(57)【要約】本発明は、生体分子（核酸、ペプチドなど）、薬物、医用画像用途に使用される分子、癌処置に使用される増感剤、および組織工学で使用される分子を送達するための可制御分解性カチオンポリマーを提供する。本発明は、本発明のポリマーを合成する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のカチオン分子と前記カチオン分子を分岐状に連結している少なくとも1つの分解性リンカー分子とを含み、前記カチオン分子が
（i）式1のカチオン化合物：
【化１】
2005532323.tif 000007
式1
［式中、
R1は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R2は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R3は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R4は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R5は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1である］、
（ii）カチオン性ポリアミノ酸、および
（iii）カチオン性多糖、
からなる群より選択され、前記分解性リンカー分子が式：
CLn
［式中、Cは、炭素原子数2〜10の直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であって、ヘテロ原子を持つまたはヘテロ原子を持たないエーテル、エステル、アミド、イミド、カルボニル基を含んでもよいスペーサー部分であり、Lはアクリレートまたはメタクリレート部分であり、nは2以上の整数であり、CとLとは共有結合している］
で表される、分解性カチオンポリマー。
【請求項２】
上記ポリマーが加水分解、酵素切断、還元、光切断、または超音波処理によって分解される、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項３】
上記カチオン分子が、ポリエチレンイミン（PEI）、ポリプロピレンイミン（PPI）、ペンタエチレンヘキサミン、N,N'-ビス(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン、N-(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン、N-(2-アミノプロピル)-1,3-プロパンジアミン、スペルミン、スペルミジン、1,4-ビス(3-アミノプロピル)ピペラジン、1-(2-アミノエチル)ピペラジン、トリ(2-アミノエチル)アミン、分岐または樹状ポリアミドアミン（PAMAM）、ポリ(L-リジン)（PLL）、およびキトサンからなる群より選択される、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項４】
上記リンカー分子が、1,3-ブタンジオールジアクリレート、1,4-ブタンジオールジアクリレート、1,6-ヘキサンジオールジアクリレート、ジ(エチレングリコール)ジアクリレート、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート、2,4-ペンタンジオールジアクリレート、2-メチル-2,4-ペンタンジオールジアクリレート、2,5-ジメチル-2,5-ヘキサンジオールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールテトラアクリレート、ジ(トリメチロールプロパン)テトラアクリレート、ジペンタエリトリトールペンタアクリレート、および少なくとも3つのアクリレートまたはアクリルアミド側基を持つポリエステルからなる群より選択される、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項５】
当該ポリマーの分子量が500Da〜1,000,000Daである、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項６】
当該ポリマーの分子量が2000Da〜200,000Daである、請求項5の分解性カチオンポリマー。
【請求項７】
上記カチオン化合物の分子量が50Da〜10,000Daである、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項８】
上記リンカー分子の分子量が100Da〜40,000Daである、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項９】
当該ポリマーと複合体を形成した生体分子をさらに含む、請求項1の分解性カチオンポリマー。
【請求項１０】
上記生体分子が核酸、タンパク質、ペプチド、脂質、および糖質から選択される、請求項9の分解性カチオンポリマー。
【請求項１１】
上記核酸がDNA、一本鎖または二本鎖RNA、リボザイム、DNA-RNAハイブリッド、およびアンチセンスDNAからなる群より選択される、請求項10の分解性カチオンポリマー。
【請求項１２】
処置を必要とする患者の遺伝子治療法であって、前記患者に請求項11の分解性カチオンポリマーを投与することを含む方法。
【請求項１３】
真核細胞をトランスフェクトする方法であって、前記細胞を請求項11のポリマーと接触させることを含む方法。
【請求項１４】
個体に画像診断用組成物を送達する方法であって、画像診断用組成物を請求項1の分解性カチオンポリマーと接合し、接合したポリマーを前記個体に投与することを含む方法。
【請求項１５】
複数の請求項1の分解性カチオンポリマーを含むポリマーライブラリーであって、前記ポリマーがリンカー分子に対して様々な比率のカチオン化合物を含んでいるポリマーライブラリー。
【請求項１６】
複数の請求項1の分解性カチオンポリマーを含むポリマーライブラリーであって、前記ポリマーがそれぞれ異なるリンカー分子を含んでいるポリマーライブラリー。
【請求項１７】
複数の請求項1の分解性カチオンポリマーを含むポリマーライブラリーであって、前記ポリマーがそれぞれ異なるカチオンオリゴマーを含んでいるポリマーライブラリー。
【請求項１８】
少なくとも1つの生体分子と、
前記生体分子に対して親和性を持つ請求項1の分解性カチオンポリマーと、
真核細胞内に内在化されうる少なくとも1つの送達促進剤であって、受容体認識、内在化、エンドソームからの前記生体分子の脱出、核局在化、生体分子放出、または前記真核細胞における系の安定化を増進することができる送達促進剤と
を含む生体材料送達系。
【請求項１９】
上記生体分子が核酸、ペプチド、タンパク質、または糖質である、請求項18の生体分子。
【請求項２０】
上記送達促進剤が上記分解性カチオンポリマーに結合されている、請求項18の送達促進剤。
【請求項２１】
造影剤と、
生体分子に対して親和性を持つ請求項1の分解性カチオンポリマーと、
真核細胞、組織または器官の特異的受容体を認識するリガンド、抗体または興味ある薬剤であって、前記分解性カチオンポリマーと結合しているリガンド、抗体または薬剤と
を含む医用診断系。
【請求項２２】
光または他の物理的刺激因子によって機能的に起動させることができる増感剤と、
生体分子に対して親和性を持つ請求項1の分解性カチオンポリマーと
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば生体分子送達、画像診断用組成物送達、増感剤組成物送達および組織工学などの生物医学的用途のための可制御分解性ポリマー担体分子の新規合成方法に関する。特に本発明は、可制御分解性ポリマー主鎖に関すると共に、核酸、タンパク質、ペプチドなどの生体分子および薬物を細胞、組織または処置を必要としている個体に送達する際に使用されるポリマーを合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療における第一の関心事は遺伝子送達である。遺伝子送達系は、標的細胞への遺伝子発現系の分布と接近および/または細胞表面受容体による認識、続いて起こる細胞内輸送および核移行に影響を及ぼすことによって、体内の遺伝子を保護し、体内での遺伝子の位置を制御するように設計される（Friedmann，T.「The Development of Human Gene Therapy」Cold Spring Harbor Laboratory Press，サンディエゴ，1999）。
【０００３】
ウイルスベクターやカチオン脂質に基づく遺伝子担体系には限界があるので、ポリマー型遺伝子担体への関心が高まっている。ポリマーは、小分子薬物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび遺伝子の新しい送達系の設計に刺激的な可能性を数多く与えてくれる高分子である。そのような系では、単に混合物の組成、ポリカチオンの分子量、ポリカチオンの構造（線状、ランダム分岐、デンドリマー、ブロックコポリマーおよびグラフトコポリマー）を変化させることによって、そしてまた、側鎖もしくは他の機能性分子（糖、ペプチドおよび抗体など）を導入してポリカチオン主鎖を修飾することによって、はるかに大きな自由度を得ることができる（Pouton CW，Seymour LW「非ウイルス遺伝子送達の重要課題（Key issues in non-viral gene delivery）」Adv．Drug Deliv．Rev. 2001 Mar．1；46(1-3)：187-203）。免疫原性が低いかまたは免疫原性を持たないという点も、脂質に基づく遺伝子担体に対する利点であり、これは、ポリマーが患者に応用できる生体適合性材料である理由になっている。
【０００４】
遺伝子担体主鎖としてよく使用されるカチオンポリマーは、ポリ(L-リジン)（PLL）、ポリエチレンイミン（PEI）、キトサン、PAMAMデンドリマー、およびポリ(2-ジメチルアミノ)エチルメタクリレート（pDMAEMA）である。
【０００５】
1987年に開拓されたポリ(L-リジン)系のポリマーは、受容体を介した取り込みが増進されるようにアシアロオロソムコイドや葉酸などのターゲティングリガンドを使用することにより、遺伝子送達に用いられた（Wu，GY.およびWu，CH「可溶性DNA担体系による受容体を介したインビトロ遺伝子形質転換（Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system）」J Biol Chem. 1987 Apr．5；262(10)：4429-32、Wu，GYおよびWu，CH「生体内での受容体を介した遺伝子送達と発現（Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo）」J Biol Chem. 1988 Oct．15；263(29)：14621-4、Mislick KA，Baldeschwieler JD，Kayyem JF，Meade TJ「葉酸-ポリリジンDNA複合体のトランスフェクション：リソソーム送達の証拠（Transfection of folate-polylysine DNA complexes: evidence for lysosomal delivery）」Bioconjug Chem. 1995 Sep-Oct；6(5)：512-5）。PLL/DNA複合体は、複合体の表面にディスプレイされたリガンドと受容体との相互作用の結果として、細胞内に内在化されることが実証されている（Wagner E，Zenke M，Cotten M，Beug H，Birnstiel ML「細胞にDNAを取り込ませるための担体としてのトランスフェリン-ポリカチオンコンジュゲート（Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells）」Proc Natl Acad Sci USA. 1990 May；87(9)：3410-4）。また、PLLによる遺伝子導入の効率は、リソソーム作用剤（例えばクロロキニン）もしくは不活化アデノウイルス、またはインフルエンザ菌エンベロープタンパク質由来のペプチドを使って、PLL/DNA複合体をエンドソームから放出されやすくすることによっても改善された（Wagner E，Plank C，Zatloukal K，Cotten M，Birnstiel ML「インフルエンザウイルス赤血球凝集素HA-2 N末端膜融合性ペプチドはトランスフェリン-ポリリジン-DNA複合体による遺伝子導入を増強する：合成ウイルス様遺伝子導入媒体を目指して（Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle）」Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Sep 1；89(17)：7934-8、Curiel DT，Wagner E，Cotten M，Birnstiel ML，Agarwal S，Li CM，Loechel S，Hu PC「DNA-ポリリジン複合体と結合させたアデノウイルスによる高効率遺伝子導入（High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes）」Hum Gene Ther. 1992 Apr；3(2)：147-54）。PLLは1級アミンだけからなるので、ターゲティングリガンドまたはエンドソーム溶解試薬を使用しない場合、PLLポリプレックスだけでは遺伝子導入が不十分であることは明らかである。一方、高分子量PLLは細胞に対して顕著な毒性を示した。
【０００６】
PLLとは異なり、高分子量分岐ポリエチレンイミンと高分子量線状ポリエチレンイミン（PEI）はどちらも、エンドソーム溶解剤やターゲティング剤を使用しなくても、高い遺伝子導入効率を示す（Boussif O，Lezoualc'h F，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，Behr JP「培養細胞および生体内細胞に遺伝子およびオリゴヌクレオチドを導入するための多用途ベクター：ポリエチレンイミン（A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine）」Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug．1；92(16)：7297-301）。正に帯電したPEIポリプレックスは細胞によってエンドサイトーシスされる。また、PEIは、その高密度な2級アミンおよび3級アミンゆえに、エンドソーム脱出を容易にするとも考えられている。残念なことに、高分子量PEIも、細胞に対して毒性があると報告されており、その毒性ゆえに、ヒト患者への用途にPEIを遺伝子送達ツールとして使用できる可能性は著しく制限される。
【０００７】
一連のポリアミドアミンデンドリマーが遺伝子送達系として研究されている（Eichman JD，Bielinska AU，Kukowska-Latallo JF，Baker JR Jr「PAMAMデンドリマーを使った細胞への遺伝物質の効率のよい導入（The use of PAMAM dendrimers in the efficient transfer of genetic material into cells）」Pharm．Sci．Technol．Today. 2000 Jul；3(7)：232-245）。末端アミノ基は静電的手段によってDNAを結合して正に帯電した複合体を形成し、その複合体がエンドサイトーシスによって取り込まれる。このポリマーの星状構造に関係する利点がある。というのも、DNAは表面1級アミンとだけ相互作用するらしいので、内部の3級アミンはデンドリマー-遺伝子複合体のエンドソーム脱出を補助するために利用することができるからである。残念ながら、デンドリマーも細胞に対して毒性があると報告されており、それがヒト患者へのその応用にとって大きな制約になっている。また、実用的な遺伝子トランスフェクション効率を示したのは高世代のポリアミドアミンデンドリマーだけであるが、これらのポリマーの製造コストは非常に高い。
【０００８】
医学的な遺伝子治療における遺伝子担体としての利用に関して、第一の関心事は、安定性および細胞を傷つける可能性である。効率のよい遺伝子送達に必要な上述の高分子量カチオンポリマーは、通常、細胞にとって毒性であるという欠点を共通して示す。一方、低分子量カチオンポリマーまたはオリゴマーは、通常、細胞毒性が低いか、または細胞毒性を持たないが、それらは意味のある遺伝子トランスフェクション効率も示さない。この矛盾を解決するための戦略の一つは、遺伝子が所望の細胞の核内に送達された後は小分子に分解される生分解性カチオンポリマーを合成することである。
【０００９】
最近、分解性カチオンポリマーで作製された遺伝子担体によって、哺乳類細胞への遺伝子導入に成功すると共に、細胞毒性も劇的に低下することが報告された（Lim YB，Kim SM，Lee Y，Lee WK，Yang TG，Lee MJ，Suh H，Park JS，J.「カチオン性超分岐ポリ(アミノエステル)：カチオン性表面と、生分解性三次元構造と、内部に3級アミン基とを持つ新しい種類のDNA凝縮分子（Cationic Hyperbranched Poly(amino ester): A Novel Class of DNA Condensing Molecule with Cationic Surface, Biodegradable Three-Dimensional Structure, and Tertiary Amine Groups in the Interior）」J．Am．Chem．Soc., 123(10)，2460-2461，2001）。しかし、非分解性ポリマー主鎖と比較すると、その遺伝子導入効率が低いのは、これらのポリマーが水溶液中で迅速に分解される結果、遺伝子送達試薬の調製中に、または遺伝子が細胞内に送達される前に、遺伝子導入効力を迅速に失うからだろう。分解速度の制御および生分解性カチオンポリマーの合成が困難であることが、これらのポリマー型遺伝子担体を生体内遺伝子送達および臨床患者に応用する際の制約になっている。
【００１０】
低分子量PEIのトランスフェクション効率を向上させるために、Gosselinら（Gosselin，Micheal A.，Guo，MenjinおよびLee，Robert J「可逆的に架橋された低分子量ポリエチレンイミンを用いる効率のよい遺伝子導入（Efficient Gene Transfer Using Reversibly Cross-Linked Low Molecular Weight Polyethylenimine）」Bioconjugate Chem. 2001．12：232-245）は、ジスルフィド含有リンカー、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）およびジメチル-3,3'-ジチオビスプロピオンイミデート-2HCl（DTBP）を使用することによって、高分子量PEIを得ることができると報告した。得られたポリマーは同程度の遺伝子トランスフェクション効率を示し、細胞毒性は低かった。細胞質環境は著しく還元的であるので、架橋試薬によって導入されたジスルフィド結合が細胞質では還元されてPEIコンジュゲートの分解が起こり、次に遺伝子は核内に送達されて、そこでDNA転写が起こると予期することは理にかなっている。しかし、Gosselinらが使用したジスルフィド含有リンカーは高価であり、そのことが、この系の大規模製造を困難で望ましくないものにしている。ジスルフィド含有リンカーを持つポリマーは還元条件下でしか分解されないため、他の条件下でのポリマーの応用は制限される。そのうえ、Gosselinらは分岐型PEI-800Daの使用しか開示していないが、このポリマーを人体に大量に使用すれば、依然として細胞毒性を示す可能性がある。また、Gosselinらの方法では、出発物質が低分子量カチオン化合物（例えばペンタエチレンヘキサミン、N-(2-アミノエチル)-1,3-プロパンジアミン）である場合には、意味のある遺伝子導入効率を持つポリマーを得ることは困難である。
【００１１】
Lynnら（Lynn，David A.;Anderson，Daniel G.;Putnam，DavidおよびLanger，Robert「合成トランスフェクションベクターの発見の促進：分解性ポリマーライブラリーのパラレル合成とスクリーニング（Accelerated Discovery of Synthetic Transfection Vectors: Parallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library）」J．Am．Chem．Soc. 2001，123，8155-8156）は、カチオン化合物間のリンカー分子としてジアクリレートを使用する生分解性カチオンポリマーの合成方法を記載している。しかし、得られるポリマーは線状であり、カチオン密度も低くてDNAを凝縮させるには不十分である。これらのポリマーの合成は完了までに数日を要し、遺伝子送達に使用することができる有効生成物の量も少ない。Lynnらの方法で100を超えるカチオンポリマーが製造されたが、これらのポリマーのうち、有効な遺伝子トランスフェクション効率を示したのは2つに過ぎなかった。これらの要因が、この方法による高分子量ポリマーの製造を達成困難なものにしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
遺伝物質を効率よく送達するための高分子量カチオンポリマーであるが、細胞毒性および細胞損傷を最小限に抑えるために可制御分解性であるポリマー型のトランスフェクションベクターが必要とされている。ここでは説明の大半を分解性ポリマーについて行うが、これは、実質的に非分解性であるポリマーの使用を除外しようとするものではない。
【００１３】
本発明の一態様は、可制御分解性カチオンポリマーおよび種々の生分解性ポリマーを合成する方法である。核酸やペプチドなどの生体分子ならびに合成薬物および他の分子は、本ポリマーに接合させるか、本ポリマーと複合体を形成させることができるので、興味ある分子の送達機構が得られる。時間的および空間的に制御されたポリマーの分解は、細胞の損傷を最小限に抑えつつ、興味ある分子による真核細胞、特に高等真核細胞の高効率トランスフェクションを可能にする。
【００１４】
さらにもう一つの態様として、低分子量のカチオン化合物またはカチオンオリゴマーを細胞毒性の低い高効率トランスフェクション材料に変換する簡単な方法も提供する。好ましい一態様では、1合成ステップで、穏和な条件下に極めて短時間で、全合成手順が完了する。したがって、この合成法の出発物質は大半が市販されていることから、製造および実験用に、極めて低コストでスケールアップすることが容易である。
【００１５】
さらに本ポリマー合成法は極めて効果的である。好ましい態様のポリマーで観察されるトランスフェクション効率は、他の市販のポリマー型遺伝子担体によるトランスフェクションよりも高い。
【００１６】
本明細書に記載するポリマー合成法は、高分子量ポリマーを製造するために使用することができる分子のタイプに関して自由度が高い。少なくとも3つのアミン基を持つ任意のカチオンオリゴマーまたはカチオン化合物を出発物質にして、リンカー分子の添加により、有用なポリマー型遺伝子担体試薬を製造することができるだろう。本発明におけるリンカー分子は加水分解可能な結合を持つ。また、リンカー分子は、物理的、生物学的または化学的に制御できる切断可能な他の結合、例えば還元可能な結合、酵素特異的切断部位を持つペプチド、または物理的もしくは化学的感受性を持つ結合（光感受性、pH感受性もしくは超音波感受性分子など）も含みうる。本発明のポリマーの分解は、例えば加水分解、酵素消化、超音波処理、および物理的分解法（例えば光分解）などの方法によって達成できるが、これらに限るわけではない。
【００１７】
本明細書に記載するポリマー合成法は、特定の用途に合わせて反応条件を最適化する目的でポリマーライブラリーを簡単に作製するための有用な方法になる。これらの方法は、研究者が所望する特徴、例えば特定の分解速度などを持つポリマーを設計し、選別する目的でポリマーライブラリーを合成するためにも使用することができる。
【００１８】
本ポリマー合成法は、興味ある機能基を含む1つまたは複数のリンカーでカチオン化合物を単に架橋するだけで、合成したポリマーにペプチド、糖またはタンパク質を簡単に組み込むための有用な方法にもなる。リガンドは、合成したポリマーに従来の方法、例えばジスルフィド含有基などによって導入することもできる。核酸、ペプチド、薬物、他の機能基などは、当業者に知られている任意の方法で、ポリマーに接合/結合させることができる。
【００１９】
他の好ましい態様として、制御可能な分解速度を持つ生分解性カチオンポリマーであって、リポフェクトアミン（lipofectamine）（Invitrogen）やスーパーフェクト（SuperFect）（Qiagen）などの市販トランスフェクション試薬と比較して、高い遺伝子トランスフェクション効率と低い細胞毒性とを示すものが挙げられる。本明細書に記載する方法によって合成されるポリマーの分解は、単にポリマー組成物中の分子の比率を調節することによって、または様々なリンカー分子を変更することによって、容易に制御することができる。
【００２０】
好ましい一態様によれば、複数のカチオン分子と前記カチオン分子を分岐状に連結している少なくとも1つの分解性リンカー分子とを含む分解性カチオンポリマーが提供される。カチオン分子は、以下の分子からなる群より選択される。
（i）式1のカチオン化合物：
【００２１】
【化２】
2005532323.tif 000002
式1
［式中、
R1は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R2は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R3は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R4は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R5は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1である］、
（ii）カチオン性ポリアミノ酸、および
（iii）カチオン性多糖。
分解性リンカー分子は式：
CLn
［式中、Cは、炭素原子数2〜10の直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であって、ヘテロ原子を持つまたはヘテロ原子を持たないエーテル、エステル、アミド、イミド、カルボニル基を含んでもよいスペーサー部分であり、Lはアクリレートまたはメタクリレート部分であり、nは2以上の整数であり、CとLとは共有結合している］
で表される。
【００２２】
もう一つの好ましい態様によれば、少なくとも1つの生体分子と、その生体分子に対して親和性を持つ上述の分解性カチオンポリマーと、真核細胞内に内在化されうる少なくとも1つの送達促進剤であって、受容体認識、内在化、エンドソームからの前記生体分子の脱出、核局在化、生体分子放出、または前記真核細胞における系の安定化を増進することができる送達促進剤とを含む生体材料送達系が提供される。
【００２３】
もう一つの好ましい態様によれば、造影剤と、生体分子に対して親和性を持つ上述の分解性カチオンポリマーと、真核細胞、組織または器官の特異的受容体を認識するリガンド、抗体または興味ある薬剤であって、前記分解性カチオンポリマーと結合している前記リガンド、抗体または興味ある薬剤とを含む医用診断系が提供される。
【００２４】
もう一つの好ましい態様によれば、光または他の物理的刺激因子によって機能的に起動させることができる増感剤と、生体分子に対して親和性を持つ上述の分解性カチオンポリマーとを含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
添付の図面では、様々な本発明のカチオンポリマーをCmLnで表す。この場合、Cmは表1に示すカチオン化合物を表し、Lnは表2に示すリンカー分子を表す。例えばC1L4は、表1のカチオン化合物C1と表2のリンカー分子L4とを含むカチオンポリマーを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書には、生体分子（核酸、ペプチドなど）、薬物、医用画像用途に使用される分子、癌処置に使用される増感剤、および組織工学で使用される分子を送達するための分解性カチオンポリマーを記載する。それらのポリマーを合成する方法も述べる。
【００２７】
好ましい態様では、カチオンオリゴマーまたは3カ所を超える反応性部位を持つ任意のアミノ基含有分子を使用することができる。これらの低分子量カチオン化合物またはオリゴマーは、細胞内への遺伝子輸送または核酸輸送用の担体として使用しても、通常は、トランスフェクション能力を全く示さないか、または極めて低いトランスフェクション効率しか示さない。しかしこれらは、高いトランスフェクション効率を持つ高分子量担体と比較すると細胞毒性が低いか、または細胞毒性を持たない。生分解性カチオンポリマーは通例、低い細胞毒性を示すが、迅速な分解が起こるためにトランスフェクション効率も低いことが、遺伝子導入および他の用途に関して、他の担体に対する生分解性カチオンポリマーの競争力を弱めている。これらの分解性カチオンポリマーは、低分子量カチオン化合物またはオリゴマーを分解性リンカーで一つに連結することによって、トランスフェクション効率を向上させている。リンカー分子は、生物学的、物理的または化学的に切断可能な結合、例えば加水分解可能な結合、還元可能な結合、酵素特異的切断部位を持つペプチド配列、pH感受性結合、または超音波感受性結合などを含有しうる。これらのポリマーの分解は、例えば加水分解、酵素消化、および物理的分解方法、例えば光学的切断（光分解）などの方法によって達成できるが、これらに限るわけではない。
【００２８】
また、トランスフェクション効率を高めるために、分解性ポリマーをウイルスタンパク質または非ウイルスタンパク質と接合または会合させてもよい。例えば、トランスフェクション効率を向上させるために、水疱性口内炎ウイルスGタンパク質（VSVG）および当業者に知られている他のペプチドまたはタンパク質をポリマーに付加することができる。
【００２９】
本明細書に記載するポリマーの最も魅力的な特徴の1つは、リンカーのタイプと構造に基づいて、ポリマーの分解を、ポリマー分解の速度と部位に関して制御することができるという点である。
【００３０】
低分子量ポリエチレンイミン（PEI）、低分子量ポリ(L-リジン)（PLL）、低分子量キトサン、および低分子量PAMAMデンドリマーなどのカチオンオリゴマーを使って、本明細書に記載のポリマーを製造することができる。さらに、3カ所を超える反応性部位を持つ任意のアミン含有分子を使用することができる。カチオン化合物は以下の化合物から選択することができるが、これらに限るわけではない：
（i）式1のカチオン化合物：
【００３１】
【化３】
2005532323.tif 000003
式1
［式中、
R1は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R2は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R3は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であり、
R4は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1であり、
R5は、水素原子、炭素原子数2〜10のアルキルもしくはヘテロアルキル基、原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基、またはもう1つの式1である］
（ii）カチオン性ポリアミノ酸、および
（iii）カチオン性多糖。
【００３２】
そのようなカチオン分子の例として、図11および表1に示す分子が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００３３】
【表１】
2005532323.tif 000004
ここで使用されるカチオンポリマーは、活性なリガンド（例えば糖、ペプチド、タンパク質および他の分子）と接合することができる1級または2級アミノ基を含みうる。好ましい一態様ではラクトビオン酸をカチオンポリマーに接合する。肝細胞の表面にはガラクトース受容体が存在するので、ガラクトシル単位は肝細胞への有用なターゲティング分子になる。別の一態様では、ポリマー上にガラクトシル単位を導入するために、分解性カチオンポリマーにラクトースを接合する。
【００３４】
分解性連結分子には、例えば、少なくとも1つの生分解性スペーサーを含有するジ-および多価-アクリレート、ジ-および多価-メタクリレート、ジ-および多価-アクリルアミド、ジ-および多価-イソチオシアネート、ジ-および多価-イソシアネート、ジ-および多価-エポキシド、ジ-および多価-アルデヒド、ジ-および多価-アシルクロリド、ジ-および多価-スルホニルクロリド、ジ-および多価-ハライド、ジ-および多価-無水物、ジ-および多価-マレイミド（multi-malemides）、ジ-および多価-カルボン酸、ジ-および多価-α-ハロアセチル基、ならびにジ-および多価-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどがあるが、これらに限るわけではない。次の式は、好ましい態様で使用することができるリンカーを表している：
CLn
［式中、Cは、炭素原子数2〜10の直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはヘテロアルキル基、または原子数5〜30のアリールもしくはヘテロアリール基であって、ヘテロ原子を持つまたはヘテロ原子を持たないエーテル、エステル、アミド、イミド、カルボニル基を含んでもよいスペーサー部分であり、Lはアクリレートまたはメタクリレート部分であり、nは2以上の整数であり、CとLとは共有結合している］。リンカー分子の例を図12にいくつか示した。ただし、これらの分子には他の態様も考えられ、本明細書にはそれら他の態様も記載されている。
【００３５】
リンカー分子の反応性残基の態様を図13にいくつか例示した。ただし、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。反応性残基は、例えばアクリルオイル、マレイミド、ハライド、カルボキシルアシルハライド、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、アルデヒド、スルホニルクロリド、およびN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基またはそれらの組合せから選択することができるが、これらに限るわけではない。本明細書には、リンカーおよびカチオン分子の他の態様も開示されている。表2に、本発明の好ましい態様で使用されるリンカーを示す。
【００３６】
【表２】
2005532323.tif 000005
ポリマーの分解速度は、ポリマー組成、供給比、ポリマーの分子量を変化させることによって制御することができる。例えば、嵩高いアルキル基を持つリンカーをリンカーとして使用すると、ポリマーの分解が遅くなるだろう。また、分子量を増加させると、場合によっては、分解速度の低下が起こるだろう。ポリマーの分解速度は、リンカーに対するカチオンポリマーの比を調節するか、様々な分解性リンカー分子を変更することによって、制御することができる。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの態様として、非分解性カチオンポリマーを製造することもできる。これらのポリマーのカチオン化合物間のリンカー分子は、本明細書に記載する方法では分解できない。
【００３８】
アクリレートリンカーはジスルフィド含有リンカーよりもはるかに安価である。ジスルフィド含有リンカーの方が合成が困難だからである。アクリレートリンカーは任意の水溶液中で加水分解性を持ちうるので、アクリレートリンカーを含有するポリマーは、水を含む環境である限り、様々な環境で分解されうる。したがってアクリレートリンカーを含有するポリマーは、ジスルフィドリンカー含有ポリマーよりも広い応用範囲を持っている。また、ジスルフィドリンカーを持つポリマーの分解速度は通常、同じであるが、アクリレートリンカーを使って合成されるポリマーの分解速度は、使用する様々なアクリレートリンカーに依存して変化しうる。
【００３９】
カチオンポリマーを製造するための本明細書記載の合成方法は、簡単であり、しかも比較的低コストである。様々な組合せのカチオン化合物またはカチオンオリゴマーとリンカー分子とを使って、またはリンカーに対するカチオン化合物の比を変えることによって、生分解性カチオンポリマーのライブラリーを得ることができる。このライブラリーに含まれるポリマーの物理的化学的性質は、様々な組合せのカチオン化合物とリンカーを使用するか、リンカー分子に対するカチオン化合物の比を変えることによって、調節することができる。このライブラリーのポリマーは、興味あるプラスミドDNAおよびアンチセンスオリゴDNAを細胞内に導入するために、分解性遺伝子担体として使用することができる。図14に示すGFPトランスフェクション結果は、これらのうち50％を超えるポリマーが、細胞内にGFP遺伝子を効果的に送達することができ、GFPタンパク質の発現をもたらしうることを示している。
【実施例１】
【００４０】
合成の概要
分岐または弱架橋生分解性カチオンポリマーの合成を図1に例示する。この合成方法は、分岐または弱架橋生分解性カチオンポリマーの大きなライブラリーを製造するために使用することができる。本発明のカチオンポリマーの分解も図示する。
【００４１】
図1において、Cは、少なくとも3カ所の反応性部位（マイケル付加反応に関する反応性部位）を持つアミン含有カチオン化合物またはアミン含有カチオンオリゴマーを表し、Lは少なくとも2つのアクリレート基を持つ化合物を表す。CとLとの反応は有機溶媒中、極めて穏和な条件下で起こる。反応後は、2種類の方法でポリマーを回収することができる。第1の方法では、減圧下で溶媒を直接除去することによって、ポリマーを回収した。第2の方法では、塩酸などの酸を加えてポリマーを中和し、中和されたポリマーをろ過または遠心分離によって回収した。Lに対するCの比、反応時間、反応温度、溶媒および溶質の濃度を制御することにより、高い分子量を持つ分岐または弱架橋水溶性ポリマーを得ることができる。
【実施例２】
【００４２】
カチオンオリゴマーをジアクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー（溶媒の直接除去によって回収）
本発明の高分子量カチオンポリマーの合成は、当業者に知られている様々な方法によって行うことができる。一連の分解性カチオンポリマーの合成に使用することができる類似の化合物を使った他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、分子量600のポリエチレンイミンオリゴマー（PEI-600）と1,3-ブタンジオールジアクリレート（1,3-BDODA）から誘導されるポリマーの合成を記載する。0.44gのPEI-600（Aldrich）を秤量し、小さなバイアルに入れ、6mlの塩化メチレンを加えた。PEI-600が完全に溶解してから、そのPEI溶液に塩化メチレン2ml中の1,3-BDODA 0.1gを撹拌しながらゆっくりと加えた。その反応混合物を室温で10時間撹拌した。有機溶媒を減圧下で除去したところ、0.55gの透明で粘稠な液体を得た。1H-NMRスペクトルから、アクリル酸の炭素−炭素二重結合が完全に消失していることがわかった。得られたポリマーの分子量をアガロースゲル電気泳動によって見積もった。ここで用いたものに類似する構造を持つ他のカチオンオリゴマーおよび他のリンカーから誘導される他の分岐または弱架橋分解性カチオンポリマーを、同様の方法で製造した。
【実施例３】
【００４３】
カチオンオリゴマーをジアクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー（酸による中和後に回収）
一連の分解性カチオンポリマーの合成に使用することができる類似の化合物を使った他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、PEI-600と1,6-ヘキサンジオールジアクリレート（1,6-HDODA）から誘導されるポリマーの合成を記載する。20mlの小バイアルに、塩化メチレン2ml中のPEI-600 0.43gを、ピペットまたは注射器で加えた。0.23g（1.0mmol）の1,6-HDODAを、上記のPEI-600溶液に、撹拌しながら素早く加えた。塩化メチレンを追加することにより、反応溶液中のPEI-600濃度を0.1g/mlに調節した。その反応混合物を室温（25℃）で5時間撹拌した。次に、2.5mlの4M HClを加えることによって、反応混合物を中和した。白色沈殿物を濾過し、塩化メチレンで洗浄し、減圧下に室温で乾燥した。得られたポリマーをNMR分光計およびアガロースゲル電気泳動で特徴づけた。ここで用いたものに類似する構造を持つ他のカチオンオリゴマー、例えばポリプロピレンイミンおよび他のポリアルキレンイミンを使って、同様の方法により、他の様々な分解性カチオンポリマーを製造した。
【実施例４】
【００４４】
カチオンオリゴマーを多価アクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー
実施例2および実施例3で述べたカチオンオリゴマーの架橋には、3つ以上のアクリレート基を持つアクリレート型リンカーを使用することもできる。ただし、3つ以上のアクリレート基を持つリンカーを使用する場合は、カチオンオリゴマーに対するリンカーのモル比を、ジアクリレートリンカーの場合よりも下げる必要がある。類似の化合物を使った他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、トリメチロールプロパントリアクリレート（TMOPTA）によるPEI-600の架橋反応を記載する。2mlの塩化メチレン中に0.43gのPEI-600を含んでいる溶液に、塩化メチレン2ml中のTMOPTA 0.13g（0.44mmol）を撹拌しながら素早く加えた。CH2Cl2を追加することにより、反応溶液中のPEI-600濃度を0.1g/mlに調節した。その反応混合物を室温（25℃）で5時間撹拌し、実施例3と同じ方法でポリマーを回収した。他のポリアルキレンイミンを、ここで使用したものに類似する構造を持つ他の多価アクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマーを、同様の方法で製造した。
【実施例５】
【００４５】
PAMAMオリゴマーをアクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー
1級または2級アミノ基を末端に持つポリ(アミド-アミン)デンドリマー（PAMAM）をカチオンオリゴマーとして、本発明の方法により、分解性カチオンポリマーを製造した。均一な溶液を得るために、メタノールと塩化メチレンとの混合溶媒を溶媒として使用した。メタノール0.5mlおよび塩化メチレン1.0mlの混合溶媒に、0.1gのPAMAM（第2世代、1級アミン基0.39mmol）を溶解した。この溶液に、塩化メチレン1ml中の1,3-BDODA 40mgを、撹拌しながら加えた。5℃で10時間撹拌した後、反応混合物に0.25mlの2M HClを加えた。ポリマーを遠心分離によって回収し、減圧下に室温で乾燥した。PAMAMオリゴマーと、ここで使用したものに類似する構造を持つ他のアクリレートリンカーとから誘導されるポリマーを、同様の方法で製造した。
【実施例６】
【００４６】
ポリ(アミノ酸)オリゴマーをアクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー
0.11gのポリ(L-リジン)臭化水素酸塩オリゴマー（Mw：1000〜3000）と50mgのトリエチルアミンとを1.0mlの乾燥DMSOに溶解した。この溶液に、乾燥DMSO 1.0ml中の2,4-ペンタンジオールジアクリレート（2,4-PDODA）42mgを素早く加えた。室温で6時間撹拌した後、0.5MのHCl水溶液を添加することによって、反応混合物のpH値を4.5に調節した。3000のMWCOを持つチューブを使ってHCl水溶液（pH：4.0，4℃）中で透析することによってポリマーを精製し、凍結乾燥法によってポリマーを回収した。3つ以上の1級または2級アミノ基を持つ他のポリ(アミノ酸）と、ここで使用したものに類似する構造を持つ他のアクリレートリンカーとから誘導されるポリマーを、同様の方法で製造した。
【実施例７】
【００４７】
多価アミンをアクリレートリンカーで架橋することによって製造されるポリマー
実施例2〜実施例6で使用したカチオンオリゴマーの他に、低分子量の多価アミンを使って、本発明の架橋法により、分解性カチオンポリマーを製造することもできる。類似の化合物を使用する他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、ジ(トリメチロールプロパン)テトラアクリレート（DTMOPTA）によるペンタエチレンヘキサミン（PEHA）の架橋反応を記載する。2mlの塩化メチレンが入っている小さなバイアルに、0.23gのPEHAを秤量した。PEHAが完全に溶解してから、その溶液に、塩化メチレン1ml中のDTMOPTA 0.28gを撹拌しながらゆっくり加えた。2mlの塩化メチレンを追加した。室温で8時間撹拌した後、2mlの4M HClを加えることによって、反応混合物を中和した。有機溶媒を直接除去することによってポリマーを回収した後、減圧下に室温で乾燥した。ここで使用したものに類似する構造を持つ他の多価アミンおよびアクリレートリンカーから誘導されるポリマーを同様の方法で製造した。
【実施例８】
【００４８】
カチオンオリゴマーまたはカチオン化合物をアクリレートリンカーで架橋することによって製造される分解性カチオンポリマーのライブラリー
実施例2〜実施例6に記載の手順に基づいて、分岐または弱架橋水溶性分解性カチオンポリマーのライブラリーを、様々なカチオンオリゴマーまたはカチオン化合物と様々なリンカーとから作製した。本発明で使用されるカチオンオリゴマーまたはカチオン化合物とリンカーをそれぞれ表1および表2に示すが、これらに限るわけでない。また、本発明で製造されるポリマーを表3に示すが、これらに限るわけではない。リンカーに対するカチオン化合物の比、反応時間、反応温度、溶媒および溶質の濃度を制御することによって、ポリマーの性質を調節した。これらのポリマーの一部を、GFPレポーター遺伝子のトランスフェクション効率によって評価した（図11）。
【００４９】
【表３】
2005532323.tif 000006
【実施例９】
【００５０】
カチオンオリゴマーをジエポキシドリンカーで架橋することによって製造される実質的に非分解性のカチオンポリマー
一連の非分解性カチオンポリマーの製造に使用することができる他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、PEI-600をグリセロールジグリシジルエーテルで架橋することによって製造されるポリマーの合成を記載する。0.43gのPEI-600と0.37gのグリセロールジグリシジルエーテルとを7.0mlのメタノールに溶解した。その反応溶液を40℃で48時間撹拌した。室温まで冷却した後、2.5mlの4M HCl（ジオキサン溶液）を反応溶液に加えところ、白色沈殿物が生じた。ポリマーを遠心分離によって回収し、減圧下に室温で乾燥した。得られたポリマーをNMR分光計とアガロースゲル電気泳動で特徴づけた。他のカチオンオリゴマーを他のジエポキシドリンカーで架橋することによって製造されるポリマーを同様の方法で製造した。
【実施例１０】
【００５１】
多価アミンを多価エポキシドリンカーで架橋することによって製造される実質的に非分解性のカチオンポリマー
類似する化合物を使った他の合成手順のモデルとして役立つように、一般的手順として、N,N'-ビス(2-アミノプロピル)エチレンジアミン（BAPEDA）をトリメチロールプロパントリグリシジルエーテル（TMOPTE）で架橋することによって製造されるポリマーの合成を記載する。0.18gのBAPEDAと0.24gのTMOPTEとを3.0mlのメタノールに溶解した。その反応溶液を35℃で74時間撹拌した。室温まで冷却した後、1.0mlの4M HCl（ジオキサン溶液）を反応溶液に加え、沈殿したポリマーを、減圧下で溶媒を除去することによって回収した。得られたポリマーをNMR分光計とアガロースゲル電気泳動で特徴づけた。他の多価アミンを他の多価エポキシドで架橋することによって製造されるポリマーを同様の方法で製造した。
【実施例１１】
【００５２】
カチオンポリマーへのガラクトシル単位の接合
本合成方法の一態様として、102mgのポリマーC3L5と50mgのラクトビオン酸とを10mlの水に加え、Na2CO3水溶液を添加することによって、pHを5.5に調節した。25mgの1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミドを激しく撹拌しながら加えた。室温で5時間撹拌した後、反応溶液を水（pH＝3.5）中で24時間透析した。ガラクトース接合ポリマーを凍結乾燥によって回収し、NMR分光計で特徴づけた。
【実施例１２】
【００５３】
DNA遅延実験
DNAの結合と凝縮は、カチオンポリマーによる遺伝子トランスフェクション過程の第1段階である。ポリマーのDNA結合親和性を決定するために、DNA遅延実験がよく使用される。DNA結合能が低いポリマーは、通常は、トランスフェクション効率が低いか、トランスフェクション能力を持たない。実験プロトコールを以下に説明する。簡単に述べると、DMEM（血清および抗生物質なし）10μl中の緑色蛍光タンパク質（GFP）プラスミド0.2μgに、DMEM（血清および抗生物質なし）10μl中の様々な比率のポリマーを、ボルテックスしながら滴下した。得られた複合体を室温で15分間静置してから電気泳動にかけた。各複合体に5μlのローディング色素を加え、15μlの各混合物を各ウェルに個別に充填した。1mM EDTAを含む0.04Mトリス酢酸緩衝液（pH7.4）を使った0.3％アガロースゲルでの電気泳動（100Vで30分間）により、DNA複合体を分析した。DNAをUV照明によって可視化した。電界中で、遊離のDNAはウェルから流れ出し、プラスミドバンドをゲル中に観察することができた（図2の各試料のレーン0）。プラスミドがポリマーによって完全に束ねられると、その移動は完全に阻害され、ゲル内のバンドはゲル上に観察されないだろう。しかし、プラスミドがポリマーに結合しない場合は、プラスミドがウェルの外へ移動し、結合したプラスミドまたはスミアをゲル中に観察することができる。この実験では、出発カチオン化合物またはカチオンオリゴマー、ペンタエチレンヘキサミン（C1）、線状PEI423Da（C2）、分岐PEI 600Da（C3）および分岐PEI 1200Da（C4）のDNA結合親和性は、ポリマー/DNA比を16：1にした場合でさえ、極めて弱かった。プラスミドはまだ漏出していた（図2，C3）。架橋後は、上記出発オリゴマーまたは出発カチオン化合物から本発明に従って誘導された全てのポリマーが、高い結合親和性を示した。例えば、C3L1では、ポリマー/DNA比を2：1にすると、DNA移動が完全に阻害され（図2，C3L1）、C4L1では、ポリマー/DNA比を4：1にすると、DNA移動が完全に阻害された（図2，C4L1）。図2の結果は、本発明によって製造されるポリマーがDNA結合親和性を増加させることを示している。
【実施例１３】
【００５４】
アガロースゲル電気泳動によるポリマー分子量の推定
分子量はDNA結合親和性およびトランスフェクション効率を決定する重要な論点である。高いDNA結合親和性およびトランスフェクション効率には高い分子量が必要である。本発明の重要な利点の1つは、低分子量のカチオンオリゴマーまたはカチオン化合物を、より高分子量のポリマーにすることができる点である。本発明によって合成されるポリマーの分子量範囲を評価するために、アガロースゲル電気泳動アッセイを行った。この実験では、150mM NaCl溶液に最終濃度が5mg/mlになるようにポリマーを溶解した。20μlの試料を採取し、各ウェルにつき2μlの50％グリセロールおよび1μlのオレゴンレッド（Oregon red）蛍光色素と混合して、TAE緩衝液中の0.6％アガロースゲルに充填した。電気泳動を100ボルトで30分間行い、UV光下で蛍光色素を可視化するか、またはクマシーブルー染色の結果として可視化することによって、ポリマー分子量を解析した。ポリマーの移動速度はポリマーの大きさに依存した。一般に低分子量ポリマーはアガロースゲル中で高分子量ポリマーより速く移動する。これらの実験では、分岐PEI25K、PEI10K、PEI1.8Kをそれぞれレーン1〜3にポリマー分子量標準として使用した。レーンC3はポリマーC3L1の合成に出発物質として使用したカチオンオリゴマーPEI0.6Kである。この実験の結果から、ポリマーC3L1の分子量は、分子量標準と比較して、その出発物質C3よりはるかに高いことがわかった（図3）。
【実施例１４】
【００５５】
インビトロトランスフェクション
個別の実験ごとに示すように、これらの研究では様々なトランスフェクションプロトコールを使用した。永久細胞（293細胞およびHT1080細胞，ATCC）を24穴組織培養プレートに播種し（293細胞の場合は2×105細胞/ウェル、HT1080の場合は8×104細胞/ウェル）、10％FBS（Gibco）を含むDMEM（Gibco）中で終夜培養した。プラスミド-ポリマー複合体の正確な混合順序は、トランスフェクションの結果を決定する重要なパラメータである。各ウェルについて、様々な量のポリマーを含む30μlのDMEMを、0.6μgのプラスミドDNA（例えばpCMV-GFPプラスミドDNAまたはpCMV-luc）を含む30μlのDMEM溶液に、ボルテックスしながら滴下した。そのポリマー-DNA溶液を室温で15分間インキュベートしてDNA-ポリマー複合体を形成させた。10％FBSと抗生物質とを含む150μlのDMEM培地を、上記DNA-ポリマー複合体に加えた後、その混合物を、PBSで細胞を洗浄した後の個々のウェル中の細胞に加えた。細胞を3時間インキュベート（37℃、7.5％CO2）した後、10％FBSと100U/mlペニシリンと100μg/mlストレプトマイシンとを含むDMEM培地に、培地を換えた。トランスフェクションの24時間後に、GFPシグナルとホタルルシフェラーゼ活性を、後述の方法で検出した。リポフェクトアミンおよびスーパーフェクトを、製造者によって提供されたプロトコールに従って、陽性対照として使用した。
【００５６】
新規合成ポリマーによるGFPレポーター遺伝子トランスフェクション
緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を1次スクリーニングに使用した。トランスフェクション後に、細胞内のGFPシグナルを蛍光顕微鏡（オリンパス製，フィルター515〜550nm）で観察した。10倍対物レンズを使って細胞を写真撮影した。トランスフェクトした培養物中のGFPシグナルを持つ細胞のパーセンテージを、最適なカチオンポリマー量について、3視野での数から決定した。出発ポリマーC1、C2、C3およびC4はトランスフェクション能力をほとんど示さないことがわかった。架橋すると、これらから誘導されたポリマーは、高いトランスフェクション効率を示した。例えば、C4L1、C3L1、C3L2、C2L3、C1L3、C1L4のトランスフェクション効率は約45％〜55％で、LPEI25KDa（約45％）より良かった。
【００５７】
図5に、C3、C4およびC3L1、C4L1を使って得られる典型的な結果を示す。C3およびC4は、トランスフェクションの24時間後に、試験した細胞内でGFPシグナルをほとんど示さなかった。C4L1およびC3L1は極めて明るいGFPシグナルを示し、そのシグナルは市販のトランスフェクション試薬リポフェクトアミン（Gibco）に匹敵し、もう一つの市販トランスフェクション試薬スーパーフェクト（Qiagen）よりも良かった。
【００５８】
新規合成ポリマーによるルシフェラーゼレポーター遺伝子トランスフェクション
ルシフェラーゼ活性の測定は、化学ルミネセンスアッセイを使用して、製造者の説明書に従って行った（ルシフェラーゼ・アッセイ・システム：Promega，米国ウィスコンシン州マディソン）。簡単に述べると、遺伝子導入の30時間後に、細胞をPBSで2回すすぎ、次に、溶解緩衝液（1％トリトン（Triton）X-100、100mM K3PO4、2mMジチオスレイトール、10％グリセロールおよび2mM EDTA pH7.8）を使って室温で15分間溶解した。次に、照度計中、室温で、10μlの細胞溶解液を50μlのルシフェラーゼアッセイ試薬とインジェクターで混合した。発光を10秒間にわたって3重に測定し、RLU（relative light units；相対発光量）として表した。相対発光量（RLU）は、クマシー・プロテイン・アッセイ（Pierce，イリノイ州ロックフォード）によって決定した各試料のタンパク質濃度に標準化した。全ての実験を3重に行った。様々なトランスフェクション試薬を使ってpCMV-lucを293、HT1080にトランスフェクトした結果を図6に示す。得られた結果から、C4、C3およびC2はトランスフェクション能力を持たないことがわかった。ルシフェラーゼ活性はバックグラウンドと同等だった。架橋後は、これらの低分子量カチオン化合物から誘導されたC3L1、C4L1およびC2L3が、高いトランスフェクション効率を示した。C4L1のルシフェラーゼ活性は1.88×106で、これは分岐PEI 25Kおよびリポフェクトアミン（ルシフェラーゼ活性はそれぞれ1.58および1.28×106だった）よりも高く、線状PEI 25Kと比較すると7.9倍高いルシフェラーゼ活性を持っていた。これらの結果は、本発明の方法を使用することによって、トランスフェクション効率を著しく向上させることができ、新しいトランスフェクション試薬の優れた製造方法が得られることを示している。
【実施例１５】
【００５９】
細胞に対する新規合成ポリマーの毒性
臭化3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム（MTT）法を使って、哺乳類細胞に対するカチオン遺伝子担体の細胞毒性を評価した。簡単に述べると、2×104細胞/ウェルのHT1080細胞、または4×104個の293細胞を、96穴プレートに播種し、16〜24時間培養した。ポリマーを含む15μlのDMEMを、0.3μgのプラスミドを含む15μlのDMEMに滴下し、室温で15分間インキュベートして、ポリマー-DNA複合体を形成させた。そのポリマー-DNA複合体に75μlのDMEMを加え、その混合物のうち50μlを上記の細胞に加えて、3時間インキュベート（37℃、7.5％CO2）した。次に、培地を除去し、10％FBSと100U/mlペニシリンと100μg/mlストレプトマイシンとを含むDMEMを加えた。さらに24時間インキュベートした後、培地を除去し、10μlのMTT溶液（5.0mg/ml，Sigma）を各ウェルに加え、3時間インキュベートした。次に、培地を除去し、200μlのDMSOを加えてホルマザン結晶を溶解させた。その溶液の吸光度を570nmで測定した。次の等式を使って細胞の生存率を計算した：生存率（％）＝｛Abs570(試料)/Abs570(対照)｝×100。全ての実験を3重に行った。得られた結果から、C4L1、C3L1、C2L3、C1L3の細胞毒性は分岐PEI25Kよりも低く、トランスフェクション後も、はるかに多くの細胞が生き残った。これらのポリマーの細胞毒性はLPEI 25Kが引き起こす細胞毒性と同等か、またはそれ未満だった（図7）。これらの結果は、本発明の方法を用いて、高い遺伝子トランスフェクション効率と低い細胞毒性とを持つ合成カチオンポリマーを容易に取得できることを示している。
【実施例１６】
【００６０】
合成ポリマーの可制御分解
新規合成カチオンポリマーの分解を評価するために、PEI 600Dから誘導されるC1L3をPBSと共に37℃で6時間、12時間、1日間、2日間、3日間、4日間および6日間インキュベートした。インキュベーション前後の分子量分析のゲルプロファイル（図8A）およびトランスフェクション効率（図8B）によってポリマーの分解を評価した。分子量アッセイから得られるデータは、インキュベーション前にはC1L3の分子量が標準ポリマーPEI25Kよりも高いことを示した。37℃で6時間のインキュベーション後には、ゲルの上側にあるポリマーバンドが徐々に消失してゲルの下部にある染色バンドが蓄積されたという証拠によって示されるとおり、ポリマーが低分子量オリゴマーに分解された。3日間のインキュベーション後には、ほとんどのポリマーが低分子領域に現れたことから、ポリマーはほとんど完全に分解されたことがわかる（図8A）。これらの結果は、37℃で3日間のインキュベーション後にはトランスフェクションが30％から0％まで減少したことを示すトランスフェクション効率の結果と相関的である（図8B）。
【００６１】
異なる分解速度を持つポリマーは、様々なタイプのリンカーを変更するだけで容易に得ることができる。例えばポリマーC3L1およびC3L2は同じカチオン化合物PEI 600D（C3）から合成されたが、使用した加水分解性リンカーが異なっている。C3L1は1,3-ブタンジオールジアクリレート（L1）を使って合成され、C3L2は2-メチル-2,4-ペンタンジオールジアクリレート（L2）を使って合成される。得られたポリマーはゲル電気泳動アッセイおよびトランスフェクションアッセイで異なる分解速度を示した。トランスフェクションアッセイから、C3L2ポリマーのトランスフェクション効率は、BPSと共に37℃で24時間インキュベートした後にほんど変化がなく、PBSと共に37℃で3日間インキュベートした後でも10％しか減少しなかったが、ポリマーC3L1のトランスフェクション効率は24時間後に40％から25％への著しい減少を示し、同じ条件で3日間インキュベートした後にはほとんど0％まで減少した（図9A）。アガロースゲル電気泳動から得られるデータも、トランスフェクションアッセイと合致していて、C3L2分子量には有意差がほとんど無く（図9B、下）、C3L1の分子量は6時間後には変化し、4日間の分解後にはC3とほとんど同じだった（図9B、上）。これらの結果は、ポリマー分解速度を制御することができ、異なるリンカーを使用することによって所望の分解速度を達成できることを示している。
【実施例１７】
【００６２】
新規合成ポリマーによるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの送達
この実験では、C4、C3、C2、C3L1、C2L3、C1L3、BPEI25KおよびリポフェクトアミンのアンチセンスODN送達効率を調べた。
【００６３】
DMEM（血清も抗生物質もなし）25μl中の様々な比率の試料に、DMEM（血清も抗生物質もなし）10μl中のFITC標識ODN 0.3μgを滴下し、それと同時にボルテックスした。15分後に、150μlのDMEM（血清も抗生物質もなし）を、ポリマー-ODN複合体に加え、混合した。ODNの最終濃度は250nMだった。24穴プレート中のHeLa 705細胞をPBSで洗浄した後、その細胞に上記ポリマーーODN複合体を加えた。FITCシグナルを顕微鏡下で観察した。C4、C3、C2は、FITC標識ODNを送達する能力を示さなかった。BPEI25KおよびリポフェクトアミンはODN送達効率が高かった。BPEIはリポフェクトアミンよりも送達効率が高く、PEI/ODN比を0.25μg/0.3μgにした場合は、ODN処理の2時間後には、約60〜70％の細胞がFITCシグナルを示した。この時点で、リポフェクトアミン群は5〜10％の細胞しか陽性でなかった。BPEI 25k群の場合は、ODN送達の24時間後に、85％以上の細胞がFITCシグナルを示したのに対して、リポフェクトアミン群では65％の細胞がFITCシグナルを示した。3つの試料は全て高いODN送達効率を示した。C3L1、C2L3、C1L3は、BPEI25Kよりもわずかに低い送達効率を示し、それらの細胞毒性はBPEI25Kよりはるかに低かった。C3L1、C2L3、C1L3のODN送達効率は、リポフェクトアミンより高かった（図10）。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】分解性カチオンポリマーの合成と分解を表す図である。「C」はカチオン化合物またはカチオンオリゴマーを表し、「L」はリンカー分子を表す。
【図２】オリゴマーC3、ポリマーC3L1およびC4L1のDNA結合親和性を表す図である。ポリマー/DNA重量比を16、8、4、2、1および0.5として表し、遊離のDNA（ポリマー無しの対照）はポリマー/DNA重量比が0であるとして表している。Mは1kb DNA分子マーカーを示す。
【図３】いくつかのカチオンオリゴマーおよびポリマーの電気泳動パターンを示す図である。レーン1〜3はそれぞれ分子量25KD、10KDおよび1.8KDの分岐PEIであり、C3は分岐PEI600Dであり、PLLは分子量30KDのポリ-L-リジンであり、C3L1はC3とL1から得られるポリマーである。
【図４】トランスフェクションの24時間後の様々なポリマーの緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子トランスフェクション効率を表す図であり、Y軸はトランスフェクションに使用したポリマー/DNA重量比を示す。
【図５】分解性カチオンポリマーおよび市販のトランスフェクション試薬を使って293細胞にGFP遺伝子をトランスフェクトした後に観察されるGFPシグナルを表す図である。
【図６】様々なポリマーを使ったpCMV-Luc遺伝子トランスフェクションの24時間後のルシフェラーゼ活性を表す図である。
【図７】様々なポリマー-DNA複合体を使った処理後の細胞生存率を表す図である。
【図８Ａ】図8Aは、C3L1を37℃で0時間（A）、6時間（B）、12時間（C）、1日間（D）、2日間（E）、3日間（F）、4日間（G）および6日間（H）インキュベートした後のアガロースゲル電気泳動によるC3L1の分子量変化を表す図である。レーン1は分岐PEI10Kを含み、レーン2は分岐PEI25Kを含む。レーン3およびレーン4はそれぞれC4およびC3を含む。
【図８Ｂ】図8Bは、C3L1を37℃で0時間、6時間、12時間、1日間、2日間、3日間、4日間および6日間インキュベートした後のC3L1によるGFP遺伝子トランスフェクション効率を表す図である。
【図９Ａ】図9Aは、C3L2を37℃で0時間（A）、6時間（B）、12時間（C）、1日間（D）、2日間（E）、3日間（F）、4日間（G）および6日間（H）インキュベートした後のアガロースゲル電気泳動によるC3L2の分子量変化を表す図である。レーン1はBPEI10Kを含み、レーン2はC3を含む。
【図９Ｂ】図9Bは、C3L2およびC3L1を37℃で0時間、6時間、12時間、1日間、2日間、3日間、4日間および6日間インキュベートした後のC3L2およびC3L1によるGFP遺伝子トランスフェクション効率を表す図である。
【図１０】様々なポリマーによってODNを送達した後のFITCシグナルを表し、様々なポリマーによるODNのトランスフェクション効率を表す図である。
【図１１】上述した好ましい態様で使用することができるカチオン分子の例をいくつか示している図である。ただし、使用できるカチオン分子は、これらの例に限定されるわけではない。
【図１２】上述した好ましい態様で使用することができるリンカー分子の例をいくつか示している図である。ただし、使用できるリンカー分子は、これらの例に限定されるわけではない。
【図１３】本明細書に記載する好ましい態様で使用することができる、(メタ)アクリレート基以外の、他のアミノ反応性残基の例をいくつか示している図である。ただし、使用できる反応性残基は、これらの例に限定されるわけではない。
【図１４】様々なポリマー（CmLn）によってGFP遺伝子がトランスフェクトされ、タンパク質発現が起こった細胞のパーセンテージをグラフ表示した図である。様々な組合せのカチオン化合物とリンカーとを使って、カチオン担体ポリマーを製造した。ただし、使用できるカチオン担体ポリマーは、これらの例に限定されるわけではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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