(57)【要約】診断及び治療用途のために使用することができる新規のターゲット化組成物。この組成物は、脂質、タンパク質又はポリマーガス充填ベシクルを含有し、これはさらに、一般式：Ｌ−Ｐ−Ｔの新規の化合物を含有する［式中、Ｌは、疎水性化合物を含み、Ｐは、親水性ポリマーを含み、かつＴは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体を含む組織、細胞又は受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドを含む］。組成物は、超音波などの画像診断、さらに治療用超音波などの治療用途と組み合わせて使用することができる。
2005500245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式を有する化合物
【化１】
2005500245.tif 000079
［上式中、
Ｘ１及びＸ２は独立に、直接結合あるいは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−からなる群から選択される架橋原子又は基であり；
Ｘ３は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒ１は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ２は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ３は、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ４は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ５は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ８は、水素又は低級アルキルであり；
Ｐは、親水性ポリマーであり；かつ
Ｔは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドである］。
【請求項２】
式中、
Ｘ１及びＸ２は独立に、−Ｃ（＝Ｘ３）、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−からなる群から選択される架橋基であり；
Ｒ１は、約１０個から約２２個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ２は、水素であり；
Ｒ３は、１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ４は、約１０個から約２２個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ５は、水素であり；
Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は低級アルキレンであり；かつ
Ｒ８は、水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式中、
Ｘ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｘ２は、−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｒ１は、約１５個から約２０個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ３は、１から約３個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ４は、約１５個から約２０個の炭素からなるアシルであり；かつ
Ｒ６は、直接結合であり；
Ｒ７は、低級アルキレンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
式中、
Ｒ１は、約１７個から約１９個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ３は、メチレンであり；
Ｒ４は、約１７個から約１９個の炭素からなるアシルであり；かつ
Ｒ７は、エチレンである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式中、
Ｒ１及びＲ２は、約１８個の炭素からなるアシルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記の親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）及びポリオキサゾリジンからなる群から選択されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記の親水性ポリマーが、ポリアルキレンオキシドを含有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記の親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールからなる群から選択されている、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記の親水性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記の親水性ポリマーが、ＰＥＧ３４００である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記のターゲッティングリガンドが、次式のペプチドを包含する、請求項１に記載の化合物
（Ｘａａ）ｎ−Ｙａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｚａａ）ｍ
［上式中、
ｍ及びｎは独立に、１から約１００の整数であり；
Ｘａａ及びＺａａは独立に、天然アミノ酸及び合成アミノ酸からなる群から選択され；
Ｙａａは、アルギニン、ホモアルギニン及びリジン−Ｎ−アセトイミデートであり；
ただし、Ｘａａ及びＺａａが、イオウを含有するアミノ酸である場合には、Ｘａａ及びＺａａは、ジスルフィド結合を介して相互に結合していてよい］。
【請求項１２】
式中、
Ｘａａは、グリシンであり；
Ｙａａは、アルギニンであり；
Ｚａａは、セリンであり；
ｎは、１、２又は３であり；かつ
ｍは、１である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
式中、
ｎは、３である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
式中、
Ｘａａ及びＺａａが、イオウ含有アミノ酸から独立に選択されるアミノ酸を包含する、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
前記のターゲッティングリガンドが、次式のペプチドを包含する、請求項１に記載の化合物
【化２】
2005500245.tif 000080
［上式中、
ｘ及びｙはそれぞれ独立に、０から約５０の整数であり；
Ｓａａはそれぞれ、天然及び合成のイオウ含有アミノ酸からなる群から選択され；
Ｘａａ及びＺａａはそれぞれ独立に、中性アミノ酸及び合成アミノ酸からなる群から選択され；かつ
Ｙａａは、アルギニン、ホモアルギニン及びリジン−Ｎ−アセトイミデートから選択される］。
【請求項１６】
Ｓａａはそれぞれ独立に、Ｄ−システイン、Ｌ−システイン、Ｄ−ペニシラミン及びＬ−ペニシラミンからなる群から選択される、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
水性キャリヤー中に脂質、タンパク質又はポリマーガス充填ベシクルを含有する、インビボで治療的又は診断的に使用するためのターゲット化ベシクル組成物において、前記のベシクルがさらに請求項１に記載の化合物を含有する、ターゲット化ベシクル組成物。
【請求項１８】
前記のベシクルが、リポソーム及びミセルからなる群から選択されている、請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項１９】
前記のベシクルが、リポソームを包含する、請求項１８に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２０】
前記のリポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸からなる群から選択されるリン脂質を含有する、請求項１９に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２１】
前記のホスファチジルコリンが、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンからなる群から選択されている、請求項２０に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２２】
前記のホスファチジルコリンが、ジパルミトイルホスファチジルコリンを包含する、請求項２１に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２３】
前記のホスファチジルエタノールアミンが、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン及び１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンからなる群から選択されている、請求項２０に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２４】
前記のホスファチジルエタノールアミンが、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンを包含する、請求項２３に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２５】
前記のホスファチジン酸が、ジパルミトイルホスファチジン酸を包含する、請求項２０に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２６】
前記のベシクルが、ペルフルオロ炭化水素及び六フッ化イオウからなる群から選択されるガスを含有する、請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２７】
前記のペルフルオロ炭化水素ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン及びペルフルオロシクロブタンからなる群から選択されている、請求項２６に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２８】
前記のペルフルオロ炭化水素ガスが、ペルフルオロプロパン及びペルフルオロブタンからなる群から選択されている、請求項２７に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項２９】
前記のペルフルオロ炭化水素ガスが、ペルフルオロブタンを包含する、請求項２８に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３０】
前記のガスが、少なくとも部分的にガス前駆体に由来する、請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３１】
前記のガス前駆体が、約３７℃を上回る沸点を有する、請求項３０に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３２】
前記のガス前駆体が、ペルフルオロ炭化水素を包含する、請求項３１に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３３】
前記のペルフルオロ炭化水素が、ペルフルオロペンタン及びペルフルオロヘキサンからなる群から選択される、請求項３２に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３４】
前記のベシクルがさらに、前記のガス及び前記の化合物とは異なる生物活性剤を含有する、請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３５】
前記の生物活性剤が、遺伝物質、ジヒドロエルゴタミン、硫酸ヘパリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ヒルジン及びこれらの混合物からなる群から選択される治療薬を包含する、請求項３４に記載のターゲット化ベシクル組成物。
【請求項３６】
患者の局部内の血栓を撮像する方法において、（ｉ）請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）画像診断により、患者の前記の局部を走査するステップとを包含する方法。
【請求項３７】
前記の画像診断が、診断用超音波を包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
患者の前記の局部が、心臓部を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
血管中の血栓を溶解する方法において、（ｉ）静脈内注入により、請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）画像診断により、前記の患者を走査して、前記の血栓を可視化するステップと、（ｉｉｉ）超音波エネルギーを前記の血栓に適用するステップとを包含する方法。
【請求項４０】
血管中の血栓を溶解する方法において、（ｉ）静脈内注入により、請求項３５に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）画像診断により、前記の患者を走査して、前記の血栓を可視化するステップと、（ｉｉｉ）超音波エネルギーを前記の血栓に適用するステップとを包含する方法。
【請求項４１】
患者の体内局部の画像を得る方法において、（ｉ）請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）超音波を使用して、患者を走査し、局部の可視画像を得るステップとを包含する方法。
【請求項４２】
前記のターゲッティングリガンドが、動脈硬化の局部をターゲットとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記の動脈硬化が、アテローム斑を包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記のターゲッティングリガンドが、梗塞している心筋をターゲットとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記のターゲッティングリガンドが、ガン細胞をターゲットとする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
患者の体内にある病的組織の存在を診断する方法において、（ｉ）請求項１７に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）超音波を使用して、患者を走査し、局部の可視画像を得るステップとを含む方法。
【請求項４７】
前記のターゲッティングリガンドが、動脈硬化の局部をターゲットとする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の動脈硬化が、アテローム斑を包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記のターゲッティングリガンドが、梗塞している心筋をターゲットとする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記のターゲッティングリガンドが、ガン細胞をターゲットとする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
生物活性剤をインビボで治療輸送するための方法において、（ｉ）治療的に有効な量の、請求項３４に記載のターゲット化ベシクル組成物を患者に投与するステップと、（ｉｉ）超音波エネルギーを患者に適用して、前記のターゲットベシクルから前記の生物活性剤を放出するステップとを包含する方法。
【請求項５２】
前記の超音波エネルギーにより、前記のベシクルを破裂させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
画像診断により、患者を走査して、ターゲット部位でベシクルを可視化するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規のターゲット化組成物及びその使用に関する。特に本発明は、新規の化合物及びこれらの化合物を含有するターゲット化組成物並びに画像診断及び／又は生物活性剤の投与のためのこれらの組成物の使用法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
疾患を診断するために、様々な撮像技術が使用されている。これらの撮像技術には、Ｘ線撮像が含まれる。Ｘ線では、生じる画像は、患者の体内の構造及び組織間の異なる密度を反映する。この撮像技術の診断的有用性を改善するために、造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ）を使用して、周囲組織に比較して該当組織の密度を高めることができる。このような造影剤の例には例えば、食道、胃、腸及び直腸を含む胃腸部のＸ線調査のために使用することができるバリウム、ヨウ化化合物が含まれる。さらに造影剤を、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）及びコンピュータ連動断層撮影（ＣＡＴ）調査で使用して、該当組織、例えば胃腸管の可視化を改善するために使用することもできる。
【０００３】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、Ｘ線とは異なり、イオン化放射線を必要としない別の撮像技術である。ＭＲＩは、様々な走査面、例えば軸方向、冠方向、矢状方向又は直交方向で、体の断面画像を得るために使用することができる。ＭＲＩは、磁場、高周波エネルギー及び磁場勾配を用いて、体の画像を作成する。組織間のコントラスト又はシグナル強度差は、Ｔ１（縦）及びＴ２（横）緩和値及び、遊離水に通常は対応している組織のプロトン密度を反映している。造影剤を使用して、患者の局部でのシグナル強度を変えるために、いくつかの可能なアプローチを利用することができる。例えば、Ｔ１又はＴ２又はプロトン密度を変えるように、造影剤を設計することができる。
【０００４】
一般的には、ＭＲＩは、造影剤の使用を必要とする。造影剤を使用することなく、ＭＲＩを行うと、生じた画像中で、該当組織と周囲組織とを判別することは難しい。以前には、ＭＲＩでは常磁性造影剤が第一に、注目されていた。常磁性造影剤は、不対電子を含有する物質を必要とする。不対電子は、主磁場内で小さな磁石として作用して、縦（Ｔ１）及び横（Ｔ２）緩和の速度を高める。常磁性造影剤は通常、不対電子源をもたらす金属イオン、例えば、遷移金属イオンを含有する。しかしながら、これらの金属イオンは通常、極めて毒性である。毒性を低減しようと、金属イオンは通常、リガンドでキレート化される。
【０００５】
特には酸化鉄である金属酸化物が、ＭＲＩ造影剤として使用されている。酸化鉄の小さい粒子、例えば、約２０ｎｍ未満の直径を有する粒子は、望ましい常磁性緩和特性を有するが、これらの主な効果は、体積磁化率に基づく。ニトロキシドは、これも常磁性であるＭＲＩ造影剤の別の群である。これらは比較的低い緩和性を有し、通常は、常磁性イオンよりも低い有効性を有する。
【０００６】
存在するＭＲＩ造影剤は、数多くの制限を受けている。例えば、キレート化金属が含まれる造影剤を含む特定の造影剤は、高い画像ノイズを伴うことがある。このノイズは通常、固有ぜん動運動並びに呼吸又は心臓血管作用からの運動により生じる。加えて、造影剤でのシグナル強度は通常、使用される造影剤の濃度及びパルス系列に左右される。十分に高濃度の常磁性種を使用しない限り、造影剤の吸収によって、特に、小腸の遠位部で、画像の解釈が複雑になりうる。例えば、Ｋｏｒｎｍｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ，６：１２４（１９８８）参照。
【０００７】
他の造影剤は、パルス系列のバリエーションに対して感度が低く、より一貫したコントラストをもたらしうる。しかしながら、高い濃度のフェライトなどの粒子は、例えば、腸管液体の吸収が生じ、超常磁性物質が濃縮される結腸で特に明白である磁化率アーチファクトをもたらしうる。
【０００８】
毒性が、もう１つの問題であり、これは通常、ＭＲＩのための造影剤を含む近年利用されている造影剤に随伴する。例えば、フェライトは往々にして、経口投与の後に、悪心、さらに鼓腸及び血清鉄の一過性の上昇の症状を惹起する。Ｇｄ−ＤＴＰＡ中で錯化されているガドリニウムイオンは、遊離の形では極めて毒性である。胃での高い酸性度（低いｐＨ）及び腸での高いアルカリ度（高いｐＨ）を含む胃腸管の様々な環境により、錯体からの遊離イオンの脱カップリング及び分離の確度が高まることがある。
【０００９】
超音波は、例えば、組織微小血管などの血管系を含む体の様々な範囲を調査するための別の有用な画像診断技術である。超音波は、他の診断技術を上回るある程度の利点をもたらす。例えば、核医学及びＸ線を用いる診断技術は通常、患者を電離電子線に暴露することを含む。このような放射線は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質を含む細胞内物質に損傷をもたらしうる。超音波は、このような強力な損傷放射線を用いない。加えて、超音波は、精巧で高価な装置を必要とするＣＴ及びＭＲＩを含む他の診断技術に比較して、比較的安価である。
【００１０】
超音波は、患者を音波に暴露することを含む。通常、音波は、体組織によって吸収されることにより散逸されるか、組織を貫通するか、又は組織に反射される。通常は、後方散乱又は反射率と称される組織による波長の反射が、超音波画像を現像するためのベースとなる。これに関して、音波は、様々な体組織から様々に反射される。この異なる反射は、観察される特定の組織の成分及び密度を含む様々なファクターに基づく。超音波は、１メガヘルツ（ＭＨｚ）から１０ＭＨｚの周波数を有する音波を検出することができるトランスデューサーを通常は用いて、様々に反射された音波を検出することを含む。検出された音波を集積して、定量化された画像にし、組織の画像に変換された定量化音波を、調査することができる。
【００１１】
前記の診断技術のように、超音波は通常、造影剤の使用を必要とする。代表的な造影剤には例えば、固体粒子の懸濁液、乳化液滴及びガス充填気泡が含まれる。例えば、Ｈｉｌｍａｎｎらの米国特許第４４６６４４２号及び公開国際特許出願ＷＯ９２／１７２１２号及びＷＯ９２／２１３８２号参照。Ｗｉｄｄｅｒらの公開出願ＥＰ−Ａ第０３２４９３８号には、熱変性可能な生体適合性タンパク質、例えばアルブミン、ヘモグロビン及びコラーゲンから製造された安定化ミクロ気泡タイプ超音波造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）が開示されている。
【００１２】
超音波から得られた画像の品質は、大幅に改善された。しかしながら、特に、血管血液供給で潅流される組織中の血管系に関する画像に関しては、更なる改善が必要である。したがって、血管系及び血管関連臓器の医学的に有用な画像を得ることができる改善された造影剤を含む改善された超音波技術に対する必要性が存在する。
【００１３】
液−ガス界面からの音波の反射は、極めて有効である。したがって、ガス充填バブルを含むバブルは、造影剤として有用である。ここで使用する場合、「バブル」との用語は、ガス又はその前駆体を充填されている内部ボイドを取り囲む１つ又は複数の膜又は壁の存在により通常は特徴付けられるベシクルに関する。代表的なバブルには例えば、リポソーム、ミセルなどが含まれる。後記でより詳細に記載するように、造影剤としてのバブルの有効性は、例えば、バブルのサイズ及び／又は弾性を含む様々なファクターに応じる。
【００１４】
バブルサイズの効果に関しては、次の見解が得られている。専門家には知られているように、バブルに反射されるシグナルは、バブルの半径（ｒ６）の関数である（レイリー散乱体）。したがって、診断用超音波の周波数範囲では、４マイクロメートル（μｍ）の直径を有するバブルは、２μｍの直径を有するバブルに対して、６４倍の散乱能を有する。したがって一般的に、バブルが大きくなるほど、反射されるシグナルは大きくなる。
【００１５】
しかしながら、バブルサイズは、バブルが通過すべき毛細血管の直径に制限される。通常、１０μｍを上回る直径を有するバブルを含む造影剤は危険なものとなりうる。それというのも、微細血管が閉塞されうるためである。したがって、造影剤中のバブルの約９９％以上が、１０μｍ未満の直径を有するのが望ましい。平均バブル直径も重要であり、１μｍを上回るべきであり、２μｍを上回るのが好ましい。バブルの容量加重（ｖｏｌｕｍｅ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ）平均直径は、約７から１０マイクロメートルであるべきである。
【００１６】
バブルの弾性も、重要である。この理由は、高度に弾性なバブルは変形して、必要な場合には、毛細血管に「押し入る」か、かつ／又はバブルの周囲に血液が流れるようにすることができるためである。これにより、梗塞の可能性が低減される。バブルを含む造影剤の有効性は、バブル濃度にも左右される。通常、バブル濃度が高くなるほど、造影剤の反射率は大きくなる。
【００１７】
造影剤としてのバブルの有効性に関する他の重要な特性は、バブル安定性である。ここで使用する場合、特に、ガス充填バブルに関して、「バブル安定性」とは、気圧よりも高い圧力にさらされた後にも、その中に捕捉されているガスを保持するバブルの能力のことである。造影剤として有効であるためには、バブルは通常、水銀（Ｈｇ）３００ミリメートル（ｍｍ）の圧力に約１分間さらされた後に、捕捉されているガスの５０％より多くを保持することを必要とする。特に有効なバブルは、Ｈｇ３００ｍｍの圧力に１分間さらされた後に、捕捉されているガスの７５％を維持し、９０％の捕捉ガス含有率は、極めて有効な造影剤をもたらす。放圧した後に、バブルが本来のサイズに戻ることが、特に望ましい。このことは通常、「バブル回復性」と称される。
【００１８】
所望の安定性を備えていないバブルは、不十分な造影剤をもたらす。例えば、バブルがその中に捕捉されているガスをインビボで放出すると、反射率は低下する。同様に、低い回復性を有するバブルのサイズも、インビボで低減して、低い反射率をもたらす。
【００１９】
先行技術で開示されているバブルの安定性は通常、造影剤として使用するには不十分である。例えば、先行技術は、脂質含有壁又は膜を含むバブルを開示しており、これには、ガス充填リポソームが含まれる。例えば、Ｒｙａｎらの米国特許第４９００５４０号及び同第４５４４５４５号；Ｔｉｃｋｎｅｒらの米国特許第４２７６８８５号；ＫｌａｖｅｎｅｓｓらのＷＯ９３／１３８０９号及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒらのＥＰＯ第０５５４２１３号及びＷＯ９１／１５２４４号参照。ＬａｎｚａらのＷＯ９３／２０８０２号は、音響的に反射性のオリゴラメラリポソームを開示しており、これは、二分子層の間に高い水性スペースを有するマルチラメラリポソームであるか、非同心的に二分子層の間に組み込まれているリポソームを有して、内部で分かれている二分子層を含む。超音波撮像を強化するための超音波造影剤としてのその使用及び患者に投与されたリポソーム中に輸送されている薬剤を監視する際のその使用も、記載されている。Ｄ’Ａｒｒｉｇｏの米国特許第４６８４４７９号及び同第５２１５６８０号はそれぞれ、液中ガスエマルション及び脂質コーティングされているミクロバブルを開示している。
【００２０】
先行技術に開示されているバブルの多くは、不本意にも、不十分な安定性を有する。したがって、先行技術のバブルは、インビボで壊れやすく、例えば、中に含有されている治療薬及び／又は診断薬の早すぎる放出が生じる。バブル安定性を改善しようとして、様々な研究が行われている。このような研究には例えば、その膜又は壁が、アルブミンなどのタンパク質又は架橋によりかなり強化された物質を含有するバブルの調製が含まれる。例えば、生分解性架橋剤で架橋されているタンパク質を含有するバブルが開示されているＫｌａｖｅｎｅｓｓらのＷＯ９２／１７２１２号参照。Ｍｏｓｅｌｅｙらにより、１９９１年のカリフォルニア州ナパでのＳｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの会合において、「Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＭＲ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔ」と称される要約書にまとめられたプレゼンテーションが行われた。Ｍｏｓｅｌｅｙらにより記載されたミクロバブルは、ヒトアルブミンのシェルでコーティングされている気体を含む。もしくは、バブル膜は、タンパク質ではないが、生体適合性化合物と架橋する化合物を含有してよい。例えば、ＫｌａｖｅｎｅｓｓらのＷＯ９２／１７４３６号、ＷＯ９３／１７７１８号及びＷＯ９２／２１３８２号参照。
【００２１】
外側膜にタンパク質を使用するか、膜成分を架橋させることを含む、バブルを安定化するための先行技術は、様々な欠点を有する。例えば、前記の架橋は通常、それに関する代謝予定が知られていない架橋タンパク質又は他の化合物を含む新規の材料を使用することを伴う。加えて、架橋は、架橋化合物の単離及び精製を含む付加的な化学的プロセスステップを必要とする。さらに、アルブミンなどのタンパク質からなるバブル膜の使用及びバブル膜成分の架橋は、バブルの壁に剛性を与えうる。これにより、低い弾性を有し、したがって変形し、毛細血管を通過する能力の低いバブルが生じる。このように、タンパク質及び／又は架橋を必要とする先行技術の造影剤では、血管の閉塞の可能性が高い。
【００２２】
したがって、新規かつ／又は改良された安定化造影剤及びその製造方法が必要である。本発明は、このこと、さらに他の重要な目的を対象としている。
【００２３】
（発明の概要）
本発明は、１つには、次式を有する新規の化合物を対象とする
【化３】
2005500245.tif 000003
［上式中、
Ｘ１及びＸ２は独立に、直接結合あるいは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−からなる群から選択される架橋原子又は基であり；
Ｘ３は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒ１は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ２は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ３は、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ４は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ５は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ８は、水素又は低級アルキルであり；
Ｐは、親水性ポリマーであり；かつ
Ｔは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドである］。
【００２４】
さらに、インビボで治療又は診断に使用するためのターゲット化ベシクル組成物及び処方物を提供する。これらの組成物及び処方物は、水性キャリヤ中に、脂質、タンパク質又はポリマーガス充填ベシクル、さらに前記の化合物を含有する。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、診断及び治療用途で、これらの組成物及び処方物を使用する方法を対象とする。本発明のこれら、及び他の態様は、次の詳細な記載で明らかになるであろう。
【００２６】
本発明の実施形態を詳述するために、現段階で好ましい形態を図面で示す。しかしながら、本発明は、示されているとおりの配置及び手段に限定されない。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
前記及び本開示全体で使用されるように、次の用語は、特に記載のない限り、次の意味を有すると理解されたい。
【００２８】
「脂質」とは、通常、両親媒性及び生体適合性の合成又は天然由来化合物のことである。脂質は通常、親水性成分及び疎水性成分を含有する。代表的な脂質には例えば、脂肪酸、中性脂肪、リン脂質、糖脂質、界面活性剤、脂肪族アルコール、ロウ、テルペン及びステロイドが含まれる。一定の好ましい実施形態では、ここに記載されている組成物中に導入されうる脂質は、スルフヒドリル基又はジスルフィド結合を含有しない。
【００２９】
「脂質組成物」とは、通常は水性媒体中に脂質化合物を含有する組成物のことである。代表的な脂質組成物には、懸濁液、エマルション及びベシクル組成物が含まれる。
【００３０】
「脂質処方物」とは、生物活性剤をさらに含有する脂質組成物のことである。
【００３１】
「ベシクル」とは、１個又は複数の内部ボイドを形成する１つ又は複数の壁又は膜の存在により通常は特徴付けられる球状実体のことである。ベシクルは例えば、ここに記載される様々な脂質を含む脂質、タンパク性材料あるいは、天然、合成及び半合成ポリマーを含むポリマー材料から処方することができる。好ましいベシクルは、脂質から処方された壁又は膜を含むものである。これらの好ましいベシクルでは、脂質は、単分子層又は二分子層の形であってよく、単分子層又は二分子層脂質を使用して、１つ又は複数の単分子層又は二分子層を生じさせることができる。単分子層又は二分子層が２つ以上である場合には、単分子層又は二分子層は、同心であってよい。脂質を使用して、ユニラメラベシクル（１つの単分子層又は二分子層からなる）、オリゴラメラベシクル（約２つ又は約３つの単分子層又は二分子層からなる）又はマルチラメラベシクル（約３を上回る単分子層又は二分子層からなる）を生じさせることができる。同様に、タンパク質又はポリマーから調製されたベシクルも、１つ又は複数の同心壁又は膜を含みうる。タンパク質又はポリマーから調製されたベシクルの壁又は膜は、実質的に充実性（均一）であってよいか、これらは、多孔性又は半多孔性であってよい。一定の好ましい実施形態では、ベシクルは、スルフヒドリル基又はジスルフィド結合を含有しない。ここに記載されているベシクルは、例えば、リポソーム、ミセル、バブル、ミクロバブル、ミクロスフェア、脂質−、ポリマー−及び／又はタンパク質被覆バブル、ミクロバブル及び／又はミクロスフェア、ミクロバルーン、エーロゲル、包接化合物結合ベシクルなどと一般的に称されるような実体を含む。ベシクルの内部ボイドは、液体（例えば、水溶液が含まれる）、ガス、ガス前駆体及び／又は、例えば必要に応じターゲッティングリガンド及び／又は生物活性剤を含む固体又は溶質材料を充填されていてよい。
【００３２】
「リポソーム」とは、通常は１つ又は複数の同心層、例えば単分子層又は二分子層の形である脂質化合物を含む両親媒性化合物の通常は球状のクラスター又は凝集体のことである。これらはここでは、脂質ベシクルとも称される。例えば、イオン脂質及び／又は非イオン脂質から、リポソームを処方することができる。非イオン脂質から処方されたリポソームは、ニオソームとも称される。
【００３３】
「ミセル」とは、脂質から処方されたコロイド実体のことである。一定の好ましい実施形態では、ミセルは、単分子層又は六方Ｈ２相構造を有する。好ましい他の実施形態では、ミセルは、二分子層構造を有してもよい。
【００３４】
「エーロゲル」とは、複数の小さな内部ボイドにより特徴付けられる、通常は球状の実体のことである。合成材料（例えば、レソルシノール又はホルムアルデヒドのベーキングから調製されたフォーム）、さらに多糖又はタンパク質などの天然材料から、エーロゲルを処方することができる。
【００３５】
「包接化合物」とは、ベシクルを随伴しうる固体、半多孔性又は多孔性粒子のことである。好ましい形態では、包接化合物は、ベシクルを含むキャビティを含有するケージ様の構造を形成しうる。１個又は複数のベシクルが、包接化合物に結合しうる。望ましい場合には、安定化材料を包接化合物に随伴させて、ベシクルと包接化合物との会合を促進することができる。包接化合物をそれから処方することができる適切な材料には、例えば、カルシウムヒドロキシアパタイトなどの多孔性アパタイト、カルシウム塩で沈殿させたアルギン酸などのポリマー及び金属イオンからなる沈殿物が含まれる。
【００３６】
本発明のベシクルは好ましくは、ガス又はガス前駆体を含有する。「ガス充填ベシクル」とは、ガスがその中に封入されているベシクルのことである。「ガス前駆体充填ベシクル」とは、ガス前駆体がその中に封入されているベシクルのことである。ベシクルは、最小限にか、部分的にか、又は実質的に完全に、ガス及び／又はガス前駆体で充填されていてよい。一定の好ましい実施形態では、ベシクルは実質的に、又は完全にガス及び／又はガス前駆体で充填されていてよい。ガス及び／又はガス前駆体充填ベシクルに関して使用される場合の「実質的に」との用語は、ベシクルの内部ボイド容量の約５０％より多くが、ガスからなることを意味する。好ましくは、実質的に充填されているベシクルの内部ボイドの６０％より多くが、ガスからなり、この際、７０％より多いのが、さらに好ましい。さらに好ましくは、実質的に充填されたベシクルの内部ボイドの約８０％より多くがガスからなり、約９０％より多いのが、いっそう好ましい。特に好ましい実施形態では、ベシクルの内部ボイドの約９５％より多くがガスからなり、約１００％が、極めて好ましい。本発明の好ましい一実施形態とは考慮しないが、ベシクルは、所望ならば、ガス又はガス前駆体を含有しないか、実質的に含有しない。
【００３７】
「ベシクル組成物」とは、通常は水性媒体中のベシクルを含有する組成物のことである。
【００３８】
「ベシクル処方物」とは、生物活性剤も含有するベシクル組成物のことである。ベシクル処方物中で使用するために適したベシクル又はベシクル種には例えば、ガス充填ベシクル及びガス前駆体充填ベシクルが含まれる。
【００３９】
「エマルション」とは、２種又はそれ以上の液体からなる類脂質混合物のことであり、通常は、コロイドの形である。脂質は、エマルション中に不均一に分散されていてよい。もしくは、脂質は、例えば、クラスター又は、単分子層又は二分子層を含む層の形に凝集してもよい。
【００４０】
「懸濁液」とは、長時間にわたって安定なままである、液体中に浮いている微細な液体又は固体粒子の混合物のことである。
【００４１】
「六方ＨＩＩ相構造」とは、液体媒体、例えば水性媒体中の脂質からなる通常は管状の凝集体のことであり、その際、脂質の親水性部分が、通常は内部に面していて、管の内部の液体環境と会合している。脂質の疎水性部分は通常は、外側に向かっていて、錯体は、六方管の形を呈する。複数の管が通常は、六方相構造に一緒に詰まっている。
【００４２】
「患者」との用語は、哺乳類を含む動物、好ましくはヒトのことである。
【００４３】
「患者の体内局部」及び「該当局部」との句は、患者全体か、又は患者の特定区域又は部分のことである。患者の体内局部及び該当局部には例えば、画像診断で撮像される部位及び／又は生物活性剤で処理される部位が含まれる。このような部位の例には例えば、心筋組織を含む心臓局部、さらに、血管系及び循環系及びガン組織を含む他の体組織が含まれる。ここで使用される場合の「血管系」との句は、体又は体の臓器又はその一部の血管を示している。
【００４４】
「生物活性剤」との用語は、患者で疾患の存在の有無を診断するための方法及び／又は患者の疾患を治療するための方法などの、治療又は診断のための適用に関連して使用することができる物質のことである。ここで使用する場合、「生物活性剤」とは、インビトロ及び／又はインビボで生物作用を発揮しうる物質でもある。生物活性剤は、中性に、又は正に、又は負に荷電されていてもよい。適切な生物活性剤の例には、診断薬、薬剤、医薬品、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ステロイド及び、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む遺伝物質が含まれる。
【００４５】
「診断薬」とは、患者の体内局部を撮像するための、かつ／又は患者で疾患の存在の有無を診断するための方法に関して使用することができる薬剤のことである。代表的な診断薬には例えば、患者の超音波、磁気共鳴映像法又はコンピュータ断層撮影法に関連して使用するための造影剤、例えば、ここに記載の脂質及び／又はベシクル組成物が含まれる。
【００４６】
ここで使用する場合、「ポリマー」とは、２個又はそれ以上の繰り返し単位の化学的結合から生じる分子のことである。したがって、「ポリマー」との用語には例えば、ダイマー、トリマー及びオリゴマーが含まれうる。ポリマーは、合成、天然由来又は半合成であってよい。好ましい形態では、「ポリマー」との用語は、１０個又はそれ以上の繰り返し単位を含む分子のことである。一定の好ましい実施形態では、ここで記載する組成物中に導入しうるポリマーは、スルフヒドリル基又はジスルフィド結合を含有しない。
【００４７】
「増粘剤」とは、ここに記載されている脂質及び／又はベシクル組成物中に導入されると、粘度調整剤、乳化及び／又は可溶化剤、懸濁剤及び張度上昇剤として作用しうる、通常は親水性の様々な材料のうちのいずれかのことである。増粘剤は、そのような特性により組成物の安定性の維持を助けうると、考えられている。
【００４８】
「分散剤」とは、例えば、ここに記載されている一定の脂質及び／又はベシクル組成物を含むコロイド粒子の懸濁媒体に加えられると、粒子の均一な分離を促進しうる界面活性剤のことである。一定の好ましい実施形態では、分散剤は、ポリマーシロキサン化合物を含んでもよい。
【００４９】
「遺伝物質」とは通常、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド及びポリヌクレオチドのことである。遺伝物質は、当技術分野の専門家に知られている合成化学的方法論により、又は組換え技術を使用することにより、又はこれら２つの組合せにより製造することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡは場合によって、非天然ヌクレオシドを含有してもよく、一本鎖又は二本鎖であってよい。「遺伝物質」とは、センス及びアンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ、即ち、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ中のヌクレオチドの特異的配列に対して相補的であるヌクレオチド配列のことでもある。
【００５０】
「薬剤」又は「医薬品」とは、患者の疾病、病気、疾患又は外傷を治療（予防、診断、緩和又は治療を含む）する際に使用することができる治療薬又は予防薬のことである。治療に有効なペプチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチドも、薬剤又は医薬品との用語の意味に含まれる。
【００５１】
「安定化材料」とは、例えば、エマルション、懸濁液、分散液及びベシクル組成物を含む、ここに記載されているような組成物の安定性を改善しうる材料のことである。安定性の改善には、例えば、相対的にバランスのとれた状態の維持が含まれ、例えば、崩壊、分解、劣化などに対する耐性の上昇が例となる。ベシクル、特にガス充填ベシクルに関する好ましい実施形態では、安定化化合物は、例えば、ベシクルの破裂及び／又は凝集により生じるような、ベシクル内に捕捉されているガスの脱出を最小化するか、実質的に防ぐ（完全に防ぐことを含む）ことによりベシクルの安定性を改善するために役立つ。捕捉されているガスの脱出を防ぐことに関して使用されるような「実質的」との用語は、約５０％を上回るガスの捕捉が保持されることを意味する。好ましくは、約６０％を上回るガスの捕捉が保持され、約７０％を上回るのがより好ましい。いっそう好ましくは、約８０％を上回るガスの捕捉が保持され、約９０％を上回るのが、さらに好ましい。特に好ましい実施形態では、約９５％を上回るガスの捕捉が保持される。所望の場合には、ガスの捕捉を完全に保持することができる（即ち、約１００％のガスの捕捉が保持される）。安定化化合物は、離散している個々の化合物（モノマー）を含有してよいか、ポリマーを含有してよい。脂質に関する好ましい実施形態では、安定化物質は、共有結合及び／又は非共有結合により、脂質化合物と会合してよい。一般的に、安定化化合物は例えば、界面活性剤、被膜形成物質、膜及び／又は膜形成物質を含有してよい。本発明の方法及び組成物で使用することができる代表的な安定化化合物には、脂質、タンパク質及びポリマーが含まれる。一定の本生物活性剤も、「安定化物質」の定義に包含される。安定化物質は、中性であるか、正又は負に荷電されていてもよい。中性安定化材料のうちで、極性物質が好ましい。一定の実施形態では、安定化化合物は、実質的に（完全であってもよい）架橋されていてよい。ここで使用する場合、「架橋」、「架橋された」及び「架橋する」との用語は通常、１つ又は複数のブリッジによる、脂質、タンパク質及びポリマー安定化化合物を含む２個又はそれ以上の安定化化合物の架橋のことである。１個又は複数の元素、基又は化合物からなっていてよいブリッジは通常、第１の安定化化合物分子からの元素を第２の安定化分子の原子に結合させるために役立つ。架橋ブリッジは、共有結合性及び／又は非共有結合性会合を含む。様々な元素、基及び／又は化合物のいずれかが、架橋でブリッジを形成してよく、安定化化合物は、そのまま、又は合成手段によって架橋させることができる。例えば、架橋は、ケラチン、インスリン及び他のタンパク質中などのように、シスチン基のジスルフィド結合により結合されるペプチド鎖から処方された材料中では、自然に生じる。もしくは、例えば、安定化材料などの化合物と、例えば熱、高エネルギー放射線、超音波放射などに暴露することにより反応を惹起する架橋剤として役立つ化学物質とを組み合わせるなどの、適切な化学的変性により、架橋を生じさせることができる。例には例えば、システイン基中にスルフヒドリル基などとして存在しうるイオウを用いる、ジスルフィド結合が生じる架橋、有機ペルオキシドを用いる架橋、高エネルギー放射線を用いる、不飽和材料の架橋、カルバミン酸ジメチロールでの架橋などが含まれる。架橋された安定化化合物に関して使用される「実質的」との用語は、約５０％を上回る安定化化合物が、架橋ブリッジを含有することを意味する。一定の実施形態では好ましくは、約６０％を上回る安定化化合物が架橋ブリッジを含み、約７０％を上回るのが、さらに好ましい。いっそう好ましくは、約８０％を上回る架橋された安定化化合物が架橋ブリッジを含有し、約９０％を上回るのが、特に好ましい。一定の特に好ましい実施形態では、約９５％を上回る架橋された安定化化合物が、架橋ブリッジを含む。望ましい場合には、実質的に架橋されている安定化化合物は、完全に架橋されていてもよい（即ち、架橋された安定剤化合物の約１００％が、架橋ブリッジを含む）。最も好ましい実施形態では、安定化化合物は、実質的に（完全にであってもよい）架橋されていなくてもよい。架橋されていない安定化化合物に関して使用する場合の「実質的」との用語は、約５０％を上回る安定化化合物に、架橋ブリッジが存在しないことを意味している。好ましくは、約６０％を上回る安定化化合物に、架橋ブリッジが存在せず、約７０％を上回るのが、特に好ましい。いっそう好ましくは、約８０％を上回る安定化化合物に、架橋ブリッジが存在せず、約９０％を上回るのが、特に好ましい。特に好ましい実施形態では、約９５％を上回る安定化化合物に、架橋ブリッジが存在しない。望ましい場合には、実質的に架橋されていない安定化化合物は、完全に架橋されていなくてもよい（即ち、安定化化合物の約１００％に、架橋ブリッジが存在しない）。
【００５２】
「ベシクル安定性」とは、Ｈｇ約３００ｍｍの圧力に約１分間さらした後に、ガス充填ベシクルが、その中に捕捉されているガスを保持する能力のことである。ベシクル安定性は、パーセント（％）で測定し、これは、ベシクル中にもともと捕捉されていたガスの量と、放圧後に保持されているガスの量との分数である。ベシクル安定性は、ベシクルが、放圧後にその元のサイズに回復する能力に関する「ベシクル回復性」にも関する。
【００５３】
「共有結合性会合」とは、２個の原子の結合性軌道中での電子の共有を伴う分子間会合又は結合のことである。
【００５４】
「非共有結合性会合」とは、共有結合を伴わない、２個又はそれ以上の別々の分子間の分子間相互作用のことである。分子間相互作用は、例えば、関連分子の極性、場合によっては関連分子の電荷（正又は負）などを含む様々なファクターに依存する。非共有結合性会合は好ましくは、イオン相互作用、双極子−双極子相互作用及びファンデルワールス力及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００５５】
「イオン相互作用」又は「静電的相互作用」とは、それぞれが正又は負に荷電されている２個又はそれ以上の分子間の分子間相互作用のことである。したがって例えば、「イオン相互作用」又は「静電的相互作用」は、第１の正に荷電されている分子と第２の負に荷電されている分子との間の作用のことである。代表的なイオン又は静電的相互作用には例えば、負に荷電されている安定化材料、例えば遺伝物質と、正に荷電されている脂質、例えば、臭化ラウリルトリメチルアンモニウムなどのカチオン脂質との間の引力が含まれる。
【００５６】
「双極子−双極子相互作用」とは通常、２個又はそれ以上の極性分子の間で生じうる引力のことである。したがって「双極子−双極子相互作用」とは、一般的にδ＋と記載される第１の極性分子の荷電されていない、部分的に正の末端と、一般的にδ−と記載される第２の極性分子の荷電されていない、部分的に負の末端との引力のことである。双極子−双極子相互作用は例えば、ホスファチジルコリンの陽性頭部基、例えばコリン頭部基と、陰性原子、例えば多糖などの安定化材料中に存在する酸素、窒素又はイオウなどのヘテロ原子との間の引力により示される。「双極子−双極子相互作用」とは、分子間水素結合のことでもあり、この際、水素原子は、別々の分子の上の陰性原子間のブリッジとして役立ち、水素原子は、共有結合により第１の分子に、そして静電力により第２の分子に保持される。
【００５７】
「ファンデルワールス力」とは、量子力学により説明される非極性分子間の引力のことである。ファンデルワールス力は通常、一時的な双極子モーメントを伴い、これは、隣接する分子により惹起され、電子分布の変化を伴う。
【００５８】
「水素結合」とは、陰性原子、例えば酸素、イオウ、窒素などに共有結合している水素原子と他の陰性原子との間で生じうる引力又はブリッジのことである。水素結合は、第１の分子中の水素原子と、第２の分子中の陰性原子との間で生じうる（分子間水素結合）。したがって、水素結合は、いずれも単一分子中に含有されている水素原子と陰性原子との間で生じうる（分子間水素結合）。
【００５９】
「親水性相互作用」とは、水と実質的に結合しているか、水を吸収するか、かつ／又は水に溶解しうる分子又は分子部分のことである。これにより、可逆ゲルの膨潤及び／又は形成が生じる。
【００６０】
「疎水性相互作用」とは、水と実質的に結合しないか、水を吸収しないか、かつ／又は水に溶解しない分子又は分子部分に関する。
【００６１】
「生体適合性」とは、通常は生物学的機能を損なうことがなく、アレルゲン応答及び疾患状態を含む、許容し得ない毒性規模をもたらすことのない物質に関する。
【００６２】
「組み合わせて」とは、一定の実施形態では、ターゲッティングリガンドを、脂質組成物及びベシクル組成物を含む本発明の組成物に導入することに関する。「組み合わせて」は、生物活性剤を、脂質組成物及びベシクル組成物を含む本発明の組成物に導入することに関する。生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは、様々な方法で本発明の組成物と組み合わせることができる。所望の場合には、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドを、例えば脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクル又は他の付加的な安定化物質などの本発明の組成物の１種又は複数の成分と共有結合性会合をさせることもできる。さらに所望の場合には、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクル又は他の付加的な安定化剤などの本発明の組成物の他の成分との共有結合性会合は実質的に存在しなくてもよい。生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルなどの本発明の組成物の他の成分との共有結合性会合が存在しないことに関して使用される場合、「実質的にない」との用語は、約５０％未満、例えば、約０％から約５０％未満（この範囲内の特定のパーセンテージ及びパーセンテージ範囲の組合せ及び二次的組合せの全てを含む）の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と共有結合性会合をしていてよいことを意味している。好ましくは、約４０％未満の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と共有結合性会合をしていてよく、約３０％未満であるのが、さらに好ましい。いっそう好ましくは、約２０％未満の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と共有結合性会合をしていてよく、約１０％未満であるのが、さらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと組成物の他の成分との共有結合性会合は、全く存在しない（即ち０％）。
【００６３】
組成物の他の成分との共有結合性会合を実質的に有さない生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは場合によっては、ここで、「非結合」又は「遊離」生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと称される。このような組成物では、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは、所望の場合には、例えば脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクル又は他の付加的な安定化剤などの組成物の他の成分と非共有結合性会合をしていてもよい。加えて、所望の場合には、非結合又は遊離生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと、例えば脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルなどの組成物の他の成分との非共有結合性会合が実質的に存在しなくてもよい。生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと、例えば脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルなどの組成物の他の成分との非共有結合性会合が存在しないことに関して使用する場合、「実質的にない」との用語は、約５０％未満、例えば、約０％から約５０％未満（この範囲内の特定のパーセンテージ及びパーセンテージ範囲の組合せ及び二次的組合せの全てを含む）の非結合又は遊離の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と非共有結合性会合をしていてよいことを意味している。好ましくは、約４０％未満の非結合又は遊離の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と非共有結合性会合をしていてよく、約３０％未満であるのが、さらに好ましい。いっそう好ましくは、約２０％未満の非結合又は遊離の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドが、組成物の他の成分と非共有結合性会合をしていてよく、約１０％未満であるのが、さらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、非結合又は遊離の生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドと組成物の他の成分との非共有結合性会合は、完全に存在しなくてもよい（即ち０％）。
【００６４】
ベシクル組成物では、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは、ベシクルの内部ボイド内に捕捉されていてよい。生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは、例えばベシクル層又は壁内に含まれる脂質の間に散在させることにより、ベシクルの層又は壁の間に組み込むことができる。加えて、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドを、ベシクルの表面上に位置させることも考えられる。いずれにせよ、生物活性剤及び／又はターゲッティングリガンドは、例えば、ベシクルの内及び／又は外表面を含むベシクルの壁と化学的に相互作用することができ、実質的にこれに付着しうる。このような相互作用は、例えば、共有結合性会合又は非共有結合性会合の形をとる。一定の実施形態では、相互作用により、ベシクルの安定化が生じる。
【００６５】
「ターゲッティングリガンド」とは、本発明の組成物と共にインビボで、組織及び／又は受容体のターゲッティングを促進しうる材料又は物質のことである。ターゲッティングリガンドは、合成、半合成又は天然由来であってよい。ターゲッティングリガンドとして役立ちうる材料又は物質には例えば、抗体、糖タンパク質及びレクチンを含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、単糖類及び多糖を含む糖類、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子、生物活性剤並びに、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む遺伝物質が含まれる。
【００６６】
ターゲッティングリガンドへの「前駆体」とは、ターゲッティングリガンドに変化しうる材料又は物質のことである。このような変化には、例えば、前駆体をターゲッティングリガンドに定着させることも含まれる。代表的なターゲッティング前駆体成分には、マレイミド基、オルト−ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド基、ビニルスルホン基、アジド基及びα−ヨードアセチル基が含まれる。
【００６７】
「ペプチド」とは、約２から約１００個のアミノ酸基を含有してよい窒素化合物のことである。一定の好ましい実施形態では、ここに記載されている組成物中に導入されうるペプチドは、スルフヒドリル基又はジスルフィド結合を含まない。
【００６８】
「タンパク質」とは、約１００個を上回るアミノ酸基を含有してよい窒素化合物のことである。一定の好ましい実施形態では、ここに記載されている組成物中に導入されうるタンパク質は、スルフヒドリル基又はジスルフィド結合を含まない。
【００６９】
「コート」又は「コーティング」とは、安定化物質と脂質及び／又はベシクルとの相互作用のことであり、共有結合性及び／又は非共有結合性会合を伴ってよい。
【００７０】
「組織」とは通常、特別な機能を果たす特殊細胞のことである。ここで使用する場合の「組織」との用語は、個々の細胞あるいは複数の細胞又は細胞の凝集体、例えば膜又は臓器のことであると理解すべきである。「組織」との用語にはさらに、異常細胞又は複数の異常細胞のことも含まれる。代表的な組織には例えば、心筋の細胞及び心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｉｔｅｓ）を含む心筋組織（心臓組織又は心筋層とも称される）、内皮及び上皮を含む膜組織、上皮、間質組織を含む結合組織並びに腫瘍が含まれる。
【００７１】
「受容体」とは、特異的物質の選択的な結合により通常は特徴付けられる細胞内又は細胞表面上の分子構造のことである。代表的な受容体には例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片及びイムノグロブリンのための細胞表面受容体並びにステロイドホルモンのための細胞質受容体が含まれる。本発明に関連する代表的な受容体は、血小板インテグリンである糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａである。
【００７２】
「内皮細胞」又は「内皮」とは、正常又は異常であってよく、縁部同士で、又は重なり合う形で接合して、膜を形成し得る扁平化した透明な内皮細胞の単一層を含む細胞の集合体及び／又は組織のことである。内皮細胞は、心臓の裏層膜の一部である漿膜、血管及びリンパ管の遊離表面上に、脳及び脊髄の表面上に、さらに眼の前眼房中に存在している。内皮は、胎芽の中胚葉に由来し、梗塞している心臓組織を含む心臓組織、心臓血管、動脈、静脈及び毛細血管などの末梢血管（位置が、心臓に対して末梢と記載される）、血餅及びアテローム斑の周辺領域を含む。
【００７３】
「上皮細胞」又は「上皮」とは、正常又は異常であってよく、基底膜に支持されている間質セメント質物質により相互に結合されていてよい細胞からなる１つ又は複数の層を含む細胞及び／又は組織の凝集体のことである。内皮は、例えば細胞からなる単一層（単層上皮）；細胞からなる１つより多い単一層（重層上皮）；及び、実質的に層化の様相なしに相互に密着している細胞からなる約３又は４つの層を含む、様々な群に分類することができる。単層上皮の異なる形は通常、扁平、単層扁平、円柱、腺、球状及び／又は繊毛と称される。上皮は、胚の原外胚葉又は内胚葉に由来する。上皮は、梗塞している心臓組織を含む心臓組織、心臓血管、動脈、静脈及び毛細血管などの末梢血管、血餅及びアテローム斑の周辺領域を含む。
【００７４】
「心筋性」とは通常、心筋細胞、心筋層、心内膜及び心外膜の細胞を含んだ心臓組織のことである。「心筋性」との用語には、梗塞している心臓組織、心臓血管、動脈、静脈及び毛細血管などの末梢血管（その部位を心臓に対して末梢と記載する）、血餅及びアテローム斑の周辺領域が含まれる。
【００７５】
「心臓領域」とは通常、心臓及び周辺組織、構造及び冠動脈を含む血管のことである。
【００７６】
「腫瘍細胞」又は「腫瘍」とは、無制御の細胞増殖により特徴付けられる疾患状態を伴う異常細胞及び／又は組織の凝集体のことである。疾患状態は、例えば、内皮、上皮及び心筋細胞を含む様々な細胞タイプに関わりうる。これらの疾患状態には、新生物、ガン、白血病及び再狭窄損傷が含まれる。
【００７７】
「アルキル」とは、鎖中に１から約５０個及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの炭素原子を有する直鎖、分枝鎖又は環式であってよい脂肪族炭化水素基のことである。「低級アルキル」とは、１から約８個の炭素原子を有するアルキル基のことであり、１から約４個の炭素からなる低級アルキルが好ましい。「高級アルキル」とは、約１０から約２０個の炭素原子を有するアルキル基のことである。アルキル基は場合によって、同じか又は異なってよい１個又は複数のアルキル基置換基で置換されていてよく、この際、「アルキル基置換基」には、ハロ、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシ、アラルキルチオ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、オキソ及びシクロアルキルが含まれる。アルキル基に沿って、場合によって、１個又は複数の酸素、イオウあるいは置換又は非置換の窒素原子が挿入されていてもよく、この際、窒素置換基は、低級アルキルである。「分枝鎖」とは、メチル、エチル又はプロピルなどの低級アルキル基が、直鎖アルキル鎖に結合しているアルキル基のことである。代表的なアルキル基には、メチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘプチル、オクチル、デシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル及びヘキサデシルが含まれる。好ましいアルキル基には、１から約４個の炭素原子からなる低級アルキル基及び約１２から約１６個の炭素原子からなる高級アルキル基が含まれる。好ましいアルキル基にはさらに、１個又は複数のハロ原子で置換されているアルキル基が含まれる。ハロ置換アルキル基のうちでは、フルオロアルキル基が好ましく、例えば、式：ＣＦ３（ＣＦ２）ｎ（ＣＨ２）ｍ−のフルオロアルキル基が含まれる（式中、ｍ及びｎはそれぞれ独立に、０から約２２の整数である）。代表的なフルオロアルキル基には、ペルフルオロメチル、ペルフルオロエチル、ペルフルオロプロピル、ペルフルオロブチル、ペルフルオロシクロブチル、ペルフルオロペンチル、ペルフルオロヘキシル、ペルフルオロヘプチル、ペルフルオロオクチル、ペルフルオロノニル、ペルフルオロデシル、ペルフルオロウンデシル及びペルフルオロドデシルが含まれる。代表的な環式炭化水素基（すなわち、シクロアルキル基）には例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチル基が含まれる。代表的な環式炭化水素基にはさらに、例えば、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどのシクロアルケニル基、さらに、例えばコレステロールなどのステロイド基を含む、縮合したシクロアルキル及び／又はシクロアルケニル基を含有する炭化水素基が含まれる。
【００７８】
「アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有するアルキル基のことである。代表的なアルケニル基には例えば、ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、デセニル及びドデセニル基が含まれる。
【００７９】
「アルコキシ」とは、アルキル−Ｏ−基のことであり、ここでアルキルは、前記と同様のものである。代表的なアルコキシ基には例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及びヘプトキシが含まれる。
【００８０】
「アルキレン」とは、１から約３０個の炭素原子及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せを含む直鎖又は分枝鎖の二価脂肪族炭化水素基のことである。「低級アルキレン」とは、１から約４個の炭素原子を有するアルキレン基のことである。アルキレン基は、直鎖、分枝鎖又は環式であってよい。アルキレン基は場合によって、不飽和であってよいか、かつ／又は１個又は複数の「アルキル基置換基」で置換されていてよい。アルキレン基に、１個又は複数の酸素、イオウあるいは置換又は非置換の窒素原子が挿入されていてもよく、この際、窒素置換基は、前記のようなアルキルである。代表的なアルキレン基には、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−（ＣＨ２）３−）、シクロへキシレン（−Ｃ６Ｈ１０−）、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−（ＣＦ２）ｎ（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｎは、約１から約２２の整数であり、ｍは、０から約２２の整数である）、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ）−（ＣＨ２）ｍ−（式中、各ｍ及びｎは独立に、０から約３０の整数であり、Ｒは、水素又はアルキルである）、メチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）及びエチレンジオキシ（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）が含まれる。アルキレン基が約１から約３個の炭素原子を有するのが好ましい。
【００８１】
「アシル」とは、直鎖又は分枝鎖のアルキル−Ｃ＝Ｏ基のことである。「チオアシル」とは、直鎖又は分枝鎖のアルキル−Ｃ＝Ｓ基のことである。好ましいアシル及びチオアシル基は、約５から約３０個の炭素原子（ここで、炭素原子の数は、−Ｃ（＝Ｏ）基の炭素原子を含む）及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せを有する。
【００８２】
本発明は、一部では、脂質及び／又はベシクル組成物を対象とする。脂質、インビボで組織、細胞及び／又は受容体をターゲットとし、架橋基を介して脂質に結合しうるターゲッティングリガンド及びガス又はガス前駆体を含有する脂質組成物を含む実施形態を提供する。水性キャリヤ中に、脂質、タンパク質又はポリマーを含有するベシクル、インビボで組織、細胞及び／又は受容体をターゲットとしうるターゲッティングリガンド及びガス又はガス前駆体を含有するベシクル組成物を含む実施形態もここに提供する。これらの後者の実施形態では、ターゲッティングリガンドは、ベシクルがそれらから処方される脂質、タンパク質又はポリマーを含むベシクルに、架橋基を介して結合していてよい。脂質組成物、特に、ベシクル組成物の形の脂質組成物に関して、該当脂質のゲル−液晶相転移温度未満の温度で脂質組成物を調製するのが好ましい。この相転移温度は、脂質二分子層がゲル状態から液晶状態へと変換する温度のことである。例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７４  ２４９，２５１２−２５２１参照。
【００８３】
比較的高いゲル状態−液晶状態相転移温度を有する脂質から調製されたベシクルは、所定の温度で高い不透過性を有する傾向があると、通常は考えられている。飽和ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの主鎖融解転移に関する、ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ  １９９０）のｐ．１３９参照。様々な脂質のゲル状態−液晶状態相転移温度は、当技術分野の専門家には容易に理解され、例えば、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ｅｄ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，１−１８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４）に記載されている。次の表に、いくつかの代表的な脂質及びその相転移温度を挙げる。
【００８４】
2005500245.tif 000004
【００８５】
例えば、Ｄｅｒｅｋ  Ｍａｒｓｈ，ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ，ｐ．１３９（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９９０）参照。
【００８６】
存在する脂質及び／又はベシクル組成物に、少なくとも少量、例えば使用される脂質の全量に対して約１から約１０モルパーセントの負に荷電している脂質を導入することにより、ベシクルの安定性を高めることもできる。適切な負に荷電している脂質には例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸及び脂肪酸が含まれる。何らかの作動理論に結びつけることは意図していないが、このような負に荷電されている脂質は、相互に融合することによりベシクルが破裂する傾向を妨害することにより、付加的な安定性をもたらすと、考えられる。したがって、負に荷電されている脂質は、ベシクルの外側表面上に均一に負に荷電している層が生じるように作用し、これは、近接している他のベシクル上の同様に荷電している外側層と反発する。こうして、ベシクルは、相互に接触しにくくなるが、この相互接触は、各ベシクルの膜又はスキンの破裂をもたらし、接触しているベシクルの単一のより大きなベシクルへの合併をもたらす。合併のこのプロセスの連続により当然に、ベシクルの著しい劣化が生じる。
【００８７】
特に、ベシクル組成物と組み合わされて使用される脂質物質は、好ましくは柔軟である。このことは、本発明との関連では、例えば、ベシクルの直径よりも小さい直径を有する開口部を通過することができるように、ベシクルが、その形を変えることができることを意味している。
【００８８】
幅広い脂質が、脂質組成物に導入するために適していると考えられる。特にベシクル組成物に関しては、例えば、ミセル及び／又はリポソーム、当技術分野の専門家にその調製のために適していると知られている材料又はこれらの組合せを使用することができる。使用される脂質は、天然、合成又は半合成由来であってよい。前記のように、適切な脂質には通常、例えば脂肪酸、中性脂肪、リン脂質、糖脂質、脂肪族アルコール及びワックス、テルペン、セスキテルペン及びステロイドが含まれる。
【００８９】
本発明の脂質組成物を調製するために使用することができる代表的な脂質は例えば、脂肪酸、リゾリン脂質を含むリゾ脂質、血小板活性因子（ＰＡＦ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）に随伴するような、血餅をターゲットとする１−アルキル−２−アセトイル−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスホコリン及び１−アルキル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ  ３−ホスホコリンを含むホスホコリン；ジオレオイルホスファチジルコリンを含む、飽和及び不飽和脂質を伴うホスファチジルコリン；ジミリストイルホスファチジルコリン；ジペンタデカノイルホスファチジルコリン；ジラウロイルホスファチジルコリン；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）；及びジアラキドニルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）；ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）及びジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミン；ホスファチジルセリン；ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）及びジパルミトイル−グリセロールスクシネート（ＤＰＧＳ）を含むホスファチジルグリセロール；ホスファチジルイノシトール；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴ脂質；スフィンゴシン；ガングリオシドＧＭ１及びＧＭ２などの糖脂質；グルコ脂質；硫脂質；スフィンゴ糖脂質；ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）及びジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）などのホスファチジン酸；パルミチン酸；ステアリン酸；アラキドン酸；オレイン酸；ポリマーを有する脂質であって、そのポリマーはキチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などであり、ＰＥＧを有する脂質は、ここで「ぺグ化脂質（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄｓ）」とも称し、ポリマーを有する好ましい脂質としてＤＰＰＥ−ＰＥＧ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ）を含み、これは、結合しているＰＥＧポリマーを有する脂質ＤＰＰＥのことであり、例えば、平均分子量約５０００を有するＰＥＧポリマーを結合しているＤＰＰＥのことであるＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を含むＤＰＰＥ−ＰＥＧを含めた脂質；脂質支持スルホン化モノ−、ジ−、オリゴ−又は多糖類；例えば、コレステロール、硫酸コレステロール、ヘミコハク酸コレステロール及びコレステロールアミンなどのステロイド；ヘミコハク酸トコフェロール；エーテル及びエステル架橋脂肪酸を伴う脂質；重合脂質（この幅広いバリエーションは、当技術分野でよく知られている）；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；ステアリルアミン；カルジオリピン；鎖長中に約６から約８個の炭素を有する短鎖脂肪酸を伴うリン脂質；例えば、約６個の炭素からなるアシル鎖及び約１２個の炭素からなる別のアシル鎖などの不斉アシル鎖を伴う合成リン脂質；セラミド；ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪族アルコール、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン）脂肪族アルコールエーテル、ポリオキシアルキレン（例��ば、ポリオキシエチレン）ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥから市販されているＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含む、ＴＷＥＥＮ（登録商標）と称されるような化合物の群）、グリセロールポリエチレングリコールオキシステアレート、グリセロールポリエチレングリコールリシノレエート、アルキルオキシ化（例えばエトキシ化）大豆ステロール、アルキルオキシ化（例えばエトキシ化）ヒマシ油、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマー及びポリオキシアルキレン（例えばポリオキシエチレン）脂肪酸ステアレートなどのニオソームを含む、非イオンリポソーム；硫酸コレステロール、酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール及びｎ−酪酸フィトステロールを含む、ステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロ−コレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロール及びグルコン酸エルゴステロールを含む、糖酸のステロールエステル；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、グルコン酸ラウリル、グルコン酸ミリストイル及びグルコン酸ステアロイルを含む、糖酸及びアルコールのエステル；ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸及びポリウロン酸を含む、糖及び脂肪酸のエステル；サルササポゲニン、スミラゲニン（ｓｍｉｌａｇｅｎｉｎ）、ヘデラゲニン（ｈｅｄｅｒａｇｅｎｉｎ）、オレアノール酸及びジギトキシゲニンを含む、サポニン；ジラウリン酸グリセロール、トリラウリン酸グリセロール、ジパルミチン酸グリセロール、グリセロール及び、トリパルミチン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセロールを含む、グリセロールエステル；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール及びｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノ−クマリン−３−イル）−カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタン酸コレステリル；Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン及びパルミトイルホモシステイン及び／又はこれらの組合せが含まれる。好ましい実施形態では、安定化物質は、１種又は複数のＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＧ及びＤＡＰＣを含む、リン脂質を含む。
【００９０】
適切なフッ素化脂質の例には、これらに限らないが、次式の化合物が含まれる：
ＣｎＦ２ｎ＋１（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＯＯＰ（ＯＯ−）Ｏ（ＣＨ２）ｗＮ＋（ＣＨ３）３ＣｎＦ２ｎ＋１（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｏ
［上式中、ｍは、０から約１８であり、ｎは、１から約１２であり；ｗは、１から約８である］。これらの例及び合成するための方法、さらに、本発明で使用することができる他のフッ素化脂質は、Ｕｎｇｅｒの米国特許第５９９７８９８号、Ｒｅｉｓｓらの米国特許第５３４４９３０号、Ｆｒｅｚａｒｄ，Ｆ．らのＢｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１１９２：６１−７０（１９９４）及びＦｒｅｚａｒｄ，Ｆ．らのＡｒｔ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｏｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２：１４０３−１４０８（１９９４）に記載されており、これらそれぞれの記載をここでは全て、参照して援用する。ジフルオロアシルグリセリルホスファチジル−コリン、ノナフッ素化ジアシルグリセリルホスファチジルコリンの特異的例は、下記の化合物Ａにより示される。当技術分野の専門家には、他の通常のリン脂質の同様のフッ素化誘導体（ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロールなど）、さらに、脂肪族アシルエステル及び遊離脂肪酸のフッ素化誘導体も、本発明の範囲に従い機能しうることは、理解されるであろう。加えて、脂質をベースとするフッ素化（過フッ素化を含む）界面活性剤を、本発明での安定化物質として使用することもできる。
【００９１】
重合脂質の例には、約５０個までの炭素原子を含有するアルケニル又はアルキニルなどの不飽和親油性鎖が含まれる。その他の例は、重合可能な基を担持する、ホスホグリセリド及びスフィンゴ脂質などのリン脂質；及び、ヒマシ油及び麦角油（ｅｒｇｏｔ  ｏｉｌ）を含む、例えばｄ−１２−ヒドロキシオレイン酸のトリグリセリドなどの、ヒドロキシル基を伴う飽和及び不飽和脂肪酸誘導体である。分散性が高まって、生分解により生じる主鎖基が水溶性となるように、カルボキシル又はヒドロキシル基などの親水性置換基を含むように、重合をデザインすることができる。適切な重合可能な脂質は例えば、Ｋｌａｖｅｎｅｓｓらの米国特許第５５３６４９０号に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。
【００９２】
本発明の組成物中で使用することができる代表的な重合可能な及び／又はフッ素化脂質化合物を、次に示す。
【化４】
2005500245.tif 000005
2005500245.tif 000006
2005500245.tif 000007
上式の式Ａ中、ｘは、約８から約１８の整数であり、ｎは、２ｘである。最も好ましくは、ｘは、１２であり、ｎは、２４である。上式の式Ｂ、Ｃ及びＫ中、ｍ、ｎ、ｍ’及びｎ’は独立に、約８から約１８、好ましくは約１０から約１４の整数である。
【００９３】
本発明の組成物中で使用することができる他の脂質には例えば次式：
【化５】
2005500245.tif 000008
［上式中、Ｒは、コリンである］、
【化６】
2005500245.tif 000009
2005500245.tif 000010
次式のような重水素化脂質
【化７】
2005500245.tif 000011
が含まれる。
【００９４】
所望の場合には、例えば、塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；及び１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）−ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）などのカチオン脂質を使用することができる。脂質組成物中でカチオン脂質を使用する場合には、カチオン脂質と非カチオン脂質とのモル比は例えば、約１：１０００から約１：１００であってよい。好ましくは、カチオン脂質と非カチオン脂質とのモル比は、約１：２から約１：１０であってよく、約１：１から約１：２．５の比が、好ましい。さらに好ましくは、カチオン脂質と非カチオン脂質とのモル比は、約１：１であってよい。
【００９５】
カチオン脂質と非カチオン脂質との両方を含有する脂質組成物の場合には、幅広い脂質を、非カチオン脂質として使用することができる。好ましくは、非カチオン脂質は、１種又は複数のＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含む。前記で挙げたカチオン脂質の代わりに、ポリリジン又はポリアルギニンなどの脂質支持カチオンポリマー、さらにホスホン酸アルキル、ホスフィン酸アルキル、亜リン酸アルキルを、脂質組成物中で使用することができる。
【００９６】
本発明の一定の好ましい実施形態では、脂質組成物は、次式を有する１種又は複数のカチオン脂質を含有してよい
【化８】
2005500245.tif 000012
［上式中、
ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ独立に、０から約１００の整数であり；
Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ５−、−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ２）−又は−Ｘ２−（Ｒ５Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−であり；
Ｘ２はそれぞれ独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｙ１はそれぞれ独立に、リン酸基、Ｎ（Ｒ６）ａ−、Ｓ（Ｒ６）ａ−、Ｐ（Ｒ６）ａ−又は−ＣＯ２Ｒ６であり、ここで、ａは、１から３の整数であり；
Ｙ２はそれぞれ独立に、−Ｎ（Ｒ６）ｂ−、−Ｓ（Ｒ６）ｂ−又は−Ｐ（Ｒ６）ｂ−であり、ここで、ｂは、０から２の整数であり；
Ｙ３はそれぞれ独立に、リン酸基、Ｎ（Ｒ６）ａ−、Ｓ（Ｒ６）ａ−、Ｐ（Ｒ６）ａ−又は−ＣＯ２Ｒ６であり、ここで、ａは、１から３の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ５はそれぞれ独立に、水素又は１から約１０個の炭素からなるアルキルであり；かつ
Ｒ６はそれぞれ独立に、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８又は−Ｒ９−［Ｘ４−Ｒ１０］ｄ−Ｑであり、ここで：
ｃ及びｄはそれぞれ独立に、０から約１００の整数であり；
Ｑはそれぞれ独立に、リン酸基、−Ｎ（Ｒ１１）ｑ、−Ｓ（Ｒ１１）ｑ、−Ｐ（Ｒ１１）ｑ又は−ＣＯ２Ｒ６であり、ここで、ｑは、１から３の整数であり；
Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ５−、−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ２）−又は−Ｘ２−（Ｒ５Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−であり；
Ｒ７はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ８はそれぞれ独立に、水素又は炭素１から約６０個からなるアルキルであり；
Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；かつ
Ｒ１１はそれぞれ独立に、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８又は−Ｒ９−［Ｘ４−Ｒ１０］ｄ−Ｗであり、ここで：
Ｗはそれぞれ独立に、リン酸基、−Ｎ（Ｒ１２）ｗ、−Ｓ（Ｒ１２）ｗ、−Ｐ（Ｒ１２）ｗ又は−ＣＯ２Ｒ６であり、ここで、ｗは、１から３の整数であり；
Ｒ１２は、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８であるが、ただし、式（Ｉ）の化合物は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の四級塩を含む］。
【００９７】
本発明の組成物中に導入することができる他のカチオン脂質化合物は、次式の化合物である
【化９】
2005500245.tif 000013
［上式中、
Ｙ１はそれぞれ独立に、リン酸基、Ｎ（Ｒ２）ａ−、Ｓ（Ｒ２）ａ−、Ｐ（Ｒ２）ａ−又は−ＣＯ２Ｒ２であり、ここで、ａは、１から３の整数であり；
Ｒ１は、０から約３０個の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ３−又は−Ｘ２−（Ｒ３Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−へテロ原子又はへテロ原子基を含有する１から約６０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ２は、式：−Ｒ４−［（Ｘ１−Ｒ５）ｘ−Ｙ２］ｙ−Ｒ６の基であり、ここで：
ｘ及びｙはそれぞれ独立に、０から約１００の整数であり；
Ｘ１はそれぞれ独立に、直接結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ３−、−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｎ（Ｒ３）−、−Ｎ（Ｒ３）−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ２）−又は−Ｘ２−（Ｒ３Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−であり；
Ｘ２はそれぞれ独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｙ２はそれぞれ独立に、−Ｓ（Ｒ２）ｂ−、−Ｎ（Ｒ２）ｂ−又はＰ（Ｒ２）ｂ−であり、ここで、ｂは、０から２の整数であり；
Ｒ３はそれぞれ独立に、水素又は１から約１０個の炭素からなるアルキルであり；
Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、直接結合又は０から約１５個の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ３−又は−Ｘ２−（Ｒ３Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−へテロ原子又はへテロ原子基を含有する１から約３０個の炭素からなるアルキレンであり；かつ
Ｒ６はそれぞれ独立に、水素又は０から約３０個の−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ３−又は−Ｘ２−（Ｒ３Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−へテロ原子又はへテロ原子基を含有する１から約６０個の炭素からなるアルキルであり；但し、式（ＩＩ）の化合物は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の４級塩を含有する］。
【００９８】
さらに他の実施形態では、本発明の脂質組成物は、次式のカチオン脂質化合物を含有してもよい
【化１０】
2005500245.tif 000014
［上式中、
ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ独立に、０から約１００の整数であり；
Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ５−、−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ２）−又は−Ｘ２−（Ｒ５Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−であり；
Ｘ２はそれぞれ独立に、Ｏ又はＳであり；
各Ｙ１はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ６）ａ−、−Ｓ（Ｒ６）ａ−又はＰ（Ｒ６）ａ−であり、ここで、ａは、０から２の整数であり；
Ｙ２はそれぞれ独立に、−Ｎ（Ｒ６）ａ−、−Ｓ（Ｒ６）ａ−又はＰ（Ｒ６）ａ−であり、ここで、ａは、０から２の整数であり；
Ｙ３はそれぞれ独立に、リン酸基、Ｎ（Ｒ６）ｂ−、Ｓ（Ｒ６）ｂ−、Ｐ（Ｒ６）ｂ−又は−ＣＯ２Ｒ６であり、ここで、ｂは、１から３の整数であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ５はそれぞれ独立に、水素又は１から約１０個の炭素からなるアルキルであり；かつ
Ｒ６はそれぞれ独立に、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８又は−Ｒ９−［Ｘ４−Ｒ１０］ｄ−Ｑであり、ここで：
ｃ及びｄはそれぞれ独立に、０から約１００の整数であり；
Ｑはそれぞれ独立に、リン酸基、−Ｎ（Ｒ１１）ｑ、−Ｓ（Ｒ１１）ｑ、−Ｐ（Ｒ１１）ｑ又は−ＣＯ２Ｒ１１であり、ここで、ｑは、１から３の整数であり；
Ｘ３及びＸ４はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ５−、−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｎ（Ｒ５）−、−Ｎ（Ｒ５）−Ｃ（＝Ｘ２）−、−Ｃ（＝Ｘ２）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｘ２）−又は−Ｘ２−（Ｒ５Ｘ２）Ｐ（＝Ｘ２）−Ｘ２−であり；
Ｒ７はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ８はそれぞれ独立に、水素又は１から約６０個の炭素からなるアルキルであり；
Ｒ９及びＲ１０はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンであり；かつ
Ｒ１１はそれぞれ独立に、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８又は−Ｒ９−［Ｘ４−Ｒ１０］ｄ−Ｗであり、ここで：
Ｗはそれぞれ独立に、リン酸基、−Ｎ（Ｒ１２）ｗ、−Ｓ（Ｒ１２）ｗ、−Ｐ（Ｒ１２）ｗ又は−ＣＯ２Ｒ１２であり、ここで、ｗは、１から３の整数であり；かつ
Ｒ１２は、−［Ｒ７−Ｘ３］ｃ−Ｒ８であり；ただし、式（ＩＩＩ）の化合物は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の四級塩を含む。前記で一般的に記載したカチオン脂質化合物は、米国特許第５８３０４３０号に記載されており、その記載をここでは全て、参照して援用する。
【００９９】
一定の好ましい実施形態では、脂質組成物は、リン脂質、特に１種又は複数のＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＧ及びＤＡＰＣ（炭素２０個）を含有する。
【０１００】
加えて、本脂質組成物で使用することができる飽和及び不飽和脂肪酸は、直鎖又は分枝鎖の形で約１２個の炭素から約２２個の炭素を好ましくは含有する分子を含む。イソプレノイド単位及び／又はプレニル基からなる炭化水素基を使用することもできる。適切な飽和脂肪酸の例には例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びステアリン酸が含まれる。使用することができる適切な不飽和脂肪酸には例えば、ラウロレイン酸（ｌａｕｒｏｌｅｉｃ）、フィセト酸（ｐｈｙｓｅｔｅｒｉｃ）、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸及びオレイン酸が含まれる。使用することができる分枝鎖脂肪酸の例には例えば、イソラウリン酸、イソミリスチン酸、イソパルミチン酸及びイソステアリン酸が含まれる。本発明の組成物中で使用することができる他の脂質には、Ｕｎｇｅｒらの米国特許第６０９０８００号及びＵｎｇｅｒの米国特許第６０２８０６６号に記載されているようなものが含まれ、これらの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０１０１】
脂質組成物及び／又は脂質から処方されるベシクル組成物に加えて、本発明の実施形態は、タンパク質又はその誘導体から処方されるベシクルにも関する。本発明のターゲット化ベシクルを調製するために使用することができるタンパク質から処方されるベシクルは例えば、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎの米国特許第４５７２２０３号、同４７１８４３３号及び同４７７４９５８号及びＣｅｒｎｙらの米国特許第４９５７６５６号に記載されている。前記の特許に記載されているものに加えて、他のタンパク質ベースのベシクルも、本記載が得られれば、当技術分野の専門家には明らかである。
【０１０２】
脂質組成物及び／又は脂質及び／又はタンパク質から処方されたベシクル組成物に加えて、本発明の実施形態は、天然、半合成（変性された天然）又は合成由来であってよいポリマーから処方されたベシクルにも関する。ここで使用する場合、ポリマーとの用語は、２個又はそれ以上の繰り返しモノマー単位、好ましくは１０個又はそれ以上の繰り返しモノマー単位からなる化合物を示している。ここで使用する場合、半合成ポリマー（又は変性天然ポリマー）との句は、何らかの方法で化学的に変性されている天然ポリマーを示している。本発明で使用するために適した代表的な天然ポリマーには、天然由来の多糖類が含まれる。このような多糖類には例えば、アラビナン、フルクタン、フカン（ｆｕｃａｎ）、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えば、イヌリンなど）、レバン、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギナン、ガラトカロロース（ｇａｌａｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン酸、アミロースを含むペクチン、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、ポリデキストロース、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイタン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔａｎ）、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン及び、１種又は複数の次のアルドース、ケトース、酸又はアミンを含むようなものなどの様々な他の天然ホモポリマー又はへテロポリマー：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン及びノイラミン酸及びこれらの天然由来の誘導体。したがって、適切なポリマーには例えば、アルブミンなどのタンパク質が含まれる。代表的な半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース及びメトキシセルロースが含まれる。本発明で使用するために適している代表的な合成ポリマーには、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン及びポリエチレンテレフタレートなど）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコールなど）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、塩化ポリビニル及びポリビニルピロリドンなど）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素、フッ素化炭素（例えば、ポリテトラフルオロエチレンなど）及びポリメチルメタクリレート及びこれらの誘導体が含まれる。アクリル酸、メタクリル酸、エチレンイミン、クロトン酸、アクリルアミド、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、乳酸、グリコール酸、ε−カプロラクトン、アクロレイン、シアノアクリレート、ビスフェノールＡ、エピクロロヒドリン、ヒドロキシアルキルアクリレート、シロキサン、ジメチルシロキサン、酸化エチレン、エチレングリコール、ヒドロキシアルキルメタクリレート、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２，４−ペンタジエン−１−オール、酢酸ビニル、アクリロニトリル、スチレン、ｐ−アミノ−スチレン、ｐ−アミノ−ベンジル−スチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−スルホキシエチルメタクリル酸ナトリウム、ビニルピリジン、メタクリル酸アミノエチル、塩化２−メタクリロイルオキシ−トリメチルアンモニウム及びポリビニリデンなどのモノマー、さらにＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、２，２’−（ｐ−フェニレンジオキシ）−ジエチルジメタクリレート、ジビニルベンゼン、トリアリルアミン及びメチレンビス−（４−フェニル−イソシアネート）などの多官能性架橋モノマー及びこれらの組合せから調製された生体適合性合成ポリマー又はコポリマーが好ましい。好ましいポリマーには、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、エポキシ樹脂、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）及びポリアミド（ナイロン）ポリマーが含まれる。好ましいコポリマーには、次が含まれる：ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル−ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン−ポリアクリロニトリル及びポリｄ−１、ラクチドコグリコリド（ｌａｃｔｉｄｅ  ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ポリマー。好ましいコポリマーは、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリルである。本記載を得れば、他の適切な生体適合性モノマー及びポリマーは、当技術分野の専門家には容易に分かるであろう。
【０１０３】
前記のように、本脂質組成物は好ましくは、不活性ガスのようなガスを含有する。ガスは、特に、ベシクルの内部にガスが捕捉されているベシクル組成物と組み合わせると、高い反射率を有する脂質組成物をもたらす。これにより、造影剤としてのその有効性が高まる。
【０１０４】
好ましいガスは、不活性で、生体適合性であるガス、即ち、生体機能を害さないガスである。好ましいガスには、空気、ヘリウム、ルビジウム、過分極キセノン、過分極アルゴン、過分極ヘリウム、ネオン、アルゴン及びキセノンなどの希ガス、二酸化炭素、窒素、フッ素、酸素、六フッ化イオウ及び四フッ化イオウなどのイオウ系ガス、部分的にフッ素化されたガス又は完全にフッ素化されたガスを含む、フッ素化ガスからなる群から選択されるものが含まれる。代表的なフッ素化ガスには、ペルフルオロ炭化水素などのフルオロ炭化水素及びこれらの混合物が含まれる。１７Ｏ２などの常磁性ガスを、脂質組成物中で使用することもできる。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ガスは、フッ素化ガスを含む。このようなフッ素化ガスには、１種又はそれ以上のフッ素原子を含有する物質が含まれる。１個より多いフッ素原子を含有するガスが好ましく、ペルフルオロ炭化水素（即ち、十分にフッ素化されたフッ素化炭化水素）がより好ましい。好ましくは、ペルフルオロ炭化水素ガスは、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロシクロブタン及びこれらの混合物からなる群から選択される。さらに好ましくは、ペルフルオロ炭化水素は、ペルフルオロプロパン又はペルフルオロブタンであり、ペルフルオロブタンが特に好ましい。他の好ましいガスは、六フッ化イオウである。他の好ましいガスは、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン及びその異性体、１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンを含む、ヘプタフルオロプロパンである。ペルフルオロ炭化水素ガスと、空気などの別のタイプのガスからなる混合物などの様々なタイプのガスからなる混合物を、本発明の組成物中で使用することができると、考えられる。本発明の記載に基づき、当技術分野の専門家には、前記のようなガスを含む他のガスは、容易に分かるであろう。
【０１０６】
一定の好ましい実施形態では、ガス、例えば、空気又はペルフルオロ炭化水素ガスは、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、臭化ペルフルオロオクチル（ＰＦＯＢ）、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ヨウ化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロトリプロピルアミン及びペルフルオロトリブチルアミンなどの液体過フッ化炭化水素との組合わせである。
【０１０７】
脂質組成物に、ガス物質への前駆体を導入することも、望ましい。このような前駆体には、インビボでガスに変わりうる物質が含まれる。好ましくは、ガス前駆体は、生体適合性で、インビボで製造されるガスも、生体適合性である。
【０１０８】
ここに記載されている組成物中で使用するために適しているガス前駆体には、ｐＨに対して感受性のある物質が含まれる。これらの物質には例えば、中性又は酸性であるｐＨにさらされると、ガスを発生しうる物質が含まれる。このようなｐＨ感受性物質の例には、無機酸、有機酸及びこれらの混合物からなる群から選択される酸の塩が含まれる。炭酸（Ｈ２ＣＯ３）は、適切な無機酸の例であり、アミノマロン酸は、適切な有機酸の例である。本記載をもとにすれば、当技術分野の専門家には、無機酸及び有機酸を含む他の酸は、直ちに分かるであろう。
【０１０９】
塩から誘導されるガス前駆体は好ましくは、アルカリ金属塩、アンモニウム塩及びこれらの混合物からなる群から選択される。さらに好ましくは、塩は、炭酸塩、重炭酸塩、セスキ炭酸塩（ｓｅｓｑｕｅｃａｒｂｏｎａｔｅ）、アミノマロン酸塩及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１０】
塩から誘導される適切なガス前駆体物質の例には例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸リチウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、セスキ炭酸アンモニウム、セスキ炭酸ナトリウム、アミノマロン酸ナトリウム、アミノマロン酸アンモニウムが含まれる。アミノマロン酸塩は当技術分野でよく知られており、その調製は例えば、Ｔｈａｎａｓｓｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．９，ｎｏ．３，ｐｐ．５２５−５３２（１９７０）；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３，ｎｏ．３ｐｐ．５６８−５７４（１９７４）；及びＳｔｅｌｍａｓｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｏｏｒｄｉｎａｔｓｉｏｎｎａｙａ  Ｋｈｉｍｉｙａ，Ｖｏｌ．３，ｎｏ．４，ｐｐ．５２４−５２７（１９７７）に記載されている。これらの文献の記載をここでは、参照して援用する。
【０１１１】
ｐＨ変化に対して感受性があるだけでなく、又はその代わりに、ガス前駆体物質は、温度変化に対して感受性のある化合物を含んでよい。温度変化に対して感受性のある適切なガス前駆体の例は、ペルフルオロ炭化水素である。専門家には分かるように、特定のペルフルオロ炭化水素は、脂質組成物が製造された当初には、液体状態で存在してよく、したがって、ガス前駆体として使用することができる。もしくは、ペルフルオロ炭化水素は、脂質組成物が製造される際には気体状態で存在してよく、したがって、ガスとしてそのまま使用される。ペルフルオロ炭化水素が液体又はガスのどちらとして使用されるかは通常、その液−ガス相転移温度又は沸点に応ずる。例えば、好ましいペルフルオロ炭化水素、ペルフルオロペンタンは、２９．５℃の液−ガス相転移温度（沸点）を有する。このことは、ペルフルオロペンタンは通常、室温（約２５℃）では液体であるが、ペルフルオロペンタンの転移温度を上回る、平温が約３７℃であるヒトの体内ではガスに変わることを意味している。したがって、正常な環境下では、ペルフルオロペンタンはガス前駆体である。もう１つの例として、ペルフルオロペンタンの同族体、即ち、ペルフルオロブタン及びペルフルオロヘキサンが存在する。ペルフルオロブタンの液−ガス転移は、４℃であり、ペルフルオロヘキサンでは、５７℃である。したがって、ペルフルオロブタンは、ガス前駆体として使用することができるが、ガスに近く、一方で、ペルフルオロヘキサンは、その比較的高い沸点により、ガス前駆体として使用することができる。当技術分野の専門家には知られているように、物質の有効沸点は、物質がさらされている圧力に関連する。この関係は、理想気体の法則：ＰＶ＝ｎＲＴにより示され、ここで、Ｐは、圧力であり、Ｖは、容量であり、ｎは、物質のモルであり、Ｒは、気体定数であり、かつＴは、温度である。理想気体の法則は、圧力が高まるにつれて、有効沸点も高まることを示している。逆に、圧力が低下するにつれて、有効沸点が低下する。
【０１１２】
幅広い物質を、本発明の組成物中でガス前駆体として使用することができる。物質は、適切な温度になると、気相へと相転移しうることだけが必要である。適切なガス前駆体には例えば、ヘキサフルオロアセトン、イソプロピルアセチレン、アレン、テトラフルオロアレン、三フッ化ホウ素、１，２−ブタジエン、２，３−ブタジエン、１，３−ブタジエン、１，２，３−トリクロロ−２−フルオロ−１，３−ブタジエン、２−メチル−１，３−ブタジエン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエン、ブタジイン、１−フルオロブタン、２−メチルブタン、ペルフルオロブタン、１−ブテン、２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、ペルフルオロ−１−ブテン、ペルフルオロ−２−ブテン、４−フェニル−３−ブテン−２−オン、２−メチル−１−ブテン−３−イン、硝酸ブチル、１−ブチン、２−ブチン、２−クロロ−１，１，１，４，４，４−ヘキサフルオロブチン、３−メチル−１−ブチン、ペルフルオロ−２−ブチン、２−ブロモ−ブチルアルデヒド、硫化カルボニル、クロトノニトリル、シクロブタン、メチルシクロブタン、オクタフルオロシクロブタン、ペルフルオロシクロブテン、３−クロロシクロペンテン、ペルフルオロシクロ−ペンタン、オクタフルオロシクロペンテン、シクロプロパン、ペルフルオロシクロプロパン、１，２−ジメチル−シクロプロパン、１，１−ジメチル−シクロプロパン、１，２−ジメチルシクロプロパン、エチルシクロプロパン、メチルシクロプロパン、ジアセチレン、３−エチル−３−メチルジアジリジン、１，１，１−トリフルオロジアゾエタン、ジメチルアミン、ヘキサフルオロジメチルアミン、ジメチルエチルアミン、ビス（ジメチルホスフィン）−アミン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、２，３−ジメチル−２−ノルボルナン、ペルフルオロジメチルアミン、塩化ジメチルオキソニウム、１，３−ジオキソラン−２−オン、４−メチル−１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエタン、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−１，２，２，２−テトラフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２，２−ペンタフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、１，１−ジクロロ−２−フルオロエタン、１−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエタン、２−クロロ−１，１−ジフルオロエタン、クロロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロトリフルオロエタン、フルオロエタン、ペルフルオロエタン、ニトロペンタフルオロエタン、ニトロソペンタフルオロエタン、ペルフルオロエチルアミン、エチルビニルエーテル、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロ−１，２−ジフルオロエタン、１，２−ジフルオロエタン、メタン、塩化トリフルオロメタンスルホニル、フッ化トリフルオロメタンスルホニル、ブロモジフルオロニトロソメタン、ブロモフルオロメタン、ブロモクロロフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロジフルオロニトロメタン、クロロジニトロメタン、クロロフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジフルオロメタン、ジフルオロヨードメタン、ジシラノメタン、フルオロメタン、ヨードメタン、ヨードトリフルオロメタン、ニトロトリフルオロメタン、ニトロソトリフルオロメタン、テトラフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、トリフルオロメタン、２−メチルブタン、メチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、乳酸メチル、亜硝酸メチル、硫化メチル、メチルビニルエーテル、ネオペンタン、亜酸化窒素、１，２，３−ノナデカントリカルボン酸２−ヒドロキシトリメチルエステル、１−ノネン−３−イン、１，４−ペンタジエン、ｎ−ペンタン、ペルフルオロペンタン、４−アミノ−４−メチルペンタン−２−オン、１−ペンテン、２−ペンテン（シス及びトランス）、３−ブロモペンテ−１−エン、ペルフルオロペンテ−１−エン、テトラクロロフタル酸、２，３，６−トリメチル−ピペリジン、プロパン、１，１，１，２，２，３−ヘキサフルオロプロパン、１，２−エポキシプロパン、２，２−ジフルオロプロパン、２−アミノプロパン、２−クロロプロパン、ヘプタフルオロ−１−ニトロプロパン、ヘプタフルオロ−１−ニトロソプロパン、ペルフルオロプロパン、プロペン、ヘキサフルオロプロパン、１，１，１，２，３，３−ヘキサフルオロ−２，３−ジクロロプロパン、１−クロロプロパン、クロロプロパン−（トランス）、２−クロロプロパン、３−フルオロプロパン、プロピン、３，３，３−トリフルオロプロピン、３−フルオロスチレン、十フッ化イオウ（二）（Ｓ２Ｆ１０）、２，４−ジアミノトルエン、トリフルオロアセトニトリル、トリフルオロメチルペルオキシド、硫化トリフルオロメチル、六フッ化タングステン、ビニルアセチレン及びビニルエーテル。
【０１１３】
ペルフルオロ炭化水素は、本発明の方法で使用される組成物に関連して使用するための、好ましいガス及び好ましいガス前駆体の両方である。このようなペルフルオロ炭化水素には、飽和ペルフルオロ炭化水素、不飽和ペルフルオロ炭化水素及び環式過フッ化炭化水素が含まれる。通常は好ましい飽和ペルフルオロ炭化水素は、式：ＣｎＦ２ｎ＋２を有し、ここでｎは、１から約１２、好ましくは約２から約１０、さらに好ましくは約３から約８であり、特に好ましくは、約３から約６である。適切なペルフルオロ炭化水素には例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン及びペルフルオロノナンが含まれる。好ましくは、ペルフルオロ炭化水素は、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン及びペルフルオロオクタンからなる群から選択され、ペルフルオロブタンが、特に好ましい。式：ＣｎＦ２ｎを有し、ここでｎは、３から８、好ましくは、３から６である環式ペルフルオロ炭化水素が好ましく、例えば、ヘキサフルオロシクロプロパン、オクタフルオロシクロブタン及びデカフルオロシクロペンタンが含まれる。
【０１１４】
ペルフルオロ炭化水素に加えて、完全にはフッ素化されていない安定なフルオロ炭化水素を使用することも望ましい。このようなフルオロ炭化水素には、ヘプタフルオロプロパン、例えば、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン及びその異性体、１，１，２，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンが含まれる。
【０１１５】
ガス前駆体物質は、ジアゾニウムイオン及びアミノマロン酸塩などの光活性化物質であってもよい。下記で詳細に検討するように、一定の脂質及び／又はベシクル組成物、特にベシクル組成物は、ターゲット組織で、又は脂質組成物への音波の作用により、ガスが生じるように処方することができる。ガス前駆体の例は例えば、米国特許第５０８８４９９号及び第５１４９３１９号に記載されており、これらの記載をここでは全て、参照して援用する。前記のものの他に、他のガス前駆体は、本記載をベースにすれば、当技術分野の専門家には明らかであろう。
【０１１６】
ガス物質及び／又はガス前駆体を好ましくは、組成物の物理的性質に関わらず、脂質及び／又はベシクル組成物中に導入する。したがって、ガス物質及び／又はその前駆体を例えば、脂質がランダムに凝集している脂質組成物に、さらに、ミセル及びリポソームなどの脂質から処方されているベシクル組成物を含むベシクル組成物中に導入することができる。ガス物質及び／又はその前駆体の脂質及び／又はベシクル組成物への導入は、数多くの方法のうちのいずれかを使用することにより達成することができる。例えば、脂質をベースとするベシクルでは、ガス充填ベシクルの処方は、ガス又はガス前駆体及び１種又は複数の脂質を含有する水性混合物を振盪又は攪拌することにより達成することができる。これにより、ガス又はガス前駆体が封入されている安定なベシクルの形成が促進される。
【０１１７】
加えて、ガスを、脂質及び／又はベシクル形成化合物の水性混合物中で気泡にすることもできる。もしくは、ガス点滴注入法を、例えば、米国特許第５３５２４３５号及び同第５２２８４４６号に記載されているように使用することができ、これらの記載をここで、全て参照して援用する。カチオン脂質組成物にガス又はガス前駆体を導入するための適切な方法は、米国特許第４８６５８３６号に開示されており、この記載をここで、全て参照して援用する。本記載を元にすれば、当技術分野の専門家には、他の方法は明らかであろう。好ましくは、安定化物質を加えた後、又はその間、かつ／又はベシクルの形成の間に、脂質及び／又はベシクル組成物にガスを点滴注入する。
【０１１８】
好ましい実施形態では、ガス物質及び／又はガス前駆体物質を、ベシクル組成物に導入するが、ミセル及びリポソームが好ましい。後記で詳述するように、ガス又はガス前駆体又はその両方が封入されているベシクルが有利であり、これらは、インビボで反射率の改善をもたらす。
【０１１９】
後記で詳述するように、脂質組成物、特にベシクル組成物を、脂質及び、安定なベシクルの形成を促進する付加的な安定化化合物から処方するのが好ましい。加えて、脂質及び／又はベシクル組成物が高度に安定なガスも含有するのが好ましい。「高度に安定なガス」との句は、水性媒体中で限られた可溶性及び拡散性を有するガスのことである。代表的な高度に安定なガスには、水性媒体中で通常は低い拡散性を有し、比較的不溶性であるペルフルオロ炭化水素が含まれる。したがって、これらの使用により、高度に安定なベシクルの形成を促進することができる。
【０１２０】
一定の実施形態では、例えばヒトの体のインビボ温度を含む脂質及び／又はベシクル組成物の使用温度で、液体状態であり、脂質及び／又はベシクル組成物、特にガス充填ベシクルの安定性を助けるか、強化しうるフッ素化化合物、特にペルフルオロ炭化水素化合物を使用することが望ましい。適切なフッ素化化合物には例えば、ＺＯＮＹＬ（登録商標）界面活性剤（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）として市販されているフッ素化界面活性剤などのフッ素化界面活性剤、例えば臭化ペルフルオロオクチル（ＰＦＯＢ）、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロドデカリン、ヨウ化ペルフルオロオクチル、ペルフルオロトリプロピルアミン及びペルフルオロトリブチルアミンなどの液体ペルフルオロ炭化水素が含まれる。通常、約６又はそれ以上の炭素原子を含有するペルフルオロ炭化水素は、正常なヒト体温で液体である。これらのペルフルオロ炭化水素のうち、室温で液体である臭化ペルフルオロオクチル及びペルフルオロヘキサンが好ましい。存在するガスは例えば、窒素又はペルフルオロプロパンであってよいか、又はペルフルオロ炭化水素、例えばペルフルオロペンタンであってもよいガス前駆体から誘導されてもよい。後者の場合、脂質及び／又はベシクル組成物は、ペルフルオロ炭化水素の混合物から調製することができ、この例は、ペルフルオロプロパン（ガス）又はペルフルオロペンタン（ガス前駆体）及び臭化ペルフルオロオクチル（液体）である。何らかの作動理論に結びつけることは意図しないが、ベシクル組成物の場合、液体のフッ素化化合物は、ガスと、ベシクルの膜又は壁表面との間の界面に位置すると考えられる。したがって、安定化化合物、例えばベシクルを形成するために使用される生体適合性脂質の内部表面上に、液体フッ素化化合物のもう１つの安定化層が生じ、このペルフルオロ炭化水素層は、ガスが、ベシクル膜を通って拡散することを防ぐ。本発明に関して、ガス前駆体は、製造及び／又は貯蔵温度では液体であるが、少なくとも使用時、又はその間は、ガスになる。
【０１２１】
したがって、ペルフルオロ炭化水素などの液体フッ素化化合物は、ここに記載されている脂質及び／又はベシクル組成物を製造するために通常使用されるガス又はガス前駆体と組み合わされると、ガス又はガス前駆体単独では得られない、付加的な安定性をもたらしうることが判明した。したがって、ペルフルオロ炭化水素ガス前駆体、例えばペルフルオロペンタンなどのガス又はガス前駆体を、患者に投与された後も液体なままであるペルフルオロ炭化水素、即ちその液−ガス相転移温度が、患者の体温を上回る、例えば臭化ペルフルオロオクチルと共に使用することは、本発明の範囲に該当する。ＺＯＮＹＬ（登録商標）フッ素化界面活性剤などの過フッ素化界面活性剤は、脂質及び／又はベシクル組成物を安定化させ、例えば、ベシクルのためのコーティングとして作用させるために使用することができる。好ましい過フッ化界面活性剤は、部分的にフッ素化されたホスホコリン界面活性剤である。これらの好ましいフッ素化界面活性剤では、二重アルキル化合物が、末端アルキル鎖のところでフッ素化されていてよく、中央炭素は、水素化されていてよい。これらのフッ素化ホスホコリン界面活性剤は、本発明のターゲット化脂質及び／又はベシクル組成物を製造するために使用することができる。
【０１２２】
ベシクル組成物に関する実施形態では、ベシクルのサイズを、例えば診断及び／又は治療用途を含む特別な所定の最終使用に合わせることができる。ベシクルのサイズは好ましくは、直径約３０ナノメートル（ｎｍ）から約１００マイクロメートル（μｍ）及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せであってよい。さらに好ましくは、ベシクルは、約１００ｎｍから約１０μｍの直径を有し、約２００ｎｍから約７μｍの直径がいっそう好ましい。特別な使用、例えば、血管系の磁気共鳴影像法を含む血管内使用では、ベシクルは約３０μｍ以下の直径であるのが好ましく、より小さいベシクル、例えば、直径約１２μｍ以下のベシクルが好ましい。一定の好ましい実施形態では、ベシクルの直径は約７μｍ又はそれ未満であってよく、平均直径約５μｍ又はそれ未満を有するベシクルがさらに好ましく、平均直径約３μｍ又はそれ未満を有するベシクルがいっそう好ましい。これらの比較的小さいベシクルは、微小血管のような小さい血管チャネルに灌流し、同時に、赤血球細胞がベシクルを通り過ぎることができるように十分なスペース又は余地を、血管チャネルにもたらす。
【０１２３】
所望の場合には、例えば、振盪、マイクロエマルジョン化、渦流発生、押出し、濾過、音波処理、均一化、繰り返し凍結及び解凍サイクル、規定のサイズの空孔を介しての圧力下での押出しなどを含む様々な手順により、ガス充填ベシクルのサイズを調整することができる。
【０１２４】
前記のように、ここで使用される組成物はさらに、その調製、処方及び使用に関して、温度、ｐＨ、光及びエネルギー（超音波など）によって、液体又は固体状態からガスへと変化させることができるガス前駆体を含んでよい。ガス前駆体は、前駆体を減圧下に貯蔵することにより、ガスにすることができる。
【０１２５】
例えば、減圧下に貯蔵されているバイアルは、注入前に所定のガスを生じさせるために使用することができる、ペルフルオロペンタン又はペルフルオロヘキサンガスのヘッドスペースをもたらしうる。好ましくは、ガス前駆体は、温度により活性化させることができる。後記は、正常な体温（３７℃）の比較的近くか、又はそれ未満で、液体からガス状態へと相転移しうる一連のガス前駆体及び、最大サイズ１０μｍのベシクルを生じさせるために必要な乳化液滴のサイズを挙げている表である。
2005500245.tif 000015
【０１２６】
既に記載したように、ペルフルオロ炭化水素は、ガス又はガス前駆体、さらに付加的な安定化成分として使用するために好ましい。
【０１２７】
前記のように、限られた可溶性を有するガスを使用することにより、脂質及び／又はベシクル組成物、特に脂質から処方されたベシクル組成物の便利性を最適化することが好ましい。「限られた可溶性」との句は、周囲の水性媒体中へのその可溶性によって、ベシクルの外へとガスが拡散する能力のことである。水性媒体中への比較的高い可溶性は、ベシクルの外へとガスが拡散する傾向を有するように、ガスに勾配をもたらす。他方で、水性環境中への比較的低い可溶性は、ベシクルからのガスの拡散を妨げるように、ベシクルと界面との間の勾配を低減するか、除去しうる。好ましくは、ベシクル中に捕捉されているガスは、酸素の可溶性よりも低い可溶性−即ち、水約３２部にガス約１部−を有する。Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｇａｓ  Ｄａｔａ  Ｂｏｏｋ，１９６６，Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．参照。さらに好ましくは、ベシクルに捕捉されているガスは、空気の可溶性よりも低い、水への可溶性を有し、いっそう好ましくは、ベシクルに捕捉されているガスは、窒素の可溶性よりも低い、水への可溶性を有する。
【０１２８】
一定の実施形態では、実質的に不透過性のポリマー物質からベシクルを処方することが望ましい。これらの実施形態では、高度に不溶性のガスを使用することは通常、不要である。例えば、実質的に不透過性のポリマー物質を含む安定なベシクル組成物は、比較的高い可溶性を有するガス、例えば、空気又は窒素と共に処方することができる。
【０１２９】
前記の脂質、タンパク質及び／又はポリマー化合物に加えて、又はこれらに代えて、ここに記載されている組成物は、１種又は複数の安定化物質を含んでよい。このような安定化物質の例は例えば、生体適合性ポリマーである。ベシクルの形成を所望に助けるか、かつ／又はガス又はガス前駆体の実質的な封入を保証するために、安定化物質を使用することができる。ガス及びガス前駆体充填ベシクルの形成で、１種又は複数の安定化材料を使用すると、ペルフルオロプロパン又は六フッ化イオウなどの比較的不溶性で、非拡散性のガスでも、改善されたベシクル組成物を得ることができる。これらの化合物は、そのサイズ、形及び／又は他の属性に関してベシクルの安定性及び完全性の改善を助けうる。
【０１３０】
「安定な」又は「安定化」との用語は、ここで使用する場合、ベシクルが、例えば、ベシクル構造又は封入されているガス又はガス前駆体の損失を含む劣化に対して、試用期間を通して、実質的に耐性があることを意味している。通常、本発明で使用されるベシクルは、望ましい貯蔵寿命を有し、往々にして、正常な環境条件下に少なくとも約２から３週間、本来の構造の少なくとも約９０容量％を保持する。好ましい形態では、ベシクルは望ましくは、少なくとも約１カ月の期間、さらに好ましくは少なくとも約２カ月、いっそう好ましくは少なくとも約６カ月、特に好ましくは約１８カ月、極めて好ましくは約３年までの期間、安定である。ガス及びガス前駆体充填ベシクルを含むここに記載されているベシクルは、正常な環境条件下でさらされる温度及び圧力を上回るか、下回る温度及び圧力のような不利な条件下でも安定である。
【０１３１】
ここに記載されているベシクルの安定性は、少なくとも部分的に、例えば、前記の脂質、ポリマー及び／又はタンパク質を含む、ベシクルがそれから作られる物質に基づき、往々にして、付加的で、そうするのが好ましいが、付加的な安定化物質を使用する必要はない。このような付加的な安定化物質及びその特性に関しては、後記でさらに詳述する。
【０１３２】
ベシクルがそれから構成される物質は好ましくは、生体適合性の脂質、タンパク質又はポリマー物質であり、これらの内、生体適合性の脂質が好ましい。加えて、投与の直前にベシクルを調製することができることを含む、その処方の簡単さにより、これらのベシクルは、その位置で便利に作ることができる。
【０１３３】
ガス及びガス前駆体充填ベシクルを調製するために安定化物質として使用することができる生体適合性ポリマーは、天然、半合成（変性天然）又は合成由来であってよい。ここで使用する場合、ポリマーとの用語は、２個又はそれ以上の繰り返しモノマー単位、好ましくは１０個又はそれ以上の繰り返しモノマー単位からなる化合物を示している。ここで使用する場合、半合成ポリマー（又は変性天然ポリマー）との句は、何らかの方法で化学的に変性されている天然ポリマーを示している。本発明で使用するために適している代表的な天然ポリマーには、天然由来の多糖類が含まれる。このような多糖類には例えば、アラビナン、フルクタン、フカン（ｆｕｃａｎ）、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えば、イヌリンなど）、レバン、フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、カラギナン、ガラトカロロース（ｇａｌａｔｏｃａｒｏｌｏｓｅ）、ペクチン酸、アミロースを含むペクチン、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、ポリデキストロース、プスツラン（ｐｕｓｔｕｌａｎ）、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイタン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔａｎ）、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン及び、１種又は複数の次のアルドース、ケトース、酸又はアミンを含むもののような様々な他の天然ホモポリマー又はへテロポリマー：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン及びノイラミン酸及びこれらの天然由来の誘導体が含まれる。したがって、適切なポリマーには例えば、アルブミンなどのタンパク質が含まれる。代表的な半合成ポリマーには、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース及びメトキシセルロースが含まれる。本発明で使用するために適している代表的な合成ポリマーには、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン及びポリエチレンテレフタレートなど）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコールなど）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、塩化ポリビニル及びポリビニルピロリドンなど）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素、フッ素化炭素（例えば、ポリテトラフルオロエチレンなど）及びポリメチルメタクリレート及びこれらの誘導体が含まれる。安定化化合物としてポリマーを使用するベシクルを調製するための方法は、本記載と、Ｕｎｇｅｒの米国特許第５２０５２９０号（その記載を全て、参照して援用する）に記載されているような当技術分野で知られている情報とを組み合わせることにより、本記載が得られれば、当技術分野の専門家には、容易に分かるであろう。
【０１３４】
本発明の特に好ましい実施形態は、３種の成分を含むベシクルに関する：（１）中性脂質、例えば、非イオン又は両性イオン脂質、（２）負に荷電している脂質及び（３）安定化物質、例えば親水性ポリマーを支持する脂質。好ましくは、負に荷電している脂質の量は、存在している全脂質に対して約１モルパーセントより多く、親水性ポリマーを支持する脂質の量は、存在している全脂質に対して約１モルパーセントより多い。代表的で、好ましい負に荷電している脂質には、ホスファチジン酸が含まれる。親水性ポリマーを支持する脂質は望ましくは、ポリマーに共有結合により架橋されている脂質であり、ポリマーは好ましくは、重量平均分子量約４００から約１０００００を有する。適切な親水性ポリマーは好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン及びこれらのコポリマーからなる群から選択され、ＰＥＧポリマーが好ましい。好ましくは、ＰＥＧポリマーは、分子量約１０００から約７５００を有し、分子量約２０００から約５０００がさらに好ましい。ＰＥＧ又は他のポリマーは、脂質、例えばＤＰＰＥに、アミド、カルバメート又はアミン結合などの共有結合を介して結合しうる。加えて、ＰＥＧ又は他のポリマーは、例えば、アミド、エステル、エーテル、チオエステル、チオアミド又はジスルフィド結合を含む共有結合により、ターゲッティングリガンド又は他のリン脂質に結合しうる。親水性ポリマーがＰＥＧである場合、このようなポリマーを支持する脂質は、「ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）されている」と言われる。好ましい形態では、親水性ポリマーを支持する脂質は、例えば、重量平均分子量約５０００のポリエチレングリコールポリマーを有するＤＰＰＥ（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００）のことであるＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を含むＤＰＰＥ−ＰＥＧであってよい。他の適切なぺグ化脂質には例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含むジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ジパルミトイル−グリセロ−スクシネート−ポリエチレングリコール（ＤＰＧＳ−ＰＥＧ）、ステアリルポリエチレングリコール及びコレステリル−ポリエチレングリコールが含まれる。
【０１３５】
本発明の一定の好ましい実施形態では、脂質組成物は、ＤＰＰＣ約７７．５モル％、ＤＰＰＡ１２．５モル％及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００  １０モル％を含有する。ＤＰＰＣ約８０から約９０モル％、ＤＰＰＡ約５から約１５モル％及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００約５から約１５モル％を含有する組成物も、好ましい。ＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００をそれぞれ、モル％比８２：１０：８で含有する組成物が、特に好ましい。ホスファチジル部分は負に荷電しており、コリン部分は正に荷電しているので、ＤＰＰＣは実質的に、中性である。したがって、負に荷電しているＤＰＰＡを、前記の機構に従い安定性を高めるために加えることもできる。ＤＰＰＥ−ＰＥＧは、ＤＰＰＥ成分により、ベシクルの脂質膜又はスキンに結合しているペグ化物質に、ベシクル膜又はスキンを取り囲みうるＰＥＧ成分をもたらし、したがって、このような異物を退化させることをその機能とする体内の様々な酵素又は他の内在作用物質に対する物理的バリアを形成する。ＤＰＰＥ−ＰＥＧは、所定の比で、ＤＰＰＣ及びＤＰＰＡなどの他の脂質と組み合わされると、圧力に対して安全で、安定な比較的小さいサイズの他のベシクルをもたらしうる。水とのその構造的な相似により、ペグ化物質は、ヒト免疫系のマクロファージの作用を無効にすることができ、そうでなければ、ヒト免疫系は、異物を取り囲み、除去する傾向を有すると、理論化される。その結果、安定化されたベシクルが、画像診断造影剤として機能している時間が長くなる。
【０１３６】
調製されたベシクルが、前記の安定性及び他の基準を満たすならば、ベシクル組成物を、前記の物質に加えて、他の物質から調製することもできる。これらの物質は、基本的かつ重要で、安定化されたガス及びガス前駆体充填ベシクルを作るか、生じさせるための一次的な基礎を形成してよい。他方で、これらは、補助的で、基本的な安定化材料の機能を高めるか、基本的な安定化材料により与えられる特性に加えて、望ましい特性を与えることができる補助的又は補足的な物質として作用しうる。
【０１３７】
しかしながら、所定の物質が基本的物質であるか、補足的な物質であるかを決定することは、必ずしも可能ではない。それというのも、該当する物質の機能は経験的に、例えば、安定化ベシクルの製造に関して生じる結果により決められるためである。これらの基本的物質及び補足的物質がどのように機能するかの例として、生体適合性脂質及び水又は生理食塩水の簡単な組合せを振盪すると、往々にして、濁った溶液が得られことが観察され、続いて、殺菌のためにオートクレーブ処理される。このような濁った溶液は、造影剤として機能するが、美観上好ましいものでなく、また未溶解又は未分散の脂質粒子の形の不安定性を伴う。濁った溶液は望ましくなく、その際、未溶解の微粒子物質は、約７μｍより大きい、特には約１０μより大きい直径を有する。除菌などの製造ステップは、未溶解の微粒子物質を含有する溶液では、問題となりうる。したがって、脂質粒子の分散又は溶解を容易にすることにより、濁りを除去するために、プロピレングリコールを添加することができる。プロピレングリコールは、湿潤剤として機能し、これは、ベシクル膜又はスキン上の表面張力を高めることにより、ベシクル形成及び安定化を改善しうる。プロピレングリコールは、ベシクルの膜又はスキンを被覆する付加的な層として機能しうることが可能で、したがって、付加的な安定化が生じる。このような更なる基本的又は補足的安定化物質の例として、使用することができる慣用の界面活性剤が存在する；Ｄ’Ａｒｒｉｇｏ  米国特許第４６８４４７９号及び同第５２１５６８０号参照。
【０１３８】
付加的な補足的及び基本的安定化物質には、落花生油、キャノーラ油（ｃａｎｏｌａ  ｏｉｌ）、オリーブ油、ベニバナ油、トウモロコシ油又は、ここでの教示に従い安定化化合物として使用するために適していて、摂取可能と一般的に知られている他の油などの物質が含まれる。様々な補足的及び基本的安定化物質は、例えばＵｎｇｅｒの米国特許第５７３６１２１号に記載されていて、その記載をここでは全て、参照して援用する。
【０１３９】
加えて、混合ミセル系を製造するために使用される化合物が、基本的又は補足的安定化物質としての使用に適し、これらには例えば、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（ドデシル−）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ヘキサデシル−）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（テトラデシル−）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（ここで、アルキルは、Ｃ１２、Ｃ１４又はＣ１６）、臭化／塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化／塩化セチルジメチルエチルアンモニウム又は臭化／塩化セチルピリジニウムが含まれる。
【０１４０】
ここに記載の様々な付加的又は補足的安定化物質を選択することにより、本発明で使用されるガス及びガス前駆体充填ベシクルを、サイズ、可溶性及び熱安定性に応じて調整することができる。これらの物質は、膜とのその物理的相互作用によるだけでなく、ガス及びガス前駆体充填ベシクルの表面の粘度及び界面張力を改質するその能力によって、ベシクル、特に脂質から処方されたベシクルのこれらのパラメーターに影響を及ぼすことができる。したがって、例えば、（ａ）例えば、炭水化物及びそのリン酸化及びスルホン化誘導体；好ましくは４００から１０００００の分子量範囲を有するポリエーテル；及び好ましくは、２００から５００００の分子量範囲を有するジ−及びトリヒドロキシアルカン及びそのポリマーを含む、粘度調整剤；（ｂ）例えば、アラビアゴム、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリルを含むステアリン酸エステル類、ラノリンアルコール、レシチン、モノ−及びジ−グリセリド、モノ−エタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８、ポロキサマー１８４及びポロキサマー１８１、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシ４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、パルミタテスル（ｐａｌｍｉｔａｔｅｓｌ）及び乳化ワックスを含む乳化及び／又は可溶化剤；（ｃ）例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウム及びナトリウム及びナトリウム１２、カラギナン、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガーゴム、イナゴマメゴム、ヴィーガム（ｖｅｅｇｕｍ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウム−アルミニウム、Ｚｅｏｌｉｔｅｓ（登録商標）、メチルセルロース、ペクチン、酸化ポリエチレン、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム、α−ｄ−グルコノラクトン、グリセロール及びマンニトールを含む懸濁剤及び／又は粘度上昇剤；（ｄ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）及びポリソルベートなどの合成懸濁剤；並びに（ｅ）例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、スクロース、プロピレングリコール及びグリセロールを含む、安定化させ、張性を加える張性上昇剤からなる幅広いバリエーションのうちの１種又は複数を加えることにより、本発明で使用されるガス及びガス前駆体充填ベシクルは、好適に改質及びさらに安定化することができる。
【０１４１】
前記のように、本発明の組成物はさらに、ターゲッティングリガンドを含有する。一般的には、ターゲッティングリガンドとして使用することができる物質には例えば、抗体、糖タンパク質及びレクチンを含むタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、単糖類及び多糖類を含む糖類、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ホルモン、補因子、生物活性剤並びにヌクレオシド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む遺伝物質が含まれる。
【０１４２】
本発明の組成物中に導入されるターゲッティングリガンドは好ましくは、インビボで受容体及び／又は組織をターゲットとしうる物質である。前記のように、組織をターゲットとすることに関して、ターゲッティングリガンドは望ましくは、心筋細胞並びに内皮細胞及び上皮細胞を含む膜組織を含む心臓組織をターゲットとしうる。受容体の場合には、ターゲッティングリガンドは望ましくは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとしうる。前記の組織及び受容体を含む組織及び／又は受容体をターゲットとする際に使用するために好ましいターゲッティングリガンドは、タンパク質、ペプチド、糖類、ステロイド、ステロイド類似体、生物活性剤並びに例えば抗体を含む遺伝物質、糖タンパク質及びレクチンからなる群から選択され、ペプチドが好ましい。ターゲッティングリガンドとして使用するために好ましいタンパク質の例は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの多くの株により産生されるタンパク質であるプロテインＡである。プロテインＡは、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から市販されている。プロテインＡは、様々なＩｇＧ抗体を結合するために使用することができる。一般的には、ターゲッティングリガンドとして特に有効なペプチドには、天然の、変性された天然の、又は合成ペプチドが含まれ、これらは、血管に循環しているエステラーゼ、アミダーゼ又はペプチダーゼによる劣化に対する付加的なモードの耐性をもたらす。ペプチド成分を安定化する非常に有効な方法の１つは、環化技術を使用することを伴う。例としては、カルボキシ末端が、アミド結合を介してアミン末端に共有結合する末端−末端環化は、ペプチド劣化を阻害し、循環寿命を増加するために役立つ。さらに、側鎖−側鎖環化も、安定性をもたらす際に特に役立つ。加えて、末端−側鎖環化も、変性に役立つ。加えて、ペプチドの戦略的（ｓｔｒａｔｅｇｉｃ）領域中のＤ−アミノ酸をＬ−アミノ酸に置換することは、生物分解に対する耐性をもたらす。適切なターゲッティングリガンド及びその調製方法は、この記載を得れば、当技術分野の専門家には、容易に分かるであろう。
【０１４３】
内皮細胞をターゲットとすることに関連して、適切なターゲッティングリガンドには例えば、１種又は複数の次のものが含まれる：例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、α型形質転換成長因子（ＴＧＦ−α）、β型形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びヒト成長因子（ＨＧＦ）を含む成長因子；アンジオジェニン；α型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びβ型腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−β）を含む腫瘍壊死因子；約４５００の分子量を有する銅含有ポリリボヌクレオチドアンギオトロピン（ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ）、さらに、１−ブチリルグリセロールなどの低分子量の非ペプチド血管由来因子；例えば、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含む、プロスタグランジン；ニコチンアミド；アデノシン；ジピリダモール；ドブタミン；例えば、ヒアロビウロン酸を含む、β結合の加水分解により生じる分解産物などのヒアルロン酸分解産物；例えば、コラゲナーゼ阻害剤を含む、血管形成阻害剤；ミノサイクリン；メドロキシプロゲステロン；６−Ｏ−硫酸及び６−Ｏ−カルボキシメチル基で化学的に改質されているキチン；テトラヒドロコルチゾルなどの血管新生抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）ステロイド；並びに例えば、コルチゾン又はヒドロコルチゾンなどのステロイドと混合されている、分子量約６０００を有する断片などのヘパリンの断片を含む、ヘパリン；アンギオインヒビン（ａｎｇｉｏｉｎｈｉｂｉｎ、ＡＧＭ−１４７０：血管新生抑制抗生物質）を含む、血管形成阻害剤；血小板第４因子；プロタミン；Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ種の細菌膜に由来する硫酸化多糖類ペプチドグリカン錯体；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓに由来するフマギリンなどのカビ由来血管形成阻害剤；Ｄ−ペニシラミン；チオリンゴ酸金；トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）；例えば、１−α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び合成類似体の２２−オキサ−１−α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を含む、ビタミンＤ３類似体；α−インターフェロン；例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−８（ＩＬ−８）を含む、インターロイキンなどのサイトカイン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）；ヘパリンの低分子量断片又はヘパリンの類似体を含む、ヘパリン；α−、β−及びγ−シクロデキストリンを含む、シクロデキストリンなどの簡単な硫酸化多糖類；テトラデカ硫酸塩；トランスフェリン；フェリチン；血小板第４因子；プロタミン；銅と錯化しているＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ；セルロプラスミン；（１２Ｒ）−ヒドロキシエイコサトリエン酸；オカダ酸；レクチン；抗体；ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８；及びＶＬＡインテグリン−４（ＶＬＡ−４）。
【０１４４】
内皮性白血球付着分子（ＥＬＡＭ）は、ストレス条件下に内皮細胞により発現され、血管系をライニングしている内皮を介して、周囲組織へと白血球が移動するのを容易にする抗原である。これらの同じ内皮性白血球付着分子を有利に、ベシクルのターゲッティングのための受容体として利用することができることは意外な発見である。これらの内皮細胞付着分子は、セレクチンとして知られているファミリーに属し、このファミリーでは、ＧＭＰ−１４０などの知られているメンバーは全て、内皮性白血球付着に関係し、ＥＬＡＭ−１、ＬＡＭ−１及び、血小板活性−依存性顆粒外膜タンパク質（ＰＡＤＧＥＭ）としても知られている顆粒膜タンパク質１４０（ＧＭＰ−１４０）、ＶＣＡＭ−１／ＩＮＣＡＭ−１１０（血管付着分子／誘導性付着分子）及びＩＣＡＭ−１（細胞内付着分子）が含まれる。細胞付着分子のカドヘリンファミリーも、ターゲッティングリガンドとして使用することができ、例えば、Ｅ−、Ｎ−及びＰ−カドヘリン、カドヘリン−４、カドヘリン−５、カドヘリン−６、カドヘリン−７、カドヘリン−８、カドヘリン−９、カドヘリン−１０及びカドヘリン−１１が含まれ、カドヘリンＣ−５が最も好ましい。さらに、例えば、モノクローナル抗体Ｅｃ６Ｃ１０などのカドヘリンを対象とする抗体を、特異的内皮細胞により局所的に発現されるカドヘリンを認識するために使用することもできる。
【０１４５】
幅広い異なるターゲッティングリガンドを、ＥＬＡＭ分子の細胞質ドメインに結合するために選択することができる。該当するターゲッティングリガンドには、レクチン、幅広い炭水化物又は糖成分、抗体、抗体断片、例えばＦＡｂ’２などのＦＡｂ断片並びに、創傷治癒を対象としうる例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ｒ−Ｇ−Ｄ）を含む合成ペプチドが含まれる。これらの物質の多くは、天然源に由来しうるが、いくつかは、分子生物学的組換え技術により合成することができ、他は、元から合成であってよい。当技術分野で現在知られている様々な組合せ化学技術により、ペプチドを調製することができる。ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８などのヒト白血球源に由来するか、それから変性されているターゲッティングリガンド及び白血球細胞表面糖タンパク質（ＬＦＡ−１）は、内皮細胞受容体ＩＣＡＭ−１に結合すると知られているようなものと同様に使用することができる。免疫グロブリンスーパーファミリーのサイトカイン誘導メンバーである単核白血球選択的なＶＣＡＭ−１を、ターゲッティングリガンドとして使用することもできる。ヒト単球に由来するＶＬＡ−４は、ＶＣＡＭ−１をターゲットとするために使用することができる。抗体及び他のターゲッティングリガンドは、内皮細胞増殖マーカーであるエンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）をターゲットとするために使用することができる。エンドグリンは、多種多発性充実性腫瘍中の内皮細胞にアップレギュレーションされる。エンドグリンをターゲットとするために使用することができるターゲッティングリガンドは、抗体ＴＥＣ−１１である。Ｒ．Ｅ．Ｔｈｏｒｐｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｊ．Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２３７−５１（１９９５）。
【０１４６】
本発明では、アテローム硬化の環境での内皮細胞活性を、例えばアテローム斑を含む、アテローム硬化の領域に対して組成物をターゲット化するために使用する。使用することができるこのようなターゲットの１つは、ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭとしてのＲｂ１／９により認識される誘導性単核白血球内皮付着分子である。モノクローナル抗体のＨ４／１８及びＨ１８／７を、サイトカイン化学伝達物質により惹起される内皮細胞表面抗原をターゲットとするために使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、深刻な損傷が生じる前に、例えば、脳卒中又は心筋梗塞の前に、疾患血管を非観血に検出して、適切な医学的又は外科的干渉を実施することができるように、ガス充填ベシクルを、アテローム斑に対してターゲット化する。ＡＴＨＥＲＯ−ＥＬＡＭは、好ましいターゲットであり、アテローム硬化の際に内皮細胞上に発現されるこの細胞表面エピトープをターゲットとするために、抗体、ペプチド又はレクチンあるいはこれらの組合せ等のリガンドを、使用することができる。もしくは、低密度又は高密度リポタンパク質から誘導されるリポタンパク質又はリポタンパク質断片を、ターゲッティングリガンドとして使用することができる。加えて、内皮細胞をターゲットとし、脂質、ベシクルなどをアテローム斑の領域に局在させるために、コレステロールを使用することができる。ターゲッティングリガンドとしてコレステロールを使用する実施形態では、コレステロールは好ましくは、他の化学的基、成分、リガンドなどで修飾（非誘導体化）しない。
【０１４７】
斑中の血栓性物質を対象とするターゲッティングリガンドを、アテローム斑の活性領域と非活性領域とを区別するために使用することができる。血栓の発生プロセスでの活性斑はより危険である。それというのも、これらの斑は最終的に、血管を詰まらせるか、塞栓をもたらすためである。これに関して、低分子量のヘパリン断片に加えて、例えば、血小板活性化因子を対象とする抗線維抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、抗トロンビン抗体及びフィブリン抗体などの他のターゲッティングリガンドを、血餅の発生を伴う活性斑をターゲットとするために使用することができる。最も好ましいターゲッティングリガンドは、Ｐ−セレクチンをターゲットとすることに加えて、活性化血小板中の形質膜随伴ＧＰＩＩｂＩＩＩａ及び、ＧＰＩＩｂＩＩＩａを対象とする抗体又は随伴抗体断片をターゲットとするものである。本発明は、急性心筋梗塞の領域を検出するためにも使用することができる。通常、抗ミオシン（特に、心筋ミオシン）抗体又は抗アクチン抗体を、脂質、ポリマー又は安定化物質に結合することにより、梗塞心筋を、本発明の方法により検出することができる。肉芽組織をターゲットとするためには（創傷治癒）、前記のターゲッティングリガンドの多くを使用することができる。創傷治癒トリペプチド、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）を、これに関連するターゲッティングリガンドとして使用することもできる。
【０１４８】
前記の内皮細胞と同様に、幅広いペプチド、タンパク質及び抗体を、上皮細胞をターゲットとするためのターゲッティングリガンドとして使用することができる。好ましくは、上皮細胞ターゲット受容体に対して高い親和性を有する合成、半合成又は天然由来のペプチドを含むペプチドを選択することができるが、合成ペプチドが、より好ましい。これらの好ましい実施形態では、約５から約１５個のアミノ酸基を有するペプチドが好ましい。抗体は、天然由来又は組換え由来の全抗体又は抗体断片、例えばＦａｂ又はＦａｂ’２として使用することができる。天然由来の抗体は、動物又はヒト由来であってよいか、キメラであってよい（マウス／ヒト）。ヒト組換え又はキメラ抗体が好ましく、断片が、全抗体よりも好ましい。
【０１４９】
本発明でターゲッティングリガンドとして使用することができるモノクローナル抗体の例には、舌の全ヒト扁平上皮癌でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化し、抽出された脾臓細胞とＮＳ１同系骨髄腫細胞系のものとを交叉させてハイブリドーマを生じさせることによるＣＡＬＡＭ２７が含まれる。Ｇｉｏａｎｎｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４７，ｐｐ．４４１７−４４２４（１９８７）。ＣＡＬＡＭ２７は、正常及び悪性上皮細胞の両方の表面エピトープを対象としている。正常なリンパ節は通常、これらのエピトープを発現する細胞は含有しない。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４７，ｐｐ．４４１７−４４２４（１９８７）参照。したがって、この抗体を含有する脂質及び／又はベシクル組成物は、リンパ節への転移をターゲットとするために使用することができる。モノクローナル抗体３Ｃ２は、重症の卵巣ガン及び子宮内膜ガンの悪性上皮細胞をターゲットとするためのターゲッティングリガンドとして使用することができる。他の代表的なターゲッティングリガンドは、Ｍａｂ４Ｃ７であり（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４５，２３５８−２３６２，１９８５参照）、これは、粘液性ガン、子宮内膜及び中腎ガンをターゲットとするために使用することができる。頭部及び頚部のガンでの扁平上皮癌をターゲットとするためには、Ｍａｂ  Ｅ４８（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｖｏｌ．０９９  Ｉｓｓｕｅ．０６６  Ｒｅｆ．０８２７４８）を、ターゲッティングリガンドとして使用することができる。悪性黒色腫をターゲットとするためには、モノクローナル抗体２２５．２８ｓ（Ｐａｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３８（８），ｐｐ．８６６−８６９，１９９０）を使用することができる。
【０１５０】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、繊維芽細胞成長因子受容体、ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ−２及び腫瘍随伴炭水化物抗原などの乳ガンに随伴する抗原を含む、抗原をターゲットとするために、ターゲッティングリガンドを選択することができる（Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．７４（３）ｐｐ．１００６−１２（１９９４））。サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）８、１８及び１９に相似しているＣＴＡ１６．８８は、結腸、すい臓、乳房、卵巣及び肺のガンを含む、多くの内皮由来腫瘍により発現される。したがって、ＣＴＡ１６．８８上の異なるエピトープを認識する１６．８８（ＩｇＭ）及び８８ＢＶ５９（ＩｇＧ３ｋ）などの、これらのサイトケラチンを対象とする抗体を（Ｓｅｍｉｎ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２３（２），ｐｐ．１６５−７９（１９９３））、ターゲッティングリガンドとして使用することができる。結腸ガンをターゲットとするためには、抗−ＣＥＡ  ＩｇＧ  Ｆａｂ’断片を、ターゲッティングリガンドとして使用することができる。化学的に共役な二重特異性抗細胞表面抗原、抗−ハプテンＦａｂ’−Ｆａｂ抗体を、ターゲッティングリガンドとして使用することもできる。ＭＧ系モノクローナル抗体を、例えば、胃ガンをターゲットとするために選択することができる（Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｊ．，Ｖｏｌ．６（１），ｐｐ．５６−５９（１９９１）。
【０１５１】
ターゲッティングリガンドをそのために選択することができる、様々な内皮細胞上の細胞表面エピトープが存在する。例えば、タンパク質ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、皮膚及び粘膜中の良性及び悪性上皮増殖に随伴している。２種のＨＰＶオンコジンタンパク質、Ｅ６及びＥ７をターゲットとすることができる。それというのも、これらは、子宮頚癌などの特定の上皮由来ガンで発現されうるためである。Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．６（５），ｐｐ．７４６−５４（１９９４）参照。ガン細胞増殖に関わるペプチド成長因子（ＰＧＦ−Ｒ）のための膜受容体を、腫瘍抗原として選択することもできる。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，Ｖｏｌ．５（４），ｐｐ．３７９−９３（１９９４）。さらに、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びインターロイキン−２を、これらの受容体に結合するペプチドを含む適切なターゲッティングリガンドのターゲットとすることができる。悪性黒色腫細胞により発現される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）及び付着分子などの一定の黒色腫随伴抗原（ＭＡＡ）を、ここで提供されている組成物のターゲットとすることができる（Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１５（４），ｐｐ．１８８−２０２（１９９４））。ガン細胞の表面に位置する腫瘍随伴抗原ＦＡＢ−７２を、ターゲットとして選択することもできる。
【０１５２】
心筋細胞をターゲットとするために、幅広いターゲッティングリガンドを選択することができる。代表的なターゲッティングリガンドには例えば、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ’２断片を含有するか、ヒト由来、動物由来、例えばマウス由来又はキメラ由来であってよい抗カルジオミオシン（ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｍｙｏｓｉｎ）抗体が含まれる。付加的なターゲッティングリガンドには、ジピリダモール；ジギタリス；ニフェジピン；アポリポタンパク質；α−ＬＤＬ、ｖＬＤＬ及びメチルＬＤＬを含む低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）；リアノジン（リアノジン）；エンドセリン；補体レセプター１型；ＩｇＧ  Ｆｃ；β型１−アドレナリン性；ジヒドロピリジン；アデノシン；鉱質コルチコイド；ニコチン様アセチルコリン及びムスカリン様アセチルコリン；ヒトα１Ａ−アドレナリン受容体に対する抗体；α１−アンタゴニストプラゾシンを含む薬剤などの生物活性剤；抗−β−受容体に対する抗体；抗β受容体に結合する薬剤；抗−心ＲｙＲ抗体；心組織上に強力な陽性変力効果を及ぼす内皮細胞由来血管収縮ペプチドであるエンドセリン−１（エンドセリン−１は、心筋細胞膜ベシクルに結合する）；Ｔ細胞受容体α−β受容体に対して生じるので、ターゲッティングリガンドを生じさせるために使用することができるモノクローナル抗体；補体阻害剤ｓＣＲ１；ジヒドロピリジン受容体に対して生じる薬剤、ペプチド又は抗体；抗インターロイキン２受容体を対象とするモノクローナル抗体を、本組成物の対象を心筋組織の領域とするためのターゲッティングリガンドとして使用することができ、その際、心筋組織が、この受容体を発現し、炎症の状態でアップレギュレーションされる；同様に、組成物の対象を炎症心筋組織の領域とするためにシクロスポリン；メチルイソブチルイソニトリル；心筋細胞及び心内皮細胞の膜上で特定の糖類に結合するレクチン；内在低血圧及び血管緊張性ペプチドであるアドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ；ＡＤＭ）；心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）；内皮細胞由来の２２アミノ酸ペプチドであり、構造的に、心房性ナトリウムペプチドに類似しているが、遺伝子的に異なり、血管作動性及び抗分裂促進活性を有するＣ型心房性ナトリウムペプチド（ＣＮＰ）；心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）及びＣ型心房性ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＣＮＰ）のキメラであり、２７個のアミノ酸を含むバソナトリン（ｖａｓｏｎａｔｒｉｎ）ペプチド（ＶＮＰ）；トロンビン；内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）；天然エンドペプチダーゼ１（ＮＥＰ−１）；例えば、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）を含むＥＤＲＦに対する補体阻害剤；カリブドトキシン（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）及びグリベンクラミドなどのカリウムチャネルアンタゴニスト；患者では、特発性拡張型心筋症とみなされるが、好ましいことに、心筋中の細胞融解を惹起することはない抗心臓抗体；アデニンヌクレオチドトランスロケーター、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ又は心ミオシンを対象とする抗体；ＢＱ−１２３とも称されるエンドセリン−Ａ受容体のための特異的アンタゴニスト；及びアンギオテンシンＩＩ受容体に対する抗体が含まれる。
【０１５３】
心筋細胞膜の主な抗原のうちの２種は、ジヒドロピリジン受容体と共に同時浄化（ｃｏｐｕｒｉｆｙ）されるカルシウム結合糖タンパク質である。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を含む抗血清は、精製筋細胞膜に対して上昇しうる。これらの抗体は、ターゲッティングリガンドとして使用することができる。カルシウム結合糖タンパク質の精製分率は、筋細胞膜の形質膜から単離して、抗体を生じさせるために使用することができる。前記のように、ターゲッティングリガンドとして使用することができるＡＮＰは、ヒト大動脈内皮細胞の培養から得ることができる。ＡＮＰは通常、内皮に局在するが、内皮又は心筋組織にも局在しうる。例えば、組換え技術を使用して、さらに、当技術分野の専門家によく知られているペプチド合成技術を使用するペプチド合成により、ＡＮＰは調製することができる。ＡＮＰを対象とするポリクローナル又はモノクローナルの抗体を使用することもできる。同様に、ＡＮＰを対象とするペプチドを、内皮及び／又は心筋細胞をターゲットとするために使用することもできる。心房性ナトリウム排泄増加性因子のβ型及びα型の両方を、本組成物の対象を心筋組織にするための強力なターゲッティングリガンドとして使用することができる。
【０１５４】
本脂質組成物、特にベシクル組成物の対象をＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体とするために、幅広いターゲッティングリガンドを使用することができる。好ましい形態では、ターゲッティングリガンドは、約１０−３モル以下の、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体に対する結合親和性（Ｋｄ）を示す。さらに好ましくは、ターゲッティングリガンドは、例えば、約１０−９モルから約１０−３モル未満の範囲の結合親和性及びこの範囲内の結合親和性の全ての組合せ及び二次的組合せなどの、約１０−３モル未満のＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体に対する結合親和性（Ｋｄ）を示す。いっそう好ましくは、ターゲッティングリガンドは、約１０−７モルから約１０−５モルのＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体に対する結合親和性（Ｋｄ）を示し、約１０−６モルの結合親和性が特に好ましい。
【０１５５】
ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体を対象とする組成物は、血管血栓又は血餅をターゲットとするために非常に有効であり、診断、さらにこのような血餅を治療するために有効である。一定の好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドは、例えばＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）などの配列Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＧＤ）を含有するペプチドである。他の好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドは、例えば、フィブリノゲンのγ−カルボキシ配列である配列Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＫＱＡＧＤＶ）を含有するペプチドなどの、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＡＧＤ）を含有するペプチドである。
【０１５６】
本発明の組成物及び方法で使用するために適しているターゲッティングリガンドには、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ）及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ）などのペプチドが含まれる。例えば、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含有する環式ペプチドであるＧ４１２０を含む、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含有するペンタペプチドも使用することができる。例えば、
ＮＫＬＩＶＲＲＧＱＳＦＹＶＱＩＤＦＳＲＰＹＤＰＲＲＤＬＦＲＶＥＹＶＩＧＲＹＰＱＥＮＫＧＴＹＩＰＶＰＩＶＳＥＬＱＳＧＫＷＧＡＫＩＶＭＲＥＤＲＳＶＲＬＳＩＱＳＳＰＫＣＩＶＧＫＦＲＭＹＶＡＶＷＴＰＹＧＶＬＲＴＳＲＮＰＥＴＤＴＹＩＬＦＮＰＷＣＥＤＤＡＶＹＬＤＮＥＫＥＲＥＥＹＶＬＮＤＩＧＶＩＦＹＧＥＶＮＤＩＫＴＲＳＷＳＹＧＱＦ−Ｒ’（ここで、Ｒ’は、−ＣＯＮＨ２又は−ＮＨ２である）
などの断片を含む、ヒト凝固因子ＸＩＩＩＡに由来するペプチドも使用することができる。加えて、ＸＩＩＩＡ因子の断片であるペプチドは、その配列中に、配列
ＮＫＬＩＶＲＲＧＯＳＦＹＶＱＩＤＦＳＲＰＹＤＰＲＲＤ又は
ＤＤＡＶＹＬＤＮＥＫＥＲＥＥＹＶＬＮＤＩＧＶＩＦＹＧＥＶＮＤＩＫＴＲＳＷＳＹＧＱＦ
を含む断片である。
【０１５７】
ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドとして使用することができる付加的なペプチドには例えば、アミノ−カルボキシ末端から結合していて、活性化血小板上のＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合領域に結合しうる、アルギニン−チロシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ；略称ＲＧＤ）のトリペプチド配列を有するペプチドが含まれる。このようなペプチドの例には例えば、一般式：Ｒ１−（Ｘ１）ｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−（Ｙ）０−（Ｘ２）ｍ−Ｒ２のペプチドが含まれる［式中、Ｘ１、Ｘ２及びＹはそれぞれ独立に、１個又は複数のアミノ酸基であるが、一定のケースでは、Ｙは、セリン又はアラニン基以外であるのが好ましく、ｍ、ｎ及びｏはそれぞれ独立に、０又は１であり、ただし、一定のケースでは、ｍが１である場合には、ｏは１であり、Ｒ１は、保護されているか、保護されていない末端アミノ基であり、Ｒ２は、保護されているか、保護されていない末端カルボキシ基である］。好ましい実施形態では、Ｘ１は、ペプチドＡｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒであり、Ｘ２は、ペプチドＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒである。使用することができるペプチドには、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ及びＡｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒが含まれる。
【０１５８】
配列ＸＸ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ここで、ＸＸは、直鎖の側鎖を有する合成α−アミノ酸である）を含むフィブリノゲン受容体アンタゴニスト化合物などの、天然アミノ酸配列と合成アミノ酸とを組み合わせた合成化合物、例えば、
【化１１】
2005500245.tif 000016
［上式中、ｎ＋ｎ’は、３であり；ＡＡは、単結合であり；Ｒは、フェニル又はベンジルである］
又は
−（ＣＨ２）ｎ−ＡＡ−（ＣＨ２）ｎ’−ＮＨＲ
［上式中、ｎは、１から４の整数であり；ｎ’は、２から４の整数であり；ＡＡは、酸素、イオウ又は単結合であり；Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいアリールメチル又は置換されていてもよいシクロアルキルであり、一定のケースでは、ＡＡが、単結合であり、Ｒが、Ｈである場合には、ｎ＋ｎ’は、３又は４以外である］
を、ターゲッティングリガンドとして使用することもできる。
【０１５９】
他のこのような化合物は、次式のフィブリノゲン受容体アンタゴニストを含有する
【化１２】
2005500245.tif 000017
［上式中、ＸＸは、次式の直鎖の側鎖を含有する合成α−アミノ酸であり
【化１３】
2005500245.tif 000018
（上式中、ｎ＋ｎ’は、３であり；ＡＡは、単結合であり；Ｒは、フェニル又はベンジルである）又は
−（ＣＨ２）ｎ−ＡＡ−（ＣＨ２）ｎ’−ＮＨＲ
（上式中、ｎは、１から４の整数であり；ｎ’は、２から４の整数であり；ＡＡは、酸素、イオウ又は単結合であり；Ｒは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいシクロアルキルであり、一定のケースでは、ＡＡが、単結合であり、Ｒが、Ｈである場合には、ｎ＋ｎ’は、３又は４以外である）、ＺＺは、置換されていてもよいアミノ酸１から４個からなる配列である］。
【０１６０】
ターゲッティングリガンドとして使用するための他の有効なペプチドには例えば、次の配列を有する「エレガンチン（Ｅｌｅｇａｎｔｉｎ）」：
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ−Ｒ’−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ここで、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立に、アミノ酸である）；次の配列を有する「アルボラブリン（Ａｌｂｏｌａｂｒｉｎ）」：
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ；次の配列を有する「バトロキソスタチン（Ｂａｔｒｏｘｏｓｔａｔｉｎ）」：
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ；次の配列を有する「フラボリジン（Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）」：
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｒ−Ｒ’−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（ここで、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立に、アミノ酸である）が含まれる。
【０１６１】
ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするために有効な他のリガンドには、Ａｃ（Ｄ）Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ボロＡｒｇ及び環式ペプチド様シクロ（Ｄ−２−アミノブチレート−Ｎ−メチル−Ｌ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アスパルチル−３−アミノ−メチル安息香酸）メタンスルホン酸塩などの合成化合物が含まれる。使用することができるペプチドには、システイン基が横に位置するヘキサペプチド（環式ジスルフィドを形成しうる）及び配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ又はＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有する環式のジスルフィド結合した形のペプチド、さらに、カルボキシル末端由来ペプチドＲＥＹＶＶＭＷＫのライブラリが含まれる。トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）などの一定のマトリックス糖タンパク質も、これに関して使用することができる。プラスミノゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）などのセリンプロテアーゼ阻害剤のセルピンファミリーのメンバーは、別の有効なリガンドである。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするために有効な他の合成化合物には例えば、チクロピジン、クロピドグレル（ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、チロフィブラン（ｔｉｒｏｆｉｂｒａｎ）及びアブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）及びこれらの類似体及び誘導体が含まれる。
【０１６２】
一般的には、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体のためのターゲッティングリガンドとして、約３から約２０個のアミノ酸を有するペプチドを使用するのが好ましいが、約４個から約１５個のアミノ酸を有するペプチドが、さらに好ましい。いっそう好ましくは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体のためのターゲッティングリガンドは、アミノ酸約４個から約８個を有するペプチドを含有するが、約４個から約６個又は約５個のアミノ酸を有するペプチドが、特に好ましい。
【０１６３】
望ましい場合には、（１）例えば、システイン又はペニシラミンを含む、チオールを含有するアミノ酸又はその同族体を、酸化を介してジスルフィド結合させることを含む、側鎖−側鎖共有結合により；（２）例えば、アミノ酸配列のアミノ末端及び例えば、非臨界グルタミン酸又はアスパラギン酸基などの側鎖カルボキシル酸基を使用することを含む、末端−側鎖共有結合により、ペプチドを環化することができる。もしくは、末端−側鎖共有結合は、アミノ酸のカルボキシレート末端及び側鎖アミン、アミジン、グアニジン又は、例えば、リシン、アルギニン、ホモアルギニン、ホモリシンなどを含む側鎖基などの、求核窒素原子を含有する側鎖中の他の基に関する；（３）共有アミド結合である末端−末端共有結合など。このようなプロセスは、当技術分野の専門家にはよく知られている。ペプチドは、フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）アミノ酸を付加することにより環化することもできる。例えば、トリペプチドＲＧＤを含むターゲッティングリガンドの場合には、フランキングアミノ酸の付加によって、（Ｘ）ｎ−ＲＧＤ−（Ｙ）ｎの形にし（ここで、ｎは、約１から約１００の整数であり、Ｘ及びＹは、天然又は合成アミノ酸である）、ただし、該当するアミノ酸の少なくとも１個は、システイン又はペニシラミンなどの同族体である。これらのターゲッティングリガンドは、システイン側鎖を介して環化することもでき、環化は、ジスルフィド結合を介して生じる。環化の他の形態は、アミノ−カルボキシレートペプチド結合を伴う末端−末端共有結合に関する。加えて、Ｘは、リシン及び／又はアルギニンであってよく、Ｙは、アスパルテート又はグルタメートであってよく、側鎖成分の縮合により環式アミドが生じる。付加的な置換には、末端アミノ又はカルボキシル基との側鎖基反応が含まれる。
【０１６４】
加えて、「偽環化（ｐｓｅｕｄｏｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ）」を使用することもでき、この際、環化は、二次構造をフォールディングして、環式成分の１タイプを生じさせる静電的相互作用などの非共有相互作用を介して生じる。金属イオンが、「偽環」形成の誘導を促進すると考えられる。このタイプの偽環化形成は、「ジンクフィンガー」に類似している。当技術分野の専門家には知られているように、ジンクフィンガーは、ループ（フィンガー）の形の領域での、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）及びシステイン、ペニシラミン及び／又はホモシステインとの間の静電的相互作用による形成に関する。ホモシステインの場合には、ＲＧＤ配列は、フィンガーの先端に位置する。もちろん、本発明の関連では、例えばＲＧＤなどの認識及び結合ペプチドリガンドが、適当なミカエリス‐メンテン定数（ｋｍ）又は結合定数を有する血餅中の適切な受容体に結合するために適した配座及び／又はトポグラフィーを保持しているならば、いずれの安定化環化も適切であると、理解される。ここで使用する場合、「配座」との用語は、ペプチド、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）又は偽ペプチドのバックボーンの三次元的構成のことであり、「トポグラフィー」との用語はここで使用する場合、ペプチド、ペプトイド又は偽ペプチドの側鎖の三次元的構成のことである。
【０１６５】
ターゲッティングリガンドを、本出願の教示を得れば、専門家には分かるであろう様々な方法で、本組成物に導入することができる。脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルを含有する組成物に関する実施形態を含む、一定の好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドは共有結合により、脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルに会合している。脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルを含有する組成物に関する実施形態を含む、一定の別の好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドと組成物の他の成分との間に共有結合性会合は、実質的に存在しない（即ち、ターゲッティングリガンドは、遊離又は未結合である）。例えば、脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルに関する実施形態では、ターゲッティングリガンドは非共有結合により、脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルと会合していてよい。ターゲッティングリガンドが遊離又は非結合である他の好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドを、ターゲッティングリガンドが、共有結合によっても、非共有結合によっても、例えば脂質化合物、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルを含む組成物の他の成分と会合していないような組成物と組み合わせることができる。
【０１６６】
予測されていなかったが意外にも、遊離又は非結合ターゲッティングリガンドも、ガス充填ベシクルを含むベシクル組成物などの本発明の組成物が、例えば血餅を含む所望のターゲットをターゲッティングすることを促進しうることが、判明した。作動の何らかの理論に結びつけることは意図していないが、このような結合は、例えば、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用又はいくつかの他の会合プロセスを介して、ターゲッティングリガンドと、ベシクル表面に存在する脂質を含む脂質などの組成物の他の成分との会合により生じると、考えられる。未結合のターゲッティングリガンドを含有する脂質組成物に関する好ましい実施形態の場合には、例えば、アミノ基などのターゲッティングリガンド中の官能基は自然に、例えばホスファチジン酸成分などの脂質上の基の１個と直接会合又は結合して、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）結合を生じることが可能であると、理論化される。
【０１６７】
したがって、脂質組成物の場合には、望ましくは、ターゲッティングリガンドは、例えば共有又は非共有結合を介して、組成物中に導入されている少なくとも１種の脂質に結合していてよい。脂質以外、例えばクラスレート、エーロゲル及びアルブミンベシクル以外の物質から処方されているベシクルの場合には、ターゲッティングリガンドは、共有結合又は非共有結合により、ベシクル壁に導入されている１種又は複数の物質に結合していてよい。例えば、ターゲッティングリガンドは、例えば、親水性ポリマーに共有結合により結合し、これが今度は、疎水性化合物に共有結合して、ベシクル壁に導入されうる生体複合体を生じてもよい。好ましくは、コレステロールを含む脂質組成物の場合には、ターゲッティングリガンドは、コレステロールに実質的に非共有結合のみによって結合しているか、かつ／又はターゲッティングリガンドは、組成物の成分、例えばコレステロール以外の、リン脂質などの他の脂質に共有結合している。所望の場合には、ターゲッティングリガンドは共有結合により、かつ／又は非共有結合により、他の安定化物質、例えば、組成物中に存在しうる生体適合性ポリマーに結合していてよい。
【０１６８】
例えば、脂質、ポリマー、タンパク質及び／又はベシクルを含む本発明の組成物の他の成分、さらに他の安定化物質に共有結合していてよいターゲッティングリガンドでは、ターゲッティングリガンドは好ましくは、その遠位端に、例えば、そのような共有結合を生じさせるために役立つ官能基を含有してよい。このような遠位官能基の例には例えば、アミノ（−ＮＨ２）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、チオール（−ＳＨ）、ホスフェート、ホスフィネート、スルフェート及びスルフィネートが含まれる。環化ターゲッティングリガンドの場合には、リガンドは好ましくは、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、チオール、ホスフェート、ホスフィネート、スルフェート又はスルフィネートなどの官能基を含み、これらを介して、共有結合が生じるが、これらは通常、所望の受容体、例えばＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体に結合するためには不可欠ではない。環化ターゲッティングリガンドの場合には、環化により好ましくは、例えばＫＱＡＧＤＶなどの配列ＲＧＤ又はＡＧＤなどのターゲッティングリガンドのバックボーン配座及び側鎖トポグラフィーは、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体などの受容体へのリガンドの結合が可能になる。
【０１６９】
他の適切なターゲッティングリガンドには、次の化合物が含まれる：
Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２；Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２；Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２；Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２；Ａｃ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨ２；及びＡｃ−Ｃｙｓ−Ｎ−メチル−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｅｎ−ＣＯＮＨ２（ここで、Ｐｅｎは、ペニシラミン（β，β−ジメチルシステイン）のことである）。
【０１７０】
ターゲッティングリガンドとして使用することができる他の化合物には、次式で示されるペプチド又は誘導体が含まれる
【化１４】
2005500245.tif 000019
［上式中、
Ａは、プロリン、チオプロリン、ヒドロキシプロリン、デヒドプロリン、２−オキソ−４−チアゾリジンカルボン酸、Ｎ−アルキルグリシン又は次式のアミノ酸誘導体
【化１５】
2005500245.tif 000020
、トリプトファン又は次式のトリプトファン誘導体
【化１６】
2005500245.tif 000021
、ピログルタミン酸又は２−アゼチジノン−４−カルボン酸であり、
Ｂは、セリン、グリシン、バリン、アラニン、トレオニン又はβ−アラニンであり；
Ｃは、疎水性官能基を有するアミノ酸基であり、かつ
Ｄは、ヒドロキシ又はアミノであり、
ここで、
Ｒ１は、水素、−（ＣＨ２）ｐＣＨ３又は−ＣＯ−（ＣＨ２）ｐＣＨ３であり、
Ｒ２は、水素又はアルキルであり；
Ｒ３は、水素又はアルコキシであり；
Ｒ４は、水素又はアルキルであり；
Ｒ５は、水素、アミノ又はアシルアミノであり；
ｍは、２から５の整数であり、
ｎは、０から２の整数であり、
ｐは、０から５の整数であり、
ｑは、０から３の整数である］。
【０１７１】
本発明の組成物で使用するために適している他のターゲッティングリガンドは、次式を有するペプチド、そのペプチド誘導体又は塩である
【化１７】
2005500245.tif 000022
［上式中、
Ａは、アロチン酸（ａｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）又はヒドロオロチン酸であり；
Ｂは、アミノ酸であり；
Ｃは、疎水性官能基を有するアミノ酸であり；かつ
Ｄは、ヒドロキシ又はアミノである］。上式の化合物で、「Ｃ」の定義中の疎水性官能基を有するアミノ酸の例は、トリプトファン及びフェニルアラニンである。本発明の組成物中で使用するために適しているさらに別のターゲッティングリガンドは、次式を有するペプチド誘導体である
【化１８】
2005500245.tif 000023
［上式中、上式の構造中の「Ａｍｐ」は、アミノメチルフェニル酢酸である］。本発明で、特に、ＧＰＩＩｂＩＩＩａをターゲットとするためのターゲッティングリガンドとして使用するために適している様々なペプチドが例えば、Ｓａｔｏらの米国特許第５４９８６０１号及び次の公開されているヨーロッパ特許出願：第０３６８４８６Ａ２、同第０３８２４５１Ａ２及び同第０４２２９３８Ｂ１号に記載されており、これらの記載を全て、参照して援用する。前記のものに加えて、本発明の組成物中で使用することができる他のターゲッティングリガンドは、本記載を得れば、当技術分野の専門家には明らかであろう。他の適切なターゲッティングリガンドには例えば、糖成分に結合しているペプチドである複合多糖及びレクチンなどの複合ペプチドが含まれる。組成物は、単一ターゲッティングリガンド、さらに、２種又はそれ以上の異なるターゲッティングリガンドを含有してもよい。
【０１７２】
本発明では、次式を有する化合物も提供する
【化１９】
2005500245.tif 000024
［上式中、
ｘは、０又は１であり；
Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４−、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｃ（＝Ｘ５）−であり；
Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に、直接結合、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−、−Ｘ４−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−であり；
Ｘ４はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−ＮＲ４−又は−Ｓ−であり；
Ｘ５はそれぞれ独立に、Ｏ又はＳであり；
Ｍは、直接結合、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、−Ｒ５−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−であり；
Ｙは、水素又は薬剤として許容される対イオンであり；
Ｚは、直接結合又は親水性ポリマーであり；
Ｑは、ターゲッティングリガンド又はその前駆体であり；
Ｒ１はそれぞれ独立に、１から約５０個の炭素からなるアルキルであり；
Ｒ２はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約３０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素又は１から約１０個の炭素からなるアルキルであり；かつ
Ｒ５はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約３０個の炭素からなるアルキレンであり；
ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうち３個又はそれ以上が、直接結合である場合には、Ｚは、親水性ポリマーであり、Ｚが直接結合である場合には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうち３個又はそれ以上が、直接結合以外である］。
【０１７３】
上式中、特定の式又は置換基中に、記号が１回より多く現れる場合、その意味は、それぞれの場合で、相互に独立している。
【０１７４】
さらに、上式中で、２個又はそれ以上の隣接する記号のそれぞれが、「直接結合」と定義されていて、複数の隣接する直接結合が生じている場合、複数の隣接する直接結合は、単一の直接結合に変わる。加えて、上式中のｘが０である場合、基Ｒ２及びＭは相互に架橋し、「Ｃ」（即ち、Ｘ１−Ｒ１及びＲ３）に直接結合している置換基は、定義されている化合物には存在しない。
【０１７５】
上式中、Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｏ、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−ＮＲ４−、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｃ（＝Ｘ５）−である。好ましい実施形態では、Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｃ（＝Ｘ５）−である。さらに好ましくは、Ｘ１はそれぞれ独立に、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−又は−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−である。特に好ましくは、Ｘ１は、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、例えば−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨである。
【０１７６】
上式中、Ｘ２及びＸ３はそれぞれ独立に、直接結合、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−、−Ｘ４−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−である。好ましい実施形態では、Ｘ２及びＸ３は独立に、直接結合、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４、−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−、−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−、−Ｘ４−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−であるが、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４がさらに好ましい。特に好ましくは、Ｘ２は、直接結合、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、Ｘ３は、直接結合、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２、−ＮＨＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であり、ここで、ｎは、約１から約２０（この範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せを含む）、好ましくは約１から約１５、さらに好ましくは約１から約１０の整数である。
【０１７７】
上式中、Ｘ４はそれぞれ独立に、−Ｏ−、−ＮＲ４−又は−Ｓ−である。好ましくは、Ｘ４はそれぞれ独立に、−Ｏ−又は−ＮＲ４−である。
【０１７８】
上式中、Ｘ５はそれぞれ独立に、Ｏ又はＳである。好ましくは、Ｘ５は、Ｏである。
【０１７９】
上式中、Ｍは、直接結合、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−、−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−、−Ｒ５−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−である。一定の好ましい実施形態では、Ｍは、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−又は−Ｒ５−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−であるが、さらに好ましくはＭは、−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）又は−ＣＨ２Ｏ−（ＨＯ）Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−である。一定の他の好ましい実施形態では、Ｍは、−Ｒ５−Ｘ４−Ｃ（＝Ｘ５）−又は−Ｒ５−Ｃ（＝Ｘ５）−Ｘ４−である。さらに他の好ましい実施形態では、Ｍは、−Ｒ５−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−又は−Ｘ４−（ＹＸ５）Ｐ（＝Ｘ５）−Ｘ４−Ｒ５−であり、ここで、Ｘ４又はＸ５の少なくとも１個は、Ｓである。さらに他の好ましい実施形態では、Ｍは、直接結合である。
【０１８０】
上式中、Ｚは、直接結合又は親水性ポリマーである。好ましい親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）及びポリオキサゾリジンからなる群から選択される。さらに好ましくは、Ｚは、ポリアルキレンオキシドからなる。特に好ましくは、Ｚは、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールからなる群から選択されるポリアルキレンオキシドであるが、ポリエチレングリコールが、さらに好ましい。一定の他の好ましい実施形態では、Ｚは、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールを含むポリアルキレンオキシド以外の親水性ポリマーである。Ｚの分子量は、例えば、化合物の特定の最終使用に応じて変動してよい。好ましくは、Ｚは、約１００から約１００００の範囲及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの分子量を有するポリマーである。さらに好ましくは、Ｚは、約１０００から約５０００の分子量を有するポリマーである。約１から約３、及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの範囲の多分散性を示すポリマーも好ましい。さらに好ましくは、Ｚは、約１より大きく、２までの多分散性を有するポリマーであるが、約１より大きく、約１．５までの多分散性が特に好ましく、約１より大きく、約１．２までの多分散性が、さらに好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｚは、直接結合である。
【０１８１】
上式中、Ｑは、ターゲッティングリガンド又はその前駆体である。Ｑが、ターゲッティングリガンドである実施形態では、Ｑは好ましくは、前記で詳述した様々なターゲッティングリガンドから選択される。したがって、例えば、Ｑは好ましくは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとする。一定の好ましい実施形態では、Ｑは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとする。加えて、Ｑが、ターゲッティングリガンドである実施形態では、Ｑは好ましくは、タンパク質、ペプチド、糖類、ステロイド、ステロイド類似体、生物活性剤及び遺伝物質からなる群から選択される。これら後者の実施形態では、Ｑは好ましくは、タンパク質、ペプチド及び糖類からなる群から選択される。Ｑがペプチドからなる実施形態では、Ｑは好ましくは、配列ＡＲｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）又は、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＫＱＡＧＤＶ）などのＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＡＧＤ）を含むか、Ｑは、例えば、ＤＭＰ７２８などの環式ペプチドであってよい（例えば、Ｍｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７６（２），ｐｐ．１０９−１１９（１９９４）参照、この記載を全て、ここで参照して援用する）。Ｑが、タンパク質を含む実施形態では、Ｑは好ましくは、プロテインＡである。Ｑが糖類である実施形態では、Ｑは好ましくは、単糖類であり、マンノース及びグルコースが特に好ましい。Ｑが、ターゲッティングリガンドの前駆体である実施形態では、Ｑは好ましくは、１個又は２個のＮ、Ｏ又はＳ原子を含有する、部分的に不飽和又は芳香族の５員又は７員の単環を含み、マレイミド成分又はピリジル成分がさらに好ましい。
【０１８２】
上式中、Ｒ１はそれぞれ独立に、１から約５０個及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの炭素からなるアルキル又は、２から約５０個及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの炭素からなるアルケニルである。好ましくは、Ｒ１はそれぞれ独立に、１個より多く、約４０個までの炭素からなるアルキルである。さらに好ましくは、Ｒ１はそれぞれ独立に、約５から約３０個の炭素からなるアルキルである。特に好ましくは、Ｒ１はそれぞれ独立に、約１０から約３０個の炭素からなるアルキルであり、約１５から約２８個の炭素からなるアルキルが、さらに好ましい。一定の好ましい実施形態では、Ｒ１は、約１５から約１７個の炭素からなる直鎖アルキルである。さらに、Ｒ１は好ましくは、縮合したシクロアルキル及び／又はシクロアルケニルである。これら後者の実施形態では、Ｒ１は好ましくは、約１０から約４０個の炭素からなる一定の縮合したシクロアルキル及び／又はアルケニルであり、約２０から３０個の炭素からなる縮合したシクロアルキル及び／又はアルケニルがさらに好ましい。特に好ましい縮合したシクロアルキル及び／又はアルケニル基は、コレステロールである。
【０１８３】
上式中、Ｒ２はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約３０個の炭素及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せからなるアルキレンである。好ましくは、Ｒ２はそれぞれ独立に、１から約２０個の炭素からなるアルキレンである。さらに好ましくは、Ｒ２はそれぞれ独立に、１から約１０個の炭素からなるアルキレンである。特に好ましくは、Ｒ２はそれぞれ独立に、１から約５個の炭素からなるアルキレンであり、メチレンが特に好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｒ２は、直接結合である。
【０１８４】
上式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素又は１から約１０個の炭素及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せからなるアルキルである。好ましくは、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、水素又は１から約５個の炭素からなるアルキルであり、さらに好ましくは、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ、水素である。
【０１８５】
上式中、Ｒ５はそれぞれ独立に、直接結合又は又は１から約３０個の炭素及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せからなるアルキレンである。好ましくは、Ｒ５はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約２０個の炭素からなるアルキレンである。さらに好ましくは、Ｒ５はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンである。特に好ましくは、Ｒ５はそれぞれ独立に、直接結合又は１から約５個の炭素からなるアルキレンである。さらに好ましくは、Ｒ５はそれぞれ、直接結合又は−（ＣＨ２）ｙ−であり、ここで、ｘは、１又は２である。
【０１８６】
上式の化合物中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうちの３個又はそれ以上が直接結合である場合には、Ｚは、親水性ポリマーである。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうちの２個又はそれ以上が直接結合である場合には、Ｚは、親水性ポリマーである。さらに好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうちの１個又はそれ以上が直接結合である場合には、Ｚは、親水性ポリマーである。
【０１８７】
上式の化合物中、Ｚが直接結合である場合には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうちの３個又はそれ以上は、直接結合以外である。好ましくは、Ｚが直接結合である場合には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭのうちの４個又はそれ以上は、直接結合以外である。さらに好ましくは、Ｚが直接結合である場合には、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２及びＭは全て、直接結合以外である。
【０１８８】
ここでは、次式の化合物も提供する
【化２０】
2005500245.tif 000025
［上式中、
Ｌは、疎水性化合物であり；
Ｐは、架橋基であり；かつ
Ｔは、ターゲッティングリガンドである］。一般に、Ｌは、前記の脂質を含む、生体適合性脂質などの様々な適切な疎水性化合物のいずれかから選択することができる。好ましい実施形態では、Ｌは、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン、コレステロールアミン、リゾホスファチド、エリスロ−スフィンゴシン、スフィンゴミエリン、セラミド、セレブロシド、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、クリールリン脂質、脂肪酸及びステロイドからなる群から選択される脂質である。さらに好ましくは、Ｌは、レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、脂肪酸及びステロイドからなる群から選択される脂質である。特に好ましくは、Ｌは、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−セリン］、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール、例えば、１，２−ジオクタノイルエチレングリコール、１，２−ジカプロイルエチレングリコール、１，２−ジラウロイル−エチレングリコール、１，２−ジミリストイルエチレングリコール、１，２−ジパルミトイルエチレングリコール及び１，２−ジオレオイルエチレングリコールなどの１，２−ジアシルエチレングリコール、Ｎ−（ｎ−カプロイルアミン）−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−ドデカニルアミン−１、２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−スクシニル−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−グルタリル−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、Ｎ−ドデカニル−１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、ステアリン酸などの脂肪酸及びコレステロールなどのステロイドからなる群から選択される脂質である。
【０１８９】
他の好ましい実施形態では、Ｌは、アルブミンを含むタンパク質である。さらに他の好ましい実施形態では、Ｌは、アクリル酸、メタクリル酸、エチレンイミン、クロトン酸、アクリルアミド、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、乳酸、グリコール酸、ε−カプロラクトン、アクロレイン、シアノアクリレート、ビスフェノールＡ，エピクロロヒドリン、アクリル酸ヒドロキシアルキル、シロキサン、ジメチルシロキサン、酸化エチレン、酸化プロピレン、エチレングリコール、酸化プロピレン、エチレングリコール、メタクリル酸ヒドロキシアルキル、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、２，４−ペンタジエン−１−オール、酢酸ビニル、アクリロニトリル、スチレン、ｐ−アミノ−スチレン、ｐ−アミノベンジルスチレン、スチレンスルホン酸ナトリウム、２−スルホキシエチルメタクリル酸ナトリウム、ビニルピリジン、メタクリル酸アミノエチル及び塩化２−メタクリロイルオキシトリメチル−アンモニウムからなる群から選択されるモノマーから調製された合成ポリマー又はコポリマーを含むポリマーである。さらに、Ｌが、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、エポキシ樹脂、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（酸化プロピレン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル−ポリメチルメタクリレート及びポリスチレン−ポリアクリロニトリルからなる群から選択される合成ポリマー又はコポリマーを含むポリマーである化合物も好ましい。これらのポリマーのうち、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリルコポリマーが、好ましい。
【０１９０】
上式の化合物中、Ｐは、様々な長さの架橋基である。好ましい実施形態では、Ｐは、親水性ポリマーである。さらに好ましい実施形態では、Ｐは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）及びポリオキサゾリジンからなる群から選択される親水性ポリマーである。さらに好ましくは、Ｐは、ポリアルキレンオキシドポリマーであり、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールが、さらに好ましく、ポリエチレングリコールが、特に好ましい。
【０１９１】
上式中、Ｔは、ターゲッティングリガンドである。好ましい実施形態では、Ｔは、前記で詳述した様々なターゲッティングリガンドから選択することができる。したがって例えば、Ｔは好ましくは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとする。一定の好ましい実施形態では、Ｔは好ましくは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとする。加えて、Ｔは好ましくは、タンパク質、ペプチド、糖類、ステロイド、ステロイド類似体、生物活性剤及び遺伝物質からなる群から選択される。これら後者の実施形態では、Ｔは好ましくは、タンパク質、ペプチド及び糖類からなる群から選択される。Ｔがペプチドからなる実施形態では、Ｔは好ましくは、例えば、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（ＫＱＡＧＤＶ）などの配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）又はＡｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＡＧＤ）を含む配列Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＧＤ）を含むか、又はＴは、ＤＭＰ７２８などの環式ペプチドである（例えば、Ｍｏｕｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＶＯｌ．７６（２），ｐｐ．１０９−１１９（１９９４）参照、この記載を全て、ここで参照して援用する）。さらに、アテローム硬化、特にアテローム斑をターゲットとするターゲッティングリガンドも好ましい。
【０１９２】
糖類基を含むターゲッティングリガンドの場合には、適切な糖類成分には例えば、単糖類、二糖類及び多糖類が含まれる。代表的な単糖類は、６個の炭素を含み、これらの単糖類には、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フルクトース、プシコース、ヴェルボース（ｖｅｒｂｏｓｅ）及びタガトースが含まれる。５炭素糖類には、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース及びキシルロースが含まれる。４炭素糖類には、エリトロース、トレオース及びエリトルロースが含まれる。二糖類には、スクロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース及びセロビオースが含まれる。糖類支持ターゲッティング脂質は、後記で詳述するマルチステップの有機合成アプローチにより合成することができる。例えば、脂質支持ターゲッティンググルコース成分を例えば、α−グルコピラノシルブロミドテトラベンジルと、ω−トリフルオロアセチルアミノポリエチレングリコールと反応させて、ω−グルコピラノシルテトラベンジル−ω’−トリフルオロアセチルアミノポリエチレングリコールを得ることにより調製することができる。次いでこれを、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム溶液中で加水分解し、次いで、水素化すると、ω−グルコピラノシル−ω’アミノ−ポリエチレングリコールが得られる。アミノグリコピラノシル末端ポリエチレングリコールを次いで、Ｎ−ＤＰＧＳ−スクシンイミドと反応させると、脂質支持糖類ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−グルコースが生じる。梗塞した心筋をターゲットとするターゲッティングリガンドも好ましい。一定の実施形態では、ターゲッティングリガンドは、ガン細胞をターゲットとする。
【０１９３】
本発明の特に好ましい実施形態では、次式を有する化合物を提供する
【化２１】
2005500245.tif 000026
［上式中、
Ｘ１及びＸ２は独立に、直接結合あるいは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−からなる群から選択される架橋原子又は基であり；
Ｘ３は、−Ｏ−又は−Ｓ−であり；
Ｒ１は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ２は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ３は、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ４は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルであり；
Ｒ５は、水素又は低級アルキルであり；
Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンであり；
Ｒ８は、水素又は低級アルキルであり；
Ｐは、親水性ポリマーの基であり；かつ
Ｔは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドである］。
【０１９４】
上式（ＩＶ）中、特定の式又は置換基中に、記号が１回より多く現れる場合、その意味は、それぞれの場合で、相互に独立している。
【０１９５】
さらに、上式（ＩＶ）中で、２個又はそれ以上の隣接する記号のそれぞれが、「直接結合」と定義されていて、複数の隣接する直接結合が生じている場合、複数の隣接する直接結合は、単一の直接結合に変わる。
【０１９６】
上式（ＩＶ）中で、Ｘ１及びＸ２は独立に、直接結合あるいは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−からなる群から選択される架橋原子又は基である。好ましい実施形態では、Ｘ１及びＸ２は独立に、−Ｃ（＝Ｘ３）−、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−、−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−及び−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−から選択される架橋基である。さらに好ましい実施形態では、Ｘ１は、−Ｃ（＝Ｘ３）−Ｎ（Ｒ８）−Ｃ（＝Ｘ３）−であり、Ｘ２は、−Ｃ（＝Ｘ３）−である。
【０１９７】
Ｘ１及びＸ２の定義中、Ｘ３は、−Ｏ−又は−Ｓ−である。好ましい実施形態では、Ｘ３は、−Ｏ−である。
【０１９８】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ１は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルである。好ましい実施形態では、Ｒ１は、約１０個から約２２個の炭素からなるアシルであり、約１５個から約２０個の炭素が、さらに好ましい。特に好ましい実施形態では、Ｒ１は、約１７個から約１９個の炭素からなるアシルであり、約１８個の炭素が、さらに好ましい。
【０１９９】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ２は、水素又は低級アルキルである。好ましい実施形態では、Ｒ２は、水素である。
【０２００】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ３は、直接結合又は１個から約１０個の炭素からなるアルキレンである。好ましくは、Ｒ３は、１個から約３個の炭素からなるアルキレンであり、メチレンが、さらに好ましい。
【０２０１】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ４は、約７個から約２３個の炭素からなるアシルである。好ましい実施形態では、Ｒ４は、約１０個から約２２個の炭素からなるアシルであり、約１５個から約２０個の炭素が、さらに好ましい。特に好ましい実施形態では、Ｒ４は、約１７個から約１９個の炭素からなるアシルであり、約１８個の炭素が、特に好ましい。
【０２０２】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ５は、水素又は低級アルキルである。好ましい実施形態では、Ｒ５は、水素である。
【０２０３】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は１から約１０個の炭素からなるアルキレンである。好ましくは、Ｒ６及びＲ７は独立に、直接結合又は低級アルキレンである。さらに好ましくは、Ｒ６は、直接結合であり、Ｒ７は、低級アルキレンである。特に好ましくは、Ｒ７は、エチレンである。
【０２０４】
上式（ＩＶ）中で、Ｒ８は、水素又は低級アルキルである。好ましい実施形態では、Ｒ８は、水素である。
【０２０５】
上式（ＩＶ）中で、Ｐは、親水性ポリマーである。親水性ポリマーは、架橋基に関する前記の検討に関連して同定された親水性ポリマーのいずれかであってよい。好ましい実施形態では、Ｐは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）及びポリオキサゾリジンからなる群から選択される親水性ポリマーである。さらに好ましくは、Ｐは、ポリアルキレンオキシドポリマーであり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコールがさらに好ましく、ポリエチレングリコールが、特に好ましい。好ましくは、ＰＥＧポリマーは、約１０００から約７５００及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの分子量及び特定分子量を有する。さらに好ましくは、ＰＥＧポリマーは、約２０００から約５０００の分子量を有し、約３０００から約４０００の分子量がさらに好ましい。特に好ましい実施形態では、ＰＥＧポリマーは、約３４００の分子量を有する。
【０２０６】
上式（ＩＶ）中で、Ｔは、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、腫瘍細胞及び糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体からなる群から選択される細胞又は受容体をターゲットとするターゲッティングリガンドである。ターゲッティングリガンドは、ターゲッティングリガンドに関する前記の検討に関連して前記で同定されたターゲッティングリガンドのいずれかであってよい。好ましい形態では、ターゲッティングリガンドは、次式のペプチドを含む：
【化２２】
2005500245.tif 000027
【０２０７】
上式中、ｍ及びｎは独立に、１から約１００の整数及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せである。好ましい実施形態では、ｍ及びｎは独立に、１から約５０の整数であり、１から約２０の整数が、さらに好ましい。特に好ましくは、ｍ及びｎは独立に、１から約１０の整数であり、１から約５の整数が、さらに好ましい。特に好ましい実施形態では、ｎは、１、２又は３であるのが、特に好ましく、ｍは、１である。
【０２０８】
上式中、Ｙａａは、アルギニン、ホモアルギニン及びリシン−Ｎ−アセトイミデートから選択され、後者は、次式を有する
【化２３】
2005500245.tif 000028
【０２０９】
前記のターゲッティングリガンド式中、Ｘａａ及びＺａａは独立に、天然アミノ酸及び合成アミノ酸からなる群から選択される。特定の式又は置換基中に、記号が１回より多く現れる場合、その意味は、それぞれの場合で、相互に独立していることが、意図されている。したがって、例えば、ｎが３である場合、Ｘａａはそれぞれ、同一であるか、それぞれ、異なるアミノ酸である。一定の好ましい実施形態では、Ｘａａはそれぞれ、グリシンであり、Ｚａａは、セリンである。
【０２１０】
他の好ましい実施形態では、Ｘａａ及びＺａａは独立に、イオウ含有アミノ酸から選択される。適切なイオウ含有アミノ酸には例えば、Ｄ−システイン、Ｌ−システイン、Ｄ−ペニシラミン及びＬ−ペニシラミンが含まれる。このような実施形態では、イオウ含有アミノ酸は、次式で示されるようなジスルフィドブリッジを介して相互に結合していてよい
【化２４】
2005500245.tif 000029
［上式中、
Ｓａａはそれぞれ独立に、イオウ含有アミノ酸である］。上式中、ｘ及びｙはそれぞれ独立に、０から約１００の整数及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せであってよく、０から約２０の整数がさらに好ましい。特に好ましくは、ｘ及びｙは独立に、０から約１０の整数であり、０から約５の整数が、さらに好ましい。
【０２１１】
式（ＩＶ）の化合物は、例えば、下記のように合成の容易さ、診断的有効性、高い生体適合性及び／又は改善されたターゲッティング有効性を含む、望ましい利点を提供する。
【０２１２】
ターゲッティングリガンドは、様々な方法で本発明の組成物に導入することができる。一般には、例えば脂質、タンパク質又はポリマー、さらに補足的安定化物質を含む生体複合体の疎水性部分が例えば含まれる、組成物中に含まれる１種又は複数の物質と共有結合により、又は非共有結合により会合させることにより、ターゲッティングリガンドを本組成物に導入することができる。好ましい形態では、ターゲッティングリガンドは、本発明の組成物中に含まれる１種又は複数の前記の物質と共有結合により会合している。前記のように、本発明の好ましい組成物は、脂質、タンパク質又はポリマー化合物を含む。これらの組成物中で、ターゲッティングリガンドは好ましくは、脂質、タンパク質又はポリマー化合物と共有結合により会合する。
【０２１３】
ターゲッティングリガンドが脂質、タンパク質、ポリマー及び／又はベシクルがそれによって会合する代表的な共有結合には例えば、アミド（−ＣＯＮＨ−）；チオアミド（−ＣＳＮＨ−）；エーテル（ＲＯＲ’、ここで、Ｒ及びＲ’は、同じか、又は異なり、水素以外である）；エステル（−ＣＯＯ−）；チオエステル（−ＣＯＳ−）；−Ｏ−；−Ｓ−；−Ｓｎ−、ここで、ｎは、１よりも大きく、好ましくは約２から約８、さらに好ましくは約２；カルバメート；−ＮＨ−；−ＮＲ−、ここでＲは、アルキル、例えば１から約４個の炭素からなるアルキル；ウレタン；及び置換されたイミデート；及びこれらの２つ又はそれ以上の組合せが含まれる。ターゲッティングリガンドと例えば脂質との間の共有結合は、リガンドの配座的及びトポグラフィー的柔軟性を高めるスペーサーとして作用する分子を使用することにより達成することができる。このようなスペーサーの例には例えば、コハク酸、１，６−ヘキサン二酸、１，８−オクタ二酸など、さらに、例えば６−アミノヘキサン酸、４−アミノブタン酸などの変性されたアミノ酸が含まれる。加えて、ペプチド成分を含むターゲッティングリガンドの場合には、側鎖−側鎖架橋が、側鎖−末端架橋及び／又は末端−末端架橋と共に補足される。さらに、ジメチルスベリイミデートなどの小さいスペーサー分子を、同様の目的を達成するために使用することができる。グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）などのシッフ塩基型反応で使用されるものを含む薬剤を使用することもできる。還元アミノ化手順を使用することを介して、結合が可逆的となりうるシッフ塩基結合を、より永続的な共有結合にすることができる。これは例えば、水素化アルミニウムリチウム還元剤、あるいはジイソブチル水素化アルミニウムリチウム（ＤＩＢＡＬ）、ホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ４）又はシアノホウ水素化ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）を含む、より穏やかなその類似体などの化学的還元剤を必要とする。
【０２１４】
脂質、タンパク質及び／又はポリマーを含む、本組成物中の物質にターゲッティングリガンドを共有結合させることは、本記載をもとに、当技術分野の専門家には容易に分かるであろう合成有機技術を使用して達成することができる。例えば、よく知られているカップリング剤又は活性化剤を使用することで、ターゲッティングリガンドを、脂質を含む物質に結合させることができる。専門家には知られているように、活性化剤は通常、求核性である。この求核性を使用して、共有結合の形成を惹起することができる。使用することができる代表的な活性化剤には例えば、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、塩化メチルスルホニル、Ｃａｓｔｒｏ試薬及び塩化ジフェニルホスホリルが含まれる。
【０２１５】
共有結合は、架橋及び／又は重合を伴ってよい。架橋とは好ましくは、化学的な共有結合により鎖の一定の炭素原子を結合する元素、基又は化合物からなるブリッジによる、ポリマー分子の２個の鎖の結合のことである。例えば、架橋は、シスチン基のジスルフィド結合により結合されるポリペプチドで生じうる。例えば、（１）化学物質（架橋剤）を加え、混合物を熱にさらすことにより、又は（２）ポリマーに高エネルギー放射線を与えることにより、架橋を達成することができる。異なる長さ及び／又は官能性の様々な架橋剤又は「つなぎ」が例えば、Ｒ．Ｌ．Ｌｕｎｂｌａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ．ｐｐ．２４９−６８（１９９５）に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。代表的な架橋剤には例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ジメチルスベリミデート及び、炭化水素鎖に基づくそれらのバリエーション及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが含まれる。
【０２１６】
好ましい実施形態では、ターゲッティングリガンドは、架橋基を介して、脂質、タンパク質又はポリマー又は他の安定化物質に架橋又は結合することができる。様々な架橋基を利用することができ、本記載を得れば、当技術分野の専門家には分かるであろう。好ましくは、架橋基は、親水性ポリマーを含む。例えば適切な親水性架橋ポリマーには、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などのポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、例えばポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及びポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどのポリアクリルアミド、アクリル酸ポリヒドロキシエチル、メタクリル酸ポリヒドロキシプロピル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルキルカルボン酸）、ポリオキサゾリジン及びポリアスパルタミドが含まれる。親水性ポリマーは好ましくは、ＰＥＧ、ＰＰＧ、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン及びこれらのコポリマーからなる群から選択され、ＰＥＧ及びＰＰＧポリマーがさらに好ましく、ＰＥＧポリマーが特に好ましい。したがって、例えばＤＰＰＥ−ＰＥＧを含む脂質支持ポリマーを含む脂質組成物に関する実施形態では、ターゲッティングリガンドは直接、脂質に結合しているポリマーに結合していて、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＴＬの複合体をもたらす（ここで、ＴＬは、ターゲッティングリガンドである）。したがって、例えばＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００などの例ＤＰＰＥ−ＰＥＧを使用すると、前記の複合体は、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００−ＴＬとして表すことができる。架橋基として使用される親水性ポリマーは好ましくは、二官能性ポリマー、例えばジアミノ−ＰＥＧなどの二官能性ＰＥＧである。この場合、ＰＥＧ基の一方の末端は例えば、脂質化合物に結合していて、遊離の末端では、アミド結合を介してターゲッティングリガンドに結合している。一方の末端では、末端カルボキシレート基で、かつ他方の末端では末端アミノ基で置換されている親水性ポリマー、例えばＰＥＧを使用することもできる。これらの後者の二官能性親水性ポリマーが好ましい。それというのも、これらは、アミノ酸に対して様々な類似を有するためである。
【０２１７】
２個の独特な末端官能基を有する架橋基を使用して、ターゲッティングリガンドを脂質に結合するために、標準的なペプチド方法論を使用することができる。二官能性親水性ポリマー、特に二官能性ＰＥＧは、標準的な有機合成方法論を使用して、合成することができる。加えて、これらの材料のうちの多くは、市販されている。例えば、α−アミノ，ω−カルボキシＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から市販されている。架橋基としてＰＥＧ材料を使用することの利点は、エチレングリコールのモノマーサブユニットの数が、例えば約５の少数でも、例えば約５００またそれ以上の多数であってもよいように、ＰＥＧのサイズを変動させることができることである。したがって、「つなぎ」又は架橋の長さは、望ましいように変動させることができる。例えば、使用される特定のターゲッティングリガンドに応じて、このことは重要である。例えば、大きなタンパク質分子を含むターゲッティングリガンドは、膜結合タンパク質を模すように、短いつなぎを必要とする。短いつなぎにより、ベシクルが、細胞に対する緊密さを維持するようにすることもできる。生物活性剤を含むベシクルに関しては、これを使用するのが有利であり、その際、細胞に輸送される生物活性剤の濃度を、有利に高めることができる。
【０２１８】
短いつなぎをもたらす他の適切な架橋基は、グリセルアルデヒドである。シッフ塩基反応を介して、グリセルアルデヒドを、例えばＤＰＰＥに結合させることができる。後続のアマドリ転移により、かなり短い架橋基が得られる。次いで、シッフ塩基のβカルボニルを、ターゲッティングタンパク質又はペプチドのリシン又はアルギニンと反応させて、ターゲット脂質を生じさせる。
【０２１９】
特に、脂質、タンパク質及び／又はポリマーを含む本発明の組成物中で使用される化合物は、適切なカップリング条件を使用して、親水性ポリマー架橋基のカルボン酸又はカルボン酸誘導体と反応することができ、本記載を得れば、当技術分野の専門家には理解されるであろう、例えばヒドロキシ、チオ及びアミン基などの様々な官能基を含有してよい。カルボン酸基（又はその誘導体）と官能基、例えば、ヒドロキシ、チオ又はアミン基とが反応して、エステル、チオエステル又はアミド基が生じた後に、当技術分野の専門家にはよく知られている手順を使用して、保護されている官能基を脱保護することができる。ここで使用する場合、保護基との用語は、官能基の反応をブロックするために使用することができ、望ましい場合には除去して、未保護の官能基を生じさせることができる成分のことである。様々な保護基を使用することができ、これらは、例えば、保護されるべき基が、アミン、ヒドロキシル又はカルボキシル成分であるかに応じて、変わりうる。官能基がヒドロキシル基である場合には、適切な保護基には例えば、一定のエーテル、エステル及びカルボネートが含まれる。このような保護基は例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，ＴＷ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，ＰＧＭ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９１）に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。アミン基のための代表的な保護基には例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル及びトリフルオロアセテート（ＴＦＡ）が含まれる。
【０２２０】
シッフ塩基を生じさせることにより、例えば、グルタルアルデヒドなどのカップリング剤を使用することにより、例えば、ベシクル中に含有されているポリマーのバックボーン上に存在しうるアミン基を、親水性架橋ポリマー上のアミン基と結合させることができる。この結合の例は、Ａｌｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｖｏｌ．１９（６），ｐｐ．１５０２−１５０８（１９８６）に記載されており、この記載をここで全て、参照して援用する。例えば、ベシクルがポリリシンから処方されている場合には、遊離アミノ基を、ベシクルの表面上にさらすことができ、これらの遊離アミン基は、前記のように活性化することができる。次いで、活性化されたアミン基を使用して、例えば、ω−ヒドロキシ基がカルボネート基で保護されているα−アミノ−ω−ヒドロキシ−ＰＥＧなどの官能化親水性ポリマーに結合させることができる。反応が終了した後に、カルボネート基を除去して、末端ヒドロキシ基を、適切なターゲッティングリガンドに反応させるために活性化させることができる。一定の実施形態では、例えばポリジクロロホスファジンなどの塩素含有ホスファゼン基中の塩素原子を置換することにより、ベシクル表面を活性化することができる。続いて、ターゲッティングリガンドを加え、水又は水性メタノールで残留しているクロリド基をクエンチすることにより、結合している生成物が得られる。
【０２２１】
加えて、ポリ（ジフェノキシホスファゼン）を合成し（Ａｌｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｖｏｌ．（１９８６）１９（６），ｐｐ．１５０２−１５０８）、例えばＤＰＰＥ上に固定化し、引き続き、硝酸及び無水酢酸からなる混合物を加えることにより、フェノキシ成分をニトロ化することができる。次いで、例えば、（１）０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ１１）中の臭化シアンで処理し、引き続き、遊離アミノ成分を含有するターゲッティングリガンドを加えて、結合している尿素類似体を生じさせることにより、かつ／又は（２）亜硝酸ナトリウムを使用して、ジアゾニウム塩を生じさせ、引き続き、ターゲッティングリガンドを加えて、結合しているリガンドを生じさせるか、かつ／又は（３）ジアルデヒド、例えば、前記のようなグルタルアルデヒドを使用して、シッフ塩基を生じさせることにより、後続のニトロ基を活性化することができる。ＤＰＰＥを親水性ポリマー及びターゲッティングリガンドと架橋させた後に、ここに記載の手順を使用して、ベシクルを処方することができる。
【０２２２】
シッフ塩基を生じさせることにより、前記のように、ポリマー上のアルデヒドをアミンとカップリングさせることができる。このカップリング手順の例は、Ａｌｌｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ａｕｓｔｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｖｏｌ  １４．ｐ１６１６（１９８１）に記載されており、この記載をここで全て、参照して援用する。
【０２２３】
前記の手順では、脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール又はホスファチジルエタノールアミンのポリマー又は末端を好ましくは、活性化させて、その末端が適切な方法でブロックされている親水性ポリマー架橋基にカップリングさせる。この方法の例としては、ｔ−Ｂｏｃ保護されている末端アミノ基及び遊離カルボキシレート末端を有するα−アミノ，ω−カルボキシＰＥＧ−４０００を、Ｎ−メチルピロリドン中のヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下に、１，１’−カルボニルジイミダゾールを用いて活性化させることができる。ホスファチジルエタノールアミンを加えた後に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、遊離アミン基を残すことにより、ｔ−Ｂｏｃ基を除去する。次いで、リガンドを同様に活性化して、アミンを、例えばペプチド、タンパク質、アルカロイド又は他の成分を含んでよいターゲッティングリガンドと反応させて、脂質−架橋基−ターゲッティングリガンド複合体を得る。前記の方法に加えて、他の方法を使用して、脂質−架橋基−ターゲッティングリガンド複合体を調製することもできる。一般に、これらの方法は、合成有機化学の分野の専門家には通常知られている合成方法を使用する。
【０２２４】
当技術分野の専門家には知られているように、免疫グロブリンは通常、「ヒンジ」領域と同定される柔軟な領域を含む。例えば、“Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．，ｐｐ．２８２−２８３（１９８８）参照。ヒンジ領域のチオールのよく定義されているサイトを使用して、Ｆａｂ’断片を、脂質、ポリマー、タンパク質及び／又はベシクルに架橋することができる。これは、Ｆａｂ’断片をカップリングするために好ましい領域である。それというのも、強力な接合サイトは、抗原識別サイトからは離れているためである。一般に、適切に調製されていない限り、ヒンジ基のチオールを使用することは困難である。特に、Ｓｈａｈｉｎｉａｎ及びＳａｌｖｉａｓ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ  １２３９（１９９５）１５７−１６７）によって概説されているように、チオール基を減らして、例えば、マレイミド誘導架橋基にカップリングするために利用することができるようにすることが重要である。通常使用される還元剤の例は、エタンジチオール、メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン又はより一般的に使用され、クレランド試薬とも称されるジチオトレイトールである。しかしながら、ジチオトレイトールなどの一定の還元剤を利用する場合に、過還元が生じうるので、注意を払うべきであることを特記すべきである。過還元及び後続の変性又は構造変化に基づき、その活性又は結合能が低下しうるタンパク質では、還元剤の選択的な使用が必要である。例えば、Ｓｈａｈｉｎｉａｎ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｌｖｉａｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３９，１５７−１６７参照。
【０２２５】
抗体をペプシン（６０μｇ／ｍｌ）と共に、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．２）中で４時間、３７℃でインキュベーションすることにより、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片を調製することができる。２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）を、最終濃度８０ｍＭになるまで加えることにより、消化を終えることができる。次いで、遠心分離（１００００×ｇ、３０分、４℃）により、Ｆ（ａｂ’）２断片を得る。次いで、上澄みを４℃で、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのホスフェートに対して、ｐＨ７．０で透析することができる。次いで、これを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂのカラムで、クロマトグラフィー処理して、未消化のＩｇＧを除去することができる。次いで、溶液を十分に脱ガスし、使用する前に窒素でパージすることにより、Ｆａｂ’断片を調製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で供給し、アルゴン下に、３０ｍＭのシステイン中で還元する。もしくは、システアミンを使用することができる。１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）を、緩衝液として、１５分間、３７℃で使用することもできる。次いで、溶液を、等容量の適切な実験用緩衝液で２倍に希釈し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−６ＤＧの０．４ｍｌスピンカラムで遠心脱水することができる。生じたＦａｂ’断片は、マレイミド架橋基へのそのカップリングにおいて、より効果的である。例えば、マレイミドスペーサーにカップリングするための、システイン基を含有する他の高分子で、同じ手順を使用することもできる。さらに、システイン基を含有するならば、ペプチドを使用することもできる。ペプチドが新たに作られたものではなく、ペプチド構造内のシステイン基が酸化されている可能性がある場合には、前記のアプローチを使用して、チオール基を再生させる必要がある。
【０２２６】
付加的な架橋基は、二官能性スペーサーにカップリングするために使用することができる脂質の他の誘導体を含みうる。例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を、二官能性剤にカップリングさせることができる。例えば４−（ｐ−マレイミド−フェニル）酪酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）及び３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）、トランス−４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）及び３−マレイミジル安息香酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＭＢ）を使用して、例えば、官能化脂質ＭＰＢ−ＰＥ及びＰＤＰ−ＰＥを生じさせることができる。
【０２２７】
アミン又はヒドロキシル基などの反応基を含有するポリエチレングリコールエチルアミンなどの親水性スペーサーの遊離末端を使用して、補因子又は他のターゲッティングリガンドを結合することができる。例えば、ポリエチレングリコールエチルアミンを、Ｎ−スクシンイミジルビオチン又はｐ−ニトロフェニルビオチンと反応させて、スペーサー上に有効なカップリング基を導入することができる。例えば、ビオチンをスペーサーにカップリングさせることができ、これは容易に、非共役結合により、タンパク質と結合する。例として、ＭＰＢ−ＰＥＧ−ＤＰＰＥを、次のように合成することができる。ＰＥＧの末端に遊離アミノ基を有するＤＰＰＥ−ＰＥＧを、前記のように得る。次いで、ＳＭＰＢ：ＰＥＧ−ＤＰＰＥの合成を、クロロホルム中のトリエチルアミン１当量を用いて、１：５のＳＭＰＢ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧのモル比で実施することができる。３時間後、反応混合物をアルゴン下に、乾燥するまで蒸発させる。分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、クロロホルム中５０％のアセトンでシリカゲルを展開）により、過剰の未反応のＳＭＰＢ及び副生成物の大部分を除去する。脂質帯域の上部を、シリカから、クロロホルム中約２０〜３０％のメタノール（ｖ：ｖ）を用いて抽出すると、純粋完全なＭＰＢ−Ｐｅｇ−ＤＰＰＥを単離することができる。次いで、ストレプタビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）をタンパク質にカップリングさせて、次いで、タンパク質を、ＭＰＢ−ＰＥＧ−ＤＰＰＥにカップリングさせることができる。簡単にＳＰＤＰをストレプタビジンと共に室温で３０分間インキュベーションし、クロマトグラフィーを使用して、未反応のＳＰＤＰを除去する。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を反応混合物に加え、１０分後、２−チオピリドンを３４３ｎＭの濃度で加える。反応混合物の残りを、ＤＴＴで還元する（２５ｍＭ、１０分間）。チオール化生成物を、ゲル除去により単離する。生じた、ストレプタビジン標識されたタンパク質を次いで使用して、脂質成分に付いているビオチン化スペーサーに結合させることができる。
【０２２８】
脂質、タンパク質又はポリマー、ベシクル又は他の安定化物質にターゲッティングリガンドを共有結合させるために使用することができる付加的な方法は例えば、Ｕｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６０９０８００号及びＵｎｇｅｒの米国特許第６０２８０６６号に記載されており、これらの記載をここで、全て参照して援用する。
【０２２９】
本発明の好ましい実施形態では、ターゲット化化合物、即ちターゲット化脂質、タンパク質及びポリマーを、例えば、ターゲット化ミセル、ターゲット化リポソーム、ターゲット化アルブミン被覆ミクロスフェア及び／又はターゲット化ポリマー被覆ミクロスフェアを含むターゲット化ベシクルを生じさせるために使用される組成物中に導入することができる。ベシクルがそれから調製される化合物に付着しているターゲッティングリガンドは、例えば、ベシクル表面の外面に向いていてよい。したがって、受容体及び組織をターゲットとするために使用することができるターゲット化ベシクルが得られる。
【０２３０】
一定の実施形態では、ターゲッティングリガンドを、非共有結合性会合により本組成物に導入することができる。当技術分野の専門家には知られているように、非共有結合性会合は通常、例えば、該当する分子の極性、場合によっては該当する分子の電荷（正又は負）、分子ネットワークの水素結合の規模などを含む様々な要因の関数である。非共有結合は好ましくは、イオン相互作用、双極子−双極子相互作用、水素結合、親水性相互作用、ファンデルワールス力及びこれらの組合せからなる群から選択される。非共有結合性相互作用を、ターゲッティングリガンドを脂質に、又は直接にベシクル表面に結合するために使用することができる。例えば、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓを、好ましくはＰＥＧなどの架橋基によりベシクルの表面に結合させて、銅、鉄又はバナジルイオンを加えることができる。米国特許第５４６６４６７号に記載されているように（この記載をここではすべて、参照して援用する）、ヒスチジン基を含有する抗体などのタンパク質は、銅イオンを伴うイオンブリッジを介して、ベシクルに結合することができる。水素結合の例は、脂質組成物に導入することができるカルジオ脂質に関する。
【０２３１】
ベシクル組成物に関する本発明の好ましい実施形態では、例えば、インビボでのｐＨ及び／又は温度の変化を、ターゲッティングリガンド中での位置の変化、例えば、ベシクル内から、ベシクルの外側壁の外側への位置の変化を促進するために使用することができる。これは、ターゲッティングリガンドがターゲッティングサイト、例えば、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体などの受容体及び、心筋、内皮及び上皮細胞を含む組織への結合を促進する。それというのも、ターゲッティングリガンドは、このようなターゲッティング部位に対する暴露により高い可能性を有するためである。加えて、高エネルギー超音波を、ベシクルの破裂を促進するために使用することができる。これにより、ターゲッティングリガンドを所望の結合サイトに暴露することができる。
【０２３２】
本組成物中で使用されるターゲッティングリガンドの濃度は、例えば、使用される特定のターゲッティング剤、ターゲットとなるターゲット受容体又は組織、組成物の他の成分、ターゲッティングリガンドが、例えば脂質、タンパク質、ポリマー又はベシクルなどの組成物の他の成分と共有結合又は非共有結合によって会合しているかどうかに応じて、変動しうる。通常、本組成物中のターゲッティングリガンドの濃度は、低いレベルから始まって、所望の造影強化硬化が達成されるまで高めることができる。ターゲット化疎水性化合物（即ち、例えば、式Ｌ−Ｐ−Ｔの化合物又は式（ＩＶ）の化合物の場合のように、ターゲッティングリガンドが、共有結合により例えば、脂質に結合している複合体）、さらに未結合又は遊離ターゲッティングリガンド（例えば、ターゲッティングリガンドが、非共有結合により、脂質などの安定化化合物に会合している実施形態のように）を、組成物中で使用されている非結合安定化物質の重量に対して約０．０５重量％から約２０重量％の範囲の濃度（及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せ）で、組成物中で使用することができる。好ましくは、複合体又は遊離ターゲッティングリガンドを組成物中で、約０．５重量％から約１０重量％の濃度で使用することができ、約１重量％から約５重量％の濃度がさらに好ましい。特に好ましくは、複合体又は遊離ターゲッティングリガンドを本組成物中で、約１重量％から約２重量％の濃度で使用することができ、約１．２５重量％の濃度がさらに好ましい。他の実施形態では、約５重量％の濃度が特に好ましい。
【０２３３】
本発明の教示を得れば、専門家には分かるように、本発明の組成物中で使用することができるターゲット化疎水性化合物及び／又は未結合又は遊離のターゲッティングリガンドの濃度は、モル％で表すこともできる。この際には、ターゲット化疎水性化合物及び／又は未結合又は遊離のターゲッティングリガンドを、本発明の組成物中で、組成物中で使用される未結合の安定化物質のモル数に対して、０．０５モル％から約１０モル％の範囲（及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せ）の濃度で使用することができる。好ましくは、複合体又は遊離ターゲッティングリガンドを、組成物中で、約０．５モル％から約５モル％の濃度で使用することができ、約１モル％から約３モル％の濃度が好ましい。さらに好ましくは、複合体又は遊離ターゲッティングリガンドを、本組成物中で、約１モル％から約２モル％の濃度で使用することができ、約１．８モル％の濃度が特に好ましい。
【０２３４】
前記のように、本発明の脂質及び／又はベシクル組成物は望ましくは、水性環境中で処方される。これにより、脂質は、その疎水性／親水性の性質により、このような環境中で達成することができるもっとも安定な構造であるベシクルを生じる。このような水性環境を生じさせるために使用することができる希釈剤には例えば、脱イオン水あるいは、好ましくは、ベシクルの形成及び又は安定性あるいは超音波造影剤、ＭＲＩ造影剤又はＣＴ造影剤診断剤としてのその使用を妨げない塩などの１種又は複数の溶解している溶質を含む水並びに通常の食塩水及び生理食塩水が含まれる。
【０２３５】
本発明の脂質及び／又はベシクル組成物はさらに、画像診断のための造影剤としてのその有効性を高めるために役立つ慣用の造影剤を含む付加的な造影剤を含有してもよい。
【０２３６】
したがって、柔軟なベシクル、例えば、脂質から処方されたベシクルあるいは非柔軟なベシクル、例えば、ポリメチルメタクリレートから調製されたベシクルを含むベシクル組成物を提供することは、本発明の範囲内である。
【０２３７】
本発明の組成物は特に、診断用超音波及び治療用超音波を含む超音波に関して使用することができると、考えられる。超音波中での本発明の組成物の使用は、本記載を通して記載されている。
【０２３８】
前記のように、本組成物を、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）造影に関して使用することもできる。ＣＴは、様々な欠点を有しており、通常は、前記の診断技術に比べて、有効性は低い。しかしながら、十分に高い濃度の本発明の造影剤、特にガス充填ベシクル組成物が、該当領域、例えば血餅に輸送されるならば、血餅の全体密度の低減により、血餅をＣＴ画像で検出することができる。通常、前記の血餅を含む該当領域に輸送して、ＣＴにより検出するためには、ガス充填ベシクルの約１／１０％から１％以上の濃度（容量ベースに対して）が必要である。
【０２３９】
本組成物中で使用するために適している代表的な常磁性造影剤には例えば、例えば、安定なニトロキシドなどの安定な遊離のラジカル、さらに、望ましくは、塩の形であってよいか、共有結合又は非共有結合により、その親油性誘導体を含む錯化剤又はタンパク質高分子に結合していてよい遷移元素、ランタニド及びアクチニド元素を含む化合物が含まれる。
【０２４０】
好ましい遷移元素、ランタニド及びアクチニド元素には例えば、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、ＣＵ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）が含まれる。さらに好ましくは、元素は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）、特にＭｎ（ＩＩ）及びＧｄ（ＩＩＩ）であってよい。
【０２４１】
前記の元素は、望ましい場合には、マンガン塩、例えば塩化マンガン、炭酸マンガン、酢酸マンガンなどの無機塩及びグルコン酸マンガンなどの有機酸及びマンガンヒドロキシルアパタイトを含む塩の形であってよい。他の代表的な塩には、鉄の塩、例えば、硫化鉄及び塩化鉄などの鉄塩が含まれる。
【０２４２】
これらの元素は、望ましい場合には、共有結合性又は非共有結合性会合により、その親油性誘導体を含む錯化剤に、又はタンパク質高分子に結合していてもよい。好ましい錯化剤には例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレン−ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＤＯＴＡ）、３，６，９−トリアザ−１２−オキサ−３，６，９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−三デカン酸（Ｂ−１９０３６）、ヒドロキシベンジルエチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ピリドキシ−５−ホスフェート）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩（ＤＰＤＰ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、クリプタンド（ｋｒｙｐｔａｎｄ；大環式錯体）及びデスフェリオキサミンが含まれる。さらに好ましくは、錯化剤は、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ及びクリプタンドであり、最も好ましくは、ＤＴＰＡである。好ましい親油性錯体には、錯化剤ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡのアルキル化誘導体、例えば、Ｎ，Ｎ’−ビス−（カルボキシデシルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＤＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−ビス−（カルボキシ−オクタデシルアミド−メチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＯＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−ビス（カルボキシ−ラウリルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩（ＥＤＴＡ−ＬＤＰ）；など、さらに、米国特許第５３１２６１７号に記載されているものが含まれ、この記載をここでは全て、参照して援用する。好ましいタンパク質高分子には例えば、アルブミン、コラーゲン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、γ−グロブリン及びβ−グロブリンが含まれ、アルブミン、ポリアルギニン、ポリリシン及びポリヒスチジンが特に好ましい。
【０２４３】
したがって適切な錯体には、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｍｎ（ＩＩ）−クリプタンド、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−クリプタンド、Ｃｒ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｃｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ又は鉄−デスフェリオキサミン、特に、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡ又はＧｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡが含まれる。
【０２４４】
ニトロキシドは、ニトロキシド分子中に不対電子が存在することにより、ＭＲＩで、Ｔ１及びＴ２の両方の緩和速度を高める常磁性造影剤である。当技術分野の専門家には知られているように、ＭＲＩ造影剤としての所定の化合物の常磁性有効性は、少なくとも部分的に常磁性核又は分子中の不対電子の数に、特に、不対電子の数の二乗に関連している。例えば、ガドリニウムは、７個の不対電子を有し、ニトロキシド分子は１個の不対電子を有する。したがって、ガドリニウムは通常、ニトロキシドよりもかなり強力なＭＲＩ造影剤である。しかしながら、造影剤の有効性を評価するもう１つの重要なパラメーターである有効な相関時間のために、ニトロキシドの立場が相対的に強まる可能性がある。例えば、常磁性造影剤を大きな分子に結合させることにより、タンブリング速度を遅くすると、これは、より遅く、したがってより有効に、水プロトンの緩和を促進するための移動エネルギーをタンブリングする。しかしながら、ガドリニウムでは、電子スピン緩和時間は迅速で、遅い回転相関時間が緩和を高めうる規模は限られる。しかしながら、ニトロキシドでは、電子スピン相関時間は、より有利で、これらの分子の回転相関時間を遅くすることにより、緩和性のかなりの増大が達成される。遅い回転相関時間の目的及び緩和で生じる改善を達成するために、本発明のガス充填ベシクルは理想的である。特定の作動理論に結びつけることは意図していないが、例えば、そのアルキル誘導体を作ることにより、ベシクルの周囲を被覆するようにニトロキシドを設計することができるので、生じる相関時間を最適化することができると、考えられる。さらに、生じる本発明の造影剤は、緩和性を最大限にする磁性球体、幾何学的形状とみなすことができる。
【０２４５】
望ましい場合には、ニトロキシドは、アルキル化又は誘導体化されていてよく、例えば、ニトロキシド２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、遊離ラジカル及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、遊離ラジカル（ＴＭＰＯ）である。
【０２４６】
本発明の組成物中で使用するために適している代表的な超常磁性造影剤には、磁区を受ける金属酸化物及び硫化物、純粋な鉄などの強磁性又はフェリ磁性化合物、磁鉄鉱、γ−Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、亜鉄酸マンガン、亜鉄酸コバルト及び亜鉄産ニッケルなどの磁性酸化鉄が含まれる。酸素１７ガス（１７Ｏ２）などの常磁性ガスを、本発明の組成物中で使用することもできる。加えて、過分極キセノン、ネオン又はヘリウムガスを使用することもできる。ＭＲ全身造影を、例えば血栓に関して迅速に体をスクリーニングするために使用することができ、血栓崩壊を促進するために望ましい場合には、超音波を適用することもできる。
【０２４７】
前記のような常磁性及び超常磁性造影剤などの造影剤を、脂質及び／又はベシクル組成物内の１成分として使用することもできる。ベシクル組成物の場合には、前記の造影剤を、その内部ボイドの中に封入するか、溶液としてベシクルと共に投与するか、付加的な安定化物質と導入するか、ベシクルの表面又は膜上にコーティングすることができる。
【０２４８】
望ましい場合には、常磁性及び超常磁性物質を、組成物、特にベシクルの脂質壁に導入されているアルキル化されている誘導体、又は他の誘導体として輸送することができる。特に、ニトロキシド２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、遊離ラジカル及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、遊離ラジカルは、例えば、アセチルオキシ結合を含む様々な結合を介して、メチル基で占められていない環の位置で、長鎖脂肪酸と共に付加生成物を形成しうる。このような付加生成物は、本発明の脂質及び／又はベシクル組成物に導入するために非常に適している。
【０２４９】
１種又は複数の常磁性及び／又は超常磁性物質からなる混合物を、本発明の組成物中で使用することもできる。常磁性及び超常磁性物質は、望ましい場合には、別々に共投与することもできる。
【０２５０】
本発明の脂質及び／又はベシクル組成物、特にベシクル組成物は、前記の超常磁性物質の有効なキャリヤとして役立つだけではなく、造影剤の磁化率の効果を改善することができる。超常磁性造影剤には、金属酸化物、特に酸化鉄が含まれるが、磁区を受ける様々な量のマンガン、コバルト及びニッケルを含有する酸化マンガン及び酸化鉄が含まれる。これらの物質は、ナノ又はミクロ粒子であり、非常に高い体積磁化率及び横緩和速度を有する。より大きな粒子、例えば、約１００ｎｍの直径を有する粒子は、Ｒ１緩和性に比較して、より高いＲ２緩和性を有する。より小さい粒子、例えば、約１０から約１５ｎｍの直径を有する粒子は、Ｒ２緩和性よりも若干低いが、よりバランスのとれたＲ１及びＲ２値を有する。かなり小さい粒子、例えば、約３から約５ｎｍの直径を有する単結晶酸化鉄粒子は、より低いＲ２緩和性を有するが、おそらく、最もバランスの取れたＲ１及びＲ２緩和速度を有する。非常に高い緩和速度の超常磁性鉄の核を封入するようにフェリチンを処方することができる。脂質及び／又はベシクル組成物、特に、ガス充填ベシクルを含むベシクル組成物は、これらの慣用の酸化鉄ベースのＭＲＩ造影剤の効率及び安全性を高めうる。
【０２５１】
酸化鉄は簡単に、脂質及び／又はベシクル組成物に導入することができる。好ましくは、脂質から処方されたベシクルの場合には、米国特許第５０８８４９９号に記載されていて、その記載をここで全て、参照して援用することができるように、例えば、ベシクルの表面に吸収させるか、ベシクルの内部に捕捉することにより、酸化鉄を、ベシクルの壁に導入することができる。
【０２５２】
特定の作動理論に結びつけることはないが、本発明のベシクルは、いくつかの機構により、超常磁性造影剤の効力を高めると考えられる。第一に、ベシクルは、酸化鉄粒子の見かけの磁性濃度を高めるように機能すると、考えられる。即ち、ベシクルは、常磁性及び超常磁性物質を含むＭＲＩ造影剤のみかけの回転相関時間を高めて、緩和速度を高めると考えられる。加えて、ベシクルは、この後に記載の方法により、造影剤の見かけの磁区を高めるようである。
【０２５３】
いくつかの本発明のベシクル、特に脂質から処方されたベシクルは、例えば、造影剤の水性懸濁液あるいは、静脈内注入又は他の体の部位への注入の場合には、血液又は他の体液を含む懸濁媒体とは異なる磁化率の柔軟な球体領域として可視化されうる。フェライト又は酸化鉄粒子の場合には、これらの物質により得られるコントラストは、粒度に応ずることを特記する。この現象は、非常に一般的で、往々にして、水分子の「永年」緩和とも称される。さらに物理的な表現で記載すると、この緩和機構は、常磁性原子又は常磁性分子が存在する分子錯体の有効サイズに依存している。物理的説明の１つが、次のソロモン−ブルームバーゲン式（Ｓｏｌｏｍｏｎ−Ｂｌｏｅｍｂｅｒｇｅｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎｓ）で示されており、これは、常磁性寄与率を、常磁性イオンにより摂動される磁気回転比ｇを伴うスピン１／２核のＴ１及びＴ２緩和時間の関数として定義する：
１／Ｔ１Ｍ＝（２／１５）Ｓ（Ｓ＋１）γ２ｇ２β２／ｒ６［３τｃ／（１＋ωＩ２τｃ２）＋７τｃ／（１＋ωＳ２τｃ２）］＋（２／３）Ｓ（Ｓ＋１）Ａ２／ｈ２［τｅ／（１＋ωＳ２τｅ２）］
及び
１／Ｔ２Ｍ＝（１／１５）Ｓ（Ｓ＋１）γ２ｇ２β２／ｒ６［４τｃ／３τｃ／（１＋ωＩ２τｃ２）＋１３τｃ／（１＋ωＳ２τｃ２）］＋（１／３）Ｓ（Ｓ＋１）Ａ２／ｈ２［τｅ／（１＋ωＳ２τｅ２）］
［上式中、
Ｓは、電子スピン量子数であり；
ｇは、電子ｇ係数であり；
βは、ボーア磁子であり；
ωＩ及びω５（６５７ｗＩ）は、核スピン及び電子スピンに関するラーモア角歳差周波数であり；
ｒは、イオン−核距離であり；
Ａは、超微細結合定数であり；
τｃ及びτｅはそれぞれ、双極子及びスカラー相互作用に関する相関時間であり；かつ
ｈは、プランク定数である］。例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｉ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｖｏｌ．９９，ｐ．５５９（１９５５）及びＢｌｏｅｍｂｅｒｇｅｎ，Ｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．５７２，５９５（１９５７）参照。
【０２５４】
少数の大きな粒子は、主に、より大きな相関時間により、多数のより小さい粒子よりもかなり高い効果を有する。しかし、酸化鉄粒子を非常に大きくしようとすると、高い毒性が生じ、肺が梗塞しうるか、補足的なカスケード系が活性化されうる。さらに、粒子の全体サイズは、その縁部又は外側表面での粒子の直径ほどには重要ではないと考えられる。磁化のドメイン又は磁化率効果は、粒子の表面から急激に低下する。一般には、（スペースを通しての）極性緩和機構の場合には、この指数低下は、常磁性極性−極性相互作用ではｒ６依存を示す。文字通りに解釈すると、常磁性表面から４オングストローム離れている水分子は、同じ常磁性表面から２オングストローム離れている水分子の６４分の１の影響を受ける。造影効果を最適化することに関して理想的な状況は、酸化鉄粒子を中空、柔軟及び可能な限り大きくすることである。今まではこのことを達成することは不可能で、その利点も、今までは理解されていなかったと考えられる。ベシクルの内表面又は外表面を造影剤でコーティングすることにより、個々の造影剤、例えば、酸化鉄などの粒子又は常磁性イオンが比較的小さい構造であっても、造影剤の有効性をかなり高めることができる。このようにすると、造影剤は、有効なかなり大きい球体として作用し、その際、磁化の有効領域は、ベシクルの直径により決まり、ベシクル表面で最大である。これらの物質は、柔軟性、即ち、コンプライアンスの利点をもたらす。硬いベシクルが、肺又は他の臓器に留まり、毒性反応をもたらすのに対して、これらの柔軟なベシクルは、毛細血管をかなり容易にスライドする。
【０２５５】
前記の柔軟なベシクルとは異なり、一定の状況では、例えば、ポリメチルメタクリレートを含む実質的に不透過性のポリマー物質からベシクルを処方することが望ましい。これにより通常、実質的に不透過性で、比較的非弾性及び脆性であるベシクルの形成が生じる。画像診断、例えば超音波に関する実施形態では、このような脆性ベシクルを含む造影剤は通常、柔軟なベシクルがもたらす望ましい反射率をもたらさない。しかしながら、超音波の出力を高めることにより、脆性なミクロスフェアを破裂させて、アコースティック・エミッションを生じさせて、これを、超音波トランスデューサにより検出することができる。
【０２５６】
核医学影像法（ＮＭＩ）を、本発明の診断及び治療法の態様との関連で使用することができる。例えば、ＮＭＩは、本発明の組成物中に、前記のガスの他に、又はその代わりに導入することができるＸｅ１３３などの放射性ガスを検出するために使用することができる。このような放射性ガスを、例えば血栓を検出する際に使用するためのベシクル内に捕捉することができる。好ましくは、二官能性キレート誘導体を、ベシクルの壁に導入し、生じたベシクルを、ＮＭＩ及び超音波の両方で使用することができる。この場合、テクネチウム９９ｍ又はイリジウム１１１などの高エネルギー、高品質の核医学映像法同位体を、ベシクルの壁に導入することができる。次いで、全身ガンマ走査カメラを使用して、インビボで摂取されたベシクルの領域を迅速に決定することができる。望ましい場合には、超音波を使用して、例えば血管内の血餅の存在を確認することもできる。それというのも、超音波は通常、核医学技術に比較して改善された結果をもたらすためである。ＮＭＩを使用して、患者の全身をスクリーニングし、血管血栓の部位を検出することもでき、超音波をこれらの領域に局所的に適用して、ベシクルの破裂を促進し、血餅を治療することができる。
【０２５７】
光学的撮像では、アルゴン又はネオンなどの光学的に活性なガスを、本発明の組成物中に導入することもできる。加えて、光学的に活性な物質、例えば、ポルフィリン誘導体を含む蛍光物質を使用することもできる。組織弾性画像化法（Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）は、１ＭＨｚを上回る周波数に関する超音波に比較して、かなり低い周波数音波、例えば約６０ＫＨｚを通常は使用する撮像技術である。組織弾性画像化法では、音波エネルギーを通常は、組織に適用し、次いで、組織の弾性を測定することができる。高弾性なベシクルに関する本発明の好ましい実施形態では、例えば血餅へのこのようなベシクルの堆積は、組織及び／又は血餅周囲のスペースの局所的弾性を高める。次いで、この増加した弾性を、組織弾性画像化法で検出することができる。望ましい場合には、組織弾性画像化法を、ＭＲＩ及び超音波などの他の撮像技術と組み合わせて使用することができる。
【０２５８】
前記の診断撮像技術及び血餅の血栓崩壊に加えて、本発明の組成物は、様々な治療理学療法で使用することができる。例えば、生物活性剤、例えば薬剤を、本発明の組成物に導入することができる。有効な薬剤には例えば、硫酸ヘパリン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ及びヒルジンが含まれる。治療用途では、例えば、静脈うっ血を低減するための硫酸ヘパリンと共に使用することができるジヒドロエルゴタミンを含む補足的物質を使用することもできる。加えて、ワルファリンを、抗凝固療法のための補助剤として使用することもできる。遺伝物質を、本発明の組成物に導入することもできる。ベシクル組成物の場合には、遺伝物質を、ベシクルの壁中に、又はベシクルの中心ガス充填ボイド内に導入することもできる。ベシクル壁にカチオン脂質を使用すると、これは簡単に、達成することができる。血管内皮成長因子又は、塩基性線維芽細胞成長因子を対象とするアンチセンス遺伝子断片などの遺伝子を使用することもできる。原アテローム硬化を治療するために、又はフィブロ内膜過形成の傾向を低減するために、本発明を使用することもできる。
【０２５９】
本発明の脂質及び／又はベシクル組成物は、様々な適切な方法を使用して調製することができる。これらは、下記で別々に、ガス充填ベシクルを含む脂質組成物及びガスに関する実施形態並びにガス充填ベシクルを含む脂質組成物及びガス前駆体に関する実施形態で詳述するが、ガス及びガス前駆体の両方を含有する組成物も、本発明の一部である。
【０２６０】
前記のように脂質、タンパク質、ポリマー及び／又は補助的安定化物質を含む、組成物がそれから製造される組成物中で使用されている１種又は複数の物質に結合することにより、ターゲッティングリガンドを、ガス又はガス前駆体充填ベシクルに付着させることができる。
【０２６１】
ミセル及び／又はリポソームなどのベシクル組成物を含む組成物を調製するために、幅広い方法を利用することができる。これらの方法には例えば、振盪、乾燥、ガス導入、噴霧乾燥などが含まれる。ベシクル組成物を調製するための適切な方法は例えば、米国特許第５４６９８５４号に記載されていて、その記載をここでは、参照して援用する。前記のように、ベシクルを好ましくは、ゲル状態のままの脂質から調製する。
【０２６２】
ミセル組成物の調製に特に関連して、次の検討を提供する。当技術分野の専門家には分かるであろう様々な慣用のミセル調製方法のうちのいずれかを使用して、ミセルを調製することができる。これらの方法は通常、有機溶剤中に脂質化合物を懸濁させ、溶剤を蒸発させ、水性媒体に再懸濁させ、音波処理及び遠心分離することを含む。前記の方法、さらに他の方法は例えば、Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶＯｌ．１８９，ｐｐ．４１８−４２２（１９９０）；Ｅｌ−Ｇｏｒａｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．３０６，ｐｐ．５８−６６（１９７３）；Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ，Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｋ．Ｎａｋａｇａｎａ，Ｔａｍａｍｕｓｈｉ  ａｎｄ  Ｉｓｅｊｕｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９６３）（特に、“Ｔｈｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅｌｌｅｓ”，Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐｐ．１−８８）；Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅｌｌａｒ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｅｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｆｅｎｄｌｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９７５）で検討されている。前記の刊行物それぞれの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０２６３】
前記のように、ベシクル組成物は、リポソームを含んでよい。所定のリポソームでは、脂質化合物は、単分子層又は二分子層の形であってよく、単分子層又は二分子層脂質を、１つ又は複数の単分子層又は二分子層を生じさせるために使用することができる。２つ以上の単分子層又は二分子層の場合には、単分子層又は二分子層は通常、同心である。したがって、脂質を使用して、ユニラメラリポソーム（１つの単分子層又は二分子層からなる）、オリゴラメラリポソーム（約２つ又は約３つの単分子層又は二分子層からなる）又はマルチラメラリポソーム（約３を上回る単分子層又は二分子層からなる）を生じさせることができる。
【０２６４】
リポソーム組成物の調製に関して、幅広い方法を利用することができる。したがって、当技術分野の専門家には分かるであろう様々な慣用のリポソーム調製技術のうちのいずれかを使用して、リポソームを調製することができる。これらの技術には例えば、溶剤透析、フレンチプレス、押出し（凍結−融解を伴うか、伴わない）、逆相蒸発、一回凍結−融解、音波処理、キレート透析、均質化、溶剤注入、マイクロエマルジョン化、自発形成、溶剤蒸発、溶剤透析、フレンチプレッシャセル技術、制御界面活性剤透析などが含まれ、それぞれ、様々な方法でのベシクルの調製に関する。例えば、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ，１９９０  ５３，３７−４６参照、この記載をここでは全て、参照して援用する。適切な凍結融解技術は例えば、１９８９年１１月８日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／第０５０４０に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。リポソームの調製では、凍結融解技術を含む方法が、好ましい。リポソームの調製は、生理食塩水、水性リン酸緩衝液又は滅菌水などの溶液中で実施することができる。振盪又は渦流を含む様々なプロセスで、リポソームを調製することができる。例えば、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ（登録商標、Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ、Ｌｙｏｎｓ、ＩＬ）、ドイツ、フランクフルト所在のＤｅｇｕｓｓａ  ＡＧにより販売されているＭｉｘｏｍａｔ、ドイツ、Ｓｅｅｆｅｌｄ、Ｏｂｅｒａｙ所在のＥｓｐｅ  Ｆａｂｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ  ＧＭＢＨ  ＆  Ｃｏ．により販売されているＣａｐｍｉｘ、リヒテンシュタイン所在のＶｉｖａｄｅｎｔにより販売されているＳｉｌａｍａｔ  Ｐｌｕｓ、英国  Ｓｕｓｓｅｘ所在のＱｕａｙｌｅ  Ｄｅｎｔａｌにより販売されているＶｉｂｒｏｓなどの機械的振盪装置を使用することにより、これは達成される。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）などの慣用のマイクロエマルジョン化装置を使用することもできる。
【０２６５】
ガス充填ベシクルを調製するために、噴霧乾燥を使用することもできる。この手順を使用する場合、脂質を水性環境中で予め混合し、次いで、噴霧乾燥させて、ガス充填ベシクルを調製する。ベシクルを、所望のガスのヘッドスペース下に貯蔵することができる。
【０２６６】
ベシクル組成物を調製する際に適している多くのリポソーム調製技術が例えば、米国特許第４７２８５７８号；英国特許出願ＧＢ第２１９３０９５Ａ号；米国特許第４７２８５７５号；米国特許第４７３７３２３号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／第０１１６１号；Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．８５８，ｐｐ．１６１−１６８（１９８６）；Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．８１２，ｐｐ．５５−６５（１９８５）；米国特許第４５３３２５４号；Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４９，ｐｐ．６４−７７（１９８７）；Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．７５５，ｐｐ．１６９−７４（１９８４）；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４７−５５（１９８７）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／第０５０４０号；米国特許第４１６２２８２号；米国特許第４３１０５０５号；米国特許第４９２１７０６号；及びＬｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ｅｄ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ｐｐ．２９−３１、５１−６７及び７９−１０８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ  １９８４）で検討されており、これらそれぞれの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０２６７】
ガスを含有する脂質組成物は、望ましい場合には安定化物質を含有する水溶液を、ガスの存在下に攪拌することにより調製することができる。ここで使用する場合の「攪拌」との用語は、ガスが局所的な周囲環境から水溶液へと導入されるような水溶液の振盪運動のことを意味している。この攪拌は好ましくは、脂質のゲル−液晶相転移温度未満の温度で行う。溶液の攪拌に関する振盪は好ましくは、ベシクル組成物、特にガス充填ベシクルを含むベシクル組成物を含む、脂質組成物を生じさせるに十分な力である。この振盪は、渦流などの渦運動、横−横又は上下運動によるものであってよい。様々なタイプの運動を組み合わせることができる。さらに、脂質水溶液を保持する容器を振盪することにより、又は容器自体を振盪させること無く、容器内の水溶液を振盪することにより、振盪を生じさせることができる。
【０２６８】
この振盪は、手動又は機械により生じさせることができる。使用することができる機械的な振盪機には例えば、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｅｒｒｉｔｏｓ、ＣＡ）ｓｈａｋｅｒ  ｔａｂｌｅなどの振盪機テーブル、さらに、前記のような振盪装置のいずれかが含まれるが、Ｃａｐｍｉｘ（Ｅｓｐｅ  Ｆａｂｒｉｋ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｒ  Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ  ＧＭＢＨ  ＆  Ｃｏ．、ドイツ、Ｓｅｅｆｅｌｄ、Ｏｂｅｒａｙ）が好ましい。一定のモードの振盪又は渦流を使用して、好ましいサイズ範囲のベシクルを製造することができることが判明した。振盪が好ましく、Ｅｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ機械振盪機を使用して、振盪を実施することが好ましい。この好ましい方法では、往復運動を利用して、脂質組成物、特にベシクル組成物を生じさせるのが好ましい。運動を、円弧の形で往復させるのが、さらに好ましい。往復、さらに円弧の速度は特に、ベシクルの形成に関して重要であると考えられる。好ましくは、往復運動又は完全循環振動の回数は、１分当たり約１０００から約２００００回である。さらに好ましくは、往復運動又は振動の回数は、約２５００から約８０００回であり、約３３００から約５０００回の往復運動又は振動が特に好ましい。勿論、振動の回数は、攪拌される内容物の量に依存している。一般に、質量が大きいほど、振動は少ない。振盪を生じさせるための他の手段には、高速又は高圧下に放出されるガスの作用が含まれる。
【０２６９】
好ましくは、より高い容量の水溶液を用いると、力の全体量も相応して高まることは理解されるであろう。激しい振盪は、１分あたり少なくとも約６０回の振盪運動と定義され、これが好ましい。１分当たり約６０から約３００回転での渦流がさらに好ましい。１分当たり約３００から約１８００回転での渦が、特に好ましい。
【０２７０】
前記の簡単な振盪方法に加えて、より入念な方法も使用することができる。このような入念な方法には例えば、Ｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５５８０２７５号に記載されているもののような（この記載をここでは参照して援用する）、液晶振盪ガス滴注プロセス及び真空乾燥ガス滴注プロセスが含まれる。数多くの技術のうちのいずれかを使用することができるが、本発明で使用されるベシクル組成物は好ましくは、振盪技術を使用して調製される。好ましくは、振盪技術は、例えば、Ｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５５４２９３５号に記載されている技術（この記載をここでは参照して援用する）を使用するＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（ドイツ、Ｓｅｅｆｅｌｄ、Ｏｂｅｒａｙ）などの機械的振盪装置での攪拌を含む。
【０２７１】
望ましい場合には、例えば、マイクロエマルジョン化、渦流、押出し、濾過、音波処理、均質化、繰り返し凍結融解サイクル、規定のサイズの空孔を介しての圧力下での押出し及び同様の方法を含む、様々な手順により、ガス充填ベシクルサイズを調整することができる。ここに記載の方法に従い調製されたガス充填ベシクルは、約１μｍ未満から約１００μｍを上回るサイズ範囲であってよい。加えて、下記で詳述する押出し及び滅菌手順の後に、攪拌又は浸透により、ベシクル組成物が得られるが、これは、残りの溶液中に残留無水脂質相を実質的にもたらさないか、最小限しかもたらさない（Ｂａｎｇｈａｍ，Ａ．Ｄ．，Ｓｔａｎｄｉｓｈ，Ｍ．Ｍ，＆  Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２３８−２５２（１９６５））。望ましい場合には、生じさせたそのままで、そのサイズをさらに改質することを試みる必要なしに、本発明のベシクルを使用することができる。静脈内使用のためには、ベシクルは好ましくは、約３０μｍ未満、さらに好ましくは約１２μｍ未満の直径を有する。例えば、ガン組織などの特定の組織に結合することを含む、ターゲット化静脈内使用では、ベシクルはかなり小さくて、例えば、約１００ｎｍ未満の直径であってよい。小腸又は胃腸用の用途では、ベシクルは、かなり大きくて、例えば、１ミリメートルのサイズまでであってよい。好ましくは、ベシクルを、約２μｍから約１００μｍの直径を有するサイズにする。
【０２７２】
フィルターを介する簡単な押出しプロセスにより、ガス充填ベシクルのサイズを調整することができ、その際、フィルター空孔サイズによって、生じるガス充填ベシクルのサイズ分布を制御する。フィルターからなる２個又はそれ以上のカスケード状又は積層セット、例えば８μｍフィルターが後接続している１０μｍフィルターを使用することにより、７から９μｍ付近の非常に狭いサイズ分布を有するように、ガス充填ベシクルを選択することができる。濾過の後に、これらのガス充填ベシクルは、２４時間以上安定なままである。
【０２７３】
組成物が使用前に滅菌バイアルから出される場合には例えばフィルターアセンブリを使用することにより、サイズ調整又は濾過ステップを達成することができ、あるいは、さらに好ましくは、フィルターアセンブリを、使用の間にシリンジに導入しておくこともできる。ベシクルのサイズ調整の方法は、バレル、少なくとも１個のフィルター及び針を含むシリンジを使用することを含み；ベシクルをバレルから、バレルと針との間のシリンジに取り付けられているフィルターを介して押出すことを含む１ステップの押出しにより実施することができ、この際、患者に投与する前に、ベシクルをサイズ調整する。この押出しステップは、シリンジにベシクルを引き入れることも含んでよく、その際、フィルターは同様に、シリンジへの入口でベシクルをサイズ調整するように機能する。他の選択肢は、このようなシリンジに、既に他の手段でサイズ調整されているベシクルを充填することであり、この場合、所望のサイズ範囲内又は所望の最大サイズのベシクルのみが後で、シリンジから押出されて投与されることを保証するように、フィルターは機能する。
【０２７４】
一定の好ましい実施形態では、ベシクル組成物を熱滅菌又はフィルター滅菌し、振盪前にフィルターを介して押出すことができる。一般に、ガスを含有するベシクル組成物は、熱滅菌することができ、ガス前駆体を含有するベシクル組成物は、フィルター滅菌することができる。ガス充填ベシクルを生じさせたら、これを、前記のようにサイズ調整のために濾過することもできる。ガス及びガス前駆体充填ベシクルの形成前にこれらのステップを行うと、直ぐに患者に投与することができる滅菌ガス充填ベシクルが得られる。例えば、バイアル又はシリンジなどの混合容器に、濾過された脂質組成物を充填し、組成物を、混合容器内で、例えばオートクレーブ処理により滅菌することができる。ガスを、組成物中に注入して、滅菌容器を振盪することにより、ガス充填ベシクルを生じさせることができる。好ましくは、滅菌容器に、フィルターを取り付け、これを、ガス充填ベシクルが、患者に接触する前にフィルターを通過するように位置させる。
【０２７５】
フィルターを介して脂質化合物の溶液を押出すステップは、無水物質を破壊し、水和のためのより大きな表面積を与えることにより、非水和物質の量を減らす。好ましくは、フィルターは、約０．１から約５μｍ、さらに好ましくは、約０．１から約４μｍ、特に好ましくは約０．１から約２μｍ、極めて好ましくは、約１μｍの空孔サイズを有する。通常は望ましくない非水和化合物は、不均一なサイズの非晶質クランプとして生じる。
【０２７６】
滅菌ステップにより、例えば、超音波又はＣＴを含む画像診断のために患者に直ぐに投与することができる組成物が得られる。一定の好ましい実施形態では、熱滅菌により、好ましくは、少なくとも約１００℃の温度で溶液をオートクレーブ処理することにより、さらに好ましくは、少なくとも約１００℃から約１３０℃、特に、約１１０℃から約１３０℃、さらに好ましくは、約１２０℃から約１３０℃、特に好ましくは約１３０の温度で溶液をオートクレーブ処理することにより、滅菌を行うことができる。好ましくは、加熱を、少なくとも約１分間、さらに好ましくは約１から約３０分間、特に、約１０から約２０分間、極めて好ましくは、約１５分間行う。
【０２７７】
望ましい場合には、前記のような押出し及び加熱ステップは逆であってよいか、又はこの２つのステップのうちの１つのみを使用することもできる。例えば、γ線照射を含む、滅菌の他の方法を使用することもできる。
【０２７８】
前記の実施形態に加えて、ベシクルに含有される気体前駆体を処方することができ、これは、活性化すると、例えば、高温、ｐＨの変動又は光にさらすと、例えば、ベシクル中に捕捉されている液体を含む液体から、ガスへと相転移して、膨張し、前記のガス充填ベシクルを生じうる。この技術は、Ｕｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５５４２９３５号及びＵｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５５８５１１２号に詳細に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。
【０２７９】
ガス前駆体を活性化するための好ましい方法は、高温にさらすことである。活性化又は転移温度などの用語は、ガス前駆体の沸点であり、ガス前駆体の液−気相転移が生じる温度である。有効なガス前駆体は、約−１００℃から約７０℃の範囲内の沸点を有する物質である。活性化温度は、各ガス前駆体によって特異的である。約３７℃又はほぼヒトの体温の活性化温度が、本発明のガス前駆体では好ましい。したがって、好ましい形態では、液体のガス前駆体は活性化されると、約３７℃又はそれ未満でガスになる。ガス前駆体は、本発明の方法で使用するために、液体又は気相であってよい。
【０２８０】
ガス前駆体充填ベシクルを調製する方法は、液体が、例えばベシクル中に導入されるように、ガス前駆体の沸点未満で実施することができる。加えて、この方法は、ガスが、例えばベシクル中に導入されるように、ガス前駆体の沸点で行うこともできる。低い温度の沸点を有するガス前駆体では、液体の前駆体を、低温まで冷却されたミクロ流動化装置を使用して、乳化することができる。液体の形で前駆体を使用するために、液体媒体中で溶剤を使用して、沸点を低下させることもできる。さらに、プロセスを通して温度が高まる方法を行うこともでき、この際、プロセスを、液体としてのガス前駆体で開始して、ガスで終了する。
【０２８１】
ターゲット化組織又は液体中でその場で、又は患者又は動物に侵入するとインビボで、又は使用前に、又は貯蔵の間に、又は製造の間に、ガスが生じるように、ガス前駆体を選択することができる。温度−活性化ガス前駆体充填ベシクルを製造する方法を、ガス前駆体の沸点未満の温度で実施することができる。この実施形態では、ガス前駆体は、製造の間に相転移が生じないように、ベシクル内に捕捉される。代わりに、ガス前駆体充填ベシクルを、ガス前駆体の液相の形で製造する。温度が前駆体の沸点を上回った時点で、相転移の活性化が生じる。したがって、液体のガス前駆体の滴中の液体の量がわかれば、気体状態を達成した際のベシクルのサイズを決定することができる。
【０２８２】
もしくは、ガス前駆体を使用して、使用する前に予め生じている安定なガス充填ベシクルを造ることもできる。この実施形態では、ガス前駆体を、脂質組成物が収容されている容器に、個々のガス前駆体の液−気相転移温度未満の温度で加える。温度が上昇し、ガス前駆体と液体溶液との間にエマルションが生じると、ガス前駆体は、液体から気体状態へと転移する。この加熱及びガス形成の結果として、ガスが、液体混合物上のヘッドスペース中の空気に代わって、ガス前駆体のガス、周囲ガス（例えば空気）を捕捉しているか、ガス状態のガス前駆体及び周囲空気を同時に捕捉しているガス充填ベシクルが生じる。この相転移は、造影剤の最適な混合及び形成のために使用することができる。例えば、ガス前駆体、ペルフルオロブタンを脂質ベシクル中に捕捉することができ、温度が上昇してペルフルオロブタンの沸点（４℃）を上回ると、ペルフルオロブタンガスはベシクルに捕捉される。
【０２８３】
したがって、ガス前駆体を、インビボでガス充填ベシクルが生じるように選択することができるか、又は、その場で、製造プロセスの間に、貯蔵の間に、又は使用の前に、ガス充填ベシクルが生じるように設計することができる。水浴、超音波発生装置又は、閉じたストップコックの方へシリンジのプランジャを引くことによる流体力学的活性化を、Ｉ．Ｖ．注入の前に、ターゲット化ガス充填ベシクルを、温度感受性ガス前駆体から活性化するために使用することができる。
【０２８４】
本発明の他の実施形態では、水性エマルション中で液体状態のガス前駆体を予め生じさせることにより、ガス状態への転移が果たされた際のベシクルの最大サイズを、理想気体の法則を使用して概算することができる。ガス前駆体からガス充填ベシクルが生じるために、気相が直ちに生じると考えられ、新たに生じたベシクル中のガスは、通常はそのままでは水性である液体中に拡散するために、消費され尽くされない。したがって、エマルション中の判明している液体容量から、ガス充填ベシクルのサイズの上限を予測することができる。
【０２８５】
本発明の実施形態では、特異的な温度、例えばガス前駆体の沸点に達すると、液滴が、膨張して、規定のサイズのガス充填ベシクルになるように、規定のサイズの液滴を含有する脂質化合物及びガス前駆体からなる混合物を処方することができる。規定のサイズは、実際のサイズの上限を示している。それというのも、理想気体の法則は、溶液へのガスの拡散、大気へのガスの損失及び、高圧の効果などのファクターを考慮し得ないためである。
【０２８６】
液体からガス状態へと転移する際のバブルの容量の増大を算出するために使用することができる理想気体の法則は、次である：
ＰＶ＝ｎＲＴ
［上式中、
Ｐは、大気圧（ａｔｍ）であり；
Ｖは、リットル容量（Ｌ）であり；
ｎは、ガスのモル数であり；
Ｔは、ケルビン温度（Ｋ）であり；かつ
Ｒは、理想気体定数（２２．４Ｌ−ａｔｍ／Ｋ−モル）である］。液体混合物中の液体の容量、密度及び温度が分かると、液体の前駆体の例えばモルでの量及び容量を算出することができ、液体前駆体は、ガスに変わると、膨張して、判明している容量のベシクルになる。算出された容量は、ガス充填ベシクルのサイズの上限を反映しているが、その際、ガス充填ベシクル中への即時膨張及び膨張時間に亙ってのガスの無視しうる拡散を仮定してる。
【０２８７】
したがって、前駆体液滴が球体である混合物中で、液体状態で前駆体を安定化することに関して、前駆体液滴の容量は、次式で決定することができる：
容量（球体ベシクル）＝４／３・πｒ３
［上式中、
ｒは、球体の半径である］。したがって、容量を予測し、所望の温度での液体の密度が分かれば、液滴中の液体のガス前駆体の量を決定することができる。より記述的な表現では、理想気体の法則：
ＰＶ＝ｎＲＴ
により、
次の式を当てはめることができる：
Ｖｇａｓ＝４／３・π（ｒｇａｓ）３、
あるいは、
Ｖｇａｓ＝ｎＲＴ／Ｐｇａｓ
又は
（Ａ）    ｎ＝４／３・［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ
量ｎ＝４／３［πｒｇａｓ３Ｐ／ＲＴ］・ＭＷｎ
と表され、液体容量に変換すると、
（Ｂ）    Ｖｌｉｑ＝［４／３・［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ］・ＭＷｎ／Ｄ］
［上式中、Ｄは、前駆体の密度である］。液滴の直径を解くためには、
（Ｃ）    直径／２＝［３／４π［４／３・［πｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ］ＭＷｎ／Ｄ］１／３であり、これは、
直径＝２［［ｒｇａｓ３］Ｐ／ＲＴ［ＭＷｎ／Ｄ］１／３に換算される。
【０２８８】
本発明の方法で使用するために望ましいサイズのベシクルを調製するための他の方法として、容量、特に液体の液滴の半径の知識を元に、ガス前駆体液滴を適切な直径の球体にサイズ調節するために、適切なサイズのフィルターを使用することができる。
【０２８９】
代表的なガス前駆体を、規定のサイズ、例えば１０μｍ直径のベシクルを生じさせるために使用することができる。この例では、ベシクルを、ヒトの血流中で生じさせ、したがって、通常温度は、３７℃又は３１０Ｋである。１気圧の圧力で、（Ａ）の式を使用すると、ガス前駆体７．５４×１０−１７モルが、１０μｍ直径のベシクルの容量を充填するために必要であろう。
【０２９０】
前記の算出量のガス前駆体及び分子量７６．１１、沸点３２．５℃及び２０℃での密度０．７７８９ｇ／ｍｌを有する１−フルオロブタンを使用する場合、他の計算により、この前駆体５．７４×１０−１５グラムが、１０μｍベシクルのために必要であろうことが予測される。さらに推測すると、密度の知識をもとに、式（Ｂ）によりさらに、液体の前駆体８．４７×１０−１６ｍＬが、１０μｍの上限を有するベシクルを生じさせるために必要であることが予測される。
【０２９１】
最後に、式（Ｃ）を用いると、混合物、例えば半径０．０２７２μｍ又は対応する直径０．０５４４μｍを有する液滴を含むエマルションが、１０μｍベシクルの上限を有するガス前駆体充填ベシクルを製造するために生じる。
【０２９２】
適切なサイズのフィルターを使用することにより、この粒度のエマルションを簡単に得ることができる。加えて、規定のサイズのガス前駆体液滴を生じさせるために必要なフィルターサイズから分かるように、フィルターのサイズは、ありうる細菌汚染物を除去するために十分であり、したがって、滅菌濾過として使用することもできる。
【０２９３】
ガス充填ベシクルを調製するためのこの実施形態を、温度により活性化される全てのガス前駆体に適用することができる。実際に、溶剤系の凝固点の低下により、０℃未満の温度で液−気相転移が生じるガス前駆体を使用することができる。ガス前駆体を懸濁するための媒体が得られるように、溶剤系を選択することができる。例えば、緩衝食塩水に混合可能な２０％プロピレングリコールは、水単独での凝固点未満の凝固点低下を示す。プロピレングリコールの量を増やすか、塩化ナトリウムなどの物質を加えることによりさらに、凝固点を低下させることができる。
【０２９４】
適切な溶剤系の選択は、物理的方法によって決定することもできる。ここでは溶質とも称される物質、固体又は液体が、水系緩衝液などの溶剤に溶解する場合には、溶液の組成に応じた量により、凝固点が低下する。したがって、Ｗａｌｌによって定義されているように、溶剤の凝固点低下を次の式により表すことができる：
Ｉｎｘａ＝Ｉｎ（１−ｘｂ）＝ΔＨｆｕｓ／Ｒ（１／Ｔｏ−１／Ｔ）
［上式中、
ｘａは、溶剤のモル分率であり；
ｘｂは、溶質のモル分率であり；
ΔＨｆｕｓは、溶剤の熱融合であり；かつ
Ｔｏは、溶剤の通常の凝固点である］。溶剤の通常の凝固点は、式の解により得られる。ｘｂがｘａよりも小さい場合には、上式は、次のように書き直すことができる：
ｘｂ＝ΔＨｆｕｓ／Ｒ（Ｔ−Ｔｏ／ＴｏＴ）≒ΔＨｆｕｓΔＴ／ＲＴｏ２
上式により、温度ΔＴの変化は、Ｔ２よりも小さいと推測される。溶質の濃度を重量モル濃度、ｍ（溶剤１０００グラム当たりの溶質のモル）で表すことにより、この式をさらに簡単にすることができる。したがって、この式を次のように書き直すことができる：
Ｘｂ＝ｍ／［ｍ＋１０００／ｍａ］≒ｍＭａ／１０００
［上式中、
Ｍａは、溶剤の分子量である］。
【０２９５】
分率ｘｂに代えると：
ΔＴ＝［Ｍ３ＲＴｏ２／１０００ΔＨｆｕｓ］ｍ
又は
ΔＴ＝Ｋｆｍ
［式中、Ｋｆ＝ＭａＲＴｏ２／１０００ΔＨｆｕｓ］。
Ｋｆは、モルの凝固点であり、１大気圧での水のモル濃度−１単位当たり１．８６度に等しい。上式を、ガス前駆体充填ベシクルの溶液のモル凝固点を正確に決定するために使用することができる。したがって、凝固点低下を推定し、溶剤凝固温度を適切な値に低下させるために必要な液体又は固体溶質の適切な濃度を決定するために、上式を使用することができる。
【０２９６】
温度活性化ガス前駆体充填ベシクルを調製するための方法には、次の方法が含まれる：
（ａ）ガス前駆体及び、例えば、安定化物質、増粘剤及び／又は分散剤を含む前記のような付加的な物質からなる水溶性混合物を渦流及び／又は振盪する。この方法の付加的なバリエーションには、渦流又は振盪前のオートクレーブ処理；ガス前駆体の水性混合物の加熱；混合／懸濁液を含有する容器のガス抜き；ガス前駆体充填ベシクルの振盪又は放置による、ガス前駆体充填ベシクルの懸濁液の自発的な形成及び冷却；及び約０．２２μｍのフィルターを介してのガス前駆体の水性懸濁液の押出しが含まれる。もしくは、約０．２２μｍのフィルターを使用して、ベシクルのインビボ投与の間に、濾過を行うこともできる：
（ｂ）ガス前駆体の水性混合物を、攪拌により乳化させ、加熱して、例えば、患者に投与する前にベシクルを生じさせる、ミクロエマルション化；
（ｃ）攪拌を伴う、又は伴わない混合物中のガス前駆体の加熱であって、その際、膨張及び容器中の他のベシクルの置換及び空気を放出するための容器のガス抜きにより、溶液の上方に低い密度のガス前駆体充填ベシクルが浮かぶ；及び
（ｄ）前記のいずれかの方法での、ガス前駆体の水性懸濁液を保持する密閉容器の使用及びガス前駆体の相転移温度未満の温度での懸濁液の維持、さらにそれに続く、場合によって振盪しながら、相転移温度以上に温度を上昇させるためのオートクレーブ処理又はガス前駆体ベシクルの自発的な発生であって、その際、密閉された容器中の膨張したガス前駆体が、容器の圧力を高め、さらに、ガス充填ベシクル懸濁液を冷却し、その後に、振盪を行ってもよい。
【０２９７】
振盪導入方法の前に、水及び有機物質を除去するために、凍結乾燥が役立つ。ベシクルから水を除去するために、乾燥導入方法を使用することもできる。加温した後に、乾燥させるベシクル中にガス前駆体を予備捕捉（即ち、乾燥前）することにより、ガス前駆体を膨張させて、ベシクルを充填することができる。ガス前駆体はさらに、真空を適用された後の乾燥させたベシクルに充填するために使用することもできる。乾燥させたベシクルを、そのゲル状態−液晶温度未満の温度に維持したまま、乾燥室に徐々に、そのガス状態にあるガス前駆体を充填することができる。例えば、ペルフルオロブタンを使用して、４℃（ペルフルオロブタンの沸点）以上の温度で、乾燥ベシクルに充填することができる。
【０２９８】
温度活性化ガス前駆体充填ベシクルを調製するための好ましい方法は、脂質化合物を有する水溶液を、ガス前駆体の存在下に、ガス前駆体の液体状態−ガス状態相転移温度未満の温度で振盪することを含む。好ましくは、脂質のゲル状態−液晶状態相転移温度未満の温度で、これを行う。次いで、混合物を、ガス前駆体の液体状態−ガス状態相転移温度を上回る温度まで加熱すると、前駆体が揮発して、膨張する。次いで、加熱を中断し、混合物の温度を、ガス前駆体の液体状態−ガス状態相転移温度未満まで低下させる。混合物の振盪は、加熱ステップの間に、又はその後の、混合物を冷却させた後に行うことができる。
【０２９９】
ガス前駆体充填ベシクルを調製するための他の方法は、例えば脂質及びガス前駆体の水溶液を振盪すること及び生じたガス前駆体充填ベシクルを分離することを含む。
【０３００】
先行技術の慣用の水性−充填リポソームは通常、それらを作るために使用される脂質の相転移温度以上の温度で生じる。それというのも、これらは、より柔軟で、したがって、液晶状態で生物系で使用することができるためである。例えば、Ｓｚｏｋａ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７８，７５，４１９４−４１９８参照。これに対して、ここに記載の一定の好ましい実施形態に従い製造されたベシクルは、ガス前駆体を充填されていて、これは、より大きな柔軟性を与える。それというのも、ガス形成後のガス前駆体は、水性溶液よりも圧縮性及びコンプライアンスが高いためである。
【０３０１】
本発明で考えられた方法は、脂質を含有する水溶液を、温度活性化可能なガス前駆体の存在下に振盪することを規定している。好ましくは、約３０分などの短時間以内に、好ましくは約２０分以内に、さらに好ましくは、約１０分以内にフォームが生じるような力で、振盪は十分である。振盪は、ミクロエマルション化、ミクロ流動化、渦（渦流によるような）、横−横又は上下運動を伴ってよい。液体状態のガス前駆体を加える場合には、前記の振盪方法に加えて、音波処理を使用することもできる。さらに、様々なタイプの運動を組み合わせることもできる。さらに、脂質水溶液を保持する容器を振盪することによるか、又は容器自体を振盪することなく、容器内の水溶液を振盪することにより、振盪を行うことができる。さらに、振盪を手動又は機械で行うことができる。使用することができる機械的振盪装置には例えば、前記のような機械的振盪機が含まれ、Ｅｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（ドイツ、Ｓｅｅｆｅｌｄ、Ｏｂｅｒａｙ）が好ましい。振盪を生じさせるための他の手段には、高速又は高圧下に生じるガス前駆体の作用も含まれる。
【０３０２】
ここに記載されている方法では、空気などのガスは、局所的な周囲大気により得る。局所的な周囲大気には、密閉された容器内の大気、さらに、外部環境が含まれる。もしくは例えば、ガスを、脂質水溶液を有する容器又は脂質水溶液自体に注入するか、加えて、空気以外のガスを与えることもできる。空気よりも軽いガスは通常、密閉された容器に加えるが、空気よりも重いガスは、密閉された又は、密閉されていない容器に加えることができる。したがって、本発明には、ガス前駆体と共に、空気及び／又は他のガスを同時捕捉することも含まれる。
【０３０３】
したがって、ガス前駆体充填ベシクルは、ホストの組織に適用されて活性化されれば、ここに記載のガス充填ベシクルと実質的に同様に使用することができ、温度又はｐＨなどのファクターを、ガスの発生を惹起するために使用することができる。ガス前駆体は、ホストの正常体温付近で、液体からガス状態への相転移するので、例えば、ホストのインビボ温度により活性化して、気相へと転移しうるのが好ましい。代わりに、例えば、熱、機械又は光学的手段によるＩ．Ｖ．注入前の活性化を使用することもできる。例えば、ホスト組織が、約３７℃の正常温度を有するヒト組織であり、ガス前駆体が、３７℃付近で液体から気相に相転移する場合に、この活性化を行うことができる。
【０３０４】
前記のように、導入ステップの前に、又は組成物内の温度感受性ガス前駆体の温度による変化前に、これらのプロセスを行う場合には、脂質及び／又はベシクル組成物をオートクレーブ又は滅菌濾過により滅菌することができる。もしくは、安息香酸ナトリウム、４級アンモニウム塩、アジ化ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチレンジアミン、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、二酸化イオウ及び有機水銀塩などの１種又は複数の抗菌剤及び／又は防腐剤が、組成物の処方中に含まれていてよい。安定化されたベシクルを、観血的環境下で、例えば、血管内又は腹腔内で撮像するために使用する際には、放射線などの他の慣用の方法によっても達成することができるこのような滅菌が必要である。滅菌の適切な手段は、本記載を元にすれば、専門家には分かるであろう。
【０３０５】
アルブミンベシクルなどのタンパク質から処方されたベシクル（タンパク質封入ミクロバブルとも称される）を含有するベシクル組成物を、本記載を得れば、当技術分野の専門家には容易に理解されるであろう様々な方法で調製することができる。適切な方法には、例えば、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎの米国特許第４５７２２０３号、同第４７１８４３３号及び同第４７７４９５８号並びにＣｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４９５７６５６号に記載されている方法が含まれ、これらの記載をここでは全て、参照して援用する。タンパク質ベースのベシクルの調製に関する前記の特許中に記載されている方法の内には、タンパク質の溶液を音波処理することを含む方法が含まれる。好ましい形態では、出発物質は、熱変性水溶性生体適合性タンパク質の水溶液であってよい。封入タンパク質は好ましくは、熱感受性であるので、音波処理の間の加熱により、部分的に不溶化されうる。適切な熱感受性タンパク質には例えば、アルブミン、ヘモグロビン、コラーゲンなどが含まれる。好ましくは、タンパク質は、ヒトタンパク質であり、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）がさらに好ましい。ＨＳＡは、滅菌５％水溶液として市販されており、これは、タンパク質ベースのベシクルを調製する際に使用するために適している。もちろん、当技術分野の専門家には分かるように、他の濃度のアルブミン、さらに熱変性な他のタンパク質を、ベシクルを調製するために使用することができる。一般に、ＨＳＡの濃度は変動してよく、約０．１から約２５重量％及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの範囲であってよい。タンパク質ベースのベシクルを調製するための一定の方法では、希水溶液の形のタンパク質を使用することが好ましい。アルブミンでは、アルブミン約０．５から約７．５重量％を含有する水溶液を使用するのが好ましく、約５重量％未満、例えば、約０．５から約３重量％の濃度が好ましい。
【０３０６】
タンパク質系ベシクルを、市販の装置を使用して調製することもできる。例えば、Ｃｅｒｎｙ，ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４９５７６５６号に記載されているような供給調製運転では、Ｗａｌｋｅｒ  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．（Ｎｅｗ  Ｌｉｓｂｏｎ、ＷＩ）から市販されているステンレス鋼タンク及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から市販されているプロセスフィルターを使用することができる。
【０３０７】
音波処理運転では、音波処理容器を通る熱交換器及びフローの両方を連続して利用することができる。このタイプの熱交換装置は、ＩＴＴ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）から得られる。熱交換器は、音波処理プロセスのために運転温度を維持し、温度制御は、媒体の調製に応じて、約６５℃から約８０℃である。音波処理装置の振動数は、幅広い範囲で、例えば、約５から約４０キロヘルツ（ｋＨｚ）で変動しうるが、市販の音波処理装置の大部分は、約１０又は２０ｋＨｚで運転する。適切な音波処理装置には例えば、Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）により市販されている、フラットチップ音波処理器用ホーンを備えたＳｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌが含まれる。超音波処理器用ホーンに掛ける力は、Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ  Ｍｏｄｅｌ  ＶＬ１５００のように、製造者により１から１０の段階まである出力設定で変動させることができる。中間の出力設定、例えば５から９を使用することができる。振動数及び供給される力が、超音波処理される液体中にキャビテーションをもたらすのに十分であるのが、望ましい。供給流速は、約５０ｍＬ／分から約１０００ｍＬ／分及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの範囲であってよい。音波処理容器中の滞留時間は、約１秒から約４分間の範囲内であり、ガス流体添加速度は、１分当たり約１０立方センチメートル（ｃｃ）から約１００ｃｃ／分、あるいは、供給流速の５％から２５％及びこの範囲内の全ての組合せ及び二次的組合せの範囲であってよい。
【０３０８】
溶液の発泡、特に強い発泡が生じるように、音波処理を実施するのが好ましい。一般に、強い発泡及びエアロゾル化は、高い濃度及び安定性を有する造影剤を得るために重要である。発泡を促進するために、音波処理ホーンへの入力を高くして、プロセスを、穏やかな圧力、例えば約１から約５ｐｓｉの下で運転することができる。溶液の曇りの発生及び生じたフォームにより、発泡は容易に検出することができる。
【０３０９】
タンパク質ベースのベシクルを調製するための適切な方法はさらに、物理的又は化学的に、タンパク質又はタンパク質誘導体を水溶液に変えて、物質を変性又は固定することを含む。例えば、音波処理を介して造影剤を処方した後に、又はその間に、加熱することにより、タンパク質系ベシクルをＨＳＡの５％水溶液から調製することができる。化学的な変性は、タンパク質とグルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）などの二官能性アルデヒドとを結合することにより、化学的に変性又は固定することを含む。例えば、ベシクルを、タンパク質１グラム当たり５０％水性グルテルアルデヒド０．２５グラムと、ｐＨ４．５で、６時間反応させることができる。未反応のグルテルアルデヒドを次いで、タンパク質から洗浄する。
【０３１０】
本記載を与えられれば、当技術分野の専門家には分かるように、タンパク質ベースのベシクルを調製するための前記の技術のいずれかで、ターゲッティングリガンドを、ベシクルの形成の前に、その間に、又はその後に、タンパク質と共に導入することができる。
【０３１１】
本記載を得れば、当技術分野の専門家には容易に分かるように、ポリマーから処方されたベシクルを含有するベシクル組成物は、様々なプロセスで調製することができる。代表的なプロセスには例えば、界面重合、相分離及びコアセルベーションマルチオリフィス拡散調製及び溶剤蒸発が含まれる。ポリマーからベシクルを調製するための本記載に従い使用又は変更することができる適切な手順には、Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４１７９５４６号、Ｇａｒｎｅｒの米国特許第３９４５９５６号、Ｃｏｈｒｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４１０８８０６号、日本公開特許公報第６２２８６５３４号、英国特許第１０４４６８０号、Ｋｅｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３２９３１１４号、Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３４０１４７５号、Ｗａｌｔｅｒｓの米国特許第３４７９８１１号、Ｗａｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第３４８８７１４号、Ｍｏｒｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３６１５９７２号、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４５４９８９２号、Ｓａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４５４０６２９号、Ｓａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４４２１５６２号、Ｓａｎｄｓの米国特許第４４２０４４２号、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許４８９８７３４号、Ｌｅｎｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４８２２５３４号、Ｈｅｒｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第３７３２１７２号、Ｈｉｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３５９４３２６号、Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第３０１５１２８号、ＤｅａｓｙのＭｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｃｈｓ．９  ａｎｄ  １０，ｐｐ．１９５−２４０（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８４）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．のＣａｎａｄｉａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．１１５−１２９（１９６６）及びＣｈａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１４６，ｐｐ．５２４−５２５（１９６４）に記載されている手順が含まれ、これらそれぞれの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０３１２】
好ましい合成プロトコルでは、例えば、Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４１７９５４６号、Ｇａｒｎｅｒの米国特許第３９４５９５６号、Ｃｏｈｒｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４１０８８０６号、英国特許第１０４４６８０号及び日本公開特許公報第６２２８６５３４号に記載されているプロセスなどの熱膨張プロセスを使用して、ベシクルを調製することができる。通常、そのボイド（キャビティ）中に揮発性液体（ガス前駆体）を含有しうる膨張性ポリマー又はコポリマーのベシクルを調製することにより、この熱膨張プロセスを実施することができる。次いで、このベシクルを加熱して、ベシクルを可塑化し、揮発性液体をガスに変えると、ベシクルは、その本来のサイズの約数倍まで膨張する。熱を除去すると、熱可塑性ポリマーは、その膨張した形の少なくとも若干を維持する。この方法により製造されたベシクルは、特に低い密度を有する傾向があり、したがって好ましい。前記のプロセスは、当技術分野でよく知られており、低密度ベシクルを調製するための熱膨張プロセスとも称される。
【０３１３】
熱膨張プロセスで使用することができるポリマーは、当技術分野の専門家には容易に分かり、前記のモノマーの多くからなるポリマー又はコポリマーを含む熱可塑性ポリマー又はコポリマーが含まれる。好ましい前記のポリマー及びコポリマーには、次のコポリマーが含まれる：ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリル−ポリメチル−メタクリレート及びポリスチレン−ポリアクリロニトリル。最も好ましいコポリマーは、ポリビニリデン−ポリアクリロニトリルである。
【０３１４】
熱膨張プロセスで使用することができる揮発性液体は、当技術分野の専門家にはよく知られており、エタン、エチレン、プロパン、プロペン、ブタン、イソブタン、ネオペンタン、アセチレン、ヘキサン、ヘプタンなどの脂肪族炭化水素；ＣＣｌ３Ｆ、ＣＣｌ２Ｆ３、ＣＣｌＦ３、ＣＣｌＦ２−ＣＣｌ２Ｆ２、クロロヘプタフルオロ−シクロブタン及び１，２−ジクロロヘキサフルオロシクロブタンなどのクロロフルオロ炭化水素；テトラメチルシラン、トリメチルエチルシラン、トリメチルイソプロピルシラン及びトリメチルｎ−プロピルシランなどのテトラアルキルシラン；さらに、前記のペルフルオロ炭化水素を含むペルフルオロ炭化水素が含まれる。通常、揮発性液体は、使用されるポリマー又はコポリマーの溶剤ではないことが重要である。揮発性液体が、該当するポリマー又はコポリマーの軟化点未満である沸点を有することが望ましい。様々な揮発性液体の沸点及び様々なポリマー及びコポリマーの軟化点は、当技術分野の専門家には容易に確認することができ、ポリマー又はコポリマーと揮発性液体との適切な組合せは、専門家には容易に分かるであろう。指針により、さらに当技術分野の専門家には理解されるように、通常、揮発性液体の炭素鎖の長さが長くなると、液体の沸点も高まる。したがって、最終的な加熱及び膨張の前に、過酸化水素の存在下に、水中でベシクルを穏やかに予備加熱して、ベシクルを予備軟化すると、より容易に膨張させることができる。
【０３１５】
合成ポリマーからなるベシクルを製造するために例えば、１種又は２種の前記文献の方法を変更するか又はそのまま使用して、ビニリデン及びアクリロニトリルを、イソブタン液の媒体中で共重合させて、イソブタンがベシクル内に捕捉されるようにする。次いで、このようなベシクルを約８０℃から約１２０℃の温度に加熱すると、イソブタンガスが膨張して、ベシクルを膨張させる。熱を除去した後に、膨張したポリビニリデン及びアクリロニトリルコポリマーベシクルは、実質的にその膨張した位置に留まる。生じた低密度ベシクルは、乾燥した状態でも、水性媒体中に懸濁されても、極めて安定である。この場合に、イソブタンは単なる例示的な液体として使用したに過ぎず、これらのベシクルの合成及び非常に低密度のベシクルを形成するために使用することができる温度で、加温すると液／ガス転移しうる他の液体で、イソブタンに代えることができることは理解されるであろう。同様に、ビニリデン及びアクリロニトリル以外のモノマーを、ベシクルを調製する際に使用することもできる。
【０３１６】
一定の好ましい実施形態では、合成ポリマーから処方されていて、本発明の方法で使用することができるベシクルは、Ｅｘｐａｎｃｅｌ、Ｎｏｖｅｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｓｕｎｄｓｖａｌｌ、スウェーデン）から市販されていて、ＥＸＰＡＮＣＥＬ５５１ＤＥ（登録商標）ミクロスフェアが含まれる。ＥＸＰＡＮＣＥＬ５５１ＤＥ（登録商標）ミクロスフェアは、その中にイソブタン液体が封入されているビニリデン及びアクリロニトリルのコポリマーからなる。このようなミクロスフェアは、無水組成物として販売されており、ほぼ５０ミクロンのサイズである。ＥＸＰＡＮＣＥＬ５５１ＤＥ（登録商標）ミクロスフェアは、水密度の１／５０から１／２０である０．０２から０．０５の比重しか有さない。
【０３１７】
ポリマーベースのベシクルを調製するための前記の技術では、本記載を得れば、当技術分野の専門家には分かるように、ベシクルの形成の前、その間、又はその後に、ターゲッティングリガンドをポリマーと共に導入することができる。
【０３１８】
脂質及び／又はベシクル組成物の調製と同様に、幅広い技術を、脂質処方物を調製するために利用することができる。例えば、脂質及び／又はベシクル処方物を、脂質化合物、生物活性剤及びガス又はガス前駆体からなる混合物から調製することができる。この場合、脂質組成物を、前記のように調製し、その際、この組成物は、生物活性剤も含有する。したがって例えば、ミセルを、生物活性剤の存在下に調製することができる。ガスを含有する脂質組成物では、調製は例えば、脂質化合物及び１種又は複数の付加的な材料からなる混合物中で直接、ガスを発泡させることを含む。もしくは、脂質組成物を、脂質化合物及びガス又はガス前駆体から予め生じさせることもできる。後者の場合には、次いで、生物活性剤を、使用前に脂質組成物に加える。例えば、リポソーム及びガスからなる水性混合物を調製し、これに、生物活性剤を加え、攪拌すると、リポソーム処方物が得られる。リポソーム処方物は容易に、単離することができる。それというのも、ガス及び／又は生物活性剤充填リポソームベシクルは通常、水溶液の上方に浮かぶ。過剰な生物活性剤を、残留している水溶液から回収することができる。
【０３１９】
当技術分野の専門家には理解されるように、脂質及び／又はベシクル組成物及び／又は脂質及び／又はベシクル処方物を貯蔵のために凍結乾燥させ、例えば、水性媒体（滅菌水、リン酸緩衝液又は水性食塩水）で、激しい攪拌により再構成することができる。凍結乾燥の結果としての脂質及び／又はベシクルの凝集又は融合を防ぐために、このような融合又は凝集の発生を防ぐ添加剤を加えることも役立つ。使用することができる添加剤には、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、トレハロース、ポリビニルピロリドン及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ４００が含まれる。これらの、及び他の添加剤は、米国薬局方、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ、ＮＦ  ＸＶＩＩ、アメリカ薬局方、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，１２６０１  Ｔｗｉｎｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋｗａｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２などの文献に記載されており、これらの記載はここで全て、参照して援用する。凍結乾燥された製剤は通常、より長い貯蔵寿命という利点を有する。
【０３２０】
前記のように、ガス及び／又はガス前駆体充填ベシクルを含む本発明の組成物は、例えば、超音波撮像（ＵＳ）、ＣＴ血管造影（ＣＴＡ）撮像を含むコンピュータ断層撮影（ＣＴ）撮像、磁気共鳴（ＭＲ）撮像、磁気共鳴造影（ＭＲＡ）、核医学、光学撮像及びエラストグラフィを含む画像診断のための造影剤として使用することができる。
【０３２１】
本発明では、患者の１つ又は複数の局部を撮像する方法を提供する。本発明は、患者での疾患組織の存在の有無を診断する方法も提供する。本発明の方法は、造影剤を脂質及び／又はベシクル組成物の形で患者に投与することを含む。患者を、例えば、超音波撮像を含む画像診断を使用して走査して、患者の体内局部の可視映像を得る。この方法は特に、心臓領域、胃腸領域又はリンパ系の映像を得る際に使用することができるが、より幅広く、例えば血管を含む患者の他の内部領域を撮像するために使用することもできる。ここで使用する場合の「胃腸領域」又は「胃腸管」との句には、食道、胃、小腸、大腸及び直腸により規定される患者の局部が含まれる。本発明はさらに、患者の体内局部に生物活性剤を輸送するために使用することもできる。
【０３２２】
当技術分野の専門家には理解されるように、本発明の脂質及び／又はベシクル組成物の投与は、様々な方法で、即ち、非経口で、経口で、又は腹腔内で実施することができる。好ましい非経口投与には、次の経路での投与が含まれる：静脈内；筋肉内；組織内；動脈内；皮下；眼内；滑液包内；経皮を含む経上皮；吸入を介しての肺内；眼；舌下及び頬側；眼を含む局所；皮膚；眼；直腸及び吸入を介しての鼻吸入。非経口投与の経路のうちでは、静脈内投与が好ましい。投与に有効な用量及び投与の特定の方法は、年齢、体重及び特定の哺乳動物及び走査されるその局部及び使用される特定の造影剤に応じて変動する。通常、用量を比較的低いレベルから開始して、所望のコントラスト強度に達するまで、増やす。脂質組成物の様々な組合せを、粘度、容量オスモル濃度又は嗜好性を含む特性を望ましいように変更するために使用することができる。本発明の撮像方法を実施する際に、造影剤を単独で、又は診断剤、治療剤又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。このような他の薬剤には、着香剤又は着色剤などの付形剤が含まれる。使用されるＣＴ撮像技術は慣用で、例えば、Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｂｏｄｙ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．Ｔ．，Ｓａｇｅｌ，Ｓ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｒ．Ｊ．ｅｄｓ．，１９８３，Ｒａｖｅｎｓ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、特に、“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，Ｔｅｒ−Ｐｏｇｏｓｓｉａｎ，Ｍ．Ｍ．及び“Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ａｒｏｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．とのタイトルの初めの２つの章に記載されており、これらの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０３２３】
超音波及びＣＴなどの診断用途では、超音波エネルギーなどのエネルギーを、少なくとも患者の一部に適用して、ターゲット組織を撮像する。そして、疾患組織の有無が確認できるように、患者の体内局部の可視映像を得る。超音波に関しては、第二調波撮像を含む超音波撮像技術及びゲーテッド像映（ｇａｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）が当技術分野ではよく知られており、例えば、Ｕｈｌｅｎｄｏｒｆ，“Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｒａｎｇｅ”，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃｓ，ａｎｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｖｏｌ．１４（１），ｐｐ．７０−７９（１９９４）及びＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｌｏｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．７（５），ｐｐ．４４１−４５８（１９９４）に記載されており、これらの記載をここでは全て、参照して援用する。
【０３２４】
診断目的及び治療目的の両方で、超音波を使用することができる。診断用超音波では、超音波又は超音波のパルス列を、トランスデューサを用いて適用することができる。超音波は通常、連続的であるよりも、パルスとしてであるが、望ましい場合には、連続的であってもよい。したがって、診断用超音波は通常、エコーのパルスを適用し、その後、聴音期間の間に、超音波トランスデューサが、反射信号を受信することを含む。高調波、超高調波又は低調波を使用することができる。二次高調波モードを有利には使用し、この際、２ｘの周波数が受信され、ここで、ｘは、付随周波数である。これは、バックグラウンド物質からの信号を低減し、所望の部位、例えば血餅をターゲットとしうる本発明のターゲット化造影剤を使用して、トランスデューサからの信号を増幅するために役立つ。奇数調波、例えば、３ｘ又は５ｘなどの他の高調波も同様に、この方法を使用して受信される。低調波信号、例えばｘ／２及びｘ／３を受信して、映像を形成するために処理することもできる。
【０３２５】
パルス法に加えて、連続的な超音波、例えばパワードップラー（Ｐｏｗｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ）を適用することもできる。硬質ベシクル、例えば、ポリメチルメタクリレートから処方されたベシクルを使用する場合に、これは特に有用である。この場合、比較的高いエネルギーのパワードップラーは、ベシクルを共振させて、その破裂を促進しうる。これにより、アコースティックエミッションが生じ、これは、低調波又は超高調波範囲であるか、場合によっては、適用された超音波と同じ周波数でありうる。このプロセスで放出されるアコースティックサインのスペクトルが存在し、こうして使用されるトランスデューサはアコースティックエミッションを受信して、例えば、血餅の存在を検出すると考えられる。加えて、例えば血餅分解を促進するために、血餅表面に運動エネルギーを移動させるベシクル破裂のプロセスを使用することもできる。したがって、診断用及び治療用超音波を組み合わせると、治療的な血栓崩壊を達成することができる。スペクトルドップラー（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｏｐｐｌｅｒ）を使用することもできる。通常、ベシクルの破壊を促進し、生物活性剤の放出及び細胞摂取を容易にするためには、診断用超音波からのエネルギーレベルでは不十分である。前記のように、診断用超音波は、１つ又は複数の音波パルスを適用することを含む。パルス間の休止期に、反射された音波信号を受信し、分析することができる。診断用超音波で使用される限られた数のパルスにより、調査されている組織に輸送される実効エネルギーが限られる。
【０３２６】
高エネルギー超音波、例えば、治療用超音波装置により発生される超音波により通常、ベシクル種の破壊を惹起することができる。通常、治療用超音波のための装置は、超音波で治療される組織の面積に応じて、約１０から約１００％のデューティサイクルを使用する。大部分の筋肉部分により通常は特徴付けられる体の領域、例えば、背中及び大腿、さらに、心臓組織などのかなり血管化された組織は、より大きなデューティサイクル、例えば約１００％までを必要とする。
【０３２７】
治療用超音波では、連続的な超音波を使用して、より高いエネルギーレベルを輸送する。ベシクルを破壊するためには、連続的な超音波が好ましいが、音波エネルギーは、パルスであってもよい。パルス音波エネルギーを使用する場合、音波は通常、１回に約８から約２０又はそれ以上のパルスのエコー列長さのパルスである。好ましくは、エコー列長さは、１回に約２０パルスである。加えて、使用される音波の周波数は、約０．０２５から約１００メガヘルツ（ＭＨｚ）で変動する。通常、治療用超音波での周波数は、約０．７５から約３ＭＨｚの範囲であり、約１から約２ＭＨｚが、さらに好ましい。加えて、エネルギーレベルは、１立方センチメートル（ｃｍ２）当たり約０．５ワット（Ｗ）から約５．０Ｗ／ｃｍ２であってよく、約０．５から約２．５Ｗ／ｃｍ２のエネルギーレベルが好ましい。過高熱を伴う治療用超音波でのエネルギーレベルは通常、約５Ｗ／ｃｍ２から約５０Ｗ／ｃｍ２である。非常に小さいベシクル、例えば、約０．５μｍ未満の直径を有するベシクルでは、より高い音波周波数が通常は、好ましい。これは、より小さいベシクルは、より高い音波周波数で、より有効に音波エネルギーを吸収しうるためである。非常に高い、例えば、約１０ＭＨｚを上回る周波数を使用する場合、音波エネルギーは通常、流体及び組織を透過して、限られた深さにのみ到達する。したがって、音波エネルギーの外部適用は、皮膚及び他の表面組織に適している。しかしながら、深部構造では、超音波エネルギーを集中させて、焦点帯域内が優先的に対象となるようにすることが、通常は必要である。もしくは、超音波エネルギーを、介在プローブ、血管内超音波カテーテル又は管腔内（ｅｎｄｏｌｕｍｉｎａｌ）カテーテルを介して適用することができる。例えば、食道ガンの診断及び／又は治療のために食道で、このようなプローブ又はカテーテルを使用することができる。前記の治療での使用に加えて、本組成物を食道ガンで、又はアテローム硬化の治療のために冠動脈で、さらに例えば、米国特許第５１４９３１９号（この記載をここでは全て、参照して援用する）に記載されているような治療用途に、使用することができる。
【０３２８】
２つの超音波周波数を利用する治療用超音波装置を、使用することができる。第１の周波数は、ｘであってよく、第２の周波数は、２ｘであってよい。好ましい形態では、第１及び第２周波数の焦点帯域が、単一の焦点帯域に集中するように、この装置は設計される。この場合、装置の焦点帯域は、ターゲット化組織内のターゲット化組成物、例えば、ターゲット化ベシクル組成物を対象とする。この超音波装置は、超音波エネルギーのｘ及び２ｘ周波数の同時適用を用いて、第２の調波治療（ｈａｒｍｏｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）をもたらしうる。ベシクルを伴う超音波の場合には、第２の調波治療は、単一の周波数を伴う超音波エネルギーに比べて、改善されたベシクル破壊をもたらすと考えられる。また、好ましい周波数範囲は、ベシクルの基本調波内であると考えられる。より低いエネルギーを、このデバイスで使用することもできる。前記の第２の調波治療で使用することができる超音波装置は、例えば、Ｋａｗａｂａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ．１−５（１９９６）に記載されており、この記載をここでは全て、参照して援用する。
【０３２９】
望ましい安定化ベシクルレベルを生じさせるために必要な脂質の濃度は、使用される脂質のタイプに依存して変動し、慣用の実験により容易に決定することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の方法により安定化されたベシクルを生じさせるために使用される１，２−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の濃度は、生理食塩水溶液中、約０．１ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、生理食塩水溶液中、約０．５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、生理食塩水溶液中、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌである。好ましい実施形態で使用されるジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）は、生理食塩水溶液中、約０．１ｍｇ／ｍｌから約３０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、生理食塩水溶液中、約０．５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、生理食塩水溶液中、約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌである。患者に投与される組成物の量は、変動しうる。通常、ＩＶ用量は、７０ｋｇの患者で約１０ｍＬ未満であり、より低い用量が好ましい。
【０３３０】
前記の方法に加えて、ターゲット化造影剤を調製する他の実施形態は、少なくとも１種の生体適合性脂質及びガス前駆体を組合せ；ガス充填ベシクルが生じるまで攪拌し；ターゲッティングリガンドを前記のガス充填ベシクルに添加して、ターゲッティングリガンドが、共有結合又は非共有結合により前記のガス充填ベシクルに結合するようにし；ガス充填ベシクル及びターゲッティングリガンドを含有する造影剤が生じるまで、攪拌することを含む。ターゲッティングリガンドを添加する前に、ガス充填ベシクルが生じるまで攪拌する代わりに、ガス前駆体は、使用の時点まで、ガス前駆体のままでもよい。即ち、ガス前駆体を使用して、造影剤を調製し、インビボで、例えば温度により、前駆体を活性化する。
【０３３１】
もしくは、内皮細胞をターゲットとする造影剤を調製する方法は、少なくとも１種の生体適合性脂質及びターゲッティングリガンドを組み合わせて、ターゲッティングリガンドが、共有結合又は非共有結合により前記の脂質に結合するようにし、ガス前駆体を添加し、ガス充填ベシクル及びターゲッティングリガンドを含む造影剤が生じるまで攪拌することを含む。加えて、ガス前駆体を加え、使用する時点まで、ガス前駆体のままにすることもできる。即ち、ガス前駆体を使用して、ガス前駆体充填ベシクル及びターゲッティングリガンドを有する造影剤を調製して、これをインビボで使用することもできる。
【０３３２】
もしくは、ガス前駆体を利用して、使用前に予め予備形成されている、ターゲッティングリガンドを有する安定なガス充填ベシクルを作ることもできる。この実施形態では、ガス前駆体及びターゲッティングリガンドを、懸濁及び／又は安定化媒体を有する容器に、それぞれのガス前駆体の液−気相転移温度未満の温度で加える。次いで、この温度を超えて、エマルションがガス前駆体と溶液との間に生じると、ガス前駆体は、液体からガス状態へと転移する。加熱及びガス形成の結果、ガスが、気体懸濁液上のヘッドスペースの空気に代わり、ガス前駆体のガス、周囲ガス、例えば空気を捕捉しているか、ガス状態のガス前駆体及び周囲空気を同時捕捉しているガス充填脂質球体が生じる。造影剤の最適な混合及び安定化のために、相転移を使用することもできる。例えば、ガス前駆体、ペルフルオロブタンは、生体適合性脂質又は他の安定化物質に捕捉されて、温度が上がり、４℃（ペルフルオロブタンの沸点）を上回ると、フルオロブタンガスを捕捉している安定化化合物が生じる。付加的な例として、ガス前駆体フルオロブタンを、グリセロール又はプロピレングリコールなどの乳化剤及び安定化剤を含有する水性懸濁液に懸濁させて、市販の渦流装置（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）で渦流させることができる。渦流は、ガス前駆体が液体であるように十分に低い温度で開始し、試料の温度が、液体状態から気体状態へと相転移温度を過ぎて上昇するように継続する。このようにすると、ミクロエマルション化プロセスの間に、前駆体は、ガス状態に変わる。適切な安定化剤が存在すると、意外にも、安定なガス充填ベシクル及びターゲッティングリガンドが生じる。
【０３３３】
したがって、インビボでガス充填ベシクルが生じるように、ガス前駆体を選択することもできるが、その場で、製造プロセスの間に、貯蔵の際に、又は使用の直前にガス充填ベシクルが生じるように設計することもできる。
【０３３４】
出発物質として使用される脂質、タンパク質、ポリマー及び他の安定化化合物又はベシクル最終生成物は、本発明により考えられた方法に使用する前に、又はその後に、処理することができることは、本記載を与えられれば、当技術分野の専門家には理解されるであろう。例えば、生体適合性脂質などの安定化化合物を水和させ、次いで凍結乾燥させるか、凍結−融解サイクルで処理するか、又は単に水和させることができる。好ましい実施形態では、ガス前駆体充填ベシクルを生じさせる前に、脂質を、水和させ、次いで凍結乾燥するか、水和させ、次いで、凍結−融解サイクルにより処理し、次いで、凍結乾燥させる。
【０３３５】
本発明により考えられた方法では、空気に限らないが空気などのガスの存在が、局所周囲大気によりもたらされうる。局所周囲雰囲気は、密閉された容器内又は密閉されていない容器中の大気であり、外部環境であってもよい。もしくは例えば、ガスを、脂質水溶液を有する容器又は脂質水溶液自体に、注入するか、加えて、空気以外のガスを与えることもできる。空気よりも重くないガスは通常、密閉された容器に加えるが、空気よりも重いガスは、密閉された又は、密閉されていない容器に加えることができる。したがって、本発明には、ガス前駆体と共に、空気及び／又は他のガスを同時捕捉することも含まれる。
【０３３６】
安定化化合物を論じている欄で既に前記したように、本発明により考えられた好ましい方法は、使用される脂質のゲル状態−液晶状態相転移温度未満の温度で実施する。「ゲル状態−液晶状態相転移温度」とは、脂質二分子膜が、ゲル状態から液晶状態へと変わる温度を意味している。例えば、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７４，２４９，２５１２−２５２１参照。
【０３３７】
したがって、前記の安定化されたベシクル前駆体は、ホストの組織に適用されて活性化すると、本発明で使用される他の安定化ベシクルと同様に使用することができ、その際、ガスの発生をもたらすために温度又はｐＨなどのファクターが使用される。この実施形態は、ガス前駆体が前記のホストの正常な体温付近で液体からガス状態へと相転移し、したがって、前記のホスト組織の温度により活性化されて、気相へと転移しうる実施形態であることが好ましい。さらに好ましくは、この方法は、ホスト組織が、約３７℃の正常な温度を有するヒト組織であり、ガス前駆体が３７℃付近で液体からガス状態へと相転移する方法である。
【０３３８】
オートクレーブ又は滅菌濾過のプロセスを、ガス導入ステップの前、又は懸濁液中での温度感受性ガス前駆体の温度仲介ガス変化の前に行う場合には、本発明で使用される安定化されたガス充填ベシクルの調製に関する前記の実施形態全てを、オートクレーブ又は滅菌濾過により滅菌することができる。もしくは、安息香酸ナトリウム、全ての４級アンモニウム塩、アジ化ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチレンジアミン、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、二酸化イオウ及び有機水銀塩などの１種又は複数の抗菌剤及び／又は防腐剤が、造影剤の処方中に含まれていてよい。安定化されたミクロスフェアを、観血的環境下で、例えば、血管内又は腹腔内で撮像するために使用する際には、放射線などの他の慣用の方法によっても達成することができるこのような滅菌が必要である。安定化されたガス充填ベシクル及びその使用の本記載を教示されれば、滅菌の適切な手段は、専門家には分かるであろう。造影剤は通常、水性懸濁液として貯蔵するが、乾燥ベシクル又は乾燥脂質球体の場合には、造影剤を、使用前に再構成することができる乾燥粉末として貯蔵することもできる。
【０３３９】
本発明の新規の組成物、特にベシクル組成物は、画像診断での造影剤として使用することができ、さらに、画像診断が使用される全ての分野で使用するためにも適している。しかしながら、安定化ベシクルは特に、灌流撮像のために使用することができる。
【０３４０】
画像診断は、患者の内部体局部を可視化するための手段である。画像診断には例えば、超音波（ＵＳ）、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）；造影剤が放射性物質を含む場合には、核医学；及び、特に蛍光造影剤を用いる光学撮像が含まれる。画像診断はさらに、本発明の方法を介してベシクルの破裂を促進することも含む。例えば、超音波を使用して、ベシクルを可視化し、特定の組織中のベシクルの位置を確認することもできる。加えて、ベシクルが、組織及び／又は受容体目的地を含む所定のターゲットに到達したら、超音波を使用して、ベシクルの破裂を促進し、生物活性剤及び／又は診断剤を放出させることもできる。
【０３４１】
本発明では、通常は、患者を撮像するか、かつ／又は特に、患者で疾患組織の存在を診断する方法も提供する。本発明の造影剤を患者に投与し、次いで、例えば超音波、コンピュータ断層撮影及び／又は磁気共鳴撮像を使用して、患者を走査して、患者の体内局部及び／又はその局部の疾患組織の可視映像を得ることにより、本発明の撮像プロセスを実施することができる。患者の局部とは、患者の全身又は患者の特定の局部又は部分を意味している。造影剤は特に、心筋、内皮及び／又は上皮組織、さらに、胃腸及び心臓血管局部などの組織の映像を得るために使用することができるが、より広範囲に、例えば、当技術分野の専門家には容易に理解されるように、血管系又は他の方法で撮像する際に使用することもできる。ここで使用される場合、心臓血管との句は、心臓並びに直接に心臓に、及び心臓から通じる血管系により規定される患者の局部を示している。ここで使用される場合、血管系との句は、体内、又は体の臓器又は一部内の血管（動脈、静脈など）を示している。患者は、どのタイプの哺乳類であってもよいが、ヒトが、最も好ましい。
【０３４２】
本発明はさらに、疾患組織の存在を診断する方法を提供する。疾患組織には例えば、疾患組織を支持する血管系から生じる内皮組織が含まれる。結果として、正常な環境下では、内皮組織とは関連していない患者の局部に、内皮組織が位置付けられ局在し、可視化されることは、局部中の疾患組織の指標となる。
【０３４３】
本発明の磁気共鳴撮像法を実施する際に、造影剤を単独で、又は他の診断剤、治療剤又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。このような他の薬剤には、着香剤又は着色剤などの付形剤が含まれる。使用される磁気共鳴撮像技術は慣用で、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｋｅａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  １９８６）に記載されている。考えられるＭＲＩ技術には、これらに限らないが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び電子スピン共鳴（ＥＳＲ）が含まれる。好ましい撮像の種類は、ＮＭＲである。
【０３４４】
本発明の造影剤を評価する際に使用することができる代表的な方法を、図面に示されているシステムを参照して下記で検討する。同じ数字は、同じ要素を示しているこの図面では、図１は、本発明の実施形態による造影剤をインビトロ評価するためのシステム１０の図面表示である。この好ましい実施形態では、システム１０は、本発明による造影剤の有効性を評価するための装置１２を含む。装置１２は、好ましくは２％寒天などの寒天からなるブロック１４を含む。寒天ｏｓｃは、例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｏｉｓ、ＩＮ）から市販されており、通常の専門家によく知られている技術を使用して調製されたブロックであってよい。装置１２はさらに、ブロック１４を貫通している、例えばポリエチレン管などの管１６を含む。ナイロン糸などの糸１８を、管１６に通すが、これには、ブロック１２を貫通する管１６の一部中で、糸１８に固定されている木綿パイピング材料などの吸収材料２２を介して血餅２０が付着している。超音波プローブ２４を、ブロック１４に近接させる。
【０３４５】
造影剤を、図１０のシステム１０を使用して、次の手順により評価することができる。生理食塩水などの液体媒体を、ぜん動ポンプ（図示せず）を使用して望ましい流速で、管１６にポンプ導入する。造影剤を、血餅２０の循環溶液の上流に注入し、プローブ２４からの超音波信号の対象を、血餅２０付近の領域とする。撮像を連続的に行い、注入された造影剤の超音波強度を、血餅２０の近接領域で測定する。
【０３４６】
本発明をさらに、次の実施例で詳述する。実施例１から８、１３から１５、２０から２２、２７、２８、４２、４３から４５及び４７、４８、６０及び６１は、実際の実施例であり、実施例９から１２、１６から１９、２３から２６、２９から４１及び４９から５９は、推測による実施例である。実施例４６は（部分的に）実際の、及び（部分的に）推測の両方である。実施例は、説明の目的のためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０３４７】
（実施例）
実施例１
本実施例は、次式を有する四ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−エチレンジアミン（四ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＴＭＡ）の調製を対象としている。
【化２５】
2005500245.tif 000030
【０３４８】
Ａ．Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＨＡ）の調製。
【化２６】
2005500245.tif 000031
無水メタノール（３０ｍＬ）中のエチレンジアミン四酢酸二無水物（２．５６ｇ、０．０１モル）及び無水メタノール（６０ｍＬ）中のヘキサデシルアミン（４．８２ｇ、０．０２モル）を混合し、５０℃で６時間攪拌した。生じた白色の固体を濾過により分離し、室温で、真空乾燥させると、ＥＤＴＡ−ＨＡ３．４３ｇ（６４％）が得られた。
ＩＲ：ＯＨで３３２０ｃｍ−１、Ｃ＝Ｏ（カルボニル）で１６７０ｃｍ−１。
【０３４９】
Ｂ．Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−β−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エチルアミノカルボニルメチレン）エチレンジアミン（ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ）の調製
【化２７】
2005500245.tif 000032
ステップＡからのＥＤＴＡ−ＨＡ（３．６９ｇ、０．００５モル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．８８ｇ、０．０１モル）及びＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）からなる冷溶液（５℃）に、ＤＣＣ（２．２２７ｇ、０．０１１モル）のＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液を滴加した。生じたエマルションを、室温で約２４時間攪拌し、濾過した。０．５％酢酸（１００ｍＬ）で、濾液を洗浄して、過剰なＤＣＣを分解した。２層に分離している乳白色の溶液が観察された。下部有機相を一晩乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮すると、ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ３．８１ｇが軟らかい固体として得られた。
ＩＲ：３２８０ｃｍ−１、２９００ｃｍ−１、１６４０ｃｍ−１、１５３０ｃｍ−１。
【０３５０】
Ｃ．四ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＴＭＡの調製
ステップＢからのＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ（４．２２ｇ、４．７７モル）、ヨードメタン（３．４１ｇ、２４ｍｍｏｌ）及びエタノール（３０ｍＬ）を混合し、２時間還流させた。反応混合物を濃縮し、残留物を一晩凍結乾燥させた。表題生成物４．９８ｇ（四ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＴＭＡ）が黄色の固体として得られた。
ＩＲ：３２６０ｃｍ−１、１６５０ｃｍ−１。
【０３５１】
実施例２
この実施例は、次式を有する二ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン）−Ｎ−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ−メチル−Ｎ’−（カルボキシメチレン）エチレンジアミン（二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡ）の調製を対象としている。
【化２８】
2005500245.tif 000033
【０３５２】
Ａ．Ｎ，Ｎ’−ビス−（ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＨＡＬ）の調製
【化２９】
2005500245.tif 000034
ヘキサデシルアルコール（４．８４ｇ、０．０２モル）、無水ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）、無水トリエチルアミン（３．３ｇ）及びエチレンジアミンテトラ酢酸二無水物（２．５６ｇ、０．０１モル）を混合し、５０℃で２時間攪拌した。反応混合物を冷水（２００ｍＬ）に注ぎ、生じた水性混合物をＨＣｌで酸性化した。生じた白色沈殿物を濾過により分離し、濾過ケーキを水で洗浄した。エタノールから白色の固体を再結晶させると、ＥＤＴＡ−ＨＡＬ７ｇが得られた。融点１０３℃。
【０３５３】
Ｂ．Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン）−Ｎ−（β−Ｎ−ジメチルアミノエチルアミノカルボニル）−Ｎ’−酢酸（ＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡ）の調製
【化３０】
2005500245.tif 000035
ステップＡからのＥＤＴＡ−ＨＡＬ（３．７０ｇ、０．００５モル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１．５９８ｇ、０．０１７５モル）及びＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）からなる冷溶液（５℃）に、（ＤＣＣ）（３．６０ｇ、０．０１７５モル）のＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液を滴加した。沈殿物が生じ、反応混合物を室温で約２４時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を０．５％酢酸（１００ｍＬ）で洗浄して、過剰のＤＣＣを分解した。２層に分離している乳白色の溶液が生じた。底部の有機相を乾燥させ、真空濃縮すると、ＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡ３．８５ｇが粘性液体として得られた。
【０３５４】
Ｃ．二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡの調製
ステップＢからのＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡ（２．３６ｇ、０．００２７モル）、ヨードメタン（３．８１ｇ）及びエタノール（５０ｍＬ）を混合し、２時間還流させた。溶液を真空濃縮し、生じた残留物を一晩凍結乾燥させた。表題化合物（二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡＬ−ＤＭＡ）２．９６ｇが、黄色がかった固体として得られた。
【０３５５】
実施例３
この実施例は、次式を有する二ヨウ化Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン）−Ｎ−（β−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ−メチル−Ｎ’−（カルボキシメチレン）エチレンジアミン（二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ）の調製を対象としている。
【化３１】
2005500245.tif 000036
【０３５６】
Ａ．Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＥＤＴＡ−ＨＡ）の調製
【化３２】
2005500245.tif 000037
無水メタノール（６０ｍＬ）中のヘキサデシルアミン（４．８２ｇ、０．０２モル）を、エチレンジアミンテトラ酢酸二無水物（２．５６ｇ、０．０１モル）の無水メタノール（３０ｍＬ）懸濁液に加えた。混合物を５０℃で６時間攪拌した。生じた白色の固体沈殿物を濾過により分離し、室温で真空乾燥させると、ＥＤＴＡ−ＨＡ３．４３ｇ（６４％）が得られる、融点１５６〜１５８℃。
ＩＲ：ＯＨで３３２０ｃｍ−１；−Ｃ（＝Ｏ）−で１６７０ｃｍ−１。
【０３５７】
Ｂ．Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデシルアミノカルボニルメチレン）−Ｎ，Ｎ’−ビス（β−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミノカルボニルメチレン）エチレンジアミン（ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ）の調製
【化３３】
2005500245.tif 000038
ステップＡからのＥＤＴＡ−ＨＡ（３．６９ｇ、０．００５モル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（０．８８ｇ、０．０１モル）及びＣＨＣｌ３（１００ｍＬ）からなる冷溶液（５℃）に、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２．２２７ｇ、０．０１１モル）のＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液を滴加した。沈殿物が観察され、反応混合物を室温で約２４時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を０．５％酢酸（１００ｍＬ）で洗浄して、過剰のＤＣＣを分解した。２層に分離している乳白色の溶液が生じた。底部有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空濃縮させると、ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ３．８１ｇが白色の固体として得られた。
ＩＲ：３２８０ｃｍ−１；２９００ｃｍ−１；１６４０ｃｍ−１；１５３０ｃｍ−１。
【０３５８】
Ｃ．二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡの調製
ステップＢからのＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ（４．２ｇ、４．７７モル）、ヨードメタン（３．４１ｇ、２４ｍｍｏｌ）及びエタノール（３０ｍＬ）からなる溶液を２時間還流させた。エタノール溶液を真空濃縮し、生じた残留物を一晩凍結乾燥させた。表題化合物（二ヨウ化ＥＤＴＡ−ＨＡ−ＤＭＡ）３．９８ｇが黄色の固体として得られた。
ＩＲ：３２６０ｃｍ−１；１６５０ｃｍ−１。
【０３５９】
実施例４
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌの調製を対象とする。
【化３４】
2005500245.tif 000039
【０３６０】
Ａ．Ｎ−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル）−スクシンイミドの調製（Ｎ−ＤＰＧＳ−スクシンイミド）
【化３５】
2005500245.tif 000040
ＤＣＣ（２０．６ｍｇ）及びアセトニトリル（１０ｍＬ）からなる冷溶液（０から５℃）に、ｓｎ−グリセロ−３−コハク酸１，２−ジパルミトイル（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）（６６．８ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１．５ｍｇ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（２ｍｇ）及びアセトニトリル（４０ｍＬ）からなる溶液を滴加した。反応混合物を５時間攪拌し、生じた固体を濾過により除去した。濾液を真空濃縮すると、Ｎ−ＤＰＧＳ−スクシンイミド７８ｍｇが白色の生成物として生じた。
【０３６１】
Ｂ．３−ω−カルボキシ−ポリエチレングリコールイミノスクシネート−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ）の調製
【化３６】
2005500245.tif 000041
ω−アミノ−ω’−カルボキシ−ポリエチレングリコール（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）（０．３ｇ）及びトリエチルアミン（４０ｍｇ）からなる冷ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ステップＡからのＮ−ＤＰＧＳ−スクシンイミド（７８ｍｇ）のＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）溶液を滴加した。生じた溶液を１０℃で約５時間攪拌し、一晩放置した。反応混合物を、氷水に注ぎ、１０％ＨＣｌを用いて３未満のｐＨまで中和した。有機層を単離し、水で洗浄し、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。濾過し、真空濃縮すると、ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ  ０．３４ｇが白色の固体として得られた。
【０３６２】
Ｃ．３−スクシナモイルオキシカルボニル−ポリエチレングリコール−イミノ−スクシネート−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド）の調製
【化３７】
2005500245.tif 000042
ＤＣＣ（１２ｍｇ）の冷アセトニトリル（１０ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ステップＢからのＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ（２００ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ）及びジメチルアミノピリジン（２ｍｇ）からなる溶液を加えた。生じた反応混合物を５時間攪拌した。生じた白色の固体を濾過により反応混合物から除去し、濾液を真空濃縮した。ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミドが白色の固体（２００ｍｇ）として得られた。
【０３６３】
Ｄ．ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ複合体の調製
Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（５ｍｇ）の冷ｐＨ８．５緩衝液（２０ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ステップＣからのＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド（４０ｍｇ）のアセトニトリル（０．１ｍＬ）溶液を滴加した。生じた反応混合物を室温で約４８時間攪拌した。反応混合物を真空濃縮し、約１０００の分画分子量を有する膜を介して、無機塩を透析した。表題化合物（ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）が白色の固体（２４ｍｇ）として得られた。
【０３６４】
実施例５
この実施例は、次式を有するＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）の調製を対象とする。
【化３８】
2005500245.tif 000043
［上式中、「Ｐｅｐｔｉｄｅ」は、
【化３９】
2005500245.tif 000044
である］
【０３６５】
Ａ．ω，ω’−ジメチレンカルボキシ−ポリエチレングリコール無水物の調製
【化４０】
2005500245.tif 000045
イソシアン酸クロロスルホニル（１４．２ｍｇ）の冷ＣＨＣｌ３（５ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ω，ω’−ジメチレンカルボキシ−ポリエチレングリコール（０．３４ｇ）及びトリエチルアミン（２０ｍｇ）からなるＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を一晩攪拌し、氷水に注いだ。有機層を単離し、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。有機層を濾過し、真空濃縮すると、表題の無水化合物が白色の固体（０．２ｇ）として得られた。
【０３６６】
Ｂ．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニルメチレン−ω’−カルボキシ−ポリエチレングリコール（ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ）の調製
【化４１】
2005500245.tif 000046
ステップＡからの無水化合物（０．３ｇ）の冷ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）溶液（０から１０℃）に、ＤＰＰＥ（０．０７ｇ）及びトリエチルアミン（０．０５ｇ）からなるＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液を加えた。生じた反応混合物を一晩攪拌し、氷水に注ぎ、１０％ＨＣｌを用いてｐＨ３未満に中和した。有機層を単離し、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。有機層を濾過し、真空濃縮すると、ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ  ０．４５ｇが暗い白色の固体として得られた。
【０３６７】
Ｃ．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニルメチレン−ポリエチレングリコール−スクシンイミド（ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド）の調製
【化４２】
2005500245.tif 000047
ＤＣＣ（３ｍｇ）の冷アセトニトリル（２ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ステップＢからのＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ（６０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１．８ｍｇ）及びジメチルアミノピリジン（０．２ｇ）からなるアセトニトリル（６ｍＬ）溶液を加えた。生じた混合物を０から５℃で３時間攪拌し、次いで、室温で一晩攪拌した。生じた固体を、濾過により除去し、濾液を、真空濃縮すると、ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド６０ｍｇが得られた。
【０３６８】
Ｄ．ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ複合体の調製
Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（５ｍｇ）の冷ｐＨ８．５緩衝液溶液（０から５℃）に、アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド（４０ｍｇ）を滴加した。生じた混合物を室温で約４８時間攪拌した。アセトニトリルを真空除去し、分画分子量１０００を有する膜を介して無機塩を透析した。凍結乾燥により、表題化合物（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）３５ｍｇが白色の固体として得られた。
【０３６９】
実施例６
生理食塩水、プロピレングルコール及びグリセロール（８：１：１）からなる溶液に、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００及びＤＰＰＡをモル比（８２：８：１０）で加えた。生じた混合物を約４５℃に加熱し、濾過した（０．２２μｍ）。濾過した混合物をバイアルに入れ、放置して室温まで冷却した。バイアルを真空下において、ガスを排気し、その後、バイアルをＰＦＰで加圧した。次いで、バイアルを密閉し、振盪機上に置き、室温で攪拌すると、平均直径約２．５μｍを有するＰＦＰ−充填ベシクルが得られた。
【０３７０】
実施例７
この実施例は、本発明の範囲内のターゲット化ベシクルの調製を対象とする。
【０３７１】
ＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合ペプチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を、実施例５に記載の手順を使用して、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ３４００に共有結合により結合させた。次いで、このペプチド複合体を、ＤＰＰＣ（８２モル％）、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（８モル％）及びＤＰＰＡ（８モル％）からなる乾燥脂質混合物と混合した。この混合物を水和させて、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｌｙｐｈ−Ｌｏｃｋ  １２凍結乾燥機（Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）で凍結乾燥させた。凍結乾燥させた物質を、８：１：１の通常生理食塩水：プロピレングリコール：グリセロールに、１ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁した。この混合物の分量を、２ｍＬ  Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ）に入れ、キャップをし、ヘッドスペースを、ペルフルオロブタンガス（Ｆｌｕｒａ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＴＮ）に代えた。バイアルを攪拌すると、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするベシクル組成物が得られた。
【０３７２】
実施例８
この実施例には、実施例６及び７で調製されたベシクル組成物を使用するペプチド結合実験の記載が含まれる。
【０３７３】
非ヘパリン化ヒト血液を、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、ＮＪ）に入れ、血餅にした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＴＪ−６遠心分離機（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中で遠心分離することにより、血餅を集めた。次いで、血餅を正に荷電されている顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の上に置いた。スライド９枚を、血餅血液で被覆した。未被覆のスライド６枚を、対照研究として使用した。次いで、前記のスライドに、実施例６及び７（２００μＬ）からなるベシクル組成物を塗布することにより、次のように結合研究を行った：（Ａ）血餅のみ（対照）；（Ｂ）血餅を伴わない、実施例６からのベシクル組成物；（Ｃ）血餅を伴う、実施例６からのベシクル組成物；（Ｄ）血餅を伴わない、実施例７からのベシクル組成物；及び（Ｅ）血餅を伴う、実施例３からのベシクル組成物。スライドを２０分間インキュベーションし、次いで、リン酸緩衝生理食塩水を使用して、未結合の物質を洗い流した。次いで、スライドを、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ（東京、日本）顕微鏡を使用して観察した。結果を、次の表に記載する。
【０３７４】
表３
結合研究 結合
（Ａ）                なし
（Ｂ）                なし
（Ｃ）                なし
（Ｄ）                なし
（Ｅ）                あり
【０３７５】
上の表から分かるように、結合は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａターゲッティングペプチドを含有する実施例７で調製されたベシクル組成物でのみ観察された。
【０３７６】
実施例９
この実施例は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体を対象とするターゲッティングリガンドを支持するヒト血清アルブミン系ベシクルの調製を対象とする。
【０３７７】
容器に、ヒト血清アルブミン５％の懸濁液を導入する。公開国際出願ＷＯ９５／第２９７０５号（この記載を、ここでは全て参照して援用する）に記載されているように、この懸濁液を、連続的な真空下に脱気し、ヘッドスペースにペルフルオロプロパンガスを導入する。生じるガス充填アルブミンベシクルを、通常生理食塩水での洗浄を繰り返して、遊離のアルブミンから分離する。ガス充填ベシクルを、通常生理食塩水：プロピレングリコール：グリセロール（６：２：２、ｖ：ｖ：ｖ）からなる混合物に再懸濁し、この懸濁液を穏やかに混合する。この懸濁液に、グルタルアルデヒド１％及びペプチドＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ１重量％を加えると、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合ペプチドを支持する架橋ペルフルオロプロパンベシクルが生じることになる。
【０３７８】
実施例１０
この実施例は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体を対象とするターゲッティングリガンドと結合する重合可能なアクリロイル／スチリル脂質類似体により安定化されたベシクルの調製を対象とする。
【０３７９】
１２−ヒドロキシドデカン酸を、塩化メタクリロイルでエステル化し、このエステルを無水物に変えると、１２−（メタクリロイルオキシ）ドデカン酸無水物が得られよう。タマゴレシチンに由来するＬ−アルファ−グリセロホスホコリンを、１２−（メタクリロイルオキシ）ドデカン酸無水物でアシル化すると、ビス［１２−（メタクリロイル）オキシドデカノイル］−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（１）が得られよう。化合物（１）を、粗製ガラガラヘビ毒液（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）に由来するホスホリパーゼＡ２を用いて酵素により加水分解し、引き続き、パルミトイル無水物でアシル化すると、１−［２−（メタクリロイルオキシ）ドデカノイル］−２−パルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（２）が得られよう。同様の方法を使用して、ジパルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリンを１−パルミトイル−２−［１２−（メタクリロイルオキシ）−ドデカノイル］−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（３）に変えるものとする。
【０３８０】
ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（１．８ｍｇ／ｍＬ）及び、前記の実施例５に記載の手順を使用して調製されるＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合ペプチド（Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ）で標識されているＤＰＰＥ−ＰＥＧ−５０００  １０重量％からなる通常生理食塩水溶液に、前記で調製される化合物（３）を加えるものとする。この溶液の分量を、滅菌３ｍＬバイアルに入れる。バイアルのヘッドスペースを脱気し、窒素及びペルフルオロエタンガスからなる混合物（２０：８０、ｖ／ｖ）をバイアルのヘッドスペースに周囲圧力まで充填する。バイアルをＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｄ、Ｏｂｅｒａｙ  ドイツ）上で、室温で約１分間振盪する。ベシクル組成物を照射（２５４ｎｍ）すると、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ結合ペプチドを有する重合ガス充填ベシクルが得られよう。ベシクルの平均直径は、約３μｍとなろう。
【０３８１】
実施例１１
この実施例は、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとする合成ポリビス（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン）（ＰＣＰＰ）ガス充填ベシクルの調製を対象としている。
【０３８２】
前記の実施例５に記載の手順を使用して、ＰＣＰＰ−ＰＥＧ２０００−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを調製することとする。次いで、ＰＣＰＰベシクルを、米国特許第５４８７３９０号（この記載をここでは全て、参照して援用する）に記載されているように調製する。ＰＣＰＰベシクル（１００ｍｇ）を、Ｎａ２ＣＯ３溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに加え、室温で一晩攪拌して、溶解させる。溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈して、最終ポリマー濃度２．５％（ｗ／ｖ）及び溶液ｐＨ７．４にする。必要な場合には、１ＮのＨＣｌを使用して、ｐＨを調整する。
【０３８３】
Ｔｗｅｅｎ２０  ０．２％を含有するＰＣＰＰ溶液（２．５ｗ／ｖ％）を、コロイドミル中でペルフルオロプロパンガスと混合して、数時間安定なガス処理されたＰＣＰＰ溶液を生じさせる。溶液中で利用されるＰＣＰＰの１０モル％は、ＰＣＰＰ−ＰＥＧ２０００−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌである。ガス処理された溶液を、シリンジポンプから、１５０μＬ／分で、空気噴霧装置中に、ペルフルオロプロパンガスの雰囲気下に押出し、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５％を含有する７．５％ＣａＣｌ２溶液２５０ｍＬを含むパンに噴霧する。ＣａＣｌ２溶液と接触すると、ＰＣＰＰは、二価カルシウムイオンにより架橋して、ＧＰＩＩｂＩＩＩａをターゲットとし、ペルフルオロプロパンで充填されている球体ゲルベシクルの比較的均一な集団をもたらす。捕捉されているペルフルオロプロパンの存在は、倒立顕微鏡を使用してベシクルを観察することにより証明される。
【０３８４】
実施例１２
この実施例は、フッ素化脂質から処方された、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするベシクルの調製を対象とする。
【０３８５】
α−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ３４００  １当量を水：ジオキサン（１：１、ｖ：ｖ）の溶液中に溶かすことにより、α−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ３４００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）中のアミノ基を保護する。この攪拌溶液に、ｔ−Ｂｏｃ−無水物（Ｂａｃｈｅｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）及びトリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）それぞれ１モル当量を加える。生じる溶液を一晩攪拌し、真空濃縮して、揮発性ジオキサンを除去する。濃縮される物質に、水に対して１０容量当量の酢酸エチルを加え、生じる混合物を氷浴中で冷却する。混合物のｐＨを、２Ｎ硫酸水溶液でｐＨ２に調整し、分液漏斗を使用して、下部水性相を除去する。この酢酸エチル層を、飽和ブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空濃縮すると、シロップが得られる。
【０３８６】
ｔ−Ｂｏｃ−α−アミノ，ω−カルボキシルＰＥＧ３４００、１モル当量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び無水ＤＭＦを混合する。この溶液を、攪拌し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）及び１，２−ジ−（１５，１６，１７，１８−ノナフルオロ）ステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（フルオロ−ＤＳＰＥ）をそれぞれ１当量加える。生じる溶液を２時間攪拌し、真空濃縮する。フルオロ−ＤＳＰＥ−ｔ−ＢＯＣ−α−アミノ，ω−アミド  ＰＥＧ３４００を、トリフルオロ酢酸及びＣＨ２Ｃｌ２（４：６、ｖ：ｖ）からなる溶液に懸濁し、引き続き、さらに２０分間攪拌する。次いで、溶液をＤＩＥＡで中和し、真空濃縮する。生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２に再懸濁し、ＨＣｌ水溶液を、約２のｐＨになるまで加える。水性層を、分離し、ｐＨを、１．０％ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に再調整する。この水性混合物に、酢酸エチルを加え、これを分離し、飽和ブラインで洗浄し、乾燥させる（ＭｇＳＯ４）。濾過し、真空濃縮すると、フルオロ−ＤＳＰＥα−アミノ，ω−アミドＰＥＧ３４００が黄色のオイルとして得られよう。
【０３８７】
前記で得られる黄色のオイル、１当量のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＤＭＦを混合する。生じる混合物を３時間攪拌し、一晩真空濃縮する。濃縮した物質を、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁させる。ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするペプチドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）を、懸濁液に加える。一晩攪拌した後に、反応混合物を、Ａｍｉｃｏｎフィルター濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて、約３００ｍＬの容量まで濃縮する。濃縮された溶液を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製すると、フルオロ−ＤＳＰＥ−α−アミノ，ω−アミドＰＥＧ３４００−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒが得られる。この生成物を、ＤＰＰＣ及びＤＰＰＡからなる混合物に加えると、４０：５４：６（ｗ：ｗ：ｗ）のＤＰＰＣ：フルオロ−ＤＳＰＥ：ＤＰＰＡの比が生じる。この脂質混合物を、通常生理食塩水：グリセロール：プロピレングリコール（８：１：１、ｖ：ｖ：ｖ）を有する希釈剤に加えると、希釈剤１ｍｇ／ｍＬの最終脂質濃度が得られる。この溶液の分量を２ｍＬバイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に導入し、ヘッドスペースにペルフルオロプロパンを充填する。このバイアルを、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（ＥＳＰＥ、Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で４３００ｒｐｍで１分間攪拌すると、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ受容体をターゲットとするフッ素化ベシクルが得られる。
【０３８８】
実施例１３
【化４３】
2005500245.tif 000048
この実施例は、次式を有するＮ−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル）−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体の調製を対象とする。
【０３８９】
Ａ．Ｎ−ＤＰＧＳ−スクシンイミドの調製
【化４４】
2005500245.tif 000049
１００ｍＬ丸底フラスコ中のｓｎ−グリセロ−３−コハク酸１，２−ジパルミトイル（６６．８ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１．５ｍｇ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ）及びアセトニトリル（４０ｍＬ）からなる冷溶液（０から５℃）に、ＤＣＣ（２０．６ｍｇ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液を加えた。生じた混合物を５時間攪拌した。反応の間に生じた固体物質（ジシクロヘキシル尿素）を濾過により除去し、濾液を真空濃縮すると、Ｎ−ＤＰＧＳ−スクシンイミド７８ｍｇが白色の生成物として得られた。
【０３９０】
Ｂ．３−ω−カルボキシ−ポリエチレングリコール−イミノ−スクシネート−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ）の調製
【化４５】
2005500245.tif 000050
１００ｍＬ丸底フラスコ中のステップＡからのＮ−ＤＰＧＳ−スクシンイミド（７８ｍｇ）及びＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）からなる冷溶液（０から５℃）に、ω−アミノ−ω’−カルボキシ−ポリエチレングリコール（０．３ｇ）及びトリエチルアミン（４０ｍｇ）からなるＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）溶液を滴加した。生じた混合物を１０℃で５時間攪拌した。一晩攪拌した後に、反応混合物を氷水に注ぎ、１０％ＨＣｌを用いて約３又はそれ未満のｐＨまで中和した。下部有機層を分液漏斗を使用して除去し、水で３回洗浄した。有機層を集め、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。濾過し、真空濃縮すると、ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ  ０．３４ｇが白色の固体として得られた。
【０３９１】
Ｃ．３−スクシナモイル−オキシ−カルボニル−ポリエチレングリコール−イミノ−スクシネート−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド）の調製
【化４６】
2005500245.tif 000051
２５０ｍＬ丸底フラスコ中のステップＢからのＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ（２００ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ）、ＤＭＡＰ（２ｍｇ）及びアセトニトリル（４０ｍＬ）からなる冷溶液（０から５℃）に、ＤＣＣ（１２ｍｇ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）溶液を滴加した。生じた混合物を５時間攪拌し、生じた白色の固体（ジシクロヘキシル尿素）を濾過により除去した。濾液を真空濃縮すると、ＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド２００ｍｇが白色の固体として得られた。
【０３９２】
Ｄ．ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体の調製
ｐＨ８．５の水性緩衝液（２０ｍＬ）中のプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）（２０ｍｇ）の攪拌されている冷溶液（５から１０℃）に、ステップＣからのＤＰＧＳ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド（４ｍｇ）及びアセトニトリル（１０ｍＬ）の溶液を滴加した。生じた混合物の温度を室温と平衡させ、反応混合物を約４８時間攪拌した。混合物を真空濃縮させ、残留した塩を、分画分子量約３５００を有する透析バッグを使用して、透析により除去し、水に対して平衡させた。生じた透析された溶液を凍結させ、凍結乾燥させると、表題物質（ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体）１２ｍｇが白色の固体として得られた。
【０３９３】
実施例１４
この実施例は、次式を有するＤＰＰＥ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体の調製を対象としている。
【化４７】
2005500245.tif 000052
【０３９４】
Ａ．ω，ω’−ジメチレンカルボキシ−ポリエチレングリコール無水物の調製
【化４８】
2005500245.tif 000053
１００ｍＬ丸底フラスコ中のω，ω’−ジメチレンカルボキシ−ポリエチレングリコール（０．３４ｇ）及びＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）からなる冷溶液（０から５℃）に、ＤＣＣ（０．０２ｇ）のＣＨＣｌ３（５ｍＬ）溶液を加えた。この溶液を一晩攪拌し、生じた白色の固体沈殿物（ジシクロヘキシル尿素）を濾過により除去した。濾液を真空濃縮すると、無水物０．３ｇが白色の固体として得られた。
【０３９５】
Ｂ．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニル−メチレン−ω’−カルボキシ−ポリエチレングリコール（ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ）の調製
【化４９】
2005500245.tif 000054
１００ｍＬ丸底フラスコ中のステップＡからの無水物（０．３ｇ）及びＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）の冷溶液（０から１０℃）に、ＤＰＰＥ（０．０７ｇ）及びトリエチルアミン（０．０５ｇ）からなるＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液を加えた。一晩攪拌した後に、反応混合物を氷水に注ぎ、１０％ＨＣｌを用いて、約３又はそれ未満のｐＨに酸性化した。次いで、下部有機層を、２５０ｍＬ分液漏斗を使用して分離し、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２溶液を真空濃縮すると、ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ  ０．４５ｇが白色の固体として得られた。
【０３９６】
Ｃ．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエチルアミン−Ｎ−カルボニルメチレン−ポリエチレングリコール−スクシンイミド（ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド）の調製
【化５０】
2005500245.tif 000055
ＤＣＣ（３ｍｇ）及びアセトニトリル（２ｍＬ）の冷溶液（０から５℃）に、ステップＢからのＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ（６０ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１．８ｍｇ）及びＤＭＡＰ（０．２ｍｇ）からなるアセトニトリル（６ｍＬ）溶液を加えた。０から５℃で３時間攪拌した後に、反応混合物の温度を、室温と平衡させた。一晩攪拌した後に、生じた白色の固体沈殿物（ジシクロヘキシル尿素）を濾過により除去し、濾液を真空濃縮すると、ＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド６０ｍｇが得られた。
【０３９７】
Ｄ．ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体の調製
ｐＨ８．５の１５ｍｌ水性緩衝液（１５ｍＬ）中のプロテインＡ（２０ｍｇ）の冷溶液（５から１０℃）に、アセトニトリル（８ｍＬ）中のステップＣからのＤＰＰＥ−ω−カルボキシ−ＰＥＧ−スクシンイミド（４ｍｇ）を滴加した。反応混合物の温度を室温と平衡させ、攪拌を４８時間継続した。混合物を真空濃縮し、残留した塩を、分画分子量約３５００を有する透析膜を使用して、水に対して透析した。水性透析サンプルを凍結乾燥させると、表題生成物（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体）１５ｍｇが白色の固体として得られた。
【０３９８】
実施例１５
この実施例は、上皮細胞をターゲットとするターゲット化ベシクル組成物の調製及び使用を対象としている。
【０３９９】
Ａ．ベシクル組成物の調製
実施例１３からのＤＰＧＳ−ＰＥＧ−プロテインＡ複合体（１重量％）を、ＤＰＰＣ（８２モル％）、ＤＰＰＡ（１０モル％）及びＤＰＰＥ（８モル％）からなる無水脂質混合物と組み合わせた。この無水脂質混合物を水和させ、Ｌａｂｃｏｎｃｏ（Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）Ｌｙｐｈ−Ｌｏｃｋ１２凍結乾燥機で凍結乾燥させた。凍結乾燥させた混合物を、通常生理食塩水：プロピレングリコール：グリセロール（８：１：１）に、脂質濃度１ｍｇ／ｍＬで再び再懸濁させた。混合物を２ｍＬ  Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ）に分量した。バイアルにキャップをし、バイアルのヘッドスペースをペルフルオロブタンガス（Ｆｌｕｒａ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＴＮ）に代えた。次いで、バイアルをＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（登録商標）（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で１分間振盪すると、ガス充填ベシクルが得られた。ウサギ抗ケラチン抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（１００μＬ）をバイアルのサンプルに加え、これらのバイアルを、回転させて、抗体とガス充填ベシクルとを混合する。バイアルを、室温で約１時間インキュベーションした。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をベシクル組成物で、ＰＢＳで洗浄する前後に行った。このアッセイは、抗ケラチン抗体が、プロテインＡを介してベシクルに結合し、洗浄の間にも結合し続けたことを示した。
【０４００】
Ｂ．ベシクル組成物でのターゲッティング実験
ＨｅＬａ細胞（ケラチンを発現する上皮子宮頚ガン細胞系）を、ＥＭＥＭ媒体（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中の水平組織培養管（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れた。細胞を一晩成長させ、ベシクル組成物の分量をそれぞれの管に加えた。使用したベシクル組成物は：（ｉ）実施例６からのベシクル；（ｉｉ）ウサギ抗ケラチン抗体を含有しないステップＡで調製されたベシクル；及び（ｉｉｉ）ウサギ抗ケラチン抗体を含有するステップＡで調製されたベシクルであった。抗体を含む（ｉｉｉ）のベシクルのみが、ＨｅＬａ細胞に結合した。
【０４０１】
実施例１６
ペグ化脂質を、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）及びα−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ３４００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から調製する。水：ジオキサン（１：１、ｖ：ｖ）中で、α−アミノ，ω−アミド−ＰＥＧ及びそれぞれ１モル当量のｔ−Ｂｏｃ−無水物（Ｂａｃｈｅｍ、Ｇａｒｄｅｎａ、ＣＡ）及びトリエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）を組み合わせることにより、アミノ基を保護する。生じる溶液を、一晩攪拌し、ジオキサンを真空除去する。水性残留物に、水に対して１０容量当量の酢酸エチル（Ｍａｌｌｉｎｃｒｏｄｔ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を加え、この混合物を氷浴中で冷却する。ｐＨを、硫酸水溶液（２Ｎ）でｐＨ２に調整し、水性層を分液漏斗を使用して分離する。酢酸エチル層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空濃縮すると、シロップが得られよう。
【０４０２】
この黄色オイル、ＤＳＰＥ−ｔ−ＢＯｃ−α−アミノ，ω−アミド−ＰＥＧ３４００、１モル当量のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）及び無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合する。溶液を攪拌し、それぞれ１モル当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を加える。溶液を２時間攪拌し、真空濃縮する。濃縮された残留ＤＳＰＥ−ｔ−ＢＯＣ−α−アミノ，ω−アミド−ＰＥＧ３４００を、トリフルオロ酢酸及び塩化メチレン（４：６、ｖ：ｖ）と混合し、生じる混合物をさらに２０分間攪拌する。溶液をＤＩＥＡで中和し、真空濃縮する。残留物を塩化メチレンに再懸濁させ、塩酸水溶液を、ｐＨが２になるまで加える。水性層を分離し、ｐＨを、１．０％ＮａＯＨを用いてｐＨ１０まで調整する。この水性混合物に、酢酸エチルを加え、これを分離し、飽和ブラインで洗浄し、乾燥させる（ＭｇＳＯ４）。酢酸エチル溶液を真空濃縮すると、黄色オイルが得られる。
【０４０３】
ＤＭＦ中のこの黄色オイル、ＤＳＰＥ−α−アミノ，ω−アミド−ＰＥＧ３４００の溶液に、１当量のＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を加える。３時間攪拌した後に、反応混合物を一晩真空濃縮する。ｐＨ約７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の生じた濃縮残留物の懸濁液に、マウス／ヒトキメラ由来のモノクローナル抗原である抗癌胎児性抗原（抗ＣＥＡ）を加える。一晩攪拌した後に、溶液をＡｍｉｃｏｎフィルター濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で約３００ｍＬの溶液まで濃縮する。濃縮された溶液をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製すると、最終生成物が得られよう。
【０４０４】
実施例１７
ベシクル処方物を、実施例６を繰り返して調製するが、ただし、約１ナノモルの組換えヒト成長ホルモンをベシクル処方の前に脂質組成物に加えることとする。
【０４０５】
実施例１８
実施例１７を繰り返すが、ただし、ＤＰＰＡを、カチオン脂質ジパルミトイルホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ）に代え、ＤＰＰＣを中性脂質ＤＰＰＥに代える。これにより、生物活性剤、特に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のための遺伝子などの遺伝子物質に結合しうるカチオンベシクルが得られよう。抗心筋抗体複合体などのターゲッティングリガンドの導入により、梗塞及び／又は虚血組織を対象としうるターゲット化ベシクルが得られよう。高エネルギー超音波のバースト、例えば１ＭＨｚ連続波２００ｍＷをパルス期間を変えながら適用して、ベシクルの破裂を促進することができる。結果として、ＶＥＧＦを実質的に直接、梗塞及び／又は虚血組織に輸送することができる。
【０４０６】
実施例１９
この実施例は、すい臓の神経内分泌腫瘍をターゲットとするベシクル組成物の調製を対象としている。
【０４０７】
実施例１６を繰り返すが、抗ＣＥＡの代わりに、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）ペプチドを使用する。治療用抗がん剤ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）もベシクル組成物に導入する。生じるベシクル組成物を、神経内分泌腫瘍と診断された患者に静脈注入する。ベシクルは優先的に腫瘍近傍のすい臓領域に吸収されて、腫瘍への抗がん剤の高い輸送が生じることになろう。
【０４０８】
実施例２０
実施例１５を繰り返したが、ただし、ＨｅＬａ細胞に加えて、ターゲット化ベシクルをマウス正常肝細胞を有する上皮細胞系にも加えた。抗体を含有するベシクルだけが、肝細胞に結合した。
【０４０９】
実施例２１
この実施例は、心筋細胞をターゲットとするベシクル組成物の調製及び使用を対象としている。
【０４１０】
Ａ．ターゲット化ベシクルの調製
実施例１５を繰り返したが、ウサギ抗ケラチン抗体を、ウサギ抗ヒト骨ミオシン抗体（Ｂｉｏｍａｋｏｒ（登録商標）、Ｋｉｒｙａｔ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）（１００μＬ）に代えた。
【０４１１】
Ｂ．心筋細胞のターゲッティング
ラット心臓筋芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、ＥＭＥＭ媒体（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中の水平組織培養管（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）に入れた。細胞を一晩成長させ、ベシクル組成物の分量をそれぞれの管に加えた。使用したベシクル組成物は：（ｉ）実施例６からのベシクル；（ｉｉ）ウサギ抗心筋抗体を含有しないステップＡで調製されたベシクル；及び（ｉｉｉ）ウサギ抗心筋抗体を含有するステップＡで調製されたベシクルであった。抗体を含む（ｉｉｉ）のベシクルのみが、心筋細胞に結合した。
【０４１２】
実施例２２
この実施例は、心筋の細胞（心筋細胞）をターゲットとするベシクル組成物の調製及び使用を対象としている。
【０４１３】
Ａ．ターゲット化ベシクルの調製
実施例１５を繰り返したが、ただし、ウサギ抗ケラチン抗体を、ウサギ抗ミオシン（骨核）抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）（１００μＬ）に代えた。
【０４１４】
Ｂ．心筋の細胞のターゲッティング
心筋を発現するＨ９Ｃ２、ラット心筋系を使用した。（骨格筋ミオシン及び心筋ミオシンは実質的に同じである。）対照細胞系は、ヒト腸管細胞系であるＩＮＴ４０７であった。細胞を、ＥＭＥＭ媒体（Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中の水平組織培養管（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に入れた。細胞を一晩成長させ、ベシクル組成物の分量をそれぞれの管に加えた。使用したベシクル組成物は：（ｉ）実施例６からのベシクル；（ｉｉ）ウサギ抗ミオシン抗体を含有しないステップＡで調製されたベシクル；及び（ｉｉｉ）ウサギ抗ミオシン抗体を含有するステップＡで調製されたベシクルであった。次の３種の実験細胞タイプを使用した：（ａ）ＩＮＴ４０７；（ｂ）Ｈ９Ｃ２；及び（ｃ）１０％グルコースに１０分間さらして、細胞に衝撃を与え、空孔を開けて、抗ミオシンと細胞質ミオシンとが結合するようにしたＨ９Ｃ２。細胞タイプ（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれでも、ベシクル組成物（ｉ）又は（ｉｉ）では結合が観察されなかった。ベシクル組成物（ｉｉｉ）も、細胞タイプ（ａ）には結合しなかった。ベシクル組成物（ｉｉｉ）と細胞タイプ（ｂ）との若干の結合が観察され、ベシクル組成物（ｉｉｉ）と細胞タイプ（ｃ）との実質的な結合が観察された。
【０４１５】
実施例２３
ジピリダモール（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１０ｔｈ  Ｅｄ．，ｐ．４８９（１９８３）参照）は、本発明では、冠血管拡張剤である生物活性剤である。ジピリダモールは、本発明ではターゲッティングリガンドでもある。それというのも、これは、心臓組織中の１種又は複数の受容体に結合し、ホスホリピドに付着して、膜親和性誘導体をもたらすためである。特に、Ｎ−スクシニル−ＤＰＰＥは、ジシクロヘキシルカルボジイミド及び縮合剤としての触媒を使用すると、ジピリダモールに結合して、Ｎ−ジピリダモリルスクシネート−ＤＰＰＥを生じる。この脂質結合ジピリダモール誘導体を、心臓組織をターゲットとするためのベシクルを調製するために、脂質組成物中で使用することになる。
【０４１６】
実施例２４
バルーンカテーテルを経皮的に、大腿動脈を介して、実験動物の左の冠動脈回旋枝へと設置する。バルーンを、３時間膨らませて、前外側心筋層への血流を阻止し、心筋梗塞を生じさせる。心エコー検査を、５ＭＨｚトランスデューサで行い、残存壁運動異常、さらに左心室の前外側壁の心筋薄化を明らかにする。バルーンをしぼませ、例えば実施例２２のステップＡで調製したものと同様で、ドデカフルオロペンタンガスを充填した抗心筋抗体標識ベシクル３０μＬ／ｋｇの用量を、静脈により注入する。心エコー検査を注入の３０分後に行う。撮像により、梗塞の領域に対応して、前外側壁に高いエコー源性の領域が示されよう。梗塞の周辺（再還流領域）は最も明るく、中心で低い強度を示す（流れが持続的に存在しない領域）。これに対して、中心心室房は比較的暗く、ベシクルの大部分はこの時間までには除去されている。
【０４１７】
実施例２５
胸痛を病んでいる患者を、病院の救急処置室に入れることにする。超音波試験を行うと、左心室の前壁に壁運動異常を示す。患者に、例えば実施例２２のステップＡで調製したものと同様で、ペルフルオロブタンガスを充填した抗心筋抗体標識ベシクル５μＬ／ｋｇの用量を投与する。投与の１０分後、超音波撮像を繰り返すと、これにより左心室前壁に高いエコー源性の領域が示される。これにより、心筋梗塞の診断が確認され、患者を組織プラスミノーゲン活性化因子で治療することになる。
【０４１８】
実施例２６
冠状動脈疾患の有無を診断するために、患者でストレス心エコー検査法を行うことにする。ピーク運動の間、患者に、前記の実施例２３に記載のジピリダモールで標識されたペルフルオロプロパン充填ベシクル５μＬ／Ｋｇを投与する。ジピリダモールを、（ａ）二官能性架橋基；（ｂ）小さいスパニング分子；（ｃ）還元アミノ化を伴う、又は伴わないシッフ塩基；又は（ｄ）マレイミジルリンカーを使用することにより、ベシクルと組み合わせる。ベシクルは、心筋の灌流領域に結合する。約５分で、バックグラウンドベシクルが消失すると、標識ベシクルが心筋に存在し続けることになろう。後発撮像により、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）を受けている虚血心筋が、明るい正常に灌流されている心筋に取り囲まれている低強度領域として示されよう。心室内での認めうるバックグラウンドベシクルの不在により、影付きの問題が消え、ＣＡＤの診断が容易になる。
【０４１９】
実施例２７
この実施例では、本発明の範囲内のベシクル組成物及び方法を使用して、タンパク質のターゲット化発現を証明する。
【０４２０】
ここではラット（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）と同定するＳＤラット３匹を、ケタミンアセプロマジンで麻酔した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子をＳＶ４０プロモーター及びエンハンサー遺伝子と共に含有するプラスミドであるｐＳＶβ−ｇａｌを、実施例２で調製されたカチオン脂質化合物と混合する。プラスミド及びカチオン脂質化合物混合物を室温で１５分間インキュベーションした。次いで、ｃＧＭＰ及び生じたインキュベーションされた物質を、通常生理食塩水：グリセロール：プロピレングリコール（８：１：１）中のそれぞれモル％比８２：１０：８のＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００からなるブレンドに加えた。生じた混合物を、ＷＩＧ−Ｌ−ＢＵＧ（登録商標）で１分間、３２００ｒｐｍで振盪することにより、ベシクルを調製した。生じたベシクル組成物を、ラット（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）に注入した。用量は、次の通りであった。
ラット    ｐＳＶβｇａｌ用量（μｇ）    カチオン脂質用量（μｇ）
（Ａ）            ５                          ３０
（Ｂ）            ５                          ３０
（Ｃ）          ２５                        １５０
ベシクル組成物を注入している間に、ラット（Ｂ）及び（Ｃ）を、治療用超音波装置（１．０Ｍｈｚ、Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ  ｍｏｄｅｌ２５、Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｏｌａ、ＯＫ）からの超音波エネルギーにさらす。注入の間及びフラッシュ後の１分間、超音波を、左後肢の内側に向けた。ラット（Ａ）には、超音波治療を受けさせなかった。４８時間後、ＣＯ２で窒息させることにより、ラットを安楽死させた。左右の肢の筋肉及び皮膚を各ラットから切除した。心臓、肝臓及び腎臓も切除した。切除された組織を、２％ホルマリン中で７２時間固定した。固定した後に、Ｘ−ｇａｌ、フェロシアン化カリウム及びフェリシアン化カリウムを含有する溶液に組織を浸すことにより、β−ガラクトシダーゼ活性の存在をアッセイした。組織を染色し、検査し、撮影した。ラット（Ａ）の肢組織、特に、内皮細胞、筋肉及び皮膚に、発現が広く分散しているのが見られた。ラット（Ｂ）から切除された組織の検査で、同様の細胞タイプに発現が見られたが、超音波適用の部位でのみであった。ラット（Ｃ）では、ターゲット肢で点発現及びターゲットではない肢で分散発現が見られた。
【０４２１】
実施例２８
この実施例は、様々な脂質組成物の調製を対象としている。
【０４２２】
ＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００を、それぞれモル比８２：１０：８でブレンドした。この脂質混合物をここでは、組成物（Ａ）と称する。組成物（Ａ）の１部分を、蒸留脱イオン水中で、実施例２で調製されたカチオン脂質化合物と１０：１（ｗ：ｗ）の比で混合した。この後者の混合物をここでは、組成物（Ｂ）と称する。組成物（Ａ）及び（Ｂ）を、１ｍｌ血清バイアルに導入した。Ｓａｒｇｅｎｔ  Ｗｅｌｃｈ真空ポンプ（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）を用いてバイアルを排気し、ヘッドスペースをペルフルオロプロパンガス（Ｆｌｕｒａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、ＴＮ）に代えた。バイアルをＣｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ  ＷＩＧ−Ｌ−ＢＵＧ（登録商標）３１１ＯＢ（Ｌｙｏｎｓ、ＩＬ）機械的振盪機を用いて攪拌した。振盪の後に、ヘパリン（Ｅｌｋｉｎ  Ｓｉｎｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）をほぼ５：１の脂質：ヘパリンのモル比でバイアルの１部分に加えた。ヘパリン及び組成物（Ａ）の混合物をここでは、組成物（Ｃ）と称する。ヘパリン及び組成物（Ｂ）の混合物をここでは、組成物（Ｄ）と称する。
【０４２３】
次いで、組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ＢＦＧＦ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を次いで、組成物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に加え、これらをそれぞれ、組成物（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）と称する。ＢＦＧＦを、ヘパリンを含有する組成物（組成物（Ｃ）及び（Ｄ））に、モル比５：１（ＢＦＧＦ：ヘパリン）で加えた。組成物（Ａ）から（Ｈ）それぞれから少なくとも３つのサンプルを、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ７７０（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用してサイズ調整した。サイズ調整で、組成物（Ａ）から（Ｇ）にベシクルサイズの違いは見られなかった。しかしながら、カチオン脂質、ヘパリン及びＢＦＧＦを含有する組成物（Ｈ）中のベシクルは、より小さい平均サイズを有した。
【０４２４】
次いで、組成物（Ｅ）から（Ｈ）を、天然ポリアクリルアミドゲル（タンパク質ゲルＰＡＧＥミックス、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して分析し、ヘパリン及びＢＦＧＦの結合特性を識別した。ゲルを、Ｈｏｅｆｅｒ  ＳＥ４００スラブゲル装置（Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に泳動させた。ゲルを、電気泳動電力供給（ＭＢＰ３００、ＩＢＩ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して一定の電流で泳動させた。次いで、ゲルを高速クーマシーブルー染色法を使用して染色し、視覚的に分析した。ゲル電気泳動により、組成物（Ｈ）では、カチオン脂質の存在がヘパリンさらにはＢＦＧＦの結合を強めることが確認された。アニオン性のヘパリンがカチオン脂質に結合し、カチオン性であるＢＦＧＦがヘパリンに結合すると考えられる。ヘパリン及びカチオン脂質を含有しない組成物中のＢＦＧＦは、電気泳動の間に移動する。
【０４２５】
実施例２９
実施例１６を繰り返したが、ただし、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を、抗ＣＥＡ抗原の代わりに使用することにする。
【０４２６】
実施例３０
ＤＰＰＣ、ＤＰＰＡ及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００をモルパーセント比８２：１０：８で、塩水：プロピレングリコール：グリセロール（８：１：１、ｗ／ｗ／ｗ）中で混合する。溶液中の脂質の全体濃度は、１ｍｇ／ｍＬである。組換えヒト成長ホルモンを、脂質の全体重量に対して１０重量％の濃度でこの混合物に加える。この混合物の分量（１．５ｍＬ）を３ｍＬ容量ガラスバイアルに入れ、バイアルのヘッドスペースをペルフルオロプロパンガスに代える。バイアルを密閉し、振盪すると、ヒト成長ホルモンに結合していて、内皮細胞をターゲッティングするために使用することができるガス充填ベシクルが生じる。ベシクルの平均直径は、約３μｍとなろう。
【０４２７】
実施例３１
ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）及びＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００をモル比９２：８で、滅菌水中で混合する。脂質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬである。キトサンのアミン基とｂＦＧＦのカルボキシル成分とを付着させるためのアミド結合を使用して、キトサンを、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）１０モル重量％で誘導体化する。誘導体化キトサンを、キトサン中のカチオン基とＤＳＰＧ中のアニオン基を実質的に等濃度にするような量の脂質懸濁液に加える。この混合物の分量（１．５ｍＬ）を３ｍＬバイアルに入れ、ヘッドスペースをペルフルオロブタンに代えた。バイアルを密閉し、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で振盪すると、内皮細胞をターゲッティングするために使用することができるガス充填ベシクルが得られよう。
【０４２８】
実施例３２
ペグ化脂質を、ＤＳＰＥ及びα，ω−ビス（カルボキシメチル）−ＰＥＧ２０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から調製すると、ＭｅＯ２Ｃ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥが得られる。この脂質をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製すると、遊離酸（ＨＯ２Ｃ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）が得られ、この後、ＶＥＧＦを、遊離のカルボキシル基と架橋させる。ＤＰＰＣ、ＤＳＰＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＶＥＧＦをモル比８２：１０：６：２で、生理食塩水：グリセロール：プロピレングリコール（８：１：１、ｗ／ｗ／ｗ）中で、全体脂質濃度１．５ｍｇ／ｍｌで混合する。この混合物の分量（１．５ｍＬ）を滅菌３ｍＬバイアルに入れ、バイアルのヘッドスペースを３０℃でペルフルオロペンタンガスに代え、バイアルを密閉する。バイアルを３０℃で、約９０秒間、３２００ｒｐｍでＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）上で振盪させると、ペルフルオロペンタンガス充填ターゲット化ベシクルが生成することになろう。
【０４２９】
実施例３３
ＤＳＰＣ、コレステロール及びＤＰＰＡを６５：２７：８のモルパーセント比で、生理食塩水：プロピレングリコール：グリセロール（８：１：１、ｗ／ｗ／ｗ）の溶液中で混合する。全体脂質濃度は、５ｍｇ／ｍＬである。この混合物の分量（１．５ｍＬ）を滅菌バイアルに入れ、ヘッドスペースをペルフルオロブタンガスに代える。バイアルを密閉し、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）上で５分間振盪させると、本発明の範囲内のベシクル組成物が得られる。高コレステロール食を与えられているＷａｔａｎａｂｉウサギにｉ．ｖ．で、ベシクル組成物０．１０ｍＬ／Ｋｇの用量を投与する。投与の２５分後に、超音波撮像を行うと、ベシクルがアテローム斑に冒されている内皮細胞の領域に蓄積したことが示される。このことは、本発明のベシクル組成物は、内皮細胞のアテローム硬化性領域を診断する際に使用することができることを示すことになろう。
【０４３０】
実施例３４
実施例３３を繰り返すが、ただし、使用される脂質は、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−カルボキシレートへのアミド結合を介して共有結合により架橋されるコレステロールアミンとする。脂質混合物は、モルパーセント比８２：７：１：１０で混合されているＤＰＰＣ、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−コレステロールアミン及びＤＰＰＡを含むことになろう。
【０４３１】
実施例３５
実施例３３を繰り返すが、ただし、脂質濃度を、約５ｍｇ／ｍＬに高め、懸濁媒体が、通常生理食塩水、トレハロース（１０ｍｇ／ｍＬ）及びプルロニックＦ−６８（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を含む。脂質のこの懸濁液を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、１６０００ｐｓｉで、全部で１０回の通過でマイクロエマルジョン化する。生じたベシクル組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥室のヘッドスペースを、ゆっくりとペルフルオロブタンガスを注入することにより、７２時間かけて徐々に、周囲圧力に戻す。生じたガス充填凍結乾燥ベシクルを、使用するまで、無水粉末として貯蔵することとする。
【０４３２】
実施例３６
実施例３５を繰り返すが、ただし、脂質濃度を約２５ｍｇ／ｍＬに高め、懸濁媒体が、通常生理食塩水、ソルビトール（２０ｍｇ／ｍＬ）及びプルロニックＦ−６８（２０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を含有する。脂質懸濁液を４℃に冷却し、この混合物に、ペルフルオロペンタンを加えて、溶液１ｍＬ当たり８μＬのペルフルオロペンタン濃度にする。この混合物を、温度を４℃に維持されているミクロ流動化装置に２０回、１６０００ｐｓｉで通過させる。これにより、ペルフルオロペンタン充填ベシクルのベシクル組成物が得られる。この組成物をｉ．ｖ．で、患者に注入し、内皮細胞をターゲットとするために使用することができるガス充填ベシクルをインビボで形成することとする。ｉ．ｖ．注入の前に、ベシクル組成物を約３０℃以上に加温し、例えば、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で、又は他の振盪機又はアマルガメータで振盪することにより、又はペルフルオロペンタン充填ベシクルの組成物を充填されているシリンジのプランジャを引いて、圧力を低下させ、ペルフルオロペンタン液体をペルフルオロペンタンガスに変えることによって、ガス充填ベシクルを得ることもできる。
【０４３３】
実施例３７
１２−ヒドロキシドデカン酸を、塩化メタクリロイルでエステル化し、エステルを、無水物に変えて、１２−（メタクリロイルオキシ）ドデカン酸無水物を得る。タマゴレシチンに由来するＬ−アルファ−グリセロホスホコリンを、１２−（メタクリロイルオキシ）ドデカン酸無水物でアシル化して、ビス［１２−（メタクリロイル）オキシドデカノイル］−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（１）を得る。粗製ガラガラヘビ毒液（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）に由来するホスホリパーゼＡ２を用いて酵素により加水分解し、引き続き、パルミトイル無水物でアシル化すると、１−［２−（メタクリロイルオキシ）ドデカノイル］−２−パルミトイル−Ｌ−アルファ−ホスファチジルコリン（２）が得られよう。
【０４３４】
前記の（２）を、通常生理食塩水と、脂質濃度３ｍｇ／ｍＬで混合する。この混合物に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＶＥＧＦを濃度０．３０ｍｇ／ｍＬで加える。混合物の分量（１．５ｍＬ）を滅菌３ｍＬバイアルに入れる。バイアルのヘッドスペースを排気し、ペルフルオロプロパンガスに代え、バイアルを密閉し、薄い不透過性フォイルでラッピングする。バイアルを、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で約３分間振盪すると、ガス充填ベシクルが得られる。フォイルを除去し、ベシクル組成物に光（２５４ｎｍ）を照射すると、内皮細胞をターゲットとするためのＶＥＧＦを支持する重合ガス充填ベシクルが得られよう。
【０４３５】
実施例３８
実施例３７を繰り返すが、ただし、脂質（２）をＤＳＰＥ−ＰＥＧと混合する（実施例８参照）。ＶＥＧＦをこの脂質混合物に混合し、その後、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）上で振盪し、ＤＳＰＥ−ＰＥＧに共有結合により結合する。光重合の後に、ＶＥＧＦをベシクルを被覆するポリマー脂質膜に直接包埋することとする。
【０４３６】
実施例３９
この実施例は、内部で架橋しており、公開国際出願ＷＯ第９５／００１２６号（この記載をここでは全て、参照して援用する）に記載されているようなポリオキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキレン鎖の結合により変性されている表面を有するアルブミンベシクルの調製を広く対象としている。エーテル基であるＷＯ第９５／００１２６号でのアルキレン鎖の末端とは異なり、アルキレン鎖変性剤の末端は反応性基を含む。反応基は、内皮ターゲッティングリガンドを結合するために含まれることになろう。
【０４３７】
実施例３９Ａ
５％ヒトウシ血清アルブミンの水溶液（５ｍＬ）を超音波反応容器に、５００ｍＬ／分の速度で導入する。Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｂ−３０（Ｂｒａｎｓｏｎ、ＦＲＧ）を使用して、混合物を約１５分間、エネルギー束１００ワット／ｃｍ２で音波処理する。反応容器を冷却することにより、温度を２２℃に維持する。望ましい場合には、薬剤などの生物活性剤を、この混合物に加える。アルブミン溶液に、グルタルアルデヒドで飽和しているＣＨ２Ｃｌ２溶液（０．２ｍＬ）を加えることにより、架橋を開始する。生じた溶液を約１時間攪拌する。メタノールで、続いてアセトン、最後にｎ−ヘキサンで洗浄した後に、架橋されたアルブミンベシクルが、褐色の粉末として得られ、これを、真空下に約２４時間乾燥させる。生じたベシクルのサイズは、Ｎｉｃｏｍｐｓレーザー光粒子走査システムにより、約２００ｎｍと決定されよう。
【０４３８】
実施例３９Ｂ
強力乳化プロセスを、４ブレードインペラに代え、高濃度、例えば約１０から約２５％のアルブミンを使用することにより、実施例３９Ａで調製されたベシクルよりも大きな直径を有するアルブミンベシクルを調製される。架橋は、実施例３９Ａで前記したように実施することにする。
【０４３９】
実施例３９Ｃ
この実施例は、ガス充填アルブミンベシクルの調製を対象としている。
【０４４０】
滅菌バイアル中に５％アルブミン５ｍＬを入れ、バイアルのヘッドスペースにペルフルオロブタンガスを充填することにより、アルブミンベシクルを調製する。バイアルを、ＥＳＰＥ  Ｃａｐｍｉｘ（Ｓｅｅｆｅｌｄ、ドイツ）で、３３００ｒｐｍで約５分間振盪する。架橋は、実施例３９Ａで前記したように実施することにする。
【０４４１】
実施例３９Ｄ
この実施例は、ガス充填アルブミンベシクルの調製を対象としている。
【０４４２】
ヒト血清アルブミンの５％溶液及びペルフルオロプロパンガスのヘッドスペースを有するバイアルを音波処理することにより、アルブミンベシクルを調製する。この音波処理は、中間出力設定で、約５分間、液体界面に音波処理装置ホーンチップを最小限浸漬することを含む（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｂｅ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）。アルブミンベシクルを、実施例３９Ａで前記されているように架橋させることにする。
【０４４３】
実施例３９Ｅ
この実施例は、ヘテロ二官能性ＰＥＧと前記で調製されたアルブミンベシクルとを結合させることを対象としている。
【０４４４】
α−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ５０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）のωカルボキシ基を、適切なエステル官能基、例えばベンジルエステルで保護する。例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸成分などのタンパク質上の適切なアミノ酸成分を１，１−カルボニルジイミダゾールで活性化させることにより、ＰＥＧのアミノ基を、アルブミンベシクルに共有結合により結合させて、１０：１重量比のアルブミン：ＰＥＧを得る。アミド結合によりＰＥＧとアルブミンとを共有結合させた後に、ベンジルエステル基を除去する。１，１−カルボニルジイミダゾールでＰＥＧのカルボキシレート末端を活性化することにより、ａＦＧＦを、遊離のカルボキシル基に結合させることになる。これにより、ＰＥＧ架橋基によりアルブミンベシクルに結合している内皮ターゲッティングリガンドが得られる。
【０４４５】
もしくは、カルボニルジイミダゾールでａＦＧＦの適切なアミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸を活性化し、引き続き、カルボキシル基保護α−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧを加えることにより、結合を行う。保護カルボキシル基を脱保護し、保護されていないカルボキシル基を、カルボニルジイミダゾールで活性化させる。活性化ａＦＧＦ−ＰＥＧを混合し、アルブミンベシクルと反応させることにする。
【０４４６】
真空下にベシクルを慎重に脱水し、ペルフルオロブタンなどのガスを使用して、周囲圧力まで徐々に戻すことにより、ベシクルにガスを注入する。１種又は複数の界面活性剤、例えばプルロニックＦ−６８を、脱水及びガス注入ステップの前に加えることもできる。
【０４４７】
実施例４０
この実施例は、ガス充填クラスレートの調製を対象としている。
【０４４８】
α−ヒドロキシ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ２０００中のωカルボキシ基を、適切なエステル官能基、例えばベンジルエステルで保護する。保護された化合物を、Ｅｔ３Ｎ及びＣＨＣｌ３中で、０から５℃で１当量のＰＯＣｌ３と反応させて、ヒドロキシ基を塩化リンエステルに変える。次いで、この化合物を過剰のＮａＨＣＯ３と反応させて、対応するリン酸ナトリウム塩（ＰＥＧ−ＰＯ４Ｎａ２）を生じさせる。この塩を、ＨＣｌでｐＨ３．０に酸性化して、対応する酸（ＰＥＧ−ＰＯ４Ｈ２）を得る。この生成物を、分画分子量約１００を有する膜を使用して、精製水に対して透析する。
【０４４９】
透析した後に、前記のリン酸生成物（２ｇ）を、水（１００ｍＬ）中のピロリン酸二水素二ナトリウム（Ｎａ２Ｈ２Ｐ２Ｏ７）（８ｇ）と混合する。この溶液を、Ｂｕｃｈｉ噴霧乾燥装置に導入し、噴霧乾燥させた。生じた粒子を、真空下に約１時間、１２０℃で乾燥させると、中空のＰＥＧ−被覆ピロリン酸ベシクルが生じる。これらのベシクルを、水性媒体中に再懸濁させ、ベンジル保護基を除去する。ＰＥＧの脱保護されたカルボキシル基を、１，１−カルボニルジイミダゾールで活性化させ、生じた化合物を、内皮細胞をターゲットとするためにＥＬＡＭのモノクローナル抗体に結合させる。ターゲットベシクルを含有する水性媒体に、ＤＤＰＣ及びプルロニックＦ−６８を加えて、それぞれ、１ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの濃度を生じさせる。ベシクル含有水性媒体を約４５℃に加熱し、手動で穏やかに攪拌し、回転蒸発機を使用して真空下に乾燥させ、その間、この温度を維持する。生じた乾燥物質を適切な容器に導入し、凍結乾燥させる。ペルフルオロブタンガスを徐々に、容器のヘッドスペースに、周囲圧力が達成されるまで、約４８時間かけて注入する。生じたガス充填ピロリン酸クラスレートを、使用するまで、凍結乾燥粉末として貯蔵することとする。
【０４５０】
実施例４１
蒸留水（１００ｍＬ）に、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ（３．６８ｇ）を溶かすことにより、０．２５ＭのＣａ＋２溶液を調製する。この溶液のｐＨを、０．１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨ１１に調製する。蒸留水（１０ｍＬ）にリン酸二水素カリウム（０．７５ｇ）を溶かすことにより、この塩（ＫＨ２ＰＯ４）の０．７４Ｍ溶液を調製する。この溶液に、二官能性ＰＥＧ，α−フェニルカルボキシエステル，ω−ホスホリルのＰＥＧ５０００  １．７５ｇを加える。０．１ＭのＮａＯＨを用いて、ｐＨをｐＨ１１に調整する。リン酸二水素カリウム／リン酸ＰＥＧ溶液を、ＣａＣｌ２の激しく攪拌されている溶液に滴加する。一粒子光学サイジング及び光学顕微鏡使用により、生じる沈殿物をサイズ調整する。粒子の直径は、約１から２μｍの範囲内である。粒子を濾過し、通常生理食塩水に再懸濁させ、フェニル基を、カルボキシ基から除去する。カルボキシ基を、１，１−カルボニルジイミダゾールで活性化し、これを、ＥＬＡＭに特異的なモノクローナル抗体と反応させる。Ｋｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  １９７５，２５６：４９５、この記載をここでは全て、参照して援用する）の方法による慣用の技術により、モノクローナル抗体を調製する。粒子を、プルロニックＦ−６８の溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）に懸濁させ、この懸濁液を適切な容器に導入し、凍結乾燥する。容器のヘッドスペースを、ペルフルオロプロパンガスを用いて、徐々に周囲圧力と平衡させると、ヒドロキシアパタイトガスクラスレートが得られよう。
【０４５１】
実施例４２
ラットでのインビボ実験を行ったが、これにより、細胞内に遺伝子物質を輸送するための実施例３のカチオン脂質化合物の高い有効性を証明する。この実験によりさらに、遺伝子物質を含有するベシクル組成物で、インビボで特定組織をターゲッティングするために超音波エネルギーを使用することの有効性も証明する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＶβ−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及び実施例３で調製されたカチオン脂質化合物を、混合により組み合わせた。生じた混合物を、尾静脈を介して、３匹の各ＳＤラット（ラット（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ））に注入した。ラット（Ａ）には、超音波を受けさせなかった。各ラット（Ｂ）及び（Ｃ）に注入している間に、超音波エネルギーを、後肢の内側に適用した。４８時間後、ラットを安楽死させ、組織を切除した。組織を、ホルマリン２％中で７２時間固定し、薄くスライスし、Ｘ−ｇａｌ溶液に中に入れた。３７℃での１６時間後、組織を検査した。ラット（Ａ）からの組織は、青色を示し、これは、通常の移入を示している。ラット（Ｂ）及び（Ｃ）からの組織は、超音波エネルギーが適用された部位でのみ、青色を示した。このことは、遺伝子発現の局在を、本発明の化合物及び方法により達成することができることを示している。
【０４５２】
実施例４３
新鮮なヒトの血液をガーゼストリップ（Ｔｉｌｌｏｔｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＮＨ）に塗布し、血餅にした。Ｔｙｇｏｎ管を、１％アガロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）スタンドオフパッド（ｓｔａｎｄｏｆｆ  ｐａｄ）に入れた。血餅を支持するストリップを、Ｔｙｇｏｎ管に挿入する。インライン混合素子（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）も管に挿入して、乱流を生じさせた。ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ  ぜん動性ポンプ（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）をガーゼストリップにポンプで流した。７．５ＭＨｚ末梢血管トランスデューサを備えたＡｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ５２００  超音波装置（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）を使用して、超音波撮像を実施した。トランスデューサをリングスタンドに固定し、スタンドオフパッドの下から撮像を実施した。ストリップから、未結合の血餅を洗浄した後に、ＧＰＩＩｂＩＩＩａをターゲットとするターゲット化ベシクル組成物各１ｍＬ及び実施例６からのベシクル組成物（非ターゲット化）を、約２ｍＬ／分の流速で、ＰＢＳ流に注入した。この速度で２分間、ベシクルを結合させ、次いで、流速を、６ｍＬ／分に変えて、未結合のベシクルを除去した。６ｍＬ／分で洗浄した後に、ターゲットベシクルはガーゼストリップに結合し、非ターゲットベシクルは洗い流された。超音波撮像により、ＧＰＩＩｂＩＩＩａに対してターゲット化されたベシクルでは、血餅での高いエコー源性が明らかになった。
【０４５３】
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ６６０  ＡＶ  コンピュータ（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）を使用して、ビデオデンシトメトリー分析（Ｖｉｄｅｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）をオフラインで行った。血餅の全領域を選択し、ビデオデンシトメトリー単位を測定した。Ｉｍａｇｅ  １．５５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を使用して、映像を捕捉し、分析した。
【０４５４】
2005500245.tif 000056
この分析は、コントラスト後映像と共に、コントラスト前ベースライン映像をコレクションし、スーパーインポーズすること、さらにコントラスト後映像からコントラスト前映像をサブトラクションすることを必要とした。このコレクション、スーパーインポーズ及びサブトラクションを、未結合のベシクルを除去するための洗浄の前後にも行った。連続的及び間欠的超音波の両方を使用して、このビデオデンシトメトリー分析を行った。この分析で得られたデータを、次の表に記載するが、数値が大きいほど、コントラストが改善されたことを示している。
【０４５５】
上の表の考察により、非ターゲット化ベシクルに比較して、ターゲット化ベシクルからの後方散乱が高いことは明らかである。Ｔ検定を行ったが、これにより、連続的でも間欠的撮像でもｐ＜０．０１で、非ターゲット化ベシクルに比較して、ターゲット化ベシクルでは、ビデオ密度（ｖｉｄｅｏｄｅｎｓｉｔｙ）信号で著しい増加が証明された。
【０４５６】
実施例４４
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミドの調製を対象としている。
【化５１】
2005500245.tif 000057
【０４５７】
Ａ．ジパルミトイルグリセロールスクシネート−ポリエチレングリコール−アミン（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）の調製
【化５２】
2005500245.tif 000058
丸底フラスコ（１００ｍＬ）中に、ＤＰＧＳ（９８ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を加えた。別の丸底フラスコ（１００ｍＬ）中に、Ｈ２Ｈ−ＰＥＧ−ＮＨ２（ＰＥＧ−ジアミン）（５０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を加えた。ＰＥＧ−ジアミン溶液に直ちに、ＤＣＣ（３１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０２当量）のＣＨＣｌ３（５ｍＬ）溶液を加えた。ＤＣＣ及びＰＥＧ−ジアミンからなる生じた混合物を、約０から約５℃で、ＤＰＧＳに滴加した。生じた反応混合物を、攪拌しながら室温と平衡させた。２４時間の攪拌の後に、蒸留脱イオン水（５０ｍＬ）を、反応混合物に加え、生じた白色の沈殿物（ジシクロヘキシル尿素）を、濾過により除去した。底部の有機層を、２５０ｍＬ分液漏斗を使用して単離し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。乾燥させた有機溶液を濾過し、ＣＨ３ＣＮ（８０ｍＬ）を濾液に加えた。生じた白色沈殿物を濾過により除去し、濾液を、真空濃縮すると、ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２０．４４ｇが固体生成物として得られた。
ＩＲ：１７００ｃｍ−１。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．６５。
【０４５８】
Ｂ．ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミドの調製
丸底フラスコ（１００ｍＬ）中に、ステップＡからのＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（０．４４ｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を加えた。この溶液に、トリエチルアミン（１３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を加えた。この混合物に、Ｎ−マレオイル−β−アラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３４．６ｍｇのＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を滴加した。室温で一晩攪拌した後に、脱イオン蒸留水（３０ｍＬ）を、反応混合物に加え、攪拌を、さらに３時間継続した。底部の有機層を、分液漏斗を使用して単離し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。有機層を濾過し、濾液を真空濃縮すると、表題化合物３６０ｍｇがロウ状の白色の固体として得られた。
ＩＲ：１７４０ｃｍ−１、１６７０ｃｍ−１、１１００ｃｍ−１。
ＴＬＣ：Ｒｆ０．７５。
【０４５９】
実施例４５
この実施例は、次式を有する１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニルエチレンカルボニル−イミノ−ポリエチレン−グリコールエチルアミノカルボニルエチレンマレイミド（ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミド）の調製を対象としている。
【化５３】
2005500245.tif 000059
【０４６０】
Ａ．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニルエチレンカルボニルイミノポリエチレングリコールエチルアミン（ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）の調製
【化５４】
2005500245.tif 000060
ＤＰＰＥコハク酸塩（７９ｍｇ）及びω，ω’−ジアミノポリエチレングリコール（３４０ｍｇ）からなる冷ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液（０から５℃）に、ＤＣＣ（２２ｍｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を加える。反応混合物を、０から５℃で４時間攪拌し、次いで、室温で一晩攪拌した。水（１０ｍＬ）を加え、反応混合物をさらに１時間攪拌した。底部有機層を単離し、真空蒸発器を使用して真空濃縮した。残留物をＣＨ３ＣＮに溶かし、沈殿物を濾過により除去した。有機溶液を真空濃縮すると、ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミド３９０ｍｇが白色の固体として得られた。
【０４６１】
Ｂ．ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミドの調製
ステップＡからのＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（２１０ｍｇ）及びトリエチルアミン（２０ｍｇ）からなる冷ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液（０から５℃）に、マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２６ｍｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を加えた。生じた混合物を０から５℃で１時間攪拌し、次いで、室温で一晩攪拌した。水（１０ｍＬ）を加え、生じた混合物を、攪拌しながら希ＨＣｌでｐＨ３まで酸性化した。有機層を単離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（ＮａＳＯ４）。真空蒸発器を使用して、乾燥するまで真空濃縮すると、表題化合物（ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マレイミド）２１０ｍｇが白色の固体として得られた。
【０４６２】
実施例４６
Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片を、脂質−ＰＥＧ−マレイミド脂質を介して、ガス充填ベシクルに結合した。Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）からのＦａｂ’及び／又はＦ（ａｂ’）２キットを使用して、抗骨ミオシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片を調製した。
【０４６３】
パパインで抗体を消化することにより、Ｆａｂ’断片を調製した。これにより、抗体のＦｃ領域からＦａｂ’断片の両方が分裂する。Ｆｃ断片を次いで、プロテインＡカラムに結合させ、Ｆａｂ’断片を集めた。次いで、Ｆａｂ’断片を凍結乾燥させ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｌｙｐｈ−Ｌｏｃｋ  １２、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）、脂質−ＰＥＧ−マレイミド脂質に結合するために調製した。
【０４６４】
Ｆ（ａｂ’）２断片を、Ｆａｂ’断片と同様に調製した。しかしながら、パパインの代わりに、酵素のペプシンを使用した。ペプシンにより、Ｆｃ領域は分裂し、２つのＦａｂ’断片が接続したままである。Ｆ（ａｂ’）２断片を次いで、凍結乾燥させた。
【０４６５】
様々な断片を、１ｍｇ／ｍＬの濃度で、カップリング緩衝液（ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ＭＯＰＳ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭ、ＤＴＰＡ５０μｍ、ｐＨ６．５、物質は全て、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得た）中に再懸濁させることにする。次いで、脂質−ＰＥＧ−マレイミド脂質（０．２から１０ｍＭ）を加え、生じた混合物を１６時間４℃でインキュベーションした。生じた生成物を、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルで分析して、Ｆａｂ’及び／又はＦ（ａｂ’）２断片が脂質に結合したかどうかを決定する。このことは、分子量の変化を観察することにより決定することができる。次いで、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２結合脂質１重量％を使用して、ターゲット化ベシクルを調製することとする。
【０４６６】
実施例４７
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰの調製を対象としている。
【化５５】
2005500245.tif 000061
【０４６７】
ジパルミトイルグリセロールスクシネート−ポリエチレングリコール−アミン（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）を、実施例４４、ステップＡでの手順を使用して調製した。ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４４０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶かした。この溶液に、３−（２−ピリジルジチオ）プロピロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＤＰ）（３１ｍｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液を加えた。室温で一晩攪拌した後に、脱イオン水（３０ｍＬ）を、反応混合物に加え、攪拌をさらに３時間継続した。底部有機層を、分液漏斗を使用して単離し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。有機層を濾過し、濾液を真空濃縮すると、表題化合物（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰ）３６０ｍｇがロウ状の白色の固体として得られた。
【０４６８】
実施例４８
この実施例は、次式を有するＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰの合成を対象としている。
【化５６】
2005500245.tif 000062
【０４６９】
１，２ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−カルボニルエチレン−カルボニルイミノポリエチレングリコールエチルアミン（ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２）を、実施例４５、ステップＡに記載されている手順を使用して調製した。この物質（２１０ｍｇ）及びトリエチルアミン（２０ｍｇ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中で混合した。この溶液を、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＰＤＰ）（３１ｍｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に加えた。生じた混合物を、０から５℃で１時間攪拌し、次いで、室温で一晩攪拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加え、生じた混合物を、攪拌しながら希ＨＣｌで、ｐＨ３まで酸性化した。有機層を単離し、水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。有機層を濾過し、回転蒸発器を使用して、乾燥するまで真空濃縮させると、表題の化合物（ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰ）２１０ｍｇが白色の固体として得られた。
【０４７０】
実施例４９
この実施例は、次式を有する、本発明の範囲内の脂質−親水性ポリマー−タンパク質複合体の調製を対象としている。
【化５７】
2005500245.tif 000063
【０４７１】
ＤＰＰＥ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰ中の−Ｓ−Ｓ−ジスルフィド結合のイオウ原子とタンパク質のスルフヒドリル基とを反応させることにより、実施例４８からの化合物をプロテインＡと架橋させる。生じた化合物は、タンパク質支持リポソームなどのタンパク質支持ベシクルを生じさせる際に利用することができる。
【０４７２】
実施例５０
この実施例は、次式を有する、本発明の範囲内の脂質−親水性ポリマー−タンパク質複合体の調製を対象としている。
【化５８】
2005500245.tif 000064
【０４７３】
実施例４７からの化合物（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−ＰＤＰ）を、マレイミド標識されたプロテインＡとカップリングさせると、上式の化合物が得られよう。
【０４７４】
実施例５１
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−グルコースの調製を対象としている。
【化５９】
2005500245.tif 000065
【０４７５】
Ａ．ＮＨ２−ＰＥＧ−グルコースの調製
臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−グルコピラノシル（０．６ｇ）を、Ｃ．Ａ．Ａ．ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｅｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．ｖａｎ  Ｂｏｏｍ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４１，４５４５（１９８５）の手順に従い調製した。ω−トリフルオロアセチルアミノポリエチレングリコール（３．５ｇ）と混合されているＤＭＦ中で活性化された分子ふるいを使用することにより、混合物の乾燥を開始するが、前者は、ω−アミノポリエチレングリコール及びトリ酢酸無水物及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．２ｍＬ）から調製した。生じた溶液を４日間窒素下に攪拌した。溶液をＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）で希釈し、１０％ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び水で洗浄した。有機層を真空濃縮し、生じた残留物を炭酸ナトリウムメタノール−Ｈ２Ｏ溶液で、室温で２日間処理した。溶剤を真空除去し、残留物を、ＣＨＣｌ３で２回抽出した。合わせたクロロホルム抽出物を、真空濃縮し、生じた残留物をメタノール中に溶かし、炭素上の１０％パラジウム（０．４５ｇ）上で、４気圧及び室温で水素化した。触媒を濾別し、濾液を真空濃縮すると、ＮＨ２−ＰＥＧ−グルコース（３ｇ）が白色の固体として得られた。生成物をシリカゲルカラムで精製し、クロロホルム−メタノール−水の定組成溶離剤を用いて溶離した。
【０４７６】
Ｂ．ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−グルコースの調製
ステップＡからのＮＨ２−ＰＥＧ−グルコース（１ｇ）、トリエチルアミン（０．５ｇ）並びにアセトニトリル及び水からなる溶液（５０：５０）を混合し、実施例１３ＡからのＤＰＧＳ−スクシンイミド（０．１５ｇ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）冷溶液（０〜５℃）に加えた。生じた混合物を室温で２日間攪拌し、アセトニトリルを蒸発させた。生じた残留物を水で、５０ｍＬまで希釈し、５００ＭＷＣＯ膜で透析し、凍結乾燥させると、表題化合物（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−グルコース）が白色の固体として得られた。
【０４７７】
実施例５２
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マンノースの調製を対象としている。
【化６０】
2005500245.tif 000066
【０４７８】
Ａ．α−ブロモ−アセチルアミノ−Ｄ−マンノースの調製
【化６１】
2005500245.tif 000067
塩酸Ｄ−マンノサミン（２．１ｇ）、トリエチルアミン（３ｇ）及びＤＭＦ（５０ｍＬ）を混合し、攪拌しながら、臭化α−ブロモアセチル（２ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２冷溶液（０〜５℃）に加えた。生じた混合物を室温で８時間攪拌し、次いで、氷水（５０ｍＬ）中に注いだ。この水性混合物を１時間攪拌し、次いで、乾燥するまで真空濃縮した。生じた残留物を、水及びエタノールの混合物から再結晶させると、α−ブロモ−アセチルアミノ−Ｄ−マンノースが白色の固体（２．１ｇ）として得られた。
【０４７９】
Ｂ．ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マンノースの調製
【化６２】
2005500245.tif 000068
ステップＡからのα−ブロモアセチルアミノ−Ｄ−マンノース（０．３ｇ）、実施例４４ＡからのＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４ｇ）、炭酸ナトリウム（０．２ｇ）及びＫＩ（２０ｍｇ）を、水及びエタノールからなる混合物（１：１）中で混合した。生じた混合物を４０℃に８時間加熱した。エタノールを回転蒸発器上で蒸発させ、水性残留物を、５００ＭＷＣＯ膜で透析し、凍結乾燥させると、表題化合物（ＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ−マンノース）４ｇを白色の固体として得た。
【０４８０】
次の実施例は、ターゲット化ベシクルの調製を対象としている。
【０４８１】
実施例５３
アルブミンベシクル（又はアルブミンコートされたガスバブル）を、８を上回るｐＨを有する緩衝液に懸濁させた。この懸濁液に、ＣＨ３ＣＮ中の３−（２−ピリジル）ジチオプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）を、０から５℃で加えた。生じた混合物を室温で２日間インキュベーションし、５００ＭＷＣＯの膜で透析すると、ピリジルジチオプロピオノイルを支持するアルブミンベシクルが得られた。次いで、マレイミドフェニルブチレート複合抗体（ＭＰＢ−ＡＢ）を、表面変性アルブミンベシクルと共にインキュベーションすると、アルブミンベシクルに架橋した抗体が得られた。
【０４８２】
実施例５４
ポリグルタミン酸ベシクル（又はポリグルタミン酸コートされたガスバブル）を、水に懸濁させた。この懸濁液に、水中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸エチル（ＥＤＣ）を０から５℃で加える。生じた混合物を穏やかに４時間攪拌し、次いで、ペプチド溶液（ｐＨ８から９．５の緩衝液）を加えた。この混合物を室温で２日間インキュベーションし、５００ＭＷＣＯの膜で透析すると、ペプチド複合ポリグルタミン酸ベシクルが得られた。
【０４８３】
実施例５５
実施例５３を繰り返したが、ただし、アルブミンベシクルの代わりに、シアノメタクリル酸メチル（２−シアノ−２−プロペン酸、メチルエステル）及びメタクリル酸ω−アミノ−テトラエチレングリコリルからなるコポリマーから処方されたベシクルを使用した。
【０４８４】
実施例５６
この実施例は、脂質−ポリマー−ペプチド複合体及びそのターゲット化ベシクルの調製を対象としている。
【０４８５】
丸底フラスコに、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）保護基を有するα−アミノ，ω−カルボキシＰＥＧ−４０００を１当量導入した。これを、Ｎ−メチルピロリドン中のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１当量）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（１当量）を加えることにより活性化した。この溶液に、アミノ末端上で脱保護されているペプチドＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを加えた。生じた溶液を攪拌し、定期的に、メチレンブルー又はニンヒドリンを用いる分析により、遊離アミノ基に関してチェックした。遊離アミノ末端の証拠がもはや無くなったら、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸を加えることにより、混合物全体の脱保護を実施する。ＰＥＧからの遊離アミンを次いで、標準的な方法により単離した。別のフラスコに、ＤＰＰＥ（１当量）のＤＭＦ溶液及びカルボニルジイミダゾール（１当量）を導入した。攪拌を、分子ふるい（４オングストローム）上で１時間継続した。次いで、この混合物に、ＰＥＧペプチドリガンド混合物を加え、引き続き、攪拌を続けた。次いで、混合物を真空乾燥させ、ＤＥＡＥセファロースゲル濾過カラムに加えて、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ペプチド複合体を単離した。次いで、ガス充填ベシクルを、通常の方法論を使用して、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ペプチドから調製した。
【０４８６】
実施例５７
この実施例は、次式を有するＤＰＧＳ−ＰＥＧ−環式ペプチドの調製を対象としている。
【化６３】
2005500245.tif 000069
【０４８７】
環式［Ｄ−２−アミノブチリル−Ｎ−２−メチル−Ｌ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アスパルチル−３−（アミノメチル安息香酸）］を、通常のペプチド合成方法論を使用して調製した。この環式ペプチド６６ｍｇの水（２０ｍＬ）溶液に、水（１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸エチル（ＥＤＣ）を０から５℃に加えた。生じた混合物を０から５℃で４時間、続いて室温で８時間攪拌した。この溶液に、ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の実施例４４ＡからのＤＰＧＳ−ＮＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（４００ｍｇ）を０から５℃で加えた。室温で一晩攪拌した後に、反応混合物を真空濃縮し、水性残留物を１０００ＭＷＣＯ膜を介して透析した。凍結乾燥すると、前記の化合物（４１０ｍｇ）が白色の固体として得られた。
【０４８８】
実施例５８
この実施例は、環式ペプチドでターゲット化されたベシクルの調製を対象としている。
【０４８９】
環式［Ｄ−２−アミノブチリル−Ｎ−２−メチル−Ｌ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アスパルチル−３−（アミノメチル安息香酸）］（６６ｍｇ）の水（２０ｍＬ）溶液に、水（１０ｍＬ）中のＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸エチル（ＥＤＣ）を０から５℃で加えた。生じた混合物を０から５℃で４時間、続いて室温で８時間攪拌した。次いで、反応混合物を、アルブミンベシクルの懸濁液に０から５℃に加えた。生じた混合物を室温で２日間インキュベーションし、濾過し、１０００のＭＷＣＯを有する膜を使用して透析すると、ポルフィリンターゲッティングリガンドでターゲット化されたアルブミンベシクルが得られた。
【０４９０】
実施例５９
実施例５８を繰り返すが、ただし、アルブミンベシクルの代わりに、シアノメタクリル酸メチル（２−シアノ−２−プロペン酸、メチルエステル）及びω−アミノ−テトラエチレングリコリルメタクリレートからなるコポリマーから処方されたベシクルを使用した。
【０４９１】
実施例６０
前記の合成方法論を使用して、次の各化合物を調製した。
【０４９２】
Ａ．次式を有するＤＰＰＡ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ
【化６４】
2005500245.tif 000070
【０４９３】
Ｂ．次式を有するＤＰＰＥ−スクシニル−ＫＱＡＧＤＶ
【化６５】
2005500245.tif 000071
【０４９４】
Ｃ．次式を有するＤＰＰＥ−ドデカニル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ
【化６６】
2005500245.tif 000072
【０４９５】
Ｄ．次式を有するＤＰＰＥ−スクシニル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ
【化６７】
2005500245.tif 000073
［上式中、ＫＱＡＧＤは、
【化６８】
2005500245.tif 000074
である］。
【０４９６】
Ｅ．次式を有するコレステリル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ
【化６９】
2005500245.tif 000075
【０４９７】
Ｆ．次式を有するステアロイル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ
【化７０】
2005500245.tif 000076
【０４９８】
実施例６１
この実施例は、本発明の範囲内のターゲット化ベシクルの調製を対象としている。
【０４９９】
ターゲット化脂質ＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ（１．２５重量％）及び脂質ＤＰＰＡ（６重量％マイナスＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶの重量）、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（４０重量％マイナスＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶの重量）及びＤＰＰＣ（５４重量％マイナスＤＰＧＳ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶの重量）を、蒸発フラスコに導入した。トルエン及びメタノールからなる混合物（６０：４０ｖ／ｖ）の分量を加えて、脂質を溶かし、フラスコ中の脂質をすすぐ。フラスコを回転蒸発器に置き、フラスコ中の溶液が澄明になるまで、５５℃±５℃に加温した。回転蒸発器に真空を適用して、溶液を濃縮すると、粘性なゲルが得られた。次いで、フラスコを磁気攪拌プレートに置き、攪拌棒をフラスコ中に入れた。メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）をフラスコに加えて、固体物質を沈殿させ、固体混合物を２５℃±５℃に冷却した。生じた白色の固体を、真空濾過により集め、ＭＴＢＥで洗浄し、真空炉に入れ、一定の重量になるまで４５℃±５℃で少なくとも４時間乾燥させた。ここで検討した手順を使用して、脂質混合物からベシクルを調製した。使用しない場合には、脂質混合物を気密容器中、−１５℃±５℃で貯蔵した。
【０５００】
実施例６２
この実施例には、先行技術の造影剤に対する本発明のターゲット化造影剤の比較試験の記載が含まれている。
【０５０１】
試験システム
図１に記載のタイプの試験系を、この実施例では使用した。ポリエチレン管（Ｐｈａｒｍｅｄ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を、２％寒天ｏｓｃからなるブロックに通した。寒天は、寒天を水中で加熱し、プラスチック製鋳型（寸法＝８ｃｍ×１０ｃｍ）に注ぐことにより調製されたブロックであった。寒天ｏｓｃは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）から購入した。Ｍａｓｔｅｒ−Ｆｌｅｘ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒポンプにより、ぜん動流を生じさせた。正常な男性ボランティアからヒトの血液を採取し、この血液を、綿パイピング物質上で血餅にし、ナイロンフィラメントが備え付けられている＃６ゲージ釣り針に固定した。ナイロンフィラメントを、ポリエチレン管血餅に通して、血餅が、寒天ブロック内の管の中央に位置するようにした。造影剤を、血餅の上流から注入し、ポンプを使用して、生理食塩水を、血餅を越して１ｍｌ当たり５０ｃｃの速度で３０秒間循環させ、その後、速度を、１分当たり１５０ｃｃの速度まで高めた。直線アレー第２調波トランスデューサ（２から４ＭＨｚ）を使用し、基本モードで運転して、Ｓｏｎｏｓ  ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．５５００  Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ臨床超音波装置を用いて、超音波撮像を行った。超音波を、血餅に向けられているトランスデューサの焦点帯域で、０．２の機械指数で連続的に行った。該当領域を、血餅上に当て、シグナル強度を、造影剤の注入前、造影剤の注入後２分後から５分後まで測定した。
【０５０２】
比較試験で使用された造影剤
ストック用脂質混合物を、ジパルミトイルホスファチジルコリン８２重量％、ジパルミトイルホスファチジン酸８重量％及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００  １０重量％から調製した。このストック用脂質混合物の分量に、ストック用脂質混合物中で使用された無水脂質の重量に対して０．０５重量％から５重量％の範囲で変動する様々な重量％のターゲット化脂質ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ、コレステロール−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ、ステアリル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ及び非結合又は遊離ペプチドＫＱＡＧＤＶを加えた。ターゲット化脂質ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ、コレステロール−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ、ステアリル−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ中のＰＥＧの分子量は、ＭＷ３４００であった。脂質混合物をターゲット化脂質又は遊離のペプチドと共に、８：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）の通常生理食塩水、プロピレングリコール及びグリセロールからなる溶液に、最終脂質濃度１ｍｇ／ｍＬで懸濁させ、次いで、各サンプル１．５ｍＬを、２ｍＬ透明ガラスバイアルに加えた。バイアルにキャップをし、バイアルのヘッドスペースを排気し、ペルフルオロブタンガスに代えた。次いで、バイアルを、変更された歯科用アマルガム機上で、４２００ｒｐｍで６０秒間（ＥＳＰＥ、Ｓｅｃｆｅｌｄ、ドイツ）振盪すると、リン脂質コートされたミクロバブルが生じた。
【０５０３】
ミクロバブルのサイズ及び濃度を、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．７７０粒子サイザ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｌｅｔａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で求めた。ガス充填ベシクルの異なる調製全てが、約２ミクロンの平均直径の同様のサイズ及び１ｍＬ当たりバブル約１５億個の粒子濃度を有した。
【０５０４】
様々なターゲット化ベシクル組成物のサンプル（１ｍＬ容量）を、注入ポートを介して、血餅の上流に注入し、ポンプを低速及び高速で循環させた。血餅の超音波密度を、様々な組成物で測定した。ストック溶液から調製された非ターゲット化ベシクルを含有する組成物は血餅のシグナル強度に、感知できるほどの増加をもたらさなかった。この組成物から得られた超音波シグナル強度を、図２にグラフで示す。これに対して、様々なターゲット化脂質を含有するベシクルは全て、血餅のシグナル強度を高めた。図３は、ストック脂質溶液及び脂質複合体ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶ０．３重量％から調製されたベシクルにさらす前後での血餅のシグナル強度のグラフ表示を含む。ストックベシクル溶液及び未結合又は遊離のＫＱＡＧＤＶ０．３重量％から調製されたベシクル組成物から意外にも、高いシグナル強度が得られた。超音波強度のこの増加を、図４にグラフで示した。この研究は、遊離ペプチドを含有する組成物は、脂質複合体ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−ＫＱＡＧＤＶを含有する組成物と少なくとも同様に有効であることを証明している。
【０５０５】
実施例６３
この実施例は、次式を有する本発明の生体複合体であるＮ，Ｎ’−ジステアロイル−ジアミノブチル（ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｌ）−ＰＥＧ３４００−ＧＧＧＲＧＤＳの合成を記載している。
【化７１】
2005500245.tif 000077
［上式中、ｎは、約６０から約８０の整数である。］
【０５０６】
試薬
次の試薬を、この実施例では使用した。
Ｆｍｏｃ保護基を除去するために、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の２０％ピペリジン（ｖ／ｖ）。
カップリング剤：ＮＭＰ中、１Ｍの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＯＴ）；ＮＭＰ中、１ＭのＮ，Ｎ’ジイソプロピルコルボ（ｃｏｒｂｏ）ジイミド（ＤＩＣ）。
洗浄溶剤：ジクロロメタン；メタノール。
樹脂：Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−保護（Ｆｍｏｃ）アミノ酸Ｗａｎｇ樹脂。
Ｋａｉｓｅｒ試薬：１ｍＭの水性ＫＣＮ２ｍｌをピリジンで１００ｍｌまで希釈；無水エタノール１０ｍｌ中のニンヒドリン５００ｍｇ；無水エタノール２０ｍｌ中のフェノール８０ｇ。
【０５０７】
１級アミンを試験するために、少量のペプチド樹脂を、小さい試験管に入れる。それぞれＫａｉｓｅｒ試薬２滴を加え、試験管を、油浴中に２分間置く。澄明な黄色の溶液は、１級アミンに対する強い陰性反応を示しているが、暗青色溶液（ニンヒドリン陽性）は、１級アミンに対する強い陽性反応を示している。
【０５０８】
手順
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒｉｎｅ  Ｗａｎｇ樹脂から開始し、２０％ピペリジン／ＮＭＰ溶液を使用して、Ｆｍｏｃ保護基を、アミノ酸−樹脂から脱離させた。２０分後、Ｋａｉｓｅｒ（ニンヒドリン）試薬を使用して、樹脂を遊離アミン基に関して試験した。暗青色結果が観察された。ジクロロメタン及びメタノールでの交互洗浄を使用して、樹脂を洗浄した。次いで、配列（Ａｓｐ）中の次のアミノ酸の３当量を固体として加え、続いて、それぞれ３当量の１ＭのＨＯＢＴ／ＮＭＰ及び１ＭのＤＩＣ／ＮＭＰ溶液を加えた。樹脂を被覆するために十分なＮＭＰを加えた。攪拌のために、Ｎ２ガスを反応容器の底部から約１時間バブル導入した。次いで、前記のようなジクロロメタン及びメタノールでの交互洗浄を使用して、樹脂を洗浄した。別のＫａｉｓｅｒ試験を行ったが、これは、予測されたように、陰性（黄色）であった。
【０５０９】
次いで、前記のステップを、ＧＧＧＲＧＤＳペプチド配列が完了するまで、次のアミノ酸基それぞれで繰り返した。
【０５１０】
次いで、末端Ｆｍｏｃ基を、ピペリジン溶液を用いて最後のアミノ酸から除去した。被覆するために十分なＮＭＰと共に、さらにそれぞれ３当量の１ＭのＨＯＢＴ／ＮＭＰ及び１ＭのＤＩＣ／ＮＭＰ溶液と共に、１当量のＦｍｏｃ−α−アミノ，ω−カルボキシ−ＰＥＧ３４００を加えた。反応を２４時間から７２時間進行させた。さらなるＨＯＢＴ（固体）及びＤＩＣ（未希釈）をほぼ２４時間目に加えた。ＰＥＧ溶液を排出させ、貯蔵し、樹脂を洗浄し、次いで、Ｎ２上で乾燥させた。増量を使用して、カップリングが進行したと判定した。次いで、処理前に樹脂を無水酢酸及びトリエチルアミンでキャップした。
【０５１１】
３当量のＮ−ビス−Ｆｍｏｃ−Ｌ−２，４−ジアミノブチル酸（Ｆｍｏｃ−ＤＡＢ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ）及びそれぞれ３当量の１ＭのＨＯＢＴ／ＮＭＰ及び１ＭのＤＩＣ／ＮＭＰ溶液を加え、２から４時間反応させた。ニンヒドリン陰性を確認するために、Ｋａｉｓｅｒ試薬でさらにチェックした後、反応溶液を濾別し、樹脂を洗浄した。
【０５１２】
次いで、Ｆｍｏｃ基をピペリジン溶液で除去した。Ｋａｉｓｅｒ試薬でのチェックにより再び、ニンヒドリン陽性が示された。次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解された６当量のステアリン酸を加えた。さらに、６当量の１ＭのＨＯＢＴ／ＮＭＰ及び１ＭのＤＩＣ／ＮＭＰ溶液を加えた。数時間後、過剰のステアリン酸を洗浄した。最終洗浄及びＫａｉｓｅｒ試薬での試験の後に、生成物は再び、予測されたようにニンヒドリン陰性であった。
【０５１３】
樹脂からの分離及び精製
攪拌しながら、樹脂をトリフルオロ酢酸及び水の溶液（９０：１０、ｖ：ｖ）に加えた。樹脂を１５〜２０分間攪拌し、樹脂を目の粗いガラス漏斗で濾過した。次いで、濾液を水で希釈し、水性ＮａＯＨ（約１から５Ｎ）で約ｐＨ７に中和した。これを、１０００分画分子量（ＭＷＣＯ）透析バッグで透析して、低分子量副生成物を除去した。濾液を、乾燥するまで真空濃縮した。次いで、生成物を、適切な溶剤に溶かし、Ｈ２Ｏ：メタノール勾配を使用するＶｙｄａｃ、ＴＰ−１０１０Ｃ−１８逆相カラムで精製した。精製された生体複合体を、ＭＡＬＤＩ質量分析法、ＮＭＲ及びアミノ酸分析により同定した。
【０５１４】
実施例６４
この実施例は、次式を有する本発明の生体複合体であるＮ，Ｎ’−ジステアロイル−ジアミノブチル−ＰＥＧ３４００−ＣＲＧＤＣの合成を記載している。
【化７２】
2005500245.tif 000078
【０５１５】
この合成は、実施例６３に記載の手順と同様の手順に従うが、ただし、トリフルオロ酢酸を用いる分離は、捕捉剤（即ち、フェノール、エタンジチオール及びチオアニソール）を伴うか、これを使用する。さらに、濾過し、真空濃縮した後に、生成物をｐＨ８に調整し、この混濁した溶液に、０．０１Ｎのフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６）（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）を滴加した。次いで、樹脂を目の粗いガラス漏斗で濾過し、濾液を１０００ＭＷＣＯスペクトル／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、Ｃａｌｉｆ．９０２２０−６４３５）で透析した。次いで、生成物を適切な溶剤に溶かし、Ｈ２Ｏ：メタノール勾配を使用するＶｙｄａｃ、ＴＰ−１０１０Ｃ−１８逆相カラムで精製した。精製された生体複合体を再び、ＭＡＬＤＩ質量分析法、ＮＭＲ及びアミノ酸分析により同定した。
【０５１６】
実施例６５
この実験は、実施例６３に記載の生体複合体を利用するターゲット化ベシクル組成物のインビトロ試験を記載している。
【０５１７】
実施例６３の生体複合体を含むターゲット化脂質ベシクルを、ＤＰＰＣ（８２モル％）、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（８モル％）及びＤＰＰＡ（８モル％）からなる乾燥脂質混合物及び実施例６３からの化合物を使用して処方した。物質を９５：５重量％比（脂質ブレンド：生体複合体）で混合し、凍結乾燥させた。次いで、物質を５ｍｇ／ｍｌで、８：１：１の通常生理食塩水：プロピレングリコール：グリセロールに再懸濁させ、バイアル１個当たり１．５ｍｌで２ｍｌ血清バイアルに入れた。ヘッドスペースを、ペルフルオロプロパンに代えた。次いで、変更された歯科用アマルガム機上で、４２００ｒｐｍで６０秒間（ＥＳＰＥ、Ｓｅｃｆｅｌｄ、ドイツ）、バイアルを振盪すると、実施例６３の生体複合体を含有するペルフルオロプロパンガス充填ターゲット化ベシクルを含有する組成物が生じた。
【０５１８】
ミクロバブルのサイズ及び濃度を、Ａｃｃｕｓｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．７７０粒子寸法測定器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｌｅｔａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で求めた。ガス充填ベシクルは、実施例６２で製造されたものと同様のサイズを有し、平均直径は約２ミクロンであり、粒子濃度は１ｍＬ当たりバブル約１５億個であった。
【０５１９】
実施例６２に記載されている試験システムを使用した。得られた画像を、図５に示す。ベースライン映像を最初に得た（図５Ｃ）。次いで、実施例６３からのターゲット化ベシクル処方物（０．５ｍＬ）を、１分あたり６ｍｌの流速設定で注入した。流速を、この速度で、３０秒間維持した。次いで、流速を、１分当たり３０ｍｌまで２分間高め、次いで、１分当たり６ｍｌに戻して、図５Ｄに示されている映像を得た。投与前及び非ターゲット化ベシクル処方物で行われた対照の両方に比較して、血餅吸収ファントムの優れた可視化が得られた（図５Ｂ）。この実験により、本発明の生体複合化合物及びターゲット化ベシクル組成物を使用すると、血栓の優れた可視化が得られることが証明されている。
【０５２０】
本明細書で引用又は記載されている各特許、特許出願及び刊行物の記載をここでは全て、参照して援用する。
【０５２１】
ここに記載されている変更に加えて、本発明の様々な変更が、前記の記載から、当技術分野の専門家には明らかであろう。このような変更も、添付の請求項の範囲内に該当するものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施形態による造影剤をインビトロで評価するためのシステムの略図を示す図である。
【図２】
先行技術の造影剤に暴露する前及びその後の、インビトロでの血餅の超音波シグナル強度の痕跡を示すグラフである。
【図３】
本発明の実施形態による造影剤に暴露する前及びその後の、インビトロでの血餅の超音波シグナル強度の痕跡を示すグラフである。
【図４】
本発明の別の実施形態による造影剤に暴露する前及びその後の、インビトロでの血餅の超音波シグナル強度の痕跡を示すグラフである。
【図５】
本発明によるベシクル組成物及び先行技術による造影剤を投与する前及びその後の、血餅吸収ファントムの超音波映像を示す写真である。本発明の方法及び組成物を使用すると、血餅の位置及び範囲の可視化に著しい改善が観察された。
【図５Ａ】
造影剤を投与する前の血餅吸収ファントムのベースライン超音波映像の写真である。
【図５Ｂ】
先行技術の非ターゲット化ベシクル造影剤を投与した後の図５Ａでのファントムの超音波映像の写真である。
【図５Ｃ】
造影剤を投与する前の、血餅吸収ファントムの繰り返しベースライン超音波映像の写真である。
【図５Ｄ】
本発明によるターゲット化ベシクル組成物を投与した後の、図５Ｃでのファントムの超音波映像の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500245.tif 000295
2005500245.tif 000296
【国際調査報告】
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2005500245.tif 000298
2005500245.tif 000299
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