(57)【要約】本発明は、播種性血管内血液凝固に関する。より詳しくは、本発明は、播種性血管内血液凝固に対する医療処置に関する。本発明は、DICを治療するための、新規なペプチド・アルギナル類、新規でより優れた化合物および方法を提供する。本発明にかかる化合物および方法は、血塊に結合したトロンビンおよびXa因子を抑制する作用を有し、且つ、プラスミンおよびプラスミノーゲン活性化因子に対しても抑制的に作用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)で示される化合物。
[ Xaa-Xbb-Arg-H  (I)
式(I)中、Xaaは式(II)のα-置換炭酸残基を表す
Q-CH(R)-CO  (II)
式(II)中、Qは炭素数１〜３のアルキロキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、あるいは水酸基を表し、Rは炭素数７〜９のシクロアルキルメチル基、1-アダマンチルメチル基、あるいは炭素数５〜７のシクロアルキル基を表し、XbbはL-プロリンあるいはL-アゼチジン-2-カルボン酸残基、および有機酸あるいは無機酸で形成されるこれらの酸付加塩を表す ]
【請求項２】
構造１を有する化合物およびこれらの酸付加塩。
【化１】
2005502657.tif 000012
【請求項３】
構造２を有する化合物およびこれらの酸付加塩。
【化２】
2005502657.tif 000013
【請求項４】
構造３を有する化合物およびこれらの酸付加塩。
【化３】
2005502657.tif 000014
【請求項５】
構造４を有する化合物およびこれらの酸付加塩。
【化４】
2005502657.tif 000015
【請求項６】
請求項１記載の化合物を含有する医薬製剤。
【請求項７】
請求項２記載の化合物を含有する医薬製剤。
【請求項８】
請求項３記載の化合物を含有する医薬製剤。
【請求項９】
請求項４記載の化合物を含有する医薬製剤。
【請求項１０】
請求項５記載の化合物を含有する医薬製剤。
【請求項１１】
エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L- アルギニンアルデヒド化合物。
【請求項１２】
テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル-ラクチル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド化合物。
【請求項１３】
ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチル-アラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド化合物。
【請求項１４】
N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド化合物。
【請求項１５】
前記製剤が、錠剤、カプセル、散剤、丸薬、糖衣錠、顆粒剤、液剤、輸液、坐薬、プラスターあるいは軟膏剤である、請求項６〜１０のいずれかに記載の医薬製剤。
【請求項１６】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、血塊結合トロンビン、Xa因子、プラスミン、およびプラスミノーゲン活性化因子に対する抑制作用を有するペプチジル・アルギナルを投与することを含む方法。
【請求項１７】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、式(I)で示されるペプチジル・アルギナルを投与することを含む方法。
[ Xaa-Xbb-Arg-H  (I)
式(I)中、Xaaは式(II)のα-置換炭酸残基を表す
Q-CH(R)-CO  (II)
式(II)中、Qは炭素数１〜３のアルキロキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、あるいは水酸基を表し、Rは炭素数７〜９のシクロアルキルメチル基、1-アダマンチルメチル基、あるいは炭素数５〜７のシクロアルキル基を表し、XbbはL-プロリンあるいはL-アゼチジン-2-カルボン酸残基、あるいは薬学的に許容できるこれらの酸付加塩を表す ]
【請求項１８】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、構造１を有するペプチジル・アルギナルあるいは薬学的に許容できるこれらの酸付加塩を投与することを含む方法。
【化５】
2005502657.tif 000016
【請求項１９】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、構造２を有するペプチジル・アルギナルあるいは薬学的に許容できるこれらの酸付加塩を投与することを含む方法。
【化６】
2005502657.tif 000017
【請求項２０】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、構造３を有するペプチジル・アルギナルあるいは薬学的に許容できるこれらの酸付加塩を投与することを含む方法。
【化７】
2005502657.tif 000018
【請求項２１】
播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法であって、該患者に対し、構造４を有するペプチジル・アルギナルあるいは薬学的に許容できるこれらの酸付加塩を投与することを含む方法。
【化８】
2005502657.tif 000019
【請求項２２】
患者に対し、体重あたり約0.1mg〜約50mg/kgのペプチジル・アルギナルを投与する、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
患者に対し、ペプチジル・アルギナルの血中濃度が約6μM〜約100μMに達するのに十分な用量のペプチジル・アルギナルを投与する、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
ペプチジル・アルギナルの投与を、同時あるいは連続的に行う、請求項７あるいは８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、播種性血管内血液凝固に関する。より詳しくは、本発明は、播種性血管内血液凝固に対する医療処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
播種性血管内血液凝固(DIG)は二次疾患であり、多数の一次疾患のいずれかの結果として起こりうる(参照  Bick、Disseminated Intravascular Coagulation and Related Syndromes、CRC出版、ボーカラートン(1983))。その特徴は、血液凝固の系統的活性化であり、これがフィブリンの産生および堆積につながり、様々な臓器の微小血管に血栓を生じさせ、多臓器不全を引き起こす一因となる。Bickらによる、Clin. Appl Thrombosis Hemostasis 1: 3-23 (1995)は、DICのさらなる特徴が、全身的に循環するプラスミン、様々な血漿タンパク(ファクター、ホルモン等)を生分解することができ、且つフィブリノーゲン/フィブリンを切断してフィブリノーゲン/フィブリン分解生成物を産出することができる全身的なタンパク質分解酵素であることを教示する。これらの生成物は止血を妨げ、出血をもたらす。
【０００３】
DICの最も深刻な臨床型は、凝固タンパクの大量消費、フィブリンの著しい堆積、および出血を特徴とする。
【０００４】
外傷患者、特に、広範囲に渡る組織の損傷(特に脳)、敗血症および多臓器疾患を有する患者では、DICの危険が増大している。脳のトロンボプラスチン量が高く、全身の体表面積に対する頭の表面積の比が大きいため、頭の外傷は、幼児および小児において、DICを引き起こす大きな原因である。
【０００５】
敗血症は、全外傷患者の約40%で起こり得、全ての患者においてDICの重大な一次原因である。その臨床症状は、二次的な繊維素溶解によってより悪化し、結果としてFDP's (フィブリノーゲン/フィブリン分解生成物)あるいは正常なフィブリンの形成および血小板機能を妨げる「D-ダイマー」を形成する。
【０００６】
DICにおけるフィブリンの堆積は、さらなる臓器の機能不全を誘引する可能性がある。DICは急性腎不全の主な原因であり、多臓器不全の一因ともなる。逆に、損傷を受けた臓器がDICを引き起こす場合もある。
【０００７】
現在のところ、DICに対して一般に認められている治療は、第一疾患を緩和しようとする試みのみである。出血あるいは血栓症の問題に対して行われる治療の種類にかかわらず、DICは継続し、コントロールできない。おびただしい出血のある症例においては、第一疾患がコントロールされるまで、新鮮凍結血漿、血漿成分(例えば、アンチトロンビンIII) 寒冷沈降物、および／または濃厚血小板による補充療法が有益と考えられる。しかしこれらの治療は非常に高価である。DICにおけるヘパリンの使用は、非常に賛否両論が分かれ、外傷を基礎疾患に持つ患者には一般に使用されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それゆえ、DICを治療するための新しくより優れた化合物と方法が必要とされている。[参照例、de Jonge等、Drugs 55:767-777(1998)およびLevi等、Thrombosis and Haemostasis 82: 695 (1999)].
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、DICを治療するための新規でより優れた化合物および方法を提供する。予想外のことに、遊離トロンビン・血塊結合トロンビンの両方と、Xa因子の作用を阻害し、且つ、プラスミンおよびプラスミノーゲン活性化因子に対しても抑制的に働く抗凝血性の化合物が、DICの治療に有益であるということが見出された。
【００１０】
第一の面では、本発明は、式(I)で示されるペプチジル・アルギナルを含む組成物を提供する。
Xaa-Xbb-Arg-H  (I)
式(I)中、Xaaは、次式(II)のα-置換炭酸残基を表し、
Q-CH(R)-CO  (II)
式(II)中、Qは、炭素数１〜３のアルコキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、あるいは水酸基を表し、およびRは炭素数７〜９のシクロアルキルメチル基、あるいは炭素数５〜７のシクロアルキル基、あるいは1-アダマンチルメチル基を表し、Xbbは、L-プロリンあるいはL-アゼチジン-2-カルボン酸残基、および有機酸あるいは無機酸で形成されるそれらの酸付加塩を表す。
【００１１】
特に好ましい実施形態では、前記化合物は、以下の構造を持つ  : 構造１(エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)，あるいは、構造２(N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H)，あるいは構造３(D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, D-cHpl-Pro-Arg-H)，あるいは構造４(N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H)。これらは式(I)に対応しており、式(I)中、Xaaは式(II)のα-置換アルキル炭酸残基を表し、式(II)中Rは、シクロヘプチルメチルおよびシクロヘキシル基を個々に表し、Q は、エトキシカルボニルアミノ、メチルアミノ、および水酸基を個々に表し、Xbbは、L-プロリンおよびL-アゼチジニル-2-カルボン酸残基を個々に表す。
【００１２】
【化９】
2005502657.tif 000002
【００１３】
第二の面では、本発明は、抗凝血性のベプチジル・アルギナルあるいは本発明の第一の面によるこれらの薬学的に許容できる塩および薬学的に許容できるキャリアー、賦形剤あるいは希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
第三の面では、本発明は、播種性血管内血液凝固を治療する方法を提供する。この方法は、播種性血管内血液凝固に罹患している患者に対し、式(I)に対応する抗凝血性のベプチジル・アルギナルを投与すること含む。
Xaa-Xbb-Arg-H  (I)
式(I)中、Xaaは、次式(II)のα-置換炭酸残基を表し、
Q-CH(R)-CO  (II)
式(II)中、Qは、炭素数１〜３のアルコキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、あるいは水酸基を表し、およびRは炭素数７〜９のシクロアルキルメチル基、あるいは1-アダマンチルメチル基、あるいは炭素数５〜７のシクロアルキル基を表し、Xbbは、L-プロリンあるいはアゼチジン-2-カルボン酸残基、あるいはこれらの薬学的に許容できる酸付加塩を表す。特に好ましい実施形態では、前記化合物は、以下の構造を持つ  : 構造１(エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)，あるいは、構造２(N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H)，あるいは構造３(D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, D-cHpl-Pro-Arg-H)，あるいは構造４(N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H)。これらは式(I)に対応しており、式(I)中、Xaaは式(II)のα-置換アルキル炭酸残基を表し、式(II)中Rは、シクロヘプチルメチルおよびシクロヘキシル基を個々に表し、Q は、エトキシカルボニルアミノ、メチルアミノ、および水酸基を個々に表し、Xbbは、L-プロリンおよびL-アゼチジニル-2-カルボン酸残基を個々に表す。
【００１５】
【化１０】
2005502657.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、播種性血管内血液凝固に関する。より詳しくは、本発明は、播種性血管内血液凝固に対する医療処置に関する。本発明は、DICを治療するための、新規且つより優れた化合物および方法を提供する。本発明にかかる化合物は、プラスミンおよびプラスミノーゲン活性化因子に対してのみならず、遊離トロンビンと血塊結合トロンビンの両方およびXa因子に対しても抑制作用を有する。
【００１７】
明細書中に記載された特許および出版物は、当該技術分野における知識を反映するものであり、その全体が参照によりここに包含される。これらの特許および出版物と本願の開示との間に不一致があれば、本願の開示を優先して適用する。
【００１８】
第一の面では、本発明は、式(I)で示されるペプチジル・アルギナルを含む組成物を提供する。
Xaa-Xbb-Arg-H  (I)
式(I)中、Xaaは、次式(II)のα-置換炭酸残基を表し、
Q-CH(R)-CO  (II)
式(II)中、Qは、炭素数１〜３のアルコキシカルボニルアミノ基、メチルアミノ基、あるいは水酸基を表し、およびRは炭素数７〜９のシクロアルキルメチル基、1-アダマンチルメチル基、あるいは炭素数５〜７のシクロアルキル基、Xbbは、L-プロリンあるいはL-アゼチジニル-2-カルボン酸残基、および有機酸あるいは無機酸で形成されるそれらの酸付加塩を表す。
【００１９】
本発明のこの面にかかる特に好ましい一実施形態は、構造１に相当するものである(エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H)。
【００２０】
【化１１】
2005502657.tif 000004
【００２１】
本発明のこの面にかかる特に好ましい別の実施形態は、構造２に相当するものである(N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H) :
【００２２】
【化１２】
2005502657.tif 000005
【００２３】
本発明のこの面にかかるさらに好ましい一実施形態は、構造３に相当するものである(D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド, D-Hpl-Pro-Arg-H)。
【００２４】
【化１３】
2005502657.tif 000006
【００２５】
本発明のこの面にかかるよりいっそう好ましい一実施形態は、構造４に相当するものである(N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド, N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H) :
【００２６】
【化１４】
2005502657.tif 000007
【００２７】
構造１，２，３および４にかかる化合物は、例えば、NあるいはOが保護された2-残基酸成分と、グアニジノ基がベンジルオキシカルボニル基で保護された、L-アルギニンラクタムとを縮合し、得られたトリペプチドラクタムを保護されたトリペプチドアルデヒドに還元し、アルギニンのグアニジノ基から（式(II)中のQがメチルアミノあるいは水酸基である場合は、この末端メチルアミノあるいは水酸基からも）保護基を除去し、有機酸あるいは無機酸と形成された付加塩として、式(I)のペプチド誘導体を単離することによって調製される。
【００２８】
式(I)によって表される化合物は、塩の形態のほうが安定性がより大きいため、酸付加塩の形態で調製され使用される。式(I)の化合物の酸付加塩において、活性は塩基中に存在し、酸はあまり重要ではない（治療目的の場合、薬学的に許容できる酸付加塩を使用することが好ましいが）。好適な酸としては例えば、(a) 鉱酸：塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸および硫酸, (b)有機酸: 酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、パモ酸およびアリール-スルホン酸、例えばp-トルエンスルホン酸が含まれる。好ましい酸付加塩は、硫酸塩（特にヘミ硫酸塩）である。
【００２９】
酸付加塩は、従来の方法、例えば、式(I)の遊離塩基の形の化合物を酸で中和することによって、調製することができる。
【００３０】
２つの残基酸成分はD-Xaa-Xbbと表すことができる。Xaaは、式Q-CH(R)-COのα-置換カルボン酸残基を表し、Qは、炭素数１〜３のアルコキシカルボニルアミノ基を意味し、Rは、上記の定義と同一であり、XbbはL-プロリンあるいはL-アゼチジン-2-カルボン酸残基を表す。Xaa、α-置換アルキル酸が、α-メチルアミノあるいはα-ヒドロキシ酸である場合は、すなわち、Qは メチルアミノあるいは水酸基を表し、２つの残基酸成分は P-D-Xaa-Xbbと表すことができる。式中、P は、ベンジルオキシカルボニル(Z)あるいはtert-ブトキシカルボニル(Boc)基のようなN-保護基あるいはO-保護基、好ましくはテトラヒドロピラニル(THP)基を表す。
【００３１】
α-アミノあるいはα-メチルアミノ酸残基含有化合物の出発物質として使用されるアシルジペプチドは、α-アミノ酸を、対応するクロロホルム酸エステルでアシル化して、炭素数１〜３のアルコキシカルボニルアミノ酸およびベンジルオキシカルボニルアミノ酸を生成し、次にこれらをL-プロリンあるいはL-アゼチジン-2-カルボン酸と結合させて、D-Xaa-XbbおよびZ-アミノアシルXbbを生成し、求めるP-D-Xaa-Xbbを生成するためにN-メチル化することによって調製する。
【００３２】
Xbbとのカップリングに必要な、D-Xaaは、ラセミDL-Xaa化合物をアセチル化し、そのDL-アセチルアミノ酸をメチルエステルに変換し、そして、そのアセチル-DL-Xaa-OMeラセミエステルを酵素的に分解することによって、有利に調製することができる。このようにして得られたアセチル-D-Xaa-OMeは、その後けん化され、アセチル基を取り除かれ、その後必要とするN-保護 D-アミノ酸に変換される。
【００３３】
必要なD-α-ヒドロキシ酸は、対応するDa-アミノ酸から有利に得ることができる。その後、これをO-保護形に変換し、Xbbに結合させて、必要なP-D-Xaa-Xbbを生成する。
【００３４】
第二の面では、本発明は、本発明の第一の面にかかるペプチジル・アルギナルおよび薬学的に許容できるキャリアー、賦形剤あるいは希釈剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００３５】
医薬製剤は、一般式(I)で示される化合物あるいは薬学的に許容できるそれらの塩を有効量含有し、および既知の薬学的に許容できるキャリアー、充てん材、希釈剤および／または他の製薬賦形剤を含有する。
【００３６】
上述のキャリアー、希釈剤あるいは充てん材として、水、アルコール、ゼラチン、乳糖、蔗糖、でんぷん、ペクチン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、滑石粉、各種の動物性あるいは植物性オイル、さらにグリコール（例えば、プロピレングリコールあるいはポリエチレングリコール）を用いることができる。
【００３７】
前記製薬賦形剤として、防腐剤、各種の天然あるいは合成エマルゲーター、分散剤あるいは湿潤剤、着色剤、香料剤、緩衝剤、崩壊促進剤および有効成分のバイオアベイラビリティを改善する他の物質を挙げることができる。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、非経口組成物(注射、輸液、坐剤、プラスターあるいは軟膏剤のような胃腸系を避けて投与される薬)のみならず、経口組成物(錠剤、カプセル、散剤、丸薬、糖衣錠あるいは顆粒剤のような経口投与されるもの)のような通常の製剤として調製することができる。
【００３９】
第三の面では、本発明は播種性血管内血液凝固に罹患している患者を治療する方法を提供する。この方法には、播種性血管内血液凝固に罹患している患者に対して、式Xaa-Xbb-Arg-H (I)（式中、XaaおよびXbbは上述の通りである）に相当するペプチジル・アルギナルあるいはそれらの薬学的に許容できる酸付加塩を投与することが含まれる。ペプチジル・アルギナル類はペプチジル・アルギニンアルデヒド誘導体ともいわれる。
【００４０】
本発明のこの面によれば、本発明は播種性血管内血液凝固の治療方法を提供する。この方法は、人間患者を含む動物患者に対し、本発明にかかるペプチジル・アルギナル類を投与することを含む。本発明のこの面にかかる方法では、本発明にかかる治療的有効量のペプチジル・アルギナルが治療的有効期間の間、播種性血管内血液凝固を患っている、ヒトを含む動物に投与される。好ましい投与方法は、静脈内投与あるいは皮下投与であり、最も好しいのは静脈内投与である。前記治療用組成物の投与は、既知の手段を用いて行うことができ、DICの症状あるいは代替マーカーを減じるのに有効な用量と期間で行えばよい。全身投与の場合、前記治療用組成物は、好ましくはペプチジル・アルギナル類の血中濃度が約６μM〜約１００μMに達するのに十分な投与量で投与する。好ましい総投与量は、１日あたり体重１kgあたり、ペプチジル・アルギナル約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇである。本発明にかかる一以上の治療用組成物の治療的有効量を、単独治療の一回分として、個体に対し、同時に、あるいは連続して投与することが望ましい。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の特に好ましい実施形態をより詳細に説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。特に記載のない限り、以下の実施例において、ヒトトロンビン(3,000 NIH U/mg)、ヒトアルブミン、およびヒトフィブリノーゲンは、Sigma Aldrich Kft（ハンガリー、ブダペスト）から入手し、ヒトXa因子(8μg/U)はEnzyme Research Laboratories（英国、スウォンジ）から入手した。APTT試薬はREANALから（ハンガリー、ブダペスト）およびPT 試薬、Simplastin Dは、ORGANON, TEKNIKA（ドイツ、エッペルハイム）から購入した。
【００４２】
アミノ酸、ペプチド、置換基および試薬の略語は、IUPAC-IUB協定に従って使用する。この出願で用いられている略語は以下の通りである。Arg = L-アルギニン, Boc = tert-ブトキシ-カルボニル, Bzl =ベンジル, Chg = L-シクロヘキシルグリシン, DCHA = ジシクロヘキシルアミン, DHP = ジヒドロピラン, Eoc = エトキシカルボニル, Gly = グリシン, Me = メチル, MePhe = N-メチル-L-フェニルアラニン, Moc = メトキシカルボニル, Pro = L-プロリン, pNA = p-ニトロアニリノ, TFA = トリフルオロ酢酸, THP = テトラヒドロピラニル, Tos = p-トルエンスルホニル, Z = ベンジルオキシカルボニル, RT = 室温。この出願において用いられる特殊な酸の略語は、以下の通りである。Ada = アダマンチル-L-アラニン, Aze = L-アゼチジン-2-カルボン酸, N-Me-D-cHpa = N-メチル-D-シクロヘプチルアラニン, D-cHpa = D-シクロヘプチルアラニンあるいは(R)-2-アミノ-3シクロヘプチルプロピオン酸, D-Hla = D-シクロ-ヘプチル乳酸あるいは(R)-2-ヒドロキシ-3- シクロヘプチルプロピオン酸。
【００４３】
実施例で記録されるRf値は、吸着剤としてシリカゲルを用いて(DC-Alufolien Kieselgel 60 F254, メルク, ダルムシュタット)、以下の展開システムにおける、薄層クロマトグラフィーによって決定された。用いたシステムの番号は、略語Rfの後ろの括弧中に記載する。
1．酢酸エチル
2．酢酸エチル−n-ヘキサン (1: 4)
3．酢酸エチル−n-ヘキサン (1: 1)
4．酢酸エチル−シクロヘキサン (15: 85)
5．クロロホルム−アセトン (95: 5)
6．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (960 : 20 : 6 : 11)
7．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (480 : 20 : 6 : 11)
8．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (240 : 20 : 6 : 11)
9．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (120 : 20 : 6 : 11)
10．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (90 : 20 : 6 : 11)
11．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (60 : 20 : 6 : 11)
12．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (45 : 20 : 6 : 11)
13．酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 (30 : 20 : 6 : 11)
【００４４】
実施例中で示す利用率(k')は、下記の「Pharmacia LKB Analytical HPLC System Two」装置を用いて決定した。
カラム : LiChrospher RP-18 : 12μm  240x4mm
カラム温度 : 外界温度
溶離液 : 溶媒Ａ 0.1% TFA/水 ; 溶媒Ｂ 0.1% TFA/アセトニトリル
勾配プロフィール : 0→15分 30→60%B、その後60%B均一濃度
溶媒流速 : 1ml/分.
検出器 : LKB 2141 UV モニター；波長 : 214 nm.
注射器 : Rheodyne 7125. サンプルループ : 100μL
ポンプ : 2 LKB 2148型. 制御システム : LKB HPLC Manager
サンプルの濃度 : 溶媒Ａ中1 mg/ml, 注入量25μL
分析時間  40 分
【００４５】
アシル-アルギニンアルデヒドは、平衡構造中（すなわち、アルデヒド、アルデヒド水和物、および２つのアミノシクロール形中）に存在する。HPLC分析中に、アルデヒド水和物および１あるいは両方のアミノシクロール形は、２あるいは３の分離したピークとして現れる。実施例中で記述されるアシルアルギニンアルデヒドは、２あるいは３のk'値によって特定される。
【００４６】
質量分析のために、Finnigan MAT 8430 装置によってFAB陽イオン化測定を行った。サンプルをm-ニトロベンジルアルコール(NBA)マトリクス中に溶解し、イオン源中に直接誘導した。ペプチジル-アルギニンアルデヒドのスペクトル中に、NBAにより形成された別の化合物のさらなる分子イオンが検出された：[M+H]+および[M+H+NBA]+。実施例において、FABスペクトルデータをそれに応じて決定した。ESI陽イオン化測定はVG Quattro(Fisons)装置で行われた。サンプルを、1%(v/v)のギ酸を含有する、アセトニトリル-水(1:1)の混合物に溶解し、10mlのサンプル-ループを用いてイオン源中に、流速15-25 ml/分で誘導した。
【実施例１】
【００４７】
エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド ヘミサルフェートの合成
【００４８】
工程１：エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム
7.85g(20.1mM)のtert-ブチルオキシカルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム[(Bajusz等、J. Med. Chem. 33,1729(1990)]を20 mlのクロロホルム中に懸濁し, その後HClガス(0.11-0.15g/ml)で飽和した酢酸エチル20mlを撹拌および氷冷しながら添加した。Boc基の分裂を薄層クロマトグラフィー[Rf(11)=0.5(遊離化合物)；1.0(Boc-化合物)]によってモニターした。反応の終わりまでに、前記懸濁液を40mlのジエチルエーテルで希釈し、形成された結晶をろ過し、10mlのアセトンと10mlのジエチルエーテルで洗浄し、減圧でKOH上で乾燥した。その結果生じたNG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム塩酸塩を20mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-20℃まで冷却し、以下の混合無水物に添加した。
【００４９】
7.12g(20.1mM)のエトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン(実施例1、工程J)を20 mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-15℃まで冷却し、その後、撹拌しながら2.23ml(20.1mM)のN-メチル-モルホリンおよび2.65ml(20.1mM)のクロロギ酸イソブチルを添加した。10分の撹拌後、上記NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタムのジメチルホルムアミド溶液を添加し、その後、トリエチルアミンを添加して、反応混合物のｐＨを８に調節した(約2.8mlのトリエチルアミンが必要であった)。反応混合物を-10℃で30分間、次に0℃で１時間撹拌した。その後、塩をろ過し、ろ液を100mlの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、25mlの水で３回、10mlの1M KHSO4、および10mlの水で３回洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。得られた生成物を、吸着剤として200gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液として酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物[(Rf(1)=0.60]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質をジイソプロピルエーテルから結晶化した。
【００５０】
収量10.84g(86.1%)，Rf(1)=0.55-0.65
FAB質量スペクトル(627[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【００５１】
工程２：エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド
8.02g(12.8mM)のエトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム(実施例１、工程１)を15mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、その後、-50℃以下の温度で撹拌しながら、テトラヒドロフラン中に溶解した3.6mMのLiAlH4の溶液を添加した。還元の進行を、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒として溶媒7を用いた)によってモニターし、必要に応じてLIAlH4を追加した。この反応混合物に、撹拌および冷却しながら、0.5MのKHSO4を１滴ずつpH3に達するまで加え、その後35mlの水を加えた。その結果生じた溶液を、15mlのヘキサンで２回、次に20mlのジクロロメタンで３回抽出した。ジクロロメタン抽出物をプールし、15mlの水で３回、15mlの冷却した5%炭酸水素ナトリウム溶液、そして再度15mlの水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質はジイソプロピルエーテルで処理し、ろ過して、減圧で乾燥した。
【００５２】
収量7.08g(88%)、Rf(8)=0.40-0.50
FAB質量スペクトル(629[M+H]+, 782[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００５３】
工程 3: エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド ヘミサルフェート
6.91g(11.0mM)のエトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド(実施例１、工程２)を85mlのエタノールおよび11.25mlの0.5M硫酸中に溶解し、次に、14mlの水に懸濁させた0.7gのPd-C触媒を添加し、混合物を約10℃で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーによってモニターした。反応完了後(約15分)、前記触媒をろ過し、ろ液を2.0-2.5kPaで約7-9mlまで濃縮した。残留物を80mlの水で希釈し、15mlのジクロロメタンで４回抽出し、水溶液を20-22℃で24時間静置しておいた。この溶液を、再度15mlのジクロロメタンで３回抽出し、pHをイオン交換樹脂Dowex AG 1-X8 (HO−)によって3.5に調節し、その後溶液を凍結乾燥した。
【００５４】
収量4.90g(82%) Rf(11)=0.35-0.45  [α]D20=-77.6°(c=1.018；水)
HPLC：k'=1.695および2.328
FAB質量スペクトル(495[M+H]+, 648[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００５５】
出発物質の合成
エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン
【００５６】
工程A：1-シクロヘプチルアセチル-2,5-ジメチルピラゾール
58.6g(375mM)のシクロヘプチル酢酸[Protiva等, Collect. Czech., Chem., Commun., 55: 1278-1289(1990)]を375 mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、-15℃まで冷却し、その後撹拌しながら、41.3ml(375mM)のN-メチルモルホリン、49.50ml(375mM)のクロロギ酸イソブチルを添加し、-10℃で10分間撹拌した後、300mlのテトラヒドロフラン中に37.85g(393.75mM)の3,5-ジメチルピラゾールが含まれる溶液を-10℃で添加した。撹拌を-10℃で30分間、0℃で１時間、および室温で3時間続けた。その後、塩をろ過し、ろ液を減圧下で蒸発し、残留物を900mlの酢酸エチル中に溶解した。この溶液を、引き続き、80mlの1M NaOHで３回、89mlの水、80mlの1M HClで３回、そして水で洗浄して中性にした(塩基洗浄液を合わせて、酸性にし、シクロヘプチル酢酸を5.8g, 37.1mM再生成した)。酢酸エチル溶液を無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。結果として生じた油状の生成物を340mMの1-シクロヘプチルアセチル-2,5-ジメチルピラゾールとして処理し、さらに精製することなく次の工程で用いた。Rf(2)= 0.8-0. 9(酸：0.3-0.4)
【００５７】
工程B：1-シクロヘプチルアセトアルデヒド
-30℃まで冷却した350mlのテトラヒドロフランに、12.83g(338mM)のLiAlH4を添加した。その後、250mlの冷却テトラヒドロフラン中の油状生成物(実施例1、工程A)の溶液を、-25℃で撹拌しながら１滴ずつ添加した。反応後にTLCを行った。必要に応じて、テトラヒドロフラン中のLiAlH4溶液(3g/100ml)を、30-40ml添加した。還元が完了した後、冷却した混合物を6MのHClで酸性にし、酢酸エチル(500ml)で希釈した。水相を酢酸エチルで抽出し、有機溶液を合わせて、中性になるまで水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。その結果生じた油状の生成物は、2,5ジメチルピラゾール(DMP)が混入した、未精製の1-シクロヘプチルアセトアルデヒドであった。Rf(2)=0.7-0.8(DMP：0. 25-0. 35)
【００５８】
結果物である油状の生成物(62.6g)を350mlのメタノールに溶かした溶液に、70mlの水に溶かした36.4gのNaHSO3の溶液を、撹拌しながら添加した。反応混合物を冷却庫中で一晩保管した。沈殿した物質をろ過し、冷却した35mlのメタノールと7mlの水の混合物で洗浄し、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。この固体の物質は、亜硫酸水素ナトリウム付加物(73.87g, 302.38mM), Rf(14)=0.55-0.65)であり、450mlの塩化メチレンと、47.7g(450mM)のNa2CO3を含有する450mlの水との混合物に添加した。反応混合物を一晩撹拌した。２相を分離し、有機相を塩化メチレン(2×100ml)で洗浄した。合わせた有機相を水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。結果物である油状の生成物(36.97g, 263.64mM)は精製1-シクロヘプチル-アセトアルデヒドであり、次の反応にそのまま用いられた。Rf(2)=0.7-0. 8
【００５９】
工程C：5-シクロヘプチルメチルヒダントイン
50%のエタノール水溶液(857ml；3.25ml/mM)にアルデヒド(実施例1, 工程B)を溶かした溶液に、15.5g(290mM；1.1当量)の塩化アンモニウム、27.87g(659mM；2.5当量)の炭酸アンモニウム、および18.9g(290mM；1.1当量)のシアン化カリウムを50-55℃で撹拌しながら添加し、その後撹拌を50℃で48時間続けた。沈殿した物質をろ過し、50%エタノール(100ml)で洗浄し、減圧デシケーター中で乾燥した。最初の収穫物として、42.26g(206.97mM)の物質が得られた。母液エタノールを蒸留し、残留物を酢酸エチル(1×250mlおよび2×100ml)で抽出し、有機溶液を合わせて、水(3×50ml)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、その後 2.0-2.5kPaで蒸発した。残留物をジイソプロピルエーテルとともに粉砕し、ろ過して乾燥した。二度目の収穫物として、3.6g(17.12mM)の物質が得られた。全収量として、45.86g(218mM, 82.5%)の5-シクロヘプチルメチルヒダントインが得られた。融点：240.9℃  Rf(6)= 0.73-0.78
【００６０】
C11H18N2O2(210.28)の分析  計算値：C%＝62.83；H%＝8.63；N%＝13.32
実測値：C%＝63.09；H%＝8.67；N%＝13.25
【００６１】
工程D：DL-シクロヘプチルアラニン塩酸塩
87g(1.55M)のKOHを435mlのn-ブタノール中に撹拌し温めながら溶解し、45.71g(217.4mM)の5-シクロヘプチルメチルヒダントイン(実施例１，工程C)を加えた。このようにして得られた溶液を72時間還流し、その後水で希釈し、減圧下で蒸発した。残留物を220mlの水に溶解し、濃塩酸(〜130ml)を用いて酸性にし(pH2まで)、冷却庫中で一晩保管した。沈殿物をろ過し、50mlの水で洗浄し、減圧デシケーター中で乾燥した。このようにして得られた生成物(106.5g)は217mMのDL-シクロヘプチルアラニンと考えられ、次の反応に用いられた。Rf(11)＝0.2-0.3
【００６２】
工程E：DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル塩酸塩
23.65ml(325.25mM)のSOCl2を、0℃〜-5℃で撹拌しながら、217mlのメタノール中に滴下した。その後、DL-シクロヘプチルアラニン(217mM，実施例１・工程Dから)を加え、24時間撹拌した。変換後にTLCを行った。Rf(11)＝0.75-0.85(エステル)，0.3-0.4(酸)。未反応のアミノ酸が検出された場合、反応混合物を-5℃まで冷却し、11.8mlのSOCl2を滴下し、この反応混合物を24時間以上撹拌した。その後溶解していない塩をろ過し、メタノール(2×50ml)で洗浄し、合わせたメタノール溶液を蒸発させた。残留物をメタノール中に再溶解し、再度蒸発させた。最後に、残留物をジイソプロピルエーテルとともに粉砕し、ろ過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄して、減圧デシケーター中でKOHとP2O5上で乾燥した。33.68g(142.85mM)のDL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル塩酸塩が得られた。Rf(11)＝0.5-0.6  融点：95.4-96.5℃
【００６３】
工程F：アセチル-DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル
140mlのピリジンに、33.68g(142.85mM)のDL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル塩酸塩(実施例1、工程E)を溶かした溶液に、無水酢酸(16.2ml，171.43mM)を一滴ずつ１時間かけて加えた(氷浴中で冷却し撹拌しながら)。反応混合物を外界温度で24時間撹拌し、その後減圧下で蒸発した。残留物を300mlの酢酸エチル中に溶解し、1M KHSO4(3×50ml)および水(3×50ml)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5 kPaで蒸発した。結果物である油状の生成物をジイソプロピルエーテルとともに粉砕し、固体の物質をろ過し、ジイソプロピルエーテル、次に水で洗浄し、デシケーター中で乾燥した。24.36g(100.94mM, 70.4%)のメチルアセチル-DL-シクロヘプチルアラニナート (アセチル-DL-エステル)が得られた。Rf(1)＝0.55-0.65  融点：69-71℃
【００６４】
C13H23NO3(241.332)の分析。計算値：C%＝64.70；H%＝9.61；N%＝5.80
実測値：C%＝64.75；H%＝9.76；N%＝5.85
【００６５】
工程G：アセチル-D-シクロヘプチルアラニンメチルエステル(アセチル-DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステルの酵素分解)
36mlのトルエン中に、8.69g(36mM)のアセチル-DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル, アセチル-DL-エステル(実施例１，工程F)を溶かした溶液に、72mlの水および36mgのサブチリシン・カールスバーグ(Subtilisin Carlsberg)(プロテアーゼ タイプVIII, Sigma)を加えた。3M NaOHを充てんした自動滴定装置によってpHを7.0に維持しつつ、L-エナンチオマー、アセチル-L-エステルの酵素加水分解を進行させた。NaOHの消費が止まった(5.8 ml，17.4mM)後、反応混合物を36mlのトルエンで希釈し、２相を分離した。水相を30mlのトルエンで２回洗浄した。合わせたトルエン溶液はアセチル-D-エステルを含有し、合わせた水溶液は、アセチル-L-酸のナトリウム塩を含有していた。
【００６６】
無水Na2SO4上で乾燥した後、合わせたトルエン溶液を減圧下で蒸発し、3.8g(15.75mM)のアセチル-D-エステル、Rf(1)＝0.55-0.65を得て、次の工程で直接用いた。
【００６７】
合わせた水溶液を酸性にし、30mlの酢酸エチルで3回抽出した。
合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発して、4.0g(17.6mM)のアセチル-L-酸、Rf(7)＝0.38-0.42を得た。
【００６８】
9.65g(40mM)のアセチル-DL-エステル(実施例１、工程F)から同様に調製して、4.6g(19.06mM)のアセチル-D-エステルおよび4.44g(19.55mM)のアセチル-L-酸を得た。
【００６９】
工程H  D-シクロヘプチルアラニン塩酸塩
7.24g(30mM)のアセチル-D-エステル(実施例1，工程G)を120mlの6M HCl中に懸濁し、３時間還流した。遊離アミノ酸を結晶として分離した。反応混合物を冷却し、冷却庫中で一晩保管し、ろ過し、冷水とエーテルで洗浄し、その後減圧デシケーター中で乾燥した。5.9g(26.69mM, 89%)のD-シクロヘプチルアラニン塩酸塩が得られた。Rf(12)＝0.10-0.15  [α]D20＝-11°(c＝0.4；1M HCl)
【００７０】
C10H19NO2・HCl(221.728)の分析。計算値：C%＝54.17；H%＝9.09；N%＝6.32；Cl%＝15.99  実測値：C%＝54.27；H%＝9.27；N%＝6.30；Cl%＝16.2
【００７１】
工程I：エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニン
20mlのジメチルホルムアミド中に4.43g(20mM)のD-シクロヘプチルアラニン塩酸塩(実施例１，工程H)を溶かした溶液に、5.6ml(40mM)のトリエチルアミンおよび3.95g(21mM)の(N-ヒドロキシスクシンイミジル)-エチル炭酸塩＊を加えた。3時間室温で撹拌した後、反応混合物を蒸発し、40mlの酢酸エチル中に溶解した残留物を、30mlの1M KHSO4で２回と水で洗浄して中性にした。その後、有機相を無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。結果として生じた油状生成物(4.47g，〜17mM)はエトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニン[Rf(7)＝0.85-0.90]であり、次の工程で直接用いた。[α]D20＝+6.3°(c＝1，メタノール)。
【００７２】
*N-ヒドロキシスクシンイミジル)-エチル-炭酸塩の調製
11.5g(100mM)のN-ヒドロキシスクシンイミドを100mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、-10℃まで冷却し、その後撹拌しながら、15.4ml(110mM)のトリエチルアミンと10.45 ml(110mM)のエチル・クロロカーボネートを加えた。室温で２時間撹拌した後、混合物をろ過し、減圧下でろ液を蒸発した。油状の残留物を冷却して結晶化した。この結晶性物質を軽油エーテル中に懸濁し、ろ過し、減圧デシケーター中で乾燥した。収量12.78g(68.3%)  融点：39.4-39.7℃
【００７３】
C7H9NO5(187.15)の分析。計算値：C，44.92；H，4.85；N, 7.48  実測値：C%＝44.67；H%＝4.81；N%＝7.27
【００７４】
工程J：エトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン
17mlのTHF中にエトキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニン(〜17mM, 実施例1, 工程I)を溶かした溶液に、3.74g(20mM)のN-ヒドロキシスクシンイミドを混合し、10℃まで冷却し、約20mlのTHFに4.12g(20モル)の1, 3-ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶かした溶液を混合した。混合物を22℃で約5時間撹拌し、活性エステルの形成をTLCによって全て確認した。
【００７５】
撹拌した反応混合物に、L-プロリン(1.95g, 17mM)を加えて、その後2.3ml(17mM)のトリエチルアミンを添加した。反応混合物を22℃で約15時間撹拌し、その後、活性エステルの消費をTLCによって全て確認した。反応混合物をろ過し、フィルター・ケーキを10mlのTHFで洗浄し、ろ液を蒸発させた。残留物を30mlの酢酸エチルと30mlの水に溶解した。水相を20 mlの酢酸エチルで２回洗浄し、20mlの1M KHSO4で酸性にし、20mlの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄して中性にし、無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。ジイソプロピルエーテルとともに粉砕し、残留物を結晶化した。 結晶性懸濁液を冷却庫で冷やし、軽油エーテルを用いてろ過し、減圧デシケーター中で乾燥した。4.2g(11.85mM, 70%)のエトキシカルボニルD-シクロヘプチルアラニル-L-プロリンが得られた。Rf(7)＝0.45-0.55
【００７６】
C18H30N2O4(354.45)の分析。計算値：C, 60.99 ; H, 8.53 ; N, 7.90  実測値: C%=60.14 ; H%= 8.55 ; N% = 7.38.
FAB質量スペクトル(355[M+H]+)により想定される構造を確認した。
【実施例２】
【００７７】
N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド硫酸塩の合成
【００７８】
工程１: ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジル-オキシカルボニル- L-アルギニンラクタム
tert-ブチルオキシカルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム[(Bajusz等、J. Med. Chem. 33,1729 (1990)]3.93g(10mM)を10mlのクロロホルム中に懸濁し、その後、HClガス(0.11-0.15g/ml)で飽和した10mlの酢酸エチルを撹拌し氷冷しながら加えた。Boc基の分裂を薄層クロマトグラフィー[Rf(11)=0.5(遊離化合物)；1.0(Boc-化合物)]によってモニターした。反応の終わりまでに、前記懸濁液を20mlのジエチルエーテルで希釈し、形成された結晶をろ過し、5mlのアセトンと5mlのジエチルエーテルで洗浄し、減圧でKOH上で乾燥した。その結果生じたNG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム塩酸塩を10mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-20℃まで冷却し、以下の混合無水物に添加した。
【００７９】
4.32g(10mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン(実施例2, 工程C)を10mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-15℃まで冷却し、その後、撹拌しながら1.12ml(10.1mM)のN-メチル-モルホリンおよび1.33ml(10.1mM)のクロロギ酸イソブチルを添加した。10分の撹拌後、上記NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタムのジメチルホルムアミド溶液を添加し、その後、トリエチルアミンを添加して、反応混合物のｐＨを８に調節した(約1.4mlのトリエチルアミンが必要であった)。反応混合物を-10℃で30分間、次に0℃で１時間撹拌した。その後、塩をろ過し、ろ液を100mlの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、15mlの水で３回、6mlの1M KHSO4、および6mlの水で３回洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。得られた生成物を、吸着剤として100gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液として酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物[(Rf(1)=0.70]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質をジイソプロピルエーテルから結晶化した。
【００８０】
収量6.0g(85%)，Rf(1)= 0.65-0. 75
FAB質量スペクトル(703[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【００８１】
工程２ : ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L- アルギニンアルデヒド
5.62g(8mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム(実施例2, 工程1)を10mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、その後、-50℃以下の温度で撹拌しながら、テトラヒドロフラン中に溶解された2.25mMのLiAlH4の溶液を添加した。還元の進行を、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒として溶媒7を用いた)によってモニターし、必要に応じてLIAlH4を追加した。この反応混合物に、撹拌および冷却しながら、0.5MのKHSO4を１滴ずつpH3に達するまで加え、その後25mlの水を加えた。結果として生じた溶液を、10mlのヘキサンで２回、次に15mlのジクロロメタンで３回抽出した。ジクロロメタン抽出物をプールし、15mlの水で３回、15mlの冷却した5%炭酸水素ナトリウム溶液、そして再度15mlの水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質はジイソプロピルエーテルで処理し、ろ過して、減圧で乾燥した。
【００８２】
収量4.95g(88%), Rf(1)= 0.20-0.25.
FAB 質量スペクトル(705[M+H]+, 858[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００８３】
工程 3: N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド硫酸塩
4.6g(6.5mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド(実施例2,  工程2)を65mlのエタノールおよび13.5mlの0.5M硫酸中に溶解し、次に、10mlの水に懸濁させた0.4gのPd-C触媒を添加し、混合物を約10℃で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーによってモニターした。反応完了後(約15分)、前記触媒をろ過し、ろ液を2.0-2.5kPaで約5-7mlまで濃縮した。残留物を50mlの水で希釈し、10mlのジクロロメタンで４回抽出し、水溶液を20-22℃で24時間静置しておいた。この溶液を、再度10mlのジクロロメタンで３回抽出し、pHをイオン交換樹脂Dowex AG 1-X8 (HO-)によって3.5に調節し、その後溶液を凍結乾燥した。
【００８４】
収量2.85 g (82%)  Rf(9)= 0.35-0.45.  [α]D20=-79.6°(c=l ; 水)
FAB質量スペクトル(437[M+H]+, 590[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００８５】
出発物質の合成
ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン
工程 A : N-ベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニンの合成
D-シクロヘプチルアラニン塩酸塩(実施例1, 工程H)(11.09g, 50mM)を0℃で40mlのTHFおよび40mlの水と混合した。撹拌した混合物に5M NaOH溶液を加えて、pH約10に調節した。温度を約３℃に、そして必要に応じて5M NaOHを添加してpHを約10に管理しながら、この反応混合物にクロロギ酸ベンジル(8.22ml, 55.4mM)を添加した。クロロギ酸ベンジルの添加完了後、反応混合物を０℃で１時間撹拌し、pHを約10に管理した。室温で撹拌を一晩続け、反応が完了したことをTLC(7)で調べた。必要であれば、さらにクロロギ酸ベンジル(1-2 x 0.75ml, 5mM)を、温度約３℃、pHを約10(5M NaOHを添加することによって調整)に管理しながら反応混合物に添加した。t-ブチルメチルエーテル(25ml)を添加し、撹拌した混合物を22℃に温めた。水相を分離し、２回目の25mlのt-ブチルメチルエーテルで洗浄した。有機相の内容物をTLCで調べ、必要であれば、有機相を25mlの水で逆抽出した。水相と25mlの酢酸エチルを混合し、濃塩酸でpHを２に調節した。相を分離し、水相を２回目の25mlの酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相を20mlの1M KHSO4および30mlの水２回で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、 2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質を45mlのTHF中に溶解し、このベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニンの溶液をさらに精製することなく、次の工程で用いた。
【００８６】
工程 B: ベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン
実施例２の工程Aで得られたベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニンのTFA溶液を5.9g(51.24mM)のN-ヒドロキシスクシンイミドと混合し、10℃まで冷却し、その後、約25mlのTHF中の11g(53.3mM)の1,3-ジシクロヘキシルカルボジ-イミド溶液と混合した。混合物を約4.5時間22℃で撹拌し、活性エステルの形成をTLCで全て確認した。
【００８７】
L-プロリン(5.9g, 51.24mM)を撹拌した反応混合物に加えて、その後7.2ml(51.24mM)のトリエチルアミンを添加した。反応混合物を22℃で約15時間撹拌し、その後、活性エステルの消費をTLCによって全て確認した。反応混合物をろ過し、フィルター・ケーキを25mlのTHFで洗浄し、ろ液を蒸発させた。残留物を50mlの酢酸エチルと50mlの水に溶解した。水相を20 mlの酢酸エチルで２回洗浄し、20mlの1M KHSO4で酸性にし、40mlの酢酸エチルで３回抽出した。合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄して中性にし、無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。残留物である、ベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリンを、60mlのTHF中に溶解し、さらに精製することなく次の工程で使用した。
【００８８】
工程C：ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン
ヨードメタン(17.95ml, 288mM)を実施例２・工程BのベンジルオキシカルボニルD-シクロヘプチルアラニル-L-プロリンのTHF溶液に添加した。この溶液を8℃まで冷却し、20mlのTHFリンスとともに、温度を13℃未満に保ちながら、35mlTHF中の4.75g(119mL)の水素化ナトリウム60%の撹拌懸濁液に移した。反応混合物を11℃で24時間撹拌した。過剰の水素化ナトリウムは温度を13℃未満に保ち、発泡をコントロールしながら、反応物に1.6mlの水を注意深く添加して分解した。急冷した反応混合物を約20分間22℃で撹拌し、その後、30℃未満の温度で減圧して約40mlに濃縮した。水(70ml)を残留物に加え、続いて30mlのt-ブチルメチルエーテルを加えた。相を分離し、水相を30mlのt-ブチルメチルエーテルで再度洗浄した。水性の生成物相を40mlの酢酸エチルと混合し、3Mの硫酸溶液でpH2.2に調節した。相を分離し、水相を40mlの酢酸エチルで逆抽出した。合わせた有機相を70mlの5%チオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄した。相を分離し、温度を50℃未満に保ちながら、有機相を減圧(33-45kPa)下で小容量まで濃縮した。残留物を18.6mlのTHFおよび100mlの水と混合し、シクロヘキシルアミンでpH8.5に調節した。その結果生じた懸濁液を、25-55℃で減圧下(9-33kPa)、100mlに濃縮し、25℃に調節し、71.5mlの水で希釈し、約10.5時間撹拌した。この懸濁液をろ過し、水で洗浄し、45℃で空気乾燥し、16.72gのベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘプチルアラニル-L-プロリン  シクロヘキシルアミン塩(D-シクロヘプチルアラニンから63%の収量)を産出した。Rf(8)=0.55-0.65.
【実施例３】
【００８９】
D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒドヘミサルフェートの合成
工程1 : テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム
5.08g(13mM)のtert-ブチルオキシカルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム[(Bajusz等、J. Med. Chem. 33,1729 (1990)]を13mlのクロロホルム中に懸濁し, その後HClガス(0.11-0.15g/ml)で飽和した酢酸エチル13mlを撹拌し氷冷しながら添加した。Boc基の分裂を薄層クロマトグラフィー[Rf(11)=0.5(遊離化合物)；1.0(Boc-化合物)]によってモニターした。反応の終わりまでに、前記懸濁液を25mlのジエチルエーテルで希釈し、形成された結晶をろ過し、7mlのアセトンと7mlのジエチルエーテルで洗浄し、減圧で水酸化カリウム上で乾燥した。その結果生じたNG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム塩酸塩を13mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-20℃まで冷却し、以下の混合無水物に添加した。
【００９０】
実施例３の工程Iで得られたテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリン トリエチル-アンモニウム塩の溶液(12mM)を-20℃まで冷却し、その後、撹拌しながら1.6ml(12mM)のクロロギ酸イソブチルを添加した。10分の撹拌後、上記NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタムのジメチルホルムアミド溶液を添加し、その後、トリエチルアミンを添加して、反応混合物のｐＨを８に調節した(約1.8mlのトリエチルアミンが必要であった)。反応混合物を-10℃で30分間、次に0℃で１時間撹拌した。その後、塩をろ過し、ろ液を65mlの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、25mlの水で３回、7mlの1Mの硫酸水素カリウム、および7mlの水で３回洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。得られた生成物を、吸着剤として130gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液として酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物[(Rf(1)=0.60]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質をジイソプロピルエーテルから結晶化した。
【００９１】
収量5.0g(7.8mM, 64%),  Rf(1)=0.6
FAB質量スペクトル(640[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【００９２】
工程2 : テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド
4.8g(7.51mM)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム(実施例3, 工程1)を15mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、その後、-50℃以下の温度で撹拌しながら、テトラヒドロフラン中に溶解された3.6mMの水素化アルミニウムリチウムの溶液を添加した。還元の進行を、薄層クロマトグラフィーによってモニターし（展開溶媒番号８を用いた）、必要に応じて、水素化アルミニウムリチウムを追加した。この反応混合物に、撹拌および冷却しながら、0.5Mの硫酸を１滴ずつpH3に達するまで加え、その後35mlの水を加えた。結果として生じた溶液を、15mlのヘキサンで２回、その後20mlのジクロロメタン３回で抽出した。ジクロロメタン抽出物をプールし、15mlの水で３回、15mlの冷却した5%炭酸水素ナトリウム溶液、そして再度15mlの水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質はジイソプロピルエーテルで処理し、ろ過して、減圧で乾燥した。
【００９３】
収量3.9g(6.07 mM, 81%)、Rf(8)=0.40.［α］D20 ＝+16.0°(c=1, テトラヒドロフラン)
FAB質量スペクトル(642[M+H]+, 795[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００９４】
工程 3: D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-L-アルギニンアルデヒド ヘミサルフェート
3.21g(5mM)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド(実施例3, 工程2)を40mlのエタノールおよび5mlの0.5M硫酸中に溶解し、次に、6mlの水に懸濁させた0.3gのPd-C触媒を添加し、混合物を約10℃で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーによってモニターした。反応完了後(約15分)、前記触媒をろ過し、ろ液を2.0-2.5kPaで約4-6mlまで濃縮した。残留物を40mlの水で希釈し、7mlのジクロロメタンで4回抽出し、水溶液を20-22℃で24時間静置しておいた。この溶液を、再度15mlのジクロロメタンで３回抽出し、pHをイオン交換樹脂Dowex AG 1-X8 (HO-)によって3.5に調節し、その後、溶液を凍結乾燥した。
【００９５】
収量1.65g(3.5mM, 70%)  [α]D20=-94.7°(c=1；水)
HPLC：k'=2.702 および 3.010.
FAB質量スペクトル(424[M+H]+, 577[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【００９６】
出発物質の合成
テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリン トリエチルアンモニウム塩
工程A：クロロアセチル-DL-シクロヘプチルアラニン メチルエステル
65mlのジクロロメタン中に溶解された15.2g(65mM)のDL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル塩酸塩(実施例1,工程E)の溶液に、9.1ml(65mM)のトリエチルアミンおよび14.9g(78mM)の(N-ヒドロキシスクシンイミジル)-クロロアセテート*を添加した。室温で３時間撹拌後、反応混合物を65mlのジクロロメタンで希釈し、引き続いて、30mlの水で３回、1M KHSO4、水、5%NaHCO3で洗浄し、最後に水で中性にした。その後、有機相を無水Na2SO4上で乾燥し、その後2.0-2.5kPaで蒸発した。結果として生じた油状の生成物を軽油エーテルとともに粉砕した。個体の物質をろ過し、軽油エーテルで洗浄し、減圧デシケーター中で乾燥した。17.54g(63.6mM, 〜98%)のクロロアセチル-DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステルが得られ、次の反応に直接用いた。Rf(7)=0.73-0.83. 融点：78-80℃。
【００９７】
C13H22NO3Cl(275.777)の分析。計算値：C%=56.62 ; H%=8.04 ; N%=5.08 ; Cl%= 2.86. 実測値：C%=55.65 ; H%=7.93 ; N%=5.06 ; C1%=12.72.
【００９８】
(N-ヒドロキシスクシンイミジル)クロロアセテートの調製
32ml(450mM)のクロロアセチル塩化物を23g(200mM)のNヒドロキシスクシンイミドに添加し、混合物を10分間還流し、その後、粉砕した氷の上に注ぎ、ろ過し、冷水で洗浄し、減圧デシケーター内で乾燥した。収量20.23g(105.9mM, 53%). 融点：113.3-113.7 ℃。
【００９９】
C6H6NO4Cl C7H9NO5(191.55)の分析。計算値 : C%=37.62 ; H%=3.16 ; N% =7.31 ; Cl%=18.51.   実測値 : C%=37.37 ; H%=3.16 ; N%=7.23 ; Cl%=18.35.
【０１００】
工程B : クロロアセチル-D-シクロヘプチルアラニン メチルエステル (クロロアセチルDL-シクロヘプチルアラニン メチルエステルの酵素分解)
30mのトルエン中に、8.71g(31.6M)のクロロアセチル-DL-シクロヘプチルアラニンメチルエステル、DL-エステル(実施例３，工程A)を溶かした溶液に、70mlの水および50mgのサブチリシン・カールスバーグ(プロテアーゼ タイプVIII, Sigma)を加えた。3M NaOHを充てんした自動滴定装置によってpHを7.0に維持しつつ、L-エナンチオマー、L-エステルの酵素加水分解を進行させた。NaOHの消費が止まった(5.522ml，16.57mM)後、反応混合物を30mlのトルエンで希釈し、２相を分離した。水相を20mlのトルエンで２回洗浄した。合わせたトルエン溶液はD-エステルを含有し、合わせた水溶液は、L-酸のナトリウム塩を含有していた。
【０１０１】
無水Na2SO4上で乾燥した後、合わせたトルエン溶液を減圧下で蒸発し、4.18g(15.16mM)のD-エステルを得た。Rf(7)＝0.73-0.83であり、D-シクロヘプチルアラニンの調製に直接用いた。
【０１０２】
合わせた水溶液を酸性にし、30mlの酢酸エチルで3回抽出した。合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発して、3.46g(13.22mM)のL-酸、[Rf(7)＝0.40-0.50]を得て、L-シクロヘプチルアラニンの調製に直接用いた。
【０１０３】
8.25g(30mM)のDL-エステル(実施例2、工程A)から同様に調製して、4.08g(14.79mM)のD-エステルおよび3.23g(12.34mM)のL-酸を得た。
【０１０４】
工程C：D-シクロヘプチルアラニン塩酸塩
8.27g(30mM)のD-エステル(実施例3，工程B)を120mlの6M HCl中に懸濁し、３時間還流した。遊離アミノ酸を結晶として分離した。反応混合物を冷却し、冷却庫中で一晩保管し、ろ過し、冷却した水とエーテルで洗浄し、その後減圧デシケーター中で乾燥した。5.9g(26.69mM, 89%)のD-シクロヘプチルアラニン塩酸塩が得られた。Rf(12)＝0.10-0.15  [α]D20＝-11°(c＝0.4；1M HCl)
【０１０５】
C10H19NO2.HCl(221.728)の分析。計算値：C%＝54.17；H%＝9.09；N%＝6.32；Cl%＝15.99    実測値：C%＝54.27；H%＝9.27；N%＝6.30；Cl%＝16.2
【０１０６】
工程D：D-シクロヘプチル乳酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩
26mlの水に5.78g(26.15mM)のD-シクロヘプチルアラニン塩酸塩(実施例3、工程C)を溶かした溶液を、105mlの水および52.5mlの氷酢酸で希釈し、5℃に冷却した。この混合物に、水30ml中の18.0g(261mM)NaNO2の溶液を、撹拌および冷却しながら滴下した。撹拌は5℃で一時間および室温で一晩続けた。翌日、反応混合物を撹拌しながら25mlの濃HClで酸性にした。その後混合物を蒸発し、50℃、減圧下で乾燥した。残留物を100mlの水に溶解し、同様にして蒸発し、トルエンとともに粉砕し、再び蒸発した。最終残留物を50mlの酢酸エチルおよび50mlの水に溶解した。水相を酢酸エチルで洗浄し、合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄して中性にし、無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発した。得られた固体を20mlのジイソプロピルエーテルに溶解した。この溶液に、5ml(25mM)のジシクロヘキシルアミンを添加し、結晶塩を分離した。冷却した結晶をろ過した後、冷やしたエーテルで洗浄し、減圧デシケーター中で乾燥し、5.5g(14.96 mM, 57.2%)のD-シクロヘプチル乳酸ジシクロヘキシルアミン塩、D-cHIa.DCHAを得た。Rf(7)=0.53-0.60. [α]D20=+19.5°(c=1 ; メタノール). 融点 : 147-150℃。
【０１０７】
C10H18O3(C22H41NO3)の分析。計算値：C%=71.89 ; H%=11.24 ; N%=3.81.
実測値：C%=71.57 ; H%=11.34 ; N%=3.83.
0.35g(1mM)のD-cHla.DCHAを遊離のα-ヒドロキシ酸に変換し、0.15g(0.8mM)のD-cHlaを得た。[α]D20=+10.1°(c=1 ; メタノール)；融点：125-127℃.
C10H18O3(186.252)の分析。計算値：C%=64.48 ; H%=9.74.  実測値 : C%=64.54 ; H%=9.86.
【０１０８】
工程E：D-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステル
30mlのジメチルホルムアミドに11.21g(30.5mM)のD-シクロヘプチル乳酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩(実施例3.工程D)を溶かした溶液に、3.57ml(30mM)の臭化ベンジルを添加した。混合物を室温で24時間撹拌し、その後ろ過し、2.0-2.5kPaで蒸発した。残留物を20mlの0.5M炭酸水素カリウムおよび60mlのジエチルエーテルに溶解した。続いて有機相を20mlの水、0.5M KHSO4、および水で洗浄し、その後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発した。
【０１０９】
油状の残留物は、8.3g(〜30mM)のD-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステル[Rf(3)=0.2-0.3]であり、工程Fで直接用いた。
【０１１０】
工程F：テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステル
30mlのジクロロメタンに8.29g(30mM)のD-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステル(実施例3, 工程E)を溶かした溶液に、3.01ml(33mM)の3,4-ジヒドロ-2H-ピランおよび酢酸エチル中の0.3mlの3M HClを添加し、その後、混合物を室温で１６時間静置した。その後、反応混合物を40mlのジクロロメタンで希釈し、20mlの水で３回洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、2.0-25kPaで蒸発した。残留物を、吸着剤として200gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液としてシクロヘキサン：酢酸エチル＝85:15の混合物を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物[(Rf(4)=0.60-0.70]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。油状の残留物は、7.9g(21.9mM, 73%)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステルであり、次の工程で直接用いた。
【０１１１】
工程G：テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸 トリエチルアンモニウム塩
7.21g(20mM)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸ベンジルエステル(実施例3, 工程F)を20mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、2.8ml(20mM)のトリエチルアミンを添加し、0.1gのPd/C触媒の存在下で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー[Rf(1)=0.30(エステル), 0.00(酸)]によってモニターした。反応完了後、触媒をろ過して除き、5mlのジメチルホルムアミドで２回洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせ、次の工程で、20 mMのテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸 トリエチルアンモニウム塩として用いた。
【０１１２】
工程H：テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリンベンジルエステル
実施例３の工程Gで得られたテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチル乳酸 トリエチルアンモニウム塩の溶液(20mM)を+5℃まで冷却し、撹拌しながら、2.7g(20mM)の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、4.83g(20mM)のL-プロリンベンジルエステル塩酸塩、および4.12 g(20mM)のジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。反応混合物を室温で一晩放置し、その後ろ過して、2.0-2.5kPaで蒸発した。残留物を50mlの酢酸エチルに溶解し、20mlの水および５％の炭酸水素ナトリウムで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、減圧下で蒸発した。残留物を、吸着剤として200gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液としてn-ヘキサン：酢酸エチル＝1：1の混合物を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。
純粋な生成物[(Rf(3)=0.3-0.4]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。油状の残留物は、5.95g(13mM, 65%)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリンベンジルエステルであり、次の工程で直接用いた。
【０１１３】
工程I：テトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリン トリエチルアンモニウム塩
5.5g(12mM)のテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリン ベンジルエステル(実施例3, 工程H)を12mlのジメチルホルムアミドに溶解し、1.68ml(12mM)のトリエチルアミンを添加し、0.1gのPd/C触媒の存在下で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィー[Rf(1)=0.30(エステル), 0.00(酸)]によってモニターした。反応完了後、触媒をろ過して除き、2mlのジメチルホルムアミドで２回洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせ、12mMのテトラヒドロピラニル-D-シクロヘプチルラクチル-L-プロリン トリエチルアンモニウム塩を含有する溶液として用いた。
【実施例４】
【０１１４】
N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド ヘミサルフェートの合成
【０１１５】
工程１：ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-NG- ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム
1.97g(5mM)のtert-ブチルオキシカルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム[(Bajusz等、J. Med. Chem. 33,1729(1990)]を5mlのクロロホルム中に懸濁し, その後HClガス(0.11-0.15g/ml)で飽和した酢酸エチル5mlを撹拌および氷冷しながら添加した。Boc基の分裂を薄層クロマトグラフィー[Rf(11)=0.5(遊離化合物)；1.0(Boc-化合物)]によってモニターした。反応の終わりまでに、前記懸濁液を10mlのジエチルエーテルで希釈し、形成された結晶をろ過し、3mlのアセトンと3mlのジエチルエーテルで洗浄し、減圧でKOH上で乾燥した。その結果生じたNG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム塩酸塩を5mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-20℃まで冷却し、以下の混合無水物に添加した。
【０１１６】
1.95g(5mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボン酸(実施例4, 工程B)を5mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、-15℃まで冷却し、その後、撹拌しながら0.56ml(5.05mM)のN-メチル-モルホリンおよび0.665ml(5.05mM)のクロロギ酸イソブチルを添加した。10分の撹拌後、上記NＧ-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタムのジメチルホルムアミド溶液を添加し、その後、トリエチルアミンを添加して、反応混合物のｐＨを８に調節した(約0.7mlのトリエチルアミンが必要であった)。反応混合物を-10℃で30分間、次に0℃で１時間撹拌した。その後、塩をろ過し、ろ液を50mlの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、7mlの水で３回、3mlの1M KHSO4、および3mlの水で３回洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。得られた生成物を、吸着剤として50gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液として酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物[(Rf(1)=0.70]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質をジイソプロピルエーテルから結晶化した。
【０１１７】
収量2.35g(71%)，Rf(1)=0.45-0.55
FAB質量スペクトル(661[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【０１１８】
工程２：ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-NG- ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド
2.15g(3.25mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンラクタム(実施例4, 工程1)を5mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、その後、-50℃以下の温度で撹拌しながら、テトラヒドロフラン中に溶解された2.25mMのLiAlH4の溶液を添加した。還元の進行を、薄層クロマトグラフィー(展開溶媒として溶媒7を用いた)によってモニターし、必要に応じてLIAlH4を追加した。この反応混合物に、撹拌および冷却しながら、0.5MのKHSO4を１滴ずつpH3に達するまで加え、その後13mlの水を加えた。その結果生じた溶液を、5mlのヘキサンで２回、その後7mlのジクロロメタンで３回抽出した。ジクロロメタン抽出物をプールし、7mlの水で３回、7mlの冷却した5%NaHCO3溶液、そして再度7mlの水で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。蒸発残留物質はジイソプロピルエーテルで処理し、ろ過して、減圧で乾燥した。
【０１１９】
収量1.6g(74%)、Rf(7)=0.33-0.43
FAB質量スペクトル(663[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【０１２０】
工程3：N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボニル-L-アルギニンアルデヒド サルフェート
1.53g(2.3mM)のベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-アゼチジン-2-カルボニル-NG-ベンジルオキシカルボニル-L-アルギニンアルデヒド(実施例4, 工程2)を23mlのエタノールおよび4.8mlの0.5M硫酸中に溶解し、次に、3.5mlの水に懸濁させた0.15gのPd-C触媒を添加し、混合物を約10℃で水素化した。反応の進行を薄層クロマトグラフィーによってモニターした。反応完了後(約15分)、前記触媒をろ過し、ろ液を2.0-2.5kPaで約2-3mlまで濃縮した。残留物を20mlの水で希釈し、4mlのジクロロメタンで４回抽出し、水溶液を20-22℃で24時間静置しておいた。この溶液を、再度4mlのジクロロメタンで３回抽出し、pHをイオン交換樹脂Dowex AG 1-X8 (HO-)で3.5に調節し、その後、溶液を凍結乾燥した。
【０１２１】
収量1.02g(90%) Rf(12)=0.40.
FAB質量スペクトル(395[M+H]+, 548[M+H+NBA]+)で想定される構造を確認した。
【０１２２】
出発物質の合成
ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボン酸
【０１２３】
工程A：ベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシン2,4,5-トリクロロフェニルエステルの合成
50mlのジメチルホルムアミド中の5.42g(20mM)のD-シクロヘキシルグリシン トリフルオロ酢酸塩および5.6ml(40mM)のトリエチルアミンの撹拌懸濁液に、8.8g(22mM)のベンジル-ペンタクロロフェニル炭酸塩[Anteunis等：Bul. Soc. Chim. Belg. 96, 775(1987)]および6.16ml(44mM)のトリエチルアミンを添加した。３時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発し、残留物を60mlのジエチルエーテルと60mlの水に溶解した。相を分離し、有機相を水で洗い、合わせた水相をジエチルエーテルで洗い、1MのKHSO4でpH3まで酸性にし、その後30mlの酢酸エチルで３回抽出した。有機相を水で洗って中性にし、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。
【０１２４】
蒸発残留物質はベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシンであり、20mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、4.54g(22mM)の2,4,5-トリクロロ-フェノールおよび4.54g(22mM)のジシクロヘキシルカルボジイミドと混合した。３時間後、反応混合物をろ過し、ろ液と洗浄液を合わせて、減圧下で蒸発した。固体残留物は、吸着剤として140gのKieselgel 60(0.040-0.063mm)、溶離液としてクロロホルム：アセトン＝95：5の混合溶液を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物[(Rf(5)=0.7-0.8]を単独で含有するフラクションをプールし、2.0-2.5kPaで蒸発した。油状の残留物をジエチルエーテルとともに粉砕し、ろ過して、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。8.34g(88.5%)の精製ベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシン2,4,5-トリクロロフェニルエステルが得られた。
【０１２５】
工程B：ベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボン酸の合成
10mlのピリジンにベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシン2,4,5-トリクロロフェニルエステル(5.18g，11mM，実施例4工程Aから)を溶かした溶液に、L-アゼチジン2-カルボン酸(1.01g, 10mM)およびトリエチルアミン(1.4ml，10mM)を添加した。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発し、残留物を50mlの5%NaHCO3と50mlのジエチルエーテル中に溶解した。有機相を水で洗い、合わせた水相をジエチルエーテルで洗い、1MのKHSO4でpH3まで酸性にし、その後50mlの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を合わせ、水で洗って中性にし、無水Na2SO4上で乾燥し、2.0-2.5kPaで蒸発した。
【０１２６】
蒸発残留物質はベンジルオキシカルボニル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボン酸であり、10mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、5.0ml(80mM)のヨードメタンと混合し、0℃まで冷却した。この溶液に、1.2g(30mM)の水素化ナトリウム60%を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。過剰の水素化ナトリウムは0.4mlの水を注意深く添加することによって分解した。急冷した反応混合物を、減圧下30℃未満の温度で約10mlまで濃縮した。残留物を15mlの水と10mlのt-ブチルメチルエーテで希釈した。相を分離し、水相を再度10mlのt-ブチルメチルエーテルで洗浄した。水性の生成物相を15mlの酢酸エチルと混合し、3Mの硫酸溶液で、pH2.2に調節した。相を分離し、水相を10mlの酢酸エチルで逆抽出した。合わせた有機相を15mlの5%チオ硫酸ナトリウム溶液で洗浄した。相を分離し、有機相を40℃未満で蒸発した。油状の残留物は、3.75gのベンジルオキシカルボニル-N-メチル-D-シクロヘキシルグリシル-L-アゼチジン-2-カルボン酸(9.65mM，Rf(7)=0.85-0.95)であり、9.65mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、実施例４の工程１で使用するために保管した。
FAB 質量スペクトル(403[M+H]+)で想定される構造を確認した。
【実施例５】
【０１２７】
ペプチジル・アルギナル類による凝固の抑制
血漿凝固の抑制効果を、トロンビン時間（TT）、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)およびプロトロンビン時間(PT)分析で評価した（基質としてクエン酸ヒト血漿を用いた）[Bagdy, D等；Thromb. Haemostas. 67, 325(1992)]。TT分析は、単一段階（外因性トロンビンの作用によるフィブリノーゲンの凝固）の抑制性を測定する(最終濃度 2.5NIH U/ml)。APTTおよびPTにおける血漿の凝固は、カルシウム再沈着によって誘導される。産生された内因性トロンビンは理論上、50 NIH U/ml(APTT，PT)と同程度の高さの最終濃度で存在する。これらの分析は、フィブリン形成およびトロンビン産生（トロンビンあるいは他の酵素（例えばfXa）によって媒介される、いくつかのタンパク質分解反応を誘導する）における抑制作用の総和を検出する。抗凝固活性はCT2（凝固時間を２倍にするのに必要な濃度(nM)）で表される。
【０１２８】
表１
血漿凝固(コラムＡ)、血塊結合トロンビンとXa因子(コラムＢ)、及び線維素溶解酵素(コラムC)に対する、本発明の式（Ｉ）の化合物(１−４)、親化合物、Efegatran(C)および、さらに関連するペプチジル・アルギナル類(C1，C2)の抑制活性。
【表１】
2005502657.tif 000008
ａ 略語：Eoc=エトキシカルボニル；cHpa=シクロヘプチルアラニル；cHIa=シクロヘプチルラクチル；MePhe=N-メチルフェニルアラニル；cHga=シクロヘプチルグリコリル；Chg=シクロヘキシルグリシル．
b CT2=TT(トロンビン時間)、APTT(活性化部分トロンボプラスチン時間)、およびPT(プロトロンビン時間)分析において凝固時間を二倍にするのに必要な濃度。
C LA50=フィブリン平板分析において溶解面積をコントロールの５０％に減ずるのに必要な濃度；PL=プラスミン，tPA=組織プラスミノーゲン活性化因子，UK=ウロキナーゼ.
【０１２９】
これらの化合物のいくつかは、Efegatran(C，D-MePhe-Pro-Arg-H、親ペプチド・アルギナル)より、凝固時間を延長する能力において優れていた（表１参照）。表１のコラムＡは、既知の抗凝血物質であるEfegatran(C)[Bajusz, S.等：J. Med. Chem. 33,1729(1990)；米国特許第4,703,036号(1982)；Bagdy, D.等：Thromb. Haemostas. 67,357及び68,125(1992)；Jackson, C.V.等；Clin.Appl. Thrombosis/Hemostasis 2, 258(1996)]及びさらに関連するペプチジル・アルギナル類(例．Cl及びC2)[Bajusz, S. 等：Bioorg.とMed. Chem.3，1079(1995)；米国特許第6,121,241号(2000)；国際公開番号WO97/46576]と比較した本発明の式（Ｉ）の化合物(１−４)の抗凝血活性を表す。TT分析の結果は、新しい類縁体が、トロンビン-フィブリノーゲン反応の抑制において、efegatranと同程度有効であることを示す。一方、APTTは、この新しいペプチド類が、先行する工程である、凝固のトロンビン-産生工程の抑制において、efegatranより効果的であることを示す。
【実施例６】
【０１３０】
トロンビン及びXa因子の抑制
【０１３１】
酵素抑制は、(Bajusz, S.等：国際公開番号WO97/46576)に簡潔に公開されているように、色素生産性基質、すなわちトロンビン用のTos-Gly-Pro-Arg-pNA(Sl)およびXa因子用のMoc-D-Chg-Gly-Arg-pNA(S2)を使用することによって 、多血小板血漿凝固で試験した。分析は、室温において、ガラス管中で、96-ウェルマイクロタイタープレートで行った。
【０１３２】
溶液：(i) 緩衝剤A  0.1Mリン酸ナトリウム/0.05M NaCl(pH8.5)  (ii) 抑制物質：0.02%ヒトアルブミンを含有する緩衝剤A中の、0.1、1.0及び10mg/ml溶液 (iii) 基質：蒸留水中の1mMのS1および2mMのS2。
【０１３３】
（b）凝固血漿の調製：ガラス管に入れた多血小板血漿サンプル(200μl)を室温で80μl 40mM CaCl2とともに６０分間インキュベートした。血塊を、分割量2mlの生理食塩水(0.9% NaCl)で、穏やかに撹拌しながら洗浄し、非結合性の酵素を除去した。洗浄がうまくいった場合、洗浄液およびS1の反応混合物の吸光度は、コントロールの５％未満になる。このようにして得られた血漿血塊は、使用するまで管内で生理食塩水中に保管した。
【０１３４】
（c）血塊における酵素阻害の評価：生理食塩水を除去した後、血漿血塊を37℃で400μlの抑制物質(あるいはネガティブコントロールである緩衝剤A)と共に５分間、および100μlの基質S1あるいはS3とともに３０分間インキュベートした。その後、100μlの50%酢酸を加えて反応を止めた。反応混合物のうち150μl をマイクロタイタープレートのウェルに入れ、405nm(ELISA READER 800, Bio-Tek Instruments Inc. Winooski, VT, USA)で観察した。IC50値は、吸光度データから図式的に作成した。
【０１３５】
結果を表１のコラムBに示す。血塊結合トロンビンの抑制に関しEfegatranを上回る類縁体は、化合物1,2,3および4のみであるが、血塊結合Xa因子の抑制に関しては、各類縁体はEfegatranより優れている。従って、1,2,3および4は両方の血塊結合酵素を最も強く抑制する。
【実施例７】
【０１３６】
抗線維素溶解活性
プラスミン(PL)、および、プラスミノーゲン(Plogen)活性化因子[組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)およびウロキナーゼ (UK)など]によるプラスミンの産生に対する、本発明の化合物の抑制効果を、フィブリン平板法によって試験した(参照例、Bagdy, D., Barabas, E., Bajusz, S. , およびSzell, E., Thromb. Haemostas., 67: 325-330 (1992)；Barabas, E. Szell, E.およびBajusz, S, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 4: 243(1993)) 。結果を表１のコラムCに示す。いくつかの例外はあるが、類縁体は３つの線維素溶解酵素に対してEfegatranよりやや強い抑制効果を示す。例外は、PLに対するC1、およびUKに対するC1,C2であり、3はEfegatranのUKに対する活性とほぼ同等の活性を示す。
【実施例８】
【０１３７】
播種性血管内血液凝固に用いるラビットモデル
本発明にかかる化合物１と３および、C3のみならず表１の他のペプチジル・アルギナル類を、それらのDIC抑制活性について、エンドトキシン(リポ多糖、LPS)処置されたラビットを利用して、[Scherer, M.U.等：Lab. Anim Sci. 45, 538(1995)]に記述されているようにして調べた。分析は４時間に渡った。エンドトキシンは、80および40μg/kgの用量で、i.v. 大量瞬時投与で、0分と120分にそれぞれ投与し、一方、ペプチジル・アルギナル類１，３及びC-C3(0.25及び／又は0.5mg/kg/h)は全実験において注入した。コントロール群の動物は、0.9%生理食塩水で処置した。止血のパラメーターは、０分，１２０分および２４０分で決定した。
【０１３８】
慎重な処理にもかかわらず、死亡率は31%であった。これはおそらくラビットの高いエンドトキシン-感受性が原因と考えられる[Semerano, N.等：Int.J.Clin. Lab. Res. 21, 214(1992)]。
【０１３９】
表２
エンドトキシン-処置ラビットの死亡率に対する、本発明の化合物１および３、親化合物Efegatran(C)、さらなるアルギナル類(C1およびC2)およびヘパリン(H)の効果
【表２】
2005502657.tif 000009
ａ  ペプチジル・アルギナル類1,3,C,C1およびC2の構造については、表１参照。C3＝ hPla-Pro-Arg-H（hPla＝2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸）
【０１４０】
表２のデータが示すように、化合物１および３はエンドトキシン-処置ラビットの死亡率を著しく減少する。一方、他の抗凝血性物質は死亡率に対して効果を示さない（C1）か、あるいは死亡率をいくらか増加させる。最も高い値は、1.8倍であり、C3で見られる。表１のデータで注目すべきものは、死亡率を減少する１および３が、Xa因子のみならず血塊結合トロンビンを非常に強く抑制し、そして血漿凝固および線維素溶解酵素、プラスミン、およびプラスミノーゲン活性化因子の両方も効率的に抑制することである。
【実施例９】
【０１４１】
播種性血管内血液凝固に用いるためのラットモデル
DICの最も深刻な影響の中に、様々な臓器におけるフィブリンの堆積、血球の変化（例えば、血小板数の減少）、およびフィブリン分解生成物の変化がある。このような現象に対する、本発明の化合物１、および二つのコントロール用抗凝血性物質（ Efegatran(C)およびヘパリン(H)）の効果を、エンドトキシン-処置ラットで試験した[Ford, A. J.およびLongridge, D. J.：Br. J. Pharmacol 110, Suppl. 131P (1993)；Hasegawa, N.;等：Am. J. Resp. Crit, Care Med. 153, 1831(1996)；Dichneite, G.等：Thromb. Res. 77,357(1995)]。
【０１４２】
雄のラットを、10mg/kgエンドトキシンのi.v.大量瞬時投与で処置した。続いて、生理食塩水あるいは試験化合物を、４時間i.v.注入した。化合物１および３については、0.25mg/kgを初期に大量瞬時投与で投与し、続いて0.25mg/kg/hを４時間i.v.注入した。ヘパリン(H)も同様に適用した（50IU/kgを初期に大量瞬時投与で投与し、続いて50IU/kg/hを４時間i.v.注入した）。コントロール群の動物は、0.9%生理食塩水で処理した。
【０１４３】
125I-フィブリンの堆積を、特定の臓器(肝臓と腎臓)で調べた。エンドトキシン注射に先立って、125I-フィブリノーゲンを30分注射した。組織サンプル中の放射能をガンマ線測定装置(Wallac Wizard 1470)で測定した。臓器中の微小血栓の形成は、微小血栓の指標として定義される、注射した総125I活性に対する臓器の125I活性の比を用いて判定した。このパラメーターにおける変化を、生理食塩水のグループと比較して百分率で表す。
【０１４４】
血小板数は自動装置(Sysmex F-800)で決定し、コントロール値と関連付けた。
【０１４５】
FDP(フィブリン分解生成物)の決定は、Aggristin(リストセチン)沈殿滴定によって行った。動物はエンドトキシン投与後４時間で屠殺した。
【０１４６】
結果を表３にまとめる。
表３
エンドトキシン-処置ラットでの、125I-フィブリンの堆積、および血小板数とフィブリン分解生成物(FDP)の変化に対する、本発明の化合物１、親ペプチドEfegatran(C)およびヘパリン(H)の効果
【表３】
2005502657.tif 000010
ａ  I.V. 大量瞬時投与  ｂ  I.V.大量瞬時投与＋I.V. 注入
【０１４７】
表３のデータは、１のDIG抑制能力はヘパリンあるいは Efegatranのいずれの能力よりも顕著であることを示している。
【実施例１０】
【０１４８】
播種性血管内血液凝固用のラットモデルにおける生存試験
雄のラットを、30mg/kg LPS(エンドトキシン)のi.v.大量瞬時投与で処置した。ペプチド類を投与量0.5及び／又は0.75, 1.0及び1.5mg/kgで初回に大量瞬時投与し、続いて、LPS投与直後に８時間注入した。LPS後4，5，6，7，8時間後の死亡率を記録した。
【０１４９】
表４のデータは、LPS処置が、実験終了まで(８時間)に、ラットの生存率を20％まで低下させることを示す。調査した全ての新しいペプチジル・アルギナル類は、生存時間を延長し、LPS群に比較して死亡率を低下させた。化合物1,2,3および4は、基準Cより効果があった。
【０１５０】
表４
LPS-処置ラットの死亡率に対する、本発明の化合物1，2，3および４と親化合物Cの効果
【表４】
2005502657.tif 000011
雄のラットに30mg/kgのLPSをi.v.大量瞬時投与で投与した。試験化合物を、最初は大量瞬時投与によって、続いて、LPS投与直後に８時間i.v.注入することによって投与した。
LPS後4，5，6，7，8時間後に死亡率を記録した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005502657.tif 000071