(57)【要約】  本発明は、医療および商業用途のために、生物工学的方法および化学合成を用いて製造される、抗生物質として有効なペプチドに関する。その抗生物質として有効なペプチドは、薬品／動物薬、食品添加物として、または化粧品、医療用製品および必要品の微生物汚染を防ぐ保存料として、適当な生薬処方に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌活性を有し、かつアミノ酸配列
【化１】
2005532784.tif 000010
を含むペプチド、[式中
R1はアミノ基 (NH2)、アミノ酸、またはアミノ酸を最大１０個含むペプチドを表し、R2はCOOH、CONH2、アミノ酸またはアミノ酸を最大１０個含      むペプチドを表し;
Zは芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはチロシン(Y)を表し;
X1はアルギニン(R)または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W)を表し;
X2はセリン(S)、塩基性アミノ酸(R、K)、好ましくはアルギニン(R)、または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W)を表し;
X3はスレオニン(T)、疎水性アミノ酸(I、V、A、L)またはアルギニン(R)を表し;
X4はアスパラギン酸(D)、プロリン(P)、塩基性アミノ酸(K、R)、好ましくはアルギニン(R)、または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W)を表し;および
Bは塩基性アミノ酸(K、R)を表す]、
並びに、抗菌活性を有するその誘導体および／または断片、特にアミド化、アシル化、アセチル化、アルキル化、硫酸化、リン酸化、ハロゲン化、特に芳香族アミノ酸側鎖でハロゲン化、グリコシル化、酸化、エステル化またはラクトン形成で修飾、および／または環化した誘導体および／または断片。      
【請求項２】
下記の配列のうち１つを有する、請求項1に記載のペプチド:
R1−ZIX3X1BX3RX2ADBRX2BALB−R2;
R1−ZIX3X1BX3RX2APBRX2BALB−R2;
R1−ZIX3X1BX3RX2ABBRX2BALB−R2;
R1−ZIX3X1BX3RX2AZBRX2BALB−R2; または
R1−ZIX3X1BX3RX2TZBRX2BALB−R2;
[式中、X3は疎水性アミノ酸(I、V)またはアルギニン(R)を表し、かつR1、R2、Z、X1、X2、Bは請求項1に記載した通りの意味を有する]、
並びに、抗菌活性を有するその誘導体および／または断片、特にアミド化、アシル化、アセチル化、アルキル化、硫酸化、リン酸化、ハロゲン化、特に芳香族アミノ酸側鎖でハロゲン化、グリコシル化、酸化、エステル化またはラクトン形成で修飾、および／または環化した誘導体および／または断片。
【請求項３】
下記のアミノ酸配列のうち１つを有する、請求項1および／または2に記載のペプチド:
【化２】
2005532784.tif 000011
2005532784.tif 000012
2005532784.tif 000013
2005532784.tif 000014
並びに、抗菌活性を有するその誘導体および／または断片、特にアミド化、アシル化、アセチル化、アルキル化、硫酸化、リン酸化、ハロゲン化、特に芳香族アミノ酸側鎖でハロゲン化、グリコシル化、酸化、エステル化またはラクトン形成で修飾、および／または環化した誘導体および／または断片。      
【請求項４】
１個以上のアミノ酸が、対応するD-アミノ酸、請求項1から3のいずれかに記載のペプチドのretro、inversoまたはretro-inversoペプチドで置換された、請求項1から3のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
１個以上の修飾されたペプチド結合によって、特に逆転ペプチド結合によってまたはエステル結合によって特徴づけられる、請求項1から4のいずれかに記載のペプチドのペプチドミメティック。
【請求項６】
請求項1から5の少なくとも１つに記載のペプチドの、高分子、好ましくはポリソルベートとの複合体。
【請求項７】
請求項1から4のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
請求項7に記載の核酸を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項９】
請求項1から6に記載のペプチド、請求項7に記載の核酸、または請求項8に記載のベクターまたはプラスミドの少なくとも１つを含む薬物。
【請求項１０】
少なくともさらに１つの抗生物質として有効な成分を含む、請求項9に記載の薬物。
【請求項１１】
前記の抗生物質として有効な成分が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、キノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、グリコペプチド、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン、リコサミド、フルオロキノロンおよびペプチド抗生物質の群に相当する、請求項10に記載の薬物。
【請求項１２】
少なくとも１つの、抗ウイルス剤として、抗寄生虫薬として、および／または抗菌剤として有効な成分を含む、請求項9または10に記載の薬物。
【請求項１３】
輸液、軟膏、錠剤、スプレー、または「徐放性」カプセルとして使用に適した形の、請求項9から12の少なくとも１つに記載の薬物。
【請求項１４】
請求項1から6に記載のペプチド、請求項7に記載の核酸、または請求項8に記載のベクターまたはプラスミドの少なくとも１つを含む診断薬。
【請求項１５】
請求項1から6に記載のペプチドの少なくとも１つを含む食品。
【請求項１６】
請求項1から6に記載の１個以上のペプチドの抗菌剤としての有効量と微生物を接触させる、微生物の増殖を阻害する方法。
【請求項１７】
原核または真核生物における発現によるかまたは化学合成によって、請求項1から6の少なくとも１つに記載のペプチドを調製する方法。
【請求項１８】
微生物によって引き起こされる疾患、ヒトおよび動物の疾患、特に消化管、気道、尿生殖路、外皮およびその付属腺が関与する疾患の治療のために、慢性疾患の治療のために、細菌、真菌、酵母、原生生物、ウイルス、マイコプラズマ、糸状虫および／またはマラリア原虫が原因の誤入微生物定着によって生じる疾患、誤入微生物定着によって生じる感染、炎症、微生物誘導性の腫瘍、微生物によって生じた変性疾患、下痢症、疝痛、口内、腸内、膣内細菌叢の逸脱、敗血症および／またはう蝕の治療のために、薬物を調製するための、請求項1から6の少なくとも１つに記載のペプチドの使用。      
【請求項１９】
飼料ならびに化粧品用の保存料として、細胞培養用の培地および用品の微生物汚染を防ぐための保存料として、殺菌剤として、医療用製品での微生物コロニー形成の防止のために、衣服および宝石といった必要品での微生物コロニー形成の防止のために、特にビール生産およびヨーグルト生産において工業的発酵過程の助剤として、請求項1から6の少なくとも１つに記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
天然に存在するペプチドは抗生物質として有効である可能性があることが知られている。ゆえに、WO 97/35877は牛乳由来の抗生物質ペプチドの存在および精製を記載し、そしてPCT/EP 01/06518はヒト胎盤抽出物由来およびウシ胸腺抽出物由来の抗菌ペプチドの回収およびその応用を記載する。
【０００２】
ウシ胸腺抽出物から精製されるペプチドの１つがボリシンである(PCT/EP 01/06518, SEQ ID No. 5)。ボリシンは17個のアミノ酸を含むウシミトコンドリアプロテオリピドの断片であり、低塩濃度栄養培地中で病原微生物の増殖を阻害する。
【０００３】
さまざまな条件下で特に高い比活性を有する、ボリシンから作られるペプチドを提供することが本発明の目的である。生理的塩濃度の環境で微生物の増殖を阻害し、同時に溶血作用が可能な限り低いペプチドを提供することもまた本発明の目的である。
【０００４】
驚くべきことに、この目的は下記の配列のペプチドを提供することによって達成される：
【化１】
2005532784.tif 000002
式中、
R1はアミノ基 (NH2)、アミノ酸、またはアミノ酸を最大１０個含むペプチドを表し、R2はCOOH、CONH2、アミノ酸またはアミノ酸を最大１０個含むペプチドを表し;
Zは芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはチロシン(Y)または芳香族部分でモノ-またはポリハロゲン化したアミノ酸、好ましくはチロシン(Y)を表し;
X1はアルギニン(R)または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W)または芳香族部分でモノ-またはポリハロゲン化したアミノ酸、好ましくはトリプトファンを表し;
X2はセリン(S)、塩基性アミノ酸(R、K)、好ましくはアルギニン(R)、または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W)または芳香族部分でモノ-またはポリハロゲン化したアミノ酸、好ましくはトリプトファンを表し;
X3はスレオニン(T)、疎水性アミノ酸(I、V、A、L)またはアルギニン(R)を表し;
X4はアスパラギン酸(D)、プロリン(P)、塩基性アミノ酸(K、R)、好ましくはアルギニン(R)、または芳香族アミノ酸(W、Y、F)、好ましくはトリプトファン(W) または芳香族部分でモノ-またはポリハロゲン化したアミノ酸、好ましくはトリプトファンを表し;および
Bは塩基性アミノ酸(K、R)を表す。
【０００５】
本発明はまた、本発明によるペプチドの抗菌活性を有する誘導体および／または断片、特にアミド化、アシル化、アセチル化、アルキル化、硫酸化、リン酸化、ハロゲン化、特に芳香族アミノ酸側鎖でハロゲン化、グリコシル化、酸化、エステル化またはラクトン形成で修飾、および／または環化した誘導体および／または断片に関する。ハロゲン化ペプチドは好ましくはアミノ酸側鎖の芳香族残基でハロゲン化している。アミノ酸は１文字コードで表している。
【０００６】
好ましくは、本発明によるペプチドは下記の配列を有する:
【化２】
2005532784.tif 000003
【０００７】
式中、X3は疎水性アミノ酸(I、V)またはアルギニン(R)を表し、かつR1、R2、Z、X1、X2、Bは上記の通りの意味を有する。本発明の好ましいペプチドを表1に列記する。本発明はまた、抗菌活性を有するその誘導体および／または断片、特にアミド化、アシル化、アセチル化、アルキル化、硫酸化、リン酸化、ハロゲン化、グリコシル化、酸化、エステル化またはラクトン形成で修飾、および／または環化した誘導体および／または断片に関する。
【０００８】
本発明は、エステル化またはラクトン形成で修飾されたペプチド、および活性化ポリオキシアルキレングリコール、即ち、ポリオキシアルキレングリコールと、たとえば、脂肪酸との複合体と遊離アミノ基で反応させた本発明によるペプチドを含む。好ましくは、炭素原子１２から１８個の鎖長を有する脂肪酸および２から１００の鎖長を有するポリオキシアルキレングリコールとしてのポリオキシエチレンである。より好ましくは、活性化ポリソルベートエステルおよびその誘導体である。ペプチドの薬理的性質を改善するため、ペプチド複合分子が調製される。
【０００９】
上述の誘導体に加えて、ペプチドは、対応するD-アミノ酸を天然のL-アミノ酸の代わりに、ならびにイミノ酸、およびたとえばヒドロキシリジン、ホモセリン、オルニチンのような稀なアミノ酸も含みうる。さらに、本発明はretro、inversoおよびretro-inversoペプチドを含む。「Retroペプチド」は逆転したアミノ酸配列を有する本発明によるペプチドを意味し、「inversoペプチド」はD-アミノ酸から成る本発明によるペプチドを意味し、「retro-inversoペプチド」はD-アミノ酸から形成された逆転したアミノ酸配列を有するそれらのペプチドを意味する。
【００１０】
本発明はまた、本発明によるペプチドのペプチドミメティックに関する。これらは、たとえば逆転ペプチド結合によるかまたはエステル結合による、１個以上のペプチド結合の修飾によって特徴づけられる。
【００１１】
本発明によるボリシン アナログは、抗生物質 活性を有する陽イオン性ペプチドである。ボリシンアナログは少なくとも9個、最大で37個のアミノ酸残基、好ましくは20個以下のアミノ酸残基を含む。
【００１２】
本発明によるボリシンのペプチドアナログは明らかに抗菌活性の上昇を示す。本発明に記載されるペプチドはまた、生理的塩濃度を有する栄養培地中で病原菌の増殖を効果的に阻害し、したがって、天然に存在するボリシンとは対照的に、幅広い用途に用いることができる。抗生物質耐性を有するヒト病原菌もまた低いペプチド濃度で死滅する。
【００１３】
断片としては、特にN-末端でまたはC末端で短縮したペプチドとして、しかしまた個々のアミノ酸が好ましくはアミノ酸の10%以下欠失したペプチドとして用いることができる。本発明は、これらの断片が抗菌性を有する場合は、その断片に関する。断片の「抗菌性」とは断片が親ペプチドの活性の少なくとも50%を有することを意味し、すなわち、多くても２倍の阻止濃度を要する。使用した被験微生物は、どちらの微生物に対してペプチドがより良い活性を示すかに応じて、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）または大腸菌(Escherichia coli)のいずれかである。微生物は下記の通りに特徴づけられる:
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）: グラム陽性球菌、ATCC 25923;
大腸菌(Escherichia coli): グラム陰性桿菌、ATCC 25922。
【００１４】
本発明はまた、本発明によるペプチドをコードする核酸、およびそのような核酸を含むベクターまたはプラスミドを含む。
【００１５】
本発明はまた、本発明の１つ以上のペプチドを含む薬物に関する。
【００１６】
本発明によるペプチドは、誤入微生物定着によって生じる疾患、たとえば感染、炎症、微生物誘導性の腫瘍、微生物によって生じた変性疾患、下痢症、疝痛、口内、腸内、膣内細菌叢の逸脱、う蝕、敗血症、トキシックショック症状の治療に適している。誤入微生物定着は、細菌、真菌、酵母、原生生物、ウイルス、マイコプラズマ、糸状虫および／またはマラリア原虫によって生じる可能性がある。本発明によるペプチドはヒトおよび動物の急性および慢性疾患の両方に用いることができる。
【００１７】
本発明によるペプチドは好ましくは医薬処方に用いられる。その医薬処方は１つ以上の本発明によるペプチド、またはそのペプチドの生理学的に受容可能な塩を含む。医薬処方は、たとえば、薬物の溶解性、安定性または無菌性に寄与するかまたは体内への取り込みの効率を上げる、医薬として通常の助剤を含むことができる。 さらに、たとえば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、キノロン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、マクロライド、グリコペプチド、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン、リコサミド、フルオロキノロンおよびペプチド抗生物質の群から、他の抗生物質を含むことができる。
【００１８】
当該ペプチドを含む薬物の剤形および組成は投与経路に依存する。好ましくは、ペプチドが分解されない状態で標的部位に到達する、生薬処方および投与形態が選択される。ペプチド は経腸的に、非経口的に、鼻腔内に、経口的に、および吸入によって投与することができる。好ましくは、ペプチドは溶液としてまたは使用直前に溶解する凍結乾燥物として注射製剤と包装される。ペプチドは、たとえば、静脈注射、腹腔内注射または埋め込み、皮下注射または埋め込み、皮内注射、筋肉内注射または埋め込み、くも膜下注射、吸入(エアロゾル、スプレー)または局所投与(たとえば、クリーム、軟膏、点眼薬、点耳薬、シャンプー)することができる。 ボリシンアナログは注射、滴下薬、スプレー、錠剤、坐剤、クリーム、軟膏、ゲルなどとして局所投与することができる。ボーラスとしてまたはある期間にわたって繰り返し投与を行うことが可能である。
【００１９】
投与するペプチドの用量は特定の誘導体の適用および用途に依存する。好ましくは、本発明によるペプチドは0.1〜100 mg/体重のkgの量で使用する。
【００２０】
本発明はまた、本発明によるペプチドまたは核酸を含む診断薬に関する。
【００２１】
本発明によるペプチドはまた、食品への添加物として使用することができる。それらは、特に発酵およびその他の細菌による過程によって製造される食品について、食品の製造において助剤として用いることができる。本発明による調製物は天然保存料である。本発明によるペプチドの用途のさらなる可能性は、微生物が望ましくないあらゆる状況のための殺菌剤としての使用である。その例は、医療用製品、エアフィルターおよび衣服および宝石といった必要品の、表面殺菌のための、またはコーティングとしての用途である。「医療用製品」とは、たとえばインプラント、人工器官、ステント、チューブ、カニューレ、カテーテル、合成血管系、人工心臓弁、および針といった、患者に用いられるすべての医療用補助器具を意味する。「医療用製品」の語はさらに、血液または血液成分の保存容器、ならびに器官送付用の容器などを含む。さらに、当該ペプチドを水処理に、またはシャンプーまたは石けんの成分として、食品添加物、化粧品保存料、細胞培養培地などの保存のための添加剤として、および植物保護剤として用いることが可能である。
【実施例】
【００２２】
ボリシンアナログの化学合成
ボリシンアナログのペプチド合成は固相Fmoc法の標準的方法に基づく。自動合成には、ABI 433 A合成装置(Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)を用いた。Fmoc-Lys(boc) Wang樹脂を固相として用いた。ペプチド合成の間、各アミノ酸が高収量で組み込まれたことを確実にするため、個々の結合段階を検査した。ペプチドは94%トリフルオロ酢酸(TFA)、3%エタンジチオール、および3%の水で樹脂から切断し、続いてクロマトグラフィーによって精製した。
【００２３】
クロマトグラフィー精製には、逆相(RP)HPLCを適用した。調製用RP C18カラム(PrepPAK 500 C18, 47x300mm)を固相とし、アセトニトリルを溶離液とした(移動相溶媒A: 0.07% TFA水溶液;移動相溶媒B: 80%アセトニトリル/0.07% TFA水溶液)。流速40ml/minで、グラジエント法（溶離液中に移動相溶媒Bを毎分0.5%増加）によって固相からペプチドを溶出し、波長215nmで検出した。
【００２４】
合成ペプチドは質量分析によって分析した。ペプチドの純度はキャピラリーゾーンゲル電気泳動および分析逆相HPLCによって検査した(純度(95%)。ペプチドのアミノ酸 配列は自動化エドマン分解によって確認した。
【００２５】
本発明による合成ボリシンアナログのアミノ酸配列は表1に１文字コードを用いて示す。
【００２６】
【表１】
2005532784.tif 000004
2005532784.tif 000005
【００２７】
ボリシンアナログの抗菌有効性の検討
本発明のボリシンアナログを、さまざまな生物学的試験によって、抗生物質治療薬としての適合性について検討した。このように、化学的に合成されたペプチドを、その抗菌有効性について、３株のグラム陽性および３株のグラム陰性細菌株に対して、ならびに酵母に対して検討した。
【００２８】
下記の微生物を使用した:
グラム陽性: スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus） ATCC 25923
エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis) ATCC 51299 (バンコマイシン耐性)
スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae) DSM 11865 (ペニシリン耐性)
グラム陰性: 大腸菌(Escherichia coli) ATCC 25922
シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027
クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) ATCC 10031
酵母:       カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ATCC 10231
【００２９】
ボリシンアナログの抗生物質活性は、最小阻止濃度を決定することによって調べた。アナログの最小阻止濃度は、18(2時間の培養時間後に微生物の増殖を完全に阻止するのに必要な最低のペプチド濃度を表す。この方法によって、ペプチドの潜在的抗菌力について定量的結果を得ることができる。これらの試験は、化学的に合成されたペプチド(請求項1から3に従ったペプチド配列)を用いて液体培地での希釈試験を適用して、NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards、米国臨床検査標準委員会)によって編まれた勧告(M7-A3)から類推して実施された。別に記載の無い限り、NCCLS勧告に従ってMueller Hinton Brothを試験培地として用いた。表2はペプチドアナログの抗菌活性を示し、親ペプチドであるボリシンと比較して明らかに改善されている。最小阻止濃度は[μg/ml]で示す。
【００３０】
【表２】
2005532784.tif 000006
2005532784.tif 000007
*試験培地: 半分の濃度のミューラ・ヒントン・ブロス(Mueller Hinton Broth)
**試験培地: 3g/l トリプティック・ソイ・ブロス(Tryptic Soy Broth) (低イオン強度培地)
【００３１】
括弧内の値は、記載のペプチド濃度での微生物の増殖の75%阻止を表す。完全な増殖阻止は この場合には達成できなかった。最小阻止濃度を決定するためには、下記の微生物を使用した:
1.スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus） ATCC 25923
2.エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis) ATCC 51299 (バンコマイシン耐性)
3.スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae) DSM 11865 (ペニシリン耐性)
4.大腸菌(Escherichia coli) ATCC 25922
5.シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027
6.クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae) ATCC 10031
7.カンジダ・アルビカンス(Candida albicans) ATCC 10231
【００３２】
本発明によるペプチドは効果的に、グラム陽性および グラム陰性細菌の両方ならびに酵母の生育を阻害した。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）, 大腸菌(Escherichia coli), シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)およびKlebsiella pneumoniaeといったヒト病原体は、効果的に死滅させられた。特に重要なことは、たとえばスタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae) (ペニシリン耐性)および エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis) (バンコマイシン耐性)といった、既存の抗生物質耐性を有する細菌の非常に有効な増殖阻害である。ボリシン アナログの作用の可能性は、親ペプチドのボリシンの可能性よりも多面的に優れている。
【００３３】
高塩濃度での有効性の検討
これらの実験についてはまた、グラム陽性およびグラム陰性 微生物 (微生物 1-6)に対するペプチドの最小阻止濃度を決定した。生理的濃度 (塩化ナトリウム150mM) に塩を添加したトリプティック・ソイ・ブロス(Tryptic Soy Broth) (3g/l) を試験培地として用いた。表3は塩を含む培地中でのペプチド アナログの抗菌活性を示し、 また親ペプチドのボリシンの抗菌活性よりも有意に改善されている。
【００３４】
【表３】
2005532784.tif 000008
括弧内の値は、記載のペプチド濃度での微生物の増殖の75%阻止を表す。完全な増殖阻止は この場合には達成できなかった。
【００３５】
ボリシンアナログの細胞毒性活性の検討
被験微生物の７菌株のうち少なくとも１つに対して良好な抗菌活性を有するボリシンアナログ(MIC ( 37.5 μg/ml)を、細胞毒性活性を調べるのに選んだ。
【００３６】
多くの場合には、細胞膜に付着し膜透過化させる抗菌ペプチドの能力は、これらの物質の作用機構とみなされている。細菌の膜が選択的に傷害される一方、宿主の細胞は影響されないままであることが望ましい。真核細胞に対するペプチドの細胞毒性作用の試験のための簡単なモデルとして、溶血、したがって赤血球に対するペプチドの毒性作用を調べる、溶血試験が用いられる。ペプチドの溶血作用を測定するための手順は、ヘルメルホルストら(Helmerhorst et al.) (Helmerhorst et al., 1999, FEBS Lett. 449: 105-110)から類推して実施した。
【００３７】
赤血球を健常者の含クエン酸全血から遠心分離(1500xg、20℃、10分)によって単離し、試験培地で200倍に希釈した。V字底の96ウェルマイクロタイタープレートにペプチドをさまざまな濃度で添加し、希釈した赤血球懸濁液を加えて37°Cにて1時間インキュベートした。赤血球は続いて遠心分離(1000xg、5分間)によって分離した。放出されたヘモグロビンで着色した上清を、平底の96ウェルマイクロタイタープレートに移し、その吸収を波長(=450nmにてマイクロタイタープレートリーダーで測定した。界面活性剤Tween-20の1%溶液とのインキュベーションを100%溶血の参照値とした。試験培地とだけインキュベートした赤血球を陰性対照とした。
【００３８】
ボリシンアナログの溶血作用はTween-20による完全な溶血を基準として示され、下記の式で計算された:
【数１】
2005532784.tif 000009
【００３９】
287mMグルコースを含むTSB培地を試験培地とした。等張のグルコース濃度は、低張の培地での非特異的溶血を防ぐためである（浸透圧保護）。
【００４０】
本発明によるペプチドは、赤血球に対して溶解作用を示さないかまたは穏やかな作用を示すことが望ましい。「穏やかな溶解作用」とは、抗菌効果のあるペプチド濃度の適用について赤血球の30%未満の溶解を意味する。
【００４１】
図1は、ボリシンアナログが抗菌効果のある濃度で、指摘するほどの溶血を起こさないことを示す(<5%)。高濃度(500μg/ml)でさえ、穏やかな溶解作用だけを証明できた(<30%)。比較のために、抗菌ペプチドMBI-28の溶血作用(Gough et al., 1996, Infect. Immun. 64(12): 4922-7)をプロットした。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ボリシンアナログの濃度と溶血との関係を示す。
【図１】
2005532784.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月5日(2004.8.5)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、非常に有効な抗菌活性を有するペプチド、その調製のための方法、およびその使用に関する。
天然に存在するペプチドは抗生物質として有効である可能性があることが知られている。ゆえに、WO 97/35877は牛乳由来の抗生物質ペプチドの存在および精製を記載し、そしてPCT/EP 01/06518はヒト胎盤抽出物由来およびウシ胸腺抽出物由来の抗菌ペプチドの回収およびその応用を記載する。
【国際調査報告】
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