(57)【要約】移植されたバイオプロテーゼ組織の効果的な石灰化の軽減、石灰化の減少およびリン脂質含有量のための方法が組織処置分野において必要である。本発明は、バイオプロテーゼデバイスとしての組み込みのための生物学的組織を調製するための効果的なプロトコルを提供する。移植前プロトコルにおいて、生物学的組織が変性剤の非存在下、界面活性剤および架橋剤で処理される工程を包含することによって、生物学的組織の石灰化が軽減され、そしてリン脂質含有量が減少さるという発見が、本明細書中に開示される。さらに、このプロコル下で調製された生物学的組織が、バイオプロテーゼデバイスに使用するために十分に適合される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料を処理する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）変性剤の非存在下、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程；および
（ｂ）界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記方法が、宿主生物体に移植された場合、工程（ａ）を包含しない同じ方法と比較して、前記生物学的材料における石灰化の軽減をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記石灰化の軽減が、前記生物学的材料における石灰化の排除をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、宿主生物体に移植された場合、工程（ａ）を包含しない同じ方法と比較して、前記生物学的材料におけるリン脂質含有量の減少をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）が、前記工程（ｂ）の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、工程（ａ）および（ｂ）の終了の後、最終液体滅菌溶液と、前記生物学的材料とを接触する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、工程（ａ）の前に、変性剤の非存在下および界面活性剤の非存在下で、架橋剤を含む溶液と、前記生物学的材料とを接触する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的材料が、バイオプロテーゼ組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオプロテーゼ組織が、バイオプロテーゼに組み込まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記最終液体滅菌溶液が架橋剤を含み、そして３５〜５５℃の範囲の温度まで加熱される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、工程（ａ）および（ｂ）において使用される調製物の架橋剤が、以下：アルデヒド、ジイソシアネート、カルボジイミド、ポリエポキシ化合物、二官能性マレイミド化合物、二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、二官能性イミドエステル化合物、二官能性ピリジルチオ化合物、二官能性ビニルスルホン化合物、光活性化可能架橋剤またはそれらの組み合わせ、からなる群から独立して選択される、方法。
【請求項１２】
工程（ａ）において使用される前記調製物の前記架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において使用される前記調製物の前記架橋剤が、以下：ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）において使用される調製物の前記変性剤が、プロトン性溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）において使用される調製物の前記変性剤が、アルコールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）において使用される調製物の前記変性剤が、エタノールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）において使用される調製物の前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）において使用される調製物の前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ８０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が、０．７％と１５％との間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔｗｅｅｎ８０の濃度が、１．６％と１１％との間で選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的材料を処理する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する第１の工程；および
（ｂ）工程（ａ）の後に、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後に、界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の後に、最終液状滅菌溶液と該生物学的材料とを接触する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記方法が、宿主生物体に移植された場合、工程（ｂ）を包含しない同じ方法と比較して、前記生物学的材料における石灰化の軽減をもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、宿主生物体に移植された場合、工程（ｂ）を包含しない同じ方法と比較して、前記生物学的材料におけるリン脂質含有量の減少をもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
石灰化に対して耐性のある生物学的材料であって、以下：
（ａ）変性剤の非存在下、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程；および
（ｂ）界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と該生物学的材料とを接触する工程、
を包含する、該生物学的材料を処理する方法によって生産された、生物学的材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、同一人に譲渡された米国仮特許出願番号第６０／３９６，８７９号（２００２年７月１６日出願）の優先権を主張し、これは全ての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
医用デバイスのヒトおよび他の動物への移植は、ますます頻繁に行われるようになっている。移植可能な医用デバイスは、化学的に「固定」されたかまたは保存された生物学的組織から、全体的または部分的に形成され得る。生物学的組織の化学固定のために使用される技術は、代表的に、生物学的組織を、この組織に存在する結合組織タンパク質分子の間で架橋を形成し得る１つ以上の化学薬品へ曝露することを必要とする。移植可能なバイオプロテーゼを形成するために使用されている固定された生物学的組織の例としては、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靭帯および腱が挙げられる。
【０００３】
心臓弁は、最も広く研究されている移植可能なプロテーゼの１つであり、その臨床的適用および病理学は十分に実証されている（Ｓｃｈｏｅｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １：２９−５２（１９９２））。１００，０００を越える心臓弁プロテーゼが、毎年患者に移植されている（Ｌｅｖｙら、米国特許第５，６７４，２９号）。現在世界中で使用されている最も一般的なバイオプロテーゼ心臓弁は、ブタ大動脈組織またはウシ心膜組織から作製されている（Ｓｅｉｆｔｅｒら、米国特許第５，４７６，５１６号）。
【０００４】
ブタ大動脈組織およびウシ心膜組織を含む生物学的組織は、代表的に、結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）を含み、これらは、組織の支持的骨組みとして働く。各生物学的材料の柔軟性および剛直性は、大部分が、組織中に存在するコラーゲンおよびエラスチンの相対量によって、ならびに／またはその結合組織の骨組みの物理的構造および構成によって決定される。各コラーゲン分子は、コイル状の螺旋構成で絡みあった３つのポリペプチド鎖から構成される。
【０００５】
バイオプロテーゼ組織を安定化するために、組織の反応性部分は、固定として知られているプロセスによってブロックされる。１９６８年に、コラーゲンがアルデヒドによって安定化されることが見出された（Ｎｉｍｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：１４５７−１４６６（１９６８））。アルデヒドは、所定のコラーゲン分子中のポリペプチド鎖間の化学的架橋（すなわち、分子内架橋）、または隣接するコラーゲン分子間の化学的架橋（例えば、分子間架橋）を形成することによって、コラーゲンを安定化する。今日、種々の化学固定剤（時折、なめし剤と称される）が、当該分野で公知である。コラーゲン性生物学的組織を架橋するために使用されている固定剤としては、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ、パラホルムアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリオキサールアセトアルデヒド、アクロレイン）、ジイソシアネート（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）、カルボジイミド、および特定のポリエポキシ化合物（例えば、Ｄｅｎａｃｏｌ−８１０、Ｄｅｎａｃｏｌ−５１２、または関連の化合物）が挙げられる。光酸化もまた、生物学的組織を固定するために使用されている。
【０００６】
利用可能な種々の化学固定剤の中で、グルタルアルデヒドが、多くの市販のバイオプロテーゼ製品（ブタバイオプロテーゼ心臓弁（すなわち、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭステント付ブタバイオプロテーゼ；Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．９２６１４）、ウシ心膜心臓弁プロテーゼ（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭ  Ｐｅｒｉｍｏｕｎｔ  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．９２６１４）、および無ステントブタ動脈プロテーゼ（例えば、ＥｄｗａｒｄｓＴＭ  ＰＲＩＭＡ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．９２６１４）を含む）のための固定剤として使用される。
【０００７】
ブタの心臓弁および心膜生物学的置換心臓弁の両方を含む、バイオプロテーゼ組織移植の主な不良原因は、組織の石灰化である。例えば、石灰化は、移植の１０年以内に、心臓弁バイオプロテーゼの５０％より多くを不良にする（Ｓｃｈｏｅｎら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １：２９−５２（１９９２））。さらに、石灰化は、成人よりも子供においてより速く進行する（Ｉｄ）。外移植されたバイオプロテーゼの形態学的試験は、石灰化が、しばしば、コラーゲン原繊維、オルガネラ（例えば、ミトコンドリアおよび失活細胞（リーフレットの結合組織細胞、ならびに筋肉棚およびブタ大動脈弁の動脈壁の細胞を含む）の核）、血栓形成、および植生に関連していることを示す（Ｓｃｈｏｅｎ  ＦＪら、Ｊ  Ｃａｒｄ  Ｓｕｒｇ  ９（補遺）：２２２−２２７（１９９４）；Ｓｃｈｏｅｎ  ＦＪら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４７：４３９−４６５（１９９９）；Ｆｅｒｒａｎｓ  ＹＪら、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  １８：５８６−５９５（１９８７））。石灰化プロセス自体は広く研究されているが、組織の石灰化のメカニズムは不明なままである。
【０００８】
石灰化は、バイオプロテーゼの望ましくない剛直化または分解を生じ得る。２つのタイプの石灰化（内因性および外因性）が、固定されたコラーゲン性バイオプロテーゼにおいて生じることが知られている。内因性石灰化は、固定されたバイオプロテーゼ組織（コラーゲンマトリクスおよび残留細胞を含む）におけるカルシウムイオンおよびリン酸イオンの沈殿によって特徴付けられる。外因性石灰化は、このバイオプロテーゼに付着する血栓（接着細胞（例えば、血小板）を含む）におけるカルシウムイオンおよびリン酸イオンの沈殿、ならびにこのバイオプロテーゼ上のリン酸カルシウム含有表面プラークの出現によって特徴付けられる。
【０００９】
固定されたバイオプロテーゼが石灰化を受ける速度に影響を与える要因は、十分には解明されていない。しかし、石灰化の速度に影響を与えると考えられている要因としては、以下が挙げられる：
ａ）患者の年齢；
ｂ）代謝障害の存在（すなわち、
ｃ）高カルシウム血症、糖尿病など）；
ｄ）食餌要因；
ｅ）感染
ｆ）非経口的カルシウム投与；
ｇ）脱水；
ｈ）歪曲／力学的要因；
ｉ）外科的移植直後の間の不適切な凝固治療；および
ｊ）宿主組織応答。
【００１０】
固定された生物学的組織に付着する血小板の傾向に影響を与えると考えられる要因としては、以下が挙げられる：
ａ）組織損傷；
ｂ）食餌；
ｃ）組織の表面特性（露出されたコラーゲンの性質（例えば、Ｉ型、ＩＶ型など）を含む）；
ｄ）代謝変化；
ｅ）凝固；
ｆ）血行力学；
ｇ）炎症；および
ｈ）感染。
【００１１】
現在までに、グルタルアルデヒドで固定されたバイオプロテーゼのインサイチュの石灰化を減少させるための種々の技術が報告されている。これらの石灰化減少技術には、Ｎａｓｈｅｆら、米国特許第４，８８５，００５号；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、米国特許第４，６４８，８８１号；Ｇｉｒａｒｄｏｔら、米国特許第４，９７６，７３３号；Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、米国特許第５，００２，２５６６号；Ｐｏｌｌｏｃｋら、ＥＰ１０３９４７Ａ２；Ｎａｓｈｅｆら、米国特許第４，８８５，００５号；Ｃｕｎａｎａｎら、米国特許第６，２１４，０５４号、およびＣｕｎａｎａｎら、米国特許出番号第０９／６９３，１８６号（これらは、全ての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、望ましくない剛直化または分解に対して耐性のバイオプロテーゼを製造するための方法が、当該分野で必要とされ続けている。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、石灰化を軽減し、石灰化を減少させ、そして／または移植の際に生物学的細胞中のリン脂質含有量を減少させることによって、移植のために優れた生物学的材料を生成する方法を提供する。この手順は、バイオプロテーゼデバイスにおける使用に非常に適切な生物学的組織を提供する。本発明は、本発明の方法に従って調製される優れた生物学的材料、およびこのような優れた生物学的材料を含む移植可能プロテーゼをさらに提供する。
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、生物学的材料を、架橋剤および界面活性剤を含む調製物と接触させる工程を包含する。この調製物は、変性剤を含まない。
【００１５】
第２の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、生物学的材料を、界面活性剤および架橋剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触させる工程（本明細書中以下では、ＳＣＬ工程と呼ぶ）；およびこの生物学的材料と、界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物を接触させる工程（本明細書中以下では、ＳＣＬＤ工程と呼ぶ）を包含する。
【００１６】
第３の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、特定の順序で実施される４つの別個の工程を包含する。工程１において、この生物学的材料は、架橋剤を含む調製物と、変性剤および界面活性剤の非存在下で接触される。工程１の後、工程２が実施され、この工程２は、この生物学的材料と、架橋剤および界面活性剤を含む調製物を、変性剤の非存在下で接触させる工程を包含する。工程２の後、工程３が実施され、この工程３は、この生物学的材料と、架橋剤、変性剤および界面活性剤を含む調製物を接触させる工程を包含する。工程３の後、この生物学的材料は、最終液体滅菌溶液と接触される。
【００１７】
第４の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、生物学的材料を、架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触させる工程を包含する。生物学的材料が架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触されないことを除いて生物学的材料を処理する同一の方法と比較して、この方法は、宿主生物に移植された際、生物学的材料の石灰化を減少させる。
【００１８】
第５の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、生物学的材料と、架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触させる工程を包含する。生物学的材料が架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触されないことを除いて生物学的材料を処理する同一の方法と比較して、この方法は、宿主生物に移植された際、生物学的材料のリン脂質含有量を減少させる。
【００１９】
第６の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は、生物学的材料を、架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触させる工程を包含する。生物学的材料が架橋剤および界面活性剤を有する調製物と、変性剤の非存在下で接触されないことを除いて生物学的材料を処理する同一の方法と比較して、この方法は、宿主生物に移植された際、生物学的材料のカルシウム含有量を減少させる。
【００２０】
第７の実施形態において、本発明は、生物学的材料を処理する方法によって生成された、石灰化に対して耐性の生物学的材料を提供し、この方法は、生物学的材料を、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と、変性剤の非存在下で接触させる工程；およびこの生物学的材料を、界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と接触させる工程を包含する。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００２２】
（石灰化を軽減または減少する本発明の方法の詳細な説明）
１つの局面において、本発明は、生物学的材料を処理する優れた方法を提供し、ここでこの処理は、生物学的材料が宿主生物に移植された場合、石灰化を軽減する。石灰化を軽減するための処理方法はまた、本明細書中で、生物学的組織の石灰化を軽減する方法、と呼ばれる。本発明の方法は、ＳＣＬ工程が実施されないことを除いて同一である方法と比較して、生物学的材料の石灰化を軽減する。本発明の方法の個々の工程は、以下で詳細に記載される。
【００２３】
石灰化の軽減とは、石灰化の発生の減少をいう。石灰化の発生とは、移植された生物学的材料の集団のメンバーの総数と比較したときの、石灰化が生じるたときのその生物学的集団のメンバーの数をいう。石灰化の排除とは、石灰化の軽減を意味し、移植された生物学的材料の集団のメンバーが石灰化されない。
【００２４】
例示的な石灰化は、宿主生物に移植された生物学的組織の剛直化または分解を引き起こすのに十分なカルシウムの蓄積である。種々の技術が、移植後の生物学的材料における石灰化を測定する際に有用である。代表的なアッセイにおいて、石灰化は、ある期間の間、宿主生物に生物学的材料を移植し、この移植された生物学的材料を取り出し、そしてこの生物学的材料におけるカルシウムレベルを測定することによって測定される。この生物学的材料は、例えば、哺乳動物宿主生物に、１０日〜１００日間、皮下または筋肉内に移植され得る。この哺乳動物宿主生物は、任意の適切な種（例えば、ラットまたはウサギ）であり得る。
【００２５】
別の例示的な石灰化は、生物学的材料を哺乳動物宿主細胞に３０日〜９０日間移植した後の、カルシウム蓄積の測定である。次いで、この生物学的材料は取り出され、そしてカルシウム含有量について分析される。驚くべきことに、この例において、乾燥材料１ｍｇあたり５μｇより下のカルシウムレベル（本明細書中以下で、μｇ  Ｃａ／ｍｇと呼ぶ）を含む生物学的材料は、５μｇ  Ｃａ／ｍｇより多いカルシウムを含む生物学的材料と比較して、バイオプロテーゼ組織として使用された場合、優れた機械的特性、延長された寿命および持続性、および破損に対する増加した抵抗性を有する。逆に、５μｇ  Ｃａ／ｍｇより上のカルシウムレベルを含む生物学的材料は、バイオプロテーゼ組織として使用された場合、劣った機械的特性、減少した持続性、および増加した破損率を有する。従って、この例において、５μｇ  Ｃａ／ｍｇ組織より上のカルシウム含有量を含むバイオプロテーゼ組織および生物学的組織は、石灰化しているとみなされ、一方、５μｇ  Ｃａ／ｍｇ組織より下のカルシウム含有量を含むバイオプロテーゼまたは生物学的材料は、石灰化していないとみなされる。従って、この例において、石灰化の軽減は、哺乳動物宿主生物に、約３０日〜９０日間移植された場合、５μｇ  Ｃａ／ｍｇ乾燥材料より大きいカルシウムレベルを有する生物学的材料の発生における減少として定義される。
【００２６】
別の例示的な実施形態において、石灰化は、生物学的材料をラットに、約９０日間皮下移植することによって測定される。５μｇ  Ｃａ／ｍｇ組織より上のカルシウムを含有するバイオプロテーゼまたは生物学的組織は、石灰化しているとみなされ、一方、５μｇ  Ｃａ／ｍｇ組織より下のカルシウムを含有するバイオプロテーゼまたは生物学的材料は、石灰化していないとみなされる。従って、この例において、石灰化の軽減は、ラットに約９０日間皮下移植した場合、５μｇ  Ｃａ／ｍｇ材料より上のカルシウムレベルを有する生物学的材料の発生における減少として定義される。
【００２７】
別の例示的な実施形態において、石灰化の軽減は、石灰化の排除を生じる。用語「石灰化の排除（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「石灰化を排除すること（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本明細書中で使用される場合、移植された生物学的材料の集団のメンバーが石灰化されない、石灰化の軽減を意味する。
【００２８】
別の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、ここでこの処理は、この生物学的材料が宿主生物に移植された場合、カルシウム含有量を減少させる。カルシウム含有量を減少させるためのこの処理方法はまた、本明細書中で、生物学的組織のカルシウム含有量を減少させる方法とも呼ばれる。本発明の方法は、ＳＣＬ工程が実施されないこと以外は同一の方法と比較して、生物学的材料のカルシウム含有量を減少させる。本発明の方法の個々の工程は、以下に詳細に記載される。
【００２９】
（リン脂質含有量の低減方法）
別の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、ここで、この処理は、生物学的材料のリン脂質含有量を低減させる。リン脂質含有量を低減させる処理方法はまた、生物学的組織のリン脂質含有量を低減させる方法として、本明細書中で参照されている。本発明の方法は、ＳＣＬ工程が実施されないことを除いて同一である方法と対比して、生物学的材料のリン脂質含有量を低減させる。本発明の方法の個々の工程は、以下に詳細に記載される。
【００３０】
生物学的材料におけるリン脂質含有量を低減させる種々の方法は、本発明において有用である。例えば、生物学的材料のリン脂質含有量は、リン脂質を溶解する溶媒混合物を用いて組織を抽出することによって測定され得る。測定されるリン脂質の例として、組織の細胞特性に起因して組織に存在するリン脂質が挙げられる。
【００３１】
生物学的材料のリン脂質含有量は、生物学的材料の移植から生じる所望の特性または所望でない特性に関連し得る。例えば、生物学的材料のリン脂質含有量は、測定され得、次いでこの生物学的材料は宿主生物に移植され得る。次いで、生物学的材料の特性が分析され得る。例示的な実施形態において、リン脂質含有量は測定され、この生物学的材料は、続いて哺乳動物宿主生物に３０〜９０日間かけて移植される。驚くべきことに、この実施例において、乾燥物質１ｍｇあたり１μｇ以下（本明細書中、これ以降、μｇＰＬ／ｍｇという）のリン脂質を含むリン脂質含有量を含む生物学的材料は、１μｇ  ＰＬ／ｍｇより多く含む生物学的材料と比べてバイオプロテーゼ組織として使用される場合、優れた機械的特性、促進された寿命および耐久性、ならびに破壊に対して増大した耐性を有する。逆に、上記の１μｇ  ＰＬ／ｍｇのリン脂質含有量を含む生物学的材料は、バイオプロテーゼ組織として使用された場合、粗悪な機械特性、低下した耐久性、および増加した破壊速度を有する。
【００３２】
別の例示的な実施形態において、リン脂質含有量は測定され、そして生物学的材料は、次に約９０日間かけてラットに移植される。この実施例において、所望の生物学的材料は、１μｇ  ＰＬ／ｍｇ未満を含み、そして好ましくはほとんど含んでいない。
【００３３】
別の例示的な実施形態において、０．４μｇ  ＰＬ／ｍｇ未満を含む生物学的材料は、約９０日間のラットへの移植後、所望の特性を示す。
【００３４】
例示的なアッセイにおいて、リン脂質含有量は、サンプル内の選択されたリン脂質を定量することによって測定される。種々のリン脂質は、定量化のために選択され得、これらとしては、酸性リン脂質、塩基性リン脂質、および中性リン脂質が挙げられる。別の例示的な実施形態において、選択されたリン脂質は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸である。別の例示的な実施形態において、選択されたリン脂質は、ガングリオトリアオシルセラミド（Ｇｇ４）を含む。
【００３５】
従って、別の局面において、本発明は、生体組織を処理する方法を提供し、ここで、この処理は、宿主生物に移植された場合、生体組織のリン脂質含有量を低減させる。本発明の方法は、ＳＣＬ工程を実施しないことを除いて同一である方法と対比して、生物学的材料のリン脂質を低減させる。本発明の方法の個々の工程は、以下に詳細に記載される。
【００３６】
（発明の方法）
本発明の方法は、移植した生物学的材料における石灰化を緩和し、石灰化を低減させ、そして／またはリン脂質レベルを低減させるための優れた方法を提供する。本発明の方法は、変性することなく、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と、生物学的材料とを接触させる工程（本明細書これ以降、ＳＣＬ工程という）を包含する。さらなる実施形態において、本発明の方法は、界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製剤と、生物学的材料とを接触させる工程（本明細書これ以降、ＳＣＬＤ工程という）を包含する。
【００３７】
例示的な実施形態において、本発明の方法は、さらに、先に考察したＳＣＬおよびＳＣＬＤ工程の完了後、生物学的材料と最終液状滅菌溶液とを接触させる工程を包含する。
【００３８】
別の例示的な実施形態において、本発明の方法は、さらに、ＳＣＬ工程およびＳＣＬＤ工程を実施する前に、変性剤の入っていない架橋剤を含む固定化溶液と、生物学的組織とを接触させる工程を包含する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、生物学的材料を処理する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）最初に、架橋剤を含む調製剤と生物学的材料とを接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の後に、界面活性剤および架橋剤を含む調製物と、生物学的材料とを接触させる工程（ＳＣＬ工程）；
（ｃ）工程（ｂ）の後に、界面活性剤、架橋剤および変性剤を含む調製物と、この生物学的材料とを接触させる工程（ＳＣＬＤ工程）；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）の後に、最終液状滅菌溶液とこの生物学的材料とを接触させる工程。
【００４０】
これらの工程および他の工程の例示的な実施例は、以下に詳細に議論される。
【００４１】
（界面活性剤）
本発明の方法は、界面活性剤（単独、または他の化学薬品と組み合わせて）と、生物学的材料とを接触させる工程を包含する。処理は、単一工程として実施され得る。あるいは、この処理は、一連の連続工程として実施され得る。各連続工程の終わりに、界面活性剤は、好ましくは除去され、新しい界面活性剤のフラクションが添加され得る。本発明における使用のための界面活性剤は、任意の界面活性剤（実質的に純粋なものまたは添加物を含有するもののいずれも）を含む。例示的な界面活性剤は、水の表面張力を低下させ得る界面活性剤である。界面活性剤の例示的な特徴の定義は、ＫＩＲＫ−ＯＴＨＭＥＲ’Ｓ「ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ」，第３版、Ｖｏｌ．２２，ｐｐ３３２−４３２に見出される（これは、参考として本明細書中に援用される）。
【００４２】
他の例示的な界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、および両性の界面活性剤が挙げられる。例示的な実施形態において、本発明の方法は、界面活性剤として非イオン性界面活性剤を使用する。非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々のエトキシレート、カルボン酸エステル、グリコールエステル、ポリオキシエチレンエステル、無水ソルビトールエステル、エトキシ化無水ソルビトールエステル、脂肪酸のグリセロールエステル、カルボン酸アミド、ジエタノールアミン濃縮液など。例示的な非イオン性界面活性剤としてはまた、エトキシ化された天然の脂肪、油、およびワックスが挙げられる。当業者は、多くの他の界面活性剤が、本発明の方法における使用に適することを理解する。さらなる界面活性剤の列挙は、米国特許第６，２１４，０５４号に見出される（これは、全て目的のために、その全体において参考として援用される）。
【００４３】
エトキシ化された天然の脂肪、油、およびワックスは、必要に応じて、以下の群（以下が挙げられるが、これらに限定されない）に由来する：ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびパルミチン酸（Ａｒｍｏｔａｎ，Ｅｍｓｏｒｂ，Ｇｌｙｃｏｓｐｅｒｓｅ，Ｈｏｄａｇ，およびＴｗｅｅｎのような商品名を有する）。
【００４４】
別の例示的な実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）である。Ｔｗｅｅｎ８０のような界面活性剤は、以下に挙げる生化学的用途において広範に使用される：タンパク質の溶解、培養細胞からの核酸の単離、結核菌の増殖、ならびに医薬および食品における物質の乳化および分散。
【００４５】
例示的な実施形態において、この組織は、約０．１重量％〜約５０重量％の界面活性剤を含有する調製物または溶液で処理される。別の例示的な実施形態において、この組織は、約０．１％〜約１０％の界面活性剤を含有する調製物または溶液で処理される。別の例示的な実施形態において、この組織は、約０．６％より多く、約５０％未満の界面活性剤を含有する調製物または溶液で処理される。別の例示的な実施形態において、この組織は、約１．７％〜約２５％の界面活性剤を含有する調製物または溶液で処理される。別の例示的な実施形態において、この調製物または溶液は、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、または２．９％の界面活性剤を含む。別の例示的な実施形態において、この調製物または溶液は、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の界面活性剤を含む。
【００４６】
（架橋剤）
本発明の方法は、架橋剤（単独か、または他の化学薬品と組み合わせて）と、生物学的材料とを接触させる工程を包含する。この処理は、単一工程として実施され得る。あるいは、この処理は、一連の連続工程として実施され得る。各連続工程の終わりに、架橋剤は、好ましくは除去され、新しい架橋剤のフラクションが添加される。例示的な架橋剤としては、共有結合の形成によって生物学的材料の構造を安定化し得る化合物が挙げられる。
【００４７】
例示的な架橋剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドスターチ、パラホルムアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリオキサールアセトアルデヒド、アクロレイン）、ジイソシアネート（例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート）、カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド）、ポリエポキシ化合物（例えば、Ｄｅｎａｃｏｌ−８１０，−５１２）、二官能性マレイミド化合物（例えば、１，４−ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン，Ｎ−（ｐ−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）、二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物（例えば、ジスクシンイミジルグルタレート、３，３’−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート））、二官能性イミドエステル化合物（例えば、ジメチルスベリンイミデート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）、二官能性ピリジルチオ化合物（例えば、１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン）および光活性化型架橋剤（例えば、アジド、フェニルアジド）。
【００４８】
例示的な実施形態において、架橋剤は、アルデヒド（モノアルデヒドおよびポリアルデヒドの両方を含む）である。本発明の実施において使用されるアルデヒドは、全てのアルデヒド（実質的に純粋ものまたは添加物を含有するもののいずれも）を含む。例示的なアルデヒドとしては、以下の１つ以上の化合物が挙げられる：アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、プロピオンアルデヒド、α−メチルプロピオンアルデヒド、２−メチルブチルアルデヒド、シクロペンタンカルボアルデヒド、ベンズアルデヒド、カプロアルデヒド、カルボアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドなど。
【００４９】
当業者は、異なる架橋剤が本発明の異なる工程において使用され得ることを理解する。本発明の各工程で使用される、受容可能な架橋剤の決定は、本明細書の教示の指針により、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００５０】
例示的な実施形態において、この組織は、必要とされる結果を提供する、実質的に任意の量のアルデヒドで処理される。特定の適用にとって必要なアルデヒドの正確な量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、生物組織は、１回以上、アルデヒドと接触され、そしてこの生物学的材料は、回収され、分析される。
【００５１】
例示的な実施形態において、この架橋剤はホルムアルデヒドである。種々のホルムアルデヒド濃縮物が本発明において有用である。例示的な実施形態において、組織は、約０．１重量％〜約５０重量％のホルムアルデヒドを含有するホルムアルデヒド溶液で処理される。別の実施形態において、この組織は、約１％〜約１０％のホルムアルデヒドを含有するホルムアルデヒド溶液で処理される。別の実施形態において、この組織は、約４％のホルムアルデヒドを含有するホルムアルデヒド溶液で処理される。
【００５２】
別の例示的な実施形態において、架橋剤は、グルタルアルデヒドである。種々の濃度のグルタルアルデヒドが、本発明において有用である。例示的な実施形態において、この組織は、約０．１％〜約５０％のグルタルアルデヒドを含有するグルタルアルデヒド溶液で処理される。別の例示的な実施形態において、この組織は、約０．２％〜約３％のグルタルアルデヒドを含有するグルタルアルデヒド溶液で処理される。
【００５３】
本発明の特定の好ましい実施形態は、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドの使用によって哺乳動物組織から石灰化を緩和することによって説明されるが、これらの２つのアルデヒドの使用に焦点を絞っているのは、説明を簡単にするためであり、本発明の範囲を規定または限定するように解釈されるべきではない。
【００５４】
当業者は、他の薬剤が、本発明の方法における使用にとって適切であることを理解する。本発明における使用のための例示的な薬剤は、架橋剤である。架橋剤の列挙は、米国特許第６，２１４，０５４号に見出される（これは、その全体において参考として援用される）。
【００５５】
（生物学的材料）
例示的な生物学的材料としては、生物学的起源の材料から少なくとも部分的に構成される材料が挙げられる。ヒトまたは動物由来の生物学的材料に例としては、組織（例えば、脳、筋肉（心臓を含む）、肝臓、付属器、膵臓、胃腸管器官、皮膚、骨、軟骨、腱、靭帯、結合組織、ならびにリンパ組織（例えば、胸腺、脾臓、扁桃、リンパ節など））が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、生物学的材料は、生物学的流体であり得る。用語、生物学的流体は、脳脊髄液、血液、血清、血漿、乳汁、尿、唾液、涙、粘液分泌物、汗、精液、およびこれらの成分を含む体液を包含するが、これらに限定されない。生物学的材料としてはまた、組換えタンパク質の産生において使用される培養流体（または培養培地）、あるいは移植前に懸濁液中に細胞を含む培養流体が挙げられ得る。別の例示的な実施形態において、生物学的材料としては、ヒトまたは動物の器官または組織から作製される生成物（血清タンパク（例えば、アルブミンおよび免疫グロブリン）、ホルモン、食物および加工食品、栄養補充剤、骨粉、動物飼料、細胞外マトリックスタンパク質、ゼラチン、および製造または最終製品において使用される他のヒトまたは動物の副生成物が挙げられる）が挙げられる。生物学的材料はまた、感染に対して感受性のヒトまたは動物、あるいは感染を保有または伝達し得るヒトまたは動物において見出され得る、任意の材料をいい得る。
【００５６】
別の例示的な実施形態において、生物学的材料は、バイオプロテーゼ組織である。バイオプロテーゼ組織は、身体内への移植のためのバイオプロテーゼ構造体に組み込まれ得る。バイオプロテーゼ組織は、全体が、生物学的起源の材料からなってもよく、非生物学的起源の材料をさらに含んでもよい。当業者は、バイオプロテーゼ組織をバイオプロテーゼに組み込むために、バイオプロテーゼの種々の組み立て方法が使用され得ることを容易に認識する。さらなる好ましい実施形態において、バイオプロテーゼ組織は、生物学的組織である。
【００５７】
生物学的組織は、種々の組織型（生物学的構成要素を有するバイオプロテーゼを調製する際に有用な、実質的に任意の哺乳動物組織が挙げられる）から選択され得る。例えば、１つの実施形態において、生物学的組織は、器官由来である。別の実施形態において、生物学的組織は、神経組織、腺組織（例えば、リンパ組織）、呼吸組織、消化組織、尿路組織、感覚組織（例えば、角膜、水晶体など）、および生殖組織から選択される。しかし、生物学的組織が生物学的流体である、関連する実施形態において、抽出溶媒の混和を可能にするための、生物学的流体のイオン強度を希釈しない限り、流体の追加は、おそらく必要ではない。
【００５８】
例示的な実施形態において、生物学的組織は、筋肉組織、脂肪組織、上皮組織および内皮組織から選択される。別の例示的な実施形態において、生物学的組織は、心筋組織および脈管組織から選択される。関連する実施形態において、生物学的組織は、心臓弁、静脈弁、血管、大動脈、動脈、尿管、腱、硬膜、皮膚、心膜、腸管（例えば、腸壁）、または骨膜が挙げられるが、これらに限定されない群から選択される。別の例示的な実施形態において、生物学的組織は、骨、軟骨（例えば、半月板）、腱、靭帯、または他の任意の結合組織由来である。別の例示的な実施形態において、生物学的組織は、ブタ大動脈組織またはウシ心膜組織である。
【００５９】
この目的で使用される生物学的材料の源が、組織型に関して変化し得るように、この源はまた、種の型（自己組織、同種組織、または異種組織）に関して変化し得る。職人は、本発明の方法が、１つ以上の型の組織または材料を含むバイオプロテーゼデバイスと共に使用され得ることを理解する。
【００６０】
生物学的材料が固体の組織または生成物である、例示的な実施形態において、この材料は、本発明の方法における使用に適切になるように、最初に、水溶液に懸濁され得る。例えば、脳組織は、スクロース溶液（例えば、０．３２Ｍスクロース）中に、重量対体積で１０％で懸濁され得る。他の低張溶液または等張溶液としては、５％ブドウ糖、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス（ｔｒｉ）緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、または上記緩衝液のいずれかが挙げられる。水溶液中の生物学的材料はまた、均質化され得るか、粉砕され得るか、または他の様式で破壊されて、処理剤と生物学的材料との間の接触を最大にし得る。
【００６１】
別の例示的な実施形態において、架橋剤が、生物学的組織の構造的一体性を維持するために、使用される。構造的一体性とは、組織が、その必要な生物学的機能を実施する能力として定義され得る。職人は、組織がその必要な機能を実施するために必要とされる構造的一体性の程度が、異なる型の組織の間で変化し得ることを理解する。さらに、組織が使用される特定の適用は、異なるレベルの構造的一体性を必要とし得る。
【００６２】
（ＳＣＬ工程）
本発明の方法は、生物学的材料を、界面活性剤および架橋剤を含有する、変性剤を含まない調製物（本明細書中以下で、ＳＣＬ調製物と称される）と接触させる工程を包含する。本発明において有用な、生物学的材料、架橋材、および界面活性剤は、上で議論されており、そして同様に、ＳＣＬ調製物において本明細書中で有用である。
【００６３】
例示的な実施形態において、１より多いＳＣＬ工程が実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、１〜５回実施される。別の例示的な実施形態において、生物学的材料は、ＳＣＬ調製物と、１回のみ接触される。
【００６４】
種々の界面活性剤濃度が、ＳＣＬ調製物において有用である。例示的な実施形態において、組織は、約０．１重量％〜約５０重量％の界面活性剤を含有するＳＣＬ調製物で処理される。別の例示的な実施形態において、組織は、約０．１％〜約１０％の界面活性剤を含有するＳＣＬ調製物で処理される。別の例示的な実施形態において、組織は、０．６％より多く５０％未満の界面活性剤を含有するＳＣＬ調製物で処理される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物は、約１．７％〜約２５％の界面活性剤を含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物は、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、または２．９％の界面活性剤を含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物は、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％の界面活性剤を含有する。
【００６５】
上で議論されたように、種々の界面活性剤が、本発明の方法（ＳＣＬ調製物を含む）において有用である。例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物において使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。別の例示的な実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０である。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物は、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、または２．９％のＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ調製物は、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％のＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。
【００６６】
当業者は、異なる界面活性剤が、本発明の方法のＳＣＬ工程において使用され得ることを認識する。使用されるべき認容可能な界面活性剤および界面活性剤レベルを決定することは、本明細書中の教示の指針を与えられると、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【００６７】
例示的な実施形態において、生物学的組織は、架橋剤としてアルデヒドを含有するＳＣＬ調製物で処理される。関連する実施形態において、アルデヒドは、グルタルアルデヒドである。種々のグルタルアルデヒド濃度が、ＳＣＬ調製物において使用され得る。例示的な実施形態において、調製物は、約０．１重量％〜約５０重量％のグルタルアルデヒドを含有する。別の例示的な実施形態において、組織は、約０．２％〜約３％のグルタルアルデヒドを含有するＳＣＬ調製物で処理される。
【００６８】
代表的に、ＳＣＬ工程は、最適な石灰化減少、石灰化軽減、および／またはリン脂質含有量減少を提供するように選択される、任意の適切な温度で実施される。例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、およそ単一の温度で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、１つより多い温度で実施される。
【００６９】
別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、およそ室温で実施される。別の例示的な実施形態において、熱は、ＳＣＬ調製物に付与される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、約２５℃と５５℃との間の温度で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、約３５℃と５５℃との間で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、約３５℃と４５℃との間で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、約３５℃と４０℃との間で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で実施される。
【００７０】
代表的に、ＳＣＬ工程は、最適な石灰化軽減、石灰化減少またはリン脂質含有量減少を提供するように選択された時間にわたって、実施される。例示的な実施形態において、生物学的材料は、ＳＣＬ調製物と、約１日間〜約２０日間接触される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、５日間〜約１５日間続く。
【００７１】
別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、少なくとも約１２日間続く。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、少なくとも約１２日間続き、そしてＳＣＬ調製物は、少なくとも約１．７％の界面活性剤を含有する。
【００７２】
別の例示的な実施形態において、ＳＣＬ工程は、最適な石灰化軽減またはリン脂質含有量減少を提供するように選択されたｐＨで実施される。例示的な実施形態において、ＳＣＬ溶液のｐＨは、約６と約８との間である。別の例示的な実施形態において、ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９に維持される。
【００７３】
ＳＣＬ工程は、単一の工程として実施され得る。あるいは、ＳＣＬ工程は、一連の連続的な工程として実施され得る。各連続的な工程の終了時に、ＳＣＬ調製物は、好ましくは、組織から除去され、その後、この組織が、ＳＣＬ調製物の新たな画分と接触される。
【００７４】
（ＳＣＬＤ工程）
本発明の方法は、生物学的材料を、界面活性剤、架橋剤、および変性剤を含有する調製物（本明細書中以下で、ＳＣＬＤ調製物と称される）と接触させる工程を包含する。本発明において有用な生物学的材料、架橋剤、および界面活性剤は、上で議論されており、そして同様に、ＳＣＬＤ調製物において、本明細書中で有用である。
【００７５】
ＳＣＬＤ工程は、本発明の方法の異なる段階において実施され得る。例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、ＳＣＬ工程の後に実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、ＳＣＬ工程の前に実施される。
【００７６】
ＳＣＬＤ工程はまた、生物負荷減少工程と称され得る。例示的な実施形態において、１回より多くのＳＣＬＤ工程が実施される。別の例示的な実施形態において、２回のＳＣＬＤ工程が実施される。２回のＳＣＬＤ工程が実施される、例示的な実施形態において、１回目のＳＣＬＤ工程は、初期生物負荷減少工程（ｉｎｉｔｉａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ：ｉＢＲｅＰ）と称され得、そして２回目のＳＣＬＤ工程は、最終生物負荷減少工程（ｆｉｎａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ：ｆＢＲｅＰ）と称され得る。
【００７７】
種々の変性剤が、本発明のＳＣＬＤ工程において有用である。例示的な実施形態において、変性剤は、生物学的材料におけるタンパク質の、一次構造以外の高次構造の、可逆的または不可逆的な損失を生じる。別の例示的な実施形態において、変性剤は、感染性物質または化学薬剤を除去する際に有用な、プロトン性溶媒である。本発明の実施において役立つプロトン性溶媒としては、水、アルコール、カルボン酸などが挙げられる。別の例示的な実施形態において、変性剤は、アルコール、またはアルコールを含む他の溶媒である。生物学的材料は、需要の多い結果を提供する、実質的に任意の量のアルコールで処理される。
【００７８】
特定の適用のために必要とされるアルコールの正確な量の決定は、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、生物学的組織は、１回以上のＳＣＬＤ工程に供され、そして生物学的材料が回収される。このＳＣＬＤ工程によって除去される感染性材料または化学薬剤の量が、決定される。アルコールが、この組織から感染性薬剤または化学薬剤を除去することを止め、そしてエンドポイントに達すると、これは、特定の薬剤を組織から除去するために必要とされるアルコールの量を示す。アルコールを利用する例示的な実施形態において、組織は、約１％〜約１００％のアルコール、より好ましくは、約１０％〜約８０％のアルコールを含有する水性アルコール溶液で処理される。
【００７９】
例示的なアルコールとしては、メタノール、エチルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコール、デシルアルコール、長鎖アルコール（例えば、１，２−オクタンジオール）などからなる群の、一種以上の化合物が挙げられる。別の例示的な実施形態において、本発明の方法は、エタノールを使用する。別の例示的な実施形態において、アルコールは、イソプロピルアルコールである。
【００８０】
上で議論されたように、種々の架橋剤が、本発明の方法（ＳＣＬＤ調製物を含む）において有用である。例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、架橋剤としてアルデヒドを含有する。さらなる例示的な実施形態において、ホルムアルデヒドが架橋剤である。種々のホルムアルデヒド濃度が、ＳＣＬＤ調製物において有用である。例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、約０．５％〜約１０％のホルムアルデヒドを含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、約４％のホルムアルデヒドを含有する。
【００８１】
ＳＣＬＤ調製物は、任意の適切な界面活性剤を使用し得る。例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物において使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、界面活性剤としてＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、約０．５％〜約５％のＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ調製物は、約２．１％のＴｗｅｅｎ  ８０を含有する。
【００８２】
例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、生物学的材料の最適な石灰化軽減、石灰化減少およびまたはリン脂質含有量の減少を提供するように選択された温度で実施される。例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、およそ単一の温度で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、１つより多くの温度で実施される。
【００８３】
別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、およそ室温で実施される。別の例示的な実施形態において、熱が、ＳＣＬＤ調製物に付与される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、約３０℃と５５℃との間の温度で実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、約３０℃と約４０℃との間で実施される。
【００８４】
別の例示的な実施形態において、２回のＳＣＬＤ工程が実施される：ｉＢＲｅＰ工程およびｆＢＲｅＰ工程。別の例示的な実施形態において、ｉＢＲｅＰ工程は、およそ室温で実施され、そしてｆＢＲｅＰ工程は、室温より高い温度で実施される。別の例示的な実施形態において、ｆＢＲｅＰ工程は、約３０℃と約３７℃との間で実施される。
【００８５】
別の例示的な実施形態において、各ＳＣＬＤ工程は、生物学的材料の最適な石灰化軽減、石灰化減少および／またはリン脂質含有量を提供するように選択された時間にわたって、実施される。別の例示的な実施形態において、ｉＢＲｅＰ工程は、約１時間〜約４時間実施され、そしてｆＢＲｅＰ工程は、約５時間〜約１５時間実施される。
【００８６】
別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、生物学的材料の最適な石灰化軽減、石灰化減少および／またはリン脂質含有量の減少を提供するように選択されたｐＨにおいて、実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ溶液のｐＨは、約６と約８との間である。別の例示的な実施形態において、ｐＨは、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９に維持される。
【００８７】
ＳＣＬＤ工程は、単一の工程として実施され得る。あるいは、抽出が、一連の連続工程として実施され得る。各連続工程の終了時に、ＳＣＬＤ調製物は、好ましくは除去され、その後、組織を、ＳＣＬＤ調製物の新たな画分と接触させる。
【００８８】
例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、ＳＣＬ工程の前に実施される。別の例示的な実施形態において、ＳＣＬＤ工程は、ＳＣＬ工程の後に実施される。
【００８９】
（生物学的材料と最終液体滅菌溶液との接触）
例示的な実施形態において、本発明の方法は、さらに、生体組織を最終液体滅菌溶液と接触させる工程を包含する。代表的には、生体組織は、前述のＳＣＬ工程およびＳＣＬＤ工程の完了後に、最終液体滅菌溶液と接触させる。
【００９０】
例示的な最終液体滅菌溶液（本明細書中で以後、「ＴＬＳ」溶液と呼ばれる）は、移植前に、生物学的材料を滅菌し得る。本発明において有用な滅菌剤としては、架橋剤、熱、放射線、電子ビーム、紫外線照射およびこれらの組み合わせが挙げられる。例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、熱および架橋剤を含む。ＴＬＳ溶液において有用な例示的な架橋剤は、上に記載される。
【００９１】
例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、約３５℃〜約５０℃の温度まで加熱される。別の例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、約３５℃〜約４０℃の温度まで加熱される。
【００９２】
別の例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、約６と９との間のｐＨに維持される。別の例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、約７．２と７．５との間のｐＨに維持される。
【００９３】
例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、生物学的材料と十分な時間接触され、生物学的材料を滅菌する。当業者は、滅菌に必要とされる時間が、ＴＬＳ溶液のストリンジェンシーに依存することを認識する。例えば、約３７℃まで加熱されている、アルデヒドを含むＴＬＳ溶液は、生物学的材料を滅菌するのに１〜６日を必要とし得るが、５０℃までＴＬＳ溶液を加熱すると、必要とする時間を２５時間まで減少し得る。
【００９４】
別の例示的な実施形態において、ＴＬＳ溶液は、約０．２重量％〜約２．０重量％のグルタルアルデヒドを含む。
【００９５】
別の例示的な実施形態において、最終的な滅菌時間および温度は、３７℃にて１〜６日である。別の特に好ましい実施形態において、最終的な滅菌時間および温度は、５０℃にて１〜２日である。当業者は、他の最終的な滅菌時間および温度が、ＴＬＳ溶液の効率を維持しつつ調整され得ることを認識する。
【００９６】
（生物学的材料と架橋剤との接触）
例示的な実施形態において、本発明の方法は、さらに、生体組織を、変性剤の不在下に架橋剤を含む固定溶液と接触させる工程を包含する。生体組織は、ＳＣＬ工程およびＳＣＬＤ工程の前、ＳＣＬ工程およびＳＣＬＤ工程の後、またはＳＣＬ工程とＳＣＬＤ工程との間に、固定溶液と接触させる。代表的には、生体組織は、ＳＣＬ工程およびＳＣＬＤ工程の前に固定溶液と接触させる。
【００９７】
本発明において有用な固定溶液としては、組織内の結合組織タンパク質の架橋に作用する架橋剤が挙げられる。本発明において有用な架橋剤は、上で議論され、そして、固定溶液において、ここで有用なものと同様である。
【００９８】
例示的な実施形態において、固定溶液は、約０．２重量％〜約２．０重量％の濃度の架橋剤を含む。別の例示的な実施形態において、架橋剤は、グルタルアルデヒドである。別の例示的な実施形態において、固定溶液は、架橋剤として、グルタルアルデヒドを約０．２重量％〜約２．０重量％の濃度で含む。
【００９９】
別の例示的な実施形態において、固定溶液は、約０．５時間〜約１４日間、生物学的材料と接触させる。別の例示的な実施形態において、固定溶液は、約１〜４日間、生物学的材料と接触させる。別の例示的な実施形態において、固定溶液は、約２日間生物学的材料と接触させられる。
【０１００】
別の例示的な実施形態において、固定溶液は、さらに、界面活性剤を含む。有用な界面活性剤および界面活性剤の濃度は、上記され、そして、固定溶液に対して、同様に適用可能である。
【０１０１】
本明細書中で採用されている用語および表現は、制限のためではなく、説明のための用語として使用され、そして、示され説明された特徴、またはそれらの部分の等価物を除外する、このような用語および表現の使用は意図されず、そして、種々の改変が、特許請求の範囲内で可能であることが認識される。さらに、本発明の任意の実施形態の１つ以上のいずれかの特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の任意の他の実施形態の１つ以上のいずれかの特徴と合わせられ得る。例えば、ＳＣＬ工程において記載される界面活性剤および架橋剤、ならびにそれぞれの濃度は、ＳＣＬＤ工程に対しても同様に適用可能である。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１）
実施例１は、心膜組織における石灰化の緩和の方法を記載し、ここでは、心膜組織を、１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．６２５％グルタルアルデヒドを含むＳＣＬ調製物での処理に供する。
【０１０３】
（１．１  方法）
（１．１．１  ポストＴｗｅｅｎプロセスの方法）
ウシ心膜組織リーフレットを、標準的な技術を用いて、化学固定のために調製した。
【０１０４】
ウシ心膜組織リーフレットの調製後、水性溶媒中０．６２５％グルタルアルデヒド溶液への３０分間の浸漬および、その後７日間の隔離により、サンプルを化学固定した。
【０１０５】
残りのリーフレットを、水性溶媒中０．６２５％グルタルアルデヒドおよび１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０で７日間処理した。次いで、リーフレットを、引き続く工程に供するか、または、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植し、外植して、カルシウム分析に供した。ラットに移植したリーフレットを、本明細書中、以後、実施例１において「ポストＴｗｅｅｎプロセス」リーフレットと呼ぶ。
【０１０６】
残りのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットを、室温で２〜２．５時間処理した。
【０１０７】
処理後にリーフレットを７．４のｐＨの水性溶媒中の、０．６２５％のグルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり、１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の３回の連続したサイクル行った。
【０１０８】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。ｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃にて、１０時間±３０分間処理した。
【０１０９】
処理後、リーフレットを、７．４のｐＨにて水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の４回の連続したサイクル行った。
【０１１０】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液体滅菌プロセス（ＴＬＳ）に供した。ＴＬＳ手順において、リーフレットを、７．２〜７．５のｐＨにて、水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液で処理した。溶液の容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液であった。リーフレットを、３５〜４０℃（代表的な最低および最高の、生成物の内部位置にて測定した）にて、２５〜３５時間（Ｃ）、処理した。
【０１１１】
ＴＬＳ手順の後、リーフレットを、９０日間Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下移植し、外植し、そして、カルシウム分析に供し、これを、本明細書中で以後、実施例１において、「Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセス」リーフレットと呼ぶ。
【０１１２】
（１．１．２  完全プロセスコントロール法）
ウシ心膜組織リーフレットを、標準的な技術を用いて、化学固定のために調製した。
【０１１３】
調製後、リーフレットを、水性溶媒中０．６２５％のグルタルアルデヒドで１４日間処理することによって化学固定した。次いで、リーフレットを、引き続く工程に供するか、または、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植して、外植し、そして、カルシウム分析に供した。ラットに移植されたリーフレットは、本明細書中これ以後、実施例１において、以後、「１４日コントロール」リーフレットと呼ぶ。
【０１１４】
残りのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットを、室温にて、２〜２．５時間処理した。
【０１１５】
処理後、リーフレットを、７．４のｐＨにて、水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の３回の連続したサイクル行った。
【０１１６】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。ｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベース滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり、１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットは、３０〜３７℃にて、１０時間±３０分間処理した。
【０１１７】
処理後、リーフレットを、７．４のｐＨにて、水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり、１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の４回の連続したサイクル行った。
【０１１８】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液体滅菌プロセス（ＴＬＳ）に供した。ＴＬＳ手順において、リーフレットを、７．２〜７．５のｐＨにて、水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液で処理した。溶液の容量は、３つのリーフレットあたり、１００ｍｌの溶液であった。リーフレットを、３５〜４０℃（代表的な、最低および最高の、生成物の内部位置にて測定した）にて、２５〜３５時間処理した。
【０１１９】
ＴＬＳ手順の後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植し、外植し、カルシウム分析に供し、本明細書中で以後、実施例１において、「完全プロセスコントロール」リーフレットと呼ぶ。
【０１２０】
（１．１．３  カルシウム分析）
上記に概説する４つの処理のうちの１つを受けた後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植した。リーフレットを取り出し、カルシウム含有量分析のために調製した。
【０１２１】
まず、リーフレットを、凍結乾燥して、重量を測定し、次いで、完全に消化されるまで、１１０℃にて７０％硝酸で処理した。消化されたサンプルを、３，０００ｐｐｍのＫＣｌの最終濃度にした。
【０１２２】
サンプルを、原子吸光分光法（ＡＡＳ）によりカルシウム含有量について分析した。
【０１２３】
（１．２  結果）
図１は、上記の４つの方法を用いる連続処理についての、乾燥リーフレット組織の総μｇ  Ｃａ／ｍｇを示す；１）１４日コントロール；２）完全プロセスコントロール；３）ポストＴｗｅｅｎプロセス；および４）Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセス。図１のデータは、完全プロセスコントロールおよび１４日コントロールと比較して、Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセスおよびポストＴｗｅｅｎプロセスの平均カルシウム含有量の減少を示す。
【０１２４】
図２は、図１の平均カルシウム含有量の減少データの菱形プロット（ｄｉａｍｏｎｄ  ｐｌｏｔ）の代表例を示す。図２の菱形の上端および下端は、平均に対して９５％の信頼区間を形成する。小さな四角は、個々のデータ点である。各菱形の上端および下端付近の短い水平線は、重複した線である。
【０１２５】
表１は、５μｇ  Ｃａ／ｍｇより多い石灰化されている乾燥リーフレット組織を含む、完全プロセスコントロールリーフレット組織サンプルと比較して、ポストＴｗｅｅｎ／ＴＬＳ工程を用いる石灰化の緩和を示す。
【０１２６】
（表１）
【０１２７】
【表１】
2005532877.tif 000002
【０１２８】
表１は、完全プロセスコントロール（第２グループ）からの組織の７．８％が石灰化し、一方で、Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセスグループ（第４グループ）では０％が石灰化したことを示す。
【０１２９】
（実施例２）
実施例２は、ブタ心臓弁組織における石灰化の緩和の方法を記載する。ここで、ブタ心臓弁組織を、１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．６２５％グルタルアルデヒドを含むＳＣＬ調製物を用いる処理に供する。
【０１３０】
（２．１  方法）
（２．１．１  ポストＴｗｅｅｎプロセス法）
ブタ心臓弁組織リーフレットを、標準的技術による化学固定のために調製した。
【０１３１】
ブタ心臓弁組織リーフレットの調製後に、これらのサンプルを、７日間に亘って水性溶媒中の０．６２５％グルタルアルデヒドの溶液に浸漬することによって、化学的に固定した。
【０１３２】
残りのリーフレットを、７日間に亘って水性溶媒中の０．６２５％グルタルアルデヒドおよび１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０で処理した。次いで、リーフレットを、その後の工程に供するか、または９０日間に亘ってＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの皮下に移植し、そして、外植し、そして、カルシウム分析を受けさせた。ラットに移植したこれらのリーフレットを、「ポストＴｗｅｅｎプロセス」リーフレットとして、実施例２において、これ以降、称する。
【０１３３】
次いで、残りのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。このｉＢｒｅＰの手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んでいた。その体積は、３リーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。リーフレットを、室温で、２から２．５時間に亘って処理した。
【０１３４】
処理後、これらのリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドでリンスした。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。このリンス工程を、室温で、各々１０分間の４つの連続したサイクルに亘って実施した。
【０１３５】
ｉＢＲｅＰ手順の後に、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。このｆＢＲｅＰの手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んでいた。その体積は、３リーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃で、１０時間±３０分間に亘って処理した。
【０１３６】
処理後、これらのリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドでリンスした。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。このリンス工程を、室温で、各々１０分間の４つの連続したサイクルに亘って実施した。
【０１３７】
このｆＢＲｅＰの手順の後に、リーフレットを、最終液体滅菌（ＴＬＳ）に供した。このＴＬＳの手順において、リーフレットを、ｐＨ７．２〜７．５にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドでリンスした。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌであった。リーフレットを、２５〜３５時間に亘って、３５〜４０℃（最も高いおよび最も低い代表的な生成物の内部位置のにおいて測定した）で処理（３５〜４０℃の間の加熱および冷却を含む）した。
【０１３８】
ＴＬＳの手順の後に、リーフレットを、その後の工程に供するか、または９０日間に亘ってＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの皮下に移植し、そして、外植し、そして、カルシウム分析を受けさせ、そして、これ以降、これらのリーフレットを、実施例２において、「Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセス」リーフレットと称する。
【０１３９】
（２．１．２．完全プロセスコントロール法）
ブタ心臓弁組織リーフレットを、標準的技術による化学固定のために調製した。
【０１４０】
調製後に、このリーフレットを、１４日間に亘って水性溶媒中の０．６２５％グルタルアルデヒドを用いて処理することによって、化学的に固定した。次いで、リーフレットを、その後の工程に供するか、または９０日間に亘ってＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの皮下に移植し、そして、外植し、そして、カルシウム分析を受けさせた。ラットに移植したこれらのリーフレットを、「１４日コントロール」リーフレットとして、実施例２において、これ以降、称する。
【０１４１】
残りのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。このｉＢＲｅＰの手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んでいた。その体積は、３リーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。リーフレットを、室温で、２から２．５時間に亘って処理した。
【０１４２】
処理後、これらのリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドでリンスした。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。このリンス工程を、室温で、各々１０分間の３つの連続したサイクルに亘って実施した。
【０１４３】
ｉＢＲｅＰ手順の後に、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセスｆＢＲｅＰ）に供した。このｆＢＲｅＰの手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んでいた。その体積は、３リーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃で、１０時間±３０分間に亘って処理した。
【０１４４】
処理後、これらのリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドの溶液で処理した。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ミリリットル（１００ｍｌ）溶液以上であった。このリンス工程を、室温で、各々１０分間の４つの連続したサイクルに亘って実施した。
【０１４５】
このｆＢＲｅＰの手順の後に、リーフレットを、最終液体滅菌（ＴＬＳ）に供した。このＴＬＳの手順において、リーフレットを、ｐＨ７．２〜７．５にて水性溶媒中におけるリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒドで処理した。このリンス溶液の体積は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌ溶液である。リーフレットを、２５〜３５時間に亘って、３７．５±２．５℃（最も高いおよび最も低い代表的な生成物の内部位置のにおいて測定した）で処理した。
【０１４６】
ＴＬＳの手順の後に、リーフレットを、その後の工程に供するか、または９０日間に亘ってＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの皮下に移植し、そして、外植し、そして、カルシウム分析を受けさせ、そして、これ以降、これらのリーフレットを、実施例２において、「完全プロセスコントロール」リーフレットと称する。
【０１４７】
（２．１．３．カルシウム分析）
上記で概要を述べた４つの処置のうちの１つを行った後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔに皮下に９０日間移植した。このリーフレットを取り出し、カルシウム含有量分析用に調製した。
【０１４８】
最初に、リーフレットを凍結乾燥し、そして計量し、次いで、１１０℃にて７０％硝酸を用いて完全に消化するまで処理した。消化したサンプルを、ＫＣｌについて３，０００ｐｐｍの最終濃度にした。
【０１４９】
このサンプルを、原子吸光分析（ＡＡＳ）によってカルシウム含有量について分析した。
【０１５０】
（２．２．結果）
図３は、上記の４つの方法を使用する連続処理についての乾燥リーフレット組織の合計μｇ  Ｃａ／ｍｇを示す：１）１４日間コントロール；２）完全プロセスコントロール；３）ポストＴｗｅｅｎプロセス；および４）Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセス。図３のデータは、完全プロセスコントロールおよび１４日間コントロールに対する、Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセスの平均カルシウム含有量における減少を示す。
【０１５１】
図４は、図３における平均カルシウム含有量の減少データのひし形プロット表示を示す。図２におけるひし形の上部および下部は、平均について９５％信頼区間を形成する。小さい四角は、個々のデータ点である。各々のひし形の上部および下部に近接する短い水平線は、重なり線である。
【０１５２】
表２は、完全プロセスコントロールに対してポストＴｗｅｅｎ／ＴＬＳ工程を使用する石灰化の緩和を示す。５μｇ  Ｃａ／ｍｇの乾燥リーフレット組織を超える組織を含むリーフレット組織サンプルを石灰化する。
（表２）
【０１５３】
【表２】
2005532877.tif 000003
【０１５４】
表２は、完全プロセスコントロール（２グループ）から２０％（７／３５）の組織が石灰化し、一方で、Ｔｗｅｅｎ／ＴＬＳプロセスグループ（４グループ）から８．１％（３／３７）が石灰化したことを示す。
【０１５５】
（実施例３）
実施例３は、心膜組織において石灰化を緩和する方法を記載し、ここで、上記心膜組織を、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．６２５％グルタルアルデヒドを含有するＳＣＬ調製物を用いる処理に供する。
【０１５６】
（３．１．方法）
（３．１．１．コントロールグループ、１４日間グルタルアルデヒド処理したリーフレット）
ウシの心膜組織リーフレットを、標準的な技術を使用して、化学的固定用に調製した。
【０１５７】
ウシの心膜組織リーフレットの調製後、そのサンプルを、水性溶媒中の０．６２５％グルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬することによって、化学的に固定し、その後１４日間隔離した。次いで、このサンプルを、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔに皮下に９０日間移植し、外植し、そしてカルシウム分析に供した。これらのサンプルを、以下実施例３において、「１グループ」リーフレットという。
【０１５８】
（３．１．２．コントロールグループ、完全にプロセス化したリーフレット）
ウシの心膜組織リーフレットを、標準的な技術を使用して、化学的固定用に調製した。
【０１５９】
ウシの心膜組織リーフレットの調製後、そのサンプルを、水性溶媒中の０．６２５％グルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬することによって、化学的に固定化し、その後１４日間隔離した。
【０１６０】
次いで、このリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含有した。容積は、３つのリーフレット当たり、１００ミリリットル（１００ｍｌ）以上の溶液であった。リーフレットを、室温にて２〜２．５時間処理した。
【０１６１】
処理後、このリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中のリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒド中でリンスした。リンス溶液の容積は、３つのリーフレット当たり、１００ミリリットル（１００ｍｌ）以上の溶液であった。リンスは、室温にて各々１０分間のサイクルを３回連続して実施した。
【０１６２】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。ｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含有した。容積は、３つのリーフレット当たり、１００ミリリットル（１００ｍｌ）以上の溶液であった。リーフレットを、３０〜３７℃にて１０時間±３０分間処理した。
【０１６３】
処理後、このリーフレットを、ｐＨ７．４にて水性溶媒中のリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒド中でリンスした。リンス溶液の容積は、３つのリーフレット当たり、１００ミリリットル（１００ｍｌ）以上の溶液であった。リンスは、室温にて各々１０分間のサイクルを４回連続して実施した。
【０１６４】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液体滅菌プロセス（ＴＬＳ）に供した。ＴＬＳ手順において、リーフレットを、ｐＨ７．２〜７．５にて水性溶媒中のリン酸緩衝液中の０．６２５％グルタルアルデヒド溶液で処理した。この溶液の容積は、３つのリーフレット当たり、１００ｍｌの溶液であった。リーフレットを、３７．５±２．５℃（代表的に最も低温の産物内部位置および最も高温の産物内部位置にて測定した）にて、２５〜３５時間処理した。
【０１６５】
ＴＬＳ手順の後、リーフレットを、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｒａｔに皮下に９０日間移植し、外植し、そしてカルシウム分析に供し、これらのサンプルを、以下実施例３において、「２グループ」リーフレットという。
【０１６６】
（３．１．３．試験グループ、１４日目間グルタルアルデヒドで、７日目間グルタルアルデヒド／１．２％  Ｔｗｅｅｎ−８０で処理したリーフレット）
ウシ心膜組織リーフレットを、標準的な技術を使用して、化学固定のために調製した。
【０１６７】
ウシ心膜組織リーフレットを調製した後、これらのサンプルを、水性溶媒中０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬することにより化学固定し、次いで７日目に検疫した。次いで、これらのリーフレットを、水性溶媒中０．６２５％のグルタルアルデヒドおよび１．２％のＴｗｅｅｎ  ８０で７日間処理した。
【０１６８】
次いで、これらのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉｎｉｔｉａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ、ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％  ホルムアルデヒド、２２％  エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および１１．３ｍＭ  リン酸緩衝液を含んだ。その容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リーフレットを、室温で２〜２．５時間処理した。
【０１６９】
処理後、これらのリーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）でリンスした。リンス溶液の容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リンス工程を、室温で、それぞれ１０分間３回の連続サイクルで行った。
【０１７０】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆｉｎａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ、ｆＢＲｅＰ）に供した。このｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％  ホルムアルデヒド、２２％  エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭ  リン酸緩衝液を含んだ。その容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃で、１０時間±３０分間処理した。
【０１７１】
処理後、これらのリーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）でリンスした。このリンス溶液の容量は、リーフレット３つあたり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リンス工程を、室温で、それぞれ１０分間の４回の連続サイクルで行った。
【０１７２】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液体滅菌プロセス（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ、ＴＬＳ）に供した。このＴＬＳ手順において、リーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒドの溶液（ｐＨ７．２〜７．５）で処理した。この溶液の容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ｍｌであった。リーフレットを、３５〜４０℃（代表的な製品の最も冷たい内部位置および最も温かい内部位置で測定）で２５〜３５時間処理した。
【０１７３】
ＴＬＳ手順の後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植し、外植し、そしてカルシウム分析に供し、そして本明細書中以下の実施例３では、「グループ３」リーフレットと呼ぶ。
【０１７４】
（３．１．４．試験グループ、１日間グルタルアルデヒドで、１３日間グルタルアルデヒド／１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０で処理したリーフレット）
ウシ心膜組織リーフレットを、標準的な技術を使用して、化学固定のために調製した。
【０１７５】
ウシ心膜組織リーフレットを調製した後、これらのサンプルを、水性溶媒中０．６２５％のグルタルアルデヒド溶液に１２〜２４時間浸漬することにより化学固定した。次いで、これらのリーフレットを、水性溶媒中０．６２５％のグルタルアルデヒドおよび１．２％のＴｗｅｅｎ  ８０で１３日間処理した。
【０１７６】
次いで、これらのリーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％  ホルムアルデヒド、２２％  エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および１１．３ｍＭ  リン酸緩衝液を含んだ。その容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リーフレットを、室温で２〜２．５時間処理した。
【０１７７】
処理後、これらのリーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）でリンスした。リンス溶液の容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リンス工程を、室温で、それぞれ１０分間３回の連続サイクルで行った。
【０１７８】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。このｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤溶液で処理した。この溶液は、４％  ホルムアルデヒド、２２％  エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭ  リン酸緩衝液を含んだ。その容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃で、１０時間±３０分間処理した。
【０１７９】
処理後、これらのリーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒド（ｐＨ７．４）でリンスした。このリンス溶液の容量は、リーフレット３つあたり溶液１００ミリリットル（１００ｍｌ）に等しいかまたは以上であった。リンス工程を、室温で、それぞれ１０分間の４回の連続サイクルで行った。
【０１８０】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液体滅菌プロセス（ＴＬＳ）に供した。このＴＬＳ手順において、リーフレットを、水性溶媒中のリン酸緩衝液中０．６２５％のグルタルアルデヒドの溶液（ｐＨ７．２〜７．５）で処理した。この溶液の容量は、リーフレット３つ当たり溶液１００ｍｌであった。リーフレットを、３５〜４０℃（代表的な製品の最も冷たい内部位置および最も温かい内部位置で測定）で２５〜３５時間処理した。
【０１８１】
ＴＬＳ手順の後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植し、外植し、そしてカルシウム分析に供し、そして本明細書中以下の実施例３では、「グループ４」リーフレットと呼ぶ。
【０１８２】
（３．１．３．カルシウム分析）
上記に概説される４つの処理の１つを行った後、リーフレットを、９０日間、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下移植した。このリーフレットを取り出し、そしてカルシウム含有量分析のために調製した。
【０１８３】
リーフレットをまず凍結乾燥し、そして重さを量り、次いで完全に消化されるまで１１０℃にて７０％の硝酸で処理した。この消化したサンプルを、３，０００ｐｐｍのＫＣｌの最終濃度にした。
【０１８４】
このサンプルを、原子吸光分析（ＡＡＳ）によってカルシウム含有量について分析した。
【０１８５】
（３．２．結果）
表３は、完全プロセスコントロール（グループ２）と比較しての、７日間のＴｗｅｅｎ８０の試験グループ（グループ３）および１３日間のＴｗｅｅｎ８０試験グループ（グループ４）を使用する石灰化の軽減を示す。５μｇＣａ／ｍｇより多くの乾燥リーフレット組織を含むリーフレット組織サンプルが、石灰化される。
【０１８６】
（表３）
【０１８７】
【表３】
2005532877.tif 000004
【０１８８】
表２は、完全プロセスコントロール（グループ２）からの４．２６％（４／９４）の組織が石灰化されるが、７日間のグルタルアルデヒド、７日間のＴｗｅｅｎ８０試験グループ（グループ３）からの０．０％（０／９１）の組織が石灰化されたことを示す。さらに、２．２５％の１日間のグルタルアルデヒド、１３日間のＴｗｅｅｎ８０の試験グループ（グループ４）は、石灰化を示した。従って、グループ３および４の両方は、完全プロセスコントロールグループと比較して石灰化における軽減を示した。
【０１８９】
（実施例４）
実施例４は、ブタ心臓弁組織中のリン脂質含有量を減少する方法を記載し、ここで、ブタ心臓弁組織は、０．６％〜６％のＴｗｅｅｎ８０および０．６２５％のグルタルアルデヒドを含むＳＣＬ調製物を用いる処理に７日間〜１５日間供される。
【０１９０】
（４．１．方法）
（４．１．１．一般的な方法）
ブタ心臓弁組織リーフレットを、標準的な技術によって化学固定するために調製した。
【０１９１】
ブタ心臓弁組織リーフレットの調製後、表４に示されるように、水性溶媒中０．６２５％グルタルアルデヒド溶液への１〜１４日間の浸漬により、サンプルを化学固定した。
【０１９２】
次いで、リーフレットを、表４に示されるように、０．６２５％グルタルアルデヒドおよび０．６％〜６．０％のＴｗｅｅｎ８０で５〜１５日間処理した。
【０１９３】
次いで、リーフレットを、初期生物負荷減少プロセス（ｉＢＲｅＰ）に供した。ｉＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットを、室温にて２〜２．５時間処理した。
【０１９４】
処理後にリーフレットを７．４のｐＨの水性溶媒中の、０．６２５％のグルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり、１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の３回の連続したサイクルで行った。
【０１９５】
ｉＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終生物負荷減少プロセス（ｆＢＲｅＰ）に供した。ｆＢＲｅＰ手順において、リーフレットを、ホルムアルデヒドベースの滅菌剤の溶液で処理した。この溶液は、４％ホルムアルデヒド、２２％エタノール、１．２％  Ｔｗｅｅｎ８０および１１．３ｍＭリン酸緩衝液を含んだ。容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リーフレットを、３０〜３７℃にて、１０時間±３０分間処理した。
【０１９６】
処理後、リーフレットを、７．４のｐＨにて水性溶媒中の、０．６２５％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液中でリンスした。リンス溶液の容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液と同量か、またはそれ以上であった。リンスは、室温にて、各々１０分間の４回の連続したサイクルで行った。
【０１９７】
ｆＢＲｅＰ手順の後、リーフレットを、最終液状滅菌プロセス（ＴＬＳ）に供した。ＴＬＳ手順において、リーフレットを、７．２〜７．５のｐＨにて、水性溶媒中の、０．５１６〜０．６５６％グルタルアルデヒドリン酸緩衝液で処理した。溶液の容量は、３つのリーフレットあたり１００ｍｌの溶液であった。リーフレットを、３５〜４０℃（代表的な最低および最高の、生成物の内部位置にて測定した）にて、２５〜３５時間処理した。
【０１９８】
（４．１．２．リン脂質分析）
上記に概説する４つの処理のうちの１つを受けた後、リーフレットをＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに９０日間皮下移植した。リーフレットを外植し、リン脂質含有量分析のために調製した。
【０１９９】
リーフレットを、液体窒素中で凍結し、粉砕し、そしてクロロホルムおよびメタノールを含む抽出溶媒に溶解した。生理食塩水の添加後、沈殿したタンパク質および大部分の組織を遠心分離によって取り除いた。次いで、抽出した液体を、溶媒相から回収し、そして薄層クロマトグラフィー分析に供した。
【０２００】
ＴＬＣによって分析された、選択されたリン脂質は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸であった。
【０２０１】
（４．２．結果）
表４は、ＳＣＬ工程を行っていない場合の方法と比較しての、ＳＣＬ工程を使用する方法におけるリン脂質含有量の減少を示す。
【０２０２】
（表４）
【０２０３】
【表４−１】
2005532877.tif 000005
【０２０４】
【表４−２】
2005532877.tif 000006
【０２０５】
【表４−３】
2005532877.tif 000007
【０２０６】
＋＋＋は、０．２００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織未満を示す。
【０２０７】
＋＋は、０．２００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織より大きく、０．４００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織未満を示す。
【０２０８】
＋は、０．４００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織より大きく、１．０００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織未満を示す。
【０２０９】
−−−は、１．００μｇＰＬ／ｍｇ乾燥組織より大きいことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、以下の実施例１で記載されるように、９０日間のラット皮下心膜リーフレットの石灰化（μｇ  Ｃａ／ｍｇ乾燥重量）を評価するための実験からのデータを示す。
【図２】図２は、以下の実施例１に記載されるように、９０日間のラット皮下心膜リーフレットの石灰化（μｇ  Ｃａ／ｍｇ乾燥重量）を評価するための実験からのデータを示す。
【図３】図３は、以下の実施例２に記載されるように、９０日間の皮下ブタリーフレットの石灰化（μｇ  Ｃａ／ｍｇ乾燥重量）を評価するための実験からのデータを示す。
【図４】図４は、以下の実施例２に記載されるように、９０日間の皮下ブタリーフレットの石灰化（μｇ  Ｃａ／ｍｇ乾燥重量）を評価するための実験からのデータを示す。
【図１】
2005532877.tif 000008
【図２】
2005532877.tif 000009
【図３】
2005532877.tif 000010
【図４】
2005532877.tif 000011
【国際調査報告】
2005532877.tif 000012
2005532877.tif 000013
2005532877.tif 000014