(57)【要約】本発明は、相同的組み換えによって得られる組み換えウイルスの構成を利用する、幾つかのウイルス株、特にヒト免疫不全ウイルスが示す表現型特性の分析法に関する。本発明は、本発明の方法を実施するための、プライマー、ベクター、細胞宿主、ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、及びマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むキットにも同様に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染に影響を及ぼす可能性のあるウイルスのゲノムの１つ又は幾つかの突然変異から生じる、患者の生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの表現型特性の分析法であって：
ａ）前記生体試料中に含まれる核酸の抽出、
ｂ）各々が少なくとも１つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む１対のプライマーを有する、ステップ（ａ）の核酸セグメントのＰＣＲによる少なくとも１つの増幅、
ｃ）ステップ（ｂ）で増幅されたセグメントを除いて、かつ場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を除いて、ウイルス複製に必要なＨＩＶウイルスのゲノムの部分を含むベクターの調製、
ｄ）相同的組み換えによってキメラウイルスを得るために：
−ステップ（ｂ）で得られる核酸、
−ステップ（ｃ）で調製されるベクター、
−外被遺伝子がステップ（ｃ）で調製されるベクターから欠失するならば、場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第２ベクター、による第１細胞宿主のトランスフェクション、
ｅ）単一の複製サイクル中にウイルス粒子を生成することを可能にする条件における前記第１細胞宿主の培養、
ｆ）ＨＩＶウイルス、又はＨＩＶ偽型ウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染の後に活性化可能なマーカー遺伝子を場合により含む少なくとも１つの第２細胞宿主の、ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子による感染、
ｇ）生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの少なくとも１つの特性を明らかにするための、ステップ（ｆ）で発現されたマーカーの検出及び／又は定量化を含むことを特徴とする分析法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、インテグラーゼ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、シス活性配列、ＬＴＲ、二量化配列、スプライシング調整配列、又はＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）から選択されるウイルスのゲノム領域の全部又は部分を含む核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われることを特徴とする請求項１に記載の分析法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質の１部分をコードする核酸配列及びプロテアーゼをコードする核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われること、及びステップ（ｃ）のベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成されることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の分析法。
【請求項４】
プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有するステップ（ｂ）の増幅は、１２３７から２７２５までの残渣に及ぶ１４８８塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ａ−：（５’  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣ  ３’）（配列識別番号１）及び
Ｐｒｏ  Ａ−：（５’  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＴＧ３’  ３’）（配列識別番号２）により行われ、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ｂ：（５’  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴ  ３’）（配列識別番号３）及び
Ｐｒｏ  Ｂ−：（５’  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧ  ３’）（配列識別番号４）による第２の増幅が続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、１５０５から２５６５までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１から３に記載の分析法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のトランスフェクションは、逆転写酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成される第１ベクターによって行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の増幅は、プロテアーゼをコードする領域のコドン９３を超えて、かつポリメラーゼ（ＰＯＬ）をコードする領域のコドン５０３を超えて及ぶ１５３０塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＭＪ３（５’  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡ  ３’）（配列識別番号５）及び
ＲＴ−ＥＸＴ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号６）により行われ、１対のプライマー：
Ａ３５（５’  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＴ  ３’）（配列識別番号７）及び
ＲＴ−ＩＮ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号８）による第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、２６１８から２８７２までの残渣に及ぶＨＩＶ−１の逆転写酵素をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１、２又は５に記載の分析法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）の増幅が、ｇａｇタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質の１部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の１部分をコードする核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）の増幅は、１２３７から４０６２の残渣に及ぶ２８２５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、プライマー対：
ｇａｇ＋１（５’  ＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡ  ３’）（配列識別番号３１）及び
ＲＴ−ＥＸ（配列識別番号６）により行われ、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ｂ＋（配列識別番号１）及び
ＲＴ−ＩＮ（配列識別番号８）による第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のトランスフェクションは、ｇａｇ遺伝子の１部分、及び１５０７から３８７０までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼ及び逆転写酵素の１部分をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域中で欠失し、かつ唯一のＮｒｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターによって行われることを特徴とする請求項１、２又は７に記載の分析法。
【請求項９】
ステップ（ｅ）で得たウイルス粒子によって第２細胞宿主の感染前に、逆転写酵素の阻害化合物を場合により異なる濃度で、第２細胞宿主に付加すること又は付加しないこと、及びステップ（ｇ）は、逆転写酵素の阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの、逆転写酵素阻害化合物感受性を決定することからなる請求項１、２、５又は６に記載の分析法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、インテグラーゼをコードする遺伝子の全部又は部分から欠失したレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）の増幅は、３９５０から５４１０までの残渣に及ぶ１４６０塩基対のＤＮＡ断片を得るために、プライマー対：
ＩＮＴ  Ｂ＋  −５’ＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡ３’（配列識別番号９）及び
ＩＮＴ  Ｂ−  ５’ＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴ３’（配列識別番号１０）により行われ、プライマー対：
ＩＮＴ  Ｖ＋  ５’ＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡ３’（配列識別番号１１）及び
ＩＮＴ  Ｖ−  ５’ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＧＡ３’（配列識別番号１２）による第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、４２２８から５０９３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のインテグラーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠全領域、及び６３４３位から７６１１位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１、２又は１０に記載の分析法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）の間、ステップ（ｆ）の前に、インテグラーゼの阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ（ｇ）は、インテグラーゼの阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスのインテグラーゼ阻害化合物感受性を決定することからなる請求項１、２、１０又は１１に記載の分析法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われること、及びステップ（ｃ）のベクターは、外被タンパク質をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成されるレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の分析法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）のベクターは、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を構成するＨＩＶ−１ゲノム領域の、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求項１、２又は１３に記載の分析法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）の増幅は、７５５３から８５１７までの残渣に及ぶ９６５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＦＩＮ−Ａ：５’ＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴ３’（配列識別番号１３）及び
ＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）により行われ、プライマー対：
ＦＩＮ−Ｃ：５’ＣＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧ３’（配列識別番号１５）及び
ＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）により行われる第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項１６】
外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、７６３５から８４４０までの残渣に及ぶ８０５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＦｕＡ：５’ＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴ３’（配列識別番号２３）及び
ＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）により行われ、プライマー：
ＦｕＣ：５’ＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡ３’（配列識別番号２５）及び次のプライマー：
ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）
ＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物により行われる第２の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは（１０％：９０％）から（９０％：１０％）、かつ非常に好ましくは（６０％：４０％）から（４０％：６０％）の比率で行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）の増幅は、６１９７〜６２２２の残渣から６１９７〜６２２２までの残渣まで及ぶ２１０６から２３２０の塩基対のＤＮＡ断片を得るために、１対のプライマー：
ＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及び
ＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）により行われ、プライマー対：
ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及び
ＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）による第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｌｕｌ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項１８】
外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、６３２２から８４４０までの残渣に及ぶ２１１８塩基対のＤＮＡ断片を得るために、１対のプライマー：
ＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及び
ＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）により行われ、プライマー：
ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及びプライマー
ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）及び
ＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物による第２の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは（１０％：９０％）から（９０％：１０％）、かつ非常に好ましくは（６０％：４０％）から（４０％：６０％）の比率で行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項１９】
外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、６３２２から８５２２までの残渣に及ぶ２２００塩基対のＤＮＡ断片を得るために、プライマー対：
ＥＤ３：５’ＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ３’（配列識別番号２８）及び
Ｅ０１：５’ＴＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡ３’（配列識別番号２９）により行われ、プライマー：
Ｅ１０：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧＴ３’（配列識別番号３０）及び
ＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）の増幅は、６４２６から７３６４までの残渣に及ぶ９３８塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
Ｅ００：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ３’（配列識別番号１９）及び
ＥＳ８Ｂ：５’ＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＡ３’（配列識別番号２０）により行われ、プライマー対：
Ｅ２０：５’ＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧ３’（配列識別番号２１）及び
Ｅ１１５：５’ＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡ３’（配列識別番号２２）による第２の増幅ステップが続くこと、及びステップ（ｃ）のベクターは、６６１７から７２５０までに及ぶＨＩＶ−１外被のＶ１ループからＶ３ループにわたるドメインをコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＮｈｅＩ制限部位を含むことを特徴とする請求項１、２、１３又は１４に記載の分析法。
【請求項２１】
ステップ（ｅ）で得られる細胞宿主の培養の間、ステップ（ｆ）の前に、ＨＩＶ−１のｇｐ４１タンパク質を標的とする融合阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ（ｇ）は、ＨＩＶ−１のｇｐ４１を標的とする融合阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のｇｐ４１タンパク質を標的とする融合阻害化合物感受性を決定することからなる請求項１、２、１３から２０に記載の分析法。
【請求項２２】
ステップ（ｆ）の感染前に、ステップ（ｅ）で得られる細胞宿主に、標的細胞中へのＨＩＶウイルス侵入阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、及びステップ（ｇ）は、侵入阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの、標的細胞中への前記ＨＩＶウイルス侵入阻害化合物感受性を決定することからなる請求項１、２、１３、１４又は１６に記載の分析法。
【請求項２３】
一方では抗体無しで、かつ他方では抗体有りで、場合により異なる濃度で行われ、前記抗体は、ステップ（ｅ）で存在すること、及びステップ（ｇ）は、抗体有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの抗体阻害作用感受性を決定することからなる請求項１、２、１３、１４又は１７に記載の分析法。
【請求項２４】
ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子によるステップ（ｆ）の感染は、２つの別の細胞宿主に対して行われ、かつステップ（ｇ）は、２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とする細胞レセプターに関するＨＩＶウイルスの向性を決定することからなる請求項１、２、１３、１４又は１７に記載の分析法。
【請求項２５】
ステップ（ｆ）で感染した２つの細胞宿主の一方は、ＣＣＲ５レセプターを発現し、かつ他方はＣＸＣＲ４レセプターを発現することを特徴とする請求項２４に記載の分析法。
【請求項２６】
培養ステップ（ｅ）の間に、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、ステップ（ｆ）の感染は、２つの別の細胞宿主に対して行われること、及びステップ（ｇ）は、２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定することからなる請求項１、２、１３、１４又は１７に記載の分析法。
【請求項２７】
ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子によるステップ（ｆ）の感染は、２つの別の細胞宿主に対して行われ、かつステップ（ｇ）は、２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とする細胞レセプターに関してＨＩＶウイルスの向性を分析することからなる請求項１、２、１３、１４又は２０に記載の分析法。
【請求項２８】
ステップ（ｄ）の培養の間に、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること、ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子によるステップ（ｆ）の感染は、２つの別の細胞宿主に対して行われること、及びステップ（ｇ）は、２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を分析することからなる請求項１、２、１３、１４又は２０に記載の分析法。
【請求項２９】
ステップ（ｇ）は、ステップ（ａ）から（ｆ）を応用して得られるウイルス粒子により感染した第２細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、患者の生体試料と、かつステップ（ａ）から（ｆ）を応用して得られる参照ウイルス粒子により感染した同じ第２細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、参照ウイルスを含む試料と比較すること含むことを特徴とするＨＩＶウイルスの感染力又は複製能力を決定することからなる請求項１から２０のいずれかに記載の分析法。
【請求項３０】
参照ウイルスから生じた参照ウイルス粒子は、治療の先行する段階又はその前に、ステップ（ａ）から（ｆ）を同じ患者の生体試料に応用することにより得られるウイルス粒子であることを特徴とする請求項２９に記載の分析法。
【請求項３１】
培養ステップ（ｅ）の間か、第２細胞宿主かに、ステップ（ｆ）での該第２細胞宿主の感染前に、ヒドロキシ尿素を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、及びステップ（ｇ）は、ヒドロキシ尿素有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較を含むことを特徴とするＨＩＶウイルスのヒドロキシ尿素感受性を決定することからなる請求項１から２０に記載の分析法。
【請求項３２】
培養ステップ（ｅ）は、１２時間から７２時間、好ましくは、２４時間から４８時間にわたる期間で行われることを特徴とする請求項１から３１のいずれかに記載の分析法。
【請求項３３】
ｉ）少なくとも１つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む１対のプライマー、
ｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子、及び（ｉ）で定義したプライマーにより増幅されたセグメントを除き、ウイルス複製に必要なＨＩＶウイルスのゲノム部分を含むベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第２ベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項１から３２のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３４】
ｉ）配列：
−配列識別番号１及び配列識別番号２
−配列識別番号３及び配列識別番号４のプライマー対、
ｉｉ）１５０５から２５６５までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子を有する偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
ｉ）配列：
−配列識別番号５及び配列識別番号７
−配列識別番号６及び配列識別番号８のプライマー対、
ｉｉ）２６１８から２８７２までの残渣に及ぶＨＩＶ−１の逆転写酵素をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
ｉ）配列：
−配列識別番号９及び配列識別番号１０
−配列識別番号１１及び配列識別番号１２のプライマー対、
ｉｉ）４２２８から５０９３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のインテグラーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠全領域、及び６３４３位から７６１１位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
ｉ）配列：
−配列識別番号１３及び配列識別番号１４
−配列識別番号１５及び配列識別番号１６のプライマー対、
ｉｉ）７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３８】
ｉ）配列：
−配列識別番号２３及び配列識別番号２４
−配列識別番号２７を有する配列識別番号２５及び配列識別番号２６のプライマー対、
ｉｉ）７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３９】
ｉ）配列：
−配列識別番号１７及び配列識別番号１４
−配列識別番号１８及び配列識別番号１６のプライマー対、
ｉｉ）６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項４０】
ｉ）配列：
−配列識別番号１７及び配列識別番号２４
−配列識別番号１８及び配列識別番号２６及び配列識別番号２７のプライマー対、
ｉｉ）６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項４１】
ｉ）配列：
−配列識別番号１９及び配列識別番号２０
−配列識別番号２１及び配列識別番号２２のプライマー対、
ｉｉ）６６１７から７２５０までに及ぶＨＩＶ−１外被のＶ１ループからＶ３ループにわたるドメインをコードする領域から欠失し、かつ唯一のＮｈｅＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項４２】
ｉ）配列：
（配列識別番号５）及び（配列識別番号６）、
（配列識別番号７）及び（配列識別番号８）のプライマー対、
ｉｉ）２６１８から２８７２までの残渣に及ぶＨＩＶ−１の逆転写酵素をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項４３】
ｉ）配列：
（配列識別番号２８）及び（配列識別番号２９）及び
（配列識別番号３０）及び（配列識別番号２４）のプライマー対、
ｉｉ）６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、幾つかのウイルス株、特にＨＩＶウイルスを示す表現型特性の分析法に関する。
【０００２】
迅速であり、かつウイルス遺伝子中で突然変異の存在を検出するために広く使用可能な遺伝子型テストは、例えばＨＩＶのプロテアーゼ又は逆転写酵素をコードする遺伝子中に存在する突然変異を検出するために、開発された。
【０００３】
幾つかの突然変異は、特殊なウイルス活性阻害物質に関連したが、その他の多数は、幾つかの分子による処理と関連している。その上、新規な阻害物質分子の発達により、処理を逃れるウイルス変異体の遺伝子型特定は、ますます複雑になっている。このことは、評価、及びどの阻害物質に対して、ウイルスが耐性を有するようになっているか、又は僅かな感受性をなおも保っているのか知ることを難しくする。この状況下、耐性を有する突然変異の存在及び蓄積は、確かに耐性変化の良好な指数となり得るが、遺伝子型レベルでこれらの突然変異を単に検出することは、抗ウイルス治療が機能しない患者の治療的方向付けを最適化するために決定的であることが判明するパラメータである、耐性レベルを定量的に評価するために、もはや十分でない。
【０００４】
ウイルスの表現型特性は、様々なウイルスの行動局面と関連し、かつ前記ウイルス及びその環境の間の多数の相互作用に直接関与する。
【０００５】
ウイルス活性の阻害のようなウイルスの表現型特性の変化を培地中で、例えば前記ウイルス活性の阻害化合物の存在下で直接測定する表現型テストのみが、耐性の定量的指数を提供する。
【０００６】
特に医学的観点から分析が興味深いことが判明する他の表現型特性は、ウイルス活性に関与する少なくとも１つのメカニズムを阻止する可能性のある阻害剤に対する耐性をウイルスに与える特性、複製能力をウイルスに与える特性、特殊な標的に対する向性をウイルスに与える特性、又は抗体、ケモカイン又は阻害物質のような分子によって中和される能力をウイルスに与える特性である。
【０００７】
本発明により、感染患者において行われた採取見本から組み換えウイルスを再構成することに基づき、かつ唯一のウイルス複製サイクルを介在させる迅速な方法を用いて、ＨＩＶの異なっているが相補的である幾つかの表現型特性をテストすることが可能になる。この発明は、決定を補助し、かつ抗レトロウイルス治療のウイルス学的失敗の状況にあるＨＩＶ感染患者、又は抗レトロウイルス治療を受けたことがない患者において治療戦略を最適化する過程に含まれる。ウイルスの様々な表現型特性の完全な知識のみが、患者の特殊な状況に最も適した治療的決定を行うことにおいて臨床医を効果的に補助し得る。
【０００８】
医学的観点から分析が特別な重要性を有するＨＩＶウイルスの表現型特性の中で、下記に列挙するような、ウイルスのゲノムのＧＡＧ、ＥＮＶ、又はＰＯＬ領域に位置する、少なくとも１つの突然変異を受ける可能性がある遺伝子発現に関連した特性がある。
【０００９】
Ｉ  感染力、複製能力及び毒性
ＨＩＶウイルスのこれらの表現型特性は、ウイルス複製サイクルの様々なメカニズム又はステップにおいて介在する領域、又はタンパク質をコードする部分であるウイルスのゲノムのあらゆる領域の機能に関連し得る。特に、ウイルス複製に対し、かつ特には抗ウイルス剤への耐性を発達させたウイルスにおいて、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ又は外被をコードする遺伝子中の突然変異によって生じる効果を評価することは重要である。
【００１０】
その分析により、感染力又は「適応度」とも呼ばれるウイルスの複製能力を測定することが可能になる。
【００１１】
ＩＩ  逆転写酵素阻害物質感受性／耐性
ＨＩＶウイルスのこの表現型特性は、逆転写酵素をコードするＰＯＬ領域の１部分の発現に関連する。
【００１２】
その分析により、ヌクレオシド類似体又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質（ＮＮＲＴＩ）による抗レトロウイルス治療の調整が可能になる。
【００１３】
ＩＩＩ  インテグラーゼ阻害物質感受性／耐性
ＨＩＶウイルスのこの表現型特性は、インテグラーゼをコードするＰＯＬ領域の１部分の発現に関連する。
【００１４】
その分析により、インテグラーゼ阻害物質による抗レトロウイルス治療の調整のための指示が提供される。
【００１５】
ＩＶ  標的細胞中へのウイルス侵入阻害物質感受性／耐性
ＨＩＶウイルスのこの表現型特性は、ＨＩＶ外被の糖タンパク質の発現及び特にＥＮＶ遺伝子の部分によってコードされる前記糖タンパク質の膜貫通型サブユニットの発現に関連する。
【００１６】
この表現型特性の分析により、標的細胞膜とのウイルス膜の融合を阻止する阻害剤の作用を明らかにすることが可能になる。
【００１７】
Ｖ  ＨＩＶウイルスのコレセプターを標的とする阻害物質感受性／耐性
この表現型特性は、標的細胞のコレセプターとの結合に関与するポリペプチドをコードするＨＩＶウイルスのＥＮＶ領域の少なくとも１部分の発現に同様に関連する。外被／コレセプターの相互作用により、前記標的細胞中へのＨＩＶウイルスの侵入が可能になる。
【００１８】
その分析により、標的細胞中への侵入を行うためにＨＩＶによって使用されるコレセプターを阻止する阻害物質の作用に対するＨＩＶウイルスの耐性を測定することが可能になる。
【００１９】
阻害剤は、ＨＩＶ外被との相互作用を阻害して、コレセプターに干渉する。
【００２０】
特に、ＨＩＶの標的細胞のＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５レセプターにより外被タンパク質の幾つかの領域の相互作用を変更するＥＮＶ領域中の突然変異の効果を評価することは、重要である。
【００２１】
ＶＩ  向性
この表現型特性もまた、標的細胞の１つ又は幾つかのレセプター、特にＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５コレセプターとの結合に関与する、ＨＩＶウイルス外被のポリペプチドをコードするＥＮＶ領域の少なくとも１部分の発現に関連する。
【００２２】
その分析により、種々の細胞型中で異なるように発現される、前記レセプター、特にＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を使用する、ＨＩＶウイルスの能力を生体内で測定することが可能になり、かつウイルスがレセプターの一方若しくは他方、又は両方を使用するか知ることが可能になる。
【００２３】
この分析によって提供される指示により、ＨＩＶの天然標的である、幾つかの細胞型におけるウイルス行動を推論することが可能になる。
【００２４】
ＶＩＩ  毒性
この表現型特性もまた、ＨＩＶウイルス外被のポリペプチドをコードするＥＮＶ領域の全部又は部分の発現に関連する。
【００２５】
その分析によりＨＩＶウイルスの細胞変性力を評価することが可能になる。
【００２６】
ＶＩＩＩ  中和能力
この表現型特性もまた、ＨＩＶウイルス外被のタンパク質の発現に関連する。
【００２７】
その分析により、抗体、又は生体中に天然に存在し、かつ血清又は他の体液中に存在する物質の阻害作用へのウイルスの感受性を評価することが可能になる。
【００２８】
例えば、ＨＩＶウイルスの抗ウイルス治療耐性の表現型特性を検出するための第１のテストは、困難であり、かつ再現可能になり難い手順により、植物性凝集素（ＰＨＡ）によって刺激される末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及び１次分離株を使用して行われた。これらのテストの革新的な代替案である、以下にＲＶＡと呼ぶ組み換えウイルステストが、１９９４年にＫｅｌｌａｍ及びＬａｒｄｅｒによって提案された。
【００２９】
このＲＶＡ分析法は、逆転写酵素が欠失し、かつ十分に確立された多様な細胞系統中で複製能力がある、実験室で得られるウイルスのクローンで、重合連鎖反応（ＰＣＲ）によってしかるべく増幅されたウイルス配列の同時トランスフェクションによってウイルス保有患者の血漿から分離された逆転写酵素を有する組み換えウイルスの耐性を測定した。
【００３０】
この方法の幾つかの変更が今では記載された（Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｃ．，Ｋｅｕｌｅｎ，Ｗ．，Ｂｏｍｍｅｌ，Ｔ．，Ｎｉｊｈｕｉｓ，Ｍ．，Ｊｏｎｇ，Ｄ．，Ｊｏｎｇ，Ｍ．，Ｓｃｈｉｐｐｅｒ，Ｐ．及びＢａｃｋ，Ｎ．，Ｋ（１９９６）「細胞致死アッセイ中でテストする患者の血清から発生する組み換えウイルスを使用することによるＨＩＶ−１薬剤感受性決定。抗菌剤及び化学療法」４０（１０），２４０４‐２４０９）（Ｓｈｉ，Ｃ．及びＭｅｌｌｏｒｓ，Ｊ．Ｗ．（１９９７）「逆転写酵素阻害物質へのヒト免疫不全ウイルス１型感受性の迅速な生体内分析のための組み換えレトロウイルス系」。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４１（１２），２７８１‐５）（Ｈｅｒｔｏｇｓ，Ｋ．，ｄｅ  Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｐ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．，Ｉｖｅｎｓ，Ｔ．，Ｓｃｈｅｌ，Ｐ．，Ｖａｎ  Ｃａｕｗｅｎｂｅｒｇｅ，Ａ．，Ｖａｎ  Ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ，Ｃ．，Ｖａｎ  Ｇｅｒｗｅｎ，Ｖ．，Ａｚｉｊｎ，Ｈ．，Ｖａｎ  Ｈｏｕｔｔｅ，Ｍ．，Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ｆ．，Ｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｃｏｎａｎｔ，Ｍ．，Ｂｌｏｏｒ，Ｓ．，Ｋｅｍｐ，Ｓ．，Ｌａｒｄｅｒ，Ｂ．及びＰａｕｗｅｌｓ，Ｒ．（１９９８）「組み換えヒト免疫不全ウイルス１型中のプロテアーゼ及び逆転写酵素阻害物質への表現型耐性の迅速な同時検出法は、抗レトロウイルス薬剤で治療される患者から分離する」。Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４２（２），２６９−７６）（Ｈｅｃｈｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｇｒａｎｔ．Ｒ．Ｍ．，Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｉｌｌｏｎ，Ｂ．，Ｃｈｅｓｎｅｙ，Ｍ．Ａ．，Ｔｉａｎ，Ｈ．，Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｂａｎｄｒａｐａｌｌｉ，Ｎ．Ｉ．，Ｄｉｇｉｌｉｏ，Ｌ．，Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｂ．及びＫａｈｎ，Ｊ．Ｏ．（１９９８）「複数の逆転写酵素及びプロテアーゼ阻害物質に耐性を有するＨＩＶ−１変異体の性的伝染」。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９（５），３０７−１１）（Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．Ｊ．，Ｔｕｎｇ，Ｐ．Ｐ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓａｔｈｙａ，Ｂ．，Ｃａｓａｒｅａｌｅ，Ｄ．及びＳｔｒａｉｒ，Ｒ．Ｋ．（１９９８）「薬剤耐性ＨＩＶ分析用の組み換えレトロウイルス系の特徴付け及び使用」。Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１（２），１６９−７６）。
【００３１】
しかしながら、ＰＢＭＣを利用する方法のように、検出し、かつ測定しようと試みる特殊な表現型特性を発現する感染粒子の予備を生成することは、リンパ球の指数増殖によるウイルス増幅を必要とするので、大部分のこれらの組み換え系は、不都合を有する。その場合、ウイルスは、複製中に遺伝子浮動を受け、かつ調査する表現型特性の発現に必要不可欠な突然変異を失う可能性があり、このようにして方法の信頼性を減少させる。
【００３２】
先行技術の分析法に存在する、例えば耐性の表現型特性を明らかにするためのもう一つの不都合は、様々なレトロウイルス阻害物質に対する耐性を与える可能性のある幾つかの突然変異が同時に存在することが、ウイルスの複製能力を減少させることから生じる。
【００３３】
発明者は、唯一の複製サイクルしか必要としないＨＩＶウイルスの表現型特性の新規な分析法を発展させた。
【００３４】
単一のウイルス複製サイクルしか必要としないこの方法は、得られる組み換えウイルスの培養条件を選択することによって実施される。
【００３５】
これらの培養条件は、第１サイクルを超えてウイルス複製を妨げるために選択される培養時間の制御に関し、この培養時間は、１２時間から７２時間であり、好ましくは２４時間から４８時間である。
【００３６】
培養条件は、第１の細胞系の細胞選択に同様に関し、それらは、ウイルス感染を許容しないように選択され、例えばかかる細胞は、細胞中へのＨＩＶウイルス侵入に必要なＣＤ４レセプターを有さない。かかる細胞の例は、ＨｅＬａ又は２９３Ｔ細胞である。
【００３７】
最後に、これらの培養条件は、外被タンパク質不足を示す、本発明の方法により構成される組み換えウイルスにも関する。これらのウイルスは、一旦第１の細胞系で生成されると、実際この第１の細胞系の細胞を再度感染させることが不可能である。
【００３８】
この分析法は：
ａ）調査する表現型特性を変更する可能性のある突然変異を含む可能性のある分析するＨＩＶから得られるＤＮＡ配列であって、前記ウイルスの保有患者の血漿、血清、唾液、精液又はその他の分泌物のような生体媒質から抽出される配列、
ｂ）ＨＩＶ複製を可能にする配列の特異な欠失、及びＨＩＶに調査する表現型特性を与える配列の全部又は部分の欠失を有する第１ベクター、
ｃ）前記ウイルスの複製に必要な配列を補い、かつ第１ベクターに欠ける配列を含む第２ベクター、例えばプラスミドによる相同的組み換え及びトランスフェクションによって得られる組み換えウイルス（ＲＡＶ）の構成に基づく。
【００３９】
発明者が発展させた方法は、迅速であり、実施されるために約７日を必要とし、かつ従ってＨＩＶ感染患者のウイルス活性阻害物質感受性の測定のような常用決定に使用され得る。
【００４０】
このようにして、発明者は、ＨＩＶウイルスのプロテアーゼ阻害物質感受性を決定するための、特殊な組み換えウイルスの形成に基づくこの分析法の第１の応用を、米国特許６１０３４６２に既に記載した。
【００４１】
ＨＩＶの本発明の範囲内で実施される新規な分析法は、遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、インテグラーゼ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、シス活性配列、ＬＴＲ、二量化配列、スプライシング調整配列、特別組み換えウイルスによるＲＲＥを含む群から選択される、少なくとも遺伝子中に存在する可能性のある突然変異に関連したＨＩＶウイルスの表現型特性の決定に基づく。
【００４２】
従って本発明は、ウイルス感染に影響を及ぼす可能性のあるウイルスのゲノムの１つ又は幾つかの突然変異から生じる、患者の生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの表現型特性の分析法であって：
ａ）生体試料中に含まれる核酸の抽出、
ｂ）各々が少なくとも１つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む１対のプライマーを有する、ステップ（ａ）の核酸セグメントのＰＣＲによる少なくとも１つの増幅、
ｃ）ステップ（ｂ）で増幅されたセグメントを除いて、かつ場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を除いて、ウイルス複製に必要なＨＩＶウイルスのゲノムの部分を含むベクターの調製、
ｄ）相同的組み換えによってキメラウイルスを得るために：
−ステップ（ｂ）で得られる核酸、
−ステップ（ｃ）で調製されるベクター、
−外被遺伝子がステップ（ｃ）で調製されるベクターから欠失するならば、場合により外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第２ベクター、による第１細胞宿主のトランスフェクション、
ｅ）単一の複製サイクル中にウイルス粒子を生成することを可能にする条件における前記第１細胞宿主の培養、
ｆ）ＨＩＶウイルス、又はＨＩＶ偽型ウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を場合により含む少なくとも１つの第２細胞宿主の、ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子による感染、及び
ｇ）生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの少なくとも１つの表現型特性を明らかにするための、ステップ（ｆ）で発現されたマーカーの検出及び／又は定量化を含むことを特徴とする分析法に関する。
【００４３】
特に、ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、ｇａｇ、ｐｏｌ、プロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、インテグラーゼ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、シス活性配列、ＬＴＲ、二量化配列、スプライシング調整配列、又はＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）から選択されるウイルスのゲノム領域の全部又は部分を含む核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われる。
【００４４】
本発明の分析法の特殊な実施態様によれば、ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質の１部分をコードする核酸配列及びプロテアーゼをコードする核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、プロテアーゼをコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成される。
【００４５】
好適には、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列の、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、配列Ｆｉｔ  Ａ−：（５’  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣ  ３’）（配列識別番号１）及びＰｒｏ  Ａ−：（５’  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＴＧ３’  ３’）（配列識別番号２）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われ、配列：Ｆｉｔ  Ｂ−：（５’  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴ  ３’）（配列識別番号３）及びＰｒｏ  Ｂ−：（５’  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧ  ３’）（配列識別番号４）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーによる第２の増幅が続く。
【００４６】
非常に好ましくは、プロテアーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列の、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、１２３７から２７２５までの残渣に及ぶ１４８８塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ａ−：（５’  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣ  ３’）（配列識別番号１）及び
Ｐｒｏ  Ａ−：（５’  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＴＧ３’  ３’）（配列識別番号２）により行われ、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ｂ：（５’  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴ  ３’）（配列識別番号３）及び
Ｐｒｏ  Ｂ−：（５’  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧ  ３’）（配列識別番号４）による第２の増幅が続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、１５０５から２５６５までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターである。
【００４７】
本発明の分析法の第２の特殊な実施態様によれば、本発明による分析法のステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のトランスフェクションは、逆転写酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成される第１ベクターによって行われる。
【００４８】
好適には、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、配列ＭＪ３（５’  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡ  ３’）（配列識別番号５）及びＲＴ−ＥＸＴ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号６）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する転写酵素の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われ、配列：Ａ３５（５’  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＴ  ３’）（配列識別番号７）及びＲＴ−ＩＮ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号８）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する逆転写酵素の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１対のプライマーによる第２の増幅ステップが続く。
【００４９】
非常に好ましくは、逆転写酵素をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、プロテアーゼをコードする領域のコドン９３を超えて、かつポリメラーゼ（ＰＯＬ）をコードする領域のコドン５０３を超えて及ぶ１５３０塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＭＪ３（５’  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡ  ３’）（配列識別番号５）及び
ＲＴ−ＥＸＴ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号６）により行われ、１対のプライマー：
Ａ３５（５’  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＴ  ３’）（配列識別番号７）及び
ＲＴ−ＩＮ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（配列識別番号８）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、２６１８から２８７２までの残渣に及ぶＨＩＶ−１の逆転写酵素をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターである。
【００５０】
第３の実施態様によれば、本発明は、ステップ（ｂ）の増幅が、ｇａｇタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質の１部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の１部分をコードする核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われる分析法を同様に目的とする。
【００５１】
非常に好ましくは、ｇａｇタンパク質、又はプロテアーゼ若しくは逆転写酵素をコードする核酸配列中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある、ヒト免疫不全ウイルスのｇａｇタンパク質の１部分、プロテアーゼ及び逆転写酵素の１部分をコードする核酸配列を取り囲む１対のプライマーによる、ステップ（ｂ）の増幅は、１２３７から４０６２の残渣に及ぶ２８２５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、プライマー対：
ｇａｇ＋１（５’  ＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡ  ３’）（配列識別番号３１）及び
ＲＴ−ＥＸ（配列識別番号６）により行われ、１対のプライマー：
Ｆｉｔ  Ｂ＋（配列識別番号１）及び
ＲＴ−ＩＮ（配列識別番号８）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のトランスフェクションは、ｇａｇ遺伝子の１部分、及び１５０７から３８７０までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼ及び逆転写酵素の１部分をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域中で欠失し、かつ唯一のＮｒｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクターによって行われる。
【００５２】
好適には、上記トランスフェクションから生じるウイルスは、逆転写酵素及び／又はプロテアーゼ中に突然変異を有するウイルスの感染又は複製能力を決定するために使用され得る。この分析法によるウイルス粒子の定量化は、ｐ２４抗原の測定によって達成される。類似する分析法がいかなる場合も、逆転写酵素配列から単に欠失したベクターを使用して行われ得ないことを指摘すべきである。なぜならこれらの生育不能な組み換えウイルスが、ｐ２４抗原をなおも生成し得るからである。プロテアーゼに対応する領域の付加的欠失を有する組み換えウイルスを構成すると、正確に組み換えられたウイルスのみが、ｐ２４抗原を生成し、かつ生成されたウイルス粒子の確実かつ信頼できる測定をこのようにして可能にする。
【００５３】
本発明は、ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害化合物感受性を決定する分析法であって、ステップ（ｅ）で得たウイルス粒子によって第２細胞宿主の感染前に、逆転写酵素の前記阻害化合物を場合により異なる濃度で、第２細胞宿主に付加すること又は付加しないことからなり、かつ逆転写酵素の阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００５４】
本発明の分析法の第３の特殊な実施態様によれば、ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、インテグラーゼをコードする遺伝子の全部又は部分から欠失したレトロウイルスベクターである。
【００５５】
好適には、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、配列：ＩＮＴ  Ｂ＋  −  ５’ＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡ３’（配列識別番号９）及びＩＮＴ  Ｂ−  ５’ＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴ３’（配列識別番号１０）、又は少なくとも１つの突然変異を有するインテグラーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列を含む、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有するプライマー対により行われ、プライマー対：ＩＮＴ  Ｖ＋  ５’ＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡ３’（配列識別番号１１）及びＩＮＴ  Ｖ−  ５’ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＧＡ３’（配列識別番号１２）、又は少なくとも１つの突然変異を有するインテグラーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列による第２の増幅ステップが続く。
【００５６】
非常に好ましくは、インテグラーゼをコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによる、本発明の分析法によるステップ（ｂ）の増幅は、３９５０から５４１０までの残渣に及ぶ１４６０塩基対のＤＮＡ断片を得るために、プライマー対：
ＩＮＴ  Ｂ＋  −５’ＧＴＴＡＣＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡ３’（配列識別番号９）及び
ＩＮＴ  Ｂ−  ５’ＴＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＴ３’（配列識別番号１０）により行われ、プライマー対：
ＩＮＴ  Ｖ＋  ５’ＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡ３’（配列識別番号１１）及び
ＩＮＴ  Ｖ−  ５’ＡＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＧＡ３’（配列識別番号１２）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、４２２８から５０９３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のインテグラーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠全領域、及び６３４３位から７６１１位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターである。
【００５７】
本発明は、ＨＩＶウイルスのインテグラーゼ阻害化合物感受性を決定する分析法であって、ステップ（ｅ）の間、ステップ（ｆ）の前に、インテグラーゼの前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつインテグラーゼの阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００５８】
本発明の分析法の第４の特殊な実施態様によれば、ステップ（ｂ）のＰＣＲによる増幅は、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性のある核酸配列を取り囲む１対のプライマーにより行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、外被タンパク質をコードする遺伝子の全部又は部分が欠失したＨＩＶウイルスのゲノムから構成されるレトロウイルスベクターである。
【００５９】
好ましくは、ステップ（ｃ）のベクターは、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を構成するＨＩＶ−１ゲノム領域の、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターである。
【００６０】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、配列：ＦＩＮ−Ａ：５’ＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴ３’（配列識別番号１３）及びＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）か、配列ＦｕＡ：５’ＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴ３’（配列識別番号２３）及びＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われ、配列：ＦＩＮ−Ｃ：５’ＣＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧ３’（配列識別番号１５）及びＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）か、次の２つの配列：ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）及びＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物と組み合わせて使用される、配列：ＦｕＣ：５’ＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡ３’（配列識別番号２５）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われる第２の増幅ステップが続く。
【００６１】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、７５５３から８５１７までの残渣に及ぶ９６５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＦＩＮ−Ａ：５’ＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＴ３’（配列識別番号１３）及び
ＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）により行われ、プライマー対：
ＦＩＮ−Ｃ：５’ＣＴＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧ３’（配列識別番号１５）及び
ＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）により行われる第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含む。
【００６２】
非常に好ましくは、本発明による分析法は、亜型が何であれＨＩＶウイルスの、かつ特には亜型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）のウイルスの外被領域の配列の増幅を可能にし、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅のために使用しては、７６３５から８４４０までの残渣に及ぶ８０５塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
ＦｕＡ：５’ＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴ３’（配列識別番号２３）及び
ＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）により行われ、プライマー：
ＦｕＣ：５’ＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡ３’（配列識別番号２５）及び次のプライマー：
ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）
ＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物により行われる第２の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは（１０％：９０％）から（９０％：１０％）、かつ非常に好ましくは（６０％：４０％）から（４０％：６０％）の比率で行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含む。
【００６３】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、配列：ＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及びＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）、又はＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われ、配列：ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及びＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）、又は次の配列：ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）及びＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有するプライマー対による第２の増幅ステップが続く。
【００６４】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、６１９７〜６２２２の残渣から６１９７〜６２２２までの残渣まで及ぶ２１０６から２３２０の塩基対のＤＮＡ断片を得るために、１対のプライマー：
ＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及び
ＦＩＮ−Ｂ：５’ＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号１４）により行われ、プライマー対：
ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及び
ＦＩＮ−Ｄ：５’ＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴ３’（配列識別番号１６）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含む。
【００６５】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、６３２２から８４４０までの残渣に及ぶ２１１８塩基対のＤＮＡ断片を得るために、１対のプライマー：
ＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及び
ＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）により行われ、プライマー：
ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及び次のプライマー
ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）及び
ＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物による第２の増幅ステップが続き、前記混合物は、好ましくは（１０％：９０％）から（９０％：１０％）、かつ非常に好ましくは（６０％：４０％）から（４０％：６０％）の比率で行われ、かつステップ（ｃ）のベクターは、６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含む。
【００６６】
好適には、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、配列：Ｅ００：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ３’（配列識別番号１９）及びＥＳ８Ｂ：５’ＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＡ３’（配列識別番号２０）を含むか、又は該配列の断片か、若しくは少なくとも１つの突然変異を有する外被の遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーにより行われ、配列：Ｅ２０：５’ＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧ３’（配列識別番号２１）及びＥ１１５：５’ＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡ３’（配列識別番号２２）、を含むか、又は少なくとも１つの突然変異を有するプロテアーゼの遺伝子領域をハイブリダイズさせる能力を本質的に変更しない１つ又は幾つかのヌクレオチドの突然変異を有する、該配列の類似配列からなる、１０から５０のオリゴヌクレオチドの大きさを有する１対のプライマーによる第２の増幅ステップが続く。
【００６７】
非常に好ましくは、外被タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有する可能性がある核酸配列を取り囲む１対のプライマーによるステップ（ｂ）の増幅は、６４２６から７３６４までの残渣に及ぶ９３８塩基対のＤＮＡセグメントを得るために、１対のプライマー：
Ｅ００：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ３’（配列識別番号１９）及び
ＥＳ８Ｂ：５’ＣＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＣＣＴＣＡ３’（配列識別番号２０）により行われ、プライマー対：
Ｅ２０：５’ＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧ３’（配列識別番号２１）及び
Ｅ１１５：５’ＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡ３’（配列識別番号２２）による第２の増幅ステップが続き、かつステップ（ｃ）のベクターは、６６１７から７２５０までに及ぶＨＩＶ−１外被のＶ１ループからＶ３ループにわたるドメインをコードする領域から欠失するレトロウイルスベクターであり、かつ唯一のＮｈｅＩ制限部位を含む。
【００６８】
本発明は、ＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のｇｐ４１タンパク質を標的とする融合阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１５配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１３、配列識別番号１４か、プライマー対、配列識別番号１８、配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、ステップ（ｅ）で得られる細胞宿主の培養の間、ステップ（ｆ）の前に、前記融合阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつＨＩＶ−１のｇｐ４１を標的とする融合阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００６９】
本発明は、ＨＩＶウイルスの、標的細胞中への前記ＨＩＶウイルスの侵入阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１８及び配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７及び配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、ステップ（ｆ）の感染前に、ステップ（ｅ）で得られる細胞宿主に、前記侵入阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつ侵入阻害化合物有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００７０】
本発明は、ＨＩＶウイルスの抗体阻害作用感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１８、配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、培養ステップ（ｅ）の間に、前記抗体を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、かつ抗体有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００７１】
本発明は、細胞レセプターに関してＨＩＶウイルスの向性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１８、配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、２つの別の細胞宿主に対してステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子によりステップ（ｆ）の感染を行うことからなり、かつ２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００７２】
好適には、本発明の分析法によるステップ（ｆ）の感染に使用する細胞宿主は、ＣＣＲ５レセプター又はＣＸＣＲ４レセプターを発現する細胞宿主から選択される。
【００７３】
本発明は、ＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１８、配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、培養ステップ（ｅ）の間に、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないことからなり、ステップ（ｆ）の感染は、２つの別の細胞宿主に対して行われ、かつ２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００７４】
本発明は、細胞レセプターに関してＨＩＶウイルスの向性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号２１及び配列識別番号２２による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１９及び配列識別番号２０によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、ステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子により２つの別の細胞宿主をステップ（ｆ）で感染させることからなり、かつ２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で含む分析法にも同様に関する。
【００７５】
本発明は、ＨＩＶウイルスの、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする阻害化合物感受性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号２１及び配列識別番号２２による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１９及び配列識別番号２０によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、ステップ（ｄ）の培養の間に、ＨＩＶ−１のコレセプターを標的とする前記阻害化合物を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、２つの別の細胞宿主に対してステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子により、ステップ（ｆ）の感染を行うこと、及び２つの別の細胞宿主の各々によるマーカー遺伝子発現をステップ（ｇ）で比較することからなる分析法にも同様に関する。
【００７６】
本発明は、ＨＩＶウイルスの感染力又は複製能力を決定する分析法であって、ステップ（ａ）から（ｆ）を応用して得られるウイルス粒子により感染した第２細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、患者の生体試料と、かつステップ（ａ）から（ｆ）を応用して得られる参照ウイルス粒子により感染した同じ第２細胞宿主によるマーカー遺伝子発現を、参照ウイルスを含む試料と、ステップ（ｇ）で比較することからなる分析法にも同様に関する。
【００７７】
好適には、参照ウイルスから生じた参照ウイルス粒子は、治療の先行する段階又はその前に、ステップ（ａ）から（ｆ）を同じ患者の生体試料に応用することにより得られるウイルス粒子である。
【００７８】
本発明は、ＨＩＶウイルスの毒性を決定する分析法であって、プライマー対、配列識別番号１５配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１３、配列識別番号１４か、プライマー対、配列識別番号１８、配列識別番号１６による第２の増幅が続く、プライマー対、配列識別番号１７配列識別番号１８によりステップ（ｂ）の増幅を行うこと、及び第２細胞宿主に対して生成した細胞変性効果をステップ（ｆ）の感染の際に測定することからなる分析法にも同様に関する。
【００７９】
好適には、第２細胞宿主に対してステップ（ｆ）の感染の際に生成した細胞変性効果は、融合細胞誘導、アポトーシス誘導、又は流動血球計算による測定のような細胞毒性技術により測定される。
【００８０】
本発明は、ＨＩＶウイルスのヒドロキシ尿素感受性を決定する分析法であって、培養ステップ（ｅ）の間か、第２細胞宿主かに、ヒドロキシ尿素を場合により異なる濃度で付加すること又は付加しないこと、及びヒドロキシ尿素有り、及び無しでのマーカー遺伝子発現の比較をステップ（ｇ）で行うことからなる分析法にも同様に関する。
【００８１】
好ましくは、本発明の方法による培養ステップ（ｅ）の所要時間は、１２から７２時間であり、非常に好ましくは、２４から４８時間である。
【００８２】
本発明は、患者の生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの表現型特性の分析法を実施するためのキットであって：
ｉ）少なくとも１つの突然変異を有する可能性があるウイルスのゲノムの核酸配列を取り囲む１対のプライマー、
ｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子、及び（ｉ）で定義したプライマーにより増幅されたセグメントを除き、ウイルス複製に必要なＨＩＶウイルスのゲノム部分を含むベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子を含む第２ベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含むことを特徴とするキットも同様に目的とする。
【００８３】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号１及び配列識別番号２
−配列識別番号３及び配列識別番号４のプライマー対、
ｉｉ）１５０５から２５６５までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のプロテアーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、外被領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子を有する偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８４】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号５及び配列識別番号７
−配列識別番号６及び配列識別番号８のプライマー対、
ｉｉ）２６１８から２８７２までの残渣に及ぶＨＩＶ−１の逆転写酵素をコードするｐｏｌ読み取り枠領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８５】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号９及び配列識別番号１０
−配列識別番号１１及び配列識別番号１２のプライマー対、
ｉｉ）４２２８から５０９３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１のインテグラーゼをコードするｐｏｌ読み取り枠全領域、及び６３４３位から７６１１位までのウイルス外被をコードする領域から欠失するレトロウイルスベクター、
ｉｉｉ）外被タンパク質をコードする遺伝子による偽型ウイルス、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８６】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号１３及び配列識別番号１４
−配列識別番号１５及び配列識別番号１６のプライマー対、
ｉｉ）７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８７】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号１７及び配列識別番号１４
−配列識別番号１８及び配列識別番号１６のプライマー対、
ｉｉ）６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８８】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号１９及び配列識別番号２０
−配列識別番号２１及び配列識別番号２２のプライマー対、
ｉｉ）６６１７から７２５０までに及ぶＨＩＶ−１外被のＶ１ループからＶ３ループにわたるドメインをコードする領域から欠失し、かつ唯一のＮｈｅＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００８９】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号２３及び配列識別番号２４
−配列識別番号２７を有する配列識別番号２５及び配列識別番号２６のプライマー対、
ｉｉ）７７４５から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被のｇｐ４１サブユニットの細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００９０】
好適には、本発明によるキットは：
ｉ）配列：
−配列識別番号１７及び配列識別番号２４
−配列識別番号１８及び配列識別番号２６及び配列識別番号２７のプライマー対、
ｉｉ）６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ−１外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｕｌｌ制限部位を含むレトロウイルスベクター、
ｉｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性がある第１細胞宿主、
ｖ）ＨＩＶウイルスに感染した可能性があり、かつ専らウイルス粒子によって活性化可能なマーカー遺伝子を含む第２細胞宿主、
ｖｉ）ＰＣＲによる増幅を行うために必要な生成物及び試薬、
ｖｉｉ）発現されたマーカーの検出を可能にする生成物及び試薬を含む。
【００９１】
本発明のその他の利点及び特性は、これに続き、かつ次の図面を参照する実施例において図示する。
【００９２】
図１は、ｐＳＲＴプラスミドを概略的に示す。ｐＮＬ４−３ｘｃｅｎｖの逆転写酵素をコードする領域は、ＢａｌＩ−ＳｎａＢＩによる消化によって欠失する。結果として生じるｐＳＲＴの線形化は、Ｎｒｕ  Ｉの使用によって達成される。
【００９３】
図２は、逆転写酵素阻害物質による処理前及び後に、２人の患者対ＡＺＴ及び３ＴＣに関して得られた用量応答効果の曲線を図示する。
【００９４】
処理の詳細、時間に関する試料採取、及び遺伝子型は、図の見出しにある。
【００９５】
曲線は、材料及び方法の段落で、追って記載する技術によりｚｉｄｏｖｕｉｄｉｎｅ（ＡＺＴ、パネルＡ及びＣ）又はｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ（３ＴＣ、パネルＢ及びＤ）によって処理されたＰ４細胞の組み換えウイルスによる感染阻害を示す。患者１に関して、試料は、処理後０（◆）、９（●）及び１８（□）ヶ月で、かつ患者２に関して、処理後０（◆）及び２７（●）ヶ月でテストされた。
【００９６】
図３は、本発明の方法の特殊な実施の最初のステップ（ａ及びｂ）の図式である。図式は、本発明の方法のＲＴ  ＰＣＲによって患者の血漿から抽出された逆転写酵素配列の抽出（ａ）及び増幅（ｂ）ステップ、及びステップ（ｄ）で後に使用されるｐＲＶＡ／ＲＴプラスミドの構成図式を図示する。
【００９７】
図４は、本発明の方法の特殊な実施のステップ（ｃ）から（ｇ）の図式である。この図式は、ステップ（ｂ）で増幅された核酸配列の全部又は部分に対応する１つの核酸セグメントも、外被タンパク質をコードする核酸配列断片も含まない、ＨＩＶウイルスのゲノムから構成されるｐ４３ｘｃｓｎΔｅｎｖ  ＲＴ第１プラスミド、及び外被タンパク質をコードする配列を含むｐＶＳＶ−Ｇ第２プラスミドの、ステップ（ｂ）の増幅された核酸のＨｅＬａ／２９３Ｔ細胞中の同時トランスフェクションステップ（ｄ）；ウイルス粒子を生成することを可能にする培養ステップ（ｅ）、逆転写酵素の様々な阻害物質の連続希釈の存在下又は不存在下で予め保温された、Ｐ４細胞中でステップ（ｅ）で得られるウイルス粒子のトランスフェクションステップ（ｆ）、及びＣＰＲＧ基質によるベータ−ガラクトシダーゼ検出及び／又は定量化ステップ（ｇ）を図示し、前記Ｐ４指示細胞は、組み換えウイルスによって発現される活性化配列ｔａｔによって専ら活性化可能なベータ−ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝子の発現系を含む。
【００９８】
図５は、患者（Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型（ＮＬ４３及びＤＩＭ耐性クローン）に関してＴ２０融合阻害物質の存在下で得られる表現型分析の結果を図示する。
【００９９】
図６は、様々な資料から抽出されたウイルスＬ１、Ｌ２及びＬ３の複製能力の測定結果を図示する。
【０１００】
Ｉ−材料及び方法
Ｉ．１−重合連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅
ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，３８２４２  Ｍｅｙｌａｎ  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅ）により患者の血漿から分離され、かつ対象となる遺伝子は、逆転写酵素及び次のＰＣＲ反応によって分離される。
【０１０１】
逆転写酵素（ＲＴ）をコードする領域の増幅は、外部プライマーＭＪ３（５’  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡ  ３’）（添付の配列識別番号５）及びＲＴ−ＥＸＴ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（添付の配列識別番号６）、並びに内部プライマーＡ３５（５’  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＴ  ３’）（添付の配列識別番号７）及びＲＴ−ＩＮ（５’  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧ  ３’）（添付の配列識別番号８）により、５０℃（３０分）及び９４℃（２分）での最初のサイクル、その後に続く９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）及び６８℃（９０秒）での４０サイクル、並びに１０分間、９８℃でび最終伸長ステップによって行われる。このことは、プロテアーゼのコード領域のコドン９３を超えて、かつポリメラーゼ（ｐｏｌ）のコード領域のコドン５０３を超えて及ぶ１５３０ｐｂ生成物を増幅する。
【０１０２】
ＰＣＲによってこのようにして得られる生成物は、ＱｕｉａＡｍｐ（登録商標）カラムで純化され、かつアガロースゲル電気泳動によって、大きさ、純度及びおおよその濃度に関して分析される。
【０１０３】
Ｉ．２−遺伝子型特定
逆転写酵素のコード領域のヌクレオチド配列は、未加工ＰＣＲ生成物のジデオキシヌクレオチド鎖末端の自動配列決定によって決定される。
【０１０４】
Ｉ．３−プラスミド
分析法で使用するＨＩＶ−１の分子クローンは、ｐＮＬ４−３から誘導される。
【０１０５】
逆転写酵素の欠失したプラスミドは、３８７２位の唯一のＳｎａＢＩ制限部位及び３８９２位のＮｒｕ  Ｉを有するために突然変異したｐＮＬ４−３ｘｃΔｅｎｖの変更によって構成される。
【０１０６】
酵素Ｂａ  Ｉ及びＳｎａＢ  Ｉは、逆転写酵素をコードする領域（２６１８から２８７２位）を取り出すために使用され、かつ結果として生じるｐＳＲＴプラスミドの線形化は、Ｎｒｕ  Ｉ酵素によって行われる。トランスフェクトされた細胞中のＶＳＶ−Ｇ外被の糖タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下でｖｓｖ−ｇコード配列を含むｐＶＳＶプラスミドによって確実に行われる。
【０１０７】
Ｉ．４−細胞培養
ＨｅＬａ、２９３Ｔ及びＰ４細胞は、ウシ胎児血清（ＳＶＦ）１０％、ペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌが加えられたＤＭＥＭ媒質中で培養される。Ｐ４細胞は、ベータ−ガラクトシダーゼの発現がＨＩＶのトランス活性化するＴａｔタンパク質によって厳密に誘導可能である、Ｈｅｌａ−ＣＤ４、ＬＴＲ−ＬａｃＺ細胞であり、従って唯一の複製サイクルに基づくＨＩＶ−１ウイルスの感染力又は複製能力の正確な定量化を可能にする（Ｃｈａｒｎｅａｕ，Ｐ．，Ｍｉｒａｍｂｅａｕ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ，Ｐ．，Ｐａｕｌｏｕｓ，Ｓ．，Ｂｕｃ，Ｈ．及びＣｌａｖｅｌ，Ｆ．（１９９４）「ＨＩＶ−１逆転写酵素。ゲノム中心の終結ステップ」Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４１（５），６５１−６２）。Ｐ４細胞は、ジェネテシン５００μｇ／ｍｌの存在下で培養される。
【０１０８】
ＩＩ．−ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害物質（ＲＴＩ）感受性の決定
ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性決定は、次のように行われる：２９３Ｔ細胞は、ＮｒｕＩによって線形化されるｐＳＲＴプラスミド７．５μｇ、ｐＶＳＶ−Ｇプラスミド０．１μｇ、並びにＨＩＶの逆転写酵素のＰＣＲ反応から生じる生成物０．５及び１μｇによってトランスフェクトされる。トランスフェクションの沈殿物は、１８時間の保温後に細胞から取り出され、かつ新鮮な増殖培地が、加えられる。２４時間の培養後、上澄みは、遠心分離（５００ｇ、１５分）によって浄化され、かつ４時間、三重のウェル中で、逆転写酵素阻害物質の連続希釈により予め保温されたＰ４指示細胞上に移される。使用される阻害物質の濃度範囲は、化合物に応じて異なる。マーカー遺伝子の活性化により生成される信号は、逆転写酵素阻害物質感受性の分析のように、４８時間ＣＰＲＧによって発達し、かつ指数ＩＣ５０は、半有効方程式を使用して計算された。
【０１０９】
ＩＩＩ−ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定する分析法の最適化
逆転写酵素のコドン２４（塩基２６１８）から逆転写酵素のコドン４３２（塩基３８７２）にわたるｐｏｌをコードする領域中の欠失を有するｐＳＲＴプラスミドは、今日知られている耐性現象に関連する全ての突然変異を含む。ＰＣＲから生じる逆転写酵素生成物の相同的配列は、ｐＳＲＴ中の欠失から上流の８８塩基対及び下流の１８６塩基に及ぶ。逆転写酵素阻害物質感受性を決定するためのトランスフェクションは、ＨｅＬａ細胞よりも、高いトランスフェクトされる能力を有する２９３Ｔ細胞系統により行われる。このことは、細胞がＰ４細胞移動前に遠心分離によってウイルスを含む上澄みから除去されるので、問題とならない。
【０１１０】
移動条件は、チェッカーボードテストにより最適化される。プラスミド／ＰＣＲから生じた生成物の比率の変化は、生成された逆転写酵素若しくはＰ２４の量又はＣＰＲＧによる反応速度を著しく変更しない。環状プラスミド、ｐＶＳＶ−Ｇが、２９３Ｔ細胞に対して非常に有毒であるように見えるので、その量はトランスフェクション混合物中で３μｇから０．１μｇに減少され、高いｐ２４収率が導かれた（９．８ｎｇ／ｍｌと比較して＞２０ｎｇ／ｍｌ）。
【０１１１】
逆転写酵素を含むウイルスの早期複製段階が、このタイプの決定においてＰ４指示細胞中で生じるので、逆転写酵素阻害物質の連続希釈により処理されるのは、これらの細胞である。
【０１１２】
使用される阻害物質の濃度範囲は、各化合物の細胞毒性に応じて、かつ耐性分離株の感受性に関して比率ＩＣ５０／ＩＣ９０に応じて選択される（表１）。例えば、Ｐ４細胞のａｂａｃａｖｉｒに関する指数ＩＣ５０が約２５０μＭである一方、天然ウイルス株のこの化合物に関する指数ＩＣ５０が約３μＭであるので、耐性検出は、毒性により制限される。２００μＭに始まる４つの連続希釈の範囲が、ａｂａｃａｖｉｒに関して使用され、耐性の６０倍までの検出を可能にした。
【０１１３】
他方では、Ｐ４細胞のＡＺＴの毒性が高い（＞３００μＭ）一方、指数ＩＣ５０が著しく低いので、（１００倍までの）高い耐性レベルの検出を可能にするように、より広い希釈範囲が使用された（５μＭからの１／１０連続希釈）。
【０１１４】
耐性ウイルスに関する指数ＩＣ９０の検出は、大部分の逆転写酵素阻害物質で、化合物の毒性レベルを要求し得るので、ＲＶＡ逆転写酵素に関して、指数ＩＣ５０が、指数ＩＣ９０よりも使用される。
【０１１５】
表１は、ＮＬ４−３参照ウイルスの逆転写酵素阻害物質（ＲＴＩ）感受性を表す。
【０１１６】
【表１】
2005500003.tif 000002
【０１１７】
ａ−逆転写酵素阻害物質に関して反復した２０回のテストの幾何平均及び標準偏差。
ｂ−一定の薬剤の濃度範囲を使用して測定し得る、テストしたウイルス及びＮＬ４３の間の指数ＩＣ５０及びＩＣ９０の最大近似差。
【０１１８】
ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定する分析法は、１．７８（ａｂａｃａｖｉｒ）から２．７（Ｄ４Ｔ及びＡＺＴ）の、２０回のテストに関する幾何平均の標準偏差を生じさせる。テストした逆転写酵素阻害物質（ＲＴＩ）（ＡＺＴ、３ＴＣ、Ｄ４Ｔ、ＤＤＩ、ａｂａｃａｖｉｒ、ｅｆａｖｉｒｅｎｚ及びｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）の中央標準偏差は、２．２である。患者の試料の自動的な結果解釈を簡単にするように、任意の耐性指数（ＩＲ）の値、ＩＲ＝５が、ＮＬ４３に対して著しく減少したと考えられるＲＴＩへの感受性減少の最小限として定義された。
【０１１９】
ＮＬ４３が、臨床分離株との比較に適した参照ウイルスであるか決定するために、平凡な処理によって患者から取られた試料パネルが、逆転写酵素阻害物質感受性に関して３つのＲＶＡ複製に対し、テストされた。
【０１２０】
テストした２２のウイルスに関して見出だされた中央ＩＣ５０は、（ｓｔａｖｕｄｉｎｅに関して）０．９２、及び（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）１．２２付近の中央ＩＲを有するＮＬ４３ウイルスに関して見出されたそれよりも、僅かに大きい傾向がある。ＩＲは、大部分のテストした試料の阻害物質全体に対して、定義された限度の５より小さいが、ＩＲ範囲は、特に非ヌクレオシド阻害物質に関して広いように見える。特にｎｅｖｉｒａｐｉｎｅの耐性指数の１１．０は、あるウイルスに関して得られたが、しかるに、このウイルスは、ＮＮＲＴＩ耐性において以前に関与していた逆転写酵素のコドン９８（Ｓに対するＡ）に対する突然変異を有した。
【０１２１】
ＩＶ−再現性
組み換えウイルス（ＲＶＡ）の逆転写酵素阻害物質（ＲＴＩ）感受性の決定法の再現性は、ＲＮＡ製剤及び別々のＰＣＲ反応を使用して、広範囲の感受性特徴を代表するように選択される５つの試料に関する一連のテストによって、試料毎に４から８回のテストで評価された。
【０１２２】
ＨＩＶウイルスの逆転写酵素阻害物質感受性を決定するテスト間偏差は、幾つかの場合において、反復決定に関して見出された最大ＩＲ及び最小ＩＲの間に５を超える差が存在することを示す（表２）が、しかしながら幾何平均の標準偏差は、（Ｒ４、ＡＺＴ）を除く全ての場合において＝２．２に維持される。試料の３つにおいて、反復テストの際に得られたＩＲが、ウイルスが適度に耐性を有し得る化合物に関して＜５から＞５まで変化する（ＩＲは１２以下）。
【０１２３】
表２は、ＲＴＩ感受性の再現性を表す。
【０１２４】
【表２】
2005500003.tif 000003
【０１２５】
（ａ）逆転写酵素阻害物質耐性に関連するとして既に公知であるアミノ酸置換のみを示す。
（ｂ）耐性指数は、試料中のＩＣ５０の、比較決定されたＮＬ４３のそれに対する比率である。
（ｃ）幾何平均。
（ｄ）幾何平均の標準偏差。
（ｅ）最低耐性指数で除した、テストで得られる最高耐性指数。
（ｆ）ウイルスを耐性を有するとして分類する、耐性指数＞４を生じるテスト数／行われたテスト総数。
（ｇ）全てのテストで、検出可能な範囲を超えるＩＣ５０は、＞で示す。これらの場合、標準偏差及び最小／最大は、適用されない（ｎａ）。
【０１２６】
これらの逆転写酵素阻害物質に関して得られた表現型結果は、試料の遺伝子型特徴との一致を示している。
【０１２７】
テストした全化合物に対して高い耐久度を示す試料Ｒ２は、減少したＮＮＲＴＩ感受性を誘導することで知られる突然変異（１８１Ｃ、１９０Ａ）、及び１８４Ｖ突然変異に関連した３ＴＣ耐性、ＲＴＩヌクレオチド耐性を与える複数化合物耐性の複合体の突然変異（６２Ｖ、７５Ｉ、７７Ｌ、１１６Ｙ及び１５１Ｍ）を含み、複数の突然変異を含む。
【０１２８】
試料Ｒ３は、１８４Ｖ突然変異によって改めて変調された、高い３ＴＣ耐性レベルを示し、ＡＺＴに関して著しいＩＲの偏差があり、それはおそらく１８４Ｖによる、２１５Ｆによって誘導される耐性除去の不確実な性質を反映している。
【０１２９】
試料Ｒ４において、かかる除去は、２０８Ｙ突然変異を含む複数の突然変異の存在によって阻まれる。
【０１３０】
試料Ｒ５は、１０３Ｎと組み合わせて、ｅｆａｖｉｒｅｎｚ及びｎｅｖｉｒａｐｉｎｅに対して観察される高い耐性レベルの原因である、１００Ｉ突然変異の効果のために、４１Ｌ突然変異及び２１５Ｙ突然変異にもかかわらず、ＡＺＴで著しく保たれる。
【０１３１】
Ｖ−ＨＩＶウイルスの融合阻害物質感受性を決定する分析法の検証
プライマー：ＦｕＣ：５’ＡＴＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＡ３’（配列識別番号２５）及び次のプライマー：ＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）、ＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物によって行われる第２の増幅が続く、プライマー対ＦｕＡ：５’ＡＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴ３’（配列識別番号２３）及びＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）を、ステップ（ｂ）の増幅のために使用して得られる組み換えは、非常に有効である。
【０１３２】
実際、満足のゆくウイルス生成物を得るためには、組み換えステップで使用されるＰＣＲ生成物１０〜５０ｎｇで一般的に十分である。融合表現型特性を分析するためのこの方法において、ｐ２４の５０〜４００ｎｇ／ｍｌに対応するウイルス生成物は、トランスフェクション後に得られる。標的細胞の感染に関して、ｐ２４の０．５〜５ｎｇ／ウェル（９６ウェルプレート）が使用される。標的細胞の感染後に得られる光学密度の増加は、感染がこれらの条件で行われるならば、線形である。
【０１３３】
ＨＩＶウイルスの融合阻害物質感受性に関する分析法を検証するために、２つの融合阻害物質が使用された：すなわち（ＤＰ１７８又はＴ２０と呼ばれる）ＨＩＶのｇｐ４１中の遠位ヘリックス配列から誘導されるペプチド、及びベツリン酸誘導体（ＲＰＲ１０３６１１）である。各阻害物質に、２つの参照ウイルス：すなわち１次血漿ウイルスＴ５Ａ１及び生体外培養に適したウイルス（ＬＡＩ）に対し（他の著者によって以前に特定された）耐性を有する１つ以上のウイルスの感受性減少が行われた。全てのウイルスは、組み換えにより生成された。
【０１３４】
結果
Ｖ．１−ＤＰ１７８又はＴ２０阻害物質
（Ｒｉｍｓｋｙ  Ｌ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，ｖｏｌ  ７２，ｐａｇｅｓ  ９８６−９９３に記載された）高い耐性を有するＮＬ−ＤＩＭウイルス、及び（部分的に耐性を有する）ＮＬ４．３ウイルスに関するＩＣ５０の増加は、この阻害物質に対して測定された。
【０１３５】
高い耐性を有するＤＩＭウイルスは、Ｔ５Ａ１に対して８０倍の、かつＬＡＩに対して１００倍を超えるＩＣ５０値の増加を示す。
【０１３６】
部分的に耐性を有するＮＬ４．３ウイルスは、Ｔ５Ａ１に対して１０倍の、かつＬＡＩに対して１２．５倍のＩＣ５０の増加を特徴とする。
【０１３７】
Ｖ．１．１−血漿ＨＩＶのＴ２０融合阻害物質感受性の決定
ウイルスＲＮＡは、ＨＩＶ陽性患者の血漿から抽出される。
【０１３８】
プライマー対ＥＤ３＿Ｅ０１−でＰＣＲによる第１の増幅を行う。
【０１３９】
６３２２から８５２２の残渣に及ぶ２２００塩基対のＤＮＡ断片を得るために、プライマー対Ｅ１０＿ＦｕＢでＰＣＲによる第２の増幅を行う。
【０１４０】
−第２の増幅後に得られる核酸、
−６４８０から８２６３までの残渣に及ぶＨＩＶ外被の大部分のｇｐ１２０サブユニット及びｇｐ４１の細胞外部分をコードする全領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、により第１細胞宿主のトランスフェクションを行う。
【０１４１】
ウイルス粒子を生成することを可能にする条件において第１細胞宿主を培養する。
【０１４２】
Ｔ２０融合阻害物質の増加用量の存在下で、（ウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む）第２細胞宿主の、前のステップで生成したウイルス粒子による感染を行う。
【０１４３】
生体試料中に存在するＨＩＶウイルスの、Ｔ２０融合阻害物質感受性のレベルを明らかにするために、発現されたマーカーの定量化を行う。
【０１４４】
患者（Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型（ＮＬ４３及びＤＩＭ耐性クローン）に関する上記の表現型分析の結果は、添付の図５に図示され、かつ指数ＩＣ５０は、以下の表３に示す。
【０１４５】
【表３】
2005500003.tif 000004
【０１４６】
Ｖ．２−ＲＰＲ１０３６１１阻害物質
この阻害物質に対し耐性を有するウイルスＬＡＩ−Ｌ９１Ｈ（Ｌａｂｒｏｓｓｅ  Ｂ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０００  ｖｏｌ  ７４  ｐａｇｅｓ  ２１４２−２１５０）のＩＣ５０の増加が測定された。
【０１４７】
ＬＡＩ−Ｌ９１Ｈウイルスに関して、ＬＡＩ及びＴ５Ａ１に対するＩＣ５０の増加は、１００倍を超える。
【０１４８】
ＶＩ−ＨＩＶウイルスの中和能力を決定する分析法の最適化
プライマー：ＮＥＵ−Ｃ：５’ＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＧ３’（配列識別番号１８）及びプライマーＦｕＤ１：５’ＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２６）及びＦｕＤ２：５’ＴＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴ３’（配列識別番号２７）の混合物による第２の増幅が続く、１対のプライマーＮＥＵ−Ａ：５’ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧ３’（配列識別番号１７）及びＦｕＢ：５’ＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧ３’（配列識別番号２４）を、ステップ（ｂ）の増幅のために使用して得られる組み換えは、同様に非常に有効である。
【０１４９】
実際、ウイルス生成物の制御の際に、満足のゆくウイルス生成物を得るためには、組み換えステップで使用されるＰＣＲ生成物１０〜５０ｎｇで一般的に十分であることが判明した。
【０１５０】
トランスフェクション後のｐ２４の５０〜４００ｎｇ／ｍｌに対応するウイルス生成物が、得られる。標的細胞の感染に関して、ｐ２４の０．５〜５ｎｇ／ウェル（９６ウェルプレート）が使用される。標的細胞の感染後に得られる光学密度の増加は、感染がこれらの条件で行われるならば、線形である。
【０１５１】
ＶＩＩ−ウイルス感染力の測定（又は複製能力テスト）
プライマー対ＦＩＴＡ及びＰＲＯＡ−でＰＣＲによる第１の増幅を行う。
【０１５２】
１２３７から２７２５の残渣に及ぶ１４８８塩基対のＤＮＡ断片を得るために、プライマー対ＦＩＴＢ及びＰＲＯＢ−でＰＣＲによる第２の増幅を行う。
【０１５３】
−第２の増幅後に得られる核酸、
−Ｇａｇの１部分及びプロテアーゼ全体をコードする領域から欠失し、かつ唯一のＭｌｕＩ制限部位を含むレトロウイルスベクター、により第１細胞宿主のトランスフェクションを行う。
【０１５４】
ウイルス粒子を生成することを可能にする条件において第１細胞宿主の培養を行う。
【０１５５】
ｐ２４抗原の量を決めるＥｌｉｓａテストによりこの培養上澄み中の組み換えウイルス粒子の量を測定する。
【０１５６】
ウイルス上澄みの漸増希釈によって（ウイルス感染後に活性化可能なマーカー遺伝子を含む）第２細胞宿主の、前のステップで生成したウイルス粒子による感染を行う。
【０１５７】
組み換えウイルスの感染力レベルを明らかにするために、発現されたマーカーの定量化を行う。
【０１５８】
測定値からの回帰線を設定し、かつこの線の勾配を固定して、組み換えウイルスの複製能力を計算する。
【０１５９】
実験用参照ウイルスの複製能力に対する、又は処理の設定前かつ耐性の発達前に、同じ患者に由来するウイルス配列を保有する組み換えウイルスに関して、ウイルス複製能力を表す。得られた結果は、添付の図６に図示する。
【０１６０】
ウイルスＬ１、Ｌ２及びＬ３は、同じ患者において３回の異なる時期に得られたプロテアーゼ配列を保有する組み換えウイルスに対応する。ウイルスＬ１は、処理前に得られたプロテアーゼ配列を有する。各点は、３つのウイルスの各々の希釈によりＰ４指示細胞の感染後に測定された光学密度に対応する。各ウイルスの一連の測定のために、回帰線を引く。線の勾配を計算する。Ｌ２の勾配とＬ１の勾配の比率によってＬ２の複製能力を、かつＬ３の勾配とＬ１の勾配の比率によってＬ３の複製能力を表す。ここで参照ウイルスは、治療前のウイルスＬ１である。治療前のウイルスが無い時は、ｐＮＬ４−３のような実験用参照ウイルスに関する患者のウイルスの複製能力を表すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＳＲＴプラスミドを概略的に示す。
【図２】
逆転写酵素阻害物質による処理前及び後に、２人の患者対ＡＺＴ及び３ＴＣに関して得られた用量応答効果の曲線を図示する。
【図３】
本発明の方法の特殊な実施の最初のステップ（ａ及びｂ）の図式である。
【図４】
本発明の方法の特殊な実施のステップ（ｃ）から（ｇ）の図式である。
【図５】
患者（Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）の血漿中に存在するウイルス及び参照ウイルス原型（ＮＬ４３及びＤＩＭ耐性クローン）に関してＴ２０融合阻害物質の存在下で得られる表現型分析の結果を図示する。
【図６】
様々な資料から抽出されたウイルスＬ１、Ｌ２及びＬ３の複製能力の測定結果を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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