(57)【要約】物質が結合したチモシンアルファ1（ＴＡ１）生理的に活性な複合体を包含している医薬組成物であり、その物質は前記複合体を患者に投与したときに、患者の血清中のＴＡ１ペプチドの半減期を増加させる。その物質は、非抗原性ポリマーでもよい。本発明の方法において実質的非抗原性ポリマーはＴＡ１ペプチドに結合している。本発明による組成物は、免疫刺激が必要な患者へ投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的に活性な複合体を含む医薬組成物であって、前記複合体を患者に投与した時に患者の血清中でのチモシンアルファ１（ＴＡ１）ペプチドの半減期を増加させる物質に結合されたＴＡ１ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記物質が実質的に非抗原性ポリマーである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ポリマーがPEGである請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記PEGが分子量約２００−３００，０００の範囲内である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記分子量が約５，０００−３５，０００である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記分子量が約２０，０００である請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ポリマーがＴＡ１ペプチドのＮ末端部に結合された請求項２記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＴＡ１がＴＡ１である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
チモシンアルファ１ペプチドに実質的に非抗原性のポリマーを結合することを含む請求項２に係る医薬組成物の製造方法。
【請求項１０】
ポリマーがチモシンアルファ１ペプチドのＮ末端部に結合する請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
ポリマーがPEGである請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
前記PEGが分子量約２００−３００，０００の範囲内である請求項９記載の製造方法。
【請求項１３】
前記分子量が約５，０００−３５，０００である請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
前記分子量が約２０，０００である請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
前記チモシンアルファ１ペプチドがＴＡ１である請求項９記載の製造方法。
【請求項１６】
請求項１記載の医薬組成物を投与する方法あって、免疫を刺激する必要がある患者に免疫刺激有効量の医薬組成物を投与することにより、患者を処置することを含み、該医薬組成物は複合体を患者に投与した時に患者の血清中でのＴＡ１ペプチドの半減期を増加させる物質に結合されたチモシンアルファ１（ＴＡ１）ペプチドを含む生理学的に活性な複合体を含む、請求項１記載の医薬組成物を投与する方法。
【請求項１７】
前記物質が実質的に非抗原性ポリマーである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーがPEGである請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記PEGが分子量約２００−３００，０００の範囲内である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記分子量が約５，０００−３５，０００である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記分子量が約２０，０００である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリマーがＴＡ１ペプチドのＮ末端部に結合された請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＡ１ペプチドがＴＡ１である請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チモシンアルファ１ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
チモシンアルファ１（時々ＴＡ１と呼ばれる）は、免疫調節特性を伴う２８アミノ酸の胸腺ペプチドであり、元々、仔ウシ胸腺のチモシンフラクション５から単離した天然産物と同一である。その生物学的効果は、Ｔリンパ球機能の増強を包含し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の調整、インターフェロン−γ産生の刺激、Ｔリンパ球やＮＫ細胞の活性化の誘発及びチモポイエシス（thymopoiesis)の刺激を包含する。チモシンアルファ１はＭＨＣクラスＩの発現を上方に調整するものとして示されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本技術分野において、ＴＡ１及び関連するペプチドを含有する改善された組成物の必要性は存続している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明による医薬組成物は、物質が結合したチモシンアルファ1（ＴＡ１）生理的に活性な複合体を含み、該物質とは前記複合体を患者に投与した時、患者の血清中のＴＡ１ペプチドの半減期を増加させるものである。その物質は、実質的非抗原性のポリマーであってもよい。本発明の方法により、実質的非抗原性ポリマーは、ＴＡ１ペプチドに結合する。本願発明による組成物は、免疫刺激が必要な患者へ投与される。
【０００５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、天然に生成されたＴＡ１と同じく合成ＴＡ１及び組み替え体ＴＡ１を包含する実用的なＴＡ１ペプチドであり、該合成ＴＡ１及び組み替え体ＴＡ１は、天然に生成するＴＡ１のアミノ酸配列、実質的に同様なアミノ酸配列、もしくはその要約された配列形態を有し、また、代用、欠損、延長、置換または他の方法で修飾されたＴＡ１と実質的に同様の生物活性を有する配列を有する生物的活性類似体、例えばそれはＴＡ１ペプチドと十分な相同性を有し、ＴＡ１と実質的に同じ活性を伴って、同じ活性経路で機能する。
【０００６】
本願発明による医薬組成物は、ある物質が結合したＴＡ１ペプチドを含む生理的に活性な複合体を含み、前記複合体が患者に投与された場合、患者の血清中のＴＡ１ペプチドの半減期を増加させる。その物質は、非抗原性ポリマーである。適切なポリマーは、約２００〜３００，０００の範囲の分子量を有し、好ましくは約１，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有し、最も好ましくは約５，０００〜３５，０００の範囲の分子量を有し、約２０，０００の分子量が特に好ましい。
【０００７】
また好ましくは、室温で水溶性であるポリマー物質も含まれる。該ポリマーとして非限定的に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシド、そのコポリマー、およびブロックコポリマーが水溶性を維持するという条件でそのブロックコポリマーが包含される。実質的な非抗原性ポリマーの中で、末端単エチルポリエチレングリコール（mPEG's）のような単−活性化アルキル末端ポリアルキレン酸化物（PAO'S)が意図される。mPEGに加え、C１−４アルキル末端ポリマーも有用でありうる。
【０００８】
もう一方のPAOベースのポリマーとして、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマーなどの有効な非抗原性物質が意図される。当業者は、先に挙げたものは単に例示であること、および、ここで記載する性質を有する全てのポリマー物質が意図されていることは理解するであろう。本発明の趣旨として、「有効な非抗原性」とは、すべての物質が、本技術分野で、非毒性であり、かつホ乳類における感知可能な免疫反応を誘発しないものと解されることを意図する。
【０００９】
ポリマーは直鎖であってもよく、分枝していてもよい。ポリエチレングリコール（PEG）が特に好ましい。
【００１０】
ポリマーはいかなる適切な方法によってＴＡ１ペプチドと結合し得る。ポリマーをＴＡ１ペプチドに結合するための典型的な方法は、米国特許No.4179337、4766106、4917888、5122614および6177074、また、PCT国際公開番号No.WO95/13090に開示されており、これらを全て引用して本願明細書の一部とする。チモシンアルファ１は、５つの離れたポリマーのアミノ基結合可能な部位を有し、ポリマーは１もしくは複数の部位で結合し得る。ひとつの実施形態として、分子量２０，０００のPEGがＴＡ１のＮ-末端に結合されて、PEG-TA1を作り上げる。これは、不溶性ポリマーの支持(support)ビーズ上で、本技術分野で既知の固相ペプチド合成により、適切な側鎖保護基を伴って作られる。ビーズ上のＴＡ１ペプチドの合成が終了した後に、保護されたＴＡ１はビーズから切り離され、Ｎ−末端がフリーのアミノ基の状態になる。これが分子量２０，０００のPEGと反応する。それから、側鎖保護基が取り除かれて、今回の発明の具体的態様による複合体を作る。
【００１１】
本発明による組成物は、免疫刺激を必要とする患者の治療に使用することが可能である。そのような患者には、癌患者、肝炎Ｂ型または肝炎Ｃ型ウィルスに感染した患者を包含している肝炎患者、ＨＩＶ患者等も包含し得る。本発明による生理的活性複合体の免疫刺激有効量を患者に投与する方法も伴っている。
【００１２】
ＴＡ１ペプチドの単離、特性および使用は、例えば、米国特許No.4079127、米国特許No.4353821、米国特許No.4148788および米国特許No.4116951に記載されている。ＴＡ１の免疫刺激有効量は、日常業務の投与測定(dose-titration)実験により決定することが可能である。ＴＡ１は16mg/kg体重/日の高い用量を投与した場合に、ヒトに安全であることが見出されている。好ましいＴＡ１ペプチドの服用量は0.001mg/kg体重/日から10mg/kg体重/日の範囲内であり、典型的な投与量としては0.02 mg/kg体重/日である。１つの実施態様として、免疫刺激有効量は、約0.1-10mgの範囲内の量にあるＴＡ１を包含する服用量である。好ましい服用量は約1-5mgの範囲内の量にあるＴＡ１を包含する。上記服用量は、組成物にＴＡ１ペプチドのみが存在した場合を反映しており、ＴＡ１に結合されたポリマーの重さは反映していない。
【００１３】
好ましい実施態様として、ＴＡ１ペプチドが、注射のための水、生理的濃度である食塩水または類似物のような医薬上許容可能な液体担体に存在する。
【００１４】
皮下注射されたＴＡ１は、血清半減期が約２時間のみである。しかしながら、本発明によるＴＡ１ペプチドへのポリマー複合体は、実質的に血清ペプチドの半減期を増加する。
【実施例】
【００１５】
本発明は、さらに以下の実施例により例証されるが、制限されるものではない。
（実施例１）
ラットに5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)(5-FU)を、免疫抑制を生じさせるために注射し、その後、チモシンアルファ１（200ug/kg)、またはPEGを結合した（pegylate)チモシンアルファ１（20,000MW PEG-Thymosin alpha 1、これはチモシン分子の200ug/kgの質量を基礎として等価である。）、を注射して処置し、免疫パラメーターへの効果を決定した。(1)5-FUによる抑制後、ＮＫ活性の復帰が、チモシンアルファ１よりもPEG-チモシンアルファ１を注射された動物で大きかった。そして(2)活性化Ｔ-細胞CD25+の復帰がチモシンアルファ１よりもPEG-チモシンアルファ１を注射された動物で大きかった。
【００１６】
以下の実施例は、これに制限されるものではないが、ＴＡ１の継続的な注入が、外科的に移植した浸透性の小型ポンプを使用した癌治療モデルにおいて評価され、一定の流量速度で５日間液体を送った。ラットは免疫抑制を生じさせるために５-フルオロウラシル(5-FU)を与えられ、そしてその後、８日後にＴＡ１を注射または注入(infused)した（5-FU投与後の白血球(white cell)数が最低値である。）。処置群、８匹のラットはそれぞれ、対照群（食塩水を小型ポンプで注入）、低投与量ＴＡ１（0.2mg/Kg 皮下注射；小型ポンプ注入無し）；高投与量ＴＡ１（3.5mg/Kg 皮下注射；小型ポンプ注入無し）、および高注入量ＴＡ１(小型ポンプによる3.5mg/Kgの注入）。免疫パラメーターは、基線と5-FU処置８日後（ＴＡ１処置後１日目）で、またＴＡ１処置後５、１２、２０、および２７日後でも決定された。
【００１７】
(実施例２）
１０週齢ラット、体重250-300ｇ、免疫抑制のために100mg/kgの５−フルオロウラシルを受けている。5-FU処置後８日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=8)
・対照群（食塩水を小型ポンプで注入）
・0.2mg/Kg皮下注射による低投与量ＴＡ１群（小型ポンプの注入無し）
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量ＴＡ１群（小型ポンプの注入無し）
・3.5mg/Kg・5日を小型ポンプで供給される、継続的注入ＴＡ１群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後８日（ＴＡ１処置後１日目）で、またＴＡ１処置後５、１２、２０、および２７日後でも決定された。
【００１８】
評価としてＮＫ活性（PBMCに4時間曝したYAC-1細胞から放出されるLDH）、総白血球数（モノクローナル抗体で特異性を実証した後、理学的細胞蛍光パラメーター(physical cytofluorimetric parameters)で判断される。）、総リンパ球(フローサイトメトリーによるCD3+）および活性化リンパ球（フローサイトメトリーによるCD25+CD3+）が含まれる。
【００１９】
ＮＫ活性は、基線で42±5％で、5-FU後は9±2%まで抑制された。低投与量ＴＡ１処置では、ＮＫ活性が１２日後に有意に回復し、一方で高投与量ＴＡ１は５日のみで有意に回復した。しかしながら、ＴＡ１の継続的注入では５日で２倍の応答があり、32±4%であった（対応する注射による高投与量では16±2、注射による低投与量では12±3、および対照群では11±1である。)。ＴＡ１の継続的な注入により処置された動物のみが、ＮＫ細胞活性の基線濃度へ完全に回復した。
【００２０】
総白血球数は（これは形態学により決定されるが）、14,590±2,710  細胞数／ｍｍ３から5-FU処置後に2,597±582に低下した。注射による低もしくは高投与量ＴＡ１で処置された動物は、非処置動物と比較して、すぐに増加して回復する傾向にあった。ＴＡ１の継続的注入されたものは、統計学的に有意性を与え、わずか５日後に基線濃度まで完全に回復した。
【００２１】
活性化したリンパ球（CD3+CD25+)は、5-FU処置で有意に減少しなかった（65±21細胞数／ｍｍ３から37±10細胞数／ｍｍ３）。しかしながら、１２日および２０日後の高投与量ＴＡ１で処置したものは劇的に増加した（それぞれ297±136および321±75細胞数／ｍｍ３、166±70および212±77）。継続的注入によりＴＡ１を与えられたものは更に増加して422±105および446±73細胞数／ｍｍ３であった。
【００２２】
(実施例３）
１０週齢ラット、体重250-300ｇ、免疫抑制のために100mg/kgの5-FUを受けている。5-FU処置後８日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=15)
・対照群（食塩水を小型ポンプで注入）
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量ＴＡ１群（小型ポンプの注入無し）
・3.5mg/Kg/5日 を小型ポンプで供給される、継続的注入ＴＡ１群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後８日（ＴＡ１処置後１日目）で、またＴＡ１処置後５および１４日後でも決定された。
【００２３】
評価として、総白血球数（モノクローナル抗体で特異性を実証した後、理学的細胞蛍光パラメーターで判断される。）、顆粒球（FITC抗ラット顆粒球HIS-48を用いたフローサイトメトリー）、総リンパ球(フローサイトメトリーによるCD3+）、ヘルパーＴ−細胞（フローサイトメトリーによるCD4+）、活性化リンパ球（フローサイトメトリーによるCD25+CD3+）、および血清中のサイトカイン発現（ELISAによるIL-2およびIFN-γ）が含まれる。
【００２４】
実施例２で、ＴＡ１の継続的注入が、皮下注射した場合と比較して総白血球数において劇的に効果があることを確認後、どのタイプの白血球が増加の原因となっているかを確認することは興味深いものである。顆粒球は、継続的注入により供給されるＴＡ１により最も影響される白血球細胞のサブセット (subset)と思われる。顆粒級数は5-FU処置後に4,485±1,116から1,249±432に減少した。（ＴＡ１を注射したときは9,924±3,218、もしくはＴＡ１がないときは6,954±1,519であるのと比較して）継続的注入ＴＡ１で処置した場合は、５日間で14,652±2,463に増加し、この濃度は１４日後でもなお最も高かった。
【００２５】
興味深いことに、この研究で、注射（3.5mg/Kg）およびさらに継続的注入（3.5mg/Kg）によってＴＡ１を提供されたある動物がいた。この動物は、有害事象もなく、健康かつ活発であるばかりではなく、ＴＡ１の測定された免疫パラメーターへの効果もまた他の動物のものよりも非常に大きなものであった。顆粒球に関して、５日後で他の注入した動物で平均値が14,652±2,463であるのと比較して、この研究動物は19,376細胞数／ｍｍ３と大きく増加した。
【００２６】
総リンパ球数は5-FU処置により劇的に減少した（10,904±1,973細胞数／ｍｍ３から1,740±560）。ＴＡ１処置後、基線濃度まで回復した。これは、ＴＡ１が継続的注入で供給されてわずか５日後に起こるが、ＴＡ１を注射したときは１４日後まで認められなかった。
【００２７】
注射および注入の双方でＴＡ１を提供された動物は、他の動物とあまり相違のないリンパ球濃度であった（平均値が9,644±961であるのと比較して、9,765細胞数／ｍｍ３）。しかし、活性化されたこれらのリンパ球の割合は、大きく増加した（注入によってＴＡ１を提供した動物では、428±89もしくはリンパ球の4%であり、注入に続きＴＡ１の高投与量注射の動物では、976もしくはリンパ球の10％である）。
【００２８】
ヘルパーＴ−リンパ球（CD3+CD4+)もまた5-FU処置で、5,411±1,084細胞数／ｍｍ３から1,710±449まで減少した。これらのＴ−細胞の減少した濃度は、実験の14日間ＴＡ１処置なしでは増加しなかった。顆粒球で見られた結果とは対照的に、そこでは、継続的注入により提供されたＴＡ１が注射により提供されたＴＡ１よりも細胞数の回復に関し優れていたが、どちらの投与方法でも、提供されたＴＡ１は、Ｔ−ヘルパー細胞の濃度を基線まで十分に回復させた。
【００２９】
注射もしくは注入どちらでも提供されたＴＡ１はCD4ヘルパーＴ−リンパ球を増加させるので、この増加がヘルパーＴ−細胞のＴｈ１もしくはＴｈ２サブセットへの影響であるのかを確認することは興味深い。以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのデータは、ＴＡ１がＴｈ１サブセットを増加させることを立証しており、この研究で同じ効果が見られた。継続的注入によりＴＡ１を提供すると、皮下注射で見られるよりも、Ｔｈ１サイトカインＩＬ−２の血清濃度において、その増加が非常に大きい（ＴＡ１注射で21±16pg/ml、対照動物で10±16と比較して、ＴＡ1の継続的注入14日後で42±7pg/ml）。
【００３０】
ＴＡ１による処置はＴｈ１サイトカインＩＬ−２の増加を導き、そしてもう１つのＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γも増加する。処置後５日までその濃度は低いが、皮下注射ＴＡ１は、ＩＦＮ-γのより高い血清濃度にする。処置後１４日までに、継続的注入で提供されたＴＡ１を伴う動物が最も濃度が高い（注射で10±1pg/ml、対照で8±8と比較して、14±5pg/ml）。
【００３１】
注射および継続的注入の双方でＴＡ１を受け入れた動物で、測定したＴｈ１サイトカインの双方の濃度で非常に大きく、特にＩＦＮ−γは、１４日後、他の動物で14±5pg/mlと比較して、45pg/mlであった。
【００３２】
結論
血液循環（circulation）における複数日にわたって一定のＴＡ１濃度の維持が測定した免疫効果を増加する。
この投薬量の規制が顆粒球において、予期せぬ肯定的な効果を導き、ＴＡ１注射後にみられる単球においても同様に肯定的な効果を導く。
有害事象は、通常の１５倍の用量で観察されなかった。（そして、ある動物では通常の３０倍以上でも観察されなかった）。
【国際調査報告】
2005511553.tif 000002
2005511553.tif 000003