(57)【要約】前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来する生物活性ペプチドの検出方法であって、段階：（ｉ）該前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来するペプチドライブラリーを用意すること；（ｉｉ）必要に応じて、該ライブラリーを、それが１つ以上の生物活性を示すペプチドを含むことを確かめるためにスクリーニングすること；（ｉｉｉ）該ライブラリーを、ライブラリーの分画を用意するために分別すること；（ｉｖ）該分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性分画を同定するためにスクリーニングすること；（ｖ）必要に応じて、それぞれの該活性分画をその細分画を用意するために分別し、該細分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性細分画を同定するためにスクリーニングすること；次に（ｖｉ）該活性分画または活性細分画から、該１つ以上の生物活性を示す１個以上のペプチドを単離すること、を含む、方法。
2005532574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来する生物活性ペプチドの検出方法であって、段階：
（ｉ）前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来するペプチドライブラリーを用意すること；
（ｉｉ）必要に応じて、該ライブラリーを、それが１つ以上の生物活性を示すペプチドを含むことを確かめるためにスクリーニングすること；
（ｉｉｉ）該ライブラリーをライブラリーの分画を用意するために分別すること；
（ｉｖ）該分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性分画を同定するためにスクリーニングすること；
（ｖ）必要に応じて、それぞれの該活性分画をその細分画を用意するために分別し、該細分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性細分画を同定するためにスクリーニングすること；次に
（ｖｉ）該活性分画または活性細分画から、該１つ以上の生物活性を示す１個以上のペプチドを単離すること、
を含む、方法。
【請求項２】
該ペプチドライブラリーが、前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物の酵素分解によりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ペプチドライブラリーが、前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物の化学分解によりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ペプチドライブラリーが、前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物の物理的消化によりもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物、または該未分画化ペプチドライブリーが、分解または消化の程度または進行をモニターすることによる、最適な分解条件の決定の対象とされる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該決定が質量分析を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該決定がＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ分析を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該決定が自動化されている、請求項６または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該ペプチドライブラリーが化学合成により用意される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該ペプチドが少なくとも２個のアミノ酸を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該ペプチドが少なくとも５個のアミノ酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該ペプチドがペプチド変異体である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該ペプチドが、生物活性がアミノ酸配列分析により予測可能なペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該ペプチドが、生物活性がアミノ酸配列分析により予測不可能なペプチドを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該前駆体タンパク質が天然に存在するタンパク質である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該前駆体タンパク質が天然に存在しないタンパク質である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該前駆体タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該生物活性がアゴニスト活性である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該生物活性がアンタゴニスト活性である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該生物活性が任意のヒトの状態に関係する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該生物活性が、動脈血栓症および静脈血栓症、炎症、血管新生、および癌からなる群から選択される状態と関係する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ｉｉ）および／または段階（ｉｖ）の該スクリーニングが、生化学ベースのアッセイおよび細胞ベースのアッセイからなる群から選択されるアッセイを用いて行われる、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該アッセイが、血小板活性についての発光ベースのアッセイ、プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間についてのレーザーベースの方法、細胞増殖、細胞毒性、およびアポトーシスの発光および蛍光ベースの検出、およびインビボアッセイからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該アッセイがハイスループットであり、かつ自動化されている、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｉｉｉ）および／または段階（ｖ）の該分画化が、クロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション、および電気泳動からなる群から選択される分画化方法により行われる、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
段階（ｉｉｉ）および／または段階（ｖ）の該分画化がクロマトグラフィーにより行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法により検出された、１つ以上の生物活性を示す単離ペプチド。
【請求項２８】
実施例および／または図面に関連して実質的に記載された、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物活性ペプチドの検出方法に関する。より具体的には、本発明は、前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来する生物活性ペプチドを同定するためのスクリーニング方法に関する。該生物活性ペプチドは、例えば、動脈血栓症および静脈血栓症、および癌に関連して、様々な治療への応用および／または診断への応用で用いられる可能性を有する。
【０００２】
一般的事項
本明細書において、番号で引用される刊行物の書誌的詳細は、記載の末尾にまとめられる。本明細書で引用される特許、特許出願、および刊行物は全て、全体として引用により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
本明細書を通じて、文脈から別段に必要とされない限り、単語「含む」およびバリエーション（例えば、３人称単数現在形および現在進行形）は、規定の整数または段階、または整数群または段階群を包含することを含意するが、他のいかなる整数または段階、または整数群または段階群を除外することを含意しないと解される。
【０００４】
当該技術分野の技術者は、本明細書に記載の発明が、具体的に記載されたもの以外の変更および修飾を受けやすいことを理解するだろう。本発明が該変更および修飾を全て含むことは、理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において、個別または集合的に言及されるか、あるいは示される段階、特徴、組成物、および化合物の全て、および該段階、特徴、組成物、および化合物のうち任意の２つ以上の任意の組合せおよび全組合せを含む。
【０００５】
本発明は、例示のみを目的とすることが意図されている、本明細書に記載の具体的な実施態様により、範囲が制限されるべきではない。機能的に均等な生成物、組成物、および方法は、明らかに本明細書に記載の発明の範囲内にある。
【０００６】
発明の背景
ヒトゲノムの最近の配列決定により、ヒトの生物学的過程の複雑さから予測されたものよりかなり少ない、およそ３０，０００の遺伝子が明らかとなった。翻訳前の該遺伝子の選択的スプライシングは、最大２００，０００の一次転写物を生じるようであるが、ヒトプロテオームに存在する予測１，０００，０００〜１，５００，０００のタンパク質／ペプチドの活性には依然として随分と足りない。現在、該遺伝子によりコードされるタンパク質産物に対する翻訳後修飾が、機能の多様性を説明するのに必要なさらなるレベルの複雑さを表すことは、広く認められている。例として（これに制限あるいは限定されない）、多くの共通する翻訳後現象または同時翻訳現象は、プロテアーゼ仲介性タンパク質分解（エンドプロテアーゼまたはエキソプロテアーゼのいずれか）であり、これはより小さなタンパク質／ペプチドの生物活性を生じる。該分解産物は、遺伝子コードの分析によっては同定できない、異なる活性（アゴニスト／アンタゴニストなど）を有する。
【０００７】
本発明は、「クリプトミクス」として記載の新規技術基盤に基づき、そして一体となって、より大きな前駆体タンパク質に由来する生物活性ペプチドの創出、同定、および特徴決定を可能とする、一連の統合的方法を提供する。
【０００８】
本発明の背景にある理論的根拠は、天然に存在するタンパク質のプロテアーゼによる制御されたタンパク質分解性消化により、通常は完全なタンパク質および折りたたまれたタンパク質内部に隠れた状態にある潜在性生物活性ペプチドが遊離されるということである。従って、本発明は、１個のタンパク質およびタンパク質含有生物学的抽出物のプロテアーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼを含む（これらに制限されない）酵素での処理、および／または化学分解に続き、ペプチド（小タンパク質フラグメント）ライブラリーの系統的創出を含む。該修飾タンパク質混合物は、興味ある生物活性についてスクリーニングされ、生物活性部分がハイスループット生物学的スクリーニングアッセイにより同定されたものに由来するライブラリーへ分画化される。次に、活性分画が単離され、古典的プロテオミクス技術により十分に特徴決定され、より高度なアッセイ系で活性が確かめられる。従って、同定された生物活性ペプチドは、次に、治療および診断の可能性の創出を含む（これらに制限されない）生物学的「手がかり」として用いられ得る。
【０００９】
発明の要約
１つの態様において、本発明は、前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来する生物活性ペプチドの検出方法を提供し、該方法は、段階：
（ｉ）該前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来するペプチドライブラリーを用意すること；
（ｉｉ）必要に応じて、該ライブラリーを、それが１つ以上の生物活性を示すペプチドを含むことを確かめるためにスクリーニングすること；
（ｉｉｉ）該ライブラリーを、ライブラリーの分画を用意するために分別すること；
（ｉｖ）該分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性分画を同定するためにスクリーニングすること；
（ｖ）必要に応じて、それぞれの該活性分画をその細分画を用意するために分別し、該細分画を、該１つ以上の生物活性を示すペプチドを含む活性細分画を同定するためにスクリーニングすること；次に
（ｖｉ）該活性分画または活性細分画から、該１つ以上の生物活性を示す１個以上のペプチドを単離すること、
を含む。
【００１０】
本明細書において用いられる用語「ペプチド」は、共有結合により結合されたアミノ酸からなる任意のポリマーに言及するために取り上げられ、かつ該用語は、その範囲内に、例えば、ポリペプチド、オリゴペプチド、および少なくとも２個のアミノ酸、より具体的には、少なくとも約５個のアミノ酸残基からなるこれより短いペプチド配列の様な、全長タンパク質の部分またはフラグメントを含む。用語「ペプチド」は、ペプチド結合により結合された１個以上のアミノ酸を含有する部分全てを含む。さらに、該用語は、その範囲内に、例えば、塩基性ペプチド骨格を有効に変化させるグリコシル化、リン酸化、アセチル化、および／または硫酸化反応を含む（これらに限定されない）化学修飾により、翻訳後修飾されたアミノ酸を含む、修飾アミノ酸からなるその周囲のポリマーを含む。従って、ペプチドは、天然に存在するタンパク質に由来してもよく、具体的には、ＣＮＢｒの様な試薬、または中でもトリプシンまたはキモトリプシンの様なプロテアーゼを用いた化学分解または酵素分解により、全長タンパク質からもたらされてもよい。あるいは、該ペプチドは、よく知られたペプチド合成方法を用いた化学合成によりもたらされてもよい。
【００１１】
「ペプチド」の定義の範囲内には、アミノ酸配列変異体（本明細書において、ペプチド変異体と呼ばれる）も含まれる。これは、該ペプチドの少なくとも１つの本質的性質、例えば、その生物活性を変化させない１つ以上の好ましい保存的アミノ酸置換、欠損、または挿入を天然に存在するアミノ酸配列に含有する。かかるペプチドは、化学ペプチド合成により合成されてもよい。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野でよく知られている。例えば、天然のタンパク質の１個以上のアミノ酸残基は、同様の電荷、サイズ、または極性のアミノ酸残基により保存的に置換され、本明細書に記載の機能的能力を保持するペプチドを生じ得る。該置換を行うルールはよく知られている。より具体的には、保存的アミノ酸置換は、その側鎖と関連するアミノ酸ファミリー内で一般に生じるものである。遺伝子でコード化されたアミノ酸は、一般に４つの群：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、およびヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン、に分けられる。フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは、共に芳香族アミノ酸としても分類される。任意の特定の群内での１つ以上の置き換え（例えば、イソロイシンまたはバリンについてのロイシンの置換は、代わりに、グルタミン酸についてのアスパラギン酸の置換、セリンについてのスレオニンの置換、または構造上関連するアミノ酸残基での任意の他のアミノ酸残基の置換となる）は、一般的には生じたペプチドの機能に取るに足らない影響を与えるであろう。
【００１２】
「ペプチド」の定義の範囲内には、アミド結合性および非アミド結合性、ならびに共有結合性および非共有結合性修飾による、保護、カルボキシル化、および誘導体化（これらに制限されない）の様な非天然の修飾を受けたアミノ酸変異体が含まれる。
【００１３】
用語「ペプチド」の定義の範囲内には、機能的ドメインに対応するそのアミノ酸配列の結果として、生物活性が予測可能なペプチドが含まれる。用語「ペプチド」により、そのアミノ酸配列の分析により、生物活性が予測できなかったペプチドも包含される。
【００１４】
本発明は、ペプチドの供給源によっては制限されず、かつ天然に存在する供給源または天然に存在しない供給源に由来する、ペプチドまたはペプチド混合物に明らかに及んでいる。
【００１５】
用語「ペプチド」はまた、組換えタンパク質に由来するポリペプチド、オリゴペプチド、またはこれより短いペプチド配列を含む。本明細書で用いられる用語「組換えタンパク質」は、組換えタンパク質に言及するために取り上げられる。タンパク質は、該タンパク質をコード化する遺伝子配列の発現（遺伝子配列は、適当なプロモーターの制御下にあり、ここで遺伝子操作が該発現を達成するために行われる）により、インビトロまたは宿主細胞内で産生される。従って、用語「組換えタンパク質」は、原核生物または真核生物の細胞、組織、または器官に導入されたウイルスベクター、コスミド、またはプラスミドに含有された遺伝子配列の発現により、産生されるタンパク質を明らかに包含している。この文脈で用いられる遺伝子操作は、当該技術分野の技術者に知られており、核酸単離、制限酵素切断、エンドヌクレアーゼ切断、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いた末端付加、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＥｘｏＩＩＩ酵素を用いたＤＮＡ分子の平滑末端化、部位指定変異誘発、ライゲーション、および増幅反応を含むが、これに制限されない。
【００１６】
本発明のペプチドが組換えタンパク質に由来する場合、それは、組換えウイルスベクター、発現系、または宿主細胞で産生され、所望なら、そこから単離される。関連技術分野の技術者に知られた、組換えタンパク質を産生する細胞は、検討中のタンパク質を発現させるために用いられる遺伝子構造物、ならびに該タンパク質の安定性および活性を含む、いくつかのパラメーターに基づき選択される。組換えタンパク質の安定性または活性は、少なくとも部分的に、例えば、中でもグリコシル化、アシル化、またはアルキル化反応の様なタンパク質に対する翻訳後修飾により決定され、そしてそれは、組換えタンパク質を産生するために用いられる細胞株で変動してもよいことはまた、当該技術分野の技術者に知られているだろう。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「由来する」は、特定のタンパク質、タンパク質混合物、またはタンパク質含有生物学的抽出物から直接的に（例えば、該タンパク質または抽出物のタンパク質分解性消化、化学的消化または物理的消化により）または間接的に（例えば、天然に存在する配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチド、またはそのペプチド変異体の化学合成により）得られた、特定のペプチドまたはペプチド混合物を示すために取り上げられる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法を用いて、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を共に含む、広範囲の標的生物活性を有するペプチドが検出される。標的生物活性は、任意のヒトの状態と関係してもよい。ほんの一例として、標的範囲は、動脈血栓症および静脈血栓症、炎症、血管新生、および癌を含むが、本発明は、該標的範囲でのスクリーニングに限定されない。適当なスクリーニングアッセイは、血小板活性化のアクチベーター（アゴニスト）またはインヒビター（アンタゴニスト）を検出可能な、血小板活性化の際に放出されるＡＴＰを検出する発光ベースのアッセイ、ならびにプロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）についての凝固アッセイを含むが、これらに制限されない。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法において、最初のペプチドライブラリーは、包括的範囲の潜在的生物活性ペプチドを提供する前駆体タンパク質（またはタンパク質混合物、またはタンパク質含有生物学的抽出物）に由来する、不均一かつ未分画化ペプチド混合物を含む。
【００２０】
好ましくはまた、該ライブラリーは、例えば、マトリックス支援レーザー脱離時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）により、成分ペプチドのサイズおよび他の特徴についての情報を提供するため、最初の分析または特徴決定の対象とされる。
【００２１】
生物活性ペプチドを含むことを確かめるための該ライブラリーの最初のスクリーニングはまた、事前に決定された生物活性または活性を検出するために、特定の細胞ベースのアッセイを含む（これに限定されない）任意の適当なスクリーニングアッセイ（複数のアッセイを含む）を用いて行われてもよい。
【００２２】
該ライブラリーが生物活性ペプチドを含むことが確かめられると、それは、連続するさらなるスクリーニングのための該ライブラリーの分画を用意するために、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用および／または逆相高速液体クロマトグラフィー（これらに制限されない）の様なクロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション（沈殿、フロー、熱、および立体を含むが、これらに制限されない）、および電気泳動を含む（これらに制限されない）、適当な分画化により分画化される。該さらなるスクリーニングは、生物活性ペプチドを含む１つの活性分画または複数の活性分画を同定するために、任意の適当なスクリーニングアッセイまたは上記のアッセイにより行われてもよい。
【００２３】
該活性分画が１個以上のペプチドを含むようであるなら、それぞれの分画は、所望なら、生物活性ペプチドを含む活性細分画または複数の活性細分画を同定するために、細分画を形成するためのクロマトグラフィー、フィールドフローフラクショネーション（沈殿、フロー、熱、および立体を含むが、これらに制限されない）、および電気泳動を含む（これらに制限されない）、適当な分画化によるさらに１サイクル以上の分画化、続いて、上記のそれぞれの細分画のスクリーニングの対象とされてもよい。
【００２４】
産生されたそれぞれの分画または細分画はまた、該分画または細分画の成分ペプチドのサイズおよび他の特徴についての情報を提供するために、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳによる上記の分析または特徴決定の対象とされてもよい。
【００２５】
本発明に従い、１個以上の生物活性ペプチドが、活性分画または活性細分画から、当該技術分野の技術者によく知られたタンパク質／ペプチド精製方法を用いて単離され、所望なら、該単離ペプチドの生物活性を確かめるためのさらなる生物アッセイが続けられる。
【００２６】
最終的に、本発明の方法により産生されたペプチドはまた、関連アッセイでの連続スクリーニングのため、固体表面またはメンブレンに上に提示されてもよい。
【００２７】
図面の簡単な説明
図１は、治療上および診断上使用するための生物活性ペプチドを検出するための、本発明の方法の１つの実施態様の概略図である。
図２は、例として、タンパク質であるフィブリノーゲンの消化混合物の創出を示す。
図３は、例として、クロマトグラフィーによる、フィブリノーゲン消化混合物のライブラリーへの分画化を示す。
【００２８】
図４は、例として、ＲＧＤＳの存在下または非存在下でコラーゲンに応答した血小板からのＡＴＰ放出の照度計による測定を示す。
図５は、例として、分画化されたフィブリノーゲン由来ペプチドと共にインキュベーションした後、血小板からのコラーゲン誘導性ＡＴＰ放出の照度計による測定を示す。
図６は、フィブリノーゲン消化物に由来する分画のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳスペクトルの例を示す。
【００２９】
図７は、例として、消化物スカウトのユーザーインターフェースを示す。該スカウトは、消化混合物により占められた消化物ＭＴＰ上の位置決定を含む。「試料の移動」は、少量の試料をあるＭＴＰから別のＭＴＰへ、等分するために用いられる機能である。残るボタンは、試料プレート、例えば、Anchorchip［商標］（Bruker Daltonics）試料プレートの調製を意味する。
【００３０】
図８は、４ｐＨ値での平均質量と時間のグラフである。該グラフは、ｐＨ７．５〜８．０が最も有効であることを示すが、部分消化が所望なら、消化点がグラフからピックアップされ得る。
【００３１】
発明の詳細な説明
以下に概略されるスキームは、タンパク質およびタンパク質混合物に由来する生物活性ペプチドの創出、単離、および同定のための本発明の１つの実施態様を含む（図１も参照）。該スキームは、
段階１  消化混合物（すなわち、ペプチドライブラリー）を創出するための、１個のタンパク質および／またはタンパク質含有生物学的抽出物のタンパク質分解性手段、化学的手段、または物理的手段（これらに制限されない）による消化
段階２  該消化混合物に含有されるペプチドの生化学的特徴決定
段階３  生物活性についての該消化混合物のスクリーニング
段階４  クロマトグラフィーによる該消化混合物の成分ペプチド分画への分画化
段階５  ペプチド質量フィンガープリントおよび生物活性についての分画アッセイ
段階６／７  活性含有分画の連続する再分画化およびアッセイ
段階８  生物活性ペプチドの十分な同定および分析、
を含む。
【００３２】
総合すると、この８つの段階は方法を提供し、これにより、生物活性ペプチドが単純なタンパク質混合物および複雑なタンパク質混合物両方から検出される。記載の方法には、観察された生物活性ペプチドの正確な同定および活性が決定され得るように、段階２、４、６、および８でのペプチド質量および大量の情報の収集、および段階３、５、７、および８での生物活性の検出が取り込まれる。
【００３３】
生物活性ペプチドが、同定され、生化学的に特徴決定されると、類似体が、異なる配列範囲およびオーバーラップする配列範囲を含む全体としてまたは部分として合成され、そして該形態のそれぞれが、最小の活性単位についての正確な情報を提供するために生物活性についてアッセイされる。さらに、該ペプチドは、確立された方法論により、必要に応じて、細胞、標的、または受容体を所望の生物学的目的に局在化、標的化、または調節する担体、毒物、および免疫グロブリンの様な外来性タンパク質および非タンパク質分子と結合されてもよい。
【００３４】
生物活性ペプチドは、ジヒドロキシリジノノルロイシン、ヒドロキシリジノノルロイシン、またはリジノノルロイシン、ならびにヒスチジノヒドロキシリジノノルロイシンピリジノリン、デオキシピリジノリン、およびペントシジンの様な還元不可能な架橋結合を含む（これらに制限されない）方法により、架橋結合または複合体形成されてもよい。従って、検出された生物活性ペプチドの最適な活性形の創出は、推定的治療上の利点のために創出され得る。
【００３５】
段階１．−タンパク質の消化
供給源のタンパク質は、任意の形態をとってよい；それは、複雑な生物学的抽出物から精製された、１個の天然で発現されるタンパク質、または特定のタンパク質の組換え（例えば、細菌、昆虫、または哺乳類発現系（これらに制限されない））形であってもよい。あるいは、生物学的流動体、組織、または細胞抽出物由来の複雑なタンパク質混合物がタンパク質供給源として用いられてもよい。該タンパク質は、精製プロテアーゼ、抽出物含有プロテアーゼ活性、化学分解、または他の機序のタンパク質分画化を用いて（これらに制限されない）、ペプチド成分に分解されてもよい。全体的方法は、完全なタンパク質由来の不均一かつ未分画化ペプチド混合物を含む、ペプチドライブラリーを創出することである。かかるライブラリーは、タンパク質供給源の部分消化物、中程度消化物、および／または完全消化物を含むことができ、従って、できる限り包括的な範囲のタンパク質フラグメントとして供給される。広範囲のフラグメントは、消化時間、ｐＨ、バッファー、および温度条件を含む条件範囲、および酵素反応の基質を変えることにより、実現され得る。さらに、タンパク質の分解は、定義されたタンパク質分解特異性および異なるタンパク質分解特異性をそれぞれ有する一定範囲の分解剤（プロテアーゼおよび化学分解を含むが、これらに制限されない）により行われてもよい。分解はまた、該消化方法論の異なる組合せを用いて、異なるペプチド種が創出され得るように、連続してまたは平行して行われてもよい。従って、消化条件に対する変更それぞれが、特定のタンパク質供給源由来の異なるペプチドライブラリーを創出するであろう。
【００３６】
好ましくは、供給源のタンパク質の分別試料は、分解の程度または進行をモニターするための方法の対象とされる。該方法は、迅速であり、かつ信頼性があるが、試料の消費は最小量でなければならない。
【００３７】
ほんの一例として、生じたペプチドの質量を測定するためにＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ装置を、そして試薬を運び、反応物を抽出するためにＰＣ制御のＸ−Ｙピペッティングワークステーションを用いた自動化方法により、オペレーターが最適な消化パラメーターを決定し、これにより、さらなる下流の実験のための最適なペプチド特性を得ることが可能となる。
【００３８】
該方法は、次の段階からなる。
１．分解されるべきタンパク質が、濃度およびｐＨの様な事前に設定されたバッファー条件または問題の実験と関係する他のパラメーターで、恒温標準マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）のいくつかのウェルに投入される。
２．分解剤（すなわち、酵素または化学物質）が該ウェルに時間０で添加される。
【００３９】
３．一定分量（典型的には、数μｌ）が取り出され、消光剤、典型的には、希酸溶液が事前に加えられた第２のＭＴＰに投入される。一定分量には、ＰＣ制御のピペッティングステーションソフトウエアにプログラム化された連続する時間点で、実験が継続中採取されるものもある。指数関数的に増加する時間点は、５分で開始するよう設定される（５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、および１２８０分、＞２０時間など）が、それぞれの時間点は、問題の実験の必要に応じて設定され得る。無人の２４時間実験は該方法の範囲内にある。
【００４０】
４．それぞれの時間点での消化混合物の抽出に続き、Ｘ−Ｙピペッティングワークステーションにより、Anchorchip［商標］標的プレートに第２のマイクロタイタープレートの鏡像が写される。ペプチドは、マトリックスと混合され、乾燥され、洗浄され、そしてそれぞれのスポットのマトリックス／試料混合物が、再結晶され、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ分析される。
【００４１】
５．全反応混合物の質量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ装置を用いて自動的に記録される。
６．従って、測定されたペプチド質量の分布は、分解が進行した程度の「像」を生じる。例えば、完全なタンパク質または巨大ペプチドの存在は、不完全な分解の指標となる。
７．不明瞭な結果の場合は、第２のマイクロタイタープレートは、確証的分析に十分な試料を含有する。
【００４２】
タンパク質分解の古典的なモニタリングは、逆相ＨＰＬＣを用いて行われ、ここで、該タンパク質に対応するピークの縮小、および新生ペプチドピークの付加的増加が、分解の進行の表示として取り上げられる。しかしながら、新たな新生ペプチドピークの位置は、予測し難く、溶出時間およびペプチド時間が補正されても、それは理想的な方法とはほど遠い。また、部分的分解は、ＨＰＬＣベースの方法論を用いて予測し難い。さらに、溶出されたペプチドが収集され、再利用されても、実際、ＨＰＬＣベースの方法は、ｎｍｏｌまたは数μｇのタンパク質試料を必要とし、これは大抵回収不可能である。
【００４３】
提案のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ方法は、１分析当たり数ｐｍｏｌ量以下の試料または中サイズのタンパク質である５０ｋＤａについては数ｎｇを消費する。最新のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ装置は、試料が試料プレートまたは標的プレートにスポットされ、該プレートが該装置に載せられるとすぐに、少なくとも１００個の試料を自動モードで分析できる。進歩した装置の多くは、自動分析のため数１０００個もの試料を載せることができる。従って、控えめに見積もって、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ測定の分析時間は、標的の調製時間とそれぞれの質量分析の時間の合計となる。該提案での設定により、標的の調製の大部分が消化中に行われることが可能となり、このため標的の調製時間が１０分という短さとなり、それぞれの試料が典型的には２０秒未満で分析され得る。
【００４４】
段階２−消化条件の選択
未分画化ペプチドライブラリーは、質量分析（この例は、マトリックス支援レーザー脱離時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ）である）を含む（これに制限されない）分析の対象とされてもよい；該分析により、成分ペプチドのサイズおよび可能な同定についての正確な情報が提供される。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ分析の場合、多数のライブラリーのスペクトルが比較され、ペプチド特性（数／サイズ／パターンの複雑さ等）の顕著な変化が生じる、消化条件パラメーターの最適なセットが決定される。消化条件パラメーターのこれらのセット（消化は、連続する分画化のため、ライブラリーの数を制限することに焦点を置くべきである）を用いて、予測可能な「ホット・スポット」が創出さ得る。さらに、該ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳスペクトルにより、それぞれのペプチドライブラリーの特性についての正確な記録が提供され、これにより、クオリティーレベルを制御し、下流の分析（細胞活性のアッセイの場合、ペプチドライブラリーの生物活性ペプチドについての「ヒット」が同定される）のための再現性のある標本の創出が可能となる。
【００４５】
段階３−生物活性含有分画の同定
分画化され、スクリーニングされるべきライブラリーの数を減らすために、全未分画化消化混合物は、好ましくは、細胞ベースのアッセイを含む最初の生物アッセイの対象とされる（図１参照）。次に、該段階は、分画化、そして生物活性ペプチドの同定に先立ち、分画化のための消化混合物の同定を可能とし、これにより、それぞれの生物活性ペプチドの同定に必要な分画化の回数が減らされる。「生物活性」により決定される消化混合物の「有用性」は、用いられた生物活性アッセイに依存し、そして明らかに興味のない消化混合物が、新たなアッセイでインプットとして用いられるのが建設的であるなら、興味あるものとなり得ることは、注意されるべきことである。さらに、１個の消化混合物中に同時に存在するアゴニストペプチドおよびアンタゴニストペプチドは、一体となって、任意の特定アッセイにおいて正味の生物活性が存在しないように、互いに相殺し合うが、分画化後、分別された分画が生物活性についてアッセイされるときに、該活性は明らかとなる。
【００４６】
ハイスループット自動化スクリーニングアッセイを用いて、好ましくは、いくつかの主要な治療への応用と関係する、潜在的生物活性が同定される。ペプチドライブラリーは、幅広い生化学ベースのアッセイおよび細胞ベースのアッセイの対象とされ、これにより、多数の標的範囲で非常に広範囲の潜在的ヒットが提供される。ほんの一例として、最初のハイスループットスクリーンは、血小板活性化についての発光ベースのアッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＰＴ）についてのレーザーベースの方法、細胞増殖、細胞毒性、およびアポトーシスの発光および蛍光ベースの検出、およびインビボアッセイからなる。全ての場合で、それぞれのライブラリーは、アゴニスト作用およびアンタゴニスト作用についてスクリーニングされ、それ故生物活性ペプチドを同定する可能性、および治療上の価値または診断上の価値を有する活性を開発する可能性が提供される。
【００４７】
段階４−消化混合物の最初の分画化
段階３で生物活性を含有すると見出されたそれぞれのペプチドライブラリーは、次に、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、および／または逆相高速液体クロマトグラフィーを含む（これらに制限されない）クロマトグラフィー方法により分画化される。段階３で詳細に記載された生物学的スクリーニングアッセイと直接結びつけるため、分画（例えば、まず第一に２ｍｌ）は、好ましくは、段階３で概説された生物活性についてのアッセイにロボットが直接運転して移動させるのに適合したフォーマットで収集される。任意の特定のフォーマットに限定されないが、９６ディープウェルプレートの使用が目的として好ましく、可能な限り、連続する生物アッセイに適合するか、あるいは凍結乾燥に適したクロマトグラフィーの溶媒が使用されるべきである。この時点で、収集された分画は凍結乾燥され、保存されてもよい。必要なら、該凍結乾燥材料は、細胞適合性等張かつ緩衝溶液に再懸濁され得る。
【００４８】
段階５−収集された分画の分析および生物活性につていのアッセイ
スプリットフローシステムを用いて、あるいは収集分画から採取された一定分量を直接分析することにより、包括的データが、それぞれの分画の成分ペプチドの組成について収集され（質量分析）、このため、それぞれの分画は、活性を質量と一致させるために用いら得る固有のフィンガープリントを有する。収集分画はまた、生物活性含有分画（すなわち、活性分画）を同定するために、段階３で記載された、広範囲の細胞ベースのアッセイまたは他の活性アッセイの対象とされる。
【００４９】
段階６／７−活性含有分画の連続する再分画化およびアッセイ
段階５で同定された活性分画は、１個以上のペプチドを含有している可能性があるので、該分画は、好ましくは、細分画を形成するためにさらに１ラウンド以上（それぞれのラウンドが、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳによるそれぞれの細分画の組成のモニタリング、そして段階３に記載の活性アッセイを用いた活性細分画の同定を含む）のクロマトグラフィー（第２、および連続する次元）の対象とされる。
【００５０】
段階８−生物活性ペプチドの十分な同定および分析
段階５で行われた細胞ベースのアッセイまたは他の生物アッセイにおいて、アゴニスト活性および／またはアンタゴニスト活性を有することが見出された任意のペプチド部分は、さらなる分析の対象とされる。所定の推定生物活性ペプチドのペプチド配列の同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳの供給源分解後のＭＳデータとヒトゲノムデータベースに対するアラインメントとの組合せにより、成し遂げられ得る。推定生物活性ペプチドは、段階５で行われる細胞ベースのアッセイまたは他のアッセイで最初に観察される最初のアゴニスト活性／アンタゴニスト活性を再現するために、類似体および置換／配列逆転変異体を合成し、その能力を調べることにより確証され得る。最終的には、活性ペプチドは、より高度な（組織／器官／動物全体）バイオアッセイでのさらなる評価の対象とされる。
【００５１】
以下の実施例は、本発明の方法を十分かつ完全に理解するのを助けるために提供される。本発明は、該実施例により範囲を制限されるべきではないが、上記の前駆体タンパク質またはタンパク質含有生物学的抽出物に由来する生物活性ペプチドの検出まで、広範囲に及ぶことは、理解されるべきである。
【００５２】
実施例１
該実施例は、精製タンパク質であるフィブリノーゲンのタンパク質分解性消化物中の予測ＲＧＤ含有抗血栓性ペプチドの創出、同定、および活性を、本発明の方法の「概念の証明」として記載する。
【００５３】
フィブリノーゲンは、α２β２γ２ヘテロダイマー血漿糖タンパク質であり、血栓症の制御において多機能な役割を有する。それは、血小板凝集素受容体であるインテグリンＧＰ  ＩＩｂ−ＩＩＩａと結合する、内部アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列により、凝集血小板間の相互作用を架橋する。そのため、フィブリノーゲンのタンパク質分解性フラグメント、特に、ＲＧＤモチーフ含有ペプチドは、いくつかの抗血栓症スクリーニングアッセイをアンタゴナイズすると予想される。
【００５４】
予測ＲＧＤ含有フィブリノーゲンフラグメントを遊離するため、部分および完全Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシン消化フラグメントのライブラリーを創出した。広範囲の消化産物を消化条件パラメーターを変えることで創出し、生じた消化混合物を、逆相高速クロマトグラフィーにより、スクリーニングのための消化物ライブラリーを得るために分画化した。
【００５５】
潜在的抗血栓性物質のスクリーニングに適した血小板活性化を評価可能な、小型化（９６ウェルフォーマット）ハイスループットスクリーニングアッセイが開発された。１次アッセイは、血小板活性化が密顆粒からのＡＴＰの連続的放出に至るという現象に基づいている。次に、放出されたＡＴＰを、プレートリーダーにて生物発光を用いて迅速に定量し、これが血小板活性化の程度と比例する。
【００５６】
ペプチドの同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより測定したペプチド質量をフィブリノーゲンの理論的消化物から得た値のリストと比較して、確立した。反射装置を用いることで達成した質量の正確さは１００ｐｐｍの範囲内にあり、これは、非常高度の確実性のペプチド同定および整合性をもたらす。残る不明確なペプチドの同一性を、同一の装置を用いたフラグメント分析により排除できる。
【００５７】
図２は、例として、フィブリノーゲン消化混合物の創出を示す。フィブリノーゲンを、様々な条件下でプロテアーゼ消化し、広範囲の部分および完全消化産物および混合物を創出した。該消化混合物を個々に、および組み合わせて、種々の範囲の、異なるアミノ酸配列の完全および部分消化ペプチドを構成した。該工程により、天然形では検出されていない潜在性ペプチドを明らかにできる。該条件のうちいくつかを次に記載する。（Ａ）フィブリノーゲンをＬｙｓ−Ｃで長時間処理し、完全消化混合物および部分消化混合物の不均一な混合物を創出した。（Ｂ）還元型および非還元型のフィブリノーゲンをＬｙｓ−Ｃおよびトリプシンで消化し、広範囲の固有ペプチド種および異なるペプチド種を創り出した。（Ｃ）フィブリノーゲンを、様々な酵素対基質比のＬｙｓ−Ｃにより消化し、広範囲の消化ペプチド種を創り出した。
【００５８】
図３は、例として、消化混合物の消化ペプチドライブラリーへのクロマトグラフィーによる分画化を示す。フィブリノーゲンを、酵素対基質比１：１００のＬｙｓ−Ｃまたはトリプシンにより１６時間プロテアーゼ消化した。該消化混合物を、Ｃ１８（５μ、２．０×１５０ｍｍ）カラムを用いた逆相ＨＰＬＣ（ＡＣＮ（０．１％  ＴＦＡを含む０〜１００％  ＡＣＮ、３０分）、０．５ｍＬ／分で溶出し、２５０μｌ  分画に収集）により、クロマトグラフィーで分別した。一定分量のそれぞれのライブラリー分画を、質量分析のためキープし、残りを乾燥させて、−８０℃で保存した。
【００５９】
図４は、例として、コラーゲンに応答して血小板から放出されたＡＴＰの照度計による測定を示す。血小板リッチの血漿を、市販のＲＧＤＳ（３０μＭ）の存在下または非存在下で、２μｇ／ｍｌ  コラーゲンの自動注入により、刺激した。次に、相対的発光出力を、BMG Fluostarプレートリーダーで自動測定した。ＲＧＤＳは、コラーゲン誘導性ＡＴＰ放出を３０％（＊：ｐ＜０．００２  対コラーゲン単独）、部分的に阻害した。
【００６０】
図５は、例として、分画化したフィブリノーゲン由来ペプチドと共にインキュベーションした後、血小板から放出されたコラーゲン誘導性ＡＴＰの照度計による測定（図４参照）を示す。フィブリノーゲンをＬｙｓ−Ｃ（Ａ）またはトリプシン（Ｂ）のいずれかで消化し、図２および３に記載の分画化を行った。水平方向の矢印で強調した分画が、コラーゲン誘導性ＡＴＰ放出を部分的に阻害し、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳにより、ＲＧＤ含有ペプチド種を含むことを示した（図６参照）。さらに、いくつかの分画（Ａの２９、３０；Ｂの２７、２９）は、コラーゲン誘導性ＡＴＰ放出の増強を示し、これは、アゴニスト活性およびアンタゴニスト活性共に、分画化後に同定できたことを示している。
【００６１】
図６は、フィブリノーゲン消化物由来の分画のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳスペクトルの例を示す。Bruker-Daltonicsにより開発されたAnchorchip方法を用いて、該スペクトルを得た。概略、一定分量の試料０．２５μｌを、α−シアノ桂皮酸０．２５μｌと混合し、該試料を４００μｍ  スポットに配置するAnchorchipプレートに投入する。自動モードのAutoflex（Bruker-Daltonics）質量分析計の実施を用いて、スペクトルを記録した。２０４２．６のピークは、ペプチドα鎖５４７〜５６４を含有しているＲＧＤＳの第２の同位体に対応する。挿入図は、同位体のピークを示し、得られた質量の正確さが高いことを示す。
【００６２】
実施例２
該実施例は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳを用いた、タンパク質の酵素分解あるいは化学消化に最適な条件の決定方法を記載する。
【００６３】
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリプシン消化物を、４つの異なるｐＨ値（７．０、７．５、８．０、および８．５）で調製し、６つの時間点（５、１０、２０、４０、８０、および１６０分）で一定分量を試料とした。
【００６４】
ロボットシステムは、Bruker Daltonics Autoflex ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳに自動ファイル転送する、Gilson 215に基づく８チャンネルＸ−Ｙロボットであった。恒温マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）ホルダーを、ＭＴＰでの消化物を最適化するためのロボットに追加した。試料を吸引し、そして分配する場所、および該動作を行う時間についてロボットを制御するために、エクセルマクロを開発した。消化の開始に先立ち、一定分量の消化混合物をウェルに投入したときに消化が停止するように、標的ＭＴＰのそれぞれのウエルに１％  ギ酸５μｌを分配した。
【００６５】
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳ標的プレートのスポッティングを、Bruker Daltonics開発のスクリプトを用いて行った。
【００６６】
図７は、例として、消化物スカウトのユーザーインターフェースを示す。該スカウトは、消化混合物により占められた消化物ＭＴＰ上の位置決定を含む。「試料の移動」は、少量の試料をあるＭＴＰから別のＭＴＰへ、等分するために用いられる機能である。残るボタンは、試料プレート、例えば、Anchorchip［商標］（Bruker Daltonics）試料プレートの調製を意味する。
【００６７】
さらに、データ評価のためエクセルの表計算を開発した。記録したスペクトルの評価についてのいくつかのオプションを試験し、質量５ｋＤａ未満のペプチドの出現のモニタリングが最適な方法であることを見出した。全消化産物（上記の５ｋＤａのペプチドを含む）の測定とは対照的に、これより小さなペプチドのモニタリングは、自動取得モードで再現性があり、かつ確固たるものである。このことは、さらに消化が進むと、より多くの結合が分解され、故にペプチドの平均質量が小さくなるという仮説に基づく。この平均ペプチド質量を、時間に対してプロットできる（図８に示す）。図８は、４つのｐＨ値での平均質量と時間のグラフを示す。該グラフは、ｐＨ７．５〜８．０が最も有効であると示すが、部分消化が所望なら、消化時間を該グラフからピックアップできる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、治療上および診断上使用するための生物活性ペプチドを検出するための、本発明の方法の１つの実施態様の概略図である。
【図２】図２は、例として、タンパク質であるフィブリノーゲンの消化混合物の創出を示す。
【図３】図３は、例として、クロマトグラフィーによる、フィブリノーゲン消化混合物のライブラリーへの分画化を示す。
【図４】図４は、例として、ＲＧＤＳの存在下または非存在下でコラーゲンに応答した血小板からのＡＴＰ放出の照度計による測定を示す。
【図５】図５は、例として、分画化されたフィブリノーゲン由来ペプチドと共にインキュベーションした後、血小板からのコラーゲン誘導性ＡＴＰ放出の照度計による測定を示す。
【図６】図６は、フィブリノーゲン消化物に由来する分画のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ  ＭＳスペクトルの例を示す。
【図７】図７は、例として、消化物スカウトのユーザーインターフェースを示す。
【図８】図８は、４ｐＨ値での平均質量と時間のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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