(57)【要約】炎症及び感染の診断、予後、及び経過のモニターのためのマーカーペプチドとしての、及び／または炎症及び／または感染の経過に治療上影響するための標的としての、体液または身体組織から得たカルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＨＰ）の使用。
2005500044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症及び感染の診断、予後、及び経過のモニターのためのマーカーペプチドとしての、及び／または炎症及び／または感染の経過に治療上影響するための標的としての、体液または身体組織から得たカルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＨＰ）の使用。
【請求項２】
患者の生物学的液体または組織サンプル中のＣＨＰの存在及び／または量を測定することによる、敗血症及び重篤な感染、特に敗血症様の全身性の感染の、予後、重篤さの評価、及び経過の治療に随伴する評価のための、示差的な早期の診断及び診断における請求項１に記載のＣＨＰの使用。
【請求項３】
患者の生物学的液体または組織サンプル中のＣＨＰの存在及び／または量を測定し、敗血症または感染の存在、予測される経過、重篤さ、または治療の成功に関する結論を、特異的な断片の存在及び／または量から導くことを特徴とする、敗血症及び重篤な感染、特に敗血症様の感染の、示差的な早期の診断及び診断、予後、重篤さの評価、及び経過の治療に随伴する評価のための方法。
【請求項４】
免疫診断的測定方法であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
予防または治療の目的で、敗血症を含む炎症性疾患及び感染の経過に影響するための試薬としての、請求項１に記載のＣＨＰの使用。
【請求項６】
ＣＨＰ、またはその機能的な部分ペプチド、及び製薬学的に許容可能なキャリアーを含むことを特徴とする、全身性の炎症を含む炎症の治療のための製薬組成物。
【請求項７】
ＣＨＰまたはＣＨＰ断片または加工されたＣＨＰ、特に特定の形態にリン酸化されたＣＨＰに対して生産され、適切な製薬学的キャリアーと共に患者に投与するように調製された抗体を含むことを特徴とする、炎症及び身体の他のストレス反応を治療するための製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患及び敗血症の医学的診断及び治療のための、カルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＨＰ）と称されるものの新規な使用に関する。本発明は、敗血症または全身性炎症が毒素の投与によって実験的に引き起こされた霊長類の肝組織におけるＣＨＰの著しく増大した濃度の初めての検出に基づく。
【０００２】
本発明は、炎症及び感染、特に感染性の病因の炎症及び敗血症の診断及び治療の更なる改良に関する、本出願人の過度の研究的作業に由来する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、各種の外的な作用、例えば傷害、火傷、アレルゲン、細菌及び真菌及びウイルスのような微生物による感染に対する、拒絶反応を誘導する外来組織に対する、または身体の特定の炎症性の疾患、例えば自己免疫疾患及びガンに対する、生物の特定の生理学的反応によって非常に一般的に定義される。炎症は、身体の無害で局在的な反応として生じるが、個々の組織、器官、器官の一部、及び組織の一部の数多くの重大で慢性及び急性の疾患の典型的な特徴でもある。
【０００４】
局所的な炎症は一般的に、有害な作用に対する身体の健全な免疫反応の一部であり、それ故身体の自己保存防御機構の一部である。しかしながら、炎症が、例えば自己免疫疾患のような特定の内因性のプロセスに対する身体の誤った反応の一部であるならば、及び／または慢性の性質を有するならば、あるいはそれらが全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の場合、または感染によって引き起こされる重篤な敗血症の場合のような、全身性の度合いに到達するのであれば、炎症反応の典型的な生理学的プロセスは制御不能となり、急性で、しばしば生命を脅かす病理学的プロセスとなる。
【０００５】
炎症プロセスの起源と経過は、主にタンパク質またはペプチドの性質を有するかなりの数の物質によって制御され、または多かれ少なかれ制限された時間についての特定の生体分子の出現によって達成されることが知られている。炎症反応に関与する内因性物質は、特にサイトカイン、メディエーター、血管作用性物質及び早期タンパク質、及び／またはホルモン調節因子から由来するものを含む。炎症反応は、炎症プロセスを活性化する内因性物質と、脱活性化物質（例えばインターロイキン−１０）の両者が関与する複雑な生理学的反応である。
【０００６】
敗血症または敗血性ショックの場合のような全身性の炎症では、炎症特異的反応カスケードは、全身に亘り非制御的な態様で広がり、過度の免疫反応の意味で生命を脅かすようになる。内因性炎症特異的物質の個々の群の出現と考え得る役割についての現在の知見に関しては、例えばA. Beishuizen等, "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131；及びC. Gabay等, "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New England Journal of Medicine, vol. 340, No. 6, 1999, 448-454を参照。敗血症及び関連する全身性炎症性疾患の理解、及び故に認識されている定義は、数年で変化しているため、K. Reinhart等, "Sepsis und septischer Schock" [Sepsis and septic shock], Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2001, 756-760が参照され、ここでは敗血症の最近の定義が与えられている。本願の文脈においては、使用される用語、敗血症及び炎症性疾患は、述べられた３種の参考文献で与えられた定義に基づく。
【０００７】
少なくともヨーロッパでは、陽性の血液培養長によって検出可能な全身性の細菌感染は、用語、敗血症を特徴付ける一方で、敗血症は現在では、感染によって引き起こされる全身性の炎症であると主に理解されているが、病理的なプロセスとして、他の原因によって誘導される全身性の炎症と非常に類似性を有している。前記敗血症の理解の変遷は、診断的アプローチにおける変化を引き起こしている。かくして、細菌病原体の直接的検出は、生理学的パラメーターの複雑なモニタリングによって置換または補足され、より最近では、特に敗血症プロセスまたは炎症プロセスに関与する特定の内因性物質、即ち特異的「バイオマーカー」の検出によって置換または補足されている。
【０００８】
炎症プロセスに関与していることが知られている数多くのメディエーター及び早期タンパク質の中で、診断目的に適しているものは、特に炎症性疾患に非常に特異的な出現、または炎症性疾患の特定の時期に非常に特異的な出現を有するものであり、その濃度は有意な態様で劇的且つ特徴的に変化し、さらに通常の測定に必要とされる安定性を有し、高濃度の値に到達するものである。診断目的のために、病理学的なプロセス（炎症、敗血症）と、それぞれのバイオマーカーとの信頼できる相関関係が、第一義的な重要性を有し、炎症プロセスに関与する内因性物質の複雑なカスケードにおける役割を知る必要性は存在しない。
【０００９】
敗血症のバイオマーカーとして特に適している内因性物質はプロカルシトニンである。プロカルシトニンは、感染性の病因（敗血症）の全身性の炎症の条件の下で、非常に高い値に到達する血清濃度を有するプロホルモンである一方で、健康なヒトでは実際に検出できない濃度を有する。高い値のプロカルシトニンはさらに、敗血症の比較的早期でも到達し、そのためプロカルシトニンの測定は、敗血症の早期の診断に適しており、感染によって引き起こされる敗血症を、他の原因を有する重篤な炎症から容易に区別するのにも適している。敗血症マーカーとしてのプロカルシトニンの測定は、M. Assicot等, "High serum procalsitonin concentrations in patients with sepsis and infection", The Lancet, Vol. 341, No. 8844, 1993, 515-518；及び特許DE 42 27 454 C2及びEP 0 656 121 B1及びUS 5,639,617の文献の主題である。本記載を補う目的で、前記特許、及び前記文献に挙げられている早期の参考文献が参照される。近年では、プロカルシトニンの主題に関する文献の数は非常に増加している。それ故さらに、W. Karzai等, "Procalcitonin - A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection", Infection, Vol. 25, 1997, 329-334；及びM. Oczenski等, "Procalcitonin: a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the peri-operative period", European Jounal of Anaesthesiology, 1998, 15, 202-209；及びさらに、H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663；及びH. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253;及び、最近印刷されたレビューのようなこれらで引用されている更なる文献が参照される。
【非特許文献１】
A. Beishuizen等, "Endogenous Mediators in Sepsis and Septic Shock", Advances in Clinical Chemistry, vol. 33, 1999, 55-131
【非特許文献２】
C. Gabay等, "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation", The New England Journal of Medicine, vol. 340, No. 6, 1999, 448-454
【非特許文献３】
K. Reinhart等, "Sepsis und septischer Schock" [Sepsis and septic shock], Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2001, 756-760
【非特許文献４】
M. Assicot等, "High serum procalsitonin concentrations in patients with sepsis and infection", The Lancet, Vol. 341, No. 8844, 1993, 515-518
【特許文献１】
DE 42 27 454 C2
【特許文献２】
EP 0 656 121 B1
【特許文献３】
US 5,639,617
【非特許文献５】
W. Karzai等, "Procalcitonin - A New Indicator of the Systemic Response to Severe Infection", Infection, Vol. 25, 1997, 329-334
【非特許文献６】
M. Oczenski等, "Procalcitonin: a new parameter for the diagnosis of bacterial infection in the peri-operative period", European Jounal of Anaesthesiology, 1998, 15, 202-209
【非特許文献７】
H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663
【非特許文献８】
H. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
敗血症マーカーであるプロカルシトニンの利用可能性は、敗血症の研究に所定のかなりの刺激を有しており、プロカルシトニンの測定を補うことができ、及び／または細かい診断若しくは各種の診断の目的のための更なる情報を提供できる更なるバイオマーカーを見出すことに、過度の努力が現在なされている。しかしながら、潜在的な新規な敗血症バイオマーカーについての研究は、炎症または敗血症プロセスに関与する特定の内因性物質の出現についての正確な機能または正確な理由に関して、しばしばほとんど全くまたは全然知られていないという事実によって面倒になっている。
【００１１】
更なる潜在的な敗血症マーカーの測定に対する実りある純粋に仮説的なアプローチの実験的試験の結果は、DE 198 47 690 A1及びWO 00/22439に見出すことができる。そこでは、敗血症の場合に、プロホルモンプロカルシトニンの濃度が増大するだけでなく、ペプチドプロホルモンの中に含まれるであろう他の物質についても、有意に増大した濃度が観察されることが示されている。記載された現象は十分に報告されている一方、敗血症におけるプロホルモンの濃度の増大の原因は、依然として実質的に説明できるものではない。
【００１２】
本願では、更なる炎症または敗血症特異的バイオマーカーについての探索における別の純粋に実験的なアプローチの結果が報告される。これらの実験的な調査はさらに、感染性の病因の全身的な炎症反応に関連するプロカルシトニンの測定で開始する。かくして、非常に早期の段階で、プロカルシトニンは、ホルモンカルシトニンの前駆体である場合と敗血症において同様な態様では明らかに形成されないことが観察されている。かくして、高いプロカルシトニン濃度はまた、甲状腺が除去されている患者でも観察された。それ故甲状腺は、プロカルシトニンが敗血症の間で形成または分泌される器官であるはずはない。H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28. No. 11, 3659-3663；及びH. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", Sepsis 1998; 2: 243-253による文献では、敗血症におけるプロカルシトニンの形成を説明することを企図すると称される実験的調査の結果が報告されている。前記作業では、人工的な敗血症が、霊長類（ヒヒ）にエンドトキシン投与によって生産され、血液中の最高のプロカルシトニン濃度が到達される実験的に生産された状態が測定されている。前記作業において記載された実験動物モデルの更なる開発は、ペプシン性またはタンパク質の性質の新規な内因性敗血症特異的バイオマーカーを測定するために、本願の文脈において機能し、当該バイオマーカーの出現は、敗血症または特定の形態の敗血症に特徴的であり、それ故敗血症の特異的診断を許容する。霊長類モデルは、霊長類とヒトの生理学の非常に顕著な類似性、及び多くの治療上及び診断上のヒトの試薬との高い交差反応性のために選択された。
【００１３】
炎症の間で形成される内因性物質は、身体の複雑な反応カスケードの一部であるため、そのような物質は診断上興味を有するだけでなく、例えば敗血症の間で広がりが観察されている炎症の全身性の広がりをできるだけ早期に停止させるために、このタイプの個々の物質の形成及び／または濃度に影響することによって、炎症プロセスに治療上介入するための試みが、過度の努力で現在実施されている。この文脈では、炎症プロセスに関与することが示されている内因性物質はまた、潜在的な治療上の標的として考慮される。炎症プロセスの特定のメディエーターに基づき、前記プロセスに陽性の治療上の影響を有することが企図される試みは、例えばE.A. Panacek, "Anti-TNF strategies", Journal fur Anasthesie und Intensivbehandlung"; No. 2, 2001, 4-5； T. Calandra等, Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor", Nature Medicine, Vol. 6, No. 2, 2000, 164-170；またはK. Garber, "Protein C May be sepsis solution", Nature Biotechnology, Vol. 18, 2000, 917-918に記載されている。これらの治療上のアプローチは、炎症促進性物質の濃度を低下すること、またはそのような物質の形成を阻害すること、及び特に特異的抗体（ＴＮＦ−αまたはＭＩＦに対する；E.A. Panacek, "Anti-TNF strategies", Journal fur Anasthesie und Intensivbehandlung; No. 2, 2001, 4-5；T. Calandra等, "Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor", Nature Medicine, Vol. 6, No. 2, 2000, 164-170参照）の使用によりそれを実施すること、または炎症カスケードに阻害効果を有する内因性物質（プロテインＣ；K. Garber, "Protein C May be sepsis solution", Nature Biotechnology, Vol. 18, 2000, 917-918）の濃度を増加することを企図している。最後に挙げられた文献は、選択された内因性標的分子に影響することによって、炎症プロセスに対する治療上の影響を有するそのような試みの概略を与え、その試みは、不幸にも一般的に今日までほとんど成功を収めていない。今日までむしろ失望を感じさせる治療上のアプローチに鑑み、できるだけ炎症または敗血症に特異的であり、治療上の標的として、炎症と格闘する点で成功に対する新たな予測を開く更なる内因性生体分子を同定することに大きな興味が持たれている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、カルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＨＰ）と称されるものが、感染によって引き起こされる炎症を有する霊長類及びヒトにおいてかなりの濃度で検出できる一方、健康な被験者では、それは見いだせないかまたは検出の分析的限界での濃度でのみ見いだせるという事実に基づくものであり、このことは、このタンパク質ＣＨＰを、炎症診断／敗血症診断の両者について、及び新規な治療上の標的として適切なものとする。
【００１５】
炎症または敗血症の実験的シミュレーションの最初の時点でのＣＨＰの検出される出現のため生じる診断及び治療での使用が、請求項１に一般的な形態で記載されている。
【００１６】
請求項２から４は、診断的な使用または方法に関する。
【００１７】
請求項５は、特に敗血症を含む炎症及び感染の治療の領域における、新規な潜在的治療上の使用に一般的な形態で関連し、請求項６及び７は、生理学的なＣＨＰ濃度に影響する目的を有する治療上の応用のために企図される製薬組成物に関連する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
実験の部分で以下に詳細に記載されるように、本発明は、エンドトキシン投与（Salmonella Typhimurinから得たＬＰＳ）によってヒヒにおいて人工的な敗血症の実験的な誘導と、２次元ゲル電気泳動による処理動物の肝組織の精密検査の後に、処理動物においてのみ同定可能であるペプチドまたはタンパク質産物としてＣＨＰを見出すことが可能であったという事実に基づく。その同定のため、処理動物の場合でのみ見出され、ゲル電気泳動によって２２９００±７００ドルトンの分子量と、約６．２の等電点を有することが見出された新規なタンパク質スポットが、電気泳動ゲルから単離され、トリプシン切断により断片に分離され、それを本質的に既知の態様でマススペクトロメトリーによって分析し、既知のトリプシン処理タンパク質と比較することによって同定した。
【００１９】
新規なタンパク質スポットのトリプシン切断のマス分析において、以下のマス（ｍ／ｚ）を有する断片が見出された：１１６９．５２；１４６９．５０；１５５０．５６；１５６９．７；１６４５．６；１９２０．８１；２３８６．７８。７のマスの二つ（１１６９．５２及び１９２０．８１）は、既知のトリプシン処理タンパク質のいずれのマスとも合致できなかった。残りの５のマスについては、分析に引き続き、ＣＨＰの既知の配列と合致が生じた（配列番号６参照；データベースSWISS-PROT: Entry Ca22_Human: Accession number Q99653; Lin X., Barber D.L. "A calcineurin homologous protein inhibits GTAase-stimulated na-H exchange", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12636 (1996))。
【００２０】
マス１４６９．５０は、配列Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｒ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｋ（配列番号１）に対応する。アミノ酸Ｓ（セリン、二度出現する）及びＴ（トレオニン）では、配列は各々の場合でリン酸基によって修飾されている。この断片の理論的な分子量は１４６９．４９９である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は３１−４０位で見出される。
【００２１】
マス１５５０．５６は、配列Ｋ−Ｅ−Ｔ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｔ（配列番号２）に対応し、２のリン酸基によって補われている。この断片の理論的分子量は１５５０．５６４である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は１９−３０位で見出される。
【００２２】
マス１５６９．７は、配列Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｐ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｅ−Ｋ（配列番号３）に対応する。この断片の理論的分子量は１５６９．７である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は８６−９８位で見出される。
【００２３】
マス１６４５．６は、配列Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｋ（配列番号４）に対応する。この断片の理論的分子量は１６４５．５９７である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は５−１８位で見出される。
【００２４】
マス２３８６．７８は、配列Ｉ−Ｉ−Ｎ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｐ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｍ−Ｒ（配列番号５）に対応する。この断片の理論的分子量は２３８６．７８である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は６６−８５位で見出される。
【００２５】
解釈の認識されている原理によれば、そのような一致は、タンパク質スポットから得た産物のＣＨＰとしての信頼できる同定が考慮される。ＣＨＰ（１９４アミノ酸）の分子量は２２３２５ドルトンである。
【００２６】
肝臓における敗血症の間のＣＨＰの出現の同定は、かなりの科学的、診断上、及び治療上の興味を有する。
【００２７】
ヒトタンパク質ＣＨＰは、１９９６年に最初に記載され（X. Lin及びD.L. Barber, A calcineurin homologous protein inhibits GTPase-stimulated Na-H exchange, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12631-12636, 1996）、同じ年のわずかに事前にＣａ２＋結合タンパク質として記載されたラットタンパク質ｐ２２と実質的に同一であることが分かった(M.R. Barroso等, A Navel Ca2+-binding protein, p22, Is Required for Constitutive Membrane Traffic, J. Biol. Chem., 271: 10183-101878, 1996)。カルシニューリンＢ様タンパク質（ＣＨＰ）の名称は、カルシニューリンの調節Ｂサブユニットに対するこのタンパク質の高い類似性を示す（６５％）。さらに、ＣＨＰと更なるＣａ２＋結合タンパク質カルモジュリンとの間で高い類似性が存在する。
【００２８】
ＣＨＰは多くのヒト組織で発現されており、偏在して発現されるＮａ＋／Ｈ＋エクスチェンジャーであるＮＨＥ１の調節のための必須の補因子であることが分かっており、ＮＨＥ１は活性化されると、細胞内ｐＨを増大し、細胞増殖、細胞分化、及び新形成性トランスフォーメーションの活性化を引き起こす。ＣＨＰのリン酸化の度合いは、細胞分裂の間のＮＨＥ１調節にとって重要である。さらに、ＣＨＰの一過的過剰発現が、血清及びＧＴＰａｓｅ刺激的ＮＨＥ１活性を阻害することが見出されている。
【００２９】
ＣＨＰの生理学的役割に関する更なる調査は、ＮＨＥ調節についてのその重要性を確認した(T. Pang等, Calcineurin Homologous Protein as an Essential Cofactor for Na+/H+ Exchangers, J. Biol. Chem., 276: 17367-17372, 2001)。それらはまた、ＣＨＰがカルシニューリン活性を阻害することを示した(X. Lin等, Inhibition of Calcineurin Phosphatase Activity by a Calcineurin B Homologous Protein, J. Biol. Chem., 274: 36125-36131, 1999)。とりわけカルシニューリンは、Ｔ細胞活性化、かくして免疫応答の誘導において重要な役割を演じているため、この発見はかなり興味深い。このため、カルシニューリンはまた、免疫抑制製薬学的活性物質シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６の標的でもある。これらの結果に照らして、タンパク質ＣＨＰは、カルシニューリン活性、及び免疫系の活性化の以前に未認識の内因性インヒビターであると分かっている。
【００３０】
ＣＨＰの生理学的濃度が、いずれかの疾患において有意に変化し、それ故ＣＨＰ濃度の測定は、診断の観点から興味を有するといえることは、今まで知られていなかった。同様に、規定された治療上の目的を達成するための生理学的なＣＨＰ濃度に影響するための提案はほとんど存在しなかった。
【００３１】
本発明によれば、人工的な敗血症が毒素投与によって誘導された霊長類の肝臓における比較的高いＣＨＰ濃度の検出は有意に高く、同時にコントロール動物のそれ以外完全に同一の処理サンプルにおけるＣＨＰの検出は不可能である。この出現は、処理動物において、毒素投与による敗血症の誘導の後に比較的短時間でのみ観察されているため、この事実をＣＨＰの測定による有望な敗血症、感染、及び炎症の診断に当てはめるために利用することが可能である。特に興味深いことは、敗血症の予後マーカーとしてのＣＨＰの明白な適合性である。
【００３２】
ＣＨＰは、いずれかの適切な検出方法によって測定できるが、適切に選択された抗体を使用する免疫診断法による、患者の体液における測定が、実際上の観点から最も有利であろう。
【００３３】
実験的に誘導された敗血症においてＣＨＰの増大した出現を検出を初めて検出できたという事実に基づいて、炎症及び敗血症に関連する診断及び／又は治療目的のためＣＨＰを利用する可能性がかくして開かれている。この目的のため、ＣＨＰまたはその適切な部分ペプチドは、合成的に、または従来技術の一部である方法を使用する遺伝学的操作によって、標的化された態様で任意に調製できる。ＣＨＰ部分ペプチドは任意に市販形態で存在し、免疫診断測定のための特定のアッセイフォーマットのために、カリブレーター、トレーサー、及びコンペティターとして必要とされて良く、説明されている態様でこの目的のために調製されて良い。
【００３４】
さらに、ＣＨＰ断片またはその適切な部分配列は、患者の体液中のＣＨＰの診断的測定の目的として、及び／または潜在的な治療薬として適切である特異的なポリクローナル、及び特にモノクローナル抗体を生産するために、近年の従来技術の既知の方法によって使用できる。既知の部分ペプチド配列に対する適切なモノクローナル抗体の生産は、一般的な従来技術の一部であり、特に記載する必要はない。さらに、対応するＤＮＡに対する直接的な遺伝学的免疫化の方法を使用する抗体生産もまた、特に言及すべきではない。それ故、そのような免疫化方法の使用で、得ることができる抗体の標本を拡大できることが過去において見出されているため、例えば免疫化のためにＣＨＰまたはＣＨＰ断片のｃＤＮＡを使用することは、本発明の範囲内にある。しかしながら、第三者から入手可能なＣＨＰに対する既知の抗体もまた使用されて良い。
【００３５】
ＣＨＰの免疫学的測定では、例えば選択的なプロカルシトニン測定について記載されているように進行することが特に可能である。P.P. Ghillani等, "Monoclonal antipeptide antibodies as tools to dissect closely related gene products", The Journal of Immunology, Vol. 141, No. 9, 1988, 3156-3163；及びP.P. Ghillani等, #Identification and Mesurement of Calsitonin Precursors in Serum of Patients with Malignant Diseases", Cancer Reserch, Vol. 49, No. 23, 1989, 6845-6851参照。記載された方法の変形例、及び／または更なる免疫化方法は、標準的な作業及び文献から当業者に利用可能であり、文脈で適用できる。
【００３６】
ＣＨＰ、または配列番号１、配列番号２、配列番号４、及び／または配列番号５に係る部分配列、またはその部分ペプチドを有するＣＨＰ断片は、利用可能な結果に基づいて、炎症及び感染（特に敗血症タイプの全身性の感染）の経過の診断及びモニタリングのための特異的なマーカーペプチド（バイオマーカー）として機能できる。プロカルシトニンの測定と同様に、ＣＨＰの測定は、早期の示差的な診断、及び診断、及び診断の準備のため、敗血症及び感染の経過のひどさの評価、及びその治療に随伴する評価のために効果的であり得、そのような方法では、ＣＨＰの含量は、患者の生物学的液体または組織のサンプル中で測定され、炎症、重篤な感染、または敗血症の存在は、ＣＨＰの確立された存在及び／または量から結論付けられ、得られた結果は、敗血症のひどさと相関し、治療及び／または治療の予測のための可能性が見積もられる。
【００３７】
しかしながら、ＣＨＰ（または任意にそれをコードするＤＮＡ部分）は、炎症、特に感染性の病因の全身性の炎症および敗血症の予防薬または治療において使用できる。
【００３８】
ＣＨＰは免疫抑制効果を有するため、敗血症の場合におけるＣＨＰの増大した濃度は、敗血症の場合で観察された身体の過度の全身性の免疫反応に対して、身体のカウンター調節として解釈できる。それ故、外的なＣＨＰ投与によるこのカウンター反応のサポートは、ここに報告されている、敗血症における増大したＣＨＰ濃度の診断上の発見が、新規な治療上の可能性を示すように、身体の敗血症反応を制御する意味で機能することができるはずである。
【００３９】
生理学的ＣＨＰ濃度が、外的なストレス反応−毒素の効果の結果としての前述の動物モデルにおいて−の関数として非常に可変的であるという観察は、内因性免疫抑制性ＣＨＰの濃度のそのような変化が、例えば完全な生物の防御を弱化する局所的炎症の場合において、免疫防御の非所望の弱化を導くことが知られている生理学的状況で生じるが、オーバーワークによる外的なストレスの場合、または感情的ストレスの場合では生じないという事実の更なる指標である。これらの場合では、ＣＨＰによって生産される免疫抑制は非所望である。治療上の効果は、免疫防御を再生するために生理学的ＣＨＰ濃度を低下する目的で、そのような場合に生じる。そのような場合では、ＣＨＰの濃度は、結合抗体の投与によって、またはアフィニティー吸着による血液の洗浄または血漿搬出によるＣＨＰの外挿的除去によって減少できる。そのような目的のため、実際の活性物質として、ＣＨＰまたはＣＨＰ断片に対して生産され、適切な製薬学的キャリアーと共に患者に投与するよう調製された抗体を含む薬剤を提供することも可能である。
【００４０】
かくしてＣＨＰは、敗血症及び同様な重篤な炎症の治療のための、潜在的な有望な治療活性物質となるであろう。
【００４１】
もしＣＨＰ活性が、治療上の目的のため増大するのであれば、各種の翻訳後修飾形態、例えばグリコシル化またはリン酸化形態で、あるいは製薬学的賦形剤、例えばポリエチレングリコール残基によって置換された形態で、ＣＨＰを含む分子もまた、治療上有用なＣＨＰ物質として考慮される。
【００４２】
ＣＨＰの発見及び同定は以下により詳細に記載され、添付した配列表及びその一部が参照される。図面は、図面の簡単な説明に示された内容を示す。
【実施例】
【００４３】
１．動物モデル（ヒヒ）におけるエンドトキシン投与による感染刺激
エンドトキシン注射によるプロカルシトニン分泌の刺激のためのヒヒで実施された実験に基づいて（H. Redl等, "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis: Relationship to cytokines and neopterin", Crit Care Med 2000, Vol. 28, No. 11, 3659-3663；H. Redl等, "Non-Human Primate Models of Sepsis", in : Sepsis 1998; 2: 243-253参照）、ヒヒ（オス、約２年齢、２７−２９ｋｇの体重）を、体重のｋｇ当たり１００μｇのＬＰＳ(Salmonella Typhimurium由来のリポ多糖、Sigma供給)をそれぞれ静脈内に投与した。注射後５から５．５時間後、１０ｍｌのドレタールの静脈内投与によって動物を殺傷した。死から６０分以内で、全ての器官／組織を切除し、液体窒素中での凍結によって安定化した。
【００４４】
更なる加工の間で、１．５ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール）を窒素で冷却しながら個々の凍結組織（１ｇ）のサンプルに加え、サンプルを磁気製乳鉢で微粉化し、パウダーを得た（J. Klose, "Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and Human for 2-D Electrophoresis", in: Methods in Molecular Biology, Vol. 112: 2-D Proteome Analysis Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ）。引き続き４℃で１００，０００ｇで１時間の遠心分離処理の後、得られた上清を回収し、更なる加工のため必要とされるまで−８０℃で貯蔵した。
【００４５】
この態様で得られた組織抽出物を使用して、観察された組織のどの部分が、最大量の既知の敗血症バイオマーカーであるプロカルシトニンをエンドトキシン投与によって生産できるかを測定するために、最初の調査を実施した。次いで、最高レベルのプロカルシトニン形成を有する測定された組織において、エンドトキシン投与の後のみ生じる更なる以前に未同定のタンパク質産物を、ディフェレンシャルプロテオーム分析によって求めた。この目的のため、非処理ヒヒの組織サンプルをコントロール組織サンプルとして使用し、サンプルの殺傷と取得を、処理動物の場合のものと同一の条件下で実施した。
【００４６】
２．エンドトキシン注射の後のサイクレベルのプロカルシトニン形成を有するヒヒ組織の測定
個々の組織のサンプルを、一方でポリスチレンチューブに固定化されたヒヒカルシトニンに対する抗体で、他方でアクリジニウムエステルでマークされ、ヒヒプロカルシトニンのＮ末端に対して向けられたモノクローナル抗体で実施する免疫蛍光試験（ヒトプロカルシトニンの測定のために開発された、本出願人のLU-MItest(登録商標)PCTと類似する）の補助の下で調査した。この試験の目的では、個々のサンプル中のヒヒプロカルシトニンの含量を、組換えヒトプロカルシトニンを使用する試験の較正の後に測定した。
【００４７】
この実験により、肝組織が最大量のプロカルシトニンを与えることが示された。それ故、初めに記載された態様で得られたヒヒ肝臓から得たタンパク質抽出物が、新規な敗血症特異的バイオマーカーの探索のために使用された。
【００４８】
３．ヒヒの細胞質肝細胞タンパク質を使用するプロテオーム分析
一方で健康なヒヒ（コントロール）の、他方でＬＰＳで注射されているヒヒの細胞質肝細胞タンパク質抽出物が、プロテオーム分析で使用された。最初の分析的２次元ゲル電気泳動では、１００μｇのタンパク質を含む肝抽出物が、９Ｍウレア、７０ｍＭ ＤＴＴ、２％アンフォライト、ｐＨ２−４に安定化され、次いでJ. Klose等, "Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome", Electrophoresis 1995, 16, 1034-1059に記載されたような分析的２次元ゲル電気泳動によって分離された。２次元電気泳動ゲルにおけるタンパク質の視覚化は、銀染色によって実施された（J. Heukeshoven等, "Improved silver staining procedure for fast staining in Phast-System Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl gels", Electrophoresis 1988, 9, 28-32参照）。
【００４９】
評価のため、非処理動物のサンプルのタンパク質スポットパターンを、処理動物の肝組織サンプルから生じたタンパク質スポットパターンと比較した。コントロールサンプルでは存在しないが、全ての処理動物で付加的に存在する物質を、更なる分析的調査のために選択した。図１は、コントロールサンプル（Ａ）及び処理動物のサンプル（Ｂ）についての２次元電気泳動ゲルの比較を示し、（Ｂ）における付加的なタンパク質スポットが新規なタンパク質に対応し、その位置は矢印と円によって強調されている。
【００５０】
次いで、分析的２次元ゲル電気泳動のタンパク質スポットパタンで同定された新規な特異的タンパク質を、３５０μｇのタンパク質を使用する調製的２次元ゲル電気泳動によって調製した（再度（１０）を参照）。調製的２次元ゲル電気泳動では、染色はクマシーブリリアントブルーＧ２５０で実施した（V. Neuhoff等, "Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250", Electrophoresis 1988, 9, 255-262参照）。
【００５１】
更なる分析のために事前に選択されたタンパク質スポットを、A. Otto等, "Identification of human myocardial proteins separated by two-dimensional electrophoresis using an effective sample preparation for mass spectrometry", Electrophoresis 1996, 17, 1643-1650に記載された方法を使用してゲルから切り出し、トリプシン切断し、次いで特にG. Neubauer等, "Mass spectrometry and EST-database searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex", in: nature genetics vol. 20, 1998, 46-50；J. Linger等, "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerase", in: Science, Vol. 276, 1997, 561-567；M. Mann等, "Use of mass spectrometry-derived data to annotate nucleotide and protein sequence databases", in: TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 26, 1, 2001, 54-61に記載されたようなマススペクトル測定調査の使用で、マススペクトル測定によって分析した。ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）の後、トリプシン切断サンプルをタンデムマススペクトロメトリーにかけた。Micromass, UK社製のナノフロー−Ｚ−スプレーイオンソースと称されるものを有するＱ−ＴＯＦマススペクトロメーターを使用した。この方法は、装置の製造者の作用説明書に対応した。
【００５２】
４．ＣＨＰの同定
図１（Ａ）及び１（Ｂ）に示されているように、ＬＰＳ注射を投与されているヒヒの肝細胞抽出物はとりわけ、約２２，９００±７００ドルトンの分子量が、既知の分子量のマーカー物質と比較してゲル電気泳動に基づいて見積もられ、第一次元のタンパク質の相対的位置から、６．１から６．３の等電点が測定されるタンパク質のスポットを含んだ。
【００５３】
新規なタンパク質スポットのトリプシン切断のマス分析において、以下のマス（ｍ／ｚ）を有する断片が見出された：１１６９．５２；１４６９．５０；１５５０．５６；１５６９．７；１６４５．６；１９２０．８１；２３８６．７８。７のマスの二つ（１１６９．５２及び１９２０．８１）は、既知のトリプシン処理タンパク質のいずれのマスとも合致できなかった。残りの５のマスについては、分析に引き続き、ＣＨＰの既知の配列と合致が生じた（配列番号６参照；データベースSWISS-PROT: Entry Ca22_Human: Accession number Q99653; Lin X., Barber D.L. "A calcineurin homologous protein inhibits GTAase-stimulated na-H exchange", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 12636 (1996))。
【００５４】
マス１４６９．５０は、配列Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｒ−Ｆ−Ｔ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｋ（配列番号１）に対応する。アミノ酸Ｓ（セリン、二度出現する）及びＴ（トレオニン）では、配列は各々の場合でリン酸基によって修飾されている。この断片の理論的な分子量は１４６９．４９９である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は３１−４０位で見出される。
【００５５】
マス１５５０．５６は、配列Ｋ−Ｅ−Ｔ−Ｇ−Ｆ−Ｓ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｔ（配列番号２）に対応し、２のリン酸基によって補われている。この断片の理論的分子量は１５５０．５６４である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は１９−３０位で見出される。
【００５６】
マス１５６９．７は、配列Ｔ−Ｌ−Ａ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｐ−Ｉ−Ｅ−Ｄ−Ｎ−Ｅ−Ｋ（配列番号３）に対応する。この断片の理論的分子量は１５６９．７である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は８６−９８位で見出される。
【００５７】
マス１６４５．６は、配列Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｌ−Ｒ−Ｄ−Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｋ（配列番号４）に対応する。この断片の理論的分子量は１６４５．５９７である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は５−１８位で見出される。
【００５８】
マス２３８６．７８は、配列Ｉ−Ｉ−Ｎ−Ａ−Ｆ−Ｆ−Ｐ−Ｅ−Ｇ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｖ−Ｎ−Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｍ−Ｒ（配列番号５）に対応する。この断片の理論的分子量は２３８６．７８である。ＣＨＰのアミノ酸配列（前述のLin X.によってさらに言及されるメチオニン残基を有さない）では、この配列は６６−８５位で見出される。
【００５９】
解釈の認識されている原理によれば、そのような一致は、タンパク質スポットから得た産物のＣＨＰとしての信頼できる同定が考慮される。ＣＨＰ（１９４アミノ酸）の分子量は２２３２５ドルトンである。
【００６０】
初めて見出された増大したＣＨＰ濃度は、敗血症及び炎症、特に感染性の炎症のための新規なバイオマーカーとしてのその使用を可能にする。
【００６１】
同じ発見は、特にＣＨＰの投与による身体の敗血症の反応に対する阻害効果を有する活性物質として、ＣＨＰの治療上の使用を初めて示唆する。従って本発明は、適切な製薬学的キャリアーと共に、実際の活性物質としてＣＨＰを含む製薬組成物、または特定の病理学的プロセスにおいて生理学的ＣＨＰ濃度を低下する目的を有する製薬組成物、例えばＣＨＰまたはＣＨＰ断片または加工されたＣＨＰ、例えば特定の形態にリン酸化されたＣＨＰに対する抗体を、実際の活性物質として含む製薬組成物に関し、そのような抗体は好ましくは、例えば患者への投与のためヒト化されて調製され、さらに適切な製薬学的キャリアーと共に存在する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、健康なヒヒの細胞質肝細胞タンパク質（Ａ）と、ＬＰＳ投与によって誘導された敗血症の５時間後のヒヒの肝細胞タンパク質（Ｂ）の、スポットパターンの比較を可能にする２次元電気泳動ゲルの写真を示す図である。矢印は、円によって図面（Ｂ）で識別される本発明にかかる敗血症特異的産物、ＣＨＰの位置を示す。
【図２】図２は、２次元ゲル電気泳動のゲルから単離されたトリプシン切断産物のマススペクトルを示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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