(57)【要約】本発明は、質量によって区別可能なオリゴマーレパートリーを構築する方法であって、１つまたは複数の選択質量標識の付加によって修飾されているモノマーの異種プールを供するステップと、任意選択的に、非標識モノマーの異種プールを供するステップと、レパートリーに示されるオリゴマーのモノマー配列を決定し、各オリゴマーの質量が異なるように各モノマーに組み込まれた前記質量標識の数および性質を計算するステップと、複数の標識モノマー、および任意選択的に１つまたは複数の非標識モノマーを組み合わせて、オリゴマーを形成するステップとを含む方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量によって区別可能なオリゴマーレパートリーを構築する方法であって、
ａ）１つまたは複数の選択質量標識の付加によって修飾されているモノマーの異種プールを供するステップと、
ｂ）任意選択的に、非標識モノマーの異種プールを供するステップと、
ｃ）レパートリーに示されるオリゴマーのモノマー配列を決定し、各オリゴマーの質量が異なるように各モノマーに組み込まれた前記質量標識の数および性質を計算するステップと、
ｄ）複数の標識モノマー、および任意選択的に１つまたは複数の非標識モノマーを組み合わせて、オリゴマーを形成するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記オリゴマーが、オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、誘導体化ヌクレオチドを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導体化ヌクレオチドが、１つまたは複数の修飾基を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾基が、末端修飾、骨格修飾、および／または塩基修飾を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記末端修飾が、アクリジン、アミン（ＮＨ２）、ビオチン−ＴＥＧ、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ダブシル、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フロレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＰＯ４（リン酸塩）、ソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、ＳＨ（チオール）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テキサスレッド、およびチオール（ＳＨ）からなる群から選択され、前記骨格修飾が、メチルホスホネート（ＭＰ）、２’−ＯＭｅ−メチルホスフェートＲＮＡ、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ＲＮＡ、および２’−ＯＭｅＲＮＡからなる群から選択され、前記塩基修飾が、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’−ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基部位（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−Ｉ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能ｄＡ、変換可能ｄＣ、変換可能ｄＧ、変換可能ｄＴ、変換可能ｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄＩ、Ｏ６−フェニル−ｄＩ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、ｄＳｐａｃｅｒ（無塩基部位）、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−トリアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−Ｉ−ｄＵ、およびＯ４−トリアゾールｄＵからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、タンパク質核酸（ＰＮＡ）を含む請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
生物サンプル中の核酸を分析する方法であって、
ａ）前記サンプル中の核酸を固体支持体上に固定するステップと、
ｂ）請求項１〜７のいずれかに記載の方法により調製されたオリゴヌクレオチドのレパートリーを所望のストリンジェンシーで前記核酸とハイブリダイズさせ、前記所望のストリンジェンシーでハイブリダイズしないレパートリーのメンバーを溶出するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）でハイブリダイズしたレパートリーのメンバーを溶出し、前記メンバーの質量を解明するために分析するステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記生物サンプル中の核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物サンプル中の核酸が、ＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物サンプル中の核酸が、ｍＲＮＡである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、増幅されない請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸が、増幅される請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生物サンプルが、生体組織を含む請求項８〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記生物サンプルが、細胞からなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物サンプルが、１つの細胞からなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物サンプルが、精製された核酸を含む請求項８〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
生物サンプル中の核酸を分析する方法であって、
ａ）前記サンプル中の核酸を固体支持体上に固定するステップと、
ｂ）請求項１または請求項２に記載の方法により調製されたオリゴペプチドのレパートリーを所望の条件下で前記核酸と結合させ、前記所望の親和性で結合しないレパートリーのメンバーを溶出するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）で結合したレパートリーのメンバーを溶出し、前記メンバーの質量を解明するために分析するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
前記メンバーの質量を解明するための分析が、質量分析法によって行われる請求項８〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記メンバーの質量を解明するための分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって行われる請求項８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
全体および一部が、コンピュータ制御下で行われる先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
レパートリー中に示される各オリゴマーの各モノマーに組み込まれた質量標識の数および性質を計算する方法であって、各オリゴマーについて、該オリゴマーが標識されているかどうかを決定するステップ、および、標識されている場合、
１つまたは複数の質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、レパートリー内において固有の組み合わせ分子量を得るステップと、
前記１つまたは複数の質量標識を前記オリゴマー中の１つまたは複数のモノマーに割り当てるステップと
を含む方法。
【請求項２３】
１つまたは複数の質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、レパートリー内において固有の組み合わせ分子量を得るステップが、
１つまたは複数の質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、前記組み合わせ分子量がレパートリー内において固有であるかどうかを決定するステップを含み、固有でない場合、
レパートリー内において固有の組み合わせ分子量に到達するまで、１つまたは複数の別のまたはさらなる質量標識の分子量を前記オリゴマーの分子量に付加し、該組み合わせ分子量がレパートリー内で固有であるかどうかを決定するステップを繰り返す請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴマーが標識されているかどうかを決定する前記ステップが、前記オリゴマーが最初に前記レパートリー内において固有の分子量を有するかどうかを決定するステップを含む請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）１つまたは複数の質量標識の分子量をオリゴマーの分子量へ任意選択的に付加することによってオリゴマーを示すデータを処理し、オリゴマーおよび任意の質量標識の組み合わせ分子量を、該質量標識を示すデータとともにアレイ中に記録するステップと、
ｂ）ｉ）他のオリゴマーの分子量とセット中の記録された各オリゴマーの分子量とを比較することによってレパートリー中に含まれる該他のオリゴマーを示すデータを処理し、該他のオリゴマーが固有の分子量を有する場合、該オリゴマーの分子量をアレイ中に記録するステップ、そうでなければ、
ｉｉ）１つまたは複数の質量標識の分子量を該他のオリゴマーの分子量に付加し、該組み合わせ分子量とセット中の各オリゴマーの記録された分子量とを比較し、該他のオリゴマーがこの時点で固有の分子量を有する場合、該オリゴマーの組み合わせ分子量を、各質量標識を示すデータとともにアレイ中に記録するステップ、そうでなければ、
ｉｉｉ）１つまたは複数の別のまたはさらなる質量標識の分子量を該他のオリゴマーの分子量に付加し、該組み合わせ分子量とセット中の各オリゴマー中の記録された分子量とを比較し、該他のオリゴマーがこの時点で固有の分子量を有する場合、前記オリゴマーの組み合わせ分子量を、各質量標識を示すデータとともにアレイ中に記録するステップ、および
ｉｖ）固有の分子量が前記他のオリゴマーについて記録されるまでステップｉｉｉ）を繰り返すステップと、
ｃ）前記レパートリーに含まれる各オリゴマーについてステップｂ）を繰り返すステップと、
ｄ）前記アレイ中のデータを使用して前記レパートリーの表示を構築するステップと
を含む請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ａ）レパートリー中に含まれる各オリゴマーの分子量を計算または読み取るステップと、
ｂ）オリゴマーの分子量と前記レパートリー中に含まれる各オリゴマーの分子量とを比較することによって該オリゴマーを示すデータを処理し、該オリゴマーが固有の分子量を有する場合、該オリゴマーの分子量をアレイ中に記録するステップと、
ｃ）前記レパートリー中に含まれる各オリゴマーについてステップｂ）を繰り返すステップと、
ｄ）次いで、残存する各オリゴマーについて、
ｉ）１つまたは複数の質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、該組み合わせ分子量とセット中の各オリゴマーの記録された分子量とを比較し、該オリゴマーがこの時点で固有の分子量を有する場合、該オリゴマーの組み合わせ分子量を各質量標識を示すデータとともにアレイ中に記録するステップ、そうでなければ、
ｉｉ）１つまたは複数の別のまたはさらなる質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、該組み合わせ分子量とセット中の各オリゴマー中の記録された分子量とを比較し、該他のオリゴマーがこの時点で固有の分子量を有する場合、該オリゴマーの組み合わせ分子量を各質量標識を示すデータとともにアレイ中に記録するステップ、そうでなければ、
ｉｉｉ）固有の分子量が該他のオリゴマーについて記録されるまでステップｉｉｉ）を繰り返すステップ
を行うステップと、
ｄ）前記アレイ中のデータを使用して前記レパートリーの表示を構築するステップと
を含む請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記質量標識に関する情報を含む質量標識データを読み取るステップをさらに含む請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴマーに関する情報を含むオリゴマーデータを読み取るステップをさらに含む請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴマーのデータが、以下の形式：
ａ）任意選択的に必要なオリゴマー長を含む配列の表示、
ｂ）任意選択的に必要なオリゴマー長を含むゲノムの表示、
ｃ）オリゴマーセットの表示
のうちの任意の１つである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記オリゴマーデータを処理して前記レパートリー中に含まれるオリゴマーの表示を構築する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記レパートリー中に示される各オリゴマーの分子量を示すデータを読み取るか計算するステップをさらに含む請求項２２〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
請求項２２〜３１の方法のいずれかを行うように設定された、レパートリー中に示される各オリゴマーの各モノマーに組み込まれた質量標識の数および性質を計算するためのデータ処理装置。
【請求項３３】
請求項２２〜３１のいずれかの方法を実行するためにコンピュータまたは機械を操作可能または設定するように変換可能なコンピュータまたは機械読取可能なコンピュータプログラムエレメントを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項３４】
請求項３３に記載のコンピュータプログラム製品を保有するコンピュータプログラム媒体。
【請求項３５】
核酸プローブ合成機および請求項３２に記載のデータ処理装置を含む、質量によって区別可能なオリゴマーレパートリーの構築用システム。
【請求項３６】
請求項１〜７のいずれかに記載のように調製し、請求項８〜２１のいずれかに記載の分析において核酸にハイブリダイズされたオリゴマーレパートリーのメンバーセットの質量を解明するために分析からデータを受信するステップと、
前記オリゴマーの同一性とオリゴマーのレパートリーの分子量とが相関するデータを使用して前記質量分析の結果を分析し、セット中に存在するオリゴマーメンバーを決定するステップと
を含む核酸分析において使用する方法。
【請求項３７】
前記セット中に存在するオリゴマーメンバーの相対存在量を決定するステップをさらに含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
１つまたは複数の生物学的条件が生物サンプル中に存在するかどうかを前記セット中のメンバーから決定するステップ
をさらに含む請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物サンプル中に発現し得る１つまたは複数の遺伝子の同一性を前記セット中のメンバーから決定するステップ
をさらに含む請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３６〜３９の方法のいずれかを行うように設定された核酸分析用データ処理装置。
【請求項４１】
請求項３６〜３９のいずれかの方法を実行するためにコンピュータまたは機械を操作可能または設定するように変換可能なコンピュータまたは機械読取可能なコンピュータプログラムエレメントを含むコンピュータプログラム製品。
【請求項４２】
請求項４１に記載のコンピュータプログラム製品を保有するするコンピュータプログラム媒体。
【請求項４３】
質量分析計および請求項４０に記載のデータ処理装置を含む核酸分析用システム。
【請求項４４】
サンプル中の核酸を分析するためのコンピュータ実行方法であって、
ａ）オリゴマーメンバーの同一性とオリゴマーレパートリーの分子量とを相関させるようにプログラミングされたコンピュータを供するステップと、
ｂ）請求項８〜２１のいずれかに記載の生物サンプルとのハイブリッド形成によって得られたオリゴマーメンバーのセットを供し、前記サンプルを分析するステップと、
ｃ）分析由来のデータをコンピュータに供するステップと、
ｄ）前記データを処理して前記セット中のメンバーの相対存在量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記セット中に存在する各メンバーの同一性を決定するステップをさらに含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記セット中に存在する各オリゴマーの存在量および同一性を表示するステップをさらに含む請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
サンプル中の核酸を分析するためのコンピュータ実行方法であって、
ａ）請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法によりオリゴマーレパートリーのメンバーのセットを分析するステップと、
ｂ）前記オリゴマーレパートリーの１つまたは複数のメンバーの存在量と１つまたは複数の生物学的条件とを相関させるようにプログラミングされたコンピュータを供するステップと、
ｃ）前記コンピュータにおける分析によって得られたデータを処理して、前記生物サンプル中に存在し得る１つまたは複数の生物学的条件を同定するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
サンプル中の核酸を分析するためのコンピュータ実行方法であって、
ａ）請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法によりオリゴマーレパートリーのメンバーセットを分析するステップと、
ｂ）前記オリゴマーレパートリーの１つまたは複数のメンバーの同一性または分子量と１つまたは複数の遺伝子とを相関されるようにプログラミングされたコンピュータを供するステップと、
ｃ）前記コンピュータにおける分析によって得られたデータを処理して生物サンプル中で発現し得る１つまたは複数の遺伝子を同定するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
サンプル中の核酸を分析するためのコンピュータ実行方法であって、
ａ）請求項４５に記載の方法によりオリゴマーレパートリーのメンバーセットを分析してオリゴヌクレオチド同一性データを得るステップと、
ｂ）前記遺伝子配列データベースをプログラミングされたコンピュータを供するステップと、
ｃ）前記オリゴマー同一性データを処理して、オリゴヌクレオチドセットに関する配列情報を獲得し、前記配列情報と前記遺伝子配列データベースとを比較してオリゴマーセット中に示される配列を含む遺伝子を同定するステップと
を含む方法。
【請求項５０】
前記遺伝子配列データベースの比較が、配列相同性分析によって行われる請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析、および、特に、排他的ではないが、コンピュータを使用した核酸分析の態様に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸配列を検出および定量するために、一本鎖ＤＮＡ分子などの、相補的な核酸配列を使用する配列特異的な結合分子のハイブリッド形成を使用するいくつかの技術が存在する。これらは、ハイブリッド形成前に、その後の検出を可能にするために標識されたＤＮＡプローブを生産するステップを含む。１つの標識ストラテジーは、例えば、ニック翻訳、プライマー伸長、または末端充填による32Ｐ標識ヌクレオチドの組み込みである。その他として、ビオチン化ヌクレオチド、酵素結合ヌクレオチド、または蛍光標識ヌクレオチドのＤＮＡプローブへの組み込みがある。オートラジオグラフィーを使用して32Ｐ放射性標識プローブを検出するが、放射性物質の使用が潜在的に危険なことが、この標識アプローチが抱える問題である。アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ結合抗体および呈色試薬を使用した検出により、代わりに標識されたプローブを検出することができるが、このようなアプローチには時間のかかるいくつかのインキュベーションステップが必要である。
【０００３】
従来の標識は、多数の区別はさらに困難であり、プールした検出反応物中の異なるプローブを区別して検出するために使用することができるフルオロフォアまたは放射性標識の数は限られている。アレイ技術の使用によってこの問題は一部解決しているが、アレイは、生産および分析費用がかかり、個々の要件に特別に適合させなければならないという点で不利である。
【０００４】
質量分析法は、特にその質量による分子および原子種の分離に関する分光学的分析ツールであり、元素から巨大タンパク質およびポリマーまでの多数のサンプル型の分析で使用することができる。質量分析法を使用して、磁場と電場とのセットによる分子の飛行経路の決定により分子の分子量を測定する。
【０００５】
固有の分子量を有するヘテロオリゴマーフラグメントの分離、特に一塩基多型（ＳＮＰ）の定量分析のためには、質量分析法、特に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF MS: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)の使用が知られている。捕捉された一本鎖ＤＮＡ分子を、ＰＣＲ増幅によって調製し、対立遺伝子特異的な様式でタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブとハイブリダイズさせる。次いで、MALDI-TOF MSを使用して、ＰＮＡプローブを検出し、ＳＮＰを同定する。この分光分析により、迅速、正確、かつ明白な分析が容易であり、チップベースのアレイストラテジーなどの別の分析技術よりも有利でもある。しかし、増幅するステップは時間がかかり、かつ一般に増幅は稀な配列の表示が不十分である(under represent)と認識されているので、増幅するステップを含めることには問題がある。さらに、プローブは非常に特異的な役割についてのみ開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、配列特異的な結合分子を同定するための質量分析が非常に強力な技術へと開発される潜在性を有することを認識する。現在、質量によって区別可能な配列特異的な結合分子のセットまたはレパートリー(repertoire)を体系的に構築する方法は存在しない。本発明は、このようなレパートリーの構築方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様によれば、質量によって区別可能なオリゴマーレパートリーを構築する方法であって、
ａ）１つまたは複数の選択質量標識(selection of mass label)の付加によって修飾されているモノマーの異種プール(heterogeneous pool)を供するステップと、
ｂ）任意選択的に、非標識モノマーの異種プールを供するステップと、
ｃ）レパートリーに示されるオリゴマーのモノマー配列を決定し、各オリゴマーの質量が異なるように各モノマーに組み込まれた前記質量標識の数および性質を計算するステップと、
ｄ）複数の標識モノマー、および任意選択的に１つまたは複数の非標識モノマーを組み合わせて、オリゴマーを形成するステップと
を含む方法が得られる。
【０００８】
有利には、核酸を分析するために使用することができるオリゴマーのセットを構築する。異なる配列を含む各オリゴマーの質量の特徴が異なるようにレパートリーを構築する。次いで、核酸とハイブリッド結合するレパートリーのメンバーを、質量分析によって同定することができる。適用には、遺伝子発現分析、配列決定、遺伝子型分類、発見、ディファレンシャルディスプレイ、核酸診断、核酸配列決定、変異体検出分析、多型分析、および微生物から植物およびヒトに至る種内の変異分析が含まれる。
【０００９】
オリゴマーは、配列特異的な様式で核酸に結合することができる任意の分子であり得る。好ましくは、オリゴマーは、１つまたは複数の修飾基(modifying group)を含む誘導体化ヌクレオチド(derivatised nucleotides)を含み得るオリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態では、修飾基には、末端修飾、骨格修飾、および／または塩基修飾が含まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはＰＮＡを含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、生物サンプル中の核酸を分析する方法であって、
ａ）前記サンプル中の核酸を固体支持体上に固定するステップと、
ｂ）オリゴヌクレオチドのレパートリーを所望のストリンジェンシーで前記核酸とハイブリダイズさせ、前記所望のストリンジェンシーでハイブリダイズしないレパートリーのメンバーを溶出するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）でハイブリダイズしたレパートリーのメンバーを溶出し、前記メンバーの質量を解明するために分析するステップと
を含む方法を提供する。
【００１１】
オリゴマーの質量によるオリゴマーの同定に基づいた核酸配列の強力な検出および定量技術が得られる。この技術は、32Ｐ標識またはビオチン化もしくはフルオレセイン結合プローブの形成に関する不都合による悪影響を受けず、質量分析と組み合わせた場合に、迅速な、正確かつ明白な結果が得られる。
【００１２】
生物サンプル中の核酸は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを含むＲＮＡであってよく、生物サンプルは、生体組織または精製された核酸を含み得る。好ましくは、核酸は増幅されない。増幅に関する問題が回避されることが有利である。本発明は、特に、細胞および組織を含む生物サンプル中のＲＮＡの検出および定量に適用可能である。
【００１３】
さらなる態様では、生物サンプル中の核酸を分析する方法であって、
ａ）前記サンプル中の核酸を固体支持体上に固定するステップと、
ｂ）オリゴペプチドのレパートリーを所望の条件下で前記核酸と結合させ、前記所望の親和性で結合しないレパートリーのメンバーを溶出するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）で結合したレパートリーのメンバーを溶出し、前記メンバーの質量を解明するために分析するステップと
を含む方法が得られる。
【００１４】
好ましくは、メンバーの質量の解明方法を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法などの質量分析を使用して行う。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、レパートリー中に示される各オリゴマーの各モノマーに組み込まれた質量標識の数および性質を計算する方法であって、各オリゴマーについて、該オリゴマーが標識されているかどうかを決定するステップ、および、標識されている場合、
１つまたは複数の質量標識の分子量を該オリゴマーの分子量に付加し、レパートリー内において固有の組み合わせ分子量を得るステップと、
前記１つまたは複数の質量標識を前記オリゴマー中の１つまたは複数のモノマーに割り当てるステップと
を含む方法が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
用語「オリゴマー」を、モノマー単位から形成され、配列特異的な様式で核酸に結合することができる任意の分子を記載するために使用する。この用語は、本明細書中で、モノマーより複雑で比較的小さなポリマーを意味するために使用されるが、本発明の文脈では正確なサイズは重要ではない。さらに、この用語を、ヘテロおよびホモオリゴマーの両方を記載するために使用する。「オリゴヌクレオチド」を、ヌクレオチドおよび／または他の類似のモノマー単位を含むオリゴマーを記載するための用語として使用し、タンパク質核酸などの分子を含む。本明細書中で使用される、「核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む天然もしくは合成核酸または核酸アナログをいう。「質量分析法」は、その最も広い意味において、その質量によって原子種間または分子種間を区別することができる技術を示すために使用される。例としては、１つの特定の例がMALDI-TOF質量分析法であるMALDI質量分析法である。
【００１７】
本発明を、オリゴヌクレオチドの形態の配列特異的な結合分子のレパートリーについて記載する。当業者は、他の分子が本発明の実施に適切であると認識している。例えば、オリゴペプチドを構築し、本発明で使用することもできる。
【００１８】
［核酸］
本発明に記載のオリゴマーを、任意のモノマー単位から構築することができるが、核酸オリゴマーが好ましい。本明細書中で言及される核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、骨格修飾核酸（メチルホスホネート、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートであって、両方の非架橋酸素が硫黄、ホスホラミダイト、アルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートで置換されたものを含む）などの合成核酸ホモログを含む任意の核酸であり得る。アキラルなリン酸誘導体には、3'-O'-5'-S-ホルホロチオエート、3'-S-5'-O-ホルホロチオエート、3-CH2-5'-O-ホルホロチオエート、および3'-NH-5'-O-ホルホロチオエートが含まれる。ペプチド核酸は、全リン酸ジエステル骨格がペプチド結合に置換されているものである。
【００１９】
糖修飾を使用しても安定性および親和性が向上される。塩基が天然のβアノマーに関して転化されたデオキシリボースのαアノマーを使用することができる。リボース糖の２’−ＯＨを変化させて、２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖に変化させることができ、これらにより、親和性を与えることなく分解への耐性が得ることができる。
【００２０】
複素環式塩基の修飾は、適切な塩基対合を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンのデオキシウリジンへの置換、デオキシシチジンの５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンへの置換が含まれる。デオキシチミジンおよびデオキシシチジンをそれぞれ５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピル−２’−デオキシシチジンを置換した場合に親和性および生物活性の増大が認められている。
【００２１】
本明細書中で言及されるリボ核酸は、天然または修飾ＲＮＡであり得る。有利には、ＲＮＡは、上記で同定された１つまたは複数の修飾を含み得る。
【００２２】
［オリゴヌクレオチド合成］
定義された配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成することができる。一般に、合成は、モノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかを保護する能力に基づく。例えば、オリゴヌクレオチドを、固相ホスホアミダイト化学によって合成することができる。第１の塩基を含むモノヌクレオチドの３’末端を反応容器中の不活性支持体に結合させ、オリゴヌクレオチドを、サイクル処理によって３’から５’方向に一度に１ヌクレオチドずつ構築する。第２の塩基を含む５’保護ヌクレオチド前駆体を反応容器に添加し、第１の塩基の５’ヒドロキシルを第２の塩基の３’リンと反応する。得られた亜リン酸塩を安定なリン酸塩に酸化し、添加したヌクレオチドの５’末端を保護するために使用した保護基を除去する。したがって、２つの塩基を含むオリゴヌクレオチドが産生される。ついで、第３の塩基を含む第３のヌクレオチドを添加し、第４の塩基を含む第４のヌクレオチドを添加するためにこのサイクルを繰り返す。
【００２３】
図１Ａ〜１Ｆは、どのようにしてこのようなサイクル処理を使用してオリゴヌクレオチド（ここでは、６量体）を構築するかを示す。図１Ａに示すように、第１の塩基（アデニン（Ａ））を含む第１のモノヌクレオチドを、不活性支持体１０に結合させる。アデニン（Ａ）を含む第２のモノヌクレオチドもまた、サイクルへの１回の繰り返しによって添加して、図１Ｂに示す構造に到達させる。その後、グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）を含む第３、第４、第５、および第６のモノヌクレオチドをそれぞれ順番に添加してサイクルのさらなる１回の繰り返しを完了させる。サイクルの各繰り返し後の構造を、図１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、および１Ｆに示し、図１Ｆは構築された６量体を示す。
【００２４】
オリゴヌクレオチドの他の化学合成法は当分野で公知であり、これらには、トリエステル、亜リン酸塩、およびＨ−亜リン酸塩法、ＰＣＲ、および他のオートプライマー法ならびに固体支持体上にオリゴヌクレオチド合成が含まれる。オリゴヌクレオチドまたは他のオリゴマーを、１つを超えるモノマーを一度に加えることによって構築することができることが認識される。
【００２５】
本明細書中に記載のガイダンスが与えられた場合、本発明のオリゴマーのレパートリーは、当分野公知の方法によって得ることができる。Applied BiosystemsABI381Aなどのプログラミング可能な合成機を使用してオリゴヌクレオチド合成を行うことができる。
【００２６】
本発明は、４つのオリゴヌクレオチド６量体のレパートリーの合成について記載している。４つの６量体は、図２Ａ〜図２Ｄに示す配列を有し、これらはこの記載の目的のために、２つのアデニン塩基（Ａ）、２つのグアニン塩基（Ｇ）、１つシトシン塩基（Ｃ）、および１つのチミン塩基（Ｔ）を各々有するように人為的に選択されている。第１の６量体（図２Ａ）は、配列３’−ＡＡＧＧＣＴ−５’を有し、第２の６量体（図２Ｂ）は配列３’−ＡＧＡＧＴＣ−５’を有し、第３の（図２Ｃ）は３’ＴＣＡＧＧＡ−５’を有し、第４（図２Ｄ）は３’−ＧＡＣＴＡＧ−５’を有する。これらの非標識状態では、これらの６量体は、同一の分子量を有し、質量分析法では解明不可能である。
【００２７】
本発明によれば、各６量体は、選択的な質量標識によって固有(unique)の質量を有する。この選択的な質量標識を、６量体中への１つまたは複数の誘導体化ヌクレオチド（各誘導体化ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾基を有する）の組み込みによって行う。選択的質量標識した６量体の簡単な描写を図３Ａ〜３Ｄに示す。この簡単な描写において、各６量体の任意に選択されたたった１つの位置を標識する。第１の６量体（図３Ａ）は、第２の位置での誘導体化ヌクレオチド（Ｍｏｄ1−Ａとして示す）の組み込みによって標識されている。第２の６量体は、任意の（ここでは図３Ｂにおいて第４の位置でＭｏｄ2−Ｇとして示す）誘導体化ヌクレオチドの簡単な組み込みによって標識されている。第３および第４の質量標識６量体を図３Ｃおよび３Ｄに示し、それぞれ第３の位置にそれぞれＭｏｄ3−ＡおよびＭｏｄ4−Ｃとして示す誘導体化ヌクレオチドを有する。Ｍｏｄ1−、Ｍｏｄ2−、Ｍｏｄ3−、およびＭｏｄ4−はそれぞれ各ヌクレオチド上に保持された修飾基を示す。重要なことに、各６量体は同一の塩基セットの異なる配列を含み、それによりこれらの非標識状態で同一の分子量を有するので、Ｍｏｄ1−、Ｍｏｄ2−、Ｍｏｄ3−、およびＭｏｄ4−は、質量標識６量体が質量によって区別可能なように選択され、Ｍｏｄ1−、Ｍｏｄ2−、Ｍｏｄ3−、およびＭｏｄ4−自体が異なる分子量を有するように選択される。したがって、質量分析（例えば、質量分析法）によって解明可能な４つのオリゴヌクレオチドのレパートリーが確立される。
【００２８】
これらの質量標識６量体を合成するために、図１Ａ〜図１Ｆに関して上記の方法に対応する化学合成を使用する。これらの図は、図２Ａの第１の非標識６量体の形成処理を示す。図３Ａに示す第１の質量標識６量体を産生するために、図１Ｂに示す構造が得られるサイクルの繰り返しにおいて、アデニン（Ａ）を含む非誘導体化ヌクレオチド前駆体の代わりにアデニン（Ａ）を含む誘導体化ヌクレオチド前駆体を使用すること以外は同一の処理を使用する。この例では、誘導体化ヌクレオチド誘導体は、修飾基Ｍｏｄ1を有する。
【００２９】
Ｍｏｄ1−、Ｍｏｄ2−、Ｍｏｄ3−、およびＭｏｄ4−は、会合したヌクレオチドの分子量が変化した任意の修飾を示す。このような修飾を同位体標識によって組み込むことができるにもかかわらず、Ｍｏｄ1−、Ｍｏｄ2−、Ｍｏｄ3−、およびＭｏｄ4−は、ヌクレオチドに結合した修飾基、特に化学基を示すことが好ましい。任意の化学基が関連した原子量を有するので、可能性のある莫大な修飾基が予想される。オリゴヌクレオチドの質量標識に適切な特定の修飾基には、末端修飾、骨格修飾、および塩基修飾が含まれる。末端修飾には、アクリジン、アミン（ＮＨ２）、ビオチン−ＴＥＧ、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ダブシル、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、Ｅｄａｎｓ、６−ＦＡＭ、フロレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＰＯ４（リン酸塩）、ソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、ＳＨ（チオール）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テキサスレッド、およびチオール（ＳＨ）が含まれ、骨格修飾には、メチルホスホネート（ＭＰ）、２’−ＯＭｅ−メチルホスフェートＲＮＡ、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ＲＮＡ、および２’−ＯＭｅＲＮＡが含まれ、塩基修飾には、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’−ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基部位(abasic site)（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−Ｉ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能(convertible)ｄＡ、変換可能ｄＣ、変換可能ｄＧ、変換可能ｄＴ、変換可能ｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄＩ、Ｏ６−フェニル−ｄＩ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、ｄＳｐａｃｅｒ（無塩基部位）、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−トリアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−Ｉ−ｄＵ、およびＯ４−トリアゾールｄＵが含まれる。本発明の目的のために、当分野で利用可能な任意の修飾基を使用することができると理解すべきである。
【００３０】
図３Ａ〜３Ｄの略図では、各オリゴヌクレオチド中のたった１つのヌクレオチドが修飾基を有する。しかし、本発明によれば、１つを超えるヌクレオチドでオリゴマーを質量標識することができる。例えば、１つを超えるオリゴマーを質量標識することができるが、すべてのヌクレオチドまたはオリゴマーを全てのヌクレオチドで質量標識することはできない。１つを超える修飾基をオリゴマーに組み込む場合、各ヌクレオチドに対して異なる修飾基または同一の修飾基を使用することができる。いくつかの例では、１つを超える修飾基を同一のヌクレオチドに結合させることができる。さらに、一定の場合、修飾基は必要でない。図４は、このようなオリゴマーの選択であって、得られた各オリゴマーが該選択内で固有の分子量を有する場合、本発明にかかるレパートリーを示すオリゴマーの選択を例示する。このようなレパートリーには、任意の数のヌクレオチド数または任意の修飾基の数またはその組み合わせを有する任意のオリゴマー数を含み得る。図４がそれぞれ同数のヌクレオチドを有するオリゴマーの選択を示すにもかかわらず、レパートリーには、異なるヌクレオチド数のオリゴマーを含み得る。例えば、本発明のレパートリーは、いくつかの６量体、いくつかの９量体、いくつかの１２量体などを含み得る。
【００３１】
特定の適用のためにレパートリーを選択し、特定の適用には、遺伝子発現分析、配列決定、遺伝子型分類、発見、ディファレンシャルディスプレイ、ＤＮＡ診断、ＤＮＡ配列決定、変異体検出分析、多型分析、および微生物から植物およびヒトに至る種内の変異分析が含まれる。
【００３２】
［ＤＮＡプローブおよび質量分析法］
オリゴヌクレオチドをデザインおよび合成して核酸の標的配列と選択的にハイブリダイズさせることができ、それによりプローブとして作用することができる。標的配列が核酸上に存在する場合、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、そうでなければハイブリダイズしない。それぞれ固有の分子量を有するオリゴヌクレオチドプローブのレパートリーを、本発明にしたがって構築することができる。各プローブを、核酸の特定の標的配列とハイブリダイズするようにデザインすることができる。一般に、プローブとしてのオリゴマーは、偽陽性結果を最少にするために十分な長く、かつ十分に明白であるべきである。
【００３３】
本発明の態様によれば、オリゴヌクレオチドのレパートリーを核酸分析に使用する。分析は、直接的な分析であり、増幅するステップは必要でない。核酸を、その精製された形態または天然の状態（例えば、組織片または培養細胞）で固体支持体に固定する。オリゴヌクレオチドのレパートリーを所望のストリンジェンシーで核酸とハイブリダイズさせ、所望のストリンジェンシーでハイブリダイズしないこれらのレパートリーのメンバーを溶出する。ハイブリダイズしたレパートリーのメンバーを溶出し、それぞれ固有の分子量を有するメンバーを分析して、その質量、同一性、および量を次々に解明する。質量分析計を使用して質量を解明し、このような分析を使用して、核酸上に存在する（または実際に存在しない）標的配列を決定することができる。
【００３４】
本発明の態様で使用するための質量分析計の１つの特に適切な形態は、例えば、PE Corparation/Applied Biosystems Voyager(商標)DE MALDI-TOF質量分析計を使用したマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF MS)である。この質量分析計の説明は、製品に関する文献で見出すことができ、MALDI-TOF質量分析法は、「ペプチド核酸親和性MALDI-TOF質量分析法による遺伝子分析」、Griffin,Tang and Smith、Nature Biotechnology、第15巻、1997年12月15日（本明細書中で参考として組み込まれる）に記載されている。この文献では、本技術を核酸の標的配列中の点変異の検出に使用している。ビオチン化核酸を、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に固定し、質量標識ＰＮＡプローブ対を核酸とハイブリダイズさせる。洗浄後、たった１つのＰＮＡプローブ（正確な配列に対応する）が標的上に残存する。ビーズをＭＡＬＤＩプローブチップに適用し、マトリックスを添加し、結晶化させ、ハイブリダイズしたプローブを標的から解離させる。プローブチップ上に固定した残存ＤＮＡ標的を使用して、解離ＰＮＡプローブのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化を行い、脱離下ＰＮＡプローブを、飛行時間型質量分析法によって検出する。得られた質量スペクトルは、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブに対応する質量／電荷比のピークを含む。
【００３５】
この分析型は、本発明の分析に適切である。しかし、本発明では、多数のオリゴマーをオリゴマーのレパートリーに含むことができ、含むことが意図される。したがって、レパートリー中に示されるオリゴマーのモノマー配列を決定すべきであり、各オリゴマーの解明可能な質量が異なるように各オリゴマーに組み込まれる質量標識の数および性質を計算すべきである。さらに、得られた質量スペクトルを分析すべきである。本発明は、コンピュータによるアプローチが適切であることを認識する。これらのステップ（特に、各オリゴマーの数および性質を計算するステップ）を行う方法は、「コンピュータによる態様」というタイトルで以下に記載されている。
【００３６】
MALDI TOF質量測定の使用は、「MALDI TOF質量測定を使用した一塩基多型分析への定量的アプローチ」、Ross,Hall and Haff、BioTechniques、29、620-629、2000年9月；「インビトロタグ化合成ペプチドを使用したMALDI TOFベースの変異検出」、Garvin,Parker and Haff、Nature Biotechnology、第18巻、2000年1月；「MALDI TOF質量測定による高レベルの多重遺伝子分類」、Ross,Hall,Smirnov and Haff、Nature Biotechnology、第16巻、1998年12月；および「MALDI TOF質量測定によって検出されたペプチド核酸プローブを使用したヒトＤＮＡにおける一塩基多型の区別」、Ross,Lee and Belgrader、Anal.Chem.、1997、69、6197-4202にも記載されている。これらの文献は、参照して本明細書に組み込まれる。
【００３７】
［コンピュータによる態様］
本発明のある態様によると、各オリゴマーの各モノマー中に組み込まれた質量標識の数および性質を計算する方法が提供される。好ましい実施形態では、コンピュータを使用せずに実施することが予想されるにもかかわらず、コンピュータまたは他のソフトウェア制御のプログラミング可能な処理デバイスを使用して本方法を実行する。例として、図６、７および１０〜１２の流れ図を使用して本方法を記載する。当業者が多数の方法に記載の経路で実行することができるにもかかわらず、図５Ａおよび５Ｂならびに図８および９のデータ表を使用して説明を補足する。好ましい実施形態では、これらのデータ表はデータファイルとして実行されるが、当分野で公知の任意のデータ構造および／またはデータ操作技術を適用することができる。いくつかの図では分子量について略語「ｍ．ｗ．」を使用する。
【００３８】
図５Ａに関して、オリゴマーのデータセットを示す。このデータを多数の方法で示すことができ、レパートリー中に含まれる各オリゴマーの表示(representation)を含む。この表では、各オリゴマーの分子量もまた示すが、これを各オリゴマー配列から計算することができる。図５Ｂは、図６、７、および１０〜１２の流れ図中に記載の経路から受信したデータの表を示す。この表では、記載事項(entry)は、修飾基とその位置とを示すデータの記載事項とともに、各オリゴマーの配列データ、および、オリゴマーとオリゴマーに割り当てられた任意の修飾基との組み合わせ分子量に利用可能である。この例では、オリゴマーが６量体であるので、修飾基に利用可能な６つのデータファイルが存在し、第１のフィールド（例えば、Ｍｏｄ1）中の記載事項は、６量体中の第１のモノマーに割り当てられた修飾基（Ｍｏｄ1）を示す。第３のフィールド（例えば、Ｍｏｄ2）中の記載事項は、６量体中の第３のモノマーに割り当てられた修飾基（Ｍｏｄ1）を示す。したがって、オリゴマー配列、分子量、ならびに各オリゴマー上の各修飾基の性質および位置を記録することができる表示が得られる。多数の等価な表が予想される。１つの実施形態では、図５Ａの入力表および図５Ｂの出力表を、１つのデータ表として組み合わせる。
【００３９】
図６に関して、レパートリー中に示される第１のオリゴマーを示すデータを、図５Ａの入力表（すなわち、オリゴマーデータ表）から読み取る。ステップ１００で、オリゴマーが標識される必要があるかどうかを決定する。オリゴマーが標識される必要がない場合、オリゴマーを示すデータは、ステップ１０２において、オリゴマー配列および分子量を図５Ｂの出力表へ入力し、オリゴマーが標識されないことを示すために修飾基の各６つのフィールドへゼロを記録することにより処理される。オリゴマーを標識する必要がある場合、ステップ１０４で、１つまたは複数の質量標識の分子量をオリゴマーの分子量に付加してレパートリー内において固有の組み合わせ分子量を得る。オリゴマー配列および組み合わせ分子量を出力表に入力し、ステップ１０６で、１つまたは複数の質量標識を、例えば、図５Ｂの表の１つまたは複数の６つのフィールド中への対応するデータの入力によってオリゴマー中の１つまたは複数のモノマーに割り当てる。レパートリー中の各オリゴマーについてこの処理を繰り返す。
【００４０】
図８に関して、質量標識データを含む入力表を示す。図７に関して、この図は、どのようにして図６のステップ１０４を実行するのかを示す。オリゴマーの分子量をオリゴマーデータ表から獲得し、１つまたは複数の標識の分子量を質量標識データ表から得る。ステップ１０８で質量標識の分子量をオリゴマーの分子量に付加する。ステップ１１０では、組み合わせ分子量が固有であるかどうかを決定する。組み合わせ質量が固有ではない場合、ステップ１１２でさらなる質量標識の分子量を組み合わせ分子量に付加するか、あるいは再度質量標識データ表から読み取った別の質量標識の分子量をオリゴマーの分子量に付加し、ステップ１１０で、新規の組み合わせ分子量がレパートリー内において固有であるかどうかを決定する。固有の組み合わせ分子量が見出されるまでステップ１１２および１１０を繰り返す。一旦固有の組み合わせ分子量が見出されると、ステップ１１４でオリゴマー配列、組み合わせ分子量、および修飾基情報の図５Ｂの出力表への出力によってデータを処理する。
【００４１】
図８に関して、質量標識または修飾基の全ての異なる組み合わせの質量についての記載事項を使用して表を構築する。第１の記載事項は、分子量１６Ｄａの第１の修飾基（Ｍｏｄ1）に関し、第２の記載事項は第２の修飾基Ｍｏｄ2に関する。記載事項はまた、分子量５６ＤａのＭｏｄ1とＭｏｄ3との組み合わせなどの組み合わせを示す。図７に関して、ステップ１０８で、表中の第１の質量を付加する。これにより固有の分子量が得られない場合、ステップ１１２で第１の質量を差し引き、表中の第２の質量を付加する。これにより固有の分子量が得られない場合、表中の次の質量を使用し、固有の分子量を達成するまで順次使用する。
【００４２】
図９は、順次増大するように列挙され、好ましい実施形態で使用される分子量を有する別の表を示す。他の実施形態では、表中の修飾基の連続した分子量の間の相対的相違を絶対値の代わりに使用した結果、その後の質量を差し引くステップを実施しなくてもよい。
【００４３】
本発明の方法の実施形態を、図１０でより詳細に示す。第１のオリゴマーのオリゴマーデータを、図５Ａから読み取る。これは固有の分子量を有する第１のオリゴマーであるので、これを獲得し、質量標識を割り当てる必要はない。ステップ１１６では、オリゴマー配列および分子量を、表５Ｂに保存する。ステップ１１８で第２のオリゴマーのオリゴマーデータを表５Ａから読み取る。ステップ１２０で第２のオリゴマーの分子量を表５Ｂの各オリゴマーの分子量と比較し、この段階では第１のオリゴマーのみである。分子量が固有でない場合、第１の質量標識の分子量を表９から読み取り、ステップ１２２でオリゴマーの分子量に付加する。ついで、ステップ１２４で組み合わせ質量と表５Ｂ中の各オリゴマーの分子量とを比較する。組み合わせ分子量が固有のオリゴマー配列である場合、ステップ１２８で組み合わせ分子量および修飾基情報を表５Ｂに保存し、そうでなければ、ステップ１２６で図７に記載の手順を使用して別の質量標識の分子量を質量標識データからら読み取り、オリゴマーの分子量に付加し、固有の分子量が見出されるまでステップ１２４および１２６を繰り返す。ステップ１３２では、処理されるさらなるオリゴマーが存在する場合、ステップ１１８を繰り返して先に進む。ステップ１２０で固有の分子量が見出される場合、ステップ１２８に対応するステップ１３０を行う。したがって、出力表（図５Ｂ）に、レパートリー中に示される各オリゴマーの記載事項を記入する。記載事項は、オリゴマー配列、固有の分子量、およびオリゴマーの特定のモノマーに割り当てられた修飾基を示すデータを含む。ついで、この表中のデータまたは等価の構造を使用して、本発明のレパートリーを構築する。データが固有の分子量に関連する各オリゴマー配列を含むので、データを使用してレパートリーの質量分析の結果とオリゴマー配列とを相関させる。
【００４４】
図１１および１２は、表５Ｂの別の構築方法を示す。図１１に関して、表５Ａ由来の第１のオリゴマーの分子量を、ステップ１３４で読み取る。ステップ１３６では、分子量を表５Ａの他の各オリゴマーの分子量と比較する。分子量が固有である場合、質量標識は必要なく、ステップ１４０でオリゴマーの分子量が固有であるという表示を保存する。分子量が固有ではない場合、ステップ１３８でオリゴマー分子量が固有ではないという表示を保存する。表５Ａ中の各オリゴマーについて処理を繰り返す。
【００４５】
固有の分子量を有する表５Ａ中の各オリゴマーを示すデータを、表５Ｂに移す。オリゴマー配列および分子量を入力し、オリゴマーが標識されていないことを示すために修飾基についての６つの各フィールドにゼロを入力する。
【００４６】
固有でない分子量を有する表５Ｂの各オリゴマーについて、図１２に示す処理を行う。第１の質量標識の分子量を表９から読み取り、ステップ１４２でオリゴマーの分子量に付加する。次いで、ステップ１４４で組み合わせ質量を表５Ｂ中の各オリゴマーの分子量と比較する。組み合わせ分子量が固有である場合、ステップ１５２で、オリゴマー配列、組み合わせ分子量、および修飾基情報を表５Ｂに保存する。そうでなければ、ステップ１４６で、次の質量標識の分子量を質量標識データから読み取ってオリゴマーの分子量に付加し、ステップ１４８で組み合わせ質量を表５Ｂ中の各オリゴマーの分子量と比較する。固有の分子量が見出されるまでステップ１４６および１４８を繰り返し、ステップ１５０でオリゴマー配列、組み合わせ分子量、および修飾基情報を表５Ｂに保存する。図１０に記載の処理と同様に、表５Ｂをレパートリー中に示される各オリゴマーの記載事項を記入する。さらに、記載事項は、オリゴマー配列、固有の分子量、およびオリゴマーの特定のモノマーに割り当てられた修飾基を示すデータを含む。ついで、この表中のデータまたは等価の構造を使用して、本発明のレパートリーを構築する。データが固有の分子量に関連する各オリゴマー配列を含むので、データを使用してレパートリーの質量分析の結果とオリゴマー配列とを相関させる。
【００４７】
図６〜１２に記載の処理は例であり、本発明の範囲内の多数の等価な実施形態または別の実施形態が存在する。特に、図５Ａのオリゴマーデータを個別のオリゴマー配列として得る必要はなく、例えば配列またはゲノムの表示に由来し得る。
【００４８】
上記の本発明の実施形態はDigital Signal Processor、マイクロプロセッサ、他の処理デバイス、データ処理装置、またはコンピュータシステムなどのソフトウェア制御プログラミング可能な処理デバイスを使用して実行可能であると認識され、前記方法の実行のためのプログラミング可能なデバイス、装置、またはシステムの設定用コンピュータプログラムが本発明の態様として予想されると認識される。コンピュータプログラムをソースコードとして具体化して処理デバイス、装置、またはシステムでの実行のために編集するか、例えばオブジェクトコードとして具体化することができる。当業者は、用語「コンピュータ」は、その最も広い意味で上記のデバイスなどのプログラミング可能なデバイス、データ処理装置、およびコンピュータシステムを含むことを容易に理解する。
【００４９】
適切には、コンピュータプログラムを、機械中の媒体上またはデバイス読取可能な形態、例えば、ディスクまたはテープなどの固体メモリまたは磁気メモリ中に保存し、処理デバイスは、操作用の処理デバイスを設定するためのプログラムまたはその一部を使用する。コンピュータプログラムを、電気信号、ラジオ周波数搬送波、または光学搬送波などの通信媒体中に具体化されたリモートソースから得ることができる。このような媒体もまた、本発明の態様として予想される。
【００５０】
完全性および図１３に関して、コンピュータシステム形態のデータ処理装置の例示的実施の概略的かつ単純化した図を示す。図１３に示すように、コンピュータシステムは、バス構造３８に接続したプロセッサ（ＣＰＵ）１３０などの種々のデータ処理リソースを含む。バス構造３８に接続されているものはまた、読取専用メモリ３２およびランダムアクセスメモリ３４などのさらなるデータ処理リソースである。ディスプレイアダプタ３６により、ディスプレイデバイス１８とバス構造１８とが連結されている。１つまたは複数のユーザ入力デバイスアダプタ４０により、キーボード２２およびマウス２４を含むユーザ入力デバイスとバス構造３８とが連結している。プリンター２１の接続用アダプタ４１もまた供することができる。メディアドライブ（例えば、光学ディスクドライブ１４、フロッピーディスク１６、およびハードディスクドライブ１９）接続用のバス構造３８への１つまたは複数のドライブアダプタ４２を供することができる。１つまたは複数の遠隔通信アダプタ４４を供することができ、これにより１つまたは複数のネットワークまたはたのコンピュータシステムへの本コンピュータシステムの接続用のリソースインターフェース手段が処理される。遠隔通信アダプタ４４は、必要に応じてローカルエリアネットワークアダプタ、モデム、および／またはＩＳＤＮターミナルアダプタ、またはシリアルまたはパラレルポートアダプタなどを含み得る。
【００５１】
図１３はコンピュータシステム形態のデータ処理装置の１つの可能な実施形態の略図と認識される。本発明の実施形態の説明から、本発明を実施することができるコンピュータシステムは多数の形態をとることができることが認識される。例えば、ディスプレイデバイス１８およびプリンター２１を含むコンピュータシステムよりもむしろ、コンピュータシステム１０は単に処理ユニットを含む必要があり得る。処理ユニットを、システムの形成に核酸プローブ合成機（図１４）または質量分析計（図１５）などの別の装置を組み合わせるかこれらを使用して構築することができる。
【００５２】
［本発明の使用］
本明細書中に記載の本発明の主な適用は、複数の遺伝子の発現の同時測定または１つまたは複数の遺伝子もしくはｍＲＮＡを含む他の核酸配列中の変異の検出が可能な新規の方法の開発である。この方法は、既存のアレイテクノロジーの代替法および／または補足である。本方法は、溶液または組織片（インサイチュー）中の特定のＲＮＡまたはＤＮＡの存在および量を直接測定し、現在の技術と対照的にＰＣＲ増幅ステップに依存しない。
【００５３】
既存のマイクロアレイ技術は、この目的で特にデザインされる機械を使用して規則正しく整列したアレイとして固体表面に結合したＤＮＡ分子（オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ）の集団を使用する。その後、アレイを、調査中の組織または細胞型およびコントロール組織または細胞型から単離したＲＮＡ（または変異分析にはＤＮＡ）の増幅反応の使用によって得たプローブの混合物とハイブリダイズさせる。通常、２つの異なる蛍光標識を実験プローブおよびコントロールプローブ中に組み込み、アレイへのハイブリッド形成後に光学的に測定する。次いで、バイオインフォマティクスを使用して、２つのサンプルまたはサンプル集団（例えば、健康な組織対癌性組織、感染生物対正常な生物、第１の発生段階対第２の発生段階の遺伝子発現プロフィールの獲得および病原体の同定など）の間のＲＮＡの相違（または変異または配列自体）を計算する。
【００５４】
特定の配列の変異または存在の検出の場合、通常、全遺伝子配列を示すアレイ上に規則正しく整列されたオリゴヌクレオチドセットが存在する。このテクノロジーは、当分野でより一般的になりつつあり、標準的なテクノロジーとなるであろう。一番の短所は、蛍光シグナルを得るために必要な増幅するステップ（ＰＣＲの使用）である。結果として、しばしば繰り返し分析が必要である。さらに、増幅は、増幅配列プール中に異なる配列が不規則に示されることにより検出手順に偏りが生じる。
【００５５】
本発明は、既存のテクノロジーの代替法を提供する。増幅（ＰＣＲ）ステップを使用しない代わりに直接分析を行う。目的のＲＮＡまたはＤＮＡを、精製された形態または組織片としての天然の形態、および培養細胞などとして固体支持体（例えば、ガラス）に固定する。その後、オリゴヌクレオチドレパートリーとハイブリダイズさせ、レパートリーのメンバーは上記の配列について異なる分子量の特徴を有する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを単離し、質量分析法で分析して、ハイブリッド形成後に定量される分子量種が存在するかどうかを決定する。したがって、各オリゴヌクレオチドの同一性および量を決定し、それによりサンプル中に存在する配列についての情報が得られる。
【００５６】
したがって、本発明は、標的組織または細胞中の１つまたは複数の遺伝子の特徴を同時に直接的にサンプリングする方法を提供する。標的の核酸を、質量分析によって正確に同定することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して精製または粗形態で分析することができる。したがって、変異、多型、増幅、欠失、および他の遺伝子条件の存在を、ＰＣＲまたは他の増幅技術に依存することなくインサイチューで容易に決定することができる。
【実施例】
【００５７】
本発明の方法を、グロビンＲＮＡおよび相補オリゴヌクレオチドを使用して例示した。至適化ステップを行わない場合でさえ、結果を得ることができる。使用したオリゴヌクレオチドオは、βグロビン遺伝子については配列AAAGTGATGGGCCAGCACAおよびγグロビン遺伝子についてはTTGAAAGCTCTGAATTCATGGGCを有する２つのオリゴヌクレオチドであった。
【００５８】
標準的な手順を使用してオリゴヌクレオチドを標識し、非標識オリゴヌクレオチドとの並行実験で使用した。オートラジオグラムは、ヒトβグロビン遺伝子座を有し、γおよびβ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスから単離した胎児肝細胞ＲＮＡから溶出したオリゴヌクレオチドであって、ガラススライド上に固定されたものの結果を示す。Ｓ１分析により、βグロビンＲＮＡはγグロビンＲＮＡよりも大量に存在することが明らかとなった。
【００５９】
ピーク図は、分子量によってオリゴヌクレオチドを分離した質量分析計からの読み取りである。結果を図１６および１７に示す。
【００６０】
上記記載を考慮して、本発明の範囲内で種々の修正形態を得ることができることが当業者に明白である。
【００６１】
本発明の範囲には、本明細書中に明白にもしくは暗に記載の任意の新規の特徴もしくは特徴の組み合わせ、または、特許請求の範囲に記載されている発明に関するか否か、もしくは、本発明によって取り組まれた任意の問題または全問題を軽減するか否かに関係なく、それらから一般化された任意のものが含まれる。これにより、出願人は、本出願または本出願に由来する任意のこのようなさらなる出願の遂行の間に、このような特徴に対する新規請求項を作成することができることに留意すべきである。特に、添付の特許請求の範囲を参照して、従属請求項由来の特徴を独立請求項の特徴と組み合わせることができ、各独立請求項由来の特徴を適切な様式で組み合わせることができるが、特許請求の範囲に列挙された特定の組み合わせのみに限らない。
【００６２】
本明細書中に記載の全刊行物は、参照することで本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】オリゴマーの構築を示す図である。
【図２】４つのオリゴマーを示す図である。
【図３】本発明の実施形態によって構築された４つのオリゴマーを示す図である。
【図４】本発明の実施形態によって構築されたレパートリーの例を示す。
【図５】５Ａ：入力データの表を示す。  ５Ｂ：出力データの表を示す。
【図６】各オリゴマーの各モノマー中に組み込まれた質量標識の数および性質を計算するための本発明の実施形態による方法の操作の流れ図である。
【図７】本方法の実施形態の操作の流れ図である。
【図８】本方法の実施形態の使用のデータ表を示す。
【図９】本方法の実施形態の使用の別の表を示す。
【図１０】本方法の実施形態の操作の流れ図である。
【図１１】本方法の実施形態の操作の流れ図である。
【図１２】本方法の実施形態の操作の流れ図である。
【図１３】コンピュータシステム形態のデータ処理装置の成分を示すブロック図である。
【図１４】本発明を実施するためのシステムの成分を示すブロック図である。
【図１５】本発明を実施するためのシステムの成分を示すブロック図である。
【図１６】ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを含むゲルの写真を示す図である。（右から左へ：βオリゴハイブリッド形成のみ（２レーン）；γオリゴハイブリッド形成のみ（２レーン）；βγ混合物（スライド上に０．５μｇのＲＮＡ）；βγ混合物（スライド上に２．５μｇのＲＮＡ））
【図１７】実施例１で使用した質量分析計の出力を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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