(57)【要約】本発明は、血管新生関連疾患の治療または予防のための、ならびに血栓性障害の治療または予防のための製剤組成物の調製のための、一般式Ｉ（式中、Ｒ1は、水素原子、位置２’、３’または４’におけるヒドロキシル基、位置２’、３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置３’または４’におけるエトキシ基を示し、Ｒ2は、水素原子、位置３’、４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、位置３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置５’におけるエトキシ基を示し、Ｒ3は、水素原子、位置４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、あるいは位置４’、５’または６’におけるメトキシ基を示し、Ｒ4は、水素原子またはヒドロキシル基を示す）の８−プレニルフラバノンの使用を提供する。
2005526122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生関連疾患の治療または予防のための、ならびに血栓性障害の治療または予防のための製剤組成物の調製のための、一般式Ｉ：
【化１】
2005526122.tif 000006
（式中、Ｒ1は、水素原子、位置２’、３’または４’におけるヒドロキシル基、位置２’、３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置３’または４’におけるエトキシ基を示し、
Ｒ2は、水素原子、位置３’、４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、位置３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置５’におけるエトキシ基を示し、
Ｒ3は、水素原子、位置４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、あるいは位置４’、５’または６’におけるメトキシ基を示し、
Ｒ4は、水素原子またはヒドロキシル基を示す）
の８−プレニルフラバノンの使用。
【請求項２】
前記８−プレニルフラバノンが８−プレニルナリンゲニンである請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記血管新生関連疾患が癌である請求項１記載の使用。
【請求項４】
前記血管新生関連疾患の予防および治療のための1つまたは複数の一般式Ｉの８−プレニルフラバノンおよび少なくとも1つの製薬上許容可能な賦形剤を含む製剤組成物。
【請求項５】
前記８−プレニルフラバノンが８−プレニルナリンゲニンである請求項４記載の製剤組成物。
【請求項６】
前記血管新生関連疾患が癌である請求項４または５記載の製剤組成物。
【請求項７】
前記血栓性障害の予防および治療のための1つまたは複数の一般式Ｉの８−プレニルフラバノンおよび少なくとも1つの製薬上許容可能な賦形剤を含む製剤組成物。
【請求項８】
前記８−プレニルフラバノンが８−プレニルナリンゲニンである請求項７記載の製剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、製剤組成物中の８−プレニルフラバノンの使用に関する。
８−プレニルフラバノンは、種々の植物中に見出される。この群の化合物の一成員は、例えばムギワラギク属のヘリクリサムヒポセファルムHelichrysum hypocephalum（Bohlmann, F. et al. 1979, Phytochemistry 18, 1246-1247）および柑橘類植物（Ito, C. et al. 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 3292-3295）中に生じる８−プレニルナリンゲニン（５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−８−（３−メチルブト−２−エニル）−クロマン−４−オン）である。それは、以下の構造を有する：
【０００２】
【化１】
2005526122.tif 000003
【０００３】
それは、エストロゲン活性を有することが示されている（Kitaoka, M. JP 08-165238）。それは経口腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性に関しても試験されたが、しかし結果は、正常細胞と比較して、腫瘍細胞に対するわずかに高い細胞傷害活性を示しただけであった（Shirataki, Y. et al. 2001, Anticancer Research 21, 275-280）。
【０００４】
新規の毛細血管の形成である血管新生は、細胞増殖、創傷治癒および女性生殖機能に必要とされており、血管腫の、そして眼の新血管新生の過程の重要な構成成分である（Pepper, 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 605-619により再検討されている）。それは固形腫瘍の増殖および持続ならびにそれらの転移にも不可欠である。臨界サイズを越えて増殖する固形腫瘍に関しては、それらは周囲間質から内皮細胞を動員して、それら自体の内因性微小環境を形成しなければならない（Folkman, 1974）。血管新生を刺激するために、陽性制御因子の産生が上向き調節される。
【０００５】
血管新生の陽性制御因子としては、血管内皮増殖因子（VEGF）および塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGF）ファミリーの成員が挙げられる。血管新生の内因性陰性制御因子、即ち血管新生の阻害剤としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、トロンボスポンジン、インターフェロン、血小板IV因子、プロラクチンの16 kDaＮ末端断片、IL-12、gro-β、プロリフェリン関連タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、２−メトキシエストラジオールおよび可溶性サイトカインが挙げられる。これらの化合物のほとんどが、ペプチドまたはタンパク質である。
【０００６】
血管新生関連疾患の治療のためには、血管新生を抑制する低分子量化合物を有することが望ましい。
【０００７】
繊維素溶解は、プラスミノーゲン活性化因子（tPA）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（PAI-1）の発現により制御される。tPAまたはその他のプラスミノーゲン活性化因子は、急性心筋梗塞の治療のために用いられる。しかしながらこの療法は、血栓性疾患の予防または長期治療のために適用可能でない。この場合、繊維素溶解活性の内因性増大が望ましい。これは、プラスミノーゲン活性化因子活性を増大することにより、そしてPAI-1の活性を低減することにより達成され得た。両活性を増大する（例えばVEGF、Pepper et al. 1991 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 605-619; Mandriota et al. 1995, J. Biol. Chem. 270: 9709-9716）か、あるいはtPAに非常に少ししか作用しないが、しかしウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を増大する（例えばbFGF、Pepper et al. 1990, J. Cell Biol. 111: 743-755）物質が記載されている。
【０００８】
したがって問題は、内因性tPA活性を増大し、そしてPAI-1活性を低減する物質を見つけ出すことである。
本発明は、血管新生関連疾患の治療または予防のための、ならびに血栓性障害の治療または予防のための製剤組成物の調製のための、一般式Ｉ：
【０００９】
【化２】
2005526122.tif 000004
【００１０】
（式中、Ｒ1は、水素原子、位置２’、３’または４’におけるヒドロキシル基、位置２’、３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置３’または４’におけるエトキシ基を示し、
Ｒ2は、水素原子、位置３’、４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、位置３’または４’におけるメトキシ基、あるいは位置５’におけるエトキシ基を示し、
Ｒ3は、水素原子、位置４’、５’または６’におけるヒドロキシル基、あるいは位置４’、５’または６’におけるメトキシ基を示し、
Ｒ4は、水素原子またはヒドロキシル基を示す）
の８−プレニルフラバノンの使用を提供することにより、2つの問題を解決する。式Ｉの好ましい化合物は、８−プレニルナリンゲニン（式中、R1、R2およびR4は水素原子を示し、そしてR3は位置４’におけるヒドロキシル基を示す）である。
【００１１】
８−プレニルフラバノンは、血管新生に及ぼす抑制作用を示す。８−プレニルナリンゲニンは、種々の陽性制御因子、例えばbFGFおよびVEGFにより、ならびに組合せたbFGFとVEGFの相乗作用によっても誘導される血管新生を抑制する。８−プレニルナリンゲニンによるニワトリ胚漿尿膜（CAM）の処置は、血管増殖の有意の低減を生じる（表および図６）。
【００１２】
一般式Ｉの１つまたは複数の８−プレニルフラバノンは、血管新生関連疾患の予防および治療のための製剤組成物の調製のために用いられ得る。血管新生関連疾患は、例えば血管新生依存性癌様固形悪性および転移性腫瘍、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、眼性血管新生性疾患、プラーク新血管新生、アテローム硬化症および強皮症である。
【００１３】
一般式Ｉの８−プレニルフラバノンは、対応するmRNAの量を確定することにより測定されるtPAの発現を、ならびにザイモグラフィーにより測定されるtPAの活性を増大する。RNAの量は、実施例６に記載されるようなノーザンブロット分析により確定され、そしてザイモグラフィーは、実施例５に記載されるように実施され得る。さらに一般式Ｉの８−プレニルフラバノンは、逆ザイモグラフィーにより測定されるPAI-1の活性を低減し（実施例５参照）、そして対応するmRNAの量を確定することにより測定されるuPAの発現、ならびにuPAの活性を低減する。構造的に無関係な植物エストロゲンであるゲニステインは、uPAを低減することが以前に示されている（Fotsis et al. 1993, Cancer Res. 57: 2916-2921）。
【００１４】
本発明の一目的は、血栓性障害の治療および予防のための製剤組成物の調製のための一般式Ｉの１つまたは複数の８−プレニルフラバノンの使用である。血栓性障害は、例えば冠動脈血栓症（急性心筋梗塞）、静脈血栓症、脳動脈血栓症（虚血性卒中）、閉塞性血栓血管炎（バーガー病）、側頭動脈炎（ホートン病）、高安動脈炎およびAPC耐性動脈炎である。
【００１５】
さらなる目的では、本発明は、血管新生関連疾患の治療のための、ならびに血栓性障害の治療および予防のための１つまたは複数の８−プレニルフラバノンおよび少なくとも１つの製薬上許容可能な賦形剤を含む製剤組成物に関する。これらの賦形剤は、担体、希釈剤、吸収強化剤、防腐剤、緩衝剤、浸透圧を調整するための作用物質、錠剤崩壊剤、ならびに当該技術分野で慣用的に用いられるその他の成分であり得る。固体担体の例は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、デキストリン、ラクトース、糖、タルク、ゼラチン、ペクチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点蝋およびココアバターである。液体組成物としては、滅菌溶液、懸濁液および乳濁液が挙げられる。８−プレニルナリンゲニンの経皮投与のための組成物は、パッチの形態で提供され、鼻投与のための組成物は液体または粉末形態での鼻スプレーの形態で提供され得る。
【００１６】
通常1000 mg以下、好ましくは100 mg以下、そしていくつかの好ましい場合には10 mg以下の１つまたは複数の８−プレニルフラバノンが、ヒトに1日当たりで投与されるべきである。
【実施例】
【００１７】
実施例１．８−プレニルフラバノンの合成
８−プレニルフラバノンを、日本国特許第08-165238号に記載された方法により合成する。８−プレニルナリンゲニンは、Satoshi Tahara, Phytochemistry 36, 1261-1271, 1994に記載されたように合成した。
【００１８】
実施例２．細胞培養
ウシ副腎皮質由来微小血管内皮細胞（BME細胞、Furie et al., 1984, J. Cell Biol. 98, 1033-1041）を、加熱不活性化ドナー仔牛血清（DCS−Flow Laboratories）、ペニシリン（110 U/ml）およびストレプトマイシン（110 μg/ml）を補充した最小必須培地（α改変）（α−MEM−Gibco BRL）中で増殖させた。前に記載されたように（Pepper et al., Am J. Physiol. 262: C1246-C1257, 1992）成体ウシ胸大動脈の切削片から単離し、限定希釈によりクローン化したウシ大動脈内皮（BAE）細胞を、10％DCSおよび抗生物質を補充した低グルコースダルベッコ改変最小必須培地（DMEM、Gibco）中で培養した。
【００１９】
細胞株を1.5％ゼラチン被覆組織培養フラスコ（Falcon Labware, Becton-Dickinson Company）中に保持し、1/3または1/4の分離比で継代培養した。細胞の内皮細胞性は、Dil-Ac-LDL（Paesel and Lorei）取り込みおよびヒトフォン・ウィルブランド因子（Nordic Immunology）に対するウサギポリクローナル抗血清による免疫染色により以前に確証されている。
【００２０】
実施例３．８−プレニルナリンゲニンはｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生においてＢＭＥおよびＢＡＥ細胞を抑制する
bFGFおよびVEGFは、三次元コラー広がるようBMEおよびBAEを誘導し、これは管状構造のような毛細血管の形成により成し遂げられる（Montesano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7297-7301, 1986; Pepper et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 189: 824-831, 1992; Pepper et al., Exp. Cell Res. 204: 356-363, 1993; Pepper et al., J. Cell Sci. 108: 73-83, 1995）。さらにbFGFおよびVEGFは、BMEおよびBAE細胞における相乗的侵襲性応答を誘導する（Pepper et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824-831; Pepper et al., 1995, J. Cell Sci. 108: 73-83）。
【００２１】
in vitro血管新生検定
記載された通りに（Montesano et al., Cell 42: 469-477, 1985）三次元コラーゲンゲルを調製した：ラット尾の腱（約1.5 mg/ml）からのＩ型コラーゲンの溶液8容積を、10x 最小必須培地1容積および重炭酸ナトリウム（11.76 mg/ml）1容積を氷上で混合し、18 mm組織培養ウエル中に分配し、37℃で10分間、ゲル化させた。次にBME細胞を、5％DCSを補充したα−MEM500 μl中に1.0 x 105細胞／ウエルでコラーゲンゲル上に植え付けて、集密に増殖させ（3〜4日）、この時点で血清を2％に低減し、bFGF（155アミノ酸形態）および／またはVEGF（165アミノ酸ホモ二量体種−VEGF165（Peprotechから））および８−プレニルナリンゲニンによる処置を開始した。2および4日後に、培地および処置を取り替えた。1.0 mm x 1.4 mmを測定する3つの無作為選定視野を、ニコンDiaphotTMD倒立写真用顕微鏡を用いて、位相差顕微鏡により表面単層下の単一レベルで、各ウエル中で写真撮影した。
【００２２】
見かけ上単一細胞として、または細胞索の形態で、表面単層下に貫入していた全細胞構造の総付加長を確定することにより、侵襲を定量した（Pepper et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 189: 824-831, 1992）。結果を平均総付加出芽長（μm）±s.e.m．として表すが、これらは3つの別個の実験／条件からである。（±）−８−プレニルナリンゲニンの場合、bFGF（10 ng/ml）またはbFGF＋VEGFで処理した細胞を2〜3日後に写真撮影し、一方、VEGF（30 ng/ml）単独で処理した細胞を4〜7日後に写真撮影した。VEGF誘導性侵襲の動態は、bFGFまたはbFGF＋VEGFに関するものより遅い、ということが前に示されている（Pepper et al., J. Cell Physiol. 177: 439-452, 1998）。
【００２３】
結果：
（±）−８−プレニルナリンゲニンは、用量依存的方式で、bFGF、VEGFまたはbFGFおよびVEGFの組合せにより誘導されるin vitro血管新生を抑制する（図１）。定量分析は、８−プレニルナリンゲニンが、血管新生刺激に関係なく、3〜10 μM間のIC50でBME細胞侵襲を抑制する、ということを明示した（図１）。
【００２４】
実施例４．８−プレニルナリンゲニンはＢＭＥ細胞増殖を抑制する増殖検定
BME細胞を、5％DCSを補充したα−MEM中に1,000細胞／ウエルで24ウエルプレートのゼラチン被覆ウエル中に植え付けた。24時間後、新鮮な培地を、指定濃度の８−プレニルナリンゲニンまたはTGF-β1（1 ng/ml）と一緒に付加し、bFGF（10 ng/ml）をウエルの半分に付加した。2日後、培地および化合物を取り替えて、さらに3日後（即ち5日検定）、細胞をトリプシン処理し、FACスキャン分析器で計数した。結果を、二重反復実験ウエルの平均から算定した抑制（％）として示す。
【００２５】
結果：
5％DCSの存在下での5日増殖検定において、８−プレニルナリンゲニンは、用量依存的方式でBME細胞数を低減した（図２）。この作用により、bFGFが培地に同時付加されたか否かを観察した。抑制は約10 μMのIC50で起こり、最大抑制作用は30μMの８−プレニルナリンゲニンで観察された（それぞれbFGFの非存在下および存在下で67および75％抑制）。比較として、TGF-β1は、bFGFの非存在下および存在下でそれぞれ90％および92％、BME細胞増殖を抑制した（図２）。
【００２６】
実施例５．ザイモグラフィーおよび逆ザイモグラフィー検定
35 mmゼラチン被覆組織培養皿中のBMEまたはBAE細胞の集密的細胞単層を無血清培地で2回洗浄し、トラシルオール（200 カリクレイン抑制単位／ml）を含有する無血清培地中で、bFGFまたはVEGFの非存在下または存在下で（±）８−プレニルナリンゲニンで処理した。15時間後、細胞抽出物を調製し、前に記載されたようにザイモグラフィーおよび逆ザイモグラフィーにより分析した（Vassalli et al., 1984, J. Exp. Med. 159: 1653-1668）。
【００２７】
結果：
ザイモグラフィーにより、（±）−８−プレニルナリンゲニンはBME細胞におけるuPAおよびtPA活性の用量依存性増大を誘導する、ということをわれわれは観察した（図１）。これには、逆ザイモグラフィーにより検出されるようなPAI-1活性の低減が伴ったが、これはおそらく、PAI-1のtPA/PAI-1複合体への封鎖のためである（無血清培地へのトラシルオールの付加は、単一鎖形態でuPAおよびtPAを保有する。しかしながらuPAとは異なり、この形態のtPAは、PAI-1と結合することができ、この状況は用いた培養条件下では回避し得ない）。
【００２８】
bFGFはuPAを顕著に増大し、BME細胞中のtPAにはほとんど影響を及ぼさない、ということをわれわれは以前報告した（Pepper et al., 1990, J. Cell Biol. 111: 743-755）。ここで、bFGFは（±）−８−プレニルナリンゲニンによるtPA活性の誘導を助長し、uPAに可変的濃度依存性作用を及ぼす、ということをわれわれは観察した（図９）。VEGFはBME細胞中でuPA、uPAR、tPAおよびPAI-1を誘導する、ということをわれわれは以前報告した（Pepper et al., 1991, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 605-619; Mandriota et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 9709-9716）。
【００２９】
本試験において、VEGFおよび（±）−８−プレニルナリンゲニンはBME細胞中でのtPA活性の誘導において相乗作用を示す、ということをわれわれは観察した（データは示されていない）。ザイモグラフィーおよび逆ザイモグラフィー分析のために細胞を血清の非存在下で15時間インキュベートした上記の実験において、30 μMの（±）−８−プレニルナリンゲニンで明白な毒性を観察した。これは、2％血清の存在下で（±）−８−プレニルナリンゲニンをBME細胞に付加した場合に100 μMで観察される毒性と対照を成す。
【００３０】
ザイモグラフィーによれば、uPAおよびtPA活性はともに、（±）−８−プレニルナリンゲニンによりBAE細胞中で増大された。これは、逆ザイモグラフィーにより検出されるように、PAI-1の低減を伴った（図10）。BME細胞に関して上記したように、PAI-1活性の低減は、おそらくはtPA/PAI-1複合対中のPAI-1の封鎖のためである。bFGFは、BAE細胞中のuPAおよびtPAを増大する、ということをわれわれは以前報告した（Mandriota et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 9709-9716）。ここで、BAE細胞において、bFGFは（±）−８−プレニルナリンゲニンによるtPA活性の誘導を助長し、（±）−８−プレニルナリンゲニンはbFGF誘導性uPA活性を低減する、ということをわれわれは示す（図10）。
【００３１】
実施例６．RNA調製、in vitro転写およびノーザンブロットハイブリダイゼーション方法
24時間前に5％DCSを含有する新鮮な培地を付加しておいた集密的BME細胞単層に、（±）−８−プレニルナリンゲニンまたはゲニステインを付加した。メーカーの使用説明書に従って、トリゾール試薬（Life Technologies AG, Basel, Switzrland）を用いて指示時間後に総細胞RNAを調製した。ノーザンブロット、UV架橋およびフィルターのメチレンブルー染色、in vitro転写、ハイブリダイゼーションならびにハイブリダイゼーション後洗浄は、前に記載されたのと同様であった（Pepper et al., 1990, J. Cell Biol. 111: 743-755）。
【００３２】
ウシウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（u-PA）（Kratzschmar et al., 1993, Gene 125: 177-183）、ウシu-PA受容体（u-PAr）（Kratzschmar et al., 1993, Gene 125: 177-183）、ヒト組織型PA（t-PA）（Fisher et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 11223-11230）およびウシPA阻害剤-1（PAI-1）（Pepper et al., 1990, J. Cell Biol. 111: 743-755）から、［32P］−標識化cRNAプローブを調製した。フィルターをコダックX-OMAT XAR-5科学イメージングフィルム（Eastman Kodak Co., Rochester, NY）に露出した。オートラジオグラムを走査し、ImageQuant（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて定量した。
【００３３】
結果：
ノーザンブロット分析により、（±）−８−プレニルナリンゲニンがBME細胞中の定常レベルのuPA、uPARおよびtPA mRNAを増大する、ということをわれわれは見出した（図７および８）。uPA（7.5倍増）、uPAR（6.4倍増）およびtPA（9.6倍増）に関して、9時間後に（±）−８−プレニルナリンゲニンの最大作用を観察した。（±）−８−プレニルナリンゲニンはPAI-1 mRNAのレベルには有意の作用を及ぼさなかった。
【００３４】
BME細胞に対比して、（±）−８−プレニルナリンゲニンは、BAE細胞中のuPAまたはuPAR mRNAレベルにほとんど作用しなかったが、しかし24時間後にtPAレベルの4.6倍増大を誘導した（図８）。
【００３５】
実施例７．初期ニワトリ胚漿尿膜（CAM）検定における８−プレニルナリンゲニンの作用
方法：
・インキュベーション3日目に、受精ニワトリ卵を割って殻から出して、ex vivo装置に移した。
・37℃加湿インキュベーター中で4日目までインキュベーションを継続した。
・4日目に、デジタルカメラ（Panasonic GP-KR222）を取り付けた解剖顕微鏡（SZ-CTV Olympus）を用いて胚を写真撮影し、画像分析ソフトウェア（Video Pro, Leading Edge Pty Ltd, Australia）で画像を捉えた。
【００３６】
・CAM面積を測定し、胚を同サイズの群に分け、各群にはビヒクル対照を付した。
・真空下で容器中で一晩乾燥させておいたメチルセルロース円板上で処置を適用した。円板は直径5〜8 mmで、適用時にはCAMより大きく、即ち物質をCAMの全表面積上に拡散させた。用いた用量レベルは、８−プレニルナリンゲニンに関しては62.5、125、250および500 nmol、ゲニステインに関しては62.5、125および250 nmolであった。62.5 nmolの８−プレニルナリンゲニンまたは62.5 nmolのゲニステインを、単独で、または組合せ処置群と一緒に、円板に付加した。
【００３７】
・胚をさらに18〜24時間インキュベートした。
・30G針を用いて、CAM中にスキムミルク＋造影剤を注入した。漸増レベルの倍率で画像を直ちに捕獲した。CAMの左側に出た場合、63x画像を主静脈枝（単数または複数）からも撮った。
・画像分析を用いて各CAMの5倍画像から、静脈および動脈長ならびにCAM面積を測定した。相対血管長を血管長／CAM面積として算定した。
・主静脈枝（単数または複数）63x画像を用いて、血管直径を測定した。
・ウインドウズバージョン2.03用のシグマスタットSigmaStat（SPSS Inc.）を用いて、統計学的検査を実施した。一元ANOVAを用い、そして対多重比較にはスチューデント−ニューマン−クールズ法を用いた。データを非正規分布した場合、Rankに関するANOVAを実施し、その後、多重対比較のためにダン検定を実施した。ｐ＜0.05で有意が示された。
【００３８】
結果：
８−プレニルナリンゲニンを用いたニワトリ胚漿尿膜（CAM）の処置は、血管増殖の有意の低減を生じた（表）。血管長は125および500 nmolの８−プレニルナリンゲニンで最大に低減され、静脈長は対照の66％、動脈長はこれらの群における対照の74％であった。総血管長は、500 nmolの８−プレニルナリンゲニンにより対照の69％に低減された（ｐ＜0.05）。CAMの増殖に及ぼす最小作用のみが存在し、125 nmol群における対照の86％のCAM面積の増大が認められた。相対静脈および動脈長も低減された。相対静脈長は、500 nmol群においては対照の70％であった（ｐ＜0.05）。静脈直径は静脈長より多く低減され、500 nmol群においては対照の54％への低減を示した。
【００３９】
ビヒクル処置CAMは良好な発達血管系を有し、高度組織化嵌合血管を伴った。８−プレニルナリンゲニン処置CAMでは、静脈および動脈枝は十分に発達せず、主静脈枝は曲がりくねって、細い。表在レベルのCAM中の微細毛細血管が存在した。
主静脈の直径は、血管長測定値より大きい程度に低減された。血流は、血管直径の4分の1の力に比例するので、血管長より血管直径にはるかに多くよっている。静脈直径の約50％の低減が処置群で認められ、これは対照の6％の血流を示すに過ぎない。機能的には、これは、８−プレニルナリンゲニンがCAM内の血流に劇的作用を及ぼすことを意味する。
【００４０】
【表１】
2005526122.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、８−プレニルナリンゲニンが、in vitroで血管新生を抑制することを示す。指定濃度の８−プレニルナリンゲニンの非存在下または存在下で、bFGF（10 ng/ml）、VEGF（30 ng/ml）またはbFGFとVEGFの組合せを用いて、BME細胞を3日間処置した。結果を、少なくとも3つの別個の実験／条件からの平均付加出芽長±s.e.m．として表す。
【図２】図２は、８−プレニルナリンゲニンが、５日増殖検定において内皮細胞数を低減することを示す。5％DCSを含有する培地中で10,000細胞／ウエルで24ウエルプレート中にBME細胞を植え付けた。24時間後、細胞を指定濃度の８−プレニルナリンゲニンで、またはTGF-β1（1 ng/ml）で処置し、bFGF（10 ng/ml）をウエルの半分に付加した。結果を、二重反復実験ウエルの平均から算定した抑制（％）として示す。
【図３】図３は、（±）−８−プレニルナリンゲニンが、BME細胞中の定常レベルのuPA、uPARおよびtPA mRNAを増大することを示す。  指示時間の間、10 μMの（±）−８−プレニルナリンゲニンの非存在下（対照）または存在下でインキュベートしたBME細胞の集密的細胞単層から調製した総細胞RNA（5 μg／レーン）を含有する複製フィルターを、32P-標識化cRNAプローブを用いてハイブリダイズした。移入および架橋後に、フィルターをメチレンブルーで染色することにより、負荷のRNA統合性および均一性を確定した（図の下パネル）。28Sおよび18SリボソームRNAを示す。
【図４】図４は、BME細胞中のuPA、tPAおよびPAI-1活性に及ぼす（±）−８−プレニルナリンゲニンの作用を示す。  bFGF（10 ng/ml）の非存在下または存在下で15時間、指示濃度の（±）−８−プレニルナリンゲニンとともにインキュベートしたBME細胞から調製した細胞抽出物（CE）および培養上清（Sup）を、ザイモグラフィー（uPA、tPAおよびPAI-1複合体活性）および逆ザイモグラフィー（PAI-1活性）に付した。
【図５】図５は、BAE細胞中のuPA、tPAおよびPAI-1活性に及ぼす（±）−８−プレニルナリンゲニンの作用を示す。  bFGF（3 ng/ml）の非存在下または存在下で15時間、指示濃度の（±）−８−プレニルナリンゲニンとともにインキュベートしたBAE細胞から調製した細胞抽出物（CE）および培養上清（Sup）を、ザイモグラフィー（uPA、tPAおよびPAI-1複合体活性）および逆ザイモグラフィー（PAI-1活性）に付した。CEの印の付いた第二パネルは、上パネル中に示されたゲルのより長いインキュベーションである。
【図６】図６は、CAM血管長に及ぼす８−プレニルナリンゲニンの作用を示す。  実施例７に記載したように、実験を実施した。静脈および動脈の血管長を測定した。両測定値の全体も示す。各組の実験および全体に関して、第一のカラムはエタノール中の対照を示し、第二のカラムは62.5 nmolの８−プレニルナリンゲニンを付加したもの、第三、第四および第五のカラムは、それぞれ125 nmol、250 nmolおよび500 nmolの８−プレニルナリンゲニンを付加したものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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