(57)【要約】オキシトシンのヘプタペプチドアルコールアナログを合成するためのより効率的及び／または経済的な方法並びに前記オキシトシンアナログを合成する際に有用な新規中間体を提供する。前記オキシトシンアナログを合成する際に有用な中間体を合成するための効率的で経済的な方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的特性を有するペプチドを形成するのに適した式：
【化１】
2005532996.tif 000034
（式中、
Ｐ１はＨまたはアミノ保護基であり；
Ｐ２はＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり；
Ｐ３はＨであるか、またはＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３は２価のアミノ保護基であってもよく；
ｎは２、３または４であり；
Ｒは低級アルキルであり；
ＷはＨ、保護基または樹脂である）
を有する中間体。
【請求項２】
ＷがＨまたは保護基である請求の範囲第１項に記載の中間体。
【請求項３】
ｎが３であり、Ｒがメチルである請求の範囲第１項に記載の中間体。
【請求項４】
Ｐ１がＨである請求の範囲第３項に記載の中間体。
【請求項５】
Ｐ２がＢｏｃ、ＦｍｏｃまたはＺであり、Ｐ３がＨである請求の範囲第４項に記載の中間体。
【請求項６】
Ｗが樹脂である請求の範囲第１項に記載の中間体。
【請求項７】
保護アミノ側鎖及びアシル化α−アミノ基を有するα−アミノ酸を還元剤と反応させてアシル基をアルキル基に変化させると同時にα−カルボキシ基をＣＨ２ＯＨに変化させるステップを含む請求の範囲第２項に記載の中間体の製造方法。
【請求項８】
保護アミノ側鎖を有するα−アミノ酸を反応させてα−アミノ基をアシル化するステップ及びその後生じた生成物を還元剤と反応させてアシル基をアルキル基に変化させると同時にα−カルボキシ基をＣＨ２ＯＨに変化させるステップを含む請求の範囲第２項に記載の中間体の製造方法。
【請求項９】
保護側鎖アミノ基及びホルミル化α−アミノ基を有するオルニチンを適当な溶媒中で還元剤と反応させてホルミル基をメチル基に変化させると同時にα−カルボキシ基をＣＨ２ＯＨに変化させるステップを含む請求の範囲第２項に記載の中間体の製造方法。
【請求項１０】
保護側鎖アミノ基を有するオルニチンを蟻酸及び無水酢酸と反応させてα−アミノ基をホルミル化するステップ及び生じた生成物を適当な溶媒中で還元剤と反応させてホルミル基をメチル基に変化させると同時にα−カルボキシ基をＣＨ２ＯＨに変化させるステップを含む請求の範囲第２項に記載の中間体の製造方法。
【請求項１１】
還元剤がＢＨ３・ＴＨＦである請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
請求の範囲第４項に記載の中間体をペプチド断片のＣ末端と反応させるステップを含むペプチドの製造方法。
【請求項１３】
ペンタペプチドのＣ末端と反応させてヘキサペプチドを形成し、その後、生じたヘキサペプチドの５位残基の側鎖を生じたヘキサペプチドのＮ末端と反応させて共有環化結合を形成し、相当するヘプタペプチドを形成する請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
中間体を式：
【化２】
2005532996.tif 000035
（式中、Ｍｐａは３−メルカプトプロピオン酸残基を表し、Ｉｌｅはイソロイシン残基を表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し、Ａｂｕはα−アミノ酪酸残基を表し、Ｘは場合により保護側鎖を有するＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
を有する化合物と反応させる請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１５】
中間体を
【化３】
2005532996.tif 000036
（式中、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６はそれぞれ保護基である）
と反応させて線状化合物
【化４】
2005532996.tif 000037
を形成し、前記線状化合物を選択的に脱保護し、環化して、化合物：
【化５】
2005532996.tif 000038
を生成する請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）式：
【化６】
2005532996.tif 000039
［式中、Ｐ１はＨまたはアミノ保護基であり、Ｑ’は（ＣＨ２）ｎ−ＮＰ２Ｐ３（式中、ｎは２、３または４であり、Ｐ２はＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、Ｐ３はＨであり、またはＰ２と同一または異なるアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３が２価のアミノ保護基であってもよい）であり、樹脂は脂肪族アルコールとエーテル結合を形成し得るものである］
を有する樹脂結合ジアミノアルコールを用意するステップ；
（ｂ）Ｎ−アルキル化して、化合物：
【化７】
2005532996.tif 000040
（ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である）
を生産するステップ；
（ｃ）残基を個々にまたはまとめて付加して、ペプチド−樹脂：
【化８】
2005532996.tif 000041
（式中、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６はそれぞれＨまたは保護基であり、Ｘ及びＹは上記と同義である）
を生成するステップ；
（ｄ）樹脂から開裂させ、選択的に脱保護して保護基Ｐ４、Ｐ５及びＰ６を除去して、線状化合物：
【化９】
2005532996.tif 000042
を形成するステップ；
（ｅ）前記線状化合物を環化して、化合物：
【化１０】
2005532996.tif 000043
を生成するステップ；及び
（ｆ）脱保護して、環状の相当するヘキサペプチド：
【化１１】
2005532996.tif 000044
を生成するステップ；
を含み、ヘキサペプチド部分Ａ
【化１２】
2005532996.tif 000045
（式中、Ｍｐａは３−メルカプトプロピオン酸残基を表し、Ｉｌｅはイソロイシン残基を表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し、Ａｂｕはα−アミノ酪酸残基を表し、Ｘは場合により保護側鎖を有するＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
及び前記部分Ａにアミド結合により結合しているＣ末端β−アミノアルコール残基Ｂ
【化１３】
2005532996.tif 000046
［式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
から構成されるオキシトシンアンタゴニスト活性を有するヘプタペプチドアナログまたはその医薬的に許容され得る塩の製造方法。
【請求項１７】
樹脂がクロロトリチル樹脂であり、選択的脱保護を樹脂からの開裂と同時に実施する請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
ＸがＤ−ＴｒｐまたはＤ−Ｎａｌであり、ＹがａＩｌｅであり、ｎが３である請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１６項に記載の方法の生成物である環状ヘプタペプチドアルコール。
【請求項２０】
子宮筋の収縮を低下または阻止するための医薬的に許容され得る担体と組み合わせた請求の範囲第１９項に記載の生成物の使用。
【請求項２１】
（ａ）式：
【化１４】
2005532996.tif 000047
（式中、Ｐ５は保護基であり、Ｐ７はＨまたは保護基である）
を有する樹脂結合アミノ酸を用意するステップ；
（ｂ）残基を個々にまたはまとめて付加して、ペプチド−樹脂：
【化１５】
2005532996.tif 000048
（式中、Ｐ４はＨまたは保護基であり、Ｐ６は保護基である）
を生成するステップ；
（ｃ）樹脂から開裂させて、線状遊離酸化合物：
【化１６】
2005532996.tif 000049
を形成するステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）の生成物に
【化１７】
2005532996.tif 000050
をカップリングさせて、線状化合物：
【化１８】
2005532996.tif 000051
［式中、Ｑ’は（ＣＨ２）ｎ−ＮＰ２Ｐ３（式中、ｎは２、３または４であり、Ｐ２はアミノ保護基であり、Ｐ３はＨ、またはＰ２と同一または異なるアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３が２価のアミノ保護基であってもよい）である］
を形成するステップ；
（ｅ）ステップ（ｄ）から得た線状化合物を選択的に脱保護し、環化して、化合物：
【化１９】
2005532996.tif 000052
を生成するステップ；
（ｆ）脱保護して、環状の相当するヘキサペプチド：
【化２０】
2005532996.tif 000053
を生成するステップ；
を含み、ヘキサペプチド部分Ａ
【化２１】
2005532996.tif 000054
（式中、Ｍｐａは３−メルカプトプロピオン酸残基を表し、Ｉｌｅはイソロイシン残基を表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し、Ａｂｕはα−アミノ酪酸残基を表し、Ｘは場合により保護側鎖を有するＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
及び前記部分Ａにアミド結合により結合しているＣ末端β−アミノアルコール残基Ｂ
【化２２】
2005532996.tif 000055
［式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
から構成されるオキシトシンアンタゴニスト活性を有するヘプタペプチドアナログまたはその医薬的に許容され得る塩の製造方法。
【請求項２２】
ＸがＤ−ＴｒｐまたはＤ−Ｎａｌであり、ＹがａＩｌｅであり、ｎが３である請求の範囲第２１項に記載の方法。
【請求項２３】
アンモニア中でＬ−メチオニン（Ｍｅｔ）の溶液にＮａを添加してナトリウムアミド及びＨｃｙを形成するステップ；アンモニア及びナトリウムアミドを除去し、Ｈｃｙ側鎖のスルフヒドリル基を酸不安定性保護基を有するカルボキシを末端とする部分でアルキル化するステップ；及び塩基不安定性保護基をＨｃｙのα−アミノ基に付加するステップ；を含む延長保護側鎖及び保護α−アミノ基を有するＬ−ホモシステイン（Ｈｃｙ）の製造方法。
【請求項２４】
スルフヒドリル基をｔ−ブチル保護カルボキシル基を含む部分でアルキル化する請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２５】
スルホヒドリル基を−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯ−ｔＢｕでアルキル化する請求の範囲第２４項に記載の方法。
【請求項２６】
α−アミノ基をＦｍｏｃで保護する請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２７】
生じた化合物を樹脂にカップリングさせ、次いでＦｍｏｃ保護基を除去した後アミノ酸をカップリングさせて樹脂上にペンタペプチドを形成する請求の範囲第２６項に記載の方法。
【請求項２８】
生じたペクタペプチドを樹脂から開裂させ、そのＣ末端でＮαメチル−α−アミノアルコールにカップリングさせて、ヘキサペプチドを形成する請求の範囲第２７項に記載の方法。
【請求項２９】
生じたペンタペプチドを反応させて側鎖カルボキシを脱保護し、前記ヘキサペプチドのＮ末端の残基とアミド結合を形成させる請求の範囲第２８項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デスアミノ−オキシトシンの相当するヘプタペプチドアルコールアナログ（すなわち、Ｎ末端残基が脱アミノ化され、Ｃ末端がアルコールである環状ペプチド）を製造するための中間体及び方法に関する。前記方法では、オキシトシンアンタゴニスト活性を示し、よって特に子宮筋収縮を低下または阻止するために有用であるアナログを製造するために前記中間体を使用し得る。本発明はまた、前記中間体を合成するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オキシトシンは子宮筋の収縮を刺激するペプチドホルモンであり、早産及び月経困難症の原因に関与すると考えられている。オキシトシンアンタゴニストは前記状態のコントロールに有用であることが認められており、治療用途に対して良好な効力及び及び選択性を有するオキシトシンアンタゴニストペプチドが１９９５年１月２６日に公開された国際特許出願公開第９５／０２６０９号パンフレットに記載されている。オキシトシンアンタゴニストはしばしば水溶液の形態で投与することが意図されており、そのアンタゴニストの用時使用剤形を製造するためには該水溶液が長期間安定であることが必要であり得るが、常にそうとは限らない。使用直前に前記薬剤を製造しなければならないのは不便であると見做され、改善がもたらされた。
【０００３】
米国特許第６，１４３，７２２号明細書（欧州特許出願公開第９３８，４９６号明細書；国際特許出願公開第９８／２３６３６号パンフレット）には、先行技術の国際特許出願公開第９５／０２６０９号パンフレットに記載されているオキシトシンアンタゴニストに類似しているがペプチドのＣ末端がアルコールに還元されている、オキシトシンアンタゴニスト活性を示す均等なヘプタペプチドアナログが開示されている。本明細書においてヘプタペプチド及び均等ヘプタペプチドは、Ｎ末端残基が脱アミノ化されており、その側鎖がＮ末端残基に加えて６残基を含むペプチド鎖中に離れて存在する残基の側鎖に共役結合している環状化合物を意味する。
【０００４】
前記オキシトシンアンタゴニストペプチドは米国特許第’７２２号明細書に開示されている合成方法により合成し得るが、その方法はペプチド合成を１ステップとしてカウントし、修飾ホモシステイン（Ｈｃｙ）残基の合成をカウントしないとして約７つの別々のステップを必要とする。商業的に興味深い化合物類に対してより経済的な合成方法がしばしば求められているが、オキシトシンアンタゴニストペプチドもそれに当てはまる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、医薬品、特に米国特許第’７２２号明細書に教示されている一般的なタイプのオキシトシンアンタゴニストペプチドを合成する際に有用な特定の中間体化合物を製造するための新規中間体化合物及び新規方法を提供する。本発明はまた、米国特許第’７２２号明細書に開示されているオキシトシンアンタゴニストペプチドアルコールを合成するための改良方法を提供する。この方法によりＣ末端アルコールペプチドがより効率的且つ経済的に合成し得る。
【０００６】
より具体的な態様で、本発明は、医薬的特性を有するペプチドを形成するのに適した
式：
【０００７】
【化２３】
2005532996.tif 000002
（式中、
Ｐ１はＨまたはアミノ保護基であり；
Ｐ２はＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり；
Ｐ３はＨであるか、またはＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３は２価のアミノ保護基であってもよく；
ｎは２、３または４であり；
Ｒは低級アルキルであり；
ＷはＨ、保護基または樹脂である）
を有する中間体を提供し、また側鎖アミノ基が保護されており、α−アミノ基がアシル化されているアミノ側鎖を有するα−アミノ酸を適当な溶媒中で還元剤と反応させてアシル基をアルキル基に変化させると同時にα−カルボキシル基をＣＨ２ＯＨに変化させる前記中間体の製造方法も提供する。
【０００８】
別の具体的態様で、本発明は、ヘキサペプチド部分Ａ
【０００９】
【化２４】
2005532996.tif 000003
（式中、Ｘは場合により保護側鎖を有するＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
及び前記部分Ａにアミド結合により結合しているＣ末端β−アミノアルコール残基Ｂ
【００１０】
【化２５】
2005532996.tif 000004
［式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
から構成されたオキシトシンアンタゴニスト活性を有するヘプタペプチドアナログまたはその医薬的に許容され得る塩の製造方法を提供し、その方法は、
（ａ）式：
【００１１】
【化２６】
2005532996.tif 000005
［式中、Ｐ１はＨまたはアミノ保護基であり、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＰ２Ｐ３（式中、ｎは２、３または４であり、Ｐ２はＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、Ｐ３はＨであり、またはＰ２と同一または異なるアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３が２価のアミノ保護基であってもよい）であり、樹脂は脂肪族アルコールとエーテル結合を形成し得るものである］
を有する樹脂結合ジアミノアルコールを用意するステップ；
（ｂ）Ｎ−アルキル化して、化合物：
【００１２】
【化２７】
2005532996.tif 000006
（式中、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である）
を生産するステップ；
（ｃ）残基を個々にまたはまとめて付加して、ペプチド−樹脂：
【００１３】
【化２８】
2005532996.tif 000007
（式中、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６はそれぞれＨまたは保護基である）
を生成するステップ；
（ｄ）樹脂から開裂し、選択的に脱保護して保護基Ｐ４、Ｐ５及びＰ６を除去して、線状化合物：
【００１４】
【化２９】
2005532996.tif 000008
を形成するステップ；
（ｅ）線状化合物を環化して、化合物：
【００１５】
【化３０】
2005532996.tif 000009
を生成するステップ；及び
（ｆ）脱保護して、環状の相当するヘキサペプチド：
【００１６】
【化３１】
2005532996.tif 000010
を生成するステップ；
を含む。
【００１７】
更なる具体的態様において、本発明は、ヘキサペプチド部分Ａ
Ｍｐａ−Ｘ−Ｉｌｅ−Ｙ−Ａｓｎ−Ａｂｕ−
（式中、Ｘは場合により保護側鎖を有するＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
及び前記部分Ａにアミド結合により結合しているＣ末端β−アミノアルコール残基Ｂ
【００１８】
【化３２】
2005532996.tif 000011
［式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
から構成されるオキシトシンアンタゴニスト活性を有するヘプタペプチドアナログまたはその医薬的に許容され得る塩の製造方法を提供し、その方法は、
（ａ）式：
【００１９】
【化３３】
2005532996.tif 000012
（式中、Ｐ５は保護基であり、Ｐ７はＨまたは保護基である）
を有する樹脂結合アミノ酸を用意するステップ；
（ｂ）残基を個々にまたはまとめて付加して、ペプチド−樹脂：
【００２０】
【化３４】
2005532996.tif 000013
（式中、Ｐ４及びＰ６はそれぞれ保護基である）
を生成するステップ；
（ｃ）樹脂から開裂させて、線状化合物：
【００２１】
【化３５】
2005532996.tif 000014
を形成するステップ；
（ｄ）
【００２２】
【化３６】
2005532996.tif 000015
をカップリングさせて、線状化合物：
【００２３】
【化３７】
2005532996.tif 000016
［式中、Ｑ’は（ＣＨ２）ｎ−ＮＰ２Ｐ３（式中、ｎは２、３または４であり、Ｐ２はアミノ保護基であり、Ｐ３はＨ、またはＰ２と同一または異なるアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３が２価のアミノ保護基であってもよい）である］
を形成するステップ；及び
（ｅ）線状化合物を選択的に脱保護し、環化して、化合物：
【００２４】
【化３８】
2005532996.tif 000017
を生成するステップ；及び
（ｆ）脱保護して、環状の相当するヘキサペプチド：
【００２５】
【化３９】
2005532996.tif 000018
（式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２である）
を生成するステップ；
を含む。
【００２６】
（好ましい実施態様の詳細説明）
本発明は、治療上有用なオキシトシンアンタゴニスト活性及び水性媒体中で高い安定性を示すヘプタペプチドアナログを合成するための改良方法を提供する。前記ヘプタペプチドアナログの特徴は、Ｎ末端ヘキサペプチドアナログ部分Ａ及びＣ末端ジアミノアルコール部分Ｂからなる構造にある。ジアミノアルコール部分Ｂの構造は、
【００２７】
【化４０】
2005532996.tif 000019
［式中、Ｑは−（ＣＨ２）ｎＮＨ２（ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
である。部分Ａの構造は、
【００２８】
【化４１】
2005532996.tif 000020
（式中、Ｍｐａは３−メルカプトプロピオン酸残基（別名：デスアミノ−システイン）を表し、Ｉｌｅはイソロイシン残基を表し、Ａｓｎはアスパラギン残基を表し、Ａｂｕはα−アミノ酪酸残基を表し、ＸはＤ−芳香族α−アミノ酸であり、Ｙは脂肪族α−アミノ酸である）
である。
【００２９】
芳香族α−アミノ酸は、側鎖に芳香族環系を含むα−アミノ酸を意味する。前記系は炭素環またはヘテロ環であってもよく、単環であっても融合されていてもよい。芳香族α−アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシン、（Ｏ−エチル）チロシン、トリプトファン、β−（２−ナフチル）アラニン及びフェニルグリシンが含まれるが、これらに限定されない。残基Ｘは非天然Ｄ−立体配置を有する。
【００３０】
脂肪族α−アミノ酸は、側鎖が炭素原子及び水素原子のみを含む天然Ｌ−立体配置を有するα−アミノ酸を意味する。前記側鎖はアルキル基及びシクロアルキル基を含み得る。側鎖は不飽和であってもよいが、芳香族残基を含まなくてもよい。側鎖は１〜１２炭素原子を有し得、好ましくは３〜７炭素原子を有する。脂肪族α−アミノ酸の例には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン（ａＩｌｅ）、シクロヘキシルグリシン、（β，β−ジエチル）アラニン及びアダマンチルアラニンが含まれる。
【００３１】
ヘキサペプチドアナログ部分Ａの構造において、Ｍｐａ残基及びＡｂｕ残基を結合する線は通常の意味を有し、これら２つの残基の側鎖の末端を結合する共有結合が存在することを指す。この場合、Ｎ末端Ｍｐａ残基の側鎖の末端にある硫黄原子はＡｂｕ残基側鎖のγ−（すなわち、４−）炭素原子に共有結合により結合している。
【００３２】
ジアミノアルコール部分Ｂは立体生成(stereogenic)中心を含み、よって関連アミノ酸のＤ及びＬ異性体に対応して２つのエピマーＲ及びＳで存在し得る。いずれかの前記異性体を有するヘプタペプチドアナログがエピマー混合物として存在してもよい。好ましくは、ジアミノアルコール部分は単一エピマーとして存在し、より好ましくはＳ立体配置を有する。
【００３３】
本明細書において、Ｍｐａ残基及びジアミノアルコールＢはα−アミノ酸の均等物と見做され、興味深い化合物はヘプタペプチドまたは均等ヘプタペプチドと称される。
【００３４】
好ましい化合物において、ＸはＤ−トリプトファン残基またはβ（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン残基であり、Ｙはバリン、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、シクロヘキシルアラニンまたは（β，β−ジエチル）アラニンの残基である。
【００３５】
特に好ましい化合物の幾つかを以下に示す。
【００３６】
【化４２】
2005532996.tif 000021
2005532996.tif 000022
【００３７】
上記式中の略号に関し、Ｄ−ＴｒｐはＤ−トリプトファン残基；ａＩｌｅはアロイソロイシン残基；Ａｌａ（３，３−ジエチル）は（β，β−ジエチル）ジアラニン残基；Ｄ−Ｎａｌはβ−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン残基；Ｌｅｕはロイシン残基；Ｖａｌはバリン残基を意味する。
【００３８】
上に最初に挙げた化合物が現在最も好ましい化合物である。
【００３９】
この興味深いペプチドは塩基性部位（アミン）を含み、よって遊離塩基の医薬的特性を保持しながら酸と塩を形成し得る。前記塩の例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩及びメタンスルホン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている方法は、上記したオキシトシンアンタゴニストヘプタペプチドアナログの少なくとも１つを医薬的有効量含む医薬組成物を製造する際の有用なステップである。前記組成物は、医薬的に許容され得る添加剤または担体、例えば米国特許第’７２２号特許に記載されているような保存剤、希釈剤、分散剤、粘膜吸収を促進する物質、緩衝剤及び矯臭剤を含み得、子宮筋の収縮を低下または阻止するために投与され得る。１つの好ましい組成物は、鼻腔内投与または静脈注射に適した等張性塩類溶液中に前記ヘプタペプチドアナログを含む滅菌水溶液であり、この水溶液はｐＨを０．３〜７．０、好ましくは３．５〜５．５に維持するために緩衝剤（例えば、リン酸／クエン酸緩衝液）を含んでいる。投与ルートに関して、静脈または皮下注射が多分最も効率的なデリバリールートであり、鼻腔内投与は経口投与よりもより効率的であると予想され得る。一般的に、早産の女性に対して静脈または皮下投与するための１回有効用量を構成する化合物の量は２４時間で約０．１〜約５００ｍｇ、好ましくは約１〜約２００ｍｇである。本発明は上記したオキシトシンアンタゴニストヘプタペプチドアナログを合成するための改良方法及び前記合成に有用な中間体を提供し、この方法は従来方法よりも経済的であり及び／または高収率を与える。
【００４０】
オキシトシンアンタゴニスト活性を有する興味深いヘプタペプチドアナログまたはその医薬的に許容され得る塩を製造するための全方法は、通常ヘプタペプチド部分Ａ及びこの部分Ａに元々または最終的にアミド結合により結合するＣ末端ジアミノアルコール残基Ｂから構成される化合物を作成するステップを含む。ここで、
（１）ジアミノアルコールＢは
【００４１】
【化４３】
2005532996.tif 000023
［式中、Ｑは（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ここで、ｎは２、３または４である）であり、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である］
であり、
（２）部分Ａは
【００４２】
【化４４】
2005532996.tif 000024
である。
【００４３】
興味深い全合成に使用され得る幾つかの主要中間体には、遊離または保護アルコールとして、またはエーテル結合により適当な樹脂に結合したα−アルキル化ジアミノアルコール及び以下に記載する公知化合物“ｃａｒｂａ−６”が含まれる。本発明はまた、ヘプタペプチドアナログの効率的合成においてその後有効に使用され得る前記主要中間体を製造するために使用される方法も提供する。
【００４４】
環状ヘプタペプチドオキシトシンアンタゴニストを製造するために開発された改良全合成法により、ステップの簡素化、高い収率及び／または低い原料コストが得られ、この合成法は選択化合物にとって非常により望ましいルートとなる。前記合成法は通常アルキル化ジアミノアルコール及びＦｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６と称される保護アミノ酸、すなわち
【００４５】
【化４５】
2005532996.tif 000025
を用いる。中間体Ｆｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６は米国特許第’７２２特許に記載されている従来方法を用いて合成されるが、この中間体の改良合成法を以下に記載する。
【００４６】
米国特許第’７２２特許に記載されている中間体Ｆｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６、すなわちＦｍｏｃ−Ａｂｕ（ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２ｔ−Ｂｕ）ＯＨの公知の合成方法はホモシステインのダイマー（Ｈｃｙ）２を出発物質とする。しかしながら、この出発物質のコストはかなり高く、現在５ｇあたり約２５０ドル以上である。この中間体Ｆｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６の改良合成法が開発され、これにより容易に入手可能なメチオニン（Ｍｅｔ）を出発物質として使用することにより中間体が経済的に合成され得る。出発物質のコストの差は非常に重要である。なぜならば、Ｍｅｔの１モルあたりのコストは約１／５０だからである。メチオニンをアンモニア中でナトリウムで処理することにより還元した後、生じたスルフヒドリル基をｔ−ブチルアクリレートまたはｔ−ブチル−３−ブロモプロピオネートを用いてアルキル化して、最終的にヘプタペプチドのＮ末端残基となる部分を付加する。この場合、Ｎα−保護基がルーチンに導入される。原料コストが抑えられることに加えて、大規模に実施したとき生成物が蒸発中に酢酸エチル溶液から結晶形態で沈殿され、よって精製方法が単純化される。
【００４７】
最終の線状ヘキサペプチドのＣ末端部分を構築するために使用される新規中間体は、保護α−アミノ酸から誘導される場合によりＮ−保護されていてもよいＮ−アルキル−β−アミノアルコールであり、前記アミノ酸のα−カルボキシル基はアルコールに変換され、場合により保護基により保護されていてもまたは樹脂に結合されていてもよい。換言すると、この中間体は、式：
【００４８】
【化４６】
2005532996.tif 000026
（式中、
Ｐ１はＨまたはアミノ保護基であり；
Ｐ２はＰ１が存在する場合にはＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり；
Ｐ３はＨ、またはＰ１と異なり、Ｐ１を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３は２価のアミノ保護基であってもよく；
ｎは２、３または４であり；
Ｒは低級アルキルであり；
ＷはＨ、保護基または樹脂である）
で規定されるジアミノアルコールである。クロロトリチル樹脂のような適当な樹脂が使用され得、任意の保護基はＳｅｒまたはＴｈｒを保護するために通常使用されている保護基の１つ、例えばＴＭＳ（トリメチルシリル）であり得る。Ｒは好ましくはメチルまたはエチルであり、より好ましくはメチルである。好ましい環状の相当するヘプタペプチドを製造する際に使用される中間体はｎが３のもの、すなわちＮα−メチルオルニチノールである。すなわち、この化合物が特に好ましい中間体である。
【００４９】
簡単に説明すると、このようなメチルオルニチンアルコールは、側鎖アミノ基が、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）またはα−アミノ保護基を除去したときに残る別の適切なアミノ保護基により保護されているＯｒｎから出発して効率的に合成され得ることが知見された。Ｈ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＨは市販されている出発物質である。或いは、アミノ側鎖に２−または４−メチレン基を有する他の保護アミノ酸を使用して別の所望最終生成物を得ることでできる。ギ酸及び無水酢酸で処理するとα−アミノ基はホルムアミド部分に変換する。その後、ホウ水素化物−テトラヒドロフラン複合体で処理すると、α−カルボキシル基はＣＨ２ＯＨ、ホルムアミド部分はメチルアミノに還元される。エチルアミノ基が所望ならば、ホルミル基ではなくアセチル基を付加するようにＯｒｎのα−アミノ基をアセチル化する。その後、所望により、α−アミノ基を例えばＦｍｏｃで保護し、化合物をアルコールでエーテル結合により樹脂にカップリングさせ得る。或いは、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールをピリジンを含有するＤＣＭ中で反応させるようにして２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂に連結させ、樹脂上にヘキサペプチドを構築するために使用してもよい。Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールは、市販されているＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＨからその混合無水物をホウ水素化ナトリウムで還元することにより容易に得られる。
【００５０】
所望の環状の相当するヘプタペプチドを得るための１つの全合成方法では、側鎖のω−カルボキシル基及びα−アミノ基を保護しながら２−クロロトリチルクロリド樹脂（２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂）と反応させてα−カルボキシル基とエステル結合を形成させることによりＦｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６をその樹脂に連結させる。または、他の適当な樹脂を使用し得る。次いで、Ｆｍｏｃ保護基をα−アミノ基から除去し、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｙ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ及びＢｏｃ−Ｘを順次カップリングさせることによりペンタペプチドを作成する。所望により、Ａｓｎ、Ｘ及び／またはＹの側鎖を保護してもよい。例えば、ＸがＤ−Ｔｒｐのときにはインドール窒素を保護することが望ましいことがある。しかしながら、ＡｓｎまたはＤ−Ｔｒｐのいずれかを保護することなく合成は効率的に実施し得る。付加すべき最終アミノ酸のためにＢｏｃ保護基を使用すると、側鎖カルボキシを保護するｔ−ブチルエステル基及びＮ末端保護基を同時に開裂させることができる。．
合成のこの時点で、線状ペプチドを樹脂から、例えばＤＣＭ／ＴＦＥ／ＡｃＯＨの混合物で処理することにより開裂させて、Ｃ末端に遊離酸を有するペンタペプチドを生成させる。次いで、Ｃ末端にＨ−ＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールを付加するために、好ましくはＡｂｕ残基の可能性あるラセミ化を抑えるために混合無水物法により反応を実施する。所望により、アルコールを適当な保護基、例えばトリチル、ＴＭＳまたはベンジルエーテルで保護してもよい。例えば、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドで処理することによりＮαＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールをそのＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）誘導体に変換させた後反応はうまく実施された。しかしながら、前記ステップは明らかに任意であり、Ｏ−アシル化を保護する必要はないと考えられる。ヘキサペプチドを作成するためにこの付加を実施した後にジクロロメタン（ＤＣＭ）中ＴＦＡを適当なスカベンジャーと一緒に用いて脱保護を実施して、Ｎ末端のＢｏｃ保護基及び側鎖カルボキシル基のｔ−ブチル保護基を同時に除去する。その後、Ｄ−Ｔｒｐのα−アミノ基に長い側鎖をリンクさせ、均等ヘプタペプチドを作成するための環化は例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中ＰｙＢＯＰ及びＤＩＰＥＡの存在下で適当に実施される。その後、オルニチノールの側鎖アミノ基の最終脱保護をフッ化水素または臭化トリメチルシリル及び適当なスカベンジャーを用いて実施して、環状のＣ末端アルコール、オキシトシンアンタゴニストヘプタペプチドを生成する。これをＨＰＬＣにより精製し、イオン交換によりアセテート塩に変換してもよい。
【００５１】
別の全合成では、ピリジン中で反応させるようにして市販されているＦｎｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールを２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂にまず結合させることにより所望の環状ヘプタペプチドを効率的に製造する。その後、Ｆｍｏｃ保護基を適当な塩基、例えばピリジンで処理することにより適当に除去し、α−アミノ基を例えばまずＤＣＭ中でｏ−ＮＢＳ−Ｃｌ及び２，４，６−コリジンで処理した後ＴＰＰ、ＤＩＡＤ及びＭｅＯＨの混合物を添加することにより樹脂上でアルキル化する。各種アルキル基が別の方法を用いて導入され得る。ｏ−ＮＢＳ樹脂結合アルコールを４−ニトロベンゼンスルホン酸メチル（３〜５当量）及び適当な塩基、例えばＭＴＢＤで処理することによってもＮ−メチル化を実施し得る。アルキル化が完了したら、ＤＭＦ中で２−メルカプトエタノール及びＤＢＵで最終的に処理することによりｏ−ＮＢＳを除去する。その後、樹脂中にヘキサペプチドを段階的に構築するために生じたＮαＭｅＯｒｎ（Ｚ）−樹脂を順次処理する。ペプチドは通常上記したように、Ｆｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６とまずカップリングして構築され得る。ＤＩＣ／ＨＯＢｔカップリングを使用することにより、Ａｓｎの側鎖の保護を通常省略することができる。その後、例えばＴＩＳを含有するＴＦＡ及びＤＣＭの水溶液で処理することによりＢｏｃ−ヘキサペプチド樹脂を開裂させると同時に選択的に脱保護して、Ｂｏｃ及びｔ−Ｂｕ保護基を除去する。その後、最終環化及び脱保護を当業界で公知のように実施し得る。生成物を一般的技術を用いて単離し、精製するが、イオン交換後たった１回の精製ステップしか必要でない。２つの中間体を利用することにより全合成が非常に簡素化され、経済的に高収率で実施されることが判明した。
【００５２】
より具体的には、上記合成は通常
（ａ）式：
【００５３】
【化４７】
2005532996.tif 000027
［式中、Ｐ１はＨまたはアミノ保護基（例えば、Ｆｍｏｃまたはｏ−ＮＢＳである）であり、Ｑ’は（ＣＨ２）ｎ−ＮＰ２Ｐ３（式中、ｎは２、３または４であり、Ｐ２はＰ１と異なり、Ｐ１保護基を除去する条件下で不安定でないアミノ保護基であり、Ｐ３はＨ、またはＰ２と同一または異なるアミノ保護基であり、ただしＰ２及びＰ３が２価のアミノ保護基であってもよい）であり、樹脂は脂肪族アルコールとエーテル結合を形成し得るものである］
を有する樹脂結合ジアミノアルコールを用意するステップ；
（ｂ）Ｐ１がｏ−ＮＢＳ以外として存在するときにはＰ１をｏ−ＮＢＳで置換するかまたはｏ−ＮＢＳを添加し、その後Ｎ−アルキル化して、化合物：
【００５４】
【化４８】
2005532996.tif 000028
（式中、ＲはＣＨ３またはＣ２Ｈ５である）
を生成するステップ；
（ｃ）ｏ−ＮＢＳを除去し、残基を個々にまたはまとめて付加して、ペプチド−樹脂：
【００５５】
【化４９】
2005532996.tif 000029
（式中、Ｐ４、Ｐ５及びＰ６はそれぞれＨまたは保護基であり、Ｘ及びＹは上記と同義である）
を生成するステップ（なお、この化合物は
【００５６】
【化５０】
2005532996.tif 000030
としても記載され得る）；
（ｄ）樹脂から開裂させると同時に選択的に脱保護して、線状化合物：
【００５７】
【化５１】
2005532996.tif 000031
を形成するステップ；
（ｅ）前記線状化合物を環化して、化合物：
【００５８】
【化５２】
2005532996.tif 000032
を生成するステップ；
（ｆ）脱保護して、環状の相当するヘキサペプチド：
【００５９】
【化５３】
2005532996.tif 000033
を生成するステップ；
を含む。
【実施例】
【００６０】
下記特定実施例により、上記した興味深い化合物の詳細合成を説明する。これらの実施例は合成の最良形態を含み、本発明の興味深い化合物の合成の代表例と見做される。しかしながら、これらの実施例は請求の範囲に規定する本発明に限定を加えるものと解釈されるべきでない。
【００６１】
以下の略語を使用する：
ＴＢＴＵ          ２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、
ＰｙＢＯＰ        ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、
ＤＩＰＥＡ        Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、
ＤＩＣ            １，３−ジイソプロピルカルボジイミド、
Ｂｏｃ            ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、
Ｚ                ベンジルオキシカルボニル、
Ｆｍｏｃ          ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、
ｏ−ＮＢＳ−Ｃｌ  ｏ−ニトロベンゼンスルホニルクロリド、
ＴＦＡ            トリフルオロ酢酸、
ＤＣＭ            ジクロロメタン、
ＥＤＴ            エタンジチオール、
ＤＭＦ            ジメチルホルムアミド、
ＴＨＦ            テトラヒドロフラン、
ＭＴＢＤ          ７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４，４，０］デカ−５−エン、
ＢＨ３・ＴＨＦ     ボラン−テトラヒドロフラン複合体、
ＤＭＥ            １，２−ジメトキシエタン、
ＴＩＳ            トリイソプロピルシラン、
ＤＢＵ            １８−ジアザビシクロ−［５．４．０］ウンデカ−７−エン、
ＭｅＣＮ          アセトニトリル、
ＴＰＰ            トリフェニルホスフィン、
ＴＦＥ            トリフルオロエタノール、
ＴＥＡＰ          リン酸トリエチルアンモニウム、
ＥｔＯＡｃ        酢酸エチル、
ＤＩＡＤ          ジイソプロピルアゾジカルボキシレート、
ＴＭＳＢｒ        臭化トリメチルシリル、
ＡｃＯＨ          酢酸、
ＭｅＯＨ          メタノール、
ＮＭＭ            Ｎ−メチルモルホリン、
Ａｃ２Ｏ           無水酢酸、
Ｅｔ２Ｏ           エチルエーテル、
ＦｍｏｃＯＮＳｕ  Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド。
【００６２】
（実施例Ｉ）
ＮαＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールの合成
市販されているＨ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＨ（４４４．７ｇ，１．６７モル）をギ酸（３．５Ｌ，９３モル）に溶解させた。溶液を氷浴において冷却した後、反応混合物の温度を約５〜１５℃に維持しながら無水酢酸（１．１７Ｌ，１２モル）を２時間かけて滴下した。添加完了後生じた反応混合物を室温で約２時間撹拌し、反応容器を一晩冷凍した。次いで、冷水（１．５Ｌ）を添加し、溶液を減圧下で濃縮乾固した。残留淡黄色シロップをＥｔＯＡｃに取り、水及び飽和ＮａＣｌで順次洗浄し、硫酸ナトリウムで一晩乾燥した。濾過し、蒸発乾固した後、残留シロップをエチルエーテル（５Ｌ）に取った。溶液をドライアイス浴において冷却し、種晶を添加した。生じた結晶性生成物を濾過し、エチルエーテルで洗浄し、２時間風乾し、最後に凍結乾燥器において乾燥した。４３１．６ｇ（１．４７モル，８８％）のＦｏｒ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＨが得られた。
【００６３】
乾燥Ｆｏｒ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＯＨ（３５３．２ｇ，１．２モル）を凝縮器及び外部氷浴を取り付けた１０Ｌ容量の３首丸底フラスコに入れた。還元剤のＴＨＦ中１モルＢＨ３・ＴＨＦ（４Ｌ，４モル）を３０分間かけて添加した。直ちに、水素ガスの放出をともなって発熱反応が生じた。透明な還流溶液が生じ、反応混合物を一晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析によると反応が不完全であったので、更にＴＨＦ中１モルＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｌ，１モル）を添加し、混合物を室温で約２時間撹拌し、撹拌終了時点で反応は明らかに完了していた。その後、反応をメタノール（１Ｌ）でクエンチし、溶媒を蒸発させた。残渣をメタノール（６００ｍｌ）に再溶解し、蒸発させた。残留油状物を水（１．５Ｌ）及びＤＣＭ（０．８Ｌ）に分配し、ｐＨをＨＣｌを用いて約２に調節した。水性相を分離し、ＤＣＭ（３×０．８Ｌ）で洗浄し、その後ｐＨを５モル  ＮａＯＨを用いて１２に調節した。生成物をＤＣＭ（３×１．５Ｌ）で抽出した。合わせた抽出物を水性ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別し、溶媒を蒸発させた。残渣をエチルエーテル（０．５Ｌ）に取り、種晶を添加した。１４９ｇ（０．５６モル，４７％）の白色結晶性生成物が得られた。この生成物は分析により所望のＮαＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールと確認された。
【００６４】
上記から、ＢＨ３・ＴＨＦ複合体を用いる還元がホルミル基をメチルに、α−カルボキシル基をＣＨ２ＯＨに還元させるのに有効であったことが分かる。
【００６５】
（実施例ＩＩ）
ｃａｒｂａ−６の合成
最初にヘキサペプチドの残基５を形成する修飾保護ホモシステイン残基はときどき“ｃａｒｂａ−６”と呼ばれている。上記したように、ｃａｒｂａ−６は化学式Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ（ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２ｔ−Ｂｕ）ＯＨを有している。市販されているメチオニンを出発物質とする効率的な合成を設計した。
【００６６】
アンモニア（５Ｌ）をＭｅｔ（２モル）を収容しているフラスコにおいて凝縮した。ナトリウム（約６．１５モル）を少しずつ添加して、側鎖の末端にスルフヒドリル基を生成した。青色が２０分間続くまで添加を続けた。反応混合物に塩化アンモニウム（２．１モル）を添加して、形成されたナトリウムアミドを中和した。生じた透明溶液を窒素流下で一晩放置して、アンモニアを除去した。固体残渣（Ｌ−ホモシステイン及び無機塩）を脱ガス水（１５Ｌ）に溶解し、溶液のｐＨを窒素下塩酸を用いて８．１に調節した。生じた溶液にｔ−ブチルアクリレート（４モル）を滴下し、反応混合物を窒素下一晩撹拌した。形成された固体生成物を濾過により集め、水及びｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄して、粗なＳ−（２−ｔ−ブチルカルボニルエチル）−ホモシステインを得た。すなわち、そのスルフヒドリル基は保護プロピオニル基で置換されていた。粗生成物（１．５３モル）を水に懸濁し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液、ＴＨＦを順次添加した。次いで、５Ｍ  ＮａＯＨを１０を越えないｐＨで透明な溶液が得られるまで自動滴定装置から添加した。この溶液に、最初の低下後ｐＨを自動滴定装置から５Ｍ  ＮａＯＨをデリバリーすることにより７．５〜８に維持しながらＴＨＦ中ＦｍｏｃＯＮＳｕ（１．６８モル）を滴下した。反応混合物を４時間撹拌し、冷蔵庫に一晩放置した。ＴＨＦを蒸発させ、残渣をエーテルで抽出した。３層が形成された。所望生成物を含むと認められた中間層を集めた。ＨＰＬＣにより中間層は主要副生成物（Ｆｍｏｃ−Ｈｃｙ）の５〜１０％を含んでいることが判明した。その副生成物を所望生成物に変換するために、中間層を水で希釈し、トリブチルホスフィンを生じた溶液に添加し、反応混合物を４５分間撹拌した後エーテルで抽出した。水性層にｔ−ブチルアクリレートを添加し、混合物を一晩撹拌した。エーテルで洗浄した後、水溶液を６Ｍ  ＨＣｌでｐＨ  ２に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を乾燥し、真空下で濃縮した。酢酸エチルを蒸発させると、生成物のＦｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６が結晶し始めた。この時点で、濃酢酸エチル溶液をエーテル、ヘキサンで順次希釈した。沈殿を集め、エーテル−水（１：１）混合物で洗浄し、真空下で乾燥すると、最終生成物が白色固体として得られた。母液から更に生成物が回収され、（Ｍｅｔから）全部で６２５．６ｇ（１．２９モル，収率６４％）の生成物が得られた。
【００６７】
この手順は簡単で、１回の結晶後に良好な収率及び良好な純度を与える。文献に記載されているようなＤＮＡ塩中間体を製造する必要がない。
【００６８】
（実施例ＩＩＩ）
環状ヘプタペプチドの合成
興味深いヘプタペプチドの１つの改良合成方法では最初２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂上にペンタペプチドを構築しているが、この方法を以下に記載する。
【００６９】
Ｆｍｏｃ保護ｃａｒｂａ−６をＤＩＰＥＡの存在下での塩素イオンの求核置換により樹脂にカップリングさせた。次いで、ＤＭＦ中２５％  ピペリジンを３０分間用いてＦｍｏｃ基を開裂させた。その後、次の４つのアミノ酸、例えばＡｓｎ、ａＩｌｅ、Ｉｌｅ及びＤ−Ｎａｌを順次付加し、毎回約２．５モル過剰のＦｍｏｃ−ＡＡ（または、Ｎ末端に対してはＢｍｏｃ−ＡＡ）を用い、アミノ酸をそのＨｏＢｔエステルに変換し、等モル量のＤＩＣを用いた。カップリングは室温で約２時間実施した。ペンタペプチドを完成後、酢酸、ＴＦＥ及びＤＣＭＣ（１部／２部／７部）の混合物を用いて室温で約１．５時間処理することにより樹脂から開裂させ、保護基を適所に残した。こうすると、Ｃ末端での次のカップリングが簡単となる。
【００７０】
次に、ペンタペプチドを、Ａｂｕ残基の起こり得るラセミ化を抑えるために混合無水物法を用いてＮαＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オール（実施例Ｉ参照）とカップリングさせた。混合無水物はＮＭＭの存在下でペプチド及びクロロギ酸イソブチルから生成し、カップリングは速やかに進行した。粗なヘキサペプチドを水性後処理により単離し、ｔ−ブタノールから凍結乾燥させた。
【００７１】
次に、粗なヘキサペプチドを約２％  ＴＩＳを含むＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１）で１時間処理して、Ｎ末端のＢｏｃ保護基及びＡｂｕ残留側鎖上のｔ−ブチルベースの保護基を除去した。溶媒を蒸発させた後、約６０％  ＭｅＣＮ及び約０．１％  ＴＦＡを含有する水性混合物から凍結乾燥させた。次いで、ＤＭＦ中粗ペプチド１Ｌあたり約１．５ミリモルの濃度で、ＤＩＰＥＡの存在下でＰｙＢＯＰを用いて環化を実施した。反応完了後、溶媒を蒸発させ、残渣をｔ−ブタノールから凍結乾燥した。その後、Ｚ−保護基を０℃でＨＦを用いて約１時間で除去した。次いで、粗なペプチドをエチルエーテルで沈殿させ、アセトニトリル水溶液から凍結乾燥させた。
【００７２】
環状の相当するヘプタペプチドの最終精製は、Ｃ１８  ＨＰＬＣカートリッジにおいてｐＨ約２．３のＴＥＡＰ系を用いて実施した。純粋ペプチドを含有するフラクションをプールし、再びＣ１８カートリッジにかけ、その後酢酸塩を得るためにカートリッジを０．１モル  酢酸アンモニウム（約５容量）で洗浄した。２％  酢酸／アセトニトリル系を用いて最終溶離を実施し、純粋生成物を含有するフラクションをプールし、凍結乾燥させた。質量分析（エレトクロスプレーイオン化、イオントラップ分析、正モード）で、分子量は予想構造の計算値と一致していることが分かった。すなわち、ｍ／ｚ測定値は８４１．５であり、ｍ／ｚ計算値は８４１．５である。
【００７３】
全方法により高収率が得られ、最終精製は簡単であった。ＨＦで脱保護する代わりに、ＴＭＳＢｒ／チオアニソール／ＴＦＡ／ＥＤＴ（１：１：６：０．５）混合物を使用してもよい。
【００７４】
オキシトシン受容体結合アッセイ
組換えヒトオキシトシン受容体をＣＨＯ細胞において一般的な分子生物学的技術を用いて発現させた。膜フラクションを作成し、［１２５Ｉ］−オキシトシン及び異なる濃度のヘプタペプチドアナログの存在下でインキュベートした。次いで、膜を濾過により単離し、放射能をカウントして、オキシトシン結合を測定した。アナログの阻害定数Ｋｉを調べた。得られた結果は０．１ｎＭの値を示し、これは優秀と見做される。ＨＥＫ２９３細胞において発現させた同じ受容体を用いても同様の結果が得られた。
【００７５】
（実施例ＩＶ）
環状ヘプタペプチドの別の合成
全手順を更に簡素化し、ＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールまたはＦｍｏｃ−ＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールを製造しなくてすむように均等ヘプタペプチドアルコールの別の合成法を誘導した。この合成方法ではまず直接Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールを２Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂に結合させる。ヘキサペプチドをその後集合し、それを線状ペプチドとして開裂すると同時に選択的に脱保護して、直ぐに環化できるようにした。Ｇ＋１カップリングが不要であるので、このアプローチによりラセミ化のリスクが低くなる。
【００７６】
１）  Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールの合成
市販されているＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）をその混合無水物をホウ水素化ナトリウムを用いる還元によりアルコールに変換させた。ＥｔＯＡｃから結晶化後、得られた化合物を更に精製することなくその後使用した。
【００７７】
２）  Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オールの樹脂への結合
２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（１．０６ｇ，１．３９ミリモル）をＤＣＭ中に予め膨潤させ、ＤＣＭ（１０ｍｌ）中にＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）−オール（０．８４ミリモル）及びピリジン（５当量）を含む溶液を添加した。アルコールの消失をＨＰＬＣによりモニターして、反応の進行を調べた。
【００７８】
反応混合物のサンプルを保存して、反応条件下でＦｍｏｃ基の安定性を評価した。Ｆｍｏｃ基は使用した条件下で十分に安定であることが判明した。反応を約３６時間進行させて、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂１ｇあたり約０．５ミリモルの置換が達成された。
【００７９】
３）  樹脂でのアルキル化
次いで、Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２５％  ピペリジンを用いて除去した。化合物をまずＤＣＭ中２，４，６−コリジンの存在下でｏ−ＮＢＳ−Ｃｌで処理して、α−アミノ基をスルホンアミド基に変換させた。このスルホンアミド基は適当に反応性である。１時間後、ニンヒドリン試験は陰性であり、その後樹脂をＤＭＦ及びＤＭＥで洗浄した。次いで、樹脂結合スルホンアミドを溶媒としてＤＭＥを用い、ＭｅＯＨ／ＤＩＡＤ／ＴＰＰ（１０当量）で一晩処理して、アミノ基をアルキル化した。アルキル化前またはその後の樹脂のアリコートを５０％  ＴＦＡ／ＤＣＭで開裂し、サンプルをＨＰＬＣにより分析した。アルキル化は完全であると見做され、ｏ−ＮＢＳ基はＤＭＦ中２−メルカプトエタノール及びＤＢＵで処理して除去した。
【００８０】
４）  線状ペプチドの構築
その後、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌの代わりにＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを用いる以外は実施例ＩＩＩと同様に５つの残基を順次付加した。Ｆｍｏｃ−ｃａｒｂａ−６をカップリングするときにＨＯＢｔは使用しなかった。
【００８１】
５）  ヘプタペプチドの環化
ヘキサペプチドを樹脂から開裂させると同時にＴＦＡ／ＤＣＭ（１：１）及び１％  ＴＩＳで処理して選択的に脱保護して、化合物Ｈ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−ａＩｌｅ−Ａｓｎ−Ｈｃｙ（（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ）−ＭｅＯｒｎ（Ｚ）−オールが得られた。その後、ＤＭＦ中でＰｙＢＯＰ及びＤＩＰＥＡで処理することにより実施例ＩＩＩと同様に環化した。環化が完了したら、ＴＦＡ／ＴＭＳＢｒ／チオアニソール混合物で処理して最終保護基を除去した。その後、ＨＰＬＣを用いて実施例ＩＩＩと同様に精製し、ペプチドをそのアセテート塩に変換させた。質量分析で、分子量は計算構造と一致していることが分かった。すなわち、ｍ／ｚ測定値は８３０．５であり、ｍ／ｚ計算値は８３０．５である。
【００８２】
この手順は最小数のステップしか使用せず、１回の精製はかなり効率的・経済的であると認められる。オキシトシン受容体アッセイにおける結合の阻害定数Ｋｉを測定したところ０．１ｎＭであり、実施例ＩＩＩのペプチドと実質的に同一であった。このアナログにおいてＤ−Ｔｒｐ残基及びＤ−Ｎａｌ残基の見かけ互換性が確認された。
【００８３】
上記した説明及び実施例は今のところ発明者らが考える本発明を実施するための最良態様を述べてきたが、請求の範囲に規定する本発明の範囲を逸脱することなく各種変化及び修飾を加え得ることは当業者に自明である。例えば、上記記載は特定の好ましい化合物、特にＣ末端にオルニチンの誘導体を有するものに向けられてきたが、所望により本発明の方法を逸脱することなくより長いまたは短い側鎖を有する類似のα−アミノ酸を使用し得る。本明細書に記載されている特許明細書の開示内容は援用により本明細書に含まれるとする。
【００８４】
本発明の特定要件は請求の範囲に強調されている。
【国際調査報告】
2005532996.tif 000056