(57)【要約】核酸リガンドの生物活性は、インビボにおいて所望の生物学的作用を生むように制御（すなわち促進または阻害）される。これは、核酸リガンドの標的への結合を変化させる、または、リガンドの効果がまだ有効な間に核酸リガンドを分解、さもなければ切断、代謝もしくは破壊するモジュレータ、すなわちレギュレータを投与することによって行われる。本発明のモジュレータは、患者の病状の進行、および最適な治療をいかに達成するかという医師の判断などさまざまな要因に基づき、必要に応じてリアルタイムで投与することができる。そこで、本発明は、核酸リガンド療法の治療単位において初めて制御可能な治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸リガンドの投与を受ける患者に該核酸リガンドに結合するモジュレータを投与することを含み、該投与は、該モジュレータが該核酸リガンドに結合すると標的分子に対する該核酸リガンドのアフィニティーが変化するような条件下で行う、患者における標的分子に対する核酸リガンドのアフィニティーを変化させる方法。
【請求項２】
該モジュレータが該核酸リガンドに結合すると、該標的分子に対する該核酸リガンドのアフィニティーが低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該モジュレータが該核酸リガンドに結合すると、該標的分子に対する該核酸リガンドのアフィニティーが上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該モジュレータが、該患者の体内に存在する遊離の核酸リガンドに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該モジュレータが、該患者の体内で該標的分子に結合して存在する核酸リガンドに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該モジュレータが、該核酸リガンド、核酸結合性のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または核酸結合性オリゴサッカライドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該モジュレータが該オリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの６から２５ヌクレオチドに相補的な配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの８から２０ヌクレオチドに相補的な配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの１０から１５ヌクレオチドに相補的な配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該オリゴヌクレオチドが５から８０ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
該オリゴヌクレオチドが１０から３０ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該オリゴヌクレオチドが１５から２０ヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該オリゴヌクレオチドが化学置換を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
該オリゴヌクレオチドが、第５位で置換されたピリミジン基、または２’位で置換された糖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該オリゴヌクレオチドが２’−アミノ基、２’−フルオロ基、または２’−Ｏ−メチル基の置換を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該オリゴヌクレオチドがロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの一本鎖領域に相補的である、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの一本鎖領域、および該核酸リガンドの二本鎖領域に相補的である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該核酸リガンドが一本鎖の末端部を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチドが、該核酸リガンドの該一本鎖末端部に相補的である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該核酸リガンドおよび該オリゴヌクレオチドがＤ−ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
該オリゴヌクレオチドをコードする配列を含むコンストラクトを患者に投与した後に、該患者の中で該核酸リガンドが産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
該核酸リガンドがフィブリン沈着またはフィブリン溶解を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該核酸リガンドが抗血液凝固性または抗血栓性の核酸リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該モジュレータが、該核酸リガンドの抗血液凝固性または抗血栓性の作用を逆転させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該標的分子が、組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）／第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、第Ｖａ因子（ＦＶａ）／第Ｘａ因子（ＦＸａ）などの酵素複合体、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ、ｇｐＶＩ、Ｇａｓ６、ＰＡＩ−Ｉ（プラスミノゲン活性化因子）、凝固因子ＸＩＩＩａ（ＦＸＩＩＩａ）、ＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、トロンビン、または凝固因子ＸＩａ（ＦＸＩａ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
該患者が感染症に罹りやすく、インターロイキンに結合する核酸リガンドの投与を受けており、該モジュレータが、インターロイキンに対する該核酸リガンドのアフィニティーを低下させ、それによって該核酸リガンドの免疫抑制作用を逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該患者が自己免疫を発症する危険をもち、ＣＴＬＡ４に結合する核酸リガンドの投与を受けており、該モジュレータが、ＣＴＬＡ４に対する該核酸リガンドのアフィニティーを低下させ、それによって該核酸リガンドの免疫促進作用を逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該患者が腫瘍を有し、成長因子に結合する核酸リガンドの投与を受けており、該モジュレータが、該成長因子に対する該核酸リガンドのアフィニティーを低下させ、それによって該患者の正常組織に対する該核酸リガンドの有害作用を逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
該患者が、グルコースに結合する核酸リガンドの投与を受けており、該モジュレータが、グルコースに対する該核酸リガンドのアフィニティーを低下させ、それによって該患者の低血糖症を回避する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該患者が、骨格筋の神経筋接合部または自律神経節における神経インパルスの伝達に関与するレセプターに結合し、それによって神経筋作用を遮断する核酸リガンドの投与を受けており、また、該モジュレータが、該レセプターに対する該核酸リガンドのアフィニティーを低下させ、それによって該核酸リガンドの神経筋遮断作用を逆転させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該核酸リガンドがＥ２Ｆファミリーに分子に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
核酸リガンドの投与を受けている患者に、標的組織に対する該核酸リガンドの結合を阻害するモジュレータを投与することを含む、標的組織に対する標識を有する核酸リガンドの結合を逆転させる方法。
【請求項４０】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
該標識が細胞毒性標識である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
該標識が放射性標識である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
該標識が検出可能な標識である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
該患者がヒトである、請求項１または３９に記載の方法。
【請求項４５】
該患者がヒト以外の哺乳動物である、請求項１または３９に記載の方法。
【請求項４６】
核酸リガンドが標的分子に結合しやすい条件下、テスト化合物の存在および不在下で該核酸リガンドを該標的分子に接触させること、および、該テスト化合物が、該核酸リガンドの該標的分子への結合を促進するか、阻害するかを決定することを含む、テスト化合物について、標的分子に対する核酸リガンドのアフィニティーを変えることができる能力をスクリーニングする方法。
【請求項４７】
テスト化合物を核酸リガンドに接触させること、および、テスト化合物が該核酸リガンドに結合するか否かを判定することを含み、核酸リガンドに結合するテスト化合物が該核酸リガンド活性の有望なモジュレータである、テスト化合物が核酸リガンド活性の有望なモジュレータかどうかをスクリーニングする方法。
【請求項４８】
核酸リガンドを、核酸リガンドに結合するモジュレータと接触させることを含み、該モジュレータが該核酸リガンドに結合することによって、トロンビンでない標的分子に対する該核酸リガンドのアフィニティーを変えるような条件下で該接触を行う、インビトロにおいて標的分子に対する核酸リガンドのアフィニティーを変える方法。
【請求項４９】
該モジュレータが該核酸リガンドに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
配列番号２０、２１、２２、２５から３６、３８、３９、４０もしくは４１に示された配列、または、それらと９５％以上の配列相同性を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載のオリゴヌクレオチド、および担体を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般に、核酸リガンド（例えばアプタマー）の薬理活性を調節する薬剤、特に、そのようなリガンドの活性を促進または阻害する薬剤に関係する。さらに、本発明は、そのような薬剤を含む組成物、およびこれらの薬剤および組成物を薬物療法および診断法において使用する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、伝統的に、生物学的過程において主に情報を担っていると考えられてきた。ＳＥＬＥＸと呼ばれる、指数的強化によるリガンドの試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）として知られている方法によって、核酸は、タンパク質と同じように三次元構造が多様であることが明らかになった。ＳＥＬＥＸは、標的分子への高度に特異的な結合によって核酸分子をインビトロで合成・選択する方法である。ＳＥＬＥＸ法は、現在米国特許第５，４７５，０９６号となっている、１９９０年６月１１日に出願された米国特許出願第０７／５３６，４２８号においてＧｏｌｄおよびＴｕｅｒｋによって初めて記載され、その後、現在米国特許第５，２７０，１６３号となっている、１９９２年８月１７日に「核酸リガンドの特定法」という発明の名称で出願された米国特許出願第０７／９３１，４７３号（国際公開公報第９１／１９８１３号参照）に記載された。また、Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−１０（１９９０）参照。
【０００３】
核酸リガンドまたはアプタマーは、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する性質を持ち、さまざまな二次構造体および三次構造体を形成する十分な能力を有し、およびモノマーであってもポリマーであっても実質的にどの化合物にもリガンドとして作用する（特異的結合ペアを形成する）ために構造体のモノマーの中で利用することができる十分な化学的汎用性を持ち、どのような大きさや組成をもつ分子であっても標的として使用することができる、コード領域をもたない一本鎖核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ＳＥＬＥＸ法は、同一の全般的選抜法を用いて、候補オリゴヌクレオチドの混合物から選択すること、および結合、分離および増幅を段階的に繰り返して、所望の結合アフィニティーおよび選択の基準に実質的に到達することを含む。ＳＥＬＥＸ法では、好ましくは無作為化された配列の断片を含む核酸の混合物から出発して、結合するのに好適な条件下で該混合物を標的と接触させること、標的分子に特異的に結合した核酸分子から非結合の核酸を分離すること、核酸−標的複合体を解離させること、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅してリガンド増幅された核酸混合物を得ること、および、結合、分離、解離および増幅を所望の回数繰り返して、標的分子に対して高度に特異的な高アフィニティー核酸リガンドを得るということを含む。
【０００４】
核酸リガンドは、それらが治療薬剤として有用なものとなり得る特徴をいくつか具えている。それらは比較的小さな（例えば、８ｋＤａから１５ｋＤａの）合成化合物として作成することが可能であり、また、標的分子に対する高度のアフィニティーと特異性（例えば０．０５ｎＭから１０ｎＭの範囲の平衡解離定数）をもつように選抜することができる。アプタマーは、モノクローナル抗体と単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）のアフィニティー特性、および低分子のペプチドと同様の製造上の容易さを具現している。初期の研究では、タンパク質の機能を研究するためにアプタマーをインビトロで使用することが示され、より最近の研究では、タンパク質の機能を研究するためにこれらの化合物が有用であることが確認されている（Ｆｌｏｅｇｅら、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１６９−１７９（１９９９），Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：９１３−９２３（１９９９）。また、これまでの動物実験で、アプタマー、および同様の組成をもつ化合物は十分に許容され、低い免疫原性を示すか、免疫原性が無く、そのため、治療化合物として繰り返し投与するのに適していることが明らかになっている。（Ｆｌｏｅｇｅら、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１６９−１７９（１９９９），Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：９１３−９２３（１９９９），Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８１：３２７１−３２７６（１９９３），Ｈｉｃｋｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：９２３−９２８（２０００））。
【０００５】
合成化合物と同じように、アプタマーのバイオアベイラビリティおよびクリアランスの方式を合理的に変えるため、アプタマーに部位特異的改変（挿入または欠失）を加えることができる。例えば、大きさが１０ｋＤａから１２ｋＤａの２’−フルオロピリミジン修飾されたアプタマーの静脈内ボーラス投与後の循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）（１０分間）は短いが、アプタマーを単純に化学修飾したり、アプタマーを高分子量の不活性担体分子（例えばＰＥＧ）に結合させたりすると、循環半減期が実質的に増加すること（６時間から１２時間）が発見されている（Ｗｉｌｌｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９：５７３−５８２（１９９８）、Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ  ７２３：２０３−２１２（１９９９）、Ｗａｔｓｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：６３−７５（２０００））。Ｌ−ヌクレオチドを含む、生物活性およびヌクレアーゼ耐性の一本鎖核酸リガンドが記載されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９４：１１２８５（１９９７）；米国特許第５，７８０，２２１号；Ｌｅｖａら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：３５１（２００２））。これら「Ｌ−アプタマー」は、天然型掌性のヌクレオチド（Ｄ−ヌクレオチド）を含むアプタマーが分解される条件下で安定していると言われている。
【０００６】
いくつかの第三者によって、アプタマーの特定、製造、および用法をカバーする特許が出願され、特許取得されている。上記したように、Ｌａｒｒｙ  ＧｏｌｄおよびＣｒａｉｇ  Ｔｕｅｒｋは、アプタマーを単離するＳＥＬＥＸ法を初めて開発した功績があると通常信じられており、彼らの方法は、上記した米国特許、および米国特許第５，６７０，６３７号、第５，６９６，２４９号、第５，８４３，６５３号、第６，１１０，９００号および第５，２７０，１６３号、その他発明の詳細な説明に記載されているものなど数多くの米国特許に記載されている。Ｔｈｏｍａｓ  Ｂｒｕｉｃｅらは、米国特許第５，６８６，２４２号において、アプタマーを作製する方法を報告しているが、それは、スクリーニング手順において厳密にランダムなオリゴヌクレオチドを使用するため、ＴｕｅｒｋとＧｏｌｄによって報告された本来のＳＥＬＥＸ法とは異なっている。’２４２号特許の方法でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドには、ＳＥＬＥＸ法でスクリーニングされたオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドプライマーが欠けている。
【０００７】
Ｇｏｌｄらに付与された特許のいくつかはアプタマーそのものに関係する。例えば、米国特許第５，１１４，１２０号は、細胞の高分子に結合するアプタマーに関するものである。米国特許第５，６７０，６３７号は、タンパク質に結合するアプタマーに関するものである。米国特許第５，６９６，２４９号は、ＳＥＬＥＸ法で作製されるアプタマーに関するものである。
【０００８】
特異的な生物学的標的に対するアプタマー、およびこのようなアプタマーを特定する方法に対する別の特許も発行されている。例えば、Ｏ’Ｔｏｏｌｅに付与された米国特許第５，７５６，２９１号および第５，５８２，９８１号は、定義された６種類の配列を含む標識されたアプタマーを使用してトロンビンを検出する方法を開示している。Ｇｏｌｄらの米国特許第５，５２７，８９４号および第５，６３７，４６１号は、ｔａｔタンパク質に対するアプタマーを特定する方法に関係している。特異的な生物学的標的に対するアプタマーを開示する他の特許には、米国特許第５，４９６，９３８号（ＨＩＶの逆転写酵素）、第５，４７６，７６６号（トロンビン）、第５，４５９，０１５号（線維芽細胞成長因子）、第５，４７２，８４１号（好中球エステラーゼ）、第５，８４９，４７９号（血管上皮成長因子）、第５，７２６，０１７号（ＨＩＶ  ＧＡＧ）、第５，７３１，１４４号（ＴＧＦβ）、第５，８２７，４５６号（絨毛性ゴナドトロピンホルモン）、第５，７８０，２２８号（レクチン）、第５，７６６，８５３号（セレクチン）、第５，６７４，６８５号（血小板由来成長因子）、第５，７６３，１７３号（ＤＮＡポリメラーゼ）、第６，１４０，４９０号（補体系タンパク質）、および第５，８６９，６４１号（ＣＤ４）などがある。
【０００９】
Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ、Ｒｕｓｃｏｎｉ、ＫｏｎｔｏｓおよびＷｈｉｔｅは、国際公開公報第０２２６９３２Ａ２号において、凝固因子、Ｅ２Ｆファミリー転写因子Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、およびそれらの断片またはペプチド、血液凝固およびその他の生物現象において有用な転写因子、自己免疫抗体、および細胞表面レセプターに結合するＲＮＡアプタマーを記載している（Ｒｕｓｃｏｎｉら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８３：８４１−８４８（２０００）、Ｗｈｉｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：９２９−３４（２０００）、Ｉｓｈｉｚａｋｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２：１３８６−１３８９（１９９６）、およびＬｅｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４１−４５（１９９７））。
【００１０】
また、アプタマーの具体的用法に関連した特許もいくつか発行されている。例えば、Ｂｒｕｉｃｅらは、米国特許第６，０２２，６９１号において、生体液中の薬物およびその他の分子を検出するためのＳＥＬＥＸ類似法によって確認されたアプタマーの使用法を記載している。Ｇｏｌｄらは、米国特許第５，８４３，６５３号において、アプタマーを使用した診断法を提供している。米国特許第６，１１０，９００号は、アプタマーを含有する診断用組成物を開示している。米国特許第５，７８９，１６３号は、捕捉用および／または検出用リガンドとしてアプタマーを使用するサンドイッチ法を開示している。米国特許第６，１４７，２０４号は、インビボで細胞内の位置に治療用および診断用アプタマーを送達するためにアプタマー／脂質親和複合体を使用することを開示している。米国特許第５，７０５，３３７号、第５，９６２，２１９号、第５，７６３，５９５号、および第５，９９８，１４２号は、標的タンパク質に共有結合するよう化学修飾されているアプタマーを開示している。
【００１１】
基本ＳＥＬＥＸ法を改変して、標的分子に高度の結合アフィニティーを示す以外の目的を充足するアプタマーを得る方法がいくつか開発されている。例えば、いくつかの特許が、改良された性質を示すアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸ法において修飾ヌクレオチドを使用することを開示している。例えば、米国特許第５，６６０，９８５号は、インビボでより強い安定性を示す２’−修飾されたヌクレオチドを使用するＳＥＬＥＸに関係している。米国特許第６，０８３，６９６号は、非核酸機能ユニットに共有結合しているオリゴヌクレオチドをその標的分子結合能力についてスクリーニングする「混合」ＳＥＬＥＸ法を開示している。別の特許は、アプタマーをＳＥＬＥＸ後修飾してそのサイズを小さくし、その安定性を増加させ、または、標的結合アフィニティーを強化させることを記載している。例えば米国特許第５，８１７，７８５号、および第５，６４８，２１４号を参照されたい。
【００１２】
さらに別の特許は、独自のＳＥＬＥＸ法を記載している。例えば、米国特許第５，７６３，５６６号および第６，１１４，１２０号は、生体組織およびその成分に対して結合アフィニティーをもつアプタマーを特定するために、全生体組織を標的としたＳＥＬＥＸ法を用いてアプタマーを生成する方法を開示している。米国特許第５，５８０，７３７号は、２種類以上の化合物を区別することができるアプタマーが得られるＳＥＬＥＸ法の変法を開示している。米国特許第５，５６７，５８８号は、最もアフィニティーが高いアプタマーをあるいは増幅するために、核酸候補混合液を溶液の中でスクリーニングする「溶液ＳＥＬＥＸ」法を開示している。
【００１３】
Ｋａｕｆｆｍａｎは、確率論的に生成されたオリゴヌクレオチドベクターの広大なプールからタンパク質の大ライブラリーを作成することを開示している特許を取得している。米国特許第５，８１４，４７６号および第５，７２３，３２３号を参照されたい。
【００１４】
Ｗｅｉｓらは、米国特許第５，２４５，０２２号において、末端をポリアルキレングルコールで置換された約１２から２５塩基のオリゴヌクレオチドを開示している。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ活性に耐性があると報告されている。
【００１５】
Ｃｏｏｋらに付与された米国特許第５，６７０，６３３号および第６，００５，０８７号は、ＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列に相補的な熱安定性２’−フルオロオリゴヌクレオチドを開示している。Ｃｏｏｋらに付与された米国特許第６，２２２，０２５号および第５，７６０，２０２号は、２’−Ｏ置換されたピリミジン、および、これら修飾されたピリミジンを含むオリゴマーの合成について記載している。欧州特許第０５９３９０１Ｂ１号は、末端に３’，３’−および５’，５’−ヌクレオシド結合をもつ、オリゴヌクレオチドおよびリボザイムの類似化合物を開示している。Ｇｏｌｄらに付与された米国特許第６，０１１，０２０号は、ポリエチレングリコールによって修飾されたアプタマーを開示している。
【００１６】
アプタマーを作製するために使用することができる大規模製造法を記載した米国特許がいくつか発行されている。例えばＣａｒｕｔｈｅｒｓらは、米国特許第４，９７３，６７９号、第４，６６８，７７７号および第４，４１５，７３２号において、オリゴヌクレオチドの製造において有用なホスホルアミダイト化合物の種類を記載している。別の一連の特許において、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらは、無機ポリマー担体を用いたオリゴヌクレオチド合成法を開示している。例えば、米国特許第４，５００，７０７号、第４，４５８，０６６号および第５，１５３，３１９号を参照されたい。さらに別の一連の特許において、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらは、オリゴヌクレオチドを製造するために使用することができるヌクレオシドホスホロジチオエートの種類を開示している。例えば、米国特許第５，２７８，３０２号、第５，４５３，４９６号および第５，６０２，２４４号を参照されたい。他のアプタマーに結合するよう設計されたアプタマーの報告には、Ａｌｄａｚ−Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｌ，Ｔａｌｌｅｔ  Ｂ，Ｄａｕｓｓｅ  Ｅ，Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ  Ｌ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ．先端ループ−内部ループ相互作用：Ｃ型肝炎ウイルスｍＲＮＡのＲＮＡヘアピン構造に対するインビトロ選抜によって特定された新規のＲＮＡ−ＲＮＡ認識モチーフ（Ａｐｉｃａｌ  ｌｏｏｐ−ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｏｏｐ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ  ｎｅｗ  ＲＮＡ−ＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＲＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｍＲＮＡ）、２００２、５月７日，４１（１８）：５８８３−９３；Ｄａｒｆｅｕｉｌｌｅ  Ｆ，Ｃａｚｅｎａｖｅ  Ｃ，Ｇｒｙａｚｎｏｖ  Ｓ，Ｄｕｃｏｎｇｅ  Ｆ，Ｄｉ  Ｐｒｉｍｏ  Ｃ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ．；ヒト免疫不全症ウイルス−１のトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡを標的とするＲＮＡおよびＮ３’→Ｐ５’キッシングアプタマー（ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｎ３’→Ｐ５’  ｋｉｓｓｉｎｇ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ（ＴＡＲ）ＲＮＡ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ−１），Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２００１、４月−７月；２０（４−７）：４４１−９；Ｃｏｌｌｉｎ  Ｄ，ｖａｎ  Ｈｅｉｊｅｎｏｏｒｔ  Ｃ，Ｂｏｉｚｉａｕ  Ｃ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ，Ｇｕｉｔｔｅｔ  Ｅ．，ＨＩＶ−１のＴＡＲ  ＲＮＡ因子とＤＮＡアプタマーの間で形成されるキッシング複合体のＮＭＲによる特徴づけ（ＮＭＲ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＴＡＲ  ＲＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ａ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００、９月１日t；２８（１７）：３３８６−９１；Ｄｕｃｏｎｇｅ  Ｆ，Ｄｉ  Ｐｒｉｍｏ  Ｃ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ．，閉鎖「ＧＡ対」が安定したループ−ループＲＮＡ複合体となるためのルールか（Ｉｓ  ａ  ｃｌｏｓｉｎｇ  「ＧＡ  ｐａｉｒ」  ａ  ｒｕｌｅ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｌｏｏｐ−ｌｏｏｐ  ＲＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ？）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００、７月１４日；２７５（２８）：２１２８７−９４；Ｄｕｃｏｎｇｅ  Ｆ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ．インビトロ選抜はループ−ループ相互作用にとっての重要な決定因子を特定する：ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＴＡＲ  ＲＮＡ因子に対し選択的なＲＮＡアプタマー（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｋｅｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｏｐ−ｌｏｏｐ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＡＲ  ＲＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ）．１９９９、１２月；５（１２）：１６０５−１４；Ｂｏｉｚｉａｕ  Ｃ，Ｄａｕｓｓｅ  Ｅ，Ｙｕｒｃｈｅｎｋｏ  Ｌ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ，ＲＮＡ−ＤＮＡキッシング複合体からＨＩＶ−１トランス活性化応答ＲＮＡ因子に対して選択されたＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ＲＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９、４月３０日；２７４（１８）：１２７３０−７；Ｌｅ  Ｔｉｎｅｖｅｚ  Ｒ，Ｍｉｓｈｒａ  ＲＫ，Ｔｏｕｌｍｅ  ＪＪ，ｍＲＮＡヘアピン構造を標的とするオリゴヌクレオチドによる無細胞系翻訳の選択的阻害（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｍＲＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８、５月１５日；２６（１０）：２２７３−８などがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
現在、多くの薬剤が、副作用および好ましくないか抑制不能の転帰など、内科的合併症を引き起こしている。副作用から生じる内科的合併症の治療は医療費の増加をもたらす。この範囲の核酸リガンドが内科治療において有用だと近年確認されたことにより、研究開発の新たな道が開けた。この領域における進歩はあった一方で、これらのリガンドが使用される局面を改善してそれらの効果を強化するための方法および組成物を提供し、治療方法をもっとうまく調節し、また、伝統的な治療法よりも副作用を低減させた治療法を提供する強い需要がまだある。本発明は、医学療法において核酸リガンドを使用する方法を改善するための化合物、組成物および方法を提供する。本発明が提供する方法によって、核酸リガンド活性の治療効果、薬理動態学、および持続時間をより制御できるようになる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
核酸リガンドの生物活性をインビボで調節（すなわち促進または阻害）して、所望の生物学的効果を生じさせうることが発見された。これは、標的に対する核酸リガンドの結合を変化させるか、核酸リガンドがその効果を発揮している間にそのリガンドを分解、さもなければ切断、代謝または破壊するモジュレータ、すなわち制御因子を投与することによって遂行することができる。本発明のモジュレータは、患者の進行状況、および、最適な療法をどのように達成するかについての医師の判断など、さまざまな要因に基づき、必要に応じてリアルタイムで投与することができる。そこで、本発明は、核酸リガンド療法の治療単位において初めて制御可能な治療法を提供する。
【００１９】
この制御可能な治療法は、使用が容易で、患者の健康状態に左右されず、均一な作用形態をもち、かつ、連続的に薬物を注入する必要がないモジュレータを導入することによって、薬物の作用を抑制することができる。一例を挙げれば、アプタマー活性を停止させるよう合理的に設計された中和剤が医師の求めに応じて提供される。
【００２０】
モジュレータは、オリゴヌクレオチド、低分子、ペプチド、例えばアミノグリコシドのようなオリゴ糖、または、治療用核酸リガンドに結合することができるか、さもなければ、それの活性を調節することができるその他の分子であってもよく、低分子、または、これらの何れかのキメラもしくは融合もしくは結合産物などがある。例えば、モジュレータは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドであってもよい。別の実施形態において、モジュレータは、核酸リガンドを標的とするリボザイムまたはＤＮＡ酵素（ＤＮＡｚｙｍｅ）であり得る。さらに別の実施形態において、モジュレータには、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるかハイブリダイズする配列を含んでいるペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸（ＭＮＡ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、またはシュードサイクリックオリゴヌクレオベース（ｐｓｅｕｄｏｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ：ＰＣＯ）などがあり得る。典型的な核酸リガンド（例えばアプタマー）は、若干の二次構造を持ち、その活性型三次構造は適切な安定的二次構造の形成に依存している。したがって、本発明の相補的オリゴヌクレオチドモジュレータと核酸リガンドとの間で二重鎖が形成されるメカニズムは、短鎖オリゴリボヌクレオチド間におけるものと同じであるにもかかわらず、そのような相互作用を設計するためのルール、およびそのような生成物を形成する動力学ともに、分子内アプタマー構造による影響を受ける。最終的な安定した二重鎖を形成するには核生成速度が重要であり、この段階の速度は、オリゴヌクレオチドモジュレータを、核酸リガンドに存在する一本鎖ループおよび／または一本鎖３’または５’末端部を狙わせることによって大いに促進される。分子間二重鎖の形成を生じさせるためには、分子間二重鎖を形成する自由エネルギーが、核酸リガンド内に存在する分子内二重鎖の形成に対して有利なものでなけらばならない。
【００２１】
本発明の代替的な実施形態において、モジュレータそのものはアプタマーである。本実施形態において、まず、所望の治療標的に結合する核酸リガンドを作製する。第二段階において、本明細書記載のＳＥＬＥＸ法、またはその他の方法を使用して、第一の核酸リガンドに結合する第二の核酸リガンドを作製して、治療用核酸リガンドと標的との間での相互作用を調節する。一つの実施形態において、第二の核酸リガンドは、第一の核酸リガンドの作用を非活性化させる。
【００２２】
別の代替的な実施形態において、標的に結合するアプタマーはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯであり得、モジュレータは核酸リガンドである。あるいは、標的に結合するアプタマーはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯであり、モジュレータはＰＮＡであり得る。あるいは、標的に結合するアプタマーはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯであり、モジュレータはＭＮＡである。あるいは、標的に結合するアプタマーはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯであり、モジュレータはＬＮＡである。あるいは、標的に結合するアプタマーはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡまたはＰＣＯであり、モジュレータはＰＣＯである。所望であれば、天然の立体化学法または非天然の立体化学法、またはこれらの混合法において、これらの何れを使用することも可能である。例えば、好適な実施形態において、核酸リガンドはＤ型立体配座であり、それに代わる実施形態において、核酸リガンドはＬ型立体配座である。
【００２３】
また、本発明は、核酸リガンドのモジュレータを特定するための方法を提供する。モジュレータは、通常、生物学的機能の変更を測定する結合アッセイ、分子モデリングまたはインビトロもしくはインビボでのアッセイによって特定することができる。一つの実施形態において、モジュレータの核酸リガンドへの結合をゲルシフトアッセイによって決定する。別の実施形態において、モジュレータの核酸リガンドへの結合をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイ法によって決定する。その他適切なアッセイ法を発明の詳細な説明で述べる。
【００２４】
別の実施形態において、モジュレータと核酸リガンドとの結合または相互作用を、適切な生物学的条件下でモジュレータが存在する場合と存在しない場合とで該核酸リガンドの作用を評価することによって測定する。一例として、抗血栓性および抗血液凝固性のアプタマーを制御する本発明のモジュレータを特定することができる。活性化凝固時間検査、活性化部分トロンボプラスチン検査、出血時間検査、プロトロンビン時間検査、またはトロンビン凝固時間検査などの血液凝固検査バイオアッセイ法によって、インビトロまたはインビボでモジュレータの有効性を査定することができる。特定された療法を用いて、患者に抗血液凝固性核酸リガンドを投与してから、正常な凝固作用を再開させるのに適した時になったら中和剤を投与することができる。この療法は、例えば、心臓血管および血管の手術、経皮冠動脈インターベンション（血管形成術）、整形外科手術、および急性心筋梗塞の治療の過程で有用である。非制限的で説明に役立つ例としては、本発明のモジュレータを、組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）／第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、第Ｖａ因子（ＦＶａ）／第Ｘａ因子（ＦＸａ）などの酵素複合体、ならびにｇｐ  ＩＩｂＩＩＩａおよびｇｐ  ＩｂＩＸなどの血小板レセプターを標的とする核酸リガンドに結合させて、該核酸リガンドの作用を調節することができる。また、本発明は、中和剤で制御することができる血小板阻害因剤、抗血栓剤および線維素溶解剤も提供する。
【００２５】
一つの実施形態において、モジュレータは、血液凝固第ＩＸａ因子を標的とする第ＩＸａ因子アプタマー（例えばアプタマー９．３またはアプタマー９．３ｔ）に結合するオリゴヌクレオチドである。中和剤オリゴヌクレオチドは、第ＩＸａ因子アプタマーの少なくとも一部に相補的な場合がある。具体的に言えば、中和性２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドは以下の配列からなる。
【００２６】
【化１】
2005502596.tif 000002
この修飾体または誘導体であって、所望のハイブリダイゼーション強度を維持しているもの。
【００２７】
別の実施形態において、モジュレータは、血液凝固第Ｘａ因子を標的とする第Ｘａ因子アプタマー（例えばアプタマー１１Ｆ７ｔ）に結合するオリゴヌクレオチドである。中和性オリゴヌクレオチドは、第ＩＸａ因子アプタマーの少なくとも一部に相補的な場合がある。具体的に言えば、中和性オリゴヌクレオチドは以下の配列、
【００２８】
【化２】
2005502596.tif 000003
からなるか、または、その修飾体もしく誘導体であって、ハイブリダイゼーション強度を維持しているものである。
【００２９】
別の実施形態において、オリゴヌクレオチドモジュレータは、実質的に相同な核酸配列であって、実質的に、本明細書において特定されているオリゴヌクレオチドモジュレータと同一の核酸リガンド結合能力を有するものを含む。
【００３０】
さらなる実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、例えば、感染症に罹りやすい患者のインターロイキンを標的とする核酸リガンドの免疫抑制作用を逆転させることができる。本発明のモジュレータを使用して、自己免疫を発症する危険をもつ患者のＣＴＬＡ４を標的とする核酸リガンドの免疫促進作用を逆転させることができる。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、成長因子（例えばＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ）を標的とするアプタマーの作用を逆転させることができる。このような核酸リガンドは、腫瘍の治療、および炎症性の増殖疾患の治療に使用することができる。成長因子は、正常な細胞の生存および増殖において全身での役割を果たしているため、核酸リガンド治療は厳密に制御されていないと、健全な組織の破壊をもたらす可能性がある（例えば、アンジオポエチンＩを標的とする核酸リガンドを投与された患者は出血しやすい）。そのような核酸リガンドを標的とする本発明のモジュレータを使用して、必要な制御を提供することができる。
【００３２】
本発明のモジュレータを使用して、骨格筋の神経筋接合部および／または自律神経節における神経インパルスの伝達に関与するレセプター（例えば、ニコチン性アセチルコリンレセプターまたはニコチン様コリン作動性レセプター）を標的とする核酸リガンドの作用を逆転させることができる。筋弛緩または麻酔中の麻痺を起こさせるためにそのような核酸リガンドを作製することも可能である。アセチルコリンレセプターの活性を遮断する薬剤（神経筋遮断を生じさせる薬剤）は外科手術の過程で広く使用されており、患者は外科手術完了後できるだけ早く筋機能を回復して、合併症が起こりにくくし、手術室における患者の代謝回転を促すことが好ましい。したがって、薬物の活性持続時間が外科手術の予想継続時間に合致するような予測可能な薬物動態学をもつ薬剤を作製するために多大の努力が払われている。あるいは、そのような核酸リガンドを標的とする本発明のモジュレータを使用して、神経筋遮断薬の活性を望ましいように制御することができ、それによって、神経筋遮断薬を逆転させるために患者の生理機能に依存する必要が減少する。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、グルコースなどの低分子を標的とする核酸リガンドの作用を逆転させることができる。本発明のモジュレータを使用してグルコースの取り込みを制御するために、グルコースを標的とする核酸リガンドを投与された患者においては低血糖症を避けることができる。
【００３４】
さらに、モジュレータを使用して、Ｅ２Ｆファミリーの分子に対する核酸リガンドの活性を制御することもできるが、そのうちのいくつかは前増殖性（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）であり、抑制的である。本発明のモジュレータを使用して、細胞周期の所望の時点でそのような核酸リガンドのスイッチを「オン」にしたり、「オフ」にしたりすることができる。
【００３５】
別の実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、標的組織（例えば新生物組織）対して放射性または細胞毒性の部分をもつ核酸リガンドの結合を逆転させることができ、それによって、例えば、患者の系からのそのような部分のクリアランスを促進することができる。同様に、本発明のモジュレータを使用して、（例えば、画像化または細胞分離または選別に使用され）細胞または組織を標的するために、検出可能成分で標識した核酸リガンドの結合を逆転させることができる（Ｈｉｃｋｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：９２３（２０００）；Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：３９４（１９９８））。この逆転は、患者の系からの検出可能成分のクリアランスを迅速に処理するために利用することができる。
【００３６】
本発明のモジュレータを使用して、インビトロの場面において、標的分子上の核酸リガンド（例えばアプタマー）の作用を促進または阻害することもできる。例えば、本発明のモジュレータを標的検証実験に使用することができる。本発明のモジュレータを使用して、（核酸リガンドをもつ）標的細胞を阻害した後に観察される反応は、その分子を特異的に阻害するせいであることを確認することが可能である。
【００３７】
本発明のモジュレータは、モジュレータ以外に、医薬適合性の担体、希釈剤または賦形剤を含むことがある医薬組成物に製剤することができる。組成物の正確な性質は、少なくとも部分的にモジュレータの性質と投与経路によって決まる。最適な投与計画は、当業者が容易に設定することができ、モジュレータ、患者、および求められる作用によって異なる。一般的に、モジュレータはＩＶ、ＩＭ、ＩＰ、ＳＣにより、または局所的に、適宜投与することができる。
【００３８】
あるいは、本発明のモジュレータの特異性から考えて、その後の治療には、最初に投与された元々の核酸リガンド／中和剤オリゴヌクレオチドの組み合わせとと同一の、または異なった核酸リガンドをさらに投与することを含むことがある。
【００３９】
最後に、本発明の一つの最適な実施形態は、臨床前の動物実験の有用性を高めるために関連種との交差反応性を示すモジュレータおよびレギュレータを特定および選択することである。
【００４０】
本発明の目的と長所を以下の説明で明らかにする。
【００４１】
本発明は、治療薬および診断薬などの薬理学的組成物のモジュレータに関する。さらに、本発明は、本発明のモジュレータを、それを必要とする被験対象（例えばヒト）に投与して、薬理学的組成物の効果を促進するか阻害する方法に関係する。また、本発明は、本発明のモジュレータを使用して、インビボおよびインビトロで核酸リガンドの活性を測定する方法に関係する。
【００４２】
本発明は、核酸リガンドの活性を、例えば、そのコンフォメーション、したがってその機能を変えることによって調節する方法に関係する。本発明により、モジュレータが、核酸リガンドに結合して、核酸リガンドとその標的分子との間の相互作用を変える条件下で、モジュレータを標的核酸リガンドと接触させることができる。この相互作用の変更は、モジュレータによる結合の結果として核酸リガンドの構造が変更することから起こり得る。このモジュレータは、遊離の核酸リガンド、および／またはその標的分子に結合している核酸リガンドに結合することができる。
【００４３】
本発明のモジュレータは、高度の特異性および所望の度合いのアフィニティーを以って特定の核酸リガンドに結合するよう設計することができる。また、結合すると、核酸リガンドの構造がより強いか、より弱い活性型に変化するように設計することもできる。例えば、標的核酸リガンドに結合すると、その核酸リガンドの三次元構造が変化して、その核酸リガンドがもはやその標的分子に結合できなくなってしまうか、より弱いアフィニティーでその標的分子に結合するように設計することができる。
【００４４】
あるいは、モジュレータは、結合すると核酸リガンドの三次元構造が変化して、標的分子に対する核酸リガンドのアフィニティーが促進されるように設計することができる。すなわち、結合すると、核酸リガンドの中に構造モチーフができて、核酸リガンドがその標的分子に結合できるようにモジュレータを設計することができる。
【００４５】
一つの実施形態において、モジュレータはオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な配列であり得る。別の実施形態において、モジュレータは、核酸リガンドを標的とするリボザイムまたはＤＮＡ酵素である。さらに別の実施形態において、モジュレータは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的であるかハイブリダイズする配列を含むペプチド核酸またはモルフォリノ核酸であり得る。生理学的条件下で、核酸リガンドへのモジュレータの結合が核酸リガンドの通常の機能を十分に阻害して、核酸リガンドの生物学的活性に変化をもたらすとき、モジュレータは核酸リガンドに特異的にハイブリダイズすることができるといえる。別の代替的実施形態において、モジュレータの核酸リガンドへの非ワトソン−クリック型結合が十分な程度生じて、核酸リガンドの活性に影響を与える。
【００４６】
さらに別の実施形態において、モジュレータは、核酸リガンドに結合するか、さもなければそれと相互作用する核酸結合型のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。さらに別の実施形態において、モジュレータは、核酸リガンドに結合するオリゴサッカライドである。具体的な実施形態において、モジュレータはアミノグリコシドである。別の実施形態において、モジュレータは有機低分子（すなわち、合成または天然の分子であって、それ以外ではインビボで見られない、一般的には分子量が１０００よりも小さな分子）である。
【００４７】
また、本発明は、核酸リガンドのモジュレータを特定する方法も含む。一つの実施形態において、モジュレータの核酸リガンドへの結合は、ゲルシフトアッセイ法など、結合アフィニティーを測定するアッセイ法によってモジュレータの核酸への結合を決定される。別の実施形態において、モジュレータの核酸リガンドへの結合は、ビアコアアッセイ法によって決定される。別のアッセイ法の例を以下で述べる。
【００４８】
別の実施形態において、モジュレータの核酸リガンドとの結合または相互作用は、適切な生物学的条件の下でレギュレータを用いたときと用いないときのリガンドの作用を評価することによって測定される。例えば、活性化凝固時間検査、活性化部分トロンボプラスチン検査、出血時間検査、プロトロンビン時間検査、またはトロンビン凝固時間検査などの血液凝固検査バイオアッセイ法によって、核酸リガンドの抗血栓活性または抗血液凝固活性をインビトロまたはインビボにおいて変更するモジュレータを特定することができる。
【００４９】
さらに、本発明は、モジュレータを、核酸リガンド活性を制御することが望ましいさまざまな適応症に使用することを含む。モジュレータは、核酸リガンドの作用を逆転する中和剤として、核酸リガンド活性を阻害するように作用する可能性がある。また、本発明は、核酸リガンドの活性を測定するために本発明のモジュレータを使用する方法を提供する。また、本発明は、本発明のモジュレータをヒトまたはヒト以外の哺乳動物に投与することによって、核酸リガンドの効果を促進または阻害する方法を目的としている。
【００５０】
さらなる実施形態において、例えば、感染症に罹りやすい患者の体内のインターロイキンを標的とする核酸リガンドの免疫抑制作用を逆転させるために、本発明のモジュレータを使用することもできる。本発明のモジュレータを使用して、自己免疫を発症しつつある患者におけるＣＴＬＡ４を標的とする核酸リガンドの免疫促進作用を逆転させることができる。
【００５１】
さらなる実施形態において、成長因子（例えばＰＤＧＦまたはＶＥＧＦ）を標的とする核酸リガンドの作用を逆転させるために本発明のモジュレータを使用することができる。このような核酸リガンドは癌治療、および炎症性増殖疾患の治療に使用することができる。成長因子は、正常細胞の生存および増殖において全身的な役割を果たすため、核酸リガンド治療は、厳密に制御されないと正常組織の破壊をもたらすことがある（例えば、アンジオポエチンＩを標的とする核酸リガンドを投与されている患者は出血しやすいかもしれない）。このような核酸リガンドを標的とする本発明のモジュレータを使用して必要な制御を提供することができる。
【００５２】
本発明のモジュレータを使用して、骨格筋の神経筋接合部および／または自律神経節における神経インパルスの伝達に関与するレセプター（例えば、ニコチン性アセチルコリンレセプターまたはニコチン様コリン作動性レセプター）を標的とする核酸リガンドの作用を逆転させることができる。筋弛緩または麻酔中の麻痺を起こさせるためにそのような核酸リガンドを作製することも可能である。アセチルコリンレセプターの活性を遮断する薬剤（神経筋遮断を生じさせる薬剤）は外科手術の過程で広く使用されており、患者は外科手術完了後できるだけ早く筋機能を回復して、合併症が起こりにくくし、手術室における患者の代謝回転を促すことが好ましい。したがって、薬物の活性持続時間が外科手術の予想継続時間に合致するような予測可能な薬物動態学をもつ薬剤を作製するために多大の努力が払われている。あるいは、そのような核酸リガンドを標的とする本発明のモジュレータを使用して、神経筋遮断薬の活性を望ましいように制御することができ、それによって、神経筋遮断薬を逆転させるために患者の生理機能に依存する必要が減少する。
【００５３】
さらに別の実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、グルコースなどの低分子を標的とする核酸リガンドの作用を逆転させることができる。本発明のモジュレータを使用してグルコースの取り込みを制御するために、グルコースを標的とする核酸リガンドを投与された患者においては低血糖症を避けることができる。
【００５４】
さらに、モジュレータを使用して、Ｅ２Ｆファミリーの分子に対する核酸リガンドの活性を制御することもできるが、そのうちのいくつかは前増殖性（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）であり、抑制的である。本発明のモジュレータを使用して、細胞周期の所望の時点でそのような核酸リガンドのスイッチを「オン」にしたり、「オフ」にしたりすることができる。
【００５５】
別の実施形態において、本発明のモジュレータを使用して、標的組織（例えば新生物組織）対して放射性または細胞毒性の部分をもつ核酸リガンドの結合を逆転させることができ、それによって、例えば、患者の系からのそのような部分のクリアランスを促進することができる。同様に、本発明のモジュレータを使用して、（例えば、画像化または細胞分離または選別に使用され）細胞または組織を標的するために、検出可能成分で標識した核酸リガンドの結合を逆転させることができる（Ｈｉｃｋｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：９２３（２０００）；Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：３９４（１９９８））。この逆転は、患者の系からの検出可能成分のクリアランスを迅速に処理するために利用することができる。
【００５６】
本発明のモジュレータを使用して、インビトロの場面において、標的分子上の核酸リガンド（例えばアプタマー）の作用を促進または阻害することもできる。例えば、本発明のモジュレータを標的検証実験に使用することができる。本発明のモジュレータを使用して、（核酸リガンドをもつ）標的細胞を阻害した後に観察される反応は、その分子を特異的に阻害するせいであることを確認することが可能である。
【００５７】
本発明のモジュレータは、モジュレータ以外に、医薬適合性の担体、希釈剤または賦形剤を含むことがある医薬組成物に製剤することができる。組成物の正確な性質は、少なくとも部分的にモジュレータの性質と投与経路によって決まる。最適な投与計画は、当業者が容易に設定することができ、モジュレータ、患者、および求められる作用によって異なる。一般的に、モジュレータはＩＶ、ＩＭ、ＩＰ、ＳＣにより、または局所的に適宜投与することができる。
【００５８】
別の実施形態において、核酸リガンドまたはそのレギュレータは、コレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロールなどの親油性化合物、または、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非免疫原性で高分子量の化合物またはポリマーに共有結合させることもできる。これらの場合、核酸リガンドまたはモジュレータの薬理動態学的性質は強化される。さらに別の実施形態において、核酸リガンドまたはモジュレータは、例えば、リポソームの内側に封入された核酸またはＰＮＡまたはＭＮＡから成り、複合体を形成していないオリゴヌクレオチドまたはモジュレータよりも細胞内への取り込みの強化が見られる。親油性化合物または非免疫原性高分子化合物は、リガンドまたはモジュレータと共有的に結合するかまたは非共有結合的相互作用によって会合することができる。親油性化合物がコレステロール、ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、または、非免疫原性高分子量化合物がＰＥＧである場合の実施形態においては、オリゴヌクレオチドモジュレータとの共有的結合が好適である。親油性化合物がカチオン性リポソームの場合、または、オリゴヌクレオチドモジュレータがリポソームの中に封入されている場合の実施形態においては、オリゴヌクレオチドモジュレータとの非共有的結合が好適である。共有結合が用いられる場合の実施形態において、親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物が、オリゴヌクレオチドモジュレータ上のさまざまな位置、例えば、塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの第５位、プリンヌクレオチドの第８位、リン酸のヒドロキシル基、またはオリゴヌクレオチドモジュレータの５’−または３’−末端にあるヒドロキシル基または別の基に共有結合していることも可能である。しかし、好ましくは、その５’または３’−末端にあるヒドロキシル基に結合している。複合体の別の成分へのオリゴヌクレオチドモジュレータの結合は、直接に、またはリンカーもしくはスペーサーを利用して行うことができる。親油性化合物または非免疫原性高分子化合物は、オリゴヌクレオチドモジュレータと非共有結合的相互作用を介して結合することができる。例えば、本発明の一つの実施形態において、親油性化合物の内部コンパートメントの中にオリゴヌクレオチドモジュレータを封じ込める。本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチドモジュレータは、静電的相互作用を介して親油性化合物と結合する。例えば、カチオン性リポソームは、アニオン性のオリゴヌクレオチドモジュレータと結合できる。イオン性引力を介した非共有結合的相互作用の別の例は、オリゴヌクレオチドモジュレータの一部が、ワトソン−クリック型塩基対合または三重鎖塩基対合を介して、親油性化合物または非免疫原性高分子化合物に結合しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするという相互作用である。
【００５９】
Ｉ．定義
以下の用語については、当技術分野において周知の意味をもつと考えられるが、本発明の説明をより解りやすくするために以下の定義を提示する。
【００６０】
「結合活性」および「結合アフィニティー」という用語は、リガンド分子が標的に結合する、または結合しない性質を意味するものである。この相互作用のエネルギーは、「結合活性」および「結合アフィニティー」において意味がある。なぜなら、これらの用語は、相互作用する相手分子の必要濃度、これらの相手分子が結合できる速度、および溶液中で結合している分子または遊離分子の相対的濃度を規定するからである。そのエネルギー特性は、他の方法の中でもとりわけ、解離定数Ｋｄを決定することによって特徴付けられる。好適には、ＷｏｎｇおよびＬｈｏｍａｎ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，５４２８−５４３２に開示されているような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイ法を用いてＫｄ値を設定する。一つの実施形態における「特異的に結合するオリゴヌクレオチド」、「核酸リガンド」または「アプタマー」は、目的とする標的分子と複合体を形成することができる特異的結合領域をもつオリゴヌクレオチドである。結合特異性は、環境中の他の物質または通常無関係な分子に対する解離定数と比べた場合の核酸リガンドのモジュレータの比較解離定数（Ｋｄ）によって定義される。核酸リガンドのモジュレータに対するＫｄは、モジュレータおよび無関係の物質または環境中で共存する物質に対するＫｄよりも２倍、好適には５倍、より好適には１０倍低くなり得る。さらに一層好適には、Ｋｄは５０倍低く、より好適には１００倍低く、そしてより好適には２００倍低い。
【００６１】
Ｋｄは公知の方法によって直接決定することができ、例えば、Ｃａｃｅｃｉ，Ｍ．，ら、Ｂｙｔｅ（１９８４）９：３４０−３６２に記載されているような方法によって、複雑な混合物についてもコンピュータによって計算することができる。しかし、いくつかの低分子オリゴヌクレオチドについては、Ｋｄを直接決定するのは困難で、誤解を招くような高い値になることがある。このような状況下で、標的または候補物質に結合することが知られている物質に対して、標的分子または他の候補物質についての競合結合アッセイ法を行うことができる。５０％阻害が起こる濃度の値（Ｋｉ）は、理想的な条件下ではＫｄに等しい。したがって、代わりにＫｉを決定すれば、Ｋｄの値について最大値を設定したことになる。技術的な難しさからＫｄを正確に測定することが不可能な条件下では、Ｋｉの測定値を、便宜上Ｋｄの上限に代えることができる。また、Ｋｉ値を用いて、モジュレータが核酸リガンドに結合することを確認することができる。
【００６２】
上記したように特異性はＫｄとの関係で定義されているため、本発明のある実施形態において、標的が存在する環境の中で標的と共存する物質および無関係の物質というカテゴリーから、標的に交差免疫反応するほど関係がある物質を排除するのが好ましい。「交差免疫反応性」とは、標準的なアッセイ条件下において標的に対する抗体が候補物質と交差反応することを意味する。一般的に、標準的なアッセイ法において抗体が交差反応するには、標的と比べたとき、交差反応性物質に対する抗体の結合アフィニティーが５倍から１００倍でなければならず、一般的には約１０倍でなければならない。
【００６３】
本発明について、「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味し、相補鎖間または相補塩基対間におけるワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）の水素結合である。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的な核酸塩基である。本明細書において「相補的」とは、２個のヌクレオチド間で正確に対合しうることを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置にあるヌクレオチドが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の同じ位置であるヌクレオチドと水素結合できれば、このオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その位置で互いに対して相補的であると見なされる。各分子中の十分な数の対応位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドで占められているとき、そのオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズしうる」および「相補的」というのは、相補性の程度が十分であること、または、正確に対合してオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的の間で安定的かつ特異的な結合が起こることを示すために使用される用語である。特異的にハイブリダイズしうるためには、化合物の配列が、標的となる核酸の配列に１００％相補的である必要はないと、当技術分野において理解されている。化合物が標的核酸分子に結合して、その標的核酸の正常な機能を阻害して有用性に変化をもたらすとき、その化合物は特異的にハイブリダイズすることができ、また、特異的な結合が望ましい条件下、すなわち、インビボアッセイ法または治療法の場合には生理学的条件下において、インビトロアッセイ法の場合にはアッセイが行われる条件下において、該化合物が非標的配列に非特異的に結合するのを回避するのに十分な程度の相補性がある。
【００６４】
「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」には、一本鎖または二本鎖の形で１個のヌクレオチドよりも多い数のＲＮＡまたはＤＮＡの配列、その混合配列または類似配列を含み、具体的には、特異的に結合するオリゴヌクレオチドを作製するときに中間体となり得るダイマーおよびトリマーなど短い配列を含む。候補物質のプールにおいて使用される「修飾」型は、少なくとも１個の非天然型残基を含む。
【００６５】
「ＲＮＡアナログ」という用語は、２’位にあるヒドロキシル基以外の非水素置換基をもつヌクレオチドを１個以上含むことができ、さらに、例えば、以下のものを一つ以上含むことができるポリマー分子を意味しようとするものである。２’−デオキシ基、２’−ハロ基（２’−フルオロ基など）、２’−アミノ基（好ましくは、非置換型、またはモノ置換型もしくはジ置換型）、２’−モノ−ハロメチル基、ジ−ハロメチル基もしくはトリ−ハロメチル基、２’−Ｏ−アルキル基（２’−Ｏ−メチル基またはＯ−エチル基など）、２’−Ｏ−ハロ−置換型アルキル基、２’−アルキル基、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル基、メチルホスホネート、フルオロセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン、および第６位でイオウ基と、または第５位でハロ基またはＣ１−５アルキル基で置換されたピリミジン塩基、塩基性リンカー、３’−デオキシ−アデノシン、また、その他使用可能な「連鎖停止剤（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」または「非伸長型（ｎｏｎ−ｅｘｔｅｎｄｉｂｌｅ）」アナログ（ＲＮＡの３’末端にある）、または３２Ｐ、３３Ｐなどの標識。以上のものはすべて、本明細書に開示された標準的な合成技術を使用してＲＮＡに取り込ませることができる。
【００６６】
本明細書において、「標的」または「標的分子」は、治療薬の方針や診断アッセイ法の目標となる生体分子を意味し、限定ではないが、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、糖タンパク質、脂質、リン脂質、核酸、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、および細胞表面タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンなどの糖質、糖脂質などの脂質、ならびに一定のオリゴヌクレオチドなどであり、通常は、生化学的経路のスイッチをオンまたはオフに換えたり、それを調節したりすることができる生体分子、または、予測可能な生物学的応答に関わる生体分子である。標的は、トロンビンのように溶液中で遊離していることも可能であり、レセプターやエンベロープタンパク質におけるように細胞やウイルスと結合していることも可能である。核酸リガンドによって特異的に認識されるに十分なサイズをもつ分子を標的として使用することができる。すなわち、膜構造物、レセプター、オルガネラなどを複合体形成標的として使用することができる。
【００６７】
「ＲＮＡアプタマー」は、リボヌクレオシドユニットを含むアプタマーである。「ＲＮＡアプタマー」は、本明細書において既に定義されているＲＮＡアナログも含むものである。
【００６８】
「凝固因子アプタマー」という用語は、凝固因子に結合して、その機能を調節する一本鎖または二本鎖の核酸を意味するものである。「凝固因子」という用語は、内因性および外因性の両方またはどちらかの血液凝固カスケードにおいて作用する因子を意味するものである。
【００６９】
本明細書において、「コンセンサス配列」とは、２個以上の核酸配列の１個以上の領域に存在する塩基配列または領域（連続的なヌクレオチドからなるものでも、そうでないものでもよい）を意味する。コンセンサス配列は３塩基の短さでもよい。また、コンセンサス配列の間に何百もの塩基長からなる塩基配列またはポリマーが散在している、１個以上の非連続配列からなるものでもよい。コンセンサス配列は、各核酸分子種同士を配列比較することのよって特定することができるが、この比較には、コンピュータプログラム、および、配列情報から二次構造および三次構造のモデリングを行うためのツールを補助的に用いることもできる。コンセンサス配列は、通常、少なくとも約３から２０ヌクレオチドを含み、より一般的には６から１０ヌクレオチドを含む。
【００７０】
「心臓血管疾患」とは、当業者によって理解されているような心臓血管の病気を意味するものである。特に想定される心臓血管疾患の非限定的な例には、アテローム性動脈硬化症、血栓形成傾向、塞栓症、心筋梗塞（例、心筋梗塞）、血栓症、狭心症、敗血性ショック、高血圧、高コレステロール血症、再狭窄、および糖尿病などがあるが、これらに制限されない。
【００７１】
「約」という用語は、本明細書において、体重、時間、用量などの数値を言うときには、具体的な量よりも±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、一層好ましくは±０．１％の変動を含むが、このような変動は、開示された方法を実施する上で適切であるからである。
【００７２】
キラル中心をもつ本発明の化合物は、光学活性型およびラセミ型で存在し、単離される。多型を示す化合物もある。本発明は、本発明の化合物のラセミ型、光学活性型、多型もしくは立体異性型、またはそれらの混合型であって、本明細書に記載された有用な特性を有するものを包含する。光学活性型は、例えば、再結晶技術、光学活性型の出発物質からの合成法、キラル合成法、またはキラル固定相を用いたクロマトグラフィー分離法、または酵素分解法によってラセミ型を分解して調製することができる。好適な実施形態において、これらの化合物は天然型で使用される。しかし、代わりに、該化合物を非天然型で使用することもできる。
【００７３】
ＩＩ．核酸リガンド
本明細書において「核酸リガンド」（時には、「アプタマー」と称される）とは、標的に対して所望の作用をもつ非天然型の核酸である。所望の作用には、標的への結合、標的を触媒により変化させること、標的または標的の機能的活性を修飾／変化させるように標的と相互作用すること、自殺インヒビター（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）におけると同様に標的に共有結合すること、または、標的と別の分子との反応を促進させることなどがあるが、これらに限定されない。好適な実施形態において、この作用は、三次元化学構造物である標的分子に対する特異的結合アフィニティーであるが、核酸リガンドは、該標的分子が結合するという既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。本発明の一つの実施形態において、核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法を用いて特定される。核酸リガンドには、核酸の候補混合物から特定される核酸が含まれ、該核酸リガンドは、所定の標的のリガンドであって、ａ）候補混合物を標的に接触させて、候補混合物よりも標的に対するアフィニティーが強い核酸を、残りの候補混合液から分けることができること、ｂ）アフィニティーが強くなった核酸を、残りの候補混合液から分離すること、ｃ）アフィニティーが強くなった核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸混合液を得ることを含む方法によるリガンドである。本明細書において、核酸リガンドまたはアプタマーは、タンパク質またはそれ以外の分子に結合して、タンパク質またはそれ以外の分子の機能を阻害することができる１個および複数の配列を表す。
【００７４】
核酸リガンドは、Ｄ型またはＬ型の立体化学配置をもつヌクレオチド、またはその混合物を用いて作製することもできる。天然のヌクレオシドはＤ型構造である。アプタマーはＬ型ヌクレオチドから作られていて、Ｌ−アプタマーと呼ばれている。治療目的で使用される核酸リガンドは一般的にはＤ型構造であるが、所望の効果をもたらす構造を示すことができる。典型的には、Ｌ型ヌクレオチドを含む核酸リガンドがオリゴヌクレオチドモジュレータの標的である場合には、該モジュレータもＬ型ヌクレオチドを含む（例として米国特許第５，７８０，２１１号参照）。
【００７５】
核酸リガンドは、次の範囲に含まれる長さをもつオリゴヌクレオチドは常法によって簡単に調製できる故に、約１０から１００ヌクレオチドが好ましく、約１５から４０ヌクレオチドが好ましく、約２０から４０ヌクレオチドがより好ましい。一つの実施形態において、アプタマーまたはオリゴヌクレオチドモジュレータは、特異的結合を生じさせるのに必要な長さである、最短で約６ヌクレオチド、好ましくは１０ヌクレオチド、より好ましくは１４または１５ヌクレオチドを含むことができる。本発明の標的／オリゴヌクレオチドの組み合わせの結合特異性についての唯一の明らかな制限は、結合オリゴヌクレオチドにおいて特徴を示すのに十分な配列、および必要な相互作用を得るのに十分な標的物質の結合能力に関するものである。標的が置かれた環境との関連で適切な相互作用を得ることができれば、１０重合体よりも短い、例えば６重合体からなる配列を含むアプタマーの結合領域も可能である。したがって、他の物質による妨害がほとんどなれければ、より低い特異性およびより低い結合強度でよいであろう。
【００７６】
核酸リガンド、およびその製造法と使用については、例えば以下の米国特許に記載されている。以下に挙げる特許および他の特許に記載されている如何なる核酸リガンドも、または、文献に記載されている如何なる核酸リガンドも、医療において使用されている他の所望の核酸同様、本発明により調節または制御することができる。「２’−フルオロピリミジン抗ウシ腸ホスファターゼ核酸リガンド（２’−ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，３８７，６３５号、「無転写ｓｅｌｅｘ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，３８７，６２０号、「８−ニトログアニンの組成物とその使用法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｏｆ  ８−ｎｉｔｒｏｇｕａｎｉｎｅ）」という名称の米国特許第６，３７９，９００号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第６，３７６，４７４号、「精製タンパク質を用いない修正ＳＥＬＥＸ法（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第６，３７６，１９０号、「パラジウム触媒法によるプリンヌクレオシドの修飾と産生される化合物（Ｐｕｒｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ）」という名称の米国特許第６，３５５，７８７号、「ビーズアレイ法を用いた核酸増幅反応の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｅａｄ  ａｒｒａｙｓ）」という名称の米国特許第６，３５５，４３１号、「高親和性リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第６，３４６，６１１号、「肝細胞成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）またはそのレセプターｃ−ｍｅｔに結合する核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｈｉｃｈ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ／ＳＦ）ｏｒ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃ−ｍｅｔ）」という名称の米国特許第６，３４４，３２１号、「核酸リガンドの製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，３４４，３１８号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，３３１，３９８号、「インテグリンに対する核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）」という名称の米国特許第６，３３１，３９４号、「核酸リガンドとの競���による標的結合非核酸分子の決定法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）」という名称の米国特許第６，３２９，１４５号、「核酸結合比色分析物検出装置（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｔｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第６，３０６，５９８号、「有機半導体認識複合体およびシステム（Ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ）」という名称の米国特許第６，３０３，３１６号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第６，３００，０７４号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択法およびｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，２９１，１８４号、「単一分子の検出・特定法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」という名称の米国特許第６，２８７，７６５号、「２’−フルオロピリミジン抗ウシ腸ホスファターゼ核酸リガンド（２’−ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ａｎｔｉ−ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，２８０，９４３号、「レクチンに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第６，２８０，９３２号、「分析物を検出するために結合促進技術（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｅｓ）」という名称の米国特許第６，２６４，８２５号、「核酸リガンド−リガンドビーコン相互作用による標的の均一検出法（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｅａｃｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」という名称の米国特許第６，２６１，７８３号、「切断ｓｅｌｅｘ法（Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｘ  ｍｅｔｈｏｄ）」という名称の米国特許第６，２６１，７７４号、「核酸リガンド診断バイオチップ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ）」という名称の米国特許第６，２４２，２４６号、「テネイシン−Ｃ核酸リガンド（Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，２３２，０７１号、「血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）核酸リガンド複合体（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第６，２２９，００２号、「生体膜におけるＲＮＡチャンネル（ＲＮＡ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）」という名称の米国特許第６，２２５，０６３号、「成長因子に対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第６，２０７，８１６号、「標的分子の有無を判定するための組成物、方法、キットおよび装置（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ，ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第６，２０７，３８８号、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第６，１８４，３６４号、「ＤＮＡポリメラーゼ対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第６，１８３，９６７号、「標的特異的オリゴヌクレオチドリガンドの単離法（Ｍｅｔｈｏｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，１８０，３４８号、「塩基性線維芽細胞増殖因子およびトロンビンの高親和性リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ）」という名称の米国特許第６，１７７，５５７号、「核酸リガンド−リガンドビーコン相互作用による標的の均一検出法（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｅａｃｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」という名称の米国特許第６，１７７，５５５号、「ＣＤ４０リガンドに対する核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ）」という名称の米国特許第６，１７１，７９５号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第６，１６８，７７８号、「補体系タンパク質の高親和性リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という名称の米国特許第６，１４０，４９０号、「組織標的の核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔ）」という名称の米国特許第６，１２７，１１９号、「高親和性ＴＧＦβ核酸リガンド��よびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第６，１２４，４４９号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，１１４，１２０号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，１１０，９００号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：混合ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｂｌｅｎｄｅｄ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，０８３，６９６号、「リガンドの発見法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第６，０８０，５８５号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第６，０５１，６９８号、「平行ＳＥＬＥＸ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第６，０４８，６９８号、「平行ＳＥＬＥＸ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第６，０３０，７７６号、「サイトカインの高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」という名称の米国特許第６，０２８，１８６号、「治療薬、診断薬、および研究試薬のためのオリゴヌクレオチド測定法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）」という名称の米国特許第６，０２２，６９１号、「パラジウム触媒法によるヌクレオシドの修飾（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」という名称の米国特許第６，０２０，４８３号、「ＤＮＡポリメラーゼに結合して阻害する核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第６，０２０，１３０号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，０１３，４４３号、「核酸リガンド複合体（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第６，０１１，０２０号、「レクチンに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第６，００１，９８８号、「対数���濃縮法によるリガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択法およびｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第６，００１，５７７号、「標的分子の有無を判定するための組成物、方法、キットおよび装置（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ，ｋｉｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第６，００１，５７０号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，９９８，１４２号、「核酸リガンド−リガンドビーコン相互作用による標的の均一検出法（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｌｉｇａｎｄ  ｂｅａｃｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」という名称の米国特許第５，９８９，８２３号、「サイトカインの高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」という名称の米国特許第５，９７２，５９９号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，９６２，２１９号、「修飾塩基を含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，９５８，６９１号、「ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第５，８７４，５５７号、「核酸リガンドを使用して、物質の中の標的化合物を検出する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）」という名称の米国特許第５，８７４，２１８号、「アミノアシル−ＲＮＡ合成を促進することが可能なリガンドの製造法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」という名称の米国特許第５，８７１，９２４号、「ＣＤ４リガンドの高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＣＤ４）」という名称の米国特許第５，８６９，６４１号、「対数的濃縮法によるリガ��ドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，８６４，０２６号、「フローセルＳＥＬＥＸ法（Ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，８６１，２５４号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第５，８５９，２２８号、「平行ＳＥＬＥＸ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ＳＥＬＥＸ）」」という名称の米国特許第５，８５８，６６０号、「フローサイトメトリーにおける核酸リガンドの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」という名称の米国特許第５，８５３，９８４号、「絨毛膜性成長ホルモンおよびそれに関連する糖タンパク質ホルモンに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｒｏｐｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」という名称の米国特許第５，８４９，８９０号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）」という名称の米国特許第５，８４９，４７９号、「高親和性ＨＫＧＦ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＫＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，８４６，７１３号、「核酸リガンドを使用して、試料中に標的分子を検出する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）」という名称の米国特許第５，８４３，６５３号、「高親和性ＨＫＧＦ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＫＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，８３７，８３４号、「絨毛膜性成長ホルモンおよびそれに関連する糖タンパク質ホルモンに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｒｏｐｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」という名称の米国特許第５，８３７，４５６号、「ｍＲＮＡの調節因子をあるいは切断する遷移金属錯体の特定法およびその用途（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｌｅａｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」という名称の米国特許第５，８３４，１９９号、「核酸リガンドを製造する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，８１７，７８５号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）」という名称の米国特許第５，８１１，５３３号、「ＩＣＰ４の高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＩＣＰ４）」という名称の米国特許第５，７９５，７２１号、「酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ法（ＥＬＯＮＡ）（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓｓａｙｓ（ＥＬＯＮＡ）」という名称の米国特許第５，７８９，１６３号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７８９，１６０号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７８９，１５７号、「ＨＩＶ−１逆転写酵素の高親和性ｓｓＤＮＡリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｓＤＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」という名称の米国特許第５，７８６，４６２号、「レクチンに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第５，７８０，２２８号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：キメラｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７７３，５９８号、「セレクチンに対する高親和性核酸リガンドの特定法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第５，７６６，８５３号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７６３，５９５号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７６３，５６６号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：核酸リガンドの光選択法およびｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７６３，１７７号、「ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第５，７６３，１７３号、「高親和性ＨＩＶインテグラーゼインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，７５６，２８７号、「組織標的の核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔ）」という名称の米国特許第５，７５０，３４２号、「ヒト好中球エラスターゼの核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ）」という名称の米国特許第５，７３４，０３４号、「高親和性ＴＧＦβ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，７３１，４２４号、「高親和性ＴＧＦβ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７３１，１４４号、「高親和性ＨＩＶ−１  ｇａｇ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７２６，０１７号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７２３，５９４号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７２３，５９２号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７２３，２８９号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７１２，３７５号、「構造に基づいて核酸を選択する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」という名称の米国特許第５，７０７，７９６号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７０５，３３７号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６９６，２４９号、「ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ��ＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第５，６９３，５０２号、「組織標的の核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔ）」という名称の米国特許第５，６８８，９３５号、「免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ（ＩｇＥ））」という名称の米国特許第５，６８６，５９２号、「治療薬、診断薬、および研究試薬のためのオリゴヌクレオチド測定法（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）」という名称の米国特許第５，６８６，２４２号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：混合ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，６８３，８６７号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６７４，６８５号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６７０，６３７号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６６８，２６４号、「ＲＮＡタンパク質結合部位をもつリボザイム（Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」という名称の米国特許第５，６６３，０６４号、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，６６０，９８５号、「高親和性ＨＩＶヌクレオカプシド核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６５４，１５１号、「分光学的に検出可能な核酸リガンドを使用する標的検出法（Ｔａｒｇｅｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６５０，２７５号、「タキキニンサブスタンスＰに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）」という名称の米国特許第５，６４８，２１４号、「分光学的に検出可能な核酸リガンド（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６４１，６２９号、「塩基性線維芽細胞増殖因子の高親和性ＲＮＡリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ���ＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」という名称の米国特許第５，６３９，８６８号、「タキキニンサブスタンスＰに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）」という名称の米国特許第５，６３７，６８２号、「ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質のリガンド（Ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ＴＡＴ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，６３７，４６１号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：キメラｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，６３７，４５９号、「高親和性ＨＩＶヌクレオカプシド核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６３５，６１５号、「免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ（ＩｇＥ））」という名称の米国特許第５，６２９，１５５号、「分泌型ホスホリパーゼＡ２に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２（ｓＰＬＡｓｕｂ．２））」という名称の米国特許第５，６２２，８２８号、「核酸リガンドの製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，５９５，８７７号、「ＨＩＶインテグラーゼに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）」という名称の米国特許第５，５８７，４６８号、「テオフィリンとカフェインを区別する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｆｆｅｉｎｅ）」という名称の米国特許第５，５８０，７３７号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，５６７，５８８号、「トロンビンのＤＮＡリガンド（ＤＮＡ  Ｉｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ）」という名称の米国特許第５，５４３，２９３号、「ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質のリガンド（Ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，５２７，８９４号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，４７５，０９６号、「化合物ライブラリーにおける活性���化合物の測定および特定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）」という名称の米国特許第５，８６６，３３４号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，８６４，０２６号、「フローセルＳＥＬＥＸ法（Ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，８６１，２５４号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」という名称の米国特許第５，８５９，２２８号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，８５８，６６０号、「フローサイトメトリーにおける核酸リガンドの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｎ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」という名称の米国特許第５，８５３，９８４号、「絨毛膜性成長ホルモンおよびそれに関連する糖タンパク質ホルモンに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｒｏｐｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」という名称の米国特許第５，８４９，８９０号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｃｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）」という名称の米国特許第５，８４９，４７９号、「高親和性ＨＫＧＦ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＫＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，８４６，７１３号、「核酸配列の共通二次構造を決定するための方法および装置（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」という名称の米国特許第５，８４３，７３２号、「核酸リガンドを用いて試料中の標的を検出する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ａ  ｓａｍｐｌｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ）」という名称の米国特許第５，８４３，６５３号、「生体分子特異的アプタマーアナログ（Ａｐｔａｍｅｒ  ａｎａｌｏｇｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第５，８４０，８６７号、「造血幹細胞の表現形質による特徴づけ（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」という名称の米国特許第５，８４０，５８０号、「Ｂａｘインヒビタータンパク質（Ｂａｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」という名称の米国特許第５，８３７，８３８号、「高親和性ＨＫＧＦ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＫＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，８３７，８３４号、「絨毛膜性成長ホルモンおよびそれに関連する糖タンパク質ホルモンに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｒｏｐｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」という名称の米国特許第５，８３７，４５６号、「ｍＲＮＡの調節因子をあるいは切断する遷移金属錯体の特定法およびその用途（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｌｅａｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」という名称の米国特許第５，８３４，１９９号、「ＲＮＡ結合ペプチドのインビボ選抜法（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，８３４，１８４号、「核酸リガンドの製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，８１７，７８５号、「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｃｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ））という名称の米国特許第５，８１１，５３３号、「標的生体分子を特定するための核磁気共鳴の利用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第５，８０４，３９０号、「ＩＣＰ４の高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＩＣＰ４）」という名称の米国特許第５，７９５，７２１号、「酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ法（ＥＬＯＮＡ）（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓｓａｙｓ（ＥＬＯＮＡ）」という名称の米国特許第５，７８９，１６３号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７８９，１６０号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７８９，１５７号、「ＨＩＶ−１逆転写酵素の高親和性ｓｓＤＮＡリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｓＤＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ��１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」という名称の米国特許第５，７８６，４６２号、「コルチコトロピン放出因子２をコードする単離核酸（Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｕｂ．２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，７８６，２０３号、「ＨＩＶ  ＲＲＥのＲＥＶタンパク質に対する結合に関するオリゴヌクレオチド競合物、およびこの結合のインヒビターをスクリーニングするためのアッセイ法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＨＩＶ  ＲＲＥ  ｔｏ  ＲＥＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」という名称の米国特許第５，７８６，１４５号、「形質転換効率を上昇または低下させる方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」という名称の米国特許第５，７８３，５６６号、「新しい塩基対合法を使用することによる非特異的ハイブリダイゼーションの抑制（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅｓ）」という名称の米国特許第５，７８０，６１０号、「レクチンに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第５，７８０，２２８号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：キメラｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７７３，５９８号、「溶液中で制約された二次立体構造を有する可溶性ペプチド、およびそれを製造する方法（Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ，ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ｓａｍｅ）」という名称の米国特許第５，７７０，４３４号、「セレクチンに対する高親和性核酸リガンドの特定法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）」という名称の米国特許第５，７６６，８５３号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７６３，５９５号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７６３，５６６号、「対数的濃縮法によるリガンドの系��的進化：核酸リガンドの光選択法およびｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７６３，１７７号、「ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第５，７６３，１７３号、「二分子性薬剤または多分子性薬剤のヌクレオチド特異的集合および装置（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｃｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅ）」という名称の米国特許第５，７５６，２９６号、「生体分子特異的アプタマーおよび製造法（Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ）」という名称の米国特許第５，７５６，２９１号、「高親和性ＨＩＶインテグラーゼインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，７５６，２８７号、「組織標的の核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔ）」という名称の米国特許第５，７５０，３４２号、「二分子性薬剤または多分子性薬剤のヌクレオチド特異的集合および装置（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ）」という名称の米国特許第５，７３９，３０５号、「ヒト好中球エラスターゼの核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓｅ）」という名称の米国特許第５，７３４，０３４号、「原発性アドハリノパシーを検出する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｉｒｍａｒｙ  ａｄｈａｌｉｎｏｐａｔｈｙ）」という名称の米国特許第５，７３３，７３２号、「高親和性ＴＧＦβ核酸リガンドおよびインヒビター（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，７３１，４２４号、「高親和性ＴＧＦβリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＴＧＦβ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７３１，１４４号、「高親和性ＨＩＶ−１  ｇａｇ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ−１  ｇａｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７２６，０１７号、「ＤＮＡ結合分子を検出するためのスクリーニングアッセイ法（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第５，７２６，０１４号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ��ｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，７２３，５９４号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７２３，５９２号、「平行ｓｅｌｅｘ法（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７２３，２８９号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：組織ｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，７１２，３７５号、「構造に基づいて核酸を選択する方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」という名称の米国特許第５，７０７，７９６号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ケミ−ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，７０５，３３７号、「１８Ｋｄ  ＣＤＫ６阻害タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  １８Ｋｄ  ＣＤＫ６  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，６９８，４４２号、「ヘテロ重合体レセプターの表面発現ライブラリー（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」という名称の米国特許第５，６９８，４２６号、「標的生体分子を特定するための核磁気共鳴の利用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」という名称の米国特許第５，６９８，４０１号、「ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドインヒビター（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ）」という名称の米国特許第５，６９３，５０２号、「組織標的の核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔａｒｇｅｔ）」という名称の米国特許第５，６８８，９３５号、「自己修飾ＲＮＡ分子およびその製造法（Ｓｅｌｆ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ）」という名称の米国特許第５，６８８，６７０号、「免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ（ＩｇＥ））」という名称の米国特許第５，６８６，５９２号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：混合ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，６８３，８６７号、「新しい塩基対合法を使用することによる非特異的ハイブリダイゼーションの抑制（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅｓ）」という名称の米国特許第５，６８ｌ，７０２号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６７４，６８５号、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６７０，６３７号、「トロンビンに結合する二方向性オリゴヌクレオチド（Ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ）」という名称の米国特許第５，６６８，２６５号、「高親和性ＰＤＧＦ核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤＧＦ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６６８，２６４号、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，６６０，９８５号、「血管平滑筋組織を標的とする脂質構築物（Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ）」という名称の米国特許第５，６６０，８５５号、「トロンビンに結合する二方向性オリゴヌクレオチド（Ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ）」という名称の米国特許第５，６５８，７３８号、「二分子性薬剤または多分子性薬剤のヌクレオチド特異的集合および装置（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ）」という名称の米国特許第５，６５６，７３９号、「遺伝子ライブラリーを作製するための方法と材料（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」という名称の米国特許第５，６５６，４６７号、「高親和性ＨＩＶヌクレオカプシド核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６５４，１５１号、「分光学的に検出可能な核酸リガンドを使用する標的検出法（Ｔａｒｇｅｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６５０，２７５号、「タキキニンサブスタンスＰに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）」という名称の米国特許第５，６４８，２１４号、「分光学的に検出可能な核酸リガンド（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６４１，６２９号、「塩基性��維芽細胞増殖因子の高親和性ＲＮＡリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」という名称の米国特許第５，６３９，８６８号、「完全に自動化された核酸増幅、核酸アッセイおよび免疫アッセイのための方法および装置（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｎｕｃｌｅｌｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」という名称の米国特許第５，６３９，４２８号、「タキキニンサブスタンスＰに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ）」という名称の米国特許第５，６３７，６８２号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：キメラｓｅｌｅｘ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｌｅｘ）」という名称の米国特許第５，６３７，４５９号、「高親和性ＨＩＶヌクレオカプシド核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＨＩＶ  Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ）」という名称の米国特許第５，６３５，６１５号、「１８ＫＤ  ＣＤＫ６阻害タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  １８ＫＤ  ＣＤＫ６  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，６３１，１５６号、「アデノシンまたはアデノシン−５’−リン酸に結合するＤＮＡアプタマーおよび触媒、ならびにその単離法（ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｏｒ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」という名称の米国特許第５，６３１，１４６号、「１８ＫＤ  ＣＤＫ６阻害タンパク質をコードするＤＮＡ、およびそれに対する抗体（ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  １８ＫＤ  ＣＤＫ６  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈｅｒｅｔｏ）」という名称の米国特許第５，６２９，４０７号、「免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｅ（ＩｇＥ））」という名称の米国特許第５，６２９，１５５号、「分泌型ホスホリパーゼＡ２に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２（ｓＰＬＡｓｕｂ．２））」という名称の米国特許第５，６２２，８２８号、「１８ＫＤ  ＣＤＫ６阻害タンパク質をコードするＤＮＡ（ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  １８ＫＤ  ＣＤＫ６  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，６２１，０８２号、「オリゴヌクレオチドによるイン���ーフェロン−ガンマの阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−．ｇａｍｍａ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の米国特許第５，５９９，９１７号、「シアニン色素オリゴヌクレオチド会合体（Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｙａｎｉｎｅ  ｄｙｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」という名称の米国特許第５，５９７，６９６号、「ＨＩＶインテグラーゼに対する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）」という名称の米国特許第５，５８７，４６８号、「ｃ−ｍｅｒ原癌遺伝子をコードする単離ＤＮＡ（Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃ−ｍｅｒ  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）」という名称の米国特許第５，５８５，２６９号、「テオフィリンとカフェインを区別する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｃａｆｆｅｉｎｅ）」という名称の米国特許第５，５８０，７３７号、「対数的濃縮法によるリガンドの系統的進化：ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ）」という名称の米国特許第５，５６７，５８８号、「寄生生物感染症の診断法および寄生生物の薬剤感受性を試験する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ）」という名称の米国特許第５，５６５，３２７号、「ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質のリガンド（Ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という名称の米国特許第５，５２７，８９４号、「長鎖ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応を行うために方法および試薬（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ＤＮＡｅｑｕｅｎｃｅｓ）」という名称の米国特許第５，５１２，４６２号、「ＨＩＶ−１逆転写酵素の高親和性ＤＮＡリガンドの特定法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｉｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」という名称の米国特許第５，５０３，９７８号、「ヒト好中球エラスターゼの核酸リガンドを特定する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｅｌａｓｔａｓ）」という名称の米国特許第５，４７２，８４１号、「塩基性線維芽細胞増殖因子の高親和性ＲＮＡリガンド（Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）」という名称の米国特許第５，４５９，０１５号。
【００７７】
ＩＩＩ．モジュレータのタイプ
本発明のモジュレータ（すなわちレギュレータ）は、核酸リガンドに結合して、そのリガンドとその標的分子との相互作用を望むように（例えば、アプタマーの構造を変えることによって）変更することができる医薬適合性の薬剤、または、核酸リガンドを分解、代謝、切断、さもなければ化学的に変化させて、その生物学的作用を変更する薬剤を含む。モジュレータの例としては、（Ａ）アプタマー配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドまたはそのアナログ（リボザイム、またはＤＮＡ酵素、または、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、モフォリノ核酸（ＭＮＡ）、またはロックド核酸（ＬＮＡ）など）、（Ｂ）核酸結合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（核酸結合トリペプチド（一般的には、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１２９９７（１９９９）参照）、（Ｃ）オリゴサッカライド（例えば、アミノグリコシド（一般的には、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）刊、Ｇｅｓｔｌａａｄ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ編Ｄａｖｉｓ  ら、ＲＮＡワールド（ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ）、第８章第１８５頁参照））、（Ｄ）低分子、および（Ｅ）キメラ、融合タンパク質、または上記いずれかを組み合わせたものなどがある。Ｗｅｒｓｔｕｃｋら、Ｓｃｉｅｎｄｅ  ２８２：２９６（１９９８）、米国特許第５，９３５，７７６号および第５，５３４，４０８号。（また、本発明により使用することができるモジュレータのタイプを開示している以下を参照：Ｃｈａｓｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：１０３（１９８６）、Ｅｉｃｈｏｍら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，９０：７３２３（１９６８）、Ｄａｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４：２４４７（１９７５）、およびＬｉｐｐａｒｄら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ，１１：２１１（１９７８））。
【００７８】
本発明の代替的な実施形態において、モジュレータそのものがアプタマーである。この実施形態においては、所望の治療標的に結合する核酸リガンドを最初に作製する。次の工程で、本明細書に記載されているＳＥＬＥＸ法または別法を用いて、第一のアプタマーに結合する第二のアプタマーを作製し、治療用アプタマーと標的との相互作用を調節する。
【００７９】
別の代替的な実施形態において、標的に結合する核酸リガンドはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＣＯであり、モジュレータがアプタマーである。または、標的に結合する核酸リガンドはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＣＯであり、モジュレータがＬＮＡである。あるいは、標的に結合する核酸リガンドはＰＮＡ、ＭＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＣＯであり、モジュレータがＰＣＯである。
【００８０】
オリゴヌクレオチドまたはそのアナログ
１．ポリ核酸
好適な実施形態において、本発明のモジュレータは、標的となる核酸リガンドの配列の少なくとも一部に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、モジュレータオリゴヌクレオチドは、標的となる核酸リガンドの６から２５ヌクレオチド、一般的には８から２０ヌクレオチド、より一般的には１０から１５ヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。有利には、モジュレータオリゴヌクレオチドは、核酸リガンドの連続した６から２５ヌクレオチド、または連続した８から２０または１０から１５ヌクレオチドに相補的である。モジュレータオリゴヌクレオチドの長さは、標的となる核酸リガンドと求められている効果とを考慮して容易に最適化することができる。代表的には、モジュレータオリゴヌクレオチドは５から８０ヌクレオチドの長さであり、より代表的には１０から３０、もっとも代表的には、１５から２０ヌクレオチドである（例えば１５から１７）。オリゴヌクレオチドは、Ｄ型またはＬ型の立体化学構造をもつヌクレオチド、またはその混合物によって作製することができる。天然のヌクレオシドはＤ構造をとる。
【００８１】
短いオリゴヌクレオチド相補対の結合による二重鎖の形成は、通常１×１０６から３×１０５Ｍ１ｓ１の二次会合速度定数をもつ非常に速い反応である。この結合反応の初期には、「核形成」と呼ばれる２個または３個の塩基対二重鎖の形成が含まれる。核形成の後、２０℃で１秒間当たり約１０６塩基という非常に速い速度で相補配列の全長にわたって対合が進む。したがって、相補的なオリゴヌクレオチドを用いた二重鎖形成による核酸リガンドに対する調節作用は迅速である。短い二重鎖の安定性は、二重鎖の長さと塩基組成に大きく依存する。短鎖核酸二本鎖を形成するための熱力学的パラメータが厳密に測定されており、その結果、すべての可能な塩基対について、自由エネルギーＴｍの正確な予測、および、従って所与のオリゴヌクレオチド二本鎖の半減期の計算が可能となる最近傍則が成り立った（例えば、Ｘｉａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：１４７１９（１９９８）（また、Ｅｇｕｃｈｉら、Ａｎｔｉｇｅｎｓｉｓ  ＲＮＡ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６３１（１９９１）も参照）。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータは、核酸リガンドの一本鎖領域に対し有利に標的される。これにより核形成が促進され、それによって、核酸リガンド活性の調節が促進され、さらに、一般に、標的核酸リガンドよりも多くの塩基対を含む分子間二本鎖が生じる。
【００８３】
さまざまな方策を用いて、オリゴヌクレオチドが標的核酸リガンドに結合するのに最適な部位を決定することができる。相補的オリゴヌクレオチドがアプタマーの周辺を「歩く」という経験的な方法を用いることができる。歩行実験は、連続して実施される２つの実験を含む。候補混合物の各物質が対象となるオリゴヌクレオチドモジュレータに相当する固定した核酸領域を有する、新しい候補混合物を製造することができる。また、候補混合物の各物質は無作為化された配列領域をも含む。この方法によって、核酸リガンドの１個以上の結合ドメインに結合することができる領域を含む、「伸長した」核酸リガンドと称されるものが何であるかを特定することが可能になる。この方法に従って、アプタマー上の約５ヌクレオチドずつねじれている（例えば、アプタマー９．３ｔの１〜１５、６〜２０、１１〜２５など）、長さ約１５ヌクレオチドの２’−メチルオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を使用することができる。経験的な方法が特に有効である。なぜなら、ハイブリダイゼーションの効率に対するアプタマーの三次構造の影響を予測することは困難だからである。次の実施例に記載されているアッセイ法を用いて、核酸リガンドの完全な結合を達成するために必要とされるオリゴヌクレオチドのモル過剰を特に重点を置きつつ、さまざまなオリゴヌクレオチドが特異的な核酸リガンドにハイブリダイズする能力を測定することができる。さまざまなオリゴヌクレオチドモジュレータが、その標的分子から核酸リガンドを解離させるか、または標的分子に核酸リガンドを結合させることができるかも、例えばビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）アッセイ法を用いた標準的な動力学的実験を行うことによって決定することができる。５倍から５０倍以下のモル過剰のオリゴヌクレオチドが、核酸リガンドとその標的分子の相互作用を所望の形に変更するのに必要となるようなオリゴヌクレオチドモジュレータを選択することができる。
【００８４】
あるいは、標的ヌクレオチドリガンドを改変して、オリゴヌクレオチドモジュレータとの会合を促進するために一本鎖末端部（３’または５’）を含むようにすることができる。適切な末端部は、１から２０ヌクレオチド、好ましくは１から１０ヌクレオチド、より好ましくは１から５ヌクレオチド、もっとも好ましくは３から５ヌクレオチドを含むことができる（例えば、２’−Ｏ−メチル配列などの修飾ヌクレオチド）。末端部をもつ核酸リガンドを結合およびバイオアッセイ法で（例えば、次の実施例に記載されたように）テストして、一本鎖末端部の付加によって核酸リガンドの活性構造が破壊されないことを確認することができる。例えば、末端部配列と１個、３個または５個の塩基対を形成することができる一連のオリゴヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド）を設計し、末端部をもつアプタマーだけと会合できるか、また、核酸リガンドをその標的分子から解離させるか、またはアプタマーをその標的分子に結合させることができるかもテストすることができる。この効果が二本鎖形成によるものであって非特異的な効果でないことを確認するためにスクランブル配列の対照を用いることができる。次の実施例に記載された未変性ゲルアッセイ法を用いて、標的アプタマーからの／とのオリゴヌクレオチドモジュレータの解離／会合速度を測定することができる。
【００８５】
例示的な実施例において、本発明は、血液凝固経路の成分、特に、組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）／第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、第Ｖａ因子（ＦＶａ）／第Ｘａ因子（ＦＸａ）などの酵素複合体、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｇｐＩｂＩＸ、ｇｐＶＩ、Ｇａｓ６など血小板の活性化促進に関与する因子、ＰＡＩ−Ｉ（プラスミノゲン活性化因子インヒビター１）または凝固因子ＸＩＩＩａ（ＦＸＩＩＩａ）などフィブリン血餅形成の促進または維持に関与する因子、ＡＴＩＩＩ（抗トロンビンＩＩＩ）、トロンビン、または凝固因子ＸＩａ（ＦＸＩａ）などフィブリン血餅形成の促進または防止に関与する付加的因子の核酸リガンドアンタゴニストを標的とする核酸リガンドの抗凝固作用及び抗血栓作用を特異的かつ迅速に逆転するモジュレータを提供する。この実施形態にしたがい、核酸リガンド活性を逆転するモジュレータ（この場合、インヒビター、有利にはオリゴヌクレオチドインヒビター）を投与する。
【００８６】
特異的実施形態において、本発明の核酸リガンド活性モジュレータは以下の配列などからなるグループから選択される核酸である。
【００８７】
【化３】
2005502596.tif 000004
または、ハイブリダイゼーションが維持されるか、または場合によって、配列に少なくとも９５％相同である、配列の改変配列または派生配列。
【００８８】
例えば、本発明の第ＩＸａ因子に対する核酸リガンドのインヒビターはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボで核酸リガンドとハイブリダイズして、第ＩＸａ因子への核酸リガンドの結合を阻害する。
【００８９】
本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータは、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性は必要でない。本明細書において「核酸リガンドの少なくとも一部に相補的な」配列とは、核酸リガンドにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の長さによって決まる。一般的には、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが長くなるほど、標的となる核酸リガンドとの塩基ミスマッチをより多く含むことができ、なお安定した二本鎖（場合によっては三本鎖）を形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解温度を測定するための標準的な方法を利用してミスマッチの許容程度を確認することができる。特異的な局面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも５または少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５または１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはそれらのキメラ混合物または誘導体または改変体であり得る。
【００９０】
アンチセンス技術については、例えばＯｋａｎｏ，Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｉｎ．５６：５６０（１９９１）；フロリダ州ボーカラートン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）にあるＣＲＣプレス社（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）刊（１９８８）「遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」で検討されている。この方法は、ポリヌクレオチドの相補ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンを改変して、例えば、分子の安定性やハイブリダイゼーションを改善することができる。このためには、オリゴヌクレオチドを、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション開始架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション開始切断剤など別の分子に結合させることができる。オリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２α−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−イネチルチオ−Ｎ＆イソペンテニルアデニン、ウラシルオキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチルチオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシルオキシ酢酸（Ｖ）、５−メチルチオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎカルボキシプロピル）、および２，６−ジアミノプリンなどを含むグループから選択される、少なくとも１個の修飾塩基部分を含み得る。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソースなどからなるグループから選択される少なくとも１個修飾糖部分も含み得る。
【００９３】
さらに別の実施形態において、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホジエステル、およびホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、またはそれらのアナログなどを含むグループから選択される少なくとも１個修飾リン酸バックボーン部分を含み得る。
【００９４】
インビボでの安定性の増進および／または輸送特性など、所望の特徴を有するオリゴヌクレオチドモジュレータを調製することができる。このような修飾の例としては、糖部分および／またはバックボーン部分および／または塩基部分における化学置換などがある。オリゴヌクレオチドモジュレータは、ピリミジンの５−および２’位で修飾されたヌクレオチド誘導体を含むことができ、例えば、ヌクレオチドは、２’アミノ基、２’−フルオロ基、および／または２’−Ｏ−メチル基で修飾することができる。本発明の調節オリゴヌクレオチドの修飾は、付加的な電荷、極性、疎水性、水素結合、および／または静電相互作用を取り込む別の化学基を提供する修飾などである。このような修飾には限定ではないが、２’位の糖修飾、ロックド核酸、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換、バックボーン修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジン、およびイソグアニンなど異常塩基対合などがある。また、修飾には、キャッピングなど、３’および５’の修飾がある。（また、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４８９：１１７（１９９９）；Ｈｅｒｄｅｗｉｊａ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０：２９７（２０００）；Ｍａｉｅｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：１８１９（２０００）も参照。）
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の常法によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置（バイオサーチ、アプライドバイオシステムズなどから市販されている）を利用して合成することができる。
【００９５】
本明細書に記載されている指示を用いて、当業者は本発明を容易に実施して、治療用リガンドの活性を停止させるか変更させる相補鎖核酸を適時投与することによって治療用リガンドを制御することができる。この技術は、例えば、上記引用特許文献で記載または言及されている核酸リガンドの何れかと一緒に使用することができる。
【００９６】
２．リボザイムとＤＮＡ酵素
同様に、本明細書に記載されている指示を用いて、当業者は本発明を容易に実施し、治療用リガンドの活性を停止させるか変更させるリボザイムまたはＤＮＡ酵素を適時投与することによって治療用リガンドを制御することができる。
【００９７】
酵素性核酸は、まず標的ＲＮＡ（またはＤＮＡ、Ｃｅｃｈ米国特許第５，１８０，８１８号参照）に結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するために作用する分子の酵素部位の極めて近傍に置かれた酵素性核酸の標的結合部位を介して生じる。したがって、酵素性核酸は、相補的塩基対合を介して標的ＲＮＡを認識してからそれに結合し、いったん正しい位置に結合すると酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの切断によって、コードされているタンパク質の合成を指示する能力が破壊される。酵素性核酸は、ＲＮＡ標的に結合して、それを切断すると、そのＲＮＡから遊離して別の標的を捜し、何度でも新しい標的との結合・切断を行い、それによってＲＮＡアプタマーの不活性化が可能になる。各々異なった特異性を示すリボザイムが少なくとも５種類ある。例えば、グループＩイントロンは、大きさ約３００から１０００よりも長いヌクレオチドであり、標的配列の切断部位の直近５’側にＵを必要とし、切断部位の５’側にある４から６ヌクレオチドに結合する。この種類のリボザイムで既知のものは７５を超え、テトラヒメナ・テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ｒＲＮＡ、真菌類のミトコンドリア、クロロプラスト、Ｔ４ファージ、藍藻類などに見られる。
【００９８】
別の種類としてはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（Ｍ１  ＲＮＡ）があり、大きさ約２９０から４００ヌクレオチドである。これらは、リボヌクレオタンパク質のＲＮＡ部位であり、ｔＲＮＡ前駆体を切断して成熟ｔＲＮＡを形成させる。このグループにはほぼ１０種類のリボザイムがあり、すべて細菌に由来する。第三の例はハンマーヘッドリボザイムであり、大きさが約３０から４０ヌクレオチドである。これらは、切断部位の直近５’側に標的配列ＵＨを必要とし、切断部位の両側にある異なる数のヌクレオチドに結合する。この種類には少なくとも１４の既知のリボザイムがあり、ＲＮＡを感染因子として利用するいくつかの植物病原体（ウイルソイド）に見られる。四番目の種類はヘアピンリボザイムで、大きさ約５０ヌクレオチドである。これらは、切断部位の直近３’側に標的配列ＧＵＣを必要とし、切断部位の５’側にある４ヌクレオチドと切断部位の３’側にある異なる数に結合する。これは、ＲＮＡを感染因子として利用する１種類の植物病原体（タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ）に見られる。第五のグループは肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムであり、大きさ約６０ヌクレオチドである。
【００９９】
治療効果をもたらすのに必要な有効リボザイム濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いことがあるため、一定の応用場面においてリボザイムの酵素的性質は、アンチセンス技術など他の技術よりも有益である。この利点は、リボザイムが酵素的に作用しうることを反映している。すなわち、単一のリボザイム分子で多くの標的ＲＮＡアプタマーを切断できるのである。さらに、リボザイムは、結合の塩基対合メカニズムだけでなく、それが結合するＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存する阻害特異性をもつ、高度に特異的なインヒビターである。すなわち、阻害はＲＮＡ標的の切断によって起こるため、特異性は、非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の割合として定義される。この切断メカニズムは、塩基対合に関与する因子の付加的因子に依存する。したがって、一定の条件下におけるリボザイム作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも大きいかもしれない。
【０１００】
触媒分子の別の種類は「ＤＮＡ酵素（ＤＮＡｚｙｍｅ）」と呼ばれている。ＤＮＡ酵素は一本鎖で、ＲＮＡとＤＮＡを切断する。ＤＮＡ酵素に関する一般的なモデルが提唱されており、「１０−２３」モデルとして知られている。「１０−２３」モデルに従ったＤＮＡ酵素は、単に「１０−２３ＤＮＡ酵素」とも呼ばれるが、１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインと、それに隣接したそれぞれ７個から９個のデオキシリボヌクレオチドからなる２つの基質認識ドメインをもつ。インビトロ解析は、このタイプのＤＮＡ酵素が、生理学的条件下でプリン：ピリミジン結合部位にある基質ＲＮＡを効果的に切断できることを示している。本明細書において「ＤＮＡ酵素」とは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、他とは異なる標的核酸配列を特異的に認識して切断するＤＮＡ分子を意味する。
【０１０１】
リボザイムおよびＤＮＡ酵素は、基質結合ドメインと触媒ドメインを含む。調節リボザイムを最適に設計するための法則が、Ｐｈｉｌｉｐ  Ｃ．Ｔｕｒｎｅｒ編（ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）にあるヒュマナプレス社（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ））、分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）第７４巻「リボザイムプロトコール（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」に記載されている。この書物には、標的核酸の内部にあるリボザイム反応部位を特定する方法も記載されている。これらの標準的法則を用いて、標的核酸リガンドに結合して切断するようにハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎デルタウイルスリボザイム、およびグループＩイントロン由来のリボザイムを具体的に改造することができる。このようなリボザイムまたはＤＮＡ酵素が標的核酸リガンドを切断できることを、いくつかのアッセイ法で決定することができる。例えば、リボザイムまたはＤＮＡ酵素を、反応に有利な条件下で非標識または標識した（例えば、３２Ｐ）標的核酸リガンドとインキュベートした後、標的核酸を変性ゲル電気泳動によって分析し、リボザイムまたはＤＮＡ酵素が標的核酸リガンドのバックボーンを切断したかどうか判定することができる。あるいは、蛍光共鳴エネルギー転移、または蛍光強度の変化を用いて、適切に標識した核酸リガンドの切断を測定することができる。
【０１０２】
３．ポリ核酸アナログ（ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ核酸（ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ））、およびシュードサイクリック（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ）オリゴヌクレオチド（ＰＣＯ）
本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータの核酸塩基は、例えばペプチド結合（ペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合；Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７および米国特許第５，５３９，０８２号）およびモルフォリノ結合（Ｑｉｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０，１１（２０００）；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７，１８７（１９９７）；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．７，６３（１９９７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，１７４４５（１９９６）；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．６，１６９（１９９６））、またはその他天然のまたは修飾された結合などの核酸塩基間結合によって連結することができる。また、オリゴ核酸塩基はロックド核酸（ＬＮＡ）でもよい。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  １７，１７５（１９９９）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ  Ｍｏｔ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １３，４４（２０００）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １１，２２８（２０００）。
【０１０３】
ＰＮＡは、オリゴヌクレオチドに類似した化合物であるが、構成が異なっている。ＰＮＡでは、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格がペプチド骨格に置き換わっている。ペプチド骨格の各サブユニットは、天然または非天然の核酸塩基に結合している。ＰＮＡは、しばしば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなるアキラルなポリアミド骨格を有する。プリンまたはピリミジン塩基がメチレンカルボニルリンカー（１−３）を介して各ユニットに結合していて、相補核酸を標的とする。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対ルールに従って、平行または逆平行の方向に相補鎖ＲＮＡまたはＤＮＡと結合する。ＰＮＡオリゴマーの非荷電性は、天然のホモ二本鎖に比べ、ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）ハイブリッド二本鎖の安定性を増強する。ＰＮＡの非天然性の特性のため、ＰＮＡオリゴマーはプロテアーゼおよびヌクレアーゼによる攻撃に対して高度に抵抗性となっている。これらＰＮＡオリゴマーの性質によって、ＰＮＡオリゴマーは、核酸リガンド活性の有効なアンチセンスまたはモジュレータとして役立つ。実際、ペプチド核酸は、転写および翻訳レベルにおけるタンパク質発現を阻害するために利用されており、微量注入されたＰＮＡオリゴマーは、元の細胞において強いアンチセンス作用を示す。ＰＮＡアンチセンス応用に関する最近の成果の詳細、特に、全細胞または組織でのＰＮＡの輸送については、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／１９９９／ｖ４／ｄ／ｓｏｏｍｅｔｓ／ｆｕｌｌｔｅｘｔ．ｈｔｍ；およびＦｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４，４７８２−７８６（１９９９年１１月１日）参照。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｅｇｈｏｌｍ．Ｍ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．＆  Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．（１９９３）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）。ポリアミンの骨格を有するＤＮＡアナログ（ＤＮＡ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）「アンチセンスの研究と応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｃｒｏｏｋ，Ｓ．＆  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ボーカラートン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ）にあるＣＲＣプレス社（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）刊、第３６３〜３７３頁も参照のこと。
【０１０４】
ＰＮＡはＤＮＡにもＲＮＡにも結合して、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡの二本鎖を形成する。得られたＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡの二本鎖は、より高い融解温度（Ｔｍ）からも明らかなように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖よりも強く結合している。このＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）の高い熱安定性は、ＰＮＡ骨格が中性であることに起因しており、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡの二本鎖に存在する電荷の反発の消失をもたらす。ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）の別の利点は、Ｔｍが実際には塩濃度と無関係である一方、イオン強度に高度に依存するという点である。
【０１０５】
ＰＮＡは、その骨格が糖ではなくシュードペプチドになっているＤＮＡのアナログであるから、ＤＮＡの挙動を模倣して相補的な核酸鎖に結合する。とりわけ、シュードイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏ  ｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−メチルシトシンおよび２，６−ジアミノプリンなどの非天然の核酸塩基がＰＮＡシントンの中に取り込まれ得る。ＰＮＡは、ｔ−Ｂｏｃ／ベンジル基保護法によって保護されたモノマー（ＰＮＡシントン）から最も普通に合成され、伸長しつつあるポリマーの骨格にあるアミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基によって保護されており、また、核酸塩基の環外アミノ基があれば、ベンジルオキシカルボニル（ベンジル）基によって保護されている。ｔ−Ｂｏｃ／ベンジル基保護法を用いて保護されているＰＮＡシントンは現在市販されている。
【０１０６】
ＰＮＡは生物学的にも化学的にも安定しており、自動合成法によって簡単に入手することができる（（Ｈｙｒｕｐ，Ｂ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．およびＢｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．（１９９３）ペプチド核酸（ＰＮＡ）の結合親和性の改変法。２−アミノエチル−アラニンまたは３−アミノプロピルグリシンのユニット（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）。ＰＮＡ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−Ａｌａｎｉｎｅ  ｏｒ  ３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｕｎｉｔｓ）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓａｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１８−５１９）；Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．，Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，Ｍ．Ｄ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９３）。ヌクレアーゼＳ１を用いた、ＰＮＡ標的による配列選択的二本鎖ＤＮＡ切断（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ＰＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓｌ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１，２１０３−２１０７）。これらの性質によって、ＰＮＡは、アンチセンス遺伝子治療薬にとって非常に優れたリードとなっており、インビトロ実験によって、アンチセンスとしての可能性がさらに具体化されている（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．「ペプチド核酸（ＰＮＡ）原始遺伝物質としてのモデル構造（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」生命の起源（Ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）、１９９３，２３，３２３−３２７；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｃ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．およびＢｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．「アデニンまたはグアニンを含むペプチド核酸は、相補ＤＮＡ配列中のチミンおよびシトシンを認識する（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｏｒ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｔｈｙｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡｅｑｕｅｎｃｅｓ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３，８００−８０１；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．およびＮｏｒｄｅｎ，Ｂ．「直線および円二色性分光法によってペプチド核酸ＰＮＡ−Ｔ８とポリ（ｄＡ）の間で形成される右手型三本鎖（Ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ＰＮＡ−Ｔ８  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（ｄＡ）ｓｈｏｗｎ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１．５，６４７７−６４８１；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．，Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｃ．，Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｄｒｉｖｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｋ．，Ｎｏｒｄｅｎ，Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．「ワトソン−クリック水素結合ルールに従って、ＰＮＡは相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする（ＰＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｂｅｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｉｎｇ  ｒｕｌｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  １９９３，３６５，５５６−５６８；Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｅｒｇ，Ｒ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．「ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および医学およびバイオテクノロジーにおけるそれらの応用の可能性（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，１１，３８４−３８ｂ）。
【０１０７】
多くの具体的な応用場面においてＰＮＡは非常に有用であると思われる。稀なプリンだけの配列を標的とする場合、ＰＮＡは、ダブルクランプ（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｌａｍｐ）構造を形成して、ｍＲＮＡのどこでも翻訳を阻害することができる。このような稀なＲＮＡ配列によって、ＰＮＡの一部が、ワトソン／クリック結合によって標的配列に結合し、ＰＮＡの他の部分は、得られるＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の主溝に結合する。おそらく、骨格構造が非常に可動的であるため、ＰＮＡは、一方の鎖のほとんどがプリンで他方の鎖のほとんどがピリミジンからなる稀な二本鎖ＤＮＡ配列と簡単に三重鎖構造も形成する。最後に、無細胞系における低塩条件下では、二本鎖ＤＮＡ配列の配列特異的侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）を行い、侵入された二本鎖の転写を阻害することが示されている。
【０１０８】
いくつかのグループによる最近の研究で、ＰＮＡがさまざまな担体に結合すると、細胞へのそれらの取り込みが促進されうることが示された。これらのうち、「細胞内取り込みペプチド」、脂肪酸またはＤＮＡ、特にいくつかのペプチド配列が、細胞膜を通ってＰＮＡオリゴマーを運搬できることが示されている。ベクターペプチド−ＰＮＡ複合体がニューロン膜を通過して標的ｍＲＮＡを抑制することが示されている（Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ，Ｇ．ら、（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：４９２０）。ストレプトアビジンと、ラットトランスフェリンレセプターに対するＯＸ２６マウスモノクローナル抗体との複合体に結合したビオチン化ＰＮＡは、インビボでラットの血液脳関門を通過することが報告されている（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．ら、１９９５  ＰＮＡ  ９２：５５９２−５５９６）。Ｃｈｉｎｎｅｒｙ  Ｐ．Ｆ．らは、核にコードされているヒトチトクロームｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）のサブユニットＶＩＩＩのシグナルペプチドを、ビオチン化ＰＮＡに結合させたところ、インビトロで単離されたミトコンドリアの中にうまく輸送された（Ｃｈｉｎｎｅｒｙ，Ｐ．Ｆ．ら、１９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１９１９−２８）。共焦点顕微鏡によって、無傷細胞におけるビオチン化ペプチド−ＰＮＡのミトコンドリアへの輸送を確認した。さらに、ＰＮＡトリマーに結合したビオチニル−ＦＬＦＬ配列をもつ短い疎水性ペプチドは、ヒト赤血球およびＮａｍａｌｗａ細胞の中に吸収されることが示されている（Ｓｃａｒｆｉ，Ｓ．，Ａ．Ｇａｓｐａｒｉｎｉ，Ｇ．ＤａｍｏｎｔｅおよびＵ．Ｂｅｎａｔｔｉ：疎水性テトラペプチド−ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ビオチン分子の合成、取り込み、および細胞内代謝（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｕｐｔａｋｅ，ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）−ｂｉｏｔｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９７，２３６，３２３−３２６）。ＢａｓｕおよびＷｉｃｋｓｔｒｏｍ（細胞内への取り込みを増加させるためのインシュリン様成長因子１のＤ−ペプチドアナログに結合するペプチド核酸の合成と特徴づけ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  Ｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９９７，８，４８１−４８８）は、すべてＤ型のアミノ酸のインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ１）模倣ペプチドと結合したＰＮＡが、ＩＧＦ１レセプターを発現する細胞によって取り込まれることを示したが、アンチセンス活性についての記載はない。
【０１０９】
別の研究のいくつかの例については以下を参照。Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ：チミン置換ポリアミドとの鎖置換による配列選択的ＤＮＡ認識（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｔ，Ｐ．Ｅ．ＮｉｅｌｓｅｎおよびＲ．Ｈ．Ｂｅｒｇ：ペプチド核酸（ＰＮＡ）アキラルなペプチド骨格とのオリゴヌクレオチドアナログ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）。ＯｌｉｇｏｎｕｃＩｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｃｈｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４，１８９５−１８９７（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｍ．ＥｇｈｏｌｍおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ：ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド骨格をもつＤＮＡ模倣物質（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）．Ａ  ＤＮＡ  ｍｉｍｉｃ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓ，３−７（１９９４）；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．ＢｕｃｈａｒｄｔおよびＲ．Ｈ．Ｂｅｒｇ：シトシンおよびチミンを含むペプチド核酸による、ＤＮＡ中のグアニンとアデニンの認識（Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｕａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｙｍｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４，９６７７−９６７８（１９９２）；Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ：ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対ルールに従って、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする（ＰＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｔｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｂｅｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｉｎｇ  ｒｕｌｅｓ）［コメント参照］．Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６−５６８（１９９３）；Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｍ．ＥｇｈｏｌｍおよびＢ．Ｎｏｒｄｅｎ：ペプチド核酸によって形成されるＤＮＡ様二本鎖（ＤＮＡ−ｌｉｋｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，５６１−５６３（１９９４）；Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｓ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ＶｅａｌおよびＤ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ：ＲＮＡと複合したペプチド核酸のＮＭＲ分析による構造（ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ）、Ｓｃｉｅｎｃ���  ２６５，７７７−７８０（１９９４）；Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．Ｖ．，Ｖ．Ｎ．Ｐｏｔａｍａｎ，Ｍ．Ｄ．Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄ，Ｓ．Ｈ．ＳｏｎｎｉｃｈｓｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ：ヒト血清および細胞抽出物におけるペプチド核酸の安定性（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４８，１３１０−１３１３（１９９４）；Ｐｅｆｆｅｒ，Ｎ．Ｓ．，Ｊ．Ｃ．Ｈａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｅ．Ｂｉｓｉ，Ｓ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｃ．Ｆ．Ｈａｓｓｍａｎ，Ｓ．Ａ．ＮｏｂｌｅおよびＬ．Ｅ．Ｂａｂｉｓｓ：ペプチド核酸オリゴマーによる二本鎖ＤＮＡの鎖侵入（Ｓｔｒａｎｄ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＬＩＳＡ  ９０，１０６４８−１０６５２（１９９３）。
【０１１０】
Ｓｈａｙらに付与された米国特許第６，０４６，３０７号は、哺乳動物細胞においてテロメラーゼ活性を阻害するＰＮＡを開示している。Ｂａｋｅｒらに付与された米国特許第５，７８９，５７３号は、ＰＮＡを用いた、キャップをもつ標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する組成物と方法を開示している。米国特許第６，１６５，７２０号は、ＰＮＡ複合体の標識について開示している。
【０１１１】
通常のオリゴヌクレオチドアンチセンス分子の調製に使用される相補性のルールおよびワトソンクリック塩基対ルールと同じルールを用いて、核酸リガンドの少なくとも一部に相補的なＰＮＡまたはＭＮＡを簡単に調製することができる。
【０１１２】
モルフォリノ核酸は、それぞれが６員環のモルフォリノ環に結合した４種類の遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン）の一つを含むモルフォリノサブユニットから組み立てられるためこういう名前が付いた。これら４種類のサブユニット型の１８個から２５個のサブユニットが、非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合によって特定の順序に繋げられてモルフォリノオリゴができる。これらのモルフォリノオリゴは、その６員環モルフォリノ骨格部分が非イオン性結合によって繋がっていて、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびイオン性結合によって繋がっているリボースまたはデオキシリボースの骨格部分をもつそれらのアナログがもつアンチセンス特性よりも実質的にすぐれたアンチセンス特性を提供する（ｗｗｗｇｅｎｅ−ｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ／ｂｏｄｙ＿ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ．ＨＴＭＬ参照）。
【０１１３】
１９８５年にＳｕｍｍｅｒｔｏｎによって考案されたモルフォリノは、天然の核酸を徹底的に再設計した核酸を構成し、出発物質が低価格で構築費用が安いという有望な利点をもっている。ＰＮＡと同様、モルフォリノはヌクレアーゼに完全に抵抗性であり、Ｓ−ＤＮＡで見られる非アンチセンス効果のほとんどすべてを持たないと思われる。ＰＮＡとは対照的に、ほとんどのモルフォリノは優れた水溶性を示す。また、モルフォリノは、ＰＮＡほどではないが、Ｓ−ＤＮＡよりもずっと高いＲＮＡ結合アフィニティーを有する。おそらく十分なＲＮＡ結合アフィニティーがあることから、長いモルフォリノ（２５重合体）は予測可能な標的性と非常に高い有効性を提供する。もっとも注目すべきは、モルフォリノが優れた配列特異性をもつことである。並外れた配列特異性の基礎をなす同じ因子が、点突然変異を標的とするには不適切なものにしている。
【０１１４】
Ｍａｎｏｈａｒａｎらに付与された米国特許第６，１５３，７３７号は、結合したヌクレオシドが、ペプチド、タンパク質、水溶性ビタミン、または脂溶性ビタミンによって官能性を持たされた誘導体化オリゴヌクレオチドを目的としている。この開示内容は、複合体が核膜の中にあるいは進入するのを補助するペプチドまたはタンパク質の配列によってオリゴヌクレオチドを改変することによって、アンチセンス治療薬を対象としていた。同様に、アンチセンス治療薬または診断薬が細胞膜を通過して移動するのを補助するために水溶性および脂溶性のビタミンを用いることができる。
【０１１５】
ＰＮＡおよびＮＭＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡへの効率的で配列特異的な結合が、非常に高い生物学的安定性と重なると、本発明のモジュレータを開発するための非常に魅力的なリードとなる。ＩＳＩＳファーマシューティカルズ社（ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）によって開発された、ペプチド核酸のコンビナトリアルライブラリーと改良合成法（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）という名称の米国特許第５，８６４，０１０号において、担体に結合することができるペプチド核酸が特徴づけられており、これは参照して本明細書に組み込まれる。なお、本発明の担体に結合することができるペプチド核酸は、２本のペプチド核酸鎖および１本の核酸鎖からなるペプチド核酸複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄｓ  ａｎｄ  ｏｎｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔｒａｎｄ）という名称の米国特許第５，９８６，０５３号において特徴づけられている。
【０１１６】
ＬＮＡは、本発明のモジュレータの主な候補となるに適した特徴をいくつか持った新しい種類のＤＮＡアナログである。ＬＮＡモノマーは、ＲＮＡ−モノマーに構造上類似した二環式化合物である。ＬＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的性質のほとんど同じであって、水溶性であり、ゲル電気泳動、エタノール沈殿などによって分離することができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０（１９９８））。しかし、ＤＮＡオリゴまたはＲＮＡオリゴの中にＬＮＡモノマーを導入すると、一方で同時にワトソン−クリック塩基対合ルールに従いつつ、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡとの熱安定性の高い二本鎖が生じる。このようにＬＮＡオリゴマーによって形成される二本鎖の高度の熱安定性を、３’に位置するＬＮＡを含むプライマーが、例えばＰＣＲ反応など酵素伸長反応の基質であるとの発見とともに本発明において利用して、本願記載のインビトロアッセイ法において変異型核酸検出の特異性を顕著に上昇させる。各対立遺伝子の増幅プロセスが、高度に差別的（交差反応が見られない）に起こり、反応をいくつか同一の容器で行うことができる。例えば米国特許第６，３１６，１９８号を参照。
【０１１７】
また、シュードサイクリックオリゴ核酸塩基（ＰＣＯ）を本発明におけるモジュレータとして使用することもできる（米国特許第６，３８３，７５２号参照）。ＰＣＯは、３’−３’または５’−５’末端を介して結合している２つのオリゴヌクレオチド分節を含む。このＰＣＯ分節の一つ（「機能的分節」）は何らかの機能性を有する（例えば、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド）。別の分節（「保護的分節」）は、機能的分節の３’末端または５’末端に相補的である（機能的分節がどちらの末端を介して結合しているかによる）。機能的分節と保護的分節との間に相補性がある結果、標的核酸（例えばＲＮＡ）が存在しないとき、ＰＣＯは分子内シュードサイクリック構造を形成する。ＰＣＯは、３’−３’または５’−５’結合が存在し、分子内シュードサイクリック構造を形成するため、通常のアンチセンスオリゴヌクレオチドよりも安定性が高い。マウスにおける薬理動態学的研究、組織分布研究、および安定性研究によって、通常、ＰＳ−オリゴヌクレオチドよりもインビボでの安定性が高く、ＰＳ−オリゴヌクレオチドと同じような薬理動態学プロフィールおよび組織分布プロフィールを有するが、選択された組織から速やかに消失することが示唆されている。蛍光分子と消光分子を本発明のＰＣＯに適宜結合させると、それが直線状の構造をしていると蛍光を発し、サイクリック構造になると蛍光が消される。
【０１１８】
Ａ．核酸結合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質
タンパク質−核酸相互作用は、転写、ＲＮＡスプライシング、および翻訳など多くの細胞機能に関与する。高いアフィニティーをもって一本鎖核酸の特異的配列に結合できる合成分子は、調節可能な方法でこれらの相互作用を妨害する能力を有する。
【０１１９】
核酸配列に直接結合できるタンパク質が数多く特定されている。ＤＮＡに直接結合できるタンパク質の主なグループの一つは転写因子である。転写因子のいくつかの実例は次の分類に含まれる。塩基ドメイン転写因子（ロイシンジッパー因子、ＣＲＥＢ、へリックス−ループ−へリックス因子、へリックス−ループ−へリックス／ロイシンジッパー因子、細胞周期調節因子、ＮＦ−１、ＲＦ−Ｘ、ｂＨＳＨ）、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメイン転写因子（核内レセプター型のｃｙｓ４ジンクフィンガー、甲状腺ホルモンレセプター様因子、さまざまなＣｙｓ４ジンクフィンガー、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメイン、真菌類における代謝レギュレータ、ＮＦ−６Ｂ様結合特性を有する大因子（ｌａｒｇｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ｃｙｓ６システイン−亜鉛クラスター、交互構成物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｓｉｏｎ）のジンクフィンガー、ホメオドメイン）、へリックス−ターン−へリックス（ホメオドメインのみ、ＰＯＵドメイン因子、ペアードボックス、フォークヘッド／ウィング付きへリックス、ヒートショック因子、トリプトファンクラスター、ＴＥＡドメイン）、副溝と接触するベータ−足場因子（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ）（ＲＨＲ、ＳＴＡＴ、ｐ５３、ＭＡＤＳボックス、ベータ−バレル・アルファ−へリックス転写因子、ＴＡＴＡ−結合タンパク質、ＨＭＧ、ヘテロ重合ＣＣＡＡＴ因子、グレイニーヘッド（ｇｒａｉｎｙｈｅａｄ）、コールドショックドメイン因子、ラント（ｒｕｎｔ））、その他の転写因子（銅フィストタンパク質（ｃｏｐｐｅｒ  ｆｉｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＨＭＧＩ（Ｙ）、ポケットドメイン、Ｅ１Ａ様因子、ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ関連因子）。
【０１２０】
その主要な構造に加えて、ＲＮＡは、ループ、隆起、シュードノット、およびターンなどの局所的モチーフからなる複合体三次構造体に折りたたまれることができる。これらが、タンパク質と相互作用するＲＮＡの中に存在するとき、これらの局所的な構造がタンパク質−ＲＮＡ相互作用において重要な役割を果たすことが分かったことは驚くことではない。しかしながら、このような局所的三次構造の多様性は、二重らせんおよび三重らせんの核酸を形成するためのルールと同様の一般的な使い易さ認識（ｓｉｍｐｌｅ−ｔｏ−ｕｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）ルールによって合成薬剤を設計することを不可能にしている。核酸の三次構造に特異的に結合できるトリペプチドが特定されている（Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１２９９７（１９９９））。したがって、一つの実施形態において、これらのトリペプチドは、核酸リガンド活性のモジュレータとして利用することができる。
【０１２１】
ペプチドをベースとする核酸リガンドのモジュレータは、オリゴヌクレオチドまたはそれらのアナログに対するモジュレータの代替的分子の分類を代表している。標的とオリゴヌクレオチドモジュレータの間に核形成を促すための十分な一本鎖領域がないために、標的核酸リガンドの十分に活性のあるオリゴヌクレオチドモジュレータを単離できないとき、この種類のモジュレータが特に有用であることが明らかになっている。さらに、オリゴヌクレオチドモジュレータよりもペプチドモジュレータの方が、さまざまな生物利用能および薬理動態学を提供するため、いくつかの標的核酸リガンドにとっては好適であろう。
【０１２２】
核酸リガンドに結合してその活性を調節することができるペプチドを単離する方法をいくつか利用することができる。例えば、ビーズに固定されているコードされたペプチドのコンビナトリアルライブラリーについて記載されており、ウイルスのＲＮＡ配列に結合して、ウイルスＲＮＡと、該ＲＮＡに特異的に結合するウイルス調節タンパク質との間の相互作用を破壊することができるペプチドを含むことが実証されている（Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１２９９７（１９９９））。このようなライブラリーを使用して、標識（例えば色素）を標的核酸リガンドに付加し、標識された標的とビーズに固定されたペプチドライブラリーとを、ライブラリーの構成分子のいくつかと核酸が結合するのに有利な条件下でインキュベートすることによって核酸リガンドのモジュレータを単離することができる。所与のビーズ上で核酸リガンドが特異的ペプチドに結合すると、核酸リガンド上の標識によってビーズの「着色」がもたらされ、それによって、標的に結合できるペプチドの特定とビーズの簡単な分離が可能になる。このようなスクリーニング法によって単離されたペプチドと、標的核酸リガンドとの間の直接的相互作用を、核酸リガンドのモジュレータを特定するために記載されている結合アッセイ法をいくつでも用いて確認し定量することができる。該ペプチドが標的核酸リガンドの活性を調節できることを適切なバイオアッセイ法で確認することができる。
【０１２３】
別の方策として、適切なアフィニティーハンドル（例えば、ストレプトアビジンでコートした表面にビオチン）または反応部位（例えば脂肪族アミン）を化学合成する間標的核酸リガンドのどちらかの末端に付加することによって、標的核酸リガンドを固形支持体（例えばプラスチック、ビーズなど）上に固定することができる。あるいは、標準的な転写プロトコールに従うが、反応混合液におけるＧＴＰに対して５倍モル過剰の５’−ビオチン−修飾ＧＭＰまたは修飾ＧＭＰを含む、ビオチン化ＲＮＡ、または所望の改変を含むＲＮＡを調製することができる。５’−ビオチン−修飾されたグアノシンヌクレオチド、および別のグアノシンヌクレオチド誘導体を合成し、該ＧＭＰ誘導体をインビトロ転写物の中に取り込ませる方法が、「オリゴヌクレオチドの生物学的結合（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」という名称の国際公開公報第９８／３０７２０号に記載されている。標的ＲＮＡが表面に固定されると、例えば、ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする標準的な方法を使用して、標的核酸リガンドに結合できるペプチドのランダムファージディスプレイライブラリーなどのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、該標的ＲＮＡに結合できるペプチドを単離することができる。一度単離されたら、核酸リガンドのモジュレータを特定するために記載されている結合アッセイ法をいくつでも用いて、ペプチドと標的核酸リガンドとの間の直接相互作用を確認して定量することができる。該ペプチドが標的核酸リガンドの活性を調節できることは、適切なバイオアッセイ法で確認することができる。
【０１２４】
さらに、記載されている質量スペクトル法を使用して、アミノ酸および低分子量ペプチドライブラリーをスクリーニングして標的核酸リガンドに結合できるものを特定することができる（米国特許第６，３４２，３９３号、第６，３２９，１４６号、第６，２５３，１６８号および第６，２２１，５８７号参照）。一度特定されたら、核酸リガンドのモジュレータである可能性があるものを特定するために記載されている結合アッセイ法をいくつでも用いて、そのような作用薬と標的核酸リガンドとの直接的な相互作用を確認して定量することができる。該ペプチドが標的核酸リガンドの活性を調節できることは、適切なバイオアッセイ法で確認することができる。
【０１２５】
また、米国特許第５，８３４，１８４号、第５，７８６，１４５号および第５，７７０，４３４号は、本発明のペプチドモジュレータを作製・スクリーニングする方法を開示している。
【０１２６】
Ｂ．オリゴサッカライド
オリゴサッカライドは核酸と相互作用することができる。抗生物質のアミノグリコシドは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種の産生物であり、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、アミカシン、およびゲンタマイシンなどに代表される。これらの抗生物質は、細菌のリボゾームに結合して、タンパク質合成の開始を阻害することによってその活性を発揮する。アミノグリコシド系抗生物質は、さまざまなリボザイムおよびＨＩＶ−１のＴＡＲおよびＲＲＥ配列など、さまざまなＲＮＡ分子と特異的に相互作用する。３０ｓリボゾームのＡ−部位ＲＮＡに結合するアミノグリコシド系抗生物質は遺伝子コードの読み間違いを引き起こし、翻訳を阻害する。アミノグリコシド系抗生物質であるパロモマイシンは、３０Ｓ  Ａ部位のＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的に結合する。この抗生物質は、Ａ−Ａ対合と１個の隆起アデニン（ｂｕｌｇｅｄ  ａｄｅｎｉｎｅ）によって作り出されるポケットの中にあるＡ部位ＲＮＡ上の主溝に結合する。アミノグリコシド化学基とＲＮＡ中の保存ヌクレオチドとの間に生じる相互作用がいくつかある。
【０１２７】
したがって、アミノグリコシドのように、オリゴサッカライドは核酸と結合し、核酸リガンドの活性を調節するために利用することができる。また、記載されている質量スペクトル法を使用して、標的核酸リガンドに結合できるオリゴサッカライド（例えばアミノグリコシド）を、単独または混合物でスクリーニングすることができる（米国特許第６，３４２，３９３号、第６，３２９，１４６号、第６，２５３，１６８号および第６，２２１，５８７号参照）。
【０１２８】
Ｄ．低分子
核酸リガンドと標的との間に割り込むか、さもなければ核酸リガンドと標的との間の結合を破壊または改変する低分子も、治療用レギュレータとして利用できる。
【０１２９】
このような低分子は、該低分子が存在するときとしないときとで核酸リガンドと標的との間の結合が変化するのを測定するアッセイ法で候補分子をスクリーニングするか、または、該低分子が存在するときとしないときの標的に対する核酸リガンドの生物学的作用における差異を測定するインビボまたはインビトロのアッセイ法を用いて特定することができる。所望の作用を示す低分子が特定されたら、コンビナトリアル法などの技術を用いて、所望の調節作用を得るために化学構造を最適化することができる。
【０１３０】
低分子のスクリーニングに使用するのに適したアッセイ法が、米国特許第５，８３４，１９９号に記載されており、以下でさらに詳しく説明する。また、記載されている質量スペクトル法を使用して、標的核酸リガンドに結合できる低分子を特定するために低分子ライブラリーをスクリーニングすることができる（米国特許第６，３４２，３９３号、第６，３２９，１４６号、第６，２５３，１６８号および第６，２２１，５８７号参照）。
【０１３１】
Ｅ．キメラ、融合生成物、およびその他の結合物質
オリゴヌクレオチドまたはそのアナログ（リボザイムまたはＤＮＡ酵素またはペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ核酸（ＭＮＡ）など）、核酸結合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（核酸結合トリペプチドなど）、オリゴサッカライド、および低分子を共有結合的または非共有結合的に結合して所望の結合レギュレータを提供することができる。一例として、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡまたはＭＮＡをペプチドまたはタンパク質に結合させて、所望の性質または治療効果をもたらすことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドまたはそのアナログまたはペプチドまたはタンパク質を低分子に結合させて、その性質を増進させることができる。これらの物質を直接結合させるか、当業者に周知されているスペーサー基を介して結合させることができる。一つの実施形態において、低分子は、放射性リガンド、または、標準的な技術を用いてモニターすることができるその他の検出可能な作用薬を含む。このようにして、レギュレータの進行と位置をモニターすることができる。または、低分子は、レギュレータによって治療部位まで運んで来られた治療薬であり、その後あるいはは切断されて、適切な位置でその治療効果をもたらす。第三の実施形態において、低分子は、２種類の生体材料を一つに結合して併合効果を生み出すキレート剤である。
【０１３２】
キメラ、融合生成物、その以外の多成分レギュレータは、以下で詳しく説明するように、治療効果について確認・評価することができる。
【０１３３】
ＩＩＩ．モジュレータの特定および選択
標準的な結合アッセイ法を用いて、本発明のモジュレータを特定・選択することができる。非制限的な例はゲルシフトアッセイ法とビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）アッセイ法である。すなわち、被検モジュレータを核酸リガンドと接触させて、試験条件または一般的な生理学的条件下で標的させて、被検モジュレータが実際に核酸リガンドに結合するかどうかを決定する。次に、核酸リガンドに結合することが認められた被検モジュレータを適切なバイオアッセイ法（アプタマーおよびその標的分子によって変わる。例えば血液凝固試験）で解析して、その標的分子上の核酸リガンドによってもたらされた生物学的効果に対して影響を与えうるか否かを決定することができる。
【０１３４】
ゲルシフトアッセイ法は、結合能力を測定するのに使用される技術である。例えば、被検配列を含むＤＮＡ断片を、まず被検タンパク質または推定結合タンパク質を含む混合物とインキュベートしてから電気泳動によってゲル上で分離する。ＤＮＡ断片にタンパク質が結合するとサイズが大きくなり、結合していない断片の移動度と比べると移動度が遅くなる。例えば、電気泳動ゲル移動度シフトアッセイを行う一つの方法は、（ａ）混合液中で、核酸結合タンパク質を、分子プローブを含む非放射活性または放射活性標識された核酸分子と適切な条件下で接触させて、複合体形成におけるタンパク質とプローブとの特異的結合相互作用を促進すること、ここで、該プローブはｄｓＤＮＡｓＤＮＡおよびＲＮＡからなるグループから選択される；（ｂ）混合液を電気泳動すること；（ｃ）陽圧ブロット転移法またはキャピラリー転移法を用いて、複合体を正に荷電したナイロン膜に転移させること；および（ｄ）複合体中の非放射活性または放射活性の標識を検出して、膜に結合した複合体を検出することである。
【０１３５】
ビアコア技術は、表面に結合した相互作用物質が解析の特異性を決定するよう、センサーチップ表面上で起こる結合現象を測定する。相互作用の特異性を試験することは、さまざまな分子が固定した相互作用物質に結合できるかを単純に解析することを含む。結合すると、直ちに表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルに変化が生じるため、相互作用が起きたか否かが直接明らかになる。ＳＰＲに基づくバイオセンサーは、表面近くにある生体分子の質量濃度を測定することにより相互作用をモニターする。表面は、相互作用の相手分子の一つが結合すると特異的になる。その他の相互作用相手を含む試料は表面を流れ去る。すなわち、試料由来の分子が表面に結合している相互作用物質に結合すると、局所的な濃度が変化してＳＰＲ反応が測定される。この反応は、表面に結合する分子の質量と直接比例している。
【０１３６】
異なる屈折率をもつ２つの媒体の間の界面に置かれた電導膜から一定の条件下で光が反射するとＳＰＲが生じる。ビアコア技術において、媒体は試料とガラスのセンサーチップであり、電導膜はチップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角度で反射光の強さを低下させる。この角度は、反射光の反対側の表面近くの屈折率によって変化する。試料中の分子がセンサー表面に結合すると、濃度ひいては表面の屈折率が変化してＳＰＲ反応が検出される。相互作用の過程で時間に対して反応をプロットすると、相互作用の進行を定量的に測定することができる。ビアコア技術は、最小の反射光強度の角度を測定する。光は試料に吸収されるのではなく、光エネルギーはＳＰＲによって金膜に分散して失われる。ＳＰＲ反応値は、共鳴ユニット（ＲＵ）で表される。１ＲＵは最小強度の角度が０．０００１°変化したことを表す。これは、ほとんどのタンパク質にとって、センサー表面上における濃度が約１ｐｇ／ｍｍ２変化したのとほぼ同じである。ＲＵと表面濃度との正確な変換係数は、センサー表面の性質と、濃度変化に関与する分子の性質によって決まる。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドまたはそのアナログ、ペプチド、ポリペプチド、オリゴサッカライドまたは低分子が、標的との相互作用が変化するように核酸リガンドに結合できるか否かを決定できる別のアッセイ法がいくつかある。例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ法（ＥＭＳＡｓ）、滴定熱量測定法、シンチレーション近接アッセイ法、分析的超遠心分離を用いる沈降平衡アッセイ法（例えば、ｗｗｗ．ｃｏｒｅｓ．ｕｔａｈ．ｅｄｕ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎを参照）、蛍光偏光アッセイ法、蛍光異方性（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）アッセイ法、蛍光強度アッセイ法、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイ法、ニトロセルロースフィルター結合アッセイ法、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＯＮＡ（例えば米国特許第５，７８９，１６３号参照）、ＲＩＡ、または平衡透析アッセイ法を用いて、薬剤が核酸リガンドに結合する能力を評価することができる。薬剤と核酸リガンドとの相互作用を直接測定する直接的なアッセイ法を行うことができる。または、その作用薬がその標的から核酸リガンドを排除することができる競合アッセイ法または置換アッセイ法を行うことができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ，ＢｅｌｌおよびＪａｎｊｉｃ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０（５），２００１，ｐ１０９４、および米国特許第６，３０６，５９８号参照）。候補調節作用薬が特定されたら、標的に対する核酸リガンドの活性を調節できることをバイオアッセイ法で確認することができる。または、核酸リガンドと標的との相互作用を調節できる作用薬が特定されれば、結合アッセイ法を用いて、その作用薬が核酸リガンドと直接相互作用しており、その相互作用のアフィニティーを測定できることを確認することができる。
【０１３８】
別の実施形態において、核酸リガンドに結合するレギュレータ、レギュレータと核酸リガンドが相互作用する部位、および核酸リガンドに対する作用薬の相対的結合アフィニティーを特定するために質量分析法を用いることができる（例えば、米国特許第６，３２９，１４６号、Ｃｒｏｏｋｅら参照）。また、このような質量分析法は、核酸リガンドのモジュレータとして使用することができる選択された標的核酸リガンドに結合する各化合物について、化学物質の混合物またはライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするのに用いることもできる。さらに、質量分析技術を用いて、例えば、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対して複数の標的核酸リガンドを同時にスクリーニングすることができる。その上、質量分析技術を用いて、複数の分子種、特に「低」分子の間の相互作用、および標的核酸リガンド上の分子相互作用部位を特定することもできる。
【０１３９】
核酸リガンドと標的との相互作用を変化させる上でのレギュレータの有効性を評価するインビボまたはインビトロにおけるアッセイ法は、治療すべき疾患ごとに特異的である。生物学的特性を測定するための周知で使用可能な標準的アッセイ法は豊富にある。生物学的アッセイ法の例は、具体的に応用するための一定の核酸リガンドを記載する本願において引用されている特許に示されている。
【０１４０】
非制限的な例として、臨床検査室では血液凝固試験を行うことができる。これらの試験は、通常、機能的終点（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）アッセイ法であり、患者の試料（血漿または全血）を、血液凝固カスケードを活性化させる外因試薬とともにインキュベートして、血栓が形成されるまでの時間を測定する。次に、患者試料の血栓形成時間を収集された正常血漿または全血の血栓形成時間と比較して、患者の止血状態の標準測定値を提示する。下で説明するように、このような血栓形成アッセイ法は、患者の内因および外因の凝固系の機能を評価するスクリーニング試験法として広く使用されている。
【０１４１】
活性凝固時間検査法（ＡＣＴ）は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検査法に似たスクリーニング検査法であるが、新鮮な全血液試料を用いて行われる。ＡＣＴは、高用量のヘパリン（例えばＣＰＢおよびＰＴＣＡ）の投与を含むなどの臨床処置とともに患者の血液凝固状態をモニターするために利用することができる。
【０１４２】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）検査法は、一般的な中央検査室で行われる検査法で、ＡＰＴＴは、第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩおよびＸＩＩ因子を含む内因系凝固経路を評価するために用いられる。この検査法は、内因系経路が、リン脂質、活性化因子（エラグ酸、カオリン、または微粉化されたシリカ）およびＣａ２＋を加えると活性化される血漿試料を用いて行われる。リン脂質の表面上でＸａｓｅとプロトロンビナーゼの複合体が形成されると、プロトロンビンがトロンビンに変化することができるようになり、その後血栓が形成される。ＡＰＴＴ検査法の結果は、この反応に必要とされる時間（秒）である。出血傾向に関する手術前スクリーニング検査として、また、ヘパリン療法をモニターするための日常的な検査として、患者の凝固系の全体的な能力を測定するためにＡＰＴＴを用いることができる。ＡＰＴＴの別の例は、以下のように実施される。まず、血液を遠心分離にかけた後血漿を集め、それにアクティング（ａｃｔｉｎｇ）を加える。さらに、塩化カルシウムを加える。凝固が形成されるまでの時間を測定する。より詳しくは、血漿は、血液を遠心分離して得られた後冷蔵庫に保存する。０．１ｍｌの活性化剤を３７℃の温度の湯で１分間温めて、０．１ｍｌの血漿を入れた試験管の中に注ぎ込む。この混合液を３７℃の湯に２時間入れておく。次に、この混合液に、３７℃の温度の湯に入れておいた０．０２ＭのＣａＣｌ２を圧力下０．１ｍｌ加える。この時ストップウォッチのスイッチを押す。試験管を３７℃の湯で２５秒間加熱する。試験管を取り出し、凝固が見られる場合にはストップウォッチのスイッチを切る。これが、血液の凝固時間を測ることが出来る方法の一つである。
【０１４３】
止血障害、フォン・ヴィレブランド病、および血管障害を診断するために出血時間検査法を用いることができる。また、手術前に血小板の異常をスクリーニングするために利用することもできる。この検査法は、前腕を僅かに切開し、傷口から血液を排出させて行う。出血が止まるまでにかかる時間を記録すると、対照用の被験者では３．５分である。出血時間が長引くのは、血小板の定性的または定量的な欠陥を示す指標である。
【０１４４】
ＰＴ検査は、外因系凝固経路についての評価を与えることができ、経口抗凝固療法をモニターするため広範に利用されている。
【０１４５】
プロトロンビン時間検査（ＰＴ）は、Ｑｕｉｃｋによって１９３５年に初めて記載され、血液または血漿の組織因子によって誘導される凝固時間を測定する。この検査は、外因系血液凝固経路の完全性を評価するためのスクリーニング検査法として利用されており、凝固因子の第Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩおよびＸ因子に対して感度が高い。この検査は、患者試料にトロンボプラスチンとＣａ２＋を加え、血栓形成時間を測定して行うことができる。出血時間が長引くのは、外因系経路の凝固因子の１種類以上に対するインヒビターが存在するか、またはそれらに欠陥が存在することを示唆する。しかし、ＰＴ血栓形成時間は、ワーファリン治療を受けている患者、または、ビタミンＫ欠乏または肝機能障害のある患者でも遅延することがある。
【０１４６】
トロンビン凝固時間検査法（ＴＣＴ）は、正常な血漿対照と比較して患者の血栓形成速度を測定する。この検査法は、血小板を涸渇させた患者の血漿に標準量のトロンビンを加え、血栓を形成するのに必要となる時間を測定して行われる。この検査法は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および肝疾患の診断を補助する方法として使用されている。
【０１４７】
また、患者の血液凝固状態を診断するのに利用できる検査法もいくつかある。それらは、２つに分類できる。そのいくつかが上記で概説したスクリーニング検査に基づく複合体検査法、および免疫アッセイ法である。複合体検査法は、ＡＰＴＴ、ＰＴ、およびＴＣＴなどの検査室での検査法に基づく特異的因子アッセイ法を含む。一つのアッセイ法では、活性化ペプチド因子ＩＸａ、または第ＩＸａ因子−抗トロンビンＩＩＩ複合体のレベルを測定する。これらの測定値を用いて、第ＩＸａ因子または第ＶＩＩ因子−組織介在型複合体のレベルを決定することができる。活性化されたプロテインＣ抵抗性、抗トロンビン、プロテインＣ欠乏、およびプロテインＳ欠乏のアッセイ法もこのグループの一部である。プロテインＣおよびＳが不均一に欠乏しており、活性化プロテインＣに抵抗性の無症状個体は、対照と比較すると、プロトロンビン断片Ｆ１．２のレベルを顕著に上昇させた。
【０１４８】
Ｖ．核酸リガンド療法を調節する方法
（ｉ）それを必要とする患者に、標的に結合して治療効果を生じさせる核酸リガンドを投与すること、そして選択された時間または所望の時間に、（ｉｉ）治療効果を変化させるモジュレータをその患者に投与することを含む、生物活性を調節する方法を提供する。ある場合には、モジュレータは治療効果のスイッチをオフにする。もう一つの実施形態では、モジュレータは、治療効果を低下させるかまたは最小限に抑えるが、治療効果を停止させることはしない。さらにもう一つの実施形態では、モジュレータは治療効果を強化する。
【０１４９】
基本的な治療効果は、標的と核酸リガンドによって決定される。治療効果の変化はモジュレータによって決定される。いかなる既知のまたは開発された核酸リガンドも、本発明により調節することができる。
【０１５０】
一つの実施形態では、該方法は、（ａ）それを必要とする温血脊椎動物を含む患者に、凝固経路因子にあるいは結合する核酸リガンドまたはＤＮＡアプタマー、凝固経路因子に対して約２０ｎＭまたはそれ以下の解離定数を有するＲＮＡアプタマーの有効量を投与すること；（ｂ）段階（ａ）でのＲＮＡアプタマーの投与を通して温血脊椎動物における凝固経路因子の生物活性を変更すること、および（ｃ）モジュレータの投与によってアプタマーの作用を逆転させる中和剤を提供することを含む。例えば、本発明のモジュレータは、組織因子（ＴＦ）／第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）／第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、第Ｖａ因子（ＦＶａ）／第Ｘａ因子（ＦＸａ）酵素複合体、ならびにｇｐ  ＩＩｂＩＩＩａおよびｇｐ  ＩｂＩＸなどの血小板レセプターを標的とする核酸リガンドに結合して、該核酸リガンドの作用を調節することができる。本発明はまた、中和剤による血小板阻害因子、抗血栓薬および線維素溶解剤の制御も提供する。
【０１５１】
抗血栓性または抗血液凝固性核酸リガンドの活性を速やかに逆転させることが望ましい、少なくとも３つの臨床状況が存在する。第一の場合は、抗血液凝固薬または抗血栓薬治療が、頭蓋内または胃腸管出血を含む出血を導くときである。より安全な標的タンパク質を特定することはこの危険度を低下させうるが、この種の出血事象からの罹病率または死亡率の潜在的可能性はこの危険度を看過できないほど高い。第二の場合は、抗血栓薬治療を受けた患者において緊急手術が必要となったときである。この臨床状況は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害因子の投与下で経皮冠動脈手術を受けている間に緊急の冠状動脈バイパス移植が必要となる、低いパーセンテージの患者で起こる。この状況での現在の措置は、化合物のクリアランスを生じさせること（エプチフィバチドなどの低分子拮抗物質の場合）、これは２時間から４時間かかることもある、若しくは血小板の注入（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ治療の場合）である。第三の場合は、抗血液凝固性核酸リガンドを心肺バイパス処置の際に使用するときである。バイパス患者は術後出血を起こしやすい。各々の場合に、中和剤（例えば抗血液凝固薬または抗血栓性核酸リガンドを標的とする本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータ）による化合物の抗血液凝固作用の急激な逆転は、抗血液凝固薬または抗血栓性化合物の改善された、そしておそらくより安全な、医学的制御を可能にする。
【０１５２】
患者において心臓血管疾患を治療する方法も本発明により提供される。その方法は、心臓血管疾患に罹患している脊椎動物被験対象に、凝固経路因子にあるいは結合するＲＮＡアプタマー、すなわち凝固経路因子に対して約２０ｎＭまたはそれ以下の解離定数を有するＲＮＡアプタマーの有効量を投与し、それによって脊椎動物被験対象における心臓血管を治療し、その後モジュレータの投与によってアプタマーの作用を逆転させる中和剤を提供することを含む。
【０１５３】
そのような調節が望ましい、温血脊椎動物を含む患者において、Ｅ２Ｆ活性を調節する方法も提供される。その方法は、（ａ）Ｅ２Ｆファミリーの成員にあるいは結合するＲＮＡアプタマー、すなわちＥ２Ｆファミリーの成員に対して約２０ｎＭまたはそれ以下の解離定数を有するＲＮＡアプタマーの有効量を温血脊椎動物に投与すること；（ｂ）段階（ａ）のＲＮＡアプタマーの投与を通して温血脊椎動物においてＥ２Ｆを調節すること、および（ｃ）モジュレータの投与によってアプタマーの作用を逆転させる中和剤を提供することを含む。
【０１５４】
本発明の多くの実施形態において、本発明で治療される患者は望ましくはヒト患者であるが、本発明の原理は、本発明が、「患者」の語に包含されることが意図されている、温血脊椎動物（例えば鳥類および哺乳類）を含むすべての脊椎動物種に関して有効であることを示唆していることは明白である。これに関して、哺乳類は、心臓血管疾患の治療が望ましいあらゆる哺乳動物種、特に農業および家畜哺乳動物種を包含すると理解される。
【０１５５】
ヒトなどの哺乳動物、ならびに絶滅が危惧されているために重要である哺乳動物（シベリアトラなど）、ヒトにとって経済的重要性を持つ哺乳動物（ヒトによって消費されるために農場で飼育される動物）および／または社会的重要性を持つ動物（ペットとしてまたは動物園で飼育される動物）、例えばイヌおよびネコなどのヒト以外の食肉動物、ブタ（ブタ、去勢雄ブタ、および野生雄ブタ）、反芻動物（ウシ、去勢雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、野牛、およびラクダなど）、およびウマなどの哺乳動物の治療が想定される。また、絶滅が危惧されている種類の鳥類、動物園で飼育されている種類の鳥類、ならびに家禽、より特定すると飼育されている家禽、すなわちシチメンチョウ、ニワトリ、雌アヒル、雌ガチョウ、ホロホロ鳥などのような家禽の治療を含む、鳥類の治療も、それらもやはりヒトにとって経済的重要性を持つので、考慮される。
【０１５６】
組織における心臓血管疾患を治療するための本発明の方法は、心臓血管疾患が起こっている若しくは起こる危険性のある組織を、凝固因子に結合することができるＲＮＡアプタマーの治療上有効な量を含有する組成物と接触させること、ならびにモジュレータの投与によってアプタマーの作用を逆転させる中和剤を提供することを意図する。それ故、該方法は、ＲＮＡアプタマーを含有する生理的に耐容される組成物の治療上有効な量を患者に投与すること、ならびにモジュレータの投与によってアプタマーの作用を逆転させる中和剤を提供する方法を含む。
【０１５７】
モジュレータの投与に関する用量範囲は、ここでさらに述べるように、モジュレータの形態およびその効力に依存し、所望の作用を生じさせるのに十分な量である。凝固を調節する、従ってそれに対応して心臓血管疾患および心臓血管疾患の症状を改善しうる状況に関しては、用量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全などのような有害な副作用を生じさせるほど高くてはならない。一般に、用量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって異なり、当業者によって決定されうる。何らかの合併症が起きた場合には個々の医師が用量を調節することもできる。
【０１５８】
治療上有効な量は、凝固調節量、Ｅ２Ｆ活性調節量、凝固および／または血管新生因子活性（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）調節量を含むがこれらに限定されない、核酸リガンドの作用の測定可能な変化を生じさせるのに十分なモジュレータの量である。凝固、Ｅ２Ｆ活性、および／または血管新生因子活性（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）の変化は、実施例で開示されている方法によって、または当業者に既知の他の方法によって、免疫組織化学によりインサイチューで測定することができる。
【０１５９】
好ましいモジュレータは、１マイクロモル（μＭ）未満、好ましくは０．１μＭ未満、より好ましくは０．０１μＭ未満のモジュレータ濃度で溶液中の核酸リガンドに実質的に結合する能力を有する。「実質的に」とは、標的の存在下での調節によって標的生物活性の少なくとも５０パーセントの低下が認められることを意味し、５０％低下をここではＩＣ５０値と称する。
【０１６０】
哺乳類宿主への本発明の物質の好ましい投与様式は、非経口的、静脈内、皮内、関節内、滑液包内、クモ膜下腔内、動脈内、心臓内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節包内、脊椎内、胸骨内、局所的、経皮パッチ、経直腸、膣または尿道坐薬、腹腔内、経皮的、鼻スプレー、外科的移植、内科手術塗布剤（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐａｉｎｔ）、持続注入ポンプまたは経カテーテルである。一つの実施形態では、作用物質と担体を、移植片、ボーラス、マイクロ粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子またはナノスフェアなどの徐放性製剤中で投与する。医薬製剤に関する標準情報については、Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，第６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９５）参照。
【０１６１】
本発明のモジュレータは、好ましくは注射または時間をかけた緩徐な持続注入によって非経口的に投与することができる。治療する組織は、典型的には全身投与によって体内でアクセスすることができ、それ故ほとんどの場合、治療用組成物の静脈内投与によって治療されうるが、標的とする組織が標的分子を含む可能性が高い場合は、他の組織および送達手法が提供される。そこで、本発明のモジュレータは、典型的には経口的、血管組織に対して局所的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的に投与され、ぜん動手法によって送達することができる。上述したように、該製薬組成物は、経口的、血管組織に対して局所的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的などの様々な経路によって個体に供給することができ、ぜん動手法によって送達しうる。血管組織への局所投与のための代表的な非制限的アプローチは、（１）インビボでの送達のために、核酸リガンドを含有するゲルで血管組織を被覆するまたは浸透させること、例えば切除したまたはバイパスした損傷または罹患血管組織セグメントの代わりに被覆または含浸した血管を移植することによって；（２）送達を所望する血管へのカテーテルによる送達；（３）患者の体内に移植する血管への核酸リガンド組成物のポンプ送達を包含する。あるいは、核酸リガンドは、マイクロインジェクションによってまたはリポソーム被包によって細胞に導入することができる。好都合に、本発明の核酸リガンドは単回一日用量として投与することができ、若しくは総一日用量を数回に分けて投与することもできる。その後、モジュレータの投与によって核酸リガンドの作用を変化させるために、適切な手段によってモジュレータを供給する。
【０１６２】
本発明のモジュレータポリペプチドを含有する治療用組成物は、好都合に、例えば単位用量の注射などによって静脈内投与される。本発明の治療用組成物に関して使用するとき「単位用量」の語は、各々の単位が、必要とされる希釈剤、すなわち担体または賦形剤と共に所望の治療効果を生じるように算定された、あらかじめ定められた量の有効成分を含有する、被験対象への単位別投与に適した物理的に分離した単位を指す。
【０１６３】
該組成物は、調合に適した方法および治療上有効な量で投与される。投与する量は、治療する被験対象、被験対象の系が有効成分を利用する能力、所望の治療効果の程度に依存する。投与するために必要な有効成分の正確な量は医師の判断に依存し、各々の個体に独自である。しかし、全身適用のための適切な用量範囲はここで開示されており、投与経路に依存する。適切な投与計画も一定ではないが、初回投与とそれに続く注射または他の投与法による１時間またはそれ以上の間隔での反復投与が代表的である。あるいは、インビボ治療についての規定範囲内の血中濃度を維持するのに十分な持続静脈内注入が考慮される。
【０１６４】
ここで使用するとき、「医薬適合性の」、「生理的に耐容される」、およびそれらの文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合、交換可能に使用され、その物質が実質的なまたは消耗性の毒性副作用を伴わずに投与できることを表わす。
【０１６５】
本発明のモジュレータを含有する医薬上有用な組成物は、医薬適合性の担体の混合などの既知の方法に従って調合できる。そのような担体および調合方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの中に認められる。有効な投与に適した医薬適合性の組成物を形成するために、そのような組成物は有効量のアプタマーを含有する。そのような組成物は、２つ以上のモジュレータの混合物を含有しうる。
【０１６６】
有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢および投与する核酸リガンドの量などの様々な因子によって変化しうる。他の因子として投与方法が含まれる。一般に、組成物は体重に合わせて調節した用量で、例えば約１μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の用量で投与される。
【０１６７】
核酸リガンドのモジュレータは、凝固、Ｅ２Ｆ活性および／または血管新生因子活性（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）を阻害する、またはそのような活性が生じるのを予防することが有益である疾患の治療のために特に有用である。該製薬組成物は、治療上有効な量で、すなわち凝固、Ｅ２Ｆ活性および／または血管新生因子活性（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）の調節応答を生じさせるのに十分な量で、または予防上有効な量で、すなわち凝固因子が凝固カスケードにおいて作用するのを妨げる、Ｅ２Ｆ活性を介した応答を妨げるまたは血管新生因子活性（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）を介した応答を妨げるのに十分な量で投与される。治療上有効な量および予防上有効な量はモジュレータの種類によって異なりうる。該製薬組成物は単回または多回分割用量で投与することができる。
【０１６８】
一般に、本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータは、アンチセンス療法において使用される確立されたプロトコールを用いて投与できる。実施例６で示すデータは、治療用核酸リガンドの活性がヒトまたは他の動物への中和剤オリゴヌクレオチドの静脈内注入によって調節されうることを示唆する。さらに、モジュレータの活性は持続的であるので、ひとたびモジュレータによって核酸リガンドの所望調節レベルが達成されれば、モジュレータの注入を終了することができ、残留モジュレータはヒトまたは動物から清掃される。これは、必要に応じて核酸リガンドによるその後の再治療を可能にする。あるいは、本発明のモジュレータの特異性を考慮して、その後の治療は第二の異なる核酸リガンド／モジュレータ（例えばオリゴヌクレオチド）対を使用することを含みうる。
【０１６９】
ここで開示する方法に従って合成または特定されるモジュレータは、潜在的な毒性を最小限に抑えながら凝固、Ｅ２Ｆおよび／または血管新生因子カスケード（例えばＡｎｇ１またはＡｎｇ２活性）における核酸リガンド活性の最適調節を得るために、常用試験によって決定される適切な用量で単独使用することができる。さらに、他の薬剤の同時投与または連続投与が望ましい場合がある。有効成分が別々の投与剤型である、２つ以上の有効成分による併用治療については、それらの有効成分を同時に投与するか、若しくは各々を別々にずらせた時点で投与することができる。
【０１７０】
本発明のモジュレータを使用する投与計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；および使用する特定モジュレータを含む様々な因子に従って選択される。通常の技術を有する医師は、状態を予防する、対抗するまたは状態の進行を停止させるために必要なアプタマーの有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴わずに効果を生じさせる範囲内のモジュレータ濃度を達成する上で至適正確さを期すためには、標的部位に対するモジュレータのアベイラビリティーの動態に基づく投与計画が必要である。これは、モジュレータの分布、平衡および排出についての配慮を含む。
【０１７１】
本発明の方法において、ここで詳述するモジュレータは有効成分を形成することができ、典型的には、意図する投与形態、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ、坐薬、ゲルなどのために適切に選択された、従来の製薬慣例に合致する適切な製薬希釈剤、賦形剤または担体（ここでは集合的に「担体」と称する）と混合して投与される。
【０１７２】
例えば、錠剤またはカプセルの形態での経口投与に関しては、活性薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口で非毒性の医薬適合性の不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望または必要に応じて、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もその混合物に組み込むことができる。適切な結合剤は、限定を伴わずに、デンプン、ゼラチン、グルコースまたはβ−ラクトースなどの天然糖類、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ろうなどを包含する。これらの剤型において使用する潤滑剤は、限定を伴わずに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、限定を伴わずに、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【０１７３】
液状形態については、活性薬剤成分を、合成および天然ゴム、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどのような適切な着香懸濁防止剤または分散剤と組み合わせることができる。使用できる他の分散剤は、グリセリンなどを包含する。非経口投与に関しては、無菌懸濁液および溶液が望ましい。静脈内投与を所望するときには、一般に適切な防腐剤を含有する等張製剤を使用する。
【０１７４】
活性薬剤成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２パルミチン酸ミリスチルなどのような当分野で周知の様々な担体材料と混合して、例えばアルコール溶液、局所クレンザー、クレンジングクリーム、皮膚ゲル、皮膚ローション、およびクリームまたはゲル製剤のシャンプーを形成することができる。
【０１７５】
本発明の化合物はまた、小さな単層小胞、大きな単層小胞および多重膜小胞などのリポソーム送達システムの形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの様々なリン脂質から形成することができる。
【０１７６】
本発明の化合物はまた、標的可能な薬剤担体としての可溶性ポリマーと結合することができる。そのようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含しうる。さらに、本発明の化合物は、薬剤の制御された放出を達成する上で有用な生分解性ポリマーのクラス、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合することができる（好ましくは共有結合によって）。コレステロールおよび類似分子をアプタマーに結合して、バイオアベイラビリティーを上昇させ、延長させることができる。
【０１７７】
オリゴヌクレオチドモジュレータは直接投与することができる（例えば単独でまたはリポソーム製剤中でまたは担体（例えばＰＥＧ）に複合して）（例えば、米国特許第６，１４７，２０４号、同第６，０１１，０２０号参照）。
【０１７８】
核酸リガンドまたはモジュレータは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非免疫原性高分子量化合物に結合したオリゴヌクレオチドモジュレータから成る場合がある。この実施形態では、核酸リガンド単独に比べてその複合体の薬物動態特性が改善される。上記で論じたように、その結合は、共有結合または非共有結合性相互作用を通して行われうる。一つの実施形態では、共有結合を通してモジュレータをＰＥＧ分子に結合する。また、上述したように、共有結合を用いる場合、ＰＥＧはオリゴヌクレオチドモジュレータ上の様々な位置に結合しうる。好ましい実施形態では、マレイミドまたはビニルスルホン官能基を通してオリゴヌクレオチドモジュレータを５’チオールに結合する。一つの実施形態では、複数のモジュレータを１個のＰＥＧ分子に結合することができる。そのモジュレータは、同じかまたは異なる標的に対してでありうる。同じ核酸リガンドに対して多数のモジュレータが存在する実施形態では、リガンドとの多数の結合相互作用のために結合活性の上昇が存在する。さらなる実施形態では、複数のＰＥＧ分子が互いに結合しうる。この実施形態では、同じ標的または異なる標的に対する１またはそれ以上のモジュレータを各々のＰＥＧ分子に結合することができる。これもまた、その標的に対する各々のモジュレータの結合活性の上昇をもたらす。同じ標的に特異的な多数のモジュレータがＰＥＧに結合している実施形態では、同じ標的間の特異的相互作用を生じさせるために同じ標的を互いに近接させる可能性がある。異なる標的に特異的な多数のモジュレータをＰＥＧに結合する場合は、標的間の特異的相互作用を生じさせるために異なる標的を互いに近接させる可能性がある。さらに、ＰＥＧに結合した同じ標的または異なる標的に対するモジュレータが存在する実施形態では、薬剤もＰＥＧに結合させることができる。従って、そのドムプレックス（ｄｏｍｐｌｅｘ）は、ＰＥＧをリンカーとして使用して、薬剤の標的送達を提供する。
【０１７９】
核酸の治療的使用およびインビボ診断での使用において遭遇する一つの問題は、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、所望の作用を発現する前に、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内および細胞外酵素によって体液中で速やかに分解されうることである。核酸のインビボでの安定性を高めるためまたは核酸の送達を仲介するために、核酸にある種の化学修飾を施すことができる。本発明で考慮される核酸リガンドの修飾は、核酸塩基または全体としての核酸に付加的な電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電的相互作用、および流動性を組み込む他の化学基を提供するものを含むが、それらに限定されない。そのような修飾は、２’位の糖修飾、５位のピリミジンの修飾、８位のプリンの修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、バックボーン修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェートの修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジンとイソグアニジンなどのような異例の塩基対合の組合せを包含するが、それらに限定されない。修飾はまた、キャップ形成のような３’および５’修飾も包含しうる。
【０１８０】
本発明において使用するために本発明のモジュレータと共に製剤することができ、当分野で現在既知のまたは今後開発される様々な手法のいずれかによって製造できる親油性化合物および非免疫原性高分子量化合物。代表的には、これらはリン脂質、例えばジステアロイルホスファチジルコリンから製造され、中性脂質、例えばコレステロールのような他の物質、および正に荷電した（例えばステリルアミン若しくはコレステロールのアミノマンノースまたはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した（例えばジアセチルホスフェート、ホスファチジルグリセロール）化合物のような表面変性剤も含みうる。多重膜リポソームは、従来の手法、すなわち、選択した脂質を適切な溶媒に溶解し、その後溶媒を蒸発させて適切な容器の内壁に薄層を残すことによってまたは噴霧乾燥することによって、脂質を容器の内壁に沈着させて形成することができる。次に水相を渦巻きまたは渦動運動させながら容器に加えて、ＭＬＶを形成させる。その後、ＭＬＶの均質化、音波破砕または押出（フィルターを通して）によってＵＶを形成することができる。さらに、洗浄剤除去手法によってＵＶを形成することができる。
【０１８１】
本発明のある実施形態では、複合体は、リポソームの表面に結合した標的核酸リガンドを含むリポソームおよび被包された治療薬または診断薬を含有する。前形成されたリポソームを、核酸リガンドと結合するように修飾することができる。例えば、陽イオンリポソームは静電的相互作用を通して核酸と結合させる。あるいは、コレステロールなどの親油性化合物に結合した核酸を前形成されたリポソームに加え、それによってコレステロールをリポソームの膜に結合させる。あるいは、リポソームの形成の間に核酸をリポソームに結合させることができる。好ましくは、前形成したリポソームに充填することによって核酸をリポソームに結合する。
【０１８２】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドモジュレータは、オリゴヌクレオチドをコードする配列を含むコンストラクトの投与後にインビボで生産することができる。遺伝子発現のＲＮＡモジュレータの細胞内送達を生じさせるために使用可能な手法が利用できる（一般にＳｕｌｌｅｎｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：６５１２（１９９０）参照）。
【０１８３】
本発明のある種の局面は、下記の非制限的実施例においてより詳細に説明されうる。
【実施例１】
【０１８４】
第ＩＸａ因子に対するアプタマー
ヒト血液凝固性第ＩＸａ因子に対するヌクレアーゼ耐性２’−フルオロピリミジン修飾アプタマーを、国際公開公報第ＷＯ０２２６９３２Ａ２号に述べられているように作製した。８回の反復サイクルの選択を実施し、第ＩＸａ因子に高いアフィニティーを有する１６のアプタマーのファミリーを生成した；ＫＤは３７℃で生理的塩およびｐＨ中０．６ｎＭから１５ｎＭの範囲であった。比較配列分析により、図１に示す、ＲＮＡ９．３ｔ（「ｔ」はトランケートを表わす）と称する最も高いアフィニティーのアプタマーの最小バージョンを予測し、合成することができた。この３４ヌクレオチドのアプタマーは、１１．５ｋＤａの分子量を持ち、完全長配列と基本的に同じアフィニティー（ＫＤ  ０．６ｎＭ）で第ＩＸａ因子に結合する。対照として、内部ループ内の絶対的に保存されたＡがＧに突然変異している、９．３ｔＭと称するＲＮＡ９．３ｔの突然変異型を合成した。このアプタマーは、競合結合アッセイによって測定したときＫＤ＞５μＭで第ＩＸａ因子に結合する。すべての活性アッセイにおいて、ＲＮＡ９．３ｔＭを、この組成のアプタマーによって生じる非特異的作用を測定するための対照として使用する。アプタマー９．３ｔは、第ＶＩＩＩａ因子／第ＩＸａ因子／脂質による第Ｘ因子の活性化を遮断し、また第ＩＸａ因子による合成基質の加水分解も部分的に遮断する。
【０１８５】
第ＩＸａ因子対構造的に類似する凝固因子についての該アプタマーの特異性を調べるため、先に記述されている（Ｒｕｓｃｏｎｉら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８３：８４１−８４８（２０００））直接結合アッセイにおいて第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子およびＡＰＣに対する９．３ｔのアフィニティーを測定した。該アプタマーは、第ＩＸ因子に対してのみ、第ＩＸａ因子よりも〜５倍から５０倍弱く結合する。試験した他のいずれのタンパク質に対しても５μＭまでのタンパク質濃度で有意の結合を示さなかった（結合ＲＮＡ分画＜１０％）。それ故、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子またはＡＰＣに比べて第ＩＸａ因子に対するアプタマー９．３ｔの特異性は＞５０００倍である。
【０１８６】
ＲＮＡ９．３ｔの抗血液凝固効力を測定するため、９．３ｔがヒト血漿の凝固時間を延長させる能力を活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）凝固アッセイにおいて評価した。アプタマー９．３ｔはヒト血漿の凝固時間を用量依存的に延長させることができたが、対照アプタマー９．３ｔＭは凝固時間を延長させなかった（図２）。いずれのアプタマーもＰＴには作用を及ぼさず、第ＩＸａ因子に対するアプタマー９．３ｔの機能的特異性を明らかにし、またこの種のオリゴヌクレオチドが、１μＭまでの濃度で、ヒト血漿の凝固時間を非特異的に延長させないことを示した。それ故、ＲＮＡ９．３は、第ＩＸ因子欠損血漿において認められるのと同様のＡＰＴＴへの最大作用を有する、強力な抗血液凝固薬である。同様の実験をブタ血漿において実施し、同様の効力と特異性を認めた。
【０１８７】
この分子がインビボで第ＩＸ因子／第ＩＸａ因子活性を阻害することができるかどうかを判定するため、このアプタマーがボーラス静脈内注入後に小さなブタ（１．５ｋｇから４ｋｇ）を全身的に抗血液凝固させる能力を試験した。これらの実験のために、試料注入用に静脈内カテーテルを動物の大腿静脈に設置し、血液試料の連続的な採取用に動脈内カテーテルを大腿動脈に設置した。注入前の血液試料を採取し、ＡＣＴ時間をオンサイトで測定し、動物についての基線全血凝固時間を確立した。次に、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）および１．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）の用量のアプタマー９．３ｔ、１．０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）の用量のアプタマー９．３ｔＭまたは賦形剤（ｎ＝３）を静脈内ボーラス注入によって送達した。注入後種々の時点で血液試料を採取し、直ちにＡＣＴを測定した。注入後種々の時点でＡＰＴＴの測定のために追加血液を採取した。図３に示すように、アプタマー９．３ｔは、動物の注入後ＡＣＴの有意の用量依存的延長が明らかにするように、インビボでも第ＩＸａ因子活性を阻害することができたが、対照アプタマー９．３ｔＭまたは賦形剤は第ＩＸａ因子活性を阻害することができなかった。図４に示すように、アプタマー９．３は特に動物のＡＰＴＴを用量依存的に延長させたが、ＰＴは延長させなかった。ＡＰＴＴ実験からのインビトロ用量反応曲線を使用して、注入後の経時的な９．３ｔ血漿中濃度の変化を推定することができる。
【０１８８】
９．３ｔのバイオアベイラビリティーを上昇させる試みとして、このアプタマーの５’コレステロール部分を有する形態を合成し、９．３ｔ−Ｃと称した。コレステロール修飾アプタマーは第ＩＸａ因子に対する高いアフィニティー結合（図５Ａ）と強力な抗凝固活性（図５Ｂおよび５Ｃ）を保持していた。この修飾が９．３ｔ−Ｃと９．３ｔ（各々のアプタマーについてｎ＝２動物）の循環半減期に及ぼすインビボでの影響を、ブタ全身抗血液凝固モデルを用いて試験した。９．３ｔ−Ｃ  ０．５ｍｇ／ｋｇの注入後、動物のＡＣＴは〜１．４倍に延長し、注入後１時間このレベルに維持された（図６Ａ）。図６Ｂは、この実験からの動物のＡＰＴＴとＰＴの分析を示す。２つのアプタマーの抗凝固効力は同様であるが、９．３ｔ−Ｃの抗凝固作用の期間は有意に長い（図６Ｃ）。
【実施例２】
【０１８９】
第ＩＸａ凝固因子と第ＩＸａ因子アプタマーの相互作用を逆転させるオリゴヌクレオチド
９．３ｔの二次構造モデルを図１に示しており、これは図７に示す関連第ＩＸａ因子アプタマー配列の比較配列分析から開発した。これらのデータは、図１に示すステムループ構造の形成を強く支持する。さらに、アプタマー９．３ｔの突然変異分析は、ステム１またはステム２のいずれかの分断が第ＩＸａ因子に対するアフィニティーの１０００倍以上の喪失をもたらすことを明らかにした。それ故、ループ２（図７のＬ２）の５’末端から始まり、アプタマーの３’末端まで伸びる、アプタマー９．３ｔの３’側半分に相補的な１７残基２’Ｏメチルオリゴヌクレオチドを設計した（配列５’ａｕｇｇｇｇａｇｇｃａｇｃａｕｕａ３’）（抗Ｄ１）。この設計は、オリゴヌクレオチドとアプタマーのループ２の間の分子間二重鎖の核形成を可能にする。また、分子間二重鎖の形成が相補的オリゴヌクレオチドの長さと塩基組成の両方によって熱力学的に強化される。この配列のリボヌクレオチド二重鎖は、−２６．０３ｋｃａｌ／ｍｏｌの算定自由エネルギーと７５．４℃の予測Ｔｍを有する。３７℃でのそのような二重鎖の半減期は２４時間を大きく上回るであろう。
【０１９０】
このオリゴヌクレオチドがアプタマー９．３ｔを変性しうるかどうかを調べるため、放射能標識アプタマー９．３ｔ（１２５ｎＭ）を３７℃で１５分間、漸増濃度の「中和剤」オリゴヌクレオチド（等モルから８倍モル過剰まで）と共にインキュベートし（図８の−加熱）、形成された分子間二重鎖の量を未変性ゲル電気泳動（１２％アクリルアミド、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２ｍＭ、１Ｘトリス−ホウ酸緩衝液＋ＣａＣｌ２  ２ｍＭ中で実施）およびそれに続くリン光画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によって視覚化した（図８）。ゲル運動性対照としてオリゴヌクレオチド−アプタマー複合体を作製するため、アプタマーと８倍モル過剰のオリゴヌクレオチドを９５℃で５分間加熱してオリゴヌクレオチドをアプタマー９．３ｔにアニーリングした後、３７℃でインキュベートした（図８の＋加熱）。中和剤オリゴヌクレオチドと同じ塩基組成のナンセンスオリゴヌクレオチドに関して同じセットの実験を実施した（図８のＮ．Ｓ．）。図８からわかるように、オリゴヌクレオチドがアプタマーに対して８倍モル過剰で存在するときのほぼ完全なオリゴヌクレオチド−アプタマー複合体の形成が示すように、中和剤オリゴヌクレオチドはアプタマー９．３ｔを容易に変性する。加えて、加熱ありまたは加熱なしで、アプタマーとナンセンス対照オリゴヌクレオチドの間では複合体が全く認められないことから、この相互作用は非常に特異的である。
【０１９１】
この中和剤オリゴヌクレオチドがアプタマー９．３ｔの抗凝固作用を逆転させうるかどうかを調べるため、９．３ｔ  ５０ｎＭおよび漸増濃度の中和剤オリゴヌクレオチドの存在下でプールヒト血漿のＡＰＴＴを測定した（図９Ａおよび９Ｂ）。この実験では、アプタマー９．３ｔを５分間予備インキュベートしたあと、中和剤オリゴヌクレオチドに加えてアプタマー−第ＩＸ因子複合体を作製し、次に中和剤またはナンセンスオリゴヌクレオチドを加えて、さらに１０分間インキュベーションを続けたあと、ＣａＣｌ２を加えて血餅形成を開始させた。図９Ａおよび９Ｂに示すように、中和剤オリゴヌクレオチドはアプタマー９．３ｔの抗凝固活性の約８０％を有効に逆転させることができる。しかし、この作用を達成するために必要なモル過剰の中和剤オリゴヌクレオチドは、タンパク質の不在下でアプタマーを有効に変性するために必要な量を実質的に上回る。
【実施例３】
【０１９２】
オリゴヌクレオチド中和剤の特異性
オリゴヌクレオチド中和剤の特異性を評価するため、アプタマー９．２０ｔを作製した（図１０Ａ参照）。９．２０ｔのステム１は、ステム２の３’側半分であるので、アプタマー９．３ｔのステム１と同じである。９．２０ｔと９．３ｔの主たる相違はループ２とループ３に認められる（図１と図１０Ａを比較すること）。
【０１９３】
アプタマー９．２０ｔは、９．３ｔと同等のＫＤで第ＩＸａ因子に結合する。ＡＰＴＴアッセイを使用して、ヒト血漿の凝固時間をアプタマー９．２０ｔの濃度の関数として測定した。ヒト血漿におけるそのインビトロ抗凝固効力は９．３ｔと同等であった（図１０Ｂ）。アプタマー９．２０ｔを５０ｎＭの濃度でヒト血漿に加え、５分間血漿第ＩＸ因子と結合させた。次に種々の濃度の中和剤オリゴヌクレオチド抗Ｄ１を加え、血漿への中和剤添加の１０分後にＡＰＴＴを測定した。血漿への９．２０ｔの添加によって生じる凝固時間の相対的変化は、アプタマー９．３ｔに相補的なこの中和剤オリゴヌクレオチドの添加によって影響を受けなかった（図１０Ｃ）。
【実施例４】
【０１９４】
テール付加したアプタマー９．３ｔ
アプタマーの末端に付加した一本鎖「テール」が「中和剤」オリゴヌクレオチドとアプタマーの会合を促進するかどうかを調べるため、３’テールをアプタマー９．３ｔに付加し、テール付加したアプタマーを９．３ｔ−３ＮＴと称した（図１１）。９．３ｔ−３ＮＴの３’テールは３ヌクレオチドの２’Ｏメチル修飾ＲＮＡテールである。アプタマーの活性に影響を及ぼす可能性を低下させ、相補的中和剤オリゴヌクレオチド内の潜在的二次構造を低減するためにこのテール配列を選択した。
【０１９５】
アプタマー９．３ｔ−３ＮＴのアフィニティーを競合結合アッセイにおいて９．３ｔと比較した（図１２Ａ）。第ＩＸａ因子に対するアプタマー９．３ｔ−３ＮＴのアフィニティーは９．３ｔと同等であった（ＫＤ１．５ｎＭまたはそれ以下）。ＡＰＴＴアッセイを使用して、ヒト血漿の凝固時間をアプタマー９．３ｔ−３ＮＴおよび９．３ｔの濃度の関数として測定した（図１２Ｂ）。アプタマーの抗凝固活性は同様であり、どちらのアプタマーもヒト血漿における第ＩＸ因子活性を完全に阻害することができた。
【０１９６】
アプタマー９．３ｔ−３ＮＴを５０ｎＭの濃度でヒト血漿に加え（ＡＰＴＴの〜３倍上昇）、５分間血漿第ＩＸ因子と結合させた。次に種々の濃度の中和剤オリゴヌクレオチド（図１１参照）を加え、血漿への中和剤添加の１０分後にＡＰＴＴを測定した（図１３Ａ）。中和剤オリゴヌクレオチドによって逆転される抗凝固活性の分画は、アプタマー単独の存在下でのＡＰＴＴとアプタマー＋中和剤の存在下でのＡＰＴＴの差をアプタマー単独の存在下での基線に対するＡＰＴＴの変化で除したものである（０＝影響なし、１＝完全な逆転）。試験した相補的中和剤オリゴヌクレオチドの各々が、ヒト血漿への添加から１０分以内にアプタマー９．３ｔ−３ＮＴの抗凝固活性の＞９０％を逆転させることができ、ＡＳ３ＮＴ−３は最も強力な逆転作用を示した（図１３Ｂ）。この逆転作用は、ヒト血漿へのヘパリン添加後のＡＰＴＴ上昇を逆転させるプロタミンの能力と同等である。
【０１９７】
中和剤オリゴヌクレオチドＡＳ３ＮＴ−３による９．３ｔ−３ＮＴの抗凝固作用の逆転を、中和剤オリゴヌクレオチド抗Ｄ１による９．３ｔの抗凝固作用の逆転と比較した。アプタマーへのテールの付加は、アプタマーの３’テールに相補的な配列を有する中和剤オリゴヌクレオチドによる逆転の効率を上昇させる（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１９８】
上記に加えて、アプタマー９．３ｔを標的し、インビトロでヒト血漿におけるその抗凝固作用を逆転させるのに有効な下記のオリゴヌクレオチドモジュレータを生産した（すべて２’Ｏメチルオリゴヌクレオチドである）：
【０１９９】
【化４】
2005502596.tif 000005
【０２００】
下記のオリゴヌクレオチドモジュレータは、アプタマー９．３ｔおよび９．３ｔ−３ＮＴを標的し、インビトロでヒト血漿におけるその抗凝固作用を逆転させるのに有効である（すべて２’Ｏメチルオリゴヌクレオチドである）：
【０２０１】
【化５】
2005502596.tif 000006
【０２０２】
下記のオリゴヌクレオチドモジュレータは、アプタマー９．３ｔまたはアプタマー９．３ｔ−３ＮＴのいずれかを標的し、これらのアプタマーに対する調節オリゴヌクレオチドの設計の特定局面を試験するために設計された突然変異型オリゴヌクレオチドである（すべて２’Ｏメチルオリゴヌクレオチドである）：
【０２０３】
【化６】
2005502596.tif 000007
【実施例５】
【０２０４】
アプタマー９．３ｔに対する中和剤オリゴヌクレオチド
中和剤オリゴヌクレオチド５−２Ｃ（５’ＣＧＣ  ＧＧＵ  ＡＵＡ  ＧＵＣ  ＣＣＣ  ＡＵ）は、インビトロでヒト血漿においてアプタマー９．３ｔおよびＰｅｇ−９．３ｔの活性を有効に逆転させることを示したが、この中和剤オリゴヌクレオチドのスクランブル型、５−２Ｃｓｃｒはアプタマー活性の逆転を示さなかった。Ｐｅｇ−９．３ｔは、リンカーを通してその５’末端に付加された４０ＫＤａポリエチレングリコールを有する９．３ｔである。
【０２０５】
これらの実験では、アプタマーを血漿に添加し（９．３ｔ  ５０ｎＭ、Ｐｅｇ−９．３ｔ  １２５ｎＭ）、５分間インキュベートした。その後中和剤オリゴヌクレオチドを加え、中和剤の添加から１０分後にＡＰＴＴアッセイを開始した。その結果を図１５に示す。
【実施例６】
【０２０６】
中和剤オリゴヌクレオチドによるアプタマー９．３ｔの制御の迅速性と持続性
アプタマー９．３ｔまたはＰｅｇ−９．３ｔを、９．３ｔについては５０ｎＭ、Ｐｅｇ−９．３ｔについては１２５ｎＭの最終濃度で、インビトロでヒト血漿に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。その後表示されているモル過剰の中和剤オリゴヌクレオチド５−２Ｃを加えて、中和剤の添加後表示された時点でＡＰＴＴアッセイにおいて凝固時間を測定することにより、残留アプタマー活性を測定した。％残留抗凝固活性は、１−（Ｔアプタマー単独−Ｔアプタマー＋中和剤）対（Ｔアプタマー単独−Ｔ基線地）の比率×１００［式中、Ｔ＝ＡＰＴＴ凝固時間］に等しい。
【０２０７】
中和剤オリゴヌクレオチド５−２ＣによるＰｅｇ−９．３ｔの抗凝固作用の不活性化の期間をヒト血漿においてインビトロで測定した。簡単に述べると、Ｐｅｇ−９．３ｔをヒト血漿に加えて最終濃度１２５ｎＭとし、５分間インキュベートした。次に中和剤オリゴヌクレオチド５−２Ｃを１０倍モル過剰で加えるか、若しくは平行実験において中和剤オリゴヌクレオチドの代わりに緩衝剤を単独で加え、中和剤添加後様々な時点でＡＰＴＴアッセイにおいて凝固時間を測定した。％残留抗凝固活性を上記のように測定した。各時点での基線凝固時間を確立するため、未処置ヒト血漿のＡＰＴＴも平行して測定した。３７℃で５時間のインキュベーション後、未処置血漿のＡＰＴＴが上昇し始め、血漿の血餅形成活性の喪失を示唆し、それ故５時間目で実験を中止した。
【０２０８】
図１６および１７に示すデータは、中和剤オリゴヌクレオチドを使用して、第ＩＸａ因子拮抗物質アプタマー９．３ｔおよびその誘導体の抗凝固作用を迅速且つ持続的に制御する能力を明らかにしている。同時にこれらのデータは、中和剤の作用の発現が速やかであること、中和剤が作用するために必要な時間は、少なくとも一部には中和剤の濃度に依存すること、およびひとたび中和剤がアプタマーを不活性化すれば、この作用は持続的であることを明らかにしている。
【実施例７】
【０２０９】
血液凝固性第Ｘａ因子に対するアプタマーの中和剤オリゴヌクレオチド
図１８Ａに示されているのは、ヒト血漿においてインビトロで強力な抗血液凝固剤である、血液凝固性第Ｘａ因子に対するアプタマー（１１Ｆ７ｔと称する）である。図１８Ｂに示されているのは、１１Ｆ７ｔＭと称する、アプタマー１１Ｆ７ｔの突然変異型である。図１８Ｂに示す位置の同一性の変化は、血液凝固性第Ｘａ因子についての突然変異型アプタマーのアフィニティーの＞１３００倍の喪失を導く。様々な濃度のアプタマー１１Ｆ７ｔおよび１１Ｆ７ｔＭをインビトロでヒト血漿に加え、ＰＴ（図１９Ａ）またはＡＰＴＴアッセイ（図１９Ｂ）において凝固時間を測定した。図１９において、点線は、正常血漿レベルの１０％または１％未満の第Ｘ因子を含む血漿の凝固時間の相対的変化を示しており、アプタマー１１Ｆ７ｔの強力な抗血液凝固作用を明らかにしている。すべてのデータはその日の基線に対して、１の値＝凝固時間の変化となるように、基準化した。アプタマー１１Ｆ７ｔはまた、第Ｘａ因子阻害因子に関して予想されるように、ＰＴ凝固アッセイにおいて検定したときヒト血漿の強力な抗血液凝固因子である。突然変異型アプタマー、１１Ｆ７ｔＭは、ＰＴまたはＡＰＴＴアッセイのいずれにおいても抗凝固作用を示さなかった。
【０２１０】
下記の中和剤オリゴヌクレオチドを、ヒト血漿においてインビトロでアプタマー１１Ｆ７ｔの抗凝固作用を逆転させる能力に関してスクリーニングした：
【０２１１】
【化７】
2005502596.tif 000008
図２０は、これらの中和剤オリゴヌクレオチドが相補的である１１Ｆ７ｔの配列を示す。図２１Ａに示すように、中和剤オリゴヌクレオチドはヒト血漿においてアプタマー１１Ｆ７ｔの活性を有効に逆転させる。これらの実験では、アプタマーを血漿に加えて（最終濃度１２５ｎＭ）、５分間インキュベートした。次に中和剤オリゴヌクレオチドを加え、中和剤の添加から１０分後にＡＰＴＴアッセイを開始した。上述した中和剤オリゴヌクレオチドに加えて、下記の配列もアプタマー１１Ｆ７ｔに対して中和作用を有することが認められた：
【０２１２】
【化８】
2005502596.tif 000009
図２１Ｂは、中和剤５−２のより大きな濃度範囲にわたる中和剤５−２の特性指摘、および中和剤５−２のスクランブル配列型、５−２ｓｃｒの中和活性との比較を示す。データは、中和剤５−２の強力な逆転作用、およびＡＯ５−２ｓｃｒに逆転作用がないことが示すように、中和剤オリゴヌクレオチド活性の特異性を明らかにしている。
【０２１３】
図２２および２３は、中和剤オリゴヌクレオチドを使用して、第Ｘａ因子拮抗物質アプタマー１１Ｆ７ｔおよびその誘導体の抗凝固作用を迅速且つ持続的に制御する能力に関するものである。同時にこれらのデータは、中和剤の作用の発現が速やかであること（図２２）、中和剤が作用するために必要な時間は、少なくとも一部には中和剤の濃度に依存すること（図２２）、およびひとたび中和剤がアプタマーを不活性化すれば、この作用は持続的であること（図２３）を明らかにしている。同じこれらのデータは、中和剤オリゴヌクレオチドがヒトまたは他の動物に静脈に注入できること、中和剤オリゴヌクレオチドを使用することは治療的アプタマーの活性を調節するための潜在的な方法であることを示唆している。さらに、中和剤の作用は持続的であるので、ひとたび中和剤によってアプタマーの所望の調節レベルが達成されれば、中和剤の注入を終了して、残留中和剤をヒトまたは動物から清掃することができる。これは、必要に応じてその後のアプタマーによるヒトまたは動物の再治療を可能にする。
【実施例８】
【０２１４】
アプタマー中和剤対の独立機能
アプタマー−中和剤対（アプタマー９．３ｔとその中和剤ＡＯ５−２ｃおよびアプタマー１１Ｆ７ｔとその中和剤ＡＯ５−２）が互いに独立して機能することを明らかにするため、図２４に示すように３７℃のヒト血漿にアプタマーを加え、５分間インキュベートした。次に中和剤を加え、中和剤添加から１０分後にＡＰＴＴアッセイにおいて凝固作用を測定した。すべてのアッセイにおいて、１つのアプタマーまたは中和剤だけを血漿に加える場合には、緩衝液単独をアプタマーまたは中和剤の代用とした。すべてのデータはその日の基線に、１の値＝凝固時間の変化なしとなるように、基準化してある。
【０２１５】
試料Ａｐｔ１＆２＋ＡＤ１をＡｐｔ１単独と比較し、試料Ａｐｔ１＆２＋ＡＤ２をＡｐｔ２単独と比較すると（図２４参照）、中和剤の逆転作用は標的アプタマーに特異的であり（例えばＡＤ１の存在下でＡｐｔ２活性の喪失は存在せず、逆もまた同様である）、中和剤の活性が第二のアプタマーの存在によって有効に変化しなかったことは明らかである。
【０２１６】
これらの結果は２つの重要な意味を持つ。第一に、患者に核酸リガンド（例えば９．３ｔ）を投与することは対合する中和剤でその核酸リガンドを逆転させうること、およびその後第二の核酸リガンドで患者を再治療しうることを明らかにしている。第二に、それらの結果は、標的確認のためおよび生化学経路の検討のための核酸リガンド−中和剤対の有用性を明らかにしている。中和剤は、核酸リガンドによる標的タンパク質の阻害後に認められる応答が、そのタンパク質を特異的に阻害することによるものであることを判定することを可能にする。さらに、中和剤は、標的タンパク質への核酸リガンドの結合がタンパク質の代謝回転を導くかどうかを判定することを可能にする。例えば、中和剤を添加したとき完全なタンパク質活性が回復される場合、核酸リガンド結合の結果としてタンパク質濃度には正味の変化がなかったことを裏付ける。
【実施例９】
【０２１７】
アプタマーＰＥＧ−９．３ｔおよび中和剤５−２Ｃは、ヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）を有する患者からの血漿において機能する
ヘパリンの抗血液凝固作用をプロタミンで制御できることは、術後出血の危険性が高い、高レベルの抗血液凝固薬を必要とする手術を受ける患者のより安全な治療を可能にする。しかし、ヘパリンを摂取する患者の〜３％から５％がヘパリン誘導性血小板減少症（ＨＩＴ）と称される薬剤誘導性の免疫応答を発現し、これは、これらの患者のヘパリンによるその後の治療を禁忌にする（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７９：１−７（１９９８））。この疾患は、血小板数の減少と、新たなまたは再発性の生命および四肢を脅かす血栓塞栓症の高い危険度によって特徴付けられる（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７９：１−７（１９９８））。いくつかの代替的な抗血液凝固薬が使用可能であるが、これらの抗凝固薬のいずれもが逆転薬によって制御することができない。このことは、ＨＩＴの患者にとっての治療の選択肢を有意に制限しており、治療を受けている間の出血合併症や再発性血栓塞栓症は一般的である（Ｇｒｅｉｎａｃｈｅｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９：７３−８０（１９９９）、Ｌｅｗｉｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１８３８−１８４３）（２０００）。それ故、ＨＩＴを有する６名の患者からの血漿試料において抗血液凝固薬−中和剤対として働くアプタマーＰＥＧ−９．３ｔと中和剤５−２Ｃの能力を検討した。前記６名の患者のうち３名は血液透析を必要とする、従って抗血液凝固薬の反復投与を必要とする末期腎疾患を有しており、また３名は抗凝固薬治療を必要とする血栓塞栓性合併症を有していた。（血清学的判定基準は、ヘパリン誘導性血小板凝集アッセイ陽性（Ｏｒｔｅｌら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６７：２９２−２９６（１９９２））および／またはＥＬＩＳＡ（ＧＴＩ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｏｋｉｆｉｅｌｄ，ＷＩ）によって検出される高いヘパリン／血小板第４因子抗体レベルを包含した。５名の患者が臨床および血清学的判定基準の両方に適合した；１名の患者は臨床判定基準を満たしていたが、血清検査が陰性であった。）アプタマーＰＥＧ−９．３ｔは６名の患者全員からの血漿のＡＰＴＴ凝固時間を延長させ、中和剤５−２はこの抗凝固作用を各々の患者の治療前の基線まで有効に逆転させることができた（図２５）。重要な点として、２名の患者は試料を採取した時点で抗凝固薬治療を受けているところであり（患者３はダナプロイドナトリウム、患者６はワルファリン）、これらの患者からの血漿へのＰＥＧ−９．３ｔの添加は治療基線に比べて凝固時間を上昇させ、中和剤５−２Ｃはこの応答を逆転させて治療基線にもどし、患者血漿においてこの薬剤−中和剤対が「作用中の（ｏｎ  ｂｏａｒｄ）」抗血液凝固薬とは独立して機能しうることを明らかにした。加えて、これらの患者の血漿試料を対照アプタマー９．３ｔＭおよび中和剤５−２Ｃで処置すると凝固時間の上昇は生じず、アプタマーまたは中和剤の組成物のオリゴヌクレオチドが生得的に有意の抗血液凝固活性を有するわけではないことをさらに示唆した。
【０２１８】
アプタマー１１Ｆ７ｔおよびその対応する中和剤５−２がＨＩＴを有する２名の患者からの血漿試料において抗凝固薬−中和剤対として働く能力。前記２名の患者のうち１名は血液透析を必要とする、従って抗血液凝固薬の反復投与を必要とする末期腎疾患を有しており、１名は抗凝固薬治療を必要とする血栓塞栓性合併症を有していた。アプタマー１１Ｆ７ｔは両方の患者からの血漿のＡＰＴＴ凝固時間を延長させ、中和剤５−２はこの抗凝固作用を各々の患者の治療前の基線まで有効に逆転させることができた（図２６）。重要な点として、これら２名の患者は試料を採取した時点で抗凝固薬治療を受けているところであり（患者３はダナプロイドナトリウム、患者６はワルファリン）、これらの患者からの血漿への１１Ｆ７ｔの添加は治療基線に比べて凝固時間を上昇させ、中和剤５−２はこの応答を逆転させて治療基線にもどし、患者血漿においてこの薬剤−中和剤対が「作用中の（ｏｎ  ｂｏａｒｄ）」抗血液凝固薬とは独立して機能しうることを明らかにした。加えて、これらの患者の血漿試料を対照アプタマー９．３ｔＭおよび中和剤５−２で処置すると凝固時間の上昇は生じず、アプタマーまたは中和剤の組成物のオリゴヌクレオチドが生得的に有意の抗血液凝固活性を有するわけではないことをさらに示唆した。
【０２１９】
上記で引用したすべての資料は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】ＦＩＸａアプタマー９．３ｔ（配列番号１）を示す。プリン基はすべて２’−ヒドロキシル基であり、ピリミジン基はすべて２’−フルオロヌクレオチドである。
【図２】アプタマー９．３ｔの抗血液凝固活性を示す。血液凝固時間の増加は、アプタマー不在下での基準血液凝固時間に対して標準化してある。
【図３】アプタマー注射後のブタのＡＣＴ変化を示す。データは、注射前の基準値に対して標準化してある。
【図４】アプタマー注射後のブタの血液凝固時間変化を示す。
【図５Ａ】コレステロール修飾されたアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビトロ阻害活性を示す。コレステロールの添加は、ＦＩＸａに対する９．３ｔ−Ｃのアフィニティーに対して適度の作用を有する。競合結合アッセイを用いて、ＦＩＸａに対する９．３ｔ−Ｃのアフィニティーを測定する。
【図５Ｂ】コレステロール修飾されたアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビトロ阻害活性を示す。ヒト血漿におけるアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビトロでの抗血液凝固活性。
【図５Ｃ】コレステロール修飾されたアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビトロ阻害活性を示す。ブタ血漿におけるアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビトロでの抗血液凝固活性。
【図６Ａ】アプタマー９．３ｔ−Ｃのインビボ抗血液凝固活性を示す。ＩＶ大量瞬時投与後のブタにおけるアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビボ抗血液凝固活性、ＡＣＴアッセイ（点線は、図３の０．５ｍｇ／ｍｌにおける９．３ｔ  ＡＣＴデータ）。
【図６Ｂ】アプタマー９．３ｔ−Ｃのインビボ抗血液凝固活性を示す。ＩＶ大量瞬時投与後のブタにおけるアプタマー９．３ｔ−Ｃのインビボ抗血液凝固活性、ＡＰＴＴアッセイおよびＰＴアッセイ（図４の０．５ｍｇ／ｋｇの９．３ｔ）。
【図６Ｃ】アプタマー９．３ｔ−Ｃのインビボ抗血液凝固活性を示す。ＩＶ大量瞬時投与後長時間にわたる９．３ｔ−Ｃ対９．３ｔのインビボにおける血漿中濃度。濃度は、各アプタマーに対するＡＰＴＴアッセイのインビトロにおける用量応答曲線からの補間によって計算した。
【図７】最小ＦＩＸａアプタマー（配列番号２から配列番号１７）のアラインメントを示す。小文字で表した配列は、ＳＥＬＥＸ法で使用したライブラリーの固定領域に由来するものであり、大文字で表した配列は、ＳＥＬＥＸ法で使用したライブラリーの任意領域に由来するものである。Ｓ＝ステム、Ｌ＝ループ
【図８】中和剤オリゴヌクレオチドのアプタマー９．３ｔへの結合の未変性ゲル解析を示す。中和剤オリゴヌクレオチドがアプタマー９．３ｔに結合して、これを変性できるかを未変性ゲルによって調べた。要するに、放射性標識した９．３ｔ（１２５ｎＭ）を、（左から右へ）８倍、４倍、２倍過剰モルの、または等モル量の中和剤オリゴヌクレオチド（Ａ．Ｓ．）またはナンセンスオリゴヌクレオチド（Ｎ．Ｓ．）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。
【図９Ａ】ヒト血漿におけるアプタマー９．３ｔの抗血液凝固活性の中和剤オリゴヌクレオチドによる逆転を示す。中和剤オリゴヌクレオチドまたはナンセンスオリゴヌクレオチドに対する血液凝固時間の変化。１．０という値は、基準値に対して血液凝固時間が変化していないことを意味する。９．３ｔＭは、抗血液凝固活性を持たないアプタマー９．３ｔの変異型である。
【図９Ｂ】ヒト血漿におけるアプタマー９．３ｔの抗血液凝固活性の中和剤オリゴヌクレオチドによる逆転を示す。過剰モルの中和剤オリゴヌクレオチドに対して逆転したアプタマー９．３ｔの抗血液凝固活性の画分。
【図１０Ａ】オリゴヌクレオチド中和剤の特異性を示す。アプタマー９．２０ｔ（配列番号１８）の最小二次構造。
【図１０Ｂ】オリゴヌクレオチド中和剤の特異性を示す。アプタマー９．２０ｔの抗血液凝固活性。
【図１０Ｃ】オリゴヌクレオチド中和剤の特異性を示す。中和剤オリゴヌクレオチド抗Ｄ１の特異性。
【図１１】末端を切り取ったアプタマー９．３ｔ−３ＮＴ（配列番号１９）の二次構造を示す。中和剤オリゴヌクレオチド（配列番号２０から配列番号２２）も示されている。
【図１２Ａ】アプタマー９．３ｔ−３ＮＴの活性を示す。競合的結合のデータ。
【図１２Ｂ】アプタマー９．３ｔ−３ＮＴの活性を示す。インビトロ抗血液凝固のデータ。
【図１３Ａ】アプタマー９．３ｔ−３ＮＴの抗血液凝固活性のインビボにおける逆転を示す。中和剤オリゴヌクレオチドの濃度に対する抗血液凝固活性のインビボにおける逆転。
【図１３Ｂ】アプタマー９．３ｔ−３ＮＴの抗血液凝固活性のインビボにおける逆転を示す。アプタマーに対する中和剤オリゴヌクレオチドのモル過剰に対するインビボにおける逆転。
【図１４Ａ】ＦＩＸａアプタマー９．３ｔにテールを付加した場合の抗血液凝固活性逆転能力に対する影響。
【図１４Ｂ】ＦＩＸａアプタマー９．３ｔにテールを付加した場合の抗血液凝固活性逆転能力に対する影響。
【図１５】中和剤オリゴヌクレオチド５−２Ｃのスクランブル型である５−２Ｃｓｃｒではない、中和剤オリゴヌクレオチド５−２Ｃが、ヒト血漿において効果的にアプタマー９．３ｔおよびＰｅｇ−９の活性を逆転する。
【図１６】実施例６に記載されたところのヒトの血漿における中和活性のキネティクス
【図１７】実施例６に記載されたところのインビトロでの中和活性持続時間
【図１８Ａ】ヒト凝固因子Ｘａに約１．５ｎＭのＫＤ値で結合するアプタマー１１Ｆ７ｔ（配列番号２３）の推定二次構造。変異型アプタマー１１Ｆ７ｔ（配列番号２４）の推定二次構造。
【図１８Ｂ】１１Ｆ７ｔＭと名付けられた変異型アプタマー１１Ｆ７ｔ（配列番号２４）の推定二次構造。
【図１９Ａ】アプタマー１１Ｆ７ｔはヒト血漿の強力な凝固因子である。さまざまな濃度のアプタマー１１Ｆ７ｔをインビトロにおいてヒト血漿に加えて、ＰＴアッセイ法で測定した。すべてのデータをその日の基準値に対して血液凝固時間に変化のない場合数値１となるように標準化した。
【図１９Ｂ】アプタマー１１Ｆ７ｔはヒト血漿の強力な凝固因子である。さまざまな濃度のアプタマー１１Ｆ７ｔをインビトロにおいてヒト血漿に加えて、ＡＰＴＴアッセイ法で測定した。すべてのデータをその日の基準値に対して血液凝固時間に変化のない場合数値１となるように標準化した。
【図２０】中和剤オリゴが相補性をもつ１１Ｆ７ｔの配列。
【図２１Ａ】中和剤オリゴヌクレオチドはヒト血漿においてアプタマー１１Ｆ７ｔの活性を効果的に逆転する。
【図２１Ｂ】より広い濃度範囲にわたる中和剤５−２の中和活性の特徴、および中和剤５−２のスクランブル配列型５−２ｓｃｒの中和活性との比較。
【図２２】ヒト血漿における中和活性のキネティクス。アプタマー１１Ｆ７ｔをインビトロにおいて最終濃度１２５ｎＭとなるようヒト血漿に加え、３７℃で５分間インキュベートした。中和剤オリゴヌクレオチド５−２を１：１、または５：１のモル過剰となるよう加えてから、または中和剤を加えずに、図中に示した時間毎にＰＴアッセイ法で血液凝固時間を測定して血漿の血液凝固活性を決定した。残っている残留抗血液凝固活性割合（％）は、各時点において、血液凝固時間の中和剤存在下における基準値に対する差と、中和剤不在下における基準値に対する差とを比較して計算した。抗血液凝固活性の逆転が最初の時点（１分後）で完了していたため、アプタマー１１Ｆ７ｔに対し中和剤５−２が５：１のモル過剰の場合に集められたデータは図に示されていない。
【図２３】インビトロにおける中和活性の持続。中和剤オリゴヌクレオチド５−２によるアプタマー１１Ｆ７ｔの抗血液凝固活性の不活性化作用の持続時間をヒト血漿においてインビトロで測定した。要約すると、アプタマー１１Ｆ７ｔをインビトロにおいて最終濃度１２５ｎＭとなるようヒト血漿に加え、５分間インキュベートした。次いで、４倍のモル過剰になるよう中和剤オリゴヌクレオチド５−２を加えるか、または、並行実験においては中和剤オリゴの代わりにバッファーのみを加えて、中和剤を添加した後さまざまな時点においてＰＴアッセイ法で血液凝固時間を測定した。すべてのデータをその日の基準値に対して血液凝固時間に変化のない場合数値１となるように標準化した。３７℃で５時間インキュベートした後非処理血漿のＰＴが上昇し始めることが発見され、血漿の血液凝固塊形成活性が失われたことを示した。このため、実験を５時間で終了させた。
【図２４】ヒト血漿における、アプタマー９．３ｔおよび１１Ｆ７ｔ、ならびに相互に独立のそれぞれの中和剤の活性。Ａｐｔ１＝９．３ｔ（３０ｎＭ）、Ａｐｔ２＝１１Ｆ７ｔ（１００ｎＭ）、ＡＤ１＝ＡＯ  ５−２ｃ（３００ｎＭ）、ＡＤ２＝ＡＯ５−２（５００ｎＭ）。（  ）内は血漿における最終濃度。表示されている通りに３７℃でアプタマーをヒト血漿に加え、５分間インキュベートした。そして、表示されている通りに中和剤を加え、中和剤を加えてから１０分後にＡＰＴＴアッセイ法で血液凝固活性を測定した。全てのアッセイにおいて、１種類のアプタマーまたは中和剤だけを血漿に加える場合には、バッファーのみをアプタマーまたは中和剤の代わりとした。全てのデータを、その日の基準値に対して、数値１は血栓時間に変化がないことを表すように、標準化してある。
【図２５Ａ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴと診断された血液透析依存患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。
【図２５Ｂ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴと診断された血液透析依存患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。
【図２５Ｃ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴと診断された血液透析依存患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。
【図２５Ｄ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴの血栓塞栓性合併症を患う患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。血漿試料は以下の通り処理した。アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔ；中和剤、１．２５μＭ  ＡＯ  ５−２；変異型アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔＭ。実験は、実施例２、図９に記載されているようにして実施した。データは秒単位（ｓ）で報告され、反復測定した結果の平均±レンジである。
【図２５Ｅ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴの血栓塞栓性合併症を患う患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。血漿試料は以下の通り処理した。アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔ；中和剤、１．２５μＭ  ＡＯ  ５−２；変異型アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔＭ。実験は、実施例２、図９に記載されているようにして実施した。データは秒単位（ｓ）で報告され、反復測定した結果の平均±レンジである。
【図２５Ｆ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴの血栓塞栓性合併症を患う患者由来の血漿で、アプタマーＰｅｇ−９．３ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。血漿試料は以下の通り処理した。アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔ；中和剤、１．２５μＭ  ＡＯ  ５−２；変異型アプタマー、１２５ｎＭ  Ｐｅｇ−９．３ｔＭ。実験は、実施例２、図９に記載されているようにして実施した。データは秒単位（ｓ）で報告され、反復測定した結果の平均±レンジである。
【図２６Ａ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴと診断された血液透析依存患者およびＨＩＴの血栓塞栓性合併症を患う患者に由来する血漿で、アプタマー１１Ｆ７ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。患者３について、血漿試料は以下の通り処理した。アプタマー、２５０ｎＭ  １１Ｆ７ｔ；中和剤、１．０μＭ  ＡＯ  ５−２；変異型アプタマー、２５０ｎＭ  ９．３ｔＭ。実験は、実施例２、図９に記載されているようにして実施した。
【図２６Ｂ】ヘパリン起因性血小板減少症患者由来の血漿の中和剤制御による抗血液凝固。ＨＩＴと診断された血液透析依存患者およびＨＩＴの血栓塞栓性合併症を患う患者に由来する血漿で、アプタマー１１Ｆ７ｔおよび中和剤５−２の活性を検査した。患者６について、血漿試料は以下の通り処理した。アプタマー、１２５ｎＭ  １１Ｆ７ｔ；中和剤、２５０ｎＭ  ＡＯ  ５−２；変異型アプタマー、１２５ｎＭ  ９．３ｔＭ。データは秒単位（ｓ）で報告され、反復測定した結果の平均±レンジである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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