(57)【要約】電極上に吸着されたオリゴヌクレオチド二本鎖内の遺伝子点突然変異、一般的なDNA損傷、および他の塩基スタッキング障害を電気化学的に検出して位置特定するための組成物および方法、ならびに生物測定技術におけるその利用について記述する。インターカレート性酸化還元活性部分（インターカレート剤または核酸結合タンパク質など）を、電極から異なる離隔距離で固定されたDNA二本鎖に接着および／または架橋して、非インターカレート性酸化還元部分の存在下または非存在下で電気化学的に調べる。変異またはタンパク質のその認識部位への結合のような塩基スタッキング障害によって生じたDNA媒介電子移動の妨害は、電流、電荷、および／または電位の差に反映される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項２】
第一の一本鎖核酸プローブ配列がチオール末端5'末端を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
チオール末端5'末端がチオール末端アルキル鎖である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
インターカレート性酸化還元活性部分がメチレンブルーである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
非インターカレート性酸化還元活性部分がフェリシアン化物である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分と非インターカレート性酸化還元活性部分とを含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項９】
誘導体化核酸プローブ配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
電極が金である、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
電極が炭素である、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
二本鎖核酸を電極に沈着させる前に、二本鎖核酸に塩を加える、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
塩がMgCl2である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
添加した塩が10 mMより大きい濃度を有する、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
塩が100 mMの濃度を有する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層が、約35 pmol/cm2から約60 pmol/cm2である、請求項8記載の方法。
【請求項２０】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層が約50 pmol/cm2である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層が約0.5 pmol/cm2から約35 pmol/cm2である、請求項8記載の方法。
【請求項２２】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層が約1 pmol/cm2である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させて、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレートしてスタッキングされるインターカレート性酸化還元活性部分、および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項２４】
インターカレート性酸化還元活性部分がメチレンブルーである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
非インターカレート性酸化還元活性部分がフェリシアン化物である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
インターカレート性酸化還元活性部分が核酸改変被膜に共有結合していない、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基ミスマッチを検出する方法：
a）第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖（誘導体化）核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列ミスマッチを有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列ミスマッチの有無が示される段階。
【請求項３０】
一塩基ミスマッチがグアニン-アデニン対形成である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
一塩基ミスマッチがアデニン-アデニン対形成である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
一塩基ミスマッチがグアニン-グアニン対形成、チミン-チミン対形成、シトシン-シトシン対形成、グアニン-チミン対形成、シトシン-チミン対形成、またはシトシン-アデニン対形成である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
第一の一本鎖誘導体化核酸プローブ配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
一つまたは複数の一塩基配列損傷が疾患に関連する、遺伝子配列の一部における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）遺伝子の配列の誘導体化部分を含む第一の一本鎖核酸プローブ配列を、遺伝子の野生型部分を含む第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、遺伝子配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階（ここで塩基スタッキング障害または一塩基配列損傷が疾患に関連する）。
【請求項３７】
遺伝子配列の一部が、長さ200ヌクレオチドまでである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子配列の一部が、長さ10ヌクレオチドから50ヌクレオチドである、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子配列の一部が長さ15ヌクレオチドから35ヌクレオチドである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子がヒトp53遺伝子である、請求項36記載の方法。
【請求項４１】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項36記載の方法。
【請求項４２】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項36記載の方法。
【請求項４３】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の天然に存在するDNA損傷を検出する方法：
a）DNA損傷を含む第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数のDNA損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数のDNA損傷の有無が示される段階。
【請求項４４】
DNA損傷が酸化ヌクレオチドである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
酸化ヌクレオチドが8-オキソ-アデニンである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
DNA損傷がヒドロキシピリミジンである、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
ヒドロキシピリミジンが5,6-ジヒドロチミンである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
DNA損傷が脱塩基部位である、請求項43記載の方法。
【請求項４９】
DNA損傷がヌクレオチドの脱アミノ化である、請求項43記載の方法。
【請求項５０】
脱アミノ化ヌクレオチドがシトシンである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
DNA損傷が、グアニンと対形成したデオキシウラシルである、請求項43記載の方法。
【請求項５２】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項43記載の方法。
【請求項５３】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項43記載の方法。
【請求項５４】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、位置づけ可能な多電極アレイ上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を位置づけ可能な多電極アレイに付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が位置づけ可能な多電極アレイに付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項５５】
多電極アレイが金電極を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
多電極アレイが炭素電極を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
多電極アレイの電極の直径が500 μmまたはそれ未満である、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項54記載の方法。
【請求項６０】
以下の段階を含む、標的核酸配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が超微小電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を超微小電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が超微小電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項６１】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
以下の段階を含む、DNAとRNAとのハイブリッドにおける一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、DNAとRNAとのハイブリッドにおける一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項６４】
第一の一本鎖核酸プローブ配列がDNAであって、第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
RNAがmRNAである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
DNAがcDNAである、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
誘導体化野生型標的核酸試料の一部における、一つまたは複数の一塩基配列損傷を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）第一の一本鎖核酸プローブ配列を、誘導体化野生型標的核酸試料の一部を含む第二の一本鎖核酸標的配列と接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）インターカレート性酸化還元活性部分および非インターカレート性酸化還元活性部分を含む溶液に、核酸改変被膜を液浸する段階；ならびに
c）インターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、誘導体化野生型標的核酸試料の一部における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階。
【請求項６８】
第二の一本鎖核酸標的配列がDNAである、請求67記載の方法。
【請求項６９】
第二の一本鎖核酸標的配列がRNAである、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列における塩基フリッピングを検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が、電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合による塩基フリッピングの有無が示される段階。
【請求項７１】
第一の一本鎖誘導体化核酸配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
電極が金である、請求項70記載の方法。
【請求項７４】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられる、請求項70記載の方法。
【請求項７５】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられない、請求項70記載の方法。
【請求項７６】
二本鎖核酸を電極上に沈着させた後に、電極表面をメルカプトヘキサノールに接触させる、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
電気化学プローブがダウノマイシン（DM）である、請求項70記載の方法。
【請求項７８】
ダウノマイシンが、第一の一本鎖核酸配列の二本鎖末端近傍のグアニン残基に共有結合によって架橋される、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
タンパク質が、メチルトランスフェラーゼHhaI（M.HhaI）、Q237W、またはウラシル-DNAグリコシラーゼである、請求項70記載の方法。
【請求項８０】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列における塩基スタッキング障害を検出する方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、そして第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが、二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖における一つまたは複数の塩基スタッキング障害の有無が示される段階。
【請求項８１】
第一の一本鎖誘導体化核酸配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
電極が金である、請求項80記載の方法。
【請求項８４】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられる、請求項80記載の方法。
【請求項８５】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられない、請求項80記載の方法。
【請求項８６】
二本鎖核酸を電極上に沈着させた後に、電極表面がメルカプトヘキサノールによって埋め戻される、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
電気化学プローブがダウノマイシン（DM）である、請求項80記載の方法。
【請求項８８】
ダウノマイシンが、第一の一本鎖核酸配列の二本鎖末端近傍のグアニン残基に、共有結合によって架橋される、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
タンパク質が、TATAボックス結合タンパク質（TBP）、または制限エンドヌクレアーゼPvuII（R. PvuII）である、請求項80記載の方法。
【請求項９０】
二本鎖核酸配列へのタンパク質結合に関連した、二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応を電気的にモニターする方法であって、以下の段階を含む方法：
a）タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む第一の一本鎖誘導体化核酸配列を、第二の一本鎖核酸配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸配列が、電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされ、単層が、まず第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極に付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；
b）第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；
c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を、二本鎖核酸改変被膜に加える段階；ならびに
d）電気化学プローブの還元の電流または電荷を測定する段階であって、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖における酵素反応の有無が示される段階。
【請求項９１】
第一の一本鎖誘導体化核酸配列が、5'末端にチオール末端アルキル鎖を有するオリゴヌクレオチドである、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
オリゴヌクレオチドがDNA配列である、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
電極が金である、請求項90記載の方法。
【請求項９４】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられる、請求項90記載の方法。
【請求項９５】
二本鎖核酸を電極上に沈着させる前に、Mg2+が二本鎖核酸に加えられない、請求項90記載の方法。
【請求項９６】
二本鎖核酸を電極に沈着させた後に、電極表面がメルカプトヘキサノールによって埋め戻される、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
電気化学プローブがダウノマイシン（DM）である、請求項90記載の方法。
【請求項９８】
ダウノマイシンが、第一の一本鎖核酸配列の二本鎖末端近傍のグアニン残基に、共有結合によって架橋される、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
タンパク質が制限エンドヌクレアーゼである、請求項90記載の方法。
【請求項１００】
制限エンドヌクレアーゼがPvuIIである、請求項99記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
米国政府は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号GM49216号に準じて、本発明において一定の権利を保有する可能性がある。
【０００２】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチド二本鎖内の塩基対ミスマッチおよび他の塩基スタッキング障害（perturbation）の検出および位置特定に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
DNAに変異が起こると、最終的に多様な疾患において発現される代謝機能の重篤な結末（例えば、遺伝子発現の調節、タンパク質産生の調節）が起こりうることは今では周知である。例えば、有意な数のヒト癌は、三つのras遺伝子の一つにおける一塩基変異を特徴とする（Bos、1989）。そのような疾患の遺伝子成分を解明するためには、一塩基ミスマッチを迅速かつ効率よく検出することができるDNAセンサーを開発すること、およびそのようなセンサーに基づいて疾患に関連する遺伝子変異の日常的なスクリーニングを確立することが最も重要である（Skogerboe、1993；Southern、1996；Chee、1996；Eng、1997）。
【０００４】
DNA配列間の差を検出するために開発されている様々な方法は、変異配列に対して本来の配列を区別するためにハイブリダイゼーションに依存しているが、伸長したポリヌクレオチド内での点突然変異によって引き起こされた塩基対エネルギーの差が小さいことから限界がある（Millan、1993；Hashimoto、1994；Xu、1995；Wang、1996；Lockhart、1996；Alivisatos、1996；Korriyoussoufi、1997；Elghanian、1997；Lin、1997、Herne、1997）。典型的に、RNAまたはDNAのいずれかにおける特定のヌクレオチド配列（すなわち、「標的配列」）の有無を決定するための核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、多数の段階を含む。第一に、標的配列の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを、容易に検出可能な原子または群によって標識する。標識したプローブを、標的ヌクレオチド配列を含むことが疑われる試験試料にハイブリダイズ条件で曝露すると、標的はプローブとハイブリダイズするであろう。試料中の標的配列の存在は、多様な方法で、通常、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブとを分離してから、プローブハイブリッドにおける標識の有無を決定する、またはハイブリダイズしていないプローブにおける標識量を決定することのいずれかによって、ハイブリダイズした標識プローブの量を決定することによって、定性的または定量的に決定することができる。適した標識は、発光、放射活性、比色法、x-線回折または吸収、磁気または酵素活性によって検出可能なシグナルを提供してもよく、例えば、蛍光体、発色団、放射活性同位元素、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれてもよい。しかし、選択される特異的標識法は、標識の結合の容易さ、その感度および経時的安定性、迅速かつ容易な検出および定量のみならず、費用および安全性の問題のような、様々な要因に依存する。このように、標識技術が豊富であるにもかかわらず、対象となる材料を検出するための特定の系の有用性、用途の広さ、および診断的価値は、しばしば限られている。
【０００５】
現在用いられているミスマッチ検出法の中には、一本鎖構造多形（SSCP）（Thigpen、1992；Orita、1989）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）（Finke、1996；Wartell、1990；Sheffield、1989）、RNアーゼ保護アッセイ（PeltonenおよびPulkkinen、1986；Osborne、1991）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Wu、1989）、対立遺伝子特異的PCR（Finke、1996）および大腸菌mutSタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の利用（Modrich、1991）が含まれる。
【０００６】
最初の三つの方法において、新しい電気泳動バンドの出現は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって認められる。SSCPは、pH、温度等の変化のような異なる条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動における一本鎖DNA配列の移動速度の差を検出する。一本鎖DNAセグメントのヌクレオチド塩基配列の変化（変異または多形による）によって、空間的な配置の差そしてこのように移動度の差が起こる可能性がある。DGGEは、変異が存在する場合または存在しない場合のDNAセグメントの安定性の差を利用する。二本鎖配列に変異を導入すると、DNA二本鎖を脱安定化させるミスマッチを変異部位で作製する。ホルムアミドの勾配を増加させるゲル（変性勾配ゲル）を用いて、変異体および野生型DNAは、その変化した移動距離によって区別することができる。RNアーゼ保護アッセイの基礎は、RNアーゼA酵素がその相補鎖と完全にハイブリダイズしていないmRNAを切断するのに対し、完全にハイブリダイズした二本鎖は、RNアーゼA消化から保護される点である。ミスマッチが存在すると、ハイブリダイゼーションは不完全となり、このように、変異部位でRNアーゼAによる切断が起こる。切断時のこれらのより小さい断片の形成は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出することができる。ミスマッチ検出に基づく技術は、一般的に遺伝子またはそのmRNA産物における点突然変異を検出するために用いられる。これらの技術は、シークエンシングより感度が悪いものの、多数の腫瘍試料について行うにはより単純である。RNアーゼA保護アッセイの他に、酵素的または化学的切断によってミスマッチを検出するために用いることができる他のDNAプローブが存在する。例えば、SmookerおよびCotton、1993；Cotton、1988；Shenk、1975を参照されたい。他の酵素的方法には、例えば、相補的標的核酸上でハイブリダイズする隣接する二つのオリゴヌクレオチドを共有結合させるDNAリガーゼの利用が含まれ、例えばLandegren（1988）を参照されたい。ミスマッチは、ライゲーション部位で起こらなければならない。
【０００７】
または、ミスマッチはまた、マッチした二本鎖と比較したミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度のシフトによって検出することができる（Cariello、1988）。リボプローブまたはDNAプローブのいずれかによって、変異を含む可能性がある細胞mRNAまたはDNAは、ハイブリダイゼーションの前にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅することができる。遺伝子そのもののDNAにおける変化は、特に、変化が欠失および挿入のような大きい再配列である場合、サザンハイブリダイゼーションを用いても検出することができる。
【０００８】
PCRを用いて増幅されている特定の遺伝子のDNA配列はまた、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングしてもよい。これらのプローブは、そのそれぞれが調べた遺伝子の対応するセグメントに対して相補的であって、既知の変異を含んでも含まなくてもよい核酸オリゴマーである。アッセイは、特異的配列に関するハイブリダイゼーションシグナルの有無を検出することによって行われる。対立遺伝子特異的PCRの場合、PCR技術は、その3'末端で特定の変異配列に選択的にハイブリダイズする独自のプライマーを利用する。特定の変異が存在しない場合、増幅産物は認められない。
【０００９】
さらに、遺伝子または周辺のマーカー遺伝子の制限断片長多形（RFLP）プローブを用いて、対立遺伝子の変化または多形断片における挿入を評価することができる。しかし、制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、一般的に4〜10塩基対の範囲であることから、任意の一つの酵素によってモニターされるのはゲノムのごく小さい部分に過ぎない。
【００１０】
塩基の置換を同定するもう一つの手段は、核酸断片の直接シークエンシングである。従来の方法は、特定のヌクレオチドでの分解によって、または複製鎖のジデオキシ鎖終結によって無作為に終了した異なるように標識されたDNA断片の混合物を調製することに基づいている（Maxam＆Gilbert、1980；Sanger、1977）。得られた1〜500塩基対のDNA断片をゲル上で分離して、隣接する試料の長さがヌクレオチド1個分異なる梯子状のバンドを形成する。核酸をシークエンシングする他の方法は、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングである（SBH、Drmanac、1993）。短いn-ヌクレオチドオリゴマー（n-mer）のミスマッチ識別ハイブリダイゼーションを用いて、標的DNAに関する成分n-merのリストを決定してもよい。標的DNAのDNA配列は、独自の重なり合うように得たオリゴヌクレオチドによって構築してもよい。さらにもう一つのアプローチは、遺伝子変異を決定するために高密度オリゴヌクレオチドアレイとのハイブリダイゼーションに依存する。二色標識スキームを用いて、参照DNAまたはRNAに対する多形標的の同時比較を行うことができる（Lipshutz、1995；Chee、1996；Hacia、1996）。
【００１１】
これらの既知の先行技術の塩基対ミスマッチ検出法のそれぞれは、適当な感度、特異性、およびアッセイの自動化の容易さに影響を及ぼす制限を有する。特に、これらの方法は、配列組成と無関係にミスマッチを検出することができず、注意深く制御された条件を必要とし、ほとんどの方法が多数のミスマッチのみを検出する。これらの方法を制限するさらなる短所は、バックグラウンドシグナルが高いこと、酵素特異性が不良であること、および／または混入が含まれる。
【００１２】
過去10年のあいだに、光による電子移動反応における電荷の移動媒体としてのDNAならびに変異誘発および発癌におけるその役割に注目が集まっている。例えば、光による電子移動のための供与体および受容体として、様々な八面体金属錯体（インターカレーションによってDNAに堅固に結合する）を用いる研究が行われた。ルテニウム、オスミウム、コバルト、ニッケルおよびレニウムのDppz複合体は、堅固なインターカレート結合ならびに独自の光物理的および電気化学的特性を示した。DNAが存在しなければ、水溶液中で金属錯体に放射線を放射しても光発光を認めなかった（溶媒からの光子移動による消光の結果として）が、DNAの存在下では、錯体の励起は、有意な長波長の放出を与えた（現在ではインターカレート複合体は、消光から保護されている）。フェナントレンキノン-ジイミン（phi）リガンドを含むロジウムインターカレート剤を用いる研究は、選択的インターカレーションによる堅固なDNA結合を示し、中には、DNA結合タンパク質に近づく親和性および特異性を示したものもあった。
【００１３】
DNAを分子架橋として用いる光による電子移動は、様々な系において確立されている。供与体および受容体としてDNAの塩基スタックにインターカレートした金属錯体を用いて、DNAπ-スタックが、長い範囲の電子移動を促進できることが提唱されている。さらに、DNA塩基の酸化還元誘発反応の産物は、インターカレート酸化物質とは離れた部位で検出されている（Hall、1996；Dandliker、1997；Hall、1997；Arkin、1997）。例えば、金属インターカレート剤は、離れた部位から穴の中の長距離移動によって酸化的DNA障害を促進できることが示されている。ロジウムインターカレート剤が一端に共有結合し、酸化の5'-GG-3'二重項部位とは空間的に離れているオリゴマーDNA二本鎖を調製した。ロジウムによる光酸化は、5'-GG-3'ダブレットの5'-Gで特異的に起こり、ロジウムインターカレーションの部位とは37Åまで離れて認められた。さらに、ロジウムインターカレート剤は、400 nmの光を励起して、合成16量体オリゴヌクレオチド二本鎖の中心に部位特異的に組み入れられたチミン二量体の修復を開始することが判明した。修復メカニズムは、インターカレートされたφリガンドに電子の欠損（穴）が局在するロジウム錯体の、リガンド内励起状態による二量体の酸化によって進行すると考えられた。金属インターカレート剤のあいだの電子移動と同様に、長距離の酸化的プロセスの効率は、塩基スタックへの反応物質のカップリングに対して極めて感度がよいことが判明し（Holmlin、1997）、酸化電位と共に塩基のスタックそのものの完全性に依存した（Kelley、1997c、1997d；Hall、1997；Arkin、1997）。ミスマッチまたは隆起によって引き起こされた障害は、DNA媒介電荷輸送効率を大きく減少させた。
【００１４】
他の研究は、オリゴヌクレオチドの末端位でアミノ改変糖に直接配位結合した非インターカレートルテニウム錯体を用いてDNAの中の電子移動を報告した（Meade、1995）。この系において、電子移動はタンパク質様であることが示唆された。カップリングにおけるエネルギーの差がσ結合相互作用に依存するタンパク質では、システム間の小さいエネルギーの差が電子カップリングの大きい差を引き起こさない。しかし、DNA二重らせんでは、π-スタッキングは、小さいエネルギーの差がカップリング効率の大きい差とならないように電子カップリングに関与しうる。より最近、Lewisと共同研究者は、ヘアピン上部で結合した関連するスチルベン結合によるDNAヘアピンにおけるグアニン塩基の光酸化率を測定した（Lewis、1997）。ヘアピン内のグアニン塩基の位置を系統的に変化させて、電子移動速度を測定することによって、電子カップリングパラメータであるβの値を求めることができる。ここで、βは、σ結合アレイの場合にタンパク質において認められた値と、高度にカップリングしたπ結合アレイに関して認められた値との中間であることが判明した。
【００１５】
低分子／DNA複合体の電子化学研究は、酸化還元電位におけるDNAによる変化および／または有機および無機分子種の拡散定数を分析して結合定数を得る溶液相の現象に主に重点を置いている（Carter、1989、1990；Rodriguez、1990；Welch、1995；Kelly、1986；Molinier-Jumel、1978；Berg、1981；Plambeck、1984）。さらに、電子化学的に酸化された遷移金属錯体によって触媒されるグアニン酸化速度を用いて、溶液中のミスマッチを検出するために塩基の溶媒到達性が評価されている（Johnston、1995）。低分子とDNAとの会合によって誘発された電子化学シグナルもまた、他の新規バイオセンサーの設計に応用されている。この目的のため、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるために多様な結合によって電極表面に固定されている。これらには、金に固定されたチオール（Hashimoto、1994a、1994b；Okahata、1992）、ガラス状炭素に固定されたグアニン残基のカルボジイミドカップリング（Millan、1993）、およびAl3+-処理金上に固定されたアルカンビスホスホネート被膜（Xu、1994、1995）が含まれる。質量の直接の変化（水晶結晶の微量天秤によって測定）（Okahata、1992）および電流の変化（Hashimoto、1994a、1994b；Millan、1993）または二本鎖結合分子による電気生成化学発光（Xu、1994、1995）は、二本鎖DNAのレポーターとして用いられている。チオール化ポリヌクレオチドによって改変された金表面も同様に金属イオンおよびDNA結合薬を検出するために用いられている（Maeda、1992、1994）。
【００１６】
ますます増えつつある臨床、環境、農業およびバイオテクノロジー応用において用いられる他の既知の電子化学センサーには、酵素に基づくバイオセンサーが含まれる。電流滴定酵素電極は典型的に、電極と、基質によって還元または酸化される酸化還元酵素の活性部位とのあいだに何らかの形の電気的連絡を必要とする。一つのタイプの酵素電極において、非天然酸化還元対は、基質還元酵素から電極への電子移動を媒介する。このスキームにおいて、酵素は所定の速度でその天然の基質によって還元される；還元された酵素は次に、酵素に拡散する酸化還元対の非天然酸化成分によって急速に酸化されて、還元され、拡散して、それが酸化された電極に最終的に拡散する。
【００１７】
基質還元酵素からの電子は、酵素の天然の再酸化剤へ、またはポリマーの酸化還元中心によって電極へのいずれかに移動するであろう。後者のプロセスのみが電流に関与する。このように、後者のプロセスを最初のプロセスより速く行うことが望ましい。これは、（a）酸化還元中心の濃度を増加させる、または（b）これらの中心が確実に速いこと、すなわち、それらが確実に迅速に酸化および還元されるようにすることによって行うことができる。
【００１８】
ほとんどの天然の酵素は、電極で直接酸化されないが、媒介物質は電極に結合するか、または溶液中に存在する必要がある。しかし、酵素は、還元状態であれば、それらが電極に電子を移動すると、そのタンパク質酸化還元対との結合によって化学的に改変されうることが示されている。同様に、溶液中の酸化還元ポリ陽イオンがポリ陰イオン酵素と静電気的に複合体を形成する場合、電子はこれらの複合体の中を基質から酵素へと、そして酵素から酸化還元ポリマーを通って電極へと流れるであろう。さらに、酵素を電極に電気的に接続するポリ（ビニル-ピリジン）のような酸化還元活性ポリマーが導入された系が開発されている。この場合、ポリ陽イオン酸化還元ポリマーは、酵素に関する何らかの酸化還元タンパク質、例えば、チトクロームcオキシダーゼの場合はチトクロームcの天然の引力を模倣するように、ポリ陰イオングルコースオキシダーゼとの静電気的複合体を形成する。
【００１９】
本発明は、DNA媒介電荷輸送によってミスマッチおよび一般的なDNA損傷を検出するための新規アプローチを提供する。この電気化学的方法は、インターカレート性酸化還元活性種を用いるDNA媒介電子移動に基づいており、ミスマッチのような塩基スタッキング障害を含む二本鎖と比較した場合の、完全な塩基対形成二本鎖によって産生された電流または電荷の差を検出する。位置づけ可能な（addressable）多電極アレイで行うと、本発明の方法によって、一回の測定のあいだに多数の配列の処理を行うことができ、このように、野生型配列の大きいプールにおけるごく少数の変異DNA試料の検出ならびにRNA／DNAハイブリッドおよび二本鎖DNAにおける一塩基損傷の検出を含む、多数の遺伝子欠損に関するスクリーニング効率を有意に改善する。最も重要なことは、アッセイは、条件依存的なハイブリダイゼーション事象そのものに基づく熱力学的な差ではなくて、ハイブリダイズした二本鎖内での塩基対スタッキングにおける構造の差に関して直接報告する。その結果、ミスマッチの検出は、配列組成とは無関係となり、このアプローチに基づくセンサーは、他の既存の方法に対して範囲、感度、および精度において根本的な長所を提供する。
【発明の開示】
【００２０】
発明の概要
本発明は、核酸配列における遺伝子点突然変異および一般的なDNA損傷を検出するための非常に感度のよい正確な方法を提供し、DNA媒介電荷輸送によるバイオセンサーとしてのその応用を提供する。本発明はまた、DNA電荷輸送を用いて、DNA塩基スタッキングにおける関連障害を検出することに基づく、DNA改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイを提供する。特定の態様において、本発明は、インターカレート性酸化還元活性種と組み合わせたオリゴヌクレオチド二本鎖によってその表面を改変することによって調製される電極、および電子が電極と酸化還元種とのあいだを移動する電気化学的プロセスに基づくセンサーとしてのその利用に関する。もう一つの態様において、本発明はまた、塩基対ミスマッチ、塩基のフリッピング（flipping）、またはタンパク質-核酸相互作用による他の塩基スタッキング障害にも関する。さらに、タンパク質-DNA相互作用によって、二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応の電気的モニタリング法が可能となる。
【００２１】
本発明の一つの局面は、インターカレート性酸化還元活性部分を用いて、一連のオリゴヌクレオチド二本鎖における連続的な点突然変異の存在を決定する方法に関する。好ましい方法には、（a）核酸分子の一つが官能基リンカーによって誘導体化されている、ハイブリダイズ条件で、第一の核酸分子の少なくとも一つの鎖を第二の核酸分子の鎖に接触させる段階、（b）電極または位置づけ可能な多電極アレイにこの二本鎖を沈着させる段階、（c）塩基対ミスマッチを含む可能性がある吸着した二本鎖を、複合体を形成させるために適した条件でインターカレート性酸化還元活性部分に接触させる段階、（d）吸着された二本鎖に塩基対ミスマッチが存在することの指標として、生成した電流または電荷量を測定する段階、（e）複合体を分離するために変性条件で複合体を処理して、一本鎖オリゴヌクレオチドの単層を生じる段階、および（f）一本鎖オリゴヌクレオチドをもう一つの標的配列と再度ハイブリダイズさせる段階が含まれる。様々なオリゴヌクレオチドプローブを連続的に分析する場合には、段階（c）から（f）を繰り返すことができる。完全な塩基対形成配列、すなわち野生型配列に関して認められたシグナルと比較して弱いシグナルは、変異配列に対応するであろう。
【００２２】
いくつかの場合において、インターカレート性酸化還元活性種を二本鎖に架橋して、段階（a）から（d）のみからなるアッセイを行うことが望ましいかも知れない。
【００２３】
もう一つの好ましい方法は、電気触媒原理を利用する点突然変異の検出に関する。より詳しく述べると、この方法は、単層に結合するインターカレート性酸化還元活性種と溶液中に残っている非インターカレート性酸化還元活性種とを含む溶液に液浸した電極結合二本鎖DNA単層を利用する。この方法には、（a）核酸分子の一つが官能基リンカーによって誘導体化されている、第一の核酸分子の少なくとも一つの鎖をハイブリダイズ条件で第二の核酸分子の鎖に接触させる段階、（b）電極または位置づけ可能な多電極アレイに、塩基対ミスマッチを含む可能性があるこの二本鎖を沈着させる段階、（c）この複合体を、複合体の形成を可能にするために適した条件で、インターカレート性酸化還元活性部分と非インターカレート性酸化還元活性部分とを含む水溶液に液浸する段階、（d）吸着された二本鎖内に塩基対ミスマッチが存在する指標として産生された電流または電荷量を測定する段階、（e）複合体を分離するために変性条件で複合体を処理して、一本鎖オリゴヌクレオチドの単層を得る段階、および（f）一本鎖オリゴヌクレオチドをもう一つの標的配列と再度ハイブリダイズさせる段階が含まれる。様々なオリゴヌクレオチドプローブを連続的に分析する場合には、段階（c）から（f）を繰り返すことができる。この方法を利用すると、表面結合酸化還元活性部分による非インターカレート性酸化還元活性部分の電気触媒的還元により、顕著な電流およびこのように増加したシグナルが認められるであろう。
【００２４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、起こりうる全ての一塩基ミスマッチ、野生型配列の大きいプールにおける少数の変異DNA試料、DNAまたはRNA/DNAハイブリッドのいずれかにおけるいくつかの天然に存在する塩基損傷および一塩基損傷を検出することができる電気触媒アッセイを提供する。特に、本発明の方法は、単層表面に結合するインターカレート性酸化還元活性種と、溶液中に残っている非インターカレート性酸化還元活性種とを含む溶液に液浸した電極結合二本鎖DNA単層を利用する。本発明の方法には、誘導体化してもよい第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列に接触させて、二本鎖を形成する段階であって、第二の一本鎖核酸標的配列が、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層とハイブリダイズし；単層が、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させて、一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、かつ第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する段階；インターカレート性酸化還元活性種と非インターカレート性酸化還元活性種とを含む溶液に核酸改変被膜を液浸する段階；ならびにインターカレート性酸化還元活性部分による、非インターカレート性酸化還元活性種の触媒的還元の電流または電荷を測定する段階であって、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される段階、が含まれる。様々なオリゴヌクレオチドプローブを連続的に分析する場合には、最後の二段階を繰り返すことができる。この方法を用いると、表面に結合した酸化還元部分による非インターカレート性酸化還元活性種の電気触媒的還元により、顕著な電流およびこのように増加したシグナルが認められるであろう。
【００２５】
一般的に、その熱力学的安定性が比較的高いこととDNA二本鎖に対するその改変が軽微であることから、これらの損傷は検出することが非常に難しく、ポストラベル技法は好ましい分析方法である。しかし、これらの損傷は、DNA二本鎖内での電子カップリングを障害するように思われる。その結果、電気触媒にカップリングさせたDNA媒介電荷輸送は、それらの障害に対して感受性がある。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの局面は、タンパク質の有無を検出する方法に関し、それには（a）核酸分子の一つが官能基リンカーによって誘導体化され、および形成された二本鎖が、選択される核酸結合タンパク質の認識部位を含むように設計される、第一の核酸分子の少なくとも一つの鎖をハイブリダイゼーション条件で第二の核酸分子の鎖に接触させる段階、（b）電極または位置づけ可能な多電極アレイにこの二本鎖を沈着させる段階、（c）複合体を形成させるために適した条件で、吸着された二本鎖をインターカレート性酸化還元部分に接触させる段階、（d）インターカレート性酸化還元部分を二本鎖におそらく架橋させる段階、（e）核酸結合タンパク質の存在に関して分析される第一の試料溶液に複合体を液浸する段階、（f）試料溶液中の核酸結合タンパク質の有無の指標として産生された電流または電荷量を測定する段階、（g）核酸結合タンパク質を除去するために適当な条件で複合体を処理する段階、および（h）複合体を分離するために核酸結合タンパク質の存在に関して分析される第二の試料溶液にそれを液浸する段階、が含まれる。様々な試料溶液を連続的に分析する場合には、段階（e）から（h）を繰り返すことができる。核酸結合タンパク質を含まない参照溶液に関して測定されたシグナルと比較して弱いシグナルは、その認識部位に結合して、このように塩基スタッキング障害を引き起こす核酸結合タンパク質が存在することを示している。
【００２７】
もう一つの局面において、本発明は、DNA電荷輸送を用いるDNA塩基スタッキングにおける塩基フリッピングの検出に基づく、核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学的アッセイに関し、それには以下が含まれる；a）第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列および電気化学プローブ結合配列を含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列にハイブリダイズさせて二本鎖を形成する段階。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極にまず付着させ、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成し；b）この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加え；c）二本鎖核酸改変被膜に、第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を加え；かつd）産生された電荷を測定して、タンパク質を含まずに測定された電荷と比較して、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合による塩基フリッピングの有無が示される段階。
【００２８】
本発明のもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いてDNA塩基スタッキングにおける関連障害の検出に基づく核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイに関する。方法は以下を含む：a）第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列と電気化学プローブ結合配列とを含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列とハイブリダイズさせて、二本鎖を形成する段階。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極にまず付着させて、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製し、第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖核酸配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成し；b）この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加え；c）第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を二本鎖核酸改変被膜に加え；かつd）産生された電荷を測定して、タンパク質なしで測定された電荷と比較して、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合によるDNA塩基スタッキング障害の有無が示される段階。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いて、二本鎖核酸配列に対するタンパク質結合に関連した二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応の電気化学的モニタリング法に関し、以下が含まれる：a）第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列と電気化学プローブ結合配列とを含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列にハイブリダイズさせて、二本鎖を形成する段階。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖を電極にまず付着させて、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズし、かつ第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成し；b）この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加え；c）二本鎖核酸改変被膜に、第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を加え、かつd）産生された電荷を測定して、タンパク質なしで測定された電荷と比較して、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖の酵素反応の有無が示される段階。
【００３０】
本発明はまた、酸化還元活性部分の特性にも関する。適したインターカレート性酸化還元部分の必要条件には、その中でオリゴヌクレオチド表面結合が安定であるウィンドウに関してその酸化還元電位の位置と共に、オリゴヌクレオチドとの共有結合の合成実現可能性が含まれる。さらに、酸化還元活性インターカレート剤の化学および物理的特徴は、部位特異的または非特異的にそのインターカレーションを促進してもよい。好ましい態様において、酸化還元活性種は、それ自身がインターカレート剤であるか、またはインターカレート性部分を含む核酸結合タンパク質のような大きな部分である。
【００３１】
電気触媒に基づくアッセイの場合の非インターカレート性酸化還元活性種の特性は、そのアッセイにおいて利用されたインターカレート性酸化還元種の酸化還元電位に主に依存する。
【００３２】
本発明のさらにもう一つの局面は、オリゴヌクレオチドプローブの組成および長さ、ならびにそれらを作製する方法に関する。好ましい態様において、プローブは、等しい長さの二つの核酸鎖からなる。もう一つの好ましい態様において、二つの核酸鎖は、長さが等しくなく、所望の配列組成の一本鎖オーバーハング（すなわち「粘着末端」）を生じる。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、好ましくは12〜25オリゴヌクレオチドの範囲であるが、一本鎖オーバーハングは長さがおよそ5〜10ヌクレオチドである。これらの一本鎖オーバーハングは、相補的オーバーハングを有する他のオリゴヌクレオチドまたはマッチする認識部位を有する酵素の部位特異的吸着を促進するために用いることができる。
【００３３】
本発明はさらに、吸着された二本鎖の空間的に位置づけ可能なアレイを作製する方法に関する。好ましい方法には、（a）官能基リンカーによって誘導体化した多様な配列組成物の二本鎖を生成する段階、（b）多電極アレイ上の異なる部位にこれらの二本鎖を沈着させる段階、（c）変性条件で複合体を処理して、一本鎖オリゴヌクレオチドの単層を形成する段階、および（d）相補的標的配列とこれらの一本鎖オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズする段階が含まれる。もう一つの好ましい方法には、（a）官能基リンカーによって一つの端部を誘導体化して、既知の配列組成物の一本鎖オーバーハング（長さが約5〜10ヌクレオチド）を反対の端部に含む、長さが5〜10塩基対のオリゴヌクレオチド二本鎖を多電極アレイに沈着させる段階、および（b）相補的オーバーハングを含む一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドに、ハイブリダイズ条件でこれらの電極結合二本鎖を接触させる段階が含まれる。
【００３４】
本発明のもう一つの局面は、電極の特性、オリゴヌクレオチド二本鎖を電極に沈着させる方法（酸化還元活性部分をそれに吸着させて、またはさせずに）、およびオリゴヌクレオチド二本鎖を電極に連結する結合の特性に向けられる。好ましい態様において、電極は金であり、オリゴヌクレオチドは、硫黄結合によって電極に付着する。もう一つの好ましい態様において、電極は炭素であり、結合はより安定なアミド結合である。いずれの場合においても、オリゴヌクレオチドと電極とを接続するリンカーは、好ましくは共有結合5〜20個からなる。
【００３５】
本発明のもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いて、DNA塩基スタッキングにおける塩基フリッピングの検出に基づく核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイに関する。このアッセイは、核酸構造のタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。
【００３６】
本発明のもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いてDNA塩基スタッキングにおける関連障害の検出に基づく核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイに関する。このアッセイは、核酸構造におけるタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いて、二本鎖核酸配列に対するタンパク質結合に関連した二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応を電気化学的にモニターする方法に関する。このアッセイは、核酸構造におけるタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの局面は、インターカレート性酸化還元種と組み合わせた電極結合二本鎖によって生成された電流または電荷を検出する様々な方法に関する。好ましい態様において、電流または電荷は、電子的方法、例えばボルタンメトリーもしくはアンペロメトリー、または光学的方法、例えば蛍光もしくは燐光を用いて検出される。もう一つの好ましい態様において、電流が生成される電位は、クロノクーロメトリー（chronocoulometry）によって検出される。
【００３９】
表1は、二本鎖改変電極に非共有結合した1.0 μMダウノマイシンに関して測定されたサイクリックボルタンモグラムに基づく一塩基ミスマッチの電気化学的検出を示す。
【００４０】
発明の詳細な説明
「ポリヌクレオチドの増幅」という表現には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、LCR）、およびQ-βレプリカーゼを用いることに基づく増幅法のような方法が含まれる。これらの方法は周知であり、当技術分野において広く実践されている。例えば、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、ならびにInnisら、1990（PCRに関して）およびWuら、1989a（LCRに関して）を参照されたい。PCRを実施するための試薬およびハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域からの配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくは標的領域またはその隣接領域の配列に対して相補的であって、特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成された核酸配列は、直接シークエンシングしてもよい。または、増幅された配列（複数）は、配列分析の前にクローニングしてもよい。酵素的に増幅されたゲノムセグメントの直接クローニングおよび配列分析の方法は、Scharf（1986）によって記述されている。
【００４１】
「塩基スタッキング障害」という用語は、例えば、塩基対のミスマッチ、その認識部位に対するタンパク質の結合、脱塩基部位、隆起、またはオリゴヌクレオチド付加物を形成する他の任意の実体のような、塩基スタッキングの障害を引き起こす任意の事象を指す。
【００４２】
「塩基のフリッピング」という用語は、それによって標的核酸塩基が二重らせんからはじき飛ばされて、その塩基を反応にとって到達可能にするプロセスを指す。
【００４３】
「変性」という用語は、それによってオリゴヌクレオチド二本鎖が水素結合によってもはや塩基対形成されず、一本鎖分子に分離されるプロセスを指す。変性法は当業者に周知であり、これには熱変性およびアルカリ変性が含まれる。
【００４４】
「電極」という用語は、導電媒体へとそして導電媒体から電流を伝導する導体を指す。二つの電極、すなわち陰極と陽極は、それぞれ電子を受領して放出する。電極は、一般的に導体を記述するために用いられる。本発明において、電極はまた、個々に位置づけ可能な多数の電極からなるマイクロアレイ、または超微小電極であってもよい。
【００４５】
「ハイブリダイズした」という用語は、完全に塩基対を形成してもしていなくてもよい、互いに関連した二つの核酸鎖を指す。
【００４６】
「インターカレート性部分」という用語は、二本鎖オリゴヌクレオチドの隣接する塩基対のあいだに部分的挿入およびスタッキングすることができる平面の芳香族またはヘテロ芳香族部分を指す。これらの部分は、低分子であってもよく、またはタンパク質のような大きい部分の一部であってもよい。本発明の意味において、インターカレート性部分は、反応を生成するかまたは触媒事象を媒介することができる。
【００４７】
「損傷」という用語は、DNAまたはRNAの構造における異常な変化を指す。損傷には、DNAまたはRNAにおける変異およびミスマッチが含まれてもよく、損傷は天然に存在するか、または天然に存在しなくてもよい。
【００４８】
「ミスマッチ」という用語は、100％相補性でないハイブリダイズした二本鎖内の核酸塩基を指す。ミスマッチには、ワトソン-クリックの塩基対A：TまたはG：CでないDNAの相補鎖に存在する二つのヌクレオチドの塩基間の任意の不正確な対形成が含まれる。全体的な相同性の欠如は、欠失、挿入、反転、置換、またはフレームシフト変異による可能性がある。
【００４９】
「変異」という用語は、DNA内の配列再配列を指す。最も一般的な一塩基変異は、他の塩基の代わりに一つのプリンまたはピリミジンを用いる（例えば、Gの代わりにA、またはTの代わりにC、またはその逆）、「トランジション」と呼ばれる変異のタイプを含む。他のあまり頻繁でない変異には、プリンがピリミジンの代わりに用いられるかまたはその逆の「トランスバーション」、および少数（1、2、または3個）のヌクレオチドの付加または喪失がそれぞれ、複製プロセスの何らかの段階でDNA二本鎖の一つの鎖に起こる「挿入」または「欠失」が含まれる。そのような変異はまた、二つのヌクレオチドの一つの挿入／欠失の場合には遺伝子コードのタンパク質への翻訳に及ぼすその作用のために、「フレームシフト」変異として知られる。より大きい配列再配列を含む変異も同様に起こる可能性があり、遺伝医学において重要となりうるが、その発生は先に概要したクラスと比較して比較的まれである。
【００５０】
「ヌクレオシド」という用語は、五炭糖、リボース、デオキシリボース、またはその誘導体もしくは類似体に結合する窒素複素環骨格を指す。「ヌクレオチド」という用語は、窒素複素環骨格、五炭糖、および一つまたは複数の燐酸塩または他の骨格形成基を含むヌクレオシドの燐酸エステルに関する；これはオリゴヌクレオチドの単量体単位である。ヌクレオチド単位には、グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）またはその誘導体のような一般的な塩基が含まれてもよい。五炭糖は、デオキシリボース、リボース、またはその置換基の群であってもよい。
【００５１】
「ヌクレオチド類似体」、「改変塩基」、「塩基類似体」、または「改変ヌクレオシド」という用語は、天然に存在する相対物と類似のように機能するが構造的に改変されている部分を指す。
【００５２】
「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、特定の配列において、天然に存在する複素環骨格と、ホスホジエステルまたは他の骨格形成基を通して結合したペントフラノシル同等基とによって形成された複数の結合ヌクレオチド単位を指す。
【００５３】
「オリゴヌクレオチド類似体」または「改変オリゴヌクレオチド」という用語は、天然のオリゴヌクレオチドと類似のように機能するが、天然に存在しない部分を有する組成物を指す。オリゴヌクレオチド類似体または改変オリゴヌクレオチドは、当技術分野での使用が既知である、改変された糖部分、改変された塩基、改変された糖と塩基の双方、または改変された糖間結合を有してもよい。
【００５４】
「酸化還元活性部分」または「酸化還元活性種」という用語は、酸化および還元されうる化合物、すなわち、電子を受容して移動させる一つまたは複数の化学機能を含む化合物を指す。
【００５５】
「酸化還元タンパク質」という用語は、電子に可逆的に結合するタンパク質を指す。補欠分子団が存在しない最も単純な酸化還元タンパク質は、チオレドキシンの場合のような、二つのシステイン残基のあいだにジスルフィド結合の可逆的な形成を用いるタンパク質である。しかし、ほとんどの酸化還元タンパク質は、フラビンまたはNADのような補欠分子団を利用する。多くは、鉄または銅イオンが二つの異なる酸化還元状態に存在できることを利用している。
【００５６】
本発明は、単一または多数の塩基対ミスマッチの存在および位置を決定するために、インターカレート性酸化還元活性種を用いる電気化学アッセイに基づく非常に感度の高い正確な方法を提供する。簡単に説明すると、系は、（i）それに対してインターカレート性酸化還元部分が会合する電極結合オリゴヌクレオチド二本鎖を含む試薬混合物、および（ii）完全に塩基対を形成した二本鎖対ミスマッチ含有二本鎖の存在の指標として、生成された電流または電荷を検出および定量する手段からなる。本発明は、点突然変異によって生じた遺伝子疾患の診断において特に有用である。例えば多くの癌を、キナーゼ、増殖因子、受容体結合タンパク質および／または核タンパク質における点突然変異まで追跡することができる。遺伝子障害から生じた他の疾患には、嚢胞性線維症、ブルーム症候群、地中海貧血、および鎌状赤血球貧血が含まれる。さらに、DCC、NF-1、RB、p53、erbAおよびウィルムス腫瘍遺伝子のような癌に関連するいくつかの特異的遺伝子と共に、abl、erbB、src、sis、ras、fos、myb、およびmycのような様々な腫瘍遺伝子が既に同定されており、特異的変異に関して調べられている。
【００５７】
本発明は、酸化還元活性種を有するオリゴヌクレオチド二本鎖が、その電位が該化学部分の還元を行うために十分な電位と、化学部分の酸化を行うために十分な電位のあいだで振動する電極に吸着されて、したがって絶えず曝露される、単一または多数の点突然変異を検出する方法を提供する。本発明の方法は、多くの理由から他の方法より好ましい。最も重要なことは、本発明の方法によって、完全に塩基対を形成した二本鎖と比較した、ミスマッチを含む二本鎖に関して測定された電流の差に基づいてオリゴヌクレオチド二本鎖内に存在する一つまたは複数のミスマッチを検出することができる。このように、本発明の方法は、ミスマッチの塩基スタッキングの差に基づいており、ハイブリダイゼーションの熱力学的差に依存する既存の方法とは対照的に、ハイブリダイズした二本鎖の配列組成とは無関係である。さらに、本発明の方法は、有害でなく、安価であり、単独または他のハイブリダイゼーション依存的な方法と組み合わせて広く多様な応用に利用することができる。
【００５８】
本発明の一つの特定の局面は、以下を含む多数の核酸試料内でのミスマッチの連続的な検出法に関する：核酸の一つが官能基リンカーによって誘導体化される、核酸分子の少なくとも一つの鎖が、第一の核酸標的配列と適した条件でハイブリダイズして、ミスマッチをおそらく含む二本鎖を形成する。次に、この二本鎖を、単層を形成する電極または位置づけ可能な多電極アレイに沈着させる。インターカレート性酸化還元活性種（例えば、ダウノマイシン）をこの芝状の分子の上に非共有結合によって吸着させて（または望ましければ架橋させ）、吸着されたオリゴヌクレオチド複合体内での塩基対ミスマッチの存在の指標として、生成された電流または電荷を測定する。続いてインターカレート性酸化還元種を含む二本鎖を変性条件で処置することによって、オリゴヌクレオチドの一本鎖単層が得られ、これを第二のオリゴヌクレオチド標的配列に再度ハイブリダイズさせることができる。二本鎖形成段階、インターカレート性酸化還元種の吸着段階、電流または電荷の測定段階、および複合体を変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを再生する段階は、多様なオリゴヌクレオチドプローブにおける遺伝子点突然変異を連続的に検出する場合には、望ましい回数繰り返してもよい。
【００５９】
それぞれの電極を通過した電荷を測定して、野生型、すなわち完全に塩基対を形成した配列と比較する。弱いシグナルを有する電極は変異配列に対応するが、電流または電荷に変化を示さない電極は変異していない。
【００６０】
本発明のもう一つの局面は、電気触媒を利用して変異を検出する方法に関する。簡単に説明すると、オリゴヌクレオチド二本鎖による電極表面の改変は、オリゴヌクレオチドの高い陰性荷電による反発力のために、陰性荷電種が入り込めない媒体を提供する。しかし、電子は、固定された二本鎖を通して、単層の溶媒曝露辺縁部に局在する酸化還元活性インターカレート剤まで往復することができ、次にインターカレート剤がこれらの陰性荷電種を触媒的に還元することができる。より詳しくは、この電気触媒法には、核酸の一つが官能基リンカーによって誘導体化されている、核酸分子の少なくとも一つの鎖が第一の核酸標的配列と適した条件でハイブリダイズして、ミスマッチをおそらく含む二本鎖を形成する段階が含まれる。次に、この二本鎖を単層を形成する電極または多電極アレイの上に沈着させる。集合体を、インターカレート性酸化還元種（例えば、メチレンブルー）と非インターカレート性酸化還元活性種（例えば、フェリシアン化物）の双方を含む水溶液に液浸する。メチレンブルーによって媒介されるフェリシアン化物の触媒的還元に対応する電流または電荷を、メチレンブルーの電位でそれぞれの核酸改変電極に関して測定して、野生型、すなわち完全に塩基対が形成された配列について得られたものと比較する。変性条件での二本鎖のその後の処置によって、オリゴヌクレオチドの一本鎖単層を得て、これを第二のオリゴヌクレオチド標的配列に再度ハイブリダイズさせることができる。二本鎖形成段階、触媒的に増強された電流または電荷の測定段階、および複合体を変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを再生する段階は、多様なオリゴヌクレオチドプローブにおいて遺伝子点突然変異を連続的に検出する場合には、望ましい回数繰り返してもよい。オリゴヌクレオチド改変表面での電気触媒に基づくこの特定の方法は、ミスマッチの存在に帰因する弱いシグナルが小さい系にとって極めて有用である。非インターカレート性電子受容体を加えると、シグナル強度が増幅され、より正確に測定することができる。このアプローチは、オリゴヌクレオチド改変表面に結合するが、酸化還元活性中心がインターカレート性ではないために容易に酸化または還元されない酸化還元活性タンパク質に基づくアッセイをモニターするために特に有用となる可能性がある。
【００６１】
本発明のもう一つの局面は、起こりうる全ての一塩基ミスマッチ、大きいプールの野生型配列内で変異した少数のDNA試料、いくつかの天然に存在する塩基損傷、およびDNAまたはRNA/DNAハイブリッドのいずれかにおける一塩基損傷を検出する電気触媒法に関する。より詳しく述べると、この電気触媒法には、二本鎖を形成するために第一の一本鎖核酸プローブ配列を第二の一本鎖核酸標的配列に接触させることが含まれる。第一の一本鎖核酸は、チオール末端アルキル鎖または他の誘導体によって誘導体化してもよい。第二の一本鎖核酸標的配列は、電極上の第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層にハイブリダイズさせる。第一の一本鎖核酸プローブ配列の単層は、まず第一の一本鎖核酸プローブ配列を含む二本鎖を電極に付着させて、第一の一本鎖核酸プローブ配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製される。第一の一本鎖核酸プローブ配列と第二の一本鎖標的配列とのハイブリッドは、二本鎖核酸改変被膜を形成する。核酸改変被膜を、インターカレート性酸化還元種（例えば、メチレンブルー（MB+））と非インターカレート性酸化還元活性種（例えば、フェリシアン化物）の双方を含む水溶液に液浸する。電気触媒プロセスにおいて、電子は、DNA媒介反応において電極表面からインターカレートしたMB+へと流れる。MB+の還元型であるロイコメチレンブルー（LB+）は次に、より多くの電子がMB+に流れて触媒サイクルが継続するように、溶液中のフェリシアン化物を還元する（図9）。このように、一つの実験において、表面結合DNAには繰り返し呼びかけ信号が送られる。一つまたは複数のミスマッチを含む二本鎖では、より少ないMB+分子が電気化学的に還元され、そのため活性触媒の濃度は大きく低下して全体的な電気触媒反応は減少する。その結果、触媒反応は、ミスマッチに関連した阻害作用を増強する上に、MB+に対応する絶対的なシグナルを増幅する。さらに、その触媒特性により、測定される電荷は試料採取時間が増加するにつれて増加して、これは原則的に溶液中のフェリシアン化物の濃度に限って制限される。インターカレート性酸化還元部分による非インターカレート性酸化還元活性種の触媒還元の電流または電荷を測定して、一つまたは複数の一塩基配列損傷を有しない核酸二本鎖の電流または電荷と比較がした電流または電荷の差から、標的配列における一つまたは複数の一塩基配列損傷の有無が示される。
【００６２】
本発明はさらに、酸化還元活性種の特性に関する。これらの種は、それらが電子（複数）を受容することができる還元状態、およびそれらが電子（複数）を供与することができる酸化状態を有する。オリゴヌクレオチド二本鎖に吸着されるまたは共有結合されるインターカレート性酸化還元活性種には、インターカレート剤、および酸化還元活性部分を含む核酸結合タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。インターカレート性酸化還元部分は、結合がDNA被膜内で個々のらせんの上部に主に拘束されていることから、DNA単層に対して共有結合する必要はない。非共有結合色素はインターカレート性に積み重ねられなければならない。電荷が、DNA被膜を通ってインターカレート性酸化還元活性部分まで輸送されると、触媒サイクルが開始する。さらに、触媒サイクルの完了は、陰イオンDNA被膜の内部から静電気的に反発される陰性荷電フェリシアン化物との反応を含む。このように、被膜の上部付近に結合したインターカレート性酸化還元活性部分のみが、溶液に到達可能であり、従って、触媒サイクルに関与しうる。
【００６３】
明記された電気化学アッセイにとって有用なインターカレート剤は、核酸二重らせんにおいて積み重ねられた塩基対のあいだに部分的挿入を行うことができる物質または部分である。周知のインターカレート剤の例には、フェナンスリジン（例えば、エチジウム）、フェノチアジン（例えば、メチレンブルー）、フェナジン（例えば、フェナジンメトスルフェート）、アクリジン（例えば、キナクリン）、アントラキノン（例えば、ダウノマイシン）、およびインターカレートリガンドを含む金属錯体（例えば、φ、クリセン、dppz）が含まれるがこれらに限定されない。これらのインターカレート剤のいくついかは、オリゴヌクレオチド二本鎖と部位選択的に相互作用する可能性がある。例えば、クリセンリガンドは、二重らせん自身の誤って対形成された部位でインターカレートすることが知られており（Jackson、1997）、これは、インターカレート剤の選択的局在のために利用することができる。これは、インターカレート性酸化還元種をその辺縁部に限って含む二本鎖単層を構築するために特に有用となりうる。
【００６４】
タンパク質の選択は、均一な溶液中であれ、または表面に固定される場合であれ、生体高分子、例えば核酸と非生体高分子とに対するその吸着および結合特性に依存する。吸収または結合特徴を選択的に変化させることによって、これらのアッセイにおける選択性、シグナル対ノイズ比およびシグナルの安定性は、改善することができる。タンパク質の電荷は、表面に対するその吸着、被膜における吸収、電極表面に対する電気泳動沈着、および高分子との相互作用に影響を及ぼす。したがって、選択される高分子、例えば核酸に対するその吸着または結合を増強するために、タンパク質の電荷を調整することは、タンパク質を利用する診断および分析システムにおいて重要である。他の例において、例えば数サイクルのあいだに検出アッセイを用いる場合、高分子からのタンパク質の脱着、除去または剥離を促進できることも等しく重要である。これらのアッセイは、一本鎖オーバーハングを必要としてもよい、選択されるタンパク質の部位特異的結合を可能にするように設計されるオリゴヌクレオチド二本鎖を必要とする。タンパク質が核酸上に吸着されれば、電子はオリゴヌクレオチド二本鎖を中継して電極に送られる。
【００６５】
特定の電気触媒アッセイにおいて用いられる非インターカレート性酸化還元活性種の特性は、同じアッセイにおいて利用されるインターカレート性酸化還元種の酸化還元電位に主に依存する。例には、任意の中性または陰性荷電プローブ、例えば、フェリシアン化物／フェロシアン化物、フェロセンおよびその誘導体（例えば、ジメチルアミノメチル、モノカルボン酸、ジカルボン酸）、ヘキサシアノルテネート、ならびにヘキサシアノオスメートが含まれるがこれらに限定されない。
【００６６】
核酸結合タンパク質の場合、二本鎖結合タンパク質と電極とのあいだのDNA媒介電子移動の差によって、塩基対ミスマッチ、塩基フリッピング、または他の塩基スタッキング障害を検出することができる。さらに、タンパク質-DNA相互作用によって、二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応を電気的にモニターする方法が可能となる。
【００６７】
本発明の一つの局面は、DNA電荷輸送を用いて、DNA塩基スタッキングにおける塩基フリッピングの検出に基づく核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイに関する。このアッセイは、核酸構造におけるタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。第二の一本鎖核酸配列が電極上で第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列と電気化学プローブ結合配列とを含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列とハイブリダイズさせて、二本鎖を形成する。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖をまず電極に付着させて、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズさせることによって調製され、第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する。この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加える。第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を二本鎖核酸改変被膜に加える。産生された電荷を測定して、タンパク質なしで測定された電荷と比較して、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合による塩基フリッピングの有無が示される。
【００６８】
一つの好ましい態様において、電気化学プローブは、二本鎖末端付近のグアニン残基に共有結合によって架橋されるダウノマイシンである。酸化還元プローブの結合部位を確保するために、ダウノマイシンを、DNA被膜の上部に共有結合によって架橋する。共有結合付加物は、ホルムアルデヒドの存在下でグアニン残基における環外アミンとの反応によって形成される。二本鎖における全てのグアニンは、ダウノマイシンが意図される二本鎖の末端を除き、イノシン（I；環外アミンを含まないグアニン）によって置換される。もう一つの態様において、二本鎖核酸改変被膜はMg2+の非存在下で形成される。二本鎖の構築後、残っている曝露表面をメルカプトヘキサノールによって充填する、または「埋め戻す」。一つの説明的な例において、タンパク質はメチルトランスフェラーゼHhaI（M.HhaI）、変異体M.HhaI Q237W、またはウラシル-DNAグリコシラーゼである（実施例23〜28を参照されたい）。
【００６９】
本発明のもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いてDNA塩基スタッキングにおける関連障害の検出に基づく核酸改変電極に対するタンパク質結合の電気化学アッセイに関する。本発明のアッセイは、核酸構造のタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列と電気化学プローブ結合配列とを含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列とハイブリダイズさせて、二本鎖を形成する。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖をまず電極に付着させて、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように、二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖核酸配列のハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する。この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加える。第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を二本鎖核酸改変被膜に加える。生成された電荷を測定して、二本鎖DNAに結合したタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖におけるタンパク質結合によるDNA塩基スタッキング障害の有無が示される。
【００７０】
一つの態様において、電気化学プローブは、二本鎖末端付近でグアニン残基に共有結合によって架橋するダウノマイシンである。酸化還元プローブの結合部位を確保するために、ダウノマイシンをDNA被膜の上部に共有結合によって架橋する。共有結合付加物は、ホルムアルデヒドの存在下でグアニン残基における環外アミンとの反応によって形成される。二本鎖におけるグアニンは、ダウノマイシンが意図される二本鎖末端のグアニンを除き、全てイノシンに置換される（I；環外アミンを含まないグアニン）。もう一つの態様において、二本鎖核酸被膜は、Mg2+の非存在下で形成される。二本鎖の構築後、残っている曝露表面をメルカプトヘキサノールで充填する。一つの説明的な例において、用いたプローブは、TATAボックス結合タンパク質（TBP）またはR. PvuIIである（実施例23〜28を参照されたい）。
【００７１】
本発明のさらにもう一つの局面は、DNA電荷輸送を用いて二本鎖核酸配列に対するタンパク質結合に関連した二本鎖核酸配列におけるDNA酵素反応の電気化学的モニタリング法に関する。本発明のアッセイは、核酸構造のタンパク質依存的変化を調べる方法を提供する。第二の一本鎖核酸配列が電極上の第一の一本鎖核酸配列の単層にハイブリダイズされる、タンパク質結合配列と電気化学プローブ結合配列とを含む一本鎖誘導体化核酸配列の少なくとも一つの鎖を、第二の一本鎖核酸配列とハイブリダイズさせて、二本鎖を形成する。単層は、第一の一本鎖核酸配列を含む二本鎖をまず電極に付着させて、第一の一本鎖核酸配列が電極に付着したままであるように二本鎖を脱ハイブリダイズすることによって調製され、第一の一本鎖核酸配列と第二の一本鎖核酸配列とのハイブリッドが二本鎖核酸改変被膜を形成する。この被膜に、第一の一本鎖核酸配列の電気化学プローブ結合配列に結合する電気化学プローブを加える。第一の一本鎖核酸配列のタンパク質結合配列に結合するタンパク質を二本鎖核酸改変被膜に加える。生成した電荷を測定して、二本鎖DNAに結合するタンパク質を有しない核酸二本鎖の電流または電荷との電流または電荷の差から、二本鎖の酵素反応の有無が示される。
【００７２】
一つの態様において、電気化学プローブは二本鎖末端近傍でグアニン残基に共有結合によって架橋するダウノマイシンである。酸化還元プローブの結合部位を確保するために、ダウノマイシンをDNA被膜の上部に共有結合によって架橋する。共有結合付加物は、ホルムアルデヒドの存在下でグアニン残基における環外アミンとの反応によって形成される。二本鎖におけるグアニンは、ダウノマイシンが意図される二本鎖末端のグアニンを除き、全てイノシンによって置換される（I；環外アミンを含まないグアニン）。もう一つの態様において、二本鎖核酸被膜球は、Mg2+の非存在下で形成される。二本鎖の構築後、残っている曝露表面をメルカプトヘキサノールで充填する。一つの局面において、用いたタンパク質は、PvuIIのような制限エンドヌクレアーゼである（実施例23〜28を参照されたい）。
【００７３】
本発明のさらにもう一つの局面は、以下の段階を含む、DNA二本鎖における塩基スタッキング障害を誘導するタンパク質の有無を検出する方法に関する。核酸の一つが機能的リンカーによって誘導体化されている、核酸分子の少なくとも一つの鎖が、核酸分子の第二の鎖と適した条件でハイブリダイズして二本鎖を形成する。この二本鎖は、その二本鎖に沿って個々の部位で選択されたタンパク質の認識部位を含むように設計される。次に、この二本鎖を電極または位置づけ可能な多電極アレイに沈着させて、単層を形成して、この芝状の分子にインターカレート性酸化還元種を吸着させる。好ましい態様において、インターカレート性酸化還元活性種は部位特異的に局在する。もう一つの好まし態様において、インターカレート性酸化還元活性種はオリゴヌクレオチド二本鎖に架橋される。次に、この形成された複合体を、おそらく特異的タンパク質を含む試料溶液に曝露して、生成された電流または電荷をタンパク質の有無の指標として測定する。その後、タンパク質を、インターカレート性酸化還元活性部分を再生するために適当な条件で除去する。二本鎖形成段階、インターカレート性酸化還元活性種を吸着または架橋させる段階、電流または電荷の測定段階、およびインターカレート性酸化還元活性部分を含む二本鎖の再生は、多数の試料溶液中の特異的タンパク質の存在を連続的に検出する場合、望ましい回数繰り返してもよい。
【００７４】
それぞれの電極を通過した電荷を測定して、タンパク質を含まない参照溶液において測定された電荷と比較した。弱いシグナルを有する電極は、その認識部位に結合していることが疑われ、このように塩基スタッキングの障害を引き起こすタンパク質の存在を示す。このアッセイのために用いることができるタンパク質の例には、制限酵素、TATA結合タンパク質、および塩基フリッピング酵素（例えば、DNAメチラーゼ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７５】
本発明はまた、核酸プローブの選択にも関する。電流の差を検出することができるように、検出されるミスマッチ（複数）が、インターカレート性酸化還元活性部分の結合部位と電極とのあいだの領域内に存在する限り、任意の核酸、DNAまたはRNAに、このミスマッチ検出法を行うことができる。比較される核酸プローブは、生物のゲノム全体までをコードする天然または合成配列を含んでもよい。これらのプローブは、任意の起源、例えば、プラスミド、クローニングしたDNAもしくはRNA、または細菌、酵母、ウイルス、オルガネラ、ならびに植物および動物のような高等生物を含む任意の起源の天然のDNAまたはRNAから得ることができる。試料は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Maniatisら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1982）に記載されるような多様な技術によって、血球、羊水細胞、骨髄細胞、生検標本から得た細胞等を含む組織材料または細胞から抽出してもよい。
【００７６】
または、選択される配列はまた、周知の合成技法によって調製することができる。標準的なDNAおよびRNA合成法に関して、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「Synthesis and Applications of DNA and RNA」、S.A. Narang編、アカデミック出版、1987、M.J. Gait、「Oligonucleotides Synthesis」、IRL出版、ワシントンD.C.、アメリカ、1984、および「Oligonucleotides and Analogues」、F. Eckstein編、IRL出版、ワシントンD.C.、アメリカ、1991を参照されたい。簡単に説明すると、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、既知の方法論の固相合成によって簡便に合成してもよい。好ましい態様において、固相支持体に共有結合によって固定された成長しつつあるオリゴヌクレオチドに、単量体単位を加える。典型的に、第一のヌクレオチドを、合成を開始する前に切断可能な結合によって支持体に結合する。段階的なオリゴヌクレオチド鎖の伸長は通常、3'から5'方向で行う。合成が終了すれば、上記の結合を加水分解することによってポリマーを支持体から切断して、支持体に当初結合したヌクレオチドは、得られたオリゴマーの3'末端となる。Applied Biosystems, Incorporated 380Bのような核酸合成機が市販されており、その使用は一般的に、望ましい可能性がある妥当な長さのほぼ如何なるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体も産生するために有効であると当業者に理解されている。トリエステル、ホスホラミダイト、または燐酸水素塩カップリング化学は、所望のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を提供するためにこれらの合成機について用いられる。
【００７７】
さらに、本発明はまた、インターカレート性酸化還元活性物質の結合部位の数を一つの部位に制限するために、ヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチド単量体からなる既定の配列によって構築される核酸プローブに関する。例えば、酸化還元活性インターカレート剤であるダウノマイシンの場合には、A-Tおよび／またはI-C塩基対と、ダウノマイシンが架橋される一つの別々のグアニン結合部位とを含む混合ヌクレオチド／非天然のヌクレオチドオリゴマーを調製した。非天然のヌクレオチドは、当技術分野で周知の現在のDNA合成法の一つを用いて混合ヌクレオチド／非天然ヌクレオチドポリマーを産生するように段階的に構築することができる、例えば、「Synthesis and Applications of DNA and RNA」、S.A. Narang編、アカデミック出版、1987、M.J. Gait、「Oligonucleotides Synthesis」、IRL出版、ワシントンD.C.、アメリカ、1984、および「Oligonucleotides and Analogues」、F. Eckstein編、IRL出版、ワシントンD.C.、アメリカ、1991を参照されたい。
【００７８】
二つのDNA、二つのRNA、または一つのDNAと一つのRNA分子のオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズ条件で接触させるために用いられる方法および条件は、当技術分野で広く既知である。適したハイブリダイゼーション条件は、研究室において用いられるプロトコールを確率するために当業者に周知の最適な技法によって日常的に決定してもよい。例えば、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、Ausubelら「Current Protocols in Molecular Biology」、第1〜2巻、ジョンウィリー＆サンズ（1989）；Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第2版、第1〜3巻、コールドスプリングハーバー出版（1989）；およびManiatisら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1982）を参照されたい。例えば、温度、成分濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄回数、緩衝液成分、ならびにそのpHおよびイオン強度のような条件を変更してもよい。
【００７９】
本発明のもう一つの局面は、表面改変電極に関し、電子が電極と、一つまたは複数の電子を受容または供与することができる電子活性生物材料とのあいだを直接移動する生物電気化学プロセスにおけるその利用に関する。そのような生物電気化学プロセスはいずれの方向ともなりうる。特に、本発明は、インターカレート性酸化還元活性部分を有するオリゴヌクレオチド二本鎖によって改変された表面を有する電極を提供する。電極は、金、銀、白金、パラジウムのような貴金属と共に炭素を含むがこれらに限定されない、そこに吸着または結合させた表面改変剤と適合性の任意の材料で構成されうる。電極にとって好ましい材料は金および炭素である。
【００８０】
オリゴヌクレオチド二本鎖は、任意の都合のよい方法で電極に吸着させることができる。好ましくは、そのような改変電極を調製するプロセスは、官能基リンカー鎖によって5'末端で誘導体化したオリゴヌクレオチド二本鎖を、一つの単層の電極表面上に吸着させて、均一な芝状の分子を得ることが含まれる。これらのリンカーには、チオールまたはアミン末端鎖が含まれるがこれらに限定されない。プロセスは一般的に、当業者によって理解され、比較的単純で、再現可能であり、容易に自動化されうる。
【００８１】
さらに、単層の密度および組成は、選択したアッセイに依存して変更される。インターカレート性酸化還元活性部分を用いて一塩基ミスマッチを検出する方法は、吸着されたインターカレート性酸化還元活性部分が芝の中に拡散しないように、密に充填された単層を必要とする。タンパク質の有無を検出する方法は、タンパク質を二本鎖に沿ってその認識部位に有効に結合させるために、好ましくは、多様な長さの二本鎖からなる平坦でない単層を必要とする。または、単層は、それほど密でなくてもよい。密度の低い単層は、緩衝液のイオン強度の低下、電極上に沈着させた溶液中での誘導体化オリゴヌクレオチド濃度の減少、または電極上への二本鎖の沈着時間の短縮を組み合わせることによって調製してもよい。
【００８２】
さらに、本発明はさらに、吸着された二本鎖の空間的に位置づけ可能なアレイを作製する方法に関する。好ましい態様において、官能基リンカーによって5'末端を誘導体化した多様な配列組成のオリゴヌクレオチド二本鎖を、多電極アレイに沈着させる。これらの電極結合二本鎖を次に変性条件で処置すると、一本鎖オリゴヌクレオチドの単層が得られ、次にこれをミスマッチを含む可能性がある相補的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることができる。もう一つの好ましい態様において、官能基リンカーによって一端を誘導体化して、所望の配列組成の一本鎖オーバーハング（長さが5〜10ヌクレオチド）を反対の末端に含む短いオリゴヌクレオチド二本鎖（長さが5〜10塩基対）を多電極アレイに沈着させて、空間的に位置づけ可能なマトリクスを形成する。次に、これらの電極に結合した二本鎖を、相補的オーバーハングを含む一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることができる。
【００８３】
固定された分子を含む固相支持体は、研究、臨床分析、ならびに食品および化学物質の商業的生産において広く用いられている（例えば、米国特許第5,153,166号；Akashi、1992）。固定された核酸は、ハイブリダイゼーションアッセイ（Lamture、1994）において用いられ、固定されたタンパク質はラジオイムノアッセイまたはELISAアッセイにおいて用いられる（例えば、米国特許第5,314,830号を参照されたい）。さらに、酵素は、産物からの分離を促進するため、ならびにその効率的および繰り返し利用を可能にするために固定されている。有効な固定技法を開発するためには、多くの重要な要因を考慮しなければならない。第一に、技法は分子の非特異的吸着を最小限にしなければならない。第二に、技法は固定された分子の機能的完全性を維持しなければならない。第三に、支持体と固定された分子との結合の安定性は、精度および感度の減少に至る浸出を回避する程度でなければならない。最後に、カップリング技法は、費用効果が高いのみならず標的分子に対する高い結合能を有する支持体を得るためには十分に効率的でなければならない。
【００８４】
本発明のもう一つの局面は、電極に吸着させたオリゴヌクレオチド二本鎖のハイブリダイゼーションの程度の関数として電流を測定することに関する。インターカレート性酸化還元活性種を電気化学または化学エネルギーに曝露すると、当技術分野で周知の技術を用いて電流が連続的に検出される可能性がある。これらには、電子的方法、例えば、ボルタンメトリーもしくはアンペロメトリー、または光学的方法、例えば蛍光もしくは燐光が含まれるがこれらに限定されない。
【００８５】
一般的に、光発光励起および放出は、波長約200 nm〜約900 nmの電磁放射線によって起こる。同様に、化学発光および電気化学発光放出は、一般的に波長が約200 nm〜約900 nmの範囲である放出された電磁放射線によって起こる。化学部分の還元または酸化が起こる電位は、溶液のpHおよび用いる電極の特性のような要因と共にその正確な化学構造に依存する。光発光システムにおける最適な放出および励起波長、ならびに電気化学発光および化学発光システムにおける最適な電位および放出波長を決定する方法は周知である。
【００８６】
存在する発光種の量を定量する多くの方法が存在する。系へのエネルギー入力速度は発光種の測定を提供しうる。適した測定には、例えば発光種が電気化学的に産生される場合の電流の測定、発光種が化学的に産生される場合には還元剤もしくは酸化剤の利用速度、または光発光技術における電磁エネルギーの吸収が含まれる。さらに、発光種は、放出された電磁放射線を測定することによって検出することができる。これらの測定は全て、持続的な事象に基づく測定として、または長期間のシグナルを付加する累積的方法のいずれかとして行うことができる。事象に基づく測定は、その大きさが入射光強度に比例する電流を得るために、または電荷カップリング装置を用いることによって、光電子増倍管、フォトダイオード、またはフォトトランジスタによって行ってもよい。累積的方法の例は、事象に基づくデータの積分、および累積データを直接提供するための写真用フィルムの利用である。
【００８７】
本明細書において言及した出版物および他の参考材料は、本発明の背景を記述し、その実践に関するさらなる詳細を提供し、参照として本明細書に組み入れられる。便宜上、参考材料は添付の参考文献に参照してまとめる。
【００８８】
本発明はさらに、以下の実施例を参照して説明するが、本発明は、そのような実施例に限定されないと理解すべきである。
【００８９】
実施例
材料
フォスホラミダイト試薬（C6S-Sチオール改変剤を含む）は、グレンリサーチ（Glen Research）から入手した。[γ-32P]dATPは、NEN-デュポン（NEN-DuPont）から得た。フェロシアン化カリウム（フィッシャー（Fisher））は、使用前に水溶液から再結晶した。ダウノマイシンはフルカ（Fluka）から得た。
【００９０】
誘導体化二本鎖の合成
制御された孔のガラス樹脂上に固定したオリゴヌクレオチドを、5'ヒドロキシ末端でカルボニルジイミダゾール、および1,6-ジアミノヘキサン（1 g/10 mlジオキサン、30分/ea.）によって連続的に処置してから樹脂を切断した（Wachter、1986）。脱保護した後、遊離のアミンを2-ピリジルチオプロピオン酸N-スクシニミドエステルによって処理して、ジスルフィドを生成した（Harrison、1997）。配列は、逆相HPLCによって精製して、ジチオスレイトールを用いて遊離のチオールに変換し、再精製してからその相補体とハイブリダイズさせた。誘導体化オリゴヌクレオチドは、質量補助レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析およびHPLC保持時間によって特徴を調べた。二本鎖を、90℃に加熱した後徐々に室温まで冷却することによって、脱酸素化5 mM燐酸塩／50 mM NaCl（pH 7）においてハイブリダイズした。脱保護二本鎖は、チオールへの酸化を防止するためにアルゴン下で凍結保存した。
【００９１】
原子間力顕微鏡（AFM）
AFM画像は全て、ナノスコープIIIaコントローラー（デジタルインストルメンツ（Digital Instruments）、サンタバーバラ、カリフォルニア州）において操作したマルチモードAFMを用いて撮像した。ガラスAFMチャンバー（デジタルインストルメンツ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）および液体容積約50 μlを実験に用いた。一体型の末端付き酸化物尖鋭化Si3N4プローブ先端を有するSi3N4片持ちばり（バネ定数、0.06 N/m）を用いた。撮像の際にAFMプローブに適用した垂直方向の力は、100 pNより下となるよう最小にした。片持ちばりの偏向フィードバックセットポイントを絶えず調節して、片持ちばりの熱ドリフトを補正して、一定の最少の力を維持した。AFMの高さの較正は、NIST追跡可能な180 nmの高さ標準について行い、Au金表面での一原子段階を測定することによって確認した。AFM画像は、「高さ」（または一定の力）モードで記録した。単層の厚さを決定するために用いた単層の穴は、スキャンサイズを約100〜150 nmに減少させて、スキャン速度を24〜30 Hzに増加させ、セットポイントを数単位進めて垂直力を増加させることによって調製した。約1分後、スキャンサイズ、スキャン速度、およびセットポイントをその前回の値に戻し、露出した四角い金を特徴とする画像を得た。高さの対比分析のために得た画像は全て、最少の垂直先端力で記録した。これは、先端が表面からはずれるまでセットポイントを減少させた後、安定な画像を得るために必要な最少の力でそれを再導入することによって得た。いくつかの場合において、フィルムの高さはまたタッピングモードでも測定し、接触モード実験と同じ結果を得た。
【００９２】
電気化学
サイクリックボルタンメトリー（CV）は、0.02 cm2多結晶金電極において、バイオアナリティカルシステムズ（BAS）モデルCV-50W電気化学アナライザを用いて20±2℃で100 mM燐酸緩衝液（pH 7）において行った。改変金円板作業電極、飽和カロメル照合電極（SCE、フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific））、および白金針金補助電極からなる通常の三電極コンフィギュレーションを用いた。電気化学セルの作業区画を、改変ルギン毛細管によって参照区画から分離した。電位は、SCEに対して報告する。不均一な電子移入速度を決定して、CVによって分析した（Nahir、1994；Weber、1994；Tender、1994）。
【００９３】
偏光解析
ガートナー（Gaertner）モデルL116C楕円偏光計（ellipsometer）を用いて、乾燥試料について25℃で光学的偏光解析（λ＝632.8 nm）を行った。
【００９４】
実施例1：DNA二本鎖への酸化還元活性インターカレート剤の部位特異的組み込み
酸化還元インターカレート剤であるダウノマイシン（DM）（Arcamone、1981）をDNA二本鎖に組み入れて、これらの二本鎖を通しての電荷誘導を調べた（図1）。DMは、起こりうる単層の窓（Kelley、1997a）内で可逆的な還元（Molinier-Jumel、1978；Berg、1981）を受けて、グアニンの2-アミノ基に架橋したインターカレートDMの共有結合付加物（Leng、1996）は、二本鎖DNAにおいて結晶学的に特徴が調べられている（Wang、1991）。このように、DMが架橋した別々のグアニン結合部位を有するA-Tまたはイノシン(I)-C対を主に含む一連のオリゴヌクレオチドを構築した。好ましくは、隣接するグアニン対を含むチオール末端二本鎖（0.1 mM）をハイブリダイズして、5 mM燐酸塩、50 mM NaCl、pH 7において0.2％ホルムアルデヒドおよび0.2 mM DMと共に1時間インキュベートして、過剰量のDMを除去するためにフェノール抽出した。
【００９５】
二本鎖に沿ってグアニン部位を移動させると、らせん内DM/金分離の系統的変化が得られ、単層を通しての電荷輸送の力学に及ぼす距離の影響を調べることができる（図1）。
【００９６】
実施例2：酸化還元活性インターカレート剤によって改変したDNA二本鎖の特徴付け
改変された二本鎖は、質量分析、紫外線／可視光吸収分光法、および熱変性実験によって特徴を調べ、その全てが1：1のDM-二本鎖化学量論と一致した。例えば、DMによって改変されたそのイノシン相補体を有する二本鎖
2005502874.tif 000002
を、MALDI-TOF分光法によって分析した。質量対電荷比（実測値／計算値）、5284/(5282)（DM＋SH鎖）、4541/(4540)（相補体）、および4742/(4742)（SH鎖）を検出した。これらの値は、この二本鎖から予想される断片に関して計算された質量に対応する。UV-可視光吸収分光法によっても同様に、260 nmでの二本鎖の吸光度（M＝14.9×103 M-1cm-1）とインターカレートしたDMの480 nmでの吸光度（M＝5.1×103 M-1cm-1）との比較に基づいて、二本鎖/DM化学量論が1：1であることが判明した。100 mM燐酸塩、100 mM MgCl2、pH 7の存在下で、5 DM二本鎖の熱変性試験（260 nmでの吸光度によってモニターする）から、無処置およびダウノマイシン架橋二本鎖に関して、融解温度がそれぞれ48℃および50℃であることが判明した。DM二本鎖の482 nmでの淡色性をモニターすることによって類似の融解プロフィールを得た。
【００９７】
実施例3：DNA二本鎖によって誘導体化した金電極の調製
電極は、チオール末端アルカン鎖によって5'末端を誘導体化した15塩基対のDNA二本鎖によって金表面を改変することによって簡便に調製される。バルク金電極を、0.3 μMおよび0.5 μMアルミナ（Buhler）によって連続的に研磨して、30分間超音波処理し、1.0 M硫酸によって腐食させた。Au（111）表面は、雲母またはガラス上に蒸着させることによって調製した（Widrig、1991；Zei、1983）。次に、電極を、5 mM燐酸塩/50 mM NaCl（pH 7）において誘導体化DNA二本鎖の0.1 mM溶液において室温で12〜48時間インキュベートすることによって改変した。改変した電極は、使用前に緩衝液によってすすいだ。
【００９８】
金表面に二本鎖を沈着させる前に、ジチオニトロベンゼンに基づく分光光度アッセイ（Riddles、1979）を用いて遊離のチオールが存在することを確認した。その後、試料を金表面に12〜24時間沈着させた。
【００９９】
電気化学アッセイ、放射活性タギング実験、および原子間力顕微鏡（AFM）（Kelley、1997a、1997b）は全て、オリゴヌクレオチドが金表面に関して垂直位置を向いた密に充填された単層を形成することを示している。
【０１００】
実施例4：金表面上の改変DNA二本鎖単層の特徴付け
DM改変二本鎖は、金上で自己構築単層を容易に形成した。改変された被膜のAFM試験は、開回路で45Åより大きい高さの密に充填された単層を示す。より詳しく述べると、AFM試験を電気化学的制御下で行ったところ、DNA被膜が電位依存的構造変化を受けることが判明した。開回路では、単層の被膜の高さは45(3)Åである。15塩基対の二本鎖（直径20Å対長さ60Å）の異方性寸法に基づくと、この厚さは、らせん軸が金表面から〜45"の方向であることを示している。電位ゼロ荷電の陰圧を適用すると、被膜の厚さ〜60Åを認め、より陽電圧では、低い表面被覆の20Åという限界値まで被膜の高さの減少を引き起こす。
【０１０１】
DNAの断面積（〜3 nm2）および金電極の幾何学面積（0.02 cm2）に基づいて、DNAの最大表面被覆は〜6×10-11 mol/cm2であると計算された。架橋したDMを含む二本鎖によって改変した電極でのクーロメトリーによって、DM表面の被覆が7.5(7)×10-11 mol/cm2であることが明らかにとなり、表面が改変二本鎖によって密に充填されていることが示される。DM値はDNAに関して理論的なΓをわずかに超えるように思われ、おそらくさらなる電極表面の粗面度に起因するように思われた。
【０１０２】
DM誘導体化DNAの金上での表面被覆をおおよそ評価するために、Fe(CN)64-（2 mM）の電気化学反応をモニターした。この陰性荷電イオンは、多陰イオンDNAによって改変電極表面から反発され、表面が十分に被覆されている場合には本質的に全く反応を示さない。表面被覆の直接測定ではないが、この技術によって、適当な改変に関して個々の電極の簡便なアッセイを行うことができる。
【０１０３】
これらの表面のサイクリックボルタンメトリーは、SCEに対して-0.65 VでDMの可逆的な還元を示した（Molinier-Jumel、1978；Berg、1981）。これらの被膜は極めて安定であり、表面結合種の特徴である反応を示した（例えば、ピーク電流対スキャン速度の直線プロット）（Bard、1980）。
【０１０４】
実施例5：金表面上で完全に塩基対を形成したDNA二本鎖に架橋した酸化還元インターカレート剤の電気化学反応の測定
電気化学反応の積分によって、電気活性ダウノマイシンの表面被覆（Γ）7.5(7)×10-11 mol/cm2が得られ、この値は32P標識によって先に測定した15塩基対の二本鎖の被覆と良好な一致を示した（Kelley、1997a）。しかし、DM改変二本鎖の表面被覆には有意な変動を認めた。したがって、架橋したDNAの還元に関する大きい積分電流と溶液中のフェロシアン化物の酸化に関する弱い反応の双方を示す電極のみを調べた。
【０１０５】
架橋したDM対DNAの1：1化学量論を考慮すると、認められたデータは、結合したDMの全てが電気化学的に還元されることを示した。これらの被膜をDM不含二本鎖の割合を増加させて処理すると、認められた電気化学シグナルの直線的な減少が起こり（クーロメトリーアッセイによって決定）、結合したインターカレート剤のそれぞれが電気化学的に活性であることと一致した。
【０１０６】
顕著なことに、図2に示すように15塩基対配列に沿って、その位置とは無関係にDMの効率的な還元を認めた。分子モデリングに基づくと、DM/金分離は〜25Åに及ぶ。らせん内DM電極の分離は、電極に最も近い二本鎖の末端で結合したDMに関して＞10Å（図2A）、そして電極から最も遠い二本鎖末端で架橋したDMに関してDM電極分離は＞35Å（図2B）である。説明したボルタンモグラム内で電流を積分することによって測定したこれらの15塩基対二本鎖に関する電気活性ダウノマイシンの表面被覆はそれぞれ、0.65×10-10 mol/cm2および0.80×10-10 mol/cm2であった。吸収分光光度法によって測定したこれらの同じ試料に関するDM：DNA化学量論はそれぞれ、0.9：1および1.1：1であった。このように、電荷は距離に依存しなかったが、架橋収率を反映した。
【０１０７】
実施例6：金表面上でのミスマッチ含有DNA二本鎖に架橋した酸化還元インターカレート剤の電気化学反応の測定
金表面上でミスマッチ含有DNA二本鎖に架橋した酸化還元活性インターカレート剤の電気化学反応を測定して、これらの認められた割合が酸化還元活性共因子と電極表面とのあいだの直接接触の結果であるか否かを決定した（これまで、明らかに距離非依存的な不均一な電子移動を生じることが示されている）（Feng、1995、1997）。15塩基対二本鎖内の単一の部位を、インターカレートしたDMと電極表面とのあいだにDNA塩基スタックの局所的な障害を引き起こすことが知られているCAミスマッチを生じるように変異させた（Patel、1984；Aboul-ela、1985）。図3は、そのような単純な変化が電気化学反応を実質的に消失させたことを示す。
【０１０８】
CA含有二本鎖によって改変した電極でのDMのクーロメトリーは、表面被覆の関数としてある程度変化した。高い表面被覆（フェロシアン化物アッセイによって決定）では、ミスマッチ二本鎖について本質的にシグナルを認めなかった。しかし、より中等度の表面被覆では、DMの還元に対応する小さいシグナルを認めた。これらは典型的にTA二本鎖に関して認められたシグナルの30％を超えなかった。部分的DNA単層の形態は不明である。
【０１０９】
重要なことに、DMおよびCAミスマッチの位置が逆転した配列（金に対してDMの上にミスマッチが存在する場合）は、電気化学反応の減少を示さなかった。CA変異配列のAFM画像はTA類似体の画像と同一であり（開回路での単層の厚さ、〜40Å）、DNA被膜のバルク構造がミスマッチの存在によって有意に変化しなかったことを示している。その上、フェロシアン化物の酸化は、双方の表面で同様に弱められた。DM架橋DNA二本鎖に関して予想される質量（一塩基変化を説明する）を質量分析によって測定し、分光光度測定アッセイから、架橋の程度が、完全に対形成した配列とミスマッチ配列の双方において同一であることが判明した。
【０１１０】
したがって、塩基スタックにおける介在する損傷に対するDMの電気化学の鋭い感度は、非常に用途の広いDNAミスマッチセンサーの基礎となる。
【０１１１】
実施例7：非架橋インターカレート剤を含む完全な塩基対形成またはミスマッチ含有DNA二本鎖の電気化学挙動の分析
ミスマッチを検出する実際の方法は、非架橋インターカレート性酸化還元活性種に基づく系を利用する。一つより多いグアニン結合部位を有する可能性がある不均一な配列を調べる全般的アプローチを開発するために、DNA改変被膜に非共有結合によってインターカレートしたDMの電気化学を調べた。クーロメトリー滴定から、DMが、完全に塩基対を形成した二本鎖によって改変した表面に強く結合し、均一な溶液の場合に決定した値と非常に類似の親和性定数を生じることが確認された（Arcamone、1981；Molinier-Jumal、1978；Berg、1981）。バルク濃度が≧1 μMの場合、改変された電極をインターカレート剤によって飽和して、表面に拘束された二本鎖1個あたりインターカレート剤約1個を保持する。さらに、これらの被膜に共有結合しないインターカレート剤は、結合が可逆的であることを除き、すなわち純粋な緩衝溶液では、完全な解離が起こるまでボルタンメトリーシグナルの減少を認めたことを除き、架橋したDMに関して記述された特性と全く類似の電気化学特性を示した。
【０１１２】
共有結合したDMに関する試験と一致して、これらの二本鎖に単一のCAミスマッチを組み入れると、電気化学反応は劇的に減少した（表1）。このミスマッチの程度は、配列に沿ったCA塩基の段の位置に強く依存した：変異が単層内に深く埋もれている場合、測定された電荷の減少は3.5（5）倍減少したが（ワトソンクリックの二本鎖と比較して）、溶媒露出末端近傍に存在する場合、2.3（4）倍に過ぎなかった。これらの知見は、これらの同じ表面に結合したメチレンブルーに関する初期の試験において示唆されているように、DM占有部位が密に充填された単層の上部近傍に存在することと一致する（Kelley、1997b）。したがって、電気化学シグナルの強度は、ミスマッチの存在を報告するのみならず、破壊の位置を説明する可能性がある。
【０１１３】
さらに、これらの単層内での側方の電荷拡散を分析した。例えば、CAミスマッチらせんの分画を増加させて処理した一連の塩基対形成被膜（配列：
2005502874.tif 000003
）を調製した（ミスマッチは、上記の配列において太字のCで示した塩基の段階に局在した）。これらの表面に非共有結合したDMのクーロメトリー反応は、電気化学シグナルが、変異した二本鎖の割合の増加に比例して減少するように、被膜の組成に強く依存した。TA対CA含有被膜に対するDMの親和性に測定可能な差を認めないことから、この直線的な反応は、電気的に不活性なインターカレート剤（おそらく、変異したらせんに結合したそれらの分子）が、電気活性種からの側方電気移動によって還元されないことを示している。この結果は、被膜において異なる二本鎖に結合したインターカレート剤の分子間相互作用が明らかに効率的な電子移動を媒介しないことから、電荷伝導がらせん内経路であることをさらに支持する。
【０１１４】
実施例8：電気化学反応の変異依存性の分析
このミスマッチ検出戦略の範囲を調べるために、異なる一塩基ミスマッチを含むDNA改変電極でのDMに関する電荷（Qc）を分析した（図4）。チオール改変配列、
2005502874.tif 000004
と以下の7個の異なる相補体（ミスマッチは太字で示し、二本鎖の特異的塩基対および融解温度を括弧内に示す）とのハイブリダイゼーションによって7個の異なるミスマッチ二本鎖を得た：
2005502874.tif 000005
。次に、バックグラウンドを差し引いたサイクリックボルタンモグラムを積分することによって電荷を計算した。得られた値は、＞5試行に基づき、結果は、同時に行ったかまたは異なる試料調製物を利用して行った実験に関して同等であった。溶液中のオリゴマーの融解温度は、10 μM二本鎖、100 mM MgCl2、および100 mM燐酸塩、pH 7を含む試料を用いて260 nmでの二本鎖淡色性をモニターすることによって測定した。
【０１１５】
クーロメトリー分析によって、特徴的なDM反応の減弱が変異の同一性に強く依存することが確認された。一般的に、ピリミジン-ピリミジンおよびプリン-ピリミジンミスマッチは、電気化学シグナルの顕著な減少を引き起こし、調べた一つのプリン-プリン対（GAミスマッチ、これは二本鎖DNA内で良好にスタッキングされることで知られる（Patel、1984；Aboul-ela、1985））は、測定可能な作用を示さなかった。意外にも、GT対によって有意な減少が引き起こされたが、これはまたらせんに対してあまり破壊的ではない。このゆらぎ塩基対は、熱力学的に安定であるが、電子移動をあまり媒介しないように思われる。
【０１１６】
図4は、非常に狭い範囲の二本鎖熱安定性にわたって、電気化学反応の大きい差が認められたことを示している。全体的に、異なるミスマッチを含む被膜の電気化学特性は、個々の二本鎖による塩基スタッキングに対する破壊の程度と相関した。これらの結果は、DNA内の塩基のスタッキングに対するこの電気化学アッセイの感度を強調し、この被膜の中の電荷の伝導に基づいてミスマッチを検出する実行可能性を証明する。
【０１１７】
実施例9：ミスマッチ検出アッセイの配列依存性の分析
単一のCAミスマッチを、アッセイの配列依存性を調べるために異なる三つのDNA二本鎖に組み入れた。二本鎖は、多様な割合のGC含有量を特徴とし、広い範囲の二本鎖安定性を示す。10 μM二本鎖、100 mM燐酸塩、および100 mM MgCl2を含む二本鎖溶液における260 nmでの淡色性をモニターすることによって得られた熱変性測定によって決定すると、これらの二本鎖の融解温度は、
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であった。電荷は、ν＝100 mV/sで得たバックグラウンドを差し引いたサイクリックボルタンモグラムを積分することによって定量し、電極領域に関して補正した。図5に示すように、完全に塩基対を形成したDNA被膜と比較して一つのCAミスマッチを含むDNA二本鎖に関するクーロメトリーシグナルにおける特徴的な減少は、CGリッチ配列に対してATリッチ配列では全域で本質的に不変であった。この配列非依存的反応は、示差ハイブリダイゼーションに基づく従来のミスマッチ検出アッセイを用いて得ることができない。
【０１１８】
実施例10：繰り返しサイクルの際の電気化学反応の分析
この方法論を一本鎖標的にも応用するために、インサイチューハイブリダイゼーション技術を開発した。チオール改変二本鎖を金表面に沈着させて、熱変性させ、十分にすすいでから一本鎖オリゴヌクレオチドの≧50 pmol中でインキュベートすることによって所望の標的と再ハイブリダイズさせた。得られた表面の電気化学特性は、上記の特性と同一であり、ゲノム試験に関してこの系が適切であることを示唆している。
【０１１９】
例えば、チオール末端リンカーによって誘導体化した15塩基対のオリゴヌクレオチド
2005502874.tif 000007
を、その本来の成分および変異成分（配列において下線で示した部位で）の双方とハイブリダイズさせ、完全に塩基対を形成した二本鎖およびCAミスマッチ含有二本鎖をそれぞれ産生した（図6）。これらの二本鎖を異なる電極上に沈着させて、これらの二本鎖に非共有結合したDMの電気化学反応を、サイクリックボルタンメトリー（ν＝100 mV/s、1.0 μM DM）を用いて測定した。図6は、DMが、完全に塩基対を形成したおよびCA変異被膜に特徴的な電気化学反応をそれぞれ示したことを示している。次に、電極を90℃の純粋な緩衝液に2分間浸して、同一の配列の一本鎖単層を生じることによって、表面を変性させた。これらの電極でのDMのサイクリックボルタンメトリーによって、ほぼ同一の反応が明らかとなったが、還元は非常に非可逆的で、より広いように思われ、増加するスキャンの関数としてより小さくなるように思われる。重要なことは、当初CAミスマッチを有する電極は、変性後大きいシグナル（最初のスキャンに関して）を示したが、対応するTA類似体についてはその逆が当てはまった。相補体が交換するように（TA→CA、CA→TA）緩衝100 mM MgCl2の存在下で反対の相補鎖100 pmolと共に電極をインキュベートすることによって、新たな二本鎖が形成され、二本鎖改変被膜での電気化学は再度、完全に塩基対を形成した被膜およびCA変異被膜について予想される特徴的な挙動を示した。最後に、電極を再度加熱して二本鎖を変性させ、反応を定量すると、この場合も一本鎖オリゴヌクレオチドの特徴を示した。このように、電極は、この順序の事象によって繰り返し循環させることができ、天然のDNA内での点突然変異を検出する実際的な手段を示している。
【０１２０】
実施例11：金表面でのチオール改変二本鎖の直流測定を用いるp53遺伝子の特異的領域内での遺伝子変異の検出
特定の態様は、位置づけ可能な部位約30個を有する金微小電極を利用する。ヘキシルチオールリンカーによって誘導体化した異なる20塩基対の二本鎖を、濃縮した二本鎖溶液を一晩沈着させて、これらの部位のそれぞれに結合させる。ほとんどの癌関連変異が認められるp53遺伝子のエキソン5〜8内の600塩基対領域に対応する配列を選択した。アレイを90℃の水溶液に60秒間液浸して、固定した二本鎖を変性させ、相補鎖を除去した。p53遺伝子を含むヒト試料を増幅の前後いずれかに断片化する。断片化ゲノム一本鎖DNAを含む溶液を、ハイブリダイゼーションが起こるようにアレイに1時間沈着させる。次に、1.0 μM DM溶液の存在下で、それぞれの電極を通過した電荷を測定して、それぞれの配列の反応を野生型（すなわち、完全に塩基対を形成した）配列から得られた反応と比較する。弱いシグナルを有する電極は変異配列に対応するが、予想された電荷を示す配列は変異していないと分類される。
【０１２１】
実施例12：DNA改変表面で生成された電気触媒電流を用いる変異の検出
ミスマッチおよび完全に塩基対を形成した配列に対応するシグナルは、DNA改変表面での触媒電流をモニターすることによってより高度に区別することができる。電子は、固定された二本鎖の中を通って、単層の溶媒曝露辺縁部に存在する酸化還元インターカレート剤まで往復し、次に陰性荷電溶液中の種（単層内部から静電気的に禁止されている）がインターカレートする媒介物質によって触媒的に還元される。触媒反応は、本質的にインターカレート剤に対応するシグナルを増幅することから、ミスマッチの存在下でのこの反応の減弱は有意により顕著である。特定の態様において、配列
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を、完全に塩基対を形成した相補体およびCAミスマッチを含む相補体とハイブリダイズした電極上に沈着させた（ミスマッチの位置を太字で示す）。これらの二本鎖を1.0 μMメチレンブルーおよび1 mMフェリシアン化物を含む溶液に液浸した。これらの試薬のいずれか単独の存在下で、ごく小さい直流を測定した。しかし、インターカレート剤と陰性荷電プローブの混合物の存在下では、メチレンブルーによるフェリシアン化物の電気触媒的還元に対応する顕著な電流を測定した。TAおよびCA含有被膜に関して認められた電流の量は大きく異なる。電気触媒を用いると、ミスマッチ二本鎖は完全に塩基対を形成した二本鎖と約3倍区別することができる。その上、図8に示すように、TAおよびCA二本鎖のピーク電位は有意に分離され、ミスマッチの存在は電位差測定によって検出することができる。したがって、このアプローチは、遺伝子変異を電気化学的に検出する極めて感度のよい手段を表す。
【０１２２】
実施例13：金表面上でのチオール改変二本鎖の電気触媒的電流測定を用いるp53遺伝子の特異的領域内での遺伝子変異の検出
もう一つの特定の態様は、電気触媒を用いてp53内の変異を検出することを含む。ヘキシルチオールリンカーによって誘導体化した異なる20塩基対の二本鎖を、濃縮した二本鎖溶液から一晩沈着させることによって金微小電極アレイの位置づけ可能な部位約30個のそれぞれに結合させる。ほとんどの癌関連変異が認められるp53遺伝子のエキソン5〜8内の600塩基対領域に対応する配列を選択する。アレイを90℃の水溶液に60秒間液浸して、固定された二本鎖を変性させ、相補鎖を除去する。p53遺伝子を含むヒト試料を増幅の前後いずれかに断片化する。断片化ゲノム一本鎖DNAを含むヒト試料をハイブリダイゼーションが起こるように1時間アレイに沈着させる。アレイをすすいで、1.0 μMメチレンブルーおよび1.0 mMフェリシアン化物を含む溶液に浸す。認められた顕著な電流は、溶媒曝露二本鎖部位で吸着されたメチレンブルーによる溶液中のフェリシアン化物の電気触媒還元に起因する。これらの触媒電流を、それぞれの位置づけ可能な電極に関して測定し、野生型配列について得られた電流と比較して変異の可能性がある部位を検出する。
【０１２３】
実施例14：炭素表面上でのアミン改変二本鎖の直接または電気触媒的電流測定を用いる対象となる遺伝子内で遺伝子変異の検出
もう一つの態様は炭素電極を利用する。電極はK2Cr2O7およびHNO3の存在下で+1.5 V（Ag/AgClに対して）で酸化して、塩酸1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスルホスクシニミド（NHS）によって処置する。対象となる特異的遺伝子の変異配列に対応する二本鎖をヘキシルアミンリンカーによって誘導体化して電極表面に適用する。装置を90℃の水溶液に60秒間液浸して、一本鎖単層を生成し、固定したプローブに断片化ゲノムDNA試料を室温で1時間ハイブリダイズさせる。変異の検出は、（i）1.0 μMダウノマイシン溶液の存在下で直流を測定すること、または（ii）1.0 μMメチレンブルーおよび1.0 mMフェリシアン化物の存在下で触媒電流を測定することによって行われる。それぞれの電極を通過した電荷を測定して、それぞれの配列に対する反応を、野生型、すなわち完全に塩基対を形成した配列について得られた反応と比較する。弱いシグナルは変異配列に対応するが、電流の変化を示さないシグナルは変異していないと分類される。
【０１２４】
本発明は、特定の応用を参照して記述してきたが、含まれる原理は他の応用に用いてもよく、それらは当業者に明らかとなるであろう。したがって、本発明は、以下の請求の範囲に限って制限される。
【０１２５】
実施例15：電気触媒のためのDNA改変被膜の作製
DNA改変電極は、本明細書においてSH-5'-DNAと呼ばれるチオール末端アルキル鎖[SH(CH2)2CONH(CH2)6NHCO-DNA]によって5'末端で一本鎖オリゴヌクレオチド（典型的に15量体）を誘導体化することによって調製した。誘導体化した一本鎖オリゴヌクレオチドを、それぞれの非改変相補体にハイブリダイズさせた。得られた二本鎖溶液のイオン強度を100 mM MgCl2によって増加させて、この溶液を金表面に1滴滴下した。12〜24時間後、電極を緩衝液によって十分にすすいで電気触媒試験のために用いた。放射活性標識および走査型プローブ顕微鏡による分析から、二本鎖が金表面に関して垂直位置方向の密に充填した単層（50 pmol/cm2）を形成することを示した。
【０１２６】
密度の低い単層（〜1 pmol/cm2）は、上記のプロセスを用いて作製され、緩衝液のイオン強度を低下させ、沈着溶液におけるSH-5'-DNAの濃度を減少させ、または沈着時間を短縮することによって作製される。
【０１２７】
自己構築後、曝露された金表面を、電子の移動が電極結合二本鎖のみを通して起こるように、インターカレート性プローブ分子と電極表面との直接解離を防止するために2-ナフトールの重合化によって電気化学的に不動態化した。
【０１２８】
実施例16：メチレンブルーの電気触媒還元による全ての一塩基ミスマッチの検出
異なる実験において、起こりうる全ての塩基ミスマッチを
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を用いてDNA二本鎖に組み入れた。電極表面をこれらの二本鎖によって改変して、クロノクーロメトリーを用いて呼びかけ信号を送った（適用した電位＝-350 mV；0.5 μMメチレンブルー（MB+）；および2.0 mM Fe(CN)63-）。このアッセイの顕著な感度は、実験条件の操作を行わなくとも、プリン-プリンミスマッチを含む全てのミスマッチが検出されることによって証明される（図10）。シグナルの区別の改善は、試料採取時間を増加することによって得られ、この結果は、このアッセイの触媒特性を反映する。
【０１２９】
ミスマッチ二本鎖は、正準二本鎖DNAと容易に区別されるが、ほとんどがほぼ同じ電気触媒反応を生じることから、ミスマッチは互いに容易に区別することができない。GAおよびAAは実際、他のミスマッチよりわずかに高い電気触媒電流を生じるが、これらの差は、完全にマッチした配列と比較してシグナルが全体的に減弱しているため大きくない。それにもかかわらず、この方法論は、GAミスマッチを検出する明確な戦略を提供する。GAミスマッチは、高い熱力学安定性のために従来の方法では有効に検出されていない。実際に、細胞の修復機構でさえもGAミスマッチを効率よく認識できない。
【０１３０】
実際にGAミスマッチは、電気触媒アッセイを用いなければ、DNA電荷輸送によって有意に検出することができない。ミスマッチは一般的に、DNA二本鎖において積み重ねられるが、十分に対を形成した塩基よりいくぶん大きい力学的運動を受ける。塩基スタック内での電子カップリングに依存するDNA電荷輸送の検出は、それらの運動に対して感受性があり、電気触媒は、この感度の増幅を可能にする。
【０１３１】
したがって、ミスマッチの電気触媒検出は、熱力学的安定性ではなくて、どれほど良好にまたは不良にミスペアが塩基対スタックに電子的にカップリングされるかに依存する。これは、逆に、活性触媒を生成するためにMB+をどれほど効率的に還元できるかに影響を及ぼす。配列にかかわらず、一塩基ミスマッチを検出できることは、変異アッセイおよび遺伝子多様性（SNP）に関してこの方法が適切であることを強調する。
【０１３２】
実施例17：ヒトp53遺伝子からの配列における一塩基ミスマッチ検出
p53腫瘍抑制遺伝子は、ヒト癌を予防するために重要な役割を果たす多機能転写因子をコードする。腫瘍誘発変異は、p53遺伝子の100個を超える部位において認められているが、DNA結合ドメイン（残基100〜293位）をコードする領域では90％より多い変異が認められる。これらの中で、25％がコドン175、245、248、249、および273位における5カ所の「ホットスポット」で起こる。ホットスポット変異は、二つの分類に分離され、クラスI変異は、DNA結合表面で重要な残基（例えば、Arg248およびArg273）に影響を及ぼし、クラスII変異は、DNAに容易に結合するコンフォメーションにおけるタンパク質の折り畳みに関与する残基（例えば、Arg175およびArg249）に影響を及ぼす。
【０１３３】
電気触媒を用いる最初の検査のために、コドン248位および249位におけるこれらの変異ホットスポットの二つを選択した。コドン248位における変異は、タバコの喫煙によって引き起こされるクラスI変異であり、これによって肺癌が起こり、249位変異はアフラトキシンB1曝露によって引き起こされるクラスII変異であり、これによって肝臓癌が起こる。配列
2005502874.tif 000010
には、これらのホットスポットの双方が含まれ、5'末端でアルカンチオールリンカーによって合成した。異なる試料において、電極を、太字のC（一般的な248位変異）でのCAミスマッチ、または下線のCでのCT変異（一般的な249位変異）を含む二本鎖によって改変した。図11において明らかであるように、これらのミスマッチはいずれも、-350 mVで0.5 M MB+および2 mM Fe(CN)63-による電気触媒的クロノクーロメトリーによって、無処置の二本鎖と首尾よく区別することができた。
【０１３４】
したがって、電気触媒を用いて二本鎖DNAの天然の配列内の変異を検出することが可能である。これらの方法は、他の遺伝子および配列に十分に応用可能となるはずである。
【０１３５】
実施例18：天然に存在するDNA損傷の検出
生きた細胞におけるDNAは、細胞に存在する多様な化学化合物および物理的物質との反応と共に自然発生変化を受ける。例えば、シトシンの脱アミノ化は、CGからATトランジションを生じる。反応性酸素種は、ミトコンドリア漏出および電離放射線を含むいくつかの経路を通して産生される。8-オキソ-アデニンは、ヒドロキシルラジカルをプリン塩基のC8位置に付加することに起因であるDNAの可能性がある酸化産物である。5,6-ジヒドロキシチミンのようなヒドロキシピリミジンは、電離放射線にDNAを曝露する際にヒドロキシルラジカルによって形成された塩基破損産物のもう一つの例である。
【０１３６】
これらの可能性があるDNA損傷のいくつかを、配列
2005502874.tif 000011
に組み入れた。電極を、8-オキソ-アデニン、5,6-ジヒドロチミン、脱塩基部位、およびグアニンと対を形成したデオキシウラシルを含む二本鎖DNA配列によって（異なる試料において）改変した。形成された被膜を、-350 mVで0.5 M MB+および2 mM Fe(CN)63-による電気触媒によって調べた。これらの損傷は、DNA二本鎖内で電子カップリングを障害するように思われた。その結果、電気触媒とカップリングしたDNA媒介電荷輸送は、それらの障害に対して感受性があった。それぞれの損傷は二本鎖DNA内で首尾よく検出された（図12）。
【０１３７】
実施例19：電子マイクロアレイによる電気触媒プロセスの感度と検出限界
大きさがミクロンスケールの個々に位置づけ可能な金電極18個からなる金マイクロアレイについて、電気触媒アッセイを行った。図13に認められるように、電気触媒の5秒後に蓄積された電荷の全量は、直径が30 μmまたはそれより小さい電極まで電極領域に厳密に比例することが判明した。
【０１３８】
実施例20：超微小電極による電気触媒プロセスの感度と検出限界
超微小電極上の金表面にハイブリダイズした配列によるミスマッチ検出も同様に可能である。インサイチューハイブリダイゼーション後のミスマッチ配列を調べた。図14に示すように、チップ上の電極をまず、十分にマッチさせた配列
2005502874.tif 000012
によって改変して、電気触媒によって調べた。次に、それらを90℃の緩衝液によって2分間洗浄後、すすいで、ミスマッチ1個を含む相補体と共にインキュベートした。十分にハイブリダイズした後、電気触媒を再度測定して、蓄積された電荷はミスマッチDNA単層の特徴であることが判明した。
【０１３９】
超微小電極上の一本鎖単層から蓄積された電荷も同様に調べた。一本鎖単層上の電気触媒によって、ミスマッチを含まない被膜と類似の電荷が得られることは明らかである。これは、一本鎖単層（二本鎖単層の変性によって形成された）の場合、金表面がより多く曝露されるという事実に帰因する。このように、MB+およびフェリシアン化物は、直接の触媒のために電極にアクセスすることができる（DNAを通してではなく）。さらに、一本鎖単層の線形の形状は二本鎖単層とは異なり、電気触媒に関するメカニズムが異なることと一貫する（直接対DNA損傷を通して）。一本鎖DNAについて認められた知見はまた、検出がハイブリダイゼーションの測定ではないことを証明する対照を提供した。二本鎖（ミスマッチを有しない）および一本鎖被膜はいずれも類似の反応を生じた。対照的に、ミスマッチを有する相補体は、完全にハイブリダイズしたが、弱いシグナルを生じた。
【０１４０】
実施例21：DNA/RNAハイブリッドにおけるミスマッチ検出
細胞試料に呼びかけ信号を送るアッセイでは、ゲノムDNAよりむしろmRNA転写物を調べることが好ましいかも知れない。このシナリオにおいて、患者のmRNAを一本鎖DNAによって改変したチップまたは電極とハイブリダイズさせると、DNA/RNAハイブリッドが得られた。そのような二本鎖の構造は、A型とB型核酸とのハイブリッドであり、それによって純粋なB型DNAとは異なる塩基スタッキングが起こる。このように、この代わりの二本鎖構造における塩基スタッキング障害に対する感受性を確認するために、DNA/RNAハイブリッド内の全ての一塩基ミスマッチを電気触媒によって調べた。
【０１４１】
異なる実験において、全ての起こりうる一塩基ミスマッチを
2005502874.tif 000013
（表面結合鎖はDNAであって、相補鎖はRNAであった）を用いて形成されたDNA/RNAハイブリッドに組み入れた。これらの二本鎖によって改変された電極表面に、クロノクーロメトリーを用いて呼びかけ信号を送った。図15において明らかであるように、起こりうる変異は全て容易に検出された。実際に、変異に対する感度はDNA/DNA結果とほぼ同一であった（図10）。このことは、臨床試料における変異に関する試験を利用する場合、ゲノムDNA、cDNA、またはmRNAを利用することができ、それによって電気触媒アッセイは日常的に用いるために柔軟かつ実際的となることを意味している。
【０１４２】
実施例22：野生型被膜内の小さい割合のミスマッチ二本鎖の検出
電気触媒アッセイが、DNA被膜上の完全なワトソン-クリック対形成した二本鎖の海において少数のミスマッチ二本鎖を検出できるか否かを調べるために、CA塩基の段を特徴とするらせんの割合が0〜100％まで変化する単層を構築した。図16に示すように、適当な実験条件を用いて（例えば、0.2 μM MB+および2 mMフェリシアン化物）、電気触媒シグナルは、被膜における％CA二本鎖の関数として非直線的に急激に減少した。その結果、単層におけるミスマッチ二本鎖が少量であっても電気触媒反応の顕著な減少が起こった。または、より高濃度のMB+（例えば、5 μM）を用いると、直線反応が起こる（図16）。そのような条件は、二倍体生物における遺伝子の半分がおそらく有害な変種を有するヘテロ接合遺伝形質の検出に、および癌に関連する場合のように体細胞変異の検出において有用となる可能性がある。
【０１４３】
実施例23：Mg2+の存在下および非存在下で形成されたDNA結合電極のCTの比較。
DNA結合電極はMg2+の存在下および非存在下で形成された。二つのタイプの表面の特徴は、化学改変されたSi3N4チップによる走査型プローブ顕微鏡によって調べた。Mg2+の存在下で形成された結合した15量体オリゴヌクレオチド二本鎖を有する表面は、深さ45Åのなめらかな凹凸のない被膜を形成することが判明した。しかし、Mg2+なしで形成されたDNA表面の画像は、非常に異なる形態を有することが判明した。Mg2+なしで形成されたDNA表面の画像は、表面上にあまり整っていない二本鎖を有するように思われ、いくつかの領域において金表面が露出していた。Mg2+がなければ、二本鎖は有意により緩く充填されるように思われた。
【０１４４】
Mg2+の存在下でおよび非存在下で形成された電極について得られた方形波ボルタンモグラムは、金に対して-580 mVでDMの可逆的還元を示し、表面結合種の特徴的な特徴を有した。自己構築溶液においてMg2+の非存在下でAu（111）に吸着されたDNAを、32P放射活性標識実験において定量した。アッセイは、改変の24時間後、平均表面被覆12 pmol/cm2を生じ、これは分画被覆0.19に対応した。これらの値は、高いMg2+濃度の存在下で形成された単層に関するこれまでの試験よりはるかに低い表面被覆を反映した。DNAに対する架橋したDMの化学量論が1：1であることは、UV-可視光分光法および電気化学シグナルの積分によって確認した。全てのデータから、架橋したDMが電気化学的に活性であることが示された。
【０１４５】
実施例24：DM-DNA改変表面上のタンパク質の結合による塩基フリッピングの検出
異なるDNA結合タンパク質の非存在下および存在下におけるDM-DNA改変表面のクロノクーロメトリーの結果を図17に示す。調べた十分にマッチしたDNA二本鎖配列に関して、結合したタンパク質の非存在下では、（Agに対して）-575 mVでのクロノクーロメトリーは、5秒間での積分により実質的なシグナルを生じた。しかし、いくつかのタンパク質の存在下では、シグナルの減弱を認め、このようなシグナルの減弱は、タンパク質がDNAを構造的に障害するか否かに依存した。
【０１４６】
タンパク質依存的変化を、メチルトランスフェラーゼHhaI（M.HhaI）の存在下および非存在下でM. HhaI標的配列を含むDNA被膜に関して明確に説明する。この酵素は、配列5'-GCGC-3'の存在下でシトシンのメチル化を触媒し、M.HhaI-DNA共結晶構造から、M.HhaIが二本鎖からシトシンをはじき飛ばして、それによってできた塩基スタックの空間にグルタミン237を挿入することが判明した。二本鎖配列
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（タンパク質結合部位を太字で、DM結合部位を斜体で示す）を含む電極を調製した。メチル基源の共因子であるS-アデノシルメチオニンは、結合を調べる場合には省略したが、電極表面上の反応を調べる場合には省略しなかった。図18Aにおいて明らかであるように、DNA改変電極に結合したM. HhaIでは、被膜の中を通過した電荷量は大きく減少した。DNAに結合しないタンパク質であるBSAを調べると、電流の阻害は起こらなかった。M. HhaIによる電流の減弱は、M. HhaIによる塩基フリッピングとグルタミンの挿入の結果としての、塩基対スタックの中断に基づくと理解することができる。
【０１４７】
塩基フリッピングにより塩基対スタックに芳香族アミノ酸側鎖であるトリプトファンを代わりに挿入した変異体M.HhaI、Q237Wも同様に調べた。この変異体タンパク質との結合およびπスタックの回復によって、電流は回復した。同様に、変異体酵素の結合によって電荷の小さい減少を認めたが、BSAでは認めなかった（下記参照）。
【０１４８】
これらの結果は、溶液中で行われたこれまでの知見を支持し、これらの知見では、CTは、酸化部位としてグアニンダブレットと、空間的に離れたロジウム光酸化剤とを含むDNA構築体に及ぼす長距離の酸化障害に関する研究によって測定された。タンパク質結合に対して遠位の部位での酸化的障害は、未変性のM. HhaIの存在下では実質的に減少したが、Q237W変異体の存在下では回復した。モニターされる反応が、ロジウム光酸化剤との酸化化学、またはここではDMとの還元化学を含むか否かにかかわらず、これらの実験のあいだで類似の結果が得られた。
【０１４９】
実施例25：DNA被膜がタンパク質結合部位における脱塩基部位を含むDM-DNA改変表面に及ぼすタンパク質の影響
類似の結果が、タンパク質結合部位（5'-GAbGC-3'）内で脱塩基部位を含むDNA被膜についても示された。M. HhaIは、より堅固に脱塩基基質に結合することが認められたが、らせんが破壊されたために、タンパク質を含まない脱塩基部位の存在により、十分にマッチした基質と比較して積分電荷は減少した。しかし、図18Bにおいて示されうるように、Trp残基の挿入を有する変異体タンパク質の結合によって、πスタックが完成して、電流が回復した。このように、Q237Wについて認められた効率的なDM還元は、タンパク質結合親和性の喪失によって説明することができない。
【０１５０】
方形波ボルタンメトリー試験も同様に、一貫した結果を生じた。タンパク質またはQ237Wが被膜に結合しなければ、DMの還元電位である-580 mVで可逆的なピークを認めたが、野生型酵素ではピークを認めなかった。したがって、タンパク質-DNA複合体内のDNAの塩基スタックのみを、感度よくアッセイすることができた。
【０１５１】
実施例26：DM-DNA改変表面上でのさらなるタンパク質の結合による塩基フリッピングの検出
いくつかの他の構造的に十分に特徴が調べられたタンパク質-DNA複合体も同様に調べた。ウラシル-DNAグリコシラーゼは、塩基の切除修復にとって重要な塩基フリッピング酵素である。酵素の代謝回転を防止するために、太字のAと反対側の相補鎖に2'-フルオロ-ウラシルを組み入れた配列
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によって、Au電極表面を改変した。メルカプトヘキサノールで埋め戻して1 μM UDGと共にインキュベートした後、クロノクーロメトリーによって-575 mVで表面に呼びかけ信号を送った（図18C）。この場合もこのタンパク質-DNA複合体を通して輸送される電荷は非常に少量であった。この結果は、ウラシルDNAグリコシラーゼによる塩基フリッピングが塩基スタッキングを障害し、したがって、DMに対する電流を障害するという構造モデルをさらに支持した。
【０１５２】
実施例27：DM-DNA改変二本鎖の塩基スタックに対する障害の検出
アッセイはまた、塩基フリッピングの他に塩基スタックに対する障害に関連した電流の測定を提供した。例えば、TATA-ボックス結合タンパク質（TBP）は、その標的部位との結合時にDNAを約90°ねじれさせ、塩基スタッキングを完全に破壊したが、塩基対形成は破壊しなかった。TBPのその認識部位への結合を、配列
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およびメルカプトヘキサノールによって改変した電極について調べた。図18Dにおいて明らかであるように、タンパク質（1 μM）が結合すると、DNA媒介CTによるDMの還元能は有意に減少した。
【０１５３】
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によって改変し、メルカプトヘキサノールによって不動態化し、1μM酵素と共にインキュベートした表面での制限エンドヌクレアーゼPvuII（R.PvuII）によるDNA結合も同様に調べた。メチル化シトシン（M）は、電気化学試験のあいだDNA被膜の切断を防止するために組み入れた。DNA塩基スタックの有意な障害を認めなかった、DNAに結合したこの酵素の結晶構造から予想されるように、DMの効率的な還元は、PvuIIの非存在下および存在下の双方で-575 mVでのクロノクーロメトリーによって認められた（図18E）。しかし、PvuIIのその標的との結合の際に蓄積された電荷の小さい減少を認めた。PvuII DNAによって改変したがBSAまたはM.HhaI（DNA被膜上に結合部位を有しない；図18F）と共にインキュベートした電極表面を用いた対照実験は、電気化学セルに存在するが電極に特異的に結合していないタンパク質は、DMの還元に全く影響を及ぼさないことを示した。クロノクーロメトリーにおけるこの小さい変化の存在または非存在でさえも、タンパク質結合を示すように思われた。これはまた、PvuII DNAによって改変した電極に結合するM.HhaIにおいても認められた（図18F）。ここに、M.HhaIは表面に結合したが、5'-GCGC-3'部位を有しないために塩基をはじき飛ばさなかった。一方、BSAはDNAに結合せず、したがって電荷の低下を認めなかった。
【０１５４】
実施例28：酵素反応速度論の電気プローブのためのCTの利用
このアッセイがDNA酵素反応速度論の電気プローブに従うか否かも同様に調べた（図19）。PvuII（1μM）の制限活性を、
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によって改変したが、エンドヌクレアーゼアッセイをモニターするために未変性の非メチル化制限部位を単層に組み入れたAu表面上でアッセイした。酵素がDNAを切断すると、DMプローブが表面から放出されて、被膜におけるCTの減少が起こる。実際に、クロノクーロメトリーの5秒後、この表面で蓄積された電荷量は、反応時間の増加と共に減少したが、タンパク質を含まない同一表面上でのDM還元量は一定のままであった。電荷の減少は、PvuIIの速度論に関して予想されるように指数的である。さらに、電気化学データは、電気化学条件下で行われたゲルに基づく切断アッセイと一致する。したがって、DNA改変被膜はDNA酵素反応の電気的モニタリングにおいても用いてもよい。
【０１５５】
参考文献
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2005502874.tif 000020
2005502874.tif 000021
2005502874.tif 000022
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【０１５６】
本発明は、その特定の好ましい態様を参照して詳細に説明してきたが、改変および変更は、記述され主張される本発明の趣旨および範囲に含まれると理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
（図１）ダウノマイシンの距離依存的還元を調べるために用いられるDNA二本鎖を示す略図である。右の挿入図は、ダウノマイシン-グリシン架橋を示す。左の挿入図は、電極表面に二本鎖を結合させるチオール末端鎖を示し、電極と電気スタックとのあいだにσ結合16個を提供する。
（図２）ダウノマイシンを架橋したチオール末端二本鎖
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および
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によって改変した金電極のサイクリックボルタンモグラムであり、太字のGは、ダウノマイシン架橋部位を表す。
（図３）TAおよびCA塩基対を含むダウノマイシン架橋チオール末端二本鎖によって改変した金電極のサイクリックボルタンモグラムを示す。オリゴヌクレオチド
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は、下線で示したAとは反対側のTまたはCのいずれかを含む対応する相補体とハイブリダイズした。
（図４）異なる一塩基ミスマッチを含むDNA改変電極でダウノマイシンに関して測定した電荷（Qc）を示す。異なるミスマッチ二本鎖7個を得るために、チオール改変配列
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を以下の異なる相補体7個（ミスマッチは太字で示し、二本鎖の特異的塩基対および融解温度を括弧内に示す）：
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とハイブリダイズさせた。
（図５）1.0 μMダウノマイシンの存在下でDNA改変電極について得られた電荷を示す。様々な割合のGC含有量を有する同定された二本鎖は、完全に塩基対を形成しているか、またはCAミスマッチ1個を含んだ。生じた電流または電荷を測定するミスマッチ検出は、配列組成とは無関係であった。
（図６）CAミスマッチのインサイチュー検出の際に測定された電荷（Qc）を記述する。電極は、CまたはTが相補体ににおいて下線で示したAの向かいに組み入れられた配列
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によって誘導体化した。サイクリックボルタンメトリーを用いて、二本鎖改変電極に非共有結合したダウノマイシンの電気化学反応は、最初に無傷のTAまたはCA二本鎖（TA対CA）に関して、次に（二本鎖の変性後）一本鎖オリゴヌクレオチド（ss）に関して、三番目に（反対の相補鎖との再ハイブリダイゼーション後）再度二本鎖（CA対TA）に関して、そして最後に（変性段階を繰り返した後）もう一度一本鎖オリゴヌクレオチド（ss）に関して測定した。
（図７）フェリシアン化物の電気触媒還元の略図を示す。メチレンブルー（MB+）は、DNA塩基スタックを通して電気化学的に還元されて、ロイコメチレンブルー（LB+）を形成する。次に、フェリシアン化物をLB+によって還元すると、MB+が再生されて、触媒電流を認める。
（図８）1.0 μMメチレンブルーと1.0 mMフェリシアン化物とを含む溶液に液浸したTAおよびCA塩基対を含むチオール末端二本鎖によって改変された金電極のサイクリックボルタンメトリーを示す。オリゴヌクレオチド
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を、下線で示したAとは反対のTまたはCのいずれかを含む対応する相補鎖とハイブリダイズさせた。
（図９）電気触媒プロセスにおけるフェリシアン化物の還元を示す。DNA媒介反応において、電子は電極表面からインターカレートしたMB+へと流れる。MB+の還元型であるロイコメチレンブルー（LB+）は、次に、より多くの電子がMB+に流れて、触媒サイクルが持続するように、溶液中のフェリシアン化物を還元する。
（図１０）  完全な塩基対相補体（TA）および一塩基ミスマッチを導入した相補体とハイブリダイズしたチオール末端配列
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によって改変した金電極で2.0 mM Fe(CN)63-＋0.5 mM MB+（pH 7）の-350 mVでのクロノクーロメトリーの経時的な電荷の結果を示す。上段から、最初の線は、完全に対形成したTA相補体であり、第二および第三の線はプリン-プリンミスマッチ、第四および第五の線は、プリン-ピリミジンミスマッチ、第六の線は、プリン-プリンミスマッチ、第七の線は、プリン-ピリミジンミスマッチ、ならびに第八および第九の線は、ピリミジン-ピリミジンミスマッチである。これらの実験は、5 mM燐酸ナトリウム、50 mM NaCl、pH 7.0において室温で完全にハイブリダイズする条件で行った。ミスマッチの検出は、ミスマッチによって引き起こされた局所塩基スタック障害によるDNA媒介電子移動効率の減少に基づく。ワトソン-クリック配列とミスマッチ配列との識別は、試料採取時間の増加と共に大きくなる。
（図１１）太字のC（一般的な248位変異）でのCAミスマッチまたは下線で示したCでのCTミスマッチ（一般的な249位変異）のいずれかを有する配列
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に関する0.5 M MB+および2 mM Fe(CN)63-による-350 mVでの電気触媒的クロノクーロメトリーを用いて経時的に測定した電荷（uC）を示し、これらは未変性の二本鎖に関する経時的電荷とは区別される。
（図１２）配列
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の様々な改変に関する0.5 M MB+および2 mM Fe(CN)63-による-350 mVでの電気触媒的クロノクーロメトリーを用いて経時的に測定した電荷（uC）を示す。電極は、個々の試料において、8-オキソ-アデニン、5,6-ジヒドロチミン、脱塩基部位、およびグアニンと対を形成したデオキシウラシル（シトシン脱アミノ化の結果）を含む二本鎖DNA配列によって改変した。それぞれの損傷は、二本鎖DNA内で首尾よく検出された。
（図１３）5秒間の電気触媒の際に電荷を蓄積させた後、金マイクロアレイにおける電極の面積あたりの電荷を示す。図において、蓄積された電荷の全量と電極とのあいだに厳密な比例関係を認めることができる。
（図１４）電極上の単層、すなわち良好にマッチした配列
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にハイブリダイズした単層およびCAミスマッチ1個を有する相補体とハイブリダイズした単層の電気的触媒の経時的な電荷の結果を示す。
（図１５）完全に塩基対を形成したRNA相補体（Ta）と一塩基ミスマッチを導入した他のRNA相補体とハイブリダイスしたチオール末端配列
2005502874.tif 000036
によって改変した金電極での2.0 mM Fe(CN)63-＋0.5 mM MB+（pH 7）による-350 mVでのクロノクーロメトリーの経時的な電荷（uC）の結果を示す。これらの実験は、5 mM燐酸ナトリウム、50 mM NaCl、pH 7.0において室温で完全にハイブリダイズする条件で行った。ミスマッチの検出も同様に、これらのDNA/RNAハイブリッドにおいて行われる。
（図１６）様々な触媒濃度での電気触媒によるミスマッチ検出の比較を示す。より低いMB+濃度では、電気触媒シグナルは、被膜におけるCA二本鎖の割合の関数として非直線的に急激に減少することが示される。しかし、より高いMB+濃度では、直線反応が起こる。
（図１７）タンパク質結合と反応の電気化学分析のためのDNA媒介金電極の作製を示す。金電極の改変が完了した後、電極を約1μMの試験タンパク質と共に20分間インキュベートして、SCEに対して-575 mVでのクロノクーロメトリーによって電極に呼びかけ信号を送った。5秒後に蓄積された電荷量が、タンパク質を含まない対照より有意に少なければ、その特定のタンパク質は、結合によりDNAの塩基スタックを破壊する。
（図１８）タンパク質結合によって引き起こされたDNA構造障害を正確に反映する、DNA改変表面を通しての電荷輸送を示す。タンパク質を結合したまたは結合していない金におけるチオール末端DNA被膜（pH 7）に共有結合によって架橋したDMの-575 mVでのクロノクーロメトリー。パネルA〜Eに示した実験に関して、用いたDNA配列は、DNA結合部位を下線で示し、ダウノマイシン結合部位を斜体で示すグラフの上に示す。その表面の対照トレースは、「DM」（DMのみ、タンパク質を含まない）によって示す。タンパク質とインキュベートした後の「M. HhaI」、「UDG」または「TBP」（DNA媒介CTの阻害を示す）、「Q237W」、または「PvuII」（効率的なCTを示す）、または「BSA」（DNAに結合しないタンパク質）による試験トレースを示す。パネルAおよびBは、M. HhaIについて得られたデータを含む；パネルAは、良好にマッチした結合部位を用いて、パネルBは、酵素による塩基フリッピングを促進する脱塩基部位を含む結合部位を用いる。パネルCはもう一つの塩基フリッピング酵素であるUDGについて得られたデータを含む。パネルDは、TBPを用いた電気化学試験の結果を含み、パネルEはPvuIIの存在下および非存在下でのデータを含む。パネルFは、DNA結合部位（PvuIIに関する）とタンパク質（M. HhaI野生型、Q237W）とがマッチしない、または用いたタンパク質がDNAに全く結合しない（BSA）対照実験である。結晶学的測定からDNAをねじれさせることが知られているタンパク質は全て、DMクロノクーロメトリーの阻害を示した（DNAが、それ自身塩基スタック障害である脱塩基部位を含むパネルBを例外とする）が、塩基スタックを破壊することなくDNAに結合するタンパク質は、有意な阻害を示さない。蓄積された電荷量の小さい減少は、タンパク質結合時に常に認められる。被膜の電気的特性におけるこの小さい変化は、タンパク質結合を示しているように思われる。例えば、BSA（DNAに結合しない）を用いる場合、電荷の小さい減少は認められない（パネルAおよびF）。しかし、M. HhaIを、結合部位を有しないが（パネルF）DNAに非特異的に結合する濃度で被膜に用いると、塩基フリッピングを伴わないタンパク質結合のために、蓄積された電荷が非常に少量減少する。このように、DNA構造を破壊しないタンパク質と共にインキュベートした際の電荷の減少は小さく、またはDNA構造を破壊するタンパク質とインキュベートした場合の減少が大きいことは、電気化学測定がタンパク質結合の反映である証拠である。
（図１９）酵素の速度論に従って用いることができるDNA改変表面を通しての電荷輸送を示す。図19Aは、PvuIIの制限部位を含むDM架橋表面結合オリゴヌクレオチド二本鎖の酵素とのインキュベーションを示す。酵素が切断すると、酸化還元プローブを含む二本鎖の末端が表面から放出される（図19A）。酸化還元プローブの放出によって、経時的なDM還元量の減少が起こる（図19B）。図19Bのグラフは、酵素反応時間の関数としてDNA被膜で蓄積された電荷量のプロットを示す。同じ表面をPvuIIを含まずにインキュベートしても、経時的なDM還元の減少を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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