(57)【要約】本発明は、Pero抽出物の活性成分として特徴づけされるＣＡＥの単離、精製、及び同定に関し、当該ＣＡＥはキナ酸類似体として同定され構造的に解明される。
2005526053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物種の水溶性抽出物の生体活性成分の単離方法であって、
前記抽出物は約199nmでＵＶ最大値を示し、
24時間に亘り100℃未満の温度で安定で、且つ
約121℃で少なくとも20分間までのオートクレーブによる滅菌処理に安定であり、
約-20℃で液体形態で凍結すると、少なくとも6ヶ月間生物学的活性を維持し、
約12,000までの分子量を有する分子から必須になり、
(a)第一のアルコール溶液での沈殿により、前記水溶性抽出物からアルコール不溶性成分を除去する工程；
(b)工程(a)で生成した前記水溶性抽出物をプレランした薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにスポットし、第二のアルコール溶液中に約1％のアンモニアの系において、スポットしたプレートをクロマトグラフィーに供し、それによってＲｆ＝0.2-0.3を有する蛍光バンドを得る工程；
(c)前記Ｒｆ＝0.2-0.3を有する蛍光バンドを分離する工程；
(d)前記分離蛍光バンドをアンモニア水で溶出し、溶出した分離蛍光バンドを乾燥してパウダーを形成する工程；
(e)前記パウダーを第三のアルコール溶液で抽出し、非アルコール可溶化シリカゲルを除去して、前記第三のアルコール溶液を残存させる工程；
(f)前記第三のアルコール溶液を濃縮する工程；及び
(g)前記濃縮した第三のアルコール溶液から前記生体活性成分を分離する工程；
を含む、生体活性成分の単離方法。
【請求項２】
前記植物種がUncaria種である、請求項1に記載の生体活性成分の単離方法。
【請求項３】
前記水溶性抽出物がUncaria tomatosaである、請求項1に記載の生体活性成分の単離方法。
【請求項４】
前記生体活性成分が一つ以上のカルボキシアルキルエステル（ＣＡＥ）から必須になる、植物種の水溶性抽出物の生体活性成分。
【請求項５】
前記ＣＡＥがキナ酸類似体である、請求項4に記載の生体活性成分。
【請求項６】
前記キナ酸類体がキナ酸ラクトンまたはキナ酸の塩を含む、請求項5に記載の生体活性成分。
【請求項７】
前記ＣＡＥがキナ酸に存在している、請求項4に記載の生体活性成分。
【請求項８】
a)ＴＮＦ−α生産を阻害するための、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するための、製薬学的な有効量の一つ以上のカルボキシアルキルエステル（ＣＡＥ）；
b)非毒性の不活性なキャリアまたは希釈液；
を含む、製薬組成物。
【請求項９】
前記ＣＡＥがキナ酸類似体である、請求項8に記載の製薬組成物。
【請求項１０】
前記キナ酸類似体がキナ酸ラクトンまたはキナ酸の塩を含む、請求項8に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、投与方法。
【請求項１２】
ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって阻害が生じる、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の免疫能力を促進することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって阻害が生じる、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の免疫系と関連する疾患を治療することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって阻害が生じる、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の炎症性応答を阻害することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって阻害が生じる、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の炎症性応答と関連する疾患を治療することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって誘導が生じる、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによって哺乳動物の抗腫瘍性応答を促進することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で、請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することによって誘導が生じる、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによる腫瘍の形成及び増殖に対する哺乳動物の応答と関連する疾患を治療することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
請求項8に記載の製薬組成物の製薬学的有効量を哺乳動物に投与することによって促進が生じる、哺乳動物のＤＮＡ修復工程を促進することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
請求項8に記載の製薬組成物の製薬学的有効量を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物の老化と関連する疾患を治療することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
請求項8に記載の製薬組成物を哺乳動物に投与することから刺激が生じる、毒性の代謝性または環境性の曝露の終了後、抹消血細胞の回復を刺激することによる、哺乳動物の免疫能力を促進することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項２１】
請求項1に記載の方法によって単離された、植物種の水溶性抽出物の生体活性成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャッツクロー（カギカズラ属）の水抽出物の生体活性成分の単離、精製、及び構造同定に関する。前記生体活性成分は、キナ酸ラクトンとして同定される。本発明はまた、温血動物における免疫、抗炎症性、抗老化性、抗腫瘍性、及びＤＮＡの修復工程を促進するための、前記生体活性成分の製薬学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウニァ・デ・ガトまたはキャッツクローとして一般的に知られているUncaria tomentosaは、天然治療薬として歴史的に広く使用されており、非常に多様な健康上の疾患を治療するために数多くの栄養補給処方に現在存在している。本出願人の知見では、米国特許第6,039,949号及び第6,238,675 B1号に開示され、Peroに対して米国番号第09/824,508号（"Pero特許"）が許可されている水溶性抽出物（"Pero抽出物"）を除き、キャッツクローの市販の調製物の全てが、そのオキシインドールアルカロイド含有物に基づいている。これは、1960年代初頭のオキシインドールアルカロイドの存在のKeplinger博士(オーストリア)の発見のためである(Keplinger, K., Laus, G., Wurm, M., Dierich, M.P., Teppner, H. Uncaria tomentosa (Willd.) DC.-Ethnomedicinal use and new pharmacological, toxicological and botanical results, J. Ethanopharmacology 64: 23-34, 1999)。Pero抽出物は、その好ましい実施態様がC-MED-100(登録商標)の名称で市販されているが、ウニァ・デ・ガトまたはキャッツクロー抽出物としても知られている、Uncaria tomentosaの木の樹皮の水ベースの抽出物であり、微量のみのアルカロイド（＜0.05％）を含む点で他の市販品とは非常に異なる。その代わりにPero抽出物は、新種の活性成分、カルボキシルアルキルエステル（ＣＡＥ）を含み、それはPero特許に記載され保護されている指摘された効力を有する。C-MED-100(登録商標)は、自己免疫及びＤＮＡ修復促進機能の両者をサポートするために栄養補助産業で提供された初めての製品であり、自己免疫疾患、炎症性疾患、新生物性疾患のような年齢相関的疾患の結果を減少する点で多大な重要性を有する。C-MED-100(登録商標)抽出物に関するここでの参考文献は、Pero抽出物を含むように理解され、その中でC-MED-100(登録商標)抽出物は好ましい実施態様である。
【０００３】
Pero抽出物の活性成分の正確な化学的同定は、今までのところ達成されていない。しかしながら当該成分の化学的及び生物学的特徴づけは、Pero抽出物の市場での製造を標準化するように十分に完成されている（Pero特許を参照）。
【０００４】
市場で入手可能なPero抽出物であるC-MED-100(登録商標)抽出物が製剤化され、キャッツクローの歴史的な医薬的使用に基づいており、その重要な工程は、約95℃で約18時間の徹底的な温水での抽出である。次いで前記抽出物は限外濾過に供せられ、高分子量（＞10,000MW）の毒性接合物が除去され、スプレー乾燥された結果、8-10％のカルボキシアルキルエステル（ＣＡＥ）が活性成分として含まれる。ＣＡＥは、木炭での吸着（85％）の結果として、C-MED-100(登録商標)抽出物の唯一の活性成分として特徴づけされた。非吸着分画においては、生物学的活性は観察されなかった。精製ツールとして薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して、活性成分は約200nmでＵＶ吸収最大値を示し、ヒドロキシルアミン及び塩化鉄と反応したため、それらはエステルと特徴づけされた(例えばＣＡＥ)。
【０００５】
250-700mgの間のC-MED-100(登録商標)の毎日の経口投与量は、ヒトにおいて有効であるとわかっている。これらの投与量は、ヒトを含む温血動物の抗炎症性、ＤＮＡ修復、免疫、及び抗腫瘍性の工程を促進することが示されている(Pero特許、Lamm, S., Sheng, Y., Pero, R. W., Persistent response to pheumococcal vaccine in individuals supplemented with a novel water soluble extract of Uncaria tomentosa, C-Med-100(登録商標) extract, Phytomed 8: 267-274, 2001; Sheng, Y., Li, L., Holmgren, K., Pero, R.W., DNA repair enhancement of aqueous extracts of Uncaria Tomentosa in a human volunteer study, Phytomed 8: 275-282, 2001; Sheng, Y., Bryngelsson, C., Pero, R. W., Enhanced DNA repair, immune function and reduced toxicity of C-MED-100(登録商標)extract, a novel aqueous extract from Uncaria tomentosa, J. of Ethnopharmacology 69: 115-126 (2000)参照)。
【０００６】
C-MED-100(登録商標)抽出物中のＣＡＥは、老化を調節する重要な生理学的応答である、ＤＮＡ修復及び免疫細胞応答の両者を促進するため、食事サプリメントとして重要な栄養学的サポートを与えることが示されている(Pero特許、Sheng, Y., Pero, R.W., Wagner, H., Treatment of chemotherapy-induced leukopania in a rat model with aqueous extract from Uncaria tomentosa, Phytomedicine 7(2): 137-143 (2000)、及び前記引用のもの参照)。これらの工程の両者は、核転写カッパベータ（ＮＦ−κβ）を調節することを含む。ＮＦ−κβは、（ｉ）アポトーシス細胞死から細胞を救助する核の現象、及び（ｉｉ）炎症後のサイトカイン生産をコントロールすることが周知である(Beg, AA及びBaltimore, D., An essential role for NF-κβ in preventing THF-α induced cell death, Science 274: 782-784, 1996; Wang, C-Y, Mayo, M.W., Baldwin, A.S., THF-α and cancer therapy-induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NF-κβ, Science 274: 784-787, 1996)。それ故、このメカニズムは、炎症後サイトカイン生産の阻害を有するプログラムされた細胞毒性に対するアポトーシスの誘導と炎症とを直接結びつける。
【０００７】
アポトーシスは、細胞を分裂(複製)から分化に調節し、増大した機能的能力に向かわせる体内で必須の生化学的工程である。アポトーシスに入った細胞は、分化して機能性を増大するように刺激されるだけではなく、この「プログラムされた細胞死」から最終的に死を迎えるであろう。かくして、C-MED-100(登録商標)抽出物によるＮＦ−κβ阻害から生ずる誘導されたアポトーシスは、（ｉ）アポトーシスにより複製から押出されて終局的な死を迎えるため、腫瘍細胞を効率的に殺傷し、同時に（ｉｉ）より免疫適合性の細胞を分化に向かわせ、ＤＮＡ修復の平行的な促進のためより長期的に生存するため、免疫細胞の応答性を増大するであろう。
【０００８】
ＮＦ−κβはまた、サイトカイン(増殖ホルモン)を生産するように炎症性細胞に支持するシグナルを送る。次いでこれらのシグナルは、食細胞により侵襲性の感染性薬剤を殺傷するように刺激し、それは少なくとも部分的に、高濃度の酸素フリーラジカルを生産することによって達成される。かくしてＮＦ−κβを阻害することは、正常な身体組織に有害であり得る炎症工程の過剰反応を防止するため、抗炎症特性を有する。さらに、炎症後のサイトカインは、ヒトにおける内因性のフリーラジカル生産の主要な供給源であるため、ＮＦ−κβの阻害は、数年間に亘り蓄積しているであろう遺伝的な損傷を減少することにより抗突然変異原性である。ラジカルがより生産されにくくなると、ＤＮＡに対する損傷が減少し、天然の修復の阻害も減る。その結果として老化が縮小するのである。
【０００９】
かくして、Pero抽出物、好ましくはC-MED-100(登録商標)抽出物は、ＮＦ−κβ阻害によりフリーラジカル損傷を防止し、アポトーシスにより分化と免疫細胞応答性を誘導し、ＤＮＡ修復を促進し、腫瘍細胞を殺傷し、これらは老化に関する主要な因子であるため、抗老化作用のための究極的な栄養補助物である(Sheng, Y., Pero, R.W., Amiri, A.及びBryngelsson, C., Induction of apoptosis and inhibition of proliferation and clonogenic growth of human leukemic cell lines treated with aqueous extracts of Uncaria Tomentosa., Anticancer Research 18: 3363-3368 (1998); Sandoval-Chacon M, Thompson JH, Zhang XJ, Liu X, Mannick EE, Sadowicka H, Charbonet RM, Clark DA, Miller NJ, Antiinflammatory actions of cat's claw: the role of NF-kappaβ, Aliment Pharmacol Ther 12: 1279-1289, 1998; Sandoval M, Charbonnet RM, Okuhama NN, Roberts J, Krenova Z, Trentacosti, AM, Miller MJ, Cat's claw inhibits TNF alpha production and scavenges free radicals: role in cytoprotection, Free Radicals Biol. Med. 29(1): 71-78, 2000)。その活性成分を同定することは有益である。活性成分を単離して同定することにより、前記成分を精製し、製薬学的な使用を促進し、その効力を増大することが可能である。
【特許文献１】米国特許第6,039,949号
【特許文献２】米国特許第6,238,675 B1号
【特許文献３】米国番号第09/824,508号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Pero抽出物の活性成分として特徴づけされるＣＡＥの単離、精製、及び同定に関し、当該ＣＡＥはキナ酸類似体として同定され構造的に解明される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
もし医薬的使用のために歴史的に実施されている、植物種Uncariaが温水抽出され、次いで限外濾過されて、例えばタンニンの毒性接合体を含む、より高分子量(>10,000)の成分が枯渇されると、限外濾過されない分画が残り、それは強力な免疫、抗腫瘍性、抗炎症性、及びＤＮＡ修復促進特性を有するUncariaの新規な植物性医薬調製物(例えばC-MED-100(登録商標)抽出物)である。本発明の好ましい実施態様では、C-MED-100(登録商標)抽出物は、水中に溶解し、スプレー乾燥され、スプレー乾燥剤(デンプン)が90％水性エタノールでの沈降により除去される。生成した溶液をシリカゲルでの薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、産物に効力を与える活性成分を同定する。90％エタノールのC-MED-100(登録商標)抽出物を、ＴＬＣプレート(シリカゲル60 Ｆ２５４)にスポット(アプライ)し、次いで約95％エタノールより高い濃度で約1％アンモニアの系でクロマトグラフィーを実施する。1％アンモニア水で溶出し、その後アポトーシスの誘導により腫瘍細胞を殺傷する能力についてバイオアッセイすると、生物学的活性（Ｒｆ＝0.2-0.3で）を有するＴＬＣクロマトグラム上の単一の領域が存在する。Ｒｆ＝0.2-0.3の化合物は、約200nmで水中において紫外線吸収最大値を示し、木炭上に吸着し、ヒドロキシルアミンと塩化鉄と反応によって化学的にＣＡＥと特徴づけされる(Bartos, Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Talanta 27: 583-590, 1980)。
【００１２】
本発明の別の実施態様では、Pero抽出物、好ましくはC-MED-100(登録商標)抽出物から単離した生物学的に活性なＣＡＥはさらに精製され、キナ酸類自体として構造的に同定される。アンモニア水でのシリカＴＬＣプレートからの溶出は、シリカに非常にタイトに結合するため必要であることがわかった。Ｒｆ＝0.2-0.3のスポットは、他のC-MED-100(登録商標)抽出物成分から本質的にフリーであるが、それは比較的高量の溶解した無機シリカを含む。シリカＴＬＣでの精製スキームから導入された無機成分を除去するために、1％アンモニア水溶液を凍結乾燥し、次いでメタノールで再溶解し、溶解したシリカを残存させる。Ｒｆ＝0.2-0.3スポットをメタノールから結晶化し、その後化学的分析によりキナ酸と同定する。
【００１３】
かくして、本発明の一つの実施態様は、
(a)Pero抽出物を蒸留水と混合し、エタノールを蒸発させることにより、Pero抽出物からスプレー乾燥キャリアを沈降し、水溶性抽出物を凍結乾燥する工程；
(b)凍結乾燥した抽出物を蒸留水とエタノールと混合し、薄層クロマトグラフィーのためのスポッティング混合物を得る工程；
(c)混合物をプレランＴＬＣプレートにスポットし、約1％のアンモニアとエタノールとの系においてプレートをクロマトグラフィーに供し、それによってＲｆ＝0.2-0.3での蛍光バンドを得る工程；
(d)Ｒｆ＝0.2-0.3での蛍光バンドを分離する工程；
(e)分離バンドをアンモニア水で溶出し、溶出された分離バンドを凍結乾燥で乾燥し、パウダーを形成する工程；
(f)パウダーをメタノールで抽出し、可溶化したシリカゲルをメタノール溶液で除去し、メタノール溶液を残存させる工程；
(g)メタノール溶液を濃縮する工程；及び
(h)濃縮した溶液を結晶化し、生体活性成分を得る工程；
を含む、Pero抽出物、好ましくはC-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分を単離する方法を含む。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、前述の方法によって得られる、Pero抽出物、好ましくはC-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分の同定を含む。この実施態様では、生体活性成分は、Pero抽出物と同じ特性を示し、キナ酸類似体から必須になる。好ましくはキナ酸類似体は、キナ酸ラクトンである。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、製薬学的な有効量のPero抽出物の生体活性成分と、非毒性の不活性なキャリアまたは希釈液とを含む製薬組成物を含む。本発明はまた、(i)ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の免疫能力を促進するために；(ii)ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の免疫系と関連する疾患を治療するために；(iii)ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の炎症性応答を阻害するために；(iv)ＴＮＦ−α生産を阻害するのに、または白血球細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、ＴＮＦ−α生産を阻害することによる、または白血球細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の炎症性応答と関連する疾患を治療するために；(v)腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによる哺乳動物の抗腫瘍性応答を促進するために；(vi)腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するのに有効量で製薬組成物を投与することを含む、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによる腫瘍の形成及び増殖に対する哺乳動物の応答と関連する疾患を治療するために；及び(vii)哺乳動物のＤＮＡ修復工程を促進し、かくして老化性疾患を治療するのに重要な抗突然変異原活性を提供するために、前記製薬組成物を使用することを含む実施態様を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の方法及び組成物は、以下の実施例を参考としてより適切に理解される。
【実施例】
【００１７】
実施例１：Pero抽出物の生体活性成分の単離及び精製
Pero抽出物、好ましくはC-MED-100(登録商標)抽出物の調製方法及び組成物はPero特許に記載されており、それは参考としてここに取り込まれる。Pero抽出物の好ましい実施態様であるC-MED-100(登録商標)抽出物は、Pero特許に以前に記載されたように、キャッツクロー(Uncaria tomentosa)に対して90-100℃で18-24時間で温水抽出を実施し、限外濾過にかけ、10,000分子量より大きい化合物を除去したものである。C-MED-100(登録商標)抽出物はさらに、コーンスターチ(Niro F-10 Spray-Drier)での抽出物のスプレー乾燥により、市販品のために調製されている。ここでは、C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分をＣＡＥとして精製するための方法が使用され、これらの方法がいずれのPero抽出物に対しても適用されると解される。この方法は以下の通りである：
【００１８】
1.  活性成分の見積もりのためのC-MED-100(登録商標)抽出物のワークアップ：
C-MED-100(登録商標)抽出物中のＣＡＥは、非常に普通でない水溶性を有する。それらはタンニン及びポリサッカリドポリマーに結合する傾向を有し、そのため乾燥すると、エタノールのような適当な有機溶媒に再溶解することが困難である。好ましい方法は以下の通りであるが、提供されるパラメーターはおよそのものであり、制限的なものではない。
【００１９】
(a)100mgのC-MED-100(登録商標)抽出物を、30分にわたりガラスチューブ中の1mlの蒸留水に溶解する。溶解した溶液を10分間2000×gで遠心分離する。生成した第一の上清を分析のために保存する。
【００２０】
(b)200μlの第一の上清を、新しいガラスチューブに配置し、4.8mlの99.7％エタノールをそこに加える。生成した溶液は、約96％エタノール中に懸濁された4mg/mlのC-MED-100(登録商標)抽出物を含む。
【００２１】
(c)C-MED-100(登録商標)抽出物/エタノール溶液をボルテックス(混合)し、2000×gで遠心分離し、不溶性の物質を除去する。生成した第二の上清を分析のため保存する。
【００２２】
(d)第二の上清を、ＵＶ吸収の測定のため99.7％のエタノールで、4mg/mlのC-MED-100(登録商標)抽出物濃度から30-200μm/mlに希釈する。好ましくは、60及び120μg/mlの濃度を、ＵＶ吸収によるＣＡＥの計算のために二重の濃度として試験する。
【００２３】
(e)二つの濃度のC-MED-100(登録商標)抽出物(好ましくは60及び120μg/ml)についての205nmでのＵＶ吸光度を、ＵＶ分光測定器で測定する。C-MED-100(登録商標)抽出物中のＣＡＥは、205nmでＵＶ最大吸収を有するので、ＣＡＥの量はＵＶ吸収の度合いによって見積もられて良い。ＵＶ吸収の度合いに対するμg/ml単位のＣＡＥの量を示す標準曲線は、図１に示されている。
【００２４】
(f)μg/ml単位でのＣＡＥの濃度の計算は、等式ｙ＝0.0491ｘ＋0.212（式中ｙ＝ＵＶ測定された吸光度の値、及びｘ＝ＣＡＥの濃度(μg/ml)）によって、ベストフィットの傾斜の直線回帰分析によって決定される。次いで、ＵＶ標準曲線から計算されたＣＡＥが、C-MED-100(登録商標)抽出物中のＣＡＥのパーセンテージの計算における指定因子として機能することに対して、二つの異なる濃度のC-MED-100(登録商標)抽出物(好ましくは60及び120μg/ml)が、決定因子として機能する。実際に二つの値は平均化される。
【００２５】
(g)前述の方法は、ＣＡＥのヒドロキサム酸への変換、及び塩化鉄との反応を含む比色測定方法に対して実証されている(Bartos, Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Telanta 27: 583-590, 1980)。二つの方法は、ＣＡＥ含有量の同じ見積もりを与える。
【００２６】
2.  C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分の最終生成及び単離のための分析方法
再言すると、提供されたパラメーターはおよそのものであり、例示的であって制限的ではない。
【００２７】
(i)C-MED-100(登録商標)抽出物の粗水抽出物からのスプレー乾燥キャリア(コーンスターチ)の沈降：5gのC-MED-100(登録商標)抽出物を、50mlの蒸留水と950mlの99.7％エタノールと混合する。エタノールを空気中に蒸発させ、生成した溶液を凍結乾燥する。収率は約1gである。
【００２８】
(ii)C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分のシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）精製及び単離
【００２９】
工程1：200mgのC-MED-100(登録商標)抽出物からデンプンを除去した（上記(i)の方法の後）ものに対して、200μlの蒸留水と、200μlの95.5％エタノールを加える。混合してスポッティング混合物を形成する。
【００３０】
工程2：4のプレランＴＬＣプレート(シリカゲル60Ｆ２５４)上に工程1のスポッティング混合物をスポットする。溶出系は、少なくとも95％のエタノール中の約1％のＮＨ３からなる。単一の活性成分が、Ｒｆ＝0.2-0.3で見出される。
【００３１】
工程3：Ｒｆ＝0.2-0.3の蛍光青色バンドを分離する。約1％のアンモニア水で溶出し、凍結乾燥して乾燥する。
【００３２】
工程4：工程3で得たパウダーをメタノールで抽出し、溶解したシリカゲルを除去する。メタノール溶液を濃縮し、活性成分を結晶化する。
【００３３】
(iii)活性成分の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での定量的測定：カラムは好ましくは3μmのＣ１８カラムである(83mm×4.3mm内径、Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)。好ましい溶媒勾配溶出液は以下の通りである：ポンプＢはメタノールを含み、ポンプＡは蒸留水中の1％酢酸を含む。勾配を1.5ml/分の流速で25分間にわたり10％から90％まで稼動させる。検出はＵＶ254nmである。ピークは勾配の稼動中の18分で出現する。
【００３４】
(iv)活性成分の分光光度測定検出：C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分は、約200nmでのＵＶ範囲で水中での吸着最大を有する。よって、約200nmでの吸着最大を有するC-MED-100(登録商標)抽出物の粗抽出物、並びにＣＡＥのようなその精製活性成分、及びその対応する有機酸を、既知のＣＡＥスタンダードに対してこの波長でのＵＶ吸収によって見積もることができる。
【００３５】
C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分の生物学的活性のアッセイは、以下のように準備された：HL-60 W6899細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいて37℃で5日間5000細胞/ウェル（96穴プレート）でミクロカルチャーにおいてさらした。インキュベーション後、細胞を塩水で洗浄し、ＭＴＴアッセイによりクローン生成を見積もった。アッセイの結果は以下の表1に要約されている。
【００３６】
実施例２：C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分のキナ酸としての分析的同定
ＴＬＣにより単離された生体活性成分(約1mgのサンプル)を、シフト試薬を添加することなく、ＮＭＲのために約0.7mlのＤ２Ｏに完全に溶解する。以下のスペクトルを記録する：
【００３７】
ＮＭＲ020180ta
-1：      １Ｈ
-2：      １Ｈ／１Ｈ関連スペクトル；ＣＯＳＹ
-3：      １Ｈ／１３Ｃ関連スペクトル；ＨＭＢＣ
-4：      １３Ｃ−Ｄｅｐｔ135
-5：      １Ｈ／１３Ｃ関連スペクトル；ＨＭＱ
【００３８】
１Ｈ−スペクトルは、主たる化合物からのシグナルを含む。4.03、3.90、及び3.43ppmでの三つの１Ｈ−シグナルは、メチン基からのシグナルであると分かった。さらに、66.9B 75.1で得られた１３Ｃ−シグナルはこれらのプロトンと相関し、その化学的シフトは炭素が酸素に結合していること、即ちＣＨＯＨ基を意味している。三つのシグナルは、ＣＯＳＹスペクトルで見出されるように、直鎖中で互いに結合している。
【００３９】
この主たる化合物は、約40ppmでの１３Ｃ−シグナルと相関する約1.72B 1.99ppmでの１Ｈ−シグナルを示した。ＨＭＱＣスペクトルは、これらのシグナルがＣＨ２基であることを明らかにし、ＣＯＳＹスペクトルは、各ＣＨ２基の個々のプロトンが均等でないことを意味する。
【００４０】
ＣＯＳＹスペクトルから判断して、二つの外側のＣＨＯＨ基は、異なるＣＨ２基に結合している。これは以下の部分構造を与える：
【００４１】
【化１】
2005526053.tif 000003
【００４２】
しかしながら、１Ｈ−１Ｈカップリングの多くが、普通のカップリングと比較してより大きい／より小さいことを示したために、この化合物の回転は立体的に妨害されているようであり、それ故環系が示唆された。さらに、ＣＨ２基についての１３Ｃシフトは40ppm近傍であったため、Ｒ１＝Ｒ２＝炭素原子であるようであった。これは以下の部分構造を示した：
【００４３】
【化２】
2005526053.tif 000004
【００４４】
化合物中のＸ及びＹを説明するシグナルは、ＮＭＲスペクトルで見出せなかった。ＮＭＲスペクトルが得られた後、ＭＳ分析を実施した。サンプルを注入によりＭＳに導入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）で希釈したＤ２Ｏ溶液（50/50）でのＭＳスペクトルは、197の分子量を与えた(陰イオン、Ｍ-Ｄ＝195)。次いで溶液を窒素の穏やかな流れによって蒸発させ、Ｈ２Ｏ/ＡＣＮ（50/50）で再構成した。ここでは192の分子量が得られた(陰イオン、Ｍ-Ｈ＝191)。この結果、化合物の分子量は192であり、5の交換可能なプロトンを含む。ＮＭＲとＭＳで得られた情報を組み合わせて、以下の構造が主たる化合物をして提案される：
【００４５】
【化３】
2005526053.tif 000005
キナ酸
【００４６】
この構造はキナ酸である。実際のキナ酸を使用して得られた参考スペクトルは、C-MED-100(登録商標)抽出物から単離されて精製されたものと同一であった。
【００４７】
C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分として同定されたキナ酸は、多くの芳香族化合物の天然の合成における中間体代謝産物として存在する既知の化合物である(Bohm, BA, Shikimic acid (3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexane-1-carboxylic acid), Chem. Rev. 65: 435-466, 1965)。ここでは、キナ酸及びその類似体は、多くの植物種に存在し、それらに更なる栄養素と発育上の利益を与えると予想されることが開示されている。
【００４８】
キナ酸及びその類似体のいずれかの医薬的使用を開示している既知の技術は、皮膚のしわの治療(米国特許第5,656,665号及び第5,589,505号)、及びニューロアミダーゼインヒビターとしてのインフルエンザの治療(米国特許第6,111,132号及び第6,225,341号)のためのもののみである。キナ酸及びその類似体が、老化、炎症、免疫抑制、及び腫瘍増殖とＤＮＡ修復の制御のような、C-MED-100(登録商標)抽出物が有用である疾患を治療するのに有用であることを開示する従来技術は存在していない。
【００４９】
よってこの開示は、キナ酸及びその類似体、特にキナ酸ラクトンについてのこれらの更なる用途を有する。さらにキナ酸は、ＣＡＥについてのポジティブな化学反応を与えていない。しかしながら、この構造に鑑みて、キナ酸が加熱によりキナ酸ラクトンを形成し、次いでＣＡＥとして反応するであろうことは明らかとなった(Fischer, H.O.及びDangschat, G. Helv. Chim Acta 18: 1200, 1935)。さらに、キナ酸ラクトンと1％アンモニア水と反応させると、それがキナ酸に変換する。この化学反応は精製したキナ酸を使用して確認され、C-MED-100(登録商標)抽出物中に存在する活性成分は、キャッツクロー産物の連歴史的な医薬的調製の間で合成されていることを確立する。実施例3はこの確認を提供する。
【００５０】
【化４】
2005526053.tif 000006
【００５１】
実施例３：この実施例は、実施例１及び２で提供された生化学的知見を説明し、C-MED-100(登録商標)抽出物の活性成分が実際にキナ酸ラクトンであることを決定する。C-MED-100(登録商標)、キナ酸、及びキナ酸ラクトンラクトンは全て木炭に吸着し、その場合、C-MED-100(登録商標)抽出物の生物学的活性及び200nmでのＵＶ吸収は存在しなくなった。このデータは、C-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分が最大200nmで吸収することを教示する。ＴＬＣの結果は、そのような吸収最大を有するC-MED-100(登録商標)抽出物の二つのみの成分が存在することを報告する。この成分は、エタノール中の１％アンモニア水でクロマトグラフィーに供すると、Ｒｆ＝0.05とＲｆ＝0.3に位置し、それぞれキナ酸及びキナ酸ラクトンに対応する。
【００５２】
しかしながら、評価の際に、C-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分の生体活性特性は、キナ酸ラクトンによることがほぼ完全に説明できた。その結果、C-MED-100(登録商標)抽出物の抗老化性、抗炎症性、免疫性、並びにＤＮＡ修復促進特性及び抗腫瘍特性は、キナ酸ラクトンの存在によるものである。これらの特性は、キナ酸ラクトンによって寄与されることがここで開示される。
【００５３】
表1は、(i)C-MED-100(登録商標)抽出物の単離された生体活性成分、(ii)キナ酸、及び(iii)キナ酸ラクトンのそれぞれの生化学的活性を説明する：キナ酸はSigma社から購入して良い（＞99％）。キナ酸ラクトン（＞95）は、以前に記載されたように250℃でのサブリメーションにより、キナ酸から合成された(Fischer, HOL,及びDangschat G. Zur konfiguration der skikimisature. Helv. Chim Act 18: 1204, 1935)。試験化合物の一連の希釈物を、96穴の丸底プレート中のHL-60白血病細胞(0.05×106細胞/ml)に加え、3000μg/mlまでカルチャー中の最終濃度を与えた。ミクロタイタープレートを37℃で72時間インキュベートし、20μlのＭＴＴ(5mg/ml)で3時間パルスし、以前に記載されたように540ナノメーターで分光光度測定により発色を見積もった(Schwaitzer, CM等, Spectrophotometric determination of clonogenic capacity of leukemic cells in semisolid microtiter culture systems. Experimental Hematology 21: 573-578, 1993)。
【００５４】
【表１】
2005526053.tif 000007
【００５５】
上述の比較から、C-MED-100(登録商標)抽出物中の生体活性成分が、実際にキナ酸ラクトンであることを明らかである。特にC-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分、キナ酸、及びキナ酸ラクトンについての相対的ＩＣ５０値は、生体活性成分が本質的にキナ酸ではなく、キナ酸ラクトンまたは１％アンモニア水での処理によって形成された塩のようなキナ酸類似体でなければならないことを確認する。C-MED-100(登録商標)抽出物の生体活性成分、及びキナ酸ラクトンについてのＩＣ５０値の差異は有意ではなく、C-MED-100(登録商標)抽出物中に存在する他の化合物の相乗効果によるものであろう。しかしながら、C-MED-100(登録商標)抽出物中の活性成分、キナ酸ラクトンの効力が、その純粋な形態よりも高いことは、キナ酸またはそのアンモニウム塩のようなC-MED-100(登録商標)抽出物中の他の天然に存在している成分の存在下で、キナ酸ラクトンがより活性であることを示す。
【００５６】
本発明は、特定の特異的な実施態様により記載されている一方で、多くの変形及び変化が、本発明から離れることなく当業者により実施できることは予測されるであろう。それ故、本発明の真の精神及び範囲内に存在するであろう、そのような変形及び変化の全てが包含されているように添付物によって企図されている。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ＵＶ吸収とＣＡＥの直線回帰を示す図である(スタンダードとして字オクチルフタラートを使用するg/mlとして見積もられる)。
【図１】
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【国際調査報告】
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