(57)【要約】本発明は、緑内障、または患者の眼の上昇眼圧に関係したその他の状態を治療する際の、プロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプの強力な選択的作動剤、その使用、またはその製剤に関する。本発明はさらに、骨のモデリングと骨芽細胞および破骨細胞のリモデリングプロセスを媒介するために、本発明の化合物を使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉを有する化合物、
【化１】
2005519879.tif 000011
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項２】
Ｒ１が、ＣＮ、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、または（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６であり、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が当初記載したものである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎヘテロアリールであり、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が当初記載したものである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ヘテロアリールがテトラゾールであり、その他全ての変数が当初記載したものである請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、または（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリールであり、前記アルキル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が当初記載したものである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が、（ＣＨ２）０〜８アリール、または（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリールであり、前記アリールまたはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が当初記載したものである請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン
【化２】
2005519879.tif 000012
４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルチオシアネート
【化３】
2005519879.tif 000013
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン
【化４】
2005519879.tif 000014
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸
【化５】
2005519879.tif 000015
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸
【化６】
2005519879.tif 000016
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン
【化７】
2005519879.tif 000017
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン
【化８】
2005519879.tif 000018
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
【化９】
2005519879.tif 000019
である化合物。
【請求項８】
高眼圧症または緑内障の治療を必要とする患者に対し、治療上有効な量の式Ｉの化合物、
【化１０】
2005519879.tif 000020
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を投与することを含む、高眼圧症または緑内障の治療方法であって、
上式で、
Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表すものである方法。
【請求項９】
前記化合物が、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン、
４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルチオシアネート、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン、
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸、
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン、または
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
局所製剤が溶液または懸濁液である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
βアドレナリン作動性遮断剤、副交感神経作用剤、交感神経様作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、およびプロスタグランジン、降圧性脂質、神経保護剤、および５−ＨＴ２受容体作動剤からなる群に属する活性成分を前記製剤に添加する請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記βアドレナリン作動性遮断剤が、チモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、またはレボブノロールであり、前記副交感神経作用剤がピロカルピンであり、前記交感神経様作動剤が、エピネフリン、ブリモニジン、イオピジン、クロニジン、またはパラ−アミノクロニジンであり、前記炭酸脱水酵素阻害剤が、ドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド、またはブリンゾラミドであり、前記プロスタグランジンが、ラタノプロスト、トラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、またはＳ１０３３であり、前記降圧性脂質がルミガンであり、前記神経保護剤が、エリプロジル、Ｒ−エリプロジル、またはメマンチンであり、前記５−ＨＴ２受容体作動剤が、１−（２アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートまたは２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
黄斑浮腫または黄斑部変性の治療を必要とする患者に対し、医薬品として有効な量の式Ｉの化合物、
【化１１】
2005519879.tif 000021
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を投与することを含む、黄斑浮腫または黄斑部変性の治療方法。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項１４】
前記式Ｉの化合物が局所製剤として適用され、βアドレナリン作動性遮断剤、副交感神経作用剤、交感神経様作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、およびプロスタグランジン、降圧性脂質、神経保護剤、および５−ＨＴ２受容体作動剤からなる群に属する活性成分を前記製剤に添加する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記βアドレナリン作動性遮断剤が、チモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、またはレボブノロールであり、前記副交感神経作用剤がピロカルプリンであり、前記交感神経様作動剤が、エピネフリン、ブリモニジン、イオピジン、クロニジン、またはパラ−アミノクロニジンであり、前記炭酸脱水酵素阻害剤が、ドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド、またはブリンゾラミドであり、前記プロスタグランジンが、ラタノプロスト、トラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、またはＳ１０３３であり、前記降圧性脂質がルミガンであり、前記神経保護剤が、エリプロジル、Ｒ−エリプロジル、またはメマンチンであり、前記５−ＨＴ２受容体作動剤が、１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートまたは２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン、
４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルチオシアネート、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン、
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸、
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン、または
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させ、網膜および視神経酸素張力を増大させ、または神経保護をもたらす治療が必要な患者に対し、式Ｉの化合物、
【化１２】
2005519879.tif 000022
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を含有する効果的な高眼圧症製剤を投与することを含む、当該治療の方法。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項１８】
前記式Ｉの化合物が局所製剤として適用され、βアドレナリン作動性遮断剤、副交感神経作用剤、交感神経様作動剤、炭酸脱水酵素阻害剤、およびプロスタグランジン、降圧性脂質、神経保護剤、および５−ＨＴ２受容体作動剤からなる群に属する活性成分を前記製剤に添加する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記βアドレナリン作動性遮断剤が、チモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、またはレボブノロールであり、前記副交感神経作用剤がピロカルピンであり、前記交感神経様作動剤が、エピネフリン、ブリモニジン、イオピジン、クロニジン、またはパラ−アミノクロニジンであり、前記炭酸脱水酵素阻害剤が、ドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド、またはブリンゾラミドであり、前記プロスタグランジンが、ラタノプロスト、トラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、またはＳ１０３３であり、前記降圧性脂質がルミガンであり、前記神経保護剤が、エリプロジル、Ｒ−エリプロジル、またはメマンチンであり、前記５−ＨＴ２受容体作動剤が、１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートまたは２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン、
４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルチオシアネート、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン、
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸、
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン、または
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記局所製剤が、キサンタンガムまたはゲランガムを場合によって含有する請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
骨形成を刺激する必要のある哺乳類に対し、治療上有効な量の式Ｉの化合物、
【化１３】
2005519879.tif 000023
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を投与することを含む、当該哺乳類の骨形成を刺激する方法。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項２３】
異常な骨吸収に関連した疾患状態または容態を治療しまたは予防する必要のある哺乳類に対し、治療上有効な量の構造式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤、
【化１４】
2005519879.tif 000024
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を投与することを含む、当該哺乳類の異常な骨吸収に関連した疾患状態または容態を治療しあるいは当該状態に罹る危険性を低下させる方法。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項２４】
前記疾患状態または容態が、骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、パジェット病、異常に増大した骨代謝、歯周疾患、歯の損失、骨折、リウマチ様関節炎、プロテーゼ周囲の骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、および多発性骨髄腫からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患または容態が、骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、または歯周疾患である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ビスホスホネート活性成分を追加として含有する請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ビスホスホネート活性成分が、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレンドロネート、薬学的に許容されるその塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ビスホスホネートが、アレンドロネート、薬学的に許容されるその塩、およびこれらの混合物である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
薬学的に許容される担体および請求項１に記載の式Ｉの化合物を含む医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳類に対し、治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤、
【化１５】
2005519879.tif 000025
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物を投与することを含む、当該哺乳類のドライアイを治療する方法。
［Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。］
【請求項３１】
前記眼に対する投与が局所的である請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緑内障は、眼圧が高すぎるために正常に眼が機能しにくくなる、眼の消耗性疾患である。その結果、視神経乳頭に損傷が生じ、視覚機能が不可逆的に失われる可能性がある。治療しない場合、緑内障は最終的に失明に至る可能性がある。高眼圧症、すなわち視神経乳頭の損傷または特徴的な緑内障性視野欠損のない眼圧が高い状態は、眼科医により、緑内障発症の最も早い段階にすぎないと現在考えられている。
【背景技術】
【０００２】
緑内障の治療に以前から使用されている薬物の多くは、満足のいくものではないことが示されている。緑内障の初期の治療方法ではピロカルピンを使用したが、この薬物を、価値はあるが第１選択薬としては満足のいくものではないものにする、望ましくない局所的な作用が生じた。より最近では、多くのβアドレナリン作動性拮抗薬が眼圧を低下させるのに有効であることに、臨床医が注目している。これらの薬剤の多くはこの目的に有効であるが、この治療が有効ではなくまたは不十分である患者も一部存在する。これらの薬剤の多くは、用量を増やすことによってより明らかになる膜安定化作用などのその他の特徴も有し、したがって慢性的に眼に使用することが許容不可能であり、心臓血管作用を引き起こす可能性もある。
【０００３】
炭酸脱水酵素阻害剤と呼ばれる薬剤は、酵素である炭酸脱水酵素を阻害することによって、眼房水の形成を減少させる。そのような炭酸脱水酵素阻害剤は、現在、全身的および局所的な経路によって高眼圧の治療に使用されているが、これらの薬剤を使用する現行療法、特に全身経路を使用する療法は、依然として望ましくない作用がないわけではない。局所的に有効な炭酸脱水酵素阻害剤は、米国特許第４，３８６，０９８号、第４，４１６，８９０号、第４，４２６，３８８号、第４，６６８，６９７号、第４，８６３，９２２号、第４，７９７，４１３号、第５，３７８，７０３号、第５，２４０，９２３号、および第５，１５３，１９２号に開示されている。
【０００４】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体は、眼圧を低下させることも知られている。プロスタグランジンには、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、およびＪ系列を含めたいくつかのタイプがある（ＥＰ０５６１０７３Ａ１）。Ｂｉｔｏの米国特許第４，８８３，８１９号は、眼圧を低下させる際のＰＧＡ、ＰＧＢ、およびＰＧＣの使用および合成について記述している。Ｇｏｈ他の米国特許第４，８２４，８５７号は、ＰＧＤ２と、Ｃ−１０が窒素で置換されたものを含めたその誘導体の、眼圧を低下させる際の使用および合成について記述している。Ｕｅｎｏ他の米国特許第５，００１，１５３号は、眼圧を低下させるための、１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体の使用および合成について記述している。米国特許第４，５９９，３５３号は、眼圧を低下させるため、プロスタグランジンおよびプロスタグランジン阻害剤を含めたエイコサノイドおよびエイコサノイド誘導体を使用することについて記述している。ＷＯ００／３８６６７、ＷＯ９９／３２４４１、ＷＯ９９／０２１６５、ＷＯ００／３８６６３、ＷＯ０１／４６１４０、ＥＰ０８５５３８９、ＪＰ２０００−１４７２、米国特許第６，０４３，２７５号、およびＷＯ００／３８６９０も参照されたい。
【０００５】
プロスタグランジンおよびプロスタグランジン誘導体は、ブドウ膜強膜流出の増加によって眼圧を低下させることが知られている。これは、プロスタグランジンのＦ型とＡ型の両方に言えることである。本発明は特に、ブドウ膜強膜流出経路と、Ｅ系列プロスタグランジン（ＰＧＥ２）がＩＯＰ低下を促進させることができるその他のメカニズムとを介して、ＩＯＰを低下させる化合物に関心がある。ＥＰ受容体活性化とＩＯＰ低下作用との間の関係は十分に理解されていないが、ＥＰ受容体の４つのサブタイプが認められている（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、およびＥＰ４；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｖｏｌ．１４、第８３〜８７頁（１９９６））。Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．４、１、第１３〜１８頁（１９８８）；Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１１、３、第４４７〜４５４頁（１９９５）；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ、Ｖｏｌ．６、第５４５〜５５３頁（１９９３）；米国特許第５，６９８，５９８号、および第５，４６２，９６８号、およびＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．３１、１２、第２５６０〜２５６７頁（１９９０）も参照されたい。本発明で特に関心があるのは、ＥＰ４サブタイプ受容体の作動剤である化合物である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
眼圧を低下させるのにプロスタグランジンまたはその誘導体を使用することの問題点とは、これらの化合物がしばしば眼圧の初期増加を誘発し、眼の色素沈着の色が変化して眼の周囲の一部の組織が増殖する可能性があることである。
【０００７】
以上のように、緑内障および高眼圧を治療するためのいくつかの現行療法があるが、これらの薬剤の効能および副作用プロフィルは理想的ではない。したがって、副作用がほとんどなくまたは全くない、新しく効果的な療法が、依然として求められている。
【０００８】
ヒトおよびその他の哺乳類における様々な障害は、異常なまたは過剰な骨損失を含みまたはそのような骨損失を伴うものである。そのような障害には、骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、パジェット病、異常に増大した骨代謝、歯周疾患、歯の損失、骨折、リウマチ様関節炎、大腿骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。これらの障害の中で最も一般的なものは、閉経後の女性で最も頻繁に発症する骨粗しょう症である。骨粗しょう症は、骨質量の低下および骨組織の微細な構造上の劣化を特徴とする骨疾患であり、その結果、骨の脆弱性が増大し、骨折し易くなる。骨粗しょうによる骨折は、老齢者人口における罹患および死亡の主原因である。女性の５０％および男性の３分の１ほどが、骨粗しょうによる骨折を経験することになる。老齢者人口の大部分は、既に骨密度が低下しており、骨折の危険性が高くなっている。骨粗しょう症、および骨吸収を伴うその他の状態を予防しかつ治療することが、非常に求められている。骨粗しょう症ならびに骨損失を伴うその他の障害は一般に慢性的な状態であるので、適切な療法では、典型的な場合、長期にわたる治療が必要になると考えられる。
【０００９】
骨芽細胞および破骨細胞と呼ばれる２つの異なるタイプの細胞が、骨形成および骨吸収のプロセスにそれぞれ関与している。その全体を本明細書に参照により援用するＨ．Ｆｌｅｉｓｃｈ、Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  Ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ、第３版、Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９７）を参照されたい。骨芽細胞は、骨の表面に位置付けられた細胞である。これらの細胞は、骨有機質を分泌し、これが石灰化する。フッ化物などの物質、副甲状腺ホルモン、プロタグランジンなどのある特定のサイトカインは、骨芽細胞に対して刺激作用を及ぼすことが知られている。しかし現在の研究の目的は、骨芽細胞の骨形成機能を選択的に増大させまたは刺激する治療薬を開発することである。
【００１０】
破骨細胞は通常、皮質骨または骨梁骨の表面に、あるいは皮質骨内に位置する大きな多核細胞である。破骨細胞は、細胞と骨の間に存在する閉じた封鎖状態のミクロ環境で骨を再吸収する。破骨細胞の補充および活性は、一連のサイトカインおよびホルモンの影響を受けることが知られている。ビスホスホネートは、骨破壊性骨吸収の選択的な阻害剤であることが十分知られており、したがってこれらの化合物は、異常な骨吸収によって引き起こされまたは異常な骨吸収を伴う様々な全身的または局所的な骨障害の治療または予防において、重要な治療薬になる。しかしビスホスホネートの利用にも関わらず、研究者の間では、破骨細胞の骨吸収活性を阻害するためのさらなる治療薬を開発することが依然として望まれている。
【００１１】
ＰＧＥ２系列などのプロスタグランジンは、ヒトも含めた哺乳類の骨形成を刺激しかつ骨質量を増大させることが知られている。ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４で示される４種の異なる受容体サブタイプが、骨のモデリングの媒介と、骨芽細胞および破骨細胞のリモデリングプロセスに関与すると考えられている。骨の中の主要なプロスタグランジン受容体はＥＰ４であり、これはサイクリックＡＭＰを介したシグナル伝達によって、その作用を及ぼすと考えられている。
【００１２】
本発明ではさらに、ＥＰ４サブタイプ受容体の式Ｉの作動剤が、骨形成を刺激するのに有用であることが見出されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、プロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプの強力な選択的作動剤と、緑内障、および患者の目の高眼圧に関連したその他の状態とを治療する際に、その作動剤を使用することに関する。本発明の別の態様は、哺乳動物種、特にヒトの目に神経保護作用をもたらすため、そのような化合物を使用することに関する。本発明はさらに、骨のモデリングと骨芽細胞および破骨細胞のリモデリングプロセスを媒介するために、本発明の化合物を使用することに関する。
【００１４】
より詳細には本発明は、構造式Ｉを有する新規なＥＰ４作動剤、
【００１５】
【化１】
2005519879.tif 000002
あるいは薬学的に許容されるその塩、鏡像異性体、ジアステレオマー、またはこれらの混合物に関し、上式で
Ｒ１は、ヒドロキシ、ＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６、Ｃ１〜４アルコキシ、式−（ＣＨ２）ｎＮＲ６Ｒ７の基、または（ＣＨ２）ｎヘテロアリールを表し、前記ヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ６およびＲ７は独立に、水素またはＣ１〜４アルキルを表し；
Ｒ３およびＲ４は独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ３〜６シクロアルキル、ヒドロキシ、またはＣ１〜４アルコキシを表し；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリール、（ＣＨ２）０〜８ヘテロシクロアルキルを表し、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、またはヘテロアリールは、非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒａは、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アルキル、ＣＦ３、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜６アルキルアミノ、またはハロゲンを表し；
記号 - - - は、二重結合または単結合であり；
ｎは０〜４を表し；
ｐは１〜３を表す。
【００１６】
本発明のこの態様およびその他の態様は、本発明の全体を検証することによって実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明について、他に特に指示しない限り以下に定義される用語を使用して、本明細書に詳細に記述する。
【００１８】
本明細書で使用する「治療上有効な量」という用語は、望ましい治療計画に従って投与した場合に、所望の治療効果または応答を誘発しあるいは所望の利益をもたらすことになる、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤の量または本発明のその他の活性成分の量を意味する。異常な骨吸収の治療に関する好ましい治療上有効な量は、骨形成を刺激する量である。同様に、高眼圧症または緑内障の治療に関する好ましい治療上有効な量は、眼圧を低下させかつ／または高眼圧症および／または緑内障を治療するのに有効な量である。
【００１９】
本明細書で使用する「薬学的に許容される」とは、一般に、毒性または安全性の見地から、ヒトも含めた哺乳類への投与に適していることを意味する。
【００２０】
「アルキル」という用語は、他に特に定義しない限り、１〜１０個の炭素原子を含有する、１価のアルカン（炭化水素）から誘導された基を指す。これは直鎖状、分枝状または環状でよい。好ましいアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれる。アルキル基がアルキル基で置換されたという場合、これは「分枝状アルキル基」と同義に使用される。
【００２１】
シクロアルキルは、炭素原子間の二重結合が交互にならずまたは共鳴しない、３〜１５の炭素原子を含有するアルキル種である。これは、融合している１〜４個の環を含有してよい。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが含まれる。
【００２２】
アルコキシは、アルキル基が本明細書で述べたように場合によって置換されている、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−Ｏ−を指す。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびその異性基が含まれる。
【００２３】
アルケニルは、ビニルやプロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、その異性基など、二重結合を有するアルキル基を指す。
【００２４】
アルキニル基は、エチニルやプロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、およびその異性基など、三重結合を有するアルキル基を指す。
【００２５】
ハロゲン（ハロ）は、塩素、フッ素、ヨウ素、または臭素を指す。
【００２６】
アリールは、例えばフェニルや置換フェニルなどの芳香環、ならびに例えばナフチルやフェナントレニルなどの縮合環を指す。したがってアリール基は、少なくとも６個の原子を有する少なくとも１個の環を含有し、最大でそのような環が５個存在し、その中には最大で２２個の原子が含まれるが、この場合、隣接する炭素原子または適切なヘテロ原子の間の二重結合は交互になる（共鳴する）。好ましいアリール基は、フェニル、ナフチル、およびフェナントレニルである。アリール基は、定義されたものと同様に置換される。好ましい置換アリールには、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００２７】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基（非芳香）を指し、環の中の炭素原子の１つがＯ、Ｓ、またはＮから選択されるヘテロ原子で置換され、最大３個の追加の炭素原子がヘテロ原子で置換可能なものである。
【００２８】
「ヘテロ原子」という用語は、独立に選択されるＯ、Ｓ、またはＮを意味する。
【００２９】
「ヘテロアリール」という用語は、５個または６個の環原子を有する単環式芳香族炭化水素基、または８〜１０個の原子を有する二環式芳香基であって、少なくとも１個のヘテロ原子Ｏ、Ｓ、またはＮを含有するものを指し、この場合、炭素または窒素原子が結着点となり、１個または２個の追加の炭素原子がＯまたはＳから選択されるヘテロ原子で場合によって置換され、１〜３個の追加の炭素原子が窒素ヘテロ原子で場合によって置換され、前記ヘテロアリール基は本明細書に記載されるように場合によって置換されるものである。このタイプの例として、ピロール、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、テトラゾール、およびオキサジンがある。追加の窒素原子が第１の窒素および酸素またはイオウと共に存在してよく、例えばチアジアゾールが得られる。
【００３０】
本明細書で使用する「作動剤」という用語は、式ＩのＥＰ４サブタイプ化合物がＥＰ４受容体と相互に作用することにより、天然の作動剤ＰＧＥ２に比べて最大の、または超最大の、または最大下の効果が得られることを意味する。ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１９９６、第２章を参照されたい。
【００３１】
本明細書で有用なビスホスホネート活性成分の非限定的な例には、以下のものが含まれる。
【００３２】
アレンドロン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸
アレンドロネート（アレンドロン酸ナトリウムまたはアレンドロン酸一ナトリウム三水和物とも呼ばれる）、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸一ナトリウム三水和物
アレンドロン酸およびアレンドロネートは、１９９０年５月１日に発行されたＫｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉ他の米国特許第４，９２２，００７号、１９９１年５月２８日に発行されたＫｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉ他の第５，０１９，６５１号、１９９６年４月２３日に発行されたＤａｕｅｒ他の第５，５１０，５１７号、１９９７年７月１５日に発行されたＤａｕｅｒ他の第５，６４８，４９１号に記載されており、これら全ての全体を本明細書に参照により援用する。
【００３３】
その全体を本明細書に参考により援用する１９９０年１１月１３日発行のＩｓｏｍｕｒａ他による米国特許第４，９７０，３３５号に記載されている、シクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸、ＹＭ１７５、Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（シマドロネート（ｃｉｍａｄｒｏｎａｔｅ））
１，１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロン酸）および二ナトリウム塩（クロドロネート、Ｐｒｏｃｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ）は、いずれもその全体が本明細書に参照により援用されるベルギー特許第６７２，２０５号（１９６６）およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３２、４１１１（１９６７）に記載されている。
【００３４】
１−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＥＢ−１０５３）
１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（エチドロン酸）
ＢＭ−２１０９５５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（イバンドロネート）とも呼ばれる１−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸は、その全体を本明細書に援用する１９９０年５月２２日発行の米国特許第４，９２７，８１４号に記載されている。
【００３５】
６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸（ネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ））
３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（オルパドロネート）
３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミドロネート）
［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−１，１−ビスホスホン酸（ピリドロネート）は、その全体を参照により援用する米国特許第４，７６１，４０６号に記載されている。
【００３６】
１−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（リセドロネート）
その全体を本明細書に参照により援用する１９８９年１０月２４日発行のＢｒｅｌｉｅｒｅ他の米国特許第４，８７６，２４８号に記載されている、（４−クロロフェニル）チオメタン−１，１−ジホスホン酸（チルドロネート）
１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾル−１−イル）エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート）
本発明で有用な非限定的なクラスのビスホスホネートは、アレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレンドロネート、薬学的に許容されるこれらの塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３７】
この場合、上記クラスの非限定的なサブクラスは、アレドロネート、薬学的に許容されるその塩、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【００３８】
サブクラスの非限定的な例は、アレドロン酸一ナトリウム三水和物である。
【００３９】
本発明の一実施形態は、Ｒ１がＣＮ、（ＣＨ２）ｎヘテロアリール、（ＣＨ２）ｐＣＯ２Ｒ６、Ｏ２Ｒ６、（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｒ６であって、前記ヘテロアリールは非置換またはＲａの１〜３個の基で置換されており、その他全ての変数が最初に記載されているものである場合に実現される。Ｒ１がＯ２Ｒ６である場合、イオウは６価であることに留意されたい。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、Ｒ１が（ＣＨ２）ｎヘテロアリールであり、前記ヘテロアリールは非置換またはＲａの１〜３個の基で置換されており、その他全ての変数が最初に記載されているものである場合に実現される。
【００４１】
本発明の副次的な実施形態は、ヘテロアリールがテトラジールであり、その他全ての変数が最初に記載されているものである場合に実現される。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｒ２がＣ２〜８アルケニルアリール、Ｃ２〜８アルキニルアリール、Ｃ３〜７シクロアルキル、（ＣＨ２）０〜８アリール、または（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリールであり、前記アルキル、アリール、またはヘテロアリールは非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が最初に記載されているものである場合実現される。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態は、Ｒ２が（ＣＨ２）０〜８アリールまたは（ＣＨ２）０〜８ヘテロアリールであり、前記アリールまたはヘテロアリールは非置換または１〜３個のＲａ基で置換されており、その他全ての変数が最初に記載されているものである場合に実現される。
【００４４】
本発明の好ましい化合物は、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン、
４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルチオシアネート、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン、
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸、
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン、
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン、または
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
である。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、式ＩのＥＰ４作動剤および薬学的に許容される担体を含有する組成物を対象とする。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態は、式ＩのＥＰ４作動剤および場合によって薬学的に許容される担体を含有する組成物を、好ましくは局所的にまたは管内から投与することによって、眼圧の上昇を低下させまたは緑内障を治療する方法を対象とする。
【００４７】
本発明はさらに、式Ｉの化合物および薬学的に許容される担体を含んだ医薬組成物を作製するためのプロセスに関する。
【００４８】
特許請求の範囲に記載される化合物は、ＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４サブタイプ受容体に強力に結合して作用し、したがって緑内障および／または高眼圧症を予防しかつ／または治療するのに有用である。緑内障および眼圧の上昇を治療する薬剤を製造するために、式Ｉの化合物を使用することも包含される。
【００４９】
ドライアイは、何百万もの人々を悩ます一般的な眼の表面の疾患である。ドライアイは、関係のないいくつかの病因から生じる可能性があるようにみえるが、いずれも最終的には涙液膜が破壊され、その結果、露出した眼の外面が脱水状態になる（Ｌｅｍｐ、Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅｓ、Ｔｈｅ  ＣＬＡＯ  Ｊｏｕｒｎｅｌ、２１（４）：２２１〜２３１（１９９５））。ドライアイの１つの原因は、眼の表面を保護し潤滑にするムチンの、結膜細胞および／または角膜上皮細胞によるムチン生成が、減少することにある（ＧｉｐｓｏｎおよびＩｎａｔｏｍｉ、Ｍｕｃｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：８１〜９８（１９９７））。機能的ＥＰ４受容体はヒト結膜上皮細胞内に見出され（その全体を参照により援用する米国特許第６，３４４、４７７号参照）、ヒト角膜上皮細胞（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：８１〜９８（１９９７））と結膜細胞（Ｄａｒｔｔ他、Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅｓ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｎｊｕｃｔｉｖａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４：９９３〜１０００（１９９５））の両方が、ムチンを分泌することが可能であることが理解される。したがって式Ｉの化合物は、ドライアイの治療に有用である。
【００５０】
黄斑浮腫は、眼の後極にある極めて重要な中心視覚帯内の網膜内で肥大する。網膜内に流体が蓄積されると、神経要素が互いに剥離しかつその局所的な血液供給から切り離され易くなり、その領域での視覚機能が停止状態になる。ＩＯＰを低下させるＥＰ４作動剤は、黄斑浮腫や黄斑部変性などの黄斑性疾患を治療するのに有用と考えられる。したがって本発明の別の態様は、黄斑浮腫または黄斑部変性を治療する方法である。
【００５１】
緑内障は、視神経の進行性萎縮症を特徴とし、眼圧（ＩＯＰ）上昇をしばしば伴うものである。しかし、神経保護作用を付与する薬物を使用することにより、ＩＯＰに必ずしも影響を与えることなく、緑内障を治療することが可能である。Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｏｌ．１１２、１９９４年１月、第３７〜４４頁；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２、５、１９９１年４月、第１５９３〜９９頁を参照されたい。ＩＯＰを低下させるＥＰ４作動剤は、神経保護作用をもたらすのに有用であると考えられる。またこの作動剤は、ＩＯＰを低下させることによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させかつ網膜および視神経の酸素を増大させるのに効果的であると考えられ、これらが一緒になった場合に視神経の健康に有益なものとなる。その結果、本発明はさらに、式ＩのＥＰ４作動剤を使用することによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させ、または網膜および視神経の酸素張力を増大させ、または神経保護作用をもたらし、またはこれらの組合せを行う方法に関する。
【００５２】
本発明で生成される化合物は、効果的なＩＯＰ低下を実現するために、ヒトも含めた哺乳類に投与することができる組成物が形成されるよう、適切かつ知られている薬学的に許容される添加剤と容易に組み合わされる。したがって本発明は、高眼圧症または緑内障を治療する必要のある患者に対し、式Ｉの化合物の１つを単独で、あるいはチモロールやベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロールなどのβアドレナリン作動性遮断剤；ピロカルプリンなどの副交感神経作用剤；エピネフリンやイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラ−アミノクロニジンなどの交感神経様作動剤；ドルゾラミドやアセタゾラミド、メタゾラミド、ブリンゾラミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤；ラタノプロストやトラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号、第５，２９６，５０４号、第５，４２２，３６８号、および第５，１５１，４４４号に記載されている化合物）などのプロスタグランジン；ルミガンや米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物などの降圧性脂質；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤であって、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているエリプロジルおよびＲ−エリプロジルであり、メマンチンを含むもの；またはＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されている５−ＨＴ２受容体の作動剤であって、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートおよび２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと組み合わせて投与することによって、高眼圧症または緑内障を治療する方法にも関する。
【００５３】
したがって本発明は、治療を必要とする患者に対し、式Ｉの化合物の１つを単独で、あるいはチモロールやベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロールなどのβアドレナリン作動性遮断剤；ピロカルプリンなどの副交感神経作用剤；エピネフリンやイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラ−アミノクロニジンなどの交感神経様作動剤；ドルゾラミドやアセタゾラミド、メタゾラミド、ブリンゾラミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤；ラタノプロストやトラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号、第５，２９６，５０４号、第５，４２２，３６８号、および第５，１５１，４４４号に記載されている化合物）などのプロスタグランジン；ルミガンや米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物などの降圧性脂質；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤であって、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているエリプロジルおよびＲ−エリプロジルであり、メマンチンを含むもの；またはＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されている５−ＨＴ２受容体の作動剤であって、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートおよび２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと組み合わせて投与することによって、網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させ、または網膜および視神経の酸素張力を増大させ、または神経保護作用をもたらし、またはこれらの組合せを実施する方法にも関する。網膜および視神経乳頭の血流速度を増大させ、または網膜および視神経の酸素張力を増大させ、または神経保護作用をもたらし、またはこれらの組合せを行う薬剤を製造するために、式Ｉの化合物を使用することも、本発明に包含される。
【００５４】
本発明はさらに、黄斑浮腫または黄斑部変性の治療を必要とする患者に対し、式Ｉの化合物の１つを単独で、あるいはチモロールやベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロールなどのβアドレナリン作動性遮断剤；ピロカルプリンなどの副交感神経作用剤；エピネフリンやイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラ−アミノクロニジンなどの交感神経様作動剤；ドルゾラミドやアセタゾラミド、メタゾラミド、ブリンゾラミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤；ラタノプロストやトラバプロスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号、第５，２９６，５０４号、第５，４２２，３６８号、および第５，１５１，４４４号に記載されている化合物）などのプロスタグランジン；ルミガンや米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物などの降圧性脂質；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤であって、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているエリプロジルおよびＲ−エリプロジルであり、メマンチンを含むもの；またはＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されている５−ＨＴ２受容体の作動剤であって、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−イムダゾル−６−オルフマレートおよび２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾル−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと組み合わせて投与することによって、黄斑浮腫または黄斑部変性を治療する方法に関する。黄斑浮腫または黄斑部変性を治療する薬剤を製造するために式Ｉの化合物を使用することも含まれる。
【００５５】
本発明で使用されるＥＰ４作動剤は、静脈内から、皮下から、局所的に、経皮的に、非経口的に、または当業者に知られている任意のその他の方法で、治療上有効な量を投与することができる。眼科用医薬組成物は、溶液、懸濁液、軟膏、クリームの形で、または固体挿入物として、眼に局所的に投与できるよう構成されることが好ましい。この化合物の眼科用製剤は、薬剤を０．００１〜５％、特に０．００１〜０．１％含有することができる。眼圧を低下させ、緑内障を治療し、血流速度または酸素張力を増大させるのに用量が効果的であることを条件に、より高い投薬量、例えば最大約１０％またはそれ以下の投薬量を使用することができる。単回用量に関しては、化合物が０．００１〜５．０ｍｇ、好ましくは０．００５〜２．０ｍｇ、および特に０．００５〜１．０ｍｇの間にあるものを、ヒトの眼に適用することができる。
【００５６】
化合物を含有する医薬調製物は、無毒性の医薬品有機担体と、または無毒性の医薬品無機担体と、都合よく混合することができる。薬学的に許容される担体の典型例は、例えば水、水と低級アルカノールやアラルカノールなどの水混和性溶媒との混合物、植物油、ピーナツ油、ポリアルキレングリコール、石油ベースのゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドン、ミリスチン酸イソプロピル、およびその他の従来から使用されている許容可能な担体である。医薬調製物は、乳化剤や防腐剤、湿潤剤、増粘剤などの無毒性補助物質を含有してもよく、例えばポリエチレングリコール２００、３００、４００、および６００、カーボワックス１，０００、１，５００、４，０００、６，０００、および１０，０００、第４級アンモニウム化合物などの抗菌成分、照射殺菌性を有することが知られておりかつ使用に害のないフェニル水銀塩、チメロサール、メチルおよびプロピルパラベン、ベンジルアルコール、フェニルエタノール、ホウ酸ナトリウムや酢酸ナトリウム、グルコン酸緩衝剤などの緩衝成分、モノラウリン酸ソルビタンやトリエタノールアミン、オレイン酸剤、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン四酢酸などのその他従来の成分である。さらに本発明では、従来のリン酸緩衝賦形剤系、等張性ホウ酸賦形剤、等張性塩化ナトリウム賦形剤、等張性ホウ酸ナトリウム賦形剤などを含めた適切な眼科用賦形剤を、担体媒体として使用することができる。医薬調製物は、微小粒子配合物の形をとるものでもよい。医薬調製物は、固体挿入物の形でもよい。例えば薬剤用担体として、固体水溶性ポリマーを使用することができる。この挿入物の形成に使用されるポリマーは、任意の水溶性の無毒性ポリマーでよく、例えば、メチルセルロースやナトリウムカルボキシメチルセルロース、（ヒドロキシ低級アルキルセルロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；ポリアクリル酸塩やアクリル酸エチル、ポリアクチルアミドなどのアクリレート；ゼラチンやアルギネート、ペクチン、トラガカント、カラヤ、ツノマタ、寒天、アカシアなどの天然産物；酢酸デンプンやヒドロキシメチルデンプンエーテル、ヒドロキシプロピルデンプンなどのデンプン誘導体、ならびにポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、中和したカーボポールなどのその他の合成誘導体、キサンタンガム、ゲランガム、および前記ポリマーの混合物である。
【００５７】
本発明の製剤の投与に適切な被験体は、霊長類、ヒト、およびその他の動物であり、特にヒト、およびネコやウサギ、イヌなどの飼い慣らされた動物である。
【００５８】
医薬調製物は、使用する上で害のない、例えばチメロサールや塩化ベンザルコニウム、メチルおよびプロピルパラベン、臭化ベンジルドデシニウム、ベンジルアルコール、フェニルエタノールなどの抗菌成分；塩化ナトリウムやホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸緩衝剤などの緩衝成分；モノラウリン酸ソルビタンやトリエタノールアミン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、エチレンジアミン四酢酸などの従来の成分など、無毒性補助物質を含有することができる。
【００５９】
眼科用液剤または懸濁液は、眼に許容可能なＩＯＰレベルが維持されるよう、必要な回数だけ投与することができる。哺乳動物の目への投与は、１日につき１回から最大３回になることが考えられる。
【００６０】
局所的に眼に投与するため、本発明の新規な製剤は、単位用量が治療上有効な量の活性成分を含むように、または併用療法の場合にはその何倍かの量を含むように配合された、溶液、ゲル、軟膏、懸濁液、または固体挿入物の形をとることができる。
【００６１】
本発明の化合物は、骨のモデリングと骨芽細胞および破骨細胞のリモデリングプロセスを媒介するのにも有用である。１９９９年１０月１２日に出願されその全体を参照により本明細書に援用するＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７を参照されたい。骨の中の主なプロスタグランジン受容体はＥＰ４であり、これは、サイクリックＡＭＰを介したシグナル伝達によってその作用をもたらすと考えられる。その全体を本明細書に参照により援用するＩｋｅｄａ  Ｔ、Ｍｉｙａｕｒａ  Ｃ、Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ａ、Ｎａｒｕｍｉｙａ  Ｓ、Ｙｏｓｈｉｋｉ  Ｓ、およびＳｕｄａ  Ｔ、１９９５、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＥＰ１、ＥＰ３、およびＥＰ４）ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｍｉｃｅ、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １０（前掲１）Ｓ：１７２を参照されたい。
【００６２】
したがって本発明の別の目的は、哺乳類における骨の形成、すなわち骨生成を刺激する方法であって、その必要がある動物に対し、治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤を投与することを含む方法を提供することである。骨形成を刺激するために式Ｉの化合物を使用することも含まれる。
【００６３】
本発明のさらに別の目的は、骨形成を刺激する必要のある哺乳類において骨形成を刺激する方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤およびビスホスホネート活性成分を投与することを含む方法を提供することである。
【００６４】
本発明のさらに別の目的は、治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤およびビスホスホネート活性成分を含んだ医薬組成物を提供することである。
【００６５】
本発明の別の目的は、そのような治療または予防が必要な哺乳類の、異常な骨吸収に関連した疾患状態または容態を治療しまたはそのような状態に罹る危険性を低減させる方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤を投与することを含む方法を提供することである。
【００６６】
異常な骨吸収に関連した疾患状態または容態には、骨粗しょう症、グルココルチコイド誘発性骨粗しょう症、パジェット病、異常に増大した骨代謝、歯周疾患、歯の損失、骨折、リウマチ様関節炎、大腿骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
治療上有効な量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤およびビスホスホネート活性成分を投与することを含む方法で、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプ作動剤とビスホスホネート活性成分を同時に投与し、また逐次投与することは、本発明の範囲内と考えられる。一般に、ビスホスホン酸活性成分ベースで５ｍｇまたは１０ｍｇのビスホスホネート活性成分を含有する製剤が調製される。逐次投与では、作動剤およびビスホスホネートをどちらからか順に投与することができる。逐次投与のサブクラスでは、作動剤およびビスホスホネートは、典型的な場合、同じ２４時間以内に投与される。さらに別のサブクラスでは、作動剤およびビスホスホネートは、典型的な場合、互いに対して約４時間以内に投与する。
【００６８】
本発明は骨刺激に関連するので、作動剤は典型的な場合、所望の治療効果が実現されるまで十分な期間にわたり投与される。本明細書で使用する「所望の治療効果が実現されるまで」という用語は、疾患または状態に求められる臨床上または医学上の効果がもたらされたことが、臨床医または研究者によって観察される時まで、選択される投薬計画に従って治療薬が連続的に投与されることを意味する。本発明の治療方法では、骨の質量または構造に所望の変化が観察されるまで、化合物を連続的に投与する。そのような場合、骨質量を増加させ、または異常な骨構造を正常な骨構造に置換することが、望まれている目的である。疾患状態または容態の危険性を低減させる方法では、望ましくない状態を予防するために必要な期間にわたり化合物を連続的に投与する。そのような場合、骨質量密度の維持がしばしば目的となる。
【００６９】
投与期間の非限定的な例は、約２週間から、哺乳類の残りの寿命にまでわたる可能性がある。ヒトの場合、投与期間は、約２週間からそのヒトの残りの寿命にまでわたる可能性があり、好ましくは約２週間から約２０年、より好ましくは約１カ月から約２０年、より好ましくは約６カ月から約１０年、最も好ましくは約１年から約１０年である。
【００７０】
異常な骨吸収および眼の疾患の治療に関し、式Ｉの作動剤は一般に、そのＥＣ５０値が約０．００１ｎＭから約１００μＭであるが、投薬量および投与経路に応じて、この範囲外の活性を有する作動剤を役立てることができる。本発明の別のサブクラスでは、作動剤のＥＣ５０値が約０．０１μＭから約１０μＭである。本発明の別のサブクラスでは、作動剤のＥＣ５０値が約０．１μＭから約１０μＭである。ＥＣ５０は、当業者に十分知られている作動剤活性の一般的な評価基準であり、最大効果の半分、すなわち５０％をもたらすのに必要とされる作動剤の濃度または用量と定義される。ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１９９６年、第２章、Ｅ．Ｍ．Ｒｏｓｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔ、および１９９９年１０月１２日出願のＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７であって、その全体を本明細書に参照により援用するものも参照されたい。
【００７１】
本明細書の実施例は、特許請求の範囲に記載される発明を例示するものであるが、それに限定するものではない。特許請求の範囲に記載される化合物のそれぞれはＥＰ４作動剤であり、いくつかの生理学的な眼および骨の障害に有用である。
【００７２】
本発明の化合物は、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，０４３，２７５号、ＥＰ０８５５３８９、およびＷＯ０１／４６１４０に従って、若干の修正を加えることにより、作製することができる。例示として記載する以下の非限定的な実施例は、本発明を実証するものである。
（調製例１）
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−ピロリジン−２−オン
ステップＡ：（５Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−１−（４−クロロブチル）ピロリジン−２−オン
（５Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−ピロリジン−２−オン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９６、７、２１１３）（２．８３ｇ、１２．３４ｍｍｏｌ）を６０ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液に、ＮａＨ（９５％、３２５．７ｍｇ、１３．５７ｍｍｏｌ）を１回で添加し、その混合物を５０℃で３０分間加熱した。次いで４−ブロモ−１−クロロブタン（２．９６ｇ、１７．２７ｍｍｏｌ）および触媒量のｎＢｕ４ＮＩを添加し、その混合物を５０℃で１時間撹拌した。反応を室温に冷却し、水（１００ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×２００ｍｌ）、有機相を水（２００ｍｌ）、食塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ  １：ヘキサン  １）で精製することにより、（５Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−１−（４−クロロブチル）ピロリジン−２−オンが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）３．７１〜３．５３（ｍ，６Ｈ）、３．０５（ｍ，１Ｈ）、２．４６〜２．２４（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ）、１．８４〜１．６１（ｍ，４Ｈ）、０．８５（ｓ，９Ｈ）、０．０３（ｓ，６Ｈ）；ＭＳ  ３２０．２〜３２２．２（Ｍ＋１）。
【００７３】
ステップＢ：（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オン
テフロン製アーレンマイヤーに入れた、０℃の（５Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−１−（４−クロロブチル）ピロリジン−２−オン（１．９５ｇ、６．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）溶液に、ＨＦ−ピリジン錯体（１ｍｌ）を１滴ずつ添加し、その溶液をそのまま室温にして、１．５時間撹拌した。反応混合物に、水（２０ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）を添加した。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（４×３０ｍｌ）、有機相を食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  １：トルエン  １）で精製することにより、（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オンが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）４．００（ｓ，１Ｈ）、３．７１〜３．５３（ｍ，６Ｈ）、３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．４６〜２．２２（ｍ，２Ｈ）、２．１４〜１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．７９〜１．５５（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ  ２０６．１〜２０８．１（Ｍ＋１）。
【００７４】
ステップＣ：（２Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサルデヒド
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−オン（３０９．６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（７ｍｌ）溶液に、Ｄｒｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ過ヨウ素酸塩（６３８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、室温で４０分にわたり少量ずつ添加した。１時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔ２Ｏで粉砕し（３×５ｍｌ）、セライトプラグでろ過して溶媒を除去した。（２Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサルデヒドが無色の油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）９．５８（ｓ，１Ｈ）、４．１８（ｍ，１Ｈ）、３．６５（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）、３．０８（ｍ，１Ｈ）、２．４３（ｍ，２Ｈ）、２．３０（ｍ，１Ｈ）、２．０８（ｍ，１Ｈ）、１．７８〜１．５６（ｍ，４Ｈ）。
【００７５】
ステップＤ：（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン
（３−フェニル−２−オキソ−プロピル）−ホスホン酸ジメチルエステル（９３８ｍｇ、４ｍｍｏｌ）の０℃のＤＭＥ（２０ｍｌ）溶液に、ＮａＨ  ９５％（１００．８ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加し、その混合物を０℃で２０分間撹拌した。次いで（２Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサルデヒドのＤＭＥ（５ｍｌ）溶液を１滴ずつ添加し、反応混合物をそのまま室温にして、一晩撹拌した。ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍｌ）の半飽和溶液を添加し、水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×６０ｍｌ）、有機相を水（２０ｍｌ）、食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ２：トルエン  ８）で精製することにより、（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オンが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３５〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、６．６４（ｄｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．２５（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、３．８５（ｓ，２Ｈ）、３．５５〜３．５０（ｍ，３Ｈ）、２．７７（ｍ，１Ｈ）、２．４３〜２．１７（ｍ，３Ｈ）、１．８１〜１．７５（ｍ，１Ｈ）、１．７０〜１．５１（ｍ，４Ｈ）。
【００７６】
ステップＥ：（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン（１６１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の、−２０℃のＭｅＯＨ（５ｍｌ）溶液に、ＮａＢＨ４（３１ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加した。その混合物を−２０℃で１時間撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、水（５ｍｌ）と１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）の混合物に溶解し、水相をＡｃＯＥｔで抽出し（３×１５ｍｌ）、有機相を水（５ｍｌ）、食塩水（５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６）で精製することにより、（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オンの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３６〜７．２２（ｍ，５Ｈ）、５．７８（ｍ，１Ｈ）、５．５１（ｍ，１Ｈ）、４．４４（ｍ，１Ｈ）、４．０７（ｍ，１Ｈ）、３．５９〜３．４５（ｍ，３Ｈ）、２．９５〜２．７７（ｍ，３Ｈ）、２．４４〜２．１９（ｍ，３Ｈ）、２．４３〜２．１７（ｍ，３Ｈ）、１．７０〜１．５５（ｍ，５Ｈ）。
（調製例２）
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（トリイソプロピルシリル）チオ］ブチル｝−ピロリジン−２−オン
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン（２７３．９ｍｇ、０．８５２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液に、トリイソプロピルシリルスルフィド（３２４．４ｍｇ、１．７０ｍｍｏｌ）、触媒量のｎＢｕ４ＮＩ、および少量ずつのＮａＨ  ９５％（３０．７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を５０℃で１時間加熱した。反応を室温に冷却し、水（２ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（２ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ  １：ヘキサン  ３）で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（トリイソプロピルシリル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オンの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３０〜７．１６（ｍ，５Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．４５（ｍ，１Ｈ）、４．３７（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、２．８６〜２．７９（ｍ，３Ｈ）、２．５１（ｍ，２Ｈ）、２．３５〜２．１２（ｍ，３Ｈ）、１．９４（ｓ，１Ｈ）、１．６４〜１．５０（ｍ，５Ｈ）、１．２（ｍ，３Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１８Ｈ）；ＭＳ  ４７６．４（Ｍ＋１）。
【実施例１】
【００７７】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン
【００７８】
【化２】
2005519879.tif 000003
【００７９】
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン（５０．０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍｌ）溶液に、５−メルカプト−１−メチルテトラゾールナトリウム塩、および触媒量のｎＢｕ４ＮＩを添加した。この混合物を、一晩５０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、水（５ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（２ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ  ２：ヘキサン  ３）で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（１−メチル−１Ｈ−テトラゾル−５−イル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オンの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３０〜７．１８（ｍ，５Ｈ）、５．７４（ｍ，１Ｈ）、５．４４（ｍ，１Ｈ）、４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９０（ｓ，３Ｈ）、３．４６〜３．２７（ｍ，３Ｈ）、２．９３〜２．８２（ｍ，３Ｈ）、２．７４（ｓ，０．６Ｈ）および２．６５（ｓ，０．４Ｈ）、２．５５〜２．１３（ｍ，３Ｈ）、１．７７〜１．５３（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ４０２．３（Ｍ＋１）。
【実施例２】
【００８０】
チオシアン酸４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル
【００８１】
【化３】
2005519879.tif 000004
【００８２】
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン（５０．０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）溶液に、チオシアン酸カリウム（１５０．７ｍｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、および触媒量のｎＢｕ４ＮＩを添加した。この混合物を、一晩５０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、水（５ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（２ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６）で精製することにより、チオシアン酸４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチルの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３５〜７．２２（ｍ，５Ｈ）、５．７８（ｍ，１Ｈ）、５．４６（ｍ，１Ｈ）、４．４３（ｍ，１Ｈ）、４．０４（ｍ，１Ｈ）、３．４６（ｍ，１Ｈ）、３．０４〜２．８４（ｍ，５Ｈ）、２．４１〜２．１９（ｍ，３Ｈ）、２．０６（ｓ，０．６Ｈ）および２．０２（ｓ，０ＡＨ）、１．８２〜１．５６（ｍ；５Ｈ）；ＭＳ  ３４５．４（Ｍ＋１）。
【実施例３】
【００８３】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン
【００８４】
【化４】
2005519879.tif 000005
【００８５】
チオシアン酸４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル（５２．４ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ）をトリブチルスタニルアジド（１５１．３ｍｇ、０．４５５ｍｍｏｌ）と混合し、この混合物を３時間、１２０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、５％  ＫＦ溶液（２ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を５％  ＫＦ（２×５ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（勾配  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（１００：０：０）〜（１００：０：０．５）〜（９６：４：０．５）〜（９５：５：０．５））で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オンの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２５〜７．１４（ｍ，５Ｈ）、５．７５（ｍ，１Ｈ）、５．３６（ｍ，１Ｈ）、４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．１５（ｍ，２Ｈ）、２．９１〜２．７０（ｍ，３Ｈ）、２．３８〜２．１１（ｍ，３Ｈ）、１．６３〜１．４６（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３８６．２（Ｍ−１）。
【実施例４】
【００８６】
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸
【００８７】
【化５】
2005519879.tif 000006
【００８８】
ステップＡ：３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸メチル
（５Ｒ）−１−（４−クロロブチル）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−２−オン（５０．０ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．８ｍｌ）溶液に、３−メルカプトプロパン酸メチルエステル（９３．０ｍｇ、０．７５５ｍｍｏｌ）および触媒量のｎＢｕ４ＮＩを添加し、次いで１Ｍ  ＭｅＯＮａ（０．６２ｍｌ、０．６２ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加した。この混合物を２４時間、８０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、水（６ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（２ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６）で精製することにより、３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸メチルの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３４〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、５．７６（ｍ，１Ｈ）、５．４７（ｍ，１Ｈ）、４．４２（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、３．４８（ｍ，１Ｈ）、２．９５〜２．７６（ｍ，５Ｈ）、２．６３〜２．５４（ｍ，４Ｈ）、２．４１〜２．１７（ｍ，３Ｈ）、２．０６（ｓ，０．６Ｈ）および２．０２（ｓ，０．４Ｈ）、１．７８〜１．５０（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ４０６．７（Ｍ＋１）。
【００８９】
ステップＢ：３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸
３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸メチル（１９．６ｍｇ、０．０４８４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＴＨＦ（１：１）（２ｍｌ）溶液に、０℃の１Ｎ  ＬｉＯＨ（０．０５１ｍｌ、０．０５１ｍｍｏｌ）溶液を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。０．５Ｎ  ＨＣｌ（４ｍｌ）を添加し、水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（勾配  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（１００：０：０）〜（９５：５：０．５））で精製することにより、３−［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］プロパン酸の両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２９〜７．１６（ｍ，５Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．４２（ｍ，１Ｈ）、４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、２．９５〜２．１４（ｍ，１２Ｈ）、１．６２〜１．４８（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３９０．１（Ｍ−１）。
【実施例５】
【００９０】
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸
【００９１】
【化６】
2005519879.tif 000007
【００９２】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（トリイソプロピルシリル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン（３９．３ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍｌ）溶液に、ブロモメタンスルホン酸ナトリウム（３２．６ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１Ｍ  ｎＢｕ４ＮＦ（０．２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加した。この混合物を１時間、５０℃に加熱した。反応を室温に冷却し、１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）を添加した。水相をＥｔ２Ｏで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＣＨ２Ｃｌ２  ９５：ＭｅＯＨ  ５：ＡｃＯＨ  ０．５）で精製することにより、［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］メタンスルホン酸メチルの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３４〜７．１５（ｍ，５Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．４２（ｍ，１Ｈ）、４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、２．９５〜２．５８（ｍ，５Ｈ）、２．３８〜２．０９（ｍ，４Ｈ）、１．６８〜１．４５（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ４１２．５（Ｍ−１）。
【実施例６】
【００９３】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン
【００９４】
【化７】
2005519879.tif 000008
【００９５】
ステップＡ：（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル［４−（メチルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（トリイソプロピルシリル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン（４６．２ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍｌ）溶液に、ヨウ化メチル（１７．６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１Ｍ  ｎＢｕ４ＮＦ（０．１１６ｍｌ、０．１１６ｍｍｏｌ）を−７８℃で１滴ずつ添加した。次いでこの混合物を室温で１時間撹拌した。半飽和状態のＮＨ４Ｃｌ（２ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（５×８ｍｌ）、有機相を食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６０）で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オンが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２９〜７．１６（ｍ，５Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．４２（ｍ，１Ｈ）、４．３５（ｍ，１Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、２．８６〜２．６５（ｍ，３Ｈ）、２．４６（ｍ，２Ｈ）、２．３４〜２．２７（ｍ，２Ｈ）、２．１５〜２．０５（ｍ，５Ｈ）、１．８２〜１．４７（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３３４．０（Ｍ＋１）。
【００９６】
ステップＢ：（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル［４−（メチルスルホニル）ブチル］−ピロリジン−２−オン
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オン（３１．２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（７：２：１）（５ｍｌ）に溶かした溶液に、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）（１７２．９ｍｇ、０．２８１ｍｍｏｌ）を少量ずつ０℃で１０分間にわたり添加し、さらに室温で４時間、ＮａＨＳＯ３の５％溶液（２ｍｌ）を添加した。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（５ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ７：トルエン  ３０）で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（メチルスルホニル）ブチル］ピロリジン−２−オンが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２８〜７．１５（ｍ，５Ｈ）、５．７２（ｍ，１Ｈ）、５．４０（ｍ，１Ｈ）、４．３５（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｍ，１Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ）、３．０７〜２．９６（ｍ，２Ｈ）、２．８６〜２．７９（ｍ，５Ｈ）、２．３６〜２．１１（ｍ，４Ｈ）、１．８１〜１．５４（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３６６．０（Ｍ＋１）。
【実施例７】
【００９７】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン
【００９８】
【化８】
2005519879.tif 000009
【００９９】
ステップＡ：［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］アセトニトリル
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［（トリイソプロピル）チオ］ブチル｝ピロリジン−２−オン（５５．９ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍｌ）溶液に、ブロモアセトニトリル（２１．２ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１Ｍ  ｎＢｕ４ＮＦ（０．１７７ｍｌ、０．１７７ｍｍｏｌ）を室温で１滴ずつ添加した。次いでこの混合物を２時間、５０℃に加熱した。水（２ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（５ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６０）で精製することにより、［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］アセトニトリルが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３４〜７．２１（ｍ，５Ｈ）、５．７８（ｍ，１Ｈ）、５．４５（ｍ，１Ｈ）、４．４２（ｍ，１Ｈ）、４．０５（ｍ，１Ｈ）、３．５１（ｍ，１Ｈ）、３．３１（ｓ，２Ｈ）、２．９３〜２．７１（ｍ，５Ｈ）、２．４８〜２．１９（ｍ，４Ｈ）、２．１１〜１．５７（ｍ，５１１）；ＭＳ  ３５９．０（Ｍ＋１）。
【０１００】
ステップＢ：（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛４−［１Ｈ−テトラゾル−５−イルメチル］チオブチル｝ピロリジン−２−オン
［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］アセトニトリル（３９．８ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）を、トリブチルスタニルアジド（１１０．７ｍｇ、０．３３３ｍｍｏｌ）と混合し、その混合物を３時間、１２０Ｃに加熱した。反応を室温に冷却し、５％  ＫＦ溶液（２ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を５％  ＫＦ（２×５ｍｌ）、食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（勾配  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（１００：０：０）〜（９５：５：０．５））で精製することにより、（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−［４−（１Ｈ−テトラゾル−５−イルチオ）ブチル］ピロリジン−２−オンの両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．２６〜７．１５（ｍ，５Ｈ）、５．７５（ｍ，１Ｈ）、５．３７（ｍ，１Ｈ）、４．４２（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．９０（ｓ，２Ｈ）、３．３０（ｍ，１Ｈ）、２．９０〜２．６５（ｍ，３Ｈ）、２．５３〜２．１３（ｍ，５Ｈ）、１．６８〜１．３２（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ４００．２（Ｍ−１）。
【実施例８】
【０１０１】
［４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ］酢酸
【０１０２】
【化９】
2005519879.tif 000010
【０１０３】
ステップＡ：（｛［４−｛（２Ｒ）−２−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ｝酢酸メチル
（５Ｒ）−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシメチル）−ピロリジン−２−オン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９６、７、２１１３）（１．５ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＤＭＦに溶かした溶液に、ＮａＨ  ９５％（１７３．０ｍｇ、７．２０ｍｍｏｌ）を１回で添加し、その混合物を３０分間、５０℃に加熱した。次いで４−ブロモ−１−クロロブタン（１．３４７ｍｇ、７．８６ｍｍｏｌ）および触媒量のｎＢｕ４ＮＩを添加し、混合物を５０℃で１時間撹拌した。反応を室温に冷却し、チオグリコール酸メチル（１．３９ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）、次いで４．９Ｎ  ＭｅＯＮａ（２．４ｍｌ、１１．７９ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、水（１５０ｍｌ）を添加した。水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１５０ｍｌ）、有機相を水（２００ｍｌ）、食塩水（１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ  １：ヘキサン  １）で精製することにより、（｛［４−｛（２Ｒ）−２−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ｝酢酸メチルが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）３．７１〜３．５３（ｍ，７Ｈ）、３．１８（ｓ，２Ｈ）、２．９８（ｍ，１Ｈ）、２．６（ｍ，２Ｈ）、２．４６〜２．１８（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，１Ｈ）、１．７９（ｍ，１Ｈ）、１．７０〜１．５０（ｍ，４Ｈ）、０．８５（ｓ，９Ｈ）、０．０３（ｓ，６Ｈ）；ＭＳ  ３９０．２（Ｍ＋１）。
【０１０４】
ステップＢ：（｛４−［（２Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）酢酸メチル
０℃のテフロン製アーレンマイヤーに入れた、（｛［４−｛（２Ｒ）−２−（｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝メチル）−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル］チオ｝酢酸メチル（５７１ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍｌ）溶液に、ＨＦ−ピリジン錯体（０．８ｍｌ）を１滴ずつ添加し、その溶液をそのまま室温にして、１．５時間撹拌した。反応混合物に、水（２０ｍｌ）および１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）を添加した。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（４×３０ｍｌ）、有機相を食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去することにより、（｛４−［（２Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）酢酸メチルが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）３．８７〜３．４２（ｍ，８Ｈ）、３．２３（ｓ，２Ｈ）、３．０３（ｍ，１Ｈ）、２．６８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．６０〜２．３２（ｍ，２Ｈ）、２．２０〜１．９２（ｍ，２Ｈ）、１．７９〜１．５５（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ  ２７６．２（Ｍ＋１）。
【０１０５】
ステップＣ：（｛４−［（２Ｒ）−２−ホルミル−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）酢酸メチル
（｛４−［（２Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）酢酸メチル（６３４．５ｍｇ、２．３０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）溶液に、Ｄｒｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ過ヨウ素酸塩（９７５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を室温で４０分にわたり少量ずつ添加した。１時間後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をＥｔ２Ｏで粉砕し（３×５ｍｌ）、セライトプラグでろ過して溶媒を除去した。（｛４−［（２Ｒ）−２−ホルミル−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）酢酸メチルが無色の油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）９．６５（ｓ，１Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、３．８０〜３．６５（ｍ，４Ｈ）、３．２５（ｓ，２Ｈ）、３．１０（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｍ，２Ｈ）、２．４３（ｍ，２Ｈ）、２．４０〜２．０５（ｍ，２Ｈ）、１．７８〜１．５６（ｍ，４Ｈ）。
【０１０６】
ステップＤ：［（４−｛（５Ｒ）−２−オキソ−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチル
（３−フェニル−２−オキソ−プロピル）−ホスホン酸ジメチルエステル（２６４ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）の０℃のＤＭＥ（５ｍｌ）溶液に、ＮａＨ  ９５％（２６ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）を少量ずつ添加し、その混合物を０℃で２０分間撹拌した。次いでメチル（｛４−［（２Ｒ）−２−ホルミル−５−オキソピロリジン−１−イル］ブチル｝チオ）（２７０ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）のＤＭＥ（２ｍｌ）溶液を１滴ずつ添加し、反応混合物をそのまま室温にして、一晩撹拌した。ＮＨ４Ｃｌ（５ｍｌ）の半飽和溶液を添加し、水相をＡｃＯＥｔで抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を水（１０ｍｌ）、食塩水（１０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  ＡｃＯＥｔ）で精製することにより、［（４−｛（５Ｒ）−２−オキソ−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチルが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．４０〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、６．６５（ｄｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，８．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．２５（ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．１８（ｍ，１Ｈ）、３．８８（ｓ，２Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）、３．５５（ｍ，１Ｈ）、３．２２（ｓ，２Ｈ）、）、２．８１〜２．５５（ｍ，３Ｈ）、２．５０〜２．２２（ｍ，３Ｈ）、１．８８〜１．４２（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３９０．１（Ｍ＋１）。
【０１０７】
ステップＥ：［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチル
［（４−｛（５Ｒ）−２−オキソ−５−［（１Ｅ）−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチル（２９５．６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の、−２０℃のＭｅＯＨ（５ｍｌ）溶液に、ＮａＢＨ４（２７．６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加した。混合物を−２０℃で１時間撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を水（５ｍｌ）と１Ｎ  ＨＣｌ（１ｍｌ）の混合物に溶解し、水相をＡｃＯＥｔで抽出し（３×１５ｍｌ）、有機相を水（５ｍｌ）、食塩水（５ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（溶離液  アセトン  ４：トルエン  ６）で精製することにより、［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチルの両方のジアステレオマーが得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３７〜７．２１（ｍ，５Ｈ）、５．７０（ｍ，１Ｈ）、５．５０（ｍ，１Ｈ）、４．４４（ｍ，１Ｈ）、４．０８（ｍ，１Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）、２．９８〜２．６２（ｍ，６Ｈ）、２．５５〜２．１９（ｍ，３Ｈ）、２．４３〜２．１７（ｍ，３Ｈ）、１．８０〜１．５２（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ：  ３９２．１（Ｍ＋１）。
【０１０８】
ステップＦ：［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸
［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−ピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］酢酸メチル（９０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／ＴＨＦ（１：２）（５ｍｌ）に溶かした溶液に、０℃の１Ｎ  ＬｉＯＨ（０．４６ｍｌ、０．４６ｍｍｏｌ）溶液を添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。１Ｎ  ＨＣｌ（３ｍｌ）を添加し、水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し（４×１０ｍｌ）、有機相を食塩水（２ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥してろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留油を、シリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィ（勾配  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（１００：０：０）〜（９４：６：０．５））で精製することにより、［（４−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝ブチル）チオ］−酢酸の両方のジアステレオマーが油として得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）７．３５〜７．１６（ｍ，５Ｈ）、５．７７（ｍ，１Ｈ）、５．４２（ｍ，１Ｈ）、４．４２（ｍ，１Ｈ）、４．０５（ｍ，１Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、３．２０（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜２．４２（ｍ，５Ｈ）、２．９５〜２．１４（ｍ，５Ｈ）、１．６２〜１．４８（ｍ，５Ｈ）；ＭＳ  ３７６．３（Ｍ−１）。
【０１０９】
Ｉ．ウサギおよびサルの眼圧（ＩＯＰ）に対するＥＰ４作動剤の影響
動物
この研究では、薬物処理していないオスのＤｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギおよびメスのカニクイザルを使用する。この調査における動物の管理および処置は、研究用動物の使用に関する国立保健研究所（ＮＩＨ）の指針および視覚眼科研究協会（ＡＲＶＯ）の決議に従う。全ての実験手順は、Ｍｅｒｃｋ社の所内動物管理使用委員会により承認されている。
【０１１０】
薬物の調製および投与
薬物濃度は、活性成分（ベース）で表す。本発明の化合物を、ウサギの研究では０．０１、０．００１、０．０００１％で生理食塩水に溶解し、サルの研究では０．０５、０．００５％で溶解させる。薬物または賦形剤の一定分量（２５ｕｌ）を、局所的に、片側に、または両側に投与する。片側適用では、その反対側の眼に、等体積の生理食塩水を投与する。不快感が最小限に抑えられるよう、眼圧測定前に、プロパラカイン（０．５％）を角膜に適用する。眼圧（ＩＯＰ）を、気動眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｐｎｅｕｍａｔｏｎｏｇｒａｐｈ）またはそれと同等のものを使用して記録する。
【０１１１】
統計分析
結果は、薬物または賦形剤の投与直前に測定した基礎レベルからのＩＯＰの変化として表し、平均±標準偏差で示す。統計的な比較は、薬物処理動物の応答と賦形剤処理動物の応答との非対データ、さらに比較可能な時間間隔での同じ側の眼と反対側の眼との対データに関するステューデントｔ検定を使用して行う。データの有意性も、ダネット「ｔ」検定を使用して「ｔ−０」値からの差として決定する。アスタリスクは、ｐ＜０．０５の有意水準を表す。
【０１１２】
Ａ．ウサギの眼圧測定
体重２．５〜４．０ｋｇのオスのＤｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギを、１２時間の明／暗サイクルで維持し、食餌を与える。全ての実験は、日周リズムに関係したばらつきを最小限に抑えるため、１日のうちの同じ時間で実施する。ＩＯＰを、処理前に測定し、次いで本発明の化合物または賦形剤を、片眼または両眼に点眼し（１滴２５ｕｌ）、点眼後３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、および３６０分でＩＯＰを測定する。場合によっては、賦形剤のみで両眼を処理した同じ数の動物について評価し、並行対照として、薬物処理した動物と比較する。
【０１１３】
Ｂ．サルの眼圧測定
Ｌｅｅ他の方法（１９８５）を使用した、アルゴンレーザシステム（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ＮＯＶＵＳ  ２０００、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＵＳＡ）による小柱網の光凝固によって、体重２〜３ｋｇのメスのカニクイザルの右眼に片側高眼圧症を誘発させる。眼圧（ＩＯＰ）の増加が長引くことによって、緑内障患者に見られるものと同様の変化が視神経乳頭に生じる。
【０１１４】
ＩＯＰ測定では、実験期間中、サルを拘束イスに座らせた位置に保つ。各ＩＯＰ測定の約５分前に、塩酸ケタミンの筋肉内注射（３〜５ｍｇ／ｋｇ）で動物に軽く麻酔をし、０．５％プロパラカインを１滴点眼した後に、ＩＯＰを記録した。ＩＯＰは、気動眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ）またはＤｉｇｉｌａｂ気動眼圧計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定する。
【０１１５】
ＩＯＰは、処理前と、処理後の一般に３０、６０、１２４、１８０、３００、および３６０分で測定する。一般に処理を行う２日または３日前のこれらの時点で基準値も得る。処理は、本発明の化合物（０．０５および０．００５％）または賦形剤（生理食塩水）の１滴２５ｕｌを点眼することからなる。同じ動物について試験をする前に、少なくとも１週間の洗出し期間を設ける。正常圧（高眼圧とは反対側）の眼を、高眼圧の眼と全く同じ手法で処理する。両眼に関するＩＯＰ測定値を、同じ時点での対応する基準値と比較する。結果は、平均±標準偏差（ｍｍＨｇ）として表す。眼科用としての本発明の化合物の活性範囲は、０．０１〜１００，０００ｎＭの間である。
【０１１６】
ＩＩ．放射リガンド結合アッセイ
これらの化合物の試験に使用されるアッセイは、本質的に、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ  Ｍ、Ａｄａｍ  Ｍ、Ｂｏｉｅ  Ｙ、Ｃａｒｒｉｅｒｅ  Ｍ、Ｄｅｎｉｓ  Ｄ、Ｇｏｄｂｏｕｔ  Ｃ、Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｓ、Ｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｃ、Ｓａｗｙｅｒ  Ｎ、Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ＮＭ、Ｂｅｌｌｅｙ  Ｍ、Ｇａｌｌａｎｔ  Ｍ、Ｄｕｆｒｅｓｎｅ  Ｃ、Ｇａｒｅａｕ  Ｙ、Ｒｕｅｌ  Ｒ、Ｊｕｔｅａｕ  Ｈ、Ｌａｂｅｌｌｅ  Ｍ、Ｏｕｉｍｅｔ  Ｎ、Ｍｅｔｔｅｒｓ  ＫＭ、プロスタグランジンおよび関連する類似体の親和性および選択性を決定するための、組換えプロスタノイド受容体の利用、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２０００年１月１７日；１４８３（２）：２８５〜２９３に記載されたように、また以下に論じるように、実施した。
【０１１７】
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３（ＥＢＮＡ）細胞系におけるプロスタノイド受容体の安定発現
完全長コード配列に対応するプロスタノイド受容体（ＰＧ）ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適切な部位にサブクローニングし、製造業者の取扱説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｐＣＥＰ４ＰＧプラスミドＤＮＡを調製し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ＠（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用してＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞にトランスフェクトした。ハイグロマイシン抵抗遺伝子と共にｃＤＮＡを発現するＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン−Ｇ、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌ  活性ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（商標）（Ｇ４１８）（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．／ＢＲＬから）、および２００μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補ったダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で選択した。個々のコロニーを、クローニングリング法を使用して選択した状態で成長後２〜３週間過ぎた後に分離し、その後、クローン細胞系内に増殖させた。受容体ｃＤＮＡの発現を、受容体結合アッセイによって評価した。
【０１１８】
ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を、空気中６％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で、補われたＤＭＥＭ完全培地で増殖させ、次いで収集し、分画遠心分離（１０分間１０００×ｇ、次いで３０分間１６０，０００×ｇ、全て４℃で）の後に、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μＭ  Ｅ−６４、１００μＭ  ロイペプチン、および０．０５ｍｇ／ｍｌペプスタチン）の存在下、氷上で３０分間、８００ｐｓｉで窒素キャビテーションを行うことにより細胞溶解することによって膜を調製した。１６０，０００×ｇペレットを、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅ  Ａ；１０ストローク）によって、約５〜１０ｍｇ／ｍｌタンパク質の１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。
【０１１９】
プロスタノイド受容体結合アッセイ
プロスタノイド受容体結合アッセイは、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＥＰサブタイプ）または１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、およびＴＰ）および放射リガンド［ＥＰサブタイプでは０．５〜１．０ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＥ２（１８１  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＤＰでは０．７ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＤ２（１１５  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＦＰでは０．９５ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＦ２α（１７０  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＩＰでは５ｎＭ［３Ｈ］イロプロスト（１６  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＴＰでは１．８ｎＭ［３Ｈ］ＳＱ２９５４８（４６  Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、］を含有する１０ｍＭ  ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０）（ＥＰサブタイプ、ＦＰおよびＴＰ）または１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）（ＤＰおよびＩＰ）中の最終インキュベーション体積０．２ｍｌで行った。ＥＰ３アッセイは、１００μＭ  ＧＴＰγＳも含有していた。反応は、１６０，０００×ｇ画分からの膜タンパク質（ＥＰ１では約３０μｇ、ＥＰ２では約２０μｇ、ＥＰ３では約２μｇ、ＥＰ４では約１０μｇ、ＦＰでは約６０μｇ、ＤＰでは約３０μｇ、ＩＰでは約１０μｇ、およびＴＰでは約１０μｇ）を添加することによって開始した。リガンドをジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）に添加し、これを全てのインキュベーションにおいて１％（ｖ／ｖ）で一定に保った。対応する非放射性プロスタノイド１μＭの存在下、非特異的結合を決定した。インキュベーションを６０分間（ＥＰサブタイプ、ＦＰ、およびＩＰ）または３０分間（ＤＰおよびＴＰ）、３０℃（ＥＰサブタイプ、ＤＰ、ＦＰ、およびＴＰ）または室温（ＩＰ）で実施し、ＥＤＴＡを含まないインキュベーション緩衝液で事前に湿潤させた（４℃で）９６ウェルＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）に通して急速ろ過し、Ｔｏｍｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ  ９６ウェル半自動化細胞収集機を使用して、終了させた。フィルタを、同じ緩衝液３〜４ｍｌで洗浄し、５５℃で９０分間乾燥し、個々のフィルタに結合した残留放射能を、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ）を使用してＵｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  Ｆ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）５０μｌを添加した状態でシンチレーションカウントすることにより決定した。全結合から非特異的結合を差し引くことによって、特異的結合を算出した。特異的結合は全結合の９０〜９５％を占め、使用した放射リガンドおよびタンパク質の濃度に対して線形であった。全結合は、インキュベーション培地に加えられた放射リガンドの５〜１０％を占めた。
【０１２０】
骨に使用される本発明の化合物の活性範囲は、０．０１〜１００，０００ｎＭの間である。
【０１２１】
骨吸収アッセイ：
１．動物の処置
ｍＲＮＡ局在化アッセイでは、５週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をＣＯ２で安楽死させ、その脛骨および頭蓋冠を切除し、軟組織を取り除いてすぐに液体窒素で凍結させる。ＥＰ４調節実験では、６週齢のラットに対し、賦形剤（エタノールの７％滅菌水溶液）またはタンパク質同化用量のＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）（同じ賦形剤中３〜６ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内に１回注射する。動物は、注射後の複数の時点で安楽死させ、その脛骨および頭蓋冠、並びに肺および腎臓組織からのサンプルを液体窒素中で凍結させる。
【０１２２】
２．細胞培養
４週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脛骨からの骨膜細胞の初代培養から、ＲＰ−１骨膜細胞を自発的に不死化し、１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を含むＤＭＥＭ（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で培養する。これらの細胞は、初期の培養では骨芽細胞表現型マーカーを発現しないが、集密状態になると、Ｉ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、およびオステオカルシンを発現し、ミネラル化細胞外基質を生成する。
【０１２３】
ＲＣＴ−１およびＲＣＴ−３は、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ消化の組合せによってラット胎児頭蓋冠から放出された細胞からのＳＶ−４０ラージＴ抗原により不死化された、クローン細胞系である。消化の最初の１０分間で放出された細胞から得られたＲＣＴ−１細胞（画分Ｉ）を、１０％ウシ胎児血清および０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（ＢＲＬ）で培養する。これらの細胞は、レチノイン酸処理によって分化し、骨芽細胞としての特徴を発現する。骨芽細胞に富む画分ＩＩＩ細胞から不死化されたＲＣＴ−３細胞を、５％ウシ胎児血清および０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＦ−１２培地（ＢＲＬ）で培養する。ＴＲＡＢ−１１細胞も、成体ラットの脛骨からのＳＶ４０ラージＴ抗原によって不死化し、１０％ＦＢＳおよび０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含んだＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。ＲＯＳ  １７／２．８ラットの骨肉腫細胞は、５％ＦＢＳを含有するＦ−１２で培養する。骨芽細胞に富む（画分ＩＩＩ）初代ラット胎児頭蓋冠細胞は、１９日齢ラット胎児の頭蓋冠の、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ消化によって得られる。その全体を本明細書に参照により援用する、Ｒｏｄａｎ他、Ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃａｌｖａｒｉａ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｃｉｄｉｃ  ＦＧＦ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２１、１９１９〜１９２３（１９８７）を参照されたい。細胞は、３０〜５０分の消化で放出され（画分ＩＩＩ）、これを５％ＦＢＳを含有するＦ−１２培地で培養する。
【０１２４】
１０％ＦＢＳを含むイーグルＭＥＭで培養したＰ８１５（マウス肥満細胞腫）細胞と、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養したＮＲＫ（正常なラットの腎線維芽細胞）細胞を、ＥＰ４発現の陽性対照および陰性対照としてそれぞれ使用する。いずれもその全体を本明細書に参照により援用する、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ他、Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓａｍｕｌｅｓｓｏｎ  Ｂ．他編）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｚｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２３、第４９９〜５０４頁（１９９５）、およびｄｅ  Ｌａｒｃｏ他、Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ：ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９４、３３５〜３４２（１９７８）を参照されたい。
【０１２５】
３．ノーザンブロット分析
組織ホモジナイザにより、凍結した骨サンプルを微粉砕した後、イソチオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法を使用して、脛骨の骨幹端または骨幹および頭蓋冠からトータルＲＮＡを抽出する。その全体を本明細書に参照により援用する、Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ他、Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．、Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２、１５６〜１５９（１９８７）を参照されたい。０．９％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上でＲＮＡサンプル（２０ｍｇ）を分離し、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）に移す。膜を、Ｈｙｂｒｉｓｏｌ  Ｉ（Ｏｎｃｏｒ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）および０．５ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケの精液ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で３時間、４２℃でプレハイブリダイズし、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用したランダムプライミングにより［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）ラットＥＰ２およびマウスＥＰ４ｃＤＮＡプローブと４２℃でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、膜を、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで４回、合わせて１時間室温で洗浄し、０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回、５５℃で１時間洗浄し、次いで増感紙を使用して、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ２フィルムに−７０℃で露光する。フィルム現像後、結合したプローブを、８０℃の０．１％ＳＤＳで２回除去し、膜を、ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）ｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡから購入）とハイブリダイズして、負荷対照に用いる。
【０１２６】
４．Ｉｎ−Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
凍結した脛骨を７ｍｍの厚さに冠状に切り取り、その切片を荷電スライド（Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎ  Ｐｌｕｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＮＪ）に載せ、ハイブリダイゼーションまで−７０℃に保つ。ｃＲＮＡプローブを、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  ＩＩキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して３５Ｓ−ＵＴＰｇＳ（ＩＣＮ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）で標識する。ハイブリダイゼーションは、５０℃で一晩行う。いずれもその全体を本明細書に参照により援用する、Ｍ．Ｗｅｉｎｒｅｂ他、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．、５、８３１〜８４２（１９９０）、およびＤ．Ｓｈｉｎｅｒ他、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖ  ａｎｄ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、８、４０３〜４１４（１９９３）を参照されたい。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、切片を、グリセロールの６％水溶液で２：１に希釈した４２℃のＩｌｆｏｒｄ  Ｋ５エマルジョンに浸漬し、１２〜１４日間、４℃で暗闇に曝す。スライドを、１５°で水と１：１に希釈したＫｏｄａｋ  Ｄ−１９で現像し、固定し、蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン染色後にグリセエロール−ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）を施す。染色した切片を、明視野または暗視野光学部品を使用して、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）で見る。
【０１２７】
５．骨芽細胞系および骨組織でのＥＰ４の発現
骨芽細胞に富む初代ラット脛骨細胞、ラット胎児頭蓋冠または成体ラット脛骨からの不死化骨芽細胞系、および骨芽細胞骨肉腫細胞系を含んだ様々な骨由来細胞での、ＥＰ４およびＥＰ２  ｍＲＮＡの発現について調べる。骨芽細胞および細胞系のほとんどは、ラット骨肉腫細胞系ＲＯＳ  １７／２．８以外、３．８ｋｂという相当な量のＥＰ４  ｍＲＮＡを示す。この知見に合わせ、ＲＯＳ  １７／２．８細胞では、ＰＧＥ２が、ＲＣＴ−３およびＴＲＡＢ−１１細胞で顕著に誘導される細胞内ｃＡＭＰに影響を及ぼさない。レチノイン酸を用いたＲＣＴ−１細胞の処理は、その分化を促進するものであるが、ＥＰ４  ｍＲＮＡのレベルを低下させる。ＮＲＫ線維芽細胞はＥＰ４  ｍＲＮＡを発現しないが、陽性対照として使用されるＰ８１５肥満細胞腫細胞は大量のＥＰ４  ｍＲＮＡを発現する。ＥＰ４  ｍＲＮＡとは対照的に、検出可能な量のＥＰ２  ｍＲＮＡをトータルＲＮＡサンプル中に発現する骨芽細胞および細胞系はない。骨芽細胞でのＥＰ４  ｍＲＮＡの発現で、ＥＰ４は、５週齢のラットの脛骨および頭蓋冠から単離されたトータルＲＮＡでも発現する。これとは対照的に、脛骨幹からのＲＮＡにＥＰ２  ｍＲＮＡは見られない。
【０１２８】
６．ＰＧＥ２は、ＲＰ−１骨膜細胞および成体ラットの脛骨で、ＥＰ４  ｍＲＮＡの発現を誘発する
ＰＧＥ２は、それ自体の生成を、骨芽細胞および骨組織におけるシクロオキシゲナーゼ２発現のアップレギュレーションを介して高め、したがってそれ自体の効果が自動増幅する。ＰＧＥ２は、ＥＰ４  ｍＲＮＡのレベルも増大させる。ＲＰ−１細胞を、成体ラット脛骨膜の初代培養から不死化させる。これらの細胞は、集密化すると骨芽細胞表現型マーカーを発現し、ヌードマウスに移植すると、ミネラル化骨基質を形成する。試験をしたその他の骨芽細胞と同様に、ＲＰ−１骨膜細胞は、３．８ｋｂのＥＰ４転写物を発現する。ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）で処理することにより、ＥＰ４  ｍＲＮＡレベルが急速に増大し、処理後２時間でピークに達する。ＰＧＥ２は、より分化したＲＣＴ−３細胞においてＥＰ４  ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさず、ＰＧＥ２によるＥＰ４発現の細胞型特異的調節であることを示している。ＥＰ２  ｍＲＮＡは、ＰＧＥ２による処理の前後でＲＰ−１細胞中に発現しない。
【０１２９】
ＰＧＥ２が、骨組織内でＥＰ４  ｍＲＮＡレベルをｉｎ  ｖｉｖｏ調節するかどうか調べるため、５週齢のオスのラットにＰＧＥ２を注射する（３〜６ｍｇ／Ｋｇ）。ＰＧＥ２を全身投与することにより、脛骨幹のＥＰ４  ｍＲＮＡレベルが急速に増大し、注射後２時間でピークに達する。脛骨幹および頭蓋冠では、ＥＰ４  ｍＲＮＡに対してＰＧＥ２の同様の効果が観察される。ＰＧＥ２は、細胞型特異的であり組織特異的な手法で、骨原性骨膜細胞では生体外で、また骨組織では生体内で、ＥＰ４  ｍＲＮＡレベルを引き上げる。ＰＧＥ２は、ＲＰ−１細胞においても骨組織においても、ＥＰ２  ｍＲＮＡレベルを引き上げない。
【０１３０】
７．骨組織におけるＥＰ４  ｍＲＮＡ発現の局在化
骨の中でＥＰ４を発現する細胞を局在化させるため、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用する。対照実験（賦形剤の注射）のラットでは、骨髄細胞で検出されるＥＰ４が少ない。単回タンパク同化用量のＰＧＥ２を投与することにより、骨髄細胞内でのＥＰ４発現が増加した。骨髄全体の銀杢の分布は均一ではなく、骨幹端の多くの領域で塊や斑が生じる。脛骨の骨幹端では、ＥＰ４発現が二次海綿質領域に制限され、一次海綿質には見られない。同様の切片とセンスプローブとのハイブリダイゼーション（陰性対照）は、いかなるシグナルも示さない。
【０１３１】
ＥＰ４は、骨芽細胞では生体外で、また骨髄細胞では生体内で発現し、そのリガンド、ＰＧＥ２によってアップレギュレートされる。
【０１３２】
８．本発明の作動剤
作動剤の活性を測定するための標準的な方法を使用して、以下の化合物を、細胞培養でおよびＥＰ４受容体を含まない系で評価し、それによって、この化合物の作動剤活性を、そのＥＣ５０値に関して決定する。
【国際調査報告】
2005519879.tif 000026