(57)【要約】      （修正有）【課題】軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中、又は食品組成物中のプロテオグリカンの新規な定量方法を提供する。【解決手段】分析試料の水溶液抽出、分子量分画膜による前処理、新規のグリコサミノグリカン比色試薬の組み合わせを見出したことで、軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中、又は食品組成物中のプロテオグリカンの定量を可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程により軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中のプロテオグリカンを定量する方法。
１）プロテオグリカンを含む軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中から水または水溶液で抽出し抽出物を回収する工程、
２）分子量分画膜を有する中空状容器にて遠心分離を行い、濃縮物を回収する工程、
３）比色試薬を加え、比色定量する工程。
【請求項２】
分子量分画膜を有する中空状容器が分子量５万〜１０万で篩い可能な容器であって、濃縮物中にコンドロイチン硫酸を含まない請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
比色試薬が、界面活性剤オクチルフェノールエトキシトレート、１，９−ジメチルメチレンブルー、エタノール、ギ酸、ギ酸ナトリウムからなる事を特徴とする、請求項１または請求項２記載の定量方法。
【請求項４】
比色試薬が、ホウ酸緩衝液、スルファミン酸アンモニウム、カルバゾール からなる事を特徴とする、請求項１または請求項２記載の定量方法。
【請求項５】
界面活性剤オクチルフェノールエトキシトレート、１，９−ジメチルメチレンブルー、エタノール、ギ酸、ギ酸ナトリウムの試薬からなる群、またはホウ酸緩衝液、スルファミン酸アンモニウム、カルバゾールの試薬からなる群のいずれか一つ以上からなるサケ鼻軟骨またはサケ鼻軟骨抽出物を含む組成物中のプロテオグリカン定量用キット。
【請求項６】
分析対象のプロテオグリカンの分子量が１０万〜２００万である、請求項１〜５いずれか記載の定量方法または定量用キット。
【請求項７】
プロテオグリカンと植物抽出物、動物抽出物、魚類抽出物、脂質類、アミノ酸類、ミネラル類、ビタミン類、菌類を１種類または２種類以上含む食品中のプロテオグリカンを定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨、軟骨抽出物中又は食品中に含まれるプロテオグリカンを精密に定量する方法、及び高純度のプロテオグリカンの回収に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に細胞外マトリックス中の基質を形成する主要な生体高分子であって、ヒトや牛などの哺乳動物、鮭や鮫など魚類の軟骨に含まれていることが知られており、プロテオグリカンを配合した健康食品、化粧品、プロテオグリカンの製造方法等が多く報告されている。また、プロテオグリカン自体の有用性も多く報告されており、分子量の低い５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａのプロテオグリカンは軟骨分化促進作用やひざ関節改善作用、皮膚色素沈着抑制作用など報告されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、プロテオグリカンの分析については糖鎖部分のウロン酸をカルバゾール法、タンパク質部分を２８０ ｎｍのＵＶ吸収で検出した分析方法が報告されているものの（特許文献２）、遊離のコンドロイチン硫酸やヒアルロン酸、コラーゲンが存在する低分子領域では利用できない問題があった。
【０００４】
また、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸、コラーゲンを除くためＨＰＬＣにインジェクトする前処理として、透析後１００万以上の分子量で定量する方法があるがこれでは１００万以下の分子量のプロテオグリカンに対して定量する事はできない（特許文献３）。
【０００５】
プロテオグリカンに対し特異的に働く抗体を作成した報告もあるが、費用も高く工業的には実現されていない。（特許文献４）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１３８０６０
【特許文献２】特開２０１６−１２８４６７
【特許文献３】特開２００２−０６９０９７
【特許文献４】特開２０１６−１６０２２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、比色法を利用し、プロテオグリカンを含む組成物中の分子量10万〜200万のプロテオグリカンを定量する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、遊離のコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸を徹底的に除くため透析、分子量分画、HPLC、電気泳動、比色法等様々な条件を検討した結果、分子量分画膜を有する中空状の容器で前処理を行えば、ほぼ全てのコンドロイチン硫酸を除き、高分子量から低分子量のプロテオグリカンを残す事を見出した。さらにグリコサミノグリカンを比色定量する試薬の組み合わせも新たに見出した。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の分析方法によれば、分子量１０万〜２００万のプロテオグリカンに対して定量が可能となり、プロテオグリカンを含む組成物中の定量も可能となる。さらに、安価な比色試薬を利用することできるようにすることで、定量分析の費用を抑えることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】分子量分画前後のプロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末を分析対象とした、クロマトグラム
【図２】実施例１によって調製した比色試薬による、プロテオグリカン標準品の検量線
【図３】実施例２によって調製した比色試薬による、プロテオグリカン標準品の検量線
【図４】実施例３によって調製した比色試薬による、プロテオグリカン標準品の検量線
【図５】実施例１〜３の方法により定量した、プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末中のプロテオグリカンの質量％濃度
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の分析対象である軟骨とはプロテオグリカンを含有することが知られている魚類や軟体動物などの水棲生物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織を指し、特に鮭の頭部や、鮫のヒレ部の軟骨組織が分析対象として好ましい。また、軟骨抽出物とは前記軟骨をそのまま又は粉砕後の搾取物。又は、そののまま又は粉砕後の溶媒抽出物を指し、軟骨抽出物の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状いずれの形状も含み、いずれの形状でも分析対象とすることができる。
【００１２】
本発明における軟骨、軟骨抽出物、またはプロテオグリカンを含む組成物に用いる抽出溶媒としては水や水溶液を用いれば良く、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ性の水溶液や、グアニジン塩酸や尿素、酢酸、クエン酸、硫酸、硝酸などの酸性の水溶液が好ましい。
【００１３】
本発明における分子量分画膜を有する中空状容器とは、主にコンドロイチン硫酸を除き使用するための容器であって、５万〜１０万の間で分子篩いが可能な膜を有し、膜の篩いによって分析対象物のプロテオグリカン含量が減少しない条件に適合する容器であればよい。特に、遠心分離に対応している容器が好ましく、ミリポア社製のアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）遠心式フィルターユニット、ジーエルサイエンス社製のＭｏｎｏＳｐｉｎ、バイラッド社製のスピンカラム、ＧＥヘルスケアジャパン社製のＶｉｖａｓｐｉｎ、日本ポール社製のマクロセップアドバンス、ザルトリウス社製のビバスピン／ビバスピンｔｕｒｂｏなどを用いるとよい。
【００１４】
本発明で使用する比色試薬としてはグリコサミノグリカンを選択的に比色定量できる試薬が好ましく、市販の試薬であればＢＬＹＳＣＡＮ  ＧＬＹＣＯＳＡＭＩＮＯＧＬＹＣＡＮ  ＡＳＳＡＹ  ＫＩＴ（ＡＣＣＵＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＆  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社製）、Ｒｈｅｕｍｅｒａ  ｋｉｔ（Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）、Ｂｌｙｓｃａｎ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）、もしくは自分で調整してもよい。
【００１５】
本発明で新たに見出したグリコサミノグリカンの比色試薬は界面活性剤オクチルフェノールエトキシトレート、１，９−ジメチルメチレンブルー、エタノール、ギ酸、ギ酸ナトリウムから構成したもの、または、ホウ酸緩衝液、スルファミン酸アンモニウム、カルバゾールから構成したものであり、それぞれ市販の試薬として存在しており入手も容易である。
【００１６】
比色定量に使用する検出器としては、各比色試薬に対応する５００〜７００ ｎｍの吸光度を測定できる分光光度計が好ましい。
【００１７】
本発明の分析方法が適用可能なプロテオグリカンを含む食品としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状、ゼリー状、ゲル状、タブレット状のいかなる形態でもよく、必要に応じて食品を粉砕、搾取、抽出を行い、比色法を適用し分析することが可能である。
【実施例】
【００１８】
以下の実施例は本発明におけるプロテオグリカン含有物の具体例であるが、本発明は以下実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１：プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末中のプロテオグリカンの定量
【００２０】
（サケ鼻軟骨からプロテオグリカンの回収）
−３０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を４００ ｇ用意し、出発原料とした。４重量％の酢酸水溶液２０００ ｇに出発原料を投入し、撹拌しながら７２時間抽出した。
この溶出液をステンレススチールメッシュ（１５０ μｍ）でろ過し、不溶物を除去した。ろ液を透析膜にて十分に透析し、得られた液にデキストリンを加えて噴霧乾燥し、プロテオグリカン２０％調製したプロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末２０ ｇを得た。
【００２１】
（分子量分画膜による分離）
前記プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末２５ ｍｇに精製水を加えて５０ ｍＬ容量に調製し、この調製液１０ ｍＬをビバスピンｔｕｒｂｏ１５  １００，０００  ＭＷＣＯ（ザルトリウス社製）に量り取り、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）した。さらに上清に精製水１０ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を３回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１とし、分子量分画を行わなかったプロテオグリカン溶液を試料２とした。
【００２２】
（標準品によるプロテオグリカンの検量線作成）
プロテオグリカンの標準品（和光純薬工業製）２ ｍｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製した（Ａ液）。Ａ液５ ｍＬを取り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製したもの、Ａ液２ ｍＬを取り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製したもの及びＡ液をそれぞれ検量線作成用標準液とする。検液及び標準液について０．４５ μｍのメンブレンフィルターを通した後、次の操作条件で液体クロマトグラフィーを行い、得られた検量線からプロテオグリカン量を求めた。なお、標準品：プロテオグリカン,サケ鼻軟骨由来（和光純薬工業製）は、室温減圧デシケーター（シリカゲル）で３時間乾燥してから採取した。
カラム    ：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相    ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量      ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器    ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ  島津製作所社製）  検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ  島津製作所製）
【００２３】
（プロテオグリカンの定量）
試料１の濃縮液を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、１０ ｍＬ容量に調整した。試料２は、５ ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、１０ ｍＬ容量に調製し、各々０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム    ：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相    ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量      ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器    ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ  島津製作所社製）  検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ  島津製作所製）
【００２４】
（試験結果）
試料１と試料２を比較すると（図１）、分子量分画を行った試料１はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができた。また、標準品の検量線は図２のようになり、この検量線を利用して試料１のプロテオグリカンを定量すると図５の結果となった。
【００２５】
実施例２：プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末中のプロテオグリカンの定量
【００２６】
（比色試薬の調製）
１，９−ジメチルメチレンブルー１６ ｍｇをエタノール５ ｍＬ、２ ｍＬのＴｗｅｅｎ２０に溶かし、これをギ酸２ ｍＬ、ギ酸ナトリウム２ ｇを加えた後、さらに精製水を加え１０００ ｍＬにメスアップし比色溶液を調整した。
【００２７】
（プロテオグリカンの定量）
実施例１で得た試料１の１ｍＬ溶液に対し、調製した比色溶液５ ｍＬを加え、攪拌しこの溶液の５２３ ｎｍの吸光度を測定した。プロテオグリカン標準液は、標準品：プロテオグリカン,サケ鼻軟骨由来（和光純薬工業製）５ ｍｇを精密に量り、精製水を加えて５０ ｍＬ容量に調製した。適宜希釈し、０ μｇ/ｍＬ、５ μｇ/ｍＬ、１０ μｇ/ｍＬ、２０ μｇ/ｍＬ、４０ μｇ/ｍＬに調製した。各標準液１ｍＬ溶液に対し、調製した比色溶液５ｍＬを加え、攪拌しこの溶液の５２３ ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】
（試験結果）
標準品の検量線は図３のようになり、この検量線を利用して試料１のプロテオグリカンを定量すると図５の結果となり、実施例１による結果とほぼ一致し、前記の比色溶液によりプロテオグリカンが定量可能であることを確認した。
【００２９】
実施例３：プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末中のプロテオグリカンの定量
【００３０】
（比色試薬の調製）
Ａ：ホウ砂１．９０６８５ ｇを適量の精製水に加温溶解し、硫酸を加えながらｐＨ  ８．４に調製後、２０ ｍＬ容量に調製し１ Ｍホウ酸緩衝液を調製した。
Ｂ：スルファミン酸アンモニウム４．５６４８ ｇを１０ ｍＬの精製水に溶解し、４ Ｍスルファミン酸溶液を調製した。
Ｃ：カルバゾール２０ ｍｇをエタノール１０ ｍＬに溶解し、０．２％カルバゾール溶液を調製した。
【００３１】
（プロテオグリカンの定量）
共栓試験管に実施例１で得た試料１の０．８ ｍＬと１Ｍホウ酸緩衝液０．１ ｍＬと４ Ｍスルファミン酸０．１ ｍＬを加えて十分に混合した後、氷水中で５ ｍＬ濃硫酸を加えた。次に０．２％カルバゾール溶液０．２ ｍＬを加えて十分に混合した後、１００℃で１０分間加熱した。加熱後、室温まで冷却し、５２５ ｎｍの吸光度を測定した。同時に標準品のプロテオグリカン,サケ鼻軟骨由来（和光純薬工業製）２ ｍｇを精密に量り、精製水を加えて１０ ｍＬ容量に調製した（２００ μｇ/ｍＬ）。適宜希釈し、５０ μｇ/ｍＬ、１００ μｇ/ｍＬに調製した。各標準液０．８ ｍＬと１ Ｍホウ酸緩衝液０．１ ｍＬと４Ｍスルファミン酸０．１ ｍＬを加えて十分に混合した後、氷水中で５ ｍＬ濃硫酸を加えた。次に０．２％カルバゾール溶液０．２ ｍＬを加えて十分に混合した後、１００℃で１０分間加熱した。加熱後、室温まで冷却し、５２５ ｎｍの吸光度を測定した。
【００３２】
（試験結果）
標準品の検量線は図４のようになり、この検量線を利用して試料１のプロテオグリカンを定量すると図５の結果となり、実施例１、実施例２による結果とほぼ一致し、前記の比色溶液によりプロテオグリカンが定量可能であることを確認した。
【００３３】
実施例４：食品組成物中のプロテオグリカン定量
【００３４】
（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
ソフトカプセル（プロテオグリカン２０ μｇ／粒配合、甘草抽出物、及びトリグリセリド配合品）１粒を解体し、内容物をクロロホルム１０ ｍＬで抽出した。次に５％エタノール溶液２０ ｍＬを加えて、振とう抽出した後、上清を回収した。さらに５％エタノール溶液２０ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を５回行った。得られた上清液をろ過し、濃縮乾固により有機溶媒を除去した。乾固物に精製水を加えてプロテオグリカン含有抽出液１００ ｇを得た。
【００３５】
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５  Ｔｕｒｂｏ  ＭＷＣＯ  １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離した。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料３とした。
【００３６】
（プロテオグリカンの定量）
試料３の１ ｍＬ溶液に対し、実施例２で調製した溶液と同様の比色溶液５ ｍＬを加え、攪拌しこの溶液の５２３ ｎｍの吸光度を測定した。
【００３７】
（試験結果）
試料３のプロテオグリカン量を算出し、１９．３μｇ/粒の結果となり、食品組成物中のプロテオグリカン定量も可能となったことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、簡単で正確なプロテオグリカンの定量方法、さらに安価な比色試薬キットを提供することで、プロテオグリカンを高含有する製造方法への利用、日常的な品質管理業務等産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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