(57)【要約】本発明はアラニン-セリン-システイン 輸送体 1 (asc-1)の阻害剤である化合物の同定及び使用方法に関する。 これは asc-1阻害剤である化合物の同定方法及びこれらの化合物を含有する含む薬学的調合物を含む。本発明はまたアルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ及び 発作に限られないがこれらに起因する記憶障害及び注意欠陥障害の治療、緩和又は改善及び 神経学的疾患を患らっていないヒトにおける学習能力及び記憶力の亢進のためのこの調合物を使用する方法からなる。 最後に、本発明は変性グルタミン酸作動性又はドパミン作動性神経伝達、たとえば統合失調症、パーキンソン病、 癲癇, うつ病, 強迫性障害及び 双極性障害がある病態の緩和又は改善用調合物を使用する方法にある。
2005527525.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
asc-1 輸送体の阻害剤を含むことを特徴とする、薬学的調合物。
【請求項２】
統合失調症、精神病、パーキンソン病、うつ病, 強迫性障害、不安障害、双極性障害、癲癇; 又は アルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ及び発作に起因する記憶障害及び注意欠陥障害を患うヒトにおけるこのような疾患の治療のための医薬の製造に、asc-1阻害剤を使用する方法。
【請求項３】
当該ヒトが統合失調症を患う、請求項２記載の使用する方法。
【請求項４】
ヒトにおける正常又は異常興奮性組織の機能の亢進のためにasc-1阻害剤を使用する方法。
【請求項５】
興奮性組織の機能の当該亢進が連想性学習及び記憶の亢進をもたらす、請求項４記載の使用する方法。
【請求項６】
当該治療が予防法である、請求項２又は４記載の使用する方法。
【請求項７】
当該治療が健康増進法である、請求項２又は４記載の使用する方法。
【請求項８】
asc-1を介したD- セリン-輸送のアンタゴニストである化合物の同定方法において、シナップス由来の脳膜フラグメント ("シナプトソーム") を標識D-又は L-セリンと共に及びD-セリン輸送アンタゴニストとしてテストされる試験化合物と共にインキュベートし、その後D-又は L-セリン取り込みをコントロールと比較して測定することを特徴とする、上記方法。
【請求項９】
D-又は L-セリン、アラニン又はシステインが放射能標識されて、使用される、請求項８記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
インキュベーションを、アラニンを含むシステムascの選択的阻害剤の存在下に行う、請求項８記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
D-セリンのasc-1を介した膜透過輸送阻害剤として請求項８記載のアッセイによって同定される化合物。
【請求項１２】
治療上有効な無毒量の請求項１１記載のasc-1 阻害剤及び薬学的に許容し得るキャリヤーを含む薬学的調合物。
【請求項１３】
調合物の単位投薬量中の有効化合物の量を、特定の適用にしたがって変化させることができるか又は約0.1 mg 〜1000 mg、より好ましくは約1 mg 〜300 mgに調整することができる、請求項1又は12記載の薬学的調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラニン-セリン-システイン輸送体 1(asc-1)の阻害剤である化合物の同定方法及び 使用方法を提供する。これらの方法はアルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ及び  発作に起因する記憶障害及び 注意欠陥障害の治療、緩和又は改善のための薬学的に許容し得る調合物の製造にこのようなasc-1阻害剤の使用を含む。この調合物はまた正常な興奮性組織の機能を、たとえば学習及び記憶を助成するために亢進させることに使用することができる。更に、この調合物は 変更されたグルタミン酸作動性又はドパミン作動性神経伝達がある病態、たとえば統合失調症、パーキンソン病、癲癇、鬱病、強迫性障害及び  双極性障害の緩和又は改善に使用することができる。本発明はまたこれらの化合物を含む薬学的調合物及び化合物及びその薬学的調合物を使用する方法を含む。
【従来技術】
【０００２】
発明の背景
ドパミン及びグルタマートは、中枢神経系の正常な機能に極めて重要である 神経伝達物質である。したがって, この神経伝達物質系での機能障害はアルツハイマー病, パーキンソン病, 統合失調症, 癲癇, うつ病, 強迫性障害及び  双極性障害を含む多くの神経学的及び精神医学的障害に関与した(Parsons等, Drug News Perspect. 1998, 11, 523-533; Goff 及び Coyle, Am J Psychiatry 2001, 158, 1367-1377)。これらの２つの系が高度に相互に連結すること及びグルタマート系に対するレセプターの遮断が伝達物質ドパミンの遊離に影響を及ぼすこと、そしてその逆もあることが現在明らかになった(参考のために参照してください: Goff 及びCoyle, Am J Psychiatry 2001, 158, 1367-1377; Whitton, Neurosci Biobehav Rev, 1997, 21(4), 481-488; Jentsch 及び   Roth, Neuropsychopharmacology, 1999, 20, 201-205)。たとえば非-競合NMDAレセプターアンタゴニストの伝達は前脳野及び腹側被蓋域を含む種々の脳領域でのドパミン伝達の強い亢進に関与する(Takahata 及び Moghaddam, J Neurochem 1998, 71, 1443-1449; Goff 及びCoyle, Am J Psychiatry 2001, 158, 1367-1377; Whitton, Neurosci Biobehav Rev, 1997, 21(4), 481-488; Jentsch 及びRoth, Neuropsychopharmacology 1999, 20, 201-205)。逆に、ドパミン作動性ドパミンD2 アンタゴニスト、たとえばハロペリドール及びクロザピンを用いるドパミン作動性伝達の遮断は、臨床上適切な濃度でNMDAレセプター機能を亢進させることによってグルタミン酸作動性伝達を亢進させることが分かった (Banerjee等, Neuroreport,1995, 6, 2500-2504)。したがって, 中枢神経系の特定領域でのNMDAレセプター機能の亢進は、ドパミンが中心的役割を示すうつ病, 強迫性障害, 双極性障害, 精神病及び  統合失調症を含む情動障害に有益であるといえる(McDougle J Clin Psychiatry 1997,58, 11-17; Naranjo 等、Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2001,25, 781-823)。
NMDA レセプターは記憶及び学習プロセスに重要であると十分に立証されている (Parsons 等, Drug News Perspect. 1998, 11, 523-533; Danysz 及び   Parsons Pharmacol Rev 1998, 50, 597-664)。 NMDA レセプターを機能させるためには、 グルタマートに対するアゴニスト結合部位と、ストリキニーネに非感受性であって、グリシン 及び   D-セリンによって活性化されるアロステリックコ-アゴニスト部位双方の活性化を必要とする (Kleckner 及び   Dingledine, Science 1988, 241, 835-837; McBain 等,  Mol Pharmacol 1989, 36, 556-565; Danysz 及び   Parsons Pharmacol Rev 1998, 50, 597-664)。 NMDA レセプター上の D-セリン- 感受性調節部位の活性化は、長期増強誘発及び記憶及び学習のインビトロ相互関係にとって前もって必要であることが分かった (Bashir等、 Neurosci Lett. 1990, 108, 261-266)。更に、精神医学的障害に関連する認知障害、たとえば統合失調症はD-セリン の経口投与に緩和されることが分かった(Tsai 等、 Biol Psychiatry 1998, 44, 1081-1089)。したがって NMDA レセプターが発現する部位でグリシン又はD-セリン濃度 の増加を引き起こす薬剤が、病理学的欠陥を患うヒト及びまた正常なヒトの双方における通常の記憶亢進剤であると期待される。更に上記のことからこのような薬剤がパーキンソン病及び  アルツハイマー病に限らない神経学的疾患に関連する又は統合失調症のような精神医学的障害に関連する認知機能障害に有効であると予想される。
癲癇徴候に対して増加したNMDAレセプターの有益な作用は、議論の余地があると考えられる。というのはNMDA レセプターの直接活性化が痙攣を引き起こすことが知られており、そして NMDAアンタゴニストが一般的に抗痙攣剤であるからである (Meldrum等、 Epilepsy Res. 1999, 36, 189-204)。しかし、活性化されたニューロンが抑制性であって、初期の主要な興奮性経路に投射するならば、神経回路のレベルでNMDA レセプターを刺激することは、純の阻害（net inhibition）を引き起こすことができる (Olney 等、 J Psychiatr Res. 1999, 33, 523-533)。 さらに、 分子レベルで  NMDAレセプターはカリウムチャネルの活性化と対になって、このレセプターが特定のシナップスで抑制性であることを示すことがわかった(Isaacson 及びMurphy Neuron 2001, 31, 1027-1034)。NMDA レセプターでのストリキニーネ非感受性部位で作用する正の（Positive） アロステリックモジュレーター、たとえば D-セリン及び   D-シクロセリンは いくつかの研究で確かに抗痙攣剤であることが分かった(Peterson Eur J Pharmacol 1991, 199, 341-348; Peterson 及び   Schwade, Epilepsy Res, 1993, 15, 141-148; Loscher 等、 Br J Pharmacol 1994, 112, 97-106)。 この作用はこの部位で特異的アンタゴニスト、7-クロロキヌレン酸によって遮断された(Loscher等、 Br J Pharmacol. 1994, 112, 97-106; Peterson Eur J Pharmacol. 1991, 199, 341-348)。 更に、 D-セリン (立体特異性を示すL-セリンでない) は既定の抗癲癇薬の抗痙攣作用を増強した (Peterson Eur J Pharmacol. 1991, 199, 341-348)。したがってストリキニーネ非感受性部位でこのようなアンタゴニストを用いるNMDA レセプターの正のアロステリックモジュレーションは、癲癇を含む発作障害に対する新規の治療パラダイムであって、単独で又は既定の抗痙攣剤と組み合わせて使用することができる。
【０００３】
NMDA レセプター介在神経伝達でこの欠損を提唱する有力な仮説は、統合失調症の病態生理学の根底にあるメカニズムである (Jentsch 及びRoth Neuropsychopharmacology 1999, 20, 201-205; Olney 等、 J Psychiatr Res. 1999, 33, 523-533)。 この仮説の基礎はNMDA レセプターアンタゴニスト、たとえばヒトに統合失調症様症状を生じさせるフェンシリジン (PCP) 及びケタミンの臨床作用に由来する(Jentsch 及び Roth、Neuropsychopharmacology 1999, 20, 201-205; Olney 等、 J Psychiatr Res. 1999, 33, 523-533)。
【０００４】
"無毒( non-toxic)" 処置での NMDA レセプター作用の亢進は統合失調症の治療戦略を提供する可能性がある。前臨床試験で、グリシン及び  D-セリンはげっ歯類でPCPの行動作用を逆にする (Contreras Neuropharmacology 1990, 29, 291-293; Javitt等、 Neuropsychopharmacology 1997, 17, 202-204; Tanii等、 J Pharmacol Exp Ther. 1994, 269, 1040-1048; Nilsson等、 J Neural Transm 1997, 104, 1195-1205)。 L-グリシン及び  D-セリンが NMDA 機能に関連するこのような動物モデルで有効であるという観測に基づいて、グリシン部位が正常な生理学的条件下で飽和されないことを結論づけることができる。より顕著なことに、小規模な臨床研究は NMDAレセプター、たとえばグリシン、D-セリン及びD-シクロセリン のグリシン部位アゴニストの治療効果の可能性を評価した(Javitt 等、 Am J Psychiatry 1994, 151, 1234-1236; Heresco-Levy 等、 Br J Psychiatry 1996, 196, 610-617; Tsai 等, 1998)。 これらの研究はこの種の化合物が陰性症状を減少させ、統合失調症の患者で認知障害を緩和することができることを示す(Javitt等、 Am J Psychiatry 1994, 151, 1234-1236; Heresco-Levy 等、 Br J Psychiatry 1996, 196, 610-617; Tsai等、 Biol Psychiatry 1998, 44, 1081-1089)。 更に、ある研究は陽性症状に対する有益な効果を示唆する (Tsai等、 Biol Psychiatry 1998, 44, 1081-1089)。
今まで、統合失調症に対する治療戦略は、NMDA関連グリシン結合部位への結合によってNMDA レセプター介在神経伝達を増強させる薬剤に関心が集まっていた。しかしながら、グリシン及び D-セリンの臨床適用は、多量の薬用量を投与して血液脳関門に浸透させねばならないという事実によって阻まれている。更に、これらのアミノ酸に対する効果的な取り込みシステムはそれらの治療効果を制限しがちである。確かに、内因性グリシンが生理学的条件下でNMDA レセプターを飽和しない理由はこのようなレセプターがある程度NMDA レセプターと共に共局在するグリシン輸送体によって、高い細胞外レベルから保護されることにある(Smith等、 Neuron 1992, 8, 927-935; Danysz及びParsons Pharmacol Rev 1998, 50(4), 597-664)。このことが統合失調症のグルタマート機能低下仮説に基づき新規の抗精神薬を開発するためにグリシン輸送体、たとえば GlyT-1を目標とする最近の創薬プロジェクトを正当化した。しかしながら、 D-セリン輸送の阻害はL-グリシン輸送の阻害に比べて都合がよい。とうのは a) D-セリンの分布及び発生パターンがNMDA レセプターと共に共局在化し、一方L-グリシンの分布が より偏在するからであり (Schell 等、  J Neurosci 1997, 17(5), 1604-1615; Hashimoto等、 Eur J Neurosci 1995, 7, 1657-1663) 、そして b) D-セリンがレセプター上のアリステリック部位でグリシンよりも3-4倍強いコアゴニストであり(Matsui 等、 J Neurochem 1995, 65, 454-458)、そしてさらに具体的には L-グリシンもまた運動調節に関与があるとされるストリキニーネ-感受性グリシンレセプターと相互に作用するからである(Betz 等、 Ann N Y Acad Sci 1999, 868, 667-676)。
中枢神経系は多数のアミノ酸輸送体系を有し、この系はシステム "Gly", "A", "L" （これはグリシン、アラニン、及び  ロイシンそれぞれの取り込みに限定される）及び  さらに"ASC" （これはアラニン、セリン及び  システインの取り込みに限定される）を含む(Christensen Physiol Rev 1990, 70, 43-77; Hashimoto 及びOka Prog Neurobiol 1997, 52, 325-353)。セリンの双方の異性体の輸送は、輸送がシステムLによっても生じうるという事実にも拘わらず、システムASCを経て達成される一般に考えれる(Christensen Physiol Rev. 1990, 70, 43-77; Hashimoto 及び   Oka Prog Neurobiol. 1997, 52, 325-353)。 ２つの ASC-様輸送体は 最近クローン化され、そしてASCT1 (Arriza 等、 J Biol Chem, 1993, 268(21), 15329-15332) 及び  ASCT2 (Utsunomiya-Tate等、 J Biol Chem. 1996, 271(25), 14883-14890)と命名された。これらのクローン化された輸送体の研究は ASC-ファミリー輸送体が L-システイン及び L-セリンに対する高い親和性と同時にL-アラニンに対する最高の親和性を示し、 D-アミノ酸よりもL-アミノ酸 に対して立体選択性を示すことを確認した。 D-アミノ酸に対するこれらの輸送体の相対的に低い親和性に基づき、 D-アミノ酸  （D-セリンを含む）に対する特異性を有する別のシステムの存在は、脳中のD-セリンレベルを比較的に低く維持すると主張されたことがある (Hashimoto等、 Neuroscience 1995, 66, 635-643)。
最近、新規 Na+-非依存性アラニン-セリン-システイン 輸送体 (asc-1) のクローニング及び  特徴付けが報告された (Nakauchi 等、 Neurosci Lett 2000, 287, 231-235)。この輸送体 ファミリーに第二メンバーも最近クローン化され、そして asc-2と命名された (Chairoungdua 等、 J Biol Chem 2001, 276(52), 49390-49399)。この輸送体は asc-1に類似する小さい中性アミノ酸を好むことが分かった。しかし、 asc-1 RNA が 脳抽出物全体中で発現することが分かったけれども (Nakauchi 等、 Neurosci Lett. 2000, 287, 231-235)、 asc-1 蛋白質の組織分布が報告されておらず、それゆえに体内での生理学及び 疾患に関してこの輸送体の重要性が判断されなかった。 Asc-2 は脳中で検出されなかった(Chairoungdua 等. J Biol Chem. 2001, 276(52), 49390-49399)。これはasc-2 が中枢神経系に関連する疾患を目標にしていないことを意味する。
【０００５】
上述のようなCNS障害の治療に対するD-セリンの使用における限界は、十分なD-セリンを血液脳関門を通過するために多量の薬用量を投与しなければならないこと、及び更に脳中の重要な部位で外部から投与されたD-セリンの濃度の増加を妨げる 輸送系が脳中に存在することである。 かくして、脳の決定的な部位でD-セリンレベルを改善するために別の方法を見出さねばならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明者は上述したようにasc-1 阻害剤 が、NMDA レセプターを発現する脳中の部位でD-セリンレベルを改善する可能性を有することを見出した。したがって本発明はNa+-非依存性 D-セリン輸送阻害剤, 特にasc-1の 阻害剤を NMDAレセプター介在神経伝達の改善に使用する方法に関する。さらに具体的には、本発明は統合失調症、精神病、パーキンソン病、うつ病、 強迫性障害、不安障害、双極性障害、癲癇; 又はアルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ及び発作に起因する記憶障害及び注意欠陥障害に治療に並びに学習及び 記憶の亢進にasc-1 阻害剤を使用する方法に関する。
【０００７】
治療上有効な量のasc-1 輸送体の阻害剤並びに適切な薬学的に許容し得るキャリヤーを含むことを特徴とする薬学的調合物を請求した。asc-1 阻害剤の治療上有効な量 は、特定の病態の治療に必要な 阻害剤の量である。
本発明で意味する治療とは、症状の処置、緩和及び 改善及び（又は）疾患の進行の完全な又は部分的阻止を含む。
【０００８】
本発明は更に統合失調症、パーキンソン病、うつ病, 強迫性障害、不安障害、双極性障害、発作障害、癲癇; アルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ及び発作に起因する記憶障害及び注意欠陥障害を患うヒトにおけるこのような疾患の治療のための医薬の製造のために、asc-1阻害剤を使用する方法を含む。特に、統合失調症患者において、陰性症状を減少し、そして認知障害を緩和することができる。発作障害及び癲癇を患う患者において、asc-1 阻害剤は抗痙攣剤であることができ、そして単独で又は既定の抗痙攣薬と組み合わせて使用することができる。D-セリン介在NMDAレセプター情報伝達（signalling）にasc-1阻害が影響するために、asc-1 薬学的調合物を上記疾患で観察される認知障害及び記憶障害の治療に使用することができる。
更に、 asc-1 阻害剤を連想性学習及び記憶を含む、正常又は異常興奮性組織の機能の亢進に有用な医薬の製造に使用することができる。
本発明はまたasc-1 阻害剤の同定に有用である方法を提供し、この方法は下記アッセイを用いて行われる。このアッセイにおいて、大脳皮質膜を横切る又はヒトasc-1 蛋白質を発現するHEK293 細胞からの膜を横切るD-セリンの輸送を阻害する化合物の能力が観測される。
【０００９】
上記アッセイに基づくこのような化合物の合成法及びスクリーニング法は当業者に明らかである。
【００１０】
無毒量でこのようなasc-1 阻害剤及び 薬学的に許容し得るキャリヤーを含む、CNSの疾患の治療に使用される薬学的調合物も含む。本発明の好ましい実施態様において、薬学的調合物は調合物の単位投薬量中の有効化合物の量を含み、その量は特定の適用にしたがって変化させることができるか又は約0.1 mg 〜1000 mg, より好ましくは約1 mg 〜300 mgに調整することができる。
【００１１】
かくて、本発明は本発明で定義された通りの神経学的及び精神医学的障害の治療のために、高められた脳D-セリン/L-グリシンレベルに十分な薬用量でasc-1輸送阻害剤を使用する方法を請求する。更に具体的には、本発明は正常又は異常興奮性組織の機能の亢進のためにasc-1阻害剤を使用する方法に関する。
【００１２】
本発明は、NMDAレセプター及び  D-セリンを含むことも知られている脳領域にasc-1が位置しているという知見に一部基づく。D-セリンに対する高い親和性を有する特異送蛋白質 (asc-1)の発現が脳中でNMDA レセプターと共に及び  D-セリンと共に共局在することが実証されたのは、本発明が初めてである。更に本発明者は ラット大脳皮質性 シナプトソーム膜を横切るD-セリン輸送 の大きい成分が Na+ 非依存性であり、そしてクローン化asc-1を連想させる基質特異性を有することを見出した。asc-1の基質特異性を脳細胞の基質特異性と対比するが、この際クローン化asc-1 を発現するHEK293 細胞及びラット大脳皮質性シナプトソームそれぞれ中での[3H]D-セリン取り込み阻害に関する20 個の天然アミノ酸の作用を比較する。 ラット脳 P2 シナプトソーム中にあるD-セリン-感受性 Na+-非依存性輸送体が "asc-1" 型であることを示唆するそれぞれの pKi (ヒトasc-1 対ラット大脳皮質膜: P < 0.0001, r2 = 0.57, F = 32, n = 26, 勾配（slope） = 0.94)の間に顕著な相互関係がある。
【００１３】
したがって本発明によれば、 asc-1 D-セリン輸送体の阻害は、asc-1がNMDA レセプターと共に共局在する領域を含む脳の別々の領域中で増加したD-セリン濃度を生じることを見出した。これは (S)-メチル-L-システインを用いて実証された。本発明者が示す上記システインはラット 大脳皮質性 シナプトソーム、ラット小脳 シナプトソーム中での及び  ヒトasc-1 輸送体を発現するHEK293 細胞中での[3H]D-セリン取り込みの強力な、そして選択的 阻害剤である。 (S)-メチル-L-システインは、以前に培養ラット 肝細胞への[3H]AIB輸送 の阻害によって測定したようにスシテムA 輸送体の弱い 阻害剤[5 mMで81% 阻害(IC50 ~ 1.2 mMに相当)]であることが示された(Bracy 等、 J Biol Chem 1986, 261, 1514-1520)。本発明において、本発明者は (S)-メチル-L-システインが ヒト asc-1 (Ki = 62 ± 15 μM)を発現する HEK293 細胞への又はラット 大脳皮質膜 (Ki = 6.6 ± 1.8 μM) への[3H]D-セリン輸送の阻害ではるかに強力であることを示した。更に、 (S)-メチル-L-システインは、通常精神病に関与するその他のアミノ酸、たとえばセロトニン (Ki > 1 mM), ノルアドレナリン (Ki > 1 mM), ドパミン (Ki > 1 mM) 又はグルタマート (Ki > 1 mM) の輸送を遮断しない。更に、 (S)-メチル-L-システインはグリシン 輸送体 (GlyT-1B) (Ki > 100 μM)を遮断しなかった。 この asc-1 阻害剤をラット脳に微小透析プローブを介して注入した場合、セリン、アラニン、スレオニン及びグリシンのレベルの著しい増加が観察された(図 1)。これらのアミノ酸 はasc-1に対する公知の基質であり (Fukasawa 等、 2000, J Biol Chem 275, 9690-9698; Nakauchi 等. Neurosci Lett 2000, 287, 231-235) 、そして観察された増加は、 輸送体がある交換法で操作されるという認知によるものである(Fukasawa 等、 2000, J Biol Chem 275, 9690-9698)。 asc-1の基質でないアミノ酸、 たとえばグルタマート及びアスパルタートは影響されず (図 1)、そしてこの作用はasc-1 阻害に特異的であることを示す。更にセリン, アラニン及びスレオニンはグリシン輸送体に対する基質でない (Kim 等、1994, Liu 等、1993、J Biol. Chem 268, 22802-22808)ので、グリシン輸送体遮断が観察された作用に介在しそうにないことを示唆させる。
【００１４】
asc-1の アミノ酸取り込み薬理学と組み合わせたこれらの知見は、選択的 asc-1 阻害剤 が多量の薬用量の D-セリン、 グリシン 、又は グリシン輸送阻害剤によって生じる作用に類似する行動作用及び神経科学作用を通常生じることを示す。
【００１５】
この作用はNMDAレセプター介在神経伝達の増強及び PCP由来の行動及び神経化学作用の逆転を含む。したがって asc-1 阻害剤 は統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、トラウマ 及び発作に関連する認知機能障害を緩和する。Asc-1 阻害剤も変更されたグルタミン酸作動性又はドパミン作動性神経伝達、たとえば 統合失調症 (陰性及び陽性症状双方)、パーキンソン病、うつ病、 強迫性障害及び双極性障害がある病態に有効である。更に、asc-1 阻害剤は癲癇を含む発作に治療に単独で又は既定の抗痙攣薬と組み合わせて有効でなければならない。インビトロでNMDAレセプター介在神経伝達を増強する薬剤は、統合失調症の持続性陰性症状及び認知症状の治療に有効性を示した。最後に、本発明の知見に基づき、asc-1の選択的阻害剤に哺乳類への投与が正常又は異常興奮性組織の機能を亢進させ、その結果として連想性学習及び記憶の亢進をもたらすことを期待することができる。
【００１６】
本発明の好ましい特徴は、asc-1 阻害剤の薬用量が病態又は病態のあらゆる症状(たとえば発作に悩む危険のある患者に対する病態)の進行を妨げるために予防的に投与される予防又は治療に関する。
【００１７】
上記疾患の１つを患う個体への投与に関して、 asc-1 阻害剤をこの阻害剤及び場合により１種以上の薬学的に許容し得る賦形剤を含む薬学的調合物に製剤化することができる。
本発明の別の好ましい具体例で、調合物の単位投薬量の形で、薬学的調合物中の有効化合物の量を、特定の適用にしたがって変化させることができるか又は約0.1 mg 〜1000 mg、より好ましくは約1 mg 〜300 mgに調整することができる。
asc-1 蛋白質は脳中に広く分布し、NMDA レセプターの高い発現を伴う領域にも位置する(たとえば大脳皮質、海馬、遍桃体、 側坐核、 黒質−脳中の発現パターンのより詳しい説明は下記を参照)。更に、 ラット 大脳皮質性シナプトソームへの[3H]D-セリン取り込みの大きな成分は、Na+-非依存性である (すなわち ラット 大脳皮質膜中に[3H]D-セリン取り込み 最大速度 (Vmax)は添加されたNa+-イオンの不在下で測定されVmax に比べて120 mM Na+-イオンの存在下で〜20−25% 低い)、そして クローン化asc-1を連想させる基質特異性を有し、これは asc-1が脳中でD-セリンの全体にわたる排除に主に貢献することを見出した。これは特にクローン化asc-1を発現するHEK293 細胞及びラット 大脳皮質シナプチトソームそれぞれ中で本発明に詳述されたプロトコルを用いて[3H]D-セリン取り込み阻害に対する20個の天然アミノ酸 の作用を比べることによって実証される。特に、有効な阻害は双方のタイプのアッセイでアミノ酸、 L-アラニン, L-システイン, L-グリシン , L-セリン及び L-スレオニンによって観察された。より効果の低い、しかし顕著な阻害が双方のアッセイでL-アスパラギン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン, L-ロイシン、 L-メチオニン、 L-フェニルアラニン、 L-チロシン及び  L-バリンを用いることによって観察された。 不活性アミノ酸は L-アスパルタート, L-アルギニン, L-シスチン, L-グルタマート, L-グルタミン, L-リジン 及び L-プロリンを含む。 量的に類似する結果が対応するD-異性体を用いて得られた。ラット大脳皮質膜への取り込みと比較してヒトasc-1 を発現するHEK293 細胞への[3H]D-セリン 取り込み阻害に関するそれぞれのpKi の間の非常に顕著な相互関係が測定された: P < 0.0001, r2 = 0.57, F = 32, n = 26, 勾配（slope） = 0.94。先願には、L-アラニンに対するその非感受性によって特徴づけられるラット脳中の[3H]D-セリンに対する推定上の新規輸送体が開示された。確かに、この出願において(Javitt, WO 01/08676 A1) 30 mM L-アラニンはアッセイ条件に含まれた。しかし、この濃度はasc-1を含むasc システム介在取り込みを完全に遮断するには十分すぎるほどである。更に、 L-アラニンはラット大脳皮質膜への[3H]D-セリン取り込みを完全に遮断し、したがってこの膜にL-アラニン-非感受性D-セリン輸送体が存在することを示唆しない。 したがって本発明に記載される asc-1 輸送体はWO 01/08676 出願に記載された取り込みシステムと明らかに異なる。
【実施例】
【００１８】
ヒトasc-1のクローニング及び発現: 
ヒトNa+-非依存性輸送体 asc-1 をコードするcDNA (Nakauchi 等. Neurosci Lett, 2000, 287, 231-235) 及び ヒトタイプ II 膜糖蛋白質, 4F2 重鎖をヒト脳 RNA での標準RT-PCR 処理を用いて単離する。フラグメントを哺乳類発現ベクターpCI/neo (Promega Corporation) にクローン化し、そしてHEK293 細胞に (米国菌培養収集所# CRL 1573) リポフェタミンを用いてコトランスフェクションする。取り込みをトランスフェクション2-4日後に測定する。
免疫組織化学によって測定されたasc-1の局在化:
特異的ポリクロナール抗体を輸送体の細胞内C-末端領域にあるペプチド配列PSPLPITDKPLKTQCに対して産生させる。このペプチドをニュージーランド白ウサギの免疫前にキーホール  リンペット  ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanine） に結合させる。ウエスタンブロット分析で、この抗血清はマウス Asc-1でトランスフクションされたCHO-K1 細胞(米国菌培養収集所# CCL-61) 中で40 kDa 蛋白質バンドを認知する。トランスフェクションされていないコントロール細胞でバンドは検出されない。
【００１９】
成熟雄性 NMRIマウス (M&B, Ry, DK)を経心腔的（ transcardially）に固定し、脳を切断する。脳を30% スクロース中に凍結保護し、ついで40 μmの 前頭部凍結切片を調製し、免疫組織化学用に加工する。切片をasc-1 抗血清を用いて4(C で一晩インキュベートする。ついでビオチン標識したanti rabbit 抗体 (DAKO) 及び西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したストレプトアビジン（streptavidin）-ビオチン (Vector Laboratories)  と共に1 時間インキュベートする。 免疫活性を 0.05% ジアミノベンジジン及び 0.01% H2O2 を用いて可視化する。免疫前血清及び吸収前抗血清をコントロールとして使用し、何ら染色を生じない。
【００２０】
Asc-1-免疫活性(Asc-1-ir) はマウス脳全体に広範に分配される。Asc-ir を神経細胞体及び樹状突起に匹敵する静脈瘤と一致する断絶染色として観察した。 ２〜３の場合に、細胞質の染色が観察される。グリア細胞体又は血管周囲部位のいずれかでの免疫染色は全く観察されなかった。
【００２１】
大脳皮質を適度に標識し、層 III 及び Vで最も強いシグナルを有する層を成して現れる。 顕著なAsc-1-irは帯状束皮質及び膨大後部皮質に観察された。
【００２２】
内側中隔（Medial septum）は強い標識を示し、外側中隔は弱いAsc-1-irを示す。大脳基底核で、淡蒼球は内包の腹側域にある内側部分に特定の強い染色を有する強い免疫染色を示す。適度の弱いAsc-1-ir は側坐核及び尾状核皮殻（caudate putamen）それぞれに存在する。分界条の床核は適度に染色された。適度の Asc-1-ir が内側領域で最強の強度を有する扁桃核全体に見られる。
【００２３】
海馬で、強い免疫染色が CA1, CA2, CA3の外錐体細胞 及び歯状回 （dentate gyrus）の門中に見出された。適度のAsc-1-irは多形細胞層及び放線状分子中にある。歯状回 の分子層は適度の染色され、顆粒細胞層は染色されない。
強い Asc-1-ir は視床下部全体にわたって正中隆起の外層を含む内側及び外側域双方で分布される。特定の神経視床下部域の標識は区別されなかった。
多くの視床域［外側視床核、外側膝状体、 網状核、傍室核、 セントロ外側（centrolateral） 及びセントロ内側（ centromedial）視床核、 外側手綱を含む］は Asc-1-irを示す。
顕著なAsc-1-ir は脳幹中にある。著しく免疫染色された領域は、上丘の表層、乳頭体上核 及びまた内側及び外側核；台形体の核に相当する錐体路を取り囲む領域、 上オリーブ核、腹側蝸牛核、外側網様体、背側被蓋核、 舌下神経核、内側傍小脳脚核、橋核、 背側縫線を含む。 適度の又は弱い染色は中脳水道周囲灰白質、黒質及び孤束の核中に検出された。
強いAsc-1-ir は小脳でプルキンエ細胞を含む分子層中に主に存在する。弱い染色は顆粒層中に観察された。
D-セリン 輸送体 asc-1の発現は、SchellによってD-セリンについて記載した同一の領域の多くに観察された(Schell 等、 Neurosci 1997, 17(5), 1604-1615)。 高いレベルのD-セリンは 大脳皮質、海馬、線条中に、及びより少ない程度で前脳辺縁系、 間脳及び 中脳中に見出される。同様にこの領域で高度に発現したasc-1を見出した。しかし、低いD-セリン存在の領域、たとえば視床及び脳幹にasc-1に対する強い免疫染色を見出した。しかしAsc-1 もD-セリン以外のアミノ酸を輸送するので、この分布傾向はその他の基質、たとえばグリシンの分布傾向に反映されうる。
【００２４】
Na+-非依存性 [3H]D-セリン取り込みの測定  
大脳皮質膜に: Cortex from 雄性ウスターラット (150-200 g) から得られた皮質を0.40 M スクロース中で均質化し、10 分間1000 x g で遠心分離する。ペレットを捨て、上澄みを20分間40.000 x g 遠心分離し、アッセイ緩衝液中に浮遊させる: 120 mM コリンクロライド、 1.5 mM KCI, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgS04, 1.2 mM KH2PO4 10 mM D-グルコース、 25 mM 重炭酸トリメチルアンモニウム、 10 mM HEPES。被験化合物及び組織(1 mg 原組織／ウエル) を96ウエルプレートに加え、[3H]-D-セリン (特異活性= 26.8 Ci/mmol, PerkinElmer, ケンブリッジ, 英国) (100 nM 最終濃度)と共に5 分間25 oCでインキュベートする。 サンプルをUnifilter GF/B ガラスファイバー(Packard Biosciences, Meriden, CT, 米国)上でろ過し、3 x 0.25 mLのアッセイ緩衝液で洗浄する。ヒト asc-1を発現するHEK293 細胞全体への[3H]-D-セリン取り込みの測定を同一の条件で96 ウエルプレート中で実施する。但し、細胞を15 分間放射性リガンドと共にインキュベートし、冷アッセイ緩衝液中に２回 浸して洗浄し、ついで放射性リガンドと共にインキュベートする。蓄積放射能を細胞から 200 μLのシンチレーション液体／ウエル (Ultima Gold, Packard Biosciences) の添加によって抽出し、プレートをマイクロプレートシンチレーションカウンター (Packard Biosciences)でカウントする。被検化合物を含むサンプル中のD-セリン取り込みを、添加化合物不含コントロール又はたとえば 30 mMの L-アラニンの添加によってasc-1介在輸送を阻害するコントロールと比較する。
【００２５】
別々の実験で、 asc-1介在取り込みを  [3H]-D-セリンの代わりに放射性リガンドとして[35S]-L-システイン (0.5 x106 DPM/ウエル、特異活性>1000 Ci/mmol, Amersham, Buckinghamshire, 英国)を用いて測定する。すべての他の実験の詳細はasc-1/HEK293 細胞での[3H]-D-セリン 取り込み実験に関して記載した通りである。
トランスフェクションされた細胞株に関連するasc-1、asc-1 阻害剤の同定を目的とするアッセイ及びスクリーニングについて言及した場合、用語 asc-1 はNakauchiによって記載された蛋白質及び翻訳後修飾形態を意味する(Nakauchi 等. Neurosci Let. 2000, 287, 231-235)。 更に、 上記と同一の状況で、asc-1はスプライス  バリアント及びasc-1 遺伝子の多形性に由来する、天然に生じる蛋白質も含むがこれらに限定されない。さらに、本発明の定義においてasc-1は asc-1のペプチドプフラグメント、点突然変異の asc-1 ペプチド、並びに天然asc-1と高い配列一致を有するasc-1蛋白質／ペプチドフラグメントを含む。本発明の意味において高い配列一致は、アミノ酸レベルで 公表された配列に対して60%, 70%, 80%, 90% 又は最も好ましくは 少なくとも95%の範囲内で同一性を示すasc-1 ペプチドフラグメント／蛋白質を含むことを意味する。
【００２６】
アミノ酸取り込みの測定
ヒト GlyT-1B を発現するCHO 細胞への[3H]-グリシン取り込みの測定を 96ウエルプレート中で1 μCi [3H]-グリシン /ウエルを用いて実施する。細胞を実験2日前にプレートに塗布し、２回アッセイ緩衝液 (組成: 150 mM NaCl, 10 mM グルコース、 2.5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 2.5 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7.4)で洗浄する。被検化合物を放射性リガンド及び細胞をさらに15 分間37 oCでインキュベートする10 分前に添加する。細胞をasc-1 細胞への[3H]-D-セリン 取り込みについて記載したように洗浄する。非特異性取り込みを100 μMの N-メチル -N-(フェニル-トリフルオロメチルフェノキシ)プロパン-1-イル-グリシンの存在下での取り込みとして定義する。
【００２７】
セロトニン (5-HT), ドパミン (DA) 及びノルアドレナリン (NA) インビトロ 取り込み阻害を、ラット脳 シナプトソ−ム中で前記プロトコル(Bogeso 等, J Med Chem 1985, 28, 1817-1828)の変法を用いて測定する。すなわちトリチウム標識したアミンを使用して、ラット全脳 (小脳を除く) からのシナプトソ−ム([3H]セロトニン)、ラット線条体シナプトソ−ム ([3H]ドパミン) への取り込み又はラット大脳皮質 シナプトソ−ム [3H]ノルアドレナリンへの取り込みを測定する。切断されたラット脳部分を1 mM ニアラミド（nialamid）を補充した0.40 M スクロース中で均質化し、 10 分間1000 x g で遠心分離する。 上澄みを更に30分間 20.000 x g、 4 oC で遠心分離し、ついで0.2 g/l アスコルビン酸を補充した クレブス-リンガー緩衝液（pH 7.4）中に再浮遊させる。 被検化合物 及び膜 を96 ウエルプレートに添加し、インキュベーションを10 nM [3H]セロトニン, 12.5 nM [3H]ドパミン 又は10 nM [3H]ノルアドレナリン のいずれかを[3H]ドパミン 取り込み (5 分間20 oCで)以外は15分間37 oCで添加して開始する。非-特異取り込みを、10 μM シタロプラム、100 μM ベンズトロピン又は 20 μM タルスプラム、それぞれの存在下で取り込みとして定義し、総取り込みの5-10%を占める。サンプルをワットマン GF/C フィルターを介してろ過し、 ３重測定による少なくとも 8 ポイント薬用量−応答曲線か得られた非直線回帰分析を用いてIC50 を概算する。
【００２８】
ラット脳シナプトソ−ムへの[3H]グルタマート 取り込みの高い親和性の測定を雄性ウスターラット(150-200 g)から得られた、上述のように調製した均質化した新鮮な皮質を用いて行う。シナプトソ−ム (3 mg 組織) を被検化合物と混合し、 5 分間25 °Cで前インキュベートする。 インキュベーション(5分間 25 °Cで) を、50 μl 3H-グルタマート (8 nM トレサー+ 0.5 μM L-グルタマート) を加えて1 mlの最終容量にして開始する。サンプルを直接ワットマン GF/B ガラスファイバー上で減圧下でろ過し、直ちに3 x 1 mlの 0.9% NaCIで洗浄する。フルター上の放射能量を通常の液体シンチレーションカウンターによって測定する。非-特異取り込みをL-グルタマート (1 mM 最終濃度)を用いて３重に測定する。
【００２９】
微小透析実験
ラット(雄性ウスター)を麻酔し、大脳内ガイドカニューレ(CMA/12)を、腹側海馬に透析分析プローブチップ (プレグマに対して5.6 mm前方、 外側 -5.0 mm、硬膜に対して 7.0 mm 腹側に配置する )が設置された脳に、三次元座標システムで（stereotaxically） インプラントする。ラットを 少なくとも 2日間 手術から回復させる。 実験のその日に、微小透析プローブ(CMA/12, 直径0.5 mm 、長さ3 mm) をガイドカニューレを通して挿入する。このプローブを微量注入ポンプに二重のチャネルスイベルを介して連結する。微小透析プローブのろ過したリンガー液(145 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2) による灌流を、プローブを脳に挿入する直前に開始し、1 μl/分の一定の流速で実験の間続ける。 165分の安定化の後、実験を開始する。20分のサンプリング体制を実験期間中に適用する。時間ポイントを微小透析部位からプローブ出口への潅水（perfusate）の遅延時間に対して修正する。化合物S-メチル-L-システイン (Sigma-Aldrich, セントルイス、米国) をろ過したリンガー液( 1 mM 濃度)に溶解させ、 そして 140分間逆透析によって腹側海馬に局所的に注入する (図 1)。実験の後、ラットを断頭して殺す。脳を摘出し、凍結し、切開し(20 μm)、ついでプローブの位置を照合する。透析物中のアミノ酸濃度を、o-フタルアルデヒドでプレカラムオンライン誘導化後に蛍光高度検出と共にHPLC によって分析する。このシステムはAgilent 1100 蛍光検出器(劣起、266-340 nm; 発光、305-340 nm)を備えたHypersil AA-ODS カラム (5 μm, 2.1 x 200 mm, Agilent) からなる。移動層はA: 20 mM 酢酸ナトリウム、 0.018% トリエチルアミン、 0.3% テトラヒドロフラン、  pH 7.2、 B: 20 mM 酢酸ナトリウム、 40% アセトニトリル及び 40% メタノール、 pH 7.2かななる。オーブン温度は40°Cで設定され、流速は0.45 ml/分である。データを集めて、標準アミノ酸溶液(0.1−10 μM)の範囲で修正した後ChemStation ソウトウエアー (Agilent)を用いて分析する。化合物投与の直前の3つの連続するサンプルの平均値は各実験に対する基礎レベルとして使用され、データは基礎に対する百分率に変換される（100%に標準化された平均基礎注射前値)。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は微小透析によって測定された、ラット脳での(S)-メチル-L-システイン のアミノ酸レベルへの影響を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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