(57)【要約】開裂することによりインスリンポリペプチドを産生することのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含有するプロインスリンポリペプチドと、オリゴマーとを、該オリゴマーを該プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、該プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとを含む、プロインスリンポリペプチドの合成方法が記載される。プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと同様に、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法についても記載する。Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法であって、
開裂することによりインスリンポリペプチドを産生することができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、親水性成分と親油性成分とを含むオリゴマーとを、前記プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へ前記オリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記プロインスリンポリペプチドと前記オリゴマーとを接触させるステップが、
前記オリゴマーと活性化剤とを、前記プロインスリンポリペプチド上の求核性基に結合することができる活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記活性化されたオリゴマーと前記プロインスリンポリペプチドとを、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴマーと前記活性化剤とを接触させるステップと、前記活性化されたオリゴマーと前記プロインスリンポリペプチドとを接触させるステップとがインサイチューで実施される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比が約４：１より大きい請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記インスリンポリペプチドがＡ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを有し、前記１以上のペプチドが、第１端でＢ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合し、第２端でＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記連結ペプチドがＣペプチドポリペプチドである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記連結ペプチドがＣペプチドである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロインスリンポリペプチドがプロインスリンである請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記連結ペプチドにリジン残基が欠けている請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記連結ペプチドが第１端に末端アミノ酸残基を有しており、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからの前記連結ペプチドの開裂が、
前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを、前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記末端アミノ酸残基がアルギニン残基である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インスリンポリペプチドがインスリンであり、前記連結ペプチドがヒトＣペプチドである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを接触させるステップと、前記末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを接触させるステップとが、実質的に同時に生ずる請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１酵素と前記第２酵素とが、前記第１酵素と前記第２酵素とを含む混合液で提供される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１酵素がトリプシンであり、前記第２酵素がカルボキシペプチダーゼＢである請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記１以上のペプチドが、前記Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リーダーペプチドにリジン残基が欠けている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから前記１以上のペプチドを開裂させるステップが、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、前記１以上のペプチドとインスリンポリペプチドの間の結合を開裂させることができる１以上の酵素とを、前記プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるのに十分な条件下で接触させるステップを含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１以上の酵素が、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴマーが式Ｉ：
【化１】
2005502353.tif 000034
（式中、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2からなる群から選択される活性化可能な成分であり、
Ｌは、アルキル成分および脂肪酸成分からなる群から選択されるリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は、各々スペーサー部分であって、糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から個別に選択され、
Ｒは親油性成分であってＲ’はポリアルキレングリコール成分であるか、またはＲ’は親油性成分であってＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分からなる群から選択される末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である）の構造を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴマーが、式ＩＩ：
【化２】
2005502353.tif 000035
（式中、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
Ｘは、酸素原子、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素原子ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分であり、
ｍは１〜３０であり、
ｎは１〜５０であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である）の構造を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴマーは、式ＩＩＩ：
【化３】
2005502353.tif 000036
（式中、Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
ｍは１〜２５であり、
ｎは１〜２５であり、
Ｒはアルキルである）の構造を含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴマーは、式ＩＶ：
【化４】
2005502353.tif 000037
（式中、ｎは１〜３０であり、
ｍは１〜５０であり、
Ｒはアルキルである）の構造を含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴマーは、式Ｖ：
【化５】
2005502353.tif 000038
の構造を含む請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記インスリンポリペプチドがインスリンである請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴマーが、前記インスリンのＢ２９位でリジンに結合している請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが、両親媒性で平衡している請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴマーは実質的に単分散の混合物として存在している請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの収率が７５％より大きい請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
インスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、
該プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合した親水性成分と親油性成分とを含むオリゴマーと
を含むプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート。
【請求項３１】
前記プロインスリンポリペプチドが、Ａ鎖ポリペプチドとＢ鎖ポリペプチドとを有するインスリンポリペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に第１端で結合し、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に第２端で結合した連結ペプチドと、前記Ｂ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを含む請求項３０に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記連結ペプチドがＣペプチドである請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記連結ペプチドのリジン残基が欠けている請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記プロインスリンポリペプチドがプロインスリンである請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記インスリンポリペプチドがインスリンである請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記オリゴマーが前記プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に該インスリンポリペプチドのリジン残基で結合している請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記インスリンポリペプチドはインスリンであり、前記リジン残基がインスリンのＢ２９位にある請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
インスリン−オリゴマーモノコンジュゲートから実質的になるインスリン−オリゴマーコンジュゲートの組成物であって、以下の構造：
【化６】
2005502353.tif 000039
（式中、ｎは１〜３０であり、
ｍは１〜５０であり、
Ｒはアルキルである）を有するオリゴマー成分にリジンＢ２９位のアミノ基で結合したインスリンを含む組成物。
【請求項３９】
前記オリゴマー成分が以下の構造：
【化７】
2005502353.tif 000040
を有する請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法であって、
開裂することによりＣペプチドポリペプチドを産生することができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したＣペプチドポリペプチドを含むプロＣペプチドポリペプチドとオリゴマーとを、プロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、
前記プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、前記Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップと
を含む方法。
【請求項４１】
前記ＣペプチドポリペプチドがＣペプチドである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロＣペプチドポリペプチドがプロインスリンポリペプチドである請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記プロＣペプチドポリペプチドがプロインスリンである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記１以上のペプチドはインスリンポリペプチドである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記１以上のペプチドはインスリンである請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記オリゴマーは親水性成分と親油性成分とを含む請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップが、前記プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、前記１以上のペプチドと前記Ｃペプチドポリペプチドとの間の結合を開裂させることができる１以上の酵素とを、前記プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから前記１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件下で接触させるステップを含む請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法によって得られるＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、その開示の全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００１年９月７日に出願された米国特許仮出願第６０／３１８，１９７号の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、インスリンコンジュゲート、そのようなコンジュゲートの合成方法、およびそれを用いた糖尿病を含む疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリペプチドインスリンは、身体内のグルコースの輸送、利用および貯蔵を制御することに責任を果たす主要ホルモンである。膵島のβ細胞はプロインスリンとして知られるインスリンの一本鎖前駆物質を分泌する。プロインスリンおよびその接続部もしくはＣペプチドのタンパク質溶解は、プロインスリン鎖内の一定の塩基性アミノ酸の除去を生じさせ、そして生物学的に活性なポリペプチドインスリンを提供する。
【０００４】
インスリン分子は進化において高度に保存されており、概してジスルフィド結合により連結された２本のアミノ酸鎖からなる。天然ヒト二本鎖インスリン分子（分子量  ５，８００ダルトン）では、Ａ鎖は２１アミノ酸残基から構成され、アミノ末端にグリジンを有する。そしてＢ鎖は３０アミノ酸残基を有し、アミノ末端にフェニルアラニンを有する。
【０００５】
インスリンは、モノマーとして存在する。または集合して二量体に、もしくは３つの二量体から形成される六量体になる。モノマーには、生物学的活性、すなわちレセプターに結合してインスリンの生物学的作用を刺激する能力が存在する。
【０００６】
糖尿病は、不都合な炭水化物代謝に伴って生じる生物学的障害である。糖尿病は、インスリンの不十分な産生、またはインスリンに対する感受性の低下の結果として生じる。糖尿病のあるヒトでは、ブドウ糖を使用する正常な能力が阻害され、それによって血糖値が上昇する（高血糖症）。ブドウ糖が血液中に蓄積するにつれて尿中へ過剰なレベルの糖が排出される（糖尿）。糖尿病のその他の症状には、尿量の増加および頻尿、口渇、掻痒、空腹感、体重減少および衰弱が含まれる。
【０００７】
糖尿病には２つのタイプがある。Ｉ型はインスリン依存型真性糖尿病、もしくはＩＤＤＭである。ＩＤＤＭは、以前は「若年型糖尿病」と呼ばれていた。ＩＤＤＭでは、膵臓からインスリンが分泌されないため、外部の供給源からインスリンを供給しなければならない。ＩＩ型もしくは成人発症型糖尿病は、通常は食事療法でコントロールできるが、一部の進行した症例ではインスリンが必要になる。
【０００８】
１９２０年代にインスリンが単離される以前は、大多数の患者は発症後短期間以内に死亡した。糖尿病を治療しないままでおくと、血液中で脂肪破壊産物のケトンの蓄積であるケトーシスを引き起こす。この後には悪心および嘔吐を伴って血液中の酸素の蓄積（アシドーシス）が生じる。炭水化物および脂肪の代謝障害の毒性産物が増加するにつれて、患者は糖尿病性昏睡に陥るが、これは死につながる。
【０００９】
糖尿病の治療法としてのインスリンの使用は、Ｂａｎｔｉｎｇら，（「真性糖尿病の治療における膵抽出物」，Ｃａｎ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，１２：１４１−１４６（１９２２））が、膵臓の活性抽出物が糖尿病の犬において治療作用を有することを証明した１９９２年に始まる。同年に、膵抽出物を用いた糖尿病患者の治療は飛躍的な、生命を救うほどの臨床的改善を生じさせた。
【００１０】
近年まで、ヒトにおける糖尿病の治療にはほとんどウシインスリンおよびブタインスリンしか使用されていなかった。しかし現在では、インスリンには種間で多数の変異があることが知られている。各変異は、Ａ鎖および／またはＢ鎖における１以上の位置でアミノ酸置換を有することで天然ヒトインスリンとは相違している。これらの相違にもかかわらず、ほとんどの哺乳動物インスリンは類似の生物学的活性を有する。組み換え技術の進歩は、天然ヒトインスリンに匹敵する生物学的活性を有するヒトインスリン（例えば、インディアナ州インディアナポリスのＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社から市販で入手できるＨｕｍｕｌｉｎ（商標）インスリン）または遺伝子組み換えインスリンの商業的大規模製造を可能にする。
【００１１】
糖尿病の治療は、典型的にはインスリンの定期的な注射を必要とする。インスリン注射は不便であるため、インスリンの投与および生体内同化を改良するために数多くの努力が重ねられてきた。
【００１２】
インスリンを経口投与により送達する試みがなされてきた。糖尿病患者において正常血糖を達成するためのインスリンの経口投与に関連する問題は、製薬学や医学の文献で明確に証明されている。消化管の消化酵素はインスリンを急速に分解し、生物学的に不活性な分解産物を生じさせる。例えば、胃の中では、経口投与されたインスリンは酵素分解および酸性分解を受ける。匹敵するインスリンのタンパク質溶解性分解は腸で生ずる。腔内では、インスリンは胃および膵臓の酵素、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼ、ならびに刷子縁ペプチダーゼを含む様々な酵素によって攻撃される。インスリンがこの酵素攻撃を切り抜けたとしても、インスリンの経口投与後には、インスリンがインビボのレセプターに到達できる前に越えなければならない生物学的障壁がそのバイオアベイラビリティを制限する可能性がある。例えば、インスリンは低い膜透過性を有するので、これは腸内腔から血流内へ通過する能力を制限する。
【００１３】
インスリンの経口投与形を得るための一部の努力は、インスリン−オリゴマーコンジュゲート類を得ることに集中してきた。ヒトインスリンおよび治療的に使用される多数の密接に関係があるインスリンは遊離の一次アミノ基を有する３つのアミノ酸残基を含有する。３つの一次アミノ基すべて、つまりＡ鎖およびＢ鎖（ＧｌｙA1およびＰｈｅB1）のＮ末端（αアミノ基）およびＬｙｓB29のε−アミノ基は、オリゴマーとのコンジュゲーションによって修飾できる。反応条件に依存して、非保護インスリンのＮアシル化はモノコンジュゲート、ジコンジュゲート、およびトリコンジュゲートの複合混合物をもたらす（例えば、ＧｌｙA1でモノコンジュゲートしたインスリン、ＰｈｅB1でモノコンジュゲートしたインスリン、ＬｙｓB29でモノコンジュゲートしたインスリン、ＧｌｙA1およびＰｈｅB1でジコンジュゲートしたインスリン、ＧｌｙA1およびＬｙｓB29でジコンジュゲートしたインスリン、ＰｈｅB1およびＬｙｓB29でジコンジュゲートしたインスリン、およびＧｌｙA1、ＰｈｅB1、およびＬｙｓB29でトリコンジュゲートしたインスリン）。例えばＬｙｓB29でモノコンジュゲートしたインスリンのような特定コンジュゲートが所望の場合は、所望のコンジュゲートを入手するためにそのようなコンジュゲートの複合混合物を分離（または精製）することは厄介である、および／または費用が高くつくことがある。
【００１４】
その結果として、所望のインスリンコンジュゲートを選択的に合成するために様々な努力がなされてきた。例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋｉｓｏは日本国特許出願第１−２５４，６９９号において脂肪酸インスリン誘導体を調製するための５段階合成を提案している。インスリンのＡ１およびＢ１アミノ基はｐ−メトキシベンズオキソアジ化カルボニル（ｐＭＺ）を用いて保護（またはブロック）されている。脂肪酸エステルによるアシル化後に、脂肪酸を用いてＬｙｓ（Ｂ２９）でモノアシル化されたインスリンを得るために保護（ブロック）基が除去される。また別の例として、Ｈａｖｅｌｕｎｄらへの米国特許第５，７５０，４９７号は、（Ａ１，Ｂ１）−ｄｉＢｏｃヒトインスリン、すなわちＡ鎖およびＢ鎖のＮ末端がＢｏｃ基によって保護されているヒトインスリンを形成するためにＢｏｃ−試薬（例えば、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート）を用いてヒトインスリンを処理することを提案している。例えばＨＰＬＣによる任意の精製後に、Ｘが導入されるべき親油性アシル基であるときに産物を式Ｘ−ＯＳｕのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって親油性アシル基がＬｙｓB29のε−アミノ基内に導入される。最終ステップでは、トリフルオロ酢酸を使用してＢｏｃ基が除去され、産物のＮεB29−Ｘヒトインスリンが単離される。
【００１５】
所望のインスリンコンジュゲートが好ましい産物であるコンジュゲートの混合物を得るために所望のインスリンコンジュゲートを優先的に合成するために様々な他の努力が企てられてきた。例えば、Ｂａｋｅｒらへの米国特許第５，６４６，２４２号は、アミノ保護基を使用せずに実施される反応を提案している。Ｂａｋｅｒは、極性溶媒中の塩基性条件下で活性化脂肪エステルインスリンとε−アミノ基との反応を提案している。ε−アミノ基のアシル化は、反応の塩基性に左右される。９．０を超えるｐＨでは、この反応はαアミノ基よりもＢ２９リジンのε−アミノ基を優先的にアシル化する。実施例１〜４では、インスリンの初期量に対する百分率としてモノコンジュゲートインスリンの６７．１％〜７５．５％の反応収率が報告されている。実施例５では、ＢａｋｅｒはさらにまたＮ−スクシンイミジルパルミテートを用いたヒトプロインスリンのアシル化を提案している。ε−アミノアシル化種対α−アミノアシル化種の正確な比率は計算されなかった。クロマトグラム内のすべてのε−アミノアシル化種の合計は全領域の８７〜９９％を占めていたが、他方全関連物質の合計（おそらくいずれかのα−アミノアシル化種を含んでいるであろう）はいずれかの所定の時点について、総面積の＜７％を占めた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の従来型方法より面倒ではなく、および／または費用効果的である可能性がある所望の特定インスリン−オリゴマーコンジュゲートを部位特異的に合成する方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述の従来型スキームと比較すると、本発明の実施形態は、部位特異的なコンジュゲーションが望ましい場合（例えば、インスリン分子のＢ−２９Ｌｙｓに結合したオリゴマーを有するインスリンモノコンジュゲートを得ることが望ましい場合）に、インスリン−オリゴマーコンジュゲートを生成するための商業的に高価ではなく、および／またはより高度に柔軟性の製造スキームを提供できる。例えばｐ−メトキシベンズオキシアジ化カルボニルのような化合物を用いてインスリンのＮ末端をブロックすること（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋｉｓｏ）による、またはインスリンのＮ末端でのコンジュゲーションを排除するのではなく減少させるように反応条件を制御することを試みること（Ｂａｋｅｒ）によるインスリンの選択的なコンジュゲーションを提案する上述の従来型スキームとは相違して、本発明の実施形態はオリゴマーをプロインスリンまたは人工プロインスリン（例えば、そのＢ鎖のＮ末端でリーダーペプチドに結合したプロインスリン）のＢ−２９Ｌｙｓに結合させる。Ｃペプチド（および、存在する場合はリーダーペプチド）はその後オリゴマーとＢ−２９Ｌｙｓでモノコンジュゲートしたインスリンを得るためにプロインスリン−オリゴマーコンジュゲートから開裂される。本発明の実施形態は、Ｂ−２９Ｌｙｓ修飾に対する高い部位特異性を提供できる。プロインスリンポリペプチドを利用する本発明の実施形態による方法は、従来型インスリン経路を介して入手されたものと比較して、例えば８０％以上という高い収率で、添加率の高いＢ−２９修飾産物を得ることができる。
【００１８】
本発明の実施形態によると、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、開裂させてインスリンポリペプチドを産生させることができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロインスリン−ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとが含まれる。
【００１９】
本発明の他の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを酵素的に開裂させるステップと、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートを得るステップとを含む、インスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートの合成方法が提供される。
【００２０】
本発明の他の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、開裂させることによりインスリンポリペプチドを産生させることができるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップが含まれる。
【００２１】
本発明のさらにまた別の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートには、インスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合したオリゴマーとが含まれる。
【００２２】
本発明のさらにまた別の実施形態によると、Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、Ｃペプチドポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したＣペプチドポリペプチドを含むプロＣペプチドポリペプチドとオリゴマーとを、プロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照して本発明について十分に説明する。しかしながら、本発明は多数の様々な形態で具体化することができ、本明細書に記載した実施形態に限定されると解釈してはならない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が完全かつ完璧であり、そして当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供される。
【００２４】
本開示に使用したすべてのアミノ酸の略語は、米国特許法施行規則第１章８２２条ｂ項に記載されているように米国特許商標庁に許容されている略語である。
【００２５】
ここで使用する様々な範囲を記述するための用語「〜と〜の間」は、記載した範囲の終点を含むと解釈されなければならない。
【００２６】
ここで使用する用語「実質的に単分散」とは、混合物中の化合物の少なくとも約９５％が同一分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００２７】
ここで使用する用語「単分散」とは、混合物中の化合物の約１００％が同一分子量を有する化合物の混合物を説明するために使用される。
【００２８】
ここで使用する用語「インスリンポリペプチド」とは、インスリンの生物学的活性（例えば、インスリンの一次作用機序を介して身体に影響を及ぼす能力）の少なくとも一部を有するポリペプチドを意味する。例えば、インスリンポリペプチドは、Ａ鎖ポリペプチドと、ジスルフィド結合によってＡ鎖ポリペプチドに結合したＢ鎖ポリペプチドとを有するインスリンのようなポリペプチドであってよい。本発明の様々な実施形態では、インスリンポリペプチドは好ましくはインスリンの生物学的活性の大多数を有し、より好ましくはインスリンの生物学的活性の実質的に全部を有し、および最も好ましくはインスリンの生物学的活性のすべてを有する。
【００２９】
ここで使用する用語「プロインスリンポリペプチド」とは、インビトロまたはインビボで開裂させることのできるペプチド結合により１以上のペプチド（例えば、リーダーペプチドおよび／または連結もしくはＣペプチド）に結合したインスリンポリペプチドを意味する。例えば、プロインスリンポリペプチドは、ジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合したＡ鎖ポリペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合してインビトロおよび／またはインビボで開裂できるペプチド結合によってＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチド（connecting peptide）とを有するインスリンのようなインスリンポリペプチドを含むことができる。また別の例として、プロインスリンポリペプチドは、ジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合したＡ鎖ポリペプチドと、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に結合してインビトロおよび／またはインビボで開裂できるペプチド結合によってＡ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合した連結ペプチドとを有するインスリンのようなインスリンポリペプチドと、およびＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドとを含むことができる。代表的なプロインスリンポリペプチドには、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリン類似体フラグメント、またはリーダーペプチドを有するプロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリン類似体フラグメントのいずれか；プレプロインスリン、プレプロインスリン類似体、プレプロインスリンフラグメント、プレプロインスリンフラグメント類似体、ミニプロインスリン、および融合タンパク質が含まれるがそれらに限定されない。
【００３０】
ここで使用する用語「インスリン」は、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供される、次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラの１つのインスリンを意味する。本発明の様々な実施形態では、インスリンは好ましくはヒトインスリンである。
【００３１】
ここで使用する用語「インスリン類似体」は、アミノ酸の１以上が置換されているがインスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリンを意味する。類似体は、後にインスリンの説明を伴う上付き文字として置換位置とともに置換アミノ酸を指摘することによって記載される。例えば、「ＰｒｏB29インスリン、ヒト」は、典型的にはヒトインスリン分子のＢ２９位で見いだされたリジンがプロリンと置換されていることを意味する。
【００３２】
インスリン類似体は、当業者には理解されるように、様々な手段によって入手することができる。例えば、あるアミノ酸は、例えば基質分子上の抗体の抗原結合領域または結合部位のような構造によって相互作用結合する能力をそれほど損失することなく、インスリン構造において他のアミノ酸と置換することができる。インスリンの相互作用能力および性質がその生物学的機能的活性を規定するので、アミノ酸配列内で一定のアミノ酸配列置換を作成することができ、それでも同様の特性を備えるポリペプチドであり続けることができる。
【００３３】
そのような置換を作成する際に、アミノ酸の疎水親水指数もまた考慮に入れることができる。ポリペプチドに相互作用的生物学的機能を与える際の疎水親水性アミノ酸指数の重要性は一般に当分野において理解されている。アミノ酸の相対的疎水親水特性が結果として生じるポリペプチドの二次構造に貢献し、これが順にタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定することは容認されている。各アミノ酸には、その疎水性および荷電特性に基づいて疎水親水度指数が下記のように指定されている。イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリジン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。当業者には理解されるように、あるアミノ酸は類似の疎水親水度指数もしくはスコアを有する他のアミノ酸によって置換することができ、さらに類似の生物学的活性を有するポリペプチドを生じさせる、すなわち生物学的機能が同等のポリペプチドを入手できる。そのような変化を生じさせる際に、その疎水親水度指数が相互の±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、相互の±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして相互の±０．５以内であるアミノ酸の置換がいっそう特に好ましい。
【００３４】
さらにまた当分野においては、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に生じさせることができることも理解されている。その開示はその全体が参照して本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号は、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関することを提供している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されたように、アミノ酸残基には以下の親水性値が指定されている。アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリジン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。当業者には理解されるように、アミノ酸は類似の親水性値を有する別のアミノ酸と置換することができ、さらに生物学的に同等に、そして特に、免疫学的に同等のポリペプチドを入手できる。そのような変化では、その親水性値が相互に±２以内であるアミノ酸どうしの置換が好ましく、相互に±１以内であるアミノ酸どうしの置換が特に好ましく、そして相互に±０．５以内であるアミノ酸どうしの置換がいっそう特に好ましい。
【００３５】
上記に略述したように、このためアミノ酸置換は一般に、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等のようなアミノ酸側鎖置換基の相対類似性に基づいている。様々な上述の特徴を考慮に入れた代表的な置換（すなわち、ポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させずに置換することのできるアミノ酸）は当業者には周知であり、例えば次のものが含まれる。アルギニンとリジン、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、およびバリン、ロイシンとイソロイシン。
【００３６】
当業者には理解されるように、インスリン類似体は古典的（溶液）法、固相法、半合成法、および組み換えＤＮＡ法を含むがそれらに限定されない様々な広く認められたペプチド合成法によって調製することができる。
【００３７】
ヒトインスリン類似体の例には次のものが含まれるがそれらに限定されない。ＧｌｙA21インスリン、ヒト；ＧｌｙA2lＧｌｎB3インスリン、ヒト；ＡｌａA21インスリン、ヒト；ＡｌａA2lＧｌｎB3インスリン、ヒト；ＧｌｎB3インスリン、ヒト；ＧｌｎB30インスリン、ヒト；ＧｌｙA21ＧｌｕB30インスリン、ヒト；ＧｌｙA21ＧｌｎB3ＧｌｕB30インスリン、ヒト；ＧｌｎB3ＧｌｕB30インスリン、ヒト；ＡｓｐB28インスリン、ヒト；ＬｙｓB28インスリン、ヒト；ＬｅｕB28インスリン、ヒト；ＶａｌB28インスリン、ヒト；ＡｌａB28インスリン、ヒト、ＡｓｐB28ＰｒｏB29インスリン、ヒト；ＬｙｓB28ＰｒｏB29インスリン、ヒト；ＬｅｕB28ＰｒｏB29インスリン、ヒト；ＶａｌB28ＰｒｏB29インスリン、ヒト；ＡｌａB28ＰｒｏB29インスリン、ヒト。
【００３８】
ここで使用する用語「インスリンフラグメント」は、インスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリン内で見いだされるアミノ酸配列のセグメントを意味する。インスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。例えば、「Ｂ２５−Ｂ３０ヒトインスリン」フラグメントは、ヒトインスリンアミノ酸配列内のＢ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０位に対応する６アミノ酸配列であろう。
【００３９】
ここで使用する用語「インスリンフラグメント類似体」は、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されているがインスリンの活性の一部または全部が保持されているインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。
【００４０】
ここで使用する用語「プロインスリン」は、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供される次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラの１つのプロインスリンを意味する。一般に、プロインスリンはインスリンのＡ鎖のＮ末端をインスリンのＢ鎖のＣ末端へ連結するＣペプチドを有するインスリンから構成される。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、プロインスリンは好ましくはヒトプロインスリンである。
【００４１】
ここで使用する用語「プロインスリン類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明した通りにプロインスリン内のアミノ酸の１以上が置換されているがプロインスリンのインスリン部分の活性の一部または全部が保持されているプロインスリンを意味する。類似体は、上付き文字としての置換位置を伴う置換アミノ酸であることを示し、その後にプロインスリンの説明を記すことによって記載する。例えば、「ＰｒｏB29プロインスリン、ヒト」は、典型的にはヒトプロインスリン分子のＢ２９位で見いだされたリジンがプロリンと置換されていることを意味する。
【００４２】
ここで使用する用語「プロインスリンフラグメント」は、プロインスリンフラグメントのインスリン、インスリン類似体またはインスリンフラグメント部分の生物学的活性の一部または全部が保持されているプロインスリン内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。プロインスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。例えば、「Ｂ２５−Ｂ３５ヒトプロインスリン」フラグメントは、ヒトプロインスリンアミノ酸配列内のＢ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、Ｂ３０、Ｂ３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４およびＢ３５位に対応する１１アミノ酸配列であろう。
【００４３】
ここで使用する用語「プロインスリンフラグメント類似体」は、インスリン類似体に関連して上記で説明されたように、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されているがプロインスリンフラグメントのインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリンフラグメント類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプロインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。
【００４４】
ここで使用する用語「プレプロインスリン」は、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供される次の種、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラの１つのプレプロインスリンを意味する。一般に、プレプロインスリンは、例えばジスルフィド結合によってＡ鎖がＢ鎖に結合している一本鎖ポリペプチド（例えば、インスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有し、さらに連結ペプチドによってＡ鎖のＮ末端に結合したＢ鎖のＣ末端を有するポリペプチド）である。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、プレプロインスリンは好ましくはヒトプレプロインスリンである。
【００４５】
ここで使用する用語「プレプロインスリン類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明した通りに、プレプロインスリン内のアミノ酸の１以上が置換されているがプレプロインスリン類似体のインスリンまたはインスリン類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリンを意味する。類似体は、上付き文字としての置換位置を伴う置換アミノ酸であることを示し、その後にインスリンの説明を記すことによって記載する。
【００４６】
ここで使用する用語「プレプロインスリンフラグメント」は、プレプロインスリンフラグメントのインスリンまたはインスリンフラグメント部分の生物学的活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリン内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。プレプロインスリンフラグメントは、アミノ酸配列内の位置を記載し、その後にアミノ酸の説明を記して表示する。
【００４７】
ここで使用する用語「プレプロインスリンフラグメント類似体」は、インスリン類似体に関連して上記で説明したように、セグメント内の１以上のアミノ酸は置換されているがプレプロインスリンフラグメント類似体のインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリンフラグメント類似体部分の活性の一部または全部が保持されているプレプロインスリン分子内で見いだされるアミノ酸配列の１セグメントを意味する。
【００４８】
ここで使用する用語「ミニプロインスリン」は、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有する一本鎖インスリンプロポリペプチドを意味するが、このときＡ鎖のＮまたはＣ末端が、１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個のアミノ酸残基（下限）と２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のアミノ酸残基（上限）との間の連結ペプチドによってＢ鎖のＣ末端またはＮ末端に結合しており、そしてこのときＡ鎖ポリペプチドはジスルフィド結合のような結合によってＢ鎖ポリペプチドに結合している。ミニプロインスリンは、それら各々の開示はそれらの全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとするＢａｌｓｃｈｍｉｄｔらへの米国特許第５，１５７，０２１号および米国特許第５，２０２，４１５号に記載されているものを含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるような様々なミニプロインスリンであってよい。
【００４９】
ここで使用する用語「Ｃペプチド」は、天然、合成、または遺伝子組み換え操作源により提供される次の種、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、トリ、アヒルまたはクジラの１つのプロインスリンのＣペプチドのアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。本明細書に記載した本発明の様々な実施形態では、Ｃペプチドは好ましくはヒトＣペプチドである。
【００５０】
ここで使用する用語「Ｃペプチド類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明した通りに、Ｃペプチド内のアミノ酸の１以上が置換されているがＣペプチドの生物学的活性の一部または全部が保持されているＣペプチドを意味する。好ましくは、Ｃペプチド類似体はＣペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチド類似体がペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントは好ましくはＣペプチド類似体のＣ末端にある。より好ましくは、Ｃペプチド類似体はＣペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチド類似体がテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントは好ましくはＣペプチド類似体のＣ末端にある。上記のＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、好ましくはヒトＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントである。
【００５１】
ここで使用する用語「Ｃペプチドフラグメント」は、Ｃペプチドの一部、実質的に全部、または全部の生物学的活性を保持しているＣペプチドのアミノ酸配列の１セグメントを意味する。好ましくは、ＣペプチドフラグメントはＣペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチドフラグメントがペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントは好ましくはＣペプチドフラグメントのＣ末端にある。より好ましくは、ＣペプチドフラグメントはＣペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチドフラグメントがテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントは好ましくはＣペプチドフラグメントのＣ末端にある。さらにより好ましくは、Ｃペプチドフラグメントは、ＣペプチドのＣ末端のペンタペプチドセグメント、Ｃペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメント、およびＣペプチドのＣ末端のテトラペプチドセグメントからなる群から選択されるペプチドからなる。上記のＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、好ましくはヒトＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントである。
【００５２】
ここで使用する用語「Ｃフラグメント類似体」は、上記でインスリン類似体に関連して説明した通りにセグメント内のアミノ酸の１以上が置換されているがインスリンの生物学的活性の一部、実質的に全部、または全部が保持されているＣペプチドのアミノ酸配列の１セグメントを意味する。好ましくは、Ｃペプチドフラグメント類似体はＣペプチドのＣ末端でのペンタペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチドフラグメント類似体がペンタペプチドセグメントを含む場合は、ペンタペプチドセグメントは好ましくはＣペプチドフラグメント類似体のＣ末端にある。より好ましくは、Ｃペプチドフラグメント類似体はＣペプチドのＣ末端でのテトラペプチドセグメントおよび／またはＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントを含む。Ｃペプチドフラグメント類似体がテトラペプチドセグメントを含む場合は、テトラペプチドセグメントは好ましくはＣペプチドフラグメント類似体のＣ末端にある。上記のＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントは、好ましくはヒトＣペプチドの１１〜１９位で見いだされるノナペプチドセグメントである。
【００５３】
ここで使用する用語「Ｃペプチドポリペプチド」は、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＪ．Ｗａｈｒｅｎら，「ヒト生理学におけるＣペプチドの役割」，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２７８：Ｅ７５９−Ｅ７６８（２０００）および／またはＴ．Ｆｏｒｓｔら，「ＩＤＤＭ患者におけるＣペプチドの生物学的活性に関する新規解釈」，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１０６：２７０−２７６（１９９８）に記載されているＣペプチドおよび／またはＣペプチドフラグメントについての治療的有用性および生物学的機能性に類似する治療的有用性および生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。例えば、Ｃペプチドポリペプチドは、糸球体超濾過の減少、全身および／または骨格筋グルコース利用率増強、自律神経機能の向上、および／または微小血管皮膚血流の再配分を含むがそれらに限定されない治療的有用性を有する。Ｃペプチドポリペプチドは、Ｎａ+−Ｋ+−ＡＴＰａｓｅ活性を刺激する能力、内皮一酸化窒素シンターゼ活性を刺激する能力、および／またはＣａ2+依存性細胞内シグナリング経路の引き続いての活性化を伴う細胞表面に（例えば、Ｇ−タンパク質結合表面レセプターで）特異的に結合する能力を含むがそれらに限定されない生物学的活性を有する。Ｃペプチドポリペプチドは、好ましくは〜３×１０9Ｍ-1の内皮細胞、腎尿細管細胞、および線維芽細胞に結合するための結合速度定数を有する。Ｃペプチドポリペプチドは、好ましくはＣペプチド、Ｃペプチド類似体、Ｃペプチドフラグメント、またはＣペプチドフラグメント類似体である。
【００５４】
ここで使用する用語「プロＣペプチドポリペプチド」は、Ｃペプチドポリペプチドを得るために開裂できる１以上のペプチドに結合したＣペプチドポリペプチドを意味する。
【００５５】
ここで使用する用語「Ａ鎖ポリペプチド」は、インスリン分子のＡ鎖と実質的に生物学的に同等であるポリペプチドを意味する。例えば、Ａ鎖ポリペプチドは上記でインスリン類似体、Ａ鎖フラグメント、またはＡ鎖類似体フラグメントに関連して説明した通りに提供できるＡ鎖類似体であってよい。
【００５６】
ここで使用する用語「Ｂ鎖ポリペプチド」は、インスリン分子のＢ鎖に実質的に生物学的に同等であるポリペプチドを意味する。例えば、Ｂ鎖ポリペプチドは、上記でインスリン類似体、Ｂ鎖フラグメント、またはＢ鎖類似体フラグメントに関連して説明した通りに提供できるＢ鎖類似体であってよい。
【００５７】
ここで使用する用語「ポリペプチド」は、２つまたは３つ以上のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。
【００５８】
ここで使用する用語「両親媒性に平衡した」は、実質的に水に溶解させることができ、そして生体膜に浸透できることを意味する。
【００５９】
ここで使用する用語「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリブチレングリコールのような直鎖または分岐ポリアルキレングリコールポリマーを意味しており、そしてポリアルキレングリコールのモノアルキルエーテルが含まれる。用語「ポリアルキレングリコールサブユニット」は、単一ポリアルキレングリコールユニットを意味する。例えば、ポリエチレングリコールサブユニットは、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−であろう。
【００６０】
ここで使用する用語「親油性」は、脂質中に溶解する能力および／または生体膜に浸透する、生体膜と相互作用するおよび／または生体膜を横断する能力を意味しており、そして用語「親油性部分」または「親油性」は親油性である、および／または他の化学実体に付加したときにそのような化学実体の親油性を増加させる部分を意味する。親油性部分の例には、アルキル、脂肪酸、脂肪酸のエステル、コレステロール、アダマンチル等が含まれるがそれらに限定されない。
【００６１】
ここで使用する用語「低級アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有する置換もしくは未置換アルキル部分をいう。
【００６２】
ここで使用する用語「高級アルキル」は、６個以上の炭素原子を有する置換もしくは未置換アルキル部分をいう。
【００６３】
本発明の実施形態によると、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、開裂させることによりインスリンポリペプチドを産生させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分にオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、プロインスリン−ポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップと、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るステップとが含まれる。例えば、インスリン−オリゴマーコンジュゲートは、下記に示す実施例に記載した通りに合成できる。合成経路の１つの実施形態は図１に示す。
【００６４】
プロインスリンポリペプチドは、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリンフラグメント類似体、ミノプロインスリン、または融合タンパク質を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろうインスリンポリペプチドを産生するために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含む様々なプロインスリンポリペプチドであってよい。一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはリーダーペプチドを有するプロインスリン類似体である。リーダーペプチドを有するプロインスリン類似体は、日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社によって製造されている。プロインスリン類似体のリーダーペプチドおよびＣペプチドは、各々、リジン残基が欠けている。他の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはブラジルのベロオリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社によって製造されるプロインスリンポリペプチドである。プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有する。このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。
【００６５】
インスリンポリペプチドは、好ましくはＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有する。Ａ鎖ポリペプチドは、リジン残基が欠けているのが好ましい。Ｂ鎖ポリペプチドは、単一リジン残基を備えているのが好ましい。Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは、好ましくは架橋しており、そしてより好ましくは１以上のジスルフィド結合を使用して架橋している。さらにいっそう好ましくは、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは各々システイン残基を備えており、それらの１以上はＡ鎖ポリペプチドをＢ鎖ポリペプチドと架橋させるために１以上のジスルフィド結合を使用して結合されている。好ましくは、インスリンポリペプチドはインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリン類似体フラグメントである。
【００６６】
一部の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは、Ｂ鎖ポリペプチドのＣ末端に第１端で結合し、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に第２端で結合した連結ペプチドを備えている。一般に、連結ペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではなく、そして連結ペプチドはミニプロインスリンにおけるＣペプチドポリペプチド、Ｃペプチド、および連結ペプチドを含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるであろう様々な連結ペプチドであってよい。一部の実施形態では、連結ペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上の可能性のあるコンジュゲーション部位の数を減少させることにより低オリゴマー試薬を利用できる。
【００６７】
他の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含む。一般に、リーダーペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではない。一部の実施形態では、リーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上のコンジュゲーション部位数を限定することにより使用するオリゴマー試薬の量を減少させることができる。
【００６８】
さらにまた別の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは上述の連結ペプチドおよび上述のリーダーペプチドの両方を含む。１以上のペプチドは、本質的にペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい、または連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい。
【００６９】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。好ましくは、ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合である。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるであろうが、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【００７０】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるあらゆるオリゴマーであってよい。例えば、オリゴマーは、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＤａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているように多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているように非多分散オリゴマーであってよい。
【００７１】
一部の実施形態では、オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が維持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような親水性成分を含む。親水性成分は、好ましくはポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７ポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１】
2005502353.tif 000002
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【００７２】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような１以上の成分を備えていてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【００７３】
オリゴマーは、さらにまた糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）を備えていてよい。隣接ポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化２】
2005502353.tif 000003
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親油性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化３】
2005502353.tif 000004
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を備えており、そして追加の親水性成分を備えていない。
【００７４】
オリゴマーは、好ましくはさらに当業者には理解されるように、１以上の親油性成分を含む。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；ならびにビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【００７５】
オリゴマーは、さらに当業者には理解されるように、１以上のスペーサー成分を含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、プロインスリンポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。
【００７６】
オリゴマーは、さらに当業者には理解されるように、オリゴマーをプロインスリンポリペプチドと結合させるために使用される１以上のリンカー成分を含むことができる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【００７７】
オリゴマーは、さらにまたオリゴマーの１以上の端に、１以上の末端成分（terminating moiety）を有していてよいが、それらはインスリンポリペプチドに結合していない。末端成分は、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、いっそうより好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【００７８】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式Ｉの構造を含む。
【化４】
2005502353.tif 000005
式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分である、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である。
【００７９】
本発明のこれらの実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化５】
2005502353.tif 000006
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【００８０】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者には理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【００８１】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者には理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、好ましくは糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは好ましくは０である）。
【００８２】
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分のＬは、当業者には理解されるようにオリゴマーを薬物と結合させるために使用できる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【００８３】
本発明のこれらの実施形態によると、末端成分のＴは、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、いっそうより好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、および脂肪酸成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【００８４】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合することのできる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ2を含むがそれらに限定されない,
当業者には理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【００８５】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＩの構造を含む。
【化６】
2005502353.tif 000007
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
Ｘは、酸素原子、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合部分であり、そして好ましくはエーテル結合部分であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８６】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＩＩの構造を含む。
【化７】
2005502353.tif 000008
式中、
Ａは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８７】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＶの構造を含む。
【化８】
2005502353.tif 000009
式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【００８８】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式Ｖの構造を含む。
【化９】
2005502353.tif 000010
上述の様々な実施形態では、オリゴマーはインスリンポリペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカーボネート結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。例えばインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、このコンジュゲートにはインスリンポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）一定の場合には、加水分解性結合は、生物学的に活性なインスリンポリペプチドを得るためにそれらの各生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーが開裂されるように所定の期間にわたり生物学的に活性なインスリンポリペプチドを提供することで持続放出性もしくは放出制御性作用を提供できる。他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。オリゴマーが、エステル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用してインスリンポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【００８９】
上述の様々な実施形態に使用したオリゴマーは、市販で入手できる、または当業者には理解されるように様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的に単分散および単分散）オリゴマーは、以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、好ましくは実質的単分散であり、より好ましくは単分散である。好ましい単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を下記の実施例１〜１０に示す。
【００９０】
プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、当業者には理解されるように様々な条件を利用して実施できる。好ましくは、プロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップは、オリゴマーと活性化剤とを、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを、プロインスリンポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【００９１】
活性化剤は、オリゴマーがＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【００９２】
当業者であれば、活性化されたオリゴマーを得るために活性化剤をオリゴマーに結合させるために十分な条件を理解するであろう。例えば、当業者であれば、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。
【００９３】
活性化されたオリゴマーをプロインスリンポリペプチドに結合させるために十分な条件は、当業者には理解されるであろう。例えば、プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような両性非プロトン性溶媒中に溶解させることができる。プロインスリンポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロインスリンポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比は、好ましくは約１：１より大きく、より好ましくは約２：１より大きく、いっそうより好ましくは約３：１より大きく、さらにいっそう好ましくは約４：１より大きく、そしてさらになおいっそう好ましくは約５：１より大きい。
【００９４】
上述の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させることができる。複数のオリゴマーは、同一であるのが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で、一部は相違していてもよい。複数のオリゴマーがプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってよいが、例えば、１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはインスリンポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有していてよい。
【００９５】
上述の様々な実施形態では、オリゴマーは求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないインスリンポリペプチド部分の様々な求核性残基でプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は、例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は好ましくは第２級アミンを形成する。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを有している場合、インスリン分子のＮ末端はコンジュゲーション（例えば、アシル化）から保護できる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有するヒトプロインスリンである場合、例えば、オリゴマーはプロインスリンの３つのアミノ基：リーダーペプチドのＮ末端、ＣペプチドのＬｙｓ残基のアミノ基、およびＬｙｓB29のアミノ基に結合させることができる。リーダーペプチドおよびＣペプチドが開裂すると、オリゴマーがＬｙｓB29でオリゴマーとモノコンジュゲートしたインスリンである単一インスリンコンジュゲートを得るためにインスリンのＬｙｓB29へ部位特異的に結合していることが見いだされる。
【００９６】
インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためのプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、当業者には理解されるように様々な工程によって実施できる。好ましくは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートからの１以上のペプチドを開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、１以上のペプチドとインスリンポリペプチドの間の結合を開裂させることのできる１以上の酵素とを、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件下で接触させるステップを含む。引用することにより本明細書の一部をなすものとする、例えばＫｅｍｍｌｅｒら，「プロインスリンからインスリンへの転換に関する研究」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６７８６−６７９１（１９７１）のような様々な参考文献に記載されているように、当業者であれば開裂される特定ペプチド結合に照らして適切な酵素を選択する方法およびプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件を提供する方法を理解するであろう。１以上の酵素は、好ましくはトリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物を含むがそれらに限定されない様々な酵素を含む。より好ましくは、１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００９７】
連結ペプチドを有する上述のような一部の実施形態では、連結ペプチドは第１端に末端アミノ酸残基を有する。これらの実施形態の一部では、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから連結ペプチドを開裂させるステップは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを、末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、および末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップとを含む。プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第１酵素とを接触させるステップおよび末端アミノ酸残基−インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと第２酵素とを接触させるステップは、例えば第１酵素および第２酵素が混合物または反応混液として提供される場合には、実質的に同時に発生させることができる。第１酵素は、トリプシンおよび第２酵素はカルボキシペプチダーゼＢであるのが好ましい。末端アミノ酸残基は、アルギニン残基のような様々な残基であってよい。例えば、末端アミノ酸残基は、インスリンポリペプチドがインスリンであり連結ペプチドがヒトＣペプチドである場合はアルギニン残基である。
【００９８】
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、単一インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート（すなわち、実質的に追加のインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが欠けている）からなるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物を得る。インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物は、単一インスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートからなるのが好ましい。例えば、上述の実施形態において、プロインスリンポリペプチドのリジン残基が欠けているＡ鎖ポリペプチドおよび単一リジン残基を有するＢ鎖ポリペプチドを有するインスリンポリペプチドを含むが、インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート産物は、好ましくはオリゴマーがＢ鎖ポリペプチドのリジン残基に結合している場合に単一インスリンポリペプチド−オリゴマーモノコンジュゲートからなる。別の例として、プロインスリンポリペプチドがリーダーペプチドを備えるプロインスリンである場合は、プロインスリン−オリゴマーコンジュゲートからＣペプチドおよびリーダーペプチドを開裂させるステップはインスリン−オリゴマーモノコンジュゲートを提供するが、このときインスリンはＬｙｓB29でモノコンジュゲートしている。
【００９９】
上述のインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の実施形態は、好ましくは、７５、７６、７７、７８、または７９％より大きいインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの収率を生じさせる。より好ましくは、収率は、８０、８１、８２、８３、８４、または８５％より大きい。より好ましくは、収率は、８６、８７、８８、８９、または９０％より大きい。さらにいっそう好ましくは、収率は、９１、９２、９３、９４、または９５％より大きい。プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートとを接触させるステップによって提供される場合は、より高い収率を達成する際に過剰の活性化されたオリゴマーを使用するのが好ましいことがある。例えば、上記の収率は、好ましくは、約２：１より大きく、より好ましくは約３：１より大きく、いっそうより好ましくは約４：１より大きく、さらにいっそう好ましくは約５：１より大きい活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比を使用することによって入手される。９１、９２、９３、９４、もしくは９５％より高い収率は、好ましくは約４：１より大きく、より好ましくは約５：１より大きい活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比を使用することによって入手される。
【０１００】
本発明の他の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、インスリンポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを、プロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分へオリゴマーを結合させてプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップが含まれる。例えば、プロインスリン−オリゴマーコンジュゲートは下記に示す実施例に記載した通りに合成できる。合成経路の１つの実施形態は図１に示した。
【０１０１】
プロインスリンポリペプチドは、プロインスリン、プロインスリン類似体、プロインスリンフラグメント、プロインスリンフラグメント類似体、ミノプロインスリン、または融合タンパク質を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろうインスリンポリペプチドを産生するために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含む様々なプロインスリンポリペプチドであってよい。一部の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはリーダーペプチドを有するプロインスリン類似体である。リーダーペプチドを有するプロインスリン類似体は、日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社によって製造されている。プロインスリン類似体のリーダーペプチドおよびＣペプチドは相互にリジン残基が欠けている。他の実施形態では、プロインスリンポリペプチドはブラジルのベロオリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社によって製造されるプロインスリンポリペプチドである。プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンのＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有する。このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。
【０１０２】
インスリンポリペプチドは、好ましくはＡ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドを有する。Ａ鎖ポリペプチドは、リジン残基が欠けているのが好ましい。Ｂ鎖ポリペプチドは、単一リジン残基を備えているのが好ましい。Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは、好ましくは架橋しており、そしてより好ましくは１以上のジスルフィド結合を使用して架橋している。さらにいっそう好ましくは、Ａ鎖ポリペプチドおよびＢ鎖ポリペプチドは各々システイン残基を備えており、それらの１以上はＡ鎖ポリペプチドをＢ鎖ポリペプチドと架橋させるために１以上のジスルフィド結合を使用して結合されている。好ましくは、インスリンポリペプチドはインスリン、インスリン類似体、インスリンフラグメント、またはインスリン類似体フラグメントである。
【０１０３】
一部の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＣ末端に第１端で結合し、Ａ鎖ポリペプチドのＮ末端に第２端で結合した連結ペプチドを備えている。一般に、連結ペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではなく、そして連結ペプチドはミニプロインスリンにおけるＣペプチドポリペプチド、Ｃペプチド、および連結ペプチドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるであろう様々な連結ペプチドであってよい。一部の実施形態では、この連結ペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上の可能性のあるコンジュゲーション部位の数を減少させることにより低オリゴマー試薬を利用できる。
【０１０４】
他の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドはＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを含む。一般に、リーダーペプチドのアミノ酸配列は決定的に重要ではない。一部の実施形態では、このリーダーペプチドにはリジン残基が欠けている。これらの実施形態は、プロインスリンポリペプチド分子上のコンジュゲーション部位数を限定することにより使用するオリゴマー試薬の量を減少させることができる。
【０１０５】
さらにまた別の実施形態では、インスリンポリペプチドに結合した１以上のペプチドは上述の連結ペプチドおよび上述のリーダーペプチドの両方を含む。１以上のペプチドは、本質的に連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい、または連結ペプチドおよびリーダーペプチドから構成されてよい。
【０１０６】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。好ましくは、ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合である。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるものであり、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【０１０７】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるあらゆるオリゴマーであってよい。例えば、オリゴマーは、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているように多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているように非多分散オリゴマーであってよい。
【０１０８】
オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が維持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるような親水性成分を含む。親水性成分は、好ましくはポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１０】
2005502353.tif 000011
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１０９】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような１以上の成分を備えていてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【０１１０】
オリゴマーは、さらにまた糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）を備えていてよい。隣接ポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされるであろう。例えば、以下の成分
【化１１】
2005502353.tif 000012
は６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親水性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化１２】
2005502353.tif 000013
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を備えており、そして追加の親水性成分を備えていない。
【０１１１】
オリゴマーは、好ましくは、当業者には理解されるように、１以上の親油性成分をさらに含む。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１２】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー成分をさらに含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、プロインスリンポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。
【０１１３】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを結合させるために使用される１以上のリンカー成分をさらに含むことができる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【０１１４】
オリゴマーは、またオリゴマーの１以上の端部に１以上の末端成分をさらに含んでいてよいが、それらはインスリンポリペプチドに結合していない。末端成分は、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらにより好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらにより好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１１５】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩの構造を含む。
【化１３】
2005502353.tif 000014
式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分である、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である。
【０１１６】
本発明のこれらの実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１４】
2005502353.tif 000015
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１１７】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者には理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１１８】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者には理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、好ましくは糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない、当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは好ましくは０である）。
【０１１９】
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分のＬは当業者には理解されるようにオリゴマーと薬物とを結合させるために使用できる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【０１２０】
本発明のこれらの実施形態によると、末端成分のＴは、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、いっそうより好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、および脂肪酸成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１２１】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合することのできる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ2を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【０１２２】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩＩの構造を含む。
【化１５】
2005502353.tif 000016
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
Ｘは、酸素原子、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分であり、そして好ましくはエーテル結合成分であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２３】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＶＩＩＩの構造を含む。
【化１６】
2005502353.tif 000017
式中、
Ａは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２４】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＩＸの構造を含む。
【化１７】
2005502353.tif 000018
式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１２５】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式Ｘの構造を含む。
【化１８】
2005502353.tif 000019
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーはインスリンポリペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカーボネート結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。例えばインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、前記コンジュゲートにはインスリンポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）一定の場合には、加水分解性結合は、生物学的に活性なインスリンポリペプチドを得るためにそれらの各生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーが開裂されるように所定の期間にわたり生物学的に活性なインスリンポリペプチドを提供することで持続放出性もしくは放出制御性作用を提供できる。他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してインスリンポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。オリゴマーがエステル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用してインスリンポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはインスリンポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【０１２６】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態に使用したオリゴマーは、市販で入手できる、または当業者には理解されるように様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的単分散および単分散）オリゴマーは、以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、好ましくは実質的単分散であり、より好ましくは単分散である。好ましい単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を下記の実施例１〜１０に示す。
【０１２７】
プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下でプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、当業者には理解されるように様々な条件を利用して実施できる。好ましくは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下でプロインスリンポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下でオリゴマーを活性化剤と接触させるステップと、プロインスリンポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【０１２８】
活性化剤は、オリゴマーがＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【０１２９】
当業者であれば、活性化されたオリゴマーを得るために活性化剤をオリゴマーに結合させるために十分な条件を理解するであろう。例えば当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。
【０１３０】
活性化されたオリゴマーとプロインスリンポリペプチドとを結合させるために十分な条件は、当業者には理解されるであろう。例えば、プロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような両性非プロトン性溶媒中に溶解させることができる。プロインスリンポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロインスリンポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。活性化されたオリゴマー対プロインスリンポリペプチドのモル比は、好ましくは約１：１より大きく、より好ましくは約２：１より大きく、いっそうより好ましくは約３：１より大きく、さらにいっそう好ましくは約４：１より大きく、そしてさらになおいっそう好ましくは約５：１より大きい。
【０１３１】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させることができる。複数のオリゴマーは、同一であるのが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で一部は相違していてもよい。複数のオリゴマーがプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってよいが、例えば１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってインスリンポリペプチドまたはインスリンポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有していてよい。
【０１３２】
上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーは求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないインスリンポリペプチド部分の様々な求核性残基でプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は好ましくは第２級アミンを形成する。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖ポリペプチドのＮ末端に結合したリーダーペプチドを有している場合、インスリン分子のＮ末端はコンジュゲーション（例えば、アシル化）から保護できる。プロインスリンポリペプチドがＢ鎖のＮ末端に結合したリーダーペプチドを有するヒトプロインスリンである場合、例えば、オリゴマーはプロインスリンの３つのアミノ基：リーダーペプチドのＮ末端、ＣペプチドのＬｙｓ残基のアミノ基、およびＬｙｓB29のアミノ基に結合させることができる。リーダーペプチドおよびＣペプチドが開裂すると、オリゴマーがＬｙｓB29でオリゴマーとモノコンジュゲートしたインスリンである単一インスリンコンジュゲートを得るためにインスリンのＬｙｓB29へ部位特異的に結合していることが見いだされる。
【０１３３】
本発明のさらにまた別の実施形態によると、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートには、インスリンポリペプチドを産生するために開裂できるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドと、およびプロインスリンポリペプチドのインスリンポリペプチド部分に結合したオリゴマーとが含まれる。
【０１３４】
インスリンポリペプチドを産生するために開裂できるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したインスリンポリペプチドを含むプロインスリンポリペプチドは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法に関連して上述のプロインスリンポリペプチドを含むがそれらに限定されない様々なプロインスリンポリペプチドであってよい。オリゴマーは、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法に関連して上述のオリゴマーを含むがそれらに限定されない様々なオリゴマーであってよい。オリゴマーは、好ましくは親水性成分および親油性成分を含む。本発明によるプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、上述のプロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な方法によって合成できる。
【０１３５】
さらにまた別の実施形態によると、Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法には、Ｃペプチドポリペプチドを産生させるために開裂させることのできるペプチド結合によって１以上のペプチドに結合したＣペプチドポリペプチドを含むプロＣペプチドポリペプチドとオリゴマーとを、プロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分にオリゴマーを結合させて、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で接触させるステップと、およびＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためにプロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップとが含まれる。
【０１３６】
プロＣペプチドポリペプチドは、当業者には理解されるように様々なプロＣペプチドポリペプチドであってよい。好ましくは、プロＣペプチドポリペプチドは、プロインスリンポリペプチドであり、そしてより好ましくは、プロＣペプチドポリペプチドはプロインスリンである。
【０１３７】
Ｃペプチドポリペプチドは、当業者には理解されるように様々なＣペプチドポリペプチドであってよい。好ましくは、ＣペプチドポリペプチドはＣペプチドである。
【０１３８】
Ｃペプチドポリペプチドに結合した１以上のペプチドは、当業者には理解されるように様々なペプチドであってよい。好ましくは、１以上のペプチドはインスリンポリペプチドを含む。より好ましくは、１以上のポリペプチドはインスリンポリペプチドである。インスリンポリペプチドはリジン残基を含んでいないことがあり、それはプロＣペプチドポリペプチドをコンジュゲートさせるために使用するオリゴマー試薬の量を減少させることがある。さらにより好ましくは、１以上のペプチドはインスリン、またはリーダーペプチドへのＢ鎖のＮ末端で結合したインスリンである。
【０１３９】
ペプチド結合は、当業者には理解されるように、様々な方法で開裂できる結合である。好ましくは、ペプチド結合はトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、トロンビン、ペプシン、およびキモトリプシンを含むがそれらに限定されない酵素によって酵素開裂させることのできる結合である。酵素により開裂できるペプチド結合は当業者には理解されるであろうが、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、およびＡｒｇ−Ｐｈｅを含むがそれらに限定されない。
【０１４０】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、様々なオリゴマーであってよい。一般に、オリゴマーは、当業者には理解されるように、ポリペプチドに結合することのできるあらゆるオリゴマーであってよい。例えば、オリゴマーは、Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号に記載されているように多分散オリゴマーであってよい。別の実施例として、オリゴマーは、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号に記載されているように非多分散オリゴマーであってよい。
【０１４１】
オリゴマーは、ブロックコポリマーの親水性が維持されていることを条件に、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような親水性成分を含む。親水性成分は、好ましくはポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化１９】
2005502353.tif 000020
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１４２】
オリゴマーは、追加の親水性成分、親油性成分、スペーサー成分、リンカー成分および末端成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような１以上の成分を含んでいてよい。オリゴマー内の様々な成分は、加水分解性結合または非加水分解結合のいずれかによって相互に共有結合している。
【０１４３】
オリゴマーは、また糖、ポリアルキレングリコール、およびポリアミン／ＰＥＧコポリマーを含むがそれらに限定されない１以上の追加の親水性成分（すなわち、ポリアルキレングリコール成分へ追加する成分）をさらに含んでいてもよい。隣接するポリアルキレングリコール成分は、それらがエーテル結合によって結合している場合は同一成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化２０】
2005502353.tif 000021
は、６個のポリエチレングリコールサブユニットを有する単一ポリエチレングリコール成分である。この成分がオリゴマー内の唯一の親水性成分であった場合、オリゴマーは追加の親水性成分を含有していないであろう。隣接するポリエチレングリコール成分は、それらがエーテル結合以外の結合によって結合している場合は相違する成分であると見なされるであろう。例えば、成分
【化２１】
2005502353.tif 000022
は、４個のポリエチレングリコールサブユニットを有するポリエチレングリコール成分および２個のポリエチレングリコールサブユニットを有する追加の親水性成分である。好ましくは、本発明の実施形態によるオリゴマーは、ポリアルキレングリコール成分を含んでおり、そして追加の親水性成分を備えていない。
【０１４４】
オリゴマーは、好ましくは当業者には理解されるように、１以上の親油性成分をさらに含む。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１４５】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、１以上のスペーサー成分をさらに含むことができる。スペーサー成分は、例えば親油性成分から親水性成分を分離するため、Ｃペプチドポリペプチドから親油性成分もしくは親水性成分を分離するため、第２親水性成分もしくは親油性成分から第１親水性成分もしくは親油性成分を分離するため、またはリンカー成分から親水性成分もしくは親油性成分を分離するために使用できる。スペーサー成分は、好ましくは糖、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。
【０１４６】
オリゴマーは、当業者には理解されるように、オリゴマーをＣペプチドポリペプチドと結合させるために使用される１以上のリンカー成分をさらに含むことができる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【０１４７】
オリゴマーは、さらにまたオリゴマーの１以上の端部に１以上の末端成分を有していてよいが、それらはＣペプチドポリペプチドに結合していない。末端成分は、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、いっそうより好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖、コレステロール、アルコール、および脂肪酸を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１４８】
本発明の他の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩの構造を含む。
【化２２】
2005502353.tif 000023
式中、
Ａは活性化可能な成分であり、
Ｌはリンカー成分であり、
Ｇ、Ｇ’およびＧ’’は個別に選択されるスペーサー成分であり、
Ｒは親油性成分でありＲ’はポリアルキレングリコール成分である、またはＲ’は親油性成分でありＲはポリアルキレングリコール成分であり、
Ｔは末端成分であり、
ｊ、ｋ、ｍおよびｎは個別に０または１である。
【０１４９】
本発明のこれらの実施形態によると、ポリアルキレングリコール成分は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、より好ましくは、２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。よりいっそう好ましくは、ポリアルキレングリコール成分は、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、さらによりいっそう好ましくは、４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。ポリアルキレングリコール成分は、最も好ましくは７個のポリアルキレングリコールサブユニットを有する。オリゴマーのポリアルキレングリコール成分は、好ましくはポリエチレングリコール成分、ポリプロピレングリコール成分、またはポリブチレングリコール成分のような低級アルキルポリアルキレングリコール成分である。ポリアルキレングリコール成分がポリプロピレングリコール成分である場合、前記成分は好ましくは均一な（すなわち、ランダムではない）構造を有する。均一な構造を有する代表的なポリプロピレングリコール成分は次の通りである。
【化２３】
2005502353.tif 000024
この均一なポリプロピレングリコール構造は、ポリプロピレングリコール鎖において各酸素原子に隣接して唯一のメチル置換炭素原子を有すると表現できる。このような均一なポリプロピレングリコール成分は親油性および親水性両方の特性を示すことができる。
【０１５０】
本発明のこれらの実施形態によると、親油性成分は当業者には理解されるような親油性成分である。親油性成分は、少なくとも１、２、３、４、５、もしくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、より好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、いっそうより好ましくは、３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、さらによりいっそう好ましくは、３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。親油性成分は、最も好ましくは６個の炭素原子を有する。親油性成分は、好ましくは飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分、飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分、コレステロール、およびアダマンタンからなる群から選択される。代表的なアルキル成分には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシルおよびエイコシルのような飽和直鎖アルキル成分；イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチルのような飽和分岐鎖アルキル成分；およびビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない上記の飽和アルキル成分から誘導された不飽和アルキル成分が含まれるがそれらに限定されない。代表的な脂肪酸成分には、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルケート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、およびドコサヘキサエノエートのような不飽和脂肪酸成分；およびアセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセラート、およびセロテートのような飽和脂肪酸成分が含まれるがそれらに限定されない。
【０１５１】
本発明のこれらの実施形態によると、スペーサー成分のＧ、Ｇ’、Ｇ’’は当業者には理解されるようなスペーサー成分である。スペーサー成分は、好ましくは糖成分、コレステロールおよびグリセリン成分からなる群から選択される。糖成分は、単糖成分および二糖成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な糖成分であってよい。好ましい単糖成分は、４〜６個の炭素原子を有する。好ましくは、これらの実施形態のオリゴマーはスペーサー成分を含んでいない（すなわち、ｋ、ｍおよびｎは好ましくは０である）。
【０１５２】
本発明のこれらの実施形態によると、リンカー成分のＬは、当業者には理解されるようにオリゴマーをＣペプチドポリペプチドと結合させるために使用できる。リンカー成分は、好ましくはアルキルおよび脂肪酸成分からなる群から選択される。アルキルリンカー成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖アルキル成分であってよい。アルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。アルキルリンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、９、１０、１１、または１２個の間の炭素原子を有していてよい。脂肪酸リンカー成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレンエート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。脂肪酸リンカー成分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子、および好ましくは１、２、３、４、または５個から８、１０、１２、１４、または１６個の間の炭素原子を有していてよい。
【０１５３】
本発明のこれらの実施形態によると、末端成分のＴは、好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分である。アルキルまたはアルコキシ成分は、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、いっそうより好ましくは、１、２、３、４、５、６、または７個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、４、または５個の下限と、５、６、７、８、９、または１０個の上限との間の炭素原子を有する。アルキルまたはアルコキシ成分は、さらによりいっそう好ましくは、１、２、３、または４個の下限と、５、６、または７個の上限との間の炭素原子を有する。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。代表的なアルコキシ成分は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ペンタデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、ノナデシルオキシ、エイコシルオキシ、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、２−メチルブトキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、２−メチル−ペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、２−エチルヘキシルオキシ、２−プロピルペンチルオキシ、ビニルオキシ、アリルオキシ、１−ブテニルオキシ、２−ブテニルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピニルオキシ、および２−プロピニルオキシを含むがそれらに限定されない様々なアルコキシ成分であってよい。末端成分は、より好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分、またはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、もしくはｔｅｒｔ−ペンチルオキシのような低級アルコキシ成分である。最も好ましくは、末端成分はメチルまたはメトキシである。末端成分は好ましくはアルキルまたはアルコキシ成分であるが、末端成分は糖成分、コレステロール、アルコール、および脂肪酸成分を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な成分であってよいと理解しなければならない。
【０１５４】
本発明のこれらの実施形態によると、活性化可能な成分のＡは、プロインスリンポリペプチドと結合することのできる活性化されたオリゴマーを生成するためにオリゴマーの活性化剤への結合を可能にする成分である。活性化可能な成分は、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨおよびＮＨ2を含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような様々な活性化可能な成分であってよい。
【０１５５】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＩの構造を含む。
【化２４】
2005502353.tif 000025
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
Ｘは、酸素原子、またはＡが−ＯＨであるときにＸが酸素ではないことを条件に共有結合であり、
Ｙは、エステル、エーテル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分であり、そして好ましくはエーテル結合成分であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１５６】
さらに別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＩＩの構造を含む。
【化２５】
2005502353.tif 000026
式中、
Ａは−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、Ｃ（Ｓ）−ＯＨ、−Ｃ（Ｓ）−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、またはＮＨ2であり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１５７】
さらにまた別の実施形態によると、オリゴマーは、式ＸＩＶの構造を含む。
【化２６】
2005502353.tif 000027
式中、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、６、７、８、または９個の下限と、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の上限との間、およびさらにより好ましくは３、４、５、６、または７個の下限と、６、７、８、９、または１０個の上限との間であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の下限と、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個の上限との間、より好ましくは２、３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の上限との間、いっそうより好ましくは３、４、５、または６個の下限と、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の上限との間のポリアルキレングリコールサブユニット、さらにいっそうより好ましくは４、５、または６個の下限と、６、７、または８個の上限のポリアルキレングリコールサブユニット、および最も好ましくは７個であり、
Ｒは、アルキル成分、糖成分、コレステロール、アダマンタン、アルコール成分、または脂肪酸成分である。アルキル成分は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、２−メチル−ペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、２−プロピルペンチル、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、エチニル、１−プロピニル、および２−プロピニルを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和のアルキル成分であってよい。アルキル成分は、より好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはｔｅｒｔ−ペンチルのような低級アルキル成分である。アルキル成分は、いっそうより好ましくはＣ1〜Ｃ3アルキルである。アルキル成分は、最も好ましくはメチルである。脂肪酸成分は、ラウロレート、ミリストレート、パルミトレート、オレエート、エライデート、エルカート、リノレート、リノレネート、アラキドネート、エイコサペンタエントエート、ドコサヘキサエノエート、アセテート、カプロエート、カプリレート、カプレート、ラウレート、アラキデート、ベヘナート、リグノセラート、およびセロテートを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるような飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐鎖脂肪酸成分であってよい。
【０１５８】
上述のＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーはＣペプチドポリペプチドに共有結合している。一部の実施形態では、オリゴマーは加水分解性結合（例えば、エステルまたはカーボネート結合）を利用してＣペプチドポリペプチドに結合している。加水分解性結合は、プロドラッグとして機能するＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを提供できる。例えばＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが生物学的に不活性である（すなわち、このコンジュゲートにはＣペプチドポリペプチドの一次作用機序を通して身体に影響を及ぼす能力が欠けている）一定の場合には、加水分解性結合は、生物学的に活性なＣペプチドポリペプチドを得るためにそれらの各生物学的に不活性なＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のオリゴマーが開裂されるように所定の期間にわたり生物学的に活性なＣペプチドポリペプチドを提供することで、持続放出性もしくは放出制御性作用を提供できる。他の実施形態では、オリゴマーは非加水分解性結合（例えば、カルバメート、アミド、またはエーテル結合）を利用してＣペプチドポリペプチドに結合している。非加水分解性結合の使用は、生物学的に不活性なＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートが好ましくは少なくとも２時間の長時間にわたり血流内を循環することを可能にすることが望ましい場合に好ましいことがある。オリゴマーがエステル、カルバメート、カーボネート、またはアミド結合成分のようなカルボニル成分を含む結合成分を利用してＣペプチドポリペプチドに結合している場合は、結果として生じるＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートはＣペプチドポリペプチド−アシルオリゴマーコンジュゲートである。
【０１５９】
上述のＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを合成する様々な方法に使用したオリゴマーは、市販で入手できる、または当業者には理解されるように様々な方法によって合成できる。例えば、多分散オリゴマーは以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｄａｖｉｓらへの米国特許第４，１７９，３３７号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄへの米国特許第５，５６７，４２２号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，３５９，０３０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，４３８，０４０号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号、Ｅｋｗｕｒｉｂｅらへの米国特許第６，３０９，６３３号。非多分散（例えば、実質的に単分散および単分散）オリゴマーは、以下の参考文献の１以上に提供された方法によって合成できる。Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリエチレングリコール混合物を有するポリマーの実質的単分散混合物の合成方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７３１号；Ｅｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含む薬物−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，７９７号；およびＥｋｗｕｒｉｂｅらによって２００１年６月４日に出願された「ポリアルキレングリコールを含むインスリン薬−オリゴマーコンジュゲートの混合物、それらの使用、およびそれらの製造方法」と題する米国特許出願第０９／８７３，８９９号。本発明の実施形態によるオリゴマーは、好ましくは実質的単分散であり、より好ましくは単分散である。好ましい単分散オリゴマーを合成するための代表的な方法を下記の実施例１〜１０に示す。
【０１６０】
プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下でプロＣペプチドポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、当業者には理解されるように、様々な条件を利用して実施できる。好ましくは、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るのに十分な条件下で、プロＣペプチドポリペプチドとオリゴマーとを接触させるステップは、活性化されたオリゴマーを得るのに十分な条件下でオリゴマーを活性化剤と接触させるステップと、プロＣペプチドポリペプチドコンジュゲートを得るのに十分な条件下で活性化されたオリゴマーをプロＣペプチドポリペプチドと接触させるステップとを含む。活性化されたオリゴマーはエクスサイチューまたはインサイチューで生成できる。
【０１６１】
活性化剤は、オリゴマーがＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、およびヒドロキシベンゾトリアジドを含むがそれらに限定されない当業者には理解されるようなプロインスリンポリペプチド内の求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基と反応できるように、上記の１以上のオリゴマーを活性化できる様々な活性化剤であってよい。
【０１６２】
当業者であれば、活性化されたオリゴマーを得るために活性化剤をオリゴマーに結合させるために十分な条件を理解するであろう。例えば当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。
【０１６３】
活性化されたオリゴマーをプロＣペプチドポリペプチドに結合させるために十分な条件は、当業者には理解されるであろう。例えば、プロＣペプチドポリペプチドは、プロＣペプチドポリペプチド溶液を得るために、ジメチルスルホキシドのような極性非プロトン溶媒中に溶解させることができる。プロＣペプチドポリペプチド溶液には、トリエチルアミンのような緩衝剤を添加できる。プロＣペプチドポリペプチド溶液には、その後アセトニトリルのような無水溶媒中に溶解させた活性化されたオリゴマーを添加できる。当業者であれば、同様にＲ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，「COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS. A GUIDE TO FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS」，（第２版，ニューヨーク，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９）を挙げることができる。活性化されたオリゴマー対プロＣペプチドポリペプチドのモル比は、好ましくは約１：１より大きく、より好ましくは約２：１より大きく、いっそうより好ましくは約３：１より大きく、さらにいっそう好ましくは約４：１より大きく、そしてさらになおいっそう好ましくは約５：１より大きい。
【０１６４】
上述のＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、２つ以上のオリゴマー（すなわち、複数のオリゴマー）をプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合させることができる。複数のオリゴマーは、同一であるのが好ましい。しかし、複数のオリゴマーは相互に相違していてもよい、あるいはまた、複数のオリゴマーの一部は同一で、一部は相違していてもよい。複数のオリゴマーがプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合している場合は、加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合させ、そして非加水分解性結合を用いて１以上のオリゴマーをプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合させるのが好ましいことがある。あるいはまた、複数のオリゴマーをプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合させる結合の全部が加水分解性であってもよいが、例えば１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってＣペプチドポリペプチドまたはプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分から迅速に除去され、そして１以上のオリゴマーが身体内の加水分解によってＣペプチドポリペプチドまたはＣペプチドポリペプチド部分から緩徐に除去されるように、相違する加水分解度を有していてよい。
【０１６５】
上述のＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートの合成方法の様々な実施形態では、オリゴマーは求核性ヒドロキシル基および／またはアミノ基を含むがそれらに限定されないＣペプチドポリペプチド部分の様々な求核性残基でプロＣペプチドポリペプチドのＣペプチドポリペプチド部分に結合されてよい。求核性ヒドロキシル基は、例えばセリンおよび／またはチロシン残基で見いだすことができ、そして求核性アミノ基は例えばヒスチジンおよび／またはリジン残基で、および／またはポリペプチドの１以上のＮ末端で見いだすことができる。オリゴマーがプロインスリンポリペプチドの１以上のＮ末端に結合している場合は、その結合は好ましくは第２級アミンを形成する。
【０１６６】
Ｃペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートを得るためのプロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、当業者には理解されるように、様々な工程によって実施できる。好ましくは、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるステップは、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートと、１以上のペプチドとＣペプチドポリペプチドの間の結合を開裂させることのできる１以上の酵素とを、プロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件下で接触させるステップを含む。例えばＫｅｍｍｌｅｒら，「プロインスリンからインスリンへの転換に関する研究」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６：６７８６−６７９１（１９７１）のような様々な参考文献に記載されているように、当業者であれば開裂される特定ペプチド結合に照らして適切な酵素を選択する方法、およびプロＣペプチドポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートから１以上のペプチドを開裂させるために十分な条件を提供する方法を理解するであろう。１以上の酵素は、好ましくはトリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物を含むがそれらに限定されない様々な酵素を含む。より好ましくは、１以上の酵素は、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１６７】
今度は、以下の実施例を参照しながら本発明について説明する。これらの実施例は本発明の態様を具体的に示すことを目的としており、請求の範囲によって規定した本発明の範囲を限定するものではないと理解しなければならない。
【実施例１】
【０１６８】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（８）の合成
ヘキサエチレングリコールモノベンジルエーテル（１）。水４ｍＬに３．９９ｇ（１００ｍｍｏｌ）のＮａＯＨを溶解させて調製した水酸化ナトリウム水溶液を単分散ヘキサエチレングリコール（２８．１７５ｇ，２５ｍＬ，１００ｍｍｏｌ）へ緩徐に添加した。塩化ベンジル（３．９ｇ，３０．８ｍｍｏｌ，３．５４ｍＬ）を添加し、この反応混合液を攪拌しながら１００℃へ１８時間加熱した。この反応混合液をその後冷却し、食塩液（２５０ｍＬ）により希釈し、塩化メチレン（２００ｍＬ×２）により抽出した。結合した有機層を食塩液により１回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で暗褐色油へ濃縮した。粗生成物混合液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチルから９／１の酢酸エチル／メタノールへの勾配溶離）により精製して、黄色油として、８．０９９ｇ（７０％）の単分散化合物１を入手した。
【０１６９】
エチル６−メチルスルホニルオキシヘキサノエート（２）。無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の単分散エチル６−ヒドロキシヘキサノエート（５０．７６ｍＬ，５０．４１ｇ，２２７ｍｍｏｌ）の溶液を氷浴中で冷やし、窒素大気下に置いた。トリエチルアミン（３４．４３ｍＬ，２４．９９ｇ，２４７ｍｍｏｌ）を添加した。無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（１９．１５ｍＬ，２８．３ｇ，２４７ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴下法で添加した。この混合物を氷浴が溶けるにつれて緩徐に室温になるに任せながら３時間半攪拌した。この混合物はシリカゲルに通して濾過し、濾液は水、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液を用いて連続的に洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で浅黄色油へ濃縮した。粗生成物の最終精製をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１／１ヘキサン／酢酸エチル）により実施して透明な無色油として単分散化合物２（４６．１３ｇ，８５％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ２３９（Ｍ＋Ｈ），１９３（Ｍ−Ｃ2Ｈ5Ｏ）。
【０１７０】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ベンジルオキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（３）。水素化ナトリウム（３．２２５ｇまたは６０％油分散液，８０．６ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水トルエン中に懸濁させ、窒素大気下に置き、氷浴中で冷却した。８０ｍＬの無水トルエン中の単分散アルコール９（２７．３ｇ，７３．３ｍｍｏｌ）の溶液をＮａＨ懸濁液に添加した。この混合液を０℃で３０分間攪拌し、室温になるに任せ、さらに５時間攪拌すると、その間に混合液は透明な褐色液になった。８０ｍＬの無水トルエン中の単分散メシレート１０（１９．２１ｇ，８０．６ｍｍｏｌ）を、ＮａＨ／アルコール混合液に添加し、そして結合溶液は室温で３日間攪拌した。この反応混合液は５０ｍＬのメタノールにより急冷し、塩基性アルミナに通して濾過した。濾液は真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、３／１酢酸エチル／ヘキサンから酢酸エチルの勾配溶離）により精製して浅黄色油として単分散化合物３（１６．５２ｇ，４４％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５１５（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７１】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（４）。実質的単分散ベンジルエーテル３（１．０３ｇ，２．０ｍｍｏｌ）は２５ｍＬのエタノール中に溶解させた。この溶液に２７０ｍｇの１０％のＰｄ／Ｃを添加し、この混合液を水素大気下に置いて４時間攪拌すると、この時間でＴＬＣは出発物質の完全な消失を示した。この反応混合液はセライト５４５に通して濾過することで触媒を除去し、濾液を真空中で濃縮すると透明な油として単分散化合物４が得られた（０．６７ｇ，７９％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４２５（Ｍ＋Ｈ），４４７（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１７２】
６−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メチルスルホニルエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−ヘキサン酸エチルエステル（５）。単分散アルコール４（０．８３５ｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を３．５ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、窒素大気下に置いた。トリエチルアミン（０．３０１ｍＬ，０．２１９ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加し、この混合液を氷浴中で冷却した。２分後、メタンスルホニルクロリド（０．１６ｍＬ，０．２４８ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を０℃で１５分間、その後室温で２時間攪拌した。この反応混合液はシリカゲルに通して濾過することで塩化トリエチルアンモニウムを除去し、濾液は水、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液を用いて連続的に洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９／１  酢酸エチル／メタノール）により精製して透明な油として単分散化合物５（０．８１９ｇ，８３％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５０３（Ｍ＋Ｈ）。
【０１７３】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸エチルエステル（６）。ＮａＨ（油中の８８ｍｇの６０％分散液，２．２ｍｍｏｌ）をＮ2下で無水トルエン（３ｍＬ）中に懸濁させ、０℃に冷却した。トルエンによる共沸蒸留を介して乾燥させた単分散ジエチレングリコールモノメチルエーテル（０．２６ｍＬ，０．２６ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液を室温へ加温するに任せて４時間攪拌すると、その間に濁った灰色懸濁液は透明かつ黄色になり、その後、褐色に変色した。２．５ｍＬの無水トルエン中のメシレート５（０．５０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で一晩攪拌した後、この反応液は２ｍＬのメタノールを添加することにより急冷し、結果として生じた溶液はシリカゲルに通して濾過した。この濾液を真空中で濃縮した。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。予備クロマトグラフィー（シリカゲル、１９／３  クロロホルム／メタノール）による追加の精製で、透明な黄色油として単分散化合物６（０．３０２ｇ，５７％）を得た。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５２７（Ｍ＋Ｈ），５４９（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１７４】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸（７）。単分散エステル６（０．２５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を０．７１ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中で１８時間攪拌した。１８時間後、混合液を真空中で濃縮してアルコールを除去し、残留物をさらに１０ｍＬの水中に溶解させた。この水溶液は２ＮのＨＣｌを用いてｐＨ２へ酸性化し、生成物をジクロロメタン中で抽出した（３０ｍＬ×２）。結合有機相を食塩液（２５ｍＬ×２）により洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると黄色油として単分散化合物１５が得られた（０．１４７ｇ，６２％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ４９９（Ｍ＋Ｈ），５２１（Ｍ＋Ｎａ）。
【０１７５】
６−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−ヘキサン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（８）。単分散酸７（０．２０９ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を４ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、Ｎ2大気下ですでにＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（５７．８ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド）（９８．０ｍｇ，０．５０２ｍｍｏｌ）を含有する乾燥フラスコへ添加した。この溶液を室温で一晩攪拌し、シリカゲルに通して濾過することで余分な試薬およびＥＤＣから形成された尿素を除去した。濾液を真空中で濃縮すると暗黄色油として活性化単分散オリゴマー８が得られた（０．２３５ｇ，９４％）。ＦＡＢ  ＭＳ：ｍ／ｅ  ５９６（Ｍ＋Ｈ），６１８（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例２】
【０１７６】
活性化されたＭＰＥＧ7−Ｃ8（１４）の合成
トリエチレングリコールモノメチルエーテルのメシレート（９）。氷浴中で０℃に冷却したＣＨ2Ｃｌ2の溶液（１００ｍＬ）に、単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル（２５ｇ，０．１５ｍｏｌ）を添加した。その後、トリエチルアミン（２９．５ｍＬ，０．２２ｍｏｌ）を添加し、この溶液を０℃で１５分間攪拌し、この後、メタンスルホニルクロリド（２０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解させた１３．８ｍＬ，０．１８ｍｏｌ）を滴下法で添加した。この反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄）に通して濾過し、その後、Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（３００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（３００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。確実に乾燥させるためにこの油を〜２時間真空ライン上に置き、黄色油として単分散化合物９を得た（２９．１５ｇ，収率８０％）。
【０１７７】
ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（１０）。ＴＨＦ（１Ｌ）中の単分散テトラエチレングリコール（５１．５ｇ，０．２７ｍｏｌ）の溶液にカリウムｔ−ブトキシド（１４．８ｇ，０．１３ｍｏｌ，３０分間かけて少しずつ）を添加した。この反応混合液を１時間攪拌し、ＴＨＦ（９０ｍＬ）に溶解させた９（２９．１５ｇ，０．１２ｍｏｌ）を滴下法で添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。油はその後ＨＣｌ（２５０ｍＬ，１Ｎ）中に溶解させ、酢酸エチル（２５０ｍＬ）により洗浄して余分な９を除去した。残留している９を除去するために酢酸エチル（１２５ｍＬ）による追加の洗浄が必要になることがある。水相から化合物１８のほとんどが除去されるまで、水相をＣＨ2Ｃｌ2（容量１２５ｍＬ）により繰り返し洗浄した。第１抽出物は９、１０および二重結合副産物を含有しているので、ＨＣｌ（１２５ｍＬ，１Ｎ）を用いて逆抽出しなければならない。有機層を結合し、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油はＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中に溶解させ、１０が除去されるまでＨ2Ｏ（容量５０ｍＬ）により繰り返し洗浄した。水性分画を総量５００ｍＬとなるように結合し、この溶液が濁るまでＮａＣｌを添加し、その後ＣＨ2Ｃｌ2（２×５００ｍＬ）により洗浄した。有機層を結合し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると油として単分散化合物１０（１６．９ｇ，４１％収率）が得られた。高純度を保証するためには精製方法の１以上のステップを繰り返すことが望ましいことがある。
【０１７８】
８−ブロモオクタネート（１１）。エタノール（１００ｍＬ）中の単分散８−ブロモオクタン酸（５．０ｇ，２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ2ＳＯ4（０．３６ｍＬ，７．５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応液を攪拌しながら３時間環流するように加熱した。粗反応混合液を室温へ冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させて透明油１１を得た（５．５ｇ，収率９８％）。
【０１７９】
ＭＰＥＧ7−Ｃ8エステル（１２）。エーテル（９０ｍＬ）中の単分散化合物１０（３．０ｇ，８．８ｍｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ−ブトキシド（１．２ｇ，９．６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応液を１時間攪拌した。エーテル（１０ｍＬ）に溶解させた単分散化合物１１（２．４ｇ，９．６ｍｍｏｌ）の滴下添加液を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル対酢酸エチル／メタノール、１０：１）を実施し、透明な油として単分散化合物１２を得た（０．８４３ｇ，収率１９％）。
【０１８０】
ＭＰＥＧ7−Ｃ8酸（１３）。単分散化合物１２（０．７０ｇ，１．４ｍｍｏｌ）の油に、１ＮのＮａＯＨ（２．０ｍＬ）を添加し、この反応混合液を４時間攪拌した。粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌにより飽和させ、そしてＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）により洗浄した。有機層を混ぜ合わせて飽和ＮａＣｌにより洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると透明な油として単分散化合物１３（０．３５ｇ，収率５３％）が得られた。
【０１８１】
ＭＰＥＧ7−Ｃ8酸の活性化。単分散ｍＰＥＧ7−Ｃ8酸１３（０．３１ｇ，０．６４ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水塩化メチレン中に溶解させ、無水塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７９ｇ，０．６９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ−ＨＣｌ（１３５．６ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応液を数時間攪拌し、１ＮのＨＣｌにより洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮させた。粗物質をカラムクロマトグラフィーにより精製し、濃縮させて透明な油として単分散活性化ＭＰＥＧ7−Ｃ8１４を得て真空により乾燥させた。
【実施例３】
【０１８２】
活性化されたＭＰＥＧ7−Ｃ10（１９）の合成
１０−ヒドロキシデカノエート（１５）。エタノール（１００ｍＬ）中の単分散１０−ヒドロキシデカン酸（５．０ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の溶液にＨ2ＳＯ4（０．４３ｍＬ，８．８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応液を攪拌しながら３時間環流するように加熱した。粗反応混合液を室温に冷却し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）を用いて洗浄しＭｇＳＯ4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させて透明な油として単分散化合物１５を得た（６．９ｇ，収率９８％）。
【０１８３】
１０−ヒドロキシデカノエートのメシレート（１６）。ＣＨ2Ｃｌ2の溶液（２７ｍＬ）に単分散１０−ヒドロキシデカノエート１５（５．６ｇ，２６ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴中で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（５ｍＬ，３７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（３ｍＬ）中に溶解させたメタンスルホニルクロリド（２．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を除去し、この反応液を室温でさらに２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄）に通して濾過し、その後Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させて黄色がかった油として単分散化合物１６を得た（７．４２ｇ，収率９７％）。
【０１８４】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10エステル（１７）。テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）中の実質的単分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル１０（２．５ｇ，７．３ｍｍｏｌ）の溶液に水素化ナトリウム（０．１９４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を１時間攪拌した。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させた単分散１０−ヒドロキシデカノエート１６のメシレート（２．４ｇ，８．１ｍｍｏｌ）の滴下添加液を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（〜２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2により洗浄）に通して濾過し、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油を酢酸エチル中に溶解させ、Ｈ2Ｏ（２×２００ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、さらにクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）にかけて透明な油として単分散化合物１７を得た（０．５７０ｇ，収率１５％）。
【０１８５】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸（１８）。単分散ｍＰＥＧ7−Ｃ10エステル１７（０．５７０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）の油に、１ＮのＮａＯＨ（１．６．０ｍＬ）を添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液を濃縮し、酸性化し（ｐＨ〜２）、ＮａＣｌにより飽和させ、そしてＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）により洗浄した。有機層を混ぜ合わせて、飽和ＮａＣｌ（２×５０ｍＬ）により洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させると透明な油として単分散化合物１８（０．３４０ｇ，収率６２％）が得られた。
【０１８６】
ＭＰＥＧ7−Ｃ10酸の活性化。単分散酸１８は、活性化ＭＰＥＧ7−Ｃ10オリゴマー１９を得るために上記の実施例１０に記載したものに類似する方法を使用して活性化した。
【実施例４】
【０１８７】
活性化されたＣ18（ＰＥＧ6）オリゴマー（２２）の合成
Ｃ18（ＰＥＧ6）オリゴマー（２０）の合成。単分散ステアロイルクロリド（０．７ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）をベンゼン中の単分散ＰＥＧ6（５ｇ，１７．７ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９７ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）の混合液へ緩徐に添加した。この反応混合液を数時間（〜５時間）攪拌した。この反応の後に、展開剤として酢酸エチル／メタノールを使用するＴＬＣを実施した。この反応混合液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方で乾燥させ、濃縮させて、真空により乾燥させた。ＦＡＢ  ＭＳにより精製単分散化合物２０を分析した。ｍ／ｅ  ５４９／Ｍ+Ｈ。
【０１８８】
Ｃ18（ＰＥＧ6）オリゴマーの活性化。単分散Ｃ18（ＰＥＧ6）オリゴマーの活性化は２つのステップで実施した。
【０１８９】
１）単分散ステアロイル−ＰＥＧ6２０（０．８ｇ，１．４６ｍｍｏｌ）をトルエン中に溶解させ、ホスゲン液（１０ｍＬ，トルエン中で２０％）に添加し、これを氷浴中で冷却した。この反応混合液を０℃で１分間攪拌し、その後、室温で３時間攪拌した。ホスゲンおよびトルエンを蒸留により除去し、残留した実質的単分散ステアロイル−ＰＥＧ６クロロホルメート２１をＰ2Ｏ5の上方で一晩かけて乾燥させた。
【０１９０】
２）無水塩化メチレン中の単分散ステアロイル−ＰＥＧ6クロロホルメート２１（０．７８ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１２８ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メチレン中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液を添加した。この反応混合液を１６時間攪拌し、水により洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮し、真空により乾燥させて単分散の活性化されたＣ18（ＰＥＧ6）オリゴマー２２を得た。
【実施例５】
【０１９１】
活性化されたＣ18（ＰＥＧ8）オリゴマー（２８）の合成
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル（２３）。単分散テトラエチレングリコール（１９．４ｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の油にＮａＯＨの溶液（４．０ｍＬ中の４．０ｇ）を添加し、この反応混合液を１５分間攪拌した。塩化ベンジル（３．５４ｍＬ，３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を１００℃へ加熱し、一晩攪拌した。この反応混合液を室温へ冷却し、飽和ＮａＣｌ（２５０ｍＬ）により希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（２×２００ｍＬ）により洗浄した。有機層を結合し、飽和ＮａＣｌにより洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、クロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）にかけると、黄色油として単分散化合物２３（６．２１ｇ、収率７１％）が得られた。
【０１９２】
テトラエチレングリコールモノベンジルエーテルのメシレート（２４）。ＣＨ2Ｃｌ2の溶液（２０ｍＬ）へ単分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル２３（６．２１ｇ，２２ｍｍｏｌ）を添加し、氷浴中で０℃に冷却した。その後、トリエチルアミン（３．２ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を０℃で１５分間攪拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（２ｍＬ）中に溶解させたメタンスルホニルクロリド（１．７ｍＬ，２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合液を０℃で３０分間攪拌し、氷浴を除去し、この反応液を室温でさらに２時間攪拌した。粗反応混合液をセライト（８０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2で洗浄）に通して濾過し、その後、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、５％のＮａＨＣＯ3（２×１００ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（１００ｍＬ）を用いて洗浄し、ＭｇＳ０4で乾燥させた。結果として生じた黄色油は、活性炭素（１０ｇ）を含有するシリカパッド上でクロマトグラフィーにかけて透明な油として単分散化合物２４（７．１０ｇ，収率８９％）が得られた。
【０１９３】
オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル（２５）。水素化ナトリウム（０．４３ｇ，１８ｍｍｏｌ）を含有するテトラヒドロフラン溶液（１４０ｍＬ）にテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の単分散テトラエチレングリコール（３．５ｇ，１８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下法で添加し、この反応混合液を１時間攪拌した。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解させた単分散テトラエチレングリコールモノベンジルエーテル２４（６．０ｇ，１６．５ｍｍｏｌ）のメシレートを滴下法で添加し、この反応混合液を一晩攪拌した。粗反応混合液をセライト（２５０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2により洗浄）に通して濾過し、濾液をＨ2Ｏで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。結果として生じた油をクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル／メタノール、１０：１）にかけ、さらにクロマトグラフィー（シリカ、クロロホルム／メタノール、２５：１）にかけて透明な油として単分散化合物２５を得た（２．６２ｇ，収率３４％）。
【０１９４】
ステアレート−ＰＥＧ8−ベンジル（２６）の合成。単分散オクタエチレングリコールモノベンジルエーテル２５（０．９９８ｇ，２．０７ｍｍｏｌ）およびピリジン（１６３．９ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）の撹拌混合液へベンゼン中の単分散ステアロイルクロリド（６２７．７ｍｇ，２．０７ｍｍｏｌ）へ添加した。この反応混合液を一晩（１８時間）攪拌した。翌日、この反応混合液を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方で乾燥させ、濃縮させて、真空により乾燥させた。その後、粗生成物は、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用するフラッシュシリカゲル・カラム上でクロマトグラフィーにかけた。生成物を含有するフラクションを混合し、濃縮し、真空により乾燥させて単分散化合物２６を得た。
【０１９５】
ステアレート−ＰＥＧ8−ベンジルの水素添加分解。単分散ステアレート−ＰＥＧ8−Ｂｚｌ２６のメタノール溶液（０．８５４ｇ，１．１３８ｍｍｏｌ）に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（パラジウム，活性炭素上で１０重量％）を添加した。この反応混合液を水素下で一晩（１８時間）攪拌した。その後、この溶液を濾過し、濃縮し、１０％メタノール／９０％クロロホルムを使用したフラッシュカラム・クロマトグラフィーにより精製し、Ｒt＝０．６のフラクションを収集し、濃縮し、乾燥させて単分散の酸２７を得た。
【０１９６】
Ｃ18（ＰＥＧ8）オリゴマーの活性化。単分散ステアレート−ＰＥＧ８オリゴマー２７の２段階活性化を上述の実施例４においてステアレート−ＰＥＧ6について記載した通りに実施し、単分散活性化されたＣ18（ＰＥＧ8）オリゴマー２８を得た。
【実施例６】
【０１９７】
活性化されたトリエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
２０％のホスゲン（１００ｍＬ，約１８．７ｇ，１８９ｍｍｏｌのホスゲン）を含有するトルエンの溶液をＮ2大気下で０℃に冷却した。単分散ｍＴＥＧ（トリエチレングリコール、モノメチルエーテル、７．８ｇ，４７．５ｍｍｏｌ）を２５ｍＬの無水酢酸エチル中に溶解させ、冷却したホスゲン溶液に添加した。この混合液を０℃で１時間攪拌し、室温へ加温するに任せ、その後さらに２時間半攪拌した。残留しているホスゲン、酢酸エチルおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散ｍＴＥＧクロロホルメートを残した。
【０１９８】
単分散ｎＴＥＧクロロホルメートを５０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、これにＴＥＡ（トリエチルアミン，６．６２ｍＬ，４７．５ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，５．８ｇ，５０．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温の乾燥大気下で２０時間撹拌すると、その間に大量の白色沈降物が生じた。この混合液を濾過してこの沈降物を除去し、真空中で濃縮した。残留油をジクロロメタン中に取り出し、冷脱イオン水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そして食塩液で１回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4の上方で乾燥させ、濾過し、濃縮して透明な浅黄色油として単分散の標題化合物を得た。必要であれば、さらに溶離剤としてＥｔＯＡｃを使用したシリカゲル上でのフラッシュカラム・クロマトグラフィーにより精製することができる。
【実施例７】
【０１９９】
活性化されたパルミテート−ＴＥＧオリゴマーの合成
単分散パルミチン酸無水物（５ｇ；１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、室温で撹拌した。この撹拌溶液に、３モル過剰のピリジンを添加し、さらに単分散トリエチレングリコール（１．４ｍＬ）を添加した。この反応混合液を１時間撹拌した（反応の進行は、ＴＬＣ；酢酸エチル−クロロホルム；３：７により監視した）。反応の終了時にＴＨＦを除去し、生成物を１０％のＨ2ＳＯ4酸と混合し、酢酸エチルを用いて抽出した（３×３０ｍＬ）。結合抽出物は、水、食塩液を用いて連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ4の上方を通して乾燥させ、蒸発させて単分散のパルミテート−ＴＥＧオリゴマーを得た。
【０２００】
ＤＭＦ（〜１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３ｍｍｏｌ）の溶液を１０ｍＬの無水ＤＭＦ中の単分散パルミテート−ＴＥＧオリゴマー（１ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら添加した。水素化ナトリウム（３ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に緩徐に添加した。この反応混合液を数時間（例えば、５時間）攪拌した。単分散の活性化された標題化合物オリゴマーを沈降させるためにジエチルエーテルを添加した。この工程を３回繰り返し、最後に生成物を乾燥させた。
【実施例８】
【０２０１】
活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルオリゴマーの合成
単分散の活性化されたヘキサエチレングリコールモノメチルエーテルは、上記の実施例１４に記載の単分散トリエチレングリコールと同様に調製した。トルエン溶液中の２０％ホスゲン（３５ｍＬ，６．６６ｇ，６７．４ｍｍｏｌのホスゲン）は氷／塩水浴中のＮ2大気下で冷却した。単分散ヘキサエチレングリコール（１．８５ｍＬ，２．０ｇ，６．７４ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水ＥｔＯＡｃ中へ溶解させ、シリンジによりホスゲン溶液へ添加した。この反応混合液を１時間氷浴中で撹拌し続け、除去し、さらに室温で２．５時間撹拌した。ホスゲン、ＥｔＯＡｃおよびトルエンを真空蒸留により除去して、透明な油性残留物として単分散のメチルヘキサエチレングリコールクロロホルメートを残した。
【０２０２】
この単分散クロロホルメートを２０ｍＬの無水ジクロロメタン中に溶解させ、乾燥した不活性大気下に置いた。トリエチルアミン（０．９４ｍＬ，０．６８ｇ，６．７ｍｍｏｌ）およびその後にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，０．８２ｇ，７．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合液を室温で１８時間撹拌した。この混合液をシリカゲルに通して濾過して白色沈降物を除去し、真空中で濃縮した。残留物をジクロロメタン中に取り出し、冷水で２回、１ＮのＨＣｌで２回、そして食塩液で１回洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュカラム・クロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ）により最終精製して活性化単分散ヘキサエチレンモノメチルエーテルを得た。
【実施例９】
【０２０３】
活性化されたヘプタエチレングリコールモノメチルエーテルの合成
８−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，６−ジオキサオクタン（２９）。無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の単分散トリエチレングリコールモノメチルエーテル分子（４．００ｍＬ，４．１９ｇ，２５．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２６ｍＬ，３．０９ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）を氷浴中で冷やし、窒素大気下に置いた。無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のメタンスルホニルクロリド（２．３７ｍＬ，３．５１ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）の溶液を添加用漏斗から滴下法で添加した。塩化物添加の完了１０分後に、反応混合液を氷浴から除去し、室温になるに任せた。この混合物をさらに１時間撹拌し、その時点のＴＬＣ（溶離剤として１５％のＭｅＯＨとともにＣＨＣ１3を使用して）は、残留しているトリエチレングリコールモノメチルエーテルを示さなかった。
【０２０４】
反応混合液を別の７５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3、水および食塩液で連続的に洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4の上方に通して乾燥させ、濾過し、濃縮して透明な油として化合物２９の単分散混合物を得た（５．３１ｇ，８６％）。
【０２０５】
ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル（３０）。無水ＤＭＦ（２５．７ｍＬ）中の単分散テトラエチレングリコール（３５．７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｎ2下で鉱油中のＮａＨの６０％分散液を少量ずつ添加し、この混合液を室温で１時間撹拌した。結果として生じたテトラエチレングリコールのナトリウム塩に無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中の単分散メシレート２９（２３．３６）の溶液を１回で添加し、その混合液を室温で３．５時間撹拌した。この反応の進行は、ＴＬＣ（１２％のＣＨ3ＯＨ−ＣＨＣ１3）により監視した。この反応混合液は等量の１ＮのＨＣｌにより希釈し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）により抽出して廃棄した。水溶液の抽出およびワークアップにより単分散のヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル３０が得られた（収率８２〜８４％）。油；Ｒｆ  ０．４６（メタノール：クロロホルム＝３：２２）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ15Ｈ32Ｏ8の計算値３４０．２１（Ｍ+＋１）、実測値３４１．２。
【０２０６】
へプタエチレングリコールモノメチルエーテルの活性化。活性化されたヘプタエチレングリコールモノメチルエーテルを得るためにトリエチレングリコールモノメチルエーテルを活性化するために上述の実施例６で使用された方法に類似する方法により単分散ヘプタエチレングリコールモノメチルエーテル３０を活性化した。
【実施例１０】
【０２０７】
活性化されたデカエチレングリコールモノメチルエーテル（３３）の合成
２０−メトキシ−１−（メチルスルホニル）オキシ−３，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサエイコサン（３１）。単分散化合物３１は、上記の実施例９において２９について記載したように化合物３０およびメタンスルホニルクロリドから定量的収率で油として入手した；Ｒｆ  ０．４（酢酸エチル：アセトニトリル＝１：５）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ17Ｈ37Ｏ10に対する計算値４３３．２１（Ｍ+＋１）、実測値４３３．４６９。
【０２０８】
デカエチレングリコールモノメチルエーテル（３２）。単分散化合物３２は上記の実施例１７において記載した方法を使用して化合物３１および単分散トリエチレングリコールから調製した；Ｒｆ  ０．４１（メタノール：クロロホルム＝６：１０）；ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ21Ｈ44Ｏ11に対する計算値４７２．２９（Ｍ+＋１）、実測値４７２．２９。
【０２０９】
デカエチレングリコールモノメチルエーテルの活性化。活性化デカエチレングリコールモノメチルエーテル３３を得るために、トリエチレングリコールモノメチルエーテルを活性化するために上述の実施例６で使用された方法に類似する方法により単分散デカエチレングリコールモノメチルエーテル３２を活性化した。
【実施例１１】
【０２１０】
ＬｙｓB29−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
組み換えプロインスリンＩのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンＩ（分子量１０，６４２ダルトン）は、ブラジルのベロホリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から入手した。プロインスリンＩの２．３２×１０-3ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３２４μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルへプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）の溶液（９．３０×１０-3ｍｍｏｌ）を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えたとき、３．５４ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。生成物の混合液であるオリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩのＨＰＬＣプロファイルは図１１に示した。
【０２１１】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩの酵素反応混液による開裂。実施例１（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。実施例１１（ａ）からの生成物混合物（０．４２４μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（５．９７×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１．５８ｍＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の参照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。インスリン（１０％）およびＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（８４％）を入手した（図１１〜１３）。
【実施例１２】
【０２１２】
組み換えプロインスリンＩのオリゴマーコンジュゲーション生成物の単離
逆相ＨＰＬＣを使用して、実施例１１（ａ）に記載したコンジュゲーション反応から入手した生成物混合物からの主要生成物を単離した。ＨＰＬＣカラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）へペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるＣ１８固定相を充填し、その後ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、５ｍＬ／ｍｉｎの流量で送達した７２％の移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ2Ｏ）および２８％の移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）を含む混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の生成物混合物の溶液を逆相カラムへ適用し、生成物を分離し、溶離液は以下のように溶離用緩衝液のアセトニトリル成分（移動相Ｂ）を増加させた勾配を使用して溶出した。
６０分間にわたり２８％〜３０％移動相Ｂ、その後
３０分間にわたり３０％〜３２％移動相Ｂ、その後
４０分間にわたり３２％〜３６％移動相Ｂ。
フラクションを収集し、ＨＰＬＣにより個別に分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。４種の生成物（モノコンジュゲート−Ａ（「プロインスリンＩモノコンジュゲート−Ａ」）、モノコンジュゲート−Ｂ（「プロインスリンＩモノコンジュゲート−Ｂ」）、ジコンジュゲート（「プロインスリンＩジコンジュゲート」）およびトリコンジュゲート（「プロインスリンＩトリコンジュゲート」）の１つを含有する共通フラクションをプールし、溶媒をロータリーエバポレーションにより除去した。ＨＰＬＣ（図１４）および質量スペクトル分析を使用して、各単離物の同一性および純度を決定した。
【実施例１３】
【０２１３】
組み換えプロインスリンの単離されたコンジュゲート（Ｉ）の酵素反応混液による開裂
実施例１２に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート（プロインスリンＩモノＡ、モノＢ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、分析用ＨＰＬＣを使用して結果として生じた溶液のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１ｍｍｏｌ）は、その後トリプシン（１．３９×１０-3ｍｍｏｌ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０-4ｍｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応からの生成物混合液を処理し、ＨＰＬＣによって分析した。標準物質の保持時間に比較したＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析を使用して、各生成物の同一性および純度を決定した（表１）。
【０２１４】
【表１】
2005502353.tif 000028
【実施例１４】
【０２１５】
プロインスリンＩの単離されたコンジュゲートのトリプシンによる開裂
実施例１２に記載した方法を使用して単離した各コンジュゲート（プロインスリンＩモノＡ、モノＢ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。各コンジュゲート（３００ｍｍｏｌ）は、その後トリプシン（１ｍｍｏｌ）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。この反応の生成物を単離し、ＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析によって分析して同一性を決定した。予測される生成物は表２に示すインスリン（Ａｒｇ31）またはＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
【０２１６】
【表２】
2005502353.tif 000029
【実施例１５】
【０２１７】
トリプシン開裂生成物混合物のカルボキシペプチダーゼＢ開裂
ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中のＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ31）（３００ｍｍｏｌ）（実施例１４から）を含有する反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。各反応の予測生成物は表３に示す。
【０２１８】
【表３】
2005502353.tif 000030
【実施例１６】
【０２１９】
ＬｙｓB29−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）組み換えプロインスリンＩＩのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンＩＩ（分子量１１，１３３ダルトン）は日本の茨城県所在の伊藤ハム食品社から入手した。組み換えプロインスリンＩＩは、各々にリジン残基が欠けているリーダーペプチドおよびＣペプチドを有していた。組み換えプロインスリンＩＩの２．５５×１０-3ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３５５μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後、アセトニトリル中の活性化メチルポリエチレングリコール（（ＰＥＧn）−ヘキシルオリゴマー）（ｎ＝７±３またはｎ＝７）の溶液（５．１０×１０-3ｍｍｏｌ）を添加した。反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えた後、３．７ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩＩ生成物混合物のＨＰＬＣプロファイルは図２に示した。
【０２２０】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩＩの酵素反応混液による開裂。
実施例１６（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。生成物混合物（０．３９９μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（５．５７×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．８２×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の５５０μＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の参照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。こうしてインスリン（２３％）およびＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧn−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（６０％）およびその他（１７％）を入手した（図９〜１０）。
【実施例１７】
【０２２１】
組み換えプロインスリンＩＩのオリゴマーコンジュゲーションの生成物の単離
実施例１６（ａ）に記載したコンジュゲーション反応からの各主要生成物は逆相ＨＰＬＣを使用して単離した。ポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるＣ１８固定相をカラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）に充填し、その後、ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、５ｍＬ／ｍｉｎの流量で送達した７５％移動相Ａ（０．１％のトリフルオロ酢酸を含むＨ2Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）を含む混合物である溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例１６（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、溶離緩衝液の組成が２５％移動相Ｂから３５％移動相Ｂへ１２０間にわたり変更された勾配溶離を使用して溶出した。収集したフラクションをＨＰＬＣにより個別に分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。各生成物の共通フラクション（プロインスリンＩＩモノコンジュゲート（「プロインスリンＩＩモノ」）およびジコンジュゲート（「プロインスリンＩＩジ」）をプールし、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。各生成物の同一性および純度はＨＰＬＣおよび質量スペクトル分析によって決定した（図２〜４）。
【実施例１８】
【０２２２】
組み換えプロインスリンＩＩの単離されたコンジュゲートの酵素反応混液による開裂
実施例１７に記載した方法を使用して単離した各プロインスリンＩＩコンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、その溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。コンジュゲート（０．１２７μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（１．７７×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（５．７７×１０-5μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の２５０μＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物の単離およびその後の標準物質に対するＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析による同定によれば、インスリンまたはＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表４に示す。
【０２２３】
【表４】
2005502353.tif 000031
【実施例１９】
【０２２４】
プロインスリンＩＩの単離されたコンジュゲートのトリプシン開裂
実施例１７からの各コンジュゲート（プロインスリンＩＩモノ、ジ、またはトリ）をｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。各コンジュゲート（０．１２７μｍｏｌ）はその後トリプシン（４．２３×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の２５０μＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物の単離は、その後ＨＰＬＣ保持時間および質量スペクトル分析によって同定し、インスリン（Ａｒｇ31）またはＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ31）が反応において産生したことがわかった。各反応の生成物および収率は表５に示す。
【０２２５】
【表５】
2005502353.tif 000032
【実施例２０】
【０２２６】
トリプシン開裂混合物のカルボキシペプチダーゼＢによる開裂
実施例１９からのＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ31）（３．１０×１０-5ｍｍｏｌ）の反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１．０３×１０-7）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。処理後、反応の生成物をＨＰＬＣによって分析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。プロインスリンＩＩモノコンジュゲートの反応からインスリン（２３％）およびＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧｎ−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（６０％）（図５、７〜８）を得た。プロインスリンＩＩジコンジュゲート反応の予測生成物は表６に示す。
【０２２７】
【表６】
2005502353.tif 000033
【実施例２１】
【０２２８】
ＬｙｓB29−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの調製
（ａ）天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーション。天然ヒトプロインスリン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）（３．２０×１０-4ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。この溶液に４５μＬのトリエチルアミンを添加した。この溶液を５分間撹拌し、その後アセトニトリル中の活性化ＰＥＧ７−ヘキシルオリゴマー（６．４×１０-4ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。プロインスリンが消費される（またはプロインスリンの濃度がもはや減少しない）ことをＨＰＬＣ解析が示すように反応が進行した後、この反応は０．５ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。
【０２２９】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした天然プロインスリンの酵素反応混液による開裂。実施例２１（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１モル等量）は、その後トリプシン（１．３９×１０-3ｍｍｏｌ等量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０-4モル等量）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。この反応の生成物混合液を処理し、ＨＰＬＣによって分析した。同一性を決定するためには保持時間（標準物質に対して）および質量スペクトル分析を使用した。反応の予測生成物はインスリンおよびＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
【実施例２２】
【０２３０】
天然ヒトプロインスリンのコンジュゲーションの生成物の単離
実施例１１（ａ）に記載したコンジュゲーション反応から入手した各主要生成物は逆相ＨＰＬＣを使用して単離した。カラム（内径１．０ｃｍ×長さ２５ｃｍ）へポリペプチドとタンパク質を分離するために有用であることが知られている市販で入手できるＣ１８固定相を充填し、その後ＨＰＬＣシステム内へ組み込んだ。このシステムを、７５％移動相Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むＨ2Ｏ）および２５％移動相Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）の混合物を含む溶離緩衝液を用いて平衡化した。実施例２１（ａ）からの生成物混合物のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液をカラムに適用し、主要生成物を分離し、アセトニトリルのパーセンテージが１２０間にわたり２５％〜３５％へ変更させられた勾配溶離を使用して溶出した。フラクションを収集し、ＨＰＬＣにより分析して、その中に含まれる生成物の同一性および純度を決定した。各生成物の共通フラクションをプールし、そしてロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。各生成物の同一性および純度はＨＰＬＣおよび質量分析法によって決定した。予測生成物は、２つのヒトプロインスリンモノコンジュゲート、１つのヒトプロインスリンジコンジュゲートおよび１つのヒトプロインスリントリコンジュゲートからなる。
【実施例２３】
【０２３１】
天然ヒトプロインスリンの単離されたコンジュゲートの酵素反応混液による開裂
実施例２２に記載した方法を使用して入手した各コンジュゲートをｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）は、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。粗混合物（１モル等量）はその後トリプシン（１．３９×１０-3モル等量）およびカルボキシペプチダーゼＢ（４．５６×１０-4モル等量）と反応させた。３０分後、この反応をアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。同一性を決定するためには保持時間（標準物質に対して）および質量スペクトル分析を使用した。反応の予測生成物はインスリンまたはＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
【実施例２４】
【０２３２】
天然ヒトプロインスリンの単離されたコンジュゲートのトリプシン開裂
実施例２２に記載の入手した各コンジュゲートをｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解させ、結果として生じた溶液をＨＰＬＣにより解析してその中のポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。コンジュゲート（３００モル等量）はその後トリプシン（１モル等量）と反応させた。２０分後、この反応はアセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。この反応の予測生成物はインスリン（Ａｒｇ31）またはＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ31）である。
【実施例２５】
【０２３３】
トリプシン開裂混合物のカルボキシペプチダーゼＢ開裂
実施例２４からのＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリン（Ａｒｇ31）（３００ｍｍｏｌ）の反応混合液のアリコートを除去した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢ（１ｍｍｏｌ）をこの反応混合液に添加した。この反応を１５時間持続させ、アセトニトリル中の１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。これらの生成物を処理し、ＨＰＬＣにより解析した。同一性を決定するためには保持時間および質量スペクトル分析を使用した。予測生成物はインスリンまたはＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンである。
【実施例２６】
【０２３４】
ＬｙｓB29−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンの最適化された調製
実施例１１からの実験データの分析は、ＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンおよびＬｙｓ−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣペプチドは（ａ）プロインスリン原料上に存在する全リジン残基のε−アミノ基をアシル化するステップと、および（ｂ）結果として生じる完全なオリゴマーをコンジュゲートしたプロインスリンをトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢから作製した酵素反応混液を用いて開裂させるステップと、によって高い収率および純度で入手できることを指示した。この仮説の実験による確証は下記の通りに実施した。
【０２３５】
（ａ）組み換えプロインスリンＩのコンジュゲーション。組み換えプロインスリンＩ（分子量１０，６４２ダルトン）はブラジルのベロホリゾンテ所在のＢｉｏｂｒａｓ社から入手した。プロインスリンＩの２．３２×１０-3ｍｍｏｌ部分を１０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この溶液に３２４μＬのトリエチルアミンを添加した。結果として生じた溶液を５分間撹拌し、その後アセトニトリル中の活性化メチルへプタエチレングリコール（（ＰＥＧ７）−ヘキシルオリゴマー）（４〜６モル等量；全プロインスリンＩからトリコンジュゲートへ転換させるために十分な）の溶液を添加した。コンジュゲーション（アシル化）反応の進行はＨＰＬＣにより監視した。反応が完了したように見えたとき（すなわち非共役プロインスリンＩがＨＰＬＣにより観察されない）、３．５４ｍＬの５％トリフルオロ酢酸水溶液の添加により反応を停止させた。この反応混合液をその後処理し、ｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中へ移した。生成物混合液であるオリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩのＨＰＬＣプロファイルはトリコンジュゲート（共役した全ＬｙｓおよびＮ末端）およびジコンジュゲートだけに対応するピークを示すと予想される。
【０２３６】
（ｂ）オリゴマーをコンジュゲートした組み換えプロインスリンＩの酵素反応混液による開裂。
実施例１６（ａ）からの生成物混合液のＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のアリコートをＨＰＬＣにより解析してポリペプチド濃度を決定した。トリプシンの溶液（ＴＰＣＫ処理；ウシ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。カルボキシペプチダーゼＢの溶液（ブタ膵臓から）はｐＨ７．６の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で調製した。実施例１６（ａ）からの生成物混合物（０．４２４μｍｏｌ／ｍＬ）はその後トリプシン（５．９７×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）およびカルボキシペプチダーゼＢ（１．９３×１０-4μｍｏｌ／ｍＬ）と反応させた。３０分後、この反応はアセトニトリル中の１．５８ｍＬの１％トリフルオロ酢酸の添加により停止させた。主要生成物はＨＰＬＣ保持時間（既知の参照標準物質の保持時間に比較して）および質量スペクトル分析により同定した。存在する唯一のインスリンコンジュゲートであるＬｙｓB29−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたインスリンは、ほぼ９５％収率で入手されると予測される。Ｌｙｓ1−ヘキシル−ＰＥＧ７−オリゴマーをコンジュゲートしたＣペプチドもまた、近い量的収率で入手した。
【０２３７】
好ましい実施形態を参照しながら本発明について説明してきた。これらの実施形態は本発明を限定するものではなく、具体的に説明する目的で記載した。本発明の範囲は、上述の請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】リーダーペプチドを有するプロインスリンを使用してＢ−２９Ｌｙｓ修飾インスリンを調製するための合成経路の実施形態を示す図である。
【図２】プロインスリンＩＩコンジュゲーションのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図３】精製プロインスリンＩＩモノコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図４】精製プロインスリンＩＩジコンジュゲートの質量スペクトルを示す図である。
【図５】インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７モノコンジュゲート産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図６】プロインスリンＩＩモノコンジュゲートのトリプシンによる開裂産物の質量スペクトルを示す図である。
【図７】カルボキシペプチダーゼＢによるインスリン（Ａｒｇ31）−ヘキシル−ＰＥＧ７開裂のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図８】Ｂ−２９アシル化インスリン（Ａｒｇ31）−ヘキシル−ＰＥＧ７コンジュゲートのカルボキシペプチダーゼによる開裂産物の質量スペクトルを示す図である。
【図９】カルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液により開裂されたプロインスリンＩＩモノコンジュゲートからのインスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７（多分散）の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１０】プロインスリンＩＩを介したインスリン−ヘキシル−ＰＥＧｎ（多分散）の質量スペクトルを示す図である。
【図１１】プロインスリンＩを介したＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１２】プロインスリンＩを介したＢ−２９アシル化インスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７の質量スペクトルを示す図である。
【図１３】プロインスリンＩコンジュゲート混合物由来のインスリン（副産物）の質量スペクトルを示す図である。
【図１４】プロインスリンＩモノコンジュゲートＡ、プロインスリンＩモノコンジュゲートＢおよびプロインスリンＩジコンジュゲートのＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１５】プロインスリンＩジコンジュゲートとカルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液との反応からのインスリン−ヘキシル−ＰＥＧ７モノコンジュゲートの産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１６】プロインスリンＩモノコンジュゲートＡとカルボキシペプチダーゼＢおよびトリプシンの酵素反応混液との反応からのインスリン（副産物）の産生のＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005502353.tif 000172
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