(57)【要約】  防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）、および浮腫因子（ＥＦ）から構成される炭疽毒素は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの主要な毒性因子である。防御抗原ＰＡは、炭疽に対するワクチンすべての主要構成要素である。ＰＡの防御効力は、少量のＬＦまたはＥＦがそのワクチンに組み込まれた場合に大いに増加される。炭疽に対する理想的ワクチンは、ＰＡ、ＬＦおよびＥＦを一緒に含むべきであるが、この組み合わせは、毒性である。従って、ＰＡ、ＬＦおよびＥＦの生物学的に不活性な変異体調製物が、より良好な免疫防御のために一緒に使用され得る。本発明は、非毒性変異体炭疽毒素タンパク質から構成される炭疽に対する組換えワクチンの生成のための方法を記載する。この手順は、その毒素タンパク質のネイティブ遺伝子の部位特異的変異誘発、変異体タンパク質の発現および精製、そして最終的にこれらのタンパク質の特徴付けを包含する。
2005511059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ構築物であって、
発現ベクターと、
野生型防御抗原（ＰＡ）についての遺伝子、または野生型致死因子（ＬＦ）についての遺伝子、または野生型浮腫因子（ＥＦ）についての遺伝子を含む、ＤＮＡフラグメントと、
を含む、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２】
組換えＤＮＡ構築物であって、
発現ベクターと、
変異型防御抗原（ＰＡ）についての遺伝子、または変異型致死因子（ＬＦ）についての遺伝子、または変異型浮腫因子（ＥＦ）についての遺伝子を含む、ＤＮＡフラグメントと、
を含む、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ベクターが原核生物ベクターである、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記原核生物ベクターがＰＱＥ３０である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記発現ベクターが、Ｔ５プロモーターと６×ヒスチジンタグとを含む、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ２０２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｌｅｕ２０３にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｒｏ２０５にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｉｌｅ２０７にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｒｏ２０５、Ｔｒｐ２２６およびＰｈｅ２３６にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ５５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｉｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ５５２およびＰｈｅ５５４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｉｌｅ５６２およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｌｅｕ５６６およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ５５２およびＰｈｅ５５４、Ｉｌｅ５６２、Ｌｅｕ５６６およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ４２７にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ａｓｐ４２５の欠失を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ４２７の欠失を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｒｐ３４６にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｌｅｕ３５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｒｐ３４６、Ｍｅｔ３５０およびＬｅｕ３５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｙｒ１４８にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｙｒ１４９にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｉｌｅ１５１にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｌｙｓ１５３にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ａｓｐ１８７にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｐｈｅ１９０にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ａｓｐ１８７、Ｌｅｕ１８８、Ｌｅｕ１８９、およびＰｈｅ１９０にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｙｒ１３７にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｔｙｒ１３８にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｉｌｅ１４０にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントが、残基Ｌｙｓ１４２にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
請求項１または２に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記ＤＮＡフラグメントによりコードされるタンパク質が、原核生物宿主において発現される、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組換えＤＮＡ構築物であって、前記原核生物宿主が、Ｅ．ｃｏｌｉ株である、組換えＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
野生型ＰＡ、野生型ＬＦ、野生型ＥＦ、およびその変異誘発された改変体である、遺伝子ＤＮＡフラグメントにより発現されるタンパク質。
【請求項３７】
変異誘発された炭疽毒素タンパク質を生成するための方法であって、
ＰＣＲ反応のために異なる相補的変異誘発プライマーを使用して、ＰＡ遺伝子、ＬＦ遺伝子、およびＥＦ遺伝子を変異誘発する工程、
該変異体ＰＣＲ産物をネイティブテンプレートとともに酵素で処理して、該ＰＣＲ産物のネイティブテンプレートを切断する工程、
該変異体産物をＥ．ｃｏｌｉ株において形質転換する工程、
形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株から組換え構築物を単離する工程および望ましい変異を確認する工程、
該確認した変異体構築物を適切なＥ．ｃｏｌｉ発現株において形質転換して、該変異体タンパク質を発現させる工程、
該発現した変異体タンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記精製が、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーおよび／または他のクロマトグラフィー技術を使用して実行される、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記酵素が、完全にメチル化されたＧｍｅ６ＡＴＣ配列を特異的に切断するＤｐｎＩ酵素である、方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、前記遺伝子が、Ｔ５プロモーターと６×ヒスチジンタグとを含むＰＱＥ発現ベクター中にクローン化される、方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の方法であって、変異が、ＰＡの第１ドメインにおいて残基２０２、２０３、２０５にてもたらされる、方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、変異が、ＰＡの第３ドメインにおいて残基５５２、５７４、５５２＋５５４、５６２＋５７４、５６６＋５７４、５５２＋５５４＋５６２＋５６６＋５７４にてもたらされ、オリゴマー化が欠損した変異体タンパク質を生じる、方法。
【請求項４３】
請求項３７に記載の方法であって、変異が、ＰＡの第２ドメインにおいてドメイン２のループ４の残基４２５および４２７にてもたらされ、該変異は、ＰＡのトランスロケーション能力を損なう、方法。
【請求項４４】
請求項３７に記載の方法であって、変異が、ＰＡの第２ドメインにおいてドメイン２のループ３における残基３４６、３５２および３４６＋３５０＋３５２にてもたらされて、ＰＡが生物学的に不活性になる、方法。
【請求項４５】
請求項３７に記載の方法であって、変異が、ＬＦの第１ドメインにおいて残基１４８、１４９、１５１、１５３、１８７、１９０および１８７＋１８８＋１８９＋１９０にてもたらされて、ＰＡへのＬＦの結合を損なう、方法。
【請求項４６】
請求項３７に記載の方法であって、変異が、ＥＦの最初の２５０残基にてもたらされる、方法。
【請求項４７】
炭疽ワクチンであって、野生型ＰＡまたは野生型ＬＦまたは野生型ＥＦから選択される炭疽毒素タンパク質を含む、炭疽ワクチン。
【請求項４８】
炭疽ワクチンであって、変異型ＰＡまたは変異型ＬＦまたは変異型ＥＦあるいはそれらの組み合わせから選択される炭疽毒素タンパク質を含む、炭疽ワクチン。
【請求項４９】
炭疽ワクチンであって、野生型ＰＡまたは野生型ＬＦまたは野生型ＥＦから選択されるいずれか１つと、変異型ＰＡまたは変異型ＬＦまたは変異型ＥＦから選択されるいずれか１つ以上との組み合わせである炭疽毒素タンパク質を含む、炭疽ワクチン。
【請求項５０】
有効量の請求項４６〜４９のうちのいずれか１項に記載の炭疽毒素タンパク質を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ構築物および非毒性炭疽ワクチンの調製のためのプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
人畜共通性疾患である炭疽は、グラム陽性の胞子形成細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓによって引き起こされる。ヒトは、動物起源の食物、動物産生物およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓでの環境の汚染を介する、偶発宿主である（Ｂｒａｃｈｍａｎ  Ｐ．Ｓ．，１９７０，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１７４，５７７−５８２）。炭疽は、最も昔から知られている細菌性疾患の１つであり、インドを含む世界の大部分で生じている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの主な毒性因子としては、ポリ−Ｄ−グルタミン酸被膜および三成分炭疽毒素複合体が挙げられる。炭疽毒素（Ｌｅｐｐｌａ  Ｓ．Ｈ．，１９９１，Ｉｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ，ｐｐ２７７−３０２）（防御抗原ＰＡ（８３ＫＤａ）、致死因子（ＬＦ−（９０ｋＤａ）および浮腫因子（ＥＦ−（８９ｋＤａ）を含む）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの主な毒性因子である。この複合体の触媒部分ＬＦ／ＥＦは、ＰＡが細胞サイトゾルに入るのを必要とする。ＬＦ（致死因子と呼ばれる）と組み合わされて、ＰＡは、実験動物の死を引き起こす（Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．およびＫｅｐｐｉｅ  Ｊ．，１９５４，Ｎａｔｕｒｅ，１７３，８６９−８７０）．ＥＦ（浮腫因子と呼ばれる）と組み合わされて、ＰＡは、実験動物の皮膚において浮腫を引き起こす（Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｊ．Ｌ．およびＳｍｉｔｈ  Ｈ．，１９６１，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，４９−６６）。ＰＡは、触媒部分、ＬＦおよびＥＦの標的細胞への移動を容易にする受容体結合部分である。細胞への移動の後、メタロプロテイナーゼのＬＦは、特定のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫｓ）の分割を引き起こし，シグナル誘導経路を不活性化させる（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  Ｎ．Ｓ．ら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，７３４−７３７）。一方、ＥＦは、細胞内に侵入すると、カルモデュリンによって活性化され、細胞内ｃＡＭＰレベルにおいて大規模な増大を引き起こす（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ｈ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，３１６２−３１６６）。
【０００３】
中毒プロセスの第１段階は、ＰＡの細胞表面受容体への結合である（Ｂｒａｄｌｅｙ  Ｋ．Ａ．ら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，２２５−２２９）。細胞表面上の受容体に結合した後、ＰＡは、細胞表面プロテアーゼによってニックを入れられて、６３ＫＤａフラグメントを生じ（Ｋｌｉｍｐｅｌ  Ｒ．Ｋ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９，１０２７７−１０２８１）、このフラグメントは、オリゴマー化し、ＬＦ／ＥＦと結合する（Ｍｉｌｎｅ  Ｊ．Ｃ．ら，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２０６０７−２０６１２）。ＬＦ／ＥＦの結合は、競合的である。次いで、全体の複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスを経る。エンドソームの酸性化（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  Ａ．Ｍ．，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，７１２３−７１２６）は、ＰＡオリゴマーのエンドソーム膜に挿入されて孔を形成し（Ｍｉｌｎｅ  Ｊ．Ｃ．およびＣｏｌｌｉｅｒ  Ｒ．Ｊ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０，６４７−６５３）、この孔を介してＬＦ／ＥＦは、細胞サイトゾルに移動される。
【０００４】
ＰＡは、主に４回転未満のほんのわずかな短いヘリックスを有する逆方向βシートに組成される４つのドメインを有する（Ｐｅｔｏｓａ  Ｃ．ら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８３３−８３８）。ドメイン１は、炭疽菌中毒プロセスの間、ＬＦ／ＥＦへの結合を担う。ドメイン２は、βバレル構造により特徴付けられ、そして膜挿入およびトランスロケーションにおいて役割を果たす。ドメイン３は、最も小さいドメインであり、ＰＡのオリゴマー形成について重要であり、そしておそらく、ＰＡのＬＦ／ＥＦへの結合においてもまた重要である。ドメイン４は、レセプター結合ドメインである。
【０００５】
ＬＦの結晶構造は、最近決定され、ＬＦが４つのドメインを有することを示す（Ｐａｎｎｉｆｅｒ  Ａ．Ｄ．ら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ，４１４，２２９−２３３）。ドメイン１は、ＰＡへの結合に関与する。このドメインは、ＥＦのＮ末端１−２５０残基に有意な相同性を有する。実際に、この領域の残基のほとんどは、完全に保存されている。
【０００６】
この３つ全ての毒素タンパク質のうち、ＰＡは、最も免疫原性であり、かつ炭疽に対するワクチンの不可欠な構成要素である（Ｇｌａｄｓｔｏｎｅ  Ｇ．Ｐ．，１９４６，Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．２７，３４９−４１８）。少量のＬＦまたはＥＦがワクチンに組み込まれる場合、ＰＡの予防効果が非常に増大することが観察されている（Ｐｅｚａｒｄら、１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６３，１３６９−１３７２）。しかし、これはまた、偶然、ワクチンの毒素産生性および反応性の主な理由である。防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）からなる炭疽毒素（Ｌｅｐｐｌａ  Ｓ．Ｈ．，１９９１，Ｉｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ、２７７−３０２頁）は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの主な毒性因子である。
【０００７】
現在使用される炭疽ワクチンは、Ｓｔｅｒｎｅ株として公知の細菌のカプセル化されていない無毒性の株由来である（Ｓｔｅｒｎｅ  Ｍ．，１９３９，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．Ａｎｉｍ．Ｉｎｄ，１３，３０７−３１２）。ロシアおよび中国では、Ｓｔｅｒｎｅ株に基づいた生きた胞子ワクチンが使用されている。イギリスでは、そのワクチンは、Ｓｔｅｒｎｅ株のミョウバン沈殿性培養液濾液であり、一方合衆国のワクチンは、ウシ炭疽菌から単離されたカプセル化されていない、非タンパク質分解由来株Ｖ７７０のアルヒドロゲル（ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）吸収細胞非含有培養液の濾液からなる（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  Ｐ．Ｃ．Ｂ，１９９１，Ｖａｃｃｉｎｅ，９，５３３−５３９）。未精製のものは別として、これらすべての現在使用される炭疽ワクチンは、不確定の組成物を有する。これらは、反応性でありかつすべてのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの天然株に対する防御を提供しない。
【０００８】
米国特許第２，０１７，６０６号は、適切な培養培地で桿菌を培養し、その培養培地から桿菌を分離することによる炭疽抗原の調製を記載する。
【０００９】
米国特許第２，１５１，３６４号は、炭疽菌の胞子の懸濁液を調製して、その懸濁液にミョウバンを含む滅菌溶液を添加する工程を包含する、炭疽ワクチンを産生する方法を記載する。
【００１０】
ロシア国特許２，１１５，４３３は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのカプセル化されていない株の生きた胞子およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの防御抗原からなる炭疽ワクチンの産生方法を記載する。
【００１１】
ＷＯ特許０００２５２２は、炭疽菌に対して防御性である免疫応答を誘導する際の使用のためのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の非毒性防御抗原を使用する炭疽ワクチンの産生の方法を記載する。
【００１２】
上記の特許における欠点は、それら特許すべてがＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ培養液／胞子を使用していることである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、感染性生物であり、閉じ込め設備なしでは扱うことができない。この調製されたワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の他の毒性タンパク質および非毒性タンパク質で汚染され、多くの副作用および反応性を生じる。
【００１３】
これらのワクチンはまた、家畜化された動物および実験動物の特定の種に対するある程度の残留性毒性を有する。このＳｔｅｒｎｅ株は、毒素産生性であり、高用量において病原性である。結果として、ヒトへの使用については危険であり不適切であると考えられる。このワクチンは、接種部位における壊死を含む所望されない副作用を引き起こし得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、副作用を有さずかつ十分に規定された組成物を有する、第２世代の炭疽ワクチンを開発する必要性が存在する。
【００１５】
本発明の目的は、炭疽毒素の免疫原性に影響することなく炭疽毒素を非毒性にして、安全かつ有効な炭疽ワクチンを開発することである。
【００１６】
この目的を達成するために、本発明は、組換えＤＮＡ構築物を提供し、この組換えＤＮＡ構築物は、発現ベクターと、野生型防御抗原（ＰＡ）についての遺伝子、または野生型致死因子（ＬＦ）についての遺伝子、または野生型浮腫因子（ＥＦ）についての遺伝子を含む、ＤＮＡフラグメントと、を含む。
【００１７】
本発明はまた、組換えＤＮＡ構築物を提供し、その組換えＤＮＡ構築物は、発現ベクターと、変異型防御抗原（ＰＡ）についての遺伝子、または変異型致死因子（ＬＦ）についての遺伝子、または変異型浮腫因子（ＥＦ）についての遺伝子を含む、ＤＮＡフラグメントと、を含む。
【００１８】
上記ベクターは、原核生物ベクター（例えば、ＰＱＥ３０である）であり、上記発現ベクターは、Ｔ５プロモーターと６×ヒスチジンタグとを含む。
【００１９】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ２０２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２０】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｌｅｕ２０３にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２１】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｒｏ２０５にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２２】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｉｌｅ２０７にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２３】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｒｏ２０５、Ｔｒｐ２２６およびＰｈｅ２３６にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２４】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ５５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２５】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｉｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２６】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ５５２およびＰｈｅ５５４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２７】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｉｌｅ５６２およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２８】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｌｅｕ５６６およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００２９】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ５５２およびＰｈｅ５５４、Ｉｌｅ５６２、Ｌｅｕ５６６およびＩｌｅ５７４にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３０】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ４２７にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３１】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ａｓｐ４２５の欠失を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３２】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ４２７の欠失を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３３】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｒｐ３４６にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３４】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｌｅｕ３５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３５】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｒｐ３４６、Ｍｅｔ３５０およびＬｅｕ３５２にてアラニン置換を含む防御抗原についての遺伝子である。
【００３６】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｙｒ１４８にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００３７】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｙｒ１４９にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００３８】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｉｌｅ１５１にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００３９】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｌｙｓ１５３にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００４０】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ａｓｐ１８７にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００４１】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｐｈｅ１９０にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００４２】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ａｓｐ１８７、Ｌｅｕ１８８、Ｌｅｕ１８９、およびＰｈｅ１９０にてアラニン置換を含む致死因子についての遺伝子である。
【００４３】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｙｒ１３７にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である。
【００４４】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｔｙｒ１３８にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である。
【００４５】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｉｌｅ１４０にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である。
【００４６】
上記ＤＮＡフラグメントは、残基Ｌｙｓ１４２にてアラニン置換を含む浮腫因子についての遺伝子である。
【００４７】
上記ＤＮＡフラグメントによりコードされるタンパク質は、原核生物宿主において発現される。この原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ株である。
【００４８】
上記遺伝子ＤＮＡフラグメントにより発現されるタンパク質は、野生型ＰＡ、野生型ＬＦ、野生型ＥＦ、およびその変異誘発された改変体である。
【００４９】
本発明はさらに、変異誘発された炭疽毒素タンパク質を生成するための方法を開示し、この方法は、
ＰＣＲ反応のために本明細書中に規定される種類の異なる変異誘発プライマーを使用して、ＰＡ遺伝子、ＬＦ遺伝子、およびＥＦ遺伝子を変異誘発する工程、
この変異体ＰＣＲ産物をネイティブテンプレートとともに酵素で処理して、このＰＣＲ産物のネイティブテンプレートを切断する工程、
この変異体産物をＥ．ｃｏｌｉ株において形質転換する工程、
形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株から組換え構築物を単離する工程および望ましい変異を確認する工程、
この確認した変異体構築物を適切なＥ．ｃｏｌｉ発現株において形質転換して、上記変異体タンパク質を発現させる工程、および
この発現した変異体タンパク質を精製する工程、
を包含する。
【００５０】
上記精製は、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーおよび／または他のクロマトグラフィー技術を使用して実行される。
【００５１】
上記遺伝子は、Ｔ５プロモーターと６×ヒスチジンタグとを含むＰＱＥ発現ベクター中にクローン化される。
【００５２】
変異が、ＰＡの第１ドメインにおいて残基２０２、２０３、２０５にてもたらされた。変異が、ＰＡの第３ドメインにおいて残基５５２、５７４、５５２＋５５４、５６２＋５７４、５６６＋５７４、５５２＋５５４＋５６２＋５６６＋５７４にてもたらされ、オリゴマー化が欠損した変異体タンパク質を生じた。変異が、ＰＡの第２ドメインにおいてドメイン２のループ４の残基４２５および４２７にてもたらされた。この変異は、ＰＡのトランスロケーション能力を損なった。変異が、ＰＡが生物学的に不活性になるように、ＰＡの第２ドメインにおいてドメイン２のループ３における残基３４６、３５２および３４６＋３５０＋３５２にてもたらされた。変異が、ＬＦの第１ドメインにおいて残基１４８、１４９、１５１、１５３、１８７、１９０および１８７＋１８８＋１８９＋１９０にてもたらされて、ＰＡへのＬＦの結合を損なった。変異が、ＥＦの最初の２５０残基にてもたらされた。
【００５３】
野生型ＰＡまたは野生型ＬＦまたは野生型ＥＦから選択される炭疽毒素タンパク質を含む、炭疽ワクチン。
【００５４】
変異型ＰＡまたは変異型ＬＦまたは変異型ＥＦあるいはそれらの組み合わせから選択される炭疽毒素タンパク質を含む、炭疽ワクチン。
【００５５】
選択された炭疽毒素タンパク質を含む炭疽ワクチンが、野生型ＰＡまたは野生型ＬＦまたは野生型ＥＦから選択されるいずれか１つと、変異型ＰＡまたは変異型ＬＦまたは変異型ＥＦから選択されるいずれか１つ以上との組み合わせである。
【００５６】
有効量の、本発明により特許請求される炭疽毒素タンパク質を含む、薬学的組成物。
【００５７】
（発明の詳細な説明）
炭疽に対する理想的なワクチンは、ＰＡ、ＬＦ、ＥＦを一緒に含むべきであるが、同時に、非毒性であり安全であるべきである。規定された組成を有する精製された組換えタンパク質は、このワクチンにおいて、ワクチンの反応性を最小限に抑えるために使用され得る。さらに、これらの炭疽毒素タンパク質は、おそらく、それらの構造または免疫原性に影響を与えることなく、このタンパク質の生物学的活性に影響を与える変異を導入することによって、非毒性を付与されるはずである。これらの非毒性の変異炭疽毒素タンパク質は、安全、非反応性、かつ効果的な、炭疽に対する組換えワクチンを生成するために一緒に使用され得る。従って、本発明の主要な目的は、毒素タンパク質の異なる機能的に重要なドメインの部位特異的変異誘発によって生成された非毒性炭疽毒素タンパク質で構成される、安全かつ効果的な、炭疽に対する第二世代のワクチンを生成するプロセスを生成することであった。
【００５８】
本出願の発明者らは、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦの遺伝子をＰＣＲ増幅させた。本発明者らは、これらの遺伝子をｐＱＥ発現ベクターにクローニングした（Ｇｕｐｔａ  Ｐ．ら，１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６，８６２−８６５；Ｇｕｐｔａ  Ｐ．ら，１９９９  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１６，３６９−３７６；Ｋｕｍａｒ  Ｐ．ら，２００１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９，６５３２−６５３６）。このベクターは、Ｔ５プロモーターおよび６×ヒスチジンタグを含み、組換えタンパク質の簡便な精製を可能とする（図１）。
【００５９】
上記の組換えプラスミドを用いたＥ．ｃｏｌｉからのこの遺伝子の過剰発現のための条件は、本発明者らにより最適化された（Ｃｈａｕｈａｎ  Ｖ．ら，２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８３，３０８−３１５）。
【００６０】
上記の組換えプラスミドを用いて、本プロセスの発明者らは、これらの遺伝子に変異を導入し、発現される組換えタンパク質が、それらの生物学的機能において欠損を有するようにし、それによってそれらを非毒性にした。本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ株からのこれらの変異タンパク質の発現および精製を伴う。本発明はさらに、精製された変異タンパク質を非毒性にする欠損を突き止めるためのそれらの完全な特徴付けを伴う。
【００６１】
（本発明の一部として防御抗原において導入された変異）
（１．ＰＡのＬＦ／ＥＦに対する結合を欠損させる変異）
本発明者らは、一連の変異をＰＡの第１ドメインに導入した。導入された変異の中でも、残基２０２、２０３、２０５、２０７、および２０５＋２２６＋２３６の変異が、ＬＦに対する結合を欠損させたことを見出した。
【００６２】
（２．ＰＡのオリゴマー化を欠損させる変異）
本発明者らは、ＰＡの第３ドメインに変異を導入した。残基５５２、５７４、５５２＋５５４、５６２＋５７４、５６６＋５７４、５５２＋５５４＋５６２＋５６６＋５７４の変異は、オリゴマー化の欠損した変異タンパク質を生じた。
【００６３】
（３．ＰＡのトランスロケーションを欠損させる変異）
本発明者らは、ドメイン２のループ４の残基４２５および４２７に変異を導入した。これらの変異は、ＰＡのトランスロケーション能力を損傷させた。
【００６４】
（４．ＰＡの挿入／トランスロケーションを欠損させる変異）
本発明者らは、ドメイン２のループ３の残基３４６、３５２、および３４６＋３５０＋３５２に変異を導入した場合、ＰＡが生物学的に不活性になることを発見した。この変異タンパク質は、細胞表面レセプターに結合することができ、オリゴマーを形成し、ＬＦに結合するためにタンパク質分解により活性化される。これらの変異タンパク質の生物学的不活性化は、挿入／トランスロケーションにおける欠損に関与し得る。
【００６５】
（本発明の一部としての、致死因子中に導入される変異）
ＰＡに対する結合においてＬＦを欠損性にする変異。このプロセスの発明者らは、ＬＦの第１ドメインに変異を導入した。発明者らは、残基１４８、１４９、１５１、１５３、１８７、１９０および１８７＋１８８＋１８９＋１９０において、ＰＡに対するＬＦの結合を損なった変異を見出した。
【００６６】
（本発明の一部としての、ＥＤＥＭＡ因子中に導入される変異）
ＰＡに対する結合においてＥＦを欠損性にする変異。このプロセスの発明者らは、ＥＦの最初の２５０残基に一連の変異を導入した。残基１３７、１３８、１４０、および１４２において、ＰＡに対するＥＦの結合を激しく損なった変異を見出した。
【００６７】
この変異タンパク質の発現および精製の後に、このタンパク質を生物学的活性について評価した。
【００６８】
本発明者らは、野生型のＬＦと一緒に添加される場合、上述したＰＡの変異が、Ｊ７７４Ａ．１細胞に対して無毒性であることを見出した。同様に、野生型のＰＡと一緒に添加される場合、ＬＦの変異は、Ｊ７７４Ａ．１細胞に対して無毒性であった。同様に、野生型のＰＡと一緒に添加される場合、ＥＦの変異は、ＣＨＯ細胞においてｃＡＭＰ毒性を生じ得ない（表２）。
【００６９】
精製変異タンパク質を、以下をアッセイすることによって、その生物学的活性について分析した：
−−細胞表面レセプターに対するＰＡの結合能力、
−−ＬＦまたはＥＦに対するＰＡの結合能力、
−−ＰＡのオリゴマー化能力、
−−ＰＡオリゴマーの膜挿入能力、
−−ＬＦまたはＥＦをサイトゾルへとトランスロケートする、ＰＡの能力、
−−ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１のようなマクロファージ細胞株を殺傷する、致死毒の能力、
−−ＣＨＯ細胞を伸長する浮腫毒の能力。
【００７０】
（免疫研究）
防御抗原は、その名前が示唆するように、高度に免疫原性のタンパク質である。実際に、これは、炭疽に対するワクチンの必要な成分である。野生型組換えＰＡを用いる免疫は、高い抗ＰＡ力価を誘発し、そしてモルモットにおける炭疽菌致死チャレンジに対する防御を提供する。変異ＰＡが野生型ＰＡと同じ免疫原性であり、そしてワクチンにおける野生型ＰＡを容易に置き換え得ることがさらに観察された（Ｓｉｎｇｈら、１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６，３４４７〜３４４８）。免疫研究はまた、免疫防御に対するＬＦ／ＥＦの有意な寄与を示す。これらの結果に基づいて、本発明者らは、炭疽に対する組換えワクチン（３つの炭疽毒素成分全ての変異体を含む）を開発した。
【００７１】
本発明者らによって開発された炭疽毒素に基づく組換えワクチンは、以下の利点を有する：
１．本明細書中に記載されるプロセスは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの培養を（いずれの段階においても）扱う工程を包含しない。このプロセスは、従って、安全で、費用効果的であり、精巧な閉じ込め設備を必要としない。
２．本発明者によって開発されたワクチンは、十分に規定された組成を有し、従って、いかなるバッチ間の変動も有さない。
３．本明細書に記載される発明は、精製された変異炭疽毒素タンパク質を使用する。結果として、この第２世代の炭疽ワクチンは、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でなく、先のワクチンとは異なり、いかなる副作用も引き起こさない。
４．さらに、本発明は、非毒性変異タンパク質から構成され、これは、（単独でまたは組み合わせとして）投与される場合、現在使用されるワクチンに関連するような、いかなる毒素産生も病原性も引き起こさない。
５．従って、本明細書に記載される本発明は、安全で、動物／ヒトの使用に適切である。
【００７２】
（実験手順の詳細）
（炭疽毒素タンパク質の部位特異的変異誘発）
炭疽毒素タンパク質において所望の変異を導入するために、相補的な変異誘発性プライマーを使用し、野生型炭疽毒素遺伝子（ＰＡまたはＬＰまたはＥＦについて）を増幅した（表１を参照のこと）。高い忠実度ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを、ＰＣＲ反応のために使用した。プラスミドＤＮＡの両方の鎖の全長を、熱サイクリングの数ラウンドの間、線状様式で増幅し、反対の鎖に交互のニックを有する変異プラスミドを生成した（図２）。増幅を、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動によって確認した。増幅産物を、完全にメチル化されたＧｍｅ５  ＡＴＣ配列を特異的に切断するＤｐｎＩで処理した。消化反応を、１００ｎｇの増幅産物、２μｌの１０×ＤｐｎＩ反応緩衝液および０．１ＵのＤｐｎＩを含有する２０μｌの反応容積中で実施した。ＤｐｎＩ消化後、所望の変異体において豊富なＤｐｎＩ耐性分子を、適切な大腸菌株へのＤＮＡの形質転換によって回収した。変異導入を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ＤＮＡ配列決定キットを使用して上記構築物を配列決定することによって確認した。
【００７３】
（変異型炭疽毒素タンパク質の発現および精製）
確認された構築物を、Ｔ５  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ発現株に形質転換した。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬｕｒｉａブロス培地（ＬＢ）中で、３７℃で０．８のＯＤ６００まで増殖した。次いで、導入を、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて実施し、インキュベーションを、３７℃で３〜４時間続けた。次いで、細胞を、６０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によて回収した。次いで、細胞を溶解した。タンパク質プロフィールを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析した。変異型ＰＡタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートアフィニティークロマトグラフィーおよび他のクロマトグラフィー技術を使用して精製した（Ｋｕｍａｒ  Ｐ．ら、２００１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９，６５３２−６５３６；Ｇｕｐｔａ  Ｐ．ら、１９９８，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６６，８６２−８６５；Ｇｕｐｔａ  Ｐ．ら、１９９９  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１６，３６９−３７６）。精製された変異タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析し、そしてＢｒａｄｆｏｒｄの方法を使用して見積もった。保存のために精製されたタンパク質を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに対して透析し、そして−７０℃でアリコートとして保存した。
【００７４】
（細胞培養）
マクロファージ様細胞株Ｊ７７４Ａ．１を、１０％の熱不活化ＦＣＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で、加湿５％ＣＯ２環境で、３７℃で、維持した。
【００７５】
ＣＨＯ細胞を、１０％の熱不活化ＦＣＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ培地中で、加湿５％ＣＯ２環境で、３７℃で、維持した。
【００７６】
野生型ＰＡまたはその変異体タンパク質の生物学的活性を研究するために、これらのタンパク質の変化させた濃度をＬＦ（１μｇ／ｍｌ）と共に、９６ウエルプレート中に播種したＪ７７４Ａ．１細胞に添加した。インキュベーションを、３７℃で３時間行い、次に細胞生存率（Ｂｈａｔｎａｇａｒら、１９８９、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ、５７、２１０７−２１１４）を、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）染料（Ｂｈａｔｎａｇａｒ  Ｒ．ら、１９９９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ、１１、１１１−１１６）を用いて決定した。ＲＰＭＩ中に溶解したＭＴＴを、０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で各ウエルに添加し、３７℃で、さらに４５分インキュベートし、生存細胞による染料の取り込みおよび酸化を可能にした。培地を、０．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２５ｍＭ  ＨＣｌを含む９０％イソプロピルアルコールで置き換え、プレートをボルテックスした。吸収を、５４０ｎｍで、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ）を使用して読み取った。
【００７７】
同様に、野生型ＬＦまたはその変異体タンパク質の生物学的活性を研究するために、これらのタンパク質の変化させた濃度をＰＡ（１μｇ／ｍｌ）と共に、９６ウエルプレートに接着させたＪ７７４Ａ．１細胞に添加した。インキュベーションを、３７℃で３時間行い、次に細胞生存率を、上述のようにＭＴＴ染料を用いて決定した。
【００７８】
野生型ＥＦまたはその変異体タンパク質の生物学的活性を研究するために、これらのタンパク質の変化させた濃度をＰＡ（１μｇ／ｍｌ）と共に、９６ウエルプレート中に播種したＣＨＯ細胞に添加した。インキュベーションを、３７℃で３時間行い、次に細胞を、伸長について顕微鏡検査した。毒素処置に対する細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａのｃＡＭＰ  ＥＩＡキットを用いて決定した（Ｋｕｍａｒ  Ｐら、２００１、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６９、６５３２−６５３６）。
【００７９】
次に、変異体が、どのように炭疽毒素変異体タンパク質の生物学的活性に影響するかを理解するために、さらなる実験を実施した。
【００８０】
（細胞表面レセプターへのＰＡの結合）
Ｊ７７４Ａ．１細胞は、２時間、４℃で１μｇ／ｍｌの野生型ＰＡタンパク質またはその変異タンパク質とインキュベートする前に、２４ウェルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させた。次いで、細胞を、冷却ＲＰＭＩで洗浄し、ＳＤＳ溶解緩衝液中に溶解し、そして電気的ブロッティングのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。そのブロットを、抗ＰＡ抗体で発色させ、細胞表面レセプターと野生型ＰＡタンパク質またはその変異タンパク質の結合を研究した。
【００８１】
（溶液中でＰＡタンパク質および変異タンパク質のタンパク分解性切断）
野生型ＰＡタンパク質およびその変異タンパク質を、トリプシンによる切断に対する感受性について試験した。タンパク質（１．０ｍｇ／ｍｌ）を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５中で室温で３０分間、１μｇ／ｍｌのトリプシンとインキュベートした。この消化反応を、１ｍＭの濃度にまでＰＭＳＦを加えることによって止めた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥについて、サンプルを、５分間、ＳＤＳサンプル緩衝液中で沸騰し、そして１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。
【００８２】
（細胞の表面上でのＬＦに対するＰＡの結合）
Ｊ７７４Ａ．１細胞を、ＲＰＭＩで２回洗浄し、次いで３時間、４℃で１μｇ／ｍｌの野生型ＰＡタンパク質またはその変異タンパク質とインキュベートした。次いで、この細胞を、冷却ＲＰＭＩで洗浄し、非結合タンパク質を除去した。さらに、この細胞を、３時間、ＬＦ（１．０μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、次いで冷却ＲＰＭＩで洗浄し、非結合ＬＦを除去した。この細胞を、ＳＤＳ溶解緩衝液中に溶解し、そして電気的ブロッティングのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。そのブロットを、抗ＬＦ抗体で発色させ、ＬＦへの野生型ＰＡタンパク質またはその変異タンパク質の結合を研究した。
【００８３】
（溶液中でＰＡのオリゴマー形成）
タンパク質分解性切断に関するＰＡは、ヘプタマ−を形成するためオリゴマー形成する。オリゴマーを形成するための野生型ＰＡタンパク質およびその変異タンパク質の能力を研究するため、タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を、２５℃で３０分間、トリプシンで分離した。サンプルを、１００ｍＭの最終濃度まで１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ５．０の添加によってｐＨ５．０にし、そして３〜１２％の勾配ゲル上にローディングする前に、ＳＤＳサンプル緩衝液（０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１．２５％  ＳＤＳ、２．５％β−メルカプトエタノールおよび５％グリセロール、ｐＨ６．８）中で５分間沸騰させた。銀染着色を、オリゴマーの形成を検出するために実施した。
【００８４】
（細胞表面結合ＰＡへのＬＦ／ＥＦの結合）
Ｊ７７４Ａ．１細胞を、冷却ＲＰＭＩで洗浄し、次いで３時間、４℃で１μｇ／ｍｌの野生型ＰＡとインキュベートした。この細胞を、冷却ＲＰＭＩで再び洗浄し、非結合タンパク質を除去した。次いで、野生型ＬＦ／ＥＦタンパク質または変異タンパク質（１．０μｇ／ｍｌ）を、加え、そしてインキュベーションを、３時間続けた。次いで、この細胞を、冷却ＲＰＭＩで洗浄し、非結合ＬＦ／ＥＦを除去した。その後、この細胞を、ＳＤＳ溶解緩衝液中に溶解し、そして電気的ブロッティングのため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このそのブロットを、抗ＬＦ／ＥＦ抗体で改良し、細胞表面結合へのＬＦ／ＥＦの結合を研究した。
【００８５】
【表１】
2005511059.tif 000003
2005511059.tif 000004
2005511059.tif 000005
2005511059.tif 000006
【００８６】
【表２】
2005511059.tif 000007
2005511059.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】
2005511059.tif 000009
【図２】
2005511059.tif 000010
【国際調査報告】
2005511059.tif 000011
2005511059.tif 000012
2005511059.tif 000013
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2005511059.tif 000015
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