(57)【要約】本発明は、細胞を定着させ且つ増殖させることができる色々な支持基質を記述する。かかる支持基質は、損傷組織の癒合及び再生を促進し得るよう傷箇所に植込むのに使用可能である。本発明は、多孔質面を有する少なくとも１つの層を備え且つ粘膜下小腸組織を含む薄膜と、層に接着させた細胞とを含む物を記述する。本発明は、層に接着させた細胞が軟骨細胞を含むことを更に記述する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質面を有する少なくとも１つの層を備え且つ粘膜下小腸組織を含む薄膜と、前記層に接着された細胞とを備える物。
【請求項２】
請求項１に記載の物において、前記細胞が軟骨細胞である物。
【請求項３】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が細胞無しである物。
【請求項４】
請求項１に記載の物において、前記薄膜がコラーゲンである物。
【請求項５】
請求項１に記載の物において、前記薄膜がＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンである物。
【請求項６】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が再吸収可能である物。
【請求項７】
請求項１に記載の物において、前記軟骨細胞が自家製である物。
【請求項８】
請求項１に記載の物において、前記薄膜に隣接する生体適合性接着剤を更に備える物。
【請求項９】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が関節軟骨の欠陥部上に配置され得るようにされた物。
【請求項１０】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が関節軟骨の欠陥部内に配置され得るようにされた物。
【請求項１１】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が関節軟骨の欠陥部上に配置される物。
【請求項１２】
請求項１に記載の物において、前記薄膜が関節軟骨の欠陥部内に配置される物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨細胞の移植、骨及び軟骨の移植、癒合、関節の修復及び関節の病気の予防の分野に関する。特に、本発明は、軟骨細胞の移植及び軟骨の再生の新たな方法及び器具に関する。
【発明の背景】
【０００２】
米国では、毎年、５００，０００件以上の関節手術及び全関節置換が行われている。欧州でもほぼ同一数の同様の手術が行われている。これらの数字には、毎年、約９０，０００件の全膝置換及び約５０，０００件の膝の欠陥を修復するための手術が含まれる。（１９９２年のアメリカ整形外科手術学会、１２５、パークリッジＩＩＩのＰｒａｅｍｅｒ  Ａ．Ｆｕｒｎｅｒ  Ｓ．Ｒｉｃｅ、Ｄ．Ｐによる、米国における筋骨格の状態（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）。軟骨の再生治療法は、関節の損傷の早期の段階にて最も有効であり且つその段階にて行うことができ、このため、人工関節の置換手術を必要とする患者数は減少している。かかる予防的な処理方法により、骨関節炎を発症する患者数も減少するであろう。
【０００３】
関節の軟骨構造体を表面再処理すべく使用される技術は、主として、軟骨下穿孔、剥離及びその他の方法を使用して主として軟骨を修復しようと試みており、このため、病気の軟骨及び軟骨下骨を切開し、血管形成された海綿状骨は露出されたままにされる（インサル．Ｊ、臨床整形外科、（Ｉｎｓａｌｌ，ｊ．，Ｃｌｉｎ．ｏｒｔｈｏｐ）１９７４年１０１：６１、Ｆｉｃａｔ  Ｒ．Ｐ．等）、臨床整形外科、１９７９年、１４４：７４、Ｊｏｈｎｓｏｎ．Ｌ、Ｌ．，Ｉｎ：（Ｍｃｇｉｎｔｙ  Ｊ．Ｂ．，Ｅｄ）、関節鏡手術（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ）、ニューヨーク、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１年、３４１）。
【０００４】
Ｃｏｏｎ及びＣａｈｎ（１９６６年、サイエンス１５３：１１１６）には、雛の胚体節から軟骨合成骨を培養するための技術が記載されている。その後、Ｃａｈｎ及びＬａｓｈｅｒ（１９６７年、ＰＮＡＳ米国５８：１１３１）は、軟骨の分化のための前提条件としてのＤＮＡ合成の関与を分析するシステムを使用した。軟骨細胞は、成長によってＥＧＦ及びＦＧＦの双方に応答するが（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ及びＭｅｓｃｈｅｒ、１９７７年、Ｊ．細胞生理学（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）９３：１１７）、最終的に、その分化した機能を失う（１９７８年、Ｂｅｎｙａ等の細胞（Ｃｅｌｌ）１５：１３１３）。Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  Ｍ．等によって僅かな変更を加えて、軟骨細胞を成長させる方法が論述され且つ主として使用されている（１９９４年、ブリットバーグ．ＭらのＮｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：８８９）。これらの方法を使用して成長させた細胞を、患者の膝関節への自家移植片として使用した。更に、Ｋｏｌｅｔｔａｓ等は、長期間の細胞培養の下でコラーゲン及びプロテオグリカンのような軟骨特有の分子の発現を調査した。彼等は、寒天ゼル、アルギン酸塩ビーズ又はスピナー培養基（円形の細胞の形態を保持する）によって成長させた懸濁培養基と比較したとき、単層培養基内で培養する間の形態の変化にも拘らず（１９８９年のＶｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，におけるＡｕｌｔｈｏｕｓｅ  Ａ．等の２５：６５９、１９９０年のＪ．ＣｅｌｌＳｃｉにおけるＡｒｃｈｅｒ  Ｃ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ、９７：３６１、Ｈａａｎｓｅｌｍａｎｎ  Ｈ．等のＪ．Ｃｅｌｌ  １９９４年、１０７：１７、Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ  Ｊ．等の、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１９９４年、２１２：９７）、ＩＩ及びＩＸ型コラーゲンのような発現したマーカ、及び大形の凝集プロテオグリカン、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、べリシカン（ｖｅｒｓｉｃａｎ）及び連結タンパク質は変化しないことがわかった（コレタスらの１９９５年のＪ．Ｃｅｌｌ、１０８：１９９１）。
【０００５】
関節軟骨細胞は、軟骨内でのみ見られる特殊な間葉誘導細胞である。軟骨は、その物理的性質が軟骨細胞により発生された細胞外基質に依存する無血管組織である。軟骨内の骨化の間、軟骨細胞は、Ｘ型コラーゲンが発現し始めることを特徴とする細胞肥大に到る成熟を受ける（Ｕｐｈｏｌｔ，Ｗ．Ｂ．及びＯｌｓｅｎ，Ｒ．Ｒ．，Ｉｎ）、軟骨分子の特徴（Ｈａｌｌ，Ｂ＆Ｎｅｗｍａｎ）、５Ｅｄｓ  ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９１年、４３、Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．等  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９１年、１４８：５６２、Ｋｉｒｓｃｈ  Ｔ．等、分化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、１９９２年、５２：８９、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｍ．等Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１９９３年、１０３：１１１１）。
【０００６】
軟骨細胞の培養及び骨及び軟骨の操作における進歩にも拘らず、損傷関節表面の修復のため、軟骨又は軟骨細胞を移植しようとする試みは余り成功していない。本発明の教示は、関節内欠陥部内への軟骨及び（又は）軟骨細胞の移植を促進し、これにより軟骨が再生されて欠陥部を固定するための効果的で且つ効率的な手段を提供するものである。
【発明の簡単な概要】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、細胞の成長及び付着を支えることのできる支持基質を含む植込み可能な物と、かかる物を植込んで植込み箇所にて細胞を再生させる方法を提供する。一実施形態において、本発明は、吸収性の支持基質内に保持された軟骨細胞を含む植込み可能な物を移植することにより、動物の関節表面の軟骨を効果的に治療するための方法を提供する。
【０００８】
一実施形態において、軟骨細胞は、基質の一端縁においてのみ保持される。一実施形態において、支持基質は、コラーゲンで出来た被覆基質であり、また、軟骨細胞は、自家又は同種である。別の実施形態において、支持基質は、コラーゲン及びエラスティン又はコラーゲン及び１つ又は２つ以上の再吸収性材料で出来ている。別の実施形態において、支持基質は、動物供給源からの小腸の粘膜下組織で作られる。
【０００９】
別の実施形態において、支持基質は、心膜で作られる。別の実施形態において、支持基質は、コラーゲンと、ポリエステルに関係した１つ又２つ以上のその他の材料とから作られる。
【００１０】
植込み可能な物は、接着剤又は機械的な保持手段によって移植箇所に連結されることが好ましい。本発明は、また、植込み可能な物を植込み可能な箇所に配置し且つ操作する器具、及び植込み可能な物を植込み箇所に連結する保持手段にも関するものである。
【００１１】
本発明は、また、吸収性の支持基質に保持された軟骨細胞を含む、動物の軟骨を修復するための植込み可能な物、及びその製造方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、軟骨細胞を治療すべき表面上に配置することと、治療すべき表面を被覆基質にて被覆することとを備える、関節表面の軟骨を治療する方法に関するものである。軟骨基質は、欠陥部を取り巻く軟骨領域に連結される。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、軟骨細胞を軟骨の欠陥部に自家移植する過程の間、確立される軟骨内に突き出す、例えば、毛管ループのような血管組織の形成を阻止する特定の製品を使用することに関する。かかる製品は、完全厚さの欠陥部と称されることがある、欠陥部が軟骨下層内に又はその下方に伸びる骨の軟骨欠陥部を修復するのに使用可能である。下方の骨から血管組織を形成することは、形成すべき新たな軟骨内に突き出し、所望の特殊な腸隔膜の軟骨細胞以外の細胞の外観を呈しがちとなる。
【００１３】
血管形成より導入された汚染細胞は、植込んだ軟骨細胞により形成される軟骨内への侵入及び過剰な成長を生ずる可能性がある。本発明にて使用することができる商業的製品の型式の１つは、７日から１４日の期間後に吸収可能であるＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標  英国、Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｌｔｄ）である。このことは、Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｌｔｄの製品説明文に記載されている、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）のような、止血装置の通常の使用法と相違する。
【００１４】
驚くべきことに、我々は、軟骨の再血管形成を阻止することを望む状況において、止血材料を使用し且つ該止血材料がゲル様の人工凝固剤として機能することがわかった。図１Ｃには、軟骨内欠陥部内での再血管形成を阻止するために使用可能であるかかる止血バリア（参照番号１）が示されている。かかる止血バリアによって被覆された関節軟骨の全厚さ欠陥部内に赤血球細胞が存在するならば、これらの血液細胞は、化学的にヘマチンに変化し、従って血管成長を誘発させない。このため、例えば、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）のようなフィブリン接着剤を使用し又は使用せずに再血管形成阻止バリアとして使用した止血製品は、本発明の教示の対象とする方法にとって効果的である。本発明の別の側面において、細胞無し基質のような基質又は別の基質をパッチ被覆物として使用するか、又は、例えば、移植のため自家軟骨細胞を使用して培養した軟骨細胞が移植される関節の欠陥領域内に挿入する。更に、本発明は、軟骨欠陥部を修復するため、同種軟骨細胞又は異種軟骨細胞を利用することもできる。図２には、欠陥領域を被覆するためのパッチとして使用することができる被覆基質２が図示されており、図３Ｂには、軟骨欠陥部の局所が図示されている。
【００１５】
このように、一実施形態において、本発明は、修復すべき軟骨箇所の血管の侵入を妨害するため薬剤又は装置を投与し、また、修復箇所を隔離して移植した細胞を所要位置に保つ基質を提供することを備える、関節骨表面の軟骨欠陥部を効果的に修復し又は治療する方法を教示する。このように、本発明は、修復すべき箇所内への血管形成が効果的に阻止されるように修復すべき箇所内へ挿入される選択的な止血構成要素を備えるキットも提供し、また、移植すべき軟骨細胞が修復すべき箇所内に配置されたならば、基質２を修復箇所の上方で塞ぎ、移植した軟骨細胞が所要位置に保持されれば、栄養物に再度接近することが可能であるようにする。
【００１６】
本発明の特定の側面は、血管組織の形成を阻止する特定の製品又は特定の製品の組み合わせ体と接触したとき、軟骨細胞の振る舞いを研究するため、生体外システムを使用することにより例示されている。この生体外試験は、軟骨細胞の成長を支える特定の試験した材料の能力を予想し、軟骨細胞が保持されたインプラントとして使用するため基質を試験し、また、軟骨細胞を軟骨の欠陥部内に自家移植する過程の間、確立される軟骨内の毛管ループが突き出す生体内で生じるような、血管形成を阻止する基質の能力を試験するものである。
【００１７】
成長、又は血管組織、骨形成細胞、線維芽細胞等が成長する軟骨内への侵入を阻止する能力を有することが適宜な止血製品の特長となるであろう。適宜な止血材料は、軟骨の形成を最適にし且つ関節軟骨内の全ての欠陥部の全厚さを修復するために、成長する軟骨内への血管及び細胞の侵入が防止される点にて本発明の方法の目的を実現する。理想的には、止血バリアは、完全な軟骨の修復を許容するのに十分、長時間、安定しており、また、時間の経過に伴なって吸収され又はその他の方法で分解可能であるようにする。適当であるとして識別される１つの材料は、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｗ１９１２（英国、エセコン・リミテッド、ロットＧＧ３ＤＨ）であり、また、酸化した再生滅菌セルロースような吸収可能な止血材である。
【００１８】
本発明は、また、軟骨被覆インプラント、及びかかるインプラントを植込み方法及び装置を含む。該インプラントは、支持基質と、該支持基質に保持された自家又は同種軟骨細胞とを備える。一実施形態において、軟骨細胞が基質の１つ又は２つ以上の端縁又は層にのみ保持されている。全体として、支持基質は、軟骨細胞を成長させ且つ時間の経過に伴い、インプラントを受け入れる患者の身体に吸収される材料である。移植法は、関節鏡、最小侵襲性又は開放手術技術によって行うことができる。本発明の方法は、また軟骨欠陥を修復するため適宜な自家及び異種軟骨細胞を使用することも考える。
【００１９】
図４には、かかるインプラントが図示されている。より具体的には、植込み可能な物２０は、軟骨細胞２４が保持されている支持基質２２を有している。適宜な支持基質２２は、移植前及び移植後の双方にて軟骨細胞が成長するのを許容する時間、安定的な形態を保持し且つ軟骨細胞の自然の環境に類似したシステムを提供して軟骨細胞の成長の分化を最適化し得ることを特徴とする固体又はゲル様の足場とする。
【００２０】
支持基質２２は、例えば、何らかの顕著な跡を残さず且つ有害な分解生成物を形成せずに、２から３箇月といった時間に亙って軟骨が完全に修復し且つその後に身体に吸収されるのに十分な時間、安定的である。「吸収された」という語は、自然の生物学的過程によって支持基質が分解され、その分解した支持基質及び分解生成物が、例えば、リンパ質又は血管を通じて処理されることを含むことを意味する。従って、支持基質２２は、生理学的に吸収可能な非抗体性の薄膜様材料であることが好ましい。更に、一実施形態において、支持基質２２は。比較的平滑な一側部２１及び比較的粗い一側部２３を有するシート状の形態である。粗い側部２３は、通常、軟骨欠陥部１８に面して軟骨細胞の内部成長を促進する一方、平滑な側部２１は、通常、軟骨欠陥部１８から離れる方向を向き且つ組織の内部成長を阻止する。別の実施形態において、支持基質２２は、同様の多孔率の２つの平滑な側部を有している。
【００２１】
一実施形態において、支持基質２２は、ポリペプチド又はタンパク質で形成されている。好ましくは、ポリペプチド又はタンパク質は、例えば、哺乳動物のような自然の供給源から得たものとする。しかし、自然の供給源からのポリペプチド又はタンパク質と同等の物理的及び化学的性質を有する人工材料を使用して支持基質２２を形成することもできる。支持基質２２は、操作者が取り扱うとき、可逆的に変形可能であり、植込み可能な物２０を操作し且つ次に本発明の１つの側面の間、以下に説明するように、その当初の形状に復帰することが可能であるようにすることも好ましい。
【００２２】
支持基質２２を形成する１つの好ましい材料は、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ及びニワトリから得られるようなコラーゲンである。支持基質２２を形成することのできる適宜な材料は、Ｃｈｏｎｄｒｏ  Ｃｅｌｌ（登録商標）（商業的に入手可能なＩＩ型コラーゲン基質パッド、スイス国Ｅｄ、ゲーストリッヒ・ゾーン（Ｅｄ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  ｓｏｈｎｅ）、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）（商業的に入手可能なＩ型コラーゲン基質パッド、スイス国、Ｅｄゲーストリッヒ・ゾーン）を含む。Ｉ型コラーゲンで形成された支持基質２２は、ＩＩ型コラーゲンで形成された支持基質よりも多少硬いが、ＩＩ型コラーゲン基質を使用することもできる。支持基質を形成する別の好ましい材料は、Ｐｅｒｍａｃｏｌ（登録商標）（英国、ティシュー・サイエンス・ラボラトリーズ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））からの架橋結合形態又は非架橋結合形態のものである。
【００２３】
これと代替的に、コラーゲンは、Ｓｗａｔｓｃｈｅｋ等による２００２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ及びＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、５３：１０７−１１３に記載され、また、オーストラリア特許出願第３７４１７０１号に記載されたような、海面動物から得られる。簡単に説明すれば、コラーゲンは、海面を水中で数回洗浄して海面組織を細かく切り且つ均質化し、溶液を高濃度尿素にて処理し、得られた溶液を遠心分離し、コラーゲンを上澄み液から抽出することによって、海面動物から隔離される。
【００２４】
上述した植込み可能な物品は、例えば、以下により詳細に説明するように、軟骨細胞をこの支持基質上で培養することにより形成することができる。
自家インプラントの場合、患者の関節の非重量支承領域から関節鏡技術によって軟骨生検を最初に採取し且つ２０％の子ウシの胎膜血清を含む成長培養基に入れて試験室まで運ぶ。
【００２５】
次に、トライプシン・エチレンジアミネテトラアクティック酸（ＥＤＴＡ）、加水分解酵素及び結合剤のような酵素にて軟骨生検を処理して軟骨の軟骨細胞を隔離し且つ抽出する。次に、抽出した軟骨軟骨細胞を成長培養基内で培養して、約５０，０００細胞の最初の細胞カウント数から、最終的に約２，０００万のカウント数の軟骨骨細胞となるようにする。
【００２６】
再植込みの３日前に、１０％の自家血清（すなわち以下に説明するように患者の血液から採取した血清）を含む移植培養基にて成長培養基を交換する。移植培養基中の培養した軟骨細胞支持基質２２を１つ又は２つ以上の層内に浸漬させ且つ浸透させて、増殖を続け、植込み可能な物２０を形成する。好ましくは、軟骨細胞は、支持基質２２の１つの端縁又は外層にのみ接着させる。次に、植込み可能な物２０を患者の軟骨欠陥箇所１８に植込む。
【００２７】
欠陥部又は損傷部１８は、植込み可能な物２０を受け入れ得るよう、米国特許出願第０９／３２０，２４６号に記載されているように、植込む前に、外科手術後により直接修復し、僅かに拡大し、又は彫刻することができる。培養方法、成長及び移植培養基は、以下に単に一例として詳細に説明するが、最初に、採取した軟骨生検を処理し且つ軟骨細胞を本発明に従って培養するために使用する実験方法について説明する。
【００２８】
培養過程中、軟骨生検を処理し且つ軟骨軟骨細胞を成長させるために使用する成長培養基（以下、「成長培養基」）は、２．５ｍｌのゼントマイシン（ｇｅｎｔｏｍｙｃｉｎ）硫酸塩（濃度７０マイクロモル／リットル）、４．０ｍｌのアムフォテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）（濃度２．２マイクロモル／リットル；スキーブ（Ｓｑｕｂｂ）から入手可能な殺菌剤である、商標名Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）、１５ｍｌの１−アスコヒック酸（３００マイクロモル／リットル）、１００ｍｌの子ウシ胎膜血清（採取濃度２０％）、及び残りのＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基を互いに混合させて、約４００ｍｌの成長培養基を形成することで作成する。（軟骨細胞を抽出し且つ増殖させる試験室まで病院から軟骨生検を運ぶためにも、同一の成長培養基が使用される。）
患者から得られた血液は、約３，０００ｒｐｍにて遠心分離し、血清を他の血液成分から分離する。分離した血清を保存して、培養過程及び移植方法の後の段階で使用する。
【００２９】
それ以前に自家移植のため患者から採取した軟骨生検を上述した成長培養基内で培養が行われる試験室に運ぶ。成長培養基はデカンタに移して軟骨生検を分離し且つ、試験室に到着したときに廃棄する。次に、軟骨生検を少なくとも３回，単純なＤＭＥＭ／Ｆ１２内で洗浄して軟骨生検上の子ウシ胎膜血清の膜を除去する。
【００３０】
次に、２８ｍｌのトライプシンＥＤＴＡ（濃度０．０５％）を追加した上述した成長培養基を含む組成物にて軟骨生検を洗浄する。この組成において、この生検は、３７℃及び５％ＣＯ２にて５から１０分間、培養する。培養後、軟骨生検を成長培養基内で２から３回洗浄して生検から全てのトリプシン酵素を除去する。次に、軟骨を計量する。典型的に、軟骨軟骨細胞を成長させるのに必要な最少量の軟骨は、約８０から１００ｍｇである。２００から３００ｍｇといった多少より多量であることが好ましい。計量後、約５０ｍｌの単純なＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基内の２ｍｌのコラゲネーゼ（５，０００酵素単位；消化作用酵素）の混合体中に軟骨を配置し且つ細かく切って酵素が軟骨を部分的に消化することを許容する。細かく切った後、その細かく切った軟骨を漏斗を使用して瓶内に移し、約５０ｍｌのコラゲネーゼ及び単純なＤＭＥＭ／Ｆ１２混合体を瓶に追加する。次に、細かく切った軟骨を３７℃及び５％のＣＯ２にて１７から２１時間、培養する。
【００３１】
次に、一実施形態において、培養後の細かく切った軟骨を４０μｍのメッシュを使用して濾し、１０分間，遠心分離し（１０５４ｒｐｍすなわち重力の２００倍）成長培養基内で２回、洗浄する。次に、軟骨細胞をカウントし、その生存率を決定し、その後、軟骨細胞を３７℃及び５％のＣＯ２にて２週間、成長培養基内で培養し、その期間の間、成長培養基は３から４回交換した。
【００３２】
患者に再度植込む少なくとも３日前に、軟骨細胞をトリプシン加水分解し及び遠心分離によって成長培養基から除去し且つ１．２５ｍｌのジェンタマイシン  硫酸塩（濃度７０マイクロモル／リットル）、２．０ｍｌのアムフォテリシン（濃度２．２マイクロモル／リットル；スキーブから入手可能な殺菌剤である、商標名ファンギゾーン（登録商標））、７．５ｍｌの１−アスコビック酸（３００マイクロモル／リットル）、２５ｍｌの自家血清（最終濃度１０％）及び残りＤＭＥＭ／Ｆ１２培養基を含む移植培養基に運んで、約３００ｍｌの移植培養基を形成する。
【００３３】
次に、支持基質２２を、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）細胞培養トレーのウェルの底部に嵌まる適宜な寸法に切断し、次に、１から２ｍｌの移植培養基を有するウェルの底部に無菌状態に置く。次に、約５から１０ｍｌの移植培養基内の十分な数の培養した軟骨軟骨細胞（例えば、３００から１０００万軟骨細胞）を支持基質２２内に浸漬させ且つ約３７℃及び５％のＣＯ２にて約７２時間、培養して軟骨細胞が成長を続けることを許容する。この培養の間、軟骨細胞は束に配置し且つ支持基質２２に接着する。一実施形態において、軟骨細胞は、支持基質２２の一側部の１つの外層にのみ接着させる。この方法を使用すれば、支持基質２２は、支持基質２２の生物化学的性質を顕著に失うことなく、植込み可能な物２０を形成するのに十分な数にて軟骨細胞の成長及び保持を支えることがわかった。支持基質２２はまた、植込み可能な物を軟骨欠陥箇所に植込んだ後、軟骨細胞の連続的な成長を支持するための環境も提供する。
【００３４】
別の実施形態において、１７から２１時間の培養期間後で且つ上述したように、細胞のカウント数及び生存率を決定した後、軟骨細胞を移植培養基まで運び且つ、上述したように、２週間の期間、支持基質２２上で直接成長させる。
【００３５】
別の実施形態において、植込み可能な物２０は、支持基質２２に接着させた軟骨細胞を機械的に破壊し又は損失することなく、一時的に変形させることが可能であることが判明した。この変形は、植え込み可能な物２０が以下に説明するように関節内に導入され、又は処理すべき表面上に配置されたならば、完全に復帰可能である。
【００３６】
従って、本発明の別の側面によれば、十分な数の軟骨細胞を成長させ又は装填した、支持基質２２は、その軟骨細胞の装填を機械的に破壊し又は損失することなく、関節鏡の作用装置内に同時に挿入することを許容するような仕方にて一時的に変形させることができる。
【００３７】
これと同時に、この基質は、軟骨細胞の更なる現所での分化及び自然の軟骨基質材料の再生を損なうことなく、接着剤又は機械的な保持手段により、この基質を軟骨の欠陥領域に連結することが可能であることが判明した。
【００３８】
本発明の別の側面は、植込み可能な物２０を植込み箇所に配置する器具及び植込み可能な物２０を植込み箇所に保持する機械的な保持手段を含む。
本発明の一実施形態において、植込み手術は、関節鏡技術を使用して行われる。図５には、植込み可能な物２０をその直径に亙って巻いて、ら旋状の円筒状の移植体を形成して、植込み可能な物２０を関節鏡導入器２８の作用通路２６を通じて植込み箇所に送り込む方法が示してある。適宜な関節鏡導入器は図６に図示されている。
【００３９】
図６において、関節鏡導入器３０は、対象とする関節に入り且つ所望の寸法の植込み可能な物２０を送り込むのに適した直径及び長さの作用通路３２を備えている。例えば、殆どの手術の場合、作用通路３２の直径は、約８から２０ｍｍであり、長さは、約３０から６０ｃｍである。引込み可能で且つ除去可能な針３６を受け入れる注射通路３４が作用通路３２内で且つ該作用通路に対し長手方向に可動である。注射通路３４は、少なくとも部分的に作用通路３２内に伸縮式に押し込むことのできるハンドル３８に取り付けられている。針３６は、注射通路３４の長さに沿って伸び且つ流体が植込み箇所まで通るのを許容する。注射通路３４は、ハンドル３８を植込み箇所に向けて又は植込み箇所から離れるよう伸縮式に動かすことにより作用通路３２内を移動する。
【００４０】
導入器３０は、また、ゴム又はその他の適宜な材料で出来ており、導入器３０に摺動可能に係合したキャップ４０を有している。使用時、キャップ４０は、軟骨欠陥箇所を取り巻き且つ血液及びその他の自然の流体のような流体が軟骨欠陥箇所に流れるのを防止する。導入器３０はまた、植込み可能な物２０を把持し、導入し且つ植込み箇所に配置するため、ハンドル３８に取り付けられた外方に偏倚する２つ又はより多くの把持要素４２も有している。使用時、ハンドル３８を操作者に向けて且つ操作者から離れる方向に伸縮式に動かしたとき、把持要素４２は、作用通路３２の内部と係合し且つ把持状態に互いに向けて移動し（ハンドル３８を操作者に向けて動かしたとき）、又は、互いに離れる方向に移動して把持状態を解放する（ハンドル３８をユーザから離れる方向に動かしたとき）、かかる伸縮式動作は、ハンドル３８内に配置された偏倚要素（図示せず）によって制御することができ、該ハンドルは、注射通路３４及び把持要素４２が作用通路３２内で摺動可能に前進し且つ引込むことを可能にする。
【００４１】
図７から図９には、植込み可能な物２０を膝関節１０のような植込み箇所に植込むための典型的な関節鏡手術方法が示してある。欠陥のある軟骨１８は、好ましくは、軟骨下層４４の上方の深さまで欠陥部の箇所から除去して、ウェル４６が残るようにする（図８及び図９を参照）。軟骨の欠陥部１８を除去した後、植込み可能な物２０を受け入れ得るように欠陥箇所を準備する。軟骨下層が植込み箇所にて出血する程度まで損傷されたならば、その箇所は選択的に止血バリアとして機能する任意の吸収性材料で被覆することができる。
【００４２】
さもなければ、欠陥箇所の準備は、針３６を通じてウェル４６内に生体適合性接着剤を注射することを含むことができる。図８に示す接着剤４８のような生体適合性接着剤は、有機質フィブリン接着剤（例えば、オートリア、バクスターの、フィブリン系接着剤であるＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）又は自家血液試料を使用して外科的方法により作製したフィブリン接着剤とする）。
【００４３】
それ以前に所望の寸法に切断し且つ図７に示すようなら旋円筒状の形状に巻いた植込み可能な物２０を把持要素４２によって把持し且つ関節鏡導入器３０の端部内に保持する。次に、植込み可能な物２０をその端部内に保持する関節鏡導入器３０をアクセス通路３３を通じて植込み箇所まで前進させ、把持要素４２から解放し且つ把持要素４２を使用して、延伸させ又は作用通路３２を出るとき、延伸するのを許容する。アクセス通路３３は、導入器３０及び視覚化器具のような器具が植込み箇所に立ち入るのを許容する１つ又は２つ以上の通路を有する。把持要素４２を使用して植込み可能な物２０を操作して、その内部の軟骨を維持する側部、この実施の形態において、植込み可能な物２０の粗い側部２３は、ウェル４６に面し且つウェル４６内で所要位置に静かに保持されて接着剤４８が硬化し且つ植込み可能な物２０がウェル４６内に噛み込むことを許容する。
【００４４】
図８に示すように、１つ又は２つ以上の通路を有する第二のアクセス通路を使用して、器具が植込み箇所に入って、植込み可能な物、接着剤及び（又は）機械的保持手段を配置するか、又は視認視覚化器具を植込み箇所に入るのを許容すべく使用することができる。関節鏡導入器３０又はその他の関節鏡器具に関して説明した１つ又は２つ以上の機能を果たすために、かかる別個のアクセス通路を使用することができる。
【００４５】
別の実施形態（図９）において、吸収性ピン、アンカー、ねじ又は縫合糸のような機械的保持手段を使用して、植込み可能な物２０をウェル４６内で固着する適宜なピン５０は、Ｏｒｔｈｏ−Ｐｉｎ（登録商標）（スイス、ゲイストリッヒ  ゾーネから商業的に入手可能なラクチド共重合体ピン）を含む。図１０には、吸収性ピン５０の一実施形態が示してある。この実施の形態において、ピン５０は、頭部５２にて軸５６内の髄内通路５４と、１つ又は２つ以上の保持リング５８とを含む。ピン５０の寸法は。特定の用途に従って異なるが、通常、ピン５０は長さ１０から１５ｍｍであり、頭部５２は直径約４ｍｍ、髄内通路５４は直径約１．２ｍｍであり、軸５６は直径約２ｍｍ、保持リング５８は直径約２．５ｍｍである。保持リング５８は、ピン５０を軟骨欠陥部を取り巻く健常な軟骨内に定着する作用を果たす。ピン５０は、身体に害を与えずにある期間の後、身体に吸収され又は身体によって分解される任意の材料で製造される。例えば、ピン５０は、ポリラクチドで出来たものとすることができる。
【００４６】
植込み可能な物２０をウェル４６内で固着するため、接着剤４８とピン５０のような機械的保持手段との組み合わせ体を使用することも本発明の範囲に属すると考えられる。
上述したように、軟骨欠陥部１８が軟骨下層４４の下方に伸び又は図１１及び図１２に図示するように、軟骨を軟骨下層４４内に又はその下方に除去することを必要とする場合、上記の方法は、選択的に修正して植込み可能な物２０を配置する前に、止血バリア６２をウェル４６内に配置することを含む。かかる欠陥部に対して、外科医は、選択的に止血バリア６２を使用して血管、骨成分、線維芽細胞等が成長する軟骨内に成長し又は侵入するのを阻止することができる。このことは、硝子軟骨が移植箇所にて成長するのを許容すると考えられる。適宜な止血バリアは、成長する軟骨内への血管形成及び細胞の侵入を阻止して、軟骨の形成を最適にし、欠陥箇所にて軟骨の全厚さが成長するのを許容すると考えられる。好ましくは、止血バリアは、長期間、安定して軟骨の完全な修復を許容し、次に、時間の経過に伴なって身体に吸収され又は身体によって分解される。適宜な止血バリアは、酸化再生した滅菌セルロースで出来た吸収性止血材である、サージセル（登録商標）Ｗ１９１２（英国、エセコン・リミテッド）である。
【００４７】
上述した外科用器具は、使い捨て型又は多数回使用型の再使用型外科用器具を製造するのに適した金属及び（又は）プラスチック又はシリコーンのような任意の材料で製造される。
【００４８】
本発明の支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として本明細書に含めた、米国特許第５，０２８，６９５号Ｃｈｅｍｏｋｏｌ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  Ｚｕｒ  Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｋｏｌｌａｇｅｎｐｒｏｄｕｋｔｅに譲渡）に記載された方法によって製造される。コラーゲン薄膜は、次のように、ウシ又はブタの原コラーゲン材料から作成することができる。すなわち、原コラーゲン材料は、脂肪酸残留物を除去し水で洗浄し、アルカリで処理し、水で洗浄し、酸で処理し、水で洗浄し、再度、強力なアルカリで処理し、酸で処理し、これにより膨潤を生じ、無機質酸で処理して収縮させ、材料を搾り出して、乾燥重量の４０から５０％として材料内に保持された水を溶剤を加えて除去し、必要であれば、材料を架橋結合させ、次に、延伸した形態に乾燥させることができる。
【００４９】
支持基質２２又は被覆基質２は又はＩ型又はＩＩ型コラーゲンのようなコラーゲンと、エラスティンとを含む、薄膜は、例えば、その内容を参考として引用し本明細書に含めた米国特許第５，３９７，３５３号（ダンディー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｎｄｅｅ）のＯｌｉｖｅｒ等に譲渡）に記載された薄膜で形成することができる。コラーゲン／エラスティン薄膜のコラーゲンは、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ及びニワトリの供給源から得ることができる。一実施形態において、支持基質２２又は被覆基質２は、真皮の脂肪成分を除去するため、多数の有機質抽出段階が行われるコラーゲン／エラスティンブタの真皮である。脂肪分が除去されたならば、その部分に対し全ての細胞材料を除去するため、多数の酵素作用抽出が行われる。米国特許第５，３９７，３５３号に従って作成されたかかる製品は、Ｐｅｒｍａｃｏｌ（登録商標）及びそのの色々な架橋結合した型式であると考えられる。
【００５０】
Ｒａｐｉ−Ｓｅａｌ  Ｐａｔｃｈ（カリフォルニア州、フリーモントのＦｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及びティシュリペアパッチ（テキサス州ダラスのグレイカー・バスキュラー・インコーポレーテッド（Ｇｌｙｃａｒ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．））のようなパーマコル（登録商標）と同様のその他の薄膜を本発明にて使用することが可能である。
【００５１】
コラーゲン／エラスティン薄膜は、ポリイソシアネート、好ましくは、０ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）で２０％まで架橋結合することができる。支持基質２２又は被覆基質２として使用されるコラーゲン／エラスティン薄膜は、２つの平滑な側部及び均質なポア寸法及び組織を有するシートの形態のものとすることができる。好ましくは、コラーゲン／エラスティン薄膜は、次のような仕様のものとする。すなわち、厚さ０．７５ｍｍ、長さ４．８から５．２ｃｍ、幅４．８から５．２ｃｍ、コラーゲン含有率＞７９％及び油脂含有率０．４％である。軟骨細胞は、植込み可能な物を形成し得るよう上記に説明したように、この支持体上で培養することができる。植込み可能な物は、軟骨の欠陥箇所内に又はその上方に配置することができる。
【００５２】
別の実施形態において、支持基質２２は、小腸粘膜下組織（「ＳＩＳ」）にて形成することができる。小腸の一部分からＳＩＳを作成する方法は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた、米国特許第４，９０２，５０８号に詳細に記載されている。ブタ、ヒツジ又はウシの種から採取されることが好ましい小腸の一部分は、最初に、長手方向への掃引動作を使用して剥離し、外層（特に、漿膜及び筋層）及び内層（少なくとも、粘膜の内腔部分）の双方を除去する。典型的に、小腸の粘膜下組織は食塩水で水洗いし且つ、選択的に以下のようにして使用される迄、水和化又は乾燥状態に保存する。
【００５３】
重ね合わせた複数層の小腸の粘膜下組織が圧縮し、互いに固着し且つその内容を参考として引用し本明細書に含めた、米国特許第５，７８８，６２５号、米国特許第５，９２２，０２８号及び米国特許第６，１７６，８８０号（Ｄｕｐｕｙ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ（インディアナ州、ワルソー）に譲渡）に記載されたように、多層の再構築構造体を提供する。多層構造体には、内部成長の軟骨性構造体を置換するため、所望の厚さを有する再構築組織移植片構造体を形成するのに十分な数の粘膜下組織の層が設けられている。
【００５４】
本発明にて使用可能なその他のＳＩＳ薄膜は、Ｍｅｎｔｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州、サンタバーバラ））のＳｕｓｐｅｎｄ  Ｓｌｉｎｇ（登録商標）、グレイカー・バスキュラー・インコーポレーテッド（テキサス州、ダラス）からのＳｔａｐｌｅ  ｓｔｒｉｐｓ（登録商標）、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃマサチューセッツ州、ナティック）からのサージカルファブリックス、クック・バイオテック・インコーポレーテッド（Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）（インディアナ州、ウエスト・ラファイエット））からのサージＳＩＳ（登録商標）スリング及びサージＳＩＳ（登録商標）メッシュ（ＳｕｒｇｉＳＩＳ  Ｓｌｉｎｇ  ａｎｄ  ＳｕｒｇｉＳＩＳ  Ｍｅｓｈ）、セントロン・メディカル・インコーポレーテッド（Ｓｅｎｔｒｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ）（オハイオ州、シンシナチ））からのＳＩＳヘルニナ・リペア・ディバイス、デュピュイ・オーソペディクスからのリストア（Ｒｅｓｔｏｒｅ）（登録商標）ソフト・ティシュー・インプラントを含む。
【００５５】
本発明に従って支持基質２２又は被覆基質２に対して採用可能である別の薄膜は、その内容を参考して引用し本明細書に含めた、米国特許第５，８３７，２７８号（Ｅｄゲーストリッヒ・ゾーネＡＧ（Ｅｄ  Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ）に譲渡）に記載された再吸収性コラーゲン薄膜である。この再吸収性コラーゲン薄膜は、獣皮の表面、腱及び色々な動物の薄膜を有する皮部分のような自然の薄膜から得ることができる。このコラーゲン薄膜は、細胞の成長を促進する繊維状側部と、細胞の接着を阻止する平滑な側部とを有している。この薄膜は脂肪を鹸化し且つ、アルカリ感受性物質を分解するためアルカリで処理し、酸感受性物質を分解するため酸で処理し、洗浄し、乾燥させ、必要であるならば、架橋結合して作成する。
【００５６】
本発明に従って、支持基質２２又は被覆基質２として使用可能であるその他のコラーゲン薄膜は、ＦｏｒｔａＦｌａｘ（登録商標）（Ｉ型コラーゲンから作製）及びＯｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｉｎｃ（マサチューセッツ州、キャントン））からのＧｒａｆｔ  Ｐａｔｃｈ（登録商標）（架橋結合したコラーゲンから作成）を含む。更に、ＯｐｉｃｒｉｎＳ．ｐ．Ａ（イタリア、コルロ））からのウマのコラーゲンＩ型組成物も本発明にて使用可能である。
【００５７】
支持基質２２又は被覆基質２として使用するのに適したその他の薄膜は、Ｃｏｌｌａ−Ｔｅｃ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、プランスボロ）からのコラテック薄膜、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州、プランスボロ）、Ｃｏｌｌａｒｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、フランクリンレイクス））からのＢｉｏＭｅｎｄ（登録商標）アブソーバブル・コラーゲン・メンブランを含む。ブタの皮膚（実質的に全てのコラーゲン）から作成された、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＵｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｅｎｎｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ（ミネソタ州、セントポール））からのＢｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｍｅｓｈ及びＣｏｌ−Ｂａｒ，Ｌｔｄ（イスラエル、ラマット−ハッシャロン））からのＢＩＯＢＡＲ（登録商標）も本発明の支持基質２２又は被覆基質２に使用可能な材料である。
【００５８】
更に、膜の分子レベルに配置された繊維を有するコラーゲン薄膜も支持基質２２又は被覆基質２として使用するのに適している。かかる薄膜は、例えば、メディオラウム・ファーマシューシティＳ．Ｐ．Ａ．及びオポクリンＳ．Ｐ．Ａ．による国際公開ＷＯ０２／０９７９０号に記載されている。
【００５９】
別の実施形態において、支持基質２２及び（又は）被覆基質２は、還元砂糖又は例えば、その内容の全体を参考として引用し本明細書に含めた、米国特許第５，９５５，４３８号（イスラエル，ラマット−ハッシャロンのＣｏｌＢｅｒ  Ｒ＆Ｄ  Ｌｔｄ）に開示されたような還元砂糖の誘導物を介して互いに架橋結合されるコラーゲンフィブリルにて形成されることができる。かかる砂糖は、非限定的に、リボース、グリセロース、トレオース、エリトロース、リキソース、キシソース、アラビノース、アロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース又はその他の任意のジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、セプトース、オクトース、ナノース又は、ジコース及び上記の１つ又は２つの組み合わせ体を含むことができる。支持基質２２及び（又は）被覆基質２は、基質が再生する間、治療効果を有する抗生物質を含むこともできる。かかる抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、スルホンアミド、抗真菌物質、マイコナゾール（ｍｙｃｏｎａｚｏｌｅ）、抗炎症の、コルチゾンを含む。線維芽細胞の成長因子、血小板誘導成長因子、変態成長因子、分化成長因子等のような組織誘発性性質を有する因子もまた支持基質２２内に含まれる。
【００６０】
本発明にて使用可能なコラーゲン材料は、米国特許第５，２５６，４１８号及び米国特許第５，９９３，８４４号（オルガノジェネシス・インコーポレーテッドに譲渡）、米国特許第６，２０６，９３１号（クック・バイオテック・インコーポレーテッドに譲渡）及び米国特許第５，０２６，３８１号（コラ−テック・インコーポレーテッドに譲渡）に開示されており、これら特許の全てはその内容を参考として引用し本明細書に含めてあり、また、本明細書にて論じた１つ又は２つの製品に関するものである。
【００６１】
支持基質２２又は被覆基質２として使用可能であるが、米国で未だ販売されていない製品は、ＭＡＣＩ−ＭａｉｘＲ（ドイツ国、マトリセル、ホーゾゲンラス（Ｍａｒｉｃｅ  Ｈｅｒｚｏｇｅｎｒａｔｈ））、Ｂｉｏ−Ｓｅｅｄ  Ｃ（フロリダ州、マイアミ、Ｂｉｏｔｉｓｓｕ）及びＶｉｖｅｓ  ＣａｒｔとＰＬＡ／ＰＧＡ共重合体（オランダ国、ビルソベンのアイソティス（ＩｓｏＴｉｓ））を含む。
【００６２】
別の実施形態において、支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた、欧州特許第４４６，２６２号（スイス国、ウォールセンのゲイストリッヒ・ゾーンＡＧ）に記載されており、抗生物質タウロリディン及び（又は）タウロタムを含むコラーゲン繊維の海綿で形成することができる。コラーゲン海綿は、スイス国バーゼルのペンタファームＡＧ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  ＡＧ）、ドイツ国ビラーベックのドクター．オットー・スウェラック（Ｄｒ．Ｏｔｔｏ  Ｓｕｗｅｌａｋ）ＧｍｇＨ又はスイス国ウォルセンのＥｄゲーストリッヒ・ゾーネＡ．Ｇのような商業的供給先から得ることができる。コラーゲン海綿は、従来の方法で形成することもできる。例えば、ウシ皮を化学的に且つ機械的に処理してエピダミスをその下方の関係した脂肪分から分離することができる。次に、その層を弱アルカリで処理し、その後、酸で処理し、その後に、洗浄することができる。タンパク分解酵素を使用してコラーゲンをその他のタンパク質から分離し、また、リパーゼを使用して残留する脂肪分を除去することができる。次に、コラーゲン製品を酸化剤で処理し、均質化し且つ凍結乾燥させることができる。タウロリディン又はタウロタムを含めることは、凍結乾燥する前に行うか又はタウロリディン又はタウロタムの溶液中に凍結乾燥させたコラーゲンを再溶解させ且つ再乾燥凍結させることにより、行うことができる。
【００６３】
別の実施形態において、支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた、国際出願ＷＯ９９／２７３１５号（ドイツ、Ｈｅｓｈｃｅｌ  Ｉｎｇｏ  Ｄｉｐｌ  Ｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に記載された多孔質構造体を製造する方法に従って形成することができる。多孔質構造体は、焼鈍しし且つ異なる温度を有することができる、２つの介在面の間で冷却させることにより、少なくとも部分的に凝固した物質の液体又はペースト状の混合体から形成される。凝固する間、規則正しい構造体が形成される。次に、部分的に凝固した製品を凍結乾燥させて均質な多孔質構造体を形成する。
【００６４】
支持基質２２又は被覆基質２は、またその内容を参考として引用し本明細書に含めた、米国特許第５，８６９，０８０号（ニュージャージー州、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．に譲渡）に記載された方法に従って相互に接続した大きいポアを有するコラーゲン、フィブリン、ラミニン及びファイブロネクティンのような１つ又は２つ以上の生体吸収性重合体で形成することができる。この吸収性ポリマーは、例えば、凍結前に、ヘキサメチレンジソシアネイト（ＨＭＤＩ）にて架橋結合することができる。
【００６５】
支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた、１９８５年９月の「インスタット・コラーゲン吸収性ヘモスタット（Ｉｎｓｔａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔ）」という名称のジョンソン・アンド・ジョンソンの小冊子に記載されたような、Ｉｎｓｔａｔ（登録商標）（ジョンソン・アンド・ジョンソン）のようなコラーゲン海綿にて形成することができる。
【００６６】
別の実施形態において、支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた、米国特許第５，７００，４７６号（ニュージャージー州、ジョンソン・アンド・ジョンソン・メディカル・インコーポレーテッドに譲渡）に記載された方法に従って生体吸収性海綿にて形成することができる。該海綿は、基質構造体と少なくとも１つの下部構造体と、少なくとも１つの薬理学的活性薬剤とを備えている。基質及び下部構造体は、特に、コラーゲン、ラミニン、エラスティン及びファイブロネクティンのような生体吸収性材料で形成することができる。更に、海綿基質は、また１つ又は２つ以上のタンパク質又は１つ又は２つ以上のポリサッチャライド又はその混合体を備えることができる。薬理学的剤は、特に、抗生物質、シトカイン、成長因子又は、抗体を含むことができる。
【００６７】
別の実施形態において、支持基質２２又は被覆基質２は、その内容を参考として引用し本明細書に含めた国際出願ＷＯ９６／２５９６１号（ゲイストリッヒ・ゾーンＡＧに譲渡）に記載されたようなコラーゲン繊維から形成される。基質は、チョンドロイチン硫酸塩、ケラチン硫酸塩、ダーマタン硫酸塩及びヒアルロン酸及び成長因子のようなグリコサミノグリカンを備えるヒドロゲル様材料を更に含むことができる。かかる基質の一例は、その内容の全体を参考として引用し本明細書に含めた、Ｏｒｇｉｌｌ等に付与した米国特許第５，４８９，３０４号に記載されている。
【００６８】
支持基質２２及び被覆基質２は、またその内容を参考として引用し本明細書に含めた、国際出願ＷＯ９９／１９００５号（ゲーストリッヒ・ゾーンＡＧ）及び米国公告第２００２／００１３６２７号（ゲーストリッヒ等）に記載されたように、主として、コラーゲンＩＩ型の多孔質層と、少なくとも１つの稠密なバリア層とを備える多層薄膜にて形成することもできる。基質層は、開放海綿様組織を有し、バリア層は、比較的不透過性の密な組織を有する。更に、基質層は、特に、ヒアルロン酸、チョンドロイチン硫酸塩、ケラチン硫酸塩及びダーマトン硫酸塩ようなグリコサミノグリカンを更に含むことができる。基質層は、またラミニン・ファイブロレクティン・カルシウム・アルギネート又はアンチョリンＩＩ及び成長因子を含むことができる。バリアは、コラーゲンＩ及びＩＩＩ又はポリエステル、ポリグリコリック、ポリラクティク酸、ホモポリマー及び共重合体、グリコライド及びラクチド共重合体、ポリオルソエルテル及びポリカプロラクトンで形成するような合成材料で形成することができる。
【００６９】
ポリエステルのような合成材料を含む薄膜の例は、本発明に含まれており且つＳｏｆｒａｄｉｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（フランス、トレボー）からのＰａｒｉｅｔｅｘ（登録商標）Ｍｅｓｈ及びＰａｒｉｅｔｅｘ（登録商標）のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍｅｓｈ、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州、フラミンガム）からのＳｅｐｒａ  Ｍｅｓｈ（登録商標）及びＣ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、マレーヒル））からのＣｏｍｐｏｓｉｘ（登録商標）メッシュがその一例である。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、支持基質２２及び（又は）被覆基質２２はペリカーディウムにて形成される。本発明にて使用可能なぺリカーディウムから形成された薄膜の例は、Ｔｕｔｇｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州、パーシパニー）からのＴｕｔｏｐａｔｃｈ（登録商標）、Ｂｉｏ  Ｖａｓｃｕｌａｒ（ミネソタ州、セントポール）からのＰｅｒｉ−Ｇａｕｒｄ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ及びＢｉｏ  Ｖａｃｕｌａｒ  Ｓｌｉｎｇを含む。
【００７１】
本発明の特定の側面は、異なる支持基質と接触したとき、軟骨細胞の振舞いを研究するため、生体外システム内で使用することにより例示されている。この生体外試験は、特定の材料が関節鏡法に機械的に耐え得る能力を予測し且つ軟骨細胞の成長振舞いに関する情報を提供する。
【００７２】
本発明の上記及びその他の側面は、非限定的に、本発明を示すことを目的とする以下の実施例から一層良く理解することができる。
【実施例１】
【００７３】
血管が自家植込みの軟骨又は軟骨細胞に成長するのを防止するため、本発明に従ってサージセル（登録商標）を使用可能であるようにすべく、我々はグルタリック・アルデヒドのような固定剤にてサージセル（登録商標）を処理した。我々は、１分間、サージセル（登録商標）を０．６％のグルタリック・アルデヒドで処理することを選び、その後、成長して組織にとって有害となるであろうグルタリック・アルデヒドの残留物を除去した。これと代替的に、実施例２に記載されているグルタリック・アルデヒドにて処理する前に、サージセル（登録商標）をＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）（オーストリア、ウィーン、Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ）と称されるフィブリン接着剤で処理した。我々は、例えば、グルタリック・アルデヒドのような固定剤にて固定したサージセル（登録商標）は、滅菌生理学的食塩水（０．９％）にて洗浄し且つ冷蔵庫に貯蔵したとき、１から２ヶ月間、溶解しないことがわかった。全体として、サージセル（登録商標）は、７から１４日の期間で再吸収した。この期間は短か過ぎる、それは、植込んだ軟骨細胞が固体の軟骨層に成長して、隣接する軟骨からその必要な栄養分を得る前に、骨構造体から得られたような血管又は血管形成部分が植込んだ軟骨内に成長するのを防止するため、より長い時間が必要とされるからである。別言すれば、例えば、１ヵ月といったより長時間、血管形成を十分に阻止することが必要である。このため、製品は、その時間の前に顕著に吸収されてはならない。他方、最終的に再吸収が必要とされる。従って、阻止バリアとして使用される有機質材料は、これらの能力を備えなければならず、我々は、このようにして処理したサージセル（登録商標）はその機能を提供することがわかった。
【実施例２】
【００７４】
サージセル（登録商標）は、有機質接着剤で被覆したが、この場合、我々は、接着剤としてティッセール（登録商標）を使用した。この製品は、サージセル（登録商標）共に、我々の特定の目的に使用可能なバリアを形成する。任意のその他の止血又は血管阻止バリアを使用することができる。ティッセール（登録商標）は、以下に説明するように、混合させた。次に、サージセル（登録商標）は、浸漬する迄、両側部にサージセル（登録商標）を噴霧することによりティッセール（登録商標）で被覆した。次に、ティッセール（登録商標）（フィブリン接着剤）を室温にて凝固させた。完全に凝固する直前に、サージセル（登録商標）を１分間、０．６％グルタリック・アルデヒドに入れ、次に、滅菌生理学的（０．９％）食塩水にて洗浄した。次に、ｐＨが７．２から７．４にて安定する迄、ＰＢＳ及び（又は）ＮａＯＨにてｐＨを調整した。その後、このようにして処理したサージセル（登録商標）を１５ｍＭヘプス緩衝液にて最小必要限培養基／Ｆ１２のような組織培養基内で洗浄した。
【００７５】
この実施例にて説明したように、サージセル（登録商標）を被覆するフィブリン接着剤としてティッセール（登録商標）を使用した。更に、フィブリン接着剤又は糊を骨に向けて病変部の底部に直接、施し、該病変部にサージセル（登録商標）を接着する。生体内試験に代えて使用した生体内システムは、細胞研究作業用ナンクロン（ＮＵＮＣＬＯＮ）（登録商標）デルタ６−ウェル滅菌性使捨て型プレート（デンマーク、ローズキルドのＮＵＮＣ（インターメド））（ＮＵＮＣ（ＩｎｔｅｒＭｅｄ））から成るものとした。ウェルの各々の寸法は直径約４ｃｍである。
【００７６】
本発明において、フィブリン接着剤は、フィブリン成分共に、人体内で許容できる糊を発生させる任意の接着剤とすることができる（Ｉｈａｒａ  Ｎ．等のＢｕｒｎｓ  Ｉｎｃｌ．Ｔｈｅｍ，Ｉｎｊ．，１９８４，１０：３９６）。本発明は、またフィブリン接着剤に代えて使用可能である任意のその他の糊成分を使用することも予測する。この実施例において、我々は。ティッセル（登録商標）又はＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（オーストリア、ウィーンのイムノＡＧ）を使用した。ティッセール（登録商標）キットは、以下の構成要素から成っている。
【００７７】
その凝固可能なタンパク質、フィブリノゲン、プラズマフィブリネチン（ＣＩＧ）及び因子ＸＩＩＩ、プラズミノゲンを含む、凍結乾燥させたウィルス不活性化したシーラであるティッセール（登録商標）。
【００７８】
アプロチニン溶液（ウシ）
スロムビン４（ウシ）
スロムビン５００（ウシ）及び
塩化カルシウム溶液
ティッセール（登録商標）キットは、ＤＵＰＬＯＪＥＣＴ（登録商標）アプリケーション・システムを含む。ティッセール（登録商標）キットを使用するフィブリン接着剤又は２成分シーラントは、イムノＡＧ製品添付説明書に記載された方法にて組み合わせる。
【実施例３】
【００７９】
軟骨細胞は、ＨＡＭＦ１２及び１５ｍＭのへプス緩衝液及び５から７．５％の自家血清を含む必要最小限の培養基内でＣＯ２培養器に入れて３７℃にて成長させ且つデンマーク、コペンハーゲン、ベルゲンヨーロッパＡ／Ｓシンビオンサイエンスパーク、クラス１００試験室（Ｃｌａｓｓ  １００  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｔ  Ｖｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ，Ｓｙｍｂｏｉｎ）で取り扱った。培養基のその他の組成物は、軟骨細胞を培養するために使用することができる。細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し、バーカーターク（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ）チャンバ内でトライパン・ブルー生存率染色法を使用してカウントした。細胞のカウント値は、ｍｌ当たり７．５ｘ１０５細胞となるように調整した。１つのナンクロン（登録商標）プレートは、クラス１００試験室内で露出させた。
【００８０】
サージセル（登録商標）止血バリアをナンクロン（登録商標）組織培養トレー内のウェルの底部に嵌まる適宜な寸法になるように切断した。この場合、寸法約４ｃｍのサークル（但し、任意の可能な寸法とすることができる）をナンクロン（登録商標）組織培養トレーのウェルの底部に滅菌状態に配置した。細胞研究作業用のデルタ６用の滅菌使捨て型プレートを使用した（デンマーク、ロスキルドのＮＵＮＣ（インターメド））。ウェルの底部に配置すべき止血バリアを、実施例１に記載したように前処理した。この処理は、サージセル（登録商標）の吸収を顕著に遅らせる。次に、止血バリアを蒸留水で数回、洗浄し、その後、反応しないグルタリックアルデヒドが洗い流される迄、数回、洗浄した。血清を含む少量の細胞培養基を止血バリア内に吸収されるように施すと同時に、止血バリアをウェルの底部に湿潤状態に保った。
【００８１】
１ｍｌの培養基内に約１０６細胞の多数の細胞を止血材の頂部に直接配置し、止血バリアの表面上に分散させ、上述したように、０．４％をグルタリックアルデヒドにて前処理した。次に、プレートは、６０分間、３７℃のＣＯ２培養器内で培養した。５から７．５％の血清を含む、２から５ｍｌの組織培養基を押し出すとき、ピペット先端がウェルの側部に対し正接状態となるように保持することで細胞の撥ね出しを回避しつつ、細胞を保持するウェルに慎重に取り付けた。培養基のｐＨは低過ぎるように思われた（ｐＨは約６．８）。次に、ｐＨを７．４から７．５となるように調整した。翌日、束に配置した止血バリアにて一部の軟骨細胞が成長し始めた。一部の細胞は、ｐＨを調整する前に、低過ぎるｐＨに露呈されたことにより死滅した。プレートは、３から７日間培養し、３日毎に培養基を交換した。
【００８２】
培養期間の終了時、培養基の水を除去し、カコジル酸塩ナトリウムとも称されるジメチルアーセニック酸の０．１Ｍナトリウム塩を含む、２．５％グリタリックアルデヒドを低温冷蔵し、ｐＨをＨＣＩにて７．４に調整し、細胞及び支持体（止血バリア）を作製するための固定剤として追加し、電子顕微鏡用に後で作成し得るようにした。
【実施例４】
【００８３】
軟骨細胞は、ＨＡＭＦ１２及び１５ｍＭのへプス緩衝液及び５から７．５％の自家血清を含む必要最小限の培養基内でＣＯ２培養器に入れて３７℃にて成長させ且つデンマーク、コペンハーゲン、ベルゲンヨーロッパＡ／Ｓシンビオンサイエンスパーク、クラス１００試験室で取り扱った。培養基のその他の組成物は、軟骨細胞を培養するために使用することができる。細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し、バーカータークチャンバ内でトライパン・ブルー生存率染色法を使用してカウントした。細胞のカウント値は、ｍｌ当たり７．５ｘ１０５細胞となるように調整した。１つのナンクロン（登録商標）プレートは、クラス１００試験室内で露出させた。
【００８４】
サージセル（登録商標）（止血バリアとして使用するためのもの）を実施例１に記載したように、１分間、０．６％のグルタリックアルデヒドにて処理し且つ０．９％の滅菌塩化ナトリウム又は好ましくは、ＰＢＳ緩衝液のような緩衝液又はＭＥＭ／Ｆ１２のような培養倍地にて洗浄したが、その理由は、グルタリックアルデヒドにて処理した後、ｐＨは６．８であっても、７．０から７．５であることが好ましいからである。ティッセール（登録商標）をデュプロジェクト（登録商標）システムを使用してサージセル（登録商標）の両側部に施し、これにより、サージセル（登録商標）の両側部を被覆し、パッチは、フィブリン接着剤と共に使用することを目的とする。糊は、少なくとも３から５分間、滅菌状態にて乾燥させる。「被覆した」止血バリアを細胞研究作業（デンマーク、ロスキルド、ＮＵＮＣ（ＩｎｔｅｒＭｅｄ））に対してナンクロン（登録商標）デルタ６−ウェルの滅菌性使捨て型プレート内のウェルの頂部に配置した。血清を含む少量の組織培養基を止血バリアに吸収されるように施した。血清を含む１ｍｌの組織培養基内の約１０６細胞という多数の細胞を止血バリアの頂部に直接配置し、止血バリアの表面上で分散させた。次に、プレートを６０分間、３７℃のＣＯ２培養器内で培養した。培養基を押し出すとき、ピペット先端をウェルの側部に対して正接状態に保持することにより、細胞の撥ね出しを阻止しつつ、５から７．５％の血清を含む、２から５ｍｌの組織培養基の量を、細胞を保持するウェルに慎重に加えた。３から６日間の顕微鏡検査の結果、細胞は、満足し得る仕方にてサージセル（登録商標）に接着し且つサージセル（登録商標）内に成長し、サージセル（登録商標）は軟骨細胞に対する毒性を示さず、軟骨細胞は満足し得る仕方にてサージセル（登録商標）内に成長したことを示唆することがわかった。
【００８５】
プレートは、３から７日間、培養し、３日目に培養基を交換した。培養期間の終了時、培養基の水分を除去し、カコジル酸塩ナトリウムと称される、０．１Ｍのジメチルアーセニックナトリウム塩を含む、２．５％グリタリックアルデヒドにて低温冷蔵し、ｐＨをＨＣＩにて７．４に調整し、電子顕微鏡用に後で作成するため細胞及び支持体（止血バリア）を作成すべく固定剤として追加した。
【実施例５】
【００８６】
ＨＡＭＦ１２及び１５ｍＭのヘップス緩衝液及び５から７．５％の自家血清を含む必要最小限の培養基内にて３７℃のＣＯ２倍容器に入れて軟骨細胞を成長させ且つ、デンマーク、コペンハーゲンのシムビオンサイエンスパークのＶｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓにおけるクラス１００試験室にて取り扱った。細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し、バーカ・ターク（Ｂｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ）チャンバ内でトリパンブルー生存率染色法を使用してカウントした。細胞のカウント値は、ｍｌ当たり７．５×１０５から２×１０６となるように調整した。１つのナンクロン（商標名）プレートをクラス１００試験室内で露出させた。
【００８７】
Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）は、再吸収性の２重薄膜であり、該２重層薄膜は、自家移植によって培養した軟骨細胞がその内部に移植される関節欠陥領域を覆うパッチ又はバンデージとして使用される。バイオギド（商標名）は、ＣＨ−６１  １０ウォルセンのＥ．Ｄ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｈｏｎｅ  ＡＧにより標準化された制御状態の製造方法によって得られる純粋なコラーゲン薄膜である。コラーゲンは、獣医の証明を受けたブタから抽出され、抗原性反応を回避し得るように慎重に精製し且つガンマ光線によって二重ブリスタ内で滅菌処理する。２重層薄膜は多孔質面及び高密度面を有する。薄膜は、更なる架橋結合又は化学的処理を行わずにＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンで作られる。コラーゲンは２４週間以内で吸収される。薄膜は、湿潤状態となったときも、その構造的完全さを維持し且つ縫合糸又は釘によって固定することができる。薄膜は、縫合糸に代えてＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）のようなファイブリン接着剤を使用して隣接する軟骨又は組織に、又は縫合糸により互いに「糊付け」することができる。
【００８８】
バイオギド（登録商標）は、クラス１００試験室内で露出させ且つナンクロン（商標名）組織培養トレーのウェルの底部に滅菌状態に配置し、２重層薄膜の多孔質面が上向きとなり又は高密度面が上向きとなる状態で、細胞研究作業（デンマーク、ロスキルドのＮＵＮＵ（インターメド））用のデルタ６ウェル滅菌使捨型プレートを使用した。血清を含む１ｍｌの組織培養基内に約１０６の細胞をバイオギド（登録商標）の上部に直接配置し、バイオギド（登録商標）の多孔質面又は高密度面の上で分散させた。次に、プレートを、６０分間、３７℃のＣＯ２培養器内で培養した。培養基を押し出すとき、ピペット先端をウェルの側部に対し正接状態に保持することにより、細胞の撥ね出しを回避しつつ、５から７．５％の血清を含む２から５ｍｌの組織培養基をウェルに慎重に加えた。
【００８９】
バイオギド（登録商標）を保持するウェル内に軟骨細胞を配置した後の２日目に、Ｎｉｋｏｎ反転顕微鏡を使用して細胞を検査した。一部の軟骨細胞は、バイオギド（登録商標）の端縁に接着していることがわかった。この顕微鏡を使用してバイオギド（登録商標）自体を見ることはできなかった。
【００９０】
プレートは、３から７日間、培養し、３日目に培養基を交換した。培養期間の終了時、培養基の水分を除去し且つ、低温冷蔵した。カコジル酸塩ナトリウムとも称される、ジンメチルヒ素酸の０．１Ｍナトリウム塩を含む、２．５％グルタルアルデヒド溶液を、ＰＨをＨＣＩにて７．４に調整して細胞及びバイオギド（登録商標）支持体を作成するための固定剤として追加し、細胞は、多孔質面、又は高密度面にて培養した。次に、バイオギド（登録商標）パッチをデンマーク、Ｈｅｒｌｖ病院の病理学部門での電子顕微鏡研究のため送った。
【００９１】
電子顕微鏡による観察の結果、バイオギド（登録商標）の高密度面の上で培養させた軟骨細胞はバイオギド（登録商標）のコラーゲン構造体内に成長しない一方、多孔質面の上で培養させた細胞は、実際にコラーゲン構造体内に成長し、更に、プロテログリカンの存在を示すものの、線維芽細胞構造体の兆候は何ら示さないことがわかった。この結果から、例えば、バイオギド（登録商標）パッチのようなコラーゲンパッチを軟骨欠陥部を被うパッチとして縫ったとき、コラーゲン軟骨の多孔質面は、培養した軟骨細胞を注射すべき欠陥部に向けて下向きとなることがわかった。次に、これらは、コラーゲンに侵入且つ、無傷の面と一直線の平滑な軟骨面を形成し、この領域内に、プロテオグリカンの平滑層が蓄積する。一方、コラーゲンパッチの高密度面が欠陥部内に下向きとなるならば、植え込むべき軟骨細胞は、コラーゲンと一体化されず、細胞は、上述したものと同一の平滑面を生じさせる。
【実施例６】
【００９２】
軟骨細胞は、ＨＡＭＦ１２と、１５ｍＭへプス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液と、５から７．５％の自家血清とを含む、最小必要限の培養基内で３７℃のＣＯ２培養器に入れて成長させ且つ、デンマーク、コペンハーゲンのシムビオンサイエンスパークのベルゲン・ヨーロッパ  Ａ／Ｓのクラス１００試験室で取り扱った。細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し且つ、バーカーターク・チャンバー内でトリパンブルー生存率染色法を使用してカウントした。細胞のカウント値は、ｍｌ当たり７．５×１０５から２×１０６細胞となるように調整した。１つのナンクロン（登録商標）プレートをクラス１００試験室内で露出させた。
【００９３】
再吸収性の２二重層薄膜として使用されたバイオギド（登録商標）は、また、製品の説明書に記載されている、通常、ティッセール（登録商標）で見られるよりも著しく高含有量の追加的なアプロティニンを加えてティッセール（登録商標）のような有機質糊と共に使用することができる。アプロティニンの含有量を約２５，０００ＫＩＵ／ｍｌまで増大させることにより、材料の吸収は、通常の数日という期間ではなくて、３週間だけ遅れる。
【００９４】
この特徴を生体外試験するため、ティッセール（登録商標）をナンクロン（登録商標）プレートのウェルの底部に施し且つ完全に凝固するようにする。次に、バイオギド（登録商標）のようなコラーゲンパッチをティッセール（登録商標）の外側に施し且つ、ウェルの底部に糊付けする。バイオギド（登録商標）及びティッセール（登録商標）のこの組み合わせ体は、軟骨細胞移植領域内の血管の成長又は侵入を阻止し又は防止する止血バリアとなるような設計とされている。次に、この複合的コラーゲンパッチは、病変部の底部（修復すべき表面に最も近接する）における止血バリアとして、また、軟骨を形成する支持体としても使用することができ、それは、末端面は、コラーゲンパッチの多孔質の側部となり、これにより軟骨細胞及び軟骨基質の侵入を促進することができるからである。このように、この複合的コラーゲンパッチは、インプラントの頂部を覆うために使用することもでき、コラーゲンの多孔質面は、植え込んだ軟骨細胞及び頂部を形成するバリアに向けられる。増殖したアプロティニン成分を有する複合的コラーゲンパッチは、また、ティッセール（登録商標）のような任意の有機質糊を使用せずに使用し且つ欠陥部内に直接配置し、自然の力によって接着させることができる。このように、コラーゲンパッチは、止血バリアとして及び修復／移植箇所の細胞が存在しない被覆の双方として使用し、パッチの多孔質面が移植した軟骨細胞／軟骨に向けられるようにすることもできる。別の変更例は、ＩＩ型コラーゲンから成るコラーゲンパッチを使用するものである（ゲイストリッチゾーンＡＧ、ＣＨ−６１  １０ウォルセン）
このように、本発明は、複合的コラーゲンパッチを提供し、該パッチが有機質基質糊と関係してアプロティニン成分の量が増大した、好ましくは約２５，０００ＫＩＵ／ｍｌのアプロティニン成分を有するコラーゲン基質であり、この場合、コラーゲン成分は、バイオギド（登録商標）と同様に、再吸収性の２重層材料又はＩＩ型コラーゲンであり、有機質糊は、ティッセール（登録商標）材料と同様である。別の実施形態において、複合的コラーゲンパッチは、修復箇所に接着するために何らの有機質糊も使用しない。
【実施例７】
【００９５】
上述したようなキットは、本発明の方法を便宜に実施することを可能にする。１つの好ましい実施の形態において、本発明のキットは、外科手術の環境にて容易に使用するのに適した滅菌構成要素を提供し、また、適宜な止血バリア、適宜な被覆パッチを提供し、また、必要であるならば、有機質糊を提供する。本発明のキットは、また、関節表面の欠陥部内に植え込まれる自家軟骨細胞を支持するための滅菌、細胞無しの基質材料をも提供することができる。一実施形態において、本発明のキットは、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）止血バリア及びティッセール（登録商標）有機質糊の適宜な被覆を有するバイオギド（登録商標）被覆パッチを保持しており、この場合、サージカル（登録商標）及びバイオギド（登録商標）は本発明の教示に従って処理され、再吸収される迄の時間を長くする。ティッセール（登録商標）が予め被覆されている場合、一実施形態において、ティッセール（登録商標）には、再吸収時間を長くし得るよう追加的なアプロティニンが補充されている。
【００９６】
別の好ましい実施の形態において、止血バリア及び被覆パッチの双方は、材料の再吸収時間を長くし得るように処理された半透過性コラーゲン軟骨である。また、修復／移植手術の各々が遭遇する固有の変化及び独特の環境の必要に応じて別個の構成要素としての改良された形態にてティッセール（登録商標）糊を施すことも可能である。
【００９７】
概略説明した本発明の精神又は範囲から逸脱せずに、特定の実施の形態にて示した本発明に対し多数の変更例及び（又は）改変例を具体化することが可能であることは、当該技術分野の当業者に理解されよう。従って、当該実施の形態及び実施例は、全ての点にて単に一例であり且つ限定的なものではないと見なすべきである。
【実施例８】
【００９８】
軟骨細胞は、デンマークコペンハーゲンのベルゲン移植サービスＡｐＳ又はドイツルーベックのＤＫ又はルーベック大学にて、上述したように成長培養基内で３７℃のＣＯ２培養器内に入れて３週間、成長させ且つクラス１００試験室で取り扱った。「軟骨細胞を培養するため、その他の成長培養基の組成を使用することも可能であることを認識すべきである」。これらの細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し且つバーカータークチャンバ内でトリパンブルー生存率染色法を使用してカウントした。細胞のカウント数は、ｍｌ当たり７．５×１０５の軟骨細胞となるように調整した。１つのナンクロン（登録商標）プレートをクラス１００試験室内で露出させた。
【００９９】
支持基質の材料、具体的には、チャンドロ−ギド（登録商標）コラーゲン薄膜（チャンドラ−ギド（登録商標）がバイオギド（登録商標）よりも広い幅及び長い長さを有する点を除いて、バイオギド（登録商標）と同一である；その双方は、スイス、ウォルセン、ゲーストリッチ、ファマＡＧから入手可能であり、ナンクロン（商標名）の細胞培養トレー内のウェルの底部に嵌る適当な寸法に切断した。この場合、約４ｃｍの寸法のサークルをウェルの底部に滅菌状態に配置した。
【０１００】
３週間後、軟骨細胞を成長培養基から上述した移植培養基に移し換え、５ｍｌの移植培養基内で約５×１０６細胞支持基質の頂部に直接配置し且つ支持基質表面上に分散させた。プレートは、３日間、３７℃にてＣＯ２培養器内で培養した。この期間の後、軟骨細胞は束に配置され且つ、支持基質上で成長し始め、また、培養基により水洗いし、又は、基質に機械的に軽い圧力を加えた場合でも支持基質から除去することはできなかった。
【０１０１】
培養期間の終了時、移植培養基の水分を除去し、その上で成長した軟骨細胞を保持する支持基質を固定剤として添加された、０．１Ｍのジメチルヒ素酸ナトリウム塩を含む、２．５％グルタリックアルデヒド内で低温冷蔵した。支持基質は、組織構造の評価のため、サフラン（Ｓａｆｒａｎｉｎ）Ｏにて染色した。そのカラー顕微鏡写真の白黒コピーが図１３Ａに掲げてある。カラー写真は、また、顕微鏡写真の特徴を一層良く示すため、図１３ＡＡとしても添付されている。
【実施例９】
【０１０２】
軟骨細胞は、デンマークコペンハーゲンのベルゲン移植サービスＡｐＳ又はドイツのＤＫ又はルーベック大学にて上述したように成長培養基内で３７℃のＣＯ２培養器に入れて３週間、成長させ且つクラス１００試験室で取り扱った。これら細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し且つバーカータークチャンバ内でトリパンブルー生存率染色法を使用してカウントした。軟骨細胞のカウント数は、ｍｌ当たり５×１０５の軟骨細胞となるように調整した。１つのナンクロン（商標名）プレートをクラス１００試験室内で露出させた。
【０１０３】
チャンドロ−ギド（登録商標）支持基質は、実施例１と同様に、ナンクロン（商標名）細胞培養トレー内のウェルの底部に嵌る適当な寸法に切断した。この場合、直径約４ｃｍの寸法のサークルをウェルの底部に滅菌状態に配置した。
【０１０４】
３週間後、軟骨細胞を成長培養基から上述した移植培養基に移し換え、５ｍｌの移植培養基内で約５×１０６細胞支持基質の頂部に直接、配置し且つ支持基質の表面上で分散させた。プレートは、３週間、３７℃にてＣＯ２培養器内で培養した。
【０１０５】
培養期間の終了時、移植培養基の水分を除去し、固定剤として添加された０．１Ｍのジメチルヒ素酸ナトリウム塩を含む、２．５％グルタリックアルデヒド内で軟骨細胞を保持する支持基質を低温冷蔵した。支持基質は、組織構造の評価のため、サフラン（Ｓａｆｒａｎｉｎ）Ｏにて染色した。免疫化学組織分析のため、コラーゲン薄膜をメタノール−アセトン内で固定し且つ兎の抗ヒトＩＩ型コラーゲン、及びマウスの抗ヒトアグリケンを使用して、アグリケン及びＩＩ型コラーゲンに対して染色した。主要な抗体は、蛍光性の２次的抗体を使用して視覚化した。そのカラー顕微鏡写真の白黒コピーが軟骨細胞２４を示す図１３Ｂに掲げてある。カラー写真は、また、顕微鏡写真の特徴を一層良く示すため、図１３ＢＢとしても添付されている。
【０１０６】
チャンドラーギド（登録商標）支持基質上で３週間の培養期間内で、軟骨細胞は、成長し且つ担体の中央で束に形成し、また、表面に沿って直線状となることが観察された。
【実施例１０】
【０１０７】
軟骨細胞は、デンマークコペンハーゲンのベルゲン移植サービスＡｐＳ又はドイツのＤＫ又はルーベック大学にて上述したように成長培養基内で３７℃のＣＯ２培養器に入れて３週間、成長させ且つクラス１００試験室で取り扱った。これら細胞は、５から１０分間、トリプシンＥＤＴＡを使用してトリプシン加水分解し且つバーカータークチャンバ内でトリパンブルー生存率染色法を使用してカウントした。軟骨細胞のカウント数は、ｍｌ当たり５×１０５の軟骨細胞となるように調整した。１つのナンクロン（登録商標）プレートをクラス１００試験質内で露出させた。
チャンドロ−ギド（登録商標）支持基質は、実施例１の場合と同様に、ナンクロン（商標名）細胞培養トレー内のウェルの底部に嵌る適当な寸法に切断した。この場合、直径が約４ｃｍの寸法のサークルをウェルの底部に滅菌状態に配置した。
【０１０８】
３週間後、軟骨細胞を成長培養基から上述した移植培養基に移し換え、５ｍｌの移植培養基内で約５×１０６細胞を支持基質の頂部に直接配置し且つ支持基質の表面上で分散させた。プレートは、３週間、３７℃にてＣＯ２培養器に入れて培養した。
【０１０９】
次に、成長した軟骨細胞を保持する支持基質は、１６時間、コラゲナーゼにて培養した。次に、軟骨細胞を保持する支持基質を遠心分離した。細胞は、ナンクロン（商標名）プレートに接種し且つバーカータークチャンバ内でトリパンブルー生存率染色法を使用してアイコットをカウントした。その顕微鏡写真は図１１Ｃに示してある。計算した合計細胞数は６×１０６であり、生存率は＞９５％であることがわかった。
【実施例１１】
【０１１０】
当該実施例では、米国特許第４，９０２，５０８号（エシコン・インコーポレーテッドの子会社であるデュピュイに譲渡；デュピュイ薄膜又は図１６の「エシコン」）に従って作製された薄膜及びチャンドロ−ギド（登録商標）薄膜（スイス、ウォルセンのＥｄゲーストリッヒ・ゾーネ、ゲーストリッヒ・ファーマＡＧ）の毒性及び生体適合性の試験について説明する。３日、２週間及び６週間、デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）薄膜に接着させた軟骨細胞の生存率及び数を薄膜に接着した細胞数を視覚的にカウントすることにより、決定した。
【０１１１】
デュピュイ薄膜は、チャンドロ−ギド（登録商標）の薄膜をプラスの対照として試験され、また、同一の方法であるが、どんな薄膜も使用せずにマイナスの対照として試験された。
【０１１２】
予め凍結させたヒト軟骨細胞（１，４００万細胞）を解凍し且つ洗浄して、細胞数及び生存率を決定した。解凍後、３２０万の細胞が再生し、８７％の生存率であった。１６０万の細胞をｍｌ当たり５．３ｘ１０４細胞濃度にて２つの組織培養フラスコの各々に追加し且つ３日間、３７℃にて培養した。フラスコに対する形成される細胞数及び生存率は、３５０万の細胞で９８％の生存率及び３６０万の細胞で９３％の生存率であった。
【０１１３】
細胞のカウント数及び生存率を各薄膜の６つのサンプルに対して分析し、また、如何なる薄膜も無い対照群の６つのサンプルを分析した。この薄膜は、３日、２週間及び６週間、分析した。デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）薄膜のサンプルを２５．４ｍｍ（１インチ）の四角に切断した。デュピュイ薄膜の乾燥密度のため、薄膜の切断は多少困難である。
【０１１４】
軟骨は、トリプシン加水分解し且つ細胞の生存率及び細胞数を上述したように決定した。細胞は、遠心分離によりペレット化し且つｍｌ当たり１００万細胞の濃度となるように懸濁させた。
【０１１５】
デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）薄膜は、ｐＨ７．１７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて２回洗浄した。薄膜の各々を、培養皿のウェル内に挿入した。ｍｌ当たり１００万細胞の濃度の軟骨細胞を細胞懸濁液の１００マイクロリットルを薄膜の各々に且つ薄膜の無い６つのウェルの底部に施した。追加的な培養基（３ｍｌ）をウェルの各々に追加した。培養プレートは３７℃にて少なくとも３日間、培養した。
【０１１６】
図１４には、デュピュイ薄膜に接着させた軟骨細胞が示してある。細胞を３日、２週間及び６週間にて採取し且つカウントした。
デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）薄膜は、０．２５％トリプシンの２ｍｌ及びコラーゲン１ｍｌの混合体（合計５，０００単位）を含む酵素溶液にて処理して薄膜を溶解させ、このため、細胞をカウントし且つ生存率を決定することができた。溶融したならば、軟骨細胞を遠心分離によって採取し且つカウントした。酵素溶液による処理時間は、薄膜の型式とともに変化する。デュピュイ薄膜の場合、コラーゲンの消化は、チャンドロ−ギド（登録商標）の場合よりも遥かに長くかかった。デュピュイ薄膜は、２時間の消化後、完全には溶解しなかった一方、チャンドロ−ギド（登録商標）の薄膜は、約１から１．５時間にて完全に溶解した。細胞のストレスを回避するため、コラーゲンの消化は、２時間以上続けるべきではない。
【０１１７】
軟骨対照群をトリプシン加水分解し、洗浄し且つ遠心分離によってペレット化した。次に、細胞をＤＭＥＭ培養基内で懸濁させ且つ最終的な細胞数を確認した。
実験結果は、次の通りである。デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）を支持基質上で成長させた細胞と比較したが、対照細胞の生存率には顕著な変化は見られなかった。図１６に示すように、３日目に対照、チャンドロ−ギド（登録商標）支持基質及びデュピュイ支持基質内の細胞の生存率は高く、対照が約８７％、チャンドロ−ギド（登録商標）支持基質が約９４％及びデュピュイ支持基質が９３％であった。２週間時、対照群の生存率は、約９０％、チャンドロ−ギド（登録商標）群は約９１％、デュピュイ群は約８３％であった。６週間時、細胞の約８０％は、制御状態を示して生存しており、チャンドロ−ギド（登録商標）薄膜にて約８１％の細胞が生存する一方、デュピュイ支持基質の状態を使用したとき、細胞の約７４％が生存していた。このように異なる成長状態にて細胞の生存率が大幅に異なることはなかった。
【０１１８】
実際の細胞数は、培養の後半になる迄、デュピュイ及びチャンドロ−ギド（登録商標）により顕著に影響を受けることはなかった。図１５に示すように、３日間の時点にて、対照細胞は約７２，０００細胞に達する一方、チャンドロ−ギド（登録商標）の細胞は約１０９，１６７であり、デュピュイ細胞は支持基質上で約１６９，５８３細胞に達した。２週間にて、対照細胞は、５７５，１６７へと約８倍に増殖する一方、チャンドロ−ギド（登録商標）細胞は、４２７，５００へと約４倍となり、また、デュピュイ細胞は４９４，１６７へと約３倍となった。最後に、６週間にて対照細胞数は、約５２８，３３３へと僅かに減少する一方、チャンドロ−ギド（登録商標）細胞及びデュピュイ細胞は、それぞれ１５３，３３３及び１００，８３３へと劇的に減少した。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１Ａは典型的な骨の関節端部を示す図である。典型的に、骨材料は、関節表面上で軟骨キャップ（標識した軟骨を剥ぎ取ることにより図示）にて被覆されている。図１Ｂは軟骨キャップに欠陥又は損傷が生じたときの軟骨キャップ内の空隙を示す。その欠陥箇所を外科的方法により直接治療し、又は僅かに拡大することができる。選択的に、止血バリア（参照番号１）を軟骨キャップの欠陥部内に配置して、必要なとき、例えば、軟骨下層内に又はその下方に伸びる血管のような下方の骨から再生する軟骨内への血管形成を阻止し又は防止することができる。図１Ｃはその骨を示す。軟骨は、欠陥部のキャビティ内に植込み、次に、この止血バリアの頂部に積層し又は欠陥部の頂部に直接積層する。
【図２】欠陥箇所上でキャップ／パッチ又はバンデージを形成するために使用される基質によって被覆された軟骨キャップ（点彩領域）内の処置した欠陥部（点彩領域内の空隙）を示す図である。このキャップは、健常な軟骨に対するキャビティの端縁に縫合し又は接着して所要位置に固定し又はその他の方法で取り付ける。このキャップは、培養した軟骨が移植された関節欠陥領域を被覆する。
【図３】図３Ａは軟骨キャップを有する関節面を備える膝関節の骨の典型的な関節端部の図である。図３Ｂは骨の関節端部の軟骨キャップに対する軟骨欠陥部又は損傷部を示す図である。
【図４】本発明による植込み可能な物品の一実施形態の図である。
【図５】図６に示したような関節鏡導入器に入れて植込むため図４の植込み可能な物を配置する方法を示すである。
【図６】本発明に従って植込み可能な物を植込み箇所に植込む、関節鏡導入器の図である。
【図７】関節鏡器具を受け入れることができる１つのアクセス通路を使用して軟骨キャップ内の欠陥部又は損傷箇所に図５の植込み可能な物を配置する状態を示す概略図である。
【図８】軟骨下層内に伸びない欠陥部又は損傷部を有する軟骨及び接着剤によって欠陥部又は損傷箇所が連結された植込み可能な物の概略図断面図である。
【図９】軟骨下層内に伸びない欠陥部又は損傷部を有する軟骨及び機械的リテーナによって欠陥部又は損傷箇所に連結された植込み可能な物の概略断面図である。
【図１０】植込み可能な物を欠陥部又は損傷箇所に連結するために使用される機械的リテーナの一実施形態の図である。
【図１１】軟骨下層内に伸びる欠陥部又は損傷部分を有する軟骨及び接着剤により欠陥部又は損傷箇所に連結された本発明による植込み可能な物の概略断面図である。
【図１２】軟骨下層内に伸びる欠陥部又は損傷部を有する軟骨及び機械的リテーナによって欠陥部又は損傷箇所に連結された植込み可能な物品の概略断面図である。
【図１３】図１３Ａは軟骨細胞の成長開始時、固体支持基質と組織構造分析用試料のカラー顕微鏡写真の白黒複写である。図１３ＡＡは図１３Ａの数値で表わした顕微鏡写真である。図１３Ｂは３週間、軟骨細胞を成長させた後、軟骨細胞が装填された図１３Ａの支持基質を示すカラー顕微鏡写真の白黒複写である。図１３ＢＢは図１３Ｂの数値で表わした顕微鏡写真である。図１３Ｃは免疫化学組織分析用に染色して示す、軟骨細胞を成長させるコラーゲンで形成された支持基質を示す写真である。図１３Ｄは免疫化学組織分析用な染色して示した生物リアクタシステム内で軟骨細胞を成長させ、コラーゲンで形成された支持基質を示す写真である。
【図１４】ディピュイ（ＤｅＰｕｙ）支持基質２２における軟骨細胞２４を示す顕微鏡写真である。
【図１５】対照（黒斜線付き）軟骨−ギド薄膜群（点彩付き）及びディピュイ薄膜群（グレー斜線付き）の３日、２週間及び６週間における合計細胞数を示すグラフである。
【図１６】対照（黒斜線付き）軟骨−ギド薄膜群（点彩付き）及びディピュイ薄膜群（グレー斜線付き）の３日、２週間、６週間における細胞の生存率を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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