(57)【要約】  本発明は、ＥＢＶ  ＬＭＰタンパク質（ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂを含む）の細胞外ドメインに対する抗体および抗体フラグメントを提供する。本発明はまた、これらのＬＭＰ特異的抗体を使用して、ＥＢＶ関連の悪性疾患を処置する方法を提供する。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ）の細胞外エピトープに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。前記ＬＭＰが、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂからなる群より選択される、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ）の細胞外エピトープに特異的に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
前記ＬＭＰが、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂからなる群より選択される、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
前記ＬＭＰがＬＰＭ１である、請求項２に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項４】
前記抗体または抗体フラグメントが、単鎖抗体、重鎖ドメイン、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ヒト化抗体、ヒト抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
安定な免疫原性エプスタインバーウイルス潜伏期膜タンパク質（ＥＢＶ  ＬＭＰ）含有プロテオリポソームであって、該プロテオリポソームは、球状もしくは楕円形の形状の基材を含み、ここで、ＥＢＶ  ＬＭＰ中の部位に結合するリガンドが、該基材に係留され、そして該基材表面は、（１）脂質膜および（２）該リガンドに結合したＥＢＶ  ＬＭＰによって取り囲まれ、ここで、該ＥＢＶ  ＬＭＰの少なくとも１つの膜貫通ドメインが、該脂質膜中に存在する、プロテオリポソーム。
【請求項６】
前記リガンドが、前記ＬＭＰ中の部位に結合する抗体である、請求項５に記載の安定な免疫原性ＥＢＶ  ＬＭＰ含有プロテオリポソーム。
【請求項７】
前記ＬＭＰが、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡまたはＬＭＰ２Ｂである、請求項５に記載の安定な免疫原性ＥＢＶ  ＬＭＰ含有プロテオリポソーム。
【請求項８】
ＬＭＰに対する抗体を得る方法であって、
請求項５に記載の免疫原性ＥＢＶ  ＬＭＰ含有プロテオリポソームを用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程、および
該プロテオリポソームに結合する抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記抗体ライブラリーが、ヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫反応を生じる方法であって、該方法は、請求項１に記載の抗体を、ＥＢＶ感染細胞を有する個体に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、悪性疾患、ホジキン病、慢性ＥＢＶ症候群および口腔ヘアリーセル白斑症からなる群より選択されるＥＢＶ関連疾患を有する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＥＢＶ関連悪性疾患は、バーキットリンパ腫、リンパ増殖疾患、Ｂリンパ増殖疾患、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｔ−ＮＨＬ、ＮＫ−ＮＨＬ、リンパ鼻咽頭癌および胃癌からなる群より選択される、方法。
【請求項１２】
ＥＢＶ感染細胞内のＬＭＰタンパク質を標的化する方法であって、該方法は、請求項１に記載の抗体をＥＢＶ感染細胞に投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、細胞内保持配列をさらに含む、方法。
【請求項１３】
ＥＢＶ感染細胞内のＬＭＰを標的化する方法であって、該方法は、ＥＢＶ感染細胞を有する個体に、請求項１に記載の抗体をコードする核酸カセットを投与する工程を包含し、ここで、該抗体は、細胞内保持配列をさらに含む、方法。
【請求項１４】
ＥＢＶ関連悪性疾患の危険性のある個体を処置する方法であって、該方法は、ＬＭＰ相互作用をブロックするのに有効な量の請求項１に記載の抗体を、ＥＢＶ感染細胞を有する個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
ＥＢＶ関連悪性疾患を有する個体を処置する方法であって、該方法は、有効量の請求項１に記載の抗体を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
ＥＢＶ関連悪性疾患を有する個体を処置する方法であって、該方法は、有効量の、細胞傷害性部分に結合した請求項１に記載の抗体を、該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの抗体重鎖結合領域をコードする第一の遺伝子セグメント、ならびに部分的にかまたは全体的に、免疫細胞誘発分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、そして必要に応じて細胞外ドメインをコードする第二の遺伝子セグメントを含むキメラ遺伝子であって、該キメラ遺伝子は、免疫細胞へのトランスフェクションの際に、抗体認識部位および免疫細胞誘発部分を１つの連続する鎖に発現する、キメラ遺伝子。
【請求項１８】
前記第一の遺伝子セグメントが、単鎖抗体をコードする、請求項１７に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１９】
請求項１７に記載のキメラ遺伝子であって、前記第二の遺伝子セグメントが、リンパ球レセプター鎖、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のポリペプチド、Ｆｃレセプターのサブユニット、またはＩＬ−２レセプターのサブユニットからなる群より選択される、キメラ遺伝子。
【請求項２０】
請求項１７に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
ＥＢＶ  ＬＭＰに対する抗体特異性を与えられた免疫細胞であって、該免疫細胞は、請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換されている、免疫細胞。
【請求項２２】
請求項１７に記載のキメラ遺伝子を含む、ＥＢＶ  ＬＭＰに対する抗体特異性を与えられた、免疫細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の免疫細胞であって、該免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞、リンホカイン活性化細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびこれらのサブタイプからなる群より選択される、免疫細胞。
【請求項２４】
請求項２３に記載の免疫細胞であって、該免疫細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞である、免疫細胞。
【請求項２５】
ＥＢＶ感染細胞を有する個体において、免疫反応を生じる方法であって、該方法は、請求項２１に記載の免疫細胞を標的化するために、該免疫細胞を、ＬＭＰを発現する該個体の細胞に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、悪性疾患、ホジキン病、慢性ＥＢＶ症候群および口腔ヘアリーセル白斑症からなる群より選択されるＥＢＶ関連疾患を有する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記ＥＢＶ関連悪性疾患は、バーキットリンパ腫、リンパ増殖疾患、Ｂリンパ増殖疾患、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｔ−ＮＨＬ、ＮＫ−ＮＨＬ、リンパ鼻咽頭癌および胃癌からなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記個体のＬＭＰを発現する細胞への前記免疫細胞の結合が、該ＬＭＰ発現細胞の細胞傷害性免疫応答を生じる、方法。
【請求項２８】
ＥＢＶ関連悪性疾患の危険性のある個体を処置する方法であって、該方法は、ＥＢＶ感染細胞を有する個体に、有効量の請求項２１に記載の免疫細胞を投与して、該個体のＬＭＰ発現細胞に対して該免疫細胞を標的化する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
ＥＢＶ関連悪性疾患を有する個体を処置する方法であって、該方法は、有効量の請求項２１に記載の免疫細胞を該個体に投与して、該個体のＬＭＰ発現細胞に対して該免疫細胞を標的化する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
ＥＢＶ関連悪性疾患を有する個体を処置する方法であって、該方法は、請求項１８に記載のキメラ遺伝子を用いて該個体のリンパ球を形質転換する工程、および該形質転換され、従って、活性化された細胞を該個体に投与する工程であって、該細胞が、該個体のＬＭＰ発現細胞に対して標的化される、工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、潜伏期膜タンパク質（ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）１（ＬＭＰ１）および２（ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂ）に対する抗体ならびにそれらの抗原性フラグメントに対する抗体、およびより詳細には、ＬＭＰ１タンパク質の細胞外膜貫通ループに対する抗体に関する。本発明はさらに、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）により引き起こされる疾患の予防および処置におけるこれらの抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
潜伏期膜タンパク質１（ＬＭＰ１）オンコジーンは、潜伏期間の間にエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に感染した細胞の表面上に発現される抗原の群に属し、最も重要なＥＢＶ形質転換タンパク質の１つであると考えられる［Ｍｅｉｊら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９：１１０８−１５，１９９９］。ＬＭＰ１は、ＥＢＶ抗原の群に属する。この抗原群の現在公知のメンバーとしては、２つのＥＢＶコード化された非コーディングＲＮＡ（ＥＢＥＲ１、２）、６つのエプスタインバー核抗原（ＥＢＮＡ１、２、３ａ、３ｂ、ＬＰ）、および３つの潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ１、２Ａ、２Ｂ）が挙げられる［同書］。
【０００３】
ＬＭＰ１タンパク質は、転写活性化に関与する短い細胞質アミノ酸末端を有する。カルボキシ末端は、原形質膜に隣接した領域であるＣ末端活性化領域１（ＣＴＡＲ１）領域を含み、これは、ＰＸＱＴＸ（配列番号１）のコアＴＲＡＦタンパク質結合モチーフ、および腫瘍壊死因子関連細胞死誘導領域タンパク質（ＴＲＡＤＤ）およびレセプター相互作用タンパク質（ＲＩＰ）結合について、最も外側のＣＴＡＲ２領域を含む。これらの機能的ドメインに加えて、ＬＭＰ１はまた、３つの原形質膜貫通ドメイン（これらは、細胞外間隙に短いループを露出する）を含む［Ｋｎｅｃｈｔら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６０：２８９−３０２，２００１］。これらの短いループは、感染細胞の表面上に存在するが、ＬＭＰ１オンコジーンは、非常に低い免疫原性を有することが公知である［Ｍｅｉｊら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１７９：１１０８−１５，１９９９］。これは、それに対する抗体の発達を妨害する。さらに、ＬＭＰ１の細胞外ループは、膜貫通ドメインの一部である。ＬＭＰ１の膜会合は、組換え抗原に対する抗体の産生を困難にする。なぜなら、このような組換え抗原は、それら自体を、ネイティブな膜結合構造に提示しないからである。
【０００４】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、γ−ヘルペスウイルスに属し、そしてそれは、種々の悪性および良性リンパ増殖性障害と関連している［Ｌｉｅｂｏｗｉｔｚ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３８：１４１３−２１（１９９８）］。それは、感染性単核細胞症の病因性因子である。それはまた、免疫無防備状態個体において、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、鼻咽頭癌、および免疫芽球性Ｂ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））のような悪性疾患と強く関連している。ＥＢＶはまた、ホジキン病（ＨＤ）の大部分の割合、特定のタイプのＴ細胞ＮＨＬ患者およびＮＫ（ナチュラルキラー）細胞ＮＨＬ患者（Ｔ−ＮＨＬおよびＢ−ＮＨＬ）、ならびに胃癌患者で検出されている。そのヒト悪性疾患の関連に加えて、ＥＢＶはまた、慢性ＥＢＶ症候群と集合的に呼ばれる範囲の疾患、およびＡＩＤＳに罹患した患者において主に見られる口腔ヘアリーセル白斑症（ｏｒａｌ  ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａ）と関連している。
【０００５】
ウイルス潜伏期間の遺伝子発現および表面抗原の発現に基づいて、３つの主要なタイプのＥＢＶ潜伏が特徴付けられている。タイプＩ潜伏では、ＥＢＶ感染細胞は、ＥＢＮＡ−１ならびにＥＢＥＲ１および２を発現し、そしてこの疾患は、通常、表現型的にはＢＬを表す。タイプＩＩ潜伏は、鼻咽頭癌、ホジキン病、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫において、ならびに免疫応答性患者において見られ、そしてＥＢＮＡ１、ＥＢＥＲ１およびＥＢＥＲ２、ならびにＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂの発現によって特徴付けられる。タイプＩＩ潜伏（ここでは、全ての遺伝子産物が発現されている）は、免疫無防備状態患者のＢ−ＮＨＬにおいて見られる。
【０００６】
多くの場合、ＥＢＶ感染は、一時的にのみ衰弱し得るリンパ増殖性疾患を生じる。しかし、免疫抑制個体では、この結果は、末期の悪性疾患であり得る。これは、故意に免疫抑制された個体（特に、シクロスポリンＡで処置された臓器移植を受けた小児）、または日和見的に免疫抑制された個体（ＥＢＶに感染した個体の場合）、または遺伝的に免疫抑制された個体（ＸＬＰ（Ｘ染色体連鎖リンパ増殖性症候群（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）遺伝子を保有する罹患男性の場合）において生じる。これらの場合、生じた悪性疾患は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞のポリクローナル増殖に由来する。さらに、このような患者において、ウイルスの制御されない上皮複製は、口腔毛髪状白斑症の病巣において検出可能である。従って、免疫応答は、ＥＢＶ感染の制御において中心的な役割を果たしている。
【０００７】
ＥＢＶに対するワクチン接種は、ＥＢＶについてセロネガティブであるヒトのいくつかの群において有用であり得る。これらとしては、骨髄移植または臓器移植を受けている患者、Ｘ染色体連鎖リンパ増殖性疾患に罹患した人々、バーキットリンパ腫の高い発症率を有する地域（赤道アフリカ）または鼻咽頭癌の高い発症率を有する地域（中国南部）の人々、および感染性単核細胞症の危険性のある青年および成人が挙げられる。
【０００８】
ＢＬおよび他のＥＢＶ関連悪性疾患の現在の処置は、化学療法（例えば、シクロホスファミド）および／または放射線療法を含む。放射線療法は、特に、ＡＩＤＳに罹患した患者において、頻繁に使用される。なぜなら、化学療法単独では、まれにしか成功しないからである。しかし、これらの処置は、迅速に分裂する細胞の特異的でない全体的な破壊に集中され、多数の望ましくない副作用と関連する。
【０００９】
いくつかの抗Ｂ細胞抗体（例えば、ＣＤ２１に対するモノクローナル抗体（ＥＢＶレセプター）、ＣＤ２４に対するモノクローナル抗体（ｐａｎ−Ｂ細胞抗体）、およびＣＤ２０に対するモノクローナル抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ  ｏｎｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．より入手可能））が、最近導入されている［Ｃｏｈｅｎ  Ｊ．Ｉ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：４８１−４９２，２０００；Ｂｅｎｋｅｒｒｏｕら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：３１３７−４７（１９９８）］。しかし、Ｂ細胞特異的であるが、それらは、ＥＢＶ感染のＢ細胞と未感染のＢ細胞とを区別せず、そしてそれらの使用は、このような表面抗原を有する全てのＢ細胞の破壊を生じる。従って、ＥＢＶ感染細胞に対して特異的であり、ＥＢＶ感染細胞に感染した標的に特異的に十分な免疫応答を惹起する抗体を開発することが望ましい。また、ＥＢＶによって感染された細胞を決定するための新規な手段、および異なる疾患状態の間を識別するために使用され得る手段を有することも望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明者らは、ＥＢＶ  ＬＭＰタンパク質（ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、およびＬＭＰ２Ｂを含む）の細胞外ドメインに対して指向される抗体および抗体フラグメントをここで見出した。ＬＭＰ１に対する抗体の生成が好ましい。しかし、同じ方法論が、３つのタンパク質全てに対して使用され得る。本発明者らはまた、これらのＬＭＰ特異的抗体を用いて、ＥＢＶ関連悪性疾患を処置する方法を見出した。例えば、これらの抗体は、細胞内でＬＭＰ１タンパク質に結合し、タンパク質の機能を阻害するように、細胞内でさらに発現され得る。本発明者らはまた、ＬＭＰに対して特異性を有する免疫細胞（細胞傷害性Ｔ細胞を含む）を生成する方法を見出した。本発明者らはまた、これらのＬＭＰ特異的免疫細胞を用いて、ＥＢＶ関連悪性疾患を処置する方法を見出した。本発明者らは、免疫応答を惹起することにおいて（例えば、ワクチン処方において）、抗原性フラグメント（例えば、ＬＭＰ１の抗原性フラグメント）を使用する方法をさらに見出した。
【００１１】
本発明の一実施形態は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）潜伏期膜タンパク質（ＬＭＰ）に結合する抗体または抗体フラグメントを提供する。好ましくは、この抗体は、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、またはＬＭＰ２Ｂに、さらにより好ましくは、ＬＭＰ１に結合する。好ましい実施形態では、抗体は、ＬＭＰ１の細胞外ドメインである抗原性フラグメントに結合する。より好ましい実施形態では、抗原性フラグメントは、ＬＭＰ１のアミノ酸１〜２０７である。好ましくは、抗体は、単鎖抗体、単鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ、時にｓＦｖとも呼ばれる）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＬＭＰを含む免疫原性プロテオリポソームを提供する。好ましくは、プロテオリポソームは、ＬＭＰ１の細胞外ドメインの少なくとも１つの抗原性エピトープを含む。好ましい実施形態では、プロテオリポソームは、ＬＭＰ１の細胞外ドメイン（これは、例えば、ＬＭＰ１のアミノ酸１〜２０７を用いて容易に調製され得る）を含む。好ましくは、プロテオリポソームは、使用される特定のＬＭＰの細胞外ドメイン全体を含む。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＬＭＰを含有するプロテオリポソームを用いて抗体のライブラリーをスクリーニングし、そしてプロテオリポソームに結合する抗体を選択することにより、ＬＭＰ特異的抗体を得る方法を提供する。好ましくは、抗体のライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、さらにより好ましくは、ヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーである。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に、ＬＭＰ（例えば、ＬＭＰ１）の抗原性フラグメントに対する抗体または抗体フラグメントと、抗体に結合された第二部分（例えば、細胞傷害性分子）とを含む複合体を含む薬学的組成物に関する。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＥＢＶ関連疾患を処置する方法に関する。好ましいＥＢＶ関連疾患としては、ＥＢＶ関連悪性疾患、ホジキン病、慢性ＥＢＶ症候群、および口腔ヘアリーセル白斑症が挙げられる。好ましくは、ＥＢＶ関連悪性疾患としては、バーキットリンパ腫、リンパ増殖性疾患、Ｂリンパ増殖性疾患、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｔ−ＮＨＬ、ＮＫ−ＮＨＬ、リンパ鼻咽頭癌、および胃癌が挙げられる。
【００１６】
１つの好ましい実施形態は、薬学的に受容可能なキャリア中のＬＭＰ（例えば、ＬＭＰ１）の抗原性フラグメントに対する抗体または抗体フラグメントを、ＥＢＶに感染した個体に投与する工程を包含する。１つの実施形態では、この個体は、ＥＢＶ感染細胞を有し、より好ましくは、ＥＢＶ関連悪性疾患を有する。１つの好ましい化合物は、抗体に結合された第二部分（例えば、細胞傷害性分子）をさらに含む。
【００１７】
なお別の実施形態では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中で少なくとも１つのＬＭＰタンパク質（例えば、ＬＭＰ１）またはその抗原性フラグメントの免疫応答惹起量を用いてＥＢＶ感染に対して個体をワクチン接種する方法に関する。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＬＭＰに特異的に結合する少なくとも抗体重鎖結合領域（例えば、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ）をコードするある遺伝子セグメント、および免疫細胞誘発分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの一部または全体をコードする第二の遺伝子セグメントを含むキメラ遺伝子を提供する。より好ましくは、第一の遺伝子セグメントは、軽鎖結合領域および重鎖結合領域の両方をコードする（例えば、単鎖抗体）。このようなキメラ遺伝子は、抗体認識部位と、リンパ球シグナル伝達部分とを、１つの連続した鎖に合わせ、そしてこのキメラ遺伝子で形質転換されたリンパ球に抗体タイプ特異性を与える。好ましくは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの両方が存在するが、細胞質ドメインを欠失することも可能である。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、抗体結合領域はｓｃＦｖである。
【００２０】
１つの好ましい実施形態において、免疫細胞誘発分子は、リンパ球レセプター鎖、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のポリペプチド、ＦｃレセプターのサブユニットまたはＩＬ−２レセプターのサブユニットである。なおより好ましくは、Ｔ細胞レセプターの鎖である。なおより好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞レセプターである。
【００２１】
別の好ましい実施形態は、ＬＭＰ特異的抗体の重鎖結合領域と免疫細胞誘発分子とを兼ね備えるキメラ遺伝子を含む、発現ベクターを提供する。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＬＭＰ特異的抗体の結合領域と免疫細胞誘発分子とを兼ね備えるキメラ遺伝子を形質転換した、ＬＭＰ特異的免疫細胞を提供する。好ましくは、この免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞、リンホカイン活性化細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞またはこれらのサブタイプである。なおより好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＬＭＰ特異的ｓｃＦｖと免疫細胞誘発分子とを兼ね備えるキメラ遺伝子を発現する免疫細胞を投与することによってＥＢＶ関連疾患を処置する方法を提供する。好ましくは、ＥＢＶ関連悪性腫瘍である。好ましくは、キメラ遺伝子を発現する免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。好ましくは、ＬＭＰ発現標的細胞への免疫細胞の結合は、標的細胞の細胞死をもたらす。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＬＭＰ特異的抗体の重鎖結合領域と免疫細胞誘発分子とを兼ね備えるキメラ遺伝子は、ＥＢＶに感染した個体のリンパ球に形質転換され、そして形質転換され、従って活性化された細胞がこの個体に投与される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂを含む、ＥＢＶ  ＬＭＰタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体および抗体フラグメントに関する。ＬＭＰ１に対する抗体を作製することが好ましい。しかし、同様の方法論が３つ全てのタンパク質について使用され得る。本発明者らはまた、これらのＬＭＰ特異的抗体を使用してＥＢＶ関連悪性腫瘍を処置する方法を見出した。例えば、これらの抗体はさらに、細胞内に発現され、細胞内のＬＭＰ１タンパク質に結合し、そしてこのタンパク質の機能を阻害し得る。本発明者らはまた、ＬＭＰに対して特異性を有する免疫細胞（細胞傷害性Ｔ細胞を含む）を作製する方法を見出した。本発明者らはまた、これらのＬＭＰ特異的免疫細胞を使用してＥＢＶ関連悪性腫瘍を処置する方法を見出した。本発明者らはさらに、免疫応答を惹起する際の（例えば、ワクチンの処方物において）、例えばＬＭＰ１の抗原性フラグメントを使用する方法を見出した。
【００２６】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、ＬＭＰの細胞外エピトープを認識する。好ましくは、ＬＭＰはＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡまたはＬＭＰ２Ｂである。なおより好ましくは、ＬＭＰ１である。
【００２７】
本発明の抗体および抗体フラグメントとしては、単鎖抗体、単鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ、ときどきｓＦｖとも呼ばれる）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、重鎖単一ドメイン（ｄＡｂ）、ヒト化抗体、ヒト抗体およびキメラ抗体が挙げられる。１つの好ましい抗体は、ｓｃＦｖ抗体である。なおより好ましくはヒトｓｃＦｖである。
【００２８】
ＬＭＰ特異的抗体を作製し得る、任意の抗原または抗原決定基を使用して、このような抗体を作製し得る。好ましい抗原としては、以下に記載されるような、ＬＭＰ含有プロテオリポソームが挙げられる。
【００２９】
好ましくは、抗原決定基は、ＬＭＰ１のような野生型（すなわち、ネイティブの）ＬＭＰに近似するコンフォメーションを有する。本発明はさらに、ＬＭＰ（例えば、ＬＭＰ１タンパク質またはその誘導体）のエピトープを特異的に認識し得、かつそれらに結合し得る、抗体またはそれらのフラグメントに関する。
【００３０】
１つの好ましい実施形態において、抗原決定基は、ＬＭＰ１の細胞外ループの部分である。例えば、抗原決定基は、おおよそＬＭＰ１のアミノ酸１〜２０７から作製され得る。この構築物は、細胞質のＮ末端、６回膜貫通ドメインおよびＣ末端テールの２０アミノ酸を含む。明らかに、他の改変体も作製され得る。例えば、Ｃ末端テールは、他の位置が改変され得るように、改変され得る。好ましくは、改変は、ネイティブの抗原性エピトープを強調するように設計される。より好ましくは、ＥＢＶ株のうちの保存されたエピトープである。
【００３１】
本発明にしたがって有用なＬＭＰ抗原としては、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）、ＬＭＰ２ＡおよびＬＭＰ２Ｂならびにこれらの抗原フラグメントが挙げられる。好ましい実施形態において、抗原はＬＭＰ１である。好ましくは、抗原はＬＭＰ１の少なくとも１つの細胞外ループを含む。抗体を作製する１つの好ましい方法は、ＬＭＰ１のようなＬＭＰタンパク質の抗原決定基を含むプロテオリポソームを調製することである。エピトープは、好ましくは野生型のコンフォメーションと近似するコンフォメーションにある。これは、本開示に基づいて、公知の手段によりなされ得る。以下に記載される基本的な方法論が、全てのＬＭＰについて使用され得る。
【００３２】
抗体を作製するための抗原性物質の１つの供給源は、ＬＭＰを含むプロテオリポソームである。ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２０、ＰＣＴ／ＵＳ００／３５２９５およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／７４９，２４０（これらは本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、ＬＭＰのような膜貫通タンパク質を含むタンパク質を発現するための１つの方法はプロテオリポソームの使用である。
【００３３】
ＬＭＰを含むプロテオリポソームを調製するために、以下に記載されるように、ＬＭＰの所望の部分を発現するベクターを、宿主細胞内に発現させる。次いで、ＬＭＰ発現細胞は、このタンパク質を害することなく、好ましくはタンパク質のネイティブのコンフォメーションを崩壊することなく、従来の方法で他の細胞砕片からＬＭＰを分離し得るような、適切な界面活性剤おおよびプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液中で溶解される。
【００３４】
一般的に、これらの両親媒性特性に起因して、膜貫通タンパク質は、疎水性会合を崩壊させ、そして、膜の脂質二重層を破壊する薬剤のみによって可溶化され得る。代表的に使用される薬剤は、水中でミセルを形成することが多い、両親媒性低分子である。好ましくは、この薬剤は界面活性剤である。膜と混合される場合、この界面活性剤の疎水性領域は、タンパク質の膜貫通ドメインに結合し、脂質分子を置換する。界面活性剤の極性末端は、荷電されるか（イオン性）、または荷電されないか（非イオン性）のいずれかであり得る。内在性膜タンパク質は界面活性剤溶液中でネイティブなコンフォメーションを維持し得るが、時間が経つと、多くのこのような可溶化タンパク質は、変性および凝集を起こす。
【００３５】
リン脂質の不在下で、界面活性剤が膜貫通タンパク質−界面活性剤の複合体から除去される場合、膜タンパク質分子は通常、変性し、凝集し、そして溶液から沈殿する。しかし、界面活性剤が除去される前に精製タンパク質がリン脂質と混合される場合、活性タンパク質を、リン脂質により形成される脂質二重層に挿入し得る。このようにして、機能的に活性な膜タンパク質は、精製成分から再構成され得る。そのネイティブの脂質環境中で適切に再構成された内在性膜タンパク質は、長期にわたって安定である。
【００３６】
さらに、精製の間にＬＭＰ膜貫通タンパク質の機能的なネイティブのコンフォメーションを維持するための重要な因子は、タンパク質を可溶化するのに使用される界面活性剤の選択である。所定の膜タンパク質に最も適した界面活性剤は、代表的には経験的に決定される。タンパク質が以前に研究されている場合、文献は、好首尾の界面活性剤を示す。さらに、他のタンパク質でも好首尾の界面活性剤を決定するために、関連タンパク質について得られた結果を頼りにし得る。このようにして、関連タンパク質についての研究は、活性化形態でそのタンパク質を抽出する可能性が最も高い、界面活性剤の型を示す。
【００３７】
界面活性剤は、その極性末端の性質に依存して、一般に３群に分類され得る：非イオン性、双性イオン性およびイオン性。強イオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）は、たいていの膜タンパク質を可溶化し得るが、そのプロセスにおいてそのタンパク質をほどく傾向があり、活性なコンフォメーションを再構成するのにあまり有用でなくする。一般的に、より穏かな非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００３８】
膜タンパク質の穏かな可溶化のために推奨される界面活性剤としては、アルキルグルコピラノシド（例えば、Ｃ８−ＧＰおよびＣ９−ＧＰ）、アルキルチオグルコピラノシド（例えば、Ｃ８−ｔＧＰ、Ｃ１０−Ｍ、Ｃ１２−Ｍ、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６およびＣｙｍａｌ−７）、アルキルスクロース（例えば、ＨＥＣＡＭＥＧ）、ＣＨＡＰＳＯ、ジギトニン、ヒドロキシエチルグルカミド（例えば、ＨＥＧＡ−１０）、オリゴエチレングリコール誘導体（例えば、Ｃ８Ｅ５、Ｃ８ＥｎおよびＣ１２Ｅ８）、ドデシルマルトピラノシドおよびフェニルポリオキシエチレン（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）が挙げられる。
【００３９】
好ましい界面活性剤としては、アクリルチオグルコピラノシド、ドデシルマルトピラノシド（ｄｏｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｐｙｐａｎｏｓｉｄｅ）およびフェニルポリオキシエチデンが挙げられる。さらに好ましくは、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｃｙｍａｌ−７、ＨＥＧＡ−１０、ジギトニン、ＣＨＡＰＳＯ、ドデシルマルトピラノシドおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が挙げられる。なおさらに好ましくは、Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｃｙｍａｌ−７およびドデシルマルトピラノシドが挙げられる。
【００４０】
市販のキットはまた、所与の膜タンパク質にふさわしい界面活性剤の選択を助ける際に有効である。例えば、ＡｎａｔｒａｃｅおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍの両方は、異なる界面活性剤の混合物を含む種々のキットを提供する。
【００４１】
機能的に活性な膜タンパク質を精製するために首尾よく使用されている界面活性剤の多くの公知の例が存在する。例えば、ドデシルマルトシドを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓからＫ＋チャネル（Ｋｓｃ  Ｋ＋）を精製するために使用し、その構造をＸ線結晶学によって決定することができた（Ｄｏｙｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：６９−７７）。Ｃｙｍａｌ−５、Ｃｙｍａｌ−６、Ｃｙｍａｌ−７およびドデシルマルトピラノシドは、ＧＣＰＲについての好ましい界面活性剤であり、ケモカインレセプターについてより好ましい（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ｔ．ら（１９９９）、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２８７４５−５０）。
【００４２】
可溶化されたＬＭＰ膜タンパク質のすべておよび他の水溶性細胞タンパク質を含む清澄な細胞溶解物は、従来の方法（例えば、高速遠心分離（例えば、１５０，０００×ｇ））によって他の細胞組織片から分離され得る。目的のタンパク質上のエピトープタグに対する抗体は、固体支持体（例えば、ビーズ）上に細胞溶解物に由来するこのタンパク質を捕獲するために使用される。固体支持体上に固定された抗体への可溶化された完全な膜タンパク質の結合の後、その固体支持体は、洗浄される。その後、精製された界面活性剤−タンパク質混合物は、以下に記載されるようなプロテオリポソームに形成される。
【００４３】
このプロテオリポソームは、球状または楕円形（ｅｌｌｉｐｔｏｉｄ）（例えば、ビーズまたは他のペレット）を含む。好ましくは、そのビーズまたはペレットは、真核生物細胞の大きさの少なくとも約１５％であり；なおさらに好ましくは、そのような細胞の大きさの少なくとも約２０％であり；そしてなお一層さらに好ましくはそのような細胞の大きさの約２５％である。その形態は、三次元であり、その結果、それはすべての面をコーティングされ得る。しかし、使用される正確な形態における実質的な可変性が存在し得る。選択される正確な形態は、プロテオリポソームが使用される方法に依存する。従って、いくつかの実施形態において、薄片は、ビーズ（例えば、免疫原として）について好ましく、他の実施形態においては、より薄い楕円形が好ましい。
【００４４】
球状または楕円形（例えば、ビーズ）はまた、好ましくは脂質層に引きつけるかまたは付着するのを助ける物質でコーティングされる。例えば、ビーズのような球状または楕円形をコーティングするためにストレプトアビジンまたはアビジンのような化合物を使用し得、そして脂質混合物に少量のビオチン化脂質を加え得る。例えば、脂質を含む溶液中の先端基を改変した合成脂質（例えば、ジパルミトイルホスホエタノールアミン−Ｎ−ビオチニル（ビオチニル−ＤＰＰＥ）またはジオケオイルホスホエタノールアミン−リサミンローダミンＢ（Ｒｈｏ−ＤＯＰＥ））を使用し得る。このような混合物は、例えば、ストレプトアビジンコーティングビーズに対して均質の強いコーティングを形成する。
【００４５】
球状または楕円形（例えば、ビーズ）はまた、ビーズに結合するべき、抗原性タグまたは完全な膜タンパク質の公知の特定部分のいずれかに特異的に結合する、球状または楕円形に結合されるアンカーリガンド（例えば、抗体）を有し、それによってタンパク質を正しい方向に置く。ビオチン化脂質を含む脂質溶液は、目的の捕獲したタンパク質とともにビーズに添加される。その後、界面活性剤は、公知の方法（例えば、透析によって、例えば少なくとも２４時間で）によってゆっくりと除去される。生じた完全な膜タンパク質含有プロテオリポソームは、長時間内、安定である。本明細書に使用されるように、長時間は、少なくとも１２時間を意味し；さおさらに好ましくは、少なくとも１日；なお一層さらに好ましくは、少なくとも１週間；なお好ましくは、少なくとも１ヶ月；そしてなお一層さらに好ましくは、少なくとも２ヶ月を意味する。タンパク質は、長時間これらのプロテオリポソームにおいてコンフォメーションを保持するだけでなく、広範な条件（例えば、ＰＨおよび温度）下でもそうである。
【００４６】
好ましくは、使用される球状または楕円表面は、磁性ビーズである。磁性ビーズは、当該分野で周知であり、かつ市販され得る。例えば、トシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−（Ｂｉｋｋｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｔｒｕｍｐｐ−Ｋａｌｌｍｅｙｅｒ，Ｓ．およびＨｕｍｂｌｅｔ，Ｃ．１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，２９１１−２９２７）０（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。これらは、タンパク質の精製を助ける際に特に有用である。中間体としてこのようなプロテオリポソームを使用し得、そして別の表面（例えば、薄片）に安定化されたプロテオリポソームを転移し得る。個体に注入するためのプロテオリポソームを使用する場合、その表面は、生分解性物質で作製されることが好まれる。
【００４７】
プロテオリポソームは、代表的に目的の完全な膜タンパク質のみを含む場合、１つ以上のタンパク質の使用を欲し得る例が存在する。例えば、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡまたはＬＭＰ２Ｂの異なるエピトープを含む混合物を調製し得るか、あるいはＬＭＰ１抗原性フラグメントまたは例えば他のＥＢＶウイルスタンパク質と共にＬＭＰ２Ａ抗原性フラグメントおよびＬＭＰ２Ｂ抗原性フラグメントを使用し得る。これは、Ｃ末端で同じエピトープでタンパク質をタギングすることおよび適切なタグ反応性抗体でビーズを調整することによって容易になされ得る。あるいは、そのタンパク質は、異なるタグでタギングされ得、そして異なる抗体の混合物を有するビーズを調製し得る。これは、プロテオリポソーム中のタンパク質の割合を変化させることを可能にする。
【００４８】
これらの安定化したプロテオリポソームは、種々の異なる方法において使用され得る。ビーズ上のタンパク質の高濃度を入手し得る。この様式において、タンパク質の未変性コンホメーションに抗体を得るための免疫原としてプロテオリポソームを使用し得る。タンパク質の異なるコンフォメーションの間に曝される異なるエピトープに対する抗体を得るためにプロテオリポソームを使用し得る。例えば、１つのタンパク質は、例えば、異なる結合パートナーの有効性に依存して、いくつかの異なる多重体の複合体に組立て得る。異なる複合体を保有するプロテオリポソームは、免疫原として使用され得、従って、他のタンパク質への結合に依存して差次的に曝される単一のタンパク質上の異なるエピトープに対する抗体を産生する。
【００４９】
免疫原性ＬＭＰプロテオリポソームは、ある範囲の抗体（例えば、ＬＭＰ１抗体）を産生するために使用され得、そしてまたこれらを同定するためにも使用され得る。
【００５０】
免疫原性ＬＭＰプロテオリポソームは、標準的な方法によって宿主内で免疫反応を産生するために使用され得る。例えば、アジュバント中にＬＭＰ１プロテオリポソームを投与し得る。あるいは、ＬＭＰプロテオリポソームは、抗体ライブラリーから抗体を選択するために使用され得る。例えば、ヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーをパニングし得る。
【００５１】
ＬＭＰプロテオリポソームは、好ましくは、アジュバントとして投与され得る。アジュバントは、当該分野に周知であり、水酸化アルミニウム、Ｒｉｂｉアジュバントなどが挙げられる。好ましくは、プロテオリポソームは、生分解性物質からなる。
【００５２】
種々の方法によってプロテオリポソームを個体に投与し得る。免疫の目的に対して、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与および粘膜投与が使用され得る。
【００５３】
投与に対して使用される場合、プロテオリポソームは、無菌条件下で薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を用いて調製される。
【００５４】
ＬＭＰ抗体の調製について、抗体分子の生成に提供される任意の技術が使用される。述べるように、好ましくは、その抗原は、プロテオリポソームの部分として存在する。しかし、本発明は、そのようには限定されない。用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および組換え核酸技術によって調製される抗体を含むことが意味される。これらの抗体は、ＬＭＰ１タンパク質のような所望の抗原またはその抗原性エピトープと選択的に反応性である。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、同種の抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されないし、その作製される様式によって制限されることも意図されない。この用語は、完全な免疫グロブリンおよびフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン重鎖およびその抗体の抗原結合機能を保持する他のもの）を含む。任意の哺乳動物種のモノクローナル抗体は、本発明において使用され得る。しかし、実際は、その抗体は、モノクローナル抗体を生成する、必要とされるハイブリッド細胞株またはハイブリドーマを作製する際の使用にラットまたはマウス細胞株が利用可能であるため、代表的にはヒト化されているか、またはラット起源もしくはマウス起源である。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部は、ヒト免疫グロブリン配列から得られることを意味する。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「単鎖抗体」とは、結合する抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）を決定し、結合機能の保存を可能にする連結部分を供給することによって調製される抗体をいう。これは、本質的に、抗原への結合に必要な可変ドメインの部分のみを有する、徹底的に縮約された抗体を形成する。単鎖抗体の決定および構築は、Ｌａｎｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載される。
【００５８】
用語「選択的に反応性」とは、所望の抗原（例えば、ＥＢＶ  ＬＭＰ１タンパク質）の１つ以上の抗原決定基に反応し、かつ他のポリペプチドで確認できるほどに反応しない抗体のことをいう。例えば、競合結合アッセイにおいて、好ましくは抗体の５％未満、より好ましくは３％未満、なおより好ましくは２％未満および最も好ましくは１％未満が、別のタンパク質に結合する。抗原決定基は、通常、分子（例えば、アミノ酸または糖側鎖）の化学的に活性な表面の分類からなり、かつ特定の三次元構造特性および特定の荷電特性を有する。抗体は、診断的適用または研究目的に対して使用され得る。
【００５９】
抗体を調製するための１つの方法は、そのような遺伝子のＰＣＴ増幅に対するテンプレートとしてハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾性ｍＲＮＡを使用することによるものである［Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７６（１９８９）］。例えば、内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）は、マウスモノクローナルハイブリドーマに由来し得る［Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．  １９７：４２２−４２７（１９９３）；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１（１９９５）］。これらのハイブリドーマは、十分に特徴付けられた試薬の信頼できる供給源を抗体の構築に提供し、そしてそれらのエピトープ反応性および親和性が、予め特徴付けられている場合、特に有用である。このような構築に対する別の供給源は、ヒトモノクローナル抗体生成細胞株の使用を含む［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３（１９９３）；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−５９３６（１９９４）］。
【００６０】
１つの好ましい方法は、標的分子上の異なるエピトープに対する新規な抗体を構築するための抗体ライブラリ（例えば、抗体ファージ提示技術）の使用を含む［Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０１３４−１０１３７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｃ．１３０：４１−６８（１９９２）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５（１９９４）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００７−１６０１０（１９９２）；Ｎｉｓｓｉｍ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２−６９８（１９９４）；Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏ．１４：３０９−３１４（１９９６）；Ｍａｒｋｓ，Ｃ．，ら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３５：７３０−７３３（１９９６）］。例えば、非常に大きな未使用の（ｎａｉｖｅ）ヒトｓｃＦｖライブラリは、多血症の標的分子に対して再配列された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するのに作製されてきており、そして作製され得る。より小さなライブラリは、自己免疫疾患［（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２８３９−２８５１（１９９３）；Ｂａｒｂａｓ，Ｓ．Ｍ．ら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２５２９−２５３３（１９９５）］または感染性疾患［Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３３９−９３４３（１９９２）；Ｚｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３１７５−３１７９（１９９２）］を有する個体から、疾患特異的抗体を単離するために構築され得る。次いで、適切な抗体を選択するためにこのようなライブラリをスクリーニングし得る。
【００６１】
他の供給源としては、トランスジェニックマウスが挙げられる。このマウスは、対応するマウス遺伝子座の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座を、およびヒト抗原特異的抗体を分泌する安定なハイブリドーマを含む。［Ｌｏｎｂｅｒｇ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１（１９９４）］。このようなトランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子の別の供給源を、従来のハイブリドーマ技術を介して、またはファージ提示技術との組合せてのいずれかで、提供する。抗原結合部位の親和性および十分な特異性を操作するためのインビトロ手順が報告されており、これにはレパートリクローニング［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａ．Ｄ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）］、インビトロ親和性成熟［Ｍａｒｋｓ、Ｊ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｇｒａｍ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０（１９９２）］、半合成ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら、前出；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．、前出；Ａｋａｍａｔｓｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４６３１−４６５９（１９９３）］およびガイド付き選択［Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．ら、Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈ  １２：８９９−９０２（１９９４）］が含まれる。これらの組換えＤＮＡベースのストラテジーのための出発材料には、マウス脾臓からのＲＮＡ［Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．前出］およびヒト末梢血リンパ球［Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ら、前出；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、前出；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、前出；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２（１９９１）］が含まれる。
【００６２】
抗原（例えば、免疫原性プロテオリポソーム）に向かって指向するモノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞系統による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用され得る。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７、（１９７３））によって本来開発されたハイブリドーマ技術、およびトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術などは、本発明の範囲内である。一般的には、Ｌａｒｒｉｃｋら、米国特許第５，００１，０６５号およびそこで引用される文献を参照のこと。さらに、１本鎖抗体（ＳＣＡ）法もまた、本発明の真核生物ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対する抗体を産生するために利用可能である（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，７０４，６９４号および同第４，９７６，７７８号）。
【００６３】
モノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であっても、キメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体であってもよい。本発明は、抗体分子およびそのような抗体分子のフラグメントを提供する。
【００６４】
当業者は、多くの種々の可能な部分が、得られる抗体か、または好ましくは、安定化三量体か、あるいは本発明の他の分子に結合され得ることを認識する。例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ（編）、Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照のこと（その内容の全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００６５】
結合は、抗体および他の部分がそのそれぞれの活性を保持する限り、２つの分子を結合する任意の化学的反応によって達成され得る。この結合は、多くの化学的機構（例えば、共有結合、アフィニティー結合、挿入、配位結合、および錯体化）を含み得る。しかし、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接縮合によって、または外部架橋分子の組込みによって、のいずれかで達成され得る。多くの二価または多価の連結剤が、タンパク質分子（例えば、本発明の抗体）を、他の分子に結合させるのに有用である。例えば、代表的な結合剤は、有機化合物（例えば、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミン）を含み得る。このリストは、当該分野で公知の種々のクラスの結合剤について包括的であることが意図されず、むしろより一般的な結合剤の例示である。（ＫｉｌｌｅｎおよびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１３３５−２５４９，１９８４；Ｊａｎｓｅｎ，Ｆ．Ｋ．ら，Ｉｍｍ．Ｒｅｖ．６２：１８５−２１６，１９８２；ならびにＶｉｔｅｔｔａら，前出、を参照のこと）。
【００６６】
好ましいリンカーは、文献に記載されている。例えば、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４：２０１−２０８（１９８４）（ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する）を参照のこと。Ｕｍｅｍｏｔｏら、米国特許第５，０３０，７１９号（オリゴペプチドリンカーの方法によって抗体に結合したハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する）もまた参照のこと。特に好ましいリンカーには、以下が含まれる：（ｉ）ＥＤＣ（塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．＃２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ｐｒｏｐｉａｎａｍｉｄｅ）］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．，＃２１６５−Ｇ）；ならびに（ｖ）ＥＤＣに結合体化したスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｃａｔ．，＃２４５１０）。
【００６７】
上記のリンカーは、異なる性質を有する成分を含み、従って、異なる生理化学特性を有する結合体を導く。例えば、アルキルカルボン酸のスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボン酸のスルホ−ＮＨＳエステルより安定である。ＮＨＳエステル含有リンカーは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも可溶性でない。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害を受けているジスルフィド結合を含み、そして増大した安定性を有する結合体を形成し得る。ジスルフィド結合は、一般に、他の結合よりも安定でない。なぜなら、ジスルフィド結合は、インビトロで切断され、その結果、利用し得る結合体がより少なくなるからである。特に、スルホ−ＮＨＳは、カルボジイミド結合の安定性を増強し得る。カルボジイミド結合（例えば、ＥＤＣ）は、スルホ−ＮＨＳと組み合わせて使用した場合、カルボジイミド結合反応単独よりも加水分解に対して抵抗性であるエステルを形成する。
【００６８】
本発明の分子とともに形成する複合体は、適切なアッセイ（例えば、先に議論された直接結合アッセイ）によって、そして他の従来型の免疫アッセイによって検出され得る。この様式において、細胞をスクリーニングして、それらがＬＭＰを発現するか否かを決定し得る。例えば、ＬＭＰ１の最終的に上昇したレベルを使用して、悪性度を診断的に確認し得、かつ特定の疾患状態を予防的に決定し得る。
【００６９】
好ましい実施形態において、調べているファージ提示ライブラリをスクリーニングして、所定のタンパク質に対する抗原を見出し得るか、またはタンパク質に結合するリガンドを見出し得る。
【００７０】
また、逆方向プロテオリポソームに対して抗体タグを使用し得る。本明細書で使用される場合に、逆方向タンパク質は、プロテオリポソームの表面上に存在する、通常細胞内に存在するタンパク質の一部を有する。次いで、細胞内相互作用に影響する化合物またはタンパク質についてスクリーニングし得る。例えば、細胞内および細胞外リガンドと、細胞内および細胞外結合に影響する化合物またはタンパク質との結合を調べ得る。
【００７１】
また、この方法を使用して、ＬＭＰへの結合に影響する化合物を調べるアッセイにおける小さなアンタゴニストを同定し得る。
【００７２】
従って、ＬＭＰプロテオリポソームは、比較的多量の純度で方向付けられかつ安定なＬＭＰ膜タンパク質を含む容易に操作可能な球状脂質二分子層を提供する。
【００７３】
プロテオリポソームは、延長された期間にわたって安定である。タンパク質（例えば、ＬＭＰタンパク質）上の構造依存性エピトープの一体性は、上記の使用を可能にする延長された期間にわたって維持される。
【００７４】
抗体は、抗体ライブラリ（ヒト抗対ファージ提示ライブラリ）をスクリーニングすることによって得られ得る。少なくとも６つの異なるグループを含む多数の抗体が、検出され得る。表１〜３は、本発明の３つの例示的な特有のｓｃＦｖｓ抗体の構造を示す（それぞれ、配列番号２〜７）。
【００７５】
【表１】
2005511047.tif 000002
【００７６】
【表２】
2005511047.tif 000003
【００７７】
【表３】
2005511047.tif 000004
このような抗体を作製する別の方法は、ハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮＡを、このような遺伝子のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用することによる［Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７６（１９８９）］。例えば、抗体は、マウスモノクローナルハイブリドーマから誘導され得る［Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｊ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２巻：３１３７−３１４１（１９９５）；Ｂｉｏｃｃａ  Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ，１９７：４２２−４２７（１９９３）；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１５４２−１５５１（１９９５）］。これらのハイブリドーマは、抗体の構築について充分に特徴付けられた試薬の信頼の高い供給源を提供し、そしてそれらのエピトープ反応性および親和性がすでに特徴付けられているときには特に有用である。そのような構築のための別の供給源としては、ヒトモノクローナル抗体産生細胞株の使用が挙げられる［Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９３２−５９３６（１９９４）］。
【００７８】
抗体が、目的の抗原に対して十分な結合親和性を有することを保証するために、抗体を容易にスクリーニングし得る。結合親和性（Ｋｄ）は、少なくとも約１０−７ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは、少なくとも約１０−８ｌ／ｍｏｌであるべきである。
【００７９】
例えば、ＬＭＰ１またはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡクローンは、宿主から回収され得る総タンパク質の５〜２０％が所望のタンパク質であるように、標準的な技術を使用して宿主において発現され得る。回収されたタンパク質は、ＰＡＧＥを使用して電気泳動され得、そして適切なタンパク質バンドがゲルから切り出され得る。次いで、所望のタンパク質サンプルは、ゲルスライスから溶出され得、そして免疫化のために調製され得る。あるいは、目的のタンパク質は、従来の方法（例えば、イオン交換疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティクロマトグラフィーなど）を使用して精製され得る。
【００８０】
一旦、タンパク質免疫原が調製されると、マウスは、１マウスあたり約５０マイクログラムのＬＭＰ１タンパク質またはそのフラグメントの免疫原を用いて２回腹腔内免疫され得る。このような免疫化されたマウス由来の血清を、このようなポリペプチドを発現する任意の宿主系において免疫組織化学によって、または免疫細胞学によって、および発現されたポリペプチドを用いるＥＬＩＳＡによって、抗体活性について試験し得る。免疫組織化学について、本発明の活性な抗体が、ビオチン結合体化抗マウス免疫グロブリン、次いでアビジンペルオキシダーゼおよび色素産生性ペルオキシダーゼ基質を使用して同定され得る。このような試薬の調製物は、例えば、Ｚｙｍａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。血清が本発明に従う検出可能な活性ＬＭＰ１抗体を含有するマウスは、３日後に屠殺され得、そしてその脾臓を融合物およびハイブリドーマ産生のために取り出し得る。このようなハイブリドーマの陽性の上清は、上記のアッセイを使用して、そして例えば、ウエスタンブロット分析により同定され得る。
【００８１】
ＬＭＰ１特異的抗体を産生する可能性をさらに改善するために、ＬＭＰ１タンパク質の真核生物ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が、増大した免疫原性に関連し得るアミノ酸配列の部分を同定するために、分析され得る。例えば、ポリペプチド配列は、潜在的に免疫原性の表面エピトープを同定するためにコンピューター分析に供され得る。このようなコンピュータ分析は、抗原性指標のプロット、親水性、構造の特徴（例えば、両親媒性へリックスまたは両親媒性シートなど）の生成を含み得る。
【００８２】
抗ＬＭＰ抗体を調製するための別の方法は、インビトロ免疫化技術（例えば、脾臓細胞（例えば、マウス脾臓細胞の培養物）を使用する）、抗原の注入、次いでその抗原に対して産生された抗体についてスクリーニングすることによるものである。この方法により、０．１マイクログラム程の少量のＬＭＰ抗原（例えば、ＬＭＰプロテオリポソーム）が使用され得るが、約１マイクログラム／ミリリットルが好ましい。インビトロ免疫化のために、脾臓細胞（例えば、マウス脾臓細胞）を収集し、そして代表的に約１マイクログラム／ミリリットルの濃度で培地プラス所望の抗原中で所望の量（例えば、１×１０７細胞／ミリリットル）でインキュベートする。その後、フィルター免疫プラークアッセイの結果に依存していくつかのアジュバントの１つは、細胞培養物に添加される。これらのアジュバントには、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン［Ｂｏｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２７−３３（１９８６）］、ネズミチフス菌マイトジェン［Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ］、または従来の技術によって産生され得るＴ細胞条件［Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：８４１−８４５（１９８４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：３７１０−３７１５（１９８６）を参照のこと］が含まれるか、あるいは、例えば、Ｈａｎｎａｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．またはＲｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．から商業的に得られる。脾臓細胞を、４日間抗原と共にインキュベートし、次いで回収する。
【００８３】
次いで、インビトロ免疫化マウス脾臓細胞の単一細胞懸濁液を、例えば、マイクロフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．から入手可能なもの）中の抗原ニトロセルロース膜上でインキュベートする。産生された抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（例えば、ウサギ抗マウスＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）のような抗体のための標識を使用して検出する。分泌された抗体のアイソタイプを決定するにおいて、ビオチン化ウサギ抗マウス重鎖特異的抗体（例えば、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．からのもの）、続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼアビジン試薬（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．から入手可能なもの）を使用し得る。
【００８４】
酵素反応の不溶性産物は、ブループラークとして膜上で可視化される。これらのプラークを、例えば、２５倍の倍率を使用して計数する。マイクロフィルタープラークのニトロセルロース膜は、容易に種々の抗原を吸収し、そして洗浄工程のために使用される濾過ユニットが、プラークアッセイを容易にするので、好ましい。
【００８５】
次いで、当業者は、標準的な技術により目的の抗ＬＭＰ１抗体を見出すために抗体をスクリーニングする。目的の抗ＬＭＰ１抗体を含有する培養物を増殖させ、そして誘導し、そしてその上清をフィルター（例えば、０．４５マイクロメートルのフィルター）、次いで、カラム（例えば、抗原アフィニティーカラムもしくは抗タグペプチドカラム）に通す。結合アフィニティーを、ミニゲル濾過技術を使用して試験する。例えば、Ｎｉｅｄｅｌ，Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：９２９５（１９８１）を参照のこと。当業者はまた、第二のアッセイ（例えば、抗ウサギＩｇＧに結合体化した磁気ビーズを使用するラジオイムノアッセイ）を使用して、遊離の１２５Ｉ標識抗原を、ウサギ抗タグペプチド抗体によって結合された１２５Ｉ標識抗原から分離し得る。好ましい代替において、当業者は、「オン」の割合および「オフ」の割合を、例えば、バイオセンサーに基づく分析システム（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢからの「ＢＩＡｃｏｒｅ」）を使用して測定し得る（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−１８７（１９９３）を参照のこと）。
【００８６】
この後者の技術は、インビボ免疫化よりも少ない抗原を必要とする。なぜなら、インビボ法は、代表的には、マウス１匹あたり一回の注射に約５０マイクログラムの抗原を必要とし、そしてそのインビボ法のための一次免疫の後、通常、２回の追加免疫が存在するからである。
【００８７】
これらの任意の抗体を使用して、当業者は、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を構築し得る。例えば、当業者は、上記のインビトロ免疫化技術によるか、または従来のインビボ免疫化によるか、のいずれかで免疫されたマウス脾臓細胞から、ならびにすでに産生されたか、または市販のハイブリドーマ細胞株から、ＶＨおよびＶＬライブラリーを作製し得る。当業者はまた、市販のＶＨおよびＶＬライブラリーを使用し得る。１つの方法は、ｃＤＮＡを合成するために使用されるｍＲＮＡを得るために脾臓細胞を使用することを含む。二本鎖ｃＤＮＡは、縮重Ｎ末端Ｖ領域プライマーおよびＪ領域プライマーを用いて、あるいはＶＨファミリー特異的プライマー（例えば、マウス１２、ヒト７）を用いて、可変領域を増幅するためにＰＣＲを使用することによって作製され得る。
【００８８】
例えば、所望の抗体（例えば、ＬＭＰ１に対するもの）のＶＨおよびＶＬドメインの遺伝子が、クローニングされ、そして配列決定され得る。第一鎖ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライミングおよびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を公知の手順に従って使用することによって、例えば、総ＲＮＡから合成され得る。次いで、この第一鎖ｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応を行うために使用される。当業者は、代表的なＰＣＲ条件（例えば、免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためにＶｅｎｔポリメラーゼを使用しての、２５〜３０サイクル）を使用する。次いで、ＤＮＡ配列分析を行う［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５４６３−５４６７（１９７７）］。
【００８９】
重鎖プライマー対および軽鎖プライマー対の両方が、この方法論によって生成され得る。当業者は、好ましくは、都合の良い制限部位をプライマーに挿入してクローニングをより簡便にする。
【００９０】
その後、その可変領域を選択する。次いで、これは、標準的な技術によって、「ヒト化」フレームワークモチーフに付加される。
【００９１】
本発明の抗ＬＭＰ抗体は、適切なアッセイ（例えば、従来のタイプの免疫アッセイ）によって検出され得る。例えば、ＬＭＰタンパク質またはそのフラグメントが固相に固定されているサンドイッチアッセイを行い得る。インキュベーションを、十分な期間維持し、サンプル中の抗体が、固相上の固定化されたポリペプチドに結合することを可能にする。この最初のインキュベーションの後、固相をサンプルから分離する。固相を洗浄して、サンプル中に同様に存在し得る非結合材料および妨害物質（例えば、非特異的タンパク質）を除去する。固定化されたポリペプチドに結合した目的の抗体を含有する固相を、標識した抗体、またはビオチンもしくはアビジンのような結合剤に結合した抗体とともに引き続いてインキュベートする。抗体のための標識は、当該分野で周知であり、そして放射性核種、酵素（例えば、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペプチドオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ）、蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコシアニン、フルオレサミン）、ビオチンなどを含む。標識した抗体を、固相とともにインキュベートし、固相に結合した標識を測定し、検出された標識の量が、サンプル中に存在する抗尿素輸送体抗体の量の測定値として機能する。これらおよび他の免疫アッセイは、当業者により容易に行われ得る。所望の抗体ならびにこのような抗体をコードする遺伝子およびプライマーは、キットにパックージされ得る。キット中の他の成分は、キットが設計される用途に依存する。これらの他の成分としては、カップリング部分、ベクター、ポリメラーゼなどが挙げられ得る。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、ＬＭＰに対して特異定な抗体型を有するリンパ球をコードするのに適切なキメラレセプター遺伝子を提供する。キメラレセプター遺伝子は、ホーミング、組織浸透、サイトカイン生産およびＴリンパ球の標的細胞破壊と抗体の特異性の利点とを組み合せ、そしてエキソビボ遺伝子操作（Ｔリンパ球の抗腫瘍特異性のスペクトル）によって伸長することを可能にする。このようなキメラ遺伝子は、キメラレセプター遺伝子またはキメラ遺伝子あるいはＴ体と時々呼ばれる。このようなキメラ遺伝子は、１９９５年１０月２４日に出願された米国特許出願第０８／５４７，２６３号に記載される。
【００９３】
キメラレセプター遺伝子は、少なくとも抗体の重鎖結合領域（例えば、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ）をコードする第１のセグメントおよび第２のレセプターまたはｃｏ−レセプター鎖（例えば、免疫細胞誘発分子をコードするセグメント）を含む。好ましくは、第１のセグメントは、重鎖および鎖結合領域の両方をコードする。
【００９４】
少なくとも抗体の重鎖結合領域をコードするキメラ遺伝子の第１のセグメントは、キメラ分子の抗原認識ユニットとして機能する。ＬＭＰ特異的結合を与える抗体の任意の重鎖結合領域が使用され得る。１つの実施形態において、重鎖結合領域は、ｓｃＦｖである。
【００９５】
キメラ遺伝子（免疫細胞誘発分子をコードする）の第２のセグメントは、好ましくは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）のレセプター分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる。このようなレセプターは、自然界で単鎖または複数鎖であり得、そしてＩｇ遺伝子スーパーファミリーに属す必要はない。免疫細胞誘発分子の候補分子は、レセプター複合体（例えば、Ｔ細胞およびＮＫの活性化および／または増幅を引き起こすレセプター）の必須の成分として、シグナル形質導入に関与するレセプター分子である。１つの実施形態において、細胞質ドメインは、欠損し得る。しかし、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの両方の存在が好ましい。Ｔ細胞の誘発の例は、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲのα鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖）のサブユニット、またはシグナル伝達に関与するＣＤ３複合体（例えば、γ、δ、ε、ζおよびηのＣＤ３鎖）を構成する任意のポリペプチドである。ＴＣＲ／ＣＤ３（Ｔ細胞の主な誘発レセプター複合体）のポリペプチドの中で、ζおよびそのηアイソフォーム鎖（ホモＳ−Ｓ結合二量体またはヘテロＳ−Ｓ結合二量体のいずれかとして存在する）が特に見込みがありそしてリガンドのＴＣＲ認識によって引き起こされる細胞活性化プログラムの少なくとも一部の媒介を担う。［Ｗｅｉｓｓｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３６５１−６（１９８９）；Ｂａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３８４２−６（１９９１）］。これらのポリペプチドは、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）の結合に役立ち得る非常に短い細胞外ドメインを有する。
【００９６】
免疫細胞誘発分子のさらなる例は、ＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）ｐ５５（α）またはｐ７５（β）またはγ鎖、特に、Ｔ細胞およびＮＫ増殖のシグナル伝達を担うｐ７５およびγサブユニットのうちの任意の１つである。
【００９７】
本発明に従うキメラレセプター遺伝子の作製のためのさらなる候補レセプター分子は、Ｆｃレセプターのサブユニット鎖を含む。
【００９８】
ＮＫ刺激レセプターの群において、最も魅力的な候補は、ＩｇＧ、Ｆｃ．γ．ＲＩＩＩに対して低い親和性レセプターのγサブユニットおよびＣＤ１６αサブユニットである。Ｆｃ．γ．ＲＩＩＩの占有または架橋（抗ＣＤ１６によって、または免疫複合体を介してかのいずれか）は、サイトカイン生成、表面分子の発現および細胞質活性化についてのＮＫ細胞を活性化する［Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−２８１（１９８８）；Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．およびＫｉｎｅｔ，Ｊ．−Ｐ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）］。ＮＫ細胞、マクロファージならびにＢ細胞およびＴ細胞において、Ｆｃ．γ．ＲＩＩＩがジスルフィド結合γ鎖またはζ鎖に関連するリガンド結合α鎖からなるヘテロオリゴマー複合体として存在する。γ鎖をシグナル伝達するＦｃ．γ．ＲＩＩＩＡ［Ｗｉｒｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１３８１−１３９０（１９９２）；Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１５７１−１５７６（１９９１）；Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４２６３−４２７０（１９９１）］はまた、Ｆｃ．ε．ＲＩ複合体の一部として役立ち、ホモダイマーとして存在する場合、ＣＤ３ζ鎖に非常に類似し、そして実際に、いくつかの細胞質Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞中で、それらとヘテロダイマーを形成し得る。［Ｏｒｌｏｆｆ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３４７：１８９−１９１（１９９０）。これらのポリペプチドとＣＤ４［Ｒｏｍｅｏ，Ｃ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ６４：１０３７−１０４６（１９９１）］、ＣＤ８［Ｉｒｖｉｎｇ，Ｂ．Ａ．およびＷｅｉｓｓ，Ａ．Ｃｅｌｌ６４：８９１−９０１（１９９１）］、ＩＬ−２レセプター鎖［Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ，Ｆ．およびＫｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８９０５−８９０９（１９９１）］またはＣＤ１６細胞外ドメインとの間のキメラは、他のＴＣＲ／ＣＤ３成分の非存在でさえ、シグナル伝達Ｔ細胞刺激において活性であり得る。
【００９９】
他のリンパ球付属物および接着分子（例えば、Ｔ細胞活性化のための同時刺激シグナルを伝達するＣＤ２およびＣＤ２８）が使用され得る。
【０１００】
好ましくは、所望の免疫細胞誘発分子は、自律的に発現される能力（すなわち、一本鎖）、結果として生じるキメラが、対応する遺伝子が遺伝的に誘導される免疫細胞の表面上に発現されるように、細胞外ドメインに融合される能力、および標的リガンドと遭遇するような二次的なシグナル伝達プログラムに関与する能力を有する。
【０１０１】
キメラが発現される場合、抗体部分が細胞外に存在するので、結合領域セグメントは、免疫細胞誘発セグメントに結合される。これは、誘発分子の細胞質ドメインと逆の膜貫通部分の末端にいずれかの抗体セグメントを結合するような、公知の手段によって、または誘発分子の内因性細胞外部分の一部または他の供給源からのいずれかであるスペーサーを使用することによって、達成される。本発明のキメラ分子は、これらが発現される免疫細胞に非限定的なＭＨＣ抗体型特異性を与える能力を有する。従って、抗原結合の連続的なポリペプチドおよびシグナル伝達特性が、生成されそして免疫細胞上で標的化レセプターとして使用され得る。
【０１０２】
これらの細胞は、エキソビボで調製され、増幅され、次いで公知の方法（例えば、Ｉ．Ｖ．投与、皮下投与、カプセル、リポソームなどの形態で）によって被験体に再導入される。インビボで、これらの遺伝的に操作されたキメラレセプターを発現する細胞は、他のエフェクター細胞を引きつけるような細胞によって、または細胞自体によって刺激されるそれらの標的に方向付けられ、標的細胞の特異的破壊を媒介する。
【０１０３】
好ましい実施形態において、標的細胞は、ＬＭＰを発現するＥＢＶ感染細胞であり、そして抗体結合ドメインは、腫瘍細胞上で発現されるエピトープに対して特異的な抗体に由来する。このような細胞溶解はまた、ＩＬ−２の外因性供給と無関係であり得、従って、養子性の免疫治療の特定かつ安全な手段を提供する。
【０１０４】
好ましい実施形態において、免疫細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。従って、本発明の抗体設計は、ＭＨＣ非限定的様式において、インビボでの再標的化リンパ球を含む。従って、Ｔ細胞は、ＥＢＶ感染細胞に、インビボで再標的化され得る。
【０１０５】
このように形質転換した細胞を投与する現在の方法は、養子性の免疫治療または細胞転移治療を含む。これらの方法は、血流への形質転換した免疫系細胞の戻しを可能にする。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ６２（１９９０年５月）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２３（９）：５７０（１９９０）。
【０１０６】
本発明はまた、上記キメラ遺伝子を含む発現ベクター、およびこの発現ベクターで形質転換されたリンパ球を提供する。種々の型のリンパ球細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、リンホカイン活性化細胞、これらのサブタイプ、およびキメラレセプター鎖を発現し得る任意の他の細胞型）が適切である。本発明の形質転換細胞は、適切な薬学的に受容可能な賦形剤と共に、薬学的組成物の形態で投与され得る。このような組成物は、本発明の形質転換細胞の有利な効果を受け得る任意の動物（ヒトを含む）に投与され得る。
【０１０７】
キメラレセプター遺伝子は、リンパ球に以下の機能を与え得る：予め規定されたＬＭＰ抗原に対する抗体型特異性；それらの標的に対する特異的「ホーミング」；標的への遭遇の結果としての特異的な認識、活性化、およびエフェクター機能の実行；ならびに標的部位における特異的かつ制御された増殖。抗体の使用は、可溶性ハプテンまたは抗イディオタイプ抗体のＦａｂ’を使用する、上記機能の制御された選択的なブロッキングを可能にし得る。
【０１０８】
このアプローチを使用して、抗体特異性を与えられるべき候補免疫細胞は、以下である：ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、および上記のものの種々のサブタイプ。これらの細胞は、それらの真正の天然機能を実施し得、そしてまた、遺伝子療法のために指定された外来遺伝子のキャリアとして働き得、そしてキメラレセプターは、この場合に、細胞をそれらの標的に指向するように働くはずである。このアプローチはまた、抗イディオタイプ抗体のＦｖから作製されたキメラレセプターを発現するヘルパーＴ細胞を使用することによって、抗イディオタイプワクチン接種に適用され得る。このような「デザイナーリンパ球」は、イディオタイプ保有Ｂ細胞と相互作用し、そして抗原特異的抗体を産生するようにこのＢ細胞を刺激し、従って、毒性の抗原を用いる能動免疫化の必要性を回避する。
【０１０９】
本発明の抗体は、上記単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターによって、発現され得る。
【０１１０】
これらは、上記のような、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含み得る。
【０１１１】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を、細胞の細胞質に導入する。トリポックスウイルスベクターは、ほんの短期間の核酸の発現を生じる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、神経細胞に核酸を導入するために好ましい。アデノウイルスベクター（約２ヶ月）は、アデノ随伴ウイルス（約４ヶ月）より短い期間の発現を生じ、これは次に、ＨＳＶベクターより短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および処理される条件に依存する。導入は、標準的な技術（例えば、注入、トランスフェクション、形質導入、または形質転換）により得る。遺伝子移入の様式の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈澱、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入、およびウイルスベクターが挙げられる。
【０１１２】
ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞（例えば、神経膠腫）を標的にするために使用され得る。例えば、定位注入は、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に指向するために使用され得る。さらに、粒子は、ミニポンプ注入システム（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、脳室内（ｉｃｖ）注入によって送達され得る。バルクフローに基づく方法（対流と称される）もまた、脳の拡大した領域に大きい分子を送達する際に効果的であることが示されており、そしてベクターを標的細胞に送達するために有用であり得る（Ｂｏｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６６：２９２−３０５（１９９４））。使用され得る他の方法としては、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内注射および皮下注射、ならびに経口投与経路または他の公知の投与経路が挙げられる。
【０１１３】
これらのベクターは、種々の様式で使用され得る多量の抗体を発現させるために使用され得る。例えば、サンプル中のＬＭＰ１タンパク質の存在を検出するために使用され得る。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、抗体はまた、ＬＭＰに結合し、そしてＬＭＰを、例えばＬＭＰ１の相互作用を妨害するために使用され得る。この抗体は、先に記載されたように投与される。
【０１１５】
抗体カセットは、任意の公知の手段によって細胞に送達される。例えば、これらの抗体遺伝子（例えば、ｓｃＦｖ遺伝子）を含むカセットは、上記のような多数の技術によって、特定の細胞を標的にし得る。
【０１１６】
好ましくは、本発明のベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を使用して、所望の遺伝子（例えば、ｓｃＦｖ）の発現を強制する。別の実施形態において、ＩＲＥＳを使用して、軽鎖および重鎖の化学量論的発現を強制し得る。この強制された発現は、「サイレンシング」の問題（ここでは、所望のタンパク質を発現する細胞が、表現型的に見られず、これらは、広範な遺伝子産物と共に生じ得る）を回避する。別の実施形態は、ＩＲＥＳ配列を使用して、目的の標的に対する単鎖抗体が、選択マーカーと連結され得ることを包含する。選択マーカーは、当該分野において周知であり、例えば、刺激（例えば、栄養分、抗生物質など）に対する細胞の感受性を変化させるタンパク質を発現させる遺伝子である。これらの遺伝子の例としては、ｎｅｏ、ｐｕｒｏ、ｔｋ、多剤耐性（ＭＤＲ）などが挙げられる。
【０１１７】
このＩＲＥＳ連結の結果の産物は、融合タンパク質ではなく、そしてこれらは、それらの通常の生物学的機能を示す。従って、これらのベクターの使用は、所望のタンパク質の強制された発現を可能にする。標的遺伝子発現を阻害することを目的とする、細胞内免疫ストラテジーは、ＲＮＡ（アンチセンス、リボザイム、ＲＮＡデコイ）またはタンパク質（細胞内で発現された抗体、細胞に送達され、次いでその細胞に入る抗体、ドミナントネガティブ変異体）に基づき得、そしてインヒビターの各群は、利点および制限を有する。
【０１１８】
ＥＢＶ感染した細胞を処置する１つの好ましい方法は、抗体をＥＢＶ感染細胞に送達することである。このことは、すでに発現された抗体を細胞に送達することによって、またはこの細胞内に抗体を発現させることによって、なされ得る。この抗体はまた、細胞内局在配列を有し、好ましくは、ゴルジ装置または小胞体に指向される配列（例えば、ＫＤＥＬ）を有する。次いで、これらの抗体は、それらがＥＢＶ感染細胞においてプロセシングされるので、ＬＭＰタンパク質を標的とし、そしてＬＭＰ機能（例えば、ＬＭＰ１）をサイレンシングし、表現型ノックアウトおよび機能的ノックアウトを生じることによって、悪性の形質転換を阻害する。米国特許第５，９６５，３７１号、同第６，００４，９４０号、および同第６，０７２，０３６号を参照のこと。
【０１１９】
当該分野において公知である任意の適切な技術（例えば、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲなど）を使用して、細胞中（特に、潜在的に悪性の細胞（例えば、前立腺細胞）中）のＬＭＰタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定し得る。ＬＭＰ１の発現レベルの増加は、悪性または悪性に対する感受性に関連する。
【０１２０】
あるいは、本発明の抗体は、ＬＭＰを発現する細胞の存在を検出するための、ウェスタンブロッティングまたは免疫組織化学のような標準的な技術において使用されて、その発現レベルを定量し得る。好ましくは、ＦＡＣＳ分析を使用する。この様式で、抗体は、診断的および予後予測的に使用され得る。
【０１２１】
別の実施形態において、本発明は、受動的免疫療法において使用され得る。好ましくは、ＩｇＧ分子全体として使用され得る。あるいは、細胞傷害性分子に連結した、ＬＭＰタンパク質の免疫原性フラグメントに対する抗体（好ましくは、ｓｃＦｖ）または抗体フラグメントを含む複合体を使用し得る。化学療法薬剤を標的にするために抗体を使用した、種々の免疫結合体（Ｐ．Ｎ．Ｋｕｌａｒｎｉ，Ａ．Ｈ．Ｂｌａｉｒ，Ｔ．Ｉ．Ｇｈｏｓｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１，２７００（１９８１）；Ｒ．Ａｒｎｏｎ，Ｒ．およびＭ．Ｓｅｌａ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２，５（１９８２）；Ｈ．Ｍ．ＹａｎｇおよびＲ．Ａ．Ｒｅｓｉｆｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，１１８９（１９８８）；Ｒ．Ｏ．Ｄｉｌｍａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｊ．Ａ．Ｋｏｚｉｏｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８，６０９７（１９８８）；Ｌ．Ｂ．Ｓｈｉｈ，Ｒ．Ｍ．Ｓｈａｒｋｅｙ，Ｆ．Ｊ．Ｐｒｉｍｕｓ，Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１，８３２（１９８８）；Ｐ．Ａ．Ｔｒａｉｌら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，５６９３（１９９２））または植物毒素および細菌毒素を標的にするために抗体を使用した、種々の免疫結合体（Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｊ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｃｅｌｌ  ４７，６４１（１９８６）；Ｄ．Ｄ．Ｂｌａｋｅｙ，Ｅ．Ｊ．Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ，Ｐ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｐ．Ｅ．Ｔｈｏｒｐｅ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ編（Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｓｅｌ，１９８８），５０−９０頁）が、臨床前モデルにおいて評価され、そしてインビトロおよびインビボで活性であることが見出された。米国特許第５，８６９，０４５号は、このような抗体結合体をどのように作製するかを詳細に記載し、そしてその全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０１２２】
抗ＬＭＰ抗体と結合体化され得る治療剤の例としては、代謝拮抗物質、アルキル化剤、アントラサイクリンおよび有糸分裂阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。代謝拮抗物質としては、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジンが挙げられる。アルキル化剤としては、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチンが挙げられる。アントラサイクリンとしては、ダウノルビシン（以前にはダウノマイシン）およびドキソルビシン（本明細書中においてアドリアマイシンとも称される）が挙げられる。さらなる例としては、ミトザントロン（ｍｉｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）およびビサントレンが挙げられる。有糸分裂阻害剤としては、ビンクリスチンおよびビンブラスチン（これらは通常、ビンカアルカロイド類と称される）が挙げられる。他の細胞傷害性薬剤としては、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトーテン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、およびインターフェロンが挙げられる。細胞傷害性薬剤のさらなる例としては、リシン、ドキソルビシン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、１−デヒドロテストステロン、および糖質コルチコイドが挙げられるが、これらに限定されない。このような治療剤および細胞傷害性薬剤の明らかなアナログおよびホモログは、本発明によって包含される。例えば、化学療法剤であるアミノプテリンは、相関する改善されたアナログ（すなわち、メトトレキサート）を有する。さらに、ドキソルビシンの改善されたアナログは、Ｆｅ−キレートである。また、１−メチルニトロソウレアの改善されたアナログは、ロムスチンである。さらに、ビンブラスチンの改善されたアナログは、ビンクリスチンである。また、メクロレタミンの改善されたアナログは、シクロホスファミドである。
【０１２３】
本発明は、ＬＭＰ（例えば、ＬＭＰ１）に対する抗体を使用して、生物学的サンプル中で、ＬＭＰまたはその誘導体の発現を検出するための方法に、さらに関する。このような抗体は、診断および／または予後予測のために、ならびにＥＢＶに罹患した個体を処置するために、使用され得る。本発明のＬＭＰ抗原は、例えば、ワクチンにおいて、免疫応答を引き起こし、個体におけるＥＢＶ感染を予防するために使用され得る。
【０１２４】
ＬＭＰ抗原またはそのフラグメントをコードする核酸は、任意の公知の手段によって発現され得る。これらとしては、発現カセット（核酸構築物）を作製する工程を包含し、ここで、核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。他の増強エレメントが公知であり、そしてまた使用され得る。目的のタンパク質を合成するために使用されるコドンは、最適化され得、これらを哺乳動物細胞において優先的に使用されるコドンに転換する。非哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現のための最適なコドンもまた公知であり、そして宿主細胞が非哺乳動物細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、細菌）である場合に、使用され得る。
【０１２５】
上記のように作製された、ＬＭＰまたはそのフラグメントをコードする核酸構築物は、公知の手段によって、発現のための細胞に導入され得る。これらとしては、例えば、ベクター、リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどが挙げられる。ベクターとしては、化学結合体、プラスミド、ファージなどが挙げられる。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。市販の発現ベクターは、当該分野において周知であり、例えば、ｐｃＤＮＡ  ３．１、ｐｃＤＮＡ４  ＨｉｓＭａｘ、ｐＡＣＨ、ｐＭＴ４、ＰＮＤなどである。遺伝子を発現するために使用され得るプロモーターは、当該分野において周知である。選択されるプロモーターは、そのタンパク質が発現される宿主細胞に基づいて選択される。これらとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期（ｉｍｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）プロモーター、ウイルスＬＴＲ（例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ  Ｖ５プロモーターおよび単純疱疹ＴＫウイルスプロモーターが挙げられる。
【０１２６】
好ましいベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学結合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、モロニーマウス白血病ウイルスが挙げられる。他のベクターとしては、ポックスベクター（例えば、オルトポックスベクターまたはトリポックスベクター）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、単純疱疹Ｉウイルス（ＨＳＶ）ベクター）（Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら，（１９９５），Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６４：４８７；Ｌｉｍ，Ｆ．ら，（１９９５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら（１９９３），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７６０３；Ｇｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｉ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：１１４９）、アデノウイルスベクター（ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅら（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：９８８；Ｄａｖｉｄｓｏｎら（１９９３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ  ３：２１９；Ｙａｎｇら，（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら（１９９４）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８）が挙げられる。選択される特定のベクターは、使用される宿主細胞に依存する。
【０１２７】
ＬＭＰ核酸構築物の宿主細胞への導入は、標準的な技術（例えば、注入、トランスフェクション、形質導入または形質転換）により得る。遺伝子移入の様式の例としては、例えば、裸のＤＮＡ、ＣａＰＯ４沈澱、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞微量注入、およびウイルスベクターが挙げられる。
【０１２８】
抗原性タグ配列は、ＬＭＰタンパク質に挿入されて、その精製、およびこのタンパク質を固体表面上で配向させることを補助し得る。好ましくは、このタグ配列は、このタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに存在する。このタグは、好ましくは、６〜１５アミノ酸長であり、なおより好ましくは、約６〜９アミノ酸である。このタグが選択され、そしてそのコード配列が、このタンパク質をコードする遺伝子に、そのタンパク質の全体のコンホメーションまたは機能に影響を与えない様式で、挿入される。タグとしては、ＨＡ、ポリオーマ、Ｃ９、ＦＬＡＧなどが挙げられ得る。
【０１２９】
薬学的組成物の用量は、被験体および使用される特定の投与経路に依存して、変化する。投薬量は、１日あたり０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは、１〜１０，０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１３０】
投与経路としては、経口、非経口、直腸、膣内、局所、鼻孔、直接注射などが挙げられる。
【０１３１】
例示的な薬学的組成物は、ＥＢＶ感染細胞を認識するか、またはＥＢＶ感染細胞に対して免疫反応を誘導し得、これによって、予防的免疫原として働く、治療有効量のオリゴマー、抗体などであり、必要に応じて、薬学的に受容可能かつ適合性のキャリアに含まれる。用語「薬学的に受容可能かつ適合性のキャリア」とは、本明細書中において使用される場合、そして以下にさらに詳細に記載されるように、ヒトまたは他の動物への投与に適した１種以上の適合性の固体または液体の充填剤希釈剤またはカプセル化物質を含む。本発明において、用語「キャリア」は、従って、本発明の分子が混合されて適用を容易にする、天然または合成の有機成分もしくは無機成分を表す。用語「治療有効量」とは、所望の結果を生じるか、または処置される特定の状態に対して所望の影響を与える、本発明の薬学的組成物の量である。例えば、免疫反応を生じて予防的保護を提供するために必要とされる量である。代表的に、組成物が予防的免疫原として使用される場合、少なくとも１つの「追加免疫」が、最初の投与の後に周期的な間隔で投与される。処置される患者の年齢、状態の重篤度、処置の持続期間および投与様式のためにバリエーションを提供するために、同じ成分を含有する組成物を調製する際に、種々の濃度が使用され得る。
【０１３２】
免疫の１つの好ましい方法において、ＬＭＰ１抗原（ＬＭＰ１の細胞外ループの少なくとも１つを含む）を含有するプロテオリポソームでプライムし、次いで、アミノ酸１〜２０７によってコードされる細胞外ループの３つ全てを含むＬＭＰ１プロテオリポソームで１回以上追加免疫する。
【０１３３】
ＬＭＰ（例えば、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ＡまたはＬＭＰ２Ｂ）を含むプロテオリポソームを備えるキットを調製し得る。このキットは、滅菌の、刺激物質を含まない容器中に、ＬＰＭプロテオリポソームを含む。本発明の薬学的組成物（例えば、ＬＭＰプロテオリポソームまたはＬＭＰに対する抗体）の用量は、被験体および使用される特定の投与経路によって変化する。投薬量は、１日当たり０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０，０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。単なる例として、例えば、１μｇ〜約３００μｇの全体的用量範囲が、ヒト使用について使用され得る。この用量は、組成に基づいて、周期的な間隔で送達され得る。例えば、少なくとも２つの別個の機会は、好ましくは約４週間の間隔を空けられる。開始が、ＬＭＰ１の細胞外ループを含むプロテオリポソームであり、追加免疫が、ＬＭＰ１およびネイティブのＬＭＰ２ＡまたはＬＭＰ２Ｂを含むプロテオリポソームである実施形態において、一年間にわたる一連の、少なくとも２回の追加免疫、好ましくは３〜５回の追加免疫を有することが現在好ましい。他の化合物が毎日投与され得る。本発明の薬学的組成物はまた、種々の他の十分特徴付けられたプロトコルに従って、被験体に投与され得る。例えば、現在受容されている特定の免疫レジメンは、以下を含み得る：（ｉ）投与回数は、選択された日付での第一用量；第一用量の１ヵ月後の第二用量；および引き続く日付（例えば、第二用量の５ヵ月後）での第三用量である（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ（１９９０）１４４２−４３（例えば、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖａｃｃｉｎｅ−ｔｙｐｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を参照のこと）；（ｉｉ）例えば、他のワクチンに関して小児について推奨される投与は、選択された日付での第一用量（年齢６週間以上にて）；第一用量の４〜８週間後の第二用量；第二用量の４〜８週間後の第三用量；第三用量の６〜１２ヵ月後の第四用量；４〜６歳での第五用量；および最後の用量の後１０年ごとのさらなる追加免疫である（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ（１９９０）８７９（例えば、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ，Ｔｅｔａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ−ｔｙｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を参照のこと）。複数の用量の特定の組成物の送達のための所望の時間間隔は、慣用的な実験にすぎないものを使用して、当業者によって決定され得る。
【実施例】
【０１３４】
（ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームの形成）
ＬＭＰ１の短縮形態（ΔＴＥＳ、１〜２０７アミノ酸）を含む常磁性プロテオリポソームを得た。この変異体は、細胞質側Ｎ末端、６個の膜貫通ドメイン、およびＬＭＰ１のＣ末端テイルの２０アミノ酸を含み、この変異体はまた、１Ｄ４モノクローナル抗体によって認識されるＣ末端ノナペプチド（Ｃ９）タグを含む。このタンパク質を、ＣＯＳ−７細胞中で発現させた。ＣＯＳ−７細胞を、記載されるように形質転換した。次いで、１０８個の細胞を、１０ｍｌの可溶化緩衝液中で、４℃で３０分間溶解した。細胞デブリを除去し、そして清浄化した溶解物を、２×１０８の１Ｄ４−ストレプトアビジン被覆ビーズと共に、ロッキングプラットホーム上で、４℃で４時間インキュベートした。
【０１３５】
常磁性ビーズを、１Ｄ４およびストレプトアビジンと結合体化し、そしてこの細胞溶解物から変異体ΔＴＥＳ−Ｃ９を捕捉するために使用した。次いで、これらのビーズを、ビオチニル−ＤＯＰＥ（これは、ビーズの周りに自己会合して、脂質二重層を生じる）を含む可溶化脂質と混合した。
【０１３６】
（ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームのタンパク質組成）
ΔＴＥＳプロテオリポソームのタンパク質組成を分析した。ΔＴＥＳを発現するＣＯＳ−７細胞を、［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システインで標識し、そしてプロテオリポソームを生成するために使用した。この目的のために、プロテオリポソームを、［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システインで標識した細胞から得、２％  ＳＤＳ緩衝液中で５５℃にて１時間インキュベートし、そして溶出したタンパク質を、１１％  ＳＤＳゲル上で電気泳動した。ゲルを、エンハンサーで処理し、乾燥し、そしてオートラジオグラフにかけた。次いで、プロテオリポソーム中に取り込まれた標識されたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲルで分析した。ΔＴＥＳの対応するバンド（２４ｋＤａ）が観察されたが、他の細胞性タンパク質は存在しなかった。
【０１３７】
（ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを用いた、ファージライブラリーのパニング）
ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを使用して、約１．５×１０１０のメンバーの、ヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーから、組換え抗体を選択した。この選択を、本質的に、「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｍｅｔｈ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ２６７、８３−１０９に記載されるように実施した。約５×１０７のプロテオリポソームを、ＰＢＳ中４％ミルクおよび１／５００Ｍｅｇａｂｌｏｃｋを用いて、室温で１時間ブロッキングした。２×１０１３ｔ．ｕ．のファージを添加し、そしてファージおよびプロテオリポソームの混合物を、室温で１時間穏やかに回転させた。プロテオリポソームおよび捕捉されたファージを、１２回洗浄し、そしてファージを、１００ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）で溶出し、そして中和した。
【０１３８】
溶出したファージの半分を使用して、１０ｍｌの対数期Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１を感染させ、そしてこれを、ＧＴＹ−ＡＭＰ−Ｇｌｕプレートにプレートした。
【０１３９】
選択の各回を、約５×１０７のプロテオリポソームを使用して実施した；第一回において約２×１０１３ｔ．ｕ．のファージを使用し、産出は、１０５ｔ．ｕ．／ｍｌであった。第四回の後、産出は、５×１０７ｔ．ｕ．／ｍｌであった。
【０１４０】
第四回のパニング後、選択された個々のファージのうちの４８個を、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して、ＢＪＡＢ細胞の結合に対して、ＢＪＡＢ−ＷＴ４細胞と結合する能力について試験した。
【０１４１】
捕捉したファージの力価は、第二回のパニングから第四回のパニングまでで、１０５から５×１０７に増加した。全てが、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ポジティブを生じた。
【０１４２】
（フィンガープリントおよび配列決定）
４８個のポジティブクローンを、フィンガープリントによって分析した。ＰＣＲ分析により、全てのクローンにおいて、ｓｃＦｖに対応する８００ｂｐの挿入物の存在が示された。増幅を、（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１．５分間）×２５サイクルで実施した。８００ｂｐのＰＣＲ産物を、ＢｓｔＮＩ制限酵素を使用して消化し、そして２％アガロースゲル上で可視化した。制限分析に基づき、４８個のクローンを、６つの群に分類し得る。配列分析により、３つの独自のｓｃＦｖの存在が示された。
【０１４３】
（細胞株およびプラスミド）
ＣＯＳ−７および２９３は、ヒト胎児腎臓細胞株である。ＣＦ２は、イヌ細胞株である。ＢＪＡＢは、ＥＢＶネガティブなバーキットリンパ腫細胞株である。ＢＪＡＢ−ＷＴ４は、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ化ＬＭＰ１を有する組換えＥＢＶによって形質転換したＬＣＬである。ｐＣ９−ＬＭＰ１は、Ｎ末端Ｃ９タグ化ＬＭＰ１を発現する、ｐＳＧ５ベースのプラスミドである。ｐΔＴＥＳ−Ｃ９は、Ｃ末端Ｃ９タグを有するＬＭＰ１の短縮形態（アミノ酸１〜２０７）を発現する、ｐＳＧ５ベースのプラスミドである。
【０１４４】
（トランスフェクションおよび放射性標識）
２９３細胞、ｃｏｓ７細胞およびＣＦ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。一過的トランスフェクションのために、細胞を、１５０ｍｍディッシュ上にプレートし、そして次の日、Ｇｅｎｅ  Ｐｏｒｔｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、Ｃ９−ＬＭＰ１またはΔＴＥＳ−Ｃ９を発現するプラスミドでトランスフェクトした。
【０１４５】
２４時間後、培地を、各々４００μＣｉの［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システインを含む、メチオニン／システインを含まない、１ディッシュ当たり８ｍｌのＤＭＥＭで置き換えた。標識した細胞を、ＰＢＳ中５ｍＭのＥＤＴＡで回収し、ペレット化し、そして凍結した。
【０１４６】
（免疫沈降）
約１０７個の細胞を、１ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１％ｗ／ＶのＣｙｍａｌ−５およびプロテアーゼインヒビター混合物）中で、４℃で３０分間溶解した。細胞デブリを遠心分離（１４，０００×ｇで１５分）によって除去し、そして清浄化した細胞溶解物を、ロッキングプラットホーム上で、４℃で２時間、抗Ｃ９  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと共にインキュベートした。次いで、ビーズを可溶化緩衝液で８回洗浄し、そして結合したタンパク質を、２％  ＳＤＳ緩衝液中で、５５℃で１時間インキュベートすることによって回収した。溶出したタンパク質を、１２％または１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離した。このゲルを、エンハンサー溶液と共に１時間インキュベートし、乾燥し、そしてオートラジオグラフにかけた。
【０１４７】
（抗体およびストレプトアビジンによる、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０の被覆）
このプロトコルは、既に記載されている（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖら、２０００）。簡潔には、６×１０８のトシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．）を、１ｍｇの１Ｄ４抗体（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）および４０μｇのストレプトアビジンと、３７℃で２０時間のインキュベーションによって、結合体化した。共有結合していないタンパク質を、１％  Ｃｙｍａｌ−５（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ  ＮａＣｌ）中でのインキュベーションによって除去した。抗体結合体化効率を、抗マウスＲ−フィコエリトリン結合体化ＩｇＧ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用するＦＡＣＳによってチェックした。
【０１４８】
（磁気ビーズ／細胞数比率の最適化）
プロテオリポソームの形成のための細胞／ビーズ比率を最適化するために、ｃｏｓ７細胞を、上記のように、ΔＴＥＳ−Ｃ９でトランスフェクトし、放射性標識し、そして溶解した。約１０７細胞に由来する、清浄化した細胞溶解物を１０６、３×１０６、１０７、３×１０７、５×１０７、７×１０７、１×１０８、３×１０８の、１Ｄ４−ストレプトアビジン被覆ビーズと共に、４℃で３時間、ロッキングプラットホーム上でインキュベートした。次いで、ビーズを数回洗浄し、そして５５℃で１時間インキュベートした。溶出したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１４９】
（ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソーム中のタンパク質組成の分析）
ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソーム中のタンパク質組成を、オートラジオグラフィーによって試験した。
【０１５０】
本明細書中に記載される全ての参考文献は、本明細書中で参考として具体的に援用される。当業者は、開示に基づき、そして慣用的実験を使用して、特定の実施形態に対する等価物を獲得し得、そしてそれが特許請求される本発明の一部であることを、認識する。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞およびＣＦ２細胞における、Ｃ９−ＬＭＰ１およびΔＴＥＳ−Ｃ９の発現を示す。ｐＣ９−ＬＭＰ１またはｐΔＴＥＳ−Ｃ９をトランスフェクトした、約１０７個のＣＯＳ−７細胞または２９３細胞またはＣＦ２細胞由来の細胞溶解物を抗Ｃ９セファロースビーズで免疫沈降した。結合したタンパク質を、２％  ＳＤＳ緩衝液中、５５℃でインキュベートすることにより回収した。溶出したタンパク質を１２％または１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルで分離した。
【図２】図２は、異なる細胞／ビーズ割合のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を示す。約１０７個のＣＯＳ−７細胞由来の放射標識した清澄な溶解物を、それぞれ１０６、３×１０６、１０７、３×１０７の１Ｄ４−ストレプトアビジンコーティングビーズと共にインキュベートした。ビーズを何回か洗浄し、そして５５℃、１時間のインキュベートによりタンパク質を溶出した。
【図３】図３は、ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームのタンパク質組成のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を示す。［３５Ｓ］メチオニンおよび［３５Ｓ］システイン標識細胞を使用し、プロテオリポソームを得た。プロテオリポソームをＳＤＳサンプル緩衝液中でインキュベートし、そして溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて解析した。ΔＴＥＳ−Ｃ９の位置（２４ＫＤａ）を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを用いたファージライブラリーのパニング後のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを使用して、約１．５×１０１０個のメンバーからなるヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーから組換え抗体を選択した。選択の各ラウンドを、約５×１０７個のプロテオリポソームを使用して実施した；第１ラウンドにおいて、２×１０１３ｔ．ｕ．のファージを使用して、結果は１０５ｔ．ｕ．／ｍｌであった。第４ラウンドの後、結果は５×１０７ｔ．ｕ．／ｍｌであった。第４ラウンドのパニングの後、４８個の選択された個々のファージを、ＢＪＡＢ細胞の結合と相対的なＢＪＡＢ−ＷＴ４細胞に結合する能力について、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して試験した。捕捉したファージの力価は、パニングの第２ラウンドから第４ラウンドの間に１０５から５×１０７に増加した。図４Ａの表に示すように、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおいて全て陽性となった。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを用いたファージライブラリーのパニング後のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。ΔＴＥＳ−Ｃ９プロテオリポソームを使用して、約１．５×１０１０個のメンバーからなるヒト単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーから組換え抗体を選択した。選択の各ラウンドを、約５×１０７個のプロテオリポソームを使用して実施した；第１ラウンドにおいて、２×１０１３ｔ．ｕ．のファージを使用して、結果は１０５ｔ．ｕ．／ｍｌであった。第４ラウンドの後、結果は５×１０７ｔ．ｕ．／ｍｌであった。第４ラウンドのパニングの後、４８個の選択された個々のファージを、ＢＪＡＢ細胞の結合と相対的なＢＪＡＢ−ＷＴ４細胞に結合する能力について、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して試験した。捕捉したファージの力価は、パニングの第２ラウンドから第４ラウンドの間に１０５から５×１０７に増加した。図４Ｂは、プールＡ（クローン１〜５、７〜２２、２４〜２６、２８〜３０、３２〜３４、３６、３８〜４６および４８を含む）、プールＢ（クローン６、２３、３１および３５を含む）およびプールＣ（クローン３７および４７を含む）を使用した、ＥＬＩＳＡアッセイを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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