(57)【要約】本発明は、毎日の治療において実施でき、敗血症の発症に対して適時の介入が適用され得るやり方で血液から有害物質を除去する体外吸着方法を提供する。当該体外吸着方法は吸着カラム・アッセンブリによって実施され、吸着カラム・アッセンブリはカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含む。粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下である。
2005532130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子が当該グラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられ、
当該哺乳類から得られる血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該粒子が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる、方法。
【請求項３】
前記処理した血液を同じ哺乳類に再度注入することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記吸着カラム・アッセンブリが流動床吸着に適合させられ、特に安定化流動床吸着に適合させられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子がなくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着により治療する方法であって、当該方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該粒子が当該グラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
ｄ）哺乳類から血液を得る工程、
ｅ）得られた血液を吸着カラム・アッセンブリを粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｆ）処理した血液を同じ哺乳類に再度注入する工程
を含む方法。
【請求項１４】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着により治療する方法であって、当該体外吸着が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該粒子が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
ｄ）哺乳類から血液を得る工程、
ｅ）得られた血液を吸着カラム・アッセンブリを粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｆ）処理した血液を同じ哺乳類に再度注入する工程
を含む方法。
【請求項１５】
カラム・アッセンブリを通過する血液の流量が、流動床の膨張比が少なくとも１．３であり、例えば少なくとも１．５となるようなものである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前に、物質が哺乳類の血流に最初に注入される開始工程が先行する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類がヒトである請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子がなくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
安定化流動床が、血液物質が予め設定された値に達すると、作動しうるスイッチと共に配置され、当該血液物質がデバイスにより監視され、当該デバイスが血液循環に合わせて配置され、当該デバイスが当該値に達したときに作動信号をスイッチに送る、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
流量が粒子の安定化流動床が形成されるような流量である、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、患者の血液を、例えば、グラム陰性菌およびグラム陽性菌に関連するものである、敗血症（またはセプシス）を促進する有害物質に対して特異的な親和性を有することを特徴とする吸着媒体の安定した流動床による体外吸着に付すことにより、患者の循環血液から有害な物質を特異的に減少させることによる敗血症の治療方法に関する。１つの特定の形態において、当該方法は、グラム陰性菌のエンドトキシン（リポ多糖（ＬＰＳ）部分）に対して特定の親和性を有する吸着媒体の安定化流動床を採用することによって、グラム陰性敗血症の治療に適用される。
【０００２】
［背景技術］
敗血症（菌血症、毒血症、敗血症候群）は、ここでは、血流で細菌が見られる細菌感染症の臨床的な帰結として定義される（医学事典（Encyclopedia of Medicine）Gale Research 1999）。敗血症の複数症状は、高度に炎症性の細菌の細胞壁構成成分に対する、全身規模での不均衡な（悪化した）免疫および炎症性の宿主反応に帰する。最終的な結果は、組織破壊、および最後には罹患率および死亡率の高い多臓器不全である。付随する凝血系の過度の活性化および繊維素溶解の抑制は、この症候群の進行に寄与する。敗血症における１つの一般的な進行した臨床的症状は、深刻な低血症が見られる敗血性ショックである。
【０００３】
敗血症および敗血性ショックは生命を脅かす合併症であり、高負荷の感染性病原体、免疫系が感染に対処できないこと、抗生物質による不適切な又は遅れた治療により促進される。免疫能力が不全または低下している患者のグループ（未熟児、老人、免疫抑制性の治療を受けている患者、重篤な病気の患者）は、高い死亡率（６０％まで）を有し、これに対し、健康な人の死亡率は、合併症のない敗血症については約５％であり、より進行した敗血症（敗血性ショック）について４０％である。全体として、敗血症による死亡率は、３０−５０％の範囲内にある。状況は悪いままであり、入院している患者、特に、集中治療室内の患者の間ではより悪くなっており、米国において、敗血症は、過去２２年間、毎年平均８．７％ずつ増加している。深刻な敗血症（急性臓器不全を伴う敗血症）の発病率の現在の推定値は、米国だけで約７００，０００件である（www.sepsis.com/epidemiology.jsp）。敗血症の発症率のこの増加は、おそらく抗生物質抵抗性が広がって、予防的な抗生物質治療が有効でなくなったことによるものであり、また、敗血症にかかりやすい患者の生存率が向上したことの影響であり、世界の西側諸国の人口の一般的な「高齢化」の結果である。敗血症に起因する病院での死亡者数は２０００年に１２０，４９１に達した。１９７９年はその数は４３，５７９であった（米国、Martinら、２００３、New England Journal of Medicine 348, 1546-1554）。
【０００４】
ヒトの患者における敗血性ショックに至る感染症の７０％はグラム陰性菌（エンドトキシン（リポ多糖（ＬＰＳ）を介して作用する）により生じ、３０％はグラム陽性菌（細胞壁成分（ペプチドグリカン、リポタイコ酸）および外毒素（またはエクソトキシン）を介して作用する）により生じると推定されている（Gutierrez-Ramos & Bluethmann、１９９７、敗血性ショックで動作する分子およびメカニズム：ノックアウト・マウスから学ぶこと（Molecules and mechanisms operating in septic shock: lessons from know-out mice）、Immunology Today 18, 329-334）。精製されたＬＰＳはそれ自体、敗血症候群の殆どを引き起こすことができる。
【０００５】
これらの毒素の効力は、毒素に曝されたときに、単核細胞、マクロファージ、および他のロイコサイト（たいていの作用はマクロファージにより媒介される）により放出される、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）および他のサイトカイン（インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６およびＩＬ−８を含む）により主に媒介される。これらのサイトカインは次に、免疫系の他の細胞および他のタイプの細胞に重大な影響を及ぼす（Gutierrez-Ramos & Bluethmann、１９９７、敗血性ショックで動作する分子およびメカニズム：ノックアウト・マウスから学ぶこと（Molecules and mechanisms operating in septic shock: lessons from know-out mice）、Immunology Today 18, 329-334）。
【０００６】
「内因性」のエンドトキシンは、粘膜バリアが傷つけられたときに生じることがあり、そのような患者に敗血症状態をもたらすことがある。
【０００７】
グラム陽性菌の誘因成分は正確には規定されておらず、それはペプチドグリカン、リポタイコ酸およびある種のタンパク性の外毒素を含むかもしれないのに対し、エンドトキシンがグラム陰性敗血症の初期誘発の原因であることは相当明らかである。グラム陰性エンドトキシンの活性は、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）に存する（Rietschel and Brade、細菌性エンドトキシン(Bacterial Endotoxins）、Sci. American、１９９２年８月、２６−３３）。当該分野の当業者に周知であるように、ＬＰＳは、ＬＰＳ分子のリピドＡ部分の強い炎症性および免疫賦活特性のために、非常に劇的な生物学的作用を有し、また、ＬＰＳは概して、グラム陰性菌感染および他の病気の病因に大いに寄与すると考えられている。生物学的な系におけるＬＰＳの作用は非常に複雑である。まず、ＬＰＳは、溶液中（例えば、血流中）で遊離分子として実際には存在せず、代わりに、非常に疎水性のリピドＡ部分により一体に保持されているミセルとして組織され、または、リピドＡ部分を介して細胞膜（グラム陰性菌の細胞膜もしくは宿主細胞膜）または宿主細胞膜レセプタに結合している。宿主細胞膜レセプタは典型的にはタンパク質であり、また、複数の可溶性のＬＰＳ結合タンパク質が説明されてきた。そのような哺乳類のタンパク質の例には、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、単核細胞／マクロファージ・マーカータンパク質ＣＤ１４、ＢＰＩ（細菌透過性亢進タンパク質）および他のエンドトキシン結合タンパク質（例えば、ＮＥＰおよびＣＡＰ−１８）である。哺乳類において、非常に重要なグループのＬＰＳレセプタは、トール（Toll）様レセプタ（Toll-like receptor）であり、それらのうち、ＴＬＲ４はメインのＬＰＳレセプタとみなされ、ＴＬＲ２は他の細菌の生成物、特に、グラム陽性菌からのリポタイコ酸およびペプチドグリカンをリガンドとして有するマイナーなレセプタとみなされている。ＴＬＲ４は、ＬＰＳによる細胞の活性化に必要不可欠なものであると考えられている。レセプタのタンパク質の幾つかはまた、可溶性の構成要素（または単位）として存在することがある。そのような可溶性のレセプタは、ＬＰＳを細菌から宿主細胞に輸送する輸送分子として作用すると考えられている。ＣＤ−１４またはＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）をブロックすることは、ＬＰＳ毒性からの保護をもたらす（Gutierrez-Ramos & Bluethmann、１９９７、敗血性ショックで動作する分子およびメカニズム：ノックアウト・マウスから学ぶこと（Molecules and mechanisms operating in septic shock: lessons from know-out mice）、Immunology Today 18, 329-334）。ＬＰＳと相互作用する宿主細胞としては、単核細胞、マクロファージ、および顆粒球が挙げられ、それらは通常、ＬＰＳを血流から除去するのに非常に効果的であるが、問題は、ＬＰＳによりそれらが過度に活性化されることである。現在のところ、ＬＰＳは、マクロファージの表面にて、ＣＤ−１４およびＴＬＲ４により、ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体として結合し、これらの細胞を大規模に活性化させるものと考えられている。ＭＤ−２と称される少量のタンパク質もまた、実際のシグナル変換に関与していると考えられる。一方、ＬＰＳとＭＤ２との間の直接的な結合は、Mancek M.らにより示されて、ＬＰＳ���ＴＬＲ−４との間の直接的な結合それ自体がなお示されなければならないことを規定しているが、ＴＬＲ４はＣＤ１４／ＬＰＳ複合体に結合している。患者におけるＬＰＳ攻撃の臨床転帰は、ＬＰＳに反応する種々の細胞種類の全範囲によって生成される反応およびメディエータの結果であり、同様に、個々の細胞の反応のタイミングに非常に依存する。敗血症の１つの特性は、これらの反応の速さであり、ＬＰＳの静脈への投与の最初の臨床効果は、数分以内に起こる。ＬＰＳの実験的な攻撃と一致して別の矛盾のない所見は、ＬＰＳに対する耐性の誘発であり、それはおそらくは糖特異的な抗体（遅延耐性）により媒介されるが、特徴の無い成分を含む（早期耐性）。典型的な早期の宿主反応の１つは、ある血清タンパク質が、血清濃度が相当増加することにより、急速に且つ相当劇的に反応する、急性期タンパク質反応である。最も早い急性期タンパク質は、ＬＰＳの投与の後、数時間で上昇し、この反応の間に、血清濃度は通常の濃度の１００倍に達するであろう。ＬＰＳは、最も強い急性期反応誘導物質の１つである。人間において、これらの早期に且つ激しく誘発される急性期タンパク質には、Ｃ−反応性タンパク質および血清アミロイドＡが含まれる。
【０００８】
マクロファージによる除去に加えて、ＬＰＳはまた、高密度リポタンパク質粒子に結合し、その後肝臓に運ばれて分解されることによっても除去される。
【０００９】
３つのポイントの介入が伝統的に考慮されてきた。即ち、
適当な抗菌療法、局所的な感染の場合には、外科的なドレナージによる、感染の除去、
結果としての心血管および複数臓器の障害の治療、
毒性メディエータの阻害（または抑制）
である。
【００１０】
敗血症の治療の現在の原則は、原因となる微生物の同定および対応する適当な抗生物質の投与をベースとする。このアプローチに対する重大な欠点は、原因となる微生物を特定することによって決定に対するベースが確立される前に、時間が必要とされることであり、したがって、広域抗生物質治療をしばしば最初に開始して、症候群の臨床的発症の速度に対応しなければならないことである。そのような抗生物質による治療は通常、静脈投与によるものであり、入院を必要とし、しばしば不適当である。
【００１１】
初期の抗菌的治療および集中治療室において臓器機能を詳細にモニタリングすること、ならびに拮抗する低血症（血行動態）に重点をおく対応する治療は、極めて重要である。例えば、抗エンドトキシン抗体の投与による毒性メディエータの阻害は、この種の治療が一番重要である場合に、臨床設定（またはある種の病態）において、一般にうまくいかなかった。宿主炎症性サイトカイン（特に腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）およびインターロイキン１）に対する阻害剤の使用もまた、それらが、グラム陰性またはグラム陽性敗血症のいずれかに限定されないという利点を有するために、研究されてきた。しかしながら、そのようなサイトカインに対する阻害剤の使用から生じる潜在的な副作用は、これらのサイトカインもまた複数の有益な宿主の炎症性および免疫防御反応に参加するために、潜在的に深刻である。また、これらの種類の阻害剤は、一般に、敗血症の大規模な臨床研究において、死亡率を減少させていない。これは、おそらく、ＬＰＳ活性化の生成物の除去が、問題を生じさせる物質を除去していないという事実に起因する。
【００１２】
敗血症に対する介入に関して、血液の循環において３つの可能な治療上のターゲット（敗血症治療のポイント）は、次のものである。
１．ＬＰＳおよびＬＰＳを運ぶ細胞（宿主単核細胞および細菌を含む）
２．応答宿主細胞（マクロファージ）
３．宿主応答の因子、およびこれらの因子に応答する細胞、例えば、ＴＮＦおよびＴＮＦ受容体を生成する細胞。ＩＬ―１もまた、重要な役割を果たす。
【００１３】
したがって、敗血症の治療のためには、患者の血液から望ましくない成分を除去すること指向した方法が非常に適切である。そのような処置は、患者の血漿を有害な成分を含まない代用血漿で部分的に置き換える血漿交換治療を含む。そのような処置においては、高価な十分に保証された血漿または血漿フラクションが必要である。また、潜在的に有益な成分が患者から除去され、血液および血液製品の輸血に関連する危険、例えば、感染症（特に、ウイルス、プリオン）の転移という危険がある。他の処置は、血液を濾過する膜を使用することを含むが、それらは、選択性にかけており、戻される必要のあるタンパク質を同時に除去する。
【００１４】
体外吸収法により敗血症を治療する可能性が、既に報告されている（Jaber & Pereira、１９９７、敗血症における体外吸着をベースとする戦略（Extracorporeal Adsorbent-based strategies in sepsis）、Am. J. Kidney Diseases 30, S44-S56参照）。そのような方法は、非特異的な吸着方法（例えば、イオン交換樹脂、活性化炭素、固定化したコレスチラミン）および特異的な吸着体（例えば、ポリミキシンＢセファロース）を含む。特異的な親和性リガンドを有する軟らかいゲルは、良好な選択性を与えるが、血液のような、粘性を有し、粒子が懸濁したものを取り扱うために使用する場合には、詰まり及び不十分な流量に関して問題をもたらす。他方において、ポリスチレン誘導化繊維のような、より硬い物質は良好な機械的安定性を与えるが、吸収性（または能力もしくは容量）が低い。
【００１５】
現在公知の体外方法は、小さい、水溶性の物質に対して、中程度の効率を示すが（Bellomoら、２００１、集中治療における血液浄化（Blood purification in intensive care）、Contrib. Nephrol. 132、367-374）、より大きい分子は、限られた程度で除去されるだけである。最も良好なターゲットと組み合わされた改良された技術が必要とされている。
【００１６】
ＬＰＳは、グラム陰性敗血症において、主要な疾病のメディエータを構成するので、ＬＰＳに対して特異性を有する特異的親和性のリガンドが、治療の潜在的能力を有するＬＰＳ減少または阻害物質として使用するのに当然に魅力的であり、そのようなリガンドは体外吸着に使用する吸着媒体に組み込むのに最も有用である。
【００１７】
そのような種類の親和性特異分子は、抗体である。これは、ＬＰＳの核の糖構造（図１参照）に対する自然に生じる高いレベルの抗体は、低いレベルよりも、敗血症のより良い予後に関連しており、また、どの患者が、そのような抗体の受動的な投与による治療から利益を受けうるかを決定するために使用され得るという研究結果によって、強調される（Strutzら、１９９９、エンドトキシンのコアに対する抗体の、敗血症候群の患者の死亡率に対する関係（Relationship of antibodies to endotoxin core to mortality in medical patients with sepsis syndrome）、Int. Care Med. 25, ４３５−４４４）。そのような抗体は、ドナー血液から精製されて、動物を大腸菌による敗血症から保護することを示しており、また、グラム陰性菌血症を有する敗血症患者の受動的な治療において使用することが提案されている（Barclay, G.R., 1999、エンドトキシン−コア抗体：再検討の時期か？（Endotoxin-core antibodies：time for a reappraisal?）、Int. Care Med. 25、２７−２９）。しかしながら、これらの同じ著者は、これまで試験されてきた抗ＬＰＳ抗体（ＨＡ−１Ａ（ヒトモノクローナル抗体）およびマウスモノクローナル（Ｅ−５）を含む）のいずれもが臨床試験まで耐えないという認識を含めて、「現在のところ、標準的な治療以外の一般的な使用のために示され、入手可能な非介在治療はない」との結論を導いている。しかしながら、これらの著者は、他の者たちと（Crossら、１９９９，敗血症の免疫治療：欠陥のある概念または不完全な実行（Immunotherapy of sepsis: flawed concept or faulty implementation））と、敗血症の治療に関する抗体の有用性は決定的に誤りであると証明されておらず、その利用の適正な形態を待っているだけであるという見方を共有している。
【００１８】
おそらくは一般的なＬＰＳのコア構造の正確な空間的な構造は、オリゴ糖類ユニット、グリコシド結合ならびに置換基（ホスフェート、スルフェート等）の位置および数に高度に依存しているために、非モノクローナル抗体が利用されてきた。したがって、おそらくは、実際には交差反応するエピトープが交差反応しないことがあり、そのような抗体の機能的な親和性について焦点を当てることがなされていなかった。また、注入した抗体の薬物動態学は、患者への直接的な注入により、治療のためにＬＰＳに対する抗体を投与することによって治療を試みる場合には、検討する重要なポイントである。
【００１９】
多くの重要な腸内細菌ＬＰＳタイプと実績のある交差反応性を有し、リピドＡではなく、保存されているコア糖構造に対する抗体であって、最も重要なことにはエンドトキシンを中和し、保護活性を有する抗体は、入手可能であり、敗血症に対する治療に適用することが提案されている（（Barclay, G.R., 1999、エンドトキシン−コア抗体：再検討の時期か？（Endotoxin-core antibodies：time for a reappraisal?）、Int. Care Med. 25、２７−２９）。そのような抗体の一例は、現在臨床試験されているヒトモノクローナル（ＷＮ１  ２２２−５）である。
【００２０】
ＬＰＳについて特異的な親和性を有する興味深い別の化合物は、ポリミシキンＢおよびその類似体（例えば、コリスチン）である。これらの物質は、図２に示す構造を有する、周知の、十分に特性が明らかである両親媒性のカチオン性環状ペプチド抗生物質である（Merck index、Vol.13、エントリー７６５６）。それらは試薬のような特性を有し、原細菌の種の別に拘わらず、グラム陰性リポ多糖を結合させる（または拘束する）能力を有する。それらは特異的に、リピドＡ部分に、おそらくはイオン性および疎水性相互作用の組み合わせによって結合している。ＬＰＳにおける正確な結合サイトは規定されていないが、おそらくは、リピドＡにおいて負に帯電したホスフェート基および／またはＬＰＳの内部コアの酸性ＫＤＯ単糖類を含むようである。遊離ＬＰＳについての研究は、ポリミシキンＢがＬＰＳ−ＬＰＳミセルを崩壊させることができ、それにより、ＬＰＳにおいて抗体結合エピトープを露出させることを示している（Barclay、http://freespace.virgin.net/r.barclay/endoceia.htm）。
【００２１】
これらの化合物は高い細菌対抗性を有するが、それらは高い腎毒性および神経毒性を有し、したがって、患者へ直接的に投与するために使用されることはほとんどない。他の抗生物質と同様に、それらは、細菌を殺すときに細菌からＬＰＳの放出を促進することにより、敗血症を促進することさえある。ポリミキシンＢはまた、最近、末梢血単核細胞を刺激して、試験管内（またはインヴィトロ）でインキュベートすると腫瘍壊死因子アルファを生成することがわかった（Jaberら、１９９８、ポリミシキンＢはヒトの末梢血単核細胞により腫瘍壊死因子アルファ生成を促進する（Polymyxin-B stimulates tumor necrosis factor-alpha production by human peripheral blood mononuclear cells）、Int. J. Artificial Organs 21、２６９−２７３）。しかしながら、そのような化合物は、体外吸着法における特異的な親和性リガンドとして非常に有用であろう。多数の他のペプチド性ＬＰＳ結合物質が説明されおり、その中には、自然に生じるカチオン性抗菌性ペプチド（Hancock, R.E.、２００１、カチオン性ペプチド：先天性免疫におけるエフェクターおよび新規抗菌薬（Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials）、Lancet Inf. Dis, 1, 156.164）およびポリミキシンＢを模倣する他のペプチド（Rusticiら、１９９３、分子マップおよび合成ペプチドによるリピドＡ結合サイトの解毒作用（Molecular mapping and detoxification of the lipid A binding site by synthetic peptides）、Science 259、３６１−３６５）が含まれる。
【００２２】
Shojiら（Shoji H.ら、１９９８、治療的血漿交換（Therapeutic Apheresis）２、３−１２）は特に、ファイバー・カートリッジ構成内のポリスチレン繊維に固定されたポリミキシンＢを使用することを教示し、敗血症／敗血性ショックを示す臨床的症状の多くの異なる部分で、治療上の改善を達成するために、このユニットを使用して直接的な血液潅流（または吸着）処置が可能であることを示している。デバイスは、血液ポンプを介して、患者の大腿部の血管と接続される。この吸収体のＬＰＳを結合する能力は、固定化されたポリミシキンＢ分子において利用可能な自由な第一アミノ基の数と相関しているが、ポリミシキンＢをその第一アミノ基を介して固定すること及びさらにＬＰＳ結合能力を保持することは一般に不可能であった。同じアプローチは、Nemotoらによってもなされている（Nemoto,H.ら、２００１、Blood Purif. 19、３６１−３６９）。彼らは、種々のグループの患者についてデバイスをさらに試験し、敗血症の初期に適用されると治療が有益である（生存率が向上する）が、重症の敗血症には効果がなかったと結論づけた。血液潅流は、２〜４時間、８０〜１００ｍｌ／分にて、抗凝血薬としてメシル酸ナファモスタット（３０〜５０ｍｇ／時間）またはヘパリンを使用して、実施した。血小板数はこの治療の後、これらの細胞がカートリッジ中で非特異的に吸着されたために、わずかに減少したが、これはそれほど深刻な副作用ではないと判断された。
【００２３】
連続的な治療は、血流力学的な不安定性が減少し、流体の過負荷を防止および処理し、尿毒症の優れた制御を提供するので、血液浄化法に有益である。しかしながら、連続的な方法は、吸着デバイスの詰まり／汚れに特に関係し、特にそのようなデバイスの低下した能力に関する技術的な問題によって現在まで妨げられている。１つの例は、先に説明した中空繊維デバイスの能力が比較的低いことである。例えば、ビーズ形状の吸着体は、中空繊維ベースの吸着材料よりもより大きい表面積を有する。
【００２４】
血液潅流または体外循環させる血漿潅流（血漿交換法）で使用する理想的な吸着体は、血液のように、細胞の懸濁物を含む粘性の流体の高い流量に耐えるために十分に安定である。これは、常套の吸着体が、溶質分子および吸着体を収容するために、親水性かつ多孔質であることを要求され、十分な結合能力を達成するために、粒子の小孔内で内側表面にて、それらの表面の相互作用を許容することと、幾分対照的である。血液を処置するのに有用な吸着体に対する別の要求は、高い流量の血液が吸着体を通過するときに観察される背圧が、血液中で懸濁している種々の壊れやすい細胞の剪断を防止する程度にまで、僅かであることである。
【００２５】
体外法および吸着体の例には、多孔質の硬い粒子上におけるリポタンパク質の特異的な吸着が含まれる（米国特許第４，６５６，２６１）。しかしながら、これは、撹拌されたバッチ試験において作用することを示すのみであった。従来技術の別の例において、アルブミンで被覆されたプラスチック（粒子、フィルムまたは中空繊維）をベースとする方法が開示されている（米国特許第６，０９０，２９２号）。この方法は、アルブミンを、多数の重要な細菌毒および投薬物質を有する血液または血漿を解毒するリガンドとして使用できるという利点を有する。しかしながら、潅流可能な充填物を１０〜５００マイクロメーター（直径）の粒子で如何に構成するかについて教示するところはなく、代わりに、全血のバッチ状の吸着が開示されているが、パックされたカラムを有する例は、僅か２ｍｌ／分の流量にてポンプで送られる血漿、および０．５ｍｌ／分にて潅流されるヘパリンで凝血防止された全血を含む。米国特許第５，０４１，０７９は、ヒト免疫不全ウイルスを寄生させている患者の治療のために薬剤を除去することを教示し、血液の代わりに血漿を使用することが推奨されている。米国特許第５，２５８，５０３号は、自己抗体を除去するための体外システムにおけるコンポーネントを開示し、当該システムは、粒状材料を可溶性の血液成分から分離するフィルターを組み込んでおり、また、多孔性の硬い粒子を吸着体として使用している。米国特許第４，８６５，８４１号は、治療上の抗毒素がそれらの作用を及ぼすようにするために、望ましくない抗体を、固定された抗原（シリカ）と接触させることによって除去することを説明している。除去は、血漿の通路（中空繊維濾過により用意される）により影響され、それは、２０〜２５ｍｌ／分にてポンプされ得る。粒子を懸濁した状態に保つ他のデバイスには、Ameerらによるテーラー・クエット（Taylor-Couette）フローが含まれる（Biotech. Biogen. 62, 602-608, 1999）。しかしながら、それはまた、高度の溶血に至る剪断に関する重要な問題により特徴づけられる。
【００２６】
連続的な静脈回路が、適当な蠕動ポンプにより作動させられ、それは、動脈回路よりもずっと好ましい。なぜならば、動脈のカニューレ挿入が困難であり、危険なプロセスであることによる。抗凝血薬（ヘパリン、クエン酸エステル）が通常、血塊を防止するために使用され、血液の活性血液凝固時間を観察し、抗凝血薬の濃度を適切に調節することによって、濃度が低く維持されている限りにおいて、患者に問題は生じない。
【００２７】
［発明の概要］
本発明は、毎日の医療業務において、実用可能であり、敗血症の発症を防止するための適時な介入に適用可能であるようなやり方で、血液を体外で処理する手段を提供する。
【００２８】
本発明の別の要旨は、血液から細菌毒素を有効に吸着することをベースとする、体外治療および予防デバイスを提供することである。
【００２９】
安定化流動床吸着プロセスに関する特徴は、床の膨張が、液体を適用した際に、典型的には床を通過する上向きのフローにおいて生じることである。吸着媒体の粒子間のスペース、空隙体積は、それにより、増加して、サンプルに含まれる大きい又は嵩高い分子（例えば、生物高分子体）がカラムを詰まらせることなく通過することを許容する。この特性は、流動床吸着を、種々の成分（例えば、血液細胞）を含む血液から特定の成分を分離することに関して特に適したものとすることが分かった。さらにまた、上向きのフローにより形成される粒子間のスペースは、細胞を損傷することがある剪断力を受けることなく、細胞が、安定化流動床を高い流量（または流速）で通過することを許容する。また、安定化流動床において、液体は、プラグ流として実質的に乱流および逆混合を生じさせることなく、カラムを通過する。
【００３０】
開示される安定化流動床が血液から細菌毒素を捕捉する最適な性能は、カラムで良好な流量を達成するために、血液の密度と粒子の密度との間で密度差を大きくすることと組み合わされて、効率的で、高い能力の吸着プロセスを成し遂げるために、非常に大きな粒子の表面積を提供することにより、さらに確実となる。
【００３１】
１つの要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により処置する医療用デバイスを製造するための吸着カラム・アッセンブリの使用を提供する。当該吸着カラム・アッセンブリは、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、当該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、グラム陰性菌のＬＰＳ部分に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有する（または担持する）ことにより特徴づけられる。
【００３２】
別の要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により処置する医療用デバイスを製造するための吸着カラム・アッセンブリの使用を提供し、当該吸着カラム・アッセンブリは、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、当該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、
１）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
２）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる。
【００３３】
さらに別の要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により治療する方法であって、当該体外吸着法が吸着カラム・アッセンブリにより実行され、当該吸着カラム・アッセンブリが、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、グラム陰性菌のＬＰＳ部分に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であり、
ａ）哺乳類から血液を得る工程、
ｂ）得られた血液を吸着カラム・アッセンブリを粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｃ）処理した血液を哺乳類に再度注入する工程
を含む方法を提供する。
【００３４】
さらに別の要旨において、本発明は、哺乳類においてグラム陰性菌またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着法により治療する方法であって、当該体外吸着法が吸着カラム・アッセンブリにより実行され、当該吸着カラム・アッセンブリは、カラムおよび粒子の形態の吸収媒体を含み、当該粒子の沈降体積はカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子は、
１）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
２）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
ａ）哺乳類から血液を得る工程、
ｂ）得られた血液を吸着カラム・アッセンブリを粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより処理する工程、および
ｃ）処理した血液を哺乳類に再度注入する工程
を含む方法を提供する。
【００３５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、特定の安定化流動床吸着カラム・アッセンブリが、哺乳類においてグラム陰性菌および場合によりグラム陽性菌により引き起こされる敗血症の治療（または処置）の医療用デバイスの製造に非常に有用であるという興味深い知見に基づいている。哺乳類は特にヒトである。
【００３６】
吸着カラム・アッセンブリは、カラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含む。吸着カラム・アッセンブリが安定化流動床吸着カラム・アッセンブリとして適切に機能するように、粒子の沈降体積がカラムの容積の多くても８０％であることが重要である。たいていの場合において、粒子の沈降体積はカラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である。しかしながら、粒子の沈降体積はカラムの容積の少なくとも５％であることを要すると考えられる。幾つかの興味深い例において、沈降体積は、カラムの容積の好ましくは５〜５０％であり、例えば、５〜４０％であり、例えば５〜３０％である。
【００３７】
「粒子の沈降体積」とは、流動していない状態にて純水中に存在するときの粒子の体積を指す。体積は、水に粒子を懸濁させた懸濁液を、測定フラスコに充填することにより容易に測定することができる。
【００３８】
「カラムの容積」とは、カラムにより規定される空間（または閉じこめられた空間もしくはエンクロージャ）の全体積（または全容積）を指す。カラムがかなり一定の寸法、例えば円筒形状を有することが多いという事実により、容積は容易に算出することができる。別法として、カラムは、水で満たすことができ、その水の体積を続いて測定フラスコで測定することができる。
【００３９】
カラムの容積は、カラムがその意図する用途に従って配置されたときに測定／算出されるべきであることに留意する必要がある。したがって、カラム・アッセンブリ（カラム＋粒子）はさらに、搬送のときに、粒子を適当な位置に圧縮または保持するために配置されたプランジャーを含んでよい。
【００４０】
吸着カラム・アッセンブリの重要な部分は粒子である。粒子は、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に対して特異的な親和性を有する、親和性（またはアフィニティ）特異的な分子を有することにより特徴づけられる。
【００４１】
「グラム陽性菌に由来する有害な物質」という用語は、敗血症の発症を促進するもの（または統一体もしくはエンティティ）を意味し、グラム陽性菌の構成要素または敗血症を起こすグラム陽性菌に対する二次的な種（またはスピーシーズ）である。そのような有害な物質の例は、グラム陽性菌からの外毒素、ペプチドグリカン、およびテイコ酸、ならびに患者の血液中の細胞とペプチドグリカン、テイコ酸、および外毒素を含む高分子体との複合体（もしくは錯体）、ならびにペプチドグリカン、テイコ酸、および外毒素をその表面に有する細菌細胞である。
【００４２】
現時点で最も好ましい形態において、親和性特異的な分子は、敗血症を引き起こすグラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して、特異的な親和性を（少なくとも）有する。
【００４３】
「グラム陰性菌のＬＰＳ部分」という用語は、遊離形態のＬＰＳだけでなく、細菌と関連する（場合により、当該細菌の膜構造に存在する）ＬＰＳを包含することを理解すべきである。
【００４４】
吸着媒体は一般には、例えば、ＷＯ００／５７９８２で示されているような、膨張床プロセスにおいて使用されるように特に設計されている媒体であり、当該文献に開示されている内容は引用により本明細書に組み込まれる。
【００４５】
血液と粒子との間の最適な密度差は、非常に高い密度（例えば、血液の密度よりも有意に高い密度）を有する粒子を供給することにより得られる。したがって、高い密度の粒子は、血液中に沈む。しかしながら、安定化流動床は、水性緩衝液中に粒子を浮遊させる密度および／または寸法を有する粒子の床に下向きの流体のフローを適用することにより、必要な変更を加えて生成することができることにも言及すべきである。この場合、密度は、一般に、下記に述べる限定および範囲の逆であることを要する。
【００４６】
前記吸着媒体は、一般には、１．３〜２０ｇ／ｍｌの密度を有し、例えば、少なくとも２．０ｇ／ｍｌであり、少なくとも３．０ｇ／ｍｌであり、少なくとも３．５ｇ／ｍｌであり、好ましくは４．０〜１６ｇ／ｍｌである。
【００４７】
本明細書において、粒子の「密度」は、水和した状態の粒子の密度である。
【００４８】
高い密度と相俟って、比較的小さい直径の粒子は、効率的な安定化流動床プロセスに重要な役割を果たすと考えられる。したがって、吸着媒体の粒子の平均直径は、好ましくは５〜７５μｍであり、例えば、１０〜６０μｍの範囲内にあり、例えば、１２〜４９μｍの範囲内にあり、より好ましくは２０〜４０μｍの範囲内にあり、さらにより好ましくは１０〜３０μｍの範囲内にある。
【００４９】
さらにまた、（材料が流動床セットアップにおいて使用される場合に、寸法分布のある種の幅が有利であることに留意して）粒子寸法の分布が比較的狭いことが有利であると考えられる。したがって、粒子の少なくとも９５％は、その直径が５〜８０μｍの範囲内にあることが必要であり、例えば１５〜４５μｍの範囲内にあり、好ましくは２０〜４０μｍの範囲内にある。
【００５０】
当該吸着媒体は、一般には、少なくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する粒子の形態である。
【００５１】
高い密度は、好ましくは少なくとも３．０ｇ／ｍｌ、例えば少なくとも５．０ｇ／ｍｌ、好ましくは６．０〜１６．０ｇ／ｍｌの範囲内にある密度を有する、高密度のコア材料を高い割合で含めることにより、主に得られる。これは、構成が薄膜（pellicular）または集塊（conglomerate）である粒子をもたらす。適当なコア材料の例は、上述の密度基準が満たされる限りにおいて、無機化合物、金属、非金属元素、金属酸化物、非金属酸化物、金属塩、金属合金、および炭化タングステン等である。
【００５２】
粒子の少なくとも９５％のコア材料は、直径が２〜４０μｍの範囲内、例えば８〜２８μｍの範囲内、好ましくは５〜２５μｍの範囲内にある鋼鉄のビーズであることが好ましい。
【００５３】
別の形態において、粒子の少なくとも９５％のコア材料は、直径が２〜４０μｍの範囲内、例えば１５〜３８μｍの範囲内、好ましくは５〜３０μｍの範囲内にある炭化タングステンの粒子である。
【００５４】
さらにまた、粒子の少なくとも９５％は、粒子の直径の少なくとも０．７０倍、例えば少なくとも０．８０倍、または少なくとも０．８５倍である直径を有する１つのコア材料を含む。
【００５５】
別法として、コア材料は、１つよりも多いビーズ、例えば１０μｍよりも小さい直径を有する粒子により構成される。
【００５６】
一般には、コア材料は、粒子の体積の１０〜９９％、好ましくは５０〜９５％を構成し、ポリマーのベースマトリックスが、粒子の体積の１〜９０％、好ましくは５〜５０％を構成する。
【００５７】
粒子の大部分（＞９５％）のコア材料が１つのビーズで構成される場合、ポリマーのベースマトリックスは、一般に、５０μｍよりも小さい厚さを有する。「厚さ」とは、コア材料と粒子の表面との間の幾何学的な距離と定義される。厚さは好ましくは２０μｍ未満であり、より好ましくは１０μｍ未満であり、最も好ましくは５μｍ未満である。１つの形態において、ポリマーのベースマトリックスは、コア材料を被覆する単分子層を構成してよい。したがって、この場合、ポリマー・マトリックスは、コア材料に対して優れた親和性を有する低分子量の種で置き換えてよいことが考えられる。低分子量の種とコア材料との間のこの親和性は、コア材料の表面処理、例えば、セラミック材料のオルガノシリル化により向上させ得る。単分子層はまた、化学の分野の当業者により理解されるような化学的手段によって、コア材料の表面に共有結合で結合してよい。
【００５８】
吸着媒体の非常に重要な特徴は、粒子がポリマーのベースマトリックス上にて親和性特異的な分子を有するという事実である。
【００５９】
本発明に関連して、「親和性特異的な分子」という用語は、血液において優勢である条件下で、関心のあるもの（または対象となっているもの）（例えば、グラム陰性菌のＬＰＳ部分）と特に結合する能力によって特徴づけられる分子を説明するために用いられる。
【００６０】
１よりも多い異なる親和性特異的な分子が、吸着媒体内で粒子上に存在してよいことに留意すべきである。したがって、吸着媒体は、異なる親和性特異的な分子をそれぞれ有する異なるプールの粒子を含んでよく、ならびに／または、各粒子は種々の親和性特異的な分子を有してよい。
【００６１】
親和性特異的な分子は、例えば、イムノグロブリン（ポリおよびモノクローナル抗体を含む）、およびペプチドのような配列特異的親和性特異的分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＣＤ１４を含み、またトル（Toll)様受容体およびトル様受容体副タンパク質（またはアクセサリ・プロテイン）を含むレセプタ・タンパク質、ポリミキシンＢのような抗生物質、およびレクチンから成る群から選択してよい。これらの例は、グラム陰性菌のＬＰＳ部分の吸着に都合よく適している。
【００６２】
１つの形態において、親和性特異的な分子はイムノグログリンから選択される。
【００６３】
現時点で最も好ましい形態において、親和性特異的な分子はポリミキシンＢである。
【００６４】
本発明の好ましい形態において、親和性特異的な分子は、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列（もしくは多量体）、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００６５】
そのような親和性特異的分子は、当業者に公知の方法、例えば、「固定した親和性リガンド技術（Immobilized Affinity Ligand Techniques）」、Hermansonら、Academic Press, Inc.、サンディエゴ、１９９２で説明されているような方法により、ベースマトリックスに結合させ得る。この文献は引用により本明細書に組み込まれる。ポリマーのベースマトリックスが、活性物質として機能する性質を有しない場合には、ポリマーのベースマトリックス（またはポリマーの混合物が使用される場合には複数のマトリックス）を、誘導体化（活性化）して、適当な環境下で化学共有結合を形成する機能的な化学基（または化学的官能基）と反応し得る反応性物質を生成してよい。したがって、水酸基、アミノ基、アミド基、カルボキシル基、またはチオール基を含む材料を、種々の活性化剤、例えば、臭化シアン、ジビニルスルホン、エピクロロヒドリン、ビスエポキシラン、ジブロモプロパノール、グルタルジアルデヒド、カルボジイミド、無水物、ヒドラジン、過ヨウ素酸塩、ベンゾキノン、トリアジン、トシレート（tosylate）、トレシレート（toresylate）および／またはジアゾニウムイオン、特にジビニルスルホンまたはエピクロロヒドリンリンカーを用いて、活性化または誘導体化してよい。
【００６６】
活性化された表面への抗体の固定は、他の文献で十分に説明されており（例えば、Harlow & Lane、１９８８、抗体研究室マニュアル（Antibodies a Laboratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratories）、抗体分子を特定条件のｐＨ、塩分濃度、および温度にて、特定の時間の間、化学的に活性化された粒子と接触させることを含む。
【００６７】
ポリマーのベースマトリックスはしばしば、複数のコア材料を一体に被覆し、保持する手段として、また、親和性特異的な分子を結合する手段として使用される。したがって、ポリマーのベースマトリックスは、特定の種類の天然または合成有機ポリマーから求められ、一般には、
Ａ）寒天、アルギン酸塩（またはアルギン酸エステル）、カラーギナン、グアールガム、ガティガム（gum ghatti）、トラガカントガム（gum tragacanth）、カラヤガム（karaya gum）、イナゴマメガム、キサンタンガム、アガロース、セルロース、ペクチン、ムチン、デキストラン、澱粉、ヘパリン、キトサン、ヒドロキシ澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含む、天然および合成多糖ならびに他の炭水化物系ポリマー、
Ｂ）アクリルポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリエーテル、ビニル化合物の重合体、ポリアルケン、およびそれらの置換された誘導体、ならびに１よりも多いポリマー機能性を含むコポリマーおよびそれらの置換された誘導体を含む、合成有機ポリマーおよびポリマーを生じさせるモノマー、ならびに
Ｃ）それらの混合物
から選択される。
【００６８】
好ましいポリマーのベースマトリックスの群は、アガロースのような多糖である。
【００６９】
単一の粒子の理想的かつ好ましい形状は実質的に球形である。しかしながら、粒子の全体の形状は、通常、極めて重要であるというわけではなく、したがって、粒子は他の丸い形状、例えば、楕円、滴、および豆形状、ならびにより不規則な形状を有することができる。
【００７０】
１つの好ましい形態において、吸着媒体は、少なくとも１．３ｇ／ｍｌ、例えば少なくとも２．０ｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３．０ｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも３．５ｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも４ｇ／ｍｌの密度を有し、その場合、粒子は５〜７５μｍの平均直径を有し、粒子は実質的に多糖のベースマトリックスおよびコア材料から構成される。
【００７１】
別の形態において、吸着媒体は、６〜１６ｇ／ｍｌの密度を有し、この場合、粒子は１０〜３０μｍの平均直径を有し、粒子は実質的に多糖のベースマトリックスおよびコア材料から構成される。
【００７２】
別の形態において、吸着媒体は、少なくとも２．５ｇ／ｍｌの密度を有し、この場合、粒子は５〜７５μｍの平均直径を有し、粒子は実質的に、多糖から選択される、好ましくはアガロースであるポリマーのベースマトリックスおよびコア材料から構成され、コア材料は６．０〜１６．０ｇ／ｍｌの範囲内にある密度を有し、その場合、粒子の少なくとも９５％は粒子の直径の少なくとも０．７０である直径を有する１つのコア材料ビーズを含む。
【００７３】
別法として、吸着媒体は、ＷＯ９２／１８２３７およびＷＯ９２／００７９９に開示されているような集塊状の（または密集した）粒子の形態であってよく、あるいは、例えば、寸法、密度、表面化学、安定性および安全性に関して所望の特性を有する他のタイプの粒子であってよい。粒子は、多孔質であってもよく、または、関心のある物に対して透過性を有するものであってよく、あるいは関心のある物を結合させるために利用可能な表面領域のみを有し、実質的に非多孔質または非透過性であってよい。
【００７４】
本明細書において、「集塊的な」という表現は、ポリマーのベースマトリックスにより一体に保持された異なるタイプおよび寸法のコア材料の複数の粒子を含む吸着媒体の粒子、例えば、ＷＯ９２／１８２３７およびＷＯ９２／００７９９に説明されているような周囲のアガロース（ポリマーのベースマトリックス）により一体の保持された２以上の高密度の粒子から成る粒子を指すことを意図している。「薄膜の」という表現は、各粒子がポリマーのベースマトリックスの層で被覆された１つだけの高密度のコア材料から成る、粒子の複合体、例えばアガロースで被覆された高密度ステンレス鋼の複合体を指すことを意図している。
【００７５】
上述したように、吸着カラム・アッセンブリは、流動床吸着に適合させられ、特に安定化流動床吸着に適合させられる。
【００７６】
「流動床」は、ここでは、撹拌、緩衝剤、および吸収性粒子の任意のアレンジメント（または配置もしくは配列）であって、個々の粒子間の空間が、当該粒子の充填カラムにおいて得られる最小空間よりも広いアレンジメントとして規定される。したがって、この定義によれば、任意のタイプの非充填床反応器で使用される任意の組の粒子が、「流動床」を構成する。そのような流動床の例は、化学工学の教科書に説明されているように、床の膨張および「流動」をもたらすのに十分に高い流量で、流体のフローを、最初は粒子が充填されていた床に適用することにより得られる流動床である（例えば、H. Scott Fogler、「化学反応工学の要素（Element of Chemical Reaction Engineering）」、７８６ページ、Prentice-Hall PTR、１９９９）。
【００７７】
「安定化流動床」は、各粒子の動きが全床体積の限られた体積に制限されることの結果として、吸着体粒子の逆混合の度合いが低い流動床として定義される。これは、各粒子が、低い度合いの軸方向分散を有し、流動床の閉じこめ空間内の任意の位置にて見出される確率が同じでないことを意味する。したがって、安定化床は、逆混合の不存在が相互に異種（または不均一）である床のゾーンの混合を妨げるために、全流動床の不均一な組成を有するものとして特徴づけられ得る。「膨張床」という用語は、サンプルまたは水性緩衝剤の上向きの液体フローを、粒子の床を含むカラムの底部にて入口から加えることによって生成される粒子の安定化流動床を意味し、当該粒子は流動床の閉じこめ空間内にそれらを配置させる密度および／または寸法分布を有する。安定化流動床のように、膨張床は、粒子の逆混合の度合いが低いことにより特徴づけられる。磁気的な安定化流動床を除いては、「膨張床」および「安定化流動床」という用語は、大体において同意語である。本明細書において、「流動床吸着（もしくは吸収）」または「安定化流動床吸着（もしくは吸収）」という用語は、入口および出口を有するカラムに含まれる吸着媒体がその落ち着いた状態から、流体（例えば、サンプル（体液）もしくは水性緩衝剤）のストリームを上向きのフローで適用することによって上昇させられ、それにより、粒子の間のスペースを増加させる特定の粒子クロマトグラフィー技術を説明する。これは、流体サンプルの導入と同時に又はその前に起こり得る。
【００７８】
安定化流動床において、血液は、実質的に乱流および逆混合の無い、吸着粒子の床を通過させられ、吸着媒体の大きい表面積の効率的かつ穏やかな接触を提供して、細胞外の体液から分離されるべき関心のあるもの（又は対象物）の大部分が拘束されることを確保する。充填床カラムのプラグ流から、乱流、逆混合およびチャンネル形成を無くすことが、多くの数の理論段が形成されることに起因して、非常に効率的な吸着方法を提供することは周知である。
【００７９】
クロマトグラフィーシステムにおいて、「理論段」の数は、吸着媒体の粒子と粒子の床と相互作用するサンプル成分との間に形成され得る、平衡の数を表すものである。この数は、カラム１メートルあたりの数で表され、当業者に知られているように（例えば、The Amersham Biosciences booklet、膨張床吸着ハンドブック（Expanded Bed Adsorption Handbook）、Ref. no. 18112426、これは、http://www.chromatography.apbiotech.comで入手可能であり、また、引用により本明細書に組み込まれる）、カラムを経由させて注入した適当なトレーサの滞留時間から算出することができる。
【００８０】
一般的には、カラム・アッセンブリを通過する血液の流量は、流動床の膨張比（膨張した状態の吸着媒体の高さの沈降した状態の吸着媒体の高さに対する比）が少なくとも１．３、例えば少なくとも１．５となるようなものである。尤も、多くの例（しばしばそれは好ましいものである）において、流量は、膨張比が少なくとも２．５、例えば少なくとも４．０、または場合により少なくとも５．０である。
【００８１】
血液の流量は好ましくは、粒子の安定化流動床が形成されるように調整される。
【００８２】
吸着カラム・アッセンブリは一般的には、入口（又は導入）手段および出口（又は導出）手段をさらに含む。使用時に、カラムは、垂直な位置に配置される（カラムのシリンダーの長さ方向が垂直方向となる）。したがって、底部は入口手段を保持するであろう。さらに、底部は、粒子が入口手段に入るのを防止するために底部分割手段を有してよい。図３を参照されたい。幾つかの形態において、吸着カラム・アッセンブリは、カラム内での血液の均一な分布を確保するために、撹拌手段、例えば、プロペラ、磁気撹拌用のマグネティック・バー等を含む。
【００８３】
「磁気的な安定化流動床」という用語によって、床を通過する流体フローのパスに平行な半径方向で均一な磁界にて粒子を配置することにより得られる、磁化可能な吸着粒子の安定化流動床が意味されるものとする。
【００８４】
「吸着カラム・アッセンブリ」は、体外吸着法により、哺乳類の敗血症の治療に用いられる医療用デバイスの製造に有用である。この医療用デバイスは、吸着カラム・アッセンブリのほかに、バルブ、ポンプ、チューブ、コンテナ・リザーバ等を含む。図３に医療用デバイスの概略図を示す。
【００８５】
患者（哺乳類）からの血液、好ましくは全血を、コンテナ・リザーバに送ることができ、本来の連続的体外吸着プロセスが開始される前に、当該リザーバにて十分な量が集められる。吸着カラム・アッセンブリを通過した後、処理した血液はまた、コンテナ・リザーバに集められて、処理した血液が治療中の哺乳類（一般にはヒト）に受動的に戻されるようにする。哺乳類の血液を扱う際に通常使用されるバルブ、ポンプ、チューブ、コンテナ・リザーバ等は、本発明の医療用デバイスに関連して使用することができる。
【００８６】
「連続的なプロセス」によって、プロセスの開始時点にて適用され、プロセスの終了時点にて終了させられる、定数関数（constant function）により規定され得るプロセスが意味されるものとする。したがって、この明細書において、連続的なプロセスの一般的な例は、全血が一定のフロー（即ち、実質的に中断されないフロー）にて患者（哺乳類）から取り出され、また、患者に一定のフローで再度導入される処置である。患者からの全血の流量は必ずしも、吸着カラム・アッセンブリを通過する全血の最適な流量又は同一の患者（哺乳類）に処理した血液を再注入するときの可能な流量と合わないために、コンテナ・リザーバが吸着カラム・アッセンブリの上流側に適切に配置され、別のコンテナ・リザーバが吸着カラム・アッセンブリの下流側に適切に配置される。
【００８７】
換言すれば、所定の流量で患者（哺乳類）からの血液を取り出すこと（ステップａ）、血液を吸着媒体と接触させるプロセス（ステップｂ）、および患者に血液を再注入すること（ステップｃ）は、患者のベッドの位置にて、１つの連続的な相互に関係する処置で実施されることが理解されるべきである。
【００８８】
この処置は、体液が患者から１つの独立した処置において一度に取り出され、必要に応じて保存され、別の時にバッチ式で吸着媒体と接触させられ、最初の２つの手順とはほとんど無関係である更に別の時に患者に再度導入される、任意の他の「不連続的な」処置と対比して、理解されるべきである。
【００８９】
ヒトの患者について体外吸着を実施する最良の形態は、当業者において周知であり、一般には、流量が１００〜２００ｍｌ／分の範囲内にあるようにして静−静脈シャントを形成すること、および適当な抗凝血薬（例えば、シトレートまたはヘパリン）を活性凝固時間を１６０〜１８０秒の間に維持する濃度にて加えることを含む。
【００９０】
抗凝血薬のこの濃度では、患者に血液を戻す前に、抗凝血薬を除去する必要はない。
【００９１】
１つの形態において、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前には、哺乳類の血流に物質が最初に注入される開始ステップが先にあってよい。
【００９２】
別の形態において、ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から成る連続的な処置は、患者からの血液を安定化流動吸着媒体に向かわせて患者に戻すスイッチの作動により開始される。この形態において、スイッチは、患者の血液循環に合わせて配置され、安静時の患者へ血液が再び輸送されることを許容している。それは、連続的な血液モニタリングデバイスと接続され、モニタリングデバイスは、適当な生物標識（例えば、Ｃ反応性タンパク質もしくは血清アミロイドＡのような急性期タンパク質、または敗血症状態の開始に反応する他の任意の物質）の血漿中の濃度について、予め設定された変化を記録したときに、スイッチを作動させうる。この方法によって、敗血症を発症する危険のある患者の連続的な無人監視が可能となり、当該方法は、血液を本発明の安定化流動吸着デバイス（スダンバイ体外吸着）を介して分岐させることにより、血液パラメータにおける敗血症のような変化に反応する。
【００９３】
好ましい形態において、本発明の安定化膨張床を形成する粒子は、非常に小さく（平均直径１５〜２０μｍ）、充填された床の体積あたりの表面積が非常に高くなることを確保し、非多孔質の粒子を、関心のある物を粒子の表面に非常に高い能力でもって吸着させるのに使用することを許容している。
【００９４】
しかしながら、本発明は、可溶性の有害物質ならびに懸濁した有害物質（細胞）を結合させ得る（または拘束もしくは捕捉し得る）ことにより特徴付けられ、このことは、先に説明した当該分野で従来公知の他の方法に対して主たる利点を構成する。敗血症の処置（治療及びプロフィラクティック（profylactic）な処置）のための体外吸着プロセスにおいて、安定化流動床を採用する方法は、可溶性の、有害な物質を結合させて血液から取り除くことに加えて、血流中の細胞上で存在する場合に、流動床の親和性特異的分子に結合させられる（または捕捉される）特異的な生体高分子体もまた結合させられ、さらに、細胞が生体高分子体を拘束し得ることを条件として、血液からの細胞を拘束する（または結合させる）ことが可能となるために、他のそのような方法と比較して非常に改善されている。
【００９５】
上述の結合相互作用から利点が得られる方法を使用する１つの好ましい例は、膨張床の粒子上で固定されたリポ多糖結合物質を含む膨張床を使用することである。患者の血液がこの膨張床を経由して循環しているとき、可溶性のリポ多糖は、床の粒子に結合するであろう。しかしながら、細菌細胞またはそれのフラグメントの表面に存在するリポ多糖、および患者自身の細胞（例えば、ＣＤ１４陽性単核細胞）に結合し、また、患者の血流等において循環しているリポ多糖類も、床の粒子に結合させられて、それらは血流から除去されるであろう。さらにまた、これに加えて、膨張床の粒子に結合したＬＰＳ部分は、固定された親和性特異的な分子として作用し、患者の体からの血流の細胞と相互作用することができるであろう。そのような細胞は、一般には、リポ多糖を固定することが知られているＣＤ−１４およびＴＬＲ４陽性単核細胞である。これは、血液から有害な物質を除去することを非常に発展させて、すべてのＬＰＳ関連又はＬＰＳ結合物質を血流から除去し、処置プロセスを促進し、かつ加速する。
【００９６】
体外吸着の原理は、抗体、および血液から除かれる有害な物質に対して親和性を有する他の物質が、注入されたときに未知の又は有益でない薬物動態を有する、患者に対して毒性を有する、ならびに／または件の有害な物質のインヴィヴォでの結合に関する親和性が不適当であるとしても、これらの抗体および物質の使用が許容されることを強調する必要がある。このことは、当該目的のための吸着媒体を形成するのに有用である物質の範囲を広げる。
【００９７】
ここで説明される方法は、ＬＰＳが６０分間で少なくとも８０％減少することを想定するとともに、血液中の他の物質（特に、関連のない血清タンパク質）の回収率が８５％を越えることを想定している。
【００９８】
ここでは、「敗血症（またはセプシス；sepsis）」という用語は、血液循環系に細菌が存在することである、全身性疾患としての敗血症（septicaemia）の同義語として用いられる。
【００９９】
［実施例］
実施例１−安定化流動床による処置の基本
Ａ．安定化流動床にヒトの全血を流すこと（ＥＤＴＡ安定型血液）
下記の例の目的は、ヒトの非分離血液を、高密度の、小さい直径の吸着粒子の安定化流動床を経由させて流すことが実行できることを示すことである。
【０１００】
材料および方法：
実験的な流動床カラムのセットアップは、下記の標準の実験室設備をベースとして設置した。
−ポンプ（Ole Dich Aps、デンマーク）
−シリコーンチューブ（MasterFlex）
−マグネティック・スターラー（Janke and Kunkel）
−カラム：アップフロント・クロマトグラフィーＡ／Ｓ、デンマーク（cat.no. 7010-0000）、直径１．０ｃｍ、高さ５０ｃｍ
【０１０１】
吸着粒子（リガンドなし）
試験用粒子は、アップフロント・クロマトグラフィーＡ／Ｓ、デンマークにより提供された。粒子は下記の特性を有していた。
−ビーズ構成：炭化タングステンのコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：４．１ｇ／ｍｌ
−沈降状態での空隙体積：充填体積の約４０％
−沈降した粒子１リットルあたりのビーズ理論表面積：約１２０ｍ２
（理論表面積は、１リットルの沈降した床が６００ｍｌの粒子（空隙の無い体積）に相当するという概算値から算出し、各粒子は１４１３０μｍ３の体積を有し、その体積から粒子の数は４２×１０９であると算出することができた。２８２６μｍ３の外側表面積を有する各ビーズについて、これは１リットルの粒子について１２０ｍ２の全床表面積を与える。
【０１０２】
吸着体平衡緩衝剤：
０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム中の６％ｗ／ｖのデキストランＭＷ１１０．０００（Pharmacosmos、デンマーク）を用いて、カラムを通過させる血液のパーコレーションの前に、吸着体を予め平衡させた。
【０１０３】
血液：
新しく取り出した、健康なドナーからのヒト血液サンプルを、標準ＥＤＴＡガラス管（Becton Dickinson、code.no.15067）に収集したものを、実験に使用した。血液は室温で保管し、収集後、１時間以内に使用した。
【０１０４】
処置：
流動床カラム（直径１ｃｍ）をサプライヤの指示に従って組み立て、吸着粒子の水性懸濁液を加えて、沈降した床高さが７に達するようにした（５．５ｍｌ、約０．７ｍ２のビーズ表面積に相当する）。それから、緩衝液で粒子を流動化させ、洗浄するために、また、カラムに入るときに血液細胞の溶血が最小となるように最適な塩濃度／オスモル濃度を確保するために、約５ｍｌ／分の吸着体平衡緩衝液の上向きのフローを加えた。
【０１０５】
カラム内で均一なフローを確保するために、カラムは完全に垂直な位置に調節された。
【０１０６】
粒子が流動化させられると（即ち、流動床高さが１０ｃｍをこえると）、カラムの底にあるマグネティック・スターラーを最大速度の約８０％で動かして、入ってくる液体の均一な分布を確保し、また、流量を２．２ｍｌ／分に調節した。吸着体平衡緩衝剤による洗浄は、１５分間の間続けられ、その間に、１６ｃｍの床高さを有する安定化流動床が形成された。流動床の安定性は、視覚化の補助として拡大鏡を使用して、注意深く目視してカラム内の粒子および床を調べることにより確かめられた。目で見えるチャネリングおよび逆混合の無いことを、床安定性を表示するものとして調べた。
【０１０７】
安定かつ平衡した流動床を確立した後、１００ｍｌのヒトの血液を、一定の流量２．２ｍｌ／分にて、カラムにポンプで注入した。
【０１０８】
結果：
血液が安定化流動床内に入ること及び浸透することは、目視観察により注意深く追跡した。赤い血液サンプルの、明確な僅かに放物線状であるフロントが、一定の速度で安定化流動床内を移動し、逆混合及びチャネリングは安定化流動床全体のいずれの箇所でも観察されなかった。血液サンプルが安定化流動床の全体積を占めたとき、床の高さは２１ｃｍに増加していた（即ち、沈降した床高さの３倍になっていた）。血液サンプルの不透過性は、カラム内の吸着粒子を観察することを非常に困難にしたが、拡大鏡を使用することにより、床高さ及び床内にチャネリングが存在しないことを確認することが可能となった。
【０１０９】
安定化流動床の頂部にて血液サンプルが漏出した後、通過したもの（またはランスルー）を、５ｍｌの血液のフラクションで収集しながら、全１００ｍｌの血液サンプルをカラムに加えることを続けた。収集したフラクションを５００Ｇにて１０分間遠心分離機にかけ、サンプルがカラムを通過した後に生じる溶血の程度を、参照サンプルとして未処理の血液を使用して、５４０ｎｍにて分光光度計により測定した。すべての収集したフラクションは、赤血球の全数の２％未満の溶血の度合（完全に実験的に溶血されたコントロールサンプルにおいて決定される）を有していた。さらに、収集した血液サンプルの顕微鏡による試験は、血液の凝血の発生を示しておらず、サンプルにおいて吸着粒子は検出されなかった。
【０１１０】
１００ｍｌの血液サンプルを加えた後、カラム内の残りの血液を洗い出す目的で、吸着体平衡緩衝剤を用いてカラムを再度パーコレートした。洗浄もまた、２．２ｍｌ／分の流量で実施した。緩衝液の投入及びカラムが徐々に洗浄されることは、入ってくる平衡緩衝剤と血液サンプルとの間で鮮明な上向きに移動する境界を生じさせ、流体がプラグ流で移動するとともに、床の安定な流動を示し、チャネリング及び逆混合の無いことを示した。血液サンプルが完全にカラムから洗い流されると、流動化床の高さは１６ｃｍに戻った。
【０１１１】
安定化流動床を平衡緩衝液で洗浄した後、カラム内部からの粒子のサンプルを顕微鏡で観察した。すべての粒子は、その平滑な表面が全く損なわれておらず、それに付着している細胞は無いことが観察された。この試験において、ＥＤＴＡ安定型ヒト全血のサンプル１００ｍｌが加えられ、沈降した床高さが７ｃｍ（５．５ｍｌ）である安定化流動床をポンプを用いて通過させた。全体の結論は、４０〜５０体積％の血液細胞ならびに高濃度のタンパク質を含む全血を、小さな粒子の安定化流動床に加えると、安定した流動床システムの崩壊という形態で重大な問題が生じ、ならびに／または重大な負の影響が血液に生じると考えられたにもかかわらず、深刻な問題は全体の過程の間、観察されなかった。さらに、粒子は、完全に血液が無くなるように、完全に洗うことができ、床全体は、血液の通過および後の洗浄の後も最初の状態に戻っていた。
【０１１２】
Ｂ．安定化流動床にヒトの全血を流すこと（ヘパリン安定型血液）
ヘパリンで凝血防止したヒト血液をＥＤＴＡ安定化血液の代わりに用いたことを除いて、実施例１Ａと同じ実験を実施した。この実験用の血液は、標準ヘパリンガラス管（Venoject、NaHeparin、Terumo Europe）に収集した。
【０１１３】
得られた結果は、ＥＤＴＡ安定化ヒト血液に関する上記の結果と同様であり、したがって、安定化流動床による処置をヘパリンで凝血防止したヒト血液についても、ＥＤＴＡ安定化血液と同様、問題なく実施できることを示していた。
【０１１４】
実施例２：安定化流動床におけるヒト全血からの酵素コンジュゲート（または接合体もしくは複合体）の特異的な吸着；ビオチン結合粒子による、アビジン−ペルオキシダーゼの結合
下記の実験の目的は、安定化流動床処置において、ヒト全血に由来する関心のある特異的な生体高分子体の結合の実行性を確立することであった。そのような結合を示す目的だけのために、酵素コンジュゲートをモデルタンパク質として使用した。酵素コンジュゲートは、酵素の結合を示すように、高感度アッセイが実施されることを許容するからである。試験物質（ペルオキシダーゼで標識されたアビジン）が、ヒト全血に添加されて、その後、試験物質をビオチンでラベルされた高密度の吸着体に、安定化流動床処置において吸着させた。試験物質の吸着体への結合は、適当な標識酵素基質（ジアミノベンジジン）を使用して、結合したペルオキシダーゼ・コンジュゲートの作用を介して、吸着粒子における染色の発現により示された。
【０１１５】
この実施例は、全血の安定化流動床クロマトグラフィーのために、低密度でより大きい粒子径を有し、ガラス粒子のコアを有する別の種類の粒子を使用することの実現性を示す点で、実施例１を補う。
【０１１６】
材料および方法：
使用した実験のセットアップおよび装置は、実施例１と同じものであった。
吸着粒子（リガンドとしてビオチンを有する）：
この実験で使用した吸着体は高密度のビオチン−アガロース／ガラス吸着体（製品no.：6302-0000、アップフロント・クロマトグラフィーＡ／Ｓ、デンマーク）であった。この吸着体は以下の特徴を有する：
−ビーズ構成：球状のガラス粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（６％ｗ／ｖ）（図５参照）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：１００〜３００μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：１．５ｇ／ｍｌ
−リガンド：ビオチン。
【０１１７】
吸着体平衡緩衝剤：
０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム中の６％ｗ／ｖのデキストランＭＷ１１０．０００（Pharmacosmos、デンマーク）を用いて、カラムを通過させる血液のパーコレーションの前に、吸着体を予め平衡させた。
【０１１８】
血液：
新しく取り出した、健康なドナーからのヒト血液サンプルを、標準ＥＤＴＡガラス管（Becton Dickinson、code.no.15067）に収集したものを、実験に使用した。血液は室温で保管し、収集後、１時間以内に使用した。吸着処置の直前に、１ｍｌのアビジンで標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（アビジン−ペルオキシダーゼ、１ｍｇ／ｍｌ、製品no.：４０３０Ｙ、Kem-En-Tec A/S、デンマーク）を１００ｍｌの血液に添加して、最終的な濃度を、ヒト血液１ｍｌあたりアビジン−ペルオキシダーゼ１０μｇとした。
【０１１９】
処置：
流動床カラムをサプライヤの指示に従って組み立て、吸着粒子の水性懸濁液を加えて、沈降した床高さが５．８ｃｍに達するようにした。
【０１２０】
カラムに入るときに血液細胞の溶血が最小となるように最適な塩濃度／オスモル濃度を確保するために、最初に吸着体平衡緩衝剤を用いた洗浄を２．２ｍｌ／分の流量で実施した。吸着粒子が平衡緩衝剤の上向きのフローによって流動化させられたときに、マグネティック・スターラーを最大速度の約８０％で動かし、カラムを完全に垂直な状態に注意深く配置した。完全に安定した流動化した状態に達したとき、吸着床の高さは１０．５ｃｍに増加していた。
【０１２１】
平衡緩衝剤による初期の洗浄に続いて、血液サンプルを２．２ｍｌ／分の流量でカラムに加えた。血液の明確な僅かに放物線状であるフロントが、安定化流動床内を徐々に上向きに移動する様子が観察された。逆混合またはチャネリングは実験の間、観察されなかった。完全にヒトの血液で充填されたとき、拡大鏡を使用して測定した床高さは、約１４．５ｃｍであった（即ち、沈降した床高さの２．５倍であった）。
【０１２２】
カラムを通過した血液の溶血の度合いは、（実施例１のように）５４０ｎｍにて分光光度計により測定したところ、０．２％未満であった。血液サンプルの適用の後、カラムを２００ｍｌの吸着体平衡緩衝液で洗浄して、血液および結合していないペルオキシダーゼで標識されたアビジンを洗い流した。
【０１２３】
安定化流動床を完全に洗浄した後、吸着粒子のサンプルを、サプライヤの指示に従って調製したジアミノベンジジン基質（cat.no.：４１５０、Kem-En-Tec A/S、デンマーク）を用いて２分間インキュベートした。
【０１２４】
結果：
ジアミノベンジジン酵素基質は、吸着粒子を、非常に濃い茶色にし、したがって、粒子上に、血液が安定化流動床を通過している間に血液から抽出された、結合したアビジチン−ペルオキシダーゼが存在することを示した（図５参照）。
【０１２５】
同じ種類の吸着粒子であるがビオチン・リガンドが無い粒子を用いて実施した実験は、この酵素基質試験において陰性の結果を与え、したがって、最初の結果が吸着粒子上のビオチン・リガンドとヒト血液サンプルに試験物質として添加されたアビジン−ペルオキシダーゼとの間の特異的な相互作用及び結合によるものであることを示した（図５参照）。
【０１２６】
実施例３−バッチ操作におけるウシ全血からのマウス抗体の特異的な吸着、マウスイムノグロブリンの抗マウス抗体結合粒子との結合
この実施例の目的は、抗マウスイムノグログリン抗体が結合した吸着体をウシ全血に添加されたマウス抗体の抽出に使用することの実行性を示すことである。
【０１２７】
この実験に使用した吸着体は、高密度の、ジビニルスルホンが結合したアガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにウサギ由来の抗マウスイムノグロブリン・ウサギ抗体（code no. Z0109、DAKO A/S、デンマーク）を結合させた。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：３ｍｇ／ｍｌにてジビニルスルホンを介して結合したウサギ抗マウスイムノグロブリン（DAKO A/S、デンマーク、code no. Z0109）。
【０１２８】
処置：
新しく得たヘパリンで凝血防止されたウシの全血を、健康なドナーから得て、その血液をヘパリン管（Venoject、NaHeparin、Terumo Europe）に収集した。血液からのマウスイムノグロブリンの選択的な抽出を示す目的のために、Amersham Pharmacia Biotechから入手されるキット（code no. PA33000）より、製造者の指示に従って調製した、１００μｌのＣｙ３標識マウスイムノグロブリンを、０．５ｍｌのウシ血液に添加して、１００μｌの吸着粒子の懸濁液を用いて、室温にて３０分間インキュベートした（ゆっくりとした循環）。マウスイムノグロブリンは、プロテインＡ精製ＩｇＧ１アイソタイプであり、ＰＢＳにて３．７ｍｇ／ｍｌで使用した。これと並行して、同様のインキュベーションを１００μｌのＣｙ３マウスイムノグロブリンを用いてＰＢＳ中で実施し（血液なし、陽性対照）、これらのインキュベーションの両方を非結合の粒子を用いて実施した（陰性対照）。
【０１２９】
吸着粒子は、インキュベーションにより使用する前に洗浄し、血液／マウス抗体混合物でインキュベートする前にＰＢＳを用いてデカントした（２回）。３０分のインキュベーションの後、粒子をデカンテーションにより回収し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し（インキュベーション／デカンテーション）、それから、目視および蛍光顕微鏡法（５７０ｎｍ）により検査した。
【０１３０】
結果：
図６に見られるように、Ｚ０１０９で誘導体化した粒子は、純粋な溶液（ＰＢＳ）に供給され、また、５倍低い濃度にてヘパリンで凝血防止された全血に混入されると、Ｃｙ３標識マウス抗体を拘束し、一方、非常に低いバックグラウンド結合が誘導体化されていない粒子について観察された。粒子の蛍光の強度は、純粋なＣｙ３イムノグロブリン溶液を用いて結合を実施したときと、全血に混合されたＣｙ３イムノグロブリンを用いてインキュベーションを実施したときと比較して、同程度であったので、イムノグロブリンの粒子への結合は明らかに全血の存在により影響を受けなかった。蛍光は、想定していたように、ポリマーのベースマトリックスの外側表面（アガロース層）に限られていた（図６）。
【０１３１】
結論において、この実験は、少量の粒子を、標識イムノグロブリン分子をウシ全血からバッチ的に特異的に取り出すために使用することの実行性を示している。
【０１３２】
実施例４−ポリエチレンイミン結合粒子を使用する、連続撹拌タンク反応器における高密度吸着体への血液細胞の吸着
下記の実施例の目的は、撹拌されたタンク反応器において、ヒト血液細胞が高密度イオン交換吸着体に結合することの実行性を示すことであった。この実験に使用した吸着体は、高密度ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であった。この吸着体は、下記の特性を有する。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【０１３３】
実施例１において説明した得たＥＤＴＡで安定化されたヒト全血（１００ｍｌ）は、１ｍｌの吸着粒子と、１０分間、室温で、注意深く撹拌した状態で混合した。吸着粒子の沈降の後、血液サンプルをデカントし、粒子を、吸着体平衡緩衝剤を用いて洗浄し（インキュベーションおよび緩衝剤のデカンティング）、その後、顕微鏡で観察した。
【０１３４】
図７に示すように、吸着体は、血液細胞をその表面の吸着ポリマーマトリックス層に結合させている。
【０１３５】
実施例５−細胞懸濁液中の細胞を、バッチプロセスにおいて、直接的に抗体が被覆された高密度集塊的粒子に特異的に結合させること
この実施例の目的は、抗体被覆した集塊状の吸着粒子が、全細胞のイムノ・アフィニティクロマトグラフィに関して有用であることを示すことである。
【０１３６】
この実験の吸着体はジビニル−スルホン活性化（低い活性化レベル）アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにマウス抗ウシＣＤ８抗体（モノクローナル、ＩｇＧ１、ＡＴＣＣ  ＣＬＲ１８７１）を結合させる。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：ジビニルスルホンを介して結合したモノクローナル抗ウシＣＤ８イムノグロブリン（ＡＴＣＣ  ＣＬＲ１８７１）。
【０１３７】
処置：
新しくヘパリンで凝血防止したウシの全血を、健康なドナーから、血液をヘパリン管（Venoject、NaHeparin、Terumo Europe）に収集することにより得る。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、標準的な方法（Ficoll（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotech、code no. 17-1440-03）を用いる密度勾配遠心分離）により標準的な手順（Rickwood ed., 1984、遠心分離：実際的なアプローチ（Centrifugation: a practical approach）、IRL Press）に従って調製され、ＰＢＳ中に約１０６ＰＭＢＣｓ／ｍｌで再度懸濁させる。この細胞懸濁液は、新鮮な血液から調製され、調製後、直ちに使用される。
【０１３８】
吸着粒子が全細胞を効率的に結合させ得ることを単に示すモデル実験として、まず、５００μｌのＰＢＭＣ懸濁液を、ウシＣＤ−８（粒子の結合に用いられる抗体と同じ）に対するＣｙ−３コンジュゲート抗体１００μｌ（３．７ｍｇ／ｍｌ）と混合する。コンジュゲート抗体１００μｌは、Amersham Pharmacia Biotech（code no. PA33000）のＣｙ３標識キットを使用して、キットとともに提供された指示に従って調製する。３０分後、室温にて、この混合物を、２００μｌの抗体結合粒子とともにＰＢＳ中でインキュベートする。陰性対照として、同様の組成の誘導体化されていない粒子もまた、独立した実験でインキュベートする。この吸着粒子は、インキュベーションの前に、ＰＢＳを用いてインキュベーションおよびデカントにより洗浄する（３回）。室温にて穏やかに撹拌を３０分した後、３回ＰＢＳで洗浄し、得られた懸濁液を蛍光顕微鏡で可視光および５７０ｎｍで検査すると、懸濁液中でＣＤ８陽性（Ｃｙ３標識）細胞の存在および局在化を示す。
【０１３９】
結果：
この実験から、抗体誘導体化粒子は、顕微鏡下で、より小さいＣＤ−８陽性（したがって、Ｃｙ−３蛍光）ＰＢＭＣｓが、何も若しくは非常に僅かな蛍光細胞が付着している粒子の表面に付着して、目立つようになると考えられる。このパターンはあきらかに、ランダムな蛍光（ＣＤ８陽性）のパターン、および誘導体化されていない集塊状の粒子について見られる非蛍光細胞とは明らかに異なっており、また、免疫吸着粒子への細胞の結合の特異性を示している。
【０１４０】
実施例６−バッチプロセスにおいて、抗体で被覆された高密度集塊状粒子への、捕捉抗体による、間接的な、細胞懸濁液における細胞の特異的な結合
この実施例の目的は、抗体で被覆された集塊的な吸着粒子を、全細胞の間接的な免疫親和性クロマトグラフィーに使用できることを示すことである。
【０１４１】
この実験で使用した吸着体はジビニルスルホン活性（低い活性レベル）アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これには、ウサギ抗マウスイムノグロブリン（DAKO  code no. Z0109）が結合している：
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：ジビニルスルホンを介して結合したウサギ抗マウスイムノグロブリン（DAKO Z0109）。
【０１４２】
処置：
新しく得たヘパリンで凝血防止したウシの血液を、健康なドナーから、血液をヘパリン管（Venoject、NaHeparin、Terumo Europe）に収集することにより得る。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、標準的な方法（Ficoll（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotech、code no. 17-1440-03）を用いる遠心分離）により標準的な手順（Rickwood ed., 1984、遠心分離：実際的なアプローチ（Centrifugation: a practical approach）、IRL Press）に従って調製され、ＰＢＳ中に約１０６ＰＭＢＣｓ／ｍｌで再懸濁させる。この細胞懸濁液は、新しい血液から調製され、調製後すぐに使用される。
【０１４３】
吸着粒子が全細胞を効率的に結合させる（または拘束もしくは捕捉する）ことが可能なことを単に示すモデル実験として、５００μｌのＰＢＭＣ懸濁液を、まず、１００μｌのウシＣＤ８に対するＣｙ３コンジュゲート抗体（３．７ｍｇ／ｍｌ）と混合する。このコンジュゲート抗体１００μｌは、Amersham Pharmacia Biotech（code no. PA33000）のＣｙ３標識キットを使用して、キットとともに提供された指示に従って調製する。それから、３０分後、室温にて、この混合物を注意深く３回洗浄して、余分なＣｙ３標識抗体を除去し、それから、２００μｌのＺ０１０９結合粒子とともにＰＢＳ中でインキュベートする。陰性対照として、同様の組成の誘導体化されていない粒子もまた、独立した実験でインキュベートする。この吸着粒子は、ＰＢＭＣとのインキュベーションの前に、ＰＢＳを用いてインキュベーションおよびデカントにより洗浄する（３回）。室温にて穏やかに撹拌を３０分した後、３回ＰＢＳで洗浄し、得られた懸濁液を蛍光顕微鏡で可視光および５７０ｎｍで検査すると、懸濁液中でＣＤ８陽性（Ｃｙ３標識）細胞の存在および局在化を示す。
【０１４４】
結果：
この実験から、抗体誘導化された粒子は、顕微鏡下で、より小さいＣＤ−８陽性（したがって、Ｃｙ−３蛍光）ＰＢＭＣｓが、何も付着していない若しくは非常に僅かな蛍光細胞が付着している粒子の表面に付着して、目立つようになると考えられる。このパターンは、ランダムな蛍光（ＣＤ８陽性）のパターン、および誘導体化されていない集塊状の粒子について見られる非蛍光細胞とは明らかに異なっており、また、免疫吸着粒子への細胞の結合の特異性を示している。
【０１４５】
このように、この実験は、ポリクローナルマウスイムノグロブリン特異的抗体を吸着集塊状粒子に結合させるリガンドとして使用して、任意の種類のモノクローナル抗体に関する「全般的な（またはユニバーサルな）」免疫吸着を調製することが可能であることを示すことを予定している。これは、当業者に公知である幾つかのモノクローナル抗体が共有結合的（化学的）に固体表面に固定されると、機能しないために、有利である。さらにまた、これは、そのような一般的な免疫吸着粒子から生成される安定化流動床を、例えば、溶液相にてこれらの二次抗体と体液の構成要素とが反応した後に、他の抗体を捕捉するためにデバイスで使用することを可能にする（「バインド・アンド・キャッチ」アプローチ）。
【０１４６】
実施例７−生きている宿主中のＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去するための、免疫吸着の高密度の集塊粒子を含む安定化流動床の使用
ウシの血流からのＴ細胞サブセットを体外で特異的に除去するための安定化流動床の使用の実行性を示すために、ウシＣＤ８（ＡＴＣＣ  ＣＬＲ１８７１）に対するモノクローナルマウス抗体をジビニルスルホンを介して粒子に結合させることにより、高密度吸着粒子をウシＣＤ８に対する抗体で誘導体化する。
【０１４７】
吸着粒子（リガンドなし）
試験粒子はアップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマークにより供給される。粒子は下記の特性を有する：
−ビーズ構成：炭化タングステンのコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：４．１ｇ／ｍｌ
−沈降状態での空隙体積：充填体積の約４０％
−沈降した粒子１リットルあたりのビーズ理論表面積：約１２０ｍ２
【０１４８】
吸着体平衡緩衝液：
０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム中の６％ｗ／ｖのデキストランＭＷ１１０．０００（Pharmacosmos、デンマーク）を用いて、カラムを通過させる血液のパーコレーションの前に、吸着体を予め平衡させる。
【０１４９】
処置：
流動床カラム（直径１ｃｍ）をサプライヤーの指示に従って組み立て、吸着粒子の水性懸濁液を加えて、沈降した床高さが７ｃｍに達するようにする（５．５ｍｌ、約０．７ｍ２のビーズ表面積に相当する）。それから、緩衝液で粒子を流動化させ、洗浄するために、また、カラムに入るときに血液細胞の溶血が最小となるように最適な塩濃度／オスモル濃度を確保するために、約５ｍｌ／分の吸着体平衡緩衝液の上向きのフローを加える。カラム内で均一なフローを確保するために、カラムは完全に垂直な位置に調節される。粒子が流動化させられると（即ち、流動床高さが１０ｃｍをこえると）、カラムの底にあるマグネティック・スターラーが最大速度の約８０％で動かして、入ってくる液体の均一な分布を確保し、また、流量を２．２ｍｌ／分に調節する。吸着体平衡緩衝液による洗浄は、１５分間続けられ、その間に、１６ｃｍの床高さを有する安定化流動床が形成される。流動床の安定性は、注意深く床を目視することにより確かめられる。安定かつ平衡した流動床を確立した後、３００ｍｌのウシの血液を、一定の流量２．２ｍｌ／分にて、カラムにポンプで注入する。これは、シリンジを介してチューブをウシの適当な静脈に接続し、血液を連続プロセスで底部の入口からカラムにポンプで送り、頂部の出口からウシの別の適当な静脈に戻すことにより為される。実験の間、少量の血液サンプルを頂部の出口から５分ごとに取り出す。吸着は、１時間の間、５ｍｌ／分にて行われ、それから終了させられた。凝固は、ヘパリンＰＢＳ溶液を、血液１ｍｌあたり２５ＩＵの量で、カラムの底部の入口にてバルブを介して連続的に添加することにより防止される。
【０１５０】
この結果は、全操作が、血液の凝固が発生せず、細胞が著しく損傷を受けることなく、また、動物に害とならないように、実施され得るかどうかを示すであろう。さらに、収集した出口フラクションの流動細胞計測による分析は、ＣＤ８細胞が出口血流からどの程度除去されているかということを示すであろう。
【０１５１】
実施例８−バインド・アンド・キャッチサンプル：生きた宿主のＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去するための、抗イムノグロブリンで誘導体化された、免疫吸着の高密度の集塊状粒子を含む安定化流動床の使用
ＣＤ８特異的な抗体がまず、１ｍｇ／ｍｌのマウス抗ＣＤ８を含む２０ｍｌの無菌のＰＢＳのボーラス注射として、ウシに静脈に注入されることを除いて、この実施例の目的および実行は実施例７に類似している。次いで、これは、リガンドとして付着した抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ  Ｚ０１０９、３ｍｇ／ｍｌ）を有する吸着粒子に、実施例１１で説明したように、体外吸着される。
【０１５２】
結果は、全操作が、血液の凝固が発生せず、細胞が著しく損傷を受けることなく、また、動物に害とならないように、実施され得るかどうかを示すであろう。さらに、収集した出口フラクションの流動細胞計測による分析は、床の体積に応じた能力によって、ＣＤ８細胞が出口血流から除去されるかどうかということを示すであろう。
【０１５３】
実施例９−ポリミキシンＢの固定、および細菌リポ多糖の結合のためのポリミキシンＢ結合吸着体の使用
この実施例の目的は、ポリミキシンＢ結合吸着剤をＬＰＳの結合（または拘束もしくは捕捉）のために使用することの実行性を示すことである。
【０１５４】
この実験で使用される吸着体は、高密度のジビニルスルホン結合アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにはポリミシキンＢスルフェート（Sigma）が結合している。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：３ｍｇ／ｍｌにてジビニルスルホンを介して結合したポリミキシンＢ（Sigma、Mo、code no. P4932）。結合（またはカップリング）は、各ポリミキシンＢの分子の結合をポリミキシンＢ中の最小の数の第一アミノ基を介して得られるように実施する。要約すると、粒子は、室温にて、ポリミキシンＢとともに、０．１Ｍカーボネート、０．５ＭＮａＣｌ中で、ｐＨ８．２、２０ｇ／ｍｌで、穏やかな撹拌を用いて一晩インキュベーションすることにより、ポリミキシンＢと結合する。その後、粒子を同じ緩衝剤で洗浄し、遊離反応性ビニルスルホン基をエタノールアミン（１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０、２時間、室温）でブロックしてから、ＰＢＳで洗浄する。
【０１５５】
処置：
大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来のＬＰＳを、Sigmaから入手し（code no. L2880）、milliQ水に溶解して１μｇ／ｍｌにし、澄んだ溶液を得る。それから、溶液を、上述のポリミキシンＢ結合粒子を用いて、バッチ吸着プロセスで処理する。対照実験は、関連のないペプチドで誘導体化して、エタノールアミンでブロックした粒子を使用して実施した。穏やかに撹拌しながら２時間インキュベーションした後、吸着粒子をデカントにより溶液から分離し、溶液を分析のために回収した。粒子は続いて、ＰＢＳを用いたインキュベーション及びデカントにより洗浄し（３回）、各洗浄液を別々に収集する。それから処理前後のＬＰＳ溶液ならびに全ての洗浄溶液は、リムルス変形細胞溶解物試験（Limulus amebocyte lysate test）により、ＬＰＳに関して分析し、また、凍結乾燥し、サンプル緩衝剤に直接再溶解化した後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、その後、Tsai & Frash（１９８２、Anal. Biochem. 119, 115-119）のように、適当な酸化処理により銀染色する。
【０１５６】
結果は、ポリミキシンＢで被覆された粒子に曝されることによって、ＬＰＳが効率的に（０．１ｎｇ／ｍｌ未満に）除去されることを示すと期待され、対照粒子については全く違いが見られないであろうと考えられる。これは、リムルス変形細胞溶解物試験でエンドトキシンの活性が存在しないこと、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてＬＰＳに関連する銀で染色されたバンドが存在しないことの両方によって示されると考えられる。粒子とＬＰＳの量との比を変化させる、類似のインキュベーションのシリーズにおいて、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５  ＬＰＳに対するポリミキシンＢ誘導粒子の能力を決定することができ、それは、沈降した床５ｍｌにつきＬＰＳが１ｍｇを越えるという、高いものであろうと考えられる。
【０１５７】
別のシリーズのインキュベーションにおいて、サルモネラネズミチフス菌のＬＰＳおよびラフ（rough）型大腸菌（短鎖ＬＰＳ）のＬＰＳを含む種々のタイプのＬＰＳが試験され、結果はこれらのタイプのＬＰＳもまた効率的に且つ高い吸着力で、ポリミキシンＢで被覆された粒子に結合するということを示すと考えられる。これらの実験の間、結合したＬＰＳの溶出および粒子の再利用もまた試みられるであろう。また、Issekutz（１９８３、「親和性クロマトグラフィーによるグラム陰性菌エンドトキシンの溶液からの除去（Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography）」、J. Immunol. Meth. 61, 275-281）が説明している緩衝条件に類似する条件を用いて、洗剤で洗浄し、食塩水で念入りに洗浄することによって、粒子の再利用が可能であると考えられる。
【０１５８】
実施例１０−全血中のＬＳＰの吸着のための、ポリミキシンＢ結合粒子の安定化流動床での使用
下記の実験の目的は、安定化流動床処置において、ポリミキシンＢで被覆された粒子による、ヒトの全血中のＬＰＳの捕捉（または結合）の実行性を確認することである。
【０１５９】
材料および方法：
使用した実験のセットアップおよび装置は実施例１と同じであった。
吸着粒子（ポリミキシンＢをリガンドとして有する）：
この実験に用いられる吸着体は高密度のジビニルスルホン結合アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにはポリミキシンＢスルフェート（Sigma）が結合している。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：３ｍｇ／ｍｌにてジビニルスルホン介して結合したポリミキシンＢ（Sigma、Mo、code no. P4932）。結合（またはカップリング）は、各ポリミキシンＢの分子の結合をポリミキシンＢ中の最小の数の第一アミノ基を介して得られるように実施する。
【０１６０】
吸着体平衡緩衝液：
０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム中の６％ｗ／ｖのデキストランＭＷ１１０．０００（Pharmacosmos、デンマーク）を用いて、カラムを通過させる血液のパーコレーションの前に、吸着体を予め平衡させた。
【０１６１】
血液：
新しく取り出した、健康なドナーからのヒト血液サンプルを、標準ＥＤＴＡガラス管（Becton Dickinson、code.no.15067）に収集したものを、実験に使用した。血液は室温で保管し、収集後、１時間以内に使用した。吸着処置の直前に、１００μｇの大腸菌Ｏ５５：Ｂ５  ＬＰＳ（Sigma、MO、L2880）が１００ｍｌの血液に加えて、最終的な濃度を、ヒト血液１ｍｌあたりＬＰＳ１μｇとする。
【０１６２】
手順：
流動床カラムをサプライヤの指示に従って組み立て、吸着粒子の水性懸濁液を加えて、沈降した床高さが５．８ｃｍに達するようにする。
【０１６３】
カラムに入るときに血液細胞の溶血が最小となるように最適な塩濃度／オスモル濃度を確保するために、最初に吸着体平衡緩衝剤を用いた洗浄を２．２ｍｌ／分の流量で実施する。吸着粒子が平衡緩衝剤の上向きのフローによって流動化させられたときに、マグネティック・スターラーが最大速度の約８０％で動かされ、カラムは完全に垂直な状態に注意深く配置される。完全に安定した流動化した状態に達したとき、吸着床の高さは１０．５ｃｍに増加すると考えられる。
【０１６４】
平衡緩衝剤による初期の洗浄に続いて、血液サンプルを２．２ｍｌ／分の流量でカラムに加える。血液の明確な僅かに放物線状であるフロントが、安定化流動床内を徐々に上向きに移動する様子が観察される。逆混合またはチャネリングは実験の間、観察されないと期待される。
【０１６５】
血液サンプルを加えた後、通過したもの全部を集めて、カラムを２００ｍｌの吸着体平衡緩衝液で洗浄して、血液および内部の結合していない高分子体を洗い出す。この洗浄フラクションもまた収集される。並行したセットアップにおいて、関係のないペプチドで誘導体化した粒子を含む参照カラムを、上述した方法と同じ方法で、ＬＰＳが混合した血液を処理するために使用する。すべての通過物および洗浄フラクションをリムルス変形細胞溶解物アッセイにより分析する。
【０１６６】
結果：
ＬＰＳを混入した血液を、ポリミキシンＢで被覆した粒子の安定化流動床を通過させた後、すべてのＬＰＳは、血液で生じる溶血の度合いを最小にして（５４０ｎｍの分光光度計により測定される場合に０．２％未満であると考えられる）、血液から除去され、一方、洗浄フラクションにはＬＰＳは存在しないと考えられる。すべてのＬＰＳはなお通過フラクション中に見られると予想されるので、ＬＰＳの吸着は、参照カラムに関しては見られると考えられる。この場合、リムルス変形細胞溶解物アッセイにより測定されるＬＰＳ活性は血液中の所定量のＬＰＳ中和活性に起因して減少することがあるものの、参照吸着体とポリミキシンＢ吸着体との間の差は、非常に明瞭であると考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、大量の細胞および血清タンパク質の存在に起因して、血液中のＬＰＳのトレース濃度の分析に直接的に適用可能ではない。
【０１６７】
さらに、結合したＬＰＳを、ｐＨ８、０．１Ｍトリス中の１％デオキシコール酸ナトリウムで溶出してから、食塩水で念入りに洗浄した後に、ポリミキシンＢ吸着体は再度使用することができると期待される（Issekutzにより教示されている（１９８３、「親和性クロマトグラフィーによるグラム陰性菌エンドトキシンの溶液からの除去（Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography）」、J. Immunol. Meth. 61, 275-281）。
【０１６８】
実施例１１−ＬＰＳ攻撃したウシからの血液を、ポリミキシンＢを含む粒子の安定化流動床で体外吸着させることによる、ウシモデルにおけるエンドトキシン症の予防
この実験の目的は、本発明の体外吸着プロセスが、動物の循環血液からのＬＰＳを、臨床的症状が有意に減少する程度まで、除去し得ることを示すことである。
【０１６９】
しかしながら、この例は、本発明の「解毒」能力を、純粋なＬＰＳのボーラス注射に付される動物との関係において示すものであることを憶えておくべきである。これは、敗血症を発症している哺乳類の状況とはかなり異なっている場合があり、敗血症を発症している哺乳類においては、かわりにＬＰＳが血液循環に連続モードで入ると予想され、根底にある感染の症状およびそれと血流との関係に応じて、比較的低いレベルから開始すると考えられる。
【０１７０】
臨床的に健康で、体重が５００〜８００ｋｇである乳汁を出さないデンマークのホルスタイン種のウシを研究に含めている。これらの動物は、ＬＰＳ（大腸菌Ｏ５５：Ｂ５  ＬＰＳ、Sigma、L2880）１０００ｎｇを体重１ｋｇにつき、耳介中間静脈（vena auriculis intermedia）内または耳介尾静脈（v. auricularis caudalis）を通過して外頸静脈に至る耳介内側静脈内（v. auriculis medialis）のカテーテルを介して、静脈注射することにより攻撃される。そのような攻撃の後には通常、攻撃後最初の３〜２４時間以内に直腸温度および心拍数の上昇を含む顕著な宿主反応が見られるが（Tolboll, T. H.、２００２、「牛のエンドトキシン症（Bovine endotoxicosis）」、博士論文、Royal Veterinary Agricultural University、デンマーク）、エンドトキシン性ショックには至らない。
【０１７１】
前述のように、ポリミキシンＢで被覆された粒子の安定化流動床を含む静脈−静脈体外吸着回路をＬＰＳで攻撃された牛に適用することにより、この実験は、静脈注射の後、種々の時に、血液の循環からＬＰＳを除去する効果を示すことを意図している。このために、直腸温度、心拍数、呼吸数、および急性期タンパク反応を含む臨床的パラメータが、攻撃の後、１週間まで測定され、上述した体外法で処置したウシと処置していないウシとの間で比較されるであろう。また、ＬＰＳの投与量を増加させることによる臨床転帰に関する、この体外処置の効果もまた、研究されるであろう。
【０１７２】
結果は、ポリミキシンＢで被覆した粒子の安定化流動床を用いて連続的なプロセスで動物の血液の体外吸着法により処置したＬＰＳ攻撃したウシは、比較の処置していないウシよりも、有意により少ない、有意により深刻でない、また有意により長続きしない臨床的兆候を示すものと期待される。ＬＰＳ攻撃の後で幾分経過した後（例えば、ＬＰＳ攻撃後１２時間までの間に）、処置が適用されたとしても、処置は有効であるということもまた、期待される結果である。
【０１７３】
実施例１２−トル（Toll）様受容体４（ＴＬＲ４）の固定およびＴＬＲ４が結合した粒子の細菌性リポ多糖の固定のための使用
この実施例の目的は、ＴＬＲ−４結合吸着体をＬＰＳの結合のために使用することの実行性を示すことである。
【０１７４】
この実験のために用いられる吸着体は、高密度のジビニルスルホン結合アガロース／ステンレス鋼吸着体（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク）であり、これにはＴＬＲ４が結合している。
−ビーズ構成：ステンレス鋼粒子のコアを有する、エピクロロヒドリン架橋アガロース（４％ｗ／ｖ）（図７）
−ビーズ形状：主として球形
−直径：２０〜４０μｍ
−水和状態での平均の固有ビーズ密度：３．８ｇ／ｍｌ
−リガンド：３ｍｇ／ｍｌにてジビニルスルホンを介して結合したＴＬＲ４。結合（またはカップリング）は、各ＴＬＲ４の分子の結合がＴＬＲ４中の最小のナンバーの第一アミノ基を介して得られるように実施される。要約すると、粒子は、室温にて、ＴＬＲ４とともに、０．１Ｍカーボネート、０．５ＭＮａＣｌ中で、ｐＨ８．２、２０ｇ／ｍｌで、穏やかな撹拌を使用して、一晩インキュベーションすることにより、ＴＬＲ４と結合する。その後、粒子を同じ緩衝剤で洗浄し、遊離反応性ビニルスルホン基をエタノールアミン（１Ｍエタノールアミン、ｐＨ９．０、２時間、室温）でブロックしてから、ＰＢＳで洗浄する。
【０１７５】
処置：
大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来のＬＰＳを、Sigmaから入手し（code no. L2880）、milliQ水に溶解して１μｇ／ｍｌにし、澄んだ溶液を得る。それから、溶液を、上述のＴＬＲ４が結合した粒子を用いて、バッチ吸着プロセスで処理する。対照実験は、関連のないペプチドで誘導体化して、エタノールアミンでブロックした粒子を使用して実施する。穏やかに撹拌しながら２時間インキュベーションした後、吸着粒子をデカントにより溶液から分離し、溶液を分析のために回収する。粒子は続いて、ＰＢＳを用いたインキュベーション及びデカントにより洗浄し（３回）、各洗浄液を別々に収集する。それから処理前後のＬＰＳ溶液ならびに全ての洗浄溶液は、リムルス変形細胞溶解物試験（Limulus amebocyte lysate test）により、ＬＰＳに関して分析し、また、凍結乾燥し、サンプル緩衝剤に直接再溶解化した後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、その後、Tsai & Frash（１９８２、Anal. Biochem. 119, 115-119）のように、適当な酸化処理により銀染色する。
【０１７６】
結果は、ＴＬＲ４で被覆された粒子に曝されることによって、ＬＰＳは効率的に（０．１ｎｇ／ｍｌ未満に）除かれることを示すと期待され、対照粒子については全く違いが見られないであろうと考えられる。これは、リムルス変形細胞溶解物試験でエンドトキシン活性が存在しないこと、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてＬＰＳに関連する銀で染色されたバンドが存在しないことの両方によって示されると考えられる。粒子とＬＰＳの量との比を変化させる、類似のインキュベーションのシリーズにおいて、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５  ＬＰＳに対するＴＬＲ４誘導粒子の能力を決定することができ、それは、沈降した床５ｍｌにつきＬＰＳが１ｍｇを越えるという、高いものであろうと期待される。
【０１７７】
別のシリーズのインキュベーションにおいて、サルモネルラネズミチフス菌のＬＰＳおよびラフ（rough）型大腸菌（短鎖ＬＰＳ）のＬＰＳを含む種々のタイプのＬＰＳが試験され、結果はこれらのタイプのＬＰＳもまた効率的に且つ高い吸着力で、ＴＬＲ−４で被覆された粒子に結合するということを示すと考えられる。これらの実験の間、結合したＬＰＳの溶出および粒子の再利用もまた試みられるであろう。また、Issekutz（１９８３、「親和性クロマトグラフィーによるグラム陰性菌エンドトキシンの溶液からの除去（Removal of gram-negative endotoxin from solutions by affinity chromatography）」、J. Immunol. Meth. 61, 275-281）が説明している緩衝条件に類似する条件を用いて、洗剤で洗浄し、食塩水で念入りに洗浄することによって、粒子の再利用が可能であると考えられる。
【０１７８】
ＴＬＲ４結合粒子は実施例１０および１１で説明したように、全血中のＬＰＳの吸着のために用いることができ、また、ウシモデルにおけるエンドトキシン症の防止のために用いることができる。
【０１７９】
実施例１３−ＬＰＳ結合粒子の安定化流動床を、血液の生物マーカがある臨界値に達したときに作動するスイッチとともに配置することによる、エンドトキシン攻撃されたウシの処置のための体外吸着の利用
この実験の目的は、敗血症を起こしやすい動物を下記のコンポーネントから成る監視システムに置くことの実現可能性を示す。
１）動物の血液循環システム上に配置される選択した被検体の血中濃度を連続的に監視するデバイス。当該デバイスは、選択した被検体の血中濃度が予め設定した正常でないレベルに達したときに、スイッチを作動する（または開く）信号を送るであろう。
２）監視デバイスによって作動させることができるスイッチ
３）本発明の前述の安定化流動床であって、スイッチが作動したときに、血液循環と一致し、スイッチが作動していないときには、血液循環から切り離される安定化流動床。
【０１８０】
しかしながら、この例は、本発明の「解毒」能力を、純粋なＬＰＳのボーラス注射に付される動物との関係において示すものであることを憶えておくべきである。これは、敗血症を発症している哺乳類の状況とはかなり異なっている場合があり、敗血症を発症している哺乳類においては、かわりにＬＰＳが血液循環に連続モードで入ると予想され、根底にある感染の症状およびそれと血流との関係に応じて、比較的低いレベルから開始すると考えられる。
【０１８１】
臨床的に健康で、体重が５００〜８００ｋｇである乳汁を出さないデンマークのホルスタイン種のウシを研究に含めている。これらの動物は、ＬＰＳ（大腸菌Ｏ５５：Ｂ５  ＬＰＳ、Sigma、L2880）１０００ｎｇを体重１ｋｇにつき、耳介中間静脈（vena auriculis intermedia）内または耳介尾静脈（v. auriculis caudalis）を通過して外頸静脈に至る耳介内側静脈内（v. auricularis medialis）のカテーテルを介して、静脈注射することにより攻撃される。そのような攻撃の後には通常、攻撃後最初の３〜２４時間以内に直腸温度および心拍数の上昇を含む顕著な宿主反応が見られるが（Tolboll, T. H.、２００２、「牛のエンドトキシン症（Bovine endotoxicosis）」、博士論文、Royal Veterinary Agricultural University、デンマーク）、エンドトキシン性ショックには至らない。
【０１８２】
ＬＰＳの注入後まもなく、ウシは、ポリミキシンＢで被覆された粒子の安定化流動床を含む静脈−静脈体外吸着回路に、スイッチを介して繋がれる。このスイッチは、血液中のハプトグロビンの血清濃度の変化を検出する連続的な監視デバイスにより作動させられる。ウシは、上述したようにＬＰＳで攻撃される。
【０１８３】
実験は、スタンバイ体外吸着回路により、循環血液からＬＰＳを除去する効果を示すことを意図している。内腸温度、心拍数、呼吸数および急性期タンパク反応を含む臨床的なパラメータが、攻撃後、１週間まで測定され、上述した体外法で処置したウシと処置していないウシとの間で比較されるであろう。また、ＬＰＳの投与量を増加させることによる臨床転帰に関する、この体外処置の効果もまた、研究されるであろう。
【０１８４】
結果は、ポリミキシンＢで被覆した粒子の安定化流動床を用いて連続プロセスにて動物の血液のスタンバイ体外吸着により処置したＬＰＳ攻撃したウシは、比較の処置していないウシよりも、有意により少ない、有意により深刻でない、また有意により長続きしない臨床的兆候を示すものと期待される。この処置は、ＬＰＳ攻撃の後、定められた、より後の時間に（例えば、ＬＰＳ攻撃後１２時間後に）適用される処置よりも、より有効であるということもまた、期待される結果である。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、グラム陰性菌のリポ多糖の一般的な構造を示す。リピドＡにおいて、ジグザグの水平線は、脂肪酸を示し、典型的にはＣ１２〜Ｃ１６であり、エステルまたはアミドとして、２つのグルコサミニル残基に結合している。ＧｌｃＮ：グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｇｌｃ：グルコース、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｈｅｐ：ヘプトース、ＫＤＯ：２−ケト−３−デオキシオクトン酸、ＰＯ４２−：ホスフェート（典型的には、他の場所にて、コアの糖においても存在する）。Rietschelら、１９９３、生物活性に関する細菌性エンドトキシンの化学構造（The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity）、Immunobiology、１８７、１６９−１９０による。
【図２】図２は、ポリミシキンＢの一般的な構造を示す（Merck Index Vol. 13、エントリー７６５６による）。Ｄａｂ：ジアミノ酪酸、Ｔｈｒ：スレオニン、Ｐｈｅ：フェニルアラニン、Ｌｅｕ：ロイシン、ＲはＮ末端Ｄａｂのα−アミノ基に付着した脂肪酸である。遊離第一アミノ基が有する正電荷が示されている。矢印はデカペプチド鎖の方向を示す。
【図３】図３は、連続的な体外吸着の原理を示す。図において、連続的に血液を患者から受け取り、閉じる又は開くことができるバルブを介して、安定化流動床カラム「ｂ」に接続されている容器「ａ」が示されている。血流は、安定化流動床の底から、上向きの方向に適用され、それから、カラムの頂部から別のバルブを経由して、連続的に血液を患者に戻す容器「ｃ」に至る。「バルブ」は、連続的または断続的にカラムに血液を分配するポンプの形態であってよく、または独立したポンプ（図示せず）を使用してよい。
【図４】図４は、市販されている装置（アップフロント・クロマトグラフィー  Ａ／Ｓ、デンマーク、7010-0000  直径１．０ｃｍ、高さ５０ｃｍ）を用いた安定化流動床のカラムのセットアップを示す。装置は、流入流体のチューブ・コネクターを含むフットプレートにより適当な位置に保持された垂直なガラス製カラムを含む。さらに、ガラス製カラムには、流出流体コネクタがカラムの頂部に設けられている。（Ａ）は輸送コンテナ内の分解されたカラムを示し、（Ｂ）は組み立てられたカラムを示す。
【図５】図５は、ガラス粒子のコアがＤＡＢ（＋ビオチン）で着色され、着色されていない（−ビオチン）、ビオチンが結合した集塊粒子を示す。ガラス粒子のコアを有する集塊吸着粒子は、誘導体化されていないか（Ａ）、リガンドとしてのビオチンで誘導体化されている（Ｂ）。両方のタイプの粒子は、実施例２で説明するように、アビジン−ペルオキシダーゼを混合した、ＥＤＴＡで安定化したヒトの血液の安定化流動床クロマトグラフィーに用いられた。クロマトグラフィーおよびサンプルの洗浄の後に、各タイプの吸着体粒子は、ＤＡＢ−着色に付されて、粒子の表面でペルオキシダーゼ活性の存在を示した。ペルオキシダーゼ活性は、ビオチンが結合した粒子に関して見られるように、粒子の茶色（黒白の図において、暗くなっている）の着色をもたらし、誘導体化されていない粒子については着色を生じさせなかった。
【図６Ａ】図６ａは、集塊吸着粒子（ステンレス鋼のコアを有するアガロースの粒子）であって、誘導体化されていないもの（Ａ）またはウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を３ｍｇ／ｍｌにて結合させたもの（ＢおよびＣ）を示す。粒子は、Ｃｙ３で標識された精製したモノクローナルマウス抗体とＰＢＳ（図４ａ）にて接触させ、あるいは、バッチ・インキュベーションにて、ヘパリンで凝血防止したウシの全血（図４ｂ）に混入した後、ＰＢＳで洗浄した。粒子は、５７０ｎｍにて（Ａ＋Ｂ）、また通常の光（Ｃ）で、蛍光発光が調べられた。ＰＢＳおよび血液において、粒子中のＣｙ−３蛍光性分子の存在は、抗体が結合した粒子に関しては、明るい赤色の発光によって示され、Ｃｙ３−イムノグロビンで誘導体化されていない粒子については、ずっと小さい度合いの発光によって示された。
【図６Ｂ】図６ｂは、集塊吸着粒子（ステンレス鋼のコアを有するアガロースの粒子）であって、誘導体化されていないもの（Ａ）またはウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体を３ｍｇ／ｍｌにて結合させたもの（ＢおよびＣ）を示す。粒子は、Ｃｙ３で標識された精製したモノクローナルマウス抗体とＰＢＳ（図４ａ）にて接触させ、あるいは、バッチ・インキュベーションにて、ヘパリンで凝血防止したウシの全血（図４ｂ）に混入した後、ＰＢＳで洗浄した。粒子は、５７０ｎｍにて（Ａ＋Ｂ）、また通常の光（Ｃ）で、蛍光発光が調べられた。ＰＢＳおよび血液において、粒子中のＣｙ−３蛍光性分子の存在は、抗体が結合した粒子に関しては、明るい赤色の発光によって示され、Ｃｙ３−イムノグロビンで誘導体化されていない粒子については、ずっと小さい度合いの発光によって示された。
【図７】図７は、ステンレス鋼／アガロースＰＥＩ粒子を用いて、バッチ処理で、ＥＤＴＡで安定化したヒトの全血をインキュベートした後に、血液の細胞の幾らかが粒子（Ａ）の外側表面に結合し、その他は結合していない（Ｂ）ことを示す（図７Ａ）。より接近した観察において、（図７Ｂ、両矢印は、約２５μｍを示す）ステンレス鋼コアの粒子（Ａ）、アガロースコーティング層（Ｂ）、および未結合の血液細胞（Ｃ）が、結合した血液細胞（Ｄ）と同様に観察される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月7日(2004.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、当該粒子が当該グラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられ、
当該哺乳類から得られる血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理することを含む、方法。
【請求項２】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を誘発する原因となる有害物質を除去する体外吸着方法であって、当該体外吸着方法が吸着カラム・アッセンブリにより実施され、
当該吸着カラム・アッセンブリがカラムおよび粒子の形態の吸着媒体を含み、
当該粒子の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該粒子が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる方法であって、
前記哺乳類から得られる血液を、吸着カラム・アッセンブリに、粒子の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理することを含む、方法。
【請求項３】
前記処理した血液を同じ哺乳類に再度注入することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記吸着カラム・アッセンブリが流動床吸着に適合させられ、特に安定化流動床吸着に適合させられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記粒子がなくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳類がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類でグラム陰性菌により引き起こされる敗血症の体外吸着による連続的な治療のための治療用吸着カラム・アッセンブリの製造のための吸着媒体の使用であって、当該吸着カラム・アッセンブリが、ｉ）哺乳類から連続的に血液を得るための容器、ii）吸着媒体を含むカラム、およびiii）血液を患者に連続的に戻す別の容器を含み、
当該吸着媒体の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該吸着媒体がグラム陰性菌のＬＰＳ部分に対して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられ、
当該カラムが、得られた血液を、吸着カラム・アッセンブリに、吸着媒体の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理するものである、
吸着媒体の使用。
【請求項１４】
哺乳類でグラム陰性またはグラム陽性菌により引き起こされる敗血症を体外吸着による治療のための治療用吸着カラム・アッセンブリの製造のための吸着媒体の使用であって、当該吸着カラム・アッセンブリが、（ａ）哺乳類から連続的に血液を得るための容器、（ｂ）カラムおよび吸着媒体、および（ｃ）患者に連続的に血液を戻す別の容器を含み、
当該吸着媒体の沈降体積がカラムの容積の８０％以下であり、
当該吸着媒体が、
ｉ）グラム陰性菌のＬＰＳ部分、および／または
ii）グラム陽性菌もしくはグラム陽性菌に由来する有害物質
に関して特異的な親和性を有する親和性特異的な分子を有することにより特徴づけられる使用であって、
当該カラムが、得られる血液を、吸着カラム・アッセンブリに、吸着媒体の流動床が形成されるような流量で通過させることにより、当該血液を処理するものである、
吸着媒体の使用。
【請求項１５】
カラム・アッセンブリを通過する血液の流量が、流動床の膨張比が少なくとも１．３であり、例えば少なくとも１．５となるようなものである、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の前に、物質が哺乳類の血流に最初に注入される開始工程が先行する、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
哺乳類がヒトである請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記粒子がなくとも１．３ｇ／ｍｌの密度、および５〜１０００μｍの範囲内にある平均直径、例えば、少なくとも１．５ｇ／ｍｌの密度および５〜３００μｍの範囲内にある平均直径、好ましくは少なくとも１．８ｇ／ｍｌの密度および５〜１５０μｍの範囲内にある平均直径、最も好ましくは２．５ｇ／ｍｌよりも大きい密度および５〜７５μｍの範囲内にある平均直径を有する、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
安定化流動床が、血液物質が予め設定された値に達すると作動しうるスイッチと共に配置され、当該血液物質がデバイスにより監視され、当該デバイスが血液循環に合わせて配置され、当該デバイスが当該値に達したときに作動信号をスイッチに送る、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
親和性特異的な分子が、イムノグロブリン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、レセプタ・タンパク質、抗生物質、およびレクチンから成る群から選択される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
２以上の異なる親和性特異的な分子が吸着媒体内で粒子上に存在している、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
親和性特異的な分子がイムノグロブリンから選択される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
親和性特異的な分子がポリミキシンＢである、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２４】
親和性特異的な分子が、トル様受容体、最も好ましくはＴＬＲ４またはそれの結合フラグメントもしくはそれの多重結合配列、ＣＤ１４、ＭＤ２、ＴＬＲ２およびＬＢＰ、ならびにそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
粒子の沈降体積が、カラムの容積の７０％以下であり、例えば、カラムの容積の６０％以下であり、例えば、カラムの容積の５０％以下である、請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
流量が粒子の安定化流動床が形成されるような流量である、請求項１３〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
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