １９９１、およびＷａｌｋｅｒ Ｇ． Ｔ．等、“Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１６９１−１６９６， １９９２ を参照。それらの開示内容の全体を参照により本書に組み込む）。そうした手順において、サンプル内にある核酸は、プローブと接触し、増幅反応が行われ、結果としての何らかの増幅生成物が検出される。増幅生成物は、反応生成物でゲル電気泳動を実施し、ゲルを臭化エチジウムなどのインターキュレーター（ｉｎｔｅｒｃｕｌａｔｏｒ）で染色することにより、検出することもできる。別の方法として、プローブの１つまたは複数は、放射性同位元素を用いてラベル付けし、ゲル電気泳動の後で、放射性増幅生成物の存在をオートラジオグラフィにより検出することもできる。
【００３８】
プローブは、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の端部付近の配列から誘導され、また染色体歩行法で使用して、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の配列に隣接して位置するゲノム配列を含むクローンを識別することもできる。このような方法により、宿主生物体からの追加タンパク質をコードする遺伝子の単離が可能となる。
グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の単離された核酸、それに対して相補的な配列、もしくはグループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちのどれか１つの配列、またはそれに対して相補的な配列の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００の連続塩基から構成される断片をプローブとして使用し、関連する核酸を識別し、単離することもできる。一部の実施例において、関連する核酸としては、核酸の単離元であるもの以外の生物体からのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが考えられる。例えば、その他の生物体は関連した生物体であることもある。そうした手順において、核酸サンプルは、プローブが関連する配列に対して特異的にハイブリッド形成をできるような条件下でプローブと接触する。プローブの関連する生物体からの核酸へのハイブリッド形成は、その後、上記に説明した任意の方法を使用して検出される。
核酸のハイブリッド形成反応では、特定レベルの厳密性を達成するために使用する条件は、ハイブリッド形成する核酸の性質に応じて異なる。例えば、核酸のハイブリッド形成領域の長さ、相補性の度合い、ヌクレオチド配列の組成（ＧＣとＡＴ含有量の比）、および核酸タイプ（ＲＮＡやＤＮＡなど）を、ハイブリッド形成の条件の選択において考慮できる。追加考慮事項は、核酸のどれかが、例えばフィルターなどに固定化されているかどうかである。
ハイブリッド形成は、低厳密性、中程度の厳密性、または高厳密性の条件下で遂行できる。核酸のハイブリッド形成の例としては、まず、固定化された変性した核酸を含む高分子膜を、０．９Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４， ｐＨ７．０、５．０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０Ｘデンハート液、および０．５ｍｇ／ｍｌ ポリリボアデニル（ｐｏｌｙｒｉｂｏａｄｅｎｙｌｉｃ）で構成される溶液内で４５℃で３０分間、プレハイブリダイズする。次に、約２×１０７ｃｐｍ（比活性４−９×１０８ｃｐｍ／μｇ）の３２Ｐ末端ラベル付きのオリゴヌクレオチドプローブをその溶液に追加する。１２〜１６時間培養した後で、この膜を、０．５％ＳＤＳを含む１ＸＳＥＴ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリスハイドロクロライド、ｐＨ７．８、１ ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）内で、室温で３０分間洗浄し、その後、オリゴヌクレオチドプローブについて、新しい１ＸＳＥＴ 内で、Ｔｍ‐１０℃にて３０ 分間洗浄する。その後、膜を自動Ｘ 線フィルムで感光し、ハイブリッド形成の信号を検出する。
【００３９】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡなど、検出可能なプローブに対してハイブリッド形成をする核酸の識別に使用するハイブリッド形成の条件の厳密性を変化させることで、プローブに対する異なったレベルの相同性を持つ核酸を識別・単離できる。厳密性は、プローブの融解温度よりも低い異なる温度でハイブリッド形成を実施することにより変化しうる。融解温度Ｔｍは、目的の配列の５０％が完全に相補的なプローブに対してハイブリッド形成を起こす温度である（イオン強度およびｐＨは定義済みとする）。特定のプローブについて、Ｔｍに等しいか、それより約５℃低い温度となるように、非常に厳密な条件が選択される。プローブの融解温度は、下記の公式を用いて計算することができる。
長さが１４〜７０ヌクレオチドの間のプローブについては、融解温度（Ｔｍ）は、公式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）を用いて計算し、この式で、Ｎは、プローブの長さである。
ハイブリッド形成が、ホルムアミドを含む溶液内で実行される場合には、融解温度は、等式Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｇ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）を用いて計算でき、この式でＮは、プローブの長さである。
プレハイブリダイゼーションは、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ 変性・細分化済みサケ精液ＤＮＡ、または６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ 変性・細分化済みサケ精液ＤＮＡ、５０％ホルムアミド内で実施されうる。 ＳＳＣおよびデンハート液の製法については、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ等にリストされている。
ハイブリッド形成は、検出可能なプローブを、上記にリストしたプレハイブリダイゼーション溶液に追加することにより実施される。プローブが二本鎖ＤＮＡから構成されている場合、ハイブリッド形成はハイブリッド形成溶液に追加する前に変性される。フィルターは、プローブが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに相補的な、またはそれと相同的な配列を含むそれらのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対してハイブリッド形成されるよう、十分な時間ハイブリッド形成溶液と接触される。長さが２００ヌクレオチドを越えるプローブについては、ハイブリッド形成は、Ｔｍよりも１５〜２５℃低い温度で実行することもできる。オリゴヌクレオチドプローブなどの短めのプローブでは、ハイブリッド形成は、Ｔｍより５〜１０℃低い温度で実施することもできる。一般に、６ＸＳＳＣでのハイブリッド形成では、約６８℃で実施される。普通、５０％ホルムアミド含有の溶液でのハイブリッド形成は、約４２℃で実施される。
【００４０】
上述のすべてのハイブリッド形成は、高い厳密性の条件下であるとみなされる。
ハイブリッド形成に続いて、フィルターが洗浄され、非特異的に結合された検出可能なプローブがあれば除去される。フィルターの洗浄に使用する厳密性も、ハイブリッド形成する核酸の性質、ハイブリッド形成する核酸の長さ、相補性の度合い、ヌクレオチド配列の組成（ＧＣとＡＴ含有量の比など）、核酸タイプ（ＲＮＡやＤＮＡなど）に応じて、変化させることができる。厳密性の条件を徐々に高くした洗浄の例を挙げれば、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で１５分間（低厳密性）、０．１ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で３０分から１時間（中程度の厳密性）、０．１ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ハイブリッド形成温度と６８℃の間の温度で１５〜３０分間（高い厳密性）、ならびに０．１５Ｍ ＮａＣｌ、７２℃で１５分間（非常に高い厳密性）となる。最終的な低厳密性の洗浄は、０．１ＸＳＳＣ、室温で実施することができる。上記の例は、単にフィルターの洗浄に使用可能な１組の条件を例証しているに過ぎない。この技術分野の熟練者であれば、異なる厳密性の洗浄のための多数の手法を知っているはずである。その他いくつかの例を下記に挙げる。
プローブに対してハイブリッド形成された核酸は、オートラジオグラフィまたはその他の従来的技術により識別される。
上記の手順を変化させて、プローブ配列に対する相同性レベルが減少している核酸を識別することもできる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が減少している核酸を獲得するには、あまり厳密ではない条件も使用される。例えば、約１ＭのＮａ＋濃度を持つハイブリッド形成バッファ内で、ハイブリッド形成温度を５℃単位で、６８℃から４２℃に下げることもできる。ハイブリッド形成に続いて、フィルターは、２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、ハイブリッド形成の温度で洗浄することができる。これらの条件は、５０℃より高ければ「中程度の」条件、５０℃より低ければ「低い」条件と見なされる。「中程度の」ハイブリッド形成条件の特定の例としては、上記のハイブリッド形成が５５℃で実施されるときである。「低厳密性」のハイブリッド形成条件の特定の例は、上記のハイブリッド形成が４５℃で実施されるときである。
【００４１】
別の方法として、ハイブリッド形成は、ホルムアミドを含有する６ＸＳＳＣなどのバッファ内で４２℃で遂行することもできる。この場合には、ハイブリッド形成バッファ内のホルムアミド濃度を、５０％から０％に５％単位で減少させて、プローブに対して相同性レベルが減少しているクローンの識別をすることができる。ハイブリッド形成に続いて、フィルターは、６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアミドが２５％より多いとき「中程度の」条件、ホルムアミドが２５％より低いとき「低い」条件とみなされる。「中程度の」ハイブリッド形成条件の特定の例は、ハイブリッド形成がホルムアミド３０％で実施されるときである。「低厳密性」ハイブリッド形成条件の特定の例は、ハイブリッド形成がホルムアミド１０％で実施されるときである。
例えば、前述の方法を使用して、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のどれか１つの配列、またはその配列の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００の連続塩基で構成される断片、およびそれに対して相補的な配列で構成されるグループから選択した核酸配列に対して、少なくとも約９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の相同性のある配列を持つような核酸の単離をすることができる。相同性は、アラインメント アルゴリズムを用いて測定できる。例えば、相同的なポリヌクレオチドには、本書で説明したコード配列のどれかの自然発生的な対立形質の変異体であるコード配列がある。グループＡ核酸配列、またはそれに対して相補的な配列の核酸と比較したとき、そうした対立形質の変異体には、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または追加があることもある。
さらに、上記の手順を使用して、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうちどれか一つの配列、または配列アラインメント アルゴリズムを使用（ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムをデフォルトのパラメータで使用するなど）して決定された、その配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片を持つポリペプチドに対して、少なくとも約９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の相同性のあるポリペプチドをコードする核酸を単離することもできる。
【００４２】
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のどれか１つの配列、またはその配列の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸で構成される断片から構成される単離または精製されたポリペプチドである。上記に説明のとおり、このようなポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入して、コード配列が適した宿主細胞内で符号化されたポリペプチドの発現を駆動する能力のある配列に操作可能なようにリンクされるようにすることで、獲得することができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターで構成することができる。また、ベクターには、発現を増幅するための適切な配列を含めることもできる。
バクテリア内のポリペプチドまたはその断片の発現に適したプロモーターには、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ｌａｍｂｄａ ＰＲプロモーター、ｌａｍｂｄａ ＰＬプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの糖分解酵素をコードするオペロンからのプロモーター、および酸性ホスタファーゼ プロモーターなどが含まれる。真菌性のプロモーターには、因子プロモーターがある。真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ プロモーター、熱ショックタンパク質、初期および後期のＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどが含まれる。原核生物または真核生物の細胞またはそれらのウイルスの遺伝子発現を制御することが知られているその他のプロモーターを使用することもできる。
哺乳類の発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスの供与体および受容体部位、転写性末端配列、および５′フランキング非転写配列で構成することもできる。一部の実施例において、ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位から誘導したＤＮＡ配列を使用して、必須の非転写遺伝因子を提供することもできる。
【００４３】
真核細胞内のポリペプチドまたはその断片を発現するためのベクターを、エンハンサーに含めて、発現レベルを向上させることもできる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性のエレメントで、通常、長さが約１０〜約３００ｂｐで、プロモーターに対して作用して転写を促進する。例としては、複製開始点ｂｐ１００〜２７０の後半にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター エンハンサー、複製開始点の後半にあるポリオーマ エンハンサー、アデノウイルス エンハンサーなどがある。
さらに、一般に、発現ベクターには、ベクターを含む宿主細胞の選択を許容するために、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子が含まれている。このような選択マーカーには、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌でテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子、および出芽酵母菌ＴＲＰ１遺伝子などがある。
一部の実施例において、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその配列の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片をコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を指示する能力のあるリーダー配列を用いて、適切な段階で集合される。任意に、核酸は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片を、安定性の向上または精製の単純化といった希望の特性を与えるＮ末端識別ペプチドなどの非相同的ペプチドまたはポリペプチドと融合されたものである融合ポリペプチドに符号化できる。
適切なＤＮＡ配列を、様々な手順によって、ベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた挿入物およびベクターの消化の後で、ベクター内の希望の位置に結合される。別の方法として、挿入物およびベクターの両方にあるブラントエンドを結合することもできる。多様なクローニング技術が、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ５０３ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７およびＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に開示されているが、その全体を参照により本書に組み込む。このような手順およびその他は、この技術分野の熟練者の視野内にあるとみなされる。
【００４４】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態が考えられる。その他のベクターには、染色体性、非染色体性および合成のＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌性のプラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせにより誘導されたベクター、そしてワクシニア、アデノウイルス、家禽ジフテリア ウイルス、および仮性狂犬病などのウイルス性ＤＮＡなどがある。原生生物および真核生物の宿主とともに使用する多様なクローニングベクターおよび発現ベクターが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．，（１９８９）に説明されているが、その開示内容を参照により本書に組み込む。
使用できる特定の細菌性ベクターには、よく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などの遺伝因子から構成される市販のプラスミドがある。特定の真核生物ベクターには、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などがある。ただし、複製可能であり、宿主内で生存可能である限り、その他の任意のベクターを使用することもできる。
宿主細胞としては、この技術分野の熟練者になじみのある任意の宿主細胞を使用できる。これには、原核細胞、真核細胞、哺乳類の細胞、昆虫の細胞、真菌の細胞、酵母菌、植物細胞、および代謝性に富んだ宿主細胞などがある。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌、ネズミチフス菌などのバクテリアの細胞、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属などに入る様々な種、酵母などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９ などの昆虫の細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞、およびアデノウイルスなどが挙げられる。適切な宿主の選択は、この技術分野における熟練者の能力の範囲内である。
【００４５】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉを媒介とした遺伝子導入などの多様な技術を使用して、宿主細胞に導入することができる。特定の方法としては、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ媒介のトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポーレーションなどがある（Ｄａｖｉｓ， Ｌ．， Ｄｉｂｎｅｒ， Ｍ．， Ｂａｔｔｅｙ， Ｉ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８６））。
適切な場合には、操作された人工宿主細胞を、プロモーターを活性化するために必要に応じて修正された従来の培養液内で培養し、本発明の遺伝子の形質転換体または増幅を選択することもできる。適切な宿主菌株を形質転換し、宿主菌株が適切な細胞密度に成長した後、選択したプロモーターを、適切な手段で誘発し（温度変化または化学作用による誘発など）、希望のポリペプチドまたはその断片が精製されるように、期間を追加して細胞を培養することができる。
一般に、細胞は、物理的または化学的な手段で分離させる遠心分離により収集され、結果としてできる粗製抽出物が、保持され、さらに精製される。タンパク質の発現に採用した微生物の細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機構的な破壊、または細胞溶解剤の使用など、従来の任意の方法で分離させることができる。こうした方法は、この技術分野の熟練者によく知られている。発現されたポリペプチドまたはその断片は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルローズ クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティー クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチン クロマトグラフィなどを含めた方法により、組換え細胞培養液から回収・精製ができる。ポリペプチドの配置を完成するにあたり、必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ手順を使用することもできる。希望に応じて、最終的な精製手順で、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を採用することができる。
各種の哺乳類の細胞培養システムを採用して組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳類の発現システムの例としては、サル腎臓の繊維芽細胞のＣＯＳ−７ 株（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ， ２３：１７５， １９８１で説明）、および例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ株細胞など、適合性のあるベクターからのタンパク質を発現可能なその他の株細胞がある。
【００４６】
宿主細胞内の構成物は、組換え配列により符号化された遺伝子生成物を生成するために、従来的な方法で使用できる。組換えの生成手順で採用した宿主に応じて、ベクターが含まれる宿主細胞により生成されたポリペプチドは、グリコシル化されたものでもグリコシル化されていないものでもよい。また、本発明のポリペプチドには、初期のメチオニン アミノ酸残基が含まれていても含まれていなくてもよい。
別の方法として、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片は、従来的なペプチド合成装置により、合成的に生成することができる。その他の実施例において、ポリペプチドの断片または部分を、ペプチド合成により、対応する全ポリペプチドの生成に採用することもでき、したがって、断片を全ポリペプチド生成の媒介物として採用しうる。
セルフリー翻訳システムを採用し、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に操作可能なようにリンクされたプロモーターで構成されるＤＮＡ構成物から転写したｍＲＮＡを使用して、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片を生成することもできる。一部の実施例において、生体外での転写反応を実施する前に、ＤＮＡ構成物を線形化することもできる。その後、転写済みのｍＲＮＡは、ウサギの網状赤血球抽出物などの適切なセルフリー翻訳抽出液で培養され、希望のポリペプチドまたはその断片が生成される。
また、本発明は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片の変異体に関するものである。「変異体」という用語には、これらのポリペプチドの誘導体または類似体も含まれる。特に、変異体は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドとは、１つまたは複数の置換、付加、欠失、融合、および切断（任意の組み合わせで存在しうる）の分だけ、アミノ酸配列が異なる。
【００４７】
変異体には、自然発生的なものと、生体外で生成したものがある。特に、こうした変異体は、部位特異的突然変異誘発、無作為な化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失手順、および標準的クローン技術などの遺伝子工学技術を用いて生成できる。別の方法として、このような変異体、断片、類似体、または誘導体は、化学合成または修飾などの手順を用いて生成することもできる。
変異体を生成するその他の方法も、この技術分野の熟練者にとって馴染みがある。これらには、天然の単離体から獲得される核酸配列を修飾して、産業または研究室の用途において、その値を改善する特性のあるポリペプチドをコードする核酸を生成する手順が含まれる。そうした手順において、天然の単離体から獲得される配列について、１つまたは複数のヌクレオチドの差異のある多数の変異体配列が生成され、特性が与えられる。一般に、これらのヌクレオチドの差異によって、天然の単離体からの核酸により符号化されたポリペプチドについてのアミノ酸変化が生じる。
例えば、変異体は、エラープローンＰＣＲ を用いて、生成することができる。エラープローンＰＣＲでは、ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下で実施され、ＰＣＲ 生成物の全長に沿って、高いレートの点突然変異が得られる。エラープローンＰＣＲは、Ｌｅｕｎｇ， Ｄ． Ｗ．等、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １：１１−１５， １９８９およびＣａｌｄｗｅｌｌ， Ｒ． Ｃ． ＆ Ｊｏｙｃｅ Ｇ． Ｆ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．， ２：２８−３３， １９９２で説明されており、その開示内容全文を参照により本書に組み込む。要は、このような手順において、ＰＣＲ 生成物の全長に沿って高いレートの点突然変異を達成するために、突然変異誘発する核酸を、ＰＣＲ プライマー、反応バッファ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、Ｔａｑポリメラーゼ、および適切な濃度のｄＮＴＰと混合する。例えば、この反応は、突然変異誘発する核酸２０ｆＭ、各ＰＣＲプライマー３０ｐＭ、反応バッファ（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣ１（ｐＨ８．３）および０．０１％のゼラチンで構成）、７ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、５単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、ならびに１ｍＭのｄＴＴＰを用いて実行することもできる。ＰＣＲは、３０サイクルを９４℃で１分間、４５℃で１分間、および７２℃で１分間実施することができる。ただし、必要に応じて、これらのパラメータは変化することが認識される。突然変異誘発済みの核酸は、適切なベクターにクローン化され、突然変異誘発済みの核酸により符号化されたポリペプチドの活性が評価される。
【００４８】
変異体は、目的とする任意のクローン化ＤＮＡにおいて部位特異性の突然変異を生成するオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発を用いて生成することもできる。オリゴヌクレオチド突然変異誘発については、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ， Ｊ． Ｆ． ＆ Ｓａｕｅｒ， Ｒ． Ｔ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：５３−５７， １９８８に説明があり、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。要するに、そのような手順において、クローン化ＤＮＡに導入される１つまたは複数の突然変異を生じさせる多数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成されて、突然変異誘発するクローン化ＤＮＡに挿入される。突然変異誘発済みのＤＮＡを含むクローンが回収され、それによって符号化されたポリペプチドの活性が評価される。
変異体を生成する別の方法は、アセンブリＰＣＲである。アセンブリＰＣＲには、小規模なＤＮＡ断片の混合物からのＰＣＲ 生成物の集合が関連する。多数の異なったＰＣＲ反応が、同一のバイアル内で並行して起こり、１つの反応生成物が、別の反応生成物の初回刺激となっている。アセンブリＰＣＲは、１９９６年７月９日出願の米国特許第５，９６５，４０８号、題名「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（断続合成によるＤＮＡ再集合の方法）」に説明があり、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。
変異体を生成するまた別の方法は、有性ＰＣＲ突然変異誘発である。有性ＰＣＲ突然変異誘発では、強制相同的組換えが、異なっているが関連性の高いＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間において生体外で発生し、配列の相同性に基づくＤＮＡ分子の無作為な断片化の結果、続いて、ＰＣＲ反応におけるプライマー伸長により、クロスオーバーの固定化が起こる。有性ＰＣＲ突然変異誘発については、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ．， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ９１：１０７４７−１０７５１， １９９４に説明があり、その開示内容を参照により本書に組み込む。要は、その手順では、組み換えられる多数の核酸がＤＮＡｓｅにより消化され、平均サイズ５０〜２００ ヌクレオチドを持つ断片が生成される。希望の平均サイズの断片は、精製されて、ＰＣＲ混合液内で再懸濁される。ＰＣＲは、核酸断片間での組換えが促進されるような条件下で実施される。例えば、ＰＣＲは、精製した断片を、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、および０．１％のトリトンＸ−１００の溶液内に、１０〜３０ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁させることで実施することもできる。反応混合物１００μｌ当り２．５単位のＴａｑポリメラーゼを追加し、ＰＣＲは、次の方式で実施される。すなわち、９４℃で６０秒間、９４℃で３０秒間、５０〜５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（３０〜４５回）および７２℃で５分間である。ただし、必要に応じて、これらのパラメータは変化することが認識される。一部の実施例において、オリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に含めることができる。その他の実施例において、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を初回のＰＣＲ反応で使用することもでき、またＴａｑポリメラーゼを、その後の回のＰＣＲ反応で使用することもできる。組換え配列は単離されて、それにより符号化されたポリペプチドの活性が評価される。
【００４９】
変異体は、生体内での突然変異誘発により生成することもできる。一部の実施例において、１つまたは複数のＤＮＡ修復経路での突然変異を保有している大腸菌菌株などの細菌性の菌株内で、所定の配列を増殖させることで、所定の配列内での無作為の突然変異が起こる。このような「ミューテーター」株では、野生型の親の菌株よりも無作為な突然変異レートが高くなっている。これらの菌株の１つでのＤＮＡの増殖により、最終的に、ＤＮＡ内で無作為な突然変異が発生する。生体内での突然変異誘発での使用に適したミューテーター株については、１９９１年１０月３１日公開のＰＣＴ公報第ＷＯ９１／１６４２７号、題名「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ（複数の遺伝子母集団からの表現型生成の方法）」に説明があり、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。
変異体は、カセット式突然変異誘発を使用して生成することもできる。カセット式突然変異誘発では、二本鎖ＤＮＡ分子の小規模な領域が、天然の配列と異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換される。オリゴヌクレオチドには、完全に、または部分的に無作為化された天然の配列（あるいはその両方）が含まれていることが頻繁にある。
連続的全体突然変異誘発を、変異体の生成に使用することもできる。連続的全体突然変異誘発は、タンパク質工学（タンパク質突然変異誘発）用のアルゴリズムで、表現型的に関連性のある突然変異体の多様な母集団（そのメンバーはアミノ酸配列に違いがある）を生成するために開発されたものである。この方法では、組み合わせカセット式突然変異誘発の連続的なラウンドを制御するために、フィードバック機構が使用される。連続的全体突然変異誘発は、Ａｒｋｉｎ， Ａ． Ｐ． ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ， Ｄ． Ｃ．， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ， ８９：７８１１−７８１５， １９９２に説明されており、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。
一部の実施例において、変異体は、指数関数的な全体的突然変異誘発を使用して生成される。指数関数的な全体的突然変異誘発は、独特および機能的な突然変異体の割合の高い組み合わせライブラリを生成するプロセスの１つであり、ここで、並行して、小規模のグループの残基が無作為化され、変化のあるそれぞれの位置で、機能性タンパクをもたらすアミノ酸が識別される。指数関数的な全体的突然変異誘発については、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｙｏｕｖａｎ， Ｄ． Ｃ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １１：１５４８−１５５２， １９９３に説明があり、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。無作為および部位特異的突然変異誘発については、Ａｒｎｏｌｄ， Ｆ． Ｈ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４：４５０−４５５， １９９３に説明があり、その開示内容全体を参照により本書に組み込む。
【００５０】
一部の実施例において、変異体は、シャフリング手順を使用して生成され、ここで明確なポリペプチドをコードする多数の核酸の一部分が、まとめて融合され、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が生成される。これについては、１９９６年７月９日出願の米国特許第５，９６５，４０８号、題名「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＤＮＡ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（断続合成によるＤＮＡ再集合の方法）」および１９９６年５月２２日出願の米国特許第 ５，９３９，２５０号、題名「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｄｅｓｉｒｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｙ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（突然変異誘発による希望の活性を有する酵素の生成）」に説明されているとおりで、この両方を参照により本書に組み込む。
グループＢアミノ酸配列のポリペプチドの変異体は、グループＢアミノ酸配列のポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基が、同類または非同類のアミノ酸残基（同類アミノ酸残基が望ましい）と置き換えられるが、その置き換えられたアミノ酸残基は、遺伝暗号により符号化された変異体でも符号化されていない変異体でもよい。
同類置換とは、類似した特性の別のアミノ酸により、ポリペプチド内の所定のアミノ酸を置き換えることである。一般に、同類置換とみられるのは、以下の置換である。すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族アミノ酸を他の脂肪族アミノ酸と置き換える、セリンをスレオニンと置換、またはその逆の置き換える、アスパラギン酸やグルタミン酸などの酸性残基を別の酸性残基と置き換える、アスパラギンやグルタミンなどのアミド基のある残基をアミド基のある別の残基と置き換える、リジンやアルギニンなどの塩基性残基を他の塩基性残基と交換する、ならびにフェニルアラニンやチロシンなどの芳香族残基を他の芳香族残基と置き換える置換などがある。
その他の変異体は、グループＢアミノ酸配列のポリペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基に置換基が含まれるものである。
また、その他の変異体は、ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（ポリエチレングリコールなど）などの別の化合物と関連しているものである。
その他の変異体は、別のアミノ酸が、リーダー配列、分泌性の配列、プロタンパク質配列、もしくはポリペプチドの精製、濃縮、または安定化を促進する配列などのポリペプチドに融合されたものである。
【００５１】
一部の実施例において、断片、誘導体、および類似体では、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドと同一の生物学的機能または活性が保持される。その他の実施例において、断片、誘導体、または類似体には、プロタンパク質が含まれ、プロタンパク質部分の切断により、断片、誘導体、類似体が活性化され、活性ポリペプチドが生成される。
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約 ６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約９５％をこえる相同性のあるポリペプチドまたはその断片である。相同性は、比較するポリペプチドまたは断片を揃えて、お互いの間のアミノ酸の同一性または類似性の範囲を決定する上記に説明のプログラムのいずれかを使用して決定することができる。アミノ酸の「相同性」には、上記に説明したものなどの同類アミノ酸置換が含まれることが認識される。
グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片に対する相同性のあるポリペプチドまたは断片は、それをコードする核酸を、上記に説明の技術を使用して単離することにより獲得することができる。
別の方法として、相同的なポリペプチドまたは断片は、生化学的な濃縮または精製手順により獲得することができる。潜在的に相同的なポリペプチドまたは断片の配列は、タンパク質分解の消化、ゲル電気泳動、およびミクロシークエンシング、あるいはそのいずれかにより決定できる。相同的である見込みのあるポリペプチドまたは断片の配列は、上記に説明したプログラムのいずれかを使用して、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片と比較される。
【００５２】
本発明の別の面は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの酵素機能を保持するような、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の断片または変異体を識別するための検定法である。例えば、このポリペプチドの断片または変異体を、断片または変異体がグループＢアミノ酸配列にあるポリペプチドの酵素活性を保持していることを示すための生化学反応の触媒として使用することができる。
断片または変異体がグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの酵素活性を保持しているかどうかを判断する検定法には、ポリペプチドの断片または変異体が機能できるような条件下で、ポリペプチドの断片または変異体を基質分子と接触させる手順、およびポリペプチドと基質との間の反応による基質レベルの低下または特異反応生成物の増加のいずれかを検出する手順が含まれる。
グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片を、ポリペプチドまたは断片に特異的に結合する抗体の生成に使用することもできる。結果としての抗体は、アフィニティー クロマトグラフィ手順に使用して、ポリペプチドの単離または精製をしたり、ポリペプチドが生体サンプル内に存在しているかどうかを確認することができる。そうした手順において、抽出液などのタンパク質製剤、または生体サンプルを、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片と、特異的に結合する能力のある抗体と接触させる。
免疫親和性の手順では、抗体を、ビーズまたはその他のカラム マトリクスなどの固体担体に付着させる。タンパク質製剤は、抗体がグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドのどれか１つ、またはその断片と特異的に結合するような条件下で、抗体と接触するように配置される。非特異的に結合したタンパク質を除去するために洗浄した後、特異的に結合したポリペプチドが溶出される。
【００５３】
「特異的に結合」とは、抗体が、関連性のないタンパク質と結合するよりも親和性の高い、目標の抗原（本発明の加水分解酵素活性のあるポリペプチドなど）と結合することを意味する。こうした親和性は、関連性のないタンパク質についての抗体の親和性よりも、少なくとも１０倍高いことが望ましく、少なくとも１００倍高いことがさらに望ましく、また少なくとも１０００倍高いことが最も望ましい。水中、生理学的条件下、またはイオン強度に関して近似的な生理学的条件下（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２など）のいずれかで、目的の抗原に特異的に結合する抗体により、その抗原との間に、少なくとも１０６Ｍ−１、また少なくとも１０７Ｍ−１、さらに少なくとも１０８Ｍ−１、またさらに少なくとも１０９Ｍ−１、そして最善として少なくとも１０１０Ｍ−１の親和性のある関係が形成されることが望ましい。
生体サンプルのタンパク質が抗体と特異的に結合する能力は、この技術分野の熟練者になじみのある様々な手順のいずれかを使用して決定することができる。例えば、結合は、蛍光剤、酵素ラベル、または放射性同位元素などの検出可能なラベルで抗体にラベル付けすることで決定できる。別の方法として、抗体のサンプルへの結合は、そのような検出可能なラベルを付けた二次的な抗体を使用して検出することもできる。特定の検定法には、ＥＬＩＳＡ試験法、サンドイッチ アッセイ、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロット法などがある。
グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片に対するものとして精製された多クローン性抗体は、動物に直接注入することで、またはポリペプチドを例えば非ヒトの動物に投与することで獲得できる。そうして獲得された抗体は、次に、ポリペプチド自体に結合される。この様に、ポリペプチドの断片のみをコードする配列でさえも、完全に天然のポリペプチドとの結合が可能な抗体の生成に使用できる。こうした抗体は、次に、ポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離するために使用される。
【００５４】
単クローン抗体の準備については、連続株細胞培養により生成される抗体を提供する任意の技術を使用できる。この例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７， １９７５、その開示内容を参照により本書に組み込む）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞 ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２， １９８３、その開示内容を参照により本書に組み込む）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ等、１９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６、その開示内容を参照により本書に組み込む）がある。
一本鎖の抗体の生成用に説明されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号、その開示内容を参照により本書に組み込む）を採用して、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片に対する一本鎖抗体を生成することができる。別の方法として、遺伝子導入マウスを使用し、ポリペプチドまたはその断片に対してヒト化抗体を発現させることもできる。
グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド、またはその少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される断片に対するものとして生成した抗体は、その他の生物体およびサンプルからの類似したポリペプチドのスクリーニングに使用することができる。そうした技法において、生物体からのポリペプチドが、抗体と接触し、抗体に特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に説明したどの方法でも結合している抗体の検出に使用できる。このようなスクリーニング法の１つが、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（セルラーセ活性の測定方法）」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １６０， ｐｐ． ８７−１１６に説明があり、その全文を参照により本書に組み込む。
【００５５】
本書で使用するとき、「配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示した核酸配列」という用語には、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のヌクレオチド配列だけでなく、グループＡ核酸配列に相同的な配列、およびその断片、および前記のすべての配列に対して相補的な配列なども含まれる。断片には、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００の連続ヌクレオチドから構成される配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３の一部分が含まれる。グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列の相同配列および断片とは、それらの配列に対して、少なくとも９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％の相同性のある配列の意味である。相同性は、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８をデフォルトのパラメータで使用するなど、本書で説明した任意のコンピュータプログラムおよびパラメータを使用して決定することができる。相同配列には、グループＡ核酸配列で示した核酸配列内のチミンがウリジンで置き換えられたＲＮＡ 配列も含まれる。相同配列は、本書で説明した任意の手順を使用して、または配列ミスを修正した結果としても獲得しうる。グループＡ核酸配列で示した核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列は、従来の１ 文字形式（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌｕｂｅｒｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの裏表紙内側を参照）で、または配列内のヌクレオチドの同一性を記録するその他の任意の形式で表現可能であることが認識される。
本書で使用するとき、「配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示したポリペプチド配列」という用語には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示した配列により符号化された、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチド配列、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドに対して相同的なポリペプチド配列、もしくはその前記のあらゆる配列の断片が含まれる。相同的ポリペプチド配列とは、グループＢアミノ酸配列のポリペプチドのどれか１つの配列に対して、少なくとも９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％の相同性を持つポリペプチド配列の意味である。相同性は、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８をデフォルトのパラメータで、またはパラメータを修正して使用するなど、本書で説明した任意のコンピュータプログラムおよびパラメータを使用して決定することができる。相同配列は、本書で説明した任意の手順を使用して、または配列ミスを修正した結果としても獲得しうる。ポリペプチド断片は、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０の連続アミノ酸から構成される。グループＢアミノ酸配列に示したポリペプチドコード、およびそれと実質的に同一な配列は、従来の１文字形式（Ｓｔｒｙｅｒ， Ｌｕｂｅｒｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの裏表紙内側を参照）で、または配列内のポリペプチドの同一性に関連するその他の任意の形式で表現可能であることが認識される。
【００５６】
この技術分野の熟練者により、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示した核酸配列、および配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示したポリペプチド配列は、コンピュータにより読み取りおよびアクセスが可能な任意の媒体上での保存、記録、および操作が可能であることが認識される。本書で使用するとき、「記録」および「保存」という用語は、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを意味する。熟練者であれば、コンピュータ読み取り可能媒体に情報を記録するために、現時点で既知の任意の方法を容易に採用でき、グループＡ核酸配列に示した核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうち １つまたは複数の配列、グループＢアミノ酸配列に示したポリペプチド配列、およびそれと実質的に同一な配列のうち１つまたは複数の配列で構成される物質を生成できる。本発明の別の面は、グループＡ核酸配列に示した核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列のうち、少なくとも２、５、１０、１５、または２０の核酸配列が記録されるコンピュータ読み取り可能媒体である。
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列に示した１つまたは複数の核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列を記録したコンピュータ読み取り可能媒体である。本発明の別の面は、グループＢ核酸配列に示した１つまたは複数の核酸配列、およびそれに実質的に同一な配列を記録した、コンピュータ読み取り可能媒体である。本発明の別の面は、上記の配列のうち、少なくとも、２、５、１０、１５、あるいは２０を記録した、コンピュータ読み取り可能媒体である。
コンピュータ読み取り可能媒体には、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体、および 磁気／光学媒体が含まれる。例えば、コンピュータ読み取り可能媒体には、ハードディスク、フロッピィディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）あるいは読み取り用メモリ（ＲＯＭ）のほか、熟練者に知られているその他のタイプの媒体がある。
【００５７】
本発明の実施例には、システム（例：インターネットベースのシステム）、特に、本書で述べられている配列情報を保存および操作するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム１００の一例が、図１のブロック図の形で図示されている。本書で使用するとき、「コンピュータシステム」は、グループＡ核酸配列で示した核酸配列のヌクレオチド配列、およびそれに実質的に同一な配列、あるいはグループＢアミノ酸配列で示したポリペプチドを分析するために使用されるハードウェア装置、ソフトウェア装置およびデータ記憶装置を指す。コンピュータシステム１００には、通常、配列データを処理、アクセスおよび操作するためのプロセッサが含まれる。プロセッサ１０５は、例えばＩｎｔｅｌ社のＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標） ＩＩＩ、あるいはＳｕｎ、Ｍｏｔｏｒｏｌａ、Ｃｏｍｐａｑ、ＡＭＤあるいはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＩＢＭ）製の類似製品など、よく知られたタイプの中央演算処理装置（ＣＰＵ）でありうる。
通常、コンピュータシステム１００は、プロセッサ１０５ と、データ保管用の１つまたは複数の内部データ記憶装置１１０、およびデータ記憶装置に格納されたデータを検索するための １つまたは複数の検索装置から成る、通常目的のシステムである。熟練者であれば、現在利用可能な任意のシステムが適していることを簡単に認識できる。
特に一つの実施例において、コンピュータシステム１００は、バスに接続されたプロセッサ１０５を含み、このバスはメインメモリ１１５（望ましくはＲＡＭとして実行される）およびハードドライブおよびデータが記録されたコンピュータ読み取り可能媒体（あるいはそのいずれか）などの１つまたは複数の内部データ記憶装置１１０に接続されている。数種の実施例においては、コンピュータシステム１００はさらに、内部データ記憶装置１１０に記憶されたデータを読み取るための１つまたは複数のデータ検索装置１１８を含む。
【００５８】
データ検索装置１１８は、例えばフロッピィディスク装置、コンパクトディスク装置、磁気テープ装置、あるいは遠隔データ記憶システム（例：インターネット経由）に接続可能なモデムなどに相当する場合もある。数種の実施例において、内部データ記憶装置１１０は、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープといった制御ロジックおよび記録データ（あるいはそのいずれか）を含む取り外し可能なコンピュータ読み取り可能媒体である。コンピュータシステム１００は、データ検索装置に挿入された場合に、制御ロジックおよびデータ記憶装置からのデータ（あるいはそのいずれか）を読み取るための適切なソフトウェアを利点として含む、あるいは上記ソフトウェアによってプログラムされる。
コンピュータシステム１００は、コンピュータ使用者に結果を表示するために使用されるディスプレイ１２０を含む。また、コンピュータシステム１００は、コンピュータシステム１００に中央化されたアクセスを提供するために、ネットワークあるいは広域ネットワーク（ＷＡＮ）内にある他のコンピュータシステム１２５ａ−ｃにリンクできる点にも留意するべきである。
グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列のヌクレオチド配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列にアクセス・処理するためのソフトウェア（検索ツール、比較ツールおよびモデル化ツールなど）は、プログラム実行中はメインメモリ１１５に設置される。
数種の実施例において、コンピュータシステム１００はさらに、コンピュータ読み取り可能媒体に保管された、グループＡ核酸配列、およびそれに実質的に同一な配列に示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列を、コンピュータ読み取り可能媒体に保管された基準ヌクレオチドあるいはポリペプチド配列と比較するための、配列比較アルゴリズムから構成される。「配列比較アルゴリズム」は、ヌクレオチド配列を、データ記憶装置内に保管された他のヌクレオチド配列および化合物（あるいはそのいずれか）と比較するためにコンピュータシステム１００上で（ローカルあるいは遠隔的に）実行される１つまたは複数のプログラムを指す。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み取り可能媒体に保管された、グループＡ核酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列のヌクレオチド配列を、コンピュータ読み取り可能媒体に保管された基準配列と比較して相同性あるいは構造モチーフを特定する。この特許仕様書のその他の部分で特定される多様な配列比較プログラムは、特に本発明のこの面での使用を想定したものである。タンパク質および核酸配列（あるいはそのいずれか）の相同性は、その技術分野で知られている多様な配列比較アルゴリズムおよびプログラムの１つを使用して評価される。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには下記が含まれるが、これに限定されない：ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８， １９８８； Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３−４１０， １９９０； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２（２）：４６７３−４６８０， １９９４； Ｈｉｇｇｉｎｓ等、Ｍｅｔｈｚｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：３８３−４０２， １９９６； Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５（３）：４０３−４１０， １９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２， １９９３）。
【００５９】
相同性あるいは同一性は、配列分析ソフトウェア（例：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ 社のＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５）を使用して測定されることがよくある。そのようなソフトウェアは、多種の欠失、置換および修飾に相同性の程度を割り当てることで類似した配列と適合させる。２つ以上の核酸あるいはポリペプチド配列が使用される文脈において「相同性」および「同一性」という単語は、任意の数の配列比較アルゴリズムあるいは手動アルゴリズムおよび目視検査により測定したとき、比較ウィンドウあるいは対応が最大になるように比較・アラインメントした場合に、同一または特定の割合のアミノ酸残基あるいは核酸を持つ、２つ以上の配列または部分列を指す。
配列比較上、通常、１つの配列が基準配列としての役割を持ち、テスト配列がこの配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する際は、テストおよび基準配列がコンピュータ入力され、必要な場合は部分列座標が指定され、必要な場合は配列アルゴリズム プログラム パラメータが指定される。デフォルトのプログラム パラメータまたは代わりのパラメータが指定され得る。それから配列比較アルゴリズムは、プログラム パラメータに基づき基準配列と比較してテスト配列の配列同一性のパーセントを計算する。
本書で使用する「比較ウィンドウ」とは、２０〜６００、通常は約５０〜約 ２００まで、さらに通常なものとしては約１００〜１５０までから成るグループから選択された近接位置にある任意の１つのセグメントの数を指し、その中で配列は、近接位置と同じ数の基準配列と最適にアラインメントされた後、その基準配列と比較される。比較のための配列アラインメントの方法は、その分野で広く知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０の相同性アラインメント アルゴリズム、Ｐｅｒｓｏｎ ［ｓｉｃ］ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８の類似方法の検索、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ 社のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにあるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、あるいは手動アラインメントおよび目視検査によって実行される。相同性あるいは同一性を決定するその他のアルゴリズムには、例えばＢＬＡＳＴ プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）に加えて、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＡＭＰＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＡＳＳＥＴ（Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ）、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｏｄｅ）、ＢＬＩＭＰＳ（ＢＬｏｃｋｓ ＩＭＰｒｏｖｅｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ）、ＦＡＳＴＡ、Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ＆ Ｐｏｉｎｔｓ、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ アルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ アルゴリズム、ＦＮＡＴ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）、Ｆｒａｍｅａｌｉｇｎ、Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（Ｆｒｉｓｔｅｎｓｋｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＧＡＰ（Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ＧｅｎＱｕｅｓｔ、ＩＳＳＣ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、ＬＡＬＩＧＮ（Ｌｏｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＬＣＰ（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＡＣＡＷ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）、ＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇ���ｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｌｔｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＳＡＧＡ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）およびＷＨＡＴ−ＩＦ などが含まれる。そのようなアラインメント プログラムはまた、実質的に同一な配列のポリヌクレオチド配列を特定するためのゲノムデータベースのスクリーニングにも使用される。数多くのゲノムデータベースが利用でき、例えば、ヒトゲノムの大部分は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｊ． Ｒｏａｃｈ， ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｅｒ．ｕ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／￣ｒｏａｃｈ／ｈｕｍａｎ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｐｒｏｇｒｅｓｓ２．ｈｔｍｌ）（Ｇｉｂｂｓ， １９９５）の一部として利用できる。例えば、Ｍ． ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（Ｆｒａｓｅｒ等、１９９５）、Ｍ． ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｂｕｌｔ等、１９９６）、Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ等、１９９５）、大腸菌（Ｂｌａｔｔｎｅｒ等、１９９７）および酵母（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｍｅｗｅｓ等、１９９７）およびＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ａｄａｍｓ等、２０００）などを含む少なくとも２１種の他のゲノムもすでに配列解明されている。ねずみ、線虫およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｓｐなど、モデルアルゴリズムのゲノム配列解明の過程でも大きな進歩があった。機能的情報についての注釈付きゲノム情報を含む数種のデータべースは、異なる組織によって保持されており、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／￣ｂａｌｌ、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、ｈｔｔｐ：／／Ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｏｔｈｅｒ／ｂｉｏｌｏｇｙおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕなどインターネット経由でアクセスすることができる。
【００６０】
有用なアルゴリズムの一例としてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２， １９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ． Ｍｏｌ， Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０， １９９０で説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用できる。このアルゴリズムでは、クエリ配列において長さＷの短い単語を特定してまず高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定し、この単語は、データベース配列にある同じ長さの単語とアラインメントされたときに、任意の＋のしきい値スコアＴ と一致またはこれを満たす。 Ｔは、周辺単語スコアしきい値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、前掲）と呼ばれている。これらの当初の周辺単語適合は、この単語適合を含むより長いＨＳＰ を見つけるための検索を開始するにあたり種となる役割を持っている。単語適合は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列ではパラメータＭ（一致する残基の組み合わせには報酬スコア、常に＞０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスが累積スコアの計算に使用される。各方向への単語適合の拡張は、下記の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成数値から数量Ｘ分だけ減少した場合、１つまたは複数のマイナススコアの残基アラインメントが累積したために累積スコアがゼロ以下になった場合、あるいはいずれかの配列の最終点に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズム パラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして単語の長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、単語の長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５， １９８９を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。
【００６１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性に関する統計分析も実行する（例：Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３， １９９３を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の一つの測定方法は、２つのヌクレオチドあるいはアミノ酸配列間の一致が偶然起きる可能性を示唆する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、テスト核酸と基準核酸の比較における最小合計確率核酸が約０．２以下、さらに望ましくは約０．０１以下、最も望ましくは０．００１以下である場合、核酸は基準配列に類似しているとみなされる。
一つの実施例において、タンパク質と核酸配列の相同性は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（“ＢＬＡＳＴ”）を使って評価される。特に、下記のタスクを実行するために５ つの特定のＢＬＡＳＴプログラムが使用される。
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３は、アミノ酸のクエリ配列をタンパク質配列データベースと比較する。
（２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドのクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
（３）ＢＬＡＳＴＸは、クエリ配列（両鎖）の６フレーム概念的に置き換えたものをタンパク質配列データベースと比較する。
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、クエリタンパク質配列を、６つすべての読み取りフレーム（両鎖）に置き換えたヌクレオチド配列データベースと比較する。
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチドのクエリ配列の６フレームへの置き換えをヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳と比較する。
ＢＬＡＳＴプログラムは、クエリアミノ酸あるいは核酸配列と、望ましくはタンパク質あるいは核酸配列データベースから得られるテスト配列間の、本書では「高スコアリングセグメント ペア」と呼ばれる類似セグメントを特定することで相同性のある配列を特定する。高スコアリングセグメント ペアはスコアリングマトリックスによって特定（アラインメント）されるのが望ましい。多数のマトリックスがこの技術分野において知られている。
【００６２】
使用されるスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５， １９９２； Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１， １９９３）が望ましい。ＰＡＭあるいはＰＡＭ２５０マトリックスの使用がその次に望ましい（例：Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， １９７８， Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ を参照）。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じてアクセスできる。
上記のアルゴリズムで使用されるパラメータは、研究対象の配列の長さおよび相同性の程度に応じて適応される。数種の実施例において、使用者による指示がない場合、パラメータはアルゴリズムが使用するデフォルトのパラメータである。
図２は、新しい配列とデータベースにある配列の間の相同性レベルを決定するために新ヌクレオチドあるいはタンパク質配列を配列データベースと比較するプロセス２００の一実施例を図示する流れ図である。配列データベースは、コンピュータシステム１００内に保管された私的データベース、あるいはインターネットを通じて利用できるＧＥＮＢＡＮＫといった公的データベースでありうる。
プロセス２００は、出発段階２０１で始まり、その後、比較される新配列がコンピュータシステム１００のメモリに保管されている段階２０２へと移る。上記に記述されたように、メモリはＲＡＭあるいは内部記憶装置を含む任意のタイプでもよい。
プロセス２００はその後段階２０４へと移り、その配列データベースが分析および比較のために開かれる。その後プロセス２００は段階２０６へと移り、データベースに保管された第一配列がコンピュータのメモリに読み込まれる。その後、段階２１０で比較が行われ、第一配列が第二配列と同一であるかを決定する。このステップは、新配列とデータベースにある第一配列間の正確な比較の実施に限定されないという点に留意することは重要である。２つのヌクレオチドあるいはタンパク質配列の比較としてよく知られている方法は、たとえそれらが同一ではない場合でもその技術分野の熟練者には既知である。例えば、２つのテスト配列間の相同性レベルを上げるために、ギャップが一つの配列に導入される。比較の間にギャップあるいは他の特徴が配列に導入されるべきかどうかを制御するパラメータは、通常コンピュータシステムの使用者が入力する。
【００６３】
段階２１０で２つの配列の比較が実行されると、決定段階２１０で２つの配列が同一であるか決定される。もちろん、「同一（ｓａｍｅ）」という単語は、絶対的な同一の配列に限定されることはない。使用者が入力した相同性パラメータ内にある配列は、プロセス２００内に「同一」と記される。
２つの配列が同一であるとの決定が行われた場合、プロセス２００は段階２１４へと移り、ここでデータベースからの配列名が使用者に表示される。この段階では、表示された名前を持つ配列は入力された相同性制限を遂行したことが使用者に通知される。保管された配列名が使用者に表示されると、プロセス２００は決定段階２１８へと移り、ここでより多数の配列がデータベースに存在するか決定される。データベースに存在する配列がない場合、プロセス２００は段階２２０で終了する。しかし、データベースにさらなる配列が存在する場合、プロセス２００は段階２２４へと移り、新配列と比較できるようにポインターがデータベースの次の配列に移動する。このような方法で、新配列はデータベースの各配列とアラインメント・比較される。
配列は相同的でないと決定段階２１２で決定が行われた場合、データベースの他の配列を比較のために利用できるかを決定するために、プロセス２００は直ちに決定段階２１８に進むという点に留意すべきである。
従って、本発明の別の面は、プロセッサ、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列に示したポリペプチド配列を保管したデータ記憶装置、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示したポリペプチド配列と比較するための基準ヌクレオチド配列あるいはポリペプチド配列を検索可能な形で保管しているデータ記憶装置、および比較を実施するための配列比較子から成るコンピュータシステム比較である。配列比較子は、比較される配列間の相同性レベルを提示したり、グループＡ核酸配列、およびそれに本質的に同一な配列に示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示したポリペプチド配列の上記核酸コードの構造モチーフを特定したり、あるいは、これらの核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列にある構造モチーフを特定する。数種の実施例において、データ記憶装置は、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示したポリペプチド配列のうち、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０あるいは４０以上の核酸配列の配列を記憶している場合もある。
【００６４】
本発明の別の面は、グループＡ核酸配列、およびそれに本質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示したポリペプチド配列と、基準核酸配列との間の相同性レベルを決定する方法である。その方法は、相同性レベルを決定し、核酸コードあるいはポリペプチドコードと基準ヌクレオチドあるいはポリペプチド配列間の相同性をコンピュータプログラムの使用を通じて決定し、核酸コードあるいはポリペプチドコード、および基準核酸あるいはポリペプチド配列をコンピュータプログラムの使用を通じて読み取ることを含む。コンピュータプログラムは、本書で具体的に名前を挙げたものを含め、相同性を決定するための任意の数あるコンピュータプログラムでよい（例：デフォルトパラメータあるいは修正されたパラメータでのＢＬＡＳＴ２Ｎ）。その方法は、上記のコンピュータシステムを使用して実行される。その方法はまた、コンピュータプログラムの使用を通じて、グループＡ核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列で示したポリペプチドの上記の核酸配列のうち少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０あるいは４０以上を読み取り、核酸コードあるいはポリペプチドコードと、基準核酸配列あるいはポリペプチド配列の間の相同性を決定することでも実行されうる。
図３は、２つの配列が相同であるかを決定するためのコンピュータにあるプロセス２５０の実施例を示す流れ図である。プロセス２５０は、段階２５２で始まり、比較される第一配列がメモリに保管されている段階２５４へと移る。比較される第二配列は、段階２５６でメモリに保管される。その後、プロセス２５０は第一配列の第一文字が読み取られる段階２６０へと移り、それから第二配列の第一文字が読み取られる段階２６２へと移る。配列がヌクレオチド配列の場合、文字は通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧあるいはＵのいずれかであることが理解されるべきである。配列がタンパク質配列である場合は、第一配列とそれに続く配列を簡単に比較できるよう一文字のアミノ酸コードであることが望ましい。
【００６５】
２つの文字が同一かどうかの決定は、段階２６４で行われる。それらが同一である場合、プロセス２５０は、第一および第二配列にある次の文字を読み取る段階２６８へと移る。そして、次の文字が同一かどうかの決定が行われる。それらが同一である場合、プロセス２５０は、２つの文字が同一でなくなるまでこのループを繰り返す。次の２つの文字が同一ではないと決定された場合、プロセス２５０は任意の配列にさらに読み取るべき文字があるかどうかを決める決定段階２７４へと移る。
読み取るべき文字がそれ以上ない場合、プロセス２５０は段階２７６ へと移り、第一および第二配列間の相同性レベルが使用者に表示される。相同性レベルは、第一配列の配列合計数に対する配列間の同一文字の割合を計算して決定される。従って、第一の１００ ヌクレオチド配列における各文字が第二配列にある各文字すべてとアラインメントされる場合、相同性レベルは１００％である。
別の方法として、コンピュータプログラムは、オプションとして、グループＡ核酸配列、およびそれに本質的に同一な配列の核酸コードが１つあるいは複数の位置において基準核酸配列と異なっているかどうかを決定するために、本発明で示した核酸配列のヌクレオチド配列を１つあるいは複数の基準ヌクレオチド配列と比較するコンピュータプログラムでありうる。それらのプログラムは、基準ポリヌクレオチドの配列あるいはグループＡ核酸配列、およびそれと本質的に同一な配列で示した核酸配列に関連して、挿入、欠失あるいは置換されたヌクレオチドの長さおよび同一性を記録する。ある実施例において、コンピュータプログラムはグループＡ核酸配列で示した核酸配列およびそれと本質的に同一な配列が、基準ヌクレオチド配列に関連して一塩基多型（ＳＮＰ）を含んでいるかどうかを決定するプログラムでありうる。
従って、本発明の別の面は、グループＡ核酸配列、およびそれに本質的に同一な配列で示した核酸配列が、１つあるいは複数のヌクレオチドにおいて基準ヌクレオチド配列と異なるかどうかを決定する方法であり、この方法には、核酸配列間の差異を特定するコンピュータプログラムの使用を通じて核酸コードおよび基準ヌクレオチド配列を読み取り、核酸コードと基準ヌクレオチド配列との差異をコンピュータプログラムで特定するステップから構成されている。数種の実施例において、コンピュータプログラムは、一塩基多型を特定するプログラムである。その方法は、上記で示したコンピュータシステムおよび図３で図示された方法によって実行される。その方法はまた、コンピュータプログラムの使用を通じて、グループＡ核酸配列で示した核酸配列、およびそれに実質的に同一な配列、および基準ヌクレオチド配列のうち、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０あるいは４０以上を読み取り、コンピュータプログラムによって核酸コードおよび基準ヌクレオチド配列の間の差異を特定することでも実行される。
【００６６】
他の実施例において、コンピュータベースのシステムは、グループＡ核酸配列で示した核酸配列内、あるいはグループＢアミノ酸配列で示したポリペプチド配列、およびそれと実質的に同一な配列内における特徴を特定する識別子を含むこともある。
「識別子」とは、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列内にある文字を特定する、１つあるいは複数のプログラムを指す。ある実施例において、識別子は、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列内にあるＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）を特定するプログラムを含む。
図４は、配列における特徴の存在を検出するためのプロセス３００の一実施例を示す流れ図である。プロセス３００は段階３０２で始まり、段階３０４へと移り、文字についてチェックを受ける第一配列がコンピュータシステム１００におけるメモリ１１５に保管される。プロセス３００はその後段階３０６へと移り、そこで配列特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースには、各特徴の名前と共に特徴の属性についての一覧が含まれている。例えば、特徴の名前は「開始コドン」であり、その属性は「ＡＴＧ」となる。もう１つの例を挙げると、特徴の名前が「ＴＡＡＴＡＡ Ｂｏｘ」であれば、その属性は「ＴＡＡＴＡＡ」である。このようなデータベースの一例に、ウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍ）が作成するものがある。別の方法としては、文字はアルファへリックス、ベータシート、あるいは、酵素活性部位、へリックス−ターン−へリックス モチーフあるいはその技術分野において熟練者に知られている他のモチーフなどの機能的ポリペプチドモチーフなど、構造的なポリペプチドモチーフの場合もある。
特徴データベースが段階３０６で開かれると、プロセス３００は段階３０８ へと移動して、第一特徴がデータベースから読み取られる。第一特徴の属性比較が段階３１０で行われる。決定段階３１６で、特徴の属性が第一配列で見つかったかどうかが決定される。属性が見つかった場合、プロセス３００は段階３１８へと移動して、その後見つかった特徴の名前が使用者に提示される。
【００６７】
その後プロセス３００は、データベースの中にさらに特徴が存在しているかを決定する決定段階３２０へと移動する。さらなる特徴が存在しない場合、プロセス３００は段階３２４で終了する。しかしさらなる文字が存在する場合、プロセス３００は段階３２６で次の配列特徴を読み取り、次の特徴の属性が第一配列と比較される段階３１０へと戻る。
段階３１６で第一配列に特徴の属性が見つからなかった場合、プロセス３００はデータベースにさらに特徴が存在するかを決めるために決定段階３２０へと直接移動する点に留意するべきである。
従って、本発明の別の面は、グループＡ核酸配列、およびそれと本質的に同一の配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列で示したポリペプチド配列の特徴を特定する方法であり、その方法には、特徴を特定するコンピュータプログラムの使用を通じた、核酸コードあるいはポリペプチドコードの読み取り、およびコンピュータプログラムによる核酸コード内の特徴の特定が含まれる。ある実施例において、コンピュータプログラムは、ＯＲＦを特定するコンピュータプログラムを含む。この方法は、単一配列あるいは、グループＡ核酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列のうち、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０あるいは４０以上をコンピュータプログラムの使用を通じて読み取り、核酸コードあるいはポリペプチドコード内の特徴をコンピュータプログラムで特定することで実行される。
グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列は、様々な形式で多種のデータプロセッサプログラム内に保管・操作される。例えば、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＷＯＲＤあるいはＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴのような文書処理ファイルでテキスト保存するか、あるいはＡＳＣＩＩファイルとしてその技術分野の熟練者に馴染みのあるＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥ、あるいはＯＲＡＣＬＥといった多種のデータベースプログラムで保存される。加えて、多くのコンピュータプログラムおよびデータベースは、配列比較アルゴリズム、識別子、あるいはグループＡ核酸配列 Ｄ、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列と比較される基準ヌクレオチド配列あるいはポリペプチドの提供元として使用される。下記のリストは、発明を制限することを意図するのではなく、グループＡ核酸配列、およびそれと実質的に同一な配列で示した核酸配列、あるいはグループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一な配列で示したポリペプチド配列に有用なプログラムおよびデータベースに対する案内を提供する意図で作成されたものである。
【００６８】
使用されるプログラムとデータベースは、下記を含むがこれに制限されない：
ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、Ｌｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＭａｃＬｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３， １９９０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：２４４４， １９８８）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ等、Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−２４５， １９９０）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）， Ｃｅｒｉｕｓ２．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＨｙｐｏＧｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＩＳＩＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＳｅｑＦｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ＭＤＬ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ データベース、ＭＤＬ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔ データベース、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ データベース、Ｄｅｒｗｅｎｔ’ｓ Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｅｘ データベース、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅ データベース、Ｇｅｎｂａｎｋ データベース、およびＧｅｎｓｅｑｎ データベース。その他多くのプログラムおよびデータベースは、現在の開示内容を知っているその技術分野の熟練者には明白である。
上記のプログラムを使用して検出されるモチーフは、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファへリックス、およびベータシートをコードする配列、ホメオボックス、酸性のストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位および酵素による切断部位のように、符号化されたタンパク質、転写調整において暗示された配列の分泌を指示する信号ペプチドをコードする信号配列を含む。
【００６９】
酵素は非常に敏感な触媒である。その顕著な特徴は、従来の合成化学において並ぶもののない、正確な立体選択性、位置選択性、および化学選択性によって触媒反応を及ぼす能力である。さらに、酵素は非常に多能性である。酵素は、有機体溶媒において機能し、極端なｐＨ（例えば高ｐＨおよび低ｐＨ）、極端な温度（例えば高温と低温）、極端な塩分濃度（例えば高塩度および低塩度）で作用し、その天然で生理学的な基質に構造的には無関係な化合物と触媒反応を起こすよう調整することができる。
酵素は、広範囲の天然基質および非天然基質に反応するため、実質的にあらゆる有機リード化合物の変更が可能となる。さらに、従来の化学触媒と違い、酵素は、極めてエナンチオ選択的および位置選択的である。酵素が示す高度な機能群の特異度により、合成配列における各反応を追跡することが可能となり、新しい活性化合物へとつながる。酵素は、また、性質的にその生理学的機能に関連のない多くの逆反応の触媒作用を及ぼすことができる。例えばペルオキシダーゼは、過酸化水素によってフェノールの酸化反応を触媒する。他の例としては、ポリペプチドの分解に対して触媒反応を起こすプロテアーゼがある。有機溶液において、プロテアーゼによっては砂糖をアシル化することができるが、この機能は酵素の元来の機能には無関係である。
本発明は、酵素の特異な触媒特性を高めるものである。実際、化学変化における生体触媒の使用（例：精製酵素あるいは天然酵素、非活性細胞あるいは活性細胞など）には、通常、特定の出発化合物と反応する特定の生体触媒の特定が求められるが、本発明は、小分子などの多くの出発化合物に見られる機能群に特有の選択された生体触媒および反応状態を使用する。各生体触媒は、１つの機能群あるいはいくつかの関連する機能群に特有のものであり、その機能群を含む出発化合物多数と反応する。
生体触媒反応は、単一の出発化合物から数多くの誘導体を生み出す。これらの誘導体は、２つ目の誘導体を生み出すため２回目の触媒反応に応じさせることもできる。本来の小分子あるいは化合物から何千もの多様性が生体触媒の誘導体化の反復によって生み出される。
【００７０】
酵素は、分子の残りの部分に影響することなく出発化合物の特定部位に反応する。このプロセスを、従来の化学方法の使用により達成するのは非常に難しい。この高い生体触媒特異度によって、ライブラリ内の単一活性化合物を特定する手段が提供される。ライブラリは、ライブラリの作成に使用される一連の生体触媒反応、いわゆる「生合成履歴」によって特徴づけられる。生物活性についてライブラリをスクリーニングし、生合成履歴を追跡調査することにより、活性化合物を生み出す特定の反応配列が特定される。反応配列は繰り返され、合成化合物が決定される。他の合成およびスクリーニング方法とは違い、この属性確認の様態は、固定化技術が要らず、化合物は実質的にあらゆる種類のスクリーニングアッセイを使用して溶媒中で自由に合成・テストされうる。機能群における酵素反応の特異度によって、生体触媒により作成されるライブラリを作り出す特定の酵素反応の「追跡調査」が可能となる点に留意することは重要である。
手順段階の多くは、ロボットによる自動装置を使用して実行されるため、高度な正確性と信頼性を保証すると同時に、一日に何千もの生体触媒反応およびスクリーニングアッセイが可能となっている。結果として、現在の化学方法を使用すれば数年はかかると思われる誘導化合物のライブラリがほんの数週間で作成されうる。（小分子を含む分子の修飾に関する詳細な説明については、その全体が参照により本書に組み込まれたＰＣＴ／ＵＳ９４／０９１７４を参照のこと）
特定の実施例において、本発明は、修飾小分子を生成するための方法を提供しているが、この方法では、本書で説明されたポリヌクレオチドにより符号化されたポリペプチドまたは酵素活性化したその断片を小分子に接触させて、修飾小分子を生成する。修飾小分子のライブラリは、希望する活性を持つ修飾小分子を生成する特定の生体触媒反応は、ライブラリの一部を作成するために使用される各々の生体触媒反応を系統的に排除していき、ライブラリのその一部に生成された修飾小分子が希望する活性を有しているかどうかについて、小分子をテストすることで特定される。希望する活性を持つ修飾小分子を生成する特定の生体触媒反応は、任意で繰り返すことができる。生体触媒反応は、小分子の構造内にみられる個別の構造的部位と反応する生体触媒群を使用して実施することができ、各生体触媒は、一つの構造的部位または関連する構造的部位群に固有のものである。そして各生体触媒は、個別の構造的部位を持つ多数の異なる小分子と反応する。
【００７１】
グループＢアミノ酸配列、およびそれに実質的に同一の配列のポリペプチド、あるいは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００あるいは１５０の連続するアミノ酸を含むその断片が、多様な用途で使用される。例えば、ポリペプチドあるいはその断片は、生体触媒反応を起こすために使用される。本発明の一面に従い、グループＢアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列のポリペプチド、あるいはグリコシド結合を加水分解するために上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用するプロセスが提供される。そのような手順においては、グリコシド結合（例：でんぷん）を含む物質と、グループＢアミノ酸配列、あるいはそれと実質的に同一な配列のポリペプチドの一つが、グリコシド結合の加水分解を促すような状況下で接触される。
本書で説明するポリペプチドとは、エナンチオマー混合物の酵素による速度論的分割に使用することもできる。それゆえ、別の面において本発明は、本発明におけるハイドロラーセ酵素を基質に接触させて基質エナンチオマー混合物を分解し、エナンチオマー混合物の分解のため、および、エナンチオマーをより豊富に含む形となった基質および生成物（あるいはそのいずれか）を回収するためのプロセスを提供する。
一つの実施例において、基質はエステルのエナンチオマー混合物であり、ハイドロラーセ酵素がアルコールあるいは酸に対してエステルの加水分解反応を起こす。特定の望ましい実施例において、エステルは、第二アルコールのアルカノールエステル（より望ましくはＣ１−Ｃ６アルカノールエステル）であることが望ましい。本発明の別の面に従い分解されうるアルカノールエステルの非制限な例としては、アセテートおよびブチラートが含まれる。ある望ましい実施例において、エステルは、キラル有機酸のアルカノールエステル（特にＣ１−Ｃ２０、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ６あるいはＣ１−Ｃ４アルキルエステルが望ましい）である。本発明の別の面に従い分解されうるアルキルエステルの非制限な例としては、メチル、エチル、プロピルおよびブチルエステルが含まれる。
【００７２】
別の実施例において、基質はアルコール、望ましくは第二アルコールのエナンチオマー混合物であり、加水酵素がアシル供与体によってアルコールに触媒反応を起こし、エステルを生成する。ビニルアセテートは、エステル化反応における使用に適したアシル供与体の例であるが、他のものを使用することもできる。
数種の実施例において、アルコールあるいはエステルが結合した炭素原子は、分解されるべきキラル中心である。他の実施例においては、アルコールあるいはエステルが結合した炭素原子はアキルであり、分解されるべきキラル中心は、分子内の異なる位置にある。
例えば、本発明の酵素は、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン、３−ブチン−２−オール、１−メチオキシン−２−プロパノール、および３−ヒドロクシテトラヒドロフラン（３−ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）あるいはそのエステルから成る群から選ばれたアルコールを分解するために使用される。これらの化合物は、有機合成に重要なキラル構成要素である。例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ： Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ９：４４２９（１９９８）は、３−ブチン−２−オールは、フェンロイトン（ｆｅｎｌｅｕｔｏｎ）の合成、オスの松食いカブトムシの性フェロモンに使用できることを開示し、Ｃｏｔｔｅｒｉｌ等、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ ３２６９（１９９４）は、同じ化合物が、オーストラリア産キノコの果肉の主要な色素である（Ｓ）−（−）−オーストロコルチシン［（Ｓ）−（−）−ａｕｓｔｒｏｃｏｒｔｉｃｉｎ］の合成に使用できることを報告した。Ｋａｔａｏｋａ等、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４４：３３３（１９９５）は、パントラクトン（２−ヒドロキシン−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン）がＤ−パントテン酸（ビタミンＢ５）の先駆物質であることを開示した。 Ｇｈｏｓｈ等、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９：３２７８（１９９６）および Ｔａｌｉｐｏｖ等、Ｒｕｓｓ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２９：１２０５（１９９３）。各場合において、生成物のエナンチオマー精製度が生物活性に重要であり、エナンチオマーをより多く含む形でキラル構成要素を獲得する方法が必要となる。
本発明は、下記の例に関連してさらに詳しく詳述される。しかしながら、本発明がこれらの例のみに限定されない点が理解される必要がある。
【００７３】
実施例
実施例１：ハイドロラーゼの単離
ＢＤ１００
本発明に従って、ＢＤ１００ハイドロラーゼが、好気的代謝を持つクレンアルカエオタ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）種の一つであるメタロスファエラ・プルエナエ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｐｒｕｎａｅ）から単離された。Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｐｒｕｎａｅを６５℃、ｐＨ２の培養条件で発育させた。
ＢＤ１００を単離するために、測色プレート分析アッセイが使用された（基質としてＸ酪酸塩を使用）。アッセイは３９℃、ｐＨ７．５で実行された。宿主生物体はＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ＶＰＮ２００１５８）であった。ＢＤ１００クローンを単離するために、ｇｔｌｌライブラリがスクリーニングされた。ＢＤ１００はｇｔｌｌから増幅されたＰＣＲで、ＴＯＰＯ−ＴＡはｐＣＲ２．１にクローン化され、それゆえベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（宿主ＴＧ１）が形成された。
ＢＤ０７３
本発明に従って、ＢＤ０７３ ハイドロラーゼを、７５℃、ｐＨ６．０で発育し、米国ワイオミング州イェローストーンから単離培養された病原菌バクテリアであるアリシクロバシルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）から単離した。好気性の有機栄養生物であるＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ を６２℃、ｐＨ３．５の培養条件で発育させた。
ＢＤ０７３を単離するために、測色プレートアッセイを使用した（基質としてＸ酪酸塩を使用）。アッセイを３９℃、ｐＨ７．５で実行した。宿主生物体はＸＬｌ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（ＶＰＮ２００１５８）であった。単離したＢＤ０７３ クローンは、ラムダＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓベクターにサブクローン化された。
【００７４】
実施例２：ハイドロラーゼのバクテリア発現および精製
本発明の酵素をコードするＤＮＡ、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３は、ｐＱＥ ベクターを使用するＰＣＲ技術によって、ＤＮＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターからまず増幅された。ｐＱＥベクターは、抗生物質への抵抗性（Ａｍｐｒ）、細菌の複製開始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ 調整可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６Ｈｉｓタグおよび制限酵素部位をコードする。
ｐＱＥベクターを制限酵素で消化した。増幅された配列を各ｐＱＥベクターに結紮し、ＲＢＳを符号化した配列のあるフレームに挿入した。その後、結紮混合物が、エレクトロポーレーションによる大腸菌菌株Ｍ１５／ｐＲＥＰ４（Ｑｉａｇｅｎ社）の変換のために使用された。Ｍ１５／ｐＲＥＰ４には、ｌａｃＩリプレッサーを発現し、またカナマイシン抵抗性（Ｋａｎｒ）を与えるプラスミドｐＲＥＰ４の複数の複製が含まれる。形質転換体はＬＢ プレート上における成長能力によって識別され、アンピシリン／カナマイシン抵抗性を持つ集団が選択された。プラスミドＤＮＡは、制限分析によって単離と確認が行われた。望ましい構造を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補完したＬＢ培養液の液体培養液内で、一晩（Ｏ／Ｎ）培養させた。Ｏ／Ｎ培養液は、１：１００から１：２５０の比率で大量の培養液を接種するために使用された。細胞は、０．４〜０．６の光学密度６００（Ｏ．Ｄ．６００）に発育させた。その後、ＩＰＴＧ（「イソプロピル−Ｂ−Ｄ−ティオガラクト・ピラノシド」）が最終濃度１ｍＭに加えられた。ＩＰＴＧは、ｌａｄリプレッサーの不活性化により誘発し、遺伝子発現の増加に結びつくＰ／０を取り除く。細胞は、３〜４時間余分に発育を促した。その後細胞は、遠心分離により回収された。
上記で述べたプライマー配列は、上記に記載のハイブリッド形成技術によって、沈積物質からの標的遺伝子の単離にも使用することができる。
【００７５】
実施例３：沈積ゲノムのクローンから選択されたクローンの単離
当該の遺伝子に対応する２つのオリゴヌクレオチドプライマーは、沈積物質にある遺伝子を増幅するために使用される。ポリメラーゼ連鎖反応は、当該遺伝子のＤＮＡ０．１μｇを反応混合物２５μｌに足して実行される。反応混合物は、１．５−５ｍＭ ＭｇＣ１２、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ 各２０μＭ、プライマー各２５ｐｍｏｌおよびＴａｑポリメラーゼ１．２５ユニットである。ＰＣＲの３０サイクル（９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）が、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ ９６００サーマルサイクラーで実行される。増幅された生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析され、予想分子量を持つＤＮＡバンドを使用して精製される。ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ生成物をサブクローン化し、配列化することにより、当該の遺伝子であることが確認される。
【００７６】
実施例４：発現遺伝子バンクの生成
有機体Ｍ１１ＴＬ、サーモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＵ５Ｌ５およびテレディニバクター（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ）からのランダム挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含む集団は、Ｈａｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔによる方法（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ５：１６， １９９２）に従い得られた。
【００７７】
実施例５：リパーゼ／エステラーゼ活性のスクリーニング
結果として生じた集団は、無菌爪楊枝で採集され、９６マイクロタイタープレートの各ウェルに接種するのみに使用された。ウェルには、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ、メチシリン８０μｇ／ｍＬおよびグリセリン１０％ｖ／ｖ（ＬＢ Ａｍｐ／Ｍｅｔｈ、グリセリン）を有するＬＢ培養液２５０μＬが含まれた。細胞は、攪拌せずに３７℃で一晩発育させた。これにより、「供給源遺伝子バンク」の世代が構成された。このように、供給源遺伝子バンクの各ウェルには、独自のＤＮＡ挿入を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを各々含む大腸菌細胞の培養ストックが含まれた。
供給源遺伝子バンクのプレートは、各ウェルにＬＢ Ａｍｐ／Ｍｅｔｈ、グリセリン２００μＬを含む単一プレート（「凝縮プレート」）を接種増殖のために使用された。このステップは、各接種の間に漂白剤１％、水、イソプロピルアルコール、空気乾燥した殺菌サイクルを用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋの高密度複製ツール（ＨＤＲＴ）を使用して実行された。このように、凝縮プレートの各ウェルには、各々の供給ライブラリ プレートから１０〜１２の異なるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローンが含まれた。凝縮プレートは、３７℃で１６時間発育し、次に、各ウェルにＬＢ Ａｍｐ／Ｍｅｔｈ ２５０μＬ（グリセリンを含まない）を含む２つの白い９６ウェルＰｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃｓマイクロタイター娘プレートを接種するために使用された。本来の凝縮プレートは−８０℃のストレージに入れられた。２つの凝縮娘プレートは３７℃で１８時間培養された。
短鎖エステラーゼの「６００μＭ基質ストック溶液」は以下のように準備された。下記の各化合物のうち２５ｍｇが適切な容量のＤＭＳＯに溶解され、２５．２ｍＭ溶液を生成した。使用された化合物は、４−メチルウンベリフェリル プロプリオネート、４−メチルウンベリフェリル酪酸塩および４−メチルウンベリフェリル ヘプタノエートであった。各ＤＭＳＯ溶液のうち２５０マイクロリットルが、５０ｍＭのｃａ ９ｍＬ、０．６％のトリトンＸ−１００およびドデシル マルトシド（Ａｎａｔｒａｃｅ）０．６ｍｇを含んだｐＨ７．５ Ｈｅｐｅｓ バッファに加えられた。容量は、わずかに濁りのある懸濁液を生成するため、上記のＨｅｐｅｓバッファで１０．５ｍＬまで取り出された。
長鎖エステラーゼの「６００μＭ基質ストック溶液」は以下のように準備された。下記の各化合物のうち２５ｍｇがＤＭＳＯに溶解され上記の２５．２ｍＭにした。使用された化合物は、４−メチルウンベリフェリル エライジン塩酸、４−メチルウンベリフェリル パルミテート、４−メチルウンベリフェリル オレアーテ、および４−メチルウンベリフェリル ステアレートであった。溶解を達成するために、７０℃で短時間の加温がすべての化合物で要求された。各ＤＭＳＯ溶液のうち２５０マイクロリットルがＨｅｐｅｓバッファに加えられ、上記のように１０．５ｍＬに希釈された。ウンベリフェロンはすべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から得られた。
長鎖エステラーゼあるいは短鎖エステラーゼ「６００μＭの基質ストック溶液」の５０μＬは、Ｂｉｏｍｅｋを用いて白い凝縮プレートの各ウェルに加えられ、基質の最終濃度約１００μＭが生成された。基質を追加した直後にプレート読取可能な蛍光計で蛍光値を記録した（励起＝３２６ｎｍ、放射＝４５０ｎｍ）。プレートは、長鎖基質の場合は７０℃で６０分間、短鎖基質の場合はＲＴでおよび３０分間、培養された。蛍光値を再度記録した。活性クローンが存在したかどうかを決定するため最初の蛍光値および最終蛍光値が比較された。
【００７８】
実施例６：活性クローンの単離および精製
活性を帯びた個々のクローンを単離するために、供給源遺伝子バンクプレートが解凍され、また個々のウェルが、ＬＢ Ａｍｐ／Ｍｅｔｈを含む新しいプレートを別々に接種するために使用された。上記と同様、細胞の発育のためにプレートが３７℃で培養され、６００μＭ基質ストック溶液の５０μＬがＢｉｏｍｅｋを使用して加えられ、蛍光性が決定された。供給源プレートから活性ウェルが特定されると、この活性ウェルからの細胞は、単一の集団を得るためにＬＢ／Ａｍｐ／Ｍｅｔｈで寒天培養基上に画線培養され、３７℃で一晩発育された。８つの単一集団が無菌爪楊枝で採集され、９６ウェルマイクロタイター プレートのウェルに別々に接種するために使用された。ウェルには、２５０μＬのＬＢ Ａｍｐ／Ｍｅｔｈが含まれた。細胞を攪拌せずに３７℃で一晩発育させた。２００μＬの部分標本が各ウェルより取り出され、上記のように適切な長鎖あるいは短鎖基質で分析評価された。最も活性の高いクローンが特定され、培養液の残り５０μＬがＬＢ／Ａｍｐ／Ｍｅｔｈで寒天培養基プレートに画線培養するために使用された。８つの単一集団が採集され、上記のように発育され、分析評価された。最も活性の高いクローンが一晩で発育されたＬＢ／Ａｍｐ／Ｍｅｔｈ ３ｍＬの培養液に接種するために使用された。プラスミドＤＮＡが培養液から単離され、配列のために利用された。
【００７９】
実施例７：エステル基質の合成
2005502310.tif 000002
ａ， Ｒ＝Ｈ； ｂ， Ｒ＝アセテート
ラセミ化合物であり光学上純粋なアルコールｌａ−４ａが、利用できる最も高い精製度で一般サプライヤーから得られた。標準手順を使用して、アセテートｌｂおよび４ｂがピリジンの対応する酸塩化物より合成された。有機溶剤はすべて分析対応等級かそれ以上であり、また使用に先立ち活性化された分子ふるい（３Å）の上で一晩乾燥された。
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣ１３に、Ｂｒｕｋｅｒ（ドイツ・カールスルーエ）分光計でそれぞれ ２５０／５００および６３／１２６ ＭＨｚ と記録された。化学シフト（δ）は、内部ＴＭＳと関連してｐｐｍで示される。結合定数（Ｊ）はＨｚで示される。エナンチオマー過剰値（％ｅｅ）はガスクロマトグラフィ分析から計算された。
（Ｒ，Ｓ）−アセトキシ−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン（１ｂ）
ピリジン７５ｍＬ中にある（Ｒ，Ｓ）−２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−γ−ブチロラクトン（９．８ｇ、７５ｍｍｏｌ）溶液に、氷水で冷却しながらアセチル塩化物（７．５ｍＬ、１０５ｍｍｏｌ）が加えられ、合成混合物が１９時間、室温で撹拌された。その後、水（５０ｍＬ）が加えられ、混合物はジエチルエーテルで抽出された。有機層は、塩酸（０．１ｍｏｌ）、飽和炭酸ナトリウム溶液および水で洗浄された。溶剤を乾燥させて取り除いた後、精製１ｂ ６．４ｇ（５０％）を生成するために、残留物はシリカゲル コラムクロマトグラフィによって精製された：１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは次の文献データに一致している：（Ｇａｍａｌｅｖｉｃｈ、Ｓｅｒｅｂｒｙａｋｏｖ， Ｒｕｓｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂｕｌｌ． ４６：１７１（１９９７年））、δс（１２６ＭＨｚ）１９．８９、２０．５５、２３．０３、４０．１６、７５．０６、７６．２１、１６９．７９、１７２．４６、分析計算対象：Ｃ８Ｈ１２Ｏ４： Ｃ ５５．８１、Ｈ ７．０２。実測：Ｃ ５５．６９、Ｈ ７．１１。
（Ｒ，Ｓ）−３−テトラヒドロフリル−アセテート（４ｂ）
ジクロロメタン７５ｍＬの４ａ（４５ｍｍｏｌ、４．０ｇ）溶液に、氷水で冷却しながらピリジン（１６ｍＬ）およびアセチル塩化物（２００ｍｍｏｌ、１４．２ｍＬ）の５倍の容量が加えられた。２４時間後、１ｂに記述される通り反応混合物が精密に検査され、純粋な４ｂが２．７ｇ（４６％）生成された。δＨ（５００ＭＨｚ）２．０２（１Ｈ、ｍ、４−Ｈ）、２．０７（３Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ３）、２．１７（１Ｈ、ｍ、４−Ｈ）、３．８８（４Ｈ、ｍ、２−Ｈ／５−Ｈ）、５．２９（１Ｈ， ｍ， ３−Ｈ）、δс（１２６ＭＨｚ）２１．１３（ＣＨ３）、３２．６９（４−Ｃ）、６７．００、７３．１４、７４．８３（３−Ｃ）、１７０．９１（ＣＯ）、分析計算対象： Ｃ６Ｈ１０Ｏ３： Ｃ ５５．３７， Ｈ ７．７４。 実測：Ｃ ５５．４１、Ｈ ７．７９。
【００８０】
実施例８：酵素活性を決定するスクリーニング反応
スクリーニング反応は、ピペットロボットシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ ２０００、Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉβｈｅｉｍ、ドイツ）によって操作される９６ウェル マイクロタイタープレートで実行された。酵素濃度が１ｍｇ以下のハイドロラーゼ／ｍＬバッファを有する１８０μＬのリン酸ナトリウムバッファ（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）が、２０ｍＭ ｌｂ−４ｂおよびブロモチモール−ブルー（０．７５ｍＭ）を含むＤＭＳＯ ２０μＬと混合された。マイクロタイタープレートは、２４時間、３７℃、５０℃あるいは８０℃の室温で覆いをかけて培養された。目視でモニターされた色の変化は、活性酵素を示していた。基質あるいは酵素のない類似の設定はブランクとして機能した。
【００８１】
実施例９：エナンチオ選択性を決定するための小規模反応
アセテート（１ｂ−４ｂ）（５０ｍＭ）が、リン酸ナトリウムバッファ（１０ｍＭ、ｐＨ７．３）中の酵素溶液（１ｍｇ以下のハイドロラーゼ／ｍＬ）に加えられた。３７℃、５０℃あるいは８０℃の室温で振動を与えた後（反応時間は表１に提示）、部分標本５００μＬがジクロロメタン（１ｂ）２５０μＬあるいはエチルアセテート（３ｂまたは４ｂ）２５０μＬで抽出され、取り出された。有機層が単離、乾燥され、希釈後のＧＣ分析に直接使用された。基質２ｂの場合には、部分標本はジクロロメタン５００μＬで抽出され、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析に先立ち、トリフルオロ酢酸無水物で誘導体化された。結果は表１に示されている。
【００８２】
表１ 小規模加水分解
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ａ Ｃｈｅｎ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０４：７２９４（１９８２年）に従って計算された
【００８３】
実施例１０：エナンチオ選択的加水分解準備の一般手順
準備反応は小規模反応に類似した形で実行されたが、ｐＨを７．３に維持し、０．１あるいは１．０ＮのＮａＯＨ溶液を追加することによる転換をモニターするために、ｐＨ−ｓｔａｔ装置（Ｍｅｔｒｏｈｍ、Ｈｅｒｉｓａｕ、スイス）で行われた。酵素量、基質濃度および反応温度が表２に示されている。望ましい転換が達成された後、ジエチルエーテルで抽出して反応は止められた。結合有機層は乾燥され、溶剤は真空蒸発によって取り除かれた。アルコールおよび無反応エステルは、シリカゲルカラムクロマトグラフィによって分離された。エナンチオマー過剰および転換はＧＣ分析によって決定され、化学的同一性はＮＭＲ分光学によって確認された。結果は表２に示されている。
【００８４】
表２ 準備規模での加水分解
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ａ Ｃｈｅｎ等、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０４：７２９４（１９８２年）に従い計算された
前述の発明は明瞭性や理解を目的としてかなり詳細に記述されたが、本実施例は例示的なものであり、制限するものではない。本明細書を読むことにより、形式上および詳細についての多様な変更が本発明および付記された請求項の範囲内において行われ得ることが、この技術分野における熟練者によって正しく認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、コンピュータシステムのブロック図である。
【図２】
図２は、新しい配列とデータベース内の配列との間の相同性レベルを決定する目的で、新しいヌクレオチドまたはタンパク質配列を配列のデータベースと比較するための一プロセスの実施例を図示した流れ図である。
【図３】
図３は、２つの配列が相同的であるかどうかを判断するための、コンピュータ内での一プロセスの実施例を図示した流れ図である。
【図４】
図４は、配列内のある特徴の存在を検出するための識別プロセス３００の一つの実施例を図示した流れ図である。
【図５】
図５Ａは、本発明のＢＤ０２１の全ＤＮＡ配列（配列番号１）を図示したものである。本発明のすべての配列について、配列決定は３７８自動ＤＮＡシークエンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を用いて実施した。
図５Ｂは、ＢＤ０２１の全アミノ酸配列（配列番号２）を図示したものである。
【図６】
図６Ａは、ＢＤ２１３の全ＤＮＡ配列（配列番号３）を図示したものである。
図６Ｂは、ＢＤ２１３の全アミノ酸配列（配列番号４）を図示したものである。
【図７】
図７Ａは、ＢＤ１００の全ＤＮＡ配列（配列番号５）を図示したものである。
図７Ｂは、ＢＤ１００の全アミノ酸配列（配列番号６）を図示したものである。
【図８】
図８Ａは、ＢＤ１００の全ＤＮＡ配列（配列番号７）を図示したものである。
図８Ｂは、ＢＤ１００の全アミノ酸配列（配列番号６）を図示したものである。
【図９】
図９Ａは、ＢＤ０７３の全ＤＮＡ配列（配列番号９）を図示したものである。
図９Ｂは、ＢＤ０７３の全アミノ酸配列（配列番号１０）を図示したものである。
【図１０】
図１０Ａは、ＢＤ０９４の全ＤＮＡ配列（配列番号１１）を図示したものである。
図１０Ｂは、ＢＤ０９４の全アミノ酸配列（配列番号１２）を図示したものである。
【図１１】
図１１Ａは、ＢＤ４２３の全ＤＮＡ配列（配列番号１３）を図示したものである。
図１１Ｂは、ＢＤ４２３の全アミノ酸配列（配列番号１４）を図示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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