(57)【要約】本発明は、非悪性細胞と比較して癌細胞の細胞表面で異なったレベルで発現される分子を同定する方法、並びに、癌治療のための治療用遺伝子の運搬および発現のために単独でまたは組み合わせて使用する癌特異的プロモーターを同定する方法に関する。本発明はさらに、本発明方法により同定される細胞表面分子にターゲッティングするターゲッティング複合体に関する。本発明の態様では、該ターゲッティング複合体は本発明方法により同定されるプロモーターを含む。加えて、本発明は、細胞表面分子のための結合パートナーを同定する方法、および該結合パートナー自体に関する。該ターゲッティング複合体を使用する治療方法、および薬物製造のための該ターゲッティング複合体の使用もまた本発明で開示する。さらに、本発明はワクチン製造のための該細胞表面分子またはそのフラグメントの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞と比較して悪性細胞中で異なったレベルで発現する多数の細胞表面分子を同定するための方法であって、
ｉ）CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24、MAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-446、SW 1271からなる群から選ばれる少なくとも３個の悪性セルラインを提供し；
ｉｉ）肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎、結腸、膵臓、小腸、脾臓、骨格筋、気管、前立腺、胎盤、唾液腺、精巣、白血球、脳、脂肪組織、膀胱、乳房、頸、食道、喉頭、卵巣、直腸、皮膚、脊髄、胃、胸腺、甲状腺および子宮からなる群から選ばれる正常組織から誘導される少なくとも３個の全ＲＮＡ試料を提供し；
ｉｉｉ）工程ｉ）に記載のセルラインと工程ｉｉ）に記載の組織試料におけるｍＲＮＡの発現を比較し；
ｉｖ）核酸配列を同定し、ここで、
ａ）ｉ）に記載の１またはそれ以上のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量とｉｉ）に記載の１またはそれ以上の組織で発現されるｍＲＮＡの量の間には差違があり；および／または、
ｂ）ｉ）に記載の少なくとも２個のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および／または、
ｃ）ｉｉ）に記載の少なくとも２個の組織試料中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および、
ｖ）ｉｖ）に記載の核酸配列の中から、可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列を選択する、
という工程を含む、該方法。
【請求項２】
工程ｉ）は少なくとも５個の悪性セルラインを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｉｉ）は、肺、肝臓、心臓および腎臓から誘導される組織試料を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程ｉｉ）は、少なくとも５個の全ＲＮＡ試料を提供することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程ｉｉｉ）は、
ｉ）悪性セルライン由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを単離し；
ｉｉ）該ＲＮＡからｃＤＮＡ個体群を調製し（ここで、１つのｃＤＮＡ個体群は１つのセルラインまたは１つの組織試料から単離したＲＮＡから調製する）；
ｉｉｉ）各ｃＤＮＡ個体群を検出可能な標識で標識し；
ｉｖ）公知の核酸配列のアレイを固定化した固体支持体を提供し；
ｖ）各ｃＤＮＡ個体群を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で固体支持体と一緒にインキュベートし；
ｖｉ）固体支持体上の検出可能標識を検出する；
という工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
検出可能標識は蛍光標識である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
固体支持体はガラスプレートである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１０００個の公知の核酸配列を固体支持体に固定化する、請求項５記載の方法。
【請求項９】
工程ｉｖ）、ａ）における差違は、少なくとも２倍のｍＲＮＡの発現である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
工程ｉｖ）、ａ）における差違は、原則的に無限数倍である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
工程ｉｖ）、ｂ）は、少なくとも３個の悪性セルラインを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
工程ｉｖ）、ｃ）は、少なくとも３個のＲＮＡ試料を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程ｖ）に記載の可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は、PubMed（NCBI）、Nucleotide（NCBI）、Protein（NCBI）、Structure（NCBI）、OMIM（NCBI）およびLocusLink（NCBI）からなる群から選ばれる商業的に入手可能なデータベースにおいて入手可能な情報に従って選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程ｖ）に記載の可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は、少なくとも２０％の配列一致が存在する、公知の細胞表面分子との配列相同性に従って選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｖ）に記載の可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は、公知の細胞表面分子内に含まれるドメインとの配列相同性に従って選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
工程ｖ）に記載の可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は、疎水性領域および可能性あるグリコシル化部位からなる群から選ばれるドメインを含む可能性ある細胞表面分子を選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
第１の核酸配列に機能的に連結した第２の核酸配列の発現を指令することができる第１の核酸配列を同定する方法であって、該発現のレベルは正常細胞と比較して悪性細胞中で異なり、該方法は、
ｉ）CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24、MAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-446、SW 1271からなる群から選ばれる少なくとも３個の悪性セルラインを提供し；
ｉｉ）肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎、結腸、膵臓、小腸、脾臓、骨格筋、気管、前立腺、胎盤、唾液腺、精巣、白血球、脳、脂肪組織、膀胱、乳房、頸、食道、喉頭、卵巣、直腸、皮膚、脊髄、胃、胸腺、甲状腺および子宮からなる群由来の正常な組織試料から選ばれる少なくとも３個のＲＮＡ試料を提供し；
ｉｉｉ）ｉ）に記載のセルラインとｉｉ）に記載の組織試料中でのｍＲＮＡの発現を比較し；
ｉｖ）第２の核酸配列を同定し、ここで、
ａ）ｉ）に記載の１またはそれ以上のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量とｉｉ）に記載の１またはそれ以上の組織中で発現されるｍＲＮＡの量の間には差違があり；および／または、
ｂ）ｉ）に記載の少なくとも２個のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および／または、
ｃ）ｉｉ）に記載の少なくとも２個の組織試料中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上相違がなく；
ｖ）工程ｉｖ）で同定した第２のヌクレオチド配列と機能的に連結する第１の核酸配列を同定する、
という工程を含む、該方法。
【請求項１８】
工程ｉ）は少なくとも５個の悪性セルラインを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程ｉｉ）は、肺、肝臓、心臓および腎臓からなる群から誘導される組織試料を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
工程ｉｉ）は、少なくとも５個のＲＮＡ試料を提供することを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
工程ｉｉｉ）は、
ｉ）悪性セルライン由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを単離し；
ｉｉ）該ＲＮＡからｃＤＮＡ個体群を調製し（ここで、１つのｃＤＮＡ個体群は１つのセルラインまたは１つの組織試料から単離したＲＮＡから調製する）；
ｉｉｉ）各ｃＤＮＡ個体群を検出可能な標識で標識し；
ｉｖ）公知の核酸配列のアレイを固定化した固体支持体を提供し；
ｖ）各ｃＤＮＡ個体群を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で固体支持体と一緒にインキュベートし；
ｖｉ）固体支持体上の検出可能標識を検出する；
という工程を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
検出可能標識は蛍光標識である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
固体支持体はガラスプレートである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１０００個の公知の核酸配列を固体支持体に固定化する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
工程ｉｖ）、ａ）における差違は、少なくとも２倍のｍＲＮＡの発現の差違である、請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
工程ｉｖ）、ａ）における差違は、原則的に無限数倍である、請求項１７記載の方法。
【請求項２７】
工程ｉｖ）、ｂ）は、少なくとも３個の悪性セルラインを含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
工程ｉｖ）、ｃ）は、少なくとも３個の組織試料を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２９】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に少なくとも１５,０００塩基対を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に少なくとも５,０００塩基対を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３１】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に５,０００までの塩基対を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３２】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流にイントロン配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３３】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの下流にイントロン配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３４】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンから１０,０００塩基対以上上流または下流に位置するエンハンサー配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項３５】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンから上流に５,０００までの塩基対を含み、そこから少なくとも１０の内部ｂｐを除去する、請求項１７記載の方法。
【請求項３６】
第２核酸配列に機能的に連結したいずれかの第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンから上流に５,０００までの塩基対を含み、そこから少なくとも１個のサイレンサーを除去する、請求項１７記載の方法。
【請求項３７】
ｉ）請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって同定される細胞表面分子と結合することができる結合パートナー（ここで、該細胞表面分子はGRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、NCAM1、NPTXR、LRP8およびCHRNA5からなる群から選ばれる）；および、
ｉｉ）生物学的反応性の種；
を含有する、ターゲティング複合体。
【請求項３８】
細胞表面分子はGRIA2を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項３９】
細胞表面分子はGRM8を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４０】
細胞表面分子はITGAVを含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４１】
細胞表面分子はITGAEを含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４２】
結合パートナーは、L-グルタミン酸塩、カイニン酸塩、5-(ブロモメチル)-4-イソキサゾールプロピオン酸、グルタミン酸塩の類似体、置換キノキサリン2,3ジオン類、GYKI52466、5-I-ウィラージン、5-F-ウィラージン、AMPA（(RS)-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸）に対するアゴニストおよびアンタゴニストリガンド、NBQX、CNQX、DNQX、GYKI52466、6-クロロキヌレン酸、JSTX、L-APA、L-SOP、ACPT、(R,S)-PPG、CPPG、MAP4、(S)-3,4-DCPG、ビトロネクチン、シタクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、MMP-2、オステオポンチン、プロトロンビン、トロンボスポンジン、フォン・ビルブラント因子、L1CAMの組換えフラグメント、サルモシン、E-カドヘリンおよびそのペプチド（ペプチド：NRDKETKVを包含する）、NCAM1ドメインIgI+II、NCAM1ドメインIgIIIおよびそのペプチド、ペプチドC3：ASKKPKRNIKA、D3：AKKERQRKDTU、D4：ARALNWGAKP、モノクローナル抗体123C3、NPTX1、NPTX2、タイポキシン、TCBP49、オキシノル、ApoE2、ApoE3、ApoE4、ApoE由来のペプチド（E141;-155；LRKLRKRLLRDADDLおよびそのタンデムE(141;-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLL RDADDL）リーリン、ニコチン、アセチルコリン、α-ブンガロトキシン、カルバコール、および該表面分子のいずれかに対する特異的抗体からなる群から選ばれる、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４３】
細胞表面分子は該ターゲティング複合体をインターナライズすることができる、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４４】
生物学的反応性の種は核酸を含む、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項４５】
核酸は、発現シグナルを含有する第１の核酸配列と機能的に連結した第２の核酸を含む、請求項４４に記載のターゲティング複合体。
【請求項４６】
ｉ）請求項１〜１６のいずれかに記載の方法によって同定される細胞表面分子と結合することができる結合パートナー（ここで、該細胞表面分子は該ターゲティング複合体をインターナライズすることができる）；および、
ｉｉ）発現シグナルを含有する第１の核酸配列と機能的に連結した第２の核酸を含有する核酸配列を含む生物学的反応性の種（ここで、該第１の核酸配列は請求項１７〜３６のいずれか記載の方法によって同定される）；
を含有する、ターゲティング複合体。
【請求項４７】
細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8およびCHRNA5からなる群から選ばれる細胞表面分子を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項４８】
細胞表面分子は、NCAM1を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項４９】
細胞表面分子は、NPTXRを含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５０】
細胞表面分子は、LRP8を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５１】
細胞表面分子は、CHRNA5を含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５２】
結合パートナーは、NCAM1ドメインIgI+II、NCAM1ドメインIgIIIおよびそのペプチド、ペプチドC3：ASKKPKRNIKA、D3：AKKERQRKDTU、D4：ARALNWGAKP、モノクローナル抗体123C3、NPTX1、NPTX2、タイポキシン、TCBP49、オキシノル、ApoE2、ApoE3、ApoE4、ApoE由来のペプチド（E141;-155；LRKLRKRLLRDADDLおよびそのタンデムE(141;-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLL RDADDL）リーリン、ニコチン、アセチルコリン、α-ブンガロトキシン、カルバコール、および該表面分子に対する特異的抗体からなる群から選ばれる、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５３】
第１の核酸配列は、非悪性細胞と比較して悪性細胞中でのより高レベルの第２の核酸配列の発現を指令する発現シグナルを含む、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５４】
第１の核酸配列は、非悪性細胞と比較して悪性細胞中でのより低レベルの第２の核酸配列の発現を指令する発現シグナルを含む、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項５５】
第１の核酸配列は、pro221、pro210、pro71、pro41、pro30、pro2、pro209、pro14、pro4、pro8、pro246、pro16、pro27、pro5、pro49、pro19、pro140、pro139、pro207、pro81、pro273およびpro362からなる群から選ばれる、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項５６】
第１の核酸配列は、pro221、pro210、pro71、pro41、pro30、pro2、pro209、pro14、pro4、pro8、pro246、pro16、pro27、pro5、pro49、pro19、pro140、pro139、pro207、pro81、pro273およびpro362からなる群から選ばれるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項５７】
第１の核酸配列は、pro221、pro210、pro71、pro41、pro30、pro2、pro209、pro14、pro4、pro8、pro246、pro16、pro27、pro5、pro49、pro19、pro140、pro139、pro207、pro81、pro273およびpro362からなる群から選ばれるヌクレオチド配列の１つ以上のフラグメントを含む、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項５８】
第１の核酸配列は、pro221またはその１つ以上のフラグメントを含む、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項５９】
第１の核酸配列は、pro220またはその１つ以上のフラグメントを含む、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６０】
第１の核酸配列は、pro71またはその１つ以上のフラグメントを含む、請求項４６または４７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６１】
第１の核酸配列は更にそれと天然状態で結合しない核酸配列を含む、請求項４６記載のターゲティング複合体。
【請求項６２】
天然状態で結合しない核酸配列はステロイドホルモンレセプター結合部位である、請求項６１記載のターゲティング複合体。
【請求項６３】
第２の核酸配列は治療タンパク質をコードしている、請求項４４または４６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６４】
第２の核酸配列は、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの一部をコードしているかまたは含む、請求項４４または４６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６５】
第２の核酸配列はリボザイムをコードしているかまたは含む、請求項４４または４６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６６】
アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムは、オンコジーンまたはプロトオンコジーンのＲＮＡをターゲットとする、請求項４４または４６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６７】
オンコジーンまたはプロトオンコジーンは、Ras、Raf、Myc、Syn、Pim、BMI-1、FOP、Sis、KGF、Fms、Flg、Neu、Trk、Kit、Met、Src、Fyn、Mas、Fes/Fps、Tre、Mer、ABL、BCL3、int-2、Cym、Ets、Elk、RhoA、Ski、Wnt-5a、Spi-1、Rap2、p55およびc-tyrからなる群から選ばれる、請求項６６に記載のターゲティング複合体。
【請求項６８】
複合体は更に保護的キャッピングを含み、ここで該保護的キャッピングは第１のおよび／または第２の核酸配列と結合する核酸配列からなる、請求項３７または４６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項６９】
保護的キャッピングは修飾ヌクレオチドを含む、請求項６８記載のターゲティング複合体。
【請求項７０】
生物学的反応性の種は毒素である、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項７１】
毒素は、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ストレプトゾトシンまたはコレラ毒素からなる群から選ばれる、請求項７０記載のターゲティング複合体。
【請求項７２】
生物学的反応性の種はアポトーシスのインジューサーである、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項７３】
アポトーシスのインジューサーは、レチン酸、A23187、オカダ酸、ピューロマイシン、スタウロスポリン、タプシガルジン、アクチノマイシンD、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメタゾン、エトポシドおよびグルココルチノイドからなる群から選ばれる、請求項７２記載のターゲティング複合体。
【請求項７４】
生物学的反応性の種は放射性同位元素である、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項７５】
生物学的反応性の種は静細胞剤である、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項７６】
生物学的反応性の種はポリペプチドを含むかまたはそれから構成される、請求項３７記載のターゲティング複合体。
【請求項７７】
ポリペプチドは治療タンパク質である、請求項７６記載のターゲティング複合体。
【請求項７８】
治療タンパク質は腫瘍抑制因子である、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項７９】
治療タンパク質はアポトーシスのインジューサーである、請求項６３または７７記載のターゲティング複合体。
【請求項８０】
治療タンパク質は、細胞周期を停止するのに寄与することができるタンパク質である、請求項６３または７７記載のターゲティング複合体。
【請求項８１】
治療タンパク質は毒性薬物から細胞を防止することができるタンパク質である、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８２】
治療タンパク質は毒性物質の製造を触媒することができるタンパク質である、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８３】
治療タンパク質はｐ５３である、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８４】
治療タンパク質は、p73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、MSH2、PTCH、DPCH、TSC2、CDKN2AおよびARFからなる群から選ばれる腫瘍抑制因子である、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８５】
治療タンパク質は、Fas/Apo1、TNF、TRAIL、TGF-β、カスパーゼ、Bak、Bax、Bid、BikおよびGZMBからなる群から選ばれるアポトーシスのインジューサーである、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８６】
１個、または１個よりも多い、例えば２個、例えば３個、例えば４個の治療タンパク質をコードしている、１個以上の第１のヌクレオチド配列を含む、請求項６３または７７のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８７】
複合体は更に、核ターゲティングシグナルを含む、請求項３７〜８６のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項８８】
核ターゲティングシグナルはオリゴペプチドである、請求項８７記載のターゲティング複合体。
【請求項８９】
核ターゲティングシグナルは、サルウイルス４０ラージ腫瘍抗原の核局在化シグナルである、請求項８７記載のターゲティング複合体。
【請求項９０】
複合体は更に、エンドソーム溶解性薬物を含む、請求項３７〜８９のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項９１】
複合体は更に、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)、複製欠損ウイルスおよびウイルスタンパク質キャプシドからなる群から選ばれるエンドソーム溶解性薬物を含む、請求項９０に記載のターゲティング複合体。
【請求項９２】
ターゲティング複合体は更に、クロロキニンを含む、請求項３７〜８９のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項９３】
両方のエンドソーム溶解性薬物は膜不安定化ポリペプチドを含む、請求項９０記載のターゲティング複合体。
【請求項９４】
結合パートナーは、該結合パートナーと共有的に結合する核酸結合性薬物を介して生物学的反応性の種と結合する、請求項３７〜９３のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項９５】
核酸結合性薬物は、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、スペラミン、スペラジミンおよびヒストンタンパク質からなる群から選ばれる、請求項９４記載のターゲティング複合体。
【請求項９６】
核酸結合性薬物は１５〜１０００個の残基を含有するＰＬＬである、請求項９４記載のターゲティング複合体。
【請求項９７】
結合パートナーは、特異的な相互作用性成分の対を介して間接的に該生物学的反応性の種と結合し、ここで１成分は該生物学的反応性な種と共有結合し、そして第２成分は該結合パートナーと共有結合する、請求項３７〜９３のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項９８】
相互作用性成分はビオチンおよびストレプトアビジンである、請求項９７記載のターゲティング複合体。
【請求項９９】
請求項１〜１６のいずれか記載に従って同定される細胞表面分子の薬物標的としての使用であって、該薬物標的は結合パートナーと結合することができ、そして該結合パートナーを該細胞表面分子を発現する細胞中にインターナライズすることができる、該使用。
【請求項１００】
細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる、請求項９９記載の使用。
【請求項１０１】
新規な薬物標的を同定するための方法であって、該方法は、
ｉ）請求項１〜１６のいずれか記載の方法によって同定される細胞表面分子を提供し（ここで、該細胞表面分子はTNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる）；および、
ｉｉ）該細胞表面分子と結合することができる結合パートナーを同定しおよび／または製造する、
工程を含む、該方法。
【請求項１０２】
結合パートナーは、前悪性および／または悪性の病気の処置のための医薬組成物中で使用することができる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
結合パートナーを、
ｉ）動物を、該細胞表面分子または該細胞表面分子の一部で免疫化させ；および
ｉｉ）該動物から抗体を得たり；または、
ｉｉｉ）該動物から抗体を産生する細胞を得たりおよび該細胞から抗体を得る；
工程によって製造される、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０４】
結合パートナーは、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドを発現するライブラリーから選ばれる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０５】
結合パートナーは、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドを発現する合成コンビナトリアルライブラリーから選ばれる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０６】
結合パートナーは、抗体のファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって同定される、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０７】
結合パートナーは、ヒト抗体のファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって同定される、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０８】
結合パートナーは、小さい化学的化合物から選ばれる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０９】
細胞表面分子と結合することができる、単離および／または精製された特異的な結合パートナーであって、正常な細胞と比較して悪性細胞中で異なったレベルで発現し、そして請求項１０１〜１０８のいずれか記載の方法によって同定される、該結合パートナー。
【請求項１１０】
結パートナーは、ポリペプチドを含むかまたはそれから本質的に構成される、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１１】
結合パートナーは、抗体または抗体のフラグメントである、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１２】
結合パートナーは、ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１３】
結合パートナーは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１４】
結合パートナーは、マウスモノクローナル抗体である、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１５】
結合パートナーは、ヒト化抗体である、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１６】
結合パートナーは、ファージディスプレーライブラリーから同定されるヒト抗体である、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１１７】
抗体は、細胞表面分子の細胞外部分と相互作用することができる、請求項１１１〜１１６のいずれか記載の結合パートナー。
【請求項１１８】
抗体は、細胞表面分子の細胞外部分の翻訳後修飾と相互作用することができる、請求項１１１〜１１６のいずれか記載の結合パートナー。
【請求項１１９】
抗体は、細胞表面分子との結合時にインターナライズすることができる、請求項１１１〜１１８のいずれか記載の結合パートナー。
【請求項１２０】
結合パートナーは、細胞表面分子についての天然に存在するリガンドである、請求項１０９に記載の結合パートナー。
【請求項１２１】
結合パートナーは、細胞表面分子についての組み換え産生されたリガンドである、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１２２】
結合パートナーはウイルスタンパク質である、請求項１０９に記載の結合パートナー。
【請求項１２３】
結合パートナーは、ウイルスキャプシドタンパク質である、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１２４】
結合パートナーは組み換え産生され、そしてウイルスキャプシドタンパク質配列を含む、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１２５】
結合パートナーは小さい化学的化合物である、請求項１０９記載の結合パートナー。
【請求項１２６】
結合パートナーは請求項１０９〜１２５のいずれかに記載の結合パートナーである、請求項３７〜９８のいずれか記載のターゲティング複合体。
【請求項１２７】
工程：
ｉ）請求項１０９〜１２５のいずれかに記載の結合パートナーを提供し；および、
ｉｉ）該結合パートナーと結合することができる可能性のある薬物標的を同定する；
ことを含む、新規な薬物標的を同定するための方法。
【請求項１２８】
薬物標的はポリペプチドを含み、そして正常な細胞と比較して悪性細胞中で異なったレベルで発現する細胞表面分子である、請求項１２７記載の方法。
【請求項１２９】
請求項１２７〜１２８のいずれか記載の方法によって同定される、薬物標的。
【請求項１３０】
請求項１〜１６のいずれかに従って同定された細胞表面分子、および請求項３７〜９８のいずれかに記載のターゲティング複合体を含有する、複合体。
【請求項１３１】
細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる、請求項１３０記載の複合体。
【請求項１３２】
請求項３７〜９８記載のターゲティング複合体の製造のための、請求項１０９〜１２５のいずれか記載の結合パートナーの使用。
【請求項１３３】
請求項３７〜９８のいずれか記載のターゲティング複合体を、医薬的に許容し得る担体と一緒に含有する、医薬組成物。
【請求項１３４】
処置が必要な個体における前悪性および／または悪性の病気の処置方法であって、該個体に請求項３７〜９８のいずれか記載のターゲティング複合体の医薬的に有効な量を投与することを含む、該方法。
【請求項１３５】
処置は軽減処置である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３６】
処置は治療学的処置である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３７】
処置は予防学的処置である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３８】
病気は、メラノーマ、脳腫、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、頚癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、大腸癌、直腸癌および膀胱癌からなる群から選ばれる癌である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３９】
病気は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からなる群から選ばれる、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４０】
病気は小細胞肺癌である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４１】
病気は乳癌である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４２】
臨床的な病気は、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、髄芽腫、神経腫、上皮細胞腫、頭蓋咽頭腫、松果体腫、生殖細胞腫瘍およびシュワン細胞腫からなる群から選ばれる脳腫瘍である、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４３】
ターゲティング複合体は非経口投与する、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４４】
ターゲティング複合体は静脈内注射によって投与する、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４５】
ターゲティング複合体は、皮下注射によって投与する、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４６】
方法は更に、１つ以上の第２処置を含む、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４７】
第２処置は、外科的処置、化学療法、放射線療法、サイトカインを用いる療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法およびレーザー光を用いる処置法からなる群から選ばれる、請求項１４６記載の方法。
【請求項１４８】
処置が必要な個体における前悪性および／または悪性の病気の処置のための薬物の製造における、請求項３７〜９８のいずれか記載のターゲティング複合体の使用。
【請求項１４９】
処置は軽減処置である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５０】
処置は治療学的処置である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５１】
処置は予防学的処置である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５２】
病気は、メラノーマ、脳腫、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、頚癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、大腸癌、直腸癌および膀胱癌からなる群から選ばれる癌である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５３】
病気は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）からなる群から選ばれる、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５４】
病気は小細胞肺癌である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５５】
病気は乳癌である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５６】
病気は、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、髄芽腫、神経腫、上皮細胞腫、頭蓋咽頭腫、松果体腫、生殖細胞腫瘍およびシュワン細胞腫からなる群から選ばれる脳腫瘍である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５７】
薬物は非経口投与に適当である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５８】
薬物は静脈内注射に適当である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１５９】
薬物は皮下注射に適当である、請求項１４８記載の使用。
【請求項１６０】
ワクチンを製造するための、請求項１〜１６のいずれかに従って同定される細胞表面分子の医薬的に有効な量の使用。
【請求項１６１】
ワクチンを製造するための、請求項１〜１６のいずれかに従って同定される細胞表面分子をコードしている核酸配列の医薬的に有効な量の使用。
【請求項１６２】
細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【請求項１６３】
ワクチンは更に、細胞表面分子と共有的に結合する非自己抗原を含む、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【請求項１６４】
ワクチンは更に、核酸配列と結合する非自己抗原をコードしている第２核酸配列を含む、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【請求項１６５】
ワクチンは更に、１個以上の抗原を含む、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【請求項１６６】
ワクチンは更に、アジュバントを含む、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【請求項１６７】
ワクチンは、前悪性および／または悪性の病気の軽減処置および／または治療学的処置および／または予防学的処置に適当である、請求項１６０または１６１のいずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、癌細胞の細胞表面上の分子を同定する方法、ならびに、癌治療のための治療用遺伝子の運搬および発現のために単独でまたは組み合わせて使用するための癌特異的プロモーターを同定する方法に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
全癌患者のおよそ半数は、診断時点で播種性疾患を持っている。現在の癌治療はこれらの患者の５〜７％を治すに過ぎない。したがって、単独でまたは現存する治療と組み合わせて全身投与できる、より有効な薬品に対する多大な需要がある。故に、癌細胞の有効且つ特異的治療を運搬する遺伝子治療を利用する方法は有望な戦略である。しかしながら、現在までに採用された戦略は限られた成功を収めているに過ぎず、適切な運搬系のさらなる開発が必要とされている。
【０００３】
運搬ベクター
遺伝子治療のための運搬ベクターの選択は重要な問題である。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルスといったウイルスベクター、および、リポソーム、カチオン脂質またはポリカチオンと複合体形成するといった非ウイルスベクターを包含する多くのベクター系が遺伝子移動に対するそれらの適性について試験されてきた。しかしながら、これらのベクターの全てには特定の利点と限界がある。レトロウイルスは形質導入のために有糸分裂を必要とするが、ゲノムに組み込まれるため、長期の発現を媒介する。アデノウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両者に形質導入するが、エピソームのままであるためそれは一時的なものに過ぎない。ところがアデノウイルスは極めて免疫原性であり、レトロウイルスは人間の補体系によって速やかに不活性化される。レンチウイルスは免疫反応を誘起しないが、免疫不全ウイルスの一員であることから安全性に対する特別な配慮が必要である。ウイルスベクターは製造が困難で且つ高価であり、治療用遺伝子の挿入サイズが限られており、そして安全性の検討を数多く行わなければならないにも拘わらず、これまで全プロトコルの７５％以上がウイルスベクターを使用してきた。故に、アデノウイルスベクターのために使用するプロトコルの大多数は、このウイルスの局所力価を増大させそして免疫原性反応を回避するために治療用遺伝子を局所運搬（腫瘍内への注射）によって投与してきたが、最も高い力価の系であっても局所の腫瘍を治癒するには未だ充分でなかった。ウイルスベクター系の主たる不都合は、これらの取り込みが非特異的であり、癌細胞にターゲッティングされないことである。しかしながら、アデノウイルスは運搬の効率性の故に依然として好ましいベクターであるため、免疫反応を低下させそして該ウイルスを特定細胞にターゲッティングする方法を開発中である。一方、免疫原性がより低く、製造がより容易であり、そしてウイルスベクターの安全性を考慮する必要のないリポソームおよびポリカチオン複合体は、トランスフェクション効率がウイルス形質導入よりずっと低く、しかも細胞特異性を欠く。しかしながら、ポリカチオンは運搬されたＤＮＡの電荷を圧縮しおよび中和する能力を有し、そしてＰＥＩ複合体は血液系において比較的安定であるように見受けられる（Goulaらによる1998; Mountain、2000における総説）。
【０００４】
治療の高い特異性を保証し望ましくない副作用を制限するため、問題の治療用遺伝子を効率的に高い特異性をもって癌細胞にターゲッティングおよび運搬するベクターまたは媒体を設計することが重要である。ところが下に記載するようにこれは多要素ベクターの組み立てを含んでいる。
【０００５】
レセプターターゲッティング
リガンドまたは抗体が癌細胞表面に結合することによりインターナライズし得る機能的レセプターまたはその他の細胞表面分子を、該細胞への遺伝子運搬のターゲッティングに使用できる。レセプターのリガンドに接合したＤＮＡによる、レセプターターゲッティングされた遺伝子運搬は有望なアプローチを提供する。ターゲッティングされた遺伝子運搬の主たる利点は、レセプターターゲッティングがウイルス無しで遂行でき、よって遺伝子治療の現行戦略に存在する障害の多くを取り除いていることである。レセプターターゲッティングを用いる癌細胞への遺伝子運搬の成功が、表皮成長因子（CristanoおよびRothによる1996、Frederiksenらによる2000）、葉酸塩（Gottschalkらによる1994）、トランスフェリン（Wagnerらによる1990）のレセプターを包含する様々な異なる表面レセプターについて報告されている。上皮成長因子レセプターに関して立証されているように、特異的レセプターの高度発現が常に効率的なレセプター媒介取り込みの必要条件である訳ではない（Frederiksenらによる2000）。しかしながら、癌細胞によって発現されるレセプターの多くは正常細胞によってもある程度発現されており、これは正常細胞もまたしばしばターゲッティングされていることを意味する。この問題は、治療用遺伝子の発現または性質に特異性のためのさらなる要件が必要であることを強調する。
【０００６】
分子接合体
ターゲッティング遺伝子治療のためには、インターナライズされるリガンド、および治療用遺伝子を発現するＤＮＡを、レセプター媒介取り込みのために物理的に結合させることが必須である。カチオン性ポリマー、例えばポリ−Ｌ−リジン（Frederiksenらによる2000）またはポリエチレンイミン(PEI)（Kircheisらによる1997)（polyplexes）をリガンドおよびＤＮＡと結合させることにより、ターゲッティングされたＤＮＡ分子接合体の非ウイルス合成ベクターを製造するための幾つかの方法が利用されている。幾つかの分子接合体について遺伝子ターゲッティングの成功が報告されている。このリガンドをポリカチオンに共有結合させるか、または、ビオチニル化リガンドとポリリジンをストレプトアビジンを介して複合体形成させてＤＮＡとの縮合(condensed)接合体を形成させるが、これは該リガンドのレセプターによってインターナライズされる。ウイルスの媒介する移動よりこれらの系が有利な点の１つは、ＤＮＡの大きさの制限が無いことである。加えてＰＥＩ複合体は肺の毛細管障壁を通過できるようであり、その事が該化合物を分子接合体のための１物質としている。
【０００７】
分子接合体のエンドソーム放出
レセプターによりＤＮＡ／リガンド接合体のエンドサイトーシスがなされた後、正常な経路によりＤＮＡの分解と喪失が導かれる。それ故分子接合体中にエンドソーム溶解物質が含まれていることが必須であると判明した。アデノウイルス、複製不全アデノウイルスおよびウイルスキャプシドは、この分子接合体中に含まれる時、全てエンドソーム溶解にとって極めて有効であることが判明している。しかしながら、ベクターとしてアデノウイルスを使用する用途を適用する非特異的取り込み、安全性および免疫原性反応についての全条件(reservation)もまたこの系に当てはまる。例えばインフルエンザウイルス、毒素または合成ペプチド由来のアミノ酸配列を含むその他の融合誘導ペプチドの、該分子接合体中への包含が、細胞質放出について試験されている。これらはより低い免疫原性とより低い費用という利点を持つが、エンドソーム溶解においてアデノウイルスより有効性が低いという事が示されている。しかしながら、ＰＥＩはエンドソームの膨潤と破壊をもたらす固有のエンドソーム緩衝能を有するため、分子接合体をポリカチオン性ＰＥＩを用いて製造するならばエンドソーム溶解物質を含ませる必要はない。
【０００８】
癌特異的プロモーター
発現を制御する腫瘍特異的プロモーターが使用できるならば、治療用遺伝子の癌細胞へのターゲッティング特異性の増大が達成できる（Nettelbeckらによる2000に総説されている）。発現が悪性表現型に特異的であるがテロメラーゼのような組織特異性を示さない遺伝子のためのプロモーターが使用されてきた。また、成人では通常発現されない腫瘍胎児抗原、例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ）を調節するプロモーターが、腫瘍細胞中で活性であることが見出された。しかしながら、これらのプロモーターの活性は（強力な常時活性型(constitutive active)ウイルスプロモーターと比較して）しばしば治療用遺伝子の充分な発現を媒介しないことが判明しており、それ故、この腫瘍特異的遺伝子を、治療用遺伝子を制御する別のより強力なプロモーターの活性化に使用した。腫瘍胎児プロモーターのもう１つの不都合は、これらのプロモーターが、腫瘍の組織起源に応じて、或る部分集合の腫瘍型でしか活性でないことである。これとは別に、癌細胞で過剰発現される多くの癌遺伝子はそれら各々のＤＮＡ認識配列からの高い転写活性を媒介できる転写因子であるという事実を利用して、合成プロモーターが設計された。
【０００９】
治療用遺伝子
治療用遺伝子の産物は細胞死を有効に誘発できなければならない。癌治療の遺伝子治療戦略は数多くの異なるアプローチを利用してきた。これらには、免疫系のサイトカイン刺激（腫瘍細胞に対する免疫反応を増強）、選択的プロドラッグ活性化、自殺遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の修復、および活性化された癌遺伝子の抑制といった免疫遺伝子治療が包含される（Frederiksenらによる1999; Gunjiらによる2000に総説されている）。事実、癌に対する臨床試験での現行の治療プロトコルの殆どは免疫療法を含んでいる。しかしながら、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の異常発現または突然変異に関する多くの型の癌の分子表現型として、これらはターゲッティングすべき明白な候補対象である。癌遺伝子の発現または活性を低下させる治療用遺伝子産物、例えばアンチセンスＲＮＡまたは中和抗体フラグメントが試用され、増殖を抑制することが示された。しかしながら、癌遺伝子の不活性化は必ずしも細胞を殺す訳ではなく、故に恐らく短期間の治療には適用できない。現在有望な戦略の１つは腫瘍抑制遺伝子を再導入することであるが、それは、殆どの癌細胞は１またはそれ以上のこれら遺伝子の機能の喪失を示すためである。特に興味深いものは、p53をコードしている腫瘍抑制遺伝子TP53であり、これは細胞周期の停止とアポトーシスの誘発に関わることが分かっている遺伝子を活性化する転写因子である。野生型p53の再導入は、インビトロおよびインビボ系の両方で腫瘍細胞の増殖を著しく低減しまたは癌細胞のアポトーシスを誘発する事が示されている（Rothらによる1996; NielsenおよびManevalによる1998）。
【００１０】
しかしながら、それ以外の状況では無害な薬物に対し細胞を感受性にする遺伝子産物もまた遺伝子治療の治験に広範囲に利用されてきた。特に、ヌクレオシドアナログ薬物ガンシクロビルと組み合わせた単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）が利用されてきた。しかしながら、該薬物をこの酵素によって毒性のヌクレオシド類似体に変換することは、それだけで分裂しつつある細胞を殺すであろう。ところが、この毒性産物はいわゆる「傍観者(by-stander)」効果によって周囲の細胞に伝達され、このアプローチが、ターゲッティング効率の低い系に対して可能となる。
【００１１】
(発明の概要）
したがって、正常細胞と比較して悪性細胞中で異なったレベルで発現する多数の細胞表面分子を同定するための方法であって、
ｉ）CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24、MAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-446、SW 1271からなる群から選ばれる少なくとも３個の悪性セルラインを提供し；
ｉｉ）肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎、結腸、膵臓、小腸、脾臓、骨格筋、気管、前立腺、胎盤、唾液腺、精巣、白血球、脳、脂肪組織、膀胱、乳房、頸、食道、喉頭、卵巣、直腸、皮膚、脊髄、胃、胸腺、甲状腺および子宮からなる群から選ばれる正常組織から誘導される少なくとも３個の全ＲＮＡ試料を提供し；
ｉｉｉ）工程ｉ）に記載のセルラインと工程ｉｉ）に記載の組織試料におけるｍＲＮＡの発現を比較し；
ｉｖ）核酸配列を同定し、ここで、
ａ）ｉ）に記載の１またはそれ以上のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量とｉｉ）に記載の１またはそれ以上の組織で発現されるｍＲＮＡの量の間には差違があり；および／または、
ｂ）ｉ）に記載の少なくとも２個のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および／または、
ｃ）ｉｉ）に記載の少なくとも２個の組織試料中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および、
ｖ）ｉｖ）に記載の核酸配列の中から、可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列を選択する、
という工程を含む方法を提供する事が、本発明の第１の目的である。
【００１２】
第１の核酸配列に機能的に連結した第２の核酸配列の発現を指令(directing)することができる第１の核酸配列を同定する方法であって、該発現のレベルは正常細胞と比較して悪性細胞中で異なり、
ｉ）CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24、MAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-446、SW 1271からなる群から選ばれる少なくとも３個の悪性セルラインを提供し；
ｉｉ）肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎、結腸、膵臓、小腸、脾臓、骨格筋、気管、前立腺、胎盤、唾液腺、精巣、白血球、脳、脂肪組織、膀胱、乳房、頸、食道、喉頭、卵巣、直腸、皮膚、脊髄、胃、胸腺、甲状腺および子宮からなる群由来の正常な組織試料から選ばれる少なくとも３個のＲＮＡ試料を提供し；
ｉｉｉ）ｉ）に記載のセルラインとｉｉ）に記載の組織試料中でのｍＲＮＡの発現を比較し；
ｉｖ）第２の核酸配列を同定し、ここで、
ａ）ｉ）に記載の１またはそれ以上のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量とｉｉ）に記載の１またはそれ以上の組織中で発現されるｍＲＮＡの量の間には差違があり；および／または、
ｂ）ｉ）に記載の少なくとも２個のセルライン中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上差違がなく；および／または、
ｃ）ｉｉ）に記載の少なくとも２個の組織試料中で発現されるｍＲＮＡの量には本質上相違がなく；
ｖ）工程ｉｖ）で同定した第２のヌクレオチド配列と機能的に連結する第１の核酸配列を同定する、
という工程を含む方法を提供する事が、本発明の第２の目的である。
【００１３】
ワクチンの製造のための、本発明に従って同定した医薬的有効量の細胞表面分子の使用を提供する事が、本発明の第３の目的である。さらに、本発明は、ワクチンの製造のための、本発明の方法に従って同定した細胞表面分子をコードしている医薬的有効量の核酸配列の使用を提供する。さらに本発明は、ワクチンの製造のための、医薬的有効量の細胞表面分子および／または該細胞表面分子をコードしている核酸配列の使用を提供し、ここで、該細胞表面分子は、好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ、例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例え���CRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン・バーシカンV1；例えばmGluR1β、例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3、例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。
【００１４】
本発明に記載の方法に従って同定した細胞表面分子の、薬物標的としての使用を提供する事が本発明の第４の目的であり、ここで該薬物標的は、結合パートナーと結合してその結合パートナーを該細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズすることができる。さらに、本発明は、好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ；例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR、例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM、例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター、例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸塩輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2、例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プ��テオグリカン・バーシカンV1；例えばmGluR1β；例えばCD97；例えばL6、例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3；例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター、例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター、例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である細胞表面分子の、薬物標的としての使用を提供し、ここで該薬物標的は、結合パートナーと結合してそして該結合パートナーを該細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズすることができる。
【００１５】
ｉ）本発明に記載の方法によって同定した細胞表面分子を提供し；
ｉｉ）該細胞表面分子と結合できる結合パートナーを同定しおよび/または製造する、
という工程を含む、特異的結合パートナーを同定しおよび/または製造する方法を提供する事が本発明の第５の目的である。
【００１６】
ｉ）好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb、例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7、例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ；例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR、例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体、例えばIGF1R；例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン バーシカンV1；例えばmGluR1β；例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3；例えば上皮成長因���レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である細胞表面分子を提供し；
ｉｉ）該細胞表面分子と結合できる結合パートナーを同定しおよび/または製造する、
という工程を含む、特異的結合パートナーを同定しおよび/または製造する方法を提供する事が本発明のさらなる目的である。
【００１７】
正常細胞と比較して悪性細胞中で異なったレベルで発現され、本発明により提供する方法によって同定される細胞表面分子と結合できる、単離および/または精製された特異的結合パートナーを提供する事が、本発明のさらなる目的である。さらに本発明は、好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6；例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ；例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R；例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸塩輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン・バーシカンV1；例��ばmGluR1β；例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3；例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である細胞表面分子と結合できる、単離されたおよび／または精製された特異的結合パートナーを提供する。
【００１８】
ｉ）本発明に記載の結合パートナーを提供し、
ｉｉ）該結合パートナーと結合できる可能性ある薬物標的を同定する、
という工程を含む、新規な薬物標的を同定する方法を提供する事もまた、本発明の目的である。
【００１９】
本発明に記載の方法により同定した薬物標的を提供する事もまた本発明のもう１つの目的である。
【００２０】
さらに、
ｉ）本発明に記載の結合パートナー；および、
ｉｉ）生物学的反応性種、
を含むターゲッティング複合体を提供する事が本発明の目的であって、該ターゲッティング複合体は、本発明に記載の方法に従って同定した細胞表面分子に結合でき、そして該細胞表面分子を有する細胞中にインターナライズされ得る。
【００２１】
さらに本発明は、本発明に係るターゲッティング複合体を製造するための、本発明に記載の結合パートナーの使用を提供する。
【００２２】
本発明に記載のターゲッティング複合体を医薬的に許容し得る担体と共に含有する医薬組成物を提供する事が本発明のさらなる目的である。
【００２３】
処置を必要とする個体における前悪性および／または悪性の病気の処置方法であって、該個体に本発明に記載のターゲッティング複合体の医薬的有効量を投与することを含む方法を提供する事が、本発明のさらなる目的である。
【００２４】
さらに、処置を必要とする個体の前悪性および／または悪性の病気の治療用薬物を製造するための、本発明に記載のターゲッティング複合体の使用を提供する事が、本発明の目的である。
【００２５】
（発明の詳細な記載）
定義
結合パートナーとは、「細胞表面分子結合パートナー」を参照されたい。
【００２６】
生物学的反応性種とは、標的細胞に直接的または間接的に生物学的影響を及ぼすことのできるいずれかの分子である。
【００２７】
Bp：塩基対
【００２８】
細胞表面分子とは、天然状態で細胞表面と結合している分子である。
【００２９】
細胞表面分子結合パートナーとは、細胞表面分子と特異的に結合できるいずれかの分子である。本明細書において用語「細胞表面分子結合パートナー」およびより短い用語「結合パートナー」は互換的に使用し、両方の用語は本明細書において互いに等価である。
【００３０】
エンハンサーとは、それに機能的に連結した第２核酸配列の転写を増強できる核酸配列である。
【００３１】
第１核酸配列とは、それに機能的に連結した第２核酸配列の発現を指令できる核酸配列である。
【００３２】
正常細胞とは、非悪性起源の非悪性細胞である。
【００３３】
正常組織とは、非悪性組織である。
【００３４】
プロモーターとは、それに機能的に連結した第２核酸配列の発現を指令できる第１核酸配列である。
【００３５】
第２核酸配列とは、発現され得る核酸配列であって、例えばｍＲＮＡはそれらが第１核酸配列と機能的に連結している時、該核酸配列から転写され得る。
【００３６】
サイレンサーとは、それと機能的に連結している第２核酸配列の転写を抑制できる核酸配列である。
【００３７】
ターゲッティング複合体とは、少なくとも１個の結合パートナーおよび生物学的反応性種を含みおよび細胞中にインターナライズされ得る複合体である。
【００３８】
（発明の態様）
もし癌の遺伝子治療が、特に播種性疾患において、癌の有効な代替または補助的治療になるとすれば、幾つかの要件が解決されねばならないという事が徐々に明らかとなってきている。これらには、例えばｉ）複合体のターゲッティングが有効且つ癌特異的であること；ｉｉ）治療用遺伝子の発現が有効且つ癌特異的であること、そしてｉｉｉ）該分子接合体が非免疫原性であり、全身投与後に高い安定性を持ち、且つ毛細管障壁を越えられるという事が包含される。
【００３９】
或る好ましい態様では、本発明は、癌細胞により特異的に発現される遺伝子を同定するための新規な高スループットスクリーニング法の使用と、二重ターゲッティング遺伝子移動および癌治療のための治療用遺伝子の発現へのそれらの適用に関するものである。二重ターゲッティング遺伝子移動の原理の例を図１に略記する。本発明に係るスクリーニング法は癌細胞によって発現される新規な分子の同定を可能にする。
【００４０】
或る態様では、この方法を小細胞肺癌（SCLC）細胞によって発現される適当な分子の遺伝子発現の同定に適用する。小細胞肺癌は全肺癌症例のおよそ２５％を構成する極めて攻撃性の新生物である。この疾患は診断時には殆ど常に転移している。SCLCは異なる化学療法薬単独で、または放射線療法と組み合わせて治療する。治療を改善するための徹底的な試みにも拘わらず、そして殆どの患者が最初は治療に良好に反応するという事実にも拘わらず、致死率は高い。現在の癌治療はこれらの患者のわずか５〜７％を治癒できるに過ぎず、５年の生存率は極端に低い（５〜１５％）。故にSCLC患者には新しい治療法開発の大きな必要性がある。
【００４１】
この疾患の分子表現型が完全に特性決定され、幾つかの腫瘍抑制遺伝子（例えばp53およびRb）の機能喪失に加えて腫瘍遺伝子（特にmycファミリー）の異常発現が、SCLC腫瘍の８０％以上に見出された。これらの表現型はまたSCLC腫瘍から誘導した殆どのセルラインにも見出され（Frederiksenらによる1999による総説）、このセルラインを抗癌薬の可能性のある物質のインビトロ試験のための実験手段として使用することを可能としている。さらに、これらのセルラインはヌードマウスでインビボ増殖させることができ、よって開発した薬物をインビボ状態で試験することができる。故に、SCLCから誘導したセルラインを、癌特異的（または高度に発現される）表面分子およびSCLC細胞において特定の転写活性を持つ領域（プロモーター）の同定のために、遺伝子発現の初回スクリーニングに利用する。
【００４２】
膨大な数のSCLCで発現される遺伝子を同定するためには、異なる研究所が樹立した、呼び異なる患者由来の多岐にわたる異なったSCLCセルラインを本発明において使用することが好ましい。さらに、これらのSCLCセルラインにおける発現を、好ましくは内胚葉、外胚葉および中胚葉起源の異なる組織の代表である様々な正常組織での発現と比較することが好ましい。
【００４３】
本発明の中では二相性戦略の適用が可能であるが、本発明のある態様では他の戦略も適用できる。本発明に係る二相性戦略は、例えば、全身投与を介して、表面上の機能的輸送コンピテントレセプターとの結合により癌細胞に効果的にターゲッティングすることができ、この事によりその後、この癌細胞で特異的に活性または機能亢進であるプロモーターにより、該遺伝子が癌細胞中で発現されるような遺伝子治療薬である。
【００４４】
アミノ酸および核酸
本明細書および特許請求の範囲全編にわたり、天然アミノ酸の一文字表記または三文字表記のいずれかを使用する。ＬまたはＤ型が明記されていない場合、問題のアミノ酸は天然Ｌ型（Pure & Appl.ChemVol56(5)pp595-624(1984)を参照されたい）またはＤ型であり、その結果形成されるペプチドはＬ型、Ｄ型、またはＬ型とＤ型の混合配列で構成され得ると理解すべきである。
【００４５】
何も明記していない場合、本発明に係るポリペプチドのＣ末端アミノ酸は遊離カルボン酸として存在すると理解すべきであり、これは「−ＯＨ」とも記載できる。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は遊離アミノ基を含み、これは「Ｈ−」とも記載できる。
【００４６】
別途明記していない場合、アミノ酸は天然または非天然の如何に拘わらず任意のアミノ酸、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、および/またはγアミノ酸から選択できる。したがってこの群は、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、リジン類似体DAPおよびDAPAを含むがこれらに限定される訳ではない。
【００４７】
「核酸」という語は、本明細書全編で、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにペプチド核酸（PNA）またはlocked核酸（LNA）といったそれらの誘導体の包含を意味する。
【００４８】
細胞表面分子とプロモーターを同定する方法
本発明に係る、細胞表面分子および／または第１核酸配列（これは機能的に連結した第２核酸配列の発現を指令できる）の同定に使用する方法は、好ましくは悪性セルライン中に見出されるｍＲＮＡのレベルを正常組織に見出されるｍＲＮＡのレベルと比較することを含む。
【００４９】
好ましくは、本発明に係る悪性セルラインは哺乳動物のセルライン、より好ましくは人間のセルラインである。より一層好ましくは該セルラインは小細胞肺癌（SCLC）から誘導する。更により一層好ましくはこのセルラインは、CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24およびMAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-44およびSW 1271からなる群から選ばれる。より好ましくは該セルラインは、CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24および MAR 86 MIからなる群から選ばれる。
【００５０】
よりいっそう好ましくは該セルラインは、CPH 54A、CPH 54 B、CHP 136A、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI-H69、NCI-N417、MAR H24およびMAR 86MIからなる群から選ばれる。
【００５１】
最も好ましくは該セルラインはDMS53、DMS70、DMS92、DMS114、DMS153、DMS273、NCI417およびNCI H69からなる群から選ばれる。
【００５２】
本発明に係る好ましいセルラインを受託番号と共に表１に列挙する。
【表１】
2005500833.tif 000002
【表２】
2005500833.tif 000003
【表３】
2005500833.tif 000004
【００５３】
例えばこの方法は、CPH 54 A、CPH 54 B、GLC 2、GLC 3、GLC 14、GLC 16、GLC 19、GLC 26、GLC 28、DMS 53、DMS 79、DMS 92、DMS 114、DMS 153、DMS 273、DMS 406、DMS 456、NCI H69、NCI N417、MAR H24およびMAR 86 MI、SHP-77、NCI-H2171、NCI-H2195、NCI-H2196、NCI-H2198、NCI-H2227、NCI-H2286、NCI-H2330、NCI-H735、NCI-H1339、NCI-H1963、NCI-H2107、NCI-H2108、NCI-H1304、NCI-H1341、NCI-H1417、NCI-H1436、NCI-H1522、NCI-H1618、NCI-H1672、NCI-H1694、NCI-H1836、NCI-H1870、NCI-H1876、NCI-H1882、NCI-H1926、NCI-H1930、NCI-H1994、NCI-H2029、NCI-H2059、NCI-H2066、NCI-H2081、NCI-H2141、NCI-H211、NCI-H220、NCI-H250、NCI-H524、NCI-H592、NCI-H711、NCI-H719、NCI-H740、NCI-H748、NCI-H774、NCI-H841、NCI-H847、NCI-H865、NCI-H1048、NCI-H1059、NCI-H1092、NCI-H1105、NCI-H1184、NCI-H1238、NCI-H1284、NCI-H1688、NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H660、NCI-H889、NCI-H60、NCI-H196、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82、NCI-H460、NCI-H345、NCI-H510A、NCI-128、NCI-446およびSW 1271からなる群から選ばれる、少なくとも4、例えば少なくとも5、例えば少なくとも6、例えば少なくとも8、例えば少なくとも10、例えば少なくとも12、例えば少なくとも14、例えば少なくとも16、例えば少なくとも18、例えば少なくとも20、例えば21、例えば少なくとも25、例えば少なくとも30、例えば少なくとも40、例えば少なくとも50、例えば少なくとも60、例えば少なくとも70、例えば79種類前後の悪性セルラインを含む。
【００５４】
本発明の或る好ましい態様では、該方法は、セルラインDMS53、DMS70、DMS92、DMS114、DMS153、DMS273、NCI417およびNCI H69の全てを含む。
【００５５】
該セルラインは任意の適当な手段で培養でき、例えば当業者の知悉する適当な条件の下にインビトロ細胞培養で培養できる。本発明の或る態様では、１またはそれ以上のセルラインを異種移植片として動物中でインビボ培養する。動物は任意の適当な動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類、最も好ましくはマウスであり得る。セルラインを異種移植片としてインビボ培養する方法の例を実施例１に示す。
【００５６】
同じセルラインをインビトロ細胞培養で、およびインビボで培養できるという事もまた本発明に包含される。
【００５７】
一般にインビボ培養状態、即ち異種移植片として動物中で培養することは、自然に発生する腫瘍または癌により似ており、よって少なくとも１、例えば少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８種類のセルラインをインビボ培養することが通常好ましい。より好ましくは１乃至７９、例えば２乃至７０、例えば３乃至６０、例えば４乃至５０、例えば５乃至４０、例えば６乃至３０、例えば７乃至２０種類の範囲のセルラインをインビボ培養する。より一層好ましくは８種類前後のセルラインをインビボ培養する。
【００５８】
好ましくは、インビボ培養するセルラインは表１に述べたセルラインの群から選ばれ、より一層好ましくはインビボ培養するセルラインはCPH54A、CHP136A、GLC3、GLC14、DMS273、NCI-H69、NCI-N417およびMAR H24からなる群から選ばれる。
【００５９】
正常組織とは非悪性である組織である。好ましくは該組織は前悪性および／または悪性の病気に罹患していない個体から誘導する。より好ましくは正常組織は哺乳動物の組織であり、より一層好ましくは該組織はヒトの組織である。更により好ましくはこの組織は、肝臓、心臓、腎臓、肺、副腎、結腸、膵臓、小腸、脾臓、骨格筋、気管、前立腺、胎盤、唾液腺、精巣、白血球、脳、脂肪組織、膀胱、乳房、頸、食道、喉頭、卵巣、直腸、皮膚、脊髄、胃、胸腺、甲状腺および子宮からなる群から選ばれる。より一層好ましくは該組織は脳、副腎、肺、腎臓、心臓、気管、前立腺、唾液腺、甲状腺、肝臓、膵臓、脾臓、小腸、骨格筋、結腸、胃および精巣からなる群から選ばれる。最も好ましくは該組織は肺、肝臓、心臓および腎臓からなる群から選ばれる。
【００６０】
好ましくは該方法は、少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも８、例えば少なくとも１０の全ＲＮＡ試料を含む。
【００６１】
該方法は、悪性セルライン中に見出されるｍＲＮＡのレベルを正常組織中に見出されるｍＲＮＡのレベルと比較するのに適した、当業者の知悉する任意の方法とすることができる。一般にこのような方法はｍＲＮＡまたは全ＲＮＡいずれかの精製を含む。ＲＮＡの精製は、例えばSambrookらによる1989または本明細書の下記実施例に記載のような、当業者の知悉する標準的な方法に従って実施できる。
【００６２】
ＲＮＡ試料は幾つかの異なる技術によって比較できる。任意の適当な技術を本発明と共に適用できる。例えば、ディファレンシャルディスプレーまたは差し引きハイブリダイゼーションによって該ＲＮＡ試料を比較できる。さらに、公知の核酸配列を持つ標識したＲＮＡまたはｃＤＮＡプールのハイブリダイゼーションを含む技術が本発明に好適である。例えば該公知の核酸をハイブリダイゼーションに先立ち固体支持体、例えば膜、例えばニトロセルロース膜上に固定化でき、または該固体支持体はプラスチックもしくはガラス製であってよい。
【００６３】
標識されたＲＮＡまたはｃＤＮＡは任意の直接または間接的に検出可能な標識、例えば酵素、放射性アイソトープ、発色団、蛍光基もしくは重金属で標識できる。さらに、該標識は一対の結合パートナーのうちの第１部分であってよく、その場合第２部分が直接的または間接的のいずれかで検出できる。間接的に検出可能な標識の検出のためには、一対の結合パートナーの第１部分が第２部分によって認識され、一方この第２部分が第１部分によって認識され、これが再度第２部分によって認識されるといった「サンドイッチ」系の使用が可能である。全ての工程において第１および/または第２部分は標識され得る。結合パートナーの対の例は抗原／抗体またはビオチン／ストレプトアビジンである。しかしながら、その他任意の適当な対もまた本発明と共に使用できる。
【００６４】
本発明の或る態様では、この方法は、
ｉ）悪性セルライン由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡを単離し；
ｉｉ）該ＲＮＡからｃＤＮＡ個体群を調製し（ここで、１つのｃＤＮＡ個体群は１つのセルラインまたは１つの組織試料から単離したＲＮＡから調製する）；
ｉｉｉ）各ｃＤＮＡ個体群を検出可能な標識で標識し；
ｉｖ）公知の核酸配列のアレイを固定化した、固体支持体を提供し；
ｖ）各ｃＤＮＡ個体群を、ハイブリダイゼーション可能な条件下で固体支持体と一緒にインキュベートし；
ｖｉ）固体支持体上の検出可能標識を検出する；
という工程を含む。
【００６５】
好ましくは該検出可能標識は間接的に検出可能な標識であり、より好ましくは該標識は一対の結合パートナーの第１部分であって、第２部分は直接的または間接的に検出可能である。最も好ましくは該標識はビオチンである。ビオチンは、標識されたストレプトアビジン種、好ましくは蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出できる。より好ましくは該ストレプトアビジンは、ビオチンで標識した抗ストレプトアビジン抗体と結合でき、そして該ビオチンが標識化ストレプトアビジン、好ましくは蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出できる。該蛍光標識は例えばフィコエリスリンまたはその他の適当な蛍光標識であり得る。
【００６６】
一つの好ましい態様では、該固体支持体はガラスプレートである。好ましくは少なくとも1000、例えば少なくとも5000、例えば少なくとも10,000、例えば少なくとも50,000、例えば少なくとも100,000、例えば少なくとも150,000、例えば少なくとも200,000、例えば240,000前後の異なる公知の核酸配列を固体支持体上に固定化する。これらの核酸配列は全て異なる遺伝子から誘導したものであってよいが、しかしながら、より好ましくは各遺伝子は、１以上、例えば２以上、例えば４以上、例えば７以上、例えば１０以上、例えば１５以上、例えば２０以上、好ましくは２０前後の異なる核酸配列で表される。
【００６７】
本発明の或る態様では、該ＲＮＡ試料をCHIPS分析またはGeneChips分析によって比較できる。Chips分析およびGeneChips分析という語は本明細書全編で互換的に使用する。Chips分析の実施方法の例を実施例１に示す。
【００６８】
適当な細胞表面分子を幾つかの基準に従って選ぶ。好ましくは、本発明に係る方法で使用する１またはそれ以上のセルラインで発現されるｍＲＮＡの量と、本発明に係る１またはそれ以上の組織で発現されるｍＲＮＡの量の間には差違がある。好ましくは該差違は少なくとも１.１倍、例えば１.２倍、例えば１.５倍、例えば１.７５倍、例えば２倍、例えば２.５倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも７．５倍、例えば少なくとも１０倍のｍＲＮＡ発現の差違である。或る好ましい態様では該差違は、原則的に無限数倍であり、例えば１またはそれ以上のセルライン中では発現される検出可能なｍＲＮＡがないが、１またはそれ以上の正常組織中ではｍＲＮＡが検出でき、あるいは、１またはそれ以上の正常組織中では発現される検出可能なｍＲＮＡがないが、１またはそれ以上のセルライン中ではｍＲＮＡが検出できる。
【００６９】
さらに、本発明に係る方法で使用する少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも８、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１８、例えば少なくとも２０、例えば２１、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば少なくとも４０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも６０、例えば少なくとも７０、例えば７９前後の悪性セルライン中で発現されるｍＲＮＡの量には好ましくは本質上差違がない。
【００７０】
加えて、本発明の方法に従ってそこから全ＲＮＡを使用する、少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも８、例えば少なくとも１０の組織試料で発現されるｍＲＮＡの量には好ましくは本質上差違がない。
【００７１】
可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列を、上の基準を満たす核酸配列から選ぶ。１つの特に好ましい態様では、この可能性ある細胞表面分子を実施例１に概説する通り同定し、そして該実施例に記載の基準に従って選ぶ。
【００７２】
どの核酸配列が可能性ある細胞表面分子をコードしているかを決定するために、異なる戦略を利用できる。例えば、可能性ある細胞表面分子は、一般にアクセス可能なデータベースで入手し得る情報に従って選択できる。このようなデータベースは例えばPubMed（NCBI）、Nucleotide（NCBI）、Protein（NCBI）、Structure（NCBI）、OMIM（NCBI）およびLocusLink（NCBI）からなる群から選ばれる。NCBIはNational Center for Biotechnology Informationの略語である。さらに、可能性ある細胞表面分子は、該可能性ある細胞表面分子の名称中に１またはそれ以上の選ばれた語が存在する事に基づいて選択できる。例えば係る語は、レセプター、膜、接着、インテグリン、表面、抗原、シンデカン、輸送、チャネル、ホルモン、結合、糖タンパク質、マトリックス、CAM、デスモソーム、ギャップ接合部、デルタ、免疫グロブリン、MHC、CD、HSPG、CSPG、内在性およびノッチからなる群から選ばれる。
【００７３】
別法として、可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列を、公知の細胞表面分子との配列相同性に従って選ぶ。可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は公知の細胞表面分子をコードしている核酸配列と、少なくとも２０％、例えば少なくとも２２.５％、例えば少なくとも２５％、例えば２７.５％、例えば少なくとも３０％の配列一致を持つべきである。
【００７４】
可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列はまた、公知の細胞表面分子内部に含まれるドメインとの配列相同性に基づいて選ぶこともできる。好ましくは、可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸のドメインと公知の細胞表面分子のドメインをコードしている核酸配列の間には、少なくとも２０％、例えば少なくとも２２．５％、例えば少なくとも２５％、例えば２７．５％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも３２．５％、例えば少なくとも３５％、例えば少なくとも３７．５％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも４２．５％、例えば少なくとも４５％、例えば少なくとも４７．５％、例えば少なくとも５０％の配列一致がある。
【００７５】
可能性ある細胞表面分子をコードしている核酸配列は、可能性ある細胞表面分子はドメイン（これはしばしば細胞表面と結合している）を含むという事に基づいて選ぶこともできる。該ドメインは例えば疎水性領域および可能性あるグリコシル化部位からなる群から選ばれ得る。
【００７６】
本発明の或る態様では、候補細胞表面分子をChips分析によって同定した。次いで適当な細胞表面分子を幾つかの基準に基づいて選ぶことができる。例えば、絶対的必要性をもって存在する（Ｐ）と採点され、例えば＞１０、例えば＞２０、例えば＞４０、例えば＞５０の平均差違を有する細胞表面分子を含めることができる。さらに、適当な細胞表面分子を同定するための得点系を作ることも可能である。例えば、該遺伝子を発現する各々のセルラインまたは組織につき１点といったように、細胞表面分子をコードしている遺伝子を幾つかの点数で採点することができる。各遺伝子に対する合計評点を正常組織とSCLCセルラインについてそれぞれ合計する。次いで、SCLCラインの少なくとも３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、例えば１０以上に存在すると採点された遺伝子を選ぶことができる。細胞表面分子を選ぶ好ましい方法を実施例１に記載する。
【００７７】
本発明はまた、それに機能的に連結した第２核酸配列の発現を指令できる第１核酸配列を同定する方法をも提供する。これらの方法は、正常細胞と比較して悪性細胞中では異なったレベルで発現される第２核酸配列を同定することを含んでいる。
【００７８】
したがって好ましくは、１またはそれ以上のセルラインで発現される第２核酸配列のｍＲＮＡの量と、１またはそれ以上の組織で発現される第２核酸配列のｍＲＮＡの量には差違がある。より好ましくは、該差違は、少なくとも１．１倍、例えば１．２倍、例えば１．５倍、例えば１．７５倍、例えば２倍、例えば２．５倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも７．５倍、例えば少なくとも１０倍のｍＲＮＡ発現の差違である。
【００７９】
或る好ましい態様では、１またはそれ以上のセルライン中で発現される検出可能な第２核酸配列ｍＲＮＡはなく、且つ１またはそれ以上の正常組織中では該ｍＲＮＡが検出可能である、あるいは、１またはそれ以上の正常組織中で発現される検出可能な第２核酸配列ｍＲＮＡはなく、且つ１またはそれ以上のセルライン中では該ｍＲＮＡが検出可能である、といったように、原則としてこの差違が無限数倍である。
【００８０】
さらに、本発明方法で使用する少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも８、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１２、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１６、例えば少なくとも１８、例えば少なくとも２０、例えば２１、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば少なくとも４０、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも６０、例えば少なくとも７０、例えば７９前後の悪性セルライン中で発現される第２核酸配列ｍＲＮＡの量には本質上差違がない。
【００８１】
さらに、好ましくは、少なくとも２、例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも８、例えば少なくとも１０の正常組織試料中で発現される第２核酸配列ｍＲＮＡの量には本質上差違がない。
【００８２】
或る特に好ましい態様では、第２核酸配列を実施例１に記載の方法に従って同定する。最も好ましくは、その実施例に概説した基準を適用して有用な第２核酸配列を選ぶ。
【００８３】
本発明の或る態様では、候補プロモーターをChips分析によって同定した。次いで適当なプロモーターを、そのプロモーターが制御する遺伝子の発現レベルに基づく幾つかの基準に基づいて選ぶことができる。例えば、絶対的必要性をもって存在する（Ｐ）と採点され、＞１０、例えば＞２０、例えば＞３０、例えば＞４０、例えば＞５０（発現レベル）の平均差違を有する遺伝子のみを含めることができる。本明細書中、上に記載した点数採点系を使用できる。例えば少なくとも３、例えば少なくとも４、例えば少なくとも５、例えば少なくとも６、例えば少なくとも７、例えば少なくとも８、例えば少なくとも９、例えば少なくとも１０、例えば少なくとも１１、例えば少なくとも１２のSCLC系列に存在すると採点された遺伝子を例えば選択できる。もし或る遺伝子が１またはそれ以上の正常組織に存在すると採点されたならば、SCLCセルラインのメジアン平均差違値は、好ましくは正常組織のメジアン平均差違値の４倍またはそれ以上でなければならない。好ましくは正常組織についての発現の平均差違が＜５０でSCLCについては＞１００であるプロモーターを選ぶ。より好ましくは、正常組織についての発現の平均差違が＜５０でSCLCについては＞２００であるプロモーターを選ぶ。最も好ましくは正常組織についての発現の平均差違が＜５０でSCLCについては＞４００であるプロモーターを選ぶ。別法として、SCLCにおける発現の平均差違が正常組織におけるそれの＞８倍であるプロモーターを選ぶことができる。細胞表面分子を選ぶ好ましい方法を実施例１に記載する。
上記の基準に従って第２核酸配列を同定したならば、この第２ヌクレオチド配列と機能的に連結した第１核酸配列を同定することが可能である。これは当業者の知悉する任意の標準的な方法に従って実施できる。例えば公知のヒトゲノム配列を利用することが可能である。
【００８４】
細胞表面分子
本発明に係る細胞表面分子は細胞表面に天然状態で結合している任意の分子である。細胞表面分子はその存続期間の間ずっと細胞表面に結合できる訳ではなく、特定の時期にのみ細胞表面に結合できる。本発明の範囲内にある細胞表面分子は細胞表面に結合しているいかなる種類の分子であってもよいが、本発明に係る細胞表面分子は好ましくはポリペプチドを含む。
【００８５】
本発明の或る態様では、細胞表面分子は細胞表面に結合せず、細胞内レセプターである。細胞内レセプターは例えば核ステロイドホルモンレセプターを包含する。
【００８６】
しかしながら本発明のその他の好ましい態様では、細胞表面分子は、例えば貫膜ドメイン、膜係留ドメイン、または膜と結合できる親油性基のような共有結合により結合した基を介して、例えば細胞表面に直接結合する分子を包含する。親油性基は例えばグリコシル−ホスファチジル−イノシトール基（GPI）であり得る。しかしながら、該細胞表面分子は、細胞表面に間接的に結合する分子、例えば細胞表面に直接的または間接的に結合している他の細胞表面分子と結合できる分子をも包含する。
【００８７】
一般に細胞表面分子は少なくとも１個の細胞外ドメインを含むが、細胞表面分子は１以上の細胞外ドメイン、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、例えば１０以上の細胞外ドメインを含むこともできる。
【００８８】
細胞表面分子はしばしばグリコシル化されたポリペプチドである。
【００８９】
本発明の或る好ましい態様では、細胞表面分子は特異的結合パートナーと結合でき、そして結合時に該特異的結合パートナーをインターナライズすることができる。即ち、結合パートナーと細胞表面分子との結合の後、該結合パートナーは細胞表面分子を発現している細胞の内部に移行する。該結合パートナーはしばしばレセプター媒介エンドサイトーシスによってインターナライズされるが、その他の機構も可能であり、本発明の範囲内にある。結合パートナーをインターナライズできる細胞表面分子は、例えば放射線療法、毒素療法もしくは遺伝子療法または癌ワクチンに有用となり得る。
【００９０】
本発明の別の好ましい態様では、細胞表面分子は細胞表面で特異的結合パートナーと結合できるが、該特異的結合パートナーをインターナライズすることはできない。非インターナライズ細胞表面分子は例えば放射線療法および癌ワクチンに有用となり得る。
【００９１】
好ましい細胞表面分子のGenBank受託番号と名称を表２に示す。
【表４】
2005500833.tif 000005
【表５】
2005500833.tif 000006
【表６】
2005500833.tif 000007
【表７】
2005500833.tif 000008
【表８】
2005500833.tif 000009
【表９】
2005500833.tif 000010
【表１０】
2005500833.tif 000011
【表１１】
2005500833.tif 000012
【００９２】
本発明に係るより一層好ましい細胞表面分子は以下の群のうちの１つに属するレセプターである：
レセプターチロシンキナーゼの成員、
インテグリンファミリーの成員、
免疫グロブリンスーパーファミリー接着性分子の成員、
ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
MAGEファミリーの成員、
RAGEファミリーの成員、
低密度リポタンパク質レセプターファミリーの成員、
カドヘリン接着分子の成員、
代謝調節型グルタミン酸レセプターの成員、
ステロイドホルモンファミリーの成員、
セブン貫膜レセプターファミリーの成員、
心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター、
GFRA3、
トランスフェリンレセプター、
セリン/スレオニンキナーゼレセプターの成員。
【００９３】
本発明に係るより更に好ましい細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる細胞表面分子である。
【００９４】
本発明の或る好ましい態様では、細胞表面分子は、結合時に特異的結合パートナーをインターナライズすることができる（本明細書上記を参照されたい）。結合パートナーをインターナライズすることのできる本発明に係る好ましい細胞表面分子はNCAM1、NPTXR、LRP8およびCHRNA5からなる群から選ぶことができる。
【００９５】
本発明の別の好ましい態様では、細胞表面分子はそれらの特異的結合パートナーをインターナライズすることができない。結合パートナーをインターナライズすることのできない本発明に係る好ましい細胞表面分子はGRIA2、GRM8、ITGAVおよびITGAEからなる群から選ぶことができる。
【００９６】
本発明に係る１つの特に好ましい細胞表面分子はNCAM1（NCAM、神経細胞接着性分子、N-CAM、CD56）である。NCAM1は殆どのSCLC中で高度に発現される。NCAM1の発現は例えばCHIPS分析、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより示されている（実施例１、図１１および図１５を参照されたい）。NCAM1は、結合パートナーとインターナライズすることができる。NCAM1と結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。NCAM1は星状細胞にインターナライズされることが示されており（Minanaらによる2001）、抗NCAM1抗体-タンパク質A-ストレプトアビジン-ビオチンβ-ガラクトシダーゼ酵素からなる極めて大型の分子複合体の非常に効率的なインターナライゼーションが可能であることが証明されている（Yuらによる2000）。
【００９７】
本発明に係る別の好ましい細胞表面分子はNPTXR（ニューロンペントラキシンレセプター、NPR）である。NPTXRは殆どのSCLC中で発現される。NPTXRの発現は例えばCHIPS分析、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより証明されている（実施例１、図１０および図１４を参照されたい）。NPTXRは高インターナライズレセプターである。NPTXRと結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。
【００９８】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はLRP8（低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質、アポリポタンパク質Eレセプター2）である。
【００９９】
LRP8は試験した全てのSCLC中で発現されている。LRP8の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRによって証明された（実施例１および図９を参照されたい）。LRP8は高インターナライズレセプターである。LRP8と結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。
【０１００】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はCHRNA5（ニコチン性アセチルコリンレセプターα5サブユニット）である。CHRNA5と結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。
【０１０１】
本発明において使用できるさらに別の細胞表面分子はL1CAM（神経細胞接着性分子L1）である。L1は結合パートナーをインターナライズできることが知られている。L1CAMと結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。
【０１０２】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はTNFRSF12（DR6、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー成員21）である。TNFRSF12は殆どのSCLC中で発現される。TNFRSF12の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRによって証明されている（実施例１および図８を参照されたい）。TNFRSF12が属するファミリーのその他の成員は結合パートナーをインターナライズすることができる。
【０１０３】
本発明に係る特に好ましい細胞表面分子はGRIA2（イオンチャネル型グルタミン酸レセプター2、GLUR2、GLURB、HBGR2、AMPA2）である。GRIA2は試験した全てのSCLC中および脳中で発現されている。GRIA2は極めて特異的な脳の外部のSCLCレセプターである。GRIA2の発現は例えばChips分析、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより証明されている（実施例１、図１２Ａおよび図１６を参照されたい）。
【０１０４】
本発明に係る別の好ましい細胞表面分子はGRM8（代謝調節型グルタミン酸8レセプター、GLUR8、mGlu8、GPRC1H）である。GRM8は脳以外のSCLC中で極めて特異的に発現され、殆どのSCLC中で発現されている。GRM8の発現は例えばChips分析、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングにより証明されている（実施例１および図１３を参照されたい）。GRM8と結合できる結合パートナーを本明細書下記に記載する。
【０１０５】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はITGAV（インテグリンサブユニットαv、ビトロネクチンレセプター、CD51）である。ITGAVはSCLCで高度に発現される。発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明されている（実施例１および図１２Ｂを参照されたい）。
【０１０６】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はITGAE（インテグリンαEサブユニット前駆体、ヒト粘膜リンパ球1'抗原、CD103）である。ITGAEは試験した全てのSCLCで発現され、ITGAEはSCLC中で極めて特異的に発現される。発現は例えばCHIPS分析およびウェスタンブロッティングにより証明されている（実施例１および図１７を参照されたい）。
【０１０７】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はGPR49（オーファンGタンパク質共役レセプター67、GPR67、HG38）である。
【０１０８】
本発明に係るさらに別の好ましい細胞表面分子はTMEFF1（EGF様および2個のフォラスタチン様ドメインを持つ貫膜タンパク質）である。
【０１０９】
しかしながら本発明は、表２に示すヌクレオチド配列のフラグメントがコードしているフラグメントを含む細胞表面分子にも関する。或る好ましい態様では、本発明は、同遺伝子がコードしているこれらの配列のスプライス変異体によってコードされている細胞表面分子にも関する。表２に概説した細胞表面分子のスプライス変異体は該細胞表面分子とフラグメントを共有するポリペプチド配列をコードしていることがあるが、しかしながら、スプライス変異体は別のリーディングフレームを利用しているかも知れず、その結果、２つのスプライス変異体の産物は共通フラグメントを持つヌクレオチド配列によってコードされていても、ポリペプチド配列は関連していないことがある。
【０１１０】
さらに、本発明は、表２に記載の細胞表面分子をコードしているヌクレオチド配列のフラグメントに関する。特に、本発明に係る結合パートナー（本明細書下記を参照されたい）は、本発明に係る細胞表面分子の１またはそれ以上のフラグメントの産物とのみ結合でき、好ましくは細胞表面分子の全フラグメントとは結合しない。したがって、可能性ある結合パートナーを同定するために該細胞表面分子のフラグメントを使用することが可能である（本明細書下記を参照されたい）。
【０１１１】
例えばこのようなフラグメントは該配列の5'側半分または3'側半分を含む。さらに、該フラグメントは、その配列の5'側半分の一部または3'側半分の一部を含むかも知れない。好ましくはこのようなフラグメントは5000bpより短く、例えば4000bpより短く、例えば3000bpより短く、例えば2500bpより短く、例えば2000bpより短く、例えば1750bpより短く、例えば1500bpより短く、例えば1250bpより短く、例えば1000bpより短く、例えば900bpより短く、例えば800bpより短く、例えば700bpより短く、例えば600bpより短く、例えば500bpより短く、例えば400bpより短く、例えば300bpより短く、例えば200bpより短く、例えば100bpより短く、例えば75bpより短く、例えば50bpより短く、例えば40bpより短く、例えば30bpより短く、例えば25bpより短く、例えば20bpより短く、例えば18bpより短い。
【０１１２】
該フラグメントは内部フラグメントであってよく、または5'もしくは3'末端を含んでいてもよい。
【０１１３】
本発明の或る好ましい態様では、該フラグメントは予め決められた長さの多数の構築(building)ブロックを含み、この構築ブロックは、天然遺伝子配列、好ましくは表２に概説した配列の一部と同一になるように連結している。したがって、フラグメントは予め決められた長さの複数の構築ブロックおよび予め決められた開始点を含み得る。
【０１１４】
構築ブロックは予め決められた長さおよび開始点を持つ核酸配列であり、その結果、第１の構築ブロックが該核酸配列のある位置で始まり、次の構築ブロックは前の構築ブロックが停止する位置の後の位置から始まる。
【０１１５】
好ましくは、該構築ブロックは以下の配列のいずれかから誘導される：配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号42、配列番号44、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号261、配列番号259、配列番号263、配列番号265、配列番号267、配列番号269、配列番号271、配列番号273、配列番号275、配列番号277、配列番号279、配列番号281、配列番号283、配列番号285、配列番号287、配列番号289、配列番号291、配列番号293、配列番号295、配列番号297、配列番号299、配列番号301および配列番号303。
【０１１６】
各構築ブロックは好ましくは1000bpより短く、例えば900bpより短く、例えば800bpより短く、例えば700bpより短く、例えば600bpより短く、例えば500bpより短く、例えば400bpより短く、例えば300bpより短く、例えば200bpより短く、例えば100bpより短く、例えば75bpより短く、例えば50bpより短く、例えば40bpより短く、例えば30bpより短く、例えば25bpより短く、例えば20bpより短く、例えば18bpより短い。或る態様では構築ブロックは18bp前後である。
【０１１７】
構築ブロックは、表２に概説した任意の配列の1位、例えば2位、例えば3位、例えば4位、例えば5位、例えば6位、例えば7位、例えば8位、例えば9位、例えば10位、例えば11位、例えば12位、例えば13位、例えば14位、例えば15位、例えば16位、例えば17位、例えば18位、例えば19位、例えば20位、例えば20位〜100位のいずれか、例えば100位のいずれかで始まり得る。
【０１１８】
該フラグメントは好ましくは複数の構築ブロック、例えば2、例えば3、例えば4、例えば5、例えば5〜10、例えば10〜20、例えば20〜30、例えば30〜40、例えば40〜50、例えば50〜75、例えば75〜100、例えば100以上の構築ブロックを含む。
【０１１９】
或る態様では、該フラグメントは、長さ100塩基対であり且つ1位で始まる構築ブロックを含む。
【０１２０】
さらに、本発明に係る細胞表面分子のフラグメントはキメラフラグメントであってよく、係るキメラフラグメントは、表２に概説した配列に従い互いに結合していない１以上のフラグメントを含む。該キメラフラグメントは同じ細胞表面分子に由来するフラグメントを含むことができたり、或いはそれらは本発明に係る１以上の細胞表面分子に由来するフラグメントを含むこともできる。
【０１２１】
さらに、本発明は表２に記載の細胞表面分子のポリペプチド配列のフラグメントに関する。特に、本発明に係る結合パートナー（本明細書下記を参照されたい）は本発明に係る細胞表面分子のうち１個だけまたはそれ以上のフラグメントに結合できるが、好ましくは細胞表面分子の全フラグメントには結合しない。したがって、該細胞表面分子のフラグメントを使用して可能性ある結合パートナーを同定することが可能である（本明細書下記を参照されたい）。
【０１２２】
ポリペプチド配列のフラグメントは3000アミノ酸よりも短く、例えば2500アミノ酸よりも短く、例えば2000アミノ酸よりも短く、例えば1750アミノ酸よりも短く、例えば1500アミノ酸よりも短く、例えば1250アミノ酸よりも短く、例えば1000アミノ酸よりも短く、例えば900アミノ酸よりも短く、例えば800アミノ酸よりも短く、例えば700アミノ酸よりも短く、例えば600アミノ酸よりも短く、例えば500アミノ酸よりも短く、例えば400アミノ酸よりも短く、例えば300アミノ酸よりも短く、例えば200アミノ酸よりも短く、例えば100アミノ酸よりも短く、例えば75アミノ酸よりも短く、例えば50アミノ酸よりも短く、例えば40アミノ酸よりも短く、例えば30アミノ酸よりも短く、例えば25アミノ酸よりも短く、例えば20アミノ酸よりも短く、例えば15アミノ酸よりも短く、例えば10アミノ酸よりも短くてよい。
【０１２３】
好ましくは、該フラグメントは以下のポリペプチド配列のフラグメントである：配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124 配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号.147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211、配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215、配列番号216、配列番号217、配列番号218、配列番号219、配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260、配列番号262、配列番号264、配列番号266、配列番号268、配列番号270、配列番号272、配列番号274、配列番号276、配列番号278、配列番号280、配列番号282配列番号284、配列番号286、配列番号288、配列番号290、配列番号292、配列番号294、配列番号296、配列番号298、配列番号300、配列番号302および配列番号304。さらに、該ポリペプチド配列のフラグメントの機能的相同体もまた本発明の細胞表面分子に包含され得、または該細胞表面分子は該ポリペプチド配列のフラグメントの機能的相同体を構成することができる。機能的相同体は本明細書下記に定義する。
【０１２４】
本発明に係る該細胞表面分子の特に好ましいフラグメントは、該細胞表面分子の１またはそれ以上の細胞外ドメインを含むフラグメントである。加えて、細胞外ドメインの一部を含むフラグメントもまた本発明の範囲内にある好ましいフラグメントである。最も好ましくは、本発明に係る細胞表面分子のフラグメントは、１またはそれ以上の細胞外ドメインを含み、且つ該フラグメントに対する親和性を持つ結合パートナーをインターナライズできるフラグメントである。
【０１２５】
或る態様では、該フラグメントは細胞外ドメインまたはそのフラグメントまたはその誘導体を含み、該細胞外ドメインは、ヌクレオチド配列番号3のヌクレオチド1014乃至2450、配列番号15のヌクレオチド216乃至3179、配列番号31のヌクレオチド147乃至2999、配列番号52のヌクレオチド419乃至4120、配列番号66のヌクレオチド268乃至7059、配列番号82のヌクレオチド235乃至2094、配列番号104のヌクレオチド160乃至663、配列番号204のヌクレオチド301乃至2250、配列番号229のヌクレオチド130乃至2880、配列番号281のヌクレオチド569乃至2152、配列番号283のヌクレオチド585乃至1901、配列番号291のヌクレオチド121乃至2836、および配列番号293のヌクレオチド259乃至2127のヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチド配列からなる群から選ぶことができる。
【０１２６】
本明細書上記に概説した細胞表面分子および細胞表面分子のフラグメントは、翻訳後修飾をさらに含むことができる。翻訳後修飾の例は、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、メチル化、硫酸化、ポリシアリル化、ファルネシル化、ミリストイル化またはパルミチル化である。
【０１２７】
表２に概説する細胞表面分子の機能的相同体もまた本発明内に含まれる。本発明に係る好ましい細胞表面分子をコードしているポリペプチド配列の配列番号もまた表２に示す。本発明に係る細胞表面分子の機能的相同体は、本発明に係る結合パートナーと結合でき、且つ好ましくは該結合パートナーをインターナライズできる細胞表面分子である。
【０１２８】
プロモーター
本発明の範囲内にあるプロモーターは、それに機能的に連結した第２核酸配列の発現を指令(directing)できる第１核酸配列である。該第１核酸配列は通常、転写され得る核酸配列の染色体上の上流に見出される。
【０１２９】
或る態様では、好ましくは、第２核酸配列に機能的に連結した第１核酸配列は、染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に少なくとも15,000塩基対を含む。しかしながら、第２核酸配列に機能的に連結した第１核酸配列は、該染色体上の第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に少なくとも12,500、例えば少なくとも10,000、例えば少なくとも8,000、例えば少なくとも6,000、例えば少なくとも5,000、例えば少なくとも4,000、例えば少なくとも3,000、例えば少なくとも2,500、例えば少なくとも2,000、例えば少なくとも1,500、例えば少なくとも1,000、例えば少なくとも500、例えば少なくとも400、例えば少なくとも300、例えば少なくとも200、例えば少なくとも150、例えば少なくとも100、例えば少なくとも50、例えば少なくとも25、例えば少なくとも10塩基対を、または遺伝子発現を指令できるいずれかのこのような配列のフラグメントを含むこともある。
【０１３０】
さらに、別の態様では、第２核酸配列に機能的に連結している第１核酸配列は、好ましくは該染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に10までの、例えば100までの、例えば500までの、例えば1000までの、例えば2500までの、例えば5000までの塩基対を、または遺伝子発現を指令できるそのフラグメントを含む。
【０１３１】
第２核酸配列に機能的に連結している第１核酸配列が、該染色体上の第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に１もしくはそれ以上のイントロン配列またはそのフラグメントを含み得るという事もまた本発明の範囲内である。さらに、第２核酸配列に機能的に連結している第１核酸配列は、該染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンの下流に見出される１もしくはそれ以上のイントロン配列またはそのフラグメントを含み得る。
【０１３２】
第２核酸配列に機能的に連結している第１核酸配列はさらに、該染色体上の該第２核酸配列の翻訳開始コドンから15,000塩基対以上上流または下流に位置するエンハンサー配列を含み得る。
【０１３３】
第２核酸配列と機能的に連結した上述の第１核酸配列はまた、核酸の欠失および／または付加を含み得る。欠失および／または付加は内部であってよく、或いは核酸配列の末端であってもよい。
【０１３４】
したがって、該染色体上の第２核酸配列の翻訳開始コドンから上流に例えば1000まで、例えば2500まで、例えば5000まで、例えば7500まで、例えば10,000まで、例えば15,000まで、例えば20,000塩基対までを含む第１核酸配列から、少なくとも10の内部bp、例えば少なくとも25の内部bp、例えば少なくとも50の内部bp、例えば少なくとも100の内部bp、例えば200の内部bp、例えば少なくとも300の内部bp、例えば少なくとも400の内部bp、例えば少なくとも500の内部bp、例えば少なくとも750の内部bp、例えば少なくとも1000の内部bp、例えば少なくとも1250の内部bp、例えば少なくとも1500の内部bp、例えば少なくとも1750の内部bp、例えば少なくとも2000の内部bp、例えば少なくとも2500の内部bp、例えば少なくとも3000の内部bp、例えば少なくとも3500の内部bp、例えば少なくとも4000の内部bp、例えば少なくとも4500の内部bpを除去することができる。
【０１３５】
特定の核酸配列は他の核酸配列よりも除去することが好ましい。例えば発現を抑制する配列または機能的に連結している第２核酸配列の発現を変化させない配列を除去することができる。したがって、本発明はまた、染色体上の第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に1000まで、例えば2500まで、例えば5000まで、例えば7500まで、例えば10,000まで、例えば15,000まで、例えば20,000までの塩基対を含む第２核酸配列に機能的に連結した第１核酸配列であって、そこから少なくとも１個のサイレンサーが除去された核酸配列をも包含する。
【０１３６】
第１核酸配列が１以上の欠失、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば５以上の欠失を含むことも可能である。
【０１３７】
さらに、染色体上の第２核酸配列の翻訳開始コドンの上流に例えば20,000まで、例えば15,000まで、例えば10,000まで、例えば7500まで、例えば5000まで、例えば2500まで、例えば1000までの塩基対を含む第１核酸配列から、少なくとも10、例えば少なくとも25、例えば少なくとも50、例えば少なくとも100、例えば200、例えば少なくとも300、例えば少なくとも400、例えば少なくとも500、例えば少なくとも750、例えば少なくとも1000、例えば少なくとも1250、例えば少なくとも1500、例えば少なくとも1750、例えば少なくとも2000、例えば少なくとも2500、例えば少なくとも3000、例えば少なくとも3500、例えば少なくとも4000、例えば少なくとも4500の塩基対を一端または他端から除去することができる。
【０１３８】
核酸配列の付加は末端または内部に行うことができる。第１核酸配列は、１以上の付加、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば５以上の付加を含み得る。それは少なくとも10、例えば少なくとも25、例えば少なくとも50、例えば少なくとも100、例えば少なくとも200、例えば少なくとも300、例えば少なくとも400、例えば少なくとも500、例えば少なくとも750、例えば少なくとも1000、例えば少なくとも1250、例えば少なくとも1500、例えば少なくとも1750、例えば少なくとも2000、例えば少なくとも2500、例えば少なくとも3000、例えば少なくとも3500、例えば少なくとも4000、例えば少なくとも4500、例えば4500以上の塩基対の付加であってよい。
【０１３９】
例えば、第１核酸配列の機能を改変する核酸配列を付加することが可能である。例えば特定の転写因子により認識される核酸配列を付加することができる。例えば、核ステロイドホルモンレセプターにより認識される核酸配列。
【０１４０】
好ましい第１核酸配列の例を表３および４に示す。本明細書下記に記載のこれら核酸配列の機能的相同体、並びに本明細書上記に記載の欠失および／または付加の突然変異体もまた本発明に包含される。
【表１２】
2005500833.tif 000013
【表１３】
2005500833.tif 000014
【表１４】
2005500833.tif 000015
【表１５】
2005500833.tif 000016
【表１６】
2005500833.tif 000017
【表１７】
2005500833.tif 000018
【表１８】
2005500833.tif 000019
【表１９】
2005500833.tif 000020
【表２０】
2005500833.tif 000021
【表２１】
2005500833.tif 000022
【表２２】
2005500833.tif 000023
【表２３】
2005500833.tif 000024
【表２４】
2005500833.tif 000025
【０１４１】
好ましくは、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro6、pro7、pro8、pro9、pro10、pro12、pro13、pro14、pro15、pro16、pro17、pro18、pro19、pro20、pro21、pro22、pro23、pro24、pro25、pro26、pro27、pro28、pro29、pro30、pro31、pro32、pro34、pro36、pro37、pro38、pro39、pro40、pro41、pro42、pro43、pro44、pro45、pro46、pro47、pro48、pro49、pro50、pro51、pro52、pro53、pro54、pro55、pro56、pro57、pro58、pro59、pro60、pro61、pro62、pro63、pro64、pro65、pro66、pro67、pro68、pro69、pro70、pro71、pro72、pro73、pro74、pro75、pro76、pro77、pro78、pro79、pro80、pro81、pro82、pro83、pro84、pro85、pro86、pro87、pro88、pro89、pro90、pro91、pro92、pro93、pro94、pro95、pro96、pro97、pro98、pro99、pro100、pro101、pro103、pro104、pro105、pro106、pro107、pro108、pro109、pro110、pro111、pro112、pro113、pro114、pro115、pro116、pro117、pro118、pro119、pro120、pro121、pro122、pro123、pro124、pro125、pro126、pro127、pro128、pro129、pro130、pro131、pro133、pro134、pro135、pro136、pro137、pro138、pro139、pro140、pro141、pro142、pro143、pro144、pro145、pro146、pro147、pro148、pro149、pro150、pro152、pro153、pro154、pro155、pro156、pro157、pro158、pro159、pro160、pro161、pro162、pro163、pro164、pro165、pro166、pro167、pro168、pro169、pro171、pro172、pro173、pro174、pro175、pro176、pro177、pro178、pro179、pro180、pro181、pro182、pro183、pro184、pro185、pro187、pro189、pro191、pro193、pro194、pro195、pro196、pro197、pro198、pro199、pro201、pro202、pro203、pro204、pro205、pro206、pro207、pro208、pro209、pro210、pro211、pro212、pro213、pro215、pro216、pro217、pro219、pro220、pro221、pro222、pro223、pro224、pro225、pro226、pro227、pro228、pro229、pro230、pro231、pro232、pro233、pro234、pro235、pro236、pro237、pro238、pro239、pro240、pro241、pro242、pro243、pro244、pro245、pro246、pro247、pro248、pro249、pro250、pro251、pro253、pro254、pro255、pro256、pro257、pro258、pro259、pro260、pro262、pro263、pro264、pro267、pro268、pro269、pro270、pro271、pro272、pro273、pro275、pro277、pro278、pro279、pro280、pro282、pro283、pro284、pro285、pro286、pro287、pro289、pro290、pro291、pro292、pro293、pro294、pro295、pro296、pro297、pro298、pro299、pro300、pro301、pro302、pro303、pro304、pro305、pro306、pro307、pro308、pro309、pro310、pro311、pro312、pro313、pro315、pro316、pro317、pro318、pro319、pro320、pro321、pro322、pro323、pro324、pro326、pro327、pro328、pro329、pro330、pro331、pro332、pro333、pro334、pro335、pro336、pro337、pro338、pro339、pro340、pro341、pro344、pro346、pro347、pro348、pro349、pro352、pro353、pro354、pro355、pro356、pro358、pro359およびpro361。
【０１４２】
より好ましくは、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro6、pro7、pro8、pro9、pro10、pro12、pro13、pro14、pro15、pro16、pro17、pro18、pro19、pro21、pro22、pro23、pro24、pro25、pro26、pro27、pro28、pro29、pro30、pro31、pro32、pro34、pro36、pro37、pro38、pro39、pro40、pro41、pro42、pro43、pro44、pro45、pro46、pro47、pro48、pro49、pro50、pro51、pro52、pro53、pro54、pro56、pro58、pro59、pro62、pro64、pro65、pro66、pro68、pro69、pro70、pro71、pro72、pro73、pro74、pro75、pro77、pro78、pro81、pro82、pro85、pro86、pro87、pro89、pro90、pro92、pro98、pro103、pro105、pro108、pro120、pro125、pro128、pro130、pro133、pro135、pro136、pro137、pro157、pro184、pro205、pro206、pro207、pro209、pro210、pro211、pro212、pro216、pro217、pro219、pro221、pro227、pro231、pro233、pro241、pro246、pro248、pro249、pro253およびpro256。
【０１４３】
より一層好ましくは、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro7、pro8、pro14、pro15、pro16、pro22、pro23、pro24、pro26、pro27、pro29、pro34、pro37、pro38、pro39、pro40、pro45、pro46、pro48、pro49、pro50、pro52、pro59、pro69、pro71、pro74、pro77、pro86、pro87、pro89、pro184、pro205、pro206、pro207、pro209、pro210、pro211、pro221、pro241、pro246、pro248およびpro256。
【０１４４】
更により好ましくは、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro2、pro4、pro8、pro14、pro15、pro16、pro22、pro49、pro74、pro86、pro87、pro89、pro205、pro221およびpro246。
【０１４５】
最も好ましくは、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro221、pro210、pro71,pro41,pro30、pro2、pro209、pro14、pro4、pro8、pro246、pro16、pro27、pro5、pro49、pro19、pro140、pro139、pro207、pro81、pro273およびpro362。
【０１４６】
別の好ましい態様において、該第１核酸配列は以下からなる群から選ばれる：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro6、pro7、pro8、pro9、pro10、pro12、pro13、pro14、pro15、pro16、pro17、pro18、pro19、pro20、pro21、pro22、pro23、pro24、pro25、pro26、pro27、pro28、pro29、pro30、pro31、pro32、pro34、pro36、pro37、pro38、pro39、pro40、pro41、pro42、pro43、pro44、pro45、pro46、pro47、pro48、pro49、pro50、pro51、pro52、pro53、pro54、pro55、pro56、pro57、pro58、pro59、pro60、pro61、pro62、pro63、pro64、pro65、pro66、pro67、pro68、pro69、pro70、pro71、pro72、pro73、pro74、pro75、pro76、pro77、pro78、pro79、pro80、pro81、pro82、pro83、pro84、pro85、pro86、pro87、pro88、pro89、pro90、pro91、pro92、pro93、pro94、pro95、pro96、pro97、pro98、pro99、pro100、pro101、pro103、pro104、pro105、pro106、pro107、pro108、pro109、pro110、pro111、pro112、pro113、pro114、pro115、pro116、pro117、pro118、pro119、pro120、pro121、pro122、pro123、pro124、pro125、pro126、pro127、pro128、pro129、pro130、pro131、pro133、pro134、pro135、pro136、pro137、pro138、pro139、pro140、pro141、pro142、pro143、pro144、pro145、pro146、pro147、pro148、pro149、pro150、pro152、pro153、pro154、pro155、pro156、pro157、pro158、pro159、pro160、pro161、pro162、pro163、pro164、pro165、pro166、pro167、pro168、pro169、pro171、pro172、pro173、pro174、pro175、pro176、pro177、pro178、pro179、pro180、pro181、pro182、pro183、pro184、pro185、pro187、pro189、pro191、pro193、pro194、pro195、pro196、pro197、pro198、pro199、pro201、pro202、pro203、pro204、pro205、pro206、pro207、pro209、pro210、pro211、pro212、pro213、pro216、pro217、pro219、pro220、pro221、pro222、pro223、pro224、pro225、pro227、pro228、pro229、pro230、pro231、pro233、pro234、pro235、pro236、pro237、pro238、pro239、pro240、pro241、pro242、pro243、pro244、pro245、pro246、pro248、pro249、pro250、pro251、pro253、pro254、pro255、pro256、pro257、pro258、pro259、pro260、pro269、pro278、pro282、pro283、pro284、pro285、pro297、pro315、pro326、pro327、pro328およびpro329。
【０１４７】
本発明の特に好ましい或る態様では、第１核酸配列はpro221またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro221はインスリノーマ関連抗原IA-1、INSM1をコードしている遺伝子のプロモーターである。インスリノーマ関連抗原ｍＲＮＡは、試験された全てのSCLCによって極めて高レベルに発現され、そして脳および副腎中では極めて低レベルでしか発現されない。発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明された（実施例１および図３を参照されたい）。
【０１４８】
本発明の別の好ましい態様では、第１核酸配列はpro210またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro210はラミンB、LMNB1をコードしている遺伝子のプロモーターである。LMNB1 mRNAは、試験された全てのSCLCによって極めて高レベルに発現され、そして脾臓、結腸および肺中では極めて低レベルでしか発現されない。LMNB1の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明された（実施例１および図６を参照されたい）。
【０１４９】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro71またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro71はp16INK4/MTS1、MTS1、サイクリン依存キナーゼインヒビター2A、CDKN2Aをコードしている遺伝子のプロモーターである。p16INK4/MTS1 mRNAは、殆どのSCLCによって極めて高レベルに発現され、正常組織中では極めて低レベルでしか発現されないか全く発現されない。LMNB1の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明された（実施例１および図７を参照されたい）。
【０１５０】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro41またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro41はヒトMAD2L1、有糸分裂停止不全、酵母相同体様1をコードしている遺伝子のプロモーターである。MAD2L1 mRNAは、SCLC中で極めて高レベルに発現され、精巣中で高レベルに発現されるが、他の正常組織中では低レベルでしか発現されない。MAD2L1の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明された（実施例１および図５を参照されたい）。
【０１５１】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro30またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro30はヒトKIAA0042遺伝子のプロモーターである。KIAA0042 RNAは、殆どのSCLC中で極めて高レベルに発現され、正常組織では精巣中で低レベルに発現されるだけである。KIAA0042の発現は例えばCHIPS分析およびRT-PCRにより証明された（実施例１および図４を参照されたい）。
【０１５２】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro2またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro2はヒトサイクリン選択的ユビキチン担体タンパク質、UBE2Cをコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。UBE2C mRNAは、殆どのSCLC中で極めて高レベルに発現され、正常組織では脾臓と精巣中で低レベルに発現される。UBE2Cの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５３】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro209またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro209はマイトシン、CENPF、セントロメアタンパク質Fをコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。CENPF mRNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織中では精巣で低レベルに発現される。CENPFの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５４】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第一核酸配列はpro14またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro14はヒトKIAA0101遺伝子のプロモーターである。KIAA0101 RNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では7種類の組織中で低レベルに発現される。KIAA0101の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５５】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro4またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro4はサイクリンタンパク質遺伝子、増殖細胞核抗原（PCNA）をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。PCNA mRNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では結腸、脾臓および精巣中で低レベルに発現される。PCNAの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５６】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro8またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro8はセリン/スレオニンキナーゼ、STK-1、STK12、fms関連チロシンキナーゼ3をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。STK-1mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では結腸、脾臓および精巣中で低レベルに発現される。STK-1の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５７】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro246またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro246はAchaete scute相同性タンパク質、ASH1、ASCL1をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。ASH1 mRNAは、多くのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では脳中で低レベルに発現される。ASH1の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５８】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro16またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro16はDNAトポイソメラーゼIIα（170kD）、TOP2Aをコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。TOP2A mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では9種類の組織中で低レベルに、そして精巣中で高レベルに発現される。TOP2Aの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１５９】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro27またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro27はサイクリンB2、CCNB2をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。サイクリンB2 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では脾臓および気管中で低レベルに、そして精巣中で高レベルに発現される。サイクリンB2の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６０】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro5またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro5はサイクリンB1、CCNB1をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。サイクリンB1 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では結腸、脾臓および気管中で低レベルに、そして精巣中で高レベルに発現される。サイクリンB1の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６１】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro49またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro49は下垂体腫瘍トランスフォーミング1、PTTG1をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。PTTG1 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では甲状腺、脾臓および気管中で低レベルに、そして精巣中で高レベルに発現される。PTTG1の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６２】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro19またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro19はキネシン様紡錘タンパク質HKSP、KNSL1をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。KNSL1 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では結腸、小腸および精巣中で低レベルに発現される。KNSL1の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６３】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro140またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro140はcdc2関連タンパク質キナーゼ、CDK2をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。CDK2 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では脾臓中で高レベルに発現される。CDK2の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６４】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro139またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro139はセリン／スレオニンタンパク質キナーゼSAKをコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。SAK mRNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では精巣中で高レベルに発現される。SAKの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６５】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro207またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro207はzeste相同体２のエンハンサー（EZH2）をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。EZH2 mRNAは、SCLC中で高レベルに発現され、正常組織では精巣中で高レベルに発現される。EZH2の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６６】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro81またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro81はヒトHSU79266遺伝子のプロモーターである。HSU79266 RNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では精巣および脾臓中で発現される。HSU79266の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６７】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro273またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro273はRad2、皮弁(flap)構造特異的エンドヌクレアーゼ1、FEN1をコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。Rad2 mRNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では12種類の組織中で低レベルに発現される。Rad2の発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６８】
本発明のもう一つの好ましい態様では、第１核酸配列はpro362またはそのフラグメントまたはその機能的相同体である。pro362はタンパク質遺伝子産物PGP、ユビキチンカルボキシ末端エステラーゼL1、ユビキチンチオールエステラーゼをコードしているヒト遺伝子のプロモーターである。PGP mRNAは、殆どのSCLC中で高レベルに発現され、正常組織では腎臓中で低レベルに、そして脳中で高レベルに発現される。PGPの発現は例えばCHIPS分析により証明された（実施例１を参照されたい）。
【０１６９】
機能的相同体
本発明に係るポリペプチドの機能的相同体とは、同じ機能を含む任意のポリペプチド配列を含むことを意味する。例えば細胞表面分子の機能的相同体は、結合パートナーと結合でき、好ましくは該結合パートナーをインターナライズできる、細胞表面に結合している分子である。結合パートナーの機能的相同体は、細胞表面分子と結合でき、好ましくはその細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズされ得る分子である。
【０１７０】
本発明に係る機能的相同体はアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、これは、本明細書上記に概説したような予め決められたポリペプチド配列と少なくとも幾らかの相同性を共有している。例えば該ポリペプチドは、本明細書上記に概説した予め決められたポリペプチド配列のいずれかと、少なくとも約40パーセント、例えば少なくとも約50パーセント相同性、例えば少なくとも約60パーセント相同性、例えば少なくとも約70パーセント相同性、例えば少なくとも約75パーセント相同性、例えば少なくとも約80パーセント相同性、例えば少なくとも約85パーセント相同性、例えば少なくとも約90パーセント相同性、例えば少なくとも約92パーセント相同性、例えば少なくとも約94パーセント相同性、例えば少なくとも約95パーセント相同性、例えば少なくとも約96パーセント相同性、例えば少なくとも約97パーセント相同性、例えば少なくとも約98パーセント相同性、例えば少なくとも約99パーセント相同性である。
【０１７１】
アミノ酸配列間の相同性は、例えばBLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85、およびBLOSUM90のいずれかといったような公知のアルゴリズムを用いて計算できる。
【０１７２】
機能的相同体は、或るアミノ酸を他の任意のアミノ酸に置換する、少なくとも１個の置換を含むアミノ酸配列を含むことができる。例えばこのような置換は同類アミノ酸置換であっても非同類置換であってもよい。
【０１７３】
同類アミノ酸置換は、予め決められたアミノ酸群内の１個のアミノ酸を同じ群内の別のアミノ酸に置換することであり、ここで該予め決められた群内のアミノ酸は類似または実質上類似の性質を示す。本明細書で適用する「同類アミノ酸置換」という語の意義内では、或るアミノ酸を
ｉ）極性側鎖（Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr、およびCys）
ｉｉ）非極性側鎖（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、およびMet）
ｉｉｉ）脂肪族側鎖（Gly、Ala Val、Leu、Ile）
ｉｖ）環状側鎖（Phe、Tyr、Trp、His、Pro）
ｖ）芳香族側鎖（Phe、Tyr、Trp）
ｖｉ）酸性側鎖（Asp、Glu）
ｖｉｉ）塩基性側鎖（Lys、Arg、His）
ｖｉｉｉ）アミド側鎖（Asn、Gln）
ｉｘ）ヒドロキシ側鎖（Ser、Thr）
ｘ）硫黄含有側鎖（Cys、Met）、および
ｘｉ）モノアミノジカルボン酸またはモノアミノ−モノカルボキシ−モノアミドカルボン酸であるアミノ酸（Asp、Glu、Asn、Gln）、
を有するという特徴を持つアミノ酸の群内の別のアミノ酸に置換することができる。
【０１７４】
非同類置換はその他の任意の置換である。機能的相同体の形成を導く非同類置換は例えば、ｉ）疎水性が実質上相違する、例えば疎水性残基（Val、Ile、Leu、PheまたはMet）をArg、Lys、TrpもしくはAsnといった親水性残基に置換、またはThr、Ser、His、Gln、Asn、Lys、Asp、GluもしくはTrpといった親水性残基を疎水性残基に置換する事；および／またはｉｉ）ポリペプチド骨格(backbone)の向きに及ぼす影響が実質上相違する、例えばProもしくはGlyを他の残基にまたは他の残基からこれらに置換する事；および／またはｉｉｉ）電荷が実質上相違する、例えば、GluもしくはAspのような負に荷電した残基をLys、HisもしくはArgのような正に荷電した残基に置換する事（およびその逆）；および／またはｉｖ）立体的な嵩が実質上相違する、例えばHis、Trp、PheもしくはTyrのような嵩高い残基を小さな側鎖を持つ残基、例えばAla、GlyもしくはSerに置換する事（またはその逆）である。
【０１７５】
本発明に係る機能的相同体はこのような置換を１以上、例えば２アミノ酸置換、例えば３または４アミノ酸置換、例えば５または６アミノ酸置換、例えば７または８アミノ酸置換、例えば１０乃至１５アミノ酸置換、例えば１５乃至２５アミノ酸置換、例えば２５乃至３０アミノ酸置換、例えば３０乃至４０アミノ酸置換、例えば４０乃至５０アミノ酸置換、例えば５０乃至７５アミノ酸置換、例えば７５乃至１００アミノ酸置換、例えば１００以上のアミノ酸置換を含むことができる。
【０１７６】
アミノ酸の付加または欠失は、2ないし5アミノ酸、例えば5ないし10アミノ酸、例えば10ないし20アミノ酸、例えば20ないし50アミノ酸の付加または欠失であってよい。しかしながら、50アミノ酸以上の付加または欠失、例えば50ないし200アミノ酸の付加もまた本発明に包含される。
【０１７７】
それらのいずれかの変異体および機能的相同体を包含する本発明に係るポリペプチドは、或る態様では、5以上のアミノ酸残基、例えば10以上のアミノ酸残基、例えば20以上のアミノ酸残基、例えば25以上のアミノ酸残基、例えば50以上のアミノ酸残基、例えば75以上のアミノ酸残基、例えば100以上のアミノ酸残基、例えば150以上のアミノ酸残基、例えば200以上のアミノ酸残基を含むことができる。
【０１７８】
本明細書で使用する意義に従う機能的相同体を決定する際には、さらなる要素を考慮に入れることができる。例えば機能的相同体は、本発明に係るポリペプチドに特異的な抗血清と結合し得る。
【０１７９】
さらなる態様では、本発明は、+/-2.5以内の親水性または疎水親水指数を持つ置換アミノ酸を含む機能的相同体に関するものであり、該指標は、置換されたアミノ酸の値が、例えば+/-2.3以内、例えば+/-2.1以内、例えば+/-2.0以内、例えば+/-1.8以内、例えば+/-1.6以内、例えば+/-1.5以内、例えば+/-1.4以内、例えば+/-1.3以内、例えば+/-1.2以内、例えば+/-1.1以内、例えば+/-1.0以内、例えば+/-0.9以内、例えば+/-0.8以内、例えば+/-0.7以内、例えば+/-0.6以内、例えば+/-0.5以内、例えば+/-0.4以内、例えば+/-0.3以内、例えば+/-0.25以内、例えば+/-0.2以内である。
【０１８０】
タンパク質に生物学的相互機能を付与する際の親水性および疎水性親水性のアミノ酸指数の重要性は当分野でよく理解されている（Kyte & Doolittleによる1982、およびHopp、米国特許第4,554,101号；それぞれ引用により本明細書の一部とする）。
【０１８１】
本明細書で使用するアミノ酸疎水性親水性指数値は、イソロイシン (+4.5); バリン（+4.2); ロイシン (+3.8); フェニルアラニン (+2.8); システイン/シスチン (+2.5); メチオニン (+1.9); アラニン (+1.8); グリシン (-0.4); スレオニン (-0.7); セリン (-0.8); トリプトファン (-0.9); チロシン (-1.3); プロリン (-1.6); ヒスチジン (-3.2); グルタミン酸 (-3.5); グルタミン (-3.5); アスパラギン酸 (-3.5); アスパラギン (-3.5); リジン (-3.9); およびアルギニン (-4.5) (Kyte & Doolittleによる1982）である。
【０１８２】
アミノ酸親水性値は、アルギニン (+3.0); リジン (+3.0); アスパラギン酸 (+3.0.+-.1); グルタミン酸 (+3.0.+-.1); セリン (+0.3); アスパラギン (+0.2); グルタミン (+0.2); グリシン (0); スレオニン (-0.4); プロリン (-0.5.+-.1); アラニン (-0.5); ヒスチジン (-0.5); システイン (-1.0); メチオニン (-1.3); バリン（-1.5); ロイシン (-1.8); イソロイシン (-1.8); チロシン (-2.3); フェニルアラニン (-2.5); トリプトファン (-3.4)（米国特許第4,554,101号）である。
【０１８３】
故に或る態様では、アミノ酸の置換は、それらの疎水性および親水性値、ならびに電荷、大きさなどを包含するアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいて行うことができる。前記の様々な性質を考慮に入れたアミノ酸置換の例は当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンとイソロイシンを包含する。
【０１８４】
本明細書に記載のポリペプチド化合物に加えて、該ペプチド構造の重要部分に似せるために立体的に類似の化合物を製造することができ、該化合物もまた本発明に係るペプチドと同様な様式で使用できる。これは当業者の知悉するモデル作製および化学設計の技術によって達成できる。例えば、テトラペプチド構造に似せるため、エステル化およびその他のアルキル化を用いて、例えばジアルギニンペプチド骨格のアミノ末端を修飾できる。該立体的に類似の構築物が全て本発明の範囲内にあるという事は明らかである。
【０１８５】
Ｎ末端アルキル化およびＣ末端エステル化を伴うペプチドもまた本発明に包含される。機能的等価物はまた、二量体または非関連化学部分を包含するグリコシル化および共有結合または凝集接合体をも包含する。該機能的等価物は、当分野で知られる方法により、フラグメント中のＮおよびＣ末端の一方または両方に見出される基に官能性を結び付けることによって製造する。
【０１８６】
したがって機能的等価物は、カルボキシ末端の脂肪族もしくはアシルエステルまたはアミド、アルキルアミンまたはカルボキシ側鎖を含む残基に接合体したフラグメント、例えばアスパラギン酸残基のアルキルアミンとの接合体；ヒドロキシ基含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体、例えばMet-Leu-Pheとの接合体を含み得る。アシル基の誘導体はアルキル部分（Ｃ３〜Ｃ１０ノルマルアルキルを包含する）の基から選ばれ、それによりアルカノイル種が形成され、および炭素環式またはヘテロ環式化合物から選ばれ、それによりアロイル種が形成される。該反応性基は好ましくは、反応性側鎖基を介したタンパク質の不溶性マトリックスへの架橋に使用するための、自体既知の二官能性化合物である。
【０１８７】
本発明の範囲内の核酸配列の相同体は、
ｉ）類似の生物学的機能を持つＲＮＡおよび／またはタンパク質をコードしており；または、
ｉｉ）類似の生物学的影響を示すことができ；そして、
ａ）少なくとも５０％一致し、例えば少なくとも６０％一致し、例えば少なくとも７０％一致し、例えば少なくとも７５％一致し、例えば少なくとも８０％一致し、例えば少なくとも８５％一致し、例えば少なくとも９０％一致し、例えば少なくとも９５％一致し、
ｂ）またはストリンジェントな条件下で該核酸配列の相補鎖とハイブリダイズできる、
核酸配列である。
【０１８８】
この文脈にある類似の生物学的影響とは、例えばその核酸配列が、その機能的相同体と類似の様式で、それと機能的に連結した第２核酸配列の転写に影響を及ぼすことができるという事である。
【０１８９】
本明細書で使用するストリンジェントな条件とは、サザンブロッティングおよび例えばSouthern E. M.による1975、J.Mol. Biol. 98: 503-517により記載されたようなハイブリダイゼーションと関連して通常適用される緊縮性を指す。係る目的のためには前ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの工程を含むのが慣例である。このような工程は通常Sambrookらによる1989、「Molecular Cloning/A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor（これは引用により本明細書の一部とする）に記載の6 x SSPE、5%デンハート、0.5% SDS、50% ホルムアミド、100μg/ml 変成鮭精巣ＤＮＡを含有する溶液を使用し（４２℃、１８時間のインキュベート）、その後2 × SSCおよび0.5% SDS（室温および３７℃）、ならびに0.1 × SSCおよび0.5% SDS（６８℃、３０分間のインキュベート）での洗浄で実施する。
【０１９０】
核酸配列の相同体はさらに、付加および／または欠失を含む核酸配列を包含する。該付加および／または欠失は内部または末端にあり得る。付加および／または欠失は1-5ヌクレオチド、例えば5〜10ヌクレオチド、例えば10〜50ヌクレオチド、例えば50〜100ヌクレオチド、例えば少なくとも100ヌクレオチドのものであってよい。
【０１９１】
ワクチン
本発明の或る態様では、細胞表面分子をワクチンの製造に使用できる。好ましくは該ワクチンはその細胞表面分子に対する免疫反応を生じることができる。該免疫反応は好ましくは該細胞表面分子を発現する細胞の特異的殺滅をもたらす。最も好ましくは、該細胞表面分子を発現する細胞は悪性細胞であり、例えばそのワクチンが悪性細胞の特異的殺滅をもたらす。
【０１９２】
したがって、該ワクチンは好ましくは前悪性および／または悪性の病気の軽減的および／または治療的および／または予防的処置に好適である。よって、該ワクチンは好ましくは、前悪性および／または悪性の病気、好ましくは癌に罹患している個体に投与すべきである。該個体は任意の動物であってよいが、好ましくは該個体は人間である。
【０１９３】
細胞表面分子またはそのフラグメントまたはその誘導体と、該細胞表面分子をコードしている核酸またはそのフラグメントまたはその誘導体のいずれかを使用することが可能である。該ワクチンと共に使用することが好ましい細胞表面分子は、正常組織中よりもインビボの悪性細胞中で、および／または悪性セルライン中で高レベルに発現される細胞表面分子である。例えば該細胞表面分子は本明細書上記に概説した方法に従って同定できる。しかしながら、その他の適当な細胞表面分子をも利用できる。
【０１９４】
好ましくは該細胞表面分子は、以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481、例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ；例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン バーシカンV1；例えばmGluR1β；例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例え��CC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3；例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。
【０１９５】
より好ましくは、該細胞表面分子はNCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる。
【０１９６】
或る好ましい態様では、該ワクチンはさらに該細胞表面分子と共有結合した非自己抗原を含む。あるいは、細胞表面分子をコードしている核酸配列を使用する場合は、該ワクチンは該核酸配列に結合した非自己抗原をコードしている第二核酸配列を含むことができる。
【０１９７】
本発明と共に使用できる非自己抗原の例はＴ細胞エピトープ、好ましくはポリペプチドまたはペプチドである。
【０１９８】
ワクチンが１以上の抗原、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば５以上の異なる抗原を含むことも可能である。抗原は自己抗原または非自己抗原であり得る。
【０１９９】
本発明に係るワクチンはさらにアジュバントおよび／または担体を含むことができる。該担体またはアジュバントはそれらの機能的等価物を包含する当分野で公知のいかなる担体またはアジュバントであってもよい。機能的に等価な担体は、同様な条件の下に使用した場合、同じ抗原を本質的に同じ立体配座で提供することができる。機能的に等価なアジュバントは、同様な条件の下に使用した場合、該組成物の有効性に同様な増大を提供することができる。
【０２００】
好ましくは、該組成物は、抗原決定因子を包含する免疫原性決定因子の免疫原性を増強および／または調節する、強力な非毒性アジュバントを含み、ハプテン決定因子が好ましいアジュバントの１群を表す。加えて、該アジュバントは好ましくはより早期の、より強力な、またはより長時間の免疫反応を誘起する。該アジュバントは抗原の供給が限定されたりまたはその産生が高価である場合にも有用である。
【０２０１】
本発明に属するアジュバントはそれらが鉱物性、細菌性、植物性、合成、または宿主生成物であるといった起源にしたがって分類できる。この分類の第一群は、アルミニウム化合物のような鉱物性アジュバントである。アルミニウム塩で沈殿させた抗原、またはアルミニウム化合物と混合したりもしくはこれに吸着させた抗原は、動物および人間の免疫反応を増大させるために広く使用されてきた。アルミニウム粒子は免疫後７日間ウサギの局所リンパ節で証明され、そしてもう１つの重要な機能はリンパ節自身にあるＴ細胞含有領域に抗原を方向付けることであろう。アジュバントの力価は流入領域リンパ節という暗示(intimation)に関連することが示されている。多くの研究が、アルミニウム塩と共に投与された抗原が液性免疫の増強を導く事を確認しているが、遅延型過敏性によって測定される細胞性免疫は僅かしか増強されないように見受けられる。水酸化アルミニウムは補体経路を活性化すると記載されている。この機構は、局所炎症反応および免疫グロブリン産生とＢ細胞記憶で役割を果たし得る。さらに、水酸化アルミニウムは抗原を急速異化作用から防御できる。主としてその優れた安全性の証拠の故に、アルミニウム化合物は現在人間に使用される唯一のアジュバントである。
【０２０２】
もう一つの大きなアジュバントの群は細菌起源のものである。細菌起源のアジュバントは精製および合成することができ（例えば、ムラミルジペプチド、脂質A）、宿主仲介物がクローニングされている（インターロイキン１および２）。ここ１０年間で細菌起源の活性成分を持つ幾つかのアジュバントの化学的精製に顕著な進展がもたらされている：Bordetella pertussis、Mycobacterium tuberculosis、リポ多糖類、フロイント完全アジュバント (FCA) およびフロイント不完全アジュバント (Difco Laboratories、Detroit、Mich.)ならびにMerck Adjuvant 65 (Merck and Company、Inc.、Rahway、N.J.)。さらに、本発明に係る好適なアジュバントは例えば、Titermax Classical adjuvant (SIGMA-ALDRICH)、 ISCOMS、Quil A、ALUN（米国特許第58767号および米国特許第5,554,372号を参照されたい）、脂質A誘導体、コレラ毒素誘導体、HSP誘導体、LPS誘導体、合成ペプチドマトリックス、GMDPなど、および免疫刺激物質と組み合わせたもの（米国特許第5,876,735号）である。
【０２０３】
B. pertussisは、Ｔリンパ球集団への作用によって細胞性免疫を調節する能力のため、本発明の状況におけるアジュバントとして興味深い。リポ多糖類およびフロイント完全アジュバントについては、構造−機能相関の研究を可能にするアジュバントの活性部分が同定および合成されている。これらはまた、本発明に係る免疫原性組成物に含めるとみなすされている。
【０２０４】
脂質Aを包含するリポ多糖類およびその様々な誘導体は、リポソームまたはその他の脂質エマルジョンと組み合わせると強力なアジュバントとなることを見出した。ヒトでの一般的使用にとって充分毒性が低い誘導体が製造できるかどうかはまだ確かではない。フロイント完全アジュバントは殆どの実験研究における標準である。
【０２０５】
抗原を急速異化から防御するため、鉱油をワクチン製剤に添加できる。
【０２０６】
その他多くの種類の材料を本発明に係る免疫原性組成物のアジュバントとして使用できる。これらにはサポニンのような植物産物、キチンのような動物産物、ならびに膨大な合成化学物質が包含される。
【０２０７】
本発明に係るアジュバントは提起されている作用機構によっても分類できる。殆どのアジュバントは１以上の機構によって機能するように思われるため、この型の分類は必然的に幾らか恣意的なものとなる。アジュバントは抗原の限局化および運搬を介して、または免疫系を作り上げている細胞、例えばマクロファージおよびリンパ球への直接効果によって作用できる。本発明に係るアジュバントが免疫反応を増強する別の機構は、抗原貯留(depot)の創成による。これは、アルミニウム化合物、油性エマルジョン、リポソーム、および合成ポリマーのアジュバント活性に寄与しているようである。リポ多糖類およびムラミルジペプチドのアジュバント活性は主にマクロファージの活性化によって媒介されているようであるが、B. pertussisはマクロファージとリンパ球の両者に影響を及ぼす。本発明に係る免疫原性組成物に組み込んだ場合に有用となり得るアジュバントのさらなる例は、米国特許第5,554,372号に記載されている。
【０２０８】
或る好ましい態様では、本発明に係るアジュバントは、アルミニウム化合物、フロイント不完全アジュバント、Titermax古典アジュバントおよび油性エマルジョンからなる群から選ばれる。
【０２０９】
免疫原性組成物が担体をさらに含む本発明の態様もまた提供する。この担体はアジュバントとは独立して存在することができる。抗原と担体のコンジュゲーションおよび／または同時免疫の目的は、例えばその抗原の活性もしくは免疫原性を高めるために抗原の分子量を増大させること、またはその抗原に安定性を付与すること、または抗原決定因子の生物学的活性を高めること、またはその血清半減期を増大させることであり得る。担体タンパク質は、抗原提示に好適な任意のタンパク質を包含する任意の通常の担体であってよい。通常の担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、牛血清アルブミン、またはヒト血清アルブミン、オボアルブミン、免疫グロブリン、またはホルモン類、例えばインスリンを包含するがこれらに限定される訳ではない。
【０２１０】
当業者に公知のいかなる適当な医薬担体も本発明に係るワクチンに使用できるが、医薬担体の種類は投与様式および持続放出投与が望まれるか否かに応じて変わり得る。皮下注射のような非経口投与の場合には、該医薬担体は、例えば水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ロウまたは緩衝液を含むことができる。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）もまた本発明の医薬組成物のための医薬担体として利用できる。
【０２１１】
本発明の或る態様では、該ワクチンは樹状細胞の使用を含む。このような態様は好ましくは、
ｉ）樹状細胞を提供し；そして、
ｉｉ）その発現を指令する第２核酸配列と機能的に連結した本発明に係る細胞表面分子をコードしている核酸配列を該樹状細胞に移したり、または細胞表面分子もしくはそのフラグメントを該樹状細胞に移し；そして、
ｉｉｉ）該細胞表面分子またはそのフラグメントを該樹状細胞の細胞表面にディスプレーし；そして、
ｉｖ）処置する個体に該樹状細胞を移す、
という工程を含む。
【０２１２】
好ましくは、該樹状細胞は治療する個体から誘導する細胞であるが、しかしながら該樹状細胞は別の個体から誘導してもよい。該樹状細胞を別の個体から誘導する場合には、好ましくは該細胞を、治療する個体と同じ種から誘導する。例えば、治療する個体がヒトであるならば、該樹状細胞はヒトから誘導する。
【０２１３】
好ましくは、該細胞表面分子はフラグメント、例えばＭＨＣ分子上にある状況のペプチドフラグメントとして該細胞表面にディスプレーされる。
【０２１４】
薬物標的
結合パートナーと結合でき且つ該結合パートナーを細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズできる細胞表面分子はまた、薬物標的としても利用できる。好ましくは、該細胞表面分子は、正常組織とは異なるレベルで悪性セルライン中で発現される。
【０２１５】
より好ましくは、該細胞表面分子は本発明に概説する方法に従って同定する。
【０２１６】
より好ましくは、該細胞表面分子は以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ；例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R；例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン バーシカンV1；例えばmGluR1β；例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；��えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3；例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。
【０２１７】
さらに好ましくは、該細胞表面分子はNCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる。
【０２１８】
本発明の範囲内にある薬物標的は、ベイトとして、薬物標的と結合する分子を同定するために使用でき、したがって薬物の可能性ある候補物質である分子である。特に、該薬物は、適切に製剤化した場合には、前悪性および/または悪性の病気の処置に使用できる。
【０２１９】
本発明はさらに、本発明に係る結合パートナーと相互作用できる新規な薬物標的を同定するための方法に関するものである（本明細書下記を参照されたい）。
【０２２０】
好ましくは係る新規な薬物標的はポリペプチドを含み、このポリペプチドは正常細胞と比較して悪性細胞中で異なるレベルで発現される細胞表面分子である。
【０２２１】
加えて、本発明はまた、上記方法によって同定される新規な薬物標的に関するものである。
【０２２２】
結合パートナーの同定方法
本発明はさらに、特異的結合パートナーの同定方法を提供する。加えて本発明は、特異的結合パートナーの製造方法を提供する。
【０２２３】
特異的結合パートナーは幾つかの異なる方法によって同定／製造できる。具体的態様に応じて、当業者の知悉するいかなる適当な方法を本発明と共に使用することができる。
【０２２４】
本発明の或る態様では、結合パートナーを特異的抗体を製造するための標準方法によって製造する。例えば係る方法は以下の工程：
ｉ）動物を該細胞表面分子または該細胞表面分子のフラグメントで免疫し；そして、
ｉｉ）該動物から抗体を得たり；または、
ｉｉｉ）該動物から抗体を産生する細胞を得て、そして該細胞から抗体を得る、
を含み得る。
【０２２５】
免疫する動物は任意の動物、好ましくは哺乳動物であってよく、より好ましくは該動物はウサギ、マウス、ラット、ロバ、ヤギおよび羊からなる群から選ばれる。
【０２２６】
該抗体は好ましくは免疫した動物の血清から得る。それらは例えばアフィニティークロマトグラフィーといったような標準方法によって精製できる。このようにして得た抗体は好ましくはポリクローナル抗体である。
【０２２７】
抗体を産生する細胞は好ましくは免疫した動物の脾臓から取得し、好ましくは該細胞はＢ細胞である。抗体産生細胞は、不死化細胞を得るために、該動物から精製した後に他の細胞と融合させることができる。該細胞はインビトロ培養でき、例えばアフィニティークロマトグラフィー、またはタンパク質Aもしくはタンパク質Gクロマトグラフィーといった標準方法によって抗体を組織培養上清から回収できる。これらの抗体はしばしばモノクローナル抗体である。
【０２２８】
続いて、該抗体を当業者の知悉するいずれかの適当な方法によってヒト化することができる。
【０２２９】
しかしながら、抗体は他の手段で製造または同定することもできる。例えば天然に存在する抗体を、ヒトを包含する適当な動物から精製することができる。抗体は発現ライブラリーから得ることもできる（本明細書下記を参照されたい）。
【０２３０】
本発明に係る別の態様では、結合パートナーはポリペプチドで構成されたりまたはポリペプチドを含み、それは発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。任意の適当な発現ライブラリーを本発明と共に使用できる。
【０２３１】
ライブラリーは適当な宿主細胞内に入れることができ、例えば宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であってよい。ライブラリーは任意の種、例えばウイルス、細菌、酵母、真菌、植物または動物から誘導したポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドをコードしている核酸配列を含むことができる。動物はいかなる動物であってもよく、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトとすることができる。該ライブラリーは、合成であって天然に存在しないポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドをコードしている核酸配列をも含むことができる。該核酸配列は適当なベクター、例えばプラスミド、ウイルス、ウイルス由来ベクター、ファージ、人工染色体またはコスミド内に含むことができる。
【０２３２】
例えば、結合パートナーはポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドを発現する発現ライブラリーから選ぶことができる。それらはまた、ポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドを発現する合成コンビナトリアルライブラリーから選択することもできる。
【０２３３】
結合パートナーはさらに、抗体のファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。好ましくはファージディスプレーライブラリーはヒト抗体のライブラリーである。
【０２３４】
さらに別の態様では、該結合パートナーは小さな化学化合物のライブラリーから選ばれる。該ライブラリーは多数の異なる化学化合物を含むことができ、それは多数の異なる反応によって製造できる。例えばコンビナトリアルライブラリーのような好適なライブラリーが当業者に知られている。
【０２３５】
細胞表面分子または細胞表面分子のフラグメントと結合できる特異的結合パートナーを同定／製造したならば、該結合パートナーを好ましくはインターナライズされる能力について試験しなければならない。該試験は該結合パートナーの性質に応じて多数の適当な方法で遂行できる。
【０２３６】
例えば、該結合パートナーを、該結合パートナーが結合することのできる細胞表面分子またはそのフラグメントを発現している細胞と一緒にインキュベートすることができる。インキュベートの後、細胞内部における結合パートナーの存在および／または不在が検出できる。検出は、例えば直接的または間接的に検出し得る標識で該結合パートナーを標識できるという利点を利用して遂行できる。別法として、該結合パートナーの存在を、該結合パートナーと特異的に相互作用できる第１種を用いて決定できる。該種は、直接的または間接的に標識できたり、あるいは、該第１種と特異的に相互作用でき且つ標識する事のできる第２種を用いて検出することができる。第２種と相互作用できる第３種、第３種と相互作用できる第４種等々を使用することも可能である。
【０２３７】
結合パートナー
本発明に係る特異的結合パートナーは少なくとも１つの細胞表面分子と相互作用できる。しかしながら、特異的結合パートナーは１以上の異なる細胞表面分子と結合できることもある。
【０２３８】
本発明の或る態様では、内部の結合パートナーは好ましくは細胞表面分子との結合後にその細胞表面分子を発現している細胞内にインターナライズされ得る結合パートナーである。
【０２３９】
本発明に係る結合パートナーは本明細書上記に概説した任意の方法によって同定できる。しかしながら、該結合パートナーはまた当業者の知悉するいずれかの他の方法によっても同定できる。
【０２４０】
好ましくは本発明に係る結合パートナーは、以下の群：
レセプターチロシンキナーゼの成員、
インテグリンファミリーの成員、
免疫グロブリンスーパーファミリー接着性分子の成員、
ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
MAGEファミリーの成員、
RAGEファミリーの成員、
低密度リポタンパク質レセプターファミリーの成員、
カドヘリン接着性分子の成員、
代謝調節型グルタミン酸レセプターの成員、
ステロイドホルモンファミリーの成員、
セブン(seven)貫膜レセプターファミリーの成員、
心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター、
GFRA3、
トランスフェリンレセプター、
セリン/スレオニンキナーゼレセプターの成員、
のうちの１つに属するレセプターからなる群から選ばれる１またはそれ以上の細胞表面分子と結合できる。
【０２４１】
より好ましくは、本発明に係る結合パートナーは、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる1またはそれ以上の細胞表面分子と結合できる。
【０２４２】
さらにより好ましくは、該結合パートナーは細胞表面分子の１またはそれ以上のフラグメントと結合できる。細胞表面分子の好ましいフラグメントは本明細書上記に概説している。最も好ましくは、該細胞表面分子のフラグメントは細胞表面分子の細胞外部分から誘導する。
【０２４３】
本発明に係る該結合パートナーは、前悪性および/または悪性の病気の処置のための医薬組成物に使用するのが好ましい。
【０２４４】
本発明の或る態様では、該結合パートナーはポリペプチドまたはオリゴペプチドを含むかまたは本質的にそれらで構成される。本発明に係るポリペプチドおよび／またはオリゴペプチドは天然に存在するものであってよく、または合成ポリペプチドであってもよい。
【０２４５】
或る好ましい態様では、該結合パートナーは抗体または抗体のフラグメントである。該抗体はポリクローナル抗体もしくはその結合フラグメントであってよく、またはモノクローナル抗体もしくはその結合フラグメントであってもよい。
【０２４６】
抗体は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット、ウサギ、マウス、ヒト、ロバ、ヤギおよび羊からなる群から選ばれる哺乳動物から誘導できる。或る態様では、該結合パートナーはマウスもしくはラットから誘導するモノクローナル抗体であり、例えば該結合パートナーはマウスモノクローナル抗体である。
【０２４７】
しかしながら、該抗体は、抗体の一部を或る種から誘導し、他の部分を別の種から誘導するといったような、組み合わせ抗体であってもよい。さらに、該抗体は、天然に産生されない合成抗体であってよい。
【０２４８】
多くの目的のため、該抗体はヒト化抗体であることが好ましい。特に、該結合パートナーを人間の前悪性および/または悪性の病気の処置に使用する場合には、抗体がヒト化されていることが望ましい。
【０２４９】
該抗体はまたヒト抗体であってもよい。ヒト抗体は天然に産生されるヒト抗体であってよく、またはファージディスプレーライブラリーから同定できる。さらにそれは、例えばコンビナトリルライブラリーから同定した、ヒト抗体から誘導した部分をも含むコンビナトリル抗体であってよい。該抗体はさらなるヒト化の必要がない。
【０２５０】
該抗体は好ましくは細胞表面分子の細胞外部分と相互作用できる（本明細書上記を参照されたい）。該抗体はまた、細胞表面分子の細胞外部分の翻訳後修飾と結合できる。或いは、該抗体は本明細書上記に概説した細胞表面分子のいずれかのフラグメントと相互作用できる。
【０２５１】
最も好ましくは該抗体は、該細胞表面分子との結合時にインターナライズされ得る。細胞表面分子と結合する多くの抗体は、結合時に細胞表面分子を発現している細胞内にインターナライズされない。本発明の範囲内の好ましい抗体は、結合後に細胞表面分子を発現している細胞内にインターナライズされ得る。
【０２５２】
本発明の別の態様では、該結合パートナーは該細胞表面分子の天然に存在するリガンドである。天然に存在するリガンドは、天然条件下で細胞表面分子と結合する化合物である。天然に存在するリガンドは例えばポリペプチド、オリゴペプチド、ホルモン、脂質、糖類、アミノ酸、神経伝達物質、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびこれらの組み合わせからなる群から選ぶことができる。
【０２５３】
ホルモンは例えばステロイドホルモンであってよい。ステロイドホルモンはアンドロゲン、エストロゲン、プロゲステロンおよびコルチコイドからなる群から選ぶことができる。
【０２５４】
アンドロゲンは例えばテストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオール、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、硫酸デヒドロエピアンドロステロン（DHEA-S）およびこれらの誘導体からなる群から選ぶことができる。
【０２５５】
エストロゲンは例えばエストリオン、エストラジオール、エストリオールおよびこれらの誘導体からなる群から選ぶことができる。
【０２５６】
天然に存在するリガンドは、本態様のリガンドに好適な任意の通常の技術により、ヒトを包含する動物から精製することができる。しかしながら、天然リガンドは当業者の知悉するいずれかの方法によりインビトロ産生することもできる。
【０２５７】
本発明の或る態様では、該結合パートナーは該細胞表面分子のための組換え産生リガンドである。リガンドがポリペプチドまたはオリゴペプチドである場合、該リガンドは、適当な宿主、例えば細菌、酵母、原生動物、動物、例えば哺乳動物、植物、動物細胞または植物細胞を、特定宿主における核酸配列の転写および／または翻訳を指令する核酸配列と機能的に連結したリガンドをコードしている核酸配列を用いて形質転換することによって産生することができる。形質転換は通常の技術に従って遂行できる。その後、該リガンドを標準方法に従って精製することができる。
【０２５８】
別の態様では、該結合パートナーはウイルスタンパク質であるか、またはウイルスタンパク質もしくはそのフラグメントを含む。膨大な数のウイルスタンパク質が細胞表面分子と結合できる。該結合はしばしばそのウイルス粒子のインターナライゼーションを生じ、よってウイルスタンパク質は本発明に係る好適な結合パートナーである。
【０２５９】
好ましくは、ウイルスタンパク質はウイルスキャプシドタンパク質であり、より好ましくは該ウイルスキャプシドタンパク質は細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズされ得る。
【０２６０】
該ウイルスタンパク質は任意のウイルス、好ましくは天然に細胞表面分子を発現する細胞に感染することのできるウイルスから誘導できる。該ウイルスは例えばアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレンチウイルスファミリーの成員からなる群から選ぶことができる。
【０２６１】
該結合パートナーは組換え産生することができ（本明細書上記を参照されたい）、ウイルスキャプシドタンパク質配列を含むことができる。好ましくはウイルスキャプシドタンパク質配列は、細胞表面分子と結合でき且つインターナライゼーションを生じることのできるウイルスタンパク質の配列である。
【０２６２】
本発明に係るさらに別の態様では、該結合パートナーは小さな化学化合物である。該小さい化学化合物は通常合成によって製造する。それは当業者の知悉する任意の方法または方法の組み合わせによって製造できる。
【０２６３】
好ましい小さな化学化合物は、本明細書上記に概説した細胞表面分子および／または細胞表面分子のフラグメントと相互作用できる。より好ましくは、該小さな化学化合物は細胞表面分子を発現している細胞中にインターナライズされ得る。
【０２６４】
或る態様では、該結合パートナーは、EGF、TGF-α、TGF-β、アンフィレグリン、HB-EGF、エピレグリン、β-セルリン、IGF-1、IGF-2、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アミロイドβ-タンパク質前駆体、インターフェロンγ、トランスフェリン、自己分泌型運動因子、L1、NCAM、カドヘリン、ボンベシン、ニューロメディンB、TNF、エリスロポエチン、インターロイキンおよびコレシストキニンBからなる群から選ばれるポリペプチドであってよい。さらに、該結合パートナーは例えばカンナビノイド、アセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニンおよびGABAからなる群から選ばれる有機化合物であってよい。加えて、該結合パートナーは例えばホルミルペプチドおよび心房性ナトリウム利尿ペプチドからなる群から選ばれるオリゴペプチドであってよい。さらに該結合パートナーは例えばアミノ酸であってよく、それは任意のアミノ酸であってよく、好ましくは該アミノ酸はグルタミン酸塩、グリシンおよびヒスタミンからなる群から選ばれる。加えて、該結合パートナーは例えばATPおよびGTPからなる群から選ばれるヌクレオチドであってよい。さらに、該結合パートナーはエストロゲンのようなホルモン、脂質または糖類であってよい。
【０２６５】
さらに、本発明に係る結合パートナーは、EGF、TGF-α、ヘレグリン、インスリン、IGF-1、PDGF、CSF-1、SCF、FIt-3L、VEGF、FGF1-9、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、HGF、MSP、Gas6、アンギオポエチン-1、エフリンA1-5、エフリンB1-3、GDNF、PEPHC1、TGF-β、アンギオテンシン、トロンビン、アデノシン、アドレナリン、セロトニン、デルトルフィン、ドーパミン、PTH、セクレチン、VIP、PA-CAP、グルカゴン、CRF、ボンベシン、ブラジキニン、NPY、グルタミン酸塩、Ca２＋、GABA、ケモカインおよびオピオイドからなる群から選ぶことができる。
【０２６６】
より好ましくは、該結合パートナーは、L-グルタミン酸塩、カイニン酸塩、5-(ブロモメチル)-4-イソキサゾールプロピオン酸()、グルタミン酸塩の類似体、置換キノキサリン2,3ジオン類、GYKI52466、5-I-ウィラージン、5-F-ウィラージン、AMPA（(RS)-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸）に対するアゴニストおよびアンタゴニストリガンド、NBQX、CNQX、DNQX、GYKI52466、6-クロロキヌレン酸、JSTX、L-APA、L-SOP、ACPT、(R,S)-PPG、CPPG、MAP4、(S)-3,4-DCPG、ビトロネクチン、シタクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、MMP-2、オステオポンチン、プロトロンビン、トロンボスポンジン、フォン・ビルブラント因子、L1CAMの組換えフラグメント、サルモシン、E-カドヘリンおよびそのペプチド（ペプチド：NRDKETKVを包含する）、NCAM1ドメインIgI+II、NCAM1ドメインIgIIIおよびそのペプチド、ペプチドC3：ASKKPKRNIKA（配列番号305）、D3：AKKERQRKDTU（配列番号306）、D4：ARALNWGAKP（配列番号307）、モノクローナル抗体123C3、NPTX1、NPTX2、タイポキシン、TCBP49、オキシノル、ApoE2、ApoE3、ApoE4、ApoE由来のペプチド（E141;-155；LRKLRKRLLRDADDL（配列番号308）およびそのタンデムE(141;-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLL RDADDL（配列番号308のタンデム)）リーリン、ニコチン、アセチルコリン、α-ブンガロトキシンおよびカルバコールからなる群から選ぶことができる。
【０２６７】
本発明に係る結合パートナーは本発明の具体的態様に使用する細胞表面分子に従って選択すべきである。
【０２６８】
よって、細胞表面分子が結合パートナーまたはターゲッティング複合体をインターナライズできる本発明の態様では、該結合パートナーは好ましくはNCAM1ドメインIgI+II、NCAM1ドメインIgIIIおよびそのペプチド、ペプチドC3：ASKKPKRNIKA（配列番号305）、D3：AKKERQRKDTU（配列番号306）、D4：ARALNWGAKP（配列番号307）、モノクローナル抗体123C3、NPTX1、NPTX2、タイポキシン、TCBP49、オキシノル、ApoE2、ApoE3、ApoE4、ApoE由来のペプチド（E141;-155；LRKLRKRLLRDADDL（配列番号308）およびそのタンデムE(141;-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLL RDADDL（配列番号308のタンデム)）リーリン、ニコチン、アセチルコリン、α-ブンガロトキシン、カルバコールならびに該細胞表面分子に対する特異的インターナライズ抗体からなる群から選ばれる。
【０２６９】
細胞表面分子が結合パートナーまたはターゲッティング複合体をインターナライズできない本発明の態様では、該結合パートナーは好ましくはL-グルタミン酸塩、カイニン酸塩、5-(ブロモメチル)-4-イソキサゾールプロピオン酸()、グルタミン酸塩の類似体、置換キノキサリン2,3ジオン類、GYKI52466、5-I-ウィラージン、5-F-ウィラージン、AMPA（(RS)-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸）に対するアゴニストおよびアンタゴニストリガンド、NBQX、CNQX、DNQX、GYKI52466、6-クロロキヌレン酸、JSTX、L-APA、L-SOP、ACPT、(R,S)-PPG、CPPG、MAP4、(S)-3,4-DCPG、ビトロネクチン、シタクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、MMP-2、オステオポンチン、プロトロンビン、トロンボスポンジン、フォン・ビルブラント因子、L1CAMの組換えフラグメント、サルモシン、E-カドヘリンおよびそのペプチド（ペプチド：NRDKETKV（配列番号309）を包含する）、ならびに該細胞表面分子に対する特異抗体からなる群から選ばれる。
【０２７０】
本発明の特に好ましい態様では、該細胞表面分子はNCAM1である。該細胞表面分子がNCAM1である時、該結合パートナーは好ましくは、NCAM1の第１および第２免疫グロブリン（Ig）ドメイン（Kiselyovらによる1997)、NCAM1の第３Igドメイン、接着性分子L1およびプロテオグリカン類からなる群から選ばれる。さらに、該結合パートナーは好ましくは、コンビナトリアルペプチドライブラリーから同定できる多数のペプチド（11アミノ酸) (Ronnらによる1999）(例えばC3：ASKKPKRNIKA（配列番号305）、D3：AKKERQRKDTU（配列番号306）およびD4：ARALNWGAKPK（配列番号307）(Ronn et al.、1999）を包含する）を包含する、NCAMと結合できる合成結合パートナーからなる群から選ぶことができる。加えて、該結合パートナーは好ましくはNCAM1に対する抗体、好ましくはNCAM1に対するモノクローナル抗体、例えばインターナライズを惹起する抗体（123C3）からなる群から選ぶことができる。
【０２７１】
本発明の別の好ましい態様では、該細胞表面分子はNPTXRである。細胞表面分子がNPTXRである時、該結合パートナーは好ましくはニューロンペントラキシン1（NP1、NPTX1）およびニューロンペントラキシン2（NP2、NPTX2）からなる群から選ばれる（Kirkpatrickらによる2000; Doddsらによる1997)。さらに、該結合パートナーは好ましくは蛇毒タイポキシンおよびタイポキシン関連カルシウム結合タンパク質49（TCBP49）およびタイポキシン類似体オキシノルからなる群から選ぶことができる。加えて、該結合パートナーは好ましくは、NPTXRに対する抗体、好ましくはNPTXRに対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７２】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はLRP8である。細胞表面分子がLRP8である時、該結合パートナーは好ましくはApoE2、ApoE3およびApoE4ならびにリーリンからなる群から選ばれる。さらに、該結合パートナーは好ましくは種々の組換えApoEイソ型からなる群から選ぶことができ、それらの幾つかは市販品が入手可能である。しかしながら、天然ApoEイソ型は幾つかのレセプターと結合できる。加えて、該結合パートナーは好ましくはApoE由来のペプチド、例えば（E141;-155；LRKLRKRLLRDADDL（配列番号308）およびそのタンデムE(141;-155)2；LRKLRKRLLRDADDL-LRKLRKRLL RDADDL）からなる群から選ぶことができ、それらはいずれもレセプター機能を阻害することが示されている（Riddellらによる1999)。加えて、該結合パートナーは好ましくはLRP8に対する抗体、好ましくはLRP8に対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７３】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はCHRNA5である。細胞表面分子がCHRNA5である時、該結合パートナーは好ましくはニコチン、アセチルコリンおよび毒素α-ブンガロトキシンからなる群から選ばれる。さらに、該結合パートナーは、CHRNA5の合成アゴニスト、例えばカルバコールからなる群から選ぶことができる。加えて、該結合パートナーは好ましくはCHRNA5に対する抗体、好ましくはCHRNA5に対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７４】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はL1CAMである。細胞表面分子がL1CAMである時、該結合パートナーは例えばインテグリンファミリーの接着性分子またはそのフラグメントを含むことができる。L1CAMは、RGD配列を介してインテグリンファミリーの、そしてオリゴマンノシド炭水化物を介して免疫グロブリンファミリーの接着性分子の幾つかに結合することが分かっている。加えて、該結合パートナーは好ましくはL1CAMに対する抗体、好ましくはL1CAMに対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７５】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はTNFRSF12である。細胞表面分子がTNFRSF12である時、該結合パートナーは例えばTNFRSF12に対する抗体、好ましくはTNFRSF12に対するモノクローナル抗体、例えばTNFRSF12の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体であってよい。
【０２７６】
本発明に係る１つの特に好ましい態様では、該細胞表面分子はGRIA2である。細胞表面分子がGRIA2である時、該結合パートナーは好ましくはL-グルタミン酸塩およびカイニン酸塩からなる群から選ばれる。さらに、該結合パートナーは好ましくはGRIA2に対する合成リガンド、例えばAMPA（(RS)-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸）レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストリガンドからなる群から選ぶことができる。AMPAレセプターリガンドは一般に、グルタミン酸塩または置換キノキサリン2,3ジオン類の類似体のいずれかである。該アンタゴニストは競合的および調節部位アンタゴニストに分けられる（(Brauner-Osborneらによる2000; Madsenらによる2001)に論評されている）。加えて、１つのAMPAアンタゴニスト、GYKI52466はGRIA2レセプターを発現している細胞上の腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている（CavalheiroおよびOlneyらによる2001）。リガンドのレセプター結合はそのリガンドの主要(mayor)部分の結合を含むことから、置換（例えばハロゲン）は極めて少ない部位でしか実施できない。AMPAの臭素置換型（ABPA）はAMPAレセプターの強力なアゴニストとして働くことが示された（Krogsgaard-Larsenらによる1985）。このアゴニストはまた、アゴニストのハロゲン化型、例えばウィリアージンおよび異なるAMPAレセプター親和性を持つ類似体であってもよい（Jane. Dによる2001）。これらの多くはAMPA自身よりもAMPAレセプターの方が何倍も高い親和性を持つことを示している。ウィリアージン(Williardiine)および6-アゾウィリアージンハロゲン化類似体の合成は（Janeらによる1997）に詳細に記載されている。5-I-ウィラージンおよび5-F-ウィラージンは３H型でも市販されている。加えて、該結合パートナーは小さな分子アンタゴニスト、例えば市販品が入手可能なNBQX、CNQX、DNQX、GYKI52466および6-クロロキヌレン酸からなる群、ならびに蜘蛛毒JSTX-3に関連するAMPAレセプターチャネルのより大きなポリアミンアンタゴニストの群（Yonedaらによる2001）から選ぶことができる。加えて、該結合パートナーは好ましくはGRIA2に対する抗体、好ましくはGRIA2に対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７７】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はGRM8である。細胞表面分子がGRM8である時、該結合パートナーは好ましくはL-グルタミン酸塩であってよい。さらに、結合パートナーは好ましくはアゴニストおよびアンタゴニスト、例えば市販品が入手可能なL-APA、L-SOP、ACPT、(R,S)-PPG、CPPG、MAP4、(S)-3,4-DCPGおよびMSOPならびにそれらの3H標識型からなる群から選ぶことができる。１つのアゴニスト(R,S)-PPGはGRM8について25倍の選択性を持ち（Gaspariniらによる1999）、またアゴニスト(S)-3,4-DCPGはGRM8について100倍以上の選択性を示す（Brunoらによる2001; Thomasらによる2001; TurnerおよびSaltによる1999）。加えて、結合パートナーは好ましくはGRM8に対する抗体、好ましくはGRM8に対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７８】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はIT-GAVである。細胞表面分子がIT-GAVである時、該結合パートナーは好ましくはビトロネクチン、シタクチン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、MMP-2、オステオポンチン、プロトロンビン、トロンボスポンジン、フォン・ビルブラント因子およびαvβ3からなる群から選ぶことができる。αvβ3はαvサブユニットを介して神経細胞接着性分子L1の組換えフラグメントに結合することが示されている（Montgomeryらによる1996）。ビトロネクチンのような天然リガンドはその他幾つかの遍在的に発現されるインテグリンのリガンドでもあり、故に特異的ターゲッティングのために最適ではない。さらに、結合パートナーは好ましくはディスインテグリン類およびADAM、例えばサルモシンまたはコントートロスタチンからなる群から選ぶことができる。ディスインテグリン類およびADAM（A DisintegrinおよびA Metalloprotease）は蛇毒由来の多数のタンパク質であり、それらは異なる特異性で異なるインテグリンに結合する（Evansによる2001; Huangによる1998）。組換え産生されたサルモシン（Kangらによる1999）およびコントートロスタチン（Mercerらによる1998）を包含する、αvβ3およびαvβ5に特異的な幾つかのディスインテグリンが同定されている。加えて、結合パートナーは好ましくは小さな環状ペプチドおよび非ペプチド化合物からなる群から選ぶことができ、それらはαvβ3結合のアンタゴニストである（Bogerらによる2001;HartmanおよびDugganによる2000; Kerrらによる2000; Battらによる2000）。加えて、結合パートナーは好ましくはITGAVに対する抗体、好ましくはITGAVに対するモノクローナル抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２７９】
本発明に係る別の好ましい態様では、該細胞表面分子はIT-GAEである。細胞表面分子がITGAEである時、該結合パートナーは好ましくは細胞接着性分子E-カドヘリンまたはそのフラグメントであってよい。αEβ7に対するE-カドヘリンのヘテロフィリック結合部位は、E-カドヘリンと別のE-カドヘリンのホモフィリック結合部位とが相違している（Kareclaらによる1996; Taraszkaらによる2000）。好ましくはこのフラグメントは、E-カドヘリンの第１ドメインからの短ペプチド配列（アミノ酸27-34：NRDKETKV（配列番号309）を含み、またはより好ましくは該ペプチド配列で構成されており、これらはαEβ7とE-カドヘリンとの結合を妨害できる。さらに、該結合パートナーは特異的αEβ7特異的ペプチドからなる群から選ぶことができる（BrennerおよびCepekによる2001）。加えて、該結合パートナーは好ましくはITGAEに対する抗体、好ましくはITGAEに対するモノクローナル抗体、例えばアンタゴニストとして使用できるαE特異抗体からなる群から選ぶことができる。
【０２８０】
複合体
ある態様において、本発明は細胞表面分子および結合パートナーを含有する複合体に関する。好ましくは、該細胞表面分子は本発明に開示される方法によって同定される。該細胞表面分子は、好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ、例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン・バーシカンV1；例えばmGluR1β、例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプ���ーαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3、例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。
【０２８１】
より好ましくは、該細胞表面分子は以下からなる群から選ばれ得る：
レセプターチロシンキナーゼの成員、
インテグリンファミリーの成員、
免疫グロブリンスーパーファミリー接着性分子の成員、
ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
MAGEファミリーの成員、
RAGEファミリーの成員、
低密度リポタンパク質レセプターファミリーの成員、
カドヘリン接着分子の成員、
代謝調節型グルタミン酸レセプターの成員、
ステロイドホルモンファミリーの成員、
セブン貫膜レセプターファミリーの成員、
心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター、
GFRA3、
トランスフェリンレセプター、
セリン/スレオニンキナーゼレセプターの成員。
【０２８２】
より好ましくは、該細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる。
【０２８３】
該複合体の結合パートナーは、該細胞表面分子と相互作用することができるいずれかの特異的な結合性パートナーであり得る。結合パートナーの例は、本明細書中に上記する。
【０２８４】
ターゲティング複合体
本発明はターゲティング複合体を提供し、このものは結合パートナーおよび生物学的反応性の種を含む。該結合パートナーは、上記本明細書中に概説する通り、１つ以上の細胞表面分子またはそのフラグメントと結合することができるべきである。
【０２８５】
本発明の１好ましい態様において、該細胞表面分子（このものは、該ターゲティング複合体の結合パートナーと結合することができる）は、該ターゲティング複合体をインターナライズすることができる。しかしながら、本発明の別の好ましい態様において、該細胞表面分子は該ターゲティング複合体とインターナライズすることができず、単に該ターゲティング複合体と結合することができるだけである。
【０２８６】
より好ましくは、該細胞表面分子は以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ、例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン・バーシカンV1；例えばmGluR1β、例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3、例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。より一層好ましくは、該細胞表面分子は以下の群の１つに属するレセプターからなる群から選ばれる：
レセプターチロシンキナーゼの成員、
インテグリンファミリーの成員、
免疫グロブリンスーパーファミリー接着性分子の成員、
ヘパラン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンファミリーの成員、
MAGEファミリーの成員、
RAGEファミリーの成員、
低密度リポタンパク質レセプターファミリーの成員、
カドヘリン接着分子の成員、
代謝調節型グルタミン酸レセプターの成員、
ステロイドホルモンファミリーの成員、
セブン貫膜レセプターファミリーの成員、
心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター、
GFRA3、
トランスフェリンレセプター、
セリン/スレオニンキナーゼレセプターの成員。
【０２８７】
一層より好ましくは、該細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれる。
【０２８８】
本発明に係わる該生物学的反応性の種は、ターゲティング細胞に生物学的な影響を直接的にまたは間接的に及ぼすことができるいずれかの種であり得て、ここで該ターゲティング細胞は該細胞表面分子を発現するいずれかの細胞であり得て、そしてこのものは該ターゲティング構築物をインターナライズすることができる。本発明に係わる生物学的な影響は、例えば細胞周期の停止、並びに毒素および細胞死からの細胞の防止からなる群から選ばれる。
【０２８９】
該生物学的反応性の種はいずれかの化合物であり得て、例えば核酸配列、ポリペプチド、オリゴペプチド、毒素、小さい化学化合物または放射性同位元素であり得る。
【０２９０】
ある好ましい態様において、該生物学的反応性の種は核酸配列である。好ましくは、該核酸配列は、発現シグナルを含有する第１の核酸配列と機能的に連結した第２の核酸を含む。
【０２９１】
ある好ましい態様において、第２の核酸配列は治療タンパク質（本明細書中の以下を参照）をコードすることができる。治療タンパク質をコードしている核酸配列は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むことができる。本明細書で使用する用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて製造するＤＮＡを意味する。ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから重合したＤＮＡ、または非もしくは部分的に加工処理したＲＮＡ鋳型と対抗して、ｃＤＮＡを用いる利点は、ｃＤＮＡがいずれかの非コードのイントロン配列を含まず、むしろ対応するタンパク質の中断されていないコード領域を含む。しかしながら、全または部分のゲノム配列が好ましい場合（例えば、非コード領域が最適な発現にとって必要である場合）もあり得る。
【０２９２】
別の態様において、該第２の核酸配列はアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの一部をコードしている。あるいは、該２の核酸配列は、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの一部を含むかまたはそれらから本質的に構成される。
【０２９３】
本発明の文脈において、用語「アンチセンスＲＮＡ」は、遺伝子の非コードＤＮＡ鎖から転写されたＲＮＡ配列、またはストリンジェントな条件下でｍＲＮＡもしくはそのフラグメントとハイブリダイズすることができるＲＮＡ配列を包含することを意図する。
【０２９４】
好ましくは、本発明の文脈におけるアンチセンスＲＮＡは、細胞の生存、細胞の増殖および／または細胞の運動を促進する、タンパク質をコードしている遺伝子のアンチセンスＲＮＡである。より好ましくは、該アンチセンスＲＮＡはオンコジーンまたは増殖因子のアンチセンスＲＮＡである。
【０２９５】
第２の態様において、該第２の核酸配列はリボザイムをコードしているかまたは含む。本発明の文脈におけるリボザイムは、少なくとも１つのＲＮＡを含み、そして酵素活性を含む分子である。好ましくは、本発明に係わるリボザイムはオンコジーン、プロトオンコジーンまたは増殖因子のＲＮＡをターゲットとする。
【０２９６】
従って、本発明の好ましい態様において、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムは、オンコジーン、プロトオンコジーンまたは増殖因子のＲＮＡをターゲットとする。増殖因子の例は、本明細書中以下に示す。
【０２９７】
オンコジーンは遺伝子の多様なクラスであり、その産物は癌の発生および／または進行に寄与し得る。プロトオンコジーンは、ある環境下でまたは突然変異による後に、癌の発生および／または進行に寄与し得る。オンコジーンまたはプロトオンコジーンは例えば、Ras、Raf、Myc、Syn、Pim、BMI-1、FOP、Sis、KGF、Fms、Flg、Neu、Trk、Kit、Met、Src、Fyn、Mas、Fes/Fps、Tre、Mer、ABL、BCL3、int-2、Cym、Ets、Elk、RhoA、Ski、Wnt-5a、Spi-1、Rap2、p55およびc-tyrからなる群から選ばれ得る。このものは、本発明と一緒に使用することができる、オンコジーンまたはプロトオンコジーンの排他的な例ではなく、単に例示的な例を含む。
【０２９８】
第２核酸配列はまた、該細胞内での腫瘍抑制遺伝子のいずれかの内因性突然変異を訂正する(correct)ために、該細胞表面分子を発現する細胞中に導入される腫瘍抑制遺伝子をコードすることができる。該腫瘍抑制因子は、いずれかの腫瘍抑制因子（例えば、本明細書中以下に示す）であり得る。
【０２９９】
本発明に係わる第１核酸配列は好ましくは、発現シグナルを含む。該発現シグナルは好ましくは、そのものに機能的に連結した第２核酸配列の転写に影響を及ぼすべきである。好ましくは、本発明に係わる第１核酸配列は、例えばそれらは特異的な環境下で転写を増大させるように、転写に影響を及ぼす。
【０３００】
本発明のある態様において、該第１核酸配列は、非悪性細胞と比較して、悪性細胞中での第２核酸配列の低レベルの発現を指令する発現シグナルを含む。別の実施態様において、該第１核酸配列は非悪性細胞と比較して、悪性細胞中での第２核酸配列のほぼ同レベルの発現を指令する発現シグナルを含む。
【０３０１】
しかしながら、本発明の好ましい態様において、該第１核酸配列は、非悪性細胞と比較して悪性細胞中での第２核酸配列のより高レベルな発現を指令する。特に、該第１核酸配列は、本明細書中上に概説する方法に従って同定された第１核酸配列からなる群から選ばれ得る。
【０３０２】
好ましくは、該第１核酸配列は、以下のものからなる群から選ばれる：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro6、pro7、pro8、pro9、pro10、pro12、pro13、pro14、pro15、pro16、pro17、pro18、pro19、pro20、pro21、pro22、pro23、pro24、pro25、pro26、pro27、pro28、pro29、pro30、pro31、pro32、pro34、pro36、pro37、pro38、pro39、pro40、pro41、pro42、pro43、pro44、pro45、pro46、pro47, pro48、pro49、pro50、pro51、pro52、pro53、pro54、pro55、pro56、pro57、pro58、pro59、pro60、pro61、pro62、pro63、pro64、pro65、pro66、pro67、pro68、pro69、pro70、pro71、pro72、pro73、pro74、pro75、pro76、pro77、pro78、pro79、pro80、pro81、pro82、pro83、pro84、pro85、pro86、pro87、pro88、pro89、pro90、pro91、pro92、pro93、pro94、pro95、pro96、pro97、pro98、pro99、pro100、pro101、pro103、pro104、pro105、pro106、pro107、pro108、pro109、pro110、pro111、pro112、pro113、pro114、pro115、pro116、pro117、pro118、pro119、pro120、pro121、pro122、pro123、pro124、pro125、pro126、pro127、pro128、pro129、pro130、pro131、pro133、pro134、pro135、pro136、pro137、pro138、pro139、pro140、pro141、pro142、pro143、pro144、pro145、pro146、pro147、pro148、pro149、pro150、pro152、pro153、pro154、pro155、pro156、pro157、pro158、pro159、pro160、pro161、pro162、pro163、pro164、pro165、pro166、pro167、pro168、pro169、pro171、pro172、pro173、pro174、pro175、pro176、pro177、pro178、pro179、pro180、pro181、pro182、pro183、pro184、pro185、pro187、pro189、pro191、pro193、pro194、pro195、pro196、pro197、pro198、pro199、pro201、pro202、pro203、pro204、pro205、pro206、pro207、pro208、pro209、pro210、pro211、pro212、pro213、pro215、pro216、pro217、pro219、pro220、pro221、pro222、pro223、pro224、pro225、pro226、pro227、pro228、pro229、pro230、pro231、pro232、pro233、pro234、pro235、pro236、pro237、pro238、pro239、pro240、pro241、pro242、pro243、pro244、pro245、pro246、pro247、pro248、pro249、pro250、pro251、pro253、pro254、pro255、pro256、pro257、pro258、pro259、pro260、pro262、pro263、pro264、pro267、pro268、pro269、pro270、pro271、pro272、pro273、pro275、pro277、pro278、pro279、pro280、pro282、pro283、pro284、pro285、pro286、pro287、pro289、pro290、pro291、pro292、pro293、pro294、pro295、pro296、pro297、pro298、pro299、pro300、pro301、pro302、pro303、pro304、pro305、pro306、pro307、pro308、pro309、pro310、pro311、pro312、pro313、pro315、pro316、pro317、pro318、pro319、pro320、pro321、pro322、pro323、pro324、pro326、pro327、pro328、pro329、pro330、pro331、pro332、pro333、pro334、pro335、pro336、pro337、pro338、pro339、pro340、pro341、pro344、pro346、pro347、pro348、pro349、pro352、pro353、pro354、pro355、pro356、pro358、pro359およびpro361。
【０３０３】
該第１核酸配列は更に、以下のものからなる群から選ばれる核酸配列のフラグメントを含むかおよび／またはそれらから本質的に構成され得る：
pro1、pro2、pro3、pro4、pro5、pro6、pro7、pro8、pro9、pro10、pro12、pro13、pro14、pro15、pro16、pro17、pro18、pro19、pro20、pro21、pro22、pro23、pro24、pro25、pro26、pro27、pro28、pro29、pro30、pro31、pro32、pro34、pro36、pro37、pro38、pro39、pro40、pro41、pro42、pro43、pro44、pro45、pro46、pro47、pro48、pro49、pro50、pro51、pro52、pro53、pro54、pro55、pro56、pro57、pro58、pro59、pro60、pro61、pro62、pro63、pro64、pro65、pro66、pro67、pro68、pro69、pro70、pro71、pro72、pro73、pro74、pro75、pro76、pro77、pro78、pro79、pro80、pro81、pro82、pro83、pro84、pro85、pro86、pro87、pro88、pro89、pro90、pro91、pro92、pro93、pro94、pro95、pro96、pro97、pro98、pro99、pro100、pro101、pro103、pro104、pro105、pro106、pro107、pro108、pro109、pro110、pro111、pro112、pro113、pro114、pro115、pro116、pro117、pro118、pro119、pro120、pro121、pro122、pro123、pro124、pro125、pro126、pro127、pro128、pro129、pro130、pro131、pro133、pro134、pro135、pro136、pro137、pro138、pro139、pro140、pro141、pro142、pro143、pro144、pro145、pro146、pro147、pro148、pro149、pro150、pro152、pro153、pro154、pro155、pro156、pro157、pro158、pro159、pro160、pro161、pro162、pro163、pro164、pro165、pro166、pro167、pro168、pro169、pro171、pro172、pro173、pro174、pro175、pro176、pro177、pro178、pro179、pro180、pro181、pro182、pro183、pro184、pro185、pro187、pro189、pro191、pro193、pro194、pro195、pro196、pro197、pro198、pro199、pro201、pro202、pro203、pro204、pro205、pro206、pro207、pro208、pro209、pro210、pro211、pro212、pro213、pro215、pro216、pro217、pro219、pro220、pro221、pro222、pro223、pro224、pro225、pro226、pro227、pro228、pro229、pro230、pro231、pro232、pro233、pro234、pro235、pro236、pro237、pro238、pro239、pro240、pro241、pro242、pro243、pro244、pro245、pro246、pro247、pro248、pro249、pro250、pro251、pro253、pro254、pro255、pro256、pro257、pro258、pro259、pro260、pro262、pro263、pro264、pro267、pro268、pro269、pro270、pro271、pro272、pro273、pro275、pro277、pro278、pro279、pro280、pro282、pro283、pro284、pro285、pro286、pro287、pro289、pro290、pro291、pro292、pro293、pro294、pro295、pro296、pro297、pro298、pro299、pro300、pro301、pro302、pro303、pro304、pro305、pro306、pro307、pro308、pro309、pro310、pro311、pro312、pro313、pro315、pro316、pro317、pro318、pro319、pro320、pro321、pro322、pro323、pro324、pro326、pro327、pro328、pro329、pro330、pro331、pro332、pro333、pro334、pro335、pro336、pro337、pro338、pro339、pro340、pro341、pro344、pro346、pro347、pro348、pro349、pro352、pro353、pro354、pro355、pro356、pro358、pro359およびpro361。
【０３０４】
一層より好ましくは、該第１核酸配列は、pro221、pro210、pro71、pro41、pro30、pro2、pro209、pro14、pro4、pro8、pro246、pro16、pro27、pro5、pro49、pro19、pro140、pro139、pro207、pro81、pro273およびpro362、並びにそれらのフラグメントからなる群から選ばれる。
【０３０５】
該第１核酸配列はまた、上記の群から選ばれるヌクレオチド配列の１つ以上のフラグメントをも含み得る。
【０３０６】
該第１核酸配列は更に自然に関係しない核酸配列を含むこともまた、本発明内に包含する。該自然に関係しない核酸配列は、例えば転写因子結合部位、好ましくは１つ以上のステロイドホルモンレセプター結合部位であり得る。
【０３０７】
本発明の好ましい実施態様において、該第１核酸配列は、本明細書中上で概説するいずれかの第１核酸配列であり得る。
【０３０８】
ある実施態様において、核酸配列は細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。この組み込みは、相同的な組み換え（遺伝子組み換え）による同族の位置および配向の内にあり得たり、またはランダムで非特異的な位置内に組み込み得る（遺伝子増強）。更なる態様において、該核酸配列はＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞中に安定に保つことができる。該核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主の細胞周期から独立しているかまたはそれと同期化した保持および複製が許容されるのに十分な配列をコードしている。
【０３０９】
該ターゲティング複合体は結合パートナーおよび生物学的反応性の種に加えて、更に別の構成成分を含むことができる。別構成成分は例えば、保護成分であり得る。
【０３１０】
該生物反応性の種が核酸である場合には、該ターゲティング複合体は更に、保護的なキャッピングを含み得て、ここで該保護的なキャッピングは該第１および／または第２の核酸配列と結合する核酸配列から成る。保護的性質を有する核酸配列は例えば、改変ヌクレオチドを含み得る。該改変ヌクレオチドは例えば、１つ以上のアミノ酸、アミン基またはビオチン基で改変することができる。
【０３１１】
本発明の１態様において、該生物学的反応性の種は毒素である。毒素は、細胞表面分子を発現する細胞にとって毒であるいずれかの種である。例えば、該毒素は、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、ストレプトゾトシンまたはコレラ毒素からなる群から選ばれ得る。しかしながら、毒素のこの例示は完全なものではなく、本発明を限定するものとみなすべきではない。
【０３１２】
本発明の別の態様において、該生物学的反応性の種はアポトーシスのインジューサーである。細胞表面分子を発現する細胞中で直接的にまたは間接的にアポトーシスを誘起することができるいずれかの化合物は、本発明の意義内でアポトーシスのインジューサーである。
【０３１３】
アポトーシスのインジューサーはポリペプチド（本明細書中以下を参照）であり得るか、またはそのものは他の種類の化合物であり得る。例えば、アポトーシスのインジューサーは、レチン酸、A23187、オカダ酸、ピューロマイシン、スタウロスポリン、タプシガルジン、アクチノマイシンD、カンプトテシン、シクロヘキシミド、デキサメタゾン、エトポシドおよびグルココルチノイドからなる群から選ばれ得る。しかしながら、アポトーシスのいずれかのインジューサーをまた、本発明内に含む。
【０３１４】
本発明の更なる別の態様において、該生物学的反応性の種は放射性同位体である。放射性同位体は、(125)I、(131)I、(123)I、(111)In、(205)Bi、(206)Bi、(213)Bi、(186)Re、(188)Re、(225)Ac、99mTc、(68)Ga、(62)Cu、(90)Y、(64)Cu、(211)At、(212)Bi、(177)Lu、(153)Smおよび(157)Gdからなる群から選ぶことができる。ある態様において、該放射性活性な種は他の種と共有結合することができ、例えば該放射性活性な種は結合パートナーと共有結合することができる。
【０３１５】
本発明の更なる実施態様において、該生物学的反応性の種は静細胞剤(cytostatica)である。静細胞剤は、例えば化学療法において使用することができる薬物であり得る。化学療法における使用に適当な薬物は、本明細書中以下に記載する。
【０３１６】
本発明に係わる該生物学的反応性の種はホルモンの作動薬、好ましくはエストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、ＬＨおよびＲＨからなる群から選ばれるホルモンの作動薬である。
【０３１７】
アンドロゲンは例えば、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオール、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン(ＤＥＨＡ)、デヒドロエピアンドロステロン硫酸(ＤＨＥＡ−Ｓ)およびそれらの誘導体からなる群から選ぶことができる。
【０３１８】
エストロゲンは例えば、エストリオン(estrion)、エストラジオール(estradiol)、エストリオール(estriol)およびそれらの誘導体からなる群から選ぶことができる。
【０３１９】
あるいは、該生物学的反応性の種は、アロマターゼインヒビターであり得る。
【０３２０】
本発明のある好ましい態様において、該生物学的反応性の種は、ポリペプチドを含むかまたはそれらから本質的に構成される。特に、該ポリペプチドは治療タンパク質であり得る。
【０３２１】
用語「治療タンパク質」とは、細胞の潜在的な利点のために細胞中に導入されるいずれかのポリペプチド、または該細胞を含有する生物を意味すると意図する。治療タンパク質は、多数の異なるクラスに属することができる。例えば、治療タンパク質は、腫瘍抑制因子、毒性物質であり得るか、またはそのものはアポトーシスのインジューサーであり得る。本発明に係わる該治療タンパク質は、細胞周期停止に寄与することができるタンパク質であり得る。
【０３２２】
癌処置様式の文脈において、特に有用な遺伝子は腫瘍抑制因子である。正常な細胞の新生物細胞中への形質転換のプロセスの間、腫瘍抑制遺伝子の突然変異は重要な役割を果たしていると考えられる。腫瘍抑制因子の最も重要な機能の１つは、細胞周期を弱毒化し、そして変異型細胞のアポトーシスを媒介することである。腫瘍抑制遺伝子は非常に有効であって、その結果該腫瘍抑制遺伝子の両方のアレルの突然変異がその機能を除去するのに必要である。従って、機能的な腫瘍抑制遺伝子の変異型表現型を有する癌細胞中への導入は、細胞周期の停止およびアポトーシスを誘起するのに十分であることが多い。p53、p73およびp16は肺癌の場合において突然変異することが多い腫瘍抑制遺伝子である。治療遺伝子運搬ベクターを用いた野生型のこれら遺伝子の癌細胞中への導入は、癌細胞を選択的に殺滅させる可能な方法である。当該分野の当業者にとってよく知られる多数の腫瘍抑制因子が存在し、好ましくは例えばp53、p73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-lI、BRCA1、VHL、FCCおよびMCCを含む。この例示は、当該分野において知られる様々な腫瘍抑制因子の排他的なものではなく、むしろより一般的な腫瘍抑制因子の典型例であると意図する。
【０３２３】
好ましくは、該治療タンパク質はp73、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-1、MEN-II、BRCA1、VHL、FCC、MCC、MSH2、PTCH、DPCH、TSC2、CDKN2AおよびARFからなる群から選ばれる腫瘍抑制である。より好ましくは、該治療タンパク質はp53である。
【０３２４】
癌治療の重要な終末点は癌細胞の殺滅または除去である。この事象の導入のために通常使用される方法の１つは、変異型p53を有する癌細胞中への野生型p53の導入、それによる細胞周期の停止およびアポトーシスの誘発である。治療遺伝子としてのp53の使用は、癌細胞中における内因性p53の状態に依存する。野生型の過剰発現は有効なことが多く、しかしながら、p53の過剰発現と細胞周期調節遺伝子（例えば、p16）の過剰発現との組み合わせは、該効果を増大させることができる。他の細胞周期調節遺伝子（例えば、p15、p17、p18またはp19）はまた、p53またはp53ファミリー由来の他の遺伝子（例えば、p73）と組み合わせて有効である。化学治療薬物またはイオン照射(ionising radiation)との組み合わせ療法は、p53遺伝子療法に対する治療学的な反応を著しく増強することができることも可能である。
【０３２５】
タンパク質のBcl-2ファミリーは、細胞死の重要な制御因子である。それらは、抗アポトーシス性成員に対するアポトーシス促進性成員という、２つの相反する機能からなる。全てのbcl-2ファミリーは、４つの非常に保存されたドメインである、BH1、BH2、BH3およびBH4の１つ以上を有する。Bcl-2ファミリーメンバーは、A1、mcl-1、bcl-2、bcl-w、bcl-x、bax、badおよびbakを含むが、これらに限定されない。細胞内膜タンパク質をコードしているA1、bcl-2、mcl-1、bcl-wおよびbcl-xl（長型のbcl-x）遺伝子は、アポトーシスを遮断したりまたは遅延させることが分かった。これら遺伝子の過剰発現は、アポトーシス（これは、化学療法によって誘発されるものを含む）に対する耐性を与えることが分かった。これらの遺伝子およびそれらのタンパク質に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、アポトーシスを誘起するのに治療学的に使用することができる。
【０３２６】
それに対して、bax、bad、bakおよびbcl-xs（短型のbcl-x）は、抗アポトーシス性bcl-2ファミリー成員の保護的な効果を抑制することによって、細胞死を促進することが本発明において分かった。腫瘍細胞中でのアポトーシスを誘起する可能な方法は、これらの遺伝子の導入および過剰発現によるものである。
【０３２７】
カスパーゼ（システイン−アスパラギン酸−プロテアーゼ）は、アポトーシスの問題の中心であるタンパク質のクラスである。これらのプロテアーゼは、アポトーシスを受ける細胞中に見られる形態学的変化を生じる、細胞タンパク質の分解における主な原因である。カスパーゼは、タンパク質分解性の切断によって活性化される不活性なプロ酵素として存在する。少なくとも１２個のカスパーゼがヒトにおいて同定されている。カスパーゼ８、９および３は、アポトーシス経路における中心的な接合部に位置する。カスパーゼ８およびカスパーゼ９は、タンパク質分解性の切断によってカスパーゼ３を活性化し、次いでカスパーゼ３は生命(vital)細胞タンパク質または他のカスパーゼを切断する。これらのカスパーゼの１つの導入および過剰発現は癌細胞のアポトーシスを生じると企図されるであろう。
【０３２８】
好ましくは、該治療タンパク質は、Fas/Apo1、TNF、TRAIL、TGF-β、カスパーゼ、Bak、Bax、Bid、BikおよびGZMBからなる群から選ばれるアポトーシスのインジューサーである。
【０３２９】
本発明に係わる該生物学的反応性の種は、更にオンコジーンタンパク質、または癌の形成に関与する他のタンパク質と結合する抗体であり得る。オンコジーンタンパク質の例示は、本明細書中上で示す。
【０３３０】
癌細胞は、増殖、血管新生および免疫系の回避(evasion)を媒介する自己分泌またはパラ分泌ループ(loop)を持続するための増殖因子または増殖因子レセプターを産生することが多い。従って、該生物学的反応性の種は抗体、例えばTGF-β、VEGF、IGFおよび増殖因子レセプター（例えば、EGFR）からなる群から選ばれる１つ以上の増殖因子を抑制する細胞内単鎖であり得る。
【０３３１】
加えて、該治療タンパク質は毒性物質から細胞を防止することができるタンパク質であり得たり、またはそれらは毒性物質の製造を触媒することができるタンパク質であり得る。
【０３３２】
プロドラッグの細胞障害性化合物への変換を媒介するタンパク質を導入する、異なるシステムが開発されている。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子は、特異的な前毒性ヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビルおよびガンシクロビル(gancyclovir)）を強力なＤＮＡ合成インヒビターへ変換する。HSV-tkを発現することができる細胞は、薬物に対して非常に感受性となり、一方で非HSV-tk発現細胞は比較的に不活性である。該プロドラッグ変換の影響は、HSV-tk形質導入細胞中だけでなく、周囲の細胞中にも見られる。この効果は傍観者(bystander)効果と呼ばれ、このものはHSV-tk遺伝子を用いて腫瘍細胞の１００％を形質導入する要求を避けるような治療学的な利点である。
【０３３３】
別の該薬物感受性の治療タンパク質は、シトシンデアミナーゼ(cytosine deaminase)（ＣＤ）である。該ＣＤタンパク質は、プロドラッグ５−フルオロシトシン（５ＦＣ）の５−フルオロウラシル（５ＦＵ）への変換を触媒し；５ＦＣを用いるＣＤ形質導入細胞の処置により、ＣＤ陽性腫瘍細胞中での該５ＦＣの抗腫瘍性薬物５ＦＵへの変換を生じる。
【０３３４】
該治療タンパク質は更に、オンコジーンの発現を妨害し、その結果新生物細胞の増殖を抑制するために導入される、毒性タンパ質（例えば、サイトカイン）であり得る。
【０３３５】
本発明に係わる該ターゲティング複合体は、１個以上の異なる生物学的反応性の種（例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば５個以上の異なる生物学的反応性の種）を含むことができる。例えば、該ターゲティング複合体は、１個以上の治療タンパク質をコードしている１個以上の第１ヌクレオチド配列（例えば１個および／またはそれ以上の治療タンパク質をコードしている、２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば５個以上の第１ヌクレオチド配列）を含むことができる。
【０３３６】
本発明のいくつかの態様において、該ターゲティング複合体は更に、核ターゲティングシグナルを含む。該核ターゲティングシグナルは、該核中への転位を指令する。ある生物学的反応性の種は、活性である該核に侵入しなければならず、そして従ってそれらが核局在化シグナルと結合する場合には有利となる。例えば、ＤＮＡ配列は、転写されるために該核に侵入しなければいけない。
【０３３７】
本発明に係わる核ターゲティングシグナルは、核に局在化することができるいずれかの核ターゲティングシグナルであり得る。該核ターゲティングシグナルは例えばオリゴペプチドであり得て、好ましくは該核ターゲティングシグナルは、以下の配列を有するオリゴペプチドからなる群から選ばれる：
RRMKWKK PDX（配列番号310）、
RVHPYQR QKI（配列番号311）、
KRPACTLKPECVQQLLVCSQEAKK HCDA（配列番号312）、
PKKKRKV（配列番号313）（SV40 LrgT）、
GKKRSKA（配列番号314）（H2B）、
KAKRQR（配列番号315）（v-Rel）、
RGRRRRQR（配列番号316）、
RKRRR（配列番号317）、
PPVKRERTS（配列番号318）（RanBP3）、
PYLNKRKGKP（配列番号319）（Pho4p）、
CYGSKNTGAKKRKIDDA（配列番号320）（DNAヘリカーゼQ1）、
KKKKRKREK（配列番号321）（LEF-1）、
KKKRRSREK（配列番号322）（TCF-1）、
Krx{7,9}PQPKKKP（配列番号323）（p53）、
KVTKRKHDNEGSGSKRPK（配列番号324）（Hum-Ku70）、
RLKKLKCSKx{19}KTKR（配列番号325）（GAL4）、
RKRIREDRKx{18}RKRKR TCPTP（配列番号326）、
RRERx{4}RPRKIPR（配列番号327）（BDV-P）、
KKKKKEEEGEGKKK（配列番号328）（act/inh ベータA）、
PRPRKIPR（配列番号329）（BDV-P）、
PPRIYPQLPSAPT（配列番号330）（BDV-P）、
KDCVINKHHRNRCQYCRLQR（配列番号331）（TR2）、
Krx{9}KTKK（配列番号332）（THOV NP）、
APKRKSGVSKC（配列番号333）（ポリオーマVP1）、
RKKRRQRRR（配列番号334）（HIV-1 Tat）、
RQARRNRRRRWR（配列番号335）（HIV-1 Rev）、
MPKTRRRPRRSQRKRPPT（配列番号336）（Rex）、
KRPMNAFIVWSRDQRRK（配列番号337）（SRY）、
PRRRK（配列番号338）（SRY）、
KRPMNAFMVWAQAARRK（配列番号339）（SOX9）、
PRRRK（配列番号338）（SOX9）、
[KAR]TPIQKHWRPTVLTEGPPVKIRIETGEWE[KA]（配列番号340）、
PPRKKRTVV（配列番号341）、
YKRPCKRSFIRFI（配列番号342）、
LKDVRKRKLGPGH（配列番号343）、
KRPRP（配列番号344）、
RKRKK（配列番号345）、
RRSMKRK hVDR（配列番号346）、
PAKRARRGYK（配列番号347）、
RKCLQAGMNLEARKTKK（配列番号348）、
RRERNKMAAAKCRNRRR（配列番号349）、
KRMRNRIAASKCRKRKL（配列番号350）、
KKSKKGRQEALERLKKA（配列番号351）、
RKEWLTNFMEDRRQRKL（配列番号352）、
KKQTTLAFKPIKKGKKR（配列番号353）、
RKRKKMPASQRSKRRKT（配列番号354）、
RAIKRRPGLDFDDDGEGNSKFLR（配列番号355）、
SxGTKRSYxxM（配列番号356）、
TKRSxxxM（配列番号357）、
RIRKKLR（配列番号358）、
KRAAEDDEDDDVDTKKQK（配列番号359）、
GRKRKKRT（配列番号360）、
KKKQKK（配列番号361）、
REKKEKEQKEKCA（配列番号362）、
LEKKVKKKFDWCA（配列番号363）、
TEKK[QG]KSILYDCA（配列番号364）、
SDKKVRSRLIECA（配列番号365）、
LKRKLQR（配列番号366）、
RRKGKEK（配列番号367）、
CKRKTTNADRRKA（配列番号368）、
VNEAFETLKRC（配列番号369）、
MPTEERVRKRKESNRESARRSRYRKAAHLK（配列番号370）、
KVNSRKRRKEVPGPNGATEED（配列番号371）、
PRRGPR HCV（配列番号372）、
PRGRRQPIPKARQP（配列番号373）、
KRSAEGGNPPKPLKKLR（配列番号374）、
KRKx{11}KKKSKK（配列番号375）、
EYLSRKGKLEL（配列番号376）、
PKRPRDRHDGELGGRKRARG（配列番号377）、
KRPAATKKAGQAKKKK（配列番号378）、
KRKKEMANKSAPEAKKKK（配列番号379）、
RKRAFHGDDPFGEGPPDKK（配列番号380）、
GGGx{3}KNRRx{6}RGGRN（配列番号381）、
YNNQSSNFGPMKGGN（配列番号382）、
PAAKRVKLD（配列番号383）、
KRPAEDMEEEQAFKRSR SxGTKRSYxxM（配列番号384）、
MNKIPIKDLLNPG（配列番号385）、
PKKARED（配列番号386）、
VSRKRPR（配列番号387）、
APTKRKGS（配列番号388）、
PNKKKRK（配列番号389）、
EEDGPQKKKRRL（配列番号390）、
PLLKKIKQ（配列番号391）、
PPQKKIKS（配列番号392）、
PQPKKKP（配列番号393）、
SKRVAKRKL（配列番号394）、
IKYFKKFPKD（配列番号395）、
KTRKHRG（配列番号396）、
KHRKHPG（配列番号397）、
PQSRKKLR（配列番号398）、
HRKYEAPRHx{6}PRKR（配列番号399）、
KKEKKKSKK（配列番号400）。
【０３３８】
ここで、それらが誘導されるタンパク質の命名は角括弧(bracket)内で示され、ここで'[KR]'は、'KまたはR'、すなわち該位置で妥当な該２つのアミノ酸のいずれかを示し、'x'はいずれかのアミノ酸を示し、'x{9}'は'９個のx'を示し、'x{7, 9}'は'少なくとも７個、ほとんどの場合９個のx'を示す。アミノ酸はそれらの１文字コードで示す。
【０３３９】
その上、本発明に係わる核局在化シグナルはまた上記の配列の変異体でもあり得る。例えば、該変異体は、例えば１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば６個、例えば７個、例えば８個、例えば９個、例えば１０個のアミノ酸がいずれかの別のアミノ酸（好ましくは、それは同類アミノ酸置換である）で置換された変異体である（本明細書中上記を参照）。例えば１個、例えば２個、例えば３個、例えば４個、例えば５個、例えば６個、例えば７個、例えば８個、例えば９個、例えば１０個のアミノ酸が欠損している突然変異体は、本発明に係わる核局在化シグナルである。
【０３４０】
より好ましくは、該核ターゲティングシグナルは、シミアンウイルス４０ラージ腫瘍抗原の核局在化シグナルである。
【０３４１】
本発明のある態様において、該ターゲティング複合体は更に、エンドソーム溶解性薬物を含む。該ターゲティング複合体は、レセプター媒介性エンドサイトーシスとして知られる方法によって、該細胞表面分子を発現する細胞中に溶かされることが多く、従って該ターゲティング複合体はエンドソーム内の細胞中に入り、そしてこのものは分解を避けるために逃避(escape)しなければいけない。このために、該ターゲティング複合体はエンドソーマル溶解性薬物を含むことが多い。
【０３４２】
多数のウイルスがエンドソームを回避するために開発されており、従って弱毒化ウイルスまたはウイルスの一部は、エンドソーム溶解性薬物であり得る。好ましくは、該エンドソーム溶解性薬物は、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)、複製欠損ウイルスおよびウイルスタンパク質キャプシドからなる群から選ばれる。より好ましくは、該エンドソーム溶解性薬物は、膜不安定化ポリペプチドを含み得る。
【０３４３】
本発明のある態様において、該ターゲティング複合体は更にクロロキンを含む。クロロキンは、エンドソーム分解から保護することができ、従って、その存在は本発明のいくつかの態様において所望され得る。
【０３４４】
本発明の好ましい態様において、該生物学的反応性の種および該結合パートナーは、直接的にまたは間接的にのいずれかで互いに結合する。該生物学的反応性の種が核酸配列である場合には、該結合パートナーは例えば、該結合パートナーと共有結合する核酸結合性薬物を介して該生物学的反応性の種と結合することができる。
【０３４５】
核酸結合性薬物としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、ヌクレオチド、炭水化物、脂肪酸、有機または無機の化合物、並びにこれらおよび他のものの組み合わせを含む。
【０３４６】
核酸結合性薬物は、化学的もしくは物理的な力によってまたはそれら２つの組み合わせによって、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡ、１本鎖または２本鎖のＲＮＡと結合することができる。核酸結合性薬物は、（ｉ）核酸そのものについてだけのアフィニティを有し得るか、（ｉｉ）核酸および別の分子の両方についてのアフィニティを有し、その結果該２つの間の架橋を形成し得るか、または（ｉｉｉ）核酸についてのアフィニティを有する別の分子についてのアフィニティを介して核酸についての間接的なアフィニティを有し得る。
【０３４７】
本発明によれば、核酸結合性薬物と結合パートナーとのカップリング反応は、該結合パートナーと該細胞表面分子との結合を妨害しない様式で生じ得る。好ましくは、レセプター媒介性エンドサイトーシスを介する該ターゲティング複合体のインターナライズもまた保持される。一層より好ましい態様において、この認識およびインターナライズは該核酸配列を、発現または標的内因性核酸との相互作用にとって適当な形態で標的細胞中へ運搬する。
【０３４８】
ある態様において、該核酸結合性薬物は、インターキャラティブ(intercalative)様式で二本鎖核酸の塩基対の間にそのものを挿入することができたり、または二本鎖核酸の小もしくは大のグローブ(grove)中で結合することができる。
【０３４９】
この結合は、配列特異的であり得たりまたは配列に全く関連得ない。他の態様において、核酸は化学的または光化学的に反応性の基を有する他の分子と架橋することができる。
【０３５０】
本発明の別の態様において、該核酸結合性薬物は、該核酸を別の分子と共有的に連結する。１態様において、該核酸結合性薬物は、カップリング試薬（例えば、カルボジイミド）の１つであり得る。しかしながら、該核酸の共有カップリング反応はその特異性を改変し得て、そして適当な遺伝子発現またはターゲット核酸認識を妨げ得る。その上、直鎖または１本鎖の核酸は、該核酸と該結合パートナーとの共有カップリング反応にとって必要となり得る。最後に、核酸は負に荷電した分子であり、このことはそれらが細胞表面から忌避する(repell)ことができて、そのことにより転移がエンドソーム溶解経路によって困難となることを意味する。従って、サイズおよび種類の制限は、結合パートナーと直接的に結合した核酸の効率的な運搬に必要となり得る。
【０３５１】
核酸結合性薬物は例えば、ポリカチオン性薬物であって、このものはWO 96/30536に記載されているＤＮＡ結合性薬物と同様に、核酸上のカチオン性基と負に荷電したホスフェートとの間の、配列に中性な相互作用に含めた静電支配の結合に依存する。
【０３５２】
該ポリカチオン性薬物はＤＮＡと強く結合し、その結果、核酸分子の負電荷が完全に中和されたトロイド(toroid)複合体を形成する。この可溶性トロイド複合体は、正常なレセプター媒介性エンドサイトーシスを介してインターナライズすることができる。
【０３５３】
１本鎖ｍＲＮＡから２本鎖環状プラスミドまでのいずれかの種類の核酸を使用することができる。
【０３５４】
その上、結合する該ポリカチオン性薬物にとっての負電荷の供給源が存在する限り、いずれかのサイズの核酸を使用することができる。ある態様において、これらのポリカチオン性部分としては例えば、中性ポリアミン（例えば、スペルミンおよび／またはスペルミジン）を含み得る。好ましい態様において、該ポリカチオン性薬物は、人為的に製造された薬物（例えば、ポリリシンまたはポリエチレンアミン）であり得る。
【０３５５】
本発明が適当に機能するために、該核酸結合性薬物に関するある基準を満たす必要がある。第１に、該細胞中へ運搬される該核酸は、いずれの様式でその整合性を失うことなく、該核酸結合性薬物と結合しなければいけない。
【０３５６】
第２に、リガンド、核酸結合性薬物および核酸を含有する複合体は、インビトロおよびインビボで該複合体が細胞へより大きく到達することができるために可溶形態でなければいけない。第３に、一旦該複合体が宿主細胞とインターナライズすれば、該核酸はそのターゲット配列に接近し、一方で分解を避けなければいけない。
【０３５７】
該核酸結合性薬物は例えば、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル、３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート、スクシンイミジル、４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどの薬物を含み得る。この例示は、当該分野において知られる様々なカップリング試薬の排他的なものではなく、むしろ使用することができるより一般的な連結薬物の典型例であると意図する。
【０３５８】
好ましくは、該核酸結合性薬物は、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、スペラミン、スペラジミンおよびヒストンタンパク質からなる群から選ばれる。
【０３５９】
核酸結合性薬物がＰＬＬである場合には、ＰＬＬは１５〜１０００、例えば５０〜７５０）、例えば１００〜５００、例えば２００〜４００の残基を含み得る。
【０３６０】
本発明のある態様において、該結合パートナーは特異的な相互作用性成分の対を介して間接的に該生物学的反応性の種と結合し、ここで１成分は該生物学的反応性な種と共有結合し、そして該第２成分は該結合パートナーと共有結合する。
【０３６１】
該特異的な相互作用性成分の対の１例はビオチンおよびステレプトアビジンであるが、しかしながら、相互作用性成分の他の対をまた使用することができる。
【０３６２】
細胞表面分子およびターゲティング複合体を含有する複合体
細胞表面分子、結合パートナーおよび生物学的反応性の種を含む複合体を提供することは、本発明の１目的である。細胞表面分子、結合パートナーおよび生物学的反応性の種の例は、本明細書中上に示す。
【０３６３】
好ましくは、該複合体は本発明に係わるいずれかの方法に従って同定される細胞表面分子、および本明細書中上記のターゲティング複合体を含み得る。
【０３６４】
あるいは、該複合体は本明細書中上記の細胞表面分子およびターゲティング複合体を含み得て、ここで該細胞表面分子は好ましくは以下のものを含んでいるか、または本質上以下のもので構成されるか、または例えばGRIA2、例えばLPR8、例えばCHRNA5、例えばTMEFF、例えばNPTXR、例えばトランスフェリンレセプター；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10481；例えばII型膜タンパク質クローン；例えばHP10390；例えばPG40；例えばTRC8；例えばTR2-11；例えばOA3抗原性表面決定因子；例えばインテグリンα6、例えばGPIIb；例えばビトロネクチンレセプターαサブユニット；例えばインテグリンα-7；例えばインテグリンαE前駆体；例えばインテグリンα6B；例えばインテグリンα5サブユニット；例えばインテグリンβ-5サブユニット；例えばインテグリンα-3鎖；例えばRYK；例えばアミロイド前駆体タンパク質結合タンパク質1；例えば推定貫膜GTPアーゼ、例えば膜補助因子タンパク質；例えばGLVR1；例えばMr110,000抗原；例えばシンデカン-1；例えば推定セブン貫膜ドメインタンパク質；例えばLCA-相同体/LARタンパク質；例えばM6抗原；例えばMe491/CD63抗原；例えばマルチスパン膜タンパク質；例えばDDR；例えば自己分泌型運動因子レセプター；例えばインスリンレセプター前駆体；例えばIGF1R、例えばインスリン様成長因子IIレセプター；例えばSAS；例えばTAPA-1；例えばMICB；例えばMHCクラスII HLA-DR7関連糖タンパク質β鎖；例えばHLA-DP；例えば骨小プロテオグリカンIビグリカン；例えばCAR；例えばMEA11；例えばインターフェロン-γレセプターα鎖；例えば多量体免疫グロブリンレセプター；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター4型；例えば代謝調節型グルタミン酸レセプター8；例えばCLPTM1；例えばMAGE-4b；例えばMAGE5a；例えばMAGE-3；例えばMAGE-1；例えばMAGE6；例えばMAGE-9；例えばMAGE11；例えばCD24；例えばCD59；例えばCD44；例えば低密度リポタンパク質レセプター；例えば超低密度リポタンパク質レセプター；例えばN-CAM；例えばラミンBレセプター相同体TM7SF2；例えば推定T1/ST2レセプター結合タンパク質レセプター前駆体；例えばNTR2レセプター；例えばRAGE-4；例えばHLA-G1；例えばMOAT-C；例えばα2δカルシウムチャネルサブユニットイソ型I；例えばLFA-3；例えばL1-CAM；例えばAVPR2；例えばC1 p115 C1；例えばTE2；例えばRbP；例えばHCF1；例えばIRAK；例えばCD151；例えば表面抗原；例えばMAG；例えばGPR19；例えばpcta-1；例えばPRAME；例えばバソプレシン活性化カルシウム動員レセプター様タンパク質；例えばセロトニンレセプター5-HT4B；例えばセロトニン1Dレセプター（5-HT1D〜）；例えばCD9；例えばLDLレセプター成員LR3；例えばDR6；例えば腫瘍壊死因子レセプター；例えばHG38；例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター；例えばFGFレセプター；例えば神経成長因子レセプター；例えばシスチン/グルタミン酸輸送体；例えばCB1カンナビノイドレセプター（CNR1）；例えばPSG；例えばPSG13'；例えばCPE-レセプター；例えばCRH2R；例えばOCI5；例えばTRAILレセプター2；例えばHNMP-1；例えば腎α-2-アドレナリン作動性レセプター；例えばエリスロポエチンレセプター；例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン・バーシカンV1；例えばmGluR1β、例えばCD97；例えばL6；例えばNY-ESO-1；例えばT細胞レセプターαδ；例えばror1；例えばror2；例えばSSTR2；例えばVESPR；例えばIgG Fcレセプター；例えばグルタミン酸レセプターサブユニットGluRC；例えばHEK2；例えばPVR；例えばCEA；例えばCC-ケモカイン-結合レセプターJAB61；例えばHER2；例えばHER3、例えば上皮成長因子レセプター関連タンパク質に類似の仮想タンパク質FLJ22357；例えば推定エンドセリンレセプターB型様タンパク質；例えばGLVR2；例えばP2X4プリンレセプター；例えばFPRL1；例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドクリアランスレセプター；例えばガストリン/CCK-Bレセプター；例えばニューロメディンBレセプター；例えばGFRA3；例えばGRPR；例えばCDH1；例えばCDH2；例えばTGFBR1；例えばTGFBR2；例えばTGFBR3；例えば上皮成長因子レセプターの前駆体である。
【０３６５】
より好ましくは、該細胞表面分子は、NCAM1、NPTXR、LRP8、CHRNA5、GRIA2、GRM8、ITGAV、ITGAE、TNFRSF12、L1CAM、GPR49およびTMEFF1からなる群から選ばれ得る。
【０３６６】
条件
前悪性および／または悪性の病気は、例えば癌であり得るか、または癌に発展し得る病気であり得る。本発明の範囲内の用語「癌」は、悪性腫瘍および良性腫瘍の両方、並びに白血病を包含する。
【０３６７】
癌は、例えば腺腫、癌腫または肉腫であり得る。癌は例えば、メラノーマ、脳腫、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、頚癌、子宮癌、卵巣癌、白血病、大腸癌、直腸癌、精巣の癌、腎臓の癌、肝臓の癌、唇の癌、舌の癌、胃の癌、皮膚癌、肉腫、中皮腫、膀胱癌、骨腫、悪性胸水、腹水、髄膜癌腫症、頭および首の癌、並びに内分泌気管（例えば、甲状腺、下垂体および副腎(suprarenal gland)）の癌からなる群から選ばれ得る。
【０３６８】
肺癌は例えば、小細胞肺癌（SCLC）および非小細胞肺癌（NSSLC）を含む群から選ばれる癌であり得る。好ましくは、該前悪性および／または悪性の病気は小細胞肺癌である。
【０３６９】
ある好ましい態様において、該前悪性および／または悪性の病気は乳癌である。
【０３７０】
別の好ましい態様において、該前悪性および／または悪性の病気は脳腫瘍である。脳腫瘍は例えば、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、髄芽腫、神経腫(neuronomas)、上皮細胞腫、頭蓋咽頭腫(craniopharingiomas)、松果体腫、生殖細胞腫瘍およびシュワン細胞腫からなる群から選ばれ得る。
【０３７１】
投与および医薬組成物
処置を受ける個体はいずれかの動物であるが、しかしながら、好ましくは該個体はヒトである。
【０３７２】
本発明に記載の処置は軽減処置であり得て、該処置は治療処置であり得ておよび／または該処置は予防処置であり得る。
【０３７３】
本発明に記載の薬物運搬の主要な経路は、以下に記載する通り、静脈内、経口および皮下である。他の薬物投与方法（例えば、局所的な運搬）（これは、該薬物をターゲット部位に運搬したり、または該薬物を該血流中に導入するのに有効である）をも企図する。該化合物はまた、吸入によって、すなわち鼻腔内および経口吸入投与によって投与することができる。
【０３７４】
本発明の医薬組成物を投与する粘膜は、該生物学的に活性な物質を、例えば鼻、膣、眼、口、生殖器官、肺、胃腸管または直腸へ与える哺乳動物のいずれかの粘膜であり得る。
【０３７５】
本発明の化合物は好ましくは、非経口的に、すなわち静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内または腹腔内投与によって投与することができる。非経口投与の皮下および筋肉内形態が通常好ましい。該投与のための適当な剤形は、通常の方法によって製造することができる。
【０３７６】
好ましくは、本発明に係わる該ターゲティング複合体は非経口的に投与し、より好ましくは該ターゲティング複合体は静脈内注射および／または皮下注射によって投与する。
【０３７７】
本発明に係わる化合物は、少なくとも１つのそれらの化合物と一緒に投与することができる。該化合物は、別々の製剤としてもしくは単位用量形態で組み合わせるかいずれかで投与するか、または連続的に投与することができる。
【０３７８】
該用量の所要量は、使用するある薬物組成物、投与の経路および処置する個体により変わる。理想的には、本発明によって処置する個体は、通常、薬物耐性が発生する前に要求されるよりも高くない、最大耐用量で該化合物の医薬的に有効な量を受ける。
【０３７９】
ターゲティング複合体の個々の用量は、処置する病気の性質および大きさ、剤形、投与の経路および部位、並びに処置する特定の患者によって決まり、そして該最適量は、通常の方法によって決定することができる。処置の最適コース、すなわち決めた日数当たりに与えられる該化合物またはその医薬的に許容し得る塩の投与の回数は、処置決定治験の通常のコースを用いて当該分野の当業者によって確かめることができることも、当該分野の当業者によって認められるであろう。
【０３８０】
本明細書において使用する用語「単位用量形態」とは、ヒトおよび動物の個体にとっての１回用量として適当な物理学的に別個な単位を意味し、ここで該各単位は医薬的に許容し得る希釈剤、担体またはビヒクルと合わせて所望する効果を与えるのに十分な量で算出された、予め決定した量の化合物を単独でまたは他の薬物と組み合わせて含有する。本発明の該単位用量形態についての規格(specification)は、使用するある化合物、および達成されるべき効果、並びに宿主中での各化合物について関連する薬力学に依存する。該投与用量は、「有効量」または該個体の患者において「有効量」を達成するのに必要な量であるべきである。
【０３８１】
「有効レベル」は投与の好ましい終点として使用されるので、該実際の用量およびスケジュールは、薬物動態学、薬物分布および代謝における個体間の差違に依存して、変わり得る。「有効レベル」は、例えば本発明に係わる１つ以上の化合物の濃度に対応する該個体中で所望される血中または組織中レベルと定義することができる。
【０３８２】
該本発明の化合物を含有する医薬組成物は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, E. W. Martin編, Mack Publishing Company, 19版, Easton, Pa.に記載する通り、通常の方法によって製造することができる。該組成物は、通常の形態、例えばカプセル剤、錠剤、エアロゾル剤、液剤、懸濁剤または局所適用剤であらわすことができる。
【０３８３】
本発明に係わる化合物の医薬的に許容し得る塩はまた、本発明の範囲内にあるとみなされるべきである。医薬的に許容し得る塩は、標準的な方法で製造する。親化合物が塩基である場合には、そのものは適当な溶媒中、過剰量の有機または無機の酸を用いて処置する。親化合物が酸である場合には、そのものは適当な溶媒中、無機または有機の塩基を用いて処置する。
【０３８４】
本発明の化合物は、そのアルカリ金属塩またはそのアルカリ土類金属塩の形態で、医薬的に許容し得る担体または希釈剤と併用して、同時にまたは一緒に、特におよび好ましくはその医薬的組成物の形態で、経口、直腸または非経口（これは、皮下を含む）経路のいずれかによって有効な量で投与することができる。
【０３８５】
本発明の医薬組成物中での使用のための医薬的に許容し得る酸付加塩は、例えば鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸および硫酸）、および有機酸（例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびアリールスルホン酸）から誘導される塩を含む。
【０３８６】
本発明の化合物または塩は未加工の化学品として投与することが可能であるが、それらを医薬的な製剤の形態で与えることが好ましい。従って、本発明は更に医学的な利用のための医薬製剤を提供し、そのものは本明細書に定義する本発明の化合物またはその医薬的に許容し得る塩、および医薬的に許容し得る担体を含む。
【０３８７】
本発明の化合物は、広範囲の経口投与剤形で投与することができる。該医薬組成物および剤形は、活性成分として、本発明の化合物もしくはその医薬的に許容し得る塩、またはそれらの結晶形態を含む。該医薬的に許容し得る担体は、固体または液体のいずれかであり得る。固体形態の製剤としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、サッシェ、坐剤および分散可能な顆粒剤を含む。固体担体は、希釈剤、芳香剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル物質として作用することもできる物質の１つ以上であり得る。
【０３８８】
好ましくは、該組成物は本発明の化合物の約０．５重量％〜７５重量％であり、残りは適当な医薬的な賦形剤からなる。経口投与の場合には、該賦形剤としては例えば、医薬的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石(talcum)、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
【０３８９】
散剤の場合には、該担体はよく粉砕した活性成分との混合物である、よく粉砕した固体である。錠剤の場合には、該活性成分は適当な割合で必要な結合能力を有する担体と一緒に混合し、そして所望する形および大きさに成型する。該散剤および錠剤は好ましくは、該活性化合物の１〜約７０パーセントを含有する。適当な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが挙げられる。用語「製剤」とは、該活性化合物と、担体としてのカプセル化物質（このものは、担体の存在または不存在での該活性成分が、担体によって囲まれたりまたは担体と結合しているカプセルを与える）との製剤を含むことを意図する。同様に、サッシェおよびトローチ剤を含む。経口投与に適当な固体形態として錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、サッシェおよびトローチ剤があり得る。
【０３９０】
本発明に係わる滴剤は、減菌または非減菌の水溶性または油性の水溶液または懸濁液を含み得て、そしてこのものは適当な水溶液中（このものは、場合により殺菌性および／または殺真菌性の薬剤、および／またはいずれかの他の適当な保存剤、および場合により界面活性剤を含む）に該活性成分を溶解させることによって製造することができる。次いで、得られた溶液をろ過によって透明にし、適当な容器に移し、次いでこのものを封し、そしてオートクレーブするか(autoclaving)または９８〜１００℃で約１時間半維持することによって滅菌する。あるいは、該溶液をろ過によって滅菌し、そして該容器に無菌的に移すことができる。滴剤中に含有するのに適当な殺菌性および殺真菌性の薬剤は例えば、フェニル水銀硝酸または酢酸（０．００２％）、バンズアルコニウムクロリド（０．０１％）およびクロロヘキシジン酢酸（０．０１％）が挙げられる。油状溶液の製剤のための適当な溶媒としては、グリセロール、希釈したアルコールおよびプロピレングリコールを含む。
【０３９１】
固体形態の製剤もまた含まれ、このものは使用する直前に経口投与のための液体形態製剤に変換されることを意図する。該液体形態としては、液剤、懸濁剤および乳剤を含む。これらの製剤は、活性成分に加えて、着色剤、芳香剤、安定化剤、緩衝化剤、人工および天然の甘味剤、分散剤、増粘剤(thickeners)、可溶化剤などを含むことができる。
【０３９２】
経口投与に適当な他の形態としては、液体形態の製剤を含む。このものは例えば、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、水性液剤、水性懸濁剤、練り歯磨き、ゲル歯磨き(dentrifrice)、チューイングガム、または固体製剤（このものは、使用する直前に液体製剤に変換することを意図する）を含む。乳剤は、プロピレングリコール溶液中の液剤として製造することができ、またはこのものは乳化剤（例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタンまたはアカシア）を含み得る。水性液剤は、該活性成分を水中に溶解し、そして適当な着色剤、芳香剤、安定化剤および増粘剤を加えることによって製造することができる。水性懸濁剤は、よく粉砕した活性成分を粘性物質（例えば、天然または合成のガム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび他のよく知られる懸濁化剤）と一緒に水中に分散させることによって製造することができる。固体形態製剤としては例えば、液剤、懸濁剤および乳剤を含み、そしてこのものは該活性成分に加えて、着色剤、芳香剤、安定化剤、緩衝化剤、人工および天然の甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含み得る。
【０３９３】
本発明の化合物は、非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射または連続注入）のために製剤化することができ、そしてこのものはアンプル、予め充填したシリンジ、保存物質を加えた少容量の注入または複数回投与の容器での単位用量形態で提示することができる。該組成物は、例えば油性または水溶性のビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤の形態、例えば水性ポリエチレングリコールの溶液をとることができる。油性または非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルとは例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）を含み、そしてこれらは処方用(formulatory)薬剤（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤）を含むことができる。あるいは、該活性成分は散剤形態であり得て、このものは減菌固体の無菌的単離によるか、または適当なビヒクル（例えば、減菌パイロジェンなしの水）と一緒に使用する前の組成用溶液からの凍結乾燥によって、得ることができる。
【０３９４】
非経口用製剤において有用な油状物は、ワセリン、動物性油、植物性油または合成油を含む。該製剤において有用な油状物の具体例は、ピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリンおよび鉱油を含む。非経口用製剤中の使用のための適当な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチル酸イソプロピルは、適当な脂肪酸エステルの例である。
【０３９５】
非経口用製剤中の使用のための適当な石鹸は、脂肪のアルカリ金属塩、アンモニウム塩およびトリエタノールアミン塩を含み、そして適当な洗浄剤は（ａ）カチオン性洗浄剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライドおよびアルキルピリジニウムハライド）；（ｂ）アニオン性洗浄剤（例えば、アルキル、アリールおよびオレフィンのスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリドの硫酸塩およびスルホコハク酸塩）、（ｃ）非イオン性洗浄剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンの共重合体）、（ｄ）両性洗浄剤（例えば、アルキル−ベータ−アミノプロピオン酸および２−アルキル−イミダゾリン４級アンモニウム塩）、および（ｅ）それらの混合物を含む。
【０３９６】
該非経口用製剤は典型的に、溶液中に約０．５〜約２５重量％の活性成分を含む。保存剤および緩衝剤を使用することができる。注射部位での刺激作用を最少としたりまたは除去するために、該組成物は約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤の１つ以上を含むことができる。該製剤における界面活性剤の量は典型的に、約５〜約１５重量％の範囲に及ぶ。適当な界面活性剤としては例えば、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレイン酸）および疎水性塩基との高分子量のエチレンオキシド付加物（このものは、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって得られる）を含む。該非経口製剤は、単位用量または複数回用量の封した容器（例えば、アンプルおよびバイアル）で提示ことができ、そしてこのものは使用する直前に、減菌液体賦形剤（例えば、注射用の水）の添加にだけ必要な凍結乾燥(freeze-dried)（凍結乾燥(lyophilized)）条件下で保存することができる。即席の(Extemporaneous)注射溶液および懸濁液は、上記の種類の減菌性の散剤、顆粒剤および錠剤から製造することができる。
【０３９７】
本発明の化合物はまた、局所的に運搬することができる。局所投与のための領域は皮膚表面および、膣、直腸、鼻、口および咽頭の粘膜組織をも含む。皮膚および粘膜を介する局所投与用組成物は、刺激作用の兆候（例えば、腫張または赤み）を引き起こしてはならない。
【０３９８】
該局所用組成物は、局所投与に適合した医薬的に許容し得る担体を含むことができる。従って、該組成物は例えば、懸濁剤、液剤、軟膏、ローション剤、性滑沢剤(sexual lubricant)、クリーム剤、発泡剤、エアロゾル剤、スプレー剤、坐剤、インプラント、吸入剤、錠剤、カプセル剤、乾燥散剤、シロップ剤、バルム(balm)またはトローチ剤の形態をとることができる。該組成物の製造法は、医薬産業においてよく知られる。
【０３９９】
本発明の化合物は、軟膏、クリーム剤もしくはローション剤としてまたは経皮パッチとして、上皮に局所投与するために製剤化することができる。本発明に係わるクリーム剤、軟膏またはペースト剤は、外部適用のための活性成分の半固体製剤である。それらは、該活性成分をよく粉砕したりもしくは粉末にした形態で単独で、または水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液中で脂肪性もしくは非脂肪性の塩基と一緒に、適当な機械類の助けで混合することによって製造することができる。該塩基は、炭化水素（例えば、固型パラフィン、軟パラフィンまたは流動パラフィン）、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸）；粘液(mucilage)；天然油（例えば、アーモンド油、コーン油、ピーナッツ油、ゴマ油またはオリーブ油）、羊脂もしくはその誘導体または脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはオレイン酸）を、アルコール（例えば、プロピレングリコールまたはマクロゴール(macrogel)）と一緒に含むことができる。該製剤は、いずれかの適当な界面活性剤（例えば、アニオン性、カチオン性、または非イオン性の界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリエチレン誘導体））を包含することができる。懸濁化剤（例えば、天然ガム、セルロース誘導体または無機物質（例えば、シリカ質(silicaceous)シリカ）および他の成分（例えば、ラノリン(lanolin)）をも含むことができる。
【０４００】
本発明に係わるローション剤としては、皮膚または眼への適用に適当なものを含む。眼ローション剤は、場合により殺菌剤を含有する減菌水性液剤を含み得て、そしてこのものは滴剤の製造法と同様な方法によって製造することができる。皮膚への適用のためのローション剤またはリニメント剤はまた、皮膚を乾燥するのを促進したりおよび冷却する薬物（例えば、アルコールまたはアセトンおよび／または湿潤剤(moisturiser)（例えば、グリセロール）または油（例えば、ヒマシ油またはピーナッツ油））を含み得る。
【０４０１】
本明細書に記載の医薬活性化合物は、経皮投与することができる。経皮投与は典型的に、患者の全身性循環への該薬物の経皮的な通過のための医薬薬剤の運搬を含む。該皮膚部位としては例えば、該薬物を経皮投与するための解剖学的な領域を含み、そしてこのものは例えば、前腕、腹部、胸部、背中、臀部、乳頭部位などを含む。
【０４０２】
経皮運搬は、該活性化合物の供給源を患者の皮膚に長時間曝露することによって達成される。経皮パッチは、医薬薬剤−化学的モディファイヤーの複合体の徐放性放出を与えるという更なる利点を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, HadgraftおよびGuy(編), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, RobinsonおよびLee(編), Marcel Dekker Inc., (1987)；並びに、Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, KydonieusおよびBerner(編), CRC Press, (1987)を参照。該剤形は、該医薬活性化合物を適当な媒質（例えば、腸溶性(elastomeric)マトリックス物質）中に溶解し、分散し、またはさもなければ取り込むことによって製造することができる。吸収エンハンサーはまた、該化合物が皮膚を通るフラックスを増大させるのに使用することができる。該フラックスの速度は、徐放性膜を与えるかまたはポリマーのマトリックスもしくはゲル中に該化合物を分散するかのいずれかによって、制御することができる。
【０４０３】
本発明の化合物は、坐剤として投与するために製剤化することができる。低融点ワックス（例えば、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物）は第１に融解し、そして該活性成分を例えば撹拌することによって均一に分散する。次いで、均一に溶融した混合物を、通常の大きさの型に注ぎ、冷却し、そして固化する。
【０４０４】
該活性化合物は坐剤に製剤化することができ、該坐剤は例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に処分された本発明の化合物の約０．５％〜約５０％を含有する。
【０４０５】
本発明の化合物は、膣投与のために製剤化することができる。該活性成分に加えて該担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、発砲剤またはスプレー剤は適当であると、当該分野において知られる。
【０４０６】
所望する場合には、製剤は該活性成分の持続放出性のまたは徐放性の投与に適当な腸溶性コーティングを用いて製剤化することができる。
【０４０７】
医薬組成物は通常、担体を含む。固体担体としては例えば、ラクトース、白陶土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。固体担体は、芳香剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、賦形剤(fillers)、グリダント(glidant)、圧縮剤、結合剤または錠剤崩壊剤としても作用し得る物質を１つ以上含み得て；そのものはまたカプセル化物質でもあり得る。散剤の場合には、該担体はよく粉砕した活性成分を一緒に混合した、よく粉砕した固体である。錠剤の場合には、該活性成分を必要な圧縮性質を有する担体と一緒に適当な割合で混合し、そして所望の形および大きさに成型する。該散剤および錠剤は好ましくは、９９％までの該活性成分を含む。適当な固体担体としては例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。
【０４０８】
例示的な液体担体としては例えば、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、水などを含む。液体担体は、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤および加圧組成物を製造するのに使用する。該活性成分は、医薬的に許容し得る液体担体（例えば、水、有機溶媒、その両方の混合物）または医薬的に許容し得る油状物もしくは脂肪中に溶解したりまたは懸濁することができる。該液体担体は、他の適当な医薬的添加物（例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝化剤、保存剤、甘味剤、芳香剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定化剤または浸透圧調節剤）を含むことができる。経口および非経口投与用の液体担体の適当な例としては、水（上記の添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、並びに油状物（例えば、分別した(fractionated)ココナッツ油およびピーナッツ油）を含む。非経口投与の場合には、該担体はまた油状エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピル）であり得る。減菌液体担体は、非経口投与のための減菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の医薬的に許容し得るプロペラントであり得る。減菌の溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば筋肉内、腹腔内、または皮下注射によって使用することができる。減菌液剤はまた、静脈内投与することもできる。該化合物はまた、液体または固体の組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。
【０４０９】
該担体または賦形剤は、当該分野で良く知られる時間遅延型(time delay)物質（例えば、グリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸）をワックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタアクリル酸などと合わせて含み得る。経口投与のために製剤化する場合には、PHOSAL PG-50中の0.01％ツウィーン80（１,２−プロピレングリコールと合わせた、リン脂質濃縮物；A. Nattermann & Cie. GmbH）は他の化合物のための許容し得る経口製剤を与えるものとして認識されており、そしてこのものは本発明の様々な化合物のための製剤に適用することができる。
【０４１０】
組み合わせ療法
本発明に係わるターゲティング複合体は、１つ以上の第２処置（例えば、現在癌を処置するのに使用されている処置）と組み合わせて投与することができる。
【０４１１】
例えば、該第２処置は、外科的処置、化学療法、放射線療法、サイトカインを用いる療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法およびレーザー光を用いる処置法からなる群から選ぶことができる。
【０４１２】
化学療法は、化学治療用薬物（例えば、静細胞剤(Cytostatica)）の投与を含む。本発明に関わる静細胞剤は、例えばカルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、イフォスファミド(iphosphamide)、ヘキサメチルメラミン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトピシド(VP-16)、テニポシド(VM-26)、ビンクリスチン、ビンデシン、タキサン、イリノテカン、チロシンキナーゼインヒビター、ニムスチン、ロムスチン(lomustine)、BCNU、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗血管新生化合物、抗転移性化合物、５−フルオロウラシル±ロイコボリン(leucovorin)、トポイソメラーゼインヒビターＩおよびＩＩ、並びにテモゾラミド(Temozolamide)からなる群から選ぶことができる。
【０４１３】
加えて、化学療法は例えば、抗エストロゲン、抗プロゲステロン、抗アンドロゲン、ＬＨ−ＲＨ拮抗薬またはアロマターゼインヒビターの投与を含み得る。
【０４１４】
実施例
以下は、本発明の態様の例であって、このものは本発明を限定するものとしてみなすべきではない。
【０４１５】
実施例１
【表２５】
2005500833.tif 000026
【０４１６】
全ての細胞を、抗体のない培地中、加湿雰囲気下、５％ＣＯ２中、３７℃で保ち、そして２週間継代する。全ての培地および血清をLife Technologiesから入手する。
【０４１７】
異種移植片
０．５〜１．２×１０７細胞を、１２〜１３週齢のBalb/cヌードマウスの側方に両側で皮下的に播種する。該マウスに殺傷し、そして腫瘍の１つが最大直径１ｃｍに達した後に、該異種移植片腫瘍を収集する。壊死性の組織を除去する。セルラインCPH 136Aだけを、２ｍｍ腫瘍ブロックの播種によってヌードマウス中で伝播する。ＲＮＡ単離のための腫瘍は、直ぐに処理するか、または後者のＲＮＡ（Ambion製）中に２４時間保存し、続いて−７０℃で保存し、そして以下に記載する通り処理する。ウェスタンブロット分析用のライセートに使用する腫瘍は、以下に記載する通り直ぐに処理する。
【０４１８】
正常な組織由来のＲＮＡ
正常なヒト組織由来の全ＲＮＡを、Clontech社（胎児脳、脳、肺、腎臓、心臓、気管、副腎、前立腺、唾液腺、甲状腺）またはAmbion社（肺、肝臓、脳、膵臓、小腸、骨格筋、大腸、胃、精巣）から入手する。１つだけの試料を２回（Clontech社およびAmbion社からの肺ＲＮＡの場合）、そして３回（Clontech社製の２個の異なるバッチおよびAmbion社製の１個の脳ＲＮＡ）を分析する。胎児の脳を、胚性の神経内分泌組織についての基準として含める。
【０４１９】
セルライン由来のＲＮＡの単離
半集密的な培養物由来の細胞を収集し（接着性細胞の場合にはトリプシン処理によって）、そして約１０７細胞を商業主の説明書に従ってRNeasyキット（Qiagen製）を用いて単離する。異種移植片腫瘍（新しいかまたは後者のＲＮＡの場合には保存後に）を、トリゾール(Trizol)（Life Technologies製）および商業主の説明書に従って精製したＲＮＡ中でホモジナイズする。該トリゾール単離したＲＮＡを、更にRNAeasyキット（Qiagen製）を用いて精製する。
【０４２０】
ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍ（Ａ２６０）での吸収によって見積もる。該ＲＮＡの整合性(integrity)は、Ａ２６０／２８０の比率が１．９以上であることを測定することによって、また18S rRNAに対する28S rRNAの比率（これは、ホルムアルデヒド（変性）ゲル分析によって分析される）が約２であることを見積もることによって、立証する。
【０４２１】
ｃＤＮＡの調製
７０℃で１０分間変性後に、全ＲＮＡ（１０μｇ）のＨ２Ｏ（１０μＬ）を、１００ｐｍｏｌ  Ｔ７−(ｄＴ)２４プライマー（ＨＰＬＣ精製した、5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG(T)24（配列番号４０１）；GENSETから入手）にハイブリダイズする。以下の反応は、Gibco BRL, Life Technologies社製の試薬を用いて行なう。第１鎖製造は、反応液（２０μＬ）の第１鎖緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（各々）中で、400U スーパースクリプト(SuperScript)RnaseH−逆転写酵素キットを用いて４２℃で１時間、行なう。第２鎖製造は、反応液（１５０μＬ）の第２鎖緩衝液（２０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ６．９）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、１０ｍＭ  (ＮＨ４)２ＳＯ４；これは、０．２６ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．０７Ｕ／μＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、０．２７Ｕ／μＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０１３Ｕ／μＬ  Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ Ｈを含有する）中、１６℃で２時間インキュベートすることによって行なう。ＤＮＡ末端は、０．０７Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの添加によって満たし(fill out)、そして１６℃で５分間インキュベートする。該反応は、ＥＤＴＡの添加によって停止させて、最終濃度を３３μＭとする。該ｃＤＮＡを、１倍容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（これは、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて飽和とする）を用いて抽出し、続いてペレットの視覚化のために２．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃの６３％エタノール中でPellet Paint（Novagen製）を加えながら沈降させることによって、精製する。該ペレットを８０％エタノールを用いて２回連続してすすいだ後に、該ペレットを風乾し、そして水（１２μＬ）中に溶解する。アリコートをアガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡの長さが０．１〜＞１０ｋｂの範囲であることを確認する。
【０４２２】
ビオチン標識ｃＲＮＡ（ＩＶＴ−ｃＲＮＡ）の製造
ビオチン標識リボヌクレオチドを用いる、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを有するビオチン標識ｃＲＮＡ（相補ＲＮＡ）を生成するインビトロ転写は、商業主の規格に従って、反応液（４０μＬ）中でｃＤＮＡ（６μＬ）（これは、約１μｇのｃＤＮＡを含むと見積もられる）を用いる、BioArray（登録商標）、High Yield（登録商標）ＲＮＡ転写標識キット（Enzo Diagnostics, NY, USA）を用いて行なう。該ビオチン標識ｃＲＮＡは、ＲＮＡ標識（cleanup）法について商業主が明記する方法に従って、RNeasyスピンカラムキット（Quiagen製）を用いて精製する。IVT-cRNAのアリコートを、変性アガロースゲル電気泳動によって分析して、全長転写物（０．１〜＞１０ｋｂ）を確認する。該ｃＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍでの吸収によって見積もり、そして該ｃＤＮＡ反応について最初に使用する全ＲＮＡの寄与について較正する。収量は、反応毎に２５〜１００μｇに及ぶ。
【０４２３】
ＩＶＴ−ｃＲＮＡのフラグメンテーション
IVT-cRNA（２２μｇ）を、トリス−酢酸（ｐＨ８．１）、０．０３Ｍ  ＭｇＡｃ、０．１Ｍ  ＫＡｃの反応液（２０μＬ）中、９４℃で３５分間インキュベートすることによってフラグメンテーションする。該フラグメンテーションしたIVT-cRNAのアリコートを、アガロースゲル電気泳動によって分析して、大きさが３０〜２００塩基のフラグメンテーションを確認する。
【０４２４】
Affymetrix GeneChip（登録商標）へのハイブリダイゼーションおよびデータ分析（ＣＨＩＰｓ分析）
０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．７５[Ｎａ＋]、０．１ｍｇ／ｍＬのヘリング(herring)精液ＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、０．０５ｎＭのビオチン化コントロールオリゴＢ２（5'-GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA（配列番号４０２)）およびスパイク(spiking)のためのコントロールビオチン標識IVT-cRNA（これは、プラスミドpglks-bioB（１５０ｐＭ)、pglks-bioC（５００ｐＭ)、pglks-bioD（２．５ｎＭ）およびpglks-cre（１０ｎＭ）（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から製造）を含有する、容量が４００μＬ中のフラグメント化したIVT-cRNA（２０μｇ）を含有するハイブリダイズ混合物。該コントロールオリゴおよびコントロールｃＲＮＡをAffymetrix社から入手する。１００μＬをAffymetrix試験用２CHIPにハイブリダイズし、続いてストレプトアジビン−フィコエリトリン接合体を用いて染色し、そしてビオチン化抗ストレプトアビジンヤギ抗体を用いて標識し、続いてストレプトアジビン−フィコエリトリン接合体を用いて最終的に染色するか（商業主プロトコールMini-euk1に従う）、あるいは３００μＬをAffymetrix U95A GeneChipにハイブリイズし、そしてAffymetrix Fluidics station中、商業主プロトコールEukGE-WS2に従って染色し、そして共焦点レーザースキャナー（Hewlett Packard GeneArray Scanner G2500A）中、５６０ｎｍでスキャンする。該デジタル化したイメージデータは第１に、該ＲＮＡの質の評価およびハイブリダイズのためにAffymetrix Microarray Suite（登録商標）version 4.0を用いて、並びに候補遺伝子の選択のためにAffymetrix Data Mining Tool（version 2.0）を用いて、処理する。表面分子の選択のために、該データをAffymetrix Microarray Suite（登録商標）version 5を用いて再分析する（結果を参照）。分析からのデータだけを使用する。ここで、コントロールオリゴBioB、BioC、BioDおよびCreは全て存在するものとして検出する。スケール化したノイズ（Ｑ）は１０よりも小さく；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびべータ−アクチンの３'末端に対する５'末端のｍＲＮＡレベルの検出比は２以下であり；全てのプローブセットの少なくとも４０％が存在するものと同定される。試料間の比較のために、全体の強度(global intensity)を１００にセットする。
【０４２５】
ＲＴ−ＰＣＲ
半定量的なRT-PCRを、Chips分析の確認のために選択した遺伝子について行なう。上記の通り製造したｃＤＮＡを、Ｃｈｉｐｓ分析に使用する以外の別個の調製物としてを除く、ＲＴ−ＰＣＲに使用する。該ＰＣＲ反応を、添加緩衝液としての緩衝液（これは、該酵素に０．００８％のクレゾール赤および１２％スクロースを与える）内の反応液（２５μＬ）（これは、２００ｎＭ  プライマー（DNA Technology A/S）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  各ｄＮＴＰｓ、０．１Ｕ／μＬ  白金Taqポリメラーゼ（Life Technologies）を有する）中の全ＲＮＡ（３５０ｎｇ）由来のｃＤＮＡを用いて行なう。全ての反応は９４℃で２分間行ない、１サイクルは；９４℃で３０秒間、各プライマーセットについて示す温度にアニーリングし、７２℃で３０秒間、２５サイクルを３０秒間、および最終伸張段階を７２℃で１０分間とする。２５サイクルだけを用いて、該反応を半定量化する。
【０４２６】
使用するプラマーセットは以下の通りである：
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）
512 bp PCR産物スパニング(spanning)GenBank Acc.番号NM_002046 bp. 608-1119,
センス: 5'-TCCATGCCATCACTGCCACCCA（配列番号403）
アンチセンス: 5'-TCTTGTGCTCTTGCTGGGGCTG（配列番号404）、アニーリング温度：56℃。
１個のRT-PCR反応を行なう。
【０４２７】
Ｐｒｏ３０（KIAA0042）
432 bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号D26361 bp. 5181-5612,
センス: 5'-GTTTTGAATCTGAAGAAAGCCC（配列番号405）
アンチセンス: 5'-TCAAACTCCTGACCTTGTGATCT(配列番号406）、アニーリング温度：49℃。
２個の別個のRT-PCR反応を行なう。
【０４２８】
Ｐｒｏ４１（MAD2）
525 bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号AJ000186 bp. 643-1167,
センス: 5'-GTAAATAGCATGGTGGCCTACA（配列番号407）
アンチセンス: 5'-GGTCCAAAGGAGCTATACAGCA（配列番号408）、アニーリング温度：45℃。
２個の別個のRT-PCR反応を行なう。
【０４２９】
Ｐｒｏ２２１（インスリノーマ関連抗原、IA-1）
532bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号M93119 bp. 1549-2080,
センス：5'-GTGTTCCCCTGCAAGTACTGCCC（配列番号409）
アンチセンス：5'-CAGAGATTGGTAGGCGAGGCGA（配列番号410）、アニーリング温度：52℃。
２個の別個のRT-PCR反応を行なう。
【０４３０】
Ｐｒｏ２１０（ラミンB1）
439bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号L37747 bp. 424-862,
センス：5'-ACTGTGTACTGTTCGGAAGGG（配列番号411）
アンチセンス：5'-TAGAGAAACCCTTCCCTCCC（配列番号412）、アニーリング温度：46℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３１】
Ｐｒｏ７１（p16INK4/MTS 1, CDKN2A）
437bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号U26727 bp.176-612,
センス：5'-TGAGGAGCCAGCGTCTAGGG（配列番号413）
アンチセンス：5'-GTGGCCCTGTAGGACCTTCG（配列番号414）、アニーリング温度：57℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３２】
ＤＲ６（TNFRS12、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー成員21）
559bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号AF068868 bp. 1081-1639,
センス：5'-GTGCTTGTGGTGATTGTGGTGTG（配列番号415）
アンチセンス：5'-TGTTCTTGTCCTGTGGGGAAGG（配列番号416）、アニーリング温度：56℃。
２個の別個のRT-PCR反応を行なう。
【０４３３】
ＮＣＡＭ１（ニューロン細胞接着性分子）
456 bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号hsu63041 bp 2045-2500,
センス5'-TATGAGGTCTACGTGGTGGC（配列番号417）
アンチセンス：5'-CTCCTGGCACTCTGGCTTTG（配列番号418）、アニーリング温度：53℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３４】
ＮＰＴＸＲ（ニューロンペントラキシンレセプター）
482 bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号HS327J16 bp.46012-46493,
センス：5'-CACACGCACACATGTTGCAGC（配列番号419）
アンチセンス5'-GCTCTGAGAGGCCAAAGCC（配列番号420）、アニーリング温度：55℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３５】
ＧＬＵＲ２（イオンチャネル型グルタミン酸レセプター2；GRIA2）
522bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号L20814 bp. 2449-2970,
センス：5'-AGGAACCCCAGTAAATCTTGCAG（配列番号421）
アンチセンス：5'-TCAGTCACACTGACATTCATTCCC（配列番号422）、アニーリング温度：51℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３６】
ＩＴＧＡＶ（インテグリンアルファＶサブユニット）
533bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号M14648 bp. 3867-4399,
センス：5'-AATTTTAGGTCAAATCCTTCAAGCCAAC（配列番号423）
アンチセンス：5'-TGACAGCCGAGACTGATTTTACACATTA（配列番号424）、アニーリング温度：50℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３７】
ＬＲＰ８（リポタンパク質Eレセプター2）
459bp PCR産物スパニングGenBank Acc.番号HSZ75190 bp. 2016-2474,
センス；5'-GCTCCATATAGGGAGAACTGCTCAG（配列番号425）
アンチセンス：5'-CCCCAGCAACCAAACATCTTCT（配列番号426）、アニーリング温度：50℃。
１個だけのRT-PCR反応を行なう。RT-PCRは、精巣については行なわない。
【０４３８】
ウェスタンブロット法
タンパク質試料
ホールセルライセートを、選択した遺伝子のタンパク質発現の確認のために、セルラインおよび異種移植片から抽出する。該ライセートは、ラバーポリースマン(rubber policeman）（接着性細胞について）を用いて擦過(scraping)し、そして氷冷２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）中で洗浄することによって、半集密培養物から調製する。該細胞ペレットを、氷冷２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２％トリトンＸ−１００（これは、１：１００に希釈したプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩおよびＩＩＩ（Calbiochem製）を含有する）中に溶解する。渦巻いた後に、該ライセートを４℃で５分間、遠心分離（１５,０００×ｇ）することによって清澄とする。異種移植片腫瘍由来のライセートを該腫瘍の収集後直ぐに調製し、そして成体ラットの脳由来のライセートを同様な方法で処理する。該腫瘍を秤量し、そして５倍容量（重量比）の氷冷２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２％トリトンＸ−１００（これは、１：１００に希釈したプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩおよびＩＩＩ（Calbiochem製）を含有する）中にホモジナイズしたHeindolph DIAX 900を用いてホモジナイズし、４℃で５分間遠心分離（１５,０００×ｇ）することによって清澄とする。該ライセートのタンパク質濃度を、商業主によって推奨されている通り、BCA Protein Assay (Pierce製)を用いて測定する。
【０４３９】
Jurkat（Santa Cruz製）およびA431（Neomarkers製）の商業的な細胞ライセートを、いくつかのウェスタンブロット法における正(positive)コントロールとして使用する。
【０４４０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびブロッティング
５〜１５μｇのライセートを、還元剤（NuPAGE）と一緒にＬＤＳ試料緩衝液中の各レーン毎に添加し、そして３〜８％のトリス酢酸ＳＤＳゲル上で分離し、トリス−酢酸ＳＤＳランニング緩衝液（NuPAGE）中で１時間、１５０Ｖで操作し、このものをPVDF LC 2002（Novex製）膜の移動緩衝液（NuPAGE）に移す。タンパク質サイズマーカーは、ProSieveカラータンパク質マーカーである。抗−NCAM1を用いてプローブするために、該ライセートを４０ｎｇ／μＬ組み換えEndoN-HIS（E. Bockから寄贈）を用いて３７℃で５分間前処理して、ポリシアリル化(polysialylation)を除去する。
【０４４１】
該膜を、洗浄緩衝液（１０ｍＭ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ツウィーン２０）（これは、５％低脂肪乳を含有する）中、室温で６０分間（インテグリンαＥに対する抗体（ＣＤ１０３）について）、ブロックする。ITGAEの場合には、トリス−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ１０．２）は、全てのインキュベーションおよび洗浄の操作に使用する。該ブロットを、以下に記載するブロック緩衝液中の一次抗体および二次抗体、並びに商業主によって推奨されるNBT/BCIP錠剤（Roche製）を用いてＥＣＬ（Amersham製）またはアルカリ性ホスファターゼによって視覚化した結合抗体と一緒に、インキュベートする。
【０４４２】
ＮＣＡＭ１（ニューロン細胞接着性分子）
一次抗体：マウスモノクローナル抗−NCAM1クローン123C3（Santa Cruz製）（このものは１：１００に希釈し、４℃で１６時間インキュベートする）。二次抗体：アルカリ性ホスファターゼ接合ラビット抗−マウスＩｇ（DAKO製）（このものは、１：５００に希釈し、室温で１時間インキュベートする）。アルカリ性ホスファターゼによって現像(development)する。
【０４４３】
ＧｌｕＲ２（イオンチャネル型グルタミン酸レセプター2）
一次抗体：マウスモノクローナル抗GluR2および4（クローン3A11）（Pharmingen製）（このものは、１：５００に希釈し、４℃で１６時間インキュベートする）。二次抗体：アルカリ性ホスファターゼラビット抗マウスＩｇ（DAKO製）（このものは、１：５００に希釈し、室温で１時間インキュベートする。アルカリホスファターゼによって現像する。
【０４４４】
ＧＲＭ８（ＧｌｕＲ８（代謝調節型グルタミン酸レセプター8））
一次抗体：ラビットポリクローナル抗−mGluR8（Upstate Biotechnology, TriChem製）（このものは、１：５００に希釈し、４℃で１６時間インキュベートする）。二次抗体：ホースラディッシュペルオキシダーゼブタ(swine)抗ラビットＩｇ（DAKO製）（このものは、１：１０００に希釈し、室温で１時間インキュベートする。ＥＣＬによって現像する。
【０４４５】
ＮＰＴＸＲ（ニューロンペントラキシンレセプター）
一次抗体：ヤギポリクローナル抗NPTXR（C-17）（Santa Cruz製）（このものは、１：５００に希釈し、４℃で１６時間インキュベートする）。二次抗体：ホースラディシュペルオキシダーゼラビット抗ヤギＩｇ（DAKO製）（このものは、１：１０００に希釈し、室温で１時間インキュベートする。ＥＣＬによって現像する。
【０４４６】
ＩＴＧＡＥ（インテグリンアルファＥサブユニット）
一次抗体：ヤギポリクローナル抗インテグリンαＥ（N-19）（Santa Cruz製）（このものは、１：１０００に希釈し、４℃で１６時間インキュベートする）。二次抗体：アルカリ性ホスファターゼラビット抗ヤギＩｇ（sc-2771）（Santa Cruz製）（このものは、１：５００に希釈し、室温で１時間インキュベートする）。アルカリ性ホスファターゼによって現像する。
【０４４７】
得られたＣｈｉｐｓ分析データのクラスター分析
分析した正常な組織および小細胞肺癌セルラインの間に見られる発現パターンの変化を解釈するために、我々はＳＯＭｓ（自己組織化マップ(self-organising maps)）および階層的クラスタリングの両方の利点を採用する。これらは、発現パターンにおける類似度に基づいて、遺伝子群に継続的に使用する。該分析に使用する遺伝子は、５０以上の平均的な差違を有し、そして該試料のいずれか１つに存在すると採点する。
【０４４８】
ＳＯＭｓ
自己組織化マップ（ＳＯＭｓ）は、ｋ−平均値クラスタリングにいくらか関連するクラスター分析の方法である。ＳＯＭアルゴリズムの陰の基本的な原理は、ニューロンのウエイトベクトルであり、このものは最初にランダムに初期化し、反復性のデータ入力の間に初期の測定ベクトルの数を示す（Toronenらによる1999）。該算出において以下のパラメータを使用した：遺伝子：Xdimは1；Ydimは10；Iterationsは100000；試料：Xdimは1；Ydimは10；Iterationsは20000。
【０４４９】
階層的クラスタリング
階層的クラスタリングの下にある基本的な原理は、樹(tree)中へ細目の組（遺伝子またはアレイ）を集合させることであり、ここでその細目は互いに非常に似ている場合には比重に短い枝(branch)によって接合し(join)し、そしてそれらの類似性が減少するにつれて徐々に長い枝によって接合する。SOMクラスタリングからの出力ファイルは、階層的クラスタリングのために使用し、このものはSOMクラスタリングによるオーダリング(odering)が階層的樹におけるノードのフリッピング(flipping)を導くのに使用されることを意味する（Eisenらによる1998）。該算出において、以下のパラメータを使用した。遺伝子の場合：クラスターはイエス、算出ウェイトはイエス、類似マトリックスは非中心の相関(correlation uncentered)；試料の場合：クラスターはイエス、算出ウェイトはイエス、類似マトリックスは非中心の相関。引き続いて、平均的な結合(linkage)クラスター分析を行なった。
【０４５０】
クラスタリング分析の結果
Ｘ−軸（試料）のクラスタリング（図２）は予想した通り、SCLCセルラインが最も離れている部分のMar86MIおよびCPH54Aと、クラスタリングすることを示す。GLC14、GLC16およびGLC19（これらは、同じ患者から誘導化する）が示す通り、CPH54AおよびBは非常に近くクラスタリングする（ここで、BはAのクローン変異体である）。脳ＲＮＡ（CLONTECH製）および脳ＲＮＡ（Ambion製）との２個の異なるバッチが示す通り、肺ＲＮＡ（Ambion製）および肺ＲＮＡ（CLONTECH製）からの正常な組織の発現は、非常に近くクラスタリングする。胎児脳から得る発現は、成熟脳と同様に近くクラスタリングされ、そしてこのものはSCLCセルラインに対する全ての正常な組織の最も近いものである。このことにより、SCLCラインが神経内分泌起源のものであることを確認する。Ｙ−軸（遺伝子）のクラスタリングは、SCLCセルライン中でのより高い発現を有する４個の非常に異なる遺伝子のクラスターであることが明白に分かる。最も小さいものは１９個の遺伝子を、第２番目および３番目のものは各々６５個の遺伝子を、そして第４番目でかつ最も大きな遺伝子クラスターは２６８個の遺伝子を含む。
【０４５１】
候補プロモーター（第１核酸配列）についての選択基準
該候補プロモーターを、プロモーターが制御しているい遺伝子の発現レベルに基づいて選択する。該選択は、異種移植片以外の全ての２１個のSCLCセルライン、および７個の正常な組織（脳、副腎、肺、腎臓、心臓、前立腺、膵臓）について行なう。
【０４５２】
選択は、いくつかの基準に基づく。絶対的必要性をもって存在する（Ｐ）と採点され、且つ＞５０の平均差違を有する、遺伝子だけを含める。これらの出力データは、マイクロソフトエクセル２０００において更に処理する。２１個のSCLCラインの内の少なくとも１１個が存在すると採点する遺伝子を選択し、そして該遺伝子が１つ以上の正常な組織中に存在すると採点する場合には、SCLCセルラインの平均差違値の中央値(the median Average difference value)は、正常な組織の平均差違値の中央値の４倍以上でなければいけない。より正常な組織からのＲＮＡを用いて第２のスクリーニング後に、該選択した候補物を上記と同じ基準に従わせ、そしてそれらが上記の要件を満たさないならば廃棄する。
【０４５３】
ＲＴ−ＰＣＲによるＣＨｉｐｓ分析の確認
選択した遺伝子は、Chips分析によって同定された発現の立証のために、半−定量的RT-PCRによって分析する。該ｃＤＮＡの質は、GADPH（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）についてのプライマーを用いて試験する（図２）。全てのｃＤＮＡ試料は非常に陽性であって、このことは更なる分析のためのｃＤＮＡの質が良好であることを示す。
【０４５４】
Pro 221としてのプライマー（IA-1、インスリノーマ関連抗原１）を用いるRT-PCR（図３）は、正常な組織である副腎、脳、および胎児脳がCHipsおよびRT-PCRの両方の分析において弱い陽性であることを示す。４個のSCLCラインまたは異種移植片は、両方の分析において陰性である。他の全ては弱から非常に強い陽性である。該RT-PCRおよびChips分析は、非常によく相関する。
【０４５５】
Pro 30としてのプライマー（KIA0042）を用いるRT-PCR（図４）は、正常な組織精巣においてCHipsおよびRT-PCRの両方について陽性であることを示す。他の正常な組織は、両方の分析法によって低いかまたは陰性である。全てのSCLC細胞および異種移植片は、ChipsおよびRT-PCR分析の両方において陽性である。ChipsおよびRT-PCRにおける相対的な量が相関しない（例えば、ある分析では高く、他の分析においては低い）いくつかの試料が存在する。
【０４５６】
Pro 41としてのプライマー（MAD2）を用いるRT-PCR（図５）は、CHips分析およびRT-PCRの両方によって測定される通り、ほとんどの正常な組織中では低い発現を、および精巣中では高い発現を示す。全てのSCLCセルラインおよび異種移植片は、ChipsおよびRT-PCR分析の両方によって非常に高い発現を示す。
【０４５７】
Pro 210としてのプライマー（ラミンB1）を用いるRT-PCR（図６）は、正常な組織中では非常に低いかまたはなしの発現を示す（両方アッセイについて、大腸は陽性である）。全てのSCLCおよび異種移植片は、Chips分析によって高い発現を有し、そして２個以外は全て、RT-PCRによって非常に陽性である。RT-PCR値は、Chipsシグナルと一致するように任意に選択する。
【０４５８】
Pro 71としてのプライマー（CDKN2A）を用いるRT-PCR（図７）は、正常な組織中では非常に低いかまたはなしの発現を示し、そして４個のSCLC以外全てにおいて高い発現を示す。１個の試料はRT-PCRにおいては陰性であり、そしてChips分析においては陽性であることを除いて、該RT-PCRおよびChipsデータは非常によく相関する。
【０４５９】
ＲＴ−ＰＣＲによるＣＨｉｐｓ分析の立証に関する結論
該ChipsデータおよびRT-PCRデータは、非常によく相関する。Chips分析によって観察されるほとんどの正常な組織中での低から無しの発現は、半定量的なRT-PCR反応によって確認する。該選択遺伝子のSCLCセルラインおよび異種移植片中での発現は、全てまたはほとんどのセルライン中で非常に高い。従って、高く且つ特異的な発現を有するプロモーターの同定のためのChips分析の使用は、利用可能な方法である。
【０４６０】
Ｃｈｉｐｓ分析によって同定された候補細胞表面分子についての選択基準
候補細胞表面分子の第１の産生(generation)は、いくつかの基準に基づいて選択する。該選択は、異種移植片以外の全ての２１個のSCLCセルラインについて、および７個の正常な組織（脳、副腎、肺、腎臓、心臓、前立腺、膵臓）について実施する。絶対的必要性をもって存在する（Ｐ）と採点され、且つ＞５０の平均差違を有する、遺伝子だけを含める。これらの出力データは、マイクロソフトエクセル２０００において更に処理する。各セルラインまたは組織についての遺伝子を、１点として採点する。各遺伝子についての全採点を、正常な組織およびSCLCセルラインについてそれぞれまとめる。２１個のSCLCラインの内の少なくとも５個に存在すると採点した遺伝子を、選択する。以下の用語：「レセプター、膜、接着、インテグリン、表面、抗原、シンデカン、輸送、チャネル、ホルモン、結合、糖タンパク質、マトリックス、CAM、デスモソーム、ギャップ接合部、デルタ、免疫グロブリン、MHC、CD、(HSPG、CSPG、完全(integral)、ノッチ）」の１つを遺伝子名称中に含む場合に、選択したこれら遺伝子および候補遺伝子について研究を行なう。該タンパク質の機能および細胞局在化は、データベースサーチ（NCBI: Nucleotide, Protein, Nucleotide, OMIM, PubMed, LocusLink）にばらばらに基づく。次いで、最も良い候補遺伝子を、機能、細胞局在化および発現についての採点（すなわち、正常な組織の場合よりもSCLCの場合により高い「発現採点」）を重要視したこれらの情報に基づいて選択する。更に、異なる正常な組織中での発現は、理論的な副作用を見積もるために、特異的な組織に従って評価する。第２の選択は、２１個のSCLCセルライン、異種移植片として増殖するセルラインの内の８個、および１７個の正常な組織（脳、肺、腎臓、心臓、気管、副腎、前立腺、唾液腺、甲状腺、肝臓、膵臓、脾臓、小腸、骨格筋、大腸、胃、精巣）からのＲＮＡについて、Affymetrix Microarray Suite（登録商標）version 5を用いて行なう。絶対的必要性をもって存在する（Ｐ）と採点され、且つ少なくとも６個のＳＣＬＣセルラインまたは異種移植片において＞２０の平均差違を有する、発現された遺伝子だけを含める。更なる選択は、上記の通り行なう。
【０４６１】
ＲＴ−ＰＣＲによるＣｈｉｐｓ分析の立証
選択した遺伝子は、Chips分析によって同定された発現の立証のために、半−定量的RT-PCRによって分析する。DR6としてのプライマー（TNFR関連死レセプター6）を用いるRT-PCR（図８）は、ほとんどの正常な組織中で中位の発現を、およびSCLCラインまたは異種移植片を除く全てにおいてで中位から高い発現を示す。Chop分析は、２個の正常な組織中で高い発現を、および８個のSCLCラインまたは異種移植片中で高い発現を示す。Chips分析による全ての陽性はまた、RT-PCRにおいて陽性である。
【０４６２】
LRP8としてのプライマー（アポリポタンパク質Eレセプター2）を用いるRT-PCR（図９）は、６個の正常な組織中で低い発現を示し、そして全てのSCLCラインおよび異種移植片中での高い発現がRT-PCRによって陽性である。CHips分析における全ての陽性はまた、RT-PCRにおいて陽性である。RT-PCR値は、CHipsシグナルに一致するように任意に選択する。
【０４６３】
NTPXRとしてのプライマー（ニューロンペントラキシンレセプター）を用いるRT-PCR（図１０）は、Chips分析による全ての陽性はまたRT-PCRによっても陽性であることを示す。RT-PCRによって測定される通り陽性発現を有する、より多くの組織およびSCLCが存在するが、発現はSCLCにおいて平均的により高い。２個のSCLC試料は陰性である、RT-PCR値は、Chipsシグナルと一致するように任意に選択する。
【０４６４】
NCAM1としてのプライマー（ニューロン細胞接着性分子）を用いるRT-PCR（図１１）は、Chips分析による陽性の全ての試料がまたRT-PCRによっても陽性であることを示す。７個の組織および１個のSCLCを除く全てがRT-PCRだけによって陽性である。１つのSCLCセルラインは、RT-PCRおよびCHips分析の両方において陽性である。RT-PCR値は、Chipsシグナルと一致するように任意に選択する。
【０４６５】
GluR2としてのプライマー（イオンチャネル型グルタミン酸レセプター2）を用いるRT-PCR（図１２Ａ）は、Chips分析による全ての試料がまたRT-PCRによっても陽性であることを示す。両方の分析は、脳において非常に高い発現を示し、そしてRT-PCRは副腎において低い発現を示す。４個のSCLCセルラインは、RT-PCRおよびChips分析の両方において陰性である。RT-PCR値は、Chipsシグナルと一致するように任意に選択する。
【０４６６】
ITGAVとしてのプライマー（インテグリンαｖサブユニット）を用いるRT-PCR（図１２Ｂ）は、５個の試料がChips分析において陽性であるが、RT-PCRによって陰性である。他の点では、CHips分析およびRT-PCR分析の間には良い相関がある。SCLCにおいて、しかし多数の組織においてもまた、高い発現がある。
【０４６７】
RT-PCR値は、Chipsシグナルと一致するように任意に選択する。
【０４６８】
RT-PCRによる表面分子の発現のCHips分析の立証についての結論
ITGAVを除いて、Chipsw分析によって発現するものとして同定される全ての遺伝子はまた、RT-PCRによって分析時に発現することが分かった。より多数の試料が、RT-PCRによって測定時に、陽性である。SCLCセルラインおよび異種移植片中での選択した遺伝子の発現は、多数のセルラインにおいて高い。従って、SCLCによって発現される表面分子についてのmRNAの同定のためのCHips分析の使用は、利用可能な方法である。
【０４６９】
ウェスタンブロッティングによるChips分析の立証
選択した遺伝子産物の発現は、Chips分析によって同定されたmRNAの発現の比較のために、特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析する。ウェスタンブロット分析は、SCLCセルラインおよび異種移植片についてのみ行なう。mGluR8（代謝調節型グルタミン酸レセプター8）に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析（図１３）は、全てのSCLCセルラインおよび異種移植片中でmGluR8タンパク質の発現を示し、一方でChips分析だけが８個の試料において発現を検出する。ウェスタンブロットの強度は、Chips値と相関しないが、しかしmGluR8の発現を明白に示す。ラット脳のホモジネートは、陽性コントロールとして使用する。
【０４７０】
NPTXR（ニューロンペントキシンレセプター）に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析（図１４）は、Chips分析による発現を有するものと同定された全てのSCLC試料中のタンパク質発現を示す。GLC 28を除いて全ての試料は、弱から強い陽性である。DMS 153は、ラットの脳中にも存在する顕著な高分子量のバンドを有し、このものは未プロッセシングまたは二量化のレセプターであり得る。該タンパク質の量は、Chipsデータと直接には相関しないが、しかしほとんどのSCLC中では明白な発現を示す。ラットの脳のホモジネートを、陽性コントロールとして使用する。
【０４７１】
NCAM1（ニューロン細胞接着性分子）に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析（図１５）は、全てのSCLCセルラインおよび異種移植片によるNCAM1の２個のイソ型の発現を示すが、一方でChips分析は１４個の試料中での発現を同定する。Chips分析によって陽性である全ての試料は、ウェスタンブロッティングによって陽性である。
【０４７２】
Chips分析およびウェスタンブロッティングにおける相対的な量の間には全く明らかな相関はない。
【０４７３】
GluR2（イオンチャネル型グルタミン酸レセプター2）に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析（図１６）は、９個の試料中での発現を示す。６個の試料は、Chips分析によって陽性であるが、ウェスタンブロッティングによって陰性である。しかしながら、抗体の感受性は、高くない。他の陽性の試料は、Chips分析とよく相関する。ITGAE（インテグリンαEサブユニット）に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析（図１７）は、ほとんどのSCLC試料中での発現を示す。１試料は、Chips分析において陽性であって、ウェスタンブロッティングによっては陰性である。Chips分析およびウェスタンブロッティングの間の発現の相対的な強度は、多数の試料について相関しない。A431細胞ライセートは、陽性コントロールとして使用する。
【０４７４】
表面分子におけるChips分析のウェスタンブロット立証の確認
選択した表面分子について、Chips分析によって発現するものと同定された全ての遺伝子はまた、ウェスタンブロッティングによって発現するものと同定され、このことはChips分析によって測定される遺伝子発現がタンパク質合成に反映されることを示す。いくつかの遺伝子について、ウェスタンブロッティングにより、Chips分析よりもより多くの試料中での発現が発現される。従って、該Chips分析は、SCLCによって発現される表面分子を同定するための利用可能な方法である。
【０４７５】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲによって同定されるＳＣＬＣセルラインによって発現する表面分子
他の発現される細胞表面分子は、RT-PCRの方法によって同定する。上記例のセルラインの内の２１個全てから、商業主の規格に従って、QuickPrep（商標）mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いて、ｍＲＮＡを調製する。２９個の異なる組織由来のｍＲＮＡまたは全ＲＮＡは、CLONTECH社から得る。該ＲＮＡは、以下の組織から得る：全脳、脊髄、小腸、腎臓、心臓、肺、精巣、網膜、膀胱、胃、子宮、肝臓、脾臓、白血球、脂肪細胞、下垂体、卵巣、乳腺、前立腺、気管、胸腺、副腎、大腸、膵臓、唾液腺、骨髄、甲状腺、リンパ節および骨格筋。
【０４７６】
一本鎖ｃＤＮＡ合成は、オリゴ−(ｄＴ)１５プライマーを用いる商業主の指示に従って、RT-PCR用の第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Boehringer Mannheim製）を用いて実施する。
【０４７７】
続く、鋳型として該ｃＤＮＡを用いるＰＣＲは、１０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．８ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．４μＭ  プライマーおよび０．１２Ｕ／μＬ  サームプライム(Thermoprime)プラスＤＮＡポリメラーゼ（Advanced Biotechnologies製）中で行ない、９５℃で３０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１分間を３５または４０サイクルの増幅を行なう。GADPHプライマーを用いる対照反応は、全てのｃＤＮＡについて実施する。該ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析する。分析する遺伝子産物、GenBankデータベース内のヌクレオチド配列におけるそれらの位置と合わせたプライマー配列、セルラインまたは組織のパーセント（このものは、対応する遺伝子からのｍＲＮＡについて陽性である）を以下に示す。
【表２６】
2005500833.tif 000027
【表２７】
2005500833.tif 000028
【０４７８】
該ＲＴ−ＰＣＲ実験からのデータは、９５．２％のＳＣＬＣセルライン中で発現するが、正常な組織の２１．１％中でだけ発現するので、該代謝調節型グルタミン酸レセプター８は候補レセプターであることを、明白に示唆する。それらは９５％以上のセルライン中で発現するので、他のレセプターもまた候補である。リアルタイムのＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングによるＲＮＡ発現の相対レベルの定量は、更に該適当なレセプターを同定する。
【０４７９】
実施例３
ウェスタンブロッティングによって同定されるＳＣＬＣセルラインによって発現される表面分子
上記の同じパネルからの１９個の試験したＳＣＬＣライン内の１８個が、該表面分子：ニューロン細胞接着性分子（NCAM1）およびカドヘリンを発現することが見出されている（Rygaardらによる1992）。該ＳＣＬＣセルライン中の発現は、インビトロでおよびヌードマウス中の異種移植片としての両方で伝播されたセルラインからのタンパク質抽出物においてポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングによって測定する。NCAM1は、２０個の外科的に切開(ressected)したＳＣＬＣ腫瘍の内の２０個における免疫組織化学的方法（Kibbelaarらによる1991）（これは、ＳＣＬＣ細胞がインビボでNCAM1を発現することを実証する）によって検出する。NCAM1は胚発生の間に広く発現するが、しかし成人においては非常に下方制御され（GegelashviliおよびBockによる1996、総説）、従ってＳＣＬＣ患者からの正常な組織中では低レベルで発現する。NCAM1発現はエンドサイトーシスによって部分的に制御され（Minanaらによる2001）、そしてNCAM1は抗体結合によってインターナライズするように導入することができる（Michalidesらによる1994）ことは、既に実証されている。カドヘリンはまた、正常な状況下（Kameiらによる1999; Leらによる1999）、および病理学的な状況下（ParkesおよびHartによる2000、総説）でエンドサイトーシスされることも見出されている。従って、これらの分子は遺伝子移入のための表面レセプターとしての可能性ある候補である。
【０４８０】
実施例４
他の方法によって同定されるＳＣＬＣセルラインによって発現される表面分子
いくつかの他の細胞表面レセプターは多数のＳＣＬＣセルラインによって発現し、従って遺伝子移入のための表面レセプターとしての可能性ある候補でもあることが分かっている。
【０４８１】
高アフィニティのトランスフォーミング成長因子−βレセプター（TGF-βR）の発現は、化学的な架橋によって上記パネル由来のセルラインのいくつかにおいて実証される（Damstrupらによる1993）。ノーザンブロット分析によって、TGF-β RIについてのmRNAの存在は９個のSCLCの内の９個において、TGF-β RIIの場合は９個のSCLCラインの内の６個において、およびTGF-β RIII（ベータグリカン(betaglycan)）の場合は９個のSCLCラインの内の９個において見出されている（Norgaardらによる1996）。これらのレセプターに対するリガンドの結合は、該レセプターのインターナライズを誘発する（Andersらによる1997, Doreらによる2001）。
【０４８２】
インスリン様成長因子レセプター（IGF-R）mRNAはRT-PCRによって測定され、そしてこのものは１４個の検査したSCLCラインの内の１４個において存在することが見出されている（Quinnらによる1996）。１１個のSCLCラインの内の１１個におけるIGF-R1（Rotschらによる1992）およびIGF-RII（Schardtらによる1993）の両方の存在は、ノーザンブロッティング、競合的な結合アッセイおよび化学的な架橋法によって実証されている。両方のレセプターは、リガンド結合後にインターナライズすることが知られる（Doreらによる1997）。
【０４８３】
上皮成長因子レセプター（EGF-R）、および様々な相同体、改変体または変異体（v-erb-B, HER2/neu (c-erb-2), ErbB3、ErbB4およびEGF-R vIII）は、多数の癌セルラインおよび腫瘍上で発現し、そしていくつかの形態はリガンド結合後にインターナライズすることが見出されている（Wellsによる1999; HuangおよびHarariによる1999、総説)。ノーザンブロッティング分析によって、上記のパネルにおける２１個のSCLCラインの内の１１個がEGF-Rを発現することが分かっている。該発現は、ラジオレセプター、および該セルラインの内の１０個におけるアフィニティー標識分析によって立証されている（Damstrupらによる1992）。実際に、該EGF-Rは、これらのSCLCラインの内のいくつかにおいてターゲットとした遺伝子運搬を媒介することを実証されている（CristanoおよびRothによる1996, Frederiksenらによる2000）。
【０４８４】
実施例５
ＳＣＬＣセルラインの遺伝子発現と、別のタイプの正常なヒト組織および他の腫瘍セルラインの遺伝子発現との比較
SCLCセルラインおよび正常な組織の間の遺伝子発現プロフィルを更に比較するために、白血球からの正常な組織由来の全RNAを、商業的な供給源（CLONTECH, Stratagene, Ambion or ResGen）から入手する。ビオチン標識cRNAは、上記の通り製造する。
【０４８５】
正常な組織と比較してSCLC細胞中で非常に高く発現する遺伝子が癌細胞についての一般的な現象であるかまたはSCLC特異的であるかどうかを決めることは重要である。従って、全RNAは、他のタイプのヒト癌由来のセルライン（これは、例えば乳癌、神経こう腫、非小細胞肺癌（NCLC）、大腸癌、神経芽腫から誘導される商業的に入手可能なセルライン）から単離され、そして上記の通り分析する。
【０４８６】
インビトロでのＳＣＬＣセルラインの遺伝発現と、インビボでのＳＣＬＣ細胞からの遺伝子発現の比較
インビボで伝播されるＳＣＬＣラインの遺伝子発現の分析
選択したセルラインを、Rygaardらによる1992に従って、BALB/cヌードマウスの両方の側方に異種移植片としてインビボで伝播する。該腫瘍の１つが約１ｃｍ×１ｃｍの大きさに達した後に、該マウスを殺し、そして腫瘍を取り出す。該腫瘍からの全ＲＮＡ単離の場合には、該腫瘍はRNAlater（登録商標）(Ambion）中で２４〜４８時間保存し、続いて該保存溶液から取り出し、そしてＲＮＡ調製まで−７０℃で保存する。全ＲＮＡは、商業主の規格に従って、トリゾール（Life Technologies製）を用いる抽出によって該腫瘍から調製する。該全ＲＮＡは更に、ＲＮＡ精製(cleanup）についての商業主の方法に従って、RNeasyカラム（Quiagen）を用いて精製する。単離した全ＲＮＡの分析、ｃＤＮＡおよびビオチン標識のｃＲＮＡの調製、並びに遺伝子発現のAffymetrix Chipsによる分析は、上記の通り行なう。ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物は、５倍容量（ｗ／ｖ）の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２％トリトンＸ−１００中、プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビター（プロテアーゼインヒビターカクテルセットIIIおよびホスファターゼインヒビターカクテルセットII、Calbiochem製）を加えながら、テフロンパステルを用いて氷上でホモジナイズし、続いて高スピード遠心分離（１３,０００×ｇ）によって清澄することによって、新しく取り出した腫瘍から調製する。
【０４８７】
小細胞肺癌を有する患者からのバイオプシーの遺伝子発現の分析
小細胞肺癌と診断された患者からのバイオプシー（これは、Herlev Hospitalから入手）を、RNAlater（登録商標）（Ambion）中に２４〜７２時間保存し、続いて該保存溶液から取り出し、そして−７０℃で保存する。該腫瘍を熟練の病理学者によってミクロ解剖し、そして上記の通りＲＮＡを該腫瘍から単離する。いくつかの腫瘍からのＲＮＡを貯蔵する。得られる全ＲＮＡ量がビオチン標識ｃＲＮＡの直接的な調製に十分でない場合には、Ohyamaらによる2000に記載の通り、標識方法を２個の更なる増幅工程を含むように改変する。
【０４８８】
実施例６
細胞表面分子の同定のための実験方法
SCLC細胞によって発現する候補細胞表面分子（レセプター）は、Gene Chip分析、ノーザンブロッティング、RT-PCRまたはウェスタンブロッティングによって同定される。該SCLC細胞によって発現される該特異的なスプライス形態は、RT-PCRおよび／またはシークエンシング法（GATC Biotech AG, 独国で実施）によって測定される。タンパク質発現および分子の細胞下局在化（これらは、ｍＲＮＡレベルに関してのみ同定する）は、他の方法によって立証されなければいけない。商業的な抗体を入手可能ならば、ウェスタンブロッティング（このものは、上記の通りインビトロおよびインビボで伝播される上記パネル由来のSCLCセルラインから調製されるタンパク質抽出物を用いる）およびSCLCセルラインの免疫染色による同定は、商業主による推奨を用いて実施する。
【０４８９】
公知のリガンド（このものは、商業的に入手可能であるかまたは組み換え的に産生することができる（以下を参照））を有する分子について、このものは加えてまたは別に、結合または架橋の研究によって達成することができる。該標識化リガンド（例えば、放射−、ビオチン−、または蛍光−標識リガンド）をも用いて、レセプターのアフィニティ、細胞当たりのレセプター分子の数、および該リガンドのインターナライズにおけるそれらの能力を測定する。
【０４９０】
公知のリガンドを有しない細胞表面分子の場合、該表面分子の発現およびリガンドの同定の両方を測定しなければいけない。該細胞表面分子をコードしているｍＲＮＡはSCLCラインから容易に入手可能であるので、該細胞外部分をコードしているｃＤＮＡは発現ベクター中に標準的なRT-PCR方法によってクローニングして、免疫化のために使用する組み換えタンパク質の発現が可能である。好ましくは、組み換えタンパク質の容易な精製のための適当なタグ（例えば、６×HIS）との融合としての細菌システム（例えば、Qiagen pQEベクター）中での発現を使用する。ウサギでのポリクローナル抗体の発生のための免疫化は、Department of Experimental Medicine, The Panum Institute, University of Copenhagenで実施する。マウスモノクローナルハイブリドーマの発生は、Serum Institute, Copenhagenで実施する。免疫化動物からの血清、およびハイブリドーマからの条件培地は、固定化抗原として組み換え産生タンパク質を用いて（ミクロタイターウェル中または膜上で）抗原との結合についてスクリーニングする。加えて、哺乳動物細胞によって発現する時の該細胞表面分子における該抗体の特異性は実施されなければいけない。このことは、RT-PCRを用いて、完全長分子をコードしているｃＤＮＡを真核生物発現ベクター（例えば、pcDNA 3.1（Invitrogen製）またはpCMV-Tag（CLONETCH製））中にクローニングすることによって達成される。該分子を内因的に発現しないセルラインの一時的な形質移入後に、該抗体の特異性は、間接的な免疫蛍光染色を用いて測定する。
【０４９１】
適当な抗体または血清を同定する場合には、該タンパク質発現は、インビトロおよびインビボで増殖されるSCLCセルラインについて、加えてSCLCバイオプシーについて免疫染色することによって分析して、インビトロおよびインビボの両方での発現を立証する。正常な組織中での発現は、ガラス顕微鏡スライド（VastArray（登録商標）（GenRes製））上にスポットした２００個の別個の組織試料を含有するヒト組織アレイを用いて評価する。
【０４９２】
別法として、ファージディスプレーライブラリーから単離したヒト１本鎖抗体を使用することができる（以下を参照）。
【０４９３】
実施例７
細胞表面分子に対するリガンドの同定およびそれらのインターナライゼーション能力の測定のための実験方法
可能ならば、商業的に入手可能である公知のリガンドを、放射−、ビオチン−または蛍光−標識形態のいずれかで得る。候補表面分子としてのインテグリンの分析について、該セルライン中に見出される特異的なインテグリンαおよびβサブユニットの組み合わせを第１に、細胞外マトリックスリガンドを同定するために測定しなければいけない。このことは、特異的インテグリン組み合わせに対する多数の抗体を商業的に入手可能であるので、免疫染色によって実施することができる。
【０４９４】
該リガンドを標識形態以外で商業的に入手可能であるならば、該リガンドを、１２５Ｉ（例えば、クロラミン−Ｔ法を使用）、または蛍光色素もしくはビオチン（例えば、FluoReporter Kits（Molecular Probes製）を使用）を用いて標識することができる。結合アッセイを実施して、該表面分子に対するリガンド結合の特異性および能力を測定する。該標識リガンドを用いて、３７℃でインターナライズする該表面分子の能力（コントロールとして、０〜４℃でインキュベートする）は、外部に結合したリガンドのストリップ（例えば、酸またはプロテアーゼ処置による）後、および放射標識リガンドについてのインターナライズされた放射能の測定後；ビオチン標識リガンドについての酵素もしくは蛍光標識のストレプトアビジンを用いる染色後、または顕微鏡観察による蛍光標識リガンドについての直接的な評価後に、追跡することができる。
【０４９５】
該リガンドが公知であるが、商業的に入手不可能である場合には、該リガンドをコードしている遺伝子を、RT-PCRを用いたり、または適当な組織もしくはセルラインからｃＤＮＡライブラリーを得て発現ベクター中にクローニングしたり、または（入手可能ならば）商業的な供給源（GeneStorm（商標）（Invitrogen製）またはGeneConnection（登録商標）（CLONTECH製））から該クローンを得る。適当なタグ（例えば、６×HIS）は、容易な精製のために該組み換えリガンド中に含まれるべきである。細菌性発現システムが好ましい。組み換え発現はまた、結合およびインターナライゼーションの分析を容易にするために、EGFPとの融合として該リガンドを発現する可能性を可能とする。別法として、該タグに対する抗体を、結合およびインターナライゼーションの分析のために使用することができる。しかしながら、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化または硫酸化）が、該リガンドとそのレセプターとの結合にとって必須である場合には、分泌型タンパク質としての発現は、酵母菌システム（Pichia pastorius）中で、昆虫システム（バキュロウイルス）中で、または哺乳動物細胞（例えば、HEK293、COS-7またはCHO細胞）中で達成することができる。
【０４９６】
細胞表面分子のリガンドが知られていない場合には、レセプターのゲノム配列またはアミノ酸配列に基づく相同研究は、あるレセプターが属するレセプターのスーパーファミリーの同定を与えることができる。次いで、このスーパーフェミリーに特異的なリガンドのパネルを、上記の方法を用いて試験することができる。別法として、細菌性ペプチド発現ライブラリー（例えば、FliTrx Random Peptide Display Library（Invitrogen製））を用いるスクリーニングは、１つ以上のペプチドリガンドを同定することができる。これらのペプチドリガンドを、引き続いて組み換え発現のためにクローニングするかまたは商業的に入手するかいずれかが可能である。このスクリーニングについて、セルライン（このものは、非特異的な結合についてのスクリーニングとしての候補表面分子、および特異的なペプチドリガンドの同定のための該表面分子についての発現プラスミドを用いて形質移入した同一セルラインを発現しない）を使用することが最適である。
【０４９７】
該細胞表面分子に対するマウスモノクローナル抗体を得た場合には、別方法は、蛍光標識抗−マウス抗体によってエンドサイトーシスされた抗体の検出によってインターナライズする該能力についてこれらの抗体をスクリーニングすることである。抗体産生ハイブリドーマからクローニングされた組み換え発現１本鎖抗体もまた、試験する。臨床治験については、これらの抗体は、例えばLosmanらによる1999に記載の方法によってヒト化しなければいけない。インターナライズするモノクローナル抗体が入手不可能である場合には、ヒト１本鎖抗体フラグメントを発現するファージライブラリーをインターナライズする抗体の単離のために使用することができる。問題の該細胞表面分子について陰性のセルラインと一緒にインキュベートし、そして該分子（上記）を発現する形質移入したセルラインを用いて選択することにより、ファージディスプレーした抗体の非特異的結合を除去することによって、特異的であって且つインターナライズする抗体を同定し、続いてエンドサイトーシス後に該細胞によって溶かされたプラスミドＤＮＡからクローニングする（NielsenおよびMarksによる2000; Heitnerらによる2001）（Prof. J, Engberg, Royal Danish School of Pharmacyとの共同研究）。
【０４９８】
実施例８
治療遺伝子の発現のためのプロモーターの同定
遺伝子由来のプロモーター領域（GeneDhips分析によるこの発現は、SCLCセルラインおよび異種移植片中では高く、且つ正常な組織中では低いかまたは陰性であることが分かる）は、ターゲットとされる遺伝子療法における治療遺伝子の発現を制御し且つ媒介するための可能性ある候補である。GeneChips分析によって測定される候補プロモーターによる発現は第１に、GeneChips分析において使用される同一のＲＮＡ上の全分子（SCLC細胞および正常な組織由来）をカバーするいくつかの異なるプライマーセットおよびプローブを用いるRT-PCRまたはノーザンブロッティングによって立証されて、該プロモーターの癌細胞特異性を確認する（正常な組織中での同一プロモーターによって発現される別のスプライシング変異体は、ffymetrix Chipによって認識され得ない）。プロモーターの活性および特異性はＤＮＡの非常に大きな領域においてコードされ得るので、表面分子による運搬を増大するために該治療遺伝子をコードしているＤＮＡのサイズを限定する目的で、SCLC細胞中での特異的で且つ高い発現に十分である、プロモーターの領域を定義することが必須である。我々はこの限定を１５ｋｂとし、これはＰＣＲによるクローニングのための実行可能なサイズ内である。最初に、候補遺伝子のコード領域から約１５ｋｂ上流の領域（これは、ｍＲＮＡの５'非翻訳部分をコードしている領域を含む）は、鋳型として熱安定ポリメラーゼ（これは、ゲノムＤＮＡを有する大きいＰＣＲ産物を伸張することができる）（例えば、Herculase（Stratagene製））を用いるＰＣＲによってクローニングする。ＰＣＲについて使用するプライマーは、HUGOデータベース内のゲノム配列から設計し、そして制限切断によるクローニングのためのまれな制限部位を含むようにまたはCreリコンビナーゼの添加による制限切断なしでの直接的なクローニングのためのLoxP部位を含むように、設計する。該プロモーター領域を試験するために使用するベクターは、多数のクローニング部位中のまれな制限部位（例えば、pd2EGFP-1（CLONTECH製））および／またはloxP部位に先行して、増強緑色蛍光タンパク質（Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)）をコードしているプロモーターなし(promoterless)遺伝子を含むように構築する。該プロモーターの活性は、該SCLCライン中への転写後の蛍光顕微鏡観察を用いる半定量的方法（例えば、Lipfectamine Plus（登録商標）（Life Technologies製））で視覚的に、あるいはフルオロメーター（例えば、Victor 1420（Wallac製））を用いて半定量的に、見積もる。形質移入の有効性についてのコントロールとして、CMVプロモーター（pDsRed2-N1（CLONTECH製））の制御下で、赤色蛍光タンパク質をコードしているプラスミドの低量を使用する。
【０４９９】
上記アッセイにおいて活性であるプロモーターを、より小さいフラグメント中にサブクローニングし（これは、上記のＰＣＲによるかまたは標準的な制限酵素消化による）、そして上記の通りプロモーター活性について調べる。プロモーターおよびそのサブクローンの相対的活性は、ホタルルシフェラーゼをコードしているプロモーターなしベクター中に再クローニング(recloning)し、および形質移入コントロールとしてＳＶ４０プロモーターから発現するウミシイタケルシフェラーゼをコードしているプラスミドと一緒に同時形質移入することによって、定量的に測定することができる。Dual-Luciferase（商標）レポーターアッセイシステム（Promega製）を用いて、一時的に形質移入した細胞の抽出物中の両方のプラスミドからの形質移入物を、ルミノメーター(luminometer)（Lumat LB9507（EG & G製））を用いて定量化する。同様な方法で、異なる強いSCLC特異的なプロモーターの活性部分のキメラを、最適な発現および制御のために試験することができる。あるいは、他の遺伝子由来の別のエンハンサー配列（例えば、ウイルスエンハンサー）を挿入することができる。正常な組織と比較してSCLC細胞についての選択プロモーター領域の特異性が様々な構築物中で失われていないことを保証するために、これらは加えて、正常な組織から誘導される様々な起源の商業的に入手可能なセルライン中に形質移入することによって試験する。より高い特異性が必要である場合には、ｐ５３遺伝子内の変異を有する癌細胞に対する別の特異性を該システムに取り込む。該治療遺伝子についてのプロモーターに近接するloxP部位を挿入し、そしてｐ５３活性化プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼをコードしている遺伝子を挿入することによって、ｗｔ ｐ５３を発現する正常な細胞は、該治療遺伝子についてのプロモーターを切除するCreリコンビナーゼを発現し、従ってそのものは発現しない。
【０５００】
腫瘍特異的なプロモーターの転写性活性が、該治療遺伝子をコードしている転写物の十分な高レベルを得るのに十分でない場合には、第２の組織に非特異的であるが、非常に活性なプロモーター（例えば、CMV）の活性化のための特異的なプロモーターを使用することが可能である。このシステムは例えば、特異的なプロモーターによるＣｒｅリコンビナーゼのコード化であり、このものは、腫瘍組織中での発現後に、loxP配列によってフランクされるサイレンシング要素の組み換え除去によるＣＭＶプロモーターを活性化する（Kijamaらによる1999）。
【０５０１】
加えて、内因性転写性エンハンサー（例えば、ステロイドホルモンレセプター結合性領域およびレセプター）の存在を測定する。このことは、ステロイドホルモン（例えば、レチン酸、エストロゲン、プロゲステロン、またはグルココルチコイド）の添加後に、上記のEGFPまたはルシフェラーゼのプロモーター制御発現を用いる形質移入によって分析する。現在、これらは該ホルモンのアジュバント投与によって、該治療遺伝子の発現を増大させる機会を与える。別に、これらの配列は、該対応するレセプターがSCLC細胞によって発現する場合には、転写性活性の増強のためにプロモーター中に挿入することができる。
【０５０２】
実施例９
ＤＮＡとリガンドとの複合体形成ための最適な方法
治療遺伝子の発現を制御する組織特異的プロモーターをコードしているＤＮＡと、該リガンドとの間の複合体形成は、特異的なインターナライゼーションのために達成されなければいけない。いくつかの異なる可能性を試験する。ストレプトアビジンを介して、ビオチン標識ポリ−カチオン性ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）と結合するビオチン標識リガンドは、負に荷電したＤＮＡと複合体を形成し、その結果コンパクトなリガンド／ＤＮＡポリプレックス(polyplex)が得られ、このものは該リガンドを介してインターナライズすることができる（Frederiksenらによる2000）。リガンドおよび異なるサイズのポリ−Ｌ−リシンのビオチン化は、Cristianoらによる1996またはWagnerらによる1990によって記載されている通り、実施することができる。
【０５０３】
あるいは、商業的に入手可能な分枝のカチオン性ポリマーのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、リガンド／ＤＮＡ複合体を得るのに使用することができる。ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体それ自身は、遺伝子移入の低活性を有する。しかしながら、該活性および特異性は、リガンドとＰＥＩとを共有的に架橋することによって実質的に増大させることができる（Kircheisらによる1997）。別の可能性は、上記のＰＬＬについて記載する通り、ビオチン標識リガンドとストレプトアジビンとを組み合わせたビオチン標識ＰＥＩを試験することである。
【０５０４】
ＰＬＬを用いるこのシステムの更なる利点は、エンドソーム溶解性薬物の該複合体中への含有が不必要であることである（以下を参照）。
【０５０５】
該リガンドを組み換え産生する場合には、異なる方法をまた試験する。該組み換えリガンド（このものは、治療遺伝子を含有するＤＮＡ中にコードされている特異的なＤＮＡ配列と強く結合することができる）中にペプチド配列を含有させることによって、ＤＮＡ／リガンド複合体を得ることが可能であり、次いでこのものを中和してそしてＰＬＬによってコンパクト化することができる。該リガンドを有する組み換え融合体として産生する、酵母菌転写性アクチベーターGAL4からのＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡを用いる本方法（ここで、GAL4認識領域のタンデム反復は該ＤＮＡ中に取り込まれる）において試験する。
【０５０６】
上記の複合体は最初に、インターナライゼーション可能な細胞表面レセプターと結合することが知られるリガンドを有するＣＭＶプロモーターによって制御された、EGFPをコードしているＤＮＡを用いて試験する。該有効性および特異性は、蛍光顕微鏡観察による視覚的な評価によって、および／または該リガンドに対するレセプターの発現のあるなしで細胞に投与後の蛍光定量的な定量法によって、測定する。
【０５０７】
実施例１０
複合体のエンドソーム溶解の最適化
エンドサイトーシスされた複合体のリソソーム分解を避けるために、細胞質または薬物（例えば、クロロキン）中へ該ＤＮＡを放出させるために、該複合体中にエンドソーム溶解薬物を含めて、このことによりエンドソームｐＨを上昇させ、その結果リポソーム酵素による分解を抑制することは必須である（Guyらによる1995、総説）。複製欠損アデノウイルスは、リガンド／ＤＮＡポリプレックスと直接的に結合する場合には、極力なエンドソモリティク(endosmolytic)薬物として実証されている（Yoshimuraらによる1993）。しかしながら、欠損アデノウイルスまたウイルス性キャプシドの欠点は望まない免疫学的な応答、ウイルスレセプターを介する該複合体の非特異的な取り込み、安全性の注意、並びに製造および安定性における困難である。従って、これらの欠点を避けそして該複合体のサイズをより小さく減少させる目的で、好ましくは非ウイルス性エンドソモリティク薬物を試験する。該インフルエンザウイルス赤血球凝集素HA-2 N-末端膜融合ペプチド（Wagnerらによる1992）、N-末端ライノウイルスペプチド、シュードモナス外毒素Aトランスロケーションドメイン（FominayaおよびWelsによる1996）および合成ペプチド（Gottschalkらによる1996）は、エンドソーム溶解またはエンドソーム回避を媒介することを見出されている。ビオチン標識エンドソモリティクペプチドは、ストレプトアビジンと結合したビオチン標識ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）によって産生する場合には、リガンド／ＤＮＡ複合体中に含まれ得る。あるいは、該リガンドを組み換え的に産生する場合には、該ペプチド配列は該リガンドのＮ−またはＣ−末端部分中に含むことができる。これらのペプチドの有効性（このものは、別々に加えられまたは組み換えリガンド中に取り込まれる）は、レポーター遺伝子をコードしているＤＮＡ（EGFPまたはルシフェラーゼ）（このものは、インターナライズすることが知られるリガンドと複合体形成するＣＭＶプロモーターによって制御されている）、および該エンドソーム溶解（これは、該レセプター遺伝子の発現の評価によって追跡される）を用いて試験する。該リガンド／ＤＮＡ複合体がＰＥＩによって集合する場合には、この薬物は単独でエンドソーム膨潤、並びにそれに続く該複合体の溶解および放出を媒介することができる（Boussifらによる1995）。
【０５０８】
実施例１１
治療遺伝子の保護および核ターゲティングのための方法の最適化
治療遺伝子をコードしているエンドソーム放出性ＤＮＡの核への運搬を増大させるために、該ＤＮＡは核ターゲティング配列（NLS- 核局在化配列）をコードしているペプチドと共有的に連結する。制限酵素を有するプロモーターと合わせた該治療遺伝子の切除によって、該ＤＮＡ末端のエンドヌクレアーゼによる消化からの防止は、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズおよびライゲーションによって達成することができ、これにより該二本鎖ＤＮＡ末端での保護的な幹(stem)−ループキャップを得る。該オリゴヌクレオチド中にアミノ改変ヌクレオチドを含有させることによって、この残渣は核局在化シグナルをコードしているＣ−末端アミド化ペプチドに共有的に架橋するために使用することができる（Zantaらによる1999）（該ペプチドは、例えばGenosys, TX, USAから商業的に入手することができる）。多数の可能性ある配列を、本明細書中に上記する。最初に、サルウイルス４０ラージ腫瘍抗原のＮＬＳペプチドと該ＤＮＡとのカップリングによる発現の増大は、ＣＭＶプロモーターを有するＥＧＦＰをコードしているＤＮＡフラグメントを用いて試験し、そしてSCLCセルラインの一時的な形質移入によって発現を試験する。他のタンパク質由来のＮＬＳをコードしている他のペプチド（本明細書中上記を参照）は、最も効率的な核運搬の測定について試験する。
【０５０９】
実施例１２
治療遺伝子の選択のための実験方法
可能性ある治療遺伝子は、アポトーシスを誘発する遺伝子産物、毒性遺伝子産物、無害な薬物に対する感受性を導入する遺伝子産物、オンコジーンについてのアンチセンスＲＮＡ、オンコジーンをターゲットとするリボザイム、およびオンコジーンに対する抗体をコードしている遺伝子からなる群から選ばれる。タンパク質またはアンチセンスＲＮＡの発現のための遺伝子産物をコードしているｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーにおけるＰＣＲをRT-PCRによってクローニングすることによって得るか、あるいは商業的な供給源から得る。細胞死を促進する治療遺伝子の有効性を評価するために、これらはＣＭＶプロモーターの制御下でベクター中に挿入され、そして発現の効果を、形質移入細胞の同定のための同時形質移入についてのEGFPを発現するプラスミドを用いて、上記のパネル由来のSCLCセルライン中への一時的な形質移入（例えば、LipofectaminePlus, Life Technologiesを使用）後に試験する。アポトーシス誘発性遺伝子の場合に、発現が形質移入細胞に及ぼす影響を、特異的な染色によって追跡する（例えば、Vybrant Apoptosis Assay Kit（Molecular Probes製）の使用による）。加えて、形質移入細胞の細胞死は、蛍光「生菌株(live strains)」（例えば、LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（Molecular Probes製））の使用によって追跡する。上記の実験から選ばれる治療遺伝子を、続いて再クローニングして、１つ以上のSCLC特異的なプロモーターの制御下で発現させ、そして上記の通り、該発現の有効性を形質移入によって分析する。
【０５１０】
実施例１３
インビボでの形質伝達実験
可能性ある表面分子およびそれらのリガンドを選択し、そしてＤＮＡ／リガンド複合体形成方法（これは、エンドソーム溶解性薬物および遺伝子の核ターゲティングを含む）を開発した後に、該運搬システムの特異性および有効性を、ヌードマウス中で伝播した上記例からの選択セルラインのSCLC腫瘍異種移植片への該複合体のインビボ投与によって試験する。適当な医薬製剤中にCMVプロモーターと一緒にレポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはEGFP）を含有する複合体を、尾静脈中に静脈内注射によって腫瘍異種移植片マウスに投与する。２４、４８または７２時間後に、該マウスを殺し、そして肺、肝臓、心臓、脳、脾臓、腎臓および骨格筋からの該腫瘍および組織を切除し、染色し、そしてレポーター遺伝子の産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ）について分析する。
【０５１１】
インビボでの治療遺伝子を使用する形質伝達実験
インビボで治療遺伝子を運搬する該ＤＮＡ／リガンドの能力を試験するために、インビトロでの実験によって選択される治療遺伝子およびインビボ実験から選択されるＤＮＡ／リガンド複合体を用いる形質導入実験を、上記の通り実施する。該治療遺伝子がチミジンキナーゼをコードしている場合には、ヌクレオチドアナログ（例えば、ガングシクロビル(gangcyclovir)）の投与によって達成される。腫瘍の発生をサイズの測定によって追跡し、バイオプシーからの細胞のフローサイトメトリーおよび該マウスの殺傷後に、該腫瘍をアポトーシスおよび壊死について分析する。
【０５１２】
引用文献
Anders RA, Arline SL, Dore JJ, Leof EB.による
Distinct endocytic responses of heteromeric and homomeric transforming growth factor beta receptors.
Mol Biol Cell. 1997 Nov; 8(11): 2133-43。
【０５１３】
Batt DG, Petraitis J J, Houghton G C, Modi D P, Cain G A, Corjay M H, Mousa S A, Bouchard P J, Forsythe M S, Harlow P P, Barbera F A, Spitz S M, Wexler R RおよびJadhav P Kによる(2000), Disubstituted Indazoles As Potent Antagonists of the Integrin Alpha(v)Beta(3). J Med Chem 43: pp 41-58。
【０５１４】
:Bepler G, Jaques G, Neumann K, Aumuller G, Gropp C, Havemann K.による
Establishment, growth properties, and morphological characteristics of permanent human small cell lung cancer cell lines.
J Cancer Res Clin Oncol. 1987; 113(1): 31-40。
【０５１５】
Berendsen HH, de Leij L, de Vries EG, Mesander G, Mulder NH, de Jong B, Buys CH, Postmus PE, Poppema S, Sluiter HJらによる
Characterization of three small cell lung cancer cell lines established from one patient during longitudinal follow-up.
Cancer Res. 1988 Dec 1; 48(23): 6891-9。
【０５１６】
Boger DL, Goldberg J, Silletti S, Kessler TおよびCheresh D Aによる(2001) Identification of a Novel Class of Small-Molecule Antiangiogenic Agents Through the Screening of Combinatorial Libraries Which Function by Inhibiting the Binding and Localization of Proteinase MMP2 to Integrin Alpha(V)Beta(3)., J Am Chem Soc 123: pp 1280-1288。
【０５１７】
Brenner, M. BおよびCepek, K. L.による、Methods and compositions for modulating heterotypic E-cadherin interactions with T lymphocytes. [米国特許第6300080号]. 2001。
【０５１８】
Bruno V, Battaglia G, Copani A, D'Onofrio M, Di Iorio P, De Blasi A, Melchiorri D, Flor P JおよびNicoletti Fによる(2001), Metabotropic Glutamate Receptor Subtypes As Targets for Neuroprotective Drugs., J Cereb Blood Flow Metab 21: pp 1013-1033。
【０５１９】
Brauner-Osborne H, Egebjerg J, Nielsen E O, Madsen UおよびKrogsgaard-Larsen Pによる(2000), Ligands for Glutamate Receptors: Design and Therapeutic Prospects., J Med Chem 43: pp 2609-2645。
【０５２０】
Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B, Behr JPによる
A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Aug 1; 92(16): 7297-301。
【０５２１】
Brenner, M. B.およびCepek, K. L.による, Methods and compositions for modulating heterotypic E-cadherin interactions with T lymphocytes. [米国特許第6300080号]. 2001。
【０５２２】
Bruno V, Battaglia G, Copani A, D'Onofrio M, Di Iorio P, De Blasi A, Melchiorri D, Flor P JおよびNicoletti Fによる(2001), Metabotropic Glutamate Receptor Subtypes As Targets for Neuroprotective Drugs., J Cereb Blood Flow Metab 21: pp 1013-1033。
【０５２３】
Brauner-Osborne H, Egebjerg J, Nielsen E O, Madsen UおよびKrogsgaard-Larsen Pによる(2000), Ligands for Glutamate Receptors: Design and Therapeutic Prospects. J Med Chem 43: pp 2609-2645。
【０５２４】
:Bulte JW, Go KG, Zuiderveen F, The TH, de Leij L.による,
Intracerebral and subcutaneous xenografts of human SCLC in the nude rat: comparison of monoclonal antibody localization and tumor infiltrating lymphocytes.
J Neurooncol. 1993 Apr; 16(1): 11-8。
【０５２５】
:Carney DN, Gazdar AF, Bepler G, Guccion JG, Marangos PJ, Moody TW, Zweig MH, Minna JD.による,
Establishment and identification of small cell lung cancer cell lines having classic and variant features.
Cancer Res. 1985 Jun; 45(6): 2913-23。
【０５２６】
Cavalheiro EA and Olney J Wによる(2001) Glutamate Antagonists: Deadly Liaisons With Cancer., Proc Natl Acad Sci U S A 98: pp 5947-5948。
【０５２７】
Chen CY, Chang YN, Ryan P, Linscott M, McGarrity GJ, Chiang YL.による,
Effect of herpes simplex virus thymidine kinase expression levels on ganciclovir-mediated cytotoxicity and the ''bystander effect''.
Hum Gene Ther. 1995 Nov; 6(11): 1467-76。
【０５２８】
:Chomczynski P, Sacchi N.による,
Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.
Anal Biochem. 1987 Apr; 162(1): 156-9。
【０５２９】
Cristiano RJ, Roth JA.による,
Epidermal growth factor mediated DNA delivery into lung cancer cells via the epidermal growth factor receptor.
Cancer Gene Ther. 1996 Jan-Feb; 3(1): 4-10。
【０５３０】
:Damstrup L, Rygaard K, Spang-Thomsen M, Poulsen HS.による,
Expression of the epidermal growth factor receptor in human small cell lung cancer cell lines.
Cancer Res. 1992 Jun 1;52(11): 3089-93。
【０５３１】
:Damstrup L, Rygaard K, Spang-Thomsen M, Skovgaard Poulsen H.による,
Expression of transforming growth factor beta (TGF beta) receptors and expression of TGF beta 1, TGF beta 2 and TGF beta 3 in human small cell lung cancer cell lines.
Br J Cancer. 1993 May; 67(5): 1015-21。
【０５３２】
:de Leij L, Postmus PE, Buys CH, Elema JD, Ramaekers F, Poppema S, Brouwer M, van der Veen AY, Mesander G, The TH.による,
Characterization of three new variant type cell lines derived from small cell carcinoma of the lung.
Cancer Res. 1985 Dec; 45(12 Pt 1): 6024-33。
【０５３３】
Dodds DC, Omeis I A, Cushman S J, Helms J A and Perin M Sによる(1997), Neuronal Pentraxin Receptor, a Novel Putative Integral Membrane Pentraxin That Interacts With Neuronal Pentraxin 1 and 2 and Taipoxin- Associated Calcium-Binding Protein 49., J Biol Chem 272: pp 21488-21494。
【０５３４】
Dore S, Kar S, Quirion R.による,
Presence and differential internalization of two distinct insulin-like growth factor receptors in rat hippocampal neurons.
Neuroscience. 1997 May; 78(2): 373-83。
【０５３５】
:Dore JJ Jr, Yao D, Edens M, Garamszegi N, Sholl EL, Leof EB.による,
Mechanisms of Transforming Growth Factor-beta Receptor Endocytosis and Intracellular Sorting Differ between Fibroblasts and Epithelial Cells.,
Mol Biol Cell. 2001 Mar; 12(3): 675-84。
【０５３６】
:Engelholm SA, Spang-Thomsen M, Vindelov LL, Brunner N, Nielsen MH, Hirsch F, Nielsen A, Hansen HH.による,
Comparison of characteristics of human small cell carcinoma of the lung in patients, in vitro and transplanted into nude mice.
Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [A]. 1986 Sep; 94(5): 325-36。
【０５３７】
Evans JPによる(2001), Fertilin Beta and Other ADAMs As Integrin Ligands: Insights into Cell Adhesion and Fertilization., Bioessays 23: pp 628-639。
【０５３８】
Foley AG, Hartz B P, Gallagher H C, Ronn L C, Berezin V, Bock EおよびRegan C Mによる(2000), A Synthetic Peptide Ligand of Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) IgI Domain Prevents NCAM Internalization and Disrupts Passive Avoidance Learning., J Neurochem 74: pp 2607-2613。
【０５３９】
:Fominaya J, Wels W.による,
Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system.
J Biol Chem. 1996 May 3; 271(18): 10560-8。
【０５４０】
Frederiksen KS, Petri A, Abrahamsen N, Poulsen HS.による,
Gene therapy for lung cancer.
Lung Cancer. 1999 Mar; 23(3): 191-207. Review。
【０５４１】
Frederiksen KS, Abrahamsen N, Cristiano RJ, Damstrup L, Poulsen HS.による,
Gene delivery by an epidermal growth factor/DNA polyplex to small cell lung cancer cell lines expressing low levels of epidermal growth factor receptor.
Cancer Gene Ther. 2000 Feb; 7(2): 262-8。
【０５４２】
Gegelashvili, G.およびBock, E.による(1996),
Cell recognition molecules of the immunoglobulin superfamily in the nervous system.
Biomembranes, vol 3, 33-75。
【０５４３】
Gottschalk S, Cristiano RJ, Smith LC, Woo SL.による,
Folate receptor mediated DNA delivery into tumor cells: potosomal disruption results in enhanced gene expression.
Gene Ther. 1994 May; 1(3): 185-91。
【０５４４】
Gottschalk S, Sparrow JT, Hauer J, Mims MP, Leland FE, Woo SL, Smith LC.による,
A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells.
Gene Ther. 1996 May; 3(5): 48-57。
【０５４５】
Goula D, Benoist C, Mantero S, Merlo G, Levi G, Demeneix BA.による,
Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung.
Gene Ther. 1998 Sep; 5(9): 1291-5。
【０５４６】
Gunji Y, Ochiai T, Shimada H, Matsubara H.による,
Gene therapy for cancer.
Surg Today. 2000; 30(11): 967-73. Review。
【０５４７】
Guy J, Drabek D, Antoniou M.による,
Delivery of DNA into mammalian cells by receptor-mediated endocytosis and gene therapy.
Mol Biotechnol. 1995 Jun; 3(3): 237-48. Review。
【０５４８】
Hartman GDおよびDuggan M Eによる(2000), Alpha(v)Beta(3) Integrin Antagonists As Inhibitors of Bone Resorption., Expert Opin Investig Drugs 9: pp 1281-1291。
【０５４９】
Heitner T, Moor A, Garrison JL, Marks C, Hasan T, Marks JD.による,
Selection of cell binding and internalizing epidermal growth factor receptor antibodies from a phage display library.
J Immunol Methods. 2001 Feb 1; 248(1-2): 17-30。
【０５５０】
Huang SM, Harari PM.による,
Epidermal growth factor receptor inhibition in cancer therapy: biology, rationale and preliminary clinical results.
Invest New Drugs. 1999; 17(3): 259-69. Review。
【０５５１】
Huang TFによる(1998), What Have Snakes Taught Us About Integrins? Cell Mol Life Sci 54: pp 527-540。
【０５５２】
Jane DE, Hoo K, Kamboj R, Deverill M, Bleakman DおよびMandelzys Aによる(1997), Synthesis of Willardiine and 6-Azawillardiine Analogs: Pharmacological Characterization on Cloned Homomeric Human AMPA and Kainate Receptor Subtypes., J Med Chem 40: pp 3645-3650。
【０５５３】
Jane.D.による, AMPA/Kainate receptors. WWW. 2001。
http://www.bris.ac.uk/synaptic/info/pharmacology/AMPA.html。
【０５５４】
:Kamei T, Matozaki T, Sakisaka T, Kodama A, Yokoyama S, Peng YF, Nakano K, Takaishi K, Takai Y.による,
Coendocytosis of cadherin and c-Met coupled to disruption of cell-cell adhesion in MDCK cells--regulation by Rho, Rac and Rab small G proteins.
Oncogene. 1999 Nov 18; 18(48): 6776-84。
【０５５５】
Kang IC, Lee Y DおよびKim D Sによる(1999), A Novel Disintegrin Salmosin Inhibits Tumor Angiogenesis., Cancer Res 59: pp 3754-3760。
【０５５６】
Karecla PI, Green S J, Bowden S J, Coadwell JおよびKilshaw P Jによる(1996), Identification of a Binding Site for Integrin AlphaEbeta7 in the N- Terminal Domain of E-Cadherin., J Biol Chem 271: pp 30909-30915。
【０５５７】
Kaufmann, O., Georgi, T.およびDietel, M.による, Utility of 123C3 monoclonal antibody against CD56 (NCAM) for the diagnosis of small cell carcinomas on paraffin sections., Hum.Pathol. 28[12], 1373-1378. 1997。
【０５５８】
Kerr JS, Slee A MおよびMousa S Aによる(2000), Small Molecule Alpha(v) Integrin Antagonists: Novel Anticancer Agents., Expert Opin Investig Drugs 9: pp 1271-1279。
【０５５９】
Kibbelaar, R. E., Moolenaar, K. E., Michalides, R. J., Van Bodegom, P. C., Vanderschueren, R. G., Wagenaar, S. S., Dingemans, K. P., Bitter-Suermann, D., Dalesio, O.およびvan Zandwijk, N.による, Neural cell adhesion molecule expression, neuroendocrine differentiation and prognosis in lung carcinoma., Eur. J. Cancer 27[4], 431-435. 1991。
【０５６０】
Kijima T, Osaki T, Nishino K, Kumagai T, Funakoshi T, Goto H, Tachibana I, Tanio Y, Kishimoto T.による,
Application of the Cre recombinase/loxP system further enhances antitumour effects in cell type-specific gene therapy against carcinoembryonic antigen-producing cancer.
Cancer Res. 1999 Oct 1; 59(19): 4906-11。
【０５６１】
Kircheis R, Kichler A, Wallner G, Kursa M, Ogris M, Felzmann T, Buchberger M, Wagner E.による,
Coupling of cell-binding ligands to polyethylenimine for targeted gene delivery.
Gene Ther. 1997 May; 4(5): 409-18。
【０５６２】
Kirkpatrick LL, Matzuk M M, Dodds D CおよびPerin M S１による(2000), Biochemical Interactions of the Neuronal Pentraxins. Neuronal Pentraxin (NP) Receptor Binds to Taipoxin and Taipoxin-Associated Calcium-Binding Protein 49 Via NP1 and NP2., J Biol Chem 275: pp 17786-17792。
【０５６３】
Kiselyov VV, Berezin V, Maar T E, Soroka V, Edvardsen K, Schousboe AおよびBock Eによる(1997), The First Immunoglobulin-Like Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) Domain Is Involved in Double-Reciprocal Interaction With the Second Immunoglobulin-Like NCAM Domain and in Heparin Binding., J Biol Chem 272: pp 10125-10134。
【０５６４】
Krogsgaard-Larsen, P., Brehm, L., Johansen, J. S., Vinzents, P., Lauridsen, J.およびCurtis, D. R.による, Synthesis and structure-activity studies on excitatory amino acids structurally related to ibotenic acid., J Med Chem. 28[5], 673-679. 1985。
【０５６５】
:Le TL, Yap AS, Stow JL.による,
Recycling of E-cadherin: a potential mechanism for regulating cadherin dynamics.
J Cell Biol. 1999 Jul 12; 146(1): 219-32。
【０５６６】
:Losman MJ, Qu Z, Krishnan IS, Wang J, Hansen HJ, Goldenberg DM, Leung SO.による,
Generation and monitoring of cell lines producing humanized antibodies.
Clin Cancer Res. 1999 Oct; 5(10 Suppl): 3101s-3105s。
【０５６７】
Madsen U, Stensbol T BおよびKrogsgaard-Larsen Pによる(2001), Inhibitors of AMPA and Kainate Receptors. Curr Med Chem 8: pp 1291-1301。
【０５６８】
Mercer B, Markland FおよびMinkin Cによる(1998), Contortrostatin, a Homodimeric Snake Venom Disintegrin, Is a Potent Inhibitor of Osteoclast Attachment., J Bone Miner Res 13: pp 409-414。
【０５６９】
Michalides R, Kwa B, Springall D, van Zandwijk N, Koopman J, Hilkens JおよびMooi Wによる(1994), NCAM and Lung Cancer. Int J Cancer Suppl 8: pp 34-37。
【０５７０】
Minana R, Duran J M, Tomas M, Renau-Piqueras JおよびGuerri Cによる(2001), Neural Cell Adhesion Molecule Is Endocytosed Via a Clathrin-Dependent Pathway., Eur J Neurosci 13: pp 749-756。
【０５７１】
Montgomery AM, Becker J C, Siu C H, Lemmon V P, Cheresh D A, Pancook J D, Zhao XおよびReisfeld R Aによる(1996), Human Neural Cell Adhesion Molecule L1 and Rat Homologue NILE Are Ligands for Integrin Alpha v Beta 3., J Cell Biol 132: pp 475-485。
【０５７２】
Mountain A.による,
Gene therapy: the first decade.
Trends Biotechnol. 2000 Mar; 18(3): 119-28. Review。
【０５７３】
Nettelbeck DM, Jerome V, Muller R.による,
Gene therapy: designer promoters for tumour targeting.
Trends Genet. 2000 Apr; 16(4): 174-81. Review。
【０５７４】
Nielsen LL, Maneval DC.による,
P53 tumor suppressor gene therapy for cancer.
Cancer Gene Ther. 1998 Jan-Feb; 5(1): 52-63. Review。
【０５７５】
Nielsen UB, Marks JD.による,
Internalizing antibodies and targeted cancer therapy: direct selection from phage display libraries.
Pharm. Sci. Technol. Today. 2000 Aug; 3(8): 282-291。
【０５７６】
:Norgaard P, Spang-Thomsen M, Poulsen HS.による,
Expression and autoregulation of transforming growth factor beta receptor mRNA in small-cell lung cancer cell lines.
Br J Cancer. 1996 May; 73(9): 1037-43。
【０５７７】
:Ohyama H, Zhang X, Kohno Y, Alevizos I, Posner M, Wong DT, Todd R.による,
Laser capture microdissection-generated target sample for high-density oligonucleotide array hybridization.
Biotechniques. 2000 Sep; 29(3): 530-6。
【０５７８】
:Parkes RJ, Hart SL.による,
Adhesion molecules and gene transfer.
Adv Drug Deliv Rev. 2000 Nov 15; 44(2-3): 135-52. Review。
【０５７９】
:Pettengill OS, Sorenson GD, Wurster-Hill DH, Curphey TJ, Noll WW, Cate CC, Maurer LH.による,
Isolation and growth characteristics of continuous cell lines from small-cell carcinoma of the lung.
Cancer. 1980 Mar 1; 45(5): 906-18。
【０５８０】
:Quinn KA, Treston AM, Unsworth EJ, Miller MJ, Vos M, Grimley C, Battey J, Mulshine JL, Cuttitta F.による,
Insulin-like growth factor expression in human cancer cell lines.
J Biol Chem. 1996 May 10; 271(19): 11477-831。
【０５８１】
Riddell DR, Vinogradov D V, Stannard A K, Chadwick NおよびOwen J Sによる(1999), Identification and Characterization of LRP8 (ApoER2) in Human Blood Platelets., J Lipid Res 40: pp 1925-1930。
【０５８２】
Roth JA, Nguyen D, Lawrence DD, Kemp BL, Carrasco CH, Ferson DZ, Hong WK, Komaki R, Lee JJ, Nesbitt JC, Pisters KM, Putnam JB, Schea R, Shin DM, Walsh GL, Dolormente MM, Han CI, Martin FD, Yen N, Xu K, Stephens LC, McDonnell TJ, Mukhopadhyay T, Cai D.による,
Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer.
Nat Med. 1996 Sep; 2(9): 985-91。
【０５８３】
:Rotsch M, Maasberg M, Erbil C, Jaques G, Worsch U, Havemann K.による,
Characterization of insulin-like growth factor I receptors and growth effects in human lung cancer cell lines.
J Cancer Res Clin Oncol. 1992; 118(7): 502-8。
【０５８４】
:Rygaard K, Moller C, Bock E, Spang-Thomsen M.による,
Expression of cadherin and NCAM in human small cell lung cancer cell lines and xenografts.
Br J Cancer. 1992 Apr; 65(4): 573-7。
【０５８５】
Ronn LC, Olsen M, Ostergaard S, Kiselyov V, Berezin V, Mortensen M T, Lerche M H, Jensen P H, Soroka V, Saffell J L, Doherty P, Poulsen F M, Bock E, Holm AおよびSaffells J Lによる(1999), Identification of a Neuritogenic Ligand of the Neural Cell Adhesion Molecule Using a Combinatorial Library of Synthetic Peptides., Nat Biotechnol 17: pp 1000-1005。
【０５８６】
:Schardt C, Rotsch M, Erbil C, Goke R, Richter G, Havemann K.による,
Characterization of insulin-like growth factor II receptors in human small cell lung cancer cell lines.
Exp Cell Res. 1993 Jan; 204(1): 22-9。
【０５８７】
Taraszka KS, Higgins J M, Tan K, Mandelbrot D A, Wang J HおよびBrenner M Bによる(2000), Molecular Basis for Leukocyte Integrin Alpha(E)Beta(7) Adhesion to Epithelial (E)-Cadherin., J Exp Med 191: pp 1555-1567。
【０５８８】
Thomas NK, Wright R A, Howson P A, Kingston A E, Schoepp D DおよびJane D Eによる(2001), (S)-3,4-DCPG, a Potent and Selective MGlu8a Receptor Agonist, Activates Metabotropic Glutamate Receptors on Primary Afferent Terminals in the Neonatal Rat Spinal Cord., Neuropharmacology 40: pp 311-318。
【０５８９】
Turner JPおよびSalt T Eによる(1999), Group III Metabotropic Glutamate Receptors Control Corticothalamic Synaptic Transmission in the Rat Thalamus in Vitro., J Physiol 519 Pt 2: pp 481-491。
【０５９０】
Yoshimura K, Rosenfeld MA, Seth P, Crystal RG.による,
Adenovirus-mediated augmentation of cell transfection with unmodified plasmid vectors.
J Biol Chem. 1993 Feb 5; 268(4): 2300-3。
【０５９１】
Wagner E, Zenke M, Cotten M, Beug H, Birnstiel ML.による,
Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells.,
Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 May; 87(9): 3410-4。
【０５９２】
Wagner E, Plank C, Zatloukal K, Cotten M, Birnstiel ML.による,
Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Sep 1; 89(17): 7934-8。
【０５９３】
Wells A.による,
EGF receptor.
Int J Biochem Cell Biol. 1999 Jun; 31(6): 637-43. Review。
【０５９４】
Yoneda Y, Kawajiri S, Sugimura M, Osanai K, Kito F, Ota EおよびMimura Tによる(2001), Synthesis of Diaminobutane Derivatives As Potent Ca(2+)-Permeable AMPA Receptor Antagonists., Bioorg Med Chem Lett 11: pp 2663-2666。
【０５９５】
Yu A, Choi J, Ohno K, Levin B, Rom W NおよびMeruelo Dによる(2000), Specific Cell Targeting for Delivery of Toxins into Small-Cell Lung Cancer Using a Streptavidin Fusion Protein Complex., DNA Cell Biol 19: pp 383-388。
【０５９６】
Zanta MA, Belguise-Valladier P, Behr JP.による,
Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5; 96(1): 91-6。
【図面の簡単な説明】
【０５９７】
【図１】図１は、標的遺伝子治療の原理を示す図である。
【図２】図２は、Chips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。この図は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のRT-PCRによるChips分析のRT-PCR確認に使用したcDNAの品質試験を示す。
【図３】図３は、Pro221（IA-1）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図４】図４は、Pro30（KIA0042）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図５】図５は、Pro41（MAD2）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図６】図６は、Pro210（ラミンB1）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図７】図７は、Pro71（CDKN2A）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図８】図８は、細胞表面分子DR6についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図９】図９は、細胞表面分子LRP8についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１０】図１０は、細胞表面分子NTPXRについてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１１】図１１は、細胞表面分子NCAM1についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、細胞表面分子GluR2（GRIA2）についてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、細胞表面分子ITGAVについてChips分析とRT-PCRにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１３】図１３は、mGluR8についてChips分析とウェスタンブロッティングにより測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１４】図１４は、NPTXRについてChips分析とウェスタンブロット分析により測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１５】図１５は、NCAM1についてChips分析とウェスタンブロット分析により測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１６】図１６は、GluR2（GRIA2）についてChips分析とウェスタンブロット分析により測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１７】図１７は、ITGAEについてChips分析とウェスタンブロット分析により測定した遺伝子発現の比較を示す図である。
【図１】
2005500833.tif 000029
【図２】
2005500833.tif 000030
【図３】
2005500833.tif 000031
【図４】
2005500833.tif 000032
【図５】
2005500833.tif 000033
【図６】
2005500833.tif 000034
【図７】
2005500833.tif 000035
【図８】
2005500833.tif 000036
【図９】
2005500833.tif 000037
【図１０】
2005500833.tif 000038
【図１１】
2005500833.tif 000039
【図１２Ａ】
2005500833.tif 000040
【図１２Ｂ】
2005500833.tif 000041
【図１３】
2005500833.tif 000042
【図１４】
2005500833.tif 000043
【図１５】
2005500833.tif 000044
【図１６】
2005500833.tif 000045
【図１７】
2005500833.tif 000046
【国際公開パンフレット】
2005500833.tif 000047
2005500833.tif 000048
2005500833.tif 000049
2005500833.tif 000050
2005500833.tif 000051
2005500833.tif 000052
2005500833.tif 000053
2005500833.tif 000054
2005500833.tif 000055
2005500833.tif 000056
2005500833.tif 000057
2005500833.tif 000058
2005500833.tif 000059
2005500833.tif 000060
2005500833.tif 000061
2005500833.tif 000062
2005500833.tif 000063
2005500833.tif 000064
2005500833.tif 000065
2005500833.tif 000066
2005500833.tif 000067
2005500833.tif 000068
2005500833.tif 000069
2005500833.tif 000070
2005500833.tif 000071
2005500833.tif 000072
2005500833.tif 000073
2005500833.tif 000074
2005500833.tif 000075
2005500833.tif 000076
2005500833.tif 000077
2005500833.tif 000078
2005500833.tif 000079
2005500833.tif 000080
2005500833.tif 000081
2005500833.tif 000082
2005500833.tif 000083
2005500833.tif 000084
2005500833.tif 000085
2005500833.tif 000086
2005500833.tif 000087
2005500833.tif 000088
2005500833.tif 000089
2005500833.tif 000090
2005500833.tif 000091
2005500833.tif 000092
2005500833.tif 000093
2005500833.tif 000094
2005500833.tif 000095
2005500833.tif 000096
2005500833.tif 000097
2005500833.tif 000098
2005500833.tif 000099
2005500833.tif 000100
2005500833.tif 000101
2005500833.tif 000102
2005500833.tif 000103
2005500833.tif 000104
2005500833.tif 000105
2005500833.tif 000106
2005500833.tif 000107
2005500833.tif 000108
2005500833.tif 000109
2005500833.tif 000110
2005500833.tif 000111
2005500833.tif 000112
2005500833.tif 000113
2005500833.tif 000114
2005500833.tif 000115
2005500833.tif 000116
2005500833.tif 000117
2005500833.tif 000118
2005500833.tif 000119
2005500833.tif 000120
2005500833.tif 000121
2005500833.tif 000122
2005500833.tif 000123
2005500833.tif 000124
2005500833.tif 000125
2005500833.tif 000126
2005500833.tif 000127
2005500833.tif 000128
2005500833.tif 000129
2005500833.tif 000130
2005500833.tif 000131
2005500833.tif 000132
2005500833.tif 000133
2005500833.tif 000134
2005500833.tif 000135
2005500833.tif 000136
2005500833.tif 000137
2005500833.tif 000138
2005500833.tif 000139
2005500833.tif 000140
2005500833.tif 000141
2005500833.tif 000142
2005500833.tif 000143
2005500833.tif 000144
2005500833.tif 000145
2005500833.tif 000146
2005500833.tif 000147
2005500833.tif 000148
2005500833.tif 000149
2005500833.tif 000150
2005500833.tif 000151
2005500833.tif 000152
2005500833.tif 000153
2005500833.tif 000154
2005500833.tif 000155
2005500833.tif 000156
2005500833.tif 000157
2005500833.tif 000158
2005500833.tif 000159
2005500833.tif 000160
2005500833.tif 000161
2005500833.tif 000162
2005500833.tif 000163
2005500833.tif 000164
2005500833.tif 000165
2005500833.tif 000166
2005500833.tif 000167
2005500833.tif 000168
2005500833.tif 000169
2005500833.tif 000170
2005500833.tif 000171
2005500833.tif 000172
2005500833.tif 000173
2005500833.tif 000174
2005500833.tif 000175
2005500833.tif 000176
2005500833.tif 000177
2005500833.tif 000178
2005500833.tif 000179
2005500833.tif 000180
2005500833.tif 000181
2005500833.tif 000182
2005500833.tif 000183
2005500833.tif 000184
2005500833.tif 000185
2005500833.tif 000186
2005500833.tif 000187
2005500833.tif 000188
2005500833.tif 000189
2005500833.tif 000190
2005500833.tif 000191
2005500833.tif 000192
2005500833.tif 000193
2005500833.tif 000194
2005500833.tif 000195
2005500833.tif 000196
2005500833.tif 000197
2005500833.tif 000198
2005500833.tif 000199
2005500833.tif 000200
2005500833.tif 000201
2005500833.tif 000202
2005500833.tif 000203
2005500833.tif 000204
2005500833.tif 000205
2005500833.tif 000206
2005500833.tif 000207
2005500833.tif 000208
2005500833.tif 000209
2005500833.tif 000210
2005500833.tif 000211
2005500833.tif 000212
2005500833.tif 000213
2005500833.tif 000214
2005500833.tif 000215
2005500833.tif 000216
2005500833.tif 000217
2005500833.tif 000218
2005500833.tif 000219
2005500833.tif 000220
2005500833.tif 000221
2005500833.tif 000222
2005500833.tif 000223
2005500833.tif 000224
2005500833.tif 000225
2005500833.tif 000226
2005500833.tif 000227
2005500833.tif 000228
2005500833.tif 000229
2005500833.tif 000230
2005500833.tif 000231
2005500833.tif 000232
2005500833.tif 000233
2005500833.tif 000234
2005500833.tif 000235
2005500833.tif 000236
2005500833.tif 000237
2005500833.tif 000238
2005500833.tif 000239
2005500833.tif 000240
2005500833.tif 000241
2005500833.tif 000242
2005500833.tif 000243
2005500833.tif 000244
2005500833.tif 000245
2005500833.tif 000246
2005500833.tif 000247
2005500833.tif 000248
2005500833.tif 000249
2005500833.tif 000250
2005500833.tif 000251
2005500833.tif 000252
2005500833.tif 000253
2005500833.tif 000254
2005500833.tif 000255
2005500833.tif 000256
2005500833.tif 000257
2005500833.tif 000258
2005500833.tif 000259
2005500833.tif 000260
2005500833.tif 000261
2005500833.tif 000262
2005500833.tif 000263
2005500833.tif 000264
2005500833.tif 000265
2005500833.tif 000266
2005500833.tif 000267
2005500833.tif 000268
2005500833.tif 000269
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500833.tif 000270
【国際調査報告】
2005500833.tif 000271
2005500833.tif 000272
2005500833.tif 000273
2005500833.tif 000274
2005500833.tif 000275
2005500833.tif 000276