(57)【要約】  この発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法に基づくハイスループットスクリーニング方法に関し、不斉なコースを示す反応のエナンチオ選択を決定する。反応は、キラル触媒、試薬、または生体触媒によって起きるので、生成物はそのエナンチオ選択を考慮して評価される。１つの態様においては、同位元素で識別した擬似エナンチオマーまたは擬似プロキラル基材が使用されて、エナンチオ選択が、それぞれの基材および／または生成物のＮＭＲ信号を積分することによって定量化されることができる。マイクロタイタープレート、ロボットおよびハイスループットＮＭＲ装置を含む自動化された装置を使用することは、ハイスループット処理にとって決め手となる。第２の態様において、ジアステレオマーの形の純粋なエナンチオマー試薬によって変形された生成物および／または抽出物を定量的に検出する自動化装置が使用される。上述した両態様において、少なくとも±５％の精度で１日当り１０００以上の決定ができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キラル触媒、生体触媒、または、キラル試薬によって生じる反応のエナンチオ選択のハイスループット決定方法であって、自動測定処理における検出システムとして、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法を使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＮＭＲ検出のために、適切な同位元素で標識した基材を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同位元素で標識した基材が、擬似エナンチオマーであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同位元素で標識した基材が、エナンチオトピック基を有する擬似プロキラル化合物であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
エナンチオメリックな生成物および／または出発化合物の比率は、同位元素標識または非標識化合物のシグナルをＮＭＲスペクトル積分によって定量的に決定する、請求項２から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記同位元素の標識を１３ＣまたはＤを使用して行うことを特徴とする請求項２から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
使用されるＮＭＲ−原子核が１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐまたは１９Ｆであることを特徴とする、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
エナンチオメリックに純粋な試薬および／またはキラル溶剤またはキラルシフト試薬を反応のキラル生成物および／または出発化合物に添加して、ジアステレオマーのＮＭＲシグナルを測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出システムとして、ハイスループットＮＭＲ装置を使用することを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイスループットＮＭＲ装置と共に、サンプルディスペンスロボットを使用することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
自動測定処理において、１以上のサンプルディスペンスロボット、１以上のマイクロタイタープレート、１以上のＮＭＲ分光器、および、１以上の測定セルを使用していることを特徴とする、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１日当り１０００以上のｅｅ決定が可能であることを特徴とする請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、同位元素で標識した基材またはキラル補助基試薬を使用し、自動測定プロセスにおける検出システムとしてハイスループット核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して、動力学的ラセミ体分割、および、プロキラル化合物の不斉に進行する化学反応のエナンチオ選択性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コンビナトリアル・ケミストリの手法を使用して、エナンチオ選択触媒の広範なライブラリを生成するための効果的な方法の開発 [ (a) M. T. Reets, angew. Chem. 2001, 113, 292-320; Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 284-310; (b) B. Jandeleit, D.J. Schafer, T.S. Powers, H.W. Turner, W.H.Weinberg, Angew. Chem. 1999, 111, 2648-2689; (c) K. Burgess, H.-J. Lim, A. M. Porte, G. A. Sulikowski, Angew. Chem. 1996, 108, 192-194; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 220-222; (d) B. M. Cole, K. D. Shimizu, C. A. Krueger, J. P. A. Harrity, M. L. Snapper, A. H. Hoveyda, Angew. Chem. 1996, 108, 1776-1779; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 1668-1671]、および、方向性発展を使用して、エナンチオ選択生体触媒のライブラリを作成するための効果的な方法の開発[(a) m.t. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K.-E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2961-2963; Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 2830-2832; (b) M. T. Reetz, K.-E. Jaeger, Chem.-Eur. J. 2000, 6, 407-412]  は、現在の研究の主題である。
【０００３】
それぞれの触媒ライブラリにおいてエナンチオ選択触媒または生体触媒を迅速にスクリーニングする効果的な方法が利用できることは、これらの新規な技術の成功を確実にする上で、極めて重要なことである。コンビナトリアル・アクティブ・コンパウンド・ケミストリのスクリーニング方法[(a) F. Balkenhohl, C. Busseche-Hunnefeld, A. Lansky, C. Zechel, Angew. Chem. 1996, 108, 2436-2488; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 2288-2337; (b) J. S. Fruchtel, G. Jung, Angew. Cem. 1996, 108, 19-46; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35, 17-42; (c) Chem. Rev. 1997, 97(2), 347-510 (issue for combinatorial chemistry); (d) G. Jung, Combinatorial Chemistry; Synthesis, Analysis, Screening, Wiley-VCH, Weinheim, 1999]とは反対に、エナンチオ選択触媒、生体触媒または光活性試薬のハイスループット・スクリーニングの効果的な方法がない。
【０００４】
ガス・クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによる静止キラル相の鏡像体過剰率（ｅｅ）の古典的な測定は、非常に高い精度が得られる一方で、時間単位あたりのサンプルスループットが限定される欠点がある。同様に、エナンチオ混合のｅｅ値の従来のＮＭＲスペクトル測定に対しても同じことが言える。その際、エナンチオ混合においては、サンプル（例えば、キラルアルコール）は研究室で先ずエナンチオ的に純粋な誘導試薬（例えば、α−メソキシ−α−トリフルオロメチルフェニルアセチルクロライド、（Mosherの酸塩化物））またはシフト試薬（例えば、１−（９−アントリル）−２，２，２−トリフルオロエタノール）と反応し、次いで、ジアステレオマー混合をＮＭＲスペクトル分析する。このような方法は、操作に非常に時間がかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このタイプの分析問題を解決する第１の分析法が最近開発された。このように、キラルカルボン酸エステルのエナンチオ選択加水分解の過程を監視することができる試験方法が、例えば、エナンチオ選択リパーゼの方向性発展の調査と関連して開発された[WO9905288A, Studiengesellschaft Kohle; M. T. Reetz, A. Zonta, K. Schimossek, K. Liebeton, K.-E. Jaeger, Angew. Chem. 1997, 109, 2962-2963; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2830-2832]。光度計検査によって、マイクロタイタープレートにおけるリパーゼ変形のエナンチオ選択加水分解を監視することができる。欠点は、正確なｅｅ値を得ることができない点にあり、この方法は、キラルカルボン酸物質クラスに限定される。関連する試験方法にも同様な限定がある[L.E. Janes, R. J. Kazlauskas, J. Org. Chem. 1997, 62, 45460-45461]。更に、エステル加水分解間にＰＨ指示薬の色の変化に基づく方法にも同様な制限がある[L. E. Janes, A. C. Lowendahl, R. J. Kazlauskas, Chrm. -Eur. J. 1998, 4, 2324-2331]。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレーを使用して、鏡像体過剰率を測定する方法によって、高いサンプルスループットを達成することができる一方で、この方法は４つの段階を必要とし、手間がかかる。更に、この方法は一般的に適用することができない[G. A. Korbel, G. Lalic, M. D. Shair, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 361-362]。最近導入された、結合酵素反応の使用による鏡像体過剰率の測定は、＋／−１０％ｅｅの誤差を有しており、これは高すぎて、ある環境では使用することができない[P. Abato, C. T. Seto, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 9206-9207]。
【０００７】
キラル触媒を特定する他の方法は、同位元素で標識した擬似エナンチオマーまたは擬似プロキラル物質の質量分析に基づいている[WO 00/58504, Studiengesellschaft Kohle; M. T. Reetz, M. H. Becher, H. W. Klein, D. Stockigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872-1875; Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1758-1761]。しかしながら、この方法は、エナンチオトピック基を有するプロキラル物質または動力学的ラセミ体分割への使用に限定される。並列毛管電気泳動に基づいてエナンチオ選択触媒をスクリーニングするシステムが最近提示されている[PCT/EP 01/09833, Studiengesellschaft Kohle; M. T. Reetz, K. M. Kuhling, A. Deege, H. Hinrichs, D. Belder, Angew. Chem. 2000, 112, 4049-4052; Angew. Chem. Int. Ed, 2000, 39, 3891-3893]。
【０００８】
このシステムによって、初めて、一日当り４００００以下のｅｅ測定を行うことができる。しかしながら、この方法はキラルアミンの分析にのみ使用される。他のｅｅスクリーニングシステムは、酵素免疫測定に基づいている[F. Turan, C. Gauchet, B. Mohar, S. Meunier, A. Valleix, P.Y. Renard, C. Creminon, J. Grassi, A. Wagner, C. Miokowski, Angew. Chem. 2002, 114, 132-135; Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 124-127]。しかしながら、エナンチオマーに指向される抗体は複雑なプロセスにおいて培養されなければならないという欠点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
キラル触媒または生体触媒またはキラル試薬によって得られる反応のエナンチオ選択のハイスループット決定方法において、自動測定プロセスにおける検査システムとしてＮＭＲ分光法を使用することによって、上述した限定または欠点を克服することができることが判明した。この発明の第１の態様において、ＮＭＲ分光法によって検出することができる同位元素で標識した基材が使用される。
【００１０】
更に、エナンチオトピック基を有する化合物の動力学的ラセミ体分割および立体選択的反応の監視に対して、この発明を使用し、エナンチオトピック基を伴わないプロキラル化合物をキラルプロダクトに変換するこれらのエナンチオ選択変換を便宜的に監視することができる。同位元素で標識した基材のＮＭＲシグナルを定量化することによって、鏡像体過剰率（ｅｅ値）を決定することができる。
【００１１】
この発明の第２の態様において、エナンチオ的に純粋な試薬を、誘導体化のために、キラルプロダクトおよび／または調査される反応の出発化合物に添加し、そして、その結果のジアステレオマーのＮＭＲシグナルを定量的に分析してｅｅ値を決定する。更に、キラル溶剤またはキラルシフト試薬を使用して、ｅｅ値を決定することができる。この発明の何れの態様においても、１日当り１０００以上のサンプルのスループットが可能である。
【発明の効果】
【００１２】
この発明によると、簡単な方法で、エナンチオ選択触媒、生体触媒または試薬のハイスループット・スクリーニングを実行することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
従来の方法と比較して、この発明は次の利点がある：
（１）最大５％の誤差で、物質分類および行われる反応の型に制限なく、不斉に進行する変換のｅｅ値の決定、
（２）調査する反応の代謝回転の決定、
（３）１日当り１０００以上の決定が可能なハイスループット方法における反応のスクリーニング。
【００１４】
この発明において使用される検出システムは、核共鳴分光計であり、特にハイスループット操作に使用されるフロースルーセルを備えた核共鳴分光計であり[(a) M. J. Shapiro, J.S. Gounarides, Prog. Nucl. Magn. Reson, Spec. 1999, 35, 153-200; (b) C. L. Gavaghan, J.K. Nicholson, S. C. Connor, I.D. Wilson, B Wright, E. Holmes, Anal. Biochem. 2001, 291, 245-252; (c) E. Macnamara, T. Hou, G. Fisher, S. Williams, D. Raftery, Anal. Chim. Acta 1999, 387, 9-16]、そして、自動化サンプルデリバリ（１以上のサンプルデリバリロボットまたはピペットロボットの使用）を備えており、所望のハイスループットを達成するために、分光計ごとに使用される１以上の測定セルを有し、または、並列で使用される複数の分光計を備えている。この目的のための適切な原子核は、１Ｈ、１９Ｆ、３１Ｐおよび１３Ｃであり、これらは他の核種（例えば、１１Ｂ、１５Ｎおよび２９Ｓｉ）に広げられる方法に対して可能である。
【００１５】
この方法は、不斉に進行する反応のためのキラル触媒、生体触媒またはキラル試薬を発見し、または最適化するために使用することができ、下記が含まれる。
（ａ）アルコール、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、オレフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホン酸エステル、亜リン酸エステル、リン酸塩、ハロゲン化物、オキシラン、チオール、スルフィド、スルホン、スルホキシド、およびスルホンアミドおよびそれらの誘導体および化学結合等の化合物の動力学的ラセミ体分割のための酵素、抗体、リボザイムまたはファージ等のキラル触媒、キラル試薬または生体触媒、
（ｂ）カルボン酸、カルボン酸エステル、アルコール、アミン、アミド、オレフィン、アルキン、ホスフィン、ホスホン酸エステル、亜リン酸エステル、リン酸塩、ハロゲン化物、オキシラン、チオール、スルフィド、スルホン、スルホキシド、およびスルホンアミド（またはそれらの誘導体および化学結合）からなる物質分類に属し基材を伴う、エナンチオトピック基を含むまたは含まないプロキラル化合物の立体選択的変換のためのキラル触媒、キラル試薬または生体触媒。
【００１６】
この発明の第１の態様は、擬似エナンチオマーまたは擬似プロキラル化合物（図１）の形で同位元素で標識した基材、特に１３Ｃ標識基材の使用に基づいている。第２の態様は、キラル補助基試薬（図２）を使用している。
従来のラセミ体におけるエナンチオ形は同位元素で標識され、このような化合物は擬似エナンチオマーと呼ばれる[ M. T. Reetz, M.H. Becker, H.-W. Klein, D. Stockigt, Angew. Chem. 1999, 111, 1872-1875; Ａngew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1758-1761参照]。プロキラル基材の１つのエナンチオトピック基が同位元素によって標識されると、その化合物は擬似プロキラル、例えば擬似メソと呼ばれる。標識は各種の方法によって導入される（図１におけるａおよびｂの場合を参照）。
【００１７】
任意のキラル化合物の動力学的ラセミ体分割の場合においては、絶対配置および機能基ＦＧまたは遊離基Ｒ２における同位体標識において相互に異なっている基材１および２または１および７を、エナンチオ的に純粋な形で作成し、ラセミ体をシュミレートするように１：１の比率で混合した（図１ａまたはｂ）。機能基において化学反応が生じる（理想的なケースでは５０％以下の変換の動力学的ラセミ体分解）エナンチオ選択反応に続いて、標識されていないまたは標識されたアキラル副生成物５および／または６と共に真のエナンチオマー３および４が形成され、または、擬似エナンチオマー３および８が形成された。プロキラル化合物が不斉であるとき、擬似エナンチオマーが形成される（図１ｃおよびｄ）。
【００１８】
１３Ｃ標識基材および／またはプロダクト、および、鏡像の非標識基材および／またはプロダクトの対応する１ＨＮＭＲシグナルを積分することによって、エナンチオ選択（ｅｅ値）および変換を定量的に決定することができる。孤立したメチル基が１３Ｃ標識されている場合には、標識されたメチル基では１ＨＮＭＲシグナルが複数現われるのに対して、エナンチオマーにおける標識されていないメチル基では単一として現われるので、特に実行が容易である。このように、動力学的ラセミ体分割の場合において、選択ファクター（ＳまたはＥ値）を得ることができる[H. B. Kagan, J. C. Fiaud, Top. Stereochem. Vol. 18, Wiley, New York, 1988, 249-330]。
【００１９】
この発明の第２の態様において、同位元素標識は行われていない。その代わりに、不斉に進む反応のエナンチオマー混合は、エナンチオ的に純粋なキラル誘導体試薬、ＮＭＲシフト試薬、または、ハイスループットＮＭＲスペクトル測定器によって分析されるジアステレオマー化合物または錯体の形の溶剤と反応する（図４）。
【００２０】
この発明の第２の態様（図２）において、マンデル酸、塩化マンデル、０−メチルマンデル酸（ＭＰＡ）、０−メチル塩化マンデル、アトロラクチン酸、塩化アトロラクチル、α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（ＭＴＰＡ、Mosher’s acid）、α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル塩化アセチル（ＭＴＰＡＣＬ、Mosher’s acid chloride）、２−（９−アントリル）−２−ヒドロキシ酢酸エステル（ＡＨＡ）、９−アントリル−２−メソキシ酢酸エステル（９−ＡＭＡ）、α−ペンタフルオロフェニルプロピオンアミド、２−フルオロフェニル酢酸（ＡＦＰＡ）等の化合物、または、キラル補助基試薬としてのエナンチオマー的に純粋な形のシンコナアルカロイド誘導体を使用することができる。
【００２１】
これらの例は、説明の目的のために示すものであって、この発明をこれらに限定するものではない[(a) reviews on these and other derivatizing agents: S. K. Latypov, N. F. Galiullina, A.V. Aganov, V. E. Kataev, R. Riguera, Tetrahedron 2001, 57, 2231-2236; (b) J. A. Dale, D. L. Dull, H. S. Mosher, J. Org. Chem. 1969, 34, 2543-2549; (c) J. A. Dale, H. S. Mosher, J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 512-519]。ジアステレオマー化合物または錯体を形成するために、Ｅｕ（ｄｃｍ）３（ここにｄｃｍはジカンホリル・メタネート、または、１−（９−アントリル）−２,２,２−トリフルオロエタノールである）等のキラルＮＭＲシフト試薬、および、キラル溶剤(E. L. Eliel, S.H. Wilson, Stereochemistry of Organic Compounds, Wiley, New York, 1994)もまた使用することができる。この発明の２つの態様において、ハイスループットの後のソートを可能にするために、自動化と小型化を組み合わせる必要がある。２つの態様のための可能な器具のセットアップを図３および図４にそれぞれ示す。
【００２２】
このように、市販のマイクロタイタープレートおよびロボット（サンプルマネジャー）を使用して、キラル触媒、生体触媒、または試薬のライブラリのハイスループットスクリーニングを行うことができる。反応が生じた後、サンプルはＮＭＲスペクトル測定器によって分析される。ＮＭＲスペクトル測定器が適切に取り付けられると、パルスフィールドグラディエントおよび成形ＨＦパルスを使用してｅｅ値を決定する近代的なパルス方法を適用することもできる。市販の装置および部品を組み合わせて使用することによって、＋／−５％の精度で一日当り１０００以上のｅｅ値を決定することができる。
【００２３】
ＮＭＲを使用する非対称反応のハイスループットスクリーニングのアセイは、次のような形状である。即ち、動力学的ラセミ体分割の場合には、先ず、擬似ラセミ体が、エナンチオマー的に純粋な同位元素で標識したまたは標識していない基材から作成される。次いで、ラセミ体分割が、例えば、触媒の存在のもと、９６ウエル・マイクロタイタープレートにおいて行われる。最後に、サンプルは、ピペットおよびサンプルディスペンスロボット（図３）を使用するＮＭＲ装置のフロースルーセル内に導入される。キラル誘導体試薬を使用するときには、手続きは次の通り変更される。即ち、触媒反応が終了した後、先ずピペットロボットが使用されて、試薬が反応混合物に添加される。サンプルがフロースルーセル内に導入されるのはその後である(図４)。両方の場合に、入手されたデータセットは適切なソフトウエア例えばBrukerのAMIX（登録商標）を使用して自動的に分析される。
【実施例１】
【００２４】
１−フェニルエチル酢酸エステルの動力学的ラセミ体分割
加水分解、リパーゼ（ワイルドタイプまたは変形）等の酵素による触媒を使用して、１−フェニルエチル酢酸エステルの動力学的ラセミ体分割を、図３に示すハイスループットアセイのコンテクスト内で観察し、エナンチオ選択および変換を決定した。
【００２５】
【化１】
2005526963.tif 000002
【００２６】
（Ｒ）−１−フェニルエチル酢酸エステルの合成：
５０ｍｌの栓付単一ネックフラスコの中で、４ｍｌのピリジン（ａｂｓ．）および１．０ｇ（８．２ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−１−フェニルエタノールを、アルゴンの下、３０ｍｌのジクロロメタンの中に溶解し、そして、その溶液を０℃まで冷却した。０．９７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）の塩化アセチルを結露状に添加し、白い析出物が現われた。この混合物をＲＴで一夜攪拌し、そして、氷浴で冷やしながら赤い溶液を水で急速冷却した。それぞれ、１Ｍの塩酸および塩化ナトリウムの飽和溶液と共に一度抽出され、硫酸マグネシウムの上で乾燥され、有機相が分離された。その溶媒が回転エバポレータの上で分離され、生成物を、ジクロロメタンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーの中に入れた。この溶媒を真空で除去し、そして、高真空下で短時間乾燥して、１．２４ｇ（９２％）の目標とする生成物を、透明な液体として得た。分析結果は次の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５３（ｄ，３ＪＨ．Ｈ＝６．６Ｈｚ、３Ｈ）；２．０６（ｓ、３Ｈ）；５．８８（ｑ，３ＪＨ．Ｈ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）；７．２４−７．３７（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝２１．３；２２．２；７２．３；１２６．１；１２７．９；１２８．５；１４１．７；１７０．３；ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）ｍ／ｚ＝１６４（Ｍ＋）：１２２；１０４；７７；ＥＡ：％Ｃ７２．９（ｃａｌｃ．７３．３）；％Ｈ７．４（ｃａｌｃ．７．３）。
【００２７】
（Ｓ）−１−フェニルエチル２−１３Ｃ−酢酸エステルの合成：
５０ｍｌの栓付単一ネックフラスコの中で、４ｍｌのピリジン（ａｂｓ．）および１．０ｇ（８．２ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−１−フェニルエタノールを、アルゴンの下、３０ｍｌのジクロロメタンの中に溶解し、そして、その溶液を０℃まで冷却した。０．９７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）の２−１３Ｃ−塩化アセチルを結露状に添加し、白い析出物が現われた。この混合物をＲＴで一夜攪拌し、そして、氷浴で冷やしながら赤い溶液を水で急速冷却した。それぞれ、１Ｍの塩酸および塩化ナトリウムの飽和溶液と共に一度抽出され、硫酸マグネシウムの上で乾燥され、有機相が分離された。その溶媒が回転エバポレータの上で分離され、生成物を、ジクロロメタンを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーの中に入れた。この溶媒を真空で除去し、そして、高真空下で短時間乾燥して、１．２４ｇ（９２％）の目標とする生成物を、透明な液体として得た。分析結果は次の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５３（ｄ，３ＪＨ．Ｈ＝６．６Ｈｚ、３Ｈ）；２．０６（ｄ、１ＪＣ．Ｈ＝１２９．４Ｈｚ，３Ｈ）；５．８８（ｑ，３ＪＨ．Ｈ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ）；７．２４−７．３７（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝２１．３；２２．２；７２．３；１２６．１；１２７．９；１２８．５；１４１．７；１７０．７；ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ＝１６５（Ｍ＋）：１２２；１０４；７７；ＥＡ：％Ｃ７２．６（ｃａｌｃ．７３．３）；％Ｈ７．５（ｃａｌｃ．７．３）。
【００２８】
事前の実験で、擬似エナンチオマーが各種の比率で混合された。これによって得られた混合物は、キラル静止相に関して、ガスクロマトグラフィーによって分析されて、擬似ｅｅ値を決定した。次いで、同一サンプルを、ＮＭＲスペクトル測定器によって分析した。２つのデータセットの比較により、＋／−２％内（表１）および高い相関（図５、Ｒ２＝０．９９９８）を示している。
【００２９】
表１：３５μｌから７００μｌのＣＤＣｌ３の混合
【表１】
2005526963.tif 000003
【００３０】
できるだけ高いサンプルスループットを達成するために、測定方法において、サイクル時間を約１分に減少することができる。これによって、分析の精度は影響を受けない。先のサンプルとの混合は１％以下にとどまる。代表的な結果を表２に示す。
【００３１】
表２：ハイスループットＮＭＲ方法（サイクル当り約１分）において、ＣＤＣｌ３の１ｍｌ当り１．３から１．７ｍｇの混合
【表２】
2005526963.tif 000004
【００３２】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図６および図７）におけるメチルシグナルの比率はＢｒｕｋｅｒのソフトウエアＡＭＩＸ（登録商標）を使用して自動的に分析された。
【実施例２】
【００３３】
メチル２−フェニルプロピオネートの動力学的ラセミ体分割
【化２】
2005526963.tif 000005
【００３４】
メチル（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸の合成：
２５ｍｌの栓付単一ネックフラスコの中で、６００ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の（Ｒ）−２−フェニルプロピオン酸および９１２ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ）のフッ化セシウムを、１２ｍｌのジメチルホルムアミド（ａｂｓ．）の中に吸収させ、そして、その溶液をクリオスタットを使用して、１３±１℃まで冷却した。１．９３ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）のヨウ化メチルを添加し、そして、この混合物をこの温度で４６時間攪拌した。その後、少量のエチル酢酸エステルを添加し、真空で過剰なヨウ化メチルと共に除去した。残留物をエチル酢酸エステル中に吸収させ、そして、この溶液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液と共に一度抽出し、硫酸マグネシウムの上で乾燥した。その溶媒が回転エバポレータの上で除去された後、生成物を、ヘキサン／エチル酢酸エーテル８：２を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーの中に入れた。この溶媒を真空で除去し、そして、高真空下で短時間乾燥して、４５４ｍｇ（６９％）の生成物を、透明な液体として得た。分析結果は次の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５０（ｄ，３ＪＨ．Ｈ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）；３．６５（ｓ、３Ｈ）；３．７２（ｑ，３ＪＨ．Ｈ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）；７．２３−７．３５（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１８．６；４５．４；５２．０；１２７．１；１２７．５；１２８．６；１４０．６；１７５．０；ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ＝１６４（Ｍ＋）：１０５；７７；５１；ＥＡ：％Ｃ＝７３．２（ｃａｌｃ．７３．３）；％Ｈ７．５（ｃａｌｃ．７．３）。
【００３５】
１３Ｃ−メチル（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸の合成：
２５ｍｌの栓付単一ネックフラスコの中で、６００ｍｇ（４．０ｍｍｏｌ）の（Ｓ）−２−フェニルプロピオン酸および９１２ｍｇ（６．０ｍｍｏｌ）のフッ化セシウムを、１２ｍｌのジメチルホルムアミド（ａｂｓ．）の中に吸収させ、そして、その溶液をクリオスタットを使用して、１３±１℃まで冷却した。１．９３ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）の１３Ｃ−ヨウ化メチルを添加し、そして、この混合物をこの温度で４６時間攪拌した。その後、少量のエチル酢酸エステルを添加し、真空で過剰なヨウ化メチルと共に除去した。残留物をエチル酢酸エステル中に吸収させ、そして、この溶液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液と共に一度抽出し、硫酸マグネシウムの上で乾燥した。その溶媒が回転エバポレータの上で除去された後、生成物を、ヘキサン／エチル酢酸エーテル８：２を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーの中に入れた。この溶媒を真空で除去し、そして、高真空下で短時間乾燥して、４５４ｍｇ（６９％）の生成物を、透明な液体として得た。分析結果は次の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１．５０（ｄ，３ＪＨ．Ｈ＝７．２Ｈｚ、３Ｈ）；３．６５（ｄ、１ＪＣ．Ｈ＝１４６．９Ｈｚ，３Ｈ）；３．７１（ｑ，３ＪＨ．Ｈ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）；７．２２−７．３５（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１８．６；４５．４；５２．０；１２７．１；１２７．５；１２８．６；１４０．６；１７５．０；ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ＝１６５（Ｍ＋）：１０５；７７；５１；ＥＡ：％Ｃ  ７２．８（ｃａｌｃ．７３．３）；％Ｈ７．４（ｃａｌｃ．７．３）。
【００３６】
スクリーニングシステムを評価するために、対応するエステルを各種の比率で混合して、ＧＣおよびハイスループットＮＭＲによって決定した。その結果を表３に示す。全ての場合において、誤差は２％ｅｅ以下である。
【００３７】
表３：１０μｌから７００μｌのＣＤＣｌ３の混合
【表３】
2005526963.tif 000006
【００３８】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図６および図７）におけるメチルシグナルの比率はＢｒｕｋｅｒのソフトウエアＡＭＩＸ（登録商標）を使用して自動的に分析された。
【実施例３】
【００３９】
メソ−１，４−ジアセトキシ−２−シクロペンテンのエナンチオ選択加水分解
この実施例は、エナンチオトピック基（この場合はアセトキシ基）を備える擬似プロキラル化合物の反応に関する。
【００４０】
【化３】
2005526963.tif 000007
【００４１】
（１Ｓ，４Ｒ）−シス−１−（２−１３Ｃ−アセトキシ）−４−アセトキシ−２−シクロペンテンの合成
空気および湿気を除去しながら、２５０ｍｌの窒素フラスコの中に、５．００ｍｇ（３５．２ｍｍｏｌ）の（１Ｓ，４Ｒ）−シス−４−アセトキシ−２−シクロペンテ−１−ｏｌ、４．２７ｍｌ（４．１８ｇ、６．９５ｍｍｏｌ）のピリジン、および、１００ｍｌのジクロロメタンを導入し、そして、この混合物を０℃まで冷却した。攪拌しながら、３．００ｍｌ（３．４４ｇ，４２．４ｍｍｏｌ）の２−１３Ｃ−塩化アセチルを１０分間隔で結露状に添加した。この混合物を１２時間内に室温まで暖め、続いて、各場合２回、１Ｍ塩酸溶液５０ｍｌ、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、および、塩化ナトリウムの飽和溶液と共に抽出した。有機相を硫酸マグネシウムの上で乾燥し、ろ過により乾燥剤から分離し、回転エバポレータの上で溶媒と分離した。生成物を、ヘキサン／エチル酢酸エーテル５：１を使用して、シリカゲルにいれ、クロマトグラフィーで精製した。生成物の片を結合して回転エバポレータ上で溶液を分離した。オイルポンプ真空下で乾燥して、透明な液体が残った（６．３８ｈ、９７％）。分析結果は次の通り。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００  ＭＨｚ）：δ＝１．７１−１．７８（ｍ、２Ｈ）；５．５５（ｄｄ，３ＪＨ．Ｈ＝３．８Ｈｚ、２ＪＨ．Ｈ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）；６．１０（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）：δ＝２１．５；３７．５；７６．９；１３５．０；１７１．１；ＭＳ（ＥＩ、７０ｅＶ）：ｍ／ｚ＝１８３（Ｍ＋）：８２；５４；４６；４３；ＥＡ：Ｃ：５７．８（ｃａｌｃ．５７．７）；Ｈ：６．５％（ｃａｌｃ．６．５）。
【００４２】
スクリーニングシステムを評価するために、対応するモノ酢酸エステルを各種の比率で混合して、ＧＣおよびハイスループットＮＭＲによって決定した。その結果を表４に示す。
【００４３】
表４：ＣＤＣｌ３１ｍｌあたり１ｍｇの混合
【表４】
2005526963.tif 000008
【００４４】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図６および図７）におけるメチルシグナルの比率はＢｒｕｋｅｒのソフトウエアＡＭＩＸ（登録商標）を使用して自動的に分析された。
【実施例４】
【００４５】
２−ブタノールの動力学的ラセミ体分割
【化４】
2005526963.tif 000009
【００４６】
対応するジアステレオマーエステルを準備するために、先ず第１に、アルコールをMosherの酸塩化物で誘導体化した。その後、サンプルは、ハイスループットＮＭＲ装置においてテストされ、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるジアステレオマーのＣＨ２シグナルを自動的に積分してｅｅ値が計算された。制御として、同一サンプルのエナンチオ純度をガスクロマトグラフィーによって決定した。ハイスループットＮＭＲおよびＧＣによって決定されたｅｅ値を相互に比較した。その結果を表５に示す。
【００４７】
表５：ＣＤＣｌ３１ｍｌあたり１ｍｇの混合
【表５】
2005526963.tif 000010
【００４８】
ジアステレオマーのＣＨ２シグナルの比率はＢｒｕｋｅｒのソフトウエアＡＭＩＸ（登録商標）を使用して自動的に分析された。
【実施例５】
【００４９】
１−フェニルエタノールの動力学的ラセミ体分割
【化５】
2005526963.tif 000011
対応するジアステレオマーエステルを準備するために、実施例４と同様に、先ず第１に、アルコールをMosherの酸塩化物で誘導体化した。その後、サンプルは、ハイスループットＮＭＲ装置においてテストされ、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるジアステレオマーのＣＨシグナルを自動的に積分してｅｅ値が計算された。制御として、同一サンプルのエナンチオ純度をガスクロマトグラフィーによって決定した。ハイスループットＮＭＲおよびＧＣによって決定されたｅｅ値を相互に比較した。その結果を表６に示す。
【００５０】
表６：ＣＤＣｌ３１ｍｌあたり１ｍｇの混合
【表６】
2005526963.tif 000012
【００５１】
ジアステレオマーのＣＨシグナルの比率はＢｒｕｋｅｒのソフトウエアＡＭＩＸ（登録商標）を使用して自動的に分析された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、擬似エナンチオマー化合物（ａおよびｂ）、擬似メソ化合物（ｃ）、および擬似プロキラル化合物の不斉変換を示す。ＦＧは機能基を示し、ＦＧ’および／またはＦＧ’’は反応によって形成された機能基を示す。同位元素の標識はアスタリスク（＊）で特定される。
【図２】図２は、ＮＭＲ分析による定量化のための、エナンチオマーとキラル補助基試薬との混合物の誘導体化を示す。
【図３】図３は、ＮＭＲおよび同位元素で標識した基材を使用してエナンチオ選択を行うスクリーニングのハイスループットシステムの実験的構成を示す。
【図４】図４は、ＮＭＲおよびキラル補助基試薬および／または溶剤のためのキラル試薬を使用してエナンチオ選択を行うスクリーニングのハイスループットシステムの実験的構成を示す。
【図５】図５は、１−フェニルエチル酢酸エステルの動力学的ラセミ体分割：キラルＧＣ（ガス・クロマトグラフィー）を使用した場合と、ハイスループットＮＭＲを使用した場合のｅｅ決定の比較を示す。
【図６】図６は、測定周波数３００ＭＨｚでの自然１３Ｃサテライトを使用する１ＨＮＭＲスペクトルにおけるジ酢酸エステルのメチルシグナルを示す。
【図７】図７は、測定周波数３００ＭＨｚでの（３８％ｅｅ）を表示する６９％１３Ｃを使用する１ＨＮＭＲスペクトルにおけるジ酢酸エステルのメチルシグナルを示す。
【図８】図８は、測定周波数３００ＭＨｚでのＭＴＰＡを使用するラセミフェニルエタノールエステルのＣＨ基の１ＨＮＭＲスペクトルにおけるジアステレオマー分割を示す。
【図１】
2005526963.tif 000013
【図２】
2005526963.tif 000014
【図３】
2005526963.tif 000015
【図４】
2005526963.tif 000016
【図５】
2005526963.tif 000017
【図６】
2005526963.tif 000018
【図７】
2005526963.tif 000019
【図８】
2005526963.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月19日(2004.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出システムとして、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル法を使用する自動測定処理において、キラル触媒、生体触媒、または、キラル試薬によって生じる反応のエナンチオ選択のハイスループット決定方法であって、ＮＭＲ検出のために、適切な同位元素で標識した基材を使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記同位元素で標識した基材が、擬似エナンチオマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同位元素で標識した基材が、エナンチオトピック基を有する擬似プロキラル化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エナンチオメリックな生成物および／または抽出物の比率は、同位元素標識または非標識化合物のシグナルをＮＭＲスペクトル積分によって定量的に決定する、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記同位元素の標識を１３ＣまたはＤを使用して行うことを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
使用されるＮＭＲ−原子核が１Ｈ、１３Ｃ、３１Ｐまたは１９Ｆであることを特徴とする、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
エナンチオメリックに純粋な試薬および／またはキラル溶剤またはキラルシフト試薬を反応のキラル生成物および／または抽出物に添加して、ジアステレオマーのＮＭＲシグナルを測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出システムとして、ハイスループットＮＭＲ装置を使用することを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ハイスループットＮＭＲ装置と共に、サンプルディスペンスロボットを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
自動測定処理において、１以上のサンプルディスペンスロボット、１以上のマイクロタイタープレート、１以上のＮＭＲ分光器、および、１以上の測定セルを使用していることを特徴とする、請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１日当り１０００以上のｅｅ決定が可能であることを特徴とする請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2005526963.tif 000021
2005526963.tif 000022
2005526963.tif 000023
2005526963.tif 000024