(57)【要約】アポトーシス細胞およびアポトーシス体に似た３次元構造、サイズおよび形状を有する合成体であって、ホスホ−アミノ酸側鎖基を保有する実態（例えば、ビーズ）が提供される。これらは、患者に投与されて、Ｔ細胞媒介障害（自己免疫状態）、炎症性障害、神経変性障害および内皮機能不全障害のような種々の障害を緩和し得る。本発明は、合成化学実体を提供し、この実体は、哺乳動物患者への投与の際に、アポトーシス細胞および／またはアポトーシス体を模倣し、結果としてプロ炎症性サイトカインのダウンレギュレーションおよび／または抗炎症性サイトカインのアップレギュレーションを生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性合成実体であって、以下：
最大寸法におけるサイズが５０ナノメートル〜５００ミクロンの３次元的ヘッド部分；
該ヘッド部分に結合した複数のテール部分であって、以下：
抗原提示細胞上のレセプターと相互作用し得るホスホ−アミノ酸末端基、および
少なくとも３つの直鎖炭素原子の化学スペーサー基、
を有する、複数のテール部分、
を含み、該スペーサー基は、該スペーサー基の近位末端において各ヘッド部分に結合しており、そして該スペーサー基の遠位末端において該ホスホアミノ酸基のホスフェートに結合している、実体。
【請求項２】
請求項１に記載の実体であって、本発明の実体の前記末端基を形成するホスホ−アミノ酸基が、一般式：
【化１】
2005502725.tif 000008
を有し、ここで、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ４の直鎖または分岐のアルキレン、アルキレン−オキシ、アルキレン−チオ、アルキレン−アミン、フェニル、ヨード置換フェニル、および５員Ｎ−複素環式基を表す、実体。
【請求項３】
前記ホスホ−アミノ酸基が、ホスホ−セリン基またはホスホ−スレオニン基である、請求項２に記載の実体。
【請求項４】
前記ホスホ−アミノ酸基が、以下の式：
【化２】
2005502725.tif 000009
のホスホ−セリン基である、請求項４に記載の実体。
【請求項５】
請求項１〜４にいずれかに記載の実体であって、前記ヘッド部分は、哺乳動物患者への投与が承認された等級の、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのビーズである、実体。
【請求項６】
前記ヘッド部分が、ポリメチルメタクリレートのビーズである、請求項５に記載の実体。
【請求項７】
哺乳動物患者における障害の症状を緩和するための方法であって、該方法は、該患者に、有効量の請求項１に記載のホスホ−アミノ酸保有実体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記障害が、Ｔ細胞媒介障害、炎症性障害、内皮機能不全障害または不適合サイトカイン発現障害である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が、生体適合性液体中のホスホ−アミノ酸保有実体の懸濁液として、動脈内、静脈内、筋内または皮下で行われる、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物患者における障害の症状を緩和するための医薬の調製における、本明細書中に規定されるホスホ−アミノ酸保有実体の使用。
【請求項１１】
哺乳動物患者における障害の症状の緩和における、本明細書中に規定されるホスホ−アミノ酸保有実体の使用。
【請求項１２】
神経変性疾患を処置するための方法であって、該方法は、非毒性の、神経変性疾患の処置に有効な量の、本明細書中に規定されるホスホ−アミノ酸保有実体をヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
不適合サイトカイン発現により特徴付けられる免疫系障害を処置するための方法であって、非毒性の、不適合サイトカイン発現を処置するのに有効な量の、本明細書中に規定されるホスホ−アミノ酸保有実体をヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
内皮機能不全障害を処置するための方法であって、非毒性の、内皮機能不全障害を処置するのに有効な量の、本明細書中に規定されるホスホ−アミノ酸保有実体をヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物に投与するための生体適合性合成体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物であって、該生体適合性合成体は、請求項１〜６のいずれかに記載のホスホ−アミノ酸保有実体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生化学的活性をい有する、新規な化学実体およびその組成物、ならびに哺乳動物患者における種々の障害の処置および／または予防におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、天然のアポトーシス体を模倣し得る新規な合成実体、および患者の体内に導入された後に有益な効果を生じる細胞、ならびにそれらの調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
以下の書類は、本明細書において引用される：
【０００３】
【数１】
2005502725.tif 000002
【０００４】
【数２】
2005502725.tif 000003
【０００５】
上記の参考文献は全て、各個々の参考文献が具体的かつ個別にその全体を本明細書中に参考として援用すると示されるのと同じ程度まで、その全体は本明細書中で参考として援用される。
【０００６】
（技術水準）
体内における細胞死の２つの機構が認識される（壊死およびアポトーシス）。アポトーシスは、Ｋｅｒｒら（１９９２）により記載されるプログラムされた細胞死のプロセスであり、このアポトーシスにより、体内の種々の器官系および組織の定常状態レベルは、連続的な細胞分裂が細胞死によりバランスをとりながら維持される。アポトーシスを受けている細胞は、特徴的な形態学的変化（例えば、細胞容積の顕著な減少、顕著な膜泡状突起形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）を生じる細胞骨格の改変、クロマチンの濃縮、およびオリゴヌクレオソームフラグメントへのＤＮＡの分解）をしばしば示す。これらの形態学的変化に続いて、アポトーシス細胞は、アポトーシス体として知られる多数の小さなフラグメントに分解し得、これは、インタクトなオルガネラ、クロマチンなどを含む膜結合体から本質的に成る。アポトーシス細胞およびアポトーシス体は、通常、溶解され得、そしてそれらの潜在的なプロ炎症性の細胞内内容物を放出し得る前に、主にマクロファージおよび樹状細胞により食作用により身体から迅速に除去される。
【０００７】
アポトーシス細胞および／またはアポトーシス体を摂取したマクロファージは、プロ炎症性サイトカイン産生を阻害するようであり（Ｆａｄｏｋら、１９９８）、従って、その食作用の際に、アポトーシス細胞またはアポトーシス体の注射後、または加速されたアポトーシスに敏感な細胞の注射後の患者の免疫系におけるＴｈ−１応答をダウンレギュレートし得る。
【０００８】
アポトーシスの間、ホスファチジルセリンは、細胞膜上で外部に曝されるようになり（Ｆａｄｏｋ  Ｖ．Ａ．ら（１９９２））、そしてこの露出されたホスファチジルセリンは、特定のレセプターに結合して哺乳動物におけるアポトーシス細胞の摂取およびクリアランスを媒介する（Ｆａｄｏｋ  Ｖ．Ａ．ら（２０００））。ホスファチジルセリンの細胞表面発現は、アポトーシス細胞の同定の認識された方法である。
【０００９】
Ｍｏｎａｓｔｒａら（１９９３）は、非常に高い用量（３０ｍｇ／ｋｇ）での、ウシ皮質（ＢＣ−ＰＳ）由来のリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）の投与が、ＳＪＬ／Ｊマウスにおける養子移入された（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して効果を有し得ることを記載する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、合成化学実体を提供し、この実体は、哺乳動物患者への投与の際に、アポトーシス細胞および／またはアポトーシス体を模倣し、結果としてプロ炎症性サイトカインのダウンレギュレーションおよび／または抗炎症性サイトカインのアップレギュレーションを生じる。この化学実体は、哺乳動物アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来のアポトーシス体のサイズに類似したサイズのビーズのような生体適合性誘導体化体を含み、このビーズは、表面上に露出されたホスホ−アミノ酸基を有し、これは、患者の体内の抗原提示細胞上のＰＳまたは他の適切なレセプターと相互作用する。これらの基は、誘導体化体と適切に間隔を空けられており、その結果この抗原提示細胞は、天然のアポトーシス細胞またはアポトーシス体の取り込みに似たインビボプロセスでホスホ−アミノ酸基がレセプターと相互作用するにつれてこれらの誘導体化体を包み込み得、結果として、プロ炎症性サイトカインのダウンレギュレーションおよび／または抗炎症性サイトカインのアップレギュレーションを生じる。結果として、この化学実体は、治療目的のため、プロ炎症性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインが関与する広範囲の哺乳動物の障害の処置および／または予防のために使用され得る。
【００１１】
従って、本発明の第１の局面によれば、以下を含む生体適合性実体が提供される：
その最大寸法が５０ｎｍ〜５００ミクロンの３次元ヘッド部分；
上記ヘッド部分の各々に結合した複数のテール部分であって、上記テール部分は、以下：
抗原提示細胞上のレセプターと相互作用し得るホスホ−アミノ酸末端基、および
少なくとも３つの直鎖状炭素原子の化学的スペーサー基
を有し、このスペーサー基は、それらの近位末端にてそれぞれのヘッド部分へ、およびそれらの遠位末端にてホスホ−アミノ基のホスホネートへ結合される。
【００１２】
（発明および好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明に従って、患者の免疫系の細胞により取り込まれて、有利な効果（例えば、インビボでのプロ炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの阻害および／またはインビボでの抗炎症性サイトカインの促進）が伴うという点で、アポトーシス性細胞および／またはアポトーシス性物体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｂｏｄｙ）を模倣する特性を有する合成実体が提供され、患者に投与される。これらの合成実体は、３次元物体であり、この３次元物体は、哺乳動物細胞に似た形状および寸法から、哺乳動物細胞のアポトーシスにより生成されるアポトーシス性物体に似せた形状および寸法までに及ぶ、形状および寸法を有し、ホスホ−アミノ酸（例えば、適切な長さの中間化学鎖（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｉｎ）を通じて表面に付着されたホスホセリン基）を有し、レセプター（例えば、哺乳動物身体の抗原提示細胞上のＰＳレセプター）と相互作用する能力を有する。このような物体は、本明細書中以降、「ホスホ−アミノ酸保有ビーズ」といわれる。
【００１３】
上記のように、細胞膜上で露出されているＰＳは、マクロファージによるアポトーシス性リンパ球のクリアランスにおいて重要な役割を果たすことが公知である。ＰＳのレセプターは、マクロファージ上に存在する。「ホスファチジルセリンレセプター」または「ＰＳレセプター」とは、マクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するレセプターであり、その活性は、モノマーまたはオリゴマーのいずれかの可溶性ホスファチジルセリンによりブロックされる。ＰＳレセプターがまた、他のＡＰＣ（例えば、樹状細胞およびＢ細胞）上に存在し得ることもまた意図される。
【００１４】
本発明に従って、ホスホ−アミノ酸保有ビーズは、患者への投与後に、適切な手段によって、おそらく、飲み込みによって、あるいはマクロファージもしくは樹状細胞または他の抗原提示細胞との他の相互作用によって、患者の免疫系と相互作用して、アポトーシス性細胞／物体が、マクロファージによりファゴサイトーシス（食作用）を受ける場合に得られる応答と、サイトカイン応答の点で実質的に類似の効果が与えられる。ホスホ−アミノ酸基（それらの化学鎖が、ビーズに付着する）は、ファゴサイトーシスを模倣するプロセスにおいて、アポトーシス性細胞におけるホスファチジルセリンの役割を果たし、ビーズは、アポトーシス細胞物体の役割を果たす。
【００１５】
好ましくは、本発明の実体の末端基を形成するホスホ−アミノ酸は、以下の一般式を有する：
【００１６】
【化３】
2005502725.tif 000004
【００１７】
ここでＲは、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分枝鎖のアルキレン、アルキレン−オキシ、アルキレン−チオ、アルキレン−アミン、フェニル、ヨード置換フェニル、および５員環Ｎ−複素環式基を示し、ただし、抗原提示細胞上の適切なレセプターと相互作用する。
【００１８】
あるいは、本発明の実体の末端基を形成するホスホ−アミノ酸は、ホスホセリン実体のカルボキシル基またはアミノ基を介してスペーサー基に付着し得ることが意図される。１つの実施形態において、そのカルボキシル基またはアミノ基は、アミド基またはカルバメート基を介してスペーサー基に連結され得る。カルボキシル基の場合、連結は、代わりにエステル基であり得、アミノ基の場合、連結は、代わりに尿素基であり得る。
【００１９】
本発明の組成物において好ましいホスホ−アミノ酸基は、ホスホ−セリンおよびホスホスレオニン基であり、最も好ましくは、以下の式のホスホセリンである：
【００２０】
【化４】
2005502725.tif 000005
【００２１】
好ましくは、ホスホ−アミノ酸基がビーズのヘッド部分に連結される化学スペーサー基は、適切には、３〜２０個の直鎖状炭素原子、ならびに酸素、硫黄および＞ＮＲ（ここでＲは、水素、１〜１０個の炭素原子のアルキルおよびフェニルから選択される）から選択される０〜５個のヘテロ原子の長さである（すなわち、それらは、化学スペーサー基の直鎖上の分枝鎖または側鎖いずれの存在にも拘わらず、ホスホ−アミノ酸末端基のヘッド部分とホスホ基との間に直鎖状に配置される３〜２０個の炭素原子および０〜５個のヘテロ原子を含む）。代表的には、その化学スペーサー基は、直鎖状エステル基である。
【００２２】
特に好ましい実施形態において、誘導体化ビーズのテール部分は、以下の化学式を有する：
【００２３】
【化５】
2005502725.tif 000006
【００２４】
アミド末端基は、ヘッド部分表面に結合される。この例において、そのスペーサーは、直鎖状の１０個の炭素原子および２個のヘテロ原子を有する基
−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）６−ＮＨＣ（Ｏ）−
を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語、ビーズ（Ａｂｅａｄｓ＠）は、実質的に任意の生体適合性物体を意味することが意図され、これは、固体、半固体または中空の形態を維持しており、代表的ではあるが、回転楕円（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ）、円筒状、楕円状（楕円かつ長球の回転楕円状、Ｓ字状、腎臓形などを含む）だけではなく、直径が約５０ｎｍ〜約５００ミクロンである。それらは、可撓性でも剛性でもよく、血液のような水溶液中で可溶性でも不溶性でもよい。それらの組成物のために好ましい材料は、哺乳動物患者への投与のために認可された等級の、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどである。
【００２６】
上記に規定のテール部分をビーズにカップリングするための手順は、当業者に周知であり、以下の実施例に適切な例示が提供される。
【００２７】
本発明のホスホ−アミノ酸保有合成実体は、患者の免疫系の活性成分と作動可能に接触させる任意の適切な手段によって、患者に投与され得る。好ましくは、その実体は、生体適合性の液体（例えば、生理食塩水）中の液体懸濁物へと構成され、患者へと動脈内、静脈内、または最も好ましくは、筋肉内もしくは皮下に投与される。
【００２８】
合成実体を患者に投与する好ましい様式は、注射の過程として、１週間から数ヶ月に及ぶ期間にわたって、患者に１日１回、１週間に数回、１週間に１回、または１ヶ月に１回投与される。投与の過程の頻度および持続期間は、患者によって、処置される状態、その重篤度、および処置が予防的、治療的、または治療的として意図されるか否かに従って、広く変化するようである。その設計および最適化は、主治医の技術範囲内である。
【００２９】
投与される合成実体の量は、処置が意図される哺乳動物の障害の性質、患者の正体および特徴に依存して極めて広く変化する。実体の有効量が、患者に対して非毒性であり、免疫系を壊滅させるほどではないことが重要である。実体の液体懸濁物の動脈内投与、皮下投与または筋肉内投与が使用される場合、各用量について、等量の全血において通常見いだされる細胞数の１．０％〜１０００％にほぼ等しいＰＳ保有物体の量、またはその細胞から生じ得るアポトーシス性物体の数を含む、約０．１〜５０ｍｌの液体を投与することが好ましい。一般に、ヒト患者への１回の送達あたりに投与される合成実体の数は、適切には、約５００〜約２０，０００，０００の範囲である。
【００３０】
合成実体は、本発明のプロセスにおいて、免疫系改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）として、ワクチンの性質において作用するので、各投与について注射部位に投与されるこのような物体の数は、患者体重の単位あたりの合成実体の数または重量ではなくより意味のある量である。同じ理由で、小動物用途についての有効量の合成実体の数は、重量比ベースで大動物についての有効量へ直接的に変換されなくてもよい。従って、その量は、１回の注射あたり、５００〜２×１０９の範囲内、および好ましくは、１０，０００〜２×１０９の範囲内の合成実体であり得る。
【００３１】
本発明の範囲は、いかなるその特定の操作様式の理論によっても制限されるべきであるとは意図されないが、前述は、本発明が実施され得る手段として、よりよく理解するために試験的例示として提供される。患者の免疫系の抗原提示細胞、特に専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）（マクロファージおよび樹状細胞を含む）は、それらがアポトーシス性細胞およびアポトーシス性物体を取り込む方法と類似の様式にて、ホスファト（ｐｈｏｓｐｈａｔｏ）−アミノ酸保有合成実体を取り込むと仮定される。実体を取り込むと、そのＡＰＣは、炎症性応答を誘導して、Ｔｈ２細胞および／または他の調節性／抗炎症性細胞の集団（例えば、Ｔｒ１細胞）の割合での増大、ならびにＴｈ１細胞の減少とともに、Ｔｈ細胞集団における変化を促進する。Ｔｈ２細胞および他の調節細胞は、抗炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１０を分泌して、炎症の減少をもたらす。
【００３２】
本発明は、Ｔ細胞機能、炎症、内皮細胞機能不全、および不適切なサイトカイン発現が関与する、広範な種々の哺乳動物の障害の予防および／または処置における使用が示される。そのような障害を有するかまたはそのような障害を有すると疑われる患者、特にそのような障害に罹患しやすい患者は、処置のために選択され得る。処置とは、症状の軽減（例えば、特定の障害の症状の重篤度または数の減少が挙げられるが、これらに限定されない）を意味する。
【００３３】
Ｔ細胞機能（Ｔ細胞媒介性）障害に関して、これらは、自己免疫障害であり得、この自己免疫障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：糖尿病、強皮症、感染および慢性関節リウマチ。本発明は、炎症性反応を生じる、炎症性アレルギー反応、器官および細胞移植反応障害、ならびに微生物感染とともに使用するために示される。本発明はまた、有害な炎症を生じる、酸化的ストレスおよび／または虚血−再灌流障害、毒素の摂取、毒性化合物への曝露、放射線損傷、ならびに風媒および水媒介性の刺激物質などへの曝露に対する予防における使用について示される。本発明はまた、内部器官（例えば、腎臓、肝臓、心臓など）の炎症性、アレルギー性およびＴ細胞媒介性の障害について示される。
【００３４】
本発明が示される不適切なサイトカイン発現に関連する障害に関して、これらの障害としては、神経変性疾患、神経変性（ダウン症候群、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む）が挙げられ、特定のサイトカイン（インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＷＳＴら（１９８９）、およびＭｏｇｉ  Ｍ．ら（１９９６）を参照のこと）を含む）の増大したレベルと関連する。ＩＬ−１βが、長期間の海馬の相乗作用を阻害することもまた、示された（Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ａ．ら（１９９８））。長期間の海馬における相乗効果は、シナプス形成性の形態であり、一般に、記憶および学習の適切なモデルであると考えられている（Ｂｌｉｓｓ，Ｔ．Ｖ．Ｐら（１９９３））。従って、脳における不適切なサイトカイン発現は、現在では、神経変性疾患の発生および進行に関与していると考えられる。
【００３５】
従って、本発明は、広範な種々の哺乳動物の神経変性障害および他の神経学的障害（ダウン症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、老年痴呆、鬱病、多発性硬化症、ハンティングトン病、末梢神経障害、脊髄疾患、神経障害性関節症（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｊｏｉｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、慢性炎症性脱髄疾患、神経障害（単神経障害、多発性神経障害、対側性末端感覚神経障害、神経筋接合部障害、筋無力症、および筋萎縮性側索硬化症を含む）を含む）の処置および予防のために示される。
【００３６】
内皮細胞機能不全に関連する障害について、本発明は、広範な種々のこのような哺乳動物の障害の処置および予防について示され、これらの障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：心臓血管疾患（例えば、アテローム硬化症、末梢血管疾患、うっ血性心不全、心臓発作、心筋梗塞、高血圧症など）、血管痙攣性障害（例えば、レーノー病、心臓症候群Ｘ（ｃａｒｄｉａｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）、片頭痛など）、および虚血から生じる損傷（虚血性傷害または虚血−再灌流傷害）。まとめると、これは、不適切に機能する内皮細胞から生じる実質的に任意の傷害であり得る。
【００３７】
本発明のホスホ−アミノ酸保有ビーズを調製するプロセスは、出発物質の性質（すなわち、ビーズおよびその化学的組成）に大きく依存する。好ましいポリメチルメタクリレートビーズの場合、これらは、一般に、表面反応基（例えば、所望のホスホ−アミノ酸保有側鎖についての化学的な付着の適切な部位を提供するカルボン酸基）を有する。第１の合成工程において、アミン末端直鎖アルカノール（例えば、８−アミノ−オクタン−１−オール、７−アミノ−ヘプタン−１−オールまたは６−アミノ−ヘキサン−１−オール）は、そのアミノ末端が化学的に保護され、次いで、そのフリーのヒドロキシ末端にて、適切なホスホ化合物（例えば、ＰＯＣｌ３）と反応されて、ホスホ末端化合物を形成し、その後、アミノ酸と反応して、所望のホスホ−アミノ酸基（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を形成し得る。次いで、そのアミン保護剤は、化学的に除去され、その化合物は、ポリメチルメタクリレートビーズ上のカルボン酸基と反応して、アミド連結を形成する。アミン基の脱保護およびポリメチルメタクリレートビーズとの反応は、本発明のホスファチド−アミノ酸保有ビーズの形成をもたらす。
【００３８】
本発明に従ってホスファト−アミノ酸保有ビーズを作製する際に使用するための適切なホスフェート化合物の例は、当業者に明らかである。
【００３９】
セリンは、患者に投与した後、マクロファージおよび他のファゴサイトーシスを生じる細胞のホスファチジルセリンレセプターと最も相互作用し得る末端ホスホ−アミノ酸基を提供するために、ホスホ−アミノ酸保有ビーズにおいて使用するための好ましいアミノ酸である。同じまたは実質的に同じ機能を果たす他のアミノ酸もまた、使用され得る。
【００４０】
本発明は、以下の特定の実施例において、例示目的で記載される。
【実施例１】
【００４１】
ホスホアミノ酸側鎖基の調製の化学手順を、添付の図１において図示する。ビーズに対する側鎖の化学結合手順を、添付の図２において図示する。
【００４２】
（１．６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１−ヘキサノール２の調製）
２５０ｍＬの３首の丸底フラスコに、磁性撹拌バー、１００ｍＬ添加漏斗、温度計を取り付け、そして氷浴中に配置した。このフラスコに、６−アミノ−１−ヘキサノール（５．０ｇ、８５．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＤＭＦ（２５ｍｌ）および水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍＬの水中２．１ｇのＮａＯＨ）をチャージした。０℃まで冷却した後、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（１１．２ｇ、１０２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、１４Ｂでの内部温度を１５℃に保ちながら、この溶液に滴下した。この反応混合物に、水（２００ｍＬ）およびジクロロメタン（２００ｍＬ）を添加した。層分離させ、そして水層をジクロロメタン（４×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（４×７５ｍＬ）で洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥させた。次いで、溶媒を減圧下で除去して、７．１ｇの生成物２（図１）を白色固体（ＫＤ−７−４５、収率：７６．３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ４．５４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ）；３．６７（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２Ｏ）；３．１５（ｓ，ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２Ｎ）；１．４９（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；１．３０  Ｂ  １．６５（ｍ，８Ｈ，４ＣＨ２）。
【００４３】
（２．Ｏ−｛６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１−ヘキシル］ホスホリル｝−Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−Ｌ−セリン５の調製）
５００ｍＬの３首丸底フラスコに、磁性撹拌バー、アルゴン入口、２５０ｍＬ添加漏斗を取り付け、そして氷浴中に配置した。このフラスコにオキシ塩化リン（８６ｍＬ、９２０ｍｍｏｌ、１００当量）および無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）をチャージした。０℃まで冷却した後、６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１−ヘキサノール２（２．０ｇ、９．２ｍｍｏｌ、１．０当量）、トリエチルアミン（１．４ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ、１．０当量）および無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）の溶液を３０分間かけて添加した。この混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで室温で１時間撹拌した。この反応混合物を２５０ｍＬの１首丸底フラスコに移し、そして高減圧下で３０℃にてエバポレートして、ＴＨＦおよび過剰のオキシ塩化リンを除去した。３０℃にて高減圧下でトルエン（２×１００ｍＬ）とともに同時エバポレートした後、残渣を、次の工程において直接用いた。
【００４４】
この最後の工程からの残渣を含む２５０ｍＬの１首丸底フラスコを無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）で処理し、そして磁性撹拌バーおよび隔壁シールを取り付けた。０℃まで冷却した後、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＬ−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（１．５１ｇ、４．６ｍｍｏｌ、０．５当量）の溶液および無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のトリエチルアミン（１．３ｍＬ，９．２ｍｍｏｌ、１．０当量）の別の溶液を、シリンジを通して同時に滴下した。添加後、この混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、減圧下で乾固するまで濃縮した。この残渣に、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）およびｔ−ブタノールと酢酸エチルとの混合物（１：３、１００ｍＬ）を添加した。水層を、ｔ−ブタノールおよび酢酸エチル（１：３）（４×５０ｍＬ）で抽出した。この有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧して濃縮した後、５．０ｇの粗製生成物が得られた。ＴＬＣは、少なくとも５つの生成物を示した。ＴＬＣ（シリカゲル、ＩＰＡ／ＣＨ２Ｃｌ２／ＨＯＡｃの１：５：１滴）。これらを、分取ＴＬＣによって、同じＴＬＣ溶媒系を用いて分離した。ＮＭＲおよびＭＳは、画分のうちの１つが、標的化合物５であることを示した（ＫＤ−７−５９−２、Ｒｆ−生成物＝０．２９、Ｒｆ−Ｆｍｏｃ−ｓｅｒ＝０．１７、シリカゲル、溶離液：ＩＰＡ／ＣＨ２Ｃ；２／ＨＯＡｃの１：５：１滴；収率：０．３ｇ、５．４％）。
【００４５】
（３．Ｏ−［（６−アミノ−１−ヘキシル）ホスホリル］−Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−Ｌ−セリン６の調製）
１００ｍＬの１首丸底フラスコに、磁性撹拌バー、隔壁シール、アルゴン入口を取り付け、そして氷浴中に配置した。このフラスコに、０．２０ｇのＯ−｛６−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−１−ヘキシル］ホスホリル｝−Ｎ−フルオレニルメトキシ−カルボニルアミノ−Ｌ−セリン５（図１）をチャージし、そして０℃まで冷却した。ＣＨ２Ｃｌ２（５．５ｍＬ）中のトリフルオロ酢酸（１．４ｍＬ）の溶液を少しずつ添加した。この混合物を室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣは、この反応が不完全であることを示した（シリカゲル、ＩＰＡ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ  １０：２：１）。この混合物に、さらに１．４ｍＬのＴＦＡを添加した。４０分間撹拌した後、ＴＬＣは、この反応が完了したことを示した。この反応混合物を乾固するまで濃縮し、そして酢酸エチル（３×１０ｍＬ）と同時エバポレートした。高減圧下で乾燥することによって、１３３ｍｇ（ＧＭ−９−２５−２）の生成物６（図１）が得られ、これを、次の工程において直接用いた。
【実施例２】
【００４６】
（Ｐｏｌｙｂｅａｄ７を用いたＯ−［（６−アミノ−１−ヘキシル）ホスホリル］−Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−Ｌ−セリン６の結合反応）
ビーズに対する側鎖の化学結合手順を、添付の図２に図示する。
【００４７】
（試薬および条件）
Ｐｏｌｙｂｅａｄ７、ポリ（メチルメタクリレート）、すなわちＰＭＭＡ（５．１５％固体−ラテックス）を、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，４００  Ｖａｌｌｅｔ  Ｒｏａｂ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐａ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．１８９７６から、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３５７０で得た。この懸濁物は、ＰＭＭＡおよび水、１グラムのポリマーあたり１００〜２００μｍｏｌのカルボキシを含む。１グラムあたり１．８×１０１３個の粒子、ｄ＝１．１９ｇ／ｍｌ、１１．０ｍＬ、１１．６４ｇ、１１．６４（ｇ）×５．１５％×２００＝１２０μｍｏｌのカルボキシ、１．０当量の活性化緩衝液（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０〜７．５）、一塩基性リン酸ナトリウム（０．２２ｇ／ｌ、ＭＷ１２０．０）（１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを７．０１に調整した）；カップリング緩衝液（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．６）、一塩基性リン酸ナトリウム（０．２２ｇ／ｌ，ＭＷ１２０．０）（１Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを８．８０に調整した）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、無水、Ｍ．Ｗ．１９１．７、ｍｐ１１７℃、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｃａｔ＃  ０００５０、ｌｏｔ＃  Ｙ２３８Ｔ。
【００４８】
本発明者らの合成による、ＮＨ２（ＣＨ２）６ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｌ−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）またはＮＨ２Ｃ６Ｈ１２Ｏ−Ｐ−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨまたはＮＨ２−ＨＰＳ−ＯＨ（０．１１０ｇ、２１７μｍｏｌ、Ｃ２４Ｈ３１Ｎ２Ｏ８Ｐ、Ｍｏｌ．Ｗｔ．：５０６．４９、１．８当量）。遠心分離をする間は常に、遠心管は強固にキャップしたままにする。
【００４９】
（水中のＮＨ２（ＣＨ２）６ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｌ−Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ）を用いたＰＭＭＡのカップリング）
３本の遠心管（ＭＩＬＩＰＯＲＥ，遠心分離フィルターを備えたＣＥＮＴＲＩＣＯＮ  ＰＬＵＳ−２０）の自重を計量し、そしてＰＭＭＡ懸濁物をこれらの遠心管に移した：＃１（２．９１ｇ）、＃２（２．９１ｇ）および＃３（５．８２ｇ）。合計：１１．０ｍＬ、１１．６４ｇ、１１．６４（ｇ）×５．１５％×２００＝１２０μｍｏｌ、１．０当量。これらを１２７００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して、上清を分離した。
【００５０】
活性化緩衝液を、これらの遠心管に添加した：＃１（２．５ｍＬ）、＃２（２．５ｍＬ）および＃３（５．０ｍＬ）。これらの管をボルテックスにかけて再度分散させた。１２７００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した後、澄んだ上清を分離した。上清を取り出し、分離した。この工程を１回繰り返した。
【００５１】
活性化緩衝液を、これらの遠心管に添加した：＃１（２．５ｍＬ）、＃２（２．５ｍＬ）および＃３（５．０ｍＬ）。これらの管をボルテックスにかけて、再度分散させた。活性化緩衝液（１４．０ｍＬ）中のＥＤＣ（２．３ｇ、ＦＷ．１９１．７、１２０００μｍｏｌ、１００当量）溶液を、これらの遠心管に移した：＃１（３．５ｍＬ）、＃２（３．５ｍＬ）および＃３（７．０ｍＬ）。これらの管を、室温にて９０分間振盪し、そして１２７００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して上清を分離した。
【００５２】
これらの管に、活性化緩衝液を添加した：＃１（３．５ｍＬ）、＃２（３．５ｍＬ）および＃３（７．０ｍＬ）。これらの管をボルテックスにかけて、再分散させた。これらの管を１２７００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して、上清を分離した。この工程を２回繰り返した。
【００５３】
ＮＨ２−ＨＰＳ−ＯＨ（０．１１０ｇ、２１７μｍｏｌ、Ｃ２４Ｈ３１Ｎ２Ｏ８Ｐ、Ｍｏｌ．Ｗｔ．：５０６．４９、１．８当量）を、８．０ｍＬのカップリング緩衝液および３．０ｍＬのＤＭＦ中に溶解し、０．５Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを８．７５に調整して、１４．０ｍＬの溶液を得た。これらの管に、この溶液を添加した：＃１（３．５ｍＬ）、＃２（３．５ｍＬ）および＃３（７．０ｍＬ）。これらの管をボルテックスにかけて、再度分散させた。これらの管における混合物を、振盪しながら室温にて６１．５時間（１９：００、０９／０１／０１  Ｂ  ８：３０、０１／０４／０１）反応させた。
【００５４】
反応混合物を、１２７００ｒｐｍにて１５分間遠心分離して、上清を分離した。固体を遠心フィルターから収集して、粗製生成物Ａを得た。上清を収集し、そして４０℃にて高減圧下で乾固するまで濃縮して、粗製生成物Ｂを得た。固体Ａおよび固体Ｂを合わせ、そしてフィルターなしの２０ｍＬの遠心管に移した。
【００５５】
ＨＰＬＣ等級の水（８．０ｍＬ）を添加した。試験管をボルテックスして、再分散させた。この反応混合物を、１２７００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、この懸濁液を分離した。この工程を３回繰り返した。固体（０．５５ｇ）を二等分し、そして２つの遠心管に入れた。
【００５６】
（水性ピペリジン溶液での脱保護）
一方の遠心管に、ジエチルエーテル（６．０ｍＬ）中のピペリジン（４．０ｍＬ）の溶液を添加した。この混合物を、５分おきに１分間ボルテックスしながら２０分間振盪した。不溶性のゴム状ガムの大きい塊が形成されるのが見出された。別の遠心管に、水中のピペリジンの溶液（２．０ｍＬのピペリジンおよび３．０ｍＬの水）を添加した。この混合物を、５分おきに１分間ボルテックスしながら３０分間振盪した。この反応混合物を、１２７００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、そして透明な上清を分離した。
【００５７】
ＨＰＬＣ等級の水（６．０ｍＬ）を添加し、そしてこの混合物をボルテックスして、再分散させた。この反応混合物を、１２７００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を分離した。この工程を、２回繰り返した。
【００５８】
残渣の固体（０．１５ｇ、湿潤）に、１０．０ｍＬのＨＰＬＣ等級の水を添加し、０．２ミクロンのシリンジフィルタで濾過した。この懸濁液を、２０分間ボルテックスし、そして１時間超音波処理して、最終懸濁液（ＧＭ−９−２９）を得た。
【００５９】
この生成物を、Ｋａｉｓｅｒ試験によって、アミンについて試験した。［エタノール中のニンヒドリン溶液を２滴、エタノール中のフェノール溶液を２滴、（２ｍＬの０．００１Ｍ水性ＫＣＮ溶液＋９８ｍＬのピリジン）を２滴、オーブン中１２０℃で５分間加熱。］結果：暗青色、陽性。
【００６０】
最終生成物名：Ｏ−（６−Ｐｏｌｙｂｅａｄ７アミノヘキシルホスホリル−Ｌ−セリンまたはＰｏｌｙｂｅａｄ７−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）６ＯＰ（ＯＨ）（Ｌ−Ｓｅｒ−ＯＨ）。
【００６１】
規格：１０．０ｍＬの懸濁液中約０．１５ｇの結合したＰｏｌｙｂｅａｄ７（１．５ｗ／ｗ％）；１ｍＬの懸濁液あたり約２．７×１０１１個のビーズ；ビーズサイズ８０〜９０ナノメートル。
【００６２】
（最終生成物の負荷試験）
２本の小さい試験管ＡおよびＢにラベルを貼った。試験管Ａに、０．５ｍＬの最終懸濁液（ＧＭ−９−２９）を添加した。溶媒を、ドライアイス／ｉ−ＰＡで凍結させ、そして凍結乾燥させることにより除去して、４．０ｍｇの乾燥ビーズを得た。試験管Ｂは、ブランクであった。
【００６３】
両方の試験管に、５０μＬのフェノール溶液（１０ｍＬの無水ＥｔＯＨ中４０ｇ）、５０μｌのＫＣＮ溶液（１００ｍＬのピリジン中１．３ｍｇ）、２５μＬのニンヒドリン溶液（５０ｍＬの無水ＥｔＯＨ中２．５ｇ）を添加した。両方の試験管を、１００℃で１０分間加熱した。
【００６４】
両方のサンプルＡおよびＢを、２．０ｍＬの６０％エタノールで希釈し、そしてガラスウールの詰まった栓を含むパスツールピペットに移した。サンプルＡの残渣を、０．５ｍＬの０．５Ｍ  Ｂｕ４ＮＨＳＯ４溶液（１．０ｍＬの水中１７０ｍｇ）で２回リンスした。両方の溶液を、６０％エタノールで２５．０ｍＬにした。
【００６５】
溶液Ａの吸光度を、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（ＨＰ８４５２Ａ）を使用して、ブランク溶液Ｂに対して５７０ｎｍで測定した。サンプルの吸光度：０．３４８（１．０ｃｍ光路）。
【００６６】
負荷の計算（Ａｌ−３−２７）：
μｍｏｌ／ｇ＝（Ａ５７０＄Ｖｍｌ／ｅ５７０＄Ｗｍｇ）＄１０６
＝（０．３４８×２５／１．５×１０４×４．０）×１０６
＝１４５μｍｏｌ／ｇ。
【実施例３】
【００６７】
（有用性）
この実施例は、マウス接触過敏症（ＣＨＳ）モデルにおいて、本発明のホスホ−アミノ酸保有ビーズの注射の、耳腫脹に対する効果を示す。
【００６８】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢、体重２２〜２５ｇ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
【００６９】
ホスホ−アミノ酸保有ビーズを、実施例１および２に記載されるように調製した。これらは、１４５μｍｏｌ／ｇのホスホセリン濃度、８０〜９０ナノメートルのビーズサイズを有した。
【００７０】
１４匹のマウスを、群Ａ（コントロール）に割り当て、そして注射をしなかった。１２匹のマウスを、群Ｂ（コントロール）に割り当て、そしてプレーンのポリメチルメタクリレートビーズ（８０〜９０ナノメートルサイズ、側鎖誘導体化を含まない）の懸濁液を注射した。別の１２匹のマウスを、群Ｃに割当て、そしてホスホセリン保有ビーズを注射した。群ＢおよびＣの両方に、同容量の注射をし、そして１回の注射あたりのビーズの数は同じであった。
【００７１】
実験を、７日間行った。感作を、１日目に起こした。感作の目的で、群ＢおよびＣのマウスに、１日目についてビーズを注射し、そして５ｍｇ／ｍｌのペントバルビタールナトリウムの０．２ｍｌの腹腔内（ＩＰ）注射を使用して麻酔した。マウスの腹部の皮膚に、７０％ＥＴＯＨをスプレーした。ブレードを使用して、腹部から１インチ直径の毛を除去した。この剥き出しの領域に、４：１のアセトン：オリーブ油中０．５％の２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）２５μｌを、ピペットチップを使用して塗布した。群Ａのコントロールマウスを、同日に同様に感作した。
【００７２】
１日目〜６日日目の毎日、実験マウスに、ホスホ−アミノ酸保有ビーズを注射した。ビーズは、生理食塩水中に懸濁しており、そして６００，０００個のビーズを含む５０μｌ容量で、筋肉内（ＩＭ）注射を介して注射された。６日目に、その日のビーズ注射後に、マウスを、以下のように、ＤＮＦＢで抗原投与した：１０μｌの０．２％ＤＮＦＢを、ピペットチップで、右耳の背側の表面に塗布し、そして１０μｌのビヒクルを、ピペットチップで、左耳に塗布した。
【００７３】
７日目に、抗原投与の２４時間後に、Ｐｅａｃｏｃｋばね負荷マイクロメータを使用して耳の厚さを測定し、これらの動物を、ハロタンで局所麻酔した。耳の腫脹の増加をＣＨＳ応答の尺度として使用する。データを、処置された右耳の厚さから、ビヒクル処置された左耳の厚さを減算した差として、ミクロンで表す。２つの実験群の間の差の有意性を、両側スチューデントのｔ検定によって決定する。０．０５未満のｐ値を、有意とみなす。
【００７４】
結果は、以下の通りであった：
【００７５】
【表１】
2005502725.tif 000007
【００７６】
これらの結果をまた、図３に、ミクロンでの耳の腫脹の測定値としてグラフで示す。実験群Ｃは、注射を受けていないコントロール群Ａ、およびプレーンの、誘導体化されていないビーズの注射を受けた実験群Ｂより優れた、統計学的に有意な改善を示す。
【００７７】
上記で先に引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明の好ましいホスホ−アミノ酸側鎖の調製の合成プロセスを示す反応スキームである；
【図２】図２は、側鎖をＰＭＭＡビーズにカップリングする合成プロセスを示す類似の反応スキームである（実施例２）。
【図３】図３は、以下の具体的な実施例３において得られた実験結果（コントロールと比較した、本発明の実体で処置した動物における接触過敏症のマウスモデルにおける耳の腫脹の測定値）のグラフである。
【図１】
2005502725.tif 000010
【図２】
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【図３】
2005502725.tif 000012
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2005502725.tif 000045