(57)【要約】本発明は、治療剤を細胞へ、典型的には癌細胞、例えば前立腺癌細胞へターゲットするように処理された遺伝的処理がなされたバキュロウィルスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療剤をコードする核酸分子とバキュロウィルスが少なくとも１種の細胞タイプをターゲットにする機能を果たすポリペプチドをコードする核酸分子とを含むように改変されているバキュロウィルスゲノムを有するバキュロウィルス。
【請求項２】
前記ゲノムが前記核酸分子の真核性遺伝子発現に適合されている請求項１に記載のバキュロウィルス。
【請求項３】
治療剤をコードしている前記核酸の発現が、癌特異的プロモータにより制御されている請求項２に記載のバキュロウィルス。
【請求項４】
前記癌特異的プロモータが前立腺癌細胞特異的プロモータである請求項３に記載のバキュロウィルス。
【請求項５】
前記プロモータが表１に示された群より選択される請求項４に記載のバキュロウィルス。
【請求項６】
前記治療剤がポリペプチドである請求項１から５のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項７】
前記ポリペプチドが表２に示された群より選択される腫瘍抑制ポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項８】
前記ポリペプチドが抗原性ペプチドである請求項７に記載のバキュロウィルス。
【請求項９】
前記抗原性ポリペプチドが前立腺腫瘍排除抗原である請求項８に記載のバキュロウィルス。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが細胞傷害性ポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項１１】
前記細胞傷害剤がシュードモナスエキソトキシン、リシントキシン、ジフテリアトキシン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ａ０４６４６）からなる群より選択される請求項１０に記載のバキュロウィルス。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが細胞周期停止誘発ポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが表４に示された群より選択される請求項１２に記載のバキュロウィルス。
【請求項１４】
前記治療ポリペプチドが医薬活性ポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがサイトカインである請求項１４に記載のバキュロウィルス。
【請求項１６】
前記サイトカインが表５に示された群より選択される請求項１５に記載のバキュロウィルス。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが抗体もしくはそれの活性結合フラグメントである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項１８】
前記フラグメントがＦａｂフラグメントである請求項１７に記載のバキュロウィルス。
【請求項１９】
前記ポリペプチドがアポトーシスを誘発するポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが表６に示された群より選択される請求項１９に記載のバキュロウィルス。
【請求項２１】
前記ポリペプチドがプロドラッグ活性化ポリペプチドである請求項６に記載のバキュロウィルス。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが表７に示された群から選択される請求項２１に記載のバキュロウィルス。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが抗血管新生(antiangiogenic)活性を有する請求項２２に記載のバキュロウィルス。
【請求項２４】
前記ポリペプチドがアンジオスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＮＭ００７０３７）、Ｔｉｅ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＡＦ４５１８６５）、エンドスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＮＭ１３０４４５）からなる群より選択される請求項２３に記載のバキュロウィルス。
【請求項２５】
前記治療剤がアンチセンス核酸分子である請求項１から５のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項２６】
前記アンチセンス核酸分子が細胞周期調整遺伝子をコードする核酸分子に結合する請求項２５に記載のバキュロウィルス。
【請求項２７】
前記細胞周期調整遺伝子が表４に示される群より選択される請求項２６に記載のバキュロウィルス。
【請求項２８】
前記アンチセンス核酸分子がアポトーシス阻害物質をコードする核酸分子に結合する請求項２５に記載のバキュロウィルス
【請求項２９】
前記アポトーシス阻害物質がカベオリン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＡＦ０９５５９１）である請求項２８に記載のバキュロウィルス。
【請求項３０】
前記治療剤が二重鎖ＲＮＡ分子である請求項１から５項のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項３１】
前記治療剤がリボザイムである請求項１から５項のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項３２】
前記バキュロウィルスゲノムが、少なくとも１種の細胞タイプの細胞表面にバキュロウィルスを結合するポリペプチドをコードする核酸分子を含む請求項１から３１項のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項３３】
前記核酸分子が、ＧｎＲＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ｌ０３３８０）、線維芽細胞成長因子、インスリン及びインスリン様成長因子、ニューロテンシン、血小板由来成長因子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯ＮＭ＿００２６０９  及び  ＮＭ＿００６２０６）、ソマトスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＢＣ０３２６２５）からなる群より選択されるポリペプチドをコードする請求項３２に記載のバキュロウィルス。
【請求項３４】
前記ポリペプチドをコードする前記核酸分子が、バキュロウィルスキャプシドポリペプチドに融合する位置でバキュロウィルスゲノムに挿入される請求項３２に記載のバキュロウィルス。
【請求項３５】
前記キャプシドポリペプチドがｇｐ６４である請求項３４に記載のバキュロウィルス。
【請求項３６】
請求項１から３５項のいずれか１項に記載のバキュロウィルスを含む医薬組成物。
【請求項３７】
癌治療用医薬の製造における使用のための請求項１から３５項のいずれか１項に記載のバキュロウィルス。
【請求項３８】
前記癌が前立腺癌である請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
請求項１から３５項のいずれか１項に記載のバキュロウィルスの治療上の有効量を投与することを含む治療方法。
【請求項４０】
前記治療が癌である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が前立腺癌である請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療剤をコードする核酸分子及び少なくとも１種の細胞タイプをバキュロウィルスのターゲットにする機能を果たすポリペプチドをコードする核酸分子をバキュロウィルスゲノムが含むバキュロウィルス、前記バキュロウィルスを用いた治療方法及び前記バキュロウィルスを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、疾患の治療上の処置のために細胞の中への新しい遺伝的情報の導入及び任意に安定挿入を必要とする。遺伝子治療に関する主な論点は、効率のよい細胞への核酸のターゲッティングと選択された組織における高い水準での導入遺伝子発現の確立である。これらの一方もしくは両方の要求を容易にすることを意図する多くの方法論が開発されてきた。例えば、ＵＳ６０４３３３９では、核酸に融合した場合、その連結された核酸の細胞膜を横断したトランスロケーションを容易にするシグナルペプチドの使用が開示されている。ＵＳ６０８３７１４では、結合した核酸およびターゲッティング手段が開示されており、これはインテグリンレセプターに結合し、それゆえにインテグリンを発現する細胞をターゲッティングするポリカチオンポリリジンを使用している。ＥＰ１０１３７７０では、オリゴヌクレオチドに結合された核局在化シグナル（ＮＬＳ）の使用が開示されている。その接合体はベクターＤＮＡに共有的に連結して、その複合体は細胞への感染するのに用いられるかもしれない。ＮＬＳ配列はベクターＤＮＡの核膜の通過を容易にするように作用し、それゆえ遺伝子の移送を核へ向ける。
【０００３】
ある範囲のウィルスを主体とするベクターが、哺乳類細胞株を上首尾にトランスフェクトするのに使用されてきた。これらには、アデノウィルス、アデノウィルス関連ウィルス、パポーバウィルス及びワクシニアウィルスが含まれる。これらのウィルスを主体とするベクターには無視できない不利益がある。アデノウィルスは遺伝子治療試行において、よく確立されているが、アメリカ合衆国での最近の問題から、その使用を制限するかもしれない（Wickham TJ,Gene Therapy,7:110.2000）。主な問題は、非選択的な細胞傷害性（特に肝臓）及び先在するそのウィルスに対する免疫反応にあると思われる。アデノウィルスキャプシド由来のペプチドに対して誘発された細胞溶解性Ｔ細胞の反応が、ベクターで形質導入された細胞の破壊を媒介することが示されており、また局在化した組織の損傷及び炎症に関連してきた。（Gilgenkrantz,H.et al. (1995) Hum Gene Ther 6,(1265-1274);Yang,Y. and Wilson,J.M.(1995) J Immunol 155,2564-2570)。内生的に感染しているアデノウィルスを特に高用量で用いた組換えの将来性は、潜在的な安全性の懸念事項でもある。
【０００４】
組換えウィルスへ挿入される外部遺伝子物質の量の限界は、アデノウィルスキャプシドの画定されたサイズによる。アデノウィルスは、先在している物質と組換えを起こしうる。これは、内生アデノウィルスが人間界に広く行き渡った潜在的な欠点である。同様にアデノウィルスベクターは、関連する内生ヒトウィルスの複製を助ける能力があることが立証されている。
【０００５】
安全性の懸念は、単純ヘルペスウィルスの臨床的使用にも関係する。ヒトの脳におけるウィルスの溶菌複製は脳炎と関連している(Latchman,D.S (1994).Mol Biotechnol,2,179-195)。
【０００６】
レトロウィルスのベクターが、臨床試験で広く使われているが、いくつもの不利益がこれらのウィルスに関連している。細胞への組込みが無作為であること、これが、主な安全上の懸念である。これらのウィルスは感染のため細胞分裂が必要であるため、これらのベクターの使用は制限されている。
【０００７】
哺乳類細胞に感染することが示されてきた他のベクターは、バキュロウィルスである。バキュロウィルスは桿状体ウィルスであり、それゆえ、組換えバキュロウィルスに挿入される遺伝物質の量の制限は、アデノウィルスキャプシドによるものほど制限されない。
【０００８】
バキュロウィルスでは、ヒト細胞内で昆虫特異性プロモータによる自身の遺伝子は発現しない。バキュロウィルスがウィルス性遺伝子のウィルス遺伝子発現の結果として免疫反応を引き起こさせないので、これは魅力的な特徴である。しかしながら、哺乳類プロモータ制御の下、マーカーや治療遺伝子の挿入は、高いレベルの導入遺伝子の発現を可能にする。アデノウィルスベクターとは異なり、バキュロウィルスは先在する物質と組換えを起こさない。バキュロウィルスによる感染は、アデノウィルスベクターで示されたようなヒト内生ウィルスの複製を容易にすることはない。他の治療用のウィルスの多くとは対照的に、バキュロウィルスは無血清培養培地で大量に育てることができる。この生産方法は、容易に産業水準まで拡大でき、ウィルス及びプリオン剤を伴う治療剤の血清汚染の潜在的な危険を取り除く。最も重要なことに、他のすべてのウィルスベクターと異なり、バキュロウィルスに対する先在の免疫反応は存在しない。
【０００９】
組換えバキュロウィルスの構築物はよく文献に出ている。ＥＰ０３４０３５９（これを引用して本明細書の一部とする）では、導入ベクターの使用を通じて外来遺伝子を組み込んでいる組換えバキュロウィルスを獲得する方法が開示されている。この新規な導入ベクターは、ポリヘドリン遺伝子本体（外来遺伝子がクローン化され得るが）のＮ末端の少し下流に制限部位を組み込む。ポリヘドリン遺伝子の天然のＡＴＧ開始コドンは与えられず、その結果、制限部位前のＮ末端ポリヘドリンをコードする配列は、保持されるが翻訳できない。外来遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウィルスは、野生型のバキュロウィルス及び導入ベクターで、バキュロウィルスの感染性の高い昆虫細胞を同時トランスフェクトすることによって導入ベクターにより誘導される。
【００１０】
同様にＵＳ６１２６９４４（これを引用して本明細書の一部とする）は、外来遺伝子、とりわけ単純ヘルペスウィルスの糖タンパク質ｇＧ１及びｇＧ２の効率よい発現のためのバキュロウィルス導入ベクターの構築物に関する。発現させるべき外来遺伝子は、翻訳開始部位に更にヌクレオチドを加えることなく、翻訳開始部位でバキュロウィルスポリへドリン遺伝子に近位している。
【００１１】
ＵＳ５７５０３８３（これを引用して本明細書の一部とする）は、バキュロウィルスのクローニングシステムを開示している。そのシステムは、必須遺伝子を用いるマーカーレスキューシステムである。その選択された必須遺伝子が不活性化される。ヌル突然変異を含むバキュロウィルスのクローニングは、それから調整可能なプロモータの制御下で、外来遺伝子に連結した遺伝子の機能的コピーを含むプラスミドで共感染した野生型宿主細胞に感染するためのウィルスを用いることにより成し遂げられる。バキュロウィルスヌル突然変異は、外来遺伝子に連結したレスキュー遺伝子によって「レスキュー(救出）」される。必須遺伝子の機能は回復し、外来遺伝子は発現される。必須遺伝子の一例としてｇｐ６４  ｅｆｐ（envelope fusion protein：外膜融合タンパク質）が挙げられ、これは、ウィルス感染と増殖に必須のタンパク質をコードする。
【００１２】
開示されている方法ではバキュロウィルスを操作できるかもしれないが、従来の技術ではターゲットされた遺伝子治療に関するウィルスベクターとしてのバキュロウィルスの使用について述べられていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
我々は、バキュロウィルスゲノムに組み込まれ、バキュロウィルスの移送を容易にしてそれにより、特異な細胞タイプに対する治療剤となるターゲッティング配列を含む組換えバキュロウィルスを開発した。
【００１４】
ターゲッティングのための候補遺伝子の一例は、バキュロウィルスｇｐ６４であり、これは、広範にプロセッシングされたタイプ１の細胞膜内在糖タンパク質である。バキュロウィルス感染のｇｐ６４の役割は、ｇｐ６４に特異な抗体による感染の中和によって立証されている。ｇｐ６４は、低ｐＨ活性化膜融合活性にとって、必要でありまたその能力を有することも示されている。決定的なデータは欠けているが、その感染周期におけるｇｐ６４の役割についての間接的なデータは、そのタンパク質がバキュロウィルス感染に必須であることを強く示唆している。
【００１５】
バキュロウィルスｇｐ６４外被タンパク質は、遺伝的情報の担体としての機能を混乱させることなく、新しく及びより特異的な付着配列としての迅速な挿入を可能にするものに、十分に変異しやすいことが見出されていた。ｇｐ６４外被タンパク質には長いループがある。これは以前に抗原提示のために用いられ、挿入には理想的である。改変ｇｐ６４が、モザイク膜で野生型ｇｐ６４と共に発現したときは、ウィルス感染には大きく影響しない。
【００１６】
本発明の一態様によれば、治療剤をコードする核酸分子と少なくとも１種の細胞タイプへバキュロウィルスをターゲットする機能を果たすペプチドとをコードする核酸分子を含むようにバキュロウィルスゲノムが変異されているバキュロウィルスが提供される。
【００１７】
好ましい実施形態では、前記バキュロウィルスゲノムは、前記核酸分子の真核性の遺伝子発現に適合される。
【００１８】
典型的な前記適合例には、例示であってこれに限られないが、細胞／組織に特異的な発現を媒介する転写制御配列（プロモータ配列）の供給が含まれる。これらのプロモータ配列は、細胞／組織に特異的、誘発的もしくは構成要素であってもよい。
【００１９】
プロモータは技術認知用語であり、そして明確性のためには以下の特徴を含むが、これらは例示のみであって限定のためではなく、与えられる。エンハンサーエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’側にしばしば見出されるシス作用性の核酸配列である（エンハンサーは、遺伝子配列の３'側に見いだされもしくはイントロン配列の中にさえ位置することもでき、それゆえ位置非依存性である。）。エンハンサーは、エンハンサーが連結している遺伝子の転写速度を上げるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合すると示されてきたトランス作用性転写要因（ポリペプチド）に感応しやすい。転写因子の結合／活性（Eukaryotic Transcription Facors, David S Latchman,Academic Press Ltd. San Diegoを参照）は、いくつかの環境的合図に感応しやすい。
【００２０】
プロモータエレメントは、いわゆるＴＡＴＡボックス及びＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列も含み、これらは転写開始の部位を選択する機能を果たす。またこれらの配列は、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にする機能を有するポリペプチドも結合する。
【００２１】
適合例にはまた、選択可能なマーカー及び自己複製の配列双方の提供が含まれ、これら双方は、真核細胞及び原核宿主のどちらかにおける前記ベクターの維持を容易にする。
【００２２】
バキュロウィルスコード遺伝子の発現を容易にする適合例には、転写末端／ポリアデニル化した配列の供給が含まれる。これはまた、２シストロン又は複シストロン発現カセット内に配置されたバキュロウィルスコード遺伝子の発現を最大化する機能を有する内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry sites（IRES）)の供給も含む。
【００２３】
これらの適合は、本技術分野ではよく知られている。一般的な発現ベクター構築物及び組換えＤＮＡ技術に関するかなりの量の刊行論文がある。Sambrook et al(1989)Moleculer Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbour laboratory, Cold Spring Harbour, NY およびその参照文献；Marston, F(1987) DNA Cloning Techniques :A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons,Inc.(1994)を参照してほしい。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、前記真核細胞の発現は、癌細胞に特異的なプロモータエレメントの提供によるものである。好ましくは、前記プロモータは前立腺癌細胞で活性があるものである。
より好ましくは、プロモータエレメントは、表１に示された群から選択されるものである。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、前記治療剤はポリペプチドである。
好ましくは、前記ポリペプチドは、表２に示された群から選択される腫瘍抑制ポリペプチドである。
【００２６】
さらに好ましく本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは抗原性ポリペプチドである。
好ましくは、腫瘍排除抗原前駆体は、表３で示された以下のファミリーから選択される。
さらに好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは前立腺腫瘍排除抗原である。
【００２７】
さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチドである。たとえば、シュードモナス外毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ａ０４６４６）である。
【００２８】
またさらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは細胞周期停止誘発ポリペプチドである。
好ましくは、前記細胞周期停止ポリペプチドは、表４に示された群より選択される。
【００２９】
さらに好ましい本発明の実施形態では、前記治療ポリペプチドは医薬活性があるポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドはサイトカインである。
好ましくは、前記サイトカインは表５に示された群から選択される。
【００３０】
さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドは抗体、又はその活性結合フラグメント、たとえばＦａｂフラグメントである。
【００３１】
Ｆａｂフラグメントよりも小さく、細胞性のターゲットに結合する抗体フラグメントもまた本発明の範囲内である。例えば、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００３２】
これらは、リンカー配列を介して対になったＨ鎖の可変領域とＬ鎖の可変領域とで成立する処理抗体フラグメントである。Adams and Schier (1999) Journal of Immunolpgical Methods 249-260を参照。
【００３３】
なお一層好ましい発明の実施形態では、前記ポリペプチドはアポトーシスを誘発するポリペプチドである。
好ましくは、前記アポトーシス誘発ポリペプチドは表６に示されたものである。
【００３４】
さらに好ましい本発明の実施形態では、前記ポリペプチドはプロドラッグ活性化ポリペプチドである。
好ましくは、前記プロドラッグ活性化ポリペプチドは、表７に示されたものである。
【００３５】
さらに好ましい本発明の実施態様では、前記ポリペプチドは抗血管新生活性を有する。例えば、アンジオスタチン、Ｔｉｅ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．ｎｏ：ＡＦ４５１８６５）、エンドスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．ｎｏ：ＮＭ１３０４４５）が挙げられる。
【００３６】
さらに好ましい本発明の実施態様として、前記治療剤がアンチセンス核酸分子である。
ここで用いられる場合、「アンチセンス核酸分子」又は「アンチセンス」という用語は、特定の遺伝子を構成するＤＮＡに又はその遺伝子のｍＲＮＡ転写物に、生理的条件下でハイブリダイズし、それにより遺伝子の転写及び／又はそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する核酸を表す。アンチセンス分子は、ターゲット遺伝子とハイブリダイズする際に、そのターゲット遺伝子の転写や翻訳を妨げるように設計されている。アンチセンス核酸の正確な長さやそのターゲットとの相補性の程度が、選択された特定のターゲットに依存し、これにはターゲットの配列およびその配列を構成する特定の塩基を含むことを当業者は理解するであろう。
【００３７】
アンチセンス核酸は生理的条件下でターゲットに選択的に結合するように、換言すれば生理的条件下で、ターゲット細胞中の他のどの配列よりも実質上よりターゲット配列にハイブリダイズするように構築及び編成されるのが好ましい。
【００３８】
遺伝子又はｍＲＮＡ転写物のどの領域に対するアンチセンスとなる核酸が置換されてもよいが、好ましい実施形態では、アンチセンス核酸が翻訳開始部位、転写開始部位又はプロモータ部位のようなＮ末端又は５’上流部位に一致するものである。加えて、３’側の非翻訳領域がターゲットであってもよい。３’側の非翻訳領域は、ｍＲＮＡを安定化に関連したタンパク質に対する結合部位として作用するシス作用性配列を含むものとして知られている。これらのシス作用性部位は、前記安定化タンパク質を結合させる機能を果たすヘアループ構造をしばしば形成する。安定化調整のこの形状のよく知られている例は、ヒストンｍＲＮＡのものにより示され、その多くは少なくとも部分的に、転写後的に調節される。
【００３９】
本発明は、従って、特定のターゲット配列、例えば、細胞周期調整遺伝子（例えば、ｐ２１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＮＭ＿０７８４６７、ｃ−ｍｙｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ｄ１０４９３及びＤ９０４６７）、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質、ｐ１６（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＮＭ０５８１９６）、ｐ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＢＣ００２０１０）、ｐ１８（マウス配列  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＢＣ０２７０２６）又はｐ１９（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＮＭ＿０７９４２１）およびカベオリンのようなアポトーシス阻害物質に対するアンチセンス核酸を組み込むことにより改変させたバキュロウィルスゲノムを意図している。
【００４０】
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記治療剤が二重鎖ＲＮＡ分子である。この実施態様において、バキュロウィルスゲノムは、上流（すなわち核酸分子の５’側）に位置する最初のプロモータ及び下流（すなわち核酸分子の３’側）に位置する二番目のプロモータの制御下で核酸分子を含みうる。プロモータの方向はセンス及びアンチセンス核酸分子の双方が生成されるようになっている。
【００４１】
遺伝子機能を特異的に除去する技術は、二重鎖ＲＮＡ、これを阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも言うが、これを細胞に導入することを通してなされ、その結果、ＲＮＡｉ分子に含まれた配列に相補的なｍＲＮＡの破壊が生じる。ＲＮＡｉ分子は、二重鎖ＲＮＡ分子を形成するため、お互いにアニール化した２つの相補的なＲＮＡ鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）で構成されている。ＲＮＡｉ分子は、一般に切除されるべき遺伝子のエキソンもしくはコード配列に由来する。あるいは前記ＲＮＡｉ分子は、遺伝子のコード配列／エキソン配列に隣接するイントロン配列又は５’及び／又は３’側の非コード配列に由来する。最近の研究では、コード配列に由来する１００−１０００ｂｐの範囲のＲＮＡｉ分子が遺伝子発現の効果的な阻害物質となることが示されている。驚くことに、ＲＮＡｉのわずかな分子が、作用機序が触媒的であることを示す遺伝子発現を阻止するのに必要である。ＲＮＡ合成又はプロセッシングの間にその影響を及ぼすことを示す細胞の細胞質において、いずれのＲＮＡｉが検出可能な場合、作用部位はいくらか不明であるようだ。
【００４２】
この現象を説明する理論は存在するが、ＲＮＡｉ作用の正確な作用機序は知られていない。例えば、すべての生体は、外因性遺伝子発現の影響を制限する保護的作用機序を進化させてきた。例えばウィルスは、しばしば感染した生体に有害な影響を引き起こす。ウィルス遺伝子発現及び／又は複製は、それゆえ抑制する必要がある。加えて、遺伝的形質転換の急速な発展並びにトランスジェニック動物及び植物の供給は、導入遺伝子がまた外来の核酸として認識され、膨化現象（Singer and Selker, Curr Top Microbiol.Immunol.1995;197:165-77)、ジーンサイレンス現象（Matzkeand Matzke, Novartis Found Symp.1998;214:168-80;discussion 181-6.Review)、同時抑制（Stam et.al.,.Plant J.2000;21(1)27-42)といわれる様々な現象に付されるという認識を導いてきた。
【００４３】
さらに好ましい実施形態では、前記治療剤がリボザイムである。
リボザイムは、本技術分野ではよく知られている触媒活性があるＲＮＡである。リボザイムは、基質ＲＮＡにハイブリダイズする配列と近くの隣接配列を有する触媒中心部を含む。もっとも簡素な触媒中心部は、ハンマーヘッドとして知られるＲＮＡモチーフである。触媒ＲＮＡが発見されて以来、疾患遺伝子のｍＲＮＡを選択的に除去することができるターゲット化遺伝子機能を有するリボザイムを設計することが切望されてきた。
【００４４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、バキュロウィルスゲノムは、少なくとも1種の細胞タイプの細胞表面にバキュロウィルスを結合するポリペプチドをコードする核酸分子を含んでいる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸が以下の群、すなわちＧｎＲＨ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．ｎｏ：Ｌ０３３８０）、線維芽細胞成長因子；インスリン及びインスリン様成長因子；ニューロテンシン血小板由来成長因子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．ｎｏ：ＮＭ＿００２６０９およびＮＭ＿００６２０６）；ソマトスタチン（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．ｎｏ：ＢＣ０３２６２５）から選択されたポリペプチドをコードする核酸である。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態は、前記ポリペプチドをコードする核酸は、前記ポリペプチドをバキュロウィルスのキャプシドポリペプチドに融合する部位で、バキュロウィルスゲノムへ挿入される。好ましくは、キャプシドポリペプチドはｇｐ６４である。
【００４７】
都合のいいことに、キャプシドポリペプチドにターゲッティングポリペプチドを融合することは、バキュロウィルス粒子表面でのそれの提示をもたらし、それにより前記細胞タイプにバキュロウィルスを提示し、それにより細胞ターゲッティングを容易にする。
【００４８】
本発明の更なる態様によれば、すべての先の発明の態様もしくは実施形態によるバキュロウィルスを含む医薬組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、癌、理想的には前立腺癌の治療用医薬の製造における使用のものである。
【００４９】
またさらなる本発明の態様によれば、本発明によるバキュロウィルスの治療上効果的な量の投与を含む治療方法を提供する。
本発明の好ましい方法では、前記治療は癌、より好ましくは前立腺癌である。
本発明の実施態様はここで、以下の材料、方法、ベクター及び図を参照して、例によってのみ示される。
【実施例】
【００５０】
材料及び方法
標的バキュロウィルスは、（ｉ）バクテリアプラスミド内での導入ベクターの生成、このプラスミドはバクテリア内で増殖し、そのＤＮＡ配列が組換えＤＮＡ配列の挿入を立証するために決定され；（ｉｉ）ｇｐ６４組換え体のどちらかの側における相同性非必須領域を介して、レシピエント昆虫細胞（ｓｆ９もしくはｓｆ２１）中へ同時トランスフェクションにより多切断されたＢｖゲノムへの導入ベクターの組換え、という２段階でつくられる。
【００５１】
実験手順の一例は以下の通りである。
ＧｎＲＨ及びニューロスタチンレセプターに結合する、レセプターに必要とされた最小ペプチドをコードするＤＮＡ配列が決定され、両鎖についてＤＮＡオリゴヌクレオチドが化学的に合成され、これは、pBACsurfベクターへの挿入を容易にするためにＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる（図４）。合成されたオリゴヌクレオチドは、それから、これらの制限エンドヌクレアーゼ部位を介して、ｐＢＡＣｓｕｒｆベクターに連結された。このペプチドの配列及びベクターのマップは後に示す。図５及び図６を参照。
【００５２】
ＧｎＲＨペプチドコード配列
ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＴＡＣＧＧＣＴＴＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣ
ＧｎＲＨアミノ酸配列
ＬｅｕＧｌｎＧｌｎＨｉｓＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｙＡｌａＶａｌ
ニューロスタチンペプチドコード配列
ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＡＣＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＴＡＣＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣ
ニューロスタチンペプチド
ＬｅｕＧｌｎＧｌｕＬｅｕＴｙｒＧｌｕＡｓｎＬｙｓＰｒｏＡｒｇＡｒｇＰｒｏＴｙｒＩｌｅＬｅｕＡｌａＶａｌ
【００５３】
構築物についての全ＤＮＡ配列データは、最終構成物、とりわけｇｐ６４融合タンパク質のセグメントについて入手可能であろう。
【００５４】
配列されたプラスミドは、それから、ｓｆ２１細胞への同時トランスフェクションによりBacvector-1000 Triple cut baculovirus DNA (Novagan)へ組み換えられる。その結果生じたバキュロウィルスは、組換えが起こった場合には単に生存可能であり、天然ｇｐ６４遺伝子座において挿入が起こらないので、、ｇｐ６４遺伝子について２倍体になる。これは、バキュロウィルスの高い感染性を維持するために必須であり、他の系、例えばＨＩＶにおいて観察されており、そこでenvタンパク質の改変が起こりうる。
【００５５】
pBACsurfベクターの更なる改変は、双方のヒト化配列（すなわち、ヒトプロモータ及び細胞表面付着配列）についての１回の組換え工程を容易にするために行われ、それにより第２のクローニング部位（ＭＣＳ２）が、組換え領域に挿入された。これは独特の（すなわち、このプラスミドに対して単一の切断部）ＲＥ部位を含んでいる。これは以下に示される。
【００５６】
多組換えを誘導する他の方法は、単独改変pBACsurfを有するプロモータベクターpBACMAN2とBacvector-1000 Triple cut baculovirus DNAとをsf21昆虫細胞へ同時トランスフェクトすること及びポリメラーゼ連鎖反応により二重組換えのウィルスについて選別することである。これは、pBACsurf(MCS2)ベクターの容量が限られているので、大きな（＞３ｋｂ）プロモータフラグメントを挿入するときに選択する方法である。従って、組換えプラーク由来のウィルスＤＮＡは、野生種のＰＣＲ産生物及び挿入組換え体由来の大きな産生物により特徴付けられる。挿入の意義は、精製したＰＣＲ産物の直接的なＤＮＡの配列の決定により立証される。
【００５７】
プロモータフラグメントは、ハイブリッドＣＡＧプロモータ（ＣＭＶエンハンサー（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＡＦ４７７２００））、鶏ベータアクチンプロモータ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ｅ０２１９９）及びウサギベータグロブリンターミナーター（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＡＸ４５１７０６）を置換するために、pBACMAMベクターに挿入される。これを容易にするために、一般的な挿入構築物は、ｐＴ７ブルーベクターで準備され、これにより、そのプロモータはいずれかの指標遺伝子（エンハンストグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ｕ５７６０９）、又は共通のバクテリア指標クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ若しくはＣＡＴの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：Ｄ１４６４１）に融合したＥＧＦＰからなるハイブリッドのような、ヒト細胞で活性についてのもの）の上流に挿入される。この構築物は、ｐＴ７ブルーキャリアから切除され、ＳｐｈＩ ／ＳｗａＩ とＨｉｎｄIII／ＢｃII部位を介してpBACMAMベクターへ挿入される。pBACMAMベクターの多クローニング部位の使用（従って、ＢｇｌII、ＳｔｕI、Ｓａｅ８３８７、ＮｏｔI、ＫｐｎI、ＳｍａI、Ｂｓｕ３６そしてＭａｃI部位は保持している）、及びウサギベータグロブリンターミネーター（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃ．♯：ＡＸ４５１７０６）の上流へプロモータ構築物を挿入することも可能である。
【００５８】
遺伝子地図はＧｅｎｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｔｅｘｃｏ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で作られる。
【００５９】
（実施例１）
１種の昆虫及び２種のヒト細胞株（表９）を感染するのに使用したバキュロウィルスは、強力な哺乳類ＣＡＧプロモータの制御の下で、ＥＧＦＰレポーター遺伝子運ぶように処理された組換えＡｃＭＮＰＶである。ヒト細胞は、蛍光顕微鏡を用いて、ＥＧＦＰ発現を視覚化して（図１）、４８時間後の感染を調べた。意義深いことに、視覚化した検査は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞へのin vitroでの感染の効率が、２９３細胞のものと等価であったことを示唆している（フローサイトメトリー解析で２５％、データは示していない）。はっきりとしたＥＧＦＰ発現は、昆虫Ｓｆ−９細胞中のＣＡＧプロモータからは見られない（データは示していない）。全ＲＮＡはすべての細胞から抽出し、バキュロウィルスｍＲＮＡに対して設計された６セットのプライマーに、ヒト細胞についてのポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨプライマーを加えたものを用いて、ＲＴーＰＣＲを実行した。
【００６０】
ｓｆ９細胞において、調べられた６つの遺伝子の中から４つの発現が、ＲＴ−ＰＣＲによって、感染していない細胞では検出されなかったが感染した細胞では検出され（図２）、これは、バキュロウィルス特有の発現であることを示していた。この例外は、ユビキチン遺伝子とｅｇｔ遺伝子である。バキュロウィルスユビキチンに対して設計されたプライマーを用いて、非感染細胞では発現水準が非常に低いが、感染昆虫細胞と非感染昆虫細胞の双方においてユビキチンの発現が検出された（図２）。これは、ユビキチンが高度に保存された分子であるという点において説明でき、同じ大きさのＲＴ−ＰＣＲ産物を生成するために、昆虫ユビキチンとバキュロウィルスユビキチンとの間に十分な相同性があるのかもしれない。バキュロウィルスユビキチンは、実際には、進化の間に昆虫細胞宿主由来であったかもしれない可能性もある。もう一方の例外は、感染及び非感染細胞のどちらでも発現しなかったｅｇｔ遺伝子であった（図２）。ｅｇｔは、幼生期の脱皮を避けるために、バキュロウィルスのライフサイクルのかなり初期に発現され、そしてｓｆ９細胞は蛹の卵巣組織に由来している。それゆえ、蛹の段階では見い出せず、またｅｇｔ発現に必要な要因が宿主の幼生形に存在すると仮定できる。
【００６１】
（実施例２）
ヒト細胞での発現解析のため、２９３ヒト胚腎細胞株が、その報告されているバキュロウィルスによる感染の容易性（Condreay JP, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999;96:127-132;Boyce FM, Bucher NLR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996;93:2348-2352)、および発現を誘発されうる広い範囲の遺伝子のために選択された。加えて、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株（リンパ節転移癌細胞由来）は、前立腺癌遺伝子治療のモデルとして、とりわけこれらの細胞は、リポソーム主体技術によって形質導入することが難しいために選択された。これらの双方の細胞株についてのＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＧＡＧ制御ＥＧＦＰの高い発現レベルにもかかわらず、調べた６つの遺伝子のいずれも、双方の細胞株の非感染もしくは感染細胞でも発現しないことを示している（図３）。ハウスキーピング遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ、Ｇ３ＰＤＨが、かなり少ないＰＣＲサイクル（バキュロウィルスのｍＲＮＡをスクリーニングするときは３５サイクルであるのと比較して２５サイクル）を用いて、双方の細胞株における非感染及び感染細胞にも見出せた。これらの結果は、バキュロウィルスに見られる内生遺伝子の代表的な部分（そのほとんどが、通常のバキュロウィルス真核細胞宿主環境下で高度に発現し、また必須ヒト細胞プロセスと相互作用する）が、このウィルスがヒト細胞への感染に用いられる場合は発現しないことを示している。対照的に、哺乳類プロモータの制御下で、レポーター遺伝子から効率的にタンパク質は生成される。バキュロウィルスの遺伝子発現もゲノムの取込みも複雑でなさそうなため、このバキュロウィルスのヒト細胞での発現欠落が、バキュロウィルスの遺伝子治療のベクターとして、とりわけ一過性自己不活性化遺伝子プロトコールとして、安全性の更なる基礎となる。
【００６２】
【表１】
2005502343.tif 000002
【００６３】
【表２】
2005502343.tif 000003
【００６４】
【表３】
2005502343.tif 000004
【００６５】
【表４】
2005502343.tif 000005
【００６６】
【表５】
2005502343.tif 000006
【００６７】
【表６】
2005502343.tif 000007
【００６８】
【表７】
2005502343.tif 000008
【００６９】
【表８】
2005502343.tif 000009
【００７０】
【表９】
2005502343.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、バキュロウィルスを基盤とするベクターＡｃＭＮＰＶのレポーター遺伝子発現を表している。
【図２】図２は、挿入した細胞ｓｆ９内で、バキュロウィルスのＡｃＭＮＰＶの発現を表している。
【図３】図３は、哺乳類細胞におけるバキュロウィルスのコードした遺伝子発現の欠落を表している。
【図４】図４は、バキュロウィルスベクター、ｐＢＡｓｕｒｆ−１  ＭＣＳ２を表している。
【図５】図５は、バキュロウィルスベクター、ｐＢＡｓｕｒｆ−１  ＧｎＲＨ（ＭＫII）を表している。
【図６】図６は、バキュロウィルスベクター、ｐＢａｃＭａｍ２  ＥＧＦＰを表している。
【図１】
2005502343.tif 000011
【図２】
2005502343.tif 000012
【図３】
2005502343.tif 000013
【図４】
2005502343.tif 000014
【図５】
2005502343.tif 000015
【図６】
2005502343.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2005502343.tif 000017
2005502343.tif 000018
2005502343.tif 000019
2005502343.tif 000020
2005502343.tif 000021
2005502343.tif 000022
2005502343.tif 000023
2005502343.tif 000024
2005502343.tif 000025
2005502343.tif 000026
2005502343.tif 000027
2005502343.tif 000028
2005502343.tif 000029
2005502343.tif 000030
2005502343.tif 000031
2005502343.tif 000032
2005502343.tif 000033
2005502343.tif 000034
2005502343.tif 000035
2005502343.tif 000036
2005502343.tif 000037
2005502343.tif 000038
2005502343.tif 000039
2005502343.tif 000040
2005502343.tif 000041
2005502343.tif 000042
2005502343.tif 000043
2005502343.tif 000044
2005502343.tif 000045
2005502343.tif 000046
2005502343.tif 000047
2005502343.tif 000048
2005502343.tif 000049
2005502343.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502343.tif 000051
【国際調査報告】
2005502343.tif 000052
2005502343.tif 000053
2005502343.tif 000054
2005502343.tif 000055
2005502343.tif 000056
2005502343.tif 000057