(57)【要約】細胞外基質分解酵素を保有する細胞を含む細胞調製物およびかかる細胞の移植効率を改良する細胞調製物の使用方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞移植前に幹細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記幹細胞を必要とする受容者に前記幹細胞を移植する工程とを含む、幹細胞移植の改良方法。
【請求項２】
前記幹細胞は自家起源である請求項１の方法。
【請求項３】
前記幹細胞は同種異系起源である請求項１の方法。
【請求項４】
前記移植は静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で行われる請求項１の方法。
【請求項５】
前記移植は骨髄注射を介して行われる請求項１の方法。
【請求項６】
前記幹細胞は成体由来の幹細胞である請求項１の方法。
【請求項７】
前記幹細胞は胚由来の幹細胞である請求項１の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は遺伝子改変幹細胞である請求項１の方法。
【請求項９】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項１０】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項９の方法。
【請求項１１】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項１の方法。
【請求項１２】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であるか、又は細胞によって活性形態に活性化可能である請求項１の方法。
【請求項１３】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項１の方法。
【請求項１４】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ヘパラナーゼは成熟活性ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項１３の方法。
【請求項１６】
外因性細胞外基質分解酵素を保有する幹細胞を含む幹細胞調製物。
【請求項１７】
前記幹細胞は自家起源である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項１８】
前記幹細胞は同種異系起源である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項１９】
前記幹細胞は成体由来の幹細胞である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２０】
前記幹細胞は胚由来の幹細胞である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２１】
前記幹細胞は遺伝子改変幹細胞である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２２】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２３】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項２２の幹細胞調製物。
【請求項２４】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２５】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２６】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項１６の幹細胞調製物。
【請求項２７】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項２６の幹細胞調製物。
【請求項２８】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項２６の幹細胞調製物。
【請求項２９】
ＣＤ３４＋前駆細胞移植前にＣＤ３４＋前駆細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記ＣＤ３４＋前駆細胞を必要とする受容者に前記ＣＤ３４＋前駆細胞を移植する工程とを含む、ＣＤ３４＋前駆細胞移植の改良方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は自家起源である請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は同種異系起源である請求項２９の方法。
【請求項３２】
前記移植は静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で行われる請求項２９の方法。
【請求項３３】
前記移植は骨髄注射を介して行われる請求項２９の方法。
【請求項３４】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項２９の方法。
【請求項３５】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は遺伝子改変ＣＤ３４＋前駆細胞である請求項２９の方法。
【請求項３６】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項２９の方法。
【請求項３７】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項２９の方法。
【請求項３９】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項２９の方法。
【請求項４０】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項２９の方法。
【請求項４１】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項４０の方法。
【請求項４３】
外因性細胞外基質分解酵素を保有するＣＤ３４＋前駆細胞を含むＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４４】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は自家起源である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４５】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は同種異系起源である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４６】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４７】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞は遺伝子改変ＣＤ３４＋前駆細胞である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４８】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項４９】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項４８のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５０】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５１】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５２】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項４３のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５３】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項５２のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５４】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項５２のＣＤ３４＋前駆細胞調製物。
【請求項５５】
骨髄間質細胞移植前に骨髄間質細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記骨髄間質細胞を必要とする受容者に前記骨髄間質細胞を移植する工程とを含む、骨髄間質細胞移植の改良方法。
【請求項５６】
前記骨髄間質細胞は自家起源である請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記骨髄間質細胞は同種異系起源である請求項５５の方法。
【請求項５８】
前記移植は静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で行われる請求項５５の方法。
【請求項５９】
前記移植は骨髄注射を介して行われる請求項５５の方法。
【請求項６０】
前記骨髄間質細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項５５の方法。
【請求項６１】
前記骨髄間質細胞は遺伝子改変骨髄間質細胞である請求項５５の方法。
【請求項６２】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項５５の方法。
【請求項６３】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項５５の方法。
【請求項６５】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項５５の方法。
【請求項６６】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項５５の方法。
【請求項６７】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項６６の方法。
【請求項６９】
外因性細胞外基質分解酵素を保有する骨髄間質細胞を含む骨髄間質細胞調製物。
【請求項７０】
前記骨髄間質細胞は自家起源である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７１】
前記骨髄間質細胞は同種異系起源である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７２】
前記骨髄間質細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７３】
前記骨髄間質細胞は遺伝子改変骨髄間質細胞である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７４】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７５】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項７４の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７６】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７７】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７８】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項６９の骨髄間質細胞調製物。
【請求項７９】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項７８の骨髄間質細胞調製物。
【請求項８０】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項７８の骨髄間質細胞調製物。
【請求項８１】
樹状細胞移植前に樹状細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記樹状細胞を必要とする受容者に前記樹状細胞を移植する工程とを含む、樹状細胞移植の改良方法。
【請求項８２】
前記樹状細胞は自家起源である請求項８１の方法。
【請求項８３】
前記樹状細胞は同種異系起源である請求項８１の方法。
【請求項８４】
前記移植は静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で行われる請求項８１の方法。
【請求項８５】
前記移植は骨髄注射を介して行われる請求項８１の方法。
【請求項８６】
前記樹状細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項８１の方法。
【請求項８７】
前記樹状細胞は遺伝子改変樹状細胞である請求項８１の方法。
【請求項８８】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項８１の方法。
【請求項８９】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項８８の方法。
【請求項９０】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項８１の方法。
【請求項９１】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項８１の方法。
【請求項９２】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項８１の方法。
【請求項９３】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項９２の方法。
【請求項９４】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項９２の方法。
【請求項９５】
外因性細胞外基質分解酵素を保有する樹状細胞を含む樹状細胞調製物。
【請求項９６】
前記樹状細胞は自家起源である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項９７】
前記樹状細胞は同種異系起源である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項９８】
前記樹状細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項９９】
前記樹状細胞は遺伝子改変樹状細胞である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項１００】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項１０１】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項１００の樹状細胞調製物。
【請求項１０２】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項１０３】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項１０４】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項９５の樹状細胞調製物。
【請求項１０５】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項１０４の樹状細胞調製物。
【請求項１０６】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項１０４の樹状細胞調製物。
【請求項１０７】
末梢血リンパ球細胞移植前に末梢血リンパ球細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記末梢血リンパ球細胞を必要とする受容者に前記末梢血リンパ球細胞を移植する工程とを含む、末梢血リンパ球細胞移植の改良方法。
【請求項１０８】
前記末梢血リンパ球細胞は自家起源である請求項１０７の方法。
【請求項１０９】
前記末梢血リンパ球細胞は同種異系起源である請求項１０７の方法。
【請求項１１０】
前記移植は静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で行われる請求項１０７の方法。
【請求項１１１】
前記移植は骨髄注射を介して行われる請求項１０７の方法。
【請求項１１２】
前記末梢血リンパ球細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項１０７の方法。
【請求項１１３】
前記末梢血リンパ球細胞は遺伝子改変末梢血リンパ球細胞である請求項１０７の方法。
【請求項１１４】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項１０７の方法。
【請求項１１５】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項１０７の方法。
【請求項１１７】
前記接触の際、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項１０７の方法。
【請求項１１８】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項１０７の方法。
【請求項１１９】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項１１８の方法。
【請求項１２０】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項１１８の方法。
【請求項１２１】
外因性細胞外基質分解酵素を保有する末梢血リンパ球細胞を含む末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２２】
前記末梢血リンパ球細胞は自家起源である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２３】
前記末梢血リンパ球細胞は同種異系起源である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２４】
前記末梢血リンパ球細胞は骨髄、末梢血、または臍帯血由来である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２５】
前記末梢血リンパ球細胞は遺伝子改変末梢血リンパ球細胞である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２６】
前記細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２７】
前記グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項１２６の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２８】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は活性形態である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１２９】
前記接触前に、前記細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１３０】
前記細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである請求項１２１の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１３１】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである請求項１３０の末梢血リンパ球細胞調製物。
【請求項１３２】
前記ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである請求項１３０の末梢血リンパ球細胞調製物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、細胞および遺伝子治療で有用な方法および細胞調製物に関する。
【０００２】
細胞療法は、自家移植または同種異系移植による損傷した組織または生理学的系の生体機能の置換、修復、または増強を目的とした戦略である。ここ数年でこの分野は大きく進展している。骨髄、血液、または臍帯血由来の幹細胞の移植は、現在、種々の血液学的疾患、新生物、および遺伝性疾患のための最適な治療である。混合キメラ現象を誘導するための毒性の低い前処置を使用した移植により、自己免疫疾患への適用が可能となる（Ｔｈｏｍａｓ  ＥＤ、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１９９９、３６（増補４版７）、９５〜１０３）。細胞移植は、血管外遊出、遊走、および浸潤に依存する。
【０００３】
細胞療法および遺伝子治療のための骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の使用
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、種々の間葉細胞に分化する潜在性を有する。過去数年内にＢＭＳＣは、細胞療法および遺伝子治療用の媒介物として調査されている。この細胞は、局所麻酔によって得ることができる骨髄の小吸引物から比較的容易に単離され、これらはまた培養によって比較的容易に拡大され、外因性ポリヌクレオチドで容易にトランスフェクトされる。現在、ＢＭＳＣの治療での使用のためにいくつかの異なる戦略が実施されている。
【０００４】
例えば、変形性関節症の治療では、変形性関節症患者の骨髄からＢＭＳＣを単離し、培養によってＢＭＳＣを拡大し、その後関節への直接注射により患者の関節表面の交換に使用することが提案された。あるいは、ＢＭＳＣを治癒が不十分な骨に移植して、その修復プロセスを増強することができる。
【０００５】
別の例では、遺伝子治療の傘下で、インスリン、エリスロポイエチンなどの分泌治療タンパク質を符号化する遺伝子を患者由来のＢＭＳＣに移入し、これらが骨髄または他の組織に戻り、治療タンパク質を分泌するように細胞を全身に注入することが提案された。さらなる例を本明細書中に記載する。
【０００６】
細胞が骨髄に再集合するだけでなく、骨、肺、およびおそらく軟骨および脳などの他の組織の再集合のために子孫が得られる条件下でＢＭＳＣを全身に注入する。最近の実験により、大量の正常なマウス由来のドナーＢＭＳＣを衰弱した幼若マウスに注入する場合、これらは変異コラーゲン遺伝子を発現するので、正常なドナー細胞は、受容者マウスの骨、軟骨、および脳の細胞の３０％まで置換することが示された。これらの結果は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の変異によって発症する重症骨形成不全症の幼児に認められる骨欠損症の治療のために現在進行中の臨床試験の基本であった（Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ；Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、２７６、７１〜７４）。
【０００７】
以前は致命的と考えられていたリソソーム病の治療および潜在的な治癒は、過去１０年間に現実のものとなっている。骨髄移植により、疾患に起因する酵素欠損の置換法が得られた。ドナー骨髄由来の細胞は、酵素を無期限に提供し続ける。異染性白質萎縮症、副腎脳白質ジストロフィ、ハーラー症候群（ＭＰＳＩ）、マトロー−ラミー症候群（ＭＰＳ  ＶＩ）、ゴーシェ病、およびフコース蓄積症などを罹患した患者のいくつかのスコアが、長期移植後に首尾よく治療されている。
【０００８】
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の発現もまた、正常なドナーからの移植後にこれらの疾患の動物モデルで予防または緩和される。小グリア細胞系は、骨髄移植後の酵素活性の最も可能性の高い媒介物と考えられている。成熟動物またはヒトの小グリア細胞は、新規に移植した骨髄に由来する。Ｋｒｉｖｉｔら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓ．、１９９５、４（４）、３８５〜９２。動物モデルでは、ＢＭＳＣを、レトロウイルスを使用してトランスフェクトし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで高レベルの遺伝子発現を達成することができる（Ｌａｚａｒｕｓ  ＨＭら、Ｂｏｎｅ、Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、１９９５、１６、５５７〜６４）。
【０００９】
ＢＭＳＣが多能性を喪失することなく広範に増殖することができるので（造血幹細胞での所見と対照的）、その遺伝子の操作および拡大により、造血性障害の遺伝子治療を容易にすることができる。
【００１０】
骨髄への間質細胞移植が非常に困難なことは証明されており、免疫不全マウスに移植された間質細胞は、脾臓、肝臓、または肺で生存可能であるが、骨髄では生存できない（Ｌａｚａｒｕｓ  ＨＭら、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌ．、１９９５、１６、５５７〜６４）。
【００１１】
細胞療法および遺伝子治療のためのＣＤ３４＋前駆細胞の使用
重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）マウス変異の発見により、正常および悪性ヒト多能性造血細胞および間葉細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ分析用ツールが得られた。照射ｓｃｉｄマウスへのヒト骨髄細胞、臍帯血、またはＧ−ＣＳＦサイトカイン固定末梢血単核細胞（全てヒト造血幹細胞活性が豊富）の静脈内注射により、マウス受容者にヒト造血系が移植される。
【００１２】
長期再生可能な幹細胞機能の真の基準は、骨髄細胞破壊受容者への移植能力、その造血系への再集合能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの長期多系統造血の維持能力である。ヒト多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）の定量分析は、幹細胞の増殖能力をサイトカインの種々の組み合わせ（クローン培養におけるコロニー形成細胞、敷石状領域形成細胞、および長期培養開始細胞）の存在を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定法に歴史的に制限されているが、これらの代理検定法は幹細胞活性を正確に反映しない。過去３０年間で、多数の研究者がヒト多能性造血幹細胞の発達および分化の定量研究のための宿主として動物の使用を試みてきた。動物モデル、特に小動物モデルの利点は明白である。ｉｎ  ｖｉｖｏでのみ同定することができるヒト細胞の発達、分化、および長期再生能力を、臨床研究を必要としない小動物モデルで確認することができる。
【００１３】
このモデル系により、ヒト多能性幹細胞を詳細に同定および特徴付けることが可能であり、以前にこのモデルを使用して研究された鎌状赤血球貧血およびβサラセミアなどの遺伝子障害の遺伝子治療のｉｎ  ｖｉｖｏ分析に容易に利用可能であることが証明される。アデノシンデアミナーゼ欠損症などの体細胞ベースの障害の遺伝子治療研究へのＮＯＤ−ＳＣＩＤモデルの拡大が最近報告されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法のみの使用では現在不可能な幹細胞導入についてのｉｎ  ｖｉｖｏでの情報が得られることが示されている。造血性キメラの確立のためのこのモデルの移植耐性研究および自己免疫への幹細胞の寄与の調査への拡大により、臨床へ適用するためのさらなる潜在的な達成手段が得られる。Ｄａｌｅ  Ｌら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１９９８、１６、１６６〜７７。
【００１４】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性（全ての造血系細胞およびリンパ系細胞を産生することができる）かつ自己再生性（本質的に生涯前駆細胞を産生することができる）を示すと定義されている。ＨＳＣは、骨髄、移動性末梢血、および臍帯血に由来し得る。ＣＤ３４表面抗原を発現する細胞は、自己再生能力を有する始原幹細胞を含む造血細胞、ならびに骨髄系細胞、赤血球系細胞、およびリンパ系細胞の発達を担う前駆細胞の異種集団で構成される。ＣＤ３４＋幹細胞選択を利用した大規模デバイスが現在市販されている。自家移植では、ＣＤ３４＋選択末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）使用の主な利点は、ＰＢＳＣ調製時の腫瘍細胞の汚染が減少することである。それに対して、同種異系移植では、ＣＤ３４＋選択法を使用して、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）の発生数および重症度を減少させる。ＰＢＳＣ由来の自家選択ＣＤ３４＋細胞の移植により、迅速かつ安定に移植される。同種異系ＣＤ３４＋選択細胞は、ＨＬＡ適合対間の巨大細胞用量効果によって免疫骨髄破壊受容者に首尾よく移植される。ＣＤ３４＋選択を遺伝子治療の標的として、癌免疫治療の樹状細胞供給源として、および自己免疫疾患患者の治療に使用することもできる（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ．ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、１９９９、８４（２）、１６７〜７６）。遺伝的に正常な同種異系ＨＳＣ移植の経験形態により、造血細胞およびリンパ系細胞の多数の遺伝性疾患を治療することができることが証明されている。同種異系ＨＳＣ移植片によって首尾よく治療された障害には、異常血色素症、白血球の産生または機能の欠損、免疫不全、リソソーム貯蔵疾患、およびファンコーニ貧血などの幹細胞欠損が含まれる。同種異系骨髄移植（ＢＭＴ）が免疫学的に制限されるため、自家ＨＳＣを使用した遺伝子治療が考慮されている。移植片拒絶、ＧｖＨＤ疾患、および移植後免疫抑制の必要性などの免疫学的副作用を排除することができる。さらに、現在ＨＳＣ遺伝子を改変する技術が利用可能であるので、ＨＳＣおよびその子孫に新規の好ましい特性（化学療法の骨髄抑制効果に対する耐性またはＨＩＶ−Ｉなどの作用因子による感染に対する耐性など）を操作することが可能である。
【００１５】
ムコ多糖症などのリソソーム貯蔵疾患のマウスモデルを使用して、正常な類似遺伝子性骨髄または遺伝子治癒自家骨髄のいずれかにより多数の異常を改善し、ＣＮＳ疾患発症に対して少なくとも一部の利点を得るために十分な関連酵素レベルを得ることができることが証明されている。
【００１６】
ＨＳＣベースの疾患を標的とした多数の臨床試験が行われているにもかかわらず、最小の効率しか得られず、再構築したＨＳＣ形質導入の失敗が示唆される。遺伝子疾患の治癒のための標識としてＨＳＣの使用は、導入遺伝子産物に対する免疫学的寛容の発生を誘導することができるという点で予期せぬ利点を得ることができる。移植細胞の移植のために骨髄中に「空間をつくる」ためのより一般的に考慮された用途に加えて、遺伝子形質導入ＨＳＣの移植前に望ましくない免疫応答を防止するための細胞減少薬を投与することができる。Ｔリンパ球同時刺激の遮断によって寛容を誘導するより新規の薬剤を、ＨＳＣ移植で適用することもできる。
【００１７】
ＨＳＣ中に導入された遺伝子産物に対する寛容を誘導するための臨床的に適用可能なアプローチは、まもなく確立される。したがって、１０年以上確立されなかったＨＳＣにおける遺伝子導入による造血障害および免疫障害治療の夢は、ゆるやかに現実のものとなりつつある（Ｈａｌｅｎｅ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｈｎ  ＤＢ、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１１、１２５９〜６７）。
【００１８】
癌および単一遺伝子障害の治療のために３００を超える第一相試験および第二相試験が世界中で行われた。最近、これらの試験が、エイズ治療に拡大され、より小さな規模で心血管疾患に拡大された。神経疾患、自己免疫疾患、アレルギー、および組織の再生のための同種異系組織および細胞移植を実行するための新規の遺伝子治療プログラムが進行中である。さらに、遺伝子免疫法と呼ばれる革新的なワクチンデザインのための強力なツールとして遺伝子導入テクノロジーが出現している。したがって、遺伝子導入テクノロジーの潜在的な治療法は膨大である。しかし、遺伝子治療プログラムの有効性には依然として問題がある。さらに、遺伝子送達の安全性についての問題が懸念されており、遺伝性遺伝子障害治療のための子宮遺伝子治療の臨床試験を開始する提案についての論議が始まっている。現在の遺伝子治療研究プログラムの観点は、科学者の冷静な楽観論ならびに癌、遺伝性または後天性単一遺伝子障害、およびエイズ治療のための臨床試験における遺伝子導入テクノロジーのより積極的な役割を明白に示す。実際、遺伝子治療は、実験医学における最も急速に成長している分野の１つである（Ｒｏｍａｎｏ  Ｇら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２０００、１８、１９〜３９）。
【００１９】
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞であり、ナイーブＴ細胞に新規の抗原を提示することができる唯一の細胞である。ＤＣは、臨床免疫治療のための有望な補薬であるプロ抗原提示細胞である。粘着性末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）またはＣＤ３４＋前駆体のいずれかを使用した適切なサイトカインカクテルの存在下で多数のＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＤＣは、特異的免疫応答を誘導することができるリンパ系組織に局在することが好ましい。したがって、これらの細胞は、癌および他の疾患の治療における免疫治療アプローチと潜在的に関連する（Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ  Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９９９、４８（２〜３）、１１８〜２２）。３つの臨床試験により、今までのところ、癌の免疫療法のための有望なツールはＤＣであることが報告されている（Ｅｓｃｈｅ  Ｃ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９９、１（１）、７２〜８１）。ＣＤ３４＋細胞由来樹状細胞の有効な遺伝子の改変により、癌、自己免疫障害、および感染症の免疫治療プロトコールの開発を有意に進歩させることができる（Ｅｖａｎｓ  ＪＴら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００１、８（１８）、１４２７〜３５）。
【００２０】
ヒト新生物細胞は、免疫原性が低いと考えられる。したがって、ヒト腫瘍の免疫治療への臨床アプローチの開発には、有効な補薬の同定が必要である。ＤＣは、抗腫瘍免疫応答を惹起するための天然の補薬として使用することができる特殊な抗原提示細胞系である（Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ  Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９８、４（４）、２６５〜７３）。
【００２１】
末梢血前駆細胞移植を使用した高用量化学療法は、造血悪性疾患および固形腫瘍の両方を罹患した患者のための潜在的に治効のある治療である。しかし、多数の臨床研究に基づいて、高用量化学療法後に多数の患者で最終的に疾患が再発する微小残存病変（ＭＲＤ）が残存している強力な証拠が存在する。したがって、ＭＲＤ治療へのいくつかのアプローチ（樹状細胞ベースの癌ワクチンでの治療および養子免疫療法を含む）が現在評価されている（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ．ら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９９、８７２、３６３〜７１）。
【００２２】
養子免疫療法のための末梢血リンパ球の使用。養子免疫療法は、白血病、癌、自己免疫疾患、またはウイルス疾患の治療のための免疫担当細胞の受動輸送を意味する。ドナーリンパ球の注入を使用した同種異系骨髄移植後の白血病の再発治療の成功によって再び非常に関心が寄せられている。
【００２３】
新生物および非新生物障害の治療のための同種異系骨髄および造血前駆体／幹細胞（樹状細胞）細胞の移植の使用が増加している。リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、７０年代から主に末期固形腫瘍患者で使用されているが、これらの治療の臨床的利点は明白に報告されていない。ＴＩＬはＬＡＫよりも特異的且つ強力な細胞傷害性エフェクターであるが、一部の患者のみ（主に黒色腫および神経膠芽腫などの固形腫瘍）の臨床での使用は潜在的に有用であるとみなすことができる。
【００２４】
末梢血ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の一部のサブセットである接着性ＮＫ細胞（Ａ−ＮＫ）は固形腫瘍組織中で抗腫瘍効果を局在化および誘導する能力を有するが、大部分の循環非接着ＮＫ（ＮＡ−ＮＫ）細胞には不可能である。ＮＡ−ＮＫ細胞は、Ａ−ＮＫ細胞よりも細胞傷害性が高いことが見出されている。したがって、固形腫瘍への移動および腫瘍へのエフェクター細胞の侵入の両方がその表面で発現する細胞接着分子およびエフェクター細胞に関連する酵素活性に関連し得る。Ａ−ＮＫとＮＡ−ＮＫ細胞との相違は、固形腫瘍組織中の腫瘍標的細胞に侵入して死滅させる能力の相違を示し得る（Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ  ＮＬら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、１５４（１）、２８１〜９）。
【００２５】
プロテオグリカン（ＰＧ）
プロテオグリカン（以前はムコ多糖類と呼ばれていた）は、非常に複雑な分子であり、体内のあらゆる組織で見出される。これらは、互いに会合し、コラーゲンおよびエラスチンなどの他の主要な構造成分とも会合している。いくつかのＰＧは、フィブロネクチンおよびラミニンなどの一定の接着タンパク質と相互作用する。ＰＧの多糖の鎖の伸長する性質（グリコサミノグリカン（ＧＡＧ））およびゲル化する能力により、小分子は比較的自由に拡散されるが、巨大分子の通過は制限される。しばしば形成されるその伸長した構造および大きな巨大分子の集合体のため、これらはタンパク質に対して細胞外基質の大部分を占める（Ｍｕｒｒｙ  ＲＫ  ａｎｄ  Ｋｅｅｌｅｙ  ＦＷ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５７章、ページ６６７〜８５）。
【００２６】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）
ＨＳＰＧは、細胞膜および細胞外基質に会合した酸性多糖−タンパク質結合物である。ＨＳＰＧは種々の生体エフェクター分子（細胞外基質成分、成長因子、成長因子結合タンパク質、サイトカイン、細胞接着分子、脂質代謝タンパク質、分解酵素、およびプロテアーゼインヒビターを含む）に強く結合する。これらの相互作用のために、ＨＳＰＧは生物学において動的な役割を果たし、実際、プロテオグリカンのほとんどの機能は、多数の系における細胞−細胞相互作用ならびに細胞の成長および分化に寄与するヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖に帰する。ＨＳは組織の完全および内皮細胞機能を維持する。これは、接着分子として作用し、接着誘導サイトカイン（特に、ケモカイン）を提示し、白血球の局在化および活性化を促進する。ＨＳは、炎症細胞によって分泌された酵素の活性化および作用を調整する。一連の免疫系の間のＨＳ変化の機能は、ＨＳ代謝の変化および発現の相違およびＨＳ結合分子間の競合による。Ｓｅｌｖａｎ  ＲＳら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９６、７９７、１２７〜３９。
【００２７】
ＨＳＰＧはまた、顕著な血管成分である（Ｗｉｇｈｔ  ＴＮら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８９、９、１〜２０）。大きな血管では、ＨＳＰＧのほとんどが血管内膜および中膜に集中しているが、毛細管では、ＨＳＰＧは主に内皮細胞の増殖および移動を補助し、微小管壁の表面構造を安定化させる内皮下基底膜で見出される。ＨＳＰＧがコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外基質（ＥＣＭ）高分子ならびに原形質膜常の異なる結合部位と相互作用する能力により、自己構築およびＥＣＭ成分の不溶性ならびに細胞の接着および運動におけるこのプロテオグリカンの鍵となる役割が示唆される。
【００２８】
ヘパラナーゼ−ＧＡＧ分解酵素
一連のリソソーム加水分解酵素によってＧＡＧの分解を行う。一定のＧＡＧの異化作用に関連する１つの重要な酵素はヘパラナーゼである。これは、特異的な鎖間部位で切断するエンド−β−グルクロニダーゼである。
【００２９】
グリコサミノグリカンの酵素分解は、Ｅｒｎｓｔら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０（５）、３８７〜４４４、１９９５）に概説されている。ＧＡＧ構造の共通の特徴は、ウロン酸およびヘキソサミンからなる反復ジサッカリド単位である。種々のＧＡＧは、ジサッカリド単位の組成ならびに修飾の型およびレベル（Ｃ５エピマー化およびＮまたはＯ硫酸化など）が異なる。硫酸化ＧＡＧには、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびケラタン硫酸が含まれる。ヘパラン硫酸およびヘパリンは、Ｃ５エピマー化、Ｎ硫酸化、およびＯ硫酸化などの修飾を受けるグルコサミンおよびグルクロン酸／イズロン酸の繰り返し単位から構成される。ヘパリンは、ヘパラン硫酸よりも高い修飾レベルによって特徴付けられる。
【００３０】
ＧＡＧを、リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．−）での切断除去または加水分解酵素（ＥＣ  ３．２．１．−）での加水分解除去のいずれかによって酵素的に解重合することができる。しばしば、これらの酵素は、一定の修飾を有するポリサッカリド鎖中の残基に特異的である。ＧＡＧ分解リアーゼは、主に細菌起源である。除去分解では、ウロン酸のＣ５水素が抽出されて不飽和Ｃ４−５結合を形成し、加水分解機構では、プロトンがグリコシドの酸素に供与されてＯ５オキソニウムイオンが作製され、その後水が付加されてオキソニウムイオンが中和され、全ての炭素が飽和する（Ｌｉｎｄｈａｒｔら、１９８６、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１２、１３５〜７５）。反応でウロン酸のカルボキシル基が関連するので、リアーゼは、ウロン酸の非還元部位上の結合のみを切断することができる。それに対して、加水分解は、反復ジサッカリド中の２つの結合のいずれかに特異的であり得る。概説の４１４および４２４頁の表８および１４（Ｅｒｎｓｔら）では、公知のＧＡＧ分解酵素が列挙されている。これらの表は、基質特異性、分解機構、分解結合、生成物の長さ、および作用様式（内部／末端分解）が記載されている。ヘパラナーゼは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸をグルクロン酸とグルコサミドとの間のβ１，４結合で切断するＧＡＧ加水分解酵素と定義されている。ヘパラナーゼは、内部分解酵素であり、生成物の平均的な長さは８〜１２サッカリドである。他の公知のヘパリン／ヘパラン硫酸分解酵素は、末端分解酵素であるβ−グルクロニダーゼ、α−Ｌインデュロニダーゼ、α−Ｎアセチルグルコサミニダーゼであり、それぞれポリサッカリド鎖内の特定の結合を切断し、ジサッカリドを生成する。表８では、著者は、同一の基質および作用機構を共有する２つのヘパラナーゼ（血小板ヘパラナーゼおよび腫瘍ヘパラナーゼ）を列挙している。これら２つは、その後分子レベルで同一であることが見出された（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９９、３４２、３６１〜３６８；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）、７９３〜８０２、１９９９；Ｈｕｌｌｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（７）、８０３〜８０９、１９９９）。
【００３１】
ヘパラナーゼ触媒加水分解によって生成したヘパリンおよびヘパラン硫酸フラグメントを、飽和非還元末端（Ｎ−アセチル−グルコースアミンの誘導体）によって遺伝的に特徴付ける。ヘパラナーゼ加水分解によって生成したヘパリンまたはヘパラン硫酸の還元糖は、炭素４に水酸基を含むので、２３２ｎｍのＵＶ照射で不活化される。
【００３２】
ＴおよびＢリンパ球、血小板、顆粒球、マクロファージ、および肥満細胞の内皮下細胞外基質（ＥＣＭ）との相互作用は、ヘパラナーゼ活性によるヘパラン硫酸分解に関連する。種々の活性化シグナル（例えば、トロンビン、カルシウムイオノフォア、免疫複合体、抗原、およびマイトジェン）に応答して細胞内成分（例えば、リソソーム、特定の粒子）から酵素が放出され、これにより、炎症および細胞免疫における関与が限定されていることが示唆される。Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓ．、１９９２、１２（２）、１１２〜２７。対照的に、種々の腫瘍細胞は、その転移可能性に相関する構成性様式でヘパリンを発現および分泌するようである。Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８、２月、３６（２）、１５７〜６７。白血球による重要な組織侵入プロセスは、血管内皮の管腔表面への接着、血管内皮細胞層の通過、および一連の分泌および／または細胞表面プロテアーゼおよびグリコシダーゼ活性による基礎をなす基底膜および細胞外基質のその後の分解を含む。したがって、ヘパラナーゼによるＨＳの分解により内皮下ＥＣＭを分解することができるので、正常および悪性の血行性細胞の管外遊出の決定的役割を果たし得る（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、Ｉｎｖ．Ｍｅｔａｓｔ．、１９９２、１２、１１２〜２７；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、Ｉｎｖ．Ｍｅｔａｓｔ．、１９９５、１４、２９０〜３０２）。
【００３３】
ヘパラナーゼは細胞の移動および侵入で機能することができるだけでなく、間接的血管新生応答も惹起することができることが以前に証明されていた（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１９９１、１６、２６８〜７１）。ＥＣＭ  ＨＳＰＧは、ｂＦＧＦの天然の貯蔵所を提供する。したがって、活性なｂＦＧＦのＥＣＭ内のその貯蔵所からのヘパラナーゼ媒介放出により、正常および疾患状態における新規の血管新生誘導機構が得られる（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｓｐｅｃｔｓ．、１９９３、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、３２７〜３４３；Ｔｈｕｎｂｅｒｇ  Ｌ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８０、１７７、２０３〜６）。ヘパラナーゼによるヘパラン硫酸の分解により、他のヘパリン結合成長因子ならびにヘパラン硫酸によって基底膜、細胞外基質、および細胞表面に隔離された酵素および血漿タンパク質が放出される。Ｓｅｌｖａｎ  ＲＳら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９６、７９７、１２７〜３９。
【００３４】
動物細胞中でのヘパラナーゼＤＮＡの発現
安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、構成性および安定な様式でヘパラナーゼ遺伝子産物を発現した。タンパク質ブロットおよび活性検定法によって同定したところ、いくつかのＣＨＯ細胞クローンは発現したヘパラナーゼで特に増殖性を示す。ヘパラナーゼＤＮＡは、５４３アミノ酸の巨大タンパク質（推定分子量約６５ｋＤａ）を符号化するが、結果は２つのタンパク質（一方は６０〜６８ｋＤａ、他方は約４５〜５０ｋＤａ）の存在が明白に証明されている。ヘパラナーゼ活性を有する４５〜５０ｋＤａのタンパク質が胎盤（Ｇｏｓｈｅｎ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．、１９９６、２、６７９〜６８４）および血小板（Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｉｓｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９８、３３９、１３４１〜１３５０）から単離されたことが以前に示されている。したがって、６５ｋＤａのタンパク質は宿主細胞中で自然にプロセシングされて４５ｋＤａのタンパク質となるプロ酵素であるようである。ｐ５０は活性があり、ｐ６５タンパク質は活性がないことから、ｐ５０は活性酵素であり、ｐ６５はプロ酵素であることが示唆される。
【００３５】
ヘパラナーゼは、患者への生体物質の導入を補助する
ＰＣＴ／ＵＳ００／０３３５３（本明細書中で参考として援用される）は、外部から添加された場合、ヘパラナーゼは細胞に接着すると教示している。ヘパラナーゼが外部から接着した細胞によりヘパラナーゼが活性形態にプロセシングされる。ヘパラナーゼの活性形態が外部から接着した細胞は、接着したヘパラナーゼがその活性を妨害する条件下でその触媒活性を維持するように周囲の媒体から接着ヘパリンを保護する。ヘパラナーゼの活性形態が外部から接着した細胞（ヘパラナーゼを発現し、ヘパラナーゼが細胞外に存在するかこれを分泌するように遺伝子が改変された細胞または精製ヘパラナーゼが外部から添加された細胞のいずれか）は、外部接着ヘパラナーゼを欠く細胞と比較して、実験動物モデルの体内でさらにより容易に転移可能である。一旦細胞に接着すると、不活性プロヘパラナーゼを、内因性プロテアーゼのその活性形態への改変によってプロセシングすることができる。したがって、ヘパラナーゼを使用して、細胞および組織などの生体物質の患者の体内の所望の位置への導入を補助することができる。
【００３６】
ＰＣＴ／ＩＬ０１／００９５０は、ヘパラナーゼでの移植可能な胚の被覆による胚移植の改良方法を教示している。
【００３７】
ヘパラナーゼ、ヘパラナーゼ遺伝子、およびその使用に関するさらに詳細な記述を、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２５６、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７９５４、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２５５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５４５１、ＰＣＴ／ＩＬ００／００３５８、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１５６４３、ＰＣＴ／ＵＳ００／０３５４２、およびＰＣＴ／ＵＳ９９／０６１８９、ならびに米国特許第６２４２２３８号、同第５９６８８２２号、同第６１５３１８７号、同第６１７７５４５号、および同第６１９０８７５号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に見出すことができる。
【００３８】
非常に限られた場合においてのみヘパラナーゼの細胞移植を改良する効率が試験されており、ヘパラナーゼおよび他のＥＣＭ分解酵素が特定の場合（幹細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、骨髄間質細胞、樹状細胞、および末梢血リンパ球の移植など）で細胞移植を補助するかどうかは同定されていない。
【００３９】
発明の概要
本発明の１つの態様によれば、幹細胞移植前に幹細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記幹細胞を必要とする受容者に前記幹細胞を移植する工程とを含む、幹細胞移植の改良方法が得られる。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、外因性細胞外基質分解酵素を保有する幹細胞を含む幹細胞調製物が得られる。
【００４１】
本発明のさらに別の態様によれば、ＣＤ３４＋前駆細胞移植前にＣＤ３４＋前駆細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記ＣＤ３４＋前駆細胞を必要とする受容者に前記ＣＤ３４＋前駆細胞を移植する工程とを含む、ＣＤ３４＋前駆細胞移植の改良方法が得られる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有するＣＤ３４＋前駆細胞を含むＣＤ３４＋前駆細胞調製物が得られる。
【００４３】
本発明のさらなる態様によれば、骨髄間質細胞移植前に骨髄間質細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記骨髄間質細胞を必要とする受容者に前記骨髄間質細胞を移植する工程とを含む、骨髄間質細胞移植の改良方法が得られる。
【００４４】
本発明のさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有する骨髄間質細胞を含む骨髄間質細胞調製物が得られる。
【００４５】
本発明のなおさらなる態様によれば、樹状細胞移植前に樹状細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記樹状細胞を必要とする受容者に前記樹状細胞を移植する工程とを含む、樹状細胞移植の改良方法が得られる。
【００４６】
本発明のさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有する樹状細胞を含む樹状細胞調製物が得られる。
【００４７】
本発明のなおさらなる態様によれば、末梢血リンパ球移植前に末梢血リンパ球を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記末梢血リンパ球を必要とする受容者に前記末梢血リンパ球を移植する工程とを含む、末梢血リンパ球移植の改良方法が得られる。
【００４８】
本発明のさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有する末梢血リンパ球を含む末梢血リンパ球細胞調製物が得られる。
【００４９】
以下に記載の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は自家起源である。
【００５０】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は同種異系起源である。
【００５１】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、または局所で移植を行う。
【００５２】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、移植は骨髄注射を介する。
【００５３】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は成体由来の細胞である。
【００５４】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は胚由来の細胞である。
【００５５】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞は遺伝子改変細胞である。
【００５６】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞外基質分解酵素は、コラゲナーゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、およびエラスターゼからなる群から選択される。
【００５７】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、グリコサミノグリカン分解酵素は、ヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼからなる群から選択される。
【００５８】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、接触の際、細胞外基質分解酵素は活性形態である。
【００５９】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、接触の際、細胞外基質分解酵素は不活性形態であり、プロテアーゼによって活性形態に活性化可能である。
【００６０】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、細胞外基質分解酵素はヘパラナーゼである。
【００６１】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼである。
【００６２】
記載の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ヘパラナーゼは成熟ヘパラナーゼに切断可能なプロヘパラナーゼである。
【００６３】
本発明は、細胞移植効率を改善可能な方法および細胞調製物を得ることによって現在公知の構成の欠点に首尾よく取り組んでいる。
【００６４】
図面の簡単な説明
本発明は、例示のみのために添付の図面を参照して記載している。詳細な図面を特に参照して、示した事項は、本発明の好ましい実施形態の例および例示的考察の例示を目的とし、本発明の原理および概念の最も有用且つ容易に理解される説明と考えられることを提示するために示したことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解のために必要以上に本発明を詳細に示すことを意図せず、図面を使用した説明によりどのようにして本発明のいくつかの形態を実施することができるかが当業者に明白となる。
図１は、ヘパラナーゼでコートした脾細胞におけるヘパラナーゼの運命を示すウェスタンブロット分析を示す。ヘパラナーゼコートおよび非コート脾細胞（３×１０５細胞）を、抗ｐ４５ヘパラナーゼポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。
図２は、ヘパラナーゼで治療した同種異系脾細胞の養子導入後のマウス生存時間を示す生存グラフである。ＣＢ６Ｆ１マウスに、２×１０５ルイス肺癌細胞ＩＶを注射した。４日後、マウスにハンクス溶液（コントロール）または１０７個の脾細胞（ｓｐｌｅｎ．）または１０７個のヘパラナーゼ処理脾細胞（ｓｐｌｅｎ．＋Ｈｅｐａ．）のいずれかを注射した。動物の生存時間を記録し、所与の時間での生存動物の割合として示した。
図３は、３×１０５個のヘパラナーゼ処理（黒四角）、非処理（白円）ＣＤ３４＋細胞のヘパラナーゼ活性を示すグラフである。放射性ＥＣＭ検定法を使用したゲル濾過によってヘパラナーゼ活性を分析した。結果をｃｐｍで示す。
図４ａは、ヒト幹細胞移植に対するヘパラナーゼの結果を示すグラフである。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、ヘパラナーゼ処理（＋）および非処理（−）ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した。８週間後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄を、特異的ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって分析した。マウス骨髄中のヒト白血球を、ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合で示す。
図４ｂは、移植ヒト幹細胞の分化に対するヘパラナーゼの効果を示すグラフである。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、ヘパラナーゼ処理（＋）および非処理（−）ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した。８週間後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄を、特異的ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ１５モノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって分析した。マウス骨髄中のヒト白血球を、ヒトＣＤ１５陽性細胞の割合で示す。
図５は、ヒトＣＤ３４＋細胞に対するヘパラナーゼの効果を示すグラフである。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、ヘパラナーゼ処理（ｗｉｔｈ  ｈｅｐａ）および非処理（ｗ／ｏ  ｈｅｐａ）ヒトＣＤ３４＋細胞を移植した。６週間後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄を、特異的ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５モノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリーによって分析した。マウス骨髄中のヒト白血球を、ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合で示す。
図６は、ヘパラナーゼでコートしたＢＭＳＣにおけるヘパラナーゼの運命を示すウェスタンブロット分析を示す。ヘパラナーゼコートおよび非コートＢＭＳＣ（１０５細胞）を、抗ｐ４５ヘパラナーゼポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット分析に供した。
図７は、ＢＭＳＣ移植に対するヘパラナーゼの効果を示すＰＣＲ分析を示す。γ照射した３週齢のルイスラットにヘパラナーゼ処理（レーン１〜６）、または非処理（レーン７〜１２）のＢＭＳＣを静脈内注射した。２週間後、雌供与マウスの組織を液体窒素中で急速冷凍した。肝臓、肺、骨、脳、および心臓由来のＤＮＡを調製した。次いで、ＤＮＡをｓｒｙ２プライマーを使用したＰＣＲに供した。ｓｒｙ遺伝子のＰＣＲ産物は、約３５０ｂｐであった。
【００６５】
好ましい実施形態の説明
本発明は、細胞療法および遺伝子治療で使用することができる方法および細胞調製物である。
【００６６】
本発明の方法および調製物の原理および操作を、添付の図面および説明を参照してより良好に理解することができる。
【００６７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その出願において以下の説明で記載されるか実施例で例示された詳細に制限されないことが理解される。本発明は、他の実施形態を実施するか種々の方法で実施および実行することができる。また、本明細書中で使用した表現および専門用語は、本発明の説明を目的とし、本発明の制限とみなすべきではないと理解すべきである。
【００６８】
本発明の１つの態様によれば、幹細胞移植前に幹細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記幹細胞を必要とする受容者に前記幹細胞を移植する工程とを含む、幹細胞移植の改良方法が得られる。
【００６９】
本発明の別の態様によれば、外因性細胞外基質分解酵素を保有する幹細胞を含む幹細胞調製物が得られる。
【００７０】
本発明のさらに別の態様によれば、ＣＤ３４＋前駆細胞移植前にＣＤ３４＋前駆細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記ＣＤ３４＋前駆細胞を必要とする受容者に前記ＣＤ３４＋前駆細胞を移植する工程とを含む、ＣＤ３４＋前駆細胞移植の改良方法が得られる。
【００７１】
本発明のさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有するＣＤ３４＋前駆細胞を含むＣＤ３４＋前駆細胞調製物が得られる。
【００７２】
幹細胞は、成体由来の細胞であり得る。あるいは、幹細胞は、胚由来の細胞であり得る。
【００７３】
本明細書中で使用される、外因性細胞外基質分解酵素に関する用語「保有する」には、外因性細胞外基質分解酵素を負荷しているか、コートされているか、トランスフェクトされているか、形質転換されていることが含まれる。細胞に対する細胞外基質分解酵素の発現および分泌を誘導するためにｅｘ  ｖｉｖｏで細胞をトランスフェクトおよび／または形質転換する方法は当該分野で周知であり、以下の実施例で列挙した引例でさらに説明されている。「保有する」は、負荷、コーティング、トランスフェクション、または形質転換前に酵素の全量がその内因性の量よりも多いことを意味する。
【００７４】
ＣＤ３４＋前駆細胞などの幹細胞の移植効率の改良は、いくつかの疾患、症候群、および／または病態の治療において有利である。１つの例では、本明細書中に記載のように移植したＣＤ３４＋前駆細胞を使用して、必要な受容者（骨髄破壊受容者など）の破壊されたか、欠損しているか、機能障害を有する造血系を再生し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期多系列造血を維持することができる。遺伝的に正常な同種異系ＨＳＣの移植からの経験により、多数の造血細胞およびリンパ系細胞の遺伝子疾患が幹細胞移植によって治癒することができることが証明された。同種異系ＨＳＣ移植片によって首尾よく治療された障害には、異常血色素症、白血球の産生または機能の欠損、免疫不全、ムコ多糖症などのリソソーム貯蔵疾患、およびファンコーニ貧血などの幹細胞欠損が含まれる。さらに、ＨＳＣ遺伝子を改変する技術が利用可能であるので、ＨＳＣおよびその子孫に新規の好ましい特性（化学療法の骨髄抑制効果に対する耐性またはＨＩＶ−Ｉなどの作用因子による感染に対する耐性など）を操作することが可能である。
【００７５】
本発明のさらなる態様によれば、骨髄間質細胞移植前に骨髄間質細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記骨髄間質細胞を必要とする受容者に前記骨髄間質細胞を移植する工程とを含む、骨髄間質細胞移植の改良方法が得られる。
【００７６】
本発明のさらなる態様によれば、外因性細胞外基質分解酵素を保有する骨髄間質細胞を含む骨髄間質細胞調製物が得られる。
【００７７】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の移植効率の改良は、いくつかの疾患、症候群、および／または病態の治療において有利である。
【００７８】
骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、種々の間葉細胞に分化する潜在性を有する。過去数年内にＢＭＳＣは、細胞療法および遺伝子治療用の媒介物として調査されている。この細胞は、局所麻酔によって得ることができる骨髄の小吸引物から比較的容易に単離され、これらはまた培養によって比較的容易に拡大され、外因性ポリヌクレオチドで容易にトランスフェクトされる。現在、ＢＭＳＣの治療での使用のためにいくつかの異なる戦略が行われている。例えば、変形性関節症の治療では、変形性関節症患者の骨髄からＢＭＳＣを単離し、培養によってＢＭＳＣを拡大し、その後関節への直接注射により患者の関節表面の交換に使用することが提案された。あるいは、ＢＭＳＣを治癒が不十分な骨に移植して、その修復プロセスを増強することができる。別の例では、遺伝子治療の傘下で、インスリン、エリスロポイエチンなどの分泌治療タンパク質を符号化する遺伝子を患者由来のＢＭＳＣに移入し、これらが骨髄または他の組織に戻り、治療タンパク質を分泌するように細胞を全身に注入することが提案された。細胞が骨髄に再集合するだけでなく、骨、肺、およびおそらく軟骨および脳などの他の組織の再集合のために子孫が得られる条件下でＢＭＳＣを全身に注入する。最近の実験により、大量の正常なマウス由来のドナーＢＭＳＣを衰弱した幼若マウスに注入する場合、これらは変異コラーゲン遺伝子を発現するので、正常なドナー細胞を、受容者マウスの骨、軟骨、および脳の細胞の３０％まで置換することが示された。これらの結果は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の変異によって発症する骨形成不全症の幼児に認められる骨欠損症の治療のために現在進行中の臨床試験の基本であった。以前は致命的と考えられていたリソソーム病の治療および潜在的な治癒は、過去１０年間に現実のものとなっている。骨髄移植により、疾患に起因する酵素欠損の置換法が得られた。ドナー骨髄由来の細胞は、酵素を無期限に提供し続ける。異染性白質萎縮症、副腎脳白質ジストロフィ、ハーラー症候群（ＭＰＳ  Ｉ）、マトロー−ラミー症候群（ＭＰＳ  ＶＩ）、ゴーシェ病、およびフコース蓄積症などを罹患した患者のいくつかのスコアが、長期移植後に首尾よく治療されている。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の発現もまた、正常なドナーからの移植後にこれらの疾患の動物モデルで予防または緩和される。小グリア細胞系は、骨髄移植後の酵素活性の最も可能性の高い媒介物と考えられている。成熟動物またはヒトの小グリア細胞は、新規に移植した骨髄に由来する。動物モデルでは、ＢＭＳＣを、レトロウイルスを使用してトランスフェクトし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで高レベルの遺伝子発現を達成することができる。
【００７９】
本発明のなおさらなる態様によれば、樹状細胞移植前に樹状細胞を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記樹状細胞を必要とする受容者に前記樹状細胞を移植する工程とを含む、樹状細胞移植の改良方法が得られる。
【００８０】
本発明のさらなる態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有する樹状細胞を含む樹状細胞調製物が得られる。
【００８１】
樹状細胞（ＤＣ）の移植効率の改良は、いくつかの疾患、症候群、および／または病態の治療において有利である。
【００８２】
樹状細胞（ＤＣ）は、最も強力な抗原提示細胞であり、ナイーブＴ細胞に新規の抗原を提示することができる唯一の細胞である。ＤＣは、臨床免疫治療のための有望な補薬であるプロ抗原提示細胞である。粘着性末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）またはＣＤ３４＋前駆体のいずれかを使用した適切なサイトカインカクテルの存在下で多数のＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＤＣは、特異的免疫応答を誘導することができるリンパ系組織に局在することが好ましい。したがって、これらの細胞は、癌および他の疾患の治療における免疫治療アプローチと潜在的に関連する。ＣＤ３４＋細胞由来樹状細胞の有効な遺伝子の改変により、癌、自己免疫障害、および感染症の免疫治療プロトコールの開発を有意に進歩させることができる。ヒト新生物細胞は、免疫原性が低いと考えられる。したがって、ヒト腫瘍の免疫治療への臨床アプローチの開発には、有効な補薬の同定が必要である。ＤＣは、抗腫瘍免疫応答を惹起するための天然の補薬として使用することができる特殊な抗原提示細胞系である。末梢血前駆細胞移植を使用した高用量化学療法は、造血悪性疾患および固形腫瘍の両方を罹患した患者のための潜在的に治効のある治療である。しかし、多数の臨床研究に基づいて、高用量化学療法後に多数の患者で最終的に疾患が再発する微小残存病変（ＭＲＤ）が残存している強力な証拠が存在する。したがって、ＭＲＤ治療へのいくつかのアプローチ（樹状細胞ベースの癌ワクチンでの治療および養子免疫療法（ＮＫ細胞を含む同種異系リンパ球の患者への受動輸送を意味する）を含む）が現在評価されている。
【００８３】
本発明のなおさらなる態様によれば、末梢血リンパ球移植前に末梢血リンパ球を有効量の細胞外基質分解酵素と接触させる工程と、前記末梢血リンパ球を必要とする受容者に前記末梢血リンパ球を移植する工程とを含む、末梢血リンパ球移植の改良方法が得られる。
【００８４】
本発明のなおさらに別の態様では、外因性細胞外基質分解酵素を保有する末梢血リンパ球を含む末梢血リンパ球細胞調製物が得られる。
【００８５】
本発明で使用される細胞は、自家起源または同種異系であり得る。このような細胞を、十分に確立されたプロトコールを使用して被験体またはドナーから採取することができる。このような細胞を、末梢血、骨髄、および／または臍帯血から得ることができる。このような細胞を、好ましくは、必要とする受容者に、静脈内、気管内、子宮内、腹腔内、局部、もしくは局所、または骨髄への注射によって投与する。
【００８６】
治療される病態に依存して、本発明の細胞は、遺伝子改変細胞であり得る。遺伝子改変した細胞は、外因性ポリヌクレオチドをそのゲノムに移入するために遺伝子操作された細胞である。このようなポリヌクレオチドには、典型的には、タンパク質を符号化する配列およびその発現を調節する調節配列が含まれる。タンパク質の例には、インスリンおよび成長ホルモンなどのホルモン、グルコセレブロシダーゼ、β−グルコロニダーゼ、およびアデノシンデアミナーゼなどの酵素、ならびにβ−グロビン、ＣＦＴＲなどの他のタンパク質が含まれる。細胞の遺伝子改変方法および改変細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖法は当該分野で周知であり、例えば、以下の実施例で列挙した引例に記載されている。
【００８７】
異なる細胞型によって輸送される活性ヘパラナーゼは細胞の異なる体内組織へのより良好な溢出を補助することを以下の実施例で示す。ヘパラナーゼは、細胞外基質分解酵素である。したがって、コラゲナーゼなどの他の細胞外基質分解酵素、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルクロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒルロニダーゼ、サルファターゼ、およびコンドロイチナーゼなどのグリコサミノグリカン分解酵素はこれに関してヘパラナーゼと類似の様式で機能することが認識される。これらの酵素および他の酵素は、種々の供給源由来の富化形態で利用可能である。組換え酵素が利用可能であるか容易に作製することができるようにこれらの酵素を符号化する遺伝子をクローニングした。
【００８８】
上記の酵素は細胞によって天然に産生され、その後細胞外基質に分泌されてその酵素活性を発揮する。このような酵素は、典型的には、成熟活性形態またはほとんど活性を示さないか活性を示さないプロ酵素として利用可能である。本発明の実施の際、一旦ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に適用すると、プロヘパラナーゼはその活性形態（成熟ヘパラナーゼ）にタンパク質分解されることが見出された。
【００８９】
したがって、本発明の実施の際、上記の任意の細胞外基質分解酵素の成熟（活性形態）またはプロ酵素（不活性形態）を使用することができる。
【００９０】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の試験により当業者に自明である。さらに、上で詳述し、且つ特許請求の範囲に記載の本発明の種々の実施形態および態様はそれぞれ以下の実施例で実験的に支持される。
【００９１】
実施例
引例は上記説明と共に以下の実施例に合わせて作成されており、非限定的様式で本発明を例示する。
【００９２】
一般に、本明細書中で使用した命名法および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術を、文献で完全に説明されている。例えば、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；「現代の分子生物学プロトコール」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｒ．Ｍ．編、１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニング実践ガイド」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｅｒｒｅｎら編、「ゲノム分析：実験マニュアルシリーズ」、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；「細胞生物学：実験ハンドブック」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；「動物細胞培養−基本技術マニュアル」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９４、第３版、「現代の免疫学プロトコール」、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、「基本的および臨床免疫学」、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ．、１９９４；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ編、「細胞免疫学法の選択」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫検定法は特許および化学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照のこと；米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；「オリゴヌクレオチド合成」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；「核酸ハイブリッド形成」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８５；「転写と翻訳」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８４；「動物細胞培養」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ．Ｉ．編、１９８６；「固定細胞および酵素」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；「分子クローニング実践ガイド」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および「酵素学的方法」、第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用ガイド」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク精製と特徴付けの戦略実験マニュアル」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中で全て記載されているかのように参考として援用される）。��書類のいたるところで他の一般的な引例を提供する。本明細書中に記載の手順は当該分野で周知と考えられ、読者の便宜上記載している。本明細書中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。
【００９３】
実施例１
導入したヘパラナーゼ処理免疫担当細胞の移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果
本実施例では、導入したヘパラナーゼ処理免疫担当細胞の移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を評価した。
【００９４】
材料および実験手順
ヘパラナーゼ：全ての実験でＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼ（１．６９３ｍｇ／ｍｌ；バッチ番号１１−１）を使用した。ＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼを、ＷＯ０１／７２９７に記載のプロトコールにしたがって調製した。酵素を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１：８５（ヘパラナーゼの最終濃度は２０μｇ／ｍｌ）で希釈した。
【００９５】
細胞：本研究で原発性腫瘍由来のルイス肺癌（Ｄ１２２）を使用した。これらの癌細胞を、８％ＣＯ２下で３７℃の１０％ＦＣＳ、２％グルタミン、ゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭ成長培地中でサブコンフルエントまで培養した。本実験でＢａｌｂ／Ｃ−ヌードマウス由来の脾細胞も使用した。脾細胞を、５％ＣＯ２下で３７℃の１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ成長培地中で１０７細胞／ｍｌまで培養した。
【００９６】
マウス：本研究でＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．（レホボト、イスラエル））から入手したＣＢ６Ｆ１（７〜９週齢）およびＢａｌｂ／Ｃ−雄ヌードマウス（１０〜１２週齢）を使用した。到着してすぐに本研究で使用する動物の健康状態を試験した。健康状態の良好な動物のみを実験条件に馴化した。研究期間中、動物を動物施設内に収容した。動物を、固体の底を取り付け、床敷きとして木の削りくずを敷いたポリプロピレンケージ（４３×２７×１８ｃｍ３）中に最大８匹のマウスの群およびポリプロピレンケージ（２９×１９×１２ｃｍ３）中に最大５匹のマウスの群を維持した。動物に市販の齧歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＴＲＭ  Ｒａ／Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ）を自由に与え、ステンレススチールのシッパーチューブを具備したポリエチレンボトルを介して各ケージに供給した飲料水に自由にアクセスさせた。自動制御環境条件を、室温２０〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間明所／１２時間暗所サイクル、および研究室の十分な換気／時間を維持するように設定した。ＣＢ６Ｆ１雄マウスを、番号を付した金属の耳輪を使用してマークした。ケージカードは、治療群に関する研究名および備考を含んでいた。研究終了後、動物を頸部脱臼によって屠殺した。
【００９７】
転移誘導実験：Ｄ１２２細胞（２×１０５細胞／０．２ｍｌＰＢＳ）を、ＣＢ６Ｆ１マウス（０日目）の尾静脈に静脈内注射した。
【００９８】
脾細胞の調製：３日目に、以下のプロトコールに従って脾細胞を調製した：１０匹のＢａｌｂ／Ｃ−ヌードマウス由来の脾細胞を滅菌様式で得た。細胞を、メッシュを使用して滅菌ＰＢＳに搾り出した。細胞をプールし、洗浄し、赤血球溶解緩衝液（細胞体積の１０倍）（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．３））と２０〜２５℃で５分間インキュベートした。次いで、細胞を、洗浄緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．５％ＢＳＡ）で２回洗浄した。細胞を計数し（３．６×１０８個の単核細胞）、７５ｍｌのフラスコに分注した。細胞（１０７細胞／ｍｌ）を、５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）＋１０％ＦＣＳ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ）＋２２ｎＭ組換えマウスＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ）中で３７℃で１２時間インキュベートした。４日目に、脾細胞を含む１つのフラスコを、５％ＣＯ２下で２０μｇ／ｍｌのｐ６５−ヘパラナーゼと３７℃で４時間インキュベートした。
【００９９】
脾細胞の注射：４日目に、脾細胞を含む０．２５ｍｌのハンクス液を、０日目にＤ１２２細胞を注射したＣＢ６Ｆ１マウスに静脈内注射した。群Ａに、０．２５ｍｌのハンクス液のみを注射し、群Ｂに脾細胞を注射し、群Ｃにヘパラナーゼ処理脾細胞を注射した。
【０１００】
ヘパラナーゼ活性および被覆細胞の発現：処理および非処理脾細胞を、例えば、米国特許第５９６８８２２号（本明細書中で参考として援用される）に記載のプロトコールを使用してＥＣＭおよびウェスタンブロット分析に供した。
【０１０１】
実験条件：ＣＢ６Ｆ１（７〜９週齢）の雄マウスにルイス肺癌（Ｄ１２２）細胞を注射した。その結果、動物にハンクス液またはまたは脾細胞（脾細胞の腫瘍の発達を防止する能力に対するヘパラナーゼの効果を試験するために静脈注射前のヘパラナーゼ処理または非処理の１０〜１２週齢のＢａｌｂ／Ｃ−雄ヌードマウス由来）のいずれかを注射した。以下の実験条件に従って２つの独立した試験を行った。
【０１０２】
2005500977.tif 000002
2005500977.tif 000003
【０１０３】
いずれの動物も３０日までに死亡しなかったので、これらの動物の肺に転移しているかを観察するためにコントロール群Ａの２匹の動物を頸部脱臼によって屠殺した。一方の動物は転移が認められなかったが、他方の動物は肺に巨大な転移が認められた。したがって、実験を継続した。死亡した動物または呼吸困難もしくは体重減少を示す動物を頸部脱臼によって屠殺し、その体重および肺重量を測定した。５６日目に実験を終了させた。依然として生存している群Ｂの２匹の動物および群Ｃの２匹の動物を頸部脱臼によって屠殺し、その体重および肺重量を測定した。
【０１０４】
2005500977.tif 000004
【０１０５】
動物の体重を毎週測定した。１７日目に第１の動物が死亡した時点で実験を終了し動物を頸部脱臼によって屠殺した。肺を切り出し、その重量を測定した。転移を検出するために肺を顕微鏡で観察した。
【０１０６】
実験番号２における肺転移の評価では、０は転移なしを示し、１は肺転移の存在を示した。ヘパラナーゼ処理群およびヘパラナーゼ非処理群中の動物数を比較した。
【０１０７】
実験結果
ヘパラナーゼ被覆脾細胞はｐ６５およびｐ５０ヘパラナーゼ形態を示し、これは、外因性ｐ６５−ヘパラナーゼが脾細胞に結合し、これらによりｐ５０−ヘパラナーゼ活性形態にプロセシングされることが示唆された（図１）。ＤＭＢ検定法によって示したヘパラナーゼ被覆脾細胞保有高ヘパラナーゼ活性を表１にまとめた。
【０１０８】
【表１】
2005500977.tif 000005
【０１０９】
実験番号１：群Ａの全動物（５／５、３０日目に２匹の動物を屠殺した）は、４４日目までに死亡した。脾細胞処理群の動物（２／７）は、研究が終了する５６日目まで死亡しなかった。結果を図２に示す。ヘパラナーゼ処理群（Ｃ）の１匹の動物は、肺転移が認められなかった。コントロール群（Ａ）および脾細胞コントロール群（Ｂ）の肺は、ヘパラナーゼ処理脾細胞群（Ｃ）と比較した場合に肺重量に反映したより多数でより大きな転移が認められた。
【０１１０】
【表２】
2005500977.tif 000006
【０１１１】
ＣＢ６Ｆ１マウスに２×１０５個のルイス肺癌細胞をＩＶ注射した。４日後、マウスにハンクス液（コントロール）、１０７個の脾細胞（Ｓｐ）、または１０７個のヘパラナーゼ処理脾細胞（ＳｐＨ）を注射した。死亡日に肺を切り出し、秤量した。
【０１１２】
実験番号２：コントロール群（Ａ）の動物は全て肺転移が進行した。脾細胞コントロール群（群ＢおよびＣ）では、１６匹中１５匹の動物で肺転移が進行するが、ヘパラナーゼ処理群（群ＤおよびＥ）では１６匹中９匹しか肺転移が進行しなかった（１６匹中７匹の動物で微視的肺転移が進行しなかった）。結果を表３にまとめる。
【０１１３】
【表３】
2005500977.tif 000007
2005500977.tif 000008
【０１１４】
結論
コントロール群における肺転移を有する動物数と処理群における肺転移を有する動物数とを比較した場合、実験番号２から得られた結果により、コントロール群と処理群との間に有意差が認められる（すなわち、移植前のヘパラナーゼ処理により免疫担当細胞のＧＶＴ効果が実質的に改良される）ことが示唆される。コントロール群における死亡日の肺重量と処理群の肺重量とを比較した場合、実験番号１から得られた結果により、コントロール群と処理群との間に有意差が認められる（すなわち、移植前のヘパラナーゼ処理により免疫担当細胞のＧＶＴ効果が実質的に改良される）ことが示唆される。生存期間で有意な効果は認められなかったが、これはおそらく動物を罹患直後に屠殺し、必ずしも自然死を待たないという人道的事実による。
【０１１５】
実施例２
幹細胞移植に対するヘパラナーゼの効果
本実施例では、幹細胞移植に対するヘパラナーゼの効果を研究した。
【０１１６】
材料と実験手順
ヘパラナーゼ：ＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼ（１．６９３ｍｇ／ｍｌ；バッチ番号１１−１）を全ての実験で使用した。ＷＯ０１／７２９７に記載のプロトコールに従って、ＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼを調製した。酵素を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで８５倍に希釈した（ヘパラナーゼの最終濃度は２０μｇ／ｍｌ）。
【０１１７】
細胞：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞／幹細胞を、５％ＣＯ２下で１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ成長培地（１０６細胞／ｍｌ）にて３７℃で培養した。
【０１１８】
マウス：本研究でＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．（レホボト、イスラエル）から入手したＮＯＤ−ＳＣＩＤ（２月齢）を使用した。本研究で使用する動物の健康状態を試験した。健康状態の良好な動物のみを実験条件に馴化させた。研究期間中、動物を動物施設内に収容した。動物を、固体の底を取り付け、床敷きとして木の削りくずを敷いたポリプロピレンケージ（２９×１９×１２ｃｍ３）中に最大５匹のマウスの群を飼育した。動物に市販の齧歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＴＲＭ  Ｒａ／Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ）を自由に与え、ステンレススチールのシッパーチューブを具備したポリエチレンボトルを介して各ケージに供給した飲料水に自由にアクセスさせた。自動制御環境条件を、室温２０〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間明所／１２時間暗所サイクル、および研究室の十分な換気／時間を維持するように設定した。ケージカードは、治療群に関する研究名および備考を含んでいた。研究終了後、動物を頸部脱臼によって屠殺した。
【０１１９】
動物の照射：０日目に、マウスにＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（レホボト、イスラエル）の照射ユニットで３７５Ｇｙのγ照射を行った。
【０１２０】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞分離：０日目に、Ｉｃｈｉｌｏｖ病院、Ｔｅｌ−Ａｖｉｖ、Ｉｓｒａｅｌの血液学部門から抗凝固臍帯血サンプル（６）を入手した。サンプルを２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで４倍に希釈した。３５ｍｌの希釈細胞懸濁液を、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に重層し、２０℃、４００×ｇで３５分間遠心分離した。層間細胞を回収し、ＰＢＳ−ＥＤＴＡで２回洗浄した（２０℃、２００×ｇで１０分間遠心分離した）。次いで、製造者のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って「ＣＤ３４前駆細胞分離キットの単離」およびＭＩＮＩ−ＭＡＣＳ分離器を使用してＣＤ３４＋細胞を分離した。次いで、少量の細胞サンプルをＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体で染色した。ＣＤ３４＋細胞の％を、ＦＡＣＳを使用して評価した（「ＦＡＣＳ分析」を参照のこと）。７５％を超えるＣＤ３４細胞を含む調製物のみを試験に使用した。
【０１２１】
ヘパラナーゼでのヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞被覆：分離ＣＤ３４＋細胞を、２つの３５ｍｍウェルに分注した。ヘパラナーゼ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を、ウェルの１つに添加した。細胞を、５％ＣＯ２下で１０％ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ成長培地中、３７℃で１６時間インキュベートした。
【０１２２】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞注射：１日目に、ＣＤ３４＋細胞（２×１０５細胞／０．５ｍｌ  ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を、照射ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに尾静脈を介して静脈内注射した（以下の試験条件を参照のこと）。
【０１２３】
ヒトＣＤ３４＋を移植したマウス骨髄のＦＡＣＳ分析：研究終了時に（６週間後）、マウスを頸部脱臼によって屠殺した。脛骨および大腿骨を採取し、骨髄を３００μｌのＲＰＭＩで洗浄した。その後、細胞を４℃で４５分間種々の結合モノクローナル抗体とインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でのフローサイトメトリー分析を行い、１０，０００個の細胞についてのデータを得た。生存リンパ球を分析するように前方散乱光閾値を設定した。使用したモノクローナル抗体は、抗ヒトＣＤ１９−ＡＰＣ（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）、抗ヒトＣＤ１５−ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および抗ヒトＣＤ３−ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）であった。
【０１２４】
ヘパラナーゼ活性および被覆細胞の発現：処理および非処理ＣＤ３４＋細胞を、例えば、米国特許第５９６８８２２号（本明細書中で参考として援用される）に記載の確立されたプロトコールを使用して、ＥＣＭ分析に供した。
【０１２５】
実験条件：
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【０１２６】
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【０１２７】
統計分析：ＣＤ３４＋細胞移植に対するヘパラナーゼの効果の統計分析に対応のないスチューデントＴ検定を使用した。実験番号２では、処理群（３＋）での動物の骨髄内のヒト細胞の％が平均値−２標準偏差値よりも小さいので、これを統計分析から排除した。
【０１２８】
実験結果
ＥＣＭ検定法で示すように、ヘパラナーゼ処理ＣＤ３４＋細胞（２×１０５細胞）は、高ヘパラナーゼ活性を示した（図３）。
【０１２９】
実験番号１：マウス骨髄中のヒト白血球の％を、フローサイトメトリーによる特異的抗ヒトＣＤ４５を使用して分析した。結果を、表４および図５にまとめる。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
実験番号２：マウス骨髄中のヒト白血球の％を、フローサイトメトリーによる特異的抗ヒトＣＤ４５を使用して分析した。ヒトＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄性細胞の％を、それぞれ抗ヒトＣＤ１９、抗ヒトＣＤ３、および抗ヒトＣＤ１５を使用して分析した。結果を、表５および図４ａおよび４ｂにまとめる。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
結論
実験番号２では、ヒトＣＤ４５を発現するマウス骨髄中の細胞の％を反映するので、ヘパラナーゼはＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルでヒトＣＤ３４＋細胞の移植を有意に（ｐ＜０．０４）改良した。実験番号１では、結果は統計的に有意ではないが、傾向は明白である。さらに、マウス骨髄でＣＤ１５を発現するヒト細胞の％はヘパラナーゼ処理群で有意に高く、これによりヘパラナーゼの一過性発現が骨髄性細胞の分化を誘導することが示唆される。
【０１３４】
実施例３
ラットモデルにおける骨髄間質細胞移植に対するヘパラナーゼの効果
本実施例では、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）移植に対するヘパラナーゼの効果を研究した。
【０１３５】
ヘパラナーゼ：全試験でＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼ（１．６９３ｍｇ／ｍｌ；バッチ番号１１−１）を使用した。ＣＨＯ−ｐ６５ヘパラナーゼを、ＷＯ０１／７２９７に記載のプロトコールにしたがって調製した。酵素を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、４０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで１７０倍（ヘパラナーゼの最終濃度１０μｇ／ｍｌ）に希釈した。
【０１３６】
細胞：８％ＣＯ２下の１０％ＦＣＳを補足した低グルコースＤＭＥＭ成長培地にて３７℃でコンフルエントまでＢＭＳＣを成長させた。
【０１３７】
ラット：本研究で、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．（レホボト、イスラエル）から入手した雄（６週齢）（３匹）および雌（３週齢）（１８匹）のルイスラットを使用した。本研究で使用する動物の健康状態を試験した。健康状態の良好な動物のみを実験条件に馴化させた。研究期間中、動物を動物施設内に収容した。動物を、固体の底を取り付け、床敷きとして木の削りくずを敷いたポリプロピレンケージ（４３×２７×１８ｃｍ３）中に最大５匹のラットの群を維持した。動物に市販の齧歯類用飼料（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  ＴＲＭ  Ｒａ／Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｅｔ）を自由に与え、ステンレススチールのシッパーチューブを具備したポリエチレンボトルを介して各ケージに供給した飲料水に自由にアクセスさせた。自動制御環境条件を、室温２０〜２４℃、相対湿度３０〜７０％、１２時間明所／１２時間暗所サイクル、および研究室の十分な換気／時間を維持するように設定した。ケージカードは、治療群に関する研究名および備考を含んでいた。研究終了後、動物を頸部脱臼によって屠殺した。
【０１３８】
動物の照射：０日目に、ラットにＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（レホボト、イスラエル）の照射ユニットで４５０Ｇｙのγ照射を行った。
【０１３９】
ＢＭＳＣ：２匹の雄ルイスラット（４５日齢）またはＣ５７ＢＬマウス由来の大腿骨および脛骨を、滅菌様式でＨａｒｌａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｓｒａｅｌ，Ｌｔｄ．（レホボト、イスラエル）から入手した。骨髄を洗浄し、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）、ゲンタマイシン、２ｍＭグルタミン（全てＢｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエルから購入）を補足した低グルコース（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭで培養した。培養物を、加湿した８％ＣＯ２で３７℃のインキュベーターに維持した。３日間のインキュベーション後、非接着細胞を洗浄し、接着細胞を、完全ＤＭＥＭ培地で再培養した。その後培地を１週間に２回交換した。
【０１４０】
ヘパラナーゼでのＢＭＳＣ被覆：ＢＭＳＣ培養物がコンフルエントに達した時点で、いくつかの細胞を１０μｇ／ｍｌのｐ６５−ヘパラナーゼ（最終濃度）と３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞はトリプシン処理され計数された。
【０１４１】
ＢＭＳＣ注射：１日目に、ＢＭＳＣ（３×１０６細胞／０．３ｍｌＰＢＳ）（以下の実験条件を参照のこと）を、照射ラットに尾静脈を介して静脈注射した。
【０１４２】
雌組織由来のＤＮＡ抽出物：研究終了時に、動物を麻酔し、以下の器官および組織を採取した：脳、骨、心臓、脾臓、肺、肝臓、および骨髄。各器官の半分を液体窒素中で凍結し、残りの器官をパラホルムアルデヒドに保存した。製造者のプロトコールに従って、「高純度ＰＣＲテンプレート調合キット」（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用してＤＮＡを凍結組織から抽出した。
【０１４３】
ＰＣＲ分析：各ＰＣＲ反応に２５０ｎｇのＤＮＡを使用した。ＰＣＲプログラムを以下であった：９５℃−５分間、４０×（９５℃−１分間、６２℃−３０秒間、７２℃−１分間）、７２℃−７分間。以下のプライマーを使用した。
ｓｒｙ２Ｒ：５’−ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＴＡ−３’（配列番号１）
ｓｒｙ２Ｆ：５’−ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＡＣＧ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧ−３’（配列番号２）
βアクチンＲ：５’−ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’（配列番号３）
βアクチンＦ：５’−ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（配列番号４）
ｓｒｙ１Ｒ：５’−ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴ−３’（配列番号５）
ｓｒｙ１Ｆ：５’−ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＧＣ−３’（配列番号６）
【０１４４】
ヘパラナーゼ活性および被覆細胞の発現：処理および非処理細胞を、例えば、米国特許第６１９０８７５号（本明細書中で参考として援用される）に記載のプロトコールを使用してＤＭＢおよびウェスタンブロット分析に供した。
【０１４５】
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【０１４６】
４日目に、尾を損傷した処理群（Ｈ）由来の動物が死亡した。１３日目および１４日目に、群Ｃ由来の３匹の動物および群Ｈ由来の２匹の動物が死亡した。１４日目に、群Ｃの全動物に頻呼吸、立毛、流涙、および無関心が認められたので、ラットをネンブタールの腹腔内注射によって安楽死させ、死後分析を行った。
【０１４７】
実験結果
顕微鏡観察（黄疸肝臓、青白い脾臓、黄色い骨髄、炎症を起こした肺、および青白い膜）により、動物は照射による損傷を負い、処理群（Ｈ）は損傷は小さいことが示唆された。
【０１４８】
ウェスタンブロット分析によって示されるように、ＢＭＳＣ細胞（１０５細胞）はｐ６５−ヘパラナーゼに結合し、そのｐ５０活性形態にプロセシングされた（図６）。ＤＭＢ検定法によって示されるように、細胞は高いヘパラナーゼ活性を示した（表６）。
【０１４９】
【表６】
2005500977.tif 000014
【０１５０】
受容者雌の組織内の雄特異的（ｙ染色体）ｓｒｙ遺伝子の発現を、ＰＣＲを使用して分析した（図７）。ｓｒｙ遺伝子は、処理群（ＢＭＳＣ＋ヘパラナーゼ、群Ｈ）の６匹中４匹の動物の肺およびコントロール群（ＢＭＳＣ、群Ｃ）の６匹中１匹の動物の肺に存在した。肺および骨中にｓｒｙ遺伝子が存在する動物数は、両群で類似していた。ＢＭＳＣ＋ヘパラナーゼ処理動物のそれぞれ３匹および１匹が心臓および脳でｓｒｙ遺伝子を発現したが、コントロール動物では発現されなかった。いずれの群でも骨髄および脾臓ではヘパラナーゼは発現されなかった。ＰＣＲ反応で使用した各動物由来のＤＮＡ量を、β−アクチンプライマーを使用したサンプルのＰＣＲ分析と比較したが、類似していた（示さず）。
【０１５１】
結論
ヘパラナーゼは、主に照射ラットの肺へのＢＭＳＣ移植を改良する。
【０１５２】
明白にするために個別の実施形態の文脈で記載した本発明の一定の特徴を１つの実施形態に組み合わせて提供することもできることが認識される。対照的に、簡潔にするために１つの実施形態の文脈で記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な小さな組み合わせで提供することもできる。
【０１５３】
本発明は特定の実施形態と併せて記載しているが、多数の変更形態、修正形態、変形形態が当業者に明らかであることが証明される。したがって、すべてのこのような変更形態、修正形態、および変形形態が添付の特許請求の範囲の精神および広範な範囲内に含まれることが意図される。本明細書中に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、各刊行物、特許、または特許出願が具体的且つ個別に本明細書中で参考として援用されるのと同一の程度に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願中の任意の参考文献の引用または同一性は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ヘパラナーゼでコートした脾細胞におけるヘパラナーゼの運命を示すウェスタンブロット分析を示す。
【図２】ヘパラナーゼで治療した同種異系脾細胞の養子導入後のマウス生存時間を示す生存グラフである。
【図３】３×１０５個のヘパラナーゼ処理（黒四角）、非処理（白円）ＣＤ３４＋細胞のヘパラナーゼ活性を示すグラフである。
【図４】図４ａは、ヒト幹細胞移植に対するヘパラナーゼの結果を示すグラフである。図４ｂは、移植ヒト幹細胞の分化に対するヘパラナーゼの効果を示すグラフである。
【図５】ヒトＣＤ３４＋細胞に対するヘパラナーゼの効果を示すグラフである。
【図６】ヘパラナーゼでコートしたＢＭＳＣにおけるヘパラナーゼの運命を示すウェスタンブロット分析を示す。
【図７】ＢＭＳＣ移植に対するヘパラナーゼの効果を示すＰＣＲ分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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2005500977.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500977.tif 000087
【国際調査報告】
2005500977.tif 000088
2005500977.tif 000089
2005500977.tif 000090