(57)【要約】【課題】新規な血管内皮機能改善用組成物を提供する。【解決手段】柿葉抽出物を含む、血管内皮機能改善用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
柿葉抽出物を含む、血管内皮機能改善用組成物。
【請求項２】
経口組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
食品組成物又は医薬組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮機能改善用組成物に関する。より詳細には、本発明は柿葉抽出物を含む血管内皮機能改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮は血管の最内層に存在しており、血液成分などの血管透過性、血管の収縮や弛緩反応、凝固線溶系に関与することによる血液凝固性の調節、血小板機能の制御等、様々な機能を有している。これらの機能は、血管内皮細胞が様々な生理活性因子を産生することと深く関与している。中でも、一酸化窒素（ＮＯ）は、血管の収縮や弛緩反応、凝固線溶系に関与することによる血液凝固性の調節などに深く関与しており、血管組織の恒常性を維持する重要な因子である。
【０００３】
血管内皮細胞は、血管ずり応力、アセチルコリン、インスリンなどに応じて一酸化窒素を産生し、血管内皮機能を調節している。血管内皮細胞が一酸化窒素を産生する際には、血管内皮型一酸化窒素産生酵素（ｅＮＯＳ）が重要な役割を果たしており、ｅＮＯＳの活性が抑制されると高血圧症、脂質異常症、上昇高脂血症、動脈硬化、血栓症などの疾患の発生に影響を与えることが知られている。さらに、これらの疾患によって血管内皮細胞が障害を受けると、ｅＮＯＳの活性が低下し、疾患の進行を促進させることが知られている。このような知見をもとに、ｅＮＯＳの発現を促進したり、ｅＮＯＳを活性化させることなどにより、血管内皮機能を改善する技術の開発が進められている。
【０００４】
例えば、本出願人はこれまでに、圧搾米糠油を水蒸気蒸留処理して得られる圧搾精油米糠油（特許文献１）、セイヨウヤナギ抽出物（特許文献２）などがｅＮＯＳの活性化作用を有し、これらの成分が血管内皮機能の改善に有用であることを見出している。
【０００５】
また、核因子赤血球２関連因子２（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２；Ｎｒｆ２）は、血管内皮を酸化ストレスから防御する上で重要な役割を担っている。Ｎｒｆ２は、通常、抑制性因子であるＫｅａｐ１と結合した状態で存在しており、細胞が酸化ストレスや親電子物質などにさらされるとＫｅａｐ１による抑制が解除され、抗酸化酵素等を誘導することが知られている。また、Ｎｒｆ２は、酸化ストレスだけでなく、一酸化窒素により、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１が刺激され、Ｎｒｆ２が活性化することも知られている。さらに、Ｎｒｆ２は、血管内皮でヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）を誘導することによって血管内皮機能が改善されることが知られている。
【０００６】
また、サーチュインは、カロリー制限による細胞老化の抑制、寿命の延長などに関与することが知られているが、血管内皮細胞において、サーチュインファミリーであるＳｉｒｔ１を過剰発現することにより、酸化ストレスによる細胞老化誘導を回避できることが知られている。さらに、Ｓｉｒｔ１は、ｅＮＯＳと直接結合し、一酸化窒素の産生を促進することが知られており、Ｓｉｒｔ１とｅＮＯＳとの関係が重要視されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−２０６９５８号公報
【特許文献２】特開２０１３−１７３６９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記した従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、血管内皮型一酸化窒素産生酵素（ｅＮＯＳ）の発現促進作用、活性化作用などを通じて血管内皮機能を改善することができる、新規な血管内皮機能改善用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した目的を達成すべき鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、柿葉抽出物が優れたｅＮＯＳ発現促進作用を有することを見出した。さらに、本発明者らは、柿葉抽出物が、Ｎｒｆ２及びＳｉｒｔ１の発現促進作用を有することも見出した。本発明者らはかかる知見に基づきさらなる研究を重ねることにより、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
柿葉抽出物を含む、血管内皮機能改善用組成物。
項２．
経口組成物である、上記項１に記載の組成物。
項３．
食品組成物又は医薬組成物である、上記項１又は２に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、血管内皮機能を改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、血管内皮機能改善用組成物を包含する。本発明の血管内皮機能改善用組成物は、柿葉抽出物を含む。なお、本明細書において、本発明の血管内皮機能改善用組成物を単に「本発明の組成物」と記載する場合がある。
【００１４】
柿葉抽出物の調製に際し、抽出に供する柿葉は特に限定されず、例えば、カキノキ科カキノキ属の落葉樹の葉などが挙げられる。柿の品種も特に限定されない。柿葉は、落葉前又は落葉後のいずれの葉であってもよく、落葉前の葉が好ましい。また、抽出に供する柿葉は、必要に応じて、常法に従って乾燥等の前処理を施したものであってもよい。柿葉の前処理としては、例えば、樹木から採取した柿葉を水洗し、必要に応じて適当な大きさ（例えば、３ｍｍ幅程度）に切断した後に乾燥する方法や、樹木から採取した柿葉を水洗し、必要に応じて適当な大きさに切断し、蒸籠等を用いて蒸した後に乾燥する方法などが挙げられる。
【００１５】
柿葉の抽出に用いる溶媒は特に制限されず、公知の溶媒を用いることができる。例えば、水、エタノール、並びに水及びエタノールの混合液などが挙げられ、好ましくは水及びエタノールの混合液である。抽出溶媒として水及びエタノールと混合液を用いる場合、当該混合液におけるエタノールの含有量は特に限定されず、任意の割合とすることができる。例えば、水及びエタノールの混合液におけるエタノールの含有量は２５〜７５％（ｗｔ／ｗｔ）程度であり、４５〜５５％（ｗｔ／ｗｔ）程度であることが好ましく、５０％（ｗｔ／ｗｔ）程度であることがより好ましい。
【００１６】
柿葉の抽出方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。例えば、浸漬し必要に応じて攪拌や加熱したり、加熱し加圧条件下で行なったり、抽出溶媒中で破砕処理したり、超音波や電磁波を照射したり、抽出溶媒を還流させたり、これらを組み合わせたりすることが出来る。この中でも、超音波や電磁波を照射したり、抽出溶媒を還流させたりする方法が好ましく、特に沸騰還流条件下で行うことが好ましい。柿葉と溶媒との混合割合については特に限定されず、例えば、柿葉１質量部に対して、溶媒を２〜１００質量部、好ましくは２〜５０質量部、より好ましくは３〜３０質量部とすることができる。抽出温度としては、用いる溶媒の種類に応じて０℃から沸点の範囲内において適宜決定することができる。例えば、溶媒として水を用いる場合には、６０〜１００℃程度、好ましくは７０〜１００℃程度とすることができ、水及びエタノールと混合液を用いる場合には、３０℃〜沸点程度、好ましくは６０℃〜沸点程度とすることができる。また、抽出時間は、用いる溶媒の種類及び抽出温度などに応じて適宜決定することができる。例えば、溶媒として水を用いる場合には、１０分〜２４時間程度、好ましくは２５分〜４時間程度とすることができ、水及びエタノールと混合液を用いる場合には、数分〜２４時間程度、好ましくは２０分〜４時間程度とすることができる。
【００１７】
上記した方法により得られた抽出物は、濾過、遠心分離などの常法に従って柿葉と分離することができる。
【００１８】
また、本発明の組成物に含まれる柿葉抽出物は、上記した方法により得られた抽出物をそのまま用いてもよいし、当該抽出物を濃縮したもの、当該抽出物をさらに抽出したもの、当該抽出物を分画したものなどであってもよい。
【００１９】
濃縮方法としては特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば、上記した方法により得られた抽出物から常法により柿葉等の固形分を除去した後、濾過処理等により得られた濾液等を、加熱濃縮、減圧濃縮、膜濃縮（例えば限外濾過）、凍結乾燥などを用いて溶媒を除去する方法等が挙げられる。
【００２０】
さらなる抽出方法としては、上記した柿葉の抽出方法と同様に特に限定されず、公知の方法を採用することができる。さらなる抽出方法は、上記した柿葉の抽出方法と同様であってもよいし、異なる方法であってもよい。例えば、上記で例示した方法により得られた柿葉抽出物を約９倍量の精製水に溶解させ、超音波処理を行った後に、約１００００Ｇの遠心分離処理を行い、上澄を回収する方法などが挙げられる。さらに、上記で例示した方法により得られた柿葉抽出物を濃縮した後に、さらなる抽出処理に供することもできる。
【００２１】
分画方法としては特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば、カラムを用いて分画する方法などが挙げられる。分画に用いるカラムとしては、公知のカラムを用いることができ、例えばオクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填したカラム（例えば、Purif-Pack Size200 ODSカラム）、修飾デキストランを充填したカラム（例えば、Sephadex LH-20カラム）などが挙げられる。
【００２２】
分画に用いる溶出液は、用いるカラムに応じて適宜選択することができる。例えば、オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填したカラムを用いる場合には、アセトニトリルと水との混合溶媒を使用することができ、修飾デキストランを充填したカラムを用いる場合には、メタノールと水との混合溶媒、及び／又はアセトンと水との混合溶媒を使用することができる。抽出溶媒は、同一組成の溶媒を使用するだけでなく、抽出工程全般、又はその一部において経時的に混合比率を変化させた溶媒を使用しても良い。
【００２３】
また、分画の条件（例えば、カラム温度、抽出溶媒の流速、溶媒組成など）は特に制限されず、用いるカラムや溶出液に応じて適宜設定すればよい。
【００２４】
好ましい分画方法としては、オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填したカラムを用いて分画を行う場合には、柿葉抽出物を、オクタデシルシリル基結合シリカゲルを充填したカラムに吸着させ、アセトニトリルと水との混合溶媒におけるアセトニトリルの含有量を０％から１〜１０％程度ずつ上昇させつつ溶出するステップワイズグラジエントにて分画する方法などが挙げられる。
【００２５】
また、修飾デキストランを充填したカラムを用いて分画を行う場合には、柿葉抽出物を修飾デキストランを充填したカラムに吸着させ、メタノールと水との混合溶媒におけるメタノールの含有量を０％から１０〜２０％程度ずつ上昇させつつ溶出するステップワイズグラジエントにて分画する方法が挙げられる。さらに、メタノールによる溶出が完了した後、６０〜８０％程度のアセトン−水混液により溶出する方法も挙げられる。
【００２６】
本発明の組成物は、上記した柿葉抽出物そのものであってもよいし、当該柿葉抽出物に加え、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、薬学的又は食品衛生学的に許容され得る担体などが挙げられる。
【００２７】
本発明の組成物は、経口組成物として利用することができる。経口組成物としては、例えば、食品組成物、医薬組成物などとして利用することができる。また、本発明の組成物に含まれる柿葉抽出物は、優れたｅＮＯＳ発現促進作用を有するだけでなく、Ｎｒｆ２及びＳｉｒｔ１の発現促進作用を有することから、血管内皮機能改善用組成物として好ましく利用することができる。さらに、本発明の組成物は、血管内皮機能を改善することができるため、血管内皮機能の低下に伴う疾患（例えば、高血圧症、動脈硬化症、脂質異常症、上昇高脂血症、血栓症、糖尿病、糖尿病合併症など）の予防及び／又は治療に好ましく用いることができる。また、これらの疾患の発症や症状を緩和させることを目的として、これらの疾患を発症している人や発症するリスクの高い人に対する用途においても好ましく用いることができる。
【００２８】
本発明の組成物は、１回又は複数回（好ましくは２〜３回）に分けて摂取することができる。また、摂取対象としてはヒトが好ましいが、ヒト以外の非ヒト哺乳動物であってもよい。
【００２９】
本発明の組成物に含まれる柿葉抽出物は優れたｅＮＯＳ発現促進作用を有することから、血圧降下作用、血管拡張作用、動脈硬化予防効果、高脂血症や糖尿病に伴う心疾患の予防作用などの作用を発揮することができ、本発明の組成物はこれらの作用を目的とした用途に好ましく用いることができる。例えば、本発明の組成物は、血圧降下（降圧）用、血管拡張用、抗動脈硬化用などの用途に用いることができる。
【００３０】
また、本発明の組成物に含まれる柿葉抽出物はＮｒｆ２の発現促進作用を有することから、血管内皮における抗酸化作用などの作用を発揮することができ、本発明の組成物はこのような作用を目的とした用途に好ましく用いることができる。例えば、本発明の組成物は、抗酸化用などの用途に用いることができる。
【００３１】
さらに、本発明の組成物に含まれる柿葉抽出物はＳｉｒｔ１の発現促進作用を有することから、抗細胞老化作用などの作用を発揮することができ、本発明の組成物はこのような作用を目的とした用途に好ましく用いることができる。例えば、本発明の組成物は、抗老化用などの用途に用いることができる。
【００３２】
本発明の組成物の形態としては特に限定されないが、経口組成物として利用する場合には、例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、サプリメント、チュアブル錠、飲料、粉末飲料、顆粒、フィルムなどの形態とすることができる。また、飲食品として使用する場合には、例えば、茶系飲料、スポーツ飲料、美容飲料、果汁飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、水や湯、炭酸水等で希釈する濃縮タイプの飲料等の飲料、水や湯等に溶解又は懸濁させて飲用する粉末や顆粒、タブレット等の乾燥固形物、タブレット菓子、ゼリー類、スナック類、焼き菓子、揚げ菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、グミなどの菓子類、スープ類、めん類、米飯類、シリアル等などの食品形態にすることもできる。このうち通常の生活において利用する場合には、サプリメントタイプ、チュアブル錠、ワンショットドリンクタイプなどの形態が好ましく、運動効果を高める目的で摂取する場合には、スポーツ飲料などの飲料の形態が最も好ましい。さらに、これらの経口組成物は容器に充填された容器詰食品として消費者に提供することができる。容器は密封できるものであれば特に限定されない。
【００３３】
錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤などの場合は、乾燥物換算で経口組成物全量に対して、本発明の組成物を０．０１  〜９５質量％程度、好ましくは５〜９０質量％程度、最も好ましくは１０〜８０質量％程度配合すればよい。上記以外の経口組成物の場合は、本発明の組成物を０．００１〜５０質量％程度、好ましくは０．００５〜３０質量％程度、最も好ましくは０．０１〜１０質量％程度配合すればよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００３５】
製造例：柿葉抽出物の調製
乾燥し裁断した柿葉約１０ｇを、２０倍質量の５０％（ｗｔ／ｗｔ）水−エタノール混合液を用いて抽出した。抽出は還流抽出装置を用い、１時間、沸騰還流の条件で実施した。抽出処理後、メッシュ及び濾紙を用いて不溶物を除去した後に、エバポレーターを用いてエタノールを除去し、得られた抽出液を凍結乾燥して粉末状の抽出物を得た。次いで、Ｐｕｒｉｆ−ｅｓｐｏｉｒ２（昭光サイエンティフィック社製）及びＳｅｐｈａｄｅｘ−ＬＨ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いた選択吸着による分画を行った。移動相は、水：メタノール＝１００：０〜０：１００の範囲で、２０％ずつメタノール比をステップワイズで増加させた混合溶媒を使用して溶出した後、水：アセトン＝３０：７０の混合溶媒を用いてさらに溶出を行った。水：アセトン＝３０：７０の混合溶媒を用いた溶出により得られた画分からエバポレーターを用いて揮発成分を除去し、凍結乾燥を行うことにより、粉末状の柿葉抽出物を得た。
【００３６】
試験例：ＮＯＳ３、Ｎｒｆ２、及びＳｉｒｔ１の遺伝子発現への影響の検討
サンプルとして、上記製造例で調製した柿葉抽出物を用いた。また、ＮＯＳ３のｍＲＮＡの発現を促進することが知られているＨ２Ｏ２及びレスベラトロール、並びにＤＭＳＯを対照として使用した。１２ウェルプレートを用い、２％ＦＢＳ培地８００μＬ中で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ、三光純薬社製）を培養し、各種サンプルを下記表１に記載の最終濃度の５倍となるように溶解した２％ＦＢＳ培地を２００μＬ添加し、６時間及び２４時間培養した。次いで、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて抽出した。１本鎖のｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）は０．３５μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡよりＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを使用して合成した。なお、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収量が不足している場合には、回収量に応じてｓｓｃＤＮＡの希釈率を変更した上でｍＲＮＡの定量分析に供した。ＮＯＳ３、Ｎｒｆ２、及びＳｉｒｔ１のｍＲＮＡの定量分析は、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して実施した。また、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）、Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ、及びＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｈｓ０１５７４６５９＿ｍ１  ｆｏｒ  ＮＯＳ３、Ｈｓ００２３２３５２＿ｍ１  ｆｏｒ  ＮＦＥ２Ｌ２（Ｎｒｆ２）、Ｈｓ０１００９００５＿ｍ１  ｆｏｒ  Ｓｉｒｔ１、及びＨｓ０２３８７３６８＿ｇ１  ｆｏｒ  ＲＰＳ１８）を定量的リアルタイムＰＣＲ分析に使用した。定量データはそれぞれ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１８（ＲＰＳ１８）の発現レベルでΔΔＣｔ  ｍｅｔｈｏｄで補正した。結果を下記表１に示す。
【００３７】
【表１】
2018095623.tif 000002
【００３８】
表１から、柿葉抽出物は、ＮＯＳ３の発現を促進することが知られているＨ２Ｏ２及びレスベラトロールよりもＮＯＳ３発現を促進することが分かった。さらに、柿葉抽出物は、ＮＯＳ３だけでなく、Ｎｒｆ２及びＳｉｒｔ１の発現をも促進することが分かった。これらの結果から、柿葉抽出物は、ＮＯＳ３だけでなく、Ｎｒｆ２及びＳｉｒｔ１の発現を促進することによって、優れた血管内皮機能改善作用を奏することが考察される。