(57)【要約】本発明は、転写終結配列、少なくとも１つの該転写終結配列を含む生物、並びに、リボフラビンの製造方法であって、リボフラビン生成能を有し、かつ少なくとも１つの該転写終結配列を有する生物を培養することを含み、その特定の転写終結配列が少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子と機能的に連結されているものである、上記方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビンの製造方法であって、
ａ）リボフラビン生成能を有し、かつ配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す転写終結配列を少なくとも１つ有する生物であって、その特定の転写終結配列が少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子と機能的に連結されているものである上記生物を培養する、
ｂ）前記生成されたリボフラビンを培地から回収する、
ことを特徴とするリボフラビンの製造方法。
【請求項２】
機能的な連結が、ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５又はｒｉｂ７の群からの少なくとも１つの遺伝子に対するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１に示す転写終結配列を用い、該転写終結配列の配列は野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置１３で改変されているものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号２に示す転写終結配列を用い、該転写終結配列の配列は野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置２５で改変されているものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号３に示す転写終結配列を用い、該転写終結配列の配列は野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置１３及び２５で改変されているものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
リボフラビン生成能を有する生物として、細菌、酵母、真菌又は植物を用いる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、エシェリヒア属、シアノバクテリウム属、アシュビア属、エレモテシウム属、ピヒア属、カンジダ属若しくはサッカロマイセス属、又はシロイナズナ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、キビ、オートムギ、サトウダイコン、ジャガイモ、ヒマワリ、マメ科植物若しくはトマト等の植物の群から選択される生物を用いる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アシュビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）、エレモテシウム・アシュビイ（Eremothecium ashbyii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・フラベリ（Candida flaveri）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、又はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）を生物として用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アシュビア・ゴシピイ又はエレモテシウム・アシュビイを用いる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１に示す配列を有する転写終結配列。
【請求項１１】
配列番号２に示す配列を有する転写終結配列。
【請求項１２】
配列番号３に示す配列を有する転写終結配列。
【請求項１３】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置１３で改変されている、請求項１０に記載の転写終結配列。
【請求項１４】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置２５で改変されている、請求項１１に記載の転写終結配列。
【請求項１５】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって、位置１３及び２５で改変されている、請求項１２に記載の転写終結配列。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの転写終結配列と、その特定の終結配列に機能的に連結された少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子、を含むことを特徴とする遺伝子構築物。
【請求項１７】
ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５又はｒｉｂ７の群からの少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１６に記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの転写終結配列又は請求項１６若しくは１７に記載の遺伝子構築物と、選択のため及び宿主細胞中での複製又は宿主細胞のゲノムへの組み込みのためのさらなるヌクレオチド配列、を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１９】
リボフラビンの生成能を有する生物であって、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの転写終結配列、又は請求項１６若しくは１７に記載の遺伝子構築物、又は請求項１８に記載のベクターを含むことを特徴とする生物。
【請求項２０】
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、エシェリヒア属、シアノバクテリウム属、アシュビア属、エレモテシウム属、ピヒア属、カンジダ属若しくはサッカロマイセス属、又はシロイナズナ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、キビ、オートムギ、サトウダイコン、ジャガイモ、ヒマワリ、マメ科植物若しくはトマト等の植物の群から選ばれる、請求項１９に記載の生物。
【請求項２１】
アシュビア・ゴシピイ、エレモテシウム・アシュビイ、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・フラベリ、カンジダ・ファマタ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、又はバチルス・ズブチリスである、請求項１９又は２０に記載の生物。
【請求項２２】
アシュビア・ゴシピイ又はエレモテシウム・アシュビイである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の生物。
【請求項２３】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５の野生型と比較して、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の群からの転写終結配列と機能的に連結されたｒｉｂ遺伝子の転写速度の上昇を示す、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の生物。
【請求項２４】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５の野生型と比較して、リボフラビン生成能が向上している、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の生物。
【請求項２５】
リボフラビン生成能を向上させるための、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の生物の使用。
【請求項２６】
リボフラビンの生成能を向上させるために、産生生物を作製するための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの転写終結配列の使用。
【請求項２７】
リボフラビン生成に関与する遺伝子の転写速度を上昇させるための、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの転写終結配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写終結配列、及びリボフラビン生成能を有し、かつ少なくとも１つのこれらの転写終結配列を含む生物に関する。本発明はまた、リボフラビン生成能を有し、かつ少なくとも１つの前記転写終結配列を有する生物を培養することを含む、改良されたリボフラビン製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＢ２は、リボフラビンとも呼ばれ、あらゆる植物及び多くの微生物によって生成される。リボフラビンは、自らこれを合成することができないためヒトや動物にとって必須のものである。リボフラビンは代謝に重要な役割を果たす。そのためリボフラビンは、例えば、炭水化物の利用と関わりがある。ビタミンＢ２欠乏症は、口及び喉の粘膜の炎症、皮膚のひだの痒みと炎症及び類似の皮膚損傷、結膜の炎症、視力低下、並びに角膜混濁に関連する。幼児や小児の場合、成長停止や体重減少が起こることもある。したがって、ビタミンＢ２は、例えば、ビタミン欠乏症のためのビタミン製品や飼料添加物として、経済的な重要性が大きい。ビタミンＢ２は様々な食料品に添加されている。例えば、マヨネーズ、アイスクリーム、ブラマンジェ等に食品着色剤としても使用されている。
【０００３】
ビタミンＢ２は化学的にあるいは微生物によって生成される（例えば、Kurthら、1996年、「Riboflavin」、Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry、VCH Weinheim）。化学的な生成方法では、リボフラビンは通常、多段階の工程において純粋な最終生産物として得られ、例えばＤ−リボースのような比較的高価な出発原料が必要である。
【０００４】
リボフラビンの化学合成に代わるのが、微生物の発酵によるビタミンＢ２の生成である。この場合、出発原料は砂糖又は植物油のような再生可能な原料である。エレモテシウム・アシュビイ（Eremothecium ashbyii）やアシュビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）等の真菌の発酵によるリボフラビン生産が知られているが（The Merck Index、Windholzら、Merck & Co.編、1983年、1183頁）、例えば、カンジダ、ピヒア、及びサッカロマイセス等の酵母、又はバチルス、クロストリジア、若しくはコリネバクテリウム等の細菌も、リボフラビンを生産するとの記述がある。欧州特許出願公開第０４０５３７０号及び同第０８２１０６３号には、細菌の組換え菌株を使用したリボフラビンの生産について記載されているが、この菌株は、リボフラビン生合成遺伝子による形質転換によってバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）から得られたものである。
【０００５】
国際公開第９５／２６４０６号又は同第９３／０３１８３号及び独国特許第４４  ２０  ７８５号の特許には真核生物であるアシュビア・ゴシピイ及びサッカロマイセス・セレビシエからのリボフラビン生合成に特異的な遺伝子のクローニング、これらの遺伝子で形質転換された微生物、並びにリボフラビン合成のためのかかる微生物の使用について記載されている。
【０００６】
どちらの生物においても、６つの酵素が、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びリブロース−５−リン酸から始まるリボフラビンの生成を触媒している。これは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ−ＩＩ（ｒｉｂ１遺伝子産物）によるＧＴＰの２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸への変換を伴うものである。その後、後者の化合物は２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−リン酸レダクターゼ（ｒｉｂ７遺伝子産物）によって２，５−ジアミノ−６−（リビチルアミノ）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン５−リン酸に還元され、続いて、特異的なデアミナーゼ（ｒｉｂ２遺伝子産物）によって脱アミノ化されて５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５−リン酸となる。その後、リン酸は非特異的なホスファターゼによって除去される。
【０００７】
ＧＴＰに加えて、第２出発原料であるリブロース５−リン酸が、リボフラビン生合成の最後の酵素反応ステップで、３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン−４−リン酸シンターゼ（ｒｉｂ３遺伝子産物）によって３，４−ジヒドロキシ−２−ブタノン４−リン酸（ＤＢＰ）に変換される。
【０００８】
ＤＢＰ及び５−アミノ−６−リビチアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオンのいずれも、６，７−ジメチル−８−リビチルルマジンの酵素的合成のための前駆体である。この反応はｒｉｂ４遺伝子産物（ＤＭＲＬシンターゼ）によって触媒される。ＤＭＲＬは、リボフラビンシンターゼ（ｒｉｂ５遺伝子産物）によってリボフラビンに変換される（Bacherら(1993年)、Bioorg. Chem. Front. 3巻、Springer Verlag）。
【０００９】
このようにリボフラビンの生成は進歩しているが、それでもなお、高まる需要に応え、リボフラビンの生成効率を高めるため、ビタミンＢ２の生産力を向上させ増加させる必要がある。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０４０５３７０号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０８２１０６３号
【特許文献３】国際公開第９５／２６４０６号
【特許文献４】国際公開第９３／０３１８３号
【特許文献５】独国特許第４４２０７８５号
【非特許文献１】Kurthら、1996年、「Riboflavin」、Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry、VCH Weinheim
【非特許文献２】The Merck Index、Windholzら、Merck & Co.編、1983年、1183頁
【非特許文献３】Bacherら(1993年)、Bioorg. Chem. Front. 3巻、Springer Verlag
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ビタミンＢ２の生産力をさらに向上させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的が、リボフラビン生成能を有し、かつ配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に示す転写終結配列を少なくとも１つ有する生物であって、その特定の転写終結配列が少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子（リボフラビン生合成の遺伝子）と機能的に連結されているものである上記生物を培養し、増加した程度まで形成されたリボフラビンを培地から回収する、リボフラビン製造方法によって達成されることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明によれば、リボフラビン製造法においては、ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５又はｒｉｂ７の群のうち少なくとも１つの遺伝子に対する機能的な連結があることが有利である。
【００１３】
リボフラビン生合成の少なくとも１つの遺伝子（ｒｉｂ遺伝子）に対する配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に示す群から選ばれる本発明の転写終結配列の機能的な連結は、そのような組み合わせが細菌、真菌、酵母、及び植物中に存在する場合、対応する遺伝子又は対応する遺伝子群の発現を増大させ、かつ／あるいは生成した転写物を安定させる作用をもたらし、その結果、これらの生物におけるリボフラビンの生成が増大する（アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５の野生型との比較において）。これに関連して、前記群から選ばれる本発明の終結配列の機能的な連結は、１つ又は複数のｒｉｂ遺伝子に対して可能であるが、それは、それぞれの遺伝子が個々にその終結配列に機能的に連結されているか、又はある遺伝子群（例えばクラスター若しくはオペロン）がそのような終結配列に機能的に連結されている場合である。リボフラビン生成のために好適な生物において、上記配列の種々の終結配列が存在することも含まれる。この場合、種々の終結配列のそれぞれを個別に１つのｒｉｂ遺伝子に機能的に連結させてもよい。あるいは、その種々の終結配列が複数の群として配置されたｒｉｂ遺伝子群に対する機能的な連結として存在してもよい。したがって、本発明の目的のため、前記転写終結配列のそれぞれが、個別に、あるいはすべての考えられる組み合わせのうち２つ単位で又は３つ単位で、リボフラビン生成のため好適な生物の中でｒｉｂ遺伝子に機能的に連結されて存在することが可能である。本発明の転写終結配列の機能的な連結はまた、リボフラビン生成に関与する１つ以上の他の遺伝子に対しても考えられる。
【００１４】
機能的な連結とは、例えば、プロモーター、コード配列、終結配列、及び必要に応じてそれ以上の調節配列の、調節機能及びコード機能を有するヌクレオチド配列が、それぞれの調節配列が、コード配列の発現時にその適切な機能を実行することができるように連続して配列されたものを意味する。このような調節機能をもつヌクレオチド配列は、天然由来のものでもよいし、化学合成によって得てもよい。ヌクレオチド配列の機能的な連結のための遺伝工学的手法は、従来から実験室での慣行の一部として行われてきたものであり、例えばD.M. Gloverら、DNA Cloning 1巻、(1995年)、IRL Press(ISBN 019-963476-9)を参照することができる。当業者には既知のヌクレオチド配列の塩基の合成法及び交換法も、ここで参照することができる。
【００１５】
配列番号１、配列番号２又は配列番号３に有利に示される本発明の転写終結配列の１つに対する、少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子の機能的な連結は、転写の終結を増大させる。このことが、今度は、終結配列の上流にある遺伝子の転写速度に間接的な影響を及ぼす。なぜなら、転写装置（つまりＲＮＡポリメラーゼとそれを補助する転写因子）が、本発明の終結配列を読み取った後、より効率的に放出され、それにより、新たな転写のために、より迅速に利用可能となるからである（Albertsら、3版、Molekularbiologie der Zelle、VCH Verlag）。その結果、このように、対応する遺伝子の転写速度を上昇させることができる。このことは、対応するコードされた遺伝子産物の活性（明らかに増大したリボフラビン生成能において最良となる）の増大と結びついた遺伝子発現の増大があることを意味している。さらに、本発明の転写終結配列のそれぞれは、形成される転写物を安定させる作用を発揮するものであってもよい。この場合、例えば、転写物の３’末端からの分解（例えばエキソヌクレアーゼによる分解）速度を遅くしたり、又は事実上、分解を妨げてもよい。その結果、転写物は、分解速度が低減するため、増大した量で翻訳されることができ、それが今度は、対応するコードされた酵素の活性を上昇させる。
【００１６】
本発明の有利な方法として、配列番号１に示す転写終結配列の使用がある。配列番号１に示す転写終結配列は、野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって位置１３で改変されている。同等に有利な方法として、配列番号２に示す転写終結配列の使用がある。配列番号２に示す転写終結配列は、野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって位置２５で改変されている。同等に有利な方法として、配列番号３に示す転写終結配列の使用がある。配列番号３に示す転写終結配列は、野生型ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の転写終結配列の配列と比較して、グアニンのアデニンによる置換によって位置１３及び２５で改変されている。これらの方法では、配列番号３に示す転写終結配列を使用する方法が好ましい。
【００１７】
本発明の転写終結配列のそれぞれは、必要に応じて、リボフラビン生成のために使用される生物のゲノム中に、数としては１つか又は複数のコピーとして存在することができる。これは、終結配列が機能的に連結される遺伝子が、１つか又は複数かによって異なる。したがって、例えば、配列番号１に示す終結配列の、１つのｒｉｂ遺伝子のみ又は複数の（この場合別々に組織化されることが好ましい）ｒｉｂ遺伝子（又はリボフラビン合成に関与する他の遺伝子）に対する機能的な連結が考えられる。同じことは、配列番号２に示す終結配列、又は配列番号３に示す終結配列に等しく適用される。
【００１８】
本発明には、このように、個々の転写終結配列又は本発明の３つの転写終結配列すべての組み合わせが含まれるが、特に、リボフラビン生成のために好適な生物のゲノム中に、単一コピーとして又は複数コピーとして、存在するものである。
【００１９】
リボフラビン生成を増大させる方法を実施するには、リボフラビン生成能を有する生物を用いるのが有利である。本発明の方法のための好適な生物又は宿主生物は、原則として、リボフラビンの合成能を有するすべての生物である。リボフラビンを自然に合成することができる生物が好ましい。しかし、完全なビタミンＢ２合成遺伝子を導入することでリボフラビンの合成能を有する生物もまた、本発明の方法に好適である。
【００２０】
細菌、酵母、真菌又は植物等の生物が、本発明の方法に好適である。
【００２１】
例として、真核生物、例えば、Indian Chem Engr. Bセクション、37巻、1,2号(1995年)15頁、表６に記載されているアシュビア属やエレモテシウム属等の真菌、カンジダ属、サッカロマイセス属若しくはピヒア属等の酵母、あるいはシロイナズナ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメ、キビ、ワタ、マメ科植物、サトウダイコン、ヒマワリ、アマ、タイマ、キャノーラ、オートムギ、タバコ、アルファルファ、レタス、又は様々な木、堅果及びつる植物種等の植物、あるいは、原核生物、例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクテリウム属、エシェリヒア属若しくはクレブシエラ属等のグラム陽性菌又はグラム陰性菌が挙げられる。
【００２２】
好ましい生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、アシュビア属、エレモテシウ属、カンジダ属、若しくはサッカロマイセス属の群、又はトウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ、若しくはトマト等の植物から選ばれる。
【００２３】
特に好ましい生物は、アシュビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）、エレモテシウム・アシュビイ（Eremothecium ashbyii）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・フラベリ（Candida flaveri）、カンジダ・ファマタ（Candida famata）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、又はバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis)の属及び種である。特に好ましい植物は、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ及びトマトである。アシュビア・ゴシピイ又はエレモテシウム・アシュビイが特に好ましい。
【００２４】
本発明にはまた、リボフラビン産生株が含まれる。その生産は、例えば、古典的な（化学若しくは物理的）方法又は遺伝子工学的方法により、リボフラビン生産に好適な野生株から始めるが、必要に応じてｒｉｂ遺伝子のフレームワーク内にさらに遺伝子改変を加えることも可能である。
【００２５】
本発明によれば、前述のｒｉｂ遺伝子には、リボフラビン生成能を有する生物由来の遺伝子が含まれる。バチルス・ズブチリス、サッカロマイセス・セレビシエ又はアシュビア・ゴシピイ由来の遺伝子が好ましいが、特に、アシュビア・ゴシピイｒｉｂ遺伝子が好ましい。本発明にはまた、これらの遺伝子の機能可能な類似体、機能的な等価物、又は誘導体が含まれる。
【００２６】
機能的な類似体とは、例えば、ｒｉｂ遺伝子又はその酵素活性の機能的なホモログ、すなわちｒｉｂ遺伝子酵素と同じ反応を触媒する酵素を意味する。
【００２７】
機能的な等価物とは、例えば、誘導されるアミノ酸レベルで、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも４５％、非常に特に好ましくは５０％の相同性を有する対立遺伝子変異体を意味する。対立遺伝子変異体には、特に、誘導される合成タンパク質の酵素活性を保持して、ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換によって得ることが可能な機能的な変異体が含まれる。
【００２８】
このタイプのＤＮＡ配列は、まず始めに、ｒｉｂ遺伝子の既知のＤＮＡ配列又はそのような配列の一部を用いて、アシュビア・ゴシピイ以外の、上述したような真核生物又は原核生物から、例えば、慣用のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ技術を用いて単離することができる。このようなＤＮＡ配列を、標準的な条件下で、前記配列とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションには、当業者に既知の方法で大腸菌と枯草菌（Bacillus subtilis）由来の対応する遺伝子と比較して同定することができる、保存領域の短いオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。
【００２９】
標準的な条件とは、例えば、濃度０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の水性緩衝液中で、又は付加的に５０％ホルムアミドの存在下で、温度４２〜５８℃を意味する。一例としては、５０％ホルムアミドの存在下で、５×ＳＳＣ、４２℃である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は例えばSambrookら「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory、1989年」等の関連した遺伝学の教科書に記載されている。ホモログとは、切断配列又は一本鎖ＤＮＡを意味する。
【００３０】
誘導体とは、遺伝子発現及び／又はタンパク質発現が変更されるように（好ましくは増大するように）、開始コドンの前のヌクレオチド配列が改変された変異体を意味する。
【００３１】
生物の異種遺伝子を最適に発現させるため、その生物の中で用いられる特異的なコドン使用頻度と一致するよう、核酸配列を改変することが有利である。コドン使用頻度は、関連する生物中の他の既知の遺伝子をコンピューターで分析することによって、容易に確認することができる。
【００３２】
また、ビタミンＢ２生産力を増大させるために有利なのは、前記ｒｉｂ遺伝子によってコードされた自然の酵素活性の増大と、前述の遺伝子の少なくとも１つを付加的に導入することによる遺伝子発現の増加とを組み合わせることか、あるいは、複数のこのような遺伝子をリボフラビンの生成能を有する生物と組み合わせることである。
【００３３】
細胞の中でｒｉｂ遺伝子産物の酵素活性を増大する可能性は多く存在する。１つの可能性としては、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す群からの、本発明の終結配列の１つに対して、ｒｉｂ遺伝子を機能的に連結させることである。その結果、その特定の遺伝子又は複数の前記遺伝子の転写速度が増大し、さらに／あるいは生成される転写物が安定化する。
【００３４】
もう１つの可能性としては、内因性のｒｉｂ遺伝子を、未改変の（初期すなわち野生型）酵素と比べてリブ活性が増大した酵素をコードするように、改変することである。酵素活性の増大は、例えば、基質変換を増大させるために触媒中心を改変することや、酵素抑制因子の効果を排除することにより達成することができる。これは、酵素の比活性が上昇したということ、あるいは酵素の活性が抑制されていないということを意味する。
【００３５】
もう１つの有利な実施形態では、例えば、酵素合成を抑制する因子を除去することによって、又は合成の増大を促進する因子や調節配列の活性を増大させることによって、細胞の酵素合成を増大させることにより、酵素活性を上昇させることが可能である。遺伝子のコピーをさらに導入することで、比酵素活性を大させることも可能である。このような手段により、比活性を変えないで、細胞の遺伝子産物の全活性を増大させることができる。また、これらの方法を組み合わせて用いること、すなわち比活性を増大させ全活性を増大させることも可能である。これらの改変は、原則として当業者に既知のあらゆる方法によって、当該遺伝子、調節配列、終結配列又はプロモーターの核酸配列に導入することができる。この目的のために、当該配列に、例えば、D.M. Gloverら、DNA Cloning、1巻、(1995年)、IRL Press(ISBN 019-9634769)、6章、193頁以下参照に記載されているような部位特異的突然変異等の突然変異誘発を引き起こさせることができる。Speeら（Nucleic Acids Research、21巻、3号、1993年、777〜778頁）は、突然変異誘発のため、ｄＩＴＰを利用するＰＣＲ方法について記述している。分子進化のための試験管内組換え技術の使用については、Stemmerによって記述されている（Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91巻、1994年、10747〜10751頁）。Mooreら、Nature Biotechnology、14巻、1996年、458〜467頁は、ＰＣＲ法と組換え方法とを組み合わせることについて記述している。改変された核酸配列は、後にベクターによって生物に戻される。
【００３６】
酵素活性を増大させるためには、天然の遺伝子の前に改変型プロモーター領域を配置することも可能である。その結果、遺伝子発現が増大し、したがって最終的に活性が上昇する。
【００３７】
有利なプロモーター配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、若しくはγ−ＰＲとして、又はγ−ＰＬプロモーター内に存在し、これらはグラム陰性菌中で有利に使用される。さらに有利な調節配列は、例えば、グラム陽性菌由来プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母若しくは真菌由来プロモーターＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、又は植物由来プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ（Franckら、Cell、21号(1980年)285〜294頁）、ＰＲＰ１（Wardら、Plant.Mol. Biol、22号(1993年)）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＬＥＢ４、ｎｏｓ、又はユビキチン若しくはファセオリンプロモーターに存在する。さらに、この関連で有利なのは、例えばハンセヌラ属由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ及びメタノールオキシダーゼのプロモーターである。さらに有利な植物プロモーターは、例えば、ベンゼンスルホンアミド誘導性（欧州特許第３８８１８６号）、テトラサイクリン誘導性（Gatzら、(1992年)、Plant J. 2、397〜404頁）、アブシジン酸誘導性（欧州特許第３３５５２８号）、又はエタノール若しくはシクロヘキサノン誘導性（国際公開第９３２１３３４号）プロモーターである。特に有利な植物プロモーターは、プリン又はその前駆体の生合成が起こる植物の組織若しくは部分において発現を保証するプロモーターである。特に葉特異的発現を保証するプロモーターを使用し得る。ジャガイモ由来の細胞質ゾルＦＢＰａｓｅプロモーター又はジャガイモ由来のＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhausら、EMBO J. 8(1989年)、2445〜245）も使用し得る。さらに、ダイズ由来のホスホリボシル−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼのプロモーター（Genebank Accession Number U87999も参照）を使用することも可能である。あるいは欧州特許第２４９６７６号に記載されているまた別の節特異的プロモーターを用いることも有利である。
【００３８】
本発明の方法のためには、上記のような調節配列を有する天然のプロモーターであれば、原則としてすべて使用することが可能である。合成プロモーターを使用することもまた有利に可能である。
【００３９】
本発明のより効率的な転写終結配列に加えて、３’末端においても、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す群からの転写終結配列の少なくとも１つの挿入によって、例えば、ｍＲＮＡの安定性を増大させ、それによって、翻訳を増大することも可能である。このことは、同様に、対応する発現遺伝子のより高い酵素活性をもたらす。転写物の安定化は、３’末端に付加的に導入された配列によってさらに強化される。
【００４０】
遺伝子コピー数を増加させることにより遺伝子発現を増大させるために、リボフラビンの生成能を有する生物に、本発明の転写終結配列の少なくとも１つとの機能的な連結状態で上述のｒｉｂ遺伝子の少なくとも１つ又は複数のこれらの遺伝子の組み合わせを付加的に導入することが有利である。これらの遺伝子コピーは自然の調節下でもよいし、また改変型の調節下でもよい。改変型調節を行う場合、自然調節領域を、遺伝子発現の増大を可能にするように改変させておく。あるいは、外来遺伝子の調節配列を用いることができる。異種遺伝子の調節配列を用いてもよい。上述の方法を組み合わせると、特に有利である。
【００４１】
また本発明は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列、及びこれらの終結配列に機能的に連結された少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子を含む、遺伝子構築物に関する。本発明の遺伝子構築物は、ｒｉｂ１、ｒｉｂ２、ｒｉｂ３、ｒｉｂ４、ｒｉｂ５又はｒｉｂ７の群からの少なくとも１つの遺伝子を含むことが好ましい。
【００４２】
本発明の有利な変異体は、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列、又は前述のタイプの遺伝子構築物、並びに選択のため及び宿主細胞中での複製若しくは宿主細胞ゲノムへの組み込みのための付加的ヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
【００４３】
本発明の遺伝子構築物はまた、生物に導入する目的の他の遺伝子を含んでもよい。そのような遺伝子は、別個のの調節下に置いてもよいし、あるいはｒｉｂ遺伝子と同じ調節領域下に置くこともできる。そのような遺伝子は、例えば、合成の増大を可能にする別の生合成遺伝子である。
【００４４】
遺伝子構築物は、発現させるために、上述の宿主生物に挿入するが、例えばプラスミド、ファージ、又は他のＤＮＡ等のベクターへ挿入することが有利である。なぜなら、ベクターは、宿主中での遺伝子発現を最適なものにするからである。好適なプラスミドの例は、大腸菌ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂｌ、λｇｔ１１若しくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２若しくはｐＩＪ３６１、バチルス属ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４若しくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属ｐＳＡ７７若しくはｐＡＪ６６７、真菌ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２若しくはｐＢＢ１１６、酵母２μｍ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３若しくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、又は植物ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４若しくはｐＤＨ５１、あるいは上述のプラスミドの誘導体の中に存在する。前記プラスミドは、可能なプラスミドの中での少数の選択肢を表すにすぎない。さらに当業者に既知のプラスミドが挙げられるが、例えば、Cloning Vectors（Pouwels P. H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford、1985年、ISBN 0 444 904018）の教科書に記載されている。とりわけ、好適な植物ベクターについて記述されているのが、「Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology」(CRC Press)、6/7章の71〜119頁である。
【００４５】
さらに、遺伝子構築物は、存在する他の遺伝子の発現のために、発現を増大するための３’及び／又は５’末端調節配列を有利に含む。これらの配列は、選択される宿主生物及び遺伝子又は遺伝子群に応じて、最適の発現が行われるように選択される。
【００４６】
これらの調節配列は、これらの遺伝子の特異的発現及びタンパク質発現を可能にするよう意図されている。このことは、例えば宿主生物に応じて、当該遺伝子が誘導後にのみ発現及び／又は過剰発現しているという意味であってもよいし、あるいは、直ちに発現及び／又は過剰発現しているという意味であってもよい。
【００４７】
この目的のため、調節配列又は因子が、好ましくは導入遺伝子の発現に有益な効果を及ぼし、その結果、発現を増大させるものでありうる。このため、プロモーター及び／又はエンハンサー等の強い転写シグナルを使用することによって、調節配列の増強を転写レベルで有利に引き起こすことができるが、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改良することによって、翻訳を増強することも可能である。
【００４８】
ベクターの別の実施形態では、本発明の遺伝子構築物を、線状ＤＮＡの形態で微生物の中に有利に導入したり、異種又は相同組換えによって宿主生物のゲノム中へ組み込むこともできる。この線状ＤＮＡは、ベクターとして、線状化されたプラスミドからなるものでもよいし、核酸断片のみからなるものでもよい。
【００４９】
ベクターとしては、細胞中で自律複製する好適なプラスミドであれば、いかなるものも用いることができる（ただし、特に、Ｓ．セレビシエ由来の２μｍプラスミドの複製開始点をもつプラスミド）。また、上述のように、宿主のゲノムに組み込まれる線状ＤＮＡ断片を用いることもできる。この組み込みは、異種組換えによって又は相同組換えによって生じるものとしうるが、言及したように、相同組換え（Steinerら、Genetics、140巻、1995年、973〜987頁）が好ましい。また、ｒｉｂ遺伝子は、異なる部位のゲノム中に又は異なるベクター上に、単独で存在することもできるし、ゲノム中に又は１つのベクター上に一緒に（複数）存在することもできる。
【００５０】
本発明の転写終結配列、あるいは、好ましくは、少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子と、とりわけ、本発明の転写終結配列の少なくとも１つのような、ｒｉｂ遺伝子に機能的に連結された調節配列を含む、本発明に係る前述の遺伝子構築物又は前述のベクターは、使用される生物へ原則として当業者に既知のあらゆる方法によって導入することができる。
【００５１】
それらは、いわゆるパーティクルガン法又はマイクロインジェクション法を用いて、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションによって、当該生物又はその細胞に導入することが有利である。当業者は、微生物に適切な方法を次のような教科書中に見出すことが可能である：Sambrook, Jら、(1989年)Molecular cloning: A laboratory manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press；F.M. Ausubelら、(1994年)Current protocols in molecular biology、John Wiley and Sons；D.M. Gloverら、DNA Cloning、1巻、(1995年)、IRL Press(ISBN 019-963476-9)；Kaiserら、(1994年)Methods in Yeast Genetics、Cold Spring Harbor Laboratory Press；又はGuthrieら、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology、1994年、Academic Press。
【００５２】
使用しうる有利な方法の例としては、例えば、ｕｒａ−３遺伝子（具体的には、独国特許出願第１９８０１１２０．２号に記載されているアシュビア属ｕｒａ−３遺伝子）によって、及び／又は以下に記述するＲＥＭＩ法（＝制限酵素媒介型遺伝子組込み法）を用いて、相同又は異種組換えによりＤＮＡを導入する方法が挙げられる。
【００５３】
ＲＥＭＩ技術は、同じ制限エンドヌクレアーゼで両端を切断した線状ＤＮＡ構築物を、そのＤＮＡ構築物を制限するのに用いた制限エンドヌクレアーゼと共に用いて、生物を共形質転換することに基づいている。その後、その制限エンドヌクレアーゼは、そのＤＮＡ構築物がその制限酵素とともに導入された生物のゲノムＤＮＡを切断する。これは、細胞自身の修復機構の活性化をもたらす。これらの修復機構は、ゲノムＤＮＡ中のエンドヌクレアーゼによって引き起こされた鎖切断を修復する。また、これは、共形質転換されたＤＮＡ構築物のゲノムへの組込みの特定の頻度とも関わりがある。制限切断部位がＤＮＡの両端で保持されるのが通例である。
【００５４】
ＲＥＭＩ技術は、真菌の挿入突然変異誘発のため、Bolkerら（Mol Gen Genet、248号、1995年、547〜552頁）が記述している。Schiestl及びPetes（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88号、1991年、7585〜7589頁）は、異種組換えがサッカロマイセスにおいて起こるかどうかを明らかにするため、この方法を使用している。Brownら（Mol. Gen. Genet. 251号、1996年、75〜80頁）は、誘導性リポーター遺伝子の安定した形質転換及び調節発現のため、この方法を記載している。この系は、これまでは、代謝経路を最適化したりタンパク質を商用目的で過剰発現させたりするための遺伝子工学ツールとして使用されたことがなかった。
【００５５】
リボフラビン合成を例として、上述の生物のゲノム中へＲＥＭＩ法を用いて生合成遺伝子を組込むことが可能であることが示される。また、したがって、一次又は二次代謝（具体的には以下の物質の生合成経路）の代謝産物を生成するための製造方法を最適化することが可能である。その物質とは、例えばリジン、メチオニン、トレオニン又はトリプトファン等のアミノ酸、ビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ若しくはＦ、Ｓ‐アデノシルメチオニン、ビオチン、パントテン酸又は葉酸等のビタミン、β−カロテン、リコペン、カンタキサンチン、アスタキサンチン又はゼアキサンチン等のカロテノイド、あるいは以下のようなタンパク質である：リパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素、サイトカイン（例えばＭＩＦ、ＭＡＦ、ＴＮＦ等のリンホカイン）、インターロイキン１等のインターロイキン、γ−インターフェロン、ｔＰＡ等のインターフェロンをはじめとするメディエーター、プロテオホルモン、糖質ホルモン（glycohormone）、バソプレッシンやエンドルフィンのようなオリゴペプチド又はポリペプチドホルモンをはじめとするホルモン、エンドスタチン、アンジオスタチン、増殖因子、エリトロポイエチン、転写因子、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ若しくはανβＩＩＩ等のインテグリン、様々なグルタミン酸受容体等の受容体、アンギオテンシン等の血管形成誘導因子。
【００５６】
前記ゲノム中の転写活性部位に、本発明の転写終結配列、少なくも１つのｒｉｂ遺伝子に機能的に連結された本発明の調節配列を少なくとも１つ含む上述の遺伝子構築物又は上述のベクターを配置するため、ＲＥＭＩを用いることもできる。
【００５７】
転写終結配列及び／又は前記遺伝子構築物は、ゲノムへ導入されるまた別のＤＮＡ構築物中に、少なくとも１つのリポーター遺伝子と共に有利にクローニングされる。このリポーター遺伝子は、増殖、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、若しくは生物発光アッセイ、又は光度測定によって検出性を容易にするはずである。リポーター遺伝子の例としては、抗生物質耐性遺伝子、加水分解酵素遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、生物発光遺伝子、グルコシダーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、又はリボフラビン遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子、リパーゼ遺伝子、エステラーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、若しくはアデニルトランスフェラーゼ遺伝子等の生合成遺伝子が挙げられる。このような遺伝子を用いれば、転写活性、ひいてはすなわち遺伝子発現を容易に測定し定量することが可能となる。生合成遺伝子が自ら検出性を容易にする場合は、例えば、リボフラビンの場合のように、付加的なリポーター遺伝子なしですませることができる。
【００５８】
複数の遺伝子を生物に導入する場合、単一のベクター中の１つのリポーター遺伝子と共に、全て一緒に導入することもできるし、１つのベクター中の１つのリポーター遺伝子と共に、各遺伝子をそれぞれ導入することもできる。この場合、様々なベクターを同時にあるいは連続的に導入することが可能である。ＲＥＭＩ技術においては、特定の活性をコードする遺伝子断片も使用することができる。
【００５９】
原則として、既知の制限酵素はすべて、調節配列又は遺伝子構築物を生物のゲノムに組込むための方法として好適である。制限酵素切断部位としてわずか４塩基対しか認識しない制限酵素は、ゲノム中又は組込むベクター中であまりに頻繁に切断を行うのであまり好ましくない。好ましい酵素は、切断部位として６、７、８又はそれ以上の塩基対を認識する酵素である。その例を少数挙げるだけでも、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩ、Ｂｐｎｌ、ＮｏｔＩ、ＳｒｆＩ、又はＳｆｉＩ等がある。使用する酵素が、導入するＤＮＡに切断部位をそれ以上持たなくても、有利である。なぜなら、組み込み効率が上がるからである。ＲＥＭＩ混合物においては、酵素は、通常５〜５００Ｕ、好ましくは１０〜２５０Ｕ、特に好ましくは１０〜１００Ｕである。酵素は、浸透圧を安定化させる物質を含む水溶液の中で有利に使用される。そのような物質の例としては、ショ糖、トレハロース若しくはグルコース等の糖類、グリセロール若しくはポリエチレングリコール等の多価アルコール、ｐＨ範囲５〜９、好ましくは６〜８、特に好ましくは７〜８で有利に緩衝作用を有するトリス、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ若しくはＰＩＰＥＳ等のバッファー、及び／又は、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｍｎ若しくはＭｏの無機若しくは有機塩のような核酸を安定させるための物質が挙げられる。また、必要に応じて、その他の物質、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＤＤＡ、ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、又はヌクレアーゼ阻害剤等を存在させることも可能である。ただし、このような追加の物質を用いないでＲＥＭＩ技術を実行することも可能である。その方法は、温度範囲５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、特に好ましくは２０〜４０℃で行う。細胞膜を不安定化するための既知の方法はすべて、例えばエレクトロポレーション、封入した小胞による融合、あるいは様々なアルカリ金属又はリチウム、ルビジウム、若しくはカルシウム塩（好ましくはリチウム塩）等のアルカリ土類金属塩を使用する不安定化等の方法のために好適である。
【００６０】
植物のゲノム中への外来遺伝子の導入を形質転換というが、この場合、一過性の形質転換についても安定的な形質転換についても、植物組織又は植物細胞から植物の形質転換及び再生のために記載されている方法が用いられる。
【００６１】
好適な方法は、ポリエチレングリコールで誘導されるＤＮＡ取込みによるプロトプラストの形質転換、遺伝子銃の使用、エレクトロポレーション、ＤＮＡを含む溶液での乾燥胚芽の培養、マイクロインジェクション、及びアグロバクテリウムを介する遺伝子導入である。前記方法は、例えば、B. Jenesら、「Techniques for Gene Transfer」、Transgenic Plants、1巻、Engineering and Utilization、S.D. Kung及びR. Wu編、Academic Press(1993年)、128〜143頁、及びPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol.42、(1991年)、205〜225頁に記載されている。
【００６２】
発現される構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を形質転換するための好適なベクター（例えばｐＢｉｎｌ９）（Bevanら、Nucl. Acids Res. 12、(1984年)、8711頁）にクローニングされることが好ましい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物の形質転換については、例えば、Hofgen及びWillmitzerによりNucl. Acid Res.(1988年)、16号、9877頁に記載されている。
【００６３】
本発明に係る発現ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムは、特に穀物、トウモロコシ、ダイズ、コメ、ワタ、サトウダイコン、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アブラナ、アルファルファ、レタス、並びに様々な木、堅果及びつる植物類等の作物、並びにマメ科植物等の植物を形質転換させる既知の方法において同様に用いることができる。例えば、傷つけた葉又は葉の切片をアグロバクテリウムの溶液中に浸し、その後適切な培地で培養する方法がある。
【００６４】
遺伝子組換え植物細胞は、当業者に既知のあらゆる方法で再生することができる。適切な方法は、上述のS.D.KungとR.Wu、及びPotrykus、又はHofgen及びWillmitzerの刊行物中に見つけることができる。
【００６５】
本発明にはまた、リボフラビン生成能を有し、配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列、又は本発明に係るタイプの遺伝子構築物若しくはベクターを含む生物が含まれる。
【００６６】
生物は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、エシェリヒア属、シアノバクテリウム属、アシュビア属、エレモテシウム属、ピヒア属、カンジダ属、若しくはサッカロマイセス属、又はシロイナズナ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ライムギ、キビ、オートムギ、サトウダイコン、ジャガイモ、ヒマワリ、マメ科植物、若しくはトマト等の植物の群からの１つであることが有利である。バチルス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、カンジダ属、エレモテシウム属、若しくはアシュビア属、又はトウモロコシ、ダイズ、アブラナ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ若しくはトマトの群から選ばれる生物が好ましい。特に好ましいのは、アシュビア・ゴシピイ、エレモテシウム・アシュビイ、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・フラベリ、カンジダ・ファマタ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、又はバチルス・ズブチリスである。なかでもとりわけ、アシュビア・ゴシピイ又はエレモテシウム・アシュビイが好ましい。
【００６７】
本発明には、さらにリボフラビン生産突然変異体又は産生株として識別される生物が含まれる。これらは、例えば、古典的な（化学的若しくは物理的）方法又は遺伝子工学的によって野生株から始めて作製することができる、また、必要に応じて、ｒｉｂ遺伝子のフレームワーク中に遺伝子改変を加えることができる。
【００６８】
本発明の生物はさらに、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す転写終結配列の１つに機能的に連結された少なくとも１つのｒｉｂ遺伝子の転写速度が、アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５の野生型と比較して、増大していることを指標として識別される。本発明の生物はまた、アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５の野生型と比較して、リボフラビン生成能を向上させたものである。
【００６９】
リボフラビン生産のために使用する生物は、その生物が成長（増殖）可能な培地を用い、本発明の方法において培養する。この培地は合成培地でも天然培地でもよい。生物に応じて使用される培地は、当業者に既知である。微生物の増殖については、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じて小量のビタミンと微量元素を含有する培地を用いる。
【００７０】
有利な炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、若しくはセルロース等の単糖類、二糖類若しくは多糖類等の糖質、糖蜜等の複合糖質源、フルクトース１，６−ビスリン酸等の糖リン酸、マンニトール等の糖アルコール、グリセロール等の多価アルコール、メタノール若しくはエタノール等のアルコール、クエン酸、乳酸若しくは酢酸等のカルボン酸、大豆油や菜種油等の脂肪、アミノ酸混合物（例えばいわゆるカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ））若しくはグリシンやアスパラギン酸等の個々のアミノ酸、又はアミノ糖類が挙げられる。後者は、窒素源として使用することもできる。
【００７１】
有利な窒素源は、有機若しくは無機窒素化合物、又はこれらの化合物を含む物質である。例としては、ＮＨ４Ｃ１や（ＮＨ４）２ＳＯ４等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、又はコーン・スティープ・リカー、醸造酵母自己分解物質、大豆ミール、コムギグルテン、酵母抽出物、肉エキス、カゼイン加水分解物、酵母若しくはジャガイモ・タンパク質等の複合窒素源が挙げられる。これらは、炭素源としても使用できることが多い。
【００７２】
無機塩類の例は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、マンガン、カリウム、亜鉛、銅、及び鉄の塩である。これらの塩の陰イオンとして特に、塩化物イオン、硫酸塩イオン、又はリン酸イオンが挙げられる。本発明の方法によって生産性を増大させるための重要な因子は、生産培地中のＦｅ２＋又はＦｅ３＋イオン濃度のコントロールである。
【００７３】
栄養培地には、さらに必要に応じて増殖因子を加える。その例としては、ビタミン、又はビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩若しくはピリドキシン等の成長促進物質、アラニン、システイン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、フェニルアラニン、オルニチン若しくはバリン等のアミノ酸、クエン酸、ギ酸、ピメリン酸若しくは乳酸等のカルボン酸、又はジチオトレイトール等の物質等が挙げられる。
【００７４】
前記栄養素の混合比は、発酵の形式により決まるので、個々の場合で確認する必要がある。このような培地成分をすべて、必要であれば別々に殺菌又は共に殺菌した後、発酵の開始時に存在させてもよいし、あるいは、必要に応じて、引き続き発酵中に連続的に又は非連続的に加えてもよい。
【００７５】
生物が最適に成長し、最大限の生産ができるように培養条件を確立する。好ましい培養温度は１５〜４０℃であり、２５〜３７℃の間の温度が特に有利である。ｐＨは、３〜９の範囲で維持するのが好ましく、５〜８の間のｐＨが特に有利である。培養時間は、一般に、数時間から数日で十分であるが、好ましくは８時間〜２１日、特に好ましくは４時間〜１４日である。その時間内で、最大量の産物が培地に蓄積する。
【００７６】
培地を有利に最適化する可能性について、当業者は、例えばApplied Microbiol Physiology、「A Practical Approach(P.M. Rhodes、P.F. Stanbury編、IRL-Press、1997年、53〜73頁、ISBN 0 19 963577 3)のような教科書に見出すことができる。有利な培地及び培養条件は、バチルス及びその他の生物については、例えば、欧州特許出願公開第０４０５３７０号の特に実施例９に、カンジダについては、国際公開第８８／０９８２２号の特に表３に、さらにアシュビアについては、Schmidtらの刊行物（「Microbiology」、142号、1996年、419〜426頁）に見出すことができる。
【００７７】
本発明の方法は、連続的に行ってもよいし、バッチとして回分式に、すなわちバッチ供給法で行ってもよい。
【００７８】
本発明の方法によれば、リボフラビン生産性の増大の程度は、使用する生物の生産性の初期レベルによって、様々である。生産性の増大率は、それぞれの場合の初期生物と比較して、通常少なくとも５％で有利であるが、好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは２０％、非常に特に好ましくは少なくとも１００％になり得る。
【００７９】
本発明にはまた、リボフラビン生成能を向上させるための、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す転写終結配列の少なくとも１つ、又は本発明のタイプの遺伝子構築物若しくはベクターを含む本発明のタイプの生物の使用が含まれる。その生物は、アシュビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）が好ましい。
【００８０】
同様に、本発明は、リボフラビンの生成能を向上させるために、産生生物を作製するための配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列の使用に関する。同様に、本発明には、リボフラビン生成に関与する遺伝子の転写速度を上昇させるための、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列の使用が含まれる。したがって、本発明はまた、リボフラビンの生成能を向上させるための、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に示す少なくとも１つの転写終結配列の使用に関する。
【００８１】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、これらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
一般的方法：
別に記載がない限り、Sambrookらの記載（1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6）による一般的な核酸法、例えばクローニング、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の結合、微生物の形質転換、細菌の培養、及び組換えＤＮＡの配列分析等を実施した。
【００８３】
組換えＤＮＡ分子は、Sangerの方法（Sangerら、(1977年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA74、5463〜5467頁）により、ＡＢＩ社のレーザー蛍光ＤＮＡシーケンサーを使用してシーケンスした。ポリメラーゼ連鎖反応から得られる断片をシーケンスし、発現させる構築物におけるポリメラーゼのエラーを回避するためチェックした。
【００８４】
ｒｉｂ遺伝子の単離：
アシュビア・ゴシピイ及びサッカロミセス・セレビシエからのｒｉｂ遺伝子１、２、３、４、５及び７の単離は、特許国際公開第９５／２６４０６号及び同第９３／０３１８３号に記載されており、その実施例において具体的な記述がある。その記述に従って単離を行った。本明細書において、これらの文献を明示的な参考とするものである。
【００８５】
終結配列領域配列の比較：
単離したｒｉｂ遺伝子から始めて、ｒｉｂ２遺伝子の終結配列領域も同定し解析した。これにより次の配列が明らかにされた。
【００８６】
アシュビア属ＡＴＣＣ１０８９５のｒｉｂ２遺伝子の終結配列（配列番号４）：
停止-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATGG
本発明の終結配列は次の配列を有する：
（配列番号１）に示す本発明の終結配列：
停止-TGATTTTGCTGCAAATTGTAGATGG
（配列番号２）に示す本発明の終結配列：
停止-TGATTTTGCTGCGAATTGTAGATGA
（配列番号３）に示す本発明の終結配列：
停止-TGATTTTGCTGCAAATTGTAGATGA
【００８７】
下線は異なるヌクレオチドを示す。ヌクレオチド配列の合成方法、又は単一のヌクレオチドに置換や突然変異を引き起こす方法は、従来の実験室での慣行及び特にD.M. GloverらのDNA Cloning、1巻(1995年)、IRL Press（ISBN 019-963476-9）の記載に基づいて実施した。
【００８８】
本発明の終結配列、及びアシュビアＡＴＣＣ１０８９５からのｒｉｂ２遺伝子の終結配列の配列を、配列表の配列番号１〜４に示す。
【配列表】
2005527200.tif 000002
2005527200.tif 000003
【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年12月14日(2004.12.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
どちらの生物においても、６つの酵素が、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びリブロース−５−リン酸から始まるリボフラビンの生成を触媒している。これは、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ−ＩＩ（ｒｉｂ１遺伝子産物）によるＧＴＰの２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン５−リン酸への変換を伴うものである。その後、後者の化合物は２，５−ジアミノ−６−（リボシルアミノ）−４（３Ｈ）−ピリミジノン−５−リン酸レダクターゼ（ｒｉｂ７遺伝子産物）によって２，５−ジアミノ−リビチルアミノ−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジン５−リン酸に還元され、続いて、特異的なデアミナーゼ（ｒｉｂ２遺伝子産物）によって脱アミノ化されて５−アミノ−６−リビチルアミノ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５−リン酸となる。その後、リン酸は非特異的なホスファターゼによって除去される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
遺伝子構築物は、発現させるために、上述の宿主生物に挿入するが、例えばプラスミド、ファージ、又は他のＤＮＡ等のベクターへ挿入することが有利である。なぜなら、ベクターは、宿主中での遺伝子発現を最適なものにするからである。好適なプラスミドの例は、大腸菌ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂｌ、λｇｔ１１若しくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２若しくはｐＩＪ３６１、バチルス属ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４若しくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属ｐＳＡ７７若しくはｐＡＪ６６７、真菌ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２若しくはｐＢＢ１１６、酵母２αｍ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３若しくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、又は植物ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４若しくはｐＤＨ５１、あるいは上述のプラスミドの誘導体の中に存在する。前記プラスミドは、可能なプラスミドの中での少数の選択肢を表すにすぎない。さらに当業者に既知のプラスミドが挙げられるが、例えば、Cloning Vectors（Pouwels P. H.ら編、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford、1985年、ISBN 0 444 904018）の教科書に記載されている。とりわけ、好適な植物ベクターについて記述されているのが、「Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology」(CRC Press)、6/7章の71〜119頁である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
ベクターとしては、細胞中で自律複製する好適なプラスミドであれば、いかなるものも用いることができる（ただし、特に、Ｓ．セレビシエ由来の２αｍプラスミドの複製開始点をもつプラスミド）。また、上述のように、宿主のゲノムに組み込まれる線状ＤＮＡ断片を用いることもできる。この組み込みは、異種組換えによって又は相同組換えによって生じるものとしうるが、言及したように、相同組換え（Steinerら、Genetics、140巻、1995年、973〜987頁）が好ましい。また、ｒｉｂ遺伝子は、異なる部位のゲノム中に又は異なるベクター上に、単独で存在することもできるし、ゲノム中に又は１つのベクター上に一緒に（複数）存在することもできる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７１】
有利な窒素源は、有機若しくは無機窒素化合物、又はこれらの化合物を含む物質である。例としては、ＮＨ４Ｃ１や（ＮＨ４）２ＳＯ４等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、又はコーン・スティープ・リカー、醸造酵母自己分解物質、大豆ミール、コムギグルテン、酵母抽出物、肉エキス、カゼイン加水分解物、酵母若しくはジャガイモ・タンパク質等の複合窒素源が挙げられる。これらは、窒素源としても使用できることが多い。
【国際調査報告】
2005527200.tif 000004
2005527200.tif 000005
2005527200.tif 000006
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