(57)【要約】発光に基づくセンサーアセンブリーが記述される。該センサーアセンブリーは、サブストレートに近い発光源から発生する光とサブストレートからずっと離れた源から発生する光とを区別するために、サブストレートの中への光の角度伝播を利用する。そのようなテクニックを用いて、発光源の直接照明を用いることが可能である。【選択図】図１５（ｂ）
2005502880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の屈折率を有する媒体中での使用のための発光センサー装置において、該センサー装置は、
ａ）直接照明の光源、
ｂ）上表面及び下表面を有し、かつ第２の屈折率を有するサブストレート、
ｃ）発光可能な物質、
ｄ）サブストレートの下表面の下に備えられ、かつ該下表面を通して放射された光を検出するように適合された検出装置、
ｅ）臨界角より下の角度においてサブストレートの中へと伝達された光を遮断するように適合された障壁、
ｆ）サブストレートの上又は下表面のいずれか一方における少なくとも１の光学的方向変換素子、該光学的方向変換素子は、臨界角より大きい角度においてサブストレートの中へ発光物質により放射された光をサブストレートから検出器の方へ方向変換するように適合されている、
を含み、使用において、該媒体及び該サブストレートが、第１及び第２の屈折率の間の境界を規定するところのサブストレートの上表面に沿って出会い、該発光可能な物質が該直接照明の光源により励起され、それにより発光し、そして該検出装置は、上表面から所定の距離内の第１層から放射された発光の光と、第２の別の層から放射された光を識別するように適合され、該識別は、媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きい角度において該発光物質から放射された光の選択的検出によりもたらされるところの発光センサー装置。
【請求項２】
該所定の距離が約４λ未満、好ましくは約０．５λ〜約３λの範囲内、ここでλは発光の光の波長である、であるところの請求項１に記載の装置。
【請求項３】
該所定の距離が約１〜約２λの範囲内であるところの、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
発光がサブストレートの中へと放射され、そして次に選択的に検出されるところの角度がしきい角より大きく、該しきい角は、式、
Ｉs（θtr）／Ｉb（θtr）＝Ｆtr
ここでＩs（θtr）は、しきい角において第１の層から放射された光の強度であり、Ｉb（θtr）はしきい角において第２の層により放射された光の強度であり、Ｆtrは、ユーザーによって選択されるところの性能因子である、を満足するところの角度であるところの請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
Ｉb（θtr）が、該装置系内のバックグラウンドレベルに相当し、その結果、不等式が、第１の層から発生する発光の量の信号対バックグラウンド比がある特定の値Ｆtrより大きいという不等式を満足するところのしきい角を与えることになるところの、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
第１及び第２の層が同じ屈折率を有するところの、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
第１及び第２の層が異なる屈折率を有するところの、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
サブストレートの中へと放射された光が１より多い光源から放射され、検出装置が検出された光の発生源を空間的に識別するように適合されているところの、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
特定のターゲット種を捕捉するように適合された、少なくとも一部の物質をさらに含み、該少なくとも一部の物質はサブストレートに結合され、そして使用するとき、媒体中の所定のターゲット物質のいずれかを捕捉するように適合され、該捕捉は捕捉された種の形成をもたらし、該捕捉された種は、励起されると発光に直接的又は間接的に適合され、そのような発光は検出器により検出可能であるところの、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
少なくとも２の別個の部分の物質を含み、各部分はサブストレートに結合され、該サブストレートは、各部分により放射された光を検出器の方へ方向変換するように構成され、その結果、第１の部分から検出器において受けられた光は、第２の部分から検出器において受けられた光から空間的に独立しているところの請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
検出器によって検出された光が、検出の前にサブストレートの中で全面的には内部的に反射されないところの、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも１の光学的方向変換素子が、全面的な内部反射を用いて光を方向変換するように適合されているところの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
複数の光学的方向変換素子を含み、各素子はサブストレートの上表面より上に立ち上げられた円錐台構造を含み、各円錐台構造は側壁及び上表面を有し、発光物質は該構造の上表面の上に備えられているセンサー装置において、該物質により該構造の中へと放射された光は該構造の側壁により内部的に反射されて、そしてサブストレートの下方に配備された検出器の方へ導かれるところの、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項１４】
複数の光学的方向変換素子を含むセンサー装置であって、各素子は、サブストレートの上表面の上に立ち上げられ、かつサブストレートの上表面に沿って延びる隆起部を含み、該隆起部は側壁及び上表面を有し、発光物質は該隆起部の上表面の上に備えられるセンサー装置において、該物質により隆起部の中へと放射された光は隆起部の側壁により内部的に反射され、サブストレートの下に配備された検出器の方へ導かれるところの、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項１５】
少なくとも１の光学的方向変換素子が屈折を用いて光を方向変換するように適合されているところの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項１６】
少なくとも１の光学的方向変換素子がサブストレートの下表面に光学的に結合されたプリズムを含み、該プリズムはサブストレートの下表面に入射した光を受け、その光を検出器の方へ、横方向へ方向変換するように適合されているところの、請求項１５に記載のセンサー装置。
【請求項１７】
複数のプリズムを含み、各プリズムはサブストレートの上表面の上の特有の点と結合され、その結果、点により放射された光がその結合されたプリズムの中で受けられ、検出器の方へ方向変換される、請求項１６に記載のセンサー装置。
【請求項１８】
プリズムがサブストレートの下表面に光学的に結合され、該プリズムが、光学的に結合されたサブストレートと少なくとも同じ屈折率を有するところの、請求項１６又は１７のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項１９】
少なくとも１の光学的方向変換素子が回折を用いて光を方向変換するように適合されているところの、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２０】
光学的方向変換素子がサブストレートの下表面に配備された回折光学素子を含むところの、請求項１９に記載のセンサー装置。
【請求項２１】
サブストレートの下表面が、サブストレートの中へと放射された光を反射しかつ屈折させるように構造的に構成され、該光の反射及び屈折が検出器の方への光の方向変換をもたらし、該方向変換された光は、サブストレート／媒体の境界面の臨界角より大きい角度においてサブストレートの中へと伝播する光であるところの、請求項１に記載のセンサー装置。
【請求項２２】
該下表面の構造的な形が第１の表面を与え、その上で、物質から放射されその上に入射する光がサブストレートから第２の表面の方へ屈折され、該第２の表面がその上に入射する光を検出器の方へ反射するところの、請求項２１に記載のセンサー装置。
【請求項２３】
該光の選択的検出が、サブストレートに非平行の上及び下表面を備えることによりもたらされ、該上及び下表面の角度は、発光物質により放射された光がサブストレート／媒体の境界面の臨界角より大きい角度において該表面に入射し、それにより、サブストレートの軸に沿って検出器の方への光の伝播をもたらすようなものであるところの、請求項１に記載のセンサー装置。
【請求項２４】
物質／サブストレートの境界面の臨界角より小さくなく、かつ媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きい角度において、第１の層の物質によりサブストレートの中へと放射された光を検出するようにさらに適合されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２５】
検出器がＣＭＯＳ、ＣＣＤ，又はフォトダイオード型の検出器であるところの、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２６】
発光可能な物質が、センサーがそれと共に使用されることを意図されるところのアナライトに敏感であり、その結果、センサーがそれと共に使用されるところの媒体中のアナライトの存在、及び該装置の次の照明が物質の発光をもたらし、上記発光が検出器において検出可能であるところの、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２７】
センサーが初めにバイオ認識素子を付与され、該バイオ認識素子は、センサーがそれと一緒に使用されるところの媒体中の任意の所与のターゲットの生物学的試料に敏感でありかつそれと結合するように適合されており、一度結合されると、結合された生物学的試料／バイオ認識素子と発光標識とのさらなる結合が、発光物質の形成をもたらすところの、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２８】
障壁がサブストレートの中又は上に備えられるところの、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項２９】
障壁が検出器の上に備えられるところの、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のセンサー装置。
【請求項３０】
ａ）上及び下表面を有し、それの上表面に光学的に接続された発光物質から放射された入射光を受けるように適合されたサブストレート、
ｂ）サブストレートの中へ、そしてサブストレートの下表面から放射された光を検出するように適合された検出器、
ｃ）発光物質の直接照明をもたらすための直接照明の光源、
ｄ）サブストレートの上又は下表面のいずれか一方における、少なくとも１の光学的方向変換素子、該光学的方向変換素子は臨界角より大きい角度において発光物質によりサブストレートの中へと放射された光をサブストレートからそして検出器の方へ方向変換するように適合されている、
ｅ）臨界角より下の角度においてサブストレートの中へと伝達された光を遮断するように適合された障壁、
ｆ）サブストレートの上又は下表面のいずれか一方における、少なくとも１の光学的方向変換素子、該光学的方向変換素子は臨界角より大きい角度において発光物質によりサブストレートの中へと放射された光をサブストレートからそして検出器の方へ方向変換するように適合されている、
を含む発光センサーにおいて、サブストレート／物質の境界面の臨界角より大きい角度においてサブストレート内を伝播する光により定義される光をサブストレートから検出器へと外側へ導くように、サブストレートが特異的に適合されているところのセンサー。
【請求項３１】
媒体中の物質の存在を検出することにおける使用のためのアッセイプラットフォームであって、該プラットフォームが、サブストレートの上又は下表面のいずれか一方において少なくとも１の光学的方向変換素子を有するサブストレートを有し、該光学的方向変換素子は、媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きいところの角度において発光物質によりサブストレートの中へと放射された光を特異的に方向変換するように適合され、該光はサブストレートから、サブストレートの下表面の下に備えられた検出器の方へ方向変換され、発光が、発光物質の直接照明によりもたらされるアッセイプラットフォーム。
【請求項３２】
サブストレートの上の第１層の中に備えられた発光物質から放射された発光の光と、サブストレートの上の第２層から放射されたその光とを識別する方法であって、該方法が
ａ）第１層及び第２層を直接照明の光源で照明すること、
ｂ）サブストレートの下方に検出装置を備えること、
ｃ）検出された光の光源を選択的に識別するように検出器及び／又はサブストレートを配置すること、ここで該識別は、光がサブストレートの中へと伝播するところの角度に基づいて達成され、その結果第１層のみから放射された光が検出器において検出されること、
ｇ）サブストレートの上又は下表面のいずれか一方において、臨界角より大きい角度においてサブストレートの中へと発光物質により放射された光を、サブストレートから検出器の方へ光学的に方向変換すること、及び
ｄ）臨界角より下の角度においてサブストレートの中へと伝達されたところの光を遮断すること、及び
ｅ）臨界角より下の角度においてサブストレートの中へと伝達された光を遮断するように適合された障壁、
の工程を含む方法。
【請求項３３】
角度が第２層／サブストレートの境界面の臨界角より大きいところの、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
角度がしきい角より大きく、該しきい角が、式、
Ｉs（θtr）／Ｉb（θtr）＝Ｆtr
ここでＩs（θtr）はしきい角において第１層から放射された光の強度であり、Ｉb（θtr）はしきい角において第２層により放射された光の強度であり、そしてＦtrは、ユーザーにより選択されるところの性能因子である、を満足するその角度であるところの、請求項３２又は３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｉb（θtr）が装置系の中のバックグラウンドレベルに相当し、その結果、不等式が、第１の層から発生する発光の量の信号対バックグラウンド比がある特定の値Ｆtrより大きいという不等式を満足するところのしきい角を与えることになる、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
媒体中の物質の存在を検出することにおける使用のためのアッセイプラットフォームであって、該プラットフォームがそれに結合された標識可能な物質を有するサブストレートを含み、該標識可能な物質は、上記物質と結合するように適合され、それにより発光の源を形成し、該発光は標識された物質の直接照明によりもたらされるアッセイプラットフォームにおいて、媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きい角度において、標識された物質から放射された光が検出されるように構成されているところのアッセイプラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーストレート、放射点を搭載するサブストレート、サブストレートの中へ光を伝達させる点の列又は層、励起光源、及びサブストレートの中へ放射され、サブストレートから伝達される光の一部を測定するための検出器を含むタイプの発光に基づくセンサーアセンブリーに関する。
【０００２】
従来、発光に基づく検出に関して、点、点の列又は層を形成する発光分子がサブストレートの上に配置され、検出器が使用されて発光を検出する。
【０００３】
生命工学及び薬学産業において行われる非常に多くのアッセイは、表面に結合した分子、例えば抗体を利用し、該抗体は流動体、典型的には上を流れる液体からの分子、例えば抗原と特異的に結合する。もし、捕捉された分子が発光（これは蛍光であるかもしれない）部分を含むか、あるいは発光部分で直接にあるいは他の分子を通して標識されることができれば、それらは光により励起され、次にこれらの捕捉された分子から出る発光は、分子に捕捉された特異的な表面を検出するための手段を提供することができる。本明細書において、捕捉された分子は第１の層を形成すると考えられ、結合されなかったか、あるいは捕捉されなかった他の分子は第２の層を形成すると考えられ得る。発光標識を含む表面から伸びる空間は、第１の層を規定する。検出の目的のために興味があるのは、通常、第１の層を形成する分子である。
【０００４】
これらの用途の多くにおいて、発光はいわゆるエバネッセント波、これは、サブストレートの上のバルクスパーストレート、即ち、第２の層においてよりもむしろ、サブストレートのインターフェース、即ち第１の層において又はその近くで発光を励起するという利点を有する。本質的に、励起されるのは、サブストレートの表面に結合された、あるいは隣接した分子であり、表面からさらに離れている発光分子は励起されず、従ってそれらの発光はサブストレートへ伝達されない。エバネッセント波は物質が励起されるところでの表面からの距離を制御するために使用され得る。本質的に、これは、スーパーストレート及びサブストレートの間の境界面の近隣にあるエバネッセント波の電磁場の局在化のために達成される。そのような形の波の使用は、検出された光が、関心のある、優先される領域であるところのサブストレートの境界面に近い光源に本来的に制限されることを保証する。照明する光は、この領域より上の他の分子には影響を与えないので、それらの分子の励起はあり得ず、従ってそれらは検出される発光には貢献しないだろう。
【０００５】
エバネッセント波励起は非常に有用であり効果的である一方で、ある状況においては、実用的ではなくあるいは便利ではない。エバネッセント場による励起、これは導波管表面の上の狭い領域に限られ、蛍光的にラベルされた表面に結合された分子を励起するために使用される、は特に効率的ではなく、励起光の光源のエネルギーの小さなフラクションのみが、実際の励起に使用されるに過ぎないからである。これは主に以下の理由による：
(ｉ)励起光源により生成された光の導波モードへの不十分なカップリング、及び
(ｉｉ)エバネッセント場に含まれる光学的な強さのフラクションが、導波層の中に含まれる強さに比較して非常に小さい。
【０００６】
実際、励起を提供する他のより効率的な方法を使用することは好ましいだろう。特に、もし励起がスーパーストレート内からの、あるいはサブストレートの下からの直接照明により提供されるならば、光源により提供される光学エネルギーのほとんどが励起のために使用されることができる。この装置は、励起の効率を改善するが、幾つかの欠点もまた有する。つまり、直接照明の光源が使用されるならば、サブストレートの表面の上に捕捉された分子以外の分子により、つまり、サブストレートとスーパーストレートとの境界面から遠く離れたスーパーストレートの中の分子により、スーパーストレートの中で生成される発光があり得る。
【０００７】
後者の光もまた検出器へ伝達されて、サブストレートとスーパーストレートとの間の境界面において又はそれの近くで生成される光、即ち第１の層から出る発光と、スーパーストレート自身の中の境界面から遠く離れて生成される発光、第２の層において生じる発光とを区別することにおいて困難を引き起こすだろう。
【背景技術】
【０００８】
米国特許第４，８１０，６５８号は、直接照明を利用して試料を励起する、試験試料の光学的分析法を記述する。得られる発光は、導波路に繋がれ、そこで、導波路に沿ってその側面から出るまで伝播する。導波の光学的軸に関する角度において、どのように検出器を選択的に配置することにより、その検出された光が導波の表面に結合された分子によるものとして帰属することが可能であるかが記述される。この配置は，導波内で伝播した光の検出に依存するために、現れる信号は導波に沿って捕捉された発光を統合したものであり、従って導波上に与えられた個々の光源の間を区別するために適さない。
【０００９】
更なる欠点は、導波内の光の伝播は、導波の側壁上の多重反射を必要とし、それは終局的に検出されるところの信号の強度における避けがたい損失に繋がる。そのような損失は全体の装置の感度を下げる可能性がある。
【００１０】
しかし、更なる欠点は、該検出システムは、導波の終わり又は側面に垂直に設置されるべきであるという必要条件であり、これは該試験装置の全体の大きさを大きくし、その結果、ある種の用途にとっては、それを不適切にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、直接照明による発光分子の励起を利用する、即ち励起光の光源の強さを完全に利用する、表面で生成された発光の検出のために使用され得、そしてしかも発光の光源を選択的に区別するために使用され得るところのシステム及び方法に対する需要がある。
【００１２】
本明細書において、用語“臨界角”は、その従来の意味において、arcsinN2／N1即ちsin-1 Ｎ2／Ｎ1であるものとして使用され、ここで、N1はサブストレートと呼ばれ、光学的に密度のより高い物質の屈折率であり、N2は通常、スーパーストレートと呼ばれ、密度のより低い物質の屈折率である。一般的に、スーパーストレートは、表面と結合する又は発光物質が存在するところの環境であり、典型的には水又は空気である。条件N2＜N1は満足されなければならない。
【００１３】
本発明は、サブストレートの中へ放射される発光を検出するための手段及び装置を提供することに向けられ、該発光は、スーパーストレート／サブストレートの境界面に近い分子から放射されるが、直接照明により励起される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に従って、スーパーストレート、サブストレートの中へ発光を伝達することのできる放射層を搭載するサブストレート、励起光源、及びサブストレートの中で放射され次にサブストレートから伝達される光の一部を測定するための検出器を含む、発光に基づくセンサーアセンブリーにおいて、励起光源が直接照明を提供し、検出された発光はスーパーストレート／サブストレートの境界面の近くの周辺から発生することを特徴とするアセンブリーが提供される。
【００１５】
望ましくは、励起光源は、サブストレートから遠いスーパーストレートの中にある。直接照明はサブストレートの下における光源の付与により同じように実行され得ることが認識されるであろうが、典型的には、励起源はサブストレートの上に提供される。
【００１６】
本発明は、発光、典型的には蛍光部分からの角エミッションパターン(angular emission pattern)が、スーパーストレート／サブストレートの境界面への近さに強く依存するという概念を利用する。これに基づいて、本発明は、角に選択的な検出原理を採用して、表面に結合された部分からの発光と大部分の流動体、即ち、スーパーストレート／サブストレートの境界面の上のスーパーストレートに存在する部分からの発光とを区別する。本質的にはこれは、サブストレートに送られ、スーパーストレート／サブストレートの境界面の臨界角より上の特定の角度の範囲の中で伝播する光が検出されるように担保することによりアレンジされる。本発明の中において、“第１の層”とは、サブストレートに結合したあるいはサブストレートに近く、かつその発光が関心の対象であるところの部分を、そして “第２の層”とはすべてのその他の部分を記述するために使用される。
【００１７】
言い換えると、本発明の鍵となる特徴は、サブストレート／スーパーストレートの境界面より上の十分に大きい距離から出る光、それはスーパーストレートの内部から発するのである、は、臨界角より大きい角度においては、より高い屈折率のサブストレートの中で伝播され得ないことである。しかし、光源が２つの物質の表面に近い時、放射は臨界角より大きい角度において、より高い屈折率の媒体中で伝播する波に接続され得る。その結果、臨界角より大きい角の特定の範囲における発光の検出は、表面又は表面の近くに位置する分子から発生する光を検出する手段を与える。
【００１８】
これを達成する１つの方法は、サブストレート中又は上に光の障壁を付与し、その光の障壁が、臨界角未満の角においてサブストレート中に伝達した任意の光を遮断するように配置される。
【００１９】
あるいは、臨界角より下の角において放射する分子からサブストレートを通して伝達される任意の光が検出から遮断されるように、障壁が検出器の上に搭載されることができる。
【００２０】
臨界角より大きい角度においてサブストレート中で放射された光の検出を達成するためのもう１つの方法は、臨界角より大きい角において伝播する光のみが検出器の方に方向変換されるように、サブストレートを内部的に又は外部的に配置することである。
【００２１】
従って、本発明は第１の屈折率を有する媒体中での使用のための発光センサー装置を提供し、該センサー装置は、直接照明の光源、上表面及び下表面を有し、かつ第２の屈折率を有するサブストレート、発光可能な物質、サブストレートの下表面より下に付与され、かつその下表面を通って放射される光を検出さるように適応された検出装置を含み、及びここで使用において、媒体及びサブストレートが、第１及び第２の屈折率の間の境界を規定するところのサブストレートの上表面に沿って出会い、発光可能な物質が直接照明の光源により励起され、それにより発光及び検出装置は、上表面の所定の距離内の領域から放射された光と他の任意の領域から放射された光とを区別するように適合され、該区別は媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きい角における発光物質から放射された光の選択的な検出により実行される。
【００２２】
臨界角より大きい角は、系の最適性能のために、所定の特異的な範囲内の角であることが望ましい。
【００２３】
望ましくは、該所定の距離は、約４λまで、望ましくは約０．５λ〜約３λの範囲内、そしてより望ましくは約１〜約２λの範囲内であり、ここでλは照明光の波長である。
【００２４】
上に詳細に述べられたように、所定の距離内に含まれる発光分子は、第１の層を形成するものと考えられ得、その距離の外側の分子又は物質は第２の層を形成するものと考えられ得る。
【００２５】
発光がサブストレートの中へ放射され、次に選択的に検出されるところの角度は、好ましくはしきい角よりずっと大きく、ここでしきい角とは以下の式を満足する角度である：
Ｉs（θtr）／Ｉb（θtr）＝Ｆtr
ここでＩs（θtr）はしきい角において第１の層から放射された光の強度であり、Ｉb（θtr）はしきい角における第２の層から放射された光の強度であり、Ｆtrはユーザーによって選択されるところの確信又は性能因子である。Ｉb(θtr)は、典型的には、装置系の中でのバックグラウンドレベルに対応し、その結果、該式は、第１の層から発生する発光の測定の信号対バックグラウンド比が、ある特定の値Ｆtrより大きいという式を満足するしきい角を与えることになる。
【００２６】
系の中には、全体のバックグラウンドレベルに影響を及ぼし得る多くの異なる貢献があることが認識されるだろうが、ある状況においてはバックグラウンドレベルは、系にとってのノイズレベルであると考えられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
第１の実施態様において、第１の及び第２の層は同じ屈折率を有する。代わりの実施態様において、第１及び第２の層は異なる屈折率を有する。
【００２８】
１つの実施態様において，光は１以上の光源からサブストレートの中へと放射され、検出装置は、検出された光の源又は光源を空間的に識別するように適合される。
【００２９】
典型的には、装置は、特異的なターゲット種を捕捉するように適合された、少なくとも１の部分の捕捉物質、該少なくとも１の部分の捕捉物質は、サブストレートに結合され、かつ使用において、媒体中の任意の所定のターゲット物質を捕捉するように適合され、該捕捉又は識別(tagging)は捕捉された種の形成をもたらし、それは直接的又は間接的に励起されたとき発光に適合され、そのような発光は検出器により検出可能である。
【００３０】
捕捉された種又は物質は直接的に発光することが出来るか、又は更なる物質との次の組合せを必要とし、発光源の形成をもたらし、それにより、照明の間接光源を形成し得る。
【００３１】
ある実施態様においては、捕捉物質の少なくとも２のはっきりした部分が提供され、それぞれの部分はサブストレートに結合され、ここで、サブストレートは検出器に向けてそれぞれの部分により放射された光を方向変換し、その結果、第１の部分から検出器において受けられた光は第２の部分から検出器において受けられた光から空間的に独立であるようにサブストレートが配置される。
【００３２】
検出器により検出された光は、検出の前に、サブストレート内で全体的に内部反射することなしに検出され得る。
【００３３】
望ましくは、検出装置は、サブストレートの上表面又は下表面において少なくとも１の光学的方向変換素子を含み、該光学的方向変換素子は、臨界角より大きい角においてサブストレートの中への発光物質により放射された光をサブストレートから検出器の方へ、方向変換するように適合されている。
【００３４】
この、少なくとも１の光学的方向変換素子は、全面的な内部反射を用いて、光を方向変換するように適合され得る。
【００３５】
複数の光学的方向変換素子が付与され得、それぞれの素子は、サブストレートの上表面の上に立ち上げられた円錐台構造を含み、各円錐台構造は側壁及び上表面を有し、発光物質は該構造の上表面の上に運ばれ、そして、ここで、該構造の中へと該物質により放射された光は該構造の側壁により内部的に反射され、サブストレートの下に配備された検出器の方へ導かれる。
【００３６】
あるいは，複数の光学的方向変換素子、各素子はサブストレートの上表面の上に構築され、サブストレートの上表面に沿って伸びる隆起部の形をとる、が付与され得，該隆起部は、側壁及び上表面を有し、発光物質は隆起部の上表面の上に運ばれ、ここで、該物質により隆起部の中へと放射された光は、隆起部の側壁により内部的に反射され、サブストレートの下に配置された検出器の方へと導かれる。
【００３７】
少なくとも１の光学的方向変換素子は、屈折を利用して光を方向変換するように適合され得る。そのような素子は、サブストレートの下表面に光学的に接続された、あるいは合成の、１以上のプリズムの形においてであり、該プリズムはサブストレートの下表面において入射する光を受け入れ、その光を検出器の方へ横へ向けて方向変換するように適合される。
【００３８】
もう１つの実施態様において、少なくとも１の光学的方向変換素子は、回折を利用して光を方向変換するように適合され、それはサブストレートの下表面に付与された回折光学素子により提供され得る。
【００３９】
サブストレートの下表面は、サブストレートの中へと放射された光を反射し、かつ屈折させるように構造的に構成され得、光の反射及び屈折は、検出器の方への光の方向変換をもたらし、方向変換された光は、サブストレート／媒体の境界面の臨界角より大きい角度においてサブストレートの中で伝播した、その光である。
【００４０】
光の選択的検出は、サブストレートに非平行の上及び下表面を付与することにより実行され得、上表面及び下表面の角度は、発光物質により放射された光がサブストレート／媒体の境界面の臨界角より大きい角度において、表面上で入射するような角であり、それにより検出器の方へサブストレートの軸に沿っての光の伝播をもたらす。
【００４１】
センサー装置は、発光物質／サブストレートの境界面の臨界角より小さくはなく、媒体／サブストレートの境界面の臨界角より大きいところの角度において、発光物質によりサブストレートの中へと放射される光を検出できるように、さらに改造され得る。
【００４２】
検出器は望ましくはＣＭＯＳ、ＣＣＤ又はフォトダイオード型検出器であり、それはサブストレートの下の特定の位置に設置され得る。
【００４３】
センサーは初めバイオ認識素子を付与され得、バイオ認識素子は、センサーがそれと共に使用されるところの媒体中において、前もって選択された種類の、互換性のある生物学的試料に敏感であり、かつそれと結合するように適合されている。そのような素子のタイプにおいて、バイオ認識素子と前もって選択された試料の種類との組合せは、発光することのできる物質の形成をもたらす。他の素子のタイプにおいて、結合された生物学的試料／バイオ―認識素子を発光タグ又はラベルとさらに結合することにより、サンドイッチアッセイが形成されて、発光物質の形成をもたらす。
【００４４】
本発明は、より高い屈折率のサブストレートの上に置かれた双極子の放射に関する我々の分析から生じ、該分析は、発光が強い空間的異方性を示し、角度のある間隔内で顕著により大きい量の発光が放射されることを明らかにする。本発明者らにより、かなりな量の発光がサブストレート／スーパーストレートの境界面の臨界角より大きい角度において、より高い屈折率のサブストレートの中へ放射されることが認識された。このようにほとんどのサブストレートにおいて、かなりの量の発光がサブストレートの中へと放射され、そこで捕らえられる。従って、考えは、これらの発見を利用し、発光がサブストレートの中に永遠に捕捉されている代わりに、次の検出と測定のために、それから伝達されることを保証する、各種の装置を提供することである。
【００４５】
より高い屈折率のサブストレートの上に置かれた双極子の放射に関する我々の分析は、サブストレート／スーパーストレートの境界面から、ｔsにより表示されるある特定の距離よりさらに離れたところに置かれた分子から発生する光は、θsにより表示されるある特定の角度より大きい角度においてサブストレートの中を伝播できないということもまた明らかにする。しかし、サブストレート／スーパーストレートの境界面より上の距離ｔs内に位置する分子から発生する発光は、θsより大きい角度においてサブストレート内で伝播していく光を放射できる。
【００４６】
本発明の１つの実施態様において、発光に基づくセンサーは、光が、実質的に通常的にそこまで、出口の表面を通って導かれるように配置される。
【００４７】
本発明のもう１つの実施態様において、少なくとも放射物を搭載する上表面又はサブストレートの下表面のいずれかが平坦ではない。もし平坦であるならば、両表面は平行ではない。
【００４８】
本発明の１つの実施態様において、サブストレートの境界面は、光が当たる境界面における内部反射が実質的に防がれ、光がサブストレートを通って伝達されることを許すように配置される。
【００４９】
本発明のもう１つの実施態様において、サブストレートの境界面は、サブストレートから検出器へ導かれる前に少なくとも１の境界面から反射されるように配置される。
【００５０】
添付の図面を参照し、例によってのみ与えられる本発明の幾つかの実施態様に関する以下の説明から本発明はよりはっきりと理解されるだろう。
【００５１】
図１は、感知素子の例を示す。同じ参照番号は、種々の実施態様における同じ成分のために使用されるだろう。それは“厚い”ガラススライドサブストレート１００（屈折率ｎs＝１．５１５、厚さ〜１ｍｍ）からなり、その頂部の上に発光物質の小さな点１１０（屈折率ｎ1＝１．４３）が堆積されている。該物質が光学的にサブストレートに結合されていることが認識されるだろう。光学的に結合されの用語により、当業者により、それが複数の以下の種々のアレンジメントを包含するが、それらに制限されないことが認識されるだろう：
ｉ．サブストレートに直接結合された、あるいはサブストレートの上に吸着された発光分子、
ｉｉ．１以上のリンカー分子を経てサブストレートに間接的に結合された発光分子（例えばサンドイッチアッセイにおけるように）、
ｉｉｉ．薄いフィルム、例えばサブストレート上にコーティングされたポリマー又はゾルゲルマトリックスの中に捕らえられた／含まれた発光分子、
ｉｖ．発光中心を含む、生きている細胞の層、例えば自家蛍光バクテリア。
【００５２】
点を形成する層の厚さｔ1は均一であり、典型的には、数百ナノメートルの範囲にあると考えられる。典型的に、そのような点の寸法は、用途によって決められ、ユーザーにより定められるだろう。さらに、簡便のため、点の大きさは、該点により生み出される光を検出するために使用されるところの検出系の面積の大きさに対して小さいと考えられる。後者の制限は、発光点が検出器にとって、その面積にわたって放射された強度が積分されなければならないところの面積というよりはむしろ点として“見える”ことを保証するためだけに仮定される。その結果、横方向（ｘ〜ｙ）の寸法は、考慮される必要がなく、放射された強度の角度依存性のみが以下の分析において考慮される必要がある。発光点は、環境により覆われていると仮定され、該環境は空気（ｎa＝１．０）又は水（ｎw＝１．３３）のどちらかである。スライドは下からの空気により囲まれる。
【００５３】
ガラスサブストレート上に堆積された小さな発光点から出る光の予想される角度分布が図１に示される。グラフ（ａ）及び（ｂ）は、該点を覆う環境又は媒体が、それぞれ空気又は水である状況に対応する。両方のグラフにおいて、実線３００及び破線３１０は、それぞれｔ1＝０．５λ及びｔ1＝１．５λに等しい発光点の厚さに対応し、ここでλは発光の波長である。ガラスサブストレートの上に置かれた検出器により検出されることができるところの発光は、矢印３２０により概略的に示される。この角度分布の中の発光は、センサー系の中で従来使用されてきたところの発光について典型的なものである。ガラスサブストレートの上の空気又は水の中に置かれた実線３００又は破線３１０において示されるように、発光の変位(displacement)から見られ得るように、該点を覆う環境の中へ放射された発光の量は相対的に小さい。
【００５４】
状況は、検出器がガラスサブストレートの下に置かれたとき、似ている。底のガラス／空気の境界面において起きる反射のために、この境界面に当たる光は、入射角が、角の範囲θ∈〈−θcas，θcas〉でありさえすれば、空気へ伝達され、ここでθcas＝ａｒｃｓｉｎ（ｎa／ｎs）≒４１．３°は、サブストレート（ガラス）／空気の境界面の臨界角である。この光は、破線の矢印３３０により図式的に表示される。屈折のために、θ∈〈−θcas，θcas〉の角度においてサブストレートの内部を伝播する光は、角度θ∈〈−９０°，９０°〉において、サブストレートの下の空気中へ部分的に伝達される。θ∈〈−θcas，θcas〉の角度の範囲内の実線３００及び破線３１０は、ガラスサブストレートの下の空気へ伝達される発光の量もまた相対的に小さいことを示す。
【００５５】
臨界角θcasより大きい角度においてサブストレート内を伝播する光は、下のサブストレート／空気の境界面において全体的に内部的に反射される。もしスライドを覆う環境が、図１（ａ）において示されるように、空気であるならば、この光もまた上の層／空気の境界面において完全に内部的に反射され、導波ガラスサブストレート中に効果的に捕捉される（あるいは閉じ込められる）。図１（ｂ）に示されるように、スライドの上の環境が水であると、θ∈〈θcas，θcws〉及びθ∈〈−θcas，−θcws〉の角度においてサブストレート中を伝播する光の一部は、部分的に水の中へ伝達され、部分的にサブストレートへ反射されて戻る。さらに、θ∈〈θcws，９０°〉及びθ∈〈−θcws，−９０°〉において伝播する光の一部は上の層／水の境界面において全体的に反射される。いずれの場合においても、θcws＞θcasの関係のために、強化された強度を示す光は、上及び下境界面の両方において、全体的な内部反射のために常にサブストレートの中に捕捉される。説明の容易性のために、発光点を覆う環境が空気であるか水であるかに依存して、用語、θces、は、θcasあるいはθcwsのいずれか一方と等価であると理解され得る。
【００５６】
伝播する光の放射の性質についての上の分析は、サブストレート中の光の伝播は、放射が励起されるところの方法から独立していることを示す。従って、任意のタイプの励起は、放射する分子の同じ空間分布を与え、放射された発光の同じ特徴をもたらすことが理解されるだろう。
【００５７】
図２について言及すると、スーパーストレート／サブストレートの境界面を形成する表面３及び発光源４、例えば任意の形の発光分子を有するサブストレート２の上にスーパーストレート１が描かれている。励起源、即ち光源５は表面３の上に、かつそれから空間的に隔たれて搭載される。発光源４は図２（ａ）及び（ｂ）において、表面３から距離Ｘにおいて描かれる。さらに、スーパーストレート１は、屈折率Ｎ2を有するところのサブストレート２より低い屈折率Ｎ1を有し、即ちＮ2＞Ｎ1である。
【００５８】
今、図２（ａ）に言及すると、光源５が発光源４に光を放射させるとき、光は、放射される光の波長であるところのλよりかなり大きい距離Ｘにおいて放射されることが注目される。光源４からの光は、臨界角θcより大きい角度においては、サブストレート２の中への伝播しない。実際、臨界角θcより大きい角度における、より高い光屈折率のサブストレートにおける発光のフラクションは、距離Ｘが増大するにつれ急速に減少する。従ってもしＸが十分に大きいように選択されると、例えばＸ＞２λ、臨界角より大きい角度においてサブストレート中を伝播する光の量は無視できる。しかし、図２（ｂ）に言及すると、光源４がスーパーストレート／サブストレートの境界面から小さい距離にあるならば、例えばＸ＜λ、発光のかなりのフラクションが臨界角θcより上の角度の範囲においてサブストレート中を伝播するだろう。
【００５９】
図３ａ及び３ｂに言及すると、ここで、前の図面に関して記述されたものと類似の部品は同じ参照番号により識別され、本発明の２つの実施態様が説明される。これらの実施態様において、図面は、同じ参照番号により識別される。図３ａの実施態様において、励起源５は、プリズムの形をしたサブストレート２の上に再び置かれる。発光源４は表面３に接着される。光検出器、この実施態様においてはＣＣＤカメラ１０、が臨界角θcより上の特定の範囲の角度において伝播された光の捕捉のために、サブストレート２の平坦な表面６の１つの隣に搭載される。図３ｂの実施態様において、サブストレート、再び参照番号２により識別される、は、再びアーチ上の下表面７を有するプリズムの形をとる。プリズムは、発光源４から検出器１０への臨界角より大きい角度の範囲内で伝播する光を導くように適合される。プリズム表面の構成のため、サブストレート内を伝播するところの光は、θcより大きい角度においてであり得るけれども、臨界角より小さい角度においてプリズムの表面に入射し、従ってサブストレートからアウトカップルすることができ、そして検出され得る。
【００６０】
もし、発光源が双極子、例えばPolereckyらにより記述されるもの(Applied  Optics第３９巻、第２２号：3968〜3977頁、2000年8月1日)、として挙動すると仮定するならば、臨界角より下で放射される光の強度の角度分布は、サブストレートからの双極子の距離によってかなりの程度には変化しないことが示され得る。図４a及び４ｂは、これらはそれぞれ、サブストレートを覆う環境が空気又は水である状況に対応し、０、０．1λ、及び０．５λに等しい距離に対応するガラスサブストレートからの放射する双極子の３つの距離の場合について、放射された発光の強度の角度分布を示す。
【００６１】
図４のグラフから見られ得るように、臨界角θcより下で放射された強度の角度分布は、ガラスサブストレートからの双極子の距離ｔdにより変化しない。環境の中へ即ち角度θ∈〈９０°，１８０°〉において放射される強度は、その合計量がｔdの値が増加するにつれて増大する。
【００６２】
さらに、ピークは、ｔdのより大きい値に対してθ≒１１０°において放射を開始する。本発明はいかなる特定の理論にも制限されることを意図しないが、これは、環境の中へ直接的に放射される発光及び環境／サブストレートの境界面から反射されたところの発光の妨害のためであると考えられる。これらのピークは強度の角度分布において房のような模様を形成し、その数は距離ｔdの増大に伴って増加するだろう(図に示されない)。
【００６３】
強度のプロファイルにおいて最も重大な変化は、角度範囲θ∈〈θces，９０°〉の角度の範囲内において観察され、ここでθcesは、環境がそれぞれ空気あるいは水であるかに依存してそれぞれ、θcas＝４１．３°、あるいはθcws＝６１．３°である。特に、臨界角より上での強度の減退は、より大きい距離ｔdに対してより急である。さらに、ｔd＝０．５λまでも低い距離に対しては、一点破線により示されるように、臨界角θcesより上で放射される発光はほとんどない。これらの重要な特徴は、以下のように説明され得る。電磁場は、角θ∈〈θces，９０°〉においてガラスサブストレート内を伝播し、環境において指数的に減少する。この所謂エバネッセント場の特徴的な浸透の深さはおよそλであり、それは伝播角θの増加につれて減少する。これらの角度における発光は双極子の近接場とエバネッセント場とをカップリングすることにより提供されるので、θが増大するにつれその強度が減少することは理解できる。さらに、表面からの十分に大きな双極子の距離に対して、エバネッセント場は双極子の位置に到達しない。このことは、そのような大きな距離に対しては、エバネッセント場と双極子の近接場との弱いカップリングのために、上で結論されたように臨界角より上で放射される発光はほとんどないことを意味する。
【００６４】
上の説明は、サブストレートの上の様々な距離において与えられた、単一の放射する双極子に関してである。図５及び６は、平坦なガラスサブストレートの上に堆積された薄い双極子層の厚さを変化させることの分析を示し、ここで環境は空気(図６ａ)、又は水（図６ｂ）のいずれかである。図６は、発光層の厚さがｔl＝０．１λ、０．５λ、及び１．５λの値をとるところの発光層から放射された発光の強度の角度分布を示し、ここでλは発光の波長である。ガラスサブストレートの中へと放射された強度のみが示される。見られるように、臨界角θcesより下の角度における角度分布は、双極子層の厚さによって大きく変化せず、図４について上で記述された点双極子の放射に対応する角度分布に近い。
【００６５】
注意すべき変化は、角θ∈〈θces，θcls〉において観察され、ここでθcls＝ａｒｃｓｉｎ（ｎl／ｎs）≒７０．７°は、層／サブストレートの境界面の臨界角である。この角度の範囲内で、強度の角度分布は、顕著なピークを示す。このピークは、双極子層の厚さのより大きい値に対してより顕著であり、θclsへシフトされる。さらに、これらのより大きい厚さにおいて、鋭いピークが複数のより重要ではないピークに伴われ、該重要ではないピークは、θcesにより決められた角度の位置から“現れる”。これは図６（ａ）において一点破線により示される。この特徴は図６（ｂ）においては、発光層の厚さが十分に大きくないため、まだ見えない。
【００６６】
上に記述された放射された強度の挙動は、以下の議論を考慮することにより定性的に理解され得る。電磁場は、角θ∈〈θces，θcls〉においてガラスサブストレート内で伝播する様式に対応し、双極子場内で伝播する。サブストレート／層及び層／環境の境界面における反射により引き起こされる干渉効果のために、場の強さは、角θのある値に対してかなり強化され得る。層の内部の双極子の近接場とガラスの中を伝播する遠距離場との間のカップリング効率は、双極子層の内部の場の大きさに比例する。従って、特定の角θにおける放射された強度の向上は、この角度において伝播する様式に対応する場の強化の結果である。
【００６７】
図７及び８は、屈折率ｎ1＝１．４３及び可変の厚さｔbのバッファー層により覆われたガラスサブストレートを含む２層系へのこの分析の拡張を示す。バッファー層の上に、屈折率ｎ1＝１．４３及び厚さｔ1＝０．１λの発光双極子層が付与される。発光層は、環境により覆われ，該環境は水又は空気のいずれかである。この特異的な例は、バッファー層の厚さが放射される発光の強度の角度特性に与える影響を説明する。
【００６８】
ガラスサブストレートの中へ放射される発光の強度の角度依存性は、図８に示される。グラフ（ａ）および（ｂ）は発光層がそれぞれ空気及び水により覆われている状況に対応する。バッファー層の厚さはｔb＝０λ；０．５λ、λの間で変化する。見られ得るように、バッファー層の放射された強度の角度特性への影響は、２要素ある。第１に、角度範囲θ∈〈θces，θcls〉において、角度θが増加するにつれての強度の滑らかな減少は、ピーク及び急降下を含むより複雑な特徴へと変化し、その数はバッファー層の厚さに依存する。これらのピークは、サブストレートの上に直接堆積された層について上で議論されたものと同じ干渉効果のためである。バッファー層の第２の重要な影響は、バッファー層／サブストレートの境界面の臨界角θclsより上の角度において観察され得る。この角度より上で放射される発光の合計量は、ｔb＝λと同じくらい薄いバッファー層の場合さえ実質的に減少される。これは上で既に議論されたのと同じ理由のためである。
【００６９】
特に、これらの角度において観察される強度に対応する場は、バッファー層において消え易い(evanescent)。バッファー層の厚さは十分に大きいとき、場はほとんど発光層に到達し、該層は、放射する双極子の近接場と放射された場の間のカップリング効率を下げる。その結果、ガラスサブストレート内を角θ＞θclsにおいて伝播する発光の量は、ｔbのより大きい値に対しては非常に小さい。
【００７０】
図９は、以前の部分において議論されたものに類似する代表的な装置を説明する。この数字上の分析から得られた結果は、表面で発生する発光が興味深いところの実際的な用途に対して特に応用できる。２層系はガラスサブストレートからなり、それは屈折率ｎ1＝１．４３及び厚さｔ1＝１．５λのゾルゲル層により覆われている。ここに示される値は装置において使用され得る代表的な値であり、ｎ1又はｔ1の任意の特定の値に本使用を制限することが意図されないことが認識されるだろう。ｎ1は単純にサブストレートの屈折率より小さく、そしてスーパーストレートの屈折率より大きくなければならず、ここに与えられた値は典型的な値の例である。この層は、発光性あるいは非発光性のいずれかである。この層の上に、水のバルク層（厚さｔb）があり、それは発光分子を含むかあるいは含まないのいずれかである。このバルク層の目的は、薄いゾルゲル層の上の体積から発生する放射された発光への貢献をモデル化することである。バルク層は、発光分子を含まない水により覆われる。
【００７１】
第１に、図９（ａ）に示されるように、ゾルゲル層は発光分子を含まず、バルク層は発光分子を含むことが考慮される。ガラスサブストレートの中へと放射された発光の強度の対応する角度分布は、図１０（ａ）中に示される。見られ得るように、バルク層から放射された発光は、主に、水／サブストレートの境界面の臨界角（θcws）より下の角度において観察され得る。バルク層の厚さｔbが大きいほど、臨界角θcesの下で観察される発光の量は大きい。
【００７２】
他方、角度範囲θ∈〈θcws，θcls〉内で観察される発光へのバルク層の寄与は小さく、バルク層の厚さが約４λを超えるとき、図１０（ａ）において破線及び一点破線により表されるように、顕著には変化しない。これは、重要な観察である、なぜならそれは、この角度範囲内で放射された発光の角度分布を改造することなしにバルク層の厚さを任意的に大きい値に拡大することを可能にするからである。臨界角θclsの上で観察された発光に対して、無視できるだけのバルク層の寄与しかないこともまた注目されるべきである。
【００７３】
もし反対の場合を考慮するならば、即ちゾル層が発光分子を含み、バルク層が含まない場合、それは図１０ｂの例において示される、ゾル―ゲル層から発生する発光に対する主な寄与は、角θ∈〈θcws，θcls〉において観察されることが示され得る。さらに、臨界角θclsより上で放射されたかなりの量の発光がある。
【００７４】
ゾルゲル層及びバルク層の両方が発光物質を含み、両方の層が分子の等しい密度を有すると仮定するところのシナリオにおいて、図９（ｃ）において示されるように、強度の角度分布は図１１に示されたものに似ている。構造の様々な部分から発生する発光への寄与は、相間関係がないと考えられる（統計的な意味において）という事実のため、合計の強度はゾルゲル及びバルク層からの寄与の合計により与えられる。従って、ドープされたゾルゲル層及び発光性のバルク層から発生する寄与を区別することが可能であることをグラフが示すことが認識されるだろう。これは、これらの寄与は、異なる角の領域内で観察されるという事実のためである。特に、バルク層からの主要な寄与は臨界角θcwsより下の角度において放射され、一方、薄いゾルゲル層から発生する主要な寄与は臨界角θcwsより上の角において観察される。２つの寄与の区別は、臨界角θcwsの周囲でははっきりしないが、θtrにより表示される明確な角があり、それより上ではバルク層から発生する寄与がゾルゲル層から発生する寄与に対して無視できる。この角度の値は、この分析及び特定の検出系に特有のバックグラウンド信号を合わせることにより決められ得る。従って、本発明のテクニックを応用することにより、検出器において検出された光においてその光が発生したところ、即ちそれはサブストレートの境界面に近い領域における発光分子の発光によるのか、又はその領域の外の分子の発光によるのかを識別することが可能であることが認識されるだろう。
【００７５】
図１２は、表面及びバルクで発生された発光を区別するために適する技術を提供できるように、表面及びバルク寄与間の双極子活性に関連する分析の応用を示す。そのような応用はセンサー用途において特に重要性を有し、それはインシチュー環境において使用され、そこでは、試験される試料が細胞を通って流れ、ユーザーはサブストレート／環境の境界面の近くに位置する分子から発生する蛍光と細胞を通ってまだ流れている分子から発生するものとをリアルタイムで区別することを望む。考慮中の構造は、水により覆われたガラスサブストレートから成る。水の環境は、形式的には“表面”層、”バルク“層，及びバルク自身に分類される。この形式的な分類は、表面層の上に置かれたバルクから発生する発光の性質のモデル化を可能にするために導入され、境界面の媒体側の上の境界面の所定の距離の中の領域及びその所定の距離の外の第２の領域を表す。表面層は、ガラスサブストレートに隣接する厚さｔsの水の層である。バルク層は表面層を覆う、もう１つの水の層（厚さｔb）である。この分類の目的は、サブストレートの表面の近くに位置する分子、及び表面からさらに離れた位置する分子から発生する、放射された発光への寄与をモデル化することである。状況は図１２において示される。第１に、表面層及びバルク層の両方が発光分子を含むと仮定される。これは、図１２（ｃ）中に示されるように、発光が厚さｔs＋ｔbの層から発生することを意味する。そのような系からガラスサブストレートの中へ放射される発光の強度の角度分布はｔs＝λ及びバルク層の厚さの種々の値の場合について図１３（ａ）に示される（グラフの説明を参照のこと）。見られ得るように、バルク層の厚さの増大する値は、環境／サブストレートの境界面の臨界角θcesより下では本質的に、発光強度のレベルの増大をもたらすのみである。この角度より上では、発光の強度は、バルク層の厚さｔbの全ての値に対して実質的に変化がない。
【００７６】
この挙動を説明するために、表面層及びバルク層から発生する寄与が別々にプロットされる。
【００７７】
これは図１３（ｂ）中にそれぞれ実線及び一点破線により示される。該一点破線は、バルク層から発生する発光は、臨界角θcesより上では急速に落下することを示す。観察角度θtrのしきい値より上では、バルクから発生する発光強度は、表面層の寄与との比較において無視できることを示す。図１３におけるグラフ（ａ）及び（ｂ）から従うように、臨界角θcesあるいは、より正確にはしきい角θtrより十分上で放射された発光に寄与するのは表面層である。従って、θtrの値を定義し、そしてθtrより上で（より高い屈折率の）サブストレートの中へと放射される発光の角度分布を観察することにより、本発明の課題であるところの検出テクニックが確立され得る。このテクニックを用いて、表面層から発生する発光と表面層を覆うバルクから発生する発光とを識別することができる。表面層の厚さは、この原理を利用する特別の応用により測定されなければならない。一度分かれば、しきい角の位置θtrは計算されることができる。
【００７８】
本発明のテクニックを用いて、発光的にラベルされた、表面に結合された分子とバルク分子、これらはバイオセンサーにとって特に関心がある、とを識別することが可能である。これは、発光的にラベルされた、表面に結合された分子とバルク分子とを識別するために特異的な用途を有する。
【００７９】
発光の光源を識別するそのような能力を使用して、本発明者らは、サブストレートの境界面に隣接する領域から発生し、かつ直接照明により励起された発光の検出を可能にするように適合された方法及びテクニックを提供することを可能にする。関心のある領域の厚さ、それは発光の波長λのオーダー内である、は特定の用途のニーズに従って合わせることが可能である。
【００８０】
以下の分析において、サブストレートはガラス（ｎs＝１．５１５）で出来ており、発光種を含む環境は水(ｎw＝１．３３)であると考えられる。しかし、当業者にとって明らかであるように、任意の他のパラメーターのセットから同様の結論が引き出され得る。上で詳細に説明されたように、（ガラス）サブストレート、即ち表面層、に隣接する薄い層から発生する発光の検出は、発光の特異的なフラクション、特にしきい角θtrより上で（ガラス）サブストレート中を伝播するフラクションを測定することにより達成され得る。この結論は、図１３（ｂ）中に示され、ここで、厚さｔs＝λ（実線）の表面層及び厚さｔb＝３λ（一点破線）バルク層から発生する発光の角度プロファイル間の相違が明らかに見える。応用の観点から，そこから発光が発生するところの表面層の厚さｔsとそれより上で発光が観察されるところのしきい角θtrとの関係を知ることが重要である。
【００８１】
図１４（ａ）は、図１２に記載された２層系から放射された発光の角度分布を示す。分布は、表面層の厚さの２つの値、即ちｔs＝０．５λ及びｔs＝λ、及びバルク層の厚さの１つの値、即ちｔb＝３λに対してプロットされる。様々な曲線間の相対的な関係を見るために、ｙ軸は、対数スケールを採用する。図１４（ａ）から表面層からの発光とバルク層からの発光の寄与の間に重大な相違があることが、特に水／サブストレート（ガラス）の境界面の臨界角θcwsより上で見られ得る。バルク層に対応する強度は、θ＞θcwsの場合急速に減少する一方、この減少は表面層に対応する強度の場合には、それほど急速ではない。さらに、この減少の速度は、表面層の厚さにより変化し、それはｔs及びθtr間の関係を決めるために利用され得る基本的な特徴である。しきい角θtrは、それより上の角において、表面層から発生する発光の強度（Ｉｓ）：バルク層から発生する発光の強度（Ｉb）の比が、特定のしきい値、又は性能因子Ｆtrより大きい角、即ち、
Ｉs（θtr）／Ｉb（θtr）＞Ｆtr
として定義されることができる。
【００８２】
従って、θtrは、上の式の左手側と右手側とが等しくなるようなする角として定義されることができ、この応用において開発された装置はこの角度より上の光の検出を使用する。
【００８３】
最も実際的な用途において、発光の強度は常に幾つかのゼロではないバックグラウンドの信号により特徴付けられることが認識されるだろう。これらのバックグラウンドの信号は、電子的な源及び他のノイズの源からの寄与を有し得、それより上で、信号を検出することが可能であるところの閾値を表す。従って、θtrの値は、上の式内のＩb（θtr）がこのバックグラウンドレベルに対応するように選択されることができる。その結果、上の定義は、表面層から発生する発光の測定の信号対バックグラウンド比が、ある特定の値Ｆtrより大きいことが必要であるという必要条件の単純に形式的な表現である。これは、該式により与えられるθtrの定義をもまた正当化する。図１４（ａ）から、厚さｔs＝λの表面層から発生する発光の強度はバルク層から発生する発光の強度より、θtr＝６２．７°において１０倍、θtr＝６５．８°において１００倍、大きいことが見られ得る。従って、角θ > ６２．７°及びθ > ６５．８°において発光を測定することにより、厚さｔs＝ラムダの表面層から発生する発光のみが測定される確実性はそれぞれ１０及び１００である。
【００８４】
しきい角の選択は、装置のパラメーターに依存するが、ユーザーにより必要とされる確信度因子にもまた依存することが認識されるだろう。しきい角の選択は、表面層内からの発光のみが検出されることを確実にするために要求されるしきい角の値の分析により与えられる。上において詳細に説明されたように、これは、図１４（ｂ）のグラフの強さにより与えられる値の検査により与えられる。図１４（ｂ）により与えられる値は、望まれる装置の較正を可能にする。この較正は、区別に寄与するパラメーター／因子の理解に基づいて与えられる。これは多段階工程であると考えられる：
１．特定の用途において含まれる物質の屈折率、即ち、サブストレートのｎs、環境のｎe、及び任意的に、もしｎeとは異なるのであれば薄い表面層のｎ1、は、知られる必要がある。これらは使用される装置に特有であり、関連する物質の仕様から典型的に見出されることができ、ｎeの場合、見積もられるか、あるいは他の手段により測定される必要がある。
２．特定の用途は、サブストレート／スーパーストレートの境界面に隣接する層、即ち表面層、これが関心の対象である、の厚さのｔ1の値を支配するだろう。これは、応用工程によってもまた定義され、ユーザーにより決められるだろう。
３．用途は、発光のいわゆる分析波長、これはある光源による励起の際に、発光の強度が最大になるところの波長である、をもまた支配するだろう。
４．最後に、しきい因子Ｆtrは、ユーザーにより供給されるべきであり、それは、表面層から発生する発光及び周りを取り囲むバルクから発生する発光が区別されることができるところの確信度のレベルを決める。
５．工程１〜３から供給されたｎs，ｎe、ｎ1、ｔs及びλの値から、多層系、例えば図９（ｎeはｎ1に等しくない場合のシナリオ）あるいは図１２（ｎe＝ｎ1の場合のシナリオ）に示される系、を定義することが可能である。バルク層の厚さｔbの値を定義することもまたできる。この値は、原則として、恣意的な値であり、約４λより大きいが、実際には、バルク層の厚さは関心のある層の厚さよりかなり大きい可能性があることが認識されるだろう。この層は、特定の用途に対する最適のしきい角を決めるために利用され、表面層より上に位置されるバルクから発生する放射の同定を提供する。
６．以下において、ｎe及びｎ1は、等しくないことが仮定されるが、当業者には、ｎe及びｎ1が等しいならば、同じ工程が行われ得るであろうことが明らかであろう。
７．論文（Polereckyら、“Applied Optics”、２０００年）中に記載されたモデル、あるいは当業者によって高く評価されるような任意の同等のモデルにより提供されるテクニックを利用することは、恣意的な多層系中に置かれた分子から放射された発光強度の角度分布を評価することを可能にする。
８．第１に、図９（ａ）における状況が考慮され、即ち、バルク層が放射する分子を含み、一方表面層は含まないと推定される。そのようなモデル化されたパラメーターのセットを用い、そのような構造から放射された発光の角度分布が計算され、図１０（ａ）中の一点破線曲線に類似する曲線が得られる。
９．第２に、図９（ｂ）における状況が考慮され、即ち、表面層は放射する物資を含み、一方バルク層は含まないと仮定される。モデル化されたパラメーターを用いて、そのような構造から放射された発光の角度分布が計算され、図１０（ｂ）中の実線の曲線に類似する曲線が得られる。
１０．ポイント９及び８における計算に対応する曲線が分離され、即ち、表面層から発生する発光の強度：バルク層から発生する発光の強度が次に計算され得る。次に、この比が、ポイント４において説明されたしきい因子Ｆtrに等しい角度の値が測定される。この点は、しきい角θtrに等しい。このパラメーターは、次に、本明細書の方法が使用されるところの実験条件を定義するパラメーターとして使用されることができる。
【００８５】
該システム装置の光学的性質のこの初期の定義が、放射された発光の角度分布の計算を行うことを可能にすることが認識されるだろう。一度この分布が計算されれば、厚さｔ1の値が用途の要求に従って選択され、性能因子が選択され、次にしきい角がすぐに見出される。
【００８６】
ｔsの異なる値に対して計算された、図１４（ａ）中の曲線から従うように、しきい角θtrの値は表面層の望まれる厚さと共に変化する。例えばｔs＝λ及びＦtr＝１０に対してθtr＝６２．７°であるが、ｔs＝０．５λ及びＦtr＝１０に対してθtr＝６６．２°まで増加する。従って、実際の用途の観点から，ｔsと対応するθtrの値との関係を樹立することが必要である。もちろん、この関係は、しきい因子Ｆtrによりパラメーター化される。ｔsの関数としてのθtrの例は、図１４（ｂ）中に示され、ここで、実線及び一点破線はＦtr＝１０及びＦtr＝１００にそれぞれ対応する。グラフは、例えばもし用途が、ｔs＝０．５λ及びｔs＝λの厚さの表面層から発生する発光のみが、Ｆtr＝１０により特徴付けられる確実度で検出されることを要求するならば、検出器は、それぞれθtr＝６６．２°及びθtr＝６２．７°より大きい角において放射された発光のみを測定するべきであることを意味する。もし、確実度のより高いレベル、即ちＦtr＝１００が要求されるならば、これらの角は、それぞれ約８８°及び６５．８°まで増加される。図１４（ｂ）中のグラフもまた、この方法により解像されることのできる表面層の最小の厚さに関していくらかの限界があることを示す。例えば、約０．２λより薄い表面層から発生する発光は、ｔs＜≒０．２λの場合には定義されていないところの実線により示されるように、Ｆtr > １０の確実度レベルで検出されることができない。この最小の厚さは、もし確実度が１００まで増加されるならば≒０．５λまで上げられる。この特徴は、９０°に近づくあるいは９０°に等しい入射角に対して、エバネッセント場の浸透の深さがゼロより大きいという事実に関連する。グラフは、もしｔs＝２λを超えない厚さの表面領域が関心があるならば、約６５°より上で放射された発光を測定することにより、高い確実度（Ｆtr＝１００）でそれは調べられることができることをもまた示す。この値は、簡単な実験装置、例えば下に詳細に説明されるような装置により利用可能であるために十分小さい。
【００８７】
上の分析において発光の励起が全く言及されなかったことを強調することは重要である。これは、放射された発光の角度に関する性質、それはこのテクニックにおいて利用される、は、発光分子が励起された方法から独立であるからである。従って、表面の近接領域から特異的に発生する発光を検出しながら、分子の効率的な励起のために直接照明を使用することが可能である。これは、このテクニックを非常に魅力的にするものである。
【００８８】
本発明のテクニックの評価は、関心のある発光が表面の近接領域に位置する分子により特異的に生成された発光であるところの領域から情報を抽出することを可能にする。特に、本発明は、そのような発光の検出のための方法を提供する。エバネッセント波励起を用いる従来法とは対照的に、この方法は、発光分子を励起するために直接照明を使用することを可能にする。バルク中及び表面の近くに置かれた分子により放射された発光間の区別は、発光強度の角度特性の測定及び適切な処理により達成される。特に、あるしきい角θtrより上で放射された発光を測定することにより、ある対応する距離ｔsより表面に近くに置かれた分子から発生する発光のみが検出される。直接照明による励起がエバネッセント波励起テクニックにより与えられる励起よりずっと効率的であることを考慮に入れると、光源から放射された光のより多くが発光物質を励起するために使用され得ることを含む理由のため、本用途の方法は、免疫感知用途において特に魅力的であり得る。
【００８９】
上の記述は、本発明の方法を用いて、発光源間を識別することが可能であること、即ち、標識をつけられた物質に関する検出器の角度配向性に基づいて、捕捉された物質から直接的にあるいは間接的に発生する光、あるいはバルク層内の幾つかの見せかけの信号から発生する光を識別することが可能であることが理解されるだろう。しかし、本発明は、標識をつけられた物質が光学的に結合されたサブストレートの修飾をもまた提供し、その結果適切に配置された検出器に、しきい角より大きい角度においてサブストレートの中へと放射された光の特異的なアウトカップリングを可能にする。
【００９０】
図１５ａ〜１５ｄは、本発明の代表的な実施態様を説明し、どのようにしてセンサー装置が配置されて、関心のある光を特異的にアウトカップルできるかを示す。
【００９１】
図１５（ａ）の実施態様において，サブストレート（Ｓ）、その上で発光性の溶液がフローセル（ＦＣ）の中を流れることができる、はサブストレートと同じ物質，例えばガラスでできた半円筒のプリズム（ＳＣＰ）に付けられる。発光性試料（ＬＳ）は照明の直接の光源、例えばＬＥＤを用いて照明され、その結果得られる、臨界角より上でサブストレート中を伝播する光は臨界角より大きい角度において配置された検出器により検出されることができる。検出器は、適切にＣＣＤカメラ、線形検出器アレイ、あるいは何らかの同等物である。
【００９２】
図１５（ｂ）の実施態様は、不透明コーティング（ＯＣ）を利用する代替の装置を採用し、サブストレートを円錐台の構成の形で提供する。表面で生成された発光は検出器における領域まで伝達され、該検出器は、バルク層から発生する発光が送られるところの領域から空間的に隔てられている。このバルク層の寄与は、対応する光が検出されることを防ぐところの不透明のコーティングを施与することにより、あるいはＣＣＤチップ、これは検出器として作用する、により得られた画像を再び加工することにより遮断される。
【００９３】
図１５（ｃ）は、参照番号２により識別されるところのサブストレートの構築を説明し、これは、そのような選択的アウトカップリングを提供するように構成される。この実施態様において、より低く構成された表面８があり、その種々の部分が参照番号８（ａ）、８（ｂ）、８（ｃ）、及び８（ｄ）により識別される。表面８（ｄ）の上に、サブストレート２の低い方の表面８（ｄ）の上に形成された不透明の表面により施与された光の障壁１５が施与されている。その結果、いくつかの用途に特異的な距離ｔs（例えばｔs＝２λ）（即ち第２の層の中）より表面３からずっと離れているスーパーストレート１中の発光源４´を励起する光源５によりスーパーストレート１中で生成された発光は、不透明な表面８（ｄ）により吸収されるだろう。しかし、表面で生成された発光、即ち、表面８（ｃ）及び８（ｂ）のより近くに、及び第１の層中に置かれた発光源４を励起する光源５により発生された発光は、屈折と反射により、検出器１０に方向変換されるだろう。光は、最初，表面８（ｃ）を通って屈折され、次に表面８（ｂ）から下向きに検出器の方へ反射される。
【００９４】
今図１５（ｄ）に言及すると、アセンブリーの代替の構成が描かれ、該アセンブリーにおいて、図１５に関して記載されたものに類似する部分は、同じ参照番号により識別される。この実施態様において、サブストレート２の上に何らかの障壁を置く代わりに、障壁は検出器１０の上に置かれ、見られ得るように、遮断板２０がスーパーストレートの体積中の発光源、例えば発光源４´の励起から来る発光の光を遮るだろう。
【００９５】
図１６及び１７は、センサーチップ１６００、１７００の概略図であり、本発明の実施態様に従う、複数の個々のセンサー装置を取り込む。図１６において、図１５ｂにおいて記述されたものに類似する、複数の円錐台構造１６０５がアレイに配備された。これらの切断された円錐それぞれが、その表面に堆積された発光点１６１０を有し、適切に検出装置を配置することにより、それぞれの点から出る光が空間的に識別され得る。図１７は、模様のような溝あるいは隆起部を使用する、代替の実施態様を示す。
【００９６】
従って、本発明は、直接照明により励起された、表面で生成された発光の収集のためのテクニックを提供することが認識されるだろう。発光の源により識別する能力は、そのような直接照明の使用を可能にし、それは、そのようなテクニックを用いるセンサーアレイの感度が、照明のより高いレベルのため、これまで可能であったよりも高められ得る点で有利である。
【００９７】
本明細書において、用語“含む（comprise）、含む（comprises）、含まれた（comprised）、及び含んでいる（comprising）”あるいはその任意の変形及び用語“含む(include)、含む（includes）、含まれた（included）、及び含んでいる（including）”あるいはその任意の変形は、総合的に交換可能であると考えられ，それらは全て最も広い可能な解釈を与えられるべきである。
【００９８】
本発明は、前に記述された実施態様に制限されず、構造と詳細の両方において変化され得ることがさらに認識されるだろう。さらに、ある実施態様は特定の整数あるいは成分に関して記述されたかもしれないが、異なる実施態様からの個々の成分は、本発明の範囲から離れることなしに、ユーザーの希望に依存して交換可能であり得る。本発明は特定のサブストレート又は媒体（流動体）タイプについて記述されたが、本発明のこれらの特定の代表的な実施態様に本発明を制限することが意図されないことがさらに認識されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１（ａ）】ガラスサブストレートの上に置かれた小さな発光点から放射される発光の角度についての性質を示す；サブストレートは下の空気及び上の空気により囲まれている。
【図１（ｂ）】ガラスサブストレートの上に置かれた小さな発光点から放射される発光の角度についての性質を示す；サブストレートは下の空気及び上の水により囲まれている。
【図２（ａ）】サブストレートの表面から様々な距離において発生された光の効果を示す側面図である。
【図２（ｂ）】サブストレートの表面から様々な距離において発生された光の効果を示す側面図である。
【図３（ａ）】本発明に従う、発光に基づくセンサーアセンブリーの側面図である。
【図３（ｂ）】本発明に従う、発光に基づくセンサーアセンブリーの側面図である。
【図４（ａ）】ガラスサブストレートから様々な距離ｔdにおいて空気中に置かれた双極子により放射された発光の強度の角度分布を示す。
【図４（ｂ）】ガラスサブストレートから様々な距離ｔdにおいて水中に置かれた双極子により放射された発光の強度の角度分布を示す。
【図５】平坦なガラスサブストレート上に堆積された薄い双極子層（屈折率ｎ1＝１．４３、厚さｔ1）の概略図であり、ここで層を覆う環境は空気又は水である。
【図６（ａ）】図５の装置から放射される発光の強度の角度分布を示し、ここで層を覆う環境は空気である。
【図６（ｂ）】図５の装置から放射される発光の強度の角度分布を示し、ここで層を覆う環境は水である。
【図７】薄い発光層（屈折率ｎ1＝１．４３、厚さｔ1）及び平坦なガラスサブストレートの上に堆積された薄いバッファー層（屈折率ｎ1＝１．４３、厚さｔb）を含む２層系の概略図である。
【図８（ａ）】図７の２層系から発生しガラスサブストレートの中へと放射される光の強度の角度分布を示し、ここで該系は空気により覆われている。
【図８（ｂ）】図７の２層系から発生しガラスサブストレートの中へと放射される光の強度の角度分布を示し、ここで該系は水により覆われている。
【図９（ａ）】ガラスサブストレート、ゾル―ゲル層及びバルク層からなる２層系の概略図を示し、該構造は水により覆われ、バルク層は発光分子を含み、一方、ゾル―ゲル層は含まない。
【図９（ｂ）】ガラスサブストレート、ゾル―ゲル層及びバルク層からなる２層系の概略図を示し、該構造は水により覆われ、バルク層は発光分子を含まず、一方、ゾル―ゲル層は含む。
【図９（ｃ）】ガラスサブストレート、ゾル―ゲル層及びバルク層からなる２層系の概略図を示し、該構造は水により覆われ、バルク層及びゾル―ゲル層の両方が発光分子を含む
【図１０（ａ）】図９（ａ）に示された多層構造により発生された光の強度の角度分布を示し、グラフ（ａ）は図９（ａ）に示された状況に対応し、ここで図１０（ａ）におけるグラフの説明文により示されるように、図１０（ａ）中の異なる線は図９（ａ）中のバルク層の厚さｔbの異なる値に対応する。
【図１０（ｂ）】図９（ｂ）に示された多層構造により発生された光の強度の角度分布を示し、グラフ（ｂ）は図９（ｂ）に示された状況に対応する。
【図１１】図９（ｃ）に示された多層構造により発生された強度の角度分布の例であり、ここで、グラフの説明文により示されるように、異なる線は図９（ｃ）のバルク層ｔbの厚さの異なる値に対応する。
【図１２（ａ）】水で覆われたガラスサブストレートからなる２層系の概略図であり、バルク層は発光分子を含み、一方、表面層は含まない。
【図１２（ｂ）】水で覆われたガラスサブストレートからなる２層系の概略図であり、バルク層は発光分子を含まず、一方、表面層は含む。
【図１２（ｃ）】水で覆われたガラスサブストレートからなる２層系の概略図であり、バルク層及び表面層の両方が発光分子を含む。
【図１３（ａ）】ガラスサブストレートの中へと放射された発光の総強度の角度分布を示し、これは、“表面”及び“バルク”層から発生する寄与の合計として与えられ，ここで異なる線は、説明文により示されるように、図１２（ｃ）のバルク層の厚さの異なる値に対応する。
【図１３（ｂ）】厚さｔsの表面層（実線）及び厚さｔbのバルク層（一点破線）から発生する発光の強度に対する別々の寄与を示す角度分布を示す。
【図１４（ａ）】図１２（ｃ）において記載された２層系により放射された発光の角度分布を示し、ここで、（ＢＬ）及び（ＳＬ）により表示された曲線は、発光がそれぞれバルク層及び表面層から発生するところの状況に対応する。
【図１４（ｂ）】しきい因子Ｆtrの異なる値に対して、表面層の厚さの関数としてのしきい角を示す。
【図１５（ａ）】本発明の実施態様に従って発光を検出するために改造された構造を示す。
【図１５（ｂ）】本発明の実施態様に従って発光を検出するために改造された構造を示す。
【図１５（ｃ）】本発明の実施態様に従って発光を検出するために改造された構造を示す。
【図１５（ｄ）】本発明の実施態様に従って発光を検出するために改造された構造を示す。
【図１６】本発明の実施態様に従う代表的なアレイ構造を示す。
【図１７】本発明のもう１つの実施態様に従う、代わりのアレイ構造を示す。
【図１（ａ）】
2005502880.tif 000003
【図１（ｂ）】
2005502880.tif 000004
【図２（ａ）】
2005502880.tif 000005
【図２（ｂ）】
2005502880.tif 000006
【図３（ａ）】
2005502880.tif 000007
【図３（ｂ）】
2005502880.tif 000008
【図４（ａ）】
2005502880.tif 000009
【図４（ｂ）】
2005502880.tif 000010
【図５】
2005502880.tif 000011
【図６（ａ）】
2005502880.tif 000012
【図６（ｂ）】
2005502880.tif 000013
【図７】
2005502880.tif 000014
【図８（ａ）】
2005502880.tif 000015
【図８（ｂ）】
2005502880.tif 000016
【図９（ａ）】
2005502880.tif 000017
【図９（ｂ）】
2005502880.tif 000018
【図９（ｃ）】
2005502880.tif 000019
【図１０（ａ）】
2005502880.tif 000020
【図１０（ｂ）】
2005502880.tif 000021
【図１１】
2005502880.tif 000022
【図１２（ａ）】
2005502880.tif 000023
【図１２（ｂ）】
2005502880.tif 000024
【図１２（ｃ）】
2005502880.tif 000025
【図１３（ａ）】
2005502880.tif 000026
【図１３（ｂ）】
2005502880.tif 000027
【図１４（ａ）】
2005502880.tif 000028
【図１４（ｂ）】
2005502880.tif 000029
【図１５（ａ）】
2005502880.tif 000030
【図１５（ｂ）】
2005502880.tif 000031
【図１５（ｃ）】
2005502880.tif 000032
【図１５（ｄ）】
2005502880.tif 000033
【図１６】
2005502880.tif 000034
【図１７】
2005502880.tif 000035
【国際公開パンフレット】
2005502880.tif 000036
2005502880.tif 000037
2005502880.tif 000038
2005502880.tif 000039
2005502880.tif 000040
2005502880.tif 000041
2005502880.tif 000042
2005502880.tif 000043
2005502880.tif 000044
2005502880.tif 000045
2005502880.tif 000046
2005502880.tif 000047
2005502880.tif 000048
2005502880.tif 000049
2005502880.tif 000050
2005502880.tif 000051
2005502880.tif 000052
2005502880.tif 000053
2005502880.tif 000054
2005502880.tif 000055
2005502880.tif 000056
2005502880.tif 000057
2005502880.tif 000058
2005502880.tif 000059
2005502880.tif 000060
2005502880.tif 000061
2005502880.tif 000062
2005502880.tif 000063
2005502880.tif 000064
2005502880.tif 000065
2005502880.tif 000066
2005502880.tif 000067
2005502880.tif 000068
2005502880.tif 000069
2005502880.tif 000070
2005502880.tif 000071
2005502880.tif 000072
2005502880.tif 000073
2005502880.tif 000074
2005502880.tif 000075
2005502880.tif 000076
2005502880.tif 000077
2005502880.tif 000078
2005502880.tif 000079
2005502880.tif 000080
2005502880.tif 000081
2005502880.tif 000082
2005502880.tif 000083
2005502880.tif 000084
2005502880.tif 000085
2005502880.tif 000086
2005502880.tif 000087
2005502880.tif 000088
2005502880.tif 000089
2005502880.tif 000090
2005502880.tif 000091
2005502880.tif 000092
2005502880.tif 000093
2005502880.tif 000094
2005502880.tif 000095
2005502880.tif 000096
2005502880.tif 000097
2005502880.tif 000098
2005502880.tif 000099
2005502880.tif 000100
2005502880.tif 000101
2005502880.tif 000102
2005502880.tif 000103
【国際調査報告】
2005502880.tif 000104
2005502880.tif 000105
2005502880.tif 000106
2005502880.tif 000107
2005502880.tif 000108