(57)【要約】  さまざまな発現系のいずれかを用いて、複数種類の目的タンパク質または目的ペプチド類、あるいは遺伝学的に発現された他の材料をスクリーニングし、引き続き産生する。その複数種類のタンパク質は、複数種類の別個の処理済み緑液汁から抽出され、各種緑液汁が目的タンパク質の１種類を含有している。多チャネル式装置が、その１チャネルにつき１種類の緑液汁を処理することにより、複数種類の緑液汁を処理する。この装置はコンピュータ制御されており、これにより、各チャネル内のさまざまなバルブおよびポンプが、各目的タンパク質を抽出してこれを専用の貯蔵容器内に送出するように、自動制御されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のタンパク質を精製する方法であって、
第１の所定の有機体を用いて第１の標識タンパク質を発現させるステップと、
第２の所定の有機体を用いて第２の標識タンパク質を発現させるステップと、
第１の緑液汁を形成するために、前記第１の所定の有機体から前記第１の標識タンパク質を採取するステップと、
第２の緑液汁を形成するために、前記第２の所定の有機体から前記第２の標識タンパク質を採取するステップと、
前記第１の標識タンパク質を抽出するために、前記第１の緑液汁を第１のアフィニティカラム内に注入するのと同時に、前記第２の標識タンパク質を抽出するために、前記第２の緑液汁を第２のアフィニティカラム内に通過させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１のアフィニティカラムを通過させた後の前記第１の緑液汁を収集するステップと、
前記第２のアフィニティカラムを通過させた後の前記第２の緑液汁を収集するステップと、
前記第１の収集した緑液汁を前記第１のアフィニティカラム内に循環させるのと同時に、前記第２の収集した緑液汁を前記第２のアフィニティカラム内に循環させるステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のアフィニティカラムから前記第１の標識タンパク質を回収するステップと、
前記第２のアフィニティカラムから前記第２の標識タンパク質を回収するステップと
をさらに含み、
前記回収された第１の標識タンパク質が、１μｇから１００ｍｇ台の範囲の量で測定可能であり、前記回収された第２の標識タンパク質が、１μｇから１００ｍｇ台の範囲の量で測定可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の有機体が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる有機体の１種類または複数種類を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識タンパク質がそれぞれ、複数のマイクロアレイ構築に使用される別種の組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標識タンパク質がそれぞれ、患者に特異な別種の薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数種類のタンパク質を産生および精製する方法であって、
少なくとも２種類のタンパク質標的を選択するステップと、
前記タンパク質標的の正確なタンパク質配列を発現する適した組換えベクターを選択するステップと、
前記被選択組換えベクターのそれぞれを、それぞれの組換えタンパク質を産生するために、別々の所定の有機体内で発現させるステップと、
前記組換えタンパク質それぞれに対応する少なくとも２種類の緑液汁を形成するために、前記有機体を採取するステップと、
前記組換えタンパク質を抽出するために、前記複数種類の緑液汁をそれぞれのアフィニティカラム内に同時に注入するステップと、
を含む方法。
【請求項８】
前記複数種類の緑液汁を、前記複数のアフィニティカラム内に通過させた後、別々の各容器内に収集するステップと、
前記複数種類の緑液汁を、前記複数のアフィニティカラム内に同時に循環させるステップと
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えタンパク質を、前記アフィニティカラムから回収するステップをさらに含み、
前記回収された組換えタンパク質が、１μｇから１００ｍｇ台の範囲の量で測定可能である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定の有機体それぞれが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる有機体の１種類または複数種類を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質がそれぞれ、複数のマイクロアレイ製造に使用される別種の組換えタンパク質である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えタンパク質がそれぞれ、患者に特異な別種の薬剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
複数種類のタンパク質を精製する装置であって、
種類の異なる緑液汁をそれぞれに入れた複数のリザーバと、
前記リザーバのそれぞれに１つずつ接続される複数のポンプと、
対応する前記ポンプの１つずつに接続され、タンパク質保持材料を中に配置した複数のカラムと、
前記タンパク質を前記カラムから取り出すための手段と、
を含む装置。
【請求項１４】
前記装置を自動制御するために、前記装置の複数部分に接続されたコンピュータをさらに含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
複数種類のタンパク質を精製する装置であって、
第１の緑液汁を入れた第１のリザーバと、
前記第１のリザーバが接続された第１のポンプと、
前記第１のポンプに接続され、タンパク質保持材料を中に配置したカラムであって、前前記第１の緑液汁が前記ポンプにより押し出されて前記カラム内を通過するようになっているカラムと、
前記装置を自動制御するために、前記ポンプに接続されたコンピュータと
を含む装置。
【請求項１６】
複数種類の生物学的物質を精製する装置であって、
第１の溶液を入れた第１のリザーバと、
第２の溶液を入れた第２のリザーバと、
前記第１のリザーバを接続した第１のバルブと、
前記第２のリザーバを接続した第２のバルブと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第１のカラムであって、前記第１のバルブと流体連通して前記第１の溶液を前記第１のカラム内に方向付けるように接続された第１のカラムと、
生物学的物質保持材料を中に配置した第２のカラムであって、前記第２のバルブと流体連通して前記第２の溶液を前記第１のカラム内に方向付けるように接続された第２のカラムと、
前記装置を自動制御するために前記第１のバルブおよび前記第２のバルブと接続されたコンピュータと
を含み、前記第１のカラムを通過する流路と前記第２のカラムを通過する流路とが互いに隔離されており、前記第１のカラムおよび前記第２のカラム内に同時に前記溶液を流動させることのできる装置。
【請求項１７】
前記第１のカラムを出る流体流を制御するための、前記第１のカラムから下流に位置する第３のバルブと、
前記第２のカラムを出る流体流を制御するための、前記第２のカラムから下流に位置する第４のバルブと
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第３のバルブおよび前記第４のバルブの動作を制御できるように、前記第３のバルブおよび前記第４のバルブが前記コンピュータに接続されている、請求項１６に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
【請求項１８】
前記第１のバルブの上流に位置する第１のポンプと、
前記第２のバルブの上流に位置する第２のポンプと、
をさらに含み、
前記コンピュータで前記第１および第２のポンプの動作を制御できるように、前記第１および第２のポンプが前記コンピュータに接続されている、請求項１７に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
【請求項１９】
前記第１および第２のポンプが単一モータに接続され、前記モータの操作が前記コンピュータにより制御される、請求項１８に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
【請求項２０】
前記第１のリザーバ、前記第１のバルブ、前記第１のカラム、前記第１のカラムの下流に位置する前記第３のバルブ、および前記第１のポンプのすべてが第１の流路を画成し、
前記第２のリザーバ、前記第２のバルブ、前記第２のカラム、前記第２のカラムの下流に位置する前記第４のバルブ、および前記第２のポンプのすべてが、前記第１の流路とは別個に設けられた第２の流路を画成し、
前記第１の流路および前記第２の流路と並行して別の生物学的物質を精製するために、前記装置が、前記第１の流路および前記第２の流路とは別個に設けられた第３の流路をさらに含む、請求項１８に記載の複数種類の生物学的物質を精製するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比較的大量の所定組換えタンパク質を発現、抽出および精製するための、融通性に富みスループットの高い方法および装置に関する。本発明はさらに、同時に別々に並行して動作する装置で複数種類の所定のタンパク質を精製するための方法および装置に関する。本発明はさらに、複数種類の所定のタンパク質を同時に産生するための産生系を追跡、計画および管理するための方法および装置に関する。本発明はさらに、個人向け薬剤に使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。本発明はさらに、マイクロアレイに使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。本発明はさらに、タンパク質関連の研究に使用する複数種類のタンパク質の産生および精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
物理学者および研究者の双方が、ヒトなどの有機体内の生理機能および代謝機能においてタンパク質が果たす役割の重要性を認識するにつれて、タンパク質の研究および利用が、科学界においても医学界においても、ここ数十年ほど重視されてきている。現在、タンパク質のさまざまな側面が研究されており、その例として、タンパク質−タンパク質相互作用、グリコシル化、タンパク質疾患関連標識の同定、および他の特徴が挙げられる。タンパク質は、研究にも臨床用途にもマイクロアレイで使用され、抗体の産生および特徴付けには大量のタンパク質が必要である。このため、タンパク質の産生が、この分野におけるさらなる開発に極めて重要となってきている。
【０００３】
タンパク質の産生技術は多数あり、それぞれに固有の利点と限界とがある。全長または部分長タンパク質を産生する方法として、細菌発現系、酵母発現系、菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および、カリフォルニア州ＶａｃａｖｉｌｌｅのＬａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが開発したＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）などの植物発現系が挙げられる。
【０００４】
異種タンパク質を発現させるタンパク質発現系すべてにおいて、目的のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列がまず適したベクター内でクローニングされる。このベクターを宿主種内に転写または誘導すると、その宿主がそのベクターＤＮＡで形質転換される。例えば、細菌発現系では、異種タンパク質の発現に、プラスミド、ファージまたはウィルス由来のベクターを使用する。目的の核酸配列を含むベクターＤＮＡ（インサートＤＮＡ）を、リン酸カルシウム法およびエレクトロポーレーション法による形質転換技術を始めとする標準形質転換技術を通じて、細菌内に挿入するのである。こうした技術の他にも、単離および精製されたインサートＤＮＡを被選択ベクターシステム内に挿入するために、数多くのキットが現在利用可能である。このため、細菌発現系は、異種タンパク質の日常的な発現および精製用に最も広範に使用されている。このように、細菌発現系は比較的大量の異種タンパク質発現によく使用されているが、適切なフォールディングおよび翻訳後処理の欠如という課題を残しているため、機能的に不活性な分子が生成される可能性がある。したがって、これまでの細菌発現系は、少量の狭い範囲のタンパク質にのみ適している。
【０００５】
昆虫発現系では、また昆虫発現系ほどではないが酵母発現系では、天然の異種タンパク質に見られる場合と同様のフォールディング、翻訳後修飾およびオリゴマー化が得られる場合もあるが、その複雑さでは天然タンパク質に遠くおよばない。タンパク質産生用の昆虫発現系の１例は、昆虫細胞内にバキュロウィルスを使用することである。プラスミド系ショウジョウバエ細胞による発現系も利用可能である。この発現系では、バキュロウィルスの操作および管理が不要である。バキュロウィルス発現系の場合もプラスミド系ショウジョウバエ発現系の場合も、宿主細胞内に異種タンパク質を挿入して連続的に発現させるために、細菌発現系と同様のベクターを用いる。酵母発現系の場合も、市販されているｐＥＳＣ、ｐＹＥＳ、ｐＮＭＴ、ｐＹＤ、ｐＰＩＣｏｐＧＡＰなどのＤＮＡベクターを用いる。
【０００６】
プラスミドやファージ系ベクターでトランスフェクトした、またはウィルスベクターを感染させた哺乳動物細胞培養（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、Ｋ５６２、２９３および他の細胞培養）などの哺乳動物発現系では、実質的な翻訳後修飾の実施が可能である。哺乳動物発現系に使用する市販のベクターの例として、アデノ関連ウィルス、ｐＦＢレトロウイルスベクターおよびアデノウィルスなどのウィルス類、ｐＡＣＴ、ｐＢＩＮＤ、ｐＣＡＴ、ｐＣＩ、ｐｈＲＧ−ＣＭＶ、ｐｈＲＧ−ＴＫ、ｐｈＲＬ−ＴＫ、ｐＳＩおよびｐＥＲＶなどのプラスミド、ｐＢＫ、ｐＢＫ−ＣＭＶおよびｐＢＫ−ＲＳＶなどのファージ系ベクターが挙げられる。しかし、哺乳動物細胞の場合、異種タンパク質の発現に培養集約的作業が必要なため、大量生産へと拡大させるにはより多くの課題が生じかねない。また、所望量のタンパク質を含む十分な細胞を産生させるには、技術上の熟練者が必要な場合がある。というのも、例えば、特に哺乳動物細胞の場合、トランジエントなトランスフェクションの効率が悪いため、ベクターＤＮＡの安定した形質転換および染色体組込みが必要となり得るからである。
【０００７】
植物発現系で発現するタンパク質にも、異種タンパク質発現用のベクターが必要である。例えば、Ｄｏｎｓｏｎらに付与された米国特許第５，３１６，９３１号および同第５，５８９，３６７号には、植物における異種遺伝物質の体系的発現に適した植物ウィルスベクターが例示されている。これらの特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。Ｄｏｎｓｏｎらは、異種遺伝子の体系的発現用に異種サブゲノムプロモーターを有する植物ウィルスベクターについて説明している。このような組換え植物ウィルスベクターが利用可能であるため、目的のタンパク質およびペプチド類を、組換えにより植物宿主内に産生させることができる。
【０００８】
細菌、酵母、昆虫（バキュロウィルス）および哺乳動物培養内に産生されたタンパク質を単離することも周知である。例えば、カリフォルニア州ＶａｌｅｎｃｉａのＱｉａｇｅｎから、６×Ｈｉｓタグタンパク質の精製に使用される９６ウェルプレートフォーマットに使用可能な金属アフィニティ樹脂および磁気ビードが販売されている。こうした精製技術は、「Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ６×Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｒｃｈ  ２００１）に記載されているほか、米国特許第４，８７７，８３０号、同第５，０４７，５１３号、同第５，２８４，９３３号および同第５，３１０，６６３号に開示されている。その内容全体を本明細書内に引用したものとする。しかし、上述した特許に開示されている方法の多くおよびＱｉａｇｅｎから販売されている材料は、μｇ以下の単位で測定されるタンパク質量の単離に最適化されたものである上（ｍｇ単位ではない）、植物内で産生されたタンパク質の精製用に特に設計されているものでもない。
【０００９】
植物からタンパク質、ペプチド類およびウィルス類を単離するための処理も、これまでにその数種類が文献に記載されている（Ｊｏｈａｌに付与された米国特許第４，４００，４７１号、Ｊｏｈａｌに付与された米国特許第４，３３４，０２４号、Ｗｉｌｄｍａｎらに付与された米国特許第４，２６８，６３２号、Ｗｉｌｄｍａｎらに付与された米国特許第４，２８９，１４７号、Ｗｉｌｄｍａｎらに付与された米国特許第４，３４７，３２４号、Ｈｏｌｌｏらに付与された米国特許第３，６３７，３９６号、Ｋｏｃｈに付与された米国特許第４，２３３，２１０号、Ｋｏｃｈに付与された米国特許第４，２５０，１９７号。これらの開示内容全体を本明細書内に引用したものとする）。
【００１０】
植物内で産生する生理活性種のコストパフォーマンスの良い大量精製に対する方法体系がこれまでに開発されてきている。こうした生理活性種として、タンパク質またはペプチド類が当てはまり、特に、組換えタンパク質またはペプチド類、あるいはウィルス粒子、特に遺伝子組換えが行われたウィルス類が当てはまる。具体的に言えば、Ｇａｒｇｅｒらに付与された米国特許第６，０３７，４５６号には、例えば組換タバコモザイクウィルスを感染させたタバコ植物から抽出した大量のタンパク質を単離および精製する方法が開示されている。米国特許第６，０３７，４５６号に開示されている方法は主に、単離されるタンパク質量が数百グラムからキログラムとなり得る、大量のタバコ植物または他の許容範囲内植物材料から得たタンパク質の単離および精製を目的としている。また、２００１年１０月３日に出願された、係属中であり譲受人を同じとする米国特許出願第０９／９７０，１５０号「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅｓ」には、植物内で生成された大量のタンパク質を精製する自動装置が開示されている。ただしこの場合も、単離されるタンパク質量は数百グラムからキログラムを単位としている。上記特許および係属中の特許出願に記載されている方法には数多くの利点があるが、その方法は材料の大量生成を目的としているため、各種タンパク質の量をマイクログラムからミリグラムの単位とする、それより少ない少量の複数種タンパク質の単離に適用することは容易ではない。米国特許第６，０３７，４５６号および２００１年１０月３日に出願された、係属中であり譲受人を同じとする米国特許出願第０９／９７０，１５０号「Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅｓ」の双方の内容全体を本明細書内に引用したものとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】
【００１１】
したがって、タンパク質をさまざまな培養のいずれかで産生することができ、そのタンパク質を信頼性の高い方法で精製して所望量の各タンパク質を提供できる、複数種類のタンパク質の産生および精製を目的とした、融通性の高い発現系が必要である。また、開始生物量が１０ｇ〜１０ｋｇ未満である植物材料から得られる１００μｇ台〜数ｍｇの組換えタンパク質の産生および単離を効率よく行う方法および装置も必要である。さらに、細菌、昆虫、哺乳動物および／または酵母培養で産生された同様量の組換えタンパク質の産しおよび単離を効率よく行う方法および装置も必要である。また、規定された細胞、組織または宿主有機体内におけるプロテオームの構造および関係を決定するための、目的タンパク質を付随したタンパク質のタンパク質の産生および単離を効率よく実施できる方法および装置も必要である。
【００１２】
また現在は、ヒトゲノム研究が進んだため、医療形態を確実に変化させる医療を実施するための新たなパラダイムへの道が開かれている。個別用薬剤、標識を補助とする診断の利用、および個人の分子プロファイルに由来する標的治療法を実施できれば、これらが、医薬品の開発方法および医療実施方法に影響を与える可能性がある。そうなれば、医薬品の発見および開発に対する従来の線形工程が、じきに統合型発見的アプローチに取って代わられる可能性がある。製薬業者は現在のところ、目的の製薬品が、目的とする患者集団の他の人々には望ましくない不都合な反応があるため、患者集団の一部のみを治療できることを立証する統計的根拠を基にその単一調合薬を大量に製造している。薬剤が特定の個人または患者集団に合うように製造される、小規模な製薬品の製造方法が必要である。
【００１３】
単離されるウィルスまたはタンパク質が、製薬品として製造されることを目的としたものである場合、一貫性があり、立証可能な方法体系が必要である。したがって、自動装置が、単離工程で使用される方法体系をモニタして、その追跡および立証を提供する、タンパク質を単離するための自動化された方法体系および装置が必要である。
【００１４】
本発明は、複数種類のタンパク質を同時に並行して精製するための多チャネル式装置に関する。
【００１５】
本発明はまた、複数種類のタンパク質を同時に産生および精製するため方法および装置に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
定義
本明細書内にて以下の用語に含まれる範囲を始めとする本願の明細書および請求の範囲を明確かつ矛盾なく理解できるように、用語を以下のように定義する。
【００１７】
ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）は、新規な遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質の機能を試験し、そのタンパク質を大量に製造するための、カリフォルニア州ＶａｃａｖｉｌｌｅのＬａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより開発された技術である。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）には、試験有機体内にいずれかの遺伝子または多数の遺伝子を配置するようにウィルスから改変されたベクターを使用することが含まれる。その有機体に、その遺伝子のタンパク質産生物を製造させて、その産生物を研究、収集および精製するものである。
【００１８】
好ましくは、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）には、移植遺伝子のタバコモザイクウィルスを感染させたタバコ植物またはこれに関連するタバコ属種を使用する。タバコ植物が早く成長するために、植物遺伝子を研究するための極めて有用なモデル有機体が得られる、また、動物タンパク質または植物タンパク質のいずれであっても大量に製造する高収益向上が得られるという理由から、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術の例として通常、タバコ植物の使用が挙げられる。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術のさまざまな側面が、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡された米国特許（Ｄｏｎｓｏｎらに付与された米国特許第５，３１６，９３１号、Ｄｏｎｓｏｎらに付与された同第５，５８９，３６７号、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎらに付与された同第５，７６６，８８５号、Ｔｕｒｐｅｎらに付与された同第５，８１１，６５３号、Ｄｏｎｓｏｎらに付与された同第５，８６６，７８５号、Ｄｏｎｓｏｎらに付与された同第５，８８９，１９０号、Ｔｕｒｐｅｎらに付与された同第５，８８９，１９１号、Ｋｕｍａｇａｉらに付与された同第５，９２２，６０２号、Ｔｕｒｐｅｎらに付与された同第５，９６５，７９４号およびＤｏｎｓｏｎらに付与された同第６，０５４，５６６号）に開示されている。これらの内容全体を本明細書内に引用したものとする。ただし、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術は、トウモロコシ、イネなどのタバコ以外の植物を使用する場合にも適用可能であることを理解されたい。
【００１９】
以下の説明において使用する用語「生物量」「バイオ物質」および「植物源」はすべて、採取される植物、種子、または、ウィルス、タンパク質および／またはそのペプチド類などの目的材料を抽出または単離するために処理可能な植物部分すべてをいう。例えば、バイオ物質処理には、数多くの種類の植物や、植物材料の種子、花、柄、茎、根、塊茎、ならびに葉部分などの植物部分を含めることができる。通常、タバコ植物の多肉多液葉が、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を用いた所定タンパク質の大量生成に理想的であるが、以下の説明から、タバコ以外の植物もＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を用いたタンパク質産生に使用可能であることを理解されたい。
【００２０】
別法として、トウモロコシ、イネ、穀物植物類または他の望ましい植物を、目的のタンパク質およびペプチド類の産生に使用することができる。
【００２１】
以下の説明では、用語「生物量」および「バイオ物質」も、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および酵母発現系で生成され、以下に記載する方法体系にしたがって産生されるタンパク質の精製用に採取された生物学的材料を指す場合がある。
【００２２】
用語「緑液汁」は、処理したバイオ物質から抽出される液体をいう。ただし、この緑液汁は、抽出した液体の色にかかわらず、植物材料またはバイオ物質から抽出した液体にいずれをも指す可能性があることを理解されたい。例えば、１種類または複数種類のタンパク質をＬａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を用いて産生した場合、緑液汁は、採取したタバコなどのバイオ物質から得られるため、文字通り緑色となる可能性がある。しかし、目的タンパク質が細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系、菌発現系および酵母発現系で発現された場合、そこから抽出される液体は緑色以外となり得るが、以下ではこれも緑液汁とする場合がある。
【００２３】
本明細書内でいう「ウィルス」を、１種類または複数種類のウィルス構造タンパク質を組み合わせた感染性核酸配列を含むビリオンと、１種類または複数種類のウィルス構造タンパク質を組み合わせた非感染性核酸を含む非感染性ビリオンと、ウィルス構造タンパク質の凝集体であって、核酸配列を含まず、その凝集体とも核酸配列が組み合わされておらず、ウィルス様中空粒子（ＶＬＰ）を含む場合もある凝集体とからなる群を含むものと定義する。このウィルス類は、天然のものであっても組換え核酸技術に由来するものでもよく、植物全体、植物組織または植物細胞内における複製用に設計または選択により適合可能なあらゆるウィルス由来核酸を含むものである。
【００２４】
本明細書内でいう「ウィルス集団」を、上記にて定義したと１種類または複数種類のウィルス類して定義する。このウィルス集団は、そのウィルス類のあらゆる組み合わせおよび比率を含む異種選択からなるものである。
【００２５】
本明細書内でいう「ウィルス様中空粒子（ＶＬＰ）」を、自己集合構造タンパク質として定義する。この構造タンパク質は、１種類または複数種類の核酸配列によりコードされるものであり、その核酸配列（１つまたは複数）が、宿主ウィルスベクターのゲノム内に挿入される。
「タンパク質およびペプチド類」を、天然のタンパク質およびペプチド類、あるいは、トランスフェクションまたは遺伝子導入形質転換により産生された組換えタンパク質およびペプチド類のいずれかとして定義する。
【００２６】
用語「目的タンパク質」「目的材料」および「複数種類の目的材料」とは、本発明による精製方法および／または装置を用いて単離すべきあらゆる材料、化合物、有機構造体または材料の組み合わせをいう。目的タンパク質あるいは１種類または複数種類の目的材料の例として、これに限定するものではないが、ビリオン、ウィルス様中空粒子、ウィルス類、タンパク質および／またはペプチド類、受容体、受容体拮抗剤、抗体、一本鎖抗体、酵素、ニューロポリペプチド類、インスリン、抗原、ワクチン、ペプチドホルモン、カルシトニン、及びヒト成長ホルモンが挙げられる。また、目的タンパク質あるいは１種類または複数種類の目的材料を、プロテグリン、マゲイニン、セクロピン、メリトチン、インドリシジン、デフェンシン、β−デフェンシン、クリプトジン、クラバイニン、植物デフェンシン、ニシン及びバクテネシンからなる抗菌性ペプチドまたはタンパク質とすることもできる。
【００２７】
本明細書でいう「細菌」を、細胞分割により増殖し、その細胞が通常細胞壁内含まれ、球状、棒状、らせん状または湾曲状で発生し、事実上あらゆる環境で見出すことのできる微細な単細胞微生物からなる群を含むものとして定義する。
【００２８】
本明細書でいう「細菌培養」を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細菌集団の維持および繁殖として定義する。この細菌集団は通常、クローンに由来する、すなわち、単一細菌細胞に由来している。したがって、所与細菌培養内の細菌すべてが同じ遺伝子の補体を含有するため、それがタンパク質発現系であれば、同じ異種タンパク質配列を発現させるはずである。しかし、特定の環境において、この細菌培養が１種類以上の細菌細胞を起源として、異なる遺伝子補体を含む、複数種類の細菌細胞を含有する可能性もある。
【００２９】
本明細書でいう「哺乳動物細胞」を、哺乳動物から由来した細胞からなる群を含むものとして定義する。起点となる哺乳動物細胞として、これに限定するものではないが、ヒトまたの哺乳動物からの組織、流体、血液、器官またの生物学的供給源が挙げられる。
【００３０】
本明細書でいう「哺乳動物細胞培養」を、細胞培地内にてｅｘ−ｖｉｖｏで生存可能な、哺乳動物から由来した細胞群を含むものとして定義する。この哺乳動物細胞を、哺乳動物細胞から直接由来する一次細胞とすることができる。より典型的には、哺乳動物細胞培養内の哺乳動物細胞を不滅化することができる、すなわち、不定数の継代および分裂を通じて増殖および分裂させることができる。
【００３１】
本明細書でいう「酵母細胞」を、出芽または直接的な分裂（核分裂）を通じて、あるいは単なる不整形花糸（菌糸）として成長することにより、成長および増殖できる微小な単細胞有機体からなる群を含むものとして定義する。酵母細胞は、異種ベクター内部に挿入された核酸配列を発現させるために、その異種ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ得るものである。酵母細胞の例として、異種タンパク質のトランスフェクションおよび発現用に一般に使用されるサッカロミケス・セレヴィシエが挙げられる。
【００３２】
本明細書でいう「昆虫細胞」を、昆虫宿主からｅｘ−ｖｉｖｏで生存可能な、昆虫から由来した細胞群を含むものとして定義する。この昆虫細胞は、異種ベクター内部に挿入されたタンパク質配列を発現させるために、その異種ベクターで形質転換、トランスフェクト、または感染され得るものである。昆虫細胞の例として、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞、セスジヤブカ細胞、キイロショウジョウバエ細胞およびヨトウガ細胞が挙げられる。
【００３３】
「アフィニティタグ」は、目的タンパク質（ポリペプチド）に付着した分子、リガンドまたはポリペプチドである。アフィニティタグの例として、これに限定するものではないが、ヘキサ−ヒスチジン、他の金属タグ、ストレプタビジン、ビオチン、抗体精製用特異エピトープ標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、□−ガラクトシダーゼ、□−アミラーゼ、ならびに、発現したタンパク質の単離および精製を補助できる他のタンパク質または小型分子タグが挙げられる。
【００３４】
「アフィニティマトリクス」は、基質またはリガンドに結合した固体材料をいう。この材料が、目的タンパク質に付着しているアフィニティタグに選択的に結合する。アフィニティタグとアフィニティマトリクスとが結合すると、目的タンパク質は、カラムまたは他の精製装置内に留まる。このため、目的タンパク質を、緑液汁内に不純物が含まれていればそれから分離することができる。アフィニティマトリクスを洗浄した後、アフィニティタグを付着した目的タンパク質を、実質的に精製された形態としてカラムまたは他の装置から溶出させることができる。アフィニティマトリクスの例として、アガロース、セルロース、セファロース、セファデックスおよび他のクロマトグラフィ媒体、ポリスチレンビード、磁気ビード、フィルタ、隔膜、および、選択したアフィニティタグに結合する基質またはリガンドに結合した他の固体材料が挙げられる。
【００３５】
「ヒスチジン−標識タンパク質」は、ヒスチジンアフィニティタグがカルボキシ末端、アミノ末端、または目的タンパク質の内部のいずれかに付着している目的タンパク質である。通常、ヒスチジンタグは、６個のヒスチジン部分からなるが、その組み合わせや数量はいずれでもよい。ヒスチジン−標識タンパク質は、ヒスチジン−標識タンパク質をＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．製）などの金属アフィニティマトリクスに結合させ、結合したアフィニティマトリクスから不純物を洗浄することにより、精製することができる。精製後、酸ｐＨ緩衝条件を用いてイミダゾールで競合溶出させることにより、またはＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）でアフィニティマトリクスから金属を剥離することにより、ヒスチジン−標識タンパク質をカラムから溶出させることができる。
概要（図１）
本発明によれば、１種類または複数種類の目的タンパク質は、図１に示すように、さまざまな方法のいずれかにより産生される。
１．本発明の一態様によれば、必要な材料および時間を最小限に抑え、目的タンパク質の産生量を最大限にするため、特定量の１種類または複数種類の目的タンパク質が自動的に産生および精製される。
【００３６】
以下、図１について簡単に説明する。図１に示すステップの詳細については、その後適宜説明する。
【００３７】
図１のＳ１に示す第１のステップにおいて、１種類または複数種類の目的タンパク質を選択し、これに対応する適したベクターおよびインサートを同定する。このタンパク質、ベクターおよびインサート選択工程については、以下の図２に関する部分でさらに説明する。
【００３８】
以下、少なくとも１種類のタンパク質の産生および精製について詳述する。以下の大部分に含む内容は、説明を簡潔にし、冗長部分を省き、説明を理解しやくするために、タンパク質１種類のみの産生および精製についての説明であるが、本発明により複数種類のタンパク質が同時に産生および精製できることを、以下の説明から理解されたい。
【００３９】
タンパク質、ベクターおよびインサートを選択した後、図１のＳ２において、その目的タンパク質の産生試験に適した有機体または発現系を選択する。具体的に言えば、例えば、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系、植物発現系、菌発現系および酵母発現系からなる発現系のいずれの１種類または複数種類を用いることができる。
【００４０】
図１のＳ３において、図１のＳ２における試験の結果産生されたタンパク質をスクリーニングして、産生試験に用いた有機体または発現系により目的タンパク質が適切に発現したかどうかを判別する。また、産生されたバイオ物質量と発現したタンパク質量との関係も判別する。この段階で発現するタンパク質量は比較的少ないが、これをさまざまな機能試験および構造試験を用いてスクリーニングする。したがって、Ｓ３に示すスクリーニング工程は、複数のサブステップからなっており、これについては以下で詳述する。
【００４１】
図１のＳ４では、どの発現系（細菌、昆虫、哺乳動物、植物、菌または酵母）が目的タンパク質の発現に最適であるかを判別する。例えば、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を通常、まずＳ２の試験で用いる。目的タンパク質が適切に発現していなかった場合、細菌発現系などの別の有機体を試験し、Ｓ３で示したようにスクリーニングする。目的タンパク質の産生に適切な発現系が構築されたら、所望量の精製タンパク質を産生するために必要なバイオ物質量を算出する。これについては以下で詳述する。別法として、種々のタンパク質発現系を並行に試験して、すなわち、細菌発現系、植物発現系および昆虫発現系を同時に試験して、より大量の発現および精製を目的とする適切な発現系を決定してもよい。
【００４２】
図１のＳ５に示すように、目的タンパク質を、判別した最適発現系または有機体で発現させる。この最適発現系により産生された生物量を、図１のＳ６に示すように採取し、Ｓ７に示すように精製前に処理または前処理する。このタンパク質発現、採取および前処理ステップについては、以下の図３に関する部分でさらに詳しく説明する。Ｓ７に示す精製ステップについては、以下の図４に関する部分でさらに詳しく説明する。
【００４３】
図１のＳ８に示すように、精製した目的タンパク質を試験して、その特徴および一貫性を確認する。
タンパク質およびインサートの選択（図２）
産生および精製用に１種類または複数種類の目的タンパク質を選択できる工程は、その機能または目的に応じて数多くある。例えば、その１種類または複数種類の目的タンパク質を、２０００年３月１０日に出願された、係属中の米国特許出願第０９／５２２，９００号に記載されているように、ワクチンなどの患者に特異な薬剤にすることができる。この場合、患者自身のＤＮＡから、特異タンパク質を発現させるための配列が得られる。あるいは、目的タンパク質を、マイクロアレイまたは所謂タンパク質チップに用いるための標的タンパク質にすることもでき、この場合には、収集した試料（血液、結成、尿、痰、髄液またの生体サンプル）からの生理学的パラメータ、器官機能または機能障害の評価、ならびに種々の病理学的感染状態の特定ができるように、タンパク質標的を選択することができる。
【００４４】
特異タンパク質または周知のタンパク質（例えば、患者から特に採られた配列ではない配列）を発現させるために配列が必要な場合、その配列を、図２に概略的に示した例などのコンピュータシステムを用いて、共有私有を含むさまざまなデータベースから取り出すことができる。図２の場合、データベースそれぞれは、企業内顧客Ａ、Ｂ〜Ｎがそれぞれのデータベースにアクセスすることでサーチできるようになっている。公的に利用可能なデータベースの例として、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＧｅｎＢａｎｋおよびＢＬＡＳＴ）ヌクレオチドおよびタンパク質データベース、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＷＩＳＳ-ＰＲＯＴ）ヌクレオチドおよびタンパク質データベース、および他のヌクレオチドおよびタンパク質データベース、ならびに医学文献が挙げられる。私有データベースの例として、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＨＰＩ）、ＭＥＤＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ）、ＭＡＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）および数多くの研究室によるデータベースが挙げられる。こうしたソースには、タンパク質または有機体構成成分を詳述する情報が含まれており、疾患のある被験者と疾患のない被験者とにおけるタンパク質発現、または正常被験者と異常被験者とにおけるタンパク質発現を比較した情報が含まれている場合もある。
【００４５】
遺伝子情報収集、すなわち目的核酸の単離は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、コロニースクリーニングおよび核酸合成を始めとするさまざまな方法で行うことができる。上述したデータベースおよび文献は、研究者や臨床医がこれを利用して所与状態に対して発現させるタンパク質を選択できるだけでなく、ヌクレオチドおよびタンパク質配列の情報を含んでいることから、適した標的プローブを、標的ｃＤＮＡおよび目的タンパク質を単離するように設計することができる。
【００４６】
単離を目的としてプローブの設計および反応条件を考察することは、目的タンパク質が周知の種であれ未知の種であれ、その特異な目的タンパク質を単離するために重要である。目的ｃＤＮＡを単離するためのプローブを、上述したデータベースおよび文献から得られるタンパク質またはＤＮＡ配列情報に基づいて設計することができる。別法として、２Ｄゲルまたは他のタンパク質を分画および単離する方法で単離された、それまでは未知のタンパク質から得たトリプシンペプチド情報を用いて、プローブを設計してもよい。このプローブを、標準ジデオキシヌクレオチド化合物（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）を組み入れつつ、標準ホスホルアミダイト化学、またの核酸合成化学を利用して合成することができる。あるいは、２種類以上のジデオキシヌクレオチド（ｄＩＴＰまたは他の修飾ヌクレオチド）とハイブリダイズし得る修飾ヌクレオチドを用いてもよい。核酸プローブ用テンプレートとしてタンパク質配列を用いる場合、プローブセットを、核酸配列の１順列をコードする少なくとも１対のプライマーで構成することができる。別法として、アミノ酸コードが縮重するため、対応する核酸配列の別の順列をコードする１対以上のプライマーを用いてもよい。例えば、リジンは、２種類のコドン配列、ＡＡＡおよびＡＡＧでコードされる。したがって、アミノ酸リジンを組み入れた配列は、リジン位置にてプローブ内に両方の変化を含むことになる。プロの合成に加えて、より大きな核酸配列から切り出された核酸断片（例えば、クローニングベクター断片および他の核酸断片）を、標的核酸単離のプローブとして用いることができる。
【００４７】
プローブを、周知のタンパク質配列と同じではないが同様に設計することもできる。こうしたプローブは、関連タンパク質を単離することができる。関連タンパク質は、個人間でそのアミノ酸配列組成が異なる可能性があるため、標準プローブ設計技術では単離しにくい場合もあるタンパク質である。別法として、低ストリンジェンシー条件を用いて核酸プローブでＤＮＡをスクリーニングすることができる。これにより、同じではないが関連するＤＮＡ配列を単離および精製することできる。この核酸プローブを、ＲＴ−ＰＣＲ単離、およびｍＲＮＡや全ＲＮＡサンプルからのクローニングに使用することができる。この核酸プローブをまた、ＰＣＲ増幅またの単離方法体系を用いて全ゲノムＤＮＡからのゲノムＤＮＡクローニングに用いてもよい。この全ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡは、動物、植物、あるいは細菌／微生物細胞または組織から、標準ＲＮＡまたはＤＮＡ精製技術で単離したものでよい。その技術例として、アルカリ溶解、イソチオシアン酸グアニジウム、ＣｓＣｌ密度勾配、フェノール／ＳＤＳ、フェノール／クロロホルム、ガラス系またはシリカ系クロマトグラフィ、あるいは、さまざまな製造業者から市販されているキットを含む他の方法が挙げられる。全ＲＮＡをさらにオリゴｄＴカラムまたは樹脂上で分画して、ポリＡ  ＲＮＡを含むｍＲＮＡを得ることができる。さらに、ｍＲＮＡを、オリゴｄＴカラムクロマトグラフィと組み合わせた標準溶解プロトコル（アルカリ溶解、界面活性剤溶解、機械的分裂および他の溶解方法体系）を用いて、細胞培養や組織溶解物から直接単離することも可能である。
【００４８】
ＲＮＡの逆転写で得られたｃＤＮＡ鎖を、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の利用可能なポリメラーゼを用いて複製し、二本鎖ＤＮＡを得ることができる。ＤＮＡポリメラーゼを用いるさまざまな標準分子生物技術により、その二本鎖ＤＮＡを増幅させ、増幅したｃＤＮＡを適した発現ベクター内に挿入およびライゲーションして、さらなる解析を行うことができる。別法として、ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の利用可能なポリメラーゼを用いて直接ＰＣＲで増幅させることも可能である。増幅したｃＤＮＡの場合と同様に、増幅したゲノムＤＮＡを適した発現ベクター内に挿入およびライゲーションして、さらなる解析を行うことができる。
【００４９】
目的のＤＮＡ配列を単離するためのもう１つのプロトコルは、標準ＤＮＡ合成プロトコルを通じて行う、インサート配列およびその相補的結合鎖の合成である。例えば、相補的ＤＮＡ鎖を、標準ホスホルアミダイト化学を用いて合成することができる。クローニングを目的として、非対称制限酵素配列を合成鎖内に組み入れて、複製および／または発現ベクター内に直接クローニングしてもよい。別法として、ＤＮＡ鎖にアニール処理を施した後、標準分子生物ライゲーションプロトコルを用いて、制限酵素リンカーの平滑末端ライゲーションを行うことができる。ＤＮＡ合成方法体系を用いて、配列の長さに応じて大抵変化する、ピコグラム、ナノグラム、ミクログラム、またはミリグラム量を合成および精製することができる。これにより、ＤＮＡポリメラーゼ酵素と共に導入されかねない増幅アーチファクトを避けることができる。ＤＮＡ合成をＰＣＲ増幅と組み合わせて、適したベクター内へのＤＮＡ挿入およびそれに引き続くＤＮＡの複製に向けて十分な量を増幅させることもできる。
【００５０】
もう１つの方法は、複数種類のベクター挿入を含む細菌宿主のコロニースクリーニングを用いることである。通常、ベクター挿入は、特異な宿主組織、器官または条件から単離された複数種類の核酸配列を含む。例えば、ネズミの肝臓または特定疾患に対して表現型であるネズミから得た複数種類のベクターインサートに対応する、市販の細菌「ライブラリ」が入手可能である。上記による単離されたプローブを用いて、ニトロセルロースやナイロンによるフィルタまたは膜などの固形培地上に移入された大量の細菌クローンをスクリーニングすることができる。固形培地上の細菌クローンが溶解すると、各クローンに含まれているＤＮＡが変性されてその培地に結合する。これにより、コロニーのパターンが、結合したＤＮＡの同じパターンで置換される。次にこの培地を、目的ＤＮＡ配列を含むクローンを同定する標識プローブにハイブリダイズする。このクローンが単離され、大量の培養により増幅される結果、そのＤＮＡが他の目的ベクター内への操作を目的として単離され、切り出される。
ベクターの選択
本発明によれば、上述したように、また本願と同一の譲受人に譲渡された上記特許に記載されているように、単離した目的ＤＮＡ配列をベクター内に挿入して、目的の組換えタンパク質を、細菌発現系、昆虫発現系、哺乳動物発現系および酵母発現系を含むさまざまな方法のいずれかにより、またはＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術の特徴を用いることにより、産生させることができる。具体的に言えば、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）発現系の場合、ベクター、タグおよびウィルスがコードするタンパク質に対して特異的に選択された、目的の遺伝子配列またはインサートを含むように、ウィルスが遺伝学的に操作される。するとこのウィルスが、タバコ植物の葉などの広葉植物組織に適用されて、その有機体に感染する。この植物とウィルスとが協働して特異なタンパク質を発現させ、このタンパク質がその植物組織から抽出され、精製されるのである。こうした本発明による方法体系の基本的ワークフローを、本発明による方法体系を有効にするために使用する装置の詳しい説明と併せて、以下に詳述する。さらに、以下により明確に説明する方法でこのワークフローを追跡し、その工程における種々の態様の判別を補助するコンピュータシステムについても説明する。
【００５１】
本発明によれば、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を用いる場合、特異なベクターおよびインサートが、タバコモザイクウィルスまたは他の適したウィルス内への挿入用に選択される。図１のＳ１に示すように、１種類のインサートが、そのインサートの遺伝子配列によりコードされる特異タンパク質用に選択される。以下の説明からより明確にわかるように、複数種類のタンパク質を同時に発現させることができるように、ウィルス毎に１インサートを含むものとして、複数種類のウィルスを使用することができる。さらに、ウィルス内に挿入するための各インサート用に、１種類または複数種類のベクターがさまざまなベクター類から選択される。例えば、すべてのベクターが各インサートと機能するわけではないため、複数種類のベクターを実験して、所望のタンパク質の発現について試験してもよい。
【００５２】
上述したように、タンパク質の発現および精製に使用するために、さまざまなクローニングベクターおよび発現ベクターを、使用する宿主発現系に応じて用いることができる。通常、クローニングベクターおよび発現ベクターは、１種類の特異な宿主発現系（例えば、植物または細菌のみ）をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させることしかできない。しかし、その中に含まれる核酸配列の性質により、複数種類の宿主発現系をトランスフェクト、形質転換、または感染させることのできるクローニングベクターおよび発現ベクターが存在する。当業者であれば、さまざまな宿主発現系をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させるようにベクターを設計できることがわかるであろう。このように宿主発現系をトランスフェクトする、形質転換する、または感染させた後、そのベクターインサートの核酸配列をその宿主内に発現させることのできるベクターすべてが、本発明の範囲内であると考えられる。
【００５３】
上述したように、使用するベクターは、精製工程で予定されている宿主発現系に応じて選択される。例えば、植物発現系の場合には、異種タンパク質の配列を導入し発現させるために、ＲＮＡウィルスまたはＤＮＡウィルス由来のウィルスベクターを使用することができる。ＲＮＡウィルスベクターは、発現レベルが高く宿主範囲も広いため、好適である。米国特許第５，３１６，９３１号に、植物宿主を全身的に感染させ、その植物宿主内に外来遺伝子配列を安定して転写または発現させることのできる異種サブゲノムプロモーターを有する植物ウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。同様に、米国特許第５，８１１，６５３号には、タバコ植物内に遺伝子を過剰発現させることのできる、タバコウィルス群から得るＲＮＡウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。米国特許第５，９７７，４３８号には、外来遺伝子をＲＮＡウィルスタンパク質（例えば、コートタンパク質）に融合させて、比較的大量の外来タンパク質を融合タンパク質として産生するＲＮＡウィルスベクターが記載されている。この特許内容全体を本明細書内に引用したものとする。
【００５４】
好適な一実施形態を、タバコウィルス群から得るＲＮＡウィルスベクターとすることができる。この１例は、タバコモザイクウィルス由来のＧＥＮＥＷＡＲＥベクターに見られる。このＧＥＮＥＷＡＲＥベクターにおいて、ＴＭＶレプリカーゼコード配列は、ＴＭＶ移行タンパク質用コード配列の上流に位置する。ＴＭＶ移行タンパク質のライゲーションされた３′末端であるｃＤＮＡのＯＲＦ（読みとり枠）は、ヘキサ−ヒスチジンによるアフィニティタグのポリペプチドコード配列または他のアフィニティタグコード配列に、その３′末端または５′末端にてインフレームで結合される。このようにアフィニティタグコード配列をクローニングベクターおよび発現ベクター内に追加すると、目的のアフィニティタグタンパク質をアフィニティマトリクスに結合させた後にこれを洗浄してすべての不純物を除去することにより、複合混合物からタンパク質を精製することができる。精製後、このタンパク質およびアフィニティタグを実質的に純粋な形態として、アフィニティマトリクスから溶出させることができる。このベクターを、プロトプラストおよび接種した葉内でより高いレベルで発現するように最適化すると、このベクターは、複数の制限酵素部位を用いてｃＤＮＡ挿入部位のポリリンカー領域５′内でクローン化し、発現したタンパク質を適切に停止させるための停止配列を含むことができる。例えば、タバコモザイクウィルス由来ベクターは、ＴＭＶレプリカーゼコード配列を含むことができる。この配列により、プロトプラストおよび接種した葉内における発現を実質的に増加させることができる。また、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｐＩその他を含む制限酵素部位を、所望する核酸配列の挿入部位をフランキングする多重クローニング部位ポリリンカー配列内に含めることができる。タバコウィルスベクターだけでなく他のＲＮＡウィルスベクターも使用可能であり、その例として、これに限定するものではないが、イネ萎縮病ウィルス、創傷腫瘍ウィルス、カブイエロー（turnip yellow）モザイクウィルス（ティモウィルス属）、イネえそウィルス、キュウリモザイクウィルス（ククモウイルス属）、オオムギ黄萎病ウィルス（ルテロウィルス属）、タバコ輪点ウィルス（ネポウィルス属）、ジャガイモＸウィルス（ポテクスウィルス属）、ジャガイモＹウィルス（ポティウィルス属）、タバコえそウィルス、タバコ茎えそウィルス（トブラウイルス属）、トマトブッシースタントウィルス（トンブスウイルス属）、カボチャモザイクウィルス、ブロムモザイクウィルス （ブロモウィルス）および他のＲＮＡウィルス類が挙げられる。一本鎖ＲＮＡウィルス類内のＲＮＡは、プラス（＋）鎖またはマイナス（−）鎖のどちらでもよい。
【００５５】
ＤＮＡウィルスベクターを、宿主植物内における次の接種およびタンパク質発現に用いることができる。ＤＮＡウィルスベクターの例として、これに限定するものではないが、カリフラワーモザイクウィルスなどのカリモウィルス類、キャッサバ潜在ウィルス、ビーンゴールデンモザイクウィルス、シバ条線（Chloris striate）モザイクウィルス、トウモロコシすじ（maize streak）ウィルス類および他のＤＮＡウィルス類が挙げられる。別法として、根頭癌腫病菌のプラスミドによるベクターをＴｉ媒介による植物形質転換に用いることができる。
【００５６】
上述したように、ベクターは、目的タンパク質のクローン化および精製を補助するために、アフィニティタグ配列（ヘキサ−ヒスチジン、他の金属アフィニティタグ、ストレプタビジン、抗体精製用の特異なエピトープ標識、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、□−ガラクトシダーゼ、および、発現したタンパク質の単離および精製を補助することのできる他のタグ）と多重クローニング部位リンカー配列とを含むことができる。ＤＮＡまたはＲＮＡウィルスベクターも、外来タンパク質の発現を間質液またはその培地内へと命令するために、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。これにより、植物宿主により間質液部分内に分泌される内因性タンパク質の量が制限されるため、精製を簡略化し、その効率を高めることができる。この１例として、キメラタンパク質の分泌を、感染した葉や他のトランスフェクトされた植物部分の間質空間内へと命令する、イネα−アミラーゼのシグナルペプチドをコード化するための配列を組み入れる、またはライゲーションすることが挙げられる。
【００５７】
植物の形質転換およびそれに引き続く発現および精製を目的とする植物ウィルスベクターに加えて、哺乳動物や原核生物の発現ベクターを、哺乳動物宿主や原核生物宿主への次のトランスフェクションや形質転換用に用いることができる。好適な一実施形態を、細菌宿主内でも哺乳動物宿主内でも転写およびその後の発現が可能な二重哺乳動物／大腸菌発現ベクターとすることができる。この１例が、発現ベクターＭＥＶ（哺乳動物発現ベクター）である。これは、従来の制限酵素クローニング部位（ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＮｏｔＩなど）ならびにＳａｐＩ／ＥａｒＩクローニング部位を有するポリリンカー部位を含んでいる。哺乳動物ＣＭＶ即時初期エンハンサープロモーターユニットが、細菌プロモーターユニットより上流に、イントロンで分離されている。シャイン−ダルガルノ／コダック配列が、発現の効率を高めるために含まれている。ヒスチジン−タグコード配列も、発現したタンパク質の単離および精製効率を高めるために含まれている。これは、ＳｕｐＥ／Ｆ部位の存在によってのみ大腸菌内で発現する。
【００５８】
種々の発現系において試験することを目的に核酸インサートを同時に複数のベクター内に挿入できるように、ベクターを構築することができる。例えば、哺乳動物発現系、細菌発現系および植物発現系内で発現できるベクターに、ベクターＤＮＡのリンカー領域内の同じ制限酵素部位を含めることができる。したがって、ｃＤＮＡインサートは、ＭＥＶおよびＧＥＮＥＷＡＲＥベクターを始めとする複数のベクターの対応制限酵素部位内にクローン化されることになる。と同時に、所与ｃＤＮＡインサートに対する全ベクターの同じフレーム配置が確実となる。
【００５９】
植物ウィルスベクターと同様に、他のベクターＤＮＡへの挿入および精製を目的として、アフィニティタグ配列（ヘキサ−ヒスチジン、他の金属アフィニティタグ、ストレプタビジン、タンパク質Ａ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、抗体精製用の特異なエピトープ標識、および、発現したタンパク質の単離および精製を補助することのできる他のタグ）と多重クローニング部位リンカー配列とを組み入れることが望ましい場合がある。パッケージとそれに続く分泌用に発現したタンパク質を細胞外流体マトリクス内に分泌するように命令するシグナルペプチ配列を用いて、発現したタンパク質の精製を簡素化し、その効率を高めてもよい。さらに、ベクターのパッケージ機能を高める他の遺伝子配列をベクター配列内に組み入れることも可能である。この１例が、遺伝子配列をコードする顆粒球／マクロファージ-コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を、抗体や他の免疫応答（例えば、ワクチン）の生成に使用可能なタンパク質用哺乳動物発現ベクターに組み入れることである。ＧＭ−ＣＳＦが抗原提示細胞（ＡＰＣ；樹状細胞およびマクロファージ）を補充すると同時に、幹細胞成長因子の生成を促進する。これにより、免疫修飾物質系が刺激され、哺乳動物宿主が、特異性および親和性のより高い抗体を多く生成できるようになる可能性がある。
【００６０】
アフィニティタグを用いて、標識目的タンパク質に結合したタンパク質複合体を単離することもできる。例えば、これまでに酵母で立証されたタンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグシステム（Ｒｉｇａｕｔ他著、「１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７」、１０３０〜１０３２頁；Ｇａｖｉｎ他著、「２００２  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５」、１４１〜１４７頁）を用いてプロテオームを単離すると、目的タンパク質がそのＴＡＰタグを含む。ＴＡＰシステムでは、目的タンパク質が、特異なＴＥＶプロテアーゼ切断配列により分離された２種類のアフィニティタグ（例えば、タンパク質ＡおよびＣＢＰ）に付着する。目的タンパク質をこの酵母発現系内にて天然レベルで発現させるには、ＴＡＰタグをコードするＤＮＡカセットを、目的タンパク質とインフレームで単相酵母細胞のゲノム内に相同組換えすることにより、インテグレートさせる。
【００６１】
ＴＡＰシステムは、非特異結合を削減するための２ステップ精製システムからなる。このアフィニティ精製システムは、特異なＴＥＶプロテアーゼ切断配列の存在と組み合わせられることにより、穏やかな溶出条件を作り出して、プロテオームやタンパク質複合体を単離する可能性を高めることができる。通常、ＴＡＰ精製はまず、特異なＴＥＶプロテアーゼ切断配列により分離された２種類のアフィニティ標識用コード配列を含むＴＡＰ遺伝子カセットを、インフレームで目的遺伝子配列の端部に付着させるステップからなる。ＴＡＰ遺伝子カセットを、ＰＣＲのクローニングまたは増幅、あるいは目的タンパク質を含む適したベクター内への挿入およびライゲーションにより、タンパク質コード配列の端部に付着させることができる。次に、目的のＴＡＰ標識タンパク質コード配列を宿主細胞内に挿入して発現させ、目的タンパク質に関連するタンパク質を単離し、同定する。別法として、ＴＡＰ遺伝子カセットを、宿主有機体の染色体内におけるインフレームでの相同組換えにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで目的タンパク質に付着させることもできる。次にＴＡＰ標識タンパク質コード配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させ、関連タンパク質を単離する。
【００６２】
関連タンパク質の単離は、２ステップによる精製工程により行われる。まず、ＴＡＰ標識タンパク質に関連するタンパク質すべてを単離するために、第１のアフィニティ精製を行う。ＴＥＶプロテアーゼで切断することによりアフィニティマトリクスからの穏やかな溶出が行われて、プロテオームまたはタンパク質複合体が第１のアフィニティ精製マトリクスから溶出される。非特異タンパク質、汚染物およびＴＥＶプロテアーゼをすべて除去するために、第２のアフィニティ精製マトリクスを使用して第２のアフィニティ精製を行う。次に、ＥＧＴＡ溶出により、結合された目的タンパク質から、関連タンパク質を放出させる。単離したタンパク質を、変性ゲル電気泳動を用いてさらに単離する。各タンパク質バンドは、トリプシンで消化され、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）で解析される。このタンパク質を、ＮＣＢＩ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴまたは他の当業者には周知であるデータベースなどのデータベースでのＰｒｏｆｏｕｎｄ（商標）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（商標）などの周知のデータベース探索アルゴリズムにより同定し、プロテオーム内のタンパク質含有量ならびに、単離されたさまざまなプロテオーム構造間のタンパク質含有量について解析することができる。
【００６３】
他の哺乳動物、原核生物、昆虫、菌または酵母ベクターも、本明細書内に開示した方法および組成と組み合わせて使用することができる。その例として、これに限定するものではないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＨＡＴ、ｐＩＲＥＳ、ｐＧＢＫＴ７、ｐＶＰａｃｋ、ｐＣＭＶ−ｔａｇ、ｐＤｕａｌ−ＧＣ、ｐＢｋ−ＣＭＶ、ｐＩＢ−Ｅ、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐｌｕｅＢａｃ４、５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＹＤｌ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＹＥＳ２、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＮＭＴｌ、ｐＰＩＣＺ、ｐＮＭＴｓｌ、ｐＭＥＴ、ｐＰＩＣ３ＪＫ、ｐＧＡＰＺ，ｐＡ０８１５、ならびに、原核生物、哺乳動物、酵母、菌または昆虫細胞発現系、あるいは異種発現系による遺伝子成分の組み合わせ内における発現に必要な遺伝子成分や、上記発現系の少なくとも１つで発現するように、異なる発現系からの遺伝子成分の組み合わせを組み入れた他のベクターが挙げられる。
組換えベクターのスクリーニング
転写解析
目的タンパク質の発現をスケールアップする前に、目的配列を含むベクターを、標的に対する正確な転写について評価することができる。ｃＤＮＡのクローニングベクター内への正確な挿入を、アレイ形態におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系、原核生物発現系、真核生物発現系または植物転写発現系を用いて評価し、精製された転写物のサイズ解析を行うことができる。好適な一実施形態が図１３に示されている。この場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写解析により、発現および精製に使用する可能性のあるベクター構築物をプレスクリーニングする。適したベクター内へのインサートのクローニングから予め選択したベクター構築物を、ステップＳ１００に示す、この例では３×６アレイであるアレイフォーマット内に配置して、同時に解析することができる。このベクター構築物は、さまざまな発現系から選択することができ、その発現系の例として、昆虫発現系、植物発現系（Ｇｅｎｅｗａｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標））（ＧＷＶ）および細菌発現系（大腸菌）が挙げられる。インサートＤＮＡを１つのクローニング内にうまく挿入できなかった場合には、Ａ１〜Ａ６として示すクローニング試料から複数のクローンをスクリーニングすると有用となり得る。ベクター構築物に、ｃＤＮＡインサートの上流に位置するＴ７プロモーターまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が可能な他のプロモーターを含めることができる。ステップＳ１０５として示すＴ７ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を、細菌Ｔ７ＴＮＡポリメラーゼの添加により開始し、ステップＳ１１０にて、ＲＮＡアガロース、ポリアクリルアミドまたは他種のＲＮＡサイズ分離ゲル電気泳動またはＲＮＡ解析システムで転写物長さを解析することができる。転写物の予想サイズにしたがって、成功した反応Ｓ１１５および不成功だった反応Ｓ１２０を記録し、許容範囲内の転写物数が５０〜７５％などの所定閾値を下回っていれば、各（またはプレート全体）転写反応を繰り返すことができる。許容範囲内の転写物数が上述した所定閾値を下回っている場合、そのクローンを適した宿主ベクター内に再度形質転換して、引き続きＴ７ベクターを増幅および再精製し、次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写することができる。
【００６４】
他の転写システムも、各クローン化されたｃＤＮＡベクトル内の成功した転写生成物の評価に使用可能である。そのシステム例として、ＳＰ６転写、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、または他のあらゆる転写システムが挙げられる。いずれのシステムの場合も、ＲＮＡポリメラーゼによる認識のために、適したプロモーター（それぞれのシステムに対してＳＰ６およびＴ３プロモーター）が必要である。ＲＮＡポリメラーゼの添加および転写後、その転写物について、ポリアクリルアミド、アガロースまたのゲルによる電気泳動で、適切なサイズの転写物が含まれているかどうかを解析できる。
発現解析
目的配列をベクター内に正確に挿入したことを確認したら、タンパク質発現について評価して、タンパク質発現に対する最適なベクターおよび条件を判別することができる。別法として、ベクター構築物をタンパク質発現について直接試験して、転写やＲＮＡ解析すべてを省略することも可能である。いずれの形態においても、小規模でのタンパク質発現評価をスクリーニング方法体系として用いて、上述したタンパク質精製方法体系と併用するための最適なタンパク質発現系を決定できる。
【００６５】
タンパク質発現の評価を、植物、細菌、酵母、菌、昆虫および哺乳動物発現系などのさまざまな発現系内で行うことができる。好適な発現系は、目的タンパク質の発現に植物発現系を使用することである。しかし、上述したように、タンパク質によっては植物発現系内でうまく発現しない、または全く発現しない種類もある。他の発現系も、その宿主発現系の培養および増幅に利用可能な設備の種類に応じて、発現用に好都合な系となり得る。ベクターおよびインサートの試験を目的とする別の実施形態として、細菌、菌、酵菌、昆虫および哺乳動物発現系が挙げられる。
【００６６】
植物内のタンパク質発現はさまざまな方法で評価可能である。本発明による好適な一実施形態は、図１４に示すように、ステップＳ１３０に示すプロトプラスト培養内およびステップＳ１２５に示す無傷な植物内双方におけるタンパク質発現を評価することである。ステップＳ１２５に示す無傷な植物に、目的のタンパク質配列（例えば、ＧＷＶ＝Ｇｅｎｅｗａｒｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標））を発現させた、適したウィルスベクターを感染させることができる。好ましくは、若い葉や茎に、目的配列を含んでタンパク質の外殻で包囲されたウィルスベクターを感染させる。ステップＳ１３５に示すように、ウィルスベクターを、エレクトロポーレーション、ボンバードメント（例えば、組換えウィルスベクターをコーティングした極微なチタンまたは金の顆粒を高速で細胞内に打ち込む）、または、目的のタンパク質配列を発現させる異種核酸を無傷な植物細胞内に導入する他の方法で、植物宿主内に挿入することができる。植物ベクターは、１７〜２８日齢（好ましくは２１日齢）の１〜３本という少数の有機体内に挿入すればよい。図１のＳ２に示すように、ウィルスに感染した植物を、１０〜１６日（ただしより好ましくは１２日）などの所定時間成長させる。成長した植物を採取して、感染した葉や茎を、磨り潰すと同時にホモジェネートを抽出するようにツインローラ式ドラムなどで磨り潰して、または、その植物材料を細かく磨り潰す他のいずれかの方法により処理する。こうして得られる抽出物が緑液汁であり、これをさらに処理して、発現したタンパク質を精製する。例えば、この緑液汁を、２５ｍＭのトリスｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＰＭＳＦ、および４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧに調節された７ｍＭの８−メルカプトエタノール緩衝液と１：２の比率で組み合わせ、１時間半４℃で放置した後、遠心処理を行うと、不純物を除いた緑液汁を得ることができる。この緑液汁を、Ｎｉ−ＮＴＡビードのスラリ２０μｌを入れた９６ウェルＭＢＰＰ（メルトブローンポリプロピレン）フィルタプレートに添加する。この緑液汁およびＮｉ−ＮＴＡビードを１時間室温にてインキュベートした後、１０００×Ｇにて５分間スピンして緑液汁をウェルから取り出す。Ｎｉ−ＮＴＡビードを洗浄して、非特異的に結合している緑液汁タンパク質を除去する。目的のアフィニティ標識タンパク質を、イミダゾールまたはＥＤＴＡインキュベーションによりビードから溶出させる。溶出したタンパク質を第２の９６ウェルプレート内でスピンし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で、タンパク質の存在について検査する。当業者であればわかるように、緑液汁タンパク質の精製はさまざまな工程で行うことができ、その例として、譲受人と同じとするＧａｒｇｅｒらに付与された米国特許第６，０３７，４５６号に記載の工程;カリフォルニア州ＶａｌｅｎｃｉａのＱｉａｇｅｎにより２００１年３月に発行されたＴｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標）  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ６×Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に記載の工程が挙げられ��。この初期試験ではわずかな量の発現タンパク質を産生することができ、その量を、μｇまたはこれより小さな単位で測定可能とすることができる。
【００６７】
Ｓ１３０（図１４）に示すタンパク質の発現には、無傷な植物に感染させるのではなく、植物細胞培養すなわちプロトプラストを植物ベクターでトランスフェクトするほうが望ましい場合がある。植物細胞培養アッセイ用に、標準分子生物プロトコルにしたがってプロトプラストを準備する。プロトプラストは、広範なソースに由来したものでよく、その例として、葉、葯、シュート、根尖、または他の利用可能な植物組織が挙げられる。好適な実施形態は、ニコチアナ・タバカムから得る葉材料の消化物である。他の植物も適したものであれば使用可能であり、それは、核酸の増殖やタンパク質の発現用に選択されたベクターの種類に応じて異なる。その例として、ジャガイモ、シロイヌナズナ、他の被子植物または維管束植物、ならびに苔類やゼニゴケ類を含む多種植物が挙げられる。単一細胞プロトプラストによる懸濁は、まず葉などの外植体組織を収集し、次亜塩素酸ナトリウムに暴露するなどの標準技術を用いてその組織表面を消毒する。次に、その外植体を酵素の適切なカクテルで消化して、単一細胞懸濁を得る。好適な実施形態では、ペクチナーゼ（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ１０、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ  Ｙ２３、Ｒｈｏｚｙｍｅ  ＨＰ１５０および他のペクチナーゼ）およびセルラーゼ（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｃｅｌｌｕｌｙｓｉｎ、Ｄｒｉｓｅｌａｓｅおよび他のセルラーゼ）を使用することができる。ただし、各植物細胞を包囲している間質組織を消化する他の酵素カクテルも使用可能である。
【００６８】
酵素消化を行った後、プロトプラスト懸濁をマイクロタイタプレート（この例では２×３マイクロタイタプレートアレイであるが、他のマイクロタイタプレートも使用可能）内に当分し、洗浄してから適切な媒体で培養する。好ましくは、これを２枚で行う。好適な実施形態に、市販されている基本のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地を使用することができるが、プロトプラストのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける維持に必要なマクロおよびミクロ成分、可溶性炭素源、窒素ビタミン類および他の成長因子の平衡混合物を提供する他の媒体調製物も使用可能である。数多くの異なる組み合わせおよび範囲の媒体成分をプロトプラストの拡大にうまく使用できることは当業者には周知のことである。
【００６９】
プロトプラストの懸濁および適した媒体内におけるインキュベーションを行った後、プロトプラスト細胞に、さまざまな方法でＤＮＡまたはＲＮＡをトランスフェクトすることができる。好ましくは、目的遺伝子をＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクター内に組み入れ、パッケージまたはタンパク質の外殻で包囲し、その包囲したウィルスをプロトプラストに感染させる。これにより、プロトプラストは適したベクターによりトランジエントにトランスフェクトされ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて誘導されて、所望のタンパク質を発現する。外来遺伝子の植物細胞内への導入および発現には、直接的なＤＮＡマイクロインジェクション、エレクトロポーレーション、リポゾーム担体、微粒子ボンバード（バイオリスティクス）、炭化ケイ素繊維、または他の方法も使用可能である。
【００７０】
別法として、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが媒介するＴｉ移入を、クローン化ＤＮＡの外来遺伝子の植物細胞内への導入および発現に使用することができる。例えば、クローン化ＤＮＡを、アグロバクテリウムが取り上げた適したベクター内に挿入することができる。挿入後、プロトプラストまたは無傷な植物を、ＤＮＡを含むアグロバクテリウムの存在下でインキュベートする。アグロバクテリウムは、Ｔｉ遺伝子の存在を通じて、形質転換および組込みをインサートＤＮＡの植物細胞宿主内へ仲介する。引き続き、目的ＤＮＡを同時にトランスフェクトされた誘導性プロモーターの制御下にてタンパク質発現を誘導することができる。または、植物宿主下での発現を引き続き規制する天然プロモーターを、トランスフェクトすることができる。こうした天然プロモーターには、高レベルにて外来遺伝子を発現させるように改変することのできる、構成的に活性なプロモーターを含めることができる。
【００７１】
プロトプラストを、細胞内または分泌経路がタンパク質発現に使用されているかどうかを判別するための初期スクリーニングツールとして使用することも可能である。マイクロウェル培養プレートをまず遠心処理してプロトプラスト細胞を細胞培地から分離する。その培地を、プロトプラスト細胞溶解物と共に並行に精製するため、吸引して収集する。プロトプラスト細胞溶解物も培地も、ならびに無傷な植物によるホモジェネート懸濁も、Ｎｉ−ＮＴＡビードやＮｉキレートディスク（Ｐｉｅｒｃｅ製Ｓｗｅｌｌ−Ｇｅｌ）などの金属結合マトリクスを含む９６ウェルフィルタプレートの別々のウェルに添加する。分画間の流動物を廃棄し、金属結合マトリクス（Ｎｉアガロースなど）を４０ｍＭ  イミダゾール／０．５ＭＮａＣｌ／リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）で洗浄する。次に、結合されているタンパク質を、１Ｍイミダゾール／０．５ＭＮａＣｌ／リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）で溶出し、１Ｄまたは２Ｄポリアクリルアミドゲル上で解析する（図１４のステップＳ１４０）。適したサイズの標的タンパク質が産生されていれば、その標的バンドを解析して、その発現レベルを定量する。プロトプラストサンプルに対する標的タンパク質はまた、どのサンプル単離体がＨｉｓ標識タンパク質を含んでいるかに応じて、分泌された経路または細胞内タンパク質経路について注目される。
【００７２】
標的バンドを、１Ｄゲルでの同定によるだけでなく、１Ｄポリアクリルアミドゲルから切り出して、トリプシンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）で解析することができる。この装置は、ｃＤＮＡのベクター（正確な読みとり枠）内への正確な挿入を確実にし、正確なタンパク質発現を確認できるものである。まずタンパク質をポリアクリルアミドゲルから溶出し、そのタンパク質をトリプシンで消化し、その断片を精製した後、凍結乾燥し、適した溶剤内で可溶化することにより、トリプシンＭＡＬＤＩを実施することができる。その後そのサンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置または他のイオン脱離方法を用いて解析し、順次ペプチド切断および質量測定を行う。別の実施形態として、標的バンドを１Ｄポリアクリルアミドゲルから切り出す、またはニトロセルロースやＰＶＤＦの膜に移入させてその膜から溶出することができる。次に、単離したタンパク質を、標準タンパク質配列技術（例えば、エドマン分解法、または他のタンパク質配列方法）を用いて配列させることができる。さらに、単離したタンパク質にトリプシン消化を行った後、標準タンパク質配列技術を適用することができる（例えば、エドマン分解法、または他のタンパク質配列方法）。
【００７３】
１ＤポリアクリルアミドゲルおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ上の解析を行った後、発現したタンパク質が正しいタンパク質である確率を、標準データベース解析を用いて算出することができる。
【００７４】
図１３について上述したのと同様に、図１４に示すように、ステップＳ１４０における解析を、ステップＳ１４５では、発現したタンパク質に関する合格の判定に、ステップＳ１５０ではその不合格の判定に用いる。
【００７５】
ベクターおよびそのインサートを、細菌、菌、酵母、昆虫および哺乳動物発現系を用いて評価することもできる。例えば、トランスフェクトしたプロトプラスト培養や感染植物からタンパク質が発現しなかった場合、対応するＭＥＶｃＤＮＡを大腸菌内の発現について解析して、植物やプロトプラスト内へのＤＮＡトランスフェクションエラーがタンパク質の発現しなかった原因ではないことを確認することができる。別法として、細菌発現系、菌発現系、酵母発現系、昆虫発現系を植物発現系と並行して試験して、タンパク質の発現および精製に最適な発現系を決定してもよい。
【００７６】
ｃＤＮＡベクターから外来タンパク質を原核生物宿主内に発現させるための、当業者には周知の方法が数多くある。好適な実施形態として、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡインサートを含むＭＥＶベクターを用いる、ＮｏｖａＢｌｕｅ  ＤＥ３などの大腸菌の適した宿主株の９６ウェルフォーマット内での形質転換が挙げられる。この転換体を、使用するベクターに応じて選択した抗体を含む固体培地上に配置し、９６ディープウェルブロック内にて３７℃にて一晩増殖させることができる。増殖させた大腸菌培養を、イソチオプロピル・ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む新鮮培地内に希釈し、そのベクター内の□−ガラクトシダーゼプロモーターを通じてタンパク質の発現を誘導する。別法として、大腸菌の他の株または適した原核生物宿主株を、ベクターＤＮＡおよびそのインサート、ならびに、温度依存発現または他の誘導性発現系などの代替誘導性プロモーター系を含む他のベクターの増殖に使用することができる。
【００７７】
規定時間による対数増殖の後、２マイクロリットルの培養を８×１２グリッドのニトロセルロース膜上にスポットし、標的タンパク質またはタグに対する抗体を用いて、ウェスタンブロットを行うことができる。別法として、発現したタンパク質とそこに付着したヘキサ−ヒスチジンタグとを、上述した９６ウェルフィルタプレートのＳｗｅｌｌ−Ｇｅｌ  Ｎｉキレートディスクマトリクス上に単離して精製することもできる。溶出したタンパク質を、１Ｄポリアクリルアミドゲル上で解析して、適したサイズの発現であったかどうかを判別することができる。また、トリプシンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを、切り出したタンパク質バンドに実施して、さらに同定することができる。
タンパク質発現のスケールアップ
タンパク質の評価およびスクリーニングを行った後、タンパク質の発現および精製をスケールアップすることができる。図１のＳ３に示すように、タンパク質の評価には、所望のタンパク質が発現したことの確認、植物当たりに得られた植物量、および標的タンパク質の発現レベルが含まれる。次に、図１のＳ４に示すように、得られた植物量および標的タンパク質発現レベルを用いて、所望量の標的タンパク質の産生に必要な有機体（すなわちタバコ植物）の数を算出する。図１のＳ４に示すように、所望量の標的タンパク質の産生に必要な数の有機体（すなわちタバコ植物）が植えられ、この有機体に、その中で発現させたいトランスジェニックウィルスおよびタンパク質を感染させる。ステップＳ１〜ステップ４に類似した一連のステップを、哺乳動物系、酵母系、昆虫系または細菌系タンパク質産生系の使用に適用できることを理解されたい。
【００７８】
図１においてＳ６およびＳ７として示すステップについて、図３および図４を参照しながら詳しく説明する。図３のＳ１０に示すように、複数種類のタンパク質が、ＧＥＮＥＷＡＲＥＸ（登録商標）発現系などの被選択発現系内に発現できるようになっている。
【００７９】
タバコ植物を採取し、ワーリングブレンダーや市販のジューサーなどの内部にて分解することにより、図３のＳ１１として示すように、所望の１種類または複数種類のタンパク質をその葉の細胞から緑液汁として放出させる。通常、抽出緩衝液に対する生物量の比は１：２であり、その緩衝液を、抽出前に植物材料内に真空浸潤させることができる。一般的抽出組成物は、２５ｍＭのトリスｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＰＭＳＦ、および７ｍＭの８−メルカプトエタノールであり、これに１％（ｗ／ｖ）以下のＴｗｅｅｎ−２０と５％（ｗ／ｖ）以下のアスコルビン酸ナトリウムとを含有させてもよい。次に、図３のＳ１２として示すように、緑液汁を、ＮａＣｌ内に通常通常４％（ｗ／ｖ）で含まれるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（濃度は３００ｍＭ〜２Ｍ）などの洗浄剤で処理する。しかし、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）などの洗浄剤を単独でまたはＰＥＧと組み合わせて使用してもよいことを理解されたい。ＰＥＧは、本願発明者らにより、より多くのかなりのクロロフィル含有タンパク質および膜複合体を除去して、クロマトグラフィカラムへの装填を可能にするほど緑液汁を十分に透明としつつ、より小さなサイズのタンパク質（および目的タンパク質）を緑液汁内に懸濁させておく洗浄剤であることがわかっている。具体的に言えば、ＰＥＧを水溶液である緑液汁に添加すると、より多くのタンパク質が相互作用するため、その凝集体が遠心処理または濾過により溶液から排出されやすくなる。
【００８０】
洗浄剤で処理した緑液汁を、少なくとも２通りある方法の一方で処理することができる。第１の方法は、図３のＳ１３に示すように、ＰＥＧで処理した緑液汁に濾過処理を施すことである。この処理には、緑液汁にパーライト（火山岩）などの濾過補助剤を混合して、その最終濃度を１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは、４％（ｗ／ｖ）とする。次に、緑液汁を、平均孔サイズが１．２ミクロンであり、パーライトでコーティングしたガラス繊維フィルタ内に通過させる。緑液汁は浄化されて通過するが、パーライトおよびより大きなタンパク質凝集体はフィルタ内に留まる。次に、浄化された緑液汁に、図３のＳ１５として示すステップを施すことができる。ただし、図３のＳ１５として示すステップは任意であり、必須ではないことを理解されたい。
【００８１】
もう１つの方法は、ステップＳ１２の後、ＰＥＧで処理した緑液汁に、３７００Ｇの力でおよそ２０分間遠心処理を施して、図３のＳ１４として示すように、より大きなタンパク質凝集体を、浄化した緑液汁から分離する。ミラクロスを通過する濾過により、うまく細かくならない破壊片が引き続き除去される。このように、クロマトグラフィに適した緑液汁を生成するだけでなく、どちらの浄化方法によっても、感染性ウィルス力価が同様に低下することがわかる。
【００８２】
必要に応じて、浄化した緑液汁に、図３のＳ１５として示す冷凍解凍処理を施す。具体的に言えば浄化した緑液汁を、ステップＳ１３またはステップＳ１４で冷凍および解凍した後、図３のステップＳ１６に示すように、再遠心処理を施す。冷凍解凍処理により、澱粉状材料および別の汚染性植物タンパク質を沈殿させ、さらに遠心処理または濾過処理を施すことにより、これを浄化した緑液汁から分離する。このステップＳ１５は、濾過または遠心処理後の緑液汁の透明度に応じて任意に行われるものであり、下流の精製ステップを補助するものではあるが、本発明に必須のステップではない。
【００８３】
次に、異なるタンパク質を含む複数種類のサンプルを同時に精製できるように、浄化した緑液汁の量を正規化する。正規化にあたり、尿素またはグリセロールを添加して、サンプルを所定の濃度および／またはｐＨ調節値にすることができる。例えば、尿素の濃度を５０ｍＭ〜４Ｍにし、グリセロールの濃度を５％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）にして、ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）またはリン酸ナトリウムあるいはトリス緩衝液を用いて、ｐＨを７．２〜７．３から７．５〜８．０へと上昇させることができる。正規化する間はｐＨの調節のみ実施できることを理解されたい。さまざまな量の尿素およびグリコールは、所望する目的タンパク質の特徴および性能に応じて、含有させてもさせなくてもよい。
浄化され正規化された緑液汁を、図４のステップＳ１７に示すように、図５〜図１１を参照しながら以下に説明する装置などの精製装置内に投入する。
ここで、図４に示した本発明の方法に関する説明を、図５〜図１１に示す装置の説明と突き合わせる。
【００８４】
図５に示すように、本発明の精製装置は、本発明の精製装置は、図４の工程系統図のステップＳ１７に示すように、浄化した緑液汁および緩衝液をまず充填する給送リザーバ５を含む。精製工程中、この給送リザーバ５は、水と氷の混合物などの冷却材で充填されたこれより大きな容器１０内に浸漬されている。これにより給送リザーバ５および浄化した緑液汁を１０℃未満、好ましくは約４℃、より好ましくは０℃近く、ただし緑液汁の凍結点よりは高い温度に維持する。酸化およびプロテアーゼ活性を最小限に抑えるため、浄化した緑液汁をほぼ低温に維持することが望ましい。浄化した緑液汁の温度を凍結点より高く、ただし１０℃未満に維持するため、水および氷などのあらゆる冷却剤を容器１０内で使用可能であることを理解されたい。別法として、冷蔵機構を用いて、容器５の周囲を低温に維持することも可能である。図示していないが、給送リザーバ５、これより大きな容器１０、および流動貫通収集リザーバ７０（以下で説明）をロボット式流体ハンドラ内に配置して、流体類をより自動化された方法で操作してもよい。こうした流体ハンドラとして、さまざまなロボット式流体取り扱い装置のいずれも使用可能であるが、例として、ロボット式サンプルプロセッサであるＧｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ、モジュラ自動ワークステーションであるＧｅｎｅｓｉｓ  Ｆｒｅｅｄｏｍ、または自動ワークステーションであるＧｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎなどのモデルを含むスイス、ＺｕｒｉｃｈのＴＥＣＡＮにより製造販売されている装置が挙げられる。
【００８５】
給送リザーバ５はチューブ１５に接続され、このチューブ１５は第１のバルブ２０に接続される。第１のバルブ２０はチューブ２５に接続され、このチューブ１５はさらに、ポンプ３０に接続される。ポンプ３０はさまざまなポンプのいずれでもよいが、好ましくは、浄化した緑液汁を本発明の精製装置内をほぼ低速で貫通させる低速ポンプとする。例えば、ポンプ３０を、流動速度範囲を０．０１〜４４．４ｍＬ／分とするＩＳＭＡＴＥＣ（登録商標）製速度可変ポンプ蠕動ポンプとすることができる。このポンプはまた、それぞれを専用精製装置内に入れる、図７を参照しながら以下で説明する方法で、複数種類のタンパク質を同時に精製できる多チャネル式ポンプである。
【００８６】
このポンプ３０を第２のバルブ４０に接続する。第２のバルブはチューブ４５に接続され、このチューブはカラム５０に接続される。カラム５０は、第３のバルブ６０に接続される配管５５に接続される。第３のバルブ６０は、チューブ６５に接続され、このチューブは流動貫通収集リザーバ７０に接続される。以下の説明から、給送リザーバ５に充填された緑液汁が、ポンプ３０の注入動作を介して、給送リザーバ５からそれぞれのチューブ１５、２５、３５、４５、５５および６５を通過し、カラム５０およびバルブ２０、４０および６０を通過して収集リザーバ７０内に収容されることを理解されたい。
【００８７】
カラム５０には、材料を中に保持しつつ流体流を貫通させることにより、流動する流体と保持している材料とを接触させて、これらの間に相互作用を起こすことのできる多孔質フリットが具備されている。本発明の精製装置において、カラム５０内のこの材料は、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（商標）として市販されている例などのアフィニティ樹脂、またはこれと同様の、所望の目的タンパク質を一時的に保持するための材料である。浄化した緑液汁をカラム５０内に流動させると、目的タンパク質がこのアフィニティ樹脂に付着して保持される。
【００８８】
バルブ２０、４０および６０はそれぞれ、チューブ７５、８０および８５に接続され、さまざまな目的で精製装置内に具備される。精製モードにおいて、バルブ２０は、流体をチューブ１５からチューブ２５まで連通（流体流動）させるように設定される。バルブ２０を、洗浄、精製した目的タンパク質の除去（これについては以下で説明する）、またはポンプ３０およびシステムの平衡化の準備などを目的として、流体をチューブ７５からチューブ２５まで流動させるように設定することも可能である。バルブ２０を、流体をチューブ１５からチューブ７５まで流動させるように設定することも可能である。
【００８９】
精製モードにおいて、バルブ４０は、流体をチューブ３５からチューブ４５まで連通させるように設定される。ただし、バルブ４０を、ポンプ３０の洗浄または準備を目的として、流体をチューブ３５からチューブ８０まで流動させるように設定することも可能である。あるいは、バルブ４０を、カラム５０の洗浄または精製した目的タンパク質の除去を目的として、流体をチューブ８０からチューブ４５まで流動させるように設定することも可能である。
精製モードにおいて、バルブ６０は通常、流体をチューブ５５からチューブ６５まで連通させるように設定される。バルブ６０を、カラム５０の洗浄またはカラム５０内で精製した目的タンパク質の除去を目的として、流体をチューブ５５からチューブ８５まで流動させるように設定することも可能である。バルブ６０を、流体をチューブ８５からチューブ６５まで流動させるように設定して、チューブ６５のフラッシュおよび洗浄を可能にすることもできる。
【００９０】
バルブ４０は任意の構成要素であり、別法として、装置の用途に応じて、図５に示す装置から省くこともできることを理解されたい。
【００９１】
このシステムを配置する環境によって、システムの始動準備が必要となり得る。具体的に言えば、バルブ２０および８５を操作することにより、流体を容器１００からライン１５、ライン２５、ポンプ３０、ライン３５、ライン４５およびライン５５に導入することができる。通常、このシステムの準備は、カラム５０を取り出した状態で、ライン４５および５５を直接相互接続することにより行われる。この準備が終了したら、図５に示すように、着脱式カラム５０をライン４５とライン５５との間に再び挿入する。この準備工程において、チューブ１５を準備流体で充填する。準備の段階ではリザーバ５に緑液汁は入っておらず、準備が完了したら自動流体ハンドラを介してリザーバ５内に緑液汁を注入できることを理解されたい。ライン４５および５５に特殊連結部（図示せず）を具備してもよい。これにより、準備工程時のカラム５０の着脱が容易となる。
【００９２】
この精製システムの操作にあたり、浄化した緑液汁を液汁容器５内に投入する。投入後、ポンプ３０を作動して、浄化した緑液汁を液汁容器５から引き出し、チューブ１５、バルブ２０、当然ながらポンプ３０、チューブ３５、チューブ４５、およびバルブ４０を通過させ、カラム５０内へと流入させる。カラム５０では、浄化した緑液汁がカラム５０内に配置されている材料と相互作用し、理想的には、すべての目的タンパク質がカラム５０内に保持され、残りの緑液汁部分がカラム５０から基本的に廃棄物として流出する。この廃棄液汁はチューブ５５、チューブ６５およびバルブ８５を通過して、収集リザーバ７０内  に流入する。
【００９３】
図４に戻ると、図４のＳ１８に「カラムの平衡化」として示すように、精製前に、精製モード開始前のアフィニティ樹脂およびカラム５０の条件を整えなければならない。カラム５０を平衡化するために、図８に示すように、容器５内の緑液汁および緩衝液の性質を刺激する平衡化溶液を容器１００内に投入する。例えば、平衡化溶液のｐＨを通常、浄化した緑液汁および緩衝液と等しくし、尿素、ＰＥＧおよび／またはグリセロールを、緑液汁および緩衝液に含有されていれば同じ濃度で平衡化溶液に含有させる。この平衡化溶液を、図８に示すように、容器１００からカラム５０を通過させ、配管８５を介して廃棄する。
【００９４】
その後、バルブ２０および６０を精製モードに設定して、図９および図４のＳ１９に示すように、浄化した緑液汁および緩衝液混合物を容器５からカラム５０を介して収集リザーバ７０へ注入する。上述したように、アフィニティ樹脂が、タンパク質内のタグとの相互作用により、目的タンパク質を捕捉する。ポンプ３０により、カラム５つまりアフィニティ樹脂内の滞留時間が３０秒〜５分となるように、浄化した緑液汁および緩衝液混合物を所定速度でカラム５０内を通過させる。ただし好ましくは、緑液汁のカラム内滞留時間がおよそ１分となる一定速度で、緑液汁および緩衝液混合物をポンプ３０で注入する。
混合物全体がカラム５０を通過した後、図４のステップＳ２０に示すように、汚染物を洗い流し、特定の緩衝液成分、例えばＰＥＧおよび尿素を除去しなければならない。図１０に示すように、汚染物は、プロポーショニングバルブ１１５を介した、容器１０５および容器１１０内に保管されている２種類の溶液の少なくとも一方で、カラム５０から洗い出される。例えば、多種タンパク質に対して、低濃度の拮抗阻害剤イミダゾール（１０〜９０ｍＭ）を含む容器１１０内の緩衝液を用いて、汚染されたタンパク質とアフィニティ樹脂との相互作用を削減することができる。別法として、容器１１０内の溶液に当初、浄化した緑液汁と同様の濃度で尿素、グリセロールおよび／またはＰＥＧを含有させる。これをカラム５０内に通過させ、その流動量を、容器１０５からの流動量を直線的に増加させるにつれて、漸次直線的に低下させる。リザーバ１０５内の緩衝液は、異なる濃度、尿素、グリセロールおよび／またはＰＥＧを含有しており、その濃度は通常ゼロである。したがって、不要な成分の濃度はこの工程中に漸次低下する。カラム５０内の状態が急激に変化すると保持されている標識タンパク質に悪影響を及ぼすことがあるが、これにより、カラム５０内の状態を急速に変化させずにすむ。図１０に示すように、洗い出された成分は、配管８５を介して排出される。
【００９５】
次に、図４のステップＳ２１に示すように、カラム５０を溶出して、目的タンパク質を取り出し、図１１に示すようにリザーバ内へ給送する。通常、１００〜２００ｍＭのイミダゾールやＥＤＴＡを含む燐酸緩衝生理食塩水などの所定の溶出液が、図５および図１１に示すリザーバ１２７内に供給される。図１１に示すように、リザーバ１２７内の溶液を、バルブ９０および２０を介してカラム５０から給送して、捕捉されている目的タンパク質をカラム５０内のアフィニティ材料から放出させ、これをリザーバ１１８内に捕捉する。
別法として、カラム５０からの溶出前に、洗浄した後に復元緩衝液（例えば、燐酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、または復元に用いられる他の緩衝液）をリニアグラジエントで導入することにより、目的タンパク質をカラムマトリクス上でｉｎ  ｓｉｔｕにリフォールドしてもよい。例えば、数多くのヒスチジン標識タンパク質が変性条件下で精製されると、そのヒスチジンタグがカルボキシ末端かアミノ末端にて露出されるため、金属アフィニティマトリクス上に含まれる結合基とのこのタグの結合量が増加する。ヒスチジン標識タンパク質は引き続き、カラム内を通過する緩衝液のｐＨを低下させることにより、または高濃度のイミダゾールまたはＥＤＴＡを導入することにより、変性された状態で金属アフィニティマトリクスから溶出される。溶出されたタンパク質は、濃度がより高い場合に特に、溶液から落下する、または沈降する場合がある。これは、溶出されたタンパク質の変性状態を原因として暴露された疎水基間における分子間相互作用によるものと考えられる。タンパク質が再溶解できない場合、タンパク質の収穫量全体は少なくなる。しかし、洗浄後に復元緩衝液をリニアグラジエントで導入することにより、タンパク質は、アフィニティマトリクスに結合しながらリフォールドできる可能性がある。リフォールドしている間、先に露出されていた疎水基は遮蔽されるため、分子間の疎水性相互作用およびタンパク質の沈降を避けることができる。
【００９６】
タンパク質のリフォールドを誘導するようにグラジエントを用いることが重要である。本願が請求する方法は、本願による機構の理解に応じてその実施に変化のあるものではないが、復元緩衝液を漸次導入することにより、タンパク質をアフィニティマトリクスに結合させつつタンパク質の適切なフォールディングを補助して、結合したタンパク質に、複雑な三次構造または四次構造に適切にリフォールドする時間を与えられると考えられる。目的タンパク質をカラム上でリフォールドさせた後、溶出緩衝液を導入して、そのタンパク質をカラムから溶出することができる。
【００９７】
目的タンパク質をｉｎ  ｓｉｔｕでリフォールドさせつつ、アフィニティマトリクスに結合させたい場合、リニアグラジエントメーカーを使用することができる。リニアグラジエントメーカーを使用すると、復元緩衝液を一定量または一定時間にわたり漸次導入することができる。リニアグラジエントメーカーに少なくとも１つのポンプまたはプロポーショニングバルブを具備して、図５および図１０に示すリザーバ１０５および１１０などの、開始用緩衝液および最終緩衝液を含む２つのリザーバからその液を抜き出すことができる。例えば、第１のリザーバに変性緩衝液を、第２のリザーバに復元緩衝液を含めることができる。第１のリザーバと第２のリザーバとの間に位置する調節バルブまたはプロポーショニングバルブ１１５が、この２種類の緩衝液の流入量を調節して、第２のリザーバから第１のリザーバへ流動するカラムランニング緩衝液の組成を変更する。カラムランニング緩衝液の組成は、ランニング当初は主に変性緩衝液からなる。この緩衝液組成は、第２のリザーバから第１のリザーバへの復元緩衝液の導入に伴って漸次変化し、最終的にカラムランニング緩衝液は復元緩衝液のみを含んで、タンパク質を徐々にリフォールドさせる。別法として、混合チャンバ（図示せず）を使用できる。この場合、第１のリザーバおよび第２のリザーバ内の溶液は、その混合チャンバ内に注入されてからカラムを通過する。上記と同様に、第１のリザーバと第２のリザーバとの相対比率は変化し、ランニング緩衝液の組成は、ランニング開始時は主に変性緩衝液からなり、ランニング終了時には主に復元緩衝液からなる。タンパク質のフォールディング時に、溶出緩衝液を通過させて、その標識タンパク質をアフィニティマトリクスから除去することができる。
【００９８】
リニアグラジエントではなく段階的に、復元緩衝液の漸次導入を行うことができる。例えば、塩または尿素濃度を下げた緩衝液を段階的にカラムに流動させることができる。当業者であれば、復元緩衝液を漸次導入して、変性された目的タンパク質のリフォールドをアフィニティマトリクスにてｉｎ  ｓｉｔｕで実施するためにさまざまな方法があることは明白であろう。
【００９９】
タンパク質には、互いから分離しにくい種類がある。したがって、図６に示す代替実施形態では、別法として、図５に示した装置に犠牲カラム４６を追加することができる。具体的に言えば、図６において、犠牲カラム４６をチューブ４５に接続して、チューブ４５から流出する液汁すべてがカラム４６内に流入するようにチューブ４５と流体連通状態とする。カラム４６をさらにチューブ４７に接続して、この間を流体連通にする。チューブ４７はバルブ４８に、バルブ４８はチューブ４９に、チューブ４９は上述したカラム５０にそれぞれ接続される。これ以外の、図６に示すシステムの構成要素はすべて、図５に示した実施形態の構成要素と同じである。
【０１００】
バルブ４８はチューブ９０にも接続される。精製モードにおいて、バルブ４８は、チューブ４７からの液汁をチューブ４９に方向付け、カラム５０内に流動させる。ただし、バルブ４８を、チューブ４７とチューブ９０との間を流体連通させるように設定することも可能である。さらに、バルブ４８を、以下で説明するように洗浄、フラッシュまたは精製したタンパク質の除去を目的として、チューブ９０とチューブ４９との間を流体連通させるように設定することも可能である。
【０１０１】
また、図９に示すように、緑液汁がカラム５０を複数回通過できるように、この装置に循環バルブ２００を設けてもよい。
【０１０２】
図１２に示すように、図５〜図１１に示す本発明による装置の各実施形態を自動制御するために、コンピュータを設ける。具体的に言えば、このコンピュータを装置のポンプおよびさまざまなバルブに接続する。図５および図８〜図１１に示したシステムの操作に関する上記説明が、図６の装置および図７の装置にも適用可能であることを理解されたい。
図７の装置は、複数の流動チャネルが別個に設けられて専用のカラム５０を有したシステムを示している。カラム５０はそれぞれ並行に動作して、複数種類のタンパク質を同時に精製する。具体的に言えば、ポンプ３０のそれぞれに連結された単一蠕動ポンプモータＭにより、複数の流動チャネルの注入動作が得られるため、緑液汁を複数のカラム内に同時に流動させることができる。また、給送リザーバ５それぞれが、単一アイスバス内に浸されている。蠕動ポンプモータの操作により所望のカラム滞留時間が得られる。これにより、上述したように、緑液汁がカラム５０内を一定速度で流動することにより緑液汁から目的タンパク質を高い信頼性で捕捉できる。流動速度が遅いため、許容範囲の目的タンパク質の精製を得るにはかなりの時間がかかる可能性がある。図５に示した装置の流動チャネルのように流動チャネルが１つのみであれば、複数種類のタンパク質精製には膨大な時間がかかる。したがって、単一装置内に複数の流動チャネルを平行に設けることにより、複数種類のタンパク質を同時に抽出することができ、タンパク質精製工程に大きな利点となる。
【０１０３】
図１２に示すコンピュータは、ポンプ３０のモータＭに、または別法として単一ポンプ３０、バルブ２０、４０、６０、９０および１１５に接続される。このコンピュータをさらに、温度センサＴおよび圧力センサ（図示せず）に接続して、多チャンバシステムを制御させることができる。あるいは、圧力センサを、カラム５０の下流および上流にて装置上に設けて、これらの間の流体流動を制御させることも可能である。さらに、図６および図９に示す代替実施形態では、バルブ４４、４８および２００にコンピュータを接続して、これらの制御を行うこともできる。
【０１０４】
図１２に示すコンピュータは、図１のブロック線図に示すＬＩＭＳ（実験室情報管理システム）の一部であり、ＬＡＮ（ローカルエリアネットワーク）により図２に示すサーバに接続されている。図１に示すように、ＬＩＭＳは、本発明による工程の統合部分であり、遺伝子配列、タンパク質の発現に使用するＤＮＡ配列、発現したタンパク質、各タンパク質の生成量、こうしたタンパク質の生成に使用する発現系、プレスクリーニング工程に関連する全データ、探索したデータベース情報の相関関係、および目的タンパク質を産生および精製するために実行されるさまざまなステップなどの生物学的材料すべてについて追跡するためのソフトウェアを含んでいる。ＬＩＭＳは、図２に示すコンピュータシステムおよび図１２に示すコンピュータを含み、図１２に示したコンピュータはさらに、このコンピュータで、さまざまなバルブ２０、４０、６０、９０および１１５と任意のバルブ４４、４８および２００を制御して、上述したように目的タンパク質を単離および溶出させられるようにするプログラミングを含んでいる。
【０１０５】
本発明によれば、コストパフォーマンスおよび効率がともに良い方法で、ミリグラム単位のタンパク質を大量に精製することができる。他の方法および装置を用いれば、極めて大量（１００ｇ〜Ｋｇ単位）または極めて少量（μｇ単位）の精製が可能であることから、本発明による方法および装置は１つの要望を満たすものである。
実施例１:抗体生成を目的とする複数種類のタンパク質の発現および精製
発現が肺または脳に限定されている標識に重点をおいたタンパク質のサブセットを、並行して行われるＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）系の発現およびそれに引き続く精製用に選択した。ヒトタンパク質指数（ＨＰＩ）およびスイススポットなどのタンパク質データベースを、企業内および市販されている遺伝子コレクションからの全長クローンの利用可能性に基づいて選択される、可能性のあるタンパク質およびサブセットについて調べた。各全長クローンに１つの配列ＩＤを割り振り、そのＤＮＡ配列および得られたタンパク質を、ベクター生成から確認まで（図１）、実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ）内で追跡できるようにした。ＤＮＡ配列に相補的なプライマーを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、各標的の読みとり枠を、増幅させてから精製して、適切なＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）発現ベクター内にライゲーションした。このベクターを、ヒスチジンタグ配列を含むように改変し、これにより、発現したタンパク質がＮ末端にタグを持つようした。得られたベクターをスクリーニングして、挿入の完全性および配位を確認した。成功したクローン事象をタンパク質の発現について評価し、失敗した事象を、クローン化ワークフローに再導入した。
【０１０６】
スクリーニングに関して、２１日齢のタバコ植物３本を接種するため、各クローンについて十分なｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写を生成した。接種後１２〜１４日してから、接種した葉より上方に位置する植物材料を採取し、重量を測り、組織解離して、緑液汁を得た。ディープウェルブロック（９６ウェル）で、１容量の緑液汁を２容量の抽出緩衝液（２５ｍＭのトリスｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｎＭのＰＭＳＦ、７ｍＭの６−メルカプトエタノール）と組み合わせて、４％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ（最終容量は１５００μｌ）に調節して、タンパク質産生時に得られた抽出物を刺激した。４℃にて１時間半保存した後、この緑液汁に２０分間、３０００×Ｇにて遠心処理を施して、標的タンパク質を含む、浄化した緑液汁を得た。標的タンパク質を捕捉するため、７００μｌの浄化した緑液汁を、９６ウェルフィルタプレートで２５μｌのアフィニティ樹脂（ＱｉａｇｅｎＮｉ−ＮＴＡ）と組み合わせて、室温にて１時間インキュベートした。浄化した緑液汁を保持できるほどに十分に疎水性であるフィルタを使用して緑液汁をインキュベート後に取り出し、５分間１０００×Ｇにて遠心処理を施した。捕捉したタンパク質と組み合わされたアフィニティ樹脂をフィルタで保持し、７００μｌの洗浄緩衝液（１６ｍＭのトリスｐＨ８．０、３３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール）で２回洗浄した。この洗浄と洗浄との間で、５分間１０００×Ｇにて遠心処理を施した。アフィニティ樹脂からの標的タンパク質の回収は、６０μｌの溶出緩衝液（１６ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および２００ｍＭのイミダゾールまたは２００ｎＭのＥＤＴＡ）内で５分間この樹脂をインキュベートし、遠心処理（１０００×Ｇにて５分間）を施してその溶出物を回収することにより行った。この溶出ステップを繰り返して、１２０μｌの最終産生物を得た。各標識タンパク質の発現レベルを評価するため、各精製から得た溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。クーマシー染色を行った後に正確な分子量とほぼ同じタンパク質バンドが見られ（±２０％）、陰性対照で共遊走するバンドが見られなければ、標的タンパク質がうまく発現したと予想された。このタンパク質レベルを、ウシ血清アルブミン標準を用いて濃度測定により定量した。この変数を、記録した植物量と共にＬＩＭＳシステムに入力し、標的タンパク質の産生に必要な植物数を決定した。
【０１０７】
タンパク質の産生に関して、タバコ野生種植物を９組植えた。追跡および接種を容易にするため、各標的タンパク質に必要な植物数を、最も近い９の倍数に切り上げた。各タンパク質の発現レベルは大幅に変化して、その結果、所与タンパク質レベルの実現に必要な植物数も大幅に変化するものである。したがって、９本から９６本の２１日齢植物を典型的に用い、これにしたがってｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写反応をスケールアップした。接種後１２〜１４日してから、接種した葉より上方に位置する植物材料を採取し、重量を測り、冷却した２容量の抽出緩衝液と組み合わせた。この抽出緩衝液を、緩衝液／植物材料が均等に分配されるように植物材料内に真空浸潤させた。その後、市販の液汁抽出機を用いて、緑液汁を得た。ＰＥＧを４％（ｗ／ｖ）まで添加し、緑液汁を４℃にて１時間半放置して、この抽出物のクロロフィル含有成分を凝集および沈降させた。４％（ｗ／ｖ）のパーライトを濾過助剤として用いて濾過することにより、緑液汁を浄化した。浄化した緑液汁を１０％（ｗ／ｖ）グリセロールに調節して、アフィニティ樹脂との疎水性タンパク質の相互作用を最小限に抑え、抽出量を抽出緩衝液で正規化した。予備平衡化精製装置の各チャネルに、特定の標的タンパク質を含む、浄化した緑液汁を装填した。所与標的タンパク質に対する緑液汁の量が他の標的タンパク質に対するより実質的に多い場合には、浄化した緑液汁を２つ以上のチャネルに分けた。精製タンパク質をアフィニティ樹脂から溶出した後、貯留した。浄化した緑液汁をアフィニティ樹脂に通過させ、ヒスチジン−標識タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティ樹脂上に滞留させた。このカラムに１０カラム容量の洗浄緩衝液を通過させて、汚染性植物タンパク質を除去し、２００ｎＭのＥＤＴＡを含む溶出緩衝液で、標的タンパク質を回収した。この抽出緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液の組成は、スクリーニングステップで用いたものと同じにした。各溶出物のアリコットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色を行ったタンパク質バンドの濃度測定とにより解析して、タンパク質の濃度を決定した。必要に応じてこのタンパク質を限外濾過により濃縮し、全タンパク質を燐酸緩衝生理食塩水内に透析した。その後、これを２０℃にて保管した。濃縮および透析を行った最終タンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施してタンパク質の純度を決定し、トリプシンＭＡＬＤＩを実施してタンパク質の同定を確認した。
【０１０８】
表１Ａ及び表１Ｂは、５〜１５種類の特有タンパク質がＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）を用いて発現し、並行して精製された、産生工程の結果をまとめたものである。スクリーニングに基づいて、標的タンパク質当たり最小限の９本の植物に抑え、１．５ｍｇの精製タンパク質を得るように十分な量の植物を接種した。産生モードにおいて、２７種類の標的中１０種類で、必要なタンパク質レベル以上を実現した。１１種類の場合で、植物数を適切に調節して、タンパク質要件を満たすように２回目の産生を行ったところ、６種類の標的でタンパク質が回収されなかった。この結果を、ＧＥＮＥＷＡＲＥ発現系を植物９組に対して行い、確認した。この精製後にタンパク質が回収されない場合、その配列ＩＤをＧＥＮＥＷＡＲＥ不適合として区別し、哺乳動物発現系などの別の発現系で評価する。
【０１０９】
【表１Ａ】
2005511755.tif 000002
【表１Ｂ】
2005511755.tif 000003
本発明の種々の詳細について、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を加えることが可能である。また、本発明による実施形態に関する上記説明は、例示のみを目的としており、請求の範囲およびその等価物により規定される本発明を何ら制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】本発明による、１種類または複数種類の所定タンパク質を産生および精製するための、融通性の高い方法の汎用ステップを示す工程系統図である。
【図２】本発明の一実施形態で使用するコンピュータシステムの一部を示す概略図であり、このコンピュータシステムは、タンパク質の選択と、１種類または複数種類の被選択タンパク質を発現させる遺伝配列の同定とを支援するものである。
【図３】本発明による、生成された１種類または複数種類のタンパク質を精製する方法のステップを示す工程系統図である。
【図４】本発明による、図３に示した精製方法の連続ステップを示す別の工程系統図である。
【図５】本発明による、単一タンパク質を精製する装置の構成部品を示す概略図である。
【図６】本発明による、単一タンパク質を精製する装置の代替実施形態の構成部品を示す概略図である。
【図７】本発明による、複数種類のタンパク質を同時に精製するために並行して動作する、図５に示した装置などの複数の装置を示す概略図である。
【図８】平衡化溶液を本発明による装置内に通過させた状態である、図５に示した装置の操作ステップを示す概略図である。
【図９】本発明による装置のカラム内にある目的タンパク質を捕捉するために緑液汁を装置内に通過させた状態である、別の操作ステップを示す、図８に類似した概略図である。
【図１０】望ましくない材料を本発明によるカラムから洗い流すために洗浄液を装置内に通過させた状態である、別の操作ステップを示す、図８および図９に類似した概略図である。
【図１１】目的タンパク質を本発明による装置から取り出すために溶出液をカラム内に通過させた状態である、図８〜図１０に類似した概略図である。
【図１２】本発明の一実施形態で使用するコンピュータシステムのうち、本発明による精製装置を制御する部分を示す概略図である。
【図１３】in vitro転写およびゲル電気泳動解析を用いた、複数種類のベクターを正確に転写するためのプレスクリーニングを示す概略図である。ゲル電気泳動に正しいサイズの転写を発現させるベクターを次の研究に用いて、タンパク質を精製するための最適なベクターおよびシステムを決定する。
【図１４】無傷な植物および／または細胞培養プロトプラスト系を用いた、複数種類のベクターを正確に翻訳および発現させるためのプレスクリーニングを示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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