(57)【要約】−該MHC/HLA分子と結合するリガンドおよび該MHC/HLA分子と結合しないリガンドを含むリガンドプールを得、−該MHC/HLA分子を該リガンドプールと接触させて該MHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンドを該MHC/HLA分子と結合させて該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体を形成させ、−該MHC/HLA分子と結合しないリガンドから該複合体を検出し、所望により分離し、−所望により該複合体からリガンドを単離し、特徴づける、工程を含むMHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンド、または該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体の単離方法、ならびにMHC/HLA分子に対する結合能を有するT細胞エピトープの単離方法について記載する。
2005527506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を特徴とするMHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンド、または該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体の単離方法：
−該MHC/HLA分子と結合するリガンドおよび該MHC/HLA分子と結合しないリガンドを含むリガンドプールを得、
−該MHC/HLA分子を該リガンドプールと接触させて該MHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンドを該MHC/HLA分子と結合させて該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体を形成させ、
−該MHC/HLA分子と結合しないリガンドから該複合体を検出し、所望により分離し、
−所望により該複合体からリガンドを単離し、特徴づける。
【請求項２】
以下の工程を特徴とするMHC/HLA分子に対する結合能を有するT細胞エピトープ、または該エピトープおよび該MHC/HLA分子を含む複合体の単離方法：
−該MHC/HLA分子と結合するリガンドおよび該MHC/HLA分子と結合しないリガンドを含むリガンドプールを得、
−該MHC/HLA分子を該リガンドプールと接触させて該MHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンドを該MHC/HLA分子と結合させて該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体を形成させ、
−該MHC/HLA分子と結合しないリガンドから該複合体を検出し、所望により分離し、
−該複合体由来のリガンドを所望により単離し、特徴づけ、
−該所望により単離されたリガンドまたは該複合体のT細胞活性化能をT細胞アッセイを用いてアッセイし、
−T細胞活性化能を有する所望により単離されたリガンドをT細胞エピトープまたは複合体として得る。
【請求項３】
該リガンドプールが、ペプチド、特にオーバーラッピングペプチドのプール、タンパク質断片プール、糖脂質プール、スフィンゴ糖脂質プール、リポペプチドプール、脂質プール、グリカンプール、修飾ペプチドプール、好ましくは抗原提示細胞の全溶解物またはその分画、特に該細胞の表面から溶出した分画またはMHC/HLA分子の形の抗原提示細胞から得られるプール、細胞、特に病原体細胞、腫瘍細胞または組織の断片からなるプール、ペプチドライブラリーからなるプール、特に病原体または腫瘍細胞由来の組換えDNAライブラリーから得た(ポリ)ペプチドのプール、特定の病原体由来のタンパク質および/またはタンパク質断片のプール、またはその混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
該MHC/HLA分子が、HLAクラスI分子、HLAクラスII分子、非古典的MHC/HLAおよびMHC/HLA様分子またはその混合物、またはその混合物から選ばれることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該複合体のリガンドの特徴付けが、質量分析、ポリペプチドシーケンシング、結合アッセイ、特にSDS-安定性アッセイ、クロマトグラフィ、特にHPLC、または他の分光学的技術、特に紫外線(UV)、遠赤外線(IR)、核磁気共鳴(NMR)、円偏光二色性(circular dichroism、CD)、または電子スピン共鳴(ESR)によるそれら保持因子の決定によるリガンドの同定、またはその組み合わせからなる群から選ばれる方法を用いて行われる請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
サイトカイン分泌アッセイ、好ましくはELIspot(エリスポット)アッセイ、細胞内サイトカイン染色、FACS、またはELISAと組み合わせることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該T細胞アッセイが、該複合体と単離T細胞を混合およびインキュベーションし、次いで、該単離T細胞のサイトカイン分泌または増殖を測定することを含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該T細胞アッセイが、活性化マーカー、特にCD69、CD38の上方制御、または表面マーカー、特にCD3、CD8、またはTCRの下方制御を測定することを含むことを特徴とする請求項1〜6記載の方法。
【請求項９】
該T細胞アッセイが、特にリアルタイムRT-PCRにより、T細胞活性化に関与するmRNAの上方/下方制御を測定することを含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該T細胞アッセイが、T細胞レセプターの下流成分、特にp56 lck、TCRのITAMSおよびzeta鎖、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn、およびlynのリン酸化/脱リン酸化を測定するT細胞アッセイ、細胞内Ca++濃度またはCa++依存性タンパク質の活性化を測定するT細胞アッセイ、免疫学的シナプスの形成を測定するT細胞アッセイ、エフェクター分子、特にパーフォリン、グランザイム、またはグラヌロリシンの放出を測定するT細胞アッセイ、または該T細胞アッセイの組み合わせから選ばれることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
配列 KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA、またはその組み合わせを含むポリペプチドからなる群から選ばれる、請求項2〜10のいずれかに記載の方法により同定できるT細胞エピトープ。
【請求項１２】
配列 RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLESFCEDV、またはその組み合わせを含むポリペプチドからなる群から選ばれる、HLA A0201分子をMHC/HLA分子として用いる請求項2〜10のいずれかに記載の方法により同定可能なT細胞活性化能を有するHLA A0201結合エピトープ。
【請求項１３】
B7陰性である個体のT細胞を活性化する組成物を製造するための配列 RPHERNGFTVを含むポリペプチドの使用。
【請求項１４】
B35陰性である個体のT細胞を活性化する組成物を製造するための配列 DDVWTSGSDSDEを含むポリペプチドの使用。
【請求項１５】
B7陰性である個体のT細胞を活性化する組成物を製造するための配列TPRVTGGGAMを含むポリペプチドの使用。
【請求項１６】
表3のペプチド番号55-64、109、383、384、421、449-454、469、および470から選ばれるクラスII HLA分子と結合するペプチド。
【請求項１７】
さらに、特にN末端、C末端、またはNおよびC末端に1〜30、好ましくは2〜10、特に2〜6の天然アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項11〜16のいずれかに記載のエピトープまたはペプチド。
【請求項１８】
さらに、N末端、C末端、またはNおよびC末端に非天然アミノ酸、好ましくは1〜1000、より好ましくは2〜100、特に2〜20の非天然アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項11〜17のいずれかに記載のエピトープまたはペプチド。
【請求項１９】
サイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのHLA制限ワクチンを製造するための請求項11〜18のいずれかに記載のエピトープまたはペプチドの使用。
【請求項２０】
サイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのワクチンを製造するための請求項11、17、または18のいずれかに記載のエピトープの使用。
【請求項２１】
請求項11、17、または18のいずれかに記載のエピトープを含むサイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのワクチン。
【請求項２２】
請求項11〜18のいずれかに記載のエピトープまたはペプチドを含むサイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのHLA特異的ワクチン。
【請求項２３】
さらに、好ましくはポリカチオニック物質、特にポリカチオニックポリペプチド、免疫調節核酸、特にデオキシイノシンおよび/またはデオキシウラシル含有オリゴデオキシヌクレオチド、またはその混合物からなる群から選ばれる免疫調節物質を含むことを特徴とする請求項19〜22のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２４】
さらに、医薬的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項19〜23のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２５】
該エピトープが、ペプチド、ペプチド類似体、タンパク質、裸DNA、RNA、ウイルスベクター、ウイルス様粒子、組換え/キメラウイルス、組換え細菌、またはタンパク質/ペプチド/RNAでパルスするか、または該エピトープを含むDNAでトランスフェクトした樹状細胞から選ばれる形で提供されることを特徴とする請求項19〜24のいずれかに記載のワクチン。
【請求項２６】
請求項11〜18のいずれかに記載のエピトープまたはペプチドを特異的に認識するT細胞、T細胞クローン、またはT細胞ポピュレーションもしくは調製物。
【請求項２７】
ヘテロクリティックエピトープを同定するための請求項26記載のT細胞、T細胞クローン、またはT細胞ポピュレーションもしくは調製物の使用。
【請求項２８】
CMV患者を治療するための組成物を製造するための請求項26記載のT細胞、T細胞クローン、またはT細胞ポピュレーションもしくは調製物の使用。
【請求項２９】
リガンド、または抗原、特にヒト免疫不全ウイルス(HIV)、AおよびB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、Staphylococcus aureus(黄色ブドウ球菌)、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus pneumoniae、Bacillus antracis、Vibrio cholerae、Plasmodium sp.(Pl.falciparum、Pl.vivaxなど)、Aspergillus sp.、またはCandida albicans由来の抗原、腫瘍抗原、または自己免疫抗原、の断片を特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
該リガンドがMHC/HLA分子に対する結合能を有するHCV-、HIV-、HAV-、HBV-、RSV-、EBV-、インフルエンザウイルス-、またはロタウイルス-ペプチドであることを特徴とする請求項1〜10および29のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド、特にMHC/HLA分子に対する結合能を有するT細胞エピトープの単離方法に関する。
【０００２】
免疫系は、感染性微生物から多細胞生物を保護するために発達した相互に関連する細胞種および分子の複雑なネットワークである。免疫系は、進化的により古い先天性(すなわち天然の)免疫または適応的(獲得)免疫に分けることができる。該先天性免疫系は、通常、病原体に共通および本質的なパターンを認識する。この限られた数の分子構造について、生殖系列がコードするレセプターが発達した。反対に、適応的免疫系の細胞(BおよびT細胞)は、多様な抗原構造を認識することができる。レセプター、それらを発現する細胞種に従って名付けられたB細胞レセプター(BCR、その可溶性のものは抗体と呼ばれる)、およびT細胞レセプター(TCR、細胞表面結合形のみ)は、体細胞組換えにより生じ、クローン性分布を示す。したがって、最初はある種の特異性を有する少数の細胞のみが存在する。抗原に出会うとこれらの細胞は分裂(クローン性増殖)を始め、抗原に対抗することができるエフェクターポピュレーションを生じる。抗原を排除後、この抗原を特異的に認識する細胞の分化したサブポピュレーションが免疫記憶として残る。これらをもとに、適応的免疫系は特異的であるが遅く(先天性免疫に比べて)、該病原体/抗原に対する反復暴露を改善する。
【０００３】
T細胞は適応的免疫に中心的役割を持つ。そのレセプター(TCR)は、細胞表面上の「主要組織適合複合体」(MHCまたはHLA)：ペプチド複合体を認識する。これらペプチドは、T細胞エピトープと呼ばれ、抗原の分解産物を提示する。T細胞には2つの主要なクラスがあり、CD8陽性細胞傷害性T細胞(CTL)はMHCクラスIに制限される。CD4陽性ヘルパーT細胞(HTL)はMHCクラスIIに制限される。HTLは適応的免疫の多くの特徴：いわゆる「専門的抗原提示細胞」(APC)、免疫グロブリン(Ig)クラススイッチ、胚中心反応、およびIg親和性成熟、CTLの活性化、免疫記憶、免疫応答の調節、その他に必須である。
【０００４】
MHC分子は細胞内側のペプチドを収集し、細胞表面上のそれらをT細胞のTCRに提示する。MHCには2つの主要なクラス、CD8陽性CTLにより認識されるクラスIおよびCD4陽性HTLにより認識されるクラスIIがある。
【０００５】
MHCクラスI分子は、45kDaの膜固定α鎖および12kDaの非共有結合b2マイクログロブリン(b2m)からなる。X線結晶学(SternおよびWiley 1994)による三次元構造分析は、α鎖が、両端が閉じ、8〜11アミノ酸長のペプチドに適合する割れ目(クレフト)を有することを明らかにした。クラスI分子は偏在性に発現し、それらが提示する該ペプチドは細胞質タンパク質に由来する。これらはプロテオソームにより分解され、生じたペプチドは小胞体(ER)に能動的に輸送される。そこで、種々のシャペロンの助けにより、MHC:ペプチド複合体が形成され、細胞表面に輸送される(Heemels 1995)。すなわち、MHCクラスIは細胞のプロテオームをその表面上に反映させ、細胞が細胞内病原体または悪性細胞を認識するのを可能にする。
【０００６】
MHCクラスII分子は、それぞれ35kDaおよび30kDaの2つの膜固定タンパク質(αおよびβ鎖)からなる。これらは一緒になって通常12〜25アミノ酸の可変長のペプチドに適合することができる両端が開いたクレフトを形成する。これらの違いにも関わらず、クラスIおよびII分子は、驚くべき構造的類似性を共有する(SternおよびWiley 1994)。クラスII分子は、樹状細胞(DC)、B細胞、およびマクロファージ/単球を含む専門的APC上にのみ発現する。これらの細胞は、エンドソーム経路中で抗原の利用およびプロセシングを専門にしている。それらの生合成直後にクラスII分子は、ER中のペプチドの結合を抑制するいわゆる不変鎖(Ii)により複合体を形成する。クラスII:Ii複合体を含む小胞が外来性抗原の分解産物を含むエンドソームと融合すると、MHC結合クレフトがいわゆるCLIPペプチドによってのみ複合体を形成するまでIiが分解される。後者は、HLA-DMのようなシャペロンの助けにより抗原性ペプチドにより交換される(Villadangos 2000)。最終的に、MHC:ペプチド複合体は、HTLと多くの方法で相互作用するAPCの表面上に再度提示される。
【０００７】
多遺伝子性であり、きわめて多形性であるMHC系は非常に複雑である。ヒトのクラスIα鎖にはHLA-A、-B、および-Cと呼ばれる3つの遺伝子座がある。同様に、3つのクラスIIα鎖遺伝子座(DRA、DQA、DPA)があり、クラスIIβ鎖遺伝子座に関しては4つの異なるDRβ鎖(DRB1、2、3、5)に加えてDQBおよびDPBがあるのでより複雑である。単一形のDRα鎖DRAを除き、各遺伝子座は該ポピュレーション中の多くの種々の対立遺伝子(数10〜数100)中に存在する(Klein 1986)。異なる対立遺伝子は、ペプチドに対する大きく異なる結合特異性を有する。対立遺伝子は、例えばHLA-A*0201またはHLA-DRB1*0401またはHLA-DPA*0101/DPB*0401で表される。
【０００８】
T細胞エピトープは、種々のアプローチにより同定されている(Van den Eynde 1997)。T細胞系およびクローンは、例えば、例えば適切なHLA分子でトランスフェクトしたCOS細胞に関連してcDNA発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いられてきた。あるいはまた、生化学的アプローチが行われてきた。後者には、標的細胞表面上のMHC分子由来の天然リガンドの溶出、種々のクロマトグラフィ工程によるこれらペプチドの分離、エピトープ再構成アッセイにおけるそれらとリンパ球との反応性の分析、および質量分析によるシーケンシングが含まれた(Woelfelら1994、Coxら1994)。
【０００９】
最近、IFN-γ ELIspot(エリスポット)アッセイのような高感度サイトカイン検出アッセイの出現は、オーバーラッピング合成ペプチドのスクリーニングのためにリンパ球をex vivoで直接使用するのを可能にした(Maecker 2001、Kern 2000、Tobery 2001)。最初に、Kernら(1999 & 2000)は、オーバーラッピング9マーペプチドプールのアレイを用い、in vitroでCD8+ T細胞エピトープをマッピングした。その後、Toberyら、2001は、このアプローチを修飾し、64もの20マーペプチドを含むプールがマウスでCD8+およびCD4+T細胞両エピトープのスクリーニングに用いることができることを示した。これら方法はともに、細胞内染色(Kernら 2000)またはELIspotアッセイ(Toberyら、2001)を用いるINF-γ生成の測定による抗原特異反応のモニターに基づいた。15マーの混合物を用いることによるCD4+T細胞の反応は、全可溶性タンパク質を抗原に用いた時に検出されるものとほぼ同等であり、驚くことではないがCD8+T細胞の反応は、可溶性タンパク質刺激を用いて検出されるしばしばごくわずかな反応より有意に高い。さらに、CD8+T細胞の15アミノ酸ペプチド混合物に対する反応は、既知のMHCクラスI最小エピトープを示すために選ばれた8-12アミノ酸ペプチド混合物を用いて得られたものと同様である。該細胞膜と結合したほとんどのペプチダーゼは、これら環境下でペプチドを最適な長さに「切る(clipping)」のに関与する(Maeckerら、2001)。
【００１０】
興味深い別の方法は、特異的リンパ球を用いて合成コンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、ポジショナルスキャンニングフォーマットを用いて配置した200混合物からなるデカペプチドライブラリーは、T細胞のクロノタイプポピュレーションを刺激するペプチドリガンドの同定にうまく用いられてきた(Wilsonら、J.Immunol.、1999、163: 6424-6434)。
【００１１】
多くのT細胞エピトープは、いわゆる「逆免疫学的アプローチ(Reverse immunological approaches)」(Rammensee 1999)により同定された。この場合は、潜在的T細胞エピトープを生じるタンパク質が知られており、その一次配列をHLA結合モチーフについて精査する。典型的には、数十〜数百の候補ペプチドまたはフルセットのオーバーラッピングペプチドを合成し、HLA分子に対する結合を試験する。通常、最良の結合物質を選び、そのT細胞との反応をさらに特徴づける。これは、例えばHLAトランスジェニックマウスの助けによりin vivoまたはin vitroでT細胞をプライミングすることにより行うことできる。
【００１２】
本発明の目的は、好ましくは該MHC分子に対する特異性が未知の種々のリガンドから選ばれる適切な特異的T細胞エピトープを供給するための特定のMHC分子に対するリガンドのスクリーニング方法を提供することである。
【００１３】
したがって、本発明は、以下の工程を含むMHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンド、または該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体の単離方法を提供する：
−該MHC/HLA分子と結合するリガンドおよび該MHC/HLA分子と結合しないリガンドを含むリガンドプールを得、
−該MHC/HLA分子を該リガンドプールと接触させて該MHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンドを該MHC/HLA分子と結合させて該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体を形成させ、
−該MHC/HLA分子と結合しないリガンドから該複合体を検出し、所望により分離し、
−所望により該複合体からリガンドを単離し、特徴づける。
【００１４】
本発明は、以下の工程を含むMHC/HLA分子に対する結合能を有するT細胞エピトープ、または該エピトープおよび該MHC/HLA分子を含む複合体の単離方法も提供する：
−該MHC/HLA分子と結合するリガンドおよび該MHC/HLA分子と結合しないリガンドを含むリガンドプールを得、
−該MHC/HLA分子を該リガンドプールと接触させて該MHC/HLA分子に対する結合能を有するリガンドを該MHC/HLA分子と結合させて該リガンドおよび該MHC/HLA分子を含む複合体を形成させ、
−該MHC/HLA分子と結合しないリガンドから該複合体を検出し、所望により分離し、
−該複合体由来のリガンドを所望により単離し、特徴づけ、
−該所望により単離されたリガンドまたは該複合体のT細胞活性化能をT細胞アッセイを用いてアッセイし、
−T細胞活性化能を有する所望により単離されたリガンドをT細胞エピトープまたは複合体として得る。
【００１５】
本発明の方法は、特定のMHC/HLA分子に対する結合能をスクリーニングするためのスクリーニング系を可能にする。MHC結合分子の同定は、病原体、腫瘍などの分子的特徴づけのための重要な手段である。したがって、本発明を用い、種々(「プール」)の可能性のあるリガンドのMHC分子に対する結合親和性を同時にスクリーニングすることができる。MHC分子に対する結合親和性も、十分条件ではないがT細胞エピトープとして用いることを目的とするリガンドの必要条件である。適切なT細胞エピトープ候補もスクリーニングし、そのT細胞活性化能をアッセイしなければならない。したがって、本発明の結合のスクリーニング方法と適切なT細胞アッセイの組み合わせは、T細胞エピトープがMHC結合アッセイを用いて可能性のあるリガンドプールから同定可能である、本発明のT細胞エピトープの単離方法を提供する。
そのようなアッセイが常に既知の結合/MHC特異性を有するリガンドを用いて行われる先行技術と対照的に、本発明の方法は、未知の特異性のリガンドを含むプールに対するスクリーニング手段として該アッセイを提供する。先行技術において、該アッセイは典型的には個々の単一リガンドを用い、そのMHC/HLA分子に対する結合親和性を試験するために実施されてきた。Kwokら(2001)において、最大5までのオーバーラッピング合成ペプチドプールを用いてMHCクラスIIテトラマーを得、次いで後者を用い、5ペプチドのプールとの結合反応において生じた特定のMHCクラスII:ペプチド複合体に特異的なT細胞についてPBMCを染色した。しかしながら、そのようなアプローチにおける1プールあたりのリガンド数の増加は、感受性および特異性両方の理由から可能であると考えなかった(Novakら2001)。特異性に関する問題は、2以上の結合物質が該プール中に存在する場合、1テトラマーあたり2以上の結合物質を有するMHCテトラマーが生成することであろう。これは先行技術に記載のアプローチにおいてエピトープの同定に使用するT細胞の染色を排除するであろう。それとは大きく異なり、本発明のアプローチは2以上の結合物質を含むきわめて複雑な混合物の中から2以上の結合物質を同定することができる。
【００１６】
本発明を用いてスクリーニングすべきプールの性質は重要ではなく、該プールは、
a)MHC/HLA分子と特異的に結合し、そして/または
b)T細胞により特異的に認識されるであろうあらゆる天然または非天然の物質を含んでいてよい。該プールのリガンドのセットのMHC分子に対する結合特性は知られておらず、通常該MHC分子の結合物質および少なくとも非結合物質が該プール中に含まれる。したがって、該プールは少なくとも10の異なるリガンドを含む。実質的に、例えば20またはそれ以上、100またはそれ以上、1.000またはそれ以上、または10.000またはそれ以上の著しく異なるリガンド種を含むプールを本発明にしたがって使用する。より大きいライブラリーをスクリーニングすることもできる(例えば、106以上、108以上、または1010以上の異なるリガンド種を使用)。しかしながら、これは主としてそのようなリガンドライブラリーの利用可能性に依存する。
【００１７】
明らかに、MHC:ペプチド複合体は、典型的なレセプターリガンド系ではなく、これまで正しいスクリーニング手段の基盤であるとみなされていなかった。in vivoでは、通常エンプティMHC分子ではなくMHC:ペプチド複合体のみが存在する。MHC:ペプチド複合体は、エンプティMHC分子に対するペプチドの単結合によってではなく、いわゆる「抗原プロセシングおよび提示」の非常に複雑な(そしてまだ完全に理解されていない)プロセスを通して生じる。これは、多様な酵素(細胞質内およびリソゾームプロテアーゼ、トランスポーター、シャペロン、ペプチド交換因子など)を含む高度に組織化された細胞内プロセスである。実際に、リガンドを持たないMHC分子は不安定であり、急速に分解される。
【００１８】
したがって、本発明の主な特徴は、組換え「エンプティ」MHC分子を得、プールからリガンドを「捕捉する」ために使用するのを可能にする製造、精製、および反応条件の開発である。先行技術には同様の可能性を明示する例はない。上記Novakらの参考文献は、組換えMHC分子を得、次いでこれを少数のペプチドとインキュベーションし、テトラマーにする生成物(昆虫細胞)、および精製戦略を開示している。MHCテトラマーを用い、該ペプチドにより示される抗原に対するT細胞を有すると思われる個体由来の細胞を染色する、すなわちリガンドが真のT細胞エピトープでもあることの必要な証拠を提供する。しかしながら、記載した先行技術は、5つまでのペプチドしかうまく使用できないかもしれないことを明確に記載している。これらは1プールあたり10、21、およびさらに数100または数1000のペプチドをうまく適用できるかもしれない本発明のアプローチと非常に異なる。
本発明の方法に用いるリガンドの好ましいプールは、ペプチド、特にオーバーラッピングペプチドのプール、タンパク質断片プール、糖脂質プール、スフィンゴ糖脂質プール、リポペプチドプール、脂質プール、グリカンプール、修飾ペプチドプール、好ましくは抗原提示細胞の全溶解物またはその分画、特に該細胞の表面から溶出した分画またはMHC/HLA分子の形の抗原提示細胞から得られるプール、細胞、特に病原体細胞、腫瘍細胞、または組織の断片からなるプール、ペプチドライブラリーからなるプール、特に病原体または腫瘍細胞由来の組換えDNAライブラリーから得た(ポリ)-ペプチドのプール、特定の病原体由来のタンパク質および/またはタンパク質断片のプール、またはその混合物からなる群から選ばれる。
【００１９】
該プールのリガンドは、天然供給源から誘導するか(天然および/または誘導体形)、合成的に製造する(例えば化学合成または組換え技術による)ことができよう。(ポリ)ペプチドリガンドがプール中に提供される場合は、それらペプチドは好ましくはペプチド合成装置または組換え技術により生じる。好ましい態様によれば、(ポリ)ペプチドのプールは、例えば病原体または腫瘍細胞由来の組換えDNAライブラリーからin vitro翻訳(例えばリボソーム表現により)、またはE.coliその他のようなヘテロローガスな宿主を通して発現することにより生成することができよう。
【００２０】
したがって、リガンドは、T細胞エピトープとしての役目を果たす抗原断片であるペプチドである。そのようなペプチドは、6より長い、特に8より長いアミノ酸であり、好ましい最大長は40、30、20、15、または11もしくは12アミノ酸である。
【００２１】
そのようなペプチドを得ることができる好ましい病原体は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、AおよびB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、Staphylococcus aureus、Chlamydia pneumoniae、Chlamydia trachomatis、Mycobacterium tuberculosis、Streptococcus pneumoniae、Bacillus antracis、Vibrio cholerae、Plasmodium sp.(Pl.falciparum、Pl.vivaxなど)、Aspergillus sp.、またはCandida albicansから選ばれる。抗原は癌細胞により発現される分子(腫瘍抗原)であってもよい。同様にして、腫瘍抗原(癌ワクチン)または自己免疫抗原を本発明の適切な(ペプチド)リガンドを得るのに用いることができよう。
【００２２】
本発明の方法のために選ばれる特定MHC分子(もちろん、MHC様分子はこの用語に含まれる)の性質も重要ではない。したがって、これら分子は原則的にあらゆる種、特に霊長類、例えばヒト(HLA、下記参照)、チンパンジー、他の哺乳動物、例えばマカーク(maquaques)、ウサギ、ネコ、イヌ、またはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、および魚のような農業的に重要な動物から選んでよいが、もちろんヒト(または「ヒト化」)分子がヒトのワクチンを得るのに好ましい。特定動物、特に農業的に重要な動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、および魚用のワクチンを得るには、これら動物に特異的なMHC分子を用いるのが好ましい。
【００２３】
したがって、好ましいHLA分子は、HLA-A、-B、または-C遺伝子座由来のクラスI分子、特にA1、A2、A3、A24、A11、A23、A29、A30、A68; B7、B8、B15、B16、B27、B35、B40、B44、B46、B51、B52、B53; Cw3、Cw4、Cw6、Cw7; HLA-DP、-DQ、または-DR遺伝子座由来のクラスII分子、特にDR1、DR2、DR3、DR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR51、DR52、DR53; DP2、DP3、DP4; DQ1、DQ3、DQ5、DQ6; およびリガンドと特異的に結合することができる非古典的MHC/HLAおよびMHC/HLA様分子、特にHLA-E、HLA-G、MICA、MICB、Qa1、Qa2、T10、T18、T22、M3、およびCD1ファミリーのメンバーを含む。
【００２４】
好ましい態様によれば、本発明方法は、該MHC/HLA分子がHLAクラスI分子、HLAクラスII分子、非古典的MHC/HLAおよびMHC/HLA様分子またはその混合物、またはその混合物から選ばれることを特徴とする。
【００２５】
好ましくは、該複合体のリガンドの任意的特徴付け工程は、質量分析、ポリペプチドシーケンシング、結合アッセイ、特にSDS-安定性アッセイ、クロマトグラフィ、特にHPLC、または他の分光学的技術、特に紫外線(UV)、遠赤外線(IR)、核磁気共鳴(NMR)、円偏光二色性(circular dichroism、CD)、または電子スピン共鳴(ESR)によるそれら保持因子の決定によるリガンドの同定、またはその組み合わせからなる群から選ばれる方法を用いて行われる。
【００２６】
好ましい態様によれば、本発明方法は、サイトカイン分泌アッセイ、好ましくはElispotアッセイ、細胞内サイトカイン染色、FACS、またはELISA(酵素免疫測定法)と組み合わせることを特徴とする(例えばCurrent Protocols in Immunology参照)。
【００２７】
好ましいT細胞アッセイは、該複合体と単離T細胞との混合およびインキュベーション、次いで該単離T細胞のサイトカイン分泌または増殖を測定し、および/または活性化マーカー、特にCD69、CD38の上方制御または表面マーカー、特にCD3、CD8もしくはTCRの下方制御の測定、および/またはT細胞活性化に関与するmRNAの上方/下方制御の特にリアルタイムRT-PCRによる測定を含む(例えばCurrent Protocols in Immunology、Current Protocols in Molecular Biology参照)。本発明のT細胞活性化能試験(本明細書では「T細胞アッセイ」という)は、好ましくは適切に設計されたヒトMHC/HLAセットアップ(例えば、そのゲノム中に統合された1またはそれ以上のヒトMHC/HLA分子を有する)を用いてトランスジェニックマウスで実現することもできよう。
【００２８】
さらに好ましいT細胞アッセイは、T細胞レセプター、特にp56 lck、TCRのITAMSおよびzeta鎖、ZAP70、LAT、SLP-76、fyn、およびlynの下流成分のリン酸化/脱リン酸化を測定するT細胞アッセイ、細胞内Ca++濃度またはCa++依存性タンパク質の活性化を測定するT細胞アッセイ、免疫学的シナプスの形成を測定するT細胞アッセイ、エフェクター分子、特にパーフォリン、グランザイム、またはグラヌロリシンの放出を測定するT細胞アッセイ、または該T細胞アッセイの組み合わせから選ばれる。(例えばCurrent Protocols in Immunology、Current Protocols in Cell Biology参照)。
【００２９】
WO 00/31542は、もっぱら腫瘍細胞由来の抗原の同定方法を示す。抗原性ペプチドは、ハプテン修飾悪性細胞の表面に位置するMHC-ペプチド複合体から抽出する。次に、ハプテン化ペプチドは、ハプテン特異的アフィニティクロマトグラフィにより分離し、シーケンシングすることができる。本発明の態様において、腫瘍細胞表面に位置するMHC分子から最初に単離したペプチドはT細胞を刺激する特性を有する。刺激とは、細胞抽出物の添加に応じたT細胞の増殖、およびサイトカイン、例えばINF-γ、TNF、IL-2などの産生をいう。単離ペプチドの配列に基づいて抗原の供給源を同定することができる。
【００３０】
本アプローチの最終的な結果もT細胞エピトープであるが、この方法は本発明とは本質的に異なり、先行技術では、天然MHC:ペプチド複合体は細胞系から単離され、本発明では精製組換えMHC分子を用いてあらゆる供給源(細胞または合成、天然または人工)からリガンドを単離する。また、先行技術ではエピトープのハプテン化がハプテンアフィニティクロマトグラフィによるその後の分離に必要であるが、本発明はそのような工程から自立している。
【００３１】
Tanaら(1998)は、セットタイプのMHC分子に対する既知の結合モチーフに基づいて設計した合成コンビナトリアルペプチドライブラリーからT細胞によって認識される抗原性ペプチドをスクリーニングするためのアプローチについて記載している。すなわち、スクリーニングすべきペプチド数は、209のすべての考えられるペプチドからなる「広範囲の」ライブラリーに比べて実質的に減少している(〜103)。該ペプチドは混合され、2つの固定位置に異なるアミノ酸を含む9ペプチドの混合物となる。次に、該混合物によるT細胞増殖反応の誘発を試験した。すなわち、本アプローチは、セットMHC分子への結合に適したアミノ酸残基の検出、およびTCRレセプターによる認識に限定される。
【００３２】
Bitmansourら(2001)は、先に記載されたKernら(1999、2000)によるマトリックスアプローチをCMV pp65タンパク質内の免疫優性CD4+エピトープの同定に使用した。全pp65タンパク質に相当する12ペプチドをそれぞれ含む24ペプチドプール(11aaだけオーバーラップした15マー)(全138ペプチド)のマトリックスを構築した。最初に、ペプチドプールおよび次いで個々のペプチドの特異的T細胞反応の誘発能を試験した。本アプローチの他(Maeker、2001; Toberyら、2001)との違いは、T細胞反応をモニターするための種々の技術、例えばフローサイトメトリー分析(表面INF-γ染色、CD4およびCD69マーカー)および分子的方法(CMV-特異的CD4+細胞のTCR-Vβ含有量に対するRT-PCR)に頼っていることである。サイトカインフローサイトメトリーと呼ばれる用いた技術は、Ag誘導増殖または細胞死いずれかの前にCMV特異的T細胞の検出を可能にし、長期間のin vitro培養によって変化しないin vivoで存在するCMV特異的T細胞のクロノタイプ(clonotypic)含有量を測定する可能性を提供する。結果として、おそらく防御的CMV特異的CD4+反応に寄与する2つのpp65エピトープが健康なCMV血清反応陽性対象にみいだされた。
【００３３】
TanaらおよびBitmansourらはともに、複雑さを伴い、生物学的細胞アッセイを制御するのが困難なだけのアプローチを記載しているが、本発明は、特に扱いやすさと再現性に関して先行技術と全く似ていない直接生化学的単離を示す。本発明の「エンプティ」MHC/HLA分子の使用は、生細胞表面に位置するMHC/HLA分子に対する結合事象を用いるすべての複雑な方法を時代遅れにする。
【００３４】
したがって、リガンドプールを(「エンプティ」)MHC/HLA分子と接触させ(また該プールは細胞系に依存しない)、次いで(好ましくは)結合するリガンドのT細胞活性化能をT細胞試験で試験するT細胞エピトープの単離方法は、特に記載した細胞依存性アッセイと比較して全く新規なアプローチである。また、「in silicio(イン・シリシオ)」法と比べて、本発明の方法は、取り扱いが容易で速く「現実的」有用性を提供する。
【００３５】
本発明の方法の能力と有用性は、実施例の項で特異的病原体タンパク質、サイトメガロウイルス(CMV)のpp65について示している。この実施例により、本発明の有効性および利点を示し、先行技術の方法と比較している。
【００３６】
CMV、βヘルペスウイルスは、一般的ポピュレーションにおける非エプスタイン・バーウイルス(EBV)伝染性単核球症の主な原因であり、後天性免疫不全症候群(AIDS)に罹患したヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染患者を含む免疫不全宿主、新生児、および移植レシピエントにおける重要な病原体である(Drewら、1999)。生存ポピュレーションに応じて、種々の領域におけるCMV血清反応陽性患者の割合は40〜100%の範囲である。他のヘルペスウイルス同様、CMVの一次感染に次いで持続感染が生じ、再感染または重複感染もある種の環境下で生じるが(Britt、1999)、予め存在している免疫のため免疫が保たれている(イムノコンピテント)宿主には病的結果はほとんど生じない(Plotkinら、1999)。CMVは、ヒトにおけるゆっくりした持続感染を確立する。CMVは免疫が保たれている宿主では制御されるが決して排除されない。特に(例えば、抗原プロセシングおよび提示と干渉しない免疫抑制遺伝子の活性発現)、2つの因子、一方で唾液腺上皮のような免疫的に特異な(immunopriviliged)部位における複製およびCD33+単球における潜在的リザーバーの形成がイムノサーベイランスから常に逃れるのに寄与しているようである。これらマクロファージの前駆体はCMVの複製を支持しないので、細胞がマクロファージに分化するまで複製は停止する。分化後にのみ、細胞環境が溶解性感染に対し許容状態になる。免疫が保たれている個体における一次感染の90%が臨床的に認識されずに済まされ(Nicholsら、2000)、ウイルスの持続性を制御し、無ウイルス化するわけではないが防御的な長期免疫が発現する。
【００３７】
感染/再活性化の高いリスクがCMV病を発現する危険性が高い以下の群に存在する：
a)血清反応陰性の妊娠女性からの胎児、
b)血清反応陰性移植患者(CMV陰性移植片をみつけるのが困難なため)、
c)血清反応陽性移植およびHIV患者(その誘導または後天性免疫不全がCMVを潜伏状態から再活性化するため)。
【００３８】
先天性CMV感染は難聴を生じることがあり、さらに重要なことは、知能発育不全の原因が一般的遺伝的症候群であるトリソミー21および脆弱X染色体と同じ頻度であることである。Fowler KB、Stagno S、Pass RFら(Fowlerら、1992)の研究から、約9000人のヨーロッパおよび8000人のアメリカの幼児(アメリカ合衆国で生まれた幼児500人に1人に相当する)が毎年子宮内CMV感染の結果被害を受けるが、出生時に臨床的に明らかになるのはそのうちわずか10%である。先天性CMV感染は大部分が出生時に静止状態(サイレント)であるが、臨床的続発症および公衆衛生上の影響に対する累積効果が大きい(Plotkinら、1999)。悪い結果と最も密接に関連する因子は、ウイルスが密接にヒト対ヒトの接触により容易に広がり、血清反応陽性小児により多量に放出されるため、血清反応陰性母において予防するのが簡単ではない出産時の一次母子感染である(Fieldら、1999)。免疫不全成人では、疾患は、固体臓器移植(SOT)患者および同種造血幹細胞移植(HCT)患者、およびHIV感染患者に最も頻繁にみられる。同種HCT患者では、いまだに患者の約15%に重傷のCMV病が発生し、死亡率は約50%である。HCTにおけるCMV病に関連したリスク因子は、CMV陽性移植ドナーおよび非感染移植レシピエント、同時細菌感染、劇症肝炎、および移植片対宿主病である。SOT、例えば腎臓、肝臓、心臓、肺、または膵臓のSOTでは、CMV病は、移植片および患者の生存の減少と関連している。CMVは、種々の感染病症候群自体を生じる。CMV病の結果はすべての移植患者で同様であるが、特定臓器の障害は移植臓器に対応することが多い。一般に、肝臓、膵臓、肺、腸、および心臓移植患者は、腎臓移植患者よりCMV病の発生率が高い。症候性感染症は、抗ウイルス予防を受けていない心肺移植患者の約39-41%、心移植患者の9-35%、肝臓および膵臓移植患者の22-29%、腎臓移植患者の8-32%に生じる。さらに、CMV感染は免疫抑制状態の増大と関連があり、このことは移植患者における頻繁な日和見重複感染を説明するかもしれない。さらに、CMV感染は、同種移植機能不全、および間接的に患者の生存率の低下および費用の増加と入院の長期化に関与するようである(Siaら、2000)。後者の三点に対して、一方で心臓移植後のCMV感染患者にみられる冠動脈硬化症の促進(Van Sonら、1999、およびFieldら、1999)、および一方でCMV/EBV二重陽性移植患者のエプスタイン・バーウイルス(EBV)関連移植後リンパ増殖性疾患のリスクの増大(Siaら、2000)へのCMVが疑われる関与が寄与するかもしれない。CMV網膜炎(retinits)は、AIDS患者において最も一般的な病気の兆候の1つであり、患者の約30%に生じ、その患者が失明する恐れがあると報告されている。最近の証拠は、CD4+リンパ球の損失は、AIDS患者のCMV病の発現、したがってHIVプロテアーゼインヒビターおよびきわめて積極的な抗レトロウイルス療法(HAART)の導入と相関があり、CMV網膜症の発生率が有意に低下することを示唆する(Fieldら、1999)。しかしながら、CMV病は、HIV複製の適切な抑制にも関わらず、依然としてHAART開始の4ヶ月以内に生じうる。さらに、抗レトロウイルス療法の失敗の問題は増加している(Nicholsら、2000)。
【００３９】
この10年間で、抗ウイルス化学療法を用いたCMV感染の予防および治療にかなりの進歩がみられた。現在、アメリカ合衆国ではCMVの治療に以下の5薬剤が承認されている。Ganciclovir(Cytovene(静脈内および経口用製剤として使用する場合)、またはVitrasert(硝子体内インプラント用製剤として使用する場合））、Foscarnet(Foscavir)、Cidofovir(Vistide)、およびFomivirsen(Vitravene)。GanciclovirおよびCidofovirのトリホスフェート等価物(前者の場合はウイルスおよび細胞酵素によるリン酸化、後者の場合は細胞酵素のみによるリン酸化を必要とする)は、ウイルスDNAポリメラーゼに対するデスオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの競合阻害剤であるが、ピロホスフェート類似体のFoscarnetは、この酵素のピロホスフェート結合部位をブロックする。Fomivirsenは、FDAの承認を得るために設計した第一アンチセンスオリゴヌクレオチドである。しかしながら、Fomivirsenの作用機序は、まだ完全に確認されておらず、アンチセンスに加えて多くのコンポーネントを有するかもしれない(Fieldら、1999)。固有の毒性が高く、遅発CMV病の発生率が高く、また一般的予防法の費用も高いため、HCT後の再活性化CMVの早期検出に基づくCMV病の発生リスクが高い患者の選択的治療に基づく抗ウイルス療法の予防戦略が出現した(Zaiaら、2000)。SOT患者における予防戦略は、移植片ドナーCMVキャリアーおよび非感染移植患者の設定において特に魅力的である。経口バイオアベリラビリティーが著しく増加した活性薬剤ガンシクロビル(ganciclovir)のバリンエステルであるValganciclovirを3ヶ月間投与すると、腎移植患者におけるCMV病の発生率が顕著に減少した。さらに、移植6ヶ月後の生検で確認される拒絶がみられる患者の割合の有意な減少もみられた。しかしながら、この形の治療を常套的静脈内用製剤より患者に好都合にする、特に利用可能な経口剤を用いる長期予防も薬剤耐性の発生率を増加させるかもしれない(Nicholsら、2000)。Ganciclovir、Cidofuvir、およびFoscarnetに対する多剤耐性(すべてウイルスDNAポリメラーゼの変化による)がすでに観察されている(Fieldら、1999)。Fomivirsenは、該突然変異体に対して有効なようであるが(Nicholsら、2000)、そのアンチセンス作用様式に加えて推定される抗ウイルス活性のため(Fieldら、1999)、Fomivirsen耐性株が生じるようである。
【００４０】
したがって、血清反応陰性母の新生児に対する被害も防ぐかもしれない、移植後のCMV特異免疫の(再)構成に焦点をあてた。これは、免疫が保たれている患者がCMV感染をどのように制御しているかという問題に関するもので、免疫が保たれていない患者において回復させるには何が必要かを学ぶためである。集めたデータは、CMV抗体がウイルス血症(無細胞ウイルスの伝搬)の減少を通して一部防御的であるが、抗体を用いて破壊することができない単球ポピュレーション内にウイルスが細胞に結合して存続するHCT患者、リザーバーにはほとんど効果がないと主張する(Plotkinら、1999)。これは、CD8+およびCD4+T細胞反応を回復するワクチンの開発を強く主張する。CMV特異的αβ/T細胞の防御機能は、移植後初期にこれら細胞を養子免疫することにより明確に樹立され得る。第I相試験においてCD8+ CMV特異的細胞障害性Tリンパ球(CTL)を養子移植した患者で、免疫が保たれている骨髄ドナーにおけるものと同等の細胞溶解反応が第4回目の注入直後に達成された。しかしながら、それらは、内在性CD4+CMV特異的Tヘルパー反応を回復できなかった患者のサブセットにおいて次の数週間にわたり低下し、このことはCD8+およびCD4+T細胞の両反応を生じる重要性を明確に示す(Zaiaら、2000)。CMVコントロールにおけるCD4+T細胞の潜在的重要性は、正常CMV血清反応陽性個体において特異的CD4+メモリー細胞が非常に高頻度(全CD4+T細胞の約2.0%)であることによっても示唆される(Waldropら、1998)。HIV感染におけるCD4+ T細胞不全とCMV病の程度の密接な関連もCMV再活性化の制御におけるCD4+T細胞の重大な役割と一致すると考えられる(Komanduriら、1998)。以下の5つの一般的タイプのCMV関連ワクチンが記載されている：弱毒生ウイルスワクチン、組換え生ウイルスワクチン、DNAワクチン、全タンパク質ワクチン、およびペプチドワクチン。弱毒生ウイルスワクチン、「Towne株」が開発され、1970年代に腎移植患者と出産可能な時期の女性で試験された。本ワクチンは免疫原性であることが示されたが、移植ポピュレーションにおける生ウイルスの使用は潜在的リスクが存在する。それほどではないにせよ、これは、ヒトにおける複製の可能性が限られた組換えポックスウイルス(アビポックス)についてもそういえる。動物モデルにおいて効果を発揮するアプローチは、CTLを誘導する手段として免疫原性タンパク質をコードするDNAベクターの導入を含む。細胞毒性が最小限のヘルパーT細胞エピトープを免疫源として用いることを含むDNAワクチン技術の改良はさらにより有効なワクチンを生じるかもしれない(Zaiaら、2000)。
【００４１】
抗ウイルス薬の負の副作用と費用が高いことをあわせて考えると、CMVワクチンに対する上記アプローチの限られた適用範囲/成功およびT細胞クローンの養子移植の効果の良さは、新規MHCクラスIおよびII制限T細胞エピトープを見いだす重要性を強調する。これらエピトープは最も一般的なHLA分子により提示され、個々のHLA背景に関わらず該ポピュレーションの大多数に防御をもたらすはずである。CMVは170-200オープンリーディングフレームを有する、既知の最も高いタンパク質コーディング能を有するウイルスの一つである(Reddehase、2000)。しかしながら、該ウイルスを明らかに制御する非症候性ドナーのT細胞反応の分析は、CMV pp65、pp150、IE-1、およびgBの免疫優性を証明することができた(Zaiaら、2000)。これは、おそらくMHCクラスIおよびII分子をロードしたペプチドの形成および脱出と干渉する種々の免疫抑制遺伝子の発現による。MHCクラスI分子の下方制御は、CMVpp65またはpp150特異的CTLによるCMV感染細胞の認識とほとんど干渉しないようである。このことは、これら2つの構造タンパク質が細胞質中に供給されるウイルスエントリー後きわめて早期に、免疫抑制ウイルス遺伝子の発現前にこれら構造タンパク質をプロセシングし、提示することができる事実により説明することができる。しかしながら、CMVpp65またはpp150特異的CTLは、MHCレベルがすでに減少している後の段階でも効率的に感染細胞を認識する。これは、宿主の対抗回避戦略(host counter evasion strategy)によるようである。CMV感染すると細胞遺伝子が導入され、これが、標的細胞がただ低ペプチド/MHC密度を発現する場合でもT細胞上のレセプターと結合し、T細胞活性化を促す(Zaiaら、2000)。他方、pp65がすべての次の免疫抑制遺伝子産物の活性化因子であるIE-1の提示と干渉するとの示唆があり(Reddehase、2000)、これはpp65抗原の免疫優性を説明すると思われる。すなわち、pp65特異的T細胞は、複製周期の全期でウイルス感染細胞を溶解することができ、in vivoで感染細胞を排除するのに必須かもしれない(Zaiaら、2000)。
【００４２】
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法により同定可能な、配列KMQVIGDQYVK、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、KYQEFFWDA、またはその組み合わせを含むポリペプチドからなる群から選ばれるT細胞エピトープも提供する。
【００４３】
本発明は、配列RLLQTGIHV、VIGDQYVKV、YLESFCEDV、またはその組み合わせを含むポリペプチドからなる群から選ばれるHLA A0201分子をMHC/HLA分子として用い、本発明の方法により同定可能なT細胞活性化能を有するHLA A0201結合エピトープも提供する。これら配列は、HLA A0201と結合することが知られているが、T細胞の活性化へのその有用性が本発明により提供される。
【００４４】
本発明は、さらにB7陰性である個体においてT細胞を活性化するための組成物を製造するための配列RPHERNGFTVを含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４５】
さらに、本発明はB35陰性である個体においてT細胞を活性化するための組成物を製造するための配列DDVWTSGSDSDEを含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４６】
本発明は、さらにB7陰性である個体においてT細胞を活性化するための組成物を製造するための配列TPRVTGGGAMを含むポリペプチドの使用を提供する。
【００４７】
これらの配列は特異的HLA制限を有すると記載されているが(RPHERNGFTV:B7、DDVWTSGSDSDE:B35、TPRVTGGGAM:B7)、これら配列が既知の制限(RPHERNGFTV:非B7、DDVWTSGSDSDE:非B35、TPRVTGGGAM:非B7)と異なる特異性を有することは驚くべきことであった。これらは、例えばこれら配列を記載されたもの以外のHLAを発現する個体に適したワクチンとして利用可能にすることによりこれら配列の有用性を広げることができる。
【００４８】
本発明は、さらに実施例の項の表3に従ってペプチドNo.55-64、109、383、384、421、449-454、469、および470から選ばれるクラスII HLA分子と結合するペプチドを提供する。
【００４９】
好ましくは、本発明のエピトープまたはペプチドは、さらに、N末端、C末端またはNおよびC末端に1〜30、好ましくは2〜10、特に2〜6個の天然のアミノ酸残基を含む。本発明の目的において、用語「天然の」アミノ酸残基は、エピトープまたはペプチドに関して特定の位置に天然のタンパク質中に存在するアミノ酸残基に関する。例えば、「AMAGASTSA」エピトープに関して、N末端の天然のアミノ酸残基はGlyであり、C末端の3個の天然のアミノ酸残基はGly-Arg-Lysである。したがって、「非天然の」アミノ酸残基は、該エピトープまたはペプチドに関して特定の位置の該アミノ酸残基と異なるアミノ酸残基である。
【００５０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のエピトープまたはペプチドは、さらに特にN末端、C末端、またはNおよびC末端に非天然のアミノ酸、好ましくは1〜1000、より好ましくは2〜100、特に2〜20個の非天然のアミノ酸を含む。非天然または天然のアミノ酸残基の組み合わせもこの特定の好ましい態様下で可能である。本発明のエピトープは、さらなるアミノ酸残基としてかまたは天然のアミノ酸残基の代わりに修飾アミノ酸(すなわち、20個の「古典的」アミノ酸と異なるアミノ酸残基、例えばD-アミノ酸またはCysのS-S結合物)を含んでいてもよい。
【００５１】
該エピトープのT細胞活性化能を改善するか、保存する、または少なくとも有意に妨げることのないアミノ酸置換により本発明のエピトープまたはペプチドから誘導されるエピトープまたはペプチドも本発明のエピトープまたはペプチドの範囲内であることは明らかである。したがって、本発明のエピトープまたはペプチドは、CMV pp65由来の最初の配列を含まないが、同じか、好ましくは改良されたT細胞反応を誘発するエピトープまたはペプチドにも及ぶ。これらエピトープは「ヘテロクリティック」と呼ばれる。これらには、最初のエピトープと同じT細胞をもたらすことができ、好ましくは、好ましくはin vivoまたはin vitroでもT細胞のより強力な活性化能を有するあらゆるエピトープを含む。
【００５２】
ヘテロクリティックエピトープは、理論的設計により、すなわち、例えばRamenseeら1999またはSturnioloら1999に記載の個々の残基のMHC/HLAとの結合への寄与を考慮し、潜在的にTCRと相互作用する残基の計画的置換と組み合わせ、得られた配列を最初のエピトープに対するT細胞を用いて試験して得ることができる。そのような設計は当業者が多大な実験を行うことなく可能である。
【００５３】
別の可能性には、最初のエピトープに対するT細胞によるペプチドライブラリーのスクリーニングが含まれる。好ましい方法は、合成ペプチドライブラリーの位置的スキャンニングである。そのようなアプローチは、例えばBlakeら1996およびHemmerら1999、およびその中に記載の参考文献に詳細に記載されている。
【００５４】
同族CMV pp65由来アミノ酸配列で示されるエピトープ、またはヘテロクリティックエピトープに代わるものとして、これらエピトープによく似た配列、例えば「ペプチドミメティカ」または「レトロ-インバーソ-ペプチド」も適用できる。
【００５５】
改良されたエピトープを設計する別の局面は、T細胞を刺激する能力を増大させる物質を用いるそれらの製剤化または修飾である。これらには、WO 01/78767に記載のTヘルパー細胞エピトープ、脂質、またはリポソーム、または好ましい修飾が含まれる。
さらなる局面において、本発明はサイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのHLA制限ワクチンを製造するための本発明のエピトープまたはペプチドの使用に関する。
【００５６】
エピトープのT細胞刺激能を増大する別の方法は、免疫刺激物質、例えばサイトカインまたはケモカイン、例えばインターロイキン-2、-7、-12、-18、クラスIおよびIIインターフェロン(IFN)、特にIFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3-リガンドなどを用いるそれらの製剤化である。
【００５７】
本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのワクチンを製造するための配列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、および/またはKYQEFFWDAを含むエピトープの使用も含む。
【００５８】
したがって、本発明は、配列KMQVIGDQYV、FTWPPWQAGI、AMAGASTSA、SDNEIHNPAV、および/またはKYQEFFWDAを含むエピトープを含むサイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのワクチンも含む。さらに、本発明のエピトープまたはペプチドを含むサイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのHLA特異的ワクチンも本発明の局面である。本発明のペプチドをコードする対応する核酸の応用、例えばDNAワクチンは、少なくともクレームしたペプチドワクチンの等価物として本発明の範囲内にある。
【００５９】
Parkerら(1994)は、個々のペプチドの結合の実験的データに基づくMHCクラスI分子に結合するペプチドの予測方法を示している。ペプチド結合能は、β2-ミクログロブリン(β2m)のHLA-A2/β2mペプチドヘテロダイマー複合体への結合を促進するペプチドの能力をモニターすることにより間接的に評価した。実験データ(β2mの解離速度の測定)から、HLA-A2分子との複合体におけるあらゆるノナペプチドに対する理論的結合安定性の計算に用いられる対応する係数の値を得ることができる。この試験において、CMV pp65由来ペプチド配列RLLQTGIHVは、HLA-A2/β32m/ペプチド複合体を安定化することができる。
【００６０】
Morganら(1998)は、β2mのHLA/ペプチド複合体への結合の間接的測定に基づく精製HLA分子に対するペプチドの結合親和性の測定方法を記載している。この試験において、RLLQTGIHVペプチドのin vitro結合が証明され、そのHLA-2分子に対する相対結合親和性(結合および解離定数)が測定された。
【００６１】
HLA-A2に対する結合はParkerらおよびMorganらにより示されるが、このリガンドが真のT細胞エピトープを表すことの最終的証拠はなく、一方、本発明では、これは、RLLQTGIHVがHLA-A2と結合するのみならず、機能的T細胞も誘導することができることを証明するインターフェロン-γELIspotにより証明されている。これはささいな知見ではなく、高親和性で結合する多くのリガンドは、例えば前記「抗原プロセシングおよび提示」経路を介して生じないかまたは十分には生じないためT細胞標的を表さないことは当該分野でよく知られている。したがって、RLLQTGIHVのHLA A0201結合活性は、驚くべきことであるだけでなく、例えばある種の対立遺伝子ポピュレーションに対して特異的に設計されたワクチンに選択的に用いることができよう。
【００６２】
好ましくは、さらに本発明のそのようなワクチンは、好ましくはポリカチオニック物質、特にポリカチオニックポリペプチド、免疫調節核酸、特にデオキシイノシンおよび/またはデオキシウラシル含有オリゴデオキシヌクレオチド、またはその混合物からなる群から選ばれる免疫調節物質を含む。
【００６３】
好ましくは、該ワクチンはさらにポリカチオニックポリマー、好ましくはポリカチオニックペプチド、特にポリアルギニン、ポリリジン、または抗菌ペプチドを含む。
【００６４】
本発明に用いるポリカチオニック化合物は、WO 97/30721記載の特徴的効果を示すあらゆるポリカチオニック化合物であってよい。好ましいポリカチオニック化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸、またはその混合物から選ばれる。これらのポリアミノ酸は、少なくとも4アミノ酸残基の鎖長を有するべきである。特に好ましいのは、アミノ酸残基が8以上、特に20以上の範囲の、20%以上、特に50%以上の塩基性アミノ酸を含むポリリジン、ポリアルギニン、およびポリペプチドの様なペプチド結合を含む物質、またはその混合物である。他の好ましいポリカチオン、およびその医薬組成物は、WO 97/30721(例えばポリエチレンイミン)およびWO 99/38528に記載されている。好ましくは、これらのポリペプチドは、20〜500アミノ酸残基、特に30〜200残基を含む。
【００６５】
これらポリカチオニック化合物は、化学的にもしくは組換えにより製造するか、または天然供給源から得ることができよう。
【００６６】
カチオニック(ポリ)ペプチドは、ポリカチオニック抗菌ペプチドであってもよい。これらの(ポリ)ペプチドは、原核性または動物もしくは植物由来であるか、化学的もしくは組換え的に製造することができよう。ペプチドはデフェンシンのクラスに属するかもしれない。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシンも本発明のポリカチオニックポリマーの好ましい形である。一般的に、最終産物として好ましくはAPC(樹状細胞を含む)が介在する養子免疫系の活性化(または下方制御)をもたらす化合物は、ポリカチオニックポリマーとして用いられる。
【００６７】
本発明のポリカチオニック物質として用いるのに特に好ましいのは、カテリシジン由来抗菌ペプチドまたはその誘導体(A 1416/2000、本明細書の一部を構成する)、特に哺乳動物、好ましくは、ヒト、ウシ、またはマウス由来のカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または神経活性化合物、例えば(ヒト)成長化合物(例えばWO 01/24822に記載の)である。
【００６８】
天然供給源由来のポリカチオニック化合物には、HIV-REVまたはHIV-TAT(由来カチオニックペプチド、アンテナペディアペプチド、キトサン、またはキチンの他の誘導体)、またはこれらのペプチド由来の他のペプチド、または生化学的または組換え生成によるタンパク質が含まれる。他の好ましいポリカチオニック化合物は、カテリン、またはカテリン関連または誘導物質、特にマウス、ウシ、または特にヒトカテリン、および/またはカテリシジンである。関連または誘導カテリン物質は、少なくとも15〜20アミノ酸残基を有するカテリン配列の部分またはすべてを含む。誘導体化には、20の標準アミノ酸でないアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾が含まれよう。さらに、さらなるカチオニック残基をそのようなカテリン分子に導入してよい。これらカテリン分子は本発明の抗原/ワクチン組成物と混合することが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は、驚くべきことにさらなるアジュバントを加えることなく抗原用のアジュバントとしても有効であることがわかってきた。したがって、そのようなカテリン分子をさらに免疫活性物質を含むか含まないワクチン製剤において有効なアジュバントとして用いることができる。
【００６９】
本発明に用いる別の好ましいポリカチオニック物質は、3〜7個の疎水性アミノ酸のリンカー、特にLにより分けられる少なくとも2のKLKモチーフを含む合成ペプチドである(例えば、KLKL5KLK; PCT/EP01/12041、本明細書の一部を構成する)。
【００７０】
本発明で用いる免疫調節(または免疫原性)核酸は、合成、原核性、および真核性起源であり得る。真核性起源の場合、DNAは系統発生樹に基づきより下等な種(例えば昆虫など)由来であるべきである。本発明の好ましい態様において、免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、合成的に製造されたDNA分子またはそのような分子の混合物である。ODNの誘導体化または修飾、例えば、米国特許US 5,723,335およびUS 5,663,153に記載のチオホスフェート置換類似体(ホスフェートをチオホスフェート残基で置換)、および好ましくは免疫刺激組成物を安定化するがその免疫特性は変化しない他の誘導体および修飾物も含まれる。好ましい配列モチーフは、2つの5’プリンおよび2つの3’ピリミジンと隣り合った(非メチル化)CpGジヌクレオチドを含む6塩基のDNAモチーフである(5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3')。本発明のODNに含まれるCpGモチーフは、より高等な脊椎動物のDNAより微生物のDNAにより一般的であり、メチル化のパターンの違いを表現する。驚くべきことに、マウスAPC刺激配列は、ヒト細胞にあまり有効ではない。本発明で用いる好ましい反復性または非反復性ODNは、例えばオーストラリア特許出願A 1973/2000、A 805/2001、EP 0468520 A2、WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/37919、WO 98/40100、WO98/52581、WO 98/52962、WO 99/51259、およびWO 99/56755(すべて本明細書の一部を構成する)に記載されている。免疫系の刺激以外に、ある種のODNはある免疫反応を中和する。これら配列も、例えば自己免疫病治療のための用途で本発明に含まれる。ODN/DNAは化学的または組換え的に生成するか、または天然供給源由来であってよい。好ましい天然の供給源は昆虫である。
【００７１】
あるいはまた、イノシンおよびシチジンに基づく核酸(例えばPCT/EP01/06437に記載)、またはデオキシイノシンおよび/またはデオキシウリジン残基を含むデオキシ核酸(オーストラリア特許出願A 1973/2000およびA805/2001に記載、本明細書の一部を構成する)も、本発明の免疫刺激性核酸として用いるのが好ましいかもしれない。
【００７２】
もちろん、種々の免疫原性核酸の混合物も本発明にしたがって用いることができよう。
【００７３】
好ましくは、本発明はさらに医薬的に許容される担体を含む。
【００７４】
さらなる好ましい態様では、本発明のワクチンは、ペプチド、ペプチド類似体、タンパク質、裸DNA、RNA、ウイルスベクター、ウイルス様粒子、組換え/キメラウイルス、タンパク質/ペプチド/RNAでパルスするかまたはエピトープまたはペプチドを含むDNAでトランスフェクトした組換え細菌または樹状細胞から選ばれる形で提供されるエピトープまたはペプチドを含む。
【００７５】
さらなる局面において、本発明は、本発明のあらゆるエピトープまたはペプチド、特に上記CMVエピトープを特異的に認識するT細胞、T細胞クローンまたはT細胞ポピュレーション(調製物)に関する。そのようなT細胞の好ましい適用は、そのin vitroでの増殖、および例えば養子移植による患者の治療への使用である。したがって、本発明は、CMV患者の治療用組成物を製造するためのT細胞、T細胞クローンまたはT細胞ポピュレーション(調製物)の使用も提供する。
【００７６】
本発明の該T細胞(クローンまたは系)、具体的には前記CMVペプチドを認識するものは、最初に同定されたエピトープと異なるが、該T細胞を誘発する(trigger)ヘテロクリティックエピトープを同定するのにも有用である。
【００７７】
本発明の該細胞、組成物、またはワクチンは、有効量で個体に投与される。
【００７８】
以下の実施例および図面により本発明をさらに詳しく説明するが、これにより限定されるものではない。
【００７９】
図1は、可溶性DR4分子に対するペプチド結合親和性を示す；
図2は、エンプティDR4分子と結合することができるペプチドの同定を示す(A. HLA-ペプチド複合体の精製; B. 結合ペプチドのMS分析；
図3は、過剰の、DR4分子に低親和性のペプチドの存在下における高親和性ペプチドの結合を示す;
図4は、DR4分子に対する個々のペプチドおよびペプチド混合物の結合を示す；
図5は、(5a)単離CD4+T細胞およびDR0401分子(抗CD28で同時刺激)、および(5b)単離CD8+T細胞およびHLA A0201分子(抗CD28mabで同時刺激)によるElispotを示す；
図6は、CMV pp65ペプチドプールアレイを示す；
図7は、(7a)pp65タンパク質由来ペプチドプールのDR4分子との結合、および(7b)単一pp65ペプチドのDR4分子との結合を示す；
図8は、ペプチド混合物(各21ペプチド含有、ドナー#10736 HLA A2/3、HLA B15/35; 8a)による第一スクリーニング、およびペプチド混合物(各21ペプチド含有、ドナー#10687 HLA A2/11、HLA B7/13; 8b)による第一スクリーニングを示す；
図9は、単一ペプチド(ドナー#10736 HLA A2/3、HLA B15/35)による第二スクリーニングを示す；
図10は、CMVpp65 15マー57、59、およびコントロール(med: ペプチドなし、HIV: 無関係なHIV由来ペプチド、ConA: ポリクローナル刺激)を用いるIFN-γ ELIspotを適用した対象10788からのPBMCを示す；
図11は、細胞内IFN-γ染色によるCMVpp65 15マー469、470に対する同時CD4+およびCD8+T細胞反応の確認を示す；
図12は、IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す:最終ワクチン接種の1週間後、脾臓を除去し、細胞を関連ペプチド(no.1500-1505)、オーバーラッピング15マーを表すこれらのより長いペプチド、および無関係なインフルエンザヘマグルチニン由来ペプチド(no.1171)でex vivoで活性化し、IFN-γ産生特異細胞を測定する(培地コントロールを引く)。
【実施例】
【００８０】
実施例の一般的説明：
本実施例は、特異的病原タンパク質、CMVのpp65に対する本発明の成績を示す。
【００８１】
第一部では、「エンプティHLA分子」の使用に基づく本発明の方法を適用した。これら分子を潜在的CMV由来ペプチドリガンドの混合物とインキュベーションし、特異的結合事象をスクリーニングした。このようにして形成された複合体を単離し、特異的に結合したリガンドを同定するために使用した。非常に複雑な混合物を用いる可能性により、数100または数1000の潜在的リガンドからわずかな結合物質を非常に速やかに同定することができる。これはHLA-DRB1*0401およびオーバーラッピング15マーのプールを用いて証明される。
【００８２】
しかしながら、同じ方法は、クラスI分子、および適切な長さ、すなわち8〜11マーのペプチドに適用することができる。リガンドプールは合成オーバーラッピングペプチドでありうる。別の可能性は、該抗原を酵素的または非酵素的に消化することである。アルカリ加水分解により達成される後者は、すべての潜在的分解産物を生じ、T細胞エピトープの同定にうまく用いられている(Gavin 1993)。酵素的消化はプロテアーゼを用いて行うことができる。ある合理的方法は、さらにクラスI制限エピトープについてはプロテオソーム(Heemels 1995)またはクラスII制限エピトープについてはカテプシン(Villadangos 2000)のような天然の抗原プロセシング経路に関与するプロテアーゼを用いることであろう。リガンドプールは、例えば、各エピトープを保持する細胞の溶解または該細胞からの溶出により得ることができる天然リガンドからなるかもしれない。これに関して、例えば糖脂質のような非ペプチドリガンドを適用しうることに注意することが重要である。MHC(例えばHLA-G、HLA-E、MICA、MICB)によりコードされ得るかまたはMHC外部(例えばCD1ファミリー)にあり得る非古典的クラスI分子はリンパ球に対する種々の非ペプチドリガンドをもたらしうることが知られている(Kronenberg 1999)。組換え「エンプティ」非古典的クラスI分子の使用は、本明細書の記載と同様にして結合反応および結合物質の同定を可能にするだろう。
【００８３】
HLA分子と結合することができるリガンドを速やかに同定した後、本発明の方法はこれら結合物質に対する特異的T細胞反応を直接特徴づける方法も提供する。一つの可能性は、いわゆる「合成T細胞アッセイ」に単離HLA:リガンド複合体を直接用いることである。後者は、活性化抗体によるCD28の活性化のような同時刺激をもたらす第二シグナルとともに、HLA:リガンド複合体によるT細胞の抗原特異的再刺激を含む。本アッセイは実施例IIに示すELIspot計測値を用いて行うことができる。
【００８４】
ここで、それぞれのペプチドがその前駆体と15aaのうち14aaがオーバーラップする一連のオーバーラッピング15マーペプチドとしてCMV pp65を合成するために選択された。該ペプチドを21単一ペプチドのプールとして適用し、各単一ペプチドが正確に2プール生じるように構築された。マトリックス形中のペプチドプールのアレイにより、横列および縦裂混合物の交差点として単一ペプチドを同定することができる(図6)。ドナーとして、MHCクラスI分子 A2を発現する10の健康CMV血清反応陽性血液ドナーを選んだ。このMHCの選択は、pp65抗原がこのMHC分子を保持するドナーにより特によく認識されることが知られているので推測された(Saulquinら、2000; Kernら、2000)。
【００８５】
平行して同じペプチド(プール)をCMV血清反応陽性個体由来の末梢血単核細胞(PBMC)(SDS安定性アッセイにおいて可溶性組換えHLA-クラスII分子と結合する)を用いるインターフェロンγ(IFN-γ)ELIspotアッセイによりスクリーニングした。両アプローチで得られたエピトープは、HLAの選択により偏らないが(ex vivo T細胞アッセイアプローチではクラスI HLA-A2、ペプチド結合アプローチではクラスII HLA-DR4)ある程度のオーバーラップを示した。
材料と方法
ペプチド
【００８６】
CMV pp65抗原の完全配列を示す14aaがオーバーラップした547の15アミノ酸残基(15マー)をSyro II合成装置(Multisyntech、Witten、Germany)で合成した。288ペプチドを標準F-moc化学を用いて同時に作製した。
【００８７】
各ペプチドを100% DMSOを用い〜10mg/mlで可溶化する。42のpp65由来ペプチドプールのストックを100% DMSOを用い各ペプチドにつき最終濃度0.45mg/mlで作製する。
【００８８】
その他のペプチドは、SyroII合成装置またはABI 433A合成装置(Applied Biosystems、Weiterstadt、Germany)を用いる標準F-moc化学を用いて合成し、C18カラム(ODS ACU(YMC)または218TP(Vydac))を用いるRP-HPLC(Biocut 700E、Applied Biosystems、Langen、Germany)により精製した。各ペプチドの純度および同定は、Reflex III質量分析器(Bruker、Bremen、Germany)を用いるMALDI-TOFにより特徴づけられた。
ペプチド結合アッセイ
【００８９】
可溶性HLAクラスI A*0201およびHLAクラスII DRA1*0101/DRB1*0101/Ii、DRAl*0101/DRBl*0401/Ii、およびDRAl*0101/DRBl*0404/Ii分子をSC-2細胞中に発現させ、Aichingerら、1997に記載のごとく精製した。
【００９０】
特に示さない限り、ペプチド結合反応では、HLA分子を0.5μMの濃度で用い、各単一ペプチドを10倍モル過剰(5μM)で加えた。結合反応中のDMSO濃度は4%以下であった。プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)および0.1%オクチル-b-D-グルコピラノシド(Sigma)存在下のPBS緩衝液(pH7.4)中で室温にて48時間反応を行った。
【００９１】
ペプチド結合は、SDS安定性アッセイ(Gorgaら、1987)を用いて評価した: 三量体HLAクラスII ab-ペプチド複合体はSDS抵抗性であるため、SDS-PAGEウエスタンブロット分析で〜60kDaバンドとして出現する。高親和性に中間体と結合するペプチドにより安定化しない個々のHLAクラスIIαおよびβ鎖は、それぞれ〜35kDaおよび〜30kDaバンドとして移動する。
【００９２】
簡単には、HLA-ペプチド複合体を室温で1%SDSで処理し、SDS-PAGEにて室温で約2.5時間20mAで分離した。タンパク質をエレクトロブロッティングでPVDF膜上に移し、抗a鎖TAL.1B5αおよび/またはβ鎖 MEM136抗体で染色した。ウエスタンブロットシグナルの検出にはECL溶液(Amersham)を用いた。
【００９３】
DRB1*0701およびDRB1*1101に対する結合親和性は、ペプチド競合アッセイ(Reayら、1992)により試験した。簡単には、ビオチニル化CLIP ペプチド(標準ペプチド)の結合をHLA:ペプチド複合体形成のモニターに用いた。CLIPペプチドと等モル濃度で結合反応に加えた被検ペプチドは、その親和性が高ければCLIPと競合し得るか、またはその親和性がCLIPの親和性と等しい場合は結合を50%阻害する。低親和性ペプチドの場合は、それを標準ペプチドに過剰に加えてHLA結合グローブの占有に競合させるべきである。標準ペプチドの結合を50%阻害するのに必要な競合ペプチドの濃度(IC50)をペプチド結合親和性の評価に用いることができる。あるいはまた、競合ペプチドの存在下または非存在下でHLA分子と結合した標準ペプチドの量を比較することにより目的とするペプチドの結合活性を決定することができる。
【００９４】
本発明のペプチド競合アッセイにおいてペプチド結合の条件は上記と同様であった。可溶性HLA分子を0.5μMの濃度で用い、ビオチン化CLIPをすべての試料に2μMの最終濃度で加えた。競合ペプチドを異なる3濃度、0.25、5、および10μMで加えた。結合反応をPBS緩衝液(pH7.4)中で37℃で18時間行った。可溶性HLA分子と結合したビオチン化CLIPmの量をELISAで測定した。簡単には、MaxiSorb 96ウェルプレート(Nunc、Denmark)をPBSで10μg/mlに希釈したマウス抗αβ抗体L243(ATCC HB-55から精製)50μlで4℃で一夜インキュベーションしてコートした。プラスチックへの非特異結合は、37℃で2時間、3% BSA含有T-PBSとインキュベーションしてブロックし、次いで、結合反応を室温で2時間記録した。プレートをT-PBSで広範に洗浄した後、HLA結合ペプチド複合体を、アルカリホスファターゼ-ストレプトアビジンコンジュゲート(Dako)およびSigma104ホスファターゼ基質(Sigma Diagnostics、USA)を用いて比色分析で検出した。405nmの光学密度をマイクロプレートリーダーSUNRISE(Tecan)で測定した。
HLA-ペプチド複合体からのペプチドの同定
【００９５】
可溶性HLA分子とのペプチド結合反応後、HLAペプチド複合体をSuperdex-200カラム(AEKTAdesign、Amersham Pharmacia Biotech)を用いるゲルろ過クロマトグラフィにより遊離ペプチドから分離した。HLA含有分画を回収し、結合ペプチドをTFAを最終濃度1%に加えて該複合体から再構成した。ペプチドをZiptip精製により脱塩し、MALDI-TOF質量分析法で分析した。
合成Elispot(エリスポット)アッセイ
【００９６】
96ウェルろ過プレート(Millipore、カタログ番号：MAHAS4510)を、1μg/ウェル 抗ヒトIFN-γ mab B140(Bender Med Systems)および0,5μg/ウェル QIAexpress Penta.His抗体(Qiagen)の混合物で4℃で一夜コートした。CD8+T細胞の生存およびサイトカイン産生の陽性コントロールとしていくつかのウェルを抗CD3抗体、クローンMEM-57(V.Horejsi、Institute of Molecular Genetics、Pragから得た)でコートした。
【００９７】
プレートをPBS(GIBCOBRL、カタログ番号14190-094)で2回洗浄し、下記ELISPOT培地：1mMピルビン酸ナトリウム(GIBCOBRL、カタログ番号：11360-039)、2mM L-グルタミン(GIBCOBRL、カタログ番号：25030-024)、0,1mM非必須アミノ酸(GIBCOBRL、カタログ番号：11140-035)、50μg/mlゲンタマイシン(GIBCOBRL、カタログ番号：15710-049)、50μM 2-メルカプトエタノール(GIBCOBRL、カタログ番号：31350-010)、および10%ヒトAB型血清(BioWhittaker、カタログ番号：14-490E)を添加したRPMI1640(GIBCOBRL、カタログ番号：31870-025)で37℃30分間ブロックした。
【００９８】
ブロッキング培地を除去後、ウェルを、ELISPOT培地で100μg/ml(10μg/ウェル)に希釈したM.tuberculosis由来のペプチド1242、インフルエンザヘマグルチニン由来のペプチド1171(HA-pep：aa306-318)またはC型肝炎ウイルス由来の陰性コントロールペプチド84(HCV-pep: NS3aa1248-1261)をロードした可溶性HLA DRB1*0401と37℃で5時間インキュベーションした(図5a)。図5bでは、EBV抗原BMLF1 aa280-88由来ペプチド、インフルエンザマトリックスタンパク質aa 58-66由来ペプチド21、または陰性コントロールとしてHIV逆転写酵素aa476-484由来ペプチド90をロードした可溶性HLA A*0201分子を用いた。分子のローディングは、実質的に「ペプチド結合アッセイ」の項に記載のごとく行った。
【００９９】
HLA表現型が一致した健康なBCGワクチン接種HIVおよびHCV陰性ドナーの末梢血(PBMC)由来の単核細胞をLeuco Sepチューブ(Greiner)を用いLymphoprep(Nycomed Pharma AS、Oslo、Norway)で単離し、PBS(GIBCOBRL、カタログ番号14190-094)で3X洗浄した。
【０１００】
CD4+T細胞(図5a)またはCD8+T細胞(図5b)を、MACS技術(Miltenyi、Germany)を用い、製造業者の指示書に従ってPBMCから単離した。単離T細胞を10μg/ml抗CD28モノクローナル抗体(クローン37407.111、mab342、R & D systems)を含むELISPOT培地に1Mio/mlの濃度で再浮遊させた。
【０１０１】
可溶性HLA(sHLA)分子を含む溶液を捨て、単離T細胞をウェルに播いた。各試料に5μM(図5a)または10μg/ml(図5b)のペプチドを再添加した。
【０１０２】
細胞をsHLA分子と共に20時間培養した。内容を除去し、洗浄用緩衝液(PBS; 0,1% Tween 20、SIGMA)で6X洗浄してアッセイを止めた。次に、1：10000希釈のビオチニル化抗ヒトIFN-γmab(B308-BT2、BMS) 100μl(0.015μg/ウェルに相当する)を加え37℃で2時間、または4℃で一夜インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジン-ALP(DAKO、カタログ番号：D0396) 1,2μg/mlを37℃で1時間加えた。100μl/ウェル BCIP/NBTアルカリホスファターゼ基質(SIGMA、カタログ番号:B-5655)を加えてアッセイを発現させた。
【０１０３】
Elispotリーダー(Bioreader 2000、Biosys、Germany)で直径130μm〜2000μmのサイズ範囲のスポットをカウントした。自発的に生じたIFN-γスポットの平均数を陰性コントロール試料(HCVまたはHIVペプチド)から推定した。陰性コントロール試料の標準偏差値の2Xを加えた平均自発的INF-γ放出を超えるすべての反応を有意と見なした。
【０１０４】
9人のCMV血清反応陽性HLA A2健康ボランティアのCMV pp65抗原PBMCに対するT細胞反応をスクリーニングするためのPBMCの回収、製造、および凍結保存は本スクリーニングに含まれた。HLAクラスIAおよびBに対するこれらドナーのHLA情報は利用可能であったが、HLAクラスIcおよびHLAクラスIIについては利用できなかった。
【０１０５】
全血をACD Vacutainerチューブ(BectonDickinson、Europe)に回収した。PBMCをLymphoprep(Nycomed Pharma AS、Oslo、Norway)およびLeuco Sepチューブ(Greiner)を用いて全血から分離し、PBS(GIBCOBRL、カタログ番号14190-094)で3X洗浄し、下記凍結用培地に20Mio c/mlの濃度で再浮遊させた： 1mMピルビン酸ナトリウム(GIBCOBRL、カタログ番号：11360-039)、2mM L-グルタミン(GIBCOBRL、カタログ番号：25030-024)、0,1mM非必須アミノ酸(GIBCOBRL、カタログ番号：11140-035)、50μg/mlゲンタマイシン(GIBCOBRL、カタログ番号：15710-049)、50μM 2-メルカプトエタノール(GIBCOBRL、カタログ番号：31350-010)添加RPMI1640(GIBCOBRL、カタログ番号：31870-025) 4部；ウシ胎児血清(FCS)(PAA、カタログ番号:All-042)5部;使用前にDMSO(SIGMA cell culture、カタログ番号 D2650)1部を加えた。
【０１０６】
PBMCを-80℃で凍結容器(Nalgene 1℃凍結容器、カタログ番号 5100-0001)に一夜保存し、次いで液体窒素容器中に移した。
単一細胞のヒトIFN-γ放出のELISPOTアッセイ：凍結PBMCからのpp65特異的エフェクターの検出
【０１０７】
アッセイは実質的にLalvaniらに記載のごとく行った。簡単には、マルチスクリーン96ウェルろ過プレート(Millipore、カタログ番号：MAHAS4510)を、10μg/ml抗ヒトIFN-γ mab B140(Bender Med Systems)(1μg/ウェル)で4℃で一夜コートした。プレートをPBS(GIBCOBRL、カタログ番号14190-094)で2回洗浄し、下記ELISPOT培地：1mMピルビン酸ナトリウム(GIBCOBRL、カタログ番号：11360-039)、2mM L-グルタミン(GIBCOBRL、カタログ番号：25030-024)、0,1mM非必須アミノ酸(GIBCOBRL、カタログ番号：11140-035)、50μg/mlゲンタマイシン(GIBCOBRL、カタログ番号：15710-049)、50μM 2-メルカプトエタノール(GIBCOBRL、カタログ番号：31350-010)、および10%ヒトAB型血清(BioWhittaker、カタログ番号：14-490E)を添加したRPMI1640(GIBCOBRL、カタログ番号：31870-025)で37℃30分間ブロックした。
【０１０８】
凍結保存PBMCを37℃水浴中で急速に解凍し、ELISPOT培地で2回洗浄した。解凍後、PBMCを2時間インキュベーター(37℃、5%CO2)中においた。このインキュベーション後、細胞を70μm細胞ろ過器(Falcon)でろ過し、2Mio/mlの濃度に調整し、200.000 PBMC/ウェルで播いた。
【０１０９】
PBMCは、各単一ペプチドを最終濃度5μg/mlで含むペプチドプールまたは最終濃度10μg/mlの個々のペプチドと20時間同時培養した。アッセイコントロールとしてConcanavalin(コンカナバリン)A(SIGMA)によるIFN-γ分泌のポリクローナル誘導を用いた。自発的IFN-y放出をPBMCと培地のみをインキュベーションするか、または(HIV陰性ドナーのみをスクリーニングしたので)HIV由来のHLA 0201制限CTLエピトープ(HIV逆転写酵素、aa476-484: ILKEPVHGV)を加えることにより測定した。陽性コントロールとしてしばしばInfluenza Matrixprotein由来HLA A 0201制限CTLエピトープを認識するペプチド(aa58-65:GILGFVFTL)およびEBV BMLF1抗原(aa280-288:GLCTLVAML)をスクリーニングに含めた。
【０１１０】
アッセイはパラグラフ「合成Elispotアッセイ」に記載のごとく発現させた。
HLAトランスジェニックマウスの免疫
【０１１１】
第一セットの免疫原性実験において、候補エピトープ配列を組み込んだより長い合成ペプチドを以下のごとくHLA-DRBl*0401トランスジェニックマウスに注射した：マウス3匹(雌マウス、8週齢)の群に、後足蹠(合計でペプチド300μgおよびCpG1668 5ナノモル/マウス)に一度皮下注射した。
【０１１２】
第二セットのエピトープマッピング実験において、合成CMV由来ペプチドを以下のごとくHLA-DRBl*0401トランスジェニックマウスを用いて試験した：マウス6匹(雌マウス、8週齢)の群に、脇腹に1週間間隔で3回(合計でペプチド100μg、およびCFA 50μl(1回)、IFA 50μl(2回)/マウス)皮下注射した。
【０１１３】
第三セットのエピトープマッピング実験において、合成CMV由来ペプチドを以下のごとくHLA-DRBl*0401トランスジェニックマウスを用いて試験した：マウス8匹(雌マウス、8週齢)の群に、後足蹠(ペプチドno.1500について合計でペプチド300μgおよびCpG1668 5ナノモル/マウス、ならびに同量のペプチドno.1503およびNo.1504およびIFA 50μl/マウス)に一度皮下注射した。
ネズミ脾細胞の単離およびCD4+/CD8+T細胞の分離
【０１１４】
脾細胞を最終注射後第7日に除去し、各群ごとに一緒にプールした。単一細胞浮遊液を調製するため脾臓を5% FCS 2mmole L-グルタミン、50μg-mlゲンタマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、0.1% 2-メルカプトエタノール、および1%非必須アミノ酸(PAA Laboratories、Linz、Austria) 添加DMEM培地(完全培地)中で粉砕し、70μm細胞ろ過器でろ過した。細胞を完全培地で洗浄し(1200rpm、10分間)、ペレットを赤血球溶解用緩衝液(Sigma-Aldrich)に再浮遊させ、2分間インキュベーションして赤血球を除去した。洗浄後、細胞をKOVA Glassticスライド(Hycor、Biomedical INC.)でカウントし、完全培地で濃度を1x107; 3.3x106、および1.1x106細胞/mlに調整した。
【０１１５】
潜在的エピトープのクラスIまたはクラスII制限を検討するため、ネズミ脾臓の全細胞を、miniM-ACSおよびmidiMACSカラムおよび抗CD4および抗CD8磁気ビーズを用いるMACS分離系(Miltenyi Biotec、Germany)を供給業者の推奨する方法に従って用いCD4+およびCD8+ポピュレーションに分離した。CD4+およびCD8+ポピュレーションの純度を以下に簡単に記載した染色後にFACS分析により測定した：全脾細胞から細胞2x105個の部分標本のCD4+およびCD8+分画を抗CD8-PE(53-6-7)および抗CD4-FITC(RM4.4)抗体(PharMingen)で室温で15分間染色した。洗浄後、試料をFACS CALIBUR(Bacton Dickinson)で分析した。ナイーブDRB1*0401トランスジェニックマウスから得た脾細胞を、実験試料と同じ方法、およびさらにアイソタイプコントロール抗体で染色し、一重および二重染色試料でFACS CALUBURの設定を調整した。
ネズミ脾細胞からのIFN-γ放出のELISPOTアッセイ
【０１１６】
ELISPOTアッセイプレート(MAHA S4510、Millipore、Germany)をPBS(200μ1-ウェル)で洗浄し、抗マウスIFN-ガンマ(INF-y)mAb(クローンR46A2、ATCC、Manassas、VAより購入；0.1M NaHCO3(pH9.2-9.5)中1μg/mlを50μl-ウェル)でコートし、4℃で一夜インキュベーションした。プレートを0.1%Tween-20を含むPBSで4回洗浄し、次いで1%BSA添加PBS(200μl/ウェル)でインキュベーションして非特異結合をブロックした。細胞を総量1x106および3.3x105および1.1x105細胞/ウェル(100μl)で播き、容量100μlの種々の刺激物質：ワクチン接種に用いる長鎖ペプチドもしくはより長いペプチド由来のオーバーラッピング15マー、またはワクチン接種に用いない無意味なペプチドHA306-318(no.1171)、または培地コントロールのいずれかを10μg/ml(最終濃度)に細胞を含むウェルに個々に加えて37℃/5%CO2で一夜インキュベーションした。次に、プレートを4回洗浄し、ビオチニル化抗マウスIFN-γmAb(クローンAN18.17.24、ATCC、Manassas、VAから購入；PBS/1% BSA中の2μg/mlを1OOml/ウェル)と37℃で2時間インキュベーションした。洗浄後、PBS中の1：5000希釈ストレプトアビジン-パーオキシダーゼ(Roche Diagnostics、Vienna、Austria)100μl/ウェルを加え、次いでプレートを37℃でさらに1時間インキュベーションした。次に、プレートをPBS/0.1% Tween-20で4回洗浄し、基質(200μlの40mg/ml DAB、50mlの80mg/ml NiCl2、および5μlの30% H2O2を添加した10mM Tris(pH7.5)；10ml)100μl/ウェルを加えた。20〜30分後にプレートを水道水で洗浄して反応を止めた。乾燥プレートをBIOREADER 2000(BioSys、Karben、Germany)およびMICROSOFT OFFICE EXCELプログラムを用いて分析した。
(実施例I)
ペプチド混合物からのエピトープの捕捉および質量分析による同定
【０１１７】
本実施例では、比較的単純なペプチド混合物からHLAクラスII分子に結合する高親和性ペプチドを捕捉する能力を証明する。
【０１１８】
第一に、いくつかの個々のペプチドの可溶性DRb1*0401分子に対する結合親和性を直接結合アッセイで検出した(図1)。ペプチド親和性は、SDS安定性アッセイを用い、よく知られた「強い」結合物質のYARおよびHA306-318(Valliら(1993))の結合と比較して高いまたは低いと定義した(表1)。1242ペプチドの結合親和性は最も高く、YARペプチドの親和性と同程度と考えられた。
【０１１９】
第二に、2つの高親和性リガンドの混合物からHLAクラスII分子を結合するペプチドを捕捉する能力を試験した。結合反応物は、1μMの可溶性DRB1*0401分子および5μMの各YARおよび1242ペプチドを含んだ。HLA-ペプチド複合体を形成し、次いでこれをゲルろ過クロマトグラフィにより過剰の遊離ペプチドから分離した。MHC分子を含む分画を回収した。結合ペプチドを該複合体から溶出し、質量分析により分析した。リードアウト(表示値)として、試験した両高親和性リガンドはMHC分子との複合体中にみられた(図2)。
【０１２０】
第三に、高親和性リガンドの結合能が過剰の低親和性ペプチドにより影響を受けるかについて試験した。この目的で、一定量(100μM)の低親和性ペプチド1236の存在下で、1242ペプチドに対して1236が2〜20倍過剰となるように5〜50μMの濃度で加えた1242ペプチドと1μM DRB1*0401分子の結合反応を行った。ペプチド結合をSDS安定性アッセイで評価し、MS分析により確認した(図3)。この実験は、20倍モル過剰の低親和性ペプチドが高親和性リガンドとの安定なMHC複合体の形成を妨げないことを示す。
【０１２１】
最後に、種々の結合親和性の10ペプチドのプールの結合を試験した(表1参照)。結合反応中の各ペプチドの最終濃度は、1236を55μMで加えた以外は5μMであり、これは各個々の結合ペプチドの濃度が全ペプチドの最終濃度より20倍低かったことを意味する。DRB1*0401分子を1μMで加えた。MHC-ペプチド複合体の形成を単一ペプチドをコントロールに用い、上記のごとく評価した(図4)。DR4分子により捕捉されたペプチドを精製し、MS分析によりシーケンシングした。この分析の結果は最も高親和性の2つのペプチド：1242およびYARを生じた(表1参照)。中程度および/または低親和性のペプチドは複合体中に見いだされず、これはこのアッセイに用いた高濃度の強競合物質によると思われる。しかし、結合ペプチドの濃度が0.5μMまで減少し、DR4分子を各ペプチドより過剰に加えた時、中程度親和性のペプチド(HA306-318)が測定された。これらの結果は、該ペプチド混合物から2以上の高親和性ペプチドおよび中程度結合親和性のペプチドを捕捉する可能性を示した。
【０１２２】
【表１】
2005527506.tif 000003
(実施例II)
合成T細胞アッセイによる捕捉ペプチドに対するT細胞反応の測定
【０１２３】
本実施例では、実施例Iに記載の同定されたペプチドがMHC分子と結合するだけでなくT細胞を刺激することができることを示し、それらがT細胞エピトープであることを証明する。この問題は、ペプチドのMHC分子に対する結合自体は保証されないので、このペプチドが「in vivo」に関連することと関連がある。該ペプチドはエンドソームプロテアーゼ(CD4+T細胞に対する抗原)またはプロテオソーム(CD8+T細胞に対する抗原)による「in vivo」抗原プロセシング中に生じないかもしれない。また、「in vivo」でプロセシングされ、提示されるペプチドでもT細胞を刺激する代わりにそれをアネルギー化することができる(アンタゴニスト)。T細胞刺激を読み取るためにIFN-γELISPOTアッセイを選んだ。
【０１２４】
図5aに示す例では、健康なHCV陰性、BCGワクチン接種ドナーからのCD4+T細胞を末梢血から単離し、P1242およびp84、陰性コントロールとして用いたHCVペプチドでロードしたsHLA DRB1*0401と同時培養した。同時刺激は抗CD28モノクローナル抗体を加えることにより得た。図5aは、誘導されたIFN-γスポット数(各スポットは刺激されたT細胞を示す)を示す。誘導された数は、陰性コントロールペプチドを用いて試料中に検出された自発IFN-γ分泌より有意に多い。
【０１２５】
これがMHCクラスII制限ペプチドについてのみ真実であるのではないことを示すために、最近インフルエンザ感染した健康なHIV陰性EBV感染ドナー由来のCD8+T細胞をインフルエンザマトリックスタンパク質由来ペプチドまたはEBV BMLF1抗原でロードしたsHLA A0201分子とインキュベーションした。また、両ウイルスペプチドに対する顕著なT細胞反応が検出されることもありうる(図5b)。この反応の特異性は、CD8+T細胞と同時培養する前にロードしたsHLA A0201分子を抗HLA A0201抗体とインキュベーションすることにより証明された。このプレインキュベーションはIFN-γ分泌をほぼ完全に止め、これら試料では自発IFN-γ分泌のみが検出された。これら実施例は、捕捉されたペプチドに対する機能的T細胞が「in vivo」で存在し、これらペプチドがエピトープであり、防御的免疫反応を誘導するワクチンに有用かもしれないことを証明する。
(実施例III)
マトリックスフォーマットに配列したペプチドプールを測定することによるHLA結合ペプチドの迅速同定
【０１２６】
個々の結合ペプチドを検出するためにペプチドプールを用いることができることを確認した後、本発明のアプローチをCMV pp65抗原由来のHLAクラスII分子を結合することができるペプチドを同定するのに適用した。この目的で、直接ペプチド結合法を先に記載のペプチドプールアレイアプローチと組み合わせた(Kernら、1999; Tobery,ら、2001)。
【０１２７】
560aa長の全pp65配列に及ぶように、14aaがオーバーラップする547個の15マーを設計した。すべてのペプチド配列を表2に示す。
【０１２８】
【表２】
2005527506.tif 000004
【０１２９】
【表３】
2005527506.tif 000005
【０１３０】
【表４】
2005527506.tif 000006
【０１３１】
【表５】
2005527506.tif 000007
【０１３２】
【表６】
2005527506.tif 000008
【０１３３】
【表７】
2005527506.tif 000009
【０１３４】
【表８】
2005527506.tif 000010
【０１３５】
【表９】
2005527506.tif 000011
【０１３６】
試験すべきペプチド数が非常に多いため、ペプチドを図6に示すようにマトリックスフォーマットに配列した21ペプチドをそれぞれ含む42プールに混合した。個々の各ペプチドが正しく1「横列」プールと1「縦列」プールに含まれるように混合物を調製した。
【０１３７】
各マトリックスプールについて、DR4分子に対する結合親和性をSDS安定性アッセイで試験した(図7a)。なお、HA306-318を標準ペプチドに用いた。第一スクリーニングにおいて、42のうち18陽性ペプチドプール、「横列」プールからno.2、3、6、15、16、19、20、および「縦列」プールからno.28-38がみられた(図6参照)。アレイ中に反応性プールの共通部分を見いだすことにより、77ペプチドが潜在的結合物質として確認された。次に、各単一15マーのDR4分子に対する結合を個々に検討した(図7b、表3)。その結果、第一スクリーニングで選んだ20ペプチドが第二スクリーニングで結合物質であると確認された。通常、アレイの横列において、2以上の陽性ペプチドがみられた。おそらく、14aaがオーバーラップしたこれらペプチドは、CD4+T細胞上のTCRレセプターにより認識されるより長いエピトープを示す。
【０１３８】
部分的または完全に同一の配列を含む4ペプチド(ペプチドno.177、361、507、508)が、健康なCMVに暴露したヒト対象において特異的CD4+T細胞反応を起こすことができることが先に記載された(Khattabら、1997; Bitmansourら、2001)。これは、本発明者らにアプローチが正しいことを確認する。
【０１３９】
同定されたDRB1*0401結合ペプチドのあるものおよび推定アルゴリズムにより選ばれた他のものの異なる対立遺伝子: DRB1*0101、DRB1*0404、DRB1*0701、およびDRB1*1101の可溶性HLA分子に対する結合も試験した(表3)。7ペプチド(No.58、177、559、360、452、470、およびNo.496)が少なくとも2のHLA分子に対する親和性を有することが証明され、これらエピトープの不規則さが示された。
【０１４０】
DRB1*0404と結合する3ペプチド(no.421、469、および470)が、CMV血清反応陽性ドナー由来のT細胞においてIFN-γ分泌を誘導することも見いだされ(実施例IV参照)、この第二逆免疫学的アプローチも真のT細胞エピトープを同定できることを示唆した。
【０１４１】
結論として、HLAクラスIIエピトープの候補であると考えられるHLAクラスII分子と結合することができるCMV pp65抗原由来の種々の新規配列(表3で陰付き)が同定された。示したエピトープを組み込んだペプチドの免疫原性、およびそのCD4+特異性は、CMV血清反応陽性ドナーおよび/またはHLA-DRB1*0401トランスジェニックマウス由来のT細胞がex vivo刺激によりIFN-γ産生を誘導することができることを立証した(実施例IV、VI、およびVII参照)。
【０１４２】
【表１０】
2005527506.tif 000012
【０１４３】
【表１１】
2005527506.tif 000013
【０１４４】
【表１２】
2005527506.tif 000014
【０１４５】
(実施例IV)
マトリックスとして配列した15マーペプチドプールに対するサイトカイン反応を測定することによるT細胞エピトープの同定、および個々のペプチドの確認
【０１４６】
個々の各ペプチドが15aaからなり、15aaのうち14がその前駆体とオーバーラップしている547ペプチドをCMV pp65抗原の完全配列に及ぶように設計した。全ペプチドの配列を表2に示す。
【０１４７】
通常、T細胞反応をスクリーニングするのに利用可能なヒトPBMC数は限られているので、ペプチドは個々にではなく、マトリックスフォーマットに配列した縦列プールまたは横列プールのいずれかにまとめて適用した(図6)。第一に、個々のペプチドを5mg/mlで100%DMSOに溶解した。次に、各21ペプチドの混合物を個々の各ペプチドが正確に2プールに含まれるように調製した。ヒトPBMCを再刺激するためペプチド混合物を、各ペプチドが最終濃度5μg/mlとなるようにアッセイ培地で希釈した。この濃度は、Maeckerら(Maeckerの論文)がCD4およびCD8陽性T細胞反応を飽和することを見いだした濃度1,75μg/mlより十分高い。各試料中のDMSOの最終濃度は2,1%であった。
【０１４８】
10人の健康なCMV血清反応陽性HLA-A2陽性ドナー由来の全PBMCを図6に示す42ペプチドプールのスクリーニングに用いた。通常15aaより短いクラスIエピトープが15マーペプチド内に正しく認識されたか、および高DMSO含有量がT細胞の活性化および機能を損なわなかったことを確認するため、CMV pp65由来の単一のよく特徴付けされた免疫優性CD8制限9マーエピトープ(NLVPMVATV、pos.495-503)を濃度10μg/ml(最終DMSO濃度0.1%)で各スクリーニングに含めた。
【０１４９】
T細胞再活性化のリードアウトとしてヒトIFN-γElispotを用いた。図8aは、非常に少数のペプチドプールと反応するドナーを示す。陽性縦列および横列プールの交差点はペプチド490-492を特定する。これら3ペプチドはよく特徴づけられた免疫優性CD8制限9マー最小エピトープNLVPMVATV、pos.495-503を含む。ペプチドプールにより誘発された反応は、9マー最小エピトープで誘発された反応とほぼ等しかった(図8a)。これは、より短いエピトープが15マーペプチド内に正しく認識され、高DMSO含量がT細胞反応を損なわなかったことを示唆する。
【０１５０】
ほとんどの他のドナーは種々のエピトープに対するより複雑な反応を示した。一例を図8bに示す。全10ドナーによるこの一次スクリーニングの結果を表4にまとめる。
【０１５１】
【表１３】
2005527506.tif 000015
【０１５２】
第二スクリーニングにおいて、陽性横列および縦列プールの交差点に対応するすべての個々のペプチドを再試験した。同じドナーのPBMCをこの例では最終濃度20μg/mlの個々のペプチドと20時間インキュベーションした。さらに、ヒトIFN-γELIspotアッセイをT細胞再活性化のリードアウトとして用いた。
【０１５３】
図9は、一次スクリーニングで非常に集中的なT細胞反応を示す個体であることが確認されたドナー10736から得た結果を示す(図8a)。個々のペプチドno.489-495に再試験でペプチド490-492の反応性を確認し、さらにペプチド493をIFN-γ分泌の誘導物質であることを確認した。15マーペプチドに対する反応の程度はこの場合も9マー最小エピトープと同程度であった。一次スクリーニングにおいて陰性横列および縦列混合物の交差点に対応するペプチドの無作為選択物を、いかなるIFN-γ分泌も誘導しない陰性コントロールとして含めた(図9)。
【０１５４】
これら第二スクリーニングの完全な結果、およびそれにより定義されるすべてのエピトープを表5(文献にすでに記載のエピトープ)および表6(本発明のアプローチにより確認された新規エピトープ)にまとめる。
【０１５５】
既知のエピトープのうち、よく特徴づけられたCD8制限9マー最小エピトープ(NLVPMVATV、pos.495-503)が10ドナーのうち9ドナーに認められ、これがCMV pp65抗原中に最もしばしば認識されるHLA-A*0201制限エピトープの1つであることが証明された。10人のHLA A2ドナーのうち2ドナーはHLA-B7も発現した。文献から2つのHLA-B7制限エピトープpp65 265-274およびpp65 417-426が知られている。いずれも両HLA-B7陽性ドナーに見いだされ、特にpp65 417-426エピトープはHLA-A*0201制限pp65 495-503エピトープよりさらに多くのIFN-γ分泌を誘導するようであった。このデータは、CMV pp65抗原に対するT細胞反応がHLA-A2および/またはHLA-B7エピトープの発現と強く関連する観察結果と一致する(Eur.J.Immunol.、2000、30、2531-2539)。これらのいわゆる「免疫優性」エピトープに加え、他の記載されたpp65内のエピトープが再発見された(表5)。これは、本アプローチが非常に感度がよく、広範囲であり、免疫優性および亜優性(サブドミナント)エピトープの検出に適していることを示す。
【０１５６】
【表１４】
2005527506.tif 000016
【０１５７】
【表１５】
2005527506.tif 000017
【０１５８】
【表１６】
2005527506.tif 000018
【０１５９】
表6に、実施例IおよびIIに記載の本発明のアプローチにより同定されたすべての新規T細胞エピトープを列挙する。
【０１６０】
第一群のエピトープ(ペプチド 262、394、395、411、415、416、417)は、本明細書でみいだされたのと異なるHLA制限を有するにも関わらずT細胞エピトープとして文献にすでに記載されている配列を含む。この結果は、これらエピトープも以前に知られているものと異なるHLA状況でT細胞により認識されることを示す。これらの知見は新規であり、これらペプチドの、例えばこれら特定HLAを発現する個体に適したワクチンの部分としての有用性を広げる。
【０１６１】
第二群のエピトープ(ペプチド213、214、および216)は、HLA-A*0201分子と結合することがすでに文献に記載されているが、本発明者らの研究以前にはこれらペプチドがT細胞を活性化できることを証明するデータはなかった。ペプチドの結合は、T細胞の活性化および/またはT細胞による認識の必要条件であるが、それを保証するものではない。第一に、抗原内のすべての可能性があるペプチド配列がin vivoでの抗原プロセシングおよび提示中に等しく十分に生じるわけではないか、または全く生じない。すなわち、HLAと結合する合成ペプチドは必ずしも天然エピトープではない。たとえT細胞が活発なワクチン接種によりそのようなペプチドに対してプライムすることができても、感染細胞はその表面上にこれらペプチドを表示しないので該T細胞は病原菌に対して有用ではない。第二に、たとえ結合ペプチドが天然エピトープに対応しても、これはそれが機能的T細胞を誘導することができることを保証しない。むしろ、ある種のペプチドはアンタゴニストとして作用し、T細胞をアネルギー化することができる。本データは、これらペプチドがウイルス感染の結果としてヒトにおいて機能的IFN-γ分泌T細胞を誘導できることを初めて示す。この知見は新規であり、CMVに対するワクチンにこれらペプチドを含めることの合理性を与える。
【０１６２】
第三群のエピトープ(ペプチド211、476、477、479、421、422、423、424、469、470、503、506)は、今までのところ全く記載されていない。本データはこれらペプチドがウイルス感染の結果としてヒトにおいて機能的IFN-γ分泌T細胞を誘導することができることを示すので、それらはそれら自身が新規T細胞エピトープであるか、それら配列内に新規T細胞エピトープを含む。これらはCMVに対するワクチンに含めるのに特に有用である。
【０１６３】
本実施例に記載のスクリーニングは全PBMCを使用するので、あらゆる15マーに対する完全なT細胞反応が分析された。この反応は、各ドナーにより発現されたあらゆるHLA対立遺伝子に制限されうる。これらは、いずれの場合もHLA-A、-B、-C(クラスI)、およびHLA-DR、-DP、-DQ(クラスII)の少なくとも2つの可能性のある対立遺伝子を含む。ここで得られた新規エピトープをさらに特徴づけるために、これらエピトープの正しいHLA制限およびT細胞が認識する配列内の最小エピトープを定義することができよう。いずれも当業者に知られた種々のよく樹立されたアプローチにより行うことができる(Current Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、Inc.)。
【０１６４】
第一に、公然に利用可能なプログラムを用い、結合モチーフに基づいてT細胞エピトープを予測することができる。これらには、例えば、http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/(Parkerら1994)、http://134.2.96.221/scripts/MHCServer.dll/home.htm(Rammenseeら、1999)、http://mypage.ihost.com/usinet.hamme76/(Sturnioloら1999)がある。後者の予測アルゴリズムは、無差別のTヘルパーエピトープ、すなわち種々のHLAクラスII分子と結合するペプチドを同定する可能性をもたらす。最も高い確率で予測された各HLA分子を表4に記載する。これら推定は各HLAに対するペプチドの結合を試験することにより立証することができる。クラスIIエピトープの可能性があると予測された配列について、そのDRB1*0101、*0401、および*0404分子に対する結合を試験した(実施例III参照)。ペプチド421、469、および470(aa421-438、469-484、および470-485に及ぶ)はDRB1*0404と結合することがわかった(表5参照)。
【０１６５】
ペプチドに対する反応がクラスIまたはクラスIIに制限されるかどうかを速やかに識別する方法は、純粋なCD4+またはCD8+T細胞エフェクターポピュレーションを用いてELIspotアッセイを反復することである。これは、例えば磁気セルソーティングにより各サブセットを単離することにより達成することができる。純粋なCD8+T細胞は、目的とするあるHLA分子のみを発現する人工抗原提示細胞とともにELIspotアッセイを用いて試験することもできる。一例は、HLA-A*0201陽性T2細胞である(174CEM.T2、Nijmanら、1993)。あるいはまた、CD4+またはCD8+T細胞サブポピュレーションのいずれかを特異的にブロックするモノクローナル抗体の存在下で全PBMCを用いるELIspotアッセイを用いることができる。正確なHLA制限をある種の対立遺伝子に特異的なモノクローナル抗体によるブロッキングを用いて同様に測定することができる。例えば、HLA-A24制限エピトープに対する反応をHLA-A24特異的モノクローナル抗体を加えて特異的にブロックすることができる。
【０１６６】
T細胞により認識されるペプチド配列内の最小エピトープを定義するため、例えば一連のオーバーラッピングおよびトランケーテッドペプチド(例えば、8、9、および10マー)を合成し、これらを個々に再試験することができる。
(実施例V)
T2-ELIspotによる新規HLA-A*0201エピトープの確認
【０１６７】
陽性15マー内の推定HLA-A2エピトープを確認するため、9または10マーペプチドを合成し、個々に試験した。ELIspotアッセイを、T2細胞を抗原提示細胞に用い、種々のドナー由来のCD8+T細胞を用いて行った。この設定では、HLA-A*0201に外側から結合する最適な長さのエピトープのみがIFN-γ分泌を引き起こすことができる。5つの新規HLA-A*0201エピトープがこのアプローチで確認できた(図6)。アッセイは記載したように実施した(Herr 1997)。簡単には、T2細胞(Nijman 1993)をELIspot培地中で増殖させ(M&Mの項参照)、使用する3日間前に4X105/mlに調整した。2回洗浄後(PBS; 1%ヒトアルブミン(SIGMA))、細胞をELIspot培地に2.5x106/mlで播き、10μg/mlペプチドを加え一夜培養した。翌日、T2細胞をELIspot培地で1回洗浄し、100μl(1x106 T2細胞/ml)を、20μg/mlを添加し、コートおよびブロックしたELIspotプレートに播いた(上記参照)。CD8+リンパ球を単離するため、1x107 PBMNCを20μl抗ヒトCD8+Microbeads(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany)と混合して最終容量を100μlとし、氷上で15分間インキュベーションした。次に、細胞を過剰のMACS緩衝液で10回洗浄し、CD8+細胞を磁気Minicolumns(Miltenyi)で単離した。1x106c/mlに調整したCD8+リンパ球100μl/ウェルを加えた。20時間培養後、細胞をPBS、0.05% Tween20で4回洗浄して除去し、アッセイをM&Mの項に記載のごとく構築した。
【０１６８】
【表１７】
2005527506.tif 000019
(実施例VI)
ヒトPBMCを用いるエピトープ捕捉法により同定した新規クラスII(HLA-DR4)エピトープの確認
【０１６９】
特に、15マー55-61がエピトープ捕捉法により可溶性HLA-DRB1*0401の強結合物質であることが確認された(図7a、7b)。個々のオーバーラッピング15マー 55-61の結合は、アミノ酸配列YTPDSTPCHを種々の種類のクラスIIエピトープを含むかもしれないLILVSQYTPDSTPCHRGDNQLのコア結合領域として確認する。クラスIIエピトープがMHC結合グローブをはみ出す種々の長さの末端を有することがよく知られている。興味深いことに、ドナー10788は実施例IVに記載のIFN-γELIspotにより測定される15マー57および59に対する強いT細胞反応を示す(図10)。これは、LILVSQYTPDSTPCHRGDNQLが本発明のエピトープ捕捉法により最初に発見された少なくともHLA-DRB1*0401と結合する少なくとも1つのHTLエピトープを示すかまたは含むことを確認する。
【０１７０】
図10:対象10788由来のPBMCを、CMVpp65 15マー57、59およびコントロール(med: ペプチドなし、HIV:無関係なHIV由来ペプチド、ConA:ポリクローナル刺激)を用いるIFN-γELIspotに適用した。
【０１７１】
本発明のエピトープ捕捉法によりDRB1*0404と弱く結合することが確認された15マー469および470(表3)のヒトPBMCとの反応性について試験した。CD8陽性CTL介在反応またはCD4陽性THL介在反応を区別するため、表面マーカーの染色と組み合わせた細胞内サイトカイン染色を実施した。すなわち、解凍後、PBMNCを10%ヒト血清AB型(BioWhittaker)を含むRPMI1640に一夜(37℃、5%CO2)保った。翌日、200万個のPBMNCの部分標本をペプチド(80μg/ml)またはConcanavalin A(SIGMA)とインキュベーションした。1時間後、10μg/mlブレフェルジンA(SIGMA)を加え、インキュベーションを5時間続けた。CD4(フィコエリスリン)、CD8(サイクロム(cychrome))、CD69(アロフィコシアニン)に対する表面染色を示されたごとく標識した抗体を用いて行った(Pharmingen、San Diego、CA、USA)。PBS中1%パラホルムアルデヒドで1分間固定後、細胞をPBS中の0.5% BSA/0.1% Naアジド/0.1%サポニンで15分間インキュベーションして透過性にした。細胞内サイトカインを抗IFN-γ(FITC)抗体4S.B3(Pharmingen)で染色した。試料(リンパ球ゲートで100,000事象)をFACScalibur(Becton Dickinson)で読み込んだ。
【０１７２】
DEDSDNEIHNPAVFTW469-484の範囲にわたる15マー469および470は、A*0201およびクラスII結合モチーフの両方を含み、可溶性DRB1*0404と結合する(表3)。細胞内サイトカイン染色は、ドナー10788についてCD8およびCD4陽性T細胞コンパートメントの両方において有意なIFN-γ分泌を確認した(図11、下段の2パネル)。反対に、ドナー10687は、15マー489 AGILARNLVPMVATV489-503に対するCD8介在IFN-γ分泌のみを示し、この場合はHLA-A2エピトープNLVPMVATV495-503のみが標的であることを示唆した。これらは、ペプチドDEDSDNEIHNPAVFTW469-484がクラスIおよびクラスII制限エピトープの両方を含むことを確認する。
【０１７３】
図11：細胞内IFN-γ染色によるCMVpp65 15マー469、470に対する同時CD4+およびCD8+T細胞反応の確認。2ドナー(10687、10788)由来のPBMCを、陽性コントロールとしてConA(第一列)、推定クラスIおよびクラスIIエピトープ両方を含む15マー(第2および3列)または陰性コントロールとして培地(右列)のいずれかで刺激した。細胞の細胞内IFN-γ(x軸)または表面T細胞分化マーカーCD4またはCD8(y軸)を染色した。四分割の右上のパーセンテージを示し、バックグラウンド以上の有意な数を太字で示す。
(実施例VII)
HLA-DR4トランスジェニックマウスを用いるエピトープ捕捉法により同定された新規クラスII(HLA-DRB1*0401)エピトープの確認
【０１７４】
それらについて、DRB1*0401結合、T細胞反応性がCMV血清反応陽性個体の試験により証明されていないペプチド、DRB1*0401分子を発現するHLA-DR4トランスジェニックマウスを用いる実験を行った。DRB1*0401分子に結合するすべての候補エピトープに及ぶより長いペプチド(no.1500-1505)を合成し(表7参照)、該マウスに注射した。最終注射の1週間後、全ネズミ脾細胞をex vivoで、ワクチン接種に用いたのと同じペプチド、および対応するより長いペプチドを示すオーバーラッピング15マー、および陰性コントロールとして無関係のインフルエンザヘマグルチニン由来ペプチド(no.1171)で再刺激した。T細胞反応性をIFN-γELIspotアッセイで測定し(図12)、その結果、6のより長いペプチドのうち5つが免疫原性であることが示された。さらに、より長いペプチドを示し、DRB1*0401分子に対する親和性を示す15マーのほとんどがDRB1*0401トランスジェニックマウス由来のT細胞をex vivoで再活性化することも証明された。あるペプチド(no.1503)は、少なくともこれら試験に用いた免疫条件下で免疫反応を誘導しなかった。
【０１７５】
精細なエピトープマッピングおよび免疫原性ペプチドのCD4+特異性のin vivo試験のために、マウスをより長いペプチドでワクチン接種し、脾臓をCD4+およびCD8+T細胞ポピュレーションに分離し(CD4+分画については純度92-94%)、上記のごとくIFN-γ産生について試験した。図12は、そのようなELIspotアッセイの結果を示す。すべての場合で、脾細胞を用いて測定したT細胞反応はCD4+細胞を用いて確認することができた。通常、CD8+反応はごくわずかであった。ペプチド1502についてみられた同時CD4+およびCD8+反応は、エピトープ配列内に含まれるさらなるクラスIマウスエピトープによるかもしれない。
【０１７６】
表7aに、可溶性DR分子を用いるペプチド結合試験およびマウス実験のすべてのデータを要約する。DRB1*0401分子に対するペプチドの親和性とHLA-DR4トランスジェニックマウスにおけるCD4+細胞の特異刺激にはよい相関関係がみられた。例えば、ペプチドno.1500-1502および1504は、両アプローチにおいて同様の結果を示した。結合アッセイであまりよくなかったペプチドno.1505は、ペプチド注射後マウスで最も高頻度に生じるT細胞を生じさせた。in vitroでDRB1*0401分子と弱い親和性を有するペプチドno.1503は、CpG1668またはCFA/IFAのいずれかを注射したマウスにおいて免疫原性でなかった。ここで、いくつかのペプチドが、注射に用いるアジュバントに応じて免疫原性および特異的CD4+頻度の変動を示したことも記載しなくてはならない。CD4+細胞の豊富化分画を用いるマウスELIspotアッセイおよび可溶性DRB1*0401分子を用いるペプチド結合アッセイの結果に基づき、DRB1*0401保持T細胞が認識するエピトープコア配列(表7および表7a参照)を決定することができる。それらのうち4つは、DRB1*0401分子と結合すると予測されなかったペプチドno.1501に対する1つを除き、TEPITOPEアルゴリズム配列により推定されるものとよく適合する。
【０１７７】
【表１８】
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【０１７８】
結論として、本発明の「逆免疫学的」アプローチにおいて可溶性DRB1*0401分子のリガンドとして見いだされたペプチドのほとんどがDRB1*0401トランスジェニックマウスにおける特異的CD4+反応を生じさせることが確認された。すなわち、6つのエピトープ候補のうちの5つが実際にDRB1*0401エピトープである。さらに、それらは無差別である(表7および表7a)。それらの3つ(no.1501、1502、および1503)は、すでに文献に記載されていたがDRB1*0401特異エピトープは記載されていなかった。DRB1*0401結合物質(no.57および59)およびDRB1*0404と結合する3ペプチド(no.421、469、および470)もCMV血清反応陽性ドナー由来のPBMCにおいてIFN-γ産生を誘導することがみいだされた(実施例IVおよびVI参照)。同時に、本発明のエピトープ捕捉アプローチは真のT細胞エピトープを同定することができることを示唆する。
【０１７９】
【表１９】
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【０１８０】
【表２０】
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【０１８１】
【表２１】
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(参考文献)
【０１８２】
【表２２】
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【０１８３】
【表２３】
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【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】可溶性DR4分子に対するペプチド結合親和性を示す。
【図２】エンプティDR4分子と結合することができるペプチドの同定を示す。
【図３】過剰の、DR4分子に低親和性のペプチドの存在下における高親和性ペプチドの結合を示す。
【図４】DR4分子に対する個々のペプチドおよびペプチド混合物の結合を示す。
【図５ａ】単離CD4+T細胞およびDR0401分子(抗CD28で同時刺激) によるElispotを示す。
【図５ｂ】単離CD8+T細胞およびHLA A0201分子(抗CD28mabで同時刺激)によるElispotを示す。
【図６】CMV pp65ペプチドプールアレイを示す。
【図７ａ】pp65タンパク質由来ペプチドプールのDR4分子との結合を示す。
【図７ｂ】単一pp65ペプチドのDR4分子との結合を示す。
【図８ａ】ペプチド混合物(各21ペプチド、ドナー#10736 HLA A2/3、HLA B15/35)による第一スクリーニングを示す。
【図８ｂ】ペプチド混合物(各21ペプチド、ドナー#10687 HLA A2/11、HLA B7/13)による第一スクリーニングを示す。
【図９】単一ペプチド(ドナー#10736 HLA A2/3、HLA B15/35)による第二スクリーニングを示す。
【図１０】CMVpp65 15マー57、59、およびコントロール(med: ペプチドなし、HIV: 無関係なHIV由来ペプチド、ConA: ポリクローナル刺激)を用いるIFN-γ ELIspotを適用した対象10788からのPBMCを示す。
【図１１】細胞内IFN-γ染色によるCMVpp65 15マー469、470に対する同時CD4+およびCD8+T細胞反応の確認を示す。
【図１２Ａ】IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す。
【図１２Ｂ】IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す。
【図１２Ｃ】IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す。
【図１２Ｄ】IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す。
【図１２Ｅ】IFN-γELIspotアッセイを用いるトランスジェニックマウスにおけるオーバーラッピング15マーを用いるDRB1*0401エピトープのマッピングを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2005527506.tif 000038
【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月1日(2004.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005527506000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
エピトープのT細胞刺激能を増大する別の方法は、免疫刺激物質、例えばサイトカインまたはケモカイン、例えばインターロイキン-2、-7、-12、-18、クラスIおよびIIインターフェロン(IFN)、特にIFN-γ、GM-CSF、TNF-α、flt3-リガンドなどを用いるそれらの製剤化である。
さらなる局面において、本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)感染を治療または予防するためのHLA制限ワクチンを製造するための本発明のエピトープまたはペプチドの使用に関する。
【国際調査報告】
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