(57)【要約】本発明は、新規ＳＮＰを含んで成る、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのＳＮＰによって生じた突然変異を含んで成る、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの治療上の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１の全部又は一部であって、但し、そのようなヌクレオチド配列、又は配列の一部が、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含んで成るもの、あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド７５１〜１３２０を含んで成る、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、但し、当該配列が、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，及びg１１８１aから成る群から選択される、少なくとも１つのコードＳＮＰを含んで成る、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１０個のヌクレオチドから構成される、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つコードＳＮＰ Ｄ９５Ｎを有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、あるいは増幅する方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含んで成る方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を遺伝子型判定するための方法であって、対象者又は対象者群のゲノムＤＮＡの注目の領域を増幅し、そして５５９，５８０，６６７，６８２，７７９，１０３３，１０８４，１１２５，１１３５，１１６１，１１６６，１１８１，及び１２１２から成る群から選択される、ヌクレオチド配列である配列番号１中の少なくとも１つの位置の対立遺伝子を決定する段階、を含んで成る方法。
【請求項８】
遺伝子型判定がミニシークエンスによって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドを分離するための方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を培養液中で培養し、そして前記ポリペプチドを培養液から分離することを含んで成る方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列である配列番号２のアミノ酸２４〜１８９を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列である配列番号２の２４〜１８９のアミノ酸を含んで成り、且つコードＳＮＰ Ｄ９５Ｎを有する、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
免疫特異的抗体を得るための方法であって、動物を請求項１２に記載のポリペプチドで免疫化し、そして前記抗体を前記動物から回収すること、を含んで成る方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法から生じる免疫特異的抗体。
【請求項１８】
試験される１又は複数の化合物の中から、アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する単離されたポリペプチドの活性を活性化し、又は阻害する物質を同定するための方法であって、
ａ）請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
ｂ）前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
ｃ）前記ポリペプチドの活性に対する活性又は阻害作用を決定し、それにより前記活性又は阻害物質を同定すること、
を含んで成る方法。
【請求項１９】
試験される１又は複数の化合物の中から、アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する単離されたポリペプチドによって活性が増強され又は阻害される物質を同定するための方法であって、
ａ）請求項９に記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
ｂ）前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
ｃ）前記物質の活性に対する増強又は阻害作用を決定し、それにより前記の増強され又は阻害された物質を同定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２０】
対象者の生物学的特性を解析するための方法であって、以下の段階：
ａ）対象者のゲノムにおける、請求項１に記載のポリヌクレオチドの有無を決定し、
ｂ）対象者における、請求項１に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを決定し、
ｃ）対象者における、請求項１２に記載のポリペプチドの有無を決定し、
ｄ）対象者における、請求項１２に記載のポリペプチドの濃度を決定し；あるいは
ｅ）対象者における、請求項１２に記載のポリペプチドの機能性を決定すること、のうちの少なくとも１つを実施すること、を含んで成る方法。
【請求項２１】
ヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列の一部が、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２g，から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含んで成る、ヌクレオチド配列である配列番号１、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体、から成る群から選択される、１又は複数の化合物を含んで成る治療物質。
【請求項２２】
個体における、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害から成る群から選択される疾患を予防又は処置する方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項２１に記載の物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
【請求項２３】
前記ガン及び腫瘍が、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記代謝病が肥満のような非免疫関連疾患を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染病が、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記の中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患が、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
個体における、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症から成る群から選択される疾患を予防又は処置するための方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項２１に記載の物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
【請求項２９】
対象者における、請求項１２に記載のポリペプチドの活性を増大又は低下させるための方法であって、治療的に有効な量の１又は複数の：ヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列の一部が、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２g，から成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含んで成るヌクレオチド配列である配列番号１、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体；及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法。
【請求項３０】
個体における、請求項１に記載のポリヌクレオチドの前記個体のゲノムの存在に関連する障害又は疾患を予防又は処置するための方法であって、治療的に有効な量の１又は複数の：ヌクレオチド配列である配列番号１の全部又は一部を含んで成り、且つa５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体；及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法。
【請求項３１】
ＩＦＮ□−７遺伝子内の、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと、疾患又は疾患に対する抵抗性、との間の統計的に関連している関係を決定するための方法であって、
ａ）個体群を遺伝子型判定し、
ｂ）前記個体群内の前記疾患又は疾患に対する抵抗性の分布を決定し、
ｃ）遺伝子型のデータと、前記疾患又は疾患に対する抵抗性とを比較し、そして
ｄ）統計的に関連している関係についての前記比較を解析すること、
を含んで成る方法。
【請求項３２】
疾患の予後又は疾患に対する抵抗性を診断し、又は決定するための方法であって、ＩＦＮ□−７遺伝子内の、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを検出することを含んで成る方法。
【請求項３３】
試験される１又は複数の化合物の中から、Ｄ９５Ｎ突然変異型ＩＦＮ□−７の遺伝子産物と実質的に同程度の生物学的活性を有する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験される化合物の生物活性、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、ＴＦ−１細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を決定し；
ｂ）前記化合物の段階ａ）で決定した活性を、Ｄ９５Ｎ突然変異型ＩＦＮ□−７の遺伝子産物の活性と比較し、
ｃ）段階ｂ）で実施した比較に基づき、前記化合物が、Ｄ９５Ｎ突然変異型ＩＦＮ□−７の遺伝子産物と比較して、実質的に同程度又はそれより低い、又はそれより高い活性を有するか否かを決定すること、を含んで成る方法。
【請求項３４】
試験される化合物が、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、高処理量スクリーニングから既に同定され、又はコンピューターを使ったドラッグデザインによって設計された結果、アミノ酸配列である配列番号２のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号２の２４から１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がＤ９５Ｎ ＳＮＰを含んで成るもの、と同一の三次元構造及び／又は化学作用を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項３６】
個体における、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害から成る群から選択される疾患を予防又は処置する方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項３５に記載の化合物、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
【請求項３７】
前記ガン及び腫瘍が、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記感染病が、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患が、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記の中枢神経系の疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記代謝病が肥満のような非免疫関連疾患を含んで成る、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
個体における、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症から成る群から選択される疾患を予防又は処置するための方法であって、前記個体に対し、有効量の請求項３５に記載の化合物、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法。
【請求項４３】
１又は複数の：ヌクレオチド配列である配列番号１の全部又は一部を含んで成り、且つa５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部、を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，及びＲ１４４Ｋから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体、を含んで成る診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００１年６月１１日に出願された、表題「Nouveaux polynucleotides et polipeptides de I'IFN alpha 7」のフランス国特許出願番号第０１０７５８８号に対し優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、新規ＳＮＰを含んで成る、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列に由来する新規ポリヌクレオチド、及びこれらのＳＮＰによって生じた突然変異を含んで成る、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質に由来する新規ポリペプチド、並びにそれらの治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
以降ＩＦＮα−７と称する、インターフェロンアルファ７遺伝子は、以下の刊行物に記載されている：
- Olopade, O. I. ;Bohlander, S. K.; Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia." ; Genomics 14:437- 443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genesand pseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15; 156 (3): 467-86.
【０００４】
この遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースにおいてアクセッション番号Ｘ０２９６０のもとアクセス可能である。
【０００５】
ＩＦＮαは、それらの細胞性抗増殖作用、並びに抗ウイルス性及び抗寄生虫性応答におけるそれらの関与について知られている。
【０００６】
ＩＦＮαはまた、造血幹細胞のレベルで複数の他のサイトカインの発現を阻害し、そしてある腫瘍の細胞増殖を阻害することも知られている。
【０００７】
ＩＦＮαはまた、腎ガンにおけるＥＧＦ受容体の発現を低下させ、あるミトコンドリア遺伝子の発現を阻害し、そして線維芽細胞、単球及びＢリンパ球の増殖を、特にｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害し、そしてＢリンパ球による抗体の合成を阻止することも知られている。
【０００８】
ＩＦＮαはまた、腫瘍細胞の表面上での腫瘍特異的抗原の発現を誘導すること、そして更にはＩＳＲＥ型（インターフェロン刺激応答因子）のプロモーター領域の支配下にある遺伝子を、これらのＩＳＲＥの特異的な転写因子に対して作用させることによって誘導することも知られている。
【０００９】
ＩＦＮαが異なる障害及び／又はヒトの疾患、例えば、異なるガン、例えばガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば免疫系等と関連していないもの、例えば肥満、感染症、例えばＢ型及びＣ型肝炎並びにＡＩＤＳ、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系等の疾患、例えばアルツハイマー病、精神分裂病及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、アレルギー、喘息、多発性硬化症、骨粗鬆症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患、又は化学療法処置と関連している障害、に関与することが知られている。
【００１０】
ＩＦＮαは、ある白血病、転移型腎ガン及び免疫欠損後に現れる腫瘍、例えばＡＩＤＳの場合にはカポジ肉腫に特に使用される。ＩＦＮαは、他のタイプの腫瘍及びあるウイルス感染に対しても有効である。ＩＦＮαはまた、生殖器のイボ又は性病の処置についてＦＤＡ（食品医薬品局）によって承認されている。
【００１１】
しかしながら、ＩＦＮα、特にＩＦＮα−７は、それらを医薬組成物において使用する場合に多くの副作用があり、例えば急性過敏症（じんま疹、気管支収縮、アナフィラキシーショック等）、心不整脈、低血圧、てんかん性発作、甲状腺機能についての問題、流感様症候群（発熱、発汗、筋肉痛）等である。
【００１２】
更に、ＩＦＮαで処置された患者は、これらの分子を中和する抗体を産生することができ、その結果それらの有効性が低下する。
【００１３】
本発明者は、天然の野生型ＩＦＮ−７タンパク質と異なる機能性を有しうる、ＩＦＮα−７遺伝子に対する新規ポリペプチド及び新規ポリヌクレオチド類似体、を発見した。
【００１４】
これらの新規ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、前文で言及した障害又は疾患を処置又は予防し、そしてそれらに縛られている欠点の全部又は一部を回避するために特に使用されうる。
【００１５】
本発明の簡単な要約
本発明は、第一の目的として、参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列と異なる、すなわち１又は複数のＳＮＰ（一塩基多型）を含んで成る新規ポリヌクレオチドを有する。
【００１６】
ヒト参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号１は、１９８３ヌクレオチドから成り、そしてヌクレオチド７５１（開始コドン）からヌクレオチド１３２０（終止コドン）の、５７０ヌクレオチドのコード配列を含んで成る。
【００１７】
本出願人は、参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列において１４個のＳＮＰを同定してきた。これらの１４個のＳＮＰは以下の通りである：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４c。
【００１８】
当然のことながら、本発明の意味においては、前文で限定したＳＮＰの位置に相当する番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号１の番号付けと関連している。
【００１９】
文字ａ，ｔ，ｃ及びｇは、それぞれ窒素性塩基のアデニン、チミン、シトシン及びグアニンに相当する。
【００２０】
最初の文字は野生型のヌクレオチドに相当し、一方、最後の文字は変異型ヌクレオチドに相当する。
【００２１】
したがって、例えばＳＮＰ ｇ１０３３ａは、参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列である配列番号１の、１０３３位のヌクレオチドであるグアニン（ｇ）が、ヌクレオチドであるアデニン（ａ）に変異したことに相当する。
【００２２】
これらのＳＮＰは、表題「Process for the determination of one or several functional polymorphism(s) in the nucleotide sequence of a preselected functional candiate gene and its applications」の、２０００年１２月６日に出願された出願人の特許出願ＦＲ００２２８９４に記載の決定方法を用いて本出願人によって同定された。
【００２３】
この特許出願に記載の方法は、無作為な個体群由来の少なくとも１つの個体において、１（又は複数）の既存のＳＮＰの同定を可能にする。
【００２４】
本発明の範囲において、例えば、コード配列を含んで成る、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントが、無作為に選択した個体群の異なる個体から単離された。
【００２５】
続いて、これらのフラグメントの配列決定が、ＤＨＰＬＣ（「変性−高性能液体クロマトグラフィー」）による解析の後、ヘテロ二重鎖プロファイル（すなわち、参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子配列と異なるプロファイル）を有するこれらの試料のうちのいくつかについて行われた。
【００２６】
この方法で配列決定されたフラグメントは、続いて参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のフラグメントのヌクレオチド配列と比較され、そして本発明に基づくＳＮＰが同定された。
【００２７】
この様にＳＮＰは天然のものであり、そしてこれらの各々が世界の人口のある個体に存在している。
【００２８】
参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子は、最初の２３アミノ酸を含むシグナルペプチドの開裂によって１６６アミノ酸の成熟タンパク質に変換される、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、１８９アミノ酸の未成熟タンパク質をコードする。
【００２９】
本発明のコードＳＮＰのそれぞれ、すなわち、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，a１２９４cは、アミノ酸配列のレベルで、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾をもたらす。
【００３０】
アミノ酸配列におけるこれらの修飾は以下の通りである：
【００３１】
ＳＮＰ ｔ７７９ｃは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子によってコードされる未成熟タンパク質の１０位にあるアミノ酸であるバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に変異させる。このＳＮＰは、タンパク質成熟の過程の間に開裂するシグナル配列に位置するアミノ酸に影響を与え、そして、それ故にこのＳＮＰは、当該成熟タンパク質上に見られない。本発明の記載において、このＳＮＰによってコードされる突然変異は、Ｖ１０Ａと称されることもある。
【００３２】
ＳＮＰ ｇ１０３３ａは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の９５位にあるアミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）の、アスパラギン（Ｎ）への突然変異、そして成熟タンパク質の７２位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、Ｄ７２Ｎ及びＤ９５Ｎは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別することなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３３】
ＳＮＰ c１０８４aは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の１１２位にあるアミノ酸、ロイシン（Ｌ）の、イソロイシン（Ｉ）への突然変異、そして成熟タンパク質の８９位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、Ｌ８９Ｉ及びＬ１１２Ｉは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３４】
ＳＮＰ g１１３５tは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の１２９位にあるアミノ酸、バリン（Ｖ）の、ロイシン（Ｌ）への突然変異、そして成熟タンパク質の１０６位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載において、Ｖ１０６Ｌ及びＶ１２９Ｌは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３５】
ＳＮＰ ｔ１１６６ｃは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の１３９位にあるアミノ酸、フェニルアラニン（Ｆ）の、セリン（Ｓ）への突然変異、そして成熟タンパク質の１１６位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、Ｆ１１６Ｓ及びＦ１３９Ｓは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３６】
ＳＮＰ g１１８１aは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の１４４位にあるアミノ酸、アルギニン（Ｒ）の、リジン（Ｋ）への突然変異、そして成熟タンパク質の１２１位にあるものの突然変異をもたらす。本発明の記載においては、Ｒ１２１Ｋ及びＲ１４４Ｋは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３７】
ＳＮＰ a１２９４ｃは、アミノ酸配列である配列番号２に相当する、ＩＦＮα−７遺伝子の未成熟タンパク質の１８２位にあるアミノ酸、リジン（Ｋ）の、グルタミン（Ｑ）への突然変異、そして成熟タンパク質の１５９位にあるものの  突然変異をもたらす。本発明の記載においては、Ｋ１５９Ｑ及びＫ１８２Ｑは、それぞれ成熟タンパク質と、又は未成熟タンパク質と言及されるかどうかにより区別されることなくこのＳＮＰによってコードされる突然変異と称される。
【００３８】
ＳＮＰ ｇ１０３３ａ（Ｄ９５Ｎ），ｔ１１６６ｃ（Ｆ１３９Ｓ），ｇ１１８１ａ（Ｒ１４４Ｋ），ａ１２９４ｃ（Ｋ１８２Ｑ）は、野生型参照ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと比較して、本発明に従うポリペプチドの空間的な高次構造の修飾をもたらす。
【００３９】
これらの修飾は、当業者に周知の方法に従い、例えば新規のモデリングツール（例えば、ＳＥＱＦＯＬＤ／ＭＳＩ）、ホモロジー（例えば、ＭＯＤＥＬＥＲ／ＭＳＩ）、力場の最小化（例えば、ＤＩＳＣＯＶＥＲ，ＤＥＬＰＨＩ／ＭＳＩ）及び／又は分子動力学（ＣＦＦ／ＭＳＩ）を利用して、コンピューター分子モデリングによって観察され得る。
【００４０】
その様なモデリングの一例は、本明細書において実験の項目に示される。
【００４１】
コンピューター分子モデリングは、成熟変異型タンパク質上の突然変異Ｄ７２Ｎが、７２位のアスパラギン酸を担持するショートヘリックス（Ｔ７０−Ａ７５）の構造的修飾をもたらすことを示す。１３６位のチロシン残基を有し、７２位のアスパラギン酸に面しているヘリックスＤとＥとの間のループも修飾される。
【００４２】
したがって、当該変異タンパク質は、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【００４３】
更に、突然変異Ｄ７２Ｎはまた、アスパラギン酸の持っていた負電荷の損失をもたらす。最終的に、７２位のアスパラギン酸残基の、アスパラギン残基への突然変異は、受容体に結合するＩＦＮα−７部分の近傍において、タンパク質機能を変えるにちがいない。
【００４４】
それ故に、コンピューターによる分子モデリングは、７２位のアスパラギンの存在が、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与していることを推測する。特に、この突然変異は、ＩＦＮα−７の、その受容体に対する親和性を変化させるようである。
【００４５】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上の突然変異Ｆ１１６Ｓが、ヘリックスＤの若干の摂動をもたらすが、ショートヘリックス（Ｅ４０−Ｄ４４）のレベルでのＡＢループの構造的修飾ももたらすことを示す。このショートヘリックス内に位置する４２位のグルタミン酸の配向は、当該突然変異に起因して修飾される。
【００４６】
Ｆ１１６Ｓの最も重要な効果は、ＩＦＮα−７構造の内側にあるフェニルアラニンのネットワークによって生じるπスタック効果が弱いことであり、これは恐らく、タンパク質構造のより高い柔軟性をもたらす。
【００４７】
１１６位のフェニルアラニンのペプチド骨格の窒素原子と、１１４位のグルタミン酸のカルボニル基の酸素原子との間の水素結合は保存される。
【００４８】
その結果、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【００４９】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、１１６位のセリンの存在が、天然の野生型ＩＦＮα−７の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【００５０】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のＲ１２１Ｋの突然変異が、ヘリックスＤの高次構造の若干の摂動をもたらすことを示す。
【００５１】
アミノ酸Ｌ１１８，Ｋ１２２，Ｑ１２５及びＦ１２４の側鎖の配向は、当該突然変異によって修飾される。
【００５２】
更に、ＩＦＮα−２のＲ１２１残基（ＩＦＮα−７のＲ１２０に等しい）は、インターフェロンの抗ウイルス活性にとって重要であろうことが証明されてきた(Weber H, Valenzuela D, Lujber G, Gubler M, Weissmann C.; "Single amino acid changes that render human IFN alpha 2 biologically active on mouse cells". (1987) EMBO J. 6:591-598)。
【００５３】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型ＩＦＮα−７と異なる三次元の高次構造を有する。
【００５４】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、１２１位にあるリジンの存在が、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【００５５】
コンピューターによる分子モデリングは、成熟突然変異タンパク質上のＫ１５９Ｑの突然変異が、ヘリックスＥの後ろにあるループの障害をもたらし、この効果は、当該タンパク質のＣ末端まで続くことを示す。ヘリックスＢの直前に位置するループも、Ｑ１４９残基のレベルで修飾される。
【００５６】
リジン１５９の窒素原子とスレオニン１５６のカルボニル基の酸素原子との間の水素架橋（Ｃ末端のループを有するヘリックスＥの末端）も抑制される。
【００５７】
１５９位にあるリジン（Ｋ）が、インターフェロンのＣ末端部分の抗ウイルス活性に影響を及ぼしうると考えられている(Chang NT, Kung HF, Pestka S.;"Synthesis of a human leukocyte interferon with a modified carboxy terminus in Escherichia coli." Arch. Biochem. Biophys. (1983) 221:585-589)。
【００５８】
このように、当該突然変異タンパク質は、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質と異なる三次元の高次構造を有する。
【００５９】
したがって、コンピューターによる分子モデリングは、１５９位にあるグルタミンの存在が、天然の野生型ＩＦＮα−７タンパク質の構造及び機能の重大な修飾に関与すると推測する。
【００６０】
本発明に従う他のＳＮＰ、すなわち、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，g１１２５a，g１１６１ａ，及びa１２１２gは、アミノ酸配列である配列番号２のレベルで、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の修飾に関与しない。
【００６１】
ＳＮＰ g１１２５a，g１１６１ａ，a１２１２ｇはサイレントであり、そしてＳＮＰ a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２tは非コード領域である。
【００６２】
事実、サイレントＳＮＰ ｇ１１２５ａは、アミノ酸配列である配列番号２上の１２５位にあるアミノ酸、グルタミン（Ｑ）を修飾しない。サイレントＳＮＰ ｇ１１６１ａは、アミノ酸配列である配列番号２上の１３７位にあるアミノ酸、グルタミン酸（Ｅ）を修飾しない。同様に、サイレントＳＮＰ ａ１２１２ｇは、アミノ酸配列である配列番号２上の１５４位にあるアミノ酸、ロイシン（Ｌ）を修飾しない。
【００６３】
本発明に従うポリヌクレオチドの遺伝子型判定は、個体群におけるこれらのポリヌクレオチドの対立遺伝子頻度を決定するように実施されうる。遺伝子型判定の例は、以後の実験的な項目において示す。
【００６４】
本発明のポリペプチドの機能性の決定は、それらの生物学的活性の試験によって等しく実施されうる。
【００６５】
これに関して、例えば、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのＴＦ−１細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定し、そして野生型ＩＦＮα−７、又は市販品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２と比較することが可能である。
【００６６】
本発明はまた、特に、あるヒトの障害及び／又は疾患の予防及び治療のための、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチド並びにこれらのポリヌクレオチド及びポリペプチドから出発して得られ、そして／あるいは同定された治療用分子の使用、という目的を有する。
【００６７】
定義
「参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列」とは、ヒトＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列、配列番号１であると理解される。
【００６８】
この配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、アクセッション番号Ｘ０２９６０のもとアクセス可能であり、そして
- Olopade, O. I. ; Bohlander, S. K.;Pomykala, H.; Maltepe, E.; Van Melle, E.; Le Beau, M. M.; Diaz, M.O. :"Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with humanneoplasia." ; Genomics 14: 437443,1992.
- Henco K, Brosius J, Fujisawa A, Fujisawa JI, Haynes JR, Hochstadt J,Kovacic T, Pasek M,Schambock A, Schmid J, et al. :"Structural relationship of human interferon alpha genes andpseudogenes." ; J Mol Biol 1985 Sep 20; 185 (2): 227-60.
- Ullrich A, Gray A, Goeddel DV, Dull TJ:"Nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster." ; J Mol. Biol. 1982 Apr 15 ; 156 (3): 467-86.
に記載されている。
【００６９】
「天然野生型ＩＦＮα−７タンパク質」又は「野生型ＩＦＮα−７タンパク質」とは、参照野生型ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされる成熟タンパク質であると理解される。天然野生型未成熟タンパク質ＩＦＮα−７は、配列番号２で示されるペプチド配列に相当する。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」とは、修飾型又は非修飾型ＤＮＡ又はＲＮＡであり得るポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであると理解される。
【００７１】
用語ポリヌクレオチドは、例えば一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、１又は複数の一本鎖領域及び１又は複数の二本鎖領域の混合物から成るＤＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ並びに１又は複数の一本鎖領域及び１又は複数の二本鎖領域の混合物から成るＲＮＡを含む。用語ポリヌクレオチドは、更に１又は複数の三本鎖領域を含むＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含むこともある。ポリヌクレオチドとは、安定性の理由又は他の理由のために修飾された骨格を有する様な方法で修飾された１又は複数の塩基を含むＤＮＡ及びＲＮＡであると等しく理解される。修飾された塩基とは、例えば異常な塩基、例えばイノシンであると理解される。
【００７２】
「ポリペプチド」とは、例えば同じペプチドの場合には通常の又は修飾されたペプチド結合によって、互いに連結した、少なくとも２つのアミノ酸を含んで成るペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー又はタンパク質であると理解される。
【００７３】
ポリペプチドは、遺伝コードによって定義される、２０アミノ酸以外のアミノ酸から成ることがある。ポリペプチドはまた、当業者に周知の、天然の過程、例えば翻訳後成熟過程又は化学的過程によって修飾されたアミノ酸から成ることもある。その様な修飾は文献において完全に詳述されている。これらの修飾は、ポリペプチド、ペプチド骨格、アミノ酸鎖において、又は例えカルボキシ末端若しくはアミノ末端であっても、いずれかに出現し得る。
【００７４】
ポリペプチドはユビキチン結合後に枝分かれするか、あるいは枝分かれしながら又は枝分かれせずに環状化することがある。このタイプの修飾は、当業者に周知の天然又は合成翻訳後過程の結果であり得る。
【００７５】
例えば、ポリペプチドの修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘムの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、共有又は非共有架橋、還化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ピログルタミン酸塩形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化（ｓｅｎｅｌｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アミノ酸付加、例えばアルギニル化又はユビキチン結合を含むことがある。その様な修飾は文献：PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et al.“Analysisfor protein modifications and nonprotein cofactors”, Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646, and Rattan et al.“Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663 : 48-62、において十分に詳述されている。
【００７６】
「単離されたポリヌクレオチド」又は「単離されたポリペプチド」とは、例えば上文で限定した様な、ヒトの身体から単離され、又はさもなければ技術的手法によって産生されるポリヌクレオチド又はポリペプチドであると理解される。
【００７７】
「同一性」とは、ヌクレオチド又はポリペプチド配列の同一性の測定値であると理解される。
【００７８】
同一性は当業者にとって周知の用語であり、そして文献に詳細に記載されている。COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford UniversityPress, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin H.G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; and SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje,G., Academic Press, 1987を参照のこと。
【００７９】
２つの配列間の同一性及び類似性を決定するために一般的に利用される方法も、文献において詳細に記載されている。GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo H. and Lipton D.,Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073を参照のこと。
【００８０】
例えば、ヌクレオチド配列である配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、１００ヌクレオチドの範囲に多くても５個所の突然変異を含むポリヌクレオチドである。
【００８１】
これらの突然変異の個所は、１（又は複数）のヌクレオチドの１（又は複数）の置換、付加及び／又は欠失であってもよい。
【００８２】
同様に、例えば、アミノ酸配列である配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドは、前記配列と比較して、１００ヌクレオチドの範囲に多くても５個所の突然変異を含むポリペプチドである。
【００８３】
これらの突然変異の個所は、１（又は複数）のアミノ酸の１（又は複数）の置換、付加及び／又は欠失であってもよい。
【００８４】
本発明のＳＮＰのうち少なくとも１つを含む、ヌクレオチド配列である配列番号１又はアミノ酸配列である配列番号２とそれぞれ完全には同一ではない、本発明に従うポリヌクレオチド及びポリペプチドは、これらの配列の変異体とみなされる。
【００８５】
通常、本発明に従うポリペプチドは、本発明のＳＮＰのうち少なくとも１つを含んで成るヌクレオチド配列、配列番号１と、同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【００８６】
同様に、本発明に従うポリペプチドは通常、本発明のコードＳＮＰのうち少なくとも１つを含んで成るアミノ酸配列、配列番号２と同一又は事実上同一の生物活性を有する。
【００８７】
本発明に従う変異体は、例えば部位指定突然変異導入法又は直接合成によって得ることができる。
【００８８】
「ＳＮＰ」とは、ヌクレオチド配列における塩基の何らかの天然の変異であると理解される。ヌクレオチド配列のＳＮＰは、コード、サイレント又は非コードであってもよい。
【００８９】
コードＳＮＰは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における１又は複数のアミノ酸の修飾に関与するコード配列における多型である。この場合、用語ＳＮＰは、拡大解釈すれば、アミノ酸配列中の突然変異にも適用される。
【００９０】
サイレントＳＮＰは、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列におけるアミノ酸の修飾に全く関与しないヌクレオチド配列のコード配列における多型である。
【００９１】
非コードＳＮＰは、ヌクレオチド配列の非コード配列における多型である。この多型は、特にイントロン、スプライシング領域、転写プロモーター又はエンハンサー部位の配列において見られる。
【００９２】
「機能的ＳＮＰ」とは、上文で限定した様な、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に含まれ、そしていくつかの機能を有するＳＮＰであると理解される。
【００９３】
「機能性」とは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物活性であると理解される。
【００９４】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の保存、増大、減少又は抑制に存することもある。
【００９５】
本発明に従うポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能性は、同様に参照野生型遺伝子のヌクレオチド配列又はこの後述するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの生物活性の性質における変化から成るともいえる。
【００９６】
生物活性は、特に本発明に従うポリペプチドと受容体との親和性又は親和性の不在と関連していることがある。
【００９７】
ポリヌクレオチド
本発明は、
ａ）配列番号１の配列又はそのコード配列（ヌクレオチド７５１〜ヌクレオチド１３２０）との少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは少なくとも９５％の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、以下のコードＳＮＰ：t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，a１２９４cのうちの少なくとも１つを含んで成ると解されるヌクレオチド配列、あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド配列を第一の目的とする。
【００９８】
当然のことながら、本発明の意味において、番号付けは、ヌクレオチド配列である配列番号１のＳＮＰの位置に相当している。
【００９９】
本発明は同様に、
ａ）配列番号１の配列又はそのコード配列であって、それぞれが以下のコードＳＮＰ：t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，a１２９４cのうちの少なくとも１つを含んで成ると解されるもの、あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１００】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列又はそのコード配列であって、これらの配列のそれぞれが、以下のコードＳＮＰ：t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，a１２９４cのうちの少なくとも１つを含んで成ると理解されるものから成る。
【０１０１】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２９４cから成る群から選択される単一のコードＳＮＰを含んで成る。
【０１０２】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードＳＮＰｇ１０３３ａを含んで成る。
【０１０３】
前文で限定したようなポリヌクレオチドは、同様に、以下の非コード及びサイレントＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，g１１２５a，g１１６１ａ，及びa１２１２g、のうちの少なくとも１つを含むことがある。
【０１０４】
本発明はまた、ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１又は、必要によりそのコード配列、であって、それぞれ以下の非コード又はサイレントＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，g１１２５a，g１１６１ａ，及びa１２１２g、のうちの少なくとも１つを含んで成ると解されるもの；あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、又はそれらから成る、単離されたポリヌクレオチドを第一の目的とする。
【０１０５】
当然ながら、以下のサイレントＳＮＰ g１１２５a，g１１６１ａ，a１２１２gのみがヌクレオチド配列である配列番号１のコード配列中に位置する。
【０１０６】
本発明はまた、ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１又はそのコード配列であって、それぞれ以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４c、のうちの少なくとも１つを含んで成ると解されるもの、あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
の一部から成る単離されたポリヌクレオチドであって、少なくとも１０個のヌクレオチドから構成される単離されたポリヌクレオチド、に関する。
【０１０７】
好ましくは、上文で定義した様な単離されたポリヌクレオチドは１０〜４０個のヌクレオチドから構成される。
【０１０８】
本発明はまた、
ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１の全部又は一部であって、但し、そのようなヌクレオチド配列、又は配列の一部が、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，ｇ１１３５ｔ，g１１６１ａ，ｔ１１６６ｃ，ｇ１１８１ａ，及びa１２１２gから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含んで成るもの、あるいは
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
を含んで成る、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１０９】
上文で限定したような、単離されたヌクレオチド配列は、少なくとも１０個のヌクレオチド、そして好ましくは１０〜４０個のヌクレオチドから構成される。
【０１１０】
本発明によると、前文で限定したポリヌクレオチドは、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２９４cから成る群から選択される単一のコードＳＮＰを含んで成る。
【０１１１】
更に好ましくは、前文で限定したポリヌクレオチドは、コードＳＮＰｇ１０３３ａを含んで成る。
【０１１２】
本発明はまた、
ａ）アミノ酸配列である配列番号２；又は
ｂ）アミノ酸配列である配列番号２の２４〜１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成るポリペプチドであって、
以下のコードＳＮＰ：Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，及びＫ１８２Ｑのうちの少なくとも１つを含んで成るアミノ酸配列を有すると解されるもの、をコードする、単離されたポリヌクレオチドをその目的とする。
【０１１３】
当然ながら、本発明の意味においては、Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，及びＫ１８２Ｑの位置に相当する番号付けは、アミノ酸配列である配列番号２の番号付けに相当する。
【０１１４】
本発明の好ましい目的よると、前文で限定したポリペプチドは、上文で限定したような単一のコードＳＮＰを含んで成る。
【０１１５】
更に好ましくは、本発明に従う単離されたポリヌクレオチドは、アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、そしてコードＳＮＰ Ｄ９５Ｎを有するポリペプチドをコードする。
【０１１６】
好ましくは、本発明に従うポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子から構成される。
【０１１７】
本発明に従うポリヌクレオチドは、標準的なＤＮＡ又はＲＮＡ合成法によって得ることができる。
【０１１８】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列である配列番号１上の各ＳＮＰにつき変異したヌクレオチドによって野生型ヌクレオチドを修飾することによって、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【０１１９】
例えば、ＳＮＰ ｇ１０３３ａを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列である配列番号１の１０３３位にあるヌクレオチド、グアニンをアデニンによって修飾することによって、ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列から出発する、部位指定突然変異導入法によって得ることができる。
【０１２０】
この様に実施され得る部位指定突然変異導入法の過程は当業者にとって周知であり、刊行物であるTA Kunkelの、1985年の「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」82: 488を参照のこと。
【０１２１】
単離されたポリヌクレオチドはまた、例えば、プレ、プロ又はプレ−プロタンパク質のアミノ酸配列又はマーカーアミノ酸配列、例えばヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことがある。
【０１２２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、融合タンパク質又は他の精製産物を得るために、他のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするヌクレオチド配列を伴うこともある。
【０１２３】
本発明に従うポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド配列、例えば５′及び／又は３′非コード配列、例えば転写又は非転写配列、翻訳又は非翻訳配列、スプライシングシグナル配列、ポリアデニル化配列、リボソーム結合配列あるいはｍＲＮＡを安定化する配列でさえも含むことがある。
【０１２４】
前記ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、このヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るものと定義される。
【０１２５】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ヌクレオチド配列が少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９５％以上、そして最も好ましくは９７％以上の同一性を有する場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする化学条件であると広く理解されるが必ずしもそうではない。
【０１２６】
ストリンジェントな条件は、当業者にとって周知な方法に従い、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mMのＮａＣｌ，１５mMのクエン酸三ナトリウム）、５０mMのリン酸ナトリウム（pH＝７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇの変性サケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液中での、４２℃での前記ポリヌクレオチドのインキュベーション、続く０．１×ＳＳＣ、６５℃でのフィルターの洗浄によって得ることができる。
【０１２７】
本発明の範囲において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のみが、１００％に等しい同一性を有するヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを可能にする場合、ヌクレオチド配列は、ａ）において記載した様なヌクレオチド配列と厳密に相補的であると考えられる。
【０１２８】
当然のことながら、本発明の意味において、ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチドは、本発明に従う少なくとも１つのアンチセンスＳＮＰを含んで成る。
【０１２９】
従って、例えば、前記ヌクレオチド配列がＳＮＰ ｇ１０３３ａを含んで成る場合、その相補ヌクレオチド配列は、１０３３位と同等の位置にチミン（ｔ）を含んで成る。
【０１３０】
ＳＮＰを含んで成るポリヌクレオチドの同定、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅
本発明はまた、ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは９５％の同一性、そして特に１００％の同一性）を有するポリヌクレオチド、及び／又はｂ）少なくとも１つのＳＮＰを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、の全部又は一部の使用であって、ヌクレオチド配列である配列番号１又は、必要によりそのコード配列（ヌクレオチド７５１〜ヌクレオチド１３２０）と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは９５％の同一性、そして特に１００％の同一性）を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、ハイブリダイズし、そして／あるいは増幅するための使用であって、これらの配列のそれぞれが以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４c、のうちの少なくとも１つを含むと解される、使用、をその目的とする。
【０１３１】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を同定し、あるいは増幅する方法であって、適当なハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを本発明に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含んで成る方法、に関する。
【０１３２】
遺伝子型判定及びＳＮＰの頻度の決定
本発明はまた：
ａ）ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは９５％の同一性、そして特に１００％の同一性）を有するポリヌクレオチド、及び／又は
ｂ）少なくとも１つのＳＮＰを含んで成る、本発明に従うポリヌクレオチド、
の全部又は一部の使用であって、
配列番号１又は必要によりそのコード配列（ヌクレオチド７５１〜ヌクレオチド１３２０）と８０〜１００％の同一性（好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは９５％の同一性、そして特に１００％の同一性）を有するポリヌクレオチドの全部又は一部の遺伝子型判定のための使用であって、これらの配列のそれぞれが、以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４c、のうちの少なくとも１つを含んで成ると解される、使用をその目的とする。
【０１３３】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号１と８０〜１００％の同一性を有するポリヌクレオチドの全部又は一部を遺伝子型判定するための方法であって、対象者又は対象者群のゲノムＤＮＡの注目の領域を増幅し、そして５５９，５８０，６６７，６８２，７７９，１０３３，１０８４，１１２５，１１３５，１１６１，１１６６，１１８１，及び１２１２から成る群から選択される、ヌクレオチド配列である配列番号１中の少なくとも１つの位置の対立遺伝子を決定する段階、を含んで成る方法に関する。
【０１３４】
本発明によれば、遺伝子型判定は、個体又は個体群で行われうる。
【０１３５】
本発明の意義の範囲内で、遺伝子型判定は個体又は個体群の遺伝子型の決定のための方法として定義される。遺伝子型は、１又は複数の特異的な遺伝子座に存在する対立遺伝子から成る。
【０１３６】
「個体群」とは、ランダムな方法又はランダムでない方法で選択された、個体の一群であると解される。これらの個体はヒト、動物、微生物又は植物であってもよい。
【０１３７】
通常、個体群は少なくとも１０の個体、好ましくは１００〜３００の個体含んで成る。
【０１３８】
個体は、それらの民族性に従い、又はそれらの表現型に従い、特に以下の障害及び／又は疾患によって影響を受けるものが選択され得る：ガン腫、黒色腫、リンパ腫、白血病並びに、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、心臓血管疾患、代謝病、例えば非免疫関連疾患、例えば肥満、感染症、特にウイルス感染、例えばＢ型及びＣ型肝炎並びにエイズ、感染性肺炎、潰瘍性大腸炎、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、統合失調症及びうつ病、組織又は器官移植の拒絶、創傷治癒、透析されている患者の貧血、喘息、多発性硬化症、骨粗しょう症、乾癬、リウマチ様関節炎、クローン病、自己免疫疾患及び障害、胃腸疾患又は化学療法と関連した疾患。
【０１３９】
本発明に従う機能的ＳＮＰは、好ましくは個体群において遺伝子型判定される。
【０１４０】
ＳＮＰを遺伝子型判定するために実施され得る多くの方法が存在している（例えば、Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, 95-100.“High-throughput genotyping assay approaches”）。これらの技術は４つの以下の原理のうちの１つに基づいている：対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、任意にデオキシヌクレオチドの存在下でのジデオキシヌクレオチドによるオリゴヌクレオチドの伸長、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのライゲーション又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの開裂。これらの技術のいずれか一つが、検出系、例えば直接的な又は偏光した蛍光の測定、あるいは質量分析と組み合わせられ得る。
【０１４１】
遺伝子型判定は、特に偏光型蛍光スキャナーと一緒に、放射性ｄｄＮＴＰ（異なるフルオロフォアによって標識された２つの異なるｄｄＮＴＰ）及び非放射性ｄｄＮＴＰ（２つの異なる非標識型ｄｄＮＴＰ）を用いたミニシークエンスによって実施され得る。偏光型蛍光の読み込みによるミニシークエンスのプロトコール（ＦＰ−ＴＤＩ技術又は蛍光偏光鋳型直接ダイターミネーター取り込み（FluorescencePolarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation））は当業者にとって周知である。
【０１４２】
それは、各個体のＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅後に得られる産物で実施され得る。このＰＣＲ産物は、研究されたＳＮＰを含むポリヌクレオチドの遺伝子領域を網羅するために選択される。ＰＣＲサーモサイクラーにおける最後の段階の後、続いて、フルオロフォア特異的励起及び放射フィルターを用いることによる標識された塩基の読み込みのために、偏光型蛍光スキャナー上にプレートが据えられる。標識された塩基の強度の値はグラフ上に記される。
【０１４３】
ＰＣＲ増幅に関して、本発明のＳＮＰの場合、センス及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、１又は複数のＳＮＰを含む注目の領域を増幅するために、本発明のＳＮＰの位置に従い、当業者によって容易に選択され得る。
【０１４４】
例えば、ＩＦＮα−７のコード配列を含んで成るヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に使用されるプライマーに相当するセンス及びアンチセンスのヌクレオチド配列は、それぞれ：
配列番号３：センスプライマー：ＴＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＡＧＣＣ
配列番号４：アンチセンスプライマー：ＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣ
であってもよい。
【０１４５】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号１におけるヌクレオチド７１１からヌクレオチド１３７９の、６６９ヌクレオチドの長さを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【０１４６】
個体群におけるＳＮＰを含んで成る遺伝子によってコードされる各対立遺伝子の頻度（対立遺伝子頻度）の統計解析が続いて行われ、これは、異なる亜集団、そして特に、必要によりこの個体群を構成する多様な民族集団、におけるそれらの影響及びそれらの分布の重要性の決定を可能にする。
【０１４７】
遺伝子型判定のデータは、研究された群において観察された、異なる対立遺伝子の分布頻度を推定するために解析される。対立遺伝子頻度の計算は、ソフトウェア、例えばＳＡＳ−ｓｕｉｔｅ（商標）（ＳＡＳ）又はＳＰＬＵＳ（商標）（ＭａｔｈＳｏｆｔ）を用いて実施され得る。個体群における異なる民族性の集団に及ぶ本発明のＳＮＰの対立遺伝子分布の比較は、ソフトウェア、例えばＡＲＬＥＱＵＩＮ（商標）及びＳＡＳ−ｓｕｉｔｅ（商標）によって実施され得る。
【０１４８】
遺伝子マーカーとしての本発明のＳＮＰ
遺伝子の機能配列（例えばプロモーター、スプライシング部位、コード領域）を修飾するＳＮＰは疾患の感受性又は抵抗性と直接関連すると思われるが、全てのＳＮＰ（機能的又は非機能的）がこれらの疾患の状態に関与する１又は複数の遺伝子の同定にとって価値のあるマーカーを提供することが可能であり、そしてこの結果、これらの疾患の状態と間接的に関連するであろう（Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22 : 231-238 ; Riley et al. (2000). Phermacogenomics 1 : 39-47 ; Roberts L. (2000). Science 287 : 1898-1899を参照のこと）。
【０１４９】
この様に、本発明はまた、ＩＦＮα−７遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４c、のうちの少なくとも１つを含んで成るデータバンクに関する。
【０１５０】
更に当然のことながら、前記ＳＮＰはヌクレオチド配列である配列番号１に従い番号が付けられている。
【０１５１】
このデータバンクは、
（i）ＩＦＮα−７遺伝子のポリヌクレオチド内の、以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cのうちの少なくとも１つと、
（ii）疾患又は疾患に対する抵抗性、
との間の統計学的に関連している関係を決定するために解析されうる。
【０１５２】
本発明はまた、疾患又は疾患に対する抵抗性のための診断／予後のキットを開発するための、ＩＦＮα−７遺伝子のポリヌクレオチドにおける以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cのうちの少なくとも１つの使用に関する。
【０１５３】
本発明のＳＮＰ、例えば上述したものは、疾患又は疾患に対する抵抗性と直接又は間接的に関連することがある。
【０１５４】
好ましくは、これらの疾患は上文で言及した様に定義されるものであってもよい。
【０１５５】
本発明はまた、ＩＦＮ□−７遺伝子内の、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰと、疾患又は疾患に対する抵抗性、との間の統計的に関連している関係を決定するための方法であって、
ａ）個体群を遺伝子型判定し、
ｂ）前記個体群内の前記疾患又は疾患に対する抵抗性の分布を決定し、
ｃ）遺伝子型のデータと、前記疾患又は疾患に対する抵抗性とを比較し、そして
ｄ）前記比較を統計的に関連している関係について解析すること、
を含んで成る方法に関する。
【０１５６】
本発明はまた、疾患の予後又は疾患に対する抵抗性を診断し、又は決定するための方法であって、ＩＦＮ□−７遺伝子内の、a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを検出することを含んで成る方法に関する。
【０１５７】
本発明のＳＮＰの検出は、下文に記載するような当業者に周知の方法によって実施されうる。
【０１５８】
本発明の少なくとも１つのＳＮＰの検出は、研究される対象者由来の生体試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究される対象者の生検又は部検から出発して実施されうる。ゲノムＤＮＡは、例えば、直接的に又はＰＣＲ増幅後に検出に使用されうる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも同様に使用されうる。
【０１５９】
その結果、対象者から単離されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、本発明の少なくとも１つのＳＮＰを含んで成るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較することができる。
【０１６０】
上記ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、ＤＮＡハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる又は用いない、電気泳動ゲル上でのＤＮＡフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施されうる。Myers et al., Science (1985) 230:1242を参照のこと。正確な点での当該ヌクレオチド配列構造のそのような修飾も、ヌクレアーゼ保護試験、例えばリボヌクレアーゼ及びＳ１ヌクレアーゼによって、又は化学開裂剤によっても明らかとなりうる。Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと。ＤＮＡハイブリダイゼーション法と酵素消化の組み合わせも、インベーダーアッセイの場合のように使用されうる。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブも、当該スクリーニングを実施するために使用されうる。
【０１６１】
発現ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、本発明に従う少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターをその目的とする。
【０１６２】
多くの発現系、例えば、限定しないが染色体、エピソーム、誘導型ウイルスが使用され得る。更に具体的には、使用される組換えベクターは細菌性プラスミド、トランスポゾン、酵母のエピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスから誘導されることもある。
【０１６３】
これらの組換えベクターはまた、コスミド又はファージミド誘導体であってもよい。ヌクレオチド配列は、当業者にとって周知な方法、例えばMOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001に記載のものによって、組換え発現ベクター内に挿入され得る。
【０１６４】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の制御を調節するヌクレオチド配列並びに本発明のポリヌクレオチドの発現及び転写並びに本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含むことがあり、これらの配列は使用される宿主細胞に従い選択される。
【０１６５】
従って、例えば適切な分泌シグナルが前記組換えベクターに組み込まれることがあり、その結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、小胞体の内腔に向かって、細胞膜周辺腔に向かって、膜上に、又は細胞外環境に向かって、方向づけられるであろう。
【０１６６】
本発明はまた、本発明に従う組換えベクターを含んで成る宿主細胞をその目的とする。
【０１６７】
宿主細胞内への組換えベクターの導入は、当業者にとって周知な方法、例えばBASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 1986及びMOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL（上記）に記載のもの、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入又は感染、に従い実施され得る。
【０１６８】
宿主細胞は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、Ｅ．コリ（Ｃｏｌｉ）又はバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞、真菌の細胞、例えば酵母細胞及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９の細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ，ＣＯＳ，ＨｅＬａ，Ｃ１２７，ＢＨＫ，ＨＥＫ ２９３細胞及び処置すべき対象のヒト細胞であっても、又は植物細胞でもよい。
【０１６９】
宿主細胞は、例えば後文で明らかとなる様に、本発明のポリペプチドを発現させるために、又は医薬組成物中の活性産物として使用され得る。
【０１７０】
ポリペプチド
本発明はまた：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の２４〜１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
の全部又は一部と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、更に好ましくは少なくとも９５％の同一性、そしてより更に好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドであって、以下のコードＳＮＰ：Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，及びＫ１８２Ｑのうちの少なくとも１つを含むと解されるポリペプチド、をその目的とする。
【０１７１】
本発明のポリペプチドはまた：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の２４〜１８９位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部を含んで成り、前記ポリペプチドは、以下のコードＳＮＰ：Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，Ｋ１８２Ｑのうちの少なくとも１つを含むと解される。
【０１７２】
本発明のポリペプチドは、更に具体的には：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列、又は
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の２４〜１８９位の間に含まれるアミノ酸を含むアミノ酸配列、
の全部又は一部から成り、前記ポリペプチドは、以下のコードＳＮＰ：Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，Ｋ１８２Ｑのうちの少なくとも１つを含むと解される。
【０１７３】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、Ｖ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，Ｋ１８２Ｑから成る群から選択される単一のコードＳＮＰを含む。
【０１７４】
更に好ましくは、本発明に従うポリペプチドは、アミノ酸配列である配列番号２の２４〜１８９のアミノ酸を含んで成り、且つコードＳＮＰ，Ｄ９５Ｎを有する。
【０１７５】
本発明はまた、その目的のために上述のポリペプチドの調製方法を有し、ここで、上文で限定した宿主細胞が培養液中で培養され、そして前記ポリペプチドが当該培養液から単離される。
【０１７６】
ポリペプチドは、当業者にとって周知な方法、例えばカオトロピック剤、例えば塩、特に硫酸アンモニウム、エタノール、アセトン又はトリクロロ酢酸による沈澱、酸抽出；イオン交換クロマトグラフィー；ホスホセルロースクロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；親和性クロマトグラフィー；ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー又は排除クロマトグラフィーに従い、宿主細胞の培養液から出発して精製され得る。
【０１７７】
「培養液」とは、本発明のポリペプチドが単離され、又は精製される培地であると理解される。この培地は細胞外培地及び／又は細胞溶解物から構成され得る。当業者にとって周知な技術も、前記ポリペプチドの高次構造が単離又は精製の間に変化する場合に、後者のものが前記ポリペプチドの活性高次構造を生むことを可能にする。
【０１７８】
抗体
本発明はまた、免疫特異的抗体を得るための方法に関する。
【０１７９】
「抗体」とは、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本鎖及び／又はヒト化抗体並びにＦａｂフラグメント、例えばＦａｂ又は免疫グロブリン発現ライブラリー産物であると理解される。
【０１８０】
免疫特異的抗体は、本発明に従うポリペプチドによる動物の免疫化によって得ることができる。
【０１８１】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド、例えば上文で限定したもののための免疫特異的抗体に関する。
【０１８２】
本発明に従うポリペプチド、そのフラグメントの１つ、類似体、その変異体の１つ又はこのポリペプチドを発現している細胞も、免疫特異的抗体を産生するために使用され得る。
【０１８３】
用語「免疫特異的」とは、抗体が、当業界で知られている他のポリペプチドよりも本発明のポリペプチドに対してより良い親和性を有することを意味する。
【０１８４】
免疫特異的抗体は、本発明のポリペプチド、そのフラグメントの１つ、類似体又はエピトープフラグメント又はこのポリペプチドを発現している細胞を、哺乳類、好ましくはヒト以外に、当業者にとって周知な方法に従い投与することによって得ることができる。
【０１８５】
モノクローナル抗体の調製に関して、抗体産生のための典型的な方法、例えばハイブリドーマ技術（Kohler et al., Nature (1975) 256 : 495-497）、トリオーマ技術、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4 : 72）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung cancer", Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series) (eds. R.A. Reisfeld and S.Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96）が、細胞系から出発して使用され得る。
【０１８６】
一本鎖抗体の産生の技術、例えば米国特許第４，９４６，７７８号に記載のものも使用され得る。
【０１８７】
トランスジェニックな動物、例えばマウスも、ヒト化抗体を産生するのに使用され得る。
【０１８８】
本発明のポリペプチドと相互作用する物質
本発明はまた、試験される１又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドの活性を活性化し、又は阻害する物質を同定するための方法であって、
ａ）少なくとも１つのコードＳＮＰを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
ｂ）前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
ｃ）前記ポリペプチドの活性に対する活性又は阻害作用を決定し、それにより前記活性又は阻害物質を同定すること、
を含んで成る方法をその目的とする。
【０１８９】
本発明に従うポリペプチドはまた、それと相互作用する化合物をスクリーニングするために適用され得る。
【０１９０】
これらの化合物は、本発明に従うポリペプチドの固有の活性を活性化する物質（アゴニスト）又は阻害する物質（アンタゴニスト）であってもよい。これらの化合物はまた、本発明のポリペプチドのリガンド又は基質であってもよい。Coliganet al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Chapter 5 (1991) を参照のこと。
【０１９１】
通常、その様な方法を実行するために、最初に本発明に従うポリペプチドを発現する適切な宿主細胞を生成することが望ましい。その様な細胞は、例えば哺乳類、酵母、昆虫、例えばショウジョウバエ又は細菌、例えばＥ．コリの細胞であってもよい。
【０１９２】
これらの細胞又はこれらの細胞の膜抽出物が、続いて試験され得る化合物の存在下に据えられる。
【０１９３】
本発明のポリペプチドとの、試験される化合物の結合能、並びに機能的応答の阻害又は活性化が続いて観察され得る。
【０１９４】
上述の方法の段階ｃ）は、直接又は間接的に標識された、試験される物質を用いることによって実行され得る。それはまた、標識又は非標識物質及び標識競合物質を用いることによる競合試験を含むことがある。
【０１９５】
試験される物質が、検出されるシグナルに従い適切に選択された検出手段を用いることによって、本発明のポリペプチドを発現する細胞上で活性又は阻害シグナルを生じるか否かも決定され得る。
【０１９６】
その様な活性又は阻害物質はポリヌクレオチドであってもよく、そしてある場合にはオリゴヌクレオチド又はポリペプチド、例えばタンパク質又は抗体であってもよい。
【０１９７】
本発明はまた、試験される１又は複数の化合物の中から、本発明に従うポリペプチドによって増強され又は阻害される物質を同定するための方法であって：
ａ）少なくとも１つのコードＳＮＰを含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターを含んで成る宿主細胞を提供し、
ｂ）前記宿主細胞を試験される前記化合物と接触させ、
ｃ）前記物質の活性に対する増強又は阻害作用を決定し、それによって前記増強又は阻害作用物質を同定すること、を含んで成る方法をその目的とする。
【０１９８】
本発明のポリペプチドによって増強され、又は阻害される物質は、それぞれ、このポリペプチドの存在下での活性化又は阻害によって応答する物質である。
【０１９９】
本発明のポリペプチドによって直接又は間接的に活性化され又は阻害される物質は、例えば膜結合型又は核受容体、キナーゼ及び更に好ましくはチロシンキナーゼ、転写因子又はポリヌクレオチドから成ることもある。
【０２００】
疾患の検出
本発明はまた、対象者における、本発明に従うポリヌクレオチド及び／又は本発明に従うポリペプチドの生物学的特性を解析するための方法であって、以下の：
ａ）対象者のゲノムにおいて、本発明に従うポリヌクレオチドの有無を決定し、
ｂ）対象者における、本発明に従うポリヌクレオチドの発現レベルを決定し、
ｃ）対象者における、本発明に従うポリペプチドの有無を決定し、
ｄ）対象者における、本発明に従うポリペプチドの濃度を決定し、そして／あるいは
ｅ）対象者における、本発明に従うポリペプチドの機能性を決定すること、のうちの少なくとも１つを含んで成る方法をその目的とする。
【０２０１】
これらの生物学的特性は、対象者において、又は対象者由来の試料において解析され得る。
【０２０２】
これらの生物学的特性は、遺伝子診断を実施し、そして対象者が本発明に従うポリヌクレオチド及び／又は本発明に従うポリペプチドの存在と関連している疾患、軽い疾病又は障害の発生に対して影響を受けているか、又は影響を受ける危険性があるか、又は反対に、それに対する部分的な耐性があるか否かを決定することを可能にし得る。
【０２０３】
これらの疾患は、障害及び／又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【０２０４】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【０２０５】
前記感染病は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【０２０６】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【０２０７】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【０２０８】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【０２０９】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【０２１０】
この方法はまた、対象者において、本発明に従うＳＮＰによってコードされる変異対立遺伝子の存在と関連している疾患又は疾患に対する抵抗性の遺伝子診断を可能にする。
【０２１１】
好ましくは、段階ａ）において、既に限定した様な、少なくとも１つのコードＳＮＰを含むポリヌクレオチドの有無が検出され得る。
【０２１２】
ポリヌクレオチドの検出は、研究され得る対象者由来の生物学的試料、例えば細胞、血液、尿、唾液から出発して、あるいは研究され得る対象者の生検又は部検から出発して実施され得る。ゲノムＤＮＡは、例えば直接的に又はＰＣＲ増幅後に使用され得る。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも同様に使用され得る。
【０２１３】
この結果、本発明に従うポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、対象者のゲノムにおいて検出されるヌクレオチド配列と比較することが可能となる。
【０２１４】
ヌクレオチド配列の比較は、配列決定によって、ＤＮＡハイブリダイゼーション法によって、変性剤を用いる、又は用いない、電気泳動ゲノム上でのＤＮＡフラグメントの移動度の差異によって、あるいは融解温度の差異によって実施され得る。Myers et al., Science (1985) 230 : 1242 を参照のこと。ヌクレオチド配列の構造における正確な位置でのその様な修飾も、ヌクレアーゼ保護試験によって、例えばリボヌクレアーゼ及びＳ１ヌクレアーゼによって、又は更に化学開裂剤によって解明されることがある。Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85 : 4397-4401 を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドフラグメントを含んで成るオリゴヌクレオチドプローブはまた、スクリーニングを行うのにも使用され得る。
【０２１５】
当業者にとって周知の多くの方法が、本発明のポリヌクレオチドの発現を決定し、そしてこのポリヌクレオチドの遺伝的変異性を同定するために使用され得る（Chee et al., Science (1996), vol.274, pp610-613 を参照のこと。）
【０２１６】
段階ｂ）において、ポリヌクレオチドの発現レベルは、当業者にとって周知な方法に従い、このポリヌクレオチドによってコードされる（そしてポリペプチドをコードする）ＲＮＡのレベルを定量することによって、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロット、及び他のハイブリダイゼーション法によって、測定され得る。
【０２１７】
段階ｃ）及びｄ）において、対象者又は対象者由来の試料における、本発明に従うポリペプチドの有無及び濃度が、周知の方法、例えば免疫放射アッセイ、競合的結合試験、ウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ試験によって実施され得る。
【０２１８】
段階ｄ）に続いて、本発明に従うポリペプチドの決定された濃度は、対象者において通常見出される天然野生型タンパク質の濃度と比較され得る。
【０２１９】
当業者は、上文の様に起こる疾患、軽い疾病又は障害に対する感受性又は、反対に抵抗性が現れる、しきい値の上限又は下限を、従来技術の刊行物又は常用の試験若しくはアッセイ、例えば既に言及されているものの助けを借りて同定することができる。
【０２２０】
段階ｅ）において、本発明に従うポリペプチドの機能の決定は、当業者にとって周知な方法によって、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験、例えば上文で言及したものによって、又は前記ポリペプチドを発現する宿主細胞の使用によって実施され得る。
【０２２１】
本発明はまた、１又は複数の：本発明に従う、単離されたポリヌクレオチド；上文で限定した組換えベクター；上文で限定した宿主細胞；本発明に従うポリペプチド；上文で限定した抗体、を含んで成る診断キットをその目的とする。
【０２２２】
薬物及び疾患の処置
本発明は、活性物質の目的で、本発明に従うポリペプチドを含む治療化合物をその目的とする。
【０２２３】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び／又は疾患の予防又は処置のための治療用化合物の製造のための、本発明に従うポリペプチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び／又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【０２２４】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【０２２５】
前記感染病は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【０２２６】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【０２２７】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【０２２８】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【０２２９】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【０２３０】
好ましくは、本発明に従うポリペプチドはまた、異なるヒトの障害及び／又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性Ｂ型及びＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする治療化合物の製造に使用されうる。
【０２３１】
本発明に従うポリペプチドを得ることを可能にする化合物及びこのポリペプチドによって得られ、又はこれから同定される化合物のいくつかは、同様にヒトの身体の治療的処置のために、すなわち治療化合物として使用され得る。
【０２３２】
このことが、本発明が更に活性物質の目的で少なくとも１つの上文で限定したコードＳＮＰ、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び／又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドを含む薬物を目的とする理由である。
【０２３３】
本発明はまた、異なるヒトの障害及び／又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも１つの上文で限定したコードＳＮＰ、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び／又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用にも関する。これらの疾患は、障害及び／又はヒトの疾患、例えばガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、であってもよい。
【０２３４】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【０２３５】
前記感染病は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【０２３６】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【０２３７】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【０２３８】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【０２３９】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【０２４０】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び／又は疾患の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための、少なくとも１つの上文で限定したコードＳＮＰ、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び／又は上文で限定した抗体を含む、本発明に従うポリヌクレオチドの使用であって、異なるヒトの障害及び／又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性Ｂ型及びＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、の予防又は処置を目的とする薬物の製造のための使用に関する。
【０２４１】
活性物質として有用な、本発明のポリペプチド及び他の化合物の用量は、化合物の選択、治療の兆候、投与形態、製剤の性質、対象者の性質及び医師の判断に依存する。
【０２４２】
それを活性物質として使用する場合、本発明に従うポリペプチドは、通常１〜１００μｇ／対象者のkgに及ぶ用量で投与される。
【０２４３】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも１つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、少なくとも１つの上文で限定したＳＮＰを含む本発明に従うポリヌクレオチド、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び／又は上文で限定した抗体、並びに医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を目的とする。
【０２４４】
これらの医薬組成物において、前記活性物質は生理学的に有効な量で有利に存在する。
【０２４５】
これらの医薬組成物は、例えば固体又は液体であってもよく、そしてヒトの薬物において現在使用されている医薬形態で、例えば単純な又はコートされた錠剤、ゲルキャップ、顆粒、キャラメル、座剤並びに好ましくは注射用調製物及び注射用調製物のための粉末で存在していてもよい。これらの医薬の形態は有用な方法に従い調製され得る。
【０２４６】
前記活性物質は、医薬組成物において通常適用される賦形剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、デキストロース、グリセロール、エタノール、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性又は非水性担体、動物又は植物起源の脂肪物質、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、防腐剤に組み込まれることもある。
【０２４７】
本発明に従う活性物質は、単独で、又は他の化合物、例えば治療化合物、例えば他のインターフェロン−α若しくは他のサイトカイン、例えばインターロイキンと組み合わせて適用され得る。
【０２４８】
前記医薬組成物の異なる製剤は、投与の形態に従い適合される。
【０２４９】
前記医薬組成物は、当業者にとって既知の異なる投与経路によって投与され得る。
【０２５０】
本発明はまた、個体における、ガン及び腫瘍、感染病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法の処置に関連する障害、から成る群から選択される疾患を予防し、又は処置する方法であって、前記個体に対し、治療として有効な量の上文で限定した物質、及び医薬として許容される賦形剤を投与することを含んで成る方法、に関する。
【０２５１】
本発明はまた、活性物質として、少なくとも１つの上記化合物、例えば本発明に従うポリペプチド、本発明に従うポリヌクレオチドの全部又は一部、上文で限定した組換えベクター、上文で限定した宿主細胞、及び／又は上文で限定した抗体、並びに適当な医薬として許容される賦形剤を含む診断組成物を目的とする。
【０２５２】
この診断組成物は、例えば適当な賦形剤、例えば診断組成物において一般に使用されているもの、例えば緩衝液及び防腐剤を含むことがある。
【０２５３】
本発明はまた：
ａ）治療として有効な量の本発明に従うポリペプチド、及び／又は
ｂ）本発明に従うポリヌクレオチド、及び／又は
ｃ）上文で限定した、処置される対象者由来の宿主細胞、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を増大せしめることを目的とする治療用化合物を調製するための使用を目的とする。
【０２５４】
この様に、本発明のポリペプチドの発現又は活性の増大を必要とする対象者を処置するために、複数の方法が可能である。
【０２５５】
前記対象者に、治療として有効な量の本発明に従うポリペプチドを、医薬として許容される賦形剤と一緒に投与することは可能である。
【０２５６】
同様に、前記対象者に対する、本発明に従うポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を増大せしめることが可能である。例えば、そのポリヌクレオチドはレトロウイルス発現ベクター内に挿入され得る。その様なベクターは、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラスミドベクターに感染した細胞から出発して、形質導入された細胞が注目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する様な方法で単離され得る。Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996)を参照のこと。
【０２５７】
本発明に従い、少なくとも１つのコードＳＮＰ、例えば上文で限定したものを含むポリヌクレオチドが好ましくは使用される。
【０２５８】
更に、対象者に対して、その者に属する宿主細胞であって、あらかじめ採取され、そして既に記載した様に本発明のポリペプチドを発現する様に修飾された宿主細胞を投与することが可能である。
【０２５９】
本発明はまた：
ａ）治療として有効な量の、上文で限定した免疫特異的抗体、及び／又は
ｂ）本発明に従うポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にするポリヌクレオチド、
の使用であって、対象者における、本発明に従うポリペプチドの発現又は活性を低下せしめることを目的とする薬物の調製のための使用に関する。
【０２６０】
この様に、前記対象者に対して、治療として有効な量の阻害剤及び／又は抗体、例えば上文で限定したものを、好ましくは医薬として許容される賦形剤と組み合わせて投与することが可能である。
【０２６１】
また、前記対象者に対して、本発明のポリヌクレオチドの発現の阻害を可能にする、本発明に従う相補的なポリヌクレオチドの投与によって、本発明のポリペプチドの内因性の産生を減少させることも可能である。
【０２６２】
好ましくは、少なくとも１つのコードＳＮＰ、例えば上文で限定したものを含む相補的なポリヌクレオチドが使用され得る。
【０２６３】
本発明はまた、対象者において、本発明に従うポリペプチドの活性を増大又は低下させるための方法であって、治療的に有効な量の：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを含んで成るヌクレオチド配列である配列番号１、又は前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞であって、処置される前記対象者から得られうる宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，及びＫ１８２Ｑから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体；及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【０２６４】
本発明はまた、ヌクレオチド配列である配列番号１であって、但し、以下のＳＮＰ：a５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cのうちの１つを含んで成るヌクレオチド配列と、少なくとも９５％の同一性（好ましくは９７％の同一性、更に好ましくは９９％の同一性及び特に１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列の、個体のゲノムにおける存在と関連しているＩＦＮα−７変異体によって生じる障害又は疾患を有する前記患者の予防又は処置のための薬物の調製のためのＩＦＮα−７タンパク質の使用に関する。
【０２６５】
好ましくは、前記薬物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患の予防又は処置のために使用される。
【０２６６】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【０２６７】
前記感染病は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【０２６８】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【０２６９】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【０２７０】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【０２７１】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【０２７２】
本発明はまた、個体において、本発明に従うポリヌクレオチドの前記個体のゲノムの存在に関連する障害又は疾患を予防又は処置するための方法であって、治療的に有効な量の１又は複数の：ヌクレオチド配列である配列番号１の全部又は一部を含んで成り、且つa５５９c，g５８０a，c６６７t，c６８２t，t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１２５a，g１１３５t，g１１６１ａ，t１１６６c，g１１８１a，a１２１２g，及びa１２９４cから成る群から選択される少なくとも１つのＳＮＰを有する、単離されたポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の全部又は一部を含んで成る、単離されたポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター；前記組換えベクターを含んで成る宿主細胞；アミノ酸配列である配列番号２の全部又は一部を含んで成り、且つＶ１０Ａ，Ｄ９５Ｎ，Ｌ１１２Ｉ，Ｖ１２９Ｌ，Ｆ１３９Ｓ，Ｒ１４４Ｋ，及びＫ１８２Ｑから成る群から選択される少なくとも１つのコードＳＮＰを有する、単離されたポリペプチド；前記ポリペプチドに特異的な抗体；及び医薬として許容される賦形剤、を投与することを含んで成る方法に関する。
【０２７３】
本発明のＳＮＰ Ｄ９５Ｎを含んで成るＩＦＮα−７ポリペプチドのミメティック化合物
本発明はまた、
ａ）アミノ酸配列である配列番号２、又は
ｂ）アミノ酸配列である配列番号２の２４〜１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列、
のポリペプチドであって、但し、ａ）及びｂ）の前記アミノ酸配列がＳＮＰ Ｄ９５Ｎを含んで成るポリペプチド、と実質的に同程度の生物活性を有する新規化合物に関する。
【０２７４】
前記生物活性は、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、ＴＦ−１細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を測定することによって評価されうる。
【０２７５】
実験の項目で言及するように、Ｄ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７は、
−樹状細胞の成熟を刺激するのが弱い能力
−ＳＥＢ抗原によってあらかじめ活性化された、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球によってサイトカインの放出（ＩＦＮガンマ及びＩＬ−１０）を刺激するのが高い能力
−Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を阻害する能力
−ＴＦ−１細胞に対する弱い抗増殖活性
−ＶＳＶに感染した細胞培養液中でのin vivoでの高い抗ウイルス活性
−ＥＭＣＶに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性
−ＦＣＬ接種マウスにおける抗腫瘍活性、
を示す。
【０２７６】
また、実験の項目において言及するように、野生型のＩＦＮα−２と比較して、Ｄ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７タンパク質は：
−シグナル伝達を同程度活性化する能力
−樹状細胞の成熟を刺激することがより低い能力
−ＳＥＢ抗原によってあらかじめ活性化された、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球によってＩＦＮガンマの放出を刺激することがより高い能力
−単球によってＩＬ−１０及びＴＮＦ−αを刺激することがより高い能力
−ＴＦ−１細胞に対する同程度の抗増殖活性
−ＶＳＶに感染した細胞培養液中でのin vitroでのより低い抗ウイルス活性
−ＥＭＣＶに感染したマウスにおけるin vivoでのより高い抗ウイルス活性
−ＦＣＬ接種マウスにおける若干低い抗腫瘍活性、
を有する。
【０２７７】
また、実験の項目において言及するように、野生型のＩＦＮα−７と比較して、Ｄ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７タンパク質は：
−シグナル伝達を活性化する同程度の能力
−Ｄａｕｄｉ細胞の成熟を刺激することが若干高い能力
を有する。
【０２７８】
上文で限定したような本発明の新規化合物は、Ｄ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７のものと実質的に同程度の生物活性を有することがある。
【０２７９】
前記化合物はまた、Ｔリンパ球によるＩＦＮ−ガンマの放出、単球によるＩＬ−１０及びＴＮＦ−αの放出、ＥＭＣＶに感染したマウスにおけるin vivoでの抗ウイルス活性、及び／又はＦＬＣ接種マウスにおける抗腫瘍活性のような生物活性を有することがあり、これらはＤ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７のものよりもはるかに高い。
【０２８０】
前記化合物はまた、樹状細胞の成熟のような生物活性を有することがあり、これはＤ９５Ｎ突然変異ＩＦＮα−７のものよりもはるかに低い。
【０２８１】
前記化合物は、例えばポリペプチド又はペプチドのような生化学的化合物、又は、例えば合成ペプチドミメティックのような有機化学的化合物、であってもよい。
【０２８２】
本発明はまた、上文で定義した様な化合物の同定のための、Ｄ９５Ｎ ＳＮＰを含む本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０２８３】
本発明は、本発明の化合物の同定のための方法であって、以下の段階：
ａ）試験される化合物の生物活性、例えば、下文の実験の項目に記載のように、シグナル伝達、樹状細胞の成熟、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出、単球によるサイトカイン放出、in vitro又はin vivoでの抗ウイルス活性、悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおける抗腫瘍活性、Daudi Burkitt's細胞系に対する細胞性の抗増殖活性、本発明に従うポリペプチドのＴＦ−１細胞系に対する細胞性の抗増殖活性を決定し；
ｂ）i）試験される化合物の、段階ａ）で決定した活性と、
ii）アミノ酸配列である配列番号２のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号２の２４から１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がＤ９５Ｎ ＳＮＰを含んで成るものの活性、
とを比較し；そして
ｃ）段階ｂ）で実施した比較に基づき、試験される化合物が、アミノ酸配列である配列番号２のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号２の２４から１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、前記アミノ酸配列がＤ９５Ｎ ＳＮＰを含んで成るポリペプチドと比較して実質的に類似又はそれより低い活性を有するか否かを決定すること、を含んで成る方法に関する。
【０２８４】
好ましくは、試験される化合物は、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリー、高処理量スクリーニングから既に同定されていることがあり、又はコンピューターを使ったドラッグデザインによって設計された結果、アミノ酸配列である配列番号２のポリペプチド、又はアミノ酸配列である配列番号２の２４から１８９位の間に含まれるアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列のポリペプチド、であって、但し、アミノ酸配列がＤ９５Ｎ ＳＮＰを含んで成るポリペプチドと同一の三次元構造及び／又は化学作用を有することがある。
【０２８５】
化合物を同定し、そして設計するための方法は、当業者に周知である。
【０２８６】
これらの方法を引用している刊行物は、例えば：
- Silverman R.B. (1992).“Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action”. Academic Press, 1st edition (January 15, 1992).
- Anderson S and Chiplin J. (2002).“Structural genomics ; shaping the future of drug design? Drug Discov. Today. 7 (2) : 105-107.
- Selick HE, Beresford AP, Tarbit MH. (2002).“The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery”. Drug Discov. Today.7 (2) : 109-116.
- Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001).“Drug design bymachine learning : support vector machines for pharmaceutical data analysis”. Comput. Chem. 26 (1) : 5-14.
- Kauvar L.M. (1996).“Peptide mimetic drugs : a comment on progressand prospects”14 (6) : 709、であってもよい。
【０２８７】
本発明の化合物は、ガン及び腫瘍、感染病、性病、免疫関連疾患及び／又は自己免疫疾患及び障害、心臓血管疾患、代謝病、中枢神経系の疾患、並びに化学療法に関連する障害、から成る群から選択される疾患のうちの１つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【０２８８】
前記ガン及び腫瘍は、転移型腎ガン、黒色腫を含んで成るガン腫、濾胞性リンパ腫及び皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を含んで成るリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病及び慢性骨髄性白血病を含んで成る白血病、肝臓、首、頭及び腎臓のガン、多発性骨髄腫、カルチノイド性腫瘍及び免疫欠損後に出現する腫瘍であってエイズの場合にはカポジ肉腫を含んで成るもの、を含む。
【０２８９】
前記感染病は、慢性Ｂ型及びＣ型肝炎並びにＨＩＶ／エイズを含んで成るウイルス感染、感染性肺炎、及び性病、例えば生殖器疣、を含む。
【０２９０】
前記免疫関連疾患及び自己免疫疾患は、組織又は器官の移植の拒絶、アレルギー、喘息、乾癬、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含むことがある。
【０２９１】
前記代謝病は、肥満のような非免疫関連疾患を含むことがある。
【０２９２】
前記の中枢神経系の疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症及びうつ病を含むことがある。
【０２９３】
前記疾患及び障害はまた、創傷治癒、透析患者の貧血、及び骨粗鬆症を含むことがある。
【０２９４】
好ましくは、本発明は、異なるヒトの障害及び／又は疾患、例えば、あるウイルス感染、例えば慢性Ｂ型及びＣ型肝炎、白血病、例えばヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、カルチノイド性腫瘍、悪性黒色腫、転移型腎ガン、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫欠損後に出現する腫瘍、例えばエイズの場合にはカポジ肉腫、並びに生殖器疣又は性病、から成る群から選択される疾患のうちの１つの予防又は処置を目的とする薬物の調製に使用されうる。
【実施例】
【０２９５】
実験の項目
実施例１：ｇ１０２３ａ，ｔ１１６６ｃ，ｇ１１８１a，又はａ１２９４ｃのＳＮＰを含むヌクレオチド配列のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質及び野生型参照遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のモデリング
最初の段階において、ＩＦＮα−７の三次元構造は、ソフトウェアＭｏｄｅｌｅｒ（MSI, San Diego, CA）を用いてＰＤＢデータベース（コード１ＩＴＦ）において利用可能な構造を有するヒトＩＦＮα−２のものから出発して構築した。
【０２９６】
続いて、成熟ポリペプチドフラグメントが、突然変異Ｄ７２Ｎ，Ｆ１１６Ｓ，Ｒ１２１Ｋ，Ｋ１５９Ｑを再現する様な方法で修飾される。
【０２９７】
１０００回の分子最小化段階が、プログラムＡＭＢＥＲ及びＤＩＳＣＯＶＥＲ（MSI：Molecular Simulations Inc. ）を用いることによってこの変異型フラグメントに対して行われた。
【０２９８】
次に、２回の分子力学計算の実行が同じプログラム及び同じ力場で行われた。
【０２９９】
それぞれの場合において、５０，０００回の段階が３００°Ｋで計算され、３００回の平衡段階によって終了した。
【０３００】
このモデリングの結果を図１、２、３及び４に表す。
【０３０１】
例２：個体群におけるt７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，又はa１２９４cのＳＮＰの遺伝子判定
ＳＮＰの遺伝子型判定は、生成物が偏光した蛍光を読み込むことによって検出される、ミニシークエンスの原理に基づいている。当該技術は蛍光ミニシークエンス（ＦＰ−ＴＤＩ技術又はFluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation）から成る。
【０３０２】
ミニシークエンスは、前記群の各個体のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅された生成物で行われる。ＰＣＲ生成物は、それが遺伝子型判定され得るＳＮＰを含む遺伝子領域を覆う様な方法で選択される。使用されなかったＰＣＲプライマー及び組み込まれなかったｄＮＴＰの排除後、ミニシークエンスは行われる。
【０３０３】
ミニシークエンスは、ポリメラーゼ酵素及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチドを用いることによって、ＳＮＰの部位のすぐ上流に配置されたポリヌクレオチドプライマーを伸長することから成る。この伸長過程から生じた生成物は、偏光した蛍光を読み込むことによって直接解析される。
【０３０４】
全てのこれらの段階、及び読み込みが同一のＰＣＲプレートにおいて行われる。
【０３０５】
この様に、遺伝子型判定は５つの段階：
１）ＰＣＲによる増幅
２）酵素消化によるＰＣＲ生成物の精製
３）オリゴヌクレオチドプライマーの伸長
４）偏光した蛍光の読み込み
５）読み込みの解釈
を必要とする。
【０３０６】
遺伝子型判定の段階１及び２は、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，又はa１２９４cのＳＮＰのそれぞれについては同一の条件で実施される。段階３、４及び５は、これらの多型のそれぞれに特異的である。
【０３０７】
１）ＩＦＮα−７遺伝子のヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は、民族的に異なる起源の２６８人の個体に由来するゲノムＤＮＡから出発して行われる。
【０３０８】
これらのゲノムＤＮＡは、米国のＣｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｆｉｔｕｅによって提供された。
【０３０９】
２６８人の個体は以下の様に分布される：
【表１】
2005500029.tif 000002
【０３１０】
これらの個体のそれぞれ１つに由来するゲノムＤＮＡが試料を構成する。
【０３１１】
全てのＳＮＰについて、ＰＣＲ増幅が以下のプライマー：
配列番号３：センスプライマー：ＴＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＴＡＧＣＣ
配列番号４：アンチセンスプライマー：ＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣ
から出発して実施される。
【０３１２】
これらのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列である配列番号１の、ヌクレオチド７１１からヌクレオチド１３７９の、６６９個のヌクレオチドを有するフラグメントの増幅を可能にする。
【０３１３】
それぞれのＳＮＰについて、ＰＣＲ生成物はミニシークエンスのための鋳型を果たすであろう。
【０３１４】
当該ＰＣＲ反応の合計の反応液量は各試料当たり５μｌである。
【０３１５】
この反応液量は、以下の表に示す試薬から構成される：
【表２】
2005500029.tif 000003
【０３１６】
これらの試薬は、ＡＢＧｅｎｅによって供給される、３８４個のウェルを有するブラックＰＣＲプレート（参照：ＴＦ−０３８４−Ｋ）に配分される。当該プレートはシーリングされ、遠心され、続いて３８４ウェルプレート用のサーモサイクラー（ＭＪ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｅｔｒａｄ）内に据えられ、そして以下のインキュベーションを受ける：ＰＣＲサイクル：９４℃で１分、これに３段階（９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、６８℃で１分）から成る３６サイクルが続く。
【０３１７】
２）ＰＣＲ増幅生成物は、続いて２つの酵素：シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及びエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を用いて精製される。これらの最初の酵素は、ＰＣＲ増幅の間に組み込まれなかったｄＮＴＰの脱リン酸化を可能にし、一方、２番目のものは一本鎖ＤＮＡ残基、特にＰＣＲの間に使用されなかったプライマーを除去する。
【０３１８】
この消化は、ＰＣＲプレートの各ウェルにおける、試料当たり５μｌの反応混合物の添加によって行われる。この反応混合物は以下の試薬から構成される：
【表３】
2005500029.tif 000004
【０３１９】
充填したら、プレートをシーリングし、遠心し、続いて３８４ウェルプレート用のサーモサイクラー（ＭＪ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｅｔｒａｄ）内に据え、そして以下のインキュベーションを受ける：ＳＡＰ−ＥＸＯ消化：３７℃で４５分、８０℃で１５分。
【０３２０】
続いて、伸長又はミニシークエンス段階が、調製した試料当たり５μｌの反応混合物の添加によって消化されたＰＣＲ生成物で行われる。
【０３２１】
ミニシークエンス３）及び読み込み段階４）及び読み込みの解釈５）は、t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２９４cに特異的である。
【０３２２】
全てのこれらの段階は、これらの多型のうちのそれぞれ１つに使用される具体的な条件をまとめて後文に記載する。
【０３２３】
３）ミニシークエンス
遺伝子型判定に必要な２つのミニシークエンスプライマーの配列は、本発明に従うＳＮＰの部位の上流に位置するヌクレオチドの配列に相当する方法で判定した。ＳＮＰを含むＰＣＲ生成物が二本鎖ＤＮＡ生成物であるので、遺伝子型判定はセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかで行われ得る。選択したプライマーはLifeTechnologies Inc.によって製造される。
【０３２４】
次の表は、各ＳＮＰについての、試験したミニシークエンスプライマーの配列及び遺伝子型判定のために保持される最適条件を示す。
【表４】
2005500029.tif 000005
【０３２５】
ＳＮＰのミニシークエンスは、最初に１６個の試料全てで確認され、続いて２６８人の個体及び１０人のコントロールから構成される個体群の集合全てを遺伝子型判定した。
【０３２６】
次に、伸長又はミニシークエンス段階が次の表に示す様に行われる。
【表５】
2005500029.tif 000006
1 ５×伸長緩衝液は、２５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH９，２５０mM ＫＣｌ，２５mM ＮａＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ2 及び４０％グリセロールから構成される。
2 ｄｄＮＴＰに関して、４塩基の混合物が研究される多型に従い実施される。ＳＮＰを構成する注目の２塩基（野生型ヌクレオチド／変異型ヌクレオチド）のみが、例えばＴａｍｒａ又はＲ１１０のいずれかで標識される。例えば、ＳＮＰ ｇ１０３３ａの場合、ｄｄＮＴＰの混合物は
−２．５μＭの非標識ｄｄＡＴＰ、
−２．５μＭの非標識ｄｄＧＴＰ、
−２．５μＭのｄｄＴＴＰ（１．８７５μＭの非標識ｄｄＴＴＰ及び０．６２５μＭのＴａｍｒａ標識型ｄｄＴＴＰ）、
−２．５μＭのｄｄＣＴＰ（１．８７５μＭの非標識ｄｄＣＴＰ及び０．６２５μＭのＲ１１０標識ｄｄＣＴＰ）、
から構成される。
【０３２７】
充填したら、プレートはシーリングされ、遠心され、続いて３８４ウェルプレート用のサーモサイクラー（ＭＪ ＲｅｓｅａｒｃｈのＴｅｔｒａｄ）に据えられ、そして次のインキュベーションを受ける：伸長サイクル：９３℃で１分、これに２段階（９３℃で１０秒、５５℃で３０秒）から構成される３５サイクルを続ける。
【０３２８】
サーモサイクラーにおける最後の段階の後、LJL Biosystems Inc. のＡｒａｌｙｓｔ（商標）型の、偏光型蛍光リーダー上にプレートを直接据える。プレートは、２つの方法を用いるＣｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｈｏｓｔ（商標）のソフトウェアを使用して読み込む。最初のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、Ｔａｍｒａ標識型塩基の読み込みを可能にし（発光５５０〜１０nm、励起５８０〜１０nm）、そして２番目のものは、このフルオロフォアに特異的な発光及び励起フィルターを用いることによって、Ｒ１１０標識型塩基の読み込みを可能にする（発光４９０〜１０nm、励起５２０〜１０nm）。両者の場合において、二色性二重ミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｒｒｏｒ）（Ｒ１１０／Ｔａｍｒａ）が使用され、そして他の読み込みパラメーターは：
Ｚの高さ：１．５mm
アテニュエーター：アウト
インテグレーションタイム：１００，０００マイクロ秒
生データユニット：カウント／秒
スイッチ偏光：ウェルごと
プレート設定時間：０ミリ秒
ＰＭＴ設定：Ｓｍａｒｔ Ｒｅａｄ（＋）、感度２
動的偏光子：発光静的偏光子：Ｓ
である。
【０３２９】
ファイルの結果は、この様にＴａｍｒａフィルターの場合のｍＰ（ミリ偏光）の計算値及びＲ１１０フィルターの場合のものを含めて得られる。これらのｍＰ値は、以下の式に従い、平行な面（//）及び垂直な面（⊥）に対して得られる強度から出発して計算される：ＭＰ＝１０００（//−ｇ⊥）／（//＋ｇ⊥）
【０３３０】
この計算において、値⊥は係数ｇによって加重される。それは実験的にあらかじめ決定されなければならない機械の係数である。
【０３３１】
４）及び５）読み込みの解釈及び遺伝子型の決定
ｍＰ値は、Microsoft Inc.のExcel、及び／又はLJL Biosystems Inc.によって開発されたＡｌｌｅｌｅ Ｃａｌｌｅｒ（商標）を用いてグラフ上に記された。
【０３３２】
横軸上にはＴａｍｒａ標識型塩基のｍＰ値を示し、縦軸上にはＲ１１０標識型塩基のｍＰ値を示す。強力なｍＰ値は、このフルオロフォアで標識した塩基が組み込まれたことを示し、そして反対に弱いｍＰ値は、この塩基の不在を明らかにしている。
【０３３３】
異なる遺伝子型を有するヌクレオチド配列の、最大３つの同種の群が得られる。
【０３３４】
Ａｌｌｅｌｅ Ｃａｌｌｅｒ（商標）のソフトウェアの使用は、一度異なる群の同定が行われると、表の書式において各個体について定義されている遺伝子型の直接的な抽出を可能にする。
【０３３５】
ＳＮＰ ｇ１０３３ａの場合、例えば、アンチセンスで読まれる対立遺伝子ｃは、センスで読まれる対立遺伝子ｇに相当し、そして未成熟ＩＦＮα−７タンパク質配列の９５位にあるアスパラギン酸（Ｄ）の存在に関連していること、そしてそれ故に、アンチセンスで読まれる対立遺伝子ｔが、センスで読まれる対立遺伝子ａに相当し、相当するタンパク質の配列のこの位置につきアスパラギン（Ｎ）に相当することを述べる必要がある。
【０３３６】
ＳＮＰ t７７９c，g１０３３a，c１０８４a，g１１３５t，t１１６６c，g１１８１a，及びa１２９４cのミニシークエンスの結果
遺伝子型判定の過程の完了後、本明細書で研究したＳＮＰについての、個体群のうちの個体の遺伝子型の決定は、上述したグラフを用いて行われる。
【０３３７】
ＳＮＰ ｔ７７９ｃの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体ＴＴ、又はヘテロ接合体ＴＣ、又はホモ接合体ＣＣのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＣＣは個体群において検出されていない。
【０３３８】
ＳＮＰ g１０３３aの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体ＧＧ、又はヘテロ接合体ＧＡ、又はホモ接合体ＡＡのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＡＡは個体群において検出されていない。
【０３３９】
ＳＮＰ ｇ１１３５ｔの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体ＧＧ、又はヘテロ接合体ＧＴ、又はホモ接合体ＴＴのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＴＴは個体群において検出されていない。
【０３４０】
ＳＮＰ ｃ１０８４ａの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体ＣＣ、又はヘテロ接合体ＣＡ、又はホモ接合体ＡＡのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＡＡは個体群において検出されていない。
【０３４１】
ＳＮＰ ｔ１１６６ｃの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体ＴＴ、又はヘテロ接合体ＴＣ、又はホモ接合体ＣＣのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＣＣは個体群において検出されていない。
【０３４２】
ＳＮＰ ｇ１１８１ａの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体において、ホモ接合体ＧＧ、又はヘテロ接合体ＧＡ、又はホモ接合体ＡＡのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＡＡは個体群において検出されていない。
【０３４３】
ＳＮＰ ａ１２９４ｃの場合、遺伝子型は、理論的には試験した個体においてホモ接合体ＡＡ、又はヘテロ接合体ＡＣ、又はホモ接合体ＣＣのいずれかである。実際には、以下に示す様に、ホモ接合体の遺伝子型ＣＣは個体群において検出されていない。
【０３４４】
個体群において決定された遺伝子型の分布及び研究した７個のＳＮＰに関する異なる対立遺伝子頻度の計算の結果を次の表に提示する：
【表６】
2005500029.tif 000007
【表７】
2005500029.tif 000008
【表８】
2005500029.tif 000009
【０３４５】
上記の表において、
−Ｎは個体数を表し、
−％は特異的な亜集団における個体のパーセンテージを表し、
−対立遺伝子頻度は、特異的な亜集団における変異した対立遺伝子のパーセンテージを表し、
−９５％ＩＣは、９５％における信頼性の最小値と最大値の間隔を表す。
【０３４６】
系統群、及びＳＮＰによるこれらの結果を調べることによって、次のことが観察される：
−ＳＮＰ ｔ７７９ｃの場合、２人のヘテロ接合体の個体ＴＣが、非ヨーロッパ系コーカソイドの亜集団出身である。
− ＳＮＰ ｇ１０３３ａの場合、４人のヘテロ接合体の個体ＧＡが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− ＳＮＰ ｃ１０８４ａの場合、２人ヘテロ接合体の個体ＣＡが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
− ＳＮＰ ｇ１１３５ｔの場合、５人のヘテロ接合体の個体ＧＴが、アフリカ系アメリカ人、カリブ人、及びメキシコ人の亜集団出身である。
− ＳＮＰ ｔ１１６６ｃの場合、５人のヘテロ接合体の個体ＴＣが、カリブ人、ヨーロッパ系のコーカソイド、及び東南アジア人の亜集団出身である。
− ＳＮＰ ｇ１１８１ａの場合、唯一のヘテロ接合体の個体ＧＡが、東南アジア人の亜集団出身である。
− ＳＮＰ ａ１２９４ｃの場合、２人のヘテロ接合体の個体ＡＣが、アフリカ系アメリカ人の亜集団出身である。
【０３４７】
例３：酵母における天然野生型ＩＦＮα−７及び変異型ＩＦＮα−７のタンパク質の発現ａ）真核生物発現ベクターpPicZα-topoにおける天然野生型ＩＦＮα−７及び変異型ＩＦＮα−７のクローニング
天然野生型ＩＦＮα−７、Ｄ２７Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、Ｖ１０６Ｌ突然変異型ＩＦＮα−７、Ｋ１５９Ｑ突然変異型ＩＦＮα−７の成熟部分をコードするヌクレオチド配列は、前記ＳＮＰのうちの１つについてヘテロ接合体である個体由来のゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲによって増幅される。
【０３４８】
その様な増幅を可能にするＰＣＲプライマーは：
配列番号１９：センスプライマー：ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣ
配列番号２０：アンチセンスプライマー：ＴＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴ
である。
【０３４９】
ＰＣＲ生成物は、メタノールによって誘導可能なハイブリッドプロモーターＡＯＸ１の支配下にある真核生物発現ベクターpPicZα-topo（ＴＯＰＯ（商標）−クローニング；Invitrogen Corp.）内に挿入される。
【０３５０】
このベクターは、酵母ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における真核生物タンパク質の異種発現を可能にする。
【０３５１】
組換えタンパク質をコードするベクターの領域のヌクレオチド配列を調べた後、ベクターはＰｍｅ１の制限酵素によって直線化され、そしてＰ．パストリスの酵母株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がこれらの組換え発現ベクターを用いて形質転換される。
ｂ）天然野生型ＩＦＮα−７及び突然変異型ＩＦＮα−７のＰ．パストリスにおける異種発現及び精製
天然野生型ＩＦＮα−７をコードするクローン、又はＤ２７Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、Ｖ１０６Ｌ突然変異型ＩＦＮα−７、又はＫ１５９Ｑ突然変異型ＩＦＮα−７をコードするクローンを含む５０ｍＬのＢＭＧＹ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、１．３４％ＹＮＢ，１％グリセロール、１００ｍＭリン酸カリウム、０．４ｍｇ／Ｌビオチン、ｐＨ６．０）の２つの飽和前培養が、２００回転／分（rpm ）の振盪で、３０℃で２４〜４８時間行われた。
【０３５２】
培養が細胞密度に達した場合（６００nmの波長で測定すると、１２の光学密度に相当する）、それは、５０ＯＤ／ｍＬで、２５０ｍＬのＢＭＭＹ培地（２％ペプトン、１％酵母抽出物、１．３４％ＹＮＢ，０．５％メタノール、１００ｍＭリン酸カリウム、０．４ｍｇ／Ｌビオチン、ｐＨ６．０）を接種するために使用される。
【０３５３】
タンパク質の発現は、続いて、１８０ｒｐｍでの培養フラスコの振とうで、３０℃で２４時間、１％の終濃度のメタノールによって誘導される。
【０３５４】
コード配列の上流にある、「アルファ因子」のシグナルペプチド配列の存在により、とは培養液中で酵母によって分泌される。アルファ因子はプロセシングの間に自然に開裂する。
【０３５５】
懸濁液を遠心し、そしてタンパク質は、ＨＰＬＣによって、得られた上清から出発して精製される。
【０３５６】
予備的な開始段階において、限外ろ過（Ｌａｂｓｃａｌｅ，カットオフ値５０００Ｄａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、続いて透析は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ９．０，２５ｍＭＮａＣｌの緩衝液中の酵母の上清の１０倍の濃縮を可能にする。
【０３５７】
最初のクロマトグラフィー段階は、ブルーセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上での、親和性によるタンパク質の回収を可能にする。回収された画分中のタンパク質の存在は、一方ではＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動によって、他方ではＩＦＮα−７タンパク質に対して特異的な抗体による免疫検出によって証明される。この段階で、注目のタンパク質の純度は７５％超である。
【０３５８】
第二の精製段階において、ゲル濾過は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ９．０，２５ｍＭＮａＣｌに対するＩＦＮα−７に相当する回収画分の緩衝液の交換を可能にする。
【０３５９】
精製の最終段階は、イオン交換クロマトグラフィーカラム上でのタンパク質の分離から成る。組換えタンパク質を含む画分は、、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ９．０，２５ｍＭＮａＣｌの緩衝液中であらかじめ平衡化した陰イオン交換カラム（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６．０ｍＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入される。タンパク質の溶出は、５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ９の緩衝液中の、０．０２５〜１Ｍの間のグラジエントの通過によって行われる。あるいは、当該精製はブルーシバクロンを用いて実施されうる。
【０３６０】
注目のタンパク質の純度はＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で推定され、そしてタンパク質濃度はデンシトメトリー（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ，Ｂｉｏｒａｄ）及びＢＣＡアッセイ（ビシンコニン酸及び硫酸銅、Ｓｉｇｍａ）によって測定された。
【０３６１】
このプロトコールに従い得られた、精製された天然野生型ＩＦＮα−７、Ｄ２７Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、Ｖ１０６Ｌ突然変異型ＩＦＮα−７、Ｋ１５９Ｑ突然変異型ＩＦＮα−７のタンパク質は、最終的にはより大量のタンパク質を得るためにスケールアップされ、後述する機能的試験に使用される。
【０３６２】
実施例４：シグナル伝達を活性化する野生型及びＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の能力の評価
インターフェロンは、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）及びＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサー及び転写のアクチベーター）タンパク質が関与するシグナル伝達経路を介して作用することが知られている。インターフェロンの、その受容体への結合は、リン酸化によってＳＴＡＴタンパク質を次々に活性化するＪＡＫタンパク質のリン酸化を誘導する。活性化されたＳＴＡＴタンパク質は、それらが、各遺伝子の転写を刺激する、遺伝子プロモーター上のインターフェロン応答因子と結合する核に転移する。インターフェロンによって開始されるシグナル伝達経路を研究するために、レポーター遺伝子技術を使用した。方法は後述する。
【０３６３】
インターフェロン応答性のキメラプロモーターの支配下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションされたヒト細胞系の使用は、このin vitroでのアッセイのための基礎を提供する。したがって、検出されたルシフェラーゼ活性は、核のレベルでシグナルを誘導するＩＦＮの能力を反映する。
【０３６４】
このレポーター遺伝子アッセイを用いて、Ｄ２７Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、野生型ＩＦＮα−７、及び野生型ＩＦＮα−２によって示された用量応答曲線が解析され、そして、ＩＦＮαタンパク質１ｍｇあたりのＩｎｔｒｏｎＡ（インターフェロンアルファ２ｂに相当する市販品）を参照して、国際単位で結果が表される。
【０３６５】
このアッセイは以下の結果をもたらす：
−Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の場合５８１ＩＵ／ｍｇ
−野生型ＩＦＮα−７の場合４８９ＩＵ／ｍｇ
−野生型ＩＦＮα−２の場合６９８ＩＵ／ｍｇ。
【０３６６】
これらの結果は、シグナル伝達を活性化するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＮＦα−７の能力が、野生型ＩＦＮα−７のもの及び野生型ＩＦＮα−２のものとかなり類似していることを示す。
【０３６７】
実施例５：Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の免疫調節活性の評価
ＩＦＮのＩ型（ＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータ）は、免疫系のある機能を調節することができる。それらは、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を増大させること：ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）及びＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子の発現の増大、Ｔリンパ球、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ８３の同時刺激に関与する分子の発現の増大、及びＴリンパ球の機能の刺激の増大、が証明されている。
【０３６８】
ａ）樹状細胞の成熟に対するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の作用
Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の免疫調節活性は、樹状細胞の成熟に対して最初に研究され、そして市販のＩｎｔｒｏｎＡ製品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２のものと比較された。
【０３６９】
それらを実施するために、樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４サイトカインの存在下で培養された成人の末梢血単球から最初に生成された。ＣＤ１４＋細胞精製キットを用いての精製の後、これらの樹状細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、又は野生型ＩＦＮα−２の存在下に据えられ、そしてそれらの表現型が、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子並びにＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３及びＣＤ１ａマーカーの発現を探す目的で、ＦＡＣＳ解析によって決定された。これらの樹状細胞の突然変異状態も、コントロールを提供するためにＩＦＮα処理無しで刺激されていない樹状細胞を用いて得られたもの、及び樹状細胞の成熟を誘導することが知られている１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は２．５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを用いて得られたものと比較された。
【０３７０】
任意の単位で表した、各マーカー及び５つの実験条件についての蛍光強度の測定値の中央値を以下の表に表す：
【表９】
2005500029.tif 000010
この試験結果は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７が、樹状細胞を刺激することが弱い能力を有することを示す。特に、野生型ＩＦＮα−２と比較して、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質は、免疫抑制活性を示す。
【０３７１】
ｂ）Ｔリンパ球によるサイトカイン放出に対するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の作用
Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の免疫調節活性も、突然変異型ＩＦＮα−７の存在下に据えられ、且つ凝集に対する免疫応答を模倣するために強力な抗原（ＳＥＢ）を用いた、又は用いずに、Ｔリンパ球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つＩｎｔｒｏｎＡの市販品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下で実施された。
【０３７２】
それらを実施するために、末梢血単球（ＰＢＭＣ）が健康なドナーから単離され、そして、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はＳＥＢを含む適切な培地中で１６時間刺激された。各培地に４μｇ／ｍＬのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７又は野生型ＩＦＮα−２が添加された。刺激後、Ｔリンパ球は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ６９抗体を用いて細胞外から、そしてＴｈ１型サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ）又はＴｈ２型サイトカイン（ＩＬ１０）に対する特異的な抗体で細胞内から標識された。蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【０３７３】
得られた結果は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７及び野生型ＩＦＮα−２が、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−ガンマの放出を刺激せず、そして、それ故にＳＥＢの不在下でＴリンパ球を活性化しないことを示す。対照的に、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７及び野生型ＩＦＮα−２タンパク質は、以下の表に示すように、ＳＥＢ活性型Ｔリンパ球によるサイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＦＮ−ガンマ）の放出を刺激する。この表は、それぞれＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球についてのＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞又はＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞のパーセンテージとして表した、ＳＥＢの存在下でのＴリンパ球によるサイトカイン放出、及び全細胞に対するＣＤ６９＋細胞のパーセンテージを表す。
【表１０】
2005500029.tif 000011
【０３７４】
これらの結果は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７が、ＳＥＢ抗原によってあらかじめ活性化されたＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球によるサイトカイン放出（ＩＦＮガンマ及びＩＬ−１０）を刺激する高い能力を有することを示す。特に、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球によるインターフェロンガンマの賛成は、野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の存在下の方が高い。
【０３７５】
ｃ）単球によるサイトカイン放出に対するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の作用
最後に、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の免疫調節活性が、細菌の毒性物質（ＬＰＳ）の不在下又は存在下で、単球によるサイトカイン放出を測定することによって研究された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つＩｎｔｒｏｎＡの市販品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下で実施された。
【０３７６】
それらを実施するために、末梢血単球（ＰＢＭＣ）が健康なドナーから単離され、そしてそれらの表現型が、ＣＤ６４＋ＣＤ４dim細胞（ＣＤ６４＋ＣＤ４dimは血液の単球のマーカーである）の相対量を決定するために解析された。一晩の培養の後、これらのＰＢＭＣは培養液のみ（刺激されていない細胞）の中で、又はＬＰＳ（刺激された細胞）の存在下でインキュベートされた。各培養において、４μｇ／ｍＬのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７又は野生型ＩＦＮα−２が添加された。培養後、細胞は抗ＣＤ６４及び抗ＣＤ４dimを用いて細胞外から、そしてＴｈ１型サイトカイン（ＴＮＦアルファ）、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０に対して特異的な抗体を用いて細胞内から標識された。
【０３７７】
蛍光細胞は、FACScalibur及びCellQuestソフトウェアを用いて解析された。
【０３７８】
得られた結果は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７及び野生型ＩＦＮα−２が、ＬＰＳの存在下でサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−アルファ）の放出を刺激しないことを示す。
【０３７９】
対照的に、ＬＰＳの存在下で、単球はサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−α）を放出し、この放出は、以下の表に示すように、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質又は野生型ＩＦＮα−２の存在下で更に増大する。この表は、ＣＤ６４＋ＣＤ４dim細胞のパーセンテージとして表した、ＬＰＳの存在下での単球によるサイトカインの放出、及び全細胞に対するＣＤ６４＋ＣＤ４dim細胞のパーセンテージを表す。
【表１１】
2005500029.tif 000012
【０３８０】
これらの結果は、ＬＰＳの存在下、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質が、単球によるサイトカイン放出を刺激することができることを示す。特に、単球によるＩＬ−１０及びＴＮＦαの放出の刺激は、野生型ＩＦＮα−２の存在下よりもＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の存在下のほうが高い。
【０３８１】
実施例６：Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７のin vitroでの抗増殖活性の評価
ａ）Daudi Burkitt細胞系のヒトリンパ芽球に対するもの
これらの試験は、４つの異なるＩＦＮ α−７の型、すなわち野生型ＩＦＮα−７、Ｖ１０６Ｌ突然変異型ＩＦＮα−７、及びＫ１５９Ｑ突然変異型ＩＦＮα−７で実施される。前もってＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清及び２mMのＬ−グルタミンを添加したもの）中で培養された細胞（ヒトＤａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞系、以後「Ｄａｕｄｉ細胞」と称する）は、４×１０4 細胞／穴の細胞密度で９６穴プレート中に接腫される。
【０３８２】
各穴において、Ｄａｕｄｉ細胞は、天然野生型又は変異型ＩＦＮ α−２のいずれかの濃度の増大させつつ据えられる。野生型及び変異型ＩＦＮ α−２のいずれかの場合に、０．００３pM〜６００nMの終濃度が試験される。
【０３８３】
Ｄａｕｄｉ細胞は、続いて、Ｕｐｔｉｂｌｕｅ試薬（Ｕｐｔｉｍａ）を培養液に添加した後に、５％ＣＯ2 のもと、３７℃で６６時間培養される。細胞増殖の速度は、４時間の追加のインキュベーション期間の後に５９０ｎｍ（励起５６０ｎｍ）で放射された蛍光を測定することによって定量される。
【０３８４】
突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質又は野生型ＩＦＮα−７の抗増殖活性は、細胞増殖を５０％阻害するＩＦＮα−７の濃度に相当するＩＣ５０の測定に基づいている。
【０３８５】
少なくとも３つの実験が、３回繰り返して両タンパク質及び各濃度について実施された。
【０３８６】
試験したＩＦＮα−７のそれぞれについて測定される平均ＩＣ５０値、同様に野生型タンパク質で測定したＩＣ５０値以上の、突然変異タンパク質を用いて測定されたＩＣ５０値に相当する平均の比率を以下の表に表す。
【０３８７】
イオン交換クロマトグラフィーによって精製したタンパク質で得られた結果：
【表１２】
2005500029.tif 000013
【０３８８】
ブルーシバクロンを用いて精製したタンパク質で得られた結果：
【表１３】
2005500029.tif 000014
【０３８９】
この試験は、３つの突然変異したＩＦＮα−７タンパク質が、Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を阻害することを示す。更に、細胞の抗増殖活性は、Ｄ７２Ｎ変異型ＩＦＮα−７及びＫ１５９Ｑ突然変異型タンパク質の場合、野生型ＩＦＮ α−２と比較して若干増大する。
【０３９０】
ｂ）ＴＦ−１赤白血病細胞系に対するもの
Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の作用はまた、ＴＦ−１赤白血病細胞系に対しても評価された。この試験はまた、コントロールとして使用され、且つＩｎｔｒｏｎＡの市販品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２の存在下で実施された。
【０３９１】
それらを実施するために、ＴＦ−１細胞は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７又は野生型ＩＦＮα−２の濃度を増大させつつ静置し（０．００１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）、そして当該細胞の増殖を測定した。
【０３９２】
この実験は３回繰り返し、そして１つの代表的な実験結果を図５に表す。
【０３９３】
これらのデータは、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７がＴＦ−１細胞に対する弱い抗増殖作用を有することを示す。特に、ＴＦ−１赤白血球細胞に対するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗増殖作用は、野生型ＩＦＮα−２のものに類似している。
【０３９４】
実施例７：Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗ウイルス活性の評価
ＩＦＮは、抗ウイルス性の防御において重要な役割を果たしている。ＩＦＮの抗ウイルス活性は、ＩＦＮが誘導する酵素系に部分的に起因しており、例えば：
−アデノシンオリゴマー合成を触媒する、２’５’オリゴアデニル酸合成酵素。これらのオリゴマーは、一旦活性化したウイルスＲＮＡを破壊するエンドリボヌクレアーゼである、リボヌクレアーゼＬを活性化する。
−ウイルスの転写物の合成及び／又は成熟を阻害するＭｘタンパク質（ＧＴＰアーゼ）。この活性は主にインフルエンザウイルスに働く。
−二本鎖ＲＮＡによって活性化されるＰＫＲタンパク質。活性化されたＰＫＲはタンパク質合成を阻害する。
【０３９５】
ＩＦＮの抗ウイルス活性はまた、他の機構、例えばレトロウイルスの場合、ウイルス粒子の細胞内への侵入、複製、結合、粒子の出口及びウイルス粒子の感染力、の阻害によっても誘導される。
【０３９６】
最終的に、ＩＦＮは、免疫系のある機能を調節することによって、特に細胞の媒介に対する応答（特に、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の増大、ＩＬ−１２及びＩＦＮ−ガンマの産生の増大、ＣＴＬ活性の増大、を含む）を支持することによって、間接的な抗ウイルス活性を発揮する。
【０３９７】
Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗ウイルス活性は、in vitroでは細胞培養液中において、そしてin vivoではマウスモデルにおいて、その両方で評価されている。両試験は、コントロールとして使用され、且つＩｎｔｒｏｎＡの市販品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２と平行して実施された。
【０３９８】
ａ）in vitroでの細胞培養液における抗ウイルス活性
このアッセイは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いての細胞培養液中でのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗ウイルス活性の評価を可能にする。
【０３９９】
それを実施するために、ＷＩＳＨヒト表皮細胞が、濃度が低下するＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７、又は野生型ＩＦＮα−２の存在下で２４時間培養された。続いて、当該細胞は水泡性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)にさらに２４〜４８時間感染させられ、そして細胞溶解が測定された。
【０４００】
試験した異なるＩＦＮαの抗ウイルス活性は、ＶＳＶによって誘導される細胞溶解の５０％を阻害するＩＦＮα−７の量に相当する比活性（ＩＵ／μｇ）と比較することによって決定される。ＩＵ／μｇの単位は、ＩＦＮαタンパク質１μｇあたりＩｎｔｒｏｎＡ活性を言及する国際単位を表す。
【０４０１】
同様の実験が３回実施され、そして１つの代表的な実験で測定された比活性の値は以下の通りである：
−Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の場合：５３ＩＵ／μｇ
−野生型ＩＦＮα−２の場合：３３０ＩＵ／μｇ
【０４０２】
この実験結果は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質が、in vitroでの細胞培養液中で弱い抗ウイルス活性を有することを示す。特に、ＶＳＶに感染した細胞培養液中で、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７は、野生型ＩＦＮα−２よりも低い抗ウイルス活性を有する。
【０４０３】
ｂ）in vivoでのマウスモデルにおける抗ウイルス活性
このin vivoでの試験は、ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）マウスモデルにおいて実施される。
【０４０４】
ヒトＩＦＮは、同量のマウスＩＦＮによって示されるものよりも通常１００〜１，０００倍低い、マウスにおける用量依存性の抗ウイルス活性を示す(Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644)。
【０４０５】
脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を用いるマウスの腹腔内注射は、中枢神経系の関与及び脳炎を特徴とする、急速に進行する致死的疾患をもたらす(Finter NB (1973). Front Biol. 2:295-360)。マウス及びヒトインターフェロン−アルファは共に、致死的なＥＭＣＶの感染からマウスを守ることにおいて有効であることが示されている(Tovey and Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19:145-155)。
【０４０６】
２０匹の６週齢のスイスマウスの群が１００ｘＬＤ５０ＥＭＣＶに腹腔内から感染させられ、そして１時間後に、そしてそれから３日間１日１回、２μｇのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７又は野生型ＩＦＮα−２の調製物で処理された。コントロール群は、賦形剤のみで処理された動物で実施された。当該動物は、２１日間、生存について毎日観察された。
【０４０７】
結果が図６に提示され、そして、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７で処理されているマウスの相対的生存率が、未処理マウスの生存率よりもはるかに高いことを示し、このことは、in vivoのマウスモデルにおけるＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗ウイルス活性を証明している。更に、１４日後、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７で処理したマウスの４５％が生存し、一方、野生型ＩＦＮα−２で処理したマウスの３０％が生存している。したがって、in vivoのマウスモデルにおけるＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗ウイルス活性は、野生型ＩＦＮα−２で処理されているマウスについて観察されたものよりも高い。
【０４０８】
実施例８：悪性フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種したマウスにおけるＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗腫瘍活性の評価
ＩＦＮαは、ＩＦＮ感受性の親のフレンド赤白血病細胞と比べて、ＩＦＮαの直接的な抗増殖活性に対し耐性があるフレンド赤白血病細胞のクローンの増殖からのマウスの保護に有効であることが示されており(Belardelli et al., Int. J. Cancer, 30, 813-820, 1982; Belardelli et al., Int J. Cancer, 30, 821-825, 1982)、これは、ＩＦＮαの抗腫瘍活性における間接的な免疫媒介機構の重要性を反映している。
【０４０９】
以下の実験は、フレンド赤白血病細胞をあらかじめ接種されたマウスにおけるＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗腫瘍活性の評価、及び市販のＩｎｔｒｏｎＡ製品の代表として選択された野生型ＩＦＮα−２のものとの比較を可能にする。
【０４１０】
それらを実施するために、１２匹の６週齢のＤＢＡ／２マウスの群が１００，０００個のＩＦＮ耐性フレンド赤白血病細胞（３Ｃ１８）（２０，０００ＬＤ５０）を腹腔内から接種され、そして、１時間後、そしてそれから２１日間１日１回、２．０μｇの野生型ＩＦＮα−２又は２．０μｇのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７又は等量の賦形剤単独で処理された。当該動物は、続いて、生存について毎日観察され、そして初頭効果解析はその賦形剤単独の群との比較における各処置群の相対的生存とされた。
【０４１１】
図７に提示した、この実験結果は、ＩＦＮαで処理されているマウスと比較して、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７によるマウスの処理が、非常に悪性のフレンド赤白血病細胞（ＦＬＣ）の接種後に生存しているマウスの数の増大をもたらす。４５日後、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７で処理したマウスの３４％が生存し、一方、野生型ＩＦＮα−２で処理したマウスの５０％が生存している。したがって、ＦＬＣ接種マウスの生存率は、野生型ＩＦＮα−２による処理後よりも、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７による処理後の方が若干低い。
【０４１２】
これらの結果は全て、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７が独特な生物学的特性を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０４１３】
【図１】図１Ａは、ＳＮＰ Ｄ７２Ｎを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型ＩＦＮα−７タンパク質のモデルを表す。図１Ｂは、図１Ａで表したタンパク質の各自の下部のモデルのクローズアップを表す。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、黒いリボンは天然野生型ＩＦＮα−７の構造を表し、そして白いリボンはＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質の構造を表す。
【図２】図２Ａは、ＳＮＰ Ｆ１１６Ｓを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型ＩＦＮα−７タンパク質のモデルを表す。図２Ｂは、図２Ａで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、黒いリボンは天然野生型ＩＦＮα−７の構造を表し、そして白いリボンはＦ１１６Ｓ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質の構造を表す。
【図３】図３Ａは、ＳＮＰ Ｒ１２１Ｋを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型ＩＦＮα−７タンパク質のモデルを表す。図３Ｂは、図３Ａで表したタンパク質の各自の中央部のモデルのクローズアップを表す。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、黒いリボンは天然野生型ＩＦＮα−７の構造を表し、そして白いリボンはＲ１２１Ｋ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質の構造を表す。
【図４】図４Ａは、ＳＮＰ Ｋ１５９Ｑを含んで成る、本発明に従うコードタンパク質及び天然野生型ＩＦＮα−７タンパク質のモデルを表す。図４Ｂは、図４Ａで表したタンパク質の各自の上部のモデルのクローズアップを表す。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、黒いリボンは天然野生型ＩＦＮα−７の構造を表し、そして白いリボンはＫ１５９Ｑ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質の構造を表す。
【図５】図５は、ＴＦ−１細胞系へのＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７の抗増殖作用の測定についての試験結果を表す。この図において、横座標はＩＦＮαの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に相当し、そして縦座標は細胞増殖の阻害（％）に相当する。Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７（黒いひし形）の抗増殖作用は、野生型ＩＦＮα−２（白い四角）のものと比較される。
【図６】図６は、ＶＳＶウイルスによってあらかじめ感染させられ、そしてＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型ＩＦＮα−２で処理したもの、又は処置されてないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間（日数）に相当し、そして縦座標はＶＳＶ感染マウスの相対的生存率に相当する。黒いひし形は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７で処理した、ＶＳＶ感染マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理されていない、ＶＳＶ感染マウスについてのデータを表す。
【図７】図７は、悪性フレンド赤白血病細胞（ＦＬＣ）をあらかじめ接種し、そしてＤ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７タンパク質で処理したマウスの生存率を、野生型ＩＦＮα−２で処理したもの、又は処理してないものと比較して表す。この図において、横座標は生存時間（日数）に相当し、そして縦座標は、ＦＬＣを接種したマウスの相対的生存率に相当する。黒い四角は、Ｄ７２Ｎ突然変異型ＩＦＮα−７で処理した、ＦＬＣ接種マウスについてのデータを表し、そして白い三角は、処理していないＦＬＣ接種マウスについてのデータを表す。
【図１】
2005500029.tif 000015
【図２】
2005500029.tif 000016
【図３】
2005500029.tif 000017
【図４】
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【図５】
2005500029.tif 000019
【図６】
2005500029.tif 000020
【図７】
2005500029.tif 000021
【国際公開パンフレット】
2005500029.tif 000022
2005500029.tif 000023
2005500029.tif 000024
2005500029.tif 000025
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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