(57)【要約】  マクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥおよびマイクロアレイのような遺伝子発現分析システムで使用するための汎用コントロール体を作成する方法。当該コントロール体は、ＤＮＡのニアランダム配列、またはゲノムの遺伝子間領域もしくはイントロン領域の何れかから作成する。２３種の特定のコントロール体配列も開示する。ネガティブコントロール、ポジティブコントロールなど、および遺伝子発現分析システムのキャリブレーターなどを含む、これらのコントロール体を用いた方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現分析システムに使用するためのコントロール体であって、
(a)(i)配列番号１−２３、
(ii)(i)に開示の配列の同義性変異体、および
(iii)(i)および(ii)に開示の配列の相補体
からなる群から選択される少なくとも１つの既知量のＤＮＡ、または
(b)(i)配列番号２４−４６、
(ii)(i)に開示の配列の同義性変異体、
(iii)(i)および(ii)に開示の配列の相補体
からなる群から転写される少なくとも１つの既知量のｍＲＮＡ
を含む当該コントロール体。
【請求項２】
遺伝子発現分析システムでネガティブコントロール体としてコントロール体を使用する方法であって、
請求項１の既知量のコントロール体ＤＮＡを、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、相補性標識化ｍＲＮＡの非存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、
シグナルの非存在または存在についてコントロール体サンプルを試験すること、
を含む当該方法。
【請求項３】
遺伝子発現分析システムでコントロール体を使用する方法であって、
請求項１の既知量のコントロール体ＤＮＡを、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１の既知量の標識化相補性ｍＲＮＡの存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、
標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および当該測定したシグナル値に基づきＤＮＡの発現レベルを測定すること、
を含む当該方法。
【請求項４】
遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとしてコントロール体を使用する方法であって、
請求項１の既知量の数種のＤＮＡを含む既知量のコントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１の既知量の対応相補性標識化ｍＲＮＡ(各ｍＲＮＡは複数濃度である)を含む当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、
標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびシグナル値と各ｍＲＮＡ濃度の間の関係に基づき用量応答性または校正曲線を作成すること、
を含む当該方法。
【請求項５】
二色遺伝子発現分析システムにおける遺伝子発現比のキャリブレーターとしてコントロール体を用いる方法であって、
請求項１の既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、
当該サンプルを、請求項１の既知量の二種標識化対応相補性標識化ｍＲＮＡを含む(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対応)当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、
二種の標識化ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、二種以上の標識化ｍＲＮＡの濃度の比と比較すること
を含む当該方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００１年５月７日出願の米国仮特許出願番号６０／２８９，２０２、および２００１年８月１５日出願の６０／３１２，４２０に基づき優先権を主張する、２００２年５月７日出願の米国特許出願番号１０／１４０，５４５の一部継続出願である。この出願はまた、２００１年１０月２４日出願の米国仮特許出願番号６０／３３５，１１５、および２００２年６月２５日出願の６０／３９１，３６７に基づく優先権を主張する。それらの開示は、引用によりすべて本明細書に含める。
【０００２】
コンパクトディスクで提出した配列表の参照
本出願は、一枚のＣＤ−Ｒディスク(同一のものを２枚提供した)にファイルされている配列表を含んでおり、ディスクにはファイル名pto_PB0181.txtの１ファイル、５６キロバイト、最終更新２００２年１０月２１日、２００２年１０月２１日記録、が保存されている。当該ディスクのファイルに含まれる配列表は、引用により本明細書にすべて含める。
【０００３】
背景技術
１．技術分野
本発明は、遺伝子発現分析システムで汎用コントロール体として人工遺伝子を使用する方法に関する。より好ましくは、本発明は、マクロアレイ、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＳＡＧＥおよびマイクロアレイのような遺伝子発現分析システム、例えば、Microarray ScoreCard systemに提供されるようなもので使用するための汎用コントロール体を作成する方法に関する。
【０００４】
２．関連技術
遺伝子発現プロファイリングは、細胞性の機能および増殖を支配する分子機構をより理解するために使用される重要な生物学的アプローチである。マイクロアレイ分析は、種々の条件下でのそれぞれの遺伝子の相対的発現レベルの測定に適用され得る１つのツールである。マイクロアレイ測定はしばしば、全体的にバイアスがかかっているように思われるが、このバイアスに関連するファクターは多く、定かでない(Bowtell, D.L., Nature Genetics 21, 25-32 (1999); Brown, P.P. and Botstein, D., Nature Genetics 21, 33-37 (1999))。他では、マイクロアレイ実験においてコントロール体として既知濃度の精製ｍＲＮＡの"スパイク"(spikes)を使用することを推奨されている。アフィメトリクス(Affymetrix)は、GeneChip製品による使用のため数種類のものを含む。当分野の現状では、これらの選択遺伝子は、非常に遠縁の関連生物から選択した実際の遺伝子である。例えば、ヒトチップ(ヒトｍＲＮＡでの使用のために設計)は、細菌性および植物性の源由来のコントロール遺伝子を含む。
【０００５】
従来のそれぞれのコントロール体は、幾つかの源由来のＤＮＡの転写配列からなるものである。結果として、当該源については、それらのコントロール体を用いてハイブリダイゼーション実験をすることができない。それは、当該源に対し当該コントロール体が独自にハイブリダイゼーションするためである。更に、種々の実験で一貫し、種々の種で一貫した汎用の参照物がないことから、科学者が研究室間、ユーザー間または時間を隔てて、データを比較することが非常に困難である。そのため、必要なものは、実験の対象となり得るいずれの源のＤＮＡともハイブリダイズしない汎用コントロール体群である。より望ましくは、いずれの既知の源ともハイブリダイズしない、遺伝子発現分析用の汎用コントロール体が必要とされる。
【０００６】
本発明の要約
従って、本発明は、任意の種用に設計した遺伝子発現分析システムで有用であり、コントロール体ＤＮＡ自体以外の源由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしないことを確認し得る、汎用コントロール体を作成する方法を提供する。
【０００７】
第一の態様では、本発明は、遺伝子発現分析システムに使用するための少なくとも１つの汎用コントロール体を作成する方法に関する。当該方法は、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域(好ましくは、遺伝子間領域、またはイントロン領域)を選択すること、当該少なくとも１つの非転写領域用のプライマー対を設計すること、およびゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域を増幅し、対応する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いで、ベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得、そして当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することを含む。
【０００８】
第二の態様では、本発明は、遺伝子発現分析システムに使用するための少なくとも１つの汎用コントロール体を作成する方法に関する。ここで、当該少なくとも１つの非転写領域を試験し、ゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域以外の源由来のｍＲＮＡとはハイブリダイズしないことを確認する。
【０００９】
第三の態様では、本発明は、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を測定すること、および選択された濃度および比で当該ＤＮＡまたは当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することを更に含む当該方法に関する。
【００１０】
本発明の他の態様は、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した既知量の少なくとも１つのＤＮＡを含むか、または既知配列のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成したＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む、遺伝子発現分析システムで使用するための汎用コントロール体である。本発明は、所望により、当該ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成すること、および当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することを含み得、それらは、所望により、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製すること、その濃度を測定すること、および選択した濃度および比の当該ＤＮＡまたは当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することにより行う。
【００１１】
本発明の他の態様は、既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した既知量の少なくとも１つのＤＮＡ配列、または既知配列由来のゲノムＤＮＡの少なくとも１つの非転写領域から作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡが含まれている、遺伝子発現分析システムで使用するための汎用コントロール体であって、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡはゲノムＤＮＡの当該少なくとも１つの非転写領域以外の源由来のいずれのＤＮＡまたはｍＲＮＡともハイブリダイズしない、上記コントロール体である。
【００１２】
本発明は、遺伝子発現分析システムでネガティブコントロール体として当該汎用コントロール体を使用する方法に関し、それは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識化ｍＲＮＡの非存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、およびシグナルの非存在または存在についてコントロール体サンプルを試験することにより行う。
【００１３】
更に、当該コントロール体を遺伝子発現分析システムで使用し得、それは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、既知量の標識化相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および当該標識化ｍＲＮＡの当該シグナル値に基づき当該遺伝子転写物の発現レベルを測定することにより行う。
【００１４】
更に、当該コントロール体を遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして使用し得、それは、既知量の数種のＤＮＡ配列を含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、既知量の対応相補性標識化ｍＲＮＡ(各ｍＲＮＡは複数濃度である)を含む当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびシグナル値と各ｍＲＮＡ濃度の間の関係に基づき用量応答性または校正曲線を作成することにより行う。
【００１５】
また、本発明は、二色遺伝子発現分析システムにおける遺伝子発現比のキャリブレーターとして当該コントロール体を用いる方法に関し、それは、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、既知量の二種標識化対応相補性標識化ｍＲＮＡを含む(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対応)当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および二種の標識化ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、二種以上の標識化ｍＲＮＡの濃度の比と比較することにより行う。
【００１６】
本発明の更なる実施態様は、任意の種用に設計された遺伝子発現分析システムに有用であり、当該コントロール体が作成される合成ＤＮＡ配列以外の源由来のｍＲＮＡとはハイブリダイズしないことを確認する試験をし得る、コントロール体を作成する方法である。
【００１７】
１以上のコントロール体は、非転写ＤＮＡのニアランダム配列を合成すること、当該少なくとも１つのニアランダム配列のためのプライマー対を設計すること、および当該非転写ＤＮＡを増幅し、対応する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いで、ベクターを用い当該二本鎖ＤＮＡをクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および当該二本鎖ＤＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することを含む方法により作成され得る。
【００１８】
非転写合成ＤＮＡの配列を試験し、非転写ＤＮＡの当該配列以外の源由来のｍＲＮＡとはハイブリダイズしないことを確認する遺伝子発現分析システムで使用するための少なくとも１つのコントロール体を、当該方法をまた使用することにより、作成し得る。
【００１９】
更に、当該合成ＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを作成し得、当該ｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を作成するように調製し得る。
【００２０】
その後、ＤＮＡおよびｍＲＮＡを精製し、その濃度を測定し、そして選択した濃度および比の当該ＤＮＡおよび当該ｍＲＮＡを含む１以上のコントロール体を調製し得る。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、遺伝子発現分析システムで使用するためのコントロール体であり、それは、ＤＮＡのニアランダム配列を合成すること、当該合成ＤＮＡ用のプライマー対を設計すること、および当該ＤＮＡを増幅し、対応する二本鎖ＤＮＡを作成すること、次いで、当該二本鎖ＤＮＡを、ベクターを用いてクローニングし、更なる二本鎖ＤＮＡを得ること、および既知量の少なくとも１つの当該二本鎖ＤＮＡまたは当該ＤＮＡから作成した既知量の少なくとも１つのｍＲＮＡを含む少なくとも１つのコントロール体を調製することを含む方法により作成する。ここで、所望により、当該ＤＮＡおよびｍＲＮＡは、非転写ＤＮＡの当該ＤＮＡ配列以外の源由来のいずれのＤＮＡまたはｍＲＮＡともハイブリダイズしない。
【００２２】
更に、本発明は、遺伝子発現分析システムでネガティブコントロール体として、既知量のＤＮＡを含む当該コントロール体を使用する方法に関し、それは、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、相補性標識化ｍＲＮＡの非存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、およびシグナルの非存在または存在についてコントロール体サンプルを試験することを含む。
【００２３】
更に、当該コントロール体は、遺伝子発現分析システムに使用され得、ここで、既知量のＤＮＡを含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加え、および当該サンプルを、既知量の標識化相補性ｍＲＮＡを含む当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、および当該標識化ｍＲＮＡの当該シグナル値に基づき当該遺伝子転写物の発現レベルを測定する。
【００２４】
本発明はまた、遺伝子発現分析システムでキャリブレーターとして当該コントロール体を使用する方法に関し、それは、既知量の数種のＤＮＡを含む既知量の当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、既知量の対応相補性標識化ｍＲＮＡ(各ｍＲＮＡは複数濃度である)を含む当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および標識化ｍＲＮＡのシグナル値を測定すること、およびシグナル値と各ｍＲＮＡ濃度の間の関係に基づき用量応答性または校正曲線を作成することを含む。
【００２５】
更に、本発明は、二色遺伝子発現分析システムにおける遺伝子発現比のキャリブレーターとして当該コントロール体を用いる方法に関し、それは、既知量のＤＮＡを含む既知量の少なくとも１つの当該コントロール体を、コントロール体サンプルとして二色遺伝子発現分析システムに加えること、および当該サンプルを、既知量の二種標識化対応相補性標識化ｍＲＮＡを含む(存在するそれぞれのＤＮＡサンプルに対応)当該コントロール体の存在下のハイブリダイゼーション条件下におくこと、および二種の標識化ｍＲＮＡのシグナル値の比を測定すること、および当該シグナル比を、二種以上の標識化ｍＲＮＡの濃度の比と比較することを含む。
【００２６】
更に、本発明の実施態様および使用は、以下の記載を考慮することにより明らかとなるであろう。
【００２７】
図面の簡単な説明
本発明の上記および他の目的および利点は、以下の詳細な記載を添付の図面と合わせて考慮することにより明らかとなるであろう。以下の図面全体において同等の記号は同等の部分を示す。
【００２８】
図１は、ヒトＲＮＡとはクロスハイブリダイズしない汎用コントロール体の選択の結果を示す。
図２は、互いにクロスハイブリダイズしない汎用コントロール体の選択の結果を示す。
図３は、汎用コントロール体のパフォーマンス評価を示す。
図４は、二色ハイブリダイゼーション実験による、キャリブレーションおよびレイショーコントロール体の未処理シグナルの散乱プロットを示す。
図５は、典型的なハイブリダイゼーション実験のキャリブレーションコントロール体に基づく校正曲線を示す。
図６は、ＤＲ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１)を示す。
図７は、ＤＲ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。
図８は、ＤＲ３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号３)を示す。
図９は、ＤＲ４のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号４)を示す。
図１０は、ＤＲ５のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号５)を示す。
図１１は、ＤＲ６のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号６)を示す。
図１２は、ＤＲ７のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号７)を示す。
図１３は、ＤＲ８のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号８)を示す。
図１４は、ＤＲ９のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号９)を示す。
図１５は、ＤＲ１０のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１０)を示す。
図１６は、ＲＣ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１１)を示す。
図１７は、ＲＣ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１２)を示す。
図１８は、ＲＣ３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１３)を示す。
図１９は、ＲＣ４のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１４)を示す。
図２０は、ＲＣ５のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１５)を示す。
図２１は、ＲＣ６のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１６)を示す。
図２２は、ＲＣ７のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１７)を示す。
図２３は、ＲＣ８のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１８)を示す。
図２４は、ユーティリティー１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１９)を示す。
図２５は、ユーティリティー２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２０)を示す。
図２６は、ユーティリティー３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２１)を示す。
図２７は、ネガティブ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２２)を示す。
図２８は、ネガティブ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２３)を示す。
図２９は、スパイクミックスに使用するＤＲ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号２４)を示す。
図３０は、スパイクミックスに使用するＤＲ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号２５)を示す。
図３１は、スパイクミックスに使用するＤＲ３ｓのヌクレオチド配列(配列番号２６)を示す。
図３２は、スパイクミックスに使用するＤＲ４ｓのヌクレオチド配列(配列番号２７)を示す。
図３３は、スパイクミックスに使用するＤＲ５ｓのヌクレオチド配列(配列番号２８)を示す。
図３４は、スパイクミックスに使用するＤＲ６ｓのヌクレオチド配列(配列番号２９)を示す。
図３５は、スパイクミックスに使用するＤＲ７ｓのヌクレオチド配列(配列番号３０)を示す。
図３６は、スパイクミックスに使用するＤＲ８ｓのヌクレオチド配列(配列番号３１)を示す。
図３７は、スパイクミックスに使用するＤＲ９ｓのヌクレオチド配列(配列番号３２)を示す。
図３８は、スパイクミックスに使用するＤＲ１０ｓのヌクレオチド配列(配列番号３３)を示す。
図３９は、スパイクミックスに使用するＲＣ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号３４)を示す。
図４０は、スパイクミックスに使用するＲＣ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号３５)を示す。
図４１は、スパイクミックスに使用するＲＣ３ｓのヌクレオチド配列(配列番号３６)を示す。
図４２は、スパイクミックスに使用するＲＣ４ｓのヌクレオチド配列(配列番号３７)を示す。
図４３は、スパイクミックスに使用するＲＣ５ｓのヌクレオチド配列(配列番号３８)を示す。
図４４は、スパイクミックスに使用するＲＣ６ｓのヌクレオチド配列(配列番号３９)を示す。
図４５は、スパイクミックスに使用するＲＣ７ｓのヌクレオチド配列(配列番号４０)を示す。
図４６は、スパイクミックスに使用するＲＣ８ｓのヌクレオチド配列(配列番号４１)を示す。
図４７は、スパイクミックスに使用するユーティリティー１ｓのヌクレオチド配列(配列番号４２)を示す。
図４８は、スパイクミックスに使用するユーティリティー２ｓのヌクレオチド配列(配列番号４３)を示す。
図４９は、スパイクミックスに使用するユーティリティー３ｓのヌクレオチド配列(配列番号４４)を示す。
図５０は、スパイクミックスに使用するネガティブ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号４５)を示す。
図５１は、スパイクミックスに使用するネガティブ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号４６)を示す。
【００２９】
本発明の詳細な説明
本発明は、マイクロアレイのような遺伝子発現分析システムに使用するための汎用コントロール体を開示する。多くの者が、アレイに含ませることのできるコントロール体として適当な遺伝子およびスパイクを得ることができる点に興味を示している。
【００３０】
本発明の汎用コントロール体の利点は、単一の当該コントロール体群が、任意の種のために設計したアッセイシステムにおいて使用され得ることであり、これは、これらのコントロール体が恣意的に加えられない限り存在しないはずだからである。これは、"遠縁の種"からの遺伝子を用いるという概念とは対照的である。例えば、ヒト遺伝子発現を検出することを目的とする分析システムは、コントロール体としてバチラス・サチラス遺伝子(ヒト遺伝物質中に存在し得ない)を用い得る。しかし、このコントロール体は、細菌性遺伝物質中には存在し得(または少なくともクロスハイブリダイズし得る)、そのため、それは、細菌性遺伝子発現での実験にとって良好なコントロール体とは言えない。本明細書で提供する新規汎用コントロール体は、試験サンプルＲＮＡの種にかかわらず同一のコントロール体の群を使用し得るという点で、当分野の現状を超える利点を提供する。
【００３１】
本発明は、鋳型として非転写ゲノム配列または全くのランダム合成配列(totally random synthetic sequence)の何れかを用い、そしてその配列由来のＤＮＡおよび相補的"ｍＲＮＡ"の両方を、コントロール体としての使用のため作成するという新規アプローチを用いる。当該コントロール体は、ニアランダム配列群を設計すること、およびそれらを合成し、汎用コントロール体として合成高分子を生ずることにより、新たに創作され得る。全くのランダム合成ＤＮＡフラグメントは、それらがお互いとクロスハイブリダイズせず、またいずれの生物学的関連種(ＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝子発現分析システムに存在し得る種を意味する)由来のＲＮＡともクロスハイブリダイズしないように設計されている。そのような大きな合成ＤＮＡ分子の作成にはコストが非常にかかり得る。しかし、それを作成するのは一度だけでよい。更に、フラグメントの大きさは、より小さな合成フラグメント群を既知の方法によりライゲーションすることにより増大し得る。この方法では、容易にクローニングするのに十分大きいフラグメントを作成し得る。クローニングおよびＰＣＲを通して、コントロール体として使用するのに十分量のＤＮＡを作成し得、ｍＲＮＡはコントロール体に使用するためインビトロ転写により作成され得る。
【００３２】
より単純なアプローチは、生物由来のゲノムＤＮＡの遺伝子間またはイントロン領域(ここでは、非転写領域という)由来の配列を同定し、これらを、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)による合成に鋳型として使用する。理想的には、約１０００塩基(５００から２０００塩基の範囲であり得る)の配列を、公衆がアクセス可能な配列データのコンピューターサーチに基づき選択する。選択の基準は、１．配列は非転写領域由来でなければならない、および２．配列は、いずれの既知の／公開された遺伝子または発現遺伝子配列断片(expressed sequence tag)(ＥＳＴ)とも相同性がないか、またはそれらとはハイブリダイズしないと予測されるものでなければならない、ことを含む。
【００３３】
ＰＣＲプライマー対を選択配列について設計し、ＰＣＲをゲノムＤＮＡ(鋳型として)を用い行い、コントロール体ＤＮＡとして非転写配列に対応するＰＣＲフラグメント(二本鎖ＤＮＡ)を作成する。更なるコントロール体ＤＮＡをベクターおよび標準技術を用いクローニングし得る。その後、インビトロ転写のような標準技術を用い、コントロール体ｍＲＮＡとしてｍＲＮＡ(ｃＤＮＡに相補的であり、ポリＡテイルを含む)を作成する。標準技術を、コントロール体ＤＮＡおよびコントロール体ｍＲＮＡ産物の精製に、およびその濃度の算出に使用する。
【００３４】
実証試験も行い、アレイ上のコントロール体ＤＮＡと他のｍＲＮＡとの間でハイブリダイズせず、重要な遺伝子発現系(例えば、ヒト、マウス、アラビドピシスなど)由来のｍＲＮＡとハイブリダイズしないことを確認する。
【００３５】
上記アプローチを用い、酵母サッカロマイセス・セレビシエゲノムの遺伝子間領域由来の２３種の汎用コントロール体配列を作成した。特に、公衆が利用可能な酵母ゲノム配列データ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)を用い、遺伝子間領域(YIR)の大きさ約１ｋｂのものを同定した。これらの配列を、BLASTにかけ、他の配列とは相同性がないものを人工遺伝子コントロール体の候補体として同定した。その候補体のGC含有率を分析し、GC含有率が３６％以上のもの(部分集合)を同定した。特定プライマー配列を同定し、そのプライマーを合成した。当該特定プライマーで増幅したPCR産物をpGEM(商標)-T Easy ベクター(Promega Corp., Madison, WI)に直接クローニングした。これらのクローンから、スパイクｍＲＮＡのアレイ標的および鋳型の両方を、それぞれの特定のプライマーを用い増幅した。
【００３６】
より多くの遺伝子間領域を試験のためクローニングした。すべての候補体からのＤＮＡサンプルを増幅し、ガラスマイクロアレイスライドにスポットし、数種の種由来のｍＲＮＡサンプルおよび各候補体スパイクｍＲＮＡとそれぞれハイブリダイズさせ、クロスハイブリダイズしないものを同定した。最初に、それらにおいて、種々の生物種由来のＲＮＡとはクロスハイブリダイズしないものをスクリーニングした。ヒト(8組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓、脳、胎盤および肺)、マウス(6組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓および脳)、ラット(６組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓および脳)、酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(大腸菌および2種の古細菌)由来のmRNAならびに植物(アラビドピシス、アブラヤシ)由来の全RNAをコントロール体の候補体に対して試験した。次いで、試験した種由来ＲＮＡサンプルと交差反応しない候補体を、お互いとのクロスハイブリダイゼーションに関して選択した。当該候補体は、各候補体ｍＲＮＡとそれぞれ別個にハイブリダイズした。
【００３７】
特異的にハイブリダイゼーションする候補体クローンのうちの、２３種が、汎用コントロール体の最終的な群に含まれていた。図６から図２８は、マイクロアレイスライドにスポットした２３種のコントロール体のヌクレオチド配列を示し、図２９から５１は、それぞれ、転写され、スパイクミックス中で使用した２３種のコントロール体のヌクレオチド配列を示す。配列番号１から配列番号２３は、マイクロアレイスライド上にスポットした２３種のコントロール体のヌクレオチド配列を示し、配列番号２４から配列番号４６は、転写され、スパイクミックス中で使用したコントロール体のヌクレオチド配列を示す。
【００３８】
マイクロアレイ実験に用いる場合には、これらの汎用コントロール体は以下の働きをし得る：
１．ネガティブコントロール体：コントロール体ＤＮＡはアレイ中に含まれるが、その相補的人工ｍＲＮＡはＲＮＡサンプル中にスパイクされず、当該コントロール体ＤＮＡはネガティブコントロール体としての役割をする。
２．キャリブレーションコントロール体：数種のコントロール体ＤＮＡサンプルがアレイ中に含まれ得、それらそれぞれに相補的なコントロール体ｍＲＮＡは既知濃度で含まれ、複数濃度のｍＲＮＡを含んでいる。これらコントロール体またはキャリブレーターに対応するアレイ特性からのシグナルを用い、"用量応答性曲線"または校正曲線を作成し、シグナルとサンプル由来のｍＲＮＡとの間の関係を推計し得る。
３．レイショーコントロール体：二色マイクロアレイ遺伝子発現の研究において、種々の、既知のレベルの、コントロール体ＤＮＡに相補的なコントロール体ｍＲＮＡを、各チャンネルの標識反応物に含ませ得る。特定遺伝子からの二色素のシグナル比を、コントロール体ｍＲＮＡの二色素からのシグナル比と比較し得る。これにより、遺伝子発現比を測定するためのシステムの精度を試験し得る。
４．ユーティリティーコントロール体：これらのコントロール体を、生物学的サンプルの標準化のためのサンプル調製ステップ(ＲＮＡ抽出および精製のような)および調製時のサンプル喪失の評価に、加え得る。他に、それらは、更なるキャリブレーターまたはレイショーとしての標識反応物に加え得る。
【００３９】
数種のコントロール体ｍＲＮＡ種の混合物を、実験プロトコールを単純化し標準化するため既知濃度および比で調製(スパイクミックス)し、またこれを用いて包括的で正確(precision and accuracy)な情報群が提供される。表１は、この概念の１つの実施態様を示す。最終的なクローン群からのｍＲＮＡを特定濃度および比で事前に混合し、それによって、それらは、アレイ上にスポットした対応するコントロール体ＤＮＡにハイブリダイズする際に種々のコントロール体として役割をする。４．５桁のダイナミックレンジ内の１０種のキャリブレーター(１：１の比で標識反応物中に含まれる)は、キャリブレーションコントロール体として含まれる。８種のレイショーコントロール体は、２つの発現レベル(低および中から高)のものが含まれ、参照および試験サンプルでは逆転する。
【００４０】
表１に示すような汎用コントロール体は、生物種間および実験プラットフォーム間でのマイクロアレイ検証および標準化で参照物として使用し得る。これらのコントロール体は、正確な遺伝子発現比、マイクロアレイシステムの感度および動力学的範囲の証明に使用され得る。校正(標準)曲線の使用により、これらのコントロール体は、一貫した質量単位での遺伝子発現レベルをレポートし得、研究室間での結果の比較を容易にし得る。
【００４１】
上記例は、これらのコントロール体ＤＮＡおよびコントロール体ｍＲＮＡをどのように作成し、次いでマイクロアレイ遺伝子発現実験で汎用コントロール体として使用するかを示す。それらは、これらコントロール体の使用により利益となり得る、典型的な多種型の実験である。以下の例は、解説のために提供し、限定のために提供するものではない。
【００４２】
表１．二色遺伝子発現比実験のための、提唱されたコントロール体ｍＲＮＡスパイクミックス組成物
【表１】
2005511036.tif 000002
【実施例】
【００４３】
実施例１．サッカロマイセス・セレビシエゲノムの遺伝子間領域からの、人工コントロール体の作製
公衆が利用可能な酵母ゲノム配列データ(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)を用い、遺伝子間領域(YIRs)の大きさ約１ｋｂのものを同定した。これらの配列をBLASTにかけ、他の配列とは相同性のないものを人工遺伝子コントロール体の候補体として同定した。候補体のGC含有率を分析し、GC含有率が３６％以上のもの(部分集合)を同定した。特定のプライマー配列を同定し合成した。特定プライマーで増幅したPCR産物を、pGEM(商標)-T Easyベクター(Promega Corp., Madison, WI)に直接クローニングした。これらのクローンから、スパイクmRNAのアレイ標的物および鋳型の両方を、それぞれの特定のプライマーを用いることにより増幅した。
【００４４】
DNAコントロール体として使用する際、特定プライマーによるPCRでYIR配列を増幅し、その増幅では、クローニングした鋳型(プラスミドDNA)5ngおよび反応体積100μl中で0.5μM濃度のプライマーを用い、以下のサイクルを行った：94℃20秒間、52℃20秒間、72℃2分間を35サイクル、その後、72℃で5分間の伸張。
【００４５】
スパイクミックス用のすべてのYIRコントロール体mRNAをインビトロ転写で作成する。インビトロ転写(IVT)の鋳型は特定のプライマーで増幅されるが、そのプライマーはPCR産物の5'端にT7 RNAポリメラーゼプロモーターを、そして3'端にポリT(T21)テイルを導入するように設計されている。AmpliScribe system (Epicentre, Madison, WI)による反応あたり当該PCR産物1μlを用い、ラン−オフmRNAを作成する。RNAEasy system (Qiagen Inc., Valencia, CA)を用いIVT産物を精製し、スペクトロフォトメトリーで定量した。
【００４６】
最初に、50の遺伝子間領域配列を試験用にクローニングした。全候補体由来のDNAサンプルを増幅し、ガラスマイクロアレイスライドにスポットし、数種由来のmRNAサンプルおよび各候補体スパイクmRNAとそれぞれハイブリダイズさせ、クロスハイブリダイズしないものを同定した。最初に、それらにおいて、種々の生物種由来のRNAとクロスハイブリダイズしないものをスクリーニングした。ヒト(8組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓、脳、胎盤および肺)、マウス(6組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓および脳)、ラット(６組織：骨格筋、脾臓、肝臓、心臓、腎臓および脳)、酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(大腸菌および2種の古細菌)由来のmRNAならびに植物(アラビドピシス、アブラヤシ)由来の全RNAをコントロール体の候補体に対して試験した。
【００４７】
図１は候補体とヒト脳mRNAとのハイブリダイゼーションを示す。その結果、2つのYIRクローン、33および62はヒト脳RNAとハイブリダイズするが、他の候補体はハイブリダイズしなかった(認め得るほどにシグナルが検出されないため)。そのようなクロスハイブリダイゼーションが見られる33および62のようなクローンを汎用コントロール体の一群の候補体から取り除いた。
【００４８】
次いで、試験した種由来のRNAサンプルとは交差反応しなかった候補体同士がハイブリダイズするか試験した。候補体それぞれを候補体mRNAとハイブリダイズした。図２では、クローン#50から作成した標識化mRNAを、他のすべての候補体クローンと特異的にハイブリダイズさせた。それは、その対応する標的DNAにのみハイブリダイズしたので、候補体群中に含ませ得る。しかし、クローン#52は、それ自体のスポットの他にクローン#49のスポットにも結合し、それ故、候補体群中では含ませなかった。
【００４９】
特異的にハイブリダイゼーションする候補体クローンのうちの、23種が、汎用コントロール体の最終的な群に含まれている。図６から図２８は、マイクロアレイスライドにスポットした23種のコントロール体のヌクレオチド配列を示し、図２９から５１は、23種のコントロール体をスパイクミックス中でそれぞれ使用するときのそれらコントロール体のヌクレオチド配列を示す。これらのクローンの配列は、以下のように配列表(引用により本明細書にすべて含める)に更に示している：
配列表1-23(nt、コントロール体ヌクレオチド配列、キャリブレーションコントロール体１〜１０、レイショーコントロール体１〜８、ユーティリティーコントロール体１〜３、およびネガティブコントロール体１および２をそれぞれ含む)；
配列表24-46(nt、スパイクミックスヌクレオチド配列、キャリブレーションコントロール体１〜１０、レイショーコントロール体１〜８、ユーティリティーコントロール体１〜３、およびネガティブコントロール体１および２をそれぞれ含む)。
【００５０】
正確な構造の確認において、構造を確認した上記それぞれの核酸は、コントロール体として直ちに有用であると認められる。
【００５１】
実施例２．人工コントロール体のパフォーマンス評価
汎用コントロール体(スパイクミックスおよびその対応するスポッティングサンプル)について、リアルマイクロアレイ実験でそのパフォーマンスを評価し、以下の試験をした。
【００５２】
実験の設計(アレイ設計を含む)を行い、ハイブリダイゼーションサンプル濃度を試験した(図３)。コントロール体サンプルを５連でスポットし、そのサンプルに、スパイクミックスのみから調製したプローブまたは骨格筋mRNAおよびスパイクミックスから調製したプローブをハイブリダイズさせた。図３では、ダイナミックレンジ全体で視覚化を容易にするため、同一アレイのイメージを２段階のグレースケールで示している。
【００５３】
汎用的な用途(事前に種々の種によりアレイしたスライドに対するスパイクのハイブリダイゼーションを含む)についても試験した。当該コントロール体は、事前にスライドにアレイした商業的な源由来のヒト、ラット、マウス、アラビドピシス、酵母および大腸菌とはクロスハイブリダイゼーションしなかった(データ示さず)。
【００５４】
スパイクミックスのパフォーマンスの試験を行った。それには、レイショーパフォーマンス(ratio performance)および校正曲線(図４および５)が含まれる。最終的なクローン群からのmRNAを特定濃度および比で事前に混合し(上記表１参照)、それにより、それらは、当該アレイにスポットした対応するコントロール体ＤＮＡにハイブリダイズする際の種々のコントロール体としての役割をし得る。４．５桁のダイナミックレンジ幅の１０種のキャリブレーター(１：１の比で標識反応中に含まれる)が、キャリブレーションコントロール体として含まれている。８種のレイショーコントロール体が２発現レベルで含まれ(低および中から高まで)、参照および試験サンプルでは逆転する。
【００５５】
図４は、二色ハイブリダイゼーション実験による、キャリブレーションおよびレイショーコントロール体の未処理シグナルの散乱プロットを示す。当該キャリブレーターは４５度の線上に、レイショーは予測される標的値に、高レベル発現('H'と標識)でも低レベル発現('L'と標識)でも正確に集まる。
【００５６】
図５は、ハイブリダイゼーション実験用のキャリブレーションコントロール体に基づく校正曲線を示す。この"標準曲線"では、キャリブレーションコントロール体からのCy3およびCy5シグナルを、スパイクミックス中のmRNA量の関数としてプロットする。エラーバーは、平均値の95%信頼区間を示す。その曲線から、検出限界、直線状のダイナミックレンジおよびシグナル飽和限界(signal saturation limit)のような特性を評価し得る。標準曲線の作成に汎用コントロール体を用いることは、マイクロアレイ実験での発現レベルを真に定量化(true quantitation)するための第一ステップとなり得る。
【００５７】
表１に示すようなコントロール体は、生物種間および実験プラットフォーム間でのマイクロアレイ検証および標準化で参照物として使用し得る。これらのコントロール体は、正確な遺伝子発現比、マイクロアレイシステムの感度およびダイナミックレンジの検証に使用することができる。校正(標準)曲線の使用により、これらのコントロール体は、一貫した質量単位での遺伝子発現レベルをレポートし得、研究室間の結果の比較を容易にし得る。
【００５８】
上記例は、本発明の特定の態様を示すが、任意の点につき本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、制限するように構成されるものでもない。
【００５９】
当業者は、上記開示のような本発明の教示により利益を有し、その発明に多くの修飾を行うことが可能である。これらの修飾は、添付の特許請求の範囲に開示の本発明の範囲内に含まれるように構成される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ヒトＲＮＡとはクロスハイブリダイズしない汎用コントロール体の選択の結果を示す。
【図２】図２は、互いにクロスハイブリダイズしない汎用コントロール体の選択の結果を示す。
【図３】図３は、汎用コントロール体のパフォーマンス評価を示す。
【図４】図４は、二色ハイブリダイゼーション実験による、キャリブレーションおよびレイショーコントロール体の未処理シグナルの散乱プロットを示す。
【図５】図５は、典型的なハイブリダイゼーション実験のキャリブレーションコントロール体に基づく校正曲線を示す。
【図６】図６は、ＤＲ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１)を示す。
【図７】図７は、ＤＲ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２)を示す。
【図８】図８は、ＤＲ３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号３)を示す。
【図９】図９は、ＤＲ４のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号４)を示す。
【図１０】図１０は、ＤＲ５のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号５)を示す。
【図１１】図１１は、ＤＲ６のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号６)を示す。
【図１２】図１２は、ＤＲ７のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号７)を示す。
【図１３】図１３は、ＤＲ８のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号８)を示す。
【図１４】図１４は、ＤＲ９のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号９)を示す。
【図１５】図１５は、ＤＲ１０のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１０)を示す。
【図１６】図１６は、ＲＣ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１１)を示す。
【図１７】図１７は、ＲＣ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１２)を示す。
【図１８】図１８は、ＲＣ３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１３)を示す。
【図１９】図１９は、ＲＣ４のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１４)を示す。
【図２０】図２０は、ＲＣ５のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１５)を示す。
【図２１】図２１は、ＲＣ６のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１６)を示す。
【図２２】図２２は、ＲＣ７のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１７)を示す。
【図２３】図２３は、ＲＣ８のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１８)を示す。
【図２４】図２４は、ユーティリティー１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号１９)を示す。
【図２５】図２５は、ユーティリティー２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２０)を示す。
【図２６】図２６は、ユーティリティー３のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２１)を示す。
【図２７】図２７は、ネガティブ１のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２２)を示す。
【図２８】図２８は、ネガティブ２のコントロール体ヌクレオチド配列(配列番号２３)を示す。
【図２９】図２９は、スパイクミックスに使用するＤＲ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号２４)を示す。
【図３０】図３０は、スパイクミックスに使用するＤＲ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号２５)を示す。
【図３１】図３１は、スパイクミックスに使用するＤＲ３ｓのヌクレオチド配列(配列番号２６)を示す。
【図３２】図３２は、スパイクミックスに使用するＤＲ４ｓのヌクレオチド配列(配列番号２７)を示す。
【図３３】図３３は、スパイクミックスに使用するＤＲ５ｓのヌクレオチド配列(配列番号２８)を示す。
【図３４】図３４は、スパイクミックスに使用するＤＲ６ｓのヌクレオチド配列(配列番号２９)を示す。
【図３５】図３５は、スパイクミックスに使用するＤＲ７ｓのヌクレオチド配列(配列番号３０)を示す。
【図３６】図３６は、スパイクミックスに使用するＤＲ８ｓのヌクレオチド配列(配列番号３１)を示す。
【図３７】図３７は、スパイクミックスに使用するＤＲ９ｓのヌクレオチド配列(配列番号３２)を示す。
【図３８】図３８は、スパイクミックスに使用するＤＲ１０ｓのヌクレオチド配列(配列番号３３)を示す。
【図３９】図３９は、スパイクミックスに使用するＲＣ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号３４)を示す。
【図４０】図４０は、スパイクミックスに使用するＲＣ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号３５)を示す。
【図４１】図４１は、スパイクミックスに使用するＲＣ３ｓのヌクレオチド配列(配列番号３６)を示す。
【図４２】図４２は、スパイクミックスに使用するＲＣ４ｓのヌクレオチド配列(配列番号３７)を示す。
【図４３】図４３は、スパイクミックスに使用するＲＣ５ｓのヌクレオチド配列(配列番号３８)を示す。
【図４４】図４４は、スパイクミックスに使用するＲＣ６ｓのヌクレオチド配列(配列番号３９)を示す。
【図４５】図４５は、スパイクミックスに使用するＲＣ７ｓのヌクレオチド配列(配列番号４０)を示す。
【図４６】図４６は、スパイクミックスに使用するＲＣ８ｓのヌクレオチド配列(配列番号４１)を示す。
【図４７】図４７は、スパイクミックスに使用するユーティリティー１ｓのヌクレオチド配列(配列番号４２)を示す。
【図４８】図４８は、スパイクミックスに使用するユーティリティー２ｓのヌクレオチド配列(配列番号４３)を示す。
【図４９】図４９は、スパイクミックスに使用するユーティリティー３ｓのヌクレオチド配列(配列番号４４)を示す。
【図５０】図５０は、スパイクミックスに使用するネガティブ１ｓのヌクレオチド配列(配列番号４５)を示す。
【図５１】図５１は、スパイクミックスに使用するネガティブ２ｓのヌクレオチド配列(配列番号４６)を示す。
【図１】
2005511036.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005511036.tif 000009
【図８】
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【図９】
2005511036.tif 000011
【図１０】
2005511036.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2005511036.tif 000021
【図２０】
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【図２１】
2005511036.tif 000023
【図２２】
2005511036.tif 000024
【図２３】
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【図２４】
2005511036.tif 000026
【図２５】
2005511036.tif 000027
【図２６】
2005511036.tif 000028
【図２７】
2005511036.tif 000029
【図２８】
2005511036.tif 000030
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2005511036.tif 000041
【図４０】
2005511036.tif 000042
【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2005511036.tif 000047
【図４６】
2005511036.tif 000048
【図４７】
2005511036.tif 000049
【図４８】
2005511036.tif 000050
【図４９】
2005511036.tif 000051
【図５０】
2005511036.tif 000052
【図５１】
2005511036.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月22日(2004.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005511036000001.app
【国際調査報告】
2005511036.tif 000054
2005511036.tif 000055
2005511036.tif 000056