(57)【要約】  本発明はオルニチン脱炭酸酵素の活性の測定及びオルニチン脱炭酸酵素活性のエフェクターの同定のための方法、並びにオルニチン脱炭酸酵素活性のエフェクター、並びにポリアミン・レベル異常の治療のための医薬品としてのその利用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチン脱炭酸酵素（ODC）を発現する細胞を、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）活性を測定する方法。
【請求項２】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム
を発現する細胞を、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び、適当な場合は、
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、アンチザイムの活性を測定する方法。
【請求項５】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、アンチザイム阻害因子活性を測定する方法。
【請求項６】
オルニチン脱炭酸酵素（ODC）を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターを同定する方法。
【請求項７】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム
を発現する細胞で、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターを同定するための請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞で、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターを同定するための請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び、適当な場合には、
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定するアンチザイム（AZ）のエフェクターを同定する方法。
【請求項１０】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び
ｂ) アンチザイム及び
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシンの存在下および不在下においてポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定するアンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターを同定する方法。
【請求項１１】
請求項６〜８に記載の方法によって同定される、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクター。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法によって同定される、アンチザイム（AZ）のエフェクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法によって同定される、アンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクター。
【請求項１４】
低すぎるもしくは高すぎるポリアミンレベルと関連するか、又はそれによって引き起こされる病気の治療又は予防のための、又はポリアミンレベルの増加又は低下が望まれる病気の治療又は予防のための医薬品を製造するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のエフェクターの使用。
【請求項１５】
低すぎるもしくは高すぎるポリアミンレベルと関連するか、又はそれによって引き起こされる病気の治療又は予防のための、又はポリアミンレベルの増加又は低下が望まれる病気の治療又は予防のための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のエフェクターの使用。
【請求項１６】
製薬上許容しうる担体及び添加物に加えて、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのエフェクターを、有効量で活性成分として含有する医薬品組成物。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのエフェクター及び製薬上許容しうる担体及び添加物を含有し、エフェクター及び製薬上許容しうる担体及び添加物が医薬品に製剤されている、医薬品を製造する方法。
【請求項１８】
ａ) 請求項１１に記載の、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターの同定；
ｂ) そのエフェクターの提供又は調製；及び
ｃ) 製薬上許容できる担体及び／又は添加物を用いるそのエフェクターの製剤
よりなる、請求項１７に記載の医薬品の製造方法。
【請求項１９】
ａ) 請求項１２に記載の、アンチザイム（AZ）のエフェクターの同定；
ｂ) 該エフェクターの準備又は調製；及び
ｃ) 製薬上許容できる担体及び／又は添加物を用いる該エフェクターの製剤
よりなる、請求項１７に記載の医薬品の製造方法。
【請求項２０】
ａ) 請求項１３に記載の、アンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターの同定；
ｂ) 該エフェクターの準備又は調製；及び
ｃ) 製薬上許容できる担体及び／又は添加物を用いる該エフェクターの製剤
よりなる、請求項１７に記載の医薬品の製造方法。
【請求項２１】
細胞又は組織サンプルを用いる診断目的のための請求項１１に記載のオルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターの使用。
【請求項２２】
細胞又は組織サンプルを用いる診断目的のための請求項１２に記載のアンチザイム（AZ）のエフェクターの使用。
【請求項２３】
細胞又は組織サンプルを用いる診断目的のための請求項１３に記載のアンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターの使用。
【請求項２４】
ａ) オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及び、適当な場合は、
ｂ) アンチザイム及び／又は
ｃ) アンチザイム阻害因子
を発現する細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法の一つを実施するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルニチン脱炭酸酵素の活性測定及びオルニチン脱炭酸酵素活性に対するエフェクターの同定のための方法、及び本発明の方法によって同定されたオルニチン脱炭酸酵素活性に対するエフェクター、及びポリアミンレベルの異常を治療するための医薬品としてのその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オルニチン脱炭酸酵素（L-ornithine carboxy-lyase, ODC, IUBMBの命名法分類：EC 4.1.1.17）はポリアミン生合成における中心的酵素である。ポリアミンは細胞成長、細胞分化及びたんぱく質の生合成において必須の役割を果たしている。ポリアミン生合成及びポリアミンの輸送は多岐にわたる方法でかつ異なったレベルで制御されている。腫瘍細胞のODC活性は増加しているので、ODCはまた腫瘍形成において重要な役割を担っている。このように、例えば、ODCの過剰発現は腫瘍性の形質変換へと進んでいく（Auvinen et al.）。ヒトのODC遺伝子と相同性のある酵母遺伝子はSPE1（ORF YKL 184w）と呼ばれる。ODC活性測定のためのアッセイ法は、例えば [14Ｃ] オルニチンのようなアイソトープラベルした基質を使用することによって通常行われてきた（Coleman & Pegg, 1998, Janne & Williams-Ashman, 1971)。
【０００３】
たんぱく質レベルにおいて、ODCの活性及び安定性はアンチザイム (AZ)によって制御されている。アンチザイムはODCと結合し、ODCの酵素活性を阻害し、ODCの蛋白分解を刺激するたんぱく質である (Hayashi et al., (1996) TIBS 21, 27-30)。さらに、アンチザイムはまた細胞内へのポリアミン輸送を制御している。アンチザイムの坑腫瘍作用に関する文献の中でさらに多く引用されている（Feith et al., 2001）。現在ヒトにおいて、アンチザイムファミリーの（非対立の）４個のメンバーが相同性が非常に少ないいくつかの症例において知られている、すなわち、アンチザイム１ (例えば、Acc. No. D87914)、アンチザイム２ (例えば、Acc. No. AF057297)、アンチザイム３（例えば、Acc. No. AF175296）及びアンチザイム４ (例えば、Acc. No. AF293339)。パン酵母 （Saccharomyces cerevisiae) はアンチザイム同族体を含まないが（Zhu et al., Bioinformatics, Vol. 16, 478-481）、一方で分裂酵母シゾサッカロマイセス・プローブはアンチザイム様たんぱく質を持っている (Chattopadhyay et al., 2001)。
【０００４】
アンチザイム阻害因子 (AZI) はアンチザイム制御因子と言われ、アンチザイムと高い親和性を持って結合し、ODC−AZ複合体内に結合しているODCを放出することさえ出来る。胃癌中ではAZIの発現が増加している (Jung et al., (2000), Genomics 69, 281-286)。
【０００５】
ODC活性の制御をより詳細に研究して、腫瘍発現及び転移との関連の中で、ODC活性（ODCエフェクター）に影響を与える効果的な物質、すなわち、ODC活性に対して直接的又は間接的に影響を与えこれらの過程を抑制する（ODC活性の制御）物質、を同定することに多くの関心が集まっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Klein 等（1997）はE. coli及びS. cerevisiae中の線虫 H. contortusからのODC cDNAのクローニング及び機能的異種発現について、及び抗寄生虫作用を有するODC阻害因子の同定のためのトランスジェニック酵母（ΔSPE１）の利用について記載している。しかしながら、Klein等の記述するアッセイシステムはポリアミンの枯渇を阻止するためにスペ
ルミジンを用いており、哺乳動物での生理的条件下でのODCの複雑な制御を考慮していない。そこで、特にAZ及びAZIの活性との関連の中で、ODC活性を調節する活性物質を同定するために利用できる、便利な方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に詳しく述べるように、上述の目的は本発明に従って、本請求項に記載されている実施態様によって達成されている。以下で述べるように、適した細胞系におけるODC及びAZの発現、及び適した場合はAZIの発現は、上述の目的の達成へと導いて行くことが発見されたことは驚きである。
【０００８】
ODC、AZ及び適した場合は、AZIの間のバランスを特に考慮しているので、本発明のアッセイ法はODC活性のエフェクターの特異的な同定を可能にしている。ポリアミンの枯渇及びそれに伴う細胞成長の阻害を避けるため本発明においてはプトレッシン（putrescine）を使用することによって、スペルミジンを使用した際の例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（S-adenosylmethionine decarboxylase）のような他の酵素に対する阻害が除かれ、ODC活性のエフェクターの特異的同定が可能になった。それ故、AZ及びAZIの活性及びその活性の制御を十分に調べることも、本発明の方法の利用によって可能である。本発明の方法を用いてAZ及びAZIのエフェクターを同定することも可能となる。本発明の方法は追加的に、大量迅速処理スクリーニング（high-throughput screening, HTS）によるODCの活性測定及び、ODC、AZ及びAZIのエフェクターの同定に適しているという利点を持っている。
【０００９】
それ故、本発明はオルニチン脱炭酸酵素（ODC）の活性測定のための方法に関するものであって、ODC、及び適当な場合は、アンチザイム及び／又はアンチザイム阻害因子を発現する細胞を、プトレッシンの存在下及び不在下で、ポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を定量するものである。
【００１０】
本発明はまた、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及びアンチザイム、及び適当な場合は、アンチザイム阻害因子を発現する細胞を、プロレシン存在下および不在下でポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を定量する、アンチザイムの活性を測定するための方法に関するものである。
【００１１】
加えて、本発明は、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）、アンチザイム及びアンチザイム阻害因子を発現する細胞を、プトレッシン存在下および不在下でポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、アンチザイム阻害因子のの活性を測定するための方法に関するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、ODC、及び適当な場合にはアンチザイム及び／又はアンチザイム阻害因子を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシン存在下および不在下でポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）のエフェクターを同定するための方法に関するものである。
【００１３】
本発明はまた、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）及びアンチザイム、及び適当な場合は、アンチザイム阻害因子を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシン存在下および不在下でポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、アンチザイム（AZ）のエフェクターの同定のための方法に関するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）、アンチザイム及びアンチザイム阻害因子を発現する細胞を、調査すべき被検物質の存在下、プトレッシン存在下および不在下でポリアミン不在培地上で培養し、その細胞の成長を測定する、アンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターの同定のための方法に関するものである。
【００１５】
本発明はまた、本発明のどれか一つ方法によって同定された、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）、アンチザイム（AZ）及びアンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターに関するものである。
【００１６】
本発明に従って同定されたエフェクターは、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）の活性を調節することを介して、ポリアミン濃度を変化させるものであり、それ故低すぎる又は高すぎるポリアミンの濃度と関連している、又はそれによって惹起される病気の治療及び予防のための、又はその治療又は予防のためにそのポリアミンレベルの増加又は減少が望まれる病気の治療又は予防のための有用な薬剤である。本発明により同定されたエフェクターによるODC活性の活性化又は阻害は、例えば本発明の方法で調べることが出来る。
【００１７】
低すぎる又は高すぎるポリアミンレベルと関連している病気及び病的状態、又はポリアミンレベルの増加又は低下が望まれるもの、その治療及び予防に本発明のエフェクターが利用出来るものは、例えば、腫瘍発生、転移の過程、中枢神経系の異常（Johnson 1998, Seiler 2000）又は免疫系の異常（Seiler & Atanassov, 1994, Kawada et al., 2000）の中に存在している。DFMO（Eflornithine, Aventis）のようなODC阻害因子はすでに睡眠病の治療に採用されている。
【００１８】
このように、本発明のエフェクターは動物、好ましくは哺乳類及び特にヒトで、それ自体として又は医薬品製剤の形で医薬品として使用出来る。それ故本発明は、医薬品としての使用のための本発明のエフェクター、ポリアミンレベルの乱れを正常化するためのそれらの使用、及び特に、上記の病的状態の治療及び予防におけるそれらの使用、及びそのための医薬品を製造するためのそれらの使用に関する。さらに本発明は、既存の薬学的に許容しうる担体及び添加物と伴に少なくとも一つの本発明のエフェクターを、効果のある用量で活性成分として含有する医薬品製造物に関するものである。
【００１９】
医薬品は、例えばピル、錠剤、フィルムコーティング錠、糖衣錠、顆粒剤、硬質及び軟質ゼラチンカプセル、水溶液、アルコール又は油性溶液、シロップ、乳剤又は懸濁液の形で経口的に投与出来、又は例えば座剤の形で直腸に投与出来る。しかしながら、例えば、注射液又は輸液の形で皮下、筋肉内又は静脈内のような非経口的な投与も可能である。さらに、適した投与剤形は、例えば軟膏、チンキ剤、スプレー又は経皮治療系の形での経皮又は局所投与、又は肺スプレー、鼻内スプレー又はエアロゾルの形での溶液又は乾燥粉末の吸入による投与、又は例えばマイクロカプセル、インプラント又はロッドである。好ましい投与剤形は、例えば治療する病気およびその重症度によって決められる。
【００２０】
さらに本発明は、本発明の少なくとも一つのエフェクター及び薬剤学的に許容できる担体及び添加物を含有する医薬品を製造する方法に関し、それにより、そのエフェクター及び薬剤学的に許容できる担体及び添加物が医薬品に製剤される。
【００２１】
さらに、本発明は、
ａ) 本発明のどれか一つの方法を手段として、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）、アンチザイム（AZ）又はアンチザイム阻害因子（AZI）のエフェクターを同定すること；
ｂ) そのエフェクターを供給又は調製すること；及び
ｃ) 薬剤学的に許容できる担体及び／又は添加物を用いて、そのエフェクターを剤形化することからなる医薬品の製造方法に関する。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の一つ又はそれ以上のエフェクター及び薬剤学的に許容できる
担体及び／又は添加物を含有する医薬品成分に関するものである。
【００２３】
本発明の薬剤生成物は既知の方法で製造可能である。これは一つ又はそれ以上の固体又は液体薬剤担体及び／又は添加物と伴に及び、もし必要なら、治療又は予防作用のある他の活性薬剤成分と一緒に、本発明の一つ又はそれ以上のエフェクターを適当な投与剤形又は服用剤形に変換することによってなされ、さらにこれは臨床医学又は獣医学の分野の医薬品として使用することが出来る。
【００２４】
例えば、ピル、錠剤、糖衣錠、及び硬質ゼラチンカプセルの製造のためには、ラクトース、でんぷん（例えば、とうもろこしでんぶん）、又はでんぷん誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩等を使用することが可能である。軟質ゼラチンカプセル及び座薬のための担体は、例えば脂肪、ワックス、半固体及び液体ポリオール、天然油又は硬化油等である。例えば注射用溶液又は乳剤又はシロップのような、溶液を製造するのに適した担体の例は水、生理食塩液、エタノールのようなアルコール、グリセロール、ポリオール、ショ糖、転化糖、グルコース、マニトール、植物油等である。本発明のエフェクターはまた凍結乾燥出来、その凍結乾燥したものは、例えば注射用又は輸液用の製剤又は吸入用の粉末の製造のために使用することが出来る。マイクロカプセル、インプラント又はロッドのために適した担体の例は、グリコール酸及び乳酸のコポリマーである。
【００２５】
医薬品製剤はまた活性成分及び担体以外に、既存の賦形剤又は添加物、例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味料、着色剤、着香剤又は芳香剤、増粘剤、稀釈剤、緩衝物質、溶媒又は可溶化剤、又は持続効果を達成するための手段、浸透圧を変える塩類、コーティング剤又は坑酸化剤などを含有していてもよい。
【００２６】
本発明のエフェクターの投与用量は個々のケースに依存しており、最適効果のため常法により個々の環境に適合させなければならない。このように、それは治療する病気の本質及び重症度及び性別、年令、体重及び治療するヒト又は動物の個々の反応、使われる化合物の作用強度及び作用持続時間、急性又は慢性治療であるか予防であるか、又は本発明のエフェクターに加えて他の薬剤が投与されているか否かということに依存している。
【００２７】
本発明のエフェクターはODC活性を調節する。この性質の故に、エフェクターは臨床医学及び獣医学の分野で活性薬剤成分としてのみでなく、化学的手法として又は、それがオルニチン脱炭酸酵素活性に影響を与えるように意図された生化学研究の助剤としてまた例えば細胞又は組織サンプルの in vitro 診断のような診断の目的のために利用することが出来る。
【００２８】
さらに本発明は、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）活性の測定、又はODC、AZ又はAZI活性に対するエフェクターの測定のために、本発明の方法を実行するための試験キットに関するものであり、それはODC、及びそれが適する場合には、アンチザイム及び／又はアンチザイム阻害因子を発現する細胞を含んでいる。
【００２９】
オルニチン脱炭酸酵素（ODC）という用語は、本発明の目的のためには、国際酵素分類に従うクラスEC 4.1.1.17に含まれる酵素、例えばヒト（ゲノム配列についてはAcc. No.
X16277、cDNAについてはM31061）、ラット（Acc. No. J04792）、マウス（Acc. No. X07392）、C. エレガンス（C. elegans、Acc. No. U03059）、好ましくは脊椎動物からのODC、特に好ましくは哺乳動物、特にヒト起源のものを包含している。「オルニチン脱炭酸酵素の活性」とは本発明の目的のためには、たんぱく質を示すEC 4.1.1.17に従う酵素活性を意味する。「ODC活性」は、例えばプトレッシンの存在下及び不在下においてポリアミン不在培地上での細胞の成長を測定することによって、例えば呈色反応によって増感しうる細胞系において定量的に又は定性的に測定出来る。とりわけ本発明の方法の実施態様においては、細胞の成長は構成しているプロモーターの制御の下にあるレポーター遺伝子（例えば、lacZ、GFP）によって検出される。
【００３０】
「アンチザイム」という用語は、本発明の目的のためには、いかなる起源からのものであろうとも、ODCのアンチザイムを意味する。すなわち、それはODCに結合しODCの酵素活性を阻害するたんぱく質であり、例えば、ヒトAZに対するAcc. No. D87914、AF057297、AF175296又はAF293339が例示される。「アンチザイム活性」とは、本発明の目的のためには、ODC活性を阻害するアンチザイム分子の能力を意味する。「アンチザイム」という用語はまた本発明の目的のためには、アンチザイム活性を有するアンチザイムの断片、変異体（mutant）、対立変異株（allelic variant）又はスプライシング変異株（splice variant）を包括する。
【００３１】
「アンチザイム阻害因子」という用語は、本発明の目的のためには、ODCアンチザイムの阻害因子を意味し、例えばAcc. No. D88674（ヒト）、AF032128（マウス）及びD89983（ラット）が例示される。「アンチザイム阻害因子の活性」は本発明の目的のためには、AZ分子の活性を阻害するアンチザイム阻害因子分子の能力を意味する。「アンチザイム阻害因子」という用語はまた、本発明の目的のためには、アンチザイム阻害因子活性を有するアンチザイムの断片、変異体（mutant）、対立変異株（allelic variant）又はスプライシング変異株（splice variant）を包括する。
【００３２】
「ポリアミン不在培地」という用語は、本発明の目的のためには、本発名に従って用いられた細胞を培養するのに適し、例えばプトレッシン、スペルミジン、スペルミンのようなポリアミンを含有しない、固体、半固体又は液体の培養媒体を意味する。「プトレッシン存在下」という用語は、本発明の目的のためには、0.1から1000μM、好ましくは２から500μM、特に５から50μのプトレッシン濃度を意味する。
【００３３】
「オルニチン脱炭酸酵素（ODC）を発現する細胞」は、本発明の目的のためには、原則として全ての原核細胞又は真核細胞を意味する。例えば、機能的に同種及び／異種のODCを発現する、細菌、酵母、藻、植物、線虫、哺乳類からの細胞、又はヒトを起源とする他の細胞、特に酵母からの細胞、C. エレガンス（C. elegans）、CHO又はHEK細胞、好ましくは酵母及び細菌細胞、特に酵母細胞である。
【００３４】
本発明の目的のためには、細胞中でのODCの発現は、同種ODCの活性を有するたんぱく質をコードする内因性／同種の核酸を持つ細胞によっても、あるいはODC活性を有する異種たんぱく質をコードするための既知の方法によって内因性／異種核酸によって形質移入された細胞によっても達成することが出来る。それが適切な場合には、例えばアンティセンス又はコサプレッション（cosuppression）による内因性ODC遺伝子の欠落（「ノック−アウト」）のような、既知の分子生物学的方法等の適当な方法によって、内因性ODCの発現が阻害又は抑制された細胞中で、前述の異種たんぱく質を発現することが可能である。
【００３５】
細胞中でのアンチザイム（AZ）の発現は、本発明にしたがって、AZ活性を有するたんぱく質をコードする同種の核酸を内因的に持つ細胞によっても、あるいはAZ活性を有する異種たんぱく質をコードするために、既知の方法によって異種核酸によって形質移入された細胞によっても達成することが出来る。それが適切な場合には、例えばアンティセンス又はコサプレッション（cosuppression）による内因性AZ遺伝子の欠落（「ノック−アウト」）のような適切な方法によって、内因性AZ発現が阻害又は抑制された細胞中で、その異種たんぱく質を発現することが可能である。
【００３６】
細胞中でのアンチザイム阻害因子（AZI）の発現は、本発明にしたがって、AZI活性を有
するたんぱく質をコードする同種の核酸を内因的に持つ細胞によっても、あるいはAZI活性を有する異種たんぱく質をコードするために、既知の方法によって異種核酸によって形質移入された細胞によっても達成することが出来る。それが適切な場合には、例えばアンティセンス又はコサプレッション（cosuppression）による内因性AZI遺伝子の欠落（「ノックーアウト」）のような適切な方法によって、内因性AZI発現が阻害又は抑制された細胞中で、その異種たんぱく質を発現することが可能である。
【００３７】
本発明の目的のためには、「エフェクター」は、特定の標的分子例えばODC、AZ又はAZIの活性を調節出来る分子を意味する。「エフェクター」という用語はさらに、ODC、AZ又はAZIの機能を調節する、すなわち、その機能を活性化（増加）、阻害（減弱）又は制御的な方法で影響し、それ故好ましくは生理的条件下でODC、AZ又はAZIの活性に影響を与えるような、精製された活性成分及び未精製又は部分的に精製された物質の混合物（例えば、野菜又は動物の抽出物からのもの）の両方を包括してもよい。
【００３８】
次の実施例は本発明を説明しているが、それを制限するものではない。
【００３９】
材料と方法
合成オリゴヌクレオチドはMetabion（Planegg-Martinsried、ドイツ）又はMWG-Biotech（Ebersberg、ドイツ）より購入した。他の全ての化学薬品はSigma（Heidelberg、ドイツ）より入手した。
酵母はGietz及びSchiestlの方法（Gietz et al.,1995）によって形質転換を行った。DNA領域をSaiki 等（1985）の方法により、特異的プライマーを用いることにより増幅した。
酵母培養のためのさらなる方法は、“Guide to yeast genetics and molecular biology”、Guthrie and Fink、Methods in Enzymology Vol. 194, 1-863, 1991の中に記載されている。パーセンテージ・データは、特に他に記載がないかぎり、質量パーセント、％ (w／w)である。
【００４０】
サッカロミセス・セレビシエ株
ポリアミン依存性サッカロミセス・セレビシエ株 Y15034 (MATα ; his3)1；leu2)0; lys2)0; ura3)0; YKL184w::kanMX4）はEuroscarf社（ドイツ、フランクフルト）より購入した。対応する野生型株Y10000 (MATα; his3)1; leu2)0; lys2)0; ura3)0) は同様にEuroscarf社から購入した。酵母株は液体培地中又はプレート上で30℃で培養した。液体培地は、酵母細胞の成長に適した必要な補充物を有するYPD pH5.5（２％グルコース、２％バクト・ペプトン、１％酵母抽出液、Difco Laboratories、デトロイト、MI、米国）又はポリアミン不在合成完全培地（PFSC、0.67％アミノ酸不在のBacto−Yeast Nitrogen Base、Difco）中のどちらかで作られた。
【００４１】
ポリアミン不在SC培地は濾過によって滅菌した；ポリアミン不在プレートは２％アガローズ（Life Technologies、パイスレー、スコットランド）によって適切に固形化した。プトレッシン（Sigma）を細胞と培養する前に加えて、ポリアミン枯渇を復帰させた。
【００４２】
プトレッシン保存溶液（0.1mg／ml）
DFMO（Bachem、ハイデルベルグ、ドイツ）は15mM（100mM保存溶液）の濃度で用いた。
酵母発現プラスミド p413 ADH、p413 GalL、p413 GalS、p426 ADH、p426 Gal1、p426 GPD、p415 ADH、p415 GalL、p415 GPDはMumberg等, 1995；Mumberg等, 1994の中に記載されている。
【００４３】
参考文献
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【実施例１】
【００４４】
ODCのクローニング及び塩基配列決定並びにODC発現プラスミドの調製
ODC遺伝子の塩基配列は、次のプライマーを用いてヒト肝臓cDNAライブラリーから増幅した：
【化１】
2005511092.tif 000002
【００４５】
製造元の指示書に従って（30サイクル、55℃）、Taqポリメラーゼ（Life Technologies）を用いて、PCRを実施した。
生成したPCR断片を、酵母発現ベクター p413GalL及びp413ADHのEcoRI-Xhol開裂部位の中にクローニングし、生成したプラスミドをp413GalL-ODC及びp413ADH-ODCと名づけた。
【実施例２】
【００４６】
アンチザイム１−４のクローニング及び塩基配列決定並びにアンチザイム発現プラスミドの調製
どの場合も、プライマーOAZ. Start／OAZΔ. Rev及びOAZΔ. For／OAZ. Revを結合させ、アンチザイム独特のストップ・コードンをORF1から切り落したものを用いて、２個のアンチザイム断片を生成させた。これらの最初のPCRはPfuポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、製造元の指示書（30サイクル、53℃）に従って実施した。生成した２個のアンチザイム断片を鋳型として用い、プライマーOAZ. Start及びOAZ. Revと伴に第２のPCRを行って、完全長のアンチザイムを調製した。第２のPCRはPfuポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、製造元の指示書（30サイクル、53℃）に従って順に実施した。アンチザイム１と同じプライマーをアンチザイム４のOAZ. Startプライマーとして使用することが可能であった。アンチザイム３及びアンチザイム４の増幅のための鋳型としてIncyte（パロ・アルト、米国）からのクローンを使用した。
【００４７】
【化２】
2005511092.tif 000003
【００４８】
【化３】
2005511092.tif 000004
【００４９】
生成したPCR断片は酵母発現ベクターp426ADH、p426Gal1及びp426GPDのEcoRI-Xhol開裂部位の中にクローニングし、生成したプラスミドをそれぞれ、p426ADH-AZ1、p426Gal1-AZ
1、p426GPD-AZ1、p426ADH-AZ2、p426Gal1-AZ2、p426GPD-AZ2、p426ADH-AZ3、p426Gal1-AZ3、p426GPD-AZ3、p426ADH-AZ4、p426Gal1-AZ4、p426GPD-AZ4と名づけた。
【実施例３】
【００５０】
アンチザイム阻害因子のクローニング及び塩基配列決定並びにアンチザイム阻害因子発現プラスミドの調製
アンチザイム阻害因子の完全長クローニングはヒト肝臓cDNAライブラリーからのPCRによって増幅させた。製造元の指示書（30サイクル、55℃）に従ってPfuポリメラーゼ（Stratagene）を使い、次のプライマーがこの目的のために用いられた：
【化４】
2005511092.tif 000005
【００５１】
生成したPCR断片はSpel／Xholを用いて消化し、酵母発現ベクター p415ADH、p415GalL及びp415GPDの中にクローニングした。そのプラスミドをそれぞれp415ADH-AZI、p415GalL-AZI 及びp415GPD-AZIと名づけた。
【実施例４】
【００５２】
ODCアッセイ
ポリアミン依存性サッカロマイセス・セレビシエ株Y15034（Saccharomyces cerevisiae
strain Y15034）及びそれに対応する野生型株Y10000をそれぞれ、プラスミドp413GalL、p413ADH、p413GalL-ODC及びp413ADH-ODCを用いてリチウム酢酸法により形質転換を行い、それぞれの形質転換株をSynthetic Complete（SC）Medium（His-、２％グルコース）上に接種した。各形質転換株に対して、１夜培養したものをポリアミン不在SC（PFSC）培地（His-、２％グルコース）に接種した。これを最初にスポット試験を行うために用いた。すなわち、酵母をOD600 3.0に合わせ、10倍稀釈した（５×）。各希釈液の２μlをOD600 3.0で開始し、PFSCプレート（His-、２％ガラクトース／ラフィノース［１：１］）上に滴下し、そのプレートを30℃で培養した。成長の阻害がプトレッシンの枯渇によるものであることを証明するために、プトレッシンが存在（10μM）するコントロール試験を行った。
次に、液体培地でアッセイを行った。１夜培養したものより開始して、酵母を0.1のOD600 を有するPFSC培地（His-、２％ガラクトース／ラフィノース［１：１］）で開始し、測定は１時間毎に行った。
【実施例５】
【００５３】
ODC活性のエフェクターのためのアッセイ
ODC阻害因子の陽性対照としてDFMO（ジフロロメチルオルニチン(difluoromethylornithine)）を用いた。ヒトODC（Y15034、p413GalL-ODC）を補充した酵母細胞、及び対応する野生型酵母株（Y10000）を１夜培養した。次の日に酵母の成長プロットを0.05のOD600より開始し、次の培地中で測定した：
１. ポリアミン不在SC培地（His-、２％ガラクトース／ラフィノース［１：１］）
２. PFSC＋DFMO（15mM）
３. PFSC＋DFMO（15mM）＋プトレッシン10μM）
【実施例６】
【００５４】
アンチザイム・アッセイ
ポリアミン依存性酵母株 Y15034（ODC−ノックアウト）及び対応する野生型株 Y10000を各々、プラスミドp413GalL-ODCを用いてリチウム酢酸法により形質転換を行った。加えて、実施例２に記載した12個のアンチザイム発現プラスミドの各々、及びコントロールとしての対応するブランク・プラスミドを共形質転換（cotransformed）した。
【００５５】
形質転換株をSynthetic Complete（SC）Medium（His-、Ura-、２％グルコース、Difco）上に接種した。各々の形質転換毎に、１夜培養したものをPFSC培地（His-、Ura-、２％グルコース）に接種した。これを最初にスポット試験を実施するために用いた。すなわち、酵母をOD600 3.0に合わせて10倍稀釈した（５×）。各希釈液の２μlをOD600 3.0より開始し、PFSCプレート（His-、Ura-、２％がラクトース／ラフィノース [ １：１] ）上に滴下し、そのプレートを30℃で培養した。
【００５６】
酵母プロモーターADH、Gal1及びGPDからの４個のアンチザイム１−４の発現は強度においてバラツキがあった。アンチザイム１及びアンチザイム４は、強いGPDプロモーター（p426GPDの中）によってのみODC活性を阻害したが、一方でODC活性の効果的な阻害はアンチザイム２に対するADHプロモーターによっても、またアンチザイム３に対するGal1プロモーターによっても可能であった。プトレッシン添加による成長阻害をなくすことも又可能であった。このことは酵母細胞のアンチザイム関連の成長阻害がポリアミン欠乏に由来することを示している。
【実施例７】
【００５７】
アンチザイム阻害因子アッセイ
さらに、実施例６の中で調製された酵母はそれぞれ、実施例３に記載した３個のAZI発現プラスミド（p415ADH-AZI、p415GalL-AZI及びp415GPD-AZI）及び対応するブランク・プラスミドと伴に共形質転換した。
【００５８】
形質転換株はSynthetic Complete（SC）Medium（His-、Ura-、Leu-、２％グルコース）上に接種した。各々の形質転換毎に、１夜培養したものをPFSC培地（His-、Ura-、Leu-、２％グルコース）に接種した。これを最初にスポット試験を行うために用いた。すなわち、酵母をOD600 3.0に合わせ、10倍稀釈（５×）した。OD600 3.0で開始して、各希釈液の２μlをPFSCプレート（His-、Ura-、Leu-、２％ガラクトース／ラフィノース［１：１]）上に適下し、そのプレートを30℃で培養した。
【００５９】
全てのプロモーターはアンチザイム阻害因子の適切な発現を可能にする能力を有し、アンチザイムに起因するODC阻害は消失した。
【配列表】
2005511092000001.app
【国際調査報告】
2005511092.tif 000006
2005511092.tif 000007
2005511092.tif 000008