(57)【要約】本発明は、ターゲティングされた、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングにより新規な核酸分子を作製するための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーRNA分子（標的プレmRNA）と相互作用し、新規なキメラRNA分子（キメラRNA）の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレトランススプライシング分子(PTM)を含む。特に、本発明のPTMは、皮膚細胞で発現された特定の標的プレmRNAと相互作用し、その結果、種々の異なる皮膚疾患の原因となる遺伝的欠陥の修正をもたらすよう遺伝子操作して、治療上の価値を有し得るレポーター分子またはタンパク質をコードするようにすることができる。本発明の組成物はさらに、本発明のPTMを発現することができる組換えベクター系および該PTMを発現する細胞を含む。本発明の方法は本発明のPTMと、皮膚細胞で発現した特定の標的プレmRNAとを、該PTMの一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされてその特定の遺伝子の遺伝的欠陥が修正されたキメラRNA分子を形成する条件下で、接触させることを含む。本発明はコラーゲンXVIIプレmRNAのトランススプライシングが上手くいき、それにより皮膚特異的な遺伝的欠陥の修正のためのトランススプライシングの有用性が確立されることに基づくものである。本発明の方法および組成物は、特定の皮膚疾患、すなわち、上皮脆弱性疾患、角質化疾患、毛髪疾患および色素沈着疾患などの遺伝性皮膚症、ならびに皮膚の癌の治療のための遺伝子療法に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a)皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域； 
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含み、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、皮膚細胞。
【請求項２】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含み、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、皮膚細胞。
【請求項３】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含み、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、皮膚細胞。
【請求項４】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
3’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記核酸分子が5’スプライス部位の片側または両側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含んでなる、請求項１、２または３に記載の細胞。
【請求項７】
前記核酸分子が3’スプライス領域の一方の側またはそれ以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１、２または３に記載の細胞。
【請求項８】
前記標的プレmRNAへの前記核酸分子の結合が相補性、三重らせんの形成、またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が皮膚細胞内で発現されるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがケラチノサイト特異的ポリペプチドである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがメラノサイト特異的ポリペプチドである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがプレクチン、VII型コラーゲン、XVII型コラーゲン、およびラミニンポリペプチドからなる群から選択される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞が皮膚の癌細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞がメラノーマまたは基底細胞腫細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞がケラチノサイト、メラノサイトおよび真皮乳頭細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
組換えベクターを含む皮膚細胞であって、該ベクターが下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域； 
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現し、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記皮膚細胞。
【請求項１７】
組換えベクターを含む皮膚細胞であって、該ベクターが下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a)皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現し、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記皮膚細胞。
【請求項１８】
組換えベクターを含む皮膚細胞であって、該ベクターが下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a)皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現し、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記皮膚細胞。
【請求項１９】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２０】
3’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含んでなる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項２１】
前記核酸分子が3’スプライス領域の一方の側またはそれ以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１６、１７または１８に記載の細胞。
【請求項２２】
皮膚細胞内でキメラRNA分子を製造する方法であって、皮膚細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて皮膚細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含み、該核酸分子が下記a)〜d)：
a)皮膚の細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。
【請求項２３】
皮膚細胞内でキメラRNA分子を製造する方法であって、皮膚細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて皮膚細胞内でキメラRNAを形成する条件下で接触させることを含み、該核酸分子が下記a)〜d)：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含んでなる、上記方法。
【請求項２４】
皮膚細胞内でキメラRNA分子を製造する方法であって、細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを接触させることを含み、該核酸分子が、
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を含んでなり、かつ、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
【請求項２５】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
3’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含んでなる、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２７】
前記核酸分子が3’スプライス領域の一方の側またはそれ以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項２２、２３または２４に記載の方法。
【請求項２８】
標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が皮膚細胞内で発現されるポリペプチドをコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドがケラチノサイト特異的ポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドがメラノサイト特異的ポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
皮膚細胞内で発現されるポリペプチドがプレクチン、VII型コラーゲン、XVII型コラーゲン、およびラミニンポリペプチドからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
皮膚細胞が癌細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞がメラノーマまたは基底細胞腫細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が前記細胞に対して有毒または治療的価値のあるポリペプチドをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がケラチノサイト、メラノサイトおよび真皮乳頭細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a)皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域； 
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
であって、かつ、上記細胞内の核スプライシング成分により認識される、上記核酸分子。
【請求項３７】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
であって、上記細胞内の核スプライシング成分により認識される、上記核酸分子。
【請求項３８】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
であって、上記細胞内の核スプライシング成分により認識される、上記核酸分子。
【請求項３９】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項４０】
3’スプライス領域がピリミジン領域をさらに含んでなる、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記核酸分子が3’スプライス領域の一方の側またはそれ以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項３６、３７または３８に記載の核酸分子。
【請求項４２】
標的プレmRNAへの核酸分子の結合が相補性、三重らせんの形成、またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項４３】
標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が皮膚細胞内で発現されるポリペプチドをコードする、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項４４】
前記ポリペプチドがケラチノサイト特異的ポリペプチドである、請求項４３に記載の核酸分子。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがメラノサイト特異的ポリペプチドである、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４６】
皮膚細胞で発現されるポリペプチドがプレクチン、VII型コラーゲン、XVII型コラーゲン、およびラミニンポリペプチドからなる群から選択される、請求項４３に記載の核酸分子。
【請求項４７】
標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列が該細胞に対して有毒または治療的価値のあるポリペプチドをコードする、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項４８】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a)皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域； 
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現する真核細胞発現ベクターであって、かつ、該核酸分子が皮膚細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記ベクター。
【請求項４９】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 3’スプライス受容部位；
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現する真核細胞発現ベクターであって、かつ、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記ベクター。
【請求項５０】
下記a)〜d)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン；
b) 5’スプライス部位；
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域；および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を発現する真核細胞発現ベクターであって、かつ、該核酸分子が上記細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記ベクター。
【請求項５１】
前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５２】
前記核酸分子がピリミジン領域をさらに含んでなる、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５３】
前記核酸分子が3’スプライス領域の一方の側またはそれ以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項４８、４９または５０に記載のベクター。
【請求項５４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４８、４９または５０に記載のベクター。
【請求項５５】
前記核酸分子の発現が皮膚細胞特異的プロモーターにより制御される、請求項４４、４３または４４に記載のベクター。
【請求項５６】
生理学上許容される担体と請求項３６〜４７のいずれか1項に記載の核酸分子を含んでなる組成物。
【請求項５７】
前記組成物が皮膚に適用される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
被験体における遺伝的欠陥を修正する方法であって、下記a)およびb)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメインであって、但し該プレmRNAが遺伝的欠陥を含む遺伝子によりコードされたものである、該ドメイン；および
b) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を該被験体に投与することを含み、かつ、該核酸分子が細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
【請求項５９】
皮膚細胞において遺伝子発現をイメージングする方法であって、下記a)およびb)を含んでなる核酸分子：
a) 皮膚細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメインであって、但し該プレmRNAが遺伝的欠陥を含む遺伝子によりコードされたものである、該ドメイン；および
b) レポーター分子をコードする、標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列；
を被験体に投与することを含み、かつ、該核酸分子が上記細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は2002年6月20日出願の米国出願番号No. 10,198,447に対する優先権を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
1.序論
本発明は、ターゲティングしたスプライセオソーム媒介RNAトランススプライシングにより新規な核酸分子を生成するための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーRNA分子（標的プレmRNA）と相互作用し、新規なキメラRNA分子（キメラRNA）の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレトランススプライシング分子(PTM)を含む。特に、本発明のPTMは、皮膚細胞で発現された特定の標的プレmRNAと相互作用し、その結果、種々の異なる皮膚疾患の原因となる遺伝的欠陥の修正をもたらすよう遺伝的に操作されている。本発明の組成物はさらに、本発明のPTMを発現することができる組換えベクター系および該PTMを発現する細胞を含む。本発明の方法は、本発明のPTMと、皮膚細胞で発現した特定の標的プレmRNAとを、該PTMの一部が標的プレmRNAの一部へとトランススプライシングされてその特定の遺伝子の遺伝的欠陥が修正されているキメラRNA分子を形成する条件下で、接触させることを含む。本発明はコラーゲンXVIIプレmRNAのトランススプライシングが上手くいき、それにより皮膚特異的な遺伝的欠陥の修正のためのトランススプライシングの有用性が確立されることに基づくものである。本発明の方法および組成物は、特定の皮膚疾患、すなわち、上皮脆弱性疾患、角質化疾患、毛髪疾患および色素沈着疾患などの遺伝性皮膚症、ならびに皮膚の癌および乾癬などの皮膚の増殖性疾患の治療のための遺伝子療法に使用できる。
【背景技術】
【０００３】
2.発明の背景
最近、遺伝性皮膚疾患の遺伝的基礎のよりよい理解に向けた重要な進展があった。特定の皮膚疾患の原因となる、基礎をなす突然変異の理解が、皮膚遺伝子療法の基礎を提供した。皮膚には容易に接近できること、そして、ケラチノサイトおよび皮膚繊維芽細胞などの皮膚細胞は培養で容易に増殖させることができるという事実のため、皮膚は遺伝子療法のための理想的な組織となる。
【０００４】
表皮水疱症(EB)は、微細な外傷が皮膚や粘膜に疱疹をつくる遺伝性皮膚疾患の不均一な一群に当てはめられた用語である。組織開裂のレベルによって、EBは、(i)水疱形成が基底ケラチノサイトで起こる単純性EB、(ii) 水疱形成が透明層(lamina lucida)で起こる接合EB(JEB)、および(iii) 水疱形成が基底膜緻密層下で起こるEBジストロフィカンス(dystrophicans)の3つの主要な群に分けられる。
【０００５】
JEB患者は致死性JEBと全身性萎縮型良性EB(GABEB)の2つの主要な群に分けられる。前者の疾病であると診断された患者は通常、生後1年以内に死に至り、一方、後者の診断の予後はもっと良く、生存に伴い改善の傾向がある。GABEB患者において、XVII型コラーゲンと同定されている水疱性類天疱瘡抗原2(BPAG2)の発現が低下していることを報告した最初の知見の後、BPAG2をコードする遺伝子(Col17A1)における突然変異が同定された。これまでに、Col17A1におけるいくつかの異なる突然変異が同定され、突然変異データベースの構築に至っており、これがnH-JEBの臨床症状に対する特定の突然変異の影響の分析を助けてきた。例えば、停止コドンの突然変異または両方の対立遺伝子上で下流の停止コドンに誘導する突然変異が、本来の「GABEB」表現型と関連していると決定づけられている。
【０００６】
さらに、遅発型筋ジストロフィー(EBS-MD)を伴う単純性EB患者はプレクチン遺伝子における突然変異として特徴づけられている。これらの患者の幾人かは、1287位における、ロイシンの挿入をもたらす3つの塩基対の挿入(1287ins3)と、プレクチンコード領域において停止コドンの挿入を生じるミスセンス突然変異Q1518Xとに関して複合ヘテロ接合性を特徴とする(Bauer, JWら, 2001 Am J Pathol 158: 617-625)。
【０００７】
皮膚の遺伝子療法では、これまでに、レトロウイルスベクターを用いて罹患遺伝子の完全長cDNAコピーを送達する努力が最も多く試みられてきた。しかし、皮膚治療における完全長cDNAの送達はmRNA(またはcDNA)の大きさのために制限されることが多い。例えば、プレクチンmRNAは14.8kbであり、VII型コラーゲンmRNAは9.2kbであり、XVII型コラーゲンmRNAは6.5kbである。種々の形態のEBを有する患者において突然変異しているこれらの遺伝子の大きさ、およびそれらの調節エレメントは、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを用いた皮膚遺伝子療法に好適な送達系の容量を超える。従って、送達しければならない治療用配列の大きさを小さくすることが有利である。
【０００８】
また、皮膚水泡性疾患に関連づけられ、遺伝子療法のターゲットとされる遺伝子は特定の上皮層のケラチノサイトでのみ発現されることも重要である。例えば、このような遺伝子の異所性発現は病的な上皮極性をもたらすことがある。ケラチノサイト特異的発現の問題に取り組むための1つの可能性のある方法は、導入遺伝子の発現を指令する特異的調節エレメントを用いることである。しかし、このようなプロモーターを用いると、治療ベクターにおける挿入サイズがさらに大きくなる。
【０００９】
Col17A1遺伝子については、遺伝子修正のための別のアプローチが報告されている。特に、Col17A1遺伝子において突然変異を修正する天然のメカニズムがあり、これにより遺伝子療法の概念が有効になる。例えば、Jonkmanら, (1997, Cell 88:543-551)は上肢において左右対称な葉様パターンの正常な外観の皮膚斑を持っていた患者に関して報告している。Col17A1遺伝子の、基礎をなす突然変異は父方がR1226X、そして母方が1706delAであると同定されている。皮膚の臨床上罹患していない領域において、基底細胞の約50%が母方突然変異を取り巻く有糸分裂遺伝子変換のためにXVII型コラーゲンを低減したレベルでしか発現せず、従って、この領域でのヘテロ接合性の喪失を招いていた。これらの知見は、nH-JEBの表現型発現を修正するのには、完全長XVII型コラーゲンの50%未満の発現で十分であることを示唆している。さらに、Col17A1遺伝子におけるヘテロ接合性R785X突然変異を有する患者において、ケラチノサイトスプライシング機構によって遺伝子修正が部分的に成功したことが記載されている(Ruzzi L ら., 2001 J. Invest Dermatol 116:182-187)。これらの患者では、突然変異を保持するエキソン33を除去すると、検出可能なXVII型コラーゲンタンパク質は3〜4%しかみとめられないが、異例の緩和された表現型がもたらされる。また、Col17A1およびLAMB3遺伝子における突然変異を有する患者に関しても、同様のエキソンのインフレームスキッピングが報告されている。
【００１０】
最近まで、特定の標的遺伝子を改変するためのターゲティングされたトランススプライシングの実際的な適用は、グループIリボザイムに基づくメカニズムに限られていた。テトラヒメナ(Tetrahymena)グループIリボザイムを用い、ターゲティングされたトランススプライシングが大腸菌(E. coli)(Sullenger B.A.およびCech. T.R., 1994, Nature 341:619-622)、マウス繊維芽細胞(Jones, J.T. ら, 1996, Nature Medicine 2:643-648)、ヒト繊維芽細胞(Phylactou, L.A.ら, 1998 Nature Genetics 18:378-381)およびヒト赤血球前駆細胞(Lanら, 1998, Science 280:1593-1596)で証明されている。改変型グループIリボザイムにより駆動される、ターゲティングされたRNAトランススプライシングの多くの適用が採用されているが、天然の哺乳類スプライシング装置、すなわちスプライセオソームにより媒介される、ターゲティングされたトランススプライシングが現在、積極的に開発されている。
【００１１】
スプライセオソーム媒介トランススプライシングは内因性細胞スプライシング装置を用いて、突然変異エキソンを置き換えることにより、RNAレベルで遺伝性の遺伝的欠陥を修復する。このような技術の使用は、従来の遺伝子療法アプローチに優るいくつかの利点を有する。例えば、修復産物は常に内因性調節下にあり、内因的に標的プレmRNAを発現する細胞においてのみ修正が起こる。さらに、遺伝様式にかかわらず、遺伝疾患が修正できる。最後に、トランススプライシングの使用により、発現ベクターへの導入遺伝子の大きさが小さくなる。
【００１２】
米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号および同第6,280,978号は、標的前駆体mRNAと接触させることによりトランススプライシング反応を媒介し、新規なキメラRNAを生成するためのPTMの使用を記載している。本発明は、皮膚細胞内で発現され、かつ、皮膚疾患と関連する特定の欠陥遺伝子を修正するようデザインされた特定のPTM分子を提供する。本発明の特定のPTMは、限定されるものではないが、上皮脆弱性疾患、角質化疾患、毛髪疾患、色素沈着疾患、および癌疾患をはじめとする遺伝性皮膚症などの種々の異なる皮膚疾患を治療するのに用い得る。
【発明の開示】
【００１３】
3.発明の概要
本発明はスプライセオソームにより媒介される、ターゲティングされるトランススプライシングにより、新規な核酸分子を製造するための組成物および方法に関する。特に、本発明の組成物は、皮膚細胞内で発現された特定の標的プレmRNA分子（以下、「皮膚細胞特異的プレmRNA」と呼ぶ）と相互作用し、スプライセオソーム性トランススプライシング反応を媒介して、新規なキメラRNA分子（以下、「キメラRNA」と呼ぶ）を生成するようデザインされたプレトランススプライシング分子（以下、「PTM」と呼ぶ）を含む。皮膚特異的プレmRNA分子としては、限定されるものではないが、コラーゲン遺伝子から転写されたもの、すなわち、いくつか挙げると、VII型コラーゲン、VII型コラーゲン(Col17A1)、ラミニンおよびプレクチン遺伝子が挙げられる。本発明は、皮膚のケラチノサイトにおける内因性のCol17A1プレmRNAのターゲティングされたトランススプライシングの成功に基づいているが、本発明の方法および組成物はまた、他のタイプの皮膚細胞、すなわち、繊維芽細胞、メラノサイト、真皮乳頭細胞、神経細胞および血液細胞における欠陥遺伝子をターゲティングするのにも使用しうる。
【００１４】
本発明の組成物は皮膚特異的標的プレmRNA分子と相互作用し、スプライセオソーム性トランススプライシング反応を媒介して、新規なキメラRNA分子を生成するようデザインされたPTMを含む。このようなPTMは皮膚特異的遺伝子における遺伝的欠陥を修正するようデザインされている。PTMの一般的なデザイン、構築および遺伝子操作、ならびに細胞内でトランススプライシング反応を首尾よく媒介するそれらの能力の証明は、米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号および同第6,280,978号、ならびに米国特許出願番号09/756,095、09/756,096、09/756,097および09/941,492に記載されており、これらの開示は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【００１５】
本発明の方法は本発明のPTMと皮膚細胞特異的標的プレmRNAとを、PTMの一部が標的プレmRNAにトランススプライシングされて新規なキメラRNAを形成する条件下で接触させることを包含する。本発明の方法は、本発明のPTMを、皮膚細胞特異的標的プレmRNAを発現する細胞内で、該PTMが細胞によって取り込まれ、PTMの一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて皮膚細胞特異的遺伝的欠陥の修正をもたらす新規なキメラRNA分子を形成する条件下で、接触させることを含む。あるいは、PTMをコードする核酸分子を標的細胞へ送達した後、その核酸分子を発現させて、トランススプライシング反応を媒介することができるPTMを形成させてもよい。本発明のPTMは、トランススプライシング反応により生じる新規なキメラRNAがその細胞内で欠陥型または不活性な皮膚細胞特異的タンパク質を相補するタンパク質をコードするように遺伝子操作されている。本発明の方法および組成物は表皮水疱症などの種々の皮膚疾患の治療のための遺伝子修復に使用できる。
【００１６】
4. 図面の簡単な説明
（図面の簡単な説明については下記参照）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
5.発明の詳細な説明
本発明は、プレトランススプライシング分子(PTM)を含む組成物と、新規な核酸分子を生成するためのそのような分子の使用に関する。本発明のPTMは、(i)皮膚細胞特異的標的プレmRNAと特異的に結合するようにデザインされた1以上の標的結合ドメイン、ならびに(ii)分岐点と3’スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域を含んでなる。この3’スプライス領域はさらにピリミジン領域を含んでもよい。さらに、本発明のPTMは翻訳されうるタンパク質産物をコードするものなどの任意のヌクレオチド配列およびRNAスプライス部位を標的結合ドメインから分離する1以上のスペーサー領域を含むように操作することができる。
【００１８】
本発明の方法は、本発明のPTMと皮膚細胞特異的標的プレmRNAとを、PTMの一部が標的プレmRNAの一部へとトランススプライシングされて、皮膚細胞特異的遺伝子欠陥の修正をもたらす新規なキメラRNAを生成する条件下で、接触させることを含む。このような皮膚特異的標的プレmRNA分子としては、限定されるものではないが、いくつか挙げれば、プレクチン、XVII型コラーゲン、VII型コラーゲンおよびラミニンがある。
【００１９】
5.1プレトランススプライシング分子の構造
本発明はターゲティングされたトランススプライシングにより新規なキメラ核酸分子を生成するのに用いられる組成物を提供する。本発明のPTMは、(i)皮膚細胞特異的標的プレmRNAに、PTMの結合をターゲティングする1以上の標的結合ドメイン、および(ii)分岐点および3'スプライス受容部位および／または5'スプライス供与部位を含む3'スプライス領域。この3'スプライス領域はさらにポリピリミジン領域を含んでもよい。PTMはまた、(a)スプライス部位を標的結合ドメインから分離する1以上のスペーサー領域、(b)ミニイントロン配列、(c)ISAR（イントロンスプライシングアクチベーターおよびリプレッサー）共通結合部位、および／または(d)リボザイム配列を含んでもよい。さらにまた、本発明のPTMは皮膚細胞特異的遺伝的欠陥を修正するようデザインされた皮膚細胞特異的エキソン配列を含む。
【００２０】
本発明はさらに皮膚細胞における遺伝子発現のリアルタイムイメージングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は皮膚細胞内で発現した標的前駆体メッセンジャーRNA分子と相互作用し、レポーター分子をコードするようにデザインされた新規なキメラRNA分子の生成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようデザインされたプレトランススプライシング分子を含む。本発明のPTMは、標的プレmRNAと相互作用するように操作されるが、ここで、標的プレmRNAはその発現が皮膚疾患に関連しているものである。このように、本発明は被験体の皮膚疾患の診断および／または予後診断のための方法および組成物を提供する。このような皮膚疾患としては、限定されるものではないが、異常な遺伝子発現による疾患、癌または乾癬などの増殖性疾患、または感染症が挙げられる。
【００２１】
欠陥型または不活性型の皮膚細胞特異的タンパク質を相補する新規なキメラRNAの産生に用いるため、種々の異なるPTM分子が合成されうる。このようなPTMの一般的デザイン、構築および遺伝子操作、ならびに細胞内でのトランススプライシング反応の成功を媒介するそれらの能力の証明は米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号および同第6,280,978号、ならびに米国特許出願番号09/941,492、09/756,095、09/756,096および09/756,097に詳細に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００２２】
本明細書において、皮膚細胞は上皮、真皮、および／または皮膚の第一層に見られる種々の細胞型のうち任意のものとして定義される。このような皮膚細胞型としては、例えば、皮膚のメラノサイト、ケラチノサイト、繊維芽細胞、血管細胞、毛包細胞、神経細胞、皮膚の癌細胞が挙げられる。
【００２３】
PTMの標的結合ドメインはPTMに結合親和性を付与する。本明細書において、標的結合ドメインは、結合の特異性を与え、核のスプライセオソームプロセッシング機構がPTMの一部を皮膚細胞特異的標的プレmRNAの一部へとトランススプライシングさせうるように、皮膚細胞特異的標的プレmRNAをPTMに近接して固定する任意の分子、すなわち、ヌクレオチド、タンパク質、化学化合物などとして定義される。PTMの標的結合ドメインは、選択されたプレmRNAのターゲティングされる領域に対して相補的かつ、アンチセンス配向にある複数の結合ドメインを含みうる。標的結合ドメインは数千までのヌクレオチドを含みうる。本発明の好ましい実施形態では、これらの結合ドメインは少なくとも10〜30、数百までまたはそれ以上のヌクレオチドを含みうる。PTMの特異性は標的結合ドメインの長さを増加させることによって著しく高めることができる。例えば、標的結合ドメインは数百以上のヌクレオチドを含みうる。さらにまた、標的結合ドメインは「直鎖状」であってもよいが、このRNAは、複合体を安定化させ、それによりスプライシング効率を高めうる二次構造を形成するように折りたたまれうると考えられる。第2の標的結合領域は分子の3’末端に位置してもよく、本発明のPTMに組み込むことができる。絶対的な相補性が好ましいが、必ずしも必要ではない。本明細書に関してRNAの一部に「相補的な」配列とは、その標的プレRNAとハイブリダイズして安定な二重らせんを形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は相補性の程度および核酸の長さの両方に依存しうる(例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照)。一般にハイブリダイズする核酸が長いほど、RNAと誤対合する塩基をより多く含むが、なお安定した二重らせんを形成する。当業者ならば、標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の安定性を調べることにより、二重らせんの誤対合、長さまたは構造の許容度を確かめることができる。 
また、結合はその他の機構によって、例えば三重らせんの形成、アプタマーの相互作用、RNAラッソ(lassos)（PCT出願：PCT/US98/17268参照)抗体相互作用、またはPTMが特定のRNA結合タンパク質、すなわち特定の標的プレmRNAと結合したタンパク質を認識するように操作されているものなど、タンパク質／核酸相互作用によって、達成することもできる。あるいは、本発明のPTMは、例えばRNA分子内のヌクレオチド間の分子内塩基対合によって生じるヘアピン構造などの二次構造を認識するようにデザインしてもよい。
【００２４】
本発明のある特定の実施形態では、標的結合ドメインを、トランススプライシングに対してターゲティングされるケラチノサイト特異的標的プレmRNAの領域に近接した配列に相補的で、かつ、アンチセンス配向とする。本発明のある特定の実施形態では、標的結合ドメインは、限定されるもはのではないが、プレクチン、VII型コラーゲン、XVII型コラーゲン(Col17A1)、およびラミニンをはじめとするケラチノサイト特異的標的プレmRNAヌクレオチド配列に相補的で、かつ、アンチセンス配向にある。皮膚疾患および既知の遺伝的欠陥に関しての総説としては、Uittoら., (2000, Human Gene Therapy  11:2267-2275)を参照。なお、この開示は参照により本明細書にそのまま組み入れられる。
【００２５】
また、PTM分子は分岐点配列および3' スプライス受容AG部位および／または5'スプライス供与部位を含む3’スプライス領域を含みうる。この3’スプライス領域はポリピリミジン領域をさらに含んでもよい。RNAスプライシングに用いる5’スプライス供与部位および3’スプライス領域の共通配列は当技術分野で周知のものである(Mooreら, 1993, The RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 303-358参照)。さらにまた、本発明の実施において、5'供与スプライス部位および3’スプライス領域として機能する能力を保持する改変共通配列を用いてもよい。要するに、5’スプライス部位共通配列はAG/GURAGU(ここで、A=アデノシン、U=ウラシル、G=グアニン、C=シトシン、R=プリンおよび/=スプライス部位)である。3’スプライス部位は分岐点または分岐部位、ポリピリミジン領域および3'共通配列(YAG)の3つの異なる配列エレメントからなる。哺乳類の分岐点共通配列は YNYURAC（Y=ピリミジン；N=任意のヌクレオチド）である。下線を引いたAは分岐形成部位である。ポリピリミジン領域は、分岐点とスプライス部位アクセプターとの間に位置し、効率的な分岐点利用および3’スプライス部位認識に重要なものである。ジヌクレオチドAUで始まり、ジヌクレオチドACで終わる他のプレ-メッセンジャーRNAイントロンも確認されており、U12イントロンと呼ばれている。U12イントロン配列ならびにスプライス受容／供与配列として機能する任意の配列を用いて本発明のPTMを生成してもよい。
【００２６】
また、標的結合ドメインからRNAスプライス部位を分離するスペーサー領域もPTMに含めてよい。このスペーサー領域は非スプライスPTMおよび／または標的プレmRNAへのトランススプライシングを促進する配列の翻訳を阻止する停止コドンなどの特徴を含むようにデザインしてもよい。
【００２７】
本発明のある好ましい実施形態では、スペーサー、結合ドメイン、またはPTM内の他のいずれかの場所に「セーフティー」を組み込んで非特異的トランススプライシングを妨げる。これは、比較的弱い相補性によってPTMの3'および／または5’スプライス部位のエレメントをカバーして非特異的トランススプライシングを妨げるPTMの領域である。PTMは、PTMの結合／ターゲティング部分のハイブリダイゼーションの際には 3'および／または5'スプライス部位はカバーされず、完全活性型となるようにデザインされる。
【００２８】
「セーフティー」は、PTM分岐点、ポリピリミジン領域、3’スプライス部位および／または5’スプライス部位（スプライシングエレメント）の片側または両側に弱く結合する1以上のシス配列の相補的ストレッチからなる（または、第2の別個の核酸鎖でありうる）か、あるいは、スプライシングエレメントそれ自体の一部と結合しうる。この「セーフティー」結合はスプライシングエレメントが活性となるのを妨げる（すなわちU2 snRNPその他のスプライシング因子がPTMスプライス部位認識エレメントと結合するのを妨げる）。この「セーフティー」の結合はPTMの標的結合領域が標的プレmRNAに結合して露出し、PTMスプライシングエレメントを活性化する（それらを標的プレmRNAへとトランススプライシングされやすくする）ことで阻害されうる。
【００２９】
本発明のPTMはまた、皮膚細胞特異的標的プレmRNAへとトランススプライシングされる場合、機能的ケラチノサイト特異的タンパク質をコードしうるキメラRNAの形成をもたらす皮膚細胞特異的エキソン配列を含みうる。いくつか挙げれば、プレクチン(Liu CGら., 1996, Proc. Natl. Acad Sci USA 93:4278-83)、Col17A1(Gatalica Bら., 1997 Am J Hum Genet 60:352-365)、VII型コラーゲン(Li, Kら., 1993, Genomics 16:733-9)、およびラミニン(Pulkkinen Lら., 1995 Genomics 25:192-8)などのケラチノサイト特異的遺伝子のゲノム構造が知られているが、なおこれらの文献は参照により本明細書にそのまま組み入れられる。PTMの構造に含められる特定のエキソン配列は、コレクションに対してターゲティングされる特定の突然変異によって異なる。Col17A1遺伝子におけるこのような突然変異としては、限定されるものではないが、表Iに示されるものが挙げられる。
【表１】
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【００３０】
本発明のPTMは単一の皮膚細胞特異的エキソン配列、複数の皮膚細胞特異的エキソン配列、あるいはまた、皮膚細胞特異的エキソン配列の完全なセットを含むように操作しうる。PTMに用いる皮膚細胞特異的配列の数および正体は、ターゲティングされる特定の突然変異、およびトランススプライシング反応のタイプ、すなわち、生じるのが5'エキソン置換か、3'エキソン置換か、内部エキソン置換かによって異なる（図１参照）。さらに、PTMの大きさを制限するため、分子は皮膚細胞特異的標的遺伝子の非必須領域の欠失を含んでもよい。PTMはまた、マーカーまたはイメージング試薬として有用な遺伝子、治療遺伝子（毒素、プロドラッグ活性化酵素）などをコードしてもよい。
【００３１】
本発明はさらに、PTMのコード領域がミニイントロンを含むように操作されているPTM分子も提供する。PTMのコード配列中へのミニイントロンの挿入は、エキソンの明確度を高め、PTM供与部位の認識を高めるようにデザインする。PTMのコード領域へ挿入されるミニイントロン配列は小さな天然イントロン、あるいはまた、5'共通供与部位と3'共通配列（分岐点、3'スプライス部位および場合によってはポリピリミジン領域を含む）を含む、合成ミニイントロンをはじめとする任意のイントロン配列を含む。
【００３２】
ミニイントロン配列は約60〜100ヌクレオチド長の間であるのが好ましいが、もっと長いミニイントロン配列も用いうる。本発明のある好ましい実施形態では、ミニイントロンは内因性イントロンの5'および3'末端を含む。本発明のある好ましい実施形態では、5'イントロン断片は約20ヌクレオチド長であり、3'末端は約40ヌクレオチド長である。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、以下の配列を含む528ヌクレオチドのイントロンを用いうる。このイントロン構築物の配列は次の通りである。
【００３４】
5'断片配列：
gtagttcttttgttcttcactattaagaacttaatttggtgtccatgtctctttttttttctagtttgtagtgctggaaggtatttttggagaaattcttacatgagcattaggagaatgtatgggtgtagtgtcttgtataatagaaattgttccactgataatttactctagttttttatttcctcatattattttcagtggctttttcttccacatctttatattttgcaccacattcaacactgtagcggccgc.
【００３５】
3'断片配列：
caactatctgaatcatgtgccccttctctgtgaacctctatcataatacttgtcacactgtattgtaattgtctcttttactttcccttgtatcttttgtgcatagcagagtacctgaaacaggaagtattttaaatattttgaatcaaatgagttaatagaatctttacaaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccag
【００３６】
本発明のさらにもう1つの特定の実施形態では、本発明のPTMに共通ISAR配列が含まれる(Jonesら., 2001 Nucleic Acid Research 29:3557-3565)。 タンパク質は、U1 SnRNP による5'スプライス部位認識に必要なウリジン豊富(uridine-rich)領域を含むISARスプライシングアクチベーターおよびリプレッサー共通配列と結合する。18ヌクレオチドのISAR共通配列は以下の配列：GGGCUGAUUUUUCCAUGUを含む。本発明のPTMへ挿入した場合、このISAR共通配列はPTM構造のイントロン配列の5'供与部位に近接して挿入される。本発明の一実施形態では、ISAR配列は5'供与部位から100ヌクレオチド以内に挿入される。本発明のある好ましい実施形態では、ISAR配列は5'供与部位から50ヌクレオチド以内に挿入される。本発明のより好ましい実施形態では、ISAR配列は5'供与部位から20ヌクレオチド以内に挿入される。
【００３７】
本発明の組成物はさらに、シス作用性リボザイム配列を含むように操作されたPTMを含む。このような配列の組み込みは、任意の付加的または副次的な(run off)PTM転写を除去することでPTMの長さを厳密に規定するようにデザインされる。PTMに挿入しうるリボザイム配列は、シス作用性（自己開裂）RNAスプライシング反応を媒介しうる任意の配列を含む。このようなリボザイムとしては、限定されるものではないが、ハンマーヘッド、ヘアピンおよび肝炎デルタウイルスリボザイムをはじめとするグループIおよびグループIIリボザイムが挙げられる(Chowら, 1994, J Biol Chem 269:25856-64参照)。
【００３８】
本発明の一実施形態では、例えばエキソンスプライシングエンハンサーと呼ばれる配列などのスプライシングエンハンサーもPTMの構造に含めてもよい。トランス作用性スプライシング因子、すなわちセリン／アルギニン豊富(SR)タンパク質は、このようなエキソンスプライシングエンハンサーと相互作用し、スプライシングをモジュレートすることが示されている(Tackeら, 1999, Curr. Opin. Cell Biol. 11:358-362; Tianら, 2001, J. Biological Chemistry 276:33833-33839; Fu, 1995, RNA 1:663-680参照)。このPTM分子中には核局在シグナルもまた含んでよい(DingwellおよびLaskey, 1986, Ann .Rev. Cell Biol. 2:367-390; Dingwell and Laskey, 1991, Trends in Biochem. Sci. 16:478-481)。このような核局在シグナルは合成PTMの核（ここでトランス-スプライシングが起こる）への輸送を増強するために用いることができる。さらに、PTMの自己発現を防止するかまたは最小限にするため、読み枠の外に、AUG開始コドン、Kozak配列または他の翻訳開始部位を含んでもよい。
【００３９】
さらなる特徴、例えば、スプライシングを促進するためのポリアデニル化シグナルもしくは5’スプライス配列、追加的な結合領域、「セーフティー」自己相補領域、追加的なスプライス部位、または分子の安定性をモジュレートし分解を防ぐための保護基などを、PTM分子の翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の前後いずれかに付加することができる。
【００４０】
また、キメラトランススプライシング産物の生成に二重トランススプライシング反応を必要とするPTMも作製することができる。このようなPTMは、皮膚細胞特異的遺伝子修復に使用できる内部エキソンの置換に用いることができる。2つのトランススプライシング反応を促進するようにデザインされたPTMは上記のように操作されるが、それらは5’供与部位と3’スプライス受容部位の双方を含む。さらに、PTMは2以上の結合ドメインおよびスペーサー領域を含んでもよい。これらのスペーサー領域は複数の結合ドメインと2つのスプライス部位との間、あるいはまた複数の結合ドメイン間に配置することができる。
【００４１】
所望のトランススプライシング反応を媒介するために最適なPTM配列を同定するため、新規なlacZに基づくアッセイが開発されている。このアッセイは多くのPTMについてそのトランススプライシングする能力を非常に迅速かつ簡単に試験することを可能とする。LacZケラチノサイト特異的キメラ標的は図２Ａに示されている。この標的はLacZのコード領域（中央のコード領域から120ヌクレオチドを除いたもの）からなり、5'「エキソン」と3'「エキソン」に分けられる。分離されたこれらのエキソンはイントロン51を含むヒトCol17A1遺伝子のゲノム断片である。この標的における全ての供与および受容部位は機能的であるが、LacZ-ケラチノサイト特異的キメラmRNAを生じるシススプライシングされた標的は機能的でない。PTMと標的の間のトランススプライシングにより、機能的な完全長LacZ mRNAが生じる。
【００４２】
試験される新規な各PTMは、リポフェクタミン試薬を用いてLacZZ-ケラチノサイト特異的標的とともに一時的に同時トランスフェクトした後、48時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイする。また、全RNAサンプルを調製し、標的およびPTM特異的プライマーを用い、正確にスプライスされた修復産物の存在および修復産物のレベルに関してRT-PCRにより評価してもよい。各トランススプライシングドメインは、β-gal活性およびRT-PCRデータの解析に基づいて効率的にスプライシングされた配列が同定された場合、一部のまたは完全なトランススプライシングドメインが皮膚細胞特異的PTM中に容易にサブクローニングできるようにいくつかのユニークな制限部位を用いて操作する。
【００４３】
特定のPTMをin vitroで合成する（合成PTM）場合、そのPTMは、例えば分子の安定性、標的特異的mRNAへのハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを改善するために塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変することができる。例えば全体としての電荷を小さくするようPTMを改変すると、分子の細胞への取り込みを増強させることができる。さらにまた、ヌクレアーゼ分解または化学分解に対する感受性を低減する改変を行うこともできる。核酸分子はペプチド（例えば、in vivoで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、または細胞膜（例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; 1988年12月15日公開のPCT公報W088/09810参照）または血液脳関門（例えば、1988年4月25日公開のPCT公報W089/10134）を通過する輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6:958-976参照）またはインターカレート剤（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549）などのその他の分子とコンジュゲートするように合成してもよい。この目的で核酸分子は、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤などにコンジュゲートしてもよい。
【００４４】
核酸分子へのその他の種々の周知の改変が細胞内安定性および半減期を上昇させる手段として導入できる。可能な改変としては、限定されるものではないが、分子の5’および／または3’末端へのデオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸およびリボヌクレオチドのフランキング配列の付加が挙げられる。安定性の上昇が望まれるいくつかの環境では、2'-O-メチル化などの改変型ヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましいものでありうる。改変型ヌクレオシド間結合を含む核酸は当技術分野で周知の試薬および方法を用いて合成することができる（Uhlmannら, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneiderら, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335およびその中に挙げられている参考文献参照）。
【００４５】
本発明の合成PTMは好ましくはそれらの細胞内での安定性が高まるように改変される。RNA分子は細胞リボヌクレアーゼによる切断に対して感受性があることから、RNA結合配列の作用を模倣するがヌクレアーゼ切断に対する感受性の低い化学修飾オリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドの組合せ）を競合阻害剤として用いるのが好ましい場合がある。さらに、合成PTMはヌクレアーゼによる分解を防ぐために安定性を増強させたヌクレアーゼ抵抗性環状分子として生成させることもできる(Puttarajuら, 1995, Nucleic Acids Symposium Series No. 33:49-51; Puttarajuら, 1993, Nucleic Acid Research 21:4253-4258)。例えば、結合を増強するため、細胞内取り込みを増強するため、薬理もしくは薬物動態を改善するため、またはその他の医薬上望ましい特性を改善するために、他の改変もまた必要とされる場合がある。
【００４６】
合成PTMの構造に対してなし得る改変としては、限定されるものではないが、(i)ホスホロチオエート（XもしくはYもしくはWもしくはZ=S、または残部のOとの2以上の任意の組合せ）、例えば、Y=S(Stein, C. A.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3209-3221)、X=S(Cosstick, R.ら, 1989, Tetrahedron Letters, 30, 4693-4696)、YおよびZ=S(Brill, W. K.-D.ら, 1989, J. Amer. Chem. Soc., 111:2321-2322)；(ii)メチルホスホネート（例えば、Z=メチル(Miller, P. S.ら, 1980, J. Biol. Chem., 255:9659-9665）；(iii)ホスホルアミデート（Z=N-(アルキル)2、例えばアルキルメチル、エチル、ブチル）（Z=モルホリンまたはピペラジン）(Agrawal, S.ら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083)（XまたはW=NH）(Mag, M.ら, 1988, Nucleic Acids Res., 16:3525-3543)；(iv)ホスホトリエステル（Z=O-アルキル、例えば、メチル、エチルなど）(Miller, P. S.ら, 1982, Biochemistry, 21:5468-5474)；および(v)リンを含まない結合（例えば、カルバメート、アセトアミデート、アセテート）(Gait, M. J.ら, 1974, J. Chem. Soc. Perkin I, 1684-1686; Gait, M. J.ら, 1979, J. Chem. Soc. Perkin I, 1389-1394)の使用などの骨格改変が挙げられる。
【００４７】
さらに、本発明のPTMに糖修飾を組み込んでもよい。このような修飾としては、(i)2'-リボヌクレオシド(R=H)；(ii)2'-O-メチル化ヌクレオシド(R=OMe)(Sproat, B. S.ら, 1989, Nucleic Acids Res., 17:3373-3386)；および(iii)2'-フルオロ-2'-リボヌクレオシド(R=F)(Krug, A.ら, 1989, Nucleosides and Nucleotides, 8:1473-1483)の使用が挙げられる。
【００４８】
さらに、PTMに対してなし得る塩基修飾としては、限定されるものではないが、(i)5位で置換（例えば、メチル、ブロモ、フルオロなどで）されたか、またはカルボニル基がアミノ基に置換されているピリミジン誘導体(Piccirilli, J. A.ら, 1990, Nature, 343:33-37)；(ii)特定の窒素原子を欠いたプリン誘導体（例えば、7-デアザアデニン、ヒポキサンチン）または8位で官能基化されたプリン誘導体（例えば、8-アジドアデニン、8-ブロモアデニン）（総説としては、Jones, A. S., 1979, Int. J. Biolog. Macromolecules,1:194-207参照）が挙げられる。
【００４９】
さらにまた、PTMは、(i)プソラレン類(Miller, P. S.ら, 1988, Nucleic Acids Res., Special Pub. No. 20, 113-114)、フェナントロリン類(Sun, J-S.ら, 1988, Biochemistry, 27:6039-6045)、マスタード類(Vlassov, V. V.ら, 1988, Gene, 72:313-322)（補助試薬を必要とする、または必要としない不可逆的架橋剤）；(ii)アクリジン（インターカレート剤）(Helene, C.ら, 1985, Biochimie, 67:777-783)；(iii)チオール誘導体（タンパク質との可逆的ジスルフィド形成）(Connolly, B. A.およびNewman, P. C., 1989, Nucleic Acids Res., 17:4957-4974)；(iv)アルデヒド類（シッフの塩基形成）；(v)アジド、ブロモ基（UV架橋）；または(vi)エリプチシン類（光分解架橋）(Perrouault, L.ら, 1990, Nature, 344:358-360)などの反応性官能基と共有結合させてもよい。
【００５０】
本発明のある実施形態では、糖とヌクレオシド間結合、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基で置換されたオリゴヌクレオチド模擬体が使用できる。例えば、天然オリゴヌクレオチドに対するよりもDNAおよびRNAに対して高い親和性で結合することが示されているそのようなオリゴヌクレオチド模擬体のあるものはペプチド核酸(PNA)と呼ばれる（総説としては、Uhlmann, E. 1998, Biol. Chem. 379:1045-52参照）。このように、PNAは、それらの安定性および／または標的プレmRNAに対する結合親和性を高めるために合成PTMへ組み込むことができる。
【００５１】
本発明のもう1つの実施形態では、合成PTMは親油基または細胞による取り込みを向上し得るその他の試薬と共有結合させてもよい。例えば、PTM分子は、PTMが細胞へ送達される効率を高めるため、(i)コレステロール(Letsinger, R. L.ら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556)；(ii)ポリアミン類(Lemaitre, M.ら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:648-652)；その他の可溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に共有結合させてもよい。さらにまた、安定性および標的細胞へのPTMの送達を増強するために上記で示した改変の組合せを用いてもよい。
【００５２】
本発明のPTMは、皮膚細胞特異的遺伝的欠陥の修正をもたらすように標的細胞内で新規なキメラRNAを産生するようデザインされた方法で用いることができる。本発明のこの方法は、PTMを皮膚細胞へ送達することを含んでなり、該PTMは当業者が用いるいかなる形態、例えばRNA分子、またはRNA分子へ転写されるDNAベクターの形態であってもよく、また該PTMは皮膚細胞特異的プレmRNAと結合し、該プレmRNAの一部へスプライスされるPTM分子の一部を含んでなるキメラRNAの形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介する。
【００５３】
5.2トランススプライシング分子の合成
本発明の核酸分子は、RNAもしくはDNAまたはその誘導体もしくは改変型であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。核酸とは、デオキシリボヌクレオチドからなる場合であれ、リボヌクレオチドからなる場合であれ、また、ホスホジエステル結合からなる場合であれ、改変型の結合からなる場合であれ、PTM分子、またはPTM分子をコードする核酸分子を意味する。また、核酸という用語には、生物学的にみられる5つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基からなる核酸も明確に含まれる。さらに、本発明のPTMはPTMの安定性を増強するようデザインされたDNA/RNA、RNA/タンパク質またはDNA/RNA/タンパク質であるキメラ分子を含みうる。
【００５４】
本発明のPTMは、核酸分子の合成に関して当技術分野で公知の任意の方法により調製することができる。例えば、これらの核酸は、当技術分野で周知の方法により、市販の試薬および合成装置を用いて化学的に合成しうる（例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England参照）。
【００５５】
あるいは合成PTMは、目的のPTMをコードするDNA配列のin vitro転写によって作製することもできる。このようなDNA配列は、多様なベクター中の、T7、SP6またはT3ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターから下流に組み込むことができる。共通RNAポリメラーゼプロモーター配列は以下のものを含む：
2005532815.tif 000003
【００５６】
太字の塩基は転写の際にRNAに組み込まれる最初の塩基である。下線は効率的な転写に必要な最小配列を示す。
【００５７】
RNAはSPS65およびBluescript(Promega Corporation, Madison, WI)などのプラスミドを用い、in vitro転写により高収量で産生されうる。さらにまた、Q-β増幅などのRNA増幅法を用いて目的のPTMを産生してもよい。
【００５８】
これらのPTMは、当技術分野で周知のように、好適ないずれの手段によって精製してもよい。例えば、PTMはゲル濾過、アフィニティーもしくは抗体相互作用、逆相クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製することができる。もちろん、当業者ならば、この精製方法が部分的には精製する核酸の大きさ、電荷および形状によるものであることが分かるであろう。
【００５９】
本発明のPTMは、化学的に合成される場合であれ、in vitroまたはin vivoで合成される場合であれ、PTMの安定性、取り込みまたは標的プレmRNAへの結合を増強するために改変または置換されたヌクレオチドの存在下で合成することができる。さらにまた、PTMの合成の後に、それらのPTMを、例えばPTM分子の物理的特性を向上させるためにペプチド、化学薬剤、抗体または核酸分子で修飾してもよい。このような修飾は当業者に周知のものである。
【００６０】
PTMをコードする核酸分子を用いる場合、核酸分子の発現ベクターへのクローニングには当技術分野で公知のクローニング技術を用いることができる。組換えDNA技術の分野で一般に知られている方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
【００６１】
DNAの大規模複製も提供し、かつ、PTMの転写を指令するのに必須のエレメントも含む様々な宿主ベクター系中に、目的のPTMをコードするDNAを組換え導入することができる。患者の標的細胞をトランスフェクトすることを目的にこのような構築物を用いると、内因的に発現した細胞特異的プレmRNA標的との相補的塩基対が形成され、それにより複合体化した核酸分子間のトランススプライシング反応が促進されるのに十分な量のPTMの転写が起こる。例えば、ベクターは、細胞に取り込まれて、PTM分子の転写を指令することができるようにin vivoで導入することができる。このようなベクターは、転写されて目的のRNA、すなわちPTMを産生することができる限り、エピソームとして維持されるものであっても染色体に組み込まれるものであってもよい。このようなベクターは当技術分野で標準的な組換えDNA技術によって構築することができる。
【００６２】
目的のPTMをコードするベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞で複製および発現させるのに用いる当技術分野で公知のその他のものであってもよい。PTMをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒトの細胞で機能させるために当技術分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー配列によって調節することができる。このようなプロモーターは誘導性のものであっても構成性のものであってもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(Benoist, C.およびChambon, P. 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22: 787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)、CMVウイルスプロモーター、ヒトβ-絨毛性ゴナドトロピン-6プロモーター(Hollenbergら, 1994, Mol. Cell.  Endocrinology 106:111-119)などが挙げられる。本発明のある好ましい実施形態では、ケラチノサイト特異的プロモーター／エンハンサー配列を用いてケラチノサイトにおけるPTMの合成を促進することができる。このようなプロモーターとしては例えば、表皮の基底層に遺伝子発現をターゲティングするケラチン14プロモーター(Wang Xら., 1997, Proc Natl. Acad Sci 94:219-26)、表皮の上部層に発現をターゲティングするロリクリンプロモーター(Disepioら., 1995, J. Biol Chem 270:10792-9)およびインボルクリンプロモーター転写応答エレメント(Phillipsら., 2000, Biochem. J. 348:45-53)が挙げられる。
【００６３】
本発明の実施において用いられるベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスのクラスに由来するものなどのウイルス発現ベクターをはじめとする任意の真核発現ベクターが含まれる。
【００６４】
5.3トランススプライシング分子の使用および投与
本発明の組成物および方法は皮膚細胞特異的遺伝的欠陥を修正するために使用できる。特に、二重トランススプライシング反応、3'エキソン置換および／または5'エキソン置換をはじめとするターゲティングされたトランススプライシングは、末端切断型か、または突然変異を含むかのいずれかの皮膚細胞特異的転写物の修復または修正に使用できる。本発明のPTMは、スプライセオソームと相互作用して特定の突然変異の上流もしくは下流の、または未成熟3'停止末端の上流のターゲティングされる転写物を切断し、突然変異を含む転写物の一部を機能的配列で置換するトランススプライシング反応により変異型転写物を修正するようデザインされる。PTMはまた、スプライセオソームプロセシングを受ける事実上任意の遺伝子のコード配列を書き替えて任意の目的遺伝子配列を標的mRNAに挿入するために、使用しうる。
【００６５】
例えば、リポソーム、微小粒子、微小カプセルへの封入、組成物を発現しうる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照)、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築、DNA注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなど、種々の送達系が知られており、本発明の組成物を細胞へ導入するのに用いることができる。
【００６６】
これらの組成物および方法は欠失遺伝子産物または変異型遺伝子産物が発現すれば正常な表現型を生じる遺伝性遺伝子疾患または他のタイプの皮膚疾患を有する患者の細胞に、生物学的に活性な機能的皮膚細胞特異的分子をコードする配列を提供するために使用できる。さらにまた、本発明の組成物および方法は、例えば皮膚の癌または乾癬を有する患者において皮膚細胞の増殖を阻害するために使用できる。このような場合、PTMは皮膚細胞増殖のレギュレーターをコードし、そのようなレギュレーターの発現を抑制し、そしてレポーター分子をコードする標的プレmRNAと相互作用するようにデザインしうる。
【００６７】
ある好ましい実施形態では、宿主細胞への遺伝子送達および発現を目的として、PTM機能を促進するためにPTMをコードする配列を含む核酸が投与される。本発明のこの実施形態では、核酸はPTM産生を促進することにより作用を媒介する。当技術分野で利用可能な宿主細胞への遺伝子送達の方法はいずれも本発明に従って使用することができる。遺伝子送達法の一般的な総説としては、Strauss, M.およびBarranger, J.A., 1997, Concepts in Gene Therapy, by Walter de Gruyter & Co., Berlin; Goldspielら, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 1993, TIBTECH 11(5):155-215を参照。例示的方法を以下に記載する。
【００６８】
PTMの宿主細胞への送達は、宿主がPTMまたはPTMをコードする核酸分子に直接曝される場合には直接的、またはまず宿主細胞がin vitroでPTMまたはPTMをコードする核酸分子でトランスフェクトされた後に宿主に移植される場合には間接的でありうる。これら2つのアプローチはそれぞれin vivoまたはex vivo遺伝子送達として知られている。
【００６９】
特定の実施形態では、核酸は直接in vivo投与し、そこで発現させてPTMを産生させる。これは当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成することができ、例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に存在するように投与することにより、あるいは例えば欠陥または弱毒化レトロウイルスその他のウイルスベクターを用いた感染（米国特許第4,980,286号参照）により、あるいは裸のDNAの直接注入により、あるいは微小粒子衝撃（例えば、遺伝子銃; Biolistic, Dupont）の使用により、あるいは脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクション剤によるコーティング、あるいはリポソーム、微小粒子または微小カプセルへの封入により、あるいは核へ侵入することが知られているペプチドにそれを結合させて投与することにより、あるいは受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを受けるリガンドへそれを結合させて投与する（例えば、WuおよびWu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）ことにより、達成することができる。
【００７０】
特定の実施形態では、PTMを含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要でないレトロウイルス配列を欠失するように改変されたレトロウイルスベクターを用いることができる(Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599参照)。あるいは、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターを細胞または組織への遺伝子送達に使用することができる（アデノウイルスに基づく遺伝子送達の総説としては、KozarskyおよびWilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503参照）。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルス随伴ウイルスベクターを用いてPTMをコードすることができる核酸分子を送達しうる。このベクターは、目的の発現レベルに応じ、選択されたプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントをベクターに挿入しうるようにデザインされる。
【００７２】
細胞への遺伝子送達の別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は選択可能なマーカーの細胞への導入を含む。次に、これらの細胞を、導入遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離するための選択下に置く。得られた組換え細胞は、当技術分野で公知の種々の方法により宿主に送達することができる。ある好ましい実施形態では、遺伝子送達に用いる細胞は宿主細胞にとって自己由来のものである。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、ケラチノサイトなどの皮膚細胞に、皮膚疾患を有する被験体から取り出し、遺伝疾患などの皮膚細胞特異的疾患を修正するようデザインされたPTMをコードしうる核酸分子をトランスフェクトすることができる。細胞は、当業者に公知の慣用法を用い、その核酸分子がゲノムに組み込まれ、それにより目的のPTMを発現する安定細胞系を提供するかどうかに関してさらに選択しうる。次に、このような細胞を被験体に移植し、それにより皮膚細胞特異的タンパク質の供給源を提供する。
【００７４】
本発明はまた、有効量のPTMまたはPTMをコードする核酸と、医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物も提供する。ある特定の実施形態では、「医薬上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局が承認した、または米国薬局方もしくは動物、およびより好ましくはヒトにおける使用に関して一般に承認されているその他の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」とは、治療薬と一緒に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをさす。好適な医薬担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical sciences"に記載されている。
【００７５】
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば皮膚細胞特異的タンパク質が欠損しているか、一般には欠陥があるか、生物学的に不活性であるか、または活性が低下しているか、または発現が低下している宿主において、内因的皮膚細胞特異的タンパク質または機能の不在またはレベルの低下（正常または望ましいレベルに比べて）を含む疾患または疾病において投与される。このような疾患としては、限定されるものではないが、上皮脆弱性疾患、角質化疾患、毛髪疾患、色素沈着疾患、乾癬、前癌疾患および癌疾患が挙げられる。さらにまた、医薬組成物は癌および乾癬などの皮膚の増殖性疾患において投与することができ、ここではその目的はこのような細胞の増殖を阻害することである。PTMにより媒介されるトランススプライシング反応から生じるキメラmRNAにコードされる皮膚細胞特異的タンパク質の活性は、例えば宿主の組織サンプルを得（例えば、生検組織から）、それをin vitroにおいてmRNAまたはタンパク質レベル、構造および／または発現したキメラmRNAの活性をアッセイすることにより、容易に検出することができる。従って、限定されるものではないが、キメラmRNAにコードされるタンパク質を検出および／または可視化するための免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロット、免疫沈降、その後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など）、および／またはキメラmRNAの存在を検出および／または可視化することによりキメラmRNA発現の形成を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット、ドットブロット、in situハイブリダイゼーション、および逆転写PCRなど）などをはじめとする当技術分野で標準的な多くの方法を用いることができる。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は治療の必要な領域、すなわち皮膚に局所投与するのが望ましい。これは例えば、限定するものではないが、局所適用（例えば、外科術後の包帯と組み合わせる、注射による、またはインプラントの手段によるもの、但しこのインプラントはシラスティック膜のような膜または繊維をはじめとする、多孔質、無孔質またはゼラチン質より構成される）により達成できる。ナノ粒子、制御放出ポリマーのようなマトリックス、ヒドロゲルなどのその他の制御放出薬物送達系。
【００７７】
PTMは標的細胞において所望の作用をもたらすのに有効な量で投与される。PTMの有効用量は、生体半減期、バイオアベラビリティーおよび毒性などのパラメーターを取り扱う当業者に周知の手順により決定することができる。本発明の組成物の有効量は治療する皮膚疾患の重篤度によって異なり、標準的な臨床技術によって決定することができる。このような技術としては、タンパク質発現のレベルを決定するための皮膚サンプルの分析を含む。さらにまた、場合により、最適な用量範囲を判定する助けとするためにin vitroアッセイを用いてもよい。
【００７８】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の1以上の成分を充填した1以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。このような容器には場合により医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された様式の表示を添付してもよい。その表示はヒトへの投与に関する製造、使用または販売の当局による承認を示したものである。
【実施例】
【００７９】
6.実施例：COL17A1遺伝子のトランススプライシング
以下に示すデータは皮膚遺伝子療法に関するケラチノサイト特異的な状況においてトランススプライシング反応を用いることの実現可能性を証明するものである。特に、このデータは、(i)トランススプライシング反応がケラチノサイトにおいて標的とPTMの間で正確に起こること；(ii) トランススプライシングドメインにステム-ループ構造を組み込むことにより有効性をモジュレートできること；および(iii) ケラチノサイトのプレmRNAレベルでスプライセオソームにより媒介されるトランススプライシングを用いてCol17A1遺伝子のイントロン51がターゲティングされ、トランススプライシングされうることを示す。
【００８０】
6.1材料および方法
細胞培養  ヒト胚腎細胞(293T)を、加湿インキュベーター中、37℃、5% CO2にて、10% FBSを添加したDMEM培地(Life Technologies, Gaithersburg, MD)中で増殖させた。1%トリプシン-EDTA(PAA Laboratories, Linz, Austria)を用い、3〜4日ごとに細胞の継代培養を行い、細胞を所望の密度で再播種した。全ての実験に用いたヒトケラチノサイトは、標準的なプロトコールを用い、新生児の包皮から調製した。細胞を計数し、60mmのプレートに所望の密度でプレーティングし、加湿インキュベーター中、37℃、5% CO2にて、KGM-2培地 (Clonetics/Bio-Whittaker, Walkersville, MD)中で10〜12日間、およそ50〜60%の密集度まで増殖させた。培地は2〜3日ごとに交換した。
【００８１】
COL17A1の4003delTCに関してホモ接合であるGABEB患者由来の一次ケラチノサイトをヒトパピローマウイルスHPV16 E6およびE7ベクターで不死化し、連続的に継代培養したところ、得られた細胞系はコラーゲンXVIIタンパク質を発現しなかった。細胞をKGM-2培地(Clonetics)中、37℃、5% CO2中で維持し、5〜7日ごとにおよそ70%の密集度で継代し、所望の密度で播種した。培地は2〜3日ごとに交換した。
【００８２】
標的の構築  LacZ-T1(図2A)はlacZ 5'「エキソン」(1〜1788bp)の後に、コラーゲン17A1遺伝子のイントロン51(282bp)およびLacZ 3'「エキソン」(1789〜3174bp)を含んでいた。このlacZ 3'エキソンは1800bpの位置に2つの停止コドンを含んでいた。Col17A1のイントロン51は、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, CA)を用い、テンプレートとしてゲノムDNAおよびプライマー：
Int51U (5'-CGGGATCCGTAGGTGCCCCGACGGTGATG-3');および
Int51D (5'CTAGGGTAACCAGGGTGAGAAGCTGCATGAGT-3')
を用いてPCR増幅した。
【００８３】
この増幅産物をBamHIおよびBstEII(New England Biolabs, Beverly, MA)で消化し、上記2つのlacZエキソンの間に挿入した。T2(図2B)はエキソン51、イントロン51およびエキソン52、その後ろにFLAG配列からなるゲノム配列を含んでいた。このエキソン51、イントロン51およびエキソン52のゲノム配列をPfu DNAポリメラーゼおよびプライマー：
COLI-F (5'-CTAGGCTAGCCTGCCGGCTTGTCATTCATCC-3')および
COLI-R (5'-CTAGAAGCTTTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCTGCATGCTCTCTGACACC-3')
を用いて増幅した。
【００８４】
FLAG配列はプライマーCOLI-Rにより導入した。このPCR産物をNheIおよびHindIII(New England Biolabs, Beverly, MA)で消化し、pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に挿入した。
【００８５】
プレトランススプライシング分子(PTM)  pCOL17-PTM1(図2C)を、PTM14(Intronn Inc., Rockville, MD)をEcoRIおよびKpnIで消化し、CFTR結合ドメイン(Mansfield SGら., 2000 7:1885-95)を、32bpアンチセンス結合ドメイン(BD)、18bpスペーサー、分岐点(BP)、ポリピリミジン領域(PPT)、およびアクセプターAGジヌクレオチド、その後ろのlacZ 3'エキソン(1789〜3174bp)を含む80bpのオリゴヌクレオチドで置換することにより構築した。シススプイシングおよびまたトランススプライシングに関与する2つのホスホリル転移反応の遂行に必要とされる共通配列に続いてBPおよびPPTを使用し、PTM1、3および5をKpnIおよびHindIIIで消化し、lacZ 3'エキソンをCOLI7A1のエキソン52〜56cDNA配列で置換することにより、pCOL17-PTM4およびpCOL17-PTM6を構築した(図2D)。このcDNA配列をPfu DNAポリメラーゼを用い、ポリdTプライミングしたcDNAから、以下のプライマー：
COL2-F (5'-CTAGGGTACCTCTTCTTTTTTTTGATATCCTGCAGGTCCTGATGTGCGCAGC-3')；および
COL-2-R (5'-CTAGAAGCTTTTATGGAGACCTTGGACCTAAG-3')
を用いて増幅した。
【００８６】
この増幅産物をKpnIおよびHindIIIで消化し、PTM1、3および5中にクローニングした。全ての構築物を配列決定し、それらの配列が正しいことを確認した。
【００８７】
293T細胞へのトランスフェクション  293T細胞を、それらが内因性のCOLI7AI mRNAを欠いていることから、予備実験に用いた。トランスフェクションの前日、1.15×106細胞を60mmプレートにプレーティングし、24時間増殖させた。製造業者のプロトコールに従ってリポフェクタミンプラス試薬(Life Technologies)を用い、細胞を発現プラスミドでトランスフェクトした。 細胞をトランスフェクションから48時間後に回収した。
【００８８】
一次ケラチノサイト(hKC)へのトランスフェクション  hKCを上記のように10〜12日間、50〜60%の密集度まで増殖させた。細胞をリポフェクタミンプラス試薬および無添加のKGM-2を用いてトランスフェクトした。2倍濃度の添加剤を含むKGM-2培地をトランスフェクションから3時間後に加えた。12時間後に培地を標準KGM-2に交換し、さらに24〜48時間、37℃でインキュベートした。
【００８９】
不死化GABEB-ケラチノサイトへのトランスフェクション  GABEBケラチノサイトを60mm径のプレートに1×106細胞/mlの密度でプレーティングし、60〜70%の密集度まで増殖させた。細胞を、Fu遺伝子6(Roche)トランスフェクション試薬(6μl/μgDNA)および無添加KGM-2培地中のDNAを用いて、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション反応物を細胞に滴下し、5% CO2中、37℃にて3時間インキュベートした。次に、2倍濃度の添加剤を含むKGM-2を加え、一晩インキュベーションを続けた。翌朝、培地を新鮮培地に置き換え、さらに24〜48時間インキュベートした。
【００９０】
全RNA単離  トランスフェクションから48時間後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回すすぎ、細胞を1ml PBS中に回収した。この細胞をペレットとし、上清を取り出した。全RNAをMasterPure RNA/DNA精製キット(Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて精製した。夾雑するDNAを、37℃にて30〜60分のDNアーゼI処理により除去した。
【００９１】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応  RT-PCRを、製造業者のプロトコールに従い、SuperScript OneStep（商標）RT-PCRキット(Life Technologies)を用いて行った。各反応には、25μlの反応容量中、50〜500ngの全RNAおよび100ngの5'-および3'-特異的プライマーを含んだ。RT-PCR産物を、2%アガロースゲルを用いるゲル電気泳動により分離した。シススプライシング産物およびトランススプライシング産物の評価のために用いたプライマーは次の通りである：
LAC9F (5'-ATCAAATCTGTCGATCCTTCC-3')；
およびシススプライシング用としてKI-3R (5'-GACTGATCCACCCAGTCCCATTA-3')とLAC9F
およびトランススプライシング用としてKI-5R (5'-GACTGATCCACCCAGTCCCAGAC-3')。 
これらのプライマーのプラスミド上の位置については図2Aを参照。COLI7A1-ミニ遺伝子シススプライシングに関するRT-PCR分析は以下のプライマー：
Ex51-1F (5'-CATCCCAGGCCCTCCAGGAC-3')；および
FLAG-R (5'-TTGTCATCGTCGTCCTTGTAG-3')
を用いて行い、一方、トランススプライシングの検出にはプライマーEx51-1FおよびKI-53-1R (5'-GTAGGCCATCCCTTGCAG-3')を用いた。これらのプライマーのプラスミド上の位置については図5Bを参照。
【００９２】
タンパク質調製およびβ-galアッセイ  トランスフェクト細胞から全タンパク質を凍結解凍法により単離し、上記(Invitrogen)のようにβ-gal活性をアッセイした。全タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ試薬(BIO-RAD, Hercules, CA)を用い、Bradfordに従う色素結合アッセイにより測定した。タンパク質濃度およびβ-gal活性の測定は全てPharmacia Ultrospec 2000分光光度計(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)を用いて行った。
【００９３】
β-galのin situ染色  機能的β-galの発現は、β-gal染色キット(Invitrogen)を製造業者のプロトコールに従って用いてモニタリングした。β-gal陽性細胞のパーセンテージは、無作為に選択した5つの視野において非染色細胞に対する染色細胞を計数することにより求めた。
【００９４】
DNAシーケンシング  構築物およびRT-PCR産物は、ABI Prism自動シーケンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)、Taqジデオキシターミネーター・サイクルシーケンシング・キット(Applied Biosystems)、および反応あたり2pmolのプライマーを用いて配列決定し、配列を確認した。
【００９５】
RNA構造の決定  PTM結合ドメイン設計のためのRNA二次構造を、ZuckerおよびTurner (http://mfold2.wustl.edu/〜mfold/ma/formI.cgi)によるRNAフォールディングプログラムmfoldを用いて推定した。
【００９６】
定量的リアルタイムRT-PCR分析  リアルタイムRT-PCRをライトサイクラー(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を用いて行った。トランスフェクション実験から得られた1μgの全RNAをオリゴdTでプライミングし、M-MLV-RT(Promega, Madison, WI)を用いてcDNAへと逆転写した。PCR反応は製造業者のプロトコールに従い、1μlのcDNA溶液、3μl SYBR-グリーンマスターミックス(Roche)、2pmolのプライマーLac9F、シススプライシング産物用には2pmolのプライマーKI-3R、およびトランススプライシング産物用には2pmolのプライマーKI-5Rを用いて行った。
【００９７】
6.2結果
LacZモデル修復系  種々の細胞型におけるトランススプライシングの効率を評価するため、発明者らはlacZモデル修復系を用いた。これはプラスミドLacZ-T1から発現された突然変異体β-gal標的、および個々の細胞へ同時トランスフェクトされたプレトランススプライシング分子(PTM)を発現する第2のプラスミドからなる。まず、LacZ-T1プラスミド(図2A)を293T細胞へ導入した後、全RNAを調製し、RT-PCR分析を行うことにより、シススプライシングを調べた。プライマーLac9F(lacZ 5'エキソン特異的)およびKI-3R(LacZ 3'停止コドン特異的)を用いて302bpのRT-PCR産物が検出されたが、これは正確なシススプライシングに関して予測される大きさを証明した(図3A; レーン2、6、7、8)。このRT-PCR産物を配列決定し、スプライス部位利用の正確性を確認した(図3B、上のパネル)。読み枠の合った停止コドンが含まれるため、モックトランスフェクションの基底発現を超えるβ-gal活性は測定できなかった(図3C)。LacZ-T1単独でトランスフェクトされた293T細胞では、細胞培養において陽性染色される細胞が全くなかったことが示された（図4、一番上のパネル、対照）。
【００９８】
lacZモデル修復系の第2の成分はPTMである。PTM1は、COL17A1イントロン51の3'末端に厳密に相補的な32bpのアンチセンス結合ドメイン、および18bpのスペーサー配列、酵母分岐点(BP)、ポリピリミジン領域(PPT)および3'スプライス受容部位、その後ろにpcDNA3.1哺乳類発現ベクターへ挿入されたヌクレオチド1789〜3174の野生型lacZ遺伝子断片のコード配列を含むものであった(図2C)。LacZ-T1と結合し、そしてLacZ-T1から転写される欠陥プレmRNAの3'エキソンにおける突然変異を置換することで該標的プレmRNAを修復し、これによりβ-gal活性を回復させるRNAを生成するため、この構築物を推定した。予測されたように、このPTMは単独でトランスフェクトした場合、機能的mRNA（図3A；レーン3、4、5；左の写真）およびβ-gal活性(図3C)を生じなかった。
【００９９】
上皮細胞系におけるRNA修復およびタンパク質機能回復に関する試験  PTMにより誘導されたRNAトランススプライシングの、選択されたプレmRNA標的を修復する能力を一時的同時トランスフェクションアッセイで調べた。LacZ-T1プレmRNAを発現するプラスミドおよびPTM1プレmRNAを発現するプラスミドを293T細胞中へ同時トランスフェクトした。このトランススプライシング反応産物は、lacZの5'エキソン、および挿入された、lacZの正常な3'エキソンからなるmRNAであるはずであり、機能的β-galタンパク質へと翻訳されるはずである。標的特異的プライマー(Lac9F)およびlacZ-PTM特異的プライマー(KI-5R)を用いたRT-PCRにより全RNAを分析したところ、推定された長さのRT-PCR産物(298bp)が示された（図3A；レーン6、7、8；右の写真）。この産物はLacZ-T1またはPTM1のいずれか単独でトランスフェクトされた細胞では見られなかった（図3A；レーン2、3、4、5；右の写真）。298bpのトランススプライシングされたRT-PCR産物を配列決定したところ、LacZ-T1プレmRNAとPTM1プレmRNAの間でトランススプライシングが正確に起こったことが示された（図3B；下のパネル）。さらに、同時トランスフェクト細胞からゲノムDNAを調製し、PTMと標的の間のDNAレベルでの組換え事象を除外するため、フォワードプライマーとして標的特異的Lac9Fを、そしてリバースプライマーとしてPTM特異的KI-5Rを用いたPCRにより分析した。PCR断片は検出されず、組換え事象は存在しないことが示された。
【０１００】
LacZ-T1プレmRNAとPTM1プレmRNAの間のトランススプライシングはβ-gal活性を回復させる  トランススプライシングによる欠陥lacZプレmRNAの修復および機能的β-galタンパク質の産生を、標的およびPTMプラスミドで同時トランスフェクトされた293T細胞で検討した。同時トランスフェクトされた293T細胞の染色はβ-gal陽性細胞（全細胞の25%）を表すが（図4 上のパネル、右）、これは修正されたRNAの産生を示す。これに対し、LacZ-T1またはPTM1のいずれか単独でトランスフェクトされた細胞は、β-gal陽性細胞が全く存在しないことで示されたように、機能的β-galを生じなかった。
【０１０１】
さらに、トランススプライシング修復によって生じたβ-gal活性の量を定量するために、酵素活性を比色測定アッセイで測定した。LacZ-T1標的またはPTM1のいずれか単独でトランスフェクトされた細胞から調製したタンパク質抽出液におけるβ-gal活性は、バックグラウンドレベルとほとんど同じであった。これに対し、LacZ-T1およびPTM1で同時トランスフェクトされた細胞はバックグラウンドに比べて高いのβ-gal活性を生じた（約100倍の上昇）(図3C)。これらのデータは、トランススプライシングによる欠陥型のLacZ-T1プレmRNAの有効な修復がβ-galタンパク質機能を回復させることを示す。
【０１０２】
結合ドメインの長さはトランススプライシングの効率および特異性をモジュレートする  結合ドメインの長さがLacZ-T1とPTMの間のトランススプライシング効率にどの程度影響を及ぼすか調べるために、PTM3およびPTM5を構築した(図2C)。PTM3は、他のRNA標的に対する非特異的結合を軽減するはずの堅固なRNA二次構造を達成するために、ヌクレオチド配列に独特の変化を有する25ntの短い結合を含む。この変化はZuckerおよびTurnerのRNAプログラム(http://mfold2.wustl.edu/〜mfold/ma/formI.cgi)から得られた予測に基づいて作製されたものである。このPTM(PTM3)をLacZ-T1とともに同時トランスフェクトし、その修復効率をRT-PCR、β-gal定量的アッセイおよびβ-galのin situ染色により測定した。PTM3はPTM1に比べてβ-gal活性に小幅な上昇を示したが、これはより効率的な結合およびトランススプライシングであることを示す。第3のPTMであるPTM5を、52ntのより長い結合ドメインを用いて構築した(図2C)。このPTMによるトランスフェクションは、PTM1またはPTM3に比べてそれぞれ3倍のβ-gal活性の回復増強を示した(図3C)。
【０１０３】
シススプライシングされた産物と比べてトランススプライシングされたmRNAを定量するために、半定量的リアルタイムPCRを行った。予測されたように、対照反応はトランススプライシング産物を示さず、LacZ-T1およびPTM1の同時トランスフェクションでは、シススプライシング標的に比べ、1.9%の修復されたlacZ mRNAを生じた。LacZ-T1およびPTM3の同時トランスフェクションではトランススプライシングを2.1%まで向上させた。PTM5に含まれる結合ドメイン長を延長したところ、修復されたmRNAの量がシススプライシングされた標的の6.5%まで増えたが、このことからβ-galタンパク質アッセイによって得られた結果が確認される(表II)。
【表２】
2005532815.tif 000004
【０１０４】
PTM1、3および5の間のトランススプライシングの特異性を比較するため、CFTR遺伝子のミニイントロン9を含む非特異的標的placZ-T4を用いた。pLacZ-T4または前述のPTMの各々1つを単独でトランスフェクションすることにより、基底レベルを超えたβ-gal活性の有意な増強は見られなかった。非特異的標的のPTM1、3および5による同時トランスフェクションでは、それらの結合ドメインにおける変化と相関したβ-gal活性の低下が見られた。PTM1を用いた場合、非特異的トランススプライシングは、CF-標的とCF-PTM14の間の特異的トランススプライシングの約12%であった。PTM5で示される最も長い結合ドメインを有するPTMでは、特異的PTMと標的の間で得られたものに比べてβ-gal活性のレベルが約6%回復したに過ぎなかった。
【０１０５】
4003delTC突然変異を担持するCOL17A1においてタンパク質の回復を達成するためには、その突然変異の3’側の完全C末端がPTMに組み込まれ、かつ、スプライセオソームにより突然変異型プレmRNAへとトランススプライシングされなければならない。これが達成されるかどうかを評価するため、エキソン51、イントロン51、およびエキソン52にわたり、3'末端にFLAG配列の付加を含んだCOL17A1ミニ遺伝子構築物(T2；図2B)を293T細胞へトランスフェクトした。ミニ遺伝子標的の機能性を証明するため、この構築物から得られたシススプライシングされたmRNAをRT-PCRにより分析し、配列決定したところ、568bpとという正確な長さが示された（図5A；上のパネル）。一連のPTMは、上記のLacZ PTMに基づき、それらの標的結合ドメインおよびトランススプライシングドメインを組み込み、3'lacZエキソンをCOL17A1エキソン52〜56のcDNA配列により置換して、構築した。これらのPTM（PTM2、PTM4およびPTM6と呼称）(図2D)を293T細胞へトランスフェクトした。プライマーEx51-1Fおよびエキソン53特異的リバースプライマーKI-53-1Rを用いたRT-PCR反応によってはトランススプライシング産物は検出されなかった。しかし、ColI7A1ミニ遺伝子標的(T2)とPTM2、4または6のいずれかで同時トランスフェクションした後のRT-PCR分析では、正確なトランススプライシングが示され、予測された574bpの断片が生じた（図5A；下のパネル）。従って、トランススプライシングはミニ遺伝子標的プレmRNAのエキソン52および付加されたFLAG配列に代えてエキソン51〜エキソン56にわたるRNAを生じる。配列解析からは、標的プレmRNAとPTMの間のトランススプライシングの正確性が示された。DNA組換えが起こった可能性を、プライマーEx51-1FおよびKI-53-1Rを用いるPCRにより分析した。生成物は得られず、DNA組換えが起こった可能性は排除された。
【０１０６】
ケラチノサイト特異的環境がトランススプライシングを起こしうるかどうかを評価するため、ヒトケラチノサイトにおいてLacZ修復系を用いた。まず、LacZ-T1またはPTM5単独を、モックトランスフェクトされたケラチノサイトにおいて測定されたレベルを超えてβ-gal活性レベルが増大しなかったヒトケラチノサイトにトランスフェクトした。β-galタンパク質の定量化では、PTM5プレmRNAがLacZ-T1プレmRNAにトランススプライシングされることによるmRNAの修復のため、β-gal活性がバックグラウンドに対し約100倍に増大した(図6A；I)。標的のシススプライシングはプライマーLac9FおよびKI-3Rを用いた全RNAのRT-PCR分析により検出した（図6A；II、左のパネル）。トランススプライシングの分析にはプライマー対Lac9FとKI-5Rを用いた（図6A；II、右のパネル）。
【０１０７】
不死化Col17A1欠陥KC細胞系におけるトランススプライシング  lacZ-T1またはPTM5のいずれか単独のトランスフェクションでは、細胞培養物においてβ-gal活性も陽性染色された細胞も生じなかった。LacZ-T1およびPTM5の同時トランスフェクションではかなりのレベルのβ-gal活性（295U/mgタンパク質）を生じた(図6B；I)。この細胞型では、シスおよびトランススプライシングは、プライマーLac9FおよびKI-3R（シス）またはLac9FおよびKI-5R （トランス）(図6B；II)を用いて検出した。さらに、LacZ-T1およびPTM5を不死化GABEB細胞系に同時トランスフェクトしたところ、β-gal陽性細胞が検出できた（図4、一番下のパネル）。
【０１０８】
一次ケラチノサイトおよびGABEB細胞系DNAの双方において、組換え事象は上記のようなPCR分析により除外された。両細胞型のさらなる配列解析では、エキソンを含み停止コドンが置換された正確なトランススプライシングが示された。
【０１０９】
HaCatKC細胞におけるCol17A1プレmRNAの内因性トランススプライシングの検出戦略が図7に示されている。Col7A1結合ドメイン51、スペーサーエレメント、分岐点(BP)およびポリピリミジン領域(PPT)、それに続くpcDNA3.1(-)中にクローニングされたβ-ガラクトシダーゼlacZ 3'エキソンの機能的部分からなるプレトランススプライシング分子(PTM5)が図示されている。この構築物をHaCaT細胞へトランスフェクトした。プレmRNAは、プライマー51-1F、lac6Rおよびlac4Rを用いたセミネスティッドRT-PCRにより確認された、エキソン1〜51およびLacZ 3'エキソンにわたるゲノム断片の内因的にトランススプライシングされた正確な産物を生じた。図8Aは、lacZ 3'エキソンを伴うゲノム断片エキソン51の内因的にトランススプライシングされた正確なスプライス接合部の配列と、226bpのRT-PCR産物をMselを用いた制限消化により168bpと58bpの2つの断片を生じることの確認を示している(B)。
【０１１０】
7.実施例：プレクチン標的プレmRNAのトランススプライシング
以下のサブセクションでは、5'トランススプライシングを用いてPTMとプレクチンプレmRNA分子の間でトランススプライシング反応を媒介するようにデザインされた実験を記載する。
【０１１１】
7.1材料および方法
ケラチノサイトの単離およびin vitro培養  ヒトケラチノサイトは皮膚生検後の皮膚サンプルから単離し、4℃で一晩ジスパーゼとともにインキュベートした後、トリプシン処理して単一細胞懸濁液を得る。細胞を0.15mM Ca2+のKGMケラチノサイト培地(BioWhitacker,Vervier, Belgium)で培養する。
【０１１２】
細胞および細胞系  EBS-MD患者からの患者ケラチノサイトを局部麻酔下の生検により採取し、トリプシンを用いて調製し、増殖させ、種々の継代回数にて液体窒素中で凍結させる。プレクチンの遺伝的バックグラウンドを有するこれらのケラチノサイトを、アクチンプロモーター（H. Lochmuller, Institute of Biochemistry-Genecenter, LMU, Munich, Germanyにより分与）の制御下、HPV16 E6およびHPV7を用いて不死化しする。
【０１１３】
器官培養  死体の皮膚を皮膚バンクから入手する。この皮膚がHIVおよびB型肝炎陰性であることを確かめるために試験する。液体窒素中で低温保存された皮膚の急速凍結-解凍サイクルを繰り返して細胞を失活させ、無菌PBS中で洗浄し、抗生物質を含んだ無菌PBS中で37℃にてインキュベートする。表皮を剥離する。その無細胞性の真皮を小片に切断し、各小片を組織培養ディッシュに乳頭面を上に向けて置く。一時的にPTMでトランスフェクトしたプレクチン欠陥ケラチノサイトをこの真皮の上に置き、1週間かけて液浸増殖させると、3〜5細胞層となる。次に、この合成皮膚を空気-液体界面に引き上げ、種々の期間増殖させた後に分析する。
【０１１４】
ノーザンブロッティング  培養細胞をトリプシンで処理して溶解させ、陰イオン交換カラム(Qiagen, Hilden, Germany)を用いてRNAを単離する。単離したRNAを電気泳動に付し、ナイロンメンブランに転写する。このメンブランを32P標識cDNA断片でプローブする。これらのブロットを洗浄し、X線フィルムに露光することで特異的なバンドを検出する。公開されている配列に従ってデザインしたプライマーを用い、プローブを作製する。RT-PCRの後、標準的な手順に従ってこれらの断片をpUC18プラスミドにサブクローニングし、増幅させる。
【０１１５】
免疫蛍光  培養したケラチノサイトを3%パラホルムアルデヒドで固定する。次に、プレクチン特異的な第1段階抗体（5B3、G. Wiche, Vienna, Austriaが厚意により提供）およびFITC標識二次抗体をサンプルに適用する。洗浄ステップの後、個々の抗マウスFITC標識および抗ラットローダミン標識第2段階抗体を適用する。スライドガラスをマウントし、Zeiss顕微鏡を用いて免疫蛍光を検出する。器官培養物からの表皮を簡易凍結(snap-frozen)し、クリオスタットで切片化する。
【０１１６】
ウエスタンブロット分析  密集培養した細胞をPBSで洗浄し、プレートは廃棄する。細胞ペレットを50mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、1%(v/v) Triton-X 100、0.1%(w/v) SDS、0.5mM EDTA、10μM ロイペプチン、100μM フッ化フェニルメチルスルホニル、100μM DTT中で溶解させる。器官培養からの表皮は直接溶解させる。対照および試験KCのタンパク質20μgを5% SDSポリアクリルアミドゲルにロードする。電気泳動後、タンパク質を48mM Tris-HCl、39mM グリシン、20%(v/v) MeOH、0.037%(w/v) SDS中、ニトロセルロース(Hybond C pure; Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)に転写する。一次モノクローナル抗体5B3をブロッキングバッファー(200mM Tris-HCl pH7.6、137mM NaCl、0.2%(w/v)I-Block、0.1%(v/v)Tween 20)中に1:3に希釈する。製造業者の使用説明書に従い、免疫検出をWestern-Star（商標）化学発光検出システム(Tropix Inc., Bedford, MA, USA)でモニタリングする。
【０１１７】
プライマー：PLEC-FN: 5' GGG AGC TGG TGC TGC TGC TGC TTC 3'
PLEC-FM: 5' GGG AGC TGG TGC TGC TGC TGC TGC 3'
PLEC-R: 5' CTC TCA AAC TCG CTG CGG AGC TGC 3'
プレクチン遺伝子由来のエキソン9〜エキソン10領域のクローニング  エキソン9〜エキソン10にわたるプレクチン遺伝子のDNA配列をエキソン9上流プライマーおよびエキソン10下流プライマーを用いて増幅させる。その断片の指向性クローニングのため、制限部位をプライマーに付加する。増幅されたDNA断片をpGEM-3Zf(+)ベクター(Promega, Madison, USA)中にクローニングする。エキソン9／イントロン9／エキソン10の領域を配列決定し、正確な配列かどうか確認する。また、EBS-MD患者由来のゲノムエキソン9〜10領域をこのプロトコールに従ってクローニングする。
【０１１８】
トランススプライシングにより媒介される遺伝子修復のためのLacZベクターおよびPTMの構築  プレクチン遺伝子のイントロン9における最良の結合要件のを択するため、3'末端(1761-1762)に2つの読み枠の合った停止コドンが挿入されたLacZコード配列の5'断片(5'エキソン 1-1788bp)、プレクチン遺伝子(PLEC1)のイントロン9およびLacZ の3'-エキソン(1789-3170bp)(=LacZ-T3)；LacZ-T4：LacZコード配列の5'断片(5'エキソン 1-1788bp)、プレクチン遺伝子(PLEC1)のイントロン9、およびLacZの3'エキソン(17899-3170bp)からなる、人工キメラLacZ標的を構築する(LacZ-T3+T4；図10)。さらに、修復分子を構築し、これをプレトランススプライシング分子と呼ぶ(Lac-PTM3+4; 図11)。LacZ-PTM-3：PLEC1のイントロン9に相補的な結合ドメイン、スペーサーおよび極めて強力な5'スプライス部位エレメント、続いてLacZの5'断片(1-1788bp)(=PTM-3)。PTM-4：ランダムな非イントロン9結合ドメイン、続いてLacZの5'断片(1-1788bp)。
【０１１９】
PTMの構築はPuttarajuら., (Mol. Therapy, 2001, 4:105-114)に従い、5'スプライス部位エレメント、スペーサー領域、およびシススプライシングを阻止するためのこのイントロンの5'末端におけるイントロン9配列に相補的な結合ドメイン(BD)を用いて行う。エキソン1〜9を、エキソン 1フォワードプライマーおよびエキソン9リバースプライマーを用い、cDNAから増幅する。5'PTMドメインを、制限酵素およびライゲーションPCR技術を用いてエキソン断片に付加する。in vitro研究のため、これらのPTMをin vitro RNA合成用のSP6/T7プロモーター(pGEM, pBS)を含むベクターにクローニングする。さらに、これらのPTMを、ヒトケラチノサイトにおけるin vivoトランスフェクション研究用の哺乳類発現ベクター(pcDNA 3.1, pcDNA 3.1/His/lacZ)にクローニングする。
【０１２０】
RNAのin vitro調製  RNAを、pGEM-3Zf(+)上のT7および／またはSP6プロモーターを用いて転写する。合成のため、T7/SP6 RNA合成キット(Promega)を用いる。0.5〜1μgの鋳型RNAを転写バッファーおよびヌクレオチド混合物（各10mM）に添加する。30℃で60分経過後、RNアーゼフリーのDNアーゼIを加えて、以降の鋳型DNAの干渉を回避する。この反応の後、4〜8%PAGEを用いてゲル精製を行い、均一な大きさのRNAを得る。一晩溶出した後、RNAを沈殿させる。
【０１２１】
HeLa抽出液を用いたin vitroスプライシングおよびトランススプライシング  in vitro合成およびゲル精製されたPTM-RNAおよび標的プレmRNAを95〜98℃で変性させた後にアニーリングさせ、その後、30〜34℃までゆっくしり冷却する。最終容量12.5μl中、4μlのアニーリングしたRNA複合体、1×スプライスバッファーおよび4μlのHeLa核抽出液(Promega)を、30℃で所定の時間インキュベートする。等量の高塩バッファーを添加することにより反応を停止させる。核酸をフェノール：クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿により精製する。β-グロビンプレmRNAを陽性対照として用いる。
【０１２２】
逆転写(RT)PCR  RT-PCRをrTth(Perkin Elmer)ポリメラーゼを用いて行う。各反応にはおよそ10ngのスプライシングされたRNAまたは1〜2μgの全RNAを含む。酵素バッファー、2.5mM dNTPs、10pM 3'および5'特異的プライマーならびに5Uの酵素を、反応容量30μlとなるように加える。RT反応は60℃で45分行う。得られたcDNAを、特異的エキソンプライマーを用いたPCRにより増幅させる。
【０１２３】
RT-PCR産物のシーケンシング  トランススプライシングされたRT-PCR産物を、ダイ・ターミネーション・ミックス、3〜10pmol/μlプライマーおよび360ng〜1.5μgのDNAを用いるサイクルシーケンシングで、特異的ネスティッドプライマーおよびPerkin Elmerシーケンシングキットを用いて増幅させる。サイクルシーケンシングの後、反応物をエタノールで沈殿させて、組み込まれていないヌクレオチドを除去するとともに、塩濃度を引き下げる。このペレットを25μlのTSR(Template suppression reagent：鋳型抑制試薬)に溶解した後、95℃で2〜3分変性させる。このシーケンシング反応をABI Prism 310シーケンサー(Perkin Elmer, Foster City, CA)を用いて分析する。
【０１２４】
ケラチノサイト中への標的およびPTMのトランスフェクションおよび同時トランスフェクション  上記のようにケラチノサイトを増殖させる。製造業者のプロトコールに従ってリポフェクタミンを用いてシスおよびトランススプライシング効率を測定するために、細胞をPTMおよび標的構築物でトランスフェクトする。トランスフェクション効率がこれらの実験に重要なので、いくつかの異なるリポソームトランスフェクション試薬が評価されている。Fugene 6(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)はKCにおいて顕著に向上したトランスフェクション効率をもたらす（データは示されていない）。さらに、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクション効率をさらに向上させる。
【０１２５】
cDNAライブラリーの構築および3'RACE
3`RACE  エキソン9は既知の配列であるため、3'RACEにより各エキソン9含有mRNAをクローニングすることができる(Volloch, Vら., 1994, Nucl Acid Res 22:2507-2511)。3'末端-cDNAクローンを作製するため、逆転写（プライマー伸長）を行い、第1鎖産物を生成する。エキソン9に特異的なフォワードプライマーおよびオリゴ-dTリバースプライマーを用いて増幅を達成し、cDNAの第2鎖を形成する。次に、PCR断片をクローニングし、配列決定する。
【０１２６】
cDNAライブラリー  第1鎖cDNAを、オリゴdTプライマーおよびM-MLV逆転写酵素を用いて合成する。2〜5μgのポリアデニル化RNAを65℃で5分間加熱し、氷上で冷却する。RT-バッファー、8mMのdNTPs、2μgのオリゴdTプライマー、25μのRNasinおよび200μのM-MLV RTを加え、37℃で1時間インキュベートした後、RNアーゼH消化を行う。過剰なプライマーをスピンフィルタを用いて除去する。このcDNAのアリコートを、ネスティッドエキソン9特異的プライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて増幅させる。得られた産物をクレノウ酵素またはT4 DNAポリメラーゼを用いてフラッシュし、配列解析のためにクローニングする。
【０１２７】
7.2結果
LacZ系におけるトランススプライシング  プレクチン1287ins3突然変異の遺伝子修正のためには、5'lacZモデル系を用いる。修正された断片は、3'トランススプライシングに関しては12833bpであるのに対し、5'トランススプライシングに関しては1356bpの長さでしかない(図9)。
【０１２８】
LacZ-T3とLacZ-PTM3の間の正確なトランススプライシングは、5'LacZ断片において導入された停止コドンが排除されるために、LacZ系において有意なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じる機能的mRNAの産生をもたらす。PTMまたは標的構築物単独でトランスフェクトされる場合には、β-ガラクトシダーゼ活性は期待されない。
【０１２９】
LacZ-T3およびLacZ PTM3が同時トランスフェクトされた場合に得られた結果に基づき、LacZの読み枠内にプレクチンイントロン9が挿入された構築物を用いるトランスフェクションおよびスプライシング効率のために適当な対照を、細胞にトランスフェクトする(LacZ-T4)(図10)。このトランスフェクションは同時トランスフェクションしなくともシススプライシングの際に機能的β-ガラクトシダーゼを生じる。さらに、ターゲティングされたトランススプライシングとターゲティングされないトランススプライシング（ターゲティングされないPTMはプレクチン結合ドメインの代わりにランダムな配列を含む；LacZ-PTM4；図11)を比較すると、タンパク質レベル（β-ガラクトシダーゼ活性）だけでなくRNAレベル（RT-PCR分析）でも特異性を示す。結合ドメインの長さのバリエーション、非特異的配列の含有、およびトランススプライシングドメイン結合配列におけるその他の改変により、最も効率的なPTM配列に関する重要な情報が得られる。
【０１３０】
細胞培養におけるトランススプライシング  PTMにより誘導されるトランススプライシングとシススプライシングの効率を非選択的一時的トランスフェクションアッセイにおいて評価する。293T細胞を、最も効率的にスプライシングされることが分かっている結合ドメインを含むプレクチンPTM-5(図12)を含み、1287ins3突然変異を含むエキソン1〜9を担持する哺乳類発現ベクター(図12, PLEC-PTM-5)でトランスフェクトする。トランスフェクションから48時間後に全RNAを単離し、プライマーを用いてRT-PCRにより分析する。増幅された産物を配列決定し、これらの細胞内の推定されるスプライス部位でPTMにより駆動されるトランススプライシングが起こっていることを確認する。シススプライシングはプライマーPLEC-RおよびPLEC-FNにより検出する。トランススプライシングはプライマー対PLEC-RとPLEC-FMにより検出する。トランススプライシングは50ngの全RNAサンプル中で検出されるはずである。シススプライシング産物は同じRNAプールにおいて、トランススプライシング産物とは3bpだけ長さが異なることで識別することができる。標的単独または対照プラスミド単独のいずれかでトランスフェクトされた細胞ではトランススプライシングは期待されない。PTMにより媒介されるRNAトランススプライシングとシススプライシングの効率は、シスおよびトランス特異的プライマー（上記参照）を用い、漸増量の全RNAを用いた半定量的RT-PCRにより評価する。標的とPTM-プラスミドの間の組換えの可能性を排除するため、PLEC-PTM-5プラスミドでトランスフェクトされた293T細胞から全DNAを単離した。逆転写PCRに用いたものと同じプライマー(PLEC-RおよびPLEC-FM)を用いてPCRを行い、内因性のプレクチン遺伝子とPLEC-PTM-5の間のトランススプライシングを検出する。
【０１３１】
293T細胞における3'RACEによる非特異的トランススプライシングの評価およびcDNAライブラリーの構築  PTMの特異性、すなわち、それらが他の内因性のRNAへとトランススプライシングされるかどうかを調べるため、3'RACEを用いて全てのトランススプライシング反応部位の配列を増幅する。特に、逆転写はオリゴdTプライマーから開始させる。得られたcDNAを、ネスティッドエキソン9プライマーおよびオリゴdTプライマーを用いて増幅させる。増幅産物をクローニングし、配列決定する。さらに、cDNAライブラリーをトランスフェクトした細胞から構築し、標準的なdTアプローチ(Sambrook, J ら., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)を用いて非正統的トランススプライシングを検出する。個々のクローンをPLEC-PTM-3構築物に特異的な配列に関して確認する。
【０１３２】
ケラチノサイト細胞培養物におけるトランススプライシング  一時的トランスフェクションによるプレクチン欠陥患者からのケラチノサイトにおける遺伝子修正。患者の細胞における突然変異したプレクチンプレmRNAを修復しうる、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランススプライシングPTMをデザインする。これらの患者の細胞において内因性のプレクチンmRNAの量は低下していないので(Bauer ら., 2001, Am J. Pathol 158:617-625)、必要なイントロン9プレmRNA配列を含むプレクチンプレmRNAは低減していないはずである。予備実験から得られた情報に基づき、エキソン1〜9のプレクチンの完全な5'末端をコードする配列を含む新たなPTMを構築する(PLEC-PTM-6)。これらの構築物を、プレクチン欠陥細胞におけるRNA修復についてRT-PCRにより試験する(図13)。トランススプライシングとシススプライシングの効率をシスおよびトランス特異的プライマーを用いてアッセイする。RT-PCR産物を配列決定し、PLEC-PTM-6と標的の間のスプライシングが正しく起こっているかどうかを確認する。全細胞DNAのPCR（逆転写ステップなし）を分析し、相同組換えを除外する。標的および非標的へのトランススプライシングにおける各PTMの特異性を、3'RACEとその後のクローニングおよび複数のクローンの配列決定を行うことにより調べる。PTM特異性を、PLEC-PTM-6およびその誘導体に関して検討する。
【０１３３】
結合ドメインにセーフティードメインを含めると、非特異的トランススプライシングが少なくなり、ひいては、第2のタイプのプレクチンPTM、すなわちプレクチン-セーフティー-PTMが生成されることが分かっている。このセーフティーPTMの結合ドメインは、PTMのスプライス部位の領域(PPTおよびBP)に相補性を有し、かつ、PTMスプライス部位へのスプライシング因子の接近を阻止するようデザインされているステム構造を形成するための挿入を有する。一本鎖として残ったPTM結合ドメインの部分が標的プレmRNAとの接触を誘導する。塩基対合により標的へ結合すると、このセーフティーはほどかれてスプライシングエレメントを露出し、スプライシング因子との結合の準備が整うと推定される。
【０１３４】
タンパク質レベルにおける、患者由来の1287ins3-プレクチン欠陥ケラチノサイトにおける遺伝子修復およびタンパク質機能の回復  改良されたPTMを患者のケラチノサイトへトランスフェクションした後、プレクチンの発現を免疫蛍光分析およびウェスタンブロッティングにより評価する。
【０１３５】
器官培養におけるトランススプライシング  合成皮膚を上記のように培養する。上記で判定したような改良されたPTMを含む発現ベクターをこれらの実験に用いる。増殖中の合成皮膚等価物を、空気中に引き上げて1〜5日後の時点で、プレクチンの正しい発現についての免疫蛍光により分析する。
【０１３６】
8.実施例：内因性COL7A1遺伝子へのトランススプライシング
下記の結果は、表皮水疱症(EB)において突然変異している内因性COL7A1およびCOL17A1遺伝子を修復または修正するためにトランススプライシングを用いることの実現可能性を証明するものである。
【０１３７】
図14Aに図示されているように、PTM6はCol17A1結合ドメイン（イントロン51）、スペーサーエレメント、分岐点(BP)およびポリピリミジン領域(PPT)、それに続くpcDNA3.1(-)にクローニングされたエキソン52〜56からなる。この構築物を、4003 del TC突然変異を担持するGABEB細胞に一時的にトランスフェクトした。GABEB細胞内でのプレmRNAスプライシングの結果、エキソン1〜56にわたるゲノム断片の内因的にトランススプライシングされた正確な産物が生じ、これをセミネスティッドRT-PCRにより確認した。PTM6をトランスフェクトしたGABEB細胞からRNAを抽出し、BPAG2-プライマー51-1F、53-1Rおよび52-1Rを用いてセミネスティッドRT-PCRを行った。予測された323bpの断片のDNAシーケンシングを行ったところ、突然変異体とトランススプライシングされた修正対立遺伝子の双方が明らかになった(図14B)。
【０１３８】
323bp断片における野生型DNAに対する変異型DNAの量を定量するため、この断片をTOPOベクターにクローニングした。100クローンをコロニーPCRにかけ、続いてCOL17A1遺伝子における4003 del TC突然変異を検出するNlaIII消化を行うことにより、分析した。得られた4つの異なる可能性の消化プロフィールおよび断片の大きさが示されている。TOPOクローンの定量により、トランススプライシング効率はほぼ50%であることが明らかとなった(図14C、14D、14E)。GABEB細胞系における、PTM6の正確なトランススプライシングによるXVII型コラーゲンタンパク質の発現が、トランスフェクト細胞の免疫蛍光(IF)により示されたが(図15)、これは対照細胞には存在しなかった。
【０１３９】
各標的遺伝子に特異的なPTMのデザインを、COL7A1遺伝子において最適なトランススプライシング効率に達するように改変すべきである(図17および18)。図17は293T細胞における、リポフェクタミンを用いた、Col7標的T1とPTM8、9および10の同時トランスフェクションのβ-galアッセイを示す。さらに、Col7PTMでトランスフェクトされたヒトHEK 293T細胞のβ-gal染色は正確なトランススプライシングが起こったことを示す(図18)。
【０１４０】
これらの結果は、表皮水疱症を患う患者由来のケラチノサイトにおいて内因性トランススプライシングが検出されることを示す。初期の研究から、PTMおよび標的プラスミドの同時トランスフェクションアッセイにおけるトランススプライシング効率は、トランスフェクション効率に関して補正した場合24%であった(Dallinger Gら., 2003, Exp Dermatol. Feb;12(1):37-46)。現在研究で用いられているモデル（COL17A1の修正3'末端による内因性トランススプライシング）では、トランススプライシング効率は、（内因系においてはトランススプライシングが起こった絶対数はもっと少ないかもしれないが）ほぼ50%であることが分かった。
【０１４１】
本発明は本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、当業者には以上の記載および添付の図面から、本明細書に記載されているものの他にも本発明の様々な改変が明らかになろう。このような改変も添付の特許請求の範囲内に入るものとする。本明細書には種々の参照文献が挙げられているが、それらの開示の全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】種々のトランススプライシング反応の模式図。(a)標的5’スプライス部位とPTM 3’スプライス部位の間のトランススプライシング反応、(b)標的3’スプライス部位とPTM 5’スプライス部位の間のトランススプライシング反応、および(c)PTMが3’および5’スプライス部位の双方を有する場合の二重トランススプライシング反応による内部エキソンの置換。BDは結合ドメイン、BPは分岐点配列、PPTはポリピリミジン領域、およびssはスプライス部位。
【図２Ａ】Col17A1モデル構築物の模式図。（図２Ａ）β-galモデル系のCOLI7A1-lacZ標的(lacZ-T1)の詳細な構造。プライマーlac9F、KI-3RおよびKI-5Rの相対的な位置が示されている。略号：BPは分岐点、PPTはポリピリミジン領域、およびssは5'および3'スプライス部位、BDは結合ドメイン。
【図２Ｂ】Col17A1モデル構築物の模式図。（図２Ｂ）Col17A1ミニ遺伝子標的(T2)の詳細な構造。プライマーlac9F、KI-3RおよびKI-5Rの相対的な位置が示されている。略号：BPは分岐点、PPTはポリピリミジン領域、およびssは5'および3'スプライス部位、BDは結合ドメイン。
【図２Ｃ】Col17A1モデル構築物の模式図。（図２Ｃ）β-gal試験系のPTMの模式図。（１；２；３）それぞれPTM1、3および5結合ドメインの詳細な構造および配列。略号：BPは分岐点、PPTはポリピリミジン領域、およびssは5'および3'スプライス部位、BDは結合ドメイン。
【図２Ｄ】Col17A1モデル構築物の模式図。（図２Ｄ）Col17A1ミニ遺伝子系で用いたPTMの模式図。（１；２；３）それぞれPTM2、4および6結合ドメインの詳細な構造および配列。略号：BPは分岐点、PPTはポリピリミジン領域、およびssは5'および3'スプライス部位、BDは結合ドメイン。
【図３Ａ−Ｂ】β-gal試験系は、Col17A1イントロン51を標的として用いる、293T細胞においてRNAレベルにおいて正確なトランススプライシングが起こること、およびβ-galタンパク質機能の回復を示す。図３Ａ。  β-gal試験系を用いた場合の293T細胞におけるシス-およびトランス-スプライシングを示す。5回のうち典型的な1回の実験を示している。30ngおよび300ngの全RNAをそれぞれシス-（左のパネル）またはトランス-スプライシング（右のパネル）の検出に用いた。レーン1：ベクター単独によるトランスフェクション実験。レーン2：LacZ-T1単独のトランスフェクション。レーン3、4、5：PTM1、3および5単独のトランスフェクション。レーン6、7、8：LacZ-T1 2μgとPTM1、3または5のいずれか2μgとの同時トランスフェクション。レーンM：100bp DNAサイズマーカー。図３Ｂ。  上のパネル：5'および3' エキソンと2つの読み枠の合った停止コドン(下線)の間の正確なスプライシングを示すシススプライシングされたlacZ-T1標的 mRNAのDNA配列。スプライス接合部は矢印で示されている。下のパネル：正確なトランススプライシングおよび停止コドンの置換を示すトランススプライシングされたmRNAのDNA配列。
【図３−Ｃ】図３Ｃ。  β-gal活性の回復は結合ドメインの長さに応じて増大する。β-gal活性は、4回の独立したトランスフェクション実験の平均を示す。それぞれ2μgのLacZ-T1、PTM3およびPTM5単独でトランスフェクトされた293T細胞、あるいは2μgの標的(LacZ-T1)と2μgのPTM；LacZ-T1 + PTM1：95.73 U/mg(+SD 30 U/mg)タンパク質；LacZ-T1 + PTM3：117.52 U/mg(+SD 30 U/mg)タンパク質で同時トランスフェクトされた293T細胞からの、溶解物。LacZ-T1 + PTM5：328.94 U/mg(+SD 50 U/mg)タンパク質。(SD=標準偏差)。
【図４】LacZ-T1プレmRNAとPTM5 RNAの間の効率的かつ正確なトランススプライシングにより、in vitroの上皮性293T細胞、ヒトケラチノサイトおよびGABEB細胞系で機能的β-galが生成される。293T細胞（一番上のパネル）、ヒト一次ケラチノサイト（中央のパネル）およびGABEB細胞系（一番下のパネル）を、pcDNA3.1ベクター（対照）でトランスフェクトするか、またはLacZ-T1 + PTM5とともに同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた293T細胞のうち25%がβ-gal発現の回復を示したが、一次ケラチノサイトおよびGABEBケラチノサイト細胞系ではその5%でβ-gal活性が回復した。β-gal活性は対照細胞では検出されなかった。
【図５】293T細胞における、T2ミニ遺伝子プレmRNAとエキソン52〜56にわたるcDNA配列を含むCol17-PTMの間のトランススプライシング。図５Ａ  上のパネル； レーン1：pcDNA3.1ベクターでのモックトランスフェクション。T2またはPTM2、PTM4およびPTM6いずれか単独でのトランスフェクション。レーン2には標的プレmRNAの正確なシススプライシングを示し、また、それぞれ単独でトランスフェクトされた場合、いずれのPTMでもシススプライシング産物が存在しないことを示す（レーン3、4および5）。レーン6、7および8は、T2とPTM2、PTM4、およびPTM6の同時トランスフェクション実験が推定長(568bp)の断片を生じることを示している。レーンM；100bpのDNAサイズマーカー。下のパネル：レーン1: cDNA3.1ベクターでのモックトランスフェクション実験。標的としてT2、およびそれぞれPTM2、PTM4、またはPTM6（レーン6、7および8）のいずれかを用いた同時トランスフェクション実験から調製されたRNAから、トランススプライシング産物のRT-PCR断片(574bp)を得ることができる。T2またはPTM2、PTM4、およびPTM6単独のいずれのトランスフェクションでもトランススプライシングは見られなかった（レーン2、3、4および5)。レーンM：100bpのDNAサイズマーカー。図５Ｂ  ミニ遺伝子シス-およびトランス-スプライシングのRT-PCR解析に用いたプライマーの結合部位を示す模式図。
【図６Ａ】正確なトランススプライシングがヒトケラチノサイトにおいてβ-gal活性を回復する。  一次ケラチノサイト(I)β-gal活性（単位／mgヒトケラチノサイト中のタンパク質）。レーン1：pcDNA3.1ベクター単独のトランスフェクション。レーン2：LacZ-T1単独。レーン3：PTM5単独。レーン4：LacZ-T1およびPTM5の同時トランスフェクションは190U/mgタンパク質(+ SD 50 U/mg)のβ-gal活性を示す。(II) シススプライシング（左のパネル）およびトランススプライシング（右のパネル）に関する同じ実験から調製された全RNAのRT-PCR解析。対照トランスフェクションにはベクター単独を含めた（レーン1）；LacZ-T1単独（レーン2）およびPTM5単独（レーン3）。レーン4は標的とPTM5の間の正確なトランススプライシングに関して推定される298ヌクレオチド(nt)長のRT-PCR産物を示す（右の図）。レーン2（LacZ-T1単独）およびレーン4(LacZ-T1 + PTM5)では302ヌクレオチド(nt)のRT-PCR産物が生成されているが、これはLacZ-T1標的のシススプライシングを示す（左の図）。
【図６Ｂ】不死化GABEBケラチノサイト(I)β-gal活性（単位／mg GABEB細胞系中のタンパク質）。レーン1：pcDNA3.1ベクター単独のトランスフェクション。レーン2：LacZ-T1単独。レーン3：PTM5単独。レーン4；LacZ-T1およびPTM5の同時トランスフェクションは295.6 U/mgタンパク質(+ SD 60 U/mg)のβ-gal活性を示す。(II) シススプライシング（左のパネル）およびトランススプライシング（右のパネル）に関する同じ実験から調製された全RNAのRT-PCR解析。対照トランスフェクションにはベクター単独を含めた（レーン1）；LacZ-T1単独（レーン2）およびPTM5単独（レーン4）。レーン3は標的およびPTM5の正確なトランススプライシングに関して推定される298ヌクレオチド(nt)長のRT-PCR産物を示す（右の図）。LacZ-T1のシススプライシングに関するRT-PCRはレーン2（LacZ-T1単独）およびレーン3(LacZ-T1 + PTM5)において302ヌクレオチド(nt)の産物を示す（左の図）。
【図７】HaCatKC細胞におけるCol17A1プレmRNAの内因的トランススプライシングの検出戦略。治療分子(PTM5)は、Col7A1結合ドメイン51、スペーサーエレメント、分岐点(BP)およびポリピリミジン領域(PPT)、それに続くpcDNA3.1(-)にクローニングされたβ-ガラクトシダーゼlacZ 3'エキソンからなる。この構築物をHaCaT細胞にトランスフェクトした。プレmRNAはエキソン1〜51およびLacZ 3'エキソンにわたるゲノム断片の内因的にトランススプライシングされた正確な産物を生じ、これはプライマー51-1F、lac6Rおよびlac4Rによるセミネスティッド(semi-nested)RT-PCRにより確認された。
【図８】PTM5によるCol17A1プレmRNAの内因的トランススプライシング。内因的にトランススプライシングされた正確な産物の配列は、エキソン51とlacZ 3'エキソンの間にスプライス接合部を示し(A)、および226bp RT-PCR産物のMselを用いた制限消化により、168bpと58bpの2つの断片を生じることが確認される(B)。
【図９】遺伝疾患の5'トランススプライシングLacZ修復モデルの模式図。
【図１０】トランススプライシングおよびトランスフェクション条件を最適化するために用いたプレクチン遺伝子のイントロン9を含む標的LacZ-T3およびlacZ-T4。
【図１１】最適なトランススプライシング条件を確立するためのLacZ-PTM3（イントロン9特異的結合ドメイン）およびlacZ-PTM4（非特異的結合ドメイン）。
【図１２】293T細胞における1287ins3突然変異の導入のためのPLEC-PTM-5。
【図１３】プレクチン欠陥患者細胞における1287ins3突然変異の修復のためのPLEC-PTM-6。
【図１４Ａ】COL17A1遺伝子のトランススプライシング戦略。PTM6はCol17A1結合ドメイン51、スペーサーエレメント、分岐点(BP)およびポリピリミジン領域(PPT)、続いて、pcDNA3.1(-)中にクローニングされたエキソン52〜56からなる。この構築物を、4003 del TC突然変異を担持するGABEB細胞へ一時的にトランスフェクトした。
【図１４Ｂ】COL17A1遺伝子のトランススプライシング戦略。BPAG2プライマー51-1F、53-1Rおよび52-1Rを用いたセミネスティッドRT-PCR。PTM6をトランスフェクトしたGABEB細胞からRNAを抽出し、BPAG2-プライマー51-1F、53-1Rおよび52-1Rを用いてセミネスティッドRT-PCRを行った。予測された323bp断片のシーケンシングにより、突然変異体と修正された対立遺伝子のヘテロ接合性が証明できた。
【図１４Ｃ】COL17A1遺伝子のトランススプライシング戦略。TOPOクローニング＋Nla III消化。野生型 対 変異型DNAの323bp断片を定量するため、これをTOPOベクターにクローニングした。コロニーPCRおよびその後の、COL17A1遺伝子の4003 del TC突然変異を検出するNlaIII消化により、100個のクローンを分析した。4つの異なる可能性および断片の大きさの消化プロフィールを示している。
【図１４Ｄ】COL17A1遺伝子のトランススプライシング戦略。変異型および野生型クローンのシーケンシングにより、GABEB細胞へのPTM6の正確なトランススプライシングが確認された。
【図１４Ｅ】COL17A1遺伝子のトランススプライシング戦略。100個のクローンを分析したところ、48個のクローンについて、正確なトランススプライシングおよびCOL17A1遺伝子における突然変異4003 del TCの修正が明らかになった。
【図１５】GABEB細胞へトランスフェクトされたPTM6の、リポフェクタミンプラスによる免疫蛍光。
【図１６】COL7A1遺伝子のトランススプライシング戦略（ジストロフィー性表皮水疱症）。図１６Ａ  LacZモデル系における、COL7A1遺伝子の標的イントロン72への3'トランススプライシング。図１６Ｂ  pcDNA3.1発現ベクター中のLacZ 5'および停止コドン-LacZ 3'の間にクローニングされたCOL7A1-イントロン72を含むLAcZ-標的1(T1)の模式図。LacZ-PTMはpcDNA3.1発現ベクターの機能的LacZ 3'の5’側にクローニングされたBDイントロン72からなる。
【図１７】リポフェクタミンを用いた、293T細胞におけるCOL7標的T1およびPTM8、9、10の同時トランスフェクションのβ-galアッセイ。
【図１８】COL7PTMをトランスフェクトしたヒトHEK 293T細胞のβ-gal染色。左のパネル：(a)標的＋PTM8、(c)標的＋PTM9、(e)標的＝PTM10；右のパネル：標的を含まない対応する対照PTM。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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