(57)【要約】本発明は、２〜１０００個の原子長のリンカー基に連結する１個または複数の新規反応基による、生体分子、ポリマー組成物、有機／無機分子／材料などの、その組合せを含む２つ以上のエンティティの改善された共有結合的カップリングに関する。本発明はまた、橋かけ分子の官能基が本発明の新規の反応性基である、２種以上のエンティティを結合するための二官能性橋かけ分子も考慮する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造体１〜６の１個または複数を任意の組合せで含むコンジュゲート組成物であって、
【化１】
2005532533.tif 000011
（式中、
ｎは０、１、２または３であり、
ＸおよびＹは任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
Ｘ2およびＸ3は塩素またはフッ素であり、
Ｙ2は窒素または炭素であり、
ａｒｏｍは置換されたもしくは置換されていないフェニル、ナフチルまたは他のポリマー性芳香族構造体であり、
Ｚはクロリド、フルオリド、２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドまたは他の求電子基であり、
Ｒ1〜Ｒ6は１種もしくは複数のハロゲンまたはＯ、Ｎ、Ｓｉ、ＰおよびＳからなる群から選択されるヘテロ原子を任意選択で含む２〜１０００個の原子を含有する炭化水素リンカー基を含む）
任意の組合せの前記構造体１〜６の１個または複数が、そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結されており、Ｂは
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体、
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子、
（ｃ）酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、デンドリマー、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマー、またはそれらの任意の組合せ、
（ｄ）発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、またはそれらの任意の組合せ、
（ｅ）そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって連結された１種または複数の任意の組合せの構造体１〜６、
あるいはそれらの任意の組合せである組成物。
【請求項２】
リンカー基Ｒ1〜Ｒ6が線状もしくは分枝鎖、環状またはこれらの組合せである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ1〜Ｒ6が２〜１００個の原子を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ1〜Ｒ6が２〜１０個の原子を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
構造体１を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ1が２〜１００個の原子を含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ1が２〜１０個の原子を含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
構造体１がそのリンカー基Ｒ1によってエンティティＢに連結されており、Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体、
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子、
（ｃ）酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、デンドリマー、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマー、またはそれらの任意の組合せ、
（ｄ）発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、またはそれらの任意の組合せ、
（ｅ）そのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって連結された１種または複数の構造体１〜６、
あるいはそれらの任意の組合せである請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
エンティティＢがポリマー性ミクロスフェアである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
構造体２が、そのリンカー基Ｒ2によって固体支持体Ｂに連結されており、固体支持体Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体または
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子
である請求項１に記載のコンジュゲート組成物。
【請求項１６】
固体支持体Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
構造体３が、そのリンカー基Ｒ3によって固体支持体Ｂに連結されており、固体支持体Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体または
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子
である請求項１に記載のコンジュゲート組成物。
【請求項２０】
固体支持体Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
構造体４が、そのリンカー基Ｒ4によって固体支持体Ｂに連結されており、Ｘ2が塩素もしくはフッ素であり、固体支持体Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体または
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子
である請求項１に記載のコンジュゲート組成物。
【請求項２４】
固体支持体Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
構造体５が、そのリンカー基Ｒ5によって固体支持体Ｂに連結されており、Ｘ3が塩素もしくはフッ素であり、Ｙ2が窒素または炭素であり、固体支持体Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体または
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子
である請求項１に記載のコンジュゲート組成物。
【請求項２８】
固体支持体Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
構造体６が、そのリンカー基Ｒ6によって固体支持体Ｂに連結されており、芳香族基であるａｒｏｍは置換されたもしくは置換されていないフェニル、ナフチルまたは他の多環式芳香族環であってよく、固体支持体Ｂが
（ａ）２−Ｄフィルムもしくは基体または
（ｂ）有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子
である請求項１に記載のコンジュゲート組成物。
【請求項３２】
固体支持体Ｂがポリマー性ミクロスフェアである請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ポリマー性ミクロスフェアが、少なくともその表面上にポリスチレン／ジビニルベンゼンおよびカルボキシル官能基を含む請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ミクロスフェアが、異なった識別可能なモル量の１種または複数の蛍光染料をさらに含む請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
（ａ）そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結された任意の組合せの１個または複数の構造体１〜６を有する請求項１に記載の１種または複数のコンジュゲート組成物を提供するステップと、
（ｂ）２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ；
を含む１種または複数の求核体含有エンティティを提供するステップと、
（ｃ）前記１種または複数のコンジュゲート組成物と前記１種または複数の求核体含有エンティティとを反応させて、１種または複数の構造体１〜６のリンカー基によって、前記１種または複数の求核体含有エンティティに連結された少なくとも１種のエンティティＢを作製するステップ
を含む２種以上のエンティティを一緒にカップリングする方法。
【請求項３６】
（ａ）請求項１に記載の前記構造体１〜６の任意の組合せの１個または複数が、前記エンティティＢの作製の前に、前記エンティティＢにコンジュゲートされる、
（ｂ）請求項１に記載の前記構造体１〜６の任意の組合せの１個または複数が、前記エンティティＢの作製の間に、前記エンティティＢにコンジュゲートされる、または
（ｃ）請求項１に記載の前記構造体１〜６の任意の組合せの１個または複数が、前記エンティティＢの作製の後に、前記エンティティＢにコンジュゲートされる
請求項１に記載の組成物の合成方法。
【請求項３７】
（ａ）ｎが０、１、２または３であり、
（ｂ）ＸおよびＹが任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
（ｃ）ＺおよびＲ1がクロリド、フルオリド；２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド；Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；および同様の求電子基、またはそれらの任意の組合せである請求項１に記載の構造体１を、
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ；
を含む１種または複数の求核体含有エンティティと反応させて、少なくとも１種の他のエンティティと架橋した１種または複数の求核体含有エンティティを提供することを含む、１種または複数の求核体含有エンティティを少なくとも１種の他のエンティティと架橋させる方法。
【請求項３８】
そのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって一緒に結合した、２種以上の請求項１に記載の構造体１〜６を任意の組合せで含む橋かけ基組成物であって、前記結合が任意の組合せの１つまたは複数の末端−末端型、分枝型または樹枝型のものである組成物。
【請求項３９】
（ａ）請求項３８に記載の１種または複数の橋かけ基組成物を提供し、
（ｂ）２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ；
を含む１種または複数の求核体含有エンティティを提供し、
（ｃ）前記１種または複数の橋かけ基組成物と前記１種または複数の求核体含有エンティティを反応させて、少なくとも２種の架橋した求核体含有エンティティを作製する、２種以上の求核体含有エンティティの架橋方法。
【請求項４０】
そのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって、１種または複数の求核基にコンジュゲートされた、任意の組合せで請求項１に記載の１種または複数の構造体１〜６を含む橋かけ基組成物であって、２種以上の構造体１〜６が一緒に結合している場合、これらの構造体は、そのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって結合しており、前記結合が任意の組合せの１つまたは複数の末端−末端型、分枝型または樹枝型のものである組成物。
【請求項４１】
１種または複数の求核体含有エンティティと請求項１に記載の１種または複数の構造体１〜６でコンジュゲートされた１種または複数のエンティティの架橋方法であって、
（ａ）請求項４０に記載の１種または複数の橋かけ基組成物を提供すること、
（ｂ）請求項１に記載の１種または複数の組成物を提供すること、
（ｃ）２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ；
を含む１種または複数の求核体含有エンティティを提供すること、および
（ｄ）前記１種または複数の橋かけ基組成物を前記１種または複数の求核体含有エンティティおよび請求項１に記載の１種または複数の組成物を反応させて、少なくとも２種の架橋したエンティティを作製すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
（関連出願の相互引用）
本出願は２００１年１１月１４日出願の米国仮出願番号第６０／３３１，３１２号に対する優先権を主張するものである。その開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、２〜１０００個の原子長のリンカー基に連結した１個または複数の新規反応基による、生体分子、ポリマー組成物、有機／無機分子／材料など、およびその組合せを含めた２つ以上のエンティティの改善された共有結合的カップリングに関する。
【背景技術】
【０００３】
エンティティ（酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、化学発光性化合物、デンドリマー、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、膜（合成または天然）、フラーレン、ナノチューブなど）の固定化は活性化された固体表面との単純な共有結合反応によって実施できる。例えば、粒子（例えばミクロスフェアおよびナノスフェア；任意の大きさ、形状または組成を有する１種もしくは複数の金属を含む金属粒子；半導体粒子、分子インプリントポリマー（ＭＩＰＳ）、磁性粒子；または着色材料）またはマイクロタイタープレートは固定化システムにおける、一般的な固体マトリックスである。活性のある官能化された表面の調製と保持は、高感度アッセイを開発するための十分な生物学的材料の確実な固定化に重要な要素である。現在の固体表面への生体分子の固定化手順では、活性化アミノ基もしくはカルボキシル基誘導固体表面とアミノもしくはチオール修飾生体分子との反応を用いる。活性化後、または官能化スペーサの導入後、これらの基は直接結合部位を提供する。ほとんどの官能基（ＮＨＳエステル、イソチオシアナートなど）は水性雰囲気で加水分解しやすく、１時間足らずで活性でなくなる（すなわち化学的に不活性化される）。
【０００４】
反応性ミクロスフェアまたは官能化ミクロスフェアは、通常適切に官能化されたモノマーの共重合、または予備形成されたミクロスフェアの後化学修飾によって製造される。後官能化はＵｐｓｏｎ（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｓｙｍｐ．１９８５年、７２，４５）によって先に述べられているように反応性粒子を調製するための一般的な方法である。
【０００５】
タンパク質、オリゴヌクレオチドなどの生体巨大分子のアフィニティクロマトグラフィー、固相合成および固定化の分野における、ここ３０年間での進歩によって、ミクロスフェアに基づいた生物医学的応用分野がもたらされた。様々な特製の粒子の製造と評価に関するより最近の研究が、Ｍａｒｇｅｌら（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９１年、Ａ−２９、３４７〜３５５頁；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８１年、１２８、３４２〜３５０頁）、Ｕｇｅｌｓｔａｄら（Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７９年、第１８０巻、７３７〜４４頁；Ａｄｖ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．１９８０年、１３，１０２〜１４０頁）およびＲｅｍｂａｕｍら（Ｂｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９７８年、１０、２７５〜２８０頁；Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．１９７９年、Ａ−１３、６０３〜６３２頁）を含む複数のグループによって報告されていた。Ｒ．Ａｒｓｈａｄｙによる総説（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９３年、１４、５〜１５頁）には、反応性があり、かつ標識化したミクロスフェアの合成および物理化学的特性が記載されている。
【０００６】
蛍光性ミクロスフェアに基づいた多重分析のためのアッセイが複数のグループ（ＦｕｌｔｏｎらのＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、４３、１７４９〜５６頁；ＫｅｔｔｍａｎらのＣｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９８年、３３、２３４〜４３頁；ＭｃＤａｄｅらのＭｅｄ．Ｄｅｖ．Ｄｉａｇ．Ｉｎｄｕｓｔ．１９９７年、第１９巻４号、７５〜８２頁；ＭｃＨｕｇｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４年、４２、５７５〜９５頁；ＮｉｋｉｆｏｒｏｖらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１９９４、２２、４１６７〜７５頁；米国特許第６，４４９，５６２号；同５，９８１，１８０号、同６，０４６，８０７号、同６，０５７，１０７号、同６，２６８，２２２号、同６，３６６，３５４号、同６，４１１，９０４号、同５，７３６，３３０号、同６，１３９，８００号）によって報告されている。
【０００７】
Ｆｒａｙらは、粒子を加水分解耐性のあるアルデヒド官能基で予備活性化する戦略を報告しているが、これらのミクロスフェアでは＜８％の低い反応収率が観察されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９年、１０、５６２〜７１頁）。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．のＭｉｌｔｏｎは、室温でのフッ化アシル活性化ポリマー表面とアミノ誘導生体分子との反応を報告している（米国特許第６，１４６，８３３号、２０００年１１月１４日）。アミド、ペプチド、ヒドロキサム酸、アミン、ウレタン、カーボネート、スルホンアミドとα置換カルボニル化合物の固相合成におけるフルオロフェニル樹脂の使用が公開されている（国際特許出願第９９／６７２２８号）。
【０００８】
Ｍｅｄｖｅｄｋｉｎらは、ペプチド合成でスルホ−テトラフルオロフェニル活性化エステルを使用し、水性貯蔵条件下での良好な安定性と相まったその反応性を実証している（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１９９５年、第２１巻９号、６８４〜９０頁）。本出願以前には明らかに、この薬品によるポリスチレン表面の予備活性化はまだ報告されていない。
【０００９】
Ｈｏｅｃｈｓｔは１９５０年（西ドイツ特許第ＤＢＰ９６０，５３４号）に、セルロース繊維と羊毛繊維を染色するための反応性ビニルスルホン（ＶＳ）修飾染料の使用を特許請求している。Ｓｉｅｇｅｌによる総説で、ビニルスルホン（ＶＳ）ならびに保護された２−スルファトエチルや２−チオスルファトエチルスルホン系の反応性染料の全般的な説明がなされている（Ｅ．Ｓｉｅｇｅｌ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｅｓ  第ＶＩ巻、（Ｅｄ．Ｋ  Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ）；２−１０８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７２年）。Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｗｉｎｔｈｒｏｐ  ＩｎｃはＰＥＧ−支持ビニルスルホンを用いたタンパク質の修飾を実証している（米国特許第５，４１４，１３５号）。
【００１０】
生体分子（オリゴヌクレオチド、タンパク質または炭化水素など）を蛍光性ミクロスフェア上に固定化するために最も頻繁に使用される方法は、表面のカルボキシ基を活性化することによるものである。活性化は、過剰のＥＤＣとカップリングｐＨ４〜６を必要とする。反応は、カルボジイミドとカルボキシル基の間での、活性化されたＯ−アシル尿素誘導体の中間形成を伴う。続く生体分子のアミノ基の第一窒素による求核的攻撃により、置換された尿素の放出を伴ってアミド結合が形成される。Ｏ−アシル尿素生成の最適ｐＨは約ｐＨ４〜５である。中間体の半減期は非常に短く、中間体は急速に加水分解を受ける、あるいは転移してＮ−アシル尿素付加体を生成する。求核試薬の第一アミノ基は約ｐＨ４〜５で大部分プロトン化され、したがってほとんど反応性がない。これらの制約によりカップリング収率が大幅に制限される。核酸塩基は低いｐＨで強いプロトン化を受ける。この種のプロトン化はらせん体の疎水性核を暴露するＤＮＡの融解を誘発し、固体マトリックスとの非特異的な疎水性相互作用を増進させる。これらの欠点にも関わらず、ＥＤＣ媒介カップリングは現在、生体分子の固体表面への共有結合固定化の主要な方法である（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎ．Ｙ．１９９６年；Ａｎｄｒｅａｓ  ＦｒｅｙらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９年、１０、５６２〜７１頁；Ｍａｘｉｍｅ  Ａ．ＧｉｌｌｅｓらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０年、１８４、２４４〜４８頁；Ｖｉｖｉｅｎ  Ｗ．Ｆ．ＣｈａｎらのＢｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．、１９８８年、第１５１巻２号、７０９〜１６頁；Ｉｖａｎ  Ｌ．ＶａｌｕｅｖらのＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９８年、１９、４１〜４３頁）。
【００１１】
上記および本出願を通しての様々な参考文献の引用は、これらの参考文献が本発明の従来技術を構成することを是認するものではない。しかし、引用した参考文献のそれぞれを、その全体で参照として本出願に組み込む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、１種または複数の「新規反応基」（構造体１〜６）による、生体分子、ポリマー組成物、有機および／または無機の分子および／または材料などの２種以上のエンティティ（Ｂ、Ｂ’等）の共有結合的カップリング（covalent coupling）のための、少なくとも部分的に、改善された方法と組成物に基づいている。本明細書で提供する説明や実施例は、本発明の範囲の制限をなんら意図するものではない。
【００１３】
【化１】
2005532533.tif 000003
【００１４】
本発明では、エンティティであるＢ、Ｂ’等は、これらに限定されないが、ガラス、石英、モノマー、ポリマー、デンドリマー、ＭＩＰＳ、膜、金属、クレー、珪藻土、粒子（着色または非着色）、粒子（磁性または非磁性）、粒子（ミクロスフェアもしくはナノスフェア）、フラーレン、ナノチューブ、生体分子、発色団、発蛍光団、化学発光性化合物、半導体粒子、半導体ナノ結晶（量子ドット）、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、有機体、バクテリア、ウイルス、またはそれらの任意の組合せを含む。エンティティＢ、Ｂ’等は、同一であっても異なっていてもよく、かつ官能化されていてもいなくてもよい。
【００１５】
本発明の新規反応基はリンカー（Ｌ）によってエンティティＢ、Ｂ’等にコンジュゲートされており、Ｌはｎ個（例えば２〜１０００個）のＨ、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓの原子を線状、分枝もしくは環状鎖またはこれらの組合せで有する炭化水素リンカーである。
【００１６】
いくつかの実施態様では、１種または複数のエンティティＢ、Ｂ’等は、求核体含有エンティティ、すなわちこれらはヒドロキシル、アミン、チオール等の基を含む、あるいはエンティティはそうした基にコンジュゲートされている。このような場合、新規反応基の結合は、１種または複数の構造体１〜６の求電子性反応基と、エンティティ上またはエンティティ内に含まれる求核基を化学反応させることによって実行される。そうした化学反応には、これらに限定されないが、当分野の技術者に知られている求核的付加または、求核体をベースとした反応の、置換および／または転位が含まれる。
【００１７】
非限定的な例示としては、本発明の反応は、２つのエンティティＢおよびＢ’を、１種または複数の構造体１〜６で架橋させる反応である。任意の求核体もしくは求電子体含有基をＡ、Ａ’等と称する。ここで、Ａおよび／またはＡ’は、それぞれ、本発明で考察する新規反応基またはその組合せ、および／または求核体（例えば、アルコール、アミン、チオール等）である。ＡおよびＡ’は同一または異なっている新規反応基、および／または同一または異なっている求核体であってよい。ＢおよびＢ’は同一エンティティであっても、かつ／または異なったエンティティであってもよい。可能性のあるそうした要素のいくつかの組合せを以下に考察する。
【００１８】
１つの実施形態では、１つのエンティティＢであるポリマー性ミクロスフェアは、求電子反応基のそれぞれのリンカーＲ1〜Ｒ6によって、構造体１〜６のうちの１つの求電子反応基でコンジュゲートされている。第２のエンティティＢ’である半導体ナノ粒子は、その表面で求核基でコンジュゲートされている。直接的な求核置換反応はリンカーによるＢとＢ’の結合をもたらす。
【００１９】
ＡおよびＡ’がどちらも構造体１〜６の新規反応基またはそれらの組合せである、ＢとＢ’を結合する反応のさらに他の実施形態では、二官能性リンカーまたは橋かけ分子を使用して、２種以上のエンティティを共有結合的にカップリングさせる。１つのそうした実施形態では、リンカーの二官能性は求核的である（例えば、アミン、チオール等）。言い換えれば、橋かけ分子は、ＢおよびＢ’がＡおよびＡ’のリンカーアームと橋かけ分子の合体した長さで結合するように、その１つがＡおよびＡ’のそれぞれと反応する２種以上の求核基を含む。
【００２０】
さらに他の実施形態では、ＢおよびＢ’はどちらも求核体であるＡおよびＡ’をそれぞれ含む。この実施形態では、２種以上のエンティティをカップリングするために、二官能性リンカーまたは橋かけ分子を用いる。ここで、リンカーまたは橋かけ分子の二官能は、その基が同一であっても異なっていてもよい新規反応基である１種または複数の構造体１〜６の新規求電子性反応基である。橋かけ分子は、構造体１〜６のそれぞれの求電子性反応基のリンカーＲ1〜Ｒ6の自由末端基の結合によって構築されてもされなくてもよい。これらの要素の反応にしたがって、ＢおよびＢ’は共有結合的にそれぞれの求核基に結合する二官能性橋かけ分子によって結合される。この実施形態の他の形では、ＡおよびＡ’がどちらも求核体である場合、Ｃおよび／またはＣ’が求核体ＡおよびＡ’と反応することが既知である１種または複数の官能基（例えば、ＮＨＳエステル、イソチオシアナート、スルホニルクロリド等）である、二官能性リンカーまたは橋かけ分子を、２種以上のエンティティをカップリングするために用いる。ＣおよびＣ’は、１種または複数（ｎ）の構造体１〜６の新規の求電子性反応基（ｎは新規求電子性反応基の数である）によってリンカーまたは橋かけ分子に結合している、同一でも異なっていてもよい官能基である。
【００２１】
具体的には、本発明は構造体１〜６の１個または複数を任意の組合せで含む新規のコンジュゲート組成物であって、
【化２】
2005532533.tif 000004
その際、式中、
ｎは０、１、２または３であり、
ＸおよびＹは任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
Ｘ2およびＸ3は１種もしくは複数のハロゲン、好ましくは塩素またはフッ素であり、
Ｙ2は窒素または炭素であり、
ａｒｏｍは置換されたもしくは置換されていないフェニル、ナフチルまたは他のポリマー性芳香族構造体であり、
Ｚはハライド、好ましくはクロリドもしくはフルオリド、２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドまたは他の求電子（離核性）基であり、
Ｒ1〜Ｒ6は１種もしくは複数のハロゲンまたはＯ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓからなる群から選択されるヘテロ原子を任意選択で、線状もしくは分枝鎖、環またはそれらの組合せで含む２〜１０００個の原子を含有する炭化水素リンカー基である、
その際、さらに、任意の組合せの構造体１〜６の１個または複数は、そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結されており、Ｂが
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、デンドリマー、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマー、またはそれらの任意の組合せ；
発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、またはそれらの任意の組合せ；
そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって連結された１種または複数の任意の組合せの構造体１〜６、あるいはそれらの任意の組合せ
である組成物を対象とする。
【００２２】
さらに他の実施態様では、本発明は、Ｒ1〜Ｒ6が２〜１００個の原子を含む、より好ましくはＲ1〜Ｒ6が２〜１０個の原子を含む上記の新規組成物を対象とする。
【００２３】
本発明は、上記の構造体１〜６を含む組成物であって、Ｒ1〜Ｒ6が２〜１０００個の原子、好ましくは２〜１００個の原子を含む線状もしくは分枝鎖、環またはこれらの組合せで１種または複数のハロゲンまたはＯ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓからなる群から選択されるヘテロ原子を任意選択で含有する炭化水素リンカー基を含む、あるいはより好ましくはＲ1〜Ｒ6が２〜１０個の原子を含む組成物も包含する。
【００２４】
本発明は、Ｂがポリマー性ミクロスフェアまたはナノスフェアである上記の組成物も対象とする。より好ましい実施態様は、ポリマー性ミクロスフェアが少なくとものその表面上に、ポリスチレン／ジビニルベンゼンおよび／またはカルボキシル官能基をさらに含むものであり、さらに好ましい実施態様は識別できる割合で１種または複数の蛍光染料をさらに含むミクロスフェアである。
【００２５】
上記のように、好ましい実施態様では、本発明は官能化ミクロスフェアに関する。原核細胞もしくは真核細胞、遺伝子組み換え細胞、有機体、バクテリア、ウイルス、プラスミド、発現ベクター、酵素、タンパク質、融合タンパク質、抗体、キメラ抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む生体分子を固定化するその能力に関して、ポリスチレンベースのミクロスフェアで一連の反応性官能基を評価した。活性化されたオキソカーボン酸（例えばモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ:mono-fluoro squaric acid））、テトラフルオロ−スルホフェニルエステル（ＴＦＳ）、ビニルスルホン（ＶＳ）、ジハロキノキサリン、スルホニルフルオリド、ハロゲン化シアヌル、ハロピリミジンは、これらが（ａ）生体分子の求核基と自発的に反応する、（ｂ）水性媒体中で実質的に改善された安定性を示す、（ｃ）生体分子と安定したコンジュゲートを形成する、（ｄ）追加の活性剤を必要とせず、かつ（ｅ）より特異的なコンジュゲーションを提供し（すなわち、固体基体との非特異的相互作用／結合が低減される）、それによって生体分子の完全性を保護できるので、生体分子の固定化に対して改善された性能を示す。
【００２６】
さらに他の実施態様では、新規反応基は、最初に生体分子に結合され、次いで求核基含有固体支持体にカップリングされてよい。固体表面への生体分子のカップリング収率を改善することを目的としたリンカー系も開示する。
【００２７】
具体的には、そのそれぞれのリンカー基であるＲ1〜Ｒ6によって、少なくとも１種のエンティティＢに連結された任意の組合せの１個または複数の構造体１〜６を有する上記の１種または複数のコンジュゲート組成物を提供するステップと、
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体（半導体、半導体ナノ結晶、磁性粒子を含む）、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せ
を含む１種または複数の求核体含有エンティティを提供するステップと、１種または複数のコンジュゲート組成物と前記１種または複数の求核体含有エンティティとを反応させて、１種または複数の構造体１〜６のリンカー基によって、前記１種または複数の求核体含有エンティティに連結された少なくとも１種のエンティティＢを作製するステップとによって２種以上のエンティティを一緒にカップリングする方法を対象とする。
【００２８】
他の実施態様では、本発明は、エンティティＢの作製の前、エンティティＢの作製の間に任意の組合せの１種または複数の構造体１〜６をコンジュゲートする、エンティティＢの作製の後にエンティティＢにコンジュゲートする、上記組成物の合成方法も包含する。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施態様は、
（ａ）ｎが０、１、２または３であり、
（ｂ）ＸおよびＹが任意の組合せで酸素および／または硫黄であり、
（ｃ）ＺおよびＲ1がハロゲン（クロリド、フルオリドを含む）；２，３，５，６−テトラフルオロ−４−スルホ−フェノキシド；Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；および同様の求電子基、またはそれらの任意の組合せである上記の構造１の組成物を、
２−Ｄフィルムもしくは基体；
有機ポリマー、ＭＩＰＳ、ガラス、金属、クレー、樹脂、珪藻土、ゼオライト、無機結晶体、半導体粒子、半導体ナノ結晶、磁性粒子、フラーレン、ナノチューブ、またはそれらの任意の組合せからなる任意の大きさもしくは形状のミクロ粒子もしくはナノ粒子；
酵素、抗体、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ＰＮＡ、炭化水素、脂肪酸、レクチン、ペプチド、受容体、発色団、発蛍光団、生物発光性もしくは化学発光性化合物、ＪもしくはＨ凝集体、細胞、バクテリア、ウイルス、すべての原核生物もしくは真核生物、合成膜もしくは天然膜、ビオチン、ハプテン、有機モノマーもしくはポリマーまたはデンドリマー、あるいはそれらの任意の組合せを含む１種または複数の求核体含有エンティティと反応させて、
架橋した１種または複数の求核体含有エンティティを提供する方法を対象とする。
【００３０】
さらに他の実施態様では、本発明は、２種以上のエンティティを互いに結合するための橋かけ分子の生成における構造体１〜６の使用、あるいは橋かけ分子として１種または複数の構造体１〜６を含む組成物を対象とする。本発明の様々な実施態様は、そのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって、末端基−末端基という形、分枝鎖、または樹枝という形で結合した２種以上の構造体１〜６からなる多官能性橋かけ分子を含む。そうした橋かけ分子を、求核的付加もしくは置換などの直接的な化学反応、または当分野の技術者に知られている他の任意の化学反応によって、求核基を有する２種以上のエンティティを共有結合的に互いに結合するために用いることができる。
【００３１】
さらに本発明の他の変形態様では、官能基が、構造体１〜６のうちの１種または複数のものであり、かつ１種または複数の求核基である多官能性橋かけ分子を提供する。求核基を有するエンティティが構造体１〜６の橋かけ基の官能基と反応し、構造体１〜６を有するエンティティが求核性橋かけ基の官能基と反応して、互いに結合した２種以上のエンティティをもたらす求核的付加もしくは置換などの直接的な化学反応によって、そうした橋かけ分子を、求核基を有する１種または複数のエンティティと、１種または複数の構造体１〜６にコンジュゲートされた１種または複数のエンティティとを共有結合的に互いに結合するために用いることができる。
【００３２】
そうした多官能性橋かけ基の組成物も考慮する。任意の組合せの１種または複数の構造体１〜６が、そのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって、１種または複数の求核基にコンジュゲートされる橋かけ基組成物を想定する。ここで、２種以上の構造体１〜６が結合する場合、これらはそのそれぞれのリンカー基Ｒ1〜Ｒ6によって互いに結合され、その結合は１種または複数の末端−末端型、分枝型または樹枝型の任意の組合せである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
６．１官能基
現在のカップリング方法に欠点（安定性の欠如または水性媒体中で自発的に生体分子と反応できないこと、あるいはその両方）があるので、本発明者らは、生体分子の固定化のために、加水分解耐性があって使用し易い、予備活性化ミクロスフェアを導入することを決心した。表１は、そうした新規反応性ミクロスフェアの一部を非限定的に示す一覧表である。
【００３４】
スルホニルフルオリドは水性雰囲気でスルホニルクロリドより安定であることが知られており（表１、１ａ〜１ｄ）、芳香族タイプのものは脂肪族のその対応物と比較してより安定である。ポリスチレンミクロスフェアの表面上にスルホニルフルオリドを合成するために、酸または酸クロリドから出発する複数の経路が用いられてきた（表１、２ａ〜２ｅ）。
【００３５】
環状オキソカーボン酸（三角状、四角状、五角（クロコン）状、六角（ロジゾン）状）は環の中に２個の酸相当物と１〜４個のカルボニル基を有している。本発明者らは酸相当物のうちの一方を、環を我々のリンカー分子の１つに結合させるのに使用し、他方を活性化させて反応性誘導体とした。ミクロスフェア誘導の四角酸を合成するための複数の経路を表１（３ａ〜３ｅ）に示す。得られた活性化ビーズはアミン含有分子との反応性が非常に高く、乾燥されていれば、長期間ベースで保存することができる。この種の反応基は、染料と生体分子を活性化させるために、ＮＨＳエステルなどに換えて使用することもできる。
【００３６】
フッ化シアヌルは、フッ素原子をアミンの窒素原子に置き換えて最大３当量のアミンと反応することができる。本発明者らはフッ化シアヌルがミクロスフェア（表１、４）と結合している１当量のアミンリンカーと反応したミクロスフェアを単離した。第２および第３のフッ素はなお生体分子との反応に使用できる。塩化シアヌル、２，４，６−トリクロロピリミジンまたは２，４，６−トリフルオロピリミジンなどの関連した分子も同様に用いられる。
【００３７】
ビニルスルホン（ＶＳ）ミクロスフェアはジビニルスルホンをヒドロキシ、アミノもしくはチオール基含有ミクロスフェアと反応させて作製した（表１、５ａ〜５ｂ）。残余のビニル部分はチオールとアミンの両方との反応に使用できる。この基は加水分解の影響をより受けにくいが、アミンとの反応のためには塩基性のｐＨが必要である。表１、５ｃに示すように、ビニルスルホン（ＶＳ）基をチオ硫酸ナトリウムと反応させることによって、長期間の保存の際の酸化からビニルスルホン（ＶＳ）基を保護することができる。ビニル部分は約ｐＨ９〜１０で再生される。
【００３８】
従来のカップリング化学反応用のＮ−ヒドロキシサクシニミドに対する、加水分解耐性のある代替品としてペルフルオロ化されたフェノールを開発した。本発明者らはテトラフルオロ−フェノールスルホン酸をカルボン酸基と直接ミクロスフェアの表面上（表１、６）、またはリンカー分子の末端で反応させた。フッ素原子は離脱し易い基を有する部分を提供し、スルホン酸は、水中にそれを分散させるのに必要な、ミクロスフェアの表面上の電荷を維持する。
【００３９】
６．２．リンカー
官能化ミクロスフェアの全体的な性能は、ミクロスフェア電荷、架橋密度、位置、官能基の到達性及び化学的安定性並びにリンカー基の長さ、電荷及び性質などのいくつかのパラメータによって制御される。
【００４０】
リンカーは生体コンジュゲーションにおいて重要な役割を果たす。これらは、その長さだけでなくその化学的性質にも基づいて選択される。リンカーの全体的な性質は薬剤の周囲の全体的な親水性または疎水性を左右することが知られている。拡大したリンカーが検体と固体マトリックスとの間の立体障害を低減できることはよく理解されている。
【００４１】
上記の官能基をミクロスフェアに結合するために複数の異なるクラスのリンカーが用いられる。これらのリンカーの例を表２に示す。
【００４２】
エチレングリコールをベースとしたリンカー（表２、１〜３）は親水性表面の安定性を改善するのに知られている表面修飾剤である。ＣＨ2をＣＦ2で置き換えることによってさらなる安定性が確保される。
【００４３】
ジアミンとヒドラジドは疎水性表面を提供することが知られている（表２、５〜８）。ポリエチレンアミン（表２、９）はミクロスフェアの表面電荷を制御するのに用いられる「プロトンスポンジ」効果を示す。ポリアミドとポリスルホンアミド（表２、１０〜１３）は約１〜２のｐＫａを有する酸性プロトンを含む。したがって、これらのリンカーは生理学的なｐＨでポリアニオンを提供し、それによって長期保存安定性がもたらされる。デンドリマーすなわち高度に分枝したリンカー（表２、１４）は、十分定義された形態構造に適合することが知られており、反応基に１種のカプセル化をもたらし、これによって反応基を加水分解から保護する。ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）リンカー（表２、１５）は多カルボキシレート体を提供する。この種のリンカーは安定した金属錯体を形成することが知られている。固定化の程度を改善するためにポリアクリル酸およびポリシラン鎖（表２、１６〜１７）を導入することができる。
【００４４】
６．３．具体的な応用例
本発明の具体的な応用例を以下に示す。これらの実施例は本発明の範囲をなんら限定しようとするものではない。
【００４５】
実施例６．３．１
この実施例は、非限定的に、生体分子の共有結合的固定化のための官能化または予備活性化されたミクロスフェアの使用に関する。
（ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
（ｂ）固体支持体が１種または複数の蛍光染料を識別できる割合で含む固体支持体（ａ）。
（ｃ）少なくとも表面のカルボキシル基が４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンリンカーで修飾されている固体支持体（ｂ）。
（ｄ）リンカーが修飾されている、かつ／または新規反応基モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）を含む固体支持体（ｃ）。
（ｅ）第一アミン末端を含む生体分子、特にはオリゴヌクレオチドプローブ。
（ｆ）安定した共有結合を形成するための、固体支持体（ｄ）と生体分子（ｅ）の自発性共有結合カップリング。
（ｇ）単一または多重ＤＮＡアッセイでの生体分子カップリング固体支持体（ｆ）の使用。
【００４６】
実施例６．３．２
この実施例は、非限定的に、生体分子の共有結合的固定化のための官能化または予備活性化されたミクロスフェアの使用に関する。
（ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
（ｂ）固体支持体が識別できる割合で１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ａ）。
（ｃ）少なくとも表面のカルボキシル基がシスタミンリンカーで修飾されている固体支持体（ｂ）。
（ｄ）リンカーが修飾されている、かつ／または新規のビニルスルホン（ＶＳ）反応基を含む固体支持体（ｃ）。
（ｅ）第一アミンまたはチオールを含む生体分子、特に抗体。
（ｆ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｄ）と生体分子（ｅ）の自発性共有結合カップリング。
（ｇ）単一または多重免疫アッセイにおける生体分子カップリング固体支持体（ｆ）の使用。
【００４７】
実施例６．３．３
この実施例は、非限定的に、生体分子の共有結合的固定化のための官能化または予備活性化されたミクロスフェアの使用に関する。
ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｂ）固体支持体が識別できる割合で１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ａ）。
ｃ）新規のテトラフルオロ−スルホフェニルエステル（ＴＦＳ）反応基を含有するためにカルボキシル基が修飾されている固体支持体（ｂ）。
ｄ）第一アミンを含む生体分子、特に抗原。
ｅ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｃ）と生体分子（ｄ）の自発性共有結合カップリング。
ｆ）単一または多重免疫アッセイにおける生体分子カップリング固体支持体（ｅ）の使用。
【００４８】
実施例６．３．４
この実施例は、非限定的に、予備活性化生体分子の共有結合的固定化のための固体表面の使用に関する。
ａ）石英を含み、かつ少なくともその表面上にヒドロキシル官能基を含有する二次元固体支持体。
ｂ）少なくとも表面ヒドロキシル基がアミノプロピル−トリエトキシシラン、アミノ末端シランリンカーで修飾されている固体支持体（ａ）。
ｃ）新規反応基モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）を含むために末端が修飾されている生体分子、特にオリゴヌクレオチド。
ｄ）安定した共有結合形成するための固体支持体（ｂ）と生体分子（ｃ）の自発性共有結合カップリング。
ｅ）単一または多重ＤＮＡアッセイにおける生体分子カップリング固体支持体（ｄ）の使用。
【００４９】
実施例６．３．５
この実施例は、非限定的に、半導体ナノ粒子の共有結合的固定化のための官能化または予備活性化されたミクロスフェアの使用に関する。
ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｂ）新規のビニルスルホン（ＶＳ）反応基を含有するためにカルボキシル基が修飾されている固体支持体（ａ）。
ｃ）１つまたは複数の識別できる蛍光発光または蛍光波長を有する１種または複数の半導体ナノ粒子。
ｄ）粒子の少なくとも表面上に少なくともチオール官能基を有する半導体ナノ粒子（ｃ）。
ｅ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｂ）と半導体ナノ粒子（ｄ）の自発性共有結合カップリング。
ｆ）解読のための単一多重アッセイにおける半導体ナノ粒子カップリング固体支持体（ｅ）の使用。
【００５０】
実施例６．３．６
この実施例は、非限定的に、リンカーまたは２粒子間の架橋を用いた官能化または予備活性化ナノスフェアへの、官能化または予備活性化ミクロスフェアの共有結合カップリングに関する。
ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｂ）新規のモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）反応基を含むためにカルボキシル基が修飾されている固体支持体（ａ）。
ｃ）新規のモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）反応基が二官能性リンカー４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミンで修飾されている固体支持体（ｂ）。
ｄ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ナノスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む第２の固体支持体。
ｅ）新規のモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）反応基を含むためにカルボキシル基が修飾されている固体支持体（ｄ）。
ｆ）識別できる割合で１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ｅ）。
ｇ）安定した共有結合を形成するためのミクロスフェア固体支持体（ｃ）とナノスフェア固体支持体（ｆ）の自発性共有結合カップリング。
ｈ）解読のための単一または多重アッセイでのナノスフェアカップリングミクロスフェア固体支持体（ｇ）の使用。
【００５１】
実施例６．３．７
この実施例は、非限定的に、デンドリマーの共有結合的固定化のための官能化または予備活性化されたミクロスフェアの使用に関する。
ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｂ）識別できる割合で固体支持体が１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ａ）。
ｃ）新規のテトラフルオロ−スルホフェニルエステル（ＴＦＳ）反応基を含むためにカルボキシル基が修飾されている固体支持体（ｂ）。
ｄ）第一アミン官能基を含むデンドリマー。
ｅ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｃ）とデンドリマー（ｄ）の自発性共有結合カップリング。
ｆ）リンカーの両末端に新規反応基モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）を含有する二官能性リンカーによるデンドリマーカップリング固体支持体（ｅ）の修飾。
ｇ）第一アミンを含む生体分子、特に抗体。
ｈ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（Ｆ）と生体分子（ｇ）の自発性共有結合カップリング。
ｉ）単一または多重免疫アッセイにおける生体分子カップリング固体支持体（ｈ）の使用。
【００５２】
実施例６．３．８
この実施例は、非限定的に、新規のリンカーによるミクロスフェアへの生体分子の共有結合カップリングに関する。
ａ）少なくともその表面上にカルボキシル官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｂ）識別できる割合で固体支持体が１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ａ）。
ｃ）少なくとも表面のカルボキシル基が、リンカー鎖中に少なくとも１種または複数の四角酸官能基を含む新規の二官能性アミン末端リンカーで修飾されている固体支持体（ｂ）。
ｄ）１つの末端に新規のテトラフルオロ−スルホフェニルエステル（ＴＦＳ）反応基を含む生体分子、特にオリゴヌクレオチドプローブ。
ｅ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｃ）と生体分子（ｄ）の自発性共有結合カップリング。
ｆ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を含む、核酸をベースとしたアッセイでの生体分子カップリング固体支持体（ｅ）の使用。
【００５３】
実施例６．３．９
この実施例は、非限定的に、官能化または予備活性化発蛍光団を用いた生体分子の共有結合標識化に関する。
ａ）新規反応基モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）を含むために官能化され、修飾されかつ／または合成された発蛍光団。
ｂ）第一アミンを含む生体分子、具体的にはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンなど。
ｃ）安定した共有結合を形成するための生体分子（ｂ）と予備活性化発蛍光団（ａ）の自発性共有結合標識化。
ｄ）少なくともその表面上にビオチン官能基を含む、ポリマー性ミクロスフェア、好ましくはポリスチレンジビニルベンゼンを含む固体支持体。
ｅ）識別できる割合で固体支持体が１種または複数の蛍光染料を含む固体支持体（ｄ）。
ｇ）発蛍光団標識化生体分子（ｃ）がリポーター分子として使用される、単一または多重アッセイにおける固体支持体（ｅ）の使用。
【００５４】
実施例６．３．１０
この実施例は、非限定的に、固体表面上への共有結合固定化のための官能化または予備活性化生体分子の使用に関する。
ａ）１種または複数の金属を含む固体支持体。
ｂ）チオール官能基を含むために、固体支持体が自己組織化された単層（ＳＡＭ）で修飾されている固体支持体（ａ）。
ｃ）１つの末端で新規反応基ビニルスルホン（ＶＳ）を含むために修飾されかつ／または合成された生体分子、特にオリゴヌクレオチド。
ｄ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｂ）と生体分子（ｃ）の自発性共有結合カップリング。
ｅ）ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を含む、単一または多重核酸をベースとしたアッセイにおける生体分子カップリング固体支持体（ｄ）の使用。
【００５５】
実施例６．３．１１
この実施例は、非限定的に、発蛍光団の共有結合固定化のための官能化または予備活性化粒子の使用に関する。
ａ）１種または複数の金属を含む固体支持体粒子。
ｂ）新規の官能基モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）を含有するために固体支持体が修飾されている固体支持体（ａ）。
ｃ）アミンとクエンチャー分子を含むＪもしくはＨ凝集体発蛍光団。
ｄ）安定した共有結合を形成するための固体支持体（ｂ）と発蛍光団（ｃ）の自発性共有結合カップリング。
ｅ）単一または多重アッセイにおけるリポーターとしての発蛍光団標識化粒子（ｄ）の使用。
【００５６】
７．０．新規反応基の調製のための合成手順の例
本発明の態様は組成物、ポリマー粒子を用いたコンジュゲートおよび／または混合物、種々のリンカー、官能基を調製するための材料や手順を含む。これらのリンカーと官能基を以下に記す。（５．０）表面官能基およびスペーサの合成手順、（５．１）新規反応基の評価、（５．２）カップリング手順の例である。本明細書で提供されるこれらの説明は本発明をなんら制限するものではない。
【００５７】
７．０．１．スルホニルクロリド
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをスルホニルクロリド基で活性化する方法を説明する。
【００５８】
１００μＬ（約１１０万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、遠心分離を用いて１３，４００×ｇで１分間、脱イオン水２５０μＬで１回、メタノール２５０μＬで３回、ベンゼン２５０μＬで３回洗浄して、ペレット化し、２０秒間の音波処理でミクロスフェアを再懸濁した。最後にこれらをベンゼン２５０μＬ中に懸濁し、チオニルクロリド５０μＬを加え、ミクロスフェアを４０℃で２時間加熱した。次いで、ミクロスフェアをベンゼン２５０μＬで２回洗浄し、減圧下（＜５トール）で２時間乾燥した。これをカリウム７−アミノ−１，３−ジスルホニルナフタレンのピリジン２００μＬの溶液に懸濁し、室温で４時間保持した。次いでこれらをピリジン２５０μＬで２回、脱イオン水２５０μＬで４回、メタノール２５０μＬで２回、ベンゼン２５０μＬで２回洗浄し、チオニルクロリド５０μＬとジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２５μＬのベンゼン溶液２５０μＬに懸濁し、室温で２０分間、４０℃で１時間保持した。続いて、反応性ミクロスフェアをベンゼン２５０μＬで１回、アセトニトリル２５０μＬで３回洗浄し、アセトニトリル中に使用時まで保存した。ここで説明した手順を表１の記入項１ｃに図示する。
【００５９】
７．０．２．スルホニルフルオリド
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをスルホニルフルオリド基で活性化する方法を説明する。
【００６０】
３００μＬ（３２０万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、ミクロスフェアをペレット化するために１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、音波処理で２０秒間ミクロスフェアを再懸濁して、脱イオン水５００μＬで２回、メタノール５００μＬで２回、ベンゼン５００μＬで２回洗浄した。ミクロスフェアをチオニルクロリド５０μＬのベンゼン２５０μＬ中への溶液に懸濁し、４０℃で２時間保持した。次いで、これらをベンゼン５００μＬで３回、アセトニトリル５００μＬで２回洗浄し、続いてアセトニトリル５００μＬ中のカリウム７−アミノ−１，３−ジスルホニルナフタレン１２ｍｇの溶液に懸濁し、室温で振とう機にかけた。１４時間後、ミクロスフェアをアセトニトリル５００μＬで２回洗浄した。ミクロスフェアをフッ化シアヌル１５μＬとピリジン２０μＬを含有するアセトニトリル溶液中に懸濁し、−１５℃で１４時間保持し、続いてアセトニトリル５００μＬで３回洗浄した。ミクロスフェアをアセトニトリル１ｍＬ中に懸濁し保存した。ここで説明した手順を表１の記入項２ｂに図示する。
【００６１】
７．０．３．モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例では、アジピン酸ジヒドラジドをリンカーとして用いて、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをモノ−フルオロ四角酸基で活性化する方法を説明する。
【００６２】
３００μＬ（３２百万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、ミクロスフェアをペレット化するために１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、音波処理で２０秒間ミクロスフェアを再懸濁して、０．０１％トゥイーン（Tween）２０と０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む５００μＬの溶液で３回洗浄した。次いで、ミクロスフェアを３２ｍｇ／ｍＬのＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）と２ｇ／ｍＬのＥＤＣ、０．０１％トゥイーン２０および０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む５００μＬの溶液中に懸濁し、光を遮断した回転ミキサーに２時間かけた。ミクロスフェアを水５００μＬで３回、メタノール５００μＬで３回、ベンゼン５００μＬで３回洗浄した。次いで、ミクロスフェアをベンゼン５００μＬ中に懸濁し、ジブトキシシクロブテンジオン１μＬを加えた。熱振とう機上で２５℃で１４時間振とう後、ミクロスフェアをベンゼン５００μＬで３回、メタノール５００μＬで３回、５００μＬ脱イオン水で３回洗浄した。ミクロスフェアに１Ｍの水酸化ナトリウム溶液５００μＬを加えた。次いで、ミクロスフェアを６０℃で２時間熱振とう機にかけた。次いでこれらをメタノール５００μＬで洗浄してミクロスフェアを回収した。次いで、ミクロスフェアを２Ｍの塩酸溶液５００μＬで洗浄した。メタノールを加えミクロスフェアを回収した。次いで、ミクロスフェアをメタノール５００μＬで３回、アセトニトリル５００μＬで３回洗浄した。次いで、ミクロスフェアをアセトニトリル５００μＬ中に懸濁した。フッ化シアヌル１５μＬとピリジン２０μＬの溶液を加え、ミクロスフェアを−１５℃で１４時間保存した。次いで、ミクロスフェアをアセトニトリル５００μＬで３回洗浄した。ミクロスフェアをアセトニトリル１ｍＬに懸濁し保存した。ここで説明した手順を表１の記入項３ｃに図示する。
【００６３】
７．０．４．フッ化シアヌル
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、１，６−ジアミノヘキサンをリンカーとして用いて、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをフッ化シアヌルで活性化する方法を説明する。
【００６４】
３００μＬ（３２百万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、ミクロスフェアをペレット化するために１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、音波処理で２０秒間ミクロスフェアを再懸濁して、０．０１％トゥイーン２０と０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含有する溶液５００μＬで３回洗浄した。続いてこれらを、３２ｍｇ／ｍＬの１，６−ジアミノへキサンと２ｇ／ｍＬのＥＤＣ、０．０１％トゥイーン２０および０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む溶液５００μＬ中に懸濁し、光を遮断した回転ミキサーに２時間かけた。続いて、ミクロスフェアを水５００μＬで３回、メタノール５００μＬで３回、アセトニトリル５００μＬで３回洗浄した。次いで、ミクロスフェアをアセトニトリル５００μＬ、トリメチルアミン２０μＬ、フッ化シアヌル１５μＬを含む溶液中に懸濁し、−１５℃で１４時間置いた。最後にこれらをアセトニトリルで３回洗浄した。ミクロスフェアをアセトニトリル１ｍＬに懸濁し保存した。ここで説明した手順を表１の記入項４に図示する。
【００６５】
７．０．５．ビニルスルホン（ＶＳ）
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、２−アミノエタンチオールをリンカーとして用いて、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをビニルスルホン（ＶＳ）で活性化する方法を説明する。
【００６６】
３００μＬ（３２百万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、ミクロスフェアをペレット化するために１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、音波処理で２０秒間ミクロスフェアを再懸濁して、５００μＬの０．０１％トゥイーン２０を含む０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で３回洗浄した。続いて、ミクロスフェアを、１６ｍｇ／ｍＬ溶液のシステアミンと３０ｍｇ／ｍＬ溶液のＥＤＣとの０．０１％トゥイーン２０、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中の５００μＬ溶液に懸濁し、光を遮断した回転ミキサーに２時間かけた。ミクロスフェアを水５００μＬで３回、５００μＬの０．１Ｍ塩化ナトリウム／０．１Ｍ酢酸ナトリウムの緩衝液（ｐＨ４．５）で３回洗浄した。ミクロスフェアを０．１Ｍ酢酸ナトリウム／０．１Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中の１１ｍｇ／ｍＬ溶液のジチオスレイトール（ＤＴＴ）の５００μＬ溶液に懸濁して、結合されたシステアミン基のジスルフィド結合を還元した。ミクロスフェアを回転ミキサーに３０分間かけ、続いて、メタノール５００μＬで３回洗浄した。次いでこれらをジクロロメタン５００μＬ中に懸濁し、ビニルスルホン（ＶＳ）５μＬを加えた。回転ミキサーで１４時間攪拌後、メタノール５００μＬを加え、ミクロスフェアを回収し、メタノール５００ｍＬで３回洗浄した。ミクロスフェアをメタノール１ｍＬに懸濁し保存した。ここで説明した手順を表１の記入項５ｂに図示する。
【００６７】
７．０．６．保護されたビニルスルホン
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、上記実施例の活性化ポリスチレンミクロスフェアをより加水分解耐性のある形態に転換する方法を説明する。
【００６８】
実施例５．０．５によって調製されたミクロスフェアを、チオ亜硫酸ナトリウム３ｍｇ、０．０１％トゥイーン２０およびリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を含む８００μＬの溶液中に１４時間懸濁した。ミクロスフェアを脱イオン水５００μＬで３回洗浄した。ミクロスフェアを脱イオン水１ｍＬ中に懸濁し保存した。ｐＨ９〜１０の緩衝液で最初に処理しない限り、ミクロスフェアは求核体と反応しない。ここで説明した手順を表１の記入項５ｃに図示する。
【００６９】
７．０．７．テトラフルオロスルホ−フェニルエステル（ＴＦＳ）
生体分子を固定化できる活性化表面の調製方法を本発明によって以下に説明する。具体的には、以下の実施例で、カルボキシル化ポリスチレンミクロスフェアをテトラフルオロスルホフェニルエステルで直接的に活性化する方法を説明する。
【００７０】
３００μＬ（３２百万個のミクロスフェア）のカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア溶液（５．５μｍ）を、ペレット化するために１３，４００×ｇで１分間遠心分離し、音波処理で２０秒間ミクロスフェアを再懸濁して、０．０１％トゥイーン２０と０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む５００μＬの溶液で３回洗浄した。次いで、これらを２４ｍｇ／ｍＬの２，３，５，６テトラフルオロフェノール−４−サルフェート（Ｇｅｅ，Ｋ．Ｒ．らの手順、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、第４０巻、１４７２〜１４７４頁によって２，３，５，６テトラフルオロフェノールから合成した）、２２０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ、０．０１％トゥイーン２０および０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を含む５００μＬの溶液に懸濁し、次いで、光を遮断した回転ミキサーに２時間かけた。ミクロスフェアを脱イオン水５００μＬで３回洗浄した。ミクロスフェアを脱イオン水１ｍＬに懸濁し保存した。ここで説明した手順を表１の記入項６に図示する。
【００７１】
７．１．新規反応基評価の例
種々の新規反応性官能基のポリスチレンミクロスフェアに対する反応性を定量化するために、ビオチン−アミン誘導体を用いた簡単なアッセイを開発した。まず、一般的なＥＤＣ媒介法を用いて、ビオチン−ＬＣ−ＰＥＯ−アミン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより入手）をカルボキシル化ミクロスフェアにカップリングさせ、続いてストレプトアビジン−ＰＥと反応させた。ビオチン−アミンとストレプトアビジン−ＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手）の両方の最適濃度を滴定した。このカップリングアッセイは、新規の反応性官能基で修飾されたミクロスフェアの反応性を測定し比較する「標準」をもたらした。ビオチン−アミンを直接反応させ続いてストレプトアビジン−ＰＥと反応させて、修飾されたミクロスフェアを評価した。ミクロスフェアを緩衝液（ｐＨ６、４℃）中またはドライ状態のどちらかで保存し、設定した間隔（例えば、日、週、月等）でビオチン−ＬＣ−ＰＥＯ−アミンアッセイを実施して官能基安定性を評価した。
【００７２】
我々の試験結果によれば、新規反応基は非常に望ましい特性を示している。例えば、新規反応基は求核的化合物との良好な反応性を示し、水性媒体中で実質的に改善された安定性を有し、安定したコンジュゲートを形成し、追加の活性化剤（例えば、ＥＤＣおよび／またはＮＨＳエステル）を必要とせず、かつより特異的なコンジュゲーション（すなわち、固体基体との非特異的相互作用／結合を低減する）を提供し、したがって生体分子の完全性を保護することができる。
【００７３】
７．１．１．カップリング反応性および再現性
ＥＤＣ媒介カップリング法とモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）修飾ミクロスフェアを比較する加速安定性試験を３５０相当日数にわたって実施した。ビオチン−アミンモデルアッセイを用いると、２つの方法は互いに匹敵する反応性を示した。結果は、モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）修飾ミクロスフェアが、より再現性のあるカップリングを毎日提供することも示している。図１に示すように、ＥＤＣカップリング法は、実験全体を通して２０％のカップリングの変化を示している。３５０相当日数の間、モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）修飾ミクロスフェアは活性をある程度徐々に失っているが、試験の最後で８０％の活性を保持している（すなわち、活性の最も大きな変化は３５０相当日数の最後で示されている）。保存手順の改善によって、修飾ミクロスフェアのどんな活性損失も無くすことが期待される。
【００７４】
７．１．２．安定性
新規反応基で修飾されたミクロスフェアは水性媒体中で実質的に改善された安定性を有する結果を示している。図２はビニルスルホン（ＶＳ）官能化ミクロスフェアの緩衝液中での少なくとも３０日間の安定性の例を示す。これはＥＤＣおよびＮＨＳ試薬と比べて実質的に改善されているが、反応性と安定性との間にはトレードオフの関係があるので、修飾されたミクロスフェアの長期間保存（例えば、６カ月、≧約６カ月、６カ月超、６〜９カ月、６カ月〜１年、６カ月〜２年等を含む）のための、様々な乾燥および保存方法も評価した。図３〜６は乾燥保存条件安定性試験の例を示す。本試験で用いたものに対して優れた水分バリアを提供する保存容器は、活性の経時的な損失を防止することになる。
【００７５】
７．１．３．バイオアッセイ
実際のアッセイでＣＯＯＨミクロスフェアＥＤＣ法と比較した修飾されたミクロスフェアの性能を評価した。図７はアミノ修飾されたＤＮＡプローブのＣＯＯＨ−官能化ミクロスフェア（ＥＤＣ媒介反応）と予備活性化ミクロスフェア法に対するカップリング滴定を示す。カップリング滴定はどちらも２５℃で実施した。アッセイのためのＤＮＡ補充目標濃度は５５℃のハイブリダイゼーション温度で２０ｆモルであった。ＣＯＯＨ−ＥＤＣ方法はミクロスフェアにカップリングされているプローブの量に対して非線形の応答をもたらす結果となっている。予備活性化ミクロスフェアプローブ滴定はより線形であり、これはプローブのより特異的なカップリングを示唆している。どちらも再現性のある結果である。注記：予備活性化ミクロスフェアのためには２５℃が最適カップリング温度ではない。カップリング温度ならびに他のパラメータを最適化することによってシグナルの改善が見込まれる。
【００７６】
７．２カップリング手順の実施例
７．２．１．ビオチン−ＬＣ−ＰＥＯアミン
表面修飾されたミクロスフェアをリン酸塩緩衝液（ｐＨ６、１００ｍＭ）で３回洗浄しカウントした。２．５×１０7個のミクロスフェアを一定分量とり、リン酸塩緩衝液（ｐＨ８、１００ｍＭ）で１回洗浄した。リン酸塩緩衝液（ｐＨ８、１００ｍＭ）中で、ＰＥＯ−ＬＣ−ビオチン−アミン（１７．４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。１００μＬのこの溶液を９００μＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ８、１００ｍＭ）中のミクロスフェアに加えた。この懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。反応が完了した後、ミクロスフェアをＰＢＳ−ＴＢＮ（リン酸塩緩衝液による生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．０２％トゥイーン２０および１ｇ／Ｌウシ血清アルブミンを有する）で３回洗浄し、再度カウントした。１００，０００個ミクロスフェア／ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮの懸濁液を１μｇのストレプトアビジン−ＰＥと室温で１時間反応させた。続いて、ミクロスフェアを３回洗浄し１ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮ中に再懸濁させた。ミクロスフェアの蛍光強度をＬｕｍｉｎｅｘ１００（商標）装置で分析した。
【００７７】
７．２．２．ビオチン化したＩｇＧ
２５×１０6個の表面修飾ミクロスフェアの懸濁液を１ｍＬ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９、１００ｍＭ）で洗浄した。ＩｇＧの１ｍＬの溶液（０．１ＭのｐＨ９炭酸塩緩衝液中に５０μｇ／ｍＬ）をミクロスフェアに加え、ボルテックスし、音波処理して３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、サンプルを１ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮ（０．０２％トゥイーン２０および１ｇ／Ｌウシ血清アルブミンを有するリン酸塩を緩衝液とした生理食塩水（ｐＨ７．４））で洗浄した。１００，０００個ミクロスフェア／ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮの懸濁液を１μｇのストレプトアビジン−ＰＥと室温で１時間反応させた。続いて、ミクロスフェアを３回洗浄し１ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮ中に再懸濁させた。ミクロスフェアの蛍光強度をＬｕｍｉｎｅｘ１００（商標）装置で分析した。
【００７８】
７．２．３．ビオチン化したオリゴヌクレオチド
５×１０6個の表面修飾ミクロスフェアを１．５ｍＬの遠心分離管中にとり、１ｍＬの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９、１００ｍＭ）で洗浄した。５０μＬの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９、１００ｍＭ）をミクロスフェアに加えた。１μＬのアミノ修飾オリゴヌクレオチド１ｍＭ溶液を加え、懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。１時間後、サンプルをＰＢＳ−ＴＢＮで洗浄した。１００，０００個ミクロスフェア／ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮの懸濁液を１μｇのストレプトアビジン−ＰＥと室温で１時間反応させた。続いて、ミクロスフェアを３回洗浄し１ｍＬのＰＢＳ−ＴＢＮ中に再懸濁させた。ミクロスフェアの蛍光強度をＬｕｍｉｎｅｘ１００（商標）装置で分析した。
【００７９】
当分野の技術者は、通常の実験を用いるだけで、本明細書で記述した本発明の具体的な実施形態と同等の多くのものを認識する、または確認できることであろう。そうした同等のものは以下の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【００８０】
【表１】
2005532533.tif 000005
2005532533.tif 000006
2005532533.tif 000007
2005532533.tif 000008
【００８１】
【表２】
2005532533.tif 000009
2005532533.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＣＯＯＨ−官能化ミクロスフェアであるＥＤＣカップリング方法（Ａ）とモノフルオロ四角酸官能化ミクロスフェア（ＭＦＳ）（Ｂ）の比較を時間にわたって（２５℃で加速）示す図である。新規の予備活性化ミクロスフェア（Ｂ）は日々にわたって標準のＥＤＣ媒介反応（Ａ）より再現性のあるカップリングを提供している。
【図２】緩衝液、ｐＨ６に４℃で保存したビニルスルホン（ＶＳ）官能化ミクロスフェアの安定性試験を示す図である。
【図３】ドライ状態で保存したモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）官能化ミクロスフェアの加速安定性試験を示す図である。
【図４】図３で示す時間より長くドライ状態で保存したモノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）官能化ミクロスフェアの加速安定性試験を示す図である。
【図５】ドライ状態で保存したテトラフルオロ−スルフェニルエステル（ＴＦＳ）官能化ミクロスフェアの加速安定性試験を示す図である。
【図６】ドライ状態で保存したビニルスルホン（ＶＳ）官能化ミクロスフェアの加速安定性試験を示す図である。
【図７】（Ａ）ＣＯＯＨ−官能化ミクロスフェア（ＥＤＣ媒介反応）法と（Ｂ）モノ−フルオロ四角酸（ＭＦＳ）官能化ミクロスフェア（自発反応）法でのアミノ官能化ＤＮＡプローブのカップリング滴定を示す図である。カップリング滴定はどちらも２５℃で実施した。アッセイのためのＤＮＡ補完目標濃度は５５℃のハイブリダイゼーション温度で２０ｆモルであった。ＣＯＯＨ−ＥＤＣ法（Ａ）はミクロスフェアにカップリングされたプローブの量に対して非線形の応答をする。モノ−フルオロ四角酸官能化ミクロスフェアのプローブ滴定（Ｂ）はより線形である。これらの結果は再現性があり、より特異的なカップリングの結果の可能性がある。注記：２５℃はモノ−フルオロ四角酸官能化ミクロスフェアに対する最適のカップリング温度ではない。全てのパラメータを最適化することによってシグナルの改善が見込まれる。
【図１】
2005532533.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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