(57)【要約】本発明は、被験者におけるミトコンドリア核酸の相対量を測定することによって、被験者における敗血症の病状を検出する測定法を提供する。本発明の測定法は、ミトコンドリアシークエンス及びゲノムシークエンス等の参照シ−クエンスの共増幅（co-amplification）を含む準定量的及び定量的なＰＣＲ等のＰＣＲ法を含んでもよい。そのような測定法からの情報は、被験者の細胞中の細胞核の核酸に対するミトコンドリア核酸の比を与えるように評価される。
2005532056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症の病状を診断することを必要とする被験者からのサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することを含む、前記被験者について敗血症の病状を診断する方法であって、
前記測定されたミトコンドリア核酸の相対量は、前記被験者における敗血症の病状の存在を示していることを特徴とする方法。
【請求項２】
敗血症の病状に対する危険度を予測することを必要とする被験者からのサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することを含む、前記被験者について敗血症の病状に対する危険度を予測する方法であって、
前記測定されたミトコンドリア核酸の相対量は、前記被験者における敗血症の病状に対する危険度を示していることを特徴とする方法。
【請求項３】
前記被験者は、敗血症を患っていることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を第一の時点で測定すること及び被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を第二の時点で測定することを含み、前記第一の時点及び前記第二の時点で測定されたミトコンドリア核酸の相対量の間差は、前記被験者における敗血症の病状の経過を示していることを特徴とする、敗血症である被験者について敗血症の病状の経過をモニターする方法。
【請求項５】
更に、被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を、その後の時点で測定することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
更に、前記被験者における敗血症の起こりそうな臨床経過を予知又は予測することを含むことを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
敗血症の病状に対する治療法の有効性を測定する方法であって、
i）対照被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定すること；及び
ii）テスト被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定すること
を含み、前記テスト被験者は、前記治療法を施され；前記テスト被験者及び対照被験者由来の前記サンプル中の前記測定されたミトコンドリア核酸の相対量の差異は、前記治療法の有効性を示していることを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記敗血症の病状は、グラム陰性菌感染、グラム陽性菌感染、真菌感染、ウィルス感染、原虫感染、物理的な外傷、膵炎、臓器移植、出血、成人呼吸窮迫症候群、火傷、手術、化学療法、及び電離放射線の曝露からなる群から選択される状態に起因する敗血症の症状であることを特徴とする、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ミトコンドリア核酸の相対量は、敗血症の重症度又は敗血症に対する治療学的な処置の成功を示していることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ミトコンドリア核酸の相対量は、前記被験者の細胞中の細胞核の核酸の量を基準として測定されることを特徴とする、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミトコンドリア核酸及び前記細胞核の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応法によって測定されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ連鎖反応法は、定量的なポリメラーゼ連鎖反応法であり、ミトコンドリア核酸の増幅は、参照核酸の増幅と比較されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅産物がハイブリダイゼーションプローブで検出されるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者は、前記ミトコンドリア核酸の相対量が予定基準より下に減少する場合には、敗血症と診断され又は敗血症の危険にさらされていると決定されることを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記予定基準は、標準のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）／細胞核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）の比を１とし、これを基準とした、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比として表され、前記予定基準は、０．４５より少ない比であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
更に、前記ミトコンドリア核酸の相対量が予定基準より下に減少するときに、前記被験者において敗血症の治療を開始することを含むことを特徴とする、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ミトコンドリアＤＮＡの前記予定基準は、標準のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）／細胞核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）の比を１とし、これを基準とした、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比として表され、前記予定基準は、０．４５より少ない比であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験者は、ヒトであることを特徴とする、請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験者は、新生児、免疫無防備状態の個体、及び年配の個体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者は、非ヒト動物であることを特徴とする、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ヒト動物は、敗血症の動物モデルであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記敗血症の動物モデルは、ＬＰＳ誘発敗血症であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、末梢血サンプルであることを特徴とする、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ミトコンドリア核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ミトコンドリア核酸は、ＲＮＡであることを特徴とする、請求項１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＮＡは、ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験者からのサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することによって、前記被験者における敗血症の病状の程度を決定することにおいて使用するための診断キットであって、
i）ミトコンドリア核酸プライマー；及び
ii）細胞核核酸プライマー
を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２８】
ミトコンドリア核酸は、ＤＮＡであることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ミトコンドリア核酸は、ＲＮＡであることを特徴とする、請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３０】
ＲＮＡは、ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症（sepsis）のための診断ないし予後徴候測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、場合によっては命にかかわり、感染ないし外傷後に発展するであろう全身性の臨床状態になる（Mesters, R.M. et al. (1996) Thromb Haemost. 75: 902-907、Wheeler A.P.及びBernard G.R. (1999) N Engl J Med. 340: 207-214）。一般に、敗血症は、重い感染の間における、微生物毒素の放出により引き起こされると考えられるが、敗血症の応答は、随伴性の微生物感染の何ら徴候もなしに、手術、物理的な外傷（physical trauma）、火傷、臓器移植、又は膵炎を含む他の状態にも起因しうる（Balk R.A.及びBone R.C. (1989) Crit Care Clin 5: 1-8、Ayres S.M. (1985) Crit Care Med 13: 864-66）。ヒトでは、実質的に全てのグラム陰性菌の外膜のリポ多糖類由来の菌体内毒素（エンドトキシン）の放出が、敗血症の共通の原因であると考えられる。
【０００３】
敗血症の後遺症は、重い低血圧、逐次的な多臓器不全又は機能不全、及び壊死性の細胞死により性格付けられてもよく、集中治療室における死亡率の最も一般的な原因であり得、重い敗血症、敗血症誘発低血圧又は敗血症性ショックの原因となるかもしれない（Parrillo, J.E. et al. (1990) Ann Intern Med 113: 227-42、Manship, L. et al. (1984) Am Surg 50: 94-101、並びにNiederman M.S.及びFein A.M. (1990) Clin Chest Med 11: 663-65）。医薬及び緊急治療の管理手順についての進歩にもかかわらず、敗血症性ショックを起こす患者の推定死亡率は、他の医学的な合併症の存在に左右されるが、３０％から５０％である（Natanson, C. et al. (1998) Crit Care Med. 26: 1927-1931、及びZeni, F. et al. (1997) Crit Care Med. 25: 1095-1100）。
【０００４】
敗血症に対する治療手順の時機は、好結果を得るために極めて重要であるかもしれない。治療の開始の遅れは、患者に対して重い結果をもたらしうる。そのうえ、治療薬の投与の最適な時機は、敗血症の進行（経過）段階に左右されるかもしれない。それゆえ、敗血症の迅速かつ確実な診断が、効果的な処置の鍵となる。
【０００５】
敗血症に対する現在の診断技術には、微生物又はアシドーシス（acidosis）に対する陽性血液テスト（positive blood test）；白血球又は血小板数における変化のテスト；或いは発熱、悪寒、震え、過度呼吸、心拍増大、錯乱又はせん妄等の身体的な症状の同定、が含まれる（von Landenberg, P及びShoenfeld, Y (2001) IMAJ 3: 439-442、Marshall, J.C et al. (1995) Crit Care Med 23(10): 1638-1652、Vincen, J.L et al. (1996) Intensive Care Med 22: 707-710、Le Gall, J.R. et al. (1996) JAMA 276: 802-810、並びにKnaus, W.A. et al. (1985) Crit Care Med 13: 818-829）。しかしながら、血液培養の結果は成功した処置のためには時間がかりすぎるかもしれないし、又は十分な感度がないかもしれないし、身体的な症状は不適当な治療によって引き起こされている他の状態によるものであるかもしれないので、これらの診断技術の価値には限界がある。
【０００６】
敗血症の進行初期、一般には敗血症性ショックの発生前に患者を特定できる、迅速かつ確実な診断テストを開発すること、敗血症の治療を受けている患者の状態をモニターすること、又は敗血症にかかる危険にさらされている患者を特定することは有用であろう。また敗血症の新規治療学の発見及び創出を促進する診断テストを開発することも有用であろう。
【発明の開示】
【０００７】
多彩な代替側面において、本発明は、一般に、ミトコンドリア核酸（例えば、ミトコンドリアのＤＮＡ又はミトコンドリアのｍＲＮＡのようなＲＮＡ）が敗血症である被験者（患者）において枯渇するであろうという発見に基づいて、敗血症患者における症状の検出のための方法を提供する。一部の患者には、その方法は、敗血症の根底にある原因にかかわらず、敗血症を検出するのに概して有用であろう。
【０００８】
一つの側面において、本発明は、敗血症の病状（disease state）の診断を必要とする被験者における敗血症の病状の診断の方法を提供する。前記方法は、被験者から採取されたサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することを含み、前記測定されたミトコンドリア核酸の相対量は、被験者における敗血症の病状の存在を示しうる。別の側面において、本発明は、敗血症の病状に対する危険度の予測を必要とする被験者について敗血症の病状に対する危険度を予測する方法を提供する。前記方法は、被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することを含み、前記測定されたミトコンドリア核酸の相対量は、被験者における敗血症の病状の危険度を示しうる。これらの側面の何れにおいても、被験者は敗血症を患っているかもしれない。
【０００９】
別の側面において、本発明は、敗血症である被験者について敗血症の病状の経過をモニターする方法を提供する。前記方法は、被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を第一及び第二の時点で測定することを含み、前記第一の時点及び前記第二の時点で測定されたミトコンドリア核酸の相対量の間差（差異）は、被験者における敗血症の病状の経過を示しうる。前記方法は、被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量をその後の時点で測定することをも含み、或いは被験者における敗血症の起こりそうな臨床経過（clinical course）を予知又は予測することをも含みうる。
【００１０】
別の側面において、本発明は、敗血症に対する治療法の有効性を測定する方法を提供する。前記方法は、対照被験者由来及びテスト被験者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定することを含み、前記テスト被験者は、前記治療法を施され、前記テスト被験者及び対照被験者由来のサンプル中の測定されたミトコンドリア核酸の相対量間の差は、前記治療法の有効性を示す。
【００１１】
他の１つの側面において、本発明は、被験者由来のサンプル中ミトコンドリア核酸の相対量を測定することによって被験者における敗血症の病状の程度を測定することにおいて使用するための診断キットを提供する。前記キットは、ミトコンドリア核酸プライマー及び細胞核の核酸プライマーを含みうる。
【００１２】
代替の実施形態において、被験者はヒト（例えば、新生児、年配の個体、若しくは免疫無防備状態の個体）又は非ヒト動物（例えば、ＬＰＳ誘発敗血症等の敗血症の動物モデル）であってもよい。いくつかの形態において、ミトコンドリア核酸の相対量が予定基準（predetermined level）より下に減少する場合には、被験者は敗血症と診断され又は敗血症の危険にさらされると決定されることがあり、或いは被験者において敗血症の治療が開始されることがある。予定基準は、任意に、例えば、標準のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）／細胞核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）の比を１とし、これを基準とした、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比として表されることができ、この予定基準は、０．４５未満の（０.４５より少ない）比であろう。
【００１３】
他の代替の実施形態において、敗血症の病状は、グラム陰性菌感染、グラム陽性菌感染、真菌感染、ウィルス感染、物理的な外傷、膵炎、臓器移植、出血、成人呼吸窮迫症候群、火傷、手術、化学療法、又は電離放射線の曝露に起因する敗血症の症状（徴候）であってもよい。サンプルは、例えば、末梢血サンプルでもよい。
【００１４】
代替の実施形態において、ミトコンドリア核酸の相当量は、敗血症の重症度、又は敗血症に対する治療学的な処置の成功を示すことがある。そのミトコンドリア核酸は、被験者の細胞中の細胞核核酸の量を基準として、例えば、定量的なポリメラーゼ連鎖反応法等のポリメラーゼ連鎖反応法によって、測定されるが、ミトコンドリア核酸の増幅は、参照核酸の増幅と比較してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅産物がハイブリダイゼーションプローブで検出されることがあるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法であってもよい。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明と関連して使用される「敗血症（sepsis）」は、用語「敗血症（sepsis）」、「菌血症（bacteremia）」、「敗血症候群（septic syndrome）、「敗血症性ショック（septic shock）」、「重い（重篤な）敗血症（severe sepsis）」、及び「全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome）」又は「ＳＩＲＳ」を含み、一般には、炎症誘発性のサイトカイン、接着分子、血管作用性の媒介物、及び活性酸素種等の血流に入り込む炎症の内在媒介物の放出に関連し、かつ白血球数、体温、心拍及び呼吸の変化を伴った、急性全身性炎症反応（acute systemic inflammatory reaction）を意味する（Bone, R.C. et al. (1992) Chest 101: 1644-55、並びにPaterson, R.L.及びN.R. Webster (2000) J.R.Coll.Surg.Edinb., 45: 178-182）。敗血症は一般に感染又は外傷によって引き起こされると考えられ、グラム陰性及びグラム陽性菌、真菌、原虫（protozoa）並びにウィルスを含む感染性の微生物；或いは感染又は外傷に起因する炎症媒介物に対する非特異性の宿主反応（non-specific host response）である（Bone, R.C. et al. (1992) Chest 101: 1644-55、並びにPaterson, R.L.及びN.R. Webster (2000) J.R.Coll.Surg.Edinb., 45: 178-182）。
【００１６】
いくつかの形態では、二つ又はそれ以上の下記徴候がある患者において、ＳＩＲＳと診断されることがある：３８℃より高い又は３６℃未満の体温；９０拍／分よりも多い頻脈；２０呼吸／分よりも多い呼吸率又は４.３ｋＰａ未満のＰａＣＯ２；並びに、１２×１０９／ｌよりも多い若しくは４×１０９／ｌ未満の又は１０％よりも多い未成熟（バンド）形態の白血球数。異なる形態において、敗血症を、感染によるSIRSと定義し、重い敗血症を、臓器低灌流の徴候を伴う敗血症と定義してもよい。代替の形態において、敗血症性ショックを、血圧を維持するために適当な蘇生法又は必要量の昇圧剤（vasopressor）／変力剤（inotrope）にもかかわらず低血圧（９０ｍｍＨＧ未満の収縮期血圧）を伴う重い敗血症と定義してもよい（Paterson, R.L.及びN.R. Webster (2000) J.R.Coll.Surg.Edinb., 45: 178-182）。敗血症は、間に合うように診断かつ治療されない場合には、血圧において命にかかわる低下をもたらしうる敗血症性ショックに発展する可能性があり、敗血症の炎症に関連した影響は、組織損傷、進行性の臓器機能不全及び臓器不全をもたらすことがある。
【００１７】
敗血症は、腎臓（例えば、尿路感染による）；肝臓；胆嚢；腸（例えば、腹膜炎（peritonitis））；皮膚（例えば、蜂巣織炎（cellulitis））；肺（例えば、細菌性の肺炎）；尿生殖器路（例えば、尿道敗血症（urosepsis））；又は脳及び脊髄（例えば、細菌性の髄膜炎）等の臓器における局所的な感染に起因しうる、或いは素物ショック症候群（toxic shock syndrome）等の全身性の状態に起因しうる。敗血症は、化学療法、急性膵炎、手術、物理的な外傷、火傷、臓器移植、多臓器機能障害（multiple organ dysfunction syndrome；MODS）、急性呼吸窮迫症候群（acute respiratory distress syndrome；ARDS）、急性肺障害（acute lung injury；ALI）、播種性血管内血液凝固（disseminated intravascular coagulation；DIC）、出血、又は電離放射線の曝露等の非感染性の傷害の結果としても起こる（Bone, R.C. et al. (1992) Chest 101: 1644-55、並びにPaterson, R.L.及びN.R. Webster (2000) J.R.Coll.Surg.Edinb., 45: 178-182）。
【００１８】
敗血症の生理的な徴候（症状）は、震え、悪寒、発熱、脱力感、吐き気、嘔吐、及び下痢から、重い低血圧、賢さ（知能）の低下（reduced mental alertness）及び錯乱、後遺症として起こる多臓器不全又は機能不全（例えば、低尿排出を引き起こす腎臓の不全；呼吸困難を引き起こし血中酸素濃度を低くする肺の不全；体液停留及び膨張を引き起こす心臓の不全）、並びに敗血症性ショックに特有である壊死性及びアポトーシスの細胞死の範囲にわたって連続に起こる。
【００１９】
代替の形態において、本発明の方法は、ミトコンドリア核酸のレベルが敗血症を示すレベルであるかどうかを測定するため、被験者由来の、末梢血サンプル又はその細胞画分等のサンプル中のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）或いはミトコンドリアＲＮＡ等、例えば、ミトコンドリアｍＲＮＡ（ｍｔ  ｍＲＮＡ）のミトコンドリア核酸を定量することを含む。「サンプル（sample）」は、制限なく末梢血、リンパ球（例えば、Ｂ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞）、痰、尿、創傷、被験者からのカテーテルの入口部位、若しくはそれらに由来する株細胞を含むあらゆる生物学的な体液、細胞又は組織を含む。本発明の代替の側面において、本発明の測定法において使用するサンプルを、例えば、剖検又は生検によって、心臓、脳、肺、腎臓、脂肪、脾臓、又は肝臓等の由来の種々の組織、或いはそれらに由来する細胞から得てもよい。
【００２０】
代替の形態において、本発明の方法は、敗血症であるか又は敗血症の危険にさらされていると思われる被験者等の被験者におけるミトコンドリア核酸の相対量を測定する測定法も含む。被験者は、例えば、急性伝染のために治療を施すヒトの患者でもよく、或いは敗血症に対して脆弱である群のメンバーでもよい。いくつかの形態では、被験者は、例えば、犬、豚、羊、牛、鳥、若しくは七面鳥等の家畜又は飼育動物のヒトでない動物でもよい。いくつかの形態では、被験者は、当業者において公知の又は本願において記載した敗血症の動物モデルでもよく、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、ヒヒ、アカゲザル、又はイヌでもよい。
【００２１】
本発明の測定法は、ミトコンドリアシークエンス及びゲノムシークエンス等の参照シ−クエンスの共増幅（co-amplification）を含む準定量的若しくは定量的なＰＣＲ又はＲＴ  ＰＣＲ等のＰＣＲ測定法を含む。本発明の測定法は、ミトコンドリア及び細胞核のＤＮＡ又はＲＮＡサンプル並びにミトコンドリア及び参照（例えば、ゲノム若しくはｃＤＮＡ）のシークエンスをプローブとして用いる、ハイブリダイゼーション測定法、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡハイブリダイゼーション測定法も含む。そのような測定法からの情報は、被験者の細胞又は組織中の細胞核の核酸に対するミトコンドリア核酸の比（例えば、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡ比又は細胞核ＲＮＡ（ｎＲＮＡ）に対するｍｔ  ｍＲＮＡ比）を与えるように、評価されうる。
【００２２】
本発明の各種の形態では、前記測定法から、それゆえ、敗血症にかかる又は敗血症が敗血症性ショックに迫るに十分に重篤になる前に、臨床的な情報が得られる。ミトコンドリア核酸（例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡ）における枯渇を、適当な治療法、例えば、適当な広域抗生物質の施与で、逆転させるかもしれない。敗血症性ショックを含む敗血症の重篤な症状は、細胞核の核酸（細胞核核酸）に対するミトコンドリア核酸（例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡ）レベルが対照サンプル若しくは公知の標準物質を基準として測定された、標準の５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％からおよそ何らかの値よりも下に減少したときに生ずる。敗血症に対する臨床処置についても、細胞核の核酸に対するミトコンドリア核酸の比（例えば、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡ比又はｎＲＮＡに対するｍｔ  ｍＲＮＡ比）が対照サンプル若しくは公知の標準物質に関して測定された０．５、０．４５、０．４、０．３５又は０．３等の許容限界値より下に減少したとき、その必要がまた示されるであろう。
【００２３】
代替の形態では、ある期間にわたる相対ミトコンドリア核酸（例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡ）濃度の変化率も、診断情報を与えるべく、測定されるかもしれない。ある被験者にとって、ミトコンドリア核酸の相対量（例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡ）についての相対的かつ急速な減少は、敗血症を示していることがある。８〜１０日未満の期間にわたって、細胞核の核酸に比較したミトコンドリア核酸の相対量（例えば、ｎＤＮＡに比較したｍｔＤＮＡ又はｎＤＮＡに比較したｍｔ  ｍＲＮＡ）についておよそ５０％以上（又はある場合では４０％よりも多い）の相対的かつ急速な減少は、被験者が敗血症にかかっていること、及びそれゆえより厳重にモニターする必要があるかもしれないこと、及び／又は抗生物質若しくは他の抗敗血症治療学を投与するないし施すことを必要とするかもしれないこと、を示すかもしれない。
【００２４】
代替の形態において、本発明は、ミトコンドリア核酸の相対量（例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔ  ｍＲＮＡ）、例えば、細胞核の核酸（例えば、ｎＤＮＡ又はｎＲＮＡ）シークエンスを基準とした量、の測定を容易にして、代わりに、ｍｔＤＮＡの複製数自体を測定する必要を無くすプロトコル（手順）をも提供する。いくつかの側面では、このアプローチは、本発明の診断測定法を簡便にするであろう。例えば、図１に示すように、細胞核ゲノム当量（nuclear-genome-equivalent）を表す数字（３０〜３０，０００）は、公知の細胞核ゲノム当量濃度の対照ヒトＤＮＡについてのキャリブレーション（検定）によって測定されるような、ｎＤＮＡ増幅標準（ｎＤＮＡ amplification standard）に割り当てられる。その数字は、（ミトコンドリア遺伝子の計算された複製数を表さないが）任意に、ミトコンドリア遺伝子に対応する標準曲線に割り当てられる。代替のアプローチでは、細胞核ゲノム当量を表す数字は、サンプル希釈の段階（度合い）にのみ基づいて、例えば、ｎＤＮＡ増幅標準に（その数字が、そのような当量の絶対値ではないが、細胞核ゲノム当量の相対複製数を示すように）任意に割り当てられてもよく、これらの任意の数字は同様にｍｔＤＮＡ増幅標準に割り当てられてもよい。そのとき、本発明の測定法の結果は、絶対的なｍｔＤＮＡ複製数を測定することを必要としないで、例えば、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの比で表されるかもしれない。そのような形態において、増幅サイクル数が最も信頼できる結果、例えば、５〜１５の全ての整数の最小値から１５〜４０の全ての整数の最大値まで、を与える範囲内にあるように、十分なＰＣＲテンプレートを与えるサンプルＤＮＡ又はＲＮＡの初期濃度を利用することが好ましいかもしれない。
【００２５】
本発明は、それゆえ、以下のステップを含む、核酸シークエンスの相対存在量を比較する工程を提供する：
ａ）第一の細胞核対照サンプル及び第二の細胞核対照サンプルにおける細胞核増幅反応条件下の細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度を測定して、対照細胞核増幅測定値を得ること（ただし、前記第一及び第二の細胞核対照サンプルにおいて、細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの濃度が異なる）；
ｂ）前記対照細胞核増幅測定値から対照細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスデータセットを作成して、細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度と濃度間のモデルスタンダード関係を得ること；
ｃ）第一のミトコンドリア対照サンプル及び第二のミトコンドリア対照サンプルにおけるミトコンドリア増幅反応条件下のミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度を測定して、対照ミトコンドリア増幅測定値を得ること（ただし、前記第一及び第二のミトコンドリア対照サンプルにおいて、ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの濃度が異なる）；
ｄ）前記対照ミトコンドリア増幅測定値から対照ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスデータセットを作成して、ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度と濃度間のモデルスタンダード関係を得ること；
ｅ）テストサンプルにおける細胞核増幅反応条件下の細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅動態を測定して、テストサンプル細胞核増幅測定値を得ること；
ｆ）前記細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度と濃度間のモデルスタンダード関係をテストサンプル細胞核増幅測定値に適用して、テストサンプル細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンス濃度測定値を得ること；
ｇ）テストサンプルにおけるミトコンドリア増幅反応条件下のミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度を測定して、テストサンプルミトコンドリア増幅測定値を得ること；
ｈ）前記ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの増幅速度と濃度間のモデルスタンダード関係をテストサンプルミトコンドリア増幅測定値に適用して、テストサンプルミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンス濃度測定値を得ること；
ｉ）前記テストサンプル細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンス濃度測定値をテストサンプルミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンス濃度測定値と比較して、テストサンプルにおける細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスと比較したミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスの相対濃度を求めること。
【００２６】
代替の形態において、本発明の方法及びキットを、急性伝染、及び結果として敗血症のより大きな危険にさらされている脆弱な群の中の個体を識別するために使用することができる。例えば、新生児、すなわち新生の乳児又は胎児、及びきわめて若年の小児（二歳より下）が、老人たち及び免疫抑制された人々（火傷患者等の重篤な物理的外傷を受けた人々を含む）と同様、特に敗血症に至る感染を受けやすい。本発明のいくつかの形態では、ＨＩＶ感染又は癌と診断され、その疑いがあり、或いはその危険にさらされている個体は、本発明の方法から除かれる。その結果、本発明は、ＨＩＶ感染又は癌と診断され、その疑いがあり、或いはその危険にさらされていると診断される個体でない患者由来のサンプル中のミトコンドリア核酸の相対量を測定する方法を含む。いくつかの形態では、本発明の方法及びキットを、ヒトでない動物、例えば、家畜、飼育動物、又は実験動物、における敗血症の病状を識別又はモニターするために使用してもよい。
【００２７】
現在の処置は、髄膜炎を除外するため、高い体温の脆弱な個体に広いスペクトルの抗生物質での治療又は腰椎穿刺を施すことを含む。したがって、現在の敗血症対応スキームの下では、敗血症ではない多数の患者が、多くの理由で好ましくないが、不必要に敗血症に対する治療をされる。例えば、広いスペクトルの抗生物質の投与は、抗生物質療法と関連した危険性、例えば、薬物アレルギー、聴覚損失、又は薬物の不十分な除去による内臓への損傷、及び微生物の抗生物質抵抗株の発生により好ましくなく、一方、腰椎穿刺のような処置は、患者に対して、比較的に侵襲性であり、さらなる外傷のもとになる。
【００２８】
本発明の迅速、かつ比較的に非侵襲性の方法（非観血法）を用いると、処置は、敗血症であると確認（識別）された患者に限定されるであろう。そのような患者は感染特異性の治療学で治療されるかもしれず、有効な場合には；より早期に又はより集中的に広域抗生物質で治療され；或いは腰椎穿刺のような処置を施されるかもしれない。血流中の微生物の存在に依拠する敗血症検出法とは異なり、本発明の方法は、被験者を新規抗生物質等の抗敗血症薬で治療するときに例えば取り組むであろう敗血症を検出するために使用されるかもしれない。
【００２９】
代替の形態において、本発明の方法はまた、早期処置の恩恵を受けるであろう脆弱な個体及び敗血症の個体を識別（同定）するためにも使用される。この同定は、より早期の又はことによるとより集中的な治療法に乗り出すべき保健医療開業医（health care practitioner）を援助することができる。したがって、相対的なミトコンドリア核酸レベル、例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡレベルが激しく枯渇した患者は、集中的、連続的、及び／又は複合的な抗生物質治療を受けるに値するかもしれない。同様に、相対的なミトコンドリア核酸レベル、例えば、ｍｔＤＮＡ又はｍｔＲＮＡレベルが枯渇した患者においては、手術を延期した方が賢明かもしれない。
【００３０】
代替の側面において、本発明の方法を、例えば、敗血症の実験モデルにおいて、敗血症治療の新規治療法の有効性をテストするために使用してもよい。敗血症の動物モデルは、限定されず；グラム陰性菌により引き起こされる敗血症をシミュレートするため微生物菌体内毒素（リポ多糖類（lipopolysaccharide；LPS））を投与したもの；化学療法誘発感染したもの；急性呼吸窮迫症候群を模擬するためラットにおいて盲腸結紮及び二重穿刺したもの；或いは敗血症の症状をシミュレートすることができる他の全ての実験モデルを含む。敗血症の動物モデルの記述は、限定されず、Bhatti AR及び Micusan VV (1996) Microbios 86 (349): 247-53；Redl H, et al. (1993) Immunobiology 187 (3-5): 330-45；Fink MP及びHeard SO (1990) J Surg Res. 49 (2): 186-96；Dunn DL (1988) Transplantation 5 (2): 424-9；Bohnen JM, et al. (1988) Can J Microbiol. 34 (3): 323-6；Mela-Riker L, et al. (1988) Circ Shock. 25 (4): 231-44；Walker JF, et al. (1986) Am J Kidney Dis. 8 (2): 88-97；Lopez-Garrido J, et al. (1987) Lab Invest. 56 (5): 534-43；Quimby F及びNguyen HT (1985) Crit Rev Microbiol. 12 (1): 1-44；Noel GJ, et al. (1985) Pediatr Res. 19 (3): 297-9；Moesgaard F, et al. (1983) Eur J Clin Microbiol. 2 (5):459-62；Hinshaw LB, et al. (1976) Surg Gynecol Obstet. 142 (6): 893-900；Tieffenberg J., et al. (1978) Infect Immun. 19 (2): 481-5；並びにWing D.A.,et al. (1978) J Lab Clin Med. 92 (2): 239-51、において見いだしてもよい。ただし、これらの全ては、参照により本願に組み込まれる。
【００３１】
代替の側面において、本発明は、本発明の方法において使用するための構成要素を有するキットを提供する。そのようなキットは、下記詳細に説明するような、mtＤＮＡ又はmtＲＮＡシークエンス及びnＤＮＡ又はnＲＮＡシークエンスに対して特異的なＰＣＲプライマーを含むＰＣＲコンポーネントを含んでもよい。そのようなキットはまた、本願に記載された本発明の方法を実施するために書かれた指示書をも含んでもよい。
【００３２】
代替の形態において、各種の技術を、細胞中のミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡの相対量を測定するために使用することができる。定量的なＰＣＲ法は、例えば下記文献において開示され、これらの全ては本願に参照により組み込まれる：Ginzinger, et al.に対して２００１年１月３０日に出された米国特許第6,180,349号；Kurnit, et al.に対して２０００年３月７日に出された米国特許第6,033,854号；Hyland, et al.に対して１９９９年１０月２６日に出された米国特許第5,972,602号；並びにSong, J. et al. (2001) Diabetes Care 24: 865-869。ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスは、ＡＴＰシンセターゼ６、GenBank Accession No.AF368271；ｔＲＮＡ−Ｌｅｕ、GenBank Accession No.S49541；ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＭＴＮＤ５）、GenBank Accession No.AF339085；ＩＤＬ、GenBank Accession No.AF079515；シトクロームｂ、GenBank Accession No.AF254896、ＣＣＯＩ、又は他の全ての適当なミトコンドリア特異性ヌクレオチドシークエンスを含むがこれらに限定されない、いかなるミトコンドリア特異性ヌクレオチドシークエンスから選択されてもよい。細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスは、ヒト２８Ｓ  ｒＲＮＡシークエンス、ＡＳＰＯＬ−ガンマシークエンス、ベータ-グロビンシークエンス、或いは他の全ての適当な細胞核ＤＮＡ又はＲＮＡシークエンスを含むがこれらに限定されない、いかなるシークエンスから選択されてもよい。増幅プローブを、技術において公知及び例えば、Samboock, et al.（モレキュラークローニング：ラボラトリーマニュアル第２版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年（Molecular Cloning: Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989））又はAusubel et al.（分子生物学におけるカレントプロトコル、ジョン  ワイリーとその子、１９９４年（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1994））において開示された方法に従って設計してもよい。
【００３３】
代替の側面において、本発明の方法は、von Landenberg, P及びShoenfeld, Y (2001) IMAJ 3: 439-442；Marshall, J.C.、 Cook, D.J.、Christou, N.V.、Bernard, G.R.、Sprung, C.L.、及びSibbald, W.J. (1995) Crit Care Med 23 (10): 1638-1652；Vincent J.L.、Moreno R.、Tanaka J.、及びWilliats S., (1996) Intensive Care Med 22: 707-710；Le Gall J.R.、Klar J.、及びLemeshow S. (1996) JAMA 276: 802-810；Knaus W.A.、Draper E.、Wagner D.、及びZimmerman J. (1985) Clit Care Med 13: 818-829；Knaus W.A.、Wagner D.P.、Draper E.A.、及びZimmerman J.E., et al. (1991) Chest 100: 1619-38；Bone, R.C.、Balk, R.A.、 Cerra, F.B.、Dellinger, R.P.、Fein, A.M.、Knaus, W.A., Schein, R.M.H.、及びSibbald W.J. (1992) Chest 101: 1644-55；Tracey, et al.に対して２００１年１０月１６日に出された米国特許第6,303,321号；Becker, et al.に対して１９９９年１１月３０日に出された米国特許第5,993,811号；Bianchi, et al.に対して１９９８年１１月３日に出された米国特許第5,830,679号；Romaschin, et al.に対して１９９８年９月８日に出された米国特許第5,804,370号；Bursten, et al.に対して１９９８年７月１４日に出された米国特許第5,780,237号；Bohuonに対して１９９７年６月１７日に出された米国特許第5,639,617号；Carroll, et al.に対して１９９６年８月１３日に出された米国特許第5,545,721号；又はDavid, et al.に対して１９９９年１２月７日に出された米国特許第5,998,482号において記載された方法を含むがこれらに限定されない、敗血症のための他の治療、予防或いは診断方法と共に用いてもよい。ただし、これらの全ては、参照により本願に組み込まれる。代わりにないしさらに、そのような患者を、ミトコンドリア治療学、すなわち、ミトコンドリア酵素の補助因子ないし前駆体等のミトコンドリアのためになる組成（構成）で治療してもよい。いくつかの形態において、そのようなミトコンドリア治療学を、例えばリボフラビン（ビタミンＢ２）、コエンザイムＱ１０、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、１-アセチルシステイン及びニコチンアミドからなる群から選択してもよい。
【実施例１】
【００３４】
敗血症は、血球ｍｔＤＮＡ量における著しい減少と関連する。測定法は、例えば敗血症の被験者におけるミトコンドリアＤＮＡレベルをモニターするために提供される。本発明の方法は、抗敗血症薬の有効性を評価するため及び敗血症である患者について又は敗血症の危険にさらされていると思われる個体について敗血症を診断するために適している。
【００３５】
（材料及び方法）
長期的血液サンプルを、一人の被験者から採集することができる。全ＤＮＡは、血球から抽出され、細胞核遺伝子とミトコンドリア遺伝子の両方は、ハイブリダイゼーションプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって増幅・定量することができる。ｍｔＤＮＡレベルは、ＤＮＡ細胞核ＤＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡの比（ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ）として表すことができる。
【００３６】
（サンプル採集及びＤＮＡ抽出）
バフィーコートを、血液サンプルから採集し、使用するまで−７０℃で冷凍保存することができる。全ＤＮＡは、DNAQIAamp DNA Blood Mini kit（キアゲン社、ミシソーガ、オンタリオ州、カナダ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、２００μＬのバフィーコートから抽出し、２００μＬの溶出緩衝液中に再懸濁させることができる。標準曲線（検量線）を作成するために、対照有志者から同様のサンプルを、採集することができ、そのＤＮＡを、抽出してプールすることができる。ＤＮＡプールの細胞核ゲノム当量（g.eq.）は、既知の細胞核g.eq.濃度の対照キットヒトＤＮＡ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック州、カナダ）により較正することによって求めることができる。
【００３７】
（定量リアルタイムＰＣＲ）
ｍｔＤＮＡ  ＣＣＯＩ遺伝子については、ＣＣＯＩ１Ｆ 5'-TTCGCCGACCGTTGACTATT-3'（配列番号１）及びＣＣＯＩ２Ｒ 5'-AAGATTATTACAAATGCATGGGC-3'（配列番号２）プライマーをＰＣＲ増幅のために使用し、オリゴヌクレオチド３’−フルオレセイン-標識ＣＣＯＩＰＲ１5'-GCCAGCCAGGCAACCTTCTAGG-F-3'（配列番号３）及び５’ＬＣ  Ｒｅｄ６４０標識ＣＣＯＩＰＲ２  5'-L-AACGACCACATCTACAACGTTATCGTCAC-P-3'（配列番号４）（但し、後者の３’末端はリン酸分子が付加されている）をハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００３８】
ｎＤＮＡ  ＡＳＰＯＬγ遺伝子については、ＡＳＰＧ３Ｆ 5'-GAGCTGTTGACGGAAAGGAG-3'（配列番号５）及びＡＳＰＧ４Ｒ 5'-CAGAAGAGAATCCCGGCTAAG-3'（配列番号６）プライマーをＰＣＲのために使用することができ、オリゴヌクレオチド３’−フルオレセイン標識ＡＳＰＧＰＲ１ 5'-GAGGCGCTGTTAGAGATCTGTCAGAGA-F-3'（配列番号７）及び５’ＬＣ  Ｒｅｄ６４０標識，３’−リン酸付加ＡＳＰＧＰＲ２ 5'-L-GGCATTTCCTAAGTGGAAGCAAGCA-P-3'（配列番号８）をハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００３９】
リアルタイムＰＣＲの反応は、ライトサイクラーファストスタートＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブキット（LightCycler FastStart ＤＮＡ Master Hybtidization Probes kit；ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック州、カナダ）を使用して、各遺伝子について独立かつ二重測定することができる。ＰＣＲの反応は、溶出緩衝液中に、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５μＭの各プライマー、０．１μＭの３’−フルオレセインプローブ、０．２μＭの５’ＬＣ  Ｒｅｄ６４０プローブ及びＤＮＡ１：１０希釈のＤＮＡ抽出物４μＬを含みうる。ＰＣＲ増幅は、９５℃、１０分の変性／酵素活性化を１ステップ行った後、２０℃／秒の温度変化率で、９５℃／０秒、６０℃／１０秒、７２℃／５秒を４５サイクル繰り返すステップから構成されうる。利得設定(gain setting)は、Ｆ１＝１、Ｆ２＝８にすることができ、単一蛍光性の獲得（single fluorescence acquisition）は、各アニーリングステップの最後にすることができる。細胞核のg.eq  ３０、３００、３０００、及び３００００外部標準曲線は、ライトサイクラーの各試行に含まれうるが、同じ細胞核g.eq値が、細胞核遺伝子（ＡＳＰＯＬγ）及びミトコンドリア遺伝子（ＣＣＯＩ）の両方について使用された。そのデータは、各増幅反応の二次導関数の極大値を使用し、かつそれをその標準曲線に当てはめることによって解析することができる。定量ＰＣＲの結果は、与えられた抽出物ＤＮＡＤＮＡについての二重測定（duplicate measurement）の平均ｎＤＮＡのg.eqに対する二重測定の平均ｍｔＤＮＡの相対比（ｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ）として表されうるが、それら２つの標準曲線を作成するために同じ細胞核g.eq値を使用されうるという事実により、比は１．０付近をとる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＣＲ法は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を採用することができるが、これは、増幅産物が前記記載したハイブリダイゼーションプローブで、ライトサイクラーファストスタートＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブキット（LightCycler FastStart DNA Master Hybtidization Probes kit；ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、ラヴァル、ケベック州、カナダ）を使用するか、ＤＮＡＤＮＡ又は（ＰＣＲ産物の蓄積をＰＣＲプロセスの間中継続して検出する例えば、ABI Prism 7700装置、アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州、米国を用いて）ABI Taqman（登録商標）技術等の代替の商業上利用可能な技術を用いて検出されてもよい。例えば、参照により組み込まれる下記米国特許において開示されているように、代替のＰＣＲ法及び前述の方法のバリエーションを採用してもよい：6,180,649号（Ginzinger et al；2001年1月30日）；6,033,854号（Kuit et al；2000年3月7日）；5,972,602号（Hyland；1999年10月26日）；5,476,774号及び5,219,727号（Wang；1995年12月19日及び1993年6月15日）；6,174,670号（Wittwer et al；2001年1月16日）；6,143,496号（Brown；2000年11月7日）；6,090,556号（Kato；2000年7月18日）；6,063,568号（Gerdes et al；2000年5月16日）。
【実施例２】
【００４１】
敗血症を検出するため、動物モデルにおいて、ＬＰＳ誘発敗血症を用いた。表１は、マウスへのＬＰＳの投与後６時間及び２４時間の肺及び肝臓組織における細胞核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）に対するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）比を示す。
【００４２】
【表１】
2005532056.tif 000003
【００４３】
その結果、ＬＰＳ誘発敗血症に関し、動物の肺組織においてｍｔＤＮＡ／ｎＤＮＡ比がより低いという強い傾向（Ｐ＝０．０６）を示す。
【００４４】
（結び）
本発明の各種の形態は本願に開示されるが、この技術について熟知した者（当業者）の共通の一般的知識に従って本発明の目的の範囲内で、多くの調節及び改良がなされてもよい。そのような改良には、実質的に同一の手法において同一の結果を得るための、本発明のいくつかの側面から公知の均等物への置換が含まれる。数値範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。本願明細書において、「含む」（comprising）の語は、「含むが、限定されない（including, but not limited to）」の句と実質的に同等である、限度を設定しない用語として使用される。本願明細書において引用した、特許及び特許出願に限定されずにこれらを含む全ての刊行物は、本願が優先権を主張する2002年7月5日に提出された米国仮出願番号60/393,368と同様に、個々の刊行物が本願に参照により組み込まれることについて及びまるで本願において十分に述べられているように明確かつ個別に示されているように、参照により本願に組み込まれる。本発明は、上に記載したように、並びに実施例及び図面に関して、実質的に全ての形態及びバリエーションを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】対照有志者からのプールＤＮＡ抽出物の段階希釈を用いて行った、細胞核遺伝子ＡＳＰＯＬＧ及びミトコンドリア遺伝子ＣＣＯＩに対し求められた一般的なライトサイクラーを用いたリアルタイムＰＣＲの標準曲線である。
【図１】
2005532056.tif 000004
【配列表】
2005532056000001.app
【国際調査報告】
2005532056.tif 000005
2005532056.tif 000006
2005532056.tif 000007
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