(57)【要約】【構成】本発明は、スクリーニングの新規な手法を用いる患者特異的抗ガン抗体の産生方法に関する。指標としてガン細胞傷害作用を用いて抗ガン抗体を分離することによって、この工程は、治療及び診断の目的のために用いられることができる個別の患者のために作製された抗ガン抗体の産生を可能にする。さらに、本発明は抗体を産生する工程と、その使用方法に関する。その抗体は、特定の患者由来の１つの腫瘍に対して特異的に作製することができ、それらのガン細胞への細胞傷害性と同時に非ガン細胞への非傷害性に基づいて選択される。その抗体は、ガンの病期と診断の目的のために用いることができ、腫瘍転移を治療するのに利用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン疾患を治療するのに有効な患者特異的抗ガン抗体の産生方法であって、特定の個体から組織サンプルを得ることと、前記組織サンプルの細胞に対する抗体を製造することと、ガン細胞に対して細胞傷害の強度を示す抗体のサブセットを産生するために設計された細胞傷害評価を前記製造された抗体に対して行うこととを含み、前記抗体のサブセットが、ガン細胞に対して細胞傷害を有し正常細胞に対して比較的良性であると特徴づけられる患者特異的抗ガン抗体のグループを決定することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法に従って産生されたことを特徴とする患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項３】
前記抗体の細胞傷害が、抗体依存性細胞傷害作用を介して媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項４】
前記抗体の細胞傷害が、補体依存性細胞傷害作用を介して媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項５】
前記抗体の細胞傷害が、細胞性化学結合の加水分解の触媒作用を介して媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項６】
前記抗体の細胞傷害が、腫瘍細胞にある特定のガン抗原に対して免疫応答を誘導することによって媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項７】
前記抗体の細胞傷害は、それらの機能を妨げるため細胞膜タンパク質の標的を介して媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項８】
前記抗体の細胞傷害は、細胞殺傷を開始するシグナルを誘導するのに有効な細胞性タンパク質における構造変化の産物を介して媒介されることを特徴とする請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体又はフラグメント。
【請求項９】
ガン疾患を患っている患者の治療方法であって、前記患者に請求項２記載の患者特異的抗ガン抗体を投与することを含み、前記抗ガン抗体は、薬学的に受容可能なアジュバントを有する混合剤中に存在し、前記ガン疾患の治療を媒介する有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記患者特異的抗ガン抗体が、ヒト化された抗体であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ガン疾患を患っている患者の治療方法であって、請求項２記載の前記患者特異的抗ガン抗体を、毒素，酵素，放射性化合物，及び造血性細胞からなるグループから選ばれた一部と結合することと、結合した抗体を前記患者に投与することを含み、前記抗ガン抗体は、薬学的に受容可能なアジュバントを有する混合剤中に存在し、前記ガン疾患の治療を媒介する有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記患者特異的抗ガン抗体が、ヒト化された抗体であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療及び診断の目的のために使用することができる個々の患者のために特注生産された抗ガン抗体の産生に関する。本発明は、さらに前記抗体の製造工程及びその使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
ガンの症状を示す各個人は独特であって、その個人の個性が異なっているのと同様に他のガンとは異なるガンを有する。これにもかかわらず、現在の治療は、同じ段階にある同じタイプのガンを有する、すべての患者を同じ方法で治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、最初に行うべき治療で失敗し、その結果さらに複数の治療が必要となり、治療不全，転移，最終的には死の可能性が増加する。優れた治療手段は、特定の個人のために療法をオーダーメイドすることである。現在、オーダーメイドに適している唯一の療法は、手術療法である。化学療法と放射線療法を患者に合わせて適応させることができず、そして、多くの場合、手術療法だけでは治療を進めていく上で不十分である。
【０００３】
モノクローナル抗体の出現によって、各抗体が単一のエピトープを認識することができるので、特注生産された治療法を開発する可能性は、より現実的になった。さらに、特定の個人の腫瘍を一意的に決定する一連のエピトープを認識する抗体の組み合わせを作製することが可能である。
【０００４】
ガン細胞と正常細胞の間の顕著な相違が、ガン化する細胞に特定の抗原をガン細胞が包含するということが認識されたので、科学界では、長い間、モノクローナル抗体を特にこれらのガン抗原に結合させることによってガン化する細胞を特異的に標的とするように設計できると考えられている。したがってガン細胞を排除するために、モノクローナル抗体が「特効薬」として役立つものと確信されている。
【０００５】
しかしながら、現在のところ通常、ガン患者には、治療の選択権がほとんどない。ガン治療の厳格に管理された方法は、世界的な生存率と疾病率の向上をもたらしている。しかしながら、特定の個人にとっては、これらの統計学上の進歩は、必ずしもそれらの個人的な状況における改善と関連するというわけではない。
【０００６】
したがって、医者が同じ集団内の他の患者と関係なくそれぞれの腫瘍ごとに治療することが可能な方法論が提案された場合、ただその１人の人に適合した他とは異なる治療手段が可能になる。このような治療法は、理想的に治癒率の向上と、そして、最良の結果をもたらし、その結果長年の必要性を満たすであろう。
【０００７】
歴史的に、ポリクローナル抗体は、ヒトのガン治療において大した成果もないまま使用されてきた。リンパ腫と白血病がヒト血漿で治療されていたが、寛解の持続あるいは反応がほとんどなかった。さらに、再現性に欠け、そして、化学療法と比べて特別な便益がなかった。例えば乳ガン，メラノーマ，及び腎細胞ガンなどの固形腫瘍に対しても、ヒト血液，チンパンジー血清，ヒト血漿，及びウマ血清を用いて治療されたが、同様に再現性に欠けそして効果のある結果は得られなかった。
【０００８】
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の多くの臨床試験が行われてきた。１９８０年代に、特異性抗原に対して、又は組織選択性に基づいて抗体を用いる少なくとも４７人の患者からただ１人の応答者を出したヒト乳ガンに対する少なくとも４つの臨床試験があった。１９９８年に初めて、シスプラチンと組み合わせてヒト化された抗Ｈｅｒ−２抗体を使用する成功した臨床試験があった。この臨床試験では、３７人の患者に対して反応性試験が行われ、その内の約４分の１に部分応答率があり、そして残りの半数に軽度の又は着実な病気進行があった。
【０００９】
結腸直腸ガンを調査する臨床試験では、糖タンパク質と糖脂質の標的の両方に対する抗体を必要とする。部分応答を有する１人の患者を合わせて６０人以上の患者を対象に、悪性腺腫に対していくつかの特異性を有する例えば１７−１Ａなどの抗体に対してPhase２の臨床試験が行われた。別の臨床試験において、１７−１Ａの使用は、さらにシクロホスファミドを使用するプロトコールにおいて５２人の患者の中で、１人の完全寛解と２人の軽度の寛解のみをもたらした。１７−１Ａを含む別の試験でも同様の結果が得られた。造影剤として初めに認可されたヒト化されたマウスのモノクローナル抗体の使用でも腫瘍の緩解が起きなかった。これまで結腸直腸ガンに有効な抗体がなかった。同様に、肺ガン，脳腫瘍，卵巣ガン，膵臓ガン，前立腺ガン，及び胃ガンに対して一様にほとんど結果がなかった。メラノーマに対する抗ＧＤ３モノクローナル抗体の使用では、ある程度の成果があった。したがって、ヒトの臨床試験の前提条件である動物実験では成功していたにもかかわらず、臨床試験された抗体にはほとんど効力がないことを見ることができる。
【００１０】
優先特許
米国特許第５，７５０，１０２号には、患者の腫瘍からの細胞が、その患者の細胞又は組織からクローニングされたＭＨＣ遺伝子を用いて形質導入される工程が開示されている。そして、これらの形質導入された細胞は、その後患者にワクチン接種するのに用いられる。
【００１１】
米国特許第４，８６１，５８１号には、哺乳動物の腫瘍性細胞及び正常細胞の細胞外成分ではなく細胞内成分に特異的なモノクローナル抗体を得るステップと、前記モノクローナル抗体を標識化するステップと、標識化された前記抗体を腫瘍性細胞を殺傷する治療を受けた哺乳動物の組織と接触させるステップと、悪化した腫瘍性細胞の細胞内成分に標識化した前記抗体の結合を測定することによって、治療効果を測定するステップと、から構成される工程が開示されている。ヒト細胞内抗原に対する抗体を調整する際に、特許権所有者は悪性細胞がそのような抗原の格好の発生源に相当することを認識している。
【００１２】
米国特許第５，１７１，６６５号は、新規な抗体及びその産生のための方法を提供している。特に、この特許は、例えば、結腸と肺にあるヒト腫瘍と関連するタンパク質抗原に強く結合する、一方正常細胞にほとんど結合しない特性を有するモノクローナル抗体の組成物を教示している。
【００１３】
米国特許第５,４８４,５９６号は、ヒトのガン患者から腫瘍組織を手術により切除することと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処理することと、生存可能だが非腫瘍形成にするために腫瘍細胞を放射線処理することと、初期の腫瘍の再発を抑制する一方、同時に転移を抑制することができるワクチンを患者に準備するためにこれらの細胞を使用することと、から構成されるガンの治療方法を提供している。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原で反応するモノクローナル抗体の開発を教示している。４欄の４５行参照に記載されるように、特許権所有者はヒト腫瘍症に有効な特定免疫療法を示すモノクローナル抗体の開発において自発腫瘍細胞を利用する。
【００１４】
米国特許第５,６９３,７６３号は、ヒトガン腫の糖タンパク質抗原の特性と、初期の上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原の特性を教示している。
【００１５】
米国特許第５,７８３,１８６号には、Ｈｅｒ２発現細胞にアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体，抗体を産生するハイブリドーマ細胞株，前記抗体を用いるガンの治療法，及び前記抗体を含む薬剤組成が記載されている。
【００１６】
米国特許第５,８４９,８７６号には、腫瘍と非腫瘍組織源から精製されるムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生に適した新規なハイブリドーマ細胞株について記載されている。
【００１７】
米国特許第５,８６９,２６８号には、好ましい抗原に特異的な抗体を産生するヒトリンパ球の産生方法，モノクローナル抗体の産生方法，同様に前記方法によって産生されたモノクローナル抗体が記載されている。特にこの特許は、ガンの診断と治療に役立つ抗ＨＤヒトモノクローナル抗体の産生について説明されている。
【００１８】
米国特許第５,８６９,０４５号は、ヒトのガン細胞に反応する抗体、抗体フラグメント、結合型抗体、および単鎖免疫毒素に関する。その分子群がヒトのガン腫の表面に存在する細胞膜抗原と反応するという点、そしてさらにその抗体がガン腫細胞の中に内在化する能力を有し、結合後、抗体薬と抗体毒素とを結合形成するのに特に有用である点において、これらの抗体の機能が２倍化されるメカニズムである。その非変形形態において、その抗体は特定の濃度で細胞傷害の特性も示す。
【００１９】
米国特許第５,７８０,０３３号には、腫瘍治療と予防のために自己抗体産生を使用することがが開示されている。しかしながら、この抗体は老齢の哺乳動物から得られる抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫システムで見られる１つのタイプの自然抗体であると言われる。自己抗体が「老齢の哺乳動物」から得られるので、自己抗体が実際に治療された患者から入手するという必要性はない。さらに、この特許には、老齢の哺乳動物から得られる天然抗核自己抗体とモノクローナル抗核自己抗体、及びモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が開示されている。
【００２０】
本発明の要約
本出願は、新規なスクリーニング手法を用いることで患者に特異的な抗ガン抗体を産生する方法を教示する。これらの抗体は、特に１つの腫瘍のために作製され、その結果、ガン治療のオーダーメイドを可能にする。本出願の明細書の中で、細胞死（細胞傷害）又は細胞増殖抑制（細胞成長抑止）の特性のどちらかを有する抗ガン抗体を以後、細胞傷害と称す。これらの抗体は、ガンの病期と診断の目的で使用でき、そして腫瘍転移を治療するのに用いることができる。
【００２１】
個別化抗ガン療法の将来の進展は、患者の治療方法において変化をもたらすであろう。考え得る臨床計画は、症状が現れた時点で腫瘍サンプルを入手し、保存することである。既存の抗ガン抗体のパネルからこの腫瘍サンプルを分類することができる。従来通りに病状で患者を分けるであろうが、さらに患者を病状別に分ける際に、入手可能な抗体を利用することができる。既存の抗体で患者を即座に治療することができ、そして、ここで概説される方法を使用することだけでなく、又はここで開示されるスクリーニング法と共にファージディスプレイライブラリーの使用によってもその腫瘍に特異的な抗体のパネルを作製することが可能である。別の腫瘍が治療されるものと同じいくつかのエピトープを生み出す可能性があるので、産生された全抗体は抗ガン抗体のライブラリーに加えられるであろう。
【００２２】
抗ガン抗体に加えて、患者は、多様な治療の処方計画の一端として現在推奨される療法を受けることを選択できる。現在の方法論によって単離された抗体が非ガン細胞に比較的無毒性であるという事実は、高用量の抗体の組み合わせを単独か、又は従来の治療と合わせて使用するのを可能にする。また、高い治療係数は、治療抵抗性細胞の出現の可能性を減少させる短期間での再治療を可能にするであろう。
【００２３】
患者が治療の初期段階で難治性であるか又は転移が進行する場合、再治療のために、腫瘍に対して特異的な抗体を産生する工程を繰り返し行うことが可能である。さらに、抗ガン抗体は、患者から得られる赤血球と結合することができ、そして転移治療のために再注入することが可能である。転移ガンのための有効な治療は今までほとんどなく、そして転移は通常、死をもたらす最悪な結果の前兆となる。しかしながら、転移ガンは通常よく血管新生され、そして、赤血球による抗ガン抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を集積させる効果を有することができる。転移の前でさえ、ほとんどのガン細胞は生存のため宿主からの血液供給に依存し、そして、赤血球と結合した抗ガン抗体は生体内（in situ）の腫瘍に対しても有効である。また、その抗体は、例えばリンパ球，マクロファージ，単球，ナチュラルキラー細胞などの他の造血性細胞と結合してもよい。
【００２４】
５クラスの抗体があり、そして、各々はその重鎖によって与えられる機能と関連している。一般に、裸の抗体によって殺されるガン細胞は、抗体依存性細胞傷害作用又は補体依存性細胞傷害作用のどちらかを介して媒介されると考えられる。例えば、マウスのＩｇＭ抗体とＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分を結合することによりヒト補体を活性化することができ、その結果腫瘍溶解を引き起こすことができる補体活性化の古典的経路を活性化する。ヒト抗体に関して、抗体を活性化する最も効果的な補体は、一般にＩｇＭとＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａとＩｇＧ３アイソタイプのマウスの抗体は、単球，マクロファージ，顆粒球及びあるリンパ球によって細胞殺傷を引き起こすＦｃレセプターを有する細胞傷害細胞を強化するのに有効である。ＩｇＧ１とＩｇＧ３アイソタイプの両方のヒト抗体はＡＤＣＣを媒介する。
【００２５】
抗体媒介性ガン殺傷の考えられる別のメカニズムは、その細胞膜とそれに結合した糖タンパク質か糖脂質において、様々な化学結合の加水分解を触媒するために機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介すかもしれない。
【００２６】
一般に、広く知られているガン細胞の殺傷を媒介する抗体の２つの別のメカニズムがある。第１は、腫瘍細胞上に存在する推定のガン抗原に対して免疫反応の産生を体に引き起こすワクチンとしての抗体の使用である。第２は、成長受容体（growth receptors）を標的とし、それらの機能を阻害するため、又は、事実上その機能を失わせるようにその受容体をダウンレギュレイトするための抗体の使用である。
【００２７】
従って、本発明の目的は、ガン細胞に対して細胞傷害があり、一方同時に非ガン細胞に対して比較的無毒性である特定の個人由来の細胞から抗ガン抗体を産生する方法を教示することである。
【００２８】
また、本発明の目的は、新規の抗ガン抗体を産生することである。
【００２９】
さらに、本発明の目的は、細胞傷害が抗体依存性細胞傷害作用によって媒介される抗ガン抗体を産生することである。
【００３０】
また、本発明の目的は、細胞傷害が細胞間化学結合の加水分解を触媒可能な機能を有する抗ガン抗体を産生することである。
【００３１】
さらに、本発明のさらなる目的は、腫瘍細胞上に存在する推定のガン抗原に対して免疫反応を誘導するためのワクチンとして有効な抗ガン抗体を産生することである。
【００３２】
また、本発明のさらなる目的は、例えば成長受容体（growth receptors），細胞膜ポンプ，及び細胞接着タンパク質などの細胞膜タンパク質を標的とし、その結果、それらの機能を阻害するか又はダウンレギュレイトする抗体の使用である。
【００３３】
さらに、本発明のさらなる目的は、細胞殺傷を開始するためにシグナルが変換されるので細胞性タンパク質において、細胞殺傷力が構造変化を作用する能力を有する抗ガン抗体の産生である。
【００３４】
また、本発明のさらなる目的は、例えば、治療用途のための任意の適当な抗体が患者サンプルに含まれるかどうか決定するために患者サンプルを検査する治療用の抗ガン抗体パネルの生産など、ガン腫の診断，予後診断，及びモニタリングに有効な抗ガン抗体を産生することである。
【００３５】
さらに、本発明の別の目的は、本発明の工程によって産生される抗ガン抗体を用いて発見されることができるガンの進行と関連する新規の抗原を生産することである。これらの抗原は、一般にゲノムデータがある場合、それらは炭水化物や脂質やその組み合わせから生産されてもよく、タンパク質に限定されるわけではない。
【００３６】
本発明のその他の目的と優位性が以下の記述で明らかになるだろう、なお説明と例示の目的で本発明のある実施例を示す。
【００３７】
【本発明の詳細な説明】
本発明のある形態を説明するが、ここで記載され示された特定形態や変形例に限定されるものではないことが理解できるであろう。種々の変形は本発明の範囲から逸脱することなしに作製されてもよいことは当業者に明らかであり、本発明は明細書に示され、記載されるものに限定されるものではない。
【００３８】
ガン治療に関するモノクローナル抗体の潜在的利益の１つは、単一の抗原を特異的に認識する能力である。いくつかの例では、ガン細胞は、変異した細胞に特異的である抗原を有していると考えられていた。現在、ガン細胞は独自の抗原をほとんど持たず、むしろ、正常抗原を過剰発現するか、又は胎児抗原を発現する傾向があるとより強く信じられている。それにもかかわらず、モノクローナル抗体の使用は、抗体の再現可能な投与量をポリクローナル抗体より良い応答率が期待される患者に送達する方法を提供した。
【００３９】
コーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）によって提唱された基礎的原理によって、従来からモノクローナル抗体が産生されていた。アジュバントのあるなしにかかわらず、マウスを抗原によって免疫化した。不死化されたハイブリドーマのパートナーとの融合のために、脾臓から脾細胞を採取する。細胞培養に使用される上清に抗体を分泌することが可能なマイクロタイタープレートに、この脾細胞を蒔く。通常、対象の抗体を産生するハイブリドーマが蒔かれているそれらから選別するために、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着検定法、Enzyme Linked Immunosorbent Assay）によってハイブリドーマ上清の抗原抗体結合性を検査する。この原理は、対象のハイブリドーマを含むウェルがテスト抗原、たいていは免疫抗原に非常に強く結合する抗体を含むということである。その後、モノクローナルハイブリドーマを産生するために限界希釈法によってこれらのウェルをサブクローンする。対象のクローンのための選別が、抗体結合性を検査するためＥＬＩＳＡ法を用いて繰り返される。したがって、増殖するその成分は、モノクローナル抗体の産生において、最も強く結合する抗体を産生するハイブリドーマが、最初に産生された全ハイブリドーマの中から選別されるものである。すなわち、好ましい抗体は、対象の抗原に非常に高い親和性を有するものである。
【００４０】
例えば免疫化のために細胞全体（whole cells）を使用するなど、この手順の多くの改良があった。この方法において、精製された抗原を使用する代わりに、細胞全体（whole cells）が免疫化に使用される。別の改良は、スクリーニングのためにセルラーＥＬＩＳＡを用いることである。この方法において、ＥＬＩＳＡの標的として精製された抗原を使用する代わりに、固定された細胞が使用される。また、ＥＬＩＳＡ法に加えて、補体媒介性細胞傷害評価法がスクリーニング工程で使用された。しかしながら、抗体結合評価法は、細胞傷害試験と併せて使用された。このように、多くの改良にもかかわらず、モノクローナル抗体の産生工程は、指標としてテスト抗原と結合する抗体に依存する。
【００４１】
上記で述べられた従来の方法を用いて、ガン細胞に対するほとんどの抗体が産生されている。これらの抗体は、治療と診断の両方で使用されている。一般に、これらの双方の適用に対して、その抗体はガンの部位にペイロードを送達するターゲティング剤として使用されている。これらの抗体結合体は、放射化され，毒性化され，又は酵素やビオチンなど薬剤を体にさらに送達するため媒介剤として働くこともできる。さらに最近まで、裸の抗体が生体内（in vivo）でほとんど効果がないと広く考えられていた。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮとＲＩＴＵＸＩＭＡＢの両方は、ＦＤＡによってヒトへの使用が最近承認されたヒト化されたマウスモノクローナル抗体である。しかしながら、これらの両方の抗体は、抗体結合性を分析することによって最初に作製され、そして、それらの直接的な細胞傷害はハイブリドーマ産生過程での本来の目的ではなかった。したがって、腫瘍細胞殺傷を発生させるこれらの抗体のあらゆる特性は意図されたものではなく偶然によるものである。
【００４２】
モノクローナル抗体の産生が様々な応用のために細胞全体（whole cells）の免疫を用いて行われてきたが、これらのハイブリドーマのスクリーニングは、推定又は同定された標的抗原のどちらかに依存しているか、又はハイブリドーマの組織特異的な選択性に依存している。最良の抗体が最も高い結合定数を有するものであることは自明である。この概念は、最も高い結合定数を有する酵素が反応を触媒するのに最も効果的であるという基本的な生化学の原理から考え出された。この概念は、最大の親和性を有する受容体に結合する薬物分子がシグナルを開始か抑制するのに通常高い確率を有する受容体リガンド結合に適用される。しかしながら、ある状況においてシグナルの開始か抑制が非受容体結合を介して媒介されるかもしれない場合がありうるので、常にこの場合にあてはまるとは限らない。リガンド結合性によって誘導された構造変化により伝達される情報は、例えばシグナル変換，エンドサイトーシス，その他様々な多くの結果をもたらす。受容体分子の中で構造変化を誘発する能力は、必ずしもリガンド受容体ポケットへの結合性を必要としないが、別の細胞外ドメインの結合を介して、又は多価リガンドによって誘導された受容体のクラスター形成によって生じる可能性がある。
【００４３】
細胞殺傷を誘発する抗体の産生には、非常に良く結合する抗体のハイブリドーマのスクリーニングが含意されなくてもよい。むしろ、モノクローナル抗体を産生する人々によって推奨されるわけではないが、細胞殺傷か、又はガン細胞の成長を停止させるためのハイブリドーマ上清のスクリーニングは、細胞傷害又は細胞増殖抑制性の抗体産生のための望ましい指標として選定されるであろう。生体内（in vivo）の抗体がＦｃ部を通じてそれらの機能を媒介し、治療上の抗体の有用性は定常領域か付属的な一部分の機能性によって決まるということがよく理解されるであろう。この場合、抗体の抗原結合部分であるＦａｂ部はその特異性を、そして、Ｆｃ部はその機能性を抗体に与えるであろう。抗体の抗原結合部位は、天然のコンビナトリアルライブラリーの産物であると考えられる。抗体可変部の再編成の結果は、その産出物がペプチドである分子コンビナトリアルライブラリーであると考えられる。したがって、このコンビナトリアルライブラリーのサンプリングは、あらゆるパラメータの基となるだろう。抗生物質の天然化合物ライブラリーをサンプリングするように、細胞傷害性の化合物又は細胞増殖抑制性の化合物の抗体ライブラリーをサンプリングすることが可能である。
【００４４】
スクリーニングにおける様々な指標は、互いと区別されなければならない。例えば、細胞への抗体結合の相違は細胞殺傷性から明確である。細胞殺傷（細胞傷害）は、例えば腫瘍症やアポトーシスなどの細胞死のメカニズムと異なっている。細胞死に達するまでには多くの過程があり、これらのいくつかは腫瘍症かアポトーシスのどちらかを誘発することができる。腫瘍症かアポトーシス以外の他の細胞死メカニズムがあると推測されるが、細胞がどのように死にいたるのかにかかわらず、細胞死にはいくつかの共通点がある。これらの一つは代謝の欠如であり、そしてもう一つは酵素の変性である。どちらの場合においても、生体染色法ではこれらの細胞を染色しないであろう。細胞死のこれらの指標は、長い間をかけて研究され、そして細胞死メカニズムの現在の解明につながっている。さらに、細胞が殺される細胞傷害効果と、細胞の増殖が抑制される細胞増殖抑制性効果には違いがある。
【００４５】
本発明の好適な実施例において、分析法は、指標としてのガン細胞に対する細胞傷害活性に注目することによって実施される。好適な実施例において、生／死分析キット、例えばモレキュラー  プローブス社によるＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存／細胞傷害分析キット（Ｌ−３２２４）が利用されている。このモレキュラー  プローブス社のキットは、細胞生存率の２つの規定パラメータである細胞内エステラーゼ活性と原形質膜の完全性とを測定する２つの試験で生死細胞の同時定量法に基づく二色蛍光細胞生存率分析を提供する。分析法の原理は、一般的であり、接着細胞とある種の組織を含むほとんどの真核生物細胞タイプに適用可能であるが、細菌や酵母では適用できない。細胞生存率を評価するこの蛍光法は、細胞生存率と細胞傷害を決定するためのトリパンブルー排除法、Ｃｒ放出法、および同様の方法のような分析評価の代わりに好んで使用される。
【００４６】
この分析法の実施において、生細胞は、遍在する細胞内エステラーゼ活性の存在によって認識され、非蛍光細胞浸透性のＣＡＬＣＥＩＮ−ＡＭから非常に強い蛍光を示すＣＡＬＣＥＩＮへの酵素変換によって視覚的に測定される。陰イオン性染色ＣＡＬＣＥＩＮは、生細胞内でよく保持され、生細胞における強い一定の緑色の蛍光を発色する（ex／em〜４９５ｎｍ〜５１５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は、損傷膜のある細胞に入り、核酸に結合すると蛍光の４０倍増進を受けて、その結果、死細胞（ex／em〜４９５ｎｍ〜６３５ｎｍ）の中で明るい赤色の蛍光を発色する。ＥｔｈＤ−１は、生細胞の完全な原形質膜からは排除される。細胞生存率の決定は、細胞の物理的及び生化学的な特性に依存する。これらの細胞の特性に影響しない細胞傷害の場合は、この方法を使用することで正確に評価されないかもしれない。色素が細胞と結合する前は、実際には非蛍光であるので、バックグラウンドの蛍光レベルがこの分析技術上、本質的に低いためである。
【００４７】
スクリーニングの様々な指標に加えて、スクリーニング工程の別の２つの主要な特性がある。抗体遺伝子産物のライブラリーは、ランダムなライブラリーではなく、偏った工程の産物である。以下の実施例において、この偏りは、固定細胞で免疫化されたマウスによって産生される。これは、標的抗原を結合する可能性のある抗体の比率を増加させる。免疫化は、より高親和性の抗体（親和性成熟）を産生する方法として考えられるが、今回はそうではない。むしろ、標的に対して抗原結合部位の組み合わせを変化させる方法として考えることができる。これもまた重鎖の定常領域によって決定されるように、初期のＩｇＭアイソタイプからＩｇＧなどの別のアイソタイプへ変化する機能性、つまりアイソタイプスイッチングの概念と異なる。
【００４８】
スクリーニングの過程において重要である第３の主要な特性は、マルチターゲットスクリーニングの使用である。ある程度まで特異性は、親和性と関係する。この例は、抗原が非常に限定された組織に分布し、抗体の親和性は、親和性が高ければ高いほど組織特異性が上がり、さらに対象の組織以外の組織と結合する親和性が低くなるという抗体の特異性の重要な要因であるという状況である。したがって、特異性の問題を扱うために、抗体は同時に、様々な細胞に対してスクリーニングされる。下記の実施例において、ハイブリドーマ上清（モノクローナル抗体開発の初期の段階を表す）は、活性と同様に特異性を決定するため多数の細胞株に対して検査される。
【００４９】
抗体は、患者のガンの治療処理のために設計される。観念的に、その抗体は裸の抗体であってもよい。それらは毒素と結合することもできる。ビオチン酵素結合体などの他の分子群をガンへの標的とするのにそれらを用いてもよい。また、放射性化合物もまた結合体として使用可能である。
【００５０】
その抗体を、断片化してもよく、分子的に再編成してもよい。例えばＦｖフラグメント，ｓＦｖ単鎖Ｆｖフラグメント，ディアボディイズ（diabodies）などを作製できる。
【００５１】
これらの抗体類は、診断，予後診断，ガンのモニタリングに使用することが想定される。例えば、ＥＬＩＳＡ法，迅速試験パネル形式分析評価などの異なった形式において、患者は、これらの抗体によって検出することができる採取された腫瘍抗原に対する血液サンプルを持つことができる。診断の目的のために腫瘍生検を染色するのに抗体を用いることができる。さらに、治療用途のために任意の適当な抗体があるかどうか決定するために、患者サンプルを検査するのに治療抗体のパネルを使用することができる。
【００５２】
【実施例】
実施例１
腫瘍サンプルに特異的なモノクローナル抗体を産生するための適切なハイブリドーマウェルの選択方法は、偽陽性シグナルを作り出すウェルを選択する蓋然性により難しくなる。すなわち、ガン細胞と同様に正常細胞に対して反応する抗体を産生するという可能性がある。この可能性を未然に防ぐための１つの方法は、選択過程から抗正常抗原抗体をマスクすることである。これは、スクリーニングの第一段階で抗正常抗体を取り除くことによって達成することができ、その結果好ましい抗体の存在を明らかする。その後の限界希釈クローニングは、コントロール細胞を殺さないが、標的ガン細胞殺傷を誘発するクローンを分けることができる。
【００５３】
乳房、メラノーマ、および肺腫瘍の生検サンプルを入手し、使用するまで−７０℃にて保管した。単細胞浮遊液を準備し、−３０℃、７０％エタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄し、そして注射用の適切な容器に移した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２．５×１０5−１×１０6細胞で免疫化し、脾臓摘出術の三日前に最終事前融合追加免疫が行われるまで３週間おきに追加免疫した。Ｓｐ２／０及びＮＳ１ミエローマパートナーと共に単離された脾細胞を融合することにより、ハイブリドーマを調製した。ハイブリドーマのサブクローニングのために、融合からの上清を検査した。細胞（例えばＡ２０５８メラノーマ細胞，ＣＣＤ−１２ＣｏＮ線維芽細胞，ＭＣＦ−１２Ａ乳房細胞を含んでいる)を、ＡＴＣＣから入手し、同封の指示に従って培養した。ＨＥＹ細胞株は、インカ  ブロックハウゼン（Inka  Brockhauscn）博士から寄贈された。非ガン細胞、例えばＣＣＤ−１２ＣｏＮ線維芽細胞とＭＣＦ−１２Ａ乳房細胞を、スクリーニングの１〜２週間前に９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）に蒔いた。ガン細胞、例えばＨＥＹ，Ａ２０５８，ＢＴ４８３，及びＨＳ２９４ｔを、スクリーニングの２日か３日前に蒔いた。
【００５４】
使用の前に、蒔かれた正常細胞を固定した。そのプレートを、室温で１０分間１００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄し、次に、吸引乾燥した。ＰＢＳで希釈した０．０１パーセントのグルタルアルデヒドの７５マイクロリットルを各ウェルに添加し、５分間置いて、次に、吸引した。そのプレートを、室温で３回１００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄した。そのウェルを空にし、そして、１パーセントのヒト血清アルブミンの入った１００マイクロリットルのＰＢＳを、各ウェルに添加して、室温で１時間放置した。そして、そのプレートを４℃で保存した。
【００５５】
ハイブリドーマプレートから上清を移す前に、固定された正常細胞を室温で３回１００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄した。初期のハイブリドーマ培養上清の吸引されたそのマイクロリットルを固定して細胞プレートに移した後、８パーセントのＣＯ2インキュベーターで３７℃２時間培養した。メラノーマから得られたハイブリドーマ上清を、ＣＣＤ−１２ＣｏＮ細胞で培養し、そして、乳ガンから得られたハイブリドーマ上清を、ＭＣＦ−１２Ａ細胞で培養した。培養後、吸収された上清を、２つの７５マイクロリットル部分に分け、ガン細胞プレートを標的とするために移した。移す前に、ガン細胞プレートを３回１００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄した。ＣＣＤ−１２ＣｏＮ細胞からの上清をＡ２０５８及びＨＳ２９４ｔ細胞に移し、一方ＭＣＦ−１２Ａ細胞からの上清をＨＥＹ及びＢＴ４８３細胞に移した。ガン細胞を、３７℃１８時間８パーセントのＣＯ2インキュベーターで、ハイブリドーマ上清と共に培養した。
【００５６】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ細胞傷害分析を、モレキュラー  プローブ社（ユージーン、オレゴン州）から入手した。下記で概説されている変更点と共に、メーカーの指示に従って分析を行った。細胞のあるプレートを、３７℃で１００マイクロリットルのＰＢＳで一回洗浄した。ハイブリドーママイクロタイタープレートからの７５〜１００マイクロリットルの上清を細胞板に移し、８パーセントのＣＯ2インキュベーターで１８〜２４時間培養した。その後、全て死細胞コントロールとなるウェルが空になるまで吸引し、そして、５０マイクロリットルの７０％エタノールを添加した。次に、そのプレートを逆さにすることによって空にし、吸引紙を用いて乾燥させた。室温でＰＢＳを、多チャンネルスクイーズボトルから各ウェルに分注し、３回採取し、逆さにして空にし、次に、吸引紙を用いて乾燥させた。ＰＢＳで希釈した５０マイクロリットルの蛍光ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素を各ウェルに添加し、５パーセントのＣＯ2インキュベーターで３７℃１時間培養した。そのプレートをパーキン・エルマーのＨＴＳ７０００蛍光プレートリーダーで読み取り、そして、そのデータをマイクロソフトのエクセルで分析した。
【００５７】
単クローンハイブリドーマ培養細胞を作製するために、４回のスクリーニングを行った。２回のスクリーニングの間に、ハイブリドーマ上清をガン細胞に対してだけ検査した。４回目のスクリーニングにおいて、表１で示される標的細胞と同様に多くの非ガン細胞に対してその上清を検査した。市販のアイソタイピングキットを用いて抗体をアイソタイプした。
【００５８】
本発明の方法に従って、多くのモノクローナル抗体を製造した。これらの抗体の特性を表１にまとめ、３ＢＤ−３，３ＢＤ−６，３ＢＤ−８，３ＢＤ−９，３ＢＤ−１５，３ＢＤ−２５，３ＢＤ−２６，及び３ＢＤ−２７として同定した。これらの抗体は、限界希釈クローニングの４回目の後にモノクローナルと見なすことができる。抗メラノーマ抗体は、著しいガン細胞殺傷を誘発しなかった。抗乳ガン抗体のパネルは、標的細胞の３２−８７％、またコントロール細胞の＜１−３％を殺傷した。抗腫瘍性抗体の大部分が糖質抗原に対して向けられ、その結果、ＩｇＭタイプであると予想されたが、主なアイソタイプはＩｇＧ１であった。ほとんどの抗体が細胞死からコントロール細胞に害を与えないので、高い治療係数となる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
実施例２
この実施例において、特注生産された抗ガン抗体は、患者の腫瘍サンプルをまず入手することによって産生される。通常これは、固形腫瘍からの生検標本か、又は造血性腫瘍からの血液サンプルである。このサンプルを、単細胞浮遊液に調製し、注射によってマウスに固定する。免疫スケジュールの終了後に、ハイブリドーマを脾細胞から生産する。標準の細胞傷害定量法において、種々のガン細胞株と正常細胞に対してそのハイブリドーマをスクリーニングする。ガン細胞株に対して反応するが、正常な非形質転換細胞に対して反応しないそのハイブリドーマを、さらに増殖用に選別する。陽性であると考えられるクローンは、選択的にガン細胞を殺すが、非形質転換細胞を殺さないものであった。多数の生化学パラメータに対してその抗体を特徴づけ、その後、治療用途のためにヒト化する。そのメラノーマ腫瘍細胞を単離し、実施例１で説明するように細胞株を培養した。以下のスケジュールに従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化し、０日目に２００，０００細胞を皮下投与及び腹腔内投与し、次に２１日目に２００，０００細胞を腹腔内注射し、次に４９日目に１，０００，０００細胞を注射し、次に１０７日目に完全フロイントアジュバントで１，２５０，０００細胞を腹腔内注射し、次に１２０日目に２００，０００細胞を腹腔内注射し、次に１２３日目にマウスを屠殺する。脾臓を採取し、そして、実施例１で概説される方法を用いながらＳｐ２／０（１ＬＮ）かＮＳ−１（２ＬＮ）のミエローマパートナーと脾細胞を融合するために２つの等分した部分に分けた。
【００６１】
Ａ２０５８メラノーマ細胞とＣＣＤ−１２ＣｏＮ線維芽細胞に対して融合した１１日後に、スクリーニングを行った。各一対のプレートを、室温で１００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄し、次にほとんど乾燥するまで吸引した。その後、５０マイクロリットルのハイブリドーマ上清を、それぞれの２枚のプレートの上にある同じウェルに添加した。使用されたＳｐ２／０の上清を、同じ容量でコントロールウェルに添加し、そして、そのプレートをＣＯ2８％，相対湿度９８％インキュベーターで３７℃約１８時間培養した。次に、各一対のプレートを除去し、そして、陽性コントロールウェルにおいて、５０マイクロリットルの７０％エタノールを４秒間、培地に代用した。次に、そのプレートを逆さにして、室温でＰＢＳで一度洗浄し、乾燥させた。次に、ＰＢＳで希釈された５０μＬの蛍光ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素（モレキュラー  プローブ社ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット）を添加し、１時間放置して、３７℃で培養した。その後、そのプレートを、パーキン・エルマーの蛍光プレートリーダーで読み取り、マイクロソフトのエクセルを用いてそのデータを分析した。陽性であると考えられたウェルをサブクローンし、そして、同じスクリーニングの工程を１３日後と、次に３３日後に繰り返した。最後のスクリーニングの結果を以下の表２で説明する。本発明の方法に従って、多数のモノクローナル抗体を生産した。これらの抗体の特性を表２にまとめ、１ＬＮ−１，１ＬＮ−１２，１ＬＮ−１４，２ＬＮ−２１，２ＬＮ−２８，２ＬＮ−２９，２ＬＮ−３１，２ＬＮ−３３，２ＬＮ−３４，及び２ＬＮ−３５として同定する。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
その表は、Ｓｐ２／０とＮＳ−１融合の両方からのクローンが、ガン細胞を５０％以上の比率で殺傷する抗体を産生することができ、そして同時にいくつかのクローンが、コントロールの正常線維芽細胞の死を1パーセント未満に抑えることができたことを示す。
【００６４】
本発明の抗ガン抗体が、薬学的に受容可能なアジュバント、例えば生理食塩水，脂質乳濁液，アルブミン，リン酸緩衝食塩水，又は同様のものを有する混合剤として投与される場合、また前記ガン疾患の治療を媒介するのに有効な量、例えば、約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌの範囲で投与される場合に、ガン疾患を有する患者を治療するのに有用である。
【００６５】
さらに、ガン疾患を患っている患者の治療方法には、結合された抗ガン抗体の使用が含まれ、そして、これには患者に特異的な抗ガン抗体を、毒素，酵素，放射性化合物，及び造血性細胞からなるグループから選ばれた一部と結合することと、これらの結合した抗体を患者に投与することとが含まれ、なお、前記抗ガン抗体は薬学的に受容可能なアジュバント、例えば生理食塩水，脂質乳濁液，アルブミン，リン酸緩衝食塩水，又は同様のものを有する混合剤が投与され、前記ガン疾患の治療を媒介するのに有効な量、例えば約１ｍｇ／ｍｌから約１ｇ／ｍｌの範囲で投与される。特定の実施例において、上記に概説された方法のどちらかの有効な抗ガン抗体は、ヒト化された抗体であってもよい。
【国際調査報告】
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