(57)【要約】本発明は、治療上有効量のステアリドン酸の投与により、上昇したＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βに関連する障害を治療し予防する方法に関する。さらに、本発明は、ステアリドン酸投与とともに、対象において、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートする方法およびＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの存在、不存在または量を決定するアッセイも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上昇した濃度のＴＮＦ−αを有するほ乳類においてＴＮＦ−αをダウンレギュレートする方法であって、
（ａ）上昇した濃度のＴＮＦ−αを有するほ乳類を同定し；次いで、
（ｂ）ＴＮＦ−αをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与し、それによってＴＮＦ−αがダウンレギュレートされることを特徴とする方法。
【請求項２】
ほ乳類がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ほ乳類が愛玩動物である請求項１記載の方法。
【請求項４】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約１．５ｇ／日を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
上昇した濃度のＴＮＦ−αが炎症性障害のためにほ乳類に存在する請求項１記載の方法。
【請求項９】
炎症性障害が、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関するカヘキシーまたは湿疹である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
炎症性障害がリウマチ様関節炎である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
上昇した濃度のＩＬ−１βを有するほ乳類においてＩＬ−１βをダウンレギュレートする方法であって、
（ａ）上昇した濃度のＩＬ−１βを有するほ乳類を同定し；次いで、
（ｂ）ＩＬ−１βをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与し、それによってＩＬ−１βがダウンレギュレートされることを特徴とする方法。
【請求項１３】
ほ乳類がヒトである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ほ乳類が愛玩動物である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項１６】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項１７】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までを含む請求項１記載の方法。
【請求項１８】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約１．５ｇ／日を含む請求項１記載の方法。
【請求項１９】
上昇した濃度のＴＮＦ−αが炎症性障害のためにほ乳類に存在する請求項１記載の方法。
【請求項２０】
炎症性障害が、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関するカヘキシーまたは湿疹である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
炎症性障害がリウマチ様関節炎である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
上昇した濃度のＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αを有するほ乳類においてＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αをダウンレギュレートする方法であるとさらに規定され、
（ａ）上昇した濃度のＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αを有するほ乳類を同定し；次いで、
（ｂ）ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与し、それによってＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αがダウンレギュレートされることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
ほ乳類がヒトである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ほ乳類が愛玩動物である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までを含む請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
投与されるステアリドン酸の治療上有効量が約１．５ｇ／日を含む請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
炎症性障害が、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関するカヘキシーまたは湿疹である請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
炎症性障害がリウマチ様関節炎である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
当該治療が必要であるほ乳類において、上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βによって特徴付けられる炎症性障害を予防する方法であって、
（ａ）上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βによって特徴付けられる炎症性障害のおそれがあるほ乳類を同定し；次いで、
（ｂ）上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βによって特徴付けられる炎症性障害を予防するのに有効な時間、有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与することを特徴とする方法。
【請求項３４】
ほ乳類が上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βを有している請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ほ乳類がヒトである請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
ほ乳類が愛玩動物である請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
投与されるステアリドン酸の量が約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までである請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
投与されるステアリドン酸の量が約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までである請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
投与されるステアリドン酸の量が約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までである請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
投与されるステアリドン酸の量が約１．５ｇ／日である請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
炎症性障害が、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関するカヘキシーまたは湿疹である請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
炎症性障害がリウマチ様関節炎である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
ヒトにおいてエイコサペンタン酸（２０：５，ｎ−３）を上昇させる方法であって、
（ａ）上昇したエイコサペンタン酸の必要があるヒト対象を同定し；次いで、
（ｂ）対象においてエイコサペンタン酸を上昇させるのに有効な時間、有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記対象に投与し、ここに、対象はステアリドン酸をエイコサペンタン酸に代謝して、上昇したエイコサペンタン酸を生じることを特徴とする方法。
【請求項４５】
上昇したエイコサペンタン酸（２０：５，ｎ−３）レベルが赤血球リン脂質、血小板リン脂質、単核細胞リン脂質、血漿リン脂質、トリグリセリド、およびコレステロールエステルよりなる群から選択される組織に存在する請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
上昇したエイコサペンタン酸レベルがＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
投与されるステアリドン酸の有効量が約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までである請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
投与されるステアリドン酸の有効量が約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までである請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
投与されるステアリドン酸の有効量が約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までである請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
投与されるステアリドン酸の有効量が約１．５ｇ／日である請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βに関連する病気の有害な影響を低減するかまたは除去する方法であって、
（ａ）対象をスクリーニングして、上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの存在を同定し；次いで、
（ｂ）ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートするのに十分な時間、有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記対象に投与し、ここに、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βが減少し、ここに、病気の有害な影響が低減または除去されることを特徴とする方法。
【請求項５２】
対象由来の血液および／または組織を用いてスクリーニングが実行される請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ステアリドン酸を対象に投与する前にスクリーニングが実行され、ステアリドン酸を対象に投与した後に再度分析が実行される請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
対象においてＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの量を用いて、前記対象に投与するステアリドン酸の有効量を決定する請求項５１記載の方法。
【請求項５５】
病気が炎症性障害である請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
炎症性障害が、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関するカヘキシーまたは湿疹である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
炎症性障害が、リウマチ様関節炎である請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である請求項５６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２００２年３月８日に出願された米国特許仮出願第６０／３６５,８７２号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、全般的に、治療上有効量のステアリドン酸の投与により、上昇したＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βに関連する障害を治療し予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
炎症は、機械的損傷、感染または抗原刺激により引き起こされた傷害に対する体の反応であり、それゆえ、健康および生存にとっては有益なプロセスである。しかしながら、炎症は、自己抗原刺激のごとき不適当な刺激によっても引き起こされ、しばしば、自己免疫疾患の発症をもたらす。また、炎症はそのような疾患の病態生理学にも著しく貢献する。
【０００４】
炎症の特徴は、灼熱、発赤、疼痛および腫脹を含み、それらの全ては、局部血管上のサイトカインの効果に少なくとも部分的には寄与している。サイトカインは炎症性白血球およびある種の非白血球から分泌される非抗体タンパク質であり、細胞間メディエータとして機能する。それらは、特殊化した腺によってよりもむしろ多数の細胞または組織型によって産生されるという点で、古典的なホルモンとは異なる。通常、それらは、エンドクリン的ではなく、パラクリンまたはオートクリン的に局所作用する。
【０００５】
炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−αのごとき腫瘍壊死因子；ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−８、ＩＬ−６のごときインターロイキンを含み；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含み；それら全てが炎症性反応を開始し、炎症プロセスを進行させ続けるのに主要な役割を演じている。炎症のメディエータたるそのようなサイトカインは、血管径、血流、局所血管の上皮細胞上での接着分子の発現に変化をもたらし、それによって、炎症部位への免疫細胞の溢出をもたらす。
【０００６】
例えば、ＩＬ−８は好中球に対する走化作用物質として作用し、かくして、傷害の部位へのこれらの細胞のより効率的な溢出を可能とする。ＩＬ−８に対してブロックする抗体は、急性炎症における好中球関連組織損傷でＩＬ−８に対しての役割を示した［Harada et al., Molecular Medicine Today, 2:482, 1996］。ＩＬ−６も、特に、中枢神経系における炎症のメディエータである。全身性エリテマトーデス、多発性硬化症ならびにウイルス性および細菌性髄膜炎のごとき疾患でＩＬ−６のレベル上昇が見られた［Gruol et al, Molecular Neurobiology, 15:307, 1997］。ＧＭ−ＣＳＦは、気管支ぜんそくに関与する炎症性サイトカインである［Lee, J.R., Coll Physicians Lond, 32:56, 1998］。ＩＦＮ−γはコラーゲン沈着の増加に関連しており、それは移植片対宿主病で観察される［Parkman, Curr, Opin. Hematol., 5:22, 1988］。インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）の発症は、膵島におけるＴ細胞産生ＩＦＮ−γの蓄積に関連している［Ablumunits, et al., J. Autoimmun., 11:73, 1998］。
【０００７】
ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１は、傷害ならびに感染性、炎症性または免疫性の攻撃に反応して単球その他の細胞によって合成される。これらのサイトカインは多くの炎症性障害に関与し、それらが発揮する作用により重大な損害を引き起こす。とりわけ、ＩＬ−１の生物学的作用は：血管内皮の活性化、リンパ球の活性化、局所組織破壊、および炎症部位へのエフェクター細胞のアクセス上昇の促進である。ＴＮＦ−αのいくつかの主要な効果は、リンパ節への増大した体液ドレナージおよび上昇した血管透過性を含み、かくして、ＩｇＧ抗体、補体および細胞の損傷組織への侵入の増大をもたらす［Charles A. Janeway, Jr., Paul Travers, Mark Walport, and J. Donald Capra, Immunobiology, Fourth Edition, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, 1999］。しばしば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、例えば、血管内皮およびアラキドン酸代謝物の合成に相乗的に作用する。
【０００８】
多数の疾患におけるＴＮＦ−αの関与は、リウマチ様関節炎、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹患した患者に抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体を投与することによって立証されている（［Rankin E.C.C., et al., British J. Rheum, 35:334-342, 1997］および［Stack, W.A., et al., Lancet 349:521-524, 1997］）。ＩＬ−１レベルの上昇は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者に観察されている。内因性ＩＬ−１ｒａの不十分な産生が、ＩＢＤの発症に寄与しているのであろう［Cominelli, et al., 1996, Ailment Pharmacol, Ther., 10, 49, 1996］。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは双方とも歯周病に関与している［Howells, Oral Dis., 1, 266, 1995］。さらに、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦは、急性骨髄性白血病芽球の増殖を刺激することが示されている［Bruserud, Leukemia Res., 20, 65, 1996］。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１は、ＩＬ−６およびＩＬ−８と共に、発熱、不快感、筋肉痛などで観察される急性期反応を開始し［Beisel, Am. J. Clin. Nutr., 62:813, 1995］、かくして、通常、外傷または病原菌の侵入後に観察される。
【０００９】
敗血症ショックに関連する重大な問題は、ほとんど、ＴＮＦ−αの作用によるものである。敗血症ショックにおいて、血管拡張、血管透過性の上昇および血液凝固がＴＮＦ−αによって開始され、しばしば、腎臓、肝臓、心臓および肺臓のごとき臓器の不全をもたらす。カヘキシーは、長期化した感染や進行した悪性度の一般的な症状であり、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−６に慢性的に曝されていることに起因する。さらに、マウスおよびラットで行った動物実験は、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１の投与が７ないし１０日以内に食欲不振、体重減少ならびに体脂質およびタンパク質の喪失を生じることをさらに示した［Cerami et al., Immunol Lett., 11:173, 1985; Fong et al., J. Exp. Med., 170:1627, 1989; Moldawer et al., Am. J. Physiol, 254:G450-G456, 1988; Fong et al., Am. J. Physiol, 256:R659-R665, 1989; McCarthy et al., Am. J. Clin. Nutr., 42:1179-1182, 1982］。
【００１０】
ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１の役割は多くの炎症性疾患の病態生理学において立証されている。近年、心臓血管病、特に、アテローム性動脈硬化症における炎症の役割に関する新たな証拠が明らかになり始めた。これは、心臓血管病が世界で第１位の死因であるということに非常に関連している。アテローム性動脈硬化症は、コレステロール、リポイド物質およびリポファージを含有するプラークの大ないし中動脈における沈着によって特徴付けられる。プラーク形成はしばしば心室筋への冠血流量不足引き起こし、ひいては、虚血および疼痛のごとき状態（狭心症）ならびに心筋の死（心筋梗塞）をもたらす。肝臓に生じる全身性炎症のそのようなマーカーの一つは、高感度Ｃ反応性タンパク（ｈｓＣＲＰ）である。ｈｓＣＲＰは、心臓血管イベントの危険性の最も強力な一変量予知因子であると示されている［NEJM Vol. 342 no. 12:836］。
【００１１】
低密度コレステロールの酸化修飾が動脈内のプラーク沈着における役割を演じていることが知られている。しかしながら、ハーバードの心臓医であるポール・リドカー(Paul Ridker)によれば、プラークを不安定にし、それにより、それらが血流を流れて移動するようにさせるという点で、炎症がアテローム性動脈硬化症において重要な役割を演じていることはほぼ確実であろう。アスピリンは、血液希薄化、高炎症性の特性を有し、コレステロールや脂質プロファイルに何ら影響しないにもかかわらず、心臓発作の可能性を減じるという事実からこの学説は支持される。
【００１２】
魚類および魚油中に見いだされるエイコサペンタン酸（ＥＰＡ、２２：５，ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６，ｎ−３）ごとき長鎖オメガ−３脂肪酸が、炎症の阻止を含む、ポリ不飽和脂肪酸の結果と考えられる多くの健康上の利益に関わっていることも知られている。
【００１３】
オメガ−３（ｎ−３）脂肪酸は、脂肪酸鎖のメチル末端から３番目および４番目の炭素原子の間に二重結合が位置するポリ不飽和脂肪酸である。それらは、限定されないが、α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３，ｎ−３）、ステアリドン酸（ＳＤＡ、１８：４，ｎ−３）、エイコサペンタン酸（ＥＰＡ、上掲）、ドコサペンタン酸（２２：５，ｎ−３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、上掲）等を含む。関連して、オメガ−６脂肪酸（「ｎ−６」）は、鎖のメチル末端から６番目の炭素に第１の二重結合を有し、限定されないが、リノレン酸（ＬＡ、１８：２）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３，ｎ−６）、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４，ｎ−６）等を含む。アラキドン酸は、ロイコトリエン類、プロスタグランジン類、およびトロンボキサン類を含み、炎症過程に役割も演じるエイコサノイドの合成の主要な前駆体である。ＳＤＡのごときオメガ−３脂肪酸の投与がロイコトリエンの生合成を阻害することが示されている（米国特許第５,１５８,９７５号）。
【００１４】
オメガ−３脂肪酸は通常の西洋料理には乏しいが、冷水域に生息する魚類またはアザラシの肉が豊富な料理において脂肪摂取の重要な部分を構成する。沿岸に住むエスキモー、日本人およびオランダ人の集団の疫学研究は、オメガ−３脂肪酸の高摂取が、ぜんそくやＩ型糖尿病のごとき心臓血管および炎症性の疾患の低発症率に相関することが示された。かくして、多数の研究が、オメガ−３脂肪酸の健康上の利益を立証している。しかしながら、以前にはＳＤＡがＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βをダウンレギュレートするために投与され得ることは知られていなかった。さらに、以下に論ずるように、天然および合成源のＳＤＡの現在の使用は数多くの問題を抱えている。
【００１５】
今、現にある炎症性障害の治療にはしばしば多くの問題点が付随する。例えば、自己免疫病を治療するのに与えられる多くの薬物は患者の免疫系を阻害することに基礎を置くので、それらは患者が感染と戦う能力も弱めてしまう。より重要なことに、それらの薬物には重大で、たまに生命を脅かす副作用が付随する。例えば、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾンのごときコルチコステロイド（グルココルチコイドとしても知られる）は、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、移植片対宿主病その他の多数の自己免疫病を制御するのに有効であるが、それらの副作用は、骨粗鬆症、水分貯留、体重増加、糖尿病の発症または悪化、白内障および高血圧を含む。メトトレキサート、アザチオプリン、シクロシポリンおよびレフトノミドのごとき免疫抑制剤として広く分類される別の薬物群も免疫系を調節するのに有効である。しかしながら、それらの副作用は、潜在的な肝臓障害（メトトレキサート）、血液異常（アザチオプリン）、高血圧、腎臓機能喪失、振せん（シクロスポリン）、下痢、皮疹および肝臓障害（レフルノミド）を含む。リウマチ様関節炎の治療用の抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体の近年の開発がその病気の症状の軽減を成功させる治療であることが証明されたが、その投与は注射によるものであり、痛みを伴い、使用が困難である。
【００１６】
したがって、オメガ−３脂肪酸は多数の炎症性疾患の治療に上手に用いられている。しかしながら、そのような治療に大いなる可能性を示すＥＰＡおよびＤＨＡの供給は、入手するのが困難であるか、あるいは、問題がある。
【００１７】
天然源由来のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の商業生産に関連していくつかの不都合がある。動物や植物のごときＰＵＦＡの天然源は、非常に種々雑多なオイル成分を含んでいる。それゆえ、これらの源から得たオイルは、１以上の所望するＰＵＦＡに分離するためにまたは１以上のＰＵＦＡが豊富なオイルを生成するために、広範囲にわたる精製が必要である。天然源は入手可能性において制御不能な変動にさらされてもいる。魚群は自然変動にあるか、または乱獲によって減少するかもしれない。魚油は高レベルのＥＰＡおよびＤＨＡを含有するが、通常、不快な味および臭いを有する。これらの所望しない要素は所望する生成物から経済的に分離することは不可能であり、当該生成物を食物サプリメントとして許容されないものにしている。さらに、動物油、特に魚油は、環境汚染物質を蓄積し得る。ボラージのごとき所望するＰＵＦＡを産生する穀物は、市場成長に適用されておらず、単一栽培では良好には実行できないかもしれない。ＰＵＦＡの生産のための微生物の使用も重大な問題を抱えている。例えば、ポルフィリジウム(Porphyridium)およびモルティエレラ(Mortierella)のごとき微生物を市場規模で培養するのは困難である。さらに、モルティエレラのごとき微生物の大規模発酵は高価である。
【００１８】
ＰＵＦＡを含有する食品サプリメントや医薬製剤はＰＵＦＡ源の不都合を保持し得る。魚油カプセルのごときサプリメントは低レベルの特定の所望する成分を含有し得、かくして、大量投与が必要である。高用量は、不純物を含む所望しない成分の高レベルの摂取をもたらす。サプリメントの不快な味と臭いはそのような摂生を嫌なものにし、患者のコンプライアンスを阻害する。脂肪酸の供給には注意が必要である。過剰に与えると、内因性の生合成経路の阻害を生じ、イン・ビボで様々な脂質フラクション中の他の必須脂肪酸との競争を引き起こし、所望しない結果に導く。例えば、ω−３脂肪酸が高い料理を食するエスキモーは出血の傾向が高くなっている［米国特許第４,８７４,６０３号； Saynor and Varell, Medical Science 8:379 (1980)］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
かくして、ＰＵＦＡを用いて炎症性サイトカインを調節する新規かつ培養上許容される方法を提供することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の概要
本出願人らは、比較的少量のＳＤＡがＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのごとき炎症性サイトカインの治療上有効なモジュレータであると決定した。そのような少量投与が治療的であるので、ＳＤＡ富化食品その他の食用組成物の摂取により、治療上有効量のＳＤＡの日常摂取が効果的かつ有効的に達成し得る。簡単にいえば、それゆえ、本発明の一つの局面は、上昇した濃度のＴＮＦ−αを示すほ乳類においてＴＮＦ−αをダウンレギュレートする方法に向けられ、この方法は、ＴＮＦ−αをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸を前記ほ乳類に投与することを特徴とする。さらに、本発明は、上昇した濃度のＩＬ−１βを示すほ乳類においてＩＬ−１βをダウンレギュレートする方法を提供し、この方法は、ＩＬ−１βをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸を前記ほ乳類に投与することを特徴とする。
【００２１】
もうひとつの局面において、本発明は、上昇した濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βを示すほ乳類においてＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートする方法に向けられ、この方法は、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸を前記ほ乳類に投与することを特徴とする。本発明の一つの具体例において、上昇した濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βは炎症性障害のためにほ乳類に存在する。この障害は、一つの具体例において、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関連するカヘキシー、および湿疹を含む。本発明のもうひとつの具体例において、ほ乳類はヒトである。
【００２２】
本発明のさらなる具体例において、本明細書に記載するように投与されるステアリドン酸の治療上有効量は約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までである。特定の具体例において、治療上の量は約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約５ｇ／日まで、または約１．５ｇ／日である。
【００２３】
本発明のさらにもうひとつの局面において、上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βに関連する障害は、本明細書に記載された方法で治療し得、限定されないが、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関連するカヘキシー、および湿疹を含む。好ましくは、炎症性障害は心臓血管病およびリウマチ様関節炎を含み、より好ましくは、心臓血管病はアテローム性動脈硬化症である。
【００２４】
本発明のもうひとつの具体例において、ステアリドン酸の治療上有効量はＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの血中濃度を変更するのに有効な量を含む。
【００２５】
さらにもうひとつの局面において、本発明は、当該治療が必要なほ乳類において上昇したレベルのＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βで特徴付けられる炎症性障害を予防する方法であって、炎症性障害を予防するのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸を前記ほ乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ヒトにおいてエイコサペンタン酸のレベルを変更する方法も提供し、ここに、この方法は、治療上有効量のステアリドン酸を投与することを特徴とする。もうひとつの具体例において、本発明は、対象由来の血液または組織を分析して、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの存在、不存在または量を決定することを含むアッセイを提供し、ここに、この分析は対象へのステアリドン酸の投与の前、最中または後に行われる。
【００２７】
本発明のなおもうひとつの具体例において、対象に投与するステアリドン酸の治療上有効量を決定するためのアッセイを用いる。
【００２８】
さらにもうひとつの局面において、本発明は、上昇した濃度のＣ反応性タンパクを有するほ乳類においてＣ反応性タンパクをダウンレギュレートする方法であって、上昇した濃度のＣ反応性タンパクを有するほ乳類を同定し、次いで、Ｃ反応性タンパクをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与し、それによって、Ｃ反応性タンパクがダウンレギュレートされることを特徴とする方法を提供する。本発明の特定の具体例において、対象は上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをさらに含むことができ、これらのレベルはＳＤＡを投与することによってダウンレギュレートすることができる。
【００２９】
なおさらにもうひとつの局面において、本発明は、上昇した濃度のＣ反応性タンパクで特徴付けられる炎症性障害を予防する方法であって、上昇した濃度のＣ反応性タンパクを有するほ乳類を同定し、次いで、Ｃ反応性タンパクをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記ほ乳類に投与し、それによって、Ｃ反応性タンパクがダウンレギュレートされることを特徴とする方法を提供する。本発明の特定の具体例において、対象は上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをさらに含むことができ、これらのレベルはＳＤＡを投与することによってダウンレギュレートすることができる。
【００３０】
なおさらにもうひとつの局面において、本発明は、上昇したＣ反応性タンパクに関連する病気の有害な影響を低減するかまたは除去する方法であって、対象をスクリーニングしてＣ反応性タンパクの存在が上昇していることを同定し、次いで、Ｃ反応性タンパクをダウンレギュレートするのに十分な時間、有効量のステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）を前記対象に投与し、ここに、Ｃ反応性タンパクが減少し、ここに、病気の有害な影響が低減されるかまたは除去されることを特徴とする方法を提供する。本発明の特定の具体例において、病気は、上昇したＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βによってさらに特徴付けられていてもよく、これらのレベルはＳＤＡを投与することによってダウンレギュレートすることができ、ここに、病気の有害な影響が低減されるかまたは除去される。
【００３１】
他の局面および特徴は明らかになり、以下に指摘される。
【００３２】
図１Ａは、１．５ｇ／日の試験脂肪酸、ＥＰＡ、ＳＤＡおよびＡＬＡの摂取による、赤血球中の長鎖ｎ−３脂肪酸の変化を示し、図１Ｂは、同様に、血漿リン脂質中の長鎖ｎ−３脂肪酸の変化を示す。「＊」は各脂肪酸についての基準値からの有意差値（ｐ＜０．０５）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
頭字語
ＰＵＦＡは、ポリ不飽和脂肪酸の略語である。
ＳＤＡは、ステアリドン酸の略語である。
ＥＰＡは、エイコサペンタン酸の略語である。
ＤＨＡは、ドコサヘキサエン酸の略語である。
ＴＮＦは、腫瘍壊死因子の略語である。かくして、例えば、ＴＮＦ−αは腫瘍壊死因子−αである。
ＩＬは、インターロイキンの略語である。かくして、例えば、ＩＬ−１はインターロイキン−１である。
【００３４】
ここで用いるとき、「治療する(treating)」および「治療するため(to treat)」なる用語は、一時的か恒久的かのいずれかで、炎症性障害の症状を軽減し、原因を除去し、症状の発現および／または障害の進行を遅延させ、または疾患を予防すること（すなわち、予防的に治療すること）を意味する。「治療」なる用語は、炎症性障害の軽減、原因の除去または予防を含む。予防方法に関して、治療すべき対象は、通常、遺伝的素因、食事、障害誘発物質への暴露、病原性物質への暴露等による炎症性状態の危険性がある動物である。
【００３５】
ここで用いるとき、「ほ乳類」なる用語は、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのごとき、家畜および畜産動物ならびに飼育動物または愛玩動物を含むほ乳類として分類されるいずれの動物をもいう。好ましくは、ほ乳類はヒトである。
【００３６】
ここで用いるとき、「炎症性障害」なる用語は、炎症によって引き起こされるか、またはその症状が炎症を含むかのどちらかであるいずれの障害をもいう。例えば、炎症によって引き起こされる炎症性障害は、敗血症ショックであり、症状が炎症を含む炎症性障害はリウマチ様関節炎を含む。本発明の炎症性障害は、限定されないが、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、乾癬、ガンに関連するカヘキシー、および湿疹を含む。
【００３７】
ここで用いるとき、「ダウンレギュレーション」または「ダウンレギュレートする」なる用語は、生体物質の濃度を下降させることを意味し、ここに、ダウンレギュレーションは、例えば、当該生体物質の合成の阻害のごときいずれかの生物学的メカニズムによって達成することができる。
【００３８】
ここで用いるとき、「有効量」は、用量すなわち患者に投与される量および患者への投与頻度を意味し、ここで明らかになった本質を考えれば、それらは、公知技術を使用し、同様の状況から得られた結果を観察することによって、疾患または病気を有効に治療するように当業者が容易に決定する。有効量または用量を決定するにおいて、限定されないが、用いる化合物の効力および作用の持続時間；治療すべき病気の特質および重篤度；ならびに治療すべき患者の性別、年齢、体重、全般的な健康状態および個人的な敏感さ；その他の当業者に知られている関連する状況を含む多数の要因が担当診断士によって検討される。
【００３９】
「治療上有効な」なる語句は、代替療法に典型的に関連する副作用を回避しつつ、剤が障害の重篤性を防止または改善する能力を示す。この「治療上有効な」なる語句は、「治療または予防に有効な」なる語句と同等であると理解すべきであり、どちらも、代替療法に典型的に関連する副作用を回避しつつ、炎症性障害の重篤度の最終的な改善かまたは障害の予防を達成する、例えば本発明の方法に用いるステアリドン酸の量を定量することを意図する。
【００４０】
「医薬上許容される」なる用語がここで用いられ、そのように修飾された名詞が特定の医薬製品に用いるのに適当であることを意味する。医薬上許容されるカチオンは金属イオンおよび有機物イオンを含む。より好ましい金属イオンは、限定されないが、適当なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩その他の生理学上許容される金属イオンを含む。代表的なイオンは、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛をそれらの通常の価数で含む。好ましい有機物イオンは、プロトン化三級アミンおよび四級アンモニウムカチオンを含み、ある程度、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインを含む。代表的な医薬上許容される酸は、限定なく、塩酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸等を含む。
【００４１】
医薬上許容される補形剤は、限定されないが、生理食塩水、リンガー液、トコフェノール、リン酸溶液すなわちバッファー、バッファー化食塩水その他の分野公知の担体を含む。医薬組成物は、安定化剤、抗酸化剤、着色剤および希釈剤を含むこともできる。医薬上許容される担体および添加物は、医薬組成物からの副作用が最小限化され、かつ、治療が無効になる程度まで組成物の性能が打ち消されるか阻害されないように選択される。
【００４２】
ここで用いるとき、ｎ−３ＰＵＦＡは、天然に産出するかまたは合成して生成されたオメガ−３ポリ不飽和脂肪酸をいう。不飽和脂肪酸を表すのに様々な命名法があることに注意すべきである。例えば、α−リノレン酸のごとき名称がポリ不飽和脂肪酸を表すのにときどき用いられる。ＡＬＡ（α−リノレン酸）のごとき三文字表記を用いた略語が、ポリ不飽和脂肪酸を識別するのに普通に用いられている。脂肪酸のカルボキシル部分から１番目の二重結合に対する炭素の位置に基づく別の方法は、ギリシャ文字Δ（デルタ）を用いて、その炭素を表す（例えば、１８：３Δ９,１２,１５）。ＩＵＰＡＣ命名システムも脂肪酸のカルボキシル末端からの炭素を数える（例えば、シス９,１２,１５−オクタデカトリエン酸）。現在、より広く用いられている方法は、鎖中の炭素数、その後ろにコロン、次いで、ギリシャ文字ω（オメガ）または文字「ｎ」を用いて、メチル末端からの１番目の二重結合を表す。かくして、ＡＬＡ（シス９,１２,１５−オクタデカトリエン酸）は１８：３ ω−３または１８：３，ｎ−３（１８個の炭素原子、３個の二重結合、メチル末端から３番目の炭素に１番目の二重結合）とも表記し得る。ここでの脂肪酸に関する名称はそれに限定をおく意図はないものと理解すべきであり、ここで用いている名称以外に、ポリ不飽和脂肪酸を表す代替的な命名は本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４３】
ステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）はオメガ−３ポリ不飽和脂肪酸であり、α−リノレン酸（１８：３，ｎ−３）へのデルタ−６脂肪酸デサチュラーゼ(desaturase)の作用によって生成される。魚類および魚油に見いだされるエイコサペンタン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のごとき長オメガ−３脂肪酸の摂取が多くの健康上の利益をもたらすことは一般的に当該分野で知られている。例えば、心臓血管病におけるオメガ−３脂肪のある種の利益が、例えば、［Simopoulos, A.P., Can. J. Physiol. Pharmacol, 75:234 (1997)］に記載されている。ＥＰＡの摂取によってだけではなく、デルタ−６デサチュラーゼの作用により体内でＥＰＡに転換されるα−リノレン酸（ＡＬＡ）の摂取によっても、ＥＰＡの組織レベルを上昇させ得る。しかしながら、この転換は非常に不十分である［Mantzioris et al., Dietary substitution with an α-linolenic acid-rich vegetable oil increases eicosapentaenoic acid concentrations in tissues, Am, J. Clin. Nutr.; 59:1304-1309 (1994)］。この不十分さの理由は、デルタ−６デサチュラーゼがイン・ビボで不十分であり、かくして、ＥＰＡへのＡＬＡの転換を律速反応にしているという事実にあると確信される。したがって、ＥＰＡの組織レベルを上昇させるためには、大量のＡＬＡを消費しなければならない。しかしながら、本出願人らは、丁度適量のＳＤＡの消費がＥＰＡの十分な源であることを発見した。本出願人らは、ＳＤＡがヒトにおいて組織中ＥＰＡレベルを上昇させるのにＡＬＡよりも約４倍も有効であると確認し、かくして、ヒトにおいてＥＰＡへのＳＤＡの転換特性を定量し、さらに、ＳＤＡについての潜在的な健康上の利益を立証した。同様の研究において、ＳＤＡ投与はＥＰＡの延長生成物であるドコサペンタン酸（ＤＰＡ）の組織レベルも上昇させた。
【００４４】
ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸としてまたは、アシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質のごときコンジュゲート形態として、植物中または微生物中に見ることができ、分野周知の様々な手段により細胞から抽出することができる。そのような手段は、有機溶媒での抽出、超音波照射、例えば二酸化炭素を用いた超臨界流体抽出および圧縮のごとき物理的手段、またはそれらの組合せを含むであろう。特に興味深いものは、メタノールおよびクロロホルムでの抽出である。望ましくは、水層を酸性化して負電荷部分をプロトン化し、それによって所望する生成物の有機層への分配を増大させる。抽出後、有機溶媒は窒素流下でのエバポレーションによって除去し得る。コンジュゲート形態で単離した場合、生成物を酵素的または化学的に分解して遊離脂肪酸またはより小さい対象のコンジュゲートを放出させ、次いで、所望の最終生成物を生成するためのさらなる操作を行い得る。望ましくは、コンジュゲート形態の脂肪酸を水酸化カリウムで分解する。
【００４５】
さらなる精製が必要ならば、標準方法を採用し得る。そのような方法には、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心または蒸留、またはこれらの技術の組合せが含まれるであろう。酸またはアルケニル基のごとき反応性基の保護は、公知技術、例えば、アルキル化またはヨウ素化によっていずれのステップにても行うことができる。用いる方法は、メチルエステルを精製するための脂肪酸のメチル化を含む。同様に、保護基はいずれのステップにても除去することができる。望ましくは、ＧＬＡ、ＳＤＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡおよびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素および／または分別蒸留での処理によって達成することができる。
【００４６】
食品栄養補給に関して、通常使用で摂取者が所望量を摂取するように、精製ＰＵＦＡ、またはその誘導体を調理油、油脂またはマーガリンに配合する。ＰＵＦＡは乳児用調合乳、栄養補給サプリメントまたはその他の食品にも配合することができ、抗炎症性剤またはコレステロール降下剤としての使用もある。あるいは、ＰＵＦＡを対象に供給することができ、ここに、対象は上昇したレベルのＳＤＡを含有する食物を消費する。
【００４７】
ステアリドン酸は、対象に植物、植物部分、またはそれらから誘導される食料品を給餌することによって投与することができる。そのような植物はステアリドン酸を天然に産出し、またはＳＤＡを上昇させる遺伝子組換えすることができる。本発明で用いることができる上昇したＳＤＡを有するそのような植物は、米国特許第６,４５９,０１８号に記載され、それは出典明示して本明細書に含まれる。
【００４８】
医薬使用に関して（ヒトまたは脊椎動物）、組成物は通常経口投与されるが、それらが上手に吸収されるいずれの経路によっても、例えば、非経口（すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内）で、直腸内または膣内でまたは、例えば、皮膚軟膏またはローションとして局所的に投与することができる。本発明のＰＵＦＡは単独でまたは医薬上許容される担体または補形剤と組み合わせて投与することができる。利用可能であれば、ゼラチンカプセルが経口投与に好ましい形態である。上記した食品サプリメントは経口投与で与え得る。本発明の不飽和酸はコンジュゲート形態で、または脂肪酸の塩、エステル、アミドもしくはプロドラッグで投与することができる。いずれの医薬上許容される塩も本発明に含まれ；特に好ましいのは、ナトリウム、カリウムまたはリチウム塩である。Ｎ−メチルグルカミンのごときＮ−アルキルポリヒドロキサミンも含まれ、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６１３３１５５に見られる。好ましいエステルは通常エチルエステルである。固体塩として、ＰＵＦＡは錠剤形態でも投与し得る。静脈内投与に関して、ＰＵＦＡまたはその誘導体をイントラリピッド(Intralipids)のごとき市販製剤に配合することができる。典型的な正常成人の血漿脂肪酸プロファイルは６．６４ないし９．４６％のＡＲＡ、１．４５ないし３．１１％のＤＧＬＡ、および０．０２ないし０．０８％のＧＬＡを含む。これらのＰＵＦＡまたはそれらの代謝前駆体は単独かまたは他のＰＵＦＡと混合してかのいずれかで投与して、患者において正常脂肪酸プロファイルを達成し得る。所望すれば、製剤の個々の成分は、キット形態で別個に単一または複数使用のために供給することができる。特定の脂肪酸の用量は毎日０．１ｍｇないし２０ｇ、またはさらに１００ｇである。しかしながら、当該量は、特定の個人の間で大きく変動する。リウマチ様関節炎のごとき炎症性障害に罹患している人は、ＳＤＡのごとき特定のＰＵＦＡを特定量必要とする。
【００４９】
本出願人らは、ＳＤＡの消費が炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの血中レベルの下降をもたらすことを見いだした。したがって、本発明は、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βならびにＣ反応性タンパクをダウンレギュレートする方法を提供する。そのような方法は、一つの具体例において、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクをダウンレギュレートするのに有効な時間、治療上有効量のＳＤＡを上昇した濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクを示すほ乳類に投与することを特徴とする。これにより、ＳＤＡがこれらのサイトカインをダウンレギュレートし得ることが初めて立証された。本発明は、正常濃度より高い濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクを示していないが、炎症性障害を発症するおそれのある対象への治療上有効量のステアリドン酸の投与も提供する。そのような治療上有効量はここに開示された結果を基にすれば当業者にとって明白となる。
【００５０】
炎症性障害に罹っていないヒトにおいてＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクの濃度は医療科学分野で知られているか、または多大なる実験なくして容易に決定し得る。他のほ乳類に関して、これらの２つのサイトカインの正常濃度は分野公知であるか、または多大なる実験なくして当業者によって決定し得る。
【００５１】
患者において正常濃度よりも高い濃度のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクは、しばしば、限定されないが、心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、ガンに関連するカヘキシー、および湿疹を含む炎症性障害に起因する。好ましい具体例において、治療される炎症性障害は心臓血管病およびリウマチ様関節炎を含み、より好ましくは、治療される心臓血管病はアテローム性動脈硬化症である。
【００５２】
治療上有効なＳＤＡ量は、治療すべき炎症性障害の重篤度、患者の食習慣、患者の年齢、さらなる病気の存在などのごとき多数の要因に依存する。いつもの食事で比較的少ないＳＤＡ量を消費する対象は、典型的により大量のＳＤＡを消費するものよりも多い量を必要とするであろう。当業者は、これらの検討に基づきいかにして患者にとって治療上有効な量を決定するかを知っている。
【００５３】
治療上有効な時間は患者の障害に依存して著しく変動し得る。かくして、細菌感染の結果である炎症は、慢性すなわち長期の病気よりも治療すべき時間は短くて済むであろう。例えば、リウマチ様関節炎のごとき慢性疾患は敗血症ショックよりも長い治療が必要であろう。治療の長さは、多大なる実験なくして当業者によって決定し得る。当業者は以下に論じるように、治療上有効な時間を決定するのに本発明のアッセイを用いることができる。
【００５４】
当業者は、［Goodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711］からのガイダンスでも用量が決定されることを理解するであろう。しかしながら、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βおよび／またはＣ反応性タンパクが上昇した患者に投与し得る治療上有効量のステアリドン酸は、通常、約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までの範囲である。好ましくは、この治療上の量は約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までである。より好ましくは、この治療上の量は約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までである。最も好ましくは、この治療上の量は約１．５ｇ／日である。
【００５５】
特定の用量は通常この範囲で変動し、採用する剤形および用いる投与経路に依存する。正確な配合、投与経路および用量は患者の状態を見て個々の医者によって選択される（例えば、［Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1］を参照せよ）。
【００５６】
ＳＤＡは非経口および腸内経路で患者に投与し得る。非経口投与は、皮下、筋肉内、経皮、乳房内、静脈内、および分野公知の他の投与方法を含む。腸内投与は、液剤、錠剤、徐放性カプセル剤、腸内糖衣カプセル剤およびシロップ剤を含む。投与するとき、医薬組成物は体温付近であってよい。
【００５７】
好ましい具体例において、ＳＤＡは、ステアリドン酸富化食料品の摂取によって経口投与される。本発明を実施するために用いる食料品は限定されないが、飲料（ソフトドリンク、炭酸飲料、即席飲料等を含む）、煎出食品（例えば、果物および野菜）、ソース、調味料、サラダドレッシング、フルーツジュース、シロップ、デザート（プリン、ゼラチン、糖衣と詰め物、焼き物、およびアイスクリームやシャーベットのごとき冷凍デザートを含む）、チョコレート、キャンディー、ソフトフローズン製品（ソフトフローズンクリーム、ソフトフローズンのアイスクリームおよびヨーグルト、乳製品または非乳製品のホイップトッピングのごときソフトフローズントッピングのごとき）、オイルおよび乳化製品（ショートニング、マーガリン、マヨネーズ、バター、調理油およびサラダドレッシングのごとき）、加工肉（ソーセージのごとき）、半乾燥食品（例えば、ライスおよびドッグフード）などを含む。
【００５８】
ＳＤＡを入手し、それを食料品に溶解によって、または懸濁化によって、または乳化物として添加し、食料品に均一に分散させるような常法によって、食料品をＳＤＡ富化し得る。例えば、ＳＤＡを食用可溶化剤に溶解させるか、または食用可溶化剤、有効量の分散剤および、所望により、有効量の抗酸化剤と混合し得る。有用な抗酸化剤の例は、限定されないが、α−トコフェノール、アスコルビン酸、廉価な合成抗酸化剤およびそれらの混合物を含む。食料品は、ＳＤＡ増加用に組み換えられたトランスジェニック植物から調製することもできる。本発明に用いることができる上昇したＳＤＡを有するそのような植物の例は、米国特許第６,４５９,０１８号に記載され、出典明示して本明細書に含まれるものとみなされる。
【００５９】
乳化物または懸濁物を調製するのに有効な担体は、水、アルコール、ポリオールおよびそれらの組合せを含む。有用な分散剤は、限定されないが、レシチンその他のリン脂質、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸、脂肪酸の塩、脂肪酸エステル、その他界面活性剤様分子およびそれらの組合せを含む。あるいは、ＳＤＡを入手し、それを食用可溶化剤および有効量の分散剤と混合することを含む方法によって、食料品を製造し得る。繰り返しになるが、食用可化剤は、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、植物油、トコフェノール、アルコール、ポリオールまたはそれらの組合せを含有し得、分散剤は、限定されないが、レシチンその他のリン脂質、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸、脂肪酸の塩、脂肪酸エステル、その他の界面活性剤様分子およびそれらの組合せを含む。
【００６０】
ＳＤＡを消費することによってＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βをダウンレギュレートする能力は、ＳＤＡを用いて炎症性障害を治療し予防する可能性を実証する。したがって、本発明は、治療が必要なほ乳類において炎症性障害を治療する方法であって、有効な時間、治療上有効量のステアリドン酸を前記ほ乳類に投与することを特徴とする方法を提供する。本発明は、炎症性疾患を発症するおそれのあるほ乳類に治療上有効量のＳＳＤＡを投与することによって予防する方法も提供する。炎症性疾患を発症するおそれのあるほ乳類は当業者によって容易に特定され、過度な実験を要しない。
【００６１】
一つの具体例において、炎症性障害は心臓血管病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、敗血症ショック、移植片対宿主病、ぜんそく、鼻炎、ガンに関連するカヘキシー、および湿疹を含む。好ましくは、炎症性障害は心臓血管病およびリウマチ様関節炎を含み、より好ましくは、心臓血管病はアテローム性動脈硬化症である。もうひとつの好ましい具体例において、ほ乳類は炎症性障害の治療または予防の必要があるヒトである。治療の必要があるほ乳類は当業者によって認識され、予防の必要があるほ乳類も同様である。
【００６２】
本発明のもうひとつの目的は、炎症性障害の治療または予防の必要がある患者に治療上有効量のステアリドン酸を投与する方法を提供することにある。一つの好ましい具体例において、治療上の量は、炎症性サイトカインの血中濃度を下降させるのに有効な量を含む。一つの具体例において、炎症性サイトカインはＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを含む。もうひとつの具体例において、ダウンレギュレートされるのはＴＮＦ−αの濃度であり、さらにもうひとつの具体例においてＩＬ−１βの濃度がダウンレギュレートされる。
【００６３】
もう一つの具体例において、ＳＤＡの治療上の量は約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までの範囲にある。より好ましくは、ＳＤＡの治療上の量は約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までの範囲にある。さらにより好ましくは、ＳＤＡの治療上の量は約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までの範囲にある。最も好ましくは、ＳＤＡの治療上の量は約１．５ｇ／日である。投与されるＳＤＡの剤形および量は、ＥＰＡまたは予防的処方を要件とする公知の処置を参照して容易に確立し得る。前記したごとく、投与されるＳＤＡの量およびＳＤＡで炎症性障害を治療するための用量処方は様々な因子に依存し、かくして、広く変化するであろう。化合物を全身ではなく局所的に投与するのであれば、また、治療ではなく予防のためであれば、通常、用量は低めである。そのような処置は、必要の度に、また、担当医の判断により判断される時間、施される。当業者は、用量処方すなわちＳＤＡの治療上有効量は各個体につき最適化される必要があり、過度の実験なくして決定し得ることを理解するであろう。
【００６４】
本発明は、治療上有効量のＳＤＡを投与することによって炎症性サイトカインをダウンレギュレートする方法も提供する。ダウンレギュレートされる炎症性サイトカインはＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βを含む。そのような治療上有効量のＳＤＡは、ＳＤＡのレベルが上昇した食物の消費によりその必要があるほ乳類によって得られるであろう。
【００６５】
本発明は、さらに、ヒトにおいてエイコサペンタン酸のレベルを変更する方法であって、治療上有効量のステアリドン酸をヒトに投与し、ここに、ヒトはＳＤＡを代謝してＥＰＡにし、ＥＰＡのレベルの変更をもたらすことを特徴とする方法も提供する。ＥＰＡへのＳＤＡの代謝は２０：４（ｎ−３）脂肪酸への鎖延長に引き続きデルタ−５デサチュラーゼによる延長生成物の不飽和化を通じて発生する。さらに、ヒトへのＳＤＡの投与は「生理学的チャネリング」を利用し、ここに、ＳＤＡのＥＰＡおよびＤＨＡへの代謝は最終的に体内脂肪酸代謝によって制御される。かくして、この代謝制御はＥＰＡおよび／またはＤＨＡの直接投与によってもたらされるものよりも脂質プール中のＥＰＡおよびＤＨＡのより効果的な分散をもたらすようである。
【００６６】
一つの具体例において、変更されたＥＰＡレベルは組織に存在するものであり、赤血球リン脂質、血小板リン脂質、単核細胞リン脂質、血漿リン脂質、トリグリセリドおよびコレステロールのレベルよりなる群から選択される。しかしながら、ＥＰＡレベルは体内の他の細胞膜においても変更されるであろう。かくして、ここに列記したもの以下の組織において変更されたＥＰＡレベルも本発明の範囲に属することが意図される。
【００６７】
もうひとつの具体例において、ＥＰＡレベルを変更するために投与されるＳＤＡの治療上有効量は約０．１ｇ／日から約１０ｇ／日までの範囲にある。好ましくは、この治療上の量は約０．２５ｇ／日から約８ｇ／日までの範囲にある。より好ましくは、この治療上の量は約０．５ｇ／日から約５ｇ／日までの範囲にある。最も好ましくは、この治療上の量は約１．５ｇ／日である。
【００６８】
ＳＤＡの投与と背景技術のセクションで上記したもののごとき炎症性障害を治療するのに臨床的に用いられる他の療法とを組み合わせることも本発明の範囲に属することが意図される。例えば、ＳＤＡを副腎皮質ステロイドまたは免疫抑制剤と組み合わせて投与して、元来自己免疫的である炎症性障害を治療することができる。ＳＤＡは、抗炎症医薬またはＣＯＸ−ＩＩを抑制するために投与されるもののごとき栄養補給サプリメントと共に投与することができる。ＳＤＡは炎症性障害の治療に向けられない他の治療的処置と共に投与することもできる。
【００６９】
本発明は、対象中のＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの存在、不存在または量を決定するための対象由来の血液および／または組織の分析を含むアッセイも提供し；ここに、この分析は、すなわち、対象へのステアリドン酸（１８：４，ｎ−３）投与の前、最中および後に一緒に行う。本発明のアッセイは、ＳＤＡの消費と炎症性マーカー、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βとの間のリンクによって特徴付けられる。このリンクは、典型的な西洋料理を介して治療上有効量のＳＤＡを投与し、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βをダウンレギュレートすることができるという発見によって特徴付けられる。
【００７０】
対象においてＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１βの分析を行うことができ、そして、当業者は治療上の量のステアリドン酸の投与が必要か所望されるかを決定し得る。対象がすでにＳＤＡの処方計画にあれば、アッセイを用いて炎症性障害を治療または予防するのに要求されるＳＤＡの量を最適化することができる。明らかに、本出願人は、全般的に、ステアリドン酸の治療上有効量はＥＰＡの治療上有効量の約４倍に等しいことを決定した。一つの好ましい具体例において、アッセイを炎症性障害の治療または予防の必要がある対象に対して行う。次いで、この対象に、治療上有効量のステアリドン酸を含有するダイエットを与える。このアッセイは、治療上有効量のステアリドン酸の効力を決定するために再度当該対象に対して行うことができる。本発明のアッセイは、ＳＤＡの治療上有効量を決定するための実験または調査目的で用いることもできる。
【００７１】
本発明の他の特徴、目的および利点は当業者にとって明らかであろう。ここに提示された説明および例示は、他の当業者に本発明、その原理およびその実用アプリケーションを知らしめることを意図する。当業者は、多数の形態で本発明を採択し適用することができ、特別の使用の要求に最もよく適合させることができる。したがって、記載されている本発明の特定の具体例は本発明を包括したり制限したりすることを意図するものではない。
【００７２】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個別の刊行物および特許出願が出典明示することによって具体的かつ個別に表示されているかのごとく、本明細書に含まれるとみなされる。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は例示のためであって、限定するものではない。
【００７４】
実施例１
対象および方法：
正常脂質血であり、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）が２０ないし３０の範囲にある１９〜６５歳の４５人の男性および閉経後の女性を動員した。排除基準は、出血性障害、高血圧、炎症性障害、進行中の胃腸障害、低用量アスピリンの常用、週に２回を超えるレストランまたは持ち帰り夕食の消費、ｎ−３またはｎ−６脂肪酸富化食品サプリメントの使用、月に１回を超える魚料理の常食、および血漿リン脂質ＥＰＡ＋ＤＨＡレベル＞総脂肪酸の７．９％（実験群において到達したレベルは総脂肪酸の４．９±１．０％であった）。
対象を無作為に３群のうちの一つに割り振り、ＡＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡと命名した。
【００７５】
Ａ．実験計画
３週間のならし期間後、対象らは、カプセル中のエチルエステルとして提供されたＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡのいずれかを摂取した。３週間は０．７５ｇ／日、その後の３週間は１．５ｇ／日の摂取量であった。
【００７６】
【表１】
2005519939.tif 000002
【００７７】
各訪問にて、一晩の絶食後、血管穿刺によって３６ｍＬの血液を採取した。血液は以下の手順により様々なチューブに分割した。
【００７８】
Ｂ．細胞分離および脂肪酸分析
血液（２０ｍＬ）を４ｍＬの水中４．５％ＥＤＴＡおよび４ｍＬの通常の食塩水中６％デキストラン、ｐＨ７．０を含有するチューブに添加した。重力下、３７℃にて３０分間赤血球を沈降させた。白血球豊富血漿をＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ、密度１．０７７(Nycomed Pharma, Oslo)上に層状に広げ、１１０ｇにて１０分間遠心して白血球を血小板から分離した、それを取り除いた。勾配をさらに２００ｇにて２０分間遠心して、好中球を単核細胞から分離し、それを取り除いた。
【００７９】
［Mantzioiris et al., Am. J. Clin. Nutr., 72:42-8 (2000)］に記載されるようにして、脂肪酸分析用に試料を加工した。血漿、洗浄血小板および単核細胞のペレットを−８０℃にて保存した。赤血球ペレットを新鮮なうちにクロロホルム：イソプロパノール（２：１）で処理し、脂質抽出物を４℃にて保存した。血漿、血小板及び単核細胞のペレットをクロロホルム：メタノールで抽出した。細胞および血漿脂質抽出物を薄層クロマトグラフィーで分画した。細胞抽出物に関して、リン脂質画分を保持し、血漿抽出物に関して、リン脂質、コレステロールエステルおよびトリグリセリドの画分を保持した。これらをメタノール化（メタノール中１％Ｈ２ＳＯ４、７０℃にて３時間）によってエステル交換した。脂肪酸メチルエステルを分離し、ＢＰＸ−７０（０．２５μｍ膜厚；SGE Pty Ltd. Victoria, Australia）で被覆した５０ｍキャピラリーカラムを装着したＨＥＷＬＥＴＴ−ＰＡＣＫＡＲＤ  ６８９０ガスクロマトグラフィーで定量した（［Mantzioris et al., 上掲示］を参照）。脂肪酸標準物質はNuChek Prep Inc. (Elysan, MN)から入手し、Sigma Aldrich Pty Ltd. (Castle Hill, NSW, Australia)から入手したステアリドン酸が含まれる。全ての有機溶媒は抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシアニソール（０．００５％）を含有していた。
【００８０】
Ｃ．エイコサノイドおよびサイトカインの合成
血液（４ｍＬ）をヘパリン化チューブに添加し、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）を添加し（２００ｇ／ｍＬ）、その混合物を３７℃、５％ＣＯ２中、２４時間インキュベートした。血漿を収集し、［Mantzioris et al., 上掲示］に記載されるようにして、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によってプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）につき、ＥＬＩＳＡによってインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）につきアッセイした。
【００８１】
血液（４ｍＬ）を凝固管に収集し、３７℃にて１時間インキュベートし、記載されるようにして（［Mantzioris et al., 上掲］を参照）、ＲＩＡによってトロンボキサンＢ２（ＴＸＢ２）につきアッセイした。ＴＸＢ２は、ＴＸＡ２の安定加水分解生成物である。
【００８２】
Ｄ．血漿脂質
血液（４ｍＬ）をヘパリン化チューブに収集し、血漿総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロール、ならびに血漿トリグリセリドをロイヤル・アデレード病院(Royal Adlaide Hospital)／医学獣医学研究所(Institute of Medical and Veterinary Science; IMVS)の臨床診断研究室で測定した。
【００８３】
Ｅ．食事
対象に、食品ｎ−６脂肪酸を避けて、できるだけモノ不飽和（ｎ−９）脂肪酸に替えるように指示した。このパターンの摂取を可能にするために、対象には、全て低ｎ−６脂肪酸で高モノ不飽和（ｎ−９）脂肪酸のサラダドレッシング、調理油およびスプレッドを与えた。対象には、食事日記を与えて、指定日（平日および週末）に計測食物記録を付けるように指示した。
【００８４】
Ｆ．摂食
ダイエット／１プログラムを用いて、食事日記を分析して、多量栄養素（炭水化物、タンパク質、脂肪、アルコール、Ｐ：Ｓ比）摂取データを得た。このプログラムは、オーストラリアンＮＵＴ−ＴＡＢデータベースを利用する。この分析は、オメガ−６およびオメガ９脂肪酸についての摂取データも提供する。
【００８５】
Ｇ．統計解析
各群内の訪問間の比較に関し、反復測定ＡＮＯＶＡに引き続きニューマン・カウル多重比較試験を用いた（Kwikstat)。
【００８６】
実施例２
結果
基準ＢＭＩにおいて群間に統計学的有意差はなかった（表１）。対象は各訪問にて体重測定し、この試行の間、体重に有意な変化はなかった。
【００８７】
【表２】
2005519939.tif 000003
【００８８】
エネルギーおよび多量栄養素摂取に関する要約データを表２に示す。基準においていずれの群間にもエネルギーまたは多量栄養素摂取に有意差はなかった（食事記録期間１）。この実験の間（すなわち、食事記録期間１ないし３）、いずれの群にも、エネルギーまたは多量栄養素に統計学的に有意な変化はなかった。
【００８９】
【表３】
2005519939.tif 000004
【００９０】
返却されたカプセル計数を用いてカプセル摂取のコンプライアンスを評価した。コンプライアンスは高く、いずれの食事記録期間においても食事群の間で差はなかった（表４）。
【００９１】
【表４】
2005519939.tif 000005
【００９２】
脂肪酸に関して、基準にて、赤血球または血漿のＥＰＡ濃度または血漿リン脂質において、食事群の間で有意差はなかった。０．７５ｇ／日（第０ないし３週）または１．５ｇ／日（第３ないし６週）のＥＰＡまたはＳＤＡの摂取は、赤血球および血漿のリン脂質フラクション中のＥＰＡ濃度を著しく上昇させた（表５）。０．７５ｇ／日は違うが、１．５ｇ／日のＡＬＡの摂取がＥＰＡ濃度を著しく上昇させた（表５）。血小板および単核細胞のリン脂質、血漿コレステロールエステル、ならびに血漿トリグリセリドにおけるＥＰＡ濃度につき、同様の結果が観察された。
【００９３】
【表５】
2005519939.tif 000006
【００９４】
０．７５ｇ／日または１．５ｇ／日でのＥＰＡの摂取は、赤血球および血漿のリン脂質フラクションにおいてＤＰＡ濃度を著しく上昇させた（表６）。０．７５ｇ／日は違うが、１．５ｇ／日でのＳＤＡの摂取は、ＤＰＡ濃度を著しく上昇させた（表６）。血漿および単核細胞のリン脂質、血漿コレステロールエステル、ならびに血漿トリグリセリドにおけるＤＰＡ濃度につき、同様の結果が観察された。
【００９５】
【表６】
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【００９６】
いずれの用量にても食事試験脂肪酸は、基準に対して全くＤＨＡ濃度を上昇させなかった。より高い用量のＥＰＡおよびＡＬＡの摂取で赤血球ＤＨＡにわずかではあるが統計学的に有意な減少があった（表７）。さもなければ、全ての細胞型または血漿フラクションにおいてＤＨＡ濃度に有意な変化はなかった。ＡＬＡまたはＳＤＡの消費は組織中ＤＨＡの上昇をもたらさないことは当業者に通常知られており、それゆえ、ＳＤＡ投与がＤＨＡの上昇した組織レベルをもたらさないことは驚くべきことではない。
【００９７】
【表７】
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【００９８】
長鎖ｎ−３脂肪酸の組織中レベルを調べると、ＳＤＡは、ＥＰＡおよびＤＰＡを上昇させたが、ＤＨＡを上昇させなかった（図１）。このパターンはＥＰＡの摂取でもみられ、そこでは、ＥＰＡおよびＤＰＡの組織中レベルが上昇し、ＤＨＡレベルは下降した。１．５ｇ／日でのＥＰＡの摂取で、ＤＰＡは違うが、ＥＰＡの組織中レベルが著しく上昇した（図１）。
【００９９】
１．５ｇ／日用量にて、赤血球および血漿リン脂質におけるＥＰＡを上昇させることについて、ＳＤＡは、ＡＬＡよりも３．７ないし４．１倍も有効であり、ＥＰＡはＳＤＡよりも３．１ないし３．６倍も有効であった。
【０１００】
０．７５ｇ／日は違うが、１．５ｇ／日のＡＬＡまたはＳＤＡまたはＥＰＡで、ＬＰＳ刺激ＴＨＦ合成に統計学的に有意な減少があった（表８）。
【０１０１】
【表８】
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【０１０２】
０．７５ｇ／日または１．５ｇ／日のＳＤＡまたはＥＰＡの摂取はＬＰＳ刺激ＩＬ−１β合成を著しく減少させた。いずれの用量にても、ＡＬＡの影響はなかった（表９）。
【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
試験脂肪酸はＬＰＳ刺激ＰＧＥ２合成に対して持続効果を有しなかった。これは、ＡＬＡおよびＳＤＡで処理された群は０．７５ｇの試験物質の摂取後訪問３でＰＧＥ２に統計学的に有意な上昇を見せたが、１．５ｇ／日のいずれかの脂肪酸を与えられた患者においてＰＧＥ２に変化が見られなかったという事実から結論付けられる。いずれの用量にてもＥＰＡは効果がなかった。
【０１０５】
【表１０】
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【０１０６】
血液凝固中のＴＡＸ２合成は、いずれの試験脂肪酸にも影響されなかった。
絶食トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールまたはＨＤＬコレステロールにつきいずれの訪問にての群間にもいずれの群についての訪問間にも有意差はなかった。
本発明の詳細な説明および上記の実施例に鑑み、本発明のいくつかの局面が達成されていることが理解される。
【０１０７】
実施例３
Ｃ反応性タンパクのダウンレギュレーションに対するＳＤＡの有効性の臨床試験
正常脂質血であり、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）が２０ないし３０の範囲にある１９〜６５歳の約３５〜５０人の男性および閉経後の女性を動員した。排除基準は、出血性障害、高血圧、炎症性障害、進行中の胃腸障害、低用量アスピリンの常用、週に２回を超えるレストランまたは持ち帰り夕食の消費、ｎ−３またはｎ−６脂肪酸富化食品サプリメントの使用、月に１回を超える魚料理の常食、および血漿リン脂質ＥＰＡ＋ＤＨＡレベル＞総脂肪酸の７．９％（実験群において到達したレベルは総脂肪酸の４．９±１．０％であった）。対象を無作為に３群のうちの一つに割り振り、ＡＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡと命名した。
【０１０８】
Ａ．実験計画
３週間のならし期間後、対象らは、カプセル中のエチルエステルとして提供されたＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡのいずれかを摂取した。３週間は０．７５ｇ／日、その後の３週間は１．５ｇ／日の摂取量であった。各訪問にて、一晩の絶食後、血管穿刺によって血液を採取した。血液は以下の手順により様々なチューブに分割した。
【０１０９】
Ｂ．細胞分離および脂肪酸分析
血液（例えば、２０ｍＬ）を水中ＥＤＴＡおよび通常の食塩水中デキストラン、ｐＨ７．０を含有するチューブに添加した。重力下、３７℃にて３０分間赤血球を沈降させた。白血球豊富血漿をＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ、密度１．０７７(Nycomed Pharma, Oslo)上に層状に広げ、１１０ｇにて１０分間遠心して白血球を血小板から分離した、それを取り除いた。勾配をさらに遠心して、好中球を単核細胞から分離し、それを取り除いた。
【０１１０】
［Mantzioiris et al., Am. J. Clin. Nutr., 72:42-8 (2000)］に記載されるようにして、脂肪酸分析用に試料を加工した。血漿、洗浄血小板および単核細胞のペレットを凍結保存した。赤血球ペレットを新鮮なうちにクロロホルム：イソプロパノール（２：１）で処理し、脂質抽出物を４℃にて保存した。血漿、血小板および単核細胞のペレットをクロロホルム：メタノールで抽出した。細胞および血漿脂質抽出物を薄層クロマトグラフィーで分画した。細胞抽出物に関して、リン脂質画分を保持し、血漿抽出物に関して、リン脂質、コレステロールエステルおよびトリグリセリドの画分を保持した。これらをメタノール化（メタノール中１％Ｈ２ＳＯ４、７０℃にて３時間）によってエステル交換した。脂肪酸メチルエステルを分離し、ＢＰＸ−７０（０．２５μｍ膜厚；SGE Pty Ltd. Victoria, Australia）で被覆した５０ｍキャピラリーカラムを装着したＨＥＷＬＥＴＴ−ＰＡＣＫＡＲＤ  ６８９０ガスクロマトグラフィーで定量した（［Mantzioris et al., 上掲］を参照）。脂肪酸標準物質を（例えば、NuChek Prep Inc., Elysan, MNから）入手し、Sigma Aldrich Pty Ltd. (Castle Hill, NSW, Australia)から入手したステアリドン酸が含まれる。全ての有機溶媒は抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシアニソール（０．００５％）を含有していた。
【０１１１】
Ｃ．Ｃ反応性タンパクおよび血漿脂質分析
血漿Ｃ反応性タンパク（Ｈｓ−ＣＲＰ）は、ＢＮ ＩＩ分析器上でラテックス凝集比濁法を用いて分析し得る［Rifai et al., Clinical efficacy of an automated high-sensitivity C-reactive protein assay, Clin. Chem 199;45:2136］。あるいは、血液をヘパリン化チューブに添加し、細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）を添加し、その混合物を３７℃、５％ＣＯ２中、２４時間インキュベートした。血漿を収集し、［Mantzioris et al., 上掲］に記載される手順を用いて、ＥＬＩＳＡによってＣ反応性タンパクにつきアッセイした。
【０１１２】
血液（４ｍＬ）をヘパリン化チューブに収集し、血漿総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロール、ならびに血漿トリグリセリドを測定する。
【０１１３】
Ｄ．食事
対象に、食品ｎ−６脂肪酸を避けて、できるだけモノ不飽和（ｎ−９）脂肪酸に替えるように指示した。このパターンの摂取を可能にするために、対象には、全て低ｎ−６脂肪酸で高モノ不飽和（ｎ−９）脂肪酸のサラダドレッシング、調理油およびスプレッドを与えた。対象には、食事日記を与えて、指定日（平日および週末）に計測食物記録を付けるように指示した。
食事日記を分析して、多量栄養素（炭水化物、タンパク質、脂肪、アルコール、Ｐ：Ｓ比）摂取データを得た。このプログラムは、オーストラリアンＮＵＴ−ＴＡＢデータベースを利用する。この分析は、オメガ−６およびオメガ９脂肪酸についての摂取データも提供する。
【０１１４】
Ｅ．統計解析
各群内の訪問間の比較に関し、反復測定（ＡＮＯＶＡ）に引き続きニューマン・カウル多重比較試験を用いる（例えば、Kwikstat, TexaSoft, Cedar Hill, TX)。各訪問での群間の比較に関し、ＡＮＯＶＡに引き続きニューマン・カウル多重比較試験を用いる（Kwikstat)。
【０１１５】
Ｆ．結果の解析
試行中の体重変化につき、各訪問で対象を体重測定する。返却されたカプセル計数を用いて、カプセル摂取のコンプライアンスを評価した。赤血球または血漿のリン脂質におけるＥＰＡ濃度において食事群間で脂肪酸を分析する。０．７５ｇ／日（第０ないし３週）または１．５ｇ／日（第３ないし６週）でのＥＰＡ、ＡＬＡまたはＳＤＡの摂取の影響を、赤血球および血漿のリン脂質フラクション中のＥＰＡ濃度について決定する。赤血球および血漿のリン脂質のフラクションにおけるＤＰＡ濃度に対する影響も解析する。ＳＤＡ摂取とＣ反応性タンパクとの相関を解析し、ＳＤＡの投与がＣ反応性タンパクの減少をもたらすことを示す。
【０１１６】
本発明の詳細な説明および上記の実施例に鑑み、本発明のいくつかの局面が達成されていることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１Ａ】赤血球中の長鎖ｎ−３脂肪酸の変化を示すグラフ。
【図１Ｂ】血漿リン脂質中の長鎖ｎ−３脂肪酸の変化を示すグラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際調査報告】
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