(57)【要約】本発明の第一の態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含む組合せに関する。本発明の第二の態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含み、治療において同時に、連続して若しくは個別に使用する複合製剤である医薬品に関する。本発明の第三の態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを同時に、連続して若しくは個別に対象に投与することを含む、増殖性疾患の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含む組合せ。
【請求項２】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項１記載の組合せ。
【請求項３】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ、及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項１又は２記載の組合せ。
【請求項４】
ＣＤＫ阻害剤が、ロスコビチンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の組合せ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の組合せと、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６】
増殖性疾患の治療用薬剤の調合における請求項１〜４のいずれか記載の組合せの使用。
【請求項７】
増殖性疾患がＲｂ欠損増殖性疾患であることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項８】
増殖性疾患がＣＤＫ依存性疾患又はＣＤＫ感受性疾患であることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項９】
ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含み、治療において、同時に、連続して若しくは個別に使用する複合製剤である医薬品。
【請求項１０】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項９記載の医薬品。
【請求項１１】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ、及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項９又は１０記載の医薬品。
【請求項１２】
ＣＤＫ阻害剤が、ロスコビチンであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の医薬品。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の形である請求項９〜１２のいずれか記載の医薬品。
【請求項１４】
増殖性疾患の治療に使用するための請求項９〜１３のいずれか記載の医薬品。
【請求項１５】
増殖性疾患が、Ｒｂ欠損疾患であることを特徴とする請求項１４記載の医薬品。
【請求項１６】
増殖性疾患が癌であることを特徴とする請求項１４記載の医薬品。
【請求項１７】
ドキソルビシンとＣＤＫ阻害剤とを同時に、連続して若しくは個別に、投与対象に投与することを含む増殖性疾患の治療方法。
【請求項１８】
ドキソルビシンを連続して又は個別に投与対象に投与する前に、前記ＣＤＫ阻害剤を該投与対象に投与することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤＫ阻害剤を連続して又は個別に投与対象に投与する前に、ドキソルビシンを該投与対象に投与することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤であることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤＫ阻害剤を、ロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ、及びオロモウシンから選択することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンの各成分について、治療に有効な量をそれぞれ投与することを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンの各成分について、治療に有効な量より少ない量をそれぞれ投与することを特徴とする、請求項１７〜２２のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
増殖性疾患が、Ｒｂ欠損疾患であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか記載の方法。
【請求項２６】
増殖性疾患が、癌であることを特徴とする請求項１７〜２４のいずれか記載の方法。
【請求項２７】
増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記治療がドキソルビシンとＣＤＫ阻害剤とを同時に、連続して若しくは個別に、投与対象に投与することを含む、ＣＤＫ阻害剤の使用。
【請求項２８】
増殖性疾患の治療用薬剤の調合における、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとの使用。
【請求項２９】
増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記薬剤をドキソルビシンとの併用療法で使用することを特徴とする、ＣＤＫ阻害剤の使用。
【請求項３０】
増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるドキソルビシンの使用であって、前記薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法に使用することを特徴とする、ドキソルビシンの使用。
【請求項３１】
ＣＤＫ阻害剤とアンスラサイクリンとを含む組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及びその他の増殖性疾患の治療に適した薬学的組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の細胞サイクルの開始、進行及び完了は、様々なサイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ）複合体によって制御されているが、これらは細胞増殖には欠くことのできないものである。これらの複合体は、少なくとも触媒（ＣＤＫそのもの）サブニット及び制御（サイクリン）サブユニットを備えている。細胞サイクルの制御にとってより重要な複合体には、サイクリンＡ（ＣＤＫ１−ｃｄｃ２及びＣＤＫ２としても知られる）、サイクリンＢ１〜Ｂ３（ＣＤＫ１）、サイクリンＣ（ＣＤＫ８）、サイクリンＤ１〜Ｄ３（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６）、サイクリンＥ（ＣＤＫ２）、サイクリンＫ及びＴ（ＣＤＫ９）並びにサイクリンＨ（ＣＤＫ７）が含まれる。これらの複合体は、それぞれ細胞サイクルの特定の段階に関連している。
【０００３】
一時的に他のタンパク質に結合することによって、またそれらの細胞内での局在が変化することによって、ＣＤＫの活性は、翻訳後に制御される。腫瘍の発生は遺伝子の変化やＣＤＫとその制御因子の制御解除に密接に関連しているが、これは、ＣＤＫの阻害剤が抗癌療法に有用である可能性があることを示している。実際に、形質転換細胞と正常な細胞とでは、例えばサイクリンＡ／ＣＤＫ２に対する所要量が異なることや、従来の細胞毒性薬や細胞増殖抑制薬に見られる一般的な宿主毒性を持たない新規の抗悪性腫瘍薬を開発できる可能性があることが、初期の結果から示唆される。
【０００４】
ＣＤＫの機能はリン酸化することであり、したがって、かかる機能は、例えば網膜芽細胞腫タンパク質、ラミン、ヒストンＨ１、及び紡錘体の構成要素のような特定のタンパク質を、活性化又は不活化する。ＣＤＫが仲介する触媒のステップには、ＡＴＰから高分子酵素基質へのホスホトランスファー反応(phospho-transfer reaction) が含まれる。化合物の基には(N. Gray, L. Detivaud, C. Doerig, L. Meijer, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 859に記載）、ＣＤＫ特異的ＡＴＰ拮抗作用によって抗増殖特性を有するものがあることが、見出されている。 
【０００５】
ロスコビチン(roscovitine)は、６−ベンジルアミノー２−［（Ｒ）−１−エチルー２−ヒドロキシエチルアミノ］−９−イソプロピルプリン化合物で、サイクリン依存キナーゼ酵素の強力な阻害剤として、特にｃｄｋ２の強力な阻害剤として実証されている。かかる化合物は現在抗癌剤として開発されている。ｃｄｋ阻害剤は、細胞サイクルのＧ１／Ｓ期及びＧ２／Ｍ期から細胞の経路をブロックすると理解されている。ロスコビチンは、網膜芽細胞腫のリン酸化に対する阻害剤としても明らかになっており、そのためＲｂ陽性腫瘍に対してより強力に作用すると意味付けられている。
【０００６】
多くの場合に、治療法の効果を最大限に発揮させるために、活性の薬剤を併用して投与することができることは、当技術分野で十分に実証されている。したがって本発明は、増殖性疾患、特に癌の治療に特に適した既知の薬剤の新規の組合せを提供しようとするものであり、より具体的には、ある薬剤を併用して使用することに関連する驚くべき効果や予期せぬ効果に焦点を当てるものである。
【発明の開示】
【０００７】
第一の態様として、本発明は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含む組合せを提供する。
【０００８】
第二の態様は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と混合した本発明による組合せを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
第三の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合における本発明による組合せの使用に関する。
【００１０】
第四の態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含み、治療において、同時に、連続して若しくは個別に使用する複合製剤である医薬品に関する。
【００１１】
第五の態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを同時に、連続して若しくは個別に、投与対象に投与する増殖性疾患の治療方法に関する。
【００１２】
第六の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる治療が、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを同時に、連続して若しくは個別に、投与対象に投与することを特徴とする、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００１３】
第七の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合における、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとの使用に関する。
【００１４】
第八の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる薬剤をドキソルビシンとの併用療法に使用することを特徴とする、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００１５】
第九の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるドキソルビシンの使用であって、かかる薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法に使用することを特徴とする、ドキソルビシンの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に示す好ましい実施態様を、上述の本発明の態様の全てに応用することができる。
【００１７】
上述のように、本発明は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含む組合せに関する。好ましくは、かかる組合せが相乗的な組合せである。
【００１８】
ドキソルビシンは、アンスラサイクリン抗生物質(anthracycline antibiotic)である化合物（８Ｓ−シス）−８−アセチル−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−へキソピラノシル）オキシ］７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−１−メトキシ−５，１２−ナフタセネジオンである。アンスラサイクリン抗生物質は１９３９年に初めて微生物から単離され、その抗菌性は１９５０年代に研究された。この抗生物質は極めて容易に細菌を死滅させたが、ヒトにおける感染の治療に使用するには、その毒性は強過ぎるものであった。１９６０年代になって初めて、アンスラサイクリン抗生物質が抗腫瘍性についてテストされ、癌細胞に対して活性であることが見出された。
【００１９】
アンスラサイクリンは全てＤＮＡに結合しており、その細胞毒性の大部分はこの結合に由来する。より具体的には、アンスラサイクリンは二本鎖ＤＮＡに結合する。アンスラサイクリンを用いて処理したヒト染色体の調製において、結合剤は、はっきりした赤橙色の蛍光バンドとして観察される。このＤＮＡとの相互作用はインターカレーションによるもので、複数の方法によってこのように同定されてきた。ＤＮＡへの結合を変化させるようにアンスラサイクリンの構造が改良されている場合、抗腫瘍活性は通常減少又は消失する。したがって、ＤＮＡ結合はこの薬剤の抗癌活性にとって欠くことができないものであると思われる。しかし、細胞毒性に至る経路は、明確に解明されてはいない。薬剤が高濃度である場合にのみ起こることから、ＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成の阻害は、細胞毒性に欠くことができないとは考えられない。
【００２０】
アンスラサイクリンは複数の重要な効果を有しているが、そのいずれか又は全てはこれらの薬剤の細胞毒性において役割を担っている。第一に、アンスラサイクリンはＤＮＡによってインターカレートすることができ、これによってＤＮＡ合成及びＲＮＡ合成を含むＤＮＡの多くの機能に影響を与える。また、ＤＮＡ鎖の破壊が発生する可能性もある。これは、酵素ＤＮＡトポイソメラーゼIIによって、或いは遊離基の形成によって、仲介されると考えられている。例えば酵素トポイソメラーゼIIを阻害することによって、ＤＮＡにおける二本鎖の破壊をもたらす連続した反応が導かれる可能性がある。
【００２１】
切断可能な複合体の形成による正常な触媒サイクルの過程において、トポイソメラーゼによって、一時的な二本鎖の破壊が引き起こされる。永続的な二本鎖の破壊の原因となる、かかる複合体の分裂は、薬剤がない限りほとんど起こらない。トポイソメラーゼIIの阻害剤によって、切断可能な複合体が継続し、それによって切断可能な複合体が不可逆的な二本鎖の破壊へと転換される可能性が高まる。
【００２２】
アンスラサイクリンも、その後一本鎖の破壊を主に引き起こす活性酸素種が形成される原因となる可能性がある。アンスラサイクリンの発色団は、十分に説明された鉄キレート構造であるヒドロキシキノンを含む。薬剤−鉄−ＤＮＡ複合体は、グルタチオンから酸素への電子の移動を触媒するが、これは、活性酸素種が形成される原因となる。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＣＤＫ阻害剤とアンスラサイクリンとを含む組合せに関する。
【００２４】
更に別の態様は、ＣＤＫ阻害剤とアンスラサイクリンとを含む医薬品に関する。
【００２５】
上述のように、本発明のある態様は、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含み、治療において、同時に、連続して若しくは個別に使用する複合性剤である医薬品に関する。
【００２６】
ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを同時に、併用して、連続して若しくは個別に（投与方法の一部として）投与してもよい。
【００２７】
本明細書に用いられるように、「同時に」なる語を用いて、２つの薬剤を一斉に投与するという意味が示され、「併用して」なる語を用いて、同時でない場合は、これら２つの薬剤が治療効果を有する同じ期間、これらを「連続して」投与するという意味が示される。したがって、最初に投与した薬剤の循環の半減期が、治療に有効な量で両薬剤が一斉に存在するようなものであるならば、「連続して」投与することによって、一方の薬剤を投与してから５分以内、１０分以内又は数時間以内に、他方の薬剤を投与することが可能となる。化合物の実際の性質、その間の相互作用並びにそれぞれの半減期によって、化合物の投与間の時間遅延が変化する。
【００２８】
「併用して」或いは「連続的して」とは対照的に、本明細書における、「個別に」とは、投与する一方の薬剤と他方の薬剤とのギャップが著しいこと、すなわち二番目の薬剤が投与された時には、最初に投与した薬剤はもはや治療に有効な量で血流に存在しない可能性があることを意味するために用いられる。
【００２９】
好ましくは、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを同時に又は連続して投与する。
【００３０】
本発明のある実施態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる治療がドキソルビシンとＣＤＫ阻害剤とを同時に、連続して若しくは個別に投与対象に投与すること特徴とする、ＣＤＫ阻害剤の使用。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施態様においては、ドキソルビシンを連続して又は個別に投与対象に投与する前に、ＣＤＫ阻害剤をかかる投与対象に投与する。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施態様においては、ＣＤＫ阻害剤を連続して若しくは個別に投与対象に投与する前に、ドキソルビシンをかかる投与対象に投与する。
【００３３】
本発明のある好ましい実施態様においては、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンの各成分について、治療に有効な量をそれぞれ投与する。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施態様においては、ＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンの各成分について治療に有効な量より少ない量をそれぞれ投与する。
【００３５】
本発明の別の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとの使用に関する。
【００３６】
本発明の更に別の態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる薬剤をドキソルビシンとの併用療法で使用することを特徴とする、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００３７】
本発明の更なる態様は、増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるドキソルビシンの使用であって、かかる薬剤をＣＤＫ阻害剤との併用療法で使用することを特徴とする、ドキソルビシンの使用に関する。
【００３８】
本明細書に用いられるように、「併用療法」なる語は、同時でない場合は、ドキソルビシンとＣＤＫ阻害剤とが治療効果を有する同じ期間に、連続してこれらを投与する治療に関する。
【００３９】
本明細書に用いられるように、「薬剤の調合」なる表現には、このような薬剤の調合のあらゆる段階で本発明の成分を使用することに加え、薬剤としてこれらの成分を直接的に使用することが含まれる。
【００４０】
「増殖性疾患」なる語は、ここでは、例えば最狭窄や心筋症のような心疾患、糸球体腎炎や関節リウマチのような自己免疫疾患、乾癬のような皮膚疾患、マラリヤや気腫や脱毛症のような抗炎症性疾患、抗真菌性疾患、抗寄生虫疾患等の、細胞サイクルのコントロールを必要とするあらゆる疾患を含むように広い意味で用いられる。これらの疾患においては、本発明の成分は、必要に応じてアポトーシスを含んでもよいし所望の細胞内の均衡状態を保っていてもよい。
【００４１】
好ましくは、かかる増殖性疾患が癌又は白血病であり、最も好ましくは癌である。
【００４２】
特に好ましい実施態様において、本発明は、ＣＤＫ依存性疾患(CDK dependent disorder)又はＣＤＫ感受性疾患(CDK sensitive disorder)の治療における、本明細書に記載の組合せの使用に関する。ＣＤＫ依存性疾患は、上述の１つ又は複数のＣＤＫ酵素の正常なレベルの活性に関連している。好ましくは、これらの疾患が、異常なレベルのＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４の活性に関連している。ＣＤＫ感受性疾患は、ＣＤＫのレベルの異常が主な原因となる疾患ではなく、一次代謝の異常から派生した疾患である。このような場合、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４は感受性の代謝経路の一部であるということができ、したがってＣＤＫ阻害剤はこれらの疾患の治療において有効であると考えられる。好ましくは、これらの疾患が癌又は白血病性の疾患である。
【００４３】
好ましくは、かかるＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４の阻害剤である。国際公開公報第９７／２０８４２号、国際公開公報第９８／０５３３５号（スィーヴィーセラピューティックス）、国際公開公報第９９／０７７０５号（リージェント・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア）に記載されるように、より好ましくは、かかるＣＤＫ阻害剤をロスコビチン、プルバラノールＡ(purvalanol A)、 プルバラノールＢ(purvalanol B)、オロモウシン(olomoucine)及び他の２，６，９三置換プリンから選択する。
【００４４】
更に好ましくは、かかるＣＤＫ阻害剤をロスコビチンとプルバラノールＡとから選択する。
【００４５】
特に好ましい実施態様においては、かかるＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである。
【００４６】
ロスコビチンは、化合物２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンであり、これは、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンとして記載されることもある。本明細書に用いられるように、「ロスコビチン」なる語には、分解したＲ体及びＳ体の鏡像異性体、それらの混合物及びそれらのラセミ体が含まれる。
【００４７】
更に好ましくは、かかる組合せが相乗効果を有する、すなわちかかる組合せが相乗的である。
【００４８】
薬剤の組合せによる効果は本質的に予測不可能であり、多くの場合に、一方の薬剤が他方の薬剤の効果を部分的に又は完全に阻害する傾向が見られる。本発明は、ドキソルビシンとロスコビチンとを併用し、同時に、個別に若しくは連続してのいずれかで投与すると、かかる２つの薬剤に逆の作用が生じないという驚くべき観察に基づいている。このような拮抗する作用がないということは、予想外ではあるが、臨床応用には重要である。
【００４９】
治療法の効果を最大にするために、多くの抗癌剤が併用して投与されている。例えば、ドキソルビシンは化学療法剤のカクテル又は投薬方法の一部として投与されることが多い。化学療法の組合せについてのデータベース、http://www.indiacancer.org/prof/acd11.html.を参照のことhttp://www.indiacancer。乳癌の治療において、ドセタキセル、ドキソルビシン及びcyclophosphamideの連続的治療法における、ドキソルビシンの使用が提案されてきた(Journal of Clinical Oncology, Volume 19, No 14, pp 3367-3375, 2001)。しかし、ロスコビチンを併用してドキソルビシンを投与することは、今日まで提案されていない。
【００５０】
好ましい実施態様においては、ドキソルビシン又はロスコビチンのいずれかの薬剤を単独で投与した場合と比較して、これらを組み合わせた場合には効果が増加する。この観察の本質は、先行技術に基づいて予測されたものと大きく異なっており、驚くに値する。
【００５１】
癌治療の分野における当業者には十分に理解されているように、癌はその部位（乳癌、肺癌、腎臓癌等）やその性質（小細胞、硬い、柔らかい等）によってだけでなく、特定の腫瘍に関連する遺伝子型に基づいて生化学的に分類することができる。癌の範囲が幅広いことから、異なる癌の中にｐ５３変異を示す亜母集団が存在すると考えられる。特定の癌における例として、乳癌の遺伝子型の特徴に基づく１組は、brca1又はbrca2変異を示す。異なる癌の基礎となる遺伝子型に関する理解が深まるにつれて、より具体的な治療や治療方法の開発が可能となると期待されるようになった。
【００５２】
この点に関して、本発明の特に好ましい実施態様においては、かかる増殖性疾患がＲｂ欠損増殖性疾患である。ドキソルビシンとロスコビチンのいずれかの薬剤を単独でＲｂ欠損癌細胞株に投与した場合と比較して、かかる薬剤の組合せを投与すると最大限の効果がもたらされることが、実験によって思いがけず示された。かかる観察の驚くべき性質は、特にＲｂのリン酸化を阻害する際のロスコビチンの活性の説明に鑑みて、予想に反するものである。
【００５３】
したがって、本発明の好ましい実施態様の１つは、治療に有効な量のＣＤＫ阻害剤と治療に有効な量のドキソルビシンとを投与することを含む、Ｒｂ欠損増殖性疾患を治療する方法に関する。
【００５４】
同様に、本発明の好ましい他の実施態様は、Ｒｂ欠損増殖性疾患の治療用薬剤の調合におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、かかる治療が、治療に有効な量のＣＤＫ阻害剤と治療に有効な量のドキソルビシンとを投与することを含む、ＣＤＫ阻害剤の使用に関する。
【００５５】
定義として、本明細書に用いられる「Ｒｂ欠損」なる語を用いて、野生型Ｒｂ遺伝子とは異なる遺伝子型を表す。したがって、Ｒｂ遺伝子型は変異又は欠損していてもよく、野生型Ｒｂ遺伝子は異形接合的に発現していてもよい。野生型Ｒｂ遺伝子に関する参考文献はLee et al に示されている(Lee W. H, Booksten, R, Hong, FD, Toung, LJ, Shew JY, Lee, EY-HP, 1987; Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification and sequence. et al Sciece 235: 1394-1399 )。
【００５６】
網膜芽細胞腫タンパク質は、遺伝した眼腫瘍のコンテクスト中に初めに同定された遺伝子によって発現する(Nevins JR, Human Molecular Genetics 2001, 10, 699-703)。そのリン酸化体において、かかるタンパク質はＥ２Ｆ等の転写調節因子のコントロールに関わることが観察されてきた。Ｒｂ機能の消失は現在では様々なヒトの癌に確認されている(Hunter T, Cell (1997) 88, 333-346, Sherr CJ, (1996) Science 274, 1672-1677 and Weinberg RA (1995) Cell 81, 537-548)。したがって、異なるタイプの癌において亜母集団がＲｂ遺伝子に変異を示すことが確認されている。これを以後Ｒｂ欠損癌と称す。
【００５７】
Li et alによる最近の報告(Cancer Research, Volume 61, No 6, pp 2579-82, 2001)によって、ＣＤＫ阻害剤flavopiridolを併用して治療した場合に、ドキソルビシンの細胞毒性作用に対して、ｐＲｂ欠損である骨肉腫細胞株ＳａＯＳ−２が、顕著に感作されることが示された。ＲｂでトランスフェクトしたＳａＯＳ−２細胞が同じ薬剤の組合せによってこの強化した感作を示さなかったことから、この作用はｐＲｂ欠損細胞だけに見られることがわかった。細胞サイクルの分析によって、flavopiridolがＲｂ回復細胞のＳ期においてドキソルビシンに誘導された細胞の蓄積を減少させるが、Ｒｂ欠損細胞では減少させないことが明らかとなった。サイクリン依存キナーゼ２における減少に伴ってｐ２１ｗａｆ−１が増加した。flavopiridolによるキナーゼ活性はＳａＯＳ−２欠損細胞では見られたが、Ｒｂ回復細胞では見られなかった。脂肪肉腫細胞株についてもＰＲｂにおける欠損が報告されている(Li et al. 1994, Br J Cancer 69, 1052-1058)。
【００５８】
上述のように、ドキソルビシンとＣＤＫ阻害剤、好ましくはロスコビチンとを併用して使用することは、Ｒｂ欠損癌に特に有効であることが認められてきた。完全ではないが、包括的な癌のリストを以下に挙げる。Ｒｂ欠損のような特定の癌を示す患者を、単純な遺伝子型アッセイによって同定してもよい。減少した又は増加したＲｂの発現を調べるための免疫組織化学によるアッセイを以下に示す。
・Xing EP, Guang-Yu, Y, Wang L-D, Shi, ST and Yang CS (1999) Loss of heterozygosity of the Rb gene correlates with pRb protein expression and associates with p53 alteration in human esophageal cancer.  Clinical Cancer Research 5: 1231-1240
・Geradts, J, Fong, KM, Zimmerman, PV, Maynard, R and Minna, JD (1999) Correlation of abnomal RB, p16ink4a, and p53 expression with 3p loss of heterozygosity, other genetic abnormalities and clinical features in 103 primary non-small cell lung cancers 
【００５９】
したがって、本発明の組合せは、特にＲｂ欠損の悪性疾患及び発癌前の疾患の治療に有効である。本発明は、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、大腸癌、及び乳癌等のＲｂ欠損の腺癌の治療に関して特に有用である。例として、本発明に従って治療することができる悪性腫瘍には、Ｒｂ欠損の急性又は慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、並びに繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮腫、血管肉腫、内皮腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫等のＲｂ欠損の肉腫が含まれる。また、Ｒｂ欠損の遺伝子型で発現する場合は、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、へん平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、希（乏）突起グリオーマ、髄膜腫、メラノーマ、神経細胞腫及び網膜芽細胞腫の癌が含まれる。
【００６０】
医薬組成物
本発明の成分（薬学的に許容される塩、エステル及び薬学的に許容される溶媒和物を含む）を、単独で投与することができるが、通常ヒトの治療には、それらを薬学的な担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与する。
【００６１】
したがって、本発明の好ましい実施態様は、薬学的に許容される賦形剤、希釈財又は担体と混合したＣＤＫ阻害剤とドキソルビシンとを含む医薬組成物に関する。
【００６２】
本明細書に記載される、様々に異なる医薬組成物の形にするこれらの賦形剤の例は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edit by A Wade PJ Wellerに見ることができる。
【００６３】
治療に使用する許容可能な担体或いは希釈剤は、薬学的分野において良く知られており、これらは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Pubilishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体の例には、乳糖、デンプン、ブドウ糖、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトール等が含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール及び水が含まれる。
【００６４】
目的の投与経路や標準的な薬学的実務に関して、薬学的な担体、賦形剤又は希釈剤を選択することができる。医薬組成物は担体、賦形剤又は希釈剤として、又はこれらに加えてあらゆる適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含有していてもよい。
【００６５】
適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース(free-flow lactose)、β−ラクトース、とうもうろこし甘味料等の天然の糖質、アラビアゴム、トラガカントゴム等の天然ゴム又は合成ゴム、若しくはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが含まれる。
【００６６】
適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウム等が含まれる。
【００６７】
かかる医薬組成物は、防腐剤、安定剤、染料を含んでいてもよく、香料さえも含んでいてもよい。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤や懸濁液を使用してもよい。
【００６８】
塩／エステル
本発明の薬剤は、塩又はエステル、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在してもよい。
【００６９】
本発明による薬剤の薬学的に許容される塩には、適切な酸の付加(acid addition)又はその塩基が含まれる。適切な薬学的な塩の記載はBerge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見ることができる。例えば、硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸等の鉱酸のような強力な無機酸によって、酢酸のような（ハロゲン等によって）置換される又は置換されない１から４個の炭素原子を有するアルカンカルボン酸等の強力な有機カルボン酸によって、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はtetraphtalic等の飽和の又は不飽和のジカルボン酸によって、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸等のヒドロキシカルボン酸によって、アスパラギン酸又はグルタミン酸等のアミノ酸によって、安息香酸によって、若しくは、メタン−又はｐ−トルエンスルホン酸のように（ハロゲン等によって）置換される又は置換されない（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリル−スルホン酸等の、有機スルホン酸によって、塩が形成される。
【００７０】
有機酸又はアルコール／水酸化物のいずれかを使用して、エステル化される官能基に応じてエステルが形成される。酢酸等の（ハロゲン等によって）置換されない又は置換される、１から１２個の炭素原子を有するアルカンカルボン酸等のカルボン酸や、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はtetraphtalic等の飽和の又は不飽和のジカルボン酸や、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸等のヒドロキシカルボン酸や、アスパラギン酸又はグルタミン酸等のアミノ酸や、安息香酸によって、若しくはメタン−又はｐ−トルエンスルホン酸のような（ハロゲン等によって）置換される又は置換されない（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリル−スルホン酸等の、有機スルホン酸が、有機酸に含まれる。適切な水酸化物には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム等の無機水酸化物が含まれる。アルコールには、（ハロゲン等によって）置換しなくても置換してもよい１から１２個の炭素原子を有するアルカンアルコールが含まれる。
【００７１】
鏡像異性体／互変異性体
適当であれば、本発明はかかる薬剤のあらゆる鏡像異性体及び互変異性体を含む。当業者であれば、光学特性（１つ又は複数のキラル炭素原子）又は互変異性の特徴を有する化合物を認識するであろう。対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体を、当技術分野において周知の方法によって同定／調製してもよい。  
【００７２】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の薬剤には、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在するものもある。例えば、それらは、２つ以上の立体異性体及び／又は幾何異性体の形で存在できるように、１つ又は複数の不斉中心及び／又は幾何中心を有していてもよい。本発明は、薬剤の個々の立体異性体及び幾何異性体並びにそれらの混合物の全ての使用を試みるものである。請求項で使用した用語にはこれらの形が含まれ、かかる形によって適当な機能的活性が保持される（必ずしも同程度でなくてよい）。
【００７３】
本発明はまた、薬剤又はその薬学的に許容される塩の適切な同位体の変異体を全て含む。本発明による薬剤又はその薬学的に許容される塩の同位体の変異体は、少なくとも１つの原子が同じ原子番号を有するが、原子量が通常自然界で見られる原子量とは異なる原子で交換されているものとして定義される。かかる薬剤と薬学的に許容されるその塩とに組み込むことができる同位体の例には、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌの、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素が含まれる。薬剤及び薬学的に許容されるその塩のある同位体の変異体は、例えば３Ｈ又は１４Ｃ等の放射性同位元素が組み込まれており、薬剤及び／又は基質組織の分配の研究に有用である。トリチウム化した、すなわち３Ｈ及び炭素−１４、すなわち１４Ｃ同位体は、調製が容易であることや、その検出能から、特に好ましい。更に、重水素、すなわち２Ｈ等の同位体との置換によって、インビボの半減期が増加する又は投薬量が減少する等の、更に優れた代謝安定性から生じる特定の治療上な利点が提供されることから、かかる置換が好ましい場合もある。本発明による薬剤及び薬学的に許容されるその塩の同位体の変異体を、通常は、適切な試薬の適当な同位体の変異体を用いて従来の手法によって調製することができる。
【００７４】
溶媒和物
本発明はまた、溶媒和物の形である、本発明による薬剤を含む。請求項に用いられた用語には、これらの形が含まれる。
【００７５】
多形体
更に本発明は、様々な結晶性形状、多形体の形及び水和した形である、本発明による薬剤に関する。精製方法及び又はこれらの化合物の合成調製で用いられる溶剤の単離の形を若干変えることによって、これらのうちいずれの形で化合物を単離してもよいことは、製薬業界では十分に確立されている。
【００７６】
プロドラッグ
本発明は更に、プロドラッグの形である、本発明による薬剤を含む。通常、このようなプロドラッグは、ヒト又は哺乳動物の投与対象へ投与する際にその改良が逆転するように、１つ又は複数の適当な基が改良されている化合物である。インビボで逆転を行うためにこのプロドラッグと共に二番目の薬剤を投与することは可能であるが、このような逆転は通常、かかる投与対象中に自然に存在する酵素によって行われる。このような改良の例には、エステラーゼ等によって逆転が行われるエステル（上述のうちのいずれか等）が含まれる。このような他のシステムは当業者には周知であると考えられる。
【００７７】
化学的誘導体
本発明はまた、薬剤の誘導体を含む組合せに関する。本明細書に用いられる「誘導体」なる用語には、薬剤の化学的な改良が含まれる。このような化学的改良の実例としては、ハロ基、アルキル基、アシル基又はアミノ基による水素の置換が挙げられる。    
【００７８】
投与
口腔、直腸、膣、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、包膜内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、頬、又は舌下の投与経路に本発明による医薬組成物を用いてもよい。
【００７９】
経口投与としては、圧縮錠、丸薬、錠剤、ゼラチンカプセル、滴薬及びカプセルを特に使用することができる。好ましくは、これらの化合物が１回の投与量に活性成分を１から２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１０００ｍｇ含む。
【００８０】
他の投与形態には、液剤又は乳剤が含まれ、これらは滅菌液又は滅菌水溶液(sterilisable solution)から調製され、静脈内、動脈内、包膜内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内に注射される。本発明による医薬組成物は、座薬、ペッサリー、懸濁液、乳剤、ローション剤、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー、液剤又は粉剤の形であってもよい。
【００８１】
経皮投与の代替方法には、皮膚パッチの使用がある。例えば、活性成分をポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性乳剤からなるクリームに配合することができる。１から１０重量％の濃度範囲で、白蝋又は白色ソフトパラフィン基剤(white soft paraffin base)と必要量の安定剤や防腐剤とからなる軟膏に、かかる活性成分を配合することもできる。
【００８２】
注射剤型は、１回の投与量に１０〜１０００ｍｇの、好ましくは１０〜５００ｍｇの活性成分を含んでいてもよい。
【００８３】
１回分の投与単位の形(unit dosage form)で、すなわち、１回分の投与単位、数回分の投与単位又は１回分の投与単位のサブユニット等に分けた形で、化合物を処方してもよい。
【００８４】
特に好ましい実施態様においては、本発明の組合せ又は医薬組成物を静脈内に投与する。
【００８５】
投与量
通常の当業者であれば、過度の実験をせずに、投与対象に投与するために適当な本発明の化合物の１つの投与量を容易に決定することができる。一般に医師であれば、個々の患者に最適と思われる実際の投与量を決定するであろう。使用する特別な薬剤の活性、その薬剤の代謝安定性及び作用時間の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の方法と時間、排出率、混合薬、特定の状態の重症度、及びそれぞれに受けている治療を含む様々な要因によって、その量が決定される。本明細書に開示された投与量は、平均的なケースにおける模範例である。もちろん、個々の事例のなかには、投与量が多い方が又は少ない方が有効な場合もあるが、それらも本発明の範囲に含まれる。
【００８６】
必要に応じて、かかる薬剤を０．１から３０ｍｇ／ｋｇ体重又は２から２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与してもよい。更に好ましくは、かかる薬剤を０．１から１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与してもよい。
【００８７】
上述のように、各活性成分、ＣＤＫ阻害剤及びドキソルビシンを好ましくは薬学的に有効な量で投与し、好ましくは薬学的に許容される量の形態で投与する。当業者であればこれらの量について熟知していると思われる。模範として(by way of guidance)は、一般にドキソルビシンを静脈内に、又は経口で投与し、最も一般的には静脈内に投与する。一般的に静脈内への投与量は１つの薬剤として２１日ごとに６０ｍｇ／ｍ２であり、一方併用療法では、投与量は２１日又は２８日ごとに２０から３０ｍｇ／ｍ２の範囲をとる。更に、適切な投薬方法には２５０ｍｇ又は５００ｍｇのドキソルビシンが含まれ、これらは医師の指示に従って静脈内に投与される。全投与量は患者の体重により異なり、例えば経口投与の場合は週に１５ｍｇ／ｋｇ、最大投与量は１ｇ／日、静脈内投与の場合は、１２ｍｇ／ｋｇを１日に４時間かけて、又は２４〜４９ｍｇ／ｋｇを１日に２４時間かけて５日間投与する。投与の量及び頻度は、患者の一般的な病状や、特に細網内皮系、肝臓系及び腎臓系に生じる副作用の重症度に適したものとする。
【００８８】
ドキソルビシンは、水又は湯で溶解する粉剤(powder for reconstitution)、リポゾーム内でカプセルに入った脂質製剤並びに溶液等の複数の投与形態で使用することができる。熟練した医師であれば、特定の患者や癌のタイプに最適な投与量及び投与形態を決定することができる。
【００８９】
一般に、約０．０５から約５ｇ／日、好ましくは約０．５から約５ｇ／日又は１から約５ｇ／日、更に好ましくは約１から約３ｇ／日の投与量で、経口で又は静脈内にロスコビチンを投与する。或いは、好ましくは約０．４から約３ｇ／日の投与量でロスコビチンを投与する。好ましくは、ロスコビチンを錠剤又はカプセルで経口的に投与する。ロスコビチンの１日の全投与量を、１回分の投与量として投与することもできる。また、１日に２回、３回、４回投与する場合には、投与量をそれぞれに分割して投与することもできる。
【００９０】
実施例
材料
ドキソルビシン及び組織培養試薬はシグマアルドリッチ社から供給される。ロスコビチンはCyclacel社(Dundee UK)から供給された。CalcuSyn プログラムはCambridge Biosoft (2001/2002)社製である。ＨＴＢ−８８：ｐ５３変異(Patterson et al. (1994) Br J Cancer 69: 1052-1058)、ｐＲｂ野生型、ｐ１６欠失の、ヒト外陰部一次平滑筋肉腫(human vulval primary leiomyosarcoma)であるＳＫ−ＬＭＳ−１細胞株をＡＴＣＣから得た。ＨＴＢ−１１４：ｐ５３変異(Patterson et al. (1994) supra.)、ｐＲｂ欠失、ｐ１６野生型の、ヒト子宮第３期平滑筋肉腫(human uterine grade III leiomyosarcoma)であるＳＫ−ＵＴ−１をＡＴＣＣから得た。
【００９１】
細胞毒性の方法(cytotox method)
３×１０４細胞／ｍｌの密度の細胞を２００μｌアリコットの９６ウェルプレートに播種した。培地は非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム及び１０％ＦＣＳ(Life Technologies/Invitrogen社製)を加えた最小必須培地であった。ガス発生加湿インキュベーター(gassing humidifying incubator)内に細胞を２４時間放置して、平衡化した。
【００９２】
薬剤のストック(stock of drags)を、滅菌水中でドキソルビシン用に形成し、ＤＭＳＯ中でロスコビチン用に作製し、使用の前に−２０℃で保存した。薬剤を組織培養培地（１０％ＦＣＳを含む）中で希釈し、所望の最終濃度を得た。かかる薬剤を５０μｌアリコットに、単独で又は組合せ（すなわち、ロスコビチン＋ドキソルビシン）として加えた。ＤＯＸを単独で１０ｎＭから３２０ｎＭの投与量で段階的に投与した。ロスコビチンを単独で１．２５μＭから４０μＭの投与量で段階的に投与した。
【００９３】
上述のように、ＤＯＸ１０ｎＭ：ロスコビチン１．２５μＭから始めてＤＯＸ３２０ｎＭ：ロスコビチン４０μＭへと段階的に希釈を連続していく間、使用した薬剤は、ＤＯＸ：ロスコビチンが互いに１：０．１２５という一定の割合であった。
【００９４】
７２時間後及び９６時間後に、ＨＴＢ１１４とＨＴＢ８８について、ＭＴＴ法（Twentyman and Luscombe 1987, Br J Cancer 56: 279-285に従って）を用いて、それぞれ細胞の生存可能性を評価した。
【００９５】
複合指数（ＣＩ）を、median effect 分析法に基づき、CalcuSyn プログラムに従って評価した。
【００９６】
結果
結果を図１及び図２に示す。これらはCalcuSynプログラムで計算された、複合指数（ＣＩ）を表す。図のように、ＣＩ指標＜１は、相乗効果を示す。ｐＲｂリン酸化の減少と相関するＨＴＢ−８８では、穏やかな相乗効果が見られた。ＨＴＢ−１４４（Ｒｂ欠損）では顕著な相乗効果が見られた。
【００９７】
インビボ検査
ロスコビチンとドキソルビシンの効果を、下垂体腫瘍の発光マウスモデル中で調べた。網膜芽細胞腫に依存した散在性癌の条件マウスモデルを作製することによって(Vooijs et al; Cancer Res 2002 Mar 15; 62(6); 1862-7; 2002)、インビボにおけるルシフェラーゼ発現の生物発光画像を介して、生きている動物の下垂体腫瘍の成長を非侵襲的にモニターすることが可能となった。かかるマウスモデルによって、腫瘍の発生や進行、並びに網膜芽細胞腫の経路を特異的にターゲットする治療的薬剤に対する反応を、縦方向にモニターすることが可能となった。要約すると、網膜芽細胞腫条件的ＫＯ細胞株をＰＯＭＣ−Ｃｒｅ／ＰＯＭＣ−ルシフェラーゼトランスジェニック細胞株と交雑し、ＰＯＭＣ−Ｃｒｅ／ＰＯＭＣ−Ｌｕｃ；Ｒｂ−ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ化合物変異マウスを作製した。図３に示すように、これらのマウスはＰＯＭＣ（Ｒｂ欠損）腫瘍(Vooijs et al, ibid)を発生する。ドキソルビシン（４×５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）を用いた治療では腫瘍形成の遅れが見られた。ドキソルビシンはＳ期に特異的で、腫瘍の進行を一時的に停止する（図４参照）。
【００９８】
ドキソルビシンに対する基準の反応が確立した後、直ちにモデルを使用して、ロスコビチンとドキソルビシンとを用いた併用療法の効果を調べた。かかる研究において、ドキソルビシンを４週間、週に１回投与した（５ｍｇ／ｋｇ；静脈内）。図５に示すスケジュールに従って、各ドキソルビシン投与の前に、ロスコビチンを２日間、１日に２回経口で投与した（５００ｍｇ／ｋｇ）。
【００９９】
１日目に対する生物発光におけるfold differenceを、図６（未処理のマウス）、図７（未処理、ドキソルビシン及びロスコビチン（「ＣＤＫ」）で処理を施したマウス、図８（未処理、ドキソルビシン、ロスコビチン及びドキソルビシン／ロスコビチンで処理を施したマウス）、及び図９（ドキソルビシン、及びドキソルビシン／ロスコビチンで処理を施したマウス）に示す。Kruskal-Wallisテスト（Ｐ＜０．０１）から、４つの末端処理グループ（図８）のmean slopesが等しくないことが示される。更に、Mann-Whitney テスト（Ｐ＜０．００９）から、ドキソルビシンで処理を施したグループとドキソルビシン／ロスコビチンで処理を施したグループとの間には種差が存在することが確認される（図９）。
【０１００】
要約すると、ドキソルビシンが一時的に腫瘍の進行を停止することや、ロスコビチンを先に投与することによってかかるドキソルビシンの効果が高まり、結果的に腫瘍が一時的に退縮することが、これらの結果から示される。ドキソルビシンとロスコビチンとの相乗効果がここ初めてインビボにおいて実証された。
【０１０１】
ウェスタン免疫ブロット法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥジェル（１０、１２又は４〜１２％）及びＭＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液を使用したＮＯＶＥＸ電気泳動法システムを用いて、タンパク質レベルの検出を行った。適切に処理し、回収し、ＳＤＳとプロテアーゼ阻害剤とでトリス緩衝液中で調製した細胞から全細胞溶解液を調製した。同量のタンパク質を各レーンにロードした。
【０１０２】
結果
２４時間で、サイクリンＡにおける投与量に依存的な低下がロスコビチンに見られ、ＳＫ−ＵＴ−１細胞において、ドキソルビシン単独の場合と比較して、併用した場合にはレベルの低下が見受けられた（図１０参照）。４８時間においても同様の結果が見られた。
【０１０３】
細胞サイクルの分析
ＤＮＡの細胞サイクルを分析するためのフローサイトメトリー：薬剤で処理した細胞を遠心分離によって回収しＰＢＳ中で洗浄し、７０％エタノール／ＰＢＳで固定した。細胞をＰＩで染色し、リボヌクレアーゼで処理した後、適当なゲーティングを行い、ＦＬ３を用いてフローサイトメトリーによる分析を実施した。
【０１０４】
結果
全体の％（４８時間処理）
サンプル                        Ｇ０  Ｇ１   Ｓ    Ｇ２Ｍ
対照                            １０  ６４  １０    １５
ロスコビチン                    ２３  ３６  １６    １９
Ｄｏｘｏ                        ２２    ９  １８    ４３
Ｄｏｘｏ＋ロスコビチン          ２２  ３６    ７    ２１
【０１０５】
ロスコビチンをドキソルビシンに加えることによって、ドキソルビシン単独の場合に見られるＧ２Ｍピークが実質的に低下し、細胞をＧ１へと移行させることが、結果から示唆される。ロスコビチンを加えることによって、ＳＫ−ＵＴ−I細胞において、ドキソルビシンに誘導されたＧ２Ｍの遮断が著しく低下することが、細胞サイクルの分析から示される。
【０１０６】
本発明の様々な改良や変形は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明は、具体的な好ましい実施例に関して説明されてきたが、本発明が請求するように、これらの具体的な実施例に不当に限定されるべきではないことは、理解されるであろう。実際には、関連する分野の当業者には自明であるところの、前述の態様についての本発明を実施する上での様々な改良も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
更に例を用いて、下記の図を参照して本発明を説明する。
【図１】図１は、ＨＴＢ８８のmedian effect 分析を用いてドキソルビシンとロスコビチンとの併用療法の効果を示す。CalcuSynプログラムを用いてデータを得た。複合指数（ＣＩ）＜１．０は共力作用を示す。
【図２】図２は、ＨＴＢ１１４のmedian effect 分析を用いてドキソルビシンとロスコビチンとの併用療法の効果を示す。CalcuSynプログラムを用いてデータを得た。複合指数（ＣＩ）＜１．０は共力作用を示す。
【図３】図３は、ＰＯＭＣ−Ｃｒｅ／ＰＯＭＣ−Ｌｕｃ；Ｒｂ−ｆｌｏｘ／ ｆｌｏｘ化合物変異マウスにおける腫瘍の成長を示す。上段：１２、１４及び１６週間後の腫瘍の成長、中段：８つの異なるマウスの時間に対する生物発光（ＢＬＵ）、下段：腫瘍の重量に対するＢＬＵ（ｍｇ）。
【図４】図４は、ＰＯＭＣ−Ｃｒｅ／ＰＯＭＣ−Ｌｕｃ；Ｒｂ−ｆｌｏｘ／ ｆｌｏｘ化合物変異マウスにおける、ドキソルビシン（４×５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）を用いて治療した場合の腫瘍の反応を示す。
【図５】図５は、ドキソルビシンを４週間、週に１回投与し（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）、それぞれのドキソルビシン投与前に、２日間、１日に２回ロスコビチンを経口で投与する（５００ｍｇ／ｋｇ）、薬剤の投与スケジュールを示す。
【図６】図６は、未処理のマウスの、生物発光における1日目に対するfold differenceを示す。
【図７】図７は、未処理のマウス及びドキソルビシン単独又はロスコビチン単独のいずれかで処理を施したマウスの、生物発光における1日目に対するfold differenceを示す。
【図８】図８は、未処理のマウス、ドキソルビシン単独又はロスコビチン単独のいずれかで処理を施したマウス、及びドキソルビシン／ロスコビチンを併用して処理を施したマウスの、生物発光における1日目に対するfold differenceを示す。
【図９】図９は、ドキソルビシン単独で処理を施したマウス及びドキソルビシン／ロスコビチンを併用して処理を施したマウスの、生物発光における1日目に対するfold differenceを示す。
【図１０】図１０は、サイクリンＡのウエスタン免疫ブロット解析を示す。Ａ：対照（４８時間）、Ｂ：ロスコビチン１０μＭ、Ｃ：ロスコビチン２０μＭ、Ｄ：ドキソルビシン５μＭ、Ｅ：ドキソルビシン１０μＭ、Ｆ：ロスコビチン／ドキソルビシン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2005527560.tif 000013
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