(57)【要約】本発明のリボ核酸の増幅方法は以下の工程を含む：（ａ）規定された配列の一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩、を用いて、ＤＮＡ一本鎖をＲＮＡから逆転写して生成する工程；（ｂ）ＲＮＡを除去する工程；（ｃ）ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩、を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程；（ｄ）ＤＮＡ二本鎖をＤＮＡ一本鎖に分離する工程；（ｅ）５’領域にプロモータの配列および３’領域に工程（ａ）のプライマーと同一配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩、を用いて、工程（ｄ）で得たＤＮＡ一本鎖の１つからＤＮＡ二本鎖を生成する工程；（ｆ）ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオシド三リン酸塩、を用いて、その両末端に規定された配列を有する複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程。
2005532797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸の増幅方法であって、以下の工程、
（ａ）  規定された配列の一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ一本鎖を、ＲＮＡから逆転写によって生成する工程と、
（ｂ）  該ＲＮＡを除去する工程と、
（ｃ）  ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、
（ｄ）  該ＤＮＡ二本鎖をＤＮＡ一本鎖に分離する工程と、
（ｅ）  その５’領域にプロモータの配列およびその３’領域に工程（ａ）における該プライマーと同一配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を、工程（ｄ）において得られた該ＤＮＡ一本鎖の１つから、生成する工程と、
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、その両末端において規定された配列を有する複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ一本鎖は、ＲＮＡ出発材料のような、逆センス方向（アンチセンス配列）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において使用される前記一本鎖プライマーは、オリゴｄＴ配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写のために、工程（ａ）において、５’（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーが使用され、ここでＶは、ｄＴではないデオキシリボヌクレオチド−モノマーを示す、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、前記ＲＮＡはＲＮアーゼによって加水分解される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）において、前記ＲＮＡはＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨによって除去される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ボックス配列は少なくとも６個のヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドは、多細胞生体で発現される既知の遺伝子配列への低いホモロジーのみを有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、ボックス配列に加え、少なくとも６個のヌクレオチドからなる任意の配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、配列  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＣＴ（ｎｔ）を有する一本鎖プライマーが使用される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
逆転写酵素がＤＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが、デオキシリボヌクレオチシド三リン酸塩として使用される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｄ）において、前記ＤＮＡ二本鎖は、熱作用によって一本鎖に分離される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｅ）において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータあるいはＳ６ＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｅ）において、プロモータ配列、および少なくとも８個のヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｅ）において、前記一本鎖プライマーは、配列  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ  ｇ＋１  ｇ（ｄＴ）１８Ｖ（４０ｎｔ）を有する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｆ）において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰがリボヌクレオシド三リン酸塩として使用される、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記開始ＲＮＡ配列の増幅は、少なくとも５００倍、好ましくは１０００倍より多く達成される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｆ）の後に、以下の工程：
（ｇ）  工程（ｆ）において生成された複数のＲＮＡ一本鎖、前記ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩から、逆転写によって、ＤＮＡ一本鎖を生成する工程と、
（ｈ）  前記ＲＮＡを除去する工程と、
（ｉ）５’領域においてはプロモータの前記配列、および３’領域においては工程（ａ）において使用されたプライマーと同一に規定された配列を含む一本鎖プライマーを用いて、工程（ｇ）において生成された前記ＤＮＡ一本鎖から、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、
（ｊ）ＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程と、
をさらに包含する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉ）において使用された前記一本鎖プライマーは、工程（ｅ）において使用されたプライマーと同一の配列を有する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｈ）における前記ＲＮＡは、ＲＮアーゼによって加水分解される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｊ）において生成された全てのＲＮＡ一本鎖は、逆センス方向を有する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から２１のいずれか１項に記載のリボ核酸の増幅用のキットであって、以下の成分
（ａ）  プロモータ配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマーと、
（ｂ）  ボックス配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマーと、
（ｃ）  ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｄ）  デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩と、
（ｅ）  ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼと、
（ｇ）  リボヌクレオシド三リン酸塩と、
を含む、キット。
【請求項２４】
３つの異なる一本鎖プライマーを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記プロモータ配列の前記一本鎖プライマーは、またオリゴｄＴ配列を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
一本鎖プライマーは、５’（ｄＴ）１８Ｖ−プライマー配列を含み、ここでＶは、ｄＴではないデオキシリボヌクレオチド−モノマーを示す、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
追加的に、ＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨを含む、請求項２３から２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
一本鎖プライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータあるいはＳ６ＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項２３から２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
連続配列  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ  ｇ＋１  ｇ（ｄＴ）１８Ｖ（４０ｎｔ）の一本鎖プライマーを含む、請求項２３から２８のいずれか１項記載のキット。
【請求項３０】
ＤＮＡポリメラーゼとして逆転写酵素を含む、請求項２３から２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２３から３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
検出可能な化合物によってＤＮＡを標識するための構成を含む、請求項２３から３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
ＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項２３から３２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
核酸の分析方法であって、
請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法を用いて増幅され、かつマイクロアレイを用いて分析されたリボ核酸が得られる、方法。
【請求項３５】
前記リボ核酸が、生化学的サンプルから単離されることによって得られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅されたリボ核酸が、逆転写によってｃＤＮＡに変換され、該ｃＤＮＡがマイクロアレイを用いて分析される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｃＤＮＡの質量および配列が分析される、請求項３４から３６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリボ核酸の増幅方法に関し、該方法は、以下の工程、
（ａ）  規定された配列の一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ一本鎖を、ＲＮＡから逆転写によって生成する工程と、
（ｂ）  該ＲＮＡを除去する工程と、
（ｃ）  ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、
（ｄ）  該ＤＮＡ二本鎖をＤＮＡ一本鎖に分離する工程と、
（ｅ）  その５’領域にプロモータの配列およびその３’領域に工程（ａ）における該プライマーと同一配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を、工程（ｄ）において得られた該ＤＮＡ一本鎖の１つから、生成する工程と、
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、その両末端において規定された配列を有する複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程と、
を包含する。
【０００２】
本発明は、さらに、本発明の方法の実施に必要な要素を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
従来技術において、リボ核酸の増幅に関して多くの方法が知られている。最もよく知られた方法は、８０年代半ばにＫａｒｙ  Ｍｕｌｌｉｓによって開発されたポリメラーゼ連鎖反応（「ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」  あるいはＰＣＲ）である（Ｓａｉｋｉらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３０（１９８５），１３５０〜１３５４ページ；およびＥＰ ２０１ １８４を参照）。
【０００４】
ＰＣＲ反応においては、一本鎖プライマー（通常１２〜２４のヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド）が、相補的なＤＮＡ一本鎖配列に付加される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を用いて、二本鎖に延長される。二本鎖は、熱作用によって一本鎖にほどかれる。温度は、一本鎖プライマーが再びＤＮＡ一本鎖に付加されるように、低下される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって再び二本鎖に延長される。
【０００５】
上記工程の繰り返しによって、指数的な出発ＤＮＡ鎖の増幅が可能である。なぜなら、各反応過程において、ほぼ全てのＤＮＡ一本鎖からＤＮＡ二本鎖が形成される反応条件が選択され得るからである。ここで、形成されたＤＮＡ二本鎖は続いて２つのＤＮＡ一本鎖に分離され、ＤＮＡ一本鎖は、再びさらなる鎖のためのマトリクスとして機能する。
【０００６】
ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ一本鎖（いわゆるｃＤＮＡ）がｍＲＮＡから形成される逆転写接続の後に、ＰＣＲ反応が、ＲＮＡ配列から出発する核酸の増幅に使用可能である（ＥＰ ２０１ １８４を参照）。
【０００７】
この反応基本型に対して、その間、出発材料（ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖、二本鎖）および反応生成物（サンプルあるいは全ての配列内の特定のＲＮＡ配列あるいはＤＮＡ配列の増幅）に依存しつつ互いに異なる多くの変形が開発された。
【０００８】
最近においては、いわゆるマイクロアレイが核酸の分析に頻繁に利用される。その際、多数の異なる核酸配列（ほとんどＤＮＡ）が異なる領域に結合されるキャリアプレートが重要である。通常、所定の極小領域内に、ＤＮＡのみが所定の配列で結合され、その際、マイクロアレイは１０００以上までもの異なる領域を有し、かつ配列を結合し得る。
【０００９】
マイクロアレイが、適正な条件（塩含量、温度等）のもとに、試験サンプルからの多数の異なる核酸配列（ほとんど同様にＤＮＡ）と接触する場合、サンプル内に存在しかつプレート上に結合された配列から相補的ハイブリッドが形成される。非相補的配列は洗い落とされ得る。マイクロアレイ上のＤＮＡ二本鎖を含む領域が見出され、該領域は開始サンプル内の核酸の配列および数量に対する逆推理を可能にする。
【００１０】
マイクロアレイは、例えば対応する方法において、例えば細胞の表示プロフィールの分析、すなわち所定の細胞から発現されるｍＲＮＡ配列の全体分析に使用される（Ｌｏｃｋ−ｈａｒｔらによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１９９６），１６７５〜１６８０ページ参照）。
【００１１】
この分析に利用されるｍＲＮＡの数量は通常制限されるため、引き続きマイクロアレイを用いて分析されねばならないリボ核酸の特別な増幅方法が開発された。そのために、リボ核酸は、必要に応じて逆転写によって、より安定したｃＤＮＡ形態に移行される。
【００１２】
個々の細胞のＲＮＡ量の高増幅を可能にする方法は、例えばＵＳ ５，５１４，５４５に記載されている。この方法においては、オリゴｄＴ配列およびＴ７プロモータ領域を有するプライマーが使用される。オリゴｄＴ配列は、ｍＲＮＡの３’ポリＡ配列に付加さて、それによってｍＲＮＡの逆転写を指導する。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスのアルカリ変性の後に、第２のＤＮＡ鎖が、ヘアピン構造の使用のもとに、ｃＤＮＡの３’末端にプライマーとして形成され、ヌクレアーゼＳ１を用いて直鎖状の二本鎖に解体される。ＤＮＡ二本鎖は、続いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼのマトリクスとして機能する。そのようにして得られたＲＮＡは、再びｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして機能する。その際、任意は配列の６マーオリゴヌクレオチド（いわゆる「ランダム  プライマー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ）」）が使用される。第２のＤＮＡ鎖が、熱変性の後に、上記Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマーの使用のもとに生成される。このＤＮＡは、再びＴ７ＲＮＡプライマーのマトリクスとして機能し得る。
【００１３】
その他に、ＵＳ ５，５１４，５２２は、高増幅率を得るために、単一のプライマーオリゴヌクレオチドが使用され得ることを開示する。そのために、ｃＤＮＡは、１つのＲＮＡから逆転写によって生成され、その際、以下の成分を有するプライマーが使用される：（ａ）５’ｄＮ２０、すなわちヌクレオチド２０個の長さより大きい任意の配列、（ｂ）最小限のＴ７プロモータ、（ｃ）転写開始配列ＧＧＧＣＧ、および（ｄ）オリゴｄＴ１５。第２のＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡの部分的な消化の後に、ＲＮアーゼを用いて行われる。その際、残存するＲＮＡオリゴヌクレオチドはポリメラーゼＩのプライマーとして機能する。そのようにして得られたＤＮＡの末端は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化される。
【００１４】
同様な方法が、ＵＳ ５，９３２，４５１に開示される。ここでは、５’近位領域に２つのボックスプライマー配列がさらに追加される。該配列はビオチンボックスプライマーを介して二重の固定化を可能にする。
【００１５】
しかしながら、上記リボ核酸の増幅方法は、不利な点を有する。各方法は、その構成においてオリジナルの群に対応しないリボ核酸の群を生成する。その原因は、ｍＲＮＡの３’領域から第一次のリボ核酸配列を増幅するＴ７プロモータオリゴｄＴプライマーを使用することにある。さらに、上記方法に使用されるかなり長いプライマー（６０のヌクレオチドより多い）は、プライマー−プライマーハイブリッドおよびプライマーの特有でない増幅を可能にすることが実験によって実証された（Ｂａｕｇｈらによる、Ｎｕｃｌｅ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９（２００１）、ｅ２９）。そのため、従来の方法は、核酸のさらなる分析の際に障害となる相当な量の人工産物を生成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、開始材料内において、一様な、特に好適に生成可能なリボ核酸の増幅を可能とするリボ核酸の増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この課題は、以下の工程を包含する本発明のリボ核酸の増幅方法によって解決される：
（ａ）  規定された配列の一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ一本鎖を、ＲＮＡから逆転写によって生成する工程；
（ｂ）  ＲＮＡを除去する工程；
（ｃ）  ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程；
（ｄ）  ＤＮＡ二本鎖をＤＮＡ一本鎖に分離する工程；
（ｅ）  その５’領域にプロモータの配列およびその３’領域に工程（ａ）における該プライマーと同一配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を、工程（ｄ）において得られた該ＤＮＡ一本鎖の１つから、生成する工程；および
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、その両末端において規定された配列を有する複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程。
【００１８】
本発明によれば、上記方法工程の結合は、開始材料内の存在するリボ核酸の特に一様な増幅を導く、かつ同時に人工産物の生成を防止することが、確定された。そのため、本発明による方法は、リボ核酸の改善された増幅方法を示し、かつマイクロアレイを用いたリボ核酸の改善された分析方法を可能にする。
【００１９】
示された本発明の方法によれば、増幅の際に、ＲＮＡ出発材料のような逆センス方向（アンチセンス配列）を有するＲＮＡ一本鎖が生成される。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、工程（ａ）において、マトリクスとして機能するＲＮＡが生体の細胞から単離される。ｍＲＮＡの多細胞生体の細胞から単離は、特に好ましい。
【００２１】
工程（ａ）において使用される一本鎖プライマーは、任意に規定された配列を有するプライマーであり、すなわち、いかなる偶然の連続ヌクレオチドをも含まない。１つより多い規定されたプライマーが使用され得る。
【００２２】
工程（ａ）において使用される一本鎖プライマーは、オリゴｄＴ配列、すなわち、その中で複数のｄＴヌクレオチドが隣接して連なる配列を含む。これは、ｍＲＮＡのポリＡ配列の領域内にプライマーが付加されるという長所を有する。そのため、それは、逆転写において、ほぼ続いてｍＲＮＡに転写される。
【００２３】
本発明によれば、特に好ましくは、工程（ａ）において、逆転写のために、５’（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーが使用さる。ここで、プライマーは、他の種類（すなわち、ｄＡ、ｄＣ、あるいはｄＧ、ここではＶとして示される）の個別のデオキシヌクレオチドモノマーによって後続された１８ｄＴデオキシリボヌクレオチド−モノマーを含む。このプライマーは、ポリＡ配列の５’領域に隣接して開始する配列をほとんど連続的に転写する逆転写を可能にする。そのため、このプライマーの使用は転写人工産物の形成を抑制する。この転写人工産物は、従来技術の方法の場合には、ｍＲＮＡのより大きなポリＡ領域内における通常のオリゴｄＴプライマーの付加によって生じる。
【００２４】
その他さらに、工程（ａ）において、１つのあるいは複数の所定の配列に対するホモロジーをサンプル内に有するプライマーが使用され得る。そのため、対応する方法において、リボ核酸の増幅は所定の目的配列に制限される。
【００２５】
本発明によれば、好ましくは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド内のＲＮＡは、工程（ｂ）において、ＲＮアーゼによって加水分解される。ＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨの使用が好ましい。それによって、さらに、第１の工程においてｃＤＮＡ内に書き込まれなかった全てのＲＮＡ、特にリボソームＲＮＡが除去され、さらにｍＲＮＡのための特徴付けられたポリ（Ａ）テイルを有さない他の細胞的なＲＮＡも除去される。逆転写によって生成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、また、熱作用によって一本鎖形態に移行され得る。ＲＮアーゼの使用は、通常同様にサンプル内に存在するゲノムＤＮＡは直線状にされず、それによってゲノムＤＮＡは、後続の工程においてプライマーのハイブリッドパートナーとして利用できないという利点を有する。ＲＮアーゼＩは熱によって不活性化されないため、特に、ＲＮアーゼＩの使用に利点がある。本発明の方法はまさにリボ核酸の増幅を目的として有し、ＲＮアーゼはこの目的に対抗して機能し、反応物から除去されねばならない。
【００２６】
工程（ｃ）において、ボックス配列を含む一本鎖プライマーが使用される。本発明の範囲において、規定された配列が１０〜２５のヌクレオチドの長さを有する場合、ＲＮＡあるいはＤＮＡ配列は、ボックス配列を有する。該ヌクレオチドは、生体で発現される遺伝子配列への低いホモロジーのみを有する。該生体から増幅されたリボ核酸が得られる。
【００２７】
対応する遺伝子配列への潜在能力のあるボックス配列の低いホモロジーは、実験的に標準ノザン分析によって決定され得る。そのために、増幅されたリボ核酸が得られる生体（例えば、植物、ヒト、動物）のＲＮＡサンプルは、電気泳動的に分離され、膜上に移転され得る。低いホモロジーは、ボックス配列を有する標識化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、ハイブリダイゼーショシグナルを生成できない場合に、提供される。ストリンジェント条件は、例えば、摂氏２５度における、４０分間の０．１＊ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いたハイブリダイゼーション後の精製により、実現され得る。
【００２８】
ボックス配列の実験的立証の他の方法として、多細胞生体で発現される既知の遺伝子配列への低いホモロジーのみを有する配列の探索が、データバンクによってなされ得る。従来技術において、多細胞生体で発現される既知の遺伝子配列は、データバンクの形で一般に利用可能である；すなわち、既知の機能を有する遺伝子配列として、あるいは既知で場合はいわゆる「発現配列タグ」あるいはＥＳＴの形において。その際において、配列が、対応するデータバンク内に格納された１０〜２５のヌクレオチドの全長を超える全ての配列と比較して、少なくとも２０％、好ましくは３０あるいは４０％の配列相違を有する場合には、該配列は、既知の遺伝子配列への低いホモロジーのみを有する配列として示され、それに応じてボックス配列として適正化される。すなわち、これは、１０ヌクレオチドの全長の場合には少なくとも２の配列相違が存在し、あるいは２０ヌクレオチドの全長の場合には少なくとも４の配列相違が存在することを意味する。配列同一性、あるいは２つの配列の相違は、その際、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアによって探索される。
【００２９】
それによって、所定の配列が、所定の使用を考慮して、ボックス配列として示めされ得る。本発明の方法を用いてヒトのｍＲＮＡが増幅される場合、上記低いホモロジーはヒトデータバンクと比較して存在していなければならないか、あるいはヒトＲＮＡ配列に対するボックス配列の実験的立証は「ノーザンブロット」を介して行われなければならない。本発明の方法を用いて植物のｍＲＮＡが増幅される場合、上記低いホモロジーは植物のリボ核酸と比較して存在していなければならない。本発明の所定の方法においてボックス配列として扱われている配列は、他の方法においては、ボックス配列でないこともあり得る。
【００３０】
さらに好ましくは、ボックス配列は、いかなるヴィールス性配列も含まず、またヴィールスあるいはバクテリオファージのコード化された配列および調節塩基配列（プロモータあるいはターミネータ）を含まないように選定される。
【００３１】
本発明の方法における、対応するボックス配列を含むプライマーの使用は、増幅人工産物の発生を大幅に減少させるため、非常に有益である。
【００３２】
その際、ボックス配列は、工程（ｃ）において使用されるプライマーの５’領域に存在する。プライマーは、さらに好ましくは、３〜６個の任意のヌクレオチド（Ｎ３〜Ｎ６）の配列、および選択されたトリヌクレオチド配列（例えばＴＣＴのような）を含む。その他、プライマーの様々なトリヌクレオチド配列の一部分の混合もあり得る。
【００３３】
ボックス配列を含むプライマーは、好ましくは４０ヌクレオチドの長さを有する。この場合、ほぼ３０ヌクレオチドの長さが特に好ましい。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、工程（ｃ）において、ボックス配列に加え、少なくとも６個のヌクレオチドの特に最適化された配列を含む一本鎖プライマーが使用される。工程（ｃ）において使用される一本鎖プライマーは、例えば、配列  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  Ｎ３〜６  ＴＣＴ（２７〜３０ｎｔ）を有する。
【００３５】
工程（ｃ）および工程（ｅ）において使用されるＤＮＡポリメラーゼとして、任意のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。好ましくは、逆転写酵素が使用される。逆転写酵素はＤＮＡ二本鎖領域を解体しないため、ＤＮＡポリメラーゼとして逆転写酵素を使用する場合は、特に有益である。工程（ａ）、（ｃ）、（ｅ）におけるＤＮＡ重合のために、さらに４つのデオキシリボヌクレオチシド三リン酸塩、通常ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが、要求される。
【００３６】
工程（ｄ）において、ＤＮＡ二本鎖は、任意の方法によって一本鎖に分離される。好ましくは、熱作用によって分離される。
【００３７】
工程（ｅ）において使用される一本鎖プライマーはプロモータを含む。プロモータ配列はＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし、それによってＲＮＡ鎖の合成が開始される。好ましくは、工程（ｅ）において使用される一本鎖プライマーは、Ｔ７、Ｔ３、あるいはＳ６Ｒのような、高度に特殊化されたＲＮＡポリメラーゼプロモータを含む。例えば、Ｔ７プロモータを含むプライマーは、配列  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ  ｇ＋１  ｇ（ｄＴ）１８Ｖ（４０ｎｔ）を有する。
【００３８】
本発明の方法において使用されるＲＮＡポリメラーゼ（ｎ）の選定は、プライマー内に存在するプロモータ配列に依存して行われる。Ｔ７ポリメラーゼの配列を含むプライマーの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが使用される。
【００３９】
リボ核酸の形成のために、さらなるリボヌクレオシド三リン酸塩が要求され、通常、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰが使用される。
【００４０】
本発明による方法は、ＲＮＡ開始配列の高度に特殊化された増幅を最初に可能にする。その際、ＲＮＡ群の全体配列が示される。開始ＲＮＡ配列は、好ましくは少なくとも５００倍増幅され、その際、１０００倍より多く増幅されることが特に好ましい。
【００４１】
本発明は、最後に、ＲＮＡポリメラーゼが認められる前に、一本鎖プライマーおよびプライマー起因人工産物（例えば、ダイマー）が除去される方法工程を含む。
【００４２】
さらなるリボ核酸の増幅が、工程（ｆ）に続く以下の工程によって達成され得る：
（ｇ）  工程（ｆ）において生成された複数のＲＮＡ一本鎖、ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩から、逆転写によって、ＤＮＡ一本鎖を生成する工程；
（ｈ）  ＲＮＡを除去する工程；
（ｉ）５’領域においてはプロモータの配列、および３’領域においては工程（ａ）において使用されたプライマーと同一に規定された配列を含む一本鎖プライマーを用いて、工程（ｇ）において生成されたＤＮＡ一本鎖から、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩ＤＮＡ二本鎖を生成する工程；および
（ｊ）ＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程。
【００４３】
この方法変形例によって、特別な利点が得られる。工程（ａ）〜工程（ｆ）の方法によって生成されたリボ核酸の規定された末端は、ＤＮＡ内において逆転写を可能にする。そのＤＮＡは、引き続いて、プロモータから開始されるさらなるＲＮＡ合成のベースとして再び機能する。この方法によって、増幅されたリボ核酸の数量は、もう一度少なくとも５０倍は増加され得る。
【００４４】
好ましくは、本方法は、工程（ｉ）において使用される一本鎖プライマーが、工程（ａ）において使用されたプライマーと同一の配列を有するように、実施される。
【００４５】
工程（ｇ）において使用されるプライマーは、工程（ｃ）において使用されるプライマーと同一である。その他さらに、工程（ｇ）において使用されるプライマーは、十分規定されたボックス配列のみを含み、工程（ｃ）において要求とされたプライマーの特別化されない要素を含まない。そのため、工程（ｇ）において使用されるプライマーは、例えば、配列  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ（２１ｎｔ）を有し得る。
【００４６】
工程（ｈ）において生成されたＲＮＡは従来技術において知られた任意の方法を用いて除去され、しかしながらその際、ＲＮアーゼを用いた加水分解が好ましい。
【００４７】
転写（本発明による方法の工程（ｆ）および（ｊ））前に、核酸を従来技術において知られた方法にしたがって精留することが有益であり得る。その際、第１の線に余分に使用されたプライマーおよびそのプライマーから発生した人工産物（例えば、プライマーダイマー）は除去されねばならない。
【００４８】
上記本発明による方法は、もっぱら、逆センス方向（いわゆるアンチセンス鎖）を有するＲＮＡ一本鎖を生成する。しかしながら、本発明の範囲において、引き続き、従来技術において通常の方法（逆転写、ＰＣＲ、ｃＤＮＡ二次鎖合成、転写等）を用いて、逆センス方向のＲＮＡ一本鎖から、ＤＮＡ二本鎖、任意センス方向のＲＮＡ一本鎖、あるいはセンス方向を有するＲＮＡ一本鎖（いわゆるセンス鎖）を生成する方法が含まれる。方法生成物の正確な性質は、当然、計画された利用の第１のラインに依存する。
【００４９】
本発明は、さらに、本発明の方法を用いてリボ核酸の増幅のための全ての試薬を利用可能にするキットに関する。該キットは以下の構成を含む：
（ａ）  プロモータ配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマー；
（ｂ）  ボックス配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマー；
（ｃ）  ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｄ）  デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩；
（ｅ）  ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼ；および
（ｇ）  リボヌクレオシド三リン酸塩。
【００５０】
そのために、キットは、上記特徴によって特徴付けられる少なくとも２つの異なる一本鎖プライマーを含む。しかしながら、キットは計画された利用に依存して、２つより多くのプライマーおよびさらなる試薬を含み得る。
【００５１】
キットは、追加的に、ＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨを含み得る。
【００５２】
キット内に存在するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、逆転写酵素あるいはＤＮＡ二本鎖領域を分解しない特性を有する他のＤＮＡポリメラーゼである。
【００５３】
キットは、さらに、検出可能な化合物によってＤＮＡを標識するための構成、および１つのあるいは複数のＤＮＡマイクロアレイを含み得る。そのため、キットによって、表示分析の実施に必要な全ての要素が提供され得る。通常、個々の成分は異なる容器に梱包される。しかしながら、一方法工程で使用される要素は、１つの容器に小分けして梱包され得る。
【００５４】
それに応じて、本発明は、さらに、核酸の分析方法に関する。該分析方法において、本発明の方法を用いて増幅され、かつマイクロアレイを用いて分析されるリボ核酸が得られる。リボ核酸は、通常、生化学的サンプルから単離される。本発明の方法を用いて増幅されたリボ核酸は、マイクロアレイを用いた分析の前に、逆転写によりｃＤＮＡへ変換され得る。該方法は、ｃＤＮＡの質量および配列の分析を可能にする。また、製造方法の中間において得られたＤＮＡも使用され得る；例えば、クローニングによって表出遺伝子バンクを得るために。その遺伝子バンクにおいては、生化学的サンプルにおいて試験された遺伝子、あるいは実験室において生成されたサンプルにおいて試験された遺伝子が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明による方法が図１に例示される。まず、ＲＮＡからＤＮＡ一本鎖の合成が逆転写によって実施され、その際、結合されたオリゴ５’（ｄＴ）１８Ｖプライマーが使用される。この方法は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）末端の３’ＵＴＲ領域への移行の転写を可能にする。次の工程において、ＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロデュプレックスからのＲＮＡが、ＲＮアーゼＨ／ＲＮアーゼＩを用いて除去され、残留するＲＮＡ（特にリボソームＲＮＡ）が除去される。
【００５６】
二次の相補的ＤＮＡ鎖の合成物は、ボックス配列の導入のために、特別のプライマーの使用によって、利用される。そのプライマーは、３〜９個の任意のヌクレオチドが互いに連なる部分と、ボックス配列を含む第２の部分とからなる。
【００５７】
プライマーの付加の後に、二本鎖のために充填がＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。過剰のプライマーは除去され、二本鎖の熱変性の後に温度が低下され、それによって、Ｔ７プロモータおよび配列（ｄＴ）１８Ｖを含むプライマーはハイブリダイズされ得る。さらなる、ＤＮＡ鎖がプライマーの延長によって得られる。続いて、過剰に存在するプライマー、および必要に応じてプライマーに起因する人工産物（例えばダイマー）が除去され、ＲＮＡの増幅が生体外の転写ごとにＴ７プロモータから行われる。
【００５８】
図１ｃには、上記工程（ｇ）〜（ｊ）を用いたリボ核酸の増幅方法が示される。逆転写酵素およびｄＮＴＰの、ボックス配列を含むプライマーの使用のもとに、工程（ｆ）において生成されたリボ核酸が逆転写される。ＲＮアーゼはＲＮＡ鎖を変性する。プロモータおよびオリゴｄＴ配列を含むプライマーの導入のもとに、転写においてＲＮＡポリメラーゼのマトリクスとして機能する二次ＤＮＡ鎖が生成される。
【００５９】
本発明による方法の反応工程の順序および詳細な実施が、以下に例示的に示される。
【００６０】
Ａ．第一の増幅ランド（図１ａ、図１ｂ参照）
Ａ１．  オリゴ（ｄＴ）１８Ｖプライマーを含む１００ｎｇの全ＲＮＡの逆転写
【００６１】
【表１】
2005532797.tif 000003
熱蓋を用いてサーモサイクラー内において６５°Ｃ、４分間培養し、続いて氷上に配置する。
【００６２】
【表２】
2005532797.tif 000004
【００６３】
第一のｃＤＮＡ鎖合成混合物をピペットで氷上に配置し、サンプルのために氷浴する。
【００６４】
続いて、サンプルを４２°Ｃに加熱されたサーモサイクラー内に配置する。
【００６５】
サンプルの培養：
３７°Ｃ／５分間
４２°Ｃ／５０分間
４５°Ｃ／１０分間
５０°Ｃ／１０分間
７０°Ｃ／１５分間（酵素の不活化のために）
続いて氷上に配置する。
【００６６】
Ａ２．ＲＮＡの除去
【００６７】
【表３】
2005532797.tif 000005
【００６８】
３７°Ｃで２０分間の培養、続いて氷上に配置。リボソームＲＮＡの除去のために、ＲＮアーゼＡは、活性化が非常に困難であるため、使用されない。使用されるＲＮアーゼＩは、この場所において、７０°Ｃで１５分間の培養によって、最適に完全に不活性化される。
【００６９】
Ａ３．ボックスランダムプライマーおよびＴ７（ｄＴ）１８Ｖを有するテンプレートＤＮＡ二本鎖
【００７０】
【表４】
2005532797.tif 000006
【００７１】
培養：
７０°Ｃ／１分間
３７°Ｃ／１分間
１μｌ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）のサンプルへの投与
３７°Ｃ／３０分間
過剰プライマーの除去
１μｌエキソヌクレアーゼＩ（１０Ｕ／μｌ）
３７°Ｃ／５分間
９６°Ｃ／６分間
続いて氷上に配置。
【００７２】
Ｔ７（ｄＴ）１８Ｖを有するテンプレートＤＮＡ二本鎖
２μｌＴ７（ｄＴ）１８Ｖプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
７０°Ｃ／１分間
４２°Ｃ／１分間
１μｌ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）のサンプルへの投与
４２°Ｃ／３０分間
３７°Ｃで冷却
１μｌＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）
３７°Ｃ／１分間
６５°Ｃ／１分間
続いてサンプルを氷上に配置する。
【００７３】
Ａ４．Ｈｉｇｈ−ＰｕｒｅＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡの精製
【００７４】
【表５】
2005532797.tif 000007
【００７５】
混合物をピペットでカラム上に配置し、卓上遠心分離器内において最大回転数において１分間遠心分離する。漏液を除去し、カラムを５００μｌの洗浄緩衝剤によって充填し、上記のように遠心分離する。漏液を除去し、カラムを２００μｌの洗浄緩衝剤によって充填し、上記のように遠心分離する。
【００７６】
カラムを新たな１．５ｍｌのエッペンドルフ容器内に移行し、かつ５０μｌの溶離緩衝剤によって充填し、１分間培養し、そして上記のように遠心分離する。溶離工程はもう一度上記のように繰り返す。
【００７７】
Ａ５．精製されたｃＤＮＡのエタノール沈殿
Ｐｅｌｌｅｔ ＰａｉｎｔＴＭキャリアストック溶液を渦巻かせることなく常に暗部保存する。−２０°Ｃでの長期保存、少量のアリコートは、ほぼ１ヶ月の４°Ｃで保存され得る。
【００７８】
【表６】
2005532797.tif 000008
【００７９】
沈殿物をよく混ぜ（ボルテックスせず）、ｃＤＮＡを室温において１０分間、最大回転数によってペレットにする。上ずみ液を除去し、ペレットを２００μｌ、７０％のエタノールで一度洗浄する。上記したように１分間遠心分離し、上ずみ液をピペットによって完全に除去する。ペレットの乾燥のために、エッペンドルフ容器をほぼ５分間、室温において開放させる。スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）内において乾燥してはならない。続いて、ペレットを８μｌのトリス緩衝剤（ｐＨ８．５）内において溶解し、氷上に配置する。
【００８０】
Ａ６．  インビトロでの増幅
【００８１】
【表７】
2005532797.tif 000009
【００８２】
全ての成分を溶かし、沈殿物を氷上ではなく室温においてピペットする。なぜなら、反応緩衝剤内のスペルミジンはテンプレートの沈降物となるためである。反応のために、０．５ｍｌあるいは０．２ｍｌのＲＮアーゼ−フリーＰＣＲチューブが使用される。
【００８３】
転写を、熱蓋を用いてサーモサイクラー内に、あるいはハイブリダイズオーブン内に３７°Ｃで夜間培養する。１〜２μｌの沈殿物を自然の１．５％アガロース上に配置する。続いて、反応毎に１μｌのＤＮアーゼを付与し、さらに１５分間、３７°Ｃにて培養する。ＲＮＡの精製のために、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキットを使用し、ＲＮＡクリーンアッププロトコルにしたがって設定する。続いて、ＲＮＡを、２×５０μｌＤＥＰＣ水を用いて溶離し、工程５に示されたように、エタノールによって沈殿する。ＲＮＡペレットは、５μｌＤＥＰＣ水内において溶解する。
【００８４】
ここで、ＲＮＡはマイクロアレイハイブリダイズするための標識のため、あるいは第二の増幅ラウンドの実施のために完成される。
【００８５】
Ｂ．第二の増幅ラウンド（図１ｃ参照）
Ｂ１．  ボックス配列を有する増幅されたＲＮＡの逆転写
【００８６】
【表８】
2005532797.tif 000010
【００８７】
熱蓋を用いてサーモサイクラー内において６５°Ｃ、４分間培養し、続いて氷上に配置する。
【００８８】
【表９】
2005532797.tif 000011
【００８９】
第一のｃＤＮＡ鎖合成混合物をピペットで氷上に配置し、サンプルのために氷浴する。
【００９０】
続いて、サンプルを４８°Ｃに加熱されたサーモサイクラー内に配置する。
【００９１】
サンプルの培養：
４８°Ｃ／１分間
４５°Ｃでの冷却
１μｌ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）のサンプルへの投与
４５°Ｃ／３０分間
７０°Ｃ／１５分間
続いて氷上に配置する。
【００９２】
Ｂ２．ＲＮＡの除去
【００９３】
【表１０】
2005532797.tif 000012
【００９４】
３７°Ｃで２０分間の培養、続いて氷上に配置。リボソームＲＮＡの除去のために、ＲＮアーゼＡは、活性化が非常に困難であるため、使用されない。使用されるＲＮアーゼＩは、この場所において、７０°Ｃで１５分間の培養によって、最適に完全に不活性化される。
【００９５】
Ｂ３．Ｔ７（ｄＴ）１８Ｖプライマーを有するテンプレートＤＮＡ二本鎖
【００９６】
【表１１】
2005532797.tif 000013
【００９７】
培養：
９６°Ｃ／１分間
４２°Ｃ／１分間
１μｌ逆転写酵素（５Ｕ／μｌ）のサンプルへの投与
４２°Ｃ／３０分間
ｄｓＤＮＡ末端の平滑化
３７°Ｃで冷却
１μｌＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）
３７°Ｃ／３分間
９６°Ｃ／１５分間
続いてサンプルを氷上に配置する。
【００９８】
Ｂ４．Ｈｉｇｈ−ＰｕｒｅＰＣＲ精製キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてｃＤＮＡの精製
【００９９】
【表１２】
2005532797.tif 000014
【０１００】
混合物をピペットでカラム上に配置し、卓上遠心分離器内において最大回転数において１分間遠心分離する。漏液を除去し、カラムを５００μｌの洗浄緩衝剤によって充填し、上記のように遠心分離する。漏液を除去し、カラムを２００μｌの洗浄緩衝剤によって充填し、上記のように遠心分離する。
【０１０１】
カラムを新たな１．５ｍｌのエッペンドルフ容器内に移行し、かつ５０μｌの溶離緩衝剤によって充填し、１分間培養し、そして上記のように遠心分離する。溶離工程はもう一度上記のように繰り返す。
【０１０２】
Ｂ５．精製されたｃＤＮＡのエタノール沈殿
Ｐｅｌｌｅｔ ＰａｉｎｔＴＭキャリアストック溶液を渦巻かせることなく常に暗部保存する。−２０°Ｃでの長期保存、少量のアリコートは、ほぼ１ヶ月の４°Ｃで保存され得る。
【０１０３】
【表１３】
2005532797.tif 000015
【０１０４】
沈殿物をよく混ぜ（ボルテックスせず）、ｃＤＮＡを室温において１０分間、最大回転数によってペレットにする。上ずみ液を除去し、ペレットを２００μｌ、７０％のエタノールで一度精製する。上記したように１分間遠心分離し、上ずみ液をピペットによって完全に除去する。ペレットの乾燥のために、エッペンドルフ容器をほぼ５分間、室温において開放させる。スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）内において乾燥してはならない。続いて、ペレットを８μｌのトリス緩衝剤（ｐＨ８．５）内において溶解し、氷上に配置する。
【０１０５】
Ｂ６．  インビトロでの第二の増幅
【０１０６】
【表１４】
2005532797.tif 000016
【０１０７】
全ての成分を溶かし、沈殿物を氷上ではなく室温においてピペットする。なぜなら、反応緩衝剤内のスペルミジンはテンプレートの沈降物となるためである。反応のために、０．５ｍｌあるいは０．２ｍｌのＲＮアーゼ−フリーＰＣＲチューブが使用される。
【０１０８】
転写を、熱蓋を用いてサーモサイクラー内に、あるいはハイブリダイズオーブン内に３７°Ｃで夜間培養する。１〜２μｌの沈殿物を自然の１．５％アガロース上に配置する。続いて、反応毎に１μｌのＤＮアーゼを付与し、さらに１５分間、３７°Ｃにて培養する。ＲＮＡの精製のために、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙキットを使用し、ＲＮＡクリーンアッププロトコルにしたがって設定する。続いて、ＲＮＡを、２×５０μｌＤＥＰＣ水を用いて溶離し、工程５に示されたように、エタノールによって沈殿する。ＲＮＡペレットは、５μｌＤＥＰＣ水内において溶解する。
【０１０９】
ここで、ＲＮＡはマイクロアレイハイブリダイズするための標識のため、あるいはさらなる増幅ラウンドの実施のために完成される（これらはＢ１〜Ｂ６に記載されたように忠実に行われる）。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】本発明による方法工程の順序を示す図である。
【図１ｂ】同じく、方法工程の順序を示す図である。
【図１ｃ】同じく、方法工程の順序を示す図である。
【図１ａ】
2005532797.tif 000017
【図１ｂ】
2005532797.tif 000018
【図１ｃ】
2005532797.tif 000019
【配列表】
2005532797000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月22日(2004.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸の増幅方法であって、以下の工程、
（ａ）  規定された配列の一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ一本鎖を、ＲＮＡから逆転写によって生成する工程と、
（ｂ）  該ＲＮＡを除去する工程と、
（ｃ）  ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、
（ｃ）  一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、ここで、該一本鎖プライマーは、ボックス配列および３個〜９個の任意のヌクレオチドの配列を含み、該ボックス配列は該一本鎖プライマーの５’領域に存在する１０個〜２５個の長さのヌクレオチドの配列を含み、該配列は生体で発現される遺伝子配列への低いホモロジーを含み、ここで該生体から該増幅されるＲＮＡが得られ、
（ｄ）  該ＤＮＡ二本鎖をＤＮＡ一本鎖に分離する工程と、
（ｅ）  その５’領域にプロモータの配列およびその３’領域に工程（ａ）における該プライマーと同一配列を含む一本鎖プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、ＤＮＡ二本鎖を、工程（ｄ）において得られた該ＤＮＡ一本鎖の１つから、生成する工程と、
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、その両末端において規定された配列を有する複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ一本鎖は、ＲＮＡ出発材料のような、逆センス方向（アンチセンス配列）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）において使用される前記一本鎖プライマーは、オリゴｄＴ配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記逆転写のために、工程（ａ）において、５’（ｄＴ）１８Ｖ−プライマーが使用され、ここでＶは、ｄＴではないデオキシリボヌクレオチド−モノマーを示す、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、前記ＲＮＡはＲＮアーゼによって加水分解される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）において、前記ＲＮＡはＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨによって除去される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）において、配列  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＴＣＴ（ｎｔ）を有する一本鎖プライマーが使用される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
逆転写酵素がＤＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰが、デオキシリボヌクレオチシド三リン酸塩として使用される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｄ）において、前記ＤＮＡ二本鎖は、熱作用によって一本鎖に分離される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｅ）において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータあるいはＳ６ＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｅ）において、プロモータ配列、および少なくとも８個のヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｅ）において、前記一本鎖プライマーは、配列  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ  ｇ＋１  ｇ（ｄＴ）１８Ｖ（４０ｎｔ）を有する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｆ）において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼとして使用される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰがリボヌクレオシド三リン酸塩として使用される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記開始ＲＮＡ配列の増幅は、少なくとも５００倍、好ましくは１０００倍より多く達成される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｆ）の後に、以下の工程：
（ｇ）  工程（ｆ）において生成された複数のＲＮＡ一本鎖、前記ボックス配列を含む一本鎖プライマー、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩から、逆転写によって、ＤＮＡ一本鎖を生成する工程と、
（ｈ）  前記ＲＮＡを除去する工程と、
（ｉ）５’領域においてはプロモータの前記配列、および３’領域においては工程（ａ）において使用されたプライマーと同一に規定された配列を含む一本鎖プライマーを用いて、工程（ｇ）において生成された前記ＤＮＡ一本鎖から、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩ＤＮＡ二本鎖を生成する工程と、
（ｊ）ＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオシド三リン酸塩を用いて、複数のＲＮＡ一本鎖を生成する工程と、
をさらに包含する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉ）において使用された前記一本鎖プライマーは、工程（ｅ）において使用されたプライマーと同一の配列を有する、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｈ）における前記ＲＮＡは、ＲＮアーゼによって加水分解される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｊ）において生成された全てのＲＮＡ一本鎖は、逆センス方向を有する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から２０のいずれか１項に記載のリボ核酸の増幅用のキットであって、以下の成分
（ａ）  プロモータ配列を含む少なくとも１つの一本鎖プライマーと、
（ｂ）  少なくとも１つの一本鎖プライマーと、ここで該一本鎖プライマーは、ボックス配列および３個〜９個の任意のヌクレオチドの配列を含み、該ボックス配列は該一本鎖プライマーの５’領域に存在する１０個〜２５個の長さのヌクレオチドの配列を含み、該配列は生体で発現される遺伝子配列への低いホモロジーを含み、ここで該生体から該増幅されるＲＮＡが得られ、
（ｃ）  ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｄ）  デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩と、
（ｅ）  ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと、
（ｆ）  ＲＮＡポリメラーゼと、
（ｇ）  リボヌクレオシド三リン酸塩と、
を含む、キット。
【請求項２２】
３つの異なる一本鎖プライマーを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記プロモータ配列の前記一本鎖プライマーは、またオリゴｄＴ配列を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
一本鎖プライマーは、５’（ｄＴ）１８Ｖ−プライマー配列を含み、ここでＶは、ｄＴではないデオキシリボヌクレオチド−モノマーを示す、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
追加的に、ＲＮアーゼＩおよび/またはＲＮアーゼＨを含む、請求項２１から２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
一本鎖プライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータあるいはＳ６ＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を含む一本鎖プライマーが使用される、請求項２１から２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
連続配列  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  Ａ  ｇ＋１  ｇ（ｄＴ）１８Ｖ（４０ｎｔ）の一本鎖プライマーを含む、請求項２１から２６のいずれか１項記載のキット。
【請求項２８】
ＤＮＡポリメラーゼとして逆転写酵素を含む、請求項２１から２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項２１から２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
検出可能な化合物によってＤＮＡを標識するための構成を含む、請求項２１から２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
ＤＮＡマイクロアレイを含む、請求項２１から３０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
核酸の分析方法であって、
請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法を用いて増幅され、かつマイクロアレイを用いて分析されるリボ核酸が得られる、方法。
【請求項３３】
前記リボ核酸が、生化学的サンプルから単離されることによって得られる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅されたリボ核酸が、逆転写によってｃＤＮＡに変換され、該ｃＤＮＡがマイクロアレイを用いて分析される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｃＤＮＡの質量および配列が分析される、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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