(57)【要約】【課題】  cAMP（環状アデノシン5’一燐酸）ホスホジエステラーゼ4 (PDE 4)族の”D”亜族に属し、関連するイソ型の類をかたちづくる単離したポリペプチド、および、このポリペプチドとポリヌクレオチドの断片と変異体、並びにこれらの使用方法を提供すること。【解決手段】  ヒト、ラットおよびマウスcAMPホスホジエステラーゼのイソ型(各種PDE4D7と表示する)およびこれ等のポリペプチドをコードするDNA (RNA)、また、これ等のポリペプチドを、診断用検定に用いて、本発明のポリペプチドをコードする核酸塩基配列の突然変異を同定する方法、本発明のポリペプチドの変化量を検出し、疾病を検出する方法、および各種PDE4D7の可能性のある調節因子（特に阻害剤）をスクリーニングする方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列SEQ ID NO : 8,12,15, 18, 19, 又は 20を含む、単離したポリペプチド、またはその変異体若しくは断片。
【請求項２】
アミノ酸配列SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20に対し、少なくとも約90-99%相同な、単離したポリペプチドまたはその断片。
【請求項３】
アミノ酸配列SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20に対し、少なくとも97-99%相同な、請求項２に記載されたポリペプチドまたはその断片。
【請求項４】
ATCC 寄託 No PTA-3893, PTA-3894, PTA-3895に含まれる、cDNAにコード化されている単離したポリペプチド、またはその断片。
【請求項５】
塩基配列SEQ ID NO: 3,7,11, 14,21-24, 25.を含む単離したポリペプチド、その変異体または断片、若しくは、塩基配列SEQ ID NO: 3,7,11, 14,21-24, 25.に対し相補的な、単離したポリペプチド、若しくはその変異体又は断片。
【請求項６】
ATCC 寄託 No PTA-3893, PTA-3894, PTA-3895に含まれる、cDNAの塩基配列を含む単離したポリヌクレオチド、またはその断片。
【請求項７】
アミノ酸配列SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19, 又は 20を含むポリペプチドをコード化する、単離したポリヌクレオチド、その断片または変異体、若しくは、アミノ酸配列SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19, 又は 20を含むポリペプチドをコード化する塩基配列に相補的な配列の、単離したポリヌクレオチド、その断片または変異体。
【請求項８】
塩基配列SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25に少なくとも約90-99%相同的な配列の、単離したポリヌクレオチドまたはその断片。
【請求項９】
塩基配列SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25に少なくとも約97-99%相同的な配列の、請求項８に記載されたポリヌクレオチドまたはその断片。
【請求項１０】
PDE4D7をコードし、SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25の配列の核酸とストリンジェント条件でハイブリッドする、単離したポリヌクレオチド。
【請求項１１】
SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25の配列のポリヌクレオチドを含む、組み換え構築体。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが操作上調節配列と連結している、請求項11に記載された組み換え構築体。
【請求項１３】
前記調節配列がプロモーター又はエンハンサーである、請求項１２に記載された組み換え構築体。
【請求項１４】
請求項11に記載された構築体を含む細胞。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物、ヒト、酵母、または昆虫細胞である、請求項14に記載された細胞。
【請求項１６】
前記構築体を前記細胞に導入することによって、請求項11の構築体を含む細胞を作製する方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが発現する条件下で請求項14の細胞をインキュベートしてポリペプチドを作り、そのポリペプチドを集めることからなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
SEQ ID NO : 8,12,15, 18, 19又は 20.のポリペプチドに特異的な抗体、またはその断片。
【請求項１９】
前記抗体がポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項18に記載された抗体。
【請求項２０】
SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25のポリヌクレオチドと患者からの核酸を接触させ、前記核酸量を測定することを特徴とする、診断を必要とする患者の疾病状態又は疾病状態への感受性を診断する方法。
【請求項２１】
細胞のゲノム中の、SEQ ID NO : 3,7, 11,14, 21-24 又は 25のヌクレオチド配列、又は、SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド塩基配列に生ずる、突然変異の存在、多型、またはSNPを決めることを特徴とする、診断を必要とする患者の疾病状態又は疾病状態への感受性を診断する方法。
【請求項２２】
SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドに対して特異的な抗体と、患者からの細胞、組織、細胞抽出液、または、ポリペプチドを接触させ、前記ポリペプチドの量又は活性を測定することを特徴とする、診断を必要とする患者の疾病状態又は疾病状態へのなりやすさを診断する方法。
【請求項２３】
患者から分離したPDE4D7ポリヌクレオチドの突然変異を同定することで特徴付けられる、前記患者の疾病状態又は疾病状態へのなりやすさを診断する方法。
【請求項２４】
調節薬剤として予想される薬剤と細胞、組織、または組織細胞抽出液とを接触させ、SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドの量又は活性を測定するか、若しくはcAMPレベルを測ることで特徴付けられる、前記ポリペプチドの発現又は活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
調節薬剤として予想される薬剤と細胞、組織、または組織細胞抽出液とを接触させ、SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量又は活性を測定するか、若しくは、cAMPレベルを測ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチドの活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２６】
SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドと結合薬剤として予想される薬剤を接触させ、結合複合体の存在を測定することを特徴とする、前記ポリペプチドに結合する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと結合薬剤として予想される薬剤を接触させ、結合複合体の存在を測定することを特徴とする、前記ポリヌクレオチドと結合する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
少なくとも1コピーのSEQ ID NO:3, 7, 11, 14, 21-24 又は25のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物。
【請求項２９】
動物がマウスである、請求項28に記載されたトランスジェニック動物。
【請求項３０】
少なくとも1コピーのSEQ ID NO:3, 7, 11, 14, 21-24 又は25のポリヌクレオチドからなるノックアウト動物。
【請求項３１】
SEQ ID NO : 8,12, 15,18, 19 又は 20のポリペプチド又はその断片、および薬学的に許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項３２】
SEQ ID NO:3, 7, 11, 14, 21-24 又は25のポリヌクレオチド又はその断片、および、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
PDE4D7の発現又は活性を調節する医薬組成物。
【請求項３４】
薬剤が阻害物又は促進物である請求項33の医薬組成物。
【請求項３５】
請求項31に記載された医薬組成物を、必要とする患者に投与することを特徴とする、PDE4D7の異常な発現、および/または、活性を介する、または、PDE4D7に関わる疾病状態を治療する方法。
【請求項３６】
請求項32に記載された医薬組成物を、必要とする患者に投与することを特徴とする、PDE4D7の異常な発現、および/または、活性を介する、または、PDE4D7に関わる疾病状態を治療する方法。
【請求項３７】
請求項33に記載された医薬組成物を必要とする患者に投与することを特徴付とする、PDE4D7の異常な発現、および/または、活性を介する、または、PDE4D7に関わる疾病状態を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばcAMP（環状アデノシン5’一燐酸）ホスホジエステラーゼ4 (PDE 4)族の”D”亜族に属し、関連するイソ型の類をかたちづくる単離したポリペプチドに関する。各種PDE4D7と命名するこれ等のイソ型は例えば、ヒト、ラット、マウスを原料として得られる。これ等のイソ型は、このポリペプチドをコードするmRNA生成時に行われる代替スプライシングを反映している。また、本発明はこのポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド、および、このポリペプチドとポリヌクレオチドの、断片と変異体に関係している。本発明のポリペプチドは、例えば記憶形成の様な多くの生理学的作用に関係している。
【発明の開示】
【０００２】
本発明の第1の発明は、SEQ ID NO:8（ラット由来）；SEQ ID NO:12（ヒト由来）；SEQ ID NO:15（マウス由来）で表される、単離したPDE4D7タンパク質の全長からなる。SEQ ID NO: 8, 12 および15で表されるポリペプチドは夫々、747, 748および747のアミノ酸を有する。
【０００３】
上記各タンパク質のN末端にはユニークな91量体（切れ目の無い91のアミノ酸配列であり、例えば連続し一体となった91のアミノ酸である）の断片が位置し、この断片はこのポリペプチドをコードするmRNAの5’領域で代替スプライシングが行われたことを反映する。この91量体はSEQ ID NO:18（ラット由来）；SEQ ID NO:19（ヒト由来）；SEQ ID NO:20（マウス由来）で表される。これ等の配列は、以後、ユニーク91量体、または総称的に91量体という。ヒト91量体はマウス91量体と89%配列同一性があり、ラット91量体とは87%配列同一性がある。マウスとラットの91量体は96%配列同一性を示す。
このように、本発明は単離したポリペプチドに関するものであり：SEQ ID NO:8, 12, または15で表されるポリペプチドの全長、またはその配列から選択されたものからなることを特徴とするポリペプチドである。
【０００４】
また、本発明は単離したポリペプチドに関するものであり：SEQ ID NO:18, 19, または20で表されるポリペプチドのN―末端に位置する配列、またはその配列から選択されたものからなることを特徴とする；あるいは、SEQ ID NO:18, 19, または20の断片又は変異体の配列、若しくはそれらの配列から選択されたものからなることを特徴とするポリペプチドである。
【０００５】
本発明の他の側面は、PDE4D7タンパク質の全長をコードする、単離したcDNAに関する。典型的なcDNAはSEQ ID NO:7 （ラット由来）、SEQ ID NO: 11（ヒト由来）、及びSEQ ID NO:14  （マウス由来）で表される。このcDNAはE. coli （例えば例１を参照）でクローン化され、このクローンは2001年11月29日にATCCに寄託されている。寄託番号は夫々、PTA-3895, PTA-3893 および PTA-3894である。
【０００６】
これ等のcDNAの5’-末端近くに位置する配列はSEQ ID NO:21（ラット）、 SEQ ID NO:22 （ヒト）又はSEQ ID NO:23（マウス）であり、これ等は上記考察した91量体ポリペプチドをコード化している。これ等マウスおよびラットの5’-末端に位置する配列は、対応するヒトの配列と81%の同一性を有し；マウスとラットの配列の同一性は91%である。SEQ ID NO:3, 24,および 25は夫々、ラット、ヒトおよびマウスの5’-末端の配列を表し、これらは91量体ポリペプチドをコードする配列ばかりでなく5’ 非翻訳配列を含んでいる。
このように、本発明は単離したポリヌクレオチドに関するものであり：SEQ ID NO:7, 11 または 14のcDNAの配列、またはその配列から選択されたものからなることを特徴とするポリペプチドである。
【０００７】
また、本発明は単離したポリヌクレオチドに関するものであり：SEQ ID NO:3, 24, 25, 21, 22 または 23の5’-末端に位置する配列； SEQ ID NO:3, 24, 25, 21, 22 または 23の断片または変異体； SEQ ID NO:3, 24, 25, 21, 22 または23の相補的な塩基配列、該相補的塩基配列の断片または変異体の配列、若しくはそれらの配列から選択されたものからなることを特徴とするポリヌクレオチドである。本発明はSEQ ID NO:3, 24, 25, 21, 22 または23の塩基配列からなるポリヌクレオチド、例えば、ヒトPDE4D7由来のSEQ ID NO:16および17のポリヌクレオチド、の内部に含まれるポリヌクレオチドも包含する。
【０００８】
本発明の他の側面は単離したポリヌクレオチドに関するものであり：SEQ ID NO:18, 19 または20のポリペプチド、又はSEQ ID NO:18, 19 若しくは20の配列の断片若しくは変異体を、中断することなくコードする塩基配列； SEQ ID NO:18, 19 または20のポリペプチド、またはこのポリペプチドの配列の断片若しくは変異体を中断することなくコードする塩基配列に相補的な塩基配列、若しくはそれらの配列から選択されたものからなることを特徴とするポリヌクレオチドである。ここで“中断することなくコードする”ポリヌクレオチドとは、イントロンあるいは他のコード化されてない塩基配列で中断されるようなオープンリーディングフレーム（読み取り枠、「ORF」）と比較し、連続的なORFを有するポリヌクレオチドを表す。
【０００９】
また、本発明は上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを作成する方法（例えば、ポリヌクレオチド配列を有する、及び/または発現する構築物を作成する方法；ポリペプチド発現しうる構築物で細胞を形質転換し、このポリペプチドを発現するに有効な条件のもとで形質転換した細胞を培養し、さらにこのポリペプチドを集める（回収する）方法）；抗体、抗原特異的な断片、またはポリペプチドに特異的（選択的）な他の特異的な結合体；このポリペプチドまたはポリヌクレオチドの異常な発現（例えば、過少または過剰発現）、または、このポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体（例えば、突然変異、多型、SNPその他）が関わる疾病状態、または疾病状態への感受性を検出する方法；このような疾病状態（例えば、いずれかの種の記憶障害）を治療する、または記憶形成を促進する方法；本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を用いて、試料中の当該ポリペプチド、ポリヌクレオチドの存欠の定性的測定、および/または、定量測定する方法；疾病状態に結びついたポリペプチド又はポリヌクレオチドの突然変異の検出；ポリペプチド又はポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を用いて、可能性のある治療薬剤、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は量を調節する薬剤、をスクリーニングする方法；これ等のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物、またはこれ等のポリペプチドを発現していないノックアウト動物；あるいはその他の可能な使用法に関する。
【００１０】
例えば、本発明は単離したポリペプチドに関するものであり：アミノ酸配列SEQ ID NO:18, 19 又は20の配列、又はSEQ ID NO:18, 19 若しくは20の配列の断片若しくは変異体の配列、若しくはそれらの配列から選択されたものからなることを特徴とするポリペプチドである。このポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:18, 19 又は 20の配列の少なくとも約10, 12, 14 または15個の連続したアミノ酸残基を含み；および/または、例えば、SEQ ID NO:18, 19又は20の配列またはその断片の配列に少なくとも、およそ65%, 70-75%, 80-85%, 90-95% 又は97-99%同一性を有する配列を含み；および/またはSEQ ID NO:18, 19又は20の配列またはその断片に実質的に同一性である配列を含み；および/または、ATCC寄託番号PTA-3893, PTA-3894, PTA-3895に含まれるcDNAまたはそれらの断片によってコード化されている。さらに、このポリペプチドは異型のアミノ酸配列を含み；PDE4活性を有し；例えば、ヒト、マウス、またはラットから得られ；および/または、実質的に精製されている。このポリペプチドはアミノ酸配列SEQ ID NO:8,12または15を有する。
【００１１】
更に、本発明は単離したポリヌクレオチドに関するものであり：塩基配列SEQ ID NO:7, 11, 14, 21, 22, 23, 3, 24又は25の配列、あるいはSEQ ID NO:7, 11, 14, 21, 22, 23, 3, 24又は25の配列の断片若しくは変異体の塩基配列、これ等の塩基配列の相補的配列、若しくはこれらの配列から選択されたものからなることを特徴とするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、例えば、SEQ ID NO:7, 11 15の塩基配列の少なくとも8, 10, 12, 14 又は 15の塩基が連続した配列、たとえば約15塩基の配列を含む。さらに、このポリヌクレオチドは異型の塩基配列含み；および/または、哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラットから得られ、；および/または、DNA, cDNA, RNA, PNAまたはこれらのコンビネーションである。このポリヌクレオチドはATCC寄託番号PTA-3893, PTA-3894, PTA-3895に含まれるcDNAの塩基配列またはその断片の塩基配列を有し；および/または、SEQ ID NO:7, 11, 14, 21, 22, 23, 3, 24又は 25の配列又はその断片と、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を含み；および/または、 SEQ ID NO:7, 11, 14, 21, 22, 23, 3, 24又は 25の配列またはその断片の配列に実質的に相同である塩基配列を含み；および/または、SEQ ID NO:7, 11, 14, 21, 22, 23, 3, 24又は 25の配列またはその断片の配列と、少なくとも約65%, 70-75%, 80-85%, 90-95% 又は97-99%同一性を有する塩基配列を有し；および/または、SEQ ID NO:7, 11又は 14の塩基配列を有する。
【００１２】
また、本発明は単離したポリヌクレオチドに関するもので、SEQ ID NO:18, 19 又は20の配列のポリペプチドを中断無くコードする塩基配列を含み、あるいは、SEQ ID NO:18, 19 又は20の配列のポリペプチドの断片または変異体を中断なくコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；相補的なポリヌクレオチド；あるいは、ATCC寄託番号PTA-3893, PTA-3894, PTA-3895に含まれるcDNAでコード化されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
また本発明は、上記ポリヌクレオチドからなる、操作上例えばバキュロウィルス発現ベクターの様な調節塩基配列に連結している、組換え構築物に関するものである。また、本発明はこのような構築物を含有する細胞、例えば哺乳動物、ヒト、酵母、もしくは昆虫細胞、好ましくはSF9細胞に関する。本発明はまた、細胞に構築物又は上記ポリヌクレオチドを導入し、上記のような細胞を作成する方法に関する。また、本発明は本発明のポリペプチドを作成する方法に関するものであり、このポリペプチドが発現する条件で細胞を培養すること、および、ポリペプチドを集めることを含む方法である。
【００１４】
また本発明は、本発明のポリペプチド、例えば、SEQ ID NO:18, 19 又は20の配列を持つポリペプチドに対して特異的な抗体、抗原−特異的抗体断片、又は他の特異的な結合体に関する。
【００１５】
また本発明は、診断法、例えば本発明のポリヌクレオチド（例えばmRNA）過剰又は過少発現と関わる患者の疾病状態の存在、あるいは疾病状態の感受性を決定する方法などの診断法に関するもので、その診断法は、上記患者の細胞、組織、細胞抽出液、又は核酸と上記のようなポリヌクレオチドと接触させ、および/または、上記核酸の量又は濃度を決定することによって行われる。細胞又は核酸は上記患者の脳、例えば脳下垂体、および神経細胞から得る。
【００１６】
本発明はまた、診断法に関するもので、その診断法は細胞のゲノムの突然変異、多型またはSNPを決定することによって行われ、前記突然変異はSEQ ID NO: 7,11,14,21,22,23,3,24又は25の塩基配列上、またはSEQ ID NO:18,19 又は20のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする塩基配列上で生ずる。
【００１７】
本発明はまた、疾病状態の存在または疾病状態への感受性を決定する方法に関するもので、上記疾病状態は本発明のポリペプチドあるいは活性の過剰発現、過少発現と関わる場合で、上記患者の細胞、組織、細胞抽出液と本発明のポリペプチドに特異的な抗体とを接触させ、このポリペプチドの量又は活性を検出することによって行われる。
【００１８】
本発明はまた、疾病状態の存在または疾病状態の感受性を決定する方法に関するものであり、疾病状態は変異したPDE4D7に関わる場合で、その方法は患者から単離したPDE4D7の突然変異を同定することによって行われる。
【００１９】
また本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現若しくは活性を調節（例えば、促進、または阻害）する薬剤を、スクリーニングする方法に関するものであり、その方法は細胞好ましくは神経組織由来の抽出液または組織細胞抽出液を、調節薬剤として想定する薬剤と接触させ、上記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量又は活性を測定する、もしくはcAMP濃度を測定することによって行われる。
【００２０】
また本発明は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドと結合する薬剤をスクリーニングする方法であり、その方法は、発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドと、結合薬剤と想定する薬剤とを接触させて結合複合体（例えば、核酸ハイブリッド、抗原−抗体複合体、タンパク質−タンパク質相互作用、リガンド−標的複合体、その他）を検出することによって行われる。本発明の方法は試験管内で、生体外で、あるいは生体内で行うことが出来る。
【００２１】
また本発明は、本発明のPDE4D7ポリヌクレオチドの少なくとも１コピ−を有することを特徴とするトランスジェニック動物（例えばマウス）に関するものであり、そのトランスジェニック動物は機能性のPDE4D7、該機能性PDE4D7の断片あるいは類似物質を、非トランスジェニック動物に比べ、過剰発現する。
【００２２】
また、本発明はノックアウト動物に関するものであり、そのノックアウト動物は機能性のPDE4D7、該機能性PDE4D7の断片またはこれ等の突然変異物質を発現する遺伝子を欠如している、例えばマウスであり；あるいは、本来のPDE4D7が異種トランスジェニック（例えばヒト）PDE4D7に置き換えられているトランスジェニック動物である。
【００２３】
また本発明は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物および薬学的に許容される担体に関する。別言すれば、本発明はPDE4D7の異常発現、および/または、活性に媒介される、若しくは関係する疾病状態を治療するための、予防上の若しくは治療上の方法に関するものであり、この方法は前記PDE4D7の発現、および/または、活性を調節する試薬を必要とする患者に投与して行う。
【００２４】
ポリペプチド
本発明のPDE4D7は、ヌクレオチド一燐酸（cAMPを含む）の加水分解を触媒する各種ホスホジエステラーゼ(PDE)の一族に属する。これ等の環状ヌクレオチドは細胞内でセカンドメッセンジャーとして働き、細胞表面のリセプターに、例えば各種ホルモンや神経伝達物質が結合し、リセプターから発生するインパルスを担う。ホスホジエステラーゼは、このメッセンジャーとしての役割が終わった環状モノヌクレオチドを分解し、これによって、細胞内の環状ヌクレオチドのレベルを調節し、環状ヌクレオチドのホメオスタシスを維持する。各種PDE4と表されるPDEの亜族は、例えば、cAMPに対する低いミハエリス定数及びロリプラムの様なある種の薬剤に対する感受性に特徴がある。本発明のPDE4D7は各種PDE4D7の幾つかのイソ型の中の一つを代表している。
【００２５】
本発明の各種PDE4D7ポリペプチドの機能性領域の中には、例えば、全ての既知の各種PDEで保存されている触媒領域（分子のC-末端側に存在）、アミノ末端調節領域、アミノ末端標的領域、膜との結合に関わる領域、例えば、リン酸化により酵素活性に関わる領域、他の環状ヌクレオチド（例えばAMP, GMP）依存性シグナル伝達経路の成分との相互作用に関わる領域等がある。例えば、本発明の各種PDE4D7は、他の各種PDE4で見出されている（例えば、Houslay, M.D.,“マルチ酵素PDE-4環状アデノシン一燐酸―特異的ホスホジエステラーゼ族：細胞内標的、調節および、抗炎症と抗欝作用を示す化合物による選択的な阻害”Advances in Pharmacology (1998) 44巻、225-342頁）２個の上流保存領域(UCR1および UCR2)、N-連関性糖鎖形成部位、c-AMPおよび c-GMP-依存性タンパク質リン酸化酵素リン酸化部位、タンパク質リン酸化酵素Cリン酸化部位、カゼイン・リン酸化酵素2リン酸化部位、およびN-ミリストイル化部位を含む。N―末端に位置する91量体塩基配列内部に位置する機能性モチーフは、例えばcAMPリン酸化部位（ヒト、ラットおよびマウスのタンパク質の39-42番目のアミノ酸、およびヒトタンパク質の2-5番目のアミノ酸）、タンパク質リン酸化酵素C（PKC）リン酸化部位（三種全てにおいて、42-44番目のアミノ酸）、および4個のカゼイン・リン酸化酵素2（CK2）リン酸化部位（三種全てにおいて14-17, 22-25, 63-66  85-88番目のアミノ酸、およびヒトタンパク質の23-26番目のアミノ酸）を含む。上記の保存された塩基配列およびモティーフは例えばexpaxsy.ch/tools/scnpsite.htmlのサイトのWorld Wide Web上で見出される。また、91量体ポリペプチド領域は細胞内標的に係わり、ホスホジエステラーゼ活性に関する触媒部位の調節に係わる。 Houslay, M.D.,“マルチ酵素PDE-4環状アデノシン一燐酸―特異的ホスホジエステラーゼ族：細胞内標的、調節および、抗炎症と抗欝作用を示す化合物による、選択的な阻害”Advances in Pharmacology (1998) 44巻、225-342頁を参照のこと。PDE4D7はCNSの特殊な信号伝達経路とカップルしていると信じられており、この申請で開示する技術を用いることにより、このCNS経路を調節する薬剤の同定、特徴づけ、発見の研究手段として用いることが出来る。
【００２６】
本発明のポリペプチドは組み換えポリペプチド、天然ポリペプチド、合成または半合成ポリペプチド、若しくはそれらのコンビネーションであり、好ましくは組み換えポリペプチドである。以下に用いるように、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質という術語は置き換え可能である。
【００２７】
本発明のポリペプチドは単離した形で供与されることが好ましく、例えば均一になるまで精製される。「単離」という術語は、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドに対して表現された際は、材料が当初の環境（例えば、もし自然界に生じたものであるならば、自然界の環境）から取り出され、当然結合している他の少なくとも一の構成物から、分離又は分けられていることを意味する。例えば、自然界で生存する宿主に存在する、自然界に生じたポリペプチドは単離されてない、しかし、自然界のシステムで共存する物質の幾つか又は全てから分離された同じポリペプチドは単離されている。このようなポリペプチドはある構成物の一部であるかも知れないが、このような構成物がその自然環境の部分で無い限り、なお、単離されているのである。
【００２８】
「断片」または「変異体」という術語は、本発明のポリペプチドを表す場合、生物機能またはポリペプチドの活性の一つを、完全に保持しているポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドの生物機能または活性は、例えば上記されたもののいずれかであり、また、抗体、即ちエピトープを担うペプチドとの反応性を持っていることを示す。例えばSEQ ID NO:8, 12 および 15のポリペプチドの断片あるいは変異体は、もともとのポリペプチドの少なくとも一つの活性を持つ様なポリペプチドに充分類似している。例えば、SEQ ID NO:18, 19又は20 (91量体)で表されるポリペプチドより小さなポリペプチドの断片あるいは変異体は、本来のポリペプチドと比較しうる配列による少なくとも一つの活性（例えば、上記の機能領域で表される活性、または本発明の抗体又は抗原−結合性断片との反応性を有する）を保持している。
【００２９】
本発明のポリペプチドの断片は、本発明品と互換性があればどのようなサイズでも良い。サイズの幅は最小の特異的なエピトープ（例えば、およそ6アミノ酸残基）から、殆ど全長の遺伝子産物（例えば、SEQ ID NO:8, 12 または15より、１アミノ酸残基短いもの）迄である。本発明のポリペプチドの断片は、例えばペプチド合成によって相当するポリペプチドの全長を作る場合に；または、例えばポリペプチドの全長を作る際の中間体として；抗体又は抗原結合性断片の産生を誘導するものとして；または、一般のデーターベースまたは類似物を探知する為の「問い合わせ配列」のために使われる。
【００３０】
本発明のポリペプチドの変異体は、例えば(i)一以上のアミノ酸残基が保存性又は非保存性のアミノ酸残基（好ましくは保存性アミノ酸残基）で置換され、置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードでコード化されていても、いなくとも良い場合、(ii)一以上のアミノ酸残基が置換群を含有する場合 (iii)ポリペプチドがポリペプチドの寿命を増加させるような化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合する場合、(iv)付加的なアミノ酸残基がリーダー配列、分泌配列、又はポリペプチド精製の為に用いられる配列を有するポリペプチドと結合する場合であり、タンパク質が形質転換した細胞から分泌出来るように、遺伝子工学的修飾を行う目的で用いられる。付加的なアミノ酸残基は異種からのものでも、自然界の遺伝子に内因性のものでも良い。
【００３１】
上記タイプ(i)に属する変異体ポリペプチドとしては、例えば、突然変異タンパク質、類似体、および誘導体がある。変異体ポリペプチドはアミノ酸配列上、例えば、１以上の付加、置換、欠失、挿入、逆位、融合および先端切断、もしくはそれらの組み合わせだけ異なる。例えば、１つの実施例としては、SEQ ID NO:18に合うように整えた91量体の２番目の残基はGlu又は Lysでよいし、4番目の残基はAspまたは Asnでよく、8番目の残基はVal またはLeuでよく、23番目の残基はCysまたはSerでよく、25番目の残基はGluまたはAspでよく、43番目の残基はCys またはSerでよく、45番目の残基はSerまたはAsnでよく、59番目の残基はAlaまたはThrでよく、62番目の残基はArgまたはLysでよく、69番目の残基はGlnまたはProでよく、84番目の残基はValまたは Ileでよく、88番目の残基はGluまたは Aspでよく、90番目の残基はSerまたはThrでよい。
【００３２】
上記タイプ(ii)に属する変異体ポリペプチドとは、例えば修飾ポリペプチドである。既知のポリペプチド修飾には、糖鎖化、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有的な結合、ヘム部分の共有的な結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有的な結合、脂質あるいは脂質誘導体の共有的結合、ホスファティジルイノシトールの共有的な結合、クロスリンク、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的クロスリンクの形成、システィン形成、グルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、糖鎖化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリスチル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化、アルギニン化およびユビキチン化のように、t-RNAを媒介したタンパク質のアミノ酸付加等であるが、これらに限られるものではない。
【００３３】
このような修飾は当業者にはよく知られており、科学文献に詳細に記載されている。幾つかの特に普通の修飾、例えば、糖鎖化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ・カルボキシル化、水酸化、およびADP-リボシル化は、例えば、“タンパク質構造と分子特性”第２版、T.E..Creighton, W.H. Freeman & Company, New York(1993)のような、多くの基礎的教科書に記載されている。 この主題について多くの詳細な総論は、“タンパク質の翻訳後の共有的な修飾”B.C. Johnson編、Academic Press、New York, 1-12 (1983)；Seifter 他（1990）Meth. Enzymol. 182:626-646およびRattan 他 (1992) Ann. N.Y.Acad. Sci. 663:48-62. 等に記載されている。
【００３４】
（iii）型に属する変異ポリペプチドは既知の技術として有名で、PEGulation または、他の化学修飾を含む。
【００３５】
上記(iv)型の変異体ポリペプチドには、例えば、プレタンパク質（前躯体）またはプロタンパク質（第二前躯体）があり、プロタンパク質部分の切断によって活性な成熟したポリペプチドができ、活性化される。変異体にはハイブリッド、キメラ、又は融合ポリペプチドがある。このような変異体の例については、以下、適宜議論する。
【００３６】
多くの他の型の変異体は当業者に知られている。例えば、よく知られているように、ポリペプチドは常に完全に線形であるとは限らない。例えば、ポリペプチドは一般的にユビキチン化の結果として分枝している場合がある、また、自然のプロセッシング事象および自然界では行われない、人為的に行われる事象のような、翻訳後の事象の結果、分枝を持ったり、持たずに、環状を形成している場合がある。環状、分枝状、および分枝的環状のポリペプチドは非翻訳的な自然過程で合成されることもあり、また人工的方法で合成される場合もある。
【００３７】
修飾もしくは変異は、ポリペプチドのペプチド骨格、アミノ酸側鎖、および、アミノもしくはカルボキシ末端等の何処の場所でも起こりうる。同型の修飾が、任意のポリペプチドの幾つかの部位で同じ程度に、または、異なる程度に存在しうる。また、任意のポリペプチドは一種以上の修飾を有する場合がある。共有的な修飾により、ポリペプチドのアミノ基又はカルボキシル基あるいは両方の基が閉塞されることは、自然界に生じたポリペプチドでも人工的ポリペプチドでも同様である。例えば、大腸菌で作られたポリペプチドのアミノ末端残基はタンパク質分解過程に入る前は、N-ホルミルメチオニンであることが多い。修飾はタンパク質の作られ方の関数である。例えば、組み換えポリペプチドの場合、修飾は、宿主細胞の翻訳後修飾能とポリペプチド・アミノ酸配列上の修飾シグナルによって決められる。従って、グリコシレーションを望む場合、あるポリペプチドは、一般的には真核細胞の、糖鎖化する宿主内で発現する。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖化を行い、このために、昆虫細胞発現システムが開発され、動物細胞のタンパク質が効率よく発現し、自然界で見られるパターンの糖鎖化が行われる。同様の考え方が他の修飾に対しても適用できる。
【００３８】
変異体ポリペプチドは、完全に機能性である場合、あるいは、例えば、上記の機能又は活性のいずれかのうち、一以上の活性について機能を欠いている場合がある。多くの有用な変異体の中には、例えば、変化した触媒活性を示すものがある。例えば、一つの実施例として、結合位置の変異型で、変異の結果、cAMPと結合する一方、加水分解能を欠くか、または、加水分解能が低い変異型がある。結合位置に関する、さらに有用な変異体としては、cAMPに対する親和性が変化したものがある。又、有用な変異体には、他の環状ヌクレオチドに対する親和性が変わったのも含まれる。また、有用な変異体には、タンパク質リン酸化酵素Aによる活性化を妨げるものがある。他の有用な変異体は融合タンパク質であり、一又はそれ以上の部分または亜領域が、他のホスホジエステラーゼ・イソ型または族の一又はそれ以上の部分または亜領域と、操作によって融合した融合タンパク質である。
【００３９】
上記のように、本発明のポリペプチドは単離したポリペプチドであり、そのポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:8, 12または 15配列（特に成熟ポリペプチド）若しくはその断片、若しくはそれらから選択したものからなることを特徴とする。また、本発明のポリペプチドは、91量体のアミノ酸配列SEQ ID NO:18, 19 または20の配列と本質的に同じであるか、91量体の一つに対して本質的に配列相同性（配列同一性）を示す配列（例えばN-末端に）を持つポリペプチドに対し、様々な程度の配列相同性（同一性）を有するポリペプチドを含む。このように、本発明に包含されるポリペプチドおよびその断片は、本発明の91量体に対し、少なくとも約65%の配列相同性（同一性）を示し、好ましくは、70-75%または 80-85%配列相同性（同一性）であり、最も好ましくは90-95%または97-99%配列相同性（同一性）を示すような91量体アミノ酸配列を含む。また、本発明は、配列相同性は低いが、ホスホジエステラーゼにより示される一またはそれ以上の機能または活性を示すポリペプチドをも包含する。
【００４０】
本発明によれば、配列に関する“パーセント同一性”または“パーセント相同性”という術語は、比較されるべき配列（“比較配列”）と、記載されたまたはクレイムされた配列（“参照配列”）がアラインメントされた後に、ある配列が、前記クレイムされたまたは記載された配列と比較されたということを意味する。その結果、パーセント同一性の決定は次式によってなされる：
パーセント同一性=100[1 ? (C/R)]
ここで、Cは参照配列と比較配列の間のアラインメントされた部分における、参照配列と比較配列の間の配列の違いの数を表している。ここで配列の違いとは、(i) 比較配列の中のアラインされた塩基またはアミノ酸に対応しない参照配列の中の塩基またはアミノ酸、(ii)参照配列の中の各ギャップ、(iii)比較配列の中のアラインされた塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列の中の整列された塩基またはアミノ酸、等々の数である。また、Rは参照配列で作り出されたギャップを持つ比較配列のアラインメントされた部分における、参照配列の塩基またはアミノ酸の数である。
【００４１】
もし、比較配列と参照配列の間のアラインメントが存在するならば（ここで、上記計算のパーセント同一性は、特定した最小パーセント同一性と等しいか、それより大きい）、比較配列は参照配列に対して特定の最小パーセント同一性を有する（上記計算のパーセント同一性が特定したパーセント同一性より小さいアラインメントが存在したとしても）。
【００４２】
好ましい態様における、比較の目的でアラインした参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、更に好ましくは少なくとも60%、そして、より好ましくは少なくとも 70%、80% または90%である（例えば、91量体のアミノ酸残基をもつアミノ酸配列と第二の配列をアラインすると、少なくとも30アミノ酸残基、好ましくは少なくとも35アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも45アミノ酸残基、さらにもっと好ましくは少なくとも55アミノ酸残基、さらにもっと好ましくは少なくとも65、70、80 または90アミノ酸残基がアラインされている。）。
ここにおけるパーセント同一性またはパーセント相同性の記載は、塩基配列とアミノ酸配列のどちらにも同様に適用できるよう意図した。
【００４３】
２個の配列間の配列の比較とパーセント同一性および類似性は数学的アルゴリズムを用いて決められる（コンピューター分子生物学, Lesk, A.M.編、Oxford University Press, New York, 1988； バイオコンピューティング：情報と遺伝子プロジェクト、Smith, D.W.,編、Academic Press, New York, 1993；配列データ−のコンピューター解析、第一部、Griffin, A.M., およびGriffin, H.G.編、Humana Press, New Jersey, 1994；分子生物学における配列解析、von Heinje, G., Academic Press, 1987；配列解析プライマー、Gribskov, M. Devereux, J., 編、M. Stockton Press, New York, 1991）。
【００４４】
このような数学的アルゴリズムの好ましい、限定されない例は、Karlin他、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されている。このようなアルゴリズムはNBLASTやXBLASTプログラム（バージョン２.0）に取り込まれており、Altschul 他(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されている。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる際には夫々のプログラム（例えばNBLAST）のデフォルト・パラメーターが用いられる。ある実施例では、配列比較の為のパラメーターはスコア＝100、ワード長＝12もしくは異なる値（例えばW=5 又は20）にセットできる。
【００４５】
一つの好ましい実施例としては、二個のアミノ酸配列間のパーセント同一性はNeedleman 他(1970)(J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを用いて決められるが、これはGCG ソフトウエアパッケージ中のGAPプログラムに取り込まれており、BLOSUM 62 マトリクスまたはPAM250 マトリクスを用い、16, 14, 12, 10, 8, 6又は 4のギャップウェイトおよび1, 2, 3, 4, 5又は 6の長さウェイトを用いている。一層好ましい他の実施例としては、二個の塩基配列間のパーセント同一性はGCG ソフトウエアパッケージ（Devereux他(1984) Nucleic Acids Res. 12(1):387）中のGAPプログラムIを用いて決められるが、NWSgapdna.CMPマトリックス、および、ギャップウェイト40, 50, 60, 70 又は80、および、長さウェイト1, 2, 3, 4, 5 又は6を用いる。
【００４６】
配列を比較する為の、他の好ましい、制限の無い数学的アルゴリズムの例はMyersおよびMillerのアルゴリズム CABIOS (1989)である。このアルゴリズムはCGC配列アラインメント・ソフトウェア−・パッケージの一部であるALIGN プログラム（バージョン2.0）に取り込まれている。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120ウェイト剰余表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を用いる。配列解析のための更なるアルゴリズムが技術上知られており、Torellis 他(1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 に記載されているADVANCEおよび ADAM；並びにPearson他(1988) PNAS 85:2444-8に記載されているFASTAに取り込まれている。
【００４７】
本発明に従えば、タンパク質配列に関し“実質的に相同”という術語はアミノ酸配列が少なくとも約90-95% または97-99%若しくはそれ以上同一であることを意味する。本発明の実質的に相同な91量体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:18, 19又は 20に示される塩基配列、あるいはその一部の配列の核酸と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸配列にコード化され得る。
【００４８】
ここで用いる“高ストリンジェンシー”の条件とは、例えば、ブロットを、一晩中（例えば少なくとも12時間）約5X SSC、0.5% SDS、100 μg/ml 変性サケ精子DNA、及び  50%ホルムアミドの組成のハイブリダイズ溶液の中で、42℃で、長いポリヌクレオチド・プローブと共にインキュベートすることを意味する。ブロットは、高ストリンジェンシー下で洗浄（65℃、30分、0.1X SSC および、0.1% SDSの条件で２回洗浄）することにより、塩基ミスマッチは5%以下となり、95%又はそれ以上の配列同一性を持った配列を選択することができる。
【００４９】
高ストリンジェンシー条件の、他の制限されることのない例としては、最終の洗浄を、65℃で30mM NaClと0.5% SDSを含む水溶液で行うというものがある。高ストリンジェンシーの他の例は、７％SDS、0.5 M NaPO4、pH7、1 mM EDTA中、50℃でハイブリダイゼーションを一晩行い、その後、一回ないしそれ以上、1% SDS中、42℃で洗浄するものである。高ストリンジェンシー洗浄は、5%以下のミスマッチを許容するが、減じられたか低いストリンジェンシー条件では20%までのヌクレオチドのミスマッチまで許容する。低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは上記と同様に行われるが、より低濃度のホルムアミド条件でより低温、および/または、より低い塩濃度で、より長時間インキュベーションされる。
【００５０】
本発明における、ポリペプチドおよびその断片又は変異体は、ここで開示した91量体（Seq ID NO:18、19又は 20）の全91アミノ酸残基より少ない、例えば10残基から91残基の間のアミノ酸残基、例えば、約6、8、10、12、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80 又は 90残基で、好ましくは少なくとも60残基の、切れ目のない一続きのアミノ酸残基を有していても良い。
【００５１】
本発明のポリペプチド(及びポリヌクレオチド)で用いたように、断片という術語はより長い配列(例えば長い配列の内部の、連続した、切れ目のない残基の配列)の部分配列を表す。例えば、ここで開示した、新しい15量体の15残基は、夫々10残基（1-10,2-11, 3-12,4-13, 5-14, 及び 6-15）の6個の断片を含むことが出来る。従来から存在する10量体又はそれ以上のペプチドは勿論除外した。
【００５２】
従って、新規な91量体（SEQ ID NO:18、19又は 20）内部の断片の部分集合で表すと、本発明のポリペプチドは、SEQ ID NO:18、19又は 20の対応する断片に、少なくとも約65%同一の配列を持ち、好ましくは約70-75% 又は80-85% 同一の、より好ましくは、少なくとも、約90-95% 又は97-99%同一の、最も好ましくは 100%同一の配列を持つ91量体の断片を包含する。
【００５３】
本発明におけるポリペプチドおよびその断片は、多くの動物種の細胞及び組織に見出されるが、好ましくは、例えば、マウス、ラット、ウサギ、家畜、ペット、霊長目、その他のような哺乳動物の細胞、特に、ヒトの細胞に見出される。与えられたいずれの動物においても、本発明に該当するそれらのポリペプチド又は断片が様々な組織に見出される。このポリペプチドの組織内又は細胞内の位置を決める手段は公知であり、例えば、免疫組織化学のような従来からの手段がある。様々な各種PDEが、例えば、心臓、卵巣、脾臓、腎臓、乳房、肝臓、睾丸、前立腺、骨格筋、および造骨細胞に見出される。Beavo 1995, Physiological Reviews 75, 725-748 及び、USP 5,798,246を参照のこと。特異的なイソ型が、しばしば、組織特異性を示す。例えば、PDE4D7タンパク質は腎臓、睾丸および脳組織に強く発現しているが、心臓、肺、肝臓、脾臓、胸腺またはすい臓においては強く発現してはいない。
【００５４】
特に、本発明のPDE4D7ポリペプチドおよびその断片は、神経系の細胞、組織および器官に見出されており、特に脳、例えば、様々な部位の脳皮質、臭蕾、基底神経節、小脳扁桃、海馬、視床下部、視床中脳、および小脳に見出されており、最も強い発現は、海馬のCA神経、歯状回、視床下部・乳頭体上核、および中脳の脊側縫線核と脳橋核に見られる。
【００５５】
核酸
上述したように、本発明は、本発明のポリペプチドの全長をコード化するcDNA (SEQ ID NO: 7、11および 14)；並びに  SEQ ID NO:3、24、25、21、22又は 23で表される上記cDNAの5’-末端からの断片を含む。第２図はPDE4D7イントロン−エクソン接合部のマップを表すと共に91量体の位置を示す。
【００５６】
SEQ ID NO:７、11および 14のポリヌクレオチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコード化している読み取り枠を含む。SEQ ID NO:7の配列においては、SEQ ID NO:8（ラット海馬PDE4D7イソ型）のポリペプチドをコードする読み取り枠(ORF)はヌクレオチド番号84-2327（ヌクレオチド2325-2327は「TAA」終止コドンを表す）にあり、ヒト・イソ型に対しては、SEQ ID NO:11の配列がヌクレオチド番号70-2316（ヌクレオチド番号2314?2316は終止コドン「TAA」を表す）に読み取り枠を持ち、マウス・イソ型に対しては、SEQ ID NO:14の配列がヌクレオチド番号181-2424（ヌクレオチド番号2422?2424は終止コドン「TAA」を表す）に読み取り枠を持つ。
【００５７】
ここで用いているように、“単離したポリヌクレオチドであるSEQ ID NO”または“SEQ ID NOから選ばれ単離されたポリヌクレオチド”という語は、列挙した配列（例えば、mRNA）が得られた核酸分子と関係する。配列決定の誤差、誤字その他により、実際の自然界に生ずる配列は、ここであげられたSEQ ID NOとは異なることがある。このように、この語はそこから配列が導かれる特定の分子を示すものであり、培養の寄託番号が凍結チューブ中の特定のクローン化したフラグメントと係わることと同じように、正確に列挙した塩基配列を有する分子を示すというものではない。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、組み換えポリヌクレオチド、天然のポリヌクレオチド、合成または半合成ポリヌクレオチド、あるいはそれらのコンビネーションでもあっても良い。ここで用いたように、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴマーおよび核酸の語には互換性がある。
【００５９】
ここで用いたように、“遺伝子”という語はポリペプチド鎖を産生する上で関与するDNAの断片を意味し、また、コードしている領域の前の領域や後の領域（リーダーおよびトレーラー）を含み得るし、また個々のコーディング領域（エクソン）の間の介在配列（イントロン）でもあり得る。勿論、cDNAは対応するイントロンを欠く。本発明には、本発明のポリペプチドをコード化した単離した遺伝子（例えば、ゲノミック・クローン）も含まれる。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、RNA、PNA、またはDNA、例えば cDNA、ゲノムDNAおよび合成または半合成DNAあるいはそれらのコンビネーションである。DNAは三重鎖、二重鎖あるいは単鎖であり、単鎖の場合は、コーディング鎖または非コーディング（アンティセンス）鎖である。DNAはヘアピンその他の二次構造を有することが出来る。RNAはオリゴマー（センス又はアンティセンス鎖を含む）、mRNA（例えば、PDE4D7の代替のスプライシングを持つ）、ポリアデニル化RNA、全RNA、単鎖あるいは二重鎖RNAなどである。DNA/RNA二重鎖も本発明に含まれる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチド及びその断片は本発明に適合する限り如何なるサイズでもよい。例えば、プローブとして用いる場合には、要求する特異性を得るに充分な如何なるサイズでもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、最小の特異的なプローブのサイズ（約、10-12ヌクレオチド）から、例えば、融合ポリヌクレオチドの場合、またはゲノム塩基配列の一部であるポリヌクレオチドのように、全長のゲノムDNAより大きなサイズまで分布し；断片の場合は、例えば、全長cDNAより１ヌクレオチド短い程度の大きさのサイズであっても良い。
本発明におけるポリヌクレオチドの断片は、別言するように、例えば、ハイブリダイゼーションのプローブとして用いられる。
【００６２】
本発明に含まれるポリヌクレオチド変異体の多くの型には、例えば、(i) １又は１以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたり他の仕方で変異する場合； (ii) 一又は一以上のヌクレオチドが、例えば、置換基等によって修飾される場合； (iii) ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの寿命が延びるような化合物と融合する場合；あるいは、(iv)リーダー又は分泌配列、若しくは、ポリペプチドの精製のために用いられる配列のように、付加的なヌクレオチドがポリヌクレオチドに共有的に結合する場合等がある。付加的なヌクレオチドは異種のものから調達する場合もあり、あるいは、自然の遺伝子の内因性のものでもよい。
【００６３】
上記した（i）型のポリヌクレオチド変異体には、例えば、単一ヌクレオチド多型（SNP）を含む多型、および、突然変異体が挙げられる。変異体ポリヌクレオチドは、例えば、一又は一以上の付加、挿入、欠失、置換、トランジション、トランスバーション、逆位、染色体転位、代替スプライシング又は類似事象による変異、あるいは、それらのコンビネーションなどからなる。
【００６４】
本発明のポリペプチド（例えば、成熟ポリペプチド）をコード化しているコード塩基配列はSEQ ID NO:7、11又は 14で示されるコード配列、または、その断片と等しい配列であるか、SEQ ID NO:7、11又は 14、若しくは、その断片のDNAと同じポリペプチドをコード化するが、遺伝子コードの重複性又は同義性の結果として異なるコードをもつ配列である。このようなペプチドは此処ではしばしば“同義的変異体”と表現する。また、このコード配列はSEQ ID NO:8、12 又は15のポリペプチド又はその断片のポリペプチドと実質的に相同なポリペプチドをコード化しているともいう。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7、11又は14の配列を含むコード配列の、自然なまたは人工的なアレリック型変異体として生ずるコード配列でもよい。技術的に知られているように、アレリック型変異体は、一又は一以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加した、ポリヌクレオチド配列の他の型であり、一般的にはコード化されたポリペプチドの機能を実質的に変えることはない。
【００６６】
コード配列又は調節配列に位置する他の変異した塩基配列は、本発明のポリペプチドの産生、あるいは、機能又は活性に（促進的又は阻害的）変化を与える。
上記(ii)型に属するポリヌクレオチド変異体には、例えば、検出可能なマーカー（アビジン、ビオチン、放射性成分、蛍光性標識と色素、エネルギー移動ラベル、エネルギー放射ラベル、結合物質その他）の付加のような修飾、あるいは、発現、取り込み、カタログ化、標識、ハイブリダイゼション、検出、および/または、安定性を改善するような部分がある。また、このポリヌクレオチドは、例えば、ニトロセルロース、磁気的または常磁性的小粒子（例えば、米国特許第5、411、863；米国特許第5,543,289に記載されている； 例えば、強磁性、超磁性、常時性、超常磁性、酸化鉄、および、多糖）、ナイロン、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックス固体小粒子、ポリアクリルアミド等の固体支持体に、所望の方法に従って結合することができる。例えば、米国特許第5,470,967； 5,476,925; 5,478,893を参照のこと。
【００６７】
上記(iii)型に属するポリヌクレオチド変異体は技術上よく知られており、例えば、様々な長さのポリA+尾部、5’キャップ構造、および、例えばイノシン、チオヌクレオチド、その他のヌクレオチド類縁物質等がある。
【００６８】
上記(iv)型に属するポリヌクレオチド変異体には、例えば、様々なキメラ型、ハイブリッド型或いは融合ポリヌクレオチドがある。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、コーディング配列、及び、付加的な人工的または異種のコーディング配列（例えば、リーダー、シグナル、分泌、標的、酵素的、蛍光性のある、抗菌性のある、および、他の機能性または診断用のペプチド）との融合ポリヌクレオチドを含む；あるいは、コーディング配列と、例えば、5’ または3’―末端の非翻訳配列、または、イントロンのようにコーディング配列に分散している、非コーディング配列との融合ポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
より具体的には、本発明は、ポリペプチド（例えば、成熟ポリペプチド）のコーディング配列が、同じリーディングフレームにおいて、例えば、宿主細胞におけるポリペプチドの発現や分泌を助けるようなポリヌクレオチド（例えば、異種の塩基配列）と融合しているポリヌクレオチドを含む。例えば、分泌配列としての機能を持つリーダー配列は、細胞からのポリペプチドの輸送を調節するように機能したり、および/または、細胞膜にポリペプチドを接着させるに役立つ貫膜アンカーとして機能する。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟したポリペプチドをつくるために、宿主細胞により分解されるリーダー配列を有する。また、このポリヌクレオチドは、成熟タンパク質と、付加的なN-末端アミノ酸残基を有するプロタンパク質をコード化するものでもよい。前駆体配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、一般的には不活性型のタンパク質である。ひとたび、前駆体配列が切断されると、活性型タンパク質になる。
【００７０】
また、本発明のポリヌクレオチドはインフレームでマーカー配列と融合したコーディング配列を持つことがある。このマーカー配列は、本発明のポリペプチドの同定および/または精製を可能にする。宿主がバクテリアである場合のマーカー配列は、マーカーと融合して成熟ポリペプチドを精製する為に、例えば、ヘキサヒスチジン・タグ（標識）（例えば、pQE-9ベクターで得られる）でもよい。宿主が、例えばCOS-7細胞のような動物細胞である場合、マーカー配列は血球凝集素（HA）タグでもよい。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Wilson, I.,他、Cell, 37:767 (1984))。
【００７１】
ポリヌクレオチドの他のタイプの変異体は当業者には明らかであろう。例えば、ポリヌクレオチドのヌクレオチドは、所望する目的に応じて、既知の、例えば、エステル、スルファミン酸塩、スルファミド、フォスソロチオエート、フォスホラミデート、メチルフォスフォネート、カルバメート、その他の様な、結合体を媒介して連結することができる。この連結により、RNAse Hのような核酸分解酵素に対する耐性が増し、生体内安定性が改善される。米国特許第 5,378,825を参照のこと。いかなるヌクレオチドも、例えば、6-メルカプトグアニン、8-オキソグアニンその他のような、ヌクレオチド類縁化合物も取り込むことが出来る。また、本発明のポリヌクレオチドは、他の組織体の他の遺伝子座位から得られたコーディング配列を持ちうるが、それは、そのコーディング配列がSEQ ID NO:7、11又は 14の全てまたは部分の配列と実質的に相同の場合、あるいは、他の組織体から得られる（例えば、オーソロガス）同じ遺伝子座の配列と実質的に相同な場合に限定される。
勿論、本発明以前に開示された如何なる塩基配列も本発明の変異体から排除される。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドは、所望されるどのような方法ででも標識できる。ポリヌクレオチドは32P, 35S, 3H 又は14Cのような放射性トレーサーを用いて標識できる。放射性標識は、例えば、放射性ヌクレオチド、ポリヌクレオチド・キナーゼ（ホスファターゼによる脱燐酸を伴うあるいは伴わずに）又はリガーゼ（標識する末端によって）を用いた3’ 又は5’末端の標識、のような如何なる方法ででも行うことが出来る。非放射性標識は、本発明のポリヌクレオチドと免疫学的性質(抗原、ハプテン)を持つ残基、あるいは、ある試薬（リガンド）に特異的親和性を有する残基、あるいは、（酵素、又は補酵素、酵素基質、酵素反応に使われる他の基質など）検出しうるだけの酵素反応を終わらすことが出来る性質を持つ残基、あるいは、蛍光または発光または望みの波長の吸収など、特徴的な物理学的性質を持つ残基を組み合わせて用いる。
【００７３】
本発明は、SEQ ID NO:18、19又は 20の新規91量体あるいはその断片又は変異体をコード化するポリヌクレオチドに近接した相同体又はその断片あるいは変異体を組み込む限り、此処で開示した全てのポリペプチド、および、その断片又は変異体をコード化するポリヌクレオチドを含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:21、22 又は23の塩基配列に対し、少なくとも、65-100%（例えば、少なくとも、およそ、70-75%、80-85%, 90-95%又は 97-99%）の配列同一性を持つ、あるいは、実質的に相同、あるいは、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする、あるいは、これ等の配列に相補的な、塩基配列からなる。
“実質的に相同”という術語は、ポリヌクレオチドの塩基配列を表す場合、塩基配列が少なくとも90-95%又は 97-99%又はそれ以上、同一であるということを意味する。
【００７４】
構築物
本発明は、また、ベクターと本発明のポリヌクレオチドの和を含む組み換え構築物に関する。このような構築物は、本発明のポリヌクレオチド配列が、順方向又は逆方向に挿入された、プラスミドまたはバイラル・ベクターのようなベクターからなる。
【００７５】
多数の適切なベクターが当業者に知られており、多くのものが商品化されている。以下のベクターは例である；バクテリア：pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pBS,pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)；pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかしながら、他のどのようなプラスミドあるいはベクターも、宿主内で複製可能であり生存し得る限り用いることができる。
【００７６】
好ましい態様においては、べクターは、本発明のポリヌクレオチドが挿入され、操作上、mRNA合成のための適切な発現制御（調節）配列(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)と連結している、発現ベクターである。例えば、制御プロモーターまたは調節プロモーターは、原核細胞または真核細胞、若しくはウィルス内におけるそれらの遺伝子発現を制御する事が知られているが、原核細胞(バクテリア)、酵母、植物、動物細胞、あるいは他の細胞内での発現のために、適切な発現調節配列が選ばれる。好ましい発現制御配列は、強く発現している遺伝子、例えば、色々の制御配列の中で、3-ホスホグリセラーテ・キナーゼ(PGK)のような解糖酵素、a―因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコード化するオペロンから導かれる。このような発現制御配列は、例えば、CAT（クロランフェニコール・トランスフェラーゼ）ベクター、または、他の適切なマーカーを持ったベクターを用い、所望されるどのような遺伝子からでも選択することができる。このような選択の結果、適切なベクターとしてはpKK232-8およびpCM7がある。
【００７７】
用いることが出来る、特に命名されたバクテリアのプロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、lambda PR、PLおよびtrpがある。真核動物のプロモーターにはCMV即時型、HSVチミジン・キナーゼ、初期及び後期SV40、アデノウィルスプロモーター、レトロウィルスのLTR、およびマウス・メタロチオネイン-Iがある。適切なベクターとプロモーターの選択は通常の技術の範囲内である。
【００７８】
本発明のポリペプチドをコード化するDNAの高等真核生物での転写は、発現ベクターにエンハンサーを挿入することによって増大する。エンハンサーはDNAのシス作用因子で、10―300 bpのサイズでプロモーターに作用し、転写を増大する。代表的な例として、複製起点の後期側で100-270番目にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーター・エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマー・エンハンサー、および、アデノウィルス・エンハンサーを含む。
【００７９】
一般的に、遺伝子組み替え発現ベクターは複製起点を持つ。発現ベクターは翻訳開始の為のリボソーム結合部位、転写終止配列、ポリアデニル化部位、スプライス・ドナー及びアクセプター・部位、および/または、5’フランキング若しくは非転写配列をもつ。SY40 スプライス、および、ポリアデニル化部位から得たDNA配列を用いて、要求される非転写遺伝子要素を得ることが出来る。ベクターは又、発現を増幅する適切な配列を含むことが出来る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換した宿主細胞を選択する為の、表現形質を与える一つまたは一つ以上のマーカー遺伝子を含んでおり、真核細胞培養の場合には、ジヒドロ葉酸リダクターゼ、または、ネオマイシン耐性、若しくはE. coliの場合にはテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のようなマーカー遺伝子である。
【００８０】
多数の、好適な発現ベクターが従来から知られており、多くは商品化されている。好適なベクターとしては、染色体、非染色体および合成のDNA塩基配列があり、例えば、SV40の誘導体；バクテリア・プラスミド；ファージDNA；バキュロウィルス；イーストプラスミド；プラスミドとファージDNAのコンビネーションによるベクター、および、バクシニア、アデノウィルス、アデノ同伴ウィルス、TMV, 家禽ポックスウィルス及び、偽狂犬病ウィルスなどのウィルスDNAなどがある。しかしながら、如何なる他のベクターであっても、宿主内で、複製、生存可能な限り差し支えない。原核及び真核宿主に用いられる好適なクローニング及び発現ベクターは次の文献に記載されている、例えば、by Sambrook, 他、“ 分子クローニング：実験室マニュアル”、Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Wu 他, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997),“ 組み換え遺伝子発現プロトコール”、Methods in Molecular Biology、Vol. 62, (Tuan, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 1997) および、“分子生物学の最新プロトコール”(Ausabel他、編), John Wiley & Sons, NY (1994-1999)である。
【００８１】
好ましい態様において、バキュロ・ウィルスをベースにした発現ベクターがもちいられる。バキュロ・ウィルスは主に昆虫に感染する大きな族のDNAウィルスを代表している。その原型は、多くの鱗し類の種に感染するAutographa californicaから得たヌクレアポリヘドロシス・ウィルス(核多角体病ウィルス、AcMNPV)である。バキュロウィルス系の一つの利点は組み換えウィルスが生体内で作られるということである。転移プラスミドとの共感染により、多くの子孫は野生型となり、スクリーニングの為に相当量の後処理が必要である。プラークを同定する為に、欠失突然変異を用いる特殊なシステムが用いられる。限定されない例として、キャプシド(ウィルス生存に不可欠)遺伝子をコードしているポリヘドリン遺伝子の上流(及び、ORF1629内)に制限酵素Bsu36Iの標的部位を持つ組み換えAcMNPV誘導体(BacPAK6と呼ぶ)が、文献として報告されている。BSf36Iは、遺伝子の他の場所は切断せず、BacPAK6消化の結果ORF1629の一部を削除する。これにより、ウィルスは生存できなくなる。このように、Bsu36I-切断BacPAK6 DNAのようなシステムがあるプロトコールにより、大部分の子孫は生存不可能となり、転移プラスミドと消化されたBacPAK6との共感染により得られた子孫のみが組み換え体となる。その理由は、外部由来DNAを含む、転移プラスミドがBsu36I部位に組み込まれ、それにより、組替え体が酵素に抵抗性となるからである。｛Kitts and Possee、“高頻度でバキュロウィルス発現ベクターを作成する方法”、BioTechniques, 14, 810-817 (1993)。  一般的な処理法としては、King and Posse、“バキュロウィルス発現システム：実験室ガイド”、Chapman and Hill, New York (1992)、及び、“組み換え遺伝子発現プロトコール”、Methods in Molecular Biology, vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), 第19章、pp235-246.｝
【００８２】
適切なDNA塩基配列が、適宜ベクターに挿入される。一般に、DNA塩基配列は、既知の方法によって適切な制限酵素切断部位に挿入される。そのような操作及び他の操作は当業者の技術範囲内と思われる。此処で考察された、種々の分子生物学的技術の慣習的処方は、適切な参考文献に見出すことが出来る、例えば、Sambrook, 他.、“分子クローニング：実験室マニュアル”, 第二版, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989)。もし望むならば、異種の構造塩基配列は、翻訳開始及び終止配列の適切な位置で発現ベクターに組み込まれ、また好ましくは、リーダー配列は翻訳したタンパク質を細胞外培地またはペリプラズム間隙に分泌できるとよい。
【００８３】
形質転換細胞及び本発明のポリペプチドを産生する方法
本発明はまた宿主細胞に関するものであり、宿主細胞は、前記した構築物で形質転換/ 形質導入/トランスデュースされたものであり、また、本発明は前記宿主細胞の子孫に関するものであり、宿主細胞の子孫は、特に、PDE4D(特にPDE4D7)活性の検定に用いられる様な安定した細胞株である。このPDE4D検定は、例えば、PDE4D活性を調節する薬剤を同定する目的で、および/または、本発明のポリペプチドを産生(調整的な産生)する目的で行われる。
【００８４】
適切な宿主の代表的な例は次のように記載されている：E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimuriumのようなバクテリア細胞；yeastの様なカビ細胞； DrosophilaS2 and SpodopteraSf9 (及び他の昆虫発現系)のような昆虫細胞; 哺乳動物 CHO、COS (例えば Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のCOS-7 株), C127,3T3, CHO, HeLa, BHK or Bowes メラノーマ細胞株を含む動物細胞；植物細胞、その他。ここにおける技術に基づいて適切な宿主を選択することは、当業者の知識の範囲内とみなされる。調節薬剤と推定される薬剤の検定のための細胞株は、通常動物細胞であり、そのcAMPレベルを観測することによってホスホジエステラーゼ(PDE4D)活性の変化が示される。
【００８５】
最も好ましい態様においては、宿主細胞はSpodoptera種の昆虫細胞であり、最も好ましくは、Spodoptera frugiperda 由来のSF9細胞である。本発明のポリペプチド(例えば全長ポリペプチド)は、バキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞から直ちに得ることが出来る。ポリペプチドの発現は既知の技術で簡単に特徴付けることが出来る「Wang その他 “ヒトcAMP-特異的ホスホジエステラーゼ(PDE4)亜型A, B, C及びDの発現、精製及び特徴“ Biochem. Biophys. Res. Comm. 234,320-324 (1997)を参照のこと」。
【００８６】
宿主細胞への構築物の導入は、例えば、燐酸カルシウム形質導入、DEAE-デクストランを介する形質導入、遺伝子銃のリポフェクション、または、電気窄孔法で行われる（Davis, L. , Dibner, M. , Battey, I. , Basic Methods in Molecular Biology, (1986)）。
【００８７】
適切な宿主株の形質転換、および、宿主株が適切な細胞密度になるまでの生育に続き、必要な場合、適切な手段(例えば、温度シフト、または化学的誘導)によって選択プロモーターが導入され、細胞はさらに培養される。扱われている宿主細胞は、適切に修飾してプロモーターを活性化(所望する場合には)させたり、形質転換細胞を選択したり、通常の栄養培地ではあるが、本発明の遺伝子を増幅するように変更するなどした培地で培養される。温度、pHその他の培養条件は、以前、発現のために選択して宿主細胞に用いた条件と同じであり、当業者に明らかなものである。
【００８８】
細胞は典型的には遠心力で集め、物理的または化学的手段で破壊し、得られた粗抽出液を更なる精製の為に保存する。また、何種類かのポリペプチドが宿主細胞から培養液中に分泌された場合には、上清液をタンパク質原料として用いる。タンパク質発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解の繰り返し、超音波、機械的破壊、または当業者に良く知られている細胞溶解試薬の使用等、通常のいずれかの方法で破壊する。
【００８９】
ポリペプチドは、組み換え細胞培養から通常の方法によって回収され、精製されるが、この通常の方法としては、硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、燐酸セルローズクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーその他がある。必要に応じて、タンパク質再生ステップを使って成熟タンパク質の立体構造を再生させる。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は最終的な精製に用いられる。「Salanova 他, “組み換え、ロリプラム−感受性cAMP-特異的ホスホジエステラーゼの異種発現と精製”, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 14: 55-64 (1998)を参照のこと」
【００９０】
原核及び真核宿主から組み換え法で得たポリペプチドを産生する為に記載した、上記方法に加えて、本発明のポリペプチドは天然の材料からも産生できるほか、普通のペプチド合成機を用いて、化学合成過程(合成または半合成)によっても産生できる。無細胞翻訳系もこのようなタンパク質合成に用いられるが、この場合には、本発明のDNA構成物から得たRNAを用いる。本発明のタンパク質は、また、トランスジェニック動物または植物において発現し、単離することも精製することもできる。このような、トランスジェニック組織体の作成法と使用法は従来の技術に属する。幾つかのこのような処方について以下、他の箇所で記載する。
【００９１】
抗体、抗原−結合断片、または他の特異的結合物
ポリペプチド、その断片、またはその変異体、あるいはそれらを発現している細胞は、特異的抗体や抗原結合性断片等を産生させるための免疫源として用いられる。“特異的”抗体または抗原結合性断片は、本発明のPDE4D7、その断片または変異体、特に、本発明の91量体ポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、選択的に（優先的に）結合する抗体または抗原結合性断片を意味する。ポリペプチドに対する“特異的”抗体とは、ポリペプチド内の、又は、ポリペプチドが含んでいる、特定のアミノ酸配列を認識する抗体を意味する。
【００９２】
本発明の抗体とは例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を意味する。本発明はまた、キメラ的、組み換え、単鎖、及び、部分的又は全的ヒト化抗体、および、Fab断片、又はFab発現ライブラリーの産物、及びその断片を含む。抗体はIgM、IgG、亜型類、IgG2A、IgG1他であり得る。このような抗体又は断片を作るために様々な公知の手法が用いられる。
【００９３】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して作られた抗体は、例えば、動物へのポリペプチドの直接の注入、または、山羊、ウサギ、マウス、鶏、その他、好ましくは、ヒト以外の動物に対するポリペプチドの投与によって得られる。得られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このようにして、ポリペプチドの断片しかコードしてない配列も、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を得るのに用いられる。このような抗体を用いて、このポリペプチドを発現している組織からポリペプチドを単離することが出来る。また、抗体は裸のDNAを投与することによっても得られる。米国特許第5,703,055; 5,589,466及び5,580,859を参照のこと。
【００９４】
モノクロナル抗体を作成するために、連続した細胞株培養で作られる抗体を提供する、如何なる技術も使うことが出来る。例としては、例えば、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497）、トリオ−マ技術、ヒトB-細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor 他. , 1983, Immunology Today 4: 72)、および、ヒト・モノクローナル抗体産生のためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole, 他. , 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96).がある。
【００９５】
単鎖抗体作成の為に記載されている技術（米国特許第 4,946, 778）は、本発明の免疫学的ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を作るために使用する事ができる。また、トランスジェニック動物は本発明の免疫学的ポリペプチド産物に対する部分的又は全的ヒト化抗体を発現するために用いることが出来る。
【００９６】
本発明の抗体の一つは、ヒト、ラット、マウスPDE4D7に対して保存されている、15個のアミノ酸からなるエピトープを含むペプチド(アミノ酸26-40)に対して作られたポリクローナル抗体である。又この抗体はPDE4D7に対し高度に特異的である。
本発明は、また、例えば、アプタマーやPNAを含む他の特異的結合物に関する。
【００９７】
トランスジェニックおよびノックアウト動物。
ここに開示した本発明は、非−ヒト・トランスジェニック動物に関するものであり、その動物のゲノムの中に本発明の新規ポリペプチドをコードする一又は一以上のポリヌクレオチドのコピーを有するものである。本発明のトランスジェニック動物は、そのゲノムの中に、本発明のポリペプチドをコードする多数のコピーのポリヌクレオチドを含んでいても良いし、あるいは、そのようなポリペプチドをコードする一コピーの遺伝子を持っていても良いが、このような遺伝子は、上記トランスジェニック動物の幾つか、又は全ての細胞内で、上記ポリペプチドを直接に発現(好ましくは、過剰発現)するプロモーター（例えば、調節プロモーター）と連結している。
【００９８】
好ましい態様における本発明のポリペプチドの発現は、優先的に、脳組織例えば海馬において生ずる。本発明に含まれる様々な非−ヒトトランスジェニック組織体としては、例えば、ショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ、および酵母等がある。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、牛、山羊、羊、ウサギ、非―ヒト霊長類、またはラットで、最も好ましくは、マウスである。
【００９９】
トランスジェニック動物を作成する方法は当業者の従来技術の範囲内であり、例えば、相同組み換え、突然変異誘発（例：ENU, Rathkolb 他. , Exp. Physiol, 85 (6): 635-644,2000）、および、テトラサイクリンの調節による遺伝子発現システム（例：U. S. Pat. No. 6,242, 667）などがあるが、此処では詳しくは触れない。「Wu 他, “遺伝子工学の方法”, CRC 1997, pp. 339-366; Jacenko,O., “組み換え遺伝子発現プロトコール”の中の、“トランスジェニック動物作成の方策”, Methods in Molecular Biology、 62巻、 Humana Press, 1997, pp 399-424を参考のこと」
【０１００】
トランスジェニック組織体は、例えば、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド原料を提供する上で、または、このようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの発現、および/または、活性を調節する薬剤を同定したり性格付けする上で有用である。トランスジェニック動物は、例えば、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの過剰発現に関係する疾患状態に対する良いモデルともなる。
【０１０１】
本発明はまた、非―ヒト・ノックアウト動物に関するもので、この動物のゲノムは、機能性のPDE4D7のイソ型、または、機能性の類縁体(例えば、遺伝子が機能的に破壊されている)の発現を欠失しているか、あるいは発現できないような動物を、慣習的に“ノックアウト”動物と呼び、特に、“ノックアウトマウス”と呼ばれる。
【０１０２】
遺伝子の機能的破壊は如何なる有効な方法で成し遂げても良い。例えば、コード配列の何れの部分にでも終止コドンを挿入し、その結果得られたポリペプチドが生物学的に不活化（例えば、そのポリペプチドが触媒領域、リガンド結合領域を欠く為に不活化される）される方法、プロモーター又は他の調節的配列に突然変異を導入し、その結果、その遺伝子の転写が停止又は低減する方法、その遺伝子に外部遺伝子を挿入し、その結果、遺伝子を不活化する(例えば、生物学的に活性なポリペプチドの生産を妨害するか、プロモーター又は他の転写機構を破壊する)方法、PDE4D7遺伝子の配列を欠失させる方法その他が挙げられる。
【０１０３】
機能的に破壊された遺伝子を持つトランスジェニック動物の例は多い。例えば、米国特許第6,239, 326,6, 225,525, 6,207, 878,6, 194,633, 6,187, 992,6, 180,849, 6,177, 610,6, 100,445, 6,087, 555,6, 080,910, 6,069, 297,6, 060,642, 6,028, 244,6, 013,858, 5,981, 830,5, 866,760, 5,859, 314,5, 850,004, 5,817, 912,5, 789,654, 5,777, 195, および 5,569, 824.に記載されている。ノックアウトは相同的でも非相同的でも良い。
【０１０４】
機能的に破壊された遺伝子や他の遺伝子突然変異を作り出すために、相同的組み換え技術は特に興味がある。その理由は、ゲノムの特異的領域を標的とすることが出来るからである。相同的組み換え技術を用いると、遺伝子は特異的に不活化され、特異的な突然変異が導入され、さらに、外部遺伝子が特異的部位に導入される。これ等の方法は既知の技術であり、上記特許に記載されている。Robertson, Biol. Reproduc., 44 (2): 238-245,1991も参照のこと。一般的には、遺伝子工学は胚幹細胞（ES細胞）、あるいは、他の多能性細胞（例えば、成人幹細胞、EG細胞）を用いて行われ、また、遺伝的に修飾された細胞（又は核）は全組織体を作成するのに用いられる。核移植は相同組み換え技術と共に用いられる。
【０１０５】
例えば、PDE4D7座位は、マウスのES細胞中で、ポジティブ/ネガティブ選択法を用いて破壊することが出来る(例えば、Mansour 他., Nature, 336: 348-352,1988参照)。この方法では、標的とすべき遺伝子の一部を含む様、標的を狙うベクターを構築することができる。標的を狙うベクターにあるPDE4D7エクソンにネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを挿入し、破壊することができる。ベクターはES細胞の標的を持つゲノムに組み込まれ、標的遺伝子の機能を破壊する。細胞内にベクターが存在することは、ネオマイシン耐性の発現で決定することができる。米国特許第6,239, 326参照のこと。機能が壊された遺伝子を少なくとも一つ有する細胞はキメラ動物及び生殖細胞系列動物を作るのに用いられ、例えば、操作された遺伝子を持つ、体細胞および/または生殖細胞動物となる。相同的なノックアウト動物は非相同的なノックアウト動物を交配させる事によって得られる。米国特許第6,225, 525.を参照のこと。
【０１０６】
本発明は、また、トランスジェニック・非―ヒト動物に関するもので、その動物のゲノムは、上記非―ヒト動物の本来のイソ型をコードする哺乳動物遺伝子の代わりに、ここで開示したPDE4D7のヒト・イソ型をコードする一又は一以上の遺伝子を含む。最も好ましくは、上記動物はマウスである。
【０１０７】
一又は一以上の機能性PDE4D7遺伝子を欠くノックアウト動物又は動物細胞は様々な応用に有用であり、PDE4D7を介した、あるいは、関連した条件の動物モデル、薬剤スクリーニング検定（例えば、PDE4D7以外のホスホジエステラーゼに対して；PDE4D7を欠く細胞を作ることにより、他のPDE4D7の寄与が特異的に吟味できる）の為の動物モデル、PDE4D7活性を欠く組織の原料、内在のPDE4D7がヒトPDE4D7に置き換えられた動物を作成する出発材料として応用される。また、どの応用例も発行されたトランスジェニック動物についての米国特許に記載されており、それらは、米国特許第6,239, 326,6, 225,525, 6,207, 878,6, 194,633, 6,187, 992,6, 180,849, 6,177, 610,6, 100,445, 6,087, 555,6, 080,910, 6,069, 297,6, 060,642, 6,028, 244,6, 013,858, 5,981, 830,5, 866,760, 5,859, 314,5, 850,004, 5,817, 912,5, 789,654, 5,777, 195, and 5,569, 824である。例えば、PDE4D7欠失動物細胞は、記憶形成、炎症、または、免疫調節応答に関する活性を研究するために利用される。細胞は、細胞外信号、および、細胞内信号に応答する、多くの酵素活性を示す。ホスホジエステラーゼを、例えば一つづつノックアウトすることにより、ホスホジエステラーゼを用いる生理的経路が切り出され、同定される。
【０１０８】
上記の方法に加え、トランスジェニックおよびノックアウト動物は既知の方法で作成することが出来る。例えば、一細胞期の胚の前核への組み換え遺伝子の前核注入、胚幹細胞への酵母人工染色体の取り込み、遺伝子標的法、胚幹細胞方法論、クローニング法、核移植法などである。また、例えば、米国特許第4,736, 866; 4,873, 191; 4,873, 316; 5,082, 779; 5,304, 489; 5,174, 986; 5,175, 384; 5,175, 385; 5,221, 778; Gordon 他., Proc. Natl. Acad. Sci. , 77: 7380-7384,1980 ; Palmiter 他., Cell, 41: 343-345,1985 ; Palmiter 他, Ann. Rev. Genet. , 20: 465-499,1986 ; Askew 他. , Mol. Cell. Biol. , 13: 4115-4124, 1993; Games 他. Nature, 373: 523-527,1995 ; Valancius and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11: 1402-1408, 1991 ; Stacey 他., Mol. Cell. Bio. , 14: 1009-1016,1994 ; Hasty 他., Nature, 350: 243-246,1995 ; Rubinstein 他. , Nucl. Acid Res. , 21: 2613-2617,1993 ; Cibelli 他., Science, 280: 1256-1258,1998を参照のこと。
【０１０９】
リコンビナーゼ除去システムの手引きについては、例えば、米国特許第5,626, 159,5, 527,695, and 5,434, 066.参考のこと。,また、 Orban, P. C. 他.,"トランスジェニックマウスにおける部位特異的DNA組み換え"  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6861-6865 (1992); O'Gorman, S. , 他. ,"哺乳動物細胞における、リコンビナーゼ経由遺伝子活性化および部位特異的組み込み“、Cells, "Science, 251: 1351-1355 (1991); Sauer, B. , 他. , ”哺乳"動物ゲノム中に置かれた、loxP含有DNA配列でのCre-活性化組み換え"  Polynucleotides Research, 17 (1) : 147-161 (1989); Gagneten, S. 他. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3326-3331; Xiao and Weaver (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2985-2991 ; Agah, R. 他. (1997) J. Clin. Invest. 100: 169-179; Barlow, C. 他. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2543-2545; Araki, K. 他. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 868-872; Mortensen, R. N. 他. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 2391-2395 (G418 段階的増加法); Lakhlani, P. P. 他. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9950-9955 ("ヒットエンドラン"); Westphal and Leder (1997) Curr. Biol. 7: 530-533 (トランスポゾンが引き起こす“ノックアウト”及び“ノックイン”); Templeton, N. S. 他. (1997) Gene Ther. 4: 700-709 (高頻度で相同組み換えを可能にする、例えば、選択マーカーなしに、効率的遺伝子標的狙い); PCT 国際公開 WO 93/22443 (機能性破壊)を参照のこと。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチドは、どんな非―ヒト・動物へも導入できる。非―ヒト・動物としてはマウス、（Hogan 他., “マウス胚の操作：実験室の手引き“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, New York, 1986), ブタ (Hammer 他. , Nature, 315: 343-345,1985), 羊 (Hammer 他. , Nature, 315: 343-345,1985), 牛、ラット、または、霊長類等がある。たとえば、Church, 1987, Trends in Biotech. 5: 13-19; Clark 他., Trends in Biotech. 5: 20-24,1987) ; 及び DePamphilis 他. BioTechniques, 6: 662-680,1988.をも参照のこと。トランスジェニック動物は米国特許第5,994, 618記載の方法でも作成でき、ここで述べられているどの方法も用いることが出来る。
【０１１１】
PDE4D7発現の条件
本発明のPDE4D7イソ型は、既に今まで考察したように、多くの機能及び活性に関連しており、このホスホジエステラーゼの異常な発現および/または活性は多くの疾病状態と関連している。本発明は、そのような疾病状態に関係する本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出（存在、非存在の決定）および/または定量に関係し、また、このような、PDE4D7を介する、または、PDE4D7に関係する症候群の診断、および/または予防、治療、または、改善に関する。また、本発明は、このような疾病状態に関連するポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現、および/または、活性を調節(増強又は低減)する薬剤を同定する方法、および、このような疾病状態に関係するポリペプチド又はポリヌクレオチドの変化又は突然変異を同定する方法に関する。さらにまた、本発明のPDE4D7は記憶形成、特に長期記憶の形成に関係している。従って本発明は、例えば加齢の過程にある中年の被験者のような、“正常”の被験者（記憶機能において異常な、あるいは、病理学的に病状を示さない被験者）の記憶形成を促進する薬剤、および/または、方法に関する。
【０１１２】
PDE4D7の、増強した発現及び/又は活性と、相伴う細胞内cAMP量の減少は、例えば、免疫及び炎症応答の増加と関連し、PDE4D7と関係する疾患状態の減少と関連し、細胞の過度な増殖と関連し、また神経状態(例えば、記憶損傷)と関連する。
【０１１３】
免疫及び炎症応答の増加を伴う状態の中には、様々な、アレルギー状態、炎症疾患、自己免疫疾患、特に、減少したcAMP レベル、及び/又は、増加したPDE4レベルにより特徴付けられる疾病状態がある。本発明の方法により治療される疾病状態には、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、春季カタル、エオジン嗜好性肉芽腫、乾せん、炎症性関節炎、リューマチ性関節炎、敗血性ショック、潰瘍性大腸炎、クローン病、心筋及び脳の再潅流、慢性腎糸球体炎、エンドトキシン・ショック、成人呼吸困難症候群と他の呼吸器疾患、嚢胞性線維症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、角化症、リュウマチ性脊椎炎、変形性関節症、熱病、糖尿病(及び、糖尿病由来抹消血管疾患)、塵肺、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、毒性及びアレルギー性接触性湿疹、アトピー性湿疹、脂蝋性湿疹、単純性苔癬、日焼け、肛門性器部掻痒、円形脱毛症、肥大性瘢痕、円板状エリテマトーデス、濾胞期および広範囲膿皮症、内因性及び外因性にきび、赤鼻、ベゲット病、アナフィラキシー性紫斑腎炎、炎症性腸管病、白血病、多発性硬化症、胃腸病、変形性関節症、虚血、リンパ肉芽腫、アレルギー、重症筋無力症、自己免疫疾患その他がある。本発明はまた、精神分裂病のような、NMDA機能低下により特徴付けられる疾患に罹った患者に関する。
【０１１４】
PDE4D7関連の細胞過剰増殖に関わる疾患には、様々な異常増殖、がん、白血病、リンパ球および骨髄球増殖と関連した疾患がある。
特に好ましい態様は、本発明の方法を伴う疾患に関するものであり、この脳(神経)機能損傷は記憶喪失に関する疾患で、特に、長期記憶喪失又は他の痴呆に関する疾患のような記憶喪失と関係する。あるいは、本発明の方法は正常な被験者の記憶を増強する方法に関する。
【０１１５】
脳内において、神経細胞内のcAMPレベルは記憶特性、特に長期記憶に関係すると信じられている。他の特別な機構にとらわれることなく、PDE4D7はcAMPを分解するので、PDE4D7のレベルが動物における記憶、特にヒトの記憶に影響を及ぼすと提起されている。例えば、cAMPホスホジエステラーゼ(PDE)を阻害する化合物はそれによって細胞内のcAMPのレベルを増加させるので、そのことが、次に転写因子（cAMP応答性結合タンパク質）をリン酸化するプロテイン・キナーゼを活性化し、この転写因子はDNAのプロモーター配列に結合し、長期の記憶に重要な遺伝子を活性化する。このような遺伝子が活性化されるほど、長期記憶は良くなる。このように、ホスホジエステラーゼを阻害することで、長期記憶が向上する。
【０１１６】
記憶損傷の疾患は、新しい情報を学ぶ能力が損なわれ、および/または、以前学んだ情報を思い出すことが出来なくなることによって分かる。PDE4D7レベル、および/または、活性によって影響を受ける記憶関連の疾患には、中程度の記憶損傷（MCI）および、加齢関連の記憶減退（脳の老化）がある。本発明はハンチンソン病およびダウン症候群のような疾患の結果としての記憶の機能的欠陥に関する。他の応用例として、本発明は、麻酔薬による記憶喪失、化学療法、放射線治療、および、外科手術後外傷性障害に関する。
【０１１７】
本発明は一般的な痴呆に関するものであり、この痴呆は記憶喪失、および、記憶とは分離できる付加的な知的損傷を含む病気である。本発明は、全ての種類の痴呆における記憶の機能的欠陥に関する。痴呆はその原因により分類され、神経変性痴呆（アルツハイマー病、パーキンソン病、ピック病）、血管性（梗塞、出血、心臓障害）、血管性とアルツハイマーの混成（細菌性髄膜炎、クロイツフェルト−ヤコブ病、多発性硬化症）、外傷性障害（硬膜下出血又は外傷性脳損傷）、感染性（HIV）、毒物性（重金属、アルコール、幾つかの医薬品）、代謝性（ビタミンB12又は葉酸欠乏、CNS低酸素症、クッシング病、）、精神科系（鬱病、精神分裂病）および、水頭症が挙げられる。
【０１１８】
本発明は又、精神分裂病、両極性又は躁鬱病、大鬱病、精神科性又は神経性損傷による鬱病、麻薬常用に関する。PDE4阻害剤はcAMPレベルを上げるのに用いられ、神経細胞のアポトーシス死を防ぎ、また、上記のように、PDE4阻害剤は抗炎症剤として知られている。特別の機構にとらわれることなく、神経細胞のアポトーシス死阻止と炎症応答の阻害のコンビネーションにより、上記のような効用を持つ薬剤の使用は、疾患または障害に由来する神経変性による様々な疾病を治療するのに役立つ。本発明に関わる疾病としては、例えば、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、多発性脳梗塞性痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、および、多系統萎縮症（MSA）がある。
【０１１９】
PDE4D7の低減した発現および/または活性は、付随する細胞内cAMPレベルの増加により、免疫及び炎症応答の低減、および、細胞増殖の低下と関係する。この応答に拮抗する薬剤(例えば、PDE4D7の発現、及び/または、活性を促進)は免疫系の増強が必要な患者(例えば、重症複合型免疫不全症（SCID）、または、薬剤による免疫抑制）；器官又は組織移植した患者；急性又は慢性感染の患者；あるいは、細胞増殖が必要な患者(例えば、脊椎障害の後、神経再生が必要)の治療に用いられる。これ等の薬剤は又、高いcAMPレベルを伴う発作治療にも役立つ。
【０１２０】
PDE4D7レベル、および/または、活性を調節する薬剤のスクリーニングと、検定
本発明は、試験管内（in vitro）または生体内（in vivo）（例えば、細胞に基づく検定又は動物モデル）において、薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法により、本発明のPDE4D7の合成、および/または、活性を調節（例えば、増強、促進、修復、阻害、遮断、安定化、不安定化、増強、容易化、正の制御、活性化、増幅、補強、誘導、低減、負の制御、減少、低下、削減、その他）する薬剤を同定できる。このような合成および/または活性を阻害する薬剤(拮抗剤)は、目的とする細胞内のcAMPレベルを増加させ、その結果として生理的変化をおこす。このような合成および/または活性を促進する薬剤(作用薬)は、目的とする細胞内のcAMPレベルを減少させる。例えば拮抗剤は、cAMPとここで開示した各種PDE4D７との相互作用を阻害し、作用薬はcAMPとここで開示した各種PDE4D７との相互作用を促進する。このような薬剤は例えば、ホスホジエステラーゼ活性を調節し、あるいは、環状ヌクレオチド加水分解を阻害又は促進する。このような薬剤は、また、間接的に働き、炎症応答に関与する、TNF-aおよびb、インターフェロンg、インターロイキン及びケモカインのような、サイトカインのレベルを低減したり増進する。
【０１２１】
PDE4D7の発現および/または活性を阻害する薬剤（ここでは時々、“PDE４D７阻害剤”と表現する）は、PDE4D7の過剰発現又は活性増加に伴う疾病状態の症状を治療、防止、および/または、改善するのに使われ；また、そのような活性を促進する薬剤は、PDE4D7の過少発現又は活性低下に伴う疾病状態の症状を治療、防止、および/または、改善するのに使われる。PDE4D7の阻害剤は、一般的に抗炎症及び免疫調整薬剤として使われる。具体的には、PDE4D7の過剰生産又は活性増加に伴う、他の箇所で記載した、全ての疾患状態を治療するのに用いられる。PDE4D7の促進剤はPDE4D7の過少生産又は活性低下に伴う、他の箇所で記載した、全ての疾患状態を治療するのに用いられる。
【０１２２】
拮抗剤や作用薬の可能性のある薬剤の検定において、様々な機能及び/または酵素活性が活用されるが、これ等の活性は、本発明の各種全長PDE4D7またはその新規91量体ポリペプチドと結びついたものである。典型的な機能及び活性については他の箇所で考察する。このような検定は、全ての適切な細胞又は組織を利用して行われる。好ましい態様においては、各種PDE4D7が強く発現している細胞又は組織で検定が行われる。これらの細胞、又は組織としては、例えば、腎臓、睾丸、好ましくは、神経細胞などがある。
【０１２３】
最も好ましい態様では、検定は、例えば海馬組織又は細胞のような、記憶に関係する細胞で行われる。検定は、試験管内（in vitro）、生体外（ex vivo）、または、生体内（in vivo）で行われる。生体内検定は、例えば既に記載したトランスジェニック又はノックアウト動物、または、ヒト化したマウスで行われる。ここでヒト化マウスとは、ここで開示したPDE4D7のヒト・イソ型をコードするヒト遺伝子が、マウス本来の類縁タンパク質をコードする遺伝子に置き換えられて存在するマウスである。記憶に影響を与える薬剤が試験される場合、例えば、長期記憶のような記憶の構成要素を測定するシステムを使って直接検定される。cAMP および/または PDE4D7レベルと記憶との間の相間を示す方法は、既知の日常業務である。Bevilaqua 他. (1997) Braz. J. Med. Biol. Res.30 (8), 967-970; Barros 他. (1999). Neurobiol. Learn. Mem.71 (1), 94-103; および Bevilaqua 他. (1997) Behav.Pharmacd.8 (4),331-338を参照のこと。
【０１２４】
ホスホジエステラーゼの阻害剤あるいは促進剤と推量される、薬剤効果に対する検定方法は慣用的であり、公知の技術である。例えば、慣用的検定を用い、cAMPの細胞内レベルの測定(例えば、定量的)ができる。一の態様では、本発明のPDE4D7を発現するCHO細胞のような、安定した細胞株を調節薬剤と目される試薬で処理し、細胞内のcAMP全量を測定する。cAMPの増加は、試験した試薬によるPDE4D7の阻害活性を示す。他方、cAMPの減少は試験した試薬によるPDE4D7の活性化効果を示す。Pon 他, “安定してPDE-IV酵素を発現するCHO-K1細胞の特徴づけ”、Cell Biochemistry and Biophysics 29: 159-178 (1998)を参照のこと。 
【０１２５】
Livi 他.,“ヒト低KMロリプラム感受性cAMPホスホジエステラーゼのcDNAクローニングと発現“、Molecular and Cellular Biol., 10,2678-2686 (1990)に報告されている、幾つかのPDE4酵素の既知の阻害剤であるロリプラムの研究を参照のこと。
Wang 他、”ヒトcAMP特異的ホスホジエステラーゼ（PDE4）亜型A, B, CおよびDの発現、生成及び特徴づけ“, Biochem. Biophys. Res. Comm., 234,320-324 (1997); および、 Houslay 他., ”多酵素からなるPDE4環状アデノシン一燐酸−特異的ホスホジエステラーゼ族：細胞内標的、調節、および、抗炎症性および抗欝作用性化合物による選択的阻害“、Advances in Pharmacology 44,225-342 (1998) に開示されている検定法も参照のこと。
ここで、図１は、（本発明の組み換えPDE4D7が発現する、CHO発現システムを用いた）本発明のPDE4D7に対する、既知の阻害剤、ロリプラムの効果を示すものである。
【０１２６】
他の慣用的な方法を用いて、ホスホジエステラーゼの阻害剤又は促進剤と推定される薬剤の結合親和性の測定、または、ホスホジエステラーゼと相互作用を持つことが通常である標的分子との相互作用を促進するか若しくは阻害するような、阻害剤または促進剤と推定される薬剤の働きを測定出来る（その標的分子は例えば、環状ヌクレオチド、あるいは、ホスホジエステラーゼが通常相互作用を持つシグナル経路の他の成分（例えば、PKAあるいは、cAMP代謝回転に関与する化合物）である）。拮抗剤の検定例としては、本発明のPDE4（PDE4D7のイソ型）と拮抗剤と目される薬剤(阻害剤)とを適切な条件で混ぜ、競合的阻害検定を行う。
【０１２７】
PDE4ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのレベルの測定、あるいは、そこでの突然変異の存在の測定は、他の慣用的方法で行われる。以下の診断学的検定の考察を参照のこと。
勿論、ここで記載したどの検定法も、様々な高処理能力の方法論の全てに適合させ、また、阻害又は促進剤と目される薬剤の生成、同定、特徴づけに使われる。PDE4D7の発現、または活性の調節能をもとにして同定した薬剤は、また、他のPDEの調節、および/または、これに関係する疾病状態の診断又は治療に対して用いられる。
【０１２８】
本発明の、例えば阻害剤あるいは活性化剤のような、調節薬剤の可能性のある薬剤としては、小化合物(無機又は有機化合物)、ポリペプチド、ペプチド又はペプチド類似物、ポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、その他がある。典型的なポリペプチド薬剤としては、酵素活性は損なわれているが、標的に対しては野生型PDE4D7より高い親和性を有する、PDE4D7変異体又はその断片がある；このようなポリペプチドはPDE4D7と競合し、その活性を阻害する。他の阻害性又は促進性物質は細胞内に入り、本発明のポリペプチドをコードする配列の近傍のDNAと結合し、発現を減少させ、細胞内cAMPレベルを増加させるか、または発現を増強させ、細胞内cAMPのレベルを減少させる。
【０１２９】
調節薬剤の一つの部門は小分子からなり、これらはペプチドの触媒部位と結合してこの部位を塞ぐことにより、触媒部位に基質が接近できなくなるので生物活性が阻害される。触媒部位は、関連するホスホジエステラーゼで見出されている触媒部位と比較するという慣用の技術によって決定される。例えばホスホジエステラーゼは、多くの場合触媒サイン配列、HXXDHXX (SEQ ID NO:26) を持つ。このような小分子の例としては、環状ヌクレオチド様構造を持つ小化合物があるが、これに限られるものではない。
【０１３０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びリボザイム
本発明の拮抗剤又は阻害剤と目される薬剤は、単離したアンチセンス・オリゴヌクレオチド、または、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを発現するアンチセンス構築物を含む。これらの部門の分子は慣用の技術で調製することができる。アンチセンス技術は、ポリヌクレオチドをDNAまたは RNAに結合させる技術に基づくものであり、遺伝子発現を制御するために使用することができる。他の特別な機構にとらわれることなく、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの型式、およびそれらが機能するメカニズムとして提起されているものは以下のようなものである：本発明の成熟したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’コード領域は、発明に対応するどの部位でも良く、末端から約10から40塩基対長の部位で、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、RNA, DNA, PNAその他オリゴヌクレオチド）の設計に用いられる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはmRNAとハイブリダイズし、mRNA分子がPDE4Dポリペプチドに翻訳されることを妨害する（Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); “遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド“、 CRC Press, Boca Raton, FL (1988)を参照のこと）。他の方法としては、オリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子領域と相補的なように設計でき（Lee,他、 Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney,他、Science, 241:456 (1988);および、 Dervan,他、 Science, 251:1360 (1991)）、このようにして、転写とPDE4Dイソ型産生を阻害する。アンチセンスの処理と設計についての指針はU.S. Pat. NO:6,200,960, 6,200,807,  6,197,584,  6,190,869,  6,190,661,  6,187,587,  6,168950,  6,153,595,  6,150,162,  6,133,246,  6,117,847,  6,096,722,  6,087,343,  6,040,296,  6,005,095, 5,998,383,  5,99,4230,  5,891,725,  5,885,970および 5,840,708を参照のこと。
【０１３１】
アンチセンス・ポリヌクレオチドは修飾された人工的ヌクレオチド、および、ヌクレオチド間の連結部（燐酸―糖鎖骨組みの修飾；燐酸メチル、チオリン酸塩、あるいは、チオリン酸塩結合；および、2’-O-メチルリボース糖単位）を含む。これにより、生体内（in vivo）または試験管内（in vitro）での安定性が増し、核酸分解酵素に対して抵抗性となり、取り込みを調節することが出来、細胞分布や細胞内区分化、その他を調節する。米国特許第6,133, 438; 6,127, 533; 6,124, 445; 6,121, 437; 5,218, 103 (例えば、ヌクレオシド・チオフォスファミダイト); 4,973, 679; Sproat 他、“2’-O-メチルオリゴリボヌクレオチド：合成と応用”、オリゴヌクレオチドと類縁体、実験手引き、Eckstein（編）、IRL Press, Oxfod, 1991, 49-86; Iribarren他、“アンチセンス・プローブとしての2’-O-アルキル・オリゴリボヌクレオチド”Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 7747-7751; Cotton他、“試験管内U7snRNP-依存mRNAプロセッシング事象の阻害剤としての2’-O-メチル、2’-O-エチル・オリゴリボヌクレオチドおよび、オリゴデオキシリボヌクレオチド.・チオリン酸塩”Nucl. Acids Res., 1991, 19, 2629-2635等の、既知の技術として既に記載されたものを含め、いかなる効果的なヌクレオチドも、修飾も用いることが出来る。上記文献に記載されている、有効量のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、必要に応じ、慣用的手段によって患者に投与できる。
【０１３２】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プラスミド又は他のべクターを介して細胞内に運ばれ、そこで、アンチセンス配列は発現制御配列と連結できる。このようにして、RNA DNAアンチセンスは細胞内で発現され、各種PDE4D、特に、PDE4D7の生産を阻害する。全長が約36ヌクレオチドが細胞培養でカチオン性リポソームと共に用いられ、細胞内に取り込まれるが、生体内（in vivo）で用いる為には、好ましくは約25ヌクレオチドの、より短いオリゴヌクレオチドが投与される。
【０１３３】
他の態様では、例えば、本発明の91量体又はその断片をコードするポリヌクレオチドのような、特異的配列を持つリボザイムが細胞内に取り込まれ、これらは、PDE4D7コード配列又は調節配列を切断する。リボザイムはRNAの特異的な切断の触媒となりうる酵素的RNAである。リボザイムの作用メカニズムは、リボザイム分子と相補的な標的RNAのハイブリダイゼーション、及び、その後のエンドヌクレアーゼによる切断を伴う。標的遺伝子であるmRNA転写物を触媒的に切断するよう設計したリボザイム分子は、標的遺伝子のmRNAの翻訳および標的遺伝子の発現を阻害するために用いることが出来る（PCT 国際公開 W090/11364, 発行 １０月 4日,1990年 ; Sarver 他. , 1990, Science 247: 1222- 1225を参照のこと）。mRNAを特異的な認識配列で切断するリボザイムは標的遺伝子mRNAを分解する為に用いられるが、それは槌型リボザイムが好ましい。槌型リボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する近傍の領域で決定される位置でmRNAを切断する。標的mRNAは次の２塩基配列：5’-UG-3’、を持つことが唯一要求される。槌型リボザイムの構築と合成は公知の技術として知られており、より完全には、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591に記載されている。例えば、本発明のPDE4D7配列のヌクレオチド配列には槌型リボザイムの切断部位の可能性のある部位は何百とある。好ましいリボザイムの設計は、切断認識部位が標的mRNAの5’-末端近くに位置し、効率を高め、非―機能性mRNA転写物の細胞内蓄積を最小限にする。
【０１３４】
本発明のリボザイムはRNAエンドリボヌクレアーゼ（以後、“Cech型リボザイム”と表記する）を含む。このRNAエンドリボヌクレアーゼは、天然にはTetrahymena Thermophila（IVS, or L-19 IVS RNAとして知られている）に存在し、Thomas Cechと共同研究者により詳しく記載されている（Zaug, 他. , 1984, Science, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, 他. , 1986, Nature, 324: 429-433; 公開された国際特許出願 No. WO 88/04300 by University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216）。Cech-リボザイムは標的RNA配列とハイブリダイズし、ここから標的RNAの切断が始まる８塩基対の活性部位を持つ。本発明は、標的遺伝子に存在する8塩基対の活性配列を標的とするCech-型リボザイムを含む。
【０１３５】
アンチセンスの処方のように、リボザイムは修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、安定性、標的への照準性等の増強の為）から作成することが出来、また、生体内（in vivo）で標的遺伝子を発現する細胞に運び込まれなければならない。運搬の為の好ましい方法としては、強い構成的なpol IIIまたはpol IIプロモーターのコントロールのもとに、このリボザイムを“コード”するDNA構築物を用いる方法があり、これにより形質転換した細胞は、内因性の標的遺伝子メッセージを破壊し、翻訳を阻害するに充分な量のリボザイムを作り出す。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒なので、効率をあげるには細胞内濃度が低いことが要求される。
【０１３６】
診断学/PDE4D7ポリペプチドのための検定
本発明は、cAMPのレベルの変動（ホスホジエステラーゼ産生又は活性を介する、または、関係する）を伴う現実の疾病状態又は潜在的疾病状態を診断または段階づける手段を提供する。この手段は、このような疾病状態又はその危険性を有する動物において、本発明のポリペプチドの量（存在するかしないか、または、量）、または、活性レベルを測定するものである。例えば、本発明は、疾病に悩む動物の疾病を診断するプロセスを提供し、あるいは、疾病の危険性のある動物の疾病に対する感受性を診断するプロセスを提供するが、前記疾病は、例えば、発明に従うホスホジエステラーゼ（SEQ ID NO:18,19 又は20の新規91量体と65-100%の配列同一性を示す配列をその構造に組み込んでいるもの、あるいは、そのアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド）の過剰又は過少発現、あるいは、活性に関係するものであり、その診断プロセスは、前記ホスホジエステラーゼの量、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの細胞中の前記ホスホジエステラーゼのレベルの測定を特徴としている。
【０１３７】
上記のどの方法を用いても、診断学的目的でサンプルを検定する場合、サンプルとしては、適切ないかなる細胞、組織、器官、あるいは、患者の、血液、尿、唾液、組織生検、死体材料も含まれるが、これらに限られるものではなく、体液からも得られる。一態様においては、診断学の為のサンプルは、高いレベルのPDE4D7発現が通常観測される細胞又は組織から取り出されるが、このような細胞又は組織は、例えば、腎臓、精巣、または、神経組織などである。好ましい態様では、診断される疾病状態は、一時的あるいは二次的効果として記憶喪失を含み、特に、長期間の記憶喪失を含む。そこで、検定される細胞は、典型的には神経細胞、特に脳の神経細胞、例えば、海馬領域の神経細胞（例えば、海馬スライスの細胞）である。
【０１３８】
各種PDE4D7によって示される様々な活性に対する酵素検定は慣用のものである。幾つかの検定法は既に記載した。タンパク質・レベルの検出および/または定量は、様々な慣用的方法、例えば、抗体または本発明の抗原特異的断片に基づく方法などによっても達成される。免疫的検定には、例えば、ELISA、RIAおよびFACS検定がある。PDE4D7ポリペプチドの２箇所の干渉しないエピトープに反応性の抗体を用いる、２ヶ所の部位、単一クローンに基づく免疫検定が好ましいが、競争的、結合検定も用いられる。これ等の検定法はHampton 他. (1990). 血清学的方法、実験室手引き、 APS Press, St. Paul, Minnに記載されている。
【０１３９】
本発明は、本発明におけるホスホジエステラーゼの異常型（例えば、遺伝的突然変異による場合）の産生にかかわる、疾病あるいは疾病への感受性の診断方法を提供する。このような、異常（又は変異体）タンパク質としては、上記記載のもの、例えば、置換、欠失、逆位、挿入、再配列（異常なスプライシングによる）、または、不適切な翻訳後修飾されたアミノ酸を有するタンパク質が挙げられる。異常なタンパク質は、上記した全ての機能の増強又は低減した活性を示しうる。異常タンパク質はまた、プロテイン・キナーゼ、骨格タンパク質その他のような、他のタンパク質との増強した又は低減した相互作用を示しうる。
【０１４０】
変異タンパク質（突然変異体または、突然変異タンパク質、特にその配列が、本発明で開示された（SEQ ID NO:18, 19または20）の91量体で見出された配列と異なるもの）は、どのような慣用的な手法でも検出しうる。例えば、抗体又は抗原結合性断片は、上記免疫学的方法を用いて、ここで開示したポリペプチドの異常型が存在することを検出する為に用いられる。
【０１４１】
本発明によれば、抗体又は抗原結合性断片をキットに組み込むことが出来、そのキットには、一ないし一以上の抗体又は抗原結合性断片、所望の緩衝液、検出構築物、対照として用いるタンパク質（野生型）などが含まれる。
【０１４２】
診断学/PDE4D7核酸のための検定
ポリヌクレオチドの検定は、サンプル中にある核酸が存在するかしないかということの測定及び/又はその定量、あるいは、突然変異または多型の検知のために用いられる。このような検定は、例えば、診断、予知、研究、または、法医学的目的の為に用いられる。この検定には、膜に拠る検定、溶液に拠る検定、または、チップに拠る検定がある。検定は、単一細胞レベルまたは多数の細胞からなるサンプルにおいてなされる、多数の細胞からなるサンプルの場合の検定は、サンプル中に存在する、集められた全細胞及び組織で“平均した”発現量となる。
【０１４３】
サザーンブロット解析、ノーザンブロット解析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiki 他., Science, 241: 53,1988 ;米国特許第4,683, 195,4, 683,202, and 6,040, 166;“ PCR プロトコール : 方法への手引きと応用“, Innis 他.,編., Academic Press, New York, 1990））、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、アンカードPCR, cDNA末端の高速増幅（RACE）（”遺伝子クローニングと解析”の中のSchaefer: “最近の新機軸”, 99-115ページ,1997）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（欧州特許第320 308）、一方向PCR（Ohara 他., Proc. Natl. Acad. Sci, 86: 5673-5677,1989）、検索システム（例えば、米国特許第5,508,169）、イン・サイテュ（in situ）・ハイブリダイゼーション、ディフェレンシャル・ディスプレイ（Liang 他., Nucl. Acid.Res., 21: 3269-3275,1993 ;米国特許第5,262, 311,5, 599,672 and 5,965, 409;  W097/18454 ; Prashar and Weissman, Proc. Natl. Acad.Sci., 93: 659-663, and米国特許第6,010, 850 and 5,712, 126; Welsh 他., Nucleic Acid Res., 20: 4965-4970,1992, and 米国特許第5,487, 985）、および、その他のRNA指紋技術、核酸塩基配列による増幅（NASBA）、及び、他の転写による増幅系（米国特許第5,409, 818 and 5,554, 527; WO 88/10315）、ポリヌクレオチド・アレイ（米国特許第5,143, 854,5, 424,186 ; 5,700, 637,5, 874,219, and 6,054, 270; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070）、Qベーター・レプリカ―ゼ（PCT/US87/00880）、ストランド・ディスプレースメント増幅（SDA）、修復連鎖反応（RCR）、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ、サブトラクションによる方法、ラピッド・スキャン、その他、を含め、どのような適切なフォーマットも使うことが出来る。その他の有効な方法としては、下記の方法が挙げられるが、これらに限られない；鋳型による増幅法、競合的PCR（米国特許第 5,747, 251）、酸化還元による検定（米国特許第5,871, 918）、タクマンに拠る検定 ( Holland 他., Proc. Natl. Acad,Sci., 88: 7276-7280,1991 ; 米国特許第5,210, 015 and 5,994, 063)、リアルタイムの蛍光による監視（米国特許第5,928, 907）、分子エネルギー移動ラベル（米国特許第5,348, 853,5, 532,129, 5,565, 322,6, 030,787, and 6,117, 635; Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 14: 303-309,1996）。単一細胞に適切な遺伝子又はタンパク質発現を調べる如何なる方法も用いることが出来下記の方法が含まれる；単一細胞内ハイブリダイゼーション、免疫細胞化学、MACS、 FACS、フローサイトメトリー、その他。単一細胞の為の検定としては、発現産物は、抗体、PCR、または、他の核酸増幅法により、測定できる（Brady 他., Methods Mol. & Cell. Biol. 2,17-25, 1990; Eberwine 他., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci., 89,3010-3014, 1992; 米国特許第5,723, 290）。
これ等及び他の方法は、示した刊行物の中に述べられているように、慣用的に遂行できる。
【０１４４】
本発明は、疾病に悩む動物の疾病を診断する方法、又は、疾病の危険性のある動物の疾病に対する感受性を診断する方法を提供するが、前記疾病は、例えば、本発明のホスホジエステラーゼ（SEQ ID NO:18,19 又は20の新規91量体と65-100%の配列同一性を示す配列をその構造に組み込んでいるもの、あるいは、そのアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチド）の過剰又は過少発現、あるいは、活性に関係しており、その診断方法は、前記ホスホジエステラーゼの量、あるいは、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトからの細胞中の前記ポリヌクレオチドのレベルを測定することで特徴付けられている。ここで記載したいずれの検定法も、あるいは既知の方法も、このようなポリヌクレオチドが存在するか否かの測定および/または定量の為に用いることができる。
【０１４５】
さらに、ある遺伝子の突然変異型または多型を検知すると、cAMPの増強又は低減した活性を有する、突然変異型のPDE4D7ポリペプチドの発現に原因する疾病、または疾病への感受性の診断が可能となる。このような突然変異体には、全て他の箇所で述べたように、点突然変異、挿入、欠失、置換、塩基転換、および、染色体転座が含まれる。
【０１４６】
本発明の遺伝子の突然変異を有する個体（人）は、様々な方法で、DNAレベルで検知される。ゲノムDNAが検知の為に直接に用いられ、あるいは、解析前にPCR（Saiki 他., Nature, 324: 163-166 (1986); Innis 他、編. (1996) “PCR プロトコール：増幅法の手引き”, Academic Press, New York）により酵素的に増幅される。RNA あるいはcDNAは同じ目的の為に用いられる。例えば、PDE4D7の新規91量体をコードする核酸に相補的なPCRプライマーは、突然変異体を同定し、解析するために用いられる。例えば、欠失および挿入は、増幅した産物のサイズの正常な遺伝子型のサイズからの変化として検知される。点突然変異は、例えば、増幅したDNAを放射性標識したRNA、または、放射性標識したアンチセンス・DNA配列とハイブリダイズすることで同定できる。完全にマッチした配列と、ミスマッチした二重鎖の区別は様々な方法でなされ、この方法には、例えばRNase A消化や融解温度の差異が含まれる。高速塩基配列決定法も用いられる。
【０１４７】
対照遺伝子と突然変異をもつ遺伝子の塩基配列の差は、直接DNA塩基配列決定により明らかとなる。加えて、クローン化したDNA部分が特異的なDNA部分を検知する為のプローブとして用いられる。この方法の感度はPCRと組み合わせることによって非常に増す。例えば、二重鎖PCR産物と共に、一つの塩基配列決定用のプライマーが用いられ、あるいは、改変したPCRにより、単鎖の鋳型分子が作られる。塩基配列の決定は、放射性標識したヌクレオチドを使った慣用的方法、あるいは、蛍光標識を用いた自動化塩基配列決定法を用いて行われる。
【０１４８】
本発明の新規91量体の部分又は全てをコードするポリヌクレオチド塩基配列はプローブ作成の為の基準として使われるが、このプローブは、30ないし40ヌクレオチド長又は、それ以上からなり、疾患の危険性が疑われる、または、疾患を有する、動物のゲノムを探索する為に使われる。例えば、本発明の各種PDE4D7をコードするmRNA量、あるいは、産生するPDE4D7タンパク質量を規定する配列である、調節配列に対応するプローブも用いられる。このような調節配列には、プロモーター又はエンハンサー要素、スプライシング事象、核酸又はタンパク質の安定性、終止ポリアデニル化、および/または、mRNA又はタンパク質の細胞内局在性を規定する配列、が挙げられる。
【０１４９】
DNA塩基配列の差異に基づく遺伝的検査は、変性剤存在下、あるいは、不在下のゲル中でDNAの断片の電気移動度の変化により検出することによって可能となる。小さな塩基配列の欠失あるいは挿入は、高分解電気泳動により見ることが出来る。異なる塩基配列のDNA断片は、ホルムアミド変性勾配ゲルで区別することが出来、このゲルの中で、異なるDNA断片の移動度は、その比融解温度又は部分融解温度（Myers 他., Science, 230: 1242 (1985)）に従い、異なる位置に遅れを示す。あるいは、異なる塩基配列のDNA断片は質量分析スペクトル解析で区別することが出来る。
【０１５０】
さらに、特別な位置での塩基配列変化は、RNase およびS1プロテクションまたは化学切断法（Cotton 他、 PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)）のような、ヌクレアーゼ・プロテクション検定で見ることが出来、これらは本発明の方法の範囲に属する。
このように、特異的なDNA塩基配列の検知は、ハイブリダイゼーション、RNaseプロテクション、化学切断、直接DNA塩基配列決定、または、ゲノムDNAへの制限酵素の使用とサザーンブロッティング（制限断片長多型(RFLP)）などの方法で行うことが出来る。
【０１５１】
突然変異は、より慣用的なゲル―電気泳動および、DNA塩基配列決定法に加えて、イン・サイチュウ（in situ）解析でも検知できる。
調節要素での突然変異は、ポリヌクレオチド(mRNA)または産生されたタンパク質レベルに影響を与え、疾病症状をもたらす。このような突然変異としては、プロモーター又はエンハンサー要素、スプライス・シグナル、終止及び/又はポリアデニル化シグナルの突然変異、タンパク質鎖終結など、切り取られたタンパク質をもたらす突然変異、核酸又はポリペプチド産生のフィードバック調節に関わる部位の突然変異、その他、が挙げられる。このような調節要素の突然変異を検知する診断学的方法は既に知られている。
【０１５２】
本発明によれば、ある種のキットはポリヌクレオチドを含むことが出来、このキットには、一又は一以上のポリヌクレオチド、所望の緩衝液（例えば、燐酸、トリスなど）、検出構築物、対照として用いる様々な組織からのRNA又はcDNA、図書、その他が含まれる。ポリヌクレオチドは、公知の技術により放射性又は非放射性標識で標識されても、非標識のままでも良い。キットはPDE4D7に対する特異的核酸を増幅する為に、一対ないし一対以上のポリヌクレオチド（PCRにおいて有効な順、逆のプライマーを含む））を含むことが出来る。これらは、センス及びアンチセンス方向性を含む。例えば、PCRを基礎としたある方法（例えば、RT-PCR）において、典型的には、一対のプライマーが用いられ、一方はセンス配列で、他方はアンチセンス配列である。
【０１５３】
ポリヌクレオチドの他の用途
本発明の塩基配列は染色体の同定に対しても貴重である。本発明の91量体をコードするポリヌクレオチド及びその同族体は、個人のヒト染色体の特別な位置を、特異的に標的とし、ハイブリダイズすることができる。さらに、例えば、ヒトゲノムプロジェクトの一部として、染色体の特定の部位を同定することは、現在必要性がある。このようにして、cDNAからPCRプライマー（好ましくは、１５−２５塩基対）を調製することによって、塩基配列は染色体上に位置付けされる。
【０１５４】
メタフェースで広げられた、染色体に対するcDNAクローンの蛍光イン・サイチュウ（in situ）ハイブリダイゼーション（FISH）は、一段階で詳細な染色体位置を決めるのに用いられる。この方法は、少なくとも50又は60塩基を持つcDNAを用いて使用される。この手法の総説として、Verma 他、“ヒト染色体：基礎技術の手引き”, Pergamon Press, New York (1988)を参考のこと。PDE遺伝子(PDE4Dを含め)の染色体位置は当業者には既知である。
【０１５５】
塩基配列が、ひとたび詳細な染色体位置に位置付けられると、染色体上での塩基配列の物理的位置は遺伝的地図データと関係付けられる。そのようなデータ―は、例えば、V. McKusick, “ヒトにおけるメンデル遺伝” (オンラインで Johns Hopkins University Welch Medical Libraryから入手できる)に見出される。同一の染色体領域に位置付けられた遺伝子と疾病の関係は、連結解析（物理的に隣接した遺伝子の共同遺伝による）によって同定される。
【０１５６】
羅患した個体（人）と羅患していない個体（人）の間のcDNA、またはゲノム塩基配列の差異を決定することが出来る。もし突然変異が羅患した個体（人）の幾つ（幾人）か、又は全て（全員）に観測されており、しかしながら、正常な個体（人）では全く突然変異が観察されないならば、その突然変異は疾患の原因物質と思われる。物理的マッピング及び遺伝的マッピングの現在の分解能によると、その疾患と関連する染色体領域に正確に局在したcDNAは、50から500の、潜在的可能性をもつ遺伝子の一つということかもしれない（ここでは、1 Mb（メガ塩基）のマッピング分解能と、1遺伝子のサイズ20 Kbを仮定している）。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチドの断片はハイブリダイゼーションのプローブとして用いられ、cDNAまたはゲノムライブラリーから全長のcDNA（または、ゲノムDNA）を単離したり、この遺伝子に非常に類似した塩基配列を持つ、または、類似した生物活性を有する他のcDNA（またはゲノムDNA）を単離するために用いる。この種のプローブは、少なくとも7または8塩基であることが好ましく、より好ましくは、およそ10、11、12、13、14または15塩基、最も好ましくは少なくとも約30塩基で、しかも、SEQ ID NO：18、19または20で開示された新規91量体ポリペプチドをコードする塩基配列の、部分的なまたは全体の配列に65-100%配列同一性を示すものである。このようなプローブは45又はそれ以上の塩基を持ち、また、本発明の新規91量体、又はその変異体の部分若しくは全てをコードする塩基配列に65-100%配列同一性を示す塩基配列を含んでいるものである。遺伝コードの同義性のために、此処で開示した新規91量体の部分又は全てをコードする塩基配列に、高度の配列同一性を示す塩基配列は多い。このような塩基配列の集合体には、また、新規91量体の部分又は全てに相同的なアミノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。ハイブリダイゼーションのプローブは、選択したポリヌクレオチドに対して、又はそのために特異的である。ポリヌクレオチド“に対して特異的である”または、“そのために特異的である”という句は機能的な意味を持ち、このプローブは、試料の中に一又は一以上の標的遺伝子がある場合、その存在を同定するために使われるということを意味する。プローブはバックグランドノイズ（“非特異的結合”）以上にポリヌクレオチドを検知するという意味で特異的である。
【０１５８】
治療学
本発明の方法は、有用性の高い治療薬剤の開発を促進する方法、および、このような治療を効果的にする方法に関するものであり、この治療薬はPDE4D7を介する、又は、それに関係する疾病状態に効果的な薬剤である。本発明は、また、“正常”な被験者の記憶機能を促進し、あるいは復活させる方法を提供するものであり、その方法は、脳、特に海馬、神経細胞のcAMPホスホジエステラーゼ、特に此処で開示したPDE4D7活性、を活性化し、それにより、これ等の細胞のcAMPレベルを低下させるものである
【０１５９】
本発明のPDE4D7ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現、及び/又は活性を調節するいかなる薬剤、例えば、此処で認められたような技術で同定したPDE4D7調節薬剤は、治療的に用いられる。そのような幾つかの薬剤については、他の箇所で述べる。
【０１６０】
本発明のポリペプチドの発現、および/または、活性に影響を与える薬剤は、此処で開示した疾病状態を予防するか、または治療する為に、および/または、そのような病態を改善する為に、必要に応じて、慣用的手法で患者に投与できる。このような薬剤は、慣用的方法によって、薬学的に許容される賦型剤、担体、その他を含む医薬組成物として処方できる。血管脳関門を通る薬剤の輸送の促進（透過の促進）をうながす処方、及び賦型剤は、やはり既知の技術である。
【０１６１】
ホスホジエステラーゼの発現あるいは活性を調節する薬剤に加えて、本発明の治療法は、このような治療を必要とする患者にホスホジエステラーゼ（PDE4D7）、又はその変異体、若しくは断片を投与することを含む。例えば、そのようなポリペプチド又はその断片は、タンパク質の低減した、あるいは、異常な発現又は活性を補正し、および/または、例えば、標的に対するより高い親和性によって、タンパク質に対する効果的な競合体となり得る。他の態様においては、免疫治療の慣用法が使われる。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドは、また遺伝子治療法にも、例えば遺伝子伝達体の中で用いられる。遺伝子伝達体はウィルス由来でも非ウィルス由来でもありうる（一般的には、Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5: 845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1: 185-193 (1995); and Kaplitt, Nature Genetics 6: 148-153 (1994)を参照のこと）。本発明の治療薬をコードする塩基配列を含む構築体運搬の為の遺伝子治療伝達体は、局部的に又は全身に投与できる。これ等の構築体はウィルス又は、非ウィルスベクター法を用いることができる。このようなコード配列の発現を誘導するには、内因的な哺乳動物、または異種動物プロモーターを用いる。コードする配列の発現は、構成的もしくは調節的である。
【０１６３】
本発明は、興味ある選択された核酸分子の運搬又は発現の為に構築された、組み換えレトロウィルスを用いることが出来る。レトロウィルスベクターには、以下の文献に記載されているものを含むことが出来る：欧州特許第0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 米国特許第5,219, 740; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864 (1993); Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962-967 (1993); Ram 他., Cancer Res. 53: 83-88 (1993); Takamiya 他., J. Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992); Baba 他.,J. Neurosurg. 79: 729-735 (1993);米国特許第4,777, 127;英国特許第2,200,651 ; and欧州特許第0 345 242。好ましい組み換えレトロウィルスはWO91/02805に記載されているものを含む。
【０１６４】
上記レトロウィルスベクター構築体を用いるに適したパッケージ細胞株は直ちに作成でき（PCT 公開 WO 95/30763 and WO 92/05266を参照）、組み換えベクター粒子を作成する為のプロデューサー細胞株（ベクター細胞株とも呼ぶ）を作成するのに用いられる。本発明の特に好ましい態様では、パッケージ細胞株は、ヒト（HT1080細胞）またはミンク細胞株から作られ、ヒト血清による不活性化を切り抜ける組み換えレトロウィルスを産生する。
【０１６５】
本発明は、また、遺伝子運搬の伝達体として働くアファウィルス由来ベクターを用いる。このベクターは様々のアルファウィルスから構築でき、例えば、シンドビスウィルス、セムリキ・フォーレスト・ウィルス（ATCC VR-67; ATCC VR-1247）、ロス・リバーウィルス（ATCC VR-373; ATCC VR-1246）、ベネゼーラ馬脳炎ウィルス（ATCC VR-923; ATCC VR-1250 ATCC VR-1249; ATCC VR-532）から構築できる。このようなベクター系の代表例は米国特許第5,091, 309; 5,217, 879; and 5,185, 440; and PCT 公開 Nos. WO 92/10578; WO 94/21792; WO95/27069 ; WO 95/27044; and WO 95/07994などに記載されている。
【０１６６】
本発明の遺伝子運搬伝達体としては、またアデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターのようなパルボウィルスが用いられる。代表例としては、AAVベクターがあり、WO 93/09239の中の Srivastava, Samulski 他., J. Vir. 63: 3822-3828 (1989); Mendelson 他., Virol. 166: 154-165 (1988); and Flotte 他. , P. N. A. S. 90: 10613-10617 (1993)に開示されているものが含まれる。
【０１６７】
アデノウィルスベクターの代表例として、Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (Biotechniques); Rosenfeld 他., Science 252: 431-434 (1991); WO 93/19191; Kolls 他. , P. N. A. S. 215-219 (1994); Kass-Eisler 他., P. N. A. S. 90: 11498-11502 (1993);Guzman 他, Circulation 88: 2838-2848 (1993); Guzman 他., Cir. Res. 73: 1202- 1207 (1993); Zabner 他.,Cell 75 : 207-216 (1993); Li 他., Hum. Gene Ther. 4: 403-409 (1993); Cailaud 他., Eur. J. Neurosci. 5: 1287-1291 (1993); Vincent 他.,Nat. Genet. 5: 130-134 (1993); Jaffe 他.,Nat. Genet. 1: 372-378 (1992); および Levrero 他., Gene 101: 195-202 (1992)に開示されているものが含まれる。また、本発明に使うことが出来る、見本としてのアデノウィルス遺伝子治療ベクターには、WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 and WO 95/00655に記載されているものが含まれる。殺されたアデノウィルスに連結したDNAの投与については、Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)に記載されている方法が使われる。
【０１６８】
他の遺伝子運搬の伝達体および方法として用いられるものには、殺されたアデノウィルスに連結する、又は非連結のポリカチオンで凝縮したDNA、例えば、Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)；リガンド連結DNA、例えば、Wu, J Biol. Chem. 264: 16985-16987 (1989)を参照；真核細胞運搬伝達体、例えば、米国特許出願第08/240,030, 1994年５月９日出願、及び米国特許出願第08/404,796参照；沈殿した光重合化ヒドロゲル物質；携帯用遺伝子移動粒子銃、米国特許第5,149, 655に記載；電離線照射、米国特許第5,206, 152 and in WO 92/11033に記載；核電荷中和法又は細胞膜との融合法が挙げられる。
他の手法は、Philip, Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994) および Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1581-1585 (1994).に記載されている。
【０１６９】
裸のDNAもまた使われる。見本的な裸のDNA導入法はWO 90/11092及び米国特許第 5,580, 859に記載されている。取り込み効率は、生物分解可能なラテックス・ビーズを用いて改善される。ラテックスビーズで覆われたDNAは、ビーズによるエンドサイトシス開始後細胞内に効率よく輸送される。この方法は、さらに、ビーズを疎水性増加処理することによって改善され、これにより、エンドソームの破壊を助け、DNAを細胞質に放出する。遺伝子輸送伝達体として働くリポソームについては米国特許第5,422, 120, PCT 特許公開 第WO 95/13796, WO 94/23697及びWO 91/14445、並びに欧州特許第0 524 968に記載されている。
【０１７０】
さらに、使用に適した非ウィルス伝達体は、Woffendin 他. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24):11581-11585 (1994).に記載されている機械的な輸送システムを含む。さらに、コード配列とその発現産物は、光重合ヒドロゲル物質の沈殿として輸送できる。コード配列の輸送に用いられる、他の慣用的な遺伝子伝達方法は、米国特許第5,149, 655に記載されている携帯遺伝子輸送粒子銃、米国特許第5,206,152及びPCT特許公開番号WO 92/11033に記載されている、輸送した遺伝子の活性化のための電離線照射が含まれる。
【０１７１】
コンピューターに基づく応用
本発明のヌクレオチド配列、又はアミノ酸配列は、また、利用を容易にするために多くの媒体から提供される。ここで“提供される”とは、本発明のヌクレオチドないしアミノ酸配列を含む、単離した核酸又はアミノ酸分子以外の製品にも及ぶものである。このような製品は、当業者が製品を吟味できる形にした、ヌクレオチド又はアミノ酸配列又はその一部（例えば、オープンリーディングフレーム（ORF）の一部）を提供するものであるが、その吟味の手段は、自然界に存在するかまたは精製した試料のヌクレオチド、若しくはアミノ酸、若しくはそれらの一部の配列吟味には、直接には適用できない。
【０１７２】
この態様の一つの応用においては、本発明のヌクレオチドあるいはアミノ酸配列はコンピューターが読み取り可能な媒体に記録される。此処で用いたように、“コンピューターが読み取り可能な媒体”とは、コンピューターにより直接読まれ、アクセスされる全てのメディアを表す。このような媒体には以下のものを含むが、これらに限定されるものではない：フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体、および、磁気テープのような、磁気記憶媒体；CD-ROMのような光学的記憶媒体；RAMおよびROMのような電気的記憶媒体；磁気/光学記憶媒体のようなこれ等のカテゴリーのハイブリッド。当業者は、現在知られているどのコンピューター読み取り可能媒体が、本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体からなる製品を作るために、どのように用いられるかについて直ちに理解するだろう。
【０１７３】
此処で用いたように、”記録する”とは情報をコンピューターが読み取り可能な媒体に保存するプロセスを表す。当業者は、本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列を記録しているコンピューター読み取り可能媒体を含む製品を作り出すために、現在知られている全ての手法を取り入れて、コンピューター読み取り可能な媒体に情報を記録することが出来る。
【０１７４】
当業者は、様々のデータ保存構造体を利用して、本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列を記録する、コンピューター読み取り可能な媒体を作製する。データ保存構造体の選択は、一般的に、保存された情報へアクセスするために選ぶ手段にもとずいている。加えて、様々なデータ処理プログラム及びフォーマットが使われて、本発明のヌクレオチド配列はコンピューターが読み取りうる媒体に保存される。配列情報は、ワードパーフェクトおよびマイクロソフトワードなど、商業的に入手可能なソフトでフォーマットされて、ワードプロセッサーのテキストファイル、あるいは、DB2、サイベース、オラクル、その他、のような、データーベース・アプリケーションに保存されるASCIIファイルの形で表現される。当業者は直ちに、いずれかの、データープロセッサー・ストラクチャリング・フォーマットを選び（例えば、テキストファイル又はデータベース）、本発明のヌクレオチド配列情報を記録したコンピューター読み取り可能な媒体を得ることが出来る。
【０１７５】
本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列をコンピューター読み取り可能な形にすることにより、当業者は日常的に、様々な目的で配列情報にアクセスできる。例えば、当業者はコンピューター読み取り可能な形の本発明のヌクレオチド又はアミノ酸配列を用いて、標的配列又は標的構造モチーフとデータ保存手段内に保存してある配列情報を比較することができる。サーチ手段を用いると、特定の標的配列又はターゲットモティーフとマッチする本発明の配列の断片、又は領域の同定が出来る。
【０１７６】
此処で用いたように、“標的配列”とは、どのようなDNAでも、どのような６個又はそれ以上のヌクレオチドでも、どのような２個又はそれ以上のアミノ酸でもよい。当業者は、標的配列が長いほど、標的配列がデータベースの中でランダムに発生することは少ないということを直ちに理解する。最も好ましい標的配列の配列長は、約10から100アミノ酸残基あるいは30から300ヌクレオチド残基である。しかしながら、遺伝子発現に関与する、あるいは、タンパク質プロセッシングに関する配列断片のような、商業的に重要な断片の長さはより短い。
【０１７７】
此処で用いたように、“標的構造モチーフ”または“標的モチーフ”は、標的モチーフの折りたたみの上に造られる、3次元立体配置の上で選ばれた全ての合理的に選択した配列又は配列のコンビネーションを表している。様々な標的モチーフが既知の技術で知られている。タンパク質標的モチーフには、酵素活性部位及びシグナル配列が含まれるが、これらには限定されない。核酸標的モチーフには、プロモーター配列、ヘアピン構造および、誘導発現要素（タンパク質結合配列）が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１７８】
コンピューターソフトウェアーは公に入手可能であり、これによって、当業者は、解析及び他の配列との比較の為に、コンピューター読み取り可能な媒体に提供された配列情報にアクセスすることができる。様々なアルゴリズムが公に開示されており、また、様々な商業的に入手可能な、検索を行うソフトウェアがあり、これを用いて、本発明のコンピューターをもとにしたシステムを利用することができる。このようなソフトウェアの例としては、MacPattern (EMBL)、BLASTNおよびBLASTX (NCBIA)が挙げられるが、これらには限られない。
【０１７９】
例えば、BLAST (Altschul 他、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) 及び、 サイベースシステム上のBLAZE (Brutlag 他、 (1993) Comp. Chem. 17: 203-207) 検索アルゴリズムを実行するソフトウェアを用いると、他のライブラリーのORF又はタンパク質に対する相同性を持っている、本発明の配列のオープンリーディングフレーム（ORF）を同定することができる。このようなORFはタンパク質をコード化している断片であり、様々な反応に用いられる酵素のように商業的に重要なタンパク質を生産する上で、また、商業的に有用な代謝物を生産する上で有用である。
前述及び後述する実施例における全ての温度は摂氏であり、特に指示しない限り、全ての割合及びパーセントは重量による。
【実施例１】
【０１８０】
5’-RACE法を用いた、ラットPDE4D7 5’-末端cDNA
Genbank(〔遺伝子銀行〕登録番号 No. U09456）から入手したラットPDE4D7塩基配列、および、Genbank（登録番号 No.U79571）から入手したヒトPDE4D塩基配列にもとづき、２個のネスティッド・リバースプライマーを設計する。プライマー塩基配列は：
ラットに対し：
RatPDE4DR1：
5'-ATGCAGAGGCCGGTTGCCAGACAGCTCCGCTATTCGG-3' (SEQ ID NO: 1) 
ラット及びヒトに対し：
SVSE：
5'-GTTGGAGGCCATCTCACTGACGG-3' (SEQ ID NO：2)
5’RACEキット（GIBCO-BRL）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行い、ラット脳組織から、5’末端の新規PDE4DcDNAイソ型の検索を行う。ラット海馬（Clontech）からの全RNAを鋳型として用いる。1 μgのRNA試料を逆転写に用いる。第１鎖cDNA合成に用いたプライマーはラットPDE4DR1である。逆転写反応は、SuperscriptII RT (GIBCO-BRL)を用いて４２℃で1時間行う。cDNAを精製し、5’RACEキットの標準的プロトコールに従い、ポリ(C)テイルをつけた。ポリ(C)テイル付けしたcDNAサンプルを、Taq DNAポリメラーゼ（GIBCO-BRL）とともにPCRに用いた。PCR反応に用いるプライマーは、前進アンカードプライマー（GIBCO-BRL）とSVSEプライマーである。このPCR反応の生産物は５００Ｘ希釈し、前進プライマーUAP (GIBCO-BRL) およびSVSEプライマーを用いて、第２ラウンドのPCRを行う。このPCR産物は、TAクローニングシステム（Invitrogen）を用いてサブクローニングされ、塩基配列が決定される。
R10/TAという１クローンは、ラットPDE4D7(SEQ ID No:3)と考えられる、新規5’末端配列を含む。
【０１８１】
ラットPDE4D7の全長クローニング
１） 若いラット海馬mRNA からのcDNA合成
若いラット（月齢〜5）を、断頭により屠殺する。海馬を手早く切り裂き、RNA-Later 溶液(Ambion)に入れる。30分後、海馬は処理され、海馬からの全RNAがTriZolプロトコール（Gibco-BRL）により抽出される。mRNAを精製するために、３匹の若いラットからの全RNAをプールする。海馬から得、プールした約240 μgの全RNAを用いて、mRNAを精製する。Oligotex mRNA Spin-Column プロトコール（Quiagen）を用いて、約7.6 μgのmRNAが回収される。二重鎖cDNAはClontech Smart cDNAライブラリー構築キットを用いて合成される。
【０１８２】
２） PCRによるラットPDE4D7の全長クローニング。
ラットPDE4D7 (SEQ ID NO:3)の新規5’末端配列とラットPDE4D3A (遺伝子銀行  登録番号：L27059)の3’UTR配列をもとに、次のプライマーを設計する：
RN4D7-5’a：
5’-GCCTCTGAGTGGATTACAGTTTCAGTGAGAGC-3’(SEQ ID NO：4)
RN4D7-3’a：
5’-GGTGTGACAGCCTTTACACTGTTACGTGTCAG-3’ (SEQ ID NO：5)
RN4D-3’b：
5’-CCTGGCAGATGACAGTGAGGTGTGACC-3’ (SEQ ID NO：6)
をClontech Advantage cDNA PCRキットと共にRN4D7-5'a/RN4D-3'a およびRN4D7-5'a/RN4D-3'bのプライマーコンビネーションを用い、若いラット海馬cDNA（上記）のPCRを行う。PCRプロトコールは次のようにする：94 ℃で1分間1サイクル；94 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、 5 サイクル；94 ℃で10秒間/68 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、30 サイクル； 72 ℃で7分1サイクル；4 ℃に保持。PCRの後、5 μlの反応混合液を、1% TBEアガロースゲル上で分析する。〜2.5 kbサイズの単一DNA断片が両PCR反応において検知される。このPCR断片はQuiagen PCR Clean-up Columnsを用いて精製し、pBAD/Thio TA-Cloning Vector (Invitrogen)を用いてクローン化する。RN4D7-5'a/RN4D-3'bコンビネーションより2個のコロニーが調整され、塩基配列決定される。ラットPDE4D7の全長cDNA（SEQ ID NO：7）とタンパク質配列（SEQ ID NO：8）が示される。
【０１８３】
ヒトPDE4D7の全長クローニング
ラットPDE4D7 (SEQ ID NO：3)の新規5’末端配列を用い、ヒトESTデータベースのBLAST検索を行う。ヒトEST配列（Genbank  登録番号：AA526207）は、DNAおよびタンパク質両レベル（開始メチオニンと、インフレームの上流終止コドンを含む）で、ラットPDE4D7 5’末端と高い相同性を示す。このESTはヒトPDE4D7の5’末端を示す。
【０１８４】
ヒトPDE4D7の全長クローニングのために、次のPCRプライマーをヒトEST配列AA526207およびヒトPDE4D4A (Genbank登録番号：L20969)3'UTR配列に基づいて設計する：
HS4D7-5’a：
5-AGTGGATACGTGCAGTGAGATCATTGACACTGG-3’ (SEQ ID NO：9)
HS4D7-3’a：
5’-GGCAGATGACAGTGAGGTGTGACCGTG-3’ (SEQ ID NO：10)
Advantage cDNA PCRキット（Clontech）と共に、プライマー対HS4D7-5’a/HS4D7-3’aを用い、ヒト海馬Quick-Clone cDNA (Clontech)のPCRを行う。PCRプロトコールは次のものである：94 ℃で1分間、1サイクル；94 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、5 サイクル；94 ℃で10秒間/68 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、30サイクル；72 ℃で7分、 1サイクル； 4 ℃に保持。PCRの後、5 μlの反応混合液を、1% TBEアガロースゲル上で分析する。〜2.5 kbサイズの単一DNA断片が検知される。このPCR断片は、Quiagen PCR Clean-up Columnsを用いて精製され、pBAD/Thio TA-Cloning Vector (Invitrogen)を用いてクローン化される。PCR産物を含む2個のコロニーが調整され、塩基配列が決定される。ヒトPDE4D7の全長cDNAおよびタンパク質配列が夫々、SEQ ID NO：11および SEQ ID NO：12に示される。
【０１８５】
マウスPDE4D7の全長クローニング
ラットPDE4D7 5’ UTR配列（図1参照）を用いてマウスESTデーターベースのBLAST検索を行い、EST配列 AU023511がマウスPDE4D7の 5’UTR配列であることを同定する。ラットPDE4D3A (L27059)の 3’UTR配列を用いてマウスESTデーターベースのBLAST検索を行い、EST配列 AW913383がマウスPDE4D7の 3’UTR配列を含むことを同定した。配列AU023511に基づき、5’末端特異的プライマーMM4D7-1を設計する：
MM4D7-1：
5’-AACAGTCCGCTCACCACCTGCCCTC-3’ (SEQ ID NO：13)
AW913383配列の一部はラットPDE4D3A 3’UTRと同一なので、プライマーRN4D-3’bをマウスPDE4D7の3’プライマーとして用いる。
Advantage HF 2 PCRキット（Clontech）と共に、プライマー対MM4D7-1/RN4D7-3’bを用い、マウス  脳Quick-Clone cDNA (Clontech)のPCRを行う。PCRプロトコールは次のものである：94 ℃で 1分間、1サイクル；94 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、5 サイクル；94 ℃で10秒間/68 ℃で10秒間/72 ℃で2分30秒間、30 サイクル； 72 ℃で7分、 1サイクル； 4 ℃に保持。PCRの後、5 μl の反応混合液を、1% TBEアガロースゲル上で分析する。〜2.5 kbサイズの一つのDNA断片が検知される。このPCR断片はQuiagen PCR Clean-up Columnsを用いて精製され、pcDNA3.1V5/His TA-Cloning Vector (Invitrogen)を用いてクローン化される。PCR産物を含む2個のコロニーが調整され、塩基配列が決定される。マウスPDE4D7の全長cDNAおよびタンパク質配列が、夫々、SEQ ID NO：14および SEQ ID NO：15に示される。
【実施例２】
【０１８６】
組み換えヒトPDE4D7のCHO細胞での発現
ホスホジエステラーゼとしてPDE4D7の活性を得るために、以下のプライマーをPCRのために設計し、ヒトPDE4D7 ORFをpcDNA3.1 V5/His哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）でクローン化する：
HS4D7-R1：
5’-GGAATTCCACCATGAAAAGAAATACCTGTGATTTGCTTTCTCGG-3’
(SEQ ID NO：16)
HS4D7-Xba1：
5’-ATCTAGATCATTACGTGTCAGGAGAACGATCATCTATGACACAG-3’
(SEQ ID NO：17)
これ等2個のプライマーを用いて、ヒトPDE4D7 ORFをPCR増幅する。得られた断片をQiaEx IIキット（Qiagen）によりゲルで精製し、pcDNA3.1 V5/His TOPOベクターでクローン化する。ミニプレプの後、候補となるクローンをBamH 1で消化し、ヒトPDE4D7 ORFの方向をチェックする。正しい方向のクローンの塩基配列を決定し確認する。
【０１８７】
ヒトPDE4D7活性のcAMPホスホジエステラーゼとしての活性、及びそのロリプラムによる特異的阻害を吟味する為に、酵素阻害検定を行う。T-175フラスコを用い、20 μg pcDNA3.1 V5/His + ヒトPDE4D7を80%コンフルエントのCHOに、Lipofectamine Plus 試薬（GibcoBRL）と共にトランスフェクトする。同量のpcDNA3.1 V5/Hisプラスミドを対照としてCHOにトランスフェクトする。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、ポリトロンを用い、2 mlの溶解液の中で均一化する。検定を始める為に、6 μgの細胞溶解液タンパク質を、増加する濃度のロリプラム (10-l2-10-5 M)と共に、50 μl の検定緩衝液 (ll.1 mMTris / HCI pH 7.5 および12.5mM MgC12) 中、３０分間室温でインキュベートする。ロリプラムとのインキュベート後、50ulの基質混合液 (100 反応に対し: 3ul 非標識cAMP(lOmM)、 4 ulの 5'-ヌクレオチダーゼ (50 units/ul)、30ulの[3H] cAMP (29.4 uM)、 5 mlの検定緩衝液) を加える。12 分後、反応は 100 μl の沸騰した 5mM HC1を加えて停止する。75 μlの反応混合液を平衡化した酸性アルミナカラムに乗せ、遠心する。カラムを通り抜けたトリチウム量をTrilux Microbeta Counterで計測する。データはプリスム・ソフトウェアを用いて解析し、図１に示されている。結果は、組み換えヒトPDE4D7はcAMPを分解することが出来、その酵素活性は、PDE4特異的阻害剤であるロリプラムにより阻害されることを示している。
【０１８８】
前記見出しは、ある情報を応用の中で見出す為の手引きを意味する。見出しはあるトピックの情報が見出される応用の唯一の出所を示すものではない。
前記の内容から、当業者は本発明の本質的特長を容易に理解することが出来、本文の意図から外れることなく、様々な利用、条件に適合できるように本発明を変えたり、改善することができる。
これ以上の詳述無しに、当業者は前述の記載を利用し、本発明を十全に利用できる。
前述した好ましい態様は、従って、単に描写的に説明されており、本開示の残りの部分について、如何なる意味でも制限を加えるものではない。
上記引用したり、図中の全ての応用、特許、出版物全ての開示は全て参考文献の中に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】組み換えヒトPDE-4D7酵素がcAMPを分解すること、および、特異的PDE4阻害剤、ロリプラムによって反応が阻害されることを示す。ここで、CHO細胞はヒトPDE-4D7で形質変換され、細胞溶解物が、組み換えヒトPDE4D7酵素源として用いられた。酵素活性はcAMPのAMPへの変換速度として測定された。ロリプラムは商業的に入手可能である（例えば、Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouriから）。
【図２】PDE4D7イントロンーエキソン接合部を示す。クローニング及び塩基配列決定により、ヒトPDE4D7 cDNA (SEQ ID NO:11,2419nt) は５番目染色体に位置し、250 kb以上の領域にわたることが確認された。91量体(SEQ ID NO:19)をコードする5’-末端の新しい塩基配列は第一及び第二エキソンを占め、共通のヒトPDE4D配列はエキソンIII―エキソンXVIを構成する。
【図１】
2005527188.tif 000002
【図２】
2005527188.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月16日(2004.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のPDE4D7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、または、その相補的ポリヌクレオチド配列を含む、単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記PDE4D7ポリペプチドを中断することなくコードする、請求項1に記載された単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
ヒト、ラット、又は、マウスポリペプチドをコードする、請求項1に記載された単離したポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項1に記載されたポリヌクレオチドにコード化された単離したポリペプチド。
【請求項５】
(a)SEQ ID NO：7,11,14,21,22,23,3,24又は25に示されたポリヌクレオチド配列；
(b)SEQ ID NO：8,12,15,18,19又は20に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；
(c)SEQ ID NO：8,12,15,18,19又は20に示されたアミノ酸配列の全長と少なくとも90％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；
(d)SEQ ID NO：7,11,14,21,22,23,3,24又は25に示されたポリヌクレオチド配列と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
(e)ATCC寄託番号PTA-3893,PTA-3894,PTA-3895に含まれるcDNAのポリヌクレオチド配列、または、その断片；
(f)それらの特異的断片、または、
それらの相補体；
からなる、PDE4D7ポリペプチドのための単離したポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記PDE4D7ポリペプチドを中断することなくコードする、請求項5に記載された単離したポリヌクレオチド。
【請求項７】
ATCC寄託番号PTA-3893,PTA-3894,PTA-3895に含まれるcDNAのポリヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載された単離したポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項5に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項6に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項6に記載されたベクターであって、前記ポリヌクレオチドがプロモーター配列に操作可能に連結しているベクター。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが操作可能にプロモーター配列と連結している請求項9に記載されたベクター。
【請求項１２】
請求項5に記載されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは、操作可能にプロモーター配列と連結する前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する形質転換した細胞。
【請求項１３】
請求項6に記載されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、あるいは、操作可能にプロモーター配列と連結する前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有する形質転換した細胞。
【請求項１４】
請求項5に記載されたポリヌクレオチドでコード化された、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項7に記載されたポリヌクレオチドでコード化された単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
請求項14に記載されたポリペプチドを含む試料と調節薬剤と予想される薬剤を接触させ、前記ポリペプチドの量又は活性を測定するかcAMPレベルを測定することからなる、PDE4D7に対するポリペプチドの発現又は活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
前記薬剤が前記PDE4D7ポリペプチドの発現又は活性を阻害する、請求項16に記載された方法。
【請求項１８】
前記試料が細胞、組織、あるいは、それらの抽出液である請求項16に記載された方法。
【請求項１９】
請求項14に記載されたポリペプチドを含む試料と調節薬剤と予想される薬剤とを接触させ、cAMPレベルを測定する、PDE4D7に対するポリペプチドの活性を阻害する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
SEQ ID NO：18,19,20を含むポリペプチド、あるいは、ATCC寄託番号PTA-3893,PTA-3894,PTA-3895に含まれるcDNAのポリヌクレオチド配列によってコード化されたN−末端の91アミノ酸に結合する薬剤をスクリーニングする方法であって：前記ポリペプチドと、結合薬剤と予想される薬剤とを接触させて結合複合体の生成を測定する方法。
【請求項２１】
被験者のPDE4D7を介した疾病、異常、または、被験者のPDE4D7を介した疾病若しくは異常への感受性を診断する方法であって：前記被験者から採取した組織、細胞またはそれらの抽出液中の、ポリヌクレオチドまたは請求項5に記載されたポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの発現を測定する方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド又はポリペプチドが過剰発現または過少発現する、請求項21に記載された方法。
【請求項２３】
請求項58に記載された方法であって、前記疾病又は異常が、記憶障害、痴呆、欝病、精神分裂病、呼吸器病、炎症、多発性硬化症、脊髄障害、若しくは卒中である方法。
【請求項２４】
請求項58に記載された方法であって、前記発現の測定がノーザンブロット解析、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆トランスクリプターゼPCR、または、RACE PCRによってなされる方法。
【請求項２５】
被験者の突然変異又は多型を検知する方法であって、請求項5に記載されたPDE4D7に対する遺伝子の突然変異又は多型を同定する方法。
【請求項２６】
請求項25に記載された方法であって、前記突然変異又は多型が5’非転写調節領域にある方法。
【請求項２７】
請求項26に記載された方法であって、前記突然変異又は多型が、前記被験者のPDE4D7を介した疾病又は異常、若しくは、前記被験者のPDE4D7を介した疾病又は異常への感受性と関連する方法。
【請求項２８】
請求項27に記載された方法であって、前記疾病又は異常が、記憶障害、痴呆、欝病、精神分裂病、呼吸器病、炎症、多発性硬化症、脊髄障害、若しくは卒中である方法。
【請求項２９】
哺乳動物のPDE4D7をコードする核酸を検知する方法であって、請求項5に記載された哺乳動物のPDE4D7に特異的ポリヌクレオチド・プローブを、前記核酸と特異的にハイブリダイズする条件下で、核酸を含む試料と接触させ、前記プローブと前記核酸とのハイブリダイゼーションを検出する方法。
【請求項３０】
哺乳動物のPDE4D7であるポリペプチドを検出する方法であって、請求項42に記載された哺乳動物のPDE4D7に特異的な抗体を、前記ポリペプチドと結合するに効果的な条件下で、ポリペプチドからなる試料と接触させ、前記抗体と前記ポリペプチド間の結合を検出する方法であって、前記抗体が、SEQ ID NO：18,19,20に示されるアミノ酸配列、またはATCC寄託番号PTA―3893,PTA-3894,PTA-3895に含まれるcDNAのポリヌクレオチド配列によってコードされているN-末端の91アミノ酸配列からなるポリペプチドに対して特異的な抗体である方法。
【請求項３１】
PDE4D7を介した疾病あるいは異常を持つ被験者、または、PDE4D7を介した疾病あるいは異常への感受性を有する被験者を治療する方法であって、有効量のヒトPDE4D7の阻害剤を投与する方法。
【請求項３２】
請求項31に記載された方法であって、前記疾病又は異常が、記憶障害、痴呆、欝病、精神分裂病、呼吸器病、炎症、多発性硬化症、脊髄障害、若しくは卒中である場合の方法。
【請求項３３】
請求項31に記載された方法であって、前記被験者がPDE4D7の発現に影響のあるPDE4D7の多型を有する患者である方法。
【請求項３４】
請求項5に記載された、少なくとも1コピーのポリヌクレオチドからなる、非-ヒト哺乳動物のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
そのゲノムが請求項5に記載されたポリヌクレオチドをコードする内因性PDE4D7遺伝子の機能的破壊を含む、トランスジェニック・非-ヒト哺乳動物細胞。
【請求項３６】
前記動物が、記憶障害、痴呆、欝病、精神分裂病、呼吸器病、炎症、多発性硬化症、脊髄障害、または、卒中に罹り易い哺乳動物である、請求項35に記載された細胞で構成されるトランスジェニック・非-ヒト哺乳動物。
【請求項３７】
SEQ ID NO：18,19,20に示されるポリペプチド、または、ATCC寄託番号PTA―3893,PTA-3894,PTA-3895に含まれるcDNAのポリヌクレオチド配列によってコードされているN-末端の91アミノ酸配列からなるポリペプチドに対して特異的な抗体、若しくはその断片。
【請求項３８】
細胞、組織、または組織細胞抽出物を請求項37に記載された抗体と接触させ、しかる後に、上記細胞、組織、あるいは、組織細胞抽出物と結合した特異的抗体を検出する、PDE4D7を検出する方法。
【請求項３９】
以下のポリヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド：
a）5'-GCCTCTGAGTGGATTACAGTTTCAGTGAGAGC-3'(RN4D7-5'a)(SEQ ID NO:4)および、5'-CCTGGCAGATGACAGTGAGGTGTGACC-3'(RN4D―3'b)(SEQ ID NO:6)の逆位、相補的配列であって、ラットPDE4D7をコードする配列；
b）5'-AACAGTCCGCTCACCACCTGCCCTC-3'(MN4D7-1)(SEQ ID NO:13)および、5'-CCTGGCAGATGACAGTGAGGTGTGACC-3'(RN4D―3'b)(SEQ ID NO:6)の逆位、相補的配列であって、マウスPDE4D7をコードする配列；
c）5'-AGTGGATACGTGCAGTGAGATCATTGACACTGG-3'(HS4D7―5'a)(SEQ ID NO:9)、および、5'-GGCAGATGACAGTGAGGTGTGACCGTG-3'(HS4D7-3'a)(SEQ ID NO:10)の逆位、相補的配列であって、ヒトPDE4D7をコードする配列；または
d）これらに相補的な配列。
【請求項４０】
核酸を含む試料と以下から選択されるプライマ―対を接触させ、ついで、ポリメラーゼ連鎖反応産物が効率的に得られる条件下で前記試料のポリメラーゼ連鎖反応を行わせる、PDE4D7をコードする全長ポリヌクレオチドを得る方法：
a）5'-GCCTCTGAGTGGATTACAGTTTCAGTGAGAGC-3'(RN4D7-5'a)(SEQ ID NO:4)および、5'-CCTGGCAGATGACAGTGAGGTGTGACC-3'(RN4D-3'b)(SEQ ID NO:6)；
b）5'-AACAGTCCGCTCACCACCTGCCCTC-3'(MM4D7-1)(SEQ ID NO:13)および、５'-CCTGGCAGATGACAGTGAGGTGTGACC-3'(RN4D-3')(SEQ ID NO:6)；または
c）5'-AGTGGATACGTGCAGTGAGATCATTGACACTGG-3'(HS4D7-5'a)(SEQ ID NO:9)および、5'-GGCAGATGACAGTGAGGTGTGACCGTG-3'(HS4D7-3'a)(SEQ ID NO:10)。
【請求項４１】
請求項40に記載された製品。
【請求項４２】
SEQ ID NO:27,または、SEQ ID NO:28で示されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項5に記載された単離したポリヌクレオチド。
【請求項４３】
コンピューター読み取り可能な媒体を使い、請求項5に記載されたポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を、使用者の選択により前記データベースより取り出して表示する、ポリヌクレオチド配列からなるデーターベースからPDE4D7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を選択する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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