(57)【要約】本発明は、カスパーゼ９を活性化するための方法であって、カスパーゼ９のモジュレーターを見出すためのアッセイにおいて使用されうる方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カスパーゼ９活性を調節する化合物を同定するための方法であって、以下の：
ａ）  カスパーゼ９またはその酵素活性を有するフラグメントを含むサンプルを、試験化合物およびコスモトロピック薬剤と接触させること；および
ｂ）  カスパーゼ９またはフラグメントの活性を検出することを含み、ここに活性の変化がカスパーゼ９活性を調節する化合物を示す、方法。
【請求項２】
前記調節がカスパーゼ９活性の阻害を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記活性が、結合アッセイを用いて検出される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記活性が、基質の代謝回転数を測定することによって検出される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記基質が、カスパーゼ９によって切断される部位を含み、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドからなる群より選択される、請求項４の方法。
【請求項６】
基質がLEHD (配列番号5)、WEHD (配列番号4)、DEVD (配列番号1)、ZEVDおよびYVAD (配列番号7)からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
前記基質が蛍光発生基質である、請求項４の方法。
【請求項８】
前記蛍光発生基質が、LEHD-AMC (配列番号5)、WEHD-AMC (配列番号4)、DEVD-AMC (配列番号1)、ZEVD-AMC、YVAD-AMC (配列番号7)、LEHD-AFC (配列番号5)、WEHD-AFC (配列番号4)、DEVD-AFC (配列番号1)、ZEVD-AFC、およびYVAD-AFC (配列番号7)からなる群より選択される標識ペプチドを含む、請求項７の方法。
【請求項９】
前記サンプルが細胞溶解物を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、酵素活性を有するカスパーゼ９活性のフラグメントを含む、請求項１の方法。
【請求項１１】
薬剤がホフマイスター系列イオンである、請求項１の方法。
【請求項１２】
薬剤が、サルフェート、ホスフェート、アセタート、シトラートからなる群より選択されるナトリウム塩である、請求項１の方法。
【請求項１３】
薬剤が、サルフェート、ホスフェート、アセタート、シトラートからなる群より選択されるアンモニウム塩である、請求項１の方法。
【請求項１４】
薬剤がクエン酸塩である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
薬剤がクエン酸塩である、請求項１３の方法。
【請求項１６】
カスパーゼ９のプロセシングの阻害剤または促進剤を同定するための方法であって、以下の：
ａ）  プロカスパーゼ９またはその切断部位を含有するフラグメントを含むサンプルを、プロカスパーゼ９のプロセシング能を有するタンパク質と、少なくとも１つの候補阻害剤または候補促進剤と接触させること；および
ｂ）  大または小カスパーゼ９サブユニットの存在を検出し、それによってプロカスパーゼ９プロセシングのレベルを測定することを含み、ここに、プロセシングの減少がカスパーゼプロセシング阻害剤の存在を示し、プロセシングの増大がカスパーゼプロセシング促進剤の存在を示すものである、方法。
【請求項１７】
プロカスパーゼ９のプロセシング能を有するタンパク質がCPP32である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
プロカスパーゼ９のプロセシング能を有するタンパク質がグランザイムＢである、請求項１６の方法。
【請求項１９】
カスパーゼ９の大および小サブユニットの検出がゲル電気泳動による、請求項１６の方法。
【請求項２０】
サンプルが、さらにクエン酸塩を含む、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、分子医学および薬剤スクリーニングアッセイ、より具体的には、プログラム細胞死の調節に関与する相互作用、およびかかる相互作用を変化させる薬剤の同定方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
アポトーシス、またはプログラム細胞死は、シー・エレガンス（C. elegans）からヒトに至るまでの多細胞生物の細胞にとって、重要なライフサイクルの決定点である。それは正常な胚発生や成長、恒常性の維持、免疫系機能において重要なプロセスである。アポトーシスの調節および開始は、複合的かつ複雑に調節される過程であり、この機能の多様性と一致する。デスドメインスーパーファミリーは、デスシグナルを伝達するのに必要な相互作用の最初のメディエーターとして明らかになった。このスーパーファミリーは、デスドメイン（DD）、デスエフェクタードメイン（DED）、およびカスパーゼリクルートメントドメイン（CARD）ファミリーからなる。これらのファミリーはそれぞれ、CARDCARD、DDDDおよびDEDDED接触を限定的に形成する同型相互作用を通じて他のタンパク質と相互作用する。
【０００３】
カスパーゼはアポトーシスの主たる死刑執行人（executioner）であり、エフェクターカスパーゼとともにポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）のごとき必須のタンパク質を切断し、（阻害物質ICADの切断によって）CADのごとき内在性エンドヌクレアーゼを活性化する。カスパーゼ８および９のごとき上流カスパーゼは、細胞死誘導シグナル伝達複合体（death-inducing signaling complex）（DISC）およびアポプトソームのごときシグナル伝達複合体によって、それぞれ活性化される。CARDまたはDEDドメインを介した特定のアダプター分子へのカスパーゼの結合によって、カスパーゼの自己活性化が起こる。例えば、アポプトソームはApaf-1、カスパーゼ９およびシトクロームｃからなり、この構造内で、Apaf-1はCARDCARD相互作用を介してプロカスパーゼ９と相互作用する。Apaf-1に結合したシトクロームｃは複合体を活性化し、プロカスパーゼ９の動員および自己活性化を可能とする。活性複合体は700 kDaの分子量を有することから、該複合体は多数のApaf-1とプロカスパーゼ９分子を含むとされる。
【０００４】
アポプトソームは、Fas DISCやPelle含有複合体と同様に、アポトーシスに関与する大きな調節複合体の例である。これらの複合体中のタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用モチーフ、キナーゼドメイン、タンパク質分解性ドメイン、リガンド結合ドメインおよび膜結合ドメインのごとき複数のドメインから構成される。デスドメインは、分子内連絡のための１方法を複雑に提供する。総説については、C. H. Weber and C. Vincenz, 典he death domain superfamily: a tale of two interfaces?  Trends in Biochemical Sciences, Vol.26 No.8, 2001.を参照。
【０００５】
カスパーゼ９は、例えば、ICE、CPP32、Nedd2/Ich-1、Mch2、Mch3、Mch4、Mch5、TX (ICH-2、ICErel-II)、およびICErel-IIIを含むアスパラギン酸特異的システインプロテアーゼ（ASCP）ファミリーのプロテアーゼのメンバーである。
【０００６】
カスパーゼ９は、いくつかのASCPと相同なアミノ酸配列を共有するが、その触媒部位QACGGは、他の既知のASCPで相対的に保存された触媒部位と４番目の残基が異なる。米国特許第6,271,361号は、カスパーゼ９についてのＤＮＡおよびアミノ酸配列を開示し、出典明示によりその全体を本明細書に組み込む。
【０００７】
多くのASCPと同様に、カスパーゼ９はプロ酵素として合成され、例えば、CPP32またはグランザイムＢによってタンパク質分解的に切断されうる。カスパーゼ９の切断により、大サブユニットと小サブユニットの２つのサブユニットが得られ、それらが会合して活性ヘテロダイマー複合体を形成する。特に、CPP32はプロカスパーゼ９を、分子量約37 kDaを有する大サブユニット(p37)と分子量約10 kDaを有する小サブユニット(p10)に分解することができる。同様に、グランザイムＢは、プロカスパーゼ９を、分子量約35 kDaを有する大サブユニット(p35)と分子量約12 kDaを有する小サブユニット(p12)に分解することができる。さらに、アポトーシス経路の他の構成要素は、カスパーゼ９をより大きなまたは小さな分解産物に分解することができる。従って、用語「大サブユニット」および「小サブユニット」は、p37またはp35のごとき大きい方のタンパク質分解産物、およびp10またはp12のごとき小さい方をそれぞれ指すことは容易に理解されよう。
【０００８】
他のASCPと同様に、活性カスパーゼ９複合体は、プロテアーゼとして働くことができ、基質結合部位のＰ１部位においてAsp残基を、Ｐ１’部位において小さい、好ましくは疎水性の残基を必要とする。
【０００９】
アポトーシスは多くの病理状態において重要な役割を果たすため、プログラム細胞死を阻害することにより細胞の生存が増大し、または促進することによって細胞の生存能が低下する。細胞生存の増大によって生じる病理状態の例は、リンパ腫、癌腫、およびホルモン依存性腫瘍のごとき癌を含む。かかるホルモン依存性腫瘍は、例えば、乳癌、前立腺癌および卵巣癌を含む。細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害によって、全身性エリテマトーデスおよび免疫介在性糸球体腎炎のごとき自己免疫疾患、ならびにヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスのごときウイルス感染も引き起こされる。細胞死経路に関与するものとして最初に同定された遺伝子であるbcl-2遺伝子は、癌細胞において同定され、該遺伝子の発現により細胞がアポトーシスされる可能性を減少させることによって機能することが示された。
【００１０】
反対に、プログラム細胞死の促進が主な原因であるアポトーシス疾患は、一般的に、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、小脳変性症、後天性免疫不全疾患（ＡＩＤＳ）に付随する脳障害のごとき変性障害を含む。一般的に、神経細胞は成人では分裂しないため、死細胞を置き換える新たな細胞が得られないことから、かかる疾患で起こる神経死によって、該疾患を患う患者では進行的に状態が悪化する。アポトーシスの増大に付随する他の疾患は、例えば、再生不良性貧血のごとき骨髄異形成症候群、ならびに心筋梗塞、脳卒中および再潅流傷害を含む虚血性障害を含む。
【００１１】
カスパーゼ９阻害剤は、プロテアーゼ活性を阻害するものだけでなく、カスパーゼ９が他のポリペプチドに結合するのを阻害する化合物も含む。かかる化合物は、アポトーシス細胞死を特徴とする疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。本発明で使用する場合、カスパーゼ９ポリペプチドを用いてプロ酵素の活性サブユニットへの分解を誘導することによって、カスパーゼ９を活性化するか、カスパーゼ９のアゴニストとして機能する化合物を選抜することができる。かかる化合物は、同様に、アポトーシス細胞死の減少を特徴とする疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
【００１２】
（発明の概要）
本出願は、カスパーゼ９活性を調節する化合物の同定方法に関する。
【００１３】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、ｐＨ７．２における、基質DEVD (配列番号1)、IETD (配列番号2)、LEED (配列番号3)、WEHD (配列番号4)、LEHD (配列番号5)、およびVEID (配列番号6)でのカスパーゼ１の特異性を示す。図１Ｂは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ２の基質特異性を示す。図１Ｃは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ３の基質特異性を示す。図１Ｄは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ６の基質特異性を示す。図１Ｅは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ７の基質特異性を示す。図１Ｆは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ８の基質特異性を示す。図１Ｇは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ９の基質特異性を示す。図１Ｈは、ｐＨ７．２におけるカスパーゼ１０の基質特異性を示す。
図２は、カスパーゼの種類で比較したAFC放出速度を示す。
図３は、ホフマイスター系列のＮａ塩を含むバッファー中でのカスパーゼ９によるLEHD (配列番号5) 分解の相対速度を示す。
図４Ａ〜４Ｃは、カスパーゼファミリーに対するホフマイスター塩の選択性を示す。図４Ａは、様々な量の硫酸アンモニウム中でのカスパーゼ９活性を示す。図４Ｂは、様々な量の硫酸アンモニウム中でのカスパーゼ３活性を示す。
図４Ｃは、様々な量のリン酸ナトリウム中でのカスパーゼ９活性を示す。
図５Ａは、様々な濃度のクエン酸Ｎａ中の30 U酵素、100 μM Ac-LEHD-AFC (配列番号5)中でのカスパーゼ９活性を示す。図５Ｂは、様々なリン酸ＮａまたはＫ溶液中、30 U enzyme, 100 μM Ac-LEHD-AFC (配列番号5)でのカスパーゼ９活性を示す。図５Ｃは、様々な濃度のCsClまたはLiCl中でのカスパーゼ９活性を示す。図５Ｄは、様々な濃度のMg(SO4)、Ca(SO4)、MgCl2またはCaCl2中でのカスパーゼ９活性を示す。
【００１４】
（発明の詳細な記載）
カスパーゼ９は、アポプトソームと呼ばれる多成分集合体のタンパク質分解活性のあるメンバーである (Renatus, et al., (2001)  Dimer formation drives the activation of the death protease Caspase 9, PNAS 98, 14250-14255)。この複合体は、発生中の神経系組織構成、および環境ストレスまたはリガンド−受容体活性化によって回復の見込みがない傷害を受けた細胞の削除を制御する。他のカスパーゼファミリーのメンバーのようにカスパーゼ９は細胞中に潜伏して存在するが、他とは異なり、単純なタンパク質分解的プロセシングでは活性化に不十分である。１メガダルトン複合体中の活性型APAF-1との会合が完全な触媒変換に必要である。複合体の各メンバーを精製するのに、およびインビトロにてそれらを組み立てるのに固有の困難性が、カスパーゼ９の構造的な理解を得るようとする試みや、特異的モジュレーターを見出すのに設計されたスクリーニングに該プロテアーゼを使用することの妨げとなっていた。インビトロでカスパーゼ９の活性化を促進するための単純かつ簡便な方法を提供することによって、この発明はハイスループットスクリーニングを含むスクリーニングを可能にする。
【００１５】
以下のホフマイスター系列は、鶏卵白色タンパク質の混合物を沈殿させる能力の順に様々なイオンを並べたものに由来する。
アニオン：  SCN-＞NO3-＞Cl-＞クエン酸イオン＞酢酸イオン−＞リン酸イオン＞SO42-
カチオン：  Ca2+＞Mg2+＞Na+＝K+＞NH4+＞N(CH3)4+
【００１６】
ホフマイスター系列塩は、生物学的巨大分子の構成または変性に対する段階的な効果を示すことを含む、より多くの一般用途を有することが示された。最近では、ホフマイスター系列は、通常、タンパク質の構造を安定化させるイオンの能力に関して定められている。同様の効果は、凍結乾燥した酵素の塩誘導性活性化で見つかっている(Ru, et al. On the salt-induced activation of lyophilized enzymes in organic solvents: Effect of salt kosmotropicity on enzyme activity, J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 1565-1571)。それらは、強力な水和度を有するアニオンとカチオンに対して逆の相関を示す。
【００１７】
その系列中での相対的位置（ほぼ水和の強度に対応する）は、タンパク質、ｐＨおよび温度に伴う変化があるため、顕著なカチオン特異的効果を示す酢酸イオンとともに単に指示的なものとして考えられるべきである。イオンは水の本来の水素結合ネットワークを破壊し、温度または圧力の増加に類似した効果；例えば、粘性の減少を有する。イオンのこの効果は、対応する浸透圧によって概算するのに成功した。かかる効果の最も高いイオン（水同士よりも水と弱い相互作用を示す）は構造ブレーカー（structure-breaker）またはカオトロープとして知られ、一方、逆の効果を有するイオンは構造メーカー（structure-maker）またはコスモトロープ（水分子と強い相互作用を示す）として知られている。
【００１８】
カスパーゼ９サンプルが硫酸アンモニウム中で調製される場合、基質のタンパク質が小さなペプチドに急速に変化するのが認められ、この溶液中でタンパク質分解が劇的に増大したことが示される。該機構の一般性を限定せず、本出願の組成および方法を限定せず、本発明者らは、硫酸アンモニウムの溶解によって水溶液の極性が増大したことが、オリゴマー化によるカスパーゼ９の構造変化または活性化を伴う立体構造変化の原因であると主張する。多くのウイルスプロテアーゼがホフマイスター系列の水構成アニオン（コスモトロピック薬剤）によって活性化されることが知られている (Cacace, M., Landau, E. and Ramsden, J.  (1997), The Hofmeister series: salt and solvent effects on interfacial phenomena, Quart. Rev. of Biophysics 30, 241-277)。例えば、ウイルスキャプシドの成熟に関与する単純ヘルペスウイルス１プロテアーゼは、1M クエン酸Na中では、活性が８６０倍の増大を示す (Hall, D. and Darke, P. (1995). Activation of the Herpes Simplex virus type 1 protease.  JBC 270, 22697-22700)。この塩での処理は、多分、ポリアニオンが高濃度である核における、活性型プロテアーゼの本来の微小環境を模倣していると考えられる。
【００１９】
プロテアーゼに対する溶媒状態を調節することによってアポプトソーム中でのカスパーゼ９の活性化を模倣することで、この酵素の阻害剤を発見するための簡単なインビトロでのスクリーニング手順をもたらす。
【００２０】
コスモトロピック薬剤によるカスパーゼ９の活性化は、活性化の程度だけでなく、カスパーゼ９の活性化が完全に起こったという事実において驚くべきものである。本発明以前は、コスモトロピック塩がカスパーゼ９を活性化すると考えさせる理由は何もなかった。この事実は、コスモトロピック塩で他のカスパーゼ、例えば、実施例４に記載のカスパーゼ３を活性化できないことによって証明される。
【００２１】
カスパーゼ９阻害剤を用いて、プログラム細胞死の増大を特徴とする疾患の重篤度を治療または低下することができる。本明細書に記載のカスパーゼ９活性のアッセイを用いて、様々な化合物をスクリーニングして、カスパーゼ９プロテアーゼ活性の発現を阻害または促進する化合物を発見することができる。かかるスクリーニング方法は、当業者に知られている。かかる阻害分子は、合成または天然由来の化合物ライブラリーに含まれるものでありうる。
【００２２】
カスパーゼ９阻害剤は、例えば、カスパーゼ９と結合して、競合または非競合型の機構によってカスパーゼ９のプロテアーゼ活性を不活化する小分子および有機化合物、不活性プロカスパーゼ９の活性カスパーゼ９プロテアーゼへの変換の阻害剤、あるいは間接的にカスパーゼ９経路を阻害する他の分子を含む。かかるカスパーゼ９阻害剤は、例えば、自殺阻害剤、抗カスパーゼ９抗体およびタンパク質、小さなペプチドプロテアーゼ阻害剤、または小さな非ペプチド有機分子阻害剤を含みうる。かかる阻害剤の具体例は、テトラペプチド DEVD-CHO (配列番号1) (Asp-Glu-Val-Asp-アルデヒド)のごとき基質類似体、蛍光標識テトラペプチド:例えば、DEVD-AMC(配列番号1) (Asp-Glu-Val-Asp-アミノメチルクマリン)、YVAD-AMC (配列番号7) (Tyr-Val-Ala-Asp-アミノメチルクマリン)、ZEVD-AMC (カルボベンズオキシ-Glu-Val-Asp-アミノメチルクマリン) 、ならびに牛痘ウイルスタンパク質Crm Aを含む。他の具体例は、108以上のペプチド配列を１回のパニングでスクリーニングできるようなファージディスプレイペプチドライブラリーを含む（米国特許第6,121,416号)。カスパーゼ９阻害剤を、所望の細胞種に導入させるための培地中に処方するか、細胞介在性エンドサイトーシスまたは他の受容体介在性イベントによる導入のための標的リガンドに結合させることができる。
【００２３】
カスパーゼ基質のアンタゴニストを用いて、プログラム細胞死の増大によって介在される疾患の重篤度を治療または低下することができる。かかる基質アンタゴニストはカスパーゼ９に結合し、カスパーゼ９による分解を阻害する。基質分解の阻害により、プログラム細胞死遂行の進行を妨げることができる。基質アンタゴニストは、例えば、リガンドおよび小分子化合物を含む。
【００２４】
本発明のカスパーゼ９をコードする核酸およびカスパーゼ９ポリペプチドを用いて、例えば、ELISAまたはRIAのごとき結合アッセイ、もしくはクマリン標識DEVD-AMC (配列番号1)およびYVAD-AMC (配列番号7)のごときテトラペプチド基質を用いた酵素アッセイにおいて、カスパーゼ９阻害剤を同定することもできる。DEVD-AMC (配列番号1)およびYVAD-AMC (配列番号7)は、それぞれ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼおよびIL-1β：P1-P4基質テトラペプチドの切断部位を示す(Nicholson et al., Nature 376:37-43 (1995))。
【００２５】
かかるアッセイで使用されるカスパーゼ９ポリペプチドを、例えば、インビトロ翻訳、組み換え発現または生化学的手法によって得ることができる。かかる、または他の方法は当技術分野内で知られている。例えば、組み換えカスパーゼ９は、カスパーゼ９  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ２１ｂ(Novagen Inc., Madison, Wis.)のごとき細菌発現ベクターにクローニングすることによって発現させることができる。次いで、カスパーゼ９を、当業者に知られた普通の分子生物学の方法を用いて発現、精製することができる。精製組み換えカスパーゼ９タンパク質を用いて、連続的な蛍光アッセイにて、DEVD-AMC (配列番号1)およびYVAD-AMC (配列番号7)のごとき様々な基質についての加水分解速度を測定することができる。
【００２６】
Current Protocols in Cell Biology, Chapter 18（出典明示によりその内容を本明細書の一部とする）に記載のカスパーゼの蛍光発生基質を用いた方法、酵素活性アッセイ、イムノブロッティング、およびアフィニティー標識を含む、カスパーゼ活性測定のための多くの方法が当技術分野で知られている。本発明以前では、これらの方法は、インビトロでの活性が低いため、カスパーゼ９に対して有用ではなかった。
【００２７】
本明細書に開示される技術を用いてカスパーゼ９を活性化すると、その活性を蛍光アッセイを用いて定量することができる。１つの実施形態において、７−アミノ−トリフルオロメチルクマリン (AFC)が用いられる。AFCはAc-LEHD-AFC (配列番号5)のごときペプチドから切断されると、アセチル(Ac)保護基により消光されないため、蛍光を発する。AFC励起は400nmで起こり、その蛍光は505nmである。該ペプチドが完全な状態であれば、両基は距離的に近いため、この蛍光は該ペプチドＮ末端の保護Ac（アセチル）基の存在により消光される。カスパーゼ９はD(asp)の後を切断し、AFC基を放出すると、それは保護基によって消光されない。
【００２８】
カスパーゼ９以外のカスパーゼのハイスループットスクリーニングは、当技術分野で既知である。例えば、カスパーゼ８は、Smith et al. (Expression, preparation, and high-throughput screening of Caspase-8: discovery of redox-based and steroid diacid inhibition, Arch Biochem Biophys 2002 Mar 15; 399(2):195-205, 出典明示によりその全体を本明細書に組み込む)によって以下のようにスクリーニングされる：カスパーゼ８のエシェリキア・コリ（Escherichia coli）発現構築物を、Ｈｉｓタグ配列がカスパーゼ８のコドン２１７の５’側に挿入して構築する。菌株は大量の可溶性Ｈｉｓタグ付加３１ｋＤａ不活性型１本鎖酵素前駆体を生成する。この３１ｋＤａタンパク質を９８％に精製する。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで、酵素を相対分子量約31,090を有するものと、さらに178分子量大きなユニット（すなわち、31,268）を有するものの２種類に分離する。後者はイー・コリ（E. coli）を基礎とするＨｉｓタグの１当量のグルコノ−１，５−ラクトンでの修飾に由来することがわかった。精製タンパク質を、適当なバッファー条件中にて、ジチオスレイトールの添加による約１９＋１１ｋＤａの酵素への自己タンパク質分解によって活性化した。これにより、２５℃で200μMのAc-IETD-pNA (配列番号2)に対して4〜5 ユニット/mg (U/mg)の特異的な活性を有する酵素が得られた。完全に活性のあるタンパク質を、カスパーゼ８についてのハイスループットスクリーニングに用いた。予備的な頑健性のスクリーニングにより、カスパーゼ８は、ジチオスレイトール(DTT)還元剤の存在下で、活性酸素に基づく不活性化に対して感受性であるが、システインの存在下ではそうでないことが示された。この不活性化の機構の研究により、活性酸素を発生するレドックスサイクルを確立するDTTによりキノン様化合物を還元し、その生成物（たぶんH(2)O(2)）が酵素を不活化することが明らかにされた。カスパーゼ８阻害剤とステロイド由来の二価酸が低μM値域で親和性を有することがスクリーニングにより明らかになった。阻害剤の構造−活性研究により、ステロイド鋳型と酸部分のいずれも活性化に必要であることが示された。当業者であれば、本発明を用いてかかる現存のスクリーニング方法を改変し、以前は有意な方法でスクリーニングできなかったカスパーゼ９に適用できることが理解されよう。
【００２９】
本発明の様々な実施形態の活動に実質的に影響を及ぼさない改変も、本明細書に提供される本発明の定義内に含まれることは理解されよう。従って、以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
市販のカスパーゼの基質特異性
市販のカスパーゼの一群を、一連の基質に対してテストし、各プロテアーゼに対する特異性を評価した。カスパーゼ９の好ましい基質は、テトラペプチド、リジン−グルタミン酸−ヒスチジン−アスパルギン酸（以後、LEHD (配列番号5)とする）であった。また、中性緩衝生理食塩水中のカスパーゼ９の好ましい基質(LEHD (配列番号5))に対しての活性レベルは、他のカスパーゼ対他の同種のペプチドのもののいずれに比べて桁違いに低い。これらの結果より、本発明以前の技術では、カスパーゼ９のモジュレーターをスクリーニング使用とした際に、困難であることが示される。
【００３１】
特異性反応を行うために用いた対照のバッファーは以下のものである： 20 mM PIPES pH 7.2、1 mM EDTA、0.1％ CHAPS、10 ％ スクロース、10 mM DTT。様々な100 μM のＮ−アセチル−テトラペプチド−７−アミノ−トリフルオロメチルクマリン基質を、様々な市販のカスパーゼとアッセイした。DMSO中で2.5 mMのストック基質濃縮液を調製し、次いで、対照バッファーで200 μMに希釈した。
【００３２】
300 Uの目的の酵素のストック溶液を前記の対照バッファー中で調製した。アッセイを以下のように行った：96ウェルの黒色のダイネックス微蛍光測定器  １プレートを用いた。総アッセイ体積は100 μlであった。７−アミノ−トリフルオロメチルクマリン(AFC)を400 nmで励起し、AFCがペプチドから切断される際の蛍光発光を505 nmで速度論的に１時間モニターした。
【００３３】
50 μlの200 μMストック基質をまず加えた（最終アッセイ濃度は100 μM）。次いで、40 μlの対照バッファーを加えた。10 μlの適当な300 Uカスパーゼストックを添加して、アッセイを開始した(最終アッセイ濃度は30 U)。直線速度(相対蛍光 U/s)を全体の実験時間から算出し、各酵素について、試験した様々な基質に対してグラフ化した。
【００３４】
実施例２
様々なカスパーゼによる切断速度の比較
最適な基質に対する様々なカスパーゼの相対切断速度を、カスパーゼ３およびその好適テトラペプチドであるＤＥＶＤ（配列番号１）と比較して、測定した。実施例１に記載の手順でアッセイを行った。結果を図２に示す。図２は、３０Ｕと最適基質を用いての、酵素間での相対活性を示す。前記のように、カスパーゼ９は他のいずれのカスパーゼよりも中性生理食塩水中での活性がはるかに低かった。表１は、図２のデータを得るのに使用したカスパーゼの濃度と、各酵素に最適な基質を示す。
【００３５】
表１
【表１】
2005532065.tif 000002
【００３６】
実施例３
ホフマイスター系列のNa塩を含むバッファー中での、カスパーゼ９によるLEHD(配列番号5)切断の相対速度
全ての塩を対照バッファーに溶解し、濃度を0.8 Mとした。バッファーは：20 mM PIPES pH 7.2、1 mM EDTA、0.1％ CHAPS、10％ スクロース、10 mM DTTであった。基質は：100 μM N-Ac-LEHD-Afc (配列番号5)、30 U カスパーゼ９/ウェル (0.72 μM)であった。
【００３７】
タンパク質分解活性は、ホフマイスターアニオンの水構成ポテンシャルの増加と相関し、クエン酸＞リン酸＞硫酸＞酢酸である。0.8 M シトラート中のカスパーゼ９の活性は、構造不安定化アニオンとされる0.8 M 臭化物イオン中の相対活性より10,000倍高い（図３参照）。
【００３８】
実施例４
ホフマイスター塩によるカスパーゼファミリーのメンバーの活性
硫酸アンモニウムを様々な濃度で用いて、カスパーゼ１、３、７および９をアッセイし、さらに、リン酸ナトリウムを様々な濃度で用いてカスパーゼ９をアッセイした。図４に示すように、塩はカスパーゼ１と７に対して効果はなく、カスパーゼ３に対してもわずかな効果であった。一方、カスパーゼ９は、0〜1.6 Mのサルフェート濃度の範囲で1400倍の活性増大を (図４Ａ)、0〜1 Mのホスフェート濃度の範囲では2200倍の増大を示した。使用したバッファーは、実施例１に記載のものである。硫酸アンモニウム中の基質は、カスパーゼ９を用いた際は25 μM Ac-LEHD-Afc (配列番号5)であり、カスパーゼ３については25 μM Ac-DEVD-Afc (配列番号1)であった。リン酸ナトリウム中でのカスパーゼ９用の基質は、100 μM Ac-LEHD-Afc (配列番号5)であった。
【００３９】
実施例５
様々なホフマイスター塩中でのカスパーゼ９活性
アニオンとカチオンをいずれも含む様々なホフマイスター塩中でのカスパーゼ９活性を測定した。結果は、上記のホフマイスター系列の理論によって予測されたように、ホフマイスター系列のより弱く組織化しているカチオンも活性を増大させるが、増大はアニオン程強くない。結果を図５に示す。30Uの酵素を使用し(0.72 μM)、基質は100 μM Ac-LEHD-AFC (配列番号5)であり、バッファーは実施例１に記載のものであった。
【００４０】
実施例６
ホフマイスター塩を用いたカスパーゼ９のハイスループットスクリーニング
以下のハイスループットスクリーニング用の一般的なプロトコールを、カスパーゼ９の許容される促進が反応バッファー中に含まれる0.8 Mクエン酸Naで達成されるという実施例３および４に記載の観察を中心に構築した。スクリーニングは、組み換えカスパーゼ９と、その蛍光発生基質であるLEHD-AFC (配列番号5)と、試験化合物を0.8Mクエン酸含有バッファー中、96-ウェル形式にて混合し、次いで酵素の反応速度論を自動分光蛍光光度計で測定することからなる。全ての操作は、ロボットを用いて自動化することができる。
【００４１】
詳細なプロトコールの例は以下のものである：全ての試薬を反応バッファー(20 mM PIPES, pH 7.2、1 mM EDTA、0.1% CHAPS、10% スクロース、0.8 M クエン酸Na, pH 7.2、1 mM システイン)で完全に希釈し、バッファーＡとする。ストック基質であるLEHD-AFC (配列番号5) (Enzyme Systems Products)をDMSO中で作成し2.5 mMとする。ストック阻害ペプチドであるLEHD-CHO (配列番号5) (Enzyme Systems Products)、および試験化合物をDMSO中で作成し10 mMとする。ストックカスパーゼ９(PharMingen, San Diego, CA)をバッファーＡ中で作成し300U/100μlとする。反応をＵ底黒色９６ウェルプレートの各ウェルにて、体積100 μlにて行う。反応混合物を以下のように処方する：１．ストック基質をバッファーＡで１：５０に希釈し、濃度50 μMとし、これを基質混合物とする。２．ストック化合物をバッファーＡで１：４０に希釈し、濃度250 μMとし、これを化合物混合物とする。反応は、50 μlの基質混合物と40 μlの化合物混合物を各ウェルに加えて準備し、10 μlのストックカスパーゼ９を加えることによって開始する。カスパーゼ９、基質および化合物の終濃度は、それぞれ、10U/100μl、25 μMおよび100 μMであった。タンパク質分解活性を、室温にて１時間、蛍光Ｕ／秒（Ｕ／ｓ）として、反応速度論的にモニターした。各反応は３連である。適切な対照は、以下の：１．基質のみ（負の対照）；２．基質と酵素（正の対照）；３．基質、酵素とペプチド阻害剤（阻害剤対照）を含むウェルからなる。これらの対照を、基質、酵素と試験化合物で追跡する。カスパーゼ９の活性を５０％以上減少させる化合物として陽性のヒット数を記録する。
【００４２】
実施例７
カスパーゼ９のアロステリック活性化の阻害剤のスクリーニング
細胞におけるカスパーゼ９活性化は、APAF 1、シトクロームＣおよびカスパーゼ９を含むタンパク質の1MDaの会合体であるアポプトソームとのアロステリックな相互作用による。精製カスパーゼ９をホフマイスター系列のコスモトロピック塩を含むバッファーに導入し、アポプトソームでのカスパーゼ９のアロステリック活性化を模倣する。これにより、カスパーゼ９の活性化領域に結合する分子のスクリーニングが可能となり、プロテアーゼの触媒部位に結合する分子とは区別される。これは、まず、カスパーゼ９に特異的な蛍光テトラペプチド(LEHD (配列番号5))の切断を阻害する化合物を0.8 M クエン酸Na中でスクリーニングすることによって達成される(実施例６参照)。得られたヒットは、触媒断裂部に結合するか、または遠くのアロステリック部位に結合してプロテアーゼの立体構造を不活性型に変化させるかのいずれかにより阻害的である。次いで、該ヒットを、触媒部位にのみ結合する同種のテトラペプチドであるLEHD (配列番号5)による化合物の競合的置換による第２スクリーニングで区別する。テトラペプチドによる阻害化合物の競合的置換による阻害化合物の放出により、触媒部位で相互作用する分子と、アロステリック部位で働く分子とを区別する。
【００４３】
簡単なプロトコールの詳細な記載は以下のものである：１次スクリーニングで得られた全てのヒットを回収し、バッファーＡ（実施例６）で250 μM (1:40)、25 μM (1:400)および2.5 μM (1:4000)に希釈する。これらの化合物の混合物それぞれ40 μlを９６ウェルプレートの各ウェルに３連で加え、次いで10 μlの酵素ストックを加え、室温で10分間プレインキュベートする。この後、50μlの基質混合物（実施例６）を加えることにより反応を開始させる。各反応物の終濃度は、30U/100μlのカスパーゼ９、25 μMの基質、ならびに100 μM、10 μMおよび1 μMの１次スクリーニングでヒットした化合物である。次いで、酵素の反応速度を１時間にわたり分光蛍光光度計によって追跡する。基質による阻害化合物の競合的置換は、１またはそれ以上の化合物濃度における最終速度が得られる前の明確な遅延時間を伴う非線形反応速度論によって検出される。時間０からの線形反応速度論または阻害からの非放出は、それぞれ、アロステリック阻害または非競合型阻害を示す。
【００４４】
全ての阻害剤−酵素関係の構造的な基礎は、Ｘ線結晶学または溶液ＮＭＲによって完全に明らかにされうる。
【００４５】
当業者であれば、この手順の変形、例えば、ジチオスレイトール(DTT)またはグルタチオンをシステインに置換して処方できることを容易に理解できるだろう。これらの変形は、本質的には本プロトコールと同等であるが、もちろん、使用される条件の特定のセットに従って、それらの有用性は異なる。
【００４６】
ハイスループットスクリーニングの典型的な反応条件は、以下のものを含む：
50 μl  120% バッファー中の基質＋40 μl  100%バッファー中の酵素＋10 μl  50 mM HEPES中のサンプル
【００４７】
酵素用バッファーpH 7.2
2005532065.tif 000003
バッファーを作製し、通常使用のために分割し、フィルター滅菌し、４℃で保存することができる。
【００４８】
基質用濃縮バッファー120% pH 7.2 (記載の濃度は120%バッファーについてのものではない)
2005532065.tif 000004
【００４９】
終濃度25 μMのLEHD-AFC (配列番号5) (カスパーゼ９の基質) 
酵素システム製品 カタログ番号AFC-138 
175 μlの100% DMSOに3 mgのLEHD-AFC (配列番号5)を溶解し、-20℃で保存する。このストックは25 mMである。
【００５０】
終濃度100 μl中に25 μMを必要とする。濃縮体積50 μlであることから、終濃度25 μMにするためには50 μMである必要がある。25 mM (25000 μM)のストックがあることから、25000 μM/50 μM＝500が得られる。１プレートにつき約5 mlを必要とする。50 μM＝1:500希釈＝40 μl 25 mM LEHD-AFC(配列番号5)/20 mlバッファー
【００５１】
終濃度5 ng/mlの組み換えヒトカスパーゼ−９
正の対照  PharMingen カタログ番号66281T 
購入したストック酵素は50 μl中、10 μgである。このストック酵素は200 ng/μlである。
終濃度5 ng/ml のCPP32酵素を必要とする。終濃度は100 μl中のものであるが、必要な酵素濃度は基質(50 μl)を添加するための40 μl中のものであり、従って、(5 ng/ml) (100 μl)＝(x ng/ml) (40 μl)を必要とする。ストック濃度12.5 ng/mlを必要とする。ストック酵素は200 ng/μl＝200 μg/mlである。
(200 μg/ml)/0.0125 μg/ml＝16,000 であることから、酵素を1:16,000で希釈する。
【００５２】
終濃度  ストック濃度
5 ng/ml＝12.5 ng/ml＝1:16,000＝2.5 μl CPP 32/40 mlバッファー
【００５３】
阻害ペプチドLEHD-CHO (配列番号5)
酵素システム カタログ番号AL-010 5 mg MW 502
乾燥中、20℃にて最長４ヶ月保存 (DMSO中、20℃にて数日)
DMSO中10 mMストック＝5 mg/ml DMSO
【図面の簡単な説明】
【００５４】
（原文に記載なし）
【配列表】
2005532065.tif 000005
2005532065.tif 000006
【図１Ａ】
2005532065.tif 000007
【図１Ｂ】
2005532065.tif 000008
【図１Ｃ】
2005532065.tif 000009
【図１Ｄ】
2005532065.tif 000010
【図１Ｅ】
2005532065.tif 000011
【図１Ｆ】
2005532065.tif 000012
【図１Ｇ】
2005532065.tif 000013
【図１Ｈ】
2005532065.tif 000014
【図２】
2005532065.tif 000015
【図３】
2005532065.tif 000016
【図４Ａ】
2005532065.tif 000017
【図４Ｂ】
2005532065.tif 000018
【図４Ｃ】
2005532065.tif 000019
【図５Ａ】
2005532065.tif 000020
【図５Ｂ】
2005532065.tif 000021
【図５Ｃ】
2005532065.tif 000022
【図５Ｄ】
2005532065.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月3日(2005.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532065000001.app
【国際調査報告】
2005532065.tif 000024