(57)【要約】本発明は、c-kitのトランスホスホリラーゼ（ホスホトランスフェラーゼとも呼ばれる）ドメインを標的とする化合物の同定および選択を可能にするスクリーニング方法に関し、より詳細には構成的に活性化されたc-kitの強力な阻害剤であるように選択されるが、例えば、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死に至る経路のような、他の活性化経路を阻害することができない化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)(i)活性化c-kitおよび(ii)試験対象の少なくとも１つの化合物を、成分(i)と(ii)との複合体を形成させる条件下において接触させる段階、
b)活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c)段階b)で同定され、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死を促進することができない、化合物のサブセットを試験および選択する段階
を含む、c-kitの選択的かつ強力な阻害剤である化合物を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項２】
活性化c-kitが活性化突然変異体c-kitである、請求項1記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
突然変異体活性化c-kitの阻害剤であり、SCF活性化野生型c-kitを阻害することができる、段階b)において同定された化合物のサブセットを試験および選択することからなる段階をさらに含む、請求項2記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
活性化c-kitがSCF活性化野生型c-kitである、請求項1記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
段階a)の化合物が10μMより高い濃度において試験される、請求項1〜4のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
IL-3が、0.5〜10ng/mlの濃度で、IL-3依存的細胞の培養培地に存在する、請求項1〜4のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
IL-3が、1〜5ng/mlの濃度で、IL-3依存的細胞の培養培地に存在する、請求項6記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
IL-3依存的細胞が、肥満細胞、トランスフェクトされた肥満細胞、BaF3、およびIC-2からなる群より選択される、請求項6または7記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
段階a)の活性化突然変異体c-kitが、Y823の近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関与する配列番号：1のアミノ酸800〜850に少なくとも１つの突然変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G突然変異体を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
成分(ii)が活性化c-kitを阻害する程度がインビトロまたはインビボにおいて測定される、請求項1〜9のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を試験および選択することからなる段階をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
化合物が野生型c-kitを阻害する程度がインビトロまたはインビボにおいて測定される、請求項11記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
化合物が強力で選択的かつ非毒性の野生型c-kit阻害剤である、請求項11記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
阻害剤が、野生型c-kitのトランスリン酸化ドメインに作用する、請求項1〜13のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
i)請求項4記載の方法によって同定された化合物に対するc-kit自己リン酸化の阻害を引き起こす化学基を付加する段階、
ii)活性化突然変異体c-kitを阻害する、段階i)で同定された化合物のサブセットを試験および選択する段階、
を含む、c-kitの選択的かつ強力な阻害剤である化合物を同定するためのスクリーニング方法。
【請求項１６】
突然変異体活性化c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害が、c-kitリン酸化の量によって測定される、請求項1〜15のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
a)細胞死の程度を測定することによって活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、各々がIC50＜10μMを有する複数の試験化合物を用いて、永続的に活性化されたc-kitである突然変異体c-kit（例えば、トランスリン酸化ドメインにおいて）を発現する細胞を用いて増殖アッセイを実施する段階、
b)c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、段階a)で同定した候補化合物のサブセットを用いて、野生型c-kitを発現し、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞である細胞を用いて増殖アッセイを実施する段階、
c)段階b)で同定した化合物のサブセットを用いて、c-kitを発現する細胞を用いて増殖アッセイを実施し、各々がIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階を含む、c-kitの阻害剤である強力かつ選択的な化合物を同定するための、請求項1記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
細胞死の程度が、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーによって測定される、請求項17記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
化合物がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項1〜18のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
化合物が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス型単環式、二環式、または複素環アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項1〜19のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
化合物がピリミジン誘導体であり、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体である、請求項1〜19のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
化合物がインドリノン誘導体であり、より詳細にはピロール置換インドリノンである、請求項1〜19のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
化合物が、単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物である、請求項1〜19のいずれか一項記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
化合物がキナゾリン誘導体である、請求項1〜19のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
化合物が活性化c-kitの選択的かつ強力な阻害剤であり、野生型c-kitの強力な阻害剤がトランスリン酸化ドメインに作用し、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死を促進することができない、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法によって入手可能な化合物。
【請求項２６】
薬剤を製造するための、請求項25記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、c-kitのトランスホスホリラーゼ（ホスホトランスフェラーゼとも呼ばれる）ドメインを標的とする化合物、より詳細には構成的に活性化されたc-kitの強力な阻害剤であると選択されるが、例えば、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死を生じる経路などの、他の活性化経路を阻害することができない化合物の同定および選択を可能にするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞因子(SCF)の受容体をコードする癌原遺伝子であるc-kitは、細胞外ドメインの5つのIg様ドメインの存在および細胞質内ドメインをアデノシン三リン酸(ATP)結合ドメインとホスホトランスフェラーゼドメインとにスプライスするキナーゼ間配列によって特徴付けられる、III型受容体型チロシンキナーゼサブファミリーに属する[1](図1)。その遺伝子は、ヒト染色体の4q12に位置し、マウス第5染色体のW遺伝子座によってコードされる[2]。c-kit遺伝子の産物は、519の細胞外アミノ酸(aa)と、23aaの膜貫通ドメインと、433aaの細胞内末端領域を有する976のアミノ酸(aa)によって構成される膜貫通受容体である[3]。c-kit受容体は、通常、メラニン形成細胞、肥満細胞、原始的な造血細胞、始原生殖細胞、およびカハール間質細胞(ICC)を含む種々の細胞型上で発現される[4]。c-kit受容体のリガンドは、幹細胞因子(SCF)もしくはKitリガンド(KL)、またはスチール因子(SL)もしくは肥満細胞増殖因子(MCGF)と呼ばれるサイトカインである[5, 6]。このサイトカインは、ヒトの第12染色体に位置する遺伝子およびマウス第10染色体上のSl遺伝子座によってコードされる[7]。または、この遺伝子の産物はスプライスされて、可溶性の形態および／または膜結合形態を生じる[8]。幹細胞の生存および自己再生ならびに以下の種々の細胞種型の増殖、分化、および遊走を促進する際に、SCFは単独または他の増殖因子と組み合わさって作用する：メラニン形成細胞、肥満細胞、原始的な造血細胞、生殖細胞、およびICC。受容体にSCFが結合すると、c-kitの二量体化が促進され、内因的なチロシンキナーゼの活性を誘導し、特定のチロシン残基がトランスリン酸化される[9, 10]。これらのチロシン残基はリン酸化されると、いくつかの細胞内信号伝達分子の結合部位となり、異なる細胞型において種々の細胞応答を生じる。
【０００３】
しかし、数多くの他のキナーゼの場合と同様に、c-kitは、そのリガンドSCFに結合しないで活性化されうる。数多くの天然型突然変異は、c-kitキナーゼの構成的な活性化を生じ、異常な細胞増殖ならびに肥満細胞症および種々の他の癌などの疾患の発症を生じる。c-kitの最初の活性化突然変異は、c-kitの突然変異型で切断型のウィルス相同物である、トランスフォーミング型の発癌遺伝子v-kitをコードするHardy-Zuckerman 4-ネコ肉腫ウィルスによって誘導されるネコモデルにおいて記載された[11]。最近、c-kitの構成的な活性化を生じる受容体突然変異が、肥満細胞性白血病細胞系統および他の血液悪性疾患と関連するまたは関連しない肥満細胞症患者由来の細胞において記載されている。これまでに同定されているc-kitの種々の活性化突然変異は以下に詳細に記載されている。
【０００４】
c-kitの増加した活性化を生じる第2の機序は、小細胞肺癌(SCLC)[12]、結腸直腸癌[13]、乳癌[14]、婦人科腫瘍[15]、および神経芽細胞腫[16]におけるように種々の腫瘍組織におけるSCFの自己分泌である。
【０００５】
c-kitを阻害することが当技術分野において提案されているチロシンキナーゼ阻害剤は、活性化突然変異体c-kitの阻害の開発も報告もされていない。以下に詳細に記載する2つの例外があり、その1つ(STI571)は本発明者らのアッセイでは活性でなく、本発明者らは著者らの誤った解釈の説明を提供しており、他方のSU6577は、毒性が見られる高濃度においてだけ活性である。
【０００６】
STI571(国際公開公報第99/03854号)は、野生型受容体のリガンド依存的活性化に対するより、ヒト肥満細胞性白血病細胞系統(HMC-1、膜近傍の突然変異を発現する)の突然変異体のキナーゼ活性に対してより強力な阻害作用を有することをHeinrichら(2000, Blood, Aug 1; 96(3):925-32)は記載している。結果として、この化合物は、活性化突然変異体c-kitに関係する増殖性疾患を治療するのに有用であると思われるが、リガンド活性化c-kitによって生じる疾患には有用ではない。
【０００７】
以下に詳細に記載されている方法は、それらがSCF活性化c-kitまたは突然変異体活性化c-kitであったとしても活性化c-kitを阻害することができる化合の同定に関するので、本発明は反対方向に進行する。
【０００８】
さらに、上記のように、Heinrichら、2000に提供されている結果は、本発明に関連して得られたものと異なる。本発明は、構成的に活性化されたc-kitを阻害することができる化合物の同定に関する方法を記載している。本発明者らは、この方法を用いて、STI571は野生型c-kitの阻害剤であるが、D816突然変異体などの突然変異体活性化c-kitに作用しないことを示すことができた。
【０００９】
従って、本発明の根底にある一般的な問題は、それらがSCF活性化c-kit阻害剤、構成的に活性化されたc-kit阻害剤、たはその両者であったとしてもc-kitを阻害することができる、非毒性の化合物の同定および選択を可能にするスクリーニング方法を規定することである。
【００１０】
Yongsheng MaおよびB. Longley, Feb 2000によってSU4984、SU6663、SU6577、およびSU5614などのインドリノン誘導体を対象として、c-kit阻害について試験されている。インドリノン誘導体は構成的に活性化されたKIT突然変異体を阻害し、腫瘍性の肥満細胞を死滅させる。The Society For Investigative Dermatology, 114巻、2号、392〜394。試験した化合物のうち、40μMのSU6577だけがD816突然変異体活性化c-kitの受容体リン酸化を実質的に低下することができたことがこの論文において示されている。この化合物はc-kitにも活性であるが、40μMという濃度では、問題は、D816突然変異体に対するSU6577の活性は毒性によって生じている可能性があるということである。チロシンキナーゼに対するc-kitの特異性の欠如から、このような化合物は治療目的には不適当である思われる。
【００１１】
これに関して、本発明に企図されている方法は、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の第2の試験を提供する。活性化c-kitに対して有効な候補化合物は、特異性および毒性について容易に交差試験される。
【００１２】
多数の異なる化合物、例えば、ビス型単環式、二環式、または複素環アリール化合物(国際公開公報第92/20642号)、ビニレン-アザインドール誘導体(国際公開公報第94/14808号)および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン(米国特許第5,330,992号)、スチリル化合物(米国特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物(米国特許第5,302,606号)、セレオインドール(seleoindole)およびセレニド(国際公開公報第94/03427号)、三環式ポリヒドロキシル化合物(国際公開公報第92/21660号)、ならびにベンジルホスホン酸化合物(国際公開公報第91/15495号)、ピリミジン誘導体(米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号)、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン(米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号)、ならびにビス型単環式、二環式アリール、またはヘテロアリール化合物(欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号)、キナゾリン誘導体(欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号)ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン(米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号)がチロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。
【００１３】
しかし、これらの化合物はどれも、活性化c-kitを選択的に阻害すると同時に、トランスリン酸化ドメインに作用する野生型c-kitの強力な阻害剤であり、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死を促進することができないことが証明されていない。
【００１４】
本発明者らは、トランスホスホリラーゼまたはc-kitの膜近傍ドメインを特異的に標的化することが関心対象であることを本明細書においさらに示す。実際、これらのドメインの突然変異または欠失により、構成的に活性化されたc-kitが生じる。例えば、D816突然変異体およびSCF活性化野生型c-kitに活性であると選択された化合物のうち、いくつかは非常に強力な野生型c-kit阻害剤であることが本発明に関連して見出されている。
【発明の開示】
【００１５】
説明
従って、本発明は、
a)(i)活性化c-kitおよび(ii)試験対象の少なくとも１つの化合物を、成分(i)と(ii)との複合体を形成させる条件下において接触させる段階、
b)活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c)段階b)で同定され、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞の細胞死を促進することができない、化合物のサブセットを試験および選択する段階
を含む、c-kitの選択的かつ強力な阻害剤である化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【００１６】
本発明の範囲において、「活性化c-kit」という表現は、天然のc-kit配列（配列番号：1）の点変異、欠失、挿入だけでなく改変および変更から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、構成的に活性化された突然変異体c-kitを意味する。このような突然変異、欠失、挿入、改変、および変更はトランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、およびc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインに生じてもよい。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitをも意味する。好ましい態様において、段階a)の活性化突然変異体c-kitは、Y823の近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関与する配列番号：1のアミノ酸800〜850に少なくとも１つの突然変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G突然変異体を有する。別の好ましい態様において、段階a)の活性化突然変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。このような欠失は、例えば、c-kit d(573〜579)と呼ばれるコドン573〜579のアミノ酸にある。膜近傍ドメインc-kitに近位の点突然変異V559Gもまた関心対象である。
【００１７】
スクリーニング方法は、SCF活性化野生型c-kitを阻害することができる突然変異体活性化c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおける）の阻害剤である、段階b)で同定された化合物のサブセットを試験および選択ことからなる段階をさらに含んでもよい。または、段階a)において、活性化c-kitはSCF活性化野生型c-kitである。
【００１８】
本発明の方法を実施するための最良の様式は、段階a)において10μMより高い濃度で試験することからなる。該当する濃度は、例えば、10、15、20、25、30、35、または40μMである。
【００１９】
段階c)において、IL-3は、0.5〜10ng/mlの濃度で、好ましくは1〜15ng/mlの濃度で、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地に存在する。IL-3依存的細胞の例には、増殖および生存のためにc-kitを天然に発現および依存する細胞系統が挙げられるが、これらに限定されない。このような細胞のうち、ヒト肥満細胞系統は、以下の手法を使用して確立することができる：
例えば、c-kitシグナルペプチドおよびTAG配列を含む突然変異体c-kitをコードする配列を含有するレトロウィルスベクターで正常なヒト肥満細胞を感染させ、抗体によって、造血細胞中で発現されている野生型c-kitから突然変異体c-kitを識別ことができる。
【００２０】
この技法は細胞死を誘導せず、遺伝子導入は安定で、満足な収率(約20%)を与えるので有利である。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られる血液から生じる前駆体細胞を培養することによって日常的に得ることができる。これに関しては、他の血液成分から単核細胞を単離するために、臍帯静脈のヘパリン処理した血液をFicoll濃度勾配遠心分離する。次いで、免疫磁気的な選択システムMACS(Miltenyi biotech)を使用して、CD34+前駆体細胞を上記の単離細胞から精製する。次いで、培地MCCM(L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5x10-5 Mβ-メルカプトエタノール、20%ウシ胎児血清、1%ウシ血清アルブミン、および100ng/ml組換えヒトSCFを補給したα-MEM)中で1mlあたり105細胞の濃度で、37℃、5%CO2雰囲気下においてCD34+を培養する。培地は5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合は、May-Grunwalギムザまたはトルイジンブルー着色を使用して毎週評価する。抗トリプターゼ抗体を使用しても培養物中の肥満細胞を検出することができる。10週間の培養後、肥満細胞の純粋な細胞集団(＜98%)が得られる。
【００２１】
上記のように確立した細胞系統をトランスフェクトするためのc-kitを発現するベクターを調製することは、標準的な手法を使用して可能である。ヒトc-kitのcDNAはYardenら、(1987)EMBO J.6(11), 3341-3351に記載されている。以下のオリゴヌクレオチドを使用して、c-kitのコード部分(3000 bp)をPCRによって増幅し、クローニングすることができる：
2005500041.tif 000002
PCR産物は、Not1およびXho1で消化し、T4リガーゼを使用してpFlag-CMVベクター(SIGMA)に挿入し、そのベクターをNot1およびXho1で消化し、CIP(Biolabs)を使用して脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを使用して、細菌クローンXL1-ブルーを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを使用して確認する：
2005500041.tif 000003
【００２２】
関連するカセットを使用して実施される定方向突然変異誘発は、当技術分野において既知の日常的で通常の手法を用いて実施される。
【００２３】
ベクターMigr-1(ABC)は、成熟した肥満細胞をトランスフェクトするために使用するレトロウィルスベクターを構築するための基礎として使用することができる。このベクターは、IRESの3'末端にGFPをコードする配列を含有するので有利である。これらの特徴により、フルオロサイトメーターを用いた直接的な分析を使用して、レトロウィルスが感染した細胞を選択することができる。上記のように、内因性c-kitから外因性c-kitを識別するのに有用であるFlag配列を導入するように、c-kit cDNAのN末端の配列を改変することができる。
【００２４】
使用することができる他のIL-3依存的細胞系統には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
- 野生型または突然変異型のc-kitを（膜近傍領域および触媒部位に）発現するBaF3マウス細胞は、Kitayamaら、(1996), Blood 88,995-1004およびTsujimuraら、(1999), Blood 93, 1319-1329に記載されている。
- c-kit野生型またはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら、(1996), Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93,14665-14669に提供されている。
【００２５】
IL-3依存的細胞系統は以下のようである：
- 肥満細胞性白血病患者由来の因子非依存性細胞系統であるHMC-1は、構成的なキナーゼ活性を有する膜近傍突然変異体c-kitポリペプチドを発現する(Furitsu Tら、J Clin Invest.1993; 92:1736-1744; Butterfieldら、Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia、 Leuk Res.1988 ; 12: 345-355、およびNagataら、Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92: 10560-10564)。
- P815細胞系統（814位でc-kit突然変異を天然に発現する肥満細胞腫)はTsujimuraら、(1994), Blood 83 ; 2619-2626に記載されている。
【００２６】
成分(ii)が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはエキソビボにおいて測定することができる。エキソビボにおいて測定する場合には、Y823の近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関与する配列番号：1のアミノ酸800〜850に少なくとも１つの突然変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G突然変異体を有する、活性化突然変異体c-kitを発現する調製した、または上で列記した細胞系統が好ましい。
【００２７】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を試験および選択することからなる段階をさらに含む。これは、インビトロまたはエキソビボにおいて測定することができる。c-kitを発現する細胞系統の例には、肥満細胞、トランスフェクトした肥満細胞、HMC-1、BaF3、P815、およびIC-2が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
従って、上記の方法により同定および選択される化合物は、強力で選択的かつ非毒性の野生型c-kit阻害剤である。この阻害剤は、野生型c-kitのトランスリン酸化ドメインに作用することも注目する価値がある。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、
i)上記の方法によって同定された化合物へのc-kit自己リン酸化の阻害を生じる化学基を付加する段階であって、活性化c-kitがSCF活性化野生型c-kitである段階、
ii)トランスホスホリラーゼドメインにおける突然変異体などの、上記に規定する活性化突然変異体c-kitを阻害する、段階i)で同定された化合物のサブセットを試験および選択段階、
を含む、c-kitの選択的かつ強力な阻害剤である化合物を同定するためのスクリーニング方法を意図する。
【００３０】
または、本発明によるスクリーニング方法はインビトロにおいて実施することができる。これに関しては、突然変異体活性化c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害は、免疫沈降およびウェスタンブロット法などの標準的な生化学的技法を使用して測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量が測定される。
【００３１】
さらに別の実施態様において、本発明は、
a)細胞死の程度を測定することによって、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、各々がIC50＜10μMを有する複数の試験化合物を用によって、永続的な活性化c-kitである、（例えば、トランスリン酸化ドメインに）突然変異体c-kitを発現する細胞を用いて増殖アッセイを実施する段階、
b)c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、段階a)で同定した候補化合物のサブセットにより、野生型c-kitを発現し、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞である細胞を用いて増殖アッセイを実施する段階、
c)細胞死を測定することによって、段階b)で同定した化合物のサブセットにより、c-kitを発現する細胞を用いて増殖アッセイを実施し、各々がIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを選択する段階
を含む、c-kitの阻害剤である強力かつ選択的な化合物を同定するための上記のスクリーニング方法を意図している。
【００３２】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される通常の技術である。
【００３３】
スクリーニングすることが意図されている化合物はチロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。例えば、ビス型単環式、二環式、または複素環アリール化合物(国際公開公報第92/20642号)、ビニレン-アザインドール誘導体(国際公開公報第94/14808号)および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン(米国特許第5,330,992号)、スチリル化合物(米国特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物(米国特許第5,302,606号)、セレオインドールおよびセレニド(国際公開公報第94/03427号)、三環式ポリヒドロキシル化合物(国際公開公報第92/21660号)、ならびにベンジルホスホン酸化合物(国際公開公報第91/15495号)のような多数の異なる化合物がチロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。
【００３４】
従って、本発明は、化合物が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス型単環式、二環式、または複素環アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール(seleoindoles)、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物から選択される、上記に規定するスクリーニング方法に関する。
【００３５】
本発明の方法により試験される好ましい化合物のうち、式I:
2005500041.tif 000004
(式中、Rl、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の記載に組み入れられている、欧州特許第564 409 B1号に記載されている意味を有する)のN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体などのピリミジン誘導体に焦点を絞ることが関心対象である。
【００３６】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式II:
2005500041.tif 000005
(式中、
R1、R2、およびR3は、非依存的に、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、または環式もしくは複素環式基、特にピリジル基から選択され、
R4、R5、およびR6は、非依存的に、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から選択され、ならびに
R7は、少なくとも１つの置換基を有し、アミノ官能基などの少なくとも１つの塩基性基を有するフェニル基である。)
に対応する化合物から選択される。
【００３７】
例えば、R7は、
2005500041.tif 000006
であってもよい。
【００３８】
これらの化合物のうち、好ましい化合物は以下のように規定される：
R1は複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4は、C1〜C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、ならびに
R7は、少なくとも１つの置換基を有し、例えば、基：
2005500041.tif 000007
のような、アミノ官能基などの少なくとも１つの塩基性基を有するフェニル基である。
【００３９】
このような化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載されている。
【００４０】
または、スクリーニングは、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン(米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号)、ならびにビス型単環式、二環式アリール、またはヘテロアリール化合物(欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号)、キナゾリン誘導体(欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号)、4-アミノ置換キナゾリン(米国特許第3,470,182号)、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン(米国特許第3,800,039号)、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン(米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号)、4-アニリノキナゾリン化合物(米国特許第4,464,375号)、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン(米国特許第3,551,427号)を用いて実施することができる。
【００４１】
従って、好ましくは、本発明はまた、化合物が以下のようである、上記に規定するスクリーニング方法に関する：
- ピリミジン誘導体、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
- インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン、
- 単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、または
- キナゾリン誘導体。
【００４２】
本発明はまた、活性化c-kitの選択的かつ強力な阻害剤であり、野生型c-kitの強力な阻害剤はトランスリン酸化ドメインに作用し、IL-3の存在下においてIL-3依存的細胞の細胞死を促進することができない、上記の方法によって入手可能な化合物を意図する。本発明はまた、薬剤を製造するための化合物の使用を含む。
【００４３】
本発明の有用性は、数多くの疾患に関与するc-kitおよび突然変異したc-kitを介する信号伝達の分子的な機序を詳細に記載することによりさらに明らかになる。
【００４４】
正常なc-kitの活性化によって誘導される信号伝達
SCFは、インビトロにおける造血を誘導するため、M-CSFを除くほとんど全ての造血性増殖因子と協同するので、造血における必須の増殖因子である[17]。この因子は、骨髄間質細胞によって産生され、その受容体、c-kitとの相互作用を介して作用する[18]。以前に注目されているように、c-kit受容体は、145kDaの糖タンパク質であり、分子の細胞外部分の5つのIg様ドメインの存在および細胞質内ドメインをアデノシン三リン酸(ATP)結合ドメインとホスホトランスフェラーゼドメインとに分割するキナーゼ間配列によって特徴付けられる、III型チロシンキナーゼサブファミリーに属する[1]。c-kitは、CFU-GEMM、BFU-E、ならびに肥満細胞系統の前駆細胞および成熟細胞によって強く発現される[19]。
【００４５】
c-kitにリガンドが結合すると、触媒機能が活性化され、細胞質ドメインのチロシン残基が自己リン酸化される。これらのホスホチロシン残基は、SH2ドメインを含有する種々の細胞質信号伝達分子の結合部位となる。c-kitは、PI3-キナーゼ、ras、およびJAK2に依存するものを含む、多数の増殖因子受容体に共通の正準信号伝達経路を活性化する。インビボまたはインビトロにおいてc-kitと関連することが既知の分子には、PI3-キナーゼのp85サブユニット、多数のSrcファミリーメンバー、LynおよびFyn、Vav、Grb2、SHP-1、SHP-2、PKC、MATK(CHK)、およびSocs1が挙げられるが、PLC-γ、ras(GAP)のGTPase活性化タンパク質、およびJAK2に関する異なるデータがある。別の分子もc-kitの活性化に応答して活性化またはリン酸化される：Shc、Tec、Vav GDP/GTP交換因子、raf-1、MAPK、Akt、CRKL、p120、CblおよびDoc。種々の細胞系で実施された最近の研究は、c-kitに関連し、c-kitによりリン酸化される基質に関する異なる結果を生じている。これらの矛盾は実験方法の違い、または同一のリガンド／受容体系によって媒介される別個のシグナルおよび細胞型特異的応答の基礎となると思われる、個々の細胞種の基質発現プロフィールにおける機能的に関連する差を反映している可能性がある。これらの理由から、本発明者らは、種々の細胞内容物におけるc-kit信号伝達に関して得られるデータを記載することを選択する。
【００４６】
信号伝達の最初のイニシエーターはc-kitのリガンド誘導性二量体化であり、c-kitの内因的なチロシンキナーゼ活性を誘導し、決定的なチロシン残基をトランスリン酸化する[10]。さらに、リガンド刺激に応答して、c-kitは、c-kit自己リン酸化を阻害するPKCによってセリン残基がリン酸化されると思われる[20]。
【００４７】
種々の細胞型において観察される、c-kitとの最も効率的な会合の1つは、マウスc-kitのリン酸化されたチロシン残基719またはヒトc-kitのチロシン721を介して[23]、PI3-キナーゼのp85サブユニットのSH2ドメインによって収縮される[21,22]。
c-kit信号伝達は、ヒト造血細胞、主に2つの巨核球細胞系統であるMO7eおよびCMKにおいて検討されている(以下表1)。
【００４８】
（表１）ヒトc-kitの細胞内部分と相互作用する分子および／またはSCFに応答して活性化される分子
2005500041.tif 000008
【００４９】
これらの細胞において、SCFは、それらのSH2ドメインを介して、PI3-キナーゼ、Srcキナーゼ(FynおよびLyn)およびJAK2、ならびに種々のアダプター分子、Grb2、Grap、Vav、CRKLなどの主要なキナーゼの活性化および/または補充を誘導する。これらの事象により、SH2、SH3、またはPHドメインを介して種々の分子的な会合が形成され、異なる経路の活性化を開始する。Ras経路は、SCF刺激に応答して活性化され、RasとRaf-1との間に相互作用を生じ、MAPKinaseカスケードを開始することが示された[24]。実際、アダプター分子であるGrapは、SH2ドメインを介してリガンド活性化c-kitと相互作用し、SH3ドメインを介してrasグアニンヌクレオチド交換因子であるmSos1と会合して、受容体および細胞質チロシンキナーゼからのシグナルをras信号伝達経路に接続する[25]。SH2ドメインを介して、c-kitのリン酸化されたチロシン残基と相互作用する、Grap、Grb2に関連する別のアダプター分子はc-CblおよびShcを補充することができる[26, 27]。活性化後、キナーゼはc-CblおよびCRKLと相互作用するPI3-キナーゼなどのアダプター分子の役割[28]、またはPI3-キナーゼリン酸化Aktなどのキナーゼの役割を果たすことができる[29]。まれに、相互作用および／または活性化は、任意の既知の信号伝達経路と関連させないで記載されている。これは、Tec [30]、MATK[31]、Vav [32]、およびDoc [33]の場合である。予期しなかったことに、JAK-STAT経路は、c-kit活性化にはあまり記載されていない。非チロシンキナーゼサイトカイン受容体スーパーファミリー信号伝達に必須の細胞質ゾルチロシンキナーゼであるJAK2は、リガンド活性化の前にc-kitに物理的に会合し、SCFに応答してチロシン残基がリン酸化されるか[34〜36]、またはc-kitに会合しない[30]と記載されている。また、SCFは、MO7e細胞系統のSTAT1のような細胞質ゾル転写因子を活性化する[37]。
【００５０】
c-kit信号伝達は、種々の非造血ヒト細胞系統において試験されている。Blume-Jensenらは、SCFはAktの活性化を誘導し、PI3-キナーゼ依存的な様式でBadのセリン残基136のリン酸化を媒介することを証明した[29]。胚性繊維芽細胞で実施されたインビトロ実験は、PI3-キナーゼおよびPLC-γは、ヒトc-kitのチロシン残基721との会合に関して、高い親和性を示すp85/PI3-キナーゼと競合することを示している[38]。H526細胞系統(小細胞肺癌、SCLC)では、SCFは、Src-キナーゼ、Lckの活性化およびc-kitの膜近傍ドメインとの相互作用を誘導した[39]。ヒトメラニン形成細胞系統、501 melにおいて、Hemesathらは、SCF刺激はMAPKを活性化し、小眼球症転写因子(Mi)をリン酸化し、p300/CBPとの相互作用を介してMiトランス活性化をアップレギュレーションすることを記載した[40]。
【００５１】
興味深いことに、c-kitとインテグリン信号伝達経路との相互連絡はTF-1細胞系統において観察された[94]。SCFは、フィブロネクチン接着性TF-1細胞の伝播を誘導し、SCFが存在しない場合のpp125FAKのチロシンリン酸化レベルと比較した場合、用量依存的様式でpp125FAKのチロシンリン酸化を増強する。これらの影響は、ワースマニン(worthmannin)感受性経路、インテグリン活性化感受性経路に依存する。
【００５２】
c-kit不活性化に関しては、2つの主要な経路が異なる細胞内容物において記載されている。造血細胞では、1つの経路はSHP-1、チロシンホスファターゼに関係し、c-kitのおそらく569チロシンリン酸化残基と相互作用して、c-kitのチロシン残基リン酸化状態をダウンレギュレーションする[42〜45]。ホスファターゼSHP-2(Syp)の役割はあまり明らかではない。SH2ドメインを介してMO7e細胞系統において活性化c-kitと会合するSHP-2はリン酸化され、Grb2と複合体となることが示されている[24]。Grb2とのこの結合によりras/MAPKinase経路は活性化され、細胞が増殖すると思われる。対照的に、c-kitを発現するBA/F3細胞では、c-kit Y567FへのSHP-2の会合は顕著に低下されることが示されている。この場合、SCFに対する過剰増殖応答が観察され、SHP-2はSCF誘導性増殖をダウンレギュレーションすることを示唆している[45]。
【００５３】
ヒトc-kitの活性化および不活性化はブタ内皮細胞(PAE)においても研究されている(表5)。PI3-キナーゼ、PLC-γ、およびRaf/MAPKinaseカスケードの活性化は、ヒトc-kitでトランスフェクションしたPAE細胞においてSCFに応答して記載された[46]。これらの細胞では、第1のネガティブフィードバックループは、c-kitの741および746セリン残基のリン酸化を生じるPI3-K、PLD、およびPKC経路である[47]。第2の不活性化経路は、PI3-キナーゼ誘導性PLD活性化およびホスファチジルコリン(PtdCho)特異的ホスホリパーゼD活性化、(PtdCho)-PLDであり、PKCのアクチベーターおよびアラキドン酸(D4Ach)の前駆体であるジアシルグリセロール(DAG)に代謝されるホスファチジル酸(PtdH)を形成した[48]。これらの著者らはまた、SCFは、第2のD4Ach形成経路であるPLA2活性化を誘導することを示した。
【００５４】
マウス骨髄由来の肥満細胞(BMMC)において、SCFは、i)Rac-1およびJnk経路を刺激するPI3-キナーゼ活性化[49]、ならびにii)SrcキナーゼFynのチロシン567[49]およびLyn[50]の結合およびリン酸化を誘導することが証明されている。腹腔から単離されたラット肥満細胞において、Koikeらは、SCFは、タンパク質チロシンキナーゼ経路を介し、ホスホイノシチド特異的PLC-γを活性化しないで、PLD活性化およびD4Achのその後の放出を誘導したことを示している[51,52]。これらの細胞において、Nagaiらは、SCF誘導性ヒスタミン放出に、PI3-キナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)、およびミオシン軽鎖キナーゼが関与することを示している[53]。マウス細胞におけるc-kit不活性化に関しては、SCFシグナルを低下する別の方法は、c-kit発現の発現低下である。YeeらおよびMiyazawaらは、c-kitの内部移行およびユビキチン化はc-kitの無傷のキナーゼ活性に依存することを示している[54,55]。BMMCでは、c-kitはPLC-γを活性化して、PI4,5 diPのDAGおよびイノシトール-1,4,5- triPへの加水分解を生じ、細胞内Ca++の移動を誘導する[56]。このカルシウムの流入はc-kitの内部移行に重要であると思われる。さらに、PI3-キナーゼ活性化が存在しない場合には、c-kit受容体は内部移行するが、細胞質膜の内側付近に局在化する。注目すべきは、PI3-キナーゼおよびCa++流入の両方が阻害されると、c-kitの内部移行は完全に妨害される[56]。c-kit依存的有糸分裂誘発のダウンレギュレーションの新規媒介物質はSocs-1(サイトカイン信号伝達のサプレッサー)であると考えられる[57]。SCFは、SH2ドメインを介してc-kitに結合するSocs-1の合成を誘導する。Socs-1活性の機序は、Grb2およびVavのネガティブ調節N末端との相互作用に関係すると思われる[58]。
【００５５】
c-kit突然変異に関連する分子的な機能不全
ヒトに見られるc-kit突然変異は、自己リン酸化のY823部位付近のホスホトランスフェラーゼドメインに影響する。しかし、c-kit突然変異体の分子的な機能不全に関する研究は、突然変異がc-kit代謝の種々の局面：二量体化、信号伝達、酵素発現、および内部移行を変更することを明らかにした。
【００５６】
c-kit受容体の二量体化
c-kit受容体の二量体化は信号伝達の主要な事象であり、チロシンリン酸化の前に生じる。c-kit活性化の逐次的なモデルがBlechmanらによって提案されている[58]。1価SCF結合は、受容体の迅速な二量体化を促進する受容体部位と推定される箇所を暴露し、二量体SCF分子の第2のアームの結合によってさらに安定化される。リガンド結合部位は、3つのN末端Ig様ドメインに限定されていると思われ、二量体形成は第4のIg様ドメインによって媒介されると思われる[10,58]。
【００５７】
従って、c-kitの改変はこの受容体の二量体化ドメインまたは伝達ドメインのどちらかを変更することができる。Tsujimurら[59]およびKitayamaら[60]は、SCFが存在しない場合に、構成的に活性化されたc-kitが受容体の二量体化を生じるかどうかを判定するために、種々のc-kit受容体、野生型および突然変異型変種の架橋分析を実施した。彼らは、それぞれ、4つの形態のc-kitを研究した：Ba/F3細胞に導入した、c-kit野生型、c-kitd(573-579)(コドン573〜579の欠失を有するc-kit)、c-kitV559Gまたはc-kitD814V。SCFは、c-kit野生型とSCFとの架橋したホモダイマーを含有する複合体を示す、分子量約330kDa付近において検出されるc-kit野生型のチロシンリン酸化を誘導する。SCFによる処理後、c-kit野生型と同様に、分子量330kDaのc-kitd(573-579)およびc-kitV559Gのリン酸化型が検出された。SCFが存在しない場合には、c-kitd(573-579)およびc-kitV559Gの大量のチロシンリン酸化が観察され、c-kit突然変異体の290kDaの架橋ホモダイマーに対応する。一方、SCFが存在しない場合には、構成的にリン酸化されたc-kitD814Vは、290kDaのダイマー形態としてはまれにしか検出されないが、c-kitD814VおよびSCFのホモダイマーを含有する架橋複合体を示す330kDaが、SCFによる刺激後に観察される。これらのデータは、膜近傍ドメインにおいて起こる、c-kitd(573-579)などの活性化欠失またはc-kitV559Gなどの活性化突然変異は、SCF刺激が存在しない場合にc-kitの構成的二量体化を誘導することができるが、触媒作用のあるキナーゼドメイン(c-kitD814V)における活性化突然変異は、二量体化を伴わずにc-kitの構成的な活性化を生じることを示唆している。
【００５８】
にもかかわらず、Tsujimuraらは、c-kitD814Vまたはc-kitD814Y構成的活性化の機序に関する対照的なデータを報告している[61]。実際、彼らは、細胞外ドメインを欠損しているこの変種受容体の切断型は構成的に活性化され、マウスIL-3依存的Ba/F3細胞に因子非依存的増殖を与えることができるが、野生型c-kitの同等な切断物はそうしないことを見出し、細胞外ドメインはc-kitD814Yまたはc-kitD814Vの構成的活性化に関与しないことを示唆している。さらに、これらの著者らは、c-kitD814Vはモノマー形態として機能しないことを示すデータを提供した。彼らは、細胞外ドメイン切断型c-kitD814Vは、ドミナントなネガティブ受容体である、全長の野生型受容体または、c-kitW42と同時免疫沈降するということを観察した。これらの著者らは、c-kitD814Yまたはc-kitD814Vの自己会合は、新規受容体自己会合ドメインを作製することによって、突然変異そのものから生じる可能性があることを提案した。
【００５９】
信号伝達の変更
c-kitD814Yに関しては、Piaoら[62]は、c-kit野生型またはc-kitD814Yを発現する、マウス肥満細胞系統IC2におけるこの突然変異による発癌活性化機序を検討している。
【００６０】
この細胞系統において、c-kitD814Yの発現は、c-kit野生型と比較したとき、c-kit信号伝達を変更した[62]。c-kitD814Y突然変異は、受容体自己リン酸化部位のパターン、チロシンリン酸化タンパク質のパターン、および合成ペプチド基質の突然変異受容体の選択性において観察されるように、c-kitの基質認識に変化を導入した。これは、この突然変異が、受容体チロシンキナーゼファミリー(RTK)に保存されている残基を、c-Ablを含む非受容体チロシンキナーゼファミリー(NRTK)に保存されている残基に変更するという事実に関連している。次いで、この突然変異は、NRTKの関連する基質であるグループI SH2ドメインと相互作用するように受容体の立体配座を変更すると考えられる[63,64]。1つの新規基質は、これらの著者らによって検出された130kDaのタンパク質でありうる。さらに、SHP-1はc-kitを不活性化するという事実を考慮すると、SHP-1は、c-kitD814Yを発現する細胞に存在しないので、c-kitD814Y突然変異は、SHP-1 Ub媒介性タンパク質分解速度を増加することによって、c-kit不活性化の1つの方法を変更すると思われる。実際、タンパク質分解経路のペプチド阻害剤、LLnLはSHP-1を安定化し、その分解を妨害する。従って、2つの主要の議論が、任意の増殖因子が存在しない場合のIC2/ c-kitD814Y細胞の増殖を説明できると思われる：突然変異体c-kitD814Yの構成的なキナーゼ活性およびSHP-1の分解の増強。それがなんであれ、著者らは、c-kitD814Y活性化がc-kit野生型より長いことを示唆するデータを提供していない。突然変異c-kitD814Yがc-kitの信号伝達の忠実度を変更する可能性があるという事実を議論するために、多数の内分泌新形成タイプ2B(NEM 2B)の95%に見られる、この突然変異とRetの突然変異M918Tとの平行関係に注目することができると思われる[65]。Retは、M918が高度に保存されているPDGF受容体ファミリーに属する別のチロシンキナーゼ受容体である[66,67]。興味深いことに、他のチロシンキナーゼ受容体ファミリーでは、等価なコドンにトレオニンが存在しており、M918T突然変異は、基質親和性または新たな基質の親和性の変更を誘導することを示唆している。
【００６１】
酵素機能およびc-kit突然変異
SHP-1発現はIC2/ c-kit野生型およびIC2/c-kitD814Y細胞で異なり、これはまた、マウス肥満細胞の顆粒に存在するプロテアーゼであり、肥満細胞の突然変異種々の段階において異なって発現される、MMCP-4およびMMCP-6のような他のタンパク質の場合も見られる。実際、MMCP-6転写物は、外因性SCFの存在下ではIC2/ c-kit野生型細胞において低レベルで発現され、このレベルは、c-kitD814Yの発現の結果増加する。MMCP-4転写物は、IC2/ c-kit野生型細胞においてはRT-PCRによって検出されないが、IC2/c-kitD814Y細胞では大量に発現される。野生型と突然変異体との間で観察される差は、SCFおよびにc-kitD814Yよって刺激されたc-kit野生型によって伝達される信号は等価ではなく、突然変異c-kitD814Yは、肥満細胞の増殖だけでなく、変異の段階も変更することを示唆している。
【００６２】
受容体の内部移行およびc-kit突然変異
内部移行は受容体信号伝達の弱体化機序として働くことが知られているので、内部移行シグナルのダウンレギュレーションはc-kitの活性延長に関与することができる。実際、c-kit受容体の分解の動力学に関する研究は、SCFが存在しない場合には、表面c-kitd(573-579)はわずかしか減少しないが、FMA3細胞をSCFと共にインキュベートすると、表面c-kitd(573-579)は顕著に減少することを示した。一方、活性化c-kitD814Vは、SCFが存在しない場合でも絶え間なく分解される[68]。カルシウム代謝およびPI3-キナーゼ活性はc-kit内部移行の媒介物質として記載されていたが[54〜56]、c-kitd(573-579)、c-kitV559G、またはc-kitD814Vを発現する細胞においてこれらの経路を研究することは興味深い。
【００６３】
実施例1: 方法／実験的アプローチ
第1の段階：c-kit活性化によって誘導された細胞増殖を低下または停止することができる分子を選択するための細胞増殖。本明細書においては、SCF活性化c-kitを使用する。次いで、阻害剤が、受容体c-kitに直接作用するか、またはKitシグナルの媒介物質である他のタンパク質に作用するかどうかを判定するために、これらの分子の影響を生化学的技法(免疫沈降法およびウェスタンブロット法)によって分析する。第2の段階において、IL-3の存在下において培養したIL-3依存的細胞についての細胞試験において同定した分子のサブセットを選択する。非毒性である分子が、治療に使用するための強力で特異的なc-kit阻害剤であると同定される。
【００６４】
実施例2: 細胞モデル
野生型または突然変異型のc-kitを保有する次の2種類の細胞系統が入手可能である：肥満細胞腫から誘導した系統およびBa/F3細胞モデル(IL-3依存性細胞)。Ba/F3細胞では、c-kitの発現はIL-3に対する依存性を除去する。結果として、野生型または突然変異型マウスc-kitのcDNAが導入され、野生型c-kitの場合にはSCFが存在する場合に細胞が増殖し、活性化突然変異体c-kitの場合には、任意の増殖因子が存在しない場合に細胞が増殖する。
【００６５】
細胞系統の調製：
- Ba/F3-Kit:突然変異型または野生型Kit遺伝子が導入されているBa/F3細胞。それらは、Kitリガンド(SCF)の存在下またはIL-3の存在下において増殖する。
【００６６】
膜近傍突然変異
- Ba/F3-KitΔ27(トランスフェクトした膜近傍突然変異-実験室で同定)
- Ba/F3-KitG559(トランスフェクトした膜近傍突然変異)
- FMA3(マウス肥満細胞腫において同定された欠失7aa.膜近傍)
【００６７】
キナーゼドメインの突然変異(残基814)
- 814突然変異c-kitをトランスフェクトしたIC2(内因性c-kitを発現しないマウス肥満細胞系統）
- P815(814V突然変異を保有する内因性c-kitを発現するマウス肥満細胞腫細胞系統)。
【００６８】
実施例3: 野生型c-kitおよび突然変異体活性化c-kitに対するSTI 571の研究
発癌遺伝子BCR-ABL、STI 571の阻害剤も、c-kitに関連するPDGF受容体の阻害剤である。結果として、STI 571をKitに試験した。
【００６９】
2.1 c-kitによって誘導される細胞増殖に対するSTI 571の影響(図1)
これらの実験では、阻害剤の毒性用量を決定するためにIL-3を対照として使用する。毒性レベルより低い用量において(＜10μM)、本発明者らは、STI 571は、野生型c-kitおよび膜近傍突然変異(Δ27、FMA3)の場合には、c-kitに依存して増殖を全体的に阻害するが、814突然変異を有する細胞(IC2およびP815)の増殖を阻害しないことを見出した。
【００７０】
2.2 活性化c-kitにおけるSTI-571の影響(図2)
c-kit活性化の第1の段階は、チロシン残基の受容体リン酸化からなる。従って、リン酸化状態が受容体の活性化の判定項目となる。特異的な抗体を使用することによって、c-kitは免疫沈降によって単離され、c-kitリン酸化は、通常の手法を使用して判定されている。STI 571は、野生型c-kitおよび膜近傍突然変異を有するc-kitのリン酸化を大幅に減少する。一方、814突然変異体c-kitのリン酸化はSTI 571によって低下されない。
【００７１】
結論: STI 571は野生型c-kitおよびKitの膜近傍活性化突然変異に非常に効率的な新規阻害剤であるが、それは814突然変異体c-kitを阻害しない。
【００７２】
実施例4: 37の新規有望なc-kit阻害剤の研究
本発明者らは、対象の阻害剤を選択するために、インドリノン誘導体である37の化合物を異なる細胞系統および連続スクリーニングにおいて試験した。
【００７３】
- 方法:効果的なc-kit阻害剤である化合物を選択する(表1)
各化合物を、以下を発現する細胞に対して高用量(10μM)で試験した:
- 814突然変異を有するc-kit
- SCF活性化野生型c-kit
- IL-3中で培養した対照細胞。
【００７４】
膜近傍突然変異(Δ27)の1つを有するc-kitを発現する細胞もまた対照として使用した。
【００７５】
結果: 21の化合物は814突然変異体c-kitを阻害する：6、9、 10、11、 14、16、 17、18、 19、20、 21、 26、28、 29、30、 31、 32、33、 34、35、および36。
- いくつかの化合物は、SCF活性化c-kitに対して阻害作用をほとんど有さない：7、12、13、24、25、および27):これらの化合物は結果として排除する。上記の21の化合物は、SCF活性化c-kitにおいても活性であるとして選択される。
- 10の化合物は、野生型c-kitに効率的であるが、814突然変異c-kitに効率的でない：1、2、3、4、5、8、15、22、23、および37(それらは、おそらく、c-kitのトランスリン酸化ドメインに作用しない)。
【００７６】
第2の選択: 低用量で活性である化合物を21の化合物から選択する(図3)
IC2 D814V系統の増殖を1μMで阻害することができるが、別の刺激(IL-3、毒性対照)に対する応答を維持している化合物を明らかにするために、21の阻害剤の影響を濃度を低下しながら試験した(10-10-1-10-2μM)。9の阻害剤が、興味深い増殖プロフィールを示す残り21から選択された：10、 11、 14、16、17、18、19、31、および35。
【００７７】
第3の選択: 最も効率的な化合物の同定(814突然変異に最も特異的)（図4）
選択した9の化合物を対象として、さらに狭い用量、0.1〜1μMで試験した。この段階では、より低用量で最も効率的な3つの化合物を選択した(≦0.6μM):11、14、および35。
【００７８】
化合物11番は、IL-3依存的細胞系統に弱い活性しか示さず、毒性が低いことを示したため、治療的用途に優れた候補である。
【００７９】
（表2）10μM用量の化合物の存在下における増殖試験
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表は、阻害剤が存在しない場合の増殖後に得られた割合を100%としたCPM(1分あたりの計数値)により表示されている( CPM(%)＞80＝--/50＜CPM(%)＜80＝-/20＜CPM(%)＜50＝+/5＜CPM(%)＜20＝+/CPM(%)＜5＝++)。全ての実験は、トリプリケートで実施した。
【００８０】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】低濃度における毒性(kit+IL3に対するkit D814)に対する特異性の試験を示す。これらの結果は、化合物11番は、SCFおよび突然変異体活性化c-kitを阻害するのに効率的な濃度でも非毒性であることを示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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