(57)【要約】【課題】  本発明は、酵素活性、特に酵素開裂及び結合活性を測定するための蛍光法、並びに酵素活性測定用並びにインビトロ及びインビボ撮影プローブとして有用な蛍光原基質の提供。【解決手段】  １以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むポリマーに結合した１種以上の蛍光標識を含み、該部分が酵素で開裂可能な結合基で１種以上の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する酵素の活性を測定する方法であって、ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で基質の１種以上の標識の蛍光寿命を測定し、ii）反応混合物に酵素を添加し、iii）段階ii）の後に１種以上の蛍光標識の蛍光寿命の増加を測定する。蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、これを用いて酵素活性を測定できる。
2005527212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むポリマーに結合した１種以上の蛍光標識を含み、前記部分が酵素で開裂可能な結合基で前記１種以上の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する前記酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で基質の１種以上の標識の蛍光寿命を測定する段階、
ii）前記反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に１種以上の蛍光標識の蛍光寿命の増加を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法。
【請求項２】
１以上のフェノキシ又はインドリル部分を含むポリマーに結合した１種以上の蛍光標識を含み、前記部分が酵素で開裂可能な結合基で前記１種以上の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する前記酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で基質の１種以上の標識の蛍光強度を測定する段階、
ii）前記反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に１種以上の蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光強度の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法。
【請求項３】
蛍光標識が次式のアクリドン染料である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【化１】
2005527212.tif 000007
（式中、
Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合していると共に、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は１又は２の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子から選択される５又は６の原子を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）及び−(ＣＨ2−)nＹ基（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である。）から独立に選択される。）
【請求項４】
蛍光標識が次式のキナクリドン染料である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【化２】
2005527212.tif 000008
（式中、
Ｒ3及びＲ4基はＺ1環構造に結合していると共に、Ｒ5及びＲ6基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は１又は２の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子から選択される５又は６の原子を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）及び−(ＣＨ2−)nＹ基（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である。）から独立に選択される。）
【請求項５】
前記ポリマーが、好ましくはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ポリマーが４〜４０のアミノ酸残基を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記結合基がＥＣクラス３の酵素で開裂可能である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
酵素が、好ましくはエステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼ及びグリコシダーゼから選択されるヒドロラーゼ酵素である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチダーゼが、好ましくはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カスパーゼ、カテプシンＤ、キモトリプシン、ペプシン、ズブチリシン、プロテイナーゼＫ、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、ａｓｐ−ｎ、マトリックスメタロプロテイン１〜２０、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼ及びウロキーゼからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼが、好ましくはエキソデオキシリボヌクレアーゼIII（Ｅ．Ｃ．３．１．１１２）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．５）、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１５．１）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．１）、デオキシリボヌクレアーゼII（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．１）、リボヌクレアーゼＨ（Ｅ．Ｃ．３．１．２６．４）、リボヌクレアーゼＴ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．３）、膵臓リボヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．５）及びミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３１．１）からなる群から選択されるエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコシダーゼが、好ましくは−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）、グルカン１，４−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、エンド−１，３−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６）、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１０）及びリゾチーム（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７）からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）前記試験剤の存在下で請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下での前記酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での前記既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。
【請求項１３】
既知値が電子データベース上に保存されている、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下及び不存在下で請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下及び不存在下で前記酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。
【請求項１５】
試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における前記活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
酵素が好ましくは請求項８乃至請求項１１のいずれか１項に定義した酵素から選択される、請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１６のいずれか１項で定義される基質。
【請求項１８】
当該基質が、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹ、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＦ（ニトロ）、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＣＨＬＤＩＩＷ及び６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＲＰＫＰＶＥ（Ｎｖａ）ＷＲＫからなる群から選択される、請求項１７記載の基質。
【請求項１９】
前記基質がさらに細胞侵入性ペプチドを含む、請求項１７又は請求項１８記載の基質。
【請求項２０】
前記細胞侵入性ペプチドが好ましくはＴＡＴ及びＣｈａｒｉｏｔからなる群から選択される、請求項１９記載の基質。
【請求項２１】
生きた細胞が取り込むことのできる請求項１７乃至請求項２０のいずれか１項記載の基質の細胞内所在及び分布を測定する方法であって、
ｉ）無細胞環境中で標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）１以上の細胞に基質を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び／又は蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法。
【請求項２２】
前記細胞が哺乳類、植物、昆虫、魚類、鳥類、細菌及び真菌の細胞からなる群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
さらに、各々が複数の異なる標識に結合された複数の異なる基質を使用することを含んでなり、前記標識の各々がその固有の蛍光発光及び／又はその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能なことで、複数の酵素開裂活性の同時測定を可能にする、請求項１乃至請求項１６、請求項２１又は請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
標識が、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド）ヘキサン酸、６−（２−（アセトアミド）−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸及び６−（１２−エチル−７，１４−ジオキソ−２，９−ジスルホ−７，１４−ジヒドロキノ［２，３−ｂ］アクリジン−５（１２Ｈ）−イル）ヘキサン酸からなる群から選択される、請求項２３記載の基質。
【請求項２５】
請求項１７乃至請求項２０のいずれか１項記載の基質の、酵素開裂活性の測定用及び／又はインビトロ若しくはインビボ撮影プローブとしての使用。
【請求項２６】
ｉ）請求項１７乃至請求項２０のいずれか１項記載の基質、及び
ii）前記基質を開裂できる酵素
を含んでなるキット。
【請求項２７】
１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含む反応体への、１種以上の蛍光標識を含む基質の結合に関する酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）前記反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命の減少を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光強度及び／又は寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法。
【請求項２８】
反応体が１種以上の蛍光標識を含み、基質が１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
蛍光標識が、請求項３記載のアクリドン染料又は請求項４記載のキナクリドン染料である、請求項２７又は請求項２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
基質及び／又は反応体が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される、請求項２７乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
酵素がＥＣクラス６のリガーゼ又はＥＣクラス２のトランスフェラーゼである、請求項２７乃至請求項３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下で請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下での前記酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での前記既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。
【請求項３３】
既知値が電子データベース上に保存されている、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下及び不存在下で請求項２７乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下及び不存在下で前記酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法。
【請求項３５】
試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における前記活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
請求項２７乃至請求項３０のいずれか１項記載の基質及び／又は反応体。
【請求項３７】
前記基質及び／又は反応体がさらに細胞侵入性ペプチドを含む、請求項３６記載の基質及び／又は反応体。
【請求項３８】
前記細胞侵入性ペプチドが好ましくはＴＡＴ及びＣｈａｒｉｏｔからなる群から選択される、請求項３７記載の基質及び／又は反応体。
【請求項３９】
生きた細胞が取り込むことのできる請求項３６乃至請求項３８のいずれか１項記載の基質及び／又は反応体の細胞内所在及び／又は分布を測定する方法であって、
ｉ）無細胞環境中で標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）１以上の細胞に基質及び反応体を添加する段階、並びに
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び／又は蛍光寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法。
【請求項４０】
前記細胞が哺乳類、植物、昆虫、魚類、鳥類、細菌及び真菌の細胞からなる群から選択される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
さらに、各々が複数の異なる標識に結合された複数の異なる基質及び／又は反応体を使用することを含んでなり、前記標識の各々がその固有の蛍光発光及び／又はその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能なことで、複数の酵素結合活性の同時測定を可能にする、請求項２７乃至請求項３５及び請求項３９〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
標識が、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド）ヘキサン酸、６−（２−（アセトアミド）−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸及び６−（１２−エチル−７，１４−ジオキソ−２，９−ジスルホ−７，１４−ジヒドロキノ［２，３−ｂ］アクリジン−５（１２Ｈ）−イル）ヘキサン酸からなる群から選択される、請求項４１記載の基質。
【請求項４３】
請求項３６乃至請求項３８のいずれか１項記載の基質及び／又は反応体の、酵素結合活性の測定用及び／又はインビトロ若しくはインビボ撮影プローブとしての使用。
【請求項４４】
請求項３６乃至請求項３８のいずれか１項記載の基質及び反応体を含んでなる組成物。
【請求項４５】
ｉ）請求項３６乃至請求項３８のいずれか１項記載の基質及び反応体、並びに
ii）前記基質を前記反応体に結合できる酵素
を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性、特に開裂反応及び結合反応を測定するための蛍光ベースアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素活性、特に加水分解のような酵素開裂活性を測定するためのアッセイは、生物科学及び薬剤科学で広く使用されている。組合せ化学及び高処理量スクリーニングの出現と共に、酵素活性のモジュレーターとして有望なものを選別するための簡単で敏感でコスト効率のよいアッセイに対するニーズが増大している。製薬工業にとって特に興味深いのは、タンパク質分解酵素による開裂を検出する方法である。
【０００３】
蛍光ベースアッセイは、取扱いの簡単さ、感度、コスト及び自動化の容易さの点で、酵素開裂活性を測定するための放射線化学技術、ＥＬＩＳＡ、抗体技術及びさらに旧来の技術に比べて大きな利点をもたらす。即ち、例えば、開裂した場合に酵素活性の測定に使用できる蛍光染料（欧州特許出願公開第０２３１１２５号）を与える加水分解性の蛍光基質が当技術分野で知られている。タンパク質分解による蛍光原基の放出に従ってプロテアーゼ活性を測定するのに使用するための類似基質が、欧州特許出願公開第０００４２５６号に報告されている。合成消光基（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）によって分子内で消光されるペプチドは、撮影プローブとして有用であることが開示されている（例えば、国際公開第０２／０５６６７０号）。かかる蛍光原標識は酵素活性を測定するための効果的な手段を提供し得るが、これらは一般に長い波長（通例は５００〜６００ｎｍの領域内の波長）で検出可能である。
【０００４】
さらに最近に至り、同一分子上に供与体及び消光受容体を有する基質の使用を伴う蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイの応用に多大の関心が集まった。国際公開第９４／２８１６６号には、ポリペプチド基質に結合したかかるＦＲＥＴ標識の使用が報告されており、これはプロテアーゼによる加水分解後にさらに強い蛍光を生じる。欧州特許出願公開第０４２８０００号に開示された蛍光原基質でも同様な原理が使用されており、このペプチド基質はウィルスプロテアーゼで開裂可能な部位を有している。米国特許第５７０８１３７号にも、内部供与体及び受容体／消光基を含むウィルスプロテアーゼを検出するために蛍光原基質を使用することが開示されている。
【０００５】
また、ペプチドの蛍光標識及び消光を行うための方法も最近開示された。即ち、国際公開第０２／０８１５０９号には、蛍光標識したペプチド内で蛍光強度の内部消光を行うためにトリプトファン、チロシン又はヒスチジン残基を使用することが記載されている。かかるペプチドは、エンドペプチターゼ及びエキソペプチターゼ活性を検出するために使用できる。
【０００６】
スクリーニングアッセイでの使用に関しては、ＦＲＥＴ技術は単純な蛍光強度技術よりも高い感度及び信頼性をもたらすが、基質が複雑な性質を有するため、基質の製造及び精製コストがかなり高い。したがって、ＦＲＥＴ標識の製造は分析コスト及び／又は精製・材料コストの両方の点で困難である。さらに、通常の蛍光又はＦＲＥＴ標識を識別するための唯一の方法は、その吸収スペクトル及び発光スペクトルによるものである。
【０００７】
本発明で使用し得る蛍光寿命測定は、蛍光強度の定量のみに基づく通常の蛍光技術に比べて大きな利点をもたらす。蛍光寿命は同じスペクトル分解された強度信号から求められるが、さらに時間ドメイン中で分解される。蛍光寿命技術は、信号が「バックグラウンドノイズ」による影響をほとんど受けないので、さらに高度の識別を可能にする。この技術のさらに別の利点は、識別可能な寿命を有する標識を選択して多重化を可能にすることで複数の異なる事象を同時に測定できることである。その上、蛍光寿命の測定は濃度効果及び光漂白による影響を受けない。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０２３１１２５号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０００４２５６号
【特許文献３】国際公開第０２／０５６６７０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９４／２８１６６号パンフレット
【特許文献５】欧州特許出願公開第０４２８０００号
【特許文献６】米国特許第５７０８１３７号
【特許文献７】国際公開第０２／０８１５０９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、生物科学及び薬剤科学では、酵素開裂活性を測定するための改良された蛍光ベースアッセイに対するニーズが今なお存在している。かかるアッセイは、以下の属性の１以上、即ち高い感度、優れた信頼性、頑強さ、使用の簡単さ、低いコスト、自動化の容易さ、標識の特異性、及び／又は標識化合物を識別するための２以上の検出形態を有し得る。好ましくは、改良アッセイはこれらの特徴の２以上を示し、好ましくはこれらの特徴のすべてを示す。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ただ１種の蛍光標識及び酵素開裂可能な結合基を含む基質の開裂に関する酵素の活性を測定する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、酵素開裂活性に影響を及ぼし又はそれを調節する薬剤のスクリーニング方法を提供することにもある。本発明のさらに別の目的は、標識化合物の細胞内所在及び分布を測定する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、基質を反応体に結合するための酵素の活性を測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第一の態様では、１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含むポリマーに結合した１種以上の蛍光標識を含み、該部分が酵素で開裂可能な結合基で１種以上の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で基質の１種以上の標識の蛍光寿命を測定する段階、
ii）反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に１種以上の蛍光標識の蛍光寿命の増加を測定する段階
を含んでなり、前記蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
【００１２】
当業者であれば、本発明の第一の態様の方法は蛍光寿命を求めるために蛍光強度を測定することを含むことが理解されよう。
【００１３】
本発明の第二の態様では、１以上のフェノキシ又はインドリル部分を含むポリマーに結合した１種以上の蛍光標識を含み、該部分が酵素で開裂可能な結合基で１種以上の蛍光標識から隔てられている基質の開裂に関する酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で基質の１種以上の標識の蛍光強度を測定する段階、
ii）反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に１種以上の蛍光標識の蛍光強度の増加を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
好適には、第一及び／又は第二の態様に係る方法では、１種以上の蛍光標識は国際公開第０２／０９９４２４号に記載されたアクリドン系の染料から選択できる。
【００１５】
本発明の方法で使用するのに適したアクリドン染料は、下記一般式（Ｉ）の構造を有するものである。
【００１６】
【化１】
2005527212.tif 000003
【００１７】
式中、
Ｒ2及びＲ3基はＺ1環構造に結合していると共に、Ｒ4及びＲ5基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は１又は２の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子から選択される５又は６の原子を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）及び−(ＣＨ2−)nＹ基（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である。）から独立に選択される。
【００１８】
好適には、標的結合基Ｆは反応基又は官能基である。式（Ｉ）に係る蛍光染料の反応基は適当な条件下で基質の官能基と反応することができ、式（Ｉ）に係る化合物の官能基は適当な条件下で基質の反応基と反応することができる。これらの反応基及び官能基の働きにより、式（Ｉ）に係る蛍光染料は基質と反応して共有結合することができ、かくして基質は蛍光染料で標識される。
【００１９】
好ましくは、Ｆが反応基である場合、それはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド、ヒドラジド及びホスホルアミダイトからなる群から選択される。好ましくは、Ｆが官能基である場合、それはヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドやケトンを含むカルボニル、ホスフェート及びチオホスフェートから選択される。
【００２０】
好適には、蛍光標識は国際公開第０２／０９９４３２号に記載されたキナクリドン系の染料から選択できる。
【００２１】
本発明の第一及び／又は第二の態様の方法で使用するのに適したキナクリドン染料は、下記一般式（II）の構造を有するものである。
【００２２】
【化２】
2005527212.tif 000004
【００２３】
式中、
Ｒ3及びＲ4基はＺ1環構造に結合していると共に、Ｒ5及びＲ6基はＺ2環構造に結合しており、
Ｚ1及びＺ2は１又は２の縮合環芳香族系又はヘテロ芳香族系を完成するのに必要な原子を独立に表し、各環は炭素原子並びに任意には酸素、窒素及び硫黄から選択される２以下の原子から選択される５又は６の原子を有しており、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、水素、ハロゲン、アミド、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、モノ−又はジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル置換アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、カルボキシル、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ1〜Ｃ20アルキル、アラルキル、−Ｅ−Ｆ基（式中、Ｅは炭素、窒素、酸素、硫黄及びリン原子からなる群から選択される１〜６０の原子を含む鎖を有するスペーサー基であり、Ｆは標的結合基である。）及び−(ＣＨ2−)nＹ基（式中、Ｙはスルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四級アンモニウム及びカルボニルから選択され、ｎはゼロ又は１〜６の整数である。）から独立に選択される。
【００２４】
好適には、標的結合基Ｆは反応基又は官能基である。式（II）に係る蛍光染料の反応基は適当な条件下で基質の官能基と反応することができ、式（II）に係る化合物の官能基は適当な条件下で基質の反応基と反応することができる。これらの反応基及び官能基の働きにより、式（II）に係る蛍光染料は基質と反応して共有結合することができ、かくして基質は蛍光染料で標識される。
【００２５】
好ましくは、Ｆが反応基である場合、それはスクシンイミジルエステル、スルホ−スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、マレイミド、ハロアセトアミド、酸ハライド、ビニルスルホン、ジクロロトリアジン、カルボジイミド、ヒドラジド及びホスホルアミダイトからなる群から選択される。好ましくは、Ｆが官能基である場合、それはヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、イミダゾール、アルデヒドやケトンを含むカルボニル、ホスフェート及びチオホスフェートから選択される。
【００２６】
アクリドン染料及びキナクリドン染料の好ましい例（並びにこれらの対応する寿命（ナノ秒））を、そのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）エステルの形態の化合物（III）、（IV）、（Ｖ）、（VI）及び（VII）として表１中に示す。
【００２７】
【表１】
2005527212.tif 000005
【００２８】
本発明に係るポリマーに結合し得る範囲の蛍光標識は、商業的に入手できる。その例には、特に限定されないが、国際公開第０２／０８１５０９号に記載されているようなオキサジン誘導体（例えば、ＭＲ１２１、ＪＡ２４２、ＪＡ２４３）及びローダミン誘導体（例えば、ＪＡ１６５、ＪＡ１６７、ＪＡ１６９）がある。（国際公開第０２／０５６６７０号に記載されているような）他の例には、特に限定されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＩＲＤ４１及びＩＲＤ７００（Ｌｉｃｏｒ）、ＮＩＲ−１及びＩＣ５−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６６０及びＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６８０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＬａＪｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ（Ｄｉａｔｒｏｎ）、ＦＡＲ−Ｂｌｕｅ、ＦＡＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｏｎｅ及びＦＡＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｔｗｏ（Ｉｎｎｏｓｅｎｓｅ）、ＡＤＳ７９０−ＮＳ及びＡＤＳ８２１−ＮＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ）、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）及びその類似体（米国特許第５９６８４７９号）、インドトリカルボシアニン（ＩＴＣ、国際公開第９８／４７５３８号）、フルオレセント・クォンタム・ドッツ（硫化亜鉛封鎖セレン化カドミウムナノ結晶−ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  Ｃｏｒｐ．）並びにキレート化ランタニド化合物（蛍光ランタニド金属にはユウロピウム及びテルビウムがある）がある。
【００２９】
蛍光標識は、適当なアミノ酸位置での直接標識のような各種の方法で基質に結合できる。標識に関して最も重要なアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、システイン、ヒスチジン及びチロシンのような電離性側鎖を有するものである。標識試薬は、蛍光を与える基と、標的との結合に関与する反応基とを共に含んでいる。最も普通に使用される官能基の若干例は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド及びＮＨＳエステルのような、アシル化又はアルキル化でアミンと反応するものである。主としてシステイン残基の遊離スルフヒドリル基で標識を行う（ハロアセテート及びマレイミドのような）チオ指向基も有用性を有している。
【００３０】
合成ペプチドの特定部位での標識を達成するために、数多くのプロトコルが考案されてきた（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年））。反応染料は公知であり、ｐＨ９の弱炭酸塩緩衝液中又は非水性環境中でポリペプチドに結合できるアクリドン染料のＮＨＳエステルを含んでいる。
【００３１】
好適には、ポリマーは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される。好ましくは、ペプチドは４〜４０のアミノ酸残基を含む。
【００３２】
第一又は第二の態様の好ましい実施形態では、ペプチドはプロテアーゼ消化に耐えるアミノ酸のＤ−異性体を含み得る。この場合、開裂部位はタンパク質分解活性に対して感受性を有するアミノ酸のＬ−異性体のみからなる。
【００３３】
好適には、結合基はＥｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（Ｅ．Ｃ．）クラス３からの酵素で開裂可能である。酵素分類の完全なリストは、ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅにある「国際生化学・分子生物学連合の命名委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」のウェブページ上に見出すことができる。好ましくは、酵素は、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼ及びグリコシダーゼからなる群から選択されるヒドロラーゼ酵素である。
【００３４】
第一又は第二の態様の好ましい実施形態では、酵素はＥ．Ｃ．クラス３．４から選択されるペプチダーゼである。さらに好ましくは、酵素は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カスパーゼ、カテプシンＤ、キモトリプシン、ペプシン、ズブチリシン、プロテイナーゼＫ、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、ａｓｐ−ｎ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１〜２０、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼ及びウロキーゼからなる群から選択される。
【００３５】
第一又は第二の態様の別の実施形態では、酵素は好ましくはＥＣクラス３．１からなる群から選択されるヌクレアーゼである。さらに好ましくは、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼからなる群から選択される。代表的なヌクレアーゼには、エキソデオキシリボヌクレアーゼIII（Ｅ．Ｃ．３．１．１１２）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．５）、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１５．１）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．１）、デオキシリボヌクレアーゼII（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．１）、リボヌクレアーゼＨ（Ｅ．Ｃ．３．１．２６．４）、リボヌクレアーゼＴ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．３）、膵臓リボヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．５）及びミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３１．１）がある。
【００３６】
別の実施形態では、酵素は好ましくはＥ．Ｃ．クラス３．２．１からなる群から選択されるグリコシダーゼである。さらに好ましくは、グリコシダーゼは、−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）、グルカン１，４−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、エンド−１，３−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６）、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１０）及びリゾチーム（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７）からなる群から選択される。
【００３７】
本発明の第三の態様では、基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下での酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
【００３８】
試験剤は、例えば、合成分子又は天然物（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド）のような任意の有機又は無機化合物であり得るか、或いはエネルギー形態（例えば、光又は熱又は他の形態の電磁放射）であり得る。プロテアーゼ活性の阻害剤は、本発明の第三の態様の方法を用いて検出できる。例えば、既知の阻害剤であるペプスタチンＡは、本発明の方法を用いれば、カテプシンＤ酵素活性を阻害することが容易に証明できる。即ち、１２ｎＭのペプスタチンＡの存在下では、カテプシンＤ活性は阻害剤の不存在下に比べて約５分の１に低下する（図７）。
【００３９】
好適には、既知値は電子データベース上に保存されている。任意には、この値を（例えば、酵素の１００％活性を表すように）基準化し、試験剤の存在下での酵素の基準化された活性と比較することができる。このようにすれば、酵素活性に対して一定の最小量だけ影響を及ぼす試験剤のみを、以後の評価のために選択することができる。
【００４０】
本発明の第四の態様に従えば、基質の開裂についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下及び不存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下及び不存在下で酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
【００４１】
好適には、試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される。即ち、例えば、活性の差を電子データベース上にパーセント阻害率（又はパーセント賦活率）として保存し、この値を問題の酵素の標準的な阻害剤に関する対応値と比較することができる。このようにすれば、（例えば、参照化合物と同等又はそれ以上に有効なものとして）一定の所定閾値を満たす試験剤のみを、以後の試験のための興味の対象として選択することができる。
【００４２】
好適には、酵素は、エステラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、ヌクレアーゼ及びグリコシダーゼからなる群から選択されるヒドロラーゼ酵素である。
【００４３】
第三又は第四の態様の好ましい実施形態では、酵素はＥ．Ｃ．クラス３．４から選択されるペプチダーゼである。さらに好ましくは、酵素は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、カスパーゼ、カテプシンＤ、ズブチリシン、キモトリプシン、ペプシン、プロテイナーゼＫ、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、ａｓｐ−ｎ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１〜２０、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼ及びウロキーゼからなる群から選択される。
【００４４】
第三又は第四の態様の別の実施形態では、酵素は好ましくはＥＣクラス３．１からなる群から選択されるヌクレアーゼである。さらに好ましくは、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼからなる群から選択される。代表的なヌクレアーゼには、エキソデオキシリボヌクレアーゼIII（Ｅ．Ｃ．３．１．１１２）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．１）、エキソデオキシリボヌクレアーゼＶ（Ｅ．Ｃ．３．１．１１．５）、ヘビ毒エキソヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１５．１）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．１．２１．１）、デオキシリボヌクレアーゼII（Ｅ．Ｃ．３．１．２２．１）、リボヌクレアーゼＨ（Ｅ．Ｃ．３．１．２６．４）、リボヌクレアーゼＴ１（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．３）、膵臓リボヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２７．５）及びミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３１．１）がある。
【００４５】
第三又は第四の態様の別の実施形態では、酵素は好ましくはＥ．Ｃ．クラス３．２．１からなる群から選択されるグリコシダーゼである。さらに好ましくは、グリコシダーゼは、−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）、グルカン１，４−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）、エンド−１，３−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６）、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１０）及びリゾチーム（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７）からなる群から選択される。
【００４６】
本発明に係るアッセイ方法は、好ましくはマルチウェルプレート（例えば、２４、９６、３８４又はそれより高い密度のウェル（例えば、８６４又は１５３６のウェル）を有するマイクロタイタープレート）のウェル内で実施される。別法として、アッセイチューブ内又は多流体装置のマイクロチャンネル内でアッセイを行うこともできる。典型的なアッセイでは、興味の対象である基質を含む試料をウェル内で反応混合物と混合する。反応は酵素の添加で開始させる。一定時間にわたって反応を進行させ、停止試薬（例えば、ＥＤＴＡ）で停止させる。
【００４７】
反応混合物は、かかるプレートのウェル内に予め分注できる。
【００４８】
通例、酵素アッセイは「停止」条件下で実施される。これは、反応を所定時間にわたって進行させ、次いで停止試薬で停止させることを意味する。停止試薬の本性は、通例は酵素の強い阻害剤であり、大抵は非特異的である。例えば、酵素活性のために通常存在する金属イオンを封鎖するためにＥＤＴＡが使用される。第一及び第三の態様の実施形態では、試験化合物の存在下及び不存在下での酵素活性のアッセイは連続測定下で実施できる。標識基質の蛍光強度及び／又は寿命は連続的に監視され、連続的に変化するのを見ることができるので、標識基質を酵素反応の生成物から分離する必要はない。このようにして反応の時間的経過が得られ、したがって速度論的研究をリアルタイムで行うことができる。
【００４９】
一般に、アッセイは幾つかの成分、通例は酵素、基質、金属イオン、緩衝塩、及び恐らくは試験用又は標準の阻害剤化合物からなっている。
【００５０】
さらに、低率の有機溶剤（例えば、ＤＭＳＯ）の存在下でアッセイを行うことが必要な場合もある。本発明では、決定的な成分は省きながら、任意の試薬を任意の順序で混合物に添加することが可能である。次いで、この種の反応を非特異的な効果について監視することができる。また、以後の制御のため、酵素を用いないで混合物を構成することも可能である。次に、反応の性質上、最終成分を添加し、リアルタイムで変化を監視するか、或いはその後のある時点で反応を停止させることで変化を監視することが可能である。
【００５１】
また、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、膣液及び精液のような各種の体液についてアッセイを行うこともできる。生物学的試料は、例えば、生物全体又は生物の一部から調製したホモジネート、溶解物又は抽出物であり得る。さらに、真核細胞又は原核細胞を増殖させることが可能な場合には、栄養ブイヨン又は類似の培養液のような培地中でアッセイを行うことも可能である。
【００５２】
典型例では、酵素はマトリックスメタロプロテイナーゼであり、基質はこの酵素で開裂可能な結合基を有する特定のペプチドである。アッセイは、マイクロタイタープレート中において、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、５０ｍＭトリス、２５０ｎＭ基質及び１０Ｍ  ＺｎＣｌ2（ｐＨ７．２）の水性環境で実施される。基質は、Ｋｍ以下である最適濃度（通例は０．１〜１００μＭ）で存在する。他の補因子は、所定の酵素に対する適当な濃度（例えば、通例は１〜１０ｍＭの濃度）で存在すればよい。典型的な蛍光標識は６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸（寿命１４ｎｓ）であるが、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド）ヘキサン酸（寿命４ｎｓ）、６−（２−（アセトアミド）−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸（寿命１７ｎｓ）、６−（２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸（寿命８ｎｓ）及び／又は６−（１２−エチル−７，１４−ジオキソ−２，９−ジスルホ−７，１４−ジヒドロキノ［２，３−ｂ］アクリジン−５（１２Ｈ）−イル）ヘキサン酸のような他の例も使用できる。
【００５３】
ペプチド基質は、標識の寿命の差に基づき、開裂生成物から容易に識別できる。強度及び寿命の変化を監視することで、このアッセイに対する二重パラメーター当てはめを得ることができる。これは多くの利点をもたらす。例えば、アッセイの生物学的挙動を生成物に特有の寿命の出現で確認できると共に、生成物の強度を監視できる。別の利点は、基質をその特有の寿命で監視できると共に、基質の強度が減少するのを見られることである。さらに、各化学種の強度の間の定量的関係を測定すると共に、反応のオンライン・リアルタイム監視のため濃度単位に直接変換することも可能である。
【００５４】
好適には、通常の検出方法を用いて標識の蛍光強度及び／又は寿命を測定できる。これらの方法は、検出装置として光電子増倍管を用いる計測器を含んでいる。これらの方法を用いれば、例えば下記のような幾つかのアプローチが可能である。
【００５５】
ｉ）時間相関単一光子計数に基づく方法（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（第４章），Ｊ  Ｒ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ編，第二版，１９９９年，Ｋｌｕｗｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００５６】
ii）周波数ドメイン／位相変調に基づく方法（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（第５章），Ｊ  Ｒ  Ｌａｋｏｗｉｃｚ編，第二版，１９９９年，Ｋｌｕｗｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００５７】
iii）時間ゲーティングに基づく方法（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２７（２），３０２−３０８を参照されたい）。
【００５８】
蛍光強度の測定は、マルチウェルプレートのすべてのウェルを撮影するための電荷共役素子（ＣＣＤ）撮像装置（例えば、走査撮像装置又は領域撮像装置）によって行うことができる。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（商標）システムは、高密度マイクロタイタープレートを１回パスで撮影できるＣＣＤカメラを備えている。撮影は定量的で迅速であり、撮影用途のために適した計測方法は現在ではマルチウェルプレート全体も同時に撮影できる。
【００５９】
本発明の第五の態様では、上述したような基質が提供される。サーモリシン用の代表的な基質は、例えば６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹであり、Ａｓｐ−ｎ用の代表的な基質は、例えば６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＣＨＬＤＩＩＷであり、マトリックスメタロプロテイナーゼ３用の代表的な基質は、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＲＰＫＰＶＥ（Ｎｖａ）ＷＲＫである（いずれも１０ナノ秒の寿命を有するのに対し、その生成物は１４ナノ秒の寿命を有する）。
【００６０】
第五の発明の好ましい態様では、基質はさらに細胞侵入性ペプチドを含んでいる。細胞侵入性ペプチドは、好ましくはＴＡＴ及びＣｈａｒｉｏｔからなる群から選択される。国際公開第０１／４１８１１号に開示されているもののような他の細胞侵入性ペプチド、即ち「キャリヤー」ペプチドも使用できる。この国際公開では、キャリヤーペプチドは１０〜１５のアミノ酸を含み、フランキングアミノ酸配列に隣接した３〜５の疎水性アミノ酸のコア配列を有している。疎水性コアはプロリン又はロイシン残基を含んでいる。好ましくは、コア配列は−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−、−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−、−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−及び−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕからなる群から選択される。
【００６１】
細胞侵入性ペプチド又はシグナルペプチドは、その性質が疎水性である共通のコアモチーフを共有しており、細胞膜を通してのペプチド及びタンパク質の移動を媒介することができる。生物学的分子及び治療用分子の細胞内取込みを容易にするためにかかるペプチドを使用することは、当技術分野で公知である。即ち、例えば米国特許第５８０７７４６号には、導入すべき分子を導入担当シグナルペプチドに結合してなる複合体を投与することで、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質及び治療剤のような生物学的活性分子を導入する方法が開示されている。同じく、Ｒｏｊａｓら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８），１６，３７０−３７５）は、タンパク質への膜移動配列の結合を記載している。膜移動配列は、カポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の疎水性領域から得られた１２アミノ酸の特定ペプチド配列である。また、Ｈａｗｉｇｅｒら（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９），８９−９４）は機能性ペプチド及びタンパク質を細胞内に送入するための方法を記載している一方、ＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、受容体及び調節因子のような細胞内成分の送入のための新規ペプチド／核酸構築物が国際公開第９９／０５３０２号に開示されている。
【００６２】
本発明の第六の態様では、生きた細胞が取り込むことのできる上述したような基質の細胞内所在及び分布を測定する方法であって、
ｉ）無細胞環境中で基質の標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）１以上の細胞に基質を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び／又は蛍光寿命の増加が基質の開裂を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法が提供される。
【００６３】
本発明の第六の態様の方法は、広範囲の細胞ベースアッセイで使用するのに適している。好適には、細胞は哺乳類、植物、昆虫、魚類、鳥類、細菌及び真菌に起源するものであり得る。細胞懸濁液は本発明の第三の態様の方法で使用するのに特に適しているが、細胞ベースアッセイに適合する他の形態の細胞培養物も使用できる。
【００６４】
本発明の第七の態様に従えば、複数の酵素開裂活性の同時測定方法であって、各々が複数の異なる蛍光標識に結合された複数の異なる基質を使用することを含んでなり、各標識がその固有の蛍光発光及び／又はその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能である、方法が提供される。これによれば、多くの基質に対する１種の酵素の作用を識別すること、及び／又は特定の基質の開裂を測定することで複数の酵素のうちのどれが試料中に存在しているかを同定することが可能である。
【００６５】
第七の態様によれば、多重アッセイを容易に行うことができる。即ち、例えば、蛍光発光及び蛍光寿命信号に基づいて識別できる任意の数の異なる蛍光標識（例えば、アクリドン染料）を用いてペプチドを標識することが可能である。次いで、標識ペプチドが活性を測定すべき推定酵素と混合され、ペプチドの開裂後に蛍光及び寿命の変化が監視される。したがって、蛍光及び／又は寿命信号は特定のペプチド／染料の組合せに特有であるので、ペプチド開裂後の蛍光発光及び寿命の変化は特定の酵素活性の同定及び定量を可能にする。このようにすれば、複数の酵素のうちのどれが試料中に存在しているかを同定すること、及び複数の酵素活性を同時に測定することが可能であろう。
【００６６】
好ましくは、標識は、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド）ヘキサン酸、６−（２−（アセトアミド）−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸及び６−（１２−エチル−７，１４−ジオキソ−２，９−ジスルホ−７，１４−ジヒドロキノ［２，３−ｂ］アクリジン−５（１２Ｈ）−イル）ヘキサン酸からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の第八の態様では、上述したような基質の、酵素開裂活性の測定用及び／又はインビトロ若しくはインビボ撮影剤としての使用が提供される。撮影剤は、診断目的及び治療処置の監視のために医学及び生物学システムで有用である。
【００６８】
本発明の第九の態様に従えば、
ｉ）上述したような基質、及び
ii）該基質を開裂できる酵素
を含んでなるキットが提供される。
【００６９】
本発明の第十の態様に従えば、１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含む反応体への、１種以上の蛍光標識を含む基質の結合に関する酵素の活性を測定する方法であって、
ｉ）酵素活性を高める反応混合物中で標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）反応混合物に酵素を添加する段階、及び
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命の減少を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び／又は寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素活性を測定できる、方法が提供される。
【００７０】
これにより、例えば、リガーゼの作用によるＤＮＡ又はＲＮＡ分子と別の核酸分子との共有結合、又はポリメラーゼによるＤＮＡ又はＲＮＡ分子へのヌクレオチドの付加、又はアセチルトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼによる化学的部分（即ち、反応体）から別の分子（即ち、基質）への転移を検出し測定できる。
【００７１】
別の例では、結合すべきＤＮＡ分子がＤＮＡリガーゼの存在下でＡＴＰを含む水性緩衝液と混合される。インキュベーションの後、二重体の両ストランド中にホスホジエステル結合を形成することにより、ＤＮＡストランドは正しい配置状態で共有結合される。結合後、標識部分は蛍光標識と芳香族消光化学種との間で消光が起こるのに十分な程度まで近接する結果、生成した連結生成物の量に比例する蛍光信号の減少が生じる。
【００７２】
任意には、反応体が１種以上の蛍光標識を含み、基質が１以上のチロシン、トリプトファン、フェノキシ、インドリル又はニトロ−フェニルアラニン部分を含む。
【００７３】
好適には、蛍光標識が上述したようなアクリドン染料又は上述したようなキナクリドン染料である。
【００７４】
好ましくは、基質及び／又は反応体が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ核酸、タンパク質核酸、多糖及びポリグリセリドからなる群から選択される。
【００７５】
第十の態様の好ましい実施形態では、酵素がＥＣクラス６のリガーゼ又はＥＣクラス２のトランスフェラーゼである。
【００７６】
本発明の第十一の態様に従えば、反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下で上述したような本発明の方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下での酵素の活性を、試験剤の不存在下での酵素の活性に関する既知値と比較する段階
を含んでなり、試験剤の存在下での酵素の活性と試験剤の不存在下での既知値との差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。試験剤は、例えば、合成分子又は天然物（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド）のような任意の有機又は無機化合物であり得るか、或いはエネルギー形態（例えば、光又は熱又は他の形態の電磁放射）であり得る。
【００７７】
好適には、既知値は電子データベース上に保存されている。任意には、この値を（例えば、酵素の１００％活性を表すように）基準化し、試験剤の存在下での酵素の基準化された活性と比較することができる。このようにすれば、酵素活性に対して一定の最小量だけ影響を及ぼす試験剤のみを、以後の評価のために選択することができる。
【００７８】
本発明の第十二の態様に従えば、反応体への基質の結合についての酵素の活性に対する効果を測定すべき試験剤のスクリーニング方法であって、
ｉ）試験剤の存在下及び不存在下で上述したような方法を実施する段階、及び
ii）試験剤の存在下及び不存在下で酵素の活性を測定する段階
を含んでなり、試験剤の存在下及び不存在下での酵素の活性間の差が酵素の活性に対する試験剤の効果を表す、方法が提供される。
【００７９】
好適には、試験剤の不存在下及び存在下での酵素の活性間における活性の差が基準化され、電子的に保存され、参照化合物の値と比較される。即ち、例えば、活性の差を電子データベース上にパーセント阻害率（又はパーセント賦活率）として保存し、この値を問題の酵素の標準的な阻害剤に関する対応値と比較することができる。このようにすれば、（例えば、参照化合物と同等又はそれ以上に有効なものとして）一定の所定閾値を満たす試験剤のみを、以後の試験のための興味の対象として選択することができる。
【００８０】
本発明の第十三の態様に従えば、上述したような基質及び／又は反応体が提供される。好ましい実施形態では、基質及び／又は反応体はさらに細胞侵入性ペプチドを含んでいる。さらに好ましくは、細胞侵入性ペプチドはＴＡＴ及びＣｈａｒｉｏｔからなる群から選択される。国際公開第０１／４１８１１号に開示されているもののような他の細胞侵入性ペプチド、即ち「キャリヤー」ペプチドも使用できる。この国際公開では、キャリヤーペプチドは１０〜１５のアミノ酸を含み、フランキングアミノ酸配列に隣接した３〜５の疎水性アミノ酸のコア配列を有している。疎水性コアはプロリン又はロイシン残基を含んでいる。好ましくは、コア配列は−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−、−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−、−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−、−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−、−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−及び−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕからなる群から選択される。
【００８１】
本発明の第十四の態様に従えば、生きた細胞が取り込むことのできる上述したような基質及び／又は反応体の細胞内所在及び／又は分布を測定する方法であって、
ｉ）無細胞環境中で標識の蛍光強度及び／又は蛍光寿命を測定する段階、
ii）１以上の細胞に基質及び反応体を添加する段階、並びに
iii）段階ii）の後に蛍光標識の蛍光強度及び／又は寿命を測定する段階
を含んでなり、蛍光強度及び／又は蛍光寿命の減少が反応体への基質の結合を表し、それを用いて酵素の活性及び局在の両方を測定できる、方法が提供される。
【００８２】
好適には、細胞は好ましくは哺乳類、植物、昆虫、魚類、鳥類、細菌及び真菌の細胞からなる群から選択される。
【００８３】
本発明の十五の態様では、各々が複数の異なる標識に結合されている、上述したような複数の異なる基質及び／又は反応体を使用することを含んでなる方法であって、前記標識の各々がその固有の蛍光発光及びその蛍光寿命で他のものから個別に識別可能なことで、複数の酵素結合活性の同時測定を可能にする方法が提供される。
【００８４】
好ましくは、標識が、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−４−カルボキサミド）ヘキサン酸、６−（２−（アセトアミド）−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸、６−（２−ブロモ−９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸及び６−（１２−エチル−７，１４−ジオキソ−２，９−ジスルホ−７，１４−ジヒドロキノ［２，３−ｂ］アクリジン−５（１２Ｈ）−イル）ヘキサン酸からなる群から選択される。
【００８５】
本発明の第十六の態様では、上述したような基質及び／又は反応体の、酵素結合活性の測定用及び／又はインビボ若しくはインビトロ撮影剤としての使用が提供される。撮影剤は、例えば国際公開第０２／０５６６７０号に記載されているように、診断目的及び治療処置の監視のために医学及び生物学システムで有用である。
【００８６】
本発明の第十七の態様に従えば、上述したような基質及び反応体を含んでなる組成物が提供される。
【００８７】
本発明の第十八の態様に従えば、
ｉ）上述したような基質及び反応体、並びに
ii）基質を反応体に結合できる酵素
を含んでなるキットが提供される。
【実施例】
【００８８】
以下の図面及び実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。図面中では、
図１は、サーモリシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示し、
図２は、ペプシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示し、
図３は、キモトリプシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示し、
図４は、サーモリシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＦ−ＮＯ2の消化を示し、
図５は、Ａｓｐ−ｎによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＣＨＬＤＩＩＷの消化を示し、
図６は、マトリックスメタロプロテイナーゼ３による６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＲＰＫＰＶＥ（Ｎｖａ）ＷＲＫの消化を示し、
図７は、ペプスタチンＡによるプロテアーゼ酵素カテプシンＤの阻害を示し、
図８は、ペプスタチンＡによるペプシンの阻害を示し、
図９は、キモスタチンによるキモトリプシンの阻害を示す。
【００８９】
実施例１：
６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹ−ＯＨの合成
標準的なＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ結合による固相ＦａｓｔＭｏｃ化学を用いてＡＢＩ  ４３３ａ合成装置で合成を行った。次のアミノ酸、即ちＴｙｒ（ｔＢｕ）については、ｆｍｏｃ保護アミノ酸の二次保護を使用した。
【００９０】
ＰｙＡｏＰ、ジエチルアミン及びＮ−メチルピロリドンを用い、すべての保護基が存在する状態で６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸をペプチド樹脂に結合した。精製に先立ち、９０％トリフルオロ酢酸を用いてペプチドを樹脂から開裂した。
【００９１】
０．１％トリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリル勾配を用いるＶｙｄａｃ  Ｃ18タンパク質及びペプチドカラム（２５０×５０ｍｍ）上での逆相クロマトグラフィーで、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹ−ＯＨの精製を行った。
【００９２】
精製したペプチドを４００ｎｍで逆相で分析したところ、９９．９％のＣ．Ｐを有すると共に、この標識ペプチドについて予想される通りの１０５１のモノアイソトピックＭＨ+質量を有することがわかった。
【００９３】
サーモリシンプロテアーゼ活性のアッセイ
プロテアーゼ基質（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ［ＡＡＦＦＡＡＹ］）をトリス緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で１００ｎＭに希釈した。マイクロタイタープレート中の標識基質の溶液（１００μｌ）に、１０ｎｇのサーモリシン（容積１０μｌ）を添加した。プロテアーゼ添加前の蛍光基線及びその後の強度増加を適当な波長で記録した。蛍光化学種の寿命も記録した。結果を図１に示す。未変化の基質では、蛍光の効率的な消光の結果として低い信号が生じる。プロテアーゼで触媒される基質の加水分解はこの消光を取り除き、蛍光を回復させる。蛍光強度の増加は連続的に監視でき、プロテアーゼ活性に比例する。生成物及び基質の寿命は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能である。固有の寿命は、反応の進行の物理化学的マーカーを提供する。
【００９４】
ペプシンプロテアーゼ活性のアッセイ
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＡＡＦＦＡＡＹ（１２５ｎＭ、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．６）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０中）８０μｌに、１０μｌの緩衝液及び１０μｌのペプシン（０〜２ｎｇ）を添加した。酵素の代わりに１０μｌの緩衝液を有する無酵素対照品（ＮＥＣ）も使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。基質の寿命（１０．３ｎｓ）及び生成物の寿命（１３．８ｎｓ）は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図２に示す。
【００９５】
キモトリプシンプロテアーゼ活性のアッセイ
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＡＡＦＦＡＡＹ（１００ｎＭ、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中）１００μｌに、１０μｌのキモトリプシン（０〜４ｎｇ）を添加した。酵素の代わりに１０μｌの緩衝液を有する無酵素対照品（ＮＥＣ）も使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。トリス緩衝液中での基質の寿命（１１．５ｎｓ）及び生成物の寿命（１４．５ｎｓ）は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図３に示す。
【００９６】
実施例２
アクリドン標識ペプチドＮＨ−ＡＡＦＦＡＡＦ（ＮＯ2）−ＮＨ2の合成
標準的なＦｍｏｃ化学を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３３Ａペプチド合成装置でペプチドを合成した。合成の終了時にＮ−末端Ｆｍｏｃ基を除去した。しかし、保護されたペプチドは固形支持体に結合したままに残され、この状態でＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノエートと反応させた。次いで、標準技術を用いて標識ペプチドを固形支持体から開裂し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００９７】
５００μｌの無水ＤＭＳＯを加えたシラン処理Ｐ８７バイアル中に、５０ｍｇ（０．０２４５ｍｍｏｌ）の樹脂結合ペプチドを秤取した。これを１／２時間膨潤させた。これに、０．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解した１１ｍｇ（１．１ｅｑ）のＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノエートを添加し、次いで１ｍｌのＤＭＳＯバイアル洗液及び２００μｌ（１０％）のＤＩＥＡを添加した。バイアルを遮光下でローラー上に配置し、周囲温度（２２℃）で１６時間撹拌した。次に、焼結ガラス製ミクロ漏斗（多孔度３）を用いて樹脂を濾別し、５ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ、５ｍｌのメタノール及び最後に５ｍｌのジクロロメタンで洗い、次いで真空中で２時間乾燥した。
【００９８】
次に、以下に記載するようにして標識ペプチドを固形支持体から開裂した。トリフルオロ酢酸（１．９０ｍｌ）、水（５０ｌ）及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（５０ｌ）の溶液２ｍｌを加えたシラン処理Ｐ８７バイアル中に樹脂を入れた。この混合物を２時間にわたりローラー撹拌した。次に、溶液を焼結ガラス製ミクロ漏斗（多孔度３）で濾過し、濾液を２０ｍｌの氷冷ジエチルエーテル中に集めた。淡黄色の沈殿を遠心で沈降させ、上澄み液を除去し、沈殿を１ｍｌのトリフルオロ酢酸中に再溶解してから１０ｍｌの氷冷エーテル中で再沈殿させた。沈殿を遠心で沈降させ、エーテルで２回洗い、真空中で乾燥した。
【００９９】
疎水性の問題を解決するため、乾燥した残留物を２００μｌのＤＭＳＯ中に溶解した。溶液に水を添加してＤＭＳＯを除去した後、バイアルを遠心し、液体をデカントで除去し、さらに数ミリリットルの水を添加して再遠心した。この液体を再びデカントで除去し、１ｍｌの水を添加し、次いで一晩凍結乾燥して乾燥粉末を得た。
【０１００】
ニトロ−ペプチドに対するサーモリシンプロテアーゼ活性のアッセイ
セルに入れたプロテアーゼ基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＡＡＦＦＡＡＦ−ニトロ（１μＭ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７）中）２０００μｌに、１００μｌのサーモリシン（１単位／μｌ）を添加した。酵素の代わりに１００μｌの緩衝液を有する無酵素対照品（ＮＥＣ）も含めた。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。伸張指数型非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。基質の寿命（２．５ｎｓ）及び生成物の寿命（１３．７ｎｓ）は著しく異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能であった。結果を図４に示す。
【０１０１】
実施例３：
プロテアーゼ酵素のアッセイ
Ａｓｐ−ｎプロテアーゼ基質（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ［ＡＡＦＦＡＡＹ］）をトリス緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で１００ｎＭに希釈した。マイクロタイター中の標識基質の溶液（１００μｌ）に、１０ｎｇの酵素（容積１０μｌ）を添加した。プロテアーゼ添加前の蛍光基線及びその後の強度増加を適当な波長で記録した。蛍光化学種の寿命も記録した。結果を図５に示す。未変化の基質では、蛍光の効率的な消光の結果として低い信号が生じる。プロテアーゼで触媒される基質の加水分解はこの消光を取り除き、蛍光を回復させる。蛍光強度の増加は連続的に監視でき、プロテアーゼ活性に比例する。生成物及び基質の寿命は異なるので、生成物の出現及び基質の消失を監視することが可能である。固有の寿命は、反応の進行の物理化学的マーカーを提供する。
【０１０２】
実施例４
アクリドン標識ペプチドＲＰＫＰＶＥ（Ｎｖａ）ＷＲＫの合成及び標識
標準的なＦｍｏｃ化学を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３１Ａペプチド合成装置でペプチドを合成した。合成の終了時にＮ−末端Ｆｍｏｃ基を除去したが、保護されたペプチドは固形支持体に結合したままに残され、この状態でＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノエートと反応させた。次いで、標準技術を用いて標識ペプチドを固形支持体から開裂し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０１０３】
２ｍｌの無水ＤＭＳＯを加えたシラン処理Ｐ８７バイアル中に１００ｍｇの樹脂結合ペプチドを秤取し、２時間膨潤させた。１ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解した１７ｍｇのＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノエート、次いで１２０μｌのジイソプロピルエチルアミンをバイアルに添加した。バイアルを遮光下でローラー上に配置し、周囲温度（２２℃）で２０時間撹拌した。次に、焼結ガラス製ミクロ漏斗（多孔度３）を用いて樹脂を濾別し、５ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ、５ｍｌのメタノール及び最後に５ｍｌのジクロロメタンで洗い、次いで真空中で２時間乾燥した。
【０１０４】
固形支持体から標識ペプチドを開裂するため、トリフルオロ酢酸（１．９０ｍｌ）、水（５０ｌ）及びトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）（５０ｌ）の氷冷溶液２ｍｌを加えたシラン処理Ｐ８７バイアル中に樹脂を入れた。この混合物を９０分間にわたりローラー撹拌し、周囲温度に温めた。次に、混合物を焼結ガラス製ミクロ漏斗（多孔度３）で濾過し、濾液を１０ｍｌの氷冷ジエチルエーテル中に滴下した。淡黄色の沈殿を遠心で沈降させ、上澄み液を除去し、沈殿を１ｍｌのトリフルオロ酢酸中に再溶解してから１０ｍｌの氷冷エーテル中で再沈殿させた。沈殿を遠心で沈降させ、エーテルで２回洗い、真空中で乾燥した。
【０１０５】
粗標識ペプチドをＨＰＬＣで精製した。即ち、０．４５ｍミリポアフィルターで濾過した水６ｍｌ中に粗標識ペプチドを溶解し、３０分間で０．１％ＴＦＡ／水から１００％の０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルまでの勾配及び４ｍｌ／分の流量を使用しながら、２５ｃｍ×１ｃｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ「Ｊｕｐｉｔｅｒ」Ｃ１８，１０カラム（コード００Ｇ−４０５５−ＮＯ）上において３回の増量「ショット」（１ｍｌ、２ｍｌ及び３ｍｌ）で精製した。検出は２２０ｎｍ及び４００ｎｍで行った。
【０１０６】
主ピークは１７分後に溶出した。この物質は、蛍光灯室内照明下で青色の蛍光を示した。溶出ピークからの物質を合わせ、風袋計量済みのバイアル中で凍結乾燥したところ、３５ｍｇ（２２ｍ）の淡黄色固体が得られた。この物質の質量分析によれば、１５８４質量単位の位置に単一ピークが得られた（アクリドン標識ペプチドの計算分子量＝１５８４）。
【０１０７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ３酵素のアッセイ
ＭＭＰ−３基質（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ2（ここで、Ｎｖａはノルバリンである））（２５０ｎＭ）を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０μＭ塩化亜鉛及び０．０５％ｗ／ｖのＢｒｉｊ（登録商標）−３５を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中のＭＭＰ−３酵素（０〜２４ｎＭ）と共に、周囲温度で２時間インキュベートした。黒色の不透明９６ウェルプレートを用い、１００μｌの最終反応容積でアッセイを行った。ＰＭＴベースのライフタイムプレートリーダー上で蛍光信号を記録した。
【０１０８】
結果（図６）は、生成物（寿命１４ｎｓの化学種）の酵素依存性出現及び基質（寿命１０ｎｓの化学種）の消失を示している。
【０１０９】
実施例５：
プロテアーゼ阻害剤のアッセイ：カテプシンＤ活性の阻害
０．００５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含む０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．６）中のウシ腎臓カテプシンＤ酵素（３ｎｇ／ウェル）の存在下又は不存在下で、ペプチド基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸標識ＡＡＦＦＡＡＹ（１００ｎＭ）を室温でインキュベートした。黒色の不透明９６ウェルプレートを用い、１００μｌの最終反応容積で周囲温度でアッセイを行った。ＰＭＴベースのライフタイムプレートリーダー上で蛍光信号を測定した。阻害試験のためには、ペプスタチンＡを０〜１２ｎＭの範囲で使用した。
【０１１０】
結果を図７に示す（各点は４つの読みを表している）。この図から、ペプスタチンＡはカテプシンＤ活性を用量依存的に阻害することがわかる。
【０１１１】
プロテアーゼ阻害剤のアッセイ：ペプシン活性の阻害
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＡＡＦＦＡＡＹ（１２５ｎＭ、０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．６）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０中）８０μｌに、１０μｌのペプスタチンＡ及び１０μｌのペプシン（０．５ｎｇ）を添加した。ペプスタチンＡは０〜１０ｎＭの範囲で使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。図８の結果は、ペプスタチンＡが０．８８ｎＭの見掛けＩＣ50でペプチド基質のペプシン消化を阻害することを示している。
【０１１２】
プロテアーゼ阻害剤のアッセイ：キモトリプシン活性の阻害
マイクロタイタープレート中に三重に配置したプロテアーゼ基質６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＡＡＦＦＡＡＹ（１２５ｎＭ、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．００５％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０中）８０μｌに、１０μｌのキモスタチン及び１０μｌのキモトリプシン（１ｎｇ）を添加した。キモスタチンは０〜１００ｎＭの範囲で使用した。周囲温度でのインキュベーションの後、蛍光強度及び寿命を記録した。非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで蛍光寿命が得られた。図９の結果は、キモスタチンが１．４８ｎＭの見掛けＩＣ50でペプチド基質のキモトリプシン消化を阻害することを示している。
【０１１３】
実施例６
６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＲＰＫＰＶＥ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ）の合成
固相ＦａｓｔＭｏｃ化学を用い、ＡＢＩ  ４３３ａ合成装置でペプチドＲＰＫＰＶＥを合成した。上記実施例１と同様にして、これを６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸で標識し、樹脂から開裂し、ＨＰＬＣで精製した。
【０１１４】
ペプチド基質（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＲＰＫＰＶＥ）をＴＮＣ−Ｔ緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2／０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１００ｎＭに希釈した。
【０１１５】
時間相関単一光子計数技術（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＦＬ９００ＣＤＴ分光計）により、この溶液の寿命を測定した（セル内容積２ｍｌ）。レーザーダイオードを用いて試料を４０５ｎｍで励起し、４５０ｎｍで検出を行った。
【０１１６】
６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＲＰＫＰＶＥＮｖａＷＲＫ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）の合成
前述の実施例と同様にして、ペプチドＲＰＫＰＶＥＮｖａＷＲＫを合成し、６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸で標識し、精製した。
【０１１７】
標識ペプチド（６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサン酸−ＲＰＫＰＶＥＮｖａＷＲＫ）をやはりＴＮＣ−Ｔ緩衝液で１００ｎＭに希釈し、寿命を同様に記録した。
【０１１８】
寿命の比較
表２に示す通り、非線形最小二乗解析アルゴリズムを用いたデコンボルーションで各ペプチドの蛍光寿命が得られた。
【０１１９】
【表２】
2005527212.tif 000006
【０１２０】
２種のペプチド（トリプトファン残基を含むもの及び含まないもの）の寿命を比較したところ、トリプトファン残基の導入が寿命を１．３ｎｓだけ減少させることがわかった。かかる寿命の減少は、一方が蛍光標識を含む２種のペプチドを結合して、標識の蛍光寿命を消光するように作用するトリプトファン残基を含む第二のペプチドを形成した場合に予想される通りであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】サーモリシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示す。
【図２】ペプシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示す。
【図３】キモトリプシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＹの消化を示す。
【図４】サーモリシンによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＡＡＦＦＡＡＦ−ＮＯ2の消化を示す。
【図５】Ａｓｐ−ｎによる６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＣＨＬＤＩＩＷの消化を示す。
【図６】マトリックスメタロプロテイナーゼ３による６−（９−オキソ−９Ｈ−アクリジン−１０−イル）ヘキサノイル−ＲＰＫＰＶＥ（Ｎｖａ）ＷＲＫの消化を示す。
【図７】ペプスタチンＡによるプロテアーゼ酵素カテプシンＤの阻害を示す。
【図８】ペプスタチンＡによるペプシンの阻害を示す。
【図９】キモスタチンによるキモトリプシンの阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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