(57)【要約】本発明は、リンカーを介して結合し且つ０．４〜３．０の範囲の置換度を有する第４級アンモニウム基により置換された多糖類、例えばポリグルカン類及び化学的もしくは酵素的に部分的に加水分解されたデンプン類に関する。これらの多糖類は抗−感染剤としてあるいはウィルス及びバクテリアにより引き起こされる感染症の処置のために用いるのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーにより結合している第４級アンモニウム基によって０．４〜３．０の置換度で置換されている多糖類の、感染症の処置のための使用。
【請求項２】
置換度が０．６〜１．８であることを特徴とする請求項１で特許請求されている多糖類の使用。
【請求項３】
多糖類がポリグルカン類、例えばセルロース、リケナン、プルラン、デキストラン及びデンプンであることを特徴とする請求項１で特許請求されている多糖類の使用。
【請求項４】
多糖類がデンプン類、例えばポテトデンプン、コムギデンプン、コーンスターチ及びライスデンプン、化学的もしくは酵素的に部分的に加水分解されたデンプンあるいは遺伝子的に改変された植物から得られたデンプンであることを特徴とする請求項３で特許請求されている多糖類の使用。
【請求項５】
第４級アンモニウム基を多糖類に結合させているリンカーが場合によりヒドロキシルで置換されていることができるＣ２−Ｃ４−アルキレン基であることを特徴とする請求項１で特許請求されている多糖類の使用。
【請求項６】
ウィルス及びバクテリア感染症の処置のための請求項１で特許請求されている多糖類の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖類及び多糖類に基づく物質の抗感染剤、例えば抗バクテリア剤及び抗ウィルス剤としての使用に関する。これらの抗感染剤を例えば化粧品用及び製薬学的調剤中の防腐剤として、薬剤調製物中の生物学的に活性な化合物として、表面の、編織布の、ならびに例えば食物又は医学、生物学及び薬学で用いられる製品のための包装材料の殺生物仕上げのために、ならびに化粧品及び製薬産業における、農業における及び食物及び飼料（ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ）産業における使用のための傷保護用に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
バクテリア性病原体への感染が全世界で増加していること、ならびにこれに関して抗バクテリア剤耐性（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）が一般的な健康の問題であることは既知である。時間を経て通常の治療薬に耐性になったマイコバクテリア株による結核感染の世界的な増加（非特許文献１）及び多剤耐性スタフィロコックスによる感染の処置（非特許文献２）は、新規な活性物質の設計を必要とする。特に抗生物質耐性に対抗するため及び既存の活性化合物に対する不耐性が存在する場合にバクテリア感染を抑制するために、新規な作用機構を有する代わりの活性化合物が緊急に必要である。
【０００３】
ヘルペスウィルスに関する高度に選択的なヌクレオシド及びヌクレオチド制ウィルス剤（ｖｉｒｕｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、例えばアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、ペンシクロビル（ｐｅｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ソリブジン（ｓｏｒｉｖｕｄｉｎｅ）及びシドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）の開発を以って、生命を脅かす感染の抑制における有意な進歩が達成されたが、これらの治療薬はすべて同じ作用原理を有する。それらはウィルスＤＮＡポリメラーゼを阻害する。これらの化合物の他の欠点は、それらが感染細胞のＤＮＡ代謝も妨げ、従って突然変異誘発、奇形形成及び発ガン効果を誘導する危険を宿していることである（非特許文献３）。さらに、ヌクレオシド及びヌクレオチドウィルス剤が長期間に及んで用いられると、感染細胞培養及び免疫抑制患者の両方においてこれらの薬剤への耐性が発現するこが示された（非特許文献４；非特許文献５）。この理由で、別の作用機構を有する新規な高度に活性な抗ウィルス性予防薬及び治療薬をさらに開発することが必要である。
【０００４】
生物学的に活性な物質の大きな群は第４級アンモニウム化合物を含む。それらはバクテリア及び菌・カビのような微生物を破壊することができる。低分子量の第４級アンモニウム塩は殺菌剤又は殺生物性コーティング材料として用いられる（非特許文献６）。低分子量化合物に伴う典型的な問題は、例えば多様な輸送及び分解プロセスにより引き起こされる不十分なバイオアベイラビリティーである。ポリマー性第４級アミン−官能基化材料を市販の第４級交換樹脂から、ポリウレタンのポリブタジエンヒドロキシテレケレス（ｐｏｌｙｂｕｔａｄｉｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｅｌｅｃｈｅｌｅｓ）とのグラフト重合により、あるいは側鎖中に第１級アルコール官能基を有するポリシロキサンから合成することができる。これらの殺生物性ポリマーは通常高い製造コストを有し、多くの場合それらが毒性モノマーの残基を含有しているために毒性である（非特許文献７）。これに加え、ポリマーは体内に望ましくない且つ危険なやり方で堆積し得、それはそれらが生物的に分解可能でないためである。さらに、カチオン性官能基を含有する合成ポリマーは木材の防腐のために分散液として用いられる（特許文献１）。カチオン性官能基を含有する合成ポリマーの欠点は、それらの製造の高いコスト、それらの毒性（残留モノマーによる汚染）及び生物分解に対するそれらの安定性である。
【０００５】
第４級アンモニウム官能基を有する多糖誘導体は既知であり、かくしてずっと特に紙及び編織布産業のための表面改良添加剤として及び化粧品における稠度調節剤として用いられてきており、そのことに関連してそれらは＜０．２の低い置換度（ＤＳ）しか有していない。今日まで、それらの生物学的効果について何も知られていない。他方、長いアルキル鎖（Ｃ８−Ｃ２２）を有し且つシリルエーテル基によりデンプンに結合しているデンプンエーテルは抗感染効果、特に抗バクテリア効果を有することが報告されている（特許文献２）。多糖類のアルキルシリルエーテルの低い化学的安定性は、単に大気水分の効果の結果として官能基の制御されない放出及び結局生物学的活性の低下もしくはその喪失に導く（非特許文献８）。これに加え、低分子量シリル化合物は毒性である。さらに公開文献は抗バクテリア活性を有するセルロース繊維及びキトサン誘導体に言及している（非特許文献９）。天然のカチオン性多糖として、キトサンは最も多く記載されているものであり、化粧品において殺菌・殺カビ剤として用いられる（非特許文献１０、非特許文献１１）。これらの多糖類の欠点は、それらが多くの場合に他の生物物質（ｂｉｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）で汚染されていること、必要な念入りな単離及び精製法の結果としてそれらが高価なことならびにアンモニウム基がポリマー主鎖上のみに位置するそれらの固有の構造である。これに加え、それらの分布を制御するのが不可能であり、且つ含有量は１の置換度に限られる。カチオン的に改質され且つ架橋されたセルロースのような多糖類を含む超吸収物質（ｓｕｐｅｒａｂｓｏｒｂｅｒｓ）（特許文献３）も記載されている。
【０００６】
文献において生物学的活性が第４級アンモニウム官能基の存在から生ずるという効果に記載があるが、他方、示され得る通り、カチオン性テトラアルキル窒素基を有する典型的な化合物、例えばポリクォーターニウム  １０（ｐｏｌｙｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ  １０）は生物活性を有していないことが報告されている（非特許文献１２）。構造が実際に生物学的に活性かどうか、そしてもしそうならどれが活性なのか、文献において入手可能な結果から結論することは全く不可能である。
【特許文献１】米国特許第５，０４９，３８３号明細書
【特許文献２】日本特許第０５２９５００２号明細書（ＪＰ  ０５２９５００２）
【特許文献３】欧州特許出願公開第０５８２６２４号明細書（ＥＰ  ０５８２６２４Ｂ１）
【非特許文献１】Ｂ．Ｒ．Ｂｌｏｏｍ，Ｊ．Ｌ．Ｍｕｒｒａｙ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１９９２年，１０５５
【非特許文献２】Ｍ．Ｋｒｅｓｋｅｎ，Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔｓｂｌａｔｔ［Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｗｓｐａｐｅｒ］，３８，１９９６年，１７０
【非特許文献３】Ｗｕｔｚｌｅｒ，Ｐ．Ｔｈｕｓｔ，Ｒ．著，Ａｎｔｉｖ．Ｒｅｓ．４９，２００１年，５５
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．著，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３９，１９９５年，１６３２
【非特許文献５】Ｐａｖｉｃ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．著，Ａｎｔｉｍｉｃｔｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３９，１９９７年，２６８６
【非特許文献６】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５０，１９９８年，１４５
【非特許文献７】Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４，１９９６年，３６４
【非特許文献８】Ｄ．Ｋｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９８年
【非特許文献９】Ｗ．Ｈ．Ｄａｌｙ，Ｍ．Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉ著，Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．７９，１９９８年，２２０
【非特許文献１０】Ｔ．Ｔａｓｈｉｒｏ著，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｅｎｇ．２８６，２００１年，６３
【非特許文献１１】Ｋ．Ｃ．Ｇｕｐｔａ，Ｍ．Ｎ．Ｖ．Ｒ．Ｋｕｍａｒ著，Ｊ．Ｍ．Ｓ．−Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ４０，２０００年，２７３
【非特許文献１２】Ｗ．Ａ．Ｄａｌｙ，Ｍ．Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉ，Ｄ．Ｃｕｌｂｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍａｃｏｓｓａｙ著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８年，４９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規な抗感染活性を有するポリマーを見出す目的に基づいている；物質は広範囲に及ぶ強力な抗感染効果を有していなければならず、バクテリア感染と関連する抗生物質耐性と有効に戦うことを可能にしなければならず、ウィルス感染の処置のための新規な可能性を与えねばならず、十分に許容され、生物分解可能であり、無毒性であり且つ製造が容易でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従い、エーテル化反応を用いてカチオン性官能基が０．４〜３．０の範囲内の置換度（ＤＳ）で、特にアルキルアンモニウム基が０．６〜１．８の範囲内のＤＳでスペーサー基により多糖類中に導入されている多糖誘導体を提供することにより、目的が達成される。それらの生物分解可能性及び無毒性のために、多糖類は特に適している。
【０００９】
結局本発明は、リンカーにより結合している第４級アンモニウム基によって０．４〜３．０の置換度で置換されている多糖類の、抗感染剤としての及び／又は感染症の処置のための使用に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従って用いられる化合物は高い程度の生物学的活性を示し、驚くべきことに病原性バクテリア、例えばスタフィロコックス及びマイコバクテリアの成長を５〜６０ｍｇ／ｌの範囲内の最小阻止濃度において阻害し、且つ３〜５０ｍｇ／ｌの範囲内でヘルペスウィルス及びインフルエンザウィルスの複製も阻害する。これらの性質のために、バクテリア及びウィルス感染の予防及び抑制用の薬剤の製造のために化合物を用いることができる。それらのみで、及び既知の治療薬又は生理学的に許容される助剤及び担体物質と組み合わせての両方でそれらを用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
抗感染性化合物を、局所的投与、静脈内、皮下もしくは筋肉内注射による非経口的投与あるいは鼻内投与のために製薬学的に許容され得る媒体中の溶液もしくは懸濁剤として、ならびに錠剤、カプセル又は座薬としての使用のために調製することができる。化合物は体重のｋｇ当たり０．１〜１０００ｍｇの用量で用いられ得る。
【００１２】
多糖類、好ましくはポリグルカン類、例えばセルロース、リケナン、プルラン及びデキストランならびに特に好ましくはデンプン類、例えば種々の起源の本来のデンプン類、例えばポテトデンプン、コムギデンプン、コーンスターチ及びライスデンプンならびに化学的もしくは酵素的に部分的に加水分解されたデンプン類、例えばソラミル、アミロース、アミロペクチン及びワックス状コーンスターチならびにまた遺伝子的に改変された植物から得られたデンプン類、例えばヒロン型（ｈｙｌｏｎ  ｔｙｐｅ）が本発明に従う活性化合物の製造に用いられる。デンプン中のアミロースの含有率は、アミロペクチンの含有率と同様に、それぞれ０〜１００％、好ましくは３０〜７０％であることができる。適した多糖類の分子量は１０３〜１０７ｇ／モルの範囲内である（表１を参照されたい）。無水グルコース単位繰り返し単位（ＡＧＵ）はα（１−４）、α（１−６）、α（１−３）、β（１−４）及びβ（１−３）結合もしくはそれらの組み合わせ、例えば図１において図式的に示される通りα（１−４）及びα（１−６）あるいはα（１−６）、α（１−３）及びα（１−４）により互いに結合していることができ、異なる長さであり且つ種々のやり方で結合している側鎖を含有していることができる。これに加え、他の官能基、例えば天然のポテトデンプンの場合、例えばホスフェートエステル官能基も存在することができる。
【００１３】
【化１】
2005519057.tif 000002
【００１４】
【表１】
2005519057.tif 000003
【００１５】
ヒドロキシル基が変換されている程度は、平均置換度（ＤＳ）により記述される。この平均値は、何らの区別もなく、官能基化されたヒドロキシル基の数を示し、従って上記の多糖類の場合、定義により０〜３の範囲内である。抗感染効果を有する本発明の多糖誘導体におけるカチオン性基のＤＳは０．４〜３．０、好ましくは０．６〜１．８である。誘導体化の間に、それ自身が反応性基、例えばエポキシドを用いる多糖類のエーテル化の結果としてのヒドロキシル基を含有する官能基が導入されると、これらの後者の基は同様に反応することができ、より長い側鎖の形成を生ずる。
【００１６】
本発明に従って用いられ得る多糖誘導体は既知であるか、又はそれ自体既知の方法で、特に反応性化合物を用いて多糖類をエーテル化し、それにより一般式（Ｉ）（ＰＳ：多糖残基、１個の置換基のみが示されている）の第４級アンモニウム化合物を直接形成するか、あるいはエーテル化反応の後に第４級化を行なうことにより得られ得る。式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は好ましくは互いに独立して、１〜４個のＣ原子を有するアルキル又はベンジルもしくは置換ベンジル（置換基の例は１〜３個のアルキル、ハロゲン、アルコキシ、カルバモイル、アルコキシカルボニル、シアノ及びジアルキルアミノである）であり、Ｒ１は水素でもあり、Ｘはアニオン（例えばハライド、ヒドロキシド、サルフェート、水素サルフェート（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）ならびに無機及びカルボン酸の他のアニオン）であり、ｎは２〜４であることができる。
【００１７】
【化２】
2005519057.tif 000004
【００１８】
好適に用いられる第４級カチオン化試薬は２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＱＵＡＢＲ１５１，Ｄｅｇｕｓｓａ  ＡＧ，式ＩＩ）又は３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＱＵＡＢＲ１８８，Ｄｅｇｕｓｓａ  ＡＧ，式ＩＩＩ）である。Ｙ＝Ｃｌ又はＢｒであり、ｎ＝１〜３である一般式ＩＶの試薬も多糖類のエーテル化に用いることができる。
【００１９】
【化３】
2005519057.tif 000005
【００２０】
従って、第４級アンモニウム基を多糖類に結合させるリンカーは、場合によりヒドロキシルで置換されていることができるＣ２−Ｃ４−アルキレンである。
【００２１】
生物学的に活性な多糖誘導体の製造のためのエーテル化は種々の方法で行なわれ得、それ自体既知の方法で行なわれてカチオン性基の高い含有率が達成される。メタノール、イソプロパノール及び好ましくはエタノールのようなアルコールを用いるアルコール及び水酸化ナトリウム溶液及び水（不均一法）あるいは不均一系から均一系への遷移を用いるアルカリ金属水酸化物水溶液、好ましくは水酸化ナトリウム溶液／水中のポリマーの懸濁液ならびにまた塩化リチウムの存在下におけるジメチルスルホキシドもしくはジメチルアセトアミドのような双極性非プロトン性溶媒又は反応媒体としての他の溶媒中のポリマーの均一溶液の両方が適している。カチオン化試薬との反応に必要な時間は１〜４８時間、好ましくは３〜２４時間であり、温度は３０〜１３０℃、好ましくは４０〜８０℃である。さらに、生成物の置換度は、用いられるエーテル化剤のモル当量により決定され得、広い限度内で変わることができる。これに加え、多糖誘導体を得るための多段階反応も適しており、すでにカチオン化されているか又はアミノ−官能基化されている生成物をもう一度上記の条件下で反応させる。反応生成物の仕上げのためにポリマー化学の通常の方法が用いられ、低分子量副生成物及び残留試薬が透析又は洗浄法又は有機溶媒中における水からの再沈殿により分離される。
【００２２】
置換度は元素分析により決定される窒素値を用い、以下の定義式（ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａ）に従って計算される：
【００２３】
【数１】
2005519057.tif 000006
【００２４】
これに加え、化合物中に存在するクロリドのような対イオン及びＮＭＲスペクトルがＤＳ値の決定に適している。
【００２５】
以下の実施例（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｘａｍｐｌｅｓ）は本発明をさらに詳細に説明することを目的とするが、本発明を制限することは全くない。
【実施例】
【００２６】
実施例：
１．エタノール／水酸化ナトリウム溶液／水中で不均一反応を行なうことによる化合物の製造
２０ｇの多糖（多糖の性質、以下の表２を参照されたい）を８０ｍｌのエタノール中に懸濁させる。２８ｍｌの水中の１０．８５ｇのＮａＯＨの溶液及び８０ｍｌのエタノールならびにまた０．２４６モルのＱＵＡＢＲ１８８の溶液（６９％水溶液）をこの懸濁液に滴下する。反応混合物を６０℃で６時間攪拌する。０．１Ｎ  ＨＣｌを用いて生成物を中和し、透析し、凍結−乾燥する。
収率は９５％（達成されたＤＳに基づいて）である。
元素分析：Ｎ  ３．５１％
平均置換度（ＤＳＮ）＝０．６６
【００２７】
【表２】
2005519057.tif 000007
【００２８】
２．水酸化ナトリウム水溶液中における多糖類の転換
２０ｇの多糖（多糖の性質、以下の表３を参照されたい）を水酸化ナトリウム溶液（１００ｍｌの水中の０．５ｇのＮａＯＨ）中に懸濁させる。混合物を６０℃で１時間攪拌する。０．１２３モルのＱＵＡＢＲ１５１又は分解デンプン（ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）ソラミルの場合はＱＵＡＢＲ１８８をこの温度で滴下する。反応混合物を６０℃で６時間攪拌する。室温に冷却した後、０．１Ｎ  ＨＣｌを用いて混合物を中和する；それを次いで透析し、生成物を凍結−乾燥する。
収率は９８％（達成されたＤＳに基づいて）である。
元素分析：Ｎ  ３．３４％
平均置換度（ＤＳＮ）＝０．６０
【００２９】
【表３】
2005519057.tif 000008
【００３０】
３．ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中における均一反応の実施
１５ｇの多糖（多糖の性質、以下の表４を参照されたい）を室温でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に懸濁させ、懸濁液を８０℃に加熱し、それと関連して多糖が溶解する。溶液を室温に冷却し、２０ｍｌの水中に溶解された０．５ｇのＮａＯＨを加える。次いで攪拌しながら０．０９２５モルのＱＵＡＢＲ１５１を滴下する。反応混合物を６０℃で２４時間攪拌する。それを室温に冷却した後、０．１Ｎ  ＨＣｌを用いて混合物を中和し、次いで透析し、凍結−乾燥する。
収率は９９％（達成されたＤＳに基づいて）である。
元素分析：Ｎ  ３．２２％
平均置換度（ＤＳＮ）＝０．５７
【００３１】
【表４】
2005519057.tif 000009
【００３２】
４．数段階におけるカチオン化
５ｇのカチオン化多糖（多糖の性質、以下の表５を参照されたい）を水酸化ナトリウム溶液（１００ｍｌの水中の０．５ｇのＮａＯＨ）中に懸濁させる。混合物を６０℃で１時間攪拌する。０．２モルのＱＵＡＢＲ１５１をこの温度で滴下する。反応混合物を６０℃で６時間攪拌する。それを室温に冷却した後、０．１Ｎ  ＨＣｌを用いて混合物を中和し、次いで透析し、凍結−乾燥する。
収率は９５％（達成されたＤＳに基づいて）である。
元素分析：Ｎ  ５．１１％
平均置換度（ＤＳＮ）＝１．３２
【００３３】
【表５】
2005519057.tif 000010
【００３４】
５．グラム−陽性及びグラム−陰性バクテリアに対するならびに酵母に対する化合物の抗バクテリア／抗微生物活性の決定
スタフィロコックス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）  ＳＧ５１１、Ｓ．アウレウス  １３４／９３（多剤耐性）及びマイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）  ＩＭＥＴ１０６７０に向けられる場合の化合物の抗バクテリア活性を、ＮＣＣＬＳ指針［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ：Ｍｅｈｔｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；第４版，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ編集；Ａｐｐｒｏｖｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｍ７−Ａ４．ＮＣＣＬＳ，（１９９７）］に従い、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＤＩＦＣＯ）中でのミクロブロス希釈試験（ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）における最小阻止濃度（ＭＨＣｓ）の決定により調べた。結果を表６に示す。
【００３５】
【表６】
2005519057.tif 000011
【００３６】
６．ヘルペス・シンプレクス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ）ウィルス１型に関する抗ウィルス効果の決定
非特異的物質効果を排除できるように、抗ウィルス研究の前にミドリザル腎臓（ＧＭＫ）細胞における５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を決定した。これを行なうために、ミクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ）中の連続ＧＭＫ細胞叢に適した物質希釈系列（因子２）を接種した（Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．９５，２００１年，１３３）。７２時間のインキュベーションの後、クリスタルバイオレット／メタノールを用いて細胞を染色した。染料をこし出した後、それぞれのウェルの光学濃度をＤｙｎａｔｅｃｈプレート光度計において測定し（５５０／６３０ｎｍ）、６個の未処理細胞標準の場合の平均値を１００％としてそれと比較した。ＣＣ５０は、希釈系列の吸光曲線が標準の場合の平均値の５０％の線と交差する点における物質濃度である。ＨＳＶ−１に関する化合物の抗ウィルス効果を、ＧＭＫ細胞において行なわれる細胞変性効果−阻害試験（ＣＰＥ−阻害試験）で調べ、５０％阻害用量（ＩＣ５０）を決定した（Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．９５，２００１年，１３３）。選択指数をＣＣ５０対ＩＣ５０の比率として計算した（表７）。
【００３７】
出発化合物（ＱＵＡＢ試薬及び非改質デンプン）は抗ウィルス効果を示さなかった（結果は示されていない）。
【００３８】
【表７】
2005519057.tif 000012
【００３９】
７．改変ＰＲＴにおける作用様式の決定
アシクロビル−感受性及びホスホノギ酸−感受性ＨＳＶ１株Ｋｕｐｋａを用い、化合物Ｍ１を例として、改変ＰＲＴにおける物質の作用の機構の研究を行なった（Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．９５，２００１年，１３３）。試験において、物質は種々の濃度で：
１．無細胞ウィルス（１０６ｐｆｕ／ｍｌ）のみに加えられ、それは次いで化合物と一緒に３７℃で６時間インキュベーションされ、物質を希釈した後にＰＲＴ中に導入された：６．２５〜２５μｇ／ｍｌまでの用量範囲内でプラークの減少なし（結果は示されていない）、
２．寒天のみに加えられた：６．２５〜２５μｇ／ｍｌの用量範囲内でプラークの減少なし（結果は示されていない）、
３．１時間の吸着の間のみに４℃において２時間加えられた（３．１２〜１２．５μｇ／ｍｌ）そして
４．ウィルスを加える１，２及び４時間前に加えられた（３．１２〜１２．５μｇ／ｍｌ）。
【００４０】
作用の機構の研究の結果は、無細胞ウィルスの不活性化を観察することができなかったので、本発明に従う化合物が殺ウィルス効果を有していないことを示す。その代わりに、ヘルペスウィルス複製の阻害のための前提条件は、試験細胞へのウィルスの吸着の前又はその間に物質が存在することである。
【国際調査報告】
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