(57)【要約】本発明は、メラノーマ分化関連遺伝子であるｍｄａ−７（インターロイキン−２４、「ＩＬ−２４」としても知られる）が悪性細胞に及ぼすアポトーシス作用が、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路、及び成長停止及びＤＮＡ損傷（ＧＡＤＤ）遺伝子ファミリーのメンバーを介して起こるが、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは実質的に独立しているという発見に関連する。従って、本発明は、被検薬剤が、好ましくはＪＡＫ／ＳＴＡＴとは実質的に独立して、ｍｄａ−７アポトーシス経路の成分の発現を増大又は低減する能力を測定するアッセイ方法を用いて、アポトーシス調節剤を同定する方法を提供する。かかる薬剤は、小分子であるか、又は天然ＭＤＡ−７の断片、変異体及び／若しくは誘導体でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス調節剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルに変化があるか否かを決定するステップ；
を含み、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの変化は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項２】
ＢＣＬ−２の発現レベルに変化があるか否かを決定するステップをさらに含み、ＢＣＬ−２の発現レベルの変化は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることをさらに示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化レベルの変化が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているか否かを決定するステップをさらに含み、この変化がＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているという決定は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることをさらに示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを調節するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被検薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項５】
被検薬剤が小分子である、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項６】
被検薬剤が核酸である、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項７】
被検薬剤がペプチドである、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項８】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
を含み、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項１０】
ＢＣＬ−２の発現レベルの低減があるか否かを決定するステップをさらに含み、ＢＣＬ−２の発現レベルの低減は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることをさらに示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化レベルの変化が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているか否かを決定するステップをさらに含み、この変化がＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているという決定は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることをさらに示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを誘導するか否かを決定するさらなるステップを含む、請求項９の結果を確認する方法。
【請求項１３】
被検薬剤が小分子である、請求項９、１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
被検薬剤が核酸である、請求項９、１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
被検薬剤がペプチドである、請求項９、１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項９、１０、１１又は１２に記載の方法。
【請求項１７】
アポトーシス阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの低減があるか否かを決定するステップ；
を含み、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの低減は、被検薬剤がアポトーシスの阻害因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項１８】
アポトーシス調節剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルに変化があるか否かを決定するステップ；
を含み、１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルに変化があれば、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項１９】
請求項１８の結果を確認する方法であって、被検細胞に、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する第２薬剤を投与することにより、第２薬剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの変化を阻害することができるか否かを決定するさらなるステップを含み、第２薬剤が被検薬剤の作用を阻害する能力は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示す、上記方法。
【請求項２０】
ＢＣＬ−２の発現レベルに変化があるか否かを決定するステップをさらに含み、ＢＣＬ−２の発現レベルの変化は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０の結果を確認する方法であって、被検細胞に、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する第２薬剤を投与することにより、第２薬剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質及びＢＣＬ−２の発現レベルの変化を阻止することができるか否かを決定するさらなるステップを含み、第２薬剤が被検薬剤の作用を阻止する能力は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示す、上記方法。
【請求項２２】
１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの変化がＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているか否かを決定するステップをさらに含み、この変化がＪＡＫ／ＳＴＡＴと独立していることは、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞におけるアポトーシスを調節するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項２４】
被検薬剤が小分子である、請求項１８、１９、２０、２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
被検薬剤が核酸である、請求項１８、１９、２０、２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
被検薬剤がペプチドである、請求項１８、１９、２０、２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２７】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項１８、１９、２０、２１、２２又は２３に記載の方法。
【請求項２８】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルに増大があるか否かを決定するステップ；
を含み、１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項２９】
請求項２８の結果を確認する方法であって、被検細胞に、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する第２薬剤を投与することにより、第２薬剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増加を阻害することができるか否かを決定するさらなるステップを含み、第２薬剤が被検薬剤の作用を阻害する能力は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示す、上記方法。
【請求項３０】
ＢＣＬ−２の発現レベルに低減があるか否かを決定するステップをさらに含み、ＢＣＬ−２の発現レベルの低減は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０の結果を確認する方法であって、被検細胞に、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害する第２薬剤を投与することにより、第２薬剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質及びＢＣＬ−２の発現レベルの増大を阻害することができるか否かを決定するさらなるステップを含み、第２薬剤が被検薬剤の作用を阻害する能力は、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示す、上記方法。
【請求項３２】
１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大がＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立しているか否かを決定するステップをさらに含み、この増大がＪＡＫ／ＳＴＡＴと独立していることは、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることをさらに示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞におけるアポトーシスを誘導するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項３４】
被検薬剤が小分子である、請求項２８、２９、３０、３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
被検薬剤が核酸である、請求項２８、２９、３０、３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３６】
被検薬剤がペプチドである、請求項２８、２９、３０、３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３７】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項２８、２９、３０、３１、３２又は３３に記載の方法。
【請求項３８】
アポトーシス阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルに低減があるか否かを決定するステップ；
を含み、１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの低減は、被検薬剤がアポトーシスの阻害因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項３９】
請求項３８の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを阻害するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項４０】
被検薬剤が小分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被検薬剤が核酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
被検薬剤がペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｂ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の作用に左右されるか否かを決定するステップ；
を含み、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは独立したｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化の増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項４５】
請求項４４の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを阻害するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項４６】
被検薬剤が小分子である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
被検薬剤が核酸である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
被検薬剤がペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｂ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γからなる群より選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結果がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の作用に左右されるか否かを決定するステップ；
を含み、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは独立した１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項５１】
ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化の阻害剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質の増大を阻害することができるか否かを決定するステップを含む、請求項５０の結果を確認する方法。
【請求項５２】
請求項５０の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを阻害するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項５３】
被検薬剤が小分子である、請求項５０、５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
被検薬剤が核酸である、請求項５０、５１又は５２に記載の方法。
【請求項５５】
被検薬剤がペプチドである、請求項５０、５１又は５２に記載の方法。
【請求項５６】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項５０、５１又は５２に記載の方法。
【請求項５７】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｂ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
（ｄ）ステップ（ｂ）及び（ｃ）の結果がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の作用に左右されるか否かを決定するステップ；
を含み、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは独立した、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化の増大、並びに１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項５８】
ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化の阻害剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質の増大を阻害することができるか否かを決定するステップを含む、請求項５７の結果を確認する方法。
【請求項５９】
請求項５７の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞においてアポトーシスを阻害するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項６０】
被検薬剤が小分子である、請求項５７、５８又は５９に記載の方法。
【請求項６１】
被検薬剤が核酸である、請求項５７、５８又は５９に記載の方法。
【請求項６２】
被検薬剤がペプチドである、請求項５７、５８又は５９に記載の方法。
【請求項６３】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項５７、５８又は５９に記載の方法。
【請求項６４】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｂ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
（ｃ）被検薬剤の投与に応答して、被検細胞において、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大があるか否かを決定するステップ；
を含み、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化の増大、並びに１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増大は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【請求項６５】
ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化の阻害剤が、被検薬剤によって引き起こされる１以上のＧＡＤＤタンパク質の増大を阻害することができるか否かを決定するステップを含む、請求項６４の結果を確認する方法。
【請求項６６】
請求項６４の結果を確認する方法であって、被検薬剤が被検細胞におけるアポトーシスを阻害するか否かを決定するさらなるステップを含み、該ステップは、被検細胞を被験薬剤に暴露するステップ、及びその後にアポトーシスが起こるか否かを決定するステップを含むものである、上記方法。
【請求項６７】
被検薬剤が小分子である、請求項６４、６５又は６６に記載の方法。
【請求項６８】
被検薬剤が核酸である、請求項６４、６５又は６６に記載の方法。
【請求項６９】
被検薬剤がペプチドである、請求項６４、６５又は６６に記載の方法。
【請求項７０】
被検薬剤がＭＤＡ−７変異体である、請求項６４、６５又は６６に記載の方法。
【請求項７１】
アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大に応答してアポトーシスを受ける細胞を同定するステップであって、該被検細胞は、被検細胞の実質的に均一な集団として増殖させることができるものである、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞においてＢＣＫ−２発現のレベルを低減する被検薬剤を被検細胞に投与するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前、これと同時又はその後に、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α又はＧＡＤＤ４５−γからなる群より選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現を阻害する第２薬剤を投与するステップ；
（ｄ）被検細胞におけるＢＣＬ−２の発現レベルに対する（ｂ）及び（ｃ）の作用を決定するステップ；
を含み、第２薬剤が、被検薬剤によるＢＣＬ−２発現の低減を阻害する能力は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
助成金支援
本出願の発明には、国立衛生研究所助成金ＣＡ３５６７５、ＣＡ８７１７０、ＣＡ８８９０６、ＣＡ９７３１８及びＤＫ５２８２５、国防総省助成金ＢＣ９８−０１４８、ＤＡＭＤ１７−９８−１−８０５３及びＤＡＭＤ−０２−１−００４１、国立癌協会からの米国公衆衛生局補助金Ｒ０１−ＣＡ４６４６５、並びに国立アレルギー及び感染症研究所からのＲＯ１−ＡＩ３６４５０、ＲＯ１−ＡＩ４３３６９及び２Ｔ３２ＡＩ０７４０３により少なくとも一部資金供給されていることから、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
１．導入
本発明は、メラノーマ分化関連遺伝子であるｍｄａ−７（インターロイキン−２４、「ＩＬ−２４」としても知られる）が悪性細胞に及ぼすアポトーシス作用が、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路、及び成長停止及びＤＮＡ損傷（ＧＡＤＤ）遺伝子ファミリーのメンバーを介して起こるが、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは実質的に独立しているという発見に関連する。従って、本発明は、被検薬剤が、好ましくはＪＡＫ／ＳＴＡＴとは実質的に独立して、ｍｄａ−７アポトーシス経路の成分の発現を増大又は低減する能力を測定するアッセイ方法を用いて、アポトーシス調節剤を同定する方法を提供する。かかる薬剤は、小分子であるか、又は天然ＭＤＡ−７の断片、変異体及び／若しくは誘導体でありうる。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
分化の異常は、組織学的に異なる多種の癌において特有かつ頻繁な事象である（Sachs, 1978, Nature 274, 535-539: Ficherら、1985, Pharmacol. Ther. 27, 143-166; Jiangら、1994, Mol. Cell. Different. 2, 221-239）。腫瘍細胞におけるこのような欠陥を利用することにより、新規で、潜在的な毒性の少ない治療形態である、「分化療法」が提示されている（Leszcynieckaら、2001, Pharmacol. Ther. 90, 105-156; Waxman, 1996, in Differentiation therapy（Ares-Serono Symposia Publishers, ローマ）、pp. 1-531）。線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）とプロテインキナーゼＣアクチベーターのメゼレイン（ＭＥＺ）の組合せを用いたヒトメラノーマ細胞の治療によって、不可逆な成長停止、最終分化、そして、時間が経過すると、プログラムされた細胞死（アポトーシス）が起こる（Fisherら、1985, Pharmacol. Ther. 27, 143-166; Jiangら、1993, Mol. Cell. Different, 1, 41-66）。メラノーマ細胞生理学におけるこれらの深い変化に関連する、及びこれらの変化を起こしうる遺伝子発現の変化を明確にするために、様々なサブトラクティブハイブリダイゼーション手法が用いられている（Jiang及びFisher, 1993, Mol. Cell. Different, 1, 285-299; Kangら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 13788-13793; Jiangら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 12684-12689; Huangら、1999, Gene 236, 125-131; Jiangら、1995, Oncogene 11, 2477-2486）。この研究の結果、メラノーマ細胞における最終分化及び不可逆な成長停止の過程で選択的にアップレギュレートされた唯一の遺伝子として、ｍｄａ−７が同定された（Jiangら、1995, Oncogene 11, 2477-2486）。最新のデータから、ｍｄａ−７が、ＩＬ−１０サブファミリー（現在、ＩＬ−１９、ＩＬ−ＴＩＦ、ＡＫ−１５５及びＩＬ−２０を含む）の新しいメンバーであることが示唆されている（Gallagherら，2000, Genes immun. 1, 442-450; Zhangら、2000, J. Biol. Chem. 275, 24436-24443; Xieら、2000, J. Biol. Chem. 275, 31335-31339; Kotenkoら、2001, J. Biol. Chem. 276, 2725-2732）。ＩＬ−１０シグネチャー配列である４９アミノ酸からなるＮ末端シグナルペプチドの存在、明らかなサイトカインクラスター（ＩＬ−１０、ＩＬ−１９及びＩＬ−２０を含む）における染色体遺伝子座１ｑ３２上のヒトゲノムでの物理的位置、並びに、ＩＬ−２０Ｒ複合体を介してシグナル伝達するその能力に基づき、ｍｄａ−７は、現在ＩＬ−２４として分類されている（Huangら、2001, Oncogene 20, 7051-7063; Wangら、2002, J. Biol. Chem. 277, 7341-7347）。
【０００４】
ｍｄａ−７／ＩＬ−２４の興味深い特性は、複製不能アデノウイルス、Ａｄ．ｍｄａ−７を用いて発現させると、これが、多種のヒト癌細胞においてアポトーシスを誘導し、しかも、正常なヒト細胞は毒性から保護する能力である（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405）。メラノーマ、乳癌、結腸癌、前立腺癌、小細胞肺癌及び膵臓癌のＡｄ．ｍｄａ−７感染（アンチセンスＫ−ｒａｓオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いた場合）は増強してアポトーシスを引き起こす（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405; Saekiら、2000, Gene Ther. 7, 2051-2057; Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10332-10337; Lebedevaら、2002, Oncogene 21, 708-718; Madireddiら、2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465, 239-261）。しかし、正常なメラニン細胞、内皮細胞、乳腺及び前立腺上皮細胞、並びに皮膚線維芽細胞は、Ａｄ．ｍｄａ−７誘導の細胞死には不応性である（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405; Saekiら、2000, Gene Ther. 7, 2051-2057; Lebedevaら、2002, Oncogene 21, 708-718; Madireddiら、2000, adv. Exp. Med. Biol. 465, 239-261）。ｍｄａ−７のアポトーシス誘導作用は十分に確立されているが、癌特異的アポトーシスを引き起こす経路はこれまでのところ解明されていない。さらに、Ａｄ．ｍｄａ−７による選択的な癌特異的細胞死に基づいて、この遺伝子が癌の遺伝子療法に有効であることが証明されるであろう（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405; Saekiら、2000, Gene Ther. 7, 2051-2057; Madireddiら、2000, adv. Exp. Med. Biol. 465, 239-261; Mhachikarら、2001, Mol. Med. 7, 271-282）。
【０００５】
成長停止およびＤＮＡ損傷誘導遺伝子は、当初は、紫外線処理細胞から単離した後、成長停止およびＤＮＡ損傷によるそれらの協調調節に応じて分類されていた（Fornaceら、1989, Mol. Cell Biol. 9, 4196-4203）。後に、これらの遺伝子は、紫外線、化学的発癌因子、飢餓、酸化ストレス、並びに、アポトーシス誘導因子、例えば、ＴＮＦ−α、Ｃ−２セラミド、ジメチルスフィンゴシン、抗Ｆａｓ抗体及びスタウロスポリンによって誘導されるストレス応答遺伝子であることがわかった（Hollanderら、2001, Int. J. Cancer 96, 22-31; Price and Calderwood, 1992, Cancer Res. 52, 3814-3817; Martenら、1994, FASEB J. 8, 538-544; Oh-hashiら、2001, Free Rad. Biol. Med. 30, 213-221）。このファミリーには、５つのメンバー、すなわち、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５α、ＧＡＤＤ４５β、ＧＡＤＤ４５γおよびＧＡＤＤ１５３があり、これらは、同様の特異な電荷特性を有する高度に酸性の核タンパク質をコードする（Takekawa及びSaito, 1998, Cell 95, 521-530; Zhanら、1994, Mol. Cell Biol. 14, 2361-2371）。ＧＡＤＤ３４は、細胞内の多様な配置のタンパク質と相互作用する７３ｋＤａタンパク質である（Hollanderら、1997, J. Biol. Chem. 272, 13731-13737; Connorら、2001, Mol. Cell Biol. 21, 6841-6850; Hasegawaら、2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 593-596; Hasegawa及びIsobe, 1999, Biochim, Biophys, Acta 1428, 161-168; Hasegawaら、1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 256, 249-254; Grishinら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10172-10177; Adlerら、1999, Mol. Cell Biol. 19, 7050-7060）。これら相互作用のいくつかは、増殖抑制／アポトーシスを促進するが、他のものは、翻訳開始、ＤＮＡ組換え若しくは修復、ｍＲＮＡ輸送及び転写調節への関与を示す。ｐ５３調節遺伝子であるＧＡＤＤ４５は、別の２つのｐ５３調節遺伝子、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１／ＭＤＡ−６及びＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の産物と相互作用する２１ｋＤａタンパク質をコードし、ヌクレオチド除去修復の特定の局面に関与している（Smithら、1994, Science 266, 1376-1380; Vairapanjiら、1996, Oncogene 12, 2579-2594）。ＧＡＤＤ４５はまた、ＭＴＫ１  ＭＡＰＫＫＫと相互作用することにより、環境ストレスに応答してｐ３８及びＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼの活性化を媒介する（Takekawa及びSaito, 1998, Cell 95, 521-530）。ＣＨＯＰ１０としても知られるＧＡＤＤ１５３（Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質）は、塩基性領域−ロイシンジッパードメインを含む転写因子であり、該ドメインは、転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーのメンバーとヘテロ二量体を形成し、Ｃ／ＥＢＰ媒介型転写を妨害する（Ron及びHabener, 1992, Genes Dev. 6, 439-45341）。加えて、ＧＡＤＤ１５３自体も、ＤＮＡエレメントに結合することにより、又はＡＰ−１のような他の転写因子との相互作用により、遺伝子転写を増強することができる（Ubedaら、1999, Mol. Cell Biol, 19, 7589-7599；Ubedaら、1996, Mol. Cell Biol. 16, 1479-1489）。各ＧＡＤＤ遺伝子の過剰発現は増殖阻害及び／若しくはアポトーシスを引き起こし、ＧＡＤＤ遺伝子の過剰発現が組み合わされると、相乗的又は協同的抗増殖作用を生み出す（Zhanら、1994, Mol. Cell Biol. 14, 2361-2371）。ｍｄａ−７を同定した差引きハイブリダイゼーション（Jiang及びFisher, 1993, Mol. Cell. Different, 1, 285-299; Jiangら、1995, Oncogene 11, 2477-2486）により、最終分化の過程でのＧＡＤＤ３４のアップレギュレーション及びヒトメラノーマ細胞における成長停止も同定���れている（Jiangら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 12684-12689）。
【０００６】
前述したように、ｍｄａ−７は、とりわけ、ＩＬ−遺伝子クラスターにおけるその局在化に基づいて、推定サイトカインをコードするものと分類されている。一般に、サイトカインは、重要な初期事象として、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ複合体のチロシンリン酸化の急速な増大によって同族（cognate）の受容体結合後にシグナルを伝達し、また続いて、多様な別の二次シグナル伝達機構及び特定の遺伝子発現プロフィールの誘発により細胞を刺激して、細胞増殖、遊走、及びアポトーシスを調節する（Darnellら、1994, Science 264: 1415-1421; Weber-Nordtら、1998, Leuk. Lymphoma 28: 459-467; Kisselevaら、2002, Gene 285: 1-24）。実験によって、ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４タンパク質が正常及び腫瘍細胞の両方から分泌されること（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10332-10337; Suら、2003, Oncogene 22: 1164-1180; Caudellら、2002, J. Immunol. 168: 6041-6046; Lebedevaら、2002, Oncogene 21: 708-718）、並びに、精製ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４は、ＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２複合体（ＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒ２を含む）を含むＩＬ−２０ヘト二量体受容体複合体と結合することができ、これにより、ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化が起こること（Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167: 3545-3549; Parrish-Novakら、2002, J. Biol. Chem. 277: 47517-47523; Wangら、2002, J. Biol. Chem. 277: 7341-7347）が証明されている。
【発明の開示】
【０００７】
３．発明の概要
本発明は、メラノーマ細胞におけるｍｄａ−７の異所性発現と、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の誘導との直接的関係の発見に関する。具体的には、ＧＡＤＤの誘導は、特にメラノーマ細胞におけるｐ３８  ＭＡＰＫにより調節されることが見出され、ｐ３８  ＭＡＰＫ又はＧＡＤＤ発現を遮断する薬剤により上記シグナル伝達経路を改変すれば、メラノーマ細胞はｍｄａ−７媒介型アポトーシスから保護された。さらに、ｍｄａ−７媒介型アポトーシスは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは実質的に独立しているということも見出された。
【０００８】
本発明は、ｍｄａ−７アポトーシス経路及び／又はＪＡＫ／ＳＴＡＴの１以上の成分に対する特定の薬剤が及ぼす作用を決定することにより、アポトーシスを促進、あるいは、阻害できる薬剤を同定する方法を提供する。この薬剤の作用の忠実度は、上記経路の別のメンバーの調節因子が被検薬剤の作用を排除する能力を決定することにより、確認することができる。
【０００９】
本発明により同定することができるアポトーシスの調節因子としては、限定するものではないが、小分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー又は合理的薬剤設計により生成されるもの）、核酸、ペプチド、タンパク質、免疫グロブリン（免疫グロブリンフラグメント、誘導体などを含む）、並びに擬似ペプチド化合物が挙げられる。本発明の範囲には、アポトーシスの調節因子のしてのＭＤＡ−７断片、変異体及び／又はその誘導体の同定も含まれる。
【００１０】
細胞増殖を阻害する方法（腫瘍成長の阻害方法及び癌の治療方法を含む）に、アポトーシス促進因子として同定された薬剤を用いることができる。アポトーシス阻害因子であると決定された薬剤を用いて、例えば、研究又は商業目的で用いられる細胞培養物において、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで組織中の細胞の生存能を増強するために、細胞増殖を促進することもできる。
【００１１】
４．図面の簡単な説明
図１Ａ〜Ｄ
Ａｄ．ｍｄａ−７の感染は、メラノーマ細胞において時間及び用量依存的にＧＡＤＤファミリーの遺伝子を誘導するが、正常な不死メラニン細胞では誘導しない
Ａ．メラノーマ細胞（ＨＯ−１、ＷＭ３５、ＭｅＷｏ及びＦＯ−１）と不死化ヒトメラニン細胞（ＦＭ５１６）を１００ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で３日間かけてＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７のいずれかに感染させた。全ＲＮＡを抽出し、第６節に記載したように、表示のｃＤＮＡプローブを用いてノーザン分析を実施した
Ｂ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ（１００ｐｆｕ／細胞）又はＡｄ．ｍｄａ−７（１、１０及び１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させ、表示のようにノーザンブロット分析を実施した
Ｃ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに３日間感染させた。細胞溶解物を調製し、第６節に記載したように、表示の抗体を用いてウエスタンブロット分析を実施した
Ｄ．１００ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．のＡｄ．ｍｄａ−７を感染させてから３日のＦＡＣＳ分析による、低二倍性を示す細胞の割合（％）（Ａ０）（アポトーシスの尺度である）。
【００１２】
図２Ａ〜Ｅ
ＳＢ２０３５８０での処理は、ＧＡＤＤファミリーの遺伝子のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導、ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化及びＢＣＬ−２タンパク質ダウンレギュレーションを阻害する
Ａ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させた後、１μＭのＳＢ２０３５８０で３日間処理するか、又は様々な濃度のＳＢ２０３５８０で２日間処理した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析を実施した
Ｂ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で３日間処理した。細胞溶解物を調製し、ウエスタンブロット分析を実施した
Ｃ．ＦＯ−１（左側パネル）及びＦＭ５１６（右側パネル）細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに３日間感染させた。細胞溶解物を調製し、第６節に記載したように、抗ホスホｐ３８及び抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体を用いてウエスタンブロット分析を実施した
Ｄ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で３日間処理した。細胞溶解物を調製し、表示の抗体を用いてウエスタンブロット分析を実施した
Ｅ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で処理するか、又はドミナントネガティブｐ３８  ＭＡＰＫ（Ａｄ．ｐ３８ＤＮ；１００ｐｆｕ／細胞）に感染させた。細胞溶解物を調製し、表示の抗体を用いてウエスタンブロット分析を実施した。
【００１３】
図３
ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を阻害すると、ＦＯ−１メラノーマ細胞はＡｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死から保護される。ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で処理するか、又はＡｄ．ｐ３８ＤＮ（１００ｐｆｕ／細胞）に感染させた。４日後、ＭＴＴアッセイにより細胞生存能を測定した。Ａｄ．ｖｅｃで処理した細胞の細胞生存能を１とした。＊：Ａｄ．ｍｄａ−７との有意差（ｐ＜０．０００１）。
【００１４】
図４Ａ〜Ｃ
ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を阻害すると、細胞はｍｄａ−７媒介型アポトーシスから保護される
Ａ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で３日間処理した。細胞からＤＮＡを単離し、第６節に記載するように、断片化を分析した
Ｂ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で処理するか、又はＡｄ．ｐ３８ＤＮ（１００ｐｆｕ／細胞）に感染させた。第６節に記載するように、細胞周期を分析した
Ｃ．ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに感染させてから、１μＭのＳＢ２０３５８０で処理するか、又はＡｄ．ｐ３８ＤＮ（１００ｐｆｕ／細胞）に感染させた。各群における、感染から１および３日後のアポトーシス細胞の割合（％）をグラフ化した。
【００１５】
図５
ＧＡＤＤファミリーの遺伝子を阻害すると、ＦＯ−１メラノーマ細胞はｍｄａ−７媒介型細胞死から保護される。表示のアンチセンス構築物を単独で用いるか又は組み合わせて用いて、ＦＯ−１細胞をトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＡｄ．ｖｅｃ（白棒）又はＡｄ．ｍｄａ−７（黒棒）（１００ｐｆｕ／細胞）のいずれかに３日間感染させた。細胞生存能をＭＴＴアッセイにより測定した。Ａｄ．ｖｅｃで処理した細胞の細胞生存能を１とした。対照であるＡｄ．ｍｄａ−７との有意差、＃：ｐ＜０．０５；＊：ｐ＜０．０５；§：ｐ＜０．０００１。
【００１６】
図６Ａ〜Ｂ
Ａ．ｐ３８  ＭＡＰＫ経路及びＧＡＤＤファミリーメンバー遺伝子の、Ａｄ．ｍｄａ−７によるヒトメラノーマ細胞におけるアポトーシスの媒介への関与を示す推定モデル
Ｂ．癌細胞及び免疫系におけるＡｄ．ｍｄａ−７及びＭＤＡ−７活性に関連するシグナル伝達経路の全体図。Ｐ−はリン酸化を示し、ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子；ＴＧＦ−β：形質転換増殖因子−β；ｉＮＯＳ：誘導性酸化窒素シンターゼ；ＰＫＲ：二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＲ；ＭＡＰＬ：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ；ｅＩＦ２−α：真核生物翻訳開始因子２−α；ＳＴＡＴ：シグナル伝達因子及び転写の活性化因子；ＧＡＤＤ：成長停止及びＤＮＡ損傷誘導性；ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン；ＩＰＳ：リポ多糖；ＩＬ：インターロイキン；ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子−α；ＩＮＦ−γ：インターフェロンγ；ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球細胞マクロファージ−コロニー刺激因子。
【００１７】
図７Ａ〜Ｂ
ｍｄａ−７誘導のアポトーシスにプロテインチロシンキナーゼ阻害剤が及ぼす作用：
Ａ．１００ｐ．ｆ．ｕ．／細胞のＡｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７での感染後、ＡＧ４９０（５μＭ）、ゲニステイン（１０μＭ）又はＡＧ１８（７μＭ）の非存在又は存在下で細胞系を増殖させた。感染から５日後、記載のように、ＭＴＴ増殖アッセイにより細胞生存能について細胞を分析した。数値は、表示する特定の処理と非処理細胞の比を示す。３つの独立した実験の平均を示す
Ｂ．ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて、Ａ０画分中の細胞の割合（％）を計算することにより、様々なＴＫ阻害剤（ゲニステイン、ＡＧ４９０及びＡＧ１８）の存在下でＡｄ．ｍｄａ−７による様々な細胞系におけるアポトーシスの選択的誘導を決定した。アポトーシス画分（Ａ０）の決定は、１００ｐ．ｆ．ｕ．／細胞のＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７で細胞を感染させ、感染が固定してから４８時間後に回収し、決定のためにそれぞれ第７節に記載するＰＩで染色した細胞に対して実施した。感受性ＤＵ−１４５前立腺癌及び耐性の正常な不死化ヒトメラニン細胞ＦＭ−５１６について分析を実施した；Ｍ１バーはＡ０画分を示す。
【００１８】
図８Ａ〜Ｂ
様々な細胞系におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒの発現パターン：様々なＡｄ．ｍｄａ−７感受性又は耐性細胞系由来のＲＮＡを用いて、第７節に記載するプライマー及びＰＣＲ条件で、ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した
Ａ．前立腺癌（ＤＵ−１４５）、子宮頚癌（ＨｅＬａ）、膠芽細胞腫（Ｈ４−ＧＢＭ）、メラノーマ（Ｃ８１６１、ＨＯ−１）を含むヒト癌細胞；正常な不死化細胞、ｈＴＥＲＴ不死化胎児星状細胞（アストロサイト）及びＳＶ４０  Ｔ−Ａｇ不死化メラニン細胞（ＦＭ−５１６）のスペクトルについて、ＲＴ−ＰＣＲ反応物由来のＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。ヒトアデノウイルス５型感染により不死化し、癌原性ｒａｓ（ＣＲＥＦ−ｒａｓ）で形質転換したラット胚線維芽細胞を陰性対照として用いた。ＧＡＰＤＨプライマーを全てのＲＴ−ＰＣＲ反応の陽性対照として用いた
Ｂ．ＩＬ−２０及びＩＬ−２２受容体のＲＴ−ＰＣＲ反応物からのＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲルを、ヒト乳癌（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７Ｄ）及び膵臓癌（ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１）並びに不死化正常乳房上皮細胞（ＨＢＬ−１００）のパネルについて示す。ヒトＥＦ−１α特異的プライマーを用いたＰＣＲを実施することにより、本来のＲＮＡの完全性を決定した。
【００１９】
図９Ａ〜Ｂ
様々な処理プロトコル後のＡｓＰＣ−１細胞系におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒの発現パターン：
Ａ．ＩＬ−２０及びＩＬ−２２受容体特異的プライマー並びにＥＦ−１αの陽性対照を用いて、ＡｓＰＣ−１ヒト膵臓癌細胞系由来のＲＮＡについて、ＲＴ−ＰＣＲ反応物からのＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲルを示す。非感染、並びにどの遺伝子も発現しないアデノウイルス、（Ａｄベクター）、アンチセンス配向Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳ、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４ ｃＤＮＡ（Ａｄ．ｍｄａ−７）、又はアンチセンスＫ−ｒａｓとｍｄａ−７の組み合わせ（Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳ）からＲＮＡを単離した
Ｂ．陽性及び陰性対照としてそれぞれＤＵ−１４５、ＦＭ−５１６及びＣＲＥＦ−ｒａｓ細胞を用いて、ＡｓＰＣ−１サンプルと同時に単離したＲＮＡと並行して、同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。
【００２０】
図１０
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の成分について突然変異したヒト線維肉腫細胞におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒの発現パターン：
ＲＴ−ＰＣＲ反応物からのＤＮＡの臭化エチジウム染色アガロースゲルを示すが、これらは、親２ｆ  ＴＧＨ線維肉腫、並びにＩＬ−２０及びＩＬ−２２受容体についての対応する突然変異体に対応する。各反応の陽性及び陰性対照をＨＯ−１（ヒトメラノーマ）及びＡｓＰＣ−１（膵臓癌）レーンにそれぞれ示す。
【００２１】
図１１
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ欠陥細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７感染後のアポトーシス活性：
各パネルの上部に示す細胞系を１５０ｐ．ｆ．ｕ／細胞のＡｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７への感染後、ＡＧ４９０（５μＭ）、ゲニステイン（１０μＭ）又はＡＧ１８（７μＭ）の非存在又は存在下でインキュベートした。感染から５日後、ＭＴＴアッセイにより細胞を細胞生存能について分析した。非処理対照細胞のＭＴＴ吸光度を１に設定することにより、生存細胞の相対数を決定した。示した結果は３回の独立した実験の平均値である。
【００２２】
図１２Ａ〜Ｂ
様々な細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７誘導細胞死にｐ３８ＭＡＰＫが及ぼす作用：
Ａ．１００ｐ．ｆ．ｕ／細胞のＡｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７への感染後、ＳＢ２０３５８０（２μＭ）の非存在又は存在下で様々な細胞系をインキュベートした。感染から５日後、ＭＴＴアッセイにより細胞を細胞生存能について分析した。非処理対照細胞のＭＴＴ吸光度を１に設定することにより、生存細胞の相対数を決定した。示した結果は３回の独立した実験の平均値である
Ｂ．ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて、Ａ０画分中の細胞の割合（％）を計算することにより、ＳＢ２０３５８０の存在下の様々な細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７によるアポトーシスの選択的誘導を決定した。アポトーシス画分（Ａ０）の決定は、１００ｐ．ｆ．ｕ．／細胞のＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７を細胞に感染させ、感染が固定してから４８時間後に回収し、決定のためにそれぞれ第７節に記載するＰＩで染色した細胞に対して実施した。感受性ＤＵ−１４５前立腺癌及び耐性の正常な不死化ヒトメラニン細胞ＦＭ−５１６について分析を実施した；Ｍ１バーはＡ０画分を示す。
【００２３】
図１３Ａ〜Ｂ
２ｆ  ＴＧＨ系列の細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７誘導細胞死にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤及びＧＡＤＤファミリーの遺伝子発現が及ぼす作用：
Ａ．１５０ｐ．ｆ．ｕ／細胞のＡｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７への感染後、ＳＢ２０３５８０（２μＭ）の非存在又は存在下で様々な細胞系をインキュベートした。感染から６日後、ＭＴＴアッセイにより細胞を細胞生存能について分析した。非処理対照細胞のＭＴＴ吸光度を１に設定することにより、生存細胞の相対数を決定した。示した結果は３回の独立した実験の平均値である
Ｂ．１５０ｐ．ｆ．ｕ／細胞の感染多重度で、Ａｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７を細胞系に４日間かけて感染させた。全ＲＮＡを抽出し、第７節に記載するように、表示のｃＤＮＡプローブを用いて、ノーザン分析を実施した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ｍｄａ−７媒介型アポトーシスに関与する分子に関する。これは、少なくとも部分的に、癌細胞に導入されたｍｄａ−７が、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７のリン酸化を促進し、ＧＡＤＤファミリーのメンバーの発現を増大し、抗アポトーシスＢＣＬ−２のレベルを低下させるという発見、さらに、ｍｄａ−７によるアポトーシス誘導が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは実質的に独立しているという知見に基づく。
【００２５】
一態様では、本発明は、被検薬剤が、（ｉ）ｐ３８  ＭＡＰＫ又はＨＳＰ２７のリン酸化、（ｉｉ）ＧＡＤＤファミリーの１以上のメンバー（例えば、限定するものではないが、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α、ＧＡＤＤ４５−γ）の発現、及び／又は（ｉｉｉ）ＢＣＬ−２の発現、を改変する能力をアッセイすることにより、アポトーシスを調節（促進又は阻害）する薬剤を同定する方法を提供する。特に、ｐ３８又はＨＳＰ２７のリン酸化を増大する、ＧＡＤＤファミリーの１以上のメンバーの発現を増大する、並びに、ＢＣＬ−２の発現を低減すると決定された薬剤は、ｍｄａ−７経路を介してアポトーシスを促進する薬剤であると考えることができる。しかし、本発明はまた、ｍｄａ−７経路とは一致しない様式で、該経路の１以上の成分を改変しうるアポトーシス調節剤の同定を提供する。これとは逆に、ｐ３８又はＨＳＰ２７のリン酸化を低減する、ＧＡＤＤファミリーの１以上のメンバーの発現を低減する、並びに、ＢＣＬ−２の発現を増大すると決定された薬剤は、ｍｄａ−７経路を介したアポトーシスを促進しない、同様に、アポトーシスを全く促進しない、さらには、アポトーシスを阻害する可能性がある薬剤であると考えることができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、図６Ａは、ｍｄａ−７アポトーシス経路の推定モデルを示し、図６Ｂは、ｍｄａ−７アポトーシス誘発経路が、ＭＤＡ−７サイトカイン経路及び他の経路（例えば、抗血管新生経路）と相互作用すると考えられる推定スキームを示す。
【００２６】
薬剤がｍｄａ−７アポトーシス経路の調節因子として作用する能力は、上記経路の第１成分に対して被検薬剤がもたらした作用が、該経路の第２成分のアゴニスト又はアンタゴニストである第２薬剤で増強又は阻害することができるか否かを決定することにより試験及び確認することができる。例えば、被検薬剤がＧＡＤＤ１５３の発現を増大する能力は、ｐ３８  ＭＡＰＫ活性のアンタゴニスト、例えば、ＳＢ２０３５８０のような選択的ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の存在下、又はＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇ３８（ＡＧＦ）のようなドミナントネガティブｐ３８  ＭＡＰＫ突然変異体の存在下で評価することができる（以下参照）。被検薬剤がｍｄａ−７経路を介して作用する場合には、該薬剤によって促進されるＧＡＤＤ１５３の増大は、ｐ３８  ＭＡＰＫアンタゴニストにより低減又は排除することができる。同様に、被検薬剤が、ＢＣＬ−２発現を低減する能力は、ＧＡＤＤ発現のアンタゴニスト、例えば、１種以上のＧＡＤＤアンチセンスＲＮＡの存在下で評価することができる。被検薬剤がｍｄａ−７経路を介して作用する場合には、該薬剤によって達成されるＢＣＬ−２の低減は、アンチセンス分子により低減又は排除することができる。アゴニスト又はアンタゴニストの結果は、該経路における第１及び第２成分の相対位置の影響を受ける。例えば、当該経路における相対位置と考えられもののために、ｐ３８  ＭＡＰＫのアンタゴニストは、ＧＡＤＤの増大及び／又はＢＣＬ−２の低減を阻害するが、ＧＡＤＤのアンタゴニストは、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害しないであろう。
【００２７】
本発明の別の態様では、細胞において、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化増大、ＧＡＤＤファミリーの１以上のメンバーの発現増大、並びに／あるいはＢＣＬ−２発現レベルの低減を検出することにより、該細胞が、ｍｄａ−７経路に沿ったアポトーシスを受けていることを決定することができる。このような方法を用いて、アポトーシス調節処理がうまくいったかを評価する（例えば、悪性疾患の治療におけるアポトーシス誘導がうまくいったかを評価する）か、あるいは、アポトーシスを調節する上での被検薬剤の有効性を確認することができる。このように、本発明の方法は、腫瘍中の細胞、例えば、腫瘍組織の生検中の細胞において実施することができる。あるいは、本発明の方法は、細胞培養物、又は生存能のあるヒト若しくはヒト以外の動物においても実施することができる。
【００２８】
ｍｄａ−７アポトーシス経路のメンバー供給源として１以上の細胞を用いて、本発明のアッセイを実施することも可能である。本発明に従って用いる細胞は、限定するものではないが、以下に挙げるような悪性疾患細胞であるのが好ましい：例えば、メラノーマ細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、膠芽細胞腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞、及び／又はｍｄａ−７の過剰発現（発現の増大、強制された発現）に応答してアポトーシスの特徴を発現する（例えば、外因性ｍｄａ−７遺伝子の導入及び／若しくはインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）のような誘導因子及びメゼレインのようなプロテインキナーゼＣアクチベーターへの暴露により起こりうる）細胞。好ましくは、細胞培養物を細胞の供給源として用いる。しかし、その他の供給源、例えば、ヒト又はヒト以外の動物に存在する細胞を用いてもよい。特定の非制限的な実施形態において、細胞がｒａｓ中に活性化突然変異を保有する場合には、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６４５４号、公開第ＷＯ０３１６４９９号（本明細書に参照として組み込む）に記載されているように、ｒａｓの阻害剤を細胞に投与することができる。アポトーシス調節剤を同定する方法に細胞を用いる場合、この細胞を「被検細胞」と呼ぶことがある。
【００２９】
ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７のリン酸化レベル、ＲＮＡ及びタンパク質の発現を測定する方法、並びにアポトーシス及び／若しくは細胞生存能を、検出及び／又は定量する方法は、当分野では周知である。これらの方法のいくつかを以下の実施例に例示する。アポトーシスを検出／定量する方法の非制限的例として、限定するものではないが、ＤＮＡ断片化分析、フローサイトメトリー及びトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介によるｄＵＴＰニック及びラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、並びに細胞生存能評価（例えば、ＭＴＴアッセイ又は生体染色）が挙げられる。
【００３０】
本発明に従い同定することができるアポトーシスの調節因子として、限定するものではないが、小分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー又は合理的な薬物設計により生成され、好ましくは、非制限的に、５００〜２０００ダルトンの分子サイズを有するもの）、核酸、ペプチド、タンパク質、免疫グロブリン（免疫グロブリンフラグメント、誘導体などを含む）、並びに擬似ペプチド化合物が挙げられる。さらに本発明の範囲には、アポトーシスの誘発因子としてのＭＤＡ−７変異体の同定（以下参照）も含まれる。本発明のアッセイ方法を実施するに際し、調節因子である可能性がある薬剤を「被検薬剤」と呼ぶ。
【００３１】
本明細書で用いる用語「ＭＤＡ−７」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６２６１として示されるアミノ酸配列を本質的に有するタンパク質を意味する。ＭＤＡ−７をコードする核酸（ｍｄａ−７と呼ぶ）は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６２６１として示される配列、又は、翻訳されると、実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を産生する別の配列を有する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／２６４５４号を参照されたい。
【００３２】
「ｍｄａ−７」変異型核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６２６１として示されるアミノ酸配列を有していないが、ストリンジェントな条件下でＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ１６２６１として示される配列を有する核酸とハイブリダイズし、好ましくは、しかし、限定するわけではないが、メラノーマ細胞のような癌細胞に導入されると、例えば、アポトーシスにより、細胞増殖を阻害する、及び／又は細胞死を促進するタンパク質をコードする核酸である。核酸分子のハイブリダイゼーションを検出するためのストリンジェントな条件の具体的かつ非制限的例は、"Current Protocols in Molecular Biology", Volume I. Ausubelら、編集John Wiley: New York NY, pp. 2.10.1-2.10.16,（1989年第１版、しかし毎年更新）に開示されており、ここでは、ニトロセルロースフィルターに固定したＤＮＡサンプルの場合、最大ハイブリダイゼーション特異性は、６５〜６８℃以上の温度で、０．１〜２×ＳＳＣ（１５〜３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５〜３ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液中でハイブリダイズしたフィルターを繰り返し洗浄することにより達成することができる。ナイロンフィルムに固定したＤＮＡサンプルについては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄溶液は、４０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２、１〜２％ＳＤＳ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡから構成することができる。やはり、６５〜６８℃以上の洗浄温度が推奨されるが、正確にストリンジェントな洗浄に必要な最適温度は、核酸プローブの長さ、そのＧＣ含量、一価カチオンの濃度、並びにもし存在すれば、ハイブリダイゼーション溶液に含有させたホルムアミドのパーセンテージに応じて変動する。
【００３３】
ＭＤＡ−７変異型タンパク質は、ｍｄａ−７変異型核酸によってコードされるタンパク質、又は天然ＭＤＡ−７を特異的に認識する抗体との結合について天然ＭＤＡ−７と競合するタンパク質である。
【００３４】
本発明はさらに、ｍｄａ−７又はＭＤＡ−７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％の配列同一性を有するが、アポトーシス調節剤としてすでに定義した天然遺伝子又はタンパク質の変異体にはあてはまらない核酸又はタンパク質を同定することも包含する。かかる分子は、アポトーシスの誘導因子又は阻害因子と考えられる。
【００３５】
本発明はまた、被検薬剤としてＭＤＡ−７の誘導体、ＭＤＡ−７のペプチド断片、若しくはＭＤＡ−７の誘導体化ペプチド断片を用いて、このような分子から、アポトーシスの調節因子を同定することも包含する。本明細書で用いる「誘導体」又は「誘導体化」という用語は、例えば、炭水化物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、脂質、若しくはその他の官能基の付加による化学的修飾、又はキメラ、組換え「融合」分子（例えば、ＭＤＡ−７誘導融合タンパク質又は融合ペプチド）の調製のいずれかを意味する。ペプチド及びその誘導体は、５〜２００、５〜１００、５〜５０若しくは５〜２０個のアミノ酸残基を含むのが好ましい。
【００３６】
好ましくは、しかし、限定するものではないが、「アポトーシスを誘導する（こと）」とは、１以上のアポトーシスマーカーのレベル又はアポトーシス細胞の割合（％）が、標準値に対して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％高いことを意味する。反対に、「アポトーシスの阻害」とは、１以上のアポトーシスマーカーのレベル又はアポトーシス細胞の割合（％）が、標準値に対して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％低い、あるいは、生存能細胞の割合（％）が、標準値に対して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％高いことを意味する。
【００３７】
特に、非制限的な実施形態において、本発明は、アポトーシス調節剤（誘導剤又は阻害剤）を同定する方法であって、
（ａ）被検細胞として、ｍｄａ−７遺伝子の発現増大（ｍｄａ−７遺伝子の導入及び発現、又は、例えば、ＩＦＮ−β及びプロテインキナーゼＣ（メゼレインなど）を用いた内因性遺伝子の誘導によって起こる）に応答して、アポトーシスを受ける細胞を任意で同定するステップであって、該被検細胞は被検細胞の実質的に均質な集団として増殖させてもよい、上記ステップ；
（ｂ）被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；
（ｃ）被検細胞への被検薬剤の投与に応答して、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又ははＨＳＰ２７のリン酸化のレベルに変化があるか否かを決定するステップ、を含む方法を提供し、ここでｐ３８  ＭＡＰＫ及び／又はＨＳＰ２７のリン酸化のレベルに変化があれば、被検薬剤がアポトーシスの調節因子であることを示しており、リン酸化の増大はアポトーシスの誘導因子に特有のものであり、リン酸化の低減はアポトーシスの阻害因子に特有のものである。このような方法は、さらに、若しくはこれに代わり、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α、若しくはＧＡＤＤ４５−γのような１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現に変化（例えば、プロモーター活性、ＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルにより測定される）があるか否かを決定するステップを含んでもよく、その際、１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現が増加すれば、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示し、１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現が低減すれば、被検薬剤はアポトーシスの阻害因子であることを示している。前記方法のいずれも、被検薬剤がＢＣＬ−２の発現レベルを変化させるか否か（例えば、プロモーター活性、ＲＮＡ、若しくはタンパク質レベルにより測定される）の決定をさらに含むことができ、その際、低減はアポトーシス誘導活性と一致し、増大はアポトーシス阻害活性と一致する。
【００３８】
好ましい非制限的ば実施形態では、リン酸化又は発現レベルの変化は、標準値に対して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０若しくは９０％の増加又は減少を意味する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、アポトーシス誘導剤を同定する方法であって、被検細胞に被検薬剤を投与するステップ；被検細胞において、被検薬剤の投与に応答して、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＨＳＰ２７からなる群より選択される分子のリン酸化レベルの増加、及び／又は被検薬剤の投与に応答して、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５−α、若しくはＧＡＤＤ４５−γから選択される１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増加があるか否かを決定するステップ；さらに、任意によいｒ、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／若しくはＨＳＰ２７のリン酸化の増大、並びに／又は１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増加が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の機能に左右されるか否かを決定することを含むステップを含んでよく、ｐ３８  ＭＡＰＫ及び／若しくはＨＳＰ２７のリン酸化の増大並びに／又は１以上のＧＡＤＤタンパク質の発現レベルの増加（これらは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路とは実質的に独立しているのが好ましい）は、被検薬剤がアポトーシスの誘導因子であることを示すものである、上記方法を提供する。このような方法は、ｍｄａ−７経路を介してアポトーシスを誘導する薬剤を同定する、例えば、ｍｄａ−７核酸又はＭＤＡ−７タンパク質の有用な変異体を同定する上で特に有用である。
【００４０】
以下の第７節には、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の独立性を証明することができる方法の非制限的例を示す。例えば、被検薬剤の存在下の被検細胞を（ａ）チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、限定するものではないが、ゲニステイン若しくはＡＧ１８、及び／又は（ｂ）ＪＡＫ−選択的阻害剤、例えば、ＡＧ４９０に暴露するか、並びに／あるいは被検薬剤がｍｄａ−７経路のメンバーを調節する能力を、ＪＡＫ／ＳＴＡＴに欠陥のある被検細胞、例えば、２ｆＴＧＨ、Ｕ１Ａ、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ａ、Ｕ５Ａ、若しくはＰＣ−３細胞系、又は、ＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体が欠失若しくは欠損した細胞において決定することもできる。被検薬剤によるｍｄａ−７経路のメンバーの調節が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の破壊または非存在によって実質的に変化しなければ、経路メンバーに対する被検薬剤の作用は、上記経路とは独立していると考えられる。ここで「実質的に変化しない」とは、ｍｄａ−７経路のメンバーに対する被検薬剤の作用が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴの排除によって、約３０％以上、好ましくは約２０％以上変化しないことを意味し、ほとんど不変である場合も含まれる。
【００４１】
以上述べたアッセイは、任意により、１種以上の別の生物活性物質の存在下で実施してもよく、このような物質として、限定するものではないが、過剰発現したｍｄａ−７、Ｘ線若しくはＵＶ照射、増殖因子、抗増殖因子などが挙げられる。ｍｄａ−７遺伝子の過剰発現と同時にアッセイを実施する場合には、ｐ３８及び／若しくはＨＳＰ２７のリン酸化の量の増減、並びに／又は１以上のＧＡＤＤタンパク質及び／若しくはＢＣＬ−２の発現レベルの増大又は低減を決定することにより、被検薬剤がｍｄａ−７誘導アポトーシスを増強又は阻害する能力を評価することができる。
【００４２】
治療を必要とする被験者におけるｍｄａ−７遺伝子療法に代わり、又はその補助として、本発明に従い同定されたアポトーシス誘導剤を用いることができる。例えば、このようなアポトーシス誘導剤を被験者の癌の治療に用いることができ、そのような癌は、例えば、限定するものではないが、メラノーマ、多形膠芽腫、骨肉種、乳癌、子宮頚癌、膵臓癌、胃癌、肝芽腫、大腸癌、肺癌（腺癌、小細胞、非小細胞、中皮腫）、鼻咽頭癌、卵巣癌、精巣癌、前立腺癌、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、腎臓癌などである。上記アポトーシス誘導剤は、ｍｄａ−７のように、悪性細胞にその作用を選択的に及ぼすものでも、あるいは、そのような選択性がないものでもよい。非悪性細胞で機能するアポトーシス誘導剤は、例えば、組織剥離、若しくは非悪性過増殖障害の治療に用いることもできる。特定の腫瘍及び患者に有効な量は、例えば、用量応答曲線の作成により決定することができる。
【実施例１】
【００４３】
６．実施例１
材料および方法
細胞系、試薬及び細胞増殖アッセイ：
正常不死ヒトメラニン細胞（ＦＭ５１６−ＳＶ；ＦＭ５１６）、ＷＭ３５初期放射状増殖期（ＲＧＰ）原発性ヒトメラノーマ及びＨＯ−１、ＦＯ−１並びにＭｅＷｏ転移性メラノーマ細胞系を、これまで記載されている（Kerbelら、1984, J. Natl. Cancer Inst. 72, 93-108; Fisherら、1985, J. Interferon Res. 5, 11-22; Herlyn,1990. Cancer Metastasis Rev. 9, 101-112; Melberら、1989, Cancer Res. 49, 3650-3655）ように培養した。ＳＢ２０３５８０をSigma（St Louis, MO）から購入した。Lebedevaら、2000, Cancer Res. 60, 6052-6060に記載されているように、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）染色により、細胞増殖及び生存細胞数をモニタリングした。
【００４４】
ウイルス構築及び感染プロトコル：
ｍｄａ−７を発現する複製欠陥Ａｄ．ｍｄａ−７の構築及び精製については、Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718に記載されている。空の（empty）アデノウイルスベクター（Ａｄ．ｖｅｃ）を対照として用いた。キナーゼ不活性ｐ３８−α（ＡＧＦ）ｃＤＮＡ（Raingeaudら、1995, J. Biol. Chem. 270, 7420-7426; Taherら, 1999, Biochemistry 38, 13055-13062）をアデノウイルス転移プラスミドにクローニングして、ドミナントネガティブキナーゼ欠失突然変異ｐ３８  ＭＡＰＫ発現ウイルス［Ｆｌａｇ−ｐ３８（ＡＧＦ）］を調製し、Valerie, 1999, Biopharmaceutical Drug Design and Development, 編集：Wu-Pong, S. & Rojanasakul, Y (Humana Press, Inc.), pp. 69-142 及びRosenbergら、2001, Cancer Res. 61, 764-770に記載されているように、複製不能Ａｄ−５（ｄｅｌＥ１、Ｅ３）ウイルスとした。このウイルスは、アミノ末端にＦｌａｇタグを有するｐ３８α（Ｔ１８０ＧＹ−ＡＧＦ）を発現する。Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718に記載されているように、ウイルス感染を実施した。
【００４５】
プラスミド構築及びトランスフェクションアッセイ：
ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５α及びＧＡＤＤ４５γコード配列をＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。配列を確認してから、アンチセンスでｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen, Carlsbad、CA）ベクターに連結した。プラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミド精製マキシキット（Qiagen, Hilden、ドイツ）により精製した。トランスフェクション前日に、２×１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播いた。マクスフェクト（Maxfect）トランスフェクション試薬（Molecular Probes International LLC, Eugene, OR）を用い、製造者の指示に従って、１ウェル当たり５００ｎｇのＤＮＡで、一過性トランスフェクションを実施した。空のベクターを添加することにより、全ＤＮＡ濃度を一定に維持した。
【００４６】
ＲＮＡ単離及びノーザンブロット分析：
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）を用いて、製造者のプロトコルに従って、全ＲＮＡを細胞から抽出し、Suら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 9125-9130に記載のように、ノーザンブロッティングを実施した。用いたｃＤＮＡプローブは、全長ヒトＧＡＤＤ１５３、全長ヒトＧＡＤＤ４５−α、β及びγ、ヒトＧＡＤＤ３４からの５００ｂｐ断片、並びに全長ヒトＧＡＰＤＨであった。
【００４７】
ウエスタンブロット分析：
Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718に記載されているように、ウエスタンブロッティングを実施した。一次抗体として、以下のものが含まれる：ＧＡＤＤ１５３（１：５００；ウサギポリクローナル；Santa Cruz, Santa Cruz, CA）、ＧＡＤＤ３４（１：２００；ウサギポリクローナル；Santa Cruz）、ＧＡＤＤ４５（１：２００；マウスモノクローナル；Santa Cruz）、ｂｃｌ−２（１：１０００；ウサギポリクローナル；John Reed博士の厚意により提供されたもの）及びＥＦ１（１：１０００；マウスモノクローナル；Upstate Biotechnology, Waltham, MA）。
【００４８】
ｐ３８−ＭＡＰＫ及びＨＳＡＰ２７のリン酸化：
プロテアーゼ阻害剤混合物、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４及び５０ｍＭ  ＮａＦを含むＲＩＰＡバッファー中で細胞を回収し、４℃にて１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。全細胞溶解物として上清を用いた。２μｌのウサギポリクローナル抗ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体（Calbiochem, San Diego, CA）を用いて、５００μｇの全細胞溶解物からｐ３８−ＭＡＰＫを４℃で一晩かけて免疫沈降させた。プロテインＡ−アガロースの添加後、インキュベーションを２時間継続した。
【００４９】
免疫複合体をＲＩＰＡバッファー中で４回洗浄し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ溶解バッファー中に再懸濁させ、ニトロセルロース膜に転写した。ウサギポリクローナル抗ホスホ−ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体（New England Biolabs, Beverly, MA）及び抗ｐ３８−ＭＡＰＫ抗体（Calbiochem, San Diego, CA）をそれぞれ用いるウエスタンブロット分析により、ホスホ−ｐ３８−ＭＡＰＫ及び全ｐ３８−ＭＡＰＫの発現を検出した。ウサギポリクローナル抗ホスホ−ＨＳＰ２７抗体及びマウスモノクローナル抗ＨＳＰ２７抗体（New England Biolabs）をそれぞれ用いたウエスタンブロット分析により、全細胞溶解物におけるホスホ−ＨＳＰ２７及び全ＨＳＰ２７の発現を検出した。
【００５０】
ＤＮＡ断片化アッセイ：
１０ｃｍ皿からの付着及び浮遊細胞をＤＮＡ断片化アッセイに用いるが、アッセイの実施は、Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718の記載に従った。
【００５１】
細胞周期分析：
細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、−２０℃で７０％エタノールで一晩固定した。細胞を３７℃のＲＮａｓｅ  Ａ（１ｍｇ／ｍｌ）で３０分、次に、ヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で処理した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを用いて細胞周期を分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて、データを分析した。
【００５２】
統計分析：
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、次に、Fisherの保護最小有意差分析を用いて、統計分析を実施した。
【００５３】
結果
ヒトメラノーマ細胞のＡｄ．ｍｄａ−７感染は、ＧＡＤＤファミリー遺伝子を誘導するが、正常な不死メラニン細胞では誘導しない
メラノーマ細胞系をＡｄ．ｍｄａ−７又はＡｄ．ｖｅｃのいずれかに感染させ、全ＲＮＡを抽出してから、ＧＡＤＤ遺伝子ファミリーのｍＲＮＡの発現パターンをノーザンブロット分析により分析した。図１Ａに示すように、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５α及びＧＡＤＤ４５γのｍＲＮＡの発現は、対照及びＡｄ．ｖｅｃに感染したメラノーマ細胞において、検出不可能か低いかであった。Ａｄ．ｍｄａ−７感染から１日後、この時点で、これらメラノーマ細胞の増殖に対する作用はなく（Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718）、ＧＡＤＤ遺伝子発現に変化は一切見られなかった。しかし、感染から２及び３日後には、メラノーマ細胞にＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５α及びＧＡＤＤ４５γ遺伝子の顕著な誘導が認められたが、不死化させた正常ヒトメラニン細胞であるＦＭ５１６−ＳＶ（ＦＭ５１６）細胞にはなかった（Melberら, 1989, Cancer Res. 49, 3650-3655）。この誘導は、メラノーマ細胞が、感染から２日後に死滅し始め、Ａｄ．ｍｄａ−７への感染は、メラノーマ細胞の選択的アポトーシスを引き起こすが、正常なメラニン細胞には起こさないというこれまでの研究と相関している（図１Ｄ）（Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718）。メラノーマ細胞系の中でも、ＨＯ−１は、Ａｄ．ｍｄａ−７によるアポトーシス誘導に最も不応性であり（Ａ０細胞の割合（％）の増大により測定される）、これは、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の誘導が弱くなることと相関していた。他の３つの細胞系、すなわちＦＯ−１、ＭｅＷｏ及びＷＭ３５は、Ａｄ．ｍｄａ−７によって容易に死滅し（図１Ｄ）（Lebedevaら、2002, Oncogenene 21, 708-718）、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の有意な誘導を呈示した。これら３つのメラノーマ細胞系の中で、ＦＯ−１がＡｄ．ｍｄａ−７に対する感受性が最も高く、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の最大誘導を示している。ＧＡＤＤ４５γｍＲＮＡの発現レベルは、すべての細胞で最小であり、誘導レベルも、このファミリーの他の三つのメンバーほど有意ではなかった。ＧＡＤＤ４５γの場合、オートラジオグラフィーを１週間実施したが、他のｍＲＮＡについては、一晩実施したことに留意すべきである。対照又はＡｄ．ｍｄａ−７感染細胞のいずれも、ノーザンブロット分析によりＧＡＤＤ４５βの発現を検出することはできなかった。しかし、ＲＴ−ＰＣＲ分析では、ＧＡＤＤ４５β  ｍＲＮＡを検出したが、そのレベルはＡｄ．ｍｄａ−７感染後も変化しなかった。ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現レベルは、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後、いずれの細胞系でも変化しなかった。
【００５４】
ＦＯ−１細胞系で試験を実施することにより、Ａｄ．ｍｄａ−７感染と、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の誘導との関係をさらに詳しく調べた。ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｍｄａ−７に３日間感染させることにより、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の用量依存的誘導が得られた（図１Ｂ）。１、１０若しくは１００ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で、細胞を感染させると、ＧＡＤＤファミリーのｍＲＮＡの誘導レベルが段階的に増加した。１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７でＦＯ−１細胞を感染させると、それぞれのＧＡＤＤファミリー遺伝子のタンパク質レベルが増加した（図１Ｃ）。ＧＡＤＤ４５γに標的化する抗体が現在入手可能でないため、ＧＡＤＤファミリーメンバーのタンパク質発現は決定しなかった。ハウスキーピングタンパク質ＥＦ１αのレベルは、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後も不変であったが、これは、ＧＡＤＤファミリー遺伝子メンバーの誘導の特異性を証明している。
【００５５】
Ａｄ．ｍｄａ−７によるＧＡＤＤファミリー遺伝子の誘導は、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を介して行なわれる
Ａｄ．ｍｄａ−７感染後のＧＡＤＤファミリー遺伝子発現に関与するシグナル伝達経路を明確にするため、実験を行なった。ＧＡＤＤファミリー遺伝子は多様な刺激により誘導され、この誘導に関与する１つの主要な経路は、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を介している（Oh-hashiら、2001, Free Rad. Biol. Med. 30, 213-221; Kultzら、1998, J. Biol. Chem. 273, 13645-13651; Brennerら、1997, J. Biol. Chem. 272, 22173-22181）。ｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化は、様々な細胞型にアポトーシスを引き起こすため、ＧＡＤＤファミリー遺伝子のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導におけるこの経路の関与を調べた。ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｍｄａ−７に感染させた後、細胞をＳＢ２０３５８０、すなわち、選択的ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤で処理することにより、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の誘導への作用を決定した。また、ＳＢ２０３５８０は、この阻害剤が、メラノーマ細胞以外にも、数種の癌細胞型におけるＡｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死を選択的に阻止することがわかっていたために、これらの実験に選択した。用量応答実験から、ＦＯ−１細胞において、毒性を誘導しない最も有効なＳＢ２０３５８０濃度は１μＭであることがわかった。ＳＢ２０３５８０単独で処理しても、ＧＡＤＤファミリー遺伝子のいずれの基底発現にも影響を与えなかった（図２Ａ）。しかし、２及び３日後、ＳＢ２０３５８０は、これら遺伝子のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導を有意に阻害した。ＳＢ２０３５８０の阻害作用は、０．０１μＭで最小阻害及び１μＭで最大阻害を示し、用量依存的であった（図２Ａ）。ウエスタンブロティングからも、ＳＢ２０３５８０がＧＡＤＤ１５３、ＧＡＤＤ３４及びＧＡＤＤ４５αタンパク質のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導を阻害できることが明らかにされた（図２Ｂ）。
【００５６】
ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化にＡｄ．ｍｄａ−７感染が及ぼす作用を試験した（図２Ｃ）。ＦＯ−１細胞では、ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫのレベルは、Ａｄ．ｍｄａ−７感染から１〜３日後、有意に増加した（図２Ｃ）。対照的に、ＦＭ５１６細胞のＡｄ．ｍｄａ−７感染は、ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化を誘導しなかった。ＦＯ−１細胞と正常な不死メラニン細胞については、Ａｄ．ｖｅｃ及びＡｄ．ｍｄａ−７感染細胞で同量の全ｐ３８  ＭＡＰＫが検出された。ｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化により、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２を介した熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）２７のリン酸化が生じる（Rouseら、1994, Cell 78, 1027-1037）。Ａｄ．ｍｄａ−７によるｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化が下流標的のリン酸化も起こすか否かを確認するために、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後、ＦＯ−１細胞におけるホスホ−ＨＳＰ２７及び全ＨＳＰ２７の発現レベルを決定した。Ａｄ．ｍｄａ−７感染によってＨＳＰ２７のリン酸化が起こり（図２Ｅ）、このリン酸化は、ＳＢ２０３５８０での処理、又はドミナントネガティブｐ３８  ＭＡＰＫを発現する複製不能アデノウイルス（Raingeaudら、1995, J. Biol. Chem. 270, 7420-7426; Taherら、1999, Biochemistry 38, 13055-13062）、ＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）への感染により阻止することができた。Ａｄ．ｖｅｃ及びＡｄ．ｍｄａ−７感染のＦＯ−１細胞において同量の全ＨＳＰ２７が検出された。これらの結果は、ＦＯ−１細胞のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死におけるｐ３８  ＭＡＰＫ経路の関与をさらに裏づけるものである。
【００５７】
ｐ３８  ＭＡＰＫを遮断すると、ヒトメラノーマ細胞はｍｄａ−７誘導型アポトーシスから保護される
次に、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後、細胞生存能の調節におけるｐ３８  ＭＡＰＫ経路の関与を決定するために実験を行なった。これは、ＳＢ２０３５８０で薬理学的にｐ３８  ＭＡＰＫを遮断するか、又はＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）を用いることにより、達成された。ＦＯ−１細胞を、Ａｄ．ｍｄａ−７単独で又はＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）と一緒に感染させるか、あるいは、ＳＢ２０３５８０で処理して、４日後に、ＭＴＴアッセイにより細胞生存能を決定した。Ａｄ．ｍｄａ−７の感染によって、感染から４日後、細胞生存能は有意に低下（約７５％）した（図３）が、ＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）の感染又はＳＢ２０３５８０での処理によってｍｄａ−７阻害作用が逆転した。
【００５８】
また、一連の実験を実施して、ＳＢ２０３５８０又はＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）が、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型アポトーシスを阻害できるか否かを決定したが、これは、ＦＯ−１細胞におけるＤＮＡ断片化によりモニタリングした。ＦＯ−１細胞をＡｄ．ｍｄａ−７で感染させてから３日後、対照及びＳＢ２０３５８０処理細胞と比較して、有意なＤＮＡ断片化が起こった（図４Ａ）。しかし、ＳＢ２０３５８０での処理は、ＦＯ−１細胞におけるＡｄ．ｍｄａ−７媒介型ＤＮＡ断片化を有効に阻害した。これらの結果は、細胞周期の分析によって確認された（図４Ｂ）。Ａｄ．ｍｄａ−７感染から１日後、アポトーシスの誘導は全く認められなかった（図４Ｃ）。しかし、３日後には、有意な割合（約２０％）の細胞に、Ａｄ．ｍｄａ−７感染によるアポトーシスが起こった。ＳＢ２０３５８０での処理又はＡｄＣＭＶ−Ｆｌａｇｐ３８（ＡＧＦ）の同時感染は、Ａｄ．ｍｄａ−７によるアポトーシスの誘導を阻止した（図４Ｂ及び４Ｃ）。これらの結果は、Ａｄ．ｍｄａ−７が、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を介してＧＡＤＤファミリー遺伝子を誘導した後、これがアポトーシスを誘導することを示唆している。
【００５９】
ｐ３８  ＭＡＰＫの阻害は、抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２のＡｄ．ｍｄａ−７ダウンレギュレーションを阻止する
これまでの研究から、Ａｄ．ｍｄａ−７感染によって、ＦＯ−１細胞において抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２のダウンレギュレーションが起こることが証明されている（Lebedevaら、2002, Oncogene 21, 708-718）。従って、ＳＢ２０３５８０処理によって、ＢＣＬ−２タンパク質レベルに対するＡｄ．ｍｄａ−７の作用を阻止することができるか否かを決定した。実際、図２Ｄに示すように、ＳＢ２０３５８０での処理は、ＢＣＬ−２タンパク質のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型ダウンレギュレーションを阻止した。他のプロアポトーシス又は抗アポトーシスタンパク質のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型調節には何の作用も及ぼさなかったことから、ＳＢ２０３５８０のこの作用はＢＣＬ−２に特異的なものであった。
【００６０】
ＧＡＤＤファミリー遺伝子の遮断は、Ａｄ．ｍｄａ−７誘導によるアポトーシスを阻害する
Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型アポトーシスにおけるＧＡＤＤファミリー遺伝子の関与をアンチセンス手法でも確認した。様々なアンチセンス構築物を、単独又はＦＯ−１細胞と組み合わせてトランスフェクトした後、細胞にＡｄ．ｖｅｃ又はＡｄ．ｍｄａ−７を感染させた。４日後、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を分析した。図５に示すように、Ａｄ．ｖｅｃの感染と比較して、Ａｄ．ｍｄａ−７の感染では、生存細胞数が約７５％減少した。アンチセンス構築物単独のトランスフェクションでは、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死に対して小さいが有意な防御が認められた。対照的に、構築物のすべてを組み合わせると、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死に対する有意に高い防御が達成され、細胞数は、Ａｄ．ｖｅｃ感染細胞と比較して、約２５％しか減少しなかった（図５）。これらの結果から、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の協調過剰発現は、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型アポトーシスにおいて重要な役割を果たしていることがわかる。
【００６１】
論考
ｍｄａ−７／ＩＬ−２４は、正常細胞は保護しながら、癌細胞を死滅させる固有の能力のために、癌の遺伝子療法に極めて有望である（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405; Saekiら、2000, Gene Ther. 7, 2051-2057; Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10332-10337; Lebedevaら、2002, Oncogene 21, 708-718; Madireddiら、2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465, 239-261; Mhashilkarら、2001, Mol. Med. 7, 271-282; Jiangら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 9160-9165）。このために、上記遺伝子は、現在、フェーズＩ臨床試験の最中であり、初期実験では、弱い毒性が観察されただけで安全であり、腫瘍内に注射すると、腫瘍体積の高い割合においてアポトーシスを誘導することがわかった（Chadaら、2001, Cancer Gene Ther. 8, S3）。しかし、臨床段階に入ったものの、ｍｄａ−７作用の分子機構は依然として解明する余地がある。本発明の実験は、第１に、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４が最初に同定及びクローニングされた（Jiangら, 1995, Oncogene 11, 2477-2486）ヒトメラノーマ細胞の枠内で、Ａｄ．ｍｄａ−７のアポトーシス誘導作用を引き起こす特定のシグナル伝達経路を説明することを目的とする。
【００６２】
近年２つの報告で、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４がＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２２Ｒ２及びＩＬ２０Ｒ１／ＩＬ２０Ｒ２受容体複合体を介して結合及びシグナル伝達でき、この相互作用がＳＴＡＴ３のリン酸化を引き起こすことが証明されている（Wangら、2002, J. Biol. Chem. 277, 7341-7347; Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167, 3545-3549）。しかし、ＳＴＡＴ３リン酸化の生物学的関係性はわかっていない。本発明の実験により、メラノーマ細胞におけるＡｄ．ｍｄａ−７のアポトーシス作用が、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路により媒介されることを示す直接的証拠を提供する。ｐ３８  ＭＡＰＫ経路の活性化がアポトーシスの誘導と相関するという多数の例がある（Kummerら、1997, J. Biol. Chem. 272, 20490-20494; Xiaら、1995, Science 270, 1326-1331; Juoら、1997, Mol. Cell Biol. 17, 24-35; Schwengerら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2869-2873; Kawasakiら、1997, J. Biol. Chem. 272, 18518-18521; Yueら、1999, J. Biol. Chem. 274, 1479-1486; Valladaresら、2000, Endocrinol. 141, 4383-4395）。これらには、多様な薬剤及び実験条件（ＮＧＦの投与、Ｆａｓ結合、並びにＴＮＦα、セラミド、サリチル酸ナトリウム、ペロキシニトリト及びＵＶ照射への曝露など）により誘導されるｐ３８  ＭＡＰＫの同時活性化及びアポトーシスが含まれる（Oh-hashiら、2001, Free Rad. Biol. Med. 30, 213-221; Kummerら、1997, J. Biol. Chem. 272, 20490-20494; Xiaら、1995, Science 270, 1326-1331; Juoら、1997, Mol. Cell Biol. 17, 24-35; Schwengerら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2869-2873; Kawasakiら、1997, J. Biol. Chem. 272, 18518-18521; Yueら、1999, J. Biol. Chem. 274, 1479-1486; Valladaresら、2000, Endocrinol. 141, 4383-4395; Galibertら、2001, EMBO J. 20, 5022-5031）。加えて、選択的ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０は、サリチル酸ナトリウム誘導型ＦＳ−４線維芽細胞アポトーシス、グルタミン酸誘導型小脳顆粒細胞アポトーシス、血清欠乏誘導型Ｒａｔ−１細胞死、ＮＧＦ消退（withdrawal）誘導型ＰＣ１２細胞アポトーシス、ＴＮＦα媒介型ラット胎仔褐色脂肪細胞アポトーシス、並びにＴＬ１−誘導型ウシ肺動脈内皮細胞アポトーシスを阻止することができる（Kummer ら、1997, J. Biol. Chem. 272, 20490-20494; Schwengerら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2869-2873; Kawasakiら、1997, J. Biol. Chem. 272, 18518-18521; Yueら、1999, J. Biol. Chem. 274, 1479-1486）。ｐ３８  ＭＡＰＫによるＧＡＤＤファミリー遺伝子の活性化は、これらプロトコルのいくつかがアポトーシスを誘導する機構を説明しうる（Oh-hashiら、2001, Free Rad. Biol. Med. 30, 213-221; Kultzら、1998, J. Biol. Chem. 273, 13645-13651; Brennerら、1997, J. Biol. Chem. 272, 22173-22181）。Ｆａｓ又はセラミド誘導型アポトーシスは、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＧＡＤＤ１５３により媒介される（Brennerら、1997, J. Biol. Chem. 272, 22173-22181）。ペロキシニトリトによる酸化ストレスは、ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を介してＧＡＤＤ３４、ＧＡＤＤ４５及びＧＡＤＤ１５３を誘導し、神経芽腫細胞においてアポトーシスを誘導する（Oh-hashiら, 2001, Free Rad. Biol. Med. 30, 213-221）。
【００６３】
この実験では、ＧＡＤＤファミリー遺伝子が、ヒトメラノーマでＡｄ．ｍｄａ−７によりｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でアップレギュレートするが、正常な不死メラニン細胞では起こらないことが明らかになった。Ａｄ．ｍｄａ−７の感染後、ＧＡＤＤファミリー遺伝子の同様のアップレギュレーション（アポトーシス誘導と相関する）が、多形膠芽腫並びに乳癌及び前立腺癌細胞において観察されるが、それらの正常な細胞同等物では認められない。メラノーマ細胞におけるこのアップレギュレーションは、アポトーシスの誘導と関連しており、ＳＢ２０３５８０によって阻止された。ＧＡＤＤ１５３は、ｂｃｌ−２プロモーターの活性をダウンレギュレートすることによりそのアポトーシス作用を誘導することが明らかにされている（Novoaら、2001, J. Cell Biol. 153, 1011-1021）。Ａｄ．ｍｄａ−７感染によって、メラノーマを含む多種の癌細胞型においてＢＣＬ−２タンパク質のダウンレギュレーションが起こることがこれまでに認められている（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14400-14405; Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 10332-10337; Lebedevaら、2002, Oncogene 21, 708-718）。これらの観察結果に基づいて、ｂｃｌ−２ダウンレギュレーションが、ＧＡＤＤ１５３のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導により起こった場合には、ＳＢ２０３５８０で処理すればＢＣＬ−２タンパク質はその基底レベルに回復するであろうと考えられた。実際、図２Ｄに示したように、ＳＢ２０３５８０は、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型ＢＣＬ−２ダウンレギュレーションを阻害し、これは、Ａｄ．ｍｄａ−７、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＧＡＤＤ１５３及びｂｃｌ−２に関与するシグナル伝達経路を示している（図６）。ヒトメラノーマ細胞でのＡｄ．ｍｄａ−７媒介型アポトーシスにおけるＧＡＤＤファミリー遺伝子の役割は、ＧＡＤＤ遺伝子の阻害（単独又は組み合わせて）によって、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型アポトーシスが阻止されるという観察結果によりさらに信頼性が増す。これらの結果から、Ａｄ．ｍｄａ−７によるヒトメラノーマ細胞におけるアポトーシス誘導は、単に成長停止及びアポトーシスの結果として起こるＧＡＤＤファミリー遺伝子のアップレギュレーションよりも、ＧＡＤＤファミリー遺伝子によって媒介されることがわかる。
【００６４】
Ａｄ．ｍｄａ−７が正常細胞では有害作用を何ら誘発しないのかという疑問は、非常に意義深い。これまでの研究から、Ａｄ．ｍｄａ−７が正常なメラニン細胞及び不死ＦＭ５１６メラニン細胞に有効に感染すると、ＭＤＡ−７タンパク質の産生が起こり、これが培地に分泌されることが証明されている（Lebedevaら, 2002, Oncogene 21, 708-718）。ＤＮＡ損傷物質であるメチルメタンスルホネートは、ＦＭ５１６細胞においてＧＡＤＤファミリー遺伝子を誘導することから、ＦＭ５１６細胞がＧＡＤＤ誘導経路に欠陥を有するわけではないようである。ＦＭ５１６細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させても、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化は起こらないが、ＦＯ−１細胞ではこの作用が観察され、ＦＯ−１細胞はｍｄａ−７によりアポトーシスを受けるように誘導される。これは、Ａｄ．ｍｄａ−７に対するＦＭ５１６細胞の耐性を部分的に説明しうるが、ｐ３８  ＭＡＰＫがこれらの細胞でリン酸化されない理由はわからない。近年の報告では、正常細胞と比較して、癌の形質転換細胞ではｐ３８  ＭＡＰＫ経路が増加し、これら腫瘍細胞の遺伝毒性ストレスに対する感受性を高めることが証明されている（Benharら, 2001, Mol. Cell Biol. 21, 6913-6926）。この現象によって、Ａｄ．ｍｄａ−７に対するＦＭ５１６細胞の耐性が説明されると考えられる。ＦＭ５１６細胞におけるＧＡＤＤ３４ｍＲＮＡ発現の基底レベルは、メラノーマ細胞系のそれよりも高かったが、ＧＡＤＤ１５３はそうではなかった（図１Ａ）。ＧＡＤＤ３４は、変性タンパク質応答過程でＧＡＤＤ１５３の発現の負の調節因子として機能することがわかっており（Novoaら,2001,  J. Cell Biol. 153, 1011-1021）、これによって、ＦＭ５１６細胞におけるこれら２つのＧＡＤＤファミリーメンバー遺伝子のレベルの違いを説明できるかもしれない。ＧＡＤＤ３４及びＧＡＤＤ１５３の両方とも、単独で又は組み合わせてアポトーシスを誘導できるが、特定の状況下では、これらは、細胞内生存能のチェックアンドバランスループ（check and balance loop）の一部をなすことも考えられる。ＦＭ５１６細胞におけるＧＡＤＤ３４の高い基底レベルが、ｍｄａ−７媒介型細胞死に対するある程度の固有耐性を賦与するという可能性もある。
【実施例２】
【００６５】
７．実施例２
材料及び方法
細胞系及び培養条件：
ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、ＨＯ−１（ヒト黒色性転移性メラノーマ）、及びＣ８１６１（ヒト無色素性メラノーマ）、ＦＭ−５１６（ＳＶ４０ Ｔ抗原により不死化されたヒトメラニン細胞）、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５（ヒト前立腺癌）、ｈＴＥＲＴ不死化ヒト胎児星状細胞（Suら、2003, Oncogene 22:1164-1180）、２ｆＴＧＨ（ヒト線維肉腫）並びに対応する突然変異亜系Ｕ１Ａ、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ａ及びＵＳＡ（Darnellら、1994, Science 264: 1415-1421）を、湿潤５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で１０％ＦＢＳを添加したダルベッコの改変イーグル培地／Ｆ１２中で増殖させた。１０％ＦＢＳ、抗生物質及びＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でヒト膵臓癌細胞系（ＢｘＰＣ−３、ＡｓＰＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、及びＰＡＮＣ−１）を維持した。ラット胚線維芽細胞ＣＲＥＦ−ｒａｓ（Su ら、1993, Oncogene 22:1164-1180; Suら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 9125-9130; Suら、2002, J. Cell Physiol. 192: 34-44）、正常なヒト乳房不死化上皮細胞ＨＢＬ−１００、並びにヒト乳癌由来系ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で増殖させた。
【００６６】
ウイルス感染：
ｍｄａ−７／ＩＬ−２４を発現する複製欠陥Ａｄ．ｍｄａ−７と、外性遺伝子のない対応する空のアデノウイルスベクター（対照として用いる、Ａｄベクター又はＡｄ．ｖｅｃ）については、Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14400-14405により以前記載されている。ウイルスストック調製物を１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈し、表示の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞単層に接種した。１５分毎に１５秒間回転攪拌を行ないながら、３７℃で２時間のウイルス吸着後、ウイルス接種材料を除去し、感染した単層培養物に１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加した後、表示の時間にわたり３７℃でインキュベーションを実施した。
【００６７】
ＭＴＴアッセイ：
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、９６ウェルディッシュ（１×１０３細胞／ウェル）に細胞を播き、１２時間付着させた後、Ａｄ．ｍｄａ−７感染（１００又は１５０ＭＯＩ）を実施した。感染から４時間後、阻害剤による処理を開始した。５〜７日の処理期間の間、培地は２回、３日及び６日後に新鮮な阻害剤を含む培地と取り替えた。記載されている（Lebedevaら, 2000, 2002）ように、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）染色により、細胞増殖と生存細胞数をモニタリングした。その結果、５９５ｎｍで測定した吸光度は生存細胞の数と直接比例する。
【００６８】
アネキシン−Ｖ結合アッセイ：
細胞をトリプシン処理してから、完全培地で１回洗浄した。細胞のアリコート（５×１０５）を完全培地（０．５ｍｌ）中に再懸濁させ、製造者の指示に従ってＦＩＴＣ標識アネキシン−Ｖ（Oncogene Research Products, Boston, MA）で染色した。アネキシン−Ｖでの染色後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をサンプルに添加することにより、後期アポトーシス及び壊死細胞を排除した。染色後直ちにＦＡＣＳアッセイを実施した。アポトーシス（Ａ０）画分における細胞の割合（％）を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Becton Dickinson）を用いて計算した。
【００６９】
ＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２ＲのＲＴ−ＰＣＲ：
ＲＮＡｅａｓｙキット（Qiagen Inc. Valencia, CA）を使用し、グアニジンイソチオシアネート溶解を用いて、１０ｃｍ皿から全ＲＮＡを単離した。以前記載されているように、オリゴ（ｄＴ）プライマーを含む５μの全ＲＮＡに対して逆転写を実施した。記載されている（Blumbergら、2001, Cell 104: 9-19）ように、５ｎｇの全ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを、ＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより３５サイクル増幅した。得られた産物を電気泳動後、臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲル上で分析した。
【００７０】
ノーザンブロット分析：
製造者のプロトコルに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて、細胞から全ＲＮＡを抽出してから、記載されている（Suら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 9125-9130）ように、ノーザンブロッティングを実施した。用いたｃＤＮＡプローブは全長ヒトＧＡＤＤ１５３、全長ヒトＧＡＤＤ４５α、β及びγ、ヒトＧＡＤＤ３４からの５００ｂｐ断片、並びに全長ヒトＧＡＰＤＨであった。
【００７１】
結果
ＴＫ阻害剤で細胞を処理しても、ｍｄａ−７細胞死は阻止されない
チロシンキナーゼの２つの阻害剤である、ゲニステイン（Akiyamaら、1987, J. Biol. Chem. 262: 5592-5595; Williamsら、2000, Williamsら、2000, Cytokine 12: 934-943）とチルホスチンＡＧ１８（Gazitら、1989, J. Med. Chem. 32: 2344-2352; Catlett-Falconeら、1999, Immunity 10: 105-115; Niら、2000, Cancer Res. 60: 1225-1228）を用いて、チロシンキナーゼ媒介型リン酸化がＡｄ．ｍｄａ−７誘導による細胞死の調節に関与しているか否かを決定した。ＪＡＫ選択的阻害剤であるＡＧ４９０（ＳＴＡＴ３シグナル伝達を有効に阻止することがわかっている）（Catlett-Falconeら、1999, Immunity 10: 105-115; Nielsenら、1999, Leukemia 13: 735-738; Wangら、1999, J. Immunol. 162: 3897-3904; Niら、2000, Cancer Res. 60: 1225-1228）がＡｄ．ｍｄａ−７細胞傷害活性を阻害できるか否かも、ｍｄａ−７／ＩＬ２４によるＳＴＡＴ３活性化の報告（Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167: 3545-3549; Parrish-Novakら、2002, J. Biol. Chem. 277: 47517-47523; Pataerら、2002, Cancer Res. 62: 2239-2243; Wang ら、2002, J. Biol. Chem. 277: 7341-7347）に基づいて試験した。４つのヒト細胞系、Ｃ８１６１、ＤＵ−１４５、ＨＯ−１およびＦＭ−５１６を感染から４時間後、阻害剤の非存在または存在下で増殖させた。図７Ａに示したデータから、ＴＫ活性化を阻害する濃度のＴＫ阻害剤で各種細胞系を処理しても、Ａｄ．ｍｄａ−７が、感受性ヒト腫瘍由来細胞系（Ｃ８１６１、ＤＵ−１４５、ＨＯ−１）を死滅させる能力は妨害されないことが明らかであるが、これまで報告されているように、不死化した正常ヒトメラニン細胞（ＦＭ−５１６）の生存能には影響を与えない（Huangら、2001, Oncogene 20: 7051-7063; Lebedevaら、2002, Oncogene 21: 708-718）。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ応答性リポーターを用いて、各阻害剤の活性を個別に試験することにより、それらの活性を確認した。これまで記載されている（Madireddiら、2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465: 239-261; Huangら、2001, Oncogene 20: 7051-7063）ように、Ａｄ．ｍｄａ−７感染によって、標準以下（sub）のＧ０／Ｇ１（Ａ０）ＤＮＡ含量を有する細胞の比率の増加が表すように、アポトーシスを受けるＤＵ−１４５細胞の比率の時間依存的増加が誘導された（図７Ｂ、ＤＵ−１４５、Ａｄ．ｍｄａ−７、上部パネル）。阻害剤が存在したとき、全体的なプロフィール変化は認められなかった（図７Ｂ；ゲニステイン、ＡＧ４９０及びＡＧ１８を有するＡｄ．ｖｅｃ及びＡｄ．ｍｄａ−７パネル）。同様に、Ａｄベクター又はＡｄ．ｍｄａ−７に感染したＦＭ−５１６には、アポトーシス細胞の割合（％）の有意な変化は認められなかった（図７Ｂ、ＦＭ−５１６とＤＵ−１４５を比較、同様に処理された細胞に対応するパネル）。従って、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性を遮断する阻害剤の存在下で、感受性細胞系をＡｄ．ｍｄａ−７で処理しても、細胞死を阻止しないが、これは、最近記載されている（Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167: 3545-3549; Caudellら、2002, J. Immunol. 168: 6041-6046; Wangら、2002, J. Biol. Chem. 277: 7341-7347）ように、上記遺伝子が呈示するサイトカイン媒介作用から上記活性が独立していることを意味している。
【００７２】
ＩＬ−２０／ＩＬ−２２受容体発現と、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４に対する感受性との相関性の欠如
近年の研究では、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４が、機能的ヘテロ二量体ＩＬ−２０（ＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２）及びＩＬ−２２（ＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０Ｒ２）受容体複合体と結合し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードを活性化するが、その際、主にＳＴＡＴ３を活性化し、これより低い程度でＳＴＡＴ１を活性化することが明らかにされている（Parrish-Novakら、2002, J. Biol. Chem. 277: 47517-47523; Pataerら、2002, Cancer Res. 62: 2239-2243）。感受性及び耐性細胞におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒの発現パターンをＲＴ−ＰＣＲ分析により決定し、正常なヒト組織由来のＲＮＡに関するこれまでの知見（Blumbergら、2001, Cell 104: 9-19）を進展させた。耐性の不死化正常（図８Ａ、レーン：星状細胞及びＦＭ−５１６メラニン細胞）並びに感受性ヒト癌細胞系（図８Ａ、レーン：ＤＵ−１４５、ＨｅＬａ、Ｈ４−ＧＢＭ、Ｃ８１６１及びＨＯ−１）のパネルは、それぞれの受容体を発現する。ＰＣＲを３５サイクル実施したが、これによって、非常に低い発現レベルの検出が可能になり、発現が所与のサンプルにおいて存在するか否かを決定することができた。示した結果は、各細胞系について、様々なＲＮＡ調製物との少なくとも３つの独立したＲＴ−ＰＣＲ反応を示している。癌Ｒａｓ形質転換ラット胚線維芽細胞系（図８ａ、レーンＣＲＥＦ−ｒａｓ）にＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、反応の特異性を決定したが、これは、他のラット線維芽細胞系で明らかにされている（Zhangら、2000, J. Biol. Chem. 275: 24436-24443）ように、種同士の受容体配列の保存がないために、陰性であった。一般に、耐性及び感受性細胞系のいずれも、検出可能なレベルの受容体ｍＲＮＡを発現することから、Ａｄ．ｍｄａ−７に対する耐性は、受容体発現とは独立しており（図８Ａ、レーン：星状細胞及びＦＭ−５１６）、耐性は、図８Ａに記載した細胞系における受容体発現の欠失によるものではないようだ。
【００７３】
分析を展開するため、ヒト乳癌及び膵臓癌由来の細胞系のパネルにＲＴ−ＰＣＲを実施することにより、それらの受容体発現プロフィールを決定した（図８Ｂ）。本発明者らは、以前、不死化したヒト乳房上皮細胞系ＨＢＬ−１００がＡｄ．ｍｄａ−７誘導による細胞死に耐性であると報告した（Suら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 14400-14405）。この系は、感受性の系であるＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３及びＴ４７Ｄ（図８Ｂ）がそうであるように、ＩＬ−２０Ｒ１及びＩＬ−２０Ｒ２ ｍＲＮＡを発現する（図８Ｂ）。ヒト膵臓癌由来の系ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１は、Ａｄ．ｍｄａ−７感受性に関して特殊なケースを呈示する（以下に記載）。これらの系は、受容体ｍＲＮＡに関して可変の発現パターンを示し、ＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２若しくはＩＬ−２２Ｒ ｍＲＮＡのいずれも発現しない（ＡｓＰＣ−１）、ＩＬ−２０Ｒ２を発現しない（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）、あるいは、三つの受容体をすべて発現する（ＢｘＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１）かのいずれかである（図２Ｂ）。全体的な陽性又は陰性受容体の遺伝子発現に関してのみ結論が得られるが、すでに指摘したように、相対レベルの違いについては得られない。
【００７４】
ほとんどの他のヒト癌由来細胞系とは違って、膵臓癌細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させても、それらの増殖速度に有意な変化は起こらず、アポトーシスも誘導されない（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）。しかし、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子（８５〜９５％の膵臓癌において突然変異した）をターゲッティングするアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はアンチセンス発現アデノウイルスとＡｄ．ｍｄａ−７を組み合わせると、増殖の劇的な抑制、並びにアポトーシスの誘導による細胞生存能の低減が誘導される（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）。突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞では、プログラムされた細胞死は、発現及びＭＤＡ−７／ＩＬ−２４及びＢＡＸタンパク質の増加、並びにＢＡＸ対ＢＣＬ−２タンパク質比の増加と相関する（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）。受容体発現の欠失はＡｓＰＣ−１細胞に一貫して観察された（図８Ｂ）ため、これらを用いて、感染後の受容体アップレギュレーションの結果として細胞の死が起こるか否かを決定した。Ａｄベクター、Ａｄ．ｍｄａ−７、Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳ、又は後者の２つのウイルスの組み合わせでＡｓＰＣ−１細胞に感染させると、非感染の対照細胞と比較して、アデノウイルス感染に対する全体応答として、ＩＬ−２０８１ ｍＲＮＡの明らかな誘導が起こったが、ＩＬ−２０Ｒ２又はＩＬ−２２Ｒは検出されないままであった（図９Ａ）。この結果から、細胞が細胞死に対し感受性になる条件下では、機能的ＩＬ−２０又はＩＬ−２２受容体の再構成又は（再）誘導がなくなることがわかる。右側のパネル（図９Ｂ）は、個々の受容体ＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性及び信頼性の検査を目的とする、ＤＵ−１４５及びＦＭ−５１６（陽性）並びにＣＲＥＦ−ｒａｓ（陰性）ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ反応（並行して実施）を示す。この観察結果によって、所与の細胞型においてＩＬ−２０又はＩＬ−２２受容体遺伝子発現が起こるか否かとは無関係にアポトーシス（又は抵抗）が起こることから、所与の細胞系の感受性と受容体発現のパターンとの間に相関性はないことがさらに明らかにされる。現時点では特異的抗体を入手できないため、これらの知見をタンパク質レベルで確認することはできない。しかし、高感度のＲＴ−ＰＣＲ方法による遺伝子発現の非存在は、タンパク質レベルでの対応する受容体の非発現と相関していると考えられる。
【００７５】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に欠陥がある突然変異細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７によるアポトーシスの誘導
上記とは別の全く異なる実験手法を用いて、Ａｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の特定の要件をさらに詳しく調べた。ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達が機能的に欠陥を有する細胞系を細胞死に対する感受性について分析した。ヒト線維肉腫細胞系２ｆＴＧＨ（親）と、該細胞系由来の対応する突然変異細胞系を使用したが、これらには以下のものが含まれる：Ｕ１Ａ（Ｔｙｋ２を欠失）、Ｕ３Ａ（ＩＦＮ−非応答性、ＳＴＡＴ１を欠失）、Ｕ４Ａ（ＪＡＫ１を欠失）及びＵＳＡ（ＩＦＮＡＲ２ｃを欠失）（G. Stark, Cleveland Clinic, OHにより寄贈）。ＳＴＡＴ３を発現しないヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３（Spiotto及びChung, 2000, Prostate 42: 88-98）を用いて、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４媒介型経路の成分の既知スペクトルを完成した。最初に、２ｆＴＧＨ系列の細胞系におけるＩＬ２０／ＩＬ２２受容体遺伝子発現のプロフィールを他の癌細胞型について前記のように決定した。図１０は、すべての系がｍｄａ−７／ＩＬ−２４の同族（cognate）の受容体の発現を有することを示しており、このことは、細胞が細胞死に対して耐性であった場合、これが、受容体発現の欠失によるものではないことを意味している。これらの細胞系をＡｄ．ｍｄａ−７に感染させた後、ＭＴＴ細胞増殖アッセイにより生存能を分析した。すべての細胞系はＡｄ．ｍｄａ−７に対して感受性であることがわかった（図１１、ＡｄベクターとＡｄ．ｍｄａ−７を比較）。Ａｄ．ｍｄａ−７は、２ｆＴＧＨ、Ｕ１Ａ、Ｕ３Ａ、Ｕ４Ａ、Ｕ５Ａ及びＰＣ−３細胞の比率の一時的増加を誘導したが、これは、標準以下（sub）のＧ０／Ｇ１（Ａ０）ＤＮＡ含量を含む細胞の比率の増加によって表される（表１）。加えて、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤が存在すると、プロフィール変化は全く観察されなかった（図１１及び表１）。対照的に、Ａｄベクターに感染させた様々な細胞では、アポトーシス細胞の比率に有意な変化は見られなかった（図１１及び表１）。このデータは、被検細胞がＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達成分に不活性化突然変異を有することから、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４により誘導されたＪＡＫ／ＳＴＡＴの活性化（Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167: 3545-3549; Parrish-Novakら、J. Biol. Chem. 277: 47517-47523, 2002; Pataerら、2002, Cancer Res. 62: 2239-2243; Wangら、2002, J. Biol. Chem. 277: 7341-7347）は、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後に誘導された細胞アポトーシスとは区別できることを確認する独立した手段を提供する。
【００７６】
ｍｄａ−７媒介型アポトーシス誘導におけるｐ３８ＭＡＰＫの関与
前記第６節に記載されているように、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後、ｐ３８ＭＡＰＫをメラノーマ細胞系で活性化させる。特異的ｐ３８ＭＡＰＫシグナル経路阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いて、ｐ３８ＭＡＰＫが、広範なスペクトルの細胞系においてＭＤＡ−７／ＩＬ−２４誘導型細胞死に何らかの役割を果たすか否かを調べた（Daviesら、2000, Biochem. J. 351: 95-105）。メラノーマ細胞系（Ｃ８１６１）と前立腺細胞系（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）において、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後に細胞死の部分的阻害が認められた（図１２）。防御の程度は各細胞系で異なっていたが、各ケースにおいてある程度の防御が観察された。これに対し、２ｆＴＧＨ系列の細胞系では、ＳＢ２０３５８０による細胞死の阻止は観察されなかった（図１３Ａ）。２ｆＴＧＨ及び派生細胞系の細胞死のＳＢ２０３５８０による阻害がないことは、２ｆＴＧＨ系列の細胞系におけるＧＡＤＤファミリー遺伝子発現の高い基底発現レベルと相関していた（図１３Ｂ）。これらの細胞のＡｄ．ｍｄａ−７感染後、ＧＡＤＤファミリー遺伝子発現はこれ以上増強されなかった（図１３Ｂ）。細胞死がＧＡＤＤ遺伝子誘導と相関していたという前記第６節で記載した観察結果によれば、比較的高レベルのＧＡＤＤをすでに発現する細胞は、これら遺伝子が誘導するアポトーシスに対する耐性を生み出したとも考えられる。ＧＡＤＤ誘導は、部分的にｐ３８ＭＡＰＫ依存性であるため、この経路の遮断による防御は、恐らく２ｆＴＧＨ特異的状況に何の作用も及ぼさなかった可能性もある。また、さらに重要なことには、これらの結果は、文献にこれまで蓄積した報告（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337; Kawabeら、2002, Mol. Ther. 6: 637-644; Lebedevaら、2002, Oncogene 21: 708-718; Pataerら、2002, Cancer Res. 62: 2239-2243; Saeki ら、2002, Oncogene 21: 4558-4566）が示すように、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４が、細胞型依存的に、多数の経路の誘導により、アポトーシスを誘導することを示唆している。
【００７７】
論考
近年の実験結果により、ＭＤＡ−７タンパク質は、ＩＬ２０（ＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０８２）及びＩＬ−２２（ＩＬ−２２Ｒ／ＩＬ−２０８２）受容体複合体と結合することができ、その結果、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化が起こることが証明されている（Kotenko, 2002, Cytokine Growth Factor Rev. 13: 223-240; Sarkarら、2002, BioTechniques, Oct. Suppl.: 30-39; Sauaneら、2003, Cytokine and Growth Factor Reviews 14: 35-51）。これらの受容体へのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４リガンドの結合が、主としてＳＴＡＴ３媒介型シグナル伝達を活性化させることがわかっている（Dumoutierら、2001, J. Immunol. 167: 3545-3549; Caudellら、2002; J. Immunol. 168: 6041-6046 Pataerら、2002）。
【００７８】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ調節異常に関連する最も頻繁な臨床疾患発症の相関は、腫瘍の変化（主としてリンパ造血）を含むが、Ａｄ．ｍｄａ−７感染後見られる抗増殖的アポトーシス誘導作用を含むものではない。特に、ＳＴＡＴ３は、最も頻繁に悪性疾患の発生及び維持に関与しているようである。ＳＴＡＴ特異的過剰活性化の例が、多発性骨髄腫、菌状息肉腫（Ｔ細胞皮膚リンパ腫）及び慢性骨髄性白血病（ＣＮＬ）に見とめられている（Chaffら、1997, J. Immunol. 159: 4720-4728; Catlett-Falconeら、1999, Immunity 10: 105-115; Nielsenら、1999, Leukemia 13: 735-738）。ＳＴＡＴ３はまた、菌状息肉腫細胞中のチロシンで構成的にリン酸化されることがわかっており、ＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合を阻害すると、アポトーシスの誘導が起こる（Nielsenら、1999, Leukemia 13: 735-738）。近年の知見により、ＳＴＡＴ３の構成的活性化が原発性前立腺癌に頻繁に起こり、これが前立腺癌細胞の増殖及び生存に不可欠であることが明らかにされている（Moraら、2002, Cancer Res. 62: 6659-6666）。これらの観察結果から、感染から４８時間後ＳＴＡＴ３活性を誘導することができるＡｄ．ｍｄａ−７が、この経路を介したアポトーシスを誘導するのを認めることは難しい。従って、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４によるサイトカイン活性関連ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性化と、その抗形質転換細胞活性との間に矛盾があるという可能性について、本節に記載した実験で追究した。
【００７９】
本明細書に示す結果は、ＴＫ活性化がＡｄ．ｍｄａ−７誘導型アポトーシスに必要ではないことを示す独立した系統の証拠を提供する。特に、２つの化学的に無関係のＴＫ阻害剤（ゲニステイン及びＡ１８）又はＪＡＫ選択的阻害剤（ＡＧ４９０）に様々な細胞を暴露しても、ＤＵ−１４５、ＨＯ−１及びＣ８１６１を含む様々な細胞系においてＡｄ．ｍｄａ−７誘導型アポトーシスが阻止されなかった。１５０ｐ．ｆ．ｕ．／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７に暴露したＪＡＫ／ＳＴＡＴ欠陥細胞系（Darnellら、1994, Science 264: 1415-1421）が、不死化したメラニン細胞（ＦＭ−１５６）と星状細胞が耐性である実験条件下で、感染後、細胞死に同様に感受性であると証明された際にも、同様の結果が得られた。この予想外の結果を初めて確認後、インターフェロン応答性ルシフェラーゼリポーター構築物（Ｉ型（ＩＦＮ−α及びβ）とＩＩ型／ＧＡＳ（ＩＦＮ−γ）を含む）を用いて、ゲニステイン、ＡＧ１８及びＡＧ４９０のＴＫ又はＪＡＫ阻害能力をそれぞれ試験することにより、本発明者らの実験には機能的阻害剤が用いられていたことを確認した。阻害剤で処理すると、両タイプのＩＦＮリポーターの活性は、トランスフェクション（Ａｄ．ｍｄａ−７活性に用いた条件と同様）後、長い暴露時間（４８〜７２時間）にわたって抑制された。これによって、ＴＫ活性が、Ａｄ．ｍｄａ−７誘導による細胞死に不可欠な役割を果たしていないことがさらに確認された。
【００８０】
ＴＫ阻害剤で得られた結果を考慮して、ＩＬ−２０及びＩＬ−２２受容体遺伝子発現についての実験を、Ａｄ．ｍｄａ−７感染に対し既知の応答を有する数種の細胞系において実施した。ＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒ特異的プライマーを用いて、ＤＵ−１４５（前立腺、感受性）、ＨｅＬａ（子宮頚、感受性）、ＦＭ−５１６（不死化メラニン細胞、耐性）、ヒト胎児星状細胞（耐性）、Ｈ４神経膠腫（感受性）及びＣＲＥＦ−ｒａｓ（不死クローン化ラット胚線維芽細胞、陰性対照）由来のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより分析したところ、Ａｄ．ｍｄａ−７による細胞死に対する細胞の耐性が、適切な受容体発現の欠失によるものではないことがわかった。耐性細胞系であるＦＭ−５１６（不死化メラニン細胞）、ＢｘＰＣ−３（膵臓癌細胞）及び不死化ヒト星状細胞は、感受性細胞系に見られるものと類似した受容体ｍＲＮＡ発現パターンを示した。所与の細胞状況における受容体の検出により、耐性が１以上の「非機能的」受容体分子の発現によるものであった可能性も排除されない。これに対し、Ａｄ．ｍｄａ−７による細胞死に感受性の膵細胞系ＡｓＰＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１は、内在性の突然変異したＫ−ｒａｓレベルを除去して初めて（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）、基底レベルの機能的受容体複合体ｍＲＮＡ発現（ＡｓＰＣ−１）又は３つの受容体遺伝子全ての頑健な発現（ＰＡＮＧ−１）の完全な非存在を示す。ＡｓＰＣ−１における受容体遺伝子誘導の可能性を膵細胞系で調べたところ、この系は、基底レベルの受容体ｍＲＮＡ発現を示さなかった。Ａｄベクター、Ａｄ．ｍｄａ−７による感染、又はＡｄ．ｍｄａ−７及びアンチセンスＫ−ｒａｓ処理の組み合わせによって、ＡｓＰＣ−１細胞において感染から様々な時間経過後に、ＩＬ−２０Ｒ１ ｍＲＮＡ発現を誘発することが観察された。しかし、これは、機能的ｍｄａ−７／ＩＬ−２４受容体を再構成せず（Parrish-Novakら、2002, J. Biol. Chem. 277: 47517-47523）、組み合わせ処理の後にやはり死滅した（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）。スペクトルの他端では、野生型Ｋ−ｒａｓ発現系であるＢｘＰＣ−３は、３つの受容体サブユニット全ての明らかに強力な発現にもかかわらず、アンチセンスＫ−ｒａｓ発現ベクターの存在または非存在下のいずれでもＡｄ．ｍｄａ−７による細胞死に耐性であり続けた（Suら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 10332-10337）。この実験から、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４の既知受容体は、分子が、形質転換細胞においてアポトーシスを誘導する能力に有意な役割を果たさないようであることがわかる。このデータは、タンパク質レベルで受容体サブユニット発現の具体的証拠がなくても、いくつかの細胞が、高感度ＲＴ−ＰＣＲ法による検出可能なレベルの一方又は両方の受容体鎖ｍＲＮＡの非存在下で感受性であったことにより確認される。
【００８１】
ｍｄａ−７／ＩＬ−２４媒介型細胞死がＪＡＫ／ＳＴＡＴから独立していることを確立する、実験による別の手段は、シグナル伝達経路の各種成分を欠失した細胞を用いることにより達成された。Ｔｙｋ２突然変異体（Ｕ１Ａ）、ＳＴＡＴ１突然変異体（Ｕ３Ａ）、ＪＡＫ１突然変異（Ｕ４Ａ）及び欠陥ＳＴＡＴ３（ＰＣ−３）を含む突然変異細胞系を用いて、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４媒介型経路成分の既知スペクトルを完成した。全ての細胞系がＡｄ．ｍｄａ−７に感受性であることがわかった。この実験の結論は、全ての突然変異細胞系において、ＴＫ阻害剤の存在または非存在下でほぼ同様の速度論でアポトーシスが誘導された観察結果によりさらに確実になった。
【００８２】
独立した実験手法：すなわち（ｉ）特異的ＪＡＫ／ＳＴＡＴ及びＴＫ阻害剤の細胞死に対する作用、（ｉｉ）受容体遺伝子発現プロフィールの決定、（ｉｉｉ）ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路が突然変異した細胞系の分析、を含む手法を用いて、Ａｄ．ｍｄａ−７アポトーシス誘導に対する癌細胞の感受性につながるシグナル伝達事象が明らかにＪＡＫ／ＳＴＡＴとは独立していることを証明した。これらの結果から、Ａｄ．ｍｄａ−７細胞死を媒介する別の受容体複合体が存在する可能性が浮上し、これは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ伝達機構とは部分的にのみ依存性である、及び／又は完全に独立していると考えられ、あるいは、形質転換細胞の死が受容体と独立の経路を介して起こる可能性もある。さらに、様々な細胞系のＡｄ．ｍｄａ−７感染は複数の独立経路を誘発すると証明されていることにより、本発明者らの知見が間接的に確認される。Ａｄ．ｍｄａ−７の感染は、プロテインキナーゼＲ経路（Pataerら、2002, Cancer Res. 62: 2239-2243）、成長停止及びＤＮＡ損傷誘導性（ＧＡＤＤ）遺伝子（第６節、前記）、並びにＪＮＫを含むＭＡＰＫ経路の成分（Kawabe ら、2002, Mol. Ther. 6: 637-644）、並びにｐ３８ＭＡＰＫ（以下参照）を活性化する。上記感染はまた、血管新生を阻害する（Saekiら、2002, Oncogene 21: 4558-4566）。これらの様々な活性は、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４の潜在的サイトカイン関連特性と矛盾するか、あるいは、完全にこれらによるかと思われる。加えて、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を用いてＡｄ．ｍｄａ−７により誘導された細胞死を部分的に阻止する能力、並びに野生型Ｋ−ｒａｓ膵細胞系（ＢｘＰＣ−３）の耐性を証明する、本第7節及び前記第６節に示したデータは、ｍｄａ−７／ＩＬ−２４誘導による細胞死の活性に、ｒａｓシグナル伝達事象の調節異常が潜在的に重要な役割を果たしていることを意味している。
【００８３】
様々な刊行物を本明細書で引用するが、それらの内容は、参照として全体を本明細書に組み込むものとする。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ａｄ．ｍｄａ−７の感染は、メラノーマ細胞において時間及び用量依存的にＧＡＤＤファミリーの遺伝子を誘導するが、正常な不死メラニン細胞では誘導しない。
【図２】ＳＢ２０３５８０での処理は、ＧＡＤＤファミリーの遺伝子のＡｄ．ｍｄａ−７媒介型誘導、ｐ３８  ＭＡＰＫリン酸化及びＢＣＬ−２タンパク質ダウンレギュレーションを阻害する。
【図３】ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を阻害すると、ＦＯ−１メラノーマ細胞はＡｄ．ｍｄａ−７媒介型細胞死から保護される。
【図４】ｐ３８  ＭＡＰＫ経路を阻害すると、細胞はｍｄａ−７媒介型アポトーシスから保護される。
【図５】ＧＡＤＤファミリーの遺伝子を阻害すると、ＦＯ−１メラノーマ細胞はｍｄａ−７媒介型細胞死から保護される。
【図６Ａ】ｐ３８  ＭＡＰＫ経路及びＧＡＤＤファミリーメンバー遺伝子の、Ａｄ．ｍｄａ−７によるヒトメラノーマ細胞におけるアポトーシスの媒介への関与を示す推定モデル。
【図６Ｂ】癌細胞及び免疫系におけるＡｄ．ｍｄａ−７及びＭＤＡ−７活性に関連するシグナル伝達経路の全体図。
【図７Ａ】ｍｄａ−７誘導のアポトーシスにプロテインチロシンキナーゼ阻害剤が及ぼす作用。
【図７Ｂ】ｍｄａ−７誘導のアポトーシスにプロテインチロシンキナーゼ阻害剤が及ぼす作用。
【図８】様々な細胞系におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ２２Ｒの発現パターン。
【図９】様々な処理プロトコル後のＡｓＰＣ−１細胞系におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒの発現パターン。
【図１０】ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の成分について突然変異したヒト線維肉腫細胞におけるＩＬ−２０Ｒ１、ＩＬ−２０Ｒ２及びＩＬ−２２Ｒの発現パターン。
【図１１】ＪＡＫ／ＳＴＡＴ欠陥細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７感染後のアポトーシス活性。
【図１２】様々な細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７誘導細胞死にｐ３８ＭＡＰＫが及ぼす作用。
【図１３】２ｆ  ＴＧＨ系列の細胞系におけるＡｄ．ｍｄａ−７誘導細胞死にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤及びＧＡＤＤファミリーの遺伝子発現が及ぼす作用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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