(57)【要約】  タンパク質分解耐性を有する上皮細胞増殖因子及び工業的生産生物による最適使用頻度のコドンを有するそれをエンコードする遺伝子配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さＸのアミノ酸配列を含む組成物であって、Ｘは少なくとも４８かつ５３以下の整数であり、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）Ｘ位置に配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を有する。
【請求項２】
Ｘ位置のアミノ酸残基が中性アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｘ位置のアミノ酸残基がアスパラギンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｘが５１位置である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１と比較して増加したタンパク質分解耐性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
生物活性が配列番号１の生物活性の少なくとも７５％である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
生物活性が配列番号１の生物活性の少なくとも９０％である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
生物活性が、有糸分裂生起、胃粘膜細胞保護作用、酸分泌の抑制、組織前駆細胞の増殖、組織前駆細胞の分化、及び組織前駆細胞の増殖及び分化、からなる群より選択される、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
有糸分裂生起が上皮細胞の有糸分裂速度によって決定される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
酸分泌は胃ろう形成した動物において決定する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
分化は島新生または粘膜細胞形成により決定される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｘが疎水性アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｘが荷電アミノ酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｘが負荷電アミノ酸である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｘがグルタミン、アラニン及びセリンから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
５１位置のアミノ酸残基はグルタミン酸以外のアミノ酸である配列番号１と実質的に相同なアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項１７】
組成物の生物活性が少なくとも配列番号１の５０％である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物の生物活性が少なくとも配列番号１の７５％である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
組成物の生物活性が少なくとも配列番号１の９０％である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が配列番号１の生物活性と実質的に等しい生物活性を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
１−５０位置のアミノ酸残基は配列番号１のアミノ酸残基と少なくとも７５％の同一性を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
配列番号２、３及び４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項２４】
５１アミノ酸長のポリペプチドであって、残基１−５０は実質的に配列番号１に示すアミノ酸配列と相同であり、残基５１はアスパラギン残基である、ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１と比較してタンパク質分解に対する増加した耐性を有する、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
残基１−５０の少なくとも１つが配列番号１に示す配列中のアミノ酸の同類置換である、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
さらに、配列番号１に示す位置１−５から選択される残基の少なくとも１つの欠失を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１に示すヒトＥＧＦの少なくとも５０％の生物活性を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号１に示す少なくとも位置１−４７のアミノ酸配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有し、かつＥＧＦカルボキシ末端の位置４８−５３において少なくとも１のアミノ酸置換を有し、該アミノ酸配列が配列番号１の配列よりもタンパク質分解に対してより安定であるヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含む組成物。
【請求項３０】
実質的に配列番号１に示す１−５０位置における残基のアミノ酸配列を含み、５１位置の残基はグルタミン酸以外のアミノ酸である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
５１位置の残基がアスパラギン、グルタミン、アラニン及びセリンからなる群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
５１位置の残基がアスパラギンである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
１−５０位置のアミノ酸が少なくとも７５％は配列番号１に示すものである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
組成物の生物活性が配列番号１の示す生物活性の少なくとも５０％である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
生物活性が有糸分裂生起、胃粘膜細胞保護作用、酸分泌の抑制、組織前駆細胞の増殖、前駆細胞の分化、及び前駆細胞の増殖及び分化からなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
有糸分裂生起が上皮細胞の有糸分裂速度によって決定される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
酸分泌は胃ろう形成した動物より決定する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
分化が島新生または粘膜細胞形成により決定する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
請求項１、１６及び２９のいずれかに記載の組成物を薬学的に許容できるキャリア内に効果的な量で含む医薬組成物。
【請求項４０】
さらに追加の治療薬を含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
追加の治療薬が増殖因子受容体配位子である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
配位子が増殖因子である、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
配位子がガストリン／コレシストキニン受容体配位子である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１、１６及び２９のいずれかに記載の組成物をエンコードするヌクレオチド配列であって、工業的に許容できる生産生物における最適使用頻度に適合させたコドンを有するヌクレオチド配列。
【請求項４５】
工業的に許容できる生産生物が酵母菌である、請求項４４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４６】
酵母菌がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項４５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４７】
５１残基長のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有し、ヒトＥＧＦの生物活性を有し、該配列はＰｉｃｈｉａ種において発現するために最適化されたコドンを含み、かつカルボキシル末端にタンパク質分解耐性を与えるアミノ酸を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
配列番号５に示すヌクレオチド配列を有するＰｉｃｈｉａの組換え型菌株。
【請求項４９】
配列番号２に示すアミノ酸配列を生成できるＰｉｃｈｉａの組換え型菌株。
【請求項５０】
配列番号２に示すアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列。
【請求項５１】
長さＸのアミノ酸配列を含む組成物を得る方法であって、Ｘは少なくとも４８かつ５３以下の整数であり、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）Ｘ位置に配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を有し、該方法は以下を含む：工業的に許容できる生物において最適使用頻度のコドンを有する、該組成物をエンコードする遺伝子を設計する工程；及び生物の発酵により生物内で該組成物を生成する工程。
【請求項５２】
組織再生が必要な対象を治療する組成物の使用であり、該医薬組成物は長さＸのアミノ酸配列を含み、Ｘが少なくとも４８かつ５３以下の整数であり、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）Ｘ位置に配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を有し；該方法は以下を含む：請求項５１に記載の方法により該組成物を得る工程；及び対象の組織再生の処置として前駆細胞の再生に十分効果的な量で該組成物を対象に投与する工程。
【請求項５３】
組成物の投与においてさらに追加の治療薬を投与する、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
追加の治療薬が増殖因子受容体配位子である、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
配位子が増殖因子である、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
配位子がガストリン／コレシストキニン受容体配位子である、請求項５４に記載の使用。
【請求項５７】
Ｘが整数の５１である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５８】
Ｘにおけるアミノ酸残基が中性アミノ酸である、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
アミノ酸残基がアスパラギンである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
組成物が配列番号１に示す配列を有する組成物よりもタンパク質分解耐性を有する、請求項５２に記載の使用。
【請求項６１】
対象が島細胞再生を必要としている、請求項５２に記載の使用。
【請求項６２】
対象が粘膜細胞再生を必要としている、請求項５２に記載の使用。
【請求項６３】
対象が糖尿病を有する、請求項５２に記載の使用。
【請求項６４】
天然型ＥＧＦよりもタンパク質分解耐性があり、実質的に生物活性を保持するＥＧＦの修飾アミノ酸配列を得る方法であり、該方法は以下を含む：工業的に有用な生物によりタンパク質分解を受ける天然型ＥＧＦ配列の少なくとも１の残基を同定する工程；タンパク質分解の対象として同定された残基が欠失または異なるアミノ酸で置換されている修飾アミノ酸配列を設計する工程；及び天然型ＥＧＦよりもタンパク質分解耐性がある修飾ＥＧＦを得るために、修飾アミノ酸配列を提供し、タンパク質分解を天然型ＥＧＦと比較して評価する工程。
【請求項６５】
天然型ＥＧＦがヒト由来である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
修飾アミノ酸配列の設計が、関連する実施態様において、新しいカルボキシル末端アミノ酸配列を得るために少なくとも１のカルボキシル末端残基を少なくとも１のアミノ酸で置換し、修飾ＥＧＦがよりタンパク質分解耐性を有するようにする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
タンパク質分解を受ける少なくとも１の残基の同定が、工業的に有用な生物の組換え型細胞の培地における天然型ＥＧＦの生成中にタンパク質分解の部位を決定する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
修飾アミノ酸配列の設計の後で修飾ＥＧＦを提供する前に、さらに修飾アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を設計することを含み、該ヌクレオチド配列が工業的に有用な生物における最適使用頻度の選択されたコドンを有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
修飾ヌクレオチド配列の設計の後で修飾ＥＧＦを提供する前に、さらに修飾ヌクレオチド配列をベクター内に組み込み、工業的に有用な生物の細胞中にベクターを形質転換させる工程を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
修飾ＥＧＦの提供が配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の提供である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
工業的に有用な生物がメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項７０に記載の方法。 
【請求項７２】
薬学的に許容できるキャリア中に請求項１、１６及び２９に記載する組成物の少なくとも１単位用量を含むキット。
【請求項７３】
さらに追加の治療薬を含む、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
追加の治療薬が増殖受容体配位子である、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
増殖受容体配位子がガストリン／コレシストキニン受容体配位子である、請求項７４に記載のキット。
【請求項７６】
配位子がガストリンである、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
単位用量が組織再生の必要な対象の治療に十分な量である、請求項７２に記載のキット。
【請求項７８】
組織が膵島または胃粘膜である、請求項７７に記載のキット。
【請求項７９】
請求項７１の方法により得られるＰｉｃｈｉａ組換え型菌株。
【請求項８０】
配列番号５に示すヌクレオチド配列を有するストレプトマイセス組換え型菌株。
【請求項８１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を生成するストレプトマイセス組換え型菌株。
【請求項８２】
請求項７１の方法により得られるストレプトマイセス組換え型菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は増加したタンパク質分解耐性及び通常ヒトＥＧＦと同等の能力を有する上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）タンパク質配列及び工業生産生物の最適コドン使用頻度を有する遺伝子配列に関する。
【０００２】
背景技術
完全長、野生型ヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；配列番号１参照）は分子量６２１７ダルトンで種々の生物学的機能を有する５３アミノ酸タンパク質である（Ｋａｒｎｅｓ，Ｗ．、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（上皮細胞増殖因子及び形質転換増殖因子α）、１９９４、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。Ｃ末端のアミノ酸配列の修飾は組換えＤＮＡ工学遺伝子研究による変質形の構築体由来のもの、及び天然型から単離したＥＧＦとして観測されるものの両方が報告されている。ＥＧＦはエンド及びエキソプロテアーゼ両方の影響を受けやすく、血流中のＥＧＦだけでなく、唾液腺で生成されて飲み込まれたＥＧＦに胃内においてタンパク質分解攻撃が起こったのが観測された（Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（２）、４０４-４０６、１９８９；Ｐｌａｙｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｎｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（胃腸病学）、１０８、９２-１０１、１９９６）。
【０００３】
４６アミノ酸長以下のＥＧＦは、４７アミノ酸以上の鎖長のＥＧＦ種と比較すると実質的に生物活性を失っている。受容体への親和力及びＥＧＦクリアランスのｉｎ  ｖｉｖｏ速度など機能的生物活性への鎖長の実際の効果について矛盾したデータがある。長さ４７、４８及び５１のアミノ酸のＥＧＦ（“ＥＧＦ４７”、“ＥＧＦ４８”等と示す）は胃酸分泌を抑制することができ（米国特許第３，９１７，８２４号）、例えば、ヒトＥＧＦ４７はＥＧＦ５３と同じ能力で酸分泌を抑制するが、該タンパク質は線維芽細胞増殖を刺激する能力を約１０分の１しか保持しない（分裂活性；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １７（分子薬理学１７）、３１４-３２０、１９８０；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２２（調節ペプチド２２）、２１７-２２６、１９８８）。これらの文献が示すように、組成物がある生物活性に関して高生物活性を示すという事実があっても、全ての生物活性が完全長組成物と等しい量で存在するということは意味しない。
【０００４】
ＥＧＦ５２は酸分泌の抑制及び細胞増殖刺激の両方についてＥＧＦ５３と等しい力を有する。マウスＥＧＦの分裂活性は鎖長が４８アミノ酸よりも小さい場合、大部分が失われる（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７（生化学２７）、４９７７-４９８５、１９８８）。さらに、ｈＥＧＦ５１及びＥＧＦ５３は類似の薬物動態を示す（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２０（薬物代謝及び薬物動態２０）、２３-３０、１９９２）。ＥＧＦ５１は、免疫抑制活性を保持することを除き（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（分子生化学２５）、４５-５９、１９８４）、ＥＧＦ５３と類似の活性を有する（Ｃａｌｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｕｔ  ４７、６２２-６２７、２０００）。ＥＧＦ４８はタンパク質分解に対して安定であり、生物活性を保持することが報告されている（米国特許第５，４３４，１３５号；Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．同上；Ｓｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７（ペプチド１７）、１２２９-１２３６、１９９６）。しかしながら、ＥＧＦ４８はＥＧＦ５３よりも著しく低い活性を有する（Ｇｏｏｄｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（臨床科学）、９１、５０３-５０７、１９９６）。
【０００５】
ＥＧＦ中のジスルフィド結合の正しい構造及びその生物活性は５アミノ酸までのＮ末端の短縮によっては影響を受けない（Ｓｈｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １６（ペプチド１６）、２０５-２１０、１９９５；ＤｉＡｕｇｕｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６５（分析生化学１６５）、４２０-４２９、１９８７）。２１位置のメチオニン残基の酸化は酵母菌によって生成された組換えｈ−ＥＧＦの生物活性に影響を与えない（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生化学）、２７、７９７-８０２）。
【０００６】
組換え型ＥＧＦは生成時に微生物プロテアーゼにより分解される。サッカロマイセス・セレヴィシエに生成された組換え型ｈＥＧＦ５３は、発酵時のプロテアーゼ活性の結果、長さ５２、次に５１アミノ酸配列に分解される（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７、７９７-８０２、１９８８）。メタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が生成したＥＧＦは安定な４８アミノ酸を有する形状に分解され、高生物活性を保持することが記載されている（米国特許第５，１０２，７８９号）。同様に、メタノール資化性酵母が生成、分泌するマウスＥＧＦは発酵中に部分的に５１アミノ酸長に分解される（Ｃｌａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １０５（遺伝子１０５）、２０５-２１２、１９９１）。
【０００７】
これらデータの比較により、様々な形状のＥＧＦによるタンパク質分解の受け易さ、及びこれら異なる形状の長さと異なる生物活性の範囲の相互関係についての問題が提起される。生物活性はそれぞれ発現され得る受容体の系統、すなわち組織特異性、により仲介されるので、修飾ＥＧＦの関連生物活性はその活性について、その機能レベルを解明するために検査しなければならない。生物活性レベルは別の生物活性分析を用いて得たデータからは必ずしも予測可能ではないからである。
【０００８】
ＴＧＦαなどのＥＧＦ及びＥＧＦ受容体配位子は、米国及びその他の地域で蔓延している病気、糖尿病治療に含むことが示されている（１９９９年、３月２３日発行のＮａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，８８５，９５６号；及び２００１年９月１１日発行のＮａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、第６，２８８，３０１号）。
【０００９】
タンパク質分解に対して安定であり、単一の分子種として高収率で安全に生成され、複製可能な構成を備えた便利な生成有機体であり、薬物承認に必要な純度を有し、治療目的などのための実質的な生物活性を保持したＥＧＦタンパク質が必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明は長さＸのアミノ酸配列を含む組成物を特徴とし、Ｘは少なくとも４８かつ５３以下の整数、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基をＸ位置に有する。関連する実施態様において、Ｘ位置のアミノ酸残基は中性アミノ酸である。Ｘ位置のアミノ酸残基は、例えばアスパラギンである。さらに、Ｘは５１位置である。該組成物は配列番号１と比較してタンパク質分解に対する増加した耐性を有する。生物活性は配列番号１の少なくとも７５％であり、例えば生物活性は配列番号１の少なくとも９０％である。生物活性は以下からなる群より選択される：有糸分裂生起、胃粘膜細胞保護作用、酸分泌の抑制、組織前駆細胞の増殖、組織前駆細胞の分化、及び組織前駆細胞の増殖及び分化。有糸分裂生起は上皮細胞の有糸分裂速度におけるアミノ酸配列の効果によって決定される。酸分泌は胃ろう形成した動物（ｇａｓｔｒｉｃ  ｆｉｓｔｕｌａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）から決定する。分化は島新生または粘膜細胞形成により決定される。
【００１１】
関連する実施態様において、Ｘは疎水性アミノ酸であり、Ｘは中性アミノ酸、またはＸは荷電アミノ酸である。関連する実施態様において、Ｘが中性アミノ酸の場合、Ｘはグルタミン、アラニン及びセリンから選択できる。
【００１２】
他の側面において、本発明は配列番号１と実質的に相同なアミノ酸配列を含む組成物を提供し、ここで配列番号１の５１位置のアミノ酸残基はグルタミン酸以外のアミノ酸である。該組成物の生物活性は少なくとも配列番号１の５０％である。例えば、該組成物の生物活性は少なくとも配列番号１の７５％であり、例えば、該組成物の生物活性は少なくとも配列番号１の９０％である。該組成物は配列番号１と実質的に等しい生物活性を有する。関連実施態様において、１−５０位置のアミノ酸残基は配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有する。
【００１３】
他の側面において、本発明は配列番号２、３及び４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む組成物を提供する。例えば、１の実施態様において本発明は配列番号２に示すアミノ酸配列組成物を提供する。さらに、他の実施態様において本発明は５１アミノ酸長のポリペプチドを提供し、残基１−５０は実質的に配列番号１に示すアミノ酸配列と相同であり、残基５１はアスパラギン残基である。該ポリペプチドは配列番号１と比較してタンパク質分解に対する増加した耐性を有する。
【００１４】
関連実施態様において、本発明は残基１−５０の少なくとも１つが配列番号１に示す配列中アミノ酸の同類置換であるポリペプチドを提供する。関連する実施態様における該ポリペプチドはさらに、配列番号１に示す位置１−５から選択された残基の少なくとも１つの欠失を含む。該ポリペプチドは配列番号１に示すヒトＥＧＦの生物活性の少なくとも５０％を有する。
【００１５】
他の側面において、本発明は配列番号１に示す少なくとも位置１−４７のアミノ酸配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有し、かつＥＧＦカルボキシ末端の位置４８−５３において少なくとも１のアミノ酸置換を有し、該アミノ酸配列が配列番号１の配列よりもタンパク質分解に対してより安定であるヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含む組成物を提供する。関連する実施態様において、１−５０位置における残基のアミノ酸配列は実質的に配列番号１に示すものであり、５１位置の残基はグルタミン酸以外のアミノ酸である。５１位置における関連する実施態様の残基は、アスパラギン、グルタミン、アラニン及びセリンからなる群より選択され、例えば５１位置における残基はアスパラギンである。１−５０位置におけるアミノ酸の少なくとも７５％は配列番号１に示すものである。該組成物の生物活性は配列番号１に示すものの少なくとも５０％である。生物活性は有糸分裂生起、胃粘膜細胞保護作用、酸分泌の抑制、組織前駆細胞の増殖、前駆細胞の分化、及び前駆細胞の増殖及び分化からなる群より選択される。有糸分裂生起は上皮細胞の有糸分裂速度によって決定される。酸分泌は胃ろう形成した動物（ｇａｓｔｒｉｃ  ｆｉｓｔｕｌａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）より決定する。分化は島新生または粘膜細胞形成により決定される。
【００１６】
他の実施態様において、本発明はここに記載する組成物を、薬学的に許容できるキャリア内に効果的な量で含む医薬組成物を提供する。関連する実施態様において該医薬組成物はさらに、追加の治療薬を含む。例えば、追加の治療薬は増殖因子受容体配位子である。例えば、配位子は増殖因子である。例えば、配位子はガストリン／コレシストキニン受容体配位子である。
【００１７】
関連する実施態様において、本発明はここに記載するＥＧＦ組成物をエンコードするヌクレオチド配列を提供し、該ヌクレオチド配列は工業的に許容できる生産生物において最適使用頻度に適合させたコドンを有する。工業的に許容できる生産生物は酵母菌である。例えば、酵母菌はメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００１８】
別の側面において、本発明は５１残基長のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有し、ヒトＥＧＦの生物活性を有し、該配列はＰｉｃｈｉａ種において発現するために最適化されたコドンを含み、かつカルボキシル末端にタンパク質分解耐性を与えることができるアミノ酸を有するポリヌクレオチドを提供する。関連する実施態様において、本発明は配列番号６に示すヌクレオチド配列を有するＰｉｃｈｉａの組換え型菌株；配列番号２に示すアミノ酸配列を生成できるＰｉｃｈｉａの組換え型菌株；及び配列番号２に示すアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００１９】
他の側面において、本発明は長さＸのアミノ酸配列を含む組成物を得る方法を提供し、Ｘは少なくとも４８かつ５３以下の整数であり、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）Ｘ位置に配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を有し、該方法は以下を含む：該組成物をエンコードする遺伝子の設計、工業的に許容できる生物における最適使用頻度に関するコドンの選択；及び生物の発酵による生物内での組成物の生成。
【００２０】
別の側面としては、組織再生が必要な対象を治療するために用いる医薬組成物の製造方法であり、医薬組成物は長さＸのアミノ酸配列を含み、Ｘが少なくとも４８かつ５３以下の整数であり、該配列は（ｉ）配列番号１の１位置からＸ−１位置までの配列番号１の部分と実質的に相同であり、及び（ｉｉ）Ｘ位置に配列番号１のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基を有し；及び対象の組織再生の処置として前駆細胞の再生に十分効果的な量で該組成物を対象に投与することを含む。従って、該組成物の投与はさらに追加の治療薬を投与する。例えば、追加の治療薬は増殖因子受容体配位子である。例えば、配位子は増殖因子である。例えば、配位子はガストリン／コレシストキニン受容体配位子である。関連する実施態様において、Ｘは整数の５１である。Ｘにおけるアミノ酸残基は中性アミノ酸である。例えば、アミノ酸残基はアスパラギンである。該組成物は配列番号１に示す配列を有する組成物よりもタンパク質分解耐性を有する。関連する実施態様において、対象は島細胞再生を必要としており、例えば対象は糖尿病；または対象は粘膜細胞再生を必要とする対象である。
【００２１】
他の側面において、本発明は天然型ＥＧＦ（ｎａｔｕｒｅ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ＥＧＦ）よりもタンパク質分解耐性があり、実質的に生物活性を保持するＥＧＦの修飾アミノ酸配列を得る方法を提供し、該方法は以下を含む：工業的に有用な生物によりタンパク質分解を受ける天然型ＥＧＦ配列の少なくとも１の残基を同定する工程；タンパク質分解の対象として同定された残基が欠失または異なるアミノ酸で置換されている修飾アミノ酸配列を設計する工程；及び天然型ＥＧＦよりもタンパク質分解耐性がある修飾ＥＧＦを得るために修飾アミノ酸配列を提供してタンパク質分解を天然型ＥＧＦと比較して評価する工程。従って、天然型ＥＧＦはヒト由来である。修飾アミノ酸配列の設計は、関連する実施態様において、新しいカルボキシル末端アミノ酸配列を得るために少なくとも１のカルボキシル末端残基を少なくとも１のアミノ酸で置換し、修飾ＥＧＦがよりタンパク質分解耐性を有するようにする。関連する実施態様において、タンパク質分解を受ける残基の同定は工業的に有用な生物の組換え型細胞の培地において天然型ＥＧＦの生成中に、タンパク質分解の部位を決定する。関連する方法において、修飾アミノ酸配列の設計の後で修飾ＥＧＦを提供する前に、該方法は修飾アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を設計することを含む。該ヌクレオチド配列は工業的に有用な生物における最適使用頻度のために選択されたコドンを有する。関連する方法において、修飾ヌクレオチド配列の設計の後で修飾ＥＧＦを提供する前に、該方法はさらに修飾ヌクレオチド配列をベクター内に組み込み、工業的に有用な生物の細胞中にベクターを形質転換させる工程を含む。１の実施態様において、修飾ＥＧＦの提供は配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。工業的に有用な生物は菌類であり、例えばＰｉｃｈｉａなどの酵母菌、メタノール資化性酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などである。その他の工業的に有用な生物はアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、アルペルギルス、サッカロマイセス、トルラ及びシゾサッカロマイセスの種を含む。他の側面において、本発明は従来方法に従って得られるＰｉｃｈｉａの組換え型菌株を提供する。関連する実施態様において、有用な生物は細菌であり、例えばストレプトマイセス、例えばＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓの菌株またはアクチノマヅラ及びノカルジアなどの放線菌類のその他の有用な菌株がある。その他の工業的に有用な非放線菌細菌種はバチルス、エシェリキア及び水素細菌を含む。
【００２２】
本発明はさらに、薬学的に許容できるキャリア中に少なくともここに記載する組成物の１単位用量を含むキットも提供する。該キットは関連する実施態様において、さらに追加の治療薬を含む。例えば、追加の治療薬は増殖受容体配位子であり；例えば、増殖受容体配位子はガストリン／コレシストキニン受容体配位子、例えば、配位子はガストリンである。単位用量は組織再生が必要な対象の治療に十分な量である。組織は膵島または胃粘膜である。
【００２３】
他の側面において、本発明は工業的に許容できる生物における最適使用頻度のために適合されたコドンを有するここに記載する組成物をエンコードするヌクレオチド配列を持つトランスジェニック動物を提供し、工業的に許容できる生物は動物である。関連する実施態様において、ヌクレオチド配列は特定組織で発現するための別の調節配列情報を含む。動物はさらに天然型と同一の内生ＥＧＦをエンコードする遺伝子中に挿入変異を含み、動物の内生ＥＧＦ生成は効果的に不活性化される。
【００２４】
詳細な実施態様の説明
ヒトＥＧＦはヒトの尿で発見され、胃内でのその酸分泌抑制能力のためにウロガストロンと名付けられた（Ｇｒｅｏｒｙ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ．Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．３５６、１７６５-１７７４、１９７５）。さらに、ＥＧＦはマイトジェン活性（分裂促進活性）を有し、すなわち、種々の細胞及び組織の増殖を刺激する（Ｋａｒｎｅｓ  ｓｕｐｒａ；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８８、２２７-２３７、１９７６；Ｇａｓｓｌａｎｄｅｒ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２９、１４２-１４９、１９９７）。ＥＧＦはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで創傷に向かって、または培養基中で単層の細胞に導入されたギャップに向かって細胞の遊走を刺激し、傷治療を促進する細胞保護効果を有することがわかっている。これらの生物活性は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン及びヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（Ｋａｒｎｅｓ，ｓｕｐｒａ）などの構造的に関連する増殖因子の系統に特異的である。増殖因子のこの系統に属するものはアミノ酸配列の１１残基において同一のアミノ酸を有し、そのうちの６つはジスルフィド結合を形成するシステイン残基である。
【００２５】
完全長、天然（標準または野生型）ヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は分子量６２１７ダルトンの５３アミノ酸タンパク質であり、該タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な生物活性を有する（Ｋａｒｎｅｓ，Ｗ．、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ（上皮細胞増殖因子及び形質転換増殖因子アルファ）、１９９４、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ここで用いる“天然型ＥＧＦ”の語は、配列番号１に示す完全長、標準ヒトＥＧＦを意味するものとする。本明細書中及び請求の範囲で用いる“上皮細胞増殖因子”または“ＥＧＦ”の語はポリペプチド生成物または薬学的に許容できるこれらの塩をいい、１以上のバイオアッセイで測定して天然型ヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ；配列番号１）と類似の生物活性を示す。
【００２６】
ＥＧＦ受容体配位子は様々な組織における様々な細胞タイプの細胞上の様々なＥＧＦ受容体に結合でき、これらの細胞にシグナルを発信でき、特定の細胞タイプの増殖及び発達の変化を生じることができるタンパク質の系統を含み、ＥＧＦ及びＴＧＦαなどを含む。
【００２７】
“修飾ＥＧＦ”の様々な形態は、天然ＥＧＦの鎖長及びアミノ酸配列とは異なり、ここに記載するような設計がされ及び特徴付けられる。これらの修飾は生物活性及びＥＧＦのクリアランス速度の両方に影響が見られる。さらに、該語はｈＥＧＦと同じまたは類似のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、例えば、様々な残基において同類アミノ酸置換を有する。１以上のＣ末端から最後の５つのアミノ酸は１以上のその他のアミノ酸で置換でき、または欠失できる。
【００２８】
２１位置にロイシン残基で置換されたメチオニンを有する組換え型ＥＧＦが記載されている（米国特許第４，７６０，０２３号）。組換え型ｈＥＧＦは保存中１１位置のアスパルチル残基から大きく減少された生物活性を示すイソアスパルチル型に変換された（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、９５８４-９５９１、１９９０）。ＥＧＦ及びＴＧＦ−αに大きく類似するタンパク質の系統をエンコードする一連の核酸分子は記載されている（ＷＯ００/２９４３８）。中性または酸性アミノ酸で置換したヒスチジンを１６残基に有するＥＧＦムテイン（変異ＥＧＦ）が説明されており（ＷＯ９３/０３７５７）、該形態は低いｐＨで活性を保持する。ＥＧＦ及びＴＧＦ−αの化学的アナログ及び断片はＥＧＦ受容体系統の様々な種類を結合する能力を保有する（米国特許第４，６８６，２８３号）。さらに、完全長かつその他の形態のＥＧＦは酸化及びタンパク質分解の両方にｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて影響を受けやすい。
【００２９】
本発明の実施態様はＥＧＦのＣ末端アミノ酸配列への特定の修飾がエンド及びエキソプロテアーゼ活性に対する耐性を有するＥＧＦ形態を生じ、十分な生物活性を保持し、該Ｃ末端が４８位置から５３位置のアミノ酸残基であるという発見に基づく。これらはアミノ酸が欠失または置換されているＥＧＦの形態を含み、例えば、４８位置（天然型ＥＧＦにおけるリジン）及び５３位置（アルギニン）の塩基性アミノ酸、４９位置（トリプトファン）及び５０位置（トリプトファン）の芳香族アミノ酸、及び５２位置（ロイシン）の脂肪族アミノ酸である。本発明における実施態様は修飾ＥＧＦの薬学的に許容しうる塩を含む。
【００３０】
“薬学的に許容しうるキャリア”はあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤などの抗菌薬、等張化剤及び吸収遅延剤及び生理学的適合性のある類似物を含む。好ましくは、キャリアは静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、経皮または皮下投与に適したものである。“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（薬物の制御放出：ポリマー及び会合体システム）”、Ｍ．Ｒｏｓｏｆｆ、Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８９）を参照されたい。
【００３１】
ここで用いる“薬学的に許容しうる塩”とは親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果与えない塩をいう。このような塩の例としては（ａ）無機酸を含んで形成される酸付加塩であり、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等；及び有機酸を含んで形成される塩であり、例えば酢酸、シュウ酸、流石酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸；（ｂ）多価金属カチオンを含む塩であり、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム等；または（ｃ）Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機カチオンを含んで形成される塩；または（ｄ）（ａ）及び（ｂ）または（ｃ）等の組み合わせ、例えば亜鉛タンニン酸塩等。
【００３２】
医者または当業者は所望の該医薬組成物の“効果的な用量”を容易に決定及び処方できる。例えば、医者は所望の治療効果、例えば糖尿病Ｉ型またはＩＩ型またはストレプトゾトシン糖尿病の治療、を達成するために必要な量より低いレベルで医薬組成物において本発明の化合物の一回分の投与をすることができ、及び所望の効果、すなわち糖尿病の治療が達成されるまで時間と共に投薬量を増やすことができる。
【００３３】
用量は例えば治療反応、特にここでは糖尿病の改善などの最適で望ましい反応を得るために調整できる。ボーラス一回など単一の用量が投与でき、長期にわたって何回かに分けて投与でき、または用量は糖尿病が示す緊急度により減少または増加することができる。医者またはその他の薬理学の熟練者は所望の医薬組成物の効果的な用量を容易に決定及び処方できる。例えば、熟練者は所望の治療効果を得るために必要なレベルより低い用量で投与は開始し、時間と共に所望の効果、特に糖尿病Ｉ型、２型またはストレプトゾトシン糖尿病の症状緩和を得るために投与量を増加させることができる。通常、修飾ＥＧＦ組成物の適当な効果的な投与量は、インスリン生成によるグルコース惹起（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）への反応の不適合及び血糖濃度の減少の緩和などの症状の緩和が得られる最も低い投与量である。
【００３４】
他の実施態様において、本発明の医薬組成物は追加の治療薬も含む。従って、本発明の方法に従い、修飾ＥＧＦを含む医薬組成物は、追加の薬剤、例えばコレシストキニン受容体配位子との組み合わせで併用治療の一部として投与できる。
【００３５】
治療上効果的な投与量は本発明の組成物を投与しない非治療対象と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％または少なくとも約８０％症状を低減する。
【００３６】
本願明細書中の様々なアミノ酸配列中に現れるアミノ酸は通常、当業界でよく用いられる３及び１文字の省略形を有する。“疎水性”アミノ酸はチロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸、及びイソロイシン、ロイシン及びバリンなどの脂肪族アミノ酸を含む。“荷電”アミノ酸はグルタミン酸及びアスパラギン酸などの酸性アミノ酸、及びリジン及びアルギニンなどの塩基性アミノ酸を含む。非荷電のその他のアミノ酸は“中性”アミノ酸である。
【００３７】
アミノ酸“同類”置換変異はＥＧＦの特定部分にあるアミノ酸、または化学的に類似のアミノ酸によって置換された関連分子を意味する。アミノ酸同類置換の例としては：Ｇｌｕで置換されたＡｓｐなど同じ荷電の異なるアミノに置換された荷電アミノ酸、または例えば異なる芳香族疎水性アミノ酸、例えばＰｈｅで置換されたＴｒｐなどの芳香族疎水性アミノ酸である（２００１年３月２７日に発行された米国特許第６，２０７，１５４号を参照。）修飾ＥＧＦ、例えば、アミノ酸の１以上の同類置換を有するＥＧＦ５１Ｎはここに記載される様々な修飾ＥＧＦ組成物と意味上等しいものとして、実施態様として包含されるものとみなす。
【００３８】
アミノ酸配列組成物は、最初の配列を作るアミノ酸残基の特定タイプの大部分が、位置を基準にして比較できるようにそれぞれ直線に並ぶその他の配列中のアミノ酸と同一である場合、“実質的に相同”である。例えば、配列中のアミノ酸が少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が同一である。５１残基長のタンパク質を同じ長さの別のものと比較して、少なくとも５０％とは配列中少なくとも２６のアミノ酸が同一でなければならず；７５％とは配列中少なくとも３９のアミノ酸が同一でなければならず；８５％とは配列中少なくとも４３のアミノ酸が同一でなければならず；９０％とは配列中少なくとも４６のアミノ酸が同一でなければならず；及び９５％とは配列中少なくとも４８のアミノ酸が最初の配列のアミノ酸と比較して同一でなければならない。
【００３９】
【表１】
2005511614.tif 000002
【００４０】
Ｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．によって最近示されたＥＧＦ活性は（米国特許第５，８８５，９５６号及び第６，２８８，３０１号）、ＥＧＦ受容体配位子とガストリン／コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体配位子との組み合わせを対象へ投与すると対象の膵島前駆細胞を分化させ、インスリン分泌細胞に成長させることができというものである。ＥＧＦ受容体配位子は従って、単独またはＣＣＫ受容体配位子などその他の薬剤と組み合わせて非分化前駆細胞の分化を引き起こす役割を果たす。“前駆”細胞は数世代に分割し、様々な異なる細胞タイプに分化させる能力を有する。
【００４１】
ＥＧＦ及びその他のＥＧＦ受容体配位子は有糸分裂活性を有し、細胞数、特に培地中またはｉｎ  ｖｉｖｏで上皮細胞増殖を刺激することができる。ＥＧＦ受容体配位子の他の活性はろう形成された動物、例えばろう形成ラットなどの実験動物で示されるような酸分泌の抑制である。ＥＧＦはさらに、組織前駆細胞の成長及び分化のいずれかまたは両方を刺激することができる。
【００４２】
本発明の修飾ＥＧＦ組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで修飾ＥＧＦの薬理効果を短縮するであろう別のタンパク質分解を抑制する目的で、１以上のアミノ酸位置に化学的類似物を組み込むためにさらに修飾することができる。本発明の修飾ＥＧＦ組成物は天然型ｈＥＧＦより明らかにタンパク質分解耐性を有するが、ここに記載する本発明の実施態様によりさらに望ましい化学的変化が想定される可能性もある。そのようなさらなる修飾は、例えば、特定位置のＬ−アミノ酸を置換する少なくとも１のＤ−アミノ酸置換の存在または少なくとも１のアラニンまたはその他のアミノ酸残基のノルバリン、アセチルシステインまたはメチルフェニルグリシンでの置換を含む。アミノ酸修飾はペプチド骨格窒素のＮ−メチル化であってもよい。
【００４３】
本発明で用いるタンパク質分解”の語は、加水分解酵素として知られる酵素グループの中で、プロテアーゼまたはペプチダーゼによりペプチド結合が加水分解される工程を意味する。ここで用いるタンパク質分解は、基質タンパク質の末端から単一のアミノ酸を順次遊離するエキソペプチダーゼの前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）活性、及び基質分解の後に２以上のポリペプチド、オリゴペプチドまたはアミノ酸断片を生成するエンドプロテアーゼの切断活性の両方を含む。
【００４４】
“工業的に有用な生物”とは、一般的に安全と考えられている微生物菌株または細胞株を意味し、該生物はマイナスの副作用または後遺症を引き起こすさらなる化合物に寄与せず、ヒトまたは動物に投与するための治療薬を生成できる。様々な細菌は工業的生産のために用いられており、例えばストレプトマイセスである（１９８８年５月１７日に発行された米国特許第４，７４５，０５６号を参照）。タンパク質分解に敏感なタンパク質にとって、真菌類、例えばサッカロマイセス・セレヴィシエのようなサッカロマイセス種、メタノール資化性酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のようなＰｉｃｈｉａ種などの酵母菌は特に力強い成長のために有用である。
【００４５】
さらに、ここに記載する修飾ＥＧＦ体、例えばＥＧＦ５１Ｎは、調節因子の制御下で哺乳類または鳥類などのトランスジェニック動物内で生成でき、哺乳類トランスジェニック動物の乳液内での生成または鳥類トランスジェニック動物の卵のアルブミン中での生成など、都合の良い生産媒体に異所性ＥＧＦの発現を導く。さらに、トランスジェニック動物の内生遺伝子はノックアウト変異により不活化でき、従ってヒト修飾ＥＧＦはトランスジェニック動物中で生成される単一ＥＧＦである。２００１年６月５日に発行された米国特許第６，２４２，６６６号及び２００１年８月７日に発行された米国特許第６，２７１，４３６号を参照されたい。
【００４６】
ここで使用する“異所性”の語は、例えばヒトの細胞などある種の生物の細胞から単離された遺伝子であり、遺伝子工学技術により酵母など異なる種の生物または豚など異種哺乳類の細胞に導入されたものをいう。
【００４７】
ここで用いる“最適コドン使用頻度”は、異なる生物のゲノム内の遺伝子で見られる、同じアミノ酸をエンコードする多数の異なるトリヌクレオチドコドンの頻度の違いを反映するために組換え型人工遺伝子のヌクレオチド配列を調節することをいう。ｔｒｐ及びｍｅｔ以外の全アミノ酸は多数のコドンによってエンコードされ得る。より具体的には、最適コドン使用頻度の語は、タンパク質またはポリペプチドをエンコードする人工ヌクレオチド配列を、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中でタンパク質を生成するために異種細胞へ挿入する目的で、天然型遺伝子から異なるコドンを用いて実質的に同じ天然型アミノ酸配列をエンコードするように変化させる手順をいう。人工遺伝子設計における異なるコドンセットは生成細胞中の使用頻度に従い選択され、生成細胞の翻訳装置部分が生産量を制限しないようにする。
【００４８】
ここで用いる“タンパク質”、“ペプチド”及び“ポリペプチド”の語は同じ意味を有するものとする。
【００４９】
ここに記載する全特許及び文献の内容はここに引用するものとする。ここに記載されるものと類似または同等の方法及び物質が本発明の実施において使用できるが、適した方法及び物質を以下に説明する。本発明は以下の実施例及び請求の範囲により十分に記載及び説明されるが、さらに限定する趣旨ではない。
【００５０】
実施例
実施例１  生産に最適なコドンを有するＥＧＦ遺伝子、及び安定性を高めるアミノ酸配列修飾の設計及び合成。
【００５１】
工業的に適した酵母、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールスバッド、カリフォルニア州）市販のベクターを用いて外来遺伝子をクローニング及び発現させることができる。細胞、ベクター及び媒体を含むキットが購入できる。手順はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手できる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中のコドンの最適化は１９９８年１０月２７日発行の米国特許第５，８２７，６８４号に記載の方法により決定でき、Ａｐｔａｍｅｒ，Ｉｎｃ（ロックビル、メリーランド州）の商業サービスが利用可能である。
【００５２】
完全長ＥＧＦのＣ末端のアミノ酸配列は４８から５３残基であり、上記１文字コードを用いると、ＫＷＷＥＬＲである（図１パネルＡ及び配列番号１を参照）。驚くべきことに、５Ｃ末端アミノ酸の少なくとも１のアミノ酸の欠失と少なくとも１のアミノ酸の置換の組み合わせは生物活性を保持し、タンパク質分解耐性を有する修飾ＥＧＦ体を生じる。これらのアミノ酸の修飾は、４８位置（天然ＥＧＦではリジン、Ｋ）及び５３（アルギニン、Ｒ）の塩基性アミノ酸及び４９位置（トリプトファン、Ｗ）及び５０（トリプトファン、Ｗ）の芳香族アミノ酸及び５２位置（ロイシン、Ｌ）の脂肪族アミノ酸の欠失または置換を含む。
【００５３】
これらのアミノ酸は、胃液、循環中及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどの生産微生物の培養基中に見られる様々な型のエキソ及びエンドプロテアーゼのための標的基質として同定される。天然型ＥＧＦカルボキシ末端のアミノ酸間のペプチド結合は公知の特異性を有するいくつかのプロテアーゼ及びペプチダーゼにより分解される。例えば、５２から５３残基間、ｌｅｕ−ａｒｇの結合はカルボキシペプチダーゼＢ活性；それぞれ４９から５０（ｔｒｐ−ｔｒｐ）及び５０から５１（ｔｒｐ−ｇｌｕ）間の結合はキモトリプシン分解を受け；及び４８から４９（ｌｙｓ−ｔｒｐ）間の結合はトリプシン分解を受ける。（“Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（タンパク質分解酵素）”、Ｅｄ．Ｂｅｙｎｏｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂｏｎｄ  Ｊ．、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（オックスフォード）、付属書ＩＩ、ｐ．２３２参照。）別のプロテアーゼはその他の優先傾向を有し、または非特異的であるが、ｇｌｎなどの中性アミノ酸はあまり好ましい基質でない。例外はグラム陽性土壌細菌バチルス・ズブチリスの生産物である、プロテアーゼ・スブチリシンである。そのため、細菌バチルス・ズブチリス中における、ここに記載される中性または酸性残基を有する修飾ＥＧＦの生成は好ましくない。
【００５４】
本発明の実施態様は５１アミノ酸長を有するヒトＥＧＦのアミノ酸配列を含むペプチドである組成物であり、５１位置の残基はグルタミン酸以外のアミノ酸であり、例えばアスパラギンである（ＥＧＦ５１Ｎとして同定）。関連する実施態様は図１パネルＢに示す修飾ＥＧＦ組成物ＥＧＦ５１Ｎ（配列番号２）の遺伝子をエンコードするヌクレオチド配列である。このヌクレオチド配列は工業的に許容できる生産生物、治療薬として使用するための組成物の生成のために、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中の発現ベクターなどのベクター中に挿入するために設計する。同様にＥＧＦ５１Ａ、ＥＧＦ５１Ｑ及びＥＧＦ５１Ｓは修飾ＥＧＦ体のさらなる実施態様である。これらの修飾体はここに記載するようにタンパク質耐性を有する（それぞれ図１パネルＢ、Ｃ及びＤを参照）。
【００５５】
修飾ＥＧＦをエンコードする遺伝子配列のここでの設計は、さらに生産生物内でのタンパク質合成時に認識されるために最適なコドンを用いる。これらのコドンは、生物の細胞増殖時に高収率を得るためにＥＧＦをエンコードする天然ヒトヌクレオチド配列中にあるコドンと置換される。
【００５６】
さらに、データ（下）はタンパク質分解耐性を得るための修飾ＥＧＦの設計、例えば５２及び５３位置の２つの末端アミノ酸の欠失、及び５１位置の天然グルタミン酸をアスパラギンに置換、は本発明の目的を満たすものであったことを示す。さらに、下の実施例に示すように、ＥＧＦ５１Ｎの修飾体は望ましい生物活性を有し、特にストレプトゾトシン糖尿病ラットにインスリンを供給するための島新生を刺激する能力を有することがわかった。
【００５７】
実施例２  最適化されたコドンを有する合成遺伝子を用いた組換え型生物からのＥＧＦ生成
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中でＥＧＦ５１Ｎを生成するために用いた図１に示す遺伝子配列により驚くべきことに発酵生成媒体中で高収量の生成物を得た（図２参照）。収率は以前報告されたものに匹敵するものであった（１９９２年４月７日に発行された米国特許第５，１０２，７８９号）。
【００５８】
実施例３  ＥＧＦ５１Ｎのタンパク質分解耐性
生成物の分子量の決定及びＥＧＦ５１Ｎ分解により得たペプチドの分析により、単一種が予測分子量に一致する分子量を有し、天然ＥＧＦと比較して２つのアミノ酸欠失を有することを確認し、該物質の同一性及び単一種のＥＧＦタンパク質の生成を確認した。ＥＧＦ５１Ｎの生成の時間的経過において、得られる高収量のＥＧＦは単一の分子量種として特徴付けられることが観測された（図２を参照）。従って、発酵培地において修飾ｈＥＧＦの著しいタンパク質分解は観測されなかった。
【００５９】
表２は別の基準を用いて得たＥＧＦ５１Ｎのプロテアーゼ活性耐性を示すデータ、すなわち酵素カルボキシペプチダーゼＢを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分解耐性を示すデータである。これらのデータは天然ヒトＥＧＦ５３と比較して、ＥＧＦ５１ＮはカルボキシペプチダーゼＢを用いた培養過程の後に６から３０倍以上の活性を維持することを示す。これらのデータは酵素分解の基質となる残基を除去するＣ末端の設計が、微生物生産時及び対象内などの環境におけるカルボキシペプチダーゼＢなどその他の酵素への暴露時のＥＧＦ保護に効果的であることを確認にするものである。
【００６０】
【表２】
2005511614.tif 000003
【００６１】
実施例４  ＢＧＦ５１Ｎの生物活性
上記の生成ＢＧＦ５１Ｎを、糖尿病ラットを用いて、グルコース刺激に対する低血糖治療動物を測定して、ｉｎ  ｖｉｖｏで島新生刺激を測定する分析に用いた。従って、図３に示すように、ｈＥＧＦは別のＥＧＦ受容体配位子である陽性対照ＴＧＦαに等しい潜在力を有することがわかった（２００１年９月１１日に発行された米国特許第６，２８８，３０１号）。
【００６２】
さらに、修飾ＥＧＦ５１Ｎはｉｎ  ｖｉｖｏの麻酔胃ろう形成ラットにおいて胃酸分泌を抑制できることがわかった。８μｇのＥＧＦ５１Ｎ静脈内ボーラス投与後、胃酸生成の抑制開始が投与後１０−２０分内に起こり、２０−５０分間抑制が続いた。酸分泌抑制開始及び継続のこの時間は陽性対照、市販の完全長ＴＧＦαに匹敵する。
【００６３】
これらのデータは、ここに記載のＥＧＦに行ったＣ末端修飾はＥＧＦをタンパク質分解から保護し、少なくとも２つの異なる治療に重要な生物活性、酸分泌の抑制及び島新生療法を維持する両方の機能を有する。
【００６４】
実施例５  放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）の菌糸体におけるＥＧＦ５１Ｎの発現
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓのプロトプラストを標準的な方法で調製し（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトマイセスの遺伝子操作）、ノリッジ、イングランド；Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、及びＥＧＦ５１Ｎをエンコードする遺伝子を含むプラスミドをトランスフォームした。放線菌ベクターｐＣＡＮ４６をＣＡＮＧＥＮＥ（ウィニペグ、マニトバ州）から入手した。プラスミドはｐＩＪ１０１レプリコンを有する放線菌−大腸菌シャトルベクターを用い、多数の宿主ストレプトマイセス細胞種において複製する高コピー数の複数コピープラスミドである（米国特許第４，７４５，０５６号）。このプラスミドはチオストレプトン耐性をエンコードする各種の抗生物質耐性遺伝子を有する。ＥＧＦ５１Ｎの発現はタンパク質発現のためのアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ）をエンコードするストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）遺伝子由来プロモータを用いる。該構築体は、タンパク質分泌を得るために、さらにＥＧＦ５１Ｎのアミノ末端アスパラギンからストレプトマイセス・グリセウス由来プロテアーゼＢシグナル配列の遺伝子融合体を用いる。
【００６５】
ＥＧＦ５１Ｎの著しく有用な生成をこの構築体を含む菌株の菌糸成長から観測した。
【００６６】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】パネルＡは、ＥＧＦ５１Ｎ（配列番号２）、ＥＧＦ５１Ａ（配列番号３）、ＥＧＦ５１Ｑ（配列番号４）及びＥＧＦ５１Ｓ（配列番号５）のタンパク質及び遺伝子をエンコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示し、これらはＥＧＦの修飾型であり、それぞれ５１アミノ酸鎖長及びそれぞれアスパラギン、アラニン、グルタミンまたはセリンであるＣ末端残基を有する。エンコード遺伝子はそれぞれ配列番号６、７、８及び９である。
【図１Ｂ】パネルＢは、ＥＧＦ５１Ｎ（配列番号２）、ＥＧＦ５１Ａ（配列番号３）、ＥＧＦ５１Ｑ（配列番号４）及びＥＧＦ５１Ｓ（配列番号５）のタンパク質及び遺伝子をエンコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示し、これらはＥＧＦの修飾型であり、それぞれ５１アミノ酸鎖長及びそれぞれアスパラギン、アラニン、グルタミンまたはセリンであるＣ末端残基を有する。エンコード遺伝子はそれぞれ配列番号６、７、８及び９である。
【図１Ｃ】パネルＣは、ＥＧＦ５１Ｎ（配列番号２）、ＥＧＦ５１Ａ（配列番号３）、ＥＧＦ５１Ｑ（配列番号４）及びＥＧＦ５１Ｓ（配列番号５）のタンパク質及び遺伝子をエンコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示し、これらはＥＧＦの修飾型であり、それぞれ５１アミノ酸鎖長及びそれぞれアスパラギン、アラニン、グルタミンまたはセリンであるＣ末端残基を有する。エンコード遺伝子はそれぞれ配列番号６、７、８及び９である。
【図１Ｄ】パネルＤは、ＥＧＦ５１Ｎ（配列番号２）、ＥＧＦ５１Ａ（配列番号３）、ＥＧＦ５１Ｑ（配列番号４）及びＥＧＦ５１Ｓ（配列番号５）のタンパク質及び遺伝子をエンコードするアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示し、これらはＥＧＦの修飾型であり、それぞれ５１アミノ酸鎖長及びそれぞれアスパラギン、アラニン、グルタミンまたはセリンであるＣ末端残基を有する。エンコード遺伝子はそれぞれ配列番号６、７、８及び９である。
【図２】Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓによるＥＧＦ５１Ｎの生成を示す。Ａ、Ｂ、及びＣで示される、それぞれアミノ酸残基長さ４９、５１及び５０である３つの各イソ型が生成される量を、ｈＥＧＦの合計量と同様に、生成中の時間の関数として表す。Ａ及びＣ型（４９または５０アミノ酸残基長さ）はどちらもほとんど観測されず、一方長さ５１残基のＥＧＦは細胞増殖に応じて継続的かつ安定に生成された。
【図３】腹腔的にヒトガストリン及びＥＧＦ５１Ｎをそれぞれ４０μｇ／ｋｇ／日で１４日間連続注入したストレプトゾトシン糖尿病ラットの治療結果である。治療後、ラットの血漿グルコースを安静時のレベルまで回復する能力を評価し、経口グルコース惹起後に横軸で示す時間（分）の関数として縦軸で示す。血漿グルコースの安静時レベルへの素早い回復はＥＧＦ５１Ｎの生物活性を表す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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