(57)【要約】本発明は、サンプル中の関心のある被検体の濃度を決定するために、毛管電気泳動およびレーザ励起蛍光（ＬＩＦ）検出と協動する粒子増感アッセイ形式を用いる高感度で迅速な均一アッセイを提供する。かかる測定は、かかる信号を発生することができる反応混合液中に存在する種のＬＩＦとともに発生する蛍光信号（すなわち、電気泳動結果図）を計測することによって行われる。本発明の方法は、分離してから測定されなければならない信号の数を低減させることにより単純化された電気泳動結果図を作成して、サンプル中の標的被検体濃度の検出および／または定量の精度を上昇させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法であって、
（ａ）被検体特異的結合パートナーを含む感作粒子を用意するステップと、
（ｂ）蛍光部分に結合した前記被検体を含む、遊離の蛍光色素標識被検体を用意するステップと、
（ｃ）前記サンプルの被検体に結合した固定化された前記結合パートナーを含む第１の複合体、および／または、前記蛍光色素標識被検体に結合した固定化された前記結合パートナーを含む第２の複合体の形成を可能にする条件下で、既知量の前記感作粒子および既知量の蛍光色素標識被検体が存在する状態で前記サンプルのインキュベーションをするステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）でインキュベーションされた前記サンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、
（ｅ）前記遊離の蛍光色素標識被検体のレーザ励起蛍光を検出することによって前記被検体の濃度を測定するステップとを含み、
前記被検体特異的結合パートナーは前記感作粒子に固定化され、
第２の複合体の前記蛍光色素部分の蛍光は第２の複合体の形成とともに消光し、
前記レーザ励起蛍光は、前記サンプル中の前記被検体の濃度に正比例する、サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法。
【請求項２】
前記不溶性粒子は蛍光消光剤のコーティングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光消光剤は、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ヨウ化物、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋からなるグループから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被検体は、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、糖タンパク質、糖、免疫グロブリン、レセプター、酵素、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド類、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬物、代謝産物、核酸、殺虫剤および毒素からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、全血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、水、排泄物、食物、タンパク質および薬物からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子は、オレフィン系不飽和単量体の重合体および共重合体、ガラス、木炭、コロイド金粒子、アクリルアミド、メタクリル酸、ナイロン、金属、金属酸化物およびその誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素およびランタニド錯体からなるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｄ）において、前記毛管電気泳動は石英ガラスカラムで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法であって、
（ａ）前記被検体を含む感作粒子を用意するステップと、
（ｂ）蛍光部分に結合した被検体特異的結合パートナーを含む遊離の蛍光色素標識結合パートナーを用意するステップと、
（ｃ）前記標識結合パートナーに結合した固定化された前記被検体を含む第１の複合体、および／または、前記蛍光色素標識結合パートナーに結合した前記サンプルの被検体を含む第２の複合体の形成を可能にする条件下で、前記サンプルを前記感作粒子および前記蛍光色素標識結合パートナーとともにインキュベーションするステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）でインキュベーションされた前記サンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、
（ｅ）第２の複合体か、複合体非形成の蛍光色素標識結合パートナーかのレーザ励起蛍光を検出することによって、前記サンプル中の前記被検体の濃度を測定するステップとを含み、
前記被検体は前記感作粒子に固定化され、
前記結合パートナーは、前記サンプルの被検体と、前記固定化された被検体とに特異的に結合し、
第１の複合体の蛍光色素部分の蛍光は第１の複合体の形成とともに消光し、
前記毛管電気泳動は、前記遊離の蛍光色素標識結合パートナーからの第２の複合体の分離を可能にする条件下で実施される、サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法。
【請求項１１】
前記不溶性粒子は蛍光消光剤のコーティングを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光消光剤は、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ヨウ化物、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋からなるグループから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被検体は、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、免疫グロブリン、レセプター、酵素、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド類、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬物、代謝産物、核酸、殺虫剤および毒素からなるグループから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルは、全血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、水、排泄物、食物、タンパク質および薬物からなるグループから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記粒子は、オレフィン系不飽和単量体の重合体および共重合体、ガラス、木炭、コロイド金粒子、アクリルアミド、メタクリル酸、ナイロン、金属、金属酸化物およびその誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素およびランタニド錯体からなるグループから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｄ）において、前記毛管電気泳動は石英ガラスカラムで実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
第２の複合体の蛍光が検出され、前記レーザ励起蛍光は前記サンプルの被検体の濃度に正比例する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記複合体非形成の蛍光色素標識結合パートナーの蛍光が検出され、前記レーザ励起蛍光は前記サンプルの被検体の濃度に反比例する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法であって、
（ａ）第１の被検体特異的結合パートナーを含む感作粒子を用意するステップと、
（ｂ）蛍光部分で標識された第２の被検体特異的結合パートナーを含む遊離の蛍光色素標識結合パートナーを用意するステップと、
（ｃ）第１の結合パートナーおよび標識結合パートナーに結合した前記被検体を含むサンドイッチ複合体の形成を可能にする条件下で、既知量の前記感作粒子および既知量の前記蛍光色素標識結合パートナーとともに前記サンプルをインキュベーションするステップと、
（ｄ）前記ステップ（ｃ）でインキュベーションされた前記サンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、
（ｅ）前記遊離の蛍光色素標識結合パートナーのレーザ励起蛍光を検出することによって、前記被検体の濃度を測定するステップとを含み、
第１の被検体特異的結合パートナーは前記感作粒子に固定化され、
前記サンドイッチ複合体の蛍光色素部分の蛍光は該サンドイッチ複合体の形成とともに消光され、
前記レーザ励起蛍光は前記サンプルの被検体の濃度に反比例する、サンプルの被検体の濃度のアッセイ方法。
【請求項２２】
前記不溶性粒子は蛍光消光剤のコーティングを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記蛍光消光剤は、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ヨウ化物、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋からなるグループから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被検体は、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、糖タンパク質、糖、免疫グロブリン、レセプター、酵素、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド類、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬物、代謝産物、核酸、殺虫剤および毒素からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第１の結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
第２の結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルは、全血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、水、排泄物、食物、タンパク質および薬物からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記粒子は、オレフィン系不飽和単量体の重合体および共重合体、ガラス、アクリルアミド、メタクリル酸、ナイロン、金属、金属酸化物およびその誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素およびランタニド錯体からなるグループから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（ｄ）において、前記毛管電気泳動は石英ガラスで実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
不溶性粒子に固定化された化合物の定量方法であって、
（ａ）蛍光部分に結合した化合物特異的結合パートナーを含む遊離の蛍光色素標識結合パートナーの既知量とともに前記化合物を固定化した前記粒子の溶液をインキュベーションするステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）でインキュベーションされた前記サンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、
（ｃ）前記遊離の蛍光色素標識結合パートナーのレーザ励起蛍光を検出することによって、前記粒子に固定化された前記化合物の量を測定するステップとを含み、
前記インキュベーションは固定化された化合物と標識結合パートナーとの複合体の形成を可能にする条件下で行われ、該複合体の蛍光色素部分の蛍光は前記複合体の形成とともに消光し、
前記レーザ励起蛍光は、前記粒子に固定化された化合物の量に反比例する、不溶性粒子に固定化された化合物の定量方法。
【請求項３２】
前記不溶性粒子は、蛍光消光剤のコーティングを含み、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記蛍光消光剤は、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ヨウ化物、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋からなるグループから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物は、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ポリペプチド、プロテインＡ、プロテインＧ、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物はアビジンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記結合パートナーはビオチンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記粒子は、オレフィン系不飽和単量体の重合体および共重合体、ガラス、木炭、コロイド金粒子、アクリルアミド、メタクリル酸、ナイロン、金属、金属酸化物およびその誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素およびランタニド錯体からなるグループから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ（ｂ）において、前記毛管電気泳動は石英ガラスで実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
サンプル中の複数の被検体を同時にアッセイする方法であって、
（ａ）第１の被検体および第２の被検体を含むかもしれないサンプルを、
ｉ）蛍光部分で標識された前記第１の被検体の既知量と、
ｉｉ）蛍光部分で標識された前記第２の被検体の既知量と、
ｉｉｉ）第１のサンプル被検体および標識された第１の被検体に結合することができる第１の結合パートナーと、第２のサンプル被検体および標識された第２の被検体に結合することができる第２の結合パートナーとを固定化した不溶性粒子を含む感作粒子とが存在する状態でインキュベーションするステップと、
（ｂ）複合体非形成の蛍光色素標識された第２の被検体から複合体非形成の蛍光色素標識された第１の被検体を分離することができる条件下で、前記ステップ（ａ）でインキュベーションされた前記サンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、
（ｃ）前記複合体非形成の蛍光色素標識された第１および第２の被検体からの第１および第２のレーザ励起蛍光をそれぞれ検出することによって、第１および第２の被検体の濃度をアッセイするステップとを含み、
前記インキュベーションは、第１の複合体、および／または、第２の複合体、および／または、第３の複合体、および／または、第４の複合体、および／または、第５の複合体、および／または、第６の複合体、および／または、第７の複合体、および／または、第８の複合体の形成を可能にする条件下で行われ、
第１の複合体は、第１の標識被検体および第２の標識被検体に結合した感作粒子を含み、第２の複合体は、第１のサンプル被検体および第２の標識被検体に結合した感作粒子を含み、第３の複合体は、第１の標識被検体および第２のサンプル被検体に結合した感作粒子を含み、第４の複合体は、第１のサンプル被検体および第２のサンプル被検体に結合した感作粒子を含み、第５の複合体は、第１の標識被検体に結合した感作粒子を含み、第６の複合体は、第１のサンプル被検体に結合した感作粒子を含み、第７の複合体は、第２の標識被検体に結合した感作粒子を含み、第８の複合体は、第２のサンプル被検体に結合した感作粒子を含み、
第１および第２の標識被検体に結合した前記蛍光色素部分の蛍光は、第１の複合体、および／または、第２の複合体、および／または、第３の複合体、および／または、第５の複合体、および／または、第７の複合体の形成とともに消光し、
第１および第２のレーザ励起蛍光は、それぞれサンプル中の第１および第２の被検体の濃度に正比例する、サンプル中の複数の被検体を同時にアッセイする方法。
【請求項４２】
前記不溶性粒子は蛍光消光剤のコーティングを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記蛍光消光剤は、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、ヨウ化物、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋からなるグループから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記封数の被検体の少なくとも１つは、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、糖タンパク質、糖、免疫グロブリン、レセプター、酵素、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド類、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬物、代謝産物、核酸、殺虫剤および毒素からなるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗原およびこれらの断片、誘導体および複合体、レクチン、プロテインＡ、プロテインＧ、ポリペプチド、アビジン、ストレプトアビジン、シクロデキストラン、クラウンエーテル、内因子および葉酸結合タンパク質からなるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルは、全血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、乳汁、水、排泄物、食物、タンパク質および薬物からなるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記粒子は、オレフィン系不飽和単量体の重合体および共重合体、ガラス、木炭、コロイド金粒子、アクリルアミド、メタクリル酸、ナイロン、金属、金属酸化物およびこれらの誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
第１および第２の蛍光部分は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、近赤外色素およびランタニド錯体からなるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ステップ（ｄ）において、前記毛管電気泳動は石英ガラスカラムで実施される、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはサンプル中の被検体検出用アッセイ方法に関し、具体的にはレーザ励起蛍光検出毛管電気泳動法を用いる新規な粒子均一アッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤、代謝産物または毒素の濃度を検出および／または定量する能力は、現代の診断および疾病管理の中心課題である。一部のケースでは、かかる被検体はその生物学的活性を検定することにより直接検出できる。しかし、たいていのケースでは、かかる分子を抗体と特異的に結合できる能力または電気泳動での移動度のような物理的特性によって検出するほうがより効率的である。
【０００３】
標的被検体の検出アッセイは、サンプル中の関心のある被検体と特異的に結合して該被検体の検出を助ける結合パートナーの使用を伴う。標的被検体の検出アッセイの１つのタイプは免疫アッセイである。免疫アッセイは、抗体が特定の標的被検体を特異的に認識し結合する能力を利用する、アッセイシステムである。免疫アッセイの概念は、抗体と、これに対応する抗原との間の特異的な化学反応に基づく。定量は、抗体に結合する抗原を遊離抗原から分離した後、具体的な分析計画に応じて、溶液中の抗体に結合した抗原か、遊離抗原かを検出することを伴う。かかるアッセイは現在の診断学で広く利用される（例えば、以下の非特許文献１−４）。
【非特許文献１】
Ｆａｃｋｒｅｌｌ，Ｊ．、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、８巻、２１３−２１９頁（１９８５年）
【非特許文献２】
Ｙｏｌｋｅｎ、Ｒ．Ｈ．、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４巻、３５頁（１９８２年）
【非特許文献３】
Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｗ．Ｐ．、「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（代替的免疫アッセイ法）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊、ＮＹ（１９８５年）
【非特許文献４】
Ｎｇｏ、Ｔ．Ｔ．ら、「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（酵素免疫アッセイ法）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社刊、ＮＹ（１９８５年）
【０００４】
被検体の検出アッセイには多くの変法があるが、重要なステップは、物理的な分離か識別かのいずれかと、検出とである。物理的な分離を要するアッセイは「不均一アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙｓ）」という。これに対し、均一アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙｓ）は、結合してない種からの結合している種の除去が不必要なように設計される。均一アッセイは、分離のステップを欠いていて、自動化がより簡単なので、大量の患者のスクリーニングを要する用途では不均一アッセイよりも望ましい。
【０００５】
１０−９Ｍ未満の濃度レベルで存在する被検体は、競合法か直接法かのいずれかを用いてアッセイされる（ａｓｓａｙｅｄ）のが一般的である。競合法アッセイでは、関心のある抗原が判断される量の抗体に対して標識抗原と競合する。直接法アッセイは、典型的には、抗原の異なる抗原部位に結合する２種類の抗体を伴うサンドイッチアッセイである。ある抗体が、固相材料に結合して、前記抗原を回収するために用いられる。別の抗体が標識されて、結合した前記抗原からの定量的な情報を得るために用いられる（以下の非特許文献５−７）。
【非特許文献５】
Ｃｏｎｅ、Ｅ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓ．Ｓｃｉ．、３５巻、７８６−７８１頁、（１９９０年）
【非特許文献６】
Ｂａｕｇｈ、Ｌ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓ．Ｓｃｉ．、３６巻、７９−８５頁、（１９９１年）
【非特許文献７】
Ｓｔａｎｄｅｆｅｒ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７巻、７３３−７３８頁、（１９９１年）
【０００６】
前記関心のある被検体と、その結合パートナーとの間の結合の検出を促進するために、１または２以上の反応被検体が、（例えば、放射性同位元素か、酵素か、蛍光部分（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）か、化学発光部分（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）か、ビーズ等のような巨視的な標識かで）標識されるのが典型的である（以下の非特許文献８、９を参照せよ。）。放射性同位元素は長い間免疫アッセイ法に利用されてきた。例えばＯ’Ｌｅａｒｙ、Ｔ．Ｄ．らは、ジゴキシンの血清濃度のラジオイムノアッセイを説明している（非特許文献１０）。かかる危険物質を取り扱う難しさと、放射活性の崩壊の問題とが、これ以外の標識を用いる免疫アッセイ法の開発につながった。
【非特許文献８】
Ｃｈａｒｄ、Ｔ．ら、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の実験技術と生化学）」（Ｗｏｒｋ、Ｔ．Ｓ．編）、Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ社刊、ＮＹ、（１９７８年）
【非特許文献９】
Ｋｅｍｅｎｙ、Ｄ．Ｍ．ら編、「ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（ＥＬＩＳＡその他の固相免疫アッセイ法）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊、ＮＹ、（１９８８年）
【非特許文献１０】
Ｏ’Ｌｅａｒｙ、Ｔ．Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２５巻、３３２−３３４頁、（１９７９年）
【０００７】
蛍光部分は免疫アッセイ形式での標識として頻繁に利用される（以下の非特許文献１１を参照せよ。）。例えば、コカイン用の蛍光偏光免疫アッセイ法形式が説明されている（ＴＤｘ（登録商標）Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）。前記ＴＤｘ（登録商標）形式は、アセトアミノフェン（非特許文献１２−１４）およびジゴキシン（非特許文献１４）の血清レベルをアッセイする（ａｓｓａｙ）ためにも利用されている。Ｗｏｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｙ．らは、自動化（ＯＰＵＳ）分析器を利用して、モノクローナル抗体および蛍光を用いるアッセイ法のプロトコールでジゴキシン濃度を測定することを説明した（非特許文献１５）。Ｌｅｅ、Ｄ．Ｈ．らは、ジゴキシンレベルのアッセイをするための蛍光偏光アッセイおよび化学発光アッセイの形式の利用を開示する（非特許文献１６）。
【非特許文献１１】
Ｉｃｈｉｎｏｓｅ、Ｎ．ら、「Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生物医学的化学における蛍光分析）」、１０巻、（１１０頁）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（化学分析）、（Ｗｉｎｅｆｏｒｄｎｅｒ、Ｊ．Ｄ．ら編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊、ＮＹ、（１９９１年）
【非特許文献１２】
Ｋｏｉｚｕｍｉ、Ｆ．ら、Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．、１５５巻、１５９頁−（１９８８年）
【非特許文献１３】
Ｅｄｉｎｂｏｒｏ、Ｌ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２９巻、２４１頁−（１９９１年）
【非特許文献１４】
Ｏｋｕｒｏｄｕｄｕ、Ａ．Ｏ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３８巻、１０４０頁、（１９９２年）
【非特許文献１５】
Ｗｏｎｇ、Ｓ．Ｈ．Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３８巻、９９６頁、（１９９２年）
【非特許文献１６】
Ｌｅｅ、Ｄ．Ｈ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３６巻、１１２１頁、（１９９０年）
【０００８】
電気泳動法は、標的被検体の検出を促進するのに用いられてきた。かかる方法は、溶液中の分子が固有の電荷を有するという事実を利用する。したがって、電場の存在下では、各分子種は、該分子種の質量対電荷の比率に応じた特徴的な「電気泳動的な」移動度で移動する。存在するさまざまな種の間でこの比率が異なるときには、これらの種は互いに分離する。かかる電場の影響下では、前記変異種の全てが該変異種の電荷と反対の指定された電荷に向かって移動し、低い電気泳動の移動度を有するものは、（比較的）高い電気泳動の移動度を有するものより遅く、かつ、分離して、移動する。
【０００９】
電気泳動法は混合物の分離および分析に利用されてきた。電気泳動法は、移動度の差に基づく電場中の分子の移動および分離を伴う。自由ゾーン電気泳動法、ゲル電気泳動法、等電点電気泳動法および等速電気泳動法を含む、さまざまな形式の電気泳動法が知られている。免疫アッセイ法の１つのアプローチは、遊離標識と結合標識との分離に毛管電気泳動（ＣＥ）法を利用する。一般にＣＥ法は、サンプルを毛管すなわち約２μｍから約２０００μｍ（好ましくは約５０μｍ未満、最も好ましくは約２５μｍ以下）の内径を有する管に導入すること、および、該管に電場を適用することを伴う（非特許文献１７、１８）。前記サンプルの成分のそれぞれが固有の電気泳動の移動度を有するため、移動度の大きい成分は、移動度の遅い成分より速く前記毛管内を移動する。したがって、前記サンプルの成分は、前記毛管内の移動中に、前記管内で別々のゾーンに分離される（非特許文献１９および２０、Ｆ−Ｔ．Ａ．、特許文献１、Ｃｈｅｎ、Ｆ−Ｔ．Ａ．、特許文献２、Ｈｓｉｅｈ、Ｙ−Ｚ．、特許文献３）。前記方法は、便利なオンラインでの注入と検出と実時間分析とを提供するため、自動化に非常に適する。毛管電気泳動法は、抗体抗原複合体を、遊離型の前記抗原または前記抗体のいずれかから分離するのに用いられる場合がある。結合型または遊離型のいずれかの種が、分析および定量される場合がある。Ｃｈｅｎに付与された特許文献４の特許明細書は、免疫化学的結合と毛管電気泳動法の分離およびレーザ励起蛍光との組み合わせに基づく、尿中の複数の薬物被検体の同時定量法を開示する。
【非特許文献１７】
Ｃｈｅｎ、Ｆ−Ｔ．Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５１６巻、６９−７８頁、（１９９１年）
【非特許文献１８】
Ｃｈｅｎ、Ｆ−Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１５巻、１１４３−１１６１頁、（１９９２年）
【非特許文献１９】
Ｈｅｅｇａｒｄ、Ｎ．Ｈ．Ｈ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６４巻、２４７９−２４８２頁、（１９９２年）
【非特許文献２０】
Ｇｏｒｄｏｎ、Ｍ．Ｊ．、ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３巻、６９−７２頁、（１９９１年）
【特許文献１】
米国特許第５，１２０，４１３号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，１４５，５６７号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，８６３，４０１号明細書
【特許文献４】
米国特許第５，５５６，９５９号明細書
【００１０】
サンドイッチ−特異的結合アッセイ法は競合アッセイ法よりもはるかに高い感度を提供することができるが、標識レセプターおよび抗体の不均一性が毛管電気泳動法の実行を困難にする。これは、非結合型及び結合型のレセプターが不均一に移動するために、電気分離分析において、鮮明で輪郭がはっきりした分布というよりも、ぼんやりして輪郭がはっきりしない分布になることからくる結果である。したがって、従来の電気分離方法は特異的結合アッセイの用途では顕著な利点をもたらすことができない。
【００１１】
さまざまなアプローチが生体高分子の不均一性を克服するために開示されてきた。１つのアプローチでは、標識抗体の電気泳動移動度が同一の標識分子に荷電性の官能基を付加することによって修飾される。別のアプローチでは、ある抗体が標識され、別の抗体は、その抗体に付加された、電荷を改変させる部分によって強く荷電している。
【００１２】
Ｃｈｅｎに付与された以下の特許文献５の特許明細書は、オリゴヌクレオチドのように定義の明確な荷電性有機分子を用いた化学的修飾で前記抗原または抗体の電気泳動移動度を改変することによって、ＣＥ法で抗原抗体複合体からの抗原または抗体の分離を実現する方法を開示する。
【特許文献５】
米国特許第５，５７１，６８０号明細書
【００１３】
Ｕｌｌｍａｎらに付与された特許文献６の特許明細書は、ＣＥ法で分離されるべきアッセイ反応混合液中の抗体の不均一性をマスクする方法を開示する。前記方法は、不溶性粒子に結合した被検体特異的な標識抗体を含む、標識試薬粒子を用意すること、および、関心のある被検体を含むサンプルを、粒子に結合した前記抗体とともにインキュベーションして（ｉｎｃｕｂａｔｅ）、前記被検体と、粒子に結合した前記標識抗体との間で複合体を形成させることを伴う。反応混合液はＣＥ法によって分離され、標識された前記複合体が前記被検体の濃度を決定するために検出される。しかし、かかる標識試薬粒子の調製においては、前記不溶性の粒子に結合する抗体の量を制御することは不可能であることが周知である。その結果、粒子が違うと、他の粒子に比較して、含まれる固定化抗体の量が異なるので、異なる量の被検体に結合することになる。よって、前記試薬粒子と、前記サンプル中の被検体との間で形成されたさまざまな標識複合体が不均一になるのは当然で、該標識複合体から検出される信号はぼんやりしたものとなるであろう。したがって、前記被検体濃度に正確に関係づけること、および、前記遊離の標識から前記複合体を形成した標識をきれいに分離することはより困難であろう。
【特許文献６】
米国特許第６，１０３，５３７号明細書
【００１４】
アビジンでコーティングされたラテックス粒子（ラテックス−アビジン）を含む試薬粒子は、ベックマン・コールターのＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ（登録商標）、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＬＸ（登録商標）およびＩｍｍａｇｅ（登録商標）システム用のラテックス−アビジン−二座配位子試薬の製造における鍵となる中間体である（特許文献７−９）。しかし、信頼できる直接的な方法が利用できないため、前記ラテックス−アビジン中間体の製造途中での試験は存在しない。さらに、現在利用可能な方法は、前記ラテックス粒子にコーティングされたアビジンの濃度を評価するのではなく、溶液中の遊離アビジンを分析するためにのみ適用可能である。アビジンの前記ラテックス粒子への装荷性能（ｌｏａｄｉｎｇ）と、古いロットとの違い（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）とがわからないとき、一般的なやり方は、前記ラテックス−アビジン中間体を前記二座配位子試薬と結合させて前記ラテックス−アビジン−二座配位子試薬を作成することによって、次のステップすなわち最後のステップに単に進むことである。前記二座配位子を結合するステップは単純で信頼性のあるステップであるため、前記ラテックス−アビジン−二座配位子試薬製造の失敗は前記ラテックス−アビジン材料が原因とされる。失敗が起こると、前記二座配位子試薬は無駄になり、前記ラテックス−アビジン材料は廃棄しなければならず、大量の洗浄バッファーが無駄になるうえに、最も重要なことには、時間が無駄になる。製造途中でラテックス−アビジン中間体を定量するありふれた方法は、少量の前記ラテックス−アビジン材料を少量の前記二座配位子材料に結合させ、得られた標識結合試薬が使い物になるかどうかについてＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ（登録商標）で免疫反応性の評価をすることである。しかし、この方法は、労働集約的で、時間がかかり、結果を得るのに３乃至１０日を要する。したがって、ラテックス−アビジン中間体を製造途中で試験する、単純で迅速で信頼できる方法の必要性はいまなお存在する。
【特許文献７】
米国特許第５，７４７，３５２号明細書
【特許文献８】
米国特許第５，４２２，２８１号明細書
【特許文献９】
米国特許第５，１９６，３５１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
サンプル中の被検体を正確に検出し定量することの重要性を考えると、粒子増感アッセイと毛管電気泳動法と蛍光検出技術との利点を組み合わせてテストサンプル中の標的被検体を迅速に検出する方法を提供することは望ましい。特に、粒子増感アッセイの手順と毛管電気泳動検出技術とを用いて、関心のある被検体についてサンプルをより正確に分析する方法を提供することが望ましい。
【００１６】
発明の概要
本発明は、サンプル中の関心のある被検体の濃度を決定するために、レーザ励起蛍光（ＬＩＦ）検出および毛管電気泳動法と協動する粒子増感アッセイ形式を利用する、非常に敏感で迅速な均一アッセイを提供する。かかる測定は、蛍光信号、すなわち、かかる信号を発生させることができる反応混合液中の分子種のレーザ励起蛍光で生成される電気泳動結果図（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ）を計測することにより実施される。有利なことに、本発明の方法は、分離後に測定されなければならない信号の数を減らし、標的被検体濃度の検出および／または定量の精度を向上させることによって、単純になった電気泳動結果図を作成する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって本発明の１つの面は、サンプル中の被検体濃度測定用競合アッセイであって、
（ａ）被検体特異的結合パートナーを含む感作粒子（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を用意するステップと、（ｂ）蛍光部分と結合する前記被検体を含む遊離の蛍光色素標識被検体を用意するステップと、（ｃ）サンプルの前記被検体に結合する前記固定化された結合パートナーを含む第１の複合体、および／または、前記蛍光色素標識被検体に結合する前記固定化された結合パートナーを含む第２の複合体の形成を可能にする条件下で、既知量の前記感作粒子および既知量の蛍光色素標識被検体の存在下で前記サンプルをインキュベーションする（ｉｎｃｕｂａｔｅ）ステップと、（ｄ）インキュベーションされた前記ステップ（ｃ）に記載のサンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、（ｅ）前記遊離の蛍光色素標識被検体のレーザ励起蛍光を検出することにより被検体濃度を測定するステップとを含み、前記被検体特異的結合パートナーは前記粒子に固定化され、前記第２の複合体の蛍光色素部分(ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｍｏｉｅｔｙ)の蛍光は前記第２の複合体の形成とともに消光し、前記レーザ励起蛍光は前記サンプル中の被検体濃度に正比例する、サンプル中の被検体濃度測定用競合アッセイを提供する。
【００１８】
本発明の別の面は、サンプル中の被検体濃度測定用の直接サンドイッチアッセイであって、（ａ）第１の被検体特異的結合パートナーを含む感作粒子を用意するステップと、（ｂ）蛍光部分に結合する第２の被検体特異的結合パートナーを含む遊離の蛍光色素標識結合パートナーを用意するステップと、（ｃ）固定化された第１の結合パートナーおよび前記標識結合パートナーに結合する、前記被検体を含むサンドイッチ複合体の形成を可能にする条件下で、既知量の前記感作粒子および既知量の前記蛍光色素標識結合パートナーと、前記サンプルとをインキュベーションするステップと、（ｄ）インキュベーションされた前記ステップ（ｃ）に記載のサンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、（ｅ）前記遊離の蛍光色素標識結合パートナーのレーザ励起蛍光を検出することによって前記被検体の濃度を測定するステップとを含み、第１の被検体特異的結合パートナーは前記感作粒子に固定化され、前記サンドイッチ複合体の蛍光色素部分の蛍光は前記複合体の形成とともに消光し、前記レーザ励起蛍光は前記サンプル中の被検体濃度に反比例する、サンプル中の被検体濃度測定用の直接サンドイッチアッセイを提供する。
【００１９】
粒子増感アッセイは、関心のある被検体に特異的に結合する結合パートナーでコーティングされた不溶性粒子を含む、感作粒子の使用を伴うことが一般的である。しかし、かかる感作粒子を感作する工程の途中で、前記粒子に結合する前記結合パートナーの量を制御することは困難である。そこで、前記粒子に固定化される分子の濃度を知ることはしばしば望ましいことではあるが、この濃度は未知であることがよくある。したがって、本発明の別の面は、不溶性粒子に固定化される結合パートナーの濃度を測定するために感作粒子をアッセイする方法であって、（ａ）第１の結合パートナーを有する前記感作粒子の溶液をインキュベーションするステップと、（ｂ）インキュベーションされた前記ステップ（ａ）に記載のサンプルの一部を毛管電気泳動に供するステップと、（ｃ）遊離の蛍光色素標識された第２の結合パートナーのレーザ励起蛍光を検出することによって、前記粒子に固定化された第１の結合パートナーの量を測定するステップとを含み、第１の結合パートナーは前記感作粒子に固定化されており、既知量の遊離の蛍光色素標識された第２の結合パートナーが蛍光部分に結合し、前記インキュベーションは、前記固定化された第１の結合パートナーと、前記標識された第２の結合パートナーとの間での複合体の形成を可能にする条件下で行われ、前記複合体の蛍光色素部分は該複合体の形成とともに消光し、前記レーザ励起蛍光は前記粒子に固定化された第１の結合パートナーの量に反比例する、感作粒子のアッセイをする方法に関する。
【００２０】
本発明の方法はサンプル中の複数の被検体を同時にアッセイするためにも用いられることがある。
【００２１】
本発明の方法に従っていったん蛍光の消光が達成されると、前記毛管電気泳動結果図は単純になり、前記感作粒子とともに形成された複合体を検出し分離する必要性がなくなる。これは前記遊離（複合体非形成）の蛍光色素標識の容易な定量を可能にする。
【００２２】
本発明のその他の面、利点および新規な特徴は、部分的には以下の説明に列挙され、部分的には以下の明細書の検討により当業者に明らかになるか、本発明の実施によって理解される場合がある。前記発明は、添付する特許請求の範囲にその完全な範囲が定義され、以下の好ましい実施態様に説明される。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、毛管電気泳動およびレーザ励起蛍光検出とともに実行することができる粒子増感均一アッセイ形式を提供することによって、サンプル中の関心のある被検体定量用の改良アッセイを提供する。本発明の改良アッセイは、前記アッセイ反応混合液のレーザ励起蛍光（ＬＩＦ）で分離および計測をされなければならない信号の数を減らすことによって、上記の従来のアッセイの欠点を克服する。結果として、本発明の方法は、標的被検体の検出および／または定量の精度を上げる。したがって本発明の方法は、ＣＥ−ＬＩＦの間に得られた電気泳動結果図を単純にする。本発明の方法に従って、前記複合体を形成した種の前記蛍光色素部分の信号を消光することによって、前記複合体非形成の標識種から前記複合体を形成する標識種をＣＥの際に分離する必要性をなくすことができる。
【００２４】
簡潔には、本発明の１の面はサンプル中の関心のある被検体の濃度測定用の改良型競合アッセイを提供する。かかる競合アッセイの１の好ましい実施態様は、一般に以下の（１）の数式に示されるように記載できる。
【００２５】
数式（１）
ＬＸ−（ＢＰ）ｘ  ＋  被検体＊  ＋  被検体
⇔
ＬＸ−（ＢＰ）ｘ−（被検体＊）ｙ  ＋  ＬＸ−ＢＰ−（被検体）ｚ  ＋  被検体＊      （１）
【００２６】
前記数式において、「ＬＸ−（ＢＰ）ｘ」は前記被検体と特異的に結合する結合パートナーＢＰでコーティングされた不溶性粒子ＬＸを含む感作粒子を表し、「ｘ」は前記不溶性粒子に固定化された結合パートナーの数を表し、「被検体＊」は蛍光部分で標識された被検体を表し、「ｙ」は前記アッセイの間に前記感作粒子（ＬＸ−ＢＰ）に結合することになる蛍光色素で標識された被検体分子の数を表し、「ｚ」は前記アッセイの間に前記感作粒子（ＬＸ−ＢＰ）に結合することになるサンプルの被検体分子の数を表す。（１）の数式で表されたアッセイでは、標識被検体および感作粒子の数は固定されている。
【００２７】
より具体的には、前記（１）の数式で表される本発明の競合アッセイの１の実施態様は、反応混合液を形成するために、関心のある被検体を含むかもしれないサンプルを、蛍光部分と結合する該被検体を含む既知量の遊離の蛍光色素標識被検体（被検体＊）と、不溶性粒子（ＬＸ）に固定化された複数の被検体特異的結合パートナー（ＢＰ）を含む既知量の感作粒子（ＬＸ−ＢＰ）と混合することを含む。前記反応混合液は、前記蛍光色素標識被検体に結合する感作粒子を含む第１の複合体（ＬＸ−（ＢＰ）ｘ−（被検体＊）ｙ）および／または前記サンプルの被検体に結合する感作粒子を含む第２の複合体（ＬＸ−ＢＰ−（被検体）ｚ）の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。かかる反応混合液の調製およびインキュベーションの方法は当業者に周知であり、より詳細に説明する必要はない。計測可能な反応が進行したときは、インキュベーションされた前記反応混合液の一部が毛管電気泳動に供される。以下に詳しく説明されるとおり、前記蛍光部分の蛍光は第１の複合体の形成とともに消光する。よって前記被検体の濃度は、前記反応混合液中の残りの遊離蛍光色素標識被検体（被検体＊）のレーザ励起蛍光を検出することにより測定される。
【００２８】
ここで用いられる「複合体」という用語は、被検体が特異的結合パートナーに結合するとともに形成される複合体を指す。
【００２９】
ここで用いられる「結合ペア要素」または「結合要素」という用語は、結合ペア、すなわち、第１の分子が化学的または物理的な手段によって第２の分子に特異的に結合した、２つの異なる分子を指す。抗原および抗体の結合ペア要素に加えて、他の結合ペアは、ビオチンおよびアビジンと、糖およびレクチンと、相補的なヌクレオチド配列と、相補的なペプチド配列と、ペプチドおよび特異的タンパク質結合剤（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｅｒｓ）と、補酵素および酵素等を例示として含むが、これらに限定されない。
【００３０】
ここで用いられる「複合体を形成する（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）蛍光色素」という用語は、複合体の一部となる化合物（例えば、被検体または結合パートナー）に結合し、該被検体または該結合パートナーが不溶性粒子に固定化されている、蛍光部分を指す。
【００３１】
ここで用いられる「遊離の蛍光色素」という用語は、複合体の一部ではない化合物（例えば、被検体または結合パートナー）である蛍光部分を指す。
【００３２】
ここで用いられる「感作粒子」という用語は、被検体特異的結合パートナーか関心のある被検体かを固定化した不溶性粒子であって、該結合パートナーまたは該被検体が共有（化学的）結合または非共有結合（例えば物理的吸着）により結合した粒子を指す。前記不溶性粒子は、毛管電気泳動に要求されるように溶液中に懸濁できることを条件として、結合パートナーまたは被検体を固定化することができるいかなる天然または人工合成の材料であってもかまわない。不溶性粒子の例は、ポリスチレン（「ラテックス」ともいう）、アクリロニトリル、ポリブタジエンのような不飽和オレフィン系単量体の重合体および共重合体と、これらの誘導体および共重合体（Ｂａｎｇｓ、Ｌ．Ｂ．、「Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（均質なラテックス粒子）」（１９８４年）および米国特許第４，３０５，９２５号明細書を参照せよ）と、木炭（ｃｈａｒｃｏａｌ）と、金コロイド粒子と、ガラスと、アクリルアミドと、メタクリル酸と、ナイロンと、金属と、金属酸化物およびその誘導体と、デキストランと、セルロースと、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌のような天然の粒子材料とを含むが、これらに限定されない。別の実施態様では、前記不溶性粒子は、以下に詳しく説明する蛍光消光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をプレコーティングすることを含む。
【００３３】
ここで用いられる「結合パートナー」という用語は、関心のある被検体のような特定の分子または物質との特異的な認識および結合を行うが、他の物質との交差反応性は無視できる程度である、分子または物質を指す。被検体とその特異的結合パートナーとの間の結合は、免疫反応、錯化およびアフィニティ結合のような化学的または物理的手段による場合がある。典型的な結合パートナーは、抗原と、抗原断片と、レセプターと、核酸と、ポリクローナルおよびモノクローナルの抗体およびこれらの断片、誘導体および複合体と、シクロデキストランと、クラウンエーテルと、レクチンと、（糖タンパク質に結合する）プロテインＡおよびプロテインＧのような結合タンパク質と、細菌と、酵素と、アビジンと、ストレプトアビジンと、（例えば、ビタミンＢ１２に結合する）内因子（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）と、葉酸結合タンパク質と、引用によりここに取り込まれ、同時継続し、承継出願人が共通する「安定な粒子−バンコマイシンコンジュゲートと、新規な速度促進剤と、新規な投与量応答改変剤とを用いるバンコマイシンの均一アッセイ」という名称の米国特許出願第０９／８８８，００５号明細書に説明されるジアセチル−Ｌ−リジン−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンのようなポリペプチドとを含むが、これらに限定されない。かかる特定の被検体特異的結合パートナーは、商業的な供給元から入手できる場合があり、あるいは、当業者に周知な標準的な手順に従って調製される場合もある。
【００３４】
以下に詳しく説明するとおり、１の実施態様では、複合体を形成する蛍光色素の蛍光は、十分な量の蛍光色素部分が蛍光色素部分どうしの間でエネルギー移動（ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が発生するほど互いに近接しているとき、自家消光（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ）を起こす。これは、十分な量の標識被検体が、感作粒子に結合して、数式（１）に示される第１の複合体（ＬＸ−（ＢＸ）ｘ−（被検体＊）ｙ）を形成するときに発生する状況である。代替的に、蛍光消光は、前記不溶性粒子が蛍光消光剤でプレコーティングされることを含む場合に、複合体の形成とともに発生することがある。前記複合体を形成する蛍光色素の消光の結果、第１の複合体から予想される信号は電気泳動結果図に現れない。よって、ＬＩＦ検出で得られた電気泳動結果図は、前記遊離蛍光色素標識被検体（被検体＊）から発生する蛍光信号だけを実質的に含む。その結果、本発明の方法に従って得られた電気泳動結果図は、従来のＣＥ−ＬＩＦアッセイから得られる結果図に比べると、単純になり解釈が容易である。
【００３５】
ＬＩＦ検出が完了するとき、得られたデータは当業者に周知の方法に従って用意される標準曲線と対比されて、前記テストサンプル中の前記被検体のもとの濃度が決定される。数式１に表されるアッセイでは、前記遊離蛍光色素標識被検体によって発生するレーザ励起蛍光は、前記サンプル中に存在する被検体濃度に正比例する。
【００３６】
本発明の方法は、従来の方法よりも時間の節約になるという利点を提供する。第１の複合体（ＬＸ−（ＢＸ）ｘ−（被検体＊）ｙ）により発生する蛍光信号が消光され、電気泳動結果図から消去されるため、本発明の方法は、複合体を形成する標識由来のぼんやりした信号からの遊離蛍光色素標識被検体の信号の完全な分離を達成するために、従来のアッセイでは必要とされた、ＣＥのパラメーターを時間をかけて最適化することを回避する。その結果、本発明の方法は、一部の信号がぼんやりして他の信号と重なるような複数の信号の完全な分離が必要な従来の方法と比較して、より正確な被検体濃度の測定と、より短時間の測定とを達成する。
【００３７】
上記のとおり、本発明の蛍光消光は、以下に説明される条件、すなわち、不溶性粒子を蛍光消光剤でプレコーティングすること、および／または、十分な量の蛍光色素標識種と不溶性粒子との複合体の形成とともに蛍光色素部分が自家消光することの少なくとも１つのために起こる。
【００３８】
１．プレコーティングされた粒子を用いる蛍光消光
本発明の１の実施態様では、前記不溶性粒子は、該粒子に結合要素を固定化するに先立って、蛍光消光剤でプレコーティングされる。１の実施態様では、前記蛍光消光剤は、蛍光受容体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）である。蛍光受容体は、アッセイで用いられる特定の蛍光標識の発光波長帯と重複する吸収波長帯を有するいずれかの化合物または種である。前記受容体はフルオレセイン誘導体およびローダミン誘導体を含むがこれらに限定されない、化合物のグループから選択されることがある。蛍光消光剤の他の例は、ヨウ化物のような重い原子と、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋のような金属イオンとを含むがこれらに限定されない。
【００３９】
その後、前記プレコーティングされた粒子は適当な量の結合要素とともに装荷（ｌｏａｄ）される。蛍光消光剤で不溶性粒子をプレコーティングして、その後、プレコーティングされた前記粒子に前記結合要素を装荷する手順は当業者に公知である。
【００４０】
固定化された第１の結合要素が、蛍光標識された第２の結合要素と複合体を形成するとき、蛍光標識および蛍光消光剤の両方が同一の粒子に配置されるため、両者は接近した状態に置かれる。前記蛍光標識が照射されるとき、エネルギーが供与体、すなわち、前記蛍光標識の電子励起状態から前記蛍光消光剤へと移動することがある。前記エネルギーの移動がうまくいくとき、蛍光強度は非常に減少するか、完全に消光するかのいずれかになる。前記移動の効率は、（１）供与体の種と消光剤の種との距離に依存するだけでなく、（２）前記供与体の蛍光量子収率と、（３）前記消光剤の吸光係数と、（４）上記の供与体の発光波長および消光剤の吸光波長のスペクトルの重複部分の積分と、（５）溶媒の屈折率とにも依存する。したがって感作粒子は、前記蛍光供与体および前記消光剤の両方が局在しており、その結果として、蛍光消光が起こるために必要な両者の近接状態のために、蛍光消光が可能になる。
【００４１】
蛍光供与体−受容体システムの周知例は、フルオレセインが供与体でローダミンが消光剤である、フルオレセイン−ローダミンシステムである。このシステムでは、ローダミンはフルオレセインの発光波長帯（約５２０ｎｍ）と重複する吸光波長帯（約５５０ｎｍ）を有する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７４巻、免疫化学的技術、パートＣ、セクションＩＡ、「蛍光免疫アッセイ法」、ＬａｎｇｏｎｅおよびＶａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ編、１９８１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社刊、「蛍光分光学  生物学および医学のための序説（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｐｅｓｃｅ、ＲｏｓｅｎおよびＰａｓｂｙ編、１９７１年、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．社刊、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ、Ｒ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７巻、４０１−４１４頁、（１９８２年））。
【００４２】
蛍光供与体および消光剤の他の例は、フルオレセイン−４’、５’−ジメトキシ−フルオレセイン−−−フルオレセインの対（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７４巻、免疫化学的技術、パートＣ、セクションＩＡ）と、土類金属錯体−−−リアクティブブルー４の対（Ｙｏｕｎ、Ｈ．Ｊ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３２巻、２４−３０頁、（１９９５年））と、フルオレセイン−Ｂ−−フィコエリスリンペアの対と、Ｂ−フィコエリスリン−−−テキサスレッドの対（Ｇｏｓｌｉｎｇ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、３６巻、（８号）、１４０８−１４２７頁、（１９９０年））とである。
【００４３】
２．不溶性粒子をプレコーティングすること（自家消光）を用いない蛍光
蛍光消光は、第１の結合要素の粒子への装荷が高度であって、第１の結合要素の局部濃度が高くなり、固定化された第１の結合要素と標識された第２の結合要素との間の錯化とともに各粒子での標識種の局部濃度が高くなることを条件として、前記不溶性粒子を蛍光消光剤でプレコーティングしなくても起こる。
【００４４】
固定化された第１の結合要素と、蛍光標識された第２の結合要素との間で複合体を形成するための結合が起こるとき、前記粒子が第１の結合要素で十分に装荷されていることを条件として、かかる複合体の形成とともに双極子−双極子結合エネルギー移動により蛍光消光が起こる。より具体的には、前記粒子に高度に装荷することは、固定化された第１の結合要素が該粒子表面で互いに近接することを意味する。その結果、蛍光標識された第２の結合要素が、固定化された第１の結合要素と複合体を形成するとき、蛍光色素部分も同様に互いに近接する。理論に拘束されることを望むわけではないが、蛍光色素で標識された種の十分な量が、固定化された第１の結合要素と複合体を形成する場合に、前記蛍光色素部分の蛍光は消光されて、電気泳動結果図でピークが現れない。すなわち、標識された第２の結合要素の十分な数が感作粒子と結合している場合には、ＬＩＦの際に励起された前記蛍光部分のエネルギーは、検出器に移動して検出可能な信号を発生させるのではなく、前記固定化された標識の間で移動する（すなわち消光する）。したがって、反応混合液中に残存する、複合体非形成（遊離）の蛍光色素標識種だけがＬＩＦによって検出される。その結果、消光効率は非常に増大する。
【００４５】
したがって前記粒子に第１の結合要素を高度に装荷することは、（１）局部的な高濃度と、（２）ある標識と、該標識が結合する結合要素との間および隣接する結合要素どうしの間での消光を起こす相互作用と、（３）前記標識と前記粒子の表面との間での消光を起こす相互作用との結果として、複合体を形成した蛍光標識の間での効率的な自家消光相互作用を可能にする。実際に、前記粒子のサイズが前記蛍光色素の波長（例えば５００ｎｍ）の程度にある場合には、半透明な粒子は、前記蛍光標識が発光することを阻止し、同様に、発光された光が前記検出器に到達することを阻止して、蛍光信号の検出が起こらないようにする。
【００４６】
したがって本発明の方法が、蛍光消光剤でプレコーティングされた粒子を用いるか、結合要素を高度に装荷した粒子を用いるかにかかわらず、本発明の鍵となる特徴は、ＬＩＦで検出されるアッセイ反応混合液中に残存する蛍光色素標識種の数がＣＥの後で減少することである。さらに、複合体を形成する標識種を、複合体非形成の標識種から分離する必要性が除かれるため、複合体非形成の標識された第２の結合ペア要素の検出が単純になる。
【００４７】
本発明の競合的なアッセイの代替的な実施態様は、数式２に示すとおり一般的に記載できる。
【００４８】
数式（２）
ＬＸ−（被検体）ｘ  ＋  被検体  ＋  ＢＰ＊
⇔
ＬＸ−（被検体）ｘ−（ＢＰ＊）ｙ  ＋  被検体−ＢＰ＊  ＋  ＢＰ＊      （２）
【００４９】
上記の数式において、「ＬＸ−（被検体）ｘ」は「ｘ」個の被検体分子を固定化した感作粒子を表し、「ＢＰ＊」は蛍光部分で標識された被検体特異的結合パートナーを表し、「ＬＸ−（被検体）ｘ−（ＢＰ＊）ｙ」は前記固定化された被検体と「ｙ」個の標識結合パートナーとの間で形成される複合体を表し、「被検体−ＢＰ＊」は前記サンプルの被検体と標識結合パートナーとの間での結合とともに形成される複合体を表す。数式（２）で表されるアッセイでは、前記標識結合パートナーおよび前記感作粒子の濃度は一定である。
【００５０】
より具体的には、数式２で表される競合的なアッセイでは、関心のある被検体を含むかも知れないサンプルが、不溶性粒子に固定化された前記被検体を含む感作粒子の一定量と、被検体特異的な蛍光色素標識結合パートナー（ＢＰ＊）の一定量とともに混合される。この実施態様では、粒子に固定化された被検体（ＬＸ−（被検体）ｘ）は、標識された前記結合パートナー（ＢＰ＊）との結合についてサンプルの被検体と競合することができる。反応混合液は、多数の標識された前記結合パートナーと結合する、固定化された前記被検体を含む第１の複合体（ＬＸ−（被検体）ｘ−（ＢＰ＊）ｙ）、および／または、前記蛍光色素標識結合パートナーと結合する、前記サンプルの被検体を含む第２の複合体（被検体−ＢＰ＊）の形成を可能にする条件下で、インキュベーションされる。かかる複合体の形成を可能にするいずれの条件が本発明の方法に用いられてもよく、これらは当業者に周知である。
【００５１】
いったん計測可能な反応が数式（２）に示されるとおり進行してきたとき、インキュベーションされた前記反応混合液の一部が毛管電気泳動に供される。数式（２）で表される前記アッセイの１の実施態様では、第１の複合体は、前記蛍光色素標識が近接するように十分な量の前記標識結合パートナー（ＢＰ＊）を含む。その結果、複合体を形成する前記蛍光色素の蛍光は消光される。数式（２）で表される前記アッセイの別の実施態様では、前記不溶性粒子は蛍光消光剤でプレコーティングされるが、複合体の形成とともに、該消光剤は複合体を形成した前記蛍光色素標識の蛍光を消光する。いずれの場合でも、ＬＩＦ検出で得られる電気泳動結果図は、残存する遊離の蛍光色素標識結合パートナー（ＢＰ＊）と、第２の複合体（被検体−ＢＰ＊）とから発生する蛍光信号だけを実質的に含むであろう。
【００５２】
好ましくは、数式２で表されるアッセイにおいて、サンプル中の被検体濃度は、反応混合液中に存在する第２の複合体（被検体−ＢＰ＊）のレーザ励起蛍光を検出することにより測定されるが、該レーザ励起蛍光は、前記サンプル中の被検体濃度に正比例する。代替的には、被検体濃度は残存する遊離の蛍光色素標識結合パートナー（ＢＰ＊）の蛍光を検出することにより測定できるが、ここでは、前記レーザ励起蛍光は前記サンプル中の被検体濃度に反比例する。
【００５３】
本発明の別の面は、サンプル中の関心のある被検体の濃度を測定するための直接的なアッセイを含む。かかる直接的なアッセイの１の実施態様は、一般的に数式３に示されるように記載できる。
【００５４】
数式（３）
ＬＸ−（ＢＰ１）ｘ  ＋  被検体  ＋  ＢＰ２＊
⇔
ＬＸ−（ＢＰ１）ｘ−（被検体）ｙ−（ＢＰ２＊）ｚ  ＋  ＢＰ２＊  ＋  ＬＸ−（ＢＰ１）ｘ      （３）
【００５５】
上記の数式で、「ＬＸ−（ＢＰ１）ｘ」は、被検体に特異的に結合する「ｘ」個の第１の結合パートナー「ＢＰ１」でコーティングされた不溶性粒子ＬＸを表し、「ＢＰ２＊」は、蛍光部分で標識された第２の被検体特異的結合パートナーを含む遊離の蛍光色素標識結合パートナーを表し、「ＬＸ−（ＢＰ１）ｘ−（被検体）ｙ−（ＢＰ２＊）ｚ」は、前記被検体と第１および第２の結合パートナーとの間の結合で形成されたサンドイッチ複合体を表し、「ｙ」は第１の結合パートナーに結合する被検体の数を表し、「ｚ」は前記被検体に結合する蛍光色素標識結合パートナーの数を表す。数式（３）で表されるアッセイでは、前記標識結合パートナーと感作粒子の濃度は一定である。
【００５６】
数式（３）で表されるアッセイの１の実施態様では、第１の複合体は、蛍光色素標識が近接するように第２の標識結合パートナー（ＢＰ２＊）の十分な量を含む。その結果、複合体を形成した前記蛍光色素標識の蛍光は消光した。数式（３）で表されるアッセイの別の実施態様では、前記不溶性粒子は蛍光消光剤でプレコーティングされ、複合体の形成とともに、該消光剤は複合体を形成した前記蛍光色素標識の蛍光を消光する。いずれの場合でも、数式（３）で表される直接的アッセイにおいて、電気泳動結果図は、唯一の信号、すなわち、サンプル中の被検体濃度に反比例する、前記遊離の標識結合パートナー（ＢＰ２＊）によって発生する信号のみを実質的に含む。
【００５７】
本発明のアッセイを実施するためには、感作粒子を用意する必要がある。１の実施態様では、前記感作粒子は、被検体に特異的結合パートナーか、関心のある被検体かのいずれかを結合する担体粒子を含む。前記結合パートナーまたは前記被検体は、物理的（受動的）吸着、促進された（強制された）吸着および共有結合のような、当業者に周知の標準的な技術に従って、前記粒子に固定化される場合がある。例えば、前記結合パートナーまたは前記被検体は、前記粒子に前記結合パートナーを結合させることができる化学的な官能基で改変することによって、前記粒子の表面に共有結合で結合させられる場合がある。例えば、引用によりここに具体的に取り込まれる米国特許第４，０６４，０８０号、第４，１８１，６３６号、第４，２１０，７２３号、第４，２６４，７６６号、第４，５２１，５２１号および第４，３０５，９２５号の明細書を参照せよ。これらの特許公報に開示された技術は、結合パートナーまたは被検体を前記粒子に結合するために用いられる場合がある。引用によりここに具体的に取り込まれるＳｅａｍａｎ、Ｇ．Ｖ．Ｆ．編、「診断学におけるラテックス関連技術（Ｌａｔｅｘ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」、Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ社刊、ワシントンＤ．Ｃ．２０００５、（１９９０）も参照せよ。望ましい特性および特徴を有する感作粒子は商業的に入手できる場合がある。
【００５８】
別の実施態様では、前記粒子は、その表面に結合パートナーを固定化する前に、まず蛍光消光剤でプレコーティングされる。前記蛍光消光剤が蛍光受容体のときには、該受容体の吸光波長は、前記具体的なアッセイで用いられることになる蛍光標識の発光波長の近傍にある。蛍光受容体は、前記蛍光標識の発光波長帯に重複する吸光波長帯を有する化合物のグループから選択され、フルオレセインおよびローダミンの誘導体を含む。蛍光消光剤の他の例は、ヨウ化物のような重い原子と、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｒ３＋のような金属イオンとを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
前記プレコーティングされた粒子は、関心のある被検体に対する結合パートナーの適当な量を装荷される。前記消光剤をプレコーティングすることおよびその後前記結合パートナーを装荷することの手順は、当業者に周知である。
【００６０】
不溶性粒子に固定化できる結合パートナーの例は、アビジンと、ストレプトアビジンと、レクチン（例えば、糖または糖タンパク質を捕捉するコンカナバリンＡ）と、ポリクローナル抗体と、モノクローナル抗体と、ポリペプチド（例えば、バンコマイシンを捕捉するジエチル−Ｌ−リジン−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン）と、（糖タンパク質を捕捉する）プロテインＡおよびプロテインＧと、（その内腔に低分子を捕捉する）シクロデキストランと、クラウンエーテルと、（ビタミンＢ１２を捕捉する）内因子と、葉酸結合タンパク質とを含む。
【００６１】
上述のとおり、かかる感作粒子の調製において、前記不溶性粒子に固定化される結合パートナーまたは被検体の量を制御することが不可能であることは周知である。その結果、同一ロットから調製された粒子の多くは、前記固定化された化合物の異なる量を含み、粒子増感アッセイにおいて特異的結合パートナーの異なる量と結合する。しかし、前記不溶性粒子に固定化された化合物の濃度を知ることがしばしば望ましい。そこで、本発明の別の面は、不溶性粒子に結合する分子の量を定量する方法を提供する。かかる方法は一般に数式４に示されるように記載できる。
【００６２】
数式（４）
ＬＸ−（化合物）ｘ  ＋  ＢＰ＊
⇔
ＬＸ−（化合物）ｘ−（ＢＰ＊）ｙ  ＋  ＢＰ＊      （４）
【００６３】
上記数式において、「ＬＸ−（化合物）ｘ」は、「ｘ」個の化合物分子を固定化した感作粒子を表し、「ＢＰ＊」は、前記化合物に対する蛍光色素標識結合パートナーであり、「ＬＸ−（化合物）ｘ−（ＢＰ＊）ｙ」は、前記化合物と前記結合パートナーとの間の結合で形成される複合体である。数式４に表される方法では、一定量の前記感作粒子が、反応混合液を形成するために、一定量の前記蛍光色素標識結合パートナーと混合される。前記反応混合液は、前記複合体の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。
【００６４】
数式（４）で表されるアッセイの１の実施態様では、前記複合体は、前記蛍光色素標識が近接するように、標識結合パートナー（ＢＰ＊）の十分な量を含む。その結果、前記複合体を形成した蛍光色素の蛍光は消光される。数式（４）で表されるアッセイの別の実施態様では、前記不溶性粒子は蛍光消光剤でプレコーティングされるが、複合体の形成とともに、該消光剤は前記複合体を形成する蛍光色素標識の蛍光を消光する。複合体ＬＸ−（化合物）ｘ−（ＢＰ＊）ｙの一部である前記標識結合パートナー（ＢＰ＊）の蛍光が消光するとき、電気泳動結果図で検出される実質的に唯一の信号は、遊離の標識結合パートナー（ＢＰ＊）によって発生する信号である。この方法を用いると、固定化された化合物の定量は、一定の標識濃度（ＢＰ＊）または一定の感作粒子（ＬＸ−（化合物）ｘ）の濃度で決定される場合がある。いずれの場合でも、前記標識の蛍光信号は、前記不溶性粒子に結合する化合物の濃度に反比例する。
【００６５】
数式４で表されるアッセイの１つの具体例は、サブミクロン範囲のラテックス粒子に結合するアビジンを含む感作粒子の定量に向けられる。アビジンでコーティングされたラテックス粒子はＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ（登録商標）、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＬＸ（登録商標）およびＩｍｍａｇｅ（登録商標）用の二座配位子コンジュゲートの調製のための鍵となる中間体である（引用により具体的にここに取り込まれる米国特許第５，７４７，３５２号、第５，４２２，２８１号および第５，１９６，３５１号の明細書を参照せよ）。これらのラテックス−アビジン粒子を評価するために用いられる現行の方法は、労働集約的で時間がかかる。従来の方法は、前記ラテックス−アビジン粒子を二座配位子と結合させることにより二座配位子コンジュゲートの少量を調製すること、その後、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ（登録商標）システムで、受容可能な免疫反応性があるかどうか前記コンジュゲートを評価することを含む。反対に、数式４で表される本発明のＣＥ−ＬＩＦ法は、前記ラテックス−アビジン粒子を直接テストするので、従来法よりはるかに単純かつ迅速で、テスト時間を３から１０日短縮する。数式４による方法は、遊離のビオチン−フルオレセインの既知量と前記ラテックス−アビジン粒子をインキュベーションすること、一部を毛管電気泳動すること、反応混合液中の残存する遊離のビオチン−フルオレセインのレーザ励起蛍光を検出することを伴う。電気泳動結果図は、前記遊離の標識を主に含み、解釈が容易であるが、これは、前記ビオチン−フルオレセインと前記ラテックス−アビジンとの複合体の形成とともに蛍光が高度に消光されるためである。各電気泳動結果図は３．５分間未満で得られる。
【００６６】
本発明の方法は、ＣＥとともに粒子増感アッセイ形式を用いてサンプル中の複数の標的被検体を同時に均一に検出するのに適している。本発明の１の実施態様に従うと、数式１で説明された競合的なアッセイと同様のかかる方法は、一般的に数式５に示されるように記載できる。
【００６７】
数式（５）
ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２  ＋  ＡＮ１  ＋  ＡＮ１＊  ＋  ＡＮ２  ＋  ＡＮ２＊＊
⇔
［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２＊＊］
＋  ［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２−ＡＮ２＊＊］
＋  ［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］
＋  ［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］
＋  ［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）］
＋  ［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）］
＋  ［（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２＊＊］
＋  ［（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］
＋  ＡＮ１＊  ＋  ＡＮ２＊＊      （５）
【００６８】
上記の数式で、「ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２」は、第１のサンプル被検体に特異的な第１の結合パートナー（ＢＰ１）と、第２のサンプル被検体に特異的な第２の結合パートナー（ＢＰ２）との両方でコーティングされた不溶性粒子を表し、「ＡＮ１」は第１のサンプル被検体で、「ＡＮ１＊」は蛍光部分で標識された第１のサンプル被検体で、「ＡＮ２」は第２のサンプル被検体で、「ＡＮ２＊＊」は蛍光部分で標識された第２のサンプル被検体である。数式（４）で表されるアッセイでは、前記標識サンプル被検体および前記感作粒子の濃度は一定である。
【００６９】
複数被検体のアッセイは、競合的なアッセイについて上述したやり方と同様のやり方で実施される。したがって、反応混合液は、第１の標識被検体と第２の標識被検体とに結合する感作粒子を含む第１の複合体［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２＊＊］、および／または、第１のサンプル被検体と第２の標識被検体とに結合する感作粒子を含む第２の複合体［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２−ＡＮ２＊＊］、およびまたは、第１の標識被検体と第２のサンプル被検体とに結合する感作粒子を含む第３の複合体［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］、および／または、第１のサンプル被検体と第２のサンプル被検体とに結合する感作粒子を含む第４の複合体［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］、および／または、第１の標識被検体に結合する感作粒子を含む第５の複合体［ＡＮ１＊−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）］、および／または、第１のサンプル被検体に結合する感作粒子を含む第６の複合体［ＡＮ１−（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）］、および／または、第２の標識被検体に結合する感作粒子を含む第７の複合体［（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２＊＊］、および／または、第２のサンプル被検体に結合する感作粒子を含む第８の複合体［（ＢＰ１−ＬＸ−ＢＰ２）−ＡＮ２］の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。前記反応混合液は、ＣＥに供され、ＬＩＦにより分析される。前記反応混合液は複数の産物を含むが、第１および第２の標識被検体のさまざまな複合体の形態の全て（すなわち、第１、第２、第３、第５、および第７の複合体）の蛍光が前記複合体の形成とともに消光するために、電気泳動結果図は、たった２個の信号、すなわち、遊離の第１および第２の標識被検体ＡＮ１＊およびＡＮ２＊＊からの信号しか含まない。かかる消光は、上述のとおり、前記複合体を形成する蛍光色素が近接している場合か、前記粒子が蛍光消光分子でプレコーティングされている場合かのときに起こる。
【００７０】
前記遊離の第１および第２の標識被検体のそれぞれＡＮ１＊およびＡＮ２＊＊をＣＥの際に分離することが可能である場合には、第１および第２の被検体は同一の蛍光部分で標識される場合がある。しかし、前記遊離の第１および第２の標識被検体由来の信号が十分に近接している場合には、それぞれの被検体は異なる蛍光部分で標識されることが好ましい。
【００７１】
本発明の方法は、既知の手順とは根本的に異なる。ＣＥ−ＬＩＦ法を被検体の定量手段として用いる従来のアッセイでは、アッセイ反応混合液中の全ての標識種からの信号は、電気泳動結果図でさまざまな該信号を正確に計測するために、十分に分離されていなければならない。しかし、粒子増感アッセイ形式を用いる従来のアッセイであっても、十分な分離と、被検体濃度の正確な測定とを達成することができない。これは、感作粒子の調製の際に、不溶性粒子に固定化される分子の濃度を制御することが困難であるという事実による。さまざまな濃度の分子でコーティングされた感作粒子を用いて粒子増感アッセイの際に形成された複合体は、ＣＥの際にさまざまな速度で移動するので、分別困難であり、電気泳動結果図において１または２以上の他のピークとしばしば重複するぼんやりしたピークが電気泳動結果図に描かれる。本発明の方法は、複合体を形成する蛍光色素標識部分から生じる前記ぼんやりしたピークを消光させることによりこの問題を回避して、よりきれいで単純な電気泳動結果図を作成するので、結果的に被検体濃度のより正確な測定を提供する。
【００７２】
本発明の方法は、さまざまなサンプル中の関心のある被検体濃度の測定に適する。典型的なサンプルは、全血液、乳汁、血清、血漿、尿、脳脊髄液等のような臨床サンプルと、水と、排泄物と、食物と、タンパク質と、精製された薬物等のような薬物とを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
非常に多様な被検体のうち、どれが本発明の方法によって評価されてもかまわない。ここで用いられる「被検体」は、サンプル中の存在および／または濃度が決定されるべき物質を指す。「被検体」という用語は、特異的結合パートナーが存在するか、特異的結合パートナーが調製できるいずれかの物質であって、アッセイにおいて前記特異的結合パートナーに結合する物質を指す。代表的な被検体は、抗原と、ハプテンと、抗体と、（免疫グロブリン、レセプター、酵素等のような）タンパク質と、ペプチドと、アミノ酸と、ホルモンと、ステロイド類と、糖タンパク質と、糖と、癌細胞マーカーと、組織細胞と、ウイルスと、ビタミンと、薬物と、代謝産物と、核酸と、殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）と、（コカイン、カナビノオイド、あへん剤等のような）乱用物質と、毒物と、薬剤等とを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、タンパク質、薬物その他の薬剤を分析するのに特に適する。
【００７４】
ここで用いられる「抗体」という用語は、外来物質の検出に応答して産生される免疫グロブリンを指し、無傷の分子とともに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような機能的断片を含む。最も好ましくは、用いられる抗体分子は精製されたモノクローナル抗体で、親和常数が１０９以上であることが好ましい。かかる抗体分子のかわりに、ポリクローナル抗体か、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２断片か、単鎖抗体か、可溶化レセプターまたはレセプターリガンドかを用いることがある。
【００７５】
上記の実施態様とともに用いられる蛍光色素標識は蛍光部分である。適当な蛍光色素は、フルオレセイン、イソチオシアナート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識、フルオレスカミン、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．社）、近赤外色素、ランタニド錯体、または、かかる蛍光部分を有する被検体を含むが、これらに限定されない。抗体の標識が望ましい場合には、フルオレセイン標識を用いることが好ましい。かかる標識抗体は、約１０−１０モルの濃度で存在するタンパク質種の直接的免疫アッセイに用いられる場合がある。当業者に知られたいずれかの適当な方法が、本発明の結合パートナーの被検体を直接標識するのに用いられてもかまわない。
【００７６】
いったん前記アッセイの反応が起こると、反応物および生成物が、複合体非形成（遊離）の標識種を分別するのには十分であるが、前記複合体を形成する蛍光色素標識種を分別するために最適化される必要はない条件下で、ＣＥに供される。タンパク質のＣＥ技術は、固体支持体を使用することなく前記遊離の標識種を分離する手段を提供する。これらの分離技術をレーザ励起蛍光検出とともに適用することは、引用によりここに具体的に取り込まれる米国特許第５，５７１，０８０号明細書に説明されるように、１０−９から１０−１０モルの範囲の濃度の種の均一的な免疫化学的測定を可能にする。
【００７７】
一般に、正常のＣＥ法は毛管カラムの内容物にもとづいて２つのカテゴリーに分類できる。「固定ゲル」ＣＥ法では、毛管は適当なゲル、例えば、ポリアクリルアミドゲルで満たされ、サンプル成分の分離は該成分のサイズおよび荷電によって予測される。分析の速さにもかかわらず、固定ゲルＣＥ法は複数の欠点、特に、予測が不可能である欠点と、前記ゲルの材料の寿命が短い欠点とを有する。これらの因子が、多数の分析作業を実施する状況では固定ゲルＣＥ法を受け入れがたいものにする。
【００７８】
ＣＥ法の第２の形態（すなわち開放ＣＥ法）では、毛管は導電性バッファー溶液で満たされる（Ｋｉｍ、Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３９巻、６８９−６９２頁、（１９９３年））。前記バッファーは１５０ｍＭ  ホウ酸、ｐＨ１０．００±０．２５が最も好ましいが、約７０ｍＭと約４００ｍＭとの間の濃度でも実施可能である。前記バッファーのモル濃度が高くなると、前記カラム内の温度は上昇するので、前記成分への温度の影響が問題となる状況では、低濃度のバッファーが用いられるべきである。しかし開示されたプロトコールは、コーティングされたカラムまたはコーティングされないカラムを使うタンパク質の材料の分離に関して用いられるいずれかの分離バッファーを用いて達成できる。
【００７９】
つぎに、前記毛管はマイナスの電荷でイオン化される。かかるイオン化は毛管壁をマイナスに荷電するので、前記バッファーから陽イオンを引きつける。前記溶液の電気的な中性は保たれなければならないため、前記毛管壁に向かう陽イオンのいずれかの流れは、前記バッファー溶液および前記サンプル成分の同様の運動を伴う。この電気浸透流は、中性の種と、荷電の正負にかかわらず電離する種との両方を陰極方向に駆動する固定する速度成分を提供する。「開放ＣＥ法」におけるバッファーは導電性および拡散に対して安定である。したがって、ゲルによる電気泳動で得られる分離と同様の分離が「開放ＣＥ法」においても達成できる。
【００８０】
開放ＣＥ法は、以下のように、例えば臨床サンプルの分析に向いた望ましい性質をたくさん有する。（１）前記分析はゲルを充填したカラムを伴わないため、いずれの特定のゲルを充填したカラムについても存在する、実行可能な分析回数の固有の限界が回避される。（２）毛管カラムが未処理のとき、コーティングされたカラムにつきまとうことがある予測不可能性が回避される。サンプルのサイズが小さい（通常希釈サンプルの５から２００μＬの程度）。（３）サンプル分析時間が早い、すなわち、約２０分間未満である。（４）前記プロトコールは自動化に向いており、効率的かつ効果的なサンプル分析に要する労働熟練度を低下させる。前記毛管カラムは、取り扱いを容易にするために（例えばポリイミド材料を用いて）外側をコーティングする場合がある。
【００８１】
本発明の方法は未処理カラムとコーティングされたカラムとのいずれでも使うことができるが、カラムは未処理が好ましい。未処理の毛管カラムが用いられるとき、分離バッファーは引用によりここに取り込まれる米国特許第５，１２０，４１３号明細書に開示されるとおりであることが好ましい。適当なカラムは、引用によりここに取り込まれるＧｕｔｔｍａｎ、Ａ．の米国特許第５，２１３，６６９号明細書と、Ｂｕｒｏｌｌａ、Ｖ．Ｐ．の米国特許第５，１９８，０９１号明細書と、Ｓｈｉｅｈ、Ｃ．−Ｈ．の米国特許第５，０９８，５３９号明細書とにも開示されている。
【００８２】
前記標識の存在は、自動式または半自動式の手段で決定されることが好ましい。好ましい実施態様では、検出はレーザ励起蛍光（ＬＩＦ）検出器を用いて行われる。代表的な検出器は、前記蛍光色素を励起するのに適した１−３ミリワットのヘリウムネオンレーザ（５４３．５ｎｍ）を含む。適当な２．５ミリワットの５４３．５ｎｍの緑色の光を発光するヘリウム−ネオンレーザは、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、コロラド州、ボールダーから入手可能である。前記レーザの出力は、レーザラインフィルターを用いてフィルター処理され、分離毛管の検出領域に集束されることが好ましい。好ましい実施態様では検出システムは、ＬＩＦ検出器付きのＰ／ＡＣＥ（登録商標）システム用の標準のＳＭＡ−９０５ファイバーコネクタへのレーザヘッドカプラー（カナダ、オンタリオ州のＯＺ  Ｏｐｔｉｃｓから入手可能）を用いて、Ｐ／ＡＣＥ（登録商標）システム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．社）の中に一体化される。蛍光発光は、前記毛管を焦点にあわせた放物面反射器を用いて集光されコリメートされるのが好ましく、散乱光マスクが前記放物面反射器の正面の強いレーザ散乱光の面に配置されることが好ましい。コリメートされた発光はまずノッチフィルター（阻止波長５４３．５ｎｍ）を通過し、つぎに５８０ｎｍを中心とする９ｎｍのバンドパスフィルターを通過する（かかるフィルターはマサチューセッツ州、ＷｅｓｔｆｏｒｄのＢａｒｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社と、コネチカット州、ＳｔｒａｔｆｏｒｄのＯｒｉｅｌ社とから入手可能である）。検出は、ハママツのＲ３７４のようなエンドオン（ｅｎｄ  ｏｎ）タイプの光電増倍管を使って達成されることが好ましい。
【００８３】
本発明とともに使用できる毛管電気泳動装置システムは周知である。特に好ましい装置は、少なくとも２個の異なるサンプルの分注を同時に評価することができるマルチチャンネル装置であり、前記装置は、複数の電気泳動結果図の取得および比較が可能なように、複数の分注を同時に分析する能力を有することがより好ましい。特に好ましい毛管電気泳動システムは、引用によりここに取り込まれる米国特許第５，４１３，６８６号明細書に開示される。
【００８４】
特に好ましい毛管電気泳動システムは、Ｐ／ＡＣＥ（登録商標）高性能毛管電気泳動システム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．社）である（全て引用よりここに取り込まれる、Ｃｈｅｎ、Ｆ．−Ｔ．Ａ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３８巻、１６５１−１９５３頁、（１９９２年）、Ｃｈｅｎ、Ｆ．−Ｔ．Ａ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５５９巻、４４５−４５３頁、（１９９１年）、Ｆｕ、Ｐ．Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７巻、９７０頁、（１９９１年）、Ｃｈｅｎ、Ｆ．−Ｔ．Ａ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７巻、１０６１頁、（１９９）、Ｇｏｒｄｏｎ、Ｍ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６３巻、６９−７２頁、（１９９１年））。かかる装置は、システム・ゴールド（登録商標）ソフトウェア（米国カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社）のようなオンボード搭載（ｏｎ  ｂｏａｒｄ）コンピュータソフトウェアを通じて達成できる点で、最も好ましい。
【００８５】
ＣＥ法の評価は視覚によることが典型的である、すなわち、サンプルの電気泳動結果図がピークの存在を決定するために評価される。ピーク部分の面積はアッセイされた被検体濃度に対応する。典型的には、電気泳動結果図は、蛍光のような検出単位を縦軸に、成分が検出領域までカラムを移動する時間を横軸にプロットすることによって得られる。結果はある単位の数値として得られる場合があり、個々のピークで仕切られた面積から得られることが典型的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
実施例
以下の実施例では、商業的に入手可能なビオチン−フルオレセインが検出標識として用いられたが、現在でも商業的に入手可能である。ラテックス粒子は、カルボン酸修飾タイプで、約６０ｎｍの直径があった。方法は、前記ビオチン−フルオレセイン標識をラテックス−アビジンと混合すること、その後に、励起光４８８ｎｍおよび発光５２０ｎｍのＬＩＦ検出器を装備したベックマンＰ／ＡＣＥ（登録商標）システムで遊離標識の蛍光信号を監視することを伴った。インプロセス（ｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）試験全体は２時間未満で完了できる。それぞれの電気泳動結果図は、３．５分間未満で得られ、主に前記遊離標識からなる。結合した前記ビオチン−フルオレセインの強力な蛍光消光作用のため、ラテックス−アビジン−ビオチンフルオレセインは、高濃度の場合を除いて、ほとんど検出できなかった。この方法を用いると、機能的なアビジンの定量は、一定の標識濃度、または、一定のラテックス−アビジン濃度で決定できた。いずれの場合でも、前記標識の蛍光信号は、アビジンの飽和点以下ではラテックスに固定化されたアビジンの濃度に反比例した。前記アビジン飽和点では、前記ラテックス粒子のビオチン結合能についての機能的なアビジン量は、ビオチン−フルオレセイン標識の既知量から求めることができた。
【００８７】
下記の実施例は、（１）アビジンのカルボン酸修飾ラテックス粒子に対する反応物重量比（以下、「Ａ／Ｃ比」という。）０．３５を用いるロットＭ６０２１００のラテックス−アビジン材料と、（２）ロット３６５ＲおよびＫＰ１という異なる２つのバッチのラテックス粒子および同じバッチのアビジンをＡ／Ｃ比０．１５で用いるラテックス−アビジン材料とから前記機能的なアビジン濃度を定量する、本発明のＣＥ−ＬＩＦ法を例示する。結果に示されるとおり、Ａ／Ｃ比が高いほど、予想通りアビジンの装荷量が多くなる。しかし、第２および第３のロットを調製するために用いられた前記２種類の適格なラテックス標識は、同一のアビジン材料が用いられたときであっても、アビジン装荷量に６０％もの相違が生じた。
【００８８】
試薬およびバッファー
ラテックス−アビジン材料（Ａ／Ｃ比０．３５）と、ロットＭ６０２１００（Ａ／Ｃ比０．３５）と、ロット３６５ＲおよびＫＰ１（Ａ／Ｃ比０．１５）は自社内で調製された。
【００８９】
ビオチン−フルオレセイン、５−（（Ｎ−（５−（Ｎ−（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチル）  チオウレイジル  フルオレセインは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社から購入された。同一のロットの２本の異なるバイアルが購入された。１本のバイアルが自社内で調製された前記ラテックス−アビジン材料を評価するのに用いられた。使用前に、前記ビオチン−フルオレセインは、既知量のストレプトアビジンについてＣＥ−ＬＩＦで標準化されたが、該ストレプトアビジンは、ＤＵ−７０でＨＡＢＡで定量された。もう１本のバイアルは、標準化することなく、残りのラテックス−アビジン材料の試験に用いられた。
【００９０】
ＧＴＳバッファー：ＧＴＳはＣＥのランニングバッファーであり、ｐＨ８．３、１９２ｍＭ  グリシン、２５ｍＭ  ＴＲＩＳおよび５０ｍＭ  塩化ナトリウムからなるものであった。
【００９１】
ＧＴＢバッファー：ＧＴＢバッファーは、前記ラテックス材料と、ビオチン−フルオレセイン標識との希釈液として用いられた。ｐＨ８．３、１９２ｍＭ  グリシン、２５ｍＭ  ＴＲＩＳおよび０．１５％  ＢＳＡを含むように調合された。
【００９２】
ＬＩＦ検出を用いる毛管電気泳動
毛管電気泳動実験は、ＬＩＦ検出を装備したＰ／ＡＣＥ（登録商標）システムで実施された。励起波長は４９０ｎｍで、発光波長は５２０ｎｍであった。分析は、５０μｍの寸法と２０ｃｍの分離長（全長２７ｃｍ）の未コーティングの石英ガラス毛管で実施された。加圧された電圧は１０ｋＶであった。サンプル注入時間は２秒であった。ＧＴＳが分離バッファーとして用いられた。観察された電流は４５から５５μＡの範囲であった。
【００９３】
アッセイプロトコール
ラテックス−アビジンおよびビオチン−フルオレセイン試薬は、以下のプロトコールに従って混合され、すなわち、ＧＴＢバッファー１００μＬと、ＧＴＢバッファーで希釈されたラテックス−アビジン１００μＬまたは基準としてのＧＴＢバッファー１００μＬと、ＧＴＢバッファー中に３  ｘ  １０−７Ｍまたは３．６８  ｘ  １０−８Ｍのビオチン−フルオレセイン１００μＬとが調製され、少なくとも２分間インキュベーションされて、ＣＥ−ＬＩＦによって分析された。
【００９４】
結果
３ｘ１０−７Ｍで一定のビオチン−フルオレセインを用いた、ラテックス−アビジン（ロットＭ６０２１００、Ａ／Ｃ比０．３５）の定量
さまざまな希釈率（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）のラテックス−アビジンのサンプルが調製され、３ｘ１０−７Ｍのビオチン−フルオレセインと反応させられた。図１に示されるとおり、約１：１２．５に希釈されたラテックス−アビジンが前記ビオチン標識の全てを使いきるために必要であった。この量は、未希釈のラテックス−アビジン材料のビオチン結合能１  ｘ  １２．５  ｘ  ３  ｘ  １０−７Ｍ、すなわち、３．７５  ｘ  １０−６Ｍに相当した。
【００９５】
希釈率が１：１００で一定のラテックス−アビジン（ロットＭ６０２１００、Ａ／Ｃ比０．３５）の定量
図２は、一定の濃度（１：１００）のラテックス−アビジンと、９  ｘ  １０−９Ｍから３  ｘ  １０−７Ｍまでの範囲の濃度のビオチン−フルオレセインとの間の反応の結果の概要である。前記結果に示されるとおり、アビジンの飽和点は約０．３５  ｘ  １０−７Ｍのビオチン−フルオレセイン濃度で達成される。これは、未希釈のラテックス−アビジン材料のビオチン結合部位の１００  ｘ  ０．３５  ｘ  １０−７Ｍ、すなわち、３．５  ｘ  １０−７Ｍに相当する機能的アビジン濃度であり、一定量のビオチン−フルオレセインを用いる上記のとおり決定された結果とよく一致した。
【００９６】
３．６８  ｘ  １０−８Ｍのビオチン−フルオレセインを用いた２つのロットのラテックス−アビジン（ロット３６５ＲおよびロットＫＰ１、Ａ／Ｃ比０．１５）の比較
新しいロットのラテックス粒子を用いてラテックス−アビジン−二座配位子試薬を製造する際に、コンジュゲート試薬が、以前のロットのラテックスを用いて調製された基準試薬と比べて非常に低い免疫反応性をＳｙｎｃｈｒｏｎで示すことがわかった。本発明で示されるＣＥ法を確認するために、我々は前記２種類のラテックス−アビジン中間体を得て評価した。
【００９７】
結果は図３に提示される。古いほうのラテックスのロット（ＫＰ１）に固定化された機能的なアビジンの量は、アビジンの飽和点での１：６０の力価、すなわち、未希釈のラテックス−アビジン材料について６０  ｘ  ３．６８  ｘ  １０−８Ｍ、または、２，２  ｘ  １０−６Ｍのビオチンに相当した。この量は、新しいほうのラテックスのロット（ロット３６５Ｒ）から生成される材料より１．７倍大きく、１：３５の力価、すなわち、３５  ｘ  ３．６８  ｘ  １０−８Ｍ、または、１．３  ｘ  １０−６Ｍのビオチンに相当した。上述のＣＥ−ＬＩＦの結果は前記免疫アッセイから得られた結果と符合したが、該免疫アッセイは、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸ（登録商標）システムで評価されたそれぞれのラテックス−アビジン−二座配位子コンジュゲートからの免疫反応性の６０％の差を示した。
【００９８】
本発明は、その本質的な特徴から逸脱することなく、他の具体的な態様で具体化される場合がある。説明された実施態様は、全ての点で、制限的ではなく、例示としてのみ考慮されるべきである。実際、当業者は、ここに示された内容に基づいて過度の実験を伴わずに、さらなる実施態様を容易に想到し作成することができる。したがって本発明の範囲は、上記の説明によってではなく、添付する特許請求の範囲によって示される。前記特許請求の範囲の均等の意味および範囲内に該当する全ての変更は、前記特許請求の範囲の中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】一定濃度のビオチン−フルオレセインにおける、アビジンでコーティングされたラテックス粒子の第１のロットの定量を示す、前記粒子のさまざまな希釈率でのＣＥ−ＬＩＦ法による電気泳動結果図。
【図２】２種類の濃度のビオチン−フルオレセインにおける、アビジンでコーティングされたラテックス粒子の第１のロットの定量を示す、ＣＥ−ＬＩＦ法による電気泳動結果図。
【図３】一定濃度のビオチン−フルオレセインにおける、アビジンでコーティングされたラテックス粒子の２種類の異なるロットの定量を示す、前記粒子のさまざまな希釈率でのＣＥ−ＬＩＦ法による電気泳動結果図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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