(57)【要約】本発明は、ヒトゲノムデータベース等のデータベースにおいて利用可能な情報をベースとしたコンピュータ制御ポリヌクレオチド構築によるゲノム配列情報の結果を利用する新規な方法を提供する。具体的には、本発明を用いることによって標的ポリペプチドをコードする新規な合成標的ポリヌクレオチド配列を選択し、合成し、構築することができる。この標的ポリヌクレオチドは、天然（野生型）あるいはモデルポリヌクレオチド配列によりコードされたモデルポリペプチドと比べて向上または改変された生物活性を示す標的ポリペプチドをコードすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法が
（ａ）部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチドを選択する工程であって、該開始オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの突出部を含む、工程、
（ｂ）該部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチドを次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドは該開始オリゴヌクレオチドと隣接し、少なくとも１つの突出部を含み、かつ、該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は該開始オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である、工程、
（ｃ）（ｂ）を繰り返して該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドを該伸長される開始オリゴヌクレオチドに逐次的に付加するする工程であって、これによって、該二本鎖ポリヌクレオチドが合成される、工程
を含む二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法。
【請求項２】
工程（ａ）における前記開始オリゴヌクレオチドが３’突出部および５’突出部を有する請求項１の方法。
【請求項３】
前記次最末端オリゴヌクレオチドが３’突出部および５’突出部を有する請求項１の方法。
【請求項４】
標的ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法が、
（ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、
（ｂ）該標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチドを同定する工程であって、該開始オリゴヌクレオチドは５’突出部および３’突出部を含む、工程、
（ｃ）該標的ポリヌクレオチド中に存在する次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドを同定する工程であって、該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドは該開始オリゴヌクレオチドと隣接し、５’突出部および３’突出部を含み、該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は該開始オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である、工程、
（ｄ）アニーリングに適するような条件下および時間で該開始オリゴヌクレオチドを該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該開始配列が伸長される、工程、および
（ｅ）（ａ）から（ｄ）までを繰り返して該次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドを該伸長される開始オリゴヌクレオチドに逐次的に付加する工程であって、これにより、標的ポリヌクレオチドを合成する、工程
を含む標的ポリヌクレオチドを構築する方法。
【請求項５】
前記開始オリゴヌクレオチドが双方向様式で伸長される請求項４の方法。
【請求項６】
前記開始オリゴヌクレオチドが単一方向様式で伸長される請求項４の方法。
【請求項７】
前記開始オリゴヌクレオチドが標的ポリペプチドの５’最末端オリゴヌクレオチドである請求項４の方法。
【請求項８】
前記開始オリゴヌクレオチドが標的ポリペプチドの３’最末端オリゴヌクレオチドである請求項４の方法。
【請求項９】
前記標的ポリヌクレオチドが標的ポリペプチドをコードする配列を含む請求項４の方法。
【請求項１０】
前記標的ポリペプチドがタンパク質である請求項９の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が酵素である請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記開始オリゴヌクレオチドがコンピュータプログラムによって同定される配列を含む請求項４の方法。
【請求項１３】
前記コンピュータプログラムが次のステップ：
（ａ）タンパク質配列をコドン単位で構文解析するステップ、
（ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＩ型コドンを用いて合成遺伝子配列を提供するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の配列をＱオリゴマー単位で、順方向セットに対してＸの重複を有するＱ長さのオリゴヌクレオチドに構文解析するステップ、
（ｄ）Ｘヌクレオチド重複するこの逆方向鎖由来のＱ長さのオリゴヌクレオチドへの配列の構文解析を行うステップ、
（ｅ）Ｑ／２長さの逆方向（ＲＥＶＥＲＳＥ）配列末端「サファー（ｓｕｆｆｅｒ）」断片の配列を決定するステップ、および
（ｆ）アレイシンセサイザを使用して配列を合成するステップ、
を含むアルゴリズムを有する請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記次最末端二本鎖オリゴヌクレオチドの  前記相補性突出部が該相補性突出部を有する鎖の約５０パーセントの長さを含む請求項４の方法。
【請求項１５】
前記相補性突出部を有する鎖の長さが約１５乃至１０００ヌクレオチドである請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記相補性突出部を有する鎖の長さが約２０乃至５００ヌクレオチドである請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記相補性突出部を有する鎖の長さが約２５乃至１００ヌクレオチドである請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記開始オリゴヌクレオチドが支持固体に結合される請求項４の方法。
【請求項１９】
二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法が、
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含む少なくとも２５塩基のオリゴヌクレオチドの第１のセットを化学的に合成する工程、
（ｂ）該二本鎖ポリヌクレオチドの第２の相補性鎖を含む少なくとも２５塩基のオリゴヌクレオチドの第２のセットを化学的に合成する工程であって、該オリゴヌクレオチドの該第２のセット内の該オリゴヌクレオチドの各々は該オリゴヌクレオチドの該第１のセット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重複する、工程、および
（ｃ）オリゴヌクレオチドの該第１および該第２のセットをアニーリングして酵素合成の非存在下で二本鎖ポリヌクレオチドを生成する工程、
を含む二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法。
【請求項２０】
前記二本鎖ポリヌクレオチドの長さが少なくとも７００塩基対である請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記二本鎖ポリヌクレオチドが複製能力を有する請求項２０の方法。
【請求項２２】
二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法が、
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含むオリゴヌクレオチドの第１のセットを化学的に合成する工程、
（ｂ）該二本鎖ポリヌクレオチドの第２の相補性鎖を含むオリゴヌクレオチドの第２のセットを化学的に合成する工程であって、該オリゴヌクレオチドの該第２のセット内の該オリゴヌクレオチドの各々は該オリゴヌクレオチドの該第１のセット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重複する、工程、および
（ｃ）ＭｕｔＳタンパク質の存在下でオリゴヌクレオチドの該第１および該第２のセットをアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチドを構築する工程、
を含む二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法。
【請求項２３】
二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法であって、該方法が、
（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含むオリゴヌクレオチドの第１のセットを化学的に合成する工程、
（ｂ）該二本鎖ポリヌクレオチドの第２の相補性鎖を含むオリゴヌクレオチドの第２のセットを化学的に合成する工程であって、該オリゴヌクレオチドの該第２のセット内の該オリゴヌクレオチドの各々は該オリゴヌクレオチドの該第１のセット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重複する、工程、
（ｃ）オリゴヌクレオチドの該第１および該第２のセットをアニーリングして部分的二本鎖成分ポリヌクレオチドを生成する工程、
（ｄ）工程（ａ）から（ｃ）までを繰り返して一連の部分的二本鎖成分ポリヌクレオチドを調製する工程、
（ｅ）開始ポリヌクレオチドとして役立つ該標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの部分的二本鎖成分ポリヌクレオチドを選択する工程であって、該開始ポリヌクレオチドは５’突出部および３’突出部を含む、工程、
（ｆ）次最末端成分オリゴヌクレオチドを付加する工程であって、該次最末端成分オリゴヌクレオチドは該開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である少なくとも１つの突出部を含む、工程、
（ｇ）アニーリングに適するような条件下および時間で該開始ポリヌクレオチドを該次最末端成分ポリヌクレオチドと接触させる工程、および
（ｈ）必要に応じ、（ｅ）から（ｇ）までを繰り返して該次最末端成分ポリヌクレオチドを該伸長される開始ポリヌクレオチドに逐次的に付加するする工程であって、これにより、標的ポリヌクレオチドが酵素的重合の非存在下で構築される、工程
を含む二本鎖ポリヌクレオチドを構築する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、概して生物情報科学の領域、より具体的にはコンピュータ制御によるポリヌクレオチド構築のための方法、アルゴリズムおよび装置に関する。さらに、本発明は、本発明により構築したポリヌクレオチド類がコードするポリペプチド類の製造に関する。
【０００２】
酵素、抗体、受容体およびリガンドは、選択的な外圧によって進化した結果、生体環境内で極めて特異的な生物学的機能を営んでいるポリペプチド類である。あるポリペプチドが特定の技術的な用途に用いられるには、このポリペプチドは、進化上の選択を受けなかった環境あるいは基質において機能することが必要とされる。極端な環境の中で繁殖する微生物から単離されたポリペプチドは、これらの分子が概して構造と機能に関して適応性があるとの十分な証拠になる。しかしながら、ポリペプチドをその自然環境から単離する方法は費用と時間がかかる。従って、目的とする活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子物質を合成によって進化させる新しい方法が必要とされている。
【０００３】
遺伝子工学的操作のために遺伝子物質を得るための方法には二通りがある。即ち、（１）自然源からＤＮＡまたはＲＮＡの形でポリヌクレオチドを単離・精製する方法、あるいは（２）種々の化学的・酵素的方法を用いてポリヌクレオチドを合成する方法、である。前者の方法によって得られるのは、容易には特定の修飾を受けない天然型の配列に限られる。また、後者の方法は、さらに複雑で手間がかかるものである。しかしながら、化学的・酵素的方法には、大した制約もなく所望のポリヌクレオチド配列を作成できる可能性があるなど、魅力的な特徴が多い。
【０００４】
現在、オリゴヌクレオチドを長いポリヌクレオチド断片に合成的に構築する一般的な方法は二通り存在する。一つ目の方法では、先ず最初に合成すべき配列全体を網羅するオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、次いで切れ目をリガーゼにより修復する。次に、得られた断片を直接クローニングするか、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅させた後にクローニングする。続いて、得られたポリペプチドを使用してインビトロで更に長い配列を構築する。二つ目の一般的遺伝子合成法は、アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対中の一本鎖間隙を埋めるためにポリメラーゼを利用するものである。このポリメラーゼとの反応により、オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は二本鎖になるが、これを制限酵素で消化した後、直接クローニングするか、異なる二本鎖断片を連結させてさらに長い配列の構築を続行するために用いる。一般的には、ポリメラーゼ反応の後、セグメントをそれぞれクローニングしなければならず、これは長鎖ＤＮＡ断片の合成を著しく遅延させこの方法の効率を大きく低下させる。
【０００５】
全く新規なポリヌクレオチドを創出したり、既存のポリヌクレオチドに実質的な修飾を加えたりすることは、極めて費用と時間がかかり、複雑で多くの工程を必要とし、場合によっては不可能なことがある。従って、目的とするいかなる配列のポリヌクレオチドをも合成的に構築できる効率的な手段が大いに必要とされている。そのような方法であれば、広く利用されうるであろう。例えば、この方法を用いて、既知の配列に特定の置換を行った一群のポリヌクレオチドを効率的に作り、これらを発現させ機能の改善を求めてスクリーニングすることができるであろう。本発明は、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドの合成のための効率的で強力な方法および組成物を提供することにより、これらの必要性を満たすものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明はポリヌクレオチドの合成的構築方法および関連するアルゴリズムを提供する。特に、本発明は、遺伝子全体、染色体セグメント、染色体およびゲノムを含めいかなる核酸配列をも生成できる迅速で効率的な方法を提供する。本方法は完全に合成的な方法に基づいているので、非常に大きな核酸セグメントの作成の妨げとなる、既存の核酸の利用可能性といったような制約がない。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
ヒトのゲノムを含む、複雑なゲノムの完全な配列の解明は、遺伝学への大規模で機能的なアプローチを可能にする。本発明は、ヒトゲノムデータベースのようなデータベースにおいて利用できる情報をベースとしたコンピュータ制御のポリヌクレオチド構築により得られるゲノム配列情報の結果を利用する新規な方法を提供する。特に、本発明は、標的ポリペプチドをコードする新規な合成標的ポリヌクレオチド配列を合成し、構築し、選択するために用いることができる。この標的ポリヌクレオチドは、天然（野生型）、あるいはモデルポリヌクレオチド配列によってコードされたモデルポリペプチドに比し向上または改変された生物活性を示す標的ポリペプチドをコードすることができる。後に、標準的なアッセイを用いて、発現させた標的ポリペプチドの活性を調べることができる。例えば、発現標的ポリペプチドをアッセイして、対応するモデルポリペプチドの機能を果たす能力を調べたり、新しい機能を発揮する標的ポリペプチドが産生されたかどうかを調べたりすることができる。このように、本発明は、モデルポリペプチドから誘導された標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコンピュータ制御によって合成することにより、モデルポリペプチドの合成的な進化を導く手段を提供する。
【０００８】
一つの実施形態において、本発明は、標的ポリヌクレオチドを提供し、少なくとも一つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも一つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして得られる５’突出部と３’突出部を含む部分的に二本鎖のポリペプチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも一つの開始オリゴヌクレオチドを同定することにより、標的ポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。続いて、二本鎖ポリヌクレオチドを連続的に構築していくために系統立てて繰り返される工程において、次の最末端のオリゴヌクレオチドを付加することができる。本発明の構築方法により提供される種々の実施形態においては、次最末端オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよいが、開始オリゴヌクレオチドを交互に双方向へ、または単一方向へ、あるいはそれらの任意の組み合わせで伸長するようにこれを付加することができる。
【０００９】
ここに用いる「標的ポリヌクレオチド配列」という用語は、本発明の方法により合成することができる標的ポリペプチドをコードするのに適したいかなる核酸配列をも含む。標的ポリヌクレオチド配列は、核酸配列を構築することができる装置を使用して標的ポリヌクレオチドを作製するために用いることができる。一般に、標的ポリペプチド配列は二本鎖領域を有するＤＮＡの線状セグメントである。このセグメントは、相補領域を有する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって創出されるのに十分ないかなる長さであってもよい。標的ポリヌクレオチドは長さが１００、２００、３００、４００、８００、１０００、１５００、２０００、４０００、８０００、１００００、１２０００、１８，０００、２０，０００、４０，０００、８０，０００あるいはそれ以上の塩基対であってもよいと考えられる。本発明の方法は、既知の細菌、酵母、ウィルス、哺乳動物、両生類、爬虫類あるいは鳥類のゲノムに匹敵する長さのゲノムを完全に人工的に創出するのに利用することができる。さらに特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは目的とするポリペプチドをコードする遺伝子である。さらにまた、標的ポリヌクレオチドは、複製起点、テロメア、プロモーター、エンハンサー、転写・翻訳開始および停止シグナル、イントロン、エクソンスプライス部位、クロマチン足場成分ならびに他の調節配列といった非コーディングエレメントを含むことができる。標的ポリヌクレオチドは同義遺伝子、染色体セグメント、染色体およびゲノム全体を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは、細菌、酵母、ウィルス、哺乳動物、両生類、爬虫類、鳥類、植物、原始バクテリアおよび他のＤＮＡ保有生物を含む原核生物あるいは真核生物の配列から誘導することができる。
【００１０】
ここに用いた「オリゴヌクレオチド」は、２種以上、好ましくは４種以上のデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドからなる分子、と定義される。オリゴヌクレオチドは、リン酸結合により結合したヌクレオチド塩基からなる、一本鎖あるいは二本鎖の小さなＤＮＡセグメントである。オリゴヌクレオチドの正確な大きさは、反応温度、塩濃度、ホルムアミドのような変性剤の存在、およびこのオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることを意図した配列との相補性の程度のような多くの要因によって決まる。
【００１１】
ヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれにも存在し、塩基として、それぞれ、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンまたはウラシルを含み、糖部分は、それぞれ、デオキシリボースまたはリボースである。しかしながら、当然のことではあるが、在来の塩基、即ち、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルのうちの一つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を、本発明において使用するオリゴヌクレオチドに用いることができる。このような修飾塩基としては、例えば、８−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。所望ならば、ヌクレオチドには、プライマー伸長生成物中への取り込み時にヌクレオチドが、例えば固相への捕獲のためにこのプライマー伸長生成物と関連するシグナルを増強するように、標識またはマーカーを付すことができる。
【００１２】
通常、プラス鎖オリゴヌクレオチドとしては、５’末端で始まり配列を読むようにして左へと伸びる短い一本鎖ＤＮＡセグメントが含まれる。マイナス鎖オリゴヌクレオチドとしては、３’末端で始まり配列を読むようにして左へと伸びる短い一本鎖ＤＮＡセグメントが含まれる。オリゴヌクレオチドの合成方法は、例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｇａｔｅ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に見出される。固相合成技術は、例えば、多数の「ピン（ｐｉｎｓ）」に関するいくつかのペプチド配列の合成について報告されている（その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，（１９８７）１０２：２５９−２７４参照を参照のこと）。
【００１３】
さらに、多数のオリゴヌクレオチドおよび他の高分子配列を短期間に形成する方法が工夫されている。特に注目すべきこととして、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９０／１５０７０号についても参照）、Ｆｏｄｏｒら、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９２／１００９２号、およびＷｉｎｋｌｅｒら、米国特許第６，１３６，２６９号（これら全ては本明細書中で参考として援用される）は、例えば、光制御合成技術を用いて膨大な数の高分子配列を形成する方法を開示している。また、本明細書中でその全体が参考として援用される、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：７６７−７７７についても参照。高分子アレイの合成を自動化する研究も一部で行われている。例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８９／１０９９７号は、３種の異なる単量体を基材上の異なる１２箇所の位置に沈着させるのに通常のペンプロッタを使用することについて記載している。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「開始」オリゴヌクレオチド配列あるいはポリヌクレオチド配列は、最初の配列あるいは開始配列として役立つオリゴヌクレオチド配列あるいはポリヌクレオチド配列であり、次最末端オリゴヌクレオチドあるいは次最末端成分ポリヌクレオチドを系統立てて付加することにより逐次伸長される。開始オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列は、５’突出部、３’突出部あるいは各々の鎖に５’突出部および３’突出部を有することができる。開始オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列は、交互に双方向へ、または単一方向へ、あるいはそれらの任意の組み合わせで伸長することができる。開始オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に含まれることができ、そして本発明のアルゴリズムによって同定することができる。このことについては、標的ポリヌクレオチド配列に含まれる開始オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列は、標的ポリヌクレオチド配列の５’最末端オリゴヌクレオチドであるか、３’最末端オリゴヌクレオチドであるか、または３’最末端オリゴヌクレオチドでも５’最末端オリゴヌクレオチドでもないかのいずれにもなることができ、これは標的ポリヌクレオチドの構築がその中央部から始まるのか、二つ末端の一方から始まるのかによって決まる。標的ポリヌクレオチド配列に含まれる開始オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列が、標的ポリヌクレオチドの５’最末端オリゴヌクレオチドか３’最末端オリゴヌクレオチドかいずれか一方を表す場合、それは１つの突出部を含むことができる。
【００１５】
標的ポリヌクレオチドの連結反応による構築について、開始オリゴヌクレオチドは、この開始オリゴヌクレオチドに隣接する後続のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成のためのアンカーを提供することによって構築を開始する。従って、連結反応による構築について、開始オリゴヌクレオチドは部分的に二本鎖核酸であり、このことによって隣接する二本鎖核酸分子のアニーリングのための一本鎖突出部を提供する。標的ポリヌクレオチドをプライマー伸張法により構築するには、開始オリゴヌクレオチドはこの開始オリゴヌクレオチドに隣接する後続のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成のための鋳型を提供することによって構築を開始する。従って、プライマー伸張法による構築のために、開始オリゴヌクレオチドは部分的に二本鎖となるか、完全に二本鎖となることができる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「次最末端」オリゴヌクレオチドという用語は、伸長される開始オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に付加されるオリゴヌクレオチドのことを言う。次最末端オリゴヌクレオチドは、一本鎖でも、部分的に二本鎖でも、あるいは完全二本鎖であってもよい。次最末端オリゴヌクレオチドを伸長した新生の二本鎖オリゴヌクレオチドの逐次付加を利用する本発明の逐次法では、次最末端オリゴヌクレオチドは、伸長した新生の二本鎖オリゴヌクレオチドのプラス鎖かマイナス鎖のいずれかに属する３’または５’突出部と相補的な少なくとも一つの突出部を有する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「５’最末端」および「３’最末端」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列の物理的な始点または末端のいずれかを含む一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドのことを言う。前述したように、本発明の逐次構築法において用いる開始オリゴヌクレオチドあるいは開始ポリヌクレオチドは、例えば、５’最末端オリゴヌクレオチドであっても、３’最末端オリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「酵素的合成」という用語は、例えば、重合、プライマー伸長、連結反応あるいはミスマッチ修復を含む機能のために、１種以上の酵素を利用するポリヌクレオチドの構築のことを言う。本明細書中に記載した本発明のポリヌクレオチド構築方法は、酵素的合成、非酵素的合成のいずれによっても実施することができる。酵素的プライマー伸長法とは、ポリヌクレオチドを合成するために熱安定ポリメラーゼおよび熱安定リガーゼをそれぞれ利用する、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む酵素反応を介するプライマー伸長を含むポリヌクレオチド合成方法を言う。さらに、ここに用いた「酵素的重合」は、伸長のために天然あるいは組換えのポリメラーゼを利用するポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの構築（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む）のことを言う。
【００１９】
本発明は、遺伝子全体、染色体セグメントまたは断片、染色体およびゲノムを含むポリヌクレオチドの迅速かつ効率的な構築方法を提供する。本発明の方法は完全に合成的なアプローチに基づいているので、非常に大きな核酸セグメントの作成の妨げとなる、既存の核酸の利用可能性あるいは部位特異的突然変異誘発の複雑さのような制約がない。特に、オリゴヌクレオチドを長鎖ＤＮＡ断片に合成的に構築するための、当該分野で知られている方法は、一般に、アニーリングしたオリゴヌクレオチド対の一本鎖間隙を埋めるためにポリメラーゼを利用する。しかしながら、このポリメラーゼ反応の後で、各セグメントをクローニングしなければならず、これが長鎖ポリヌクレオチド断片の合成を著しく遅延させ、このアプローチの効率を大きく低下させる工程である。加えて、このアプローチは小さなＤＮＡ断片を得るためにしか用いることができない。
【００２０】
当該分野で知られている他のポリヌクレオチド合成方法としては、熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用い融解、アニーリングおよび重合のサイクルを繰り返して行われる、重複オリゴヌクレオチドの構築を伴うＰＣＲをベースとした技術が挙げられる。ＰＣＲを介した方法の主要な欠点は、複雑なミスプライミング事象が、得られる構築ポリヌクレオチドの正確さに悪影響を及ぼすことである。さらに、熱安定ＤＮＡポリメラーゼの忠実度の低さが多数のＰＣＲ工程を伴うこの技術の信頼性に影響を与えている。ポリヌクレオチド合成の他の公知の方法は、鋳型を用いないで２本以上のポリヌクレオチド鎖を連結させることを必要とし、また、約２００塩基対の短い遺伝子を合成できるに過ぎないという欠点を有する。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、ａ）部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチド（ここで、開始オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの突出部を含む）を選択する工程、ｂ）この部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチドを次最末端オリゴヌクレオチド（ここで、次最末端オリゴヌクレオチドはこの開始オリゴヌクレオチドに隣接し、少なくとも一つの突出部を有し、また、この次最末端オリゴヌクレオチドの少なくとも一つの突出部は開始オリゴヌクレオチドの少なくとも一つの突出部と相補性である）と接触させる工程、およびｃ）（ｂ）を繰り返し行って、次最末端オリゴヌクレオチドを伸長された開始オリゴヌクレオチドに逐次付加することによって、二本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、二本鎖ポリヌクレオチドの構築方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、ｂ）少なくとも一つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングして得られる、５’突出部と３’突出部を含む部分的二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始オリゴヌクレオチドを同定する工程、ｃ）この開始オリゴヌクレオチドと隣接し、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングして得られる５’突出部または３’突出部あるいは５’突出部と３’突出部を含む部分的二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する第２のポリヌクレオチド（ここで、この第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を同定する工程、ｄ）開始配列と隣接し、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドとアニーリングして得られる、５’突出部または３’突出部あるいは５’突出部と３’突出部を含む部分的二本鎖ポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する第３のポリヌクレオチド（ここで、この第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、第２のポリヌクレオチドの突出部と相補性でない開始ポリヌクレオチドの少なくとも一つの突出部と相補性である）を同定する工程、ｅ）開始ポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件および時間で、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドと接触させることにより、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを形成し、その結果、開始ポリヌクレオチドを双方向性に伸長させる工程、ｆ）必要に応じて、プライマー伸長のない条件下でｅ）の混合物を連結に適した条件下でリガーゼと接触させる工程、およびｇ）必要に応じて、（ｂ）から（ｆ）までを繰り返してアニーリングと連結のサイクルを繰り返すことで、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを逐次付加することにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチド配列の合成方法を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、ａ）標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、ｂ）この標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチド（ここで、この開始オリゴヌクレオチドは５’突出部と３’突出部を含む）を同定する工程、ｃ）標的ポリヌクレオチド中に存在する次最末端オリゴヌクレオチド（ここで、この次最末端オリゴヌクレオチドは開始オリゴヌクレオチドに隣接し、５’突出部と３’突出部を含み、ここで、次最末端オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を同定する工程、ｄ）開始ポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件と時間で、次最末端オリゴヌクレオチドと接触させる工程（ここで、開始ポリヌクレオチドは伸長される）、およびｅ）必要に応じて、（ａ）から（ｄ）までを繰り返して次最末端オリゴヌクレオチドを伸長された開始ポリヌクレオチドに逐次付加していくことにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチド構築方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、ａ）存在する部分的二本鎖開始オリゴヌクレオチド（ここで、この開始オリゴヌクレオチドは５’突出部と３’突出部を含む）を提供する工程、ｃ）次最末端オリゴヌクレオチド（ここで、この次最末端オリゴヌクレオチドは開始オリゴヌクレオチドに隣接し、５’突出部と３’突出部を含み、ここで、次最末端オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を同定する工程、ｄ）開始オリゴヌクレオチドをアニーリングに適した条件下と時間で、次最末端オリゴヌクレオチドと接触させる工程（ここで、開始配列は伸長される）、およびｅ）必要に応じて、（ａ）から（ｄ）までを繰り返し、次最末端オリゴヌクレオチドを伸長された開始ポリヌクレオチドに逐次付加していくことによりポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、ポリヌクレオチド構築方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド（ここで、この開始ポリヌクレオチドは、１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む）を同定する工程、ｃ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｂ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして５’突出部と３’突出部を含む部分的二本鎖開始ポリヌクレオチドを得る工程、ｄ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する第２のポリヌクレオチド配列（ここで、第２のポリヌクレオチド配列は開始ポリヌクレオチド配列と隣接し、かつ１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチドを含む）を同定する工程、ｅ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｄ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチド（ここで、この第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を得る工程、ｆ）ａ）の標的ポリヌクレオチド中に存在する第３のポリヌクレオチド（ここで、この第３のポリヌクレオチドは開始配列と隣接し、かつ１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む）を同定する工程、ｇ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｆ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチド（ここで、第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性であり、かつ第２のポリヌクレオチドの突出部とは相補性でない）を得る工程、ｈ）ｃ）の開始ポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件と時間で、ｅ）の第２のポリヌクレオチドおよびｇ）の第３のポリヌクレオチドと接触させることにより、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程（ここで、開始配列は双方向に伸長される）、ｉ）必要に応じて、プライマー伸長のない条件で、ｈ）の混合物を連結に適した条件下でリガーゼと接触させる工程、およびｊ）必要に応じて、（ｂ）から（ｉ）までを繰り返し、アニーリングと連結のサイクルを繰り返すことで、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを逐次付加することにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチド合成方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、ｂ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも一つの開始ポリヌクレオチド配列（ここで、開始ポリヌクレオチドは、１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む）を同定する工程、ｃ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｂ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして５’突出部と３’突出部を含む部分的二本鎖開始ポリヌクレオチドを得る工程、ｄ）標的ポリヌクレオチド配列中に存在する第２のポリヌクレオチド配列（ここで、第２のポリヌクレオチド配列は開始ポリヌクレオチド配列と隣接し、かつ１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む）を同定する工程、ｅ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｄ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチド（ここで、この第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を得る工程、ｈ）ｃ）の開始ポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件下と時間で、ｅ）の第２のポリヌクレオチドと接触させることにより、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程（ここで、この開始配列は伸長される）、ｉ）必要に応じて、プライマー伸長のない状態でｈ）の混合物を連結に適した条件下でリガーゼと接触させる工程、およびｊ）必要に応じて、ｂ）からｉ）までを繰り返し、アニーリングと連結のサイクルを繰り返すことで、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを逐次付加することにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、ａ）１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む第１のポリヌクレオチドを提供する工程、ｂ）この第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをａ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖の開始ポリヌクレオチドを得る工程、ｃ）ａ）の標的ポリヌクレオチド配列中に存在する第２のポリヌクレオチド配列（ここで、この第２のポリヌクレオチド配列は開始ポリヌクレオチド配列と隣接し、かつ１）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、２）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、および３）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性の第２の隣接配列を含むマイナス鎖オリゴヌクレオチド、を含む）を同定する工程、ｅ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドをｄ）のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチド（ここで、この第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である）を得る工程、ｈ）ｃ）の開始ポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件と時間で、ｅ）の第２のポリヌクレオチドと接触させることにより、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程（ここで、この開始配列は伸長される）、ｉ）必要に応じて、プライマー伸長のない状態でｈ）の混合物を連結に適した条件下でリガーゼと接触させる工程、およびｊ）必要に応じて、ｂ）からｉ）までを繰り返し、アニーリングと連結のサイクルを繰り返すことで、伸長された開始ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチドを逐次付加することにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、ａ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドを提供する工程、ｂ）この第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性を有する第１のマイナス鎖オリゴヌクレオチド、ｃ）第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドを第１のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングさせて少なくとも１つの突出部を含む部分的二本鎖開始ポリヌクレオチドを得る工程、ｄ）この二本鎖開始ポリヌクレオチドの突出部と少なくとも部分的に相補性を有する次最末端一本鎖オリゴヌクレオチドを添加する工程、ｅ）この次最末端一本鎖オリゴヌクレオチドを二本鎖開始ポリヌクレオチドにアニーリングさせる工程、ｄ）少なくとも１つの突出部を含む部分的に二本鎖の第２のポリヌクレオチドを得る工程、ｈ）必要に応じて、プライマー伸長のない状態でｈ）の混合物を連結に適した条件下でリガーゼと接触させる工程、およびｊ）必要に応じて、ｂ）からｉ）までを繰り返し、アニーリングと連結のサイクルを繰り返すことで、伸長された開始ポリヌクレオチドに一本鎖ポリヌクレオチドを逐次付加することにより標的ポリヌクレオチドを合成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供する工程、ｂ）少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングした少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定する工程、ｃ）この開始ポリヌクレオチドを、プライマーのアニーリングに適した条件下で、開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’部分と部分的な相補性を有する第１のオリゴヌクレオチドおよび開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分と部分的な相補性を有する第２のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、ｄ）プライマー伸長に適した条件下で、１）開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、２）アニーリングさせた第１のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、３）開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、および４）アニーリングさせた第２のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、を触媒して、開始配列を双方向に伸長させることにより伸長した新生の開始ポリヌクレオチドを形成する工程、ｅ）ｄ）の伸長された開始ポリヌクレオチドを、プライマーのアニーリングに適した条件下で、伸長された開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’部分と部分的な相補性を有する第３のオリゴヌクレオチドおよび伸長された開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分と部分的な相補性を有する第４のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、ｆ）プライマー伸長に適した条件下で、１）伸長された開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、２）アニーリングさせた第３のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、３）伸長された開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、および４）アニーリングさせた第４のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシルからのポリヌクレオチド合成、を触媒して、開始配列を双方向に伸長させることにより伸長した新生の開始ポリヌクレオチドを形成する工程、およびｇ）必要に応じて、所望される場合に、ｅ）からｆ）まで繰り返し、標的ポリヌクレオチド配列を形成する工程を包含する、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、ａ）標的ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むこと、ｂ）この発現ベクターを適当な宿主細胞中へ導入すること、ｃ）この細胞を、標的ポリヌクレオチドによりコードされた標的ポリペプチドの発現を促進するような条件下および時間で培養すること、およびｄ）標的ポリペプチドを単離することを含む、本発明の方法により作成した標的ポリヌクレオチドによりコードされた標的ポリペプチドを単離する方法を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、ａ）モデル配列から誘導された標的ポリヌクレオチド配列を提供すること、ｂ）各々が、複数で存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つと部分的に相補性である複数の一本鎖オリゴヌクレオチド（この場合、複数のオリゴヌクレオチドの配列は標的ポリヌクレオチドの隣接配列である）を化学的に合成すること、ｃ）アニーリングに適した条件と時間で、これらの部分的に相補性のオリゴヌクレオチドを接触させて、複数の部分的に二本鎖のポリヌクレオチド（この場合、各々の二本鎖ポリヌクレオチドは５’突出部と３’突出部を含有する）を形成すること、ｄ）これらの複数の二本鎖ポリヌクレオチド中に存在するモデル配列から誘導した少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドを同定すること、ｅ）プライマー伸長のない状態で、この開始ポリヌクレオチドおよび１）この開始および配列の５’部分とアニーリングする二本鎖ポリヌクレオチド、２）この開始ポリヌクレオチドの３’部分とアニーリングする二本鎖ポリヌクレオチド、および３）ＤＮＡリガーゼを含む混合物を、アニーリングと連結反応に適した条件下に置くこと（この場合、この開始ポリヌクレオチドは双方向に伸長される）、ｆ）アニーリングのサイクルを繰り返して二本鎖ポリヌクレオチドをこの伸長される開始ポリヌクレオチドと逐次アニーリングさせることにより標的ポリヌクレオチドを作成することを含む、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
【００３２】
上述の逐次構築法に加えて、本発明は、また、２セットのオリゴヌクレオチドを合成した後、アニーリングさせるセット構築方法を提供する。この点について、本発明はまた、（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含む少なくとも２５塩基のオリゴヌクレオチドの第１のセットを化学的に合成すること、（ｂ）前記二本鎖ポリヌクレオチドの第２の相補的な鎖を含む少なくとも２５塩基のオリゴヌクレオチドの第２のセット（このオリゴヌクレオチドの第２のセット内の各オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの第１のセット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重なり合う）を化学的に合成すること、およびｃ）第１および第２のセットのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて酵素的合成の非存在下で二本鎖ポリヌクレオチドを作成することを含む、二本鎖ポリヌクレオチドの構築方法を提供する。
【００３３】
本発明の構築方法によって作成される二本鎖ポリヌクレオチドは、長さが、例えば、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１×１０３、５×１０３、１×１０４、５×１０４、１×１０５、５×１０５、１×１０６、５×１０６、１×１０７、５×１０７、１×１０８、５×１０８、１×１０９、５×１０９塩基対あるいはそれ以上であることができる。上述のように、本発明の１実施形態では、２セットのオリゴヌクレオチドは遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖全体に相当するように作成することができる。オリゴヌクレオチドセットは約１５塩基と１５０塩基との間、約２０塩基と１００塩基との間、約２５塩基と７５塩基との間、約３０塩基と５０塩基との間のオリゴヌクレオチドを含むことができる。具体的な長さとしては、たとえば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１５０塩基あるいはそれ以上が挙げられる。
【００３４】
大きさによって、２つのセットのオリゴヌクレオチド間の重なりは、そのオリゴヌクレオチドの長さの約５０パーセントあるいはオリゴヌクレオチド塩基対当たり約５塩基と７５塩基との間、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、８０、９０、１００塩基またはそれ以上となるよう設計することができる。第１と第２のセットによる相補的な対形成が、第１のセットの各オリゴヌクレオチドが第２のセットの２つのオリゴヌクレオチドからの領域と相補性であるように（この場合、末端のオリゴヌクレオチドは例外となる可能性がある）、対になる配列の重なりをもたらすように、セットを設計することができる。必要に応じて、第１と第２のセットのオリゴヌクレオチドを単一の混合物にアニーリングし、連結酵素で処理することができる。
【００３５】
さらに、本発明は、（ａ）コーディング領域と調節領域を有する複製能のある二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含む第１のセットのオリゴヌクレオチドを化学的に合成すること、（ｂ）コーディング領域と調節領域を有するこの複製能のある二本鎖ポリヌクレオチドの相補的な第２の鎖を含む第２のセットのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの第２のセット内の各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの第１セット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重なり合う）を化学的に合成すること、および（ｃ）第１のセットと第２のセットのオリゴヌクレオチドをアニーリングしてコーディング領域と調節領域を有する複製能のある二本鎖ポリヌクレオチドを作成することを含む、複製能のある二本鎖ポリヌクレオチドの構築方法を提供する。
【００３６】
さらに、本発明のセット構築法は、二本鎖ポリヌクレオチドを構築するために逐次構築法と併用することができる。ここに用いた「成分ポリヌクレオチド」という用語は、本発明によって提供されるセット構築法と逐次構築法を併用する構築方法に関連して用いられる場合には、別個の２セットのオリゴヌクレオチドを合成、アニーリングして作成されるポリヌクレオチドのことを言う。成分ポリヌクレオチドは、後に、本発明によって提供される逐次構築法を介してより大きなポリヌクレオチド中に組み込まれる。
【００３７】
従って、本発明は、ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖を含む第１のセットのオリゴヌクレオチドを化学的に合成すること、ｂ）二本鎖ポリヌクレオチドの相補的な第２の鎖を含む第２のセットのオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの第２のセット内の各オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの第１のセット内の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと重なり合う）を化学的に合成すること、およびｃ）第１のセットと第２のセットのオリゴヌクレオチドをアニーリングして部分的二本鎖成分ポリヌクレオチドを作成すること、ｄ）工程（ａ）から（ｃ）までを繰り返して一連の部分的二本鎖成分ポリヌクレオチドを作成すること、ｅ）開始ポリヌクレオチドとして役立つ、標的ポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの部分的二本鎖成分ポリヌクレオチド（この場合、この開始ポリヌクレオチドは５’突出部および３’突出部を含む）を選択すること、ｆ）次最末端成分ポリヌクレオチド（この場合、この次最末端成分ポリヌクレオチドは、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である少なくとも１つの突出部を含む）を添加すること、ｇ）アニーリングに適した条件および時間で開始ポリヌクレオチドを次最末端成分ポリヌクレオチドと接触させること（この場合、この開始配列は伸長される）、およびｈ）必要に応じて、（ｅ）から（ｇ）までを繰り返して次最末端成分ポリヌクレオチドをこの伸長される開始ポリヌクレオチドに逐次付加することにより酵素合成の非存在下で標的ポリヌクレオチドを構築することを含む、二本鎖ポリヌクレオチドの構築方法を提供する。
【００３８】
本発明の構築方法は、構築されるべき標的ポリヌクレオチドを提供または選択する初期の工程を含むことができ、あるいは予め標的を決めることなく実施してランダムな配列のポリヌクレオチドを構築する、例えば、ランダムライブラリーを作成することができる。あるいは、本発明の構築方法は、標的配列を含むがランダム配列も含むポリヌクレオチドを構築する、例えば、バイアスライブラリーを作成するために利用することができる。本発明は、モデル配列から誘導される標的ポリヌクレオチドを作成するための、コンピュータ可読媒体に格納されるコンピュータプログラムを提供する。このコンピュータプログラムは、コンピュータシステムに対してａ）標的ポリヌクレオチド配列に含まれる開始ポリヌクレオチド配列を同定させ、ｂ）標的ポリヌクレオチド配列を多くの異なる、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドに解釈させ、ｃ）部分的相補性オリゴヌクレオチドの逐次付加による開始ポリヌクレオチド配列の双方向伸長を制御して隣接二本鎖ポリヌクレオチドを作成することにより標的ポリヌクレオチド配列の構築を制御させる、ための命令を含む。
【００３９】
さらに、本発明は、ａ）ユーザーに対し、所望の標的ポリヌクレオチド配列を伝達する機会を与えること、ｂ）ユーザーに対し、その所望の標的ポリヌクレオチド配列をサーバーに伝えることを可能にすること、ｃ）ユーザーに対し独自の指示を与えること、ｄ）ユーザーに提供された伝達標的ポリヌクレオチド配列を入手することを含む、標的ポリヌクレオチド配列の自動化合成法を提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、ａ）ユーザーに対し、モデルポリヌクレオチド配列を伝達する機構を与えること、ｂ）必要に応じて、ユーザーに対し、要望があれば、このモデル配列に対する少なくとも１箇所の所望の修飾を伝達する機会を与えること、ｃ）ユーザーに対し、このモデル配列および所望の修飾をサーバーに伝えることを可能にすること、ｄ）ユーザーに対し独自の指示を与えること、ｅ）ユーザーによって提供された伝達されたモデル配列および任意の所望された修飾を入手すること、ｆ）このモデルポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むデータをプログラム入力したコンピュータに、入力装置を介して、入力すること、ｇ）プロセッサを使用して、所望された修飾を含むモデルポリヌクレオチド配列の配列を決定すること、ｈ）さらに、プロセッサを使用して、このモデルポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を決定すること、ｉ）プロセッサを使用して、このモデルポリヌクレオチド配列中の開始配列の位置に基づき修飾モデルポリヌクレオチド配列を合成するためのモデルを選択すること、およびｊ）出力装置に少なくとも１つの決定の結果を出力することを含む、ポリヌクレオチド配列の自動化合成法を提供する。
【００４１】
本明細書中に用いた技術用語および科学用語は全て、別に定義しない限り、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、アミノ酸の１文字略語および３文字略語ならびにヌクレオチドの１文字略語は広く了解されている。本発明の実施または試用において、本明細書中に記載したものに類似あるいは等価である方法および材料を用いることは可能であるが、適切な方法および材料は以下に記載する。さらに、これらの材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、限定的であることを意図しない。本明細書中に記載した刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献はすべて、全文引用により参考として援用される。係争の場合には、定義を含む、本明細書が制限するであろう。
【００４２】
上述の方法は、総称して本発明のポリヌクレオチド構築方法という名称になっている。本発明のポリヌクレオチド構築方法は、酵素合成法を併用して、あるいは使用しないで実施することができる。酵素合成法には、例えば、酵素的重合、酵素的連結反応、酵素的ミスマッチ修復、および本発明のポリヌクレオチド構築方法において利用できるその他の酵素作用が含まれる。上述のように、本発明のポリヌクレオチド構築方法では、伸長されるポリヌクレオチドをアニーリングに適した条件および時間で次最末端ポリヌクレオチドと接触させて、隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを作成することができる（この場合、開始配列は伸長される）。続いて、次最末端ポリヌクレオチドを、アニーリングと連結反応のサイクルを繰り返すことにより、この伸長される開始ポリヌクレオチドに付加して標的ポリヌクレオチドを構築することができる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチド構築方法は、ポリヌクレオチドを構築している間にＭｕｔＳを添加することを含むことができる。ＭｕｔＳは、ＤＮＡミスマッチ修復に関与する細菌性蛋白であり、塩基ミスマッチ、不対塩基、および小挿入または欠失ループを含む多くのエラーを認識して修復する。ＭｕｔＳは、二本鎖ポリヌクレオチド内のミスマッチ塩基対を結合することによって機能し、伸長した新生の二本鎖ポリヌクレオチド中へのミスマッチオリゴヌクレオチドの取り込みを阻止するために本発明の方法において利用することができる。特に、単一の塩基ミスマッチを有する２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングする場合、ＭｕｔＳはアニーリングされたオリゴヌクレオチドおよびミスマッチの位置に結合することによって、リガーゼ酵素が隣接のオリゴヌクレオチドに結合し連結するのを物理的に阻止する。ＭｕｔＳ結合の結果、ミスマッチ塩基を含むオリゴヌクレオチドは、伸長した新生の二本鎖ポリヌクレオチド中へ取り込まれなくなる。従って、本明細書中に記載したセット構築法および逐次構築法を含む本発明のポリヌクレオチド構築方法には、例えばプーリング工程または連結反応工程の間に、反応混合物にＭｕｔＳを添加することも含まれ得る。本発明が提供する２セットのオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築方法において、二本鎖ポリヌクレオチドを構築するためにＭｕｔＳ蛋白の存在下で第１および第２のセットのオリゴヌクレオチドをアニーリングすること。概して言えば、本明細書中に記載した逐次あるいはセット構築法では、ＭｕｔＳは一次反応混合物またはプールに添加することができ、その後の全ての構築工程において存在することになる。
【００４４】
大腸菌ＭｕｔＳ蛋白の同族体はほとんど全ての生物に見出されている。原核生物では、ＭｕｔＳ蛋白は単一の遺伝子から生じるが、真核生物は多数のｍｕｔＳ同族体（ｍｓｈ）遺伝子を持っている。熱安定ＭｕｔＳは好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られ、大腸菌ＭｕｔＳ蛋白と６３％の同一性、ヒトの同族体蛋白ＭＳＨ２と５５％の同一性を有する。熱安定ＭｕｔＳは最高７０℃までミスマッチオリゴヌクレオチドと結合でき、特に本特許請求される方法を実施するのに有用である。熱安定ＭｕｔＳは種々の供給元、例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｃｏｇｅｎ  Ｓ．Ｒ．Ｌ．、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎから市販されており、製造者の取り扱い説明書に従って、例えば反応混合物５０μｌ当たり０．１μｇ添加することによって使用することができる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチド構築方法は、先行技術により既知のポリヌクレオチド合成法に対していくつかの利点を提供する。このポリヌクレオチド構築方法は、大きな二本鎖ヌクレオチドの構築を可能にし、またその後に、複製能力を付与するベクター中へのクローニングおよび連結反応を行う必要がない。それどころか、本発明のポリヌクレオチド構築方法は、複製に必要な遠位シス−およびトランス−作用エレメントだけでなく調節領域をも含むに十分な大きさのポリヌクレオチドを効率的に構築することを可能にする。従って、本発明の方法により構築されたポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質コーディング領域、プロモーター、翻訳シグナル、複製起点、調節エレメントおよびポリアデニル化シグナルを含むことができる。本発明の方法は、大分子の構築が実施可能なため複製能力のあるオリゴヌクレオチドの構築を可能にすることによって、中間のクローニング工程を経ないで、例えば細菌宿主の形質転換によって、直接宿主細胞へ移すことのできるポリヌクレオチドの構築を可能にする。
【００４６】
さらに、本発明の逐次ポリヌクレオチド構築方法は、膨大数のオリゴヌクレオチドのプールのハイブリッド形成を必要とする方法の場合に認められるエラー率を減少させる。加えて、本発明の逐次ポリヌクレオチド構築方法は、伸長される開始オリゴヌクレオチドの対応する相補的突出部とのハイブリッド形成時に約５０パーセントの重なりを生じるように、これらの長さの約５０パーセントの突出部を有する大きなオリゴヌクレオチドを用いて実施することができる。本発明の逐次ポリヌクレオチド構築方法は、精製を必要とせず、そして同じ大きさの二本鎖あるいは一本鎖オリゴヌクレオチドを系統立てて構築することを可能にする。また、本発明の構築方法は、異なった大きさの一本鎖オリゴヌクレオチドあるいは二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて実施することもできる。さらに、本発明の逐次ポリヌクレオチド構築方法は、従来のプーリング法において遭遇する、相補的な低分子繰返し配列に関連したミスマッチ問題を回避する。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明の開始ポリヌクレオチドは、効率改善のため支持固体に結合させることができる。この固相は、構築された標的ポリヌクレオチドを他の反応成分から効率的に分離することを可能にする。この方法では種々の支持体を用いることができる。例えば、反応混合物から所望の生成物を磁気的に分離できる支持体は、磁気ラテックスビーズあるいは磁気制御細孔性ガラスビーズであってもよい。このようなビーズへの開始ポリヌクレオチドの結合は、種々の既知の方法、例えば、カルボジイミド処理（Ｇｉｌｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７：２８０９−２８１３（１９６８）；ＭｉｚｕｔａｎｉおよびＴａｃｈｂａｎａ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３５６：２０２−２０５（１９８６）；Ｗｏｌｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：２９１１−２９２６（１９８７）；Ｍｕｓｓｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：５３５３−５３７２（１９８７）；Ｌｕｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８６１−１０８８０（１９８８））によって達成され得る。
【００４８】
この固相に結合した開始ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの合成を継続するためのアンカーとして作用し得る。構築は、隣接ポリヌクレオチドをライゲーションにより構築するためのリガーゼと共に添加するか、またはオリゴヌクレオチドをプライマー伸長によって構築するためのポリメラーゼと共に添加することによって達成され得る。適切な時間インキュベートした後、本方法の未結合成分を洗い流し、再び反応を繰り返して鋳型利用の効率を改善し得る。あるいは、別のポリヌクレオチドのセットまたはオリゴヌクレオチドのセットを添加して構築を継続し得る。
【００４９】
固相は、合成用に効率的に使用するために、長鎖核酸分子を合成するに十分な空間をもつ細孔を備え得る。この固相は、所望でないあらゆる反応成分とも非特異的に結合し得ない物質を含み得る。この問題を解決する１つの方法は、長鎖ＤＮＡ分子に適した調整細孔性ガラスビーズを使用することである。開始ポリヌクレオチドは、長いコネクターを通してこのビーズに結合させることができる。このコネクターの役割は、開始ポリヌクレオチドを支持固体の表面から望ましい距離に配置することである。
【００５０】
さらに、本発明の方法は、標的ポリヌクレオチド中に存在する、開始ポリヌクレオチドに隣接する次最末端ポリヌクレオチドを同定することを含む。次最末端ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングし、５’突出部または３’突出部、あるいは５’突出部および３’突出部を含む部分的二本鎖オリゴヌクレオチドヌクレオチドが得られ得る。ここで、この次最末端ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、伸長される開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である。あるいは、次最末端ポリヌクレオチドは、一本鎖であって、この伸長される開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性の、本明細書中において突出部と称される領域を含み得る。相補性領域を有する２つ以上のオリゴヌクレオチドは、可能な場合、適切な条件下で「アニーリング」（即ち、塩基対形成）して、二本鎖領域を生ずる。アニーリング（即ち、ハイブリッド形成）するためには、オリゴヌクレオチドは、互いに少なくとも部分的に相補性でなければならない。用語「と相補性の」は、本明細書中で、別の特定のヌクレオチドと塩基対を形成するヌクレオチドを意味するヌクレオチドとの関連で用いている。従って、アデノシン三リン酸はウリジン三リン酸あるいはチミジン三リン酸と相補性であり、グアノシン三リン酸はシチジン三リン酸と相補性である。
【００５１】
本明細書中において用いられる場合、５’あるいは３’「突出部」は、二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖ポリヌクレオチドあるいは二本鎖オリゴヌクレオチドまたは一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端あるいは５’末端および３’末端の一本鎖領域を意味し、この領域は、隣接するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの突出部と相補的な突出部を含む隣接するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのその後のアニーリングのための手段を提供する。想定される用途に応じて、様々な程度のアニーリング選択性を達成するために様々なアニーリング条件を用いることが望まれる。
【００５２】
高度の選択性を必要とする用途に対して、代表的には、ハイブリッドを形成するのに比較的ストリンジェントな条件を用いることが所望される（例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１０  ＭのＮａＣｌ、約５０℃〜約７０℃の温度によって規定されるような、比較的低い塩濃度および／または高温の条件が選択される。このような非常にストリンジェントな条件は、オリゴヌクレオチドと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、たとえあるとしても、ほとんど許容しない。一般に、ホルムアルデヒドの添加量を増加することによって条件をよりストリンジェントにし得ることが理解されている。
【００５３】
特定の用途に対して、例えば、部位指定突然変異誘発によるヌクレオチドの置換の場合を例に挙げると、より低いストリンジェンシーの条件を用いることができると理解されている。この条件下では、プローブと標的鎖の配列が完全には相補的でなくてもハイブリダイゼーションが生じ得るが、１箇所以上の位置にミスマッチが起こる。塩濃度を増加させ温度を低下させることによって条件のストリンジェンシーを下げることができる。例えば、約０．１Ｍ〜約０．２５ＭのＮａＣｌ、約３７℃〜約５５℃の温度によって中間的なストリンジェンシーの条件を提供し得るが、これに対して、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩、約２０℃〜約５５℃の温度範囲により、低いストリンジェンシーの条件を規定し得る。このように、ハイブリダイゼーションの条件は、所望する結果に応じて容易に操作し得る。
【００５４】
一部の実施形態において、標識を用いることにより、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、有利に測定し得る。種々多様の適切な標識が当該分野において公知であり、検出可能な蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素性リガンドまたは他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン等）が挙げられる。好ましい実施形態において、放射性またはその他の環境的に好ましくない試薬の代わりに、蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが望まれる。酵素タグの場合には、相補的オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションが起こるか田舎を同定するために、肉眼または分光光度計により可視的な検出手段を提供するために用いられ得ることが公知である比色分析用指示薬物質が知られている。
【００５５】
固相を含む実施形態において、例えば、開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを、選択したマトリックスまたは表面に吸着させるか、または、そうでなければ貼り付ける。次いで、この固定した一本鎖核酸を、望ましい条件下で相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに供する。選択される条件はまた、必要とされる特定の基準に基づいた特定の状況に依存する（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸のソース、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ等に依存する）。ハイブリダイゼーションさせた表面を洗浄して非特異的に結合したオリゴヌクレオチドを除去した後、標識手段によってハイブリダイゼーションを検出、または定量することも可能である。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、開始ポリヌクレオチドと隣接し、そして少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングさせて得られた、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含む部分的に二本鎖であるポリヌクレオチドを含む標的ポリヌクレオチド中に存在する第２のポリヌクレオチド配列を同定する工程を包含し、ここで、この第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つ突出部は開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つ突出部と相補性である。この実施形態において、本発明は、開始配列と隣接し、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を提供するヌクレオチド中に存在する第３のポリヌクレオチドをさらに提供し、ここで、この第３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部は、第２のポリヌクレオチドと相補的でない開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である。後に、開始ポリヌクレオチドを交互に双方向様式で伸長させるように、ポリヌクレオチドを末端に交互に付加する。
【００５７】
さらに、本方法は、開始ポリヌクレオチドを、アニーリングに適した条件と時間で、第２のポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドと接触させる方法であり、この接触により、隣接する二本鎖ポリヌクレオチド、開始ポリヌクレオチドの伸長が生じる。アニーリングさせたポリヌクレオチドは、必要に応じて、ライゲーションに適した条件下でリガーゼと接触させる。上記で検討した方法を、繰り返し、必要に応じてアニーリングとライゲーションのサイクルの反復によって二本鎖ポリヌクレオチドを、伸長される開始ポリヌクレオチドに順次付加する。
【００５８】
本明細書中において記載したように、本発明の方法においては、開始ポリヌクレオチドは、単一方向の伸長または双方向の伸長によって、ならびに単一方向の伸長および双方向の伸長の混合によって伸長され得る。上記のように、交互の双方向伸長においては、直前に付加されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの突出部と相補的でない伸長される開始ポリヌクレオチドの少なくとも１つの突出部と相補性である少なくとも１つの突出部を有する次最末端オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが付加され、このようにして、その後の次最末端オリゴヌクレオチドの付加について交互に双方向性のパターンが形成される。他の実施形態において、次最末端オリゴヌクレオチドは、伸長される二本鎖ポリヌクレオチドへの付加がもたらす伸長が双方向性の伸長であるか、または単一方向性の伸長であるかに関係なく、いかなる次最末端ポリヌクレオチドであってもよい。このような実施形態において、次最末端オリゴヌクレオチドあるいは次最末端ポリヌクレオチドは、伸長される二本鎖ポリヌクレオチドのあらゆる突出部と相補性であり得る突出部を有する。
【００５９】
本発明の方法によれば、ポリヌクレオチドはランダムに構築され得るか、または標的ポリヌクレオチド配列を包含し得る。この標的ポリヌクレオチド配列は、新規に設計され得るか、または予め決定されたモデルポリヌクレオチド配列から誘導され得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の所望のサイズまたは複雑性を有し得、そしてゲノム全体をコードするポリヌクレオチド、あるいはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの部分配列、セグメントあるいはフラグメントへの経路からのいかなるものをも含み得る。モデルポリヌクレオチド配列としては、構築前に予め決定され、そして、例えばモデルポリペプチド配列をコードし得る任意の核酸が挙げられる。モデルポリペプチド配列は、所望の修飾が組み込まれた標的ポリヌクレオチドが合成されるような修飾ポリヌクレオチドを設計するためのベースを提供し得る。
【００６０】
本発明はまた、人工生物ならびにゲノム全体の特定の機能または特性をなす生体系のエレメントをコードする遺伝子（天然または人工的なプロモーター構築物から発現される天然の遺伝子、あるいは合成ＤＮＡ配列由来の人工遺伝子のいずれかである）のセットをコードするポリヌクレオチドを新規に合成するために使用できる方法を提供する。このような系およびゲノムの作成において、本発明は、複製能のある二本鎖ポリヌクレオチドの合成を提供し、ここで、このポリヌクレオチドは、複製起点、最初のコード領域およびこの最初のコード領域の発現を支持する最初の調節領域を有する。
【００６１】
本明細書中で用いられる場合、用語「複製能のある」は、それ自体の複製を支持する能力のあるポリヌクレオチドのことをいう。複製能のあるポリヌクレオチドは、コーディング領域の発現を指示するために必要なシス作用シグナルおよび調節エレメントを有する調節領域を含む。この複製能のあるポリヌクレオチドは、複製能を確認するために、合成コード領域をプラスミドあるいはウィルスのようなベクター中にクローニングするといった組み換え方法の必要性を除く。
【００６２】
遺伝子、ゲノム、遺伝子セットまたはタンパク質配列を規定するポリヌクレオチド配列は、コンピュータを利用する方法で設計し（後述する）、そしてこの配列のプラス（＋）鎖およびマイナス（−）鎖を含むオリゴヌクレオチドのセットを構文解析するために用いることが可能である。本明細書中で用いられる場合、「構文解析」は、一連の隣接するオリゴヌクレオチド配列が同定されるように、標的ポリヌクレオチド配列をコンピュータを利用する方法で図に示すことを意味する。このオリゴヌクレオチド配列は、個別に合成され、標的ポリヌクレオチドを作製するために本発明の方法において使用される。オリゴヌクレオチドの長さは、かなり調節可能である。本発明の方法において使用するオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約１５〜１００塩基、より好ましくは、約２０〜５０塩基である。具体的な長さとしては、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基、４２塩基、４３塩基、４４塩基、４５塩基、４６塩基、４７塩基、４８塩基、４９塩基、５０塩基、５１塩基、５２塩基、５３塩基、５４塩基、５５塩基、５６塩基、５７塩基、５８塩基、５９塩基、６０塩基、６１塩基、６２塩基、６３塩基、６４塩基、６５塩基、６６塩基、６７塩基、６８塩基、６９塩基、７０塩基、７１塩基、７２塩基、７３塩基、７４塩基、７５塩基、７６塩基、７７塩基、７８塩基、７９塩基、８０塩基、８１塩基、８２塩基、８３塩基、８４塩基、８５塩基、８６塩基、８７塩基、８８塩基、８９塩基、９０塩基、９１塩基、９２塩基、９３塩基、９４塩基、９５塩基、９６塩基、９７塩基、９８塩基、９９塩基および１００塩基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。部分的な相補性を有するオリゴヌクレオチド間の重複は、そのサイズに依存して、オリゴヌクレオチド対当たり５〜７５塩基となるよう設計し得る。
【００６３】
これらのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理される。このキナーゼ処理は、オリゴヌクレオチドセットの混合前または混合後、あるいはアニーリングの、前ではなく後に行い得る。アニーリングの後、オリゴヌクレオチドを連結機能を有する酵素で処理する。例えば、この機能に対して代表的にはＤＮＡリガーゼが用いられる。しかし、トポイソメラーゼは、５’リン酸化を必要とせず、室温で迅速に機能するので、リガーゼの代わりに用いられ得る。例えば、オリゴヌクレオチドアレイ合成機（ＯＡＳ）により、２５塩基が重複している５０塩基対オリゴヌクレオチドを合成し得る。オリゴヌクレオチドセットの５’（＋）鎖が１枚の９６穴ウェルプレート中で合成され、もう１つの鎖セットまたは３’（−）を別の１枚の９６穴マイクロタイタープレート中で合成される。合成は、反応規模を縮小化し小さな反応容量と２〜５ｎｍｏｌの範囲の収量をもたらすように改良されたホスホルアミダイト化学法を用いて行われ得る。調整細孔性ガラスビーズ（ＣＰＧ）上で合成を行い、次いで、完成したオリゴヌクレオチドを非ブロック化し、脱保護化してビーズから取り出す。このオリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、水に再懸濁して、ライゲーションを可能にするポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて５’リン酸化する。
【００６４】
プレート中にアレイされたオリゴヌクレオチド配列のセットは、混合プール法を用いて構築され得る。例えば、成分オリゴヌクレオチドの系統的なプーリングは、改良型ベックマン・バイオメク（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｋ）自動ピペッティングロボットまたは別の自動ラボワークステーションを使用して行われ得る。断片は、緩衝液および酵素（例えば、Ｔａｑ  Ｉ  ＤＮＡリガーゼまたはＥｇｅａ  ＡｓｓｅｍｂｌａｓｅＴＭ）を用いて結合させ得る。プーリングは、マイクロウェルプレート中で行われ得る。アニーリングおよびライゲーションを可能にするため、各工程のプーリング終了毎に温度を下げ、次いでプーリングを追加的に行う。
【００６５】
本発明の構築方法においては、一般に１分当たりわずか１．５℃ずつ３７℃以下まで下げ、ゆっくりとアニーリングを行い、ハイブリダイゼーションの効率を最大にし得る。ゆっくりとしたアニーリングは、種々の方法、例えば、プログラム制御が可能なサーマルサイクラーを使用して達成され得る。冷却速度は、線形または非線形であり、例えば、０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、０．６℃、０．７℃、０．８℃、０．９℃、１．０℃、１．１℃、１．２℃、１．３℃、１．４℃、１．５℃、１．６℃、１．７℃、１．８℃、１．９℃または２．０℃であり得る。この冷却速度を上下に調節して、効率および正確性を最大にし得る。
【００６６】
標的ポリヌクレオチドの構築は中間体のセットの形成を必要とする。中間体のセットとしては、上述のように、マイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングしたプラス鎖オリゴヌクレオチドを挙げることができる。このアニーリングされた中間体は、一本鎖のマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングさせた一本鎖のプラス鎖オリゴヌクレオチドを提供することによって形成され得る。
【００６７】
あるいは、２つ以上のオリゴヌクレオチドがプラス鎖またはマイナス鎖を構成し得る。例えば、本発明の標的ポリヌクレオチドを構築するのに用いられ得るポリヌクレオチド（例えば、開始ポリヌクレオチド）を構成するために、３つ以上のオリゴヌクレオチドがアニーリングすることが可能である。従って、第１のプラス鎖オリゴヌクレオチド、この第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第２のプラス鎖オリゴヌクレオチド、ならびに第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第１の隣接配列および第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的な第２の隣接配列を有するマイナス鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングして、部分的二本鎖ポリヌクレオチドを形成し得る。このポリヌクレオチドは、５’突出部、３’突出部、または５’突出部および３’突出部を含み得る。第１のプラス鎖オリゴヌクレオチドおよび第２のプラス鎖オリゴヌクレオチドは、それらが連結可能なように隣接した配列である。マイナス鎖オリゴヌクレオチドは、両方のプラス鎖オリゴヌクレオチドと部分的に相補性であり、両オリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって「架橋」配列あるいは「安定化」配列として作用する。以上の結果形成されたポリヌクレオチドは、前述のようにしてアニーリングされた２を越えるオリゴヌクレオチドから成り、これを用いて隣接する二本鎖ポリヌクレオチドを形成する方法で、標的ポリヌクレオチドを構築することが可能である。
【００６８】
図３に、２つ以上のプラス鎖オリゴヌクレオチドを用いてポリヌクレオチドを構築する例を示した。約２５ｂｐ重なり合う、各々約５０ｂｐの３つのオリゴヌクレオチドのトリプレックスは、「ニック」中間体を形成する。これらのオリゴヌクレオチドのうちの２つは、リガーゼにより結合される連結反応の基質となり、３番目のオリゴヌクレオチドは、アニーリングにより２つの特定の配列を結合する安定化剤となって最終的なポリヌクレオチド構築体の一部の形成をもたらす。この中間体は、ニックシーリング活性によってこれら２つの５０塩基対オリゴヌクレオチドを単一の１００塩基一本鎖ポリヌクレオチド中に結合させるＤＮＡリガーゼの基質となる。
【００６９】
初期のプーリング、およびアニーリング生成物形成に続いて、この生成物を段階的に大きなポリヌクレオチドに構築する。例えば、オリゴヌクレオチドのトリプレックス形成に続いて、トリップレックスのセットを体系的に結合、連結させて構築する。各工程は、アニーリングおよび変性を達成するために、ロボット利用のプーリング、連結反応および熱サイクリングによって調整することができる。最終工程では、構築部分を、断片の全てをアレイで示す完全な配列に結合する。各工程の収率は１００％未満であることから、最終混合物中の完成品の総量は極めて僅かとなる可能性がある。必要に応じて、通常１５乃至２０塩基の、構築体の最末端と相補的な特定のオリゴヌクレオチド・プライマーをアニーリングしＰＣＲ増幅を行うことにより最終的な完全長の生成物を増幅、精製することができる。
【００７０】
本発明の方法は、既存のポリヌクレオチド合成技術に対するいくつかの改良点を提供する。例えば、合成には、極めて迅速な合成、反応容量の低減および合成容器としてのプレートの高密度化を可能にするマイクロディスペンシング型圧電またはマイクロソレノイドナノディスペンサーを利用することができる。この装置は、ウェルプレートを最大１５３６枚まで使える能力の高いものである。さらに、個々のオリゴヌクレオチドをマイクロチャンネルの中を移動させ制御された方法で混合／連結させる微量流体マニホールドによって、プーリングを制御することができる。これにより、ロボット利用のピペッティングが不要になり、速度と効率が増大する。このように、本発明の方法を完遂する装置は、遺伝子の長さに関してより大きな全般的能力を与える同時的反応を行う機能にすぐれている。
【００７１】
本発明の方法を用いてひとたび標的ポリヌクレオチドが合成されると、機能分析のため配列をスクリーニングすることが必要となる可能性がある。本発明者らは、チップをベースとしたＤＮＡ技術を特に企図している。簡単に言えば、これらの技術は多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析するための定量的な方法である。オリゴヌクレオチドあるいは固定プローブアレイを用いて遺伝子を標識することによって、チップ技術を用いて標的分子を高密度アレイとして分離し、ハイブリッド形成に基づいてこれらの分子をスクリーニングすることができる。
【００７２】
コンビナトリアル合成およびハイスループットスクリーニングアッセイを使用することについては当業者が周知である。例えば、米国特許第５，８０７，７５４号、５，８０７，６８３号、５，８０４，５６３号、５，７８９，１６２号、５，７８３，３８４号、５，７７０，３５８号、５，７５９，７７９号、５，７４７，３３４号、５，６８６，２４２号、５，１９８，３４６号、５，７３８，９９６号、５，７３３，７４３号、５，７１４，３２０号、および５，６６３，０４６号（それぞれ本明細書中に参考として詳細に援用される）には、標的ポリヌクレオチドの活性を測定するために有用なスクリーニング系について記載されている。これらの特許は、種々のポリサブユニット（ポリヌクレオチドあるいはポリペプチド）の高密度アレイの構築物および活性分析に関連した方法ならびに組成物ついてのいろんな局面を教示する。上記の特許に記載されている方法および組成物が本発明の標的ポリペプチドの活性プロフィールを評価するのに有用であり得ると考えられる。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を提供し、少なくとも１つのプラス鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのマイナス鎖オリゴヌクレオチドにアニーリングして生ずる二本鎖ポリペプチド含む標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定することによる、標的ポリヌクレオチドの合成方法を提供する。プライマーアニーリングに適した条件下で、開始ポリヌクレオチドを、この開始ポリヌクレオチドのプラス鎖の３’部分と部分的に相補性を有する第１のオリゴヌクレオチドおよびこの開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖の３’部分と部分的に相補性を有する第２のオリゴヌクレオチドと接触させる。これに続き、１）開始ポリヌクレオチドのプラス鎖、２）アニーリングした第１のオリゴヌクレオチド、３）開始ポリヌクレオチドのマイナス鎖、および４）アニーリングした第２のオリゴヌクレオチド、の３’−ヒドロキシル基からのポリヌクレオチド合成を利用して、プライマー伸長を行う。この合成の結果、開始配列が双方向に伸長されることによって最初の伸長された開始ポリヌクレオチドが形成される。この伸長された開始配列は、アニーリングとプライマー伸長のサイクルを繰り返すことにより、さらに伸長される。
【００７４】
前述のとおり、アニーリングと連結反応によってポリヌクレオチドを構築するために、オリゴヌクレオチドを構築用ブロックとして使用することができる。あるいは、アニーリングとプライマー伸長反応によりポリヌクレオチドを作成するために、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することができる。「プライマー」という用語は、ここでは、オリゴヌクレオチドを含む結合要素のことを指して用いている。このオリゴヌクレオチドは精製した制限酵素消化物中にあるような天然のものでも、合成的に作成したものでもよく、また、核酸鎖と相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘起される条件下、すなわち、適当なヌクレオチド、および適当な緩衝液（「緩衝液」にはｐＨ、イオン強度、補因子等を含める）中のＤＮＡポリメラーゼのような重合用試薬の存在下および適切な温度に置かれた時、合成開始点として作用することができる。
【００７５】
このプライマーは、増幅効率を最大化するため一本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖とすることもできる。プライマーが二本鎖の場合、伸長生成物の作成に使用する前に、先ずその二本鎖を切り離すための処理をする。好ましくは、このプライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。このプライマーは、重合用試薬の存在下で伸長生成物の合成を開始させるためには、十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマーの供給源ならびに本方法の利用法等、多くの要素によって決まる。一般に、標的ヌクレオチドとハイブリッド形成可能な短鎖のみを有するプライマーでは、鋳型と十分安定なハイブリッド複合体を形成するには比較的低い温度が必要とされる。
【００７６】
本明細書中では、このプライマーは、増幅されるべき各々の特定の配列の種々の鎖と「実質的に」相補的であるものが選択される。このことは、このプライマーがそれらのそれぞれの鎖と十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、このプライマーの配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。しかしながら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７（７）２５０３−２５１６（１９８９）に記載の方法に従って行われる分析、あるいは直線的増幅またはポリメラーゼ連鎖反応以外の増幅技術を用いる類似の方法に関する場合を除き、このプライマーは、普通、正確な相補性を有する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドのプライマー伸長用試薬は、酵素を含む、プライマー伸長生成物の合成を完遂するよう機能するいかなる化合物あるいは系であってもよい。この目的に適した酵素としては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および熱安定酵素等の酵素が挙げられる。本明細書中で使用する場合、「熱安定酵素」という用語は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、かつ、各々の核酸鎖と相補的なプライマー伸長生成物を形成するための適切な方法でヌクレオチドの結合を触媒（促進）するあらゆる酵素を意味する。概して、この合成は各プライマーの３’末端から開始され、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５’への方向へ進む。本発明の方法において用いることのできる好ましい熱安定酵素は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から抽出、精製することができる酵素である。このような酵素は、約８６，０００乃至９０，０００ダルトンの分子量を有する。サーマス・アクアティカスのＹＴ１株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１  パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ）、ロックビル、メリーランド州、米国からＡＴＴＣ  ２５，１０４として制限なく入手できる。
【００７８】
所望の標的ポリヌクレオチドを増幅する方法が公知であり、文献に記載されている。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７１  ５６，３４１−３６１においてＫ．Ｋｌｅｐｐｅは、所望のＤＮＡ配列の増幅方法を開示している。この方法は、一本鎖を形成するためにＤＮＡ二重鎖を変性させることを含んでいる。この変性工程は、所望のＤＮＡ配列に隣接する領域とハイブリッドを形成する十分に大過量の２つの核酸プライマーの存在下で実施される。２つの構造体を冷却すると、各々、プライマーと適切に複合体を形成した完全長の鋳型鎖を含む構造体が得られる。ＤＮＡポリメラーゼおよび十分量のそれぞれの必要なヌクレオシド三リン酸を添加することによって２分子の元の二重鎖が得られる。上述の変性、プライマー添加および伸長のサイクルは、所望の標的ポリヌクレオチドの適当数のコピーが得られるまで繰り換えされる。
【００７９】
さらに、本発明は、標的ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドの発現および単離方法を提供する。この方法は、本発明の方法によって合成した標的ポリヌクレオチドを発現ベクター中に組み込むこと、その発現ベクターを適当な宿主細胞中への導入すること、標的ポリヌクレオチドによってコードされた標的ポリペプチドの発現を促進するような条件と時間でその宿主細胞を培養すること、および標的ポリペプチドを単離すること、を含む。
【００８０】
本発明は、モデルポリペプチドをコードするモデルポリヌクレオチドの特定の機能的、構造的あるいは系統発生的な特性を修飾して、改変された標的ポリペプチドを作成するのに用いることができる。モデルポリペプチドをコードするインプットまたはモデルポリヌクレオチド配列を電子的に操作して、モデルポリペプチド中の特定部位あるいは多数の部位におけるアミノ酸の変更（または改変）による効果の可能性を調べることができる。ひとたび同定すれば、新規の標的ポリヌクレオチド配列を、本発明の方法によって、この標的ポリヌクレオチドがモデルポリペプチドとは異なる特徴を有する標的ポリペプチドをコードするように構築する。
【００８１】
本発明の方法は、公開されている配列および構造のデータベースの利用に依拠することができる。これらのデータベースは、ますます多くの配列・構造が追加されるにつれてさらに強固なものになる。標的ポリペプチドのアミノ酸配列およびこのポリペプチドの三次構造に関する情報は、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドへと構築可能なオリゴヌクレオチドを合成するために利用することができる。モデルポリペプチドには、このポリペプチドの機能に関連するアミノ酸を分析するための十分な構造上の情報がなければならない。この構造上の情報は、Ｘ線結晶学、ＮＭＲあるいはアミノ酸または原子レベルでタンパク質構造を調べるいくつかの他の技術から得ることができる。モデルポリペプチドから得られる配列および構造上の情報は、ひとたび選択すると、標的ポリペプチドを含む複数の改変アミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドを作成するために用いることができる。従って、モデルポリペプチドは、標的タンパク質との全般的な配列の類似性に基づいて、あるいは標的ポリペプチドの一部と配列類似性を有する部分の存在に基づいて選択することができる。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」とは、そのモノマーがアルファ・アミノ酸であってアミド結合を介して互いに結合しているポリマーである。アミノ酸は、Ｌ型光学異性体でもＤ型光学異性体でもよい。ポリペプチドは、長さが２アミノ酸モノマー以上であり、２０アミノ酸モノマー長を超えるものが多い。アミノ酸の略語は標準的なものを使用した（例えば、プロリンについてはＰ）。これらの略語は、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版、１９８８（全ての目的のため、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。ポリペプチドに関して言うと、「単離された」とは、成分の混合物において主要な成分を構成する、例えば、重量で５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、あるいは９５％以上からなるポリペプチドのことを指して言う。単離ポリペプチドは、化学的合成も可能ではあるが、通常は、このポリペプチドが産生される生物から精製によって得られる。ポリペプチドの精製方法としては、例えば、クロマトグラフィーあるいはイムノアフィニティー技術が挙げられる。本発明のポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と、これに続く、検出されるべきポリペプチドに対し結合親和性をもつモノクロナールまたはポリクロナール抗体を使用するクーマシーブルー染色あるいはウエスタンブロット分析によって検出することができる。
【００８３】
本明細書中で使用する場合、「キメラポリペプチド」とは、２種以上の異なるタンパク質、あるいは同一タンパク質の、普通隣接していない２つ以上の領域から得られるアミノ酸配列部分を含むポリペプチドである。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、「リガンド」とは、受容体によって認識される分子である。本発明によって調べることができるリガンドの例としては、細胞膜受容体、毒素および蛇毒等に対するアゴニストおよびアンタゴニスト、ウィルスエピトープ、ホルモン、オピエート、ステロイド、ペプチド、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、ならびにタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、「受容体」とは、リガンドに対し親和性を有する分子である。受容体は、天然の分子でも人工的な分子でもよい。これらは、そのままの状態でも他種との凝集体としても用いることができる。受容体は、直接または特異的な結合基質を介して、結合構成部分に、共有結合あるいは非共有結合により結合することができる。本発明が用いることのできる受容体の例としては、抗体、細胞膜受容体、モノクロナール抗体、および特異的抗原決定基、ウィルス、細胞、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖、細胞膜ならびに細胞小器官と反応性の抗血清が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「リガンド受容体対」は、２つの分子が分子認識を介して結合し複合体を形成した場合に形成される。
【００８６】
本発明によって合成することのできるポリペプチドの具体的な例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
ａ）微生物受容体：微生物の生存に必須の特異的輸送タンパク質あるいは酵素のような微生物受容体に結合するリガンドを決定することは、新種の抗生物質を発見するための有用な手段となるであろう。特に価値が高いのは日和見菌、原虫、および現在使用されている抗生物質に耐性の細菌に対する抗生物質であろう。
【００８８】
ｂ）酵素：例えば、受容体は、神経伝達物質の分解を引き起こす酵素等の酵素の結合部位を含み得る；神経伝達物質分解酵素の作用を調節するこの種の受容体に対するリガンドを決定することは、神経伝達の疾患の治療に使用できる薬物を開発するのに有用である。
【００８９】
ｃ）抗体：例えば、本発明は、目的の抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位を含む受容体を研究するのに有用であり得る；抗原のエピトープに類似する配列を決定することは、免疫原が１つ以上のこのような配列をベースとするワクチンの開発、あるいは自己免疫疾患等の（例えば、「自己」抗体の結合を阻止することによる）治療的処置において有用な関連の診断試薬または化合物の開発をもたらすことができる。
【００９０】
ｄ）ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドの配列を合成して、合成配列の受容体として作用するＤＮＡまたはＲＮＡ結合配列を決定することができる。
【００９１】
ｅ）触媒作用を有するポリペプチド：１つ以上の反応成分の１つ以上の生成物への変換を伴う化学反応を促進することのできるポリマー、好ましくは、抗体。一般に、このようなポリペプチドは、少なくとも１つの反応成分または反応中間体に特異的な結合部位、および結合部位に近接した有効な機能性を含み、この機能性により結合された反応成分を化学的に修飾することができる。触媒作用を有するポリペプチドなどは、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９０／０５７４６号、ＷＯ  ９０／０５７４９号およびＷＯ  ９０／０５７８５号に記載されており、これらは全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【００９２】
ｆ）ホルモン受容体：インシュリン受容体および成長ホルモン受容体のような受容体と高度の親和性により結合するリガンドを同定することは、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状緩解のため受けなければならない毎日の注射に取って代わる経口剤、あるいは成長ホルモンの代替品の開発に有用である。ホルモン受容体の他の例として血管収縮ホルモン受容体が挙げられる；これらの受容体に対するリガンドを決定することは、血圧を調節する薬物の開発をもたらすことができる。
【００９３】
ｇ）オピエート受容体：脳中のオピエート受容体に結合するリガンドを決定することは、モルヒネおよび関連薬物に取って代わる依存性の少ない薬物の開発に有用である。
【００９４】
タンパク質の前後にくる語として、「構造」という用語は、タンパク質における原子の三次元配置のことを指す。「機能」とは、タンパク質の測定可能な性質のことをいう。タンパク質機能の例としては、触媒作用、他のタンパク質への結合、非タンパク質分子（例えば、薬物）への結合、および２つ以上の構造形間の異性化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「生物学的関連タンパク質」とは、生物の生命に関与するあらゆるタンパク質のことをいう。
【００９５】
重要な構造上のモチーフを確認するために、モデルポリペプチドの配列は、認知されたドメインの１つ以上のデータベース、例えば、プロサイト（ＰＲＯＳＩＴＥ）データベースドメイン［バイロック（Ｂａｉｒｏｃｈ）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．）２４：２１７，１９９７］あるいはファム（Ｐｆａｍ）エッチ・エム・エム（ＨＭＭ）データベース［ベイトマンほか（Ｂａｔｅｍａｎら）、（２０００）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．）２８：２６３］においてエントリーへの適合について調べる。プロサイト（ＰＲＯＳＩＴＥ）データベースは、主として、全タンパク質ドメインおよび、通常はタンパク質ドメインの最も高度に保存された機能上または構造上の特徴を示すパターンを表す、２種の配列シグナチャー−プロフィールをまとめたものである。
【００９６】
本発明の方法は、標的ポリペプチドの触媒活性あるいは標的ポリペプチドの非触媒活性（例えば、構造、安定性、別のタンパク質またはポリペプチド鎖への結合、核酸分子への結合、小分子への結合、および蛋白でも核酸でもない巨大分子への結合）に影響を及ぼす多形性を有するポリペプチドを作製するために用いることができる。例えば、本発明は、コードされた標的ポリペプチドを発現し特定の活性についてスクリーニングすることができるように標的ポリペプチドをコードするいかなるポリヌクレオチドをも構築する手段を提供する。標的ポリペプチド中のある決まった箇所の特定のアミノ酸を変更することによって、ポリペプチドの作用温度、作用ｐＨあるいはその他の特性を操作し、独自の活性を有するポリペプチドを得ることができる。このように、本発明の方法は、関心のあるポリペプチドの構造あるいは機能を設計する（例えば、選択した活性を増大させたり減少させる、あるいは選択的な活性を付加したり除去したりする）ために行うことができるアミノ酸置換を特定するのに用いることができる。
【００９７】
加えて、本発明の方法は、医薬品あるいは診断薬による多形性特異的ターゲッティングのための候補多形性の同定・分析において、または薬理ゲノム学用の候補多形性の同定・分析のために、あるいはアミノ酸多形性を示す薬剤ターゲットの実験的、生化学的および構造的分析のために用いることができる。
【００９８】
本発明によって複数の標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドのライブラリーを作製することができる。宿主細胞は、標的ポリヌクレオチドを含むベクターを、形質転換するのに良好な条件下で接種して人工的に導入することにより形質転換する。次に、活性についての表現型アッセイにおいて、目的とするポリペプチドの活性を示すクローンを求めて、得られた形質転換クローンのライブラリーをスクリーニングする。
【００９９】
本発明の標的ポリヌクレオチドは、適当なベクター中に取り込ませる（即ち、クローン化する）ことができる。発現のために、本発明の標的ポリヌクレオチドをコードする標的配列は、組み換え発現ベクター中に挿入することができる。「組み換え発現ベクター」という用語は、本発明の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入または取り込ませることによって操作した、当該分野において知られているプラスミド、ウィルスまたは他の伝達体を意味する。発現ベクターは、通常は、形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の遺伝子だけでなく、複製起点およびプロモーターも含む。本発明における使用に適したベクターとしては、細菌における発現用のＴ７系発現ベクター［ローゼンバーグほか（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、５６：１２５、１９８８］、哺乳動物細胞における発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター［リーおよびネーサンス（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６３：３５２１、１９８７］、昆虫細胞における発現用のバキュロウィルス由来ベクター、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ、タバコモザイクウィルスＴＭＶが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
利用されるベクターに応じて、構成および誘導プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの適した転写および翻訳エレメントのどれでも発現ベクターにおいて使用できる［ビッターほか（Ｂｉｔｔｅｒら）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１５３：５１６−５４４、１９８７］。これらのエレメントは当業者によく知られている。
【０１０１】
「作動可能なように連結された」あるいは「作動可能なように結合された」とは、調節配列とこの調節配列によって調節されるポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合を指していう。作動可能なように連結された調節配列は、ポリヌクレオチド配列によって発現される生成物の発現を制御する。あるいは、この機能的な結合は、エンハンサーエレメントも含む。
【０１０２】
「プロモーター」とは、転写を誘導するのに十分な核酸調節配列を意味する。また、本発明には、プロモーター依存性のポリヌクレオチド配列発現を制御可能、細胞型特異的、組織特異的あるいは外部シグナルまたは試薬により誘発可能にするに十分であるプロモーターエレメントも含まれる。なお、このようなエレメントは、元の遺伝子の５’または３’領域、あるいはイントロン中に位置することがある。
【０１０３】
「遺伝子発現」あるいは「ポリヌクレオチド配列発現」とは、有効な生物学的作用が得られるような量と時間で、検出可能なレベルの放出ヌクレオチド配列が発現されるように、ヌクレオチド配列が転写および翻訳を達成する過程を意味する。
【０１０４】
酵母では、構成あるいは誘導プロモーターを含有する多くのベクターを使用することができる  ［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、オースベルほか（Ａｕｓｕｂｅｌら）編、グリーン出版協会  ／  ウィリ・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、第１３章、１９８８；グラントほか（Ｇｒａｎｔら）、「エクスプレッション・アンド・セクレッション・ベクターズ・フォー・イースト（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ）」メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、ウー、グロスマン編、アカデミー・プレス（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、第１５３巻、５１６−５４４頁、１９８７年；グローバ（ＧｌｏｖｅｒＮ、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第ＩＩ巻、ＩＲＬ  プレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、ワシントンＤＣ、第３章、１９８６年；「ビター・ヘテロロガス・ジーン・エクスプレッション・イン・イースト（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ）」メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、バーガー、キンメル編、アカデミー・プレス（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、第１５２巻、６７３−６８４頁、１９８７年；およびザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・イースト・サッカロマイセス（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ストラサーンほか（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら）編、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、第Ｉ巻、第ＩＩ巻、１９８２年  ］。ＡＤＨあるいはＬＵＥ２のような酵母構成プロモーター、またはＧＡＬのような誘導プロモーターを使用することができる  ［「クローニング・イン・イースト（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ）」、第３章、アール・ロススタイン（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１１巻、ア・プラクティカル・アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ディーエム・グローバ（ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ）編、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、ワシントンＤＣ、１９８６年］。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【０１０５】
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列の末端にテロメアとして知られる特殊領域を含ませることが望ましいことがある。テロメアは、染色体の末端にある繰り返し配列であり、また、末端を切り取られた染色体は不安定で、他の染色体と融合しやすく、そうしなければ細胞分裂中に消失してしまうことがかなり以前から知られている。
【０１０６】
テロメアが核タンパク質複合体および核マトリックスと相互に作用することを示唆するデータもある。想定されるテロメアの１つの役割としては、染色体を安定化しその末端を分解酵素から保護することが挙げられる。
【０１０７】
テロメアのもう１つの考えられる役割は、複製にある。現在の学説によれば、ＤＮＡの複製は、鋳型のＴ末端にアニーリングされた短鎖ＲＮＡプライマーからの開始を必要とする。この機序は、結果として、ＲＮＡプライマー相当領域が複製されない「末端複製問題」を生ずる。このことにより、何回もの細胞分裂の間に、染色体の切り取りが進行する。テロメアは、この作用に対し、少なくともテロメア自体がこの作用によって除去されるまで、緩衝剤になると考えられている。標的ポリヌクレオチドに含ませることができるもう１つの構造は、動原体である。
【０１０８】
本発明の一部の実施形態では、発現構造物にマーカーを含ませることによって、細胞中の核酸の放出をインビトロまたはインビボで確認することができる。このマーカーは、発現の確認を容易にする、遺伝子導入された細胞への確認可能な変化をもたらす。
【０１０９】
本発明の発現ベクターは、標的細胞を形質転換するために用いることができる。「形質転換」とは、新しいＤＮＡ（即ち、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の取り込みに続いて細胞中に誘起される遺伝的な変化を意味する。細胞が哺乳動物の細胞である場合、この遺伝的な変化は、一般に、細胞のゲノム中にＤＮＡを導入することによって達成される。「形質転換された細胞」とは、組み換えＤＮＡ技術によって導入された細胞（またはその先祖に導入された細胞）を意味する。組み換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られた従来技術によって行うことができる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができる感応細胞は、指数的成長相を経た後に収集され、続いてＣａＣｌ２法により当該分野においてよく知られている手技を用いて処理された細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを用いてもよい。また、形質転換は、宿主細胞の原形質体を形成した後に、あるいはエレクトロポレーションによって行うことができる。
【０１１０】
本発明の標的ポリペプチドは、原核生物において、ポリペプチドをコードする核酸を発現させることによって作製することができる。原核生物としては、本発明のポリペプチドをコードする組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌のような微生物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの構造物は、インビトロアッセイ用に、大腸菌において大規模に作製することができる。配列がニッケル−キレートクロマトグラフィーによる一段精製のための標識を含む場合には、細菌からの精製は簡略化される。また、この構造物には、ポリペプチドの単離を簡単にするために標識を含ませることができる。例えば、６個のヒスチジン残基を含むポリヒスチジン標識をタンパク質のアミノ末端あるいはカルボキシ末端に取り込ませてもよい。このポリヒスチジン標識によって、ニッケル−キレートクロマトグラフィーにより一段階で都合よくタンパク質を単離することが可能になる。また、本発明の標的ポリペプチドは、タンパク質の回収に役立つ切断部位を含むよう設計することもできる。あるいは、本発明のポリペプチドを、インサイチュアッセイのために所望の宿主細胞において直接発現させることができる。
【０１１１】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共同沈降物のようなＤＮＡの導入法、微量注入、エレクトロポレーションまたはバイオリスティク技術等の従来の機械的方法、リポソームに封入したプラスミドの挿入、あるいはウィルスベクターを用いることができる。また、真核生物の細胞には、本発明のポリペプチド、および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子等の選択可能な表現形をコードする別の外来ＤＮＡ分子を同時導入することができる。もう１つの方法は、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）あるいはウシ乳頭腫ウィルスのような真核生物用ウィルスベクターを用いて真核細胞を一時的に感染または形質転換させてタンパク質を発現させることである。［ユーカリオティック・バイラル・ベクターズ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編、１９８２年］。好ましくは、真核生物宿主は、ここに記載したような宿主細胞として利用される。
【０１１２】
真核生物系、および好ましくは哺乳動物発現系では、哺乳動物タンパク質の発現を翻訳後に適当に修飾することが可能である。一次転写産物の適切なプロセッシング、糖鎖形成、リン酸化および、有利なことに、遺伝子産物の分泌のための細胞内機構を有する真核細胞は、本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として用いられるべきである。このような宿主細胞系としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、およびＷＩ３８を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
組み換えタンパク質を長期間にわたり高収率で生産するためには、安定した発現が望まれる。ウィルス複製起点を有する発現ベクターを用いる代わりに、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結区、ポリアデニル化部位など）によって制御された本発明の標的ポリペプチド、および選択可能なマーカーをコードするｃＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することができる。この組み換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択への抵抗性を与え、細胞がこのプラスミドを染色体中に安定的に組み込み、増殖して、順にクローン化され細胞群へと拡大されるうる集塊を形成することを可能にする。例えば、外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作された細胞は、富化培地で１乃至２日間増殖することができ、次いで選択培地へ移される。選択系として使用できるものは多数あり、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ［ウィグラーほか（Ｗｉｇｌｅｒら）、セル（Ｃｅｌｌ）、１１：２２３、１９７７］、ヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ  ［シバルスカ、シバルスキー（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、４８：２０２６、１９６２  ］、およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ  ［レービほか（Ｌｏｗｙら）、セル（Ｃｅｌｌ）、２２：８１７、１９８０］遺伝子を、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞あるいはａｐｒｔ細胞において用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質耐性を選択の基準として用いることができるものとして、メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子［ウィグラーほか（Ｗｉｇｌｅｒら）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、７７：３５６７、１９８０；オヘアほか（Ｏ’Ｈａｒｅら）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、８：１５２７、１９８１］、マイコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ遺伝子［マリガン、バーグ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｂｅｒｇ）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、７８：２０７２、１９８１］、アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ遺伝子［コルベール−ガラピンほか（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１５０：１、１９８１］、およびハイグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ遺伝子［サンテールほか（Ｓａｎｔｅｒｒｅら）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３０：１４７、１９８４］がある。最近、さらに、選択可能遺伝子が報告された。例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを．可能にするｈｉｓＤ［ハートマン、マリガン（Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、米国、８５：８０４７、１９８８］、およびオルニチン脱炭酸酵素インヒビター２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ耐性を与えるＯＤＣ（オルニチン脱炭酸酵素）［マッコンローグ・エル（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．）、カレント・コミュニケーションズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）編、１９８７］がある。
【０１１４】
細菌、真核生物のいずれを用いて発現した本発明のポリペプチドについても、その単離および精製の技術は、従来のいかなる手段、例えば、調製的クロマトグラフィー分離、およびモノクロナールまたはポリクロナール抗体あるいは抗原の使用を必要とするような免疫学的分離によることもできる。
【０１１５】
標的ポリヌクレオチド、あるいは標的ポリヌクレオチドを含む発現構造物は、リポソーム中に取り込むことができる。リポソームはリン脂質二分子膜と内部の水性媒質を特徴とする小胞性構造体である。多重膜リポソームは、水性媒質によって分離された多重脂質層を有し、リン脂質を過量の水溶液中に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉構造を形成する前に自己再配列を行い、脂質二重層間に水および溶けた溶質を取り込む。このリポソームはヘルナグルチネイティングウィルス（ＨＶＪ）と複合体を形成することができる。これは細胞膜との融合を促進し、リポソームに封入されたＤＮＡが細胞に入るのを促すことが明らかにされている。他の実施形態では、このリポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と共に複合体を形成させたり、用いたりすることができる。さらに別の実施形態では、このリポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両者と共に複合体を形成させたり、用いたりすることができる。このような発現構造物をインビトロあるいはインビボで核酸の移送および発現に首尾よく用いることができたという理由で、これらは本発明に適用できる。このＤＮＡ構造物において細菌のプロモーターを使用する場合には、適当な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含ませることも望ましいことである。
【０１１６】
本発明では、情報のみに基づいて、即ち、既存の遺伝子、ＤＮＡ分子あるいはゲノムを必要としないで標的ポリヌクレオチドの創生を可能にする方法について記載している。一般に、コンピュータソフトウェアを用いて、コンピュータで仮想のポリヌクレオチドを構築することは可能である。このポリヌクレオチドは、例えば直鎖状の完全な人工的ポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ塩基（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）の鎖を含む。配列を構築した後、次にコンピュータソフトウェアを用い、標的ポリヌクレオチドを、特定の長さの重なり合うオリゴヌクレオチドのセットに細分して解析する。
配列構築における任意の工程としては、ヘアピン、繰返しなどの望ましくない配列を生じ得る配列を同定し除去することが挙げられる。従って、面倒な領域または部分の配列を予めスクリーニングすることによって、大きな遺伝子構築の成功をかなり高めることができる。一言でいえば、アミノ酸配列を用いて、大腸菌クラスＩＩコドンを利用する合成遺伝子配列を作成する。配列の解析に先立って、多くのサブルーチンを配列に適用して、オリゴ合成の早期停止、連結もしくは合成の不良または低い効率、普通でない二次構造または異常な二次構造を引き起こし得る特殊な型の配列構成を同定する。プログラムを用いて配列を分析し、以下について同定を行う：
ＧＣ含量が７０％を超える、２５塩基対を超える全ての領域；
４塩基対までのループの発生を可能にする、７塩基対を超える「ヘアピン」ハイブリッドを形成する全ての３’末端配列または５’末端配列；
内部にヘアピンが形成され得るように５０ｂｐ間隔内で完全な逆方向繰返しを有する、８塩基対以上の全ての配列。
【０１１７】
同定の後、配列を手動で次の通り調整する。ヘアピンを除去するかまたはヘアピン中の対形成塩基の数を５個未満連続した塩基に減少させるために、コドンの３番目の塩基を変更する。
【０１１８】
可能な場合には、アミノ酸配列を不変のままにして、領域のＧＣ含量を２０塩基にわたって６５％未満にまで低下させるために、３番目の塩基コドンを変更する。
【０１１９】
可能な場合、アミノ酸配列を同一に保って、内部ハイブリッドを除去するか、マッチする塩基の数を７個未満に減少させるために、３番目の塩基を変更する。
【０１２０】
得られた合成ＤＮＡ配列は引き続き同じタンパク質をコードするが、構築にエラーをもたらし得るか、構築効率を低下させ得るか、そうでなければ遺伝子合成および構築の技術的な手順において問題を生じる配列構造を除去するために、コドン使用法は調整される。
【０１２１】
その後の標的配列の解析によって、重なり合うセットにおいて標的ポリヌクレオチドの全長が包含されるように重なり合う、より短いＤＮＡ配列のセットが得られる。
【０１２２】
代表的には、１０００塩基対の遺伝子が２０個の１００マーに細分化される。この場合、これらのうち１０個が１つの鎖を構成し、これらのうちの１０個がもう一方の鎖を構成する。これらは、各々の鎖上に２５乃至５０塩基対重なり合うように選択される。
【０１２３】
遺伝暗号の縮重により、いかなる特定のアミノ酸配列についてもコドンのかなり自由な選択が可能である。トランスジェニック生物（植物など）では、同じタンパク質をコードするが遺伝子が得られた生物のコドンとは異なり得る、特定のコドンが頻繁に優先される。例えば、Ａｄａｎｇらの米国特許第５，３８０，８３１号には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素遺伝子を発現する昆虫耐性のトランスジェニック植物の創製について記載している。昆虫毒素であるＢｔ結晶タンパク質は、トランスジェニック植物では発現が不十分である完全長の遺伝子によってコードされている。植物における発現を改善するために、天然の配列が、植物によって有利なコドンを含有するこのタンパク質をコードする合成遺伝子で置換された。この開示された発明は、Ｂｔが本来有する殺虫タンパク質と多くの場合等価である、殺虫タンパク質をコードする化学的に合成された遺伝子を含んだ。この合成遺伝子は植物において元のＢｔ遺伝子よりも高いレベルで発現するよう設計された。
【０１２４】
特定のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを設計する際、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質に、相互作用性生物学的機能を与えることにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当該分野において概して理解されている。各々のアミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて以下のように、疎水性親水性指標が割り当てられている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（４７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（４５）。
【０１２５】
特定のアミノ酸が、同様な疎水性親水性指標または疎水性親水性スコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、なお、同様な生物活性を有するタンパク質をもたらす、即ち、生物学的に機能的上等価なタンパク質を獲得することは、当該分野において公知である。このような変更を行う際、その疎水性親水性指標が±２の範囲内にあるアミノ酸間の置換が好ましく、±１の範囲内にあることが特に好ましく、±０．５の範囲内にあることがなお特に好ましい。
【０１２６】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に行われ得ることもまた、当該分野では了解されている。本明細書中に参考として援用される米国特許第４，５５４，１０１号には、隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性がそのタンパク質の生物学的特性と関連していると記載されている。
【０１２７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（４４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（４５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０１２８】
アミノ酸が、同様な親水性値を有する別のアミノ酸に代わって置換され得、なお生物学的に等価かつ免疫学的に等価なポリペプチドを獲得することが、理解されている。このような変更においては、その親水性値が±２の範囲内にあるアミノ酸間の置換が好ましく、±１の範囲内にあることが特に好ましく、±０．５の範囲内にあることがなおより特に好ましい。
【０１２９】
概略前述したように、一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に準拠している。前述のいくつかの特性を考慮にいれた典型的な置換については当業者に周知であり、そのような置換としては、アルギニンとリジン；グルタルナートとアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【０１３０】
本発明の局面は、ハードウェアまたはソフトウェア、あるいは両者の併用において実行され得る。しかしながら、好ましくは、本発明のアルゴリズムおよびプロセスは、各々が少なくとも１つのプロセッサ、少なくとも１つのデータ記憶システム（揮発性および非揮発性の記憶装置および／または記憶素子を含む）、少なくとも１つの入力装置および少なくとも１つの出力装置を含む、プログラム可能コンピュータにて実行する１つ以上のコンピュータプログラムにおいて実施される。プログラムコードを入力データに適用して、本明細書中に記載した機能を実行させ出力情報を得る。この出力情報は、既知の方法で１つ以上の出力装置に適用される。
【０１３１】
各々のプログラムは、コンピュータシステムと通信するための（マシーン、アセンブリ、高レベル手順あるいはオブジェクト指向プログラミング言語を含む）望ましいいかなるコンピュータ言語でも実行され得る。いずれにせよ、その言語は、コンパイラ型言語でもインタープリタ言語でもよい。
【０１３２】
このようなそれぞれのコンピュータプログラムは、本明細書に記載した手順を遂行するために記憶媒体または装置がコンピュータによって読み出される時にコンピュータを設定し動作させるためには、汎用プログラム可能コンピュータあるいは特殊目的用プログラム可能コンピュータにより読出し可能な記憶媒体または装置（例えば、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、テープまたは磁気ディスケット）に格納されることが好ましい。また、本発明のシステムは、コンピュータプログラムを用いて設定されたコンピュータ読出し可能な記憶媒体として実行されると考えられ得、この場合、このように設定された記憶媒体が、本明細書中に記載した機能を遂行するために特定の事前定義された方法で、コンピュータを作動させる。
【０１３３】
従って、別の実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を作成するための、コンピュータ読出し可能媒体に記憶させたコンピュータプログラムを提供する。このコンピュータプログラムは、コンピュータシステムに：１）標的ポリヌクレオチド配列に含まれる開始ポリヌクレオチド配列を同定させ；２）標的ポリヌクレオチド配列を多様に異なる部分的に相補性のオリゴヌクレオチドを解析させ；そして３）この開始ポリヌクレオチド配列の二方向伸長を部分的相補性オリゴヌクレオチドの逐次付加により制御し、連続する二本鎖ポリヌクレオチドを作成することによって、標的ポリヌクレオチド配列の構築を制御させる、ことを包含する。このコンピュータプログラムには、ポリペプチド配列に対応するオリゴヌクレオチドのセットを作成することにより標的ポリヌクレオチドの配列を解析するアルゴリズムが含まれる。このアルゴリズムは、ポリペプチド配列を利用して、指定のコドン表を使用してＤＮＡ配列を作成する。次に、このアルゴリズムは、以下の様式で、このＤＮＡ配列の（＋）鎖および（−）鎖に対応する解析されたオリゴヌクレオチドのセットを作成する：
１．指定のコドン表を用いて、アミノ酸のアレイであるタンパク質配列ＡＡ［  ］から、塩基のアレイであるＤＮＡ配列ＧＥＮＥ［  ］が作成される。大腸菌ＩＩ型コドンのコドン表の１例を以下に示す。
【０１３４】
ａ．パラメーター
ｉ．      Ｎ    アミノ酸残基単位でのタンパク質の長さ
ｉｉ．    Ｌ  ＝３Ｎ  ＤＮＡ塩基単位での遺伝子の長さ
ｉｉｉ．  Ｑ    各成分オリゴヌクレオチドの長さ
ｉｖ．    Ｘ  ＝Ｑ／２  オリゴヌクレオチド間の重なりの長さ
ｖ．      Ｗ  ＝  ３Ｎ／Ｑ  Ｆセット中のオリゴヌクレオチド数
ｖｉ．    Ｚ  ＝  ３Ｎ／Ｑ＋１  Ｒセット中のオリゴヌクレオチド数
ｖｉｉ．  Ｆ［１：Ｗ］  （＋）鎖オリゴヌクレオチドのセット
ｖｉｉｉ．  Ｒ［Ｌ：Ｚ］  （−）鎖オリゴヌクレオチドのセット
ｉｘ．    ＡＡ［１：Ｎ］  アミノ酸残基のアレイ
ｘ．      ＧＥＮＥ［１：Ｌ］  遺伝子を構成する塩基のアレイ
ｂ．アミノ酸残基のリストからなるタンパク質配列ＡＡ［  ］を獲得するかまたは設計せよ
ｃ．タンパク質配列ＡＡ［  ］からＤＮＡ配列ＧＥＮＥ［  ］を作成せよ
ｉ．      Ｉ＝１の場合、Ｎへ
ｉｉ．    コドン表からＡＡ［Ｊ］を翻訳してＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋２］を生成する
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋３
ｉｖ．    Ｊ＝Ｊ＋１
ｖ．      ｉｉへ行け
２．ＧＥＮＥ［  ］から２セットの重複オリゴヌクレオチドを作成する；Ｆ［  ］は（＋）鎖をカバーし、Ｒ［  ］は、（−）鎖をカバーする相補的な部分的に重複するセットである
ａ．オリゴのＦ［  ］セットを作成せよ
ｉ．      Ｉ＝１の場合、Ｗへ
ｉｉ．    Ｆ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｉ：Ｉ＋Ｑ−１］
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋Ｑ
ｉｖ．    ｉｉへ進め
ｂ．オリゴのＲセットを作成せよ
ｉ．      Ｊ＝Ｗ
ｉｉ．    Ｉ＝１の場合、Ｗへ
ｉｉｉ．  Ｒ［Ｉ］＝ＧＥＮＥ［Ｗ：Ｗ−Ｑ］
ｉｖ．    Ｊ＝Ｊ−Ｑ
ｖ．      ｉｉｉへ行け
ｃ．結果は、長さＱのオリゴＦ［  ］およびオリゴＲ［  ］の２セットである
ｄ．最終の２つの仕上げ（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）オリゴを作成せよ
ｉ．      Ｓ［１］＝ＧＥＮＥ［Ｑ／２：１］
ｉｉ．    Ｓ［２］＝［Ｌ−Ｑ／２：Ｌ］。
【０１３５】
所望ならば、続いて、以下のアルゴリズムによってオリゴヌクレオチドセットアセンブリを確立し得る：
２セットのオリゴヌクレオチド  Ｆ［１：Ｗ］    Ｒ［１：Ｚ］      Ｓ［１：２］
３．ステップ１
ａ．    Ｉ＝１の場合、Ｗへ
ｂ．    Ｆ［Ｉ］、Ｆ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ］をアニーリングせよ；Ｔ［Ｉ］中に入れよ
ｃ．    Ｆ［Ｉ＋２］、Ｒ［Ｉ＋１］、Ｒ［Ｉ＋２］Ｔ［Ｉ＋１］をアニーリングせよ
ｄ．    Ｉ＝Ｉ＋３
ｅ．    ｂへ行け
４．ステップ２
ａ．１つだけ反応が残るまで以下を実行せよ
ｉ．      Ｉ＝１の場合、Ｗ／３へ
ｉｉ．    Ｔ［Ｉ］、Ｔ［Ｉ＋１］を連結せよ
ｉｉｉ．  Ｉ＝Ｉ＋２
ｉｖ．    ｉｉへ行け。
【０１３６】
（コドン表（Ｅ．ｃｏｌｉクラスＩＩ優先使用法）
【０１３７】
【数１】
2005519641.tif 000002
標的ポリヌクレオチドの構築に有用な本発明のアルゴリズムは、前述したようなＰｅｒｌスクリプトとしてさらに記述され得る。アルゴリズム１は、大腸菌コドンを用いてタンパク質配列をポリヌクレオチド配列に変換する方法を提供する：
【０１３８】
【数２】
2005519641.tif 000003
次のリストは、大腸菌についてＰｅｒｌで表したクラスＩＩコドン選択を提供する。
【０１３９】
【数３】
2005519641.tif 000004
2005519641.tif 000005
アルゴリズム２は、ポリヌクレオチド配列を、標的ポリペプチドをコードする完全な標的ポリヌクレオチドへと再構築され得る順方向成分オリゴヌクレオチドおよび逆方向成分オリゴヌクレオチドに解析する方法を提供する。
【０１４０】
【数４】
2005519641.tif 000006
2005519641.tif 000007
本発明はさらに、プロセッサ、入力装置および出力装置を備えるプログラム入力したコンピュータを用い、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むデータを、このプログラム入力したコンピュータに入力装置を介して入力することによって、モデル配列から誘導した標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを合成するための、コンピュータを利用した方法を提供する。その後、標的ポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチドの配列を決定し、標的ポリヌクレオチドを合成するためのモデルを誘導する。このモデルは、標的ポリペプチドを生物系で発現するのに必要な全体的な配列パラメーターを利用して、標的ポリヌクレオチド配列中の開始配列の位置をベースにしている。この情報は、標的ポリヌクレオチドの合成および構築の手段を提供する出力装置へ出力される。
【０１４１】
ポリヌクレオチド合成に適した装置であれば全て本発明において使用され得ることが、理解される。装置、コンポーネントおよび方法の種々の非限定的例を以下に記載する。例えば、１つの実施形態では、構築用容器に合成化学物質を入れるのに最大１６バルブまでのナノディスペンシングヘッドを使用し得ることが、企図される（図４）。化学物質は、試薬レザーバーからシリンジポンプを用いて制御され得る。インクジェットディスペンシングシステムの速度と性能が原因で、合成を極めて小規模かつ迅速に行わせ得る。反応室の下には、マイクロフルイディクスにより流体を移動させるマイクロチャンネルに連結された構築用容器がある。このチャンネルの構造は、オリゴヌクレオチド対またはオリゴヌクレオチド三重鎖を、例えばロボット利用の装置を利用して系統立ててプーリングする。しかしながら、プーリングは、フルイディクスを用いて部品を動かさずに達成され得る。
【０１４２】
図５に示したように、マイクロフルイディク混合を用いて、オリゴヌクレオチド合成、プーリングとアニーリングと連結とによるオリゴヌクレオチド構築を行って、アニーリング、連結およびオリゴヌクレオチド結合のための基質として役立つ重要な三重鎖中間体の同一セットを生じ得る。ＤＮＡリガーゼと他の成分とが、機器マイクロチャンバーを通って移動する緩衝液中に入れ得る。従って、同じ機器において高度に制御された方法で、合成および構築を実施し得る。
【０１４３】
図６に示したように、プーリング用マニホールドは、通気性のないプラスチックから作ることができ、アレイで合成したオリゴヌクレオチドの逐次プーリングを制御するよう設計することができる。コンピュータで設計された遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド構文解析は、合成用にプログラム化することができる。この場合、（＋）鎖および（−）鎖をアレイのウェルに交互に入れる。このフォーマットで合成した後、重要な三重構造を形成する反応容器中に３つのウェルを系統立てプールするプーリングマニホールド中に、遺伝子の１２列の配列を誘導する。アニーリングと連結反応のための温度サイクリングを行った後、４セットの三重構造を２セットの６個のオリゴヌクレオチド生成物、次いで１セットの１２個のオリゴヌクレオチド生成物になるようにプールする。各列の合成アレイは、同様のマニホールドと対応付けられ、結果として、それぞれ１２個のオリゴヌクレオチドに相当する構築オリゴヌクレオチドの８セットの最初の構築段階が達成される。図７に示したように、マニホールドプーリングの第２段階は、この８列の構築物を単一の完全な構築物となるようプールする単一のマニホールドによって制御される。オリゴヌクレオチド成分を２箇所のマニホールド構築部（最初の８列および２番目の単一マニホールド）を通すことにより、アレイから９６個のオリゴヌクレオチド全てを含む完全な構築物が得られる。ジーンライター［ＧｅｎｅｗｒｉｒｅｒＴＭ］の構築モジュール（図８）は、合成容器の下に位置する単一のプラスチックブロックに、微細成形加工を使用して作られた７つのプーリング用マニホールドの完全なセットを含むことができる。このプーリング用マニホールドの種々の構造により９６，３８４または１５３６個のウェルアレイの、構文解析された成分オリゴヌクレオチドの構築が可能になる。
【０１４４】
この初期の構造は、重複する５０マーの４８対を含む、所定のアレイで合成された９６個のオリゴヌクレオチドの構築用に設計されている。ＤＮＡリガーゼおよび他の適当な緩衝液と化学成分の存在下、装置温度を適切に調節してこの構築装置を通すと、これらは単一の２４００塩基二本鎖遺伝子構築物に構築される（図９）。プーリング装置の基本設計は、表面にマイクログルーブまたはマイクロフルイディクチャンネルがエッチングされ、チャンネルの接合部の下にペチェ回路のような温度調節エレメントがあるプレクシグラス［ＰｌｅｘｉｇｌａｓＴＭ］または他の種類の共重合体で作製され得る。これにより、１）２つの流れを混合し、２）温度維持を制御するか、または接合部位でサイクリングし、そして、３）連結反応を行った混合物を出口チャンネルから次のセットのプーリングおよび連結反応室へ送り出すための、２つのチャンネルの結合部に微量反応容器が形成される。
【０１４５】
図１１に示したように、構築プラットホームの設計は、マイクロディスペンシングの１６のチャンネルでアドレスされた、９６ウェル構造の８枚の合成マイクロウェルプレートを含むことができる。各プレートの下には、１）合成成分を除去するための排出マニホールド、および２）各９６ウェルアレイからの成分オリゴヌクレオチドを構築するための、図９の図式に基づいた構築マニホールドがある。図１２は１５３６ウェルマイクロプレートを用い、プレート当たり１５３６個の成分オリゴヌクレオチドを合成できる高容量構築フォーマットを示したものである。各プレートの下には、１）合成成分を除去するための排出マニホールド、および２）各１５３６ウェルアレイからの１５３６個の成分オリゴヌクレオチドを構築するための構築マニホールドがある。プーリング方法および構築方法は、９６ウェルプレートに用いられた概念を基礎にすることができる。
【０１４６】
代替的な構築フォーマットとしては、ＣＰＧガラスビーズ上の溶液合成ではなく表面結合オリゴヌクレオチド合成の利用が挙げられる（図１３）。この構造では、オリゴヌクレオチドは、固体支持体への結合を可能にする炭化水素リンカーを用いて合成される。成分配列の構文解析および合成の後、合成されたオリゴヌクレオチドは、安定化剤が結合され、２つの連結反応基質が上にある液に添加されるように、固体支持体に共有結合される。連結反応は溶液中でＤＮＡリガーゼによって媒介される場合に起こり、温度をＴｍより高く上げると熱融解によって結合したオリゴヌクレオチドが除かれる。図１４に示したように、構文解析された成分オリゴヌクレオチドのセットの固体支持体上における系統立てた構築は、安定化剤オリゴヌクレオチドのセットを結合したアレイにおいて配置することができる。連結反応の基質オリゴヌクレオチドセットを液中に入れ、逐次的アニーリング、連結反応、および成長するＤＮＡ分子を膜表面で移動させる融解によって、系統立った構築を固相で行う。
【０１４７】
図１５は、さらに代替的なオリゴヌクレオチド構築手段として、成分オリゴヌクレオチドをマイクロ電子チップ上の金属電極のセットに結合させることによる手段を示したものである。この場合、各電極は、電流と電圧に関して独立に制御される。アレイは、マイナス鎖オリゴヌクレオチドのセットを含む。電極を正電荷に変化させると、電気泳動によって成分リガーゼ基質オリゴヌクレオチドが表面上を移動し、アニーリングが起こる。ＤＮＡリガーゼの存在によって、成分間の共有結合あるいは連結反応が媒介される。次に、電極をオフにするか負の電荷を加えるとＤＮＡ分子は電極から除かれる。構文解析されたセットからの次の安定化剤オリゴヌクレオチドを含む次のアレイエレメントを正の電荷によりオンにすると、セット中の次のオリゴヌクレオチドとの２番目のアニーリング、結合および連結反応が行われる。電圧制御、アニーリング、連結反応および変性を系統立てて繰り返し適用すれば、成長した新生の鎖の表面上の移動、および成分の完全なＤＮＡ分子への構築が行われる。
【０１４８】
さらに、本発明は、標的ポリヌクレオチドの自動化合成方法を提供する。例えば、所望の配列について、そのような配列を注文したいユーザーに利用可能な任意の伝達手段により注文を受けることができる。本明細書中で使用される場合、「ユーザー」とは、所望のポリヌクレオチド配列をサーバーに伝達することができるあらゆる実体のことである。この配列についての伝達は、ユーザーが利用可能で、サーバーが受信可能な任意の伝達手段によってなされるものとする。ユーザーに対しては、ユーザーが合成中のポリヌクレオチドについての合成に関する情報を得ることができるように特別な指定を与えることができる。一旦得られると、伝達された標的ポリヌクレオチド配列は、本発明において示した任意の方法によってこの配列を合成することができる。
【０１４９】
さらに、本発明は、ユーザーに対し、モデルポリヌクレオチド配列を伝達する機構を与え、そして必要に応じて、このモデル配列に対する少なくとも１箇所の所望の修飾を伝達する機会を与えることによる、ポリヌクレオチドの自動化合成方法を提供する。本発明では、モデル配列、およびこのモデル配列の改変をもたらすこの配列に対する所望の修飾を提供するユーザーを想定している。ユーザーは、標的ポリヌクレオチドまたはコードされたポリペプチドの発現、機能あるいは活性を改変するいかなる修飾についても、修飾ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドが本発明の方法に従って合成または発現されるように伝達することができる。例えば、普通真核生物系で発現されるポリペプチドをコードするモデルポリヌクレオチドについては、得られる標的ポリヌクレオチドのコドンを原核生物系でこのポリペプチドを発現することができるように改変することができる。加えて、ユーザーは、モデルポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドについて所望の改変活性を指示することができる。一旦提供されると、本発明のアルゴリズムおよび方法を用いて、所望の改変活性を有すると考えられる標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチドを合成することができる。さらに、本発明の方法は、標的ポリペプチドを発現し、所望の活性についてスクリーニングするために利用することができる。本発明の方法は、合成の展開手段を提供し、これによって、ポリヌクレオチド発現および／またはポリペプチド活性についてのいかなるパラメーターも所望通りに改変することができると理解される。
【０１５０】
一旦、ユーザーからモデル配列および所望の改変について伝達されれば、そのモデルポリヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むデータをプログラム入力されたコンピュータに入力装置を介して入力することができる。一旦入力されれば、本発明のアルゴリズムを用いて、所望の修飾を含み、その修飾を含む標的ポリヌクレオチドをもたらすモデルポリヌクレオチド配列の配列を決定する。その後、本発明のプロセッサおよびアルゴリズムを用いて、このポリヌクレオチド配列中に存在する少なくとも１つの開始ポリヌクレオチド配列を同定する。標的ポリヌクレオチド（即ち、修飾されたモデルポリヌクレオチド）を同定し、合成する。
【実施例】
【０１５１】
（核酸合成設計プロトコール）
標的ポリペプチドをコードする合成核酸配列を構築する目的のために、モデルポリペプチド配列または核酸配列を入手し、例えば、マクベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）あるいはＤＮＡスター（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ）のような適当なＤＮＡ解析パッケージを用いて解析する。例えば、標的タンパク質が細菌系において発現される場合、モデル配列をＥ．ｃｏｌｉによって選択されるコドン（即ち、タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩコドン選択）を利用して、ポリヌクレオチドをコードする配列に変換することができる。本発明は、変換プログラム（コドンＩ、コドンＩＩあるいはコドンＩＩＩ）を提供する。しかしながら、本発明の核酸配列は、いかなる原核生物あるいは真核生物のいかなるコドン選択にも対応するよう設計することができる。
【０１５２】
上記のコドン選択に加えて、特定のプロモーター、エンハンサー、複製あるいは薬物耐性配列を本発明の合成核酸配列を含むことができる。その構造の長さは、パディングによって、約２５〜１００ｂｐ合成をベースとして端数をまるめた数の塩基を与えることによって、調整することができる。長さが約２５〜１００ｂｐの配列の合成物は、アレイシンセサイザシステムを用いて作製および構築することができ、さらに精製することなく使用することができる。例えば、１００マーを含む２枚の９６ウェルプレートにより標的配列の９６００ｂｐの構造が得られる。
【０１５３】
標的配列の構築に必要なオリゴヌクレオチドを設計した後、核酸配列の構築を最適化する自社開発のコンピュータプログラム、パースオリゴ［ＰａｒｓｅＯｌｉｇｏ（登録商標）］を用いて、このオリゴヌクレオチドを構文解析する。必要に応じて実施する配列構築の工程としては、ヘアピン、繰返し体あるいは他の異なる配列を生じ得る配列を同定し除去することが挙げられる。この構文解析したオリゴヌクレオチドのリストをシンセサイザドライバソフトウェアへ転送する。個々のオリゴヌクレオチドをウェル中にペーストし、オリゴヌクレオチド合成を完遂する。
【０１５４】
パースオリゴ［ＰａｒｓｅＯｌｉｇｏ（登録商標）］プログラムがファイルからＤＮＡ配列を読み込み、合成遺伝子構築のため、これを２セットのオリゴヌクレオチド（順方向１セット、逆方向１セット）に構文解析する。
【０１５５】
入力ファイルフォーマットは次の通りである。
【０１５６】
【数５】
2005519641.tif 000008
2005519641.tif 000009
2005519641.tif 000010
2005519641.tif 000011
（２段階ＰＣＲ反応を使用した、構文解析されたオリゴヌクレオチドの構築）
約２５塩基対（ｂｐ）の重なりを有する、各５０塩基の、構文解析した重なり合うオリゴヌクレオチドのアレイセットを入手する。オリゴヌクレオチドの濃度は２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍＬ）である。５０塩基オリゴは、７５〜８５℃、６〜１０  ｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇのＴｍｓを与える。２５０ｎＭ／ｍｌとなるよう５０〜１００μｌのＨ２Ｏに懸濁する。等量の各オリゴヌクレオチドを混合して最終濃度を２５０μＭ（２５０ｎＭ／ｍｌ）とする。各々の１μｌを加えて１９２μｌとなるようにする。８μｌのｄＨ２Ｏを加えて計２００μｌとする。最終濃度は混合オリゴ２５０μＭである。１０μｌの混合オリゴを取り２５０倍希釈とし、１ｍｌの水に加え、（１／１００；２．５ｍＭ）、次に、この１μｌを取って２４μｌの１×ＰＣＲ混合物に加える。このＰＣＲ反応液は以下のものを含む：
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
この反応液に１ＵのＴａｑＩポリメラーゼを添加する。反応液を次の条件下で温度サイクリングする。
【０１５７】
ａ．          アセンブリ
ｉ．        以下の５５サイクル
１．        ９４度３０秒
２．        ５２度３０秒
３．        ７２度３０秒
構築増幅の後、この構築混合物の２．５μｌを取り、ＰＣＲ混合物１００μｌに加える。（４０×希釈）。別途２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ  −  ．２５０ｎｍｏｌｅ／μｌ）の濃度で１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を取ることによりプライマーを調製し、１００μｌのＰＣＲ反応液に加える。これにより、最終濃度は各オリゴ当たり２．５μＭとなる。１ＵのＴａｑＩポリメラーゼを添加して次の条件下で温度サイクリングする：
３５サイクル（または元のプロトコールの２３サイクル）
９４度      ３０秒
５０度      ３０秒
７２度      ６０秒
フェノール／クロロホルムで抽出する。エタノール沈殿を行う。１０μｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁し、アガロースゲルで分析する。
【０１５８】
（Ｔａｑ１連結反応を使用した、構文解析されたオリゴヌクレオチドの構築）
約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重なりを有する、長さがそれぞれ約２５〜１５０塩基の、構文解析した重なり合うオリゴヌクレオチドのアレイセットを入手する。オリゴヌクレオチドの濃度は２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍＬ）である。例えば、５０塩基オリゴは、７５〜８５℃、６〜１０ｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇのＴｍｓを与える。２５０ｎＭ／ｍｌとなるよう５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏに懸濁する。
【０１５９】
ロボット利用ワークステーションを用いて、等量の順方向オリゴおよび逆方向オリゴがペアで混合される。順方向オリゴ１０μｌおよび逆方向オリゴ１０μｌを取り、新しい９６ウェルのＶ底プレート中で混合する。表１のプーリングスキームのステップ１に従い、２５０μＭの二重鎖オリゴヌクレオチドのセットを有する１つのアレイが得られる。各オリゴマー対２μｌを取り、各ウェルに連結反応混合物液１００μｌを含む新鮮プレートに加えることにより構築プレートを調製する。これによって２．５μＭ、即ち２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度が得られる。各ウェルの２０μｌを新鮮マイクロウェルプレートに移し、各ウェルにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌおよび１ｍＭ  ＡＴＰ  １μｌを加える。各反応液にはオリゴヌクレオチド５０ｐｍｏｌｅおよびＡＴＰ  １ｎｍｏｌｅ存在することになる。３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１６０】
表１のステップ２〜７に従って構築を開始する。連続する各ウェルを次のウェルと混合してプーリングステップ２を実施する。Ｔａｑ１リガーゼ１μｌを混合した各ウェルに加える。１回サイクリングを９４度で３０秒間、５２度で３０秒間、次いで７２度で１０分間行う。
【０１６１】
プーリングスキームのステップ３（表１）を実施し、上記温度スキームに従ってサイクリングを行う。プーリングスキームのステップ４および５を実施し、上記温度スキームに従ってサイクリングを行う。プーリングスキームのステップ６を実施し、各混合液１０μｌを取り新鮮マイクロウェルに入れる。残る３つのウェルをプーリングすることによりステップ７のプーリングスキームを実施する。反応容量は以下の通りとなる：
最初のプレートにはウェル当たり２０μｌ入っている。
【０１６２】
ステップ２  ２０μｌ  ＋  ２０μｌ  ＝  ４０μｌ
ステップ３            ８０μｌ
ステップ４            １６０μｌ
ステップ５            ２３０μｌ
ステップ６    １０μｌ  ＋  １０μｌ  ＝  ２０μｌ
ステップ７    ２０  ＋  ２０  ＋  ２０  ＝  ６０μｌ  最終反応容量
次に、最終連結反応混合物液を２μｌ取り、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＣＲ混合物液２０μｌに加えることによって最終のＰＣＲ増幅が行われる。
【０１６３】
別途、２５０μＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ  −  ．２５０ｎｍｏｌｅ／μｌ）の濃度で１μｌのＦ１（順方向プライマー）および１μｌのＲ９６（逆方向プライマー）を取ることによりプライマーを調製し、１００μｌのＰＣＲ反応液に加えて各オリゴの最終濃度を２．５μＭとする。１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを添加して次の条件下で３５サイクルをサイクリングする：９４度３０秒間、５０度３０秒間、および７２度６０秒間。フェノール／クロロホルムで抽出する。エタノール沈殿を行う。１０μｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁し、アガロースゲルで分析する。
【０１６４】
【表１】
2005519641.tif 000012
2005519641.tif 000013
（ＴａｑＩ合成および構築を使用した、構文解析したオリゴヌクレオチドの構築）
約１２〜７５塩基対（ｂｐ）の重なりを有する、長さがそれぞれ約２５〜１５０塩基の、構文解析した重なり合うオリゴヌクレオチドのアレイセットを入手する。オリゴヌクレオチドの濃度は２５０ｎＭ（２５０μＭ／ｍＬ）である。５０塩基オリゴは、７５〜８５℃、６〜１０ｏｄ２６０、１１〜１５ナノモル、１５０〜３００μｇのＴｍｓを与える。２５０ｎＭ／ｍｌとなるよう５０〜１００ｍｌのＨ２Ｏに懸濁する。
【０１６５】
本発明は、核酸構築を完遂するためにロボット利用のワークステーションを使用することを想定している。本実施例では、ＰＣＲ混合物液中に２．５ｍＭの濃度で順方向および逆方向オリゴヌクレオチドを含む２枚のワーキングプレートが調製され、新鮮マイクロウェル中のＰＣＲ混合物液１００μｌに各オリゴ１μｌが加えられて１枚のプレートの順方向オリゴおよび１枚の逆方向オリゴがアレイで得られる。次に、表１に概略を示したプーリングスキームに従って、以下の通り、サイクリング構築が開始される。本実施例では、このスキームに従って、９６サイクルの構築を完遂することができる。
【０１６６】
２μｌのウェルＦ−Ｅ１を新鮮ウェルへ移し；２μｌのＲ−Ｅ１を新鮮ウェルへ移し；１８μｌの１×ＰＣＲ混合物液を加え；１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼを加える；
１回サイクル：        ９４度３０秒
５２度３０秒
７２度３０秒
その後、２μｌのウェルＦ−Ｅ２を反応容器へ移し；２μｌのウェルＲ−Ｄ１２を反応容器へ移す。上記温度に従って１回サイクリングする。表１に概略を示したスキームに従ってプーリングとサイクリングを約９６サイクル繰り返す。
【０１６７】
次に、最終反応混合物液を２μｌ取り、これを以下のものを含むＰＣＲ混合物液２０μｌに加えることによってＰＣＲ増幅が行われる：
１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
別途、２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ〜０．２５０ｎｍｏｌｅ／μｌ）の濃度で１μｌのＦ１および１ｍｌのＲ９６を取ることによってプライマーが調製され、これが１００μｌの反応液に加えられる。これにより、各オリゴの最終濃度２．５μＭが得られる。次に、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼが加えられ、この反応が約２３〜３５サイクル、以下の条件下でサイクリングされる：
９４度      ３０秒
５０度      ３０秒
７２度      ６０秒
その後、この反応液はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈殿が行われ、１０ｍｌのｄＨ２Ｏ中に懸濁されてアガロースゲルで分析される。
【０１６８】
順方向オリゴ１０μｌおよび逆方向オリゴ１０μｌを取って、等量の順方向および逆方向オリゴをペアで加え、新しい９６ウェルＶ底プレート中で混合する、これにより、表１のプーリングスキームステップ１に従って、２５０ｍＭの二重鎖オリゴヌクレオチドのセットを有する１アレイが得られる。各オリゴマー対の２μｌを取り、これらを各ウェルに１００μｌの連結反応混合液を含むプレートに加えることによって構築プレートを調製した。これにより、２．５μＭ、即ち２．５ｎＭ／ｍｌの有効濃度が得られる。各ウェルの約２０μｌが、１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰに加えて、新鮮なマイクロウェルプレートへ移される。各反応液には５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドおよび１ｎｍｏｌのＡＴＰが存在することになる。３７度で３０分間インキュベートする。核酸の構築が表１のステップ２乃至７に従って開始した。各ウェルを連続的に次のウェルと混合することによってステップ２のプーリングが実施される。各混合ウェルに１μｌのＴａｑ１リガーゼが加えられ、次の通り、１回サイクリングが行われる：
９４度３０秒
５２度３０秒
７２度１０分
プーリングスキームのステップ３が実施され、上記の温度スキームに従ってサイクリングが行われる。プーリングスキームのステップ４および５が実施され、上記の温度スキームに従ってサイクリングが行われる。プーリングスキームステップ６を実施し、各混合液を１０μｌ取って新鮮マイクロウェルへ入れる。残る３つのウェルをプーリングすることによってステップ７のプーリングスキームが実施される。反応容量は次の通りとなる（最初のプレートには１ウェルあたり２０μｌ入っている）：
ステップ２    ２０μｌ  ＋  ２０μｌ  ＝  ４０μｌ
ステップ３    ８０μｌ
ステップ４    １６０μｌ
ステップ５    ２３０μｌ
ステップ６    １０μｌ  ＋  １０μｌ  ＝  ２０μｍｌ
ステップ７    ２０  ＋  ２０  ＋  ２０  ＝  ６０μｌ  最終反応容量
最終のＰＣＲ増幅は、最終連結反応混合液２μｌを取って、これを次のものを含むＰＣＲ混合液２０μｌに加えることによって実施される：
１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０
２．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
別途、２５０ｍＭ（２５０ｎｍ／ｍｌ−０．２５０ｎｍｏｌ／μｌ）の濃度で１μｌのＦ１および１μｌのＲ９６を取り、１００μｌのＰＣＲ反応液に加えて各オリゴの最終濃度を２．５μＭとすることにより、プライマーが調製される。次に、１ＵのＴａｑ１ポリメラーゼが加えられ、約２３乃至３５サイクル、以下の条件下でサイクリングされる：
９４度      ３０秒
５０度      ３０秒
７２度      ６０秒
生成物はフェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈殿が行われ、１０μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁されてアガロースゲルで分析される。
【０１６９】
【表２】
2005519641.tif 000014
2005519641.tif 000015
【０１７０】
【表３】
2005519641.tif 000016
2005519641.tif 000017
2005519641.tif 000018
2005519641.tif 000019
2005519641.tif 000020
（核酸分子の構築）
表４に示した核酸分子は、本明細書に記載した方法を用いて作製した。また、各々の核酸分子の特徴および特性は表４に記載している。
【０１７１】
表４に記載したように、長さ４８００ｂｐの合成プラスミドを構築した。このプラスミドは１９２オリゴヌクレオチド（９６個の重複する５０マーの２セット；２５ｂｐの重複）を含む。このプラスミドは、本質的にはアンピシリン耐性の代わりにカナマイシン耐性を有するｐＵＣである。また、この合成プラスミドは、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｈｅｒｉ）細菌のルシフェラーゼ遺伝子からのルクスＡおよびＢ遺伝子を含有している。ＳｙｎＰｕｃ１９プラスミドは、長さが２７００ｂｐであり、丁度２７００ｂｐまで短くなっただけのｐＵＣ１９と本質的に同じ配列を含む。９６個の５０マーの２セットを用いて、Ｓｙｎｌｕｘ４  ｐＵＣ  プラスミドを構築し、これを短縮し、ルクスＡ遺伝子を加えた。このプラスミドを構築するために２７個のオリゴヌクレオチドの２セットを含む５４個の１００マーオリゴヌクレオチドを用いた。２４００  ｂｐを含むｍｉｎｉＱＥ１０プラスミドを、４８個の５０マーオリゴヌクレオチドを用いて構築した。ｍｉｎｉＱＥ１０は、高レベルのポリペプチド発現のために６Ｘ  Ｈｉｓタグおよび細菌プロモーターを含有する発現プラスミドである。ｍｉｎｉＱＥ１０は、本発明のＴａｑ１ポリメラーゼ増幅方法を用いて構築・合成した。ｍｉｃｒｏＱＥプラスミドは、アンピシリン遺伝子、複製起点およびｐＱＥプラスミドのリンカーのみを含有する極めて小さなプラスミドである。ｍｉｃｒｏＱＥは２４個の５０マーとの組み合わせ連結反応（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によっても、あるいは１チューブＰＣＲ増幅を用いても構築できた。ＳｙｎＦｉｂ１、ＳｙｎＦｉｂＢおよびＳｙｎＦｉｂＧの核酸配列は、原核生物発現系における発現を適正化するＥ．ｃｏｌｉコドンを用いて作った合成ヒトフィブリノーゲンである。
【０１７２】
【表４】
2005519641.tif 000021
本発明についてその詳細な記述と併せて記載したが、前述の記載は例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、その範囲は添付した「特許請求の範囲」の範囲によって決定されることが理解されるべきである。他の局面、利点および変形は添付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
種々の図中の同じ参照符号は同様な要素を表す。
【図１】図１はＦ（即ち、「順方向」あるいは「プラス鎖」）オリゴヌクレオチド合成用、Ｒ（即ち、「逆方向」あるいは「マイナス鎖」）オリゴヌクレオチド合成用の９６穴ウェルプレート、およびＦとＴオリゴヌクレオチドのアニーリング用Ｔ（即ち、「温度」）プレートを示す。
【図２】図２は、ＦオリゴヌクレオチドとＲオリゴヌクレオチドをアニーリングして連続したポリヌクレオチドを形成するオリゴヌクレオチド・プーリング計画を示す。
【図３】図３は、遺伝子、ゲノム、遺伝子セットあるいはポリペプチド配列を規定する標的ポリヌクレオチド配列の構築の概略を示す。配列はコンピュータによって設計され、標的ポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列の＋および−鎖をカバーする構文解析されたオリゴヌクレオチド断片のセットを作成するのに用いられる。
【図４】図４はポリヌクレオチド合成モジュールの概略図を示す。複数のバルブを有するナノディスペンシングヘッドは構築容器中に合成用化学物質を入れる。試薬リザーバーからの化学物質の分配は、シリンジポンプを用いて制御される。反応室の下には、マイクロフルイディクスによって液体を移動させるマイクロチャンネルに連結した構築セットがある。
【図５】図５は、マイクロフルイディク・ミキシングを用いて、オリゴヌクレオチド合成、プーリングとアニーリングによるオリゴヌクレオチド構築および連結反応を完遂することができることを示す。
【図６】図６はアレイで合成されたオリゴヌクレオチドの連続プーリングを示す。
【図７】図７は、アレイからの全てのオリゴヌクレオチドの完全な構築をもたらすマニホールド・アセンブリによるオリゴヌクレオチド成分のプーリング段階を示す。
【図８】図８は、単一装置の微細加工により作られた一式のプーリングマニホールドを含む構築モジュールの例を示す。プーリングマニホールドの種々の構造により多数のウェルアレイの構文解析された成分オリゴヌクレオチドの構築が可能になる。
【図９】図９は所定のアレイで合成されたオリゴヌクレオチドの構築の設定を示す。ＤＮＡリガーゼおよび他の適当な緩衝液ならびに化学成分の存在下にこの構築装置を通すと、二本鎖ポリヌクレオチド構築が促進される。
【図１０】図１０はプーリング装置の設計例を示す。マイクログルーブまたはマイクロフルイディクチャンネルがこのプーリング装置の表面にエッチングされる。この装置には、１）２つの流れを一つにし、２）結合部位の温度維持またはサイクリングを制御し、３）次のセットのプーリング・連結反応室への出口チャンネルから連結反応を行った混合液を排出するための、２つのチャンネルの結合部に微量反応容器が備えられる。
【図１１】図１１はマイクロディスペンシング用の複数のチャンネルでアドレスされたマイクロウェルプレートを含むポリヌクレオチド合成プラットホームの設計を示す。
【図１２】図１２は、プレート当たり１５３６個の成分オリゴヌクレオチドより多く合成できる高密度マイクロウェルマイクロプレートを使用する高容量ポリヌクレオチド合成プラットホームの一例を示す。
【図１３】図１３は溶液合成ではなく表面結合オリゴヌクレオチド合成によるポリヌクレオチド構築フォーマットを示す。この設定では、オリゴヌクレオチドは支持固体への結合を可能にするリンカーを用いて合成される。
【図１４】図１４は支持固体における系統立てたポリヌクレオチド構築の図式を示す。１セットの構文解析された成分オリゴヌクレオチドが安定剤オリゴヌクレオチドを結合させたアレイに配列されている。１セットの連結反応基質オリゴヌクレオチドが溶液中に入れられ、固相における逐次アニーリング、連結反応および融解によって系統的な構築が行われる。
【図１５】図１５は、マイクロ電子チップ上の一組の金属電極に結合させた成分オリゴヌクレオチドを用いるポリヌクレオチド構築を示す。各電極は電流と電圧に関して別々に制御することができる。
【図１６】図１６は本発明のプライマー伸長構築方法を一般的に示す。
【図１７】図１７は本発明の系統図を示す。
【図１８】図１８は本発明の装置の斜視図を示す。
【図１９−１】図１９は自己構築オリゴヌクレオチドアレイの作製を表すフローチャートを示す。
【図１９−２】図１９は自己構築オリゴヌクレオチドアレイの作製を表すフローチャートを示す。
【図１９−３】図１９は自己構築オリゴヌクレオチドアレイの作製を表すフローチャートを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【国際調査報告】
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