(57)【要約】本発明は、IV型コラーゲン形成を増大するために有効な条件下で、成長因子、成長因子をコードする遺伝子、または成長因子形成を増大する薬剤を生体系に投与することより、早産のヒト新生児の器官成熟を増強するか、または生体系のIV型コラーゲン形成を増大する方法に向けられる。本発明のもう一つの局面は、早産のヒト新生児由来の試料を提供すること、および試料の細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーを決定することにより、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を予測する方法に関する。試料におけるバイオマーカーのレベルまたはその比を標準と比較して、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を確認する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法であって、器官成熟を増強するために有効な条件下で早産のヒト新生児に成長因子を投与することを含む方法。
【請求項２】
成長因子が、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
成長因子が、ヒト第17染色体上にコードされ、かつhGH-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
成長因子が、ヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
成長因子が、ヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
成長因子が、ヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである、請求項2記載の方法。
【請求項７】
成長因子が、種々のヒト染色体上にコードされるラミニンに包含されるマトリックス成長因子の群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
器官成熟を増強するために有効な条件が、早産のヒト新生児の器官における基底膜を増大するために有効である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
器官成熟を増強するために有効な条件が、早産のヒト新生児の器官におけるIV型コラーゲン形成を増大するために有効である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
器官が肺、腎臓、胃腸管、心筋、および骨格筋、並びに血管からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
器官が肺である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
投与が吸入によって行われる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
投与が、吸入によって、経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹膜内に、または粘膜に対する適用によって行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を予測する方法：
早産のヒト新生児からの試料を提供する段階；
試料における細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーを判定する段階；および、
標準に対する試料のバイオマーカーレベルまたはその比を比較して、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を確認する段階。
【請求項１５】
試料が血漿、血清、または尿として得られる、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーがコラーゲンタンパク質から生じる、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーが早産のヒト新生児の器官におけるIV型コラーゲンから生じる、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーが非コラーゲン性タンパク質またはグリコサミノグリカンから生じる、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーが早産のヒト新生児の器官におけるラミニンから生じる、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法であって：
器官成熟を増強するために有効な条件下で、早産のヒト新生児に成長因子をコードする遺伝子を投与する段階を含む方法。
【請求項２１】
成長因子をコードする遺伝子が、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
成長因子が、ヒト第17染色体上にコードされ、かつhGN-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される、請求項21記載の方法
【請求項２３】
成長因子がヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
成長因子がヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
成長因子がヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
成長因子をコードする遺伝子が、種々のヒト染色体上に位置するラミニンに包含されるマトリックス成長因子をコードする、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
器官成熟を増強するために有効な条件が、早産のヒト新生児の器官における基底膜を増大するために有効である、請求項20記載の方法。
【請求項２８】
器官成熟を増強するために有効な条件が、早産のヒト新生児の器官におけるIV型コラーゲン形成を増大するために有効である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
器官が肺、腎臓、胃腸管、心筋および骨格筋、並びに血管からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項３０】
器官が肺である、請求項20記載の方法。
【請求項３１】
投与が吸入によって行われる、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
投与が、吸入によって、経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹膜内に、または粘膜に対する適用によって行われる、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法であって：
器官成熟を増強するために有効な条件下で、早産のヒト新生児に成長因子形成を増大する薬剤を投与する段階を含む方法。
【請求項３４】
薬剤が、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される成長因子の形成を増大する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
成長因子が、ヒト第17染色体上にコードされ、かつhGH-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
成長因子がヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
成長因子がヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
成長因子がヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
薬剤が種々の染色体上にコードされるラミニンに包含されるマトリックス成長因子の形成を増大する、請求項33記載の方法。
【請求項４０】
生体系におけるIV型コラーゲン形成を増大する方法であって：
IV型コラーゲン形成を増大するために有効な条件下で、成長因子、成長因子をコードする遺伝子、または成長因子形成を増大する薬剤を生体系に投与する段階を含む方法。
【請求項４１】
成長因子が投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
成長因子が、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
成長因子が、ヒト第17染色体上にコードされ、かつhGH-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
成長因子がヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
成長因子が、ヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
成長因子が、ヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
成長因子が、種々のヒト染色体上にコードされるラミニンに包含されるマトリックス成長因子の群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４８】
成長因子をコードする遺伝子が投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４９】
成長因子をコードする遺伝子が、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
成長因子がヒト第17染色体上にコードされ、かつhGH-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
成長因子がヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
成長因子がヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
成長因子がヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
成長因子が、種々のヒト染色体上にコードされるラミニンに包含されるマトリックス成長因子の群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５５】
成長因子形成を増大する薬剤が投与される、請求項40記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年7月27日に出願された米国仮特許出願第60/308,143号の利益を主張する。
【０００２】
本出願の発明は、国立衛生研究所助成金番号HD00072およびRR06020の資金提供によりなされた。米国政府は、一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、早産のヒト新生児の器官成熟を増強すること、および早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びにその滞在の間に負うと予測される医療費を予測することに向けられる。本発明は、また、生体系におけるIV型コラーゲン形成を増大することに向けられる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
早産は、主要な医学的チャレンジの代表例であり、何十年もの間、産科および小児科における調査取り組みの対象となってきた。早産は、その著しい経済的費用のため、主要な社会的チャレンジでもある。早産で生まれる乳児(＜37の週在胎齢)は、生きて出生する全てのうちの9%を占めるだけであるが、米国における全ての急性の新生児集中治療室(NICU)の費用のうち57%を、または年間5,800,000,000ドルを消費する(St. Johnら、「Costs Of Neonatal Care According To Gestational Age At Birth And Survival Status 」、Am. J. Obstet. Gynecol., 182: 170-175 (2000))。この額は、全ての乳児に対する総保健医療費用の40%以上を占める。出生から15歳までの長期間にわたり、早産による医学的続発症のための経過観察費用は、さらに一年あたり5,400,000,000ドル、または全ての子供のための保健医療費用の10%を上回る(Zupancicら、「Economics Of Prematurity In The Era Of Managed Care」、 Clin. Perinatol., 27 (2): 483-497 (2000))。したがって、早産による社会全体の出費は、毎年11,000,000,000ドルを上回る。この数は、もちろん、早産の生存者が受ける長期の身体的および精神的なハンディキャップ並びにこれらの介護のために必要とされる時間および資産の配分による経済生産の直接的および間接的な損失を含まず、または「早産児」の親が受ける精神的苦痛および苦悶は計上されていない。米国における早産の発生率が増大しているという一般的な合意があることに留意されたい。
【０００５】
早産で生まれた乳児のための医療は、一般に、彼らの体が未発達であるのために要求され、特に彼らの心肺系の未発達のために要求される。一旦、胎盤から切り離されると、その後は、適切に機能して、呼吸した大気中の気体から分子状酸素を抽出して、ヘモグロビンに結合した分子状酸素を血流を介して体全体の細胞に分配しなければならない。年齢に適した範囲で血液における糖、気体、および酸／塩基恒常性を維持すること、または内因性の表面活性剤の欠如を克服するために外因性の界面活性剤を供給することなどの、単なる支持処置だけでなく、ベビーの体における遺伝子の活性を増強することによって組織成熟を加速することを目的とする処置も存在する。早産児の組織の不十分な遺伝子発現に直接的に対処するこれらの薬剤の大多数は、コルチコステロイドである。早産児に輸送する直前に母に対して与えられ、彼女の胎盤の存在下で調整され、コルチコステロイドは、送達後に早産児の心肺系の実行レベルを著しく高める。
【０００６】
また、コルチコステロイドを送達後に新生児に投与しても、出生後の投与が心肺系において妊娠中の投与と同じ有益な効果を有することが期待される。平均して、米国およびカナダにおける4人の早産児のうち1人は、NICUにおいてコルチコステロイドが投薬され、出生体重が1000グラム以下である場合は、この割合は、3人のうちの1人を上回る。したがって、2002年初めに、小児科のアメリカン・アカデミーおよびカナダの小児科学会が、容認できない数の短期および長期合併症のために、出生後コルチコステロイドを早産児に、もはやルーチンで使用するべきでないことを連合声明において推奨した時は、当業者には驚くような進展であった(American Academy of Pediatrics and Canadian Pediatric Society, 「Postnatal Corticosteroids to Treat or Prevent Chronic Lung Disease in Preterm Infants」、Pediatrics, 109: 330-338 (2002))。したがって、この執筆の時点で、新生児集中治療では、「糖、水、塩、および空気」に依存する巧妙な支持療法以外に、早産児に提供するためのものは何もない。
【０００７】
したがって、早産で生まれた乳児における生命器官の子宮外成熟を促進する可能性を有する薬剤を導入すことが早急に必要である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の1つの態様は、器官成熟を増強するために有効な条件下で、早産のヒト新生児に成長因子を投与することによって、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に関する。
【０００９】
本発明のもう1つの局面は、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を予測する方法に関する。これは、早産のヒト新生児からの試料を提供する段階、および試料における細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーを判定する段階を含む。早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を確認するために、試料中のバイオマーカーのレベルまたはその比を標準と比較する。
【００１０】
本発明のさらなる態様は、器官成熟を増強するために有効な条件下で、成長因子をコードする遺伝子を早産のヒト新生児に投与することにより、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に関する。
【００１１】
本発明のもう1つの局面は、器官成熟を増強するために有効な条件下で、成長因子形成を増加する薬剤を早産のヒト新生児に投与することにより、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に向けられる。
【００１２】
本発明のさらなる局面は、IV型コラーゲン形成を増加するために有効な条件下で、成長因子、成長因子をコードする遺伝子、または成長因子形成を増加する薬剤を生体系に投与することにより、生体系におけるIV型コラーゲン形成を増加する方法に向けられる。
【００１３】
早産の新生児において、これらの患者は、成長ホルモン-インスリン様成長因子(「hGH-IGF」)系の機能欠損に苦しんでいることが知られているので、産後の直後の期間に外因性の成長ホルモンを投与することがさらに適切である。この欠損は、従来の免疫アッセイ法によって検出されるが、これらの生体影響を評価したときに不活性である成長ホルモン分子の形成を含む。早産の新生児では、免疫反応性の成長ホルモンが少なくとも10の因子が、生理活性成長ホルモンを上回る(Radettiら、「Growth Hormone Bioactivity And Levels Of Growth Hormone, Growth Hormone-Binding Protein, Insulin-Like Growth Factor I, And Insulin-Like Growth Factor-Binding Proteins In Premature And Full-Term Newborns During The First Month Of Life」、Arch. Pediatr. Adolesc. Med., 151: 170-175 (1997)、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。
【００１４】
新生児集中治療室(NICU)に滞在する長さおよび早産の新生児のための予想される費用を予測するいずれかの方法、並びに成長ホルモン、その種々のアイソフォームおよび類似体、またはこれらに関連した二次的エレメントの投与を介して、IV型コラーゲンの合成を刺激することにより、これらの上皮および内皮の表面の成熟を促進し、したがって基底膜形成を促進するいずれかの方法は、小児科の分野における主要な進歩を示す可能性があり、注目に値する保健医療費用の減少を先導する。上記の通り、未成熟で生まれる乳児(＜37の週在胎齢)は、生きて出生する全てのうちの9%を占めるだけであるが、米国における全ての急性の新生児集中治療室(NICU)の費用のうち57%を、または5,800,000,000ドルを毎年消費する(St. Johnら、「Costs Of Neonatal Care According To Gestational Age At Birth And Survival Status」、Am. J. Obstet. Gynecol., 182: 170-175 (2000))。この額は、全ての乳児に対する総保健医療費用の40%以上を占める。出生から15歳までの長期間にわたり、未成熟の医学的続発症による経過観察費用は、さらに一年あたり5,400,000,000ドル、または全ての子供のための保健医療費用の10%を上回る(Zupancicら、「Economics Of Prematurity In The Era Of Managed Care」、Clin. Perinatol., 27 (2): 483-497 (2000)、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の1つの態様は、器官成熟を増強するために有効な条件下で、成長因子を早産のヒト新生児に投与することにより、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に関する。タンパク質因子およびホルモン(「メディエータ」)は、人体の成分に、およびその種々の器官の発達および機能に重大な影響を及ぼすことが科学的に十分に確立されており、および医学の実践に不可欠な部分である。これらのタンパク質メディエータは、細胞の生態学、並びに細胞が包埋されている複合物である細胞外マトリックスの生態学に影響を及ぼす。
【００１６】
ヒトにおいて、これらのメディエータの最も顕著な群は、成長ホルモン自体並びにその種々のアイソフォームおよび類似体からなり、共通の前駆体、これらの受容体、およびインスリン様成長因子(IGFs)などの関連した二次的エレメントから発生すると考えられる。大多数の成長ホルモン遺伝子ファミリーのメンバーは、第17染色体の長腕に、以下のように5'から3'の順でコードされる：成長ホルモン固有(proper)(GH-N)−絨毛性ソマトマンモトロピン-A(CS-A)−成長ホルモンバリアント(GH-V)−絨毛性ソマトマンモトロピン-B(CS-B)。さらなるメンバーであるプロラクチンは、第6染色体上にコードされる。IGF-1Aおよび-1B、並びにIGF-2を含むIGFは、それぞれ第12染色体および第11染色体上にコードされる。これらのメディエータに対する多くの結合タンパク質および受容体が、知られている。hGH-IGF系の生理学および病理学およびこれらの実用的かつ経済的な効果は、最近のいくつかの総説の主題である(Bercuら、「Growth Hormone: Relevance To Pediatrics」、In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice, Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 191-220 (2000)； Carrollら、「Growth Hormone Deficiency In Adults: The Rationale For Growth Hormone Replacement」、In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice. Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 221-232 (2000)； Rosenfeldら、「Disorders Of Growth Hormone/Insulin-Like Growth Factor Secretion And Action」、In: Pediatric Endocrinology, Sperling, Ed., Saunders, Philadelphia, pp. 211-288 (2002)； and Kopchick, 「Growth Hormone」、In: Endocrinology, DeGrootら、Eds., Saunders, Philadelphia, pp. 389-404 (2001)、これらは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。
【００１７】
細胞外マトリックスは、成長ホルモン、成長ホルモン遺伝子ファミリーのメンバー、およびIGFなどの関連した二次的エレメントの主要な標的である。成長ホルモンが身長発達のための主要なメディエータの役割を果たすと想定されるヒトのライフサイクルの期間である幼児期に、成長ホルモンの適切な産生および分泌を欠くと、重篤な低身長を常に引き起こす。生涯の早期では、成長ホルモンは、代謝制御、たとえば血糖レベルに対して重要な因子であり、生涯の後期では、成長ホルモンは、骨密度の維持に貢献し、骨粗鬆症を防ぐ(Bercuら、「Growth Hormone: Relevance To Pediatrics」、In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice, Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 191-220 (2000)； Rosenfeldら、「Disorders Of Growth Hormone/Insulin-Like Growth Factor Secretion And Action」、In: Pediatric Endocrinology, Sperling, Ed., Saunders, Philadelphia, pp. 211-288 (2002)；および Baumら、「Growth Hormone And Osteoporosis. In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice」、Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 233-246 (2000)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。
【００１８】
この活性プロフィールと一致して、成長ホルモンは、骨の成長板において、および骨自体において顕著であるこれらのコラーゲンの形成を促進する。19の異なるコラーゲンのタイプのうちで、細胞外マトリックスの主要なタンパク質成分である3つのタイプは、これらの解剖の部位で特に顕著に生じ、成長ホルモンおよびIGFに反応することが見出された。これらは、I型コラーゲン、III型コラーゲン、およびX型コラーゲンである(I型およびIII型コラーゲンの総説については、Vihervuoriら、「Collagen Formation And Degradation Increase During Growth Hormone Therapy In Children」, Bone, 20: 133-138 (1997)を参照されたい、これらは参照としてその全体およびその中に引用された文献が本明細書に組み入れられる；また、X型コラーゲンについては、 Kikkawaら、「Altered Postnatal Expression Of Insulin-Like Growth Factor I (IGF-I) And Type X Collagen Preceding The Perthes' Disease-Like Lesion Of A Rat Model」、J. Bone Miner. Res., 15: 111-119 (2000)を参照されたい、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。実際には、成長ホルモンのマトリックス形成増強活性により、運動性能の増強のための成長ホルモンの乱用を、細胞外マトリックスから生じるバイオマーカー、特にIII型コラーゲンの測定によって検出できることが宣告されている(Langobardiら、「Growth Hormone (GH) Effects On Bone And Collagen Turnover In Healthy Adults And Its Potential As A Marker Of GH Abuse In Sports: A Double-Blind, Placebo-Controlled Study」、J. Clin. Endocrinol. Metab., 85: 1505-1512 (2000)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。薬物治療として、組換えにより産生された成長ホルモンが、I型、III型、およびX型コラーゲンの形成を増強するためにルーチンで使用され、これにより、内因性成長ホルモン欠損症または遺伝的におよび医原性に引き起こされた低身長の形態などの発達障害によって定義されるいくつかの疾病状態の身長および骨構造を改善する(Rosenfeldら、「Disorders Of Growth Hormone/ Insulin-Like Growth Factor Secretion And Action」、In: Pediatric Endocrinology, Sperling, Ed., Saunders, Philadelphia, pp. 211-288 (2002)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。また、成長ホルモンは、たとえば加齢またはヒト免疫不全ウイルスに感染することによるいくつかの異化状態の治療において有望な結果を示す(Baumら、「Growth Hormone And Osteoporosis. In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice」、Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 233-246 (2000) および Mulliganら、「Growth Hormone And AIDS. In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice」、Smithら、eds. Humana Press, Totowa, pp. 285-296 (2000)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。内因性の成長ホルモン欠損症によって例証されたように、適切な成長ホルモン分泌の欠如は、I型およびIII型コラーゲンに由来するバイオマーカーが低レベルであることと関連する。逆に、外因性の成長ホルモンの投与では、I型およびIII型コラーゲンから誘導されるバイオマーカーの著しい増加を引き起こす(総説については、Vihervuoriら、「Collagen Formation And Degradation Increase During Growth Hormone Therapy In Children」、Bone, 20: 133-138 (1997)を参照されたい、これは、参照としてその全体およびその中に引用された文献が本明細書に組み入れらる)。
【００１９】
したがって、本発明によれば、適切な成長因子は、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子を含むが、これらに限定されない。特に、ヒト第17染色体上にコードされる適切な成長因子は、hGH-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bを含む。ヒト第12染色体上にコードされる適切な成長因子は、IGF-1を含む。ヒト第11染色体上にコードされる適切な成長因子は、IGF-2を含む。ヒト第6染色体上にコードされる適切な成長因子は、プロラクチンを含む。
【００２０】
また、本発明によれば、適切な成長因子は、種々のヒト染色体上にコードされるラミニンに包含されるマトリックス成長因子の群を含む。
【００２１】
成長因子は、早産のヒト新生児に、器官成熟を増強するために有効な条件下で投与される。特に、成長因子は、早産のヒト新生児の器官における基底膜を増大するために有効な条件下で投与される。さらに、成長因子は、早産のヒト新生児の器官におけるIV型コラーゲン形成を増大するために有効な条件下で投与される。
【００２２】
より詳細には、本発明者らは、ヒトにおいて、I型およびIII型コラーゲンだけでなく、IV型コラーゲンがhGH-IGF系の制御下にあることを見出した。I型およびIII型コラーゲンは、原繊維および繊維を形成し、したがって、生体力学的ストレスにさらされた組織において顕著であるが、IV型コラーゲンは、原繊維または繊維を形成しない。その代わりに、このコラーゲンは、基底膜の主成分であるシート状のポリマーを形成し、細胞をアンカーする構造が、肺、腸、および腎臓の上皮表面を形成し、並びに心血管系の内皮の表面内部を形成する(Hanauske-Abel, 「Fibrosis Of The Liver: Representative Molecular Elements, And Their Emerging Role As Antifibrotic Targets」、In: Hepatology. A Textbook of Liver Disease, Zakimら、Eds., Saunders, Philadelphia (2002) (in press)、これは参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。この所見は、IV型コラーゲンについて低いバイオマーカーレベルと関連したヒトの症状が存在する場合、この症状が、成長ホルモン、その種々のアイソフォームおよび類似体によって軽減されるはずであり、または特にこの症状がhGH-IGF系における機能欠損と同時に発生する場合は、これらに関連した二次的エレメントを外因性に投与することによって軽減されるはずであることを示す。本発明者らは、独特な患者の分類においてこのような症状を予想外に同定した。
【００２３】
成長ホルモンは、拍動性の方法で、特に睡眠中に血流に分泌される(Bercuら、「Growth Hormone: Relevance To Pediatrics」、In: Human Growth Hormone. Research And Clinical Practice, Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 191-220 (2000) およびRosenfeldら、「Disorders Of Growth Hormone/ Insulin-Like Growth Factor Secretion And Action」、In: Pediatric Endocrinology, Sperling, Ed., Saunders, Philadelphia, pp. 211-288 (2002)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。この非連続的な分泌により、マトリックスのコラーゲン性または非コラーゲン性のいずれかのタンパク質に特異的な血清バイオマーカーを測定することによって細胞外マトリックスのインビボにおける反応をモニターすることが可能になる。このバイオマーカーの形成が成長ホルモンに応答するのであれば、それぞれの夜間の成長ホルモンのピークは、マトリックスバイオマーカーの適切な一定時刻のピークに一致するか、またはその後に生じるはずである。そうでない場合には、成長ホルモン値のおびただしくかつ迅速な夜間の揺らぎは、マトリックスバイオマーカーのレベルと切り離して考える。この成長ホルモン刺激およびマトリックス反応の間の一般的な関係は、朝の何時間かでさえも適用されるはずであり、コルチゾールの分泌が活性化されたときは、成長ホルモンの強力なアンタゴニストであり一般にマトリックス形成を阻害することが知られている。
【００２４】
したがって、器官成熟は、肺、腎臓、胃腸管、心筋および骨格筋、並びに血管などの器官において達成することができる。1つの特定の態様において、器官成熟は、肺において達成される。本発明によれば、器官成熟を増強するのに十分な用量において成長因子は投与される。
【００２５】
成長因子は、吸入、経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹膜内に、または鼻、咽喉、および気管支のものなどの粘膜に対する適用によって投与することができる。1つの特定の態様において、器官成熟が肺において達成される場合、成長因子の投与は、吸入によって行われる。成長因子は、単独で、または薬学的にもしくは生理的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と共に投与することができ、粉末、溶液、懸濁液、または乳剤などの固体または液体の状態であってもよい。
【００２６】
固体単位投与剤形は、従来のタイプのものであることができる。固体形態は、成長因子並びに担体、たとえばラクトース、スクロース、またはコーンスターチなどの潤滑剤および不活性充填剤を含む通常のゼラチンタイプなどのカプセルであることもできる。もう一つの態様において、これらの成長因子は、ラクトース、スクロース、またはコーンスターチなどの錠剤基剤を、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはアルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム様の潤滑剤と組み合わせて錠剤化することもできる。
【００２７】
また、成長因子は、薬学的担体と共に生理的に許容される希釈剤に溶解されたこの物質の溶液または懸濁液によって注射可能な用量で投与されてもよい。このような担体は、界面活性剤、アジュバント、賦形剤、または安定剤の添加と共に、または伴わずに、水および油などの無菌の液体を含む。例となる油は、石油、動物、野菜、または合成起源のもの、たとえば、ラッカセイ油、ダイズ油、または鉱油である。一般に、水、塩類溶液、水性デキストロース、および関連した糖溶液、並びにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射可能な溶液のための、好ましい液状担体である。
【００２８】
エアロゾルとして使用するためには、成長因子の溶液または懸濁液は、適切な噴射剤、たとえばプロパン、ブタン、またはイソブタン様の炭化水素噴射剤と共に、および従来のアジュバントと共に、加圧されたエアロゾル容器にパックされてもよい。また、成長因子は、噴霧器または噴霧器などの非加圧の形態で投与することもできる。
【００２９】
また、本発明は、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を予測する方法に関する。この方法は、早産のヒト新生児から試料を提供する段階、および試料における細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーを判定する段階を含む。試料におけるバイオマーカーレベルまたはその比を、標準と比較して、早産のヒト新生児が新生児集中治療室に滞在する長さ、並びに該滞在の間に負うと予想される医療費を確認する。
【００３０】
適切な試料は、血漿、血清、尿、気管支洗浄液体、および体液の塗抹標本などの生体試料を含む。
【００３１】
本発明の1つの態様によれば、細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーは、コラーゲンのタンパク質から生じる。特定の態様において、細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーは、早産のヒト新生児の器官におけるIV型コラーゲンから生じる。
【００３２】
本発明のもう一つの態様において、細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーは、非コラーゲン性のタンパク質またはグリコサミノグリカンから生じる。特定の態様において、細胞外マトリックスに由来するバイオマーカーは、早産のヒト新生児の器官におけるラミニンから生じる。
【００３３】
バイオマーカーは、当業者に既知の方法を使用して決定されてもよい。特に、細胞外マトリックスのコラーゲン性および非コラーゲンのバイオマーカーは、商業的に入手可能な、非常に特異的かつ再現可能な免疫アッセイ法および／またはクロマトグラフ的手順によって、どのような生物学的液においても決定することができる(たとえばAghaiら、「Basement Membrane Biomarkers in Very Low Birth Weight Premature Infants」、Biol. Neonate, 81: 16-22 (2002)を参照されたい、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。これらの製品は、どのような臨床的実験室においても、臨床化学の当業者が購入することができ、確実に適用することができる。一旦試料におけるバイオマーカーが決定されたら、バイオマーカーのレベルまたはその比を数理公式に使用して、早産のヒト新生児がNICUに滞在する長さ、並びに滞在の間に負うと予測される費用を評価する。それぞれのバイオマーカーまたはバイオマーカー比についての適切に正確な数理公式(「標準」)は、下記のように、たとえば実施例2のように、早産の新生児におけるバイオマーカーパラメータと彼らがNICUに滞在する長さ、または彼らが負うNICU費用との関係のルーチン統計解析によってそれぞれ明らかになる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、成長因子をコードする遺伝子を、器官成熟を増強するために有効な条件下で早産のヒト新生児に投与することにより、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に関する。
【００３５】
本発明のこの局面によれば、成長因子をコードする遺伝子は、ヒト第17染色体上、第12染色体上、第11染色体上、および第6染色体上にコードされるものに包含される内分泌成長因子をコードする遺伝子からなる群より選択される。1つの特定の態様において、成長因子は、ヒト第17染色体上にコードされ、かつhGN-N、hGH-V、絨毛性ソマトマンモトロピン-A、および絨毛性ソマトマンモトロピン-Bからなる群より選択される。もう一つの特定の態様において、成長因子は、ヒト第12染色体上にコードされ、かつIGF-1である。もう一つの態様において、さらに、成長因子は、ヒト第11染色体上にコードされ、かつIGF-2である。さらなる態様において、成長因子は、ヒト第6染色体上にコードされ、かつプロラクチンである。さらなる態様において、成長因子をコードする遺伝子は種々のヒト染色体上に位置するラミニンに包含されるマトリックス成長因子をコードする。
【００３６】
所望の成長因子、またはその断片をコードする遺伝子もしくはcDNAは、たとえばゲノムライブラリーもしくはcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって、またはPCR増幅によって得てもよい。
【００３７】
成長因子をコードする遺伝子は、核酸構築物中で投与されてもよく、これは従来の組換えDNA技術を使用して核酸分子を宿主細胞に組み込むことを含む。通常、これは、核酸分子が異種である(すなわち、通常は存在しない)発現系に、核酸分子を挿入することを含む。異種の核酸分子は、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含む発現系に挿入される。本発明の実施は、特に明記しない限り、ウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技術の従来法を当該技術分野の範囲内で使用する。このような技術は、文献において完全に記載されている。たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)； DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)； Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)； Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)； Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)を参照されたい。これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３８】
哺乳類宿主への特定の外来遺伝子または天然遺伝子の導入は、まず適切な核酸ベクターに遺伝子配列を導入することによって容易となる。「ベクター」は、本明細書において使用されるものとして、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン、その他などの、適切な調節エレメントと結合されたときに複製ができ、かつ細胞間で遺伝子配列を移動することができる任意の遺伝的エレメントを意味する。したがって、本用語は、クローニングベクターおよび発現ベクター、並びにウイルスベクターを含む。核酸分子は、当該技術分野において周知の試薬を使用して、任意の多くの入手可能な発現ベクターおよび細胞系に挿入されてもよい。
【００３９】
哺乳類細胞に外因性遺伝子を導入および発現するためのベクターとして使用されるウイルスの例は、SV40ウイルス(Innisら、「Chromatin Structure of Simian Virus 40-pBR322 Recombinant Plasmids in COS-1 Cells」、Mol. Cell Biol. 3 (12): 2203-2210 (1983)； Okayamaら、「Bacteriophage Lambda Vector for Transducing a cDNA Clone Library into Mammalian Cells」、Mol. Cell Biol. 5 (5): 1136-1142 (1985)、これらは、参照としてこれらの全体が本明細書に組み入れられる)およびウシパピローマウイルス(Meneguzziら、「Plasmidial Maintenance in Rodent Fibroblasts of a BPV1-pBR322 Shuttle Vector Without Immediately Apparent Oncogenic Transformation of the Recipient Cells」、EMBO J. 3 (2): 365-371 (1984)； DiMaioら、「Bovine Papillomavirus Vector that Propagates as a Plasmid in Both Mouse and Bacterial Cells」、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 79 (13): 4030-4034 (1982)； Luskyら、「Characterization of the Bovine Papilloma Virus Plasmid Maintenance Sequences」、Cell 36 (2): 391-401 (1984)； Giriら、「Comparative Studies of the Expression of Linked Escherichia coli gpt Gene and BPV-1 DNAs in Transfected Cells」、Virology 127 (2): 385-396 (1983)、これらは、参照としてこれらの全体が本明細書に組み入れられる)、レトロウイルス・モロニーマウス肉腫ウイルス(Perkinsら、「Design of a Retrovirus-Derived Vector for Expression and Transduction of Exogenous Genes in Mammalian Cells」、Mol. Cell Biol. 3 (6): 1123-1132 (1983)； Leeら、「DNA Clone of Avian Fujinami Sarcoma Virus with Temperature-Sensitive Transforming Function in Mammalian Cells」、J. Virol. 44 (1): 401-412 (1982)； Curranら、「FBJ Murine Osteosarcoma Virus: Identification and Molecular Cloning of Biologically Active Proviral DNA」、J. Virol. 44 (2): 674-682 (1982)； Gazitら、「Mammalian Cell Transformation by a Murine Retrovirus Vector Containing the Avian Erythroblastosis Virus erbB Gene」、J. Virol. 60 (1) : 19-28 (1986)、これらは、参照としてこれらの全体が本明細書に組み入れられる)、およびHIVに基づいたウイルスを含む。
【００４０】
多くのアデノウイルスに基づいた(Ad)遺伝子送達系も開発されている。ヒトアデノウイルスは、受容体依存性エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二本鎖DNAウイルスである。これらのウイルスは、これらを培養および操作することが簡単であり、これらがインビボにおいて幅広い宿主範囲を示すので、特に遺伝子治療によく適している。アデノウイルスは、高力価で容易に産生され、安定しており、したがって精製して貯蔵することができる。複製コンピテントな形態においてさえ、アデノウイルスは一般に低レベルの羅病率のみを引き起こし、ヒト悪性度とは関連していない。さらに、Adは、分裂細胞および非分裂細胞の両者に感染し；遺伝子治療の標的である多くの組織は、主に非分裂細胞を含む(Askariに対する米国特許第6,171,855号、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。種々のアデノウイルスに基づいた遺伝子送達系の記載については、たとえばHaj-Ahmadら、「Development of a Helper-Independent Human Adenovirus Vector and Its Use in the Transfer of the Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Gene」、J. Virol. 57 (1): 267-274 (1986)； Bettら、「Packaging Capacity and Stability of Human Adenovirus Type 5 Vectors」、J. Virol. 67 (10): 5911-5921 (1993)； Mitterederら、「Evaluation of the Efficacy and Safety of in vitro, Adenovirus-Mediated Transfer of the Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator cDNA」、Hum. Gene Ther. 5 (6): 717-729 (1994)； Sethら、「Mechanism of Enhancement of DNA Expression Consequent to Cointernalization of a Replication-Deficient Adenovirus and Unmodified Plasmid DNA」、J. Virol. 68 (2): 933-940 (1994)； Barrら、「Efficient Catheter-Mediated Gene Transfer into the Heart Using Replication-Defective Adenovirus」、Gene Ther. 1 (1) : 51-58 (1994)； Berknerら、「Development of Adenovirus Vectors for the Expression of Heterologous Genes」、Biotechniques 6 (7): 616-629 (1988)； Richら、「Development and Analysis of Recombinant Adenoviruses for Gene Therapy of Cystic Fibrosis」、Hum. Gene Ther. 4 (4): 461-476 (1993)を参照されたい。これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００４１】
また、細胞染色体への組込みができるレトロウイルスのベクターは、挿入突然変異を介した発生的に重要な遺伝子を同定するために使用されている(たとえば、Changに対する米国特許第6,207,455号を参照されたい。これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。また、レトロウイルスのベクターは、遺伝子(または遺伝子群)を細胞に添加して、喪失遺伝子もしくは欠損遺伝子を置換するか、またはウイルスなどの病原体を不活性化させるといった、治療的な適用(たとえば、遺伝子治療)に使用される。レトロウイルス科のファミリーのメンバーは、これらのビリオンに逆転写酵素が存在することによって特徴づけられる(Changに対する米国特許第6,207,344号、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。ファミリーは、3つのサブファミリーに分割される：(1)オンコウイルス亜科、全ての発癌性のレトロウイルス、および密接に関連したいくつかの非発癌性ウイルスを含む；(2)レンチウイルス亜科、「遅いレトロウイルス」は、以下において詳細を議論する、および(3)スプマウイルス亜科、一般にいかなる臨床的疾患を引き起こすことなく、持続感染を誘導する「泡沫状」のレトロウイルス(Vermaらに対する米国特許第6,218,181号、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。いくつかのレトロウイルスは、発癌性(すなわち腫瘍形成性の)であるが、その他は、そうではない。オンコウイルスは、感受性の生物種における肉腫、白血病、リンパ腫、および乳癌を誘導する(Wilsonらに対する米国特許第6,033,905号、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。レトロウイルスは、多種多様な生物種に感染し、水平におよび垂直に伝達される。これらは、宿主DNAに組み込まれて、細胞から細胞へ宿主DNAの配列を伝達することができる。これにより、遺伝子治療を含む種々の目的のためのベクターとして、レトロウイルスの開発がなされた。たとえば、米国において承認された大多数の遺伝子導入試験は、レトロウイルスのゲノムの一部として治療的なポリヌクレオチド配列を含む複製欠損レトロウイルスベクターに依存する(Millerら、「Gene Transfer by Retrovirus Vectors Occurs Only in Cells that are Actively Replicating At The Time of Infection」、Mol. Cell Biol. 10 (8): 4239-4442 (1990)； Cornettaら、「No Retroviremia or Pathology in Long-term Follow-up of Monkeys Exposed to Amphotropic Retrovirus」、Hum. Gene Ther. 2 (3): 215-219 (1991)、これらは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。当業者に既知であるように、遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクターの主要な効果は、高効率で一定のタイプの複製細胞に遺伝子導入をすること、導入遺伝子の細胞DNAへの正確な組み込み、および遺伝子導入後にさらに配列が伝播することがないことである(Wilsonらに対する米国特許第6,033,905号、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。
【００４２】
本明細書において使用される「レンチウイルス」という用語は、ゆっくりと疾患の発症を引き起こすレトロウイルスの群(または属)をいう。この群の範囲内に含まれるウイルスは、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因微生物のHIV(ヒト免疫不全ウイルス；1型HIV、および2型HIVを含む)；ヒツジにおける脳炎(ビスナ)または肺炎(マエディ)を引き起こすビスナ-マエディ；ヤギにおける免疫欠乏、関節炎、および脳症を引き起こすヤギ関節炎-脳炎ウイルス；ウマにおける自己免疫溶血性貧血、および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコにおける免疫欠乏を引き起こすネコ免疫不全ウイルス(FIV)；ウシにおけるリンパ節症、リンパ球増多症、およびおそらく中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫欠乏ウイルス(BIV)；並びに人間に近い霊長類における免疫欠乏および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス(SIV)を含む。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間および遅延性の過程によって特徴づけられる。通常、ウイルスは、潜在的に単核細胞およびマクロファージを感染し、これらはそこからその他の細胞に広がる。HIV、FIV、およびSIVは、また、容易にTリンパ球(すなわち、T細胞)に感染する。レンチウイルスビリオンは、バー形状のヌクレオイドを有し、その他のレトロウイルスよりも大きなゲノムを含む。レンチウイルスは、ネガティブ鎖合成のためのプライマーとして、その他の感染性の哺乳類レトロウイルスによって通常使用されるtRNAProではなく、tRNAlysを使用する。レンチウイルスゲノムは、互いに相同性を示すが、その他のレトロウイルスとは相同性を示さない(Davisら、Microbiology, 4th ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., pp. 1123-1151 (1990)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。これらのウイルスによって引き起こされる疾患において重要な因子は、ウイルスゲノムの高い変異性であり、これにより、宿主免疫応答を逃れることができる変異体が産生されることとなる。レンチウイルスの利点は、持続的に導入遺伝子を発現する能力である。
【００４３】
また、アデノ随伴ウイルス(AAV)は、本発明においてベクターとして使用されてもよい。AAVは、小さな1本鎖(ss)DNAの、単純なゲノム機構(4.7kb)のウイルスであり、これが遺伝子工学のための理想的な基質となる。2つのオープン・リーディング・フレームは、一連のrepおよびcapポリペプチドをコードする。repポリペプチド(rep78、rep68、rep62、およびrep40)は、複製、レスキュー、およびAAVゲノムへの組込みに関与する。capタンパク質(VP1、VP2、およびVP3)は、ビリオンキャプシドを形成する。5'および3'末端で隣接するrepおよびcapオープン・リーディング・フレームは、145bpの逆方向末端反復(ITR)であり、この最初の125bpは、Y-またはT-型の二重構造を形成することができる。AAVベクターの発生のために重要なことは、全てのrepおよびcapドメインを切り取って、治療遺伝子またはリポータ導入遺伝子と置換することができることである(B. J. Carter, in 「Handbook of Parvoviruses」、P. Tijsser編、CRC Press, pp. 155-168 (1990)、これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる)。ITRsは、複製、レスキュー、パッケージング、およびAAVゲノムの組込みのために必要な最小の配列を表すことが示されている(Wilsonらに対する米国特許第5,871,9982号、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)。
【００４４】
上述したように、ウイルスベクターは、適切に感受性の宿主細胞に組換えベクターを導入する効率を増大するためにうまく使用されている。したがって、上述したいずれのアデノウイルス(Ad)、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターまたは当業者に既知のものを含むウイルスベクターは、本発明における使用に適している。ウイルスベクターの分野における現在の研究では、哺乳類細胞において高力価かつ高効率で導入される改良されたウイルスベクターが作製されている(たとえば、Finerらに対する米国特許第6,218,187号を参照されたい。これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。このようなベクターは、本発明に適しており、これは、本明細書に記載された1つまたは複数のウイルスベクターに由来する所望のエレメントの組み合わせを含むいずれかのウイルスベクターである。発現ベクターが特定のウイルスベクターに限定されることは企図されない。
【００４５】
また、一定の「制御エレメント」または「調節配列」が、ベクター構築物に組み込まれる。「制御エレメント」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流域調節性ドメイン、複製開始点、内因性リボソーム導入部位(「IRES」)、エンハンサーなどを集合的に指し示し、これらは、受容細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列を、適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳することができる限り、これらの調節要素の全てが必ずしも必要であるというわけではない。
【００４６】
本明細書においてその通常の意味において使用される「プロモーター領域」という用語は、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域であって、調節配列がRNAポリメラーゼを結合して下流(3'-方向)のコード配列の転写を惹起することができる遺伝子に由来するものをいう。真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、酵母、昆虫、および哺乳類の細胞の遺伝子を含む様々な真核生物供与源、並びにウイルスから単離されている。また、類似した調節エレメント、すなわちプロモーターは、原核生物にも見られる。このようなエレメントは、これらの強度および特異性を変化してもよい。たとえば、プロモーターは、「構成的」または「誘導性」であってもよい。
【００４７】
構成的プロモーターは、生物の発生および生命の全体にわたって遺伝子の発現を指示するプロモーターである。導入遺伝子の発現を誘導するために広く使用されているいくつかの構成的プロモーターの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のノポリン(nopoline)シンターゼ(NOS)遺伝子プロモーター(Rogersらに対する米国特許第5,034,322号、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーター、大部分の細胞タイプで発現されることが知られているいくつかのアクチン遺伝子のいずれかに由来するもの(Privalleらに対する米国特許第6,002,068号、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)、および多くの細胞タイプに蓄積することが知られている遺伝子産物であるユビキチンプロモーターを含む。
【００４８】
誘導性プロモーターは、誘導物質に応答して、直接的または間接的に1つまたは複数のDNA配列または遺伝子の転写を活性化することができるプロモーターである。誘導物質の非存在下では、DNA配列または遺伝子は転写されないと考えられる。誘導物質は、代謝産物などの化学薬品、または冷却、熱、毒素、もしくは病原または疾患薬剤の作用を介したものなどの生物に直接課される生理ストレスであることもできる。誘導性プロモーターを含む組換え細胞は、適切な環境要因または操作的病原に暴露することにより、細胞または生物に外部から誘導物質を適用することによって誘導物質にさらされてもよい。誘導性プロモーターの例は、β-インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、またはステロイドホルモンに反応する遺伝子から得られるいずれかのものに由来するテトラサイクリン反応エレメントおよびプロモーターを含む。組織特異的な発現は、遺伝子形質発現の分野においてよく特徴づけられており、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターは、当該技術分野において周知である。これらの遺伝子は、これが標的細胞に導入された後に、外来遺伝子の発現を調節するために使用される。
【００４９】
構成的または誘導性プロモーターは、本発明のウイルスベクターに使用してもよい。
【００５０】
ベクターの選択、適切なマーカー遺伝子、プロモーター／エンハンサー領域(類)、および適切な3'調節領域は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, NY (1989), およびAusubelら、(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.(これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されたような周知の分子クローニング技術を使用して、共に使用可能にライゲーションして本発明の発現系、またはその適切な断片を作製することができる。本明細書において使用されるものとして、「使用可能にライゲーションして」という用語は、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような方法での核酸配列の結合をいう。
【００５１】
一旦本発明の核酸構築物を調製して所望のベクターに挿入されると、宿主細胞に組み込む準備ができる。基本的には、この方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, New York (1989)(これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されたものなどの、当該技術分野において既知の標準的なクローニング手順を使用して、宿主細胞においてDNA分子の転写を得るために有効な条件下で、本発明の核酸構築物で宿主細胞を形質転換することによって行われる。適切な宿主は、細菌、ウイルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などを含むが、これらに限定されない。ベクターがウイルスベクターである場合、宿主細胞は、必要な所および力価で、パッケージングを最適化するように選択される。たとえば、本発明の核酸がアデノウイルスベクターに挿入される場合、細胞株HEK293は、高いベクター後代力価の期待値を有する適切な宿主株である。ベクターDNAは、様々な任意のトランスフェクション技術、たとえばリン酸カルシウム共同沈降反応、エレクトロポレーション、その他によってパッケージング細胞に導入されてもよい(Sambrook,ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)； DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)； Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition)； Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)； Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)、これらは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる)。本発明において使用されるその他の従来法は、ウイルスゲノムの相同組換えを、寒天重層におけるウイルスのプラーク化、シグナル生成を測定する方法、およびその他当該技術分野において既知のものまたは文献に記載されたものを含む。
【００５２】
本発明のウイルスベクターで適切な宿主をトランスフェクションした後、宿主においてウイルスを増殖させて回収する。通常、これは、周期的な間隔で細胞上清を回収する段階、および当該技術分野において周知の技術を使用して(たとえば、塩化セシウム密度勾配により)ウイルスプラークを未精製の可溶化液から精製する段階を含む。ウイルスの力価(pfu/ml)を決定して、必要に応じて、上に(たとえば濾過によって)、または下に(適切な緩衝液／培地で希釈することによって)調整することができる。本発明において、典型的なAd力価は、1010〜1012pfu/mlの範囲である。
【００５３】
本発明の遺伝子治療の局面を達成するためには、成長因子をコードする核酸を含む単離され、精製されたウイルスベクター、または同じもに感染したヒト細胞が、新生児において成長因子を発現して器官成熟を増強するために有効な条件下で、早産のヒト新生児に投与される。
【００５４】
本発明の組換えウイルスは、好ましくは生物学的に適合性の溶液もしくは薬学的に許容される送達媒体に、または該新生児に由来するいずれかの細胞タイプに懸濁して、新生児に投与されてもよい。適切な媒体は、無菌の塩類溶液を含む。薬学的に許容される担体であることが既知で、かつ当業者に周知のその他の水性および非水性の無菌等張液、並びに水性および非水性の無菌懸濁液を、この目的に使用してもよい。
【００５５】
本発明の組換えウイルスは、インビトロにおいて、またはインビボにおいて、所望の細胞にトランスフェクトし、かつ選択した導入遺伝子の十分なレベルの組込みおよび発現を提供して、過度の副作用を伴わずに、または医学の分野の当業者が決定することができる医学的に許容される生理作用を有する治療的な利益を提供するために十分な量で投与されてもよい。投与の好ましい方法は、肺成熟を増強するときは、吸入によるが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、粘膜に対する適用、並びに経口投与を含むその他の従来方法および薬学的に許容される投与方法が、本発明に包含される。
【００５６】
組換えウイルスの用量は、主に選択された遺伝子、患者の年齢、体重、および健康などの因子に依存すると考えられ、したがって、患者間で変更してもよい。用量は、あらゆる副作用に対する治療的利益と釣り合うように調整されるだろう。選択された遺伝子の発現レベルをモニターして、用量投与の選択、適応、または頻度を決定することができる。
【００５７】
本発明のもう1つの局面は、器官成熟を増強するために有効な条件下で、成長因子形成を増加する薬剤を早産のヒト新生児に投与することによって、早産のヒト新生児の器官成熟を増強する方法に向けられる。
【００５８】
成長因子形成を増加する適切な薬剤は、ホルモンを放出する成長ホルモンおよびそのペプチド類似体、並びにMK-0677によって例示されるものなどのペプチド擬態性の成長ホルモン分泌促進物質を含むが、これらに限定されない(Patchettら、「The Design of Peptidomimetic Growth Hormone Secretagogues」、In: Human Growth Hormone. Research and Clinical Practice,. Smithら、Eds., Humana Press, Totowa, pp. 45-67 (2000)、これは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。
【００５９】
本発明のさらなる局面は、成長因子、成長因子をコードする遺伝子、または成長因子形成を増加する薬剤を、IV型コラーゲン形成を増加するために有効な条件下で生体系に投与することによって、生体系におけるIV型コラーゲン形成を増加する方法に向けられる。
【００６０】
本明細書において使用される、生体系は、ヒト並びにチンパンジーおよびその他の類人猿およびサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマを含む農場動物；ネコおよびイヌを含む家畜；マウスラット、およびモルモット、その他同種のものなどの齧歯類を含む実験動物などの、非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されず、哺乳類網のあらゆるメンバーを含むことを本明細書では意味する。本用語は、特定の性または年齢を示さない。したがって、成体および新生児、並びに胎児も包含されることが企図される。
【００６１】
以下の実施例は、さらに本発明を例示する。
【００６２】
実施例
実施例1−夜間の成長ホルモンおよびマトリックスバイオマーカーのレベルの関係
親のインフォームドコンセント、軽微な同意、および制度上の承認により、健康な子供における夜間の成長ホルモンおよびマトリックスバイオマーカーレベルの関係をモニターし彼らが休眠している間に、血液サンプルを20分毎に抜き取った。全てのパラメータは、抜き取った血液から得られる血清において、特異的で、標準化され、および一般に受け入れられた方法によって測定した。代表的な所見は、図1A〜Dの3つのy軸プロットに示される。それぞれのプロットにおいて、水平軸は時間(試験時間および時計の時間)を示し、左の垂直軸はマトリックスバイオマーカーのレベルを与え、右の2つの垂直軸は成長ホルモンおよびコルチゾールのレベルをそれぞれ示す。マトリックスバイオマーカーの揺らぎは、黒四角／勾配陰影をつけた領域によってコードされ(PICP、I型コラーゲンのバイオマーカー；C-IV、IV型コラーゲンのバイオマーカー；PIIINP、III型コラーゲンのバイオマーカー；P1、ラミニンのバイオマーカー)、成長ホルモン(GH)の揺らぎは、黒菱形／粗い点の領域によって、およびコルチゾール(F)の揺らぎは、白円／細かい点の領域によってコードされる。バイオリズム研究の分野における確立した手順に従って、所与の時間におけるパラメータの値は、観測期間の間の全体にわたるパラメータの平均に由来するそのパーセント偏差(平均、または%DOMからのパーセント偏差)として表してある。図1Aは、PICPあたりのI型コラーゲンと、GHおよびFとの間の相互関係を示す。図1Bは、C-IVあたりのIV型コラーゲンと、GHおよびFとの間の相互関係を示す。図1Cは、PIIINPあたりのIII型コラーゲンと、GHおよびFとの間の相互関係を示す。図1Dは、P1あたりのラミニンと、GHおよびFとの間の相互関係を示す。予想されるとおり、I型コラーゲンおよびIII型のバイオマーカーレベルの全てのピーク(図1Aおよび1Cの粗い点の領域／勾配陰影をつけた領域)は、一貫して成長ホルモンピークに関する。驚くべきことに、成長ホルモンも、IV型コラーゲンのバイオマーカーレベルのピークの引き金を引くことから(図1Bの粗い点の領域／勾配陰影をつけた領域)、成長ホルモン濃度が増大する場合に基底膜コラーゲンの生合成が増加し、かつこれらが達する成長ホルモン値のその最大値に達することが示される。対照的に、ラミニンの合成は、成長ホルモン値(図1Dの粗い点の領域の領域／勾配陰影をつけた領域)とは互いに関連しないが、ラミニンおよびIV型コラーゲンは、基底膜の形成のために同様に必要とされる。
【００６３】
図2A〜Cは、研究被検者あたりの成長ホルモンの総量およびコラーゲンバイオマーカーの総量を示し、両方とも曲線下領域の測定によって評価し、線量−効果相関を示し：成長ホルモンは低くなると、バイオマーカーも低くなる(図2A：I型コラーゲンのためのPICP；図2B：IV型コラーゲンのためのC-IV；図2C：III型コラーゲンのためのPIIINP)。概説すると、内因性のヒト成長ホルモンは、インビボにおけるIV型コラーゲンの形成を刺激することに加えて、I型コラーゲンおよびIII型を刺激する。したがって、外因性のヒト成長ホルモンの投与は、IV型コラーゲン合成の欠損によって特徴づけられるあらゆる症状を緩和するために適しており、同様に、成長ホルモンは、I型コラーゲンおよびIII型合成の欠損によって特徴づけられるあらゆる症状を緩和するために適している。
【００６４】
実施例2−生命の第一週におけるマトリックスバイオマーカーとこれらのその後の経過の種々の臨床的パラメータとの関係
親のインフォームドコンセントおよび制度上の承認により、一群の早産の新生児において、生命の第一週におけるマトリックスバイオマーカー(fw)とこれらのその後の経過の種々の臨床的パラメータとの間の関係を、治療的な介入を問わずモニターした。図3におけるカプラン-マイヤー解析で示されるように、905ng/ml以下のfwC-IVレベルを有する早産の新生児では、fwC-IVレベルが905ng/mlを超えるものよりも、新生児集中治療室に有意に長く入院を必要とした：それぞれ110日対85日。両群間の平均在胎齢は、異ならなかった。同様のカットオフ値は、その他のどのようなマトリックスバイオマーカーについても定義することができなかった。生命の第一週の間に早産の新生児において測定した場合に、その後に生命の第一週のずっと後にのみ発生する新生児集中治療における滞在期間と有意に相関するというバイオマーカーが存在するはずであることは、完全に予測されていない。また、図3は、fwC-IVを増加する、すなわち、右の曲線を左のものの方へ移動するいずれかの薬剤は、新生児集中治療における滞在期間を短縮することを合理的に予想することができることを教示する。
【００６５】
新生児集中治療室(NICU)における滞在の長さは、生存者が負う新生児集中治療室費用を決定することが知られているので(St. Johnら、「Costs Of Neonatal Care According To Gestational Age At Birth And Survival Status」、Am. J. Obstet. Gynecol., 182: 170-175 (2000)、これは、参照として、その全体が本明細書に組み入れられる)、早産の新生児の生命の第一週において測定されるマトリックスバイオマーカーと、その患者の新生児集中治療の費用に対して発行されるその後の請求書との間の関係も解析した。また、注目に値する、非常に有意な関係が確認された。表1および表2には、個々のバイオマーカーについての所見、および一次データから数学的に形成された比のセットを要約する。
【００６６】
（表１）  生命第一週(fw)のマトリックスバイオマーカーおよび新生児集中治療室における滞在期間
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【００６７】
（表２）  生命第一週(fw)のマトリックスバイオマーカーおよび新生児集中治療室における費用
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【００６８】
滞在期間に関して、基底膜を構築する2つの主成分、IV型コラーゲンおよびラミニンは、図4に示したように、同齢集団の全ての個体に対して反対の様式で挙動し：fwC-IVが高いと、滞在が短く；fwP1が高いと、滞在が短い。したがって、第一週のパラメータは、長期滞在の可能性および医薬資源の予期される必要性を評価するために、個々に、または数学的な比として使用することができる。fwマトリックスバイオマーカー測定を基礎とした滞在期間を数学的に予測するための例は、図5、6、および7に挙げてある。これらの図は、どのような医薬の介入が滞在期間を減少させる可能性があるかを教示し：コラーゲンの量の増加は、ラミニンの量と関連する。図8に示したとおり、図5、6、および7に示したバイオマーカーおよびバイオマーカーの比は、在胎齢には関連がない。
【００６９】
新生児集中治療の費用に関して、fwマトリックスバイオマーカーと医師の直接のサービスに対して発行される請求書(「医師の請求書」)との間、与えられた支持的サービスに対する病院の請求(「病院の請求書」)との間、および両方の合計(「総請求」)との間の関係を解析した。また、基底膜を構築する2つの主成分、IV型コラーゲンおよびラミニンは、図9に示したように、全ての特許研究における医者の請求に対して反対の様式で挙動し：fwC-IVが高いと、医師の費用は低く；fwP1が高いと、医師の費用が高い。したがって、第一週パラメータは、将来負うであろう費用を評価するために、個々に、または数学的な比として使用することができる。fwマトリックスバイオマーカー測定を基礎とした3つの費用パラメータのそれぞれを数学的に予測するための例は、図10、11、および12に挙げてある。それぞれの図の挿入は、在胎齢自体が、その後に負う費用を評価するために有意であることが示されたいずれのfwバイオマーカーパラメータにも関連しないことを示す。これらの図は、どんな医薬の介入が早産の新生児のNICU治療に対する3つの費用カテゴリーのそれぞれを減少する可能性があるか：コラーゲンの量の増加がラミニンの量と関連することを教示する。
【００７０】
好ましい態様を本明細書に詳細に表し記載しているが、関連技術分野における当業者には、種々の改変、付加、置換などが本発明の精神から逸脱することなく成され得ることが明らかであり、したがって、それらは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内であるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図1A〜Dは、4人の子供において、拍動性の夜間の成長ホルモン分泌(黒四角／粗く点を付けた領域)およびマトリックスバイオマーカー反応との間の典型的な関係を示すグラフである(黒四角／勾配陰影をつけた領域；図1A：PICP、プロI型コラーゲンのC末端プロペプチド；図1B：C-IV、IV型コラーゲンのらせんドメイン；図1C：PIIINP、プロIII型コラーゲンのN末端プロペプチド；図1D：ラミニン-1のP1抗原)。朝のコルチゾール分泌(白円／細かい点の領域)の生理学的な上昇は、図1AおよびBの反応を修飾する。それぞれのパラメータは、それぞれの時点における、生体リズム研究において示される標準データと一致するパラメータ(平均=0%の偏差)で全体的な夜間の平均(%DOM)からパーセント偏差として表してある。
【図２】図2A〜Cは、成長ホルモンの総量およびコラーゲンバイオマーカーの総量を示すグラフであり(図2A：PICP、プロI型コラーゲンのC末端プロペプチド；図2B：C-IV、IV型コラーゲンのらせんドメイン；図2C：PIIINP、プロIII型コラーゲンのN末端プロペプチド)、両方とも、用量−効果の関係を示す曲線下領域の測定によって評価した。
【図３】生命の最初の7日後にどのような治療的な介入があるかにかかわらず、生命第一週の間(fw)とその後の新生児集中治療室における滞在期間との間のC-IVバイオマーカーの関係を示すカプラン-マイヤープロットである。905ng/mlのfwC-IV以下のカットオフ値で、NICUにおける平均滞在は、いずれの同齢集団の新生児も、平均在胎齢(GA)が異ならないという事実にもかかわらず、905ng/mlのfwC-IVよりも高いカットオフ値よりも有意に長い。Nは、研究被検者の数。
【図４】IV型コラーゲンのC-IVバイオマーカーおよびラミニンのP1バイオマーカーの関係を示すグラフであり、生命の第一週(fw)において、NICUにおけるその後の滞在期間に関して測定した。それぞれのデータ点は、１人の早産の新生児を反映する。
【図５】fwマトリックスバイオマーカー測定に基づいたNICUにおける滞在期間の数学的な予測を示すグラフであり、比[fwC-IV+fwPICP/fwP1]に包含される。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図６】fwマトリックスバイオマーカー測定に基づいたNICUにおける滞在期間の数学的な予測を示すグラフであり、比[fwPICP/fwP1]に包含される。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図７】fwマトリックスバイオマーカー測定に基づいたNICUにおける滞在期間の数学的な予測を示すグラフであり、fwP1に包含される。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図８】図5〜7に示したバイオマーカーパラメータおよび新生児の在胎齢がいずれの関係も持たないことを示す。
【図９】IV型コラーゲンのC-IVバイオマーカーおよびラミニンのP1バイオマーカーの関係を示すグラフであり、生命の第一週(fw)において、NICUにおいて与えられる医師の直接のサービスに対するその後の請求書に関して測定した。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図１０】NICUにおいて与えられる医師の直接のサービス、与えられる支持サービスに対する病院の請求、および比[fwC-IV+fwPICP/fwP1]によって包含されるfwバイオマーカー測定を基礎とした両者の合計に対して発行される請求書の数学的な予測を示すグラフである。挿入は、バイオマーカーパラメータおよび新生児の在胎齢がいずれの関係も持たないことを示す。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図１１】NICUにおいて与えられる医師の直接のサービス、与えられる支持サービスに対する病院の請求、および比[fwC-IV/fwP1]によって包含されるfwバイオマーカー測定を基礎とした両者の合計に対して発行される請求書の数学的な予測を示すグラフである。挿入は、バイオマーカーパラメータおよび新生児の在胎齢がいずれの関係も持たないことを示す。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図１２】NICUにおいて与えられる医師の直接のサービス、与えられる支持サービスに対する病院の請求、およびfwP1によって包含されるfwバイオマーカー測定を基礎とした両者の合計に対して発行される請求書の数学的な予測を示すグラフである。挿入は、バイオマーカーパラメータおよび新生児の在胎齢がいずれの関係も持たないことを示す。それぞれのデータ点は、1人の早産の新生児を反映する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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