(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、アデノシンＡ１及びＡ３受容体を特異的に阻害する化合物、Ａ３アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療するためのこれらの化合物の使用であって、治療的有効量の前記化合物を前記患者に投与することを備えた使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造を有する化合物：
【化１】
2005529062.tif 000071
式中、
ｍは、０、１、２、又は３であり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のイミダゾール又はピラゾールであり（但し、Ｒ２がアルキル鎖に付着している点はＮではない）、
Ｒ５は、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル、アリール、又はアルキルアリール部分であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）、ＮＨ２、又はＮＨ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）である。
【請求項２】
Ｒ７が塩素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
構造：
【化２】
2005529062.tif 000072
を有する、請求項１の化合物。
【請求項４】
構造：
【化３】
2005529062.tif 000073
を有する、請求項１の化合物。
【請求項５】
構造：
【化４】
2005529062.tif 000074
を有する化合物。
【請求項６】
構造：
【化５】
2005529062.tif 000075
を有する、請求項１の化合物。
【請求項７】
構造：
【化６】
2005529062.tif 000076
を有する化合物。
【請求項８】
構造：
【化７】
2005529062.tif 000077
を有する化合物。
【請求項９】
Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の請求項１、５、又は７の化合物を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が抗利尿、心筋虚血、気管支収縮、喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、黄斑変性症、呼吸系疾患、眼の炎症であるか、又は前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、方法。
【請求項１０】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が抗利尿、心筋虚血、又は気管支収縮である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が呼吸器系疾患である、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記呼吸系疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が眼の炎症である、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が、喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、又は黄斑変性症である、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記疾病が喘息である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記疾病が緑内障である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、プロスタグランジン及びプラスタグランジン受容体アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、５−ＨＴアゴニスト、血管新生阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、レニン阻害剤、カンナビノイド受容体アゴニスト、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）、ソマトスタチンアゴニスト、グルココルチコイドアンタゴニスト、肥満細胞脱顆粒阻害剤、αアドレナリン作動性受容体遮断薬、α２アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２模倣薬、プロテインキナーゼ阻害剤、プロスタグランジンＦ誘導体、プロスタグランジン２αアンタゴニスト、ドーパミンＤ１及び５−ＨＴ２アゴニスト、一酸化窒素放出物質、５−ＨＴ２アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、イノシン、ドーパミンＤ２受容体及びα２アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト及びＤ２受容体アゴニスト、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、１−（３−ヒドロキシー２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン（ＨＰＭＰＣ）及び関連類縁体及びプロドラッグ、甲状腺ホルモン受容体リガンド、ムスカリン性Ｍ１アゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、混合作用式イオンチャネル遮断薬、βアドレナリン受容体アンタゴニストとＰＧＦ２αアゴニストの組合せ、グアニル酸シクラーゼ活性化因子、ニトロ血管拡張剤、エンドセリン受容体モジュレーター、エタクリン酸、他のフェノキシ酢酸類縁体、アクチン破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬及び神経保護物質からなる群から選択される１以上の化合物を前記患者に治療的有効量投与することをさらに備えた、請求項１７の方法。
【請求項１９】
βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、及びプロスタグランジン受容体アゴニストからなる群から選択される１以上の化合物を前記患者に治療的有効量投与することをさらに備えた、請求項１７の方法。
【請求項２０】
治療的有効量のプロスタグランジンアゴニスト、β２アゴニスト、又はムスカリン性アンタゴニストを前記患者に投与することをさらに備えた、請求項１７の方法。
【請求項２１】
Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の請求項８の化合物を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が呼吸系疾患、記憶障害、鬱血性心不全、腎不全、心不整脈、呼吸上皮、伝達物質放出、鎮静、血管収縮、徐脈、負の心臓収縮及び伝達速度、又は気管支収縮である、方法。
【請求項２２】
Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の請求項８の化合物を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が抗利尿、心臓の低酸素状態、心筋虚血、高血圧、炎症であり、又は呼吸系上皮の下部に存在する平滑筋の収縮、肥満細胞の脱顆粒、若しくは好酸球の活動を伴う、方法。
【請求項２３】
前記呼吸系疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記疾患が喘息である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾患が鬱血性心不全である、請求項２１の方法。
【請求項２６】
患者に利尿を誘導する方法であって、利尿に有効な量の請求項８の化合物を投与することにより、前記患者に利尿を誘導することを備えた、方法。
【請求項２７】
ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つを前記患者することにより、前記患者の喘息を治療することをさらに備えた、請求項２４の方法。
【請求項２８】
Ａ３アデノシン受容体が異常な刺激を受けている細胞中のＡ３アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１、５、又は７の化合物と接触させて、前記Ａ３アデノシン受容体の活性を阻害することを備えた、方法。
【請求項２９】
Ａ１アデノシン受容体が異常な刺激を受けている細胞中のＡ１アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を請求項８の化合物と接触させて、前記Ａ１アデノシン受容体の活性を阻害することを備えた、方法。
【請求項３０】
インビボでヒト患者によりＡ３アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物へと代謝される請求項１、５、又は７の化合物のプロドラッグであって、
アルコール若しくはカルボン酸基のエステル（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アルコール基のアセタール若しくはケタール（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アミン基のＮ−マンニッヒ塩基若しくはイミン（このような基が前記化合物中に存在する場合）、又は
カルボニル基のシッフ塩基、オキシム、アセタール、エノールエステル、オキサゾリジン、若しくはチアゾリジン（このような基が前記化合物中に存在する場合）である、プロドラッグ。
【請求項３１】
インビボでヒト患者によりＡ１アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物へと代謝される請求項８の化合物のプロドラッグであって、
アルコール若しくはカルボン酸基のエステル
（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アルコール基のアセタール若しくはケタール（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アミン基のＮ−マンニッヒ塩基若しくはイミン（このような基が前記化合物中に存在する場合）、又は、
カルボニル基のシッフ塩基、オキシム、アセタール、エノールエステル、オキサゾリジン、若しくはチアゾリジン（このような基が前記化合物中に存在する場合）である、プロドラッグ。
【請求項３２】
前記プロドラッグが水溶性である、請求項３０又は３１のプロドラッグ。
【請求項３３】
エステラーゼにより触媒される加水分解によって前記プロドラッグがインビボで代謝される、請求項３０又は３１のプロドラッグ。
【請求項３４】
請求項３０又は３１のプロドラッグと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項８の化合物と、薬学的に許容される担体と、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つとを含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項１、５、７、又は８の化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３７】
前記薬学的組成物が眼周囲、眼球後、又は眼球内注射製剤である、請求項３４又は３６の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記薬学的組成物が全身性製剤である、請求項３４又は３６の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記薬学的組成物が手術用灌流液である、請求項３４又は３６の薬学的組成物。
【請求項４０】
Ａ３アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療するためのパッケージされた薬学的組成物であって、
（ａ）治療的有効量の請求項１、５又は７の化合物が入った容器と、
（ｂ）患者の前記疾病を治療するための前記化合物の使用についての指示書と、
を備える、パッケージされた薬学的組成物。
【請求項４１】
Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療するためのパッケージされた薬学的組成物であって、
（ａ）治療的有効量の請求項８の化合物が入った容器と、
（ｂ）患者の前記疾病を治療するための前記化合物の使用についての指示書と、
を備える、パッケージされた薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項１、５、又は７の化合物を含む組成物を製造する方法であって、前記化合物を適切な担体と混合することを備えた方法。
【請求項４３】
請求項１、５、又は７の化合物の薬学的に許容される塩。
【請求項４４】
前記薬学的に許容される塩が、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸塩、リン酸塩、及びメシル酸塩からなる群から選択される陰イオンを含有する、請求項４３の薬学的に許容される塩。
【請求項４５】
Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための請求項１、５、又は７の化合物の使用であって、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が抗利尿、心筋虚血、気管支収縮、喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、黄斑変性症、呼吸系疾患、眼の炎症であるか、又は前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、使用。
【請求項４６】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が抗利尿、心筋虚血、又は気管支収縮である、請求項４５の使用。
【請求項４７】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が呼吸器系疾患である、請求項４５の使用。
【請求項４８】
前記呼吸系疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である、請求項４７の使用。
【請求項４９】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が眼の炎症である、請求項４５の使用。
【請求項５０】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が、喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、又は黄斑変性症である、請求項４５の使用。
【請求項５１】
前記疾病が喘息である、請求項５０の使用。
【請求項５２】
前記疾病が緑内障である、請求項５０の使用。
【請求項５３】
前記医薬が、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、プロスタグランジン及びプラスタグランジン受容体アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、５−ＨＴアゴニスト、血管新生阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、レニン阻害剤、カンナビノイド受容体アゴニスト、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）、ソマトスタチンアゴニスト、グルココルチコイドアンタゴニスト、肥満細胞脱顆粒阻害剤、αアドレナリン作動性受容体遮断薬、α２アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２模倣薬、プロテインキナーゼ阻害剤、プロスタグランジンＦ誘導体、プロスタグランジン２αアンタゴニスト、ドーパミンＤ１及び５−ＨＴ２アゴニスト、一酸化窒素放出物質、５−ＨＴ２アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、イノシン、ドーパミンＤ２受容体及びα２アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト及びＤ２受容体アゴニスト、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、１−（３−ヒドロキシー２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン（ＨＰＭＰＣ）及び関連類縁体及びプロドラッグ、甲状腺ホルモン受容体リガンド、ムスカリン性Ｍ１アゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、混合作用式イオンチャネル遮断薬、βアドレナリン受容体アンタゴニストとＰＧＦ２αアゴニストの組合せ、グアニル酸シクラーゼ活性化因子、ニトロ血管拡張剤、エンドセリン受容体モジュレーター、エタクリン酸、他のフェノキシ酢酸類縁体、アクチン破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬及び神経保護物質からなる群から選択される１以上の化合物をさらに含む、請求項５２の使用。
【請求項５４】
前記医薬が、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、及びプロスタグランジン受容体アゴニストからなる群から選択される１以上の化合物をさらに備えた、請求項５２の使用。
【請求項５５】
前記医薬が、プロスタグランジンアゴニスト、β２アゴニスト、又はムスカリン性アンタゴニストをさらに備えた、請求項５２の使用。
【請求項５６】
前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、請求項４５の使用。
【請求項５７】
Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための請求項８の化合物の使用であって、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が呼吸系疾患、記憶障害、鬱血性心不全、腎不全、心不整脈、呼吸上皮、伝達物質放出、鎮静、血管収縮、徐脈、負の心臓収縮及び伝達速度、又は気管支収縮である、使用。
【請求項５８】
Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための請求項８の化合物の使用であって、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が抗利尿、心臓の低酸素状態、心筋虚血、高血圧、炎症であり、又は呼吸上皮の下部に存在する平滑筋の収縮、肥満細胞の脱顆粒、若しくは好酸球の活動を伴う、使用。
【請求項５９】
前記呼吸系疾患が喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である、請求項５７の使用。
【請求項６０】
前記呼吸系疾患が喘息である、請求項５９の使用。
【請求項６１】
患者に利尿を誘導するのに利用できる医薬を製造するための請求項８の化合物の使用。
【請求項６２】
前記医薬が、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つをさらに備える、請求項６０の使用。
【請求項６３】
前記Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病が鬱血性心不全である、請求項５７の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１１月３０日に出願された米国仮出願第６０／３３７，２７４号及び２００１年１１月３０日に出願された米国仮出願第６０／３３５，２７３号の利益を主張するものであって、これらの内容は、その全体が参考文献として援用される。
【０００２】
本出願を通じて、様々な文献が著者と日付によって参照される。これらの参考文献の完全な引用は、本明細書を通じて見出されるであろう。本明細書に記載され、権利が請求されている本発明がなされた時点において、当業者に公知であった技術水準をより完全に記述するために、これらの文献の開示内容全体を本出願に参考文献として援用する。
【発明の背景】
【０００３】
アデノシンは、特に心血管及び神経系内において数多くの生理活性を示す、広範に分布するモジュレーターである。アデノシンの効果は、特異的な細胞表面の受容体タンパク質によって媒介されているものと思われる。アデノシンは、鎮静作用の誘導、血管拡張、心拍数と収縮性の抑制、血小板の凝集性の阻害、糖新生の刺激、脂質分解の阻害等、多岐にわたる生理機能をモジュレートしている。アデニレートシクラーゼに対する効果に加えて、アデノシンは、カリウムチャネルを開口させること、カルシウムチャネルを通じた流動を減少させること、受容体を介した機序を通じてホスホイノシチドの代謝回転を阻害又は刺激することが示されている（例えば、「C.E. Muller and B. Stein “Adenosine Receptor Antagonists: Structures and Potential Therapeutic Applications,” Current Pharmaceutical Design, 2:501(1996)」及び「C.E. Muller “A1-Adenosine Receptor Antagonists,” Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419(1997)」を参照）。
【０００４】
アデノシン受容体は、プリン受容体のスーパーファミリーに属しており、これは、現在、Ｐ１（アデノシン）及びＰ２受容体（ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びその他のヌクレオチド）に細分されている。これまでに、ヒトを含む様々な種から、ヌクレオシドアデノシンに対する４つの受容体サブタイプがクローニングされている。２つの受容体サブタイプ（Ａ１とＡ２ａ）は、アデノシンに対してｎＭ域の親和性を示すが、他の２つの公知のサブタイプＡ２ｂとＡ３は低親和性の受容体であり、アデノシンに対する親和性は低μＭ域にある。Ａ１及びＡ３アデノシン受容体が活性化されると、アデニレートシクラーゼ活性の阻害が引き起こされるのに対して、Ａ２ａ及びＡ２ｂの活性化は、アデニレートシクラーゼの刺激を引き起こすことができる。
【０００５】
認知疾患、腎不全、心不整脈を治療するために、Ａ１アンタゴニストが幾つか開発されている。Ａ２ａアンタゴニストは、パーキンソン病の患者に対して有益である可能性が示唆されている。特に、局所投与が可能であると考えられることから、アデノシン受容体アンタゴニストは、アレルギー性の炎症や喘息の治療に有益である可能性がある。入手可能な情報によれば（例えば、「Nyce & Metzger“DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Model” Nature(1997)385:721-5」）、かかる病態生理の面で、Ａ１アンタゴニストは、呼吸器系上皮の下部に存在する平滑筋の収縮を遮断し得るが、Ａ２ｂ又はＡ３受容体アンタゴニストは、肥満細胞の脱顆粒を遮断し、ヒスタミンその他の炎症媒介物質の放出を抑制し得る。Ａ２ｂ受容体は、消化管全域、特に、大腸と腸上皮中に見出されている。Ａ２ｂ受容体は、ｃＡＭＰ応答を媒介することが示唆されている（Ｓｔｒｏｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：２３８７−９４）。
【０００６】
アデノシン受容体は、ウシ、ブタ、サル、ラット、モルモット、マウス、ウサギ、及びヒトを含む様々な哺乳類種の網膜上に存在することも示されている（「Blazynski et al.,Discrete Distributions of Adenosine Receptors in Mammalian Retina,Journal of Neurochemistry,volume 54,pages 648-655(1990)」、「Woods et al.,Characterization of Adenosine A1-Receptor Binding Sites in Bovine Retinal Membranes,Experimental Eye Research, volume 53, pages 325-331(1991)」、及び「Braas et al., Endogenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Proceedings of the National Academy of Science, volume 84, pages 3906-3910(1987)」参照）。最近、Ｗｉｌｌｉａｍｓは、培養されたヒト網膜細胞株中にアデノシン輸送部位を観察したことを報告した（Williams et al.,Nucleoside Transport Sites in a Cultured Human Retinal Cell Line Established By SV-40 T Antigen Gene, Current Eye Research, volume 13, pages 109-118(1994)）。
【０００７】
アデノシンの取り込みを制御する化合物は、網膜及び視神経頭の損傷を治療するための治療剤となり得ることが以前から示唆されている。Ｓｈａｄｅに対する米国特許第５，７８０，４５０号の中で、Ｓｈａｄｅは眼疾患を治療するためにアデノシン取り込み阻害剤を使用することについて論述している。Ｓｈａｄｅは、具体的なＡ３受容体阻害剤の使用を開示していない。米国特許第５，７８０，４５０号の全内容を、参考文献として、本明細書に援用する。
【０００８】
薬理学的なツールとして、さらなるアデノシン受容体アンタゴニストが必要とされているとともに、上述した病状及び／又は症状に対する薬物として大いに興味が持たれる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、式：
【化８】
2005529062.tif 000002
【００１０】
（式中、
ｍは、０、１、２、又は３であり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のイミダゾール又はピラゾールであり（但し、Ｒ２がアルキル鎖に付着している点はＮではない）、
Ｒ５は、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル、アリール、又はアルキルアリール部分であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子（例えば、塩素、フッ素、又は臭素）、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）、ＮＨ２、又はＮＨ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）である）
を有する化合物を提供する。
【００１１】
本発明は、構造：
【化９】
2005529062.tif 000003
【００１２】
を有する化合物も提供する。
【００１３】
本発明は、治療的有効量の上記何れかの化合物を投与することによって、Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病を治療する方法も提供する。
【００１４】
本発明は、構造：
【化１０】
2005529062.tif 000004
【００１５】
を有する化合物も提供する。
【００１６】
本発明は、治療的有効量の上記化合物を投与することによって、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病を治療する方法も提供する。
【００１７】
本発明は、上記何れかの化合物のプロドラッグも提供する。
【詳細な説明】
【００１８】
ここで、本発明の特徴及びその他の詳細をさらに具体的に記載し、特許請求の範囲に適示する。本発明の具体的な実施形態は、説明のために示されているものであって、本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本発明の本質的特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において利用できる。
【００１９】
本発明は、哺乳類中のＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態を治療する方法に関する。該方法には、前記哺乳類中のＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態が治療されるように、治療的有効量（以下に記載）のＮ−６置換７−デアザプリンを前記哺乳類に投与することが含まれる。
【００２０】
「Ｎ−６置換７−デアザプリン反応性の状態（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）」という語には、以下に記した本発明のＮ−６置換７−デアザプリンによる治療に対して反応性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）を示すことを特徴とする病状（ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｅ）又は症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）が含まれるものとし、例えば、前記治療には、本発明のＮ−６置換７−デアザプリンによって達せられる、前記状態の少なくとも１つの症候（ｓｙｍｐｔｏｎ）又は効果（ｅｆｆｅｃｔ）を顕著に減退させることが含まれる。典型的には、かかる状態には、宿主内でのアデノシンの増加が伴い、宿主は、毒素の放出、炎症、昏睡、水分貯留、体重増加又は体重減少、膵炎、気腫、関節リウマチ、骨関節炎、多臓器不全、小児及び成人の呼吸窮迫症候群、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、眼疾患、胃腸疾患、皮膚腫瘍の発癌、免疫不全、及び喘息を含む生理的な症候を経験することが多いが、これらに限定されるものではない（例えば、C.E. Muller and B. Stein “Adenosine Receptor Antagonists:Structures and Potential Therapeutic Applications,” Current Pharmaceutical Design, 2:501(1996)、C.E.Muller “A1-Adenosine Receptor Antagonists,” Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419(1997)、及びI.Feoktistove,R.Polosa,S.T.Holgate and I.Biaggioni“Adenosine A2B receptors:a novel therapeutic target in asthma?” TiPS 19;148(1998)）。前記効果には、発熱、息切れ、吐き気、下痢、脱力感、頭痛、最悪の場合には死亡等の症候が伴うことが多いが、これらに限定されるものではない。１つの実施形態では、Ｎ−６置換７−デアザプリンに反応性の状態には、細胞中のカルシウム濃度及び／又はＰＬＣ（ホスホリパーゼＣ）の活性化がモジュレートされるように、アデノシン受容体（例えば、Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ３等）の刺激によって媒介される病状が含まれる。好ましい実施形態では、Ｎ−６置換７−デアザプリン反応性の状態にはアデノシン受容体が関連しており、例えば、Ｎ−６置換７−デアザプリンはアンタゴニストとして作用する。本発明の化合物によって治療できる適切な反応性状態の例は、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）効果、心血管効果、腎臓効果、呼吸器効果、免疫学的効果、胃腸効果、及び代謝効果を含む生物学的効果を媒介するアデノシン受容体サブタイプである。被験者中のアデノシンの相対量によっては、以下に列記した効果が付随する場合がある。すなわち、アデノシンレベルが増大すると、一定の効果、例えば、望ましくない生理的応答、例えば、喘息発作を誘発することがある。
【００２１】
ＣＮＳ効果には、伝達物質の放出の減少（Ａ１）、沈静（Ａ１）、運動活性の減少（Ａ２ａ）、抗痙攣活性、化学受容体の刺激（Ａ２）、及び痛覚過敏が含まれる。本発明の化合物の治療用途には、痴呆、アルツハイマー病の治療、記憶の増強が含まれる。
【００２２】
心血管効果には、血管拡張（Ａ２ａ）、（Ａ２ｂ）、及び（Ａ３）、血管収縮（Ａ１）、徐脈（Ａ１）、血小板阻害（Ａ２ａ）、負の心臓収縮（ｉｎｏｔｒｏｐｙ）と伝導速度（ｄｒｏｍｏｔｒｏｐｙ）（Ａ１）、不整脈、頻脈、及び血管新生が含まれる。本発明の化合物の治療用途には、例えば、虚血によって誘発される心機能障害の予防及び強心剤、心筋組織の保護と心臓機能の回復が含まれる。
【００２３】
腎臓効果には、ＧＦＲの減少（Ａ１）、メサンギウム細胞の収縮（Ａ１）、抗利尿（Ａ１）、及びレニン放出の阻害（Ａ１）が含まれる。本発明の化合物の適切な治療用途には、利尿薬、ナトリウム排泄増加剤、カリウム保持剤、急性腎不全の腎臓保護／予防、降圧剤、抗浮腫剤及び抗腎炎剤としての本発明の化合物の使用が含まれる。
【００２４】
呼吸器系効果には、気管支拡張（Ａ２）、気管支収縮（Ａ１）、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、粘膜分泌、及び呼吸抑制（Ａ２）が含まれる。本発明の化合物の適切な治療用途には、抗喘息用途、移植後の肺疾患及び呼吸器系疾患の治療が含まれる。
【００２５】
免疫学的効果には、免疫抑制（Ａ２）、好中球の化学走性（Ａ１）、好中球によるスーパーオキシドの生成（Ａ２ａ）、肥満細胞の脱顆粒（Ａ２ｂとＡ３）が含まれる。アンタゴニストの治療用途には、アレルギー性及び非アレルギー性炎症、例えば、ヒスタミンその他の炎症媒介物質の放出が含まれる。
【００２６】
胃腸効果には、酸分泌の阻害（Ａ１）が含まれる。治療用途には、逆流性及び潰瘍性の症状が含まれ得る。胃腸効果には、結腸、腸管、及び下痢性疾患、例えば、腸の炎症に伴う下痢性疾患（Ａ２ｂ）も含まれる。
【００２７】
眼疾患には、網膜及び視神経頭の傷害及び外傷に関連する疾患（Ａ３）が含まれる。好ましい実施形態では、眼疾患は緑内障である。
【００２８】
本発明の化合物の他の治療用途には、肥満の治療（脂肪分解特性）、高血圧、うつ病の治療、鎮痛剤、抗不安薬、抗てんかん剤、及び下剤（例えば、下痢を引き起こさずに消化管運動を発生させる）が含まれる
「病状」という用語には、望ましくないレベルのアデノシン、アデニリルシクラーゼ活性、アデノシン受容体の異常な刺激及び／又はｃＡＭＰの増加に伴う生理活性の増加によって引き起こされる症状又はこれらに伴う症状が含まれるものとする。ある実施形態では、前記病状は、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、気管支炎、腎疾患、胃腸疾患、又は眼疾患である。さらなる例には、慢性気管支炎及び嚢胞性線維症が含まれる。炎症性疾患の適切な例には、非リンパ球性白血病、心筋虚血、狭心症、梗塞、脳血管虚血、間欠性跛行、末梢血行障害（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、静脈性高血圧、静脈瘤、静脈性潰瘍、及び動脈硬化が含まれる。再潅流状態の異常には、例えば、再建外科、血栓溶解療法、又は血管形成術等のあらゆる術後の外傷が含まれる。
【００２９】
本発明は、本発明の化合物のうち１つとプロスタグランジンアゴニスト、β２アゴニスト、又はムスカリン（ｍｕｎｉｓｃｒｉｎｉｃ）アンタゴニストとを備えた、緑内障の併用療法も提供する。
【００３０】
「Ｎ−６置換７−デアザプリン反応性の状態の治療」又は「Ｎ−６置換７−デアザプリン反応性の状態を治療する」という語には、哺乳類中の生理的症候が有意に減退し又は最小化され得るような、上述の病状又は症状の変化が含まれるものとする。この語には、アデノシンの量の異常を伴う生理的症候又は効果を調節し、抑制し、又は阻害することも含まれる。ある好ましい実施形態では、病状又は症状の調節は、前記病状又は症状が根絶されるように行われる。別の好ましい実施形態では、異常なレベルのアデノシン受容体活性は調節されるが、他の生理システム及びパラメータは影響を受けないように、前記調節は選択的である。
【００３１】
「Ｎ−６置換７−デアザプリン」という用語は、本分野において周知であり、式Ｉ：
【化１１】
2005529062.tif 000005
【００３２】
を有する化合物が含まれるものとする。
【００３３】
「Ｎ−置換７−デアザプリン」には、薬学的に許容されるその塩が含まれ、ある実施形態では、本明細書に記載されている一定のＮ−６置換プリンも含まれる。
【００３４】
ある実施形態では、Ｎ−６置換７−デアザプリンは、Ｎ−６ベンジル置換又はＮ−６フェニルエチル置換されていない。別の実施形態では、Ｒ４は、ベンジル又はフェニルエチル置換されていない。好ましい実施形態では、Ｒ１とＲ２は、ともに水素原子ではない。さらに別の好ましい実施形態では、Ｒ３は、水素原子ではない。
【００３５】
以下に記載されている「治療的有効量」のＮ−６置換７−デアザプリンという語は、哺乳類内で所期の役割（例えば、哺乳類内のＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態又は病状を治療する）を果たすのに必要な又は十分な治療用化合物の量である。治療用化合物の有効量は、哺乳類中に既に存在する原因因子の量、前記哺乳類の年齢、性別、及び体重、並びに本発明の治療用化合物が前記哺乳類内のＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態に作用を及ぼす能力等の要因に応じて変動し得る。当業者であれば、上述の要因を調べ、過度の実験を行わずに前記治療用化合物の有効量を決定できるであろう。インビトロ又はインビボアッセイを用いて、以下に記載されている治療用化合物の「有効量」を決定することも可能である。当業者であれば、上述したアッセイで又は治療的処置として使用するための前記治療用化合物の適切な量を選択できるであろう。
【００３６】
治療的有効量は、治療されるＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態又は症状に伴う少なくとも１つの症候又は効果を、未処置の患者に比べて少なくとも約２０％（より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％）減退させることが好ましい。このような症候及び／又は効果の減退を測定するためのアッセイは、当業者であれば設計することができる。このようなパラメータを測定できる本分野で認知された任意のアッセイも、本発明の一部に含まれるものとする。例えば、喘息が治療すべき状態であれば、本分野で認知された技術を用いて、患者の肺から排出される空気の容量を治療の前後に測定し、容量の増加を測定することができる。同様に、炎症が治療すべき状態であれば、炎症を起こしている面積の減少を測定するために、本分野で認知された技術を用いて、炎症を起こしている面積を治療の前後に測定することができる。
【００３７】
「細胞」という用語には、原核細胞と真核細胞の両方が含まれる。
【００３８】
「動物」という用語には、アデノシン受容体を有する全ての生物又はＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態となり得る全ての生物が含まれる。動物の例には、酵母、哺乳類、爬虫類、及び鳥類が含まれる。「動物」には、トランスジェニック動物も含まれる。
【００３９】
「哺乳類」という用語は、本分野において認知されており、動物、より好ましくは、温血動物、最も好ましくは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及びヒトを含むものとする。Ｎ−６置換７−デアザプリン反応性の状態、炎症、気腫、喘息、中枢神経系症状、又は急性呼吸窮迫症候群となり得る哺乳類は、例えば、本発明の一部に含まれる。
【００４０】
別の側面では、本発明は、哺乳類中のアデノシン受容体をモジュレートする方法であって、前記哺乳類中の前記アデノシン受容体のモジュレーションが起こるように、治療的有効量のＮ−６置換７−デアザプリンを前記哺乳類に投与することによって、哺乳類中のアデノシン受容体をモジュレートする方法にも関する。適切なアデノシン受容体には、Ａ１、Ａ２、又はＡ３のファミリーが含まれる。好ましい実施形態では、前記Ｎ−６置換７−デアザプリンは、アデノシン受容体アンタゴニストである。
【００４１】
「アデノシン受容体をモジュレートする」という語は、ある化合物がアデノシン受容体と相互作用して、アデノシン受容体と関連し又はアデノシン受容体のモジュレーションから生じるその後のカスケード効果と関連する生理活性の増加、減少、又は異常を引き起こす場合を含むものとする。アデノシン受容体と関連する生理活性には、鎮静の誘導、血管拡張、心拍数と心臓収縮能の抑制、血小板凝集の阻害、糖新生の刺激、脂質分解の阻害、カリウムチャネルの開口、カルシウムチャネルの流動減少等が含まれる。
【００４２】
「モジュレートする」、「モジュレートしている」、「モジュレーション」という用語は、例えば、本発明の治療法において、アデノシン受容体の異常な刺激に伴って生じる、望ましくない生理活性の増加を抑制し、消滅させ、又は阻害することを含むものとする。別の実施形態では、「モジュレートする」という用語には、拮抗効果、例えば、アデノシン受容体の過剰刺激によって生じるアレルギー及びアレルギー性炎症の媒介物質の活性又は産生を減退させることが含まれる。例えば、本発明の治療用デアザプリンは、アデノシン受容体と相互作用して、例えば、アデニレートシクラーゼ活性を阻害することができる。
【００４３】
「異常なアデノシン受容体活性を特徴とする症状」という語には、アデノシン受容体の異常な刺激に関連する疾病、疾患、又は症状が含まれるものとし、ここで、前記受容体の刺激は、前記疾病、疾患、又は症状と直接又は間接に関連する一連の生化学的及び／又は生理的現象を引き起こす。かかるアデノシン受容体の刺激は、前記疾病、疾患、又は症状の唯一の原因である必要はなく、治療すべき前記疾病、疾患、又は症状と関連するのが通例である前記症候の一部を引き起こせば足りる。受容体の異常な刺激は、唯一の要因であってもよいし、少なくとも１つのその他の因子が治療される状態に関与してもよい。症状の例には、炎症、胃腸疾患、アデノシン受容体活性の増加が存在することによって引き起こされる症候等の上述した病状が含まれる。好ましい例には、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、浮腫、気管支炎、胃腸疾患、及び緑内障に伴う症候が含まれる。
【００４４】
「異常なアデノシン受容体活性を特徴とする症状を治療する、又は異常なアデノシン受容体活性を特徴とする症状の治療」という語には、前記症状に通例関連する少なくとも１つの症候を緩和又は減退させることが含まれるものとする。前記治療には、２以上の症候を緩和又は減退させることも含まれる。好ましくは、前記治療は、前記症状に関連する症候を治癒する（例えば、実質的に消滅させる）。
【００４５】
本発明の化合物は、１９９８年３月９日に出願され、１９９９年７月８日に公開されたＷＯ９９／３３８１５号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４５９５号に記載されている水溶性プロドラッグを含んでもよい。ＷＯ９９／３３８１５号の内容全体は、本明細書に参考文献として、明示的に取り込まれるものとする。水溶性プロドラッグは、（例えば、エステラーゼによって触媒される加水分解によって）インビボで代謝されて、活性な薬物となる。プロドラッグとなり得るものの例には、例えば、Ｒ２が−ＯＣ（Ｏ）（Ｚ）ＮＨ２で置換されたシクロアルキルであるデアザプリンが含まれる（ここで、Ｚは、天然又は非天然のアミノ酸若しくはその類縁体、α、β、γ、若しくはωアミノ酸、又はジペプチドの側鎖である）。好ましいアミノ酸側鎖には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、α−メチルアラニン、アミノシクロプロパンカルボン酸、アゼチジン−２−カルボン酸、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、アラニン−アラニン、又はグリシン−アラニンが含まれる。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、本発明のデアザプリンは、例えば、エステラーゼによって触媒される加水分解によって）インビボで代謝されて、活性な薬物となることができる水溶性プロドラッグである。
【００４７】
「アルキル」という用語は、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換されたシクロアルキル基、及びシクロアルキル置換されたアルキル基等の飽和脂肪族基のラジカルを表す。さらに、アルキルという用語には、酸素、窒素、硫黄、又はリン原子をさらに含み、炭化水素骨格の炭素が１以上置換されることがあるアルキル基も含まれる（例えば、酸素、窒素、硫黄、又はリン原子）。好ましい実施形態では、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０以下（例えば、直鎖の場合Ｃ１−Ｃ３０、分枝鎖の場合Ｃ３−Ｃ３０）、より好ましくは２０以下の炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、その環構造中に４−１０個の炭素原子、より好ましくは、環構造中に５、６、又は７個の炭素を有する。
【００４８】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される「アルキル」という用語は、「置換されていないアルキル」と「置換されているアルキル」の両方を含むものとし、後者は、炭化水素骨格の１以上の炭素上に存在する水素を置換する置換基を有するアルキル部分を意味する。このような置換基には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスヒナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、複素環、アルキルアリール、又は芳香族若しくは複素環式芳香族部分が含まれ得る。適切な場合には、炭化水素鎖上の置換された部分自体を置換できることも、当業者であれば理解できるであろう。シクロアルキルは、例えば、上記置換基によってさらに置換することができる。「アルキルアリール」部分とは、アリールで置換されたアルキル（例えば、フェニルメチル（ベンジル））である。「アルキル」という用語には、上記アルキルと同様の長さで且つ置換を有することもあるが、それぞれ、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含有する不飽和脂肪族基も含まれる。
【００４９】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、０乃至４個の複素原子を含むことがある５員環及び６員環の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、及びピリミジン等を含むアリール基のラジカルを意味する。アリール基には、ナフチル、キノリル、インドリル等の多環式縮合芳香族基も含まれる。環構造中に複素原子を有するアリール基は、「アリール複素環」、「複素アリール」、又は「複素芳香族」と称されることもある。前記複素環は、上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナート、ホスヒナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、複素環、アルキルアリール、又は芳香族若しくは複素環式芳香族部分によって、環上の１以上の位置を置換することができる。アリール基は、芳香族でない脂環式又は複素環式の環と縮合し又は架橋されて、多環（例えば、テトラリン）を形成してもよい。
【００５０】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、上記アルキルと同様の長さで且つ置換を有することもあるが、それぞれ、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含有する不飽和脂肪族基を表す。例えば、本発明では、シアノ及びプロパルギル基が想定される。
【００５１】
炭素の数について特に断りがなければ、本明細書で使用される「低級アルキル」とは、１乃至１０個、より好ましくは１乃至６個、さらに好ましくは１乃至３個の炭素原子をその骨格構造中に有する、上述したようなアルキルを意味する。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」も、類似の長さの鎖を有する。
【００５２】
「アルコキシアルキル」、「ポリアミノアルキル」、及び「チオアルコキシアルキル」という用語は、酸素、窒素、又は硫黄原子をさらに含み、炭化水素骨格の炭素が一以上置換された（例えば、酸素、窒素、又は硫黄原子）上述のアルキル基を表す。
【００５３】
「多環」又は「多環基（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ  ｒａｄｉｃａｌ）」という用語は、その中に存在する２以上の炭素原子が２つの隣接する環に共通している、２環式以上の環を有する基（例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又は複素環）を表し、例えば、環は「縮合環」である。隣接していない原子を通じて連結されている環は、「架橋された」環と呼ばれる。多環の各環は、上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナート、ホスヒナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、サルフェート、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、複素環、アルキル、アルキルアリール、又は芳香族若しくは複素環式芳香族部分によって置換することができる。
【００５４】
本明細書で使用する「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素を除く任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、及びリンである。
【００５５】
「アミノ酸」という用語には、タンパク質中に見出されるグリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン等の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸が含まれる。アミノ酸類縁体には、延長若しくは短縮された側鎖又は適切な官能基を有する変異型側鎖を有するアミノ酸が含まれる。アミノ酸の構造が立体異性の形態を採り得る場合、アミノ酸には、アミノ酸のＤ立体異性体とＬ立体異性体が含まれる。「ジペプチド」という用語には、互いに連結された２以上のアミノ酸が含まれる。ジペプチドは、ペプチド結合を介して連結された２つのアミノ酸であることが好ましい。特に好ましいジペプチドには、例えば、アラニン−アラニン及びグリシン−アラニンが含まれる。
【００５６】
本発明の前記化合物の中には、構造中に不斉炭素原子を含むものがあり、このため、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、ジアステレオマーの混合物及び個別のジアステレオマーとして存在することに留意しなければならない。これらの化合物のこのような異性体形態は全て、本発明に明示的に含まれる。各不斉炭素は、Ｒ又はＳ立体配置をとり得る。従って、特に明記されていなければ、このような不斉性から生じる異性体（例えば、全ての鏡像異性体及びジアステレオマー）は本発明の範囲に属することを理解しなければならない。このような異性体は、古典的な分離技術や立体化学的に制御した合成によって、実質的に純粋な形態で取得することができる。
【００５７】
本発明は、さらに、哺乳類のＮ−６置換７−デアザプリン反応性の状態、例えば、呼吸器系疾患（例えば、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、及びアレルギー性鼻炎）、腎疾患、胃腸疾患、及び眼疾患を治療するための薬学的組成物に関する。該薬学的組成物は、治療的有効量のＮ−６置換７−デアザプリンと薬学的に許容される担体とを含む。以下に記載されているデアザプリンは全て、治療的処置のために加えられていることを理解しなければならない。さらに、本発明のデアザプリンは、単独で使用することも可能であり、又は本発明の他のデアザプリンと組み合わせて、若しくは、例えば抗生物質、抗炎症剤、若しくは抗癌剤等のさらなる治療用化合物と組み合わせて使用することも可能であることを理解しなければならない。
【００５８】
「抗生物質」という用語は、本分野において周知であり、微生物を増殖させることによって製造される物質やそれらの合成誘導体であって、病原体の増殖を阻止又は阻害し、病原体に対して選択的に毒性を示すが、感染した宿主患者に対しては最小限の有害な効果をもたらすか又は全く有害な効果をもたらさない物質が含まれるものとする。抗生物質の適切な例には、アミノグリコシド系、セファロスポリン系、クロラムフェニコール系、フシジン酸、マクロライド系、ペニシリン系、ポリミキシン系、テトラサイクリン系、及びストレプトマイシン系の主要なクラスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
「抗炎症剤」という用語は、本分野において周知であり、炎症の原因因子と直接拮抗することなく、身体の機構に作用するグルココルチコイド類、アスピリン、イブプロフェン、ＮＳＡＩＤＳ等の物質を含むものとする。
【００６０】
「抗癌剤」という用語には、本分野において周知であり、好ましくは、他の生理機能に悪影響を与えずに、がん細胞の増殖を減少させ、根絶し、又は抑制する因子が含まれるものとする。代表的な例には、シスプラチンとシクロホスファミドが含まれる。
【００６１】
本発明の化合物を薬剤としてヒトや哺乳類に投与するときには、そのまま与えてもよいし、又は、例えば０．１乃至９９．５％（より好ましくは、０．５乃至９０％）の活性成分を薬学的に許容される担体とともに含有する薬学的組成物として与えもよい。
【００６２】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入物質等の薬学的に許容される物質、組成物、又はビヒクルであって、所期の機能を発揮することができるように、本発明の化合物を患者の中に又は患者に運搬又は輸送することに関わっている物質、組成物、又はビヒクルを意味する。典型的には、このような化合物は、ある臓器すなわち身体の一部から別の臓器すなわち身体の一部へ運搬又は輸送される。各担体は、製剤の他の成分と適合的（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）であり且つ患者に有害でないという意味で、「許容される（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として利用できる物質の例には、ラクトース、グルコース、スクロース等の糖、トウモロコシのデンプンやジャガイモのデンプン等のデンプン、セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース等のセルロースの誘導体、粉末化したトラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオバターやサポジトリーワックス等の賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油、大豆油等の油、プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マニトール、及びポリエチレングリコール等のポリオール、オレイン酸エチルやラウリル酸エチル等のエステル、寒天、水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張の生理食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝溶液、薬学的製剤中に用いられる毒性のないその他の適合的物質等が含まれる。
【００６３】
上述のように、本化合物のうち幾つかの実施形態では、アミノ又はアルキルアミノ等の塩基性官能基を含有することができ、このため、薬学的に許容される酸とともに薬学的に許容される塩を形成することが可能である。この点に関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒性である無機及び有機酸付加塩を表す。これらの塩は、本発明の化合物の最終単離及び精製の間にインシチュで調製することもできるし、あるいは、遊離塩基型の精製された本発明の化合物を適切な有機又は無機酸と別個に反応させ、形成された塩を単離することによって調製することもできる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリル硫酸塩等が含まれる。（例えば、Berge et al.,(1977)“Pharmaceutical Salts”, J.Pharm.Sci.66:1-19）。
【００６４】
別の事例では、本発明の前記化合物は、１以上の酸性官能基を含有してもよく、このため、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することが可能である。これらの例において、「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒性である無機及び有機塩基付加塩を表す。同様に、これらの塩は、前記化合物の最終単離及び精製の間にインシチュで調製することもできるし、あるいは、遊離酸型の精製された前記化合物を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩、又は重炭酸塩、アンモニア、又は薬学的に許容される有機第一級アミン、第二級アミン、若しくは第三級アミンなどの適切な塩基と別個に反応させることによって調製することもできる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩等が含まれる。塩基付加塩の形成に有用である代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が含まれる。
【００６５】
「薬学的に許容されるエステル」という用語は、本発明の化合物の比較的無毒性であるエステル化された産物を表す。これらのエステルは、前記化合物の最終単離及び精製の間にインシチュで調製することもできるし、あるいは、遊離酸型又は水酸基の精製された化合物を、適切なエステル化剤と別個に反応させることによって調製することもできる。カルボン酸は、触媒の存在下でアルコールと処理することによって、エステルに転換することができる。水酸基を含有する誘導体は、ハロゲン化アルカノイル等のエステル化剤を用いた処理によって、エステルに転換することができる。さらに、本用語には、生理的条件下で溶媒和することができる低級炭化水素基（例えば、アルキルエステル、メチル、エチル、及びプロピルエステル）が含まれるものとする（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）。
【００６６】
本発明は、さらに、インビボで、本発明の治療用化合物に転換されるプロドラッグの使用を想定している（例えば、R.B. Silverman,1992,“The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”,Academic Press,Chapter 8参照）。このようなプロドラッグは、前記治療用化合物の生体分布を変化させ（例えば、プロテアーゼの反応部位に通常進入しない化合物を可能とするために）又は薬物動態を変化させるために使用することができる。例えば、カルボン酸基は、例えばメチル基又はエチル基とエステル化させて、エステルを得ることができる。エステルを患者に投与すると、酵素的又は非酵素的に、還元又は加水分解によりエステルが切断されて、陰イオン基が生じる。切断されて中間化合物を生じ、続いて分解により活性な化合物を与える部分（例えば、アシルオキシメチルエステル）により、陰イオン基をエステル化することができる。別の実施形態では、前記プロドラッグは、還元型の硫酸塩又はスルホン酸塩（例えば、チオール）であり、これは、インビボで酸化されて治療用化合物となる。さらに、陰イオン部分はエステル化されて、インビボで能動的に輸送される基又は標的臓器によって選択的に取り込まれる基になることができる。以下で担体部分について記載されているように、エステルは、前記治療用部分を特定の反応部位に特異的に誘導することが可能となるように選択することができる。
【００６７】
様々な官能基への担体の連結
ａ．アルコールとカルボン酸  アルコール又はカルボン酸官能基を含有する薬物における最も一般的なプロドラッグの形態がエステルであることには、複数の理由が存在する。第一に、エステラーゼは至る所に存在しているので、代謝によって薬物を再生することが容易である。また、実質的にあらゆる程度の親水性又は親油性を有するエステル誘導体を調製することが可能である。最後に、電気的及び立体的な因子を適切に操作することによって、様々な安定性のエステルを得ることができる。従って、プロドラッグアプローチに必要とされる広範な課題に対応するために、多数のエステルプロドラッグを調製することができる。
【００６８】
アルコール含有薬物は、脂肪族又は芳香族カルボン酸を用いてアシル化し、水溶性を減少させる（親油性を増加させる）ことができ、あるいは、アミノ基又はさらなるカルボン酸基を含有するカルボン酸を用いてアシル化し、水溶性を増加させることができる。リン酸又は硫酸エステルへの転換によっても、水溶性は増大する。これらのアプローチを用いることによって、広範な溶解度を達成することができ、これにより、薬物の吸収及び分布特性に影響が及ぼされるであろう。これらの誘導体は、剤形（すなわち、錠剤の形態で用いられるか、水溶液中で用いられるか）にも重要な影響を与えることがある。かかるプロドラッグアプローチの使用に伴う問題の１つは、エステルが、内在性のエステラーゼ、スルファターゼ、又はホスファターゼのあまり優れた基質ではなく、十分早く加水分解され得ない場合があるということである。しかし、このようなことが生じた場合には、別のエステルを試してみることができる。加水分解速度を加速させるための別のアプローチは、電子吸引基（塩基加水分解機序が関わる場合）又は電子供与基（酸加水分解機序が重要な場合）をエステルのカルボン酸側に付着させてもよいであろう。コハク酸エステルを用いて、分子内触媒による加水分解の速度を加速させてもよい。エステルの反応性が高すぎる場合には、加水分解に対して立体的な障害を引き起こす置換基を付加することもできる。アルコール含有薬物は、胃腸管の酸性溶媒中で迅速に加水分解されるように、対応するアセタール又はケタールに変換することもできる。
【００６９】
カルボン酸含有薬物もエステル化することができる。誘導化された薬物の反応性は、構造を適切に操作することによって調整できる。エステルの加水分解速度を遅くするのが望ましい場合には、長鎖脂肪族エステル又は立体的障害のあるエステルを用いることができる。加水分解が遅すぎるのであれば、エステルのアルコール部分上に電子吸引基を付加することによって、速度を増大させることができる。カルボン酸のｐＫａは、コリンエステル又はアミノエステルに転換することによって上昇させることができる。
【００７０】
ｂ．アミン  アミンのＮ−アシル化によりアミドプロドラッグを与えることは、概して、代謝的な加水分解に対するアミドの安定性の故に、一般的には使用されていない。一般に、塩基性が低いアミンの活性化されたアミド又はアミノ酸のアミドは、酵素的な切断をより受けやすい。一般にカルバメートは安定性が高すぎるが、フェニルカルバメート（ＲＮＨＣＯ２Ｐｈ）は、血漿酵素によって迅速に切断されるので、プロドラッグとして使用することができる。
【００７１】
アミンのｐＫａ値は、Ｎ−マンニッヒ塩基に変換することによって、概ね３単位低下させることができる。これにより、アミンの塩基性が低下し、生理的Ｐｈにおいて、プロドラッグ分子のほとんどはプロトン化されなくなり、親油性が増加する。例えば、ベンズアミドと充血除去剤であるフェニルプロパノールアミンから得られるＮ−マンニッヒ塩基のオクタノールとリン酸緩衝液ｐＨ７．４間での分配係数は、元のアミンよりほぼ１００倍大きい。しかし、Ｎ−マンニッヒ塩基の加水分解の速度は、アミドを保有する基に依存する。サリチルアミドとスクシンイミドは、ベンズアミドより加水分解を受けやすい。
【００７２】
アミンのｐＫａ値を下げることにより、親油性をさらに増大させるための別のアプローチは、アミンをイミンに転換することである（シッフ塩基）。但し、イミンは、多くの場合、水溶液中では不安定である。抗痙攣薬のプロガバイド（８．３）は、γ−アミノ酪酸（重要な抑制性神経伝達物質）のプロドラッグ型である。８．３という親油性のために、本化合物は、血液脳関門を横切ることができ、一旦脳内に入ると加水分解されてγ−アミノ酪酸になる。
【００７３】
ｃ．カルボニル化合物  アルデヒト及びケトンの最も重要なプロドラッグ形態は、シッフ塩基、オキシム、アセタール（ケタール）、エノールエステル、オキサゾリジン、及びチアゾリジンである（表８．３）。生体で可逆化され得る本官能基の誘導体は、Ｂｕｎｄｇａａｒｄによって、さらに詳しく記述されている。
【００７４】
湿潤剤、乳化剤、ラウリル硫酸ナトリウムやステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤の他、着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味料、香料、防腐剤、抗酸化剤を前記組成物中に加えてもよい。
【００７５】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤、パルミチル酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等の油溶性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が含まれる。
【００７６】
本発明の製剤には、経口、経鼻、局所、経皮、口腔、舌下、直腸、膣、及び／又は非経口投与に適した製剤が含まれる。前記製剤は、単位投薬形態として与えることが便利である場合があり、薬学の分野において周知である任意の方法によって調製することができる。単一の投薬形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的には、治療効果をもたらす前記化合物の量であろう。一般的に、１００％のうち、この量は、活性成分の約１％乃至約９９％、好ましくは約５％乃至約７０％、最も好ましくは約１０％乃至約３０％の範囲であろう。
【００７７】
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明の化合物を前記担体、及び、必要に応じて１以上の副成分と会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）させる工程を含む。一般には、本発明の化合物を液状担体、若しくは細分した固体担体、又は両者と均一且つ十分に会合させた後に、必要であれば、生成物を成形することによって、前記製剤を調製する。
【００７８】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、トローチ剤（味付きの基剤、通常は、スクロースとアカシア又はトラガカントを用いる）、粉末、顆粒の形態とし、又は水性若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として、又は水中油若しくは油中水液体エマルジョンとして、又はエリキシル剤又はシロップとして、又はトローチとして（ゼラチンとグリセリン、又はスクロースとアカシア等の不活性な基剤を用いる）、及び／又はうがい液等とすることができ、それぞれ、所定量の本発明の化合物を活性成分として含有する。本発明の化合物は、大型丸剤、舐剤、又はペーストとして投与することもできる。
【００７９】
経口投与用の本発明の固形剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒等）では、前記活性成分は、クエン酸ナトリウム又は第二リン酸カルシウム等の１以上の薬学的に許容される担体、及び／又は、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又はケイ酸等の充填剤若しくは増量剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及び／又はアカシア等の結合剤、グリセロール等の保湿剤、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ若しくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、パラフィン等の溶解遅延剤、第４級アンモニウム化合物等の吸収加速剤、例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等の湿潤剤、カオリン及びベントナイト粘土等の吸収剤、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物等の潤滑剤、並びに着色剤のうち任意のものと混合される。カプセル、錠剤、及び丸薬の場合には、前記薬学的組成物は、緩衝剤を含んでもよい。同種の固体組成物は、ラクトース又は乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒ）や高分子量のポリエチレングリコール等の賦形剤を用いて、軟ゼラチンカプセルや硬ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することもできる。
【００８０】
錠剤は、必要に応じて１以上の副成分を用いて、圧縮又は成形によって製造することができる。圧縮された錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性な希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプン又は架橋されたカルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて調製することができる。成形された錠剤は、適切な機械の中で、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の前記化合物の混合物を成形することによって作製することができる。
【００８１】
錠剤その他の固体剤形（糖衣錠、カプセル、丸薬、及び顆粒等）の本発明の薬学的組成物には、必要に応じて、刻み目を入れるか、製薬の分野で周知の腸溶コーティング及びその他のコーティング等のコーティングと殻（ｓｈｅｌｌ）を用いて調製してもよい。それらは、例えば、所望の放出特性を与える様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又は小球体を用いて、その中に存在する活性成分がゆっくり又は制御放出されるように調合してもよい。それらは、例えば、細菌を捕獲するフィルター中をろ過することにより、又は滅菌水中に溶かすことができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を加えることによって、又は使用直前に他の滅菌注射可能溶媒を加えることによって滅菌してもよい。これらの組成物は、必要に応じて、不透明化剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有することもでき、必要に応じて、遅発式に、胃腸管の一部に前記活性成分のみを又は前記活性成分を優先的に放出する組成物であり得る。使用可能な包埋組成物の例には、ポリマー物質やワックスが含まれる。前記活性成分は、それが適切な場合には、上記した賦形剤を１以上有するマイクロカプセル化形態とすることもできる。本発明の化合物を経口投与するための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤が含まれる。前記活性成分に加えて、前記液体剤形は、例えば、水又はその他の溶媒等、本分野で一般的に使用される不活性な希釈剤、可溶化剤及びエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物等の乳化剤を含有することができる。
【００８２】
不活性な希釈剤に加え、前記経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、着香料、着色剤、香料及び防腐剤等の佐剤を含むこともできる。
【００８３】
前記活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、及びトラガカント、並びにこれらの混合物等の懸濁剤を含有してもよい。
【００８４】
直腸又は膣投与用の本発明の薬学的組成物の製剤は、座剤として与えることができ、これは、一以上の本発明の化合物を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、サポジトリーワックス又はサリチル酸塩を含む一以上の適切な非刺激性賦形剤又は担体と混合することによって調製することができ、室温では固体であるが、体温では液体となるので、直腸又は膣腔内で溶けて、活性な化合物を放出する。
【００８５】
膣への投与に適した本発明の製剤には、本分野において適切であることが知られたこのような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレー製剤も含まれる。
【００８６】
本発明の化合物を局所又は経皮投与するための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、吸入剤が含まれる。前記活性な化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、及び任意の防腐剤、緩衝剤、又は必要とされる場合がある噴射剤と混合することができる。
【００８７】
軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、本発明の活性な化合物に加えて、動物や植物脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、又はそれらの混合物等の賦形剤を含有することができる。
【００８８】
粉末及びスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有することができる。スプレーは、さらに、クロロフルオロ炭化水素や揮発性不飽和炭化水素（ブタンやプロパン等）等の常用噴射剤を含有することもできる。
【００８９】
経皮パッチには、本発明の化合物を制御しながら身体に送達できるというさらなる利点がある。このような剤形は、適切な溶媒中に前記化合物を溶解又は分配させることによって作製することができる。皮膚を横切る前記化合物の流動を増加させるために、吸収増強剤を使用することもできる。このような流動の速度は、速度調節膜を与えることによって、又はポリマーマトリックス若しくはゲル中に活性な前記化合物を分散させることによって調節することができる。
【００９０】
眼用製剤、眼用軟膏、粉末、溶液等も、本発明の範囲に属するものとして想定されている。好ましくは、前記薬学的調製物は、眼用製剤である（例えば、眼周囲、眼球後、若しくは眼球内注射製剤、全身性製剤、又は手術用灌流液）。
【００９１】
本発明の眼用製剤は、１以上のデアザプリンと薬学的に許容されるビヒクルとを含むことができる。様々なタイプのビヒクルを使用することができる。ビヒクルは、一般的には、性質が水性であろう。製剤の具体例に基づき、また、罹病した眼に１乃至２滴の溶液を滴下させて、かかる組成物を患者が容易に投与できるため、一般には、水溶液が好ましい。しかし、本発明のデアザプリンは、懸濁液、粘性若しくは半粘性ゲル又はその他のタイプの固形若しくは半固形組成物等、これ以外タイプの組成物中にも容易に取り込ませることができる。本発明の眼用組成物は、緩衝液、防腐剤、両親溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）、粘性増加剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）等のその他の様々な成分を含むこともできる。
【００９２】
保存条件下でのｐＨの変動を防ぐために、適切な緩衝系（例えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、又はホウ酸ナトリウム）を加えてもよい。
【００９３】
眼用製品は、複数回分をパッケージングするのが通例である。このため、使用時の微生物汚染を防ぐために、防腐剤が必要とされる。適切な防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、又は当業者に公知であるその他の物質などがある。このような防腐剤は、典型的には、０．００１乃至１．０％重量／容量（「％ｗ／ｖ」）のレベルで用いられる。
【００９４】
本発明のデアザプリンが、眼内手術処置の間に投与される場合（眼球後又は眼周囲注入、及び眼内灌流又は注入などによる）には、平衡塩類灌流溶液をビヒクルとして使用することが最も好ましい。ＢＳＳ（登録商標）  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ及びＢＳＳ  Ｐｌｕｓ（登録商標）  Sterile Intraocular Irrigating Solution(Alcon Laboratories,Inc.,Fort Worth,Texas,USA)は、生理的に平衡化された眼内灌流溶液の例である。後者のタイプの溶液は、米国特許第４，５５０，０２２号（Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．）に記載されている（その内容全体を、参考文献として本明細書に援用する）。眼球後（ｒｅｔｒｏｂｕｌｂａｒ）及び眼周囲（ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ）注入は、当業者に公知であり、例えば、「Ophthalmic Surgery: Principles of Practice,Ed.,G.L.Spaeth.W.B.Sanders Co.,Philadelphia,Pa.,U.S.A.,pages85-87(1990)」等の多数の文献に記載されている。
【００９５】
上記のように、細胞レベルで網膜及び視神経頭組織の損傷を予防し又は減少させるためにデアザプリンを用いることは、本発明の実施形態の特に重要な側面である。治療可能と考えられる眼の症状には、網膜症、黄斑変性症、眼虚血、緑内障、虚血性再灌流傷害、光化学傷害、眼の手術に伴う傷害等の眼組織への傷害、特に、光への曝露又は外科用機器による網膜又は視神経頭への傷害に伴う損傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。眼の手術後に硝子体又は結膜下に注入する等、目の手術の補助剤として用いてもよい。前記化合物は、一時的な症状の急性治療に用いてもよいし、あるいは、特に変性疾患の症例において慢性的に投与してもよい。前記化合物は、特に、眼の手術若しくは非侵襲的な眼の処置、又はその他の種類の手術に先立って、予防的に用いることもできる。
【００９６】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、本発明の１以上の化合物とともに、薬学的に許容される等張の滅菌水溶液若しくは非水溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョン、又は使用直前に注射可能な滅菌溶液若しくは分散液に戻すことができる滅菌粉末を含み、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、前記製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質、又は懸濁剤若しくは濃縮剤を含有してもよい。
【００９７】
本発明の薬学的組成物中に用いることができる適切な水性及び非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが含まれる。例えば、レシチン等のコーティング剤を用いることによって、分散液の場合に必要とされる粒子サイズを維持することによって、界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。
【００９８】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等の佐剤を含有してもよい。様々な抗菌物質及び抗真菌物質、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることによって、微生物の働きを抑えることが可能となるであろう。前記組成物中に糖、塩化ナトリウム等の等張剤を加えることも望ましいであろう。さらに、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチン等の吸収を遅らせる物質を加えることによって、注射可能な薬剤の形態を長期に吸収させることが可能となるであろう。
【００９９】
ある種のケースでは、薬物の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶性物質又は非結晶性物質の液体懸濁物を用いることによって達成することができる。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は結晶のサイズと結晶構造の型に依存することになろう。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の吸収は、油ビヒクル中に前記薬物を溶解又は懸濁させることによって遅らせることができる。
【０１００】
注射可能な持効性製剤は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中で前記化合物の微小カプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率、用いるポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）とポリ（無水物）が含まれる。注射可能な持効性製剤は、身体組織に適合的なリポソーム又はマイクロエマルジョン中に薬物を閉じ込めることによっても調製される。
【０１０１】
本発明の調製物は、経口、非経口、局所、又は直腸から与えることができる。本発明の調製物は、もちろん、各投与経路に適した形態によって与えられる。例えば、本発明の調製物は、錠剤又はカプセルの形態で、注射、吸入、目薬、軟膏、坐剤等によって、注射、注入、又は吸入による投与、ローション又は軟膏により局所に、坐剤により直腸に投与される。経口投与が好ましい。
【０１０２】
本明細書で用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という用語は、経腸及び局所投与以外の投与様式（通常、注射による）を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、関節包内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、胸骨内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
本明細書で使用する「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」、「末梢に投与する」という用語は、化合物、薬物、その他の物質（中枢神経系に直接入るものを除く）が、患者の身体に入り、代謝その他の類似プロセスを受けるように、化合物、薬物、その他の物質（中枢神経系に直接入るものを除く）を投与すること（例えば、皮下投与）を意味する。
【０１０４】
これらの化合物は、経口、経鼻（例えば、スプレーによる）、直腸、膣内、非経口、大槽内、口腔及び舌下を含む局所（粉末、軟膏、又は点滴によって）等の任意の適切な投与経路によって、治療のためにヒト及び他の動物に投与することができる。
【０１０５】
選択した投与経路にかかわらず、本発明の化合物（適切な水和物の形態で使用することができる）及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の慣用的な法によって、薬学的に許容される剤形に調合される。
【０１０６】
患者に対して有害でなく、患者、組成、投与様式について望ましい治療反応を達するのに有効な活性成分の量を得るために、本発明の前記薬学的組成物中に存在する活性成分の実際の投薬レベルは、変動させることができる。
【０１０７】
選択される投薬レベルは、用いている本発明の化合物、又はそのエステル、塩、又はアミドの活性、投与経路、投与時間、用いた化合物の排出速度、治療期間、用いている前記化合物と併用しているその他の薬物、化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、症状、治療を受けている患者の一般的な健康状態と既往歴、及び医学分野で周知の同様の要因等の様々な要因に依存するであろう。
【０１０８】
本分野における通常の知識を有する医師又は獣医師であれば、必要とされる有効量の薬学的組成物を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルから、前記薬学的組成物中に用いる本発明の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることができる。
【０１０９】
一般に、本発明の化合物の適切な一日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量の前記化合物であろう。このような有効用量は、一般的に、上記の要因に依存するものと思われる。一般に、本発明の化合物を患者の静脈内及び皮下に投与する量は、表記の鎮痛効果を与えるために用いる場合、ｋｇ体重・一日当り約０．０００１ｍｇ乃至約２００ｍｇ、より好ましくはｋｇ・日当り約０．０１乃至約１５０ｍｇ、さらに好ましくはｋｇ・日当り約０．２乃至約１４０ｍｇの範囲であろう。
【０１１０】
所望であれば、活性な化合物の一日の有効投薬量は、必要に応じて単位剤形として、一日を通じて適切な間隔を置き、２、３、４、５、６以上の投薬量に分割して別々に投与してもよい。
【０１１１】
本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、前記化合物を薬学的組成物として投与することが好ましい。
【０１１２】
本発明は、哺乳類内のＮ−６置換７デアザプリン反応性の状態（例えば、アデノシン受容体活性の望ましくない増加）を治療するためのパッケージされた薬学的組成物にも関する。該パッケージされた薬学的組成物は、治療的有効量の少なくとも１つの上記デアザプリンが入った容器と、前記哺乳類内の前記デアザプリン反応性の状態を治療するためのデアザプリンの使用についての指示書とを含む。
【０１１３】
本発明は、式（ＸＩ）：
【化１２】
2005529062.tif 000006
【０１１４】
（式中、
ｍは、０、１、２、又は３であり、
Ｒ２は、置換もしくは非置換のイミダゾール又はピラゾールであり（但し、Ｒ２がアルキル鎖に付着している点はＮではない）、
Ｒ５は、水素原子、又は置換もしくは非置換のアルキル、アリール、又はアルキルアリール部分であり、
Ｒ７は、ハロゲン原子（例えば、塩素、フッ素、又は臭素）、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＯＨ、Ｏ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）、ＮＨ２、又はＮＨ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４）である）
を有する化合物にも関する。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態では、前記化合物は構造：
【化１３】
2005529062.tif 000007
【０１１６】
を有する。
【０１１７】
本発明は、構造：
【化１４】
2005529062.tif 000008
【０１１８】
を有する化合物も提供する。
【０１１９】
本発明は、構造：
【化１５】
2005529062.tif 000009
【０１２０】
を有する化合物も提供する。
【０１２１】
本発明は、構造：
【化１６】
2005529062.tif 000010
【０１２２】
を有する化合物も提供する。
【０１２３】
本発明は、構造：
【化１７】
2005529062.tif 000011
【０１２４】
を有する化合物も提供する。
【０１２５】
本発明は、構造：
【化１８】
2005529062.tif 000012
【０１２６】
を有する化合物も提供する。
【０１２７】
本発明は、構造：
【化１９】
2005529062.tif 000013
【０１２８】
を有する化合物も提供する。
【０１２９】
本発明は、構造：
【化２０】
2005529062.tif 000014
【０１３０】
を有する化合物も提供する。
【０１３１】
本発明は、構造：
【化２１】
2005529062.tif 000015
【０１３２】
を有する化合物も提供する。
【０１３３】
本発明は、構造：
【化２２】
2005529062.tif 000016
【０１３４】
を有する化合物も提供する。
【０１３５】
本発明は、構造：
【化２３】
2005529062.tif 000017
【０１３６】
を有する化合物も提供する。
【０１３７】
本発明は、構造：
【化２４】
2005529062.tif 000018
【０１３８】
を有する化合物も提供する。
【０１３９】
本発明は、構造：
【化２５】
2005529062.tif 000019
【０１４０】
を有する化合物も提供する。
【０１４１】
本発明は、構造：
【化２６】
2005529062.tif 000020
【０１４２】
を有する化合物も提供する。
【０１４３】
Ａ３アデノシン受容体の阻害剤としての活性を有することが知られている別の化合物は、構造：
【化２７】
2005529062.tif 000021
【０１４４】
を有する化合物である。
【０１４５】
化合物１７２０は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ０２／０５７２６７  Ａ１に、さらに完全に記載されている。化合物１７２０は、本発明の化合物の活性を評価するための基準として用いた。
【０１４６】
本発明は、構造：
【化２８】
2005529062.tif 000022
【０１４７】
を有する化合物も提供する。
【０１４８】
本発明は、構造：
【化２９】
2005529062.tif 000023
【０１４９】
を有する化合物も提供する。
【０１５０】
本発明は、Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が心臓の低酸素状態、脳虚血、抗利尿、心筋虚血、気管支収縮、糖尿病、喘息、気管支炎、緑内障、網膜症、眼虚血、黄斑変性症、胃腸疾患、呼吸系疾患、眼の炎症であるか、又は前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、方法も提供する。
【０１５１】
該方法の実施形態の１つでは、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は、心臓の低酸素状態、脳虚血、抗利尿、心筋虚血、気管支収縮、又は糖尿病である。
【０１５２】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は、胃腸疾患である。
【０１５３】
上記方法のさらなる実施形態では、前記胃腸疾患は下痢である。
【０１５４】
さらなる実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は、呼吸系疾患である。
【０１５５】
上記方法のさらなる実施形態では、前記呼吸系疾患は、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である。
【０１５６】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は眼の炎症である。
【０１５７】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う。
【０１５８】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は、喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、又は黄斑変性症である。
【０１５９】
上記方法のさらなる実施形態では、前記疾病は喘息である。
【０１６０】
上記方法のさらなる実施形態では、前記疾病は緑内障である。
【０１６１】
上記方法のさらなる実施形態では、前記方法は、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、プロスタグランジン及びプラスタグランジン受容体アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、５−ＨＴアゴニスト、血管新生阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、レニン阻害剤、カンナビノイド受容体アゴニスト、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）、ソマトスタチンアゴニスト、グルココルチコイドアンタゴニスト、肥満細胞脱顆粒阻害剤、αアドレナリン作動性受容体遮断薬、α２アドレナリン受容体アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２模倣薬、プロテインキナーゼ阻害剤、プロスタグランジンＦ誘導体、プロスタグランジン２αアンタゴニスト、ドーパミンＤ１及び５−ＨＴ２アゴニスト、一酸化窒素放出物質、５−ＨＴ２アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、イノシン、ドーパミンＤ２受容体及びα２アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト及びＤ２受容体アゴニスト、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、１−（３−ヒドロキシー２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン（ＨＰＭＰＣ）及び関連類縁体及びプロドラッグ、甲状腺ホルモン受容体リガンド、ムスカリン性Ｍ１アゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、混合作用式イオンチャネル遮断薬、βアドレナリン受容体アンタゴニストとＰＧＦ２αアゴニストの組合せ、グアニル酸シクラーゼ活性化因子、ニトロ血管拡張剤、エンドセリン受容体モジュレーター、エタクリン酸、他のフェノキシ酢酸類縁体、アクチン破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬及び神経保護物質からなる群から選択される１以上の化合物を前記患者に治療的有効量投与することをさらに備える。
【０１６２】
上記方法のさらなる実施形態では、前記方法は、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、及びプラスタグランジン受容体アゴニストからなる群から選択される１以上の化合物を前記患者に治療的有効量投与することをさらに備える。
【０１６３】
上記方法のさらなる実施形態では、前記方法は、治療的有効量のプロスタグランジンアゴニスト、β２アゴニスト、又はムスカリン性アンタゴニストを前記患者に投与することをさらに備える。
【０１６４】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の化合物１６３１を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が認知疾患、呼吸系疾患、逆流性症状、潰瘍性症状、鬱血性心不全、腎不全、心不整脈、呼吸上皮、伝達物質放出、鎮静、血管収縮、徐脈、負の心臓収縮及び伝達速度、気管支収縮、気管支炎又は好中球の化学走性である、方法も提供する。
【０１６５】
１つの実施形態では、前記認知疾患は記憶障害である。
【０１６６】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療する方法であって、治療的有効量の化合物１６３１を前記患者に投与することによって、前記患者の前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病を治療することを備え、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が、抗利尿、心臓の低酸素状態、心筋虚血、高血圧、炎症であるか、又は呼吸上皮の下部に存在する平滑筋の収縮、肥満細胞の脱顆粒、若しくは好酸球の活動を伴う、方法も提供する。
【０１６７】
１つの実施形態では、前記呼吸系疾患は喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である。
【０１６８】
上記方法のさらなる実施形態では、前記疾患は喘息である。
【０１６９】
上記方法のさらなる実施形態では、前記方法は、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つを前記患者に投与することにより、前記患者の喘息を治療することをさらに備える。
【０１７０】
別の実施形態では、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病は鬱血性心不全である。
【０１７１】
上記全ての方法のさらなる実施形態では、前記患者はヒトである。
【０１７２】
本発明は、患者に利尿を誘導する方法であって、利尿に有効な量の化合物１６３１を投与することにより、前記患者に利尿を誘導することを備えた方法も提供する。
【０１７３】
本発明は、Ａ３アデノシン受容体が異常な刺激を受けている細胞中のＡ３アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５と接触させて、前記Ａ３アデノシン受容体の活性を阻害することを備えた方法も提供する。
【０１７４】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が異常な刺激を受けている細胞中のＡ１アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を化合物１６３１と接触させて、前記Ａ１アデノシン受容体の活性を阻害することを備えた方法も提供する。
【０１７５】
上記方法のさらなる実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。
【０１７６】
本発明は、インビボでヒト患者によりＡ３アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物へと代謝される化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５のプロドラッグであって、前記プロドラッグが、
アルコール若しくはカルボン酸基のエステル（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アルコール基のアセタール若しくはケタール（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アミン基のＮ−マンニッヒ塩基若しくはイミン（このような基が前記化合物中に存在する場合）、又は
カルボニル基のシッフ塩基、オキシム、アセタール、エノールエステル、オキサゾリジン、若しくはチアゾリジン（このような基が前記化合物中に存在する場合）である、プロドラッグも提供する。
【０１７７】
本発明は、インビボでヒト患者によりＡ１アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物へと代謝される化合物１６３１のプロドラッグであって、前記プロドラッグが、
アルコール若しくはカルボン酸基のエステル（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アルコール基のアセタール若しくはケタール（このような基が前記化合物中に存在する場合）、
アミン基のＮ−マンニッヒ塩基若しくはイミン（このような基が前記化合物中に存在する場合）、又は、
カルボニル基のシッフ塩基、オキシム、アセタール、エノールエステル、オキサゾリジン、若しくはチアゾリジン（このような基が前記化合物中に存在する場合）である、プロドラッグも提供する。
【０１７８】
１つの実施形態では、前記プロドラッグは水溶性である。
【０１７９】
１つの実施形態では、前記プロドラッグは、エステラーゼにより触媒される加水分解によってインビボで代謝される。
【０１８０】
本発明は、前記プロドラッグと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【０１８１】
本発明は、化合物１６３１と、薬学的に許容される担体と、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つとを含む、薬学的組成物も提供する。
【０１８２】
本発明は、化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、１７３５、又は１６３１と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【０１８３】
１つの実施形態では、前記薬学的組成物は眼周囲、眼球後、又は眼球内注射製剤である。
【０１８４】
別の実施形態では、前記薬学的組成物は全身性製剤である。
【０１８５】
別の実施形態では、前記薬学的組成物は手術用灌流液（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。
【０１８６】
本発明は、Ａ3アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療するためのパッケージされた薬学的組成物であって、
（ａ）治療的有効量の化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５が入った容器と、
（ｂ）患者の前記疾病を治療するための前記化合物の使用についての指示書と、
を備える、パッケージされた薬学的組成物も提供する。
【０１８７】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療するためのパッケージされた薬学的組成物であって、
（ａ）治療的有効量の化合物１６３１が入った容器と、
（ｂ）患者の前記疾病を治療するための前記化合物の使用についての指示書と、
を備える、パッケージされた薬学的組成物も提供する。
【０１８８】
本発明は、化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５を含む組成物を製造する方法であって、前記化合物を適切な担体と混合することを備えた方法も提供する。
【０１８９】
本発明は、化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５の薬学的に許容される塩も提供する。
【０１９０】
１つの実施形態では、前記薬学的に許容される塩は、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸塩、リン酸塩、及びメシル酸塩からなる群から選択される陰イオンを含有する。
【０１９１】
本発明は、Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５の使用であって、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が心臓の低酸素状態、脳虚血、抗利尿、心筋虚血、気管支収縮、糖尿病、喘息、緑内障、気管支炎、網膜症、眼虚血、黄斑変性症、胃腸疾患、呼吸系疾患、眼の炎症であるか、又は前記Ａ３アデノシン受容体が関連する前記疾病が肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う、方法も提供する。
【０１９２】
１つの実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病が心臓の低酸素状態、脳虚血、抗利尿、心筋虚血、気管支収縮又は糖尿病である。
【０１９３】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は胃腸疾患である。
【０１９４】
さらなる実施形態では、前記胃腸疾患は下痢である。
【０１９５】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は呼吸系疾患である。
【０１９６】
さらなる実施形態では、前記呼吸系疾患は喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である。
【０１９７】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は眼の炎症である。
【０１９８】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は喘息、緑内障、網膜症、眼虚血、又は黄斑変性症である。
【０１９９】
さらなる実施形態では、前記疾病は喘息である。
【０２００】
さらなる実施形態では、前記疾病は緑内障である。
【０２０１】
上記使用のさらなる実施形態では、前記医薬は、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、プロスタグランジン及びプラスタグランジン受容体アゴニスト、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、５−ＨＴアゴニスト、血管新生阻害剤、ＮＭＤＡアンタゴニスト、レニン阻害剤、カンナビノイド受容体アゴニスト、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）、ソマトスタチンアゴニスト、グルココルチコイドアンタゴニスト、肥満細胞脱顆粒阻害剤、αアドレナリン作動性受容体遮断薬、α２アドレナリン受容体アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２模倣薬、プロテインキナーゼ阻害剤、プロスタグランジンＦ誘導体、プロスタグランジン２αアンタゴニスト、ドーパミンＤ１及び５−ＨＴ２アゴニスト、一酸化窒素放出物質、５−ＨＴ２アンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、イノシン、ドーパミンＤ２受容体及びα２アドレナリン受容体アゴニスト、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト及びＤ２受容体アゴニスト、バソプレッシン受容体アンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、１−（３−ヒドロキシー２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン（ＨＰＭＰＣ）及び関連類縁体及びプロドラッグ、甲状腺ホルモン受容体リガンド、ムスカリン性Ｍ１アゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、混合作用式イオンチャネル遮断薬、βアドレナリン受容体アンタゴニストとＰＧＦ２αアゴニストの組合せ、グアニル酸シクラーゼ活性化因子、ニトロ血管拡張剤、エンドセリン受容体モジュレーター、エタクリン酸、他のフェノキシ酢酸類縁体、アクチン破壊物質、カルシウムチャネル遮断薬及び神経保護物質からなる群から選択される１以上の化合物をさらに含む。
【０２０２】
上記使用のさらなる実施形態では、前記医薬は、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト、及びプラスタグランジン受容体アゴニストからなる群から選択される１以上の化合物をさらに含む。
【０２０３】
上記使用のさらなる実施形態では、前記医薬はプロスタグランジンアゴニスト、β２アゴニスト、又はムスカリン性アンタゴニストをさらに含む。
【０２０４】
別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体が関連する疾病は、肥満細胞の脱顆粒又は好酸球の活動を伴う。
【０２０５】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための化合物１６３１の使用であって、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する前記疾病が認知疾患、呼吸系疾患、逆流性症状、潰瘍性症状、鬱血性心不全、腎不全、心不整脈、呼吸上皮、伝達物質放出、鎮静、血管収縮、徐脈、負の心臓収縮及び伝達速度、気管支収縮、気管支炎又は好中球の化学走性である使用も提供する。
【０２０６】
１つの実施形態では、前記認知疾患は記憶障害である。
【０２０７】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病の治療を必要としている患者の前記疾病を治療するのに使用できる医薬を製造するための化合物１６３１の使用であって、前記Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病が、抗利尿、心臓の低酸素状態、心筋虚血、高血圧、炎症であるか、又は呼吸上皮の下部に存在する平滑筋の収縮、肥満細胞の脱顆粒、若しくは好酸球の活動を伴う、使用も提供する。
【０２０８】
ある実施形態では、前記呼吸系疾患は喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である。
【０２０９】
さらなる実施形態では、前記呼吸系疾患は喘息である。
【０２１０】
上記使用のさらなる実施形態では、前記医薬は、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストのうち少なくとも１つをさらに含む。
【０２１１】
本発明は、患者に利尿を誘導するのに利用できる医薬を製造するための化合物１６３１の使用も提供する。
【０２１２】
別の実施形態では、Ａ１アデノシン受容体が関連する疾病は鬱血性心不全である。
【０２１３】
本発明は、Ａ３アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療する方法であって、治療的有効量の式ＸＩの化合物、好ましくは、１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４を投与することを備えた方法も提供する。
【０２１４】
本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療する方法であって、治療的有効量の化合物１６３１を前記患者に投与することを備えた方法も提供する。
【０２１５】
前記方法の１つの実施形態では、前記患者は哺乳類である。
【０２１６】
前記方法の別の実施形態では、前記哺乳類はヒトである。
【０２１７】
前記方法の別の実施形態では、前記Ａ３アデノシン受容体は、中枢神経系疾患、心血管疾患、喘息、過敏症、鼻炎、花粉症、血清病、アレルギー性脈管炎、アトピー性皮膚炎、皮膚炎、乾癬、湿疹、特発性肺線維症、好酸球性胆嚢炎（ｃｈｌｏｒｅｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性気道炎症、好酸球増多症候群、好酸球性胃腸炎、浮腫、じんましん、好酸球性心筋症、好酸球増多を伴う突発性血管性浮腫、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、アレルギー性肉芽腫症、癌腫症、好酸球性肉芽腫、家族性組織球増殖症、高血圧、肥満細胞の脱顆粒、腫瘍、心臓の低酸素状態、脳虚血、抗利尿、腎不全、神経疾患、精神疾患、認知疾患、心筋虚血、気管支収縮、関節炎、自己免疫疾患、クローン病、グレーブス病、糖尿病、多発性硬化症、貧血、不妊、紅斑性狼瘡、再潅流傷害、脳細動脈径（ｂｒａｉｎ  ａｒｔｅｒｉｏｌｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）、アレルギー媒介物質の放出、強皮症、卒中、全虚血、中枢神経系疾患、心血管疾患、腎疾患、炎症性疾患、胃腸疾患、眼疾患、アレルギー性疾患、呼吸器系疾患、又は免疫疾患と関連する。
【０２１８】
さらなる実施形態では、本発明は、前記Ａ１アデノシン受容体が認知疾患、腎不全、心不整脈、呼吸上皮、伝達物質放出、鎮静、血管収縮、徐脈、負の心臓収縮及び伝達速度、気管支収縮、好中球の化学走性、逆流性症状又は潰瘍性症状と関連する、上記方法を提供する。
【０２１９】
アデノシンＡ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、及びＡ３受容体が関連する疾病は、ＷＯ  ９９／０６０５３及びＷＯ−０９８２２４６５、ＷＯ−０９７０５１３８、ＷＯ−０９５１１６８１、ＷＯ−０９７３３８７９、ＪＰ−０９２９１０８９、ＰＣＴ/ＵＳ９８／１６０５３、及び米国特許第５，５１６，８９４号に開示されており、これらの内容全体を参考文献として全て本明細書に援用する。
【０２２０】
本発明は、式ＸＩの化合物と化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、又は１７３５の水溶性プロドラッグであって、前記水溶性プロドラッグがインビボで代謝されて、Ａ３アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物を与える、水溶性プロドラッグも提供する。
【０２２１】
本発明は、化合物１６３１の水溶性プロドラッグであって、前記可溶性プロドラッグがインビボで代謝されて、Ａ１アデノシン受容体を選択的に阻害する活性な薬物を与える、水溶性プロドラッグも提供する。
【０２２２】
前記プロドラッグの１つの実施形態では、前記プロドラッグは、エステラーゼにより触媒される加水分解によってインビボで代謝される。
【０２２３】
本発明は、前記プロドラッグと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【０２２４】
本発明は、細胞中のＡ３アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を、式ＸＩの化合物又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、若しくは１７３５と接触させることを備えた方法も提供する。
【０２２５】
さらなる実施形態では、本発明は、細胞中のＡ３アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４と接触させることを備えた方法を提供する。
【０２２６】
前記方法の１つの実施形態では、前記化合物は前記Ａ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。
【０２２７】
本発明は、細胞中のＡ１アデノシン受容体の活性を阻害する方法であって、前記細胞を化合物１６３１と接触させることを備えた方法も提供する。
【０２２８】
さらなる実施形態では、本発明は、細胞中のＡ１アデノシン受容体の活性を阻害する上記方法であって、前記化合物がＡ１アデノシン受容体のアンタゴニストである方法も提供する。
【０２２９】
本方法の別の実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。
【０２３０】
本発明は、患者の胃腸疾患を治療する方法であって、有効量の式ＸＩの化合物又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、若しくは１７３５を投与することを備えた方法も提供する。
【０２３１】
本方法の１つの実施形態では、前記疾患は下痢である。
【０２３２】
本方法の別の実施形態では、前記患者はヒトである。
【０２３３】
本方法の別の実施形態では、前記化合物はＡ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。
【０２３４】
本発明は、患者の呼吸器系疾患を治療する方法であって、有効量の式ＸＩの化合物又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、若しくは１７３５を前記患者に投与することを備えた方法も提供する。
【０２３５】
本方法の１つの実施形態では、前記疾患は喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である。
【０２３６】
本方法の別の実施形態では、前記患者はヒトである。
【０２３７】
本方法の別の実施形態では、前記化合物はＡ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。
【０２３８】
本発明は、患者の眼に対する損傷を治療する方法であって、有効量の式ＸＩの化合物又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、若しくは１７３５を前記患者に投与することを備えた方法も提供する。
【０２３９】
本方法の１つの実施形態では、前記損傷には、網膜又は視神経頭の損傷が含まれる。
【０２４０】
本方法の別の実施形態では、前記損傷は急性又は慢性である。
【０２４１】
本方法の別の実施形態では、前記損傷は、緑内障、浮腫、虚血、低酸素状態、又は外傷の結果である。
【０２４２】
本方法の別の実施形態では、前記患者はヒトである。
【０２４３】
本方法の別の実施形態では、前記化合物はＡ３アデノシン受容体のアンタゴニストである。
【０２４４】
さらなる実施形態では、本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療する方法であって、前記疾病が喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患である方法を提供する。
【０２４５】
さらなる実施形態では、本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療する方法であって、前記疾病が喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、又は上気道疾患であり、前記患者がヒトである、方法を提供する。
【０２４６】
さらなる実施形態では、本発明は、上記疾病を治療する方法であって、前記化合物がＡ１アデノシン受容体のアンタゴニストである方法を提供する。
【０２４７】
さらなる実施形態では、本発明は、喘息の併用療法であって、化合物１６３１と、ステロイド、β２アゴニスト、グルココルチコイド、ロイコトリエンアンタゴニスト、又は抗コリン作動性アゴニストとを備えた併用療法を提供する。
【０２４８】
さらなる実施形態では、本発明は、治療的有効量の化合物１６３１と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【０２４９】
さらなる実施形態では、本発明は、治療的有効量の化合物１６３１を投与することによって呼吸器系疾患を治療する方法であって、前記呼吸系疾患が喘息、アレルギー性鼻炎、又は慢性閉塞性肺疾患である方法を提供する。
【０２５０】
さらなる実施形態では、本発明は、薬学的に許容される化合物１６３１の塩を提供する。
【０２５１】
さらなる実施形態では、本発明は、Ａ１アデノシン受容体が関連する患者の疾病を治療する方法であって、前記Ａ１アデノシン受容体が鬱血性心不全を伴う方法を提供する。
【０２５２】
本発明は、治療的有効量の式ＸＩの化合物、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、１７３４、若しくは１７３５と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【０２５３】
薬学的組成物の１つの実施形態では、前記治療的有効量は、呼吸器系疾患又は胃腸疾患を治療するのに有効である。
【０２５４】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記胃腸疾患は下痢である。
【０２５５】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記呼吸器系疾患は喘息、アレルギー性鼻炎、又は慢性閉塞性肺疾患である。
【０２５６】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記薬学的組成物は眼用製剤である。
【０２５７】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記薬学的組成物は眼周囲、眼球後、又は眼球内注射製剤である。
【０２５８】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記薬学的組成物は全身性製剤である。
【０２５９】
前記薬学的組成物の別の実施形態では、前記薬学的組成物は手術用灌流液である。
【０２６０】
本明細書で使用する「化合物がＡ３選択的である」とは、ある化合物のアデノシンＡ３受容体に対する結合定数が、アデノシンＡ１、Ａ２ａ、又はＡ２ｂに対する結合定数より少なくとも１０倍高いことを意味する。
【０２６１】
当業者であれば、本明細書に開示されている化合物が患者の体内で代謝されることによって、薬物として作用し得る生物活性のある代謝物が生成されることを理解しているであろう。
【０２６２】
さらなる実施形態では、本発明は、緑内障の治療法であって、治療的有効量の式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４を患者に投与することを備えた治療法を提供する。
【０２６３】
さらなる実施形態では、本発明は、緑内障の治療法であって、１以上のアデノシン受容体アンタゴニスト、好ましくは、アデノシン受容体Ａ３アンタゴニスト（好ましくは式ＸＩの化合物、最も好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４）を備えた治療法を提供する。
【０２６４】
別の実施形態では、本発明は、緑内障の併用療法であって、アデノシン受容体Ａ３アンタゴニスト（好ましくは式ＸＩの化合物、最も好ましくは化合物１７３５又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４）と、βアドレナリン受容体アンタゴニスト（すなわち、βアドレナリンアンタゴニスト又はβ遮断薬）（例えば、マレイン酸チモロール、ベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール、メチプラノロール、Ｌ−６５３３２８（Ｌ−６５２６９８の酢酸エステル）、β１アドレナリン受容体アンタゴニスト）、α２アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、アプラクロニジン、ブリモニジン、ＡＧＮ−１９５７９５、ＡＧＮ−１９０８３７（Ｂａｙ−ａ−６７８１の類縁体））、炭酸脱水酵素阻害剤（ブリンゾラミド、ドルゾラミド、ＭＫ−９２７（ヒト炭酸脱水酵素ＩＩイソエンザイムの阻害剤）、炭酸脱水酵素ＩＶイソエンザイムの阻害剤）、コリン作動性アゴニスト（例えば、ムスカリン性コリン作動性アゴニスト、カルバコール、ビロカルピンＨＣｌ、硝酸ピロカルピン、ピロカルピン、ピロカルピンのプロドラッグ（例えばＤＤ−２２Ａ））、プロスタグランジン及びプラスタグランジン受容体アゴニスト（例えばラタノプロスト、イソプロピルウノプロストン、ＰＧＦ２αアゴニスト、プロスタノイド選択的ＦＰ受容体アゴニスト、降圧性プロスタミド等のＰＧアゴニスト）、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、スピラプリル、スピラプリラート）、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、５−ＨＴアゴニスト（例えば、ＭＫＣ−２４２（５−３−［（（２Ｓ）−１，４−ベンゾジオキサン−２−イルメチル）アミノ］プロポキシ−１，３−ベンゾジオキソールＨＣｌ）、血管新生阻害剤（例えば、ステロイドアネコルテーブ（ａｎｅｃｏｒｔａｖｅ））、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、ＨＵ−２１１、メマンチン、カンナビノイドＮＭＤＡ受容体アゴニストデキサナビノール、デキサナビノールのプロドラッグ及び類縁体、ＮＲ２Ｂ選択的アンタゴニスト（例えば、エリプロディル（ＳＬ−８２．０７１５））、レニン阻害剤（例えばＣＧＰ−３８５６０、ＳＲ−４３８４５）、カンナビノイド受容体アゴニスト（例えば、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びＴＨＣ類縁体、選択的ＣＢ２カンナビノイド受容体アゴニスト（例えば、Ｌ−７６８２４２、Ｌ−７５９７８７）、脳特異的ＳＢ１受容体と末梢ＣＢ２受容体の両方に結合するアナンダミド等の化合物）、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト（例えば、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ＣＳ−０８８）、ロサルタンカリウム等の選択的アンギオテンシンＩＩＡＴ−Ｉ受容体アンタゴニスト）、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）、ソマトスタチンアゴニスト（例えば、非ペプチド性ソマトスタチンアゴニストＮＮＣ−２６−９１００）、グルココルチコイドアンタゴニスト、肥満細胞脱顆粒阻害剤（例えば、ネドクロミル）、αアドレナリン作動性受容体遮断薬（例えば、ダピプラゾール、α２アドレナリン受容体アンタゴニスト、α１アドレナリン受容体アンタゴニスト（例えば、ブナゾシン））、α２アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２模倣薬、プロテインキナーゼ阻害剤（例えば、Ｈ７）、プロスタグランジンＦ誘導体（例えば、Ｓ−１０３３）、プロスタグランジン２αアンタゴニスト（例えば、ＰｈＸＡ−３４）、ドーパミンＤ１及び５−ＨＴ２アゴニスト（フェノールドパム）、一酸化窒素放出物質（例えば、ＮＣＸ−９０４又はＮＣＸ−９０５、チモロールの一酸化窒素を放出する誘導体）、５−ＨＴ２アンタゴニスト（例えば、サルポグレラート）、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えば、デキサナビノールのプロドラッグ及び類縁体）、α１アドレナリン受容体アンタゴニスト（例えば、ブナゾシン）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、ジクロフェナク、又は非ステロイド性化合物ネパフェナク）、イノシン、ドーパミンＤ２受容体及びα２アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、タリペキソール）、ドーパミンＤ１受容体アンタゴニスト及びＤ２受容体アゴニスト（例えば、ＳＤＺ−ＧＬＣ−７５６）、バソプレッシン受容体アンタゴニスト（例えば、バソプレッシンＶ２受容体アンタゴニスト（例えば、ＳＲ−１２１４６３））、エンドセリンアンタゴニスト（例えば、ＴＢＣ−２５７６）、１−（３−ヒドロキシー２−ホスホニルメトキシプロピル）シトシン（ＨＰＭＰＣ）及び関連類縁体及びプロドラッグ、甲状腺ホルモン受容体リガンド（例えば、ＫＢ−１３００１５）、ムスカリン性Ｍ１アゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（例えば、カンナビノイドＮＭＤＡ受容体アンタゴニストデキサナビノール）、降圧性脂質プロスタミド等のＰＧアゴニスト、ナトリウムチャネル遮断薬、ＮＭＤＡアンタゴニスト、混合作用式イオンチャネル遮断薬、βアドレナリン受容体アンタゴニストとＰＧＦ２αアゴニストの組合せ（例えば、ラタノプロストとチモロール）、グアニル酸シクラーゼ活性化因子（例えば、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）又は非ペプチド性模倣薬、ＡＮＰの阻害剤中性エンドペプチダーゼ）、ニトロ血管拡張剤（例えば、ニトログリセリン、ヒドララジン、ニトロプルシドナトリウム）、エンドセリン受容体モジュレーター（例えば、ＥＴ−１又は非ペプチド性模倣薬、サラフォトキシンーＳ６ｃ）、エタクリン酸、他のフェノキシ酢酸類縁体（例えば、インダクリノン（ｉｎｄａｃｒｉｎｏｎｅ）、チクリナフェン）、アクチン破壊物質（例えば、ラトランクリン）、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ブロビンカミン、ニバルジピン）及び神経保護物質からなる群から選択される１以上の他の化合物とを備えた併用療法を提供する。
【０２６５】
緑内障の併用療法であって、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４と、βアドレナリン受容体アンタゴニスト、α２アドレナリン受容体アゴニスト、炭酸脱水酵素阻害剤、コリン作動性アゴニスト及びプロスタグランジン受容体アゴニストからなる群から選択される１以上の化合物とを備えた併用療法。
【０２６６】
さらなる実施形態では、本発明は、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４を含む組成物を製造する方法であって、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４を適切な担体と混合することを備えた方法を提供する。
【０２６７】
さらなる実施形態では、本発明は、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４の化合物の薬学的に許容される塩を提供する。
【０２６８】
さらなる実施形態では、本発明は、式ＸＩの化合物、好ましくは化合物１７３５、又は化合物１７２０、１７２１、１７２２、１７２３、１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９、１７３０、１７３１、１７３２、１７３３、若しくは１７３４の化合物の薬学的に許容される塩であって、前記薬学的に許容される塩がマレイン酸、フマル酸、酒石酸、酢酸塩、リン酸塩、及びメシル酸塩からなる群から選択される陰イオンを含有する。
【０２６９】
本発明のデアザプリンは、有機合成の標準的な方法を用いて調製することができる。デアザプリンは、逆相ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー、再結晶等によって精製することができ、それらの構造物は、質量スペクトル分析、元素分析、ＩＲ及び／又はＮＭＲ分光法によって確認される。
【０２７０】
典型的には、本発明のデアザプリンと中間体の合成は、溶液中で行われる。１以上の保護基を付加し除去することも典型的な慣行であり、当業者に公知である。
【０２７１】
アデノシンＡ１及びＡ３受容体に特異的な化合物の合成スキームと結合データは、さらに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／６２５１８とＷＯ０１／３９７７７  Ａ１に開示されており、その全体が本明細書に援用される。
【０２７２】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらの実施例は、いかなる意味においてもさらなる限定を加えるものと解釈してはならない。本出願を通じて引用されている参考文献、係属中の特許出願、及び公表された特許出願の全ての内容は、背景の部に引用されているものを含み、本明細書に参考文献として援用される。実施例を通じて用いられているモデルは容認されたモデルであり、これらのモデルで効力が実証されれば、ヒトでも効力があると予測されることを理解しなければならない。
【０２７３】
本発明は、以下の実験の詳細によって、さらに深く理解されるであろう。しかし、当業者であれば、論述されている具体的な方法と結果は、これに続く特許請求の範囲にさらに完全に記載されている本発明を例示的に説明するものにすぎないことを容易に理解できるであろう。
【実験の詳細】
【０２７４】
本発明のデアザプリンは、標準的な有機合成方法を用いて調製することができる。デアザプリンは、逆相ＨＰＬＣ、クロマトグラフィ、再結晶化などによって精製することができ、それらの構造は、質量スペクトル分析、元素分析、ＩＲ及び／又はＮＭＲ分光法によって確認することができる。
【０２７５】
一般に、本発明の中間体及びデアザプリンの合成は溶液状態で実施される。１つ以上の保護基を付加及び除去することも一般に行われ、当業者には既知である。本発明のデアザプリン中間体を調製するための典型的な合成スキームを、以下のスキームＩに概説する。
【化３０】
2005529062.tif 000024
【０２７６】
式中、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は上で定義したとおりである。
【０２７７】
一般に、保護された２−アミノ−３−シアノ−ピロールを、ハロゲン化アシルで処理してカルボキシアミド−３−シアノ−ピロールを形成させることができる。これを、酸性メタノールで処理し閉環させてピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンとすることができる（Ｍｕｌｌｅｒ、Ｃ．Ｅ．等  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：４３９６（１９９７））。ピロロ保護基を除去し、塩素化試薬、例えば、オキシ塩化リンで処理して、置換又は非置換４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンを生成させた。クロロピリミジンをアミンで処理して、７−デアザプリンを得た。
【０２７８】
例えば、スキームＩに示すように、Ｎ−（１−ｄｌ−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−ピロールを、ピリジンとジクロロメタン中、ハロゲン化アシルで処理した。得られたＮ−（１−ｄｌ−フェニルエチル）−２−フェニルカルボキシアミド−３−シアノ−ピロールを、メタノール／硫酸１０：１混合物で処理して閉環させ、ｄｌ−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを得た。ピリミジンをポリリン酸（ＰＰＡ）で処理してフェニルエチル基を除去し、その後ＰＯＣｌ３で処理して主要な中間体である４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンを得た。表１に列挙した様々なアミンで４−クロロ−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンをさらに処理することによって、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物が得られる。
【表１】
2005529062.tif 000025
【０２７９】
2005529062.tif 000026
【０２８０】
2005529062.tif 000027
【０２８１】
６−置換ピロールを調製するための一般的手法を、以下のスキーム（スキームＩＩ）に示す。
【化３１】
2005529062.tif 000028
【０２８２】
式中、Ｒ１からＲ５は、上で定義したとおりである。
【０２８３】
α−ハロケトンによるエチルシアノアセテートのエステル交換反応及びアルキル化によって、ケトメチルエステルが得られる。ケトンを保護した後、アミジン（例えば、アルキル、アリール又はアルキルアリール）塩酸塩で処理することによって、ケタールで保護されたピリミジンを得た。保護基を除去し、その後環化させ、オキシ塩化リンで処理して塩化物中間体を得た。さらにアミンでこれを処理してアミン６−置換ピロールを得た。また、ピロール窒素のアルキル化を、当分野で認められている条件下で実施することができる。
【０２８４】
５−置換ピロールを調製するための一般的手法を以下のスキーム（スキームＩＩＩ）に示す。
【化３２】
2005529062.tif 000029
【０２８５】
式中、Ｒ１からＲ６は上で定義したとおりであり、Ｒは除去可能な保護基である。
【０２８６】
マロノニトリルと過剰のケトンを縮合させ、その後、その生成物を臭素化して出発材料、モノブロム化生成物及びジブロム化生成物の混合物を得て、これをアルキルアミン、アリールアミン又はアルキルアリールアミンで処理した。得られたアミン生成物を酸塩化物でアシル化し、酸の存在下でモノアシル化（ｍｏｎａｃｙｌａｔｅｄ）ピロールを環化させて対応するピリミジンを得た。ピロール保護基をポリリン酸で除去し、オキシ塩化リンで処理して塩素化生成物を得た。引き続き塩素化ピロールをアミンで処理してアミノ５−置換ピロールを生成させた。ピロール窒素のアルキル化を、当分野で認知されている条件で実施することができる。
【０２８７】
スキームＩＶ及びＶに、本発明のデアザプリン１及び２を調製する方法を示す。
【化３３】
2005529062.tif 000030
【０２８８】
式中、Ｒ５及びＲ６は、上述したように、例えば、ＣＨ３である。
【０２８９】
６−メチルピロロピリミジンの具体的調製：
６−メチルピロロピリミジン（１）［Ｒ５＝ＣＨ３］を生成する主な反応は、シアノアセテートがベンズアミジンと環化してピリミジンになるものである。メチルシアノアセテートは対応するエチルエステルよりもベンズアミジンとより効率的に環化してピリミジンになると考えられた。したがって、ＮａＯＭｅと過剰のα−ハロアセチル成分、例えば、クロロアセトンの存在下での、エチルシアノアセテートのエステル交換反応及びアルキル化によって、所望のメチルエステル（３）が収率７９％で得られた（スキームＩＶ）。ケトエステル（３）はアセタール（４）として保護され、収率は８１％であった。２当量のＤＢＵを用いて、アミジン塩酸塩、例えば、ベンズアミジン塩酸塩とのピリミジン（５）への新しい環化方法を実施し、単離収率５４％で５を得た。この方法は、グアニジンとの環化中にＮａＯＭｅを利用する公表された条件を用いて、収率を２０％から改善するものである。ピロール−ピリミジン（６）への環化は、ＨＣｌ水溶液中でアセタールを脱保護して実施され、収率は７８％であった。還流させながら（６）とオキシ塩化リンとを反応させて、対応する４−クロロ誘導体（７）を得た。（７）をジメチルスルホキシド中１３５℃でトランス−４−アミノシクロヘキサノールとカップリングさせて、（１）を５７％で得た。当業者は、試薬を選択することによって所望の置換基Ｒ５を選択するのに多大な自由度が与えられることを理解されたい。
【化３４】
2005529062.tif 000031
【０２９０】
５−メチルピロロピリミジンの具体的調製
マロノニトリルと過剰のケトン、例えば、アセトンを還流ベンゼン中でクネーフェナーゲル縮合させ、蒸留後に収率５０％で８を得た。過酸化ベンゾイルのクロロホルム溶液存在下で８をＮ−ブロモスクシンイミドで臭素化し、蒸留して、出発材料、モノブロム化生成物（９）及びジブロム化生成物の混合物（５／９０／５）を得た（７０％）。この混合物を、α−メチルアルキルアミン又はα−メチルアリールアミン、例えば、α−メチルベンジルアミンと反応させて、アミノピロール（１０）を得た。短いシリカゲルカラムを通した後、軽く精製したアミン（収率３１％）を酸塩化物、例えば、塩化ベンゾイルでアシル化してモノアシル化（１１）及びジアシル化（１２）ピロールを生成させ、フラッシュクロマトグラフィで分離させた。二置換ピロール（１２）を酸加水分解して、アシルピロール（１１）を混合収率２９％で得た。濃硫酸及びＤＭＦの存在下で環化して（１３）（２３％）を得た。これをポリリン酸で脱保護して（１４）とした。還流させながら、（１４）をオキシ塩化リンと反応させて、対応する４−クロロ誘導体（１５）を得た。ジメチルスルホキシド中１３５℃で（１４）をトランス−４−アミノシクロヘキサノールとカップリングさせて（２）［Ｒ６＝ＣＨ３］を３０％で得た（スキームＶ参照）。当業者は、試薬を選択することによって所望の置換基Ｒ６を選択するのに多大な自由度が与えられることを理解されたい。
【化３５】
2005529062.tif 000032
【０２９１】
Ｒ６−置換ピロール、例えば、５−メチルピロロピリミジンの別の合成経路：
Ｒ６−置換ピロール、例えば、５−メチルピロロピリミジンへの別の経路には、エチルシアノアセテートから（１６）へのエステル交換反応及びアルキル化が含まれる（スキームＶＩ）。２当量のＤＢＵを用いた（１６）とベンズアミジン塩酸塩との縮合によって、ピリミジン（１７）が得られる。ピロール−ピリミジン（１４）への環化は、ＨＣｌ水溶液中でアセタールを脱保護することによって実施される。還流させながら（１４）とオキシ塩化リンを反応させて、対応する４−クロロ誘導体（１５）を得た。ジメチルスルホキシド中１３５℃でトランス−４−アミノシクロヘキサノールとカップリングさせて２を得る。この手順によって、標的化合物（２）までの合成反応数が９段階から４段階に削減される。また、収率が著しく向上する。ここでもまた、当業者は、試薬を選択することによって所望の置換基Ｒ６を選択するのに多大な自由度が与えられることを理解されたい。
【化３６】
2005529062.tif 000033
【０２９２】
デス−メチルピロールを調製するための一般的手法を以下のスキーム（スキームＶＩＩ）に示す。
【化３７】
2005529062.tif 000034
【化３８】
2005529062.tif 000035
【０２９３】
式中、Ｒ１からＲ３は、上で定義したとおりである。
【０２９４】
塩基の存在下、アルキルシアノアセテートをジエチルアセタールでアルキル化するとシアノジエチルアセタールが得られ、これをアミジン塩で処理してメチルピロロピリミジン前駆体を得た。この前駆体を塩素化し、アミンで処理して、上述した目的のデス−メチルピロロピリミジンが形成された。
【０２９５】
例えば、スキームＶＩＩＩに、化合物（１８）の合成を示す。
【化３９】
2005529062.tif 000036
【０２９６】
市販のメチルシアノアセテートを、炭酸カリウムとＮａＩの存在下、ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールでアルキル化して（１９）を得た。ピリミジン（２０）への環化を２段階で実施した。始めに、２当量のＤＢＵを用いて、（１９）とベンズアミジン塩酸塩を反応させて、ピリミジン−アセタールを形成させた。得られたピリミジン−アセタールを精製せずに１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で脱保護し、得られたアルデヒドをピロロ−ピリミジン（２０）に環化させ、ろ過して単離した。還流させながら（２０）とオキシ塩化リンを反応させて対応する４−クロロ誘導体（２１）を得た。このクロロ誘導体をトランス−４−アミノシクロヘキサノールとＤＭＳＯ中１３５℃でカップリングさせて化合物（１８）を得た。
【０２９７】
スキームＩＩ−ＶＩＩＩは、ピロロピリミジン環の５位及び６位を官能化できることを示している。異なる出発試薬を使用し、上記反応スキームをわずかに変更することによって、様々な官能基を式（Ｉ）及び（ＩＩ）の５位及び６位に導入することができる。表２にいくつかの例を示す。
【表２】
2005529062.tif 000037
【０２９８】
さらに本発明を限定するものと解釈すべきではない以下の実施例によって、本発明をより詳細に説明する。背景の項で参照したものを含めて、本願を通して引用するすべての参考文献、係属中の特許出願、及び特許公報の内容を、参照により本明細書に援用する。実施例を通して使用するモデルは、容認されたモデルであり、これらのモデルで効力が実証されれば、ヒトでも効力があると予測されることを理解しなければならない。
【０２９９】
調製１：
Ｓｅｅｌａ及びＬｕｐｋｅのアルキル化法を改良した方法を使用した。１エチルシアノアセテート（６．５８ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）氷冷（０℃）溶液に、ＮａＯＭｅ溶液（２５％ｗ／ｖ；５８．１ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。１０分後、クロロアセトン（５ｍＬ；６２．８ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。４時間後、溶媒を除去した。褐色のオイルをＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄した。有機画分を乾燥させ、ろ過し、濃縮して褐色のオイル（７．７９ｇ；７９％）を得た。オイル（３）（スキームＩＶ）は、メチル／エチルエステル生成物の混合物（９／１）であり、さらに精製せずに使用した。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_4.24(q、J=7.2Hz、OCH2)、3.91(dd、1H、J=7.2、7.0Hz、CH)、3.62(s、3H、OCH3)、3.42(dd、1H、J=15.0、7.1Hz、1xCH2);3.02(dd、1H、J=15.0、7.0Hz、1xCH2);2.44(s、3H、CH3)、1.26(t、J=7.1Hz、エステル-CH3)。
【０３００】
1Seela,F.;Lｕpke,U.Chem.Ber.1977、110、1462-1469。
【０３０１】
調製２：
Ｓｅｅｌａ及びＬｕｐｋｅの手順を使用した１。したがって、ＴｓＯＨ（１００ｍｇ）存在下で、エチレングリコール（４ｍＬ、６４．４ｍｍｏｌ）によってケトン（３）（スキームＩＶ；５．０ｇ、３２．２ｍｍｏｌ）を保護することによって、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；３／７  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、Ｒｆ  ０．３５）後にオイル状の（４）（スキームＩＶ；５．２ｇ、８１．０）を得た。依然として約５％のエチルエステルを含有する：1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_4.24(q、J=7.2Hz、OCH2)、3.98(s、4H、2xアセタール-CH2)、3.79(s、3H、OCH3)、3.62(dd、1H、J=7.2、7.0Hz、CH)、2.48(dd、1H、J=15.0、7.1Hz、1xCH2)、2.32(dd、1H、J=15.0、7.0Hz、1xCH2);1.35(s、3H、CH3)、1.26(t、J=7.1Hz、エステル-CH3);MS(ES):200.1(M++1)。
【０３０２】
1Seela,F.;Lｕpke,U.Chem.Ber.1977、110、1462-1469。
【０３０３】
調製３：
アセタール（４）（スキームＩＶ、１ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）、ベンズアミジン（７８６ｍｇ、５．０２ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１．５ｍＬ、１０．０４ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を８５℃で１５時間加熱した。この混合物をＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ（１０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を乾燥させ、ろ過し、濃縮して褐色のオイルを得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；１／９  ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２、Ｒｆ  ０．３５）を試みたが、材料がカラム上で結晶化した。シリカゲルをＭｅＯＨで洗浄した。生成物（５）（スキームＩＶ）を含有する画分を濃縮し、さらに精製せずに用いた（７８３ｍｇ、５４．３％）：1H NMR(200MHz、CDCl3)δ 8.24(m、2H、Ar-H)、7.45(m、3H、Ar-H)、5.24(br s、2H、NH2)、3.98(s、4H、2xアセタール-CH2)、3.60-3.15(m、2H、CH2)、1.38(s、3H、CH3);MS(ES):288.1(M++1)。
【０３０４】
化合物（２０）（スキームＶＩＩＩ）の調製：アセタール（１９）（４．４３ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）１、ベンズアミン塩酸塩（３．２２ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（６．１５ｍＬ、４１．２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を８５℃で１５時間加熱した。この混合物をＣＨＣｌ３  １００ｍＬで希釈し、Ｈ２Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を乾燥させ、ろ過し、濃縮して暗褐色のオイルを得た。この暗褐色オイルを１Ｎ  ＨＣｌ（１００ｍＬ）中室温で２時間撹拌した。得られたスラリーをろ過して、黄褐色固体の（２０）のＨＣｌ塩（３．６０ｇ、７０．６％）を得た；1H NMR(200MHz、DMSO-d6)11.92(s 1H)、8.05(m、2H、Ar-H)、7.45(m、3H、Ar-H)、7.05(s、1H、ヒ゜ロール-H);MS(ES):212.1(M++1)。
【０３０５】
調製４：
アセタール（５）（７００ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）の１Ｎ  ＨＣｌ（４０ｍＬ）溶液を２時間室温で撹拌した。得られたスラリーをろ過して、黄褐色固体の２−フェニル−６−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンのＨＣｌ塩（４９８ｍｇ、７８．０％）を得た：1H NMR(200MHz、DMSO-d6)δ 11.78(s、1H)、8.05(m、2H、Ar-H)、7.45(m、3H、Ar-H)、6.17(s、1H、ヒ゜ロール-H)、2.25(s、3H、CH3);MS(ES):226.1(M++1)。
【０３０６】
調製５：
Ｃｈｅｎ等の環化方法を改良した方法を使用した１。臭化物（９）（スキームＶ；２０．０ｇ、１０８ｍｍｏｌ；純度９０％）のイソプロピルアルコール（６０ｍＬ）氷冷（０℃）溶液に、α−メチルベンジルアミン（１２．５ｍＬ、９７．３ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加した。この黒色溶液を室温まで加温し、１５時間撹拌した。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を乾燥させ、ろ過し、濃縮して黒色タール（１９．２ｇ；９４％）を得た。この残渣の一部をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；４／９６  ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、Ｒｆ  ０．３５）で精製して、化合物ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４−メチルピロールとして黒色固体（６．３８ｇ、３１％）を得た：ＭＳ（ＥＳ）：２２６．１（Ｍ＋＋１）。
【０３０７】
1Chen,Y.L.;Mansbach,R.S.;Winter,S.M.;Brooks,E.;Collins,J.;Corman,M.L.;Dunaiskis,A.R.;Faraci,W.S.;Gallaschun,R.J.;Schmidt,A.;Schulz,D.W.J.Med.Chem.1997、40、1749-1754。
【０３０８】
調製６：
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール１（１４．９ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）とピリジン（１０．０ｍＬ）のジクロロメタン（５０．０ｍＬ）溶液に、塩化ベンゾイル（９．３７ｇ、６６．７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。０℃で１時間撹拌した後、へキサン（１０．０ｍＬ）を添加して生成物の沈殿を促進させた。溶媒を減圧除去し、固体をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏから再結晶化させてｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−フェニルカルボニルアミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール１３．９ｇ（６５％）を得た。ｍｐ２１８−２２１℃；1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_1.72(s、3H)、1.76(d、J=7.3Hz、3H)、1.98(s、3H)、5.52(q、J=7.3Hz、1H)、7.14-7.54(m、9H)、7.68-7.72(dd、J=1.4Hz、6.9Hz、2H)、10.73(s、1H);MS(ES):344.4(M++1)。
【０３０９】
1Liebigs Ann.Chem.1986、1485-1505。
【０３１０】
調製７：
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−フェニルカルボキシアミド−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール（１．０ｇ、２．９２ｍｍｏｌ）のメタノール（１０．０ｍＬ）溶液に、濃硫酸（１．０ｍＬ）を０℃で添加した。得られた混合物を、１５時間還流させ、室温に冷却した。沈殿物をろ過してｄｌ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン０．４８ｇ（４８％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_2.02(d、J=7.4Hz、3H)、2.04(s、3H)、2.41(s、3H)、6.25(q、J=7.4Hz、1H)、7.22-7.50(m、9H)、8.07-8.12(dd、J=3.4Hz、6.8Hz、2H)、10.51(s、1H);MS(ES):344.2(M++1)。
【０３１１】
調製８：
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−ベンゾイルアミノ−３−シアノ−４−ジメチルピロール（７８５ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）と濃Ｈ２ＳＯ４（１ｍＬ）のＤＭＦ（１３ｍＬ）溶液を１３０℃で４８時間撹拌した。この黒色溶液をＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＮａＯＨ（３０ｍＬ）及び塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を乾燥させ、ろ過し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；８／２  ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ、Ｒｆ  ０．３５）で精製してｄｌ−５−メチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンの褐色固体（１８４ｍｇ、２４％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_8.18(m、2H、Ar-H)、7.62-7.44(m、3H、Ar-H)、7.40-7.18(m、5H、Ar-H)、6.48(s、1H、ヒ゜ロール-H)、6.28(q、1H、J=7.2Hz、CH-CH3)、2.18(s、3H、ヒ゜ロール-CH3)、2.07(d、3H、J=7.2Hz、CH-CH3);MS(ES):330.2(M++1)。
【０３１２】
調製９：
ｄｌ−１−（１−フェニルエチル）−２−アミノ−３−シアノ−４，５−ジメチルピロール（９．６０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）とギ酸（５０．０ｍＬ、９８％）の混合物を５時間還流させた。室温まで冷却させてフラスコ側面を擦ると多量の沈殿物が形成され、それをろ過した。この物質を、洗液が中性のｐＨを示すまで水で洗浄して、ｄｌ−５，６−ジメチル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オンを得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ 1.96(d、J=7.4hz、3H)、2.00(s、3H)、2.38(s、3H)、6.21(q、J=7.4Hz、1H)、7.11-7.35(m、5H)、7.81(s、1H)、11.71(s、1H);MS(ES):268.2(M++1)。
【０３１３】
調製１０：
ｄｌ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−７−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（１．０ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）をポリリン酸（３０．０ｍＬ）に懸濁させた。この混合物を１００℃で４時間加熱した。加熱した懸濁液を氷水に注ぎ、激しく撹拌して懸濁液を分散させ、固体ＫＯＨでｐＨ６の塩基性にした。得られた固体をろ過し、収集して、５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン０．４９ｇ（６９％）を得た。1H NMR(200MHz、DMSO-d6)δ_2.17(s、3H)、2.22(s、3H)、7.45(br、3H)、8.07(br、2H、)、11.49(s、1H)、11.82(s、1H);MS(ES):344.2(M++1)。
【０３１４】
調製１１：
５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（１．０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）のオキシ塩化リン（２５．０ｍＬ）溶液を６時間還流させ、次いで、減圧濃縮して乾燥状態にした。残渣に水を添加して結晶化させ、得られた固体をろ過し、回収して４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン０．９０ｇ（８３％）を得た。1H NMR(200MHz、DMSO-d6) δ_2.33(s、3H)、2.33(s、3H)、7.46-7.49(m、3H)、8.30-8.35(m、2H)、12.20(s、1H);MS(ES):258.1(M++1)。
【０３１５】
調製１２：
ｄｌ−１，２−ジアミノプロパン（１．４８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）と炭酸ナトリウム（２．７３ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）のジオキサン（１００．０ｍＬ）と水（１００．０ｍＬ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ジカーボネート（４．８０ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた混合物を１４時間撹拌した。ジオキサンを減圧除去した。沈殿物をろ過して分離させ、ろ液を減圧濃縮して乾燥状態にした。残渣をＥｔＯＡｃで研和し、次いで、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し乾燥状態にして、通常のクロマトグラフィ法では分離不可能であるｄｌ−１−アミノ−２−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパンとｄｌ−２−アミノ−１−（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニルアミノ−プロパンの混合物を得た。
【０３１６】
調製１３：
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−ＯＨ（１．０ｇ、３．２１２ｍｍｏｌ）と塩化オキサリル（０．４２８ｇ、０．２９ｍＬ、３．３７３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０．０ｍＬ）溶液に、数滴のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを０℃で添加した。この混合物を室温で１時間撹拌し、続いてシクロプロピルメチルアミン（０．２２９ｇ、０．２８ｍＬ、３．２１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．６５ｇ、０．９０ｍＬ、６．４２４ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、混合物を１Ｍ塩酸塩（１０．０ｍＬ）で処理し、水性混合物をジクロロメタン（３ｘ３０．０ｍＬ）で抽出した。この有機溶液を減圧濃縮して乾燥状態にした。残渣を２０％ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルフォルアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒａｍｉｄｅ）（２０．０ｍＬ）溶液で０．５時間処理した。溶媒を減圧除去した後、残渣を１Ｍ塩酸塩（２０．０ｍＬ）及び酢酸エチル（２０．０ｍＬ）で処理した。混合物を分離させ、水性層を固体水酸化ナトリウムでｐＨ＝８の塩基性にした。沈殿物をろ過除去し、水溶液をイオン交換カラムにかけ、２０％ピリジンで溶出させてＮ−シクロプロピルメチルβ−アラニンアミド０．２６２ｇ（５７％）を得た。1H NMR(200MHz、CD3OD)δ_0.22(m、2H)、0.49(m、2H)、0.96(m、2H)、2.40(t、2H)、2.92(t、2H)、3.05(d、2H);MS(ES):143.1(M++1)。
【０３１７】
調製１４：
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン。
【０３１８】
トランス−１，４−シクロネキシルジアミン（ｔｒａｎｓ−１，４−ｃｙｃｌｏｎｅｘｙｌｄｉａｍｉｎｅ）（６．０８ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させた。ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（４０ｍＬジクロロメタン中２．３２ｇ、１０．６５ｍｍｏｌ）をカニューレを用いて添加した。２０時間後、反応物をＣＨＣｌ３と水に分配した。これらの層を分離させ、水層をＣＨＣｌ３（３ｘ）で抽出した。混合有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して白色固体１．２０ｇ（５３％）を得た。1H-NMR(200MHz、CDCl3):δ 1.0-1.3(m、4H)、1.44(s、9H)、1.8-2.1(m、4H)、2.62(brm、1H)、3.40(brs、1H)、4.37(brs、1HO;MS(ES):215.2(M++1)。
【０３１９】
4-(N-アセチル)-N-tert-フ゛トキシカルホ゛ニル-トランス-1,4-シクロヘキシルシ゛アミン。
【０３２０】
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（５３０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させた。無水酢酸（２５０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を滴下した。１６時間後、反応物を水及びＣＨＣｌ３で希釈した。これらの層を分離させ、水層をＣＨＣｌ３（３ｘ）で抽出した。混合有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。再結晶化（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ）させて白色結晶１９０ｍｇ（３０％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3):δ 0.9-1.30(m、4H)、1.43(s、9H)、1.96-2.10(m、7H)、3.40(brs、1H)、3.70(brs、1H)、4.40(brs、1H)、4.40(brs、1H);MS(ES):257.2(M++1)、242.1(M+-15)、201.1(M+-56)。
【０３２１】
４−（４−トランス−アセトアミドシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
【０３２２】
４−（Ｎ−アセチル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（１９０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈した。１６時間後、反応物を濃縮した。粗製固体、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（２００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び４−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン（３５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をフラスコ中で混合し、１３０℃に加熱した。４．５時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃと水で希釈した。これらの層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出した。混合有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。クロマトグラフィ（シリカ予備プレート；２０：１  ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＨ）によって黄褐色固体０．３ｍｇ（収率１％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）：３７８．２（Ｍ＋＋１）。
【０３２３】
４−（Ｎ−メタンスルホニル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン。
【０３２４】
トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（５３０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（２３３ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）で希釈した。メタンスルホニルクロリド（３００ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を滴下した。１６時間後、反応物を水とＣＨＣｌ３で希釈した。これらの層を分離させ、水層をＣＨＣｌ３（３ｘ）で抽出した。混合有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。再結晶化（ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ）させて白色結晶２０６ｍｇ（２９％）を得た。1H-NMR(200MHz、CDCl3):δ 1.10-1.40(m、4H)、1.45(s、9H)、2.00-2.20(m、4H)、2.98(s、3H)、3.20-3.50(brs、2H)、4.37(brs、1H);MS(ES)293.1(M++1)、278.1(M+-15)、237.1(M+-56)。
【０３２５】
４−（４−トランス−メタンスルファミドシクロヘキシル）アミノ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−（１−フェニルエチル）ピロロ［２，３ｄ］ピリミジン。
【０３２６】
４−（Ｎ−スルホニル）−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−トランス−１，４−シクロヘキシルジアミン（２０６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解させ、ＴＦＡ（６ｍＬ）で希釈した。１６時間後、反応物を濃縮した。粗製反応混合物、ＤＭＳＯ（２ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（１００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）及び１−クロロ−５，６−ジメチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３ｄ］ピリミジンをフラスコ中で混合し、１３０℃に加熱した。１５時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ）で希釈した。混合有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。クロマトグラフィ（シリカ予備プレート、２０：１  ＣＨＣｌ３／ＥｔＯＨ）によって黄褐色固体２．６ｍｇ（収率５％）を得た。ＭＳ（ＥＳ）：４１４．２（Ｍ＋＋１）。
【化４０】
2005529062.tif 000038
【０３２７】
塩基性条件下、（７）（スキームＩＸ）のピロール窒素をジ−ｔ−ブチルジカーボネートで保護して、対応するカーバメイト（２２）を得た。（２２）のラジカル臭素化を位置選択的に進めて臭化物（２３）を得た。一般に、化合物（２３）は、様々な求核性カップリングの相手に対する重要な求電子性中間体として役立った。臭化アルキルをナトリウムフェノラート三水和物で置換して、化合物（２４）を得た。続いて塩化アリールの置換とｔ−ブチルカーバメイト保護基の除去を１段で行って所望の化合物（２５）を得た。
【０３２８】
スキームＩＸに従う化合物（２２）−（２５）の精密な合成
【化４１】
2005529062.tif 000039
【０３２９】
ジ−ｔ−ブチルジカーボネート（５．３７ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（１．１３ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を、（７）（１．５０ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）とピリジン（３０ｍＬ）を含有する溶液に添加した。２０時間後、反応物を濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２と水に分配した。ＣＨ２Ｃｌ２層を分離させ、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して黒色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；１／９  ＥｔＯＡｃ／へキサン、Ｒｆ  ０．４０）によって白色固体（２２）１．７０ｇ（８０％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_8.50(m、2H、Ar-H)、7.45(m、3H、Ar-H)、6.39(s、1H、ピロール-H)、2.66(s、3H、ヒ゜ロール-CH3)、1.76(s、9H、カーバメイト-CH3);MS、M+1=344.1;Mpt=175-177℃。
【化４２】
2005529062.tif 000040
【０３３０】
Ｎ−ブロモスクシンイミド（５０８ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１１２ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）を、（２２）（９３５ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）とＣＣｌ４（５０ｍＬ）を含有する溶液に添加した。この溶液を加熱し還流させた。２時間後、反応物を室温に冷却し、減圧濃縮して白色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；１／１  ＣＨ２Ｃｌ２／へキサン、Ｒｆ  ０．３０）によって白色固体（２３）９６０ｍｇ（８４％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_8.52(m、2H、Ar-H)、7.48(m、3H、Ar-H)、6.76(s、1H、ヒ゜ロール-H)、4.93(s、2H、ヒ゜ロール-CH2Br)、1.79(s、9H、カーハ゛メイト-CH3);MS、M+1=423.9;Mpt=155-157℃。
【化４３】
2005529062.tif 000041
【０３３１】
ナトリウムフェノキシド三水和物（１７３ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を、臭化物（２３）（４１０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）とＤＭＦ（１０ｍＬ）の溶液に一括添加した。２時間後、反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２と水に分配した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。混合ＣＨ２Ｃｌ２層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して黄色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；１／６  ＥｔＯＡｃ／へキサン、Ｒｆ  ０．３０）によって、白色固体（２４）２１０ｍｇ（５０％）を得た。1H NMR(200MHz、CDCl3)δ_8.53(m、2H、Ar-H)、7.48(m、3H、Ar-H)、7.34(m、2H、Ar-H)、7.03(m、3H、Ar-H)、6.83(s、1H、ヒ゜ロール-H)、5.45(s、2H、ArCH2O)、1.76(s、9H、カーハ゛メイト-CH3);MS、M+=436.2。
【化４４】
2005529062.tif 000042
【０３３２】
（２４）（８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ−アセチルエチレンジアミン（２０１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）及びＤＭＳＯ（３ｍＬ）を含有する溶液を１００℃に加熱した。１時間後、１３０℃に昇温した。３時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃと水に分配した。水層をＥｔＯＡｃ（２ｘ）で抽出した。混合ＥｔＯＡｃ層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２；１／１０  ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ３、Ｒｆ  ０．２５）によって白色泡沫状固体（２５）７３ｍｇ（９３％）を得た。1H NMR(200MHz、DMSO-d6)δ 11.81(br s、1H、N-H)、8.39(m、2H、Ar-H)、8.03(br t、1H、N-H)、7.57(br t、1H、N-H)、7.20-7.50(m、5H、Ar-H)、6.89-7.09(m、3H、Ar-H)、6.59(s、1H、ヒ゜ロール-H)、5.12(s、2H、ArCH2O)、3.61(m、2H、NCH2)、3.36(m、2H、NCH2)、1.79(s、3H、COCH3);MS、M+1=402.6。
【０３３３】
実施例１：アデノシンＡ３アンタゴニスト実験
化合物1720:1H-NMR(CD3OD)δ 3.05(t、2H、J=7.0Hz)、3.94(t、2H、J=7.0Hz)、6.50(d、1H、J=3.5Hz)、6.88(brs、1H)、7.04(d、1H、J=3.5Hz)、7.42(m、3H)、7.57(s、1H)、8.34(m、2H);MS(ES):305.1(M++1);Mpt=234-235℃。
【０３３４】
化合物1721:(20%)。1H NMR(CD3OD、400MHz)δ 3.22(t、2H、J=6.4Hz)、4.11(t、2H、J=6.4Hz)、6.73(s、2H)、7.26(d、1H、J=3.2Hz)、7.37(s、1H)、7.57(m、2H)、8.15(m、1H)、8.22(m、1H)、8.71(s、1H);MS(ES)338.95、340.95(M、M+2)。
【０３３５】
化合物1722:(41%)。Mp 199-200℃。1H NMR(CD3OD、200MHz)δ 3.25(m、2H)、4.05(t、2H、J=7.0Hz)、6.48(d、1H、J=3.8Hz)、7.05(d、1H、J=3.6Hz);MS(ES)349.93、351.94(M、M+2)。
【０３３６】
化合物1723:(84%)。Mp 183-185℃。1H NMR(CD3OD、200MHz)δ 2.24(m、2H)、3.69(t、2H、J=6.6Hz)、4.18(t、2H、J=7Hz)、6.50(d、1H、J=3.6Hz)、7.06(m、3H)、7.37(brs、2H)、7.65(brs、1H)、8.25(m、2H);MS(ES)352.9、354.9(M、M+2)。
【０３３７】
化合物1724:(83%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 3.15(m、2H)、3.82(m、2H)、6.45(m、1H)、7.12(m、1H)、7.41(m、2H)、7.55(m、2H)、7.74(m、1H)、7.02(s、1H)、8.38(m、1H、)、8.46(m、1H)。MS(ES)315.95(M+1)。
【０３３８】
化合物1725:(70%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 3.15(m、2H)、3.82(m、2H)、6.45(m、1H)、7.12(m、1H)、7.41(m、2H)、7.55(m、2H)、7.74(m、1H)、7.02(s、1H)、8.38(m、1H)、8.46(m、1H)。MS(ES)315.97(M+1)。
【０３３９】
化合物1726:(58%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 3.01(m、2H)、3.82(m、2H)、6.45(m、1H)、7.12(m、1H)、7.41(m、2H)、7.55(m、2H)、7.74(m、1H)、7.02(s、1H)、8.38(m、1H)、8.46(m、1H)。MS(ES)315.99(M+1)。
【０３４０】
化合物1727:(64%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 3.20(m、2H)、3.40(s、3H)4.2(m、2H)、6.65(m、1H)、7.12(m、1H)、7.41(m、2H)、7.55(m、2H)、7.74(m、1H)、7.02(s、1H)、8.38(m、1H)、8.46(m、1H)。MS(ES)329.99(M+1)。
【０３４１】
化合物1728：(30%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.82(t、2H、J=7.8Hz)、3.5(s、3H)、3.69(t、2 H、J=8.4Hz)、6.51(m、1H)、6.89(s、1H)、7.049(s、1 H)、7.41(m、3H、J=7Hz)、8.34(d、2H、J=5.8Hz)。MS(ES)318.99(M+1)。
【０３４２】
化合物1729：(29%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.82(t、2H、J=7.8Hz)、3.5(s、3H)、3.69(t、2 H、J=8.4Hz)、6.51(d、1H)、6.89(s、1 H)、7.049(s、1 H)、7.41(m、3H、J=7Hz)、8.34(d、2H、J=7.6Hz)。MS(ES)319.03(M+1)。
【０３４３】
化合物1730：1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 1.74(m、2H)、3.10(dt、2H、J=6.2、6.2Hz)、3.56(dt、2H、J=6.2Hz)、5.67(m、1H)、5.93(t、1H、J=5.6Hz)、6.54(dd、1H、J=1.8、3.2Hz)、7.10(dd、1H、J=2.4、3.5Hz)、7.40-7.54(m、3H)、8.30(m、2H)、11.38(brs、1H);MS(ES)：359.0(M++1)。
【０３４４】
化合物1731：1H NMR(d6-DMSO、400MHz)δ 2.31(s、3H)、2.89(m、2H)、3.75(dd、2H、J=8.0、13.6Hz)、6.21(s、1H)、6.84(s、1H)、7.43(m、3H)、7.54(s、1H)、8.34(m、2H)、11.45(s、1H)、11.83(brs、1H)。MS(ES)352.9(M+1、35Cl)、354.9(M+1、37Cl)。
【０３４５】
化合物1732：(62%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.12(tt、2H、J=7Hz)、3.57(dt、2H、J=6.6Hz)、4.11(t、2H、J=7Hz)、6.5-6.7(m、1H)、6.93(s、1H)、7.15-7.25(m、1H)、7.24(dd、1H、J=1Hz)、7.35-7.55(m、4H)、7.68(s、1H)、8.28-8.38(m、2H)、11.58(s、1H)MS(ES)318.98(M+1)。
【０３４６】
化合物1733：(75%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.7-2.9(m、2H)、4.17-4.33(m、2H)、4.9-5.1(m、2H)、6.687(d、1H、J= )、7.26(d、1H、J= )7.35-7.55(m、4H)、8.35-8.48(m、2H)、11.7-11.9(m、1H)。MS(ES)316.95(M+1)。
【０３４７】
化合物1735：(32%)。1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.63(t、2H、J=9.4Hz)、2.92(t、2H、J=9.4Hz)、3.75(s、3H)、6.51(s、1H)、6.81(s、1H)、6.94(d、1H、J=7Hz)、7.04(d、1H)、7.27(t、1H)、7.5(s、1H)、7.93(d、1H、J=8.4Hz)。MS(ES)324.94(M+1)。
【０３４８】
実施例２：アデノシンＡ１アンタゴニスト実験。
【０３４９】
化合物１６３１（塩）：1H NMR(d6-DMSO、200MHz)δ 2.05(m、1H)、2.23(m、1H)、2.38(s、3H)、3.90(m、1H)、4.15(m、1H)、4.51(brs、1H)、4.83(m、1H)、6.73(brs、1H)、7.07(brs、1H)、7.29(s、1H)、7.51(m、3H)、7.69(s、1H)、8.29(m、2H)、12.02(brs、1H)。MS(ES)323.9(M+1)。
【０３５０】
実施例３：［２−（３Ｈ−イミダゾル−４−イル）−エチル］−（２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−アミン（１７２０）
合成スキームＶＩＩの前駆体化合物１を使用して化合物１７２０を合成した。
【化４５】
2005529062.tif 000043
【０３５１】
塩化アリール１（４００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）及びヒスタミン（１．６７ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を混合し、窒素下で１２０℃に加熱する。６．５時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃと水に分配する。これらの層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出する。混合有機層を、塩水（２ｘ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して褐色の固体４９４ｍｇを得る。この固体を冷ＭｅＯＨで洗浄し、ＭｅＯＨから再結晶化させてオフホワイトの固体（１７２０）１９７ｍｇ（４３％）を得る。1H-NMR(CD3OD)d 3.05(t、2H、J=7.0Hz)、3.94(t、2H、J=7.0Hz)、6.50(d、1H、J=3.5Hz)、6.88(brs、1H)、7.04(d、1H、J=3.5Hz)、7.42(m、3H)、7.57(s、1H)、8.34(m、2H);MS(ES):305.1(M++1);Mpt=234-235℃。
【０３５２】
実施例４：化合物１７２１−１７２３の合成
【化４６】
2005529062.tif 000044
【０３５３】
化合物１（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びヒスタミン（１８５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させる。反応物をアルゴン下８０℃で１０時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃと水に分配した。これらの層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（１−２％ＭｅＯＨ）で抽出した。混合有機層を、水（２ｘ）及び塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して褐色オイルを得た。この化合物を、Ｐｒｅｐ  ＴＬＣによって１０％ＭｅＯＨのＭｅＣｌ２溶液を用いて精製して白色固体２２．６ｍｇ（２０％）を得た。
【０３５４】
実施例５：化合物１７２４、１７２５、１７２６、１７２７、１７２８、１７２９及び１７３５の合成：
【化４７】
2005529062.tif 000045
【０３５５】
（スキームＶＩＩによって合成された）化合物２（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、二塩酸ヒスタミン（４９７ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）、炭酸水素カリウム（５７２ｍｇ、５．７２ｍｍｏｌ）を窒素下でＤＭＳＯ  ０．５ｍｌに溶解させた。この混合物を、８０℃で１２時間加熱した。ＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で判断して反応は完結したと考えられた。この混合物を水（５ｍｌ）で希釈し、５％ＭｅＯＨのＣＨＣｌ３（３ｘ１０ｍＬ）溶液で抽出した。有機相を混合し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過した。溶媒を除去して褐色オイルを得た。このオイルをＳｉＯ２（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）のクロマトグラフィによって分離させた。この溶媒を除去し、生成物としてオフホワイトの固体（３６ｍｇ）を得た。
【０３５６】
実施例６：化合物１７３１を以下のスキームに従って合成した：
【化４８】
2005529062.tif 000046
【０３５７】
４−クロロ−６−メチル−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］塩酸ピリミジン（５３３ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）及びヒスタミン（９４２ｍｇ、８．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解させた。次いで、反応物を８０℃に加熱した。１９時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃと水に分配した。水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ）で抽出した。有機層を混合し、水、次いで塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して褐色オイル６４０ｍｇを得た。このオイルを１０％ＭｅＯＨのＣＨＣｌ３溶液に溶解させ、得られた沈殿物をろ過して淡いオレンジ色のカラム４０５ｍｇを得た。逆相フラッシュクロマトグラフィ（Ｃ１８、勾配５０％ＭｅＯＨ（水溶液）−１００％ＭｅＯＨ）によって脱色させ、白色固体（５５％）３３０ｍｇを得た。この固体をＥｔＯＨに溶解させ、重力ろ過した。沈殿物が形成されるまで、得られた溶液を水で徐々に希釈し静置した。固体をろ過し、５０％ＥｔＯＨ（水溶液）で洗浄し、終夜乾燥させて（６０℃、０．１ｍｍＨｇ）白色固体２５０ｍｇを得た。Ｍｐ  ２１５−２１７℃。
【０３５８】
ＩＲ  １５４２、１５６８、１５８６ｃｍ−１。
【０３５９】
実施例７：化合物１７３２の合成。
【化４９】
2005529062.tif 000047
【０３６０】
化合物１７３２の一般的合成手順：化合物１（４．７５、１７．９ｍｍｏｌ）及びヒスタミン（５．９８ｇ、５３．８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（無水、４０ｍＬ）に溶解させ、オイルバスで８０℃に加熱し、窒素下で終夜撹拌する。約１０時間後、反応物を減圧濃縮した。この残渣をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨと水に分配した。これらの層を分離させ、水層をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（３ｘ）で再抽出した。混合有機層を塩水（ｌｘ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して暗褐色オイルを得、続いてこれをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９０／１０）で研和した。徐々に（終夜）沈殿物が生じ、それをろ過し、ＣＨＣｌ３で洗浄してオフホワイト／黄褐色固体４．９５ｇ（９１％）を得た。この物質は、Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳデータから、９７％を超える純度と考えられた。
【０３６１】
５０／５０（約６００ｍＬ）ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物に物質を加熱溶解させて、着色不純物を除去した。溶解後、物質を室温に冷却し、ＢｉｏｔａｇｅシステムのＣ−１８  ５５ｇを充填したカラム（Ｂｉｏｔａｇｅ−ＫＰ−Ｃ１８−ＨＳ）に通した。勾配システム（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）を操作して、画分２５０ｍＬを回収し、５０／５０  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ  １．２Ｌ；６０／４０  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ  ０．７５Ｌ；７５／２５  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ  ０．７５Ｌ；最後に１００％ＥｔＯＨ  ０．７５Ｌで溶出させた。それらの画分を回収し、Ｓａｖａｎｔ  ｓｐｅｅｄ−ｖａｃを用いて遠心沈殿させ、加温した１００％ＥｔＯＨにその純粋画分を再溶解させ、ろ紙を通して重力ろ過してあらゆるＣ−１８残渣を除去し、次いで試料をＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで結晶化／沈降分離させて、オフホワイト固体２．６７ｇを得た。この固体は、Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳから、９９％を超える純度と考えられた。
【０３６２】
実施例８：化合物１７３３の合成
【化５０】
2005529062.tif 000048
【０３６３】
二塩酸ヒスタミン（５００ｍｇ、２．７１ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１２２ｍｇ、４．１ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（６ｍＬ）に溶解させ、４時間還流させた。ＬＣ−ＭＳから、４時間後にすべてのＳＭが消費されたと考えられた。反応混合物を濃縮して、淡黄色固体５２０ｍｇを得た。これを粗製物として、次段階の塩化物置換に使用した。
【０３６４】
塩化物置換を実施例２１のとおりに進めた。
【０３６５】
実施例９：化合物１６３１の合成
（２Ｓ、４Ｒ）−４−ヒドロキシ−１−（２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル）−ピロリジン−２−カルボン酸アミドメタンスルホン酸（１６３１）の合成
【化５１】
2005529062.tif 000049
【０３６６】
以下の合成データは、化合物１６３１の塩に対するものである。
【０３６７】
４−クロロ−２−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（４．４ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）（スキームＶＩＩ）、ＮａＨＣＯ３（２．９ｇ、３３ｍｍｏｌ）及びトランス−４−ヒドロキシ−（Ｌ）−プロリンアミド（８．６ｇ、６６．１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８０ｍＬ）に溶解させた。次いで、反応物を８０℃に加熱した。２０時間後、反応物を室温に冷却し、ＥｔＯＡｃと水に分配した。水層をＥｔＯＡｃ（７ｘ）で抽出した。有機層を混合し、水、次いで塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して褐色固体４．８ｇを得た。この固体をＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）と混合し、還流させながら０．５時間加熱した。室温に冷却後、その不均一な溶液をろ過し、ＣＨ３ＯＨで洗浄して、黄褐色固体３．４４ｇ（７４％）を得た。遊離塩基（３．１ｇ、９．６５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨとＴＨＦ（３００ｍＬ；５：３  ＥｔＯＨ／ＴＨＦ）混合物に溶解させた。次いで、その均一溶液にメタンスルホン酸（９２７ｍｇ、９．６５ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。この溶液をろ過して沈殿物を分離させ、５：３  ＥｔＯＨ／ＴＨＦで洗浄した。試料を乾燥させて（６０℃、０．ｌｍｍＨｇ）、黄褐色固体３．４ｇ（８４％）を得た。Ｍｐ  ２５７−２５８℃（分解）。
【０３６８】
化合物の活性
本明細書、特に１３４−１３５ページに記載する化合物１７２０に対して、アデノシン３（Ａ３）受容体競合放射性リガンド結合を実施した。化合物１７２０は、Ａ３受容体結合親和性が、本明細書、特に１３８−１４１ページの表８に記載する標準化合物１３０８よりも１０倍以上大きいことが判明した。本発明の化合物の結合及び溶解性データを表３に示す。
【０３６９】
同様のＡ３受容体競合放射性リガンド結合を、化合物１７２１−１７３５に対しても実施した。化合物１７２１−１７２９及び１７３０−１７３５は、それぞれのＡ１受容体結合親和性よりも高いＡ３受容体親和性を示した。なかでも、化合物１７２１、１７３０、１７３１、１７３３及び１７３５は、下記表３に示すように、化合物１７２０、したがって基準化合物１３０８よりも優れた諸特性を有することが判明した。したがって、化合物１７２１、１７３０、１７３１、１７３３及び１７３５は、開示した他のＡ３化合物よりもかなり優れた諸特性を示す。
【０３７０】
本明細書、特に１３４−１３５ページに記載する化合物１６３１に対して、アデノシン１（Ａ１）受容体サブタイプ飽和及び競合放射性リガンド結合を実施した。この化合物は、本明細書、特に１３８−１４１ページの表８に記載する標準化合物１３１８又は１３１９以上のＡ１受容体結合親和性があった。CambridgeSoft Corporation、100 Cambridge Park Drive、Cambridge、MA 02140によって提供されたコンピュータプログラムＣＳ  ＣｈｅｍＤｒａｗ、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｕｌｔｒａ  ｖｅｒ．６．０（著作権）１９９９を用いて計算されたｃＬｏｇＰ値から、化合物１６３１の水溶性は、標準化合物１３１８又は１３１９よりも良好であると予想される。化合物１６３１のｃＬｏｇＰ値は２．０５である。
【０３７１】
化合物１６３１は、ｃＬｏｇＰ値が約３．８である標準化合物１３１８又は１３１９よりも低いｃＬｏｇＰ値を示した。標準化合物１３１８又は１３１９よりも低いｃＬｏｇＰ値を有し、より極性の高いＡ１受容体化合物が、これらの標準化合物と比較して、依然として効力及びＡ１受容体結合選択性を保持していることは予測できなかった。
【表３】
2005529062.tif 000050
【０３７２】
ヒトアデノシンＡ１およびＡ２ａ受容体に対する酵母β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイ：  ヒトアデノシンＡ１（Ａ１Ｒ；ＣＡＤＵＳ株  ＣＹ１２６６０）またはヒトＡ２ａ（Ａ２ａ；ＣＡＤＵＳ株  ＣＹ８３６２）により、酵母株（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換し、さらにｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）レポーター遺伝子を付加して機能発現の読出し機構として利用した。形質転換についての完全な説明を下記に挙げる（酵母株参照）。Ａ１およびＡ２ａ受容体に対して同等の親和性を有する、強力なアデノシン受容体ゴニストであるＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）を、全アッセイにおいてリガンドとして用いた。８段階の濃度（０．１−１０，０００ｎＭ）で、被検化合物が有するＮＥＣＡ−誘導性β−ガラクトシダーゼ活性阻害能について、ＣＹ１２６６０またはＣＹ８３６２を用いて調べた。
【０３７３】
酵母保存用培養物の調製：  各酵母株、ＣＹ１２６６０およびＣＹ８３６２を別々にＬＴ寒天プレートにストリークし、コロニーが観察されるようになるまで３０℃にてインキュベーションを行った。これらのコロニーから得た酵母をＬＴ液体培地（ｐＨ６．８）に添加し、一晩、３０℃で培養した。次に各酵母株を、吸光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶＭＡＸ）による測定値がＯＤ６００＝１．０−２．０（およそ１−２ｘ１０７細胞／ｍｌ）になるように希釈した。各６ｍｌの酵母液体培養物に対して、４ｍｌの４０％グリセロール（１：１．５体積：体積）を添加した（「酵母／グリセロールストック」）。この酵母／グリセロールストックから、１０本の１ｍｌ分注試料を調製し、アッセイに必要となるまで−８０℃で保存した。
【０３７４】
酵母Ａ１ＲおよびＡ２ａＲ解析：ＣＹ８３６２およびＣＹ１２６６０の酵母／グリセロールストックのバイアルを各１本ずつ融解し、物質をさらに補充したＬＴ液体培地、ｐＨ６．８（９２ｍｌのＬＴ液体培地に対して、５ｍｌの４０％グルコース、０．４５ｍｌの１Ｍ  ＫＯＨおよび２．５ｍｌのＰｉｐｅｓ、ｐＨ６．８が添加されている）へと接種するために使用した。液体培養物を、３０℃で１６−１８時間（一晩）培養した。次に、一晩培養した培養物から分注した試料を、４Ｕ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼ（ウシ小腸粘膜由来Ｔｙｐｅ  ＶＩまたはＶＩＩ、Ｓｉｇｍａ）を含有するＬＴ培地中に希釈して、ＣＹ８３６２（Ａ２ａＲ）の場合はＯＤ６００＝０．１５（１．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）になるように、ＣＹ１２６６０（Ａ１Ｒ）の場合はＯＤ６００＝０．５０（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）になるようにした。
【０３７５】
９６穴マイクロタイタープレート中で、最終的な体積が１００μｌ、全ウェル中のＤＭＳＯの最終濃度が２％になるようにしてアッセイを行った。最初のスクリーニングで、被検化合物を１−２段階の濃度で用いた（１０μＭ、１μＭ）。化合物の性質を調べるために、８段階の濃度（１００００、１０００、５００、１００、５０、１０、１および０．１ｎＭ）で分析した。各マイクロタイタープレートに対して、「コントロール」および「トータル」ウェルには１０μｌの２０％ＤＭＳＯを添加し、「未知」のウェルには１０μｌの被検化合物（２０％  ＤＭＳＯ中）を添加した。続いて、「トータル」および「未知の」ウェルに対しては、１０μｌのＮＥＣＡ（Ａ１Ｒの場合５μＭ、Ａ２ａＲの場合１μＭ）を添加し、「コントロール」ウェルに対しては１０μｌのＰＢＳを添加した。最後に、全てのウェルに対して、８０μｌの酵母株ＣＹ８３６２またはＣＹ１２６６０を添加した。次に、全てのプレートを短時間撹拌し（ＬａｂＬｉｎｅ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ、２−３分）、ドライオーブン中で３０℃にて４時間、インキュベーションを行った。
【０３７６】
β−ガラクトシダ−ゼ活性は、比色分析用基質（例えばＯＮＰＧ，ＣＰＲＧ）、発光基質（例えばＧａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ）または蛍光基質（例えばＦＤＧ，Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）のうち何れかを用いて定量することができる。現在では、シグナル：ノイズの比率が高いこと、相対的に妨害を受けにくいということ、および低コストであるという観点から蛍光検出が好まれている。蛍光性のβ−ガラクトシダ−ゼ基質である、フルオレセインジガラクトピラノシド（ＦＤＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓまたはＭａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、全ウェルに２０μｌ／ウェルずつ添加した（最終濃度＝８０μＭ）。プレートを５−６秒振盪し（ＬａｂＬｉｎｅ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）、次に、３７℃で９０分間インキュベーションを行った（９５％  Ｏ２／５％  ＣＯ２インキュベーター）。９０分のインキュベーション時間終了時に、２０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を停止させ、全てのプレートを５−６秒間振盪した。次に、プレートを６秒間振盪し、蛍光強度計（Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ；励起＝４８５ｎｍ、発光＝５３５ｎｍ）を用いて相対的蛍光強度を測定した。
【０３７７】
計算：「コントロール」ウェルの相対的蛍光値をバックグラウンドと解釈し、「全」および「未知の」値から差し引いた。対数変換（Ｘ軸：化合物濃度）により化合物プロファイルを解析し、次に単一部位競合カーブフィッティングによりＩＣ５０値を算出した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。
【０３７８】
酵母株：  Saccharomyces cerevisiae株、ＣＹ１２６６０[far1*1442 tbt1-1 fus1-HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3*1156 gpa1(41)-Gαi3 lys2 ura3 leu2 trp1:his3;LEU2 PGKp-Mfα1Leader-hA1R-PHO5term 2mu-orig REP3 Ampr]およびCY8362[gpa1p-rGαsE10K far1*1442 tbt1-1 fus1-HIS3 can1 ste14::trp1:LYS2 ste3*1156 lys2 ura3 leu2 trp1 his3;LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Ampr]を構築した。
【０３７９】
ＬＴ培地：  ＬＴ（Ｌｅｕ−Ｔｒｐを補充した）培地は、１００ｇのＤＩＦＣＯ酵母窒素ベースから構成され、さらに、１．０ｇのバリン、１．０ｇのアスパラギン酸、０．７５ｇのフェニルアラニン、０．９ｇのリジン、０．４５ｇのチロシン、０．４５ｇのイソロイシン、０．３ｇのメチオニン、０．６ｇのアデニン、０．４ｇのウラシル、０．３ｇのセリン、０．３ｇのプロリン、０．３ｇのシステイン、０．３ｇのアルギニン、０．９ｇのヒスチジンおよび１．０ｇのスレオニンが補充されている。
【０３８０】
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株の構築：この例では、酵母フェロモン系経路に、機能的に組み込まれたヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株の構築について記述する。
【０３８１】
Ｉ．発現ベクターの構築
ヒトＡ１アデノシン受容体に対する酵母発現ベクターを構築するために、公表されているヒトＡ１アデノシン受容体の配列を基にしてデザインしたプライマーと標準的技術を用いて、ヒト海馬ｍＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲによりＡ１アデノシン受容体ｃＤＮＡを得た。そのＰＣＲ産物を、酵母発現プラスミドｐＭＰ１５のＮｃｏＩおよびＸｂａＩサイトにサブクローニングした。
【０３８２】
次のようにしてｐＬＰＸｔからｐＭＰ１５プラスミドを構築した。ＹＥＰ５１(Broach,J.R.ら、(1983)“Vectors for high-level,inducible expression of cloned genes in yeast p.83-117 in M.Inouye(ed.), Experimental Manipulation of Gene Expression.Academic Press,New York)のＸｂａＩサイトを酵素消化により除去し、末端の塩基埋め込みおよび再ライゲーションを行い、Ｙｅｐ５１ＮｃｏＤＸｂａを構築した。ＢａｍＨＩでの消化、末端塩基埋め込み、リンカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、＃１０８１）ライゲーション、ＸｂａＩ消化および再ライゲーションを行って、ＢａｍＨＩサイトに別のＸｂａＩサイトを作出し、ＹＥＰ５１ＮｃｏＸｔを構築した。このプラスミドをＥｓｐ３１およびＮｃｏＩで消化し、ＰＣＲにより得たＬｅｕ２およびＰＧＫｐ断片とライゲーションを行った。Ｅｓｐ３１およびＢｇｌＩＩサイトを含有するプライマーを用いてＹＥＰ５１Ｎｃｏから増幅を行うことにより２ｋｂのＬｅｕ２ＰＣＲ産物を得た。ＢｇｌＩＩおよびＮｃｏＩサイトを含有するＰＣＲプライマーを用いてｐＰＧＫαｓ（Ｋａｎｇ，Ｙ．−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２５８２−２５９０）から増幅を行うことにより６６０塩基対のＰＧＫｐ  ＰＣＲ産物を得た。得られたプラスミドをｐＬＰＸｔと称する。ａ−因子プレプロリーダーのコード領域をＮｃｏＩサイトに挿入してｐＬＰＸｔを改変した。リーダーの３’末端においてＮｃｏＩクローニングサイトが維持されるが、５’末端には再生されないように、プレプロリーダーを挿入した。このようにして、プラスミドをＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化することにより、受容体をクローニングすることができる。得られたプラスミドをｐＭＰ１５と称する。
【０３８３】
ヒトＡ１アデノシン受容体ｃＤＮＡが挿入されたｐＭＰ１５プラスミドをｐ５０５９と名付けた。このベクターでは、酵母ａ−因子プレプロリーダーの３’末端に受容体ｃＤＮＡが融合されている。タンパク質が成熟する間に、プレプロペプチド配列が切断されて成熟した完全長の受容体が作られる。これは、酵母分泌経路での受容体のプロセシング中に起こる。Ｌｅｕ選択（すなわち、ロイシンを欠く培地で培養を行う）により、このプラスミドを維持する。クローニングしたコード領域の配列を決定し、公表されている文献中の配列と同じものであることが分かった（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号Ｓ４５２３５およびＳ５６１４３）。
【０３８４】
ＩＩ．酵母株の構築
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株を作製するために、初発の親株として酵母株ＣＹ７９６７を用いた。ＣＹ７９６７の遺伝子型は次のとおりである：
MATα gpaD1163 gpa1(41)Gαi3 far1D1442 tbt-1 FUS1-HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3D1156 lys2 ura3 leu2 trp1 his3
遺伝子マーカーを下記にまとめる。
【表４】
2005529062.tif 000051
【０３８５】
エレクトロポレーションにより、２種類のプラスミドをＣＹ７９６７株に形質転換した。用いたプラスミドは、プラスミドｐ５０９５（ヒトＡ１アデノシン受容体をコードする；上記）およびＦＵＳ１−β−ガラクトシダ−ゼレポーター遺伝子プラスミドであるプラスミドｐ１５８４であった。プラスミドｐ１５８４は、プラスミドｐＲＳ４２６（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｔ．Ｗ．ら、（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１１２２）由来のものである。プラスミドｐＲＳ４２６は、ヌクレオチド２００４−２０１６にポリリンカー部位を含有する。ＦＵＳ１プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物を、ＥａｇＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位に挿入し、プラスミドｐ１５８４を作製した。Ｔｒｐ選択（つまり、ロイシンを欠く培地を用いて培養する）により、ｐ１５８４プラスミドを維持した。
【０３８６】
ｐ５０９５およびｐ１５８４を含有する得られた株（ＣＹ１２６６０と称する）は、ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する。この株を液体中または寒天プレート上で培養するために、ロイシンおよびトリプトファンを欠く最小培地を用いた。プレート上で増殖アッセイ（ＦＵＳ１−ＨＩＳ３のアッセイ）を行うために、プレートをｐＨ６．８とし、０．５−２．５ｍＭの３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを含有させ、ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジンを除去した。特異性に対する対照として、全ての実験において、他の酵母を１つ以上用いた７回膜貫通型受容体のスクリーニングと比較した。
【０３８７】
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株の構築
この例では、酵母フェロモン系経路中に機能的に組み込まれたヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株の構築について述べる。
【０３８８】
Ｉ．発現ベクターの構築
ヒトＡ２ａアデノシン受容体のための酵母発現ベクターを構築するために、ヒトＡ２ａ受容体のｃＤＮＡを、Ｄｒ．Ｐｈｉｌ  Ｍｕｒｐｈｙ（ＮＩＨ）から入手した。このクローンを受領してから直ちに、Ａ２ａ受容体挿入物の配列を調べ、公表されている配列と同じであることを明らかにした（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号  Ｓ４６９５０）。ＶＥＮＴポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、受容体ｃＤＮＡをプラスミドから切り出し、構成的なホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより酵母中で受容体を発現させるプラスミドｐＬＰＢＸにクローニングした。挿入断片全体の配列をもう一度決定し、公表されている配列と同一であることを明らかにした。しかし、用いたクローニング方法のため、受容体のカルボキシル末端に３個のアミノ酸、ＧｌｙＳｅｒＶａｌが付加されていた。
【０３８９】
ＩＩ．酵母株の構築
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株を作製するために、初発の親株として酵母株ＣＹ８３４２を用いた。ＣＹ８３４２の遺伝子型は、次のとおりである。即ち、MATa far1D1442 tbt1-1 lys2 ura3 leu2 trp1 his3 fus1-HIS3 can1 ste3D1156 gpaD1163 ste14::trp1::LYS2 gpa1p-rGαsE10K（またはｇｐａ１ｐ−ｒＧαｓＤ２２９Ｓまたはｇｐａ１ｐ−ｒＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ）である。
【０３９０】
Ｇ−タンパク質の変化を除き、遺伝子マーカーは、実施例１に記載のとおりである。ヒトＡ２ａ受容体を発現させるために、内因性酵母Ｇタンパク質ＧＰＡ１が欠失されて哺乳類Ｇαｓと置換されている酵母株を利用した。３つのラットＧαｓ突然変異体を用いた。これらの変異体には、１個または２個の点突然変異が含まれ、この点突然変異により、これらの突然変異体が酵母βγに効率よく結合するタンパク質へと改変される。これらの突然変異体を、ＧαｓＥ１０Ｋ（１０位のグルタミン酸がリジンに置換されている）、ＧαｓＤ２２９Ｓ（２２９位のアスパラギン酸がセリンに置換されている）、およびＧαｓＥ１０Ｋ＋２２９Ｓ（両方の点突然変異を含む）とする。
【０３９１】
親ベクターｐＬＰＢＸ（受容体）またはｐＬＰＢＸ−Ａ２ａ（受容体＋）のいずれかを用いて、（３種類の突然変異ラットＧαｓタンパク質のうち１つを含有する）ＣＹ８３４２株を形質転換した。β−ガラクトシダーゼコード配列（上記）に融合されているＦＵＳ１プロモーターを有するプラスミドを付加して、フェロモン反応経路の活性化の大きさを評価した。
【０３９２】
ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母株を用いた機能アッセイ
この例では、ヒトＡ１アデノシン受容体のモジュレーターに対する、酵母での機能スクリーニングアッセイの開発について述べる。
【０３９３】
Ｉ．アッセイに用いたリガンド
このアッセイを開発するために、本受容体に対する天然のアゴニストであるアデノシンと、他の２種類の合成アゴニストとを用いた。一部の実験では、ＥＣ５０がおよそ７５ｎＭであると報告されているアデノシンと、親和性がおよそ５０ｎＭであると報告されている（−）−Ｎ６−（２−フェニルイソプロピル）−アデノシン（ＰＩＡ）を用いた。全増殖アッセイにおいて、５’−Ｎ−エチルカルボキサミド−アデノシン（ＮＥＣＡ）を用いた。増殖培地中にアデノシンが存在することによって起こるシグナル伝達を抑制するために、アデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍｌ）を全アッセイに添加した。
【０３９４】
ＩＩ．酵母における生物学的反応
様々なＧタンパク質サブユニットを発現する一連の酵母株の中に、Ａ１受容体発現ベクター（ｐ５０９５、上記）を導入することにより、異種の酵母系の中でＡ１アデノシン受容体が機能的に共役できるかについて調べた。これらの形質転換体の多くがＧαｉまたはＧαｏのサブタイプのＧαサブユニットを発現した。さらなるＧαタンパク質に対しても、無作為の受容体Ｇαタンパク質との共役が可能であるか調べた。様々な株において、ＳＴＥ１８またはキメラＳＴＥ１８−Ｇγ２構築物が酵母ゲノムに組み込まれた。本酵母株は、欠失のあるＨＩＳ３遺伝子およびＦＵＳ１−ＨＩＳ３の組み込まれたコピーを内部に保有しており、これによって３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（０．２、０．５および１．０ｍＭで試験）を含有しヒスチジンを欠く選択培地での選択が可能であった。形質転換体を単離し、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、４Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼを含有しヒスチジンを欠く培地上で細胞単層を調製した。５μｌの様々な濃度のリガンド（例えば、０、０．１、１．０および１０ｍＭのＮＥＣＡ）を用いた。２日間、増殖をモニターした。このようにして、様々な酵母株において、リガンド依存的増殖反応を分析した。結果は、下記表５に要約されている。（−）印はリガンド依存的受容体活性化が検出されなかったことを示し、（＋）はリガンド依存的反応を示す。「ＬＩＲＭＡ」なる語は、リガンド非依存的受容体媒介性活性化を示す。 
【表５】
2005529062.tif 000052
【０３９５】
表５に示されているように、強いシグナル伝達の殆んどが、ＧＰＡ１（４１）−Ｇαｉ３キメラを発現する酵母株において起こることが明らかになった。
【０３９６】
ＩＩＩ．ｆｕｓ１−ＬａｃＺアッセイ
フェロモン反応経路の活性化の性質をさらに詳しく調べるために、アゴニスト刺激に応答して生じるｆｕｓ１ＬａｃＺを通じたβ−ガラクトシダーゼの合成を測定した。β−ガラクトシダーゼ分析を行うために、Ｓｔｅ１８−Ｇγ２キメラおよびＧＰＡ４１−Ｇαｉ３を同時発現する酵母株中で発現されるヒトＡ１アデノシン受容体の対数増殖中間期の培養物に、濃度を増加させながらリガンドを添加した。形質転換体を単離し、ヒスチジンおよび４Ｕ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼ存在下で一晩培養した。４Ｕ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼおよびリガンドとともに５時間インキュベーションを行った後、β−ガラクトシダ−ゼの基質としてＣＰＲＧを用いて、β−ガラクトシダーゼの誘導を測定した。各アッセイにつき５ｘ１０５個の細胞を用いた。
【０３９７】
ＮＥＣＡ刺激実験により得られた結果から、ＮＥＣＡ濃度が１０−８Ｍである場合に、β−ガラクトシダ−ゼ活性がおよそ２倍刺激されることが示された。さらに、ＮＥＣＡ濃度が１０−５Ｍでは、およそ１０倍の刺激指標が観察された。
【０３９８】
この株に対してアンタゴニストの活性が確認されたことにより、このアッセイの有用性が広がった。β−ガラクトシダ−ゼ分析においてＮＥＣＡ（５ｍＭ）と活性を競合する能力について、既知の２種類のアデノシンアンタゴニストであるＸＡＣおよびＤＰＣＰＸを調べた。これらの分析において、基質としてＦＤＧを用い、各アッセイ当り１．６ｘ１０５個の細胞を用いて、β−ガラクトシダーゼの誘導を測定した。ＸＡＣおよびＤＰＣＰＸの両者が酵母により発現されたＡ１アデノシン受容体の強力なアンタゴニストとして働き、ＩＣ５０値がそれぞれ４４ｎＭおよび４９ｎＭであることが、結果から示された。
【０３９９】
この阻害効果がＡ１サブタイプに対して特異的であるかどうかを調べるために、酵母を用いたＡ２ａ受容体アッセイ（実施例４に記載）により、一連の補足的実験を行った。Ａ２ａ酵母を用いたアッセイから得られた結果により、ＸＡＣが相対的に有効なＡ２ａ受容体ンタゴニストであることが示されたが、これは公表されている報告と一致する。これに対して、公表されている報告から予想されたように、この受容体に対してＤＰＣＰＸは相対的に活性が低かった。
【０４００】
ＩＶ．放射性リガンド結合
受容体の放射性リガンド結合パラメーターを測定することにより、Ａ１アデノシン受容体アッセイの特性をさらに調べた。ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母から調製した膜を用いて、いくつかのアデノシン受容体対照化合物、ＸＡＣ、ＤＰＣＰＸおよびＣＧＳによる［３Ｈ］ＣＰＸの置換結合について分析を行った。ヒトＡ１アデノシン受容体を発現する酵母膜から得た結果を、ヒトＡ２ａアデノシン受容体またはヒトＡ３受容体を発現する酵母膜から得られた結果と比較して、結合の特異性を調べた。このアッセイを行うために、０．４ｎＭ［３Ｈ］ＣＰＸおよび濃度を漸増させたアデノシン受容体リガンドとともに、５０ｍｇの膜をインキュベートした。インキュベーションは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５％  ＢＳＡおよび２Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ中で、６０分間、室温にて行った。氷冷した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加し、次にＰａｃｋａｒｄ  ９６ｗｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いて、０．５％  ポリエチレンイミンに予め浸漬しておいたＧＦ／Ｂフィルターで速やかに濾過することにより結合を停止させた。Ｐｒｉｓｍ２．０１ソフトウェアを用いて、非線形の最小２乗カーブフィット法によりデータを分析した。この実験で得られたＩＣ５０値を下記の表６にまとめる。
【表６】
2005529062.tif 000053
【０４０１】
これらのデータから、対照化合物が文献に報告されている親和性と一致する親和性を有することが示された。
【０４０２】
これらのデータからさらに、酵母を用いたアッセイが受容体サブタイプ特異性を区別するのに十分な感度を有することが示される。
【０４０３】
ヒトＡ２ａアデノシン受容体を発現する酵母株を用いた機能アッセイ
この例では、ヒトＡ１アデノシン受容体のモジュレーターに対する酵母での機能スクリーニングアッセイの開発について述べる。
【０４０４】
Ｉ．アッセイで用いたリガンド
機能的に酵母で発現されたヒトＡ２ａ受容体の研究に、天然のリガンドであるアデノシンおよび完全に特性が決定されている他の市販のリガンドを用いた。このアッセイの確立では、３種類のリガンドを使用している。それらには、以下のものが含まれる。
【０４０５】
2005529062.tif 000054
増殖培地中にアデノシンが存在することによるシグナル伝達を抑制するために、アデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍｌ）を全アッセイにおいて添加した。
【０４０６】
ＩＩ．酵母における生物学的反応
Ａ２ａ受容体発現プラスミドによって形質転換され、ＧαｓＥ１０Ｋ、ＧαｓＤ２２９ＳまたはＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓのいずれかを発現する酵母中のフェロモン反応経路の刺激能に関して、Ａ２ａ受容体アゴニストを調べた。フェロモン反応経路を受容体依存的に刺激する能力をリガンドが有することは、酵母の表現型の変化により示された。受容体活性化により、ヒスチジン栄養要求性からヒスチジン原栄養性へと表現型が改変された（ｆｕｓ１−ＨＩＳ３の活性化）。３種類の独立した形質転換体を単離し、ヒスチジンの存在下で一晩培養した。細胞を洗浄してヒスチジンを除去し、２ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。５μｌの各形質転換体を、４Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ存在下または非存在下で、非選択培地（ヒスチジンを含有する）または選択培地（１ｍＭ  ＡＴ）上にスポットした。プレートを３０℃で２４時間培養した。ヒスチジン存在下で、受容体＋（Ｒ＋）および受容体（Ｒ−）株の両方を増殖させることが可能であった。しかし、ヒスチジン非存在下では、Ｒ＋細胞のみが増殖した。これらのプレートにリガンドを全く添加しなかったので、この結果に対して、２種類の説明が可能であった。まず１つの考えうる解釈は、受容体を有する酵母が、リガンド非依存的受容体媒介性活性化（ＬＩＲＭＡ）のために生育面において有利である、ということであった。別の解釈は、リガンドであるアデノシンを酵母が合成していた可能性があるということであった。これら２つの可能性を区別するために、リガンドを分解する酵素であるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を、増殖している酵母およびプレートに添加した。アデノシンデアミナーゼの存在下では、Ｒ＋細胞はヒスチジンが存在しない環境で増殖しなかったので、酵母が確かにリガンドを合成していることが示された。
【０４０７】
液体中のＡ２ａ増殖アッセイによりこの解釈が確認された。この実験では、Ｒ＋酵母（Ａ２ａ受容体を発現するＧαｓＥ１０Ｋ株）を３段階の密度（１ｘ１０６細胞／ｍｌ、３ｘ１０５細胞／ｍｌ、または１ｘ１０５細胞／ｍｌ）で、アデノシンデアミナーゼ（４Ｕ／ｍｌ）の存在下または非存在下で播種した。イミダゾールグリセロール−ｐ−デヒドラターゼ（ＨＩＳ３遺伝子のタンパク質産物）の競合的アンタゴニストである３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（ＡＴ）の濃度を増加させながら（０、０．１、０．２、または０．４ｍＭ）、アッセイのストリンジェンシーを強めた。アデノシンデアミナーゼおよび３−アミノ−１，２，４−トリアゾール存在下で、酵母の増殖は低下した。しかし、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール非存在下では、アデノシンデアミナーゼはあまり効果を示さなかった。このように、アデノシンデアミナーゼそれ自身はフェロモン反応経路に対して直接的な影響を与えなかった。
【０４０８】
増殖を測定する他のアプローチおよびハイスループットスクリーニングのために小型化可能な方法は、Ａ２ａ受容体リガンドスポットアッセイである。Ａ２ａ受容体を発現するＧαｓＥ１０Ｋ株（Ａ２ａＲ＋）または受容体を欠く株（Ｒ−）を一晩、ヒスチジンおよび４Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ存在下で培養した。細胞を洗浄してヒスチジンを除去し、５ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。１ｘ１０６個の細胞を４Ｕ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼおよび０．５または１．０ｍＭの３−アミノ１，２，４−トリアゾール（ＡＴ）を含有する選択プレート上に広げ、１時間乾燥させた。次に挙げる試薬５μｌを細胞単層に添加した。添加した試薬は、１０ｍＭ  アデノシン、３８．７ｍＭ  ヒスチジン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１０ｍＭ  ＰＩＡまたは１０ｍＭ  ＮＥＣＡであった。細胞を３０℃で２４時間培養した。受容体を持たない細胞はヒスチジンが培地に添加されている場合のみ増殖するという結果が示された。これに対して、Ｒ＋細胞は、Ａ２ａ受容体リガンドＰＩＡおよびＮＥＣＡがスポットされた領域のみで増殖した。プレート中にアデノシンデアミナーゼが含有されていたので、アデノシンがスポットされていた領域では増殖がみられなかったことにより、アデノシンデアミナーゼが活性を有することが確認された。
【０４０９】
ＩＩＩ．ｆｕｓ１  ＬａｃＺアッセイ
酵母の接合経路の活性化を定量するために、ｆｕｓ１ＬａｃＺによるβ−ガラクトシダーゼの合成を測定した。ヒトＡ２ａ受容体（Ｒ＋）をコードするプラスミドまたは受容体を欠くプラスミド（Ｒ−）を用いて、ＧαｓＥ１０Ｋ、ＧαｓＤ２２９またはＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓを発現する酵母株を形質転換した。形質転換体を単離し、ヒスチジンと４Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼの存在下で一晩培養した。１ｘ１０７個の細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈し、漸増濃度のＮＥＣＡに４時間曝露し、細胞中のβ−ガラクトシダ−ゼ活性を測定した。この結果から、Ｒ−株にはβ−ガラクトシダ−ゼ活性が実質的に検出されず、ＧαｓＥ１０Ｋ、ＧαｓＤ２２９ＳまたはＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓのいずれかを発現するＲ＋株には、ＮＥＣＡ濃度が上昇するにつれて、β−ガラクトシダ−ゼ活性の量が増加することが検出された。このことから、濃度が増加したリガンドへの曝露に応じて検出されるβ−ガラクトシダ−ゼ単位は用量依存的に増加することが示された。この用量依存性は、Ａ２ａ受容体を発現する細胞にのみ観察された。さらに、Ａ２ａ受容体に対して最も強力なＧαｓ構築物は、ＧαｓＥ１０Ｋであった。ＧαｓＤ２２９Ｓ構築物は、Ａ２ａ受容体に対して２番目に強力なＧαｓ構築物であったが、ＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ構築物は調べた３種類のＧαｓ構築物の中で効果が最小であったが、このＧαｓＥ１０Ｋ＋Ｄ２２９Ｓ構築物を用いた場合でも、容易に検出可能な量のβ−ガラクトシダーゼ活性の刺激が見られた。
【０４１０】
本アッセイについてのさらなる説明については、米国出願第０９／０８８９８５号、発明の名称「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」、１９９８年６月２日出願（Ａｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｏ．ＣＰＩ−０９３）を参照のこと。本文献の内容全体を本明細書中に参考文献として援用する。
【０４１１】
ヒトアデノシン受容体サブタイプの薬理学的特性の決定
材料および方法
材料  ［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ［シクロペンチル−１，３−ジプロピルキサンチン、８−［ジプロピル−２，３−３Ｈ（Ｎ）］（１２０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）； ［３Ｈ］−ＣＧＳ２１６８０、［カルボキシエチル−３Ｈ（Ｎ）］（３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および［１２５Ｉ］−ＡＢ−ＭＥＣＡ（［１２５Ｉ］−４−アミノベンジル−５’−Ｎ−メチルカルボキサミドアデノシン）（２，２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）より購入した。ＸＡＣ（キサンチンアミン同族体）；ＮＥＣＡ（５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン）；およびＩＢ−ＭＥＣＡをＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＲＢＩ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）から購入した。アデノシンデアミナーゼおよびコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。ヒトアデノシン２ａ［ＲＢ−ＨＡ２ａ］；アデノシン２ｂ［ＲＢ−ＨＡ２ｂ］またはアデノシン３［ＲＢ−ＨＡ３］受容体サブタイプをそれぞれ安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞由来の膜を、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。細胞培養試薬は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）から入手した血清を除いて、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から入手した。
【０４１２】
酵母株：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＹ１２６６０  [far1*1442 tbt1-1 fus1-HIS3 can1 ste14::trp1::LYS2 ste3*1156 gpa1(41)-Gαi3 lys2 ura3 leu2 trp1:his3;LEU2 PGKp-Mfα1Leader-hA1R-PHO5term 2mu-orig REP3 Ampr]およびCY8362[gpa1p-rGαsE10K far1*1442 tbt1-1 fus1-HIS3 can1 ste14::trp1:LYS2 ste3*1156 lys2 ura3 leu2 trp1 his3;LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Ampr]を上記のように構築した。
【０４１３】
酵母培養：２％グルコースを補充したＬｅｕ−Ｔｒｐ［ＬＴ］培地（ｐＨ５．４）中で、形質転換した酵母を培養した。膜を調製するために、一晩培養した培養物３０ｍｌから得た初発力価１−２ｘ１０６細胞／ｍｌを用いて、２５０ｍｌのＬＴ培地に接種し、還流により恒久的な酸素供給下で３０℃にてインキュベーションした。培養から１６時間後に、遠心により細胞を回収し、膜を下記のようにして調製した。
【０４１４】
哺乳類組織の培養：  ヒトアデノシン２ａ受容体サブタイプを安定的に発現するＨＥＫ−２９３細胞（Ｃａｄｕｓ  ｃｌｏｎｅ＃５）を、５００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８抗生物質を用いた選択的圧力下において、１０％ウシ胎児血清および１ｘペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコの最小基本培地（ＤＭＥＭ）中で、加湿、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて培養した。
【０４１５】
酵母細胞膜調製物：  一晩インキュベーションを行った後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心機中で、２，０００ｘｇの遠心により２５０ｍｌの培養物を回収した。細胞を氷冷水で洗浄し、４℃で遠心し、プロテアーゼインヒビターカクテル錠（２５ｍｌの緩衝液当り１錠）を補充した１０ｍｌの氷冷溶解緩衝液［５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５ｍＭ  ＥＧＴＡ］中に沈殿物を再懸濁した。ガラスビーズ（１７ｇ；メッシュ４００−６００；Ｓｉｇｍａ）を懸濁液に添加し、４℃で５分間激しくボルテックスを行うことにより細胞を破壊した。３０ｍｌの溶解緩衝液およびプロテアーゼインヒビターを添加してホモジェネートを希釈し、３，０００ｘｇで５分間遠心を行った。次に、膜を３６，０００ｘｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ、タイプＳＳ３４ローター）で４５分間遠心してペレットを回収した。得られた膜ペレットを、プロテアーゼインヒビターカクテル錠（５０ｍｌ緩衝液当り１錠）を補充した５ｍｌ膜緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ；および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中に再懸濁し、以後の実験用に−８０℃で保存した。
【０４１６】
哺乳類細胞膜調製物：  以前に記述したとおりに（Ｄｕｚｉｃ  Ｅら、：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，９８４４−９８５１，１９９２）、ＨＥＫ−２９３細胞膜を調製した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで洗浄し、ラバーポリスマンで回収した。４℃にて２００ｘｇでＳｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００遠心機を用いて細胞を遠心して沈降させた。４℃の５ｍｌ／ディッシュの溶解緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ＥＧＴＡ；０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ；および１０ｍｇ／ｍｌ  アプロチニン）中に、ペレットを再懸濁し、ダウンス型ホモジェナイザーでホモジェナイズした。次に、細胞溶解液を、３６，０００ｘｇで、４５分間遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ、タイプＳＳ３４ローター）し、５ｍｌの膜緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ、および１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン］中にペレットを再懸濁し、−８０℃でその後の実験のために保存した。
【０４１７】
ブラッドフォード色素−結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９７６））を基にしたＢｉｏ−Ｒａｄ  タンパク質アッセイキットを用いて、酵母および哺乳類膜試料中の全タンパク質濃度を測定した。
【０４１８】
アデノシン１受容体サブタイプの飽和および競合放射性リガンド結合：  放射性リガンドとしてアンタゴニスト［３Ｈ］ＤＰＣＰＸを用いて、ヒトＡ１受容体サブタイプを形質転換した酵母細胞由来の膜上で飽和および競合結合実験を行った。結合緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼおよび１錠のプロテアーゼインヒビターカクテル錠／５０ｍｌを含有する］中に、濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるように膜を希釈した。
【０４１９】
飽和結合では、９６穴マイクロタイタープレート中にて、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（０．０５−２５ｎＭ）濃度を増加させながら、最終体積１００μｌの結合緩衝液中で、２５℃にて１時間、１０μＭの非標識ＸＡＣ非存在下および存在下で、膜（５０μｇ／ウェル）をインキュベーションした。
【０４２０】
競合的結合では、９６穴マイクロタイタープレート中にて、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（１．０ｎＭ）とともに、最終体積１００ｍｌの結合緩衝液中で、２５℃にて１時間、１０μＭの非標識ＸＡＣまたは漸増濃度の競合的化合物の非存在下および存在下で、膜（５０μｇ／ウェル）をインキュベーションした。
【０４２１】
アデノシン２ａ受容体サブタイプの競合的放射性リガンド結合：  ヒトＡ２ａ受容体サブタイプを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞由来の膜上での競合的結合を、放射性リガンドとしてアゴニスト［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０を用いて行った。結合緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼおよび１錠のプロテアーゼインヒビターカクテル錠／５０ｍｌを含有］中に、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で膜を希釈した。９６穴マイクロタイタープレート中において、［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０（１００ｎＭ）とともに、最終体積１００ｍｌの結合緩衝液中で、２５℃にて１時間、５０μＭの非標識ＮＥＣＡまたは漸増濃度の競合的化合物の非存在下及び存在下で、膜（１０μｇ／ウェル）をインキュベーションした。
【０４２２】
アデノシン３受容体の競合的放射性リガンド結合：  ヒトＡ３受容体サブタイプを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞由来の膜上での競合的結合実験を、放射性リガンドとしてアゴニスト［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡを用いて行った。結合緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５％  ＢＳＡ；２Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼおよび１錠のプロテアーゼインヒビターカクテル錠／５０ｍｌを含有］中に、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で膜を希釈した。９６穴マイクロタイタープレート中において、［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡ（０．７５ｎＭ）とともに、最終体積１００μｌの結合緩衝液中で、２５℃にて１時間、１０μＭの非標識ＩＢ−ＭＥＣＡまたは漸増濃度の競合的化合物の非存在下及び存在下で、膜（１０μｇ／ウェル）をインキュベートした。
【０４２３】
インキュベーション終了後、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充した氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液を添加して、次に、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）中で、予め０．５％  ポリエチレンイミンに浸漬しておいたガラスファイバーフィルター（９６穴ＧＦ／Ｂ  ＵｎｉＦｉｌｔｅｒｓ、Ｐａｃｋａｒｄ）で速やかに濾過することにより、Ａ１、Ａ２ａおよびＡ３受容体サブタイプ放射性リガンド結合アッセイを停止させた。フィルタープレートを乾燥させ、５０μｌ／ウェルのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）で被覆し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。三重試験でアッセイを行った。非特異的結合は、Ａ１Ｒ、Ａ２ａＲ、Ａ３Ｒ結合アッセイにおける全結合のうち、それぞれ５．６±０．５％、１０．８±１．４％、１５．１±２．６％であった。
【０４２４】
アデノシン２ｂ受容体サブタイプの競合的放射性リガンド結合：  ヒトＡ２ｂ受容体サブタイプを安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞由来の膜上での競合的結合実験を、放射性リガンドとしてＡ１受容体アンタゴニスト［３Ｈ］ＤＰＣＰＸを用いて行った。結合緩衝液［１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４；１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１ｍＭ  ベンザミジンおよび２Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼを含有］中に、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で膜を希釈した。９６穴マイクロタイタープレート中において、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ（１５ｎＭ）とともに、最終体積１００μｌの結合緩衝液中で、２５℃にて１時間、１０μＭの非標識ＸＡＣまたは漸増濃度の競合的化合物の非存在下および存在下で、膜（１５μｇ／ウェル）をインキュベートした。インキュベーションの終了後、氷冷した１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）緩衝液を添加して、次に、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  １９６ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）中で、予め０．５％  ポリエチレンイミンに浸漬しておいたガラスファイバーフィルター（９６穴ＧＦ／Ｃ  ＵｎｉＦｉｌｔｅｒｓ、Ｐａｃｋａｒｄ）で速やかに濾過することによりアッセイを停止させた。フィルタープレートを乾燥させ、５０μｌ／ウェルのシンチレーション液（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）で被覆し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントした。三重試験でアッセイを行った。非特異的結合は、全結合のうち、１４．３±２．３％であった。
【０４２５】
［３Ｈ］ＤＰＣＰＸ、［３Ｈ］ＣＧＳ−２１６８０および［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡの特異的結合は、全結合と非特異的結合との差として定義した。全結合に対する化合物のパーセント阻害率を算出した。一部位モデルに対する反復カーブフィッティングにより競合データを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ２．０１  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、ＩＣ５０値からＫＩ値を算出した（ＣｈｅｎｇおよびＰｒｕｓｏｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２、３０９９−３１０９、１９７３）。
【０４２６】
結果
ある種の細胞表面受容体の第一の機能は、適切なリガンドを認識することである。そこで、本発明者らはリガンド結合親和性を調べ、酵母中に発現されるアデノシン１受容体サブタイプが機能的に完全であることを確認した。ヒトアデノシン１受容体サブタイプ構築物を形質転換したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから調製した未精製の膜試料は、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸの特異的な飽和結合を示し、ＫＤは４．０±０．１９ｎＭであった。飽和等温線からＫＤおよびＢＭＡＸ値を算出し、データのスカッチャード変換により結合部位が単一種類であることが示された。酵母膜調製物のアデノシン結合部位の密度を７１６．８±４３．４ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質と推定した。
【０４２７】
予想された順位で、［３Ｈ］ＤＰＣＰＸと競合するサブタイプ選択的なアデノシンリガンド（ＸＡＣ、ＤＰＣＰＸ；ＣＧＳ−１５９４３；Ｃｏｍｐｏｕｎｄ６００；Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１００２；ＮＥＣＡ、（Ｒ）−ＰＩＡ；ＩＢ−ＭＥＣＡおよびアロキサジン）を用いて、ヒトＡ１受容体サブタイプを形質転換した組み換え酵母細胞の薬理学的サブタイプ特性を調べた。これらの化合物を用いて記録した置換曲線は、全リガンドについて典型的な勾配を示し、それぞれのリガンドに対するデータが、ｏｎｅ  ｓｉｔｅフィットによりモデル化することが可能であった。個々の化合物について、曲線から推定した見かけの解離定数（表７）は、受容体に対して公表されている、他の典拠から得た値と一致する。
【表７】
2005529062.tif 000055
【表８】
2005529062.tif 000056
【０４２８】
2005529062.tif 000057
【０４２９】
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【０４３０】
2005529062.tif 000059
【表９】
2005529062.tif 000060
【０４３１】
2005529062.tif 000061
【０４３２】
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【０４３３】
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【０４３４】
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【０４３５】
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【０４３６】
2005529062.tif 000066
【０４３７】
2005529062.tif 000067
【０４３８】
2005529062.tif 000068
【０４３９】
2005529062.tif 000069
【０４４０】
2005529062.tif 000070
【０４４１】
参考文献としての援用
本明細書中で開示した全ての特許、公表されている特許出願および他の参考資料は、参考文献として本明細書中に援用されることをここに明示する。
【０４４２】
均等物
当業者であれば、慣用的な実験のみを用いて、具体的に本明細書中に記述した本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物に想到し、または確認することが可能であろう。かかる均等物は、本願特許請求の範囲に包含されるものである。
【国際調査報告】
2005529062.tif 000078