(57)【要約】本発明は、細胞成長および細胞分化および他の細胞機能に対して及ぼす効果について、単独で、または３Ｄ足場と共に生物活性物質を試験するために使用し得る方法および装置を指向する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞付着抵抗性（ＣＡＲ）表面を形成するＣＡＲ材料層と接触する培養容器または支持体表面、および前記ＣＡＲ表面に接触する複数の３次元（３Ｄ）足場を含むことを特徴とする、所望の細胞活性に対する３Ｄ足場の効果を評価する細胞培養装置。
【請求項２】
前記ＣＡＲ材料が前記表面に不可逆的に結合していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記ＣＡＲ材料が前記表面に可逆的に結合していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記足場が前記ＣＡＲ材料に不可逆的に結合していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記足場が前記ＣＡＲ材料に可逆的に結合していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記細胞付着抵抗性材料が、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グリム、（ｃ）グリム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸、（ｈ）ヒアルロン酸またはアルギン酸の誘導体、および（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記細胞付着抵抗性材料がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項８】
前記支持体表面と前記ＣＡＲ層との間に反応性材料を含む付加的な層をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記反応性材料が、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびポリ−Ｄ−オルニチンであることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記結合したＣＡＲ材料が酸化を媒介とした化学的活性化を受けやすいことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記足場の表面上にあるか、またはこれに結合している生物活性物質をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記生物活性物質が細胞外マトリックス分子または成長因子を含むことを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記細胞外マトリックス分子が、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、アグレカン、デコリン、ビグリカン、グリコサミノグリカンまたはマトリゲル（商標）であることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記細胞外マトリックス分子が、コラーゲンであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記生物活性物質が成長因子であることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】
前記成長因子が、骨形態形成タンパク質、表皮成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン結合因子、肝細胞成長因子、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、インターロイキン、筋肉形態形成タンパク質、神経成長因子、血小板由来成長因子またはトランスホーミング成長因子αまたはβであることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記足場が、（ａ）天然ポリマー、（ｂ）合成ポリマー、（ｃ）無機複合体および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせからなる群から選択される基本材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
（ａ）請求項１から１７のうちのいずれかの装置、および
（ｂ）パッケージング材料
を含むことを特徴とする細胞培養システムでの細胞成長および／または細胞分化を最適化するのに有用なキット。
【請求項１９】
（ｃ）細胞培養に使用し、および／または前記細胞成長または細胞分化を測定するための１または複数種の試薬
をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
（ｄ）前記システムを使用するための指示書をさらに含むことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
（ｄ）前記システムを使用するための指示書をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
予め定義された量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進し、任意選択的に前記細胞活性の評価が可能な培養システムを設計する方法であって、該方法が、
（ａ）（ｉ）候補培地成分および
（ｉｉ）１または複数の３Ｄ足場中またはその足場上の細胞に提示される１または複数種の生物活性物質を含む候補生物活性表面
の１または複数種の第１レベルの組み合わせの存在下に、培養容器中または培養表面上での培養後に前記細胞活性に関して細胞を試験し、ここで、培養容器表面および／または足場はＣＡＲ材料に接触しており、これにより、前記培地成分と前記生物活性物質の第１の最適レベルの組み合わせを識別する工程、
（ｂ）工程（ａ）で識別した前記第１の最適レベルの組み合わせを選択する工程、および
（ｃ）培地成分および生物活性物質の前記選択した第１の最適レベルの組み合わせを培養容器または表面を含む培養システム中に組み込む工程を含み、１または複数種の３Ｄ足場が、その中にまたはその上に前記選択された第１の最適レベルの組み合わせの培地成分および生物活性表面を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
（ｄ）前記細胞培養システムが前記予め定義された量またはレベルの前記細胞活性を可能にするか促進する能力を測定する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）前記培地成分および前記生物活性表面の１または複数種の第２レベルの組み合わせの存在下において培養後に前記細胞を所望の活性に関して試験し、これにより、第２の最適レベルの組み合わせを識別する工程；
（ｉｉ）第２の最適レベルの組み合わせを選択する工程；および
（ｉｉｉ）前記選択した培地成分および生物活性物質の第２の最適レベルの組み合わせを前記第２のレベルの組み合わせを含む培養容器または表面および１または複数種の３Ｄ足場を含む培養システム中に組み込む工程
を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
予め定義された量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進し、任意選択的に細胞活性の評価が可能な培養システムを設計する方法であって、
（ａ）（ｉ）前記足場上の１または複数種のＣＡＲ材料と結合した１または複数種の生物活性物質、および
（ｉｉ）１または複数種の培地成分
の１または複数種の組み合わせの存在下において複数の３Ｄ足場を含む培養容器中または培養表面上での培養後に細胞活性に関して細胞を試験し、これによりＣＡＲ材料、生物活性物質および培地成分の最適の組み合わせを識別する工程；
（ｂ）工程（ａ）で識別した前記最適な組み合わせを選択する工程；および
（ｃ）ＣＡＲ材料、培地成分および生物活性物質の前記選択した最適の組み合わせを、
（ｉ）前記組み合わせ中のＣＡＲ材料を含む培養容器または表面を含み
（ｉｉ）前記培養容器または表面と接触している
培養システム中に組み込む工程を有し、１または複数の３Ｄ足場は、最適の組み合わせのＣＡＲ材料に結合していて、それにより培養システムを設計することを特徴とする方法。
【請求項２６】
（ｄ）前記細胞培養システムが、前記予め定義された量またはレベルの前記細胞活性を可能にするか促進する能力を測定する工程
をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記測定が、前記培養システムに動作可能に連結された画像化装置を使用して細胞を画像化することにより行うことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＡＲ材料が、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グリム、（ｃ）グリム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸、（ｈ）ヒアルロン酸またはアルギン酸の誘導体、および（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれか２つ以上の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＡＲ材料がヒアルロン酸であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物活性物質が細胞外マトリックス分子または成長因子を含むことを特徴とする請求項２２または２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞外マトリックス分子が、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、アグレカン、デコリン、ビグリカン、グリコサミノグリカンまたはマトリゲル（商標）であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記コラーゲンがコラーゲンＶＩであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記表面を、前記ＣＡＲ層の生成に先立って酸化性プラズマで処理することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記容器または表面と前記ＣＡＲ層との間に反応性材料を含む付加的な層をさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記反応性材料が、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−オルニチンを含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＡＲ層を酸化剤で処理することを特徴とする請求項２２のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記生物活性物質を、前記ＣＡＲ層上にマイクロアレイとして堆積することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物活性物質が成長因子であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記足場が、（ａ）天然ポリマー、（ｂ）合成ポリマー、（ｃ）無機複合体および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの組み合わせからなる群から選択される基本材料を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項４０】
前記足場がコラーゲンを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞活性が細胞成長または細胞分化であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞成長または細胞分化を検出可能に標識された抗体を用いて測定することを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
３Ｄ足場を含む培養システムで細胞を培養するプロセスが、選択された細胞活性に対し及ぼす効果を評価するための装置を製造する方法であって
（ａ）第１の支持体表面上の第１のＣＡＲ層に結合した生物活性物質を、その物質の存在下で細胞を培養し、前記細胞活性に所望の効果を有する１または複数種の前記物質を選択することにより、前記細胞活性に対するその効果に関してスクリーニングする工程；
（ｂ）工程（ａ）で選択した前記１または複数種の生物活性物質を３Ｄ足場上に堆積させて前記足場上に生物活性表面を生成する工程；および
（ｃ）第２のＣＡＲ支持体表面上に前記生物活性表面を有する複数の前記足場を堆積させる工程であって、前記第１および第２の支持体表面は同一または異なるＣＡＲ材料を含む工程
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、細胞培養および組織工学の分野において、生物活性物質（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が単独で、または３次元（３Ｄ）足場と共に、細胞成長および細胞分化に対して及ぼす効果を試験するために使用し得る方法および装置を指向する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学という分野は、臨床的および非臨床的な種々の範囲の必要性によって過去十年間に出現した。これらは、病気に冒されまたは損傷を受けた組織の置換、および遺伝子操作した細胞の患者への送達を含む。この分野はまた、動物実験ではヒトにおける結果が必ずしも予測できるとは限らない薬剤の開発に使用可能な組織に対する必要性によっても後押しされている。
【０００３】
組織工学技術者の目標は、細胞を用いて生きた三次元の組織および器官を造り出すことにより、これらの必要性を満たすことである。多くの場合、その方法は、細胞を巨視的なスケールで細胞を組織する物理的な足場を用いて細胞に適当な大きさおよび／または形状の組織構造を形成させ、適当な細胞の成長、移動および分化を刺激する分子的きっかけを与えるというものである。例えば、骨組織工学および血管組織工学などのいくつかの適用例では、供与体材料が、刺激を受けて移動、増殖および分化し得る前駆細胞となり、体内部位に埋め込まれた足場の中で適当な組織構造を形成させることが可能である。
【０００４】
細胞が適切に成長するためには、個々の細胞が所望の組織構造を形成し、しかも、それが再現性をもって経済的かつ大規模に行われるように、足場は、細胞の配置を適切な３Ｄ配置に導き、空間的および時間的に適切な方法で分子シグナルを提示するものでなければならない。この目標のためには、足場と細胞との間での適当な相互作用が生じるように、足場が適切な生体適合材料および生物活性物質を含む必要がある。
【０００５】
足場の表面は、細胞特性に大きな効果を及ぼし得る。例えば、表面構成、粗度、疎水性、帯電性および化学組成は、細胞付着、およびそれに続くポリマー表面に対する細胞挙動に影響を及ぼすことが知られている表面特性である。したがって、足場の物理的な設計においては表面の選択が最も重要である。
【０００６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に存在するリガンドなどの生物活性物質は、足場表面に付着した時、細胞付着を増強するように作用し得る。ＥＣＭは、タンパク質の組み合わせ、プロテオグリカンおよび荷電多糖を含み、細胞と組織のために物理的な足場材料を提供する。ＥＣＭは、組織コンパートメント間に浸透性障壁をもたらす助けともなり、組織構造が極性を有し得るようにする。
【０００７】
分子および細胞生物学の技術は、多数のＥＣＭ分子の構造的／機能的な特性を理解し、レセプター結合機能を多数の様々なリガンドタンパク質の間で保存されている小さな（３〜２０個のアミノ酸）ドメインにマッピングするために使用されてきた。プロトタイプ的な接着ドメインは、トリペプチドであるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸塩（ＲＧＤ）であり、これは当初、ＥＣＭ分子であるフィブロネクチンにおいて細胞付着に必要な最小アミノ酸配列として確認された。ＲＧＤはその後、細胞付着を媒介するより広い範囲のＥＣＭ分子で見つかっている。ＲＧＤの発見に続いて、多数のそうした小さな接着媒介ペプチドドメインが、ＥＣＭ分子内で識別され特性決定されている。これらのペプチドは、多くの態様の細胞挙動を媒介するインテグリンと呼ばれる細胞表面付着レセプターのクラスと相互作用する。したがって、足場を作るために用いられる合成バイオマテリアル中にペプチド接着ドメインを包含させ、インテグリンライゲーションを操作するようにすれば、より望ましい細胞および組織の培養環境を生じさせることができる。
【０００８】
生物活性物質は細胞培養表面の接着性に効果を及ぼすだけでなく、分化などの生理学的応答を引き起こすこともある。例えば、ＥＣＭ分子は、神経細胞分化を可能にする足場に含有されていた。ポリヒドロキシエチルメタクリレートを含む足場では、ＥＣＭタンパク質フィブロネクチンが足場に含まれていない場合は細胞の成長は生じなかった（非特許文献１。参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００９】
生物活性物質、成長因子の別個の「クラス」は、ＥＣＭ物質、または細胞付着、分化および他の細胞挙動を促進する他の物質と相乗的に作用し得る。こうした物質は、足場に組み込んでよいし、または培地に含有させてもよい。例えば、ラット胎児頭蓋冠細胞において組換え成長分化因子−５（ＧＤＦ−５）によって誘導され、細胞の凝集と結節形成を特徴とする形態変化は、表面にフィブロネクチンが存在しても増強されないが、Ｉ型コラーゲンの存在によって劇的に増強される。
【００１０】
また、他の細胞分裂促進性物質（これらは同様の応答を引き起こさなかった）と比較して、この相乗効果はＧＤＦ−５に高度に特異的なものである。この発見は、インビトロでの最適な細胞の成長のために必要な外来因子の組み合わせを識別する重要性を強調する（非特許文献２。参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００１１】
足場の形態も成長に大きな効果をもたらし得る。三次元の足場では、多数の細胞の付着を支持するためには３Ｄ構造内で表面対体積比が大きい必要があるだろう。足場材料の多孔率は、細胞が三次元（３Ｄ）構造に入り込むために十分な空間を提供するのに適したものでなければならない。孔は一様に分布していてもよいが、足場全体にわたって細胞が適切に分布し得るように適当な大きさとすべきである。
【００１２】
このため、細胞のために最適なインビトロの環境の全体的設計は、非常に複雑な仕事である。細胞培養基材の表面の特性、培地の内容、２次元−または３Ｄ環境の選択、これらの可変条件と培養する所与のタイプの細胞との相互作用は、一般には細胞の成長の達成において望ましい結果を達成することにおいて成功を決定付ける重要な要素である。しかし、インビトロの培養環境を最適化するために用いられる現在の方法は、典型的には、培地に加えられる成長因子やシグナル因子についてのみの非常に限定的な試験を含むものにすぎず、表面の化学および形態などの可変条件ならびにこうした可変条件の間における相互作用（時には相乗的である）を無視している。明らかに、細胞の成長表面の特性、培地成分、成長因子とシグナル因子間の相互作用、３Ｄ足場が細胞成長および細胞分化に与えるインパクトなどの培養環境の「形態学」を効率的かつ迅速に評価し得る新しい方法および装置が必要である。こうしたより完全な分析によって、当業者が、細胞挙動に関する研究と、実際的応用（細胞集団の調製および細胞ベースの臨床用バイオ医学器具を含む）の両方について最適なインビトロ環境を確立することが可能になるであろう。
【００１３】
薬剤発見のための細胞ベースのアッセイは長期的または恒久的な（多くの場合遺伝子操作された）細胞系統（例えば、Ｈｏｕｓｅｙの特許文献１を参照）を使用して、一般に行われている。このような細胞系統は、典型的には多数世代にわたって培養維持されており、通常腫瘍のような異数体（ａｎｅｕｐｌｏｉｄ）組織に起源を持つため、正常な生理学的応答に関する研究について理想的な細胞を表わすものではない。遺伝子組み換えによる細胞系統は、多数の特徴において不安定かもしれないし、そのため、生体内での細胞挙動のままに細胞を表現するものではないかもしれない。
【００１４】
多くの標的および薬剤のスクリーニングアプローチはリガンド結合アッセイに基づいている。このようなアッセイを使用することで、標的とされている疾患に生理学的または病態生理学的には関わらないレセプターまたは他の結合性分子を薬剤標的として識別できる。薬剤標的の識別のためのより新しいアプローチは、従来の生物学および細胞シグナリング技術に基づく標的発見に加えて比較遺伝子発現プロファイリングおよびプロテオミックな方法を含む。従来の薬剤発見では、遺伝子（タンパク質）機能の識別およびその病態生理学の役割の確認が、リード化合物発見の前提条件と考えられている。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，９８０，２８１号
【特許文献２】国際公開第０１／０７６４２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／０２５９１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／２１６７号パンフレット
【特許文献５】米国特許第４，８１６，３９７号
【特許文献６】米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献７】米国特許第４，４９３，７９５号
【特許文献８】米国特許第４，９８２，７３９号
【特許文献９】米国特許第５，３０１，７９７号
【特許文献１０】米国特許第５，５８５，０６９号
【特許文献１１】米国特許第５，９８９，８３５号
【非特許文献１】Carbonetto, S. et al., Science 216:897-899(1982)
【非特許文献２】Heidaran et al., E-biomed 2: 121-135, (2000)
【非特許文献３】Chen, G. et al, Adv Materials 12:455-457(2000)
【非特許文献４】Zhang et al., J. Biomed. Mater. Res., 45: 285-293 (1999)
【非特許文献５】Ranucci et al., Tissue Engineering 5 : 407-420, (1999)
【非特許文献６】Lu et al., Biomaterials 21 : 1595-1605, (2000)
【非特許文献７】Pieper etal., Biomaterials, 20: 847-858 (1999)
【非特許文献８】Hem et al., J. Biomed. Mater. Res. 39 : 266-276, (1998)
【非特許文献９】Oxyley et al., Biomaterials 14:1064-1072(1993)
【非特許文献１０】Madihally, S.V. et al., Biomaterials. 21:1607-1619, (1999)
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【非特許文献３６】S. Hellberg et al., (1987) J. Med. Chem.30:1126
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【非特許文献３８】Thomson et al. Proc. Natl. A cad. Sci. USA 92 7844-7848 (1995)
【非特許文献３９】Thomson et al., Science 282:1145-1147 (1998)
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【非特許文献４１】Harlow, E. et al. (eds), Antibodies-A Laboratory Manual (1988) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
【非特許文献４２】Harlow, E. et al. (eds), Using Antibodies : A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
【非特許文献４３】Taylor et al., Amer. Scientist 80 : 322-335,1992
【非特許文献４４】Proffitt et al.(Cytometry 24 : 204-213, 1996
【非特許文献４５】J. A. Rowley et al., Biomaterials (1999) 20 : 45-53
【非特許文献４６】J Oral Biol 23 : 899 (1981)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記の発見方法は、困難な上に時間も掛かり、したがって、多くの場合、割合も限定され、小さな分子または巨大分子の薬剤候補による所望のタイプの調整に従うような標的を識別するために広範囲な努力を必要とする。ポストゲノム時代では可能性があると見られる薬剤は多数に上るため、この従来のアプローチは最も有効な戦略ではない。むしろ、生体内で疾病状態に最も近い適当なモデル細胞システムにおいて、「薬剤となり得る」可能性のある標的を識別する方法が求められているが、これまでに得られていない。本発明の装置および方法はこれらの需要によく合致するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、３Ｄ足場の細胞活性に対する効果を評価するための装置であって、細胞付着抵抗性（ＣＡＲ：ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）または低親和性の材料を結合した支持体表面および前記表面と機能的に接触する複数の３Ｄ足場を含む装置を提供する。さらに、この装置を含むキットを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、培養システムを形成するように組み合わせたときに所望の細胞活性を刺激するか促進し、または可能にする成分を選択する方法であって、（ａ）所望の細胞活性についての生物活性表面として使用するのに適した生物活性物質をスクリーニングする工程；（ｂ）工程（ａ）で選択された生物活性表面上で、またはそれと共に、化合物をこれに提示したときにその所望の細胞活性を支持する培地成分または添加物として適当な化合物のライブラリーをスクリーニングする工程；（ｃ）工程（ａ）で選択された生物活性表面と工程（ｂ）で選択された培地化合物を含む１または複数の３Ｄ足場を含む培養システムを作り上げる工程；およびｄ）細胞培養システムの効果が前記所望の細胞活性を達成するかどうか決定する工程を含む方法を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、３Ｄ足場の細胞活性に対する効果を評価するための機器または装置を設計する方法であって、（ａ）所望の細胞活性を促進するための、ＣＡＲ材料層を含む生物活性表面の成分として適した生物活性物質をスクリーニングする工程；（ｂ）複数の３Ｄ足場の上または中に生物活性物質を堆積させる工程；および（ｃ）前記ＣＡＲ層を含む第２の支持体表面上に、付随する生物活性物質と共に３Ｄ足場を堆積させる工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、生物活性表面をスクリーニングするための機器であって、ａ）酸化剤と反応する細胞付着抵抗性（ＣＡＲ）材料層を有する支持体表面およびｃ）前記層の上に配置された複数の生物活性物質を含み、前記層が任意選択的に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）またはポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）などのアミノ基を備えたポリカチオン性ポリマーを含む付加的な層を介して支持体表面に結合している機器を含む。
【００２１】
本発明の１つの実施形態は、ＣＡＲ表面を形成する細胞付着抵抗性（ＣＡＲ）材料層と接触する培養容器または支持体表面およびＣＡＲ表面に接触する複数の三次元足場を含む所望の細胞活性に対する三次元足場の効果を評価する細胞培養装置である。
【００２２】
この装置では、ＣＡＲ材料は、表面に不可逆的に、一般にはすなわち、共有結合によって結合し得る。本明細書ではこれを「結合している」または「結合されている」と呼ぶ。ＣＡＲ材料はまた、例えば静電気、イオンまたは水素結合、ファンデルワールス力、親水性／疎水性相互作用などによって、表面へ可逆的に結合してもよい。さらに、３Ｄ足場は同様にＣＡＲ材料に不可逆的または可逆的に結合してもよい。
【００２３】
好ましいＣＡＲ材料（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グリム、（ｃ）グリム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸（ＨＡ）、（ｇ）アルギン酸（ＡＡ）、（ｈ）ＨＡまたはＡＡの誘導体および（ｉ）（ａ）〜（ｈ）の２つ以上の任意の組み合わせである。最も好ましいのはＨＡである。
【００２４】
装置は、支持体表面とＣＡＲ層の間に反応性材料を含む付加的な層をさらに含んでもよい。この層の好ましい反応性材料は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）およびポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）である。
【００２５】
ＣＡＲ材料は、好ましくは酸化を媒介とした化学的活性化を受けやすいものである。
【００２６】
上記の装置はさらに、足場表面上に存在するかこれに結合したＥＣＭ材料または成長因子のような生物活性物質を含んでもよい。有用なＥＣＭ分子の例は、ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ラミニン、コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）、プロテオグリカン、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）、ビグリカン（ｂｉｇｌｙｃａｎ）、グリコサミノグリカンまたはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（商標）である。有用な成長因子の例は、骨形態形成タンパク質、表皮成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン結合因子、肝細胞成長因子、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、インターロイキン、筋肉形態形成タンパク質、神経成長因子、血小板由来成長因子またはトランスホーミング成長因子αまたはβである。
【００２７】
装置の足場は、（ａ）天然ポリマー、（ｂ）合成ポリマー、（ｃ）無機複合体および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせからなる群から選択される基本材料を含む。
【００２８】
本発明は、（ａ）上記装置のいずれかの実施形態および（ｂ）パッケージング材料を含む細胞培養システム、細胞成長および／または細胞分化を最適化するのに有用なキットを提供する。このキットは好ましくはさらに、（ｃ）細胞培養および／または細胞成長もしくは細胞分化の測定のための１または複数種の試薬および／または（ｄ）システムを使用するための指示書を含む。
【００２９】
本発明はまた、前もって定義した量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進し、任意選択的に細胞活性の評価が可能な培養システムを設計する方法であって、
（ａ）（ｉ）候補培地成分および
（ｉｉ）１または複数の３次元足場においてまたはその足場上の細胞に提示される１または複数種の生物活性物質を含む候補生物活性表面
の１または複数種の第１レベルの組み合わせの存在下において培養容器中または培養表面上での培養後に細胞活性に関して細胞を試験する工程であって、その培養容器表面および／または足場がＣＡＲ材料と接触しており、これにより培地成分と生物活性物質の最適な第１レベルの組み合わせを同定する工程；
（ｂ）工程（ａ）で識別された第１の最適レベルの組み合わせを選択する工程；および
（ｃ）選択した培地成分および生物活性物質の第１の最適レベルの組み合わせを培養容器または表面を含む培養システム中に組み込む工程を有し、１または複数の三次元足場は、その中にまたはその上に選択した培地成分および生物活性表面の第１の最適レベルの組み合わせを有する方法を指向する。
【００３０】
この方法は、任意選択的に、さらに、
（ｄ）細胞培養システムが前もって定義した量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進する能力を測定する工程を含んでもよい。
【００３１】
この方法はさらに、
（ｉ）培地成分および生物活性表面の１または複数種の第２のレベルの組み合わせの存在下において培養後に細胞を所望の活性に関して細胞を試験する工程；
（ｉｉ）第２の最適レベルの組み合わせを選択する工程；および
（ｉｉｉ）選択した培地成分および生物活性物質の第２の最適レベルの組み合わせを培養容器または表面を含む培養システム中に組み込む工程（１または複数の三次元足場は選択した第２のレベルの組み合わせを含む）を含んでもよい。
【００３２】
また、予め定義された量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進し、任意選択的に細胞活性の評価が可能な培養システムを設計する方法であって、
（ａ）（ｉ）足場上の１または複数種のＣＡＲ材料と結合した１または複数種の生物活性物質
および
（ｉｉ）１または複数種の培地成分
の１または複数種の組み合わせの存在下において複数の三次元足場を含む培養容器中または培養表面上での培養後に細胞活性に関して細胞を試験し、これによりＣＡＲ材料、生物活性物質および培地成分の最適の組み合わせを識別する工程；
（ｂ）工程（ａ）で識別された最適な組み合わせを選択する工程；および
（ｃ）培養システム中に、ＣＡＲ材料、培養成分および生物活性物質の選択した最適の組み合わせを組み込み、その培養システムは、
（ｉ）組み合わせ中のＣＡＲ材料を含む培養容器または表面
（ｉｉ）培養容器または表面と接触している、１または複数の三次元足場は、最適な組み合わせのＣＡＲ材料を結合していて、それにより培養システムを設計する方法も提供する。
【００３３】
この方法はさらに、
（ｄ）細胞培養システムが予め定義された量またはレベルの細胞活性を可能にするか促進する能力を測定する工程を含んでもよい。
【００３４】
上記の測定は、好ましくは、培養システムに動作可能に連結された画像化装置を使用して細胞を画像化することにより行う。したがって、本発明は、その新規な装置および動作可能に連結された画像化装置を備えた培養システムを含む装置を含む。市販の任意の適当な画像化システムまたは設計され得る任意の適当な画像化システムも、本発明の機器、装置および方法の範囲内であることを意図する。
【００３５】
上記方法では、ＣＡＲ材料は好ましくは上に挙げたものの１種であり、生物活性物質は、ＥＣＭ分子、成長因子、あるいはその他のものであるか否かに関わらず、好ましくは、上に記載したもののうちの１または複数種である。
【００３６】
上記方法では、足場は好ましくは、上に記載したような材料である。
【００３７】
上記の方法で測定された細胞活性は好ましくは成長または細胞分化であり、そのいずれも抗体に基づくアッセイを使用して測定することができる。
【００３８】
本発明はまた、三次元足場を含む培養システムで細胞を培養するプロセスが、選択された細胞活性に対する効果を評価するための装置を生産する方法であって
（ａ）第１の支持体表面上の第１のＣＡＲ層に結合した生物活性物質を、その物質の存在下で細胞を培養し細胞活性に所望の効果を有する１または複数種の物質を選択することにより、細胞活性に対するその効果に関してスクリーニングする工程；
（ｂ）工程（ａ）で選択した１または複数種の生物活性物質を三次元足場上に堆積させて足場上に生物活性表面を生成する工程；および
（ｃ）第２のＣＡＲ支持体表面（ここで第１および第２の支持体表面は同一または異なるＣＡＲ材料を含む）上に生物活性表面を有する複数の足場を堆積させる工程
を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、様々な生物活性物質を試験し、３Ｄ足場を最適の細胞培養環境の設計に使用するための装置を提供する。本発明はまた、最適の細胞培養環境を設計する方法を提供する。
【００４０】
１つの実施形態では、装置は、細胞付着抵抗性物質を結合させ複数の３Ｄ足場を結合させた支持体表面を含む。
【００４１】
本発明で使用するための適当な支持体表面は、セラミック、金属またはポリマーを含むが、これらに限定されない。支持体表面は、皿状、フラスコ、マイクロプレート、チューブ、縫合糸、薄膜、フィルム、バイオリアクターおよび微粒子とすることができ、プラスチック製が好ましい。こうした表面に好ましいポリマーには、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（スチレン）（「ＰＳ」）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ヘキサフルオロプロピレン）、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（ジメチルシロキサン）および他のシリコーンゴムが含まれる。グリセロールプロピルシランを結合したガラスを含むガラス支持体表面も含まれる。
【００４２】
例えば、本発明の１つの態様では、標準的なマルチウェルＰＳ  マイクロプレート（９６、３８４または１５３６個のウェルを有する）が使用され、これは例えば、ベクトンディキンソン（マサチューセッツ州ベッドフォード所在）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって製造されたものである。別の実施形態では、１５３６個のバーチャルウェル、すなわち、ウェルのないタイプのマイクロプレート（ベクトンディキンソン製）が使用される。
【００４３】
本発明で使用する場合、「細胞付着抵抗」（または抵抗性）材料は、「低親和性物質」とも呼ぶが、これは表面に存在する場合、細胞付着または付属を妨げるか低減させるものである。そのような材料はタンパク質結合も低減させ得る。適当な細胞付着抵抗性材料としては、ポリエチレングリコール、グリムおよびその誘導体、ポリ−ｈｅｍａ、ポリ−イソプロピルアクリルアミドおよび荷電多糖（ヒアルロン酸（ＨＡ）およびアルギン酸（ＡＡ）を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。一般に、多数の水酸基を備えた高度に親水性な物質を、単独でまたは組み合わせて細胞付着抵抗性材料として使用できる。好ましい細胞付着抵抗性材料はＨＡである。ＣＡＲ層およびＣＡＲ表面を形成するのに有用な方法および組成物は、同時係属中の同じ出願人に係る米国特許出願連続番号              に（本願と同日付でリーブマン−ビンソンら（Ｌｉｅｂｍａｎｎ−Ｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）によって出願された「細胞付着抵抗性表面」”Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ”）に、より一層詳細に記載される。これらは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【００４４】
「反応性材料」は、支持体表面上に堆積させ得るアミンまたはイミンのような基を有し、それに細胞付着抵抗性材料が結合され得るものである。そのような市販の反応性材料の例としては、ポリカチオン性ポリマー、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、ポリ−Ｄ−オルニチン（ＰＤＯ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）およびポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）が挙げられる。
【００４５】
好ましい実施形態では、ＰＥＩをイオン的に支持体表面に反応させる。ＰＥＩは遊離アミノ基の表面を形成し、これはカルボジイミド結合（１つの実施形態）を使用して、細胞付着抵抗性物質との結合に利用可能である。
【００４６】
本発明の別の態様では、酸化プラズマで処理した支持体表面上に細胞付着抵抗性物質を堆積させる。「酸化プラズマ処理」は、真空中のプラズマ放電またはコロナ放電への暴露を含む。真空中のプラズマ放電のためには、支持体表面の成形部分を真空チャンバー内に置き、酸素を含むガス混合物をチャンバー内にポンプで送り込む。部分真空および放電の定義された条件下で、反応性プラズマが作り出され、これが支持体表面と反応する。このプロセスによって、前記表面上に水酸基、カルボニル基およびカルボキシル基を含む負帯電官能基が生成する。より複雑な酸化プラズマ処理表面を作り出すためには、他のガス混合物を添加することができる。例えば、プライマリア（Ｐｒｉｍａｒｉａ）（商標）製品（ＢＤバイオサイエンシーズ、マサチューセッツ州ベッドフォード所在）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の表面およびＣＥＬＬ＋（商標）製品（スターシュテット、ノースカロライナ州ニュートン所在）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）は、正帯電官能基と負帯電官能基の両方を含み、これらは、細胞付着抵抗性材料の結合を促進するように作用し得る。
【００４７】
あるいは、酸化プラズマ処理後に、ＰＥＩなどの反応性材料を支持体表面上に堆積させてもよい。
【００４８】
「低親和性領域」は、「細胞付着抵抗性領域すなわちＣＡＲ領域」とも呼ぶが、これは細胞付着抵抗性材料が置かれ、添加され、スポットされ、堆積等された支持体表面領域である。
【００４９】
本発明の１つの態様では、複数の３Ｄ足場を共有結合的にまたは非共有結合的に低親和性領域に固定化する。１つの実施形態では、ＨＡコートを施したスライド上に注射により、またはシリコンガスケットで囲むことによって規定したウェルを有するマルチウェルスライドのウェル中に足場を置くなどの別の方法によって、足場を配置する。
【００５０】
「三次元足場」は、本明細書では、インビトロまたはインビボで当初の細胞付着およびこれに続く組織形成のために使用され得る３Ｄの多孔性のテンプレートを指す。三次元足場は、基本材料（下に規定する）とともに細胞の成長、移動、付着および／または分化を増強する他の物質も含み得る。例としては、細胞付着を促進するペプチドが挙げられる。
【００５１】
これらの足場を構築する基本材料は、天然ポリマー、合成ポリマー、無機複合体およびこれらの材料の組み合わせを含む。有用な天然ポリマーとしては、コラーゲンおよびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が挙げられる。基本材料としてのコラーゲンの１つの利点は組織中、天然に豊富に存在する点である。大多数のヒト組織中にコラーゲンが遍在するのは、種々様々な細胞の成長を支持し、かつこれらの組織を支持するその能力が根底にある。同様に、ＧＡＧは、それらを組織移植の基礎材料とするのに望ましい物理的および生物学的特性を有している。特に、ＧＡＧは細胞挙動をコントロールし、組織の成長および修復に寄与する。
【００５２】
足場材料としての適用に有用な合成ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびこれらの共重合体（ＰＬＧＡ）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）類、ポリ（オルトエステル）類、ポリウレタン類、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ−ＨＥＭＡ）またはポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体（ＰＥＯ−ＰＰＯ）などのヒドロゲルを含む。ポリ（α−ヒドロキシ酸）は、ヒトの臨床的使用のために承認され、縫合のために広範囲に使用されてきた数少ない分解可能な合成ポリマーの１種である。
【００５３】
天然および合成ポリマー材料を含むハイブリッド材料も、本発明の３Ｄ足場用に使用し得る。これらの材料の使用例は、例えば、非特許文献３に開示されており（但し、これに限定されない）、そこではＰＬＡまたはＰＬＧＡスポンジの孔中に存在するコラーゲンマイクロスポンジを含むハイブリッドスポンジを、ウシ関節軟骨細胞から得た軟骨マトリックスの増殖および再生を刺激するために使用している。非特許文献１では、培養ニューロンの成長を刺激するため、フィブロネクチンコラーゲンまたは神経成長因子に組み込まれた合成ポリ−ＨＥＭＡヒドロゲルを使用している。
【００５４】
無機複合体は、骨代用品としての応用で特に関心が持たれている。特に、リン酸カルシウムセラミックス、バイオガラスおよび生物活性ガラスセラミックスは骨と強く特に相互作用する。カルシウムハイドロキシアパタイトとシリコン安定化リン酸トリカルシウムを組み合わせた複合体はこのクラスの材料の別の例である。
【００５５】
三次元（３Ｄ）足場
本発明の３Ｄ足場は、上に記載した基本材料のうちのいずれかを単独または組み合わせで含み得るだけでなく、当業者に知られた基本材料も含む得ることが理解される。
【００５６】
三次元足場はよく知られた方法によって作り上げることができる。合成足場材料と天然足場材料に共通の製造方法は、相分離である。特に凍結乾燥での相分離は広範囲に使用されている（例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６。その各々は、参照によって本明細書に組み込まれる）。基本材料を適当な溶媒に溶解し、急速冷凍する。溶媒を凍結乾燥で除去すると、多孔性の構造が後に残る。この技術を使用した天然ポリマーからの足場の製造例（但し、これらに限定されない）は、約５０μｍと約１５０μｍの間の孔を備えた多孔質コラーゲンスポンジ（非特許文献７。参照によって本明細書に組み込まれる）、平均孔サイズが約９０μｍと約１２０μｍの間であるコラーゲン−ＧＡＧ足場（非特許文献８。参照によって本明細書に組み込まれる）、約４５μｍと約２５０μｍの間の孔を備えたキトサンヒドロゲル（非特許文献９。参照によって本明細書に組み込まれる）、および孔径が凍結条件に応じて１μｍから２５０μｍの範囲であるキトサン足場（非特許文献１０。参照によって本明細書に組み込まれる）である。凍結乾燥によって製造される合成ポリマー足場の例は、多孔率が約９５％以下で異方性の管状形態が内部の梯子状構造（直径で数十μｍから数百μｍの範囲のチャンネルを含む）と組み合わさったＰＬＬＡ発泡体（非特許文献４）、および多孔率が約９０〜９５％で平均孔径が約１５μｍから約３５μｍであり、約２００μｍ以下の大きな孔を有するＰＬＧＡ発泡体（非特許文献１１。参照によって本明細書に組み込まれる）である。凍結乾燥には、トムソン（Ｔｈｏｍｓｏｎ）とその共同研究者が示したように（例えば、非特許文献１２参照。参照によって本明細書に組み込まれる）、小さな親水性および疎水性の生物活性分子をＰＬＬＡおよびポリ（ホスホエステル）足場に組み込み得るという別の利点もある。
【００５７】
本発明の３Ｄ足場を作る上で有用な、凍結乾燥技術の修正法は、非特許文献９（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された「凍結融解法」である。この手法は、溶媒、特に水と親水性モノマーが凍結に際して起こす相分離と、これに続けて紫外線照射によって親水性モノマーを重合させ、および融解による溶媒の除去をする。これにより、マクロ孔質のヒドロゲルが得られる。第２の修正はポリマーを溶媒に溶解し、冷却し、非溶媒に含浸し、室温に戻す凍結含浸沈殿であり、約１００μｍから約１５０μｍの範囲の孔サイズを備えたポリエステルウレタンフォームの製造で実証されている（非特許文献１３。参照によって本明細書に組み込まれる）。相分離を噴霧および薄膜堆積と組み合わせることによって、孔サイズが約１００μｍ以下の孔を備えたＰＳフォームが製造された（非特許文献１４。参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００５８】
天然ポリマーは、３Ｄ培養に適したネットワークおよびゲルに形成できる。例えば、フィブリノーゲンなどのＥＣＭタンパク質の重合を使用して、ファイバー束間が約２５０ｎｍと約５００ｎｍ隔たったネットワークを作成できる（非特許文献１５。参照によって本明細書に組み込まれる）。コラーゲン由来タンパク質であるゼラチンの架橋、およびアルギン酸塩は、約１０μｍから約１００μｍの範囲に及ぶ孔を備えたスポンジを形成する（非特許文献１６。参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００５９】
三次元印刷はステレオリソグラフィに類似の製造技術である。これは、ＮａＣｌ粒子とともに充填したポリマー粉上に選択的に溶媒を方向付け、一連の非常に薄い二次元の薄片として複雑な立体構造を作り上げ、次いで、ＮａＣｌ粒子を水中に浸出する工程を含む。この技術を使用して約６０％の多孔率および約４５μｍから約１５０μｍの微細孔を備えたＰＬＧＡ足場が製造されている（非特許文献１７。参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
ガス発泡法は、固体形成後、この固体を高圧下、ガス（例えば、ＣＯ2）にさらし、ポリマーを飽和し、その後にガス圧を急速に減少させる工程を含む。圧力開放の間、ポリマーマトリックスに溶解したＣＯ2の核形成と拡張により孔形成が起こる。約９３％までの多孔率および約１００μｍの孔サイズを備えたＰＬＧＡ発泡体が、この方法によって調製されており（非特許文献１８。参照によって本明細書に組み込まれる）、９７％の多孔率で約１０μｍから約１００μｍまでの孔サイズのＰＬＧＡ発泡体がこの方法を用いて製造される旨報告されている。
【００６１】
三次元の足場は、上に記載した方法を含む（但し、これらに限定されない）知られている任意の方法により作り上げられることが可能であり、また、それらは、市販品として得ることもできる。市販の３Ｄ足場は、例えばニューブランズイックサイエンティフィック社（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ）（ニュージャージー州エジソン所在）（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）から得られる（例えば、Ｆｉｂｒａ  Ｃｅｌ（登録商標））。
【００６２】
本発明において使用される３Ｄ足場は、任意の適当なサイズまたは形状でよい。１つの実施形態では、３Ｄ足場は直径が約１と５０ｍｍの間である。別の望ましい実施形態では、３Ｄ足場は直径で約３ｍｍと２５ｍｍの間である。さらに望ましい実施形態では、３Ｄ足場は直径で約３ｍｍと１０ｍｍの間である。
【００６３】
３Ｄ足場の表面の好適な性質は細胞付着および成長を可能にする点である。したがって、この要求を満たす表面構造、粗度、疎水性、帯電性および化学組成のいかなる適当な組み合わせも受け入れることができる。任意選択的に、細胞−表面の付着ではなく細胞−細胞を促進する、より付着性の低い表面が好ましい場合もあり得る。
【００６４】
３Ｄ足場表面は、細胞付着、成長または分化を可能にするか促進するペプチドなどの生物活性物質を組み込んでもよい。「生物活性物質」または「生物活性成分」または、「生物活性化合物」は細胞付着を可能にするか促進する薬剤など、細胞の生理学なプロセスに影響するものである。例えば、細胞付着は、付着タンパク質に由来する配列を備えた多くの短鎖ペプチドのうちのいずれによってでも増強され得る。これらの配列は、完全なタンパク質と同様またはより低い親和性で、細胞表面レセプターに結合し、および基質への細胞付着を媒介する。Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＲＧＤＳＰ）［配列番号１］は細胞付着を増加させるために立体足場の表面を被覆し得るそのようなペプチドの１つである。このペプチドは種々様々の細胞タイプ上のインテグリンレセプターに結合する。
【００６５】
好ましくは、足場の基本材料は細胞付着を支持しないものである。細胞付着剤特性は、後で上に記載したような付着タンパク質またはペプチドを導入することによって足場に与えられる。例えば、非特許文献１９は、界面活性剤ＰＥＧにより細胞付着抵抗性を示すラクチドに基づくＰＥＧネットワークを合成した。細胞付着抵抗性材料を表面に被覆した場合、遊離の末端水酸基によってＰＥＧなどの抵抗性材料に結合する適当な生物活性物質を導入することによって容易に付着特性を導入できる。
【００６６】
細胞表面レセプターに結合し、細胞の成長、複製または分化を調節する他の生物活性物質は、高分子の成長因子（一般にタンパク質）、ペプチド、小さな分子および細胞外マトリックス分子、タンパク質（改変タンパク質、例えば、糖タンパク質を含む）、脂質、炭水化物、核酸その他を含む。
【００６７】
成長因子の例としては、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスホーミング成長因子（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子、ヘパリン結合因子、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ、繊維芽細胞の成長因子、エリスロポエチン、神経成長因子、骨形態形成タンパク質、筋肉形態形成タンパク質、および当業者に知られた他の因子が挙げられる。他の有用な成長を刺激する分子としては、インターロイキンなどのサイトカイン、およびインシュリンなどのホルモンが挙げられる。これらも文献に記載され、市販されている。例えば、非特許文献２０（参照によって本明細書に組み込まれる）参照のこと。
【００６８】
成長因子は、従来の生化学の方法を用いて組織から分離するか、バクテリア、酵母または哺乳類細胞（または他の真核細胞）において遺伝子組み換え手段によって生産させることができる。例えば、ＥＧＦはマウスの顎下腺から単離することができ、ＴＧＦ−βは遺伝子組み換えにより生産されている（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州Ｓ．サンフランシスコ所在（Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ））。さらに、多くの成長因子が、天然および遺伝子組み換えの形で販売会社から販売されている。例えば、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（ミズーリ州セントルイス所在）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、コラボラティブリサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（カリフォルニア州ロスアルトス所在）（Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ）、ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（ドイツ）、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネソタ州ミネアポリス所在）  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびギブコ（ＧＩＢＣＯ）（ニューヨーク州グランドアイランド所在）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）など。
【００６９】
ＥＣＭ分子の例としては、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよびプロテオグリカンが挙げられる。ＥＣＭ分子は非特許文献２１（参照によって本明細書に組み込まれる）その他の当業者によく知られている文献に記載されている。多くのＥＣＭ分子が市販されている。例えば、一般に用いられているＥＣＭ材料（マトリゲル（商標））は、ＥＨＳマウス肉腫腫瘍で作られており、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（マサチューセッツ州ベッドフォード）（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能である。マトリゲル（商標）はラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、成長因子、マトリックスメタロプロテイナーゼを含み得る。
【００７０】
上記のまた他の生物活性物質は、成長因子またはＥＣＭ分子であるかどうかに関わらず、本発明による３Ｄ足場に組み込むことができる。
【００７１】
１つの実施形態では、成長因子などの１または複数種の生物活性物質を、ミクロスフェア、好ましくは、ＰＬＧＡミクロスフェア中に封入して、そのまま３Ｄ足場中に組み込む（例えば、非特許文献２２参照。参照によって本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、１または複数種の生物活性物質を水などの担体に溶解して溶液とし、これを用いて３Ｄ足場の表面を被覆する。足場依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞を成長させる場合、後者は有用である。例えば、１または複数種の生物活性物質を含む溶液を、３Ｄ足場上にまたは足場中へ分配し、逆気流フード中で乾燥させる。これは、足場表面上の乾燥フィルムとして生物活性物質の堆積をもたらす。さらに別の実施形態では、１または複数種の生物活性物質の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3溶液を調製し穏やかに振とうする。３Ｄ足場をこの溶液で「被覆し」、室温で約２時間置いてから、足場をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞を播種する。
【００７２】
１つの実施形態では、生物活性物質は、非特許文献２３；  非特許文献２４；および非特許文献２５に記載されているような、周知のマイルドバイオコンジュゲーション技術を使用して三次元足場上に固定化する。
【００７３】
１つの実施形態では、三次元足場はアルギン酸（ＡＡ）を含む。１または複数種の生物活性物質はカルボジイミド化学（好ましくはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドすなわちＥＤＣ）（非特許文献２６。参照によって本明細書に組み込まれる）を使用して、ＡＡ中の遊離カルボキシル基を介して足場に連結する。
【００７４】
別の実施形態では、過ヨウ素酸塩化学反応を使用して生物活性物質を足場に連結する。このためには、足場が、ｃｉｓ−ジオールのうちのいくつかをジアルデヒドに変換するように温和な酸化剤によって部分的に酸化される多糖を含まなければならない。これらのアルデヒド官能基は、生物活性ポリペプチド中に存在する遊離アミン基（Ｎ−末端アミノ基またはＬｙｓまたはＡｒｇの側鎖アミノ基）を有するシッフ塩基を形成し得る。
【００７５】
好ましくは、多数の基本材料および／または生物活性物質のうちのいずれかを含む３Ｄ足場を、支持体表面上に堆積させた低親和性層上にグリッド状パターンまたは「マイクロアレイ」状に配置する。各々の複数の足場は同一でもよい。
【００７６】
生物活性物質を含み、支持体表面上に配置される３Ｄ足場は、適当な「生物活性表面」として作用すると考えられ得る。足場の中におよびその上に存在するこのような生物活性表面は、好ましくは（ａ）所望の細胞タイプの付着および／または成長、（ｂ）所望の細胞タイプへの細胞分化または（ｃ）他の所望の細胞活性を支持する。したがって、「生物活性表面」という用語は、所望の細胞活性を可能にするか促進するか、または増強する生物活性物質を含む表面を指す。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明の装置の３Ｄ足場中に細胞を播種し、複数の３Ｄ足場タイプ（基本材料、堆積させた生物活性物質などに関して）の１または複数が、所望の細胞活性の発現をもたらすことを決定すべくスクリーニングを行う。所望の細胞活性としては、変化した成長パターン（例えば、「増強されまたは増加したもの」対「阻害されまたは抑制されたもの」）、変化した細胞機能、例えば、遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳、翻訳後のタンパク質のプロセシング、タンパク質またはペプチドの細胞内輸送、分泌またはターンオーバーが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなタンパク質は、抗原、毒素、抗体、ホルモン、成長因子、サイトカイン、凝固因子、酵素などであり得る。また、培養中の細胞活性の変化は、任意の内生的または外生的化合物または代謝物質（例えば、抗生物質、ステロイド、炭水化物、脂質、核酸など）の合成処理および／または分泌における変化も含む。本発明の装置および方法は、細胞の成熟、分化、成長および／または増殖における変化の誘導およびスクリーニングまたは識別を可能にすることが最も好ましい。
【００７８】
「成長」という用語は、本願で用いる場合、細胞の数（「増殖」）、細胞サイズ、または細胞器官などの細胞コンポーネントの量や濃度および／または細胞「突起」伸長のいずれの増加をも意味する。細胞突起は細胞質が伸長したもので専門化された構造を含み得る。例としては、軸索、樹状突起、仮足、繊毛、知覚末端および鞭毛が挙げられる。
【００７９】
「分化」という用語は、当技術分野ではよく知られており、本明細書では広い意味で用いるものとし、また、より専門化されるか成熟した、または関与した子孫細胞を生じる任意の全てのタイプの幹細胞または前駆細胞の潜在的可能性を含むように意図される。
【００８０】
「分化」という用語は、当技術分野ではよく知られており、本明細書では、より専門化されるか成熟した、または関与した子孫細胞を生じる任意の全てのタイプの幹細胞または前駆細胞の潜在的可能性の実現を含む広い意味で用いる。
【００８１】
本発明はまた、所望の細胞活性を促進する生物活性表面（複数可）をスクリーニングし発見する方法を対象とする。この方法は、最適の表面特性（それらは、例えば、後で３Ｄ足場の成分として使用され得る）を識別することを含む。この方法の好ましい実施形態においては、適当な支持体表面は、細胞付着抵抗性材料、任意選択的に、反応性材料（上に記載した）および／または細胞付着抵抗性材料上に堆積させるかこれに結合した生物活性物質で被覆する。細胞を添加し、適当な培養間隔の後に、所望の細胞活性についてスクリーニングする。
【００８２】
好ましい実施形態では、生物活性物質（複数可）をほぼ円形のスポット、矩形状スポット、卵形状スポットまたは他の適当な任意の形状を取る細胞付着抵抗性すなわち「低親和性」領域に連結させる。より好ましい実施形態では、生物活性物質は「グリッド」または「マイクロアレイ」パターン、すなわち、比較的均一な間隔を置いて２本の直交軸で描かれる領域として細胞付着抵抗性表面上に堆積させる。
【００８３】
本発明の方法において使用される生物活性物質は、本発明の装置に関して記載したものである。それらは、細胞付着抵抗性表面上の領域に共有結合して複数の「生物活性領域」を規定し得る。「生物活性領域」は、性質または関連する生物活性物質の濃度のいずれかが互いに異なるものでもよい。したがって、好ましい実施形態では、個々の生物活性領域は異なる生物活性物質または物質の組み合わせを含む。
【００８４】
一旦、支持体表面上に細胞付着抵抗性層が形成されてしまえば、当技術分野で知られている穏やかなバイオコンジュゲーション技術を用いてその上に生物活性物質を固定化できる。例えば、上記非特許文献２３、上記非特許文献２４、上記非特許文献２５。
【００８５】
好ましい実施形態では、生物活性物質は、ＨＡ層に共有結合的に連結させる。これを行うために、ＨＡを温和な酸化剤で部分酸化して、ｃｉｓ−ジオールのうちいくつかをジアルデヒド部分に変換する。温和な酸化剤としては、過マンガン酸カリウムおよびより好ましくは過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられる。この結果、このように形成されたアルデヒド官能基は、生物活性物質のアミノ基（例えば、ポリペプチドまたはペプチドのＬｙｓまたはＡｒｇのε−アミノ残基）を有するシッフ塩基を形成することができる。
【００８６】
本発明の装置は、支持体表面および上記細胞付着抵抗材料の任意選択的な層から構成されることが可能であり、その上に１または複数種の生物活性物質が堆積され（例えば、共有結合に、または非共有結合的に連結される）、生物活性表面を作り出す。
【００８７】
次いで、堆積された生物活性物質を、本明細書に記載したか、当技術分野で知られている様々な方法のうちのいずれかを使用して、任意の所望の細胞活性に対するその効果についてスクリーニングを行うことができる。
【００８８】
本発明はまた、細胞成長および／または細胞分化に対する効果に関して、１つの細胞培養表面に対して複数の生物活性物質または物質の異なる濃度を試験する方法を提供する。方法は候補生物活性物質をその上に、少なくとも１つのＣＡＲ領域および少なくとも１つの生物活性領域の形で有する支持体表面を形成する工程、それらの領域の各々の上に細胞を堆積させる工程および前記領域の各々に接触し、その結果、生物活性領域を構成する生物活性分子に露出した細胞に対する効果を決定する工程を含む。
【００８９】
上記に関連して、本発明は、細胞が領域間の違いまたは勾配に応答することができるように単一表面上または単一培養容器中に様々な生物活性領域を並置した物品、装置および方法に関する。例えば、並置された生物活性領域は、異なる生物活性物質、または同一の生物活性物質を異なる濃度で含むものとすることができ、これにより、特定の生物活性物質の濃度勾配が細胞の活性（例えば成長、分化）を誘導するシグナルとして働き得る場合、細胞はそのような勾配に従って応答することができる。従来の細胞培養方法を使用する場合、本発明により達成されたそれらのような条件は、従来の培養表面上または容器中では生じないものであった。したがって、このアプローチは、インビボでは重要であり得るが従来の細胞／組織培養環境では失われていたシグナルおよび相互作用の検出を可能にする。
【００９０】
本発明の１つの実施形態では、生物活性物質が成長および／または分化を阻害するかどうかを決定するために、表面の生物活性領域を同じ表面のＣＡＲ領域と比較する。１つの実施形態では、生物活性物質が誘導物質の役割を果たすが、ＣＡＲ材料は細胞分化に効果がない。別の実施形態では、誘導物質またはシグナルは、１つの表面上に並置された１または複数種の異なる生物活性領域の勾配の形で現れ、細胞は生物活性物質の差異または生物活性物質の濃度差に応答することができる。そのような誘導は典型的には細胞活性を刺激する。しかし、別の実施形態では、特定の生物活性物質または異なる生物活性領域の並置によって作成された勾配は細胞成長または細胞分化（または他の細胞活性）の誘導を阻害するか妨げるように作用する。
【００９１】
好ましい実施形態において、生物活性物質は円状スポット、矩形状スポット、卵形状スポットまたは他の任意の形状のスポットである１つ以上のＣＡＲ領域に連結される。好ましくは、生物活性物質は「グリッドパターン」、すなわち、比較的均一に間隔を置いて水平および垂直なスポットとして配置されてＣＡＲ材料上に堆積される。
【００９２】
同じ物質の様々な濃度をそれぞれ有する多数の生物活性領域を作成するために、生物活性物質をＣＡＲ材料を含む表面に共有結合的に結合させてもよい。別の実施形態では、各生物活性領域は異なる生物活性物質またはその異なる組み合わせを含む。同一または多数の異なる生物活性物質がスポットされたグリッドまたは他のパターンの任意の組み合わせも考えられる。
【００９３】
細胞（単数または複数）を、ＣＡＲ材料および／または生物活性物質を表示する表面上に堆積させてもよい。本発明の方法では、どのような細胞タイプ（原核生物、真核細胞を含む）も使用し得るが、最も好ましいのは哺乳類細胞、特にヒト、ラット、マウスまたはウシの種から選択されるものである。１つの好ましい実施形態では幹細胞が使用される。
【００９４】
本発明のスクリーニング方法の１つの実施形態では、生物活性表面を培地成分と組み合わせてスクリーニングし、相乗的に作用する生物活性物質と培地成分の組み合わせを識別する。別の実施形態では、最初は培地成分を個別に評価する。次いで、特定の細胞活性に対する所望の効果を備えた選択された培地成分を、生物活性領域（生物活性表面）の形を取った１または複数種の生物活性物質と組み合わせて試験する。
【００９５】
ペプチドライブラリー：アルゴリズムおよびスクリーニングへの数学的／統計的アプローチ
好ましい実施形態では、共に本出願人の所有に係る２件のＰＣＴ特許出願（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒらによる特許文献２およびＨａａｌａｎｄらによる特許文献３。これらは双方とも参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された方法およびソフトウェアを使用して、望ましい培地成分のスクリーニングおよび決定を行う。特許文献２に記載されているように、望ましい培地成分、例えば、使用により所望の細胞活性がもたらされる生物活性物質が識別される。使用される生物活性物質の好ましいクラスはペプチドまたはポリペプチドである。
【００９６】
１つの好ましい実施形態では、生物活性物質の第１の試験ライブラリーを評価して、培地成分として望ましい特性を有するライブラリーメンバーを識別する。第１の試験ライブラリーから得たそれぞれの試験化合物（複数可）を含む複数の培地を、選択された細胞活性に対するこれらの培地の効果の測定によりスクリーニングする。典型的には、複数の第１細胞培養物（各々がそれぞれの試験化合物を含むそれぞれの培地を含む）として培地をスクリーニングする。
【００９７】
当技術分野で知られている任意の方法により、生物活性物質を含む化合物ライブラリーを生成することができる。個々のライブラリーメンバーは単離することができ、かつ／または固相または液相合成法によって合成できる。例えば、ペプチドはＦＭＯＣ化学（非特許文献２７）をＡｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  Ｍｏｄｅｌ  ３９６合成器に用いることで合成できる。あるいは、ペプチドは、ｔ−Ｂｏｃ化学を含むメリフィールドアプローチ（非特許文献２８）、他の固体支持体上での（例えば、他の樹脂、ピンなど；「ティーバッグ」合成（非特許文献２９）およびコンビナトリアル法によって合成できる。ペプチドはまたカルボキシル基末端（例えば、エステル、アミドなど）、アミノ末端（例えば、アセチル基）で改変されていてもよく、非天然のアミノ酸（例えば、ノルロイシン）を含んでもよい。オリゴヌクレオチド合成の方法も当技術分野で知られている。例えば、非特許文献３０を参照のこと。炭水化物ライブラリーの生成は、例えば、非特許文献３１に記載されている。ＲＮＡライブラリーの構築は、当技術分野において知られている（例えば、ＳＥＬＥＸ法（非特許文献３２）参照）。
【００９８】
この実施形態を実行する際、各々が第１の試験化合物を含む第１の複数の培地が提供される。細胞培養物は、当技術分野で知られているように、適当な持続期間、適当な条件下にインキュベートし、標的とした細胞活性の発生を定性的にまたは定量的に決定するためにアッセイを行う。
【００９９】
第１の試験化合物は、好ましくは空間充填設計を使用して、化合物の第１の試験ライブラリーから選択される。第１の試験化合物は第１の試験ライブラリーの代表であるべきである。本明細書で用いる場合、「空間充填設計」という用語は、広く解釈されるように意図され、そのような知られた技術をすべて含む。例示的な空間充填設計は、完全要因計画（ｆｕｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）、部分要因計画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）、最大多様性ライブラリー、遺伝的アルゴリズムカバレッジ設計、拡張設計、クラスターベース設計、ラテンハイパーキューブサンプリングおよび他の最適化設計、例えば、Ｄ−最適化法などを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
空間充填設計は、実験の設計ポイントの選択を支援する。理想的には、データはすべて、恐らく興味のある応答に影響するかもしれない説明的変数のあらゆる組み合わせで、言い換えれば、全空間を満たすように集められるであろう。候補空間が非常に大きく、可能な値の数が大きい場合、そのようなすべての可能な組み合わせをすべて数えあげるのは現実的でも効率的でもなく、遥かに少ないデータを物理的に集める。例えば、あらゆるペプチド４量体または５量体を評価することは一般に実現可能ではないであろう（すなわち、１６０，０００個の可能な４量体および３２０，０００個の可能な５量体がある）。空間充填設計は、集めたデータが効率的に候補化合物をすべて表わすような設計ポイントの集合（「候補空間」として知られる）としてデータを集めるための戦略を提供する。事前に情報が利用可能でない場合に空間充填設計を生成する１つの方法は、幾何学的な距離に基づく基準を使用することである。
【０１０１】
一般的に距離に基づく設計の２つのカテゴリーはミニマックス（ｍｉｎｉｍａｘ）とマクシミン（ｍａｘｉｍｉｎ）である。Ｃが可能な設計ポイントの有限集合を表し、（Ｃ，ｄ）が距離空間となるようにＣ×Ｃ空間上に距離関数ｄが存在すると仮定する。大きさｎのＣの部分集合Ｄを考える。設計基準が距離関数ｄに依存する場合、Ｄは距離ベース設計と呼ばれる。ミニマックスの基準では、候補ポイントについての最大距離を最も近い設計ポイントまで最小化するように設計ポイントを配置することにより実験空間をカバーしようとする。具体的には、下記の場合、Ｄ*をミニマックスの距離設計と呼ぶ。
【０１０２】
【数１】
2005526489.tif 000002
【０１０３】
マクシミン基準では、設計ポイント対間の最小の距離を最大にするために空間における設計ポイントを拡張しようとする。特に下記の場合、Ｄｏをマクシミン距離設計と呼ぶ。
【０１０４】
【数２】
2005526489.tif 000003
【０１０５】
マクシミン設計は、非特許文献３３によって生み出すことができる。
【０１０６】
「カバレッジ」および「拡張」基準は、それぞれミニマックスおよびマクシミン基準に対し数的により安定した近似であり、それは交換アルゴリズムを使用して［計算する］を求めることができる。ミニマックス（すなわち、カバレッジ基準）が領域内部により多くのポイントを備えた設計を作成するのに対し、マクシミン（すなわち、拡張基準）は、領域の境界すなわち最も極端な値に多くの設計ポイントを備えた設計を作成する傾向がある。カバレッジ設計は、パラメーターｐおよびｑの選択について以下の基準を最小化する。
【０１０７】
【数３】
2005526489.tif 000004
【０１０８】
ここで、距離関数（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｔｒｉｃ）は以下のように定義される。
【０１０９】
【数４】
2005526489.tif 000005
【０１１０】
ここで、ｐ＜０およびｑ＞０である。
【０１１１】
あるいは、別の空間充填設計として、自然淘汰のモデルに一般に基づく遺伝的アルゴリズムを使用して試験ライブラリーを作成できる。遺伝的アルゴリズムは、自然淘汰と類似したやり方で、構造集団中の選択、交差および変異をコンピューターによって実行することにより構造を最適化する。所与の化合物の集団をバイナリー法構造（「染色体」）としてコード化する。それらが「複製し」、次世代に含められるチャンスはその生物学的活動に基づく。複製工程では、２つの化合物に対して染色体が単一のポイントで交差し、２つの新しい「子」化合物を生じる。変異は、配列の任意のシグナルビットをランダムに変更することにより生じる。次いで、染色体を化合物構造に解読し、次いで、それらを合成して試験する。このプロセスを次世代でも繰り返す。
【０１１２】
典型的な遺伝的アルゴリズムは以下のように実行される。
工程１．染色体、すなわち、化合物の集団を初期化する（コンピューターはこれをランダムに行うことができるが、初期集団に「種をまく」ために選択された構造を使用してもよい）。
工程２．初期集団中の各染色体を評価する（例えば、初期集団中の各ペプチドを合成し試験する）。
工程３．現在の染色体を交配することにより新しい染色体を作成して親染色体が交配する際に、変異と組み換えを適用する（これはコンピューターに与えられた化合物の特性の指標上で変異および組み換えプロセスを実行するプログラムによって行う）。
工程４．新しい染色体に場所を空けるために集団のメンバーを削除する（集団は固定サイズに保持される）。
工程５．新しい染色体を評価して、集団にそれらを挿入する。
工程６．プロセスは選択された最良の染色体を伴ってこの時点で終わることができるが、あるいは、工程３〜５を繰り返すことでさらなる世代を続けて行くことができる。
【０１１３】
遺伝的アルゴリズムを使用して、ペプチドライブラリーを選択する際には、染色体は個々のペプチドとすることができる。各アミノ酸はバイナリーストリングとして表わされる。４ビットのストリングについては、１６種類の可能な組み合わせがある。例えば、可能なアミノ酸のうちの１０個だけを使用する場合、１６個の可能な組み合わせがすべてアミノ酸に割り当てられるため、これらのアミノ酸のうちの６個は２重に表わされなければならない（例えば、Ｇｌｙは１０１０と１０１１で表わされる）。
【０１１４】
初期のテトラペプチド集団は乱数ジェネレーターによって作成することができる。この時点では合成の複雑さや各アミノ酸が各位置で表わされることなどを確実にするために構造を修正することができる。
【０１１５】
例として、以下の染色体（ペプチド）の集合が作成されると仮定する。
【０１１６】
もし、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙがバイナリーストリング１０１００１１１０００１０１０１０として、Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌが０１０１０１１０００１１００００として表わされ、コンピューターがそれらを中央のポイントで「交差する」と決定した場合、２つの新しい子供染色体／ペプチド：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌおよびＳｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙが作成され、試験するべき集団に加えられるであろう。
【０１１７】
遺伝的アルゴリズムはより詳細には、例えば、非特許文献３４および非特許文献３５に記載されている。
【０１１８】
試験化合物は第１の試験ライブラリーの化合物のすべてまたは部分集合であり得る。第１の試験ライブラリーは任意の知られた所望の基準に基づいて選択することができる。例えば、第１の試験ライブラリーはあらゆるペンタペプチド（自然に存在するアミノ酸および／または天然に存在しないアミノ酸を含む）を含み得る。あるいは、第１のライブラリーは、一組の１０個の選択されたアミノ酸を利用するあらゆるペンタペプチドを含むものでもよい。別の例として、第１の試験ライブラリー中の化合物はすべて特定の位置で、特定のアミノ酸、アミノ酸の化学クラスまたは指定されたサブユニットを有するものでもよい。例えば、第１のアミノ酸は、（ｉ）Ａｌａまたは（ｉｉ）芳香族アミノ酸として設定することができる。
【０１１９】
本発明の１つの用途は培地成分として加えた時に有効なメンバーペプチドを識別するペプチドライブラリーのスクリーニングである。この実施形態で使用されるペプチドライブラリーのアプリオリな必要条件はない。ここでも、ライブラリーペプチドのアミノ酸は、天然および／または非天然の合成アミノ酸でもよい。ライブラリーはまた、Ｄ−アミノ酸、または化学的に改変された、または誘導されたアミノ酸（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化されたものなど）を含んでもよい。さらに、ペプチドライブラリーは、可能な天然および／または合成アミノ酸のすべてではなく一部を含むと予め定義することができる。ペプチドライブラリーは、すべてのペプチドメンバーの長さに関して、例えば、同じ長さであるとか長さが制限された範囲にあるとか予め定義することもできる。あるいは、メンバーが長さにおいて異なるように、例えば、４量体、５量体および／または６量体の範囲でライブラリーを選択してもよい。メンバーがすべて同じ長さ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０など）を有するペプチドライブラリーなどが好ましい。他の実施形態では、ペプチドが約４個と約２０個の間の残基の範囲、より好ましくは約４個と約１０個の間の残基の範囲の長さを有するようにペプチドライブラリーを選択する。
【０１２０】
好ましい実施形態において、ペプチド中の１または複数のアミノ酸位置を、指定されたアミノ酸（複数可）またはアミノ酸のクラス（複数可）に固定（すなわち、非変動）するか、または制限する。例えば、位置４および５の残基を特定のアミノ酸（例えば、ＡｌａまたはＶａｌ）またはアミノ酸のクラス（例えば、芳香族アミノ酸）として固定してもよい。同様に、位置のうちの５個だけが可変で、他の位置は、任意の所望の基準（例えば、ランダムな割り当て、先行する化学知識、製造の容易さおよび／または合成コスト）に基づいて固定した２０ｍｅｒｓのライブラリーを設計することができる。
【０１２１】
当業者は、特定の位置（複数可）でのアミノ酸の選択を固定するか制限することがライブラリーのトータルサイズを縮小し、同様に、ライブラリーのペプチドを準備し試験し、リード化合物を識別し、必要ならば、さらに検討を行う時間、費用および／または技術的な困難を低減させ得るということを認識するであろう。
【０１２２】
本発明は、少なくとも１つの位置が可変でないか、制限されている（例えば、あらゆる可能なアミノ酸に対してではないペプチドとして）、化合物ライブラリー（好ましくはペプチドライブラリー）をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニングの第１ラウンドは興味のある化合物を生じ得る（例えば、培地成分）。あるいは、本明細書に記載する連続スクリーニングを行うプロセスの繰り返しを通じてリード化合物を識別する。
【０１２３】
１または複数の適当なアッセイ操作の実行することによって所望の細胞活性の存在または誘導を決定する。１つのアプローチでは、試験の必要条件を確立する基礎として一連の細胞活性を使用する。次いで、成分を変えた複数の培地試料をこの活性範囲を指標として比較して試験する。試験の必要条件は、例えば、最適の培地成分を識別する過程にあるどの段階でも決定され得る。試験の必要条件はアプリオリに設定してもよいし、あるいは、各々特定の試験化合物を含む複数の異なる培地を試験した後に決定することもできる。さらに、試験の必要条件はスクリーニングの過程で変わることもあり得る。
【０１２４】
試験の必要条件は、試験する成分が閾値（例えば、抗生物質生産を増大させる化合物をスクリーニングする場合）にこの閾値に適合するか超過しなければならないように所望の特性の閾値レベルまたは指標を表し得る。あるいは、試験の必要条件以下に入る値が目標（例えば、薬剤発酵法において菌体内毒素生産を抑える化合物をスクリーニングする場合）であるように、試験の必要条件が上限を表わすこともある。さらに別の実施形態では、試験の必要条件は所望の細胞活性の値の範囲に関するものでもよい。すなわち、試験の必要条件は、競争要因（例えば、細胞の成長対タンパク質生産）間のバランスの達成を可能にする下限と上限の両方を定めることができる。当業者は、試験の必要条件が単独で（例えば、最大の免疫原生産）得られる生物学的特性の最適のインデックスまたは最適の指標を表わし得ることを認識するであろう。あるいは、試験の必要条件は、実現可能性、コスト、時間的制約その他の所望の特性（例えば培地）に対する効果などの他の基準を考慮することもできる。
【０１２５】
別の実施形態では、試験の必要条件は自然界において定量的ではなく定性的なものでもよい。例えば、特定の応答の存否（すなわち、イエス／ノーの結果）について試験する場合、当業者は、定性的日付の計算上の分析については、定性的データポイントを定量的値（例えば、応答／応答なしは、それぞれ１／０として得点付けできる）に一般に変換されることを認識するであろう。
【０１２６】
操作は第１の試験化合物の少なくとも１つのパラメーターと第１の試験化合物の各々について測定した細胞活性と間の関係を決定するために行う。数学的な関係、好ましくはパラメーターと興味のある細胞活性の数学的構造−細胞活性関係が得られると信じられているし、そうであることが好ましい。関係を決定するために使用するパラメーターの数の特に制限はない。限定的な例ではないが、２と１０の間（両端を含む）が使用する。
【０１２７】
化合物を特徴付けるために適用することができるどのような知られたパラメーター（すなわち、記述子）も本発明を行うために使用できる。物理的、化学的（生化学を含む）、生物学的および／または位相幾何学的パラメーターは関係を決定するために使用できる。本明細書で使用する場合、「パラメーター」という用語は、非特許文献３６の原理的成分（例えば、ｚ１、ｚ２、ｚ３）を包含するものとして意図される。試験化合物について記載するために使用されるパラメーターは、選択プロセスにおいて、数およびタイプの両方が変化することがあり得る。さらに、パラメーターは分子全体のパラメーターでもよいし、配列特異的パラメーターまたは両方の組み合わせでもよい。
【０１２８】
本発明によって使用し得る実例となるパラメーターとしては、分子全体または分子の個別構成ブロック（例えば、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖単位等）の分子量、帯電量、等電点、全双極子モーメント、等方性表面積（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）、電子帯電インデックス（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｃｈａｒｇｅ  ｉｎｄｅｘ）および疎水性（例えば、ｌｏｇＰ、ＨＰＬＣ保持時間、疎水性を決定する他の知られた方法などによって測定されるものが例として挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
パラメーターの計算は、任意の知られた方法により、例えば、コンピューター化されたシステム（例えばシリコングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ）のコンピューターやＰＣ）を使用して行うことができる。全帯電量、分子量および双極子の合計は、Ｓｙｂｙｌ  ６．５（トリポス（Ｔｒｉｐｏｓ））を使用して計算できる。「Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  ｌｏｇＰ」（ＭｌｏｇＰまたはｍｌｏｇＰと呼ばれる疎水性の基準）は、Ｓｙｂｙｌプログラミング言語スクリプトを使用して計算することができる。アミノ酸についての電子帯電インデックスおよび等方性表面積の文献値は利用可能である（例えば、非特許文献３７参照）。電子帯電インデックスの変動は非特許文献３７によって使用されたＣＮＤＯ／２帯電量の代わりにＳｙｂｙｌによって与えられるＧａｓｔｅｉｇｅｒ帯電量を使用して、同様の方法で準備することができる。主要な構成要素の記述子ｚｌ、ｚ２およびｚ３は、非特許文献３６（上掲）によって与えられる。等電点の計算はＳｙｂｙｌプログラミング言語スクリプトを使用して実行することができる。
【０１３０】
試験化合物（培地成分）の少なくとも１つのパラメーターと、試験化合物の各々についての所望の細胞活性の測定指示量との関係は第２の複数の培地を識別するために利用される。第２の培地の各々は、第２の試験ライブラリーに由来する第２の化合物（複数可）を含んでいる。第２の複数の培地は、試験必要条件を満たす細胞活性を可能にするか促進すると予測される。典型的には、第２の試験化合物は未試験化合物であるが、試験化合物の第１の集合からの１または複数種の化合物が、第２の集合の試験化合物にも含まれ得る（例えば、対照として）ことを当業者は認識するであろう。
【０１３１】
特定の実施形態では、試験の必要条件を満たす化合物の総数の部分集合を含むように第２の試験ライブラリーを選択する。第２セットの試験化合物は、第２の試験ライブラリーまたはその部分集合の試験験化合物のすべてを含み得る。例えば、第２の試験ライブラリーは、培地に加えられた時に、培養されたハイブリドーマ細胞によって、あるレベルの抗体産生（つまり試験の必要条件）を可能にするか刺激すると予測される５個のアミノ酸を有するペプチドをすべて含んでもよい。あるいは、また、好ましくは、第２の試験化合物は第２の試験ライブラリーから選択され、より好ましくは代表する。さらに好ましくは、第２の試験化合物は上記の空間充填設計を使用して、第２の試験ライブラリーから選択される。あるいは、上記プロセスは、反復的に行われる。第２の試験化合物の少なくとも１つのパラメーターと測定された指標との間の第２の関係が決定され、第３の化合物ライブラリーから第３の試験化合物の集合が識別される。さらに別の方法として、第１の試験ライブラリーが適当な化合物を生じる場合、スクリーニングプロセスは、第２の試験ライブラリーを生成する必要なしに、そこで終了するか、あるいはさらなる化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０１３２】
化合物のフォローアップライブラリーを選択する過程では化学的挙動についての知識によって、本明細書に記載する体系的な方法を補うことができる。例えば、ペプチドライブラリーをスクリーニングする際に大きな芳香族残基を含むペプチドが所望の細胞活性の所望の表示を示すことが明らかになる可能性がある。したがって、フォローアップライブラリーでは、大きな芳香族残基を含むペプチドが多くなる。
【０１３３】
満足なペプチド（すなわち、試験の必要条件を満たすもの）が試験ペプチドの第１のセット中に識別されない場合は、スクリーニングプロセスを繰り返す。次いで、試験していないペプチドの第２のセットを当技術分野で知られている任意の手段によって選択でき、ペプチドの第２のセットについてのパラメーターを計算してもよい。
【０１３４】
プロセス最適化のさらなる例としては、「カクテル」すなわち培地を処方し、および最適化するのに使用される化合物の混合物を識別することができる。化合物のカクテルは単一化合物単独の結果よりも改善された結果を与えるかもしれない（すなわち、相乗作用の実証）。さらに、一旦培地成分として使用される化合物が識別されたならば、培地の基本処方はそのような化合物を含めるために再処方し得るし、そのために、さらに最終培地が改善される。
【０１３５】
基本培地はスクリーニングプロセスでの任意の時点でも再処方し得る。状況によっては、試験化合物のその活性に対するインパクトがより容易に観察されるように、特定の細胞活性に関しては次善のやり方で当初の基本培地を処方するのが有利である。スクリーニングプロセスでは、２つの異なる基本培地中の化合物を同時にまたは引き続いて平行してスクリーニングすることが有利でありうる。ここで、１つの培地は化学的に「定義されていない」が、第２の培地は化学上的により定義された培養である。
【０１３６】
「化学的に定義された」および「化学的に定義されていない」という用語は、培地について本明細書で使用する場合、当技術分野でそれらの一般的に容認された意味において使用される。一般に、「化学的に定義された」培地は、その成分が実質的にすべて知られており、知られた濃度で存在するものである。「化学的に定義されていない」培地は、ある培地成分の同一性および／または濃度が未知であり、割合的な値だけ（アミノ窒素の合計のような）が知られているかアクセス可能なものである。したがって、不確定成分を含むどのような培地も「定義されていない」と考えられる。「半定義された」という用語は、典型的には少数の不確定成分を含む培地について記載するために当技術分野で使用される。酵母抽出物およびウシ胎児血清は培地に一般に加えられる定義されていない成分の例である。
【０１３７】
培地を再処方する過程で、新しい培地に応じて細胞集団の顕著な変化の生産を回避すること（すなわち、集団のサブクローニングを回避すること）は有利かもしれない。例えば、培養された細胞を、タンパク質水解物を含む複雑な培地からより定義された培地（そこでは、選択されたペプチドがタンパク質加水分解物に代わる）に移動させる場合、培養細胞集団に変化が生じ得る。培養された細胞が、複合培地（試験化合物を加えたものでも加えていないものでもよい）中でその成長能力を保持することが望ましい。上に記載した並列スクリーニングプロセスによれば、研究者によって再処方された培地中で培養された細胞の特性を維持することが可能である。さらに、定義されていない培地および定義された培地において細胞の生存および成長を並列的に調べることによって、両方のタイプの培地の能力を増強する化合物を識別することが可能である。
【０１３８】
したがって、１つの実施形態では、生物活性物質は化学的に定義されていない培地中、化学的に定義された培地、またはその両方で（並列的に）、細胞活性に対するその効果に関してスクリーニングされる。
【０１３９】
化学的に定義された培地も定義されていない培地も、２次元でも３Ｄ培養条件でも、生物活性表面上で細胞をスクリーニングし成長させるのに用いることができる。
【０１４０】
生物活性物質を培地に加えるスクリーニングに先立って、細胞をその現在の成長培地およびスクリーニングプロセスで使用する基本培地を通して少なくとも１回「サイクリング」することにより、培養した細胞を「調整し」または「適応させ」ることができる。典型的には、スクリーニングの基本培地が化学的に定義されている一方で、本発明の成長培地は定義されていないか、半定義された培地である。この調整／適応プロセスは、細胞が両者（その前の培地となる現在の培地および新しい基本培地）中で成長する可能性を増加させるであろう。細胞系統を調整／適応させることにより、成長アッセイの再現性が増す結果となり、そしてそのためにアッセイの解像度を増す。さらに、上記のように、細胞が化学的に定義された培地と化学的に定義されていない培地の両者において成長できる場合、望ましい培地成分を識別することはより容易になり得る。
【０１４１】
さらに任意選択的な工程として、細胞は、試験化合物に露出されるに先立ち、試験化合物を欠く基本培地だけの中で１回または２回のインキュベーションを経由させてもよい。このような条件に細胞をさらすことには２重の効果がある。第１に、それは、前の培地から新しい培地まで定義されていない培地成分の繰り越しを防ぎ、それにより、スクリーニング結果の意図しない歪みを回避する。第２に、このような一時的なインキュベーションにより細胞を新しい基本培地に適合させることができ、そのために、新しい培地を使用して得られた結果が基本培地自体ではなく試験化合物を加えた効果と考える蓋然性を増加させる。
【０１４２】
本発明の方法（および特許文献２に記載した方法）を使用して得られた結果は、必ずしも完全に定義された培地をもたらすものではない。言い換えれば、本発明のスクリーニングプロセスを通して発見され最適化された最終的な培地処方は、様々な定義されない成分（例えば、血清、タンパク質加水分解物など）を含んでもよい。
【０１４３】
本明細書（および特許文献２）に記載された本発明のスクリーニング方法は、定義されていないタンパク質成分を含まない基本培地を使用して行うことができる。あるいは、試験化合物の効果は、定義されていないタンパク質成分の存在と紛れてしまわない限り、基本培地は定義されていないタンパク質成分を含んでもよい。１つの実施形態では、スクリーニングプロセスで使用する基本培地中には、好ましくは約３０％（ｖ／ｖ）未満、より好ましくは約２０％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む。基本培地中の好ましい血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）から約３０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１％（ｖ／ｖ）から約３０％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは約５％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。血清の源としては、ウシ胎児（子牛）血清、成牛、馬血清、ヒト血清等（好ましくは血液型ＡＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
動物血清に加えて、培地に使用される他の定義されてないタンパク質成分としては、トリプトン、プロテアーゼ−ペプトンなどの加水分解物（例えば、酵素消化物）、抽出物（例えば、酵母抽出物）および浸出液（例えば、脳心臓浸出液などの器官または組織の浸出液）が挙げられるが、それらの用語は当技術分野で理解される通りである。定義されていないタンパク質の源は、酵母、屠殺場屑、ミルクまたは他のタンパク質（例えば、ゼラチン）でもよいし、または動物の組織または器官でもよい。
【０１４５】
本明細書に定義されるように、「誘導物質」または「誘導剤」は、成長または分化のような所望の細胞活性を促進するように作用する物質である。可能性のある誘導物質または知られた誘導物質は、本明細書ではさらに「生物活性」物質であると特徴付けることができる。本明細書に記載される生物活性表面および培地成分は、３Ｄ足場または３Ｄ培養それ自体の構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を含む材料またはその任意の組み合わせと同様に、培養した細胞に対して誘導物質の役割を果たし得る。したがって、誘導物質は、細胞培養材料または容器の表面もしくは領域の形で提供してもよく、そうすることで、細胞成長および／または細胞分化は、細胞付着抵抗性材料および／または生物活性物質の形で（これは、不均一にまたは培養容器表面の個別領域（スポット、ドット、マイクロアレイ）の形で提示され得る）支持体表面に導入された成長または接触表面の表面特性によって促進することができる。
【０１４６】
多数の細胞タイプのうちのいずれも、本発明の装置および方法に使用できる。１つの所望の細胞タイプは幹細胞である。「幹細胞」はここでは、専門化し分化した細胞をさらに生じさせる間に培養中、連続的に分裂する能力を有する細胞として定義される。成熟細胞または分化した細胞の形態やマーカー特性を欠き、それらは分化していないか、または比較的分化していない。幹細胞は、一般に、その発展的、すなわち、分化可能性によって特徴付けられる。したがって、本当に、「分化全能の幹細胞」は、胚、胚外の膜および組織、およびすべての後胚組織および器官になる能力を有する。
【０１４７】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞またはＥＳＣとも呼ばれる）は、胚組織から分離される一種の中立的な（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）分化全能の幹細胞である。胎児に注入した場合、ＥＳＣは、機能的な配偶子と同様に身体のあらゆる細胞系統を生じることができる。未分化状態では、ＥＳＣはアルカリホスファターゼに陽性であり、胚性幹細胞および胚性生殖細胞に特有の免疫学的マーカー特性を発現し、テロメラーゼを発現して、延長された自己更新能力を保持する。分化に際して、ＥＳＣは外胚葉、中胚葉、内胚葉起源の種々様々の細胞タイプになる。ＥＳＣは、胚盤胞内細胞塊から、またはマウス、ウサギ、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ヒトを含む霊長類、胚の生殖隆起から分離される（例えば、非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０参照。これらはすべて参照により本願に組み込まれる）。
【０１４８】
正常な胚の発生では、分化全能細胞が増殖し、主要な胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）を形成して、様々な細胞系統（細胞系統コミットメント）に分離する。これらの胚葉細胞はさらに、前駆体細胞系統中への発展的な細胞系統コミットメントを通じて、さらに細胞の分化経路を規定し、その最終的機能を定義する。
【０１４９】
生命体中の細胞の大多数は発生と分化を経る細胞の成長シーケンスの結果であるが、少数の細胞はこの経路を外れて保存された幹細胞になり、幹細胞プール（これは必要に応じて生命体を「修理」する助けとなり得る）の継続維持に寄与できるようである。そのような細胞をここでは成体幹細胞（ＡＳＣ）と呼ぶ。ＡＳＣは万能幹細胞としても前駆幹細胞としても知られている細胞を含む。「前駆幹細胞」は（培地または基材に加えられ得る誘導物質に関わらず）特定の細胞系統に関わる細胞である。その結果、前駆幹細胞はそれぞれの各胚葉内の単一系統に限られた子孫、例えば肝臓、甲状腺（内胚葉起源）；筋肉、骨（中胚葉の起源）、ニューロン、メラノサイト、表皮の細胞（外胚葉の起源）を生じさせる細胞である。ＡＳＣは静止していて増殖不能であることもある。対照的に、細胞系統の関わる前駆幹細胞は、自己複製できるが、プログラム化された老化が現われる前に限定された寿命を有することもある。
【０１５０】
生命体中の細胞の大多数は発生と分化の順序を経る細胞の成長の結果であるが、少数の細胞はこの経路を外れて保存された幹細胞になり、幹細胞プール（これは必要に応じて生命体を「修理」する助けとなり得る）の継続維持に寄与できるようである。そのような細胞をここでは「成体幹細胞」（ＡＳＣ）と呼ぶ。ＡＳＣは「万能幹細胞」としても「前駆幹細胞」としても知られている細胞を含む。「前駆幹細胞」は特定の細胞系統に関わる細胞である。その結果、前駆幹細胞はそれぞれの各胚葉内の単一系統に限られた子孫、例えば肝臓、甲状腺（内胚葉起源）；筋肉、骨（中胚葉の起源）、ニューロン、メラノサイト、表皮の細胞（外胚葉の起源）を生じさせる細胞である。ＡＳＣは静止していて増殖不能であることもある。対照的に、細胞系統を関わる前駆幹細胞は、自己再生できるが、プログラム化された老化が現われる前に限定された寿命を有することもある。
【０１５１】
前駆幹細胞はさらに、「分化多能」、「分化少能」または「分化単能」に分類することができる。本明細書において、「分化多能前駆細胞」は、細胞系統内の多数の細胞タイプを形成する。「分化単能前駆細胞」は単一のタイプの細胞を形成する。「分化少能幹細胞」は細胞系統内のあらゆるタイプではないが１種類を超えるタイプの細胞を形成する。
【０１５２】
説明的に言えば、成熟中枢神経系（ＣＮＳ）は３つの主要な細胞のタイプを含む：ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞である。分化単能の神経前駆細胞（ＮＰＣ）は専ら（かつ変わることなく）単一タイプのニューロンまたは星状膠細胞、または乏突起膠細胞を生じる。分化少能ＮＰＣは、（ａ）多数の様々なニューロンの発現型のニューロン（例えば、知覚のニューロンまたは運動ニューロン）を生じるが、星状膠は生じないか、（ｂ）１つのタイプのニューロンおよび１つのタイプのグリア細胞を生じるか、または、（ｃ）星状膠細胞および乏突起膠細胞を生じるがニューロンは生じない。対照的に、「分化多能」ＮＰＣは、３つのＣＮＳ細胞系統すべての子孫細胞を生成する。
【０１５３】
「分化多能幹細胞」は（複数の胚の胚葉に由来する）生命体中のほとんどの組織を生じさせることができる幹細胞である。分化多能の幹細胞は任意の特定の組織系統に関わらない（「細胞系統中立」）。それらは、
（ａ）内胚葉起源、以下に限定されるものではないが、上皮細胞またはその誘導体および／または気管、気管支、肺、消化管、肝臓、膵臓、膀胱、咽頭、甲状腺、胸腺、上皮小体、鼓室、耳管、扁桃腺の実質組織など
（ｂ）中胚葉起源、以下に限定されるものではないが、骨格筋、平滑筋、心筋、白色脂肪、褐色脂肪、結合組織隔膜、緩い輪状結合組織、繊維器官カプセル、腱、靭帯、真皮、骨、硝子軟骨、弾性軟骨繊維軟骨、関節軟骨、骨端軟骨、内皮細胞、髄膜、骨膜、軟骨膜、赤血球、リンパ細胞、単球、マクロファージ、小グリア細胞、形質細胞、マスト細胞、樹状細胞、巨核球、破骨細胞、軟骨吸収細胞、リンパ節、扁桃腺、脾臓、腎臓、尿管、膀胱、心臓、精巣、卵巣、子宮など；
（ｃ）外胚葉起源、以下に限定されるものではないが、ニューロン、乏突起神経膠細胞、星状細胞、網膜、松果体、前部脳下垂体、後部脳下垂体、表皮、毛髪、爪、汗腺、唾液腺、皮脂腺、乳腺、歯、内耳、眼のレンズなど
の細胞を生じさせることができる。
【０１５４】
分化多能の細胞は静止しているままでもいられるが、増殖を刺激することができ、細胞系統中立なまま広範囲な自己再生ができる。分化多能の細胞は、その寿命中であればいつでも、単一のクローンから様々な細胞系統に関わる前駆細胞を作成することができる。細胞系統への関与は、１または複数の誘導剤の影響下に生じる。一旦、特定の組織系統に関わるように誘導されると、分化多能の幹細胞は、その系統に特有の前駆細胞の特性を備えるようになる。
【０１５５】
前駆細胞の例としては、分化単能な筋肉のマイオサテライト（ｍｙｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）筋芽細胞；脂肪組織の分化単能アディオブラスト(ａｄｉｐｏｂｌａｓｒｔ）細胞、分化単能コンドロジェニック（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）細胞、および軟骨膜および骨膜の骨形成細胞が含まれるが、これらに限定されない。分化少能幹細胞は、脂肪組織の分化少能アディポフィブロブラスト（ａｄｉｐｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を含む。好ましいタイプの分化多能の幹細胞は、骨髄の造血幹細胞であり、これは末梢血や臍帯血中にも見出される。他の分化多能細胞は、結合組織に対する分化多能間葉細胞である。
【０１５６】
本発明は任意のタイプの幹細胞またはそこから由来する細胞集団（クローン集団を含む）を使用することができる。幹細胞は任意の生命体に由来するものでよいが、ヒトやヒト以外の霊長類、さらには、げっ歯動物、ウマ科、イヌ科あるいはウサギ目の動物を含む哺乳類幹細胞が好ましい。
【０１５７】
本発明の方法では、当技術分野で知られているどのような適当な手段を使用して細胞活性を評価してもよい。適当な生物活性物質および表面、適当な培地成分をスクリーニングする場合や、生物活性物質／表面培地成分の相乗効果を試験する場合、細胞活性を評価する。実施形態によっては、生物活性表面および培地成分を、本発明の装置を使用し好ましくは３Ｄ足場の存在下でスクリーニングする。
【０１５８】
本発明でスクリーニングされる重要な細胞活性は、細胞の成長あるいは増殖のそれである。多数のアッセイおよびアプローチが、細胞の増殖の評価のために開発されており、染色後の顕微鏡観察に基づくもの、比濁測定法や分光分析法（比色定量および特定波長での光吸光度の測定を含む）、自動細胞カウンターおよび／または自動プレートカウンターでの直接的な細胞の計数、全細胞のＤＮＡおよび／またはタンパク質の測定、電場のインピーダンス（例えば、コールターカウンター）、生物発光、二酸化炭素の生産、酸素消費、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）生産その他が挙げられる。ある種の測定では酸素バイオセンサー（例えばベクトンディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（マサチューセッツ州ベッドフォード所在）（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用することもできる。
【０１５９】
分化は、発現分析（例えば、ｍＲＮＡ発現）、免疫学的分析および組織化学的分析またはその組み合わせによって評価することができる。例えば、特定の生物活性物質が単独でまたは１または複数種の特定の培地成分および／または３Ｄ足場と共に細胞分化を誘導するかどうか決定するためには、ある遺伝子に対応する核酸の発現を分析することができる。そのような分析方法は当技術分野においてよく知られており、増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅など）およびノーザン分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）におけるようなプローブ配列のハイブリダイゼーションを含む。ノーザンブロットは、既知の（または未知の）遺伝子の発現を調べるものである。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーを作成するか、本発明の３Ｄ足場とともに供試生物活性物質と培地成分に露出させる前後に、幹細胞中でまたは幹細胞に由来する細胞中で発現する遺伝子のディファレンシャルディスプレイを観察してもよい。例えば、マイオジェニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）ｍＲＮＡ翻訳の存在およびＭｙｏＤ１遺伝子発現を評価するために、分化多能の幹細胞クローン中での筋形成の誘導の測定指標としてノーザン分析を使用した（例えば、特許文献４。参照によって本願に組み込まれる）。
【０１６０】
さらに、分化を評価するためには、抗原への抗体の結合（その発現は細胞の表現型または分化段階の特性である）の評価を用いる。本明細書で使用する場合、「抗体」は任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、または抗原結合力（＝エピトープ結合力）のある断片である。この用語はポリクーナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を包含する。後者は、特許文献５および特許文献６に記載されている。
【０１６１】
本発明の方法は、幹細胞、分化した子孫細胞もしくは幹細胞、またはそのような幹細胞もしくは子孫を含む組織を認識しこれに結合するのに十分な検出可能な標識抗体を用いる免疫アッセイを使用して細胞試料を検査することを含む。
【０１６２】
ポリクーナル抗体を生産する方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、特許文献７（Ｎｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．）参照。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそこから誘導されるＦａｂ鎖は、従来の方法およびハイブリドーマ技術を使用して調製できる。例えば、非特許文献４１および非特許文献４２参照のこと（これらは参照によって本願に組み込まれる）。
【０１６３】
例えば、１つの実施形態では、対象とするエピトープを発現する分化した細胞の存在は、そのエピトープに対する検出可能な標識１次抗体によって検出されるか、あるいは、好ましくは、非標識１次抗体および検出可能な標識２次抗体（１次抗体のＩｇアイソタイプに特異的なもの）によって検出されるであろう。細胞に結合した検出可能な標識抗体の存在は、特定タイプの標識に特異的な任意の適当な方法を使用して測定される。細胞にこの抗体が結合していれば分化を示す。結合した抗体の測定を可能にする方法の使用を、本願では「抗体の可視化」とも呼ぶ。
【０１６４】
最も一般的に使用される抗体標識は、放射性核種、酵素、紫外線に露出された時に蛍光を発する蛍光剤、ルミネッサー（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）などである。標識として有用な適当な蛍光剤としては、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローなどを含む多数が知られている。タンパク質にこれらの標識をコンジュゲートさせる方法はよく知られている。好ましい放射性核種は、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57ＣＯ、59Ｆｅ、125Ｉおよび131Ｉからなる群から選ばれる。
【０１６５】
特定の検出材料はヤギにおいて調製されイソチオシアネートを介してフルオレセインと結合した抗ウサギ抗体である。
【０１６６】
酵素標識は同様に有用で、目下利用されている比色定量の技術、分光測光法の技術または蛍光測定の技術のうちのどれによってでも検出することができる。酵素は、カルボジイミド類、ジイソシアネート類、グルタルアルデヒド類その他の橋掛け分子との反応によって抗体または粒子と複合化させる。多数の酵素が、免疫測定のための検出できる標識として知られているが、好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ウレアーゼおよびアルカリホスファターゼである。
【０１６７】
細胞分化が生じたかどうか判断するため、分化マーカーに対する抗体で培養中の細胞を処理する。ニューロン、骨細胞などの細胞を識別する抗体が知られている。限定的なものではないが、特定の細胞タイプを示すマーカーを検出するのに有用な抗体の例としては下記のものが挙げられる：筋肉を示す中胚葉性マーカー（例えば、マイオジェニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）［Ｆ５Ｄ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ  （ＤＳＨＢ）  ］、筋節ミオシン（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  ｍｙｏｓｉｎ）［ＭＦ−２０  （ＤＳＨＢ）］、速骨格筋  ［ＭＹ−３２，  ｓｉｇｍａ］、ミオシン重鎖［Ａ４．７４］（ＤＳＨＢ）、平滑筋［平滑筋α−アクチン，  ＩＡ４  （Ｓｉｇｍａ）  ］、軟骨（ＩＩ型コラーゲン［ＣＩＩＣＩ，  ＤＳＨＢ］、骨（骨シアロタンパク質［ＷＶＩＤＩ，  ＤＳＨＢ］、内皮細胞（内皮細胞表面マーカー［Ｈ−Ｅｎｄｏ，  Ａｃｃｕｒａｔｅ］  ）；内胚葉マーカー（α−フェトタンパク質［ＨＡＦＰ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］）、上皮細胞［ＨＡ４ｃｌ９，  ＤＳＨＢ］  ）および外胚葉マーカー（例えば、神経前駆細胞［ＦＯＲＳＥ−Ｉ，  ＤＳＨＢ］、ネスチン［ＲＡＴ−４０１，  ＤＳＨＢ］、ニューロン［８Ａ２，  ＤＳＨＢ］  ），ニューロフィラメント［ＲＴ９７，  ＤＳＨＢ］。
【０１６８】
組織化学は細胞形態および分化を評価するために使用することができる。そのような特性はニューロンの発現型の表示としては中央に位置する円形領域とクモのような細胞突起または細胞内繊維を備えた長い多角形の細胞；肝臓細胞を示すものとしては、中央に核を、核周辺に小胞を備えた小さな丸い多核または２核細胞の存在；骨格筋を示す多核の線形および枝分かれ構造の存在を含み、また、アルカリホスファターゼ活性は骨分化を示し得る。硝酸銀を使用したカルシウム沈殿も骨分化を識別するために使用できる。
【０１６９】
一旦先の装置および方法を使用して、好ましい培地成分および生物活性表面が識別されたならば、それらを３Ｄ足場の組立てに適用することができる。したがって、好ましい生物活性表面を有する足場が形成され、本発明の方法においてそれらを使用することにより、培養中に所望の細胞活性を誘導することが可能になる。１つの実施形態では、３Ｄ足場間の領域の支持体表面に細胞が付着するのを防ぐために、これらの３Ｄ足場を低親和性支持体表面に配置する。必要な場合、これは、足場それ自身への細胞付着を最大にする。
【０１７０】
１つの実施形態では、細胞を、選択された培地成分を含む培地の存在下、選択された生物活性表面を有する３Ｄ足場上で、またはその中で培養する。この実施形態では、３Ｄ足場はバイオリアクター中に入れられ、細胞は三次元の足場に捲種されインキュベートされる。「バイオリアクター」は、細胞をバイオプロセシングして所望の組織を生産するためにするために使用される任意の適当な容器を指す。バイオリアクターにより、栄養素の適当な供給を維持することができる。成長のコントロールは、インラインでのモニタリング、およびバイオリアクター内のｐＨ、酸素、グルコースおよび機械的圧力の調節によって増強されるかもしれない。選択された生物活性表面を有する３Ｄ足場を含むバイオリアクターは本発明の装置の１つの実施形態である。そのような装置の別の実施形態はさらに、選択された生物活性成分を含む培地を含む。この装置の別の実施形態は、培養すべき細胞をさらに含む。
【０１７１】
本発明の方法および装置は高い処理能力フォーマットで使用することができる。多数の高処理能力の培養システムおよび分析システムが当技術分野において知られており、典型的には共通のコンポーネントまたは装置を含む。例えば、本発明によれば、細胞の分配および組み合わせ培地の最適化は微量流体の取り扱いを用いて行ってもよい。微量流体工学は細胞処理および細胞分配に対応し、これに適合するかもしれない。二、三のものを挙げれば、生体試料吸引のための小液体試料を正確に取り扱うための方法および装置は特許文献８に、試薬の保管および送達は特許文献９に記載されており、臨床診断および化学合成のための分割された超小型電子技術と流体装置配列および化学合成は、特許文献１０に記載されている。
【０１７２】
（０１６３）スタンダード９６，３８４、１５３６ポリスチレンマイクロプレート、ＢＤＴ  １５３６、バーチャルポリスチレンマイクロプレート、標準ポリスチレンスライドおよびＢＤＴポリスチレンマイクロスライドは本発明における使用に望ましい支持体表面である。
【０１７３】
さらに、インキュベーターを微量流体取扱器に接続してもよく、これによって支持体表面を低親和性および生物活性物質で被覆し、細胞を導入し、画像化装置を使用して細胞の画像化を行い、成長と分化を観察することができる。
【０１７４】
蛍光性細胞を顕微鏡で画像化し、空間的分布およびこれらの細胞に生じている一時的な変化に関して情報を抽出するための多数の方法が知られている。そのような方法の多くおよびそれらの適用例が非特許文献４３に記載されている。これらの方法は、細胞の蛍光性リポーター分子の分布、量および生化学的環境について、高い空間的および時間的な分解能で画像化測定を行うために少数の標本を調製するように設計され最適化されてきた。
【０１７５】
ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）（セロミックス（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）社、特許文献１１）は、特定の細胞活性に対する効果について多数の化合物をスクリーニングする目的で、細胞上または細胞中の発光標識されたリポーター分子の分布、環境または活性を決定するための光学システムである。ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）システムを使用する際に、ユーザーは、アレイ状の位置に発光リポーター分子を含む細胞を用意し、各位置で細胞をスキャンし、光学的情報をデジタルデータに変換し、デジタルデータを使用して細胞中の発光標識リポーター分子の分布、環境または活性を決定する。ＡＲＲＡＹＳＣＡＮ（商標）システムは、データを処理、表示および格納するための装置およびコンピューター化された方法を含む。このシステムは、大きなマイクロプレートフォーマットを使用して、高細胞含有量の細胞ベーススクリーニングを提供するだけでなく、高い処理能力と高細胞含有量の細胞ベーススクリーニングの組み合わせを実現する。分化を検出するため、この装置およびシステムを本発明に従い使用してもよい。
【０１７６】
本発明の１つの実施形態においては、非特許文献４４に記載されているような画像化装置を使用することができる。これは、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）で予め処理した細胞の相対数をインサイチュで定量するための半自動式蛍光デジタル画像化システムである。このシステムは様々な組織培養プレートフォーマット、特に、９６−ウェルマイクロプレートを利用する。システムは、機械駆動式ステージ、ビデオカメラ、イメージインテンシファイアーおよびマイクロコンピュータをＰＣビジョンディジタイザーとともに備えたエピフルオレセンス倒立顕微鏡からなる。ＴｕｒｂｏＰａｓｃａｌ（商標）ソフトウェアでステージをコントロールし、プレートを走査し、ウェル当たり多数の画像を得る。ソフトウェアでウェル当たりの蛍光合計量を計算し、日常的な校正を行い、様々な組織培養プレートフォーマットに合わせて調整する。デジタル画像の閾値設定を行い、生体観察用蛍光性試薬（これは生細胞中でのみ蛍光を発する）を使用した。これは、過剰の蛍光試薬を除去することなくバックグラウンド蛍光を低減するためである。
【０１７７】
本発明はまた、薬剤標的の識別および確認をするための新規な方法およびアプローチを提供する。この方法は迅速かつ効率的であり、異なるクラスの多数の要因を試験して薬剤標的を識別し、究極的には識別された標的に特異的な薬剤の識別を可能にする。本発明の方法で「プローブ」として用い得る因子としては、タンパク質（例えば、様々な成長因子、生存因子、サイトカイン、形態形成タンパク質、死リガンド）などの可溶性因子、小さな分子（例えば、ペプチド、ステロイド、他の天然または合成有機化学物質）；無機塩類のイオン（Ｃａ++、Ｚｎ++）が挙げられる。細胞活性に影響を及ぼす因子の別のクラスはＥＣＭ分子であり、これらは組織化された組織に存在するためにインビボではしばしば「不溶性の」形態で作用する。ＥＣＭタンパク質の例は上に論じた通りであり、分子を含む（１）ビトロネクチン、フィブロネクチン、テネイシン、ラミニン、コラーゲンなどのタンパク質；（２）ヘパラン硫酸塩プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、アグレカン、デコリン、ビグリカンなどのプロテオグリカン（ＰＧ）；（３）ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸塩（ＣＳ）、ケラタン硫酸塩（ＫＳ）、ヘパラン硫酸塩（ＨＳ）およびデルマタン硫酸塩（ＤＳ）などのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が挙げられる。
【０１７８】
本発明の方法は、高い処理能力および効率的なシステムにおいて、例えば、本明細書に記載する一般的な発見方法とともに使用して、多数の環境「因子」（成長因子、ＥＣＭ分子および、例えば、細胞培養添加物として試験されるペプチドライブラリー由来のペプチド）の組み合わせの機能的な効果を決定するために使用することができる。この方法によれば、標的のスクリーニングにおいて、既知または未知の機能を備えた遺伝子産物が使用できる。
【０１７９】
標的発見方法は、以下の工程に分けて見ることができる：
（１）一般に被験者の疾患組織に由来する異常な（例えば、腫瘍）細胞、および同様の組織に由来する「ペアになった」正常な細胞を対として取得する工程；
（２）選択された細胞活性または機能、例えば、細胞成長、細胞分化、１または複数のタンパク質または他の生体分子の濃度、タンパク質の活性（例えば、酵素活性）などを反映した情報を（一般に実験／分析データの形で）得るために、これらの２つのタイプの細胞を、薬剤標的となり得る候補として選択された複数の異なる因子を含む体系的な培養環境に露出する工程。環境は、３Ｄ足場およびマイクロアレイフォーマットを含む本明細書に示す様々なフォーマットで細胞に提示することができる。
（３）上記のようにして得られたデータを、適当に高度な統計的技法（ペアになる正常細胞と比較して、異常な細胞の細胞活性に差異の効果がある因子のセットまたはクラスを識別するために本明細書に記載したものなど）を使用して分析する工程、
（４）１または複数の生化学経路（例えば、上記のようにして識別された因子のセットまたはクラスによって影響を受ける代謝または情報伝達経路）を標的として識別する工程、および任意選択的に、
（５）選択された経路においてまたは経路上で作用する既知のアンタゴニストまたはアゴニストを試験することにより上に識別された標的を確認する工程。
【０１８０】
この体系的なアプローチにおいて測定され得る細胞活性のタイプとしては、培養中の細胞の成長および／または分化が挙げられるが、これに限定されない。応答の例としては、細胞の増殖または細胞分化の刺激または阻害、（１）転写、（２）翻訳、（３）翻訳後処理、（４）細胞内輸送、（５）細胞外への分泌、（５）ペプチドまたはタンパク質のターンオーバー、（６）炭水化物、脂質、核酸およびステロイドを含む化合物クラスに由来する非タンパク質分子および代謝物質の合成、処理および／または分泌、を含む任意のレベルで生じた変化に起因する細胞産物の変更された生産または分泌である。他のタイプの応答は、抗生物質および生体異物などの外来分子のターンオーバーまたは代謝である。
【０１８１】
好ましい細胞活性の基準として選択され得るタンパク質としては、表面抗原、毒素、抗体、ホルモン、成長因子、サイトカイン、凝固因子、酵素などが挙げられる。
【０１８２】
１つの実施形態では、細胞の増殖が測定対象機能である。細胞の増殖は、当技術分野で知られている様々な技術、例えば、（１）染色および顕微鏡観察によって、（１）比濁測定法、（２）分光分析法（比色定量および特定波長での光吸光度の測定を含む）、自動細胞カウンターおよび／または自動プレートカウンターでの計数、全細胞のＤＮＡおよび／またはタンパク質の測定、電場のインピーダンス、生物発光、ＣＯ2、酸素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）生産または消費その他によって、または酸素バイオセンサー（ベクトンディキンソン、ベッドフォード、ＭＡ）を使用して評価することができる。
【０１８３】
分化を評価するために抗体も使用できる。「抗体」という用語は、任意の免疫グロブリンをも含むように意図され、場合によっては特定のエピトープを結合する抗体および断片を指す。当業者にはよく知られているように、この用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体を包含する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産する方法は、当業者によく知られている。抗原抗体複合体の可視化のために一般に使用される標識は放射性元素、酵素、紫外線に露出された時蛍光を発する化学物質などである。標識として使用するのに適した蛍光材料は、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシファーイエローなどを含む多数が知られている。１つの特定の実施形態においては、ヤギにおいて調製されイソチオシアネートを介してフルオレセインと結合した抗ウサギ抗体が使用される。抗体は、例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、59Ｆｅ、125Ｉおよび131Ｉなどの放射性元素で標識することもでき、標準的な計数方法によって検出される。
【０１８４】
ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ウレアーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素も、標識化し、比色定量の分光分析法および蛍光分光分析法を用いて検出することによって分化を検出するために使用できる。
【０１８５】
細胞（複数可）は、それらが疾病状態または疾患に起因するか（または結果としてそうなる）特性または機能を変化させる場合には「異常な」ものも包含する。本発明では疾患または障害に由来する任意の異常な細胞（培養のために分離および準備でき比較できる程度すなわち正常細胞と「ペア」になる程度に得られるもの）を使用することが可能である。
【０１８６】
本発明が対象とし得るに疾病または疾患のいくつかのクラスおよび具体例は、（ａ）神経疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病）；（ｂ）糖尿病、ゴーシェリ（Ｇａｕｃｈｅｒｉｅ）病およびファブリー病（Ｆａｂｒｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）などの脂質蓄積疾患を含む代謝性の疾患および障害；（ｃ）肉腫、癌腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、乳頭腫などの良性および悪性の任意の腫瘍を含む。また、本発明の方法は、結腸癌および結腸−直腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、肺癌などの固形癌ならびに明細胞腎細胞癌またはウィルムス腫瘍などの腎臓癌、神経膠腫、星細胞腫および良性および悪性の髄膜腫などの脳癌などに対する薬剤標的を評価するのに用いることができる。
【０１８７】
本発明の実施においては、関心のある異常細胞の集団（例えば、固形腫瘍由来のもの）を比較し得る正常細胞（例えば、同一被験者において正常な周辺組織に由来するもの、または異なる個体から得た比較可能な正常な組織に由来するもの）と共に分離する。次いで、これらの「ペアになった」正常細胞および異常細胞を、より高濃度であるか（細胞系統および本来の異常な細胞および正常な細胞の特徴を維持する程度に）純化された「１次細胞」を分離して得るための期間培養する。
【０１８８】
次いで、正常な細胞集団と異常な細胞集団に対する効果の異なる薬剤または化学物質を識別する目的で、このようにして得たこれら２つの細胞集団を複数の異なる因子に、本明細書に記載したフォーマットで露出し、少なくとも１つの細胞の応答または活性（例えば、細胞の増殖）を測定する。これは、例えば異常な細胞の増殖を抑制するか、正常な細胞の増殖を刺激するか何の効果も有しない物質であり得るし、あるいは異常な細胞においては分化を誘導し正常な細胞においては何の効果も有しない物質であり得る。１または複数種のそのような物質が識別される場合、薬剤または化学物質によって影響を受ける生化学的経路またはレセプターを識別することが可能であり、試験すべき薬剤または化学物質を有効である可能性のある薬剤のクラスまたはセットとして示唆する。このように識別された生化学経路またはレセプターは、その経路またはレセプターについて知られたアゴニストまたはアンタゴニストの効果を２つの集団で比較することによりさらに試験して確認できる。このようにして、本発明は、薬剤標的の識別および新しいクラスの医薬品を体系的かつ効率的かつ迅速に識別する方法を提供する。
【０１８９】
本発明について一般的に記載してきたが、以下の例を参照することによって本発明はより容易に理解されるであろう。但し、これらの例は例示のためのものであり、特に断らない限り、本発明を限定ことを意図するものではない。
【実施例１】
【０１９０】
表面で使用するために最適な生物活性物質を発見するのに使用したコーティングプロセス
この例において支持体表面として使用したＢＤＴ  １５３６バーチャルプレート（ベクトンディキンソン、マサチューセッツ州ベッドフォード所在）  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）は、疎水性材料で処理した平らなポリスチレンシート表面であり、この処理により、等ピッチで、かつ標準１５３６ウェルマイクロプレートと同じ直径のバーチャルウェルを形成したものである。ＢＤＴ  １５３６バーチャルプレートはまた、標準的な顕微鏡用スライドと同じ寸法を有しているが、標準の９６または３８４ウェルマイクロプレートと同じピッチで正方形を形成するように切れ目を入れる（ｓｃｏｒｅｄ）。
【０１９１】
表面の調製および改変は以下の基本的工程を使用して行う（より詳細で模式的な例示については、同一出願人による、本出願と同日に出願された同時係属中の米国特許出願連続番号            、リーブマン−ビンソンら（Ｌｉｅｂｍａｎｎ−Ｖｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の”Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｒｅｓｉｓｔｉｎｇ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ”を参照（これは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）。
（１）例えば、酸化性プラズマ処理またはアンモニアプラズマ処理を使用した表面前処理。
（２）任意選択的に、ＰＥＩ、ＰＬＬなど（上記参照）の遊離アミノ基を有するポリカチオン性物質による処理
（３）ＣＡＲ材料（ここではＨＡ）によるコーティング、
（４）穏やかな酸化剤（ここでは過ヨウ素酸ナトリウム）によるＣＡＲ材料の穏やかな酸化
（５）生物活性物質の堆積および還元アミド化による酸化したＨＡへの結合。
【０１９２】
スライドを酸化性プラズマで処理して表面を活性化する。その後、ＰＥＩ水溶液でスライドを覆い、２時間インキュベートする。スライドは水で洗浄してから乾燥させる。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ピアス（Ｐｉｅｒｅｃｅ）（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を含むＨＡのバッファー溶液を加えて反応基を付与する。ＥＤＣはカルボジイミドの水溶性の誘導体であり、カルボニル（またはリン酸）を活性化してｏ−アシルイソ尿素−尿素誘導体を形成することにより、カルボン酸（またはリン酸）とアミンの間のアミド結合の形成を触媒する。これらの基は、表面に化合物を共有結合的に結合させることができる。スルホ−ＮＨＳは水溶性で、カルボン酸の活性化のための基を残す。
【０１９３】
次に、スライドはバッファーで洗浄し１〜２時間乾燥させる。スライドを光から保護し、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。バッファーで洗浄し乾燥させた後、ペプチドなどの生物活性物質を光から保護し、スライド表面に（遊離アミンを酸化したＨＡに結合して）連結する。スライドを、水、塩および酢酸の混合物で洗浄し、次に水で洗浄し乾燥させる。ペプチドをグリッドまたはマイクロアレイパターン中に堆積させる。
【０１９４】
ＥＣＭ分子またはペプチドなどの生物活性物質を酢酸ナトリウムまたは他のバッファーに溶解し、ＨＡの酸化後に堆積させる。いくつかの生物活性物質の溶液での粘性は室温で明白である。減少した粘性は、４℃で明白である。室温または４℃でピペッティングが容易になり、安定性が増強する。ＥＣＭ分子の堆積を好ましくは暗所で行う。無菌状態は要求されない。生物活性物質を堆積させたスライドは１時間以内に使用できる。
【０１９５】
図３は、上記のように改変した支持体表面に連結された生物活性物質のマイクロアレイを描く。ビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）（商標）コラーゲン、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、マトリゲル（商標）、コラーゲンＩ、およびラミニンを様々な濃度でＨＡ表面に連結する。濃度は１．０〜０．０５ｍｇ／ｍｌまで変動する。過ヨウ素酸塩またはブランクを対照として使用する。
【０１９６】
コヒージョン（カリフォルニア州パロアルト所在）（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，カタログ番号  ＦＸＰ−０１９）から得られるビトロゲン（商標）コラーゲンおよびシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス所在）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ＃Ｆ−０８９５）から得られるフィブロネクチン以外のＥＣＭはすべて、ベクトンディキンソンから購入される。追加のＥＣＭとしては、タイプＶコラーゲン、ラミニン、ヒトコラーゲンＩ、ヒトＥＣＭ、コラーゲンタイプＩＶ、コラーゲンタイプＩＩＩ、ヒトコラーゲンＩが挙げられる。ポリリシンは、ベクトンディキンソンラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）から入手し、ペプチドＲＧＤＳＰ（配列番号１）はアナスペック（ＡｎａＳｐｅｃ）社（カリフォルニア州サンホセ所在）  （Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）から得た。
【実施例２】
【０１９７】
改変表面（実施例１による）上の細胞の成長
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて、生物活性表面の生成用の様々な生物活性物質がこれらの骨芽細胞（骨形成幹細胞であるとも考えられる）の成長および分化に影響を及ぼす効果を決定した。これらの細胞はマウス頭蓋冠由来骨芽細胞（非特許文献４６に記載される新生児マウス頭蓋冠から確立されたクローンの骨形成細胞系統である）のクローン細胞系統に由来する。細胞を、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；不活性化）および１００ユニットすなわちμｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  カタログ＃１２５６１）で維持する。
【０１９８】
細胞をおよそ１０4細胞／２０ｍｌ培地の濃度で、２５０ｍｌの傾斜首ポリスチレン組織培養処理フラスコ中の培地で播種した。約２×１０6細胞／フラスコに達するまで細胞を培養した。細胞を収穫し２％ＦＣＳを添加したα−ＭＥＭ５ｍｌ中に最終細胞濃度が約４×１０4細胞／１００μｌになるように再懸濁しした。
【０１９９】
表面改変スライドをポリスチレンペトリ皿に入れ、３０分間細胞で覆った。付着していない細胞を除去したところ、表面の被覆領域のみ付着が起こっていることがわかった（図を参照）。細胞付着と成長の量を計るために、ヘマトキシリン／エオシンで染色後、スライドまたは他の表面のイメージを、カラースキャナーを使用して取り込みＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ分析プログラムを用いて濃度を決定した。
【０２００】
図１Ａと１Ｂは、生物活性物質を含むマイクロアレイの特定のエリア上で細胞が優先的に成長したことを示す。ブランクまたは過ヨウ素酸塩でのみ処理したマイクロアレイのエリアでは細胞は成長せず付着もしなかった。図２は、いくつかの細胞が特定の生物活性物質上でより疎にまたはより密に成長したことを示す。例えば、細胞密度はラミニン上よりビトロゲン（商標）上がより大きかった。
【０２０１】
図３Ａ〜３Ｅは、細胞密度がＥＣＭ分子の濃度に比例することを示す。１．０ｍｇ／ｍｌを含むウェルは、０．０５ｍｇ／ｍｌのＥＣＭ分子で覆われた表面を備えたウェルより大きな細胞の増殖を示した。
【０２０２】
図４Ａ〜４Ｆは、骨芽細胞に対する改変表面の効果を示す。生物活性物質で機能化していない表面は細胞の増殖を促進しない。３つの過ヨウ素酸塩のより高い濃度では、５種のＥＣＭ材料がすべて結合し、これは細胞付着と成長を刺激した。最低（３ｍＭ）の過ヨウ素酸塩濃度では、コラーゲンおよびラミニンだけが細胞付着と成長を支持した。図４Ｂ〜４Ｆでは、細胞は、ＲＧＤＳＰを堆積させた表面でのみ成長し、対照(control)表面では成長しなかった。
【実施例３】
【０２０３】
最適の培地成分のためのスクリーニング
培地成分の最適化で試験するペプチドは、従来のペプチド合成技術を使用して構築したライブラリーに由来する。当初のペプチド候補の各ライブラリーは、電荷、分子量、質量および疎水性を含む特定の設計基準に基づいて選択されている。例えば、１つのライブラリーの各ペプチドは、次の構造のうちの１つに対応する５つのアミノ酸残基からなるものでもよい：（ａ）ｘｘｘＫｘ［配列番号２］、（ｂ）ｘｘＫｘｘ［配列番号３］、（ｃ）ｘｘｘｘＫ［配列番号４］、（ｄ）ｘＫｘｘｘ［配列番号５］、および（ｅ）Ｋｘｘｘｘ［配列番号６］（ここで各ｘは同一または異なる疎水性または非荷電極性アミノ酸残基とすることができ、ＫはＬｙｓである）。ペプチドは、５個の位置の各々でＬｙｓと残りの４つの位置に存在する疎水性または非荷電極性アミノ酸残基とで合成する。
【０２０４】
ペプチドは、所望の第１のアミノ酸を含む約１５０ｍｇのＷａｎｇ樹脂を合成用容器に小分けすることにより合成される。次に、樹脂を４ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で撹拌しながら４分間で膨潤させる。第１の付着アミノ酸を、撹拌しながら２０分間、２０％ｗ／ｖピペリジン（Ｐｉｐ）／８０％ＮＭＰ１ｍｌで２度脱保護する。この工程の後、撹拌しながらＮＭＰ（工程２と同じ時間および体積）で洗浄する。次のアミノ酸は、７５０μｌのアミノ酸ストックを２モル過剰で、５００μｌの０．５Ｍジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／ＮＭＰおよび２５０μｌのＮＭＰとともに撹拌しながら６０分間かけて２重に連結する。ＮＭＰでの洗浄を繰り返す。ＮＭＰでの脱保護、洗浄、２重連結、再びＮＭＰでの洗浄を各追加アミノ酸に対して繰り返す。次いで、樹脂をメタノール１０ｍｌで１０分間洗浄し、次に乾燥させる。ペプチドは室温で３時間、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／５％水３ｍｌを用いて樹脂から開裂させる。樹脂をグラスウールろ過によって遊離ペプチドから分離する。ＴＦＡ体積の８０％を除去する。抽出物にエーテル４．５ｍｌを加え、次いで４℃で０．５時間インキュベートし、１０ｍｌ容器において一夜置いて沈殿を増やす。沈殿を２２００ｒｐｍ２０分間の遠心分離によってペレット化する。抽出、インキュベーションおよびペレット化を繰り返す。ペレット化を乾燥させ、０．５ｍｌ酢酸を最後のペレットに加え、さらに水４．５ｍｌを加える。ペレットを−２０℃で凍結し凍結乾燥する。次いで、水５ｍｌ加えてペレットを凍結し凍結乾燥する。水和、凍結および凍結乾燥を繰り返す。また、処理したペプチドを−２０℃で維持する。
【０２０５】
このようなペプチドライブラリーは、培地に含有させた場合、試験の必要条件（例えば、細胞の成長の増加）を満たすペプチドを識別するために試験することもできる。
【０２０６】
以下の議論は特許文献２（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）に、一層詳しく記載されたアルゴリズムおよびアプローチを例示するためのものである。この例において、８種の試験ペプチドがテトラペプチドライブラリーから選択される。試験ペプチドは任意の知られた手段によってライブラリーから選択できる。３つのパラメーター（分子量、全帯電量および疎水性（ｍＬｏｇＰ））が８種のペプチドの各々について決定され得る。この例において、特性指標は、特定の細胞活性（すなわち、成長）であり、同様に８種のペプチドについて決定され得る。
【０２０７】
回帰分析、例えば、プログラムＳ−プラス（Ｓｏｌａｒｉｓ用バージョン３．４、マスソフト（Ｍａｔｈｓｏｆｔ）、ワシントン州シアトル所在）を用い、次の方程式を誘導して３つのパラメーターと試験化合物の第１のセットの特性（すなわち、成長）の（仮説的）指標の関係について記載することができる。
【０２０８】
【数５】
2005526489.tif 000006
【０２０９】
（ここで、ｙ＾は特性の指標の評価値であり、ＭｌｏｇＰは疎水性の基準である、ＭＷは分子量であり、Ｒ2は、統計モデルによって説明される本来の応答変数（ｙ＾）中の変わりやすさの量の統計的基準である。Ｒ2の値が０．９９９ということは、ｙ＾における本来の変わりやすさの９９．９％が統計モデルによって説明されたものであることを示す。
【０２１０】
満足なペプチド（それは試験の必要条件を満たす）が試験ペプチドの第１セット中に識別されない場合は、スクリーニングプロセスを継続する。次いで、試験していないペプチドの第２セットを当技術分野で知られている任意の手段によって選択することができ、ペプチドの第２のセットに対するパラメーターを計算することができる。方程式１を使用すると、培地の第２のセットの予測される活性（その各々は試験ペプチドの第２のグループのうちの１つを含む）が、そこに含まれるペプチドのパラメーターに基づいて第２セット中の各培地について計算できる。例えば、試験していない４量体ペプチドを含む培地については２８．２の予測活性が誘導され得る。この値は本来のライブラリーの細胞活性のうちのどれよりも高いので、このペプチドは、合成と試験に対する良い候補として分類される。
【０２１１】
試験の成長必要条件が、少なくとも２５ユニットのレベルに設定される場合、化合物のスクリーニングプロセスは、特定のテトラペプチドの識別をもって終了し得る（実際の細胞活性が予測された活性と等しいと仮定して）。
【０２１２】
あるいは、もし成長必要条件が少なくとも３０と設定されていたならば、スクリーニングプロセスは継続するであろう。第２の試験ペプチドのうちの１つを各々含む培地の第２のセットの特性の実際の指標を決定することができる。この測定から、少なくとも１つのパラメーターと細胞活性の新しい関係が計算される。この最新の方程式から、培地に含まれていた場合、細胞の成長をレベル３０以上に促進すると予測されるペプチドの第３のセットが識別される。典型的には、所望の生物学活性を有するペプチドが識別されるまで、このプロセスを反復的方法で継続することができる。
【０２１３】
同様に、試験の必要条件が少なくとも２０のレベルに設定された場合、本来の試験ペプチドのより多くが試験の必要条件を満たし得るため、化合物のスクリーニングプロセスはこの時点で停止できるが、成績のさらに良好なペプチドを求めて継続することもできる。
【０２１４】
特許文献２の図２を参照すると、各々それぞれの試験化合物を含む複数の第１の培地の特性の測定された指標と試験化合物のパラメーターの関係を決定するための好ましい操作が、図式表現によって説明できる。ｄパラメーターの計算値をプロットし、またｎ培地についての特性の測定された指標をｄ＋１次元空間のパラメーター値に対してプロットする。説明を簡単にするために、特許文献２の図２ではｎ＝１０培地でｄ＝１パラメーターである。
【０２１５】
従来のライン当て嵌め式のアルゴリズムが、プロットデータについて「最良の適合」ラインを生成するために使用できる。例えば、回帰分析は、特性指標と、各培地中の試験化合物に対するパラメーターの値の数学的な関係を決定するために利用できる。関係はｙ＾i＝ｆ（ｘij）で表わすことができる。ここで、ｘijはパラメーターを表し、ｉは１からｎまでの範囲、ｎは第１の培地の数を表わし、ｊは１からｄまでの範囲、ｄはパラメーターの数を表わし、ｉは、第１の培地の特性の測定された第１の指標の評価を表わす。
【０２１６】
この関係は、試験の必要条件を満たす、測定された特性の指標を与えると予測されるそれぞれの第２の試験化合物を含む第２の複数の培地を識別するために利用することができる。特許文献２の図２では、試験の必要条件が指標＞２０ユニットを与える化合物を選択するように確立されている。方程式ｙ＾i＝ｆ（ｘij）を用いて、特許文献２の図２のラインの上部の右上部分に位置する特性の指標を与える培地の成分としてそれらの化合物を識別することができる  （すなわち、それは＞２０ユニットの特性の指標を与える）。
【０２１７】
図５Ａおよび５Ｂは、骨芽細胞の増強された成長と分化のために培地を最適化した結果を示す。細胞が最適化された培地と組み合わされて生物活性表面上で成長する場合、増殖と分化が改善される。血清の代わりの成長因子を補足した培地と比較して、１０％のＦＣＳを含む培地を使用すると、少ない増殖および分化しか観察されなかった。
【実施例４】
【０２１８】
三次元足場としての改変表面の使用
この例は、実施例１に記載するようにして作成され、実施例２に記載されるようにして増強された細胞の成長のような所望の特性に関して試験された表面を３Ｄ足場としてどのように使用して、さらに成長および／または分化のような所望の細胞活性を増強することができるかを例証する。
【０２１９】
表面の最適化および培地の最適化の後に、細胞は、最適の成長培地の存在下で、最適の表面成分を含む３Ｄ足場上で成長することができる。
【０２２０】
図６Ａ〜６Ｃは、０．１ＭのＭＥＳバッファー、ｐＨ６．０中の３％アルギン溶液を使用して構築され、ジアミン架橋剤であるアジピン酸ジヒドラジド（ＡＡＤ）とＥＤＣ化学を使用して架橋された本発明のいくつかの３Ｄ足場を示す。材料は２ｍｍの空隙を隔てた平行なＰＳ表面間にゲル化され、均質ゲルを生じる。６ｍｍの穴パンチを用いて「シート」からディスクを切り取る。このディスクを水で念入りに洗浄し、−１００℃で凍結し、乾燥するまで凍結乾燥する。
【０２２１】
３Ｄの多孔性のマトリックスは、氷晶に由来するであろう相互に連結した孔構造を有する。ゲルが凍結すると、氷晶は核を形成し成長する。氷が結晶化するにつれて、ポリマーは結晶から押し出される。凍結乾燥した時、結晶によって占拠された空間は相互に連結した孔構造をもたらすであろう。これらのマトリックスは、細胞移植、インビトロでの立体培養ならびに細胞機能調整用タンパク質およびペプチドのスクリーニングを含むいくつかの目的のために使用することができる。
【０２２２】
架橋されたアルギン酸塩は、ＥＤＣ化学（非特許文献４５参照、本明細書に参照によって組み込まれる）を使用し、または、生物活性物質の表面の活性化およびカップリングについて上に記載されているものと同じ化学反応を使用すると、改変のための利用可能なカルボキシル基を有することになる。足場によって提供される３Ｄ環境は、インビボの環境をより正確に模倣しており、三次元的に成長する細胞を組織に類似するものとして使用して、成長環境、薬剤または他のインビトロの細胞および組織に対する生物学的効果をスクリーニングすることが可能になる。
【０２２３】
３Ｄアルギン酸塩の足場は、実施例１に記載するようにしてＨＡコーティングを施したポリスチレンスライド上に配置される。図６Ｃを参照のこと。立体アルギン酸塩足場は、５０−ウェルシリコーンガスケット付きスライドのウェルに材料を注入することにより配置される。播種の際に足場から「こぼれた」細胞が周辺表面では付着もせず成長もせず、一方、足場はゲル化足場と多糖（ＨＡ）基材の間の共有結合架橋によって基材に共有結合的に結合されるので、ＨＡコーティングを施したスライドはそのような足場の好ましい支持体である。
【０２２４】
スライド上にマトリックスを配置することで、インビトロに作り上げられる組織の開発に最適な条件の自動スクリーニングが可能になる。作り上げられる組織開発のための最適条件を発見するために、様々な基材上に異なるタイプの細胞を様々な密度で播種し、かつ／または同じ足場上で異なるタイプの細胞を同時培養することが可能である。
【０２２５】
本明細書に記載した架橋されたアルギン酸塩は、非特許文献２６に従って、または実施例１に記載した化学反応を使用して、改変のために繰り返しカルボキシル基を提供する。したがって、アルギン酸塩は、ＥＣＭ分子、成長因子、生物活性ペプチドなどの様々な生物活性物質を用いて改変される。配置されたマトリックススライドを自動画像化および分析システムと組み合わせて使用すると、インビトロ、またさらにはインビボの組織の開発に有用な環境（溶解度、不溶性物質、および３Ｄ組織組成および構造）の自動発見および最適化が可能になる。
【実施例５】
【０２２６】
３Ｄ足場における骨芽細胞の成長および分化をモニターするためのインビトロアッセイ
成長因子を含む最適の培地および最適の表面を使用して、立体足場中で骨芽細胞を成長させた。低いアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性（市販のキット（シグマ製）を使用しメーカーの指示により比色分析的に検出した）およびコラーゲンマトリックスの排泄は、培養１日目と９日目の間で明白であった。９日目と１６日目の間で、ＡＬＰ活性が蓄積しオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）分泌が生じた。ＥＣＭは１６日後に鉱物化した。足場内で成長させた細胞においては、より大きな細胞の増殖が、ＢＤ酸素バイオセンサー（ベクトンディキンソン、ベッドフォード、ＭＡ）を使用する酸素消費測定により観察された。ＤＮＡの量は０日目から、３日目、そして１０日目に増加した。ＡＬＰも１０日目に劇的に増加し、これは分化の増加を示している。ＡＬＰ活性とＤＮＡとの比も１０日目に増加した。
【０２２７】
上に引用した参照文献はすべて、個別に組み込むか否かに関わらず、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０２２８】
本発明について十分に説明してきたが、本発明の技術思想および範囲から外れず、かつ、過度な実験なしで、広範囲の等価なパラメーター、濃度および条件において同じことが実行できることが当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、実施例１に記載するように改変された表面上での細胞の成長を表す図である。
【図２】改変された表面上で成長させた細胞（蛍光染色後）を示す図である。
【図３Ａ】１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｂ】０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｃ】０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｄ】０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｅ】０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｆ】コラーゲンＩのタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｇ】コラーゲンＶのタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｈ】ビトロゲン（商標）のタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｉ】ラミニンのタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｊ】フィブロネクチンのタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図３Ｋ】マトリゲル（商標）のタイプのＥＣＭ分子に付着し成長するマウスＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、ＥＣＭペプチド、ＲＧＤＳＰ（配列番号１）を含む改変された表面への細胞の付着および成長を対照表面との比較で示す図である（図４Ａは、ペトリ皿上のマス目の円形領域に付着した細胞を示す。固定化したＨＡ表面は、ＮａＩＯ4濃度を横方向に増加させながら（３、１０、３０および１００ｍＭ）処理するかまたは処理しなかった（最左欄「−ＮａＩＯ4」）。次いで、表面領域をバッファー（１μｌ）（最下列）、または等体積の様々なＥＣＭ材料、ＲＧＤＳＰ−１ｍｇ／ｍｌ；コラーゲン−３．２ｍｇ／ｍｌ；フィブロネクチン−０．１％ｗ／ｖ；ラミニン−２ｍｇ／ｍｌ；またはヒトＥＣＭ（ｈＥＣＭ）と呼ぶ混合物−０．３ｍｇ／ｍｌのいずれかで処理した（最上列〜最下列）。図４Ｂ−４Ｅは、図示するように、ＥＣＭと対照表面上に付着および成長する細胞の拡大顕微鏡写真図を示す）。
【図５Ａ】血清を定義された成長因子に置き換えることで骨芽細胞の成長が増強される培地最適化プロセスの結果を示す図である（マウスＭＣ３Ｔ３〜Ｅ１細胞について調べた）。
【図５Ｂ】血清を定義された成長因子に置き換えることで骨芽細胞の分化が増強される培地最適化プロセスの結果を示す図である（マウスＭＣ３Ｔ３〜Ｅ１細胞について調べた）。
【図６Ａ】様々なプラスチック表面に配置した共有結合で架橋された３Ｄ足場を示す図である（コイン（米国１０セント硬貨）を比較のために示す）。
【図６Ｂ】様々なプラスチック表面に配置した共有結合で架橋された３Ｄ足場を示す図である（コイン（米国１０セント硬貨）を比較のために示す）。
【図６Ｃ】顕微鏡用スライド上に配置した多くの足場を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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