(57)【要約】本発明は、分裂している細胞で組換え率及び／又は標的組換えを高める方法、キット、分子及び細胞に関する。特定の態様では、本発明は、標的減数分裂組換えを誘導する方法及びキットに関する。
2005532823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分裂する細胞における相同染色体の間の組換えを増やす方法であって、
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入する工程、及び
（ｉｉ）前記細胞における相同染色体の間の組換えを増やすように細胞を分裂させる工程を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉｉ）の前に、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列を前記細胞のゲノムに導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）で行われる細胞分裂が減数分裂である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）において、融合タンパク質の配列が、減数分裂特異的なプロモーターの制御下にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
減数分裂特異的なプロモーターが、ＩＭＥ１プロモーター又はＲＥＣ８プロモーターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が真核細胞である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
細胞が、真菌、植物細胞、哺乳類細胞及び昆虫細胞より成る群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインによって認識される１以上の配列を有する人工染色体を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）において、細胞に導入される核酸が細胞ゲノムに安定して組み込まれる請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
細胞が酵母であり、工程（ｉ）で導入される核酸がＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
細胞において同一染色体が有する２以上の多型の間で標的組換えを行う方法であって、
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで前記ＤＮＡ結合ドメインが前記２以上の多型の間に置かれた配列を認識する工程、及び
（ｉｉ）前記細胞において前記２以上の多型の間で組換えが生じるように細胞を分裂させる工程
を含む方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）の前に、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列を、前記２以上の多型の間で、前記細胞のゲノムに導入する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）で行われる細胞分裂が減数分裂である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）において融合タンパク質の配列が、減数分裂特異的なプロモーターの制御下にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
減数分裂特異的なプロモーターが、ＩＭＥ１プロモーター又はＲＥＣ８プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が真核細胞である、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、真菌、植物細胞、哺乳動物細胞及び昆虫細胞より成る群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されている前記ＤＮＡ結合ドメインによって認識される１以上の配列を有する人工染色体を含む請求項１１〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
細胞が真菌であり、工程（ｉ）で導入される核酸がＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする、請求項１１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
細胞において遺伝子変換を誘導する方法であって、
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで、前記ＤＮＡ結合ドメインが多型の近傍に置かれた配列を認識する工程、及び
（ｉｉ）遺伝子変換が生じるように細胞を分裂させる工程
を含む方法。
【請求項２１】
細胞において人工染色体に減数分裂組換えを誘導する方法であって、
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで前記ＤＮＡ結合ドメインが前記人工染色体が有する１以上の配列を認識する工程、及び
（ｉｉ）相同な人工染色体の間で減数分裂組換えを生じるように細胞を分裂させる工程
を含む方法。
【請求項２２】
細胞が酵母であり、前記人工染色体がＣＧＧＮ１１ＣＧＧ配列を伴う１以上の部位を有するＹＡＣであり、前記融合タンパク質がＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
生物の変異体を創生する方法であって
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記生物の細胞に導入し、ここで前記ＤＮＡ結合ドメインが前記細胞のゲノムが有する１以上の配列を認識する工程、
（ｉｉ）前記細胞に減数分裂を行わせて、前記生物の自然の減数分裂に比して、高い比率で及び／又はそれとは異なった遺伝子座で、前記細胞の相同染色体の間で減数分裂組換えを生じさせる工程、及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた細胞により前記生物の変異体を創生する工程
を含む方法。
【請求項２４】
生物が、真菌、植物、哺乳類及び昆虫より成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
２以上の形質の存在について前記変異体をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質において、Ｓｐｏ１１部分がＳｐｏ１１を動員することが可能であるＳｐｏ１１のパートナーに置き換えられる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
パートナーがＲＥＣ１０４である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生物のゲノムを解析する方法であって、
（ｉ）請求項２３〜２７のいずれか一項記載の方法を実施することにより前記生物の変異体を創生する工程、
（ｉｉ）前記変異体の特定の形質の遺伝子解析及び表現型解析を行う工程、及び
（ｉｉｉ）前記生物のゲノムを解析する工程
を含む方法。
【請求項２９】
Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有し、ここで前記融合タンパク質が以前は不活性の領域で二本鎖切断を誘導することができる、請求項１〜２８のいずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
【請求項３０】
Ｓｐｏ１１が、真菌、植物細胞、哺乳類細胞及び昆虫細胞より成る群から選択される細胞に由来するＳｐｏ１１タンパク質の配列を有する、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインにより認識される標的配列を有する核酸をさらに含む、請求項２９又は３０に記載のキット。
【請求項３２】
核酸がベクターに含まれる、請求項２９〜３１のいずれか一項記載のキット。
【請求項３３】
ベクターが、プラスミド、複製可能なＤＮＡ、形質移入剤と複合体化した核酸、ファージ又はウイルスである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
融合タンパク質をコードする核酸において、Ｓｐｏ１１のコーディング配列が、Ｓｐｏ１１を動員することが可能であるＳｐｏ１１のパートナーのコーディング配列に置き換えられている、請求項２９〜３３のいずれか一項記載のキット。
【請求項３５】
パートナーがＲＥＣ１０４である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を発現し、ここで前記融合タンパク質が、真核細胞のゲノムの以前は不活性であった領域で二本鎖切断を誘導することが可能である、前記真核細胞。
【請求項３７】
真菌、植物細胞、哺乳類細胞又は昆虫細胞である、請求項３６に記載の真核細胞。
【請求項３８】
アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）由来のＡｔＳｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３９】
マウスのＳｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
あらゆる真核生物では、父性染色体と母性染色体との間の減数分裂組換えの比率は、様々な染色体遺伝子座にて数桁異なっている。サッカロマイセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）及びそのほかの生物では、切断を触媒すると思われる広く保存されたタンパク質であるＳｐｏ１１を含む少なくとも１５のタンパク質を必要とする過程である、プログラムされたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）によって減数分裂組換えは開始される。
【０００２】
本発明は、細胞における減数分裂組換えの比率を高める、さらに具体的には標的化減数分裂組換えを誘導する方法及びキットに関する。本発明は、作動可能にＳｐｏ１１タンパク質に連結されたＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質を細胞内で発現させることによって、減数分裂組換えの開始を標的部位に標的化することが可能であるという事実に基づく。
【０００３】
背景技術
両性生殖を行う生物では、減数分裂細胞周期の間で二倍体の生殖系細胞のＤＮＡ含量を半分にすることにより半数体の配偶子を生じる。この過程の間に、組換えは二重の役割：相同染色体の長さに沿った情報をシャッフルし、子孫に伝える遺伝的多様性を創出すること、及び２回の減数分裂の最初の間に確実に相同体を対極に正しく分離させることを担っている。およそ１世紀前、デ・フリースは、遺伝的に伝達される間に、相同の母性染色体と父性染色体との間で交換が起きることを予測した。その後まもなく、１９０５年、ベイトソンはスイートピーにおいて花弁の色と花粉の形状という形質の間に部分的な連鎖があることを発見した。組換えという新しい分野におけるこれらの及びそれに続く発見は、連鎖したマーカーの間の交換（乗換え）の頻度によって測定される遺伝的距離という概念を導き、連鎖地図を開発した。１９１３年、スターテバントは、「当然、描かれたこれらの距離が因子からの実際の相対的な空間的距離を表すのかどうかは分からない」と書いた。分子時代の到来以来、遺伝的距離と物理的距離の定量的な比較によって、この予知された見識が広範に検証されてきた。サッカロマイセス・セレビシアエ、アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosphila melanogastor）、ムス・ムスクルス（Mus musculus）及びヒトを含むあらゆる生物については、減数分裂組換えの比率（ｃＭ／ｋｂで表す）は、染色体によって、数桁異なる。酵母の最近の研究では、この変動のほとんどは開始事象の頻度に関係することが示唆されているが（Baudat & Nicolas, 1997）、何故、いくつかの遺伝子座（ホットスポット）では相対的に頻度が高く、また、別の遺伝子座（不活性スポット）では相対的に頻度が低いのかは説明されないままである。
【０００４】
Ｓ．セレビシアエでは、減数分裂組換えは、プログラムされたＤＮＡ二本鎖の切断(ＤＳＢ)の形成及び修復の結果生じる（概説については、Smith & Nicolas, 1998を参照のこと）。多数の研究によって、天然のＤＳＢ部位は均一に分布するのではなく、切断頻度は、部位ごとに１０〜１００倍異なる（Baudat & Nicolas, 1997; gerton et al., 2000）。特定の領域や部位がＤＳＢを形成する（従って、組換え）傾向があるかどうかを決定する因子は完全には理解されていないが、それらは、局所的に及び全体的にの両方で作用することが分かっている。局所的には、遺伝子構成及びクロマチン構造が主要で、かつ関連する重要性を持っていると思われる。通常、天然のＤＳＢ部位はほとんどプロモーターを含有する領域にある（Baudat & Nicolas, 1997）。ＨＩＳ４遺伝子座では、２種の組換えホットスポット、α（転写因子依存性であるが転写には依存しない）及びβ（転写因子非依存性）が識別されている（Petes, 2001による概説）。さらに注目すべきは、既知のＤＳＢ部位のすべてが、有糸分裂及び減数分裂双方の細胞においてＤＮＡ分解酵素Ｉ又はミクロコッカス・ヌクレアーゼ（ＭヌクレアーゼＩ）に感受性である領域に局在するということは、開放クロマチンの構成が切断に必要であることを示唆している（Ohta etal., 1994; Wu & Lichten, 1994）。しかしながら、ヌクレアーゼ超感受性の部位のすべてがＤＳＢ部位であるわけではないので、局所クロマチンの接近可能性がＤＳＢ部位の選択性の唯一の決定因子ではありえない。
【０００５】
全体的な決定因子もＤＳＢの分布を制御する。酵母の第３染色体におけるＤＳＢ部位の細かなマッピング及びＤＳＢのゲノムレベルでのマッピングの両方によってＤＳＢ形成について活性のある（hot）又は不活性（cold）の大型染色体ドメイン（subchromosomal domain）の存在が裏付けられている（Baudat & Nicolas, 1997; Gerton et al., 2000）。これらＤＳＢに熟達した（proficient）、又はそれに不応のドメインの分子的根拠は解明されていないが、第３染色体に沿って種々の部位に挿入された組換えに熟達したレポーターが、ＤＮＡ分解酵素Ｉへの感受性、及びＤＳＢの形成と組換えの頻度に関して局所の特性に適応するという知見は、ドメインレベルの制御が局所の決定因に重ね合わせられることを示している（Borde et al., 1999）。すなわち、活性領域を不活性にすることはできるが、これまで、その逆は観察されておらず、不活性領域は通常不活性のままである。
【０００６】
ＤＳＢ頻度における染色体変動を考慮するには、トランス作用因子の影響も計算に入れなければならない。Ｓｐｏ１１、ＭＥ１４、ＭＥＲ１、ＭＥＲ２／ＲＥＣ１０７、ＭＲＥ２／ＮＡＭ８、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０３／ＳＫ１８、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４及びＸＲＳ２を含む多数の遺伝子がＤＳＢの形成に必要とされるが、ほとんどの場合、それらの分子的役割は不明である。上記遺伝子のすべてについての無発現変異体は減数分裂組換えを行うことができず、生存不能の胞子を生じる。ＤＳＢの完全なレベルには、さらに３つの減数分裂特異的遺伝子が必要である：ＭＥＫ１／ＭＲＥ４は、減数分裂染色体の構造成分であるＲＥＤ１及びＨＯＰ１の産物の活性を調節するキナーゼをコードする。ＳＰＯ１１は、好熱性古細菌（アーカエバクテリウム・スルフォロブス・シバタエ（Sulfobolus shibatae）のＩＩ型トポイソメラーゼの小型サブユニット（Ｔｏｐ６Ａ）と配列類似性を共有するタンパク質をコードする（Bergerat et al., 1997）。通常、修復に先行するＤＳＢ末端の５’から３’へのヌクレオチド鎖切断のプロセッシングを欠損する変異体（たとえば、ｒａ５０Ｓ）では、Ｓｐｏ１１がＤＳＢ断片の５’鎖末端に共有結合したままであるということは（Keeney et al., 1997）、それが減数分裂のＤＳＢの切断活性の触媒成分であることを示している。真菌及び高等真核生物におけるこれらの及びさらなる分子遺伝学的研究が、Ｓｐｏ１１オルソログは減数分裂組換えに普遍的に必要とされるようであることを明らかにしてきたということは、ＤＳＢが、すべてではないにしろほとんどの真核生物において減数分裂組換えを開始させることを示唆している。鎖切断及びＤＮＡ結合に寄与するＳｐｏ１１の領域を同定するための部位特異的突然変異誘発の使用により、Ｓｐｏ１１／Ｔｏｐ６Ａファミリー全体で保存されている構造的モチーフの機能的意味が明らかにされている（Bergerat et al., 1997; Diaz et al., 2002）。興味深いことに、ｓｐｏ１１突然変異体の一部におけるｈｉｓ４：：Ｌｅｕ２ホットスポットでのＤＳＢのレベルと分布の変動は、Ｓｐｏ１１が切断活性に関与するだけでなく、少なくとも局所的にはＤＳＢ形成のための部位の選択にも寄与していることを示唆している（Diaz et al., 2002）。
【０００７】
発明の開示
本発明者らは、Ｓｐｏ１１をＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４ＢＤ）に融合させて、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を創った。Ｇａｌ４タンパク質はＳ．セレビシアエにおいて最もよく性状分析された転写活性化因子の１つであり、ガラクトース異化に関与する遺伝子の発現に必要とされる。該タンパク質は、Ｎ−末端ドメインを介して活性化因子配列の上流にあるコンセンサスに結合し、Ｃ末端の活性化ドメインを介して転写を刺激する。インビトロ及びインビボでの「フットプリント」解析によって、Ｇａｌ４の結合に十分であるとしてＵＡＳＧＡＬ部位にて１７塩基対のコンセンサス配列（ＣＧＧＮ１１ＣＣＧ）が明らかにされている。次いで、本発明者らは、実施例で説明するように、この融合タンパク質が以前は不活性であった領域で組換えを刺激できることを明らかにし、本発明に至った。
【０００８】
本発明の目的の１つは、分裂している細胞でＤＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質（ＤＢＤはＤＮＡ結合ドメインである）を発現する工程を含む、分裂している細胞にて相同染色体の間での組換えを増やす方法である。
【０００９】
本発明はまた、細胞内で同一染色体が有する２以上の多型の間で標的組換えを行い、分裂細胞において前記融合タンパク質を発現させ、その際、結合ドメインは前記多型間又はその近傍に位置するＤＮＡ配列を認識する方法に関する。
【００１０】
必要に応じて、Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されている前記ＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列は、標準的方法により細胞ゲノムに導入することができる。
【００１１】
本発明の方法では、分裂している細胞は有糸分裂細胞でもよく、又は減数分裂細胞でもよい。
【００１２】
これらの方法では、細胞は、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインによって認識される１以上のＤＮＡ配列を有する人工染色体を含むことができる。
【００１３】
必要に応じて、ＤＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする核酸は安定的に細胞ゲノムに組み込まれる。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、ＤＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする核酸の減数分裂細胞への導入を含み、その際、ＤＮＡ結合ドメインは、前記人工染色体の少なくとも１つの配列を認識する、細胞において人工染色体で減数分裂組換えを誘導する方法である。
【００１５】
本方法の実施の１つに従って、細胞は酵母であり、人工染色体はＣＧＧＮ１１ＣＧＧ配列を有する１以上の部位を有する酵母又は非酵母のＤＮＡから成るＹＡＣであり、融合タンパク質はＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質である。
【００１６】
本発明はまた、減数分裂細胞で発現されるＤＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を用いて減数分裂組換えを誘導する工程、及び減数分裂細胞の相同染色体にて高い比率で、及び／又は異なった遺伝子座で減数分裂組換えを起こさせる工程を含む、生物の変異体を創生する方法に関する。
【００１７】
本方法は、２以上の形質の存在について前記変異体をスクリーニングする工程をさらに含むことができる。
【００１８】
同様に、本発明は、上記方法を実施することによる前記生物の変異体を創生する工程、前記変異体の特定の形質の遺伝的解析及び表現型解析を実施する工程、並びに前記生物のゲノムを解析する工程を含む、生物のゲノムを解析する方法を包含する。
【００１９】
本発明に係る方法はすべて、真菌、植物及び動物等のいかなる種類の真核細胞並びに生物でも実施することができる。
【００２０】
本発明のそのほかの態様は、上記方法を実施するためのキットであり、Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有し、その際、前記融合タンパク質は、以前は不活性であった領域で減数分裂組換えを誘導することが可能である。そのようなキットはさらに、Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されている前記ＤＮＡ結合ドメインにより認識される標的配列を持つ核酸を含むことができる。
【００２１】
本発明に係るキットの核酸は、たとえば、プラスミド、又は複製可能なＤＮＡ、必要に応じて形質移入剤と複合体化したもの、又はファージ又はウイルスのようないかなるベクターであってもよいベクターに含有されることができる。
【００２２】
本発明はまた、Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を発現する真核細胞に関するものであり、ここで、前記融合タンパク質は前記真核細胞のゲノムのかつて不活性の領域で減数分裂組換えを誘導することが可能である。
【００２３】
本真核細胞は、真菌細胞、植物細胞、動物細胞又は昆虫細胞であることができる。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、前記Ｓｐｏ１１タンパク質がたとえば、アラビドプシス・サリアーナのＡｔＳｐｏ１１タンパク質又はマウスのＳｐｏ１１タンパク質である、それに作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸に関する。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１．ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構造及び発現
（Ａ）実験方法に記載したように、ＡＤＨ１のプロモーター（ｐＡＤＨ１）及びターミネーター（ｔＡＤＨ１）の制御のもとでＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１融合体を含有するプラスミドｐＡＰ１を構築した。Ｇａｌ４ＢＤ及びＳｐｏ１１に由来するアミノ酸残基はそれぞれ上と下に示す。
【００２６】
（Ｂ）ノーザン解析のために、単調な増殖中（Ｙ）又は胞子形成培地に移した後様々な時間で、ＳＰＯ１１（ＯＲＤ５７４０）細胞及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（ＯＲＤ５８０６）細胞から全ＲＮＡを調製し、ＳＰＯ１１プローブとハイブリダイゼーションさせた。比較のために、ブロットをＡＣＴ１プローブと再びハイブリダイゼーションさせた。
【００２７】
（Ｃ）減数分裂の経過中にわたるＡＣＴ１のｍＲＮＡレベルに比べたＳＰＯ１１（○）及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（■）の転写レベルの定量。
【００２８】
（Ｄ）抗Ｇａｌ４（ＤＢＤ）抗体を用いたウエスタンブロット解析により検出されたＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質。各レーンには同一量のタンパク質を負荷、減数分裂周期を通してＯＲＤ５８０６細胞には同レベルで融合タンパク質が存在する。減数分裂ではｓｐｏ１１Δ二倍体（ＯＲＤ５８０５）についてシグナルは検出されなかった。
【００２９】
図２．  ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の二倍体における天然のＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ、ＡＲＧ４及びＣＹＳ３のホットスポットでの減数分裂ＤＳＢの形成
胞子形成培地に移した後、示した時間に採取したＳＰＯ１１（ＯＲＤ１１８１）及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（ＯＲＤ５８０７）の二倍体からゲノムＤＮＡを調製し、ＤＳＢはサザン解析により検出した。これらの株は、ｒａｄ５０Ｓ：：ＵＲＡ３対立遺伝子についてホモ接合体であり、ＤＳＢの形成はできるが、切除及び修復を妨害する（Alani et al., 1990）。各ゲルの右側で、領域地図によって、ＯＲＦ（白抜きの矢印は転写センスを示す）、ＤＳＢ部位（矢印）及びプローブの位置を示す。
（Ａ）ＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ領域におけるＤＳＢの形成。ＡｓｅＩでＤＮＡを消化し、ＹＣＲ０４８ｗの内部断片をプローブとした。ＹＣＲ０４８ｗＯＲＦにおける推定Ｇａｌ４コンセンサス結合配列を黒棒として示す。
【００３０】
（Ｂ）図２Ａで示したＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１における顕著なＤＳＢの定量。ＹＣＲ０４６ｃプロモーター（１）、ＹＣＲ０４７ｃ−ＹＣＲ０４８ｗプロモーター（２）及びＹＣＲ０４８ｗＯＲＦ（３）におけるＤＳＢ形成頻度の合計をヒストグラムとして表す。これらの合計は、ＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ領域で検出された合計ＤＳＢの９９％以上を説明する。
【００３１】
（Ｃ）ＡＲＧ４遺伝子座におけるＤＳＢの形成。ＳｎａＢＩでＤＮＡを消化し、ＡＲＧ４の内部断片をプローブとした。星印は交差ハイブリダイゼーションのバンドを示す。
【００３２】
（Ｄ）ＣＹＳ３遺伝子座におけるＤＳＢ形成。ＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを消化し、ＥＵＮ３６の内部断片をプローブとした。
【００３３】
図３．  ＵＡＳＧＡＬ配列のある遺伝子座におけるＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１が促進するＤＳＢ
ＳＰＯ１１（ＯＲＤ１１８１）及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（ＯＲＤ５８０７）の二倍体からゲノムＤＮＡを調製し、図２に記載したように解析した。ＵＡＳＧＡＬ配列は四角で示す。（Ａ）ＧＡＬ２遺伝子座におけるＤＢＡ形成。ＸｂａＩ／ＮｃｏＩでＤＮＡを消化し、ＧＡＬ２内部断片をプローブとした。
【００３４】
（Ｂ）ＧＡＬ１、７、１０遺伝子座におけるＤＳＢの形成。ＣｌａＩ／ＡａｔＩＩでＤＮＡを消化し、ＧＡＬ１内部断片をプローブとした。
【００３５】
図４．ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２遺伝子座で組換えは刺激される
（Ａ）ＲＡＤ５０株（ＯＲＤ５８０６）におけるＧＡＬ２遺伝子座でのＤＳＢの形成。ゲノムＤＮＡをＸｂａＩ／ＮｃｏＩで消化し、ＧＡＬ２内部断片をプローブとした。左の矢印は、同質遺伝子系統のｒａｄ５０Ｓ（ＯＲＤ５８０７）におけるＧＡＬ２ＵＡＳＧＡＬでのＤＳＢを示す；右の棒は、ＤＳＢ断片の「スメア」の程度を示す。
【００３６】
（Ｂ）ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１二倍体（ＯＲＤ６６２６）の子孫におけるＧＡＬ２及びｇａｌ２−Ｂｓｐの対立遺伝子の分離。四分子をＹＰＤ上で分析し、コロニーＹＰＧａｌした。ｇａｌ２−Ｂｓｐ対立遺伝子は遅い増殖表現型を付与する。この例では、遺伝子の変換（３＋：１−及び１＋：３−）並びにメンデル式（２＋：２−）の分離パターンを見ることができる。
【００３７】
（Ｃ）ＧＡＬ２及びｇａｌ２−Ｂｓｐの対立遺伝子ついて二倍体ヘテロ接合体であるＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（ＯＲＤ６６２６）及びＳＰＯ１１（ＯＲＤ６６３２）におけるＧＡＬ２遺伝子座での減数分裂遺伝子変換の頻度。
【００３８】
図５．ＧＡＬ２遺伝子座は不活性領域に位置する
ＧＡＬ２遺伝子座を中心とした２０ｋｂ区間におけるＤＳＢ形成のサザンブロット解析。ＳＰＯ１１（ＯＲＤ１１８１）及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１（ＯＲＤ５８０７）二倍体の減数分裂ＤＮＡを、示した制限酵素で消化し、ＧＡＬ２の内部断片をプローブとした。模式図は、遺伝子の転写センス及び関連する制限部位を示す。矢印はＤＳＢ部位を示す。
【００３９】
図６．ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の株におけるＤＳＢ形成に対する遺伝的必要条件
野生型及び変異型（ｘ軸上に示すように）の背景においてＳＰＯ１１又はＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構築物（それぞれ、黒又は白の棒）を有する二倍体におけるＧＡＬ２遺伝子座、ＹＣＲ０４８ｗＯＲＦ及びＹＣＲ０４８ｗプロモーター（ｙ軸）での減数分裂頻度（ｚ軸）を測定するために、図２及び３のようにサザンブロット解析を行った。アッセイした株すべての遺伝子型を表１に列記する。胞子形成培地に移した後８時間又は１０時間でＤＳＢ頻度を測定した。
【００４０】
図７．ＹＣＲ０４８ｗ領域（Ａ）及びＧＡＬ２領域（Ｂ）における減数分裂ＤＳＢの形成
減数分裂ＤＳＢはさらに短いバンドにより検出される。固有のＤＳＢ部位及びＵＡＳ部位依存性のＤＳＢ部位をそれぞれ、実線及び点線の矢印で示す。双方の構築物（これらによってＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質は、減数分裂の前期（prophase）に極めて早期に（ＩＭＥ１プロモーター）及び早期に（ＲＥＣプロモーター）発現される）によってＵＡＳ部位にてＤＳＢを標的とすることができる。
【００４１】
図８．ＹＣＲ０４８ｗ領域及びＧＡＬ２領域における減数分裂ＤＳＢの形成
減数分裂ＤＳＢはさらに短いバンドにより検出された。固有のＤＳＢ部位及びＵＡＳ部位依存性のＤＳＢ部位をそれぞれ、実線及び点線の矢印で示す。構築物（それにより、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｒｅｃ１０４融合タンパク質が構成的に発現される）によって、ＵＡＳ部位においてＤＳＢを標的とすることができる。
【００４２】
図９．ＰＩＭＥ１−Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１構築物の配列
ＩＭＥ１プロモーターの配列に下線を引き、Ｇａｌ４結合ドメインをコードする配列を太字で、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質の中でＳｐｏ１１部分をコードする配列をイタリック体で示す。
【００４３】
図１０．ＰＲＥＣ８−Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１構築物の配列
ＲＥＣ８プロモーターの配列に下線を引き、Ｇａｌ４結合ドメインをコードする配列を太字で、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質の中でＳｐｏ１１部分をコードする配列をイタリック体で示す。
【００４４】
図１１．ＰＡＤＨ１−ＱＱＲ−Ｓｐｏ１１構築物の配列
ＡＤＨ１プロモーターの配列に下線を引き、ＱＱＲ結合ドメインをコードする配列を太字で、ＱＱＲ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質の中でＳｐｏ１１部分をコードする配列をイタリック体で示す。
【００４５】
図１２．ＰＡＤＨ１−Ｇａｌ４ＢＤ−ＲＥｃ１０４構築物の配列
ＡＤＨ１プロモーターの配列に下線を引き、Ｇａｌ４結合ドメインをコードする配列を太字で、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｒｅｃ１０４融合タンパク質の中でＲｅｃ１０４をコードする配列をイタリック体で示す。
【００４６】
図１３．ＰＡｔＳＰＯ１１−Ｇａｌ４ＢＤ−ＡｔＳｐｏ１１−１構築物の配列
ＡｔＳＰＯ１１プロモーターの配列に下線を引き、Ｇａｌ４結合ドメインをコードする配列を太字で、Ｇａｌ４ＢＤ−ＡｔＳｐｏ１１−１融合タンパク質の中でＡｔＳｐｏ１１をコードする配列をイタリック体で示す。
【００４７】
好ましい形態の詳細な説明
この出願を通して、幾つかの用語を採用するが、その意味は、以下の定義に従って理解すべきである：
「融合タンパク質」は、異なった起源に由来する少なくとも２つの部分を含むキメラタンパク質である。それは通常、異なった起源に由来するコーディング配列を含み、前記コーディング配列がインフレームである融合遺伝子の産物である。
【００４８】
本発明は、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質に関与する。これらの融合において、ＤＮＡ結合ドメイン、即ちＤＢＤは、この結合が配列特異的であろうとなかろうと、ＤＮＡに結合する特性を有する任意のタンパク質の任意のドメインである。非特異的ＤＢＤの例は、ＴｏｐｏＩ及びＴｏｐｏＩＩのようなトポイソメラーゼ類並びにＲａｄ５１のような鎖交換タンパク質であり、配列特異的なＤＢＤの例として、Ｇａｌ４ＤＢＤ（以下、Ｇａｌ４ＢＤとする）、ＱＱＲ（Smith, Bibikova et al., 2000）又はｌｅｘＡレプレッサーがあげられる。当然、これらの例は純粋に指示的であり、そのほかのＤＢＤを用いて本発明を実施することができる。Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質の例の配列は、図９及び１０に記載され、ＱＱＲ−Ｓｐｏ１１の例の配列は図１１に示されている。
【００４９】
本発明に係る融合タンパク質の第２の部分はＳｐｏ１１タンパク質である。この用語は、Ｓ．セレビシアエ（Esposito & Esposito, 1969）で同定されたＳＰＯ１１遺伝子のタンパク質産物を指すが、Ｓｐｏ１１のオルソログタンパク質、すなわちＳＰＯ１１遺伝子のオルソログ遺伝子の産物も指し、オルソログ遺伝子は２つの異なった分類群で見い出され、各分類群で同一の機能を実行すると理解されている。Ｓｐｏ１１タンパク質のそのほかの例は、アラビドプシス・サリアーナのＡｔＳｐｏ１１（Grelon et al., 2001）、及びその配列がBaudat & Keeney, 2000に記載されているマウスのｍＳｐｏ１１である。
【００５０】
あるいは、融合タンパク質の第２の部分はＳｐｏ１１とは異なるタンパク質であることができ、それは、ＤＳＢの形成に関与するＳｐｏ１１のパートナーであり、Ｓｐｏ１１を動員することができる。「動員すること」によって、ＤＢＤとパートナーとの融合タンパク質がＳｐｏ１１と複合体を形成し、ＤＢＤによって標的とされる部位にてＤＳＢの形成を招くという事実を意味する。以下に用いられる用語「パートナー」は、Ｓｐｏ１１を動員することが可能であるＳｐｏ１１のパートナーを指す。本発明に係る融合タンパク質で第２の部分として使用することができるタンパク質の例は、Keeney(2001)及びSmith & Nicolas (1998)による概説に引用されている。
【００５１】
本発明に含まれる融合タンパク質の２つの部分−ＤＢＤ及びＳｐｏ１１又はそのパートナーの１つ−は「作動可能に連結され」、このことは、融合タンパク質がＤＢＤ部分を介してＤＮＡに結合する能力を保持し（ＤＢＤが配列特異的であれば、配列特異的な方式で）、かつ、Ｓｐｏ１１の当初の機能（二本鎖切断を生じる）を保持することを意味する。ＤＢＤ及びＳｐｏ１１に依存して、ＤＢＤ部分は、融合のＮ末端又はＣ末端の先端に位置することができる。あるいは、タンパク質の各先端で２つのＤＢＤ（おそらく異なったもの）をＳｐｏ１１に融合することができる。
【００５２】
そのほかの定義は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明で見られるであろう。
【００５３】
興味深いことに、実施例に記載するように、本発明は、減数分裂の間の相同組換えの頻度を実質的に高め、Ｓｐｏ１１タンパク質の単純な改変によりこの組換えを標的とする新規の方法を提供する。以前の報告では、減数分裂の相同組換えを局所的に刺激するための、たとえば、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＨＯ又はＶＤＥのような部位特異的ヌクレアーゼの使用が記載されている。Ｓｐｏ１１に非相同のＤＮＡ結合ドメインを加える本方法は、識別可能な特徴及び実用的な利点を持つ別の戦略を提供する。たとえば、このアプローチは複雑さの少ない天然に生じる染色体部位を活用し、それによって、特異的な配列を予め導入する必要も常在のＳＰＯ１１遺伝子を欠失させる必要もなく、多数の可能性のある標的を複製する。また、切断が、シス及びトランスで作用する決定因子に関して正常な生理的条件下にあるままであり、その結果、相同組換え経路によってＤＳＢが修復されるので、生存可能な配偶子を生じ、新規の組換え体を得ることができる。
【００５４】
本発明は、分裂している細胞において相同染色体間の組換えを高める方法に関するものであり、該方法は、
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入する工程；及び
（ｉｉ）前記細胞において相同染色体間の組換えが増すように細胞を分裂させる工程を含む。
【００５５】
実際、実施例１にて以下で記載するように、本発明者らは、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質が、天然のホットスポット、さらにはＧａｌＢＤのコンセンサス配列のレベルで、たとえ、ゲノムの不活性領域に位置していても、二本鎖切断を誘導できた事を明らかにした。必要に応じて、上記方法は、工程（ｉｉ）の前に、Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列を前記細胞のゲノムに導入する工程をさらに含むことができる。多数のそのような配列の導入は、細胞における相同組換えの比率を高めるであろう。さらに、これらの配列を特定の位置に導入し、それによって、以下にさらに詳細に記載するように、組換えのターゲティングを可能にする。
【００５６】
あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質と、Ｓｐｏ１１を動員することが可能であるＤＳＢ形成に関与するＳｐｏ１１のパートナーとの間の融合タンパク質をコードする核酸を導入することによって上記方法を実施することができる。上ですでに述べたように、本出願のこの具体的な実施形態に従って使用できるタンパク質は、たとえば、Kenney(2001)及びSmith & Nicolas (1998)による概説論文に引用されているタンパク質の間で、さらに具体的には、哺乳類におけるＲＥＣ１０２、ＲＥＣ１０３／ＳＫ１８、ＲＥＣ１０４、ＲＥＣ１１４、ＭＥＩ４、ＭＲＥ２／ＮＡＭ８、ＭＥＲ２／ＲＥＣ１０７、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、ＸＲＳ２／ＮＢＳ１、並びにＨＯＰ１、ＲＥＤ１、ＳＡＥ２／ＣＯＭ１、ＭＥＲ１及びＭＥＫ１を含む群で選択することができる。本発明のこの実施形態は、実施例１．１０においてＧａｌ４ＢＤ−Ｒｅｃ１０４タンパク質により説明される。以下の本文を通して、用語「Ｓｐｏ１１」は、以後、Ｓｐｏ１１タンパク質自体又はＳｐｏ１１を動員可能であるＳｐｏ１１のパートナーのいずれかとして理解すべきである。
【００５７】
本方法は、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されている前記ＤＮＡ結合ドメインにより認識される１以上の配列を有する人工染色体を含む細胞の内部で実施することができる。実施例５で説明するように、人工染色体は減数分裂の間、必ず組換えを生じるとは限らないが、それは、分離の問題を招くので、娘細胞の一部ではこれらの染色体の喪失を招く。
【００５８】
上述の方法では、ＤＢＤ−Ｓｏｐ１１融合タンパク質をコードする、工程（ｉ）で細胞に導入した核酸が細胞ゲノムに安定して組み込まれうる。あるいは、この核酸は、一時的な又は安定的なエピソームのいずれかでエピソームになる。一時的なエピソームは細胞ゲノムの外側に残るＤＮＡ分子であり、細胞分裂で必ずしも娘細胞に伝えられるとは限らない。それは、たとえば、宿主細胞によって、プラスミド又はアデノウイルスのベクターゲノムであることができる。安定的なエピソームは、複製され、娘細胞に伝えられるものであり、たとえば、ＥＢウイルスのｏｒｉＰ−ＥＢＮＡ−１系を有するレプリコンである。重要なことに、本発明者らは、細胞に導入されたプラスミドにコードされたＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１により、常在のＳｐｏ１１遺伝子を変更することなく、標的とする減数分裂二本鎖切断を誘導できることを明らかにした。
【００５９】
本発明に従って細胞に導入された核酸では、ＤＢＤ−Ｓｐｏ１１（又はパートナー）タンパク質をコードする配列は、構成的なプロモーター（たとえば、ＡＤＨ１のプロモーター）、又はＳｐｏ１１プロモーターのような減数分裂特異的なプロモーター、又はたとえばＩＭＥ１プロモーター（Guttman-Raviv et al., 2001）若しくはＲＥＣ８プロモーター（実施例１．９に記載）のような異種プロモーターの制御下に置かれる。
【００６０】
実施例１で説明する上記方法の具体的実施形態では、細胞は酵母であり、工程（ｉ）で導入される核酸は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする。
【００６１】
興味深いことに、本発明者らは、酵母ゲノムからの常在Ｇａｌ４配列の欠損は、ＵＡＳ部位にてＤＳＢが介在するＧＡＬ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１の上昇を招く（実施例１．１１）ことを示した。
【００６２】
本発明はまた、細胞において同一染色体が有する２以上の多型の間で標的組換えを行う方法に関するものであり、それは、以下の工程を含む：
（ｉ）Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで、前記ＤＮＡ結合ドメインは、前記２以上の多型の間に位置する配列を認識する工程；及び
（ｉｉ）前記細胞において前記２以上の多型の間で組換えを生じるように細胞を分裂させる工程。
【００６３】
細胞において遺伝子の変換、すなわち、１又は数個の多型の局所転移を標的とし、結果として染色体による前記多型の一方向性の取得を生じる方法も本発明の一部である。実際、本発明は、乗換えと同様に遺伝子変換によって異なったハプロタイプの獲得を可能にする。この後者の方法は以下の工程を含む：
（ｉ）Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで、前記ＤＮＡ結合ドメインが、転移されるべき２以上の多型の近傍に位置する配列を認識する工程；及び
（ｉｉ）遺伝子変換を生じるように細胞を分裂させる工程。
【００６４】
これらの方法は、通常一緒に分離する遺伝子の、特にホットスポットを含まないＤＮＡ領域に位置する遺伝子の間の相互作用を研究するのに特に有用であることができる。必要に応じて、これらの方法は、工程（ｉｉ）の前に、前記細胞のゲノムの前記多型の間又は近傍にＳｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインにより認識されるＤＮＡ配列を導入する工程をさらに含むことができる。
【００６５】
本発明に従って標的組換えを行う方法では、細胞は、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＢＤにより認識される１以上の配列を有する人工染色体を含むことができる。従って、本方法は、人工染色体に沿った特異的な位置での標的化相同組換えをするのに役立つ。
【００６６】
上記方法の好ましい実施形態では、細胞は、酵母であり、Ｓｐｏ１１部分は、Ｓ．セレビシアエに由来する。あるいは、及び上述のように、いわゆるＳｐｏ１１部分は、Ｓｐｏ１１を動員することが可能であるＳｐｏ１１パートナーであることができ、たとえば、ＲＥＣ１０４である。場合により、ＤＢＤはＧａｌ４ＢＤである。
【００６７】
本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）で行われる細胞分裂は減数分裂である。酵母のようなある種の細胞は、減数分裂を開始し、次いで、「増殖回帰」又はＲＴＧと呼ばれる過程によって有糸分裂に戻る。そのような細胞では、減数分裂の早期工程で組換えを誘導することにより該方法を行うことができ、次いで細胞を増殖に戻すことができる。本発明のこの実施形態では、Ｓｐｏ１１のプロモーターのような減数分裂特異的なプロモーター又はＩＭＥ１若しくはＲＥＣ８プロモーターのような異種プロモーターが、ＤＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質の発現を有利に駆動する。
【００６８】
本発明のもう１つの態様は、細胞において人工染色体で減数分裂組換えを誘導する方法であり、以下の工程を含む：
（ｉ）Ｓｐｏ１１に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記細胞に導入し、ここで、前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記人工染色体が有する１以上の配列を認識する工程；及び
（ｉｉ）人工染色体間で減数分裂組換えを生じるように細胞を分裂させる工程。
【００６９】
上述のように、人工染色体は減数分裂の間、必ずしも組換えるとは限らず、それによって分離問題を被ることになる。これは、人工染色体の使用を限定する主な欠点である。本明細書では、用語「人工染色体」は、完全な人工染色体（たとえばＹＡＣｓ）だけでなく、他の株由来の同質及び非相同の染色体も指す。たとえば、酵母では、異なった野生型の株を起源とする染色体を含む雑種株を入手することができる。そのような染色体は、相対的に高い比率の同一性を有する場合、前記「同質」であり、配列があまり近くない場合、「非相同」である。雑種の酵母では、非相同の染色体及び程度は少ないが同質の染色体は減数分裂の間、組換えることができない。
【００７０】
細胞において人工染色体間での減数分裂組換えを可能にすることによって、本発明は、新しい興味深い見通しを開いている。たとえば、醸造の分野では、熟練者が様々な野生型の株に由来する幾つかの有利な形質を同じ株で組み合わせるので、酵母は雑種株であることが多い。特に、これらの株は上述の理由によって胞子形成できないために、最適な株の選抜は容易ではない。
【００７１】
本発明の方法は一般に、細胞におけるハプロタイプを組換えるのに役立つ。本方法によって得られる組換えは、それが相同染色体の同一の位置間で生じる場合、対立遺伝子的であり、局所でのみ相同の領域で生じる場合、異所性である。従って、本方法は染色体間の転座を創出できる。その結果、本発明の方法は、細胞分裂の間に細胞中で異なる染色体間での組換えを可能にすることにより、上述の酵母株、さらに一般的には当分野で使用されるいかなる株の能力も明らかに高め得る。興味深いことに、上述のように、減数分裂の早期工程に組換えを誘導し、次いでＲＴＧ過程によって細胞を有糸分裂に戻すことができる。
【００７２】
細胞が酵母であるとき、人工染色体で組換えを誘導する本発明の具体的な実施形態では、人工染色体は、ＣＧＧＮ１１ＣＧＧ配列を伴う１以上の部位を有するＹＡＣであり、融合タンパク質は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質である。
【００７３】
人工染色体の組換えは、たとえば医薬分野における、真核細胞の培養におけるタンパク質合成において、このツールのさらに広い利用をも導くことができる。
【００７４】
本発明はまた、生物の変異体を創生する方法に関するものであり、以下の工程を含む：
（ｉ）Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を前記生物の細胞に導入し、ここで前記ＤＮＡ結合ドメインが前記細胞のゲノムが有する１以上の配列を認識する工程；
（ｉｉ）前記細胞に減数分裂を行わせて、前記生物の天然の減数分裂に比べ高い比率、及び／又はそれとは異なった遺伝子座で、前記細胞の相同染色体間で減数分裂組換えが生じさせる工程；及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において得られた細胞によって前記生物の変異体を創生する工程。
【００７５】
本方法では、用語「変異体」は、広く理解されるべきであり、その親を考慮して少なくとも１つの表現型又は遺伝子型の差異を提示する生物を指す。相同染色体間の組換えの結果生じる変異体は、遺伝子間又は遺伝子内で生じ、ＤＮＡ配列によって定義される遺伝子多型の再会合の結果生じる。さらに一般的には、ここでの変異体は、そのハプロタイプが親のハプロタイプと異なる生物を指す。
【００７６】
前に記載したように、Ｓｐｏ１１は、古細菌のトポイソメラーゼと相同である（Bergerat, de Massy, 1997）。しかしながら、本発明の方法は好ましくは真核細胞の中で実施する。たとえば真菌細胞、植物細胞、哺乳類細胞及び昆虫細胞より成る群から、これらの細胞を選択することができる。以下に記載される実験部分では、真菌についてはＳ．セレビシアエ、植物についてはＡ．サリアータ、哺乳類についてはマウス、昆虫についてはドロソフィラにより、こうした細胞の例を説明する。いずれにしても、生物の変異体を創生する上記方法では、この生物は真菌、植物、非ヒト哺乳類及び昆虫より成る群から選択することができる。
【００７７】
本発明に従って生物の変異体を創生する方法は、２以上の形質の存在について、得られた変異体をスクリーニングする工程をさらに含むことができる。本方法は、組換え率を高めることおよび／又は標的化減数分裂組換えを誘導することにより親細胞とは異なる形質を兼ね備える変異体の迅速入手を可能にする。従って、それは、対立遺伝子の特定の組み合わせを提示するものを見い出すためにスクリーニングしなければならない個体の量を劇的に減らすことができる。
【００７８】
上述の方法は本発明のもう１つの態様を導き、それは、生物のゲノムの解析方法であり、以下の工程を含む：
（ｉ）本発明の方法に従って、前記生物の変異体を創生する工程；
（ｉｉ）前記変異体の特定の形質の遺伝子解析及び表現型解析を行う工程；及び
（ｉｉｉ）前記生物のゲノムを解析する工程。
【００７９】
実際、所望の対立遺伝子を有するものを見い出すためにスクリーニングしなければならない生物（たとえば、マウス）の量が減るので、大量の変異体の迅速な入手によって遺伝子型と表現型との間の相関を確立することが容易になる。
【００８０】
本発明の方法によって入手可能な変異体は、任意の種類の化合物の作用を、たとえば、薬剤開発の過程においてスクリーニングするために、又は組換え遺伝子の発現に好適な、適当な宿主細胞を入手するために、実験モデルで使用することができる。
【００８１】
本発明はまた、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有し、ここで、前記融合タンパク質が以前不活性であった領域で二本鎖切断を誘導することが可能であることを特徴とする、上記方法を実施するためのキットに関する。
【００８２】
本キットでは、Ｓｐｏ１１は、真菌、植物細胞、哺乳類細胞及び昆虫細胞より成る群から選択される細胞由来のＳｐｏ１１タンパク質の配列を有する。そのような配列の例は、Ｓ．セレビシアエ（酵母）のｓｐｏ１１、Ａ．サリアーナ（植物）のＡｔｓｐｏ１１、マウス（哺乳類）のｓｐｏ１１、及びドロソフィラ（Drosophila, 昆虫）のｓｐｏ１１である。当然、これらの例に制限されるものではなく、他のいかなる生物由来のいかなるｓｐｏ１１オルソログも使用することができる。
【００８３】
本発明のキットは、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されている前記ＤＮＡ結合ドメインにより認識される標的配列を有する核酸をさらに含むことができる。所望の染色体の所望の遺伝子座にこの標的配列を挿入するための構築を容易にするように、この標的配列は、いかなる種類のベクター、たとえば、多数の制限部位を含むクローニングベクターを含むことができる。
【００８４】
ＤＢＤ−ｓｐｏ１１配列を含む核酸をベクターに含ませることができる。上述のように、本発明の方法は、細胞のゲノムにＤＢＤ−ｓｐｏ１１遺伝子を組み込まずに実施することができる。従って、細胞の種類により、たとえば、プラスミド、複製可能なＤＮＡ類、任意の形質移入剤との複合体形成した核酸、ファージ及びウイルスのような、多種多様なベクターが適当である。様々なウイルスをベクターとして使用し、ＤＢＤ−ｓｐｏ１１配列を含む核酸を哺乳類細胞に導入するが、そのうちのいくつかは細胞ゲノムに組み込まれ（たとえば、レトロウイルス）、一部は組み込まれない（たとえば、アデノウイルス）。
【００８５】
また、本発明の一部は、Ｓｐｏ１１タンパク質に作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を発現する真核細胞であり、ここで、前記融合タンパク質は、前記真核細胞のゲノムの以前は不活性であった領域において二本鎖切断を誘導することが可能である。当然、この文脈における、語句「不活性な領域」は、減数分裂組換えについて不活性な領域を指す。この細胞で、ＤＢＤ−ｓｐｏ１１遺伝子は、減数分裂特異的であっても、そうでなくてもよいプロモーターの制御下にある。減数分裂特異的なタンパク質が、実施例６で説明されるように改変されるように、本発明に基づいた細胞を工学操作することができる。本細胞は、たとえば、真菌、植物細胞、哺乳類細胞又は昆虫細胞であることができる。
【００８６】
本発明のさらに別の態様は、Ｓｐｏ１１部分及びそれに作動可能に連結されているＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸に関するものであり、ここで前記Ｓｐｏ１１タンパク質は、たとえば、Ａ．サリアーナのＡｔＳｐｏ１１タンパク質又はマウスのＳｐｏ１１タンパク質である。
【実施例】
【００８７】
以下に記載する実験方法を用いて、以下の実施例を実施することができる。
【００８８】
実験方法
プラスミドの構築
Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合体をコードする組込み型プラスミドｐＡＰ１を創出するために、ＰＣＲによりＳＰＯ１１のＯＲＦを作製し、２ハイブリッドベクターｐＡＳ２ΔΔ（Fromont-Racine, Rain et al., 1997）においてＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４ＢＤ）をコードする配列の下流にＢａｍＨＩ／ＰａｔＩ断片として導入した。配列決定によって、Ｇａｌ４ＢＤのＳｐｏ１１へのインフレームＮ末端融合及び完全なＯＲＦを検証した。ｋａｎＭＸ４薬剤耐性カセット（Wach, 1996）を唯一のＮｒｕＩ部位に挿入し、ｐＲＳ３０４（Sikorski & Hieter, 1989）から相当する断片でＢｐｍＩ−Ｂｓｕ３６Ｉを置き換えることにより複製開始点２μを除いてｐＡＰ１を作製した。。ｐＩＣＭ９９を創出するために、ゲノムＤＮＡ及びプロモーター領域を含むサブクローンからＧＡＬ２遺伝子座を増幅し、ＧＡＬ２のＯＲＦの最初の６５５ｂｐを、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン）で変異誘発した。このフレームシフト突然変異は、ＢｓｐＨＩ制限部位を生じさせ、６６アミノ酸の短縮タンパク質を生じた。当該断片を配列決定し、突然変異を確認し、最終的にｐＲＳ３０６（Sikorski & Hieter, 1989）にサブクローニングしてｐＩＣＭ９９を得た。
【００８９】
酵母株
酵母株はすべてＳＫ１（Kane & Roth, 1974）の同質遺伝子的誘導体である。形質転換又は交配によりそれらを得たが、関連する遺伝子型を表１に示す。酢酸リチウム／ポリエチレングリコール法（Ausubel et al., 1988）を用いて形質転換により、ＸｂａＩで消化したｐＡＰ１をｔｒｐ１遺伝子座に組み込んだ。Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）耐性形質転換体を選択し、トリプトファン原栄養性についてチェックした。サザン解析により正しいターゲティングを検証した。ＵＲＡ３を選択可能なマーカー（Ausubel et al., 1988）として、２段階置換法によりｇａｌ２−ＢｓｐＨＩ突然変異をＧＡＬ２遺伝子座に導入した。形質転換のために、ＧＡＬ２のＯＲＦにおいて唯一のＢａｇｌＩＩ部位にてｐＩＣＭ９９を線状化し、ターゲティングをＰＣＲとサザン解析により検証した。増幅したＧＡＬ２断片のＢｓｐＨＩ制限解析により、５−フルオロオロチン酸耐性として出現するクローンの中に所望の点突然変異の保持を確認した。
【００９０】
培地及び遺伝的手法
単調な増殖には、必要な場合適当な栄養素（Sherman et al., 1983）を補完した、標準培地（ＹＰＤ）及びＳＤ（アミノ酸なしで０．６７％の酵母窒素ベース、２％グルコース）を用いた。減数分裂の培養は記載されている（Alani et al., 1990）ように調製した。グルコースがガラクトース（２０ｇ／Ｌ）に置き換えられている完全ガラクトース培地、ＹＰＧａｌによってｇａｌ２−ＢｓｐＨＩ対立遺伝子の分離をモニターすることができる。４８時間後、胞子形成培地において生じた４胞子の子嚢を分析することにより胞子の生存率を決定した。
【００９１】
分子技術
ＤＳＢの検出及び定量のために、胞子形成細胞からゲノムＤＮＡを調製し、サザン解析の対象とした。親型のバンド及びＤＳＢのバンドはPhosphorImagerにより視覚化し、記載されているような（Vedel & Nicolas, 1999）ImageQuant ソフトウエア（モレキュラー・ダイナミクス）を使用することによって定量した。ノーザン解析は記載されている（Smith et al., 2001）ように行った。全細胞の抽出物を調製し、常法（Ausubel et al., 1988）を用いて、抗Ｇａｌ４（ＤＢＤ）抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー）によるウエスタンブロットによって解析した。
【００９２】
プラスミド構築体の説明
プロモーターＩＭＥ１−ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体：ｐＡＰ１１１と命名されたプラスミド
ｐＡＰ１（Pecina et al., 2002）のＳａｃ１−Ｓａｃ１断片（１８９１〜３３３０位）の欠失によってｐＡＰ１１プラスミドを構築した。ｐＡＰ１１の１２１６ｂｐのＸｈｏＩ断片を含有するｐＢＳデルタ１プラスミドをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのＳｍａＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片の欠失によって予め得られたｐＢＳデルタ０プラスミドにサブクローニングした。ＳｐｈＩで切断し、次いでクレノウ処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりプラスミドｐ２０５３（Guttmann-Raviv et al., 2001）からＩＭＥ１プロモーターを単離した。ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳデルタ１ベクターにこの断片を挿入した。それによってプラスミドｐＢＳデルタ１１を創出した。ｐＢＳデルタ１１のＩＭＥ１プロモーター含有領域をＸｈｏＩで切断し、ｐＡＰ１１のＸｈｏＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐＡＰ１１１を創った。
【００９３】
プロモーターＲＥＣ８−ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体：ｐＡＰ１１８と命名されたプラスミド
プラスミドｐＡＰ１１の１４７１ｂｐのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＳデルタ０プラスミドにサブクローニングしてｐＢＳデルタ２を創った。２つのプライマー、ＲＥＣ８ＵＰ（５’−ＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡＴＴＡＣＣＡＡＴＣＣＴＴＣＣＴ−３’）及びＲＥＣ８ＬＯ（５’−ＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴＴ−３’）により、Ｓ．セレビシアエ株ＯＲＤ７２５４−２５Ｄ（ＳＫ１バックグラウンド）のゲノムＤＮＡからＲＥＣ８プロモーターを増幅し、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（プロメガ）にクローニングして配列決定した。次いで、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＲＥＣ８プロモーターを含有する）を、やはりＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断したプラスミドｐＢＳデルタ２にサブクローニングした。これによってプラスミドｐＢＳデルタ２８を創出した。最後に、ｐＢＳデルタ２８のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＲＥＣ８プロモーターを含有する）を、ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ部位で切断したプラスミドｐＡＰ１１にサブクローニングしてｐＡＰ１１８を創った。
【００９４】
プロモーターＡＤＨＩ−ＱＱＲ−ＳＰＯ１１構築体：ｐＡＰ１１９と命名されたプラスミド
２つのプライマーＱＱＲ  ＵＰ（５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＣＧＧＡ−３’）及びＱＱＲ  ＬＯ（ＴＧＧＣＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧＧＡＣＴＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＴＡＴ−３’）によって、ｐＥＴ１５ｂｉＱＱＲ（Ｌｏ）ＦＮ（米国ユタ大学ダナ・キャロール博士より供与、Smith, Bibikova et al., 2000）のプラスミドＤＮＡからＱＱＲ断片を増幅した。増幅した断片をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（プロメガ）にクローニングして配列決定した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩとＭｓｃＩで切断したｐＢＳデルタ２ベクターにＱＱＲをサブクローニングしてｐＢＳデルタ２９を作った。最後に、ｐＢＳデルタ２９のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＱＱＲ配列を含有する）を、ＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ部位で切断したプラスミドｐＡＰ１１にサブクローニングしてプラスミドｐＡＰ１１９を創った。
【００９５】
プロモーターＡＤＨ１−ＧＡＬ４ＢＤ−ＲＥＣ１０４構築体：ｐＸＰ３と命名されたプラスミド
２つのプライマー、ＲＥＣ１０４ＵＰ（５’−ＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）及びＲＥＣ１０４ＬＯ(５’−ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡ−３’）により、Ｓ．セレビシアエ株ＯＲＤ７２５４−２５Ｄ（ＳＫ１のバックグラウンド）からＰＣＲによってＲＥＣ１０４のコーディング領域を増幅した。増幅した断片をｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし、検証した。次いで、ＳｆｉＩとＸｍａ１で切断した組込み型ベクターｐＡＳＩＮにＲＥＣ１０４断片をサブクローニングした。それによってプラスミドｐＸＰ３を創出した。ｐＡＳＩＮプラスミド（プロモーターＡＤＨ１−ＧＡＬ４ＢＤ、ＡｍｐＲ、ＴＲＰ１）は、複製開始点２μの除去により、ｐＡＳ２ΔΔ（Fromont-Racine, Rain et al., 1997）に由来する。
【００９６】
ｃｐｈｓ−ｇａｌ４ｂｄ−ｍｅｉｗ６８プラスミド
ｍｅｉ−Ｗ６８（Ｓｐｏ１１のドロソフィラオルソログ）のｃＤＮＡをプラスミドｐＡＨ６９（Kim McKim & Aki Hayashi-Hagihara, 1998）から単離した。
−ＳｍａＩにより消化したｐＡＳΔΔにｐＡＨ６９由来のＸｍｎＩ−ＤｒａＩをクローニングする。これによりプラスミドｐＡＰＡＰ１を創出する。
−ＰＣＲによる増幅及びｍｅｉ−Ｗ６８断片のｐＧｅｍＴ−ｅａｓｙ：ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（ｍｅｉ５）へのクローニング。プライマー：
５’ｍｅｉＷ６８：５’−ｇｇａａｔｇｇｃｃａｃａａｔｇｇａｔｇａａｔｔｔｔｃｇｇ−３’
３’ｍｅｉＷ６８：５’−ｇｇｔｇａａａｃｔｔｃｃｔｃｃｇｃｇｇａｃ−３’
−ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（ｍｅｉ５）のＭｓｃＩ−ＳａｃＩＩ断片のｐＡＰＡＰ１へのクローニング。これによりプラスミドｐＡＰＡＰ２を創出する。このプラスミドは、複製可能な、Ａｍｐ及びＴＲＰ１のマーカーを有するプラスミド中への、ＡＤＨ１プロモーターの下に融合タンパク質Ｇａｌ４ＢＤ−ｍｅｉＷ６８を含有する。
−ＨｓＰ７０プロモーターを含有するドロソフィラのベクターｐＣａｓｐｅｒ−ｈｓ（Ｈｐａｌ）への、ｐＡＰＡＰ２がＢｓｇＩ−ＳａｌＩのクローニング。これによってｃｐｈｓ−ｑａｌ４ｂｄ−ｍｅｉｗ６８プラスミドを創出する。
【００９７】
構築体の組込み及び株
ｐＸＰ３をＸｂａＩにより線状化し、ＯＲＤ７２５４−２５Ｄ（α、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｈｉｓ４）の形質転換に使用した。酢酸リチウム法で形質転換を行い、トリプトファン欠損プレートに細胞を播いた。サザンブロット解析によって形質転換した細胞を検証した。形質転換細胞を交配させ、胞子形成させ、分離したものを交配してＯＲＤ７７７０株を創った。
【００９８】
ｐＡＰ１１１をＢｓｕ３６Ｉにより線状化し、ＯＲＤ７２５４−２５Ｄ（α、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｈｉｓ４）の形質転換に使用した。酢酸リチウム法で形質転換を行い、トリプトファン枯渇プレートに細胞を播いた。サザンブロット解析によって形質転換した細胞を検証した。形質転換細胞を交配させ、胞子形成させ、分離したものを交配してＯＲＤ８０１６株を創った。
【００９９】
ｐＡＰ１１８をＸｂａＩにより線状化し、ＯＲＤ７２５４−２５Ｄ（α、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｈｉｓ４）の形質転換に使用した。酢酸リチウム法で形質転換を行い、トリプトファン枯渇プレートに細胞を播いた。サザンブロット解析によって形質転換した細胞を検証した。形質転換細胞を交配させ、胞子形成させ、分離したものを交配してＯＲＤ８０５０株を創った。
【０１００】
ＤＮＡの単離及びＤＳＢの検出
減数分裂培養物１０ｍＬを各時点で回収し、無菌水で１回洗浄した。チモリアーゼ２０Ｔ（Chemical Credential、ＩＣＮ）と共に３０℃にて３０分インキュベートすることによりスフェロプラストを生じた。６５℃にて３０分、溶解液（５０ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｎｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ、０．４％のＳＤＳ）５００μＬでスフェロプラストを溶解した。次いで、５Ｍの酢酸カリウム２００μＬを加え、氷上で１時間を超えてインキュベートした。速度１３００ｒｐｍで１５分間の遠心分離の後、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、イソプロパノール５００μＬを加えて核酸を沈殿させた。沈殿させた核酸を７０％エタノールで洗浄し、ＲＮＡ分解酵素Ａで３７℃にて１時間処理した。エタノールでＤＮＡを沈殿させ、最終的に無菌水に再懸濁した。
【０１０１】
ＹＣＲ０４８Ｗ領域でＤＳＢを検出するにはＡｓｅＩで、ＧＡＬ２（ＹＬＲ０８１Ｗ）領域で検出するにはＸｂａＩでＤＮＡ約１μｇを消化した。これらの試料を１％アガロースゲルでの電気泳動にかけ、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ；アマシャム（登録商標））上にブロットした。ＹＣＲ０４８Ｗ及びＧＡＬ２の領域でＤＳＢを検出するには、それぞれ、ＹＣＲ０４８Ｗ及びＧＡＬ２のオープンリーディングフレームのＤＮＡをプローブとして用いた。
【０１０２】
実施例１：サッカロマイセス・セレビシアエにおける減数分裂組換えの標的刺激
１．１．Ｇａｌ４ＢＤ−ＳＰＯ１１融合タンパク質は減数分裂中に発現される
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４ＢＤ，アミノ酸１〜１４７）をＳ．セルビシアエの完全長のＳｐｏ１１のＮ末端とともにコードする融合体を構成的ＡＤＨ１プロモーターの制御下に置き（図１Ａ）、ｓｐｏ１１Δ株にてＴＲＰ１遺伝子座に組み込んだ。遺伝子交配によりホモ接合性二倍体を誘導した（表１）。
【０１０３】
【表１】
2005532823.tif 000003
2005532823.tif 000004
2005532823.tif 000005
【０１０４】
発現を検証するために、単調な増殖又は胞子形成培地に移した後様々な時間で全ＲＮＡを分析し、ノーザンブロット解析の対象とした。野生型二倍体では、ＳＰＯ１１のｍＲＮＡは、胞子形成培地に移した後蓄積し始め、それまでに子嚢胞子の形成が始まる７時間後に、低下する（図１Ｂ）。対照的に、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１のｍＲＮＡは、栄養細胞及び減数分裂細胞の双方で検出されるが、ＳＰＯ１１のｍＲＮＡのように、あとの時点（６〜７時間）で減少する。転写レベルの定量（図１Ｃ）は、融合体が単調に増殖する細胞で高度に発現されること、及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１のｍＲＮＡのレベルが減数分裂前期（２〜６時間）中のＳＰＯ１１のｍＲＮＡのレベルよりもほんの少し高いにすぎないことを示していた。そのもっともらしい理由は、ＳＰＯ１１プロモーターは強く誘導される一方、ＡＤＨ１プロモーターの活性は、有糸分裂細胞よりも減数分裂細胞で低いことである。最後に、ウエスタンブロット解析では、融合タンパク質は、有糸分裂及び減数分裂中のＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１細胞で発現され、予想通りのサイズ、６３０５ｋＤａ（図１Ｄ）であることが示された。
【０１０５】
１．２．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１は、ｓｐｏ１１Δ株の胞子形成欠損を補完する
二倍体ｓｐｏ１１Δ細胞は、減数分裂組換えが開始されない場合、染色体が異常に分離するので、胞子形成はできるが、生存不能の子孫を生じる。本発明者らは、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質が、ｓｐｏ１１Δ二倍体の胞子形成欠損を補完するかどうかを調べた。野性型ＳＰＯ１１（ＣＲＤ５７４０）株及びｓｐｏ１１Δ（ＯＲＤ５８０５）株と同様に、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１ｓｐｏ１１Δ二倍体（ＯＲＤ５８０６）も効率的に胞子形成を行い（およそ８０％）、主として四胞子子嚢を生じた。四分子解析は、予想通り、ｓｐｏ１１Δ二倍体により生じた胞子は発芽しなかった（０／５１２）。対照的に、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質は、ＳＰＯ１１二倍体の子孫で見られた（５０５／５２６、９６％）と同様に、ｓｐｏ１１Δの胞子に対して完全な生存性を回復した（５３１／５５２、９６％）。胞子の高い生存性は、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１及びＳＰＯ１１（ＯＲＤ５８１７）の双方を含有する二倍体でも同様に見い出された。要するに、これらの結果は、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体は、機能的であり、有害な効果を付与することはないことを明らかにしている。
【０１０６】
１．３．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１は、天然の部位でＤＳＢの形成を促進する
胞子の生存性が各対の相同染色体対のそれぞれの間での減数分裂組換えに依存するので、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１によるｓｐｏ１１Δ欠損の補完は、該融合タンパク質がｓｐｏ１１ΔのＤＳＢ欠損をも救済する可能性があることを示唆した。この考えを試すために、減数分裂ＤＳＢが通常形成するゲノムの数箇所の領域を調べた。第３染色体のＹＣＲ０４３ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗの領域は、ＹＣＲ０４７ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗ遺伝子間領域における強力なホットスポットを含む多数のＤＳＢを含有しいる（Baudat & Nicolas, 1997）。図２Ａに示すように、ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の減数分裂細胞の双方において、これらのＤＳＢは形成される。ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株では、ＹＣＲ０４８ｗのコーディング領域に２つの新たなＤＳＢ部位を見ることができ、それは、天然のＤＳＢが一般にプロモーター含有領域に制約されているので、注目に値する（図２Ａ、及び以下を参照のこと）。ＤＳＢバンド強度の定量的解析は、この９．６ｋｂの染色体領域における減数分裂ＤＳＢの累積度数が、双方の株で類似することを示した（およそ１３±２％）。ほとんどの場合、ＤＳＢは、ＳＰＯ１１二倍体よりもＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１二倍体中のＹＣＲ０４７ｃ４８ｗ遺伝子間領域において、より低い頻度で形成されるが（それぞれ１１±１％対５±１％）、任意の部位でのＤＳＢ頻度も近似していた（図２Ｂ）。興味深いことに、この部位でのＤＳＢ頻度の低下は、ＹＣＲ０４８ｗのＯＲＦにおける新しいＤＳＢの出現によって局所的には相殺され（４±１％）；この再分布は、ＳＰＯ１１が開始させるＤＳＢについて以前報告されたように（Wu & Lichten, 1995）、隣接するＤＳＢ部位間の競合について示唆している。そのほかの２つのよく性状分析された領域、ＡＲＧ４遺伝子座（第８染色体）及びＣＹＳ３遺伝子座（第１染色体）（Vedel & Nicolas, 1999）も調べた。いずれの場合も、位置決め及び強度に関して、ＳＰＯ１１細胞及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１細胞において、近似した減数分裂ＤＳＢのプロフィールが検出された（図２Ｃ及び２Ｄ）。要するに、これらの結果は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質は、野生型Ｓｐｏ１１により促進されるものに匹敵する頻度で天然の部位にてＤＳＢ形成を促進し、それによってｓｐｏ１１Δの胞子の生存不能を完全に補完する能力を説明しうることを明らかにしている。
【０１０７】
１．４．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１は、コンセンサスＧａｌ４ＤＮＡ結合部位の近傍でＤＳＢ形成を促進する
上述のように、ＹＣＲ０４８ｗのコーディング領域内で２つの追加のＤＳＢ部位が認められた：ＹＣＲ０４８ｗのＯＲＦの５’末端近傍の強力な部位及びさらに下流のずっと弱い部位である（図２Ａ）。これらの新しい部位は、Ｓｐｏ１１タンパク質ドメイン自体、少なくともＳｐｏ１１がすでに活性化されているＹＣＲ０４８ｗ遺伝子座のような領域のターゲティング特異性における異常の結果生じた可能性があり、又はそれらは、Ｇａｌ４コンセンサス結合部位の偶然の存在を反映する可能性がある。実際、ＹＣＲ０４８ｗ配列の検討は、ＯＲＦの内部、翻訳開始部位からそれぞれ＋２９５ｎｔ及び＋１３２０ｎｔの位置でそのような２つの部位を示し、この遺伝子座における２つの新しいＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１に特異的なＤＳＢの推定位置に相関していた。この所見は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質が少なくともこのＤＳＢ豊富なドメイン（Baudat & Nicolas, 1997）で特異的な配列に対してＤＳＢを標的化することができることを示している。
【０１０８】
Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインをＳｐｏ１１につなぐことによって、よく性状分析されたＧａｌ４結合部位に減数分裂ＤＳＢを標的化できるかどうかを確定するために、本発明者らは、ガラクトースの異化に関与しているＵＡＳＧＡＬ部位を含有する幾つかの遺伝子座を調べた。ＧＡＬ２プロモーター領域は４つのＣＣＧ（Ｎ）１１ＧＧＣ配列を含有し（ＯＲＤ６６３２のＧＡＬ２プロモーターの配列決定で検証）、そのうち２つは、インビボで構成的にＧａｌ４に結合している（Huibregtse et al., 1993）。ＳＰＯ１１株では、ＤＳＢはＧＡＬ２遺伝子座ではほとんど検出可能ではないということは、この領域が頻繁な天然のＤＳＢ部位ではないことを示している。対照的に、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株ではＵＡＳＧＡＬ部位の近傍のＧＡＬ２プロモーター又はＵＡＳＧＡＬ部位にて顕著なＤＳＢを観察することができた（図３Ａ）。ＹＣＲ０４３ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗ区間で認められたものと同様に、ＤＳＢは、細胞を胞子形成培地に移して２時間以内にＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１減数分裂細胞におけるＧＡＬ２遺伝子座に現れ、その強度は減数分裂過程を通して増加し、８〜１０時間で最大に達した（図３Ａ）。幾つかの別々の実験の定量的解析は、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２  ＤＳＢの頻度がおよそ１２±２％であるのに対して、野生型株では０．６％以下しか認められず、２０倍の刺激であることを示した（図３）。
【０１０９】
これらの所見を一般化するために、本発明者らは、ＧＡＬ２のようにガラクトースの存在下でＧａｌ４タンパク質により転写が誘導されるＧＡＬ７、ＧＡＬ１０及びＧＡＬ１遺伝子の近傍でのＤＳＢの標的化を調べた。これらの遺伝子座では、ＳＰＯ１１二倍体においては減数分裂ＤＳＢは形成されなかったが、対照的に、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１二倍体において関連するＵＡＳＧＡＬ部位又はその近傍でそれは容易に検出可能だった（図３Ｂ）。定量的解析は、ＧＡＬ７上流領域については４±１％、広範に転写されたＧＡＬ１〜ＧＡＬ１０の遺伝子間領域については２±１％の頻度をもってＤＳＢ形成の実質的刺激を示した。これは、ＧＡＬ２プロモーターで見られた（図３Ａ）１２±２％の頻度よりも顕著に低い。要するに、これらの結果は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質が、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合部位に対して減数分裂特異的ＤＳＢを標的化することができ、種々の強度の新規のゲノムＤＳＢ部位を創出することを示している。
【０１１０】
最後に、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質が単独でこれらの新しいＤＳＢの出現を担当することを数種の対照株によって検証した。第１に、Ｓｐｏ１１の触媒チロシン残基が触媒として不活性のフェニルアラニン残基に置換された（Bergerat et al., 1997）Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１Ｙ１３５Ｆ融合タンパク質を発現するｓｐｏ１１Δ株は、ＹＣＲ０４３ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗ領域又はＧＡＬ２遺伝子座のいずれにおいても減数分裂ＤＳＢを示さなかった。第２に、Ｇａｌ４結合ドメインを単独で、又はＲｂｐ５タンパク質（その機能が組換えの開始とは無関係であるＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）との融合で発現しているＳＰＯ１１株及びｐＡＤＨ１：：ＳＰＯ１１構築体（Ｇａｌ４ＢＤなし）を発現している株は、ＹＣＲ０４３ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗ領域でＤＳＢを示したが、ＧＡＬ２遺伝子座では示さなかった。まとめると、これらの対照実験は、Ｇａｌ４結合部位近傍でのＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１依存性ＤＳＢの刺激には、キメラタンパク質のＧａｌ４ＢＤ成分及びＳｐｏ１１成分の双方が必要とされることを明らかにしている。
【０１１１】
１．５．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合物は、ＧＡＬ２遺伝子座での組換えを強く刺激する
それからは生存可能な組換え体を回収することができないｒａｄ５０Ｓ株において上記のＤＳＢ実験を行った。ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１が促進した新しいＤＳＢが組換え可能かどうかを確定するために、ＲＡＤ５０バックグラウンドでのＧＡＬ２領域における減数分裂ＤＳＢ断片をまず調べて、Ｓｐｏ１１で誘導したＤＳＢのようにそれらがプロセッシングを受けているがどうかを見た。ＤＳＢは、個々のｒａｄ５０Ｓのバンドよりも大きな移動度の断片のスメアとして検出されたということは、新しいＧＡＬ２のＤＳＢはプロセッシングを受けていることを示している。さらに、スメアの一過性の形質（３時間までに出現し、７〜９時間の間に消失する）は、これらのＤＳＢが正常の動態により修復されていることを示唆している。
【０１１２】
次いで、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１依存性ＤＳＢが相同組換えによって修復されるかどうかを評価するために、ＧＡＬ２遺伝子座における減数分裂の遺伝子変換の頻度を測定した。この目的で、変異対立遺伝子、ｇａｌ２−Ｂｓｐを構築した。この変異対立遺伝子はＧＡＬ２のＯＲＦでの１９７位にフレームシフトを含有し、ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の双方のバックグラウンドでのＧＡＬ２／ｇａｌ２−Ｂｓｐへテロ接合体を導き出した。ＳＰＯ１１二倍体により生じた２１８の四胞子四分子からは、たった５つの変換事象しか見い出せなかった。対照的に、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株については、解析した２１２の四分子の中で双方向（３：１及び１：３）で５５の変換事象が観察され（２６％）、ＳＰＯ１１株で見られたレベルの１０倍増加した（図４Ｃ）。Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１促進ＤＳＢは、他の遺伝子座での組換えも開始することができ：四分子解析は、ＡＲＧ４天然ホットスポットにおける減数分裂の遺伝子変換のレベルは、ＳＰＯ１１二倍体とＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１二倍体で類似していた。これらの結果は、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２プロモーターで形成されるＤＳＢは、組換え可能であり、Ｓｐｏ１１が誘導切断のように挙動することを示している。
【０１１３】
１．６．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１はＤＳＢ形成に関して通常不活性である大きな領域内での切断を促進する
８つの遺伝子間プロモーター含有領域を含有するＧＡＬ２を中心としたおよそ２０ｋｂの大きな区間（第１２染色体上のＹＬＲ０７２ｗ〜ＹＬＲ０８４ｃの間のＯＲＦ）に対するＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１活性の解析（図５Ａ）。ＳＰＯ１１株ではこの区間にＤＳＢは認められなかった。ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株では、ＧＡＬ２プロモーター領域がＤＳＢを検出できた唯一の部位であった。この区間には他にＧａｌ４コンセンサス配列はないので、これらの結果は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１のＤＳＢ活性の３つの重要な特徴を強調している。第１に、ＧＡＬ２近傍におけるＤＳＢの刺激は特異的に標的化されていた。第２に、ＧＡＬ２における切断は、そのほかのＤＳＢのすぐ近傍での形成を促進しなかった。第３に、第３染色体のＹＣＲ０４８ｗにおけるＤＳＢについて認められたものとは対照的に、新しいＧＡＬ２のＤＳＢは天然では不活性である染色体の領域で生じた。
【０１１４】
１．７．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１によるＤＳＢの形成には、他の既知のＤＳＢ遺伝子の活性を必要とする
Ｓ．セレビシアエにおける天然部位での野生型レベルのＤＳＢの形成には、ＳＰＯ１１に加えて１４の他の遺伝子を必要とすることが知られている。将来のＤＳＢ部位にＳｐｏ１１を動員するのに１以上の産物を必要とするのなら、Ｓｐｏ１１に対してＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを追加することは、少なくともＧａｌ４結合部位でのＤＳＢについてはこの必要条件を迂回する可能性がある。サザンブロット解析によれば、ＳＰＯ１１又はＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１のバックグラウンドのいずれかでのｒｅｃ１０２、ｒｅｃ１０３／ｓｋｉ８、ｒｅｃ１０４、ｒｅｃ１１４、ｍｅｉ４、ｍｅｒ２／ｒｅｃ１０７、ｍｒｅ２／ｎａｍ８、ｍｒｅ１１、ｒａｄ５０及びｘｒｓ２の無発現変異は、ＹＣＲ０４３ｃ〜ＹＣＲ０４８ｗの区間又はＧＡＬ２での減数分裂ＤＳＢを示さなかったが、ｒｅｄ１、ｍｒｅ４／ｍｅｋ１、ｈｏｐ１及びｍｅｒ１の無発現変異は、低下したが検出可能なレベルのＤＳＢを示した。量的には、ＧＡＬ２遺伝子座では、ｒｅｄ１変異は、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１が促進するＤＳＢの頻度を約３倍低下させ、ｍｒｅ４／ｍｅｋ１及びｈｏｐ１変異は１０倍低下し、ｍｅｒ１変異はＤＳＢの形成をほぼ完全に失っていた。ＹＣＲ０４７ｃ〜４８ｗ領域（ＹＣＲ０４８ｗプロモーター＋ＯＲＦ）では、幾分異なって、ｍｒｅ４／ｍｅｋ１変異は、ＳＰＯ１１又はＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の株いずれでも影響がなく、ｒｅｄ１、ｍｅｒ１及びｈｏｐ１の変異は、双方の株でますます抑制的な効果を有した。これら突然変異の第３染色体及びＧＡＬ２への差次的影響は、遺伝子座特異的な変動を反映している可能性がある。結局のところ、ＳＰＯ１１株においてＤＳＢ形成に必須又は重要であるこれらの遺伝子すべては、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株においても同様に必要であるので、それらは標的部位の選択においてＳｐｏ１１を補佐しないと結論付けることができる。
【０１１５】
１．８．Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１の切断はＣｌｂ５Ｃｌｂ６の活性も必要とする
Ｂ型のサイクリンであるＣＬＢ５及びＣＬＢ６は減数分裂の複製及び減数分裂ＤＳＢの形成に必要とされる。Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１が促進するＤＳＢもＣｌｂ５及びＣｌｂ６の活性に依存しているかどうかを確定するために、ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体を含有するｃｌｂ５及びｃｌｂ６の二倍体（それぞれ、ＯＲＤ６５３４及びＯＲＤ６５５１）でＤＳＢの形成を測定した。図６に示すように、これらの株ではＹＣＲ０４８ｗ又はＧＡＬ２遺伝子座のいずれにおいてもＤＳＢ形成が検出されなかった。これは、Ｓｐｏ１１への非相同のＤＮＡ結合ドメインの追加がＣｌｂ５及びＣｌｂ６の活性の要求を迂回せず、したがって、ＤＳＢの誘導に関連する減数分裂複製の欠損を克服できないことを示している。そのほかのＤＳＢ遺伝子についての明らかにされた要求と併せて、この結果は、天然ドメイン及び標的化ドメインの双方におけるＤＳＢの形成について、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質がＳｐｏ１１タンパク質と同じ（トランスに作用する）遺伝制御を受けていることを示している。
【０１１６】
１．９．非相同の減数分裂特異的プロモーターを用いたＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１の切断
ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構築体を、減数分裂の極めて早期に発現するＩＭＥ１プロモーター（Guttmann-Raviv et al., 2001）、又は減数分裂の早期に発現するＲＥＣ８プロモーターの制御下に置いた。プロモーター−ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体の得られた配列をそれぞれ、図９及び図１０に示す。図７は、これらの構築体の両方がＹＣＲ０４８ｗ領域（図７Ａ）又はＧＡＬ２領域（図７Ｂ）のいずれかにおいてＵＡＳ部位でＤＳＢ形成を誘導したことを示す。
【０１１７】
１．１０．ＤＳＢ形成に要求される別のタンパク質によってＳｐｏ１１を動員することができる
Ｒｅｃ１０４は、酵母においてＤＳＢを誘導するのに要求されるタンパク質である。Ｇａｌ４ＢＤ配列と同じオープンリーディングフレームでそのコーディング配列をクローニングし、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｒｅｃ１０４融合タンパク質の配列を作製し、構成的なＡＤＨ１プロモーターの制御下に置いた。得られた配列を図１２に示す。
【０１１８】
図８は、酵母におけるＧＡＬ４ＢＤ−ＲＥＣ１０４構築体の存在が、ＵＡＳ部位において二本鎖切断を誘導し、従ってＧＡＬ４ＢＤ−ＲＥＣ１０４はこれらの部位でＳｐｏ１１を動員できることを示すという事実を説明する。
【０１１９】
１．１１．常在ＧＡＬ４遺伝子の欠失はＵＡＳ特異的二本鎖切断を増やす
酵母のゲノムから常在のＧＡＬ４配列を欠失させ、それにＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１構築体を導入した。依然としてＧＡＬ４ＢＤコーディング配列を抱える酵母と比較すると、ＵＡＳ部位で誘導されたＤＳＢの数は多かった。このことはおそらくＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１タンパク質と常在Ｇａｌタンパク質との間のＵＡＳ部位で競合がないことによった。
【０１２０】
実施例２：植物における減数分裂組換えの標的刺激
２つのオリゴヌクレオチド、ＭＧ１３３(５’−ＧＡＡＡＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣ−３’）及びＭＧ１３４（５’−ＧＧＡＧＡＣＴＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡ−３’）を用いて、ＡｔＳＰＯ１１タンパク質（Grelon, Vezon et al., 2001）をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ（インビトロゲン）にクローニングし、配列決定してプラスミド、ｐＶｅＣＭ２を得た。ｐＶｅＣＭ２からｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳのＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位の間に再クローニングし、プラスミド、ｐＶｅＣＭ１２を得た。２つのオリゴヌクレオチド、ＣＭ１（５’−ｇａＣＴＧＣＡｇａａａｇａｇＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴ−３’）及びＣＭ２（５’−ＣＧＧＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＡＡＡ−３’）を用いて、ｐＡＰＩプラスミドからＰＣＲにて、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＢＤ）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。ＧＡＬ４ＢＤのＡＴＧ−ＮｃｏＩ断片（４５５ｂｐ）に相当するこのＰＣＲ断片をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏにクローニングしてプラスミド、ｐＶｅＣＭ１５を得、配列決定した。Ｇａｌ４ＢＤを含有するｐＶｅＣＭ１５からの、及びＡｔＳＰＯ１１−１ＡＴＧの上流の−８〜−１の塩基に相当するＡＴＧ８塩基の５’及びＰｓｔ１部位における（ＣＴＧＣＡｇａａａｇａｇＡＴＧ）Ｐｓｔ１−Ｎｃｏ１のＤＮＡ断片をｐＶｅＣＭ１２のＰｓｔ１とＮｃｏ１の部位の間にクローニンフしてプラスミド、ｐＶｅＣＭ２０を得た。ｐＶｅ２０は後にＡｔＳＰＯ１１−１の−８〜−１の塩基が続くＰｓｔ１を含有し、その後にＡｔＳＰＯ１１−１の完全なｃＤＮＡ（１０８９ｂｐ）が融合で続くＧＡＬ４ＢＤを含有する。２つのオリゴヌクレオチド、ＣＭ３（５’−ｃｃａｔｃｔｃｔｔｔｃＴＧＣＡＧｔｃａａａａｃｔｇａａａａａｔｇ−３’）及びＣＭ４（５’−ＡＴＧＧＧＣＣＣｇｃｃｔｔｔｇｔｔｔｔａｔｃｔｃｔｃｃｔｃａｃｃｇｔａ−３’）を用いて、Mathilde Grelonが単離したＡｔＳＰＯ１１−１プロモーター（ジーンバンク、ＡＰ０００３７５）の断片をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏにクローニングし、プラスミドｐＶｅＣＭ１４を得て、配列決定した。ＡｔＳＰＯ１１−１プロモーターの−１３５２〜−８の塩基を含有するｐＶｅＣＭ１４からのＡｐａ１−Ｐｓｔ１断片をＡｐａ１とＰｓｔ１の間でｐＶｅＣＭ２０にクローニングして、プラスミドｐＶｅＣＭ２２を得た。次いで、ＡｔＳＰＯ１１−１の−２２６６〜−１３２４の領域を含有するＡｐａ１−ＢｓｅＲ１の断片をＡｐａ１とＢｓｅＲ１の部位の間でｐＶｅＣＭ２０にクローニングして、プラスミドｐＶｅＣＭ２５を得た。ＡｔＳＰＯ１１−１プロモーター／ＧＡＬ４ＢＤ−ＡｔＳＰＯ１１−１のｃＤＮＡの構築体を含有するｐＶｅＣＭ２５からのＡｐａ１−Ｓｐｅ１断片を再び配列決定した。１１のヌクレオチド（ＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴ）の挿入が、Ｐｓｔ１クローニング部位の５’にまさに存在した。従って、プロモーターは、Ｐｓｔ１クローニング部位のまさに５’にて１１ヌクレオチドの挿入を伴った、Ａｔプロモーターの−２２６６〜−１の塩基に相当する。ｐＶｅＣＭ２５からのＡｐａ１−Ｓｐｅ１断片をＡｐａ１とＳｐｅ１の部位の間でｐＣａｍｂｉａ１３８０（オーストラリア、キャンビアから市販）にクローニングし、プラスミド、ｐＶｅＣＭ２６を得た。形質転換によりｐＶｅＣＭ２６をアグロバクテリウム株、Ｃ５８Ｃ１ｐＭＰ９０に導入した。この株を使用して、ＡｔＳＰＯ１１−１−１突然変異についてヘテロ接合体であるアラビドプシス・サリアーナ系統ＤＹＫ２０９（Grelon et al., 2001）を形質転換した。ハイグロマイシンによりインビトロで形質転換植物Ｔ１を選抜し、土壌に移し、ＰＣＲで解析した。１つの植物、Ａｔｓｐｏ１１−１変異についてホモ接合体であり、ＡｔＳＰＯ１１−１プロモーター−ＧＡＬ４ＢＤ−ＡｔＳＰＯ１１−１のｃＤＮＡ導入遺伝子を含有するＡｔｐＶｅＣＭ２６．９は、Ａｔｓｐｏ１１−１ホモ接合体植物で通常見られるよりも長い種子の鞘を有していた。ハイグロマイシンで選抜し、土壌に移し、ＰＣＲで遺伝子型を決定したこのＡｔｐＶｅＣＭ２６．９の子孫の中で、９つがＡｔｓｐｏ１１−１−１変異についてホモ接合体であり、ＡｔＳＰＯ１１−１プロモーターを含有していた。ＧＡＬ４ＢＤ−ＡｔＳＰＯ１１−１のｃＤＮＡ導入遺伝子は、鞘当たり平均３．７±０．７の種子を有したが、それは、Ａｔｓｐｏ１１−１−１変異についてホモ接合体である植物で検出される鞘当たりの種子数（Grelon et al., 2001）よりもおよそ２倍多かった。
【０１２１】
上述のように観察された１１ヌクレオチドの挿入を回避するために、別のプロトコールを用いてＰＡｔＳＰＯ１１−ＧＡＬ４ＢＤ−ＡｔＳＰＯ１１−１構築体を再び作成し、図１３に示す配列を得た。次いで上述のようにアラビドプシス・サリアーナの形質転換を行った。
【０１２２】
次いで、ホモ接合体の変異体及び野生型の株において、アラビドプシスのゲノムに存在するＧＡＬ４ＢＤに対する天然の標的の上流及び下流に存在するマイクロサテライトのマーカー（４０を超えるさらに厳密なコンセンサス配列、及び数百までの最も変性させた、すなわち、ＵＡＳの各側たったの３ｂｐ）を解析することによって減数分裂組換えの刺激を確定した。
【０１２３】
２つのマーカーの間の乗換えを検討するために、１つのＧＡＬ４ＢＤ認識配列によって分離される、マーカーとしての２つの耐性遺伝子を示す細胞株を構築した。
【０１２４】
実施例３：マウスにおける部位特異的及び／又は増加した減数分裂組換えの誘導
マウスのシナプトネマ構造をコードするＳｙｃｐ１遺伝子は、減数分裂の接合期及びパテキン期の双方で発現される（Sage, Martin et al., 1999）。従って、減数分裂早期でＳＰＯ１１遺伝子を発現させるのにそれを使用することができる。減数分裂早期でＧａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１融合タンパク質を発現させることには３つの利点がある：それは、新しい部位での減数分裂組換えの標的化を可能にし、関連した染色体の変化及びマウスの発生における組換えを開始することの影響を追跡するのを助けることを可能にする。
【０１２５】
Ｇａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１キメラＤＮＡを細菌プラスミドで、Ｓｙｃｐ１コーディング配列の上流の領域又は早期減数分裂に機能的な別のプロモーター断片の制御下に置いた。
【０１２６】
Ｇａｌ４ＢＤコーディング配列を、Metzler-Guillemain C. 及びB. de Massy (2000)により記載されたマウスのｃＤＮＡ  ＳＰＯ１１配列と同位相に置くことによって、ｍＳｐｏ１１タンパク質がマウスのＳｐｏ１１タンパク質であるＧａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１の融合タンパク質をコードする配列を構築した。たとえば、以下のマルチステップクローニング方法：プライマー、ＡＰＧ４ｕｐ（５’−ＧＡＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡ）及びＡＰＧ４ＬＯ（５’−ＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴ）を用いＰＣＲにより、ｐＡＰ１のＧａｌ４ＢＤ断片増幅し、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（プロメガ）にクローニングし、配列決定して、Ｇａｌ４ＢＤ配列のＡＴＧ翻訳開始部位を重ね合うＮｄｅＩ部位を含有するｐＡＰ１５を創出することにより、これを行うことができる。
【０１２７】
次に、ｐＡＰ１５をＰａｃＩ−ＨｐａＩにより切断し、５’Ｇａｌ４ＢＤ（ＮｄｅＩ含有部位）配列を含有する断片をｐＡＰ１ベクターにクローニングし、ＰａｃＩ−ＨｐａＩにより切断してｐＡＤＨ１プロモーターを外し、プラスミドｐＡＰ１６を創出した。
【０１２８】
次に、ＰａｃＩ−ＳａｃＩでｐＡＰ１６を切断し、ＫａｎＭＸマーカー（Ｇ４１８耐性）を外し、平滑化し、再連結してｐＡＰ１７を創出した。
【０１２９】
次いで、Ｓ．セレビシアエのＳｐｏ１１断片を含有するｐＡＰ１７のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片をＳＶ４０のポリアデニル化部位を含有するｐＣＭＶβ（クロンテック）のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片に置き換えて、プラスミドｐＡＰ３を創出した。
【０１３０】
次に、ＳｙＣＰ１のプロモーターを含有するｐＴＡｇ０．８のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩの平滑化して埋めた断片を平滑化して埋め、ｐＡＰ３のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＡＰ１８を創出した。
【０１３１】
次いで、マウスＳＰＯ１１のｃＤＮＡを含有するプラスミド、ｐＧＥＭ−ｔＳＰＯ１１ｓのＥｃｏＲＩ断片をプライマーでＰＣＲにより増幅し、隣接するＳｆｉＩ及びＸｍａＩ制限部位を加え、ｐＧＥＭ−ｔＥａｓｙベクター（プロメガ）にクローニングして、プラスミド、ｐＡＰ１９を得、配列決定した。
【０１３２】
最後に、ｐＳｙｃｐ１プロモーター（ＴａｑＩ−ＥｃｏＲＩ断片）続いてＧａｌ４ＢＤ断片（ＥｃｏＲＩ−ＳｆｉＩ）を含有するｐＡＰ１９のＳｆｉＩ−ＸｍａＩ断片をマウスＳＰＯ１１のｃＤＮＡ（ＳｆｉＩ−ＸｍａＩ断片）に融合させ、ポリＡ断片（ＸｍａＩ−ＰｓｔＩ）で終結させ、細菌中で複製できるベクターによって運ばれる、種々の成分の交換に好都合な基準寸法のカセットを創出した。
【０１３３】
このｐＧａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１プラスミドを線状化し、微量注入法によりマウスの卵に導入した。次いで、Ｓｙｃｐ１／Ｇａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１導入遺伝子に特異的なプローブによるゲノムＤＮＡの解析によりマウスを選抜した。次いで正常なマウスと特徴解析されたマウスの交配を介して独立したＳｙｃｐ１／Ｇａｌ４ＢＤ−ｍＳｐｏ１１導入遺伝子のファミリーを確立した。
【０１３４】
次いで、野生型及びｍＳＰＯ１１遺伝子（Baudat, Manova et al., 2000）を不活化した変異型のマウスにおいて、動物における繁殖性に対する影響を観察し、及びＧａｌ４タンパク質に対するコンセンサス認識部位を含有する染色体領域をプローブとしたサザンブロット又はＰＣＲにより、子孫、配偶子、又は減数分裂細胞の調製物において多型マーカー間の減数分裂組換え頻度をモニターすることによって導入遺伝子発現の減数分裂における機能性を確定した。この標的部位は、天然の配列、又はＧＡＬＵＡＳモチーフの１以上のコピーを有するトランスジェニック配列のいずれかである。
【０１３５】
実施例４：ショウジョウバエにおける相同組換えの改善
ドロソフィラは、実験用生物として多数の利点を提供している。しかしながら、２つの他の広く使用されている真核生物のモデル系である酵母やマウスと比べて、ドロソフィラでは、導入ＤＮＡと相当する染色体上の遺伝子座との間で相同組換えを生じることができない。酵母やマウスのゲノムを特異的に改変する能力によって、そのＤＮＡクローンや配列が利用可能である、遺伝子における突然変異を生じる又は救う迅速で簡便な方法が提供されている。最近、Rong及びGolicは、ＤＮＡのｆｌｉｐリコンビナーゼ切り出しから生じるＤＮＡの直鎖状分子における二本鎖切断の誘導剤として、イントロン限定酵素、Ｉ−Ｓｃｅｌを用いた標的化相同組換えのための新しい技術を開発した（Rong & Golic, 2000）。この方法で、彼らは黄色突然変異を救済し（Rong & Golic, 2000）、ｐｕｇｉｌｉｓｔ遺伝子を破壊し、より最近、ＮｌａｃＺ、ＧＣ、ｐ５３及びＣＧ１１３０５の遺伝子を破壊した。このノックアウト技術は極めて効率が低く、突然変異は２工程で生じる。
【０１３６】
ドロソフィラにおいて「ノックアウト」を生じ、標的化相同組換えの効率を高める新しいアプローチを開発するためにＩ−Ｓｃｅｌ酵素の代わりに実施例１で記載したＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を使用することができる。この目的で、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１をコードする配列をドロソフィラ用の発現ベクター（Ｐ（Ｃａｓｐｅｒ−ｈｓ）、Pirrotta, 1988）に挿入した。このベクターでは、Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１配列は熱ショックプロモーターの制御下に置いた。ドロソフィラでは、この転移因子の５つの異なった挿入物が得られた。
【０１３７】
配偶子が生じる発生期にＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１の誘導により、Ｓｐｏ１１相同ドロソフィラにおけるｍｅｉＷ６８不稔表現型（McKim & hayashi-Hagihara, 1998）の救済を調べた。
【０１３８】
yellow遺伝子に対するＩ−Ｓｃｅｌ認識配列をＧＡＬ４結合ドメインに認識されるＵＡＳ配列で置き換え（Ｐ要素を用いて）、ｇａｌ４−ｍｅｉＷ６８株を構築した。Rong及びGolicの黄色救済（yellow rescue）を繰り返し、２つの方法の効率を比較した。
【０１３９】
これらの実験を行うために以下のプラスミドを使用した：
−発現ベクター：ｐＣａｓｐｅｒ−ｈｓ（Pirrotta, 1988）
−熱ショックプロモーターｈｓ７０（Pirrotta, 1988）
−標的ｐ（ＵＡＳ）：ＵＡＳ配列（５）によるＩ−Ｓｃｅｌ部位の置換により改変されたｙ−ドナー（Rong & Golic, 2000）
【０１４０】
この実験で使用したショウジョウバエの系統は、Ｃａｎｔｏｎ−Ｓｐｅｃｉａｌ（ＣＳ）ｙ１であった。
【０１４１】
上述のように、Ｇａｌ４−Ｓｐｏ１１の効果をアッセイする方法は、ｍｅｉＷ６８の表現型の救済及びｙ１（正常な体色）の救済である。
【０１４２】
実施例５：組換えの少ない染色体間の減数分裂組換えの刺激
相同染色体間の効率的な遺伝子組換えは、実施例１で例示したようにＳｐｏ１１タンパク質によって形成されるＤＮＡ二本鎖の切断のような、開始するための損傷の形成を必要とする。従って、Ｓｐｏ１１標的部位を欠く染色体の組換えは乏しい。実施例１で記載したＧａｌ４Ｂｄ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を用いて、酵母又は非酵母のＤＮＡから成る天然の又は人工の（ＹＡＣ）染色体に沿った、天然の又は人為的に導入されたＧａｌ４結合部位で組換えの開始を刺激することができる。同様に、組換えに乏しいバクテリオファージλＤＮＡの主鎖を持つ酵母の直鎖状プラスミド間で組換えを刺激してもよい。
【０１４３】
効率的な遺伝子組換えはまた、関与する分子間でほぼ完全な相同性を必要とする。多様性の程度に従って、相同染色体が減数分裂で多様に組換え、乗換えのレベルが低下した結果、配偶子の生存性が低下し、減数分裂Ｉ又はＩＩの相同体の不分離と一致して異数体産物の割合が増す。サッカロマイセス・セレビシアエ及びサッカロマイセス・カールベルゲンシスの相同な第５染色体は、減数分裂で事実上組み換えないが、人工的に創った相同性の短い領域は、おそらく隣接する部位で開始されるヘテロ二本鎖の中間体形成の促進によって減数分裂での乗換えを誘導することが見い出された。実施例１に記載したＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質を用いて、酵母又は非酵母の同質ＤＮＡから成る天然の又は人工的な（ＹＡＣ）染色体に沿った、天然の又は人工的に導入したＧａｌ４結合部位で組み換えの開始を刺激することができる。
【０１４４】
実施例６：有糸分裂細胞における相同組換えの刺激
減数分裂の間の高レベルの相同組換えは、Ｓｐｏ１１依存性の二本鎖切断の形成による減数分裂の間のＳｐｏ１１−高レベルの相同組換えの形成によって誘導されるが、それは、また、少なくとも１４のその他のタンパク質（実施例１ではＤＳＢ遺伝子と呼ばれる）の発現を必要とする。それらの一部は減数分裂の誘導で発現されるだけである。Ｓｐｏ１１を標的部位にもたらすトランスに作用する因子に対する要求を迂回することができるＧａｌ４ＢＤ−ＳＰＯ１１融合タンパク質の新規なＤＮＡ結合特性を利用して、有糸分裂細胞においてＤＳＢの形成に必要とされる追加の遺伝子を発現させることによって、有糸分裂細胞においてＳｐｏ１１依存性のＤＮＡ切断活性を得る試みを達成した。幾つかのアプローチ：有糸分裂で発現されるプロモーターを背景にした個々の遺伝子及び／又はｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの非相同発現、又は有糸分裂で増殖している細胞での発現を抑える転写因子の突然変異による変更によってこれを達成することができる。
【０１４５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構造及び発現を示す図である。
【図１Ｂ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構造及び発現を示す図である。
【図１Ｃ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構造及び発現を示す図である。
【図１Ｄ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の構造及び発現を示す図である。
【図２Ａ】ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の二倍体における天然のＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ、ＡＲＧ４及びＣＹＳ３のホットスポットでの減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図２Ｂ】ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の二倍体における天然のＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ、ＡＲＧ４及びＣＹＳ３のホットスポットでの減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図２Ｃ】ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の二倍体における天然のＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ、ＡＲＧ４及びＣＹＳ３のホットスポットでの減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図２Ｄ】ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の二倍体における天然のＹＣＲ０４３ｃ−ＹＣＲ０４８ｗ、ＡＲＧ４及びＣＹＳ３のホットスポットでの減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図３Ａ】ＵＡＳＧＡＬ配列のある遺伝子座におけるＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１が促進するＤＳＢを示す図である。
【図３Ｂ】ＵＡＳＧＡＬ配列のある遺伝子座におけるＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１が促進するＤＳＢを示す図である。
【図４Ａ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２遺伝子座で組換えは刺激されることを示す図である。
【図４Ｂ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２遺伝子座で組換えは刺激されることを示す図である。
【図４Ｃ】ＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１株におけるＧＡＬ２遺伝子座で組換えは刺激されることを示す図である。
【図５】ＧＡＬ２遺伝子座は不活性領域に位置することを示す図である。
【図６】ＳＰＯ１１及びＧＡＬ４ＢＤ−ＳＰＯ１１の株におけるＤＳＢ形成に対する遺伝的必要条件ことを示す図である。
【図７Ａ】ＹＣＲ０４８ｗ領域における減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図７Ｂ】ＧＡＬ２領域（図７Ｂ）における減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図８】ＹＣＲ０４８ｗ領域及びＧＡＬ２領域における減数分裂ＤＳＢの形成を示す図である。
【図９】ＰＩＭＥ１−Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１構築体の配列を示す図である。
【図１０】ＰＲＥＣ８−Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１構築体の配列を示す図である。
【図１１】ＰＡＤＨ１−ＱＱＲ−Ｓｐｏ１１構築体の配列を示す図である。
【図１２】ＰＡＤＨ１−Ｇａｌ４ＢＢ−ＲＥｃ１０４構築体の配列を示す図である。
【図１３】ＰＡｔＳＰＯ１１−Ｇａｌ４ＢＤ−ＡｔＳｐｏ１１−１構築体の配列を示す図である。
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
2005532823.tif 000029
2005532823.tif 000030
【図１０】
2005532823.tif 000031
【図１１】
2005532823.tif 000032
【図１２】
2005532823.tif 000033
【図１３】
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2005532823.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月9日(2005.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005532823000001.app
【国際調査報告】
2005532823.tif 000036
2005532823.tif 000037
2005532823.tif 000038
2005532823.tif 000039