(57)【要約】樹状細胞は、抗原特異的免疫応答に重要な役割を果たす。プラズマ細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）として公知の特定のサブセットの抗原提示樹状細胞の移動または活性化を促進または阻害することによって、癌、感染疾患、自己免疫疾患、移植、およびアレルギーを含む疾患状態を処置する、物質および方法が提供される。特に、疾患状態を処置する方法が提供され、この方法は、ケモカインレセプターアゴニストおよびアンタゴニストを、活性化剤と共にかまたは伴わずに、単独でかまたは疾患関連抗原と組み合わせて投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患状態を処置する方法であって、該方法は、プラズマ細胞様樹状細胞の移動を増加または減少させるのに十分な量のケモカインレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを、処置が必要な個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
疾患状態を処置する方法であって、該方法は、免疫応答を増強または調節するのに十分な量のケモカインレセプターアゴニストを処置が必要な個体に投与する工程を包含し、ここで、該ケモカインレセプターアゴニストは、ＣＸＣＲ３アゴニスト、ＣＸＣＲ４アゴニスト、ＣＣＲ６アゴニスト、およびＣＣＲ１０アゴニストまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項３】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、ＩＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−３α、ＭＥＣおよびＣＴＡＣＫからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、組換え体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、低分子である、請求項２に記載の方法
【請求項６】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、１種以上の他のケモカインレセプターアゴニストと組み合わせて投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記疾患状態が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染または癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患状態が、自己免疫障害、アレルギー、または移植である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の疾患関連抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原が、自己抗原、組織適合性抗原またはアレルゲンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびｇｐ１００からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記処置される疾患状態が、口腔、咽頭、消化器系、呼吸器系、頭部および頸部、骨および関節、軟組織、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および神経系、内分泌系、および血液／造血系に発症する癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記処置される癌が、前立腺癌であり、前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＡおよび／またはＰＳＭである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記処置される疾患状態が、黒色腫であり、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００またはチロシナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
生存因子を投与する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記生存因子が、ＩＬ−３、ＩＦＮαおよびＲＡＮＫ−Ｌからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
活性化剤を投与する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性化剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストおよびＴｏｌｌ様レセプターリガンド／アゴニストからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、経皮的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、経口的に、局所的に投与されるか、またはベクターの形態で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され、ここで、該標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低分子、または疾患関連抗原を認識もしくは標的するように操作されたベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、融合タンパク質の形態で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質がまた、疾患関連抗原を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
疾患状態を処置する方法であって、該方法は、有効量のＣＸＣＲ４アゴニストと組み合わせて、有効量のＣＸＣＲ３アゴニストを、処置が必要な個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記ＣＸＣＲ４アゴニストが、ＳＤＦ−１またはその生物学的に活性なフラグメントであり、前記ＣＸＣＲ３アゴニストが、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、Ｉ−ＴＡＣ、およびこれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＸＣＲ３アゴニストまたは前記ＣＸＣＲ４アゴニストが組換え体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＸＣＲ３アゴニストまたは前記ＣＸＣＲ４アゴニストが、低分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患状態が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染ま
たは癌である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１種の疾患関連抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原が、自己抗原、組織適合性抗原またはアレルゲンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびｇｐ１００からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記処置される疾患状態が、口腔、咽頭、消化器系、呼吸器系、頭部および頸部、骨および関節、軟組織、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および神経系、内分泌系、および血液／造血系に発症する癌からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記処置される癌が、前立腺癌であり、前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＡおよび／またはＰＳＭである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記処置される疾患状態が、黒色腫であり、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００またはチロシナーゼである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
生存因子を投与する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記生存因子が、ＩＬ−３、ＩＦＮαおよびＲＡＮＫ−Ｌからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
活性化剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記活性化剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストおよびＴｏｌｌ様レセプターリガンド／アゴニストからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、経皮的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、経口的に、局所的に投与されるか、またはベクターの形態で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され、ここで、該標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低分子、または疾患関連抗原を認識もしくは標的するベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、融合タンパク質の形態で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質が、腫瘍関連抗原をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
疾患状態を処置する方法であって、該方法は、有効量の生存因子と組み合わせて、有効量のＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アゴニストを、処置が必要な個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記ＣＣＲ６アゴニストがＭＩＰ−３αまたはその改変体であり、前記ＣＣＲ１０アゴニストが、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＰまたはこれらの改変体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＣＲ６アゴニストまたは前記ＣＣＲ１０アゴニストが組換え体である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＣＣＲ６アゴニストまたは前記ＣＣＲ１０アゴニストが低分子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記生存因子が、ＩＬ−３、ＩＦＮαおよびＲＡＮＫ−Ｌからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
活性化剤を投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記活性化剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストおよびＴｏｌｌ様レセプターリガンド／アゴニストからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾患状態が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染ま
たは癌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１種の疾患関連抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗原が、自己抗原、組織適合性抗原またはアレルゲンである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびｇｐ１００からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記処置される疾患状態が、口腔、咽頭、消化器系、呼吸器系、頭部および頸部、骨および関節、軟組織、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および神経系、内分泌系、および血液／造血系に発症する癌からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記処置される癌が、前立腺癌であり、前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＡおよび／またはＰＳＭである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記処置される疾患状態が、黒色腫であり、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００またはチロシナーゼである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、経皮的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、経口的に、局所的に投与されるか、またはベクターの形態で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され、ここで、該標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低分子、または疾患関連抗原を認識もしくは標的するよう操作されたベクターである、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、融合タンパク質の形態で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記融合タンパク質が、疾患関連抗原をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
疾患状態を処置する方法であって、該方法は、有効量のＣＸＣＲ３アゴニストおよび生存因子と組み合わせて、有効量のＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０を、処置が必要な個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６７】
前記ＣＣＲ６アゴニストがＭＩＰ−３αまたはその生物学的に活性なフラグメントであり、前記ＣＣＲ１０アゴニストが、ＣＴＡＣＫまたはその生物学的に活性なフラグメントであり、そして前記ＣＸＣＲ３アゴニストが、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、およびこれらの生物学的に活性なフラグメントからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣＣＲ６アゴニストまたは前記ＣＣＲ１０アゴニストまたは前記ＣＸＣＲ３アゴニストが組換え体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＣＲ６アゴニストまたは前記ＣＣＲ１０アゴニストまたは前記ＣＸＣＲ３アゴニストが低分子である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記生存因子が、ＩＬ−３、ＩＦＮαおよびＲＡＮＫ−Ｌからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
活性化剤を投与する工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記活性化剤が、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストおよびＴｏｌｌ様レセプターリガンド／アゴニストからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患状態が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染または癌である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも１種の疾患関連抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗原が、自己抗原、組織適合性抗原またはアレルゲンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ、およびｇｐ１００からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記処置される疾患状態が、口腔、咽頭、消化器系、呼吸器系、頭部および頸部、骨および関節、軟組織、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼および眼窩、脳および神経系、内分泌系、および血液／造血系に発症する癌からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項８０】
前記処置される癌が、前立腺癌であり、前記腫瘍関連抗原が、ＰＳＡおよび／またはＰＳＭである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記処置される疾患状態が、黒色腫であり、前記腫瘍関連抗原が、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００またはチロシナーゼである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、経皮的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、経口的に、局所的に投与されるか、またはベクターの形態で投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項８３】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され、ここで、該標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低分子、または疾患関連抗原を認識もしくは標的するよう操作されたベクターである、請求項６６に記載の方法。
【請求項８４】
前記ケモカインレセプターアゴニストが、融合タンパク質の形態で投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項８５】
前記融合タンパク質が、疾患関連抗原をさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
疾患を処置する方法であって、該方法は、ｐＤＣの移動を減少させるのに有効なケモカインレセプターアゴニストを、処置が必要な個体に投与する工程を包含し、ここで、該ケモカインレセプターアンタゴニストは、ＣＸＣＲ３アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＣＣＲ６アンタゴニスト、およびＣＣＲ１０アンタゴニストまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項８７】
前記疾患状態が、自己免疫疾患、移植片拒絶またはアレルギーである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記疾患状態が、癌または感染疾患である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記ケモカインレセプターアンタゴニストが、組換え体である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記ケモカインレセプターアンタゴニストが、低分子である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記ケモカインレセプターアンタゴニストが、経皮的に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、経口的に、局所的に投与されるか、またはベクターの形態で投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記ケモカインレセプターアンタゴニストが、ケモカインレセプターアンタゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され、ここで、該標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、低分子、または疾患関連抗原を認識もしくは標的するよう操作されたベクターである、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、癌を含む疾患状態の処置におけるヒトケモカインレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの使用に関連する。投与されるケモカインレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストは、樹状細胞の特定のサブセットの移動を方向付けるかまたは防止する。１つの実施形態において、樹状細胞を活性化するように設計された疾患特異的抗原および／または疾患特異的部分は、ケモカインレセプターアゴニストとともに投与される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原の取り込みおよびＴ細胞へのそれらの提示に従事している。従って、ＤＣは、抗原特異的免疫応答において重要な役割を果たす。
【０００３】
ＤＣは、骨髄由来であり、血流から組織の至るところまで前駆体として移動し、ここでＤＣは、その表皮におけるランゲルハンス細胞のような常在の細胞となる。末梢において、病原体侵入後、ランゲルハンス細胞のような未成熟ＤＣは、抗原を捕獲しプロセシングする炎症部位（Ｋａｐｌａｎら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１７１７−１７２８；ＭｃＷｉｌｌｉａｍら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１３３１−１３３６）に補充される（Ｉｎａｂａら、１９８６．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：６０５−６１３；Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３９２５−３９３３；Ｒｏｍａｎｉら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９−１１７８；Ｐｕｒｅら、１９９０．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４５９−１４６９；Ｓｃｈｕｌｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６−５４６）。次いで、抗原が負荷されたＤＣは、リンパ管を経由して末梢組織から、リンパ節のＴ細胞が豊富な領域まで移動し、ここで成熟ＤＣは、相互連結細胞（ＩＤＣ）と呼ばれる（Ａｕｓｔｙｎら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６４６−６５１；Ｋｕｐｉｅｃ−Ｗｅｇｌｉｎｓｋｉら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６３２−６４５；Ｌａｒｓｅｎら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９４；Ｆｏｓｓｕｍ、Ｓ．１９８８、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：９７−１０５；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１６５４−１６６７；Ｋｒｉｐｋｅら、１９９０．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２８３３−２８３８）。この部位で、これらは、ネイティブのＴ細胞に対してプロセシングされた抗原を提示し、そして抗原特異的な初期のＴ細胞応答を発生する（Ｌｉｕら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２９９−１３０７；Ｓｏｒｎａｓｓｅら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１５−２１；Ｈｅｕｆｌｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：７００−７０５）。
【０００４】
ＤＣ系は、身体の至る所に広範囲に分布した形態学的に類似の細胞型の多様な集団から構成される（Ｃａｕｘら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６：２；Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。数種の樹状細胞（例えば、表皮のランゲルハンス細胞（ＬＣ））は、免疫系の歩哨の役割を果たす。他のＤＣ亜集団（例えば、単球、血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、およびプラズマ細胞様ＤＣ（ｐＤＣ））は、特定の解剖学的部位における感染の間に補充される必要がある循環細胞である。
【０００５】
プラズマ細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）は、炎症性リンパ節のＨＥＶ周辺に蓄積するプラズマ細胞様単球／Ｔ細胞として、病理学者によって最初に特徴付けされた（Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒら、１９８３、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．（Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．）４４：１−１１４；Ｆａｃｃｈｅｔｔｉら、１９８８，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  １９（９）：１０８５−９２；Ｆａｃｃｈｅｔｔｉら、１９８８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：１５２１）。次いで、プラズマ細胞様ＤＣは、血液からＣＤ１１ｃ−ＤＣサブセットとして同定され（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８２：４８７−４９３）、扁桃からの単離の際の、Ｉｇ分泌プラズマ細胞との超微細構造的類似点に起因して、プラズマ細胞様として特徴付けされた（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１）。これらは、独自の表面表現型（ＣＤ４＋ＩＬ−３Ｒ＋＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１；Ｆａｃｃｈｅｔｔｉら、１９９９，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ３５（１）：８８−９；Ｒｅｓら、１９９９，Ｂｌｏｏｄ９４（８）：２６４７−５７）によって特徴付けされる。ｐＤＣは、天然のＩＦＮα産生細胞（ＮＩＰＣ）と同一であることが、近年実証された（Ｓｉｅｇａｌら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４２１）：１８３５−７；Ｃｅｌｌａら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９−９２３）（これらは、抗ウイルス免疫応答において血液中のＩＦＮαの主要な供給源として長い間認識されている（Ｉｔｏら、１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（２）：５１９−２３；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ−Ｂｏｃａｒｓｌｙら、１９９３，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６０：３９−６２；Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０４（１）：１−７；（Ｐｅｒｕｓｓｉａら、１９８５，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ  ４（３）：１２０−３７；Ｃｈｅｈｉｍｉら、１９８９，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６８（４）：４８８−９０；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ−Ｂｏｃａｒｓｌｙら、１９８８，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ４３（４）：３２３−３４；Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９０，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ  １０（４）：４３５−４６）。ウイルスの遭遇後、これらの細胞は、高レベルのＩＦＮαを産生し、そしてインビトロでの強力なプライミングおよびネイティブＴ細胞のＴｈ−１分極を誘導する（Ｃｅｌｌａら、２０００，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １（４）：３０５−１０；Ｋａｄｏｗａｋｉら、２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２（２）：２１９−２６）。ｐＤＣの起源は、依然として不明確であるが、いくつかのエレメントは、それらがＴ細胞およびＢ細胞と共通の前駆体由来であり得ることを示唆している：ｉ）これらは、骨髄性抗原の発現を欠如し（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５，６：１１０１−１１１１；Ｒｅｓら、１９９９．Ｂｌｏｏｄ  ９４，８：２６４７−５７）、ｉｉ）これらは、プレＴＣＲ転写物（Ｒｅｓら、１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４（８）：２６４７−５７；Ｂ��ｕｎｏら、１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：８７５−８８４）、およびＳＰＩ−Ｂａリンパ球転写因子（Ｂｅｎｄｒｉｓｓ−Ｖｅｒｍａｒｅら、２００１，ＪＣＩ  １０７：８３５）を発現し、ｉｉｉ）骨髄性ＤＣではなく、ｐＤＣ、ＴおよびＢの発達が、ＤＮＡ結合ｌｄ２またはｌｄ３のインヒビターの異所性発現によってブロックされる（Ｓｐｉｔｓら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１２）：１７７５−８４）。
【０００６】
それらの形態学、それらのＩＦＮα産生およびそれらの推定起源に加えて、ｐＤＣはまた、それらの弱い食細胞活性において（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１）、それらの弱いＩＬ−１２産生能力において（Ｒｉｓｓｏａｎら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３−１１８６）、およびそれらの活性を誘導するシグナルにおいて（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６（４）：２２９１−５）、骨髄性ＤＣとは異なっている。特に、ｐＤＣは、ＣｐＧに応答するが、ＩＦＮαを産生することによってＬＰＳ活性化に応答せず、一方、骨髄性ＤＣは、ＩＬ−１２を産生することによってＬＰＳに主に応答する（Ｃｅｌｌａら、１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７４７−７５２；Ｋｏｃｈら、１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：７４１−７４６）。ｐＤＣは、活性化シグナルの存在または非存在に依存して（Ｌｉｕら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：５８５）、Ｔｈ−１免疫応答（Ｒｉｓｓｏａｎら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３）またはＴｈ−２免疫応答（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２０００，ＪＥＭ  １９２：２１９）を誘導することが示されている。活性化ｐＤＣの漸増は、ネイティブのＴ細胞活性を介する免疫を開始するはずであるが、不活性化ＤＣは、おそらく調節性Ｔ細胞の誘導を介して、免疫耐性を誘導することが報告されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３９４；Ｂｅｌｌら、２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１１，Ｒｏｎｃａｒｏｌｏら、２００１，ＪＥＭ  １９３：Ｆ５；Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、２０００，ＪＥＭ  １６２：１２１３）。さらに、ｐＤＣは、ＩＬ−１０分泌Ｔ細胞（Ｒｉｓｓｏａｎら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３；Ｌｉｕら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：５８５）、およびＣＤ８調節性Ｔ細胞（Ｇｉｌｌｉｅｔら、２００２．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９５（６）：６９５−７０４）を誘導することが示されている。さらに、ｐＤＣは近年、自己免疫疾患、特に狼瘡（Ｆａｒｋａｓら、２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２３７）に関連している。さらに、卵巣腫瘍におけるｐＤＣの活発な漸増が、報告されており（Ｃｕｒｉｅｌら、２００１，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  Ｍａｒｃｈ  １２−１８，２００１：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、このことは、ｐＤＣは、おそらく調節性免疫応答の誘導を介して、特定の環境における腫瘍の発達に好都合であり得ることを実証している。これらの場合において、その腫瘍環境は、ｐＤＣの活性化を防止すると推測される。
【０００７】
ケモカインは、白血球の移動および活性化を調節する低分子量タンパク質である（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、１９９３、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。これらは、活性化された白血球自身、ならびに炎症刺激に際しての内皮細胞および上皮細胞を含む間質細胞により分泌される（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、１９９３、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。ケモカインに対する応答は、７つの膜貫通Ｇタンパク質共役レセプターにより媒介される（Ｒｏｌｌｉｎｓ、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｐｒｅｍａｃｋら、１９９６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１７４−１１７８；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｐ．Ｍ．１９９４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３）。
【０００８】
ケモカイン構造ファミリーに属する数種のタンパク質が、インビトロにおいて樹状細胞（ＤＣ）の特定のサブセットの漸増を促進し得ることが示されている（Ｃａｕｘら、２０００，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：３４５−６９；Ｓｏｚｚａｎｉら、１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら、１９９６，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０：３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら、１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２３７−２２４７）。しかし、樹状細胞の輸送を調節するシグナルは、複雑でありかつ完全には理解されない。特に、非常に少ない情報が、プラズマ細胞様樹状細胞の移動能力に関して利用可能である。このＤＣサブクラスの漸増および移動に関与するシグナルを理解することは、免疫応答を制御または調節し、そして免疫疾患を処置するための治療剤の開発において有用である。特に、腫瘍におけるｐＤＣの動員は、それらの機能の活用が抗腫瘍免疫を誘発または増幅することを可能する。ｐＤＣは抗ウイルス免疫の重要なイニシエータであるので、それらの制御された操作は、潜在的な抗腫瘍免疫を生じると予測される。
【０００９】
治療的および予防的の両方に有用であるように、抗原提示樹状細胞を伸長および活性化させるだけでなく、ＤＣの移動も調節するために使用され得る、改善された材料および方法のための継続的な必要性が存在している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、抗原提示樹状細胞の特定のサブセットの移動もしくは活性化を促進または阻害することにより疾患状態を処置するための材料および方法を提供することによって、前述の必要性を満たす。現在、ヒトプラズマ細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）（血液の天然のＩＦＮα産生細胞）は、選択されたケモカインによって制御される独自の輸送経路に従うことが発見されている。従って、特定のケモカインレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを、単独または疾患関連抗原と組み合わせて投与することは、有用な治療方法である。本発明に従って処置され得る疾患状態としては、寄生生物感染、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、癌、自己免疫疾患、移植片拒絶、およびアレルギーが挙げられる。
【００１１】
従って、本発明は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態の処置が必要な個体に、プラズマ細胞様樹状細胞の抗原送達部位への移動を増減させるに十分な量のケモカインレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態の処置が必要な個体に、（ｐＤＣ漸増および活性化を介する）免疫応答を増強するのに十分な量のケモカインレセプターアゴニストを投与する工程を包含し、ここで、このケモカインレセプターアゴニストは、ＣＸＣＲ３アゴニスト、ＣＸＣＲ４アゴニスト、ＣＣＲ６アゴニスト、およびＣＣＲ１０アゴニスト、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、この疾患状態は、寄生生物感染、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染また癌である。より好ましくは、この疾患状態は、癌である。
【００１３】
特定の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、天然のリガンドであり、この天然のリガンドは、以下からなる群より選択される：ＳＤＦ−１、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、Ｍｉｐ−３α、またはそれらの改変体。特定の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、組換え体である。他の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、低分子である。このケモカインレセプターアゴニストは、単独でかまたは他のケモカインレセプターアゴニストと組み合わせて、投与され得る。
【００１４】
好ましい局面において、このケモカインレセプターアゴニストは、例えば、融合タンパク質の形態で、疾患関連抗原とともに投与される。このような抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または自己抗原、組織適合性の抗原またはアレルゲンに関連した腫瘍であり得る。
【００１５】
このケモカインレセプターアゴニストは、１種以上の疾患関連抗原に融合された１種以上のケモカインレセプターアゴニストを含有する、融合タンパク質の形態でか、あるいはＤＮＡまたは抗原を有するかもしくは有さないケモカインレセプターアゴニストをコードするウイルスベクターによって、投与され得る。好ましい実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、局所投与および／または全身投与される。
【００１６】
ケモカインレセプターアゴニストはまた、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で、投与され得、ここで、この標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、低分子、またはベクター（例えば、ウイルスベクター）（これは、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍の非癌性成分によって特異的に発現される構造（例えば、腫瘍脈管構造）を認識または標的するように操作される）である。この認識された構造はまた、感染性疾患、自己免疫、アレルギーまたは移植片拒絶のような他の疾患に関連し得る。
【００１７】
ケモカインレセプターアゴニストは、ｐＤＣ生存因子（例えば、ＩＬ−３、ＩＦＮαまたはＲＡＮＫリガンド／アゴニスト）と組み合わせて投与され得る。
【００１８】
ケモカインレセプターアゴニストはまた、活性化剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＫリガンド／アゴニスト、ＣＤ４０リガンド／アゴニストまたはＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーの他のメンバーのリガンド／アゴニスト、ＩＦＮαまたはＴＬＲリガンド／アゴニスト（例えば、ＣｐＧ））と組み合わせて、投与され得る。
【００１９】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ＣＸＣＲ３アゴニストおよびＣＸＣＲ４アゴニストは、単独でかまたは組み合わせて投与される。好ましくは、このＣＸＣＲ３アゴニストは、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、もしくはＩ−ＴＡＣ、またはそれらの改変体であり、ＣＸＣＲ４アゴニストは、ＳＤＦ−１またはそれらの改変体である。より好ましくは、本発明は、疾患状態の処置が必要な個体において疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、一定量のＳＤＦ−１またはその改変体を、ＩＰ−１０、ＭｉｇもしくはＩ−ＴＡＣ、またはそれらの改変体と組み合わせて投与する工程を包含する。より好ましくは、腫瘍関連抗原または他の疾患関連抗原もまた、投与される。最も好ましくは、生存因子および／または活性化剤もまた、投与される。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、ＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アゴニストが、単独でかまたは組み合わせて投与される。これらの実施形態において、生存因子（例えば、ＩＬ−３）が、必要に応じて投与され得る。好ましくは、このＣＣＲ６アゴニストは、ＭＩＰ−３αまたはその改変体であり、このＣＣＲ１０アゴニストは、ＣＴＡＣＫもしくはＭＥＣ、またはそれらの改変体である。最も好ましくは、腫瘍関連抗原、または別の疾患関連抗原もまた、投与される。最も好ましくは、活性化剤もまた、投与される。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、ＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アゴニストが、ＣＸＣＲ３アゴニストと組み合わせて投与される。これらの実施形態において、生存因子（例えば、ＩＬ−３）もまた、投与され得る。好ましくは、このＣＣＲ６アゴニストは、Ｍｉｐ−３αまたはその改変体であり、このＣＣＲ１０アゴニストは、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、またはその改変体であり、そしてこのＣＸＣＲ３アゴニストは、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣおよびそれらの改変体からなる群より選択される。このアゴニストはまた、組換え体であり得るか、または低分子の形態であり得る。好ましくは、腫瘍関連抗原または別の疾患関連抗原もまた、投与される。最も好ましくは、活性化剤もまた、投与される。
【００２２】
本発明の別の局面は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態の処置が必要な個体に、免疫応答を調節する（例えば、調節性Ｔ細胞の誘導を介して耐性を誘導する）のに十分な量のケモカインレセプターアゴニストを投与する工程を包含し、ここで、このケモカインレセプターアゴニストは、ＣＸＣＲ３アゴニスト、ＣＸＣＲ４アゴニスト、ＣＣＲ６アゴニスト、およびＣＣＲ１０アゴニスト、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、活性化剤なしで投与され、この疾患状態は、好ましくは、自己免疫疾患、移植片拒絶またはアレルギーである。
【００２３】
特定の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、天然のリガンドであり、この天然のリガンドは、以下からなる群より選択される：ＳＤＦ−１、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＴＡＣＫ、ＭＥＣ、Ｍｉｐ−３α、またはそれらの改変体。特定の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、組換え体である。他の実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、低分子である。このケモカインレセプターアゴニストは、単独でかまたは他のケモカインレセプターアゴニストと組み合わせて、投与され得る。
【００２４】
好ましい局面において、このケモカインレセプターアゴニストは、例えば、融合タンパク質の形態で、疾患関連抗原とともに投与される。このような抗原は、自己抗原、組織適合性抗原またはアレルゲンであり得る。
【００２５】
ケモカインレセプターアゴニストは、１種以上の疾患関連抗原に融合された１種以上のケモカインレセプターアゴニストを含有する融合タンパク質形態でか、あるいはＤＮＡまたは抗原を有するかもしくは有さないケモカインレセプターアゴニストをコードするウイルスベクターによって、投与され得る。好ましい実施形態において、このケモカインレセプターアゴニストは、局所投与および／または全身投与される。
【００２６】
ケモカインレセプターアゴニストはまた、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され得、ここで、この標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、低分子、またはベクター（例えば、ウイルスベクター）（これは、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍の非癌性成分によって特異的に発現される構造（例えば、腫瘍脈管構造）を認識または標的するように操作される）である。この認識された構造はまた、感染性疾患、自己免疫、アレルギーまたは移植片拒絶のような他の疾患に関連し得る。
【００２７】
本発明の別の局面は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、疾患状態の処置が必要な個体に、（ｐＤＣ漸増をブロックすることによって）免疫応答を減少させるのに十分な量のケモカインレセプターアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここで、このケモカインレセプターアンタゴニストは、ＣＸＣＲ３アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＣＣＲ６アンタゴニスト、およびＣＣＲ１０アンタゴニスト、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの実施形態において、この疾患状態は、自己免疫疾患、移植片拒絶またはアレルギーである。
【００２８】
特定の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、天然のリガンドアンタゴニストであり、この天然のリガンドは、以下からなる群より選択される：ＳＤＦ−１、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＴＡＣＫおよびＭｉｐ−３α。特定の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、組換え体である。他の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、低分子である。このケモカインレセプターアゴニストは、単独でかまたは他のケモカインレセプターアンタゴニストと組み合わせて、投与され得る。
【００２９】
ケモカインレセプターアンタゴニストは、融合タンパク質の形態でか、あるいはＤＮＡまたはこのケモカインレセプターアンタゴニストをコードするウイルスベクターによって、投与され得る。好ましい実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、局所投与または全身投与される。
【００３０】
このケモカインレセプターアンタゴニストはまた、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され得、ここで、この標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、低分子、またはベクター（例えば、ウイルスベクター）（これは、自己免疫、アレルギーまたは移植片拒絶のような疾患に関連する構造を認識または標的するように操作される）である。
【００３１】
本発明の最終局面は、疾患状態を処置する方法を提供し、この方法は、そのような処置が必要な個体に、免役応答を調節するのに十分な量のケモカインレセプターアンタゴニストを投与する工程を包含し、ここでこのケモカインレセプターアンタゴニストは、ＣＸＣＲ３アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＣＣＲ６アンタゴニスト、およびＣＣＲ１０アンタゴニスト、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、活性化剤なしで投与され、そしてこの疾患状態は、好ましくは、癌である。特に、この疾患状態は、調節性Ｔ細胞の方へその免役応答をそらせ得るｐＤＣの活発な漸増が存在する状態である。
【００３２】
特定の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、天然のリガンドのアンタゴニストであり、この天然のリガンドのアンタゴニストは、以下からなる群より選択される：ＳＤＦ−１、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＴＡＣＫおよびＭｉｐ−３α。特定の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、組換え体である。他の実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、低分子である。このケモカインレセプターアンタゴニストは、単独でかまたは他のケモカインレセプターアンタゴニストと組み合わせて、投与され得る。
【００３３】
このケモカインレセプターアンタゴニストは、融合タンパク質の形態でか、あるいはＤＮＡまたはこのケモカインレセプターアンタゴニストをコードするウイルスベクターによって、投与され得る。好ましい実施形態において、このケモカインレセプターアンタゴニストは、局所投与または全身投与される。
【００３４】
このケモカインレセプターアゴニストはまた、ケモカインレセプターアゴニストおよび標的部分を含む標的構築物の形態で投与され得、ここで、この標的部分は、ペプチド、タンパク質、抗体もしくは抗体フラグメント、低分子、またはベクター（例えば、ウイルスベクター）（これは、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍の非癌性成分によって特異的に発現される構造（例えば、腫瘍脈管構造）を認識または標的するように操作される）である。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、その全体が、参考として援用される。
【００３６】
本発明は、形質細胞性樹状細胞（ｐＤＣ）が、他のＤＣサブセットに比べて特有の移動経路をたどり、そしてこれらの移動経路が、特定のケモカインの組み合わせによって制御されるという発見に一部基づく。本発明者らは、ｐＤＣが、他のＤＣサブセットまたは前駆体集団に比べて、異なるスペクトルのケモカインレセプター発現を示し、そして特有のケモカインの組み合わせに応答するということを示した。この発見に基づいて、本発明者らは、これらのレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを、単独でまたは疾患関連抗原、ｐＤＣ生存因子、および／もしくは活性化因子と組み合わせて投与することによる、ｐＤＣの補充を調節する方法を提供する。抗ウイルス免疫を開始する際のｐＤＣの重要な役割を考慮して、これらの方法は、癌のような疾患において強力な治療免疫を達成するために有用である。
【００３７】
本発明者らは、本明細書中において、ｐＤＣがほとんどの炎症性ケモカインに対して応答しないのに対して、ＣＸＣＲ４リガンド（ＳＤＦ−１）ならびにＣＸＣＲ３リガンド（Ｍｉｇ、ＩＰ−１０およびＩ−ＴＡＣ）は、ｐＤＣ移動を誘導することが非常に強力であることを実証している（実施例１、３および５）。重要なことに、本発明者らは、ＣＸＣＲ３リガンドがＳＤＦ−１と相乗作用し、ＳＤＦ−１に対する感度の閾値を下げることによってヒトｐＤＣ移動を誘導することを示した（実施例３および４）。さらに、ＣＸＣＲ３リガンドの活性は、勾配に独立であり、そして低いＳＤＦ−１濃度に対して応答するようにｐＤＣをプライミングすることによって作用するということが示された（実施例４、図８）。ヒトｐＤＣ（実施例１および３；図２および５）およびマウスｐＤＣ（実施例５；図７）の両方は、ＣＸＣＲ３リガンドおよびＣＸＣＲ４リガンドに対して応答することもまた示された。ｐＤＣはまた、皮膚ホーミング分子（ＣＬＡ）を発現し、このことは、周辺皮膚炎症部位に入る能力を示唆する（実施例６）。さらに、ケモカイン発現のインビボ分析は、炎症部位において、ＣＸＣＲ３リガンドが、ＳＤＦ−１を発現する基底上皮細胞と接触する内皮細胞によって発現され（実施例８）、このことは、以下の続いて起こる効果を議論する：ｐＤＣ補充に対する、ＣＸＣＲ３リガンドの第１の効果およびＳＤＦ−１の第２の効果。
【００３８】
従って、本発明者らは、選択的にｐＤＣを補充するための方法を提供し、この方法は、有効量のＣＸＣＲ３アゴニスト（これは、ｐＤＣに対して高度に選択的である）をＣＸＣＲ４アゴニスト（これは、より選択性が低いが、強力な化学誘引物質である）と組み合わせてｐＤＣを必要とする個体に投与する工程を包含する。さらに、ＣＸＣＲ３リガンドの活性が、少なくとも部分的に勾配と独立であり得る（実施例４および図８）ので、これらの観察は、ＣＸＣＲ４アゴニストの局所送達と組み合わせてのＣＸＣＲ３アゴニストの全身性使用が、免疫応答を増強する際に非常に有効であることを示唆する。ｐＤＣ補充をブロックすることが所望される場合、ＣＸＣＲ３アンタゴニストおよびＣＸＣＲ４アンタゴニストが、本発明に従って投与され得る。
【００３９】
骨髄性ＤＣの移動が、連続的かつ相補的なケモカインの勾配を必要とし、特に、ＣＣＲ２＋／ＣＣＲ６−循環血液ＤＣまたは前駆体が、ＣＣＲ２−リガンドによって血液から組織に補充されることが以前に観察された（Ｖａｎｂｅｒｖｌｉｅｔら、２００１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（１）：２３１−４２）。従って、微小環境に依存して、他のレセプターは、アップレギュレートされ（例えば、ＴＧＦ−βによるＣＣＲ６）、細胞を病原体侵入部位（例えば、皮膚または粘膜）に到達させる。
【００４０】
ｐＤＣ移動の種々の工程をよりよく理解するために、本発明者らは、ケモカインレセプター発現に対する、ｐＤＣ生理の公知の主要なレギュレーター（特に、生存因子ＩＬ−３）の効果を調査した。これらの条件下で、ｐＤＣは、高いレベルのＣＣＲ６およびＣＣＲ１０を発現し、そしてケモカインＭＩＰ−３αに応答することが結論付けられた（実施例７）。ＩＬ−３がｐＤＣに対する生存因子である場合、ｐＤＣ上でのＣＣＲ６インビボ発現およびＣＣＲ１０インビボ発現は、ｐＤＣ分化の生理学的工程を示すようである。これらの条件において、ＣＸＣＲ３は、さらに高度に発現され、このことは、ＣＸＣＲ３アゴニストが、ＣＣＲ６／ＣＣＲ１０アゴニストと相乗作用し得ることを示唆する。さらに、ケモカイン発現のインビボ分析は、炎症部位において、ＣＸＣＲ３−リガンド、ＳＤＦ−１、ＣＴＡＣＫおよびＭＩＰ−３αが、相補的な勾配を形成することを示し、このことは、ケモカインのｐＤＣを病原体侵入部位に到達させる連続的作用を示唆する。ＣＸＣＲ３−リガンドは、ＳＤＦ−１およびＣＴＡＣＫ（Ｍｏｒａｌｅｓら、１９９９、ＰＮＡＳ  ９６：１４４７０）を発現する基底上皮細胞と接触する内皮細胞によって発現され、ＭＩＰ−３αは、上皮の外層によって発現される（実施例８）。
【００４１】
従って、上記される方法に加えて、本発明はまた、免疫応答を増強または調節することが所望される疾患状態を処置するために方法を提供し、この方法は、その必要がある個体に、一定量のＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アゴニストを、単独でかまたは生存因子（例えば、ＩＬ−３またはこれらのレセプターを誘導する他の因子）と組み合わせて投与する工程を包含する。ＣＣＲ６アゴニストおよびＣＣＲ１０アゴニストはまた、ＣＣＲ３アゴニストおよびＣＣＲ４アゴニストと組み合わせて投与され得る。ＣＣＲ６リガンドおよびＣＣＲ１０リガンドのこの特有の細胞型に対する比活性によって、病理（例えば、自己免疫、アレルギーおよび移植）におけるＣＣＲ６／ＣＣＲ１０アンタゴニスト（ＣＸＣＲ３／ＣＸＣＲ４アンタゴニストを有しても有さなくてもよい）の使用が可能になるが、いくつかの型の腫瘍および感染疾患においてもまた可能になる。
【００４２】
最後に、ウイルスと接触する際に、ｐＤＣは、ＣＣＲ７の発現を非常に迅速にアップレギュレートし、そしてＣＣＲ７リガンド応答性を獲得し（実施例９参照）、このことは、局所的補充および活性化に続いて、これらの細胞が、リンパ節内をリンパ流、ＣＣＲ７およびそのリガンドによって制御されるプロセスを介して移動する能力を有する（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ  １７７：１３４；Ｓｏｚｚａｎｉら、２０００，ＪＣＩ  ２０：１５１）。従って、ｐＤＣ補充を可能にするケモカインレセプターアゴニストとｐＤＣ活性化を誘導するシグナルとの組み合わせは、ｐＤＣがリンパ節をリンパ流を介して移動する能力を与え、そしてリンパ節内の免疫応答を誘導する。
【００４３】
これらの活性化状態に依存して、ｐＤＣは、Ｔｈ−２免疫応答（Ｒｉｓｓｏａｎら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３）またはＴｈ−１免疫応答（Ｋａｄｏｗａｋｉら、２０００，ＪＥＭ  １９２：２１９；Ｌｉｕら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：５８５）を誘導することが示される。従って、文脈に依存して、ｐＤＣ上に選択的に発現されるケモカインレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストは、ｐＤＣ移動を誘導するかまたは抑制するかのいずれかをするために使用され、免疫性を調整し得る。
【００４４】
従って、本明細書中に示される発見の１つの適用は、癌および感染症の場合に所望されるように、これらのｐＤＣ特異的レセプターのアゴニストを使用して、ｐＤＣを補充しそしてそれらを活性化することによって免疫応答を増強する。この文脈において、目的は、抗原発現の部位に対してｐＤＣを補充しそしてそれを活性化することであり、これらの方法は、必要に応じて、ｐＤＣの生存を増進するかまたはこれらｐＤＣをネイティブなＴ細胞の活性化を介して免疫を開始する能力を与える、生存因子および／または活性化因子の投与を包含し得る。
【００４５】
他の場合において、ケモカインレセプターアンタゴニストはまた、免疫寛容を誘導するために使用される。不活性化されたＤＣは、おそらく調節性Ｔ細胞の誘導を介して免疫寛容を誘導することが報告された（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  Ｈ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：３９４；Ｂｅｌｌ  Ｅ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１１；Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ  Ｍ．Ｇ．，２００１，ＪＥＭ  １９３：Ｆ５；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  Ｈ．，２０００，ＪＥＭ  １６２：１２１３）。さらに、ｐＤＣは、ＩＬ−１０分泌性Ｔ細胞（Ｒｉｓｓｏａｎ  Ｍ．Ｃ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：１１８３；Ｌｉｕ  Ｙ．Ｊ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：５８５）およびＣＤ８調節性Ｔ細胞（Ｇｉｌｌｉｅｔら、ＩＬ−１０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＣＤ８＋Ｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＤＣ，投稿中）を誘導することが示された。従って、本発明はまた、自己免疫、アレルギーおよび移植の場合に所望されるように、ケモカインレセプターアゴニストを使用して免疫応答を低下するための方法を提供する。この文脈において、その目的は、不活性化されたｐＤＣを補充することであり、従って、これらの方法は、活性化因子の投与を包含しない。
【００４６】
同様に、ケモカインレセプターアンタゴニストは、種々の疾患状態を処置するために使用され得る。自己免疫、アレルギーおよび移植のような疾患状態において、アンタゴニストは、活性化されたｐＤＣの補充を減少するために使用され得る。例として、ｐＤＣは、最近、自己免疫疾患（特に、Ｌｕｐｕｓ）と関連付けられてきている（Ｆａｒｋａｓら、２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９：２３７）。しかし、アンタゴニストはまた、ｐＤＣの補充をブロックすることが所望される特定の癌において使用され得る。例えば、卵巣腫瘍におけるｐＤＣの能動的補充が、報告されており（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｋｅｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  Ｍａｒｃｈ  １２−１８  ２００１：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、これは、ｐＤＣが、特定の環境における、おそらく調節性免疫応答の誘導を介する腫瘍の発達に好ましくあり得ることを示す。これらの場合において、腫瘍環境は、ｐＤＣの活性化を阻害することが推測される。従って、ケモカインレセプターアンタゴニストを投与する工程を包含する、これらの疾患状態を処置するための方法が、適用可能である。
【００４７】
従って、本明細書中に記載されるケモカインレセプターアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って使用され、ｐＤＣ補充を選択的に誘導し得るかまたは抑制し得る。ＣＸＣＲ３アゴニスト、ＣＸＣＲ４アゴニスト、ＣＣＲ６アゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アゴニストと生存因子との組み合わせは、疾患関連抗原を有しても有さなくてもよく、活性化因子を有しても有さなくてもよく、免疫応答を増強するかまたは調節することが所望される疾患状態を処置するために使用され得る。ＣＸＣＲ３アンタゴニスト、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＣＣＲ６アンタゴニストおよび／またはＣＣＲ１０アンタゴニストの組み合わせは、ｐＤＣ移動に干渉することによってｐＤＣ機能をブロックすることが望ましい場合、使用され得る。
【００４８】
ケモカインレセプターＣＸＣＲ４（ＮＰＹ３Ｒ）は、Ｔリンパ球細胞株熱帯性ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対するＣＤ４（１８６９４０）と同じレセプターである（Ｆｅｎｇら、１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９５５−５８）。これは、一次ヒト乳癌細胞および転移性ヒト乳癌細胞において高度に発現されることが見出されているが、正常な哺乳動物組織において検出不可能である（Ｍｕｌｌｅｒら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：６８２４）。組織ＰＣＲ分析および定量的ＰＣＲ分析は、静脈的にまたは正常位で注射された乳癌細胞の転移が、抗−ＣＸＣＲ４抗体で処置することによって、ＳＣＩＤマウスにおいて有意に減少され得ることを示した。
【００４９】
間質細胞誘導因子１αおよび１β（ＳＤＦ１）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ３０９９１）は、ＣＸＣＲ４に対する主要なリガンドである（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１１）：１７６７−７１）。マウスＳＤＦ−１αタンパク質およびマウスＳＤＦ−１βタンパク質は、８９のＮ末端アミノ酸が同一であるが、β型は、Ｃ末端にさらに４残基有する。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号は、Ｐ３０９９１である。ヒトＳＤＦ−１は、マウスタンパク質に対して約９２％の同一性を保有する（Ｓｈｉｒｏｚｕら、１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２８（３）：４９５−５００）。ヒトα異性体およびβ異性体は、単一の遺伝子の選択的スプライシングの結果である；α型は、エキソン１〜３に由来する一方、β型は、エキソン４からさらなる配列を含む。ＳＤＦ１は、高度に効果的なリンパ球化学誘引物質であることが示された（Ｂｌｅｕｌら、１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８４（３）：１１０１−９；Ｂｌｅｕｌら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５９９４）：８２９−３３）。
【００５０】
ＣＸＣＲ３は、その発現がＩＬ−２および活性Ｔリンパ球に限定されるケモカインレセプターである（１９９８年３月１９日に公開された、ＷＯ９８／１１２１８を参照のこと）。公知のＣＸＣＲ３リガンドは、ＩＰ−１０、ＭｉｇおよびＩ−ＴＡＣを含む。ＣＸＣＲ３は、Ｔｈ−１細胞（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、２０００，Ａｒｃｈ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．４８：４５１−６）およびＮＫ細胞（Ｔａｕｂら、１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３１１２−２２）によって優先的に発現されることが示された。ＣＸＣＲ３リガンドは、抗脈管形成活性を有し、ＩＬ−１２およびＩＦＮαを含むサイトカインカスケードの抗腫瘍作用における究極の伝達物質を代表する（Ｎａｒｖａｉｚａら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３１１２−２２；Ｓｇａｄａｒｉら、１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：３８７７−８２；Ｋａｎｅｇａｎｅら、１９９８，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６４：３８４−９２）。
【００５１】
ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０，ヒトタンパク質についてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号ＰＯ２７７８）、Ｍｉｇ（ＣＸＣＬ９，ヒトタンパク質についてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ０７３２５）、およびＩ−ＴＡＣ（ＣＸＣＬ１１，ヒトタンパク質についてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号０１４６２５）は、ＣＸＣＲ３（Ｆａｒｂｅｒら、１９９７，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６１：２４６−５７；Ｃｏｌｅら、１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２００９−２１）に対する３つのリガンドである。ＩＰ−１０およびＭｉｇは、ＩＦＮγ誘導遺伝子として最初に報告された（Ｃｏｌｅら、１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２００９−２１；Ｌｕｓｔｅｒら、１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１０８４−９７；Ｆａｒｂｅｒら、１９９０，Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：５２３８−４２）。ＩＰ−１０およびＭｉｇは、ウイルスチャレンジの際に誘導され（Ｓａｌａｚａｒ−Ｍａｔｈｅｒら、２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：９８５−９３）、そしてＩＦＮγの非存在下においても、発現され得る（Ｍａｈａｌｉｎｇａｍら、２００１，ＪＢＣ  ２７６：７５６８）。
【００５２】
ケモカインレセプターＣＣＲ６は、周辺血液記憶Ｔ細胞（特に、上皮ホーミング特性を有するＴ細胞）の４０〜５０％で発現されるが、ナイーブなＴ細胞では発現されない（ＷＯ９８／０１５５７；Ｆｉｔｚｈｕｇｈら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６６７７−６６８１を参照のこと）。ＣＣＲ６、ＭＩＰ−３αに対するリガンドは、ＬＡＲＣ、エキソダス（ｅｘｏｄｕｓ）およびＣＣＬ２０としてもまた公知である（Ｆｉｔｚｈｕｇｈら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６６７７−６６８１）。ＭＩＰ−３αは、ＳＤＦ−１、６ＣｋｉｎｅおよびＴＡＲＣを含む少数のケモカインの１つであり、これらのケモカインは、生理的流れ条件下でリンパ球の捕獲を誘導することを示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３８１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４００：７７６；Ｔａｎｇｅｍａｎｎら、１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：６３３０）。ＭＩＰ−３αのアミノ酸配列は、登録番号Ｕ７７０３５．１（Ｒｏｓｓｉら、１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１０３３）に見出され得る。ＤＣ集団の間で、ＣＣＲ６／ＭＩＰ−３αは、皮膚ランゲルハンス細胞移動に選択的に関与し（Ｄｉｅｕら、１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８８（２）：３７３−８６；Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（５）：７０５−１８；Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０（１２）：１７５５−６８）、そして消化管の上皮ＤＣのサブセットに関与することが報告されている（Ｉｗａｓａｋｉら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１（８）：１３８１；Ｃｏｏｋら、２０００，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２（５）４９５−５０３）。さらに、Ｍｉｐ−３αのインビボ発現は、炎症を起こした上皮に限定される（Ｄｉｅｕら、１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８８（２）：３７３−８６；Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎら、２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（５）：７０５−１８；Ｔａｎａｋａら、１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（２）：６３３−４２）。
【００５３】
ケモカインレセプターＣＣＲ１０は、Ｂｏｎｉｎｉら、１９９７，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（１０）１２４９９−５６に開示される。公知のＣＣＲ１０リガンドとしては、ケモカインＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７（Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ登録番号Ｑ９Ｙ４Ｘ３）、皮膚ホーミング記憶Ｔ細胞を優先的に誘引する皮膚関連ケモカイン（Ｍｏｒａｌｅｓら、１９９９，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１４４７０；Ｈｏｍｅｙら、２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（７）：３４６５−７０）が挙げられる。より最近は、種々の粘膜組織で発現される、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ／ＣＣＬ２８）（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ登録番号Ｑ９ＮＲＪ３）が、ＣＣＲ１０に対する新規のケモカインリガンドとして同定された（Ｐａｎら、２０００，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１６５：２９４３−２９４９）。
【００５４】
本発明における使用のための「ケモカインレセプターアゴニスト」は、ＤＣの限定されたサブセット、特にｐＤＣに対して、ｐＤＣ上に発現されるレセプター（例えば、ＣＸＣＲ３レセプター、ＣＸＣＲ４レセプター、ＣＣＲ６レセプターまたはＣＣＲ１０レセプター）を介して活性である薬剤である。この用語は、ＣＸＣＲ３レセプター、ＣＸＣＲ４レセプター、ＣＣＲ６レセプターおよびＣＣＲ１０レセプターのケモカインリガンドのような、生体の天然タンパク質を包含する。これらのケモカインのいくつか（例えば、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−３α、ＣＴＡＣＫ／ＣＣＬ２７およびＭＥＣ／ＣＣＬ２８が挙げられるが、これらに限定されない）は、本発明者らによって同定されている。本明細書中で開示されるケモカインに加えて、他のＣＸＣＲ３リガンド、ＣＸＣＲ４リガンド、ＣＣＲ６リガンドおよびＣＣＲ１０リガンドが、本発明の方法において使用され得る。この用語はまた、前記ケモカインの改変体を含む。このような改変体は、上記の所望のｐＤＣ化学物質遊走活性を保有し続ける。改変体とは、天然タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の欠損または付加；天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠損または付加；あるいは天然タンパク質中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換による、天然タンパク質に由来するポリペプチドをいう。このような改変体としては、変異体、フラグメント、対立遺伝子改変体、相同的オルソログ、および天然タンパク質の融合体が挙げられる。ケモカインレセプターアゴニストはまた、グリコシル化、リン酸化、非天然アミノ酸アナログの置換などによって改変され得る。
【００５５】
さらに、ＣＸＣＲ３レセプター、ＣＸＣＲ４レセプター、ＣＣＲ６レセプターおよびＣＣＲ１０レセプター、またはこれらのフラグメントを使用したリガンドのスクリーニングを実施して、これらのレセプターへの結合親和性を有する分子を同定し得る。次いで、その後の生物学的アッセイを利用して、推定のアゴニストが活性を提供し得るかどうかを決定し得る。化合物が固有の刺激性活性を有する場合、この化合物はレセプターを活性化し得、従ってこれがレセプターの活性を刺激するかまたはそのリガンドの活性（例えば、シグナル伝達を含む）を模倣することにおいて、アゴニストである。
【００５６】
低分子であるケモカインレセプターアゴニストはまた、公知のスクリーニング手順によって同定され得る。特に、所定の標的（例えば、レセプターのような腫瘍関連分子）を特異的に結合する低分子についてのスクリーニング方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ  ０１７７２−１７４９での会合を参照のこと。
【００５７】
本発明における使用のための「ケモカインレセプターアンタゴニスト」は、ＤＣの限定されたサブセット、特にｐＤＣの遊走を、ＣＸＣＲ３レセプター、ＣＸＣＲ４レセプター、ＣＣＲ６レセプターまたはＣＣＲ１０レセプターの活性をブロックすることによって低下させる薬剤である。この用語は、レセプターのアンタゴニストおよびリガンドのアンタゴニストの両方を含む。本発明のケモカインレセプターアンタゴニストは、抗体由来であっても、そして抗体フラグメントを含んでもよい。さらに、任意の低分子アンタゴニスト、アンチセンスヌクレオチド配列、ｐＤＣの遊走を低下させるアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのような遺伝子送達ベクター中に含まれるヌクレオチド配列が、この定義内に入る。同様に、膜貫通ドメインを欠失したＣＸＣＲ３レセプター、ＣＸＣＲ４レセプター、ＣＣＲ６レセプターおよびＣＣＲ１０レセプターの可溶性形態が使用され得る。最後に、対応のレセプターに強力に結合するが本質的に生物学的活性を欠いた、天然リガンドの変異アンタゴニスト形態が使用され得る。
【００５８】
種々の他のケモカインレセプターアンタゴニストが生成され得る。レセプター結合アッセイが開発され得る。例えば、Ｂｉｅｒｉら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１１０５−１１０８および１０６０頁の添付の注記を参照のこと。カルシウム流動アッセイは、アンタゴニスト活性を保有する化合物をスクリーニングするために開発され得る。遊走アッセイは、膜中の細孔を通る細胞の移動を利用し得、このことは、アンタゴニストアッセイの基本を形成し得る。これによって走化性を測定し得る。あるいは、動態学的移動の誘導（必ずしも勾配自体に関係するわけではない）を測定する化学動態学的アッセイを開発し得る。
【００５９】
低分子であるケモカインレセプターアンタゴニストはまた、公知のスクリーニング手順によって同定され得る。特に、所定の標的（例えば、レセプターのような腫瘍関連分子）を特異的に結合する低分子についてのスクリーニング方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ  ０１７７２−１７４９での会合を参照のこと。
【００６０】
本発明における使用のための「生存薬剤」は、ｐＤＣの生存を促進するシグナルを提供し、そしてｐＤＣの分化プログラム（皮膚誘導（ｓｋｉｎ  ｈｏｍｉｎｇ）特性の顕在化およびケモカインレセプター発現の出現を含む）を許容する薬剤として定義される。生存薬剤の例としては、生体の天然産物（例えば、ＩＬ−３、ＩＦＮαおよびＲＡＮＫリガンド（これらはｐＤＣの成熟を誘導しない、ｐＤＣの生存薬剤である）が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
本発明における使用のための「活性化剤」とは、ｐＤＣの成熟を活性化、誘導または刺激し得る部分として定義される。このような薬剤は、組織からリンパ節への遊走を促進し、そしてｐＤＣがナイーブなＴ細胞を活性化する能力を与える、成熟シグナルを提供する。活性化剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：生体の天然産物（例えば、ＩＦＮα、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ４０リガンド、もしくは、ＴＮＦ／ＣＤ４０レセプターファミリーの他のメンバーのリガンド、ＤＣ上の特定の構造を認識するアゴニスト抗体（例えば、抗ＣＤ−４０／ＲＡＮＫ抗体）、または別の基質。活性化基質はまた、非メチル化ＣｐＧモチーフを含む核酸の配列であるか、またはＤＣを刺激することが既知のｔｏｌｌ様レセプターのアゴニストであり得る。ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストおよび／または抗原が、プラスミドベクターの手段によって送達される、本発明の実施形態において、これらの核酸配列は、ベクターの一部であり得る。
【００６２】
上記のケモカインレセプターアゴニストまたはアンタゴニストは、単独で投与され得るかまたは１つ以上のさらなるケモカインレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストと併用して投与され得る。ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストは、同じ部位または異なる部位（全身性  対  局所性）に送達または投与され得、そして１つ以上の他のケモカインレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストと同時にかまたは４８時間を超えない遅延の後、投与され得る。本明細書中で使用される場合、同時的投与または併用投与とは、ケモカインおよび抗原が被験体に、通常の処置スケジュールの間に、（ａ）時間内に同時にかまたは（ｂ）異なる時間でかのいずれかで投与される。後者の場合、これら２つの化合物は、意図する効果を達成するために、十分に近い時間で投与される。
【００６３】
種々のケモカインレプターアゴニストおよびケモカインレセプターアンタゴニストの送達形態は、注入によるものであり得、皮内、筋肉内、腫瘍内、皮下、静脈内もしくは経口、または局所的（例えば、軟膏またはパッチ）を含む。
【００６４】
ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストはまた、ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）または操作されたプラスミドＤＮＡ）による核酸配列として、投与され得る。
【００６５】
ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストは、単独でかまたは送達部位での徐放性を可能にする物質（デポー）と併用して投与され得る。ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストは、局所的または全身的に投与され得る。
【００６６】
ケモカインレセプターのアゴニスト／アンタゴニストはまた、ケモカインレセプターのアゴニストまたはアンタゴニスト、および、腫瘍関連抗原のような疾患関連抗原、または腫瘍の非癌性成分によって特異的に発現される構造（例えば、腫瘍脈管構造）を認識または標的化するように設計された標的化部分を含む、標的化構築物の一部として投与され得る。標的化部分の例としては、ペプチド、タンパク質、低分子、ベクター、抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｅｌａｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４を参照のこと）。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施形態において、ケモカインレセプターアゴニストまたはケモカインレセプターアンタゴニストは、疾患関連抗原と共に投与される。この抗原は、免疫応答の増強または低下が求められる、任意の分子の部分であり得る。これは、ヒトまたは動物において疾患を引き起こすことが公知の生物体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫および真菌）由来の抗原を含む。これはまた、腫瘍（腫瘍関連抗原）および植物／食物抗原（アレルゲン）によって発現される抗原、ならびに自己抗原（自己免疫）を含む。
【００６８】
本発明における使用のための腫瘍関連抗原としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトブロテイン、甲状腺ペルオキシダーゼ（ｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ならびにｐ５３。この列挙は、本発明の実施において使用され得る抗原の型を網羅することを意図するのではなく、単に例示するに過ぎない。
【００６９】
異なる人種グループ、性別、地理的分布、および疾患の病期に従って最適な機能を示す、抗原の異なる組み合わせが使用され得る。本発明の１つの実施形態において、少なくとも２つ以上の異なる抗原が、ケモカインの投与とともに投与される。
【００７０】
さらに、ＩＰ−１０、Ｍｉｇ、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＩＰ−３α、ＣＴＡＣＫ、ＳＤＦ−１またはそれらの一部のようなケモカインレセプターアゴニスト、および抗原からなる融合タンパク質が、投与され得る。
【００７１】
原発性癌および転移性癌の両方を、本発明に従って処置し得る。処置され得る癌の型は、以下に影響を与える型が挙げられるが、これらに限定されない：口腔および咽頭（舌、口、咽頭その他）、消化器系（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門／肛門直腸）、肝臓／肝臓内胆汁管、胆嚢／他の胆管、膵臓、その他）、呼吸器系（喉頭、肺／気管支、その他）、頭部および頚部、骨および関節、軟組織（心臓を含む）、皮膚（基底癌および扁平上皮癌、黒色腫、その他）、乳房、生殖器系（子宮頸管、子宮本体（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｏｒｐｕｓ）、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、その他）、泌尿器系（膀胱、腎臓／腎盂、尿管、その他）、眼および眼窩、脳および神経系、内分泌系（甲状腺、その他）、血液／造血系（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、その他の白血病）。癌は、異なる細胞起源の物（例えば、癌腫、黒色腫、肉種、白血病／リンパ腫など）であり得、そして任意の公知または未知の病因（ｅｔｈｉｏｌｏｇｙ）（例えば、日光、ウイルス、タバコ／アルコールの使用、職業、栄養、生活習慣、など）であり得る。用語「癌腫」とは、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍をいい、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖組織癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫を含む。本明細書中でこの用語が使用される場合、転移とは、原発腫瘍から離れた部位（限局性リンパ節を含む）への腫瘍の伝播として定義される。
【００７２】
生存薬剤、またはｐＤＣ上でケモカインレセプターの発現を誘導するように設計された他の部分は、有利に投与され得る。
【００７３】
ｐＤＣの成熟を活性化、誘導または刺激する様に設計された、活性化剤または他の部分もまた、投与され得る。
【００７４】
一般的に、ケモカインおよび／または抗原および／または生存薬剤／活性化剤および／またはサイトカインは、薬学的キャリア中に、有効量のケモカインおよび／または抗原および／または活性化剤および／またはサイトカインを含有する薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、生理学的に無害な安定剤および賦形剤とともに、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中に、さらなる活性成分または不活性成分を用いて、治療使用のために組み合わせられ得る。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するのに適切な、任意の適合性の非毒性の物質であり得る。
【００７５】
有効な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる要因（投与の手段、標的部位、患者の身体的状態、および投与されている他の医薬品が挙げられる）に依存する。従って、処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために力価測定されるべきである。特定の癌の処置のための有効用量についての動物試験は、ヒトの投薬量についてのさらなる断定的な指標を提供する。種々の検討材料が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら編（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されている。投与のための方法は、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮的拡散などについて、それらの中および以下で議論される。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および例えばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物が挙げられる。徐放性処方物、または徐放性装置は、継続的投与のために使用され得る。
【００７６】
ケモカインレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、および／または抗原、および／または生存薬剤、および／または活性化剤についての投薬量範囲は、適切なキャリアと共に、普通は１ｍＭ未満の濃度量、代表的には約１０μＭ未満の濃度量、通例は約１００ｎＭ未満の濃度量、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル濃度）未満の濃度量、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル濃度）未満の濃度量であることが予想される。一般的に、処置はその化合物の最適用量未満の、より少量の投薬量を用いて開始される。その後、この投薬量は、その条件下で最適な効果に達するまで、少しずつ増大される。特定の状況のための適切な投薬量および投与レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。
【００７７】
好ましい実施形態は、必要に応じて、生存薬剤、および／または活性化剤との併用であるか、または送達部位で徐放を可能にする物質（デポー）；ＩＰ−１０、ＭｉｇもしくはＩ−ＴＡＣからなる融合タンパク質、またはＩＰ−１０、ＭｉｇもしくはＩ−ＴＡＣおよび抗原の画分（９アミノ酸より大きなペプチドまたはタンパク質または他の抗原部分）；ＩＰ−１０、ＭｉｇもしくはＩ−ＴＡＣをコードするＤＮＡもしくはウイルスベクター、または抗原を含むかもしくは含まない、ＩＰ−１０、ＭｉｇもしくはＩ−ＴＡＣの画分（９アミノ酸より大きなペプチドまたはタンパク質または他の接触部分）、あるいは送達ベクターに含まれる核酸配列と組み合わせられた、組換えＩＰ−１０タンパク質単独、組換えＭｉｇタンパク質単独もしくは組換えＩ−ＴＡＣタンパク質単独、またはＳＤＦ−１と一緒の投与からなるが、これに限定されない。他の好ましい実施形態としては、生存薬剤もしくは活性化剤との併用か、単独か、または徐放を可能にする物質と組み合わされた、組換えＭＩＰ−３αタンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質またはＭＥＰタンパク質の投与を包含する。全ての好ましい実施形態において、これらのケモカインレセプターアゴニストは、活性化剤と共にかまたは共にせずに、抗原と併用して投与され得る。
【実施例】
【００７８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示され得、これらは以下の材料および方法を参照することによってより容易に理解され得る。
【００７９】
（造血系薬剤、試薬および抗体）
ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（比活性：２．１０６Ｕ／ｍｇ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、ｒｈＴＮＦα（比活性：２×１０７Ｕ／ｍｇ、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、ｒｈＳＣＦ（比活性：４×１０５Ｕ／ｍｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、およびｒｈＩＬ−４（比活性：２．１０７Ｕ／ｍｇ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）を、それぞれ、最適濃度１００ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌおよび５０Ｕ／ｍｌで使用した。組換えヒトケモカインはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製であり、そして以下の最適濃度を使用した：ＭＣＰ１／ＣＣＬ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ２／ＣＣＬ８（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ３／ＣＣＬ７（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ４／ＣＣＬ１３（１μｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ３α／ＣＣＬ２０（１μｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＩＰ１α／ＣＣＬ３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＩＰβ／ＣＣＬ４（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＩＰ１δ／ＣＣＬ１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｅｏｔａｘｉｎ／ＣＣＬ１１（１μｇ／ｍｌ）、ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＭＤＣ／ＣＣＬ２２（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＭＩＰ３β／ＣＣＬ１９（１μｇ／ｍｌ）、６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１（１μｇ／ｍｌ）、Ｉ３０９／ＣＣＬ１（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ８／ＣＸＣＬ８（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９（１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、ＳＤＦ１α  ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１（１０ｎｇ／ｍｌ）。ＰＥ結合体化した特異的な抗ヒトＣＣＲ３（クローン６１６２８．１１１）を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより購入した。ＰＥ抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン５１５０５．１１１）、ＰＥ抗ヒトＣＣＲ５（クローン２Ｄ７）、ＰＥ抗ヒトＣＣＲ６（クローン１１Ａ９）およびＰＥ抗ヒトＣＸＣＲ３（クローン１Ｃ６）を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より入手した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のビオチンが結合した抗ヒトＣＣＲ１（クローン５３５０４．１１１）およびＣＣＲ２（クローン４８６０７．２１１）を、ＰＥ結合体化したストレプトアビジン（ＤＡＫＯ）によって明示化した。抗ＣＣＲ７（クローン２Ｈ４）は、ビオチンが結合したヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｃａｌｔａｇ）によって明示化されたマウスＩｇＭモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）であった。全ての抗体は、最初に、異なる血液細胞のサブセットに対する特異性を確認された。ＰＥ結合体化抗ＣＤ８３は、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ製であり、そして抗ＩＬ−３Ｒａ、抗ＣＬＡ、抗ＣＤ−６２Ｌは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製であった。
【００８０】
（末梢血からのＣＤ１１ｃ−形質細胞性（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣおよびＣＤ１１ｃ＋骨髄球性ＤＣについての富化）
循環中の血液ＣＤ１１ｃ−形質細胞性ＤＣ（ｐＤＣ）および骨髄球性ＣＤ１１ｃ＋  ＤＣを、以前に記載されるように、末梢血から調製した（Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（６）：１１０１−１１１１；Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：３６４−３６７）。簡潔に述べると、末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅによって単離し、そして抗体の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ＣＤ１９（４Ｇ７）、抗ＣＤ１４（ＭＯＰ９）、抗ＣＤ５６（ＮＫＨ１、Ｃｏｕｌｔｅｒ）抗ＣＤ１６（ＩＯＮ１６、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、高ＣＤ３５（ＣＤ１、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）および抗グリコホリンＡ（ＪＣ１５９、ＤＡＫＯ）、ならびに磁性ビーズ（抗マウスＩｇ被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ）を用いて、系列ポジティブの細胞を除去した。除外（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）および染色の全ての手順を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で実施した。この富化した集団は、１０％と３０％との間のＣＤ１１Ｃ−  ｐＤＣおよび１５％〜２５％の間のＣＤ１１ｃ＋骨髄球性ＤＣを含んでおり、ＨＬＡ−ＤＲ（トリカラー、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の発現、および系統マーカー（ＦＩＴＣ）ＣＤ１ａ（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）；ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の欠失について同定された。いくつかの実験のために、上記の３重染色に基づくＦａｃｓソーティングによって、細胞をさらに精製し、そして分類されたＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ−集団、およびＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋集団の再分析は、９５％より高い純度を示した。
【００８１】
（臍帯血ＣＤ３４＋  ＨＰＣおよび単球由来のＤＣの産生）
記載されるようなポジティブ選択（Ｃａｕｘら、１９９０、Ｂｌｏｏｄ  ７５：２２９２−２２９８；Ｃａｕｘら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６）によって臍帯血単核画分から単離したＣＤ３４＋細胞を、Ｃａｕｘら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６に記載されるように、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαならびに５％  ＡＢ＋ヒト血清の存在下で、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＵＫ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｌｅｖａｌｌｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からなるエンドトキシン不含有完全培地中で、培養した。最適条件を、同じ条件における４日目でのこれらの培養物を分けることによって、６日まで維持した。遊走実験、ケモカインレセプター発現分析および／またはＦＡＣＳソーティングのために、細胞を６日目に慣用的に使用した。
【００８２】
単球を、Ｄｉｅｕら、１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１−１４に記載されるような免疫磁性除外（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ  Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって精製した。単球由来の樹状細胞を、精製した単球を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６〜７日間培養することによって、生成した（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８）。
【００８３】
（骨髄由来のマウス形質細胞性ＤＣについての富化）
マウス形質細胞性ＤＣを骨髄から単離し、磁性ビーズ除外によって富化し、そして３重染色（ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ＋、ＧＲ１＋）に基づいて同定した。マウスｐＤＣを、トランスウェル実験における遊走アッセイのために使用した。
【００８４】
（トランスウェル中での走化性アッセイ）
遊走アッセイを、５×１０５細胞／ウェルでＴｒａｎｓｗｅｌｌ（６．５ｍｍ直径、ＣＯＳＴＡＲ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して実施した。富化した血液ＤＣ集団を、最初に３７℃で２時間予めインキュベートし、次いで、３μｍ孔サイズのインサートの中に２時間置き、そして遊走を、ＣＤ１１ｃ−／ＨＬＡ−ＤＲ＋／系統−およびＣＤ１１ｃ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／系統−に対してゲートを掛けた３重染色によって明示した。６日のＣＤ３４＋  ＨＰＣ−由来のＤＣ前駆体を、５μｍ孔サイズのインサートの中で１時間インキュベートし、そして遊走する細胞を、ＣＤ１ａおよびＣＤ１４のいずれかを染色する２重染色によって明示した。単球および単球由来ＤＣを、５μｍ孔サイズのインサートの中で２時間インキュベートし、そして遊走を、ＣＤ１４および／またはＣＤ１ａの染色によって明示した。
【００８５】
いくつかの実験において、ＣＸＣＲ４リガンドおよびＣＸＣＲ３リガンドが、上側ウエルおよび下側ウェルにおいて対向するチェッカーボード分析を実施した。他のプロトコルにおいて、両方のレセプターリガンドへの移動アッセイを実施する前に、１時間、ＣＸＣＲ４リガンドおよびＣＸＣＲ３リガンドの存在下で細胞を最初にインキュベートしたプレインキュベーション実験を実施した。
【００８６】
（不活化インフルエンザウイルスを伴うｐＤＣの培養）
細胞（１×１０６／ｍｌ）を、３７℃で２時間、ＩＬ−３を伴うかまたは伴わないで、完全培地中で、パラホルムアルデヒド不活化インフルエンザウイルス（Ｂｅｉｊｉｎｇ株２６２／９５、１赤血球凝集単位／ｍｌ）の存在下でプレインキュベートした。次いで、細胞を、トランスウェル中で移動アッセイを行う前に、完全培地中で２回洗浄した。
【００８７】
（ケモカインレセプターｍＲＮＡ発現の定量的実時間ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析）
上記のように、細胞を調製し、そして製造業者によって言及されるように、グアニジニウムチオシアネート方法によって、全ＲＮＡを抽出した（ＲＮＡｇｅｎｔ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。４μｇのＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理し、そして標準的なプロトコルを使用して、オリゴｄＴ１４−１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびランダムヘキサマープライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを５ｎｇ／μｌの最終濃度に希釈した。１０μｌのｃＤＮＡを、１２．５μｌのＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．６２５μｌの遺伝子特異的ＴａｑＭａｎプローブ、０．５μｌの遺伝子特異的順方向プライマーおよび逆方向プライマー、ならびに０．５μｌの水の存在下で増幅させた。内部ポジティブコントロールとして、０．１２５μｌの１８Ｓ  ＲＮＡ特異的ＴａｑＭａｎプローブおよび０．１２５μｌの１８Ｓ  ＲＮＡ特異的順方向プライマーおよび逆方向プライマーを各反応に添加した。測定されるケモカインおよびケモカインレセプターについての特定のプライマーおよびプローブは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから得た。遺伝子特定的プローブは、レポーターとしてＦＡＭを使用したが、内部ポジティブコントロール（１８Ｓ  ＲＮＡ）に対するプローブは、ＪＯＥレポーターまたはＶＩＣレポーターのいずれかと関連した。サンプルは、以下のステージを受けた：ステージ１、５０℃で２分間、ステージ２、９５℃で１０分間、およびステージ３、９５℃で１５秒間、続いて、６０℃で１分間。ステージ３を、４０回繰り返した。遺伝子特異的ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ／−Ｅ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって、４０サイクルの間、連続的に、測定した。プライマープローブの組合せの特異性を、全ての公知のケモカインレセプター（ＣＣＲ１−ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１−ＣＸＣＲ５、ＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１）のプラスミドに対して実施された交差反応性研究において確認した。標的遺伝子発現は、内部ポジティブコントロールの発現の値に基づいて、異なるサンプル間で規格化した。
【００８８】
（免疫組織化学）
凍結した６μｍの組織切片（ヒト扁桃腺および皮膚）を、免疫染色の前に、アセトン中（およびＭＩＰ３α染色のために４％パラホルムアルデヒド中）で固定した。非特異的活性をブロックするために、切片を、それぞれの工程で、１０分間、アビジンＤおよびビオチン溶液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇキット，Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｉｏｓｙｓ  ＳＡ，Ｃｏｍｐｉｅｇｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、そして室温で１５分間、０．３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて前処理した。ＰＢＳ中での手短な洗浄の後に、切片を、両方の一次抗体を添加する前に、少なくとも３０分間、ブロッキング血清（２％正常ウサギ血清、二次抗体以外の同じ種）とともにインキュベートした。切片を、以下の抗体のうちの２つ（同時に）用いて、１時間、室温、湿潤大気中において免疫染色した：ポリクローナル抗ｈＭＩＰ−３α（Ｇｏａｔ  ＩｇＧ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）、抗ｈＭｉｇマウスモノクローナル抗体（ｍｌｇＧ１，クローン  ４９１０６．１１，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）、抗ｈＳＤＦ１マウスモノクローナル抗体（ｍｌｇＧ２ａ，クローン  Ｋ１５Ｃ，Ａｍａｒａ  Ａｌｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．１９９９，ｖｏｌ２７４，ｐ２３９１６−２３９２５）および抗ｈＭＩＰ−３αマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１  ２０６Ｄ９，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）、抗ｈＣＤ１１ｃマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１，クローン  ＫＢ９０，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、抗ｈＥカドヘリンマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｌ，ＨＥＣＤ−１，Ｔａｋａｒａ）、抗ｈＣＤ１０５マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１，クローン２６６，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。ヤギＩｇＧの結合を、ビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ、続いて、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（ともに、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  ＰＫ−４００５，Ｖｅｃｔｏｒ）中に含まれる）によって検出し、マウスＩｇＧ１の結合を、湿潤大気中で、室温で３０分間、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ（Ｄ０３１４、Ｄａｋｏ）によって明らかにした。ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ活性を、それぞれ、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（ＳＫ−４２００，Ｖｅｃｔｏｒ）およびアルカリホスファターゼ基質ＩＩＩ（ＳＫ−５３００，Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、１〜１０分間、室温で、明らかにした。ネガティブコントロールを、一次抗体として非特異的アイソタイプコントロールを添加することによって、確立した。
【００８９】
（実施例１）
（炎症性ケモカインに対するレセプターの発現にも関わらず、プラスマ細胞様ＤＣが、構成的ケモカインＳＤＦ−１に応答する）
ｐＤＣは、磁性ビーズ除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によってＰＢＭＣから富化させた。ケモカインレセプターおよび他のマーカー発現を、ＰＥ結合抗体を使用して、富化した血液ＤＣ集団における三連の染色、およびＬｉｎ−、ＣＤ１１ｃ−（ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（トリカラー）でのゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）によって決定した。このプロトコルに続いて、ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣは、９５％〜９８％のＣＤ４５ＲＡ＋およびＩＬ−３Ｒα＋であった。ｐＤＣは、ＣＤ１１ｃ＋循環血液ＤＣに匹敵するレベルで、ＣＣＲ２およびＣＣＲ５（図１）発現した（Ｖａｎｂｅｒｖｌｉｅｔら、２００１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（ｌ）：２３１−４２）。ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５は、細胞蛍光測定法（図１）および／またはＲＴ−ＰＣＲによって検出されるようには有意に発現されなかった。
【００９０】
種々のケモカインに応答したｐＤＣの移動を決定するために、循環血液サブセットを、磁性ビーズ除去によって富化させた。精製後、細胞を２時間３７℃で休止させ、そしてトランスウェル（５μｍポアサイズ）移動アッセイで研究した。移動は、三重の染色によって２時間後に明らかにされた：系統マーカーＦＩＴＣ、ＨＬＡ−ＤＲトリカラー、およびＣＤ１１ｃ  ＰＥ。そしてＦａｃｓで分析された。図２に示されるように、ｐＤＣのみが血液ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと比較して、ＣＣＲ２（ＭＣＰ）およびＣＣＲ５（ＲＡＮＴＥＳ）リガンドにわずかに応答した。対照的に、図２および３に示されるように、ｐＤＣは、ＳＤＦ−１に応答して、非常に効率的に移動し、ＩＣ５０が、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１の周囲で観察された（図３Ａ）。
【００９１】
次に、種々のＤＣ集団を、幅広い範囲の濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で、ＳＤＦ−１に対するそれらの応答について分析した。循環血液ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣおよび骨髄性ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを、磁性ビーズ除去によって富化させ、そして上記のように、トランスウェル（３μｍポアサイズ）移動アッセイで研究した。単球および単球由来のＤＣ（ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で７日間）を、トランスウェル（５μｍポアサイズ）移動アッセイで試験し、２時間後、ＣＤ１４／ＣＤ１ａ二重染色によって明らかにした。ＣＤ３４＋ＨＰＣを、６〜７日間、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよび５％ヒト血清の存在下で培養し、そしてトランスウェル（５μポアサイズ）移動アッセイ（５×１０５細胞／ウェル）で使用した。１時間後、移動を、ＣＤ１ａおよびＣＤ１４について二重色染色によって明らかにし、そしてＦａｃｓによって分析した。他のＤＣサブセットと比較して、ＳＤＦ−１は、他のＤＣ集団と比較して、ｐＤＣに対して、高度にかつより活性であった（図３Ｃ）。
【００９２】
ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ発現を、次に、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。細胞を、血液ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣおよび骨髄性ＣＤ１１ｃ＋（これらは、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ発現および系統マーカーの欠如に基づくＦａｃｓソーティングによって単離された）を除いて、上記のように調製した。細胞を回収し、ＲＮＡ抽出し、ＤＮＡｓｅ処理し、逆転写し、そしてＣＸＣＲ４についての定量的ＰＣＲを実施した。高レベルのＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを、図３Ｄに示されるように、検出した。さらに、ＣＸＣＲ４の発現は、ｐＤＣの細胞表面において、迅速に（２時間）アップレギュレートされた（図３Ｂ）。
【００９３】
ＳＤＦ−１は、新たに単離したｐＤＣ移動を誘導する際に非常に強力であった。ＳＤＦ−１のこの強力な活性は、他のＤＣ集団と比較して、非常に高いレベルのＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ発現と一致する。さらに、単離後に細胞表面においてすでに検出されたＣＸＣＲ４タンパク質は、３７℃において細胞表面に非常に迅速に移動した。ＣＸＣＲ４タンパク質は、他の細胞型において以前に記載される（Ｆｏｒｓｔｅｒら，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（３）：１５２２−３１；Ｃｏｌｅら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（３）：１３９２−４００）ように、これらの細胞において細胞質内の区画に保存されるようである。
【００９４】
（実施例２）
（他のＤＣ集団と比較して、プラスマ細胞様ＤＣは、高レベルのＣＸＣＲ３を発現する）
血液ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣについて、ケモカインレセプターおよび他のマーカーの発現は、富化血液ＤＣ集団における三連の染色、およびＰＥ結合抗体を使用して、Ｌｉｎ−、ＣＤ１１ｃ−（ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（トリカラー）に対してゲーティングすることによって、決定された。このプロトコルに続いて、ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣは、９５〜９８％、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＩＬ−３Ｒα＋であった。
【００９５】
血液ＣＤ１１ｃ＋骨髄性ＤＣについて、ケモカインレセプターおよび他のマーカーを、ＰＥ結合抗体を使用して、Ｌｉｎ−、ＣＤ４５ＲＡ−（ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（トリカラー）上でゲーティングした三連の染色によって決定した。このプロトコルに続いて、ＣＤ１１ｃ＋骨髄性ＤＣは、９５〜９８％、ＣＤ１１ｃ＋、ＩＬ−３Ｒα−であった。
【００９６】
ＣＤ３４誘導ＤＣまたは単球誘導ＤＣを、ＦＩＴＣ結合ＣＤ１ａまたはＣＤ１４、およびヒトケモカインレセプターに対するＰＥ結合モノクローナル抗体を使用する二重染色のために処理した。
【００９７】
図１に示されるように、ｐＤＣは、細胞表面において、高レベルのＣＸＣＲ３を発現した。対照的に、循環中のＣＤ１１ｃ＋血液ＤＣ、ならびに他のＤＣ集団は、実施例１に開示される方法に従って、ＦＡＣＳによってまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって検出されるように、有意なレベルのＣＸＣＲ３を発現しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００９８】
次に、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現を、実施例１に記載されるように分析した。他のケモカインレセプターと比較して、ＣＸＣＲ３のｍＲＮＡは、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡよりもかなり高く、ｐＤＣにおいて最も高いレベルで発現されるレセプターであった（図４Ｃ）。
【００９９】
ｐＤＣにおけるＣＸＣＲ３レセプターの高レベルの発現に関しての上記結果を考慮して、次に、ＣＸＣＲ３リガンドのＩＰ−１０、ＭｉｇおよびＩ−ＴＡＣを、上記走化性アッセイにおいて試験した。期待したこととは反対に、ウイルスとの接触後（実施例９を参照のこと）でさえ、わずかな移動のみが観察され（図２）、そして高濃度においてのみ（図５、１〜５μｇ／ｍｌ）、またはトランス−内皮移動アッセイにおいて観察された。
【０１００】
（実施例３）
（ｐＤＣの強力な移動を誘導するために、ＣＸＣＲ３リガンドが、ＳＤＦ−１と協調する）
移動アッセイを、異なるＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ３リガンドの組合せに応答して実施した。
【０１０１】
図５に示されるように、最適より少ない用量のＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、３つ全てのＣＸＣＲ３リガンドの活性が、より低濃度（１００〜５００ｎｇ／ｍｌ）で観測された（図５Ｂ）。さらに、ＳＤＦ−１と組み合わせて試験された場合、３つ全てのＣＸＣＲ３−リガンドが、２桁、ＳＤＦ−１の感度の閾値を下げさせた。
【０１０２】
（実施例４）
（ＣＸＣＲ３リガンドは、ＳＤＦ−１に対するそれらの感受性を増加させることによって、ヒトＣＤ１１ｃ−ｐＤＣをプライムする）
ＣＸＣＲ４リガンドおよびＣＸＣＲ３リガンドが、上側ウエルおよび下側ウェルにおいて対向するチェッカーボード分析を実施した。２つのケモカインが下側ウェルに一緒に配置される場合、およびＩＰ−１０がｐＤＣとともに上側ウェルにあり、そして下側ウェルにＳＤＦ−１がある場合に、相乗的活性が観察されたが、逆は、そうではなかった（図６Ａ）。次いで、両方のレセプターリガンドに対する移動アッセイを実施する１時間前に、ＣＸＣＲ４リガンドまたはＣＸＣＲ３リガンドの存在下で細胞を最初にインキュベートする、プレインキュベーションを実施した。細胞を最初にＩＰ−１０でプライムした場合、ＳＤＦ−１に対する増加した応答が観察されたが、逆の実験ではそうではなかった（図６Ｂ）。
【０１０３】
これらの結果は、ＣＸＣＲ３−Ｌ活性が、勾配とは無関係であること、およびこれらがより低いＳＤＦ−１濃度に応答するようにｐＤＣを感作することを示唆する。最後に、これらの観察はまた、この相乗的活性が、連続的作用（ＣＸＣＲ３リガンドが最初に作用し、そして第２にＳＤＦ−１が作用する）から生じることを実証する。これらの結論は、炎症部位におけるインビボでのＣＸＣＲ３リガンドの観察される発現およびＳＤＦ−１の発現と一致する（実施例８を参照のこと）。
【０１０４】
（実施例５）
（ＣＸＣＲ３リガンドおよびＳＤＦ−１が、マウスｐＤＣ移動を誘導する）
マウスプラスマ細胞様ＤＣを、骨髄から単離し、磁性ビーズ除去によって富化させ、そして三重の染色（ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ＋、ＧＲ１＋）に基づいて識別した。マウスｐＤＣを、トランスウェル実験における移動アッセイのために使用した。
【０１０５】
最近同定したマウスｐＤＣに対して試験する場合、ＣＸＣＲ３リガンドのＩＰ−１０、ＭＩＧおよびＩ−ＴＡＣ単独は、トランスウェルアッセイにおいてそれらの移動を誘導した（図７）。ＣＸＣＲ３−リガンドを用いて誘導した移動のレベルは、ＳＤＦ−１で観測されたレベルと匹敵したが、ＣＸＣＲ３−リガンドの選択性は、ＳＤＦ−１の選択性よりもずっと重要であった。
【０１０６】
（実施例６）
（プラスマ様ＤＣは、他のＤＣ集団と比較して高レベルのＬ−セレクチンを発現するが、これらはまた、ＣＬＡを発現する）
ｐＤＣは、ＣＤ６２Ｌを発現することが示されている（Ｃｅｌｌａら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９−９２３）。ここで、本発明者らは、異なるＤＣ集団におけるＬ−セレクチンの発現を比較した。血液ＣＤ１１ｃ−ｐＤＣについて、Ｌ−セレクチンおよびＣＬＡ発現の分析を、以下の三重染色によって富化されたＤＣ集団で実施した：ｌｉｎ−ＣＤ１１ｃ−（ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）および抗ＣＤ６２ＬまたはＣＬＡ（ＰＥ）。血液ＣＤ１１ｃ＋骨髄性ＤＣについて、発現を、以下の三重の染色によって決定した：ｌｎ−ＣＤ４５ＲＡ−（ＦＩＴＣ）、ＨＬＡ−ＤＲ＋（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）および抗ＣＤ６２ＬまたはＣＬＡ（ＰＥ）。単球、および単球由来のＤＣについて、それぞれ、抗ＣＤ１４抗体または抗ＣＤ１ａ（ＦＩＴＣ）に対して二重染色することによって、分析を得た。ＣＤ３４＋ＨＰＣ誘導ＣＤ１ａ＋およびＣＤ１４＋ＤＣ前駆体について、抗ＣＤ６２ＬまたはＣＬＡ（ＰＥ）およびＣＤ１ａまたはＣＤ１４抗体（ＦＩＴＣ）を用いて二重染色した。
【０１０７】
図８において見られ得るように、本発明者らは、単離の際に、ｐＤＣが、ナイーブなＴ細胞と匹敵する密度で、非常に高レベルのＬ−セレクチンを発現することを見出した。対照的に、ＣＤ１１ｃ＋血液ＤＣは、循環する単球のレベルと比べて、２０〜５０倍低いレベルのＬ−セレクチンを発現した。単球またはＣＤ３４＋前駆体からインビトロ生成されたＤＣは、有意なレベルのＬ−セレクチンを発現しなかった。さらに、２〜１６時間の培養後、ＣＤ６２−Ｌ発現は、ｐＤＣにおいて維持されたが、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣにおいては消失した。
【０１０８】
これらの観察は、ｐＤＣが、ナイーブＴ細胞のように、ＨＥＶを通って血液からリンパ節に入る能力を有し得ることを示唆する。しかし、ｐＤＣはまた、ほとんどの他の循環ＤＣおよび単球において発現される密度と類似の密度で、皮膚ホーミング分子ＣＬＡを発現し（図４Ｂ）、これは、これらが、非リンパ節組織に入る能力もまた有し得ることを示唆する。
【０１０９】
（実施例７）
（ヒトｐＤＣにおけるＣＣＲ６およびＣＣＲ１０の発現およびそれらのそれぞれのリガンドに対する移動が、ＩＬ−３における培養において誘導される）
Ｆａｃｓ−ソーティングによって単離されたプラスマ様ＤＣを、ＩＬ−３および他の生存因子（ＰＦＡ不活化インフルエンザウイルス、ＯＤＮ、ＣＤ４０Ｌ）または組合せの存在下で、２４〜７２時間、培養した。
【０１１０】
ＩＬ−３（図９）またはＩＬ−３＋ＣＤ４０−Ｌの存在下で培養した場合、ヒトｐＤＣは、ＣＣＲ６およびＣＣＲ１０の発現を特異的に獲得したが、他のレセプターの発現は獲得せず、単離の際に存在したレセプターの発現を失った。ＩＬ−３での培養の際に、ｐＤＣは、ＣＣＲ６リガンドおよびＣＣＲ１０リガンド、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ２７／ＣＣＬ２８、それぞれに応答して、トランスウェル移動アッセイにおいて強力に移動する（図１０Ａ、Ｂ）。ＩＬ−３において培養されたｐＤＣは、１０ｎｇ／ｍｌからのＣＣＬ２０に応答し始めるが、一方、より高いＣＣＲ１０−リガンドが、メモリＴ細胞について以前に報告されたように、必要とされた（１μｇ／ｍｌ）（Ｍｏｒａｌｅｓら，１９９９，ＰＮＡＳ  ９６（２５）：１４４７０−５；Ｈｕｄａｋら，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（３）：１１８９−９６）。ＣＣＲ６の発現およびＣＣＬ２０に対する応答は、ＩＬ−３によってのみ誘導された（図１０Ａ）が、ＣＣＲ１０発現およびそのリガンドへの応答は、他の生存因子（例えば、ウイルスおよびＯＤＮ）によって誘導された（図１０Ｂ）。これは、ＣＣＲ１０発現が、ｐＤＣライフサイクルの間の分化プログラムの一部であり得、そしてｐＤＣトラフィッキングの制御において重要な生理学的役割を有し得ることを示唆し得る。ＣＣＲ６の発現は、より密接に制御されるようであり、組織におけるｐＤＣの微細な位置付けにおいてある役割を果たし得る。
【０１１１】
（実施例８）
（内皮細胞によって発現されるＭｉｇは、ＳＤＦ−１、ＣＴＡＣＫおよびＭＩＰ−３αと相補的な勾配を形成する）
扁桃および炎症した皮膚（乾癬損傷）における免疫組織化学は、異なるケモカインに対する抗体を使用して実施された。
【０１１２】
炎症した皮膚において、Ｍｉｇは、真皮乳糖の血管、ＣＴＡＣＫおよびＭＩＰ−３αを発現する上皮細胞の近位で発現した。同様に、扁桃腺において、Ｍｉｇは、上皮細胞と接触する血管によって発現され、ＳＤＦ−１およびＭＩＰ−３αが相補的な勾配を形成する。
【０１１３】
（実施例９）
（ウイルスとの接触において、ｐＤＣは、ＣＣＲ７発現およびＣＣＲ７リガンド活性を獲得し、そしてＬ−セレクチン発現を迅速に失う）
ｐＤＣがウイルスと遭遇した際のＩＦＮα産生の重要なメディエーターであることが公知である（Ｓｉｅｇａｌら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４２１）：１８３５−７；Ｃｅｌｌａら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：９１９−９２３）ので、次いで、ｐＤＣのケモカインレセプター発現およびケモカイン応答性を、ＰＦＡ不活化インフルエンザウイルスへの暴露後（２〜１６時間）に、評価した。ウイルスとの接触の２時間後、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３およびＣＸＣＲ４の発現のレベルは、変化無しのままである（図１１Ａ）か、またはわずかに増加したが、ＣＣＲ２リガンドおよびＣＸＣＲ３リガンドへの応答は、全体的に破壊され（図１１Ｂ）、一方ＳＤＦ−１は、依然として活性なままであった（５０％未満の活性の減少）。１６時間後、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４のレセプター発現とリガンド応答性との両方が、消失した。対照的に、すでに、ウイルスの存在下で２時間後に、ＣＤ８３およびＣＣＲ７のアップレギュレーションが、明らかに観察され（図１１Ａ）、そして１６時間後に強調された。ＣＣＲ７誘導発現と並行して、６ＣｋｉｎｅおよびＭＩＰ−３βが、２時間（図１１Ｂ）および１６時間で、ウイルス活性化ｐＤＣの強力な移動を誘導したが、非活性化ｐＤＣの移動は観察されないか、またはわずかな移動が観察された。両方のリガンドについて、最適な活性濃度は、１００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１４】
この観察は、局所的な補充および活性化に続いて、これらの細胞が、リンパのストリームを通ってリンパ節内を移動する能力を有する、ＣＣＲ７およびそのリガンドによって制御されるプロセスを示唆する。
【０１１５】
従って、シグナル誘導ｐＤＣ活性化とともに、ｐＤＣ補充を可能にするケモカインの組み合わせが、ｐＤＣに、リンパ節を移動し、そしてＩＦＮα産生を通じた特定のＴｈ−１型免疫応答において、免疫応答を開始する能力を与える。
【０１１６】
まとめると、これらの結果は、高い上皮小静脈を通って血液からリンパ節にしみ出る能力に加えて、ｐＤＣが、ＣＬＡ発現を介して炎症した組織に到達する能力を有し得ることを示唆する。非リンパ組織におけるこの補充は、異なるケモカイン勾配の連続的作用を必要とするようである。最初に、ＣＸＣＲ３リガンドは、ＣＸＣＲ４リガンドと協調して、血液から組織へのｐＤＣの補充を誘導する。次いで、微小環境からのシグナル（例えば、肥満細胞からのＩＬ−３）は、ＣＣＲ６発現および／またはＣＣＲ１０発現を誘導し得、ｐＤＣが、ウイルス侵入の部位である上皮（ＣＣＲ６リガンドおよびＣＣＲ１０リガンドが産生される）に到達し得る。あるいは、可溶性メディエーターとして、ＩＬ−３は、血液に到達し得、循環中のｐＤＣでのＣＣＲ６／１０の発現および血液から組織へのＣＣＲ６／１０リガンドを介するそれらの直接的な補充を可能にする。
【０１１７】
要約すると、本明細書中に報告された結果は、上記ケモカインレセプターアゴニストの、単独、または互いと組み合わせて、生存因子および／または疾患関連抗原と組み合わせて、ケモカイン注入の部位での局所的もしくは腫瘍への直接的なｐＤＣの補充のための活性化因子を伴うかまたは伴わない使用を支持する。また、これらの結果によって、上記ケモカインレセプターアゴニストの、ｐＤＣの移動をブロックするための単独または互いと組み合わせての使用が支持される。
【０１１８】
本発明の多くの改変および変更は、当業者に明らかなように、その精神および範囲から逸脱することなく、なされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、単なる例示を提供し、そして本発明が、添付の特許請求の範囲が与える完全な範囲の等価物とともに、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ｐＤＣは、ケモカインレセプターの特有のパターンを表す。ｐＤＣを、系列ポジティブな細胞の磁気ビーズ除去の後、人血から単離し、三重染色（ＨＬＡ−ＤＲ＋、Ｌｉｎｅａｇｅ−、ＣＤ１１ｃ−）に基づいて同定した。
【図２】ｐＤＣは、ほとんどの炎症性のケモカインに応答しない。図２は、種々のケモカインに対する、血液ＣＤ１１ｃ−  ｐＤＣおよびＣＤ１１ｃ＋骨髄性ＤＣの応答を示す。各ケモカインを、広い範囲の濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）にわたって試験し、最適の応答のみを示す。結果を、移動指数（ケモカイン／培地比）として示し、３〜１０の独立した実験から得られた平均値を示す。
【図３】構成的ケモカインＳＤＦ−１およびｐＤＣ上の高ＣＸＣＲ４発現の強い活性。パネルＡは：ｐＤＣのＳＤＦ−１に対する用量応答を示す。結果を、移動細胞数として示し、これは、５つの独立した実験を示す。パネルＢは、新規に単離されたｐＤＣまたは３７℃での２時間のプレインキュベーションの後のｐＤＣ上のＣＸＣＲ４発現の分析を示す。結果は、５つの独立した実験を示す。パネルＣは、広い範囲の濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）にわたって、ＳＤＦ−１に対するこれらの応答についての種々のＤＣ集団の分析を示し、最適な応答の未が示される。パネルＤは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＣＸＣＲ４ｍＲＮＡの分析を示す。結果を、内部標準としてＧ３ＰＤＨを使用して正規化し、そしてｆｇ５０ｎｇの全ＲＮＡとして示す。値は、３つの独立のサンプルからの平均を示す。
【図４】ヒトｐＤＣは、ＣＸＣＲ３を選択的に、他のレセプターよりも高いレベルで発現する。パネルＡは、細胞蛍光分析によって決定された、異なるＤＣ集団上でのＣＸＣＲ３の細胞表面発現を示す。結果は、各集団について４を超える独立した実験を示す。パネルＢは、実施例１および図３Ｄに記載されるような、異なるＤＣ集団において定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡ発現を示す。結果を、内部標準としてＧ３ＰＤＨを使用して正規化した。そしてこの結果を、ｆｇ／５０ｎｇの全ＲＮＡとして表す。値は、３つの独立したサンプルからの平均を示す。パネルＣは、実施例１および図３Ｄに記載されるような、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定されるＦａｃｓ分類ｐＤＣでのケモカインレセプターのｍＲＮＡ発現分析の結果を示す。結果を、内部標準としてＧ３ＰＤＨを使用して正規化した。そしてこの結果を、ｆｇ／５０ｎｇの全ＲＮＡとして表す。値は、３つの独立したサンプルからの平均を示す。
【図５】ＣＸＣＲ３−リガンドは、ＳＤＦ−１と相乗作用し、ヒトｐＤＣの強力な移動を誘導する。パネルＡ：低用量のＳＤＦ−１（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、ｐＤＣのＣＸＣＲ３−リガンドに対する用量応答。パネルＢ：ＣＸＣＲ３−リガンド（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下における、ｐＤＣのＳＤＦ−１に対する用量応答。結果は、３つの独立した実験を示す。
【図６】ＣＸＣＲ３−リガンドは、ＳＤＦ−１に対するこれらの感受性の増加による、ヒトＣＤ１１ｃ−形質細胞性ＤＣをプライムする。パネルＡは、チェッカー板分析を示し、ここで、ＣＸＣＲ４リガンドおよびＣＸＣＲ３リガンドを、上壁および下壁に向かい合わせる。結果は、３つの独立した実験を示す。パネルＢは、両方のレセプターリガンドに対する移動アッセイを実施する前１時間の、ＣＸＣＲ４リガンドまたはＣＸＣＲ３リガンドの存在下で、細胞がまずインキュベートされる、プレインキュベーション実験を示す。
【図７】ＣＸＣＲ３リガンドおよびＳＤＦ−１は、マウスｐＤＣ移動を誘導する。図７は、骨髄から単離され、磁気ビーズ除去によって濃縮され、そして三重染色（ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１Ｃ＋  ＧＲ１＋）に基づいて同定される、マウス形質細胞性ＤＣのトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）移動アッセイにおけるケモカインに対する応答を示す。パネルＡは、移動指数（ケモカイン／培地比）として示される結果を示し、そして３つの独立した実験から得られた平均値を示す。各ケモカインを、広い範囲の濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）にわたって試験した。最適の応答のみを示す。パネルＢは、代表的な実験の用量応答曲線を示す。
【図８】他のＤＣ集団と比較して、ｐＤＣは、高レベルのＬ−セレクチンを発現するが、これらは、ＣＬＡもまた発現する。結果は、各集団について４つを超える独立した実験を示す。
【図９】ＣＣＲ６発現およびＣＣＲ１０発現を、ＩＬ−３中の培養の際に、ヒト形質細胞性ＤＣ上で誘導する。Ｆａｃｓ分類によって単離された形質細胞性ＤＣを、ＩＬ−３の存在下で２４〜９６時間培養した。ＣＣＲ６発現およびＣＣＲ１０発現を、示された時間点で細胞蛍光分析によって追跡した。
【図１０】形質細胞性ＤＣは、ＩＬ−３中の培養の前のみに、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３αに応答して移動するのに対して、これらは、異なる生存因子に応答してＣＣＲ１０−リガンド応答を獲得する。Ｆａｃｓ分類によって単離された形質細胞性ＤＣは、ＩＬ−３の存在下で４８時間培養され、ＰＦＡは、インフルエンザウイルス（ＯＤＮ）を不活化する。パネルＡは、トランスウェル移動アッセイにおける、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３αに応答した、ＣＣＲ６ケモカインレセプター発現および移動を示す。パネルＢは、トランスウェル移動アッセイにおける、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫおよびＣＣＬ２８／ＭＥＣに応答した、ＣＣＲ１０ケモカインレセプター発現および移動を示す。
【図１１】ウイルスとの接触の際に、ｐＤＣは、ＣＣＲ７発現およびＣＣＲ７リガンド活性を獲得する。ｐＤＣを、培地のみまたはＰＦＡ不活性化インフルエンザウイルス（１ヘマグルチン（ｈａｍｅｇｌｕｔｉｎ）単位／ｍｌ）の存在下で２時間培養した。次いで、これらの細胞を、ケモカインレセプター発現（パネルＡ）に関しては、図１に示されるように、そしてケモカイン応答（パネルＢ）に関しては、図２に示されるようにプロセスした。結果は、３つの独立した実験を示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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