(57)【要約】アメリカヤマゴボウ抗ウイルス・タンパク質（ＰＡＰ）とＲＮＡの相互作用の分子モデルを用いて、強力な抗ＨＩＶ活性を有する無毒なＰＡＰタンパク質として、ＦＬＰ−１０２ (151ＡＡ152)とＦＬＰ−１０５ (191ＡＧ192)を合理的に設計した。ＦＬＰ−１０２とＦＬＰ−１０５は、大腸菌で作られ、インビトロ並びにインビボの両方でテストされた。これらのタンパク質は、リボソームＲＮＡよりもＨＩＶ−１ ＲＮＡからよりよく脱プリン化し、且つ天然ＰＡＰや組換え野生型ＰＡＰよりもより強力な抗ＨＩＶ剤である。これらのタンパク質は、バルブシー・マウスにおいて天然ＰＡＰよりもはるかに毒性が低く、ヒト・エイズの代わりのＨｕ−ＰＢＬ−ＳＬＩＤにおいて遺伝子型的且つ表現型的にＮＲＴＩ耐性なＨＩＶ−１に対して強力なインビボ活性を示す。ＦＬＰ−１０２とＦＬＰ−１０５などの合理的に設計された無毒な組換えＰＡＰタンパク質は、ＨＩＶ−１の薬剤耐性菌株が居ついた患者の効果的な治療法の基礎になる。ＦＬＰ−１０２とＦＬＰ−１０５の記録されたインビトロ効力、ＨＩＶに感染したＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおけるこれらのインビボ抗レトロウイルス活性、およびバルブシー・マウスにおけるこれらの好ましい毒性分析表は、これらの有望で新規な生物療法剤をさらに開発することを保証する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたアメリカヤマゴボウ抗ウイルス・タンパク質（ＰＡＰ）であって、前記修飾されたＰＡＰのウイルスＲＮＡに対する活性が野生型ＰＡＰに比べて向上しているような活性部位以外の一つ以上の領域内で、野生型ＰＡＰに対して一つ以上の修飾を有する前記修飾されたアメリカヤマゴボウ抗ウイルス・タンパク質。
【請求項２】
前記ウイルスＲＮＡに対する前記修飾されたＰＡＰの活性が向上しており、前記ウイルスＲＮＡがレトロウイルスＲＮＡである、請求項１に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項３】
前記レトロウイルスＲＮＡがＨＩＶ−１ ＲＮＡである、請求項２に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項４】
前記ＨＩＶ−１ ＲＮＡが薬剤耐性ＨＩＶ−１菌株のＲＮＡである、請求項２に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項５】
野生型ＰＡＰに比べると前記修飾されたＰＡＰの活性がリボソームＲＮＡに対して低下している、請求項１に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項６】
前記一つ以上の修飾により、少なくとも一部が野生型ＰＡＰに埋め込まれている一つ以上のアミノ酸の相対的コンフォメーションが変えられる、請求項１に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項７】
前記一つ以上の修飾がＰＡＰの疎水性領域内にある、請求項６に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項８】
前記一つ以上の修飾がαヘリックス４−ループ−αヘリックス５領域内にある、請求項７に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項９】
前記一つ以上の修飾に、次のアミノ酸、すなわち、７６、１５１、１５２、１５８、１６２または１６６の一つ以上における修飾が含まれる、請求項８に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１０】
アミノ酸１５１が修飾される請求項９に記載のＰＡＰ。
【請求項１１】
アミノ酸１５１における前記修飾がリシンからアラニンへの突然変異である、請求項１０に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１２】
アミノ酸１５２が修飾される請求項９に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１３】
アミノ酸１５２における前記修飾がイソロイシンからアラニンへの突然変異である、請求項１０に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１４】
一つ以上の前記修飾がαヘリックス６のＣ末端部分内で行われる、請求項７に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１５】
一つ以上の修飾に、次のアミノ酸、すなわち、１３、１６、１４２、１８８、１９１または１９２の一つ以上における修飾が含まれる、請求項１４に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１６】
前記修飾がアミノ酸１９１において行われる請求項１５に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１７】
アミノ酸１９１における前記修飾がフェニルアラニンからアラニンへの突然変異である請求項１６に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１８】
前記修飾がアミノ酸１９２において行われる、請求項１５に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項１９】
アミノ酸１９２における前記修飾がアスパラギンからグリシンへの突然変異である、請求項１８に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項２０】
一つまたは修飾が一つ以上のアミノ酸置換であり、前記置換にＫ１５１Ａ、Ｉ１５２Ａ、Ｆ１９１Ａ、Ｎ１９２Ｇ、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項１に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項２１】
前記置換にＫ１５１ＡとＩ１５２Ａが含まれる、請求項２０に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項２２】
前記置換にＦ１９１ＡとＮ１９２Ｇが含まれる、請求項２０に記載の修飾されたＰＡＰ。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰと薬学的に許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項２４】
一つ以上の抗ウイルス性化合物をさらに含み、該抗ウイルス性化合物がヌクレオシド類似体逆転写酵素抑制剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体逆転写酵素抑制剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ抑制剤（ＰＩ）、またはこれらの組み合わせである請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰと前記ウイルスとの接触を含む、ウイルスの複写を抑制する方法。
【請求項２６】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＩＶウイルスがＨＩＶ−１ウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法において、前記ＨＩＶ−１が薬剤耐性ＨＩＶ−１ウイルスである前記方法。
【請求項２９】
前記薬剤耐性ＨＩＶ−１ウイルスが次の薬剤、すなわち、ヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド類似体、またはプロテアーゼ抑制剤の中の一つ以上の薬剤に対して耐性がある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰと前記ウイルスとの接触を含む、ウイルスＲＮＡの脱プリン化を誘導する方法。
【請求項３１】
ウイルス感染処置を必要とする対象にその処置をする方法であって、請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰを前記対象に抗ウイルスに有効な量投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
ウイルスの複写を抑制するための、請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰの利用。
【請求項３３】
ウイルスＲＮＡの脱プリンを誘起するための、請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰの利用。
【請求項３４】
ウイルス感染を処置する薬剤の製造における、請求項１−２２のいずれかの項に記載の修飾されたＰＡＰの利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年６月１７日に、米国を除くすべての国への出願の場合は、米国（Ｕ.Ｓ.）の国有法人であり且つ居住者であるパーカー・ヒューズ・インスティテュート（Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、および米国のみへの出願の場合は、米国の市民であり且つ居住者であるファティス・エム・アッカン（Ｆａｔｉｈ Ｍ. Ｕｃｋｕｎ）の名称においてＰＣＴ国際特許出願として提出され、すべての国を指定し、２００２年６月１７日に提出された米国（Ｕ.Ｓ.）特許出願番号第６０／３８９,６４９号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
抗レトロウイルス薬併用療法は、米国におけるＨＩＶ感染患者の標準的な治療方法になっている〔ゴットリーブ・エムエス(Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ＭＳ),２００１年,ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）,第３４４巻,第２３号,ｐ.１７８８−９１、セプコビッチ・ケイエイ(Ｓｅｐｋｏｗｉｔｚ ＫＡ), ２００１年, ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４４巻,第２３号,ｐ.１７６４−７２、フリードベルク・ケイエイら(Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ ＫＡ,ｅｔ ａｌ.), ２００１年, ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４４巻,第１１号,ｐ.８２４−３１、リッチマン・ディーディー(Ｒｉｃｈｍａｎ ＤＤ),２００１年,「エイズウイルスの化学療法」(ＨＩＶ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ),ネーチャー(Ｎａｔｕｒｅ),第４１０巻,ｐ.９９５−１００１、シャファー・アールダブリューおよびブイトン・ディーエイ(Ｓｈａｆｅｒ ＲＷ ａｎｄ Ｖｕｉｔｔｏｎ ＤＡ),１９９９年,バイオメディシン・アンド・ファーマコセラピー（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ）,第５３巻,第２号,ｐ.７３−８６、スター・エスイーら(Ｓｔａｒｒ ＳＥ,ｅｔ ａｌ.)、１９９９年、小児エイズ臨床トライアル・グループ３８２チーム(Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ ３８２ Ｔｅａｍ), ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４１巻,第２５号,ｐ.１８７４−８１、レイ・ディーら(Ｒｅｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,ジャーナル・オブ・アクアイアード・イミューン・デフィシェンシー・シンドローム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）,第２７巻,第5号,ｐ.４５９−６２〕。３種類の抗レトロウイルス療法、すなわち、ヌクレオシド類似体ＲＴ抑制剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体ＲＴ抑制剤（ＮＮＲＴＩ）、およびプロテアーゼ抑制剤（ＰＩ）の中の少なくとも２つの薬剤を併用した抗レトロウイルス処理方法は、ＨＩＶ感染した患者において強力で持続性のある抗ウイルス作用を示し、一貫した長期にわたるウイルス抑制をもたらす〔ゴットリーブ・エムエス(Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  ＭＳ),２００１年, ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４４巻,第２３号,ｐ.１７８８−９１、セプコビッチ・ケイエイ(Ｓｅｐｋｏｗｉｔｚ ＫＡ), ２００１年, ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４４巻,第２３号,ｐ.１７６４−７２、フリードベルク・ケイエイら(Ｆｒｅｅｄｂｅｒｇ ＫＡ,ｅｔ ａｌ.), ２００１年, ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ） ,第３４４巻,第１１号,ｐ.８２４−３１、リッチマン・ディーディー(Ｒｉｃｈｍａｎ ＤＤ),２００１年,「エイズウイルスの化学療法」(ＨＩＶ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ),ネーチャー(Ｎａｔｕｒｅ),第４１０巻,ｐ.９９５−１００１、シャファー・アールダブリューおよびブイトン・ディーエイ(Ｓｈａｆｅｒ ＲＷ ａｎｄ Ｖｕｉｔｔｏｎ ＤＡ),１９９９年, バイオメディシン・アンド・ファーマコセラピー（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ） ,第５３巻,第２号,ｐ.７３−８６、スター・エスイーら(Ｓｔａｒｒ ＳＥ,ｅｔ ａｌ.)、１９９９年、小児エイズ臨床トライアル・グループ３８２チーム(Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ＡＩＤＳ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ ３８２ Ｔｅａｍ), ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）,第３４１巻,第２５号,ｐ.１８７４−８１、レイ・ディーら(Ｒｅｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.),２００１年, ジャーナル・オブ・アクアイアード・イミューン・デフィシェンシー・シンドローム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）,第２７巻,第5号,ｐ.４５９−６２〕。これらの併用療法の個々の成分では、薬剤耐性ウイルスを選択することはできない。しかし、抗ウイルス薬剤耐性が出現すると、これらの療法の臨床効果を限定する〔ロス・エルら(Ｒｏｓｓ Ｌ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）,第１７巻,第１２号,ｐ.１１０７−１５、ピカード・ブイら（Ｐｉｃａｒｄ Ｖ,ｅｔ ａｌ.）,２００１年,ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８４巻,第6号,ｐ.７８１−４、スズキ・ケイら（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ,ｅｔ ａｌ.）, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ） ,第１７巻,第１３号,ｐ.１２９３−６、イゾペット・ジェイら（Ｉｚｏｐｅｔ Ｊ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年,ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）,第５９巻,第４号,ｐ.５０７−１１、ベンチュリ・ジイら（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｇ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年,ユーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシァス・ディジージス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８巻,第４号,ｐ.２７４−８２、クリックス・ディーアールら（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ ＤＲ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８１巻,第２号，ｐ.４９１−７、オブライエン・ダブリューエイ（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ ＷＡ）,２０００年,クリニカル・インフェクシァス・ディジージス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第３０巻,追補第２号，ｓ���８５−９２、ピレイ・ディーら（Ｐｉｌｌａｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年,レビューズ・イン・メディカル・ビロロジー（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）,第１０巻,第４号,ｐ.２３１−５３、ブリオンズ・シイら（Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｃ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年,エイズ（ＡＩＤＳ）,第１４巻,第１１号,ｐ.１６５９−６０〕。この耐性は、ＨＩＶの高い突然変異率と迅速な複製およびこれらの薬剤の選択作用の結果である。これらの薬剤は臨床薬剤耐性を確立し得る突然変異の出現を助長する。最近の結果によると、通常、少なくとも２つのＮＲＴＩとプロテアーゼ抑制剤またはＮＮＲＴＩを含む高度に活性な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）不全は、利用できるほとんどすべての抗レトロウイルス薬剤に対して遺伝子型耐性を付与する多重突然変異により生じる〔ロス・エルら(Ｒｏｓｓ Ｌ,ｅｔ ａｌ.),２００１年, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ） ,第１７巻,第１２号,ｐ.１１０７−１５、ピカード・ブイら（Ｐｉｃａｒｄ Ｖ,ｅｔ ａｌ.）,２００１年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８４巻,第6号,ｐ.７８１−４、スズキ・ケイら（ＳｕＺｕｋｉ Ｋ,ｅｔ ａｌ.）, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）,第１７巻,第１３号,ｐ.１２９３−６、イゾペット・ジェイら（Ｉｚｏｐｅｔ Ｊ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第５９巻,第４号,ｐ.５０７−１１、ベンチュリ・ジイら（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｇ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ユーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシァス・ディジージス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８巻,第４号,ｐ.２７４−８２、クリックス・ディーアールら（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ ＤＲ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８１巻,第２号ｐ.４９１−７、オブライエン・ダブリューエイ（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ ＷＡ）,２０００年, クリニカル・インフェクシァス・ディジージス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第３０巻,追補第２号，ｓ１８５−９２、ピレイ・ディーら（Ｐｉｌｌａｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, レビューズ・イン・メディカル・ビロロジー（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第１０巻,第４号,ｐ.２３１−５３、ブリオンズ・シイら（Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｃ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年,エイズ（ＡＩＤＳ）,第１４巻,第１１号,ｐ.１６５９−６０〕。これらの患者では、遺伝子型耐性のテストにより、現在利用できる抗レトロウイルス薬剤に基づく、代わりの救助治療法がないことが確認されている〔ロス・エルら(Ｒｏｓｓ Ｌ,ｅｔ ａ��.),２００１年, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ） ,第１７巻,第１２号,ｐ.１１０７−１５、ピカード・ブイら（Ｐｉｃａｒｄ Ｖ,ｅｔ ａｌ.）,２００１年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８４巻,第6号,ｐ.７８１−４、スズキ・ケイら（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ,ｅｔ ａｌ.）, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）,第１７巻,第１３号,ｐ.１２９３−６、イゾペット・ジェイら（Ｉｚｏｐｅｔ Ｊ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第５９巻,第４号,ｐ.５０７−１１、ベンチュリ・ジイら（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｇ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ユーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシァス・ディジージス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８巻,第４号,ｐ.２７４−８２、クリックス・ディーアールら（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ ＤＲ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）,第１８１巻,第２号,ｐ.４９１−７、オブライエン・ダブリューエイ（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ ＷＡ）,２０００年, クリニカル・インフェクシァス・ディジージス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第３０巻,追補第２号,ｓ１８５−９２、ピレイ・ディーら（Ｐｉｌｌａｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, レビューズ・イン・メディカル・ビロロジー（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第１０巻,第４号,ｐ.２３１−５３、ブリオンズ・シイら（Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｃ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年,エイズ（ＡＩＤＳ）,第１４巻,第１１号,ｐ.１６５９−６０〕。ＨＡＡＲＴが効かない
患者は多剤耐性ＨＩＶの感染者であり、将来、療法の選択肢を制限されるおそれがある。遺伝子型および表現型薬剤耐性ＨＩＶの発現頻度は、治療を受けていないＨＩＶ感染抗体陽転者（sero-converters）の中で増加している〔ロス・エルら(Ｒｏｓｓ Ｌ,ｅｔ ａｌ.),２００１年, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ） ,第１７巻,第１２号,ｐ.１１０７−１５、ピカード・ブイら（Ｐｉｃａｒｄ Ｖ,ｅｔ ａｌ.）,２００１年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８４巻,第6号,ｐ.７８１−４、スズキ・ケイら（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ,ｅｔ ａｌ.）, エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロウイルシズ（ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）,第１７巻,第１３号,ｐ.１２９３−６、イゾペット・ジェイら（Ｉｚｏｐｅｔ Ｊ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第５９巻,第４号,ｐ.５０７−１１、ベンチュリ・ジイら（Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｇ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年, ユーロピアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー・アンド・インフェクシァス・ディジージス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８巻,第４号,ｐ.２７４−８２、クリックス・ディーアールら（Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ ＤＲ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第１８１巻,第２号,ｐ.４９１−７、オブライエン・ダブリューエイ（Ｏ'Ｂｒｉｅｎ ＷＡ）,２０００年, クリニカル・インフェクシァス・ディジージス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ） ,第３０巻,追補第２号,ｓ１８５−９２、ピレイ・ディーら（Ｐｉｌｌａｙ Ｄ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年, レビューズ・イン・メディカル・ビロロジー（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） ,第１０巻,第４号,ｐ.２３１−５３、ブリオンズ・シイら（Ｂｒｉｏｎｅｓ Ｃ,ｅｔ ａｌ.）,２０００年,エイズ（ＡＩＤＳ）,第１４巻,第１１号,ｐ.１６５９−６０〕。したがって、薬剤耐性ＨＩＶの伝播は、公衆衛生当局並びにウイルス学者や医師がさらに注目するに値する重要な問題である。したがって、薬剤耐性ＨＩＶの複製を抑制しうる新しい抗ＨＩＶ剤を緊急に必要とする。
【０００３】
アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）は、薬剤耐性ＨＩＶに対して使用できると約束された薬剤である。ＰＡＰは２９ｋＤａの自然界に存在する抗ウイルス剤で、アメリカヤマゴボウ、すなわち、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）の葉から分離することができる〔イルビン・ジェイディーとアッカン(Ｉｒｖｉｎ ＪＤ ａｎｄ Ｕｃｋｕｎ),１９９２年,ファーマコロジー・アンド・セラピューティックス（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）,第５５巻,ｐ.２７９−３０２、ザーリング・ジェイエムら(Ｚａｒｌｉｎｇ ＪＭ,ｅｔ ａｌ.),１９９０年,ネーチャー(Ｎａｔｕｒｅ),第３４７巻,ｐ.９２−５〕。ＰＡＰにはＨＩＶ−１ ＲＮＡから脱プリン化する特異な能力がある〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ),第２６３巻,第２号,ｐ.４１９−２４、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）,第２６０巻,第２号,ｐ.４５３−８〕。ＰＡＰはＮＲＴＩ耐性一次臨床ＨＩＶ−１分離株に対して強力な抗ウイルス活性を呈する［エリス・エイら(Ｅｒｉｃｅ Ａ,ｅｔ ａｌ.),１９９３年,アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）,第３７巻,ｐ.８３５−８］。ジドブジン（ＺＤＶ）感受性およびＺＤＶ耐性の両臨床ＨＩＶ−１分離株は、ＺＤＶに対するよりもＰＡＰに対して４-ｌｏｇｓを超えて感受性が高いことが判明した［エリス・エイら(Ｅｒｉｃｅ Ａ,ｅｔ ａｌ.),１９９３年,Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ,第３７巻,ｐ.８３５−８］。ＰＡＰの遺伝子はクローン化され、クローン化された組換え体ＰＡＰの精製と大規模生産の手順が確立された［ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８,１９９９年、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１８巻,第２号,ｐ.１９３−２０１］。組換え体ＰＡＰは、インビトロで広範囲のウイルスに対してテストされ、このＰＡＰがＤＮＡとＲＮＡの両ウイルスに対して天然のＰＡＰと同程度に活性があると記録された〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８,１９９９年、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１８巻,第２号,ｐ.１９３−２０１〕。ＰＡＰのＸ線結晶構造は、２.１Åの分解能にて測定された〔クリノフ・アイら(Ｋｕｒｉｎｏｖ Ｉ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,プロウティーン・サイエンス(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ),第８巻,第１１号,ｐ.２３９９−４０５、クリノフ・アイブイら(Ｋｕｒｉｎｏｖ ＩＶ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,プロウティーン・サイエンス(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ),第８巻,第９号,ｐ.１７６５−７２〕。
【０００４】
最近、ＰＡＰとＨＩＶ ＲＮＡの相互作用の分子モデル〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第５号,ｐ.３３８２−９０、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７６巻,第２６号,ｐ.２４０７５−８１、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第４０巻,p.９１０４−１４,２００１年〕、およびこのモデルは強力な抗ＨＩＶ活性を有するＰＡＰ突然変異体を合理的にデザインするために使われている。強力な抗ＨＩＶ活性を有するＰＡＰ突然変異体の合理的なデザインは、新規で有用な抗ＨＩＶ剤を開発する場合に有力なツールとして役立つ。しかし、ＰＡＰ分子の活性部位以外のどの領域が、活性を有するＰＡＰ突然変異体を作るために修飾できるかはほとんど知られていない。
【発明の開示】
【０００５】
本出願により、修飾されたＰＡＰのウイルスＲＮＡに対する活性が野生型ＰＡＰに比べて向上しているような活性部位以外の一つ以上の領域内で、野生型ＰＡＰに比べて一つ以上の修飾部位を有する修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られる。ウイルスＲＮＡはレトロウイルスＲＮＡでもよい。この種のレトロウイルスには、ＨＩＶ−１や薬剤耐性ＨＩＶ−１が含まれる。一つの実施態様では、修飾されたＰＡＰは野生型ＰＡＰに比べてリボソームＲＮＡに対する活性も低い。
【０００６】
本発明の一つの実施態様では、ＰＡＰポリペプチドには、活性部位以外の領域において野生型ＰＡＰに関する修飾部位が含まれ、且つこのポリペプチドにより少なくとも一部が野生型ＰＡＰに埋め込まれている一つ以上のアミノ酸の相対的コンフォメーションが変えられる。活性部位以外の領域は疎水性領域でもよい。一つの実施態様では、修飾は活性部位から１５Å以上離れた領域において行われる。
【０００７】
一つの実施態様では、ＰＡＰポリペプチドの修飾はαヘリックス４−ループ−αヘリックス５領域内で起きる。この修飾は、野生型ＰＡＰの少なくとも一つのアミノ酸が埋め込まれている疎水性サブ領域に限定することができる。例えば、この領域におけるＰＡＰの修飾は、次のアミノ酸、すなわち、７６、１５１、１５２、１５８、１６２、または１６６の一つ以上で行うことができる。これらの数字は野生型ＰＡＰのアミノ酸の番号を意味している。例えば、位置１５１のアミノ酸はリシンからアラニンへ突然変異させることができ、または位置１５２におけるアミノ酸はイソロイシンからアラニンへ修飾することができる。
【０００８】
一つの実施態様では、ＰＡＰポリペプチドの修飾はαヘリックス６のＣ末端領域内で起きる。この領域におけるＰＡＰの修飾は、例えば、次のアミノ酸、すなわち、１３、１６、１４２、１８８、１９１、または１９２の一つ以上において起こりうる。これらの数字は、野生型ＰＡＰのアミノ酸の番号を意味している。例えば、位置１９１のアミノ酸はフェニルアラニンからアラニンへ変えることができ、または位置１９２のアミノ酸はアスパラギンからグリシンへ修飾することができる。
【０００９】
本発明により、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを一つ以上含む組成物も得られる。この種の組成物は医薬品組成物として使用することができる。
【００１０】
本発明により、ウイルスの複製を抑制する方法も得られ、この方法には本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドの一つ以上とウイルスＲＮＡとの接触が含まれる。
【００１１】
本発明により、ウイルスＲＮＡを脱プリン化する方法も得られ、この方法には本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドの一つ以上とウイルスＲＮＡとの接触が含まれる。
【００１２】
本発明により、ウイルス感染を治療する方法も得られ、この方法には治療を必要とする患者に本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを一つ以上投与する方法が含まれる。一つの実施態様では、ウイルス感染を治療する方法には、さらに、一つ以上の抗ウイルス剤の投与が含まれる。この抗ウイルス剤には、逆転写酵素のヌクレオシド類似体抑制剤、逆転写酵素の非ヌクレオシド抑制剤、ウイルス・プロテアーゼ抑制剤、などがある。
【００１３】
本発明の詳細な説明
略語
（ＦＬＰ）全長アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）
（ＨＡＡＲＴ）高活性抗レトロウイルス療法
（ＨＣＭＶ）ヒトのサイトメガロウイルス
（ＮＲＴＩ）ヌクレオシド逆転写抑制剤
（ＮＮＲＴＩ）非ヌクレオシド逆転写抑制剤
（ＰＩ）プロテアーゼ抑制剤
（ＰＡＰ）アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質
（ＰＢＭＣ）末梢血液単核細胞
（ＰＢＳ-ＰＡＰ）全長ＰＡＰ挿入断片含有プラスミド（ブルースクリプト;Bluescript）
（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
（ＷＴ）野生型
【００１４】
定義
本明細書で使用されている「野生型ＰＡＰ」は、本質的には、表２に記載されたアミノ酸配列を意味する。アミノ酸１−２６２が配列番号：１に対応する表２の野生型アミノ酸配列には、２２のアミノ酸Ｎ−末端信号ペプチドおよび２９のアミノ酸Ｃ末端拡張（表２に例示された２６３から２９１まで列挙されたアミノ酸）が含まれる。真核細胞で発現すると、Ｎ末端２２のアミノ酸配列は、通常、共翻訳的に切断され、分子量約３２ｋＤａのポリペプチドが得られる。このポリペプチドは、さらに、Ｃ末端２９のアミノ酸の切断により処理されて、分子量約２９ｋＤａの成熟した野生型ＰＡＰ（以後、「ＰＡＰ(１−２６２)」と呼ばれる）（すなわち、これはアメリカヤマボゴウ(Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ)から分離される）が得られる。イルビンら(Ｉｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ.),上記と同じ,ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス(Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ),第５５巻,ｐ.２７９−３０２ (１９９２年)。したがって、「野生型で成熟したＰＡＰ」では、このアミノ酸配列は表２に示されたＰＡＰアミノ酸配列１−２６２に対応することを意味している。本明細書で使われた「野生型ＰＡＰ」は、野生型ＰＡＰまたは野生型の成熟したＰＡＰを意味している。本明細書のＰＡＰまたは修飾されたＰＡＰポリペプチドのいろいろな位置のアミノ酸に言及することは、野生型ＰＡＰの対応するアミノ酸位置に言及することである。
【００１５】
本明細書で使用されている「修飾されたＰＡＰ」は、修飾されたＰＡＰのウイルスＲＮＡに対する活性が野生型ＰＡＰに比べて向上しているような、活性部位以外の一つ以上の領域内で、野生型ＰＡＰに比べて一つ以上のアミノ酸が変えられているＰＡＰポリペプチドを意味する。アミノ酸の変化には、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異、化学的修飾、などがある。
【００１６】
本明細書で使用されている「ＰＡＰ活性」は、ＲＮＡを脱プリン化するかまたはウイルス複製を抑制するＰＡＰの能力を意味している。本明細書で言及された修飾されたＰＡＰの活性向上は、触媒された脱プリン化またはウイルス複製の抑制の速度または量が、野生型ＰＡＰの場合よりも修飾されたＰＡＰの場合の方が大きいことを意味している。リボソームＲＮＡについては、ＰＡＰの活性は原核および真核リボソームの大きなｒＲＮＡの３’ 末端の近くに配置された高度に保存され、表面を露出した「α−サルシン／リシン」ループから単一アデニンの除去を意味している。イルビンら(Ｉｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ.),ファーマコロジー・アンド・セラピューティクス(Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ),第５５巻,ｐ.２７９−３０２ (１９９２年)。
【００１７】
本明細書で使用されているＰＡＰの「活性部位」は、ＰＡＰの触媒残基の約１０Å以内にあるＰＡＰの空洞（cavity）様表面を意味している。ＰＡＰの触媒残基は、ＲＮＡの脱プリン化を触媒する残基である。活性部位以外のＰＡＰの領域には、ＰＡＰの触媒残基から約１０Åを超えた領域が含まれる。活性部位以外の領域は、ＰＡＰの触媒残基から約１０−１５Å、約１５−２０Å、約２０Åを超えて、または約２５Åを超えて離れることができる。触媒残基Ｒ１７９は活性部位からアミノ酸または領域の間隔を測定する基準点として使用することができる。
【００１８】
１．ＲＮＡとＰＡＰの相互作用のモデル化
修飾されたＰＡＰポリペプチドがウイルスＲＮＡに対して活性の向上を示すかどうかを決める一つの方法は、本明細書で述べた方法か、または当該分野で周知のウイルスＲＮＡとＰＡＰの相互作用をモデル化する方法である。イン・シリコでテストされた修飾されたＰＡＰポリペプチドは、本明細書で述べた方法かまたは周知のいずれかの方法によりインビトロで任意に作り、次いで、任意に本明細書で述べた方法かまたは周知のいずれかの方法によりテストすることができる。
【００１９】
２．ＰＡＰの修飾
本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドは、任意の位置で一つのアミノ酸を別のアミノ酸で置換することにより修飾することができる。これは、例えば、修飾されたＰＡＰをコード化する点突然変異を核酸に導入することにより行うことができる。この種の修飾されたＰＡＰ分子を取得する技術は、本明細書に記載され、当該分野で周知である。
【００２０】
どのアミノ酸が相互に置換するかを決める基本的理念は、当該分野で周知のアミノ酸の物理的サイズ、極性、およびその他の周知の特性に基づいている。例えば、本発明のＰＡＰポリペプチドの特定の位置にアラニン置換基が含まれていれば、極性アミノ酸とは相反するその他の非極性アミノ酸がその位置における適切な置換基として役立つであろう。また、本発明のＰＡＰポリペプチドの特定の位置にアラニン置換基が含まれていれば、サイズの異なるアミノ酸とは相反する類似のサイズのアミノ酸がその位置における適切な置換基として役立つであろう。アミノ酸に関する特性の一部を下の表１に載せている。表１の特性は、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドではどのアミノ酸置換基が適切であるかを決める場合に役立てることができる。
【００２１】
2005533793.tif 000002
【００２２】
小さな極性アミノ酸には、Ｐ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱがある。小さな非極性アミノ酸には、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、およびＣがある。大きな極性アミノ酸には、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、およびＹがある。大きな非極性アミノ酸には、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、およびＬがある。
【００２３】
さらに、次のアミノ酸グループは、溶媒に曝されたアミノ酸残基では保存性の結果が得られると当該分野では教示されており、したがって、類似した結果が得られると期待することができる。すなわち：１）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、２）Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、３）Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、４）Ｋ、Ｒ、５）Ｆ、Ｙ、Ｗ（ＰＲＯＷＬ−アミノ酸特性のウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ.ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ.ｅｄｕ／ａａｉｎｆｏ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ.ｈｔｍ）。
【００２４】
内側の残基では、次のアミノ酸グループは、保存性の結果が得られると当該分野では教示されている。すなわち：１）Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、２）Ｎ、Ｄ、Ｅ、３）Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、４）Ｆ、Ｙ、Ｗ、５）Ｈ、Ｒ、６）Ｖ、Ａ、７）Ｌ、Ｆ（ＰＲＯＷＬ−アミノ酸特性のウエブサイトｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ.ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ.ｅｄｕ／ａａｉｎｆｏ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ.ｈｔｍ）。
【００２５】
適切なアミノ酸置換基であれば、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られる。
【００２６】
一つの実施態様では、修飾されたＰＡＰポリペプチドには、αヘリックス４−ループ−αヘリックス５領域におけるアミノ酸修飾が含まれている。代表的な修飾は下の実施例に提示されている。この実施例では、Ｋ１５１Ａ、Ｉ１５２ＡまたはＫ１５１ＡとＩ１５２Ａの両方の置換により本発明の修飾されたＰＡＰが得られた。野生型ＰＡＰでは、Ｉ１５２ａは、大抵、αヘリックス４−ループ−αヘリックス５の疎水性領域内に埋め込まれている。イソロイシンをアラニンで置換すると、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られた。したがって、この位置における大きな非極性アミノ酸をさらなる小さな非極性アミノ酸で置換すると、本発明のＰＡＰポリペプチドを修飾することもできる。さらに、この領域内におけるその他のアミノ酸を類似な形で修飾すると、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られると思われる。この領域内におけるその他のアミノ酸には、Ｆ１５８、Ｔ１６２、Ｔ１６６、およびＹ７６がある。一つ以上のこれらのアミノ酸を比較的小さなアミノ酸で置換すると、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られると思われる。さらに、αヘリックス４−ループ−αヘリックス５の領域内で、類似した立体配座の変化をもたらすその他の修飾により、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られると思われる。丁度、Ｆ１５８、Ｔ１６２、Ｔ１６６、およびＹ７６は立体構造上Ｉ１５２の近辺にあり、アミノ酸Ｋ１５１は一次構造上Ｉ１５２に隣接している。Ｋ１５１Ａ突然変異により、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られた。したがって、αヘリックス４−ループ−αヘリックス５の疎水性領域内でアミノ酸を修飾すると、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られ、一次構造上隣接アミノ酸を修飾すると、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドが得られる。一次構造上隣接するアミノ酸には、１５１、１５３、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、７５および７７がある。
【００２７】
一つの実施態様では、修飾されたＰＡＰポリペプチドにはαヘリックス６のＣ末端領域におけるアミノ酸修飾が含まれる。代表的な修飾は下の実施例に提示されている。この実施例で、Ｆ１９１Ａ、Ｎ１９２Ｇ、またはＦ１９１ＡおよびＮ１９２Ｇ両方の置換により本発明の修飾されたＰＡＰが得られた。野生型ＰＡＰでは、Ｆ１９１ａは大抵αヘリックス６のＣ末端領域内に埋め込まれており、Ｉ１４２、Ｉ１３、Ｙ１６の側鎖およびＫ１８８の疎水性部分と疎水性接触している。したがって、Ｉ１４２、Ｉ１３、Ｙ１６、およびＫ１８８の類似した修飾、またはこの領域における立体配座の類似な変化を生じる修飾は、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを生じると思われる。同様に、一次構造上隣接するアミノ酸の修飾によっても、Ｎ１９２Ｇの場合に示したように、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを作り得る思われる。したがって、αヘリックス６のＣ末端領域の内または周辺の次のような位置、すなわち、１９０、１９１、１９２、１４１、１４２、１４３、１２、１３、１４、１５、１６、１６、１８７、１８８、および１８９において、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを作ることができる。
【００２８】
アミノ酸置換の他に、修飾されたＰＡＰポリペプチドの中のアミノ酸は、化学的修飾などの当該分野で周知の方法により修飾して所望の効果を作ることができる。
【００２９】
３．結合
本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドは、標的の部分に結合してウイルスの複製を抑制したり、ウイルスＲＮＡの脱プリン化を触媒する能力をさらに高めることができる。標的の部分に本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドを標的とする一つの方法は、免疫結合である。適切な抗体へのＰＡＰの結合は、当該分野で周知の方法により行うことができる。
【００３０】
ＰＡＰの抗ウイルス活性は、細胞表面受容体に特異な抗体への結合により、顕著に促進され且つ細胞の選択性を非常に高めることができる。ＰＡＰを含むこの種の免疫結合の一つが、ヘルペス・ファミリーの一つ、すなわち、ヒトのサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に対して、我々のグループにより開発され、テストされている。この研究では、ＰＡＰの抗ウイルス作用はＰＡＰを抗体に化学的に結合することにより高められることが判明した。ゲールツら(Ｇｅｈｒｚ  ｅｔ ａｌ.)著,「新規な抗ウイルス免疫結合を用いたヒトのサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の治療(Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ (ＨＣＭＶ)  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ),プログレス・イン・サイトメガロウイルス・リサーチにおいて(ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ),ランディン・エム．ピー．編(Ｌａｎｄｉｎ,Ｍ.Ｐ.Ｅｄ.),エルセビア・サイエンス・パブリッシャーズ・ビーブイ(Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ),アムステルダム(Ａｍｓｔｅｒｄａｍ),ｐ.３５３(１９９１年)」。ＰＡＰ−抗体の結合体は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）に特異なモノクローナル抗体とＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ５５を用いて作られ、ｇｐ５５はＨＣＭＶ感染した細胞で発現され、且つ抗ウイルス効果をテストされる。ＰＡＰと抗ＬＤＬｒを用いて作られた結合体は、ＰＡＰの抗ウイルス作用を１０００倍に向上させ、１ｎｇ／ｍＬにおいてプラークの形成を５０％低下させる。抗ｇｐ５５へＰＡＰを結合しても、ＰＡＰ単独の場合に観察された抗ウイルス活性は向上しなかった。上で引用したゲールツら(Ｇｅｈｒｚ ｅｔ ａｌ.)。これらの研究は、ＰＡＰの抗ウイルス活性が細胞表面に向けられた抗体に結合することにより顕著に向上するが、これらの抗体は内面化されうる細胞表面タンパク質への標的にされねばならない。
【００３１】
ａ．免疫結合
免疫毒素に対して最も有効であるためには、いくつかの要件を満たす必要がある。パスタンら（Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ.）,セル（Ｃｅｌｌ）,第４７巻,ｐ.６４１(１９８６年)。まず第１に、免疫結合体は、特異的であり、且つ未感染組織と反応してはならない。抗原を発現しない組織への結合は、毒素の非特異的天然細胞結合サブユニットまたはドメインの除去により低減させることができる。さらに、植物糖タンパク質毒素には、細網内皮系の細胞に結合するマンノースオリゴ糖が含まれており、また、一部のケースでは肝細胞上の受容体により認識されるフコース残基も含まれているので、迅速なクリアランスとこれらの細胞に対する潜在的な細胞障害効果を回避するためには植物毒素の脱グリコシル化が必要である。第２に、抗体への毒素の結合は、抗原に結合する抗体の能力を低減させない。第３に、免疫毒素はエンドソームの小胞の中へ内部移行されねばならない。したがって、通常内部移行する表面受容体に対するモノクローナル抗体に配された毒素は、非内面化細胞表面分子に配されたものよりも活性が強い。第４に、毒素の活性成分は、細胞質内へ移行させなければならない。最後に、生体内治療の場合、免疫毒素が患者の組織を通過して細胞の活動部位まで移行する間、結合が無傷のままでいるために十分安定していなければならない。毒素をモノクローナル抗体へ結合するために使われたヘテロ２官能性架橋剤の第１世代は、生体内で不安定なジスルフィド結合を生み出すものであった。この問題は、一部は、より安定な架橋剤の合成により解決された。この架橋剤は、ジスルフィド結合に隣接してフェニル基かメチル基、またはこれら両方を用いてこの結合へのアクセスを制限した。
【００３２】
免疫毒素の活性は、初めは、これらの表面上の標的抗原を用いて細胞を撲滅するこの毒素の能力を測定して評価される。毒素は細胞内で作用するので、エンドサイトーシスにより自然に細胞に入る受容体およびその他の表面タンパク質は、通常、免疫毒素の良好な標的になるが、細胞表面に固定されている表面タンパク質はそうではない。しかし、同じ細胞表面タンパク質上で異種エピトープを認識している抗体の一部を利用できるならば、それらをすべてテストすることは有用である。これは、おそらく、標的タンパク質構造に立体配座を変化させることにより、一部にその内部移行を誘導するか、または毒素移行の場合の適切な位置への細胞間の経路を定めるからである〔メイら(Ｍａｙ ｅｔ ａｌ.),セルラー・イミュノロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）,第１３５巻,ｐ.４９０(１９９１年)〕。また、もし免疫毒素が、受容体に対する毒素部分の結合が、化学修飾により弱められても、なおも起こり、且つ毒素受容体が効果的に内部移行されるので、内部移行を促進するような毒素の形態を含んでいるなら、標的表面タンパク質の内部移行を誘起させることができる。〔ウィリンガムら(Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ.),プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）,第８４巻,ｐ.２４７４ (１９８７年)〕。
【００３３】
いくつかの免疫毒素が開発され、臨床試験で承認された。２種類の試験が行われた。第１の試験には、摘出された骨髄に免疫毒素が体外で加えられ、自己骨髄移植を行う患者への自己輸血の前に腫瘍含有細胞が除去された。リシンまたはリシンＡ鎖に連結された、抗ＣＤ５および抗ＣＤ７を含む多様な抗体が、この目的に使われた。アッカンら（Ｕｃｋｕｎ ｅｔ ａｌ.）,ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）,第７６巻,ｐ.１７２３ (１９９０年)。第２の種類の試験には、癌患者への局部的（腹腔などへの）または全身的な免疫毒素の非経口投与が含まれる。これらは、普通の治療では成功しなかった患者への主としてフェーズ１と２の試験であり、これらの患者には大きな腫瘍がある。これまでは、癌またはその他の固形の癌を治療する免疫毒素の調製に用いた抗体は、重要な正常ヒト組織（神経組織および骨髄）と反応し、顕著な臨床反応なしに量依存的な毒性を生じることが分かっている。例えば、グールドら（Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ.）,ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）,第８１巻,Ｐ.７７５ (１９８９年)。
【００３４】
ｂ．融合タンパク質
融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により作られ、修飾されたハイブリッドＰＡＰポリペプチドであり、この技術は、ウイルスにより感染した細胞に対して本発明の一つ以上の修飾されたＰＡＰポリペプチドを選択的に標的にするようにデザインされている。融合タンパク質は、細胞表面受容体に結合する標的部分と本発明の修飾されたＰＡＰとの融合により合成される。細胞毒性剤は、好適には、バクテリアまたは植物の毒の一部である。これらの融合タンパク質の活性は、用いた毒素のみならず、抗体の抗原への有効な結合、エンドサイトーシス、および機能的なリボソーム失活タンパク質の細胞内放出にも左右される。
【００３５】
ｃ．標的部分
ウイルスに感染した細胞は、多くが、サイトカイン受容体を産生することが示されているので、この型の治療の標的は成長因子受容体、分化抗原、またはその他の全く特徴が明らかにされていない細胞表面抗原である。したがって、有効な標的部分には、サイトカイン、サイトカイン・サブユニット、抗体または抗体サブユニットがあるが、これらに限定されない。特に、本明細書で使われた「標的部分」という用語はすべてのモノクローナル抗体、モノクローナル抗体フラグメント、単一鎖可変領域ポリペプチド、免疫毒素の産生に使われたサイトカインおよび融合毒素を意味すると定義される。標的部分の有用な実施例には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７２、ＴＸＵ．１、ＮＸＵ．１、ＴＰ−１、またはＴＰ−３抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体断片、または単一鎖可変領域ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明の標的部分はサイトカインでもよい。標的部分がサイトカインであるならば、好適なサイトカインにはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＮＧＦがあるが、これらに限定されない。標的部分は、宿主細胞の表面に存在しうるｇｐ１２０などのＨＩＶ特異性抗原でも、またはその他のＨＩＶ特異性抗原でよい。標的部分はＣＣＲ５でもよい。
【００３６】
ＰＡＰ、ＴＸＵ（抗ＣＤ７）−ＰＡＰの一つの免疫結合体は、ヒトのＨＩＶの治療に好適な特性を持っていると記載されている。［アッカンら(Ｕｃｋａｎ ｅｔ ａｌ.),ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・イクスペリメンタル・セラピューティックス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）,１９９９年,第２９１巻,第３号,ｐ,１３０１−７］。したがって、ＴＸＵ修飾ＰＡＰは有効であると期待される。
【００３７】
１．抗体
モノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）は、骨髄原発腫瘍の悪性細胞（骨髄腫）と脾臓リンパ球の融合により産生される。ミルスタイン(Ｍｉｌｓｔｅｉｎ),サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ）,第２４３巻,ｐ.６６(１９８０年)。この手順により、リンパ球と骨髄腫細胞系の両方の特徴を有する単一融合細胞ハイブリッドから生じるハイブリッド細胞系が得られる。リンパ球（抗原としてヒツジの赤い血液細胞を用いて感作した動物から採取した）と同様に、融合ハイブリッド、または、融合細胞腫は抗原と反応する抗体（免疫グロブリン）を分泌する。その上、骨髄腫細胞系と同様に、ハイブリッド細胞系は不死である。特に、ワクチン接種を受けた動物から得られた抗血清は、同一性を保持して再生することができない抗体の多様な混合物であるのに対して、融合細胞腫により分泌された単一型の免疫グロブリンは、抗原、つまり抗原分子サブ構造の多重度を有する複合分子または決定因子群（エピトープ群）の１つ、唯一の決定因子に特異的である。したがって、単一抗原に対して作られたモノクローナル抗体は、それらの形成を誘導した決定因子によっては互いに異なるかもしれない。しかし、任意のクローンにより作られたすべての抗体は同一である。さらに、融合細胞腫細胞系は、いつまでも再生され、生体外でも、生体内でも容易に伝播され、極端に高濃度のモノクローナル抗体を生じる。
【００３８】
モノクローナル抗体は、癌の診断と治療および自己免疫および移植片宿主相関病（ＧＶＨＤ）の治療と同種移植片拒絶反応の予防のための免疫抑制剤を産生するための免疫応答の調節に臨床的に大いに適用された。ヒトのモノクローナル抗体は、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、および緑膿菌の種々の特異な血清、大腸菌、および肺炎桿菌に対しても臨床的に適用された。
【００３９】
抗体とそれらのフラグメントは、より迅速なクリアランスを持つように遺伝子的に処理することもできる。これは、モノクローナル抗体が放射免疫スキャンニングで使用するラジオヌクレオチドに接合されている場合に望ましい。例えば、モノクローナル抗体の抗原結合フラグメント(Ｆａｂ)、Ｆ(ａｂ').ｓｕｂ.2、または単一鎖Ｆｖフラグメントの生存半減期は５時間未満である。迅速な代謝転換は、神経外胚葉を起源とするヒトの腫瘍上に発現されたディスアロガングリオシドＧＤ２と反応する抗体について証明されたＣＨ.ｓｕｂ.２ドメインの欠失によっても実現することができる。ミューラーら(Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔ ａｌ.), プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）,第８７巻,ｐ.５７０２ (１９９０年)。
【００４０】
さらに、それらのサイズが大きいために、無傷の抗体および対応する抗体毒素結合体は、血管領域から移動するそれらの能力が限定され、免疫結合体（これは一つの免疫グロブリン分子へのいくつかの毒素分子の連鎖を生じうる）として不均一であり、且つこれらの産生は高価であり、非常に労働集約的である。例えば、アッカン(Ｕｃｋｕｎ)の米国特許第４,８３１,１１７号、ロットドウエルら(Ｒｏｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ.)の米国特許第４,６７１,９５８号を参照のこと。これらの特許の教示は、本明細書で引用されている。その上、抗体および抗体の対応する免疫結合体の効能を改良する試みにおいて、単一鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)フラグメントとしてバクテリア中の抗体の軽重鎖可変領域を発現する場合に遺伝子設計が用いられた。パスタンら(Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ.),サイエンス(Ｓｃｉｅｎｃｅ),第２５４巻,ｐ.１１７３ (１９９１年)。一般に、これらの分子は不溶性であり、結合活性を検出するためには変性し且つ再び折り畳む必要がある。この方法で抗体結合ドメインを産生する場合の一つの問題は、親和力の高い抗体結合がすべての場合にうまく再構成できないことである。抗体がその標的に結合できるｓｃＦＶを生じる能力を支配するパラメータは未知であり、したがって、対象になる抗体遺伝子セグメントの直接クローン化と分析を必要としている。
【００４１】
４．生物学的療法剤の産生と精製
ａ．免疫結合体
この方法で使われる好適な抗体−ＰＡＰ免疫毒素は、有効量の細胞毒性ＰＡＰ分子を抗体の各分子に連結することにより形成される。例えば、本発明を実施する場合に有用な試薬は抗体分子につき１−３個のＰＡＰ分子を有する抗体とＰＡＰの約１：１混合物である。しかし、抗体分子は、［マスホら(Ｍａｓｕｈｏ ｅｔ ａｌ.)の米国特許第４,３６３,７５８号、ネビル・ジュニアーら(Ｎｅｖｉｌｌｅ, Ｊｒ, ｅｔ ａｌ.)の米国特許第５,１６７,９５６号、およびボイシンら(Ｖｏｉｓｉｎ ｅｔ ａｌ.)の米国特許第４,３４０,５３５号］で教示されたものを含む当該分野で開示されたその他の方法により有効量のＰＡＰに連結させることができる。例えば、Ｎ−サクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)に加えて、連結剤として、４−サクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−(２−ピリジルジチオ)トルエン(ＳＭＰＴ)およびＮ−サクシンイミジル ６−[3−(２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)が使用できる。
【００４２】
ｂ．融合タンパク質
ＰＡＰコード化ＤＮＡは、植物資源などの適切な資源から誘導または分離し、次いで、インビトロで化学的に変化させて、最後に動物、植物、昆虫、イースト、菌類またはバクテリアなどの資源から誘導された標的宿主細胞に導入することができる。ある資源から「誘導された」この種のＰＡＰ ＤＮＡの１例は、ＰＡＰをコードする有用なフラグメント、またはそれらの突然変異体または変異型フラグメントとして識別されているＤＮＡ配列であり、この配列は、次いで、本質的に純粋な形で化学的に合成される。ある資源から「分離された」この種のＰＡＰ ＤＮＡの１例は、有用なＤＮＡ配列であり、これは制限エンドヌクレアーゼの利用などの化学的方法により植物細胞から切除されたもので、この配列は、さらに、操作すること、例えば、本発明で使用するために遺伝子設計の方法により増幅することができる。
【００４３】
したがって、組換えＰＡＰをコードするＤＮＡには、完全合成のＤＮＡ配列、半合成のＤＮＡ配列、植物細胞から分離された天然のＤＮＡ配列、および導入されたＲＮＡから誘導されたＤＮＡ配列、並びにそれらの混合物がある。一般に、組換えＤＮＡ配列は、初めは、ＤＮＡの受容体である宿主標的細胞のゲノムには存在せず、また、ゲノムにも存在せず、発現されない。
【００４４】
本明細書の形質転換に使用された組換えＰＡＰ ＤＮＡ配列を含むベクターは、環状または線状の二本鎖または一本鎖である。一般に、ＤＮＡ配列はプラスミドＤＮＡなどのキメラＤＮＡの形をしている。このＤＮＡ配列には、得られた形質転換宿主細胞に存在する組換えＤＮＡの発現を促進するコントロール配列に隣接するコーディング領域も含まれる。例えば、組換えＤＮＡには、それ自身、細胞内で活性な異質のプロモーターが含まれているか、または形質転換の標的であるゲノム中にすでに存在するプロモーターを利用することができる。この種のプロモーターには、ＧＡＬ１プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、ＣＭＶプロモーター、並びにＳＶ ４０後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲｓ（長い末端反復エレメント）がある。ＰＡＰまたはその一部の転写ユニットとして役立つ組換えＤＮＡ配列を除いて、一部の組換えＤＮＡは転写されず、調節機能または構造機能を果たす。
【００４５】
「コントロール配列」は、本明細書では、特定の宿主細胞において作用可能に連結されたコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味すると定義されている。原核細胞に対して適切なコントロール配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位がある。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化信号、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００４６】
「作用可能に連結された」という用語は、核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれていることを意味すると定義されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、もしそのＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与しているプレタンパク質として発現されるならば、ＰＡＰポリペプチドのＤＮＡに作用可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、そのＤＮＡが配列の転写に影響を及ぼすならば、コーディング配列に作用可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、もしそのＤＮＡが翻訳を促進するように配置されるならば、コーディング配列に作用可能に連結される。一般に、「作用可能に連結された」という用語は、連結されているＤＮＡ配列が切れ目なくつながっており、分泌リーダーの場合読み取りフェーズにおいて切れ目なくつながっていることを意味している。しかし、エンハンサーは切れ目なくつながっている必要はない。連結は、好都合な制限部位における連結反応により実現される。この種の部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチド・アダプターまたはリンカーは普通の慣行に従って使われる。
【００４７】
組換え形質転換ベクターには、一般に、形質転換されることを要求された細胞集団から形質転換された細胞の同定と選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子またはリポーター遺伝子または両遺伝子が含まれている。一方、選択可能なマーカーは、個別のＤＮＡ切片上に運ばれ、共形質転換操作において使われる。選択可能なマーカー遺伝子およびリポーター遺伝子は、両方とも、適切な調節配列により側面に隣接された、宿主細胞における発現を可能にする。選択可能で有用なマーカーは、当該分野でよく知られており、これらのマーカーには、例えば、ｕｒａ、ｎｅｏ、ｈｐｔ、ｄｈｆｒ、ｂａｒ、ａｒｏＡ、ｄａｐＡなどの抗生物質や除草剤に耐性のある遺伝子がある。
【００４８】
リポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞の同定および調節配列の機能性の評価に使われる。容易に効力検定可能なタンパク質をコード化するリポーター遺伝子は、当該分野においてよく知られている。一般に、リポーター遺伝子は、受容体生物または組織に存在しないか、受容体生物または組織により発現しない遺伝子であり、且つこの遺伝子はタンパク質をコード化し、タンパク質の発現は、容易に検出できる特性、例えば、酵素活性により明示される。好適な遺伝子には、大腸菌のＴｎ９からのクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ｃａｔ）、大腸菌のｕｉｄＡ遺伝子座のベータ・グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、およびホタルのフォチナス・ピラリスからのルシフェラーゼ遺伝子がある。リポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡが受容体細胞に導入された後の適切な時間に効力検定される。
【００４９】
イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの宿主細胞において機能的なその他のエレメントは、組換えＰＡＰの一部でもありうる。この種のエレメントは、ＤＮＡの機能にとって必要な場合もあるし、不必要な場合もあるが、転写の影響、ｍＲＮＡの安定性などによりＤＮＡの発現を改善することができる。この種のエレメントは、細胞内の形質転換ＤＮＡの最適な性能をうるために望ましいＤＮＡに含まれる。
【００５０】
標的細胞を形質転換することができる組換えＤＮＡを組み立てる一般的な方法は、当業者にはよく知られており、且つ同じ組成と構築方法が本明細書で有用な組換えＰＡＰの産生に利用されうる。例えば、［ジェイ・サンブルックら(Ｊ, Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.)著,モレキュラー・クローニング(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ),「実験室のマニュアル(Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ)」,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ発行,（第２版,１９８９年）］により適切な構築方法が得られる。
【００５１】
組換えＰＡＰは、ＰＡＰコード化cＤＮＡを含む発現ベクターを用いたトランスフェクションにより、例えば、[シー・チェンら(Ｃ. Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.),モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）,第７巻,ｐ.２７４５ (１９８７年)]の修飾された燐酸カルシウム沈殿操作により、標的細胞に容易に導入することができる。トランスフェクションは、例えば、ＢＲＬにより提供された購入可能なキットを用いてリポフェクチンにより実現することもできる。
【００５２】
組換えＰＡＰを発現する適切な宿主細胞は、イースト、昆虫および植物などの多細胞生物から導かれる。この種の宿主細胞は、複雑な処理が可能で、また、これらの細胞にはグリコシル化活性がある。原理的には、いずれかのより高等な真核細胞の培養物は、脊椎動物からであろうと、非脊椎動物からであろうと、機能的である。非脊椎動物の細胞の例には、植物や昆虫の細胞がある。多数のバキュロウイルス株や変異型およびスポドプテラ・フルギペルダ（芋虫）、アエデス・アエグプティ（蚊）、アエデス・アルボピクタス（蚊）、ドウロソフィラ・メラノガスター（ミバエ）、およびボンビクス・モリなどの宿主からの対応する許容できる宿主細胞が同定されている。例えば、[ルッコウら(Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ.),バイオ・テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）,第６巻,ｐ,４７(１９８８年)、ジェー・ケイ・セトロウら(Ｊ.Ｋ. Ｓｅｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ.)編,Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇのミラーら(Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.)の論文,第８巻,プレナム・パブリッシング(Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ),１９８６年,ｐｐ.２７７−９、およびマエダら(Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ.),ネーチャー(Ｎａｔｕｒｅ),第３１５巻,ｐ.５９２(１９８５年)]を参照のこと。トランスフェクション用の多様なウイルス株は、公的に利用できる。例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異型やボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５株、およびこの種のウイルスが、好適には、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションに使える。
【００５３】
バキュロウイルス昆虫細胞システムは、哺乳動物のタンパク質の発現によく似ているので、しばしば使われる。その場合タンパク質は翻訳後の適切な修飾を用いて作られる［エイ・アンジェルマンら(Ａ. Ａｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.),ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）,第２０６巻,ｐ.２２５(１９９２年)、エム・ディー・サマーズら(Ｍ.Ｄ. Ｓｕｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ.)著,「マイクロジーン・システム・インクのバキュロウイルス・ベクターズに関する方法および昆虫細胞培養操作のマニュアル(Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ ＭｉｃｒｏＧｅｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ.) 」,コネチカット州ニューハーベン(Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ, Ｃｏｎｎ,)(１９８８年)、ディー・アール・オライリーら(Ｄ.Ｒ. Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ.)著,「バキュロウイルス発現ベクターズ：実験室マニュアル」(Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ),オクスフォード大学プレス発行(Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ. Ｐｒｅｓｓ),ニューヨーク(Ｎ.Ｙ.)(１９９４年)］。
【００５４】
制限消化物からの任意のＤＮＡフラグメントの回収または分離は、電気泳動によるポリアクリルアミド・ゲルまたはアガロース・ゲルにおける消化物の分離、既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントとの移動度の比較による問題のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含むゲル・セクションの除去、およびＤＮＡからのゲルの分離を用いることができる。例えば、［ローンら(Ｌａｗｎ ｅｔ ａｌ.),ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）,第９巻,ｐ.６１０３ (１９８１年)、およびゲッデルら(Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ.), ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒａｒｃｈ）,第８巻,ｐ.４０５７ (１９８０年)］を参照のこと。
【００５５】
「サザン分析」または「サザン・ブロッティング」は、ＤＮＡまたはＤＮＡ含有組成物の制限エンドヌクレアーゼ消化物にＤＮＡ配列が存在するかどうかを、周知の標識つきオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントのハイブリッド形成により確認する方法である。サザン分析には、上記、サンブルックら(Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.)のセクション９.３７−９.５２に記載されているように、通常、アガロース・ゲルにおけるＤＮＡ消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のＤＮＡの変性、および、放射性標識付きでビオチニル化したプローブまたは酵素で標識をつけたプローブを用いて分析するための、ニトロセルロース、ナイロン、または別の適切な膜支持体へのＤＮＡの移動が含まれている。
【００５６】
「ノーザン分析」または「ノーザン・ブロッティング」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡまたはそれらのフラグメント、またはＲＮＡフラグメントなどの周知のプローブにハイブリッド化するＲＮＡ配列を同定するために使われる方法である。このプローブは、３２−Ｐなどの放射性同位元素、ビオチン化または酵素により標識される。分析対象のＲＮＡは、通常、上記、サンブルックら(Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.)のセクション７.３９−７.５２に記載されている方法などの当該分野でよく知られた標準的な方法を用いて、アガロース・ゲルまたはポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動により分離され、ニトロセルロース、ナイロン、または別の適切な膜に移され、次いで、プローブとハイブリッド化される。
【００５７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ある量の予め選択された核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、米国特許第４,６８３,１９５号に記載されているように増幅されることを意味している。一般に、この領域の複数の末端からの配列情報はオリゴヌクレオチド・プライマーのデザインに使われる。これらのプライマーは、増幅対象の鋳型の反対側の配列と同一か、または類似している。ＰＣＲは、特異なＲＮＡ配列、特異なＤＮＡ配列をゲノムＤＮＡ全体から増幅するために使われ、ｃＤＮＡは細胞の全ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写された。一般に、［ムリスら(Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ.),コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・クォンティタティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）,第５１巻,ｐ.２６３(１９８７年)、エルリッヒ編,ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,ストックトン・プレス(Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ)発行,ニューヨーク(Ｎ.Ｙ.)，１９８９年］を参照のこと。
【００５８】
「緊縮条件」は、（１）洗浄に、例えば、０.０１５Ｍ ＮａＣｌ／０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)、０.１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を５０℃にて低いイオン強度と高温で用いる条件、または（２）ハイブリッド化の間に、ホルムアミドなどの変性剤を用いる条件がある。ホルムアミドとしては、例えば、０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％フィコール／０.１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６.５にて７５０ｍＭ ＮａＣｌ、４２℃で７５ｍＭクエン酸ナトリウムを有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)ホルムアミドがある。別の例は、５０％ホルムアミド、５倍のＳＳＣ(０.７５Ｍ ＮａＣｌ,０.０７５Ｍクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５倍のデンハルト溶液、超音波処理したサーモン精液ＤＮＡ(５０.ｍｕ.ｇ／ｍＬ）、０.１％ＳＤＳ、および４２℃の１０％硫酸デキストランの使用である。その際、０.２倍のＳＳＣと０.１％のＳＤＳ中における４２℃での洗浄を伴う。
【００５９】
組換えＰＡＰがヒトを起源とするもの以外の組換え細胞中で発現される場合は、ＰＡＰポリペプチドには、ヒトを起源とするタンパク質やポリペプチドは全くない。しかし、天然のＰＡＰと同じ程度に実質的に均一な標品を取得するためには組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＰＡＰポリペプチドを精製する必要がある。例えば、培養媒体またはライゼートは、遠心分離して細胞のかけらを除去することができる。次いで、膜と可溶性タンパク質画分が分離される。次いで、ＰＡＰポリペプチドは、可溶性タンパク質画分から、必要であれば、培養ライゼートの膜画分から精製することができる。次いで、ＰＡＰポリペプチドは、免疫アフィニティーまたはイオン交換カラムにおける画分、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂またはシリカ上のクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲルろ過、またはリガンド・アフィニティー・クロマトグラフィにより夾雑可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製することができる。
【００６０】
得られた形質転換した宿主細胞から一旦分離されると、ＰＡＰポリペプチドの誘導体と変異型は容易に作ることができる。ＰＡＰポリペプチドの一つ以上の残基は、抗ウイルス活性が保持される限り、変えることができる。保存的アミノ酸置換は好適である。これには、例えば、酸性アミノ酸としてアスパルティック−グルタミック、塩基性アミノ酸としてリシネルアルギニン／ヒスチジン、疎水性アミノ酸としてロイシン／イソロイシンとメチオニン／バリン、親水性アミノ酸としてセリン／グリシン／アラニン／スレオニンがある。さらに、ポリペプチドのカルボキシル基の塩類は、ポリペプチドを一つ以上の等価な所望の塩基と接触させることにより普通の方法で作ることができる。所望の塩基には、例えば、水酸化ナトリウムなどの金属水酸化物塩基、炭酸ナトリウムや重炭酸ナトリウムなどの炭酸金属や重炭酸塩基、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなどのアミン塩基がある。
【００６１】
さらに、ポリペプチドの酸付加塩類は、例えば、塩化水素酸などの所望の無機または有機酸の一つ以上の等価物とポリペプチドを接触させて作ることができる。
【００６２】
ポリペプチドのカルボキシル基のエステル類は、当該分野で周知の通常の手段によりカルボン酸または前駆物質をエステルに転換して作ることができる。このポリペプチドのエステルを作る一つの好適な方法は、樹脂から完全なポリペプチドを切り取る方法であり、この方法は樹脂により塩基性または酸性条件下で所望のアルコールの存在下で行われる。したがって、樹脂からフリーになったポリペプチドのＣ末端を、フリーな酸を分離することなく直接エステル化する。
【００６３】
分離されたポリペプチドのアミド類も、当該分野で周知の方法によりカルボン酸基または前駆物質をアミドに転換して作ることができる。Ｃ末端カルボキシル基においてアミドを形成する好適な方法は、適切なアミンを用いて固体支持体からポリペプチドを切り取るか、またはアルコールの存在下で切り取ってエステルを作り、次いで、所望のアミンを用いてアミノ分解する方法である。
【００６４】
このポリペプチドのアミノ基のＮ−アシル誘導体は、Ｎ−アシルで保護されているか、保護されていないペプチドを利用して作ることができる。Ｏ−アシル誘導体は、例えば、フリーなヒドロキシ・ペプチドまたはペプチド樹脂のアシル化により作ることができる。アシル化は、各々、アシルハライド、無水物、アシルイミダゾールなどのような標準アシル化剤を用いて行える。Ｎ−およびＯ−アシル化は、望ましいならば、一緒に行うことができる。
【００６５】
次の文献には、アミノ酸残基を連結する非ペプチジル結合を含むポリペプチド類似体の調製について記載されている。スパトラ(Ｓｐａｔｏｌａ),ベガデータ(Ｖｅｇａ Ｄａｔａ),第１巻,ｐ.３(１９８３年)、ハドソンら(Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ.),インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・プロティーン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）,第１４巻,ｐ.１７７(１９７９年)、スパトラ(Ｓｐａｔｏｌａ)著,ビー・ワインスタイン(Ｂ. Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ)編,「アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質の化学と生化学(Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ  Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ, Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ)」,マルセル・デッカー(Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ)発行,ニューヨーク(Ｎ.Ｙ.),ｐ.２６７(１９８３年)、スパトラら(Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ.),ライフ・サイエンス(Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ),第３８巻,ｐ.１２４３(１９８６年)、アルムキストら(Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ.),ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）,第２３巻,ｐ.１３９２ (１９８０年)、ホラデイら(Ｈｏｌｌａｄａｙｅｔ ａｌ.),テトラヘドロン・レターズ(Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ),第２４巻,ｐ.４４０１ (１９８３年)。
【００６６】
本発明の融合タンパク質を作るために、ＰＡＰ遺伝子は、本発明で使用するのに適した成熟した形のサイトカインをコード化する遺伝子か、または好適には柔軟性のある分子ヒンジの部位において遺伝学的に設計された新規なモノクローナル抗体サブユニット、例えば、Ｆｖフラグメントに連結される。さらに、短いＳｅｒ−(Ｇｌｙ)４−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ介在リンカーをコード化する合成ＤＮＡ配列は、ＰＡＰとサイトカインを分離するヒンジ部位に挿入されるか、またはＭｏＡｂｓｃＦｖ部分に結合ドメインが高いアフィニティー受容体結合に関与するのに利用できることを保証する。組換えポリペプチド細胞毒素の合理的な薬剤デザインは、ＰＡＰとサイトカイン両方または抗体分子の結晶学的分析で同定された本質的な構造と機能の関係を保持しようとしている。ラムバルジら(Ｒａｍｂａｌｄｉ ｅｔ ａｌ.),ブラッド(Ｂｌｏｏｄ),第８１巻,ｐ.１３７６ (１９９３年)。
【００６７】
大腸菌において組換えポリペプチド細胞毒素の産生に用いたｐＥＴ１１ｄ発現ベクター〔５３７１１ウィスコンシン州(Ｗｉｓ.)マジソン(Ｍａｄｉｓｏｎ)サイエンス・ドライブ５９７,ノバーゲン・インク(Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ.)〕には、３'ラック・オペレーター配列融合と基礎発現を抑制するためのラッドの内部コピー、翻訳効率に関わる有効なシャイン・ダルガルノ配列、および組換えｓｃＦｖ、ｄｓＦｖの挿入に関わるＮｃｏｌクローニング部位、および毒素遺伝子融合が含まれている。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子をコード化する遺伝子は、溶原性により大腸菌発現宿主のゲノムに組み込まれ、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターのコントロール下にある。例えば、ＨＭＳ １７４(ｄｅ３)ｐｌｙｓＳ宿主のｐｌｙｓＳ遺伝子は少量のＴ７リゾチーム、すなわち、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ天然抑制剤を産生し、遺伝子発現調節のさらなる厳格さを提供する。ｐＥＴ１１ｄ発現ベクター内からの生物療法剤の発現は、大腸菌発現宿主を含む媒体へのイソプロピルチオガラクトシド(ＩＰＴＧ)の付加により誘導される。
【００６８】
生物療法剤は、ＨＭＳ １７４(ｄｅ３)ｐｌｙｓＳなどの宿主で個別に発現され、可溶性生成物は凍結−解凍サイクルと超音波処理により破壊された細胞から回収される。組換えポリペプチド細胞毒素を含む可溶性画分は、逐次ろ過、抗毒素免疫アフィニティー・クロマトグラフィ、ろ過と透析、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ、追加のろ過内毒素除去樹脂、および最終ろ過と透析により逐次的に精製される。不溶性生成物は、リン酸緩衝生理食塩水などの生理的緩衝液のコントロール条件下でゆっくりした再生を伴いながら７ＭグアニジンＨＣｌへの溶解による精製の場合に可溶性にすることができる。
【００６９】
Ｆ．生物療法剤の投与モード
この修飾されたＰＡＰポリペプチドは、医薬組成物として処方し、これらの薬剤により治療できる患者やその他の哺乳動物に投与することができる。これらの薬剤は、単独または医薬品として使用できるキャリアーや媒介体と併用して一つ以上のこれらの薬剤の有効量を含む単位用量として使用することができる。
【００７０】
１．剤型
本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドは、注入または注射により、非経口的、すなわ
ち、静脈または皮下に投与するのが好ましい。修飾されたＰＡＰポリペプチドの溶液または懸濁液は、水またはＰＢＳなどの等浸透圧の生理食塩水を用いて作ることができる。これらの水や食塩水は、任意に毒性のない界面活性剤と混合することができる。分散体も、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、ＤＭＡ、植物油、トリアセチン、およびこれらの混合物中で作ることができる。普通の貯蔵および使用条件下では、これらの製剤には、微生物の増殖を防ぐために保存剤が含まれている。さらに、修飾されたＰＡＰポリペプチドの肺へのより特異的な運搬は、エアロゾル運搬システムを介して行うことができる。エアロゾル運搬に適した医薬品用量形式は、適切なサイズのリボソームなどのアディポット処方が含まれる。
【００７１】
注射や注入用に適した薬剤型には、修飾されたＰＡＰポリペプチドを含む無菌の水溶液または分散剤、あるいは無菌の粉末がある。これらのポリペプチドは、無菌の注射や注入可能な溶液または分散体の必要に応じて調合される製剤用に適合している。すべての場合に、最終的な剤型は、無菌の液体で、且つ製造および貯蔵条件下で安定していなければならない。液状キャリアーや媒介体は、溶媒または液状分散媒体であればよく、これらの溶媒または液状分散媒体には、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール、など）、植物油、無毒のグリセロール・エステル、脂質（例えば、ジミリストイル・フォスフォチジル・コリン）およびこれらの適切な混合物が含まれている。適切な流動性は、例えば、リボソームの形成により、分散体の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、または無毒の界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌性および抗真菌性薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザール、などにより達成することができる。多くの場合、等浸透剤、例えば、砂糖、緩衝剤または塩化ナトリウムを含むことが望ましい。これらの組成物に、吸収遅延剤、例えば、アルミニウム・モノステアレート・ヒドロゲルおよびゼラチンを入れることにより注射可能な組成物の吸収を引き延ばすことができる。
【００７２】
注射または注入が可能な無菌溶液は、適切な溶媒に、必要な量の修飾されたＰＡＰポリペプチドを、上に挙げたその他の種々の成分と共に加え、必要に応じて、次いで、ろ過無菌化することにより作られる。無菌粉末の場合、注射または注入が可能な無菌溶液の調製では、好適な調製方法は、真空乾燥と凍結乾燥法であり、これらの方法では、活性成分と予め無菌ろ過溶液に存在する追加の所望成分を含む粉末が得られる。
【００７３】
さらに、本発明の修飾されたＰＡＰポリペプチドの適切な処方には、経口、直腸、鼻、局所（眼および舌下を含む）または膣からの投与または吸入や吹き込みによる投与に適した形の処方がある。これらの処方は、薬学の分野で周知の方法により作られる。この種の方法には、液状キャリアーや微粉砕した固体キャリアーまたは両方と修飾されたＰＡＰポリペプチドを会合させ、次いで、必要ならば、製品を所望の処方に成形するステップがある。
【００７４】
経口投与に適した薬剤処方は、カプセル、サチェット、または錠剤などの個別ユニットとして提供するのが便利である。各々のユニットには、所定量の活性成分が、粉末または顆粒として、溶液、懸濁液または乳液として含まれている。活性成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとしても提供することができる。経口投与の錠剤とカプセルには、結合剤、フィラー、潤滑剤、錠剤分解物質または湿潤剤などの賦形剤が含まれている。錠剤は、当該分野で周知の方法にしたがって被覆することができる。経口液状製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシル剤の形をしているか、または使用する前に水またはその他の適切な溶媒と組成物を形成する乾燥製品として提供することができる。この種の液状製剤には、懸濁剤、乳化剤、非水性媒介体（これには食用油が含まれる）、または保存剤などの通常の添加剤が含まれる。
【００７５】
修飾されたＰＡＰポリペプチドは、鼻腔内または眼に投与できるように処方することもできる。この型の投与では、活性成分は液状スプレイまたは分散性粉末として、または液滴の形で使える。液滴、例えば、目薬は、一つ以上の分散剤、可溶化剤または懸濁剤を含む水性または非水性ベースを用いて処方することができる。液状スプレイは加圧パックから放出するのが便利である。
【００７６】
吸入による投与の場合、ビオット（biot）修飾されたＰＡＰポリペプチドは、吹き込み器、噴霧器または加圧パックまたはエアロゾル・スプレイを放出するその他の便利な手段から送り込むのが便利である。加圧パックには、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスなどの適切な噴射剤が含まれている。加圧エアロゾルの場合、用量ユニットは計量した量を送り込むためにバルブを用意することにより決められる。
【００７７】
一方、吹き込みの吸入による投与の場合、修飾されたＰＡＰポリペプチドは、乾燥粉末組成物、例えば、化合物の粉末混合物またはラクトースや澱粉などの適切な粉末ベースの形をとる。この粉末組成物は、ユニット剤型、例えば、カプセルかカートリッジまたは例えば、ゼラチンかブリスター包装で提供することができる。ブリスター包装から粉末は吹き込み器の吸入器により投与することができる。
【００７８】
さらに、修飾されたＰＡＰポリペプチドは、剤型またはコントロールされた放出剤型によく適合している。剤型は、活性乾燥成分のみを、好適には特定の生理学的位置において任意にある時間をかけて放出するように構成され得る。コーティング、包被、および保護マトリックスを、例えば、ポリマー物質またはワックスから作る。このコンパウンドは、経皮的輸送、皮下インプラント、融合ポンプのためのパッチを介して、またはインプラントされた貯留物持続性放出剤型からの放出を介して送り届けることもできる。
【００７９】
２．用量
前記組成物における修飾されたＰＡＰポリペプチドの用量は、患者の体重、年齢お
よび状態と標的となる癌によって広く変えることができる。動物データに基づいて、３〜５日にわたり投与した場合、用量は０.０２５ ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙと１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの間で変えることができる。
【００８０】
次の詳細な実施例を参照して、本発明についてさらに説明する。
【実施例１】
【００８１】
突然変異体ＰＡＰタンパク質の合理的なデザイン−分子モデル化
組換えＰＡＰタンパク質の合理的なデザインに関わる分子モデル化の研究は、以前に詳細に説明した方法で行われた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第5号,ｐ.３３８２−９０、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７６巻,第２６号,ｐ.２４０７５−８１、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第４０巻,ｐ.９１０４−１４〕。ＰＡＰ−リボソーム（大きなサブユニット）錯体の分子モデルは、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｍｏｒｔｕｉ（タンパク質データバンク・アクセスコード１ＦＦＫ）［バンら(Ｂａｎ ｅｔ ａｌ.),(２０００年),サイエンス(Ｓｃｉｅｎｃｅ),第２８９巻,ｐ.９０５−２０］からの大きなリボソーム・サブユニットの２.４Å結晶構造およびＰＡＰ−ヌクレオチド錯体（アクセスコード１ｐａｇ）の結晶構造から導かれた。
【００８２】
強力な抗ＨＩＶ活性を有する無毒な突然変異体ＰＡＰタンパク質の構造をベースにしたデザイン
分子モデル化の研究により、リボソームＲＮＡとＨＩＶ−１ ＲＮＡは、ＰＡＰとそれらの相互作用において明らかに異なる結合モードを選ぶことが判明した。ＰＡＰの抗ＨＩＶ活性選択的強化をもたらす特異的突然変異に関する合成研究において、我々は活性部位の反対側にある残基Ｉ１５２が埋め込まれていることを指摘した（図１）。残基Ｋ１５１とＩ１５２はヘリックスα４に配置され、ヘリックスα４にループとヘリックスα５が続く。Ｉ１５２の側鎖は、大部分が、Ｆ１５８（ループから）、Ｔ１６２とＦ１６６（ヘリックスα５）、およびミドルβ鎖からのＹ７６の接触部を有する疎水性接触部（約３−４Å）に埋め込まれている。対照的に、Ｋ１５１の側鎖は、大部分が露出し、同じヘリックスからのＮ１４８と水素結合を形成できる。残基１５２は、触媒残基Ｒ１７９から約２０Å、ＰＡＰ活性部位の反対側に位置している。
【００８３】
アルファヘリックス上の疎水性残基のアラニン置換は、一般に、らせん配座を破壊しないとされている〔ベル・ジェイエイら(Ｂｅｌｌ ＪＡ ｅｔ ａｌ.),１９９２年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第３１巻,第１４号,ｐ.３５９０−６〕。多くの場合、Ｉ１５２Ａなどの大から小への突然変異は、事実、らせん状の配座の場合構造的に好ましい〔ツァン・エックスジェイら(Ｚｈａｎｇ ＸＪ ｅｔ ａｌ.),１９９２年,プロティーン・サイエンス(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ),第1巻,第６号,ｐ.７６１−７６〕。しかし、Ｉ１５２と周囲の残基の間の多重ファン・デル・ワールス接触に照らして、Ｉ１５２Ａの大から小への突然変異がなければぎっしり詰め込まれた疎水性領域に潜在的に空洞を作りうる。このタンパク質のコアの中の嵩の大きいイソロイシン側鎖は、比較的小さなアラニン側鎖の場合よりも比較的大きな疎水性安定化をもたらす。大きな空洞を作りうるＩｌｅのＡｌａへの置換は、特に安定化を損なう。なぜならば、それは疎水性とファン・デル・ワールスの両相互作用の喪失を生じるからである。結果としては、周囲の残基は緊張を緩め、想定された空洞の容積を低下させる。この種の突然変異は、局部的な配座の安定性を低下させ、配座に顕著な変化を生じさせる〔マテウス・ビーダブリュー(Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＢＷ.),アドバンシス・イン・プロティーン・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９５年,第４６巻,ｐ.２４９−７８〕。この残基の側鎖は、根本的に異なる方位に回転し、Ｔ４リゾチームで観察されたＳ１１７突然変異で実証されたようにコアの再充填を認める。この種の再充填は、主鎖と側鎖両方の調節に関連している。突然変異された残基を含むタンパク質の骨格は、天然の配座から逸脱する。この種の配座の変化は、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ）におけるＧ９３Ａ突然変異について以前に示されたように、２５Åを超えて離れている触媒残基動的挙動に到達し且つこの動的挙動に影響を及ぼすことがある〔イム・エッチエスら（Ｙｉｍ ＨＳ, ｅｔ ａｌ.）,１９９７年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７２巻,第１４号,ｐ.８８６１−３、リウ・アールら（Ｌｉｕ Ｒ,ｅｔ ａｌ.）,１９９９年,ラディエーション・リサーチ(Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ),第１５１巻,ｐ.１３３−４１〕。我々およびその他のグループは、この種の突然変異は酵素活性（基質結合ではなく）に影響を及ぼす劇的な効果を永い間認識し、我々のタンパク質設計におけるコンセプトを活発に追求していた。
【００８４】
我々は、ＰＡＰとリボソームの結晶構造に基づくリボソームとＰＡＰの錯体構造およびＨＩＶウイルスＲＮＡ基質の錯体構造を以前にモデル化した〔クリノフ・アイブイら(Ｋｕｒｉｎｏｖ ＩＶ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,プロウティーン・サイエンス(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ),第８巻,第９号,ｐ.１７６５−７２〕。提案されたこの構造モデルは、活性部位と延長された基質結合部位に含まれた残基に関する我々の突然変異研究とよく一致している〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第5号,ｐ.３３８２−９０〕。我々のモデル化解析に基づいて、我々は、リボソームの結合モードは図1に示したウイルスＲＮＡの結合モードとは明らかに異なることを認識した。我々のモデル化研究により、アラニン（Ｉ１５２Ａ）などの比較的小さな残基を用いたこのイソロイシンの置換は、空洞を作りコアの再充填と活性部位の配座のかなりの変化を生じ、これがリボソームＲＮＡのＰＡＰを介した脱プリン化にとって選択的に好ましくないが、ＨＩＶ−１ ＲＮＡの触媒脱プリン化には影響を及ぼさないことが判明した。
【００８５】
Ｉ１５２とＫ１５１の両残基の二重突然変異は、これら２つの残基の一つのみを含む単一の突然変異よりも、リボソーム抑制活性のより実質的な喪失を生じると予測された。残基Ｆ１９１とＮ１９２は触媒残基Ｒ１７９から約２０Å離れたヘリックス６のＣ末端基上でより柔軟性のある環境に配置されている（図１）。
【００８６】
Ｉ１５２の結合環境に似て、Ｆ１９１の側鎖は埋め込まれ、Ｉ１４２、Ｉ１３、Ｙ１６、およびＫ１８８の疎水性部分の側鎖と疎水性接触しており、これらのすべては隣接ヘリックス上に位置している。Ｎ１９２の側鎖は大部分露出し、隣接残基とはほとんど接触しない。我々は、アラニンやグリシンによるこれらの残基の置換は、活性部位において配座の変化を生じリボソームＲＮＡ（ＨＩＶ−１ ＲＮＡではない）基質に対する活性をほどほどに低下させる。ただし、Ｉ１５２Ａ突然変異より程度はかなり低い。しかし、Ｋ１５１、Ｉ１５２、Ｆ１９１、またはＮ１９２突然変異はいずれも、それぞれのＰＡＰタンパク質がリボソームまたはリボソーム・タンパク質Ｌ３と結合する能力を低下させる原因にはならない。なお、リボソーム・タンパク質Ｌ３は、活性部位切片の部分的に露出した部分と相互作用する（図１）。
【００８７】
図１
リボソームＲＮＡ（左側の白）およびウイルスＲＮＡ（右側の白）分子と錯体を形成したＰＡＰ（グレイリボン）のリボンと空間充填発現量。
スティック・モデルに示された残基Ｋ１５１とＩ１５２は、ＦＬＰ−１０２において突然変異される。スティック・モデルに示された残基Ｆ１９１とＮ１９２は、ＦＬＰ−１０５において突然変異される。これらの残基は、ＰＡＰ活性部位の反対側に位置しており、これらの残基の突然変異は、リボソームＲＮＡまたはＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡ基質の結合に影響を及ぼすとは予測されない。しかし、残基Ｉ１５２は埋め込まれており、ＩｌｅからＡｌａへの大から小への突然変異は空洞を作り且つコアの再充填を可能にし、したがって、触媒残基の配座をかなり変化させ、リボソーム基質とウイルスＲＮＡに対するＰＡＰの活性に特異的に影響を及ぼす。
【実施例２】
【００８８】
組換え突然変異体ＰＡＰタンパク質の設計、発現および精製
設計
組換え野生型ＰＡＰ（ＰＢＳ−ＰＡＰ）は、ＰＡＰ−Ｉ遺伝子（アミノ酸２２から３１３まで）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−発現ベクターへのサブクローン化により得られた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８〕。ＰＡＰ−Ｉ遺伝子は次の２つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された。プライマーの一つは、ＰＡＰ-Ｂａｍ（５'ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＴＡＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＣＣ ３'）（配列番号：２）で、これはＮ末端にＢａｍＨＩＩ部位を導入し、もう一つのプライマーはＰＡＰ−Ｈ３（５' ＧＣＣ ＴＣＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＴＡ ＡＴＡ ＴＡＧ ＴＴＧ ＧＡＧ ３'）（配列番号：３）で、これはＣ末端にＨｉｎｄＩＩ部位を導入する。ＰＡＰのウラシル含有鋳型は、組換えプラスミドＰＢＳ−ＰＡＰを用いて大腸菌ＣＪ236を形質転換して得られた。部位誘導された突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、２００ ｎｍｏｌのスケールとテキサス州ルイスビルのバイオシンセシス・インク（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ.）により精製されたＨＰＬＣで合成された。部位誘導された突然変異誘発操作は、インビトロ形質転換誘発キット、Ｍｕｔａｇｅｎｅ Ｍ１３〔カリフォルニア州ハーキュレスのバイオ・ラッド(Ｂｉｏ−Ｒａｄ)〕を用いて製造者のマニュアルに記載されているとおりに行われた。ＤＮＡの配列決定は、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ.）の方法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ），第７４巻,第１２号,ｐ.５４６３−７,１９７７年］により、製造者（オハイオ州クリーブランドのＵ.Ｓ. Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ.）の説明書に従って行われた。化学物質と制限酵素は、インディアナ州インディアナポリスのロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した。
【００８９】
発現と精製
野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質は、封入体として大腸菌ＭＶ１１９０において発現され、次いで、以前に記載したように分離し、溶解し、再び折り畳まれた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８〕。再び折り畳まれたタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム１２％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥ）により分析された。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてこのゲルから定量された。
【００９０】
イムノブロット分析
タンパク質試料は、ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥで分析し、以前に述べたバイオ−ラッド・トランス−ブロット装置を用いてポリビニリデン・ジフルオライド膜（バイオ−ラッド）に移した〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８〕。この膜は、それぞれ、一次と二次の抗体としてウサギ抗ＰＡＰ血清（１：２０００に希釈）およびセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ〔ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル・カンパニー(Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.)〕を用いてイムノブロットされた。このブロットは、ペルオキシダーゼ活性の比色分析の指示薬として３,３'−ジアミノベンジジン（シグマ）を用いて現像された。
【００９１】
結果
上で述べたように、Ｉ１５２、Ｋ１５１、およびＦ１９１のアラニン置換およびＮ１９２のグリシン置換を有する組換えＰＡＰ突然変異体は、部位誘導突然変異誘発を用いて組み立てられた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第５号,ｐ.３３８２−９０〕。突然変異体タンパク質ＦＬＰ−１００ (Ｋ１５１Ａ)、ＦＬＰ−１０１ (Ｉ１５２Ａ)、ＦＬＰ−１０２ (Ｋ１５１Ａ,Ｉ１５２Ａ)、ＦＬＰ−１０３ (Ｆ１９１Ａ)、ＦＬＰ−１０４ (Ｎ１９２Ｇ)、ＦＬＰ−１０５ (Ｆ１９１Ａ,Ｎ１９２Ｇ)は大腸菌菌株ＭＶ１１９０において発現され、封入体として精製され、溶解され、再び折り畳まれ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された（図２Ａ、レーンにつき５μｇ）。突然変異体ＰＡＰタンパク質各々の見かけの分子量は３３ｋＤａで、組換え野生型ＰＡＰの分子量に似ている（図２Ａ）。再び折り畳まれた組換え野生型および突然変異体タンパク質は、ウエスタン・ブロット分析による抗ＰＡＰ血清との免疫反応性が高い（図２Ｂ、レーンにつき５μｇ）。
【００９２】
2005533793.tif 000003
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【実施例３】
【００９３】
天然真核リボソームおよび合成リボソーム・タンパク質Ｌ３の突然変異体ＰＡＰタンパク質への結合
リボソーム結合検定
リボソームは以前に述べたように〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第４０巻,p.９１０４−１４〕、ウサギの網状赤血球に富む全血液から分離された〔ロジャース・エイアール(Ｒｏｇｅｒｓ, ＡＲ),ペルフリーズ・バイオロジカルス(Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ)〕。全リボソーム（３０μｇ）を、結合緩衝液中最終容量１００μＬにて、５μｇの野生型または突然変異体ＰＡＰタンパク質と共にインキュベートし、次いで、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、リボソームは、３００,０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離によりペレットにされた。ペレットは溶液Ｄ（１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ, ｐＨ７.５, １ｍＭ ＫＣｌ, ０.１Ｍ ＭｇＣｌ２）で２度洗浄し、２０μＬのＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２.７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，１ｍＭ ＫＨ2ＰＯ４，ｐＨ７.４）に再懸濁した。タンパク質試料は、ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥで分析し、以前に述べたバイオ−ラッド・トランス−ブロット装置を用いてポリビニリデン・ジフルオライド膜（バイオ−ラッド）に移した〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第５号,ｐ.３３８２−９０〕。この膜は、それぞれ、一次と二次の抗体としてウサギ抗ＰＡＰ血清（１：２０００に希釈）およびセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマ）を用いてイムノブロットされた。
【００９４】
Ｌ３結合検定
野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｉｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅリボソーム・タンパク質Ｌ３をコード化するｃＤＮＡ(ｐｊＤ１６６.ｔｒｐ)を含むプラスミドは、ニュージャージーの医科歯科大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ）のジョナサン・デイ・ディンマン（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｄ. Ｄｉｎｍａｎ）博士のご好意により譲渡を受けた。放射性の標識を付けたＬ３タンパク質は、製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って転写−翻訳がリンクしたシステム（ＴＮＴ Ｔ３−ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒａｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ, Ｐｒｏｍｅｇａ）〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第４０巻,p.９１０４−１４〕により合成された。翻訳生成物は、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥゲルで分析され、このゲルは乾燥され且つオートラジオグラフで写真を記録された。マウス抗Ｌ３モノクローナル抗体は、ニューヨーク、ブロンクスのアルバート・アインシュタイン・カレッジ・オブ・メディシン（Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、デパートメント・オブ・セル・バイオロジー（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョナサン・アール・ワーナー（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｒ. Ｗａｒｎｅｒ）博士のご好意により譲渡を受けた。インビトロで合成されたＬ３タンパク質（８×１０４ｃｐｍ）は、５０μＬ（最終容積）の結合緩衝液（１０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ４，５ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ ８.０）中で３０℃で３０分間、１μｇの野生型または突然変異体ＰＡＰタンパク質を用いてインキュベートした。ＰＡＰ−Ｌ３複合体は、５μＬのマウス抗Ｌ３モノクローナル抗体（１：５００に希釈）を加えて共免疫沈殿させた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第４０巻,p.９１０４−１４〕。３０℃で６０分培養後、ＰＡＰ−Ｌ３抗体複合体は、５０μＬのプロテインＡ−セファローズ・ビーズを加えて沈殿させた。このビーズは、ウサギ抗マウスＩｇＧ（２０μＬ／ｍＬ ビーズ）を用いて前処理し、インキュベートをさらに１時間４℃で続けた。これらのビーズは、０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むホスフェート緩衝生理食塩水を用いて３度洗浄し、これらのタンパク質はＳＤＳ試料緩衝液を用いてセファローズ・ビーズから溶離した。これらのタンパク質はＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、それぞれ、一次と二次の抗体としてポリクローナル・ウサギ抗ＰＡＰ血清（１：２０００に希釈）およびセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００に希釈）を用いて検出された。このブロットは、ペルオキシダーゼ活性の比色分析の指示薬として３,３'−ジアミノベンジジン（シグマ）を用いて展開された。乾燥された膜はオートラジオグラフィにも露出され、Ｌ３タンパク質の量を求めた。
【００９５】
図3.
（Ａ）ウサギの網状赤血球に富む血液から分離されたリボソームとＰＡＰ突然変異体の会合。（Ａ.１）全リボソームタンパク質（５μｇ）を、１μｇのＰＡＰを用いてインキュベートし、次いで、超遠心分離によりリボソーム−ＰＡＰ複合体を分離した。このリボソーム−ＰＡＰ複合体はＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上にエレクトロブロットし、ＰＡＰに対するポリクローナル抗体を用いてイムノブロットした。（Ａ.２）ＰＡＰリボソーム複合体を分離する前に、反応混合物の画分（５μＬ）を除去し、ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＰＡＰに対するポリクローナル抗体を用いてイムノブロットした。結果は、反応混合物に等量のＰＡＰタンパク質が加えられたことを示している。
【００９６】
（Ｂ）インビトロで合成されたリボソーム・タンパク質Ｌ３と野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質の会合。（Ｂ.１）抗ＰＡＰ抗体を用いたイムノブロッティングにより明らかにされた共免疫沈降したＰＡＰ。３５Ｓで標識を付けたＬ３を野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質とインキュベートし、次いで、Ｌ３に対するモノクローナル抗体を用いて前もってコートしたタンパク質Ａ−セファローズビーズを用いて共免疫沈降した。ＰＡＰとＬ３の複合体を、ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜上に移し、ポリクローナル抗ＰＡＰ抗体を用いてイムノブロットした。（Ｂ.２）このブロットをＸ線フィルムに露出すると、各反応に等量の標識付きＬ３タンパク質が関与していることを示している。（Ｂ.３）共免疫沈降の前に、反応混合物の画分（５μＬ）を反応から除去し、ＳＤＳ−１２％ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ＰＡＰに対するポリクローナル抗体を用いてイムノブロットした。結果は、各反応に等量のＰＡＰが加えられたことを示している。
【００９７】
結果
我々のモデル化研究の予測によると、ＦＬＰ−１０２またはＦＬＰ−１０５のリボソーム抑制活性の低下は、リボソーム（図３、パネルＡ）またはＳＲループとＰＡＰのドッキング部位として役立つリボソーム・タンパク質Ｌ３（図３、パネルＢ）への結合が弱くなったためではない。
【実施例４】
【００９８】
大腸菌ｒＲＮＡとＨＩＶ−１ ＲＮＡのＲＮＡ脱プリン化に対する突然変異体ＰＡＰタンパク質の影響。
ウサギのリボソームにおける大腸菌リボソームＲＮＡ脱プリン化：アニリン切断検定
５μｇの大腸菌２３Ｓおよび１６ＳｒＲＮＡ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）および/またはウサギの網状赤血球に富む全血液から作られた３０μｇの全リボソームは〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年, バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ） ,第２６０巻,第２号,ｐ.４５３−８〕、５０μＬ（最終体積）の結合緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ, ｐＨ７.８, １０ｍＭ ＫＣｌ, ５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２％グリセロール）中で３７℃にて１時間野生型または突然変異体ＰＡＰタンパク質の量を増やしてインキュベートされた。ｒＲＮＡをフェノール：クロロホルム（２４：２４）で抽出し、エタノールで沈殿させ、氷上で３０分間２０μＬの１Ｍアニリン・アセテート（ｐＨ４.５）で処理した。ｒＲＮＡをエタノールで沈殿させ、６％尿素／ポリアクリルアミド・ゲル中で電気泳動させ、以前に述べたようにエチジウム・ブロマイドで染めた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第５号,ｐ.３３８２−９０〕。
【００９９】
図４．
大腸菌２３Ｓ＋１６ＳｒＲＮＡをＰＡＰの量を増やしながら処理し、アニリンで処理し、６％尿素／ポリアクリルアミド・ゲルにより分離し、エチジウム・ブロマイドで染めた。矢印はアニリンにより分解されたフラグメントを示している。
【０１００】
結果：ウサギのリボソームにおける大腸菌ｒＲＮＡのアニリン切断
ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５タンパク質が、ウサギのリボソームにおいて大腸菌ｒＲＮＡから脱プリン化する能力を、これらのリボソームをＰＡＰタンパク質で処理し、次いで、大腸菌ｒＲＮＡを精製し、アニリンで切断して評価した。アニリンは、ＰＡＰ脱プリン化部位におけるｒＲＮＡにおける糖とホスフェートの骨格を切断する。したがって、アニリン処理したｒＲＮＡからのフラグメントの放出は、ＰＡＰを介したｒＲＮＡ脱プリン化の指標である。図４に示されたように、アニリン処理は、組換え野生型ＰＡＰで前処理したウサギのリボソームにおける大腸菌ｒＲＮＡからの６００ ｎｔ ＲＮＡの放出をもたらす。対照的に、アニリン処理は、突然変異体ＰＡＰタンパク質のＦＬＰ−１０２またはＦＬＰ−１０５で処理したリボソームから分離されたｒＲＮＡから検出できる量の６００ ｎｔ ＲＮＡフラグメントを放出することはできなかった。これらの知見は、インビトロ翻訳検定におけるこれらの組換えＰＡＰタンパク質のリボソーム抑制活性が顕著に低下していることと一致している（図６下）。我々のモデル化研究の予測によると、ＦＬＰ−１０２またはＦＬＰ−１０５のリボソーム抑制活性の低下は、リボソーム（図３上、パネルＡ）またはＳＲループとＰＡＰのドッキング部位として役立つリボソーム・タンパク質Ｌ３（図３上、パネルＢ）への結合が弱くなったためではない。
【０１０１】
リボソームＲＮＡ脱プリン化のＨＰＬＣをベースにした定量的なヌクレオチド放出検定
大腸菌２３Ｓ＋１６ＳｒＲＮＡ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）およびＨＩＶ−１ ＲＮＡ〔メリーランド州コロンビアのＡＢＩバイオテクノロジーズ(Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)〕からのアデニン／グアニンの放出は、ダイオード・アレイ検出器および前に述べた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ),第２６３巻,第２号,ｐ.４１９−２４、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年, バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ） ,第２６０巻,第２号,ｐ.４５３−８〕データ解析用のケムステーション(ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ)・ソフトウエアー・プログラムを備えたＨＰＬＣシステム（カリフォルニア州パロアルトのヒューレット・パッカード）を用いて測定した。簡潔に言えば、２μｇのＲＮＡ基質は、５０μＬの結合緩衝液（２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ, ｐＨ７.８, １０ｍＭ ＫＣｌ, ５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２％グリセロール）中で３７℃にて１時間、２.５μＭの野生型または突然変異体ＰＡＰタンパク質と共にインキュベートされた。この反応は、１００μＬのＨＰＬＣランニング緩衝液（５０ｍＭ ＮＨ4Ｃ2Ｈ３Ｏ2, ５％ メタノール, ｐＨ ５.０）を加えて停止し、次いで、１００μＬの試料を、逆相リクロスファー １００ＲＰ−１８Ｅ分析カラム（ヒューレット・パッカード, 粒子サイズ５ｍｍ, ２５０×４ｍｍ）に自動的に注入した。なお、このカラムは、以前に述べたようにＨＰＬＣランニング緩衝液と平衡状態になっていた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ),第２６３巻,第２号,ｐ.４１９−２４、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年, バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ） ,第２６０巻,第２号,ｐ.４５３−８〕。対照には、（ａ）未処理ｒＲＮＡを含む試料、および（ｂ）ｒＲＮＡを含まないテスト試料があった。校正曲線を作り、絶対ピーク面積と以前に述べたアデニン／グアニン（シグマ）の間に直線関係を定めた〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ),第２６３巻,第２号,ｐ.４１９−２４、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),１９９９年, バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ���ｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ） ,第２６０巻,第２号,ｐ.４５３−８〕。校正曲線の重要視されていない線形回帰分析が、ＣＡクリケット・グラフＩＩＩコンピュータ・プログラム〔ニューヨーク州イスランディア、コンピュータ・アソシエーション・インク(Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ, Ｉｎｃ.)〕を用いてなされた。検定内および検定間の正確さは、以前に述べた方法で評価された〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２００１年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７６巻,第２６号,ｐ.２４０７５−８１〕。記述されたクロマトグラフィ条件下では、アデニン残基とグアニン残基の保持時間は、それぞれ、１１.５分と５.７分であり、これらはブランク対照からの干渉ピークなしに溶離された。アデニンの検出限界は、信号とノイズの比が約３の場合に２.５ｐｍｏｌであった。アデニン・スタンダード５０μＬに付き５０および２５０ｐｍｏｌの場合に得られた平均ピーク面積は、それぞれ、２９±１および１４３±７ｍＡＵであった。グアニン・スタンダード５０μＬに付き５０および２５０ｐｍｏｌの場合に得られた平均ピーク面積は、それぞれ、３１±２および１５６±８ｍＡＵであった。検定内および検定間変動係数は４％未満であった。この方法の全体的検定内および検定間精度は、それぞれ、９８.７±１.７％（Ｎ＝５）および９５.７±３.０％（Ｎ＝５）であった。
【０１０２】
図５．
２μｇの大腸菌ｒＲＮＡまたはＨＩＶ−１ ＲＮＡは、５０μＬの結合緩衝液中で３７℃にて１時間、２.５μＭの野生型または突然変異体ＰＡＰタンパク質と共にインキュベートされた。この反応は、１００μＬのＨＰＬＣランニング緩衝液を加えて停止し、次いで、上で述べたように、１００μＬの試料をカラムに注入した。ＲＮＡの対照試料はＰＳＰの代わりにＰＢＳで処理した。差込図：アデニンとグアニン・スタンダードのスタンダード曲線。
【０１０３】
表３．野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質のＲＮＡ脱プリン化活性とインビボ抗ＨＩＶ活性
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【０１０４】
結果：アデニン／グアニン放出検定
突然変異体ＰＡＰタンパク質ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５が、リボソームＲＮＡ対ＨＩＶ−１ ＲＮＡを脱プリン化する能力を、ＨＰＬＣをベースとする定量的プリン放出検定を用いて、組換え野生型ＰＡＰの脱プリン化能力と比べて比較した。組換え野生型ＰＡＰは、ＨＩＶ−１ ＲＮＡよりもリボソームＲＮＡをより効果的に脱プリン化したが、ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５の両方はＨＩＶ−１ ＲＮＡを脱プリン化する場合より効果的であり、且つＨＩＶ−１ ＲＮＡに対するこれらの活性は野生型ＰＡＰの活性よりも優れていた（表３）。ＦＬＰ−１０２は最も有望な選択性抗ＨＩＶ活性を示した。野生型ＰＡＰタンパク質に関わる大腸菌リボソームＲＮＡからのアデニンの放出は、７６±４ｐｍｏｌｓ／μｇ ＲＮＡ／μｍｏｌｓタンパク質であった。ＦＬＰ−１０２タンパク質の活性は１／１０で、わずか７±２ｐｍｏｌｓアデニン／μｇ ＲＮＡ／μｍｏｌｓタンパク質であった（Ｐ＜０.０５、表３、図５）。しかし、ＦＬＰ−１０２はＨＩＶ−１ ＲＮＡを脱アデニン化する場合には野生型ＰＡＰよりも強力であった。野生型ＰＡＰは３６±３ｐｍｏｌｓアデニン／μｇ ＲＮＡ／μｍｏｌｓタンパク質を放出した。ＦＬＰ−１０２は１００±７ｐｍｏｌｓアデニン／μｇ ＲＮＡ／μｍｏｌｓタンパク質を放出した（Ｐ＜０.０５）（表３、図５）。グアニン放出検定でも類似した結果が得られた（表３）。
【実施例５】
【０１０５】
野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質による真核タンパク質合成への影響
無細胞系翻訳検定
タンパク質合成を、ヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球ライゼート（ウイスコンシン州マジソンのプロメガ）および前に述べたように〔ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),プロウティーン・イクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション(Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ),第１６巻,第２号,ｐ.３５９−６８、ラジャモハン・エフら(Ｒａｊａｍｏｈａｎ Ｆ,ｅｔ ａｌ.),２０００年,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ),第２７５巻,第５号,ｐ.３３８２−９０〕ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて、無細胞系において検定した。種々の量の組換えまたは突然変異体ＰＡＰタンパク質（０．１−１００ｎｇ／ｍｌ、ｐＨ可溶化）を、１０μＬのウサギ網状赤血球ライゼート、０.５μＬのＲＮａｓｉｎ、１.０μＬの１ｍＭアミノ酸混合物（マイナス・メチオニン）、および１.０μＬの〔35Ｓ〕−メチオニンを含有する翻訳混合物に加えた（イリノイ州アーリントン・ハイツ、アメルシャム、１０ｍＣｉ／ｍＬ）。最終体積をＲＮａｓｅフリーの水を用いて１９μＬに調節し、室温で１５分間インキュベートし、次いで、１.０μＬの１：９に希釈したルシフェラーゼｍＲＮＡ（０.１２μｇ）を加えた。２時間後、タンパク質への放射性標識の組み込みが、製造者の説明書（プロメガ）に従って５％トリクロロ酢酸を用いて合成されたルシフェラーゼ・タンパク質（６１ｋＤａ）を沈降させて測定された。ｒＰＡＰ（ＷＴ）または突然変異体ｒＰＡＰの最低１０個の濃度を、ＩＣ50（５０％抑制濃度）値の計算に用いた。調整されたＩＣ50値（沈降検定から）は、３つの独立した実験の平均値を用いて非線形回帰分析（カリフォルニア州サンジエゴ、プリズム−２グラフ・パッド・ソフトウエア）により計算された。テスト試料を除いて加えられたすべての試薬を用いた場合の対照試料におけるｃｐｍ値は、３〜４×１０７ｃｐｍ／ｍＬの範囲にあった。これらの値は、テスト物質を用いて処理した試料について、％対照タンパク質合成値を測定する場合１００％組み込まれたものと考えられた。
【０１０６】
図６．
各値は、３つの独立した実験において得られた平均値である。タンパク質合成は、〔35Ｓ〕−メチオニン組み込みにより測定され、ＰＡＰを除くすべての試薬を用いた試料は１００％組み込みに帰属された。（Ａ）ＦＬＰ−１０２および単一残基突然変異体ＦＬＰ−１００とＦＬＰ−１０１。（Ｂ）ＦＬＰ−１０５および単一残基突然変異体ＦＬＰ−１０３とＦＬＰ−１０４。
【０１０７】
表４．野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質の配列同一性と生物活性
2005533793.tif 000007
*９５％信頼限界は（  ）内に示す。
各値は少なくとも３度の実験の平均値である。
【０１０８】
結果
無細胞系真核細胞翻訳抑制検定における組換え野生型ＰＡＰのＩＣ50値は３ｎｇ／ｍＬであった（図６、表４）。比較すると、二重置換突然変異体ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５のＩＣ50値は、それぞれ、９９４ ｎｇ／ｍＬと１０５ ｎｇ／ｍＬであった。したがって、ＦＬＰ−１０２は野生型ＰＡＰよりも３３１倍毒性が弱く、ＦＬＰ−１０５は野生型ＰＡＰよりも３５倍毒性が弱かった（図６、表４）。対応する単一残基突然変異体ＦＬＰ−１００（Ｋ１５１Ａ）、ＦＬＰ−１０１（Ｉ１５２Ａ）、ＦＬＰ−１０３（Ｆ１９１Ａ）およびＦＬＰ−１０４（Ｎ１９２Ｇ）も、野生型ＰＡＰよりも毒性が弱かった（図６、表４）。表４に示されたように、ＦＬＰ−１０２の３３１倍の活性低下は、大部分が、Ｉ１５２Ａ突然変異によるものである。なぜならば、単一残基置換突然変異体ＦＬＰ−１０１（Ｉ１５２Ａ）は、野生型ＰＡＰよりも２０６倍毒性が弱いが、単一残基置換突然変異体ＦＬＰ−１００はわずか４９倍だけ毒性が弱いからである。
【０１０９】
野生型組換えＰＡＰタンパク質に比べて、記述された突然変異体ＰＡＰタンパク質（残基置換１５１、１５２、１９１、１９２、またはそれらの組み合わせ）は真核細胞ｍＲＮＡの翻訳（ルシフェラーゼｍＲＮＡ）を抑制する。残基１５１および／または１５２に置換を有する突然変異体ＰＡＰタンパク質は、野生型ＰＡＰに比べて最低の抑制を生じた。
【実施例６】
【０１１０】
突然変異体ＰＡＰタンパク質によるレトロウイルス複製（ＨＩＶ−１）の抑制
野生型および突然変異体ｒＰＡＰ（ｐＨ可溶化）タンパク質の抗ＨＩＶ−１活性は、正常ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、前に述べたように〔アッカン・エフエムら(Ｕｃｋｕｎ  ＦＭ,ｅｔ ａｌ.), １９９８年, アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ） , 第４２巻, ｐ.３８３−８〕ＨＩＶ陰性ドナーから、ＨＩＶ−１菌株、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢの複製を抑制するこれらの能力を測定することにより評価した。ウイルス複製を抑制するパーセンテージは、未処理感染細胞（すなわち、ウイルス対照）のｐ２４／ＲＴ値を有するテスト物質で処理した感染細胞の平均ｐ２４抗原／逆転写酵素（ＲＴ）検定値を比較することにより計算された。ＩＣ50値は、３つの独立した実験からのデータを用いて非線形回帰分析（カリフォルニア州サンジエゴ、プリズム−２グラフ・パッド・ソフトウエア）により計算された。
【０１１１】
結果
各々が三重に行われた独立した実験では、正常ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、ＨＩＶ−１菌株、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢの複製を抑制するＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５の能力を調べた（表３）。両タンパク質は、濃度に依存する形でＨＩＶ−１の複製を抑制した。すなわち、ＩＣ50値は、ＦＬＰ−１０２の場合は０.２±０.０μｇ／ｍＬおよびＦＬＰ−１０５の場合は０.７±０.２μｇ／ｍＬであった。比較すると、野生型タンパク質（ＦＬＰ−ＷＴ，表３）はいずれのタンパク質よりも活性が弱く、ＨＩＶ−１の複製を抑制し、ＩＣ50値は２.９±１.３μｇ／ｍＬであった（表３，Ｐ＜０.００１）。
【０１１２】
結果の概要
ＦＬＰ−１０２におけるＫ１５１ＡおよびＩ１５２Ａ突然変異と比較して、ＦＬＰ−１０５におけるＦ１９１ＡおよびＮ１９２Ｇ突然変異は、リボソーム基質とウイルスＲＮＡに対するＰＡＰ活性への影響が比較的小さい。Ｎ１９２ＧおよびＦ１９１Ａの両方は、リボソームの脱活性化活性において中程度の低下をもたらし（脱プリン化、表6、図6）、且つＨＩＶ ＲＮＡ基質に対する活性をわずかに改善した（脱プリン化、表6、図6）。これは、Ｎ１９２とＦ１９１がＩ１５２よりもより柔軟な環境に位置しているという観察と一致している。これら２つの突然変異の結果としてＰＡＰ活性が中程度に変化することに照らして、配座変化のレベルはＩ１５２Ａにより生じたものよりもおそらく著名ではない。それにも関わらず、Ｆ１９１Ａ突然変異は、Ｉ１５２Ａ突然変異の場合に提案されたものと同じメカニズムを採用する（活性の低下に導く）が、インパクトは小さい。
【実施例７】
【０１１３】
バルブシー（Ｂａｌｂ／ｃ）マウスにおける突然変異体ＰＡＰタンパク質の毒性研究。
バルブシー（Ｂａｌｂ／ｃ）マウス
この研究で使われたすべてのバルブシーマウスは、ニューヨーク州ジャーマンタウンのタコニックの特異な病原体のない繁殖施設から５週齢にて得られた。雌のバルブシーマウスとなされたすべての畜産的で実験的な接触は、コントロールされた環境（１２時間明るく／１２時間暗い、２２±１℃、相対湿度６０±１０％）でなされた。この環境は、ＵＳＤＡ（米国農務省）により完全に認定されている。すべてのマウスは、圧熱滅菌された寝具を含む隔離された小さなケージ［ニューヨーク州メイウッド、ラブ・プロダクツ・インク（Ｌａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）］に収容された。これらのマウスは、実験中いつでも、圧熱滅菌されたペレット状の食料に自由にアクセスすることができた。動物試験は、パーカー・ヒューズ・インスティテュート・アニマル・ケア・アンド・ユース・コミティー（Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され、且つすべての動物ケア操作は、研究用動物のケアと利用に関する指針に従った〔ワシントンＤＣ, ナショナル・リサーチ・カウンサル(Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ), ナショナル・アカデミー・プレス，１９９６年〕。
【０１１４】
マウスにおける毒性試験
バルブシーマウスにおけるＰＡＰタンパク質の毒性分析表は、その他の実験用薬品について以前に報告された方法を用いて調べられた〔アッカン・エフエムら(Ｕｃｋｕｎ ＦＭ,ｅｔ ａｌ.)，１９９８年，Ｃｌｉｎ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. 第４巻，ｐ. １１２５−３４、アッカン・エフエムら(Ｕｃｋｕｎ ＦＭ,ｅｔ ａｌ.), １９９８年, アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ） , 第４２巻, ｐ.３８３−８)。雌のバルブシーマウスは、ＨＥＰＥＳ緩衝液中２.７、４.１、５.５、６.８および８.２ｍｇ／ｋｇにて用量レベルの天然または組換えＰＡＰタンパク質を静脈注射され、嗜眠、清浄さおよび発症率について毎日記録された。対照マウスは、ＰＡＰなしのＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて処理された。死亡時には、剖検を行い、ＰＡＰタンパク質の毒性効果を検定した。組織病理学的研究では、常用の方法により組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、次いで、パラフィンに埋め込んだ。６ミクロンの組織切片を貼り付けたガラス・スライドを用意し、ヘモトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染めた。実験中、鎮静および麻酔は使用しなかった。３０日間の半数致死量ＬＤ50を決めるためにマウスの死亡率を毎日記録した。動物は、３０日に選択的に屠殺され、それらの血液化学の分析表や血液計数、並びに毒性病変の存在に関わる複数の臓器を調べることによりＳＴＡＭＰの毒性を決めた。血液は、ケタミン：キシラジンを用いて麻酔した後心内穿刺により集め、直ちにヘパリナイズした。血液化学の分析表は、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ ＣＸ ５ＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎｚｌｙｚｅｒ（カリフォルニア州フラートン、ベックマン・インスツルーメント・インク）を用いて調べた。血液計数〔赤血球細胞（ＲＢＣ）、白血球細胞（ＷＢＣ）および血小板（Ｐｌｔ）〕は、ＨＥＳＫＡ Ｖｅｔ ＡＢＣ−Ｄｉｆｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（血液検査）Ａｎａｌｙｓｅｒ（コロラド州フォート・コリンズ、ＨＥＳＫＡコーポレーション）を用いて測定した。絶対好中球計数（ＡＮＣ）および絶対リンパ球計数（ＡＬＣ）は、マニュアル微分計数により好中球とリンパ球のパーセンテージを測定後ＷＢＣ値から計算した。
【０１１５】
剖検の時には、マウスから２２種類の組織（入手可能な、骨、骨髄、脳、盲腸、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、骨格筋肉、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、膀胱、および子宮）を屠殺の１５分以内に集め、全体的所見を記録し、臓器は１０％中性ホスフェート緩衝ホルマリン中に保存し、組織病理学検査用に処理した。組織病理学検査では、ホルマリンに固定された組織は、通常の方法により脱水され、パラフィンに埋め込まれた。４−５ミクロンの組織切片を貼り付けたガラス・スライドを用意し、ヘモトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染めた。
【０１１６】
ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５のインビボ毒性分析表と抗ＨＩＶ活性
バルブシーマウスは、５０μｇ（ｎ＝１０），７５μｇ（ｎ＝１０），１００μｇ（ｎ＝１０），１２５μｇ（ｎ＝１０），または１５０μｇ（ｎ＝１０）のＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５で処理された。ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５は、用量レベルが１５０μｇ/マウス（マウスの平均重量は１８.２ｇで、約８.２ｍｇ／ｋｇに相当）の場合でもバルブシーマウスに対して無毒であったが、野生型の天然ＰＡＰは５０μｇ/マウスの用量レベルでも毒性を示し、１２５μｇ／マウス以上の用量レベルでは致命的であった（図７、表５）。対照マウス（ｎ＝１０）はＰＡＰなしの溶媒溶液を腹腔内に注射して処理した。全部で４９匹のＦＬＰ−１０２で処理したマウスと全部で５０匹のＦＬＰ−１０５で処理したマウスは、３０日間の観察期間を健康にすごし、発症した証拠は認められなかった。３０日目になされた血液テストでは、重要な全身毒性は認められなかった。特に、１５０μｇ／マウスという最高の累積用量レベルにおいてさえ、ＦＬＰ−１０２もＦＬＰ−１０５も、（ａ）血液学的毒性を示唆する貧血、好中球減少、またはリンパ球減少、（ｂ）腎臓毒性を示唆するＢＵＮおよびクレアチニンの上昇または電解質異常、（ｃ）肝毒性を示唆するＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリ性ホスファターゼ、ＬＤＨまたはビリルビンの上昇、（ｄ）膵臓毒性を示唆するアミラーゼの上昇、を生じなかった（表５）。
【０１１７】
２５匹（５/用量グループ）のＦＬＰ−１０２または２５匹（５/用量グループ）のＦＬＰ−１０５で処理した３０日目に屠殺されたマウスからの２２の臓器のいずれにも毒性病変は認められなかった。同様に、１０匹の媒介体処理した対照マウスの臓器にも、毒性病変は認められなかった。対照的に、天然のＰＡＰ（１００−１５０μｇ／マウス）で処理した対照マウスからの臓器を調べた時には、心筋壊死、壊死性肝炎、壊死的筋肉炎、および急性腎尿細管壊死が認められた。要約すると、これらの実験では、ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５は、８.２ｍｇ／ｋｇ程度の用量レベルではバルブシーマウスに対して無毒であることが証明された。
【０１１８】
図７．
バルブシーマウスは、突然変異体組換えＰＡＰタンパク質ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５、または天然ＰＡＰタンパク質のいずれかを、指定された用量レベルにて単一の腹腔ボーラス注射で処理した。特定のＰＡＰタンパク質の特定用量レベルで処理されたマウスの生存曲線が図示されている。５０μｇ／マウスから１５０μｇ／マウスまでの範囲の用量レベルのＦＬＰ−１０２またはＦＬＰ−１０５にて処理された９９匹のマウスの中で、３０日の観察期間内に病気になったり、死んだものは１匹もいなかった。
【０１１９】
表５．マウスにおける健康、血液の化学分析表、および末梢血液計数に対するＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５の影響
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【実施例８】
【０１２０】
ＨＩＶに感染したＳＣＩＤマウスにおける突然変異体ＰＡＰタンパク質の抗ウイルス研究（ヒト・エイズ・モデル）
ヒト・エイズのＳＣＩＤマウス・モデル
本研究で使われたすべてのＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウスは、ニューヨーク州ジャーマンタウンのＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓから６−８週齢で購入され、パーカー・ヒューズ・インスティテュートの前臨床に関わるレベル３封じ込め施設（ｔｈｅ Ｌｅｖｅｌ ３ (ＢＬ−３) Ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に保存された。これらのマウスとなされたすべての畜産学的および実験的接触は、特異な病原体のない条件を維持した。これらのマウスは、圧熱滅菌された食料、水および寝具を有するマイクロ・アイソレーター・ケージ（Ｍｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｏｒ ｃａｇｅ）に収容された。これらのＳＣＩＤマウスの飲料水には、週に３度、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（Ｂａｃｔｒｉｍ）が加えられた。ヒト末梢血液リンパ球−ＳＣＩＤ（Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤ）マウスは、前に報告したように〔ベル・ジェーエーら(ＢｅｌｌＪＡ, ｅｔ ａｌ.)，１９９２年，バイオケミストリー(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)，第３１巻，第１４号，ｐ.３５９０−６〕、血清学的陰性被験者ドナーからの１０×１０６のＰＢＭＣを腹腔に注入してＳＣＩＤマウスを再構成することにより作られた。細胞接種２週間後、マウスはイソフルレーンで麻酔をかけられ、次いで、無細胞のＢＲ／９２／０１９、すなわち、遺伝型的に且つ表現型的にＮＲＴＩ耐性のあるＨＩＶ−１分離株を１×１０５メディアンの組織培養感染用量（ＴＣＩＤ50）にて腹腔に注入されてチャレンジされた。ＳＣＩＤマウスはＢＬ-３封じ込め施設においてＢＲ／９２／０１９に感染し、次いで、すべての操作は生物学的に安全なキャビネットで行われた。ＰＡＰタンパク質は、腹腔注射により投与された。実験期間をとおして、マウスは全体的な健康状態が記録された。
【０１２１】
感染後２週間して、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスは、選択的に屠殺され、これらのマウスの腹腔透析細胞、並びに脾臓細胞はＨＩＶ−１共培養検定による感染の証拠について調べられ〔エリス・エイら(Ｅｒｉｃｅ Ａ,ｅｔ ａｌ.),１９９３年, アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ） ,第３７巻,ｐ.８３５−８〕、且つＯｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ（登録商標）Ｎｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）のＨＩＶ−１ ＱＴ検定キットを用いたＲＴ ＰＣＲによるウイルスＲＮＡ負荷（複製数／腹腔透析流体のｍＬまたは複製数／脾臓組織のｍｇ）の測定がなされた。ＲＮＡの抽出は、スタンダードのブーム・テクノロジーおよびＮｕｃｌｉｓｅｎｓ（商標）の抽出器を利用してシリカ（５０μL）を用いてなされた。スタンダード増幅（ＮＡＳＢＡ−核酸配列をベースとする増幅）および検出検定は、製造者の推奨する方法に従って行われた。検出は、電極の表面で起こる化学反応により発光する電気化学発光（ＥＣＬ）標識に基づいてなされた。異なる薬剤処理グループにおける比例応答速度の差は、独立のカイ２乗テストを用いて分析された。ＨＩＶ感染のＰＣＲ証拠を有するＳＣＩＤマウスのＨＩＶ負荷を比較するために、ロジスティックな回帰を一致させて、テストされた組織における平均ＨＩＶ負荷が５０％低減（信頼精度９５％）した用量レベルを得た。組織病理学的研究では、通常の方法により、組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、次いで、パラフィンに埋め込んだ。６μｍの組織切片を貼り付けたガラス・スライドを用意し、ヘマトキシリン−エオシンを用いて染め、盲検の様式で調べるために獣医病理学者へ提出した。
【０１２２】
表６．Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおけるＢＲ／９２／０１９に対するＦＬＰ−１０２および１０５の抗ＨＩＶ活性
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【０１２３】
ＦＬＰ−１０２またはＦＬＰ−１０５は、週に５日で２週間２０μｇ／マウスの毎日の用量レベルで用い、腹腔内ボーラス注射により投与した。ＺＤＶ／３ＴＣは８ｍｇＺＤＶ＋４ｍｇ３ＴＣの用量レベルで用い、週に５日で２週間毎日２回の洗浄を介して投与した。すべてのマウスは、１０×１０６のＰＢＭＣを用いて再構成し、再構成２週間後１×１０５ＴＣＩＤ50のＨＩＶ−１分離株ＢＲ／９２／０１９で感染させた。処理は、ＨＩＶ−１分離株の接種後直ちに開始された。
【０１２４】
結果
我々は、次いで、ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５が、ヒト・エイズのＨｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいて生体内で抗ＨＩＶ活性を呈するかどうかを決めようとした。対照マウスは、溶媒単独（陰性の対照処理）か、またはＺＤＶ＋３ＴＣ（陽性の対照処理）を用いて処理された。ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５は、週に５日で２週間２０-４０μｇ／マウス（２−４ｍｇ／ｋｇ）の非毒性の用量レベルで用い、腹腔内ボーラス注射により投与した。ＺＤＶ／３ＴＣの組み合わせは、８ｍｇジドブディン＋４ｍｇラミブディン／３ＴＣの用量レベルで用い、週に５日で２週間毎日２回の洗浄を介して投与した。すべてのマウスは、１０×１０６のＰＢＭＣを用いて再構成し、再構成２週間後１×１０５ＴＣＩＤ50の遺伝子型と表現型がＮＲＴＩ耐性ＨＩＶ−１分離株ＢＲ／９２／０１９で感染させた。処理は、ＨＩＶ−１分離株の接種後直ちに開始された。溶媒処理した対照マウス１０匹の内の９匹（９０％）からの脾臓の試料は、３.９±０.３ｌｏｇｓのＨＩＶ ＲＮＡ負荷を有するＨＩＶ−１ ＰＣＲは陽性であり、一方、ＺＤＶ／３ＴＣ処理した対照マウス１０匹の内の３匹のみ（３０％）からの脾臓の試料は、３.２±０.３ｌｏｇｓのＨＩＶ ＲＮＡ負荷を有するＨＩＶ−１ ＰＣＲは陽性であった（表６）。比較すると、ＦＬＰ−１０２処理したマウス１０匹（平均ＨＩＶ ＲＮＡ負荷＝２.９ｌｏｇｓ）の内の２匹のみ（２０％）、およびＦＬＰ−１０５処理したマウス１０匹（平均ＨＩＶ ＲＮＡ負荷＝３.２±０.３ｌｏｇｓ）の内の３匹（３０％）は、ＨＩＶ−１ ＰＣＲは陽性であった。したがって、ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５の両方は、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの脾臓において、インビボのＨＩＶ−１複製を防止する場合と、少なくとも同程度に有効であった。溶媒で処理した対照マウス８匹の内の７匹およびＺＤＶ／３ＴＣ処理した１０匹の内の6匹からの腹膜洗浄試料は、ＨＩＶ−１ ＰＣＲが陽性であった。対照的に、ＦＬＰ−１０２処理した９匹のマウスは、すべて、ＨＩＶ−１感染のＰＣＲ証拠を示さず、一方、ＦＬＰ−１０２処理した９匹のマウスのうち３匹のみが、ＨＩＶ−１感染のＰＣＲ証拠を示した（表６）。突然変異体ＰＡＰタンパク質のインビボ抗ＨＩＶ活性は、脾臓試料のＨＩＶ−１１培養によりさらに確認された。溶媒で処理した対照マウスからの１０個の試料の内の９個および１０個の脾臓+洗浄（混合された）試料のうちの９個が、ＨＩＶ−１培養に陽性であったが、ＦＬＰ−１０２処理したマウスからの１０個の脾臓試料の内の２個のみおよび１０個の脾臓+洗浄試料の内の３個のみが、ＨＩＶ−１培養に陽性であった。比較すると、ＦＬＰ−１０５処理したマウスからの１０個の脾臓試料の内の３個および１０個の脾臓+洗浄試料の内の５個が、ＨＩＶ−１培養に陽性であった。したがって、両ＰＡＰ突然変異体は、ＺＤＶ／３ＴＣの組み合わせと少なくとも同程度の効果があり、また、ＦＬＰ−１０２は、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおいてＨＩＶ−１の複製を防止する上で最も活性なＰＡＰタンパク質であった。
【０１２５】
上の明細書、実施例およびデータにより、本発明の組成物の製造と利用について完全な説明がなされている。本発明の多くの実施態様が本発明の精神と範囲から逸脱することなく作られるので、本発明は明細書に添付した特許請求の範囲に存在している。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】ＰＡＰのリボンと空間充填モデル（灰色リボン）の図であり、左側の白い部分はリボソームＲＮＡと錯体を形成し、右側の白い部分はＲＮＡ分子と錯体を形成している。
【図２】野生型および突然変異組換え体ＰＡＰタンパク質の分析を示し、(Ａ)はクーマシーブルーで染色したＳＤＳ１２％ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるものであり、(Ｂ)はウエスタンブロットによるものである。
【図３】生体外ウサギにおける野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質に対する、網状赤血球分解溶液翻訳システムの効果を示す（すなわち、リボソーム結合の抑制を介して）。(Ａ) ＦＬＰ−１０２および単一残基突然変異体ＦＬＰ−１００とＦＬＰ−１０１。(Ｂ) ＦＬＰ−１０５および単一残基突然変異体ＦＬＰ−１０３とＦＬＰ−１０４。
【図４】野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質による大腸菌リボソームＲＮＡの生体外脱プリンを示す。測定は、アニリン切断と６％尿素／ポリアクリルアミド・ゲルにおけるフラグメント分離により行った。
【図５】天然リボソームまたは生体外で合成されたリボソーム・タンパク質Ｌ３と野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質の会合を示す。(Ａ)網状赤血球に富むウサギの血液から分離されたリボソームと突然変異体ＰＡＰタンパク質の会合。(Ｂ) 生体外で合成されたリボソーム・タンパク質Ｌ３と野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質の会合。
【図６】野生型および突然変異体ＰＡＰタンパク質による大腸菌とＨＩＶ−１ ＲＮＡの脱プリンを示す。差込図はアデニンとグアニンのスタンダードのスタンダード曲線。
【図７】バルブシー・マウスにおける突然変異体ＰＡＰタンパク質、ＦＬＰ−１０２およびＦＬＰ−１０５の生体内毒性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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