(57)【要約】本発明は、物質を確認する方法及び腫瘍疾患、好ましくはホジキンリンパ腫、又は炎症性気道疾患、好ましくは喘息に関係する、IL-4依存情報伝達を調節できる、そのような物質の使用、及び物質がSTAT６とNCoA-1の相互作用を調節できるかどうかを決定する方法に関し、ａ）NCoA-1に結合する能力を有するSTAT６又はこのフラグメント若しくは誘導体を、STAT６及びNCoA-1又はフラグメント若しくは誘導体が複合体を形成できる条件下で、STAT６を結合する能力を有するNCoA-1又はNCoA-1のフラグメント若しくは誘導体に接触させ、前記複合体を、測定可能な読み取り情報を誘導するように使用することができ、ｂ）読み取り情報を、興味ある物質の不存在又は存在下で測定し、ｃ）興味ある物質の不存在下での読み取り情報を興味ある物質の存在下で読み取り情報を比較する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が、STAT６とNCoA-１との相互作用を調整できるかどうかを決定する方法であって、
ａ）NCoA-1に結合する能力を有するSTAT６又はそのフラグメント若しくは誘導体を、STAT６及びNCoA-1又は前記フラグメント若しくは誘導体が複合体を形成することができる条件下で、STAT６に結合する能力を有するNCoA-1又はNCoA-1のフラグメント若しくは誘導体と接触し、かつ前記複合体を、測定可能な読み取り情報を誘発するのに使用可能であり、
ｂ）読み取り情報を、興味ある物質の不存在下又は存在下で測定し、
ｃ）興味ある物質の不存在下での読み取り情報が、興味ある物質の存在下の読み取り情報と比較される、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記物質が、前記相互作用を活性化できる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記物質が、前記相互作用を抑制できる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分析を、細胞系を使用して行う、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記分析を、細胞フリー系を使用して行う、請求項１記載の方法。
【請求項６】
配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７を含み、任意に他のアミノ酸配列と融合されているポリペプチドを使用する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７を含み、配列番号１の他のアミノ酸配列に融合されているポリペプチドを使用する、請求項６項記載の方法。
【請求項８】
配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７を含むポリペプチドを使用する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７を含むポリペプチドを使用す、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
配列番号６のSTAT６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含むポリペプチドを使用する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含み、任意に他のアミノ酸配列に融合されているポリペプチドを使用する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含み、配列番号３の他のアミノ酸配列に融合されているポリペプチドを使用する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含むポリペプチドを使用する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記STAT６又はそのフラグメント若しくは誘導体が、検出可能な標識に連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記NCoA-1又はそのフラグメント若しくは誘導体が、検出可能な標識に連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記標識が、少なくとも５つの連続したヒスチジン残基からなるヒスチジンタグである、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程、
（ａ）配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは、配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは配列番号６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む第一ポリペプチドを、容器又はその容器の一部に存在する固体担体に結合する工程、
（ｂ）任意に好適な溶媒中の、興味ある物質又は偽のコントロールを添加する工程、
（ｃ）配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む、検出可能な標識された第二ポリペプチドを、前記ポリペプチドの両方が互いに結合できる条件下で、添加する工程、
（ｄ）未結合第二ポリペプチドを除去する工程、
（ｅ）前記第一ポリペプチドに結合した検出可能な標識された第二ポリペプチドの量を測定する工程、
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程、
（ａ）配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む第一ポリペプチドを、容器又はその容器の一部に存在する固体担体に結合する工程、
（ｂ）任意に好適な溶媒中の、興味ある物質又は偽のコントロールを添加する工程、
（ｃ）配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは、配列番号６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む、検出可能な標識された第二ポリペプチドを、前記ポリペプチドの両方が互いに結合できる条件下で、添加する工程、
（ｄ）未結合第二ポリペプチドを除去する工程、
（ｅ）前記第一ポリペプチドに結合した検出可能な標識された第二ポリペプチドの量を測定する工程、
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記標識が、その標識に特異的な抗体の結合によって検出される、請求項１７及び１８記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が、少なくとも５つの連続したヒスチジン残基を含むヒスチジンタグであり、前記抗体が、前記ヒスチジンタグに特異的である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、第二抗体の第一抗体への結合によって検出され、前記第二抗体が、測定可能な反応を触媒することができる酵素に連結されている、請求項１９又は２０記載の方法。
【請求項２２】
高処理スクリーニングで使用される、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
物質が、STAT６とNCoA-1との相互作用のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定するテストシステムであって、以下、
（ｂ）NCoA-1に結合する能力を有するSTAT６又はそのフラグメント若しくは誘導体、
（ｃ）STAT６に結合する能力を有するNCoA-1又はそのフラグメント若しくは誘導体、
（ｄ）前記STAT６又はそのフラグメント若しくは誘導体が、前記NCoA-1又はそのフラグメント若しくは誘導体と複合体を形成することができる容器、
（ｅ）前記複合体を測定する装置、
を含むことを特徴とする、テストシステム。
【請求項２４】
配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは、配列番号６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む、第一ポリペプチドが含まれ、かつ配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む、第二ポリペプチドが含まれる、請求項２３記載のテストシステム。
【請求項２５】
STAT６及びNCoA-1の相互作用のアクチベーター又はインヒビターであることを特徴とする、物質。
【請求項２６】
STAT６及びNCoA-1相互作用のインヒビターである、請求項２５記載の物質。
【請求項２７】
少なくとも２つの機能部分から成り、そのひとつが、配列番号６のペプチド１であり、もうひとつが、ペプチド１の抑制機能を妨げない分子である、請求項２６記載の物質。
【請求項２８】
配列番号６のペプチド１である、請求項２６記載の物質。
【請求項２９】
配列番号６のペプチドに対する抗体である、請求項２６記載の物質。
【請求項３０】
病気の治療のための、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の物質。
【請求項３１】
任意に、製薬上許容できる担体と組み合わされる、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の物質を含む医薬組成物。
【請求項３２】
炎症性気道疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項３３】
前記炎症性気道疾患が、喘息である、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
腫瘍疾患を治療する医薬組成物を調製するための、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の物質の使用。
【請求項３５】
前記腫瘍疾患が、ホジキンリンパ腫である、請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
請求項３１記載の医薬組成物の好適な量を、炎症性気道疾患又は腫瘍疾患の治療を必要とする生物に投与することを含む、炎症性気道疾患又は腫瘍疾患を治療する方法。
【請求項３７】
前記生物が、哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記炎症性気道疾患が、喘息である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍疾患が、ホジキンリンパ腫である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４０】
STAT６とNCoA-1の相互作用のアクチベーター又はインヒビターである物質を投与することを含む、STAT６とNCoA-1との相互作用を選択的に調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、製薬的に活性な物質を確認する分野、及び特に腫瘍疾患、好ましくは炎症性気道疾患の治療におけるこのような物質の使用に属する。
【背景技術】
【０００２】
IL-4依存性情報伝達は、腫瘍疾患や、例えば喘息のような炎症性気道疾患の免疫及び/又は抗炎症反応の調節において重要な役割を果たす。IL-4は、免疫及び抗炎症反応を調節する。IL-4は、Th2系列に向かうTヘルパー前駆体の分化を促進し、Th1の発達を抑制する。更に、B細胞のIL-4の刺激は、免疫グロブリンクラスのIgEアイソタイプへのスイッチを誘発する。この組換えは、不稔性ε転写物の発生を導く、生殖系列εプロモーターの転写活性化を続いて起こすと考えられる。IL-4の調節された機能の多くは、シグナルトランスデューサー及び転写活性化因子６（STAT6)によって媒介される。
STAT6は、STATタンパク質ファミリーに属し、活性化されたサイトカインレセプターから核にシグナルを伝達する。Janusキナーゼ（JAK)によって発揮される、サイトカイン誘導チロシンリン酸化が続く。STATは、二量体化し、核に移動して、特定のDNA配列エレメントを介して転写を調節する（Darnell1997年、Darnellら1994年、Ihle1996年）。今までに、７つの哺乳類のSTATが確認されている（STAT1、STAT２、STAT３、STAT４、STAT５ａ、STAT５ｂ、STAT６）。これらは、機能的な領域の同一構造を共有する。N末端部分は、複数のDNA部位の協同的結合を媒介する（Vinkemeierら、1996年、Xuら、1996年）。DNA結合部位の特異性を決定する領域は、アミノ酸４００と５００の間に位置する（Horvathら、1995年）。SH2領域は、活性化されたレセプターとの関係（Greenlundら、1994年、Stahlら、1995年）と互いにSH2-ホスホ-チロシン相互作用を介する二量体化（Schindlerら、1995年、Shuaiら、1994年）とを媒介する。C末端部分は、トランス活性化領域を構成する（Darnell  1997年、Hoey及びSchindler1998年）。STAT３及びSTAT５が多くの細胞タイプで発現し、様々なサイトカインと成長因子により活性化されると、他のSTATタンパク質は、宿主防御に特定の役割を果たす（Darnell1997年）。STAT６は、IL-4（Houら、1994年）及びIL-13に応答して活性化される。
【０００３】
STAT６欠乏マウスは、Th2の発達、CD23及びMHCクラスII発現の誘発、免疫グロブリンクラスのIgEへのスイッチ、これらのIL-4反応性誘発機能におけるSTAT６の本質的な役割を明らかにすることを含む、IL-4の媒介機能に欠陥がある（Kaplanら、1996年、Shimodaら、1996年）。STAT6結合部位は、いくつかのIL-4反応性遺伝子で確認された。これらは、Ig生殖系列εプロモーターで最もよく特徴づけられ、STAT６及びCAAT/エンハンサー結合タンパク質（C/EBP)の複合結合エレメントを含む（Delphin及びStavnezer、1995年）。
STAT6のトランス活性領域は、モジュラー、即ちタンパク質のC末端のプロリンリッチ領域で特徴づけられた。この領域の構造は、STATファミリーの他のメンバーの構造とは全く異なる（Luら、1997年、Morigglら、1997年）。互いに及びそれ自身協同する、２つの異なるC末端転写活性領域が最近マップされた(Goenkaら、1999年）。この協同作用の分子メカニズムは、まだ明確にされていない。
【０００４】
一般的に転写の活性化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するクロマチン再構築複合体の一部であり、基礎的な転写性機構にブリッジの役目を果たす、転写の活性化補助因子の補充を要求する（Hampsey及びReinberg1999年）。機能的に保存された活性化補助因子CREB結合タンパク質（CBP)及びp300は、STAT6によって補充され、IL-4による転写性誘発に必要とされることが確認された（Gingrasら、1999年）。また、p300／CBPは、核内受容体（NR)、AP-1、NHkBのp53、p65サブユニット、及びSTAT１、STAT２及びSTAT５を含む、転写因子の異なるクラスによって補充される（Goodmanら、2000年、Pfitznerら、1998年）。
NCoA（核活性化補助因子）ファミリーは、p160又はSRC（ステロイド受容体活性化補助因子）ファミリーとも呼ばれ、NR（核内受容体）結合タンパク質として確認され、これらのリガンド誘発転写因子により転写活性化を高める（Xuら、1999年）。NCoA-1/SRC-1（Onateら、1995年、Kameiら、1996年）、NCoA-2/TIF2/GRIP1（Voegelら1996年、Hongら1997年）及びp/CIP/ACTR/AIB1（Torchiaら1997年、Chenら1997年、Anzickら1997年）と呼ばれる３つの相同性因子が確認された。また、NCoA因子は、p300/CBPと結合する（Kameiら1996年、Yaoら1996年）。
腫瘍疾患及び炎症性気道疾患を治療するための薬物を提供することが引き続き必要とされている。腫瘍疾患及び炎症性気道疾患の症状は、IL-4の情報伝達にあるとされる。従って、前記疾患と炎症性過程の症状の根本を除去するためにIL-4情報伝達を調節する薬物が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の詳細）
本発明において、IL-4に応答して遺伝子発現を活性化するSTAT６の生物活性は、例２に示すように、インビボ及びインビトロで、NCoA-1（核活性化補助因子１）により強く増強され、かつ依存する。驚くべきことに、NCoA活性化補助因子ファミリーの他のメンバーはSTAT６と結合しないのに対して、NCoA-1は、STAT6と直接相互作用する。NCoA-1の領域と相互作用するSTAT６の過剰発現は、トランスドミナントマナーでSTAT６によりトランス活性化を抑制する。NCoA-1は、STAT６トランス活性領域の特定の部分に独立的に結合する。
NCoA-1のSTAT６との相互作用の確認は、様々な適用の基礎を提供する。例えば、本発明は、物質が調節できるか、即ち、IL-4依存性情報伝達のインヒビター又はアクチベーターとして機能を果たすかどうかを決定する方法及び/又はテストシステムを提供する。好ましくは、物質が調節できる、即ち、STAT６の生物活性のインヒビター又はアクチベーターとして機能を果たすことができる。
また、それにより、本発明は、医薬組成物、及び動物、好ましくは腫瘍疾患又は炎症性気道疾患、好ましくは喘息に苦しむヒトを治療する方法を提供する。
本発明による「腫瘍疾患」は、悪性又は良性腫瘍の発達に伴う疾患である。本発明の好ましい腫瘍疾患は、ホジキンリンパ腫である。
以下に使用される、用語「STAT６の生物活性」は、例えば、転写を誘発するのに必要なSTAT６以外の因子とのSTAT６の相互作用及び結合を含む。本発明の文脈における用語「STAT６の生物活性」の好ましい意味は、IL-4情報伝達の結果、転写を誘発すること、より好ましい意味は、好ましくは腫瘍疾患又は炎症性気道疾患において、遺伝子のSTAT６応答エレメントを有する遺伝子の転写を誘発する必要条件として複合体を形成する、NCoA-1とのSTAT６の相互作用及び結合である。
【０００６】
また本発明は、NCoA-1に相互作用及び結合する能力を有するSTAT６の対立遺伝子、誘導体、バリアント、ミュータント及びフラグメントを自然に発生させるような、機能的等価に関する。特に好ましくは、STAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７（配列番号２）を含むSTAT6のフラグメント、より好ましくは、少なくともアミノ酸７９２〜８４７（配列番号５）を含むフラグメント、最も好ましくは、配列番号６で示される、（アミノ酸３〜２３にわたる配列番号５の番号付けシステムで）少なくともアミノ酸７９４〜８１４にわたる配列番号５のフラグメントを含むフラグメントである。このようなフラグメントは、他のアミノ酸配列に融合することができる。例えば、このような誘導体は、例えば、配列番号１で示される、STAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７に融合された、グルタチオンSトランスフェラーゼの一部を含む融合ポリペプチドである。
以下で使用される用語「STAT６及びNCoA-1が複合体を形成することができる条件下で」は、例１に述べられた条件を含むが、これに限定されない。
本発明のNCoA-1の生物活性、即ち、好ましくは腫瘍疾患又は炎症性気道疾患におけるSTAT６の生物活性を高めることは、NCoA-1のSTAT６との相互作用に、好ましくは両方のタンパク質の直接結合に依存する。
また、本発明は、STAT６との相互作用及び結合する能力を有する、NCoA-1の対立遺伝子、誘導体、例えば相同的ヒトアミノ酸配列のバリアント、ミュータント及びフラグメントを自然に発生させるような、機能的等価に関する。好ましい態様において、本発明は、配列番号４に示したNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含むNCoA-1のフラグメントに関する。このようなフラグメントは、他のアミノ酸配列と融合し得る。例えば、このような誘導体は、トロンビンプロテアーゼ切断端、エンテロキナーゼ端、配列番号３で示される、少なくともアミノ酸２１２〜４６２のNCoA-1に融合した列の幾つかのヒスチジン残基を含むいわゆるヒスチジンタグ（Hisタグ）（Janknechtら、1991年）を含む融合ポリペプチドである。好ましい態様において、NCoA-1又はそれらのフラグメントは、例えばヒスチジンタグに融合した、検出可能な標識で標識される。
【０００７】
一つの態様において、本発明は、物質がSTAT6のNCoA-1との相互作用を調節することができるかどうかを決定するための細胞系及び細胞フリー系で行うことができる方法、好ましくは、物質がアクチベーターかどうか、即ちペプチド又はインヒビターの両方の相互作用を促進するか相互作用を妨げるかどうかを決定する方法に関する。この方法は、STAT６又はNCoA-1に結合する能力を有するそれらのフラグメント又は誘導体が、STAT６およびNCoA-1又はフラグメント又は誘導体が複合体を形成でき、その複合体が、測定可能な読み取り情報を誘導するのに使用され得る条件下で、NCoA-1と又はSTAT６に結合する能力を有するNCoA-1のフラグメント又は誘導体と接触して運ばれることに特徴がある。読み取り情報は、興味ある物質の不存在下又は存在下で測定され、得られた読み取り情報が比較される。複合体の高量に対応する読み取り情報を、物質の不存在下で得られた読み取り情報と比較したときに、それが本発明のアクチベーターとして作用する物質を示すのに対して、読み取り情報が同じであると、相互作用を調節しない物質であることがわかる。低量に対応する読み取り情報は、本発明のインヒビターとして作用できる物質であることを示す。本発明において、読み取り情報を測定することは、本発明に従って相互作用した本発明のSTAT6及びNCoA-1又はフラグメント又は誘導体を測定する従来知られた技術を含む。例えば、本発明の形成された複合体の直接検出は、例えば、物理的方法又は、例えば抗体などの複合体を認識する他の分子の結合を介して行うことができる。前記認識において、未標識及び標識したSTAT６、NCoA-1又はフラグメント又は誘導体が使用され、例えば、相互作用するポリペプチドの一つが、例えば、少なくとも５つの連続的なヒスチジン残基からなる、融合されたヒスチジンタグで標識され、例えばヒスチジン特異抗体のタグに特異的に結合する分子によって認識され得る。抗体は、例えばそれ自身が測定可能な反応を触媒することができる酵素に結合される、第二抗体を使用する従来よく知られている技術によって、例えば、修飾された物質や放射光のような副産物によって反応生成物を検出することによって検出できる。
このような方法は、以下の工程、
（ａ）配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは、配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは配列番号６のSTAT６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む第一ポリペプチドを、容器又は容器の一部に存在する固体キャリアーに結合させる工程、
（ｂ）任意に好適な溶媒中の、興味ある物質又は偽のコントロールを添加する工程、
（ｃ）配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む検出可能に標識した第二ポリペプチドを、両方のポリペプチドが互いに結合できる条件下で、添加する工程、
（ｄ）未結合第二ポリペプチドを除去する工程、
（ｅ）第一ポリペプチドと結合した検出可能な標識された第二ポリペプチドの量を測定する工程、
を含むことができ、
又は以下の工程、
（ａ）配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む第一ポリペプチドを、容器又は容器の一部に存在する固体キャリアーに結合させる工程、
（ｂ）任意に好適な溶媒中の、興味ある物質又は偽のコントロールを添加する工程、
（ｃ）配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは配列番号６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む、検出可能な標識された第二ポリペプチドを、両方のポリペプチドが互いに結合することができる条件下で、添加する工程、
（ｄ）未結合第二ポリペプチドを除去する工程、
（ｅ）第一ポリペプチドに結合した検出可能な標識第二ポリペプチドの量を測定する工程、
を含むことができる。
【０００８】
本発明は、物質が、本発明による相互作用のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定するためのテスト方法に関する。IL-４情報伝達を引き起こすSTAT６とNCoA-1の相互作用は、腫瘍疾患又は炎症性気道疾患に含まれ、炎症を媒介する役割を果たすので、STAT６又はNCoA-1の生物活性を調製する物質を、腫瘍疾患、好ましくはホジキンリンパ腫、又は炎症性気道疾患、好ましくは喘息を治療するのに使用でき、又は、至適物質が腫瘍疾患、好ましくはホジキンリンパ腫、又は炎症性気道疾患、好ましくは喘息を治療するのに好適である方法で、物質の機能を至適化するためのリード化合物として使用できる。
又は、本発明は、物質が、STAT６のNCoA-1との相互作用のアクチベーター又はインヒビターであるかどうかを決定するテスト方法に関する。本発明の方法を行うのに有用なテストシステムは、細胞又は細胞フリー系を含むことができる。例えば、本発明の１つの態様は、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子の発現を使用して、STAT６応答エレメントで調節された測定可能な読み取り情報として、本発明によるSTAT６と、NCoA-1、又はそのフラグメント、バリアント、又は誘導体の相互作用に作用する物質をテストすることができる方法で設計されるテストシステムに関する。
本発明の方法は、物質が発明のインヒビター又はアクチベーターであるかどうかを決定するのに好適な高処理試験に有用であり、また例えば第二試験又は高処理試験で確認されるヒット又はリード物質の確認にも有用である。
本発明の方法を行うのに、本発明によるテストシステムを使用できる。
本発明のテストシステムは、従来良く知られているエレメントを含むことができる。このテストシステムは、固体表面、好ましくは容器の底、より好ましくはELISAプレートに、相互作用するポリペプチドのひとつを固定化することによって行われる本発明のSTAT６のNCoA-1、フラグメント又は誘導体の相互作用を測定する方法で設計される。好ましくはヒスチジンタグで標識された他のポリペプチド、および任意に好適な溶媒中の、興味ある物質又は偽のコントロールが、ポリペプチドの両方が互いに結合することができる条件下で、添加される。本発明のポリペプチドの相互作用を検出するより前に、即ち形成された複合体の検出前に、未結合ポリペプチドを除くことができ、第一ポリペプチドに結合された検出可能な標識された標識第二ペプチドの量を測定することによって行うことができる複合体の検出を促進する。このような、物質がSTAT６のNCoA-1との相互作用のアクチベーター又はインヒビターかどうかを決定するためのテストシステムは、例えば、以下、
（ａ）NCoA-1に結合する能力を有する、STAT６又はそのフラグメント又は誘導体、
（ｂ）STAT６に結合する能力を有するNCoA-1又はそのフラグメント又は誘導体、
（ｃ）STAT６又はそのフラグメント又は誘導体が、NCoA-1又はそのフラグメント又は誘導体との複合体を形成できる容器、
（ｄ）複合体を測定する装置、
を含む。
テストシステムは、配列番号２のSTAT６の少なくともアミノ酸６７７〜８４７、より好ましくは、配列番号５のSTAT６の少なくともアミノ酸７９２〜８４７、最も好ましくは、配列番号６の少なくともアミノ酸７９４〜８１４を含む第一ポリペプチドと、配列番号４のNCoA-1の少なくともアミノ酸２１２〜４６３を含む第二ポリペプチドを含むことができる。
【０００９】
また、本発明は、本発明によるSTAT６のNCoA-1との相互作用のインヒビター又はアクチベーターである、本発明による方法で決定可能な又は決定された物質に関する。本発明の物質は、本発明による相互作用の機能を活性化でき、又は好ましくは抑制できる化合物である。相互作用を活性化又は抑制する方法の一例は、高い親和性を有する各ポリペプチドの１つに結合することによるものであり、それによってポリペプチドの少なくとも１つのドメイン及び/又は機能的ドメインと結合するのをブロックし、それは適用される物質の性質により、可逆的又は不可逆的に行われる。また、本発明は、例えば、相互作用に直接結合し又は干渉し、それによってSTAT６の生物活性に影響を及ぼす、抗体、又は有機若しくは無機化合物である。本発明の好ましい物質は、ペプチド１（配列番号６）又はペプチド１に対する抗体である。
当業者がどのように本発明の教示にならい、本発明の方法を使用するかを例示することは、本発明の物質を簡単に確認でき、以下の例が開示される。
本発明の物質の例として、本発明は、「ペプチド１」（配列番号６）として設計されたペプチドを開示し、本発明の方法を使用するSTAT６のNCoA-1との相互作用を調整するのに確認され、本発明の方法を使用して相互作用のインヒビターとして決定されている（例１ａに示す）。
本発明の物質の他の例として、本発明は、ペプチド１に対する２つのポリクローナル抗体血清を開示する。「ＡＢ  １ａ」及び「ＡＢ  １ｂ」として設計された前記血清は、それぞれ、本発明の方法を使用して、本発明のSTAT６のNCoA-1との相互作用のインヒビターとして決定された（例１ｂに示す）。
【００１０】
また、本発明は、薬物、即ち病気治療用の本発明の物質に関する。好ましい物質は、ペプチド１（配列番号６）、又は１つは配列番号６によるペプチド１であり、もう1つはその抑制機能からペプチド１を妨害しない分子である、少なくとも２つの機能的部分からなる物質、又は前記ペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体、例えばＡＢ  １ａ又はＡＢ  １ｂである。
また、本発明は、本発明の物質、好ましくはペプチド１又はペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体や例えば病気、好ましくは腫瘍疾患、より好ましくはホジキンリンパ腫、又は好ましくは炎症性気道疾患、より好ましくは喘息を治療するための、ＡＢ１ａ又はＡＢ１ｂのポリクローナル抗体の使用に関する。
また、本発明は、本発明の物質、好ましくはペプチド１又はペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体や例えば病気、好ましくは腫瘍疾患、より好ましくはホジキンリンパ腫、又は好ましくは炎症性気道疾患、より好ましくは喘息を治療するための医薬組成物を調製するためのＡＢ１ａ又はＡＢ１ｂのポリクローナル抗体の使用に関する。
本発明の他の態様は、アクチベーター又はインヒビター、好ましくはペプチド１又は前記ペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体、例えばＡＢ  １ａ又はＡＢ  １ｂのポリクローナル抗体であることが決定された、少なくとも１つの本発明の物質を含む医薬組成物に関する。この組成物は、公知の方法で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成、すりつぶし、粉砕、乳状化、カプセル化、包括、又は凍結乾燥工程の方法によって、製造することができる。
腫瘍疾患又は慢性炎症性気道疾患の治療用薬物として、本発明の活性又は抑制する物質を使用するため、これらの物質を、腫瘍、好ましくはリンパ腫、又は炎症性気道疾患に苦しむ動物、又はSTAT６及び/又はNCoA-1を過剰発現するトランスジェニック動物などの動物モデルにテストすることができる。
本発明の物質の毒性及び治療有効性は、細胞培養を誘導し、IC50、LD50及びED50を決定する動物実験が含まれる、標準の製薬手順によって決定することができる。得られたデータは、動物又は好ましくはヒト投与範囲を評価するのに使用され、投与形態（錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、アンプルなど）及び投与ルート（例えば、経皮的、経口的、口内、経鼻、経腸、非経口、吸入、気管内又は直腸）にもよるであろう。
活性成分としての本発明の少なくとも1種類の物質を含む医薬組成物は、従来の方法で調剤され得る。このような調剤を作る方法は、例えば「レミントンファーマシューティカルサイエンス」などのマニュアルで見つけられる。また、本発明による少なくとも１種類の物質を調剤するのに有用な成分の例は、WO99/18193に見つけられ、ここに参照によって組み込まれる。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、本発明によって腫瘍疾患を治療する、及び本発明によって炎症性気道疾患を治療する方法に関する。このような方法には、本発明のSTAT６のNCoA-1との相互作用のアクチベーター又はインヒビター、好ましくはペプチド１又は前記ペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体、又は例えばＡＢ  １ａ又はＡＢ  １ｂのポリクローナル抗体かどうかを決定する方法によってアクチベーター又はインヒビターであると決定された、少なくとも１種類の物質を含む医薬組成物の好適な量を、このような治療を必要とする、生物好ましくはヒトに投与することが含まれる。
別の態様において、本発明は、前記相互作用のアクチベーター又はインヒビター、好ましくはペプチド１又は前記ペプチド１に対する抗体、例えばペプチド１に対するモノクローナル抗体又は例えばAB  1a又はAB  1bのポリクローナル抗体であると決定された物質を投与することを含む、本発明のSTAT６とNCoA-1との相互作用を選択的に調節するための方法に関する。
以下の例１は、本発明を説明するものであるが、限定するものとして解釈されるべきではない。しかしながら、例１は、本発明の最も好ましい態様を説明する。
【実施例１】
【００１２】
実施例
例１：STAT６／NCoA-1-ELISA
以下は、相互作用を調節できる物質を確認するために、どのようにSTAT６のNCoA-1との相互作用が行われるかを説明したものである。
溶液：
コーティング緩衝液：１ｘPBS  pH７．２
ブロッキング緩衝液：１ｘPBS  pH７．２、５％  BSA、０．１％  Tween  ２０
洗浄緩衝液：１ｘPBS  pH７．２、０．１％  Tween  ２０
基質液：リン酸塩クエン酸塩緩衝液錠剤（シグマ）を１００ｍｌの水に溶解し、０．０５Mリン酸塩クエン酸塩緩衝液pH５．５を得た。o-フェニレンジアミンジヒドロクロライド（シグマ）の錠剤を３０ｍｌのリン酸塩クエン酸塩緩衝液に暗所で溶解した。使用前に３０μｌの３０％H2O2を添加した。
組換えタンパク質：
GST-STAT6  aa  677-847及びHis-タグNCoA-1  aa  212-463を、E.coliで発現して、従来技術に従って、アフィニティクロマトグラフィーで精製し、１ｘPBSで透析した。
組換えタンパク質の配列：
GST-STAT６  aa  677-847タンパク質、配列番号１
HisタグNCoA-1  aa  212-463、配列番号３
抗体：
１．抗体：ペンタ-His、キアゲン（カタログ番号３４６６０）
２．抗体：ヒツジ抗マウスIg、HRPリンク、アマシャムファルマシア（カタログ番号NA931)
プレート調製：
−１００μｌのコーティング緩衝液中の５００ｎｇのGST-STAT6アミノ酸６７７〜８４７をELISAプレートに移した。プレートをシールし、一晩４℃でインキュベートした。
−ウエルを、５分間洗浄液をインキュベートして、３回洗浄緩衝液（２００μｌ）で洗浄した。最後の洗浄後、残りの洗浄液を除去した。
−２００μｌのブロッキング緩衝液を添加することにより、プレートをブロックした。室温で２時間インキュベートした。
−洗浄緩衝液でウエルを３回洗浄した（上記参照）。
−洗浄緩衝液に、興味ある物質又は偽のコントロールを１００μｌ添加した。
−２５０ｎｇのHisタグNCoA-1アミノ酸２１２〜４６３を１００μｌ洗浄緩衝液に添加した。一定の攪拌下で室温で１時間インキュベートした。
−洗浄緩衝液（２００μｌ）で３回洗浄した（上記参照）。
−検出抗体（ペンタ-His抗体、キアゲン、希釈１：２０００、ブロッキング緩衝液）を、１００μｌ添加した、１時間インキュベートした。
−洗浄緩衝液（２００μｌ）で３回洗浄した（上記参照）。
−第二抗体（ヒツジ抗マウス抗体、HRPリンク、アマシャムファルマシア、１：２０００、ブロッキング緩衝液）を、１００μｌ添加した。１時間インキュベートした。
−洗浄緩衝液（２００μｌ）でウエルを５回洗浄した（上記参照）。各ウエルに１００μの基質液を添加した。暗所で６分間インキュベートした。１００μｌの１N  H2SO4を添加することによって反応を止めた。４５０ｎｍにセットしたELISAリーダーを使用して、１５分間以内に各ウエルの吸光度を測定した。
得られたシグナルが、STAT６に結合したNCoA-1の量の測定を。これを表１に示す。
【００１３】
【表１】
2005500046.tif 000002
【００１４】
表１の説明
５００ｎｇのE.coli発現かつアフィニティー精製されたGST-STAT６  TAD（アミノ酸、aa  677-847)を、指示したように９６ウエルELISAプレートに被覆した。２５０ｎｇのE.coli発現、アフィニティー精製His-NCoA-1（aa  212-463）でインキュベーションの後、結合したタンパク質を、指示されたようにマウス抗His抗体とペルオキシターゼ連結ヒツジ抗マウス抗体によって検出した。ライン２、４及び６では、GST-STAT6  TAD（aa  677-847)を被覆しなかった。ライン３及び４では、His-NCoA-1を添加しなかった。ライン５及び６では、抗His抗体を添加しなかった。ペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミンの転換を、４９２nmで測定した。標準偏差(s.ｄ.)で３つの独立した実験の平均を示した。
アッセイがテスト基質の存在下で行われると、STAT６及びNCoA-1間の相互作用を妨げる能力が測定されるだろうし、テスト化合物の存在下でのシグナルを、例えば例１ａ）及び１ｂ）で示したテスト物質の不存在下で、コントロール値と比較することができる。
【００１５】
例１ａ）：本発明のインヒビター：ペプチド１
以下は、本発明の教示がどのように本発明の物質に導くかを説明する。
［ペプチド１は、STAT６とNCoA-1の相互作用に対して効力のあるインヒビターである］
図８  Ａ）は、i)ヒトSTAT６、ii)GST-STAT６融合タンパク質（GSTはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）の構造を描き、アミノ酸の場所、DNA結合領域（DBD)、SH2領域、TAD及びサイトカイン依存リン酸化部位（Y）を示す。iii)トランス活性化領域（TAD)由来のペプチド：ペプチド１（アミノ酸７９４〜８１４、配列番号６）、ペプチド２（アミノ酸８１７〜８３０）及びペプチド３（アミノ酸８３０〜８４７）、iv)は、それぞれ前記ペプチド（AB  1a、AB  1b；AB  2a、AB  2b；AB  3a、AB  3b）に対して産生されたポリクローナルウサギ抗血清の表示である。
B）で、プルダウンアッセイが以下のように与えられる：
指示したように、E．coliから精製された４μｇのGST又はGST-STAT６-TAD融合タンパク質を、２０μｌのグルタチオン-セファロースに結合させて、１００μｇのペプチド１、又はペプチド２又はペプチド３それぞれの存在下において１．５μｌの［35S］-標識NCoA-1とインキュベートした。グルタチオン-セファロースに結合した材料を結合反応から回収して、大量に洗浄して、SDS-PAGE及びフルオログラフィーで分析した（レーン２〜６）。レーン１のインプットコントロールは、この実験で使用された35S標識NCoA-1の全体量の１０％を表わす。結果は、ペプチド２又はペプチド３の存在は、GST-STAT６-TADとNCoA-1の結合能を有意に変えないが、ペプチド１（配列番号６）の存在で、GST-STAT6-TADのNCoA-1との結合が少ないことが明らかになった。
C）で、（例１で行われた）ELISAアッセイの結果が以下のように与えられる：
２５０ng結合タンパク質に対応する、細菌粗製ライセートからの８μｌのHisタグNCoA-1アミノ酸２１２〜４６２（配列番号３）を、１００μｌのコーティング緩衝液でニッケルコートしたELISAプレートに固定化した。ペプチド１又はペプチド２又はペプチド３の１１，２ｎモルを指示したようにそれぞれ添加した。１時間のインキュベーション後、５００ｎｇの精製GST-STAT6-TADを、各反応サンプルに添加した。結合SGT-STAT6-TADを抗GST-HRP連結抗体で検出した。コントロールインキュベーションを、追加のペプチド無しで（レーン４）、又は固定化HisタグNCoA-1無しで（レーン５）、又は抗GST−HRP連結抗体単独をコントロールバックグラウンド結合で（レーン６）行った。結果は、B）で得られた結果に対応した。
【００１６】
例１ｂ）：本発明のインヒビター：抗体AB 1a、AB 1b
以下は、どのように本発明の示唆が本発明による物質に導くかを例証する。
［ペプチド１に対して産生された抗血清はSTAT６とNxoA-1の相互作用を抑制する]
図９Ａ）は、以下のプルダウンアッセイの結果を与える：
２０μｌのグルタチオン−セファロースに結合した、４μｇのGST又はGST-STAT6-TAD融合タンパク質を、残基２１３〜４６２（配列番号３）を含む、１．５μｌの［35S]標識HisタグNCoA-1融合タンパク質とインキュベートした。プローブ４〜１０で、無関係のペプチドに対して産生された（レーン４）、又はペプチド１（レーン５及び６：AB  1a、AB  1b）又はペプチド２（レーン７及び８：AB  2a、AB  2b）及びペプチド３（レーン９及び１０、AB  3a、AB  3b）に対して産生されたポリクローナルウサギ抗血清１０μｌの存在下で、指示されたように、結合反応を行った。結合タンパク質をSTS−PAGE及びフルオログラフィーで分析した（レーン２〜１０）。コントロールとして、実験に使用した［35S]標識タンパク質の１０％を並行して分析した（レーン１）。結果は、ペプチド１に対して産生された抗血清AB  １a又はAB  1bの存在下で、STAT６融合タンパク質とNCoA-1融合タンパク質の結合が少ないことを示した。残りの血清は、タンパク質相互作用を変えなかった。
B)で、（例１で行われた）ELISAアッセイの結果が以下のように与えられる：
１００ｎｇの結合タンパク質に対応する、細菌粗製ライセートからのGST-STAT6-TAD融合タンパク質０．５μｌを、GST抗体で被覆したプレートに固定化した。ペプチド１(AB-a1、AB-1b）又はペプチド２（AB-2a、AB-2b）又はペプチド３（AB-3a、AB-3b)に対して産生されたポリクローナルウサギ抗血清を、ブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈して添加した。１時間のインキュベーション後、E.coliから精製した、アミノ酸２１３〜４６２（配列番号３）を含む２５０ngのHis-タグNCoA-1融合タンパク質を添加した。結合His-NCoA-1を、ペンタHis抗体及び続いて第二抗体（HRP連結ヒツジ抗マウス抗体）で検出した。コントロールとして、第二抗体のプレートへの結合を並行して分析した。結果は、A)の研究結果に対応した。
【００１７】
例１ｃ）：STAT６  NCoA-1相互作用の更なる特徴づけ
［STAT-TADのLXXLLモチーフの点突然変異は、インビトロでのNCoA-1の相互作用を無効にする］
図１０Ａ）は、ペプチド１の配列（配列番号６）及びそのLXXLLモチーフを示す。アラニン配列に導入された突然変異をアスタリスクでラベルした。
B)で、GSTプルダウンアッセイの結果を以下のように与える：
野生型STAT６（WT)又は変異体STAT６(mut;アミノ酸位置802及び805の両方のLがAに変異した）の残基６４２から８４７を含む、４μｇのGST又はGST融合タンパク質を、残基２１３〜４６２（配列番号４）を含む１．５μｌの［35S]標識NCoA-1フラグメントとインキュベートし、２０μｌのグルタチオン-セファロースとインキュベートした。グルタチオン-セファロースに結合した材料をSDS-PAGEで分離した。放射線標識タンパク質をフルオログラフィーで検出した。結果は、突然変異STAT６タンパク質及びNCoA-1タンパク質の相互作用に不可欠である８０２と８０５の位置のアミノ酸を示すNCoA-1タンパク質と突然変異STAT６が殆ど結合していないことを示した。
C)で、タンパク質の比較できる量をB)で使用したことを示す、コントロールが行われた：各反応の四分の一を、指示したように、別々にSDS-PAGE、及びつづくGST及びGST-STAT６融合タンパク質（WT及びmut)を検出するクマシー染色で分析した。
【００１８】
［LXXLLモチーフの点突然変異は、２９３T細胞のエオタキシン（Eotaxin)-3の発現を減少させる］
図１１A)は、トランスフェクション実験と、続いてIL-4処理で誘発されたエオタキシン-2の判定量分析の結果を示す：
２９３T細胞を、野生型（WT、レーン３、４）又は変異体STAT６（mut；突然変異は上記参照：レーン４、５）をコードする発現ベクター又は空の発現ベクター（偽、レーン１、２）で形質移入した。細胞を、指示したように、IL-４で１６時間誘導し（＋）、又は未処理（−）にした。全RNAを調製して、エオタキシン-3及びGAPDHの発現レベルをRT-PCRで分析した。結果は、IL4刺激後エオタキシン-3発現に不可欠である８０２及び８０５の位置のアミノ酸を示すWT  STAT６と比べて、変異体STAT６で形質移入された細胞でIL4刺激後、エオタキシン-3の減少した発現を示した。
B)培養された細胞の上清から分泌されたエオタキシン-3の量を、IL-4で４８時間誘発し（レーン２、４、６）、又は未処理のまま（レーン１、３、５）で、Aで説明したように、２９３Tの形質移入後のELISAタイプアッセイで測定した。３つの独立した実験の標準偏差で平均値を得た。結果は、A)の研究結果に対応した。
C)で、WT及びmut  STAT６の比較できる量が、B)でそれぞれ形質移入した細胞で製造されたことを示す、コントロールを行った：指示したように、Bからの細胞を溶解して、SDS-PAGE及び抗STAT６-AB又は抗βアクチンABを使用するウエスタンブロット（WB)で分析した。
【実施例２】
【００１９】
例２： STAT６依存転写を誘発するIL-４情報伝達はNCoA-1によって高まる
以下は、IL-4情報伝達での重要因子としてのNCoA-1を証明する。
［NCoA-1はSTAT６によるIL-4誘発転写を高める］
先の研究は、STAT６のトランス活性化領域（TAD)を特徴付けし（Luら、1997；Morigglら、1997）、自律的トランス活性エレメントを確認した（Goenkaら、1990）。発明者らは、STAT６  TADの活性は、活性化補助因子p300／CBPによって高まることを最近見出し、インビボでSTAT６とp300/CBPの相互作用を観察した（Gingrasら、1999)。アミノ酸１８５０〜２１７６の領域は、p300/CBPのSTAT６相互作用と特徴づけられた。また、この領域は、p300/CBPと核受容体活性化補助因子のNCoAファミリーの相互作用を媒介し（Yaoら、1996）、一緒になって大きい活性化補助因子複合体を形成する。SRC/NCoA活性化補助因子がSTAT６によるトランス活性化に関連するかどうかを調べるために、IL-4反応性肝臓細胞株HepG2で一時的形質移入アッセイを行った。
細胞を、多量体化したSTAT６応答エレメントと、STAT６及び活性補助因子NCoA-1、NCoA-2及びp/CIPをそれぞれコードする発現ベクターとを有するルシフェラーゼレポーター構築物で形質移入した（図１）。形質移入後、細胞をIL-4で処理して又は未処理のままにした。IL-4での誘発は、基礎のレポーター遺伝子発現の６倍の増強を導いた（図１、レーン１及び２）。更に、この誘発は、NCoA-1が同時形質移入されたときに３倍まで高まったが（レーン３及び４）、p/CIP又はNCoA-1のそれぞれの同時形質移入は効果がなかった（レーン５〜８）。
これらの結果は、NCoA-1がSTAT６の活性化補助因子であるが、NCoAファミリーの他のメンバーNCoA-2及びp/CIPは、STAT６によってトランス活性化に関連しないようであることを示す。
【００２０】
［NCoA-1はSTAT６のC末端トランス活性化領域のトランス活性化ポテンシャルを強く高める］
NCoA-1がSTAT６媒介トランス活性化を高めることによって仕組みを啓発するために、発明者らは、NCoA-1がSTAT６  TADに対して標的にされたかどうかを調べた。発明者らは、GAL-4  DNA結合領域(GAL4-DBD)に融合した場合に、過剰発現したNCoA-1の存在又は不存在化で、適切なルシフェラーゼレポーターを誘発する、STAT６  TADの受容力を測定した。先の研究は、既に、同様の設定でSTAT６  TADの活性の特性を表わした（Goenkaら、1999；Luら、1997；Morigglら、1997）。STAT６（アミノ酸６７７〜７９１）の主要トランス活性化機能及びSTAT６（アミノ酸７９２〜８４７）の極端なC末端（図２A)のどちらかを有する２つのGAL4融合タンパク質を、NCoA-1がこれらの領域に入れられるかどうか、調べるのに使用した。
様々なGAL4-STAT６  TAD構築物及びプロモーター領域に３つのGAL４応答エレメントを含むルシフェラーゼレポーター構築物は、活性化補助因子NCoA-1の同時形質移入有り又は無しで、HepG2に形質移入された。単離されたGAL4-DBDの発現は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の有意な増強を起こさず、NCoA-1の同時形質移入による効果もなかった（図２B、レーン１及び２）。GAL4-STAT６（６７７〜７９１）は、レポーター遺伝子発現を強く誘導した（レーン３）。NCoA-1の同時形質移入は、わずかな増強を導いた（レーン４）。GAL4-STAT６（７９２〜８３７）は、レポーター遺伝子活性を有意に誘発せず、GAL4  DBDに融合したときに、副次的なトランス活性化ポテンシャルを有することが示された。驚くべきことに、NCoA-1の同時形質移入は、STAT６の極端のC末端領域のトランス活性化機能を、STAT６の主要なトランス活性化領域の高さと同じレベルまで強く増強した。
この知見を確認するため及びGAL4-STAT６（７９２〜８４７）のトランス活性化因子活性へのNCoA-1の強い効果が細胞タイプ特異的であることを除外するため、発明者らは、前B細胞株Ba/F3-IL-4Rで実験を繰り返した（図２C)。更にまた、GAL4-DBDのみが有意なトランス活性化受容力を有さず、これは、NCoA-1の同時発現により変わらなかった（図2C、レーン１及び２）。GAL4-STAT６（６７７〜７９１）は、リポーター遺伝子活性を強く誘発したが（レーン３）、HepG2細胞での発明者らの結果と対照的に、これはNCoA-1の同時発現により増強されなかった（レーン４）。GAL4-STAT６（７９２〜８４７）は、それ自身による有意なトランス活性化因子活性を示さなかった（レーン５）。同時形質移入されたNCoA-1の存在下で、GAL４-STAT６（７９２〜８４７）は転写を強く増強した（レーン６）。これらの実験の結果により、NCoA-1は、STAT６トランス活性化領域の同時アクチベーターとして役立つことが確認された。強い同時活性化は、非常に弱い自律性トランス活性化因子活性を有する、STAT６  TADの遠いC末端部分に影響し、NCoA-1がこの領域に補われることを示唆した。これに対し、STAT６の主要トランス活性化領域（aa６７７〜７９１）でのNCoA-1の細胞タイプ特異的効果は、細胞特異的因子によるNCoA-1のこの領域への間接的な補充によるのかもしれない。
【００２１】
［NCoA-1及びSTAT６はインビボで相互作用する。相互作用はSTAT６の遠いC末端領域の存在に依存する。］
形質移入の実験は、NCoA-1が遠いC末端STAT６  TAのトランス活性化ポテンシャルを強く増強し、NCoA-1とこの領域との直接相互作用を示唆した。インビボでのSTAT６とNCoA-1との起こりそうな相互作用を証明するため、同時免疫沈降実験を行った。２９３T細胞を、それぞれ、完全長のSTAT６、アミノ酸７９２〜８４７を欠くSTAT６と、NCoA-1をコードする発現ベクターで形質移入した。全細胞抽出物を調製し、同時免疫沈降実験を指示した抗体で行った。免疫沈降を、NCoA-1及びSTAT６特異的抗血清でウエスタンブロッティングで分析した。大量のNCoA-1をNCoA-1特異的抗体で沈降させた（図３、レーン３及び７）。無関係の抗体は、全くNCoA-1を沈降させなかった（レーン４及び８）。STAT６特異的抗体は、NCoA-1特異的抗体で沈降したのとほぼおなじ程度のNCoA-1を同時免疫沈降させた。これは、完全長STAT６が細胞に同時形質移入されたときに観察されたのみであった。STAT６Δ７９２の不完全な形が細胞に存在した場合、野生型及び不完全なSTAT６の相当量が両方の反応で沈降したが（比較レーン１０及び１２）、NCoA-1は全く同時免疫沈降しなかった（比較レーン２及び６）。要約すれば、これらの実験は、NCoA-1及びSTAT６はインビボで強く相互作用し、この相互作用は、おそらくC末端領域STAT６を介して起こることがはっきりと示された。
【００２２】
［STAT６のトランス活性化領域は、インビトロで、NCoA-1と相互作用するが、NCoA-2及びp/CIPと相互作用しない］
STAT６及びNCoA-1の相互作用を更に特徴づけ、特異性を決定するため、GSTプルダウン実験を行った。３つの関連したNCoA/SRC-1ファミリーのメンバーが、STAT６  TADとの相互作用についてテストされた。そのため、STAT６のトランス活性化領域をGSTと融合させて、GSTとGST-STAT６-TADの相当量を、インビトロ合成された、［35S]標識活性化補助因子とインキュベートした。NCoA-1は、GST-STAT６  TADに強く結合した（図４、レーン７）。対照的に、NCoA-2及びp/CIPは、STAT６  TADとの相互作用に失敗した（レーン８、９）。GST単独で結合は観察されなかった（レーン４、５、６）。これらの知見は、図１で示した、一過性形質移入実験と一致し、NCoA-２及びp/CIPではなく、NCoA-1が、STAT６によってトランス活性化を増強させた。まとめると、NCoA-1はSTAT６と特異的に相互作用し、STAT６の活性化補助因子として役立つ。
【００２３】
［STAT６トランス活性化領域の遠いC末端部分は、インビトロでNCoA-1と相互作用する］
更に、相互作用に原因があるSTAT６トランス活性化領域の範囲の特徴を示す。そのため、NCoA-1に強く応答する、全TAD（アミノ酸６７７〜８４７）、主要N末端TAD（アミノ酸６７７〜７９１）及び遠いC末端領域（アミノ酸７９２〜８４７）を示す様々なGST-STAT６融合構築物を、NCoA-1との相互作用において調べた（図５A)。異なるGST-STAT6融合タンパク質の同様量をクマシー染色で確認するのに適用した（図５C)。予想通り、NCoA-1は全TADを含むGST  STAT６と強く相互作用した（図５B、レーン２）。同じ強い相互作用がSTAT６  TADの遠いC末端部分だけを示すGST融合タンパク質で観察されたが（レーン４）、N末端STAT６  TADを示すGST融合は、NCoA-1に結合しなかった（レーン３）。この結果は、NCoA-1とSTAT６  TADのC末端部分の直接相互作用がNCoA-1の強い活性化補助因子の原因であるという発明者らの仮定を確認した。
【００２４】
［STAT６のトランス活性化領域は、NCoA-1のアミノ酸２１２〜４６２に直接相互作用する］
NCoA-1は、幾つかの構造的及び機能的領域を含む（図６A)。NCoA-1の領域がSTAT６の相互作用を媒介するのを調べるために、発明者らは、プルダウン実験でSTAT６との相互作用においてNCoA-1の様々なフラグメントをテストした（図６A)。発明者らは、残基６７７〜８４７を含むGST  STAT６融合タンパク質を使用して、インビトロで翻訳された標識NCoA-1の様々なフラグメントへの結合を分析した。発明者らは、アミノ酸１〜７８１にわたるN末端フラグメント（図６B、レーン１１）及び完全長NCoA-1タンパク質（レーン１５）とGST−STAT６  TADの特異的相互作用を観察したが、GST単独と相互作用しなかった（レーン６〜１０）。核受容体相互作用領域（レーン１２）、CBP/p300相互作用領域（レーン１３）及びC末端トランス活性化領域（レーン１４）を含むフラグメントは、相互作用しなかった。NCoA-1のSTAT６結合部位を更に限定するため、発明者らは、NCoA-1のN末端領域を切ってプルダウン実験で異なるフラグメントを試験した（図６A)。最も短いN末端相互作用フラグメント（１〜５７１）の分割された部分（１〜３６１及び３６１〜５７１）は、STAT６  TAと相互作用せず（図６C、レーン６及び９）、結合する側は、どうやら間にあることが示された。GST  STAT６と今なお相互作用できるNCoA-1の最小フラグメントは、Per-Arnt-Sim（PAS)領域B及びセリン/スレオニンリッチ領域の部分（レーン１８）を含むアミノ酸２１３から４６２の領域を有する。更に、N末端（３１３〜４６２、レーン２１）又はC末端（１〜３６１、レーン６）の欠失は、結合を止める。また、強い相互作用は、GST  STAT６が精製ヒスチジンタグNCoA-1（２１２〜４６２）とインキュベートしたときに観察され（データは示さず）、NCoA-1とSTAT６の相互作用は、追加のタンパク質に依存しないことが確認された。
【００２５】
［NCoA-1のN末端領域は、STAT６による転写活性化にドミナントネガティブとして働く］
STAT６のトランス活性化におけるNCoA-1の相互作用の関連を確認するため、発明者らは、NCoA-1のN末端領域の過剰発現（図７A)がSTAT６の転写受容力に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。その結果、発明者らは、N末端フラグメント、又はコントロールとしてBa/F3-IL-4R細胞のNCoA-1の核受容体相互作用領域（NID)を発現させ、STAT６反応Igε-TKルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性での影響を分析した。IL-4の誘発で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の強い影響が観察された（図７B、レーン１及び２）。STAT６相互作用領域を含むN末端NCoA-2構築物の同時発現は、この刺激を止める（レーン３、４）。対照的に、NIDをかくまうフラグメントの同時発現は、STAT６媒介刺激に著しい影響を示さなかった。
【００２６】
文献
2005500046.tif 000003
2005500046.tif 000004
2005500046.tif 000005
2005500046.tif 000006
【００２７】
図１〜７の説明（図８〜１１の説明はそれぞれ例１で与えられる）
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】NCoA-2及びｐCIPではなく、NCoA-1は、STAT６によるIL-4誘発転写を高める  HepG２細胞を、N4(STAT-RE)３  TK  LUCレポータープラスミド（２μｇ）、STAT６発現ベクター（２５ｎｇ）、NCoA-1、NCoA-2、p/CIP又は空の発現ベクター（２００ｎｇ）で、形質移入コントロールとしてSV40-LacZ発現プラスミド（２５ｎｇ）と一緒に、指示したように形質移入した。形質移入された細胞を、１６時間IL-4（１０ng/ml）で処理し（縞模様のバー）、又は処理しないでおいた（塗りつぶしたバー）。細胞抽出物を調製して、ルシフェラーゼ活性を測定した。相対的ルシフェラーゼ活性を、βガラクトシダーゼ活性で基準化した。平均値を、３つの独立した実験から標準偏差で得た。
【図２】STAT６の遠いC末端トランス活性化領域のトランス活性化ポテンシャルは、NCoA-1によって強く高められる  （A)ヒトSTAT６の構造及びSTAT６トランス活性化領域（TAD)を伴うGAL4-DNA  結合領域（DBD)の融合タンパク質を示した。GAL4-DBD（アミノ酸１〜１４７）を、STAT  TADの異なる領域に融合した。アミノ酸(aa)位置、DBS、SH2領域、TAD及びサイトカイン依存リン酸化部位（Y)を示した。（B)レポータープラスミド（GAL4-RE)３TK  LUC（２μｇ）、GAL4-DBD又はGAL4-DBD-STAT６-TAD融合タンパク質をコードする発現プラスミド（５０ｎｇ）、NCoA-1又は空の発現プレスミド（４００ｎｇ）およびSV40-LacZ発現プラスミド（２５ｎｇ）を、指示されたようにHepG2に形質移入した。（C)Ba/F3細胞を、レポータープラスミド(GAL4-RE)３TK  LUC（５μｇ）、GAL4-DBD又はGAL4-DBD-STAT6-TAD融合タンパク質をコードするプラスミド（５０ｎｇ）、NCoA-1（５００ｎｇ）又は空の発現遺伝子及びSV40-LacZ発現プラスミド（１μｇ）で、指示したように形質移入した。（B及びC)相対的ルシフェラーゼ活性を、測定して、βガラクトシダーゼ活性に対して基準化した。標準偏差で３つの独立した実験の平均値を示した。
【図３】NCoA-1は、STAT６で免疫共沈降する  ２９３T細胞を、完全長又は切り取ったSTAT６をコードする発現ベクターで、NCoA-1発現ベクターと共に、形質移入した。全細胞抽出物を調製して、STAT６特異的抗体、NCoA-1特異的抗体又は無関係の抗体で免疫沈降した。全てのサンプルを、SDS−PAGE及びNCoA-1（上のパネル）及びSTAT６（下のパネル）に対する抗血清でウエスタンブロッティングで分析した。アッセイに使用した材料の１％に対応する細胞ライセートのアリコートを、並行して分析した（レーン１、５、９及び１１）
【図４】STAT６のトランス活性化領域は、インビトロでNCoA-1と特異的に相互作用する  GST又はGST-STAT6-TAD融合タンパク質を、E.coliから精製し、グルタチオン-セファロースに結合させ、NCoA-1、NCoA-2又はp/CIPでそれぞれインキュベートし、インビトロで、(35S)メチオニンの存在化で転写及び翻訳した。グルタチオン-セファロースに結合した材料を、結合反応で回収して、十分に洗浄し、SDS-PAGE及びフルオログラフィーで分析した（レーン４〜９）。レーン１〜３のインプットコントロールは、実験で使用した(35S)メチオニン標識タンパク質の全量の１０％を示す。
【図５】STAST６は、トランス活性化領域の遠いC末端部分を介してNCoA-1と接する  （A）ヒトSTAT６及びGST-STAT6  TAD融合タンパク質の構造である。（B) 指示したように、NCoA-1を、インビトロでの翻訳で(35S)メチオニンで標識し、GST又はGST-STAT６融合タンパク質を結合したグルタチオン−セファロースとインキュベートした。特異的に結合された材料を、グルタチオン−セファロースから溶出し、SDS-PAGEで分離した。アッセイに使用した材料の１０％に対応する網状赤血球ライセートのアリコートを、並行して分析した（レーン１）。放射性標識タンパク質を、フルオログラフィーで可視化した。(C)反応におけるGST融合タンパク質の量を調べるため、クマシー染色を行った。
【図６】NCoA-1のN末端部分は、STAT６との相互作用を媒介する  （A)NCoA-1の略図を作成した。完全長NCoA-1及びNCoA-1欠失変異体のシリーズを示した。塩基性へリックスループへリックス(bHLH)、Per-Arnt-Sim領域（PAS)、核受容体相互作用領域（NID)、CBP相互作用領域（CID)/活性化領域１（AD1)、活性化領域（AD2)を示した。各構造物におけるアミノ酸の数を示した。STAT６に結合しているNCoA-1フラグメントを、縞の長方形で示し、非結合フラグメントを白の長方形で示した。（B)及び（C) 指示したように、NCoA-1及びNCoA-1フラグメントのシリーズを、インビトロで(35S)メチオニンの存在下で翻訳し、GST単独又はグルタチオン−セファロースに結合したGST-STAT６-TAD融合タンパク質とインキュベートした。沈降したタンパク質を洗浄し、溶出してSDS-PAGEで分離した。相互作用アッセイに使用した材料の１０％に対応する、インビトロで翻訳されたNCoA-1欠失変異体のアリコートを、並行して分析した（Bレーン１〜５、Cレーン１、４、７、１０、１６、１９）。放射性標識タンパク質をフルオログラフィーで可視化した。
【図７】NCoA-1のN末端領域は、STAT６による転写活性化にドミナントネガティブな影響を有する  （A）NCoA-1の構造である。機能的及び構造的領域の、塩基性へリックスループへリックス(bHLH)、Per-Arnt-Sim領域（PAS)及び核受容体相互作用領域（NID)を示す。(B)Ba/F3細胞を、STAT６発現ベクター２００ｎｇ、NCoA-1の示されたフラグメントをコードする発現ベクター３μｇ又は空のベクターを、Igε−TK  LUCレポータープラスミド５μｇ及びSV40-LacZ発現ベクター１μｇと共に、形質移入した。４時間後、形質移入細胞を、IL-4で処理し又は未処理のままにした。２０時間後、形質移入細胞を採収して、ルシフェラーゼ活性を測定し、βガラクトシダーゼ活性に対して基準化した。値は、3つの独立した実験からの平均値を示す。
【図１】
2005500046.tif 000007
【図２】
2005500046.tif 000008
【図３】
2005500046.tif 000009
【図４】
2005500046.tif 000010
【図５】
2005500046.tif 000011
【図６ＢＣ】
2005500046.tif 000012
【図７】
2005500046.tif 000013
【図８】
2005500046.tif 000014
【図９】
2005500046.tif 000015
【図１０】
2005500046.tif 000016
【図１１】
2005500046.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2005500046.tif 000018
2005500046.tif 000019
2005500046.tif 000020
2005500046.tif 000021
2005500046.tif 000022
2005500046.tif 000023
2005500046.tif 000024
2005500046.tif 000025
2005500046.tif 000026
2005500046.tif 000027
2005500046.tif 000028
2005500046.tif 000029
2005500046.tif 000030
2005500046.tif 000031
2005500046.tif 000032
2005500046.tif 000033
2005500046.tif 000034
2005500046.tif 000035
2005500046.tif 000036
2005500046.tif 000037
2005500046.tif 000038
2005500046.tif 000039
2005500046.tif 000040
2005500046.tif 000041
2005500046.tif 000042
2005500046.tif 000043
2005500046.tif 000044
2005500046.tif 000045
2005500046.tif 000046
2005500046.tif 000047
2005500046.tif 000048
2005500046.tif 000049
2005500046.tif 000050
2005500046.tif 000051
2005500046.tif 000052
2005500046.tif 000053
2005500046.tif 000054
2005500046.tif 000055
2005500046.tif 000056
2005500046.tif 000057
2005500046.tif 000058
2005500046.tif 000059
2005500046.tif 000060
2005500046.tif 000061
2005500046.tif 000062
2005500046.tif 000063
2005500046.tif 000064
2005500046.tif 000065
2005500046.tif 000066
2005500046.tif 000067
2005500046.tif 000068
2005500046.tif 000069
2005500046.tif 000070
2005500046.tif 000071
2005500046.tif 000072
2005500046.tif 000073
2005500046.tif 000074
2005500046.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500046.tif 000076
【国際調査報告】
2005500046.tif 000077
2005500046.tif 000078
2005500046.tif 000079
2005500046.tif 000080
2005500046.tif 000081