(57)【要約】腸型胃癌を検出および診断する客観的な方法を本明細書において記載する。同様に、リンパ節転移の有無を予測する方法も記載する（すなわち、転移性表現型の同定）。一つの態様において、診断法は、リンパ節陽性腫瘍とリンパ節陰性腫瘍とを判別する遺伝子発現プロフィールのスコアリングを含む。計算された予測スコアは、試料組織が転移性表現型を有するか否かを客観的に示すことができる診断指標として作用する。本発明はさらに、被験者における腸型胃癌を診断する方法、腸型胃癌の治療において有用な治療薬剤をスクリーニングする方法、腸型胃癌を治療する方法、および腸型胃癌に対して被験者をワクチン接種する方法を提供する。
2005532077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子が、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANK（商標）アクセッション番号AA533633およびAI755112）からなる群より選択され、腫瘍における発現レベルが対照値と比較して増加すれば腫瘍が転移性であることを示す、腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較する段階を含む、腫瘍が転移性であるか否かを決定する方法。
【請求項２】
遺伝子が、UBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択され、腫瘍における発現レベルが対照値と比較して減少すれば、腫瘍が転移性であることを示す、腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較する段階を含む、腫瘍が転移性であるか否かを決定する方法。
【請求項３】
発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の一つの方法によって決定される、請求項1または2に記載の方法：
（a）遺伝子のmRNAを検出する段階；
（b）遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階；および
（c）遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的活性を検出する段階。
【請求項４】
以下の段階を含む、被験者における腸型胃癌を診断する方法：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子が、表1に記載の遺伝子および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、診断すべき被験者から採取した標本における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（b）対照と比較して、表1のマーカー遺伝子の発現レベルが高ければ、または表2のマーカー遺伝子の発現レベルが低ければ、腸型胃癌であることを示している、一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを対照の発現レベルと比較する段階。
【請求項５】
以下の段階を含む、リンパ節陰性癌とリンパ節陽性癌を予測する方法：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子が、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、二つのEST（GENBANKアクセッション番号AA533633およびAI755112）、UBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択される、予測すべき被験者から採取した標本における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（b）DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANKアクセッション番号AA533633およびAI755112）からなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現レベルが対照と比較して高ければもしくは低ければ、それぞれリンパ節陽性癌もしくはリンパ節陰性癌であることを示す、またはUBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現レベルが対照と比較して低ければもしくは高ければ、リンパ節陽性癌もしくはリンパ節陰性癌であることを示す、一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを対照の発現レベルと比較する段階。
【請求項６】
選択されるマーカー遺伝子が、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、およびAIM2からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
マーカー遺伝子が、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、およびAIM2の全てを含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
段階（b）が、選択された遺伝子に対する発現プロフィールの加重対数比を合計する段階を含む、選択された遺伝子に対する発現プロフィールの対数比の関数を決定する段階をさらに含み、ここで、各遺伝子に関する加重が、リンパ節陽性癌に関する平均対数比がリンパ節陰性癌より大きい場合に第一の値であり、リンパ節陰性癌に関する平均対数比がリンパ節陽性癌より小さい場合に第二の値である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
発現レベルが以下からなる群より選択される任意の一つの方法によって決定される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法：
（a）遺伝子のmRNAを検出する段階；
（b）遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階；および
（c）遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質の生物学的活性を検出する段階。
【請求項１０】
一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルが、以下の段階によって決定される、請求項9記載の方法：
（a）標本からマーカー遺伝子のaRNAまたはcDNAを合成する段階；
（b）aRNAまたはcDNAをマーカー遺伝子に関するプローブとハイブリダイズさせる段階；および
（c）プローブとハイブリダイズしたaRNAまたはcDNAを検出してそのmRNAの量を定量する段階。
【請求項１１】
プローブがDNAアレイ上に固定されている、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階を含む、腸型胃癌を治療または予防するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；ならびに
（b）表1に示す上方制御されたマーカー遺伝子の一つもしくは複数の発現レベルを対照と比較して減少させる、または表2に示す下方制御されたマーカー遺伝子の一つもしくは複数の発現を対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【請求項１３】
以下の段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法：
（a）候補化合物を試験動物に投与する段階；
（b）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、試験動物からの生体試料における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを測定する段階；
（c）表1に示す上方制御されたマーカー遺伝子の一つもしくは複数の発現レベルを対照と比較して減少させる、または表2に示す下方制御されたマーカー遺伝子の一つもしくは複数の発現を対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【請求項１４】
以下の段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
（b）該レポーター遺伝子の活性を測定する段階；ならびに
（c）該マーカー遺伝子が表1から選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合に該レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して減少させる化合物、または該マーカー遺伝子が表2から選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合に該レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【請求項１５】
以下の段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法：
（a）マーカー遺伝子が表1および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に候補化合物を接触させる段階；
（b）該タンパク質の活性を測定する段階；ならびに
（c）該マーカー遺伝子が表1から選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合に該タンパク質の活性を低下させる化合物、または該マーカー遺伝子が表2から選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合に該タンパク質の活性を増強する化合物を選択する段階。
【請求項１６】
マーカー遺伝子が表1に記載の遺伝子からなる群より選択される、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
マーカー遺伝子が表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法によって得られた化合物を投与する段階を含む、腸型胃癌を治療または予防する方法。
【請求項１９】
上方制御されたマーカー遺伝子が表1に記載の遺伝子からなる群より選択される、上方制御されたマーカー遺伝子に対するアンチセンス核酸またはsiRNAを被験者に投与する段階を含む、被験者における腸型胃癌を治療または予防する方法。
【請求項２０】
上方制御されたマーカー遺伝子が表1に記載の遺伝子からなる群より選択される、上方制御されたマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片を被験者に投与する段階を含む、被験者における腸型胃癌を治療または予防する方法。
【請求項２１】
下方制御されたマーカー遺伝子が表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、下方制御されたマーカー遺伝子またはこの遺伝子によってコードされるタンパク質を被験者に投与する段階を含む、被験者における腸型胃癌を治療または予防する方法。
【請求項２２】
ワクチン組成物が以下からなる群より選択される一つまたは複数の成分を含む、腸型胃腫瘍を治療または予防するワクチン組成物：
（a）表1に記載の遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の上方制御されたマーカー遺伝子に対応するDNA；
（b）上記の（a）に記述したDNAによってコードされるタンパク質；および
（c）上記の（b）に記述したタンパク質の抗原性断片。
【請求項２３】
以下を単独または併用して投与する段階を含む、腸型胃癌に対して被験者をワクチン接種する方法：
（a）表1に記載の遺伝子からなる群より選択される一つまたは複数の上方制御されたマーカー遺伝子に対応するDNA；
（b）上記の（a）に記述したDNAによってコードされるタンパク質；または
（c）上記の（b）に記述したタンパク質の抗原性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権に関する情報
本出願は、2002年7月10日に提出された米国特許仮出願番号第60/394,941号に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、癌研究の分野に関する。より詳細に述べると、本発明は、腸型胃腫瘍の検出に関する。本発明はさらに、被験者における腸型胃腫瘍を診断する方法、腸型胃腫瘍の治療において有用な治療薬剤をスクリーニングする方法、腸型胃腫瘍を治療する方法、および腸型胃腫瘍に対して被験者をワクチン接種する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本発明は、腫瘍、特に腸型胃腫瘍の検出および診断に関する。
【０００４】
胃癌は、世界で、特に極東における癌による主な死因の一つであり、全世界で年間約700,000人の新規症例が診断されている。治療に関しては、化学療法が十分でないために手術が主流である。初期の胃癌は、外科的切除によって治療することができるが、進行胃癌の予後は依然として非常に悪い。
【０００５】
胃癌の大多数（90〜95％）が、腺形成腺癌である。胃の他のあまり一般的でない腫瘍には、リンパ腫、カルチノイド、および胃間質腫瘍が含まれる。疫学的研究から、胃の腺癌に関する二つの主要な組織学的サブタイプ、すなわち腸型（十分に分化した）およびびまん型（あまり分化していない）が、異なる経路によって発生することが示されている。腸型は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）に強く関連し、通常、慢性胃炎、胃萎縮、および腸上皮化生の背景に基づいて発生する。対照的に、あまり分化していない腺癌は、通常これらの変化に関連しない。臨床的に、後者はしばしば、見分けのつく塊（形成性胃線維炎）というよりむしろ胃壁のびまん性の肥厚と共に存在する。腸型の腺癌は、そのほとんどが診断時には転移して胃の境界を越えて広がっているびまん型変種より予後が良好である。
【０００６】
他の癌と同様に、病期は転帰の最も重要な決定因子である。ヒトにおける固形腫瘍の予後を決定する要因はリンパ節転移であり、これは胃癌の再発に関する独立した危険因子である。いくつかの遺伝子の発現がリンパ節転移に関連しているが、関係する分子メカニズムは不明である。
【０００７】
本発明は、腸型胃癌の検出および診断の分野における顕著な改善である。本発明以前は、腸型胃癌に関係する遺伝子の知識は断片的であった。本明細書に記述する情報は、多段階発癌および転移の際にどのように遺伝子発現プロフィールが変化したかに関するゲノム全体の情報を提供する。特に、本発明は、非腫瘍組織と比較して、腸型胃腫瘍において上方制御または下方制御されている「マーカー」遺伝子について記述する。本明細書に開示の情報は、胃癌、特に腸型の腫瘍発生および転移のより深い理解に貢献するのみならず、腸型胃癌を診断、治療、および最終的に予防する新規戦略を開発するための指標を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
したがって、本発明は、マーカー遺伝子の発現を腸型胃癌の有無と相関させる診断法を提供する。より詳細に述べると、本発明は、良性病変と悪性病変とを区別するため、およびリンパ節転移の有無を同定する（すなわち、転移表現型を同定する）ための感度のよい、特異的かつ簡便な診断法を提供する。
【０００９】
本発明は、レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除法およびcDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現分析のゲノム全体に及ぶ分析に基づく。分析によって「マーカー遺伝子」、すなわち腸型胃癌において過剰発現（上方制御）または過少発現（下方制御）されている遺伝子が定義された。これらの遺伝子は、この疾患に関する新規治療標的およびバイオマーカーとなる。転移表現型と相関する遺伝子の発現パターンも同様に定義した。したがって、本発明は、胃癌に関する感度のよい、特異的かつ簡便な診断および予測の方法を提供する。
【００１０】
腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較することによって、腫瘍が転移性であるか否かを決定する方法も、同様に本発明に含まれる。遺伝子は、図2に提供したリストから選択され、好ましくはDDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANK（商標）アクセッション番号AA533633およびAI755112）遺伝子を上方制御される遺伝子として用いることができる。対照値と比較して腫瘍における発現レベルが増加すれば、腫瘍が転移性であることを示している。または、方法は、遺伝子が図2に記載した遺伝子から選択される、腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較することによって行われ、好ましくはUBQLN1、AIM2、およびUSP9X遺伝子を下方制御された遺伝子として用いることができる。腫瘍における発現レベルが対照値と比較して減少すれば、腫瘍が転移性であることを示している。
【００１１】
腸型胃癌を治療または予防するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法を提供する。方法には、表1および表2に記載されるマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階、ならびに表1に示す上方制御されたマーカー遺伝子の発現レベルを減少させる、または表2に示す下方制御されたマーカー遺伝子の発現を増強する化合物を選択する段階が含まれる。
【００１２】
本発明はさらに、候補化合物を試験動物に投与する段階、マーカー遺伝子の発現レベルを測定する段階、およびマーカー遺伝子の発現レベルを減少または増強する化合物を選択する段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、マーカー遺伝子の転写調節領域およびレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階、レポーター遺伝子の活性を測定する段階、ならびにレポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物を選択する段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に候補化合物を接触させる段階、このタンパク質の活性を測定する段階、およびこのタンパク質の活性を低下させる化合物を選択する段階を含む、腸型胃癌を治療するために有用な治療薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなると考えられる。しかし、本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様に関するものであり、本発明または本発明の他の代わりの態様を制限するものではないと理解すべきである。
【００１６】
詳細な説明
本発明の文脈においては、以下の定義を適用する。
【００１７】
本発明は、腸型腺癌としても知られる、腸型の胃癌の診断および治療に関する。
【００１８】
腸管および胃上皮の腫瘍は、良性、悪性、または前悪性として分類される。本発明の文脈において、「腸型腫瘍」という用語は、胃および腸の上皮の良性、悪性、および前悪性の腫瘍を含む。「腸型胃癌」という用語は、制御されない異常な細胞増殖によって特徴付けられた悪性状態を意味する。癌細胞は局所的に、または血流およびリンパ系を通して体の他の部分に広がりうる。
【００１９】
「癌腫」は、上皮から発生した悪性の新規細胞増殖である。癌腫は、隣接する組織に浸潤して遠位臓器に転移する傾向がある癌性腫瘍である。腺癌は、胃または腸のような臓器の壁の内側から発生する特定の種類の癌腫である。本明細書において、「癌腫」および「腺癌」という用語は互換的に用いられる。他の臓器系に癌腫が転移する前の初期段階で腸型腺癌を診断、治療、および予防するための新規な方法は当技術分野において明らかに必要である。
【００２０】
「腺腫」は、細胞が認識可能な腺構造を形成する、または細胞が明らかに腺上皮に由来する良性の上皮腫瘍である。腸型胃癌は、文献における「腺腫から癌腫への変化（adenoma-to-carcinoma sequence）」モデルを通して発生すると考えられている。したがって、胃腫瘍において、腺腫は、胃癌の前悪性期である。腺腫を早期に検出および診断することは、癌腫の発症を予防するために有用である。同様に、腺腫を治療および予防すれば、被験者における腸型胃癌への進行を防御することができる。
【００２１】
本発明の文脈において、「転移性」という用語は、起源となる臓器または組織から体の別の部分への疾患の広がりを意味する。
【００２２】
本発明は、腸型腫瘍と非癌性粘膜とを区別する遺伝子、および転移性腸型胃癌と非転移性腸型胃癌とを区別する遺伝子について記述する。そのような遺伝子は本明細書において、集合的に「マーカー遺伝子」と呼ぶ。本発明は、そのようなマーカー遺伝子の発現を分析して腸型の悪性腫瘍と良性腫瘍とを区別する、および転移性腸型胃癌（例えば、リンパ節陽性腫瘍）を非転移性腸型胃癌（例えば、リンパ節陰性腫瘍）から区別することができることを証明する。
【００２３】
本明細書において用いられる「発現プロフィール」という用語は、多くの遺伝子の発現レベルの集合を意味する。本発明の文脈において、発現プロフィールは、好ましくは転移性胃癌と非転移性胃癌とを区別するマーカー遺伝子を含む。本発明は、試料が腸型胃癌の特徴を示すか否かを決定するためにマーカー遺伝子の発現プロフィールを分析し、それによって転移性の癌を非転移性の癌から区別して被験者における腸型胃癌の有無を診断する段階を含む。
【００２４】
「腸型胃癌の特徴」という用語は、本明細書において、腸型胃癌に対して特徴的な一組のマーカー遺伝子発現レベルの変化パターンを意味するために用いられる。特に、特定のマーカー遺伝子は、本明細書において腸型胃癌において上方制御（すなわち、表1に記載の遺伝子）または下方制御（すなわち、表2に記載の遺伝子）されていると記述される。発現プロフィールに含まれる一つまたは複数の上方制御されたマーカー遺伝子の発現レベルが対照の発現レベルと比較して上昇している場合、発現プロフィールは、腸型胃癌の特徴を有すると評価することができる。同様に、発現プロフィールに含まれる一つまたは複数の下方制御されたマーカー遺伝子の発現レベルが対照の発現レベルと比較して低下している場合、発現プロフィールは腸型胃癌の特徴を有すると評価することができる。必ずしも全てではないが、発現プロフィールを構成する発現レベルの変化パターンのほとんどが腸型胃癌の特徴である場合、発現プロフィールは腸型胃癌の特徴を有すると評価される。
【００２５】
本発明の文脈において、発現プロフィールは、「DNAアレイ」を用いて得ることができる。「DNAアレイ」は、同時に多くの遺伝子の発現レベルを比較するために都合のよい装置である。DNAアレイに基づいて発現プロフィールを調べることは、例えば、「Microarray Biochip Technology」（Mark Schena、イートン出版、2000）等に開示される方法によって行うことができる。
【００２６】
DNAアレイは、多数の遺伝子を検出するために固定された高密度プローブを含む。本発明において、任意の種類のポリヌクレオチドもDNAアレイのプローブとして用いることができる。好ましくは、cDNA、PCR産物、およびオリゴヌクレオチドはプローブとして有用である。このように、多くの遺伝子の発現レベルを、1ラウンドの分析によって同時に評価することができる。すなわち、標本の発現プロフィールは、DNAアレイによって決定することができる。本発明のDNAアレイに基づく方法は、以下の段階を含む：
（1）マーカー遺伝子のaRNAまたはcDNAを含むaRNAまたはcDNAを合成する段階；
（2）aRNAまたはcDNAをマーカー遺伝子のためのプローブとハイブリダイズさせる段階；および
（3）プローブとハイブリダイズしているcRNAまたはcDNAを検出して、そのmRNA量を定量する段階。
【００２７】
「aRNA」という用語は、RNAポリメラーゼによって鋳型cDNAから転写されたRNA（増幅されたRNA）を意味する。DNAアレイに基づく発現プロフィールを調べるためのaRNA転写キットが市販されている。そのようなキットによって、aRNAは、T7 RNAポリメラーゼの鋳型として、T7プロモーター結合cDNAを用いて合成することができる。または、ランダムプライマーを用いるPCRによって、cDNAは、鋳型としてmRNAから合成されたcDNAを用いて増幅することができる。
【００２８】
DNAアレイはさらに、本発明のマーカー遺伝子を検出するために、その上に配置されたプローブを含んでもよい。DNAアレイ上に配置されるマーカー遺伝子の数に制限はない。例えば、本発明のマーカー遺伝子の5％またはそれ以上、好ましくは20％またはそれ以上、より好ましくは50％またはそれ以上、さらにより好ましくは70％またはそれ以上を選択してもよい。マーカー遺伝子以外の遺伝子も同様にDNAアレイ上に配置してもよい。例えば、その発現レベルが有意に変化していない遺伝子のプローブをDNAアレイ上に配置してもよい。そのような遺伝子は、アッセイ結果を標準化して多数のアレイのアッセイ結果または異なるアッセイ法と比較するために用いることができる。
【００２９】
「プローブ」を、それぞれの選択されたマーカー遺伝子のために設計して、DNAアレイ上に配置する。そのような「プローブ」は、例えば、5〜50ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。DNAアレイ上でそのようなオリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に公知である。より長いDNAをPCRによって、または化学的に合成することができる。PCR等によって合成される長いDNAをスライドガラス上に配置する方法も同様に当業者に公知である。上記の方法によって得られるDNAアレイは、本発明に従って腸型胃癌を診断するために用いることができる。
【００３０】
調製されたDNAアレイをaRNAに接触させた後、プローブとaRNAとのハイブリダイゼーションを検出する。aRNAは、蛍光色素によって予め標識することができる。Cy3（赤色）およびCy5（緑色）のような蛍光色素を用いて、aRNAを標識することができる。被験者および対照由来のaRNAはそれぞれ、異なる蛍光色素によって標識される。両者の発現レベルの差は、シグナル強度の差に基づいて推定することができる。DNAアレイ上の蛍光色素のシグナルはスキャナによって検出して、特殊なプログラムを用いて分析することができる。例えば、AffymetrixのSuiteは、DNAアレイ分析のためのソフトウェアパッケージである。
【００３１】
スクリーニングによって単離された化合物は、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する薬物の候補であり、腸型腺癌の治療または予防に適用することができる。
【００３２】
その上、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物も同様に、本発明のスクリーニング法によって得ることができる化合物に含まれる。
【００３３】
本発明の方法によって単離された化合物を、ヒトならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのような他の哺乳類のための薬剤として投与する場合、単離された化合物は直接投与することができ、または公知の薬剤調製法を用いて投与剤形に処方することができる。例えば、必要に応じて、薬剤は糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口投与することができ、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射用製剤として非経口投与することができる。例えば、化合物は、薬学的に許容される担体または培地、特に滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、香味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤等と共に、一般的に許容される薬物投与にとって必要な単位用量形態で混合することができる。これらの調製物における活性成分の量によって、表記の範囲内の適した用量を獲得することができる。
【００３４】
錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例は、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、およびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ならびにペパーミント、アカモノ（Gaultheria adenothrix）油、およびサクランボのような香味剤である。単位用量形態がカプセル剤である場合、油のような液体担体が上記の成分にさらに含まれうる。注射用滅菌組成物は、注射に用いられる蒸留水のような溶剤を用いて通常の薬剤の実現に倣って製剤化することができる。
【００３５】
生理食塩液、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムのようなアジュバントを含む他の等張溶液を、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、特にエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール、ポリソルベート80（TM）およびHCO-50のような非イオン性界面活性剤のような適した溶解剤と共に用いることができる。
【００３６】
ゴマ油または大豆油は油脂性液体として用いることができ、溶解剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと共に用いてもよく、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝液；塩酸プロカインのような鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤；ならびに抗酸化剤と共に処方してもよい。調製した注射剤は適したアンプルに充填してもよい。
【００３７】
当業者に周知の方法を用いて、本発明の薬学的組成物を例えば動脈内注射、静脈内注射、または経皮注射として、同様に鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、または経口投与として患者に投与してもよい。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与方法に従って変化する。しかし、当業者は適した投与方法を日常的に選択することができる。前記化合物がDNAによってコードされる場合、遺伝子治療のためにDNAをベクターに挿入し、このベクターを治療を行うために患者に投与することができる。投与の用量および方法は患者の体重、年齢、および症状に応じて変化するが、当業者はそれらを適切に選択することができる。
【００３８】
例えば、本発明のタンパク質に結合してその活性を調節する化合物の用量は症状に依存するが、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合、用量は一日当たり約0.1 mg〜約100 mg、好ましくは一日当たり約1.0 mg〜約50 mg、およびより好ましくは一日当たり約1.0 mg〜約20 mgである。
【００３９】
正常な成人（体重60 kg）に対して注射剤形態で非経口投与する場合、患者、標的臓器、症状、および投与方法に従って何らかの差があるが、一日当たり約0.01 mg〜約30 mg、好ましくは一日当たり約0.1〜約20 mg、およびより好ましくは一日当たり約0.1〜約10 mgの用量を静脈内注射することが都合がよい。同様に、他の動物の場合においても、体重60 kgに変換した量を投与することが可能である。
【００４０】
上述したように、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを減少させることができる。腸型胃癌において上方制御されているマーカー遺伝子に対応するアンチセンス核酸は、腸型胃癌の治療にとって有用である。特に、本発明のアンチセンス核酸は、それに対応するマーカー遺伝子またはmRNAに結合し、これにより遺伝子の転写または翻訳を阻害、mRNAの分解を促進、および／またはマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最後的にタンパク質の機能を阻害することによって作用しうる。本発明において用いられるように「アンチセンス核酸」という用語は、アンチセンス核酸が標的配列と特異的にハイブリダイズ可能である限り、標的配列に対して完全に相補的であるヌクレオチドと、一つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの双方を含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15連続ヌクレオチドの長さにわたって、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野で公知のアルゴリズムを用いて相同性を決定することができる。
【００４１】
本発明のアンチセンス核酸誘導体は、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合、その転写または翻訳を阻害、mRNAの分解を促進、およびタンパク質の発現を阻害し、これによりタンパク質の機能を阻害することによって、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を産生する細胞に作用する。
【００４２】
同様に、マーカー遺伝子に対するsiRNAを用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを低下させることができる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を阻害する二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNAの転写の鋳型である方法を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な方法が用いられる。本発明の文脈において、siRNAは、表1に記載する遺伝子のような、上方制御されたマーカー遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、一つの転写物が標的遺伝子からのセンスおよび相補的アンチセンス配列の双方、例えばヘアピンを有するように構築される。
【００４３】
本方法は、例えば細胞の悪性形質転換の結果として上方制御された細胞における発現を変化させるために用いられる。標的細胞において、表1の上方制御されたマーカー遺伝子の一つに対応する転写物にsiRNAが結合すると、細胞によるタンパク質産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在する転写物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さが19〜25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが75、50、25ヌクレオチド未満である。
【００４４】
siRNAのヌクレオチド配列は、Ambionのウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から利用できるsiRNA設計コンピュータープログラムを用いて設計した。このコンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００４５】
siRNA標的部位の選択：
1．転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列に対して下流にスキャンする。各AAの頻度および可能性があるsiRNA標的部位として3'隣接19ヌクレオチドを記録する。Tuschlらは、5'および3'の非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン近傍の領域（75塩基内）には調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があるため、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨する。UTR結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する可能性がある。
2．可能性がある標的部位をヒトゲノムデータベースと比較して、他のコード配列に対して有意な相同性を有する如何なる標的配列も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/のNCBIサーバー上で見ることができる。
3．合成のための適格な標的配列を選択する。Ambionでは、好ましくはいくつかの標的配列を、評価すべき遺伝子の長さに沿って選択することができる。
【００４６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、これにより本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するために有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害剤は、それらが本発明のポリペプチドの生物学的活性を阻害することができるという点において有用である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、癌のような細胞増殖疾患を治療するために有用である。
【００４７】
本発明のアンチセンス核酸またはsiRNA誘導体は、誘導体に対して不活性な適した基剤と混合することによって、リニメント剤または湿布剤のような外用調製物に調製することができる。
【００４８】
同様に、必要であれば、誘導体は、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤等を添加することによって、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、溶液、点鼻液、および凍結乾燥物質に処方することができる。これらは、以下の公知の方法によって調製することができる。
【００４９】
アンチセンス核酸またはsiRNA誘導体は、病気の部位に直接適用することによって、またはそれが病気の部位に達するように血管に注射することによって患者に投与される。アンチセンスを含む培地も同様に耐久性および膜の透過性を増加させるために用いることができる。例は、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体である。
【００５０】
本発明のアンチセンス核酸誘導体の用量は、患者の状態に応じて適切に調節することができ、所望の量で用いることができる。例えば、0.1〜100 mg/kgの用量範囲、好ましくは0.1〜50 mg/kgの範囲を投与することができる。
【００５１】
本発明のアンチセンス核酸には、改変されたオリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオール化ヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドに対してヌクレアーゼ抵抗性を付与してもよい。
【００５２】
本発明はさらに、遺伝子がDDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANK（商標）アクセッション番号AA533633およびAI755112）からなる群より選択され、腫瘍における発現レベルが対照値と比較して増加すれば腫瘍が転移性であることを示している、腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較する段階を含む、腫瘍が転移性であるか否かを決定する方法を提供する。
【００５３】
または、本発明は、遺伝子がUBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択され、腫瘍における発現レベルが対照値と比較して減少すれば腫瘍が転移性であることを示している、腫瘍における遺伝子の発現レベルを対照値と比較する段階を含む、腫瘍が転移性であるか否かを決定する方法を提供する。
【００５４】
もう一つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、被験者における腸型胃癌を診断する方法を提供する：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1に記載の遺伝子および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、診断すべき被験者から採取した標本における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（b）表１からのマーカー遺伝子の発現レベルが対照と比較して高ければ、または表2からのマーカー遺伝子の発現レベルが対照と比較して低ければ、腸型胃癌であることを示している、一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを対照の発現レベルと比較する段階。
【００５５】
さらに、本発明は、以下の段階を含む、リンパ節陰性癌および／またはリンパ節陽性癌を予測する方法を提供する：
（a）一つまたは複数のマーカー遺伝子がDDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、二つのEST（GENBANKアクセッション番号AA533633およびAI755112）、UBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択される、予測すべき被験者から採取した標本における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを検出する段階；ならびに
（b）DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANKアクセッション番号AA533633およびAI755112）からなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現レベルが、対照と比較して高ければもしくは低ければ、それぞれリンパ節陽性癌もしくはリンパ節陰性癌であることを示し、またはUBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択されるマーカー遺伝子の発現レベルが対照と比較して低ければもしくは高ければ、リンパ節陽性癌もしくはリンパ節陰性癌であることを示す、一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを対照の発現レベルと比較する段階。
【００５６】
本発明において、マーカー遺伝子は、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT5、CCT3、PPP2R1B、二つのEST（GENBANKアクセッション番号AA533633およびAI755112）、UBQLN1、AIM2、およびUSP9Xからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子であってもよい（図2a）。それらの中で、好ましくはDDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、およびAIM2を、マーカー遺伝子として選択してもよい。本発明において、これらの遺伝子5個を「予測因子（predictor)」と命名した。より好ましくは、DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、およびAIM2の全ての発現レベルを検出することができる。次に、マーカー遺伝子の発現レベルを正常対照と比較することができる。
【００５７】
もう一つの別の態様において、本発明の方法は、リンパ節陰性癌および／またはリンパ節陽性癌を区別する遺伝子の発現プロフィールをスコアリングする段階を含む。この方法の段階には、リンパ節陰性癌 対 リンパ節陽性癌において発現が異なるとして選択された遺伝子（すなわち「マーカー遺伝子」）の発現プロフィールを得る段階、および選択された遺伝子に対する発現プロフィールの対数比の関数を決定する段階が含まれる。「選択された遺伝子に対する発現プロフィールの対数比の関数を決定する段階」は、選択された遺伝子に対する発現プロフィールの加重対数比を合計する段階を含んでもよい。各遺伝子に関する加重は、平均対数比がリンパ節陰性癌の場合よりリンパ節陽性癌について高い場合に第一の値を割付され、平均対数比がリンパ節陰性癌の場合よりリンパ節陽性癌について低い場合に第二の値を割付される。好ましくは、第二の値は第一の値と実質的に反対であり、例えば、第一の値が1である場合、第二の値は-1である。一つの態様において、本発明の方法は、リンパ節陽性腫瘍とリンパ節陰性腫瘍とを区別する遺伝子発現プロフィールをスコアリングする段階を含む。計算された予測スコアは、試料組織が転移性の表現型を有するか否かを客観的に示すことができる診断指標として作用する。例えば、予測法における段階（b）は、各遺伝子に関する加重が、平均対数比がリンパ節陰性癌の場合よりリンパ節陽性癌について高い場合に第一の値であって、平均対数比がリンパ節陽性癌の場合よりリンパ節陰性癌について低い場合に第二の値である、選択された遺伝子に対する発現プロフィールの加重対数比を合計する段階を含む、選択された遺伝子に対する発現プロフィールの対数比の関数を決定する段階を含んでもよい。
【００５８】
本発明において、リンパ節陰性癌および／またはリンパ節陽性癌を予測する方法は、胃癌のリンパ節転移の有無を予測することを含む。または、リンパ節転移を有する胃癌または転移を有しない胃癌であるか否かを、本方法によって決定することができる。
【００５９】
特定の標本におけるマーカー遺伝子の発現レベルは、マーカー遺伝子に対応するmRNAまたはマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を定量することによって推定することができる。mRNAの定量法は当業者に既知である。例えば、マーカー遺伝子に対応するmRNAレベルは、マーカー遺伝子の全てのヌクレオチド配列が既知であることから、ノーザンブロッティングまたはRT-PCRによって推定することができる。本発明の各マーカー遺伝子のGenBankアクセッション番号を表1、表2および図2に記載する。如何なる当業者も、マーカー遺伝子を定量するためにプローブまたはプライマーのヌクレオチド配列を設計することができる。
【００６０】
同様に、マーカー遺伝子の発現レベルは、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または量に基づいて分析することができる。マーカータンパク質の量を決定する方法を下記に示す。例えば、イムノアッセイ法は、生体材料中のタンパク質を検出／定量するために有用である。任意の生体材料を、タンパク質またはその活性を検出／定量するために用いることができる。例えば、血液試料は、血清マーカーによってコードされるタンパク質を決定するために分析される。または、分析される各タンパク質の活性に従ってマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を決定するために適した方法を選択することができる。
【００６１】
標本（試験試料）におけるマーカー遺伝子の発現レベルを推定して正常試料におけるレベルと比較する。そのような比較によって、表1に示すマーカー遺伝子の発現レベルが正常試料の発現レベルより高いことが示される場合、被験者は、腸型胃癌に罹患していると判断される。正常な個体および被験者からの標本におけるマーカー遺伝子の発現レベルは同時に決定してもよい。または、発現レベルの正常範囲は、対照群から予め採取した標本におけるマーカー遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づいて統計学的方法によって決定することができる。被験者の試料を調べることによって得た結果を正常範囲と比較して、結果が正常範囲に入らない場合、被験者は腸型胃癌に罹患していると判断される。
【００６２】
本発明において、腸型胃癌を診断する診断物質も同様に提供する。本発明の診断物質は、マーカー遺伝子のDNAまたはタンパク質に結合する化合物を含む。好ましくは、マーカー遺伝子のポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を化合物として用いてもよい。本発明はさらに、被験者から採取した試料標本のマーカー遺伝子発現プロフィールと対照（すなわち、非癌性）標本のマーカー遺伝子発現プロフィールとを比較する段階を含む、被験者における腸型胃癌を診断する方法を提供する。発現プロフィール分析によって、発現プロフィールが腸型胃癌の特徴を含むことが示される場合、被験者は疾患に罹患していると判断される。特に、マーカー遺伝子の全てではないがそのほとんどが、遺伝子発現レベルの腸型胃癌関連変化パターンを示す場合、マーカー遺伝子の発現プロフィールを含む発現プロフィールは腸型胃癌の特徴を有する。例えば、発現プロフィールを構成するマーカー遺伝子の50％またはそれ以上、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは90％またはそれ以上が遺伝子発現レベルの腸型胃癌関連変化パターンを示す場合、発現プロフィールは腸型胃癌の特徴を有すると結論付けても構わない。
【００６３】
本発明の診断法において、その発現レベルを比較するために多数のマーカー遺伝子を選択することが好ましい。比較のために選択されるマーカー遺伝子がより多い程、診断はより信頼できる。多くの遺伝子の発現レベルは、発現プロフィールを用いることによって簡便に比較することができる。「発現プロフィール」という用語は、多くの遺伝子、好ましくは良性組織と比較して腸型胃癌において異なるように発現されている、または転移性と非転移性の表現型の間で異なるように発現されているマーカー遺伝子の発現レベルのコレクションを意味する。
【００６４】
本発明の方法の有意な長所は、診断または予後の決定が主観的よりむしろ客観的になされる点である。初期の方法は、組織学試料の主観的検査に基づいていたために限界があった。もう一つの長所は感度である。本明細書に記述の方法は、正常、前癌性（すなわち、良性腺腫）、および発癌プロセスの非常に早期の癌性組織（すなわち胃癌）を区別することができるが、主観的な組織学的検査は、前癌状態の非常に早期の検出には用いることができない。この方法はまた、患者の予後、すなわち癌が転移性であるか、または転移性となる可能性があるか否かに関する貴重な情報を提供する。
【００６５】
さらなる態様において、本発明は、腸型胃癌の治療において可能性がある標的である候補物質をスクリーニングする方法を提供する。先に詳述したように、マーカー遺伝子の発現レベルまたは活性を制御することによって、腸型胃癌の発症および進行を制御することができる。このように、腸型胃癌の治療において標的となる可能性がある候補物質は、指標としてマーカー遺伝子の発現レベルおよび活性を用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含んでもよい：
（1）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載される遺伝子からなる群より選択される、一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；ならびに
（2）表1に示す一つもしくは複数の上方制御されたマーカー遺伝子の発現レベルを対照と比較して減少させる化合物、または表2に示す一つもしくは複数の下方制御されたマーカー遺伝子の発現を対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【００６６】
マーカー遺伝子を発現する細胞には、例えば、腸型癌から確立された細胞株が含まれ、そのような細胞は、本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。
【００６７】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
（1）候補化合物を試験動物に投与する段階；
（2）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載される遺伝子からなる群より選択される、試験動物からの生体試料における一つまたは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを測定する段階；
（3）表1から選択された一つもしくは複数の上方制御されたマーカー遺伝子の発現レベルを対照と比較して減少させる化合物、または表2から選択された一つもしくは複数の下方制御されたマーカー遺伝子の発現を対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【００６８】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
（1）一つまたは複数のマーカー遺伝子が表1および表2に記載される遺伝子からなる群より選択される、一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
（2）前記レポーター遺伝子の活性を測定する段階；ならびに
（3）マーカー遺伝子が表1から選択された上方制御された遺伝子である場合に前記レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物、またはマーカー遺伝子が表2から選択された下方制御された遺伝子である場合に、前記レポーター遺伝子の発現レベルを対照と比較して増強する化合物を選択する段階。
【００６９】
適したレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野で既知である。スクリーニングにとって必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知である場合、レポーター構築物は、これまでの配列情報を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントを、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリから単離することができる。
【００７０】
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含んでもよい：
（1）マーカー遺伝子が表1および表2に記載の遺伝子からなる群より選択される、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に候補化合物を接触させる段階；
（2）前記タンパク質の活性を測定する段階；および
（3）マーカー遺伝子が表1から選択される上方制御された遺伝子である場合に前記タンパク質の活性を低下させる化合物、またはマーカー遺伝子が表2から選択される下方制御された遺伝子である場合に前記タンパク質の活性を増強する化合物を選択する段階。
【００７１】
スクリーニングにとって必要なタンパク質は、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列を用いて組換え型蛋白質として得ることができる。マーカー遺伝子の情報に基づいて、当業者は選択された生物学的活性に基づいたスクリーニングおよび測定法に関する指標としてタンパク質の任意の生物学的活性を選択することができる。
【００７２】
選択されたマーカー遺伝子の発現レベルが腸型胃癌において減少している（すなわち、下方制御されたマーカー遺伝子）本発明のスクリーニング法では、遺伝子の発現レベルを対照と比較して増加させる活性を有する化合物を候補物質として選択すべきである。逆に、その発現レベルが腸型胃癌において増加しているマーカー遺伝子（すなわち、上方制御されたマーカー遺伝子）をスクリーニング法において選択する場合、発現レベルを対照と比較して減少させる活性を有する化合物を候補物質として選択すべきである。
【００７３】
本発明のスクリーニングにおいて用いられる候補物質の種類に制限はない。本発明の候補化合物は、以下を含む、当技術分野で既知の組み合わせライブラリ法の多数の任意のアプローチを用いて得ることができる：生物ライブラリ法；空間的位置づけ可能な平行固相または液相ライブラリ法；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法；「1ビード1化合物」ライブラリ法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法。生物ライブラリアプローチは、ペプチドライブラリに限定されるが、他の四つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子のライブラリに応用することができる（Lam（1997）、Anticancer Drug Des. 12：145）。分子ライブラリを合成するための方法の例は、当技術分野において、例えばDeWittら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6909；Erbら（1994）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422；Zuckermannら（1994）、J. Med. Chem. 37：2678；Choら、（1993）Science 261：1303；Carrellら（1994）、Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2059；Carrellら（1994）、Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2061；およびGallopら（1994）、J. Med. Chem. 37：1233に認められうる。化合物のライブラリは溶液中（例えば、Houghten（1992）、BioTechniques 13：412）、またはビーズ上（Lam（1991）、Nature 354：82）、チップ（Fodor（1993）、Nature 364：555）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号；第5,403,484号；および第5,223,409号）、プラスミド（Cullら（1992）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865）、またはファージ（Scott および Smith（1990）、Science 249：386；Devlin（1990）、Science 249：404；Cwirlaら（1990）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：6378；ならびにFelici（1991）、J. Mol. Biol. 222：301）（米国特許出願第2002/0103360号）で呈示されうる。
【００７４】
本発明は、抗体、特に上方制御されたマーカー遺伝子によってコードされたタンパク質に対する抗体、または抗体断片を用いることに関する。本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いられる抗原（すなわち、上方制御されたマーカー遺伝子産物）、またはそれに極めて近縁の抗原に限って相互作用する（すなわち、結合する）特異的構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。さらに、抗体は、マーカー遺伝子によってコードされた一つまたは複数のタンパク質に結合する限り、抗体または改変された抗体の断片であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはHおよびL鎖からのFv断片が適当なリンカーによってライゲーションされている一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Huston, J.S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879〜5883（1998））。より詳細に述べると、抗体断片は、パパインまたはペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して、発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Co M.S.ら、J. Immunol. 152：2968〜2976（1994）；Better, M. and Horwitz, A.H.、Methods Enzymol. 178：476〜496（1989）；Pluckthun, A. および Skerra, A.、Methods Enzymol. 178：497〜515（1989）；Lamoyi, E.、Methods Enzymol. 121：652〜663（1986）；Rousseaux, J.ら、Methods Enzymol. 121：663〜669（1986）；Bird, R.E. および Walker, B.W.、Trends Biotechnol. 9：132〜137（1991）を参照されたい）。
【００７５】
抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）のような多様な分子との結合によって改変してもよい。本発明は、そのような改変された抗体を提供する。改変された抗体は、抗体を化学的に改変することによって得ることができる。これらの改変法は、当技術分野において慣習的な方法である。
【００７６】
本発明はさらに、腸型胃癌を治療する方法を提供する。本発明は、腸型胃腫瘍において、正常上皮と比較して特定の識別マーカー遺伝子の発現レベルが有意に増加（すなわち、上方制御）または減少（すなわち、下方制御）することを明らかにした（表1および2に記載の遺伝子を参照されたい）。したがって、これらの任意のマーカー遺伝子を、腸型胃癌の治療における標的として用いることができる。特に、マーカー遺伝子の発現レベルが腸型胃腫瘍において上昇している場合（上方制御；例えば表1の遺伝子）、病態は、発現レベルを減少させる、またはその活性を抑制することによって治療することができる。マーカー遺伝子の発現レベルを制御する方法は当業者に既知である。例えば、マーカー遺伝子の発現レベルを減少させるために、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸またはsiRNAを投与することができる。または、タンパク質の生物学的活性を阻害するために、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を投与することができる。
【００７７】
逆に、マーカー遺伝子の発現レベルが腸型胃腫瘍において減少している場合（下方制御；例えば、表2の遺伝子）、病態は、発現レベルを増加させるまたは活性を増強することによって治療することができる。例えば、腸型胃癌は、下方制御されたマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を投与することによって治療することができる。このタンパク質は、患者に直接投与してもよく、または例えば下方制御されたマーカー遺伝子を有する発現ベクターもしくは宿主細胞を投与することによって、患者に導入された後にインビボで発現させてもよい。遺伝子のインビボ発現のための適したメカニズムは当技術分野で公知である。または、腸型胃癌は、上方制御されたマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を投与することによって治療することができる。さらなる態様において、腸型癌は、上方制御されたマーカー遺伝子に対するアンチセンス核酸を投与することによって治療することができる。
【００７８】
腸型胃癌を治療する方法を提供することに加え、本発明はまた、腸型胃癌を予防する方法、より詳細には、腸型胃癌の発症、進行、および転移を予防する方法を提供する。特に、本発明は、マーカー遺伝子が表1に記載する遺伝子のような腸型胃癌において上方制御された遺伝子を含む、一つまたは複数のマーカー遺伝子に対応するDNA、マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそのようなタンパク質の抗原性断片を投与する段階を含む、腸型胃癌に対して被験者をワクチン接種する方法を提供する。ワクチンは、多数の上方制御されたマーカー遺伝子に対応する多数のワクチン抗原を含んでもよい。
【００７９】
本発明は、上方制御されたマーカー遺伝子（例えば、表1の遺伝子）に対応するポリペプチドに対する抗体を用いて、腸型胃癌のような細胞増殖疾患を治療または予防する方法を提供する。本方法に従って、本発明のポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。表1の遺伝子の発現は腸型腺癌細胞において上方制御されていることから、かつこれらのタンパク質の発現の抑制によって細胞増殖活性の減少が起こることから、腸型胃癌は抗体およびこれらのタンパク質の結合によって治療または予防することができると予想される。このように、表1のマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドに対する抗体は、対応するマーカータンパク質の活性を低下させるために十分な用量で投与される。または、腫瘍細胞に対して特異的な細胞表面マーカーに結合する抗体を、薬物輸送のためのツールとして用いることができる。例えば、細胞障害物質を有する抗体を、腫瘍細胞を障害するために十分な用量で投与する。
【００８０】
または、抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として得てもよい。そのような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。
【００８１】
本発明は、予防的および治療的ワクチンを提供する。本発明の文脈において、「ワクチン」という用語は、腸型胃腫瘍に対する免疫を誘導する抗原性製剤を意味する。免疫は一過性であってもよく、一回またはそれ以上の追加免疫を必要としてもよい。
【００８２】
ワクチン内の抗原は、表1に記載されるような一つもしくは複数の上方制御されたマーカー遺伝子に対応するDNA、またはそのようなマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質もしくはその抗原性断片を含んでもよい。本発明の文脈において、「抗原性断片」という用語は、体に導入された場合にマーカー遺伝子に対して特異的な抗体の産生、または腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導を刺激する、分子の一部を意味する。
【００８３】
本発明はまた、上方制御されたマーカー遺伝子（例えば、表1の遺伝子）に対応するタンパク質；その免疫学的活性断片；またはこのタンパク質の任意の一つおよびその断片をコードする核酸を投与する段階を含む、抗腫瘍免疫を誘導する方法にも関する。表1の上方制御されたマーカー遺伝子のタンパク質またはその免疫学的活性断片は、腸型胃癌に対するワクチンとして有用である。本発明において、腸型胃癌に対するワクチンは、動物に接種した場合に、抗腫瘍免疫を誘導する作用を有する物質を意味する。一般的に、抗腫瘍免疫には、以下のような免疫応答が含まれる：
−  腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
−  腫瘍を認識する抗体の誘導、および
−  抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【００８４】
したがって、特定のタンパク質の動物への接種によって、これらの免疫応答の任意の一つが誘導される場合、タンパク質は、抗腫瘍免疫誘導作用を有すると言われる。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、インビボまたはインビトロでタンパク質に対する宿主の免疫系の反応を観察することによって検出することができる。
【００８５】
例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。生体に入る外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによる抗原提示に対して抗原特異的に反応するT細胞は、抗原による刺激のために細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化して、その後増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、特定のペプチドによるCTLの誘導は、APCによるペプチドのT細胞への提示、およびCTL誘導の検出によって評価することができる。さらに、APCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する作用を有する。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞は抗腫瘍免疫においても重要であることから、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化作用を指標として用いて評価することができる。
【００８６】
例えば、樹状細胞（DC）をAPCとして用いるCTLの誘導作用を評価する方法は周知である。DCは、最も強いCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法において、試験ポリペプチドをまずDCに接触させて、次にこのDCをT細胞に接触させる。DCとの接触後に対象となる細胞に対して細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、試験ポリペプチドが細胞障害性T細胞の誘導活性を有することを示している。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば、指標として51Cr標識腫瘍細胞の溶解を用いて検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH（乳酸デヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法も同様に周知である。
【００８７】
APCはDCに限定されず、末梢血単核細胞（PBMC）を用いてもよい。この場合、CTLの誘導はPBMCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で培養することによって増強することができるという報告がある。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることが示されている。
【００８８】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された試験ポリペプチドは、DC活性化作用およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、腸型腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腸型胃癌に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドとの接触によって腸型腫瘍に対するCTLの誘導能を獲得したAPCは、腸型胃癌に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチド抗原の提示により細胞障害性を獲得したCTLも同様に、腸型胃癌に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いて腸型胃癌を治療または予防するためのそのような治療方法は、細胞性免疫治療と呼ばれる。
【００８９】
一般的に、細胞性免疫治療のためにポリペプチドを用いる場合、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせて、それらをDCに接触させることにより、CTL誘導効率は増加することが知られている。したがって、DCをタンパク質断片によって刺激する場合、多数の種類の断片の混合物を用いることが都合がよい。
【００９０】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することができる。例えば、ポリペプチドによって免疫した実験動物においてそのポリペプチドに対する抗体を誘導させて、腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制されれば、ポリペプチドは抗腫瘍免疫の誘導能を有する。
【００９１】
抗腫瘍免疫は、本発明のワクチンを投与することによって誘導され、これによって、腸型胃癌の治療および予防が可能となる。癌に対する治療または癌の発症を予防する作用は、癌性細胞の増殖に対する阻害活性、癌の退縮、および癌の発生の抑制のような、任意の一つの段階であってもよい。そうでなければ、作用は、癌を有する個体の死亡率の減少、血液中の腫瘍マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減等であってもよい。そのような作用は、好ましくはワクチンを投与していない対照と比較した、胃癌に対する治療効果または癌の発症に対する予防作用に関して、例えば有意水準5％またはそれ未満の統計学的に有意な知見である。例えば、スチューデントのt検定、マンホイトニーU検定、またはANOVAを統計分析に用いてもよい。
【００９２】
免疫学的活性を有する上記のタンパク質またはこのタンパク質をコードするベクターをアジュバントと組み合わせてもよい。アジュバントは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続的に）投与した場合に、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を意味する。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適当に併用してもよい。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは全身投与または局所投与される。ワクチン投与は、1回投与であってもよく、多数回投与によって強化してもよい。
【００９３】
APCまたはCTLを本発明のワクチンとして用いる場合、腫瘍は、例えば、エクスビボ法によって治療または予防することができる。より詳細に述べると、治療または予防を受ける被験者のPBMCを採取し、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させ、APCまたはCTLを誘導した後、細胞を被験者に投与することができる。APCはまた、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは投与前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷する高い活性を有する細胞をクローニングおよび増殖させることによって、細胞性免疫治療をより有効に行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLは、細胞が由来する個体に対するのみならず、他の個体からの類似の種類の腫瘍に対する細胞性免疫治療のために用いてもよい。さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む腸型胃癌のような細胞増殖疾患を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を生じさせるために用いてもよい。このように、一つまたは複数の上方制御されたマーカー遺伝子（例えば、表1の遺伝子）に対応するポリペプチドを用いて腸型胃癌を治療してもよい。
【００９４】
以下の実施例は本発明の局面を説明するが、決して本発明の範囲を制限することを意図していない。
【００９５】
実施例
本発明より以前では、腸型胃腫瘍に関係する遺伝子に関する知識は断片的であった。本明細書において、腸管胃粘膜の転移性および初期病変の発現プロフィールを調べて比較し、転移への進行の際に発現の変化を受ける遺伝子に関する情報を得た。本明細書に記載のデータは、多段階の発癌の際にどのようにして発現プロフィールが変化したかに関するゲノム全体の情報を提供する。
【００９６】
特に、腸型腺癌の発症および／または進行の基礎となる遺伝子メカニズムを決定するために、腸型胃腫瘍20例のレーザービームを用いた顕微鏡下微小切除によって得られた癌細胞の遺伝子発現プロフィールを、遺伝子23,040個からなるcDNAマイクロアレイを用いて、対応する非癌性粘膜における遺伝子の発現と比較した。調べた癌組織において、遺伝子62個が一貫して上方制御され、76個が一貫して下方制御されていることが判明した。それらの遺伝子の12個の発現の変化はリンパ節転移に関連した。本発明者らのパネルにおいて転移を有する腫瘍とリンパ節陰性腫瘍とを区別することができた遺伝子5個の発現プロフィールに基づく「予測スコア」は、さらなる胃癌4個のリンパ節状態を正確に診断した。データは、臨床医がリンパ節への転移を予測する際の貴重な指標を提供する。システムはまた、この種類の癌の新規治療標的を同定するために有用である。
【００９７】
胃癌
組織学研究は胃癌を、疫学、病因学、病原論、および生物学的挙動に関して異なる特徴を有する、二つの異なる群、すなわち腸型（または分化型）およびびまん型（または未分化型）に分類した。腸型は、高齢者により多く起こり、予後はより良好であるが、びまん型胃癌は、性別によらず比較的若い人に認められ、重篤な臨床経過を示すより浸潤性の高い表現型を示す。腸型胃癌は、萎縮性胃炎の結果であると推定され、その後腸上皮化生および／または異形成へと進行するが、びまん型腫瘍の前駆病変はわかっていない。
【００９８】
疫学および実験研究は、薫製、塩分を含むおよび硝酸塩を含む食物を大量に摂取し、かつ野菜および果物の摂取量が少ないと、胃癌のリスクを増大させること、かつヘリコバクター・ピロリ感染症はこの疾患の危険因子であることを明らにした。多数の遺伝的変化は胃の腫瘍発生に関与している。ヘテロ接合性の喪失（LOH）は、染色体1p、5q、7p、12q、13q、17p、18q、およびY上での座で頻繁に認められる。K-ras、CTNNB1（β-カテニン）、c-erbB-hs 2、K-sam、cyclinE、およびc-metを含む癌遺伝子の変化および／または増幅は、いくつかの胃癌において役割を有し、p53、RB、APC、DCC、および／またはCDH1（E-カドヘリン）のような腫瘍抑制遺伝子の不活化も同様に要因となりうる。CDH1における生殖系列変異は、通常びまん型腫瘍を患っている家族性胃癌患者のサブセットにおける疾患に関与する。APCまたはCTNNB1における変異は、腸型腫瘍において選択的に認められる。
【００９９】
胃癌組織における多数の遺伝子の発現の変化に関する包括的な分析を行うために、腸型胃癌組織の遺伝子発現プロフィールのゲノム全体の分析を行った。レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除によって組織試料を得て、腫瘍細胞からのRNAを、遺伝子23,040個を含むcDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。腸型胃癌において発現が変化した遺伝子の組と共に、リンパ節転移に関連した組を定義した。分析は以下のように実施した。
【０１００】
患者および組織試料
原発性胃癌および対応する非癌性胃粘膜を、胃切除を受けた患者20人から得た。患者のプロフィールは診療記録から得た。標準的なLaurenの分類（Laurenら、1965、Acta. Path. Microbiol. Scand. 64：31〜49）に従って実施した各腫瘍の組織病理学的分類は、全ての試料を腸型腺癌であると診断した。臨床病期は、標準的なUICC TNM分類に従って決定した。最初に分析した胃癌組織20個には、進行癌18例（T2〜T4）、および初期症例（T1）2例が含まれた。進行した分類には、リンパ節陽性腫瘍9例およびリンパ節陰性腫瘍9例が含まれた。リンパ節陽性患者とリンパ節陰性患者との間には、年齢、性別、腫瘍の深さ、または腫瘍の進行度に有意差は認められなかった。試料は全て、直ちに凍結して、TissueTek OCT培地（Sakura、東京、日本）に抱埋し、マイクロアレイ分析に用いるまで-80℃で保存した。
【０１０１】
レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除、RNAの抽出、およびT7に基づくRNA増幅
癌細胞および非癌性胃上皮は、レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除を用いて保存された試料から選択的に採取した。総RNAの抽出およびT7に基づく増幅は標準的な方法を用いて行った。癌性組織および非癌性組織それぞれからの増幅されたRNA（aRNA）2.5 μgアリコートを、それぞれCy3-dCTPおよびCy5-dCTPによって標識した。
【０１０２】
cDNAマイクロアレイおよびデータの分析
cDNAマイクロアレイスライドの作製、ハイブリダイゼーション、洗浄、およびシグナルの検出は、当技術分野で公知の方法を用いて行った。各標的スポットに関するCy5（非腫瘍）およびCy3（腫瘍）の蛍光強度は、ハウスキーピング遺伝子52個のCy3/Cy5比の平均値が1に等しくなるように調節した。低いシグナル強度に由来するデータは信頼性が低いことから、最初に各スライドガラス上のシグナル強度に関してカットオフ値を決定して、Cy3およびCy5色素の双方がカットオフより低いシグナル強度を示す場合には、遺伝子にこれ以上の分析を行わなかった。遺伝子をその発現比（Cy3/Cy5）に従って三つの群に分類した：上方制御された発現（比が2.0に等しいまたはそれより大きい）、下方制御された発現（比が0.5に等しいまたはそれより小さい）、および変化しない発現（比が0.5〜2.0である）発現。調べた症例の75％より多い症例においてCy3/Cy5比が2.0より大きい、または0.5より小さい遺伝子を、それぞれ共通して上方制御または下方制御された遺伝子であると定義した。
【０１０３】
リアルタイム定量的RT-PCR
四つの上方制御された遺伝子（CDH3、NHE1、PLAB、およびSOX9）を選択して、リアルタイムRT-PCR技術（TaqMan PCR、Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州）を適用することによってその発現レベルを調べた。グルタミニル-tRNAシンセターゼ（QARS）遺伝子は、実験の間に示したCy3/Cy5変動が最も小さかったことから、内部対照としての役割を有した。TaqManアッセイ法は、アレイ分析のために用いた同じaRNAについて製造元のプロトコールに従って行った。PCR反応は95℃で10分間行った後、95℃で15秒、および60℃で1分を40サイクル行った。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りであった：
QARSフォワードプライマー、 5’-GGTGGATGCAGCATTAGTG GA-3’ (配列番号:1)
および
リバース、5’-AAGACGCTCAAA CTGGAACTTGTC-3’ (配列番号:2)； 
プローブ、5’-VIC-CTCT GTGGCCCTGGCAAAACCCTT-TAMRA-3’ (配列番号:3)； 
CDH3フォワードプライマー、5’-CTTCAAAA GTGCAGCCCAGA-3’  （配列番号：4）
および
リバース、5’-GCAACCTAGGCACACTCAGTATAAAA-3’ （配列番号：5）； 
プローブ、5’-FAM-TGGCCGTCCTGCATTT CTGGTTTC-TAMRA-3’ （配列番号：6）；
NME1フォワードプライマー、5’-CAGAGAAGGAGATCGGCTTGT G-3’（配列番号：7）
および
リバース、5’-CTTGTCATTCAT AGATCCAGTT-3’ （配列番号：8）； 
プローブ、5’-FAM-CACCC TGAGGAACTGGTAGATTACACGAGC-TAMRA-3’（配列番号：9）； 
PLABフォワードプライマー、5’-GTGC TCATTCAAAAGACCGACA-3’ （配列番号：10）
および
リバース、5’-GGAAGGACCAGGACTGCTCATA T-3’（配列番号：11）； 
プローブ、5’-FAM-TTAGCCAAA GACTGCCAC-TAMRA-3’（配列番号：12）； 
SOX9フォワードプライマー、5’-TGCAAGCATGTGTCATCCA-3’ （配列番号：13)）
および
リバース、5’-AGCAATCCTCAAACTCTCTAGCC-3’ （配列番号：14）； 
プローブ、5’-FAM-CTCTGCATCTTCTCTTGGAGTG-TAMRA-3’ （配列番号：15）
【０１０４】
発現に差のある遺伝子の同定および「予測スコア」の開発
リンパ節陽性腫瘍およびリンパ節陰性腫瘍間における平均発現レベル（Cy3/Cy5）における有意な差を示す「予測因子」遺伝子を同定するために、無作為並べかえ検定（random permutation test）を行った（Golubら、1999、Science 286：531〜537）。並べかえP値＜0.01は、有意であると見なされた。その後、フォワードステップワイズ判別関数分析により、「予測因子」遺伝子（j）の判別係数（kj）および一定値（C＝-1.945）を決定した。「予測スコア（Xi）」は、以下の式によって各試料（i）について計算した：
Xi=Σj kj × log2(rij) + C
式中、rijは、試料iの遺伝子jの発現比（Cy3/Cy5）である。統計分析は、SPSSソフトウェアパッケージによって行った（SPSS社、シカゴ）。
【０１０５】
腸型胃癌において共通して上方制御または下方制御された遺伝子の同定
腸型胃癌の発癌の基礎となるメカニズムを決定するために、この種類の腫瘍において一貫して上方制御または下方制御された遺伝子を同定した。腫瘍20例における20,000個を超える遺伝子のcDNAマイクロアレイ分析から、調べた症例の75％を超える症例において上方制御された遺伝子62個（機能不明の17個を含む）が同定された（表1）。遺伝子76個（機能不明の27個を含む）が、調べた試料の75％またはそれ以上において下方制御されることが判明した（表2）。
【０１０６】
（表１）腸型胃癌において一貫して上方制御された遺伝子
2005532077.tif 000003
調べた症例の75％を超える症例において、その標準化発現比（腫瘍／正常）が2より大きかった遺伝子を選択した。上方制御された遺伝子の割合、発現比の中央値（Cy3/Cy5）、およびGenBankアクセッション番号を示す。遺伝子の機能は、典拠またはNCBIのLocusLink（www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink）に従って要約した。
【０１０７】
（表２）腸型胃癌において一貫して下方制御された遺伝子
2005532077.tif 000004
2005532077.tif 000005
調べた症例の75％を超える症例において、その標準化発現比（腫瘍／正常）が0.5より小さかった遺伝子を選択した。下方制御された遺伝子の割合、発現比の中央値（Cy3/Cy5）、およびGenBankアクセッション番号を示す。遺伝子の機能は、典拠またはNCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink）のLocusLinkに従って要約した。
【０１０８】
一貫して上方制御された要素には、シグナル伝達経路に関連する遺伝子（GFRA2、HGF、HRH1、PLEK2、PLAB、PPI5PIV）、転写因子をコードする遺伝子（NFIL3、LHX1、SOX9、IRF7、HOXB7、およびHSF4）、ならびに様々な代謝経路（SCD、CHST1、LPAP、PRPS1）、輸送系（TFRC、SLC2A1、SLC16A1、SLC16A2、SLC25A4）、細胞増殖（MIA）、抗アポトーシス（BCL2）、タンパク質翻訳およびプロセシング（EIF3S9、HSPA9B、HSPCB、RPL10）、DNA複製および組換え（RPA3、RUVBL1、PRDKC）、または他の機能（NME1、PROCR、SERPING1、およびHRG）に関係する遺伝子が含まれた。
【０１０９】
一貫して下方制御される遺伝子には、胃粘膜に対して特異的であり、かつ脂質代謝 （MTP、APOB、APOA4、APOA1）、糖質代謝（KHK、ADH3、ALDH3、FBP1、ADH1、ALDOB、MGAM）、薬物代謝（CYP2C9、CYP3A7、CYP3A5）、二酸化炭素代謝（LOC56287、CA2）、防御反応（TFF1、TFF2）、または小分子もしくは重金属の輸送（ATP2A3、GIF、ATP4B、MT1E、MT1H）に関係する遺伝子があった。
【０１１０】
データの再現性は、カットオフ値より低いシグナル強度を有する遺伝子を除外した場合85％より大きかった。マイクロアレイのデータをさらに確認するために、四つの共通して上方制御された遺伝子（NME1、CDH3、PLAB、SOX9）を選択し、RNA試料11対を用いて定量的RT-PCRを行った。結果は、四つ全ての遺伝子に関するマイクロアレイデータと非常に類似であった（図1）。これらのデータは、用いた分析的アプローチが信頼でき、かつ予測可能であることを示している。
【０１１１】
リンパ節転移に関連した遺伝子の同定
リンパ節への腫瘍転移に関連した遺伝子を同定した。リンパ節陽性症例9例における発現プロフィールを、リンパ節陰性腫瘍試料9個の発現プロフィールと比較した。無作為並べかえ試験によって発現に差のある（P値は0.01未満）遺伝子12個を同定した（図2A〜B）。リンパ節陽性腫瘍において、遺伝子12個中9個（DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、CCT3、CCT5、PPP2R1B、および二つのEST（GENBANK（商標）アクセッション番号AA533633およびAI755112））は相対的に上方制御され、3個（UBQLN1、AIM2、およびUSP9X）は下方制御された。
【０１１２】
リンパ節転移に関する「予測スコア」の開発
リンパ節転移の予測に関するスコアリングパラメータを得るために数学的等式を開発した。リンパ節陽性腫瘍とリンパ節陰性腫瘍との間で発現に統計学的に有意な差を有する遺伝子12個のうち、フォワードステップワイズ判別関数分析は独立した「予測因子」として5個を同定した。判別関数分析によって、遺伝子の発現レベルが他の遺伝子に様々に関連するか否かを調べた。他の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼさない遺伝子5個をこの分析によって選択した。これらの遺伝子5個は、「予測因子」と命名した。「予測スコア」は、これらの遺伝子5個（予測因子）の発現プロフィールおよびその判別係数を用いて計算した。「予測スコア」は、以下の段階によって決定されている：
−  遺伝子の対数発現比（Cy3/Cy5）を決定する段階、
−  対数発現比に対して判別係数を乗じる段階、
−  対数発現比毎の判別係数の値を合計する段階（多数の遺伝子が予測因子として選択された場合）、および
−  一定値を合計に加える段階。
予測スコアがプラスである場合にリンパ節転移が陽性であり、予測スコアがマイナスである場合には陰性であると決定した。
「一定値」：判別スコア、各群の平均値の中央値。
【０１１３】
試料を二つの群に分類する場合、各試料の分類は、試料の値がより近い2群の平均値の基準に従って行われる。本明細書において、「一定値」は、各試料に関して、それに基づいてこの分析が行われる値として用いることができる。特に、判別スコアを0に設定することによって（判別スコアが2群の平均値の平均値（または中央値）として得られる）、および各試料の「一定値」が判別スコアに関して陽性または陰性であるか否かを決定することによって、試料の分類を行うことができる。分類の結果として、試料が疾患を有するか否かを判断することができる。
「判別係数」：判別に関係する各遺伝子の「加重」。
【０１１４】
「判別係数」は、2群の平均値の差を2群の標準偏差の合計によって除することによって得られる。
【０１１５】
測定値およびその分散の程度は、各遺伝子に特異的であり、一般的に他の遺伝子の値とは異なる。したがって、いくつかの遺伝子が同じ量の発現を示す場合であっても、その「測定値」の有意性は遺伝子の種類に応じて変化する（分散の程度が高ければ、有意性は低下する。逆に、分散の程度が低い場合には、有意性は増加する。もう一つの局面において、2群をより遠くに分離する程、有意性はより大きくなる。逆に、2群が近い程、有意性はより小さくなる。）。分散の程度が1として表記される場合に2群間の距離を表す定数は、「分散」および「2群の距離」の二つの値に由来し、二つの値は上記のように、各遺伝子に対して特異的である。この定数は、2群を互いに判別する場合に、各遺伝子の「加重」として利用される。
【０１１６】
図2AおよびBに示すように、このスコアリングシステムは、リンパ節陽性腫瘍をリンパ節陰性腫瘍から正確かつ信頼できるように分離した。分類が強固であることは、リーブワンアウト交叉確認法によって、すなわち、一つを除く全ての試料についてトレーニング（training）し、得られたモデルを用いて残っている試料の分類を予測することによって確認した。さらなる胃癌試料4個を得て、その「予測スコア」を調べた。スコアは、1.2、1.9、-1.0、および-4.3であり；前者の二つは、リンパ節転移に関して陽性であると独立して決定され、他は陰性であると決定され、「予測スコア」の信頼性を確認した。
【０１１７】
マイクロアレイ技術の開発によって、1回の実験で何千もの遺伝子の発現レベルの分析が容易となった。この技術は、様々な腫瘍の病的な表現型に発現が相関している遺伝子を分析するための強力なツールである。遺伝子発現パターンの同定に基づいて、癌の種類の分類の見直しを行う。遺伝子発現プロフィールは、予後マーカーおよび腫瘍細胞の薬物感受性指標として役立つ特異的パターンを開示したのみではなかった。腫瘍の悪性の形質転換、進行、および／または転移に関係する遺伝子が同定された。本明細書に記載のデータは、腸型胃癌からの顕微解剖細胞における遺伝子発現の最初のゲノム全体の研究を示す。
【０１１８】
20,000個を超える遺伝子の発現の分析により、腸型胃癌の発現の一貫したパターンが判明した。一般的に腫瘍において変化している遺伝子は、いくつかの機能的分類に入る。ERBB2、EGFR、およびCCNEのような、胃癌発生に関連しているいくつかの遺伝子は、本発明者らの実験におけるその上方制御の頻度が、一貫して上方制御された遺伝子に関して定義された基準に適合しなかったために（すなわち、75％またはそれ以上の頻度）、本発明者らのリストには含めなかった。例えば、ERBB2、EGFR、およびCCNEは、それぞれ腸型胃癌の20％、50％、および20％において過剰発現されると報告されたが、本明細書に記載の研究において、それらの遺伝子はそれぞれ腫瘍の45％、62.5％、および10％に限って2より大きい発現比を示した。
【０１１９】
シグナル伝達に関係する上方制御された遺伝子において、GFRA2は、ニューツリン（neurturin）のグリコシル-ホスファチジルイノシトール結合細胞表面受容体をコードする。この受容体はRET膜貫通チロシンキナーゼと複合体を形成し、その過剰発現は様々な癌に関連している。ニューツリン/GFRA2/RET経路は、ニューロンの生存を促進する。
【０１２０】
METのリガンドであるHGFの発現も同様にアレイにおいて増強された。受容体型チロシンキナーゼであるMET癌原遺伝子は細胞増殖に関係し、様々な他の腫瘍においても同様に上方制御されている。HGFおよびMET産物は前立腺癌細胞および乳癌細胞に同時局在する。結果は、胃癌細胞におけるHGFの過剰発現が、HGF/METシグナル伝達経路をオートクライン的に活性化して、発癌において重要な役割を有することを示した。
【０１２１】
調べた胃癌において共通して上方制御されたもう一つの遺伝子であるNFIL3は、IL-3によって調節される。IL-3欠乏細胞におけるその発現の増強は、アポトーシスを予防しうる。この転写因子は抗アポトーシス経路において中心的な段階を調節し、その変化はおそらくヒトB-細胞白血病の発症に関与する。独自のシステインに富んだ亜鉛結合ドメインを有し、神経およびリンパ様組織の分化および発達の制御に関係している転写因子LHX1も同様に、マイクロアレイ上において共通して上方制御された。LHX1の発現は、急性骨髄性白血病細胞株および慢性骨髄性白血病の急性転化を有する患者の細胞において認められている。胚発達に関係するホメオボックス転写因子であるHOXB7の発現も同様に、調べた胃腫瘍において頻繁に上昇した。HOX遺伝子の発現の変化はしばしば白血病および固形腫瘍に関係し、不死化正常卵巣表面上皮細胞におけるHOXB7の過剰発現は、細胞増殖を劇的に増強する。
【０１２２】
細胞内代謝、DNA複製、ならびにタンパク質合成およびプロセシングに関連したいくつかの遺伝子も同様に、本発明者らの胃癌パネルにおいて上方制御され、この結果は増殖および／または細胞分裂の加速を反映しうる。血液凝固に関連したいくつかの遺伝子（PROCR、SERPING1、およびHRG）も同様に上方制御された。PROCR（プロテインC受容体）はプロテインCに結合し、この複合体は血液凝固において主要な役割を果たす。PROCRはいくつかの癌細胞株において検出されており、その発現の変化は、癌患者における凝固障害の複雑さを説明しうる。C1阻害剤であるSERPING1は、補体活性化、血液凝固、および線維素溶解を含む重要な生理的経路の調節において潜在的に重要な役割を有する。HRG産物は、ヘパリン、トロンボスポンジン、およびプラスミノーゲンと相互作用する。HRGタンパク質の二つの作用である、線維素溶解の阻害および凝固阻害の減少は、潜在的な前血栓作用を示している。凝固障害は癌患者において一般的な合併症であることから、これらの標的に対して阻害的な薬剤を投与すると、胃癌患者における凝固欠損の重症度を減少させる。
【０１２３】
機能的に不明の遺伝子27個を含む遺伝子76個が、調べた胃癌の75％を超える症例において下方制御された。このリストには、糖質、脂質、および薬物の代謝に関係する、または小分子の輸送に関係する遺伝子が含まれる。胃上皮において特定の機能を有するいくつかの遺伝子も同様に下方制御され；それらの多くが、栄養吸収または腸管内の細菌に対する障壁に関連した産物をコードする。これらの遺伝子の下方制御は、発癌における「脱分化」を反映する。
【０１２４】
リンパ節への転移は、癌患者の最も有用な予後因子の一つである。VEGF CおよびDは、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。しかし、転移の複雑なメカニズムは、ほんの数個の遺伝子の変化によっては完全に説明することはできない。リンパ節陽性腫瘍およびリンパ節陰性腫瘍の間で発現が異なる遺伝子の組が同定されれば、貴重な診断マーカーとなり、転移に至る厳密な生物物理的事象の理解の改善に貢献する。例えば、2群の間で有意に異なる発現を示した遺伝子12個中2個は、糖タンパク質の代謝に関係している（DDOST、GNS）。糖タンパク質は細胞外マトリクス（ECM）および細胞表面接着分子の構成成分である。MMP、uPA、およびヘラパナーゼをコードする遺伝子は、癌の浸潤および転移に関係する段階であるECMの分解に関連している。DDOSTおよび／またはGNSは、細胞接着または浸潤に関連するタンパク質を改変するプロセスを媒介する。さらに、推定の腫瘍抑制遺伝子であるAIM2（黒色腫に存在しない）は、リンパ節陰性腫瘍と比較してリンパ節陽性群では下方制御された。
【０１２５】
五つの遺伝子（DDOST、GNS、NEDD8、LOC51096、およびAIM2）の発現レベルに基づく「予測スコア」、「判別子（discrimimator）」によって、検査のためのリンパ節の切除を必要とせずに、高い確率でリンパ節陽性腫瘍をリンパ節陰性腫瘍から区別することができる。この予測モデルは、臨床的な診断および予測の目的にとって強力なツールである。
【０１２６】
産業上の利用可能性
レーザービームを用いた切除およびゲノム全体のcDNAマイクロアレイの組み合わせによって得た本明細書に記述した腸型胃癌の遺伝子発現分析は、癌の予防および治療の標的として特異的遺伝子を同定した。これらの発現が異なる遺伝子のサブセットの発現に基づいて、本発明は、転移性腸型胃腫瘍を同定する方法を提供する。本発明の方法は、そのような腫瘍の感度の良い、特異的かつ正確な診断を容易にする、感度のよい信頼できる強力なツールである。このシステムは、悪性組織の非悪性組織からの区別、および初期の癌の、転移した癌、特にリンパ節に転移した癌からの区別に特異的に利用することができる。
【０１２７】
本明細書に記載の方法はまた、腸型胃癌の予防、診断、および治療のためのさらなる分子標的の同定において有用である。本明細書に報告したデータは、腸型胃癌発生の包括的理解の一助となり、新規診断戦略の開発を容易にし、治療的薬剤および予防的薬剤の分子標的を同定する手がかりを提供する。そのような情報は、腸型胃腫瘍形成、特にリンパ節転移への進行のより深い理解に貢献し、腸型腺癌の診断、治療、および最終的に予防のための新規戦略を開発するための指標を提供する。
【０１２８】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願、および出版物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。さらに、本発明は詳細にかつその特定の態様に関連して記述してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な改変および変更を行ってもよいことは当業者に明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】定量的RT-PCRによるマイクロアレイデータの確認を示すドットプロットである。スキャッタープロットは、アレイ（左）および定量的RT-PCR（右）によって得られた各試料の対数発現比（Cy3/Cy5）を示す。
【図２Ａ】その発現がリンパ節陽性（N+）およびリンパ節陰性（N-）腫瘍クラス間において異なる遺伝子を示す図である。各試料の対数発現比を示す。右の欄は、フォワードステップワイズ判別関数分析によって計算した判別係数を含む。フォワードステップワイズ判別関数分析によって、独立した「予測因子」として遺伝子5個（太字で示す）が同定された。
【図２Ｂ】判別関数分析の結果を示すドットプロットである。スキャッタープロットは、リンパ節陽性（N+）およびリンパ節陰性（N-）クラスに関する「予測」（判別）スコアを示す。群の重心を水平方向のバーで示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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