(57)【要約】【課題】ヒト癌原遺伝子ＫＧ−２０およびそれによってコードされるタンパク質の提供。【解決手段】配列番号: １の塩基配列を有するヒト癌原遺伝子またはその断片は、様々な癌組織で過発現され、様々な癌を診断するのに使用でき、それに相補的なアンチセンス遺伝子は癌を治療するに利用できる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列を有するヒトＫＧ−２０癌原遺伝子またはその断片。
【請求項２】
配列番号：１の塩基番号７４〜６１３に該当する塩基配列を有する、請求項１記載のヒトＫＧ−２０癌原遺伝子またはその断片。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片。
【請求項４】
請求項１の癌原遺伝子またはその断片を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターによって形質転換された微生物。
【請求項６】
大腸菌ＤＨ５α／ＫＧ−２０／ｐＣＥＶ−ＬＡＣ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０２８ＢＰ）である、請求項５記載の微生物。
【請求項７】
請求項５または６の微生物を培養することを含む、請求項３のタンパク質またはその断片を製造する方法。
【請求項８】
請求項１または２の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット。
【請求項９】
請求項３のタンパク質またはその断片を含む癌診断用キット。
【請求項１０】
請求項１または２の癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合して前記癌原遺伝子または断片の発現を抑制する塩基配列を有するアンチセンス遺伝子。
【請求項１１】
治療学的有効量の請求項１０に係るアンチセンス遺伝子と、薬剤学的に許容可能な担体を含む癌の予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関するものであって、これらは、種々の癌の診断、形質転換動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤の開発などに効果的に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む高等動物は、約１００，０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが発現され、発生、分化、恒常性（homeostasis）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（apoptosis; programmed cell death）などのような個人の生物学的過程の特性はどの遺伝子が発現するかによって決定される（Liang, P. and A. B. Pardee, Science, 257: 967-971(1992)参照）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝子突然変異によって誘発され、遺伝子発現の変化をもたらす。したがって、種々の細胞における遺伝子発現の比較研究は多様な生物学的現象を理解する上で基本的で効果的な接近方法であるといえる。
【０００４】
腫瘍形成は、特定染色体部位の消失、細胞癌遺伝子の活性化およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の不活性化などのような種々の遺伝的変化によって誘発されると報告された (Bishop, J. M., Cell, 64: 235-248(1991);およびHunter, T., Cell, 64: 249-270(1991)参照)）。さらに、ヒト癌の１０〜３０％は細胞癌遺伝子の増幅を通じて発癌遺伝子が活性化されることによって発病すると報告されている。
【０００５】
したがって、細胞癌遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果し、これを明らかにすることが要求されている。
【０００６】
そこで、本発明者は、子宮頸部癌の腫瘍形成に介入された機構を調査するために鋭意研究した結果、ヒト子宮頸部癌１（ＨＣＣＲ−１）（韓国特許出願第２０００−１６７５７号；２０００．３．３１）およびヒト子宮頸部癌２（ＨＣＣＲ−２）（韓国特許出願第２０００−７１２０２号；２０００．１１．２８）と命名された新規な癌原遺伝子が癌細胞中で特異的に過発現されるという意外な事実を発見した。癌原遺伝子は、構造的な変異を通じて該当するタンパク質産物の質的、そして量的な発現の変化を引起こす（Weinberg, R. A., Cancer Research, 49: 3713-3721, 1989）。癌タンパク質は、細胞表面、細胞質または核において信号伝達経路（signal transduction pathway）を破壊するが、腫瘍抑制遺伝子産物がない場合、他の種類の癌タンパク質とともに細胞の増殖を促進し、細胞周期（cell cycle）を撹乱し、また、アポトーシス機構を取り崩す（Todd, R., Anticancer Research, 19: 4729-4746, 2000）。
【０００７】
このようなタンパク質とタンパク質の相互作用を糾明する酵母２ハイブリッド（Yeast two-hybrid）法は、1989年に考案されて以来（Fields, S. and Song, O., Nature, 340: 245-246, 1989）、細胞死滅機構(Wallach, D. et al., Curr Opin Immunol, 10: 131-136, 1998)と種々の遺伝体系を用いて生命現象を明らかにするのに利用されている(Pandey, A. and Mann, M., Nature, 405: 837-846, 2000)。
【０００８】
本発明者らは、酵母２ハイブリッド法を用いて前記ＫＧ−１９癌原遺伝子と結合して癌化過程に参与する新規な癌原遺伝子であるＫＧ−２０を明らかにした。前記癌原遺伝子ＫＧ−２０は、白血病、リンパ腫、結腸癌、乳房癌、腎臓癌、胃癌、肺癌、卵巣癌、および子宮癌などのような様々な癌の診断、予防および治療に効果的に使用し得る。
【０００９】
【非特許文献１】
Liang, P.及びA. B. Pardee著、１９９２年発行、Science, 257：967-971
【００１０】
【非特許文献２】
Bishop, J. M.著、１９９１年発行、Cell, 64: 235-248
【００１１】
【非特許文献３】
Hunter, T.著、１９９１年発行、Cell, 64: 249-270
【００１２】
【非特許文献４】
Weinberg, R. A.著、１９８９年発行、Cancer Research, 49: 3713-3721
【００１３】
【非特許文献５】
Todd, R.著、２０００年発行、Anticancer Research, 19: 4729-4746
【００１４】
【非特許文献６】
Fields, S.及びSong, O.著、１９８９年発行、Nature, 340: 245-246
【００１５】
【非特許文献７】
Wallach, D.ら著、１９９８年発行、Curr Opin Immunol, 10: 131-136
【００１６】
【非特許文献８】
Pandey, A.及びMann, M.著、２０００年発行、Nature, 405: 837-846
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の目的は、新規な癌原遺伝子およびその断片を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよびそれによって形質転換された微生物；
前記癌原遺伝子によってコードされるタンパク質およびその断片；
前記癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット；
前記タンパク質またはその断片を含む癌診断用キット；
前記癌原遺伝子またはその断片から誘導されるｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス遺伝子；
前記アンチセンス遺伝子を用いて癌を治療または予防する方法；および
前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法；を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一実施態様によって、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する新規な癌原遺伝子またはその断片が提供される。
【００２０】
本発明の他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよび該ベクターによって形質転換された微生物が提供される。
【００２１】
本発明のまた他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片から誘導された配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片が提供される。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る癌原遺伝子は、癌原遺伝子であるＫＧ−１９のタンパク質産物と結合して乳房癌、卵巣癌、白血病、リンパ腫、子宮癌、肺癌、大腸癌、皮膚癌などを誘発する過程に参与する遺伝子であって、これらの癌の診断、形質転換動物の製造およびアンチセンス（anti-sense）遺伝子治療などに効果的に利用でき、また、従来報告されたヒト時間調節タンパク質（ＣＬＫ−１）と類似するタンパク質を生産するので、ヒトの寿命を調節する遺伝子として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
本発明の新規癌原遺伝子（protooncogene）はＫＧ−２０と命名されたものであって、６２２塩基対（ｂｐ）からなり、配列番号：１のＤＮＡ配列を有する。
【００２５】
特に、本発明のＫＧ−２０癌原遺伝子は、韓国特許出願第２００２−４１５５３号に記載されたヒト癌原遺伝子ＫＧ−１９（以下、「ＫＧ−１９」と称する）と特異的に結合する性質を有する。
【００２６】
配列番号：１の塩基配列において、塩基番号７４〜６１３部位に該当するオープン・リーディング・フレーム（Open reading frame; ORF）は、全長タンパク質コーディング領域であり、それから誘導されるアミノ酸は配列番号：２に示される１７９個のアミノ酸からなっている（「ＫＧ−２０タンパク質」）。しかし、コドンの縮退性（degeneracy）および本発明の癌原遺伝子を発現させようとする特定生物において選好されるコドンを考慮するとき、配列番号：１のＤＮＡ配列の多様な変化および変形は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えない範囲内のコーディング領域または癌原遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内の非−コーディング領域で行われることができる。したがって、本発明の癌原遺伝子と実質的に同様な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその断片もまた本発明の範疇に含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と塩基配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２７】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、１７９個のアミノ酸からなり、配列番号：２のアミノ酸配列を有し、このタンパク質の分子量は約２０ｋｄである。本発明のＫＧ−２０タンパク質は従来報告されたヒト時間調節タンパク質（Homo sapiens timing protein, CLK-1;(Vajo, Z. et al., Am. J. Hum. Genet, 61: A263-A263(1997)）とは異なる新規タンパク質である。すなわち、ＣＬＫ−１の３４番および１３４番アミノ酸であるアルギニンがＫＧ−２０では各々アラニンおよびリジンである。
【００２８】
しかし、タンパク質のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失をタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内で行うことができる。また、目的に応じてタンパク質の一部のみが使用され得る。このような変形されたアミノ酸およびその断片もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明の範疇には、本発明の発癌遺伝子から誘導されたタンパク質と実質的に同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片が含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリペプチド」とは、配列番号：２のアミノ酸配列とアミノ酸配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００２９】
本発明の癌原遺伝子またはタンパク質は、ヒトの胎盤（placenta）組織および癌組織から得られるか、通常のＤＮＡまたはペプチド合成方法に従って合成することができる。また、このように製造された遺伝子を当分野で公知の微生物発現用ベクターに挿入して発現ベクターを製造した後、これを適切な宿主、たとえば、大腸菌または酵母のような微生物、或はマウスのような動物細胞、またはヒト細胞に導入し得る。本願では、ＫＧ−２０癌原遺伝子で形質転換された細胞を「ＫＧ−２０細胞」と称する。
【００３０】
このように形質転換された宿主を用いて本発明のＤＮＡまたはタンパク質を大量生産することができる。たとえば、ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクター（Miki, T. et al., Gene, 83: 137-146 (1989)）でＫＧ−２０癌原遺伝子を大腸菌ＤＨ５αにトランスフェクト（transfection）して得られた大腸菌ＤＨ５α／ＫＧ−２０／ｐＣＥＶ−ＬＡＣを、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、２００１年６月２日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Korean Collection for Type Cultures (KCTC)；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology(KRIBB)）に寄託番号第ＫＣＴＣ  １０２８ＢＰ号として寄託した。
【００３１】
ベクター製作の際には、プロモーター、ターミネーターのような発現調節配列、自家複製配列および分泌シグナルを宿主細胞の種類によって適宜選択し、結合することができる。
【００３２】
本発明の癌原遺伝子の過発現は、白血病、リンパ腫、腎臓癌、肺癌、胃癌、皮膚癌細胞株において起こるので、これから、本発明の癌原遺伝子は前述の癌を誘発させることが分かる。また、正常の２９３ヒト胎生期腎臓細胞（human embryonic kidney;HEK）が本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされると非正常細胞が生成する。光学顕微鏡と電子顕微鏡で観察する形態学的特定技術によれば非正常細胞が腫瘍細胞の形態を有することを示す。すなわち、ヘマトキシリン−エオシン染色法を用いて腫瘍細胞が癌にかかったこと（癌腫）を確認できる。
【００３３】
また、本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされた正常ＨＥＫ２９３細胞をヌードマウスの背部に注射する場合、注射してから約２１日後に腫瘍形成が観察され、約３５日目には２．０ｃｍ×２．０ｃｍ大きさの腫瘍が観察される。
【００３４】
したがって、本発明の癌原遺伝子は種々の癌の発生に共通した因子であると判断され、種々の癌の診断および形質転換された動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療および抗癌剤薬物の開発に効果的に利用することができる。
【００３５】
本発明の癌原遺伝子を用いた診断方法は、たとえば、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含有するプローブを用いて対象者の体液から分離した核酸をハイブリッド化する段階および当分野で公知の検出方法を用いてその物質が癌原遺伝子を有しているかを判断する段階を含む。前記プローブを放射線同位元素または酵素で標識することによって、癌原遺伝子の存在を容易に確認することができる。したがって、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キットもまた本発明の範疇に含まれる。
【００３６】
形質転換動物は、本発明の癌原遺伝子を哺乳動物、たとえば、ラットに導入することによって製造でき、これもまた本発明の範疇に含まれる。形質転換動物の製造に当たっては、本発明の癌原遺伝子を８細胞期以前の動物受精卵段階に導入することが好ましい。このように形質転換された動物は、発癌性物質、または抗酸化剤のような抗癌性物質の探索などに有用である。
【００３７】
また、本発明は、遺伝子治療に効果的なアンチ−センス遺伝子を提供する。本願において、「アンチセンス遺伝子（anti-sense gene）」とは、配列番号：１の塩基配列を有する癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味し、前記ヌクレオチドはｍＲＮＡのタンパク質結合部位に結合することによって癌原遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の発現を防止することができる。
【００３８】
本発明はまた、その範囲内に本発明のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量を患者に投与することによって癌を治療または予防する方法を含む。
【００３９】
本発明のアンチセンス遺伝子の治療に当たっては、本発明のアンチセンス遺伝子は癌原遺伝子の発現を予防するために通常の方法で患者に投与される。たとえば、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を文献［J.S. Kim et al. J. Controlled Release, 53, 175-182(1998)］に開示された方法に従って、ポリ−Ｌ−リジン誘導体と静電気的引力によって混合し、この混合したアンチセンスＯＤＮを患者に静脈投与する。
【００４０】
本発明の範囲にはまた、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または必要に応じて他の添加剤とともに本発明のアンチセンス遺伝子を活性成分として含む抗癌組成物が含まれる。本発明の薬剤学的組成物は注射剤に製剤化することが好ましい。
【００４１】
実際に投与されるアンチセンス遺伝子の量は治療する症状、選択された投与経路、患者の年齢および体重、症状の重症度を含む種々の関連因子を考慮して決定されなければならない。
【００４２】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、診断道具として抗体を生産するのに有用である。本発明の抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を用いて当分野で公知の通常の方法に従ってモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の形態に製造できる。このような抗体を用いて当分野で公知の任意の方法、たとえば、酵素免疫測定法（enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)）、放射線免疫測定法（radioimmunoassay(RIA)）、サンドイッチ分析法（sandwich assay）、免疫組織化学染色法、ポリアクリルゲル上ウエスタンブロットまたは免疫ブロット方法によって対象者の体液に当該タンパク質が発現されたかを確認することによって癌を診断することができる。したがって、本発明の範疇には、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を含む発癌診断キットが含まれる。
【００４３】
本発明の癌原遺伝子を用いて持続的に増殖し得る癌細胞株を確立することができ、このような細胞株は、たとえば、本発明の癌原遺伝子で形質転換された繊維芽細胞をヌードマウスに注射することによって背部に形成された腫瘍組織から得られる。このように製造された細胞株は、抗癌剤の探索に効果的に利用することができる。
【００４４】
また、本発明の範疇には、前記癌原遺伝子またはその断片を用いて抗癌剤候補物質をスクリーニングする方法が含まれる。
【実施例】
【００４５】
下記の実施例および試験例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００４６】
［実施例１］酵母２ハイブリッド分析
ヒト癌原遺伝子であるＫＧ−１９遺伝子（Genebank accession no.:AF283671）のタンパク質産物と結合するタンパク質を発見するために、マッチメーカーＬｅｘＡ２ハイブリッドシステム（MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System; Clontech. Laboratories, Inc., USA）を用いて従来報告されている方法（Golemis, E. A., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Chapters 20.0 and 20.1, 1996）に従って実験を行った。
【００４７】
次の実験に用いられた細胞株とベクターはクロンテック（Clontech）社のカタログ＃Ｋ１６０９−１キットに記載されているものである。
【００４８】
酵母菌株であるＥＧＹ４８にｐ８ｏｐ−ｌａｃＺベクターを導入して形質転換（transformation）した後、ウラシル（Uracil）のない合成ドロップアウト（dropout）培地であるＳＤ／−ウラシル／グルコースプレートで培養した。前記プレートで成長したコロニー（colony）を選別してＳＤ／−ウラシル／グルコース培地（media）で培養した後、ＫＧ−１９癌原遺伝子をｐＬｅｘＡベクターのＳａｌＩとＢａｍＨＩ部位に挿入して製造したベクターをバイトプラスミド（bait plasmid）としてこの酵母菌株で形質転換した。
【００４９】
ＰＬｅｘＡベクターにクローニングされたＫＧ−１９癌原遺伝子が発現されるかを確認するために、ＬｅｘＡ抗体を用いてウェスタンブロット（western blotting）を行った。その結果、３７ｋＤａでバンドが得られた。
【００５０】
ＫＧ−１９癌原遺伝子を発現するコロニーをＳＤ／−ウラシル、−ヒスチジン／グルコース培地で培養した後、ヒト胎児脳（fetal brain）由来のＡＤ融合ライブラリーであるｐＢＤ４２ＡＤベクターでさらに形質転換した。バイトとライブラリーが結合することを確認するために、コロニーリフト分析法（colony lifting assay; Breeden, L. & Nasmyth, K., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio., 50: 643-650, 1985）を行った。バイトとライブラリーが結合すると、Ｘ−ｇａｌの入っているプレートで青色コロニーが形成する。酵母を培養した後、ガラスビード（glass bead）を用いてＤＮＡを抽出し、大腸菌（E. coli）ＫＣ８を電気穿孔法（electroporation）で形質転換した後、Ｍ９最少培地に展開して形質転換体を選別した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、これで大腸菌ＤＨ５αをさらに形質転換した後、大腸菌形質転換体からＤＮＡを抽出してHindIIIで処理して約０．６ｋｂ  ＤＮＡを有するクローンを得た。
【００５１】
［実施例２］ＫＧ−２０癌原遺伝子の全体ｃＤＮＡ配列分析
実施例１で得られたクローンをシケナーゼバージョン２．０ＤＮＡ配列分析キット（Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA）を用いてジデオキシ鎖終結法（dideoxy chain termination）に従って配列分析を行った。その結果、配列番号：１に示される６２２ｂｐからなる新規な癌原遺伝子を確認し、これを「ＫＧ−２０」と称した。全長ＫＧ−２０  ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を登録番号第ＡＦ３７４４１３号としてジーンバンク（GenBank）に登録した。
【００５２】
配列番号：１の塩基配列において、本発明の癌原遺伝子ＫＧ−２０の完全オープン・リーディング・フレーム（open reading frame）は、塩基番号７４〜６１３に該当し、配列番号：２の１７９個のアミノ酸からなるタンパク質をコードすると予測される。
【００５３】
ファージλからＫＧ−２０遺伝子を含むｐＣＥＶベクターを分離し、ＮｏｔＩ切断によってアンピシリン耐性ｐＣＥＶ−ＬＡＣを得た。ｐＣＥＶ−ＬＡＣベクターをＤＮＡリガーゼを用いて連結してＫＧ−２０遺伝子を発現する組換えベクターを得た。組換えベクターで大腸菌ＤＨ５αを形質転換してＤＨ５α／ＫＧ−２０／ｐＣＥＶ−ＬＡＣと命名された形質転換大腸菌を得、これを２００１年６月２日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地）に寄託番号第ＫＣＴＣ  １０２８ＢＰ号として寄託した。
【００５４】
［実施例３］ノーザンブロット分析
様々な組織においてＫＧ−２０遺伝子の発現程度を決定するために、ナイロン膜上にブロッティングした８種類の癌細胞から抽出したＲＮＡを含むヒト癌細胞サンプルを用いて製造社（Clontech社）の指針に従ってノーザンブロットを行った（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００５５】
ブロットを、レディプライム（rediprime）II無作為プライムラベリングシステム（Amersham, England）を用いて３２Ｐ−標識された無作為−プライムＫＧ−２０  ｃＤＮＡプローブで６８℃で一晩ハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を標準化した。
【００５６】
図１Ａは、ＫＧ−２０  ｃＤＮＡプローブを用いてヒト癌細胞株、すなわち、前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１においてＫＧ−２０遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。図１Ｂは、図１Ａと同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化して得られた結果である。図１Ａから分かるように、ＫＧ−２０の０．６ｋｂ転写物はバーキットリンパ腫細胞株であるＲａｊｉにおいて特に発現が増加し、また、前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１においても発現が確認された。
【００５７】
［実施例４］発現ベクターおよび形質転換された動物細胞の製造
（段階１）ＫＧ−２０を含むベクターの製造
ＫＧ−２０のコーディング部位を含有する発現ベクターを次の通り製造した。
【００５８】
まず、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, USA）真核細胞発現ベクターにＦｌａｇ遺伝子を導入することによって製造された融合ベクターＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐＦｌａｇ−ＣＭＶをＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理し、全長コーディング配列を有するＫＧ−２０遺伝子（配列番号：１において配列番号７４〜６１３に該当する）をＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理し、得られた断片をＳａｌＩとＢａｍＨＩで処理されたＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐＦｌａｇ−ＣＭＶに挿入した。生成したＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐＦｌａｇ−ＣＭＶ／ＫＧ−２０発現ベクターをリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７５３）内に形質導入し、Ｇ４１８（Gibco,U.S.A.）を含む培地で選別した。ＫＧ−２０遺伝子でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を「ＫＧ−２０細胞」と称した。
【００５９】
（段階２）ＫＧ−２０癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓上皮細胞
野生型ＨＥＫ２９３細胞および段階１で得られたＫＧ−２０細胞を、１０％血清を含むＤＭＥＭ培地で単層培養した後、その成長様相を位相差顕微鏡（Phase contrast microscopy, Olympus, USA）で観察した。図２Ａおよび図２Ｂは、単層培養された野生型ＨＥＫ２９３細胞およびＫＧ−２０でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の特徴を位相差顕微鏡で観察した写真である。図２Ａに示すように、分化された上皮細胞である野生型ＨＥＫ２９３細胞は、長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞である。ＫＧ−２０細胞の場合、細胞の形態は、図２Ｂに示すように、卵形の核および多量の細胞質を有する多角形模様に変化する。
【００６０】
単層培養したＫＧ−２０細胞をヘマトキシリン−エオシン（hematoxylin-eosin, H & E）で染色した後観察した結果、核の多形成、明らかな核小体、および顆粒状染色質所見および腫瘍巨大細胞、並びに非定型類似分裂が観察された（図３参照）。
【００６１】
［実施例５］動物におけるＫＧ−２０癌原遺伝子の腫瘍形成能
腫瘍形成能を分析するために、５×１０６  ＫＧ−２０細胞を９匹のヌードマウス（５週齢、ＢＡＬＢ／ｃ由来胸腺のないヌードマウス（athymic nu/nu on BALB/c background））の背部に皮下注射した。ＫＧ−２０が注射された９匹のすべてのマウスにおいて２１日経過後から明瞭な腫瘍を示し、腫瘍のサイズが３５日以内に２．０ｃｍ×２．０ｃｍになった（図４参照）。
【００６２】
［実施例６］ＫＧ−２０癌原遺伝子を大腸菌にトランスフェクトした後発現されるタンパク質サイズの決定
配列番号：１のヌクレオチド番号７４〜６３１に該当し、配列番号：２のアミノ酸番号１〜１７９をコードするＫＧ−２０癌原遺伝子のコーディング領域全体をＧＳＴ遺伝子が融合されたｐＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクター（Amersham Pharmacia Biotech., 米国）の多重クローニング部位のＢａｍＨＩとＮｏｔＩ部位に挿入してｐＧＥＸ  ４Ｔ−３／ＫＧ−２０ベクターを製造した後、これを大腸菌ＢＬ２１（ATCC 47092）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた大腸菌をＬＢブロース培地で３７℃で１６時間振盪培養した後、培養液を１／１００に稀釈し、さらに３時間培養した。これに、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Isopropyl beta-D-thiogalacto-pyranoside, IPTG, Sigma）を加えてタンパク質生産を誘導した。
【００６３】
ＩＰＴＧ誘導前と誘導後に培養液試料を取って大腸菌細胞を超音波粉砕した後、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。図５は、ｐＧＥＸ  ４Ｔ−３／ＫＧ−２０ベクターでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１菌株のタンパク質の発現様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。ＩＰＴＧ誘導後、約４６ｋＤａのタンパク質バンドが明らかに観察された。この４６ｋＤａ融合タンパク質はｐＧＥＸ  ４Ｔ−３ベクターの遺伝子から発現された約２６ｋＤａサイズのＧＳＴタンパク質を含有していた。
【００６４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ヒト癌細胞株（前骨髄球性白血病細胞株であるＨＬ−６０、子宮癌細胞株であるＨｅＬａ細胞、慢性骨髄白血球細部株であるＫ−５６２、リンパ球白血病細胞株であるＭＯＬＴ−４、バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞株であるＲａｊｉ、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、肺癌細胞株Ａ５４９および黒色腫皮膚癌細胞株であるＧ３６１）においてＫＧ−２０癌原遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図１Ｂ】図１Ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図２Ａ】単層培養された野生型２９３ヒト胎生期腎臓細胞の成長様相を示す。
【図２Ｂ】ＫＧ−２０癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞を単層培養した後の成長様相を示す。
【図３】単層培養されたＫＧ−２０癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図４】ヌードマウスにおけるＫＧ−２０癌原遺伝子の腫瘍形成能を示す。
【図５】ＫＧ−２０癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３ヒト胎生期腎臓細胞を、ＩＰＴＧ誘導前および誘導後に発現されるタンパク質の発現パターンを示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）で電気泳動を行った結果である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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