(57)【要約】  本発明は、新規なサイクリン依存性キナーゼの阻害剤（ｃｄｋｓ）及び、限定されないが、特に、ｃｄｋ/サイクリン複合体の阻害剤に関する。本明細書に記載されているように、本発明の阻害剤は、細胞周期の仕組みを阻害することができ、その結果、細胞周期の進行を調節し、最終的には、細胞の成長及び分化をコントロールするのに有用かもしれない。そのような化合物は、細胞の過増殖にかかわる疾患に罹患している被験者を治療するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式Ｉによって表される構造を有する、化合物：
【化１】
2005511535.tif 000037
式中、Ｗは、Ｏ又はＮＲ”であり、
Ｘは、それぞれ個別に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩのようなハロゲンであり、
Ｙは、Ｈ又はＸであり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又は金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ2は、Ｒ１及びＲ２のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない、メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、
ｎは、１〜５の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基である。
【請求項２】
Ｘは、すべての場合においてＣｌである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ”は、Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｍは、それぞれ個別に、ＣＨ２、又はＷに付着している場合、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、もしくはＣ（＝Ｏ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ｎは、Ｒ１にｎが存在する場合は２〜４の整数であり、Ｒ２にｎが存在する場合は１〜３の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｑは、ジアルキルアミンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｑは、置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物は、下記式Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2005511535.tif 000038
【請求項９】
薬学的に許容される添加剤及び請求項１に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を動物に投与することを含む、高増殖性障害の治療方法。
【請求項１１】
細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を請求項１に記載の化合物に接触させることを含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法。
【請求項１３】
前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１以上の化学療法又は放射線治療と合わせて請求項１に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、化学療法又は放射線治療によって誘発された脱毛症を治療又は予防する方法。
【請求項１５】
異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式ＩＩによって表される、化合物：
【化３】
2005511535.tif 000039
式中、Ｗ及びＺは、独立してＯ又はＮＲ”であり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又は金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ5は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ６は、Ｒ５及びＲ６のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｒ７は、それぞれ個別に、ハロゲン、メチルなどの低級アルキル、又はメトキシなどの低級アルコキシルであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない、メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、
ｎは、１〜５の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基である。
【請求項１６】
Ｒ”は、Ｈである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｍは、それぞれ個別に、ＣＨ２、又はＷに付着している場合、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、又はＣ（＝Ｏ）である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
ｎは、Ｒ５にｎが存在する場合は２〜４の整数であり、Ｒ６にｎが存在する場合は１〜３の整数である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｑは、ジアルキルアミンである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｑは、置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、下記式Ｅ〜Ｑより選択される、請求項１５に記載の化合物。
【化４】
2005511535.tif 000040
【請求項２３】
薬学的に許容される添加剤及び請求項１５に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１５に記載の化合物を動物に投与することを含む、高増殖性障害の治療方法。
【請求項２５】
細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を請求項１５に記載の化合物に接触させることを含む方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載された化合物を哺乳動物に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法。
【請求項２７】
前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
１以上の化学療法又は放射線治療と合わせて請求項１５に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、化学療法又は放射線治療によって誘発された脱毛症を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害剤として有用な化合物、それを含む薬学的組成物、癌及び増殖性疾患の治療のためのその使用、及びそれを製造するための中間体及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学における最も重要かつ基本的なプロセスの１つは、細胞周期によりもたらされる細胞分裂である。このプロセスは、定められた生物学的機能をもつ次世代の細胞の生成を確実にコントロールする。それは、高度に調節された現象であり、細胞内及び外部のソースの双方からの多様な細胞シグナルに反応する。腫瘍が遺伝子の生成を促進及び抑制する複雑なネットワークは、この細胞シグナルプロセスの重要な要素である。腫瘍促進要素の過剰発現又はそれに続く腫瘍抑制生成物の損失は、調節されない細胞増殖及び腫瘍の生成を導くだろう（Pardee、Science 246:603-608、1989）。サイクリン依存性キナーゼは、細胞周期の仕組みを調節する上で重要な役割を果たす。これらの複合体は、触媒サブユニット（キナーゼ）及び調節サブユニット（サイクリン）の２つの要素からなる。これまで複数の調節サブユニット（サイクリンＡ〜Ｈ、Ｋ、Ｎ及びＴ）とともに、９つのキナーゼサブユニット（サイクリン依存性キナーゼ１〜９）が確認されている。各キナーゼは、特異的な調節パートナーと関連し、それと一緒に活性触媒部分を作る。細胞周期の各遷移期は、特定のサイクリン依存性キナーゼ複合体:サイクリン依存性キナーゼ２/サイクリンＥ、サイクリン依存性キナーゼ４/サイクリンＤ１及びサイクリン依存性キナーゼ６/サイクリンＤ２によるＧ１１Ｓ；サイクリン依存性キナーゼ２/サイクリンＡ及びサイクリン依存性キナーゼ１/サイクリンＡによるＳ/Ｇ２；サイクリン依存性キナーゼ１/サイクリンＤによるＧ２/Ｍによって調節される。これらのキナーゼの調和された活性は、複製プロセスによって個別の細胞を導き、それぞれの次世代の存続を確実にする（Sherr、Cell 73:1059-1065、1993； Draetta、Trends Biochem. Sci. 15:378-382、1990）。
【０００３】
腫瘍の発生とサイクリン依存性キナーゼに関連する機能不全との間の関係を示す証拠が増えてきた。サイクリン調節蛋白質及び続くキナーゼの機能亢進が複数のタイプの癌と関連付けられた（Jiang、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9026-9030、1993；Wang、Nature 343:555-557、1990）。より最近では、サイクリン依存性キナーゼの内因性の、高度に特異的な蛋白質阻害剤が、細胞の増殖に大きな影響を有していることがわかった（Kambら、Science 264:436-440、1994; Beach、Nature 336:701-704、1993）。これらの阻害剤としては、ｐ１６ＩＮＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４／Ｄｌの阻害剤）、ｐ２１ＣＩＰ１（一般的なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤）、及びｐ２７ＫＩＰ１（特異的なサイクリン依存性キナーゼ２／Ｅ阻害剤）があげられる。サイクリン依存性キナーゼ２／Ａに結合したｐ２７の最近の結晶構造から、これらの蛋白質がどのようにしてサイクリン依存性キナーゼ複合体との多数の相互作用を介して、キナーゼ活性を阻害するかが明らかになった（Pavletich、Nature 382:325-331、1996）。これらの蛋白質は、対応するサイクリン依存性キナーゼ複合体との特異的な相互作用を介して、細胞周期の調節を助長する。これらの阻害剤が欠乏している細胞は、調節されない成長や腫瘍形成を起こしやすい。この一連の証拠をもとに、治療物質としてのｃｄｋファミリーの小分子阻害剤の多くの研究が行われるようになった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼとして既知のクラスの酵素の潜在的な阻害剤である化合物を記載している。本発明は、治療的有効量の、本発明の化合物又は薬学的に許容される塩又はそのプロドラッグの少なくとも１つを投与することによって、癌及びその他の増殖性疾患を治療する方法を提供する。本発明はさらに、本発明の化合物および別の抗癌剤又は抗増殖剤のうちの少なくとも１つの治療的に有効な組み合わせを投与することによって、癌又はその他の増殖性疾患を治療する方法を提供する。
【０００５】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体及び式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される、治療的有効量の化合物、又は薬学的に許容可能なその塩を含む、新規な薬学的組成物を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、癌又はその他の増殖性疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とするホストに対して、治療的有効量の、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩の形態を投与することを含む方法を提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、癌又はその他の増殖性疾患を治療する方法であって、そのような治療を必要とするホストに対して、治療的有効量の（ａ）式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩の形態；及び（ｂ）抗癌剤及び抗増殖剤から選択される少なくとも１つの化合物を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
本明細書に記載されているところによれば、本発明の阻害剤は、細胞周期の仕組みを阻害することが可能であり、その結果、細胞周期の進行を調整し、最終的には細胞の成長及び分化をコントロールする際に有用であるだろう。そのような化合物は、癌、乾癬、好ましくない白血球増殖に関与した免疫障害のような過剰な細胞増殖に関連した障害を持つ被験者の、再狭窄及び他の平滑筋細胞障害の治療などに有用であるだろう。そのような化合物はまた、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）の転写の阻害にも有用であるだろう（Wangら、J. Virology 75:7266-7279 （2001））。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、新規なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ｃｄｋ）、特に、限定されないがｃｄｋ/サイクリン複合体の阻害剤に関する。本明細書に記載されているところによれば、本発明の阻害剤は、細胞周期の仕組みを阻害することができ、その結果、細胞周期の進行を調整し、最終的には細胞の成長及び分化を制御するのに有用かもしれない。そのような化合物は、過剰な細胞増殖に関連した障害を持つ被験者の治療、例えば、癌、乾癬、好ましくない白血球増殖に関与した免疫障害の治療、再狭窄及び他の平滑筋細胞障害の治療などに有用であるだろう。以下において、より詳細に説明する。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式Ｉ（化１）によって表される、化合物を提供する。
【化１】
2005511535.tif 000002
式中、Ｗは、Ｏ又はＮＲ”であり、
Ｘは、それぞれ個別に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩのようなハロゲンであり、好ましくはＣｌであり、
Ｙは、Ｈ又はＸであり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又はアルカリもしくはアルカリ土類金属対イオンのような金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキル、好ましくはＭｅであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ2は、Ｒ１及びＲ２のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない（例えば、低級アルキル、オキソ、ヒドロキシルなどで置換された）メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、好ましくは、ＣＨ２であり、又はＷに付着している場合は、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、もしくはＣ（＝Ｏ）であり、
ｎは、１〜５の整数、好ましくはＲ１の場合は２〜４の整数であり、Ｒ２の場合は１〜３の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基、例えば、ジアルキルアミン、又はモルフォリン、ピペリジン、ピペラジン、もしくはピロリジンのような置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である。
【００１１】
いくつかの態様において、ＷはＯである。
【００１２】
式Ｉの化合物の例としては、下記Ａ〜Ｄがある。
【化５】
2005511535.tif 000003
【００１３】
別の態様において、本発明はまた、異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式ＩＩによって表される化合物を提供する。
【化３】
2005511535.tif 000004
式中、Ｗ及びＺは、個別にＯ又はＮＲ”であり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又はアルカリもしくはアルカリ土類金属対イオンのような金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキル、好ましくはＨであり、
Ｒ5は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ６は、Ｒ５及びＲ６のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｒ７は、それぞれ個別に、ハロゲン、メチルなどの低級アルキル、又はメトキシなどの低級アルコキシルであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない（例えば、低級アルキル、オキソ、ヒドロキシルなどで置換された）メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、好ましくは、ＣＨ２であり、又は、Ｗに付着している場合は、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、もしくはＣ（＝Ｏ）であり、
ｎは、１〜５の整数、好ましくは、Ｒ５の場合は２〜４の整数であり、Ｒ６の場合は１〜３の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基、例えば、ジアルキルアミン、又はモルフォリン、ピペリジン、ピペラジン、もしくはピロリジンのような置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である。
【００１４】
式ＩＩの化合物の例としては、下記Ｅ〜Ｑがある。
【化６】
2005511535.tif 000005
【００１５】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体及び治療的有効量の式ＩもしくはＩＩの化合物、又はその塩形態を含む新規な薬学的組成物を提供する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、癌又は、下記において述べるあらゆる疾患もしくは状態を含む他の増殖性疾患の新規な治療方法であって、そのような治療を必要とするホストに対して、治療的有効量の式ＩもしくはＩＩに記載の化合物又は薬学的に許容されるそれらの塩を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗癌剤及び抗増殖剤から選択される少なくとも1つの化合物を、式ＩもしくはＩＩの化合物とともに投与してもよい。本明細書において用いられるところの、「ともに投与する」とは、2つの療法を単一の製剤に組み合わせ、例えば、同時にもしくは異なる時間に、別個の製剤において投与すること、あるいは別の方法では、一患者に治療的投薬計画の一環として投与することを意味する。
【００１７】
ii．定義
本明細書において用いられるところの、下記の用語及び表現は、下記に示す意味をもつ。本発明の化合物は、非対称に置換された炭素原子を含有してもよく、また光学的に活性な形態又はラセミ体であってもよい。ラセミ体の分解又は光学的に活性な開始物質からの合成によるなどの光学的に活性な形態の調製のしかたは、当該技術分野において公知である。特に立体化学又は異性体形態が特に指摘されていない限り、全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体及び幾何学的異性体の形態の構造が意図される。本発明の化合物を調製するために用いられる全てのプロセスおよび調製されてその化合物となる中間体を本発明の一部とみなす。
【００１８】
本発明は、本発明の化合物に存在している原子の全ての同位体を含むことが意図されている。同位体は、原子数が同じで、質量数が異なる原子を含む。一般的な例によれば、限定されないが、水素の同位体は、トリチウムとジュウテリウムとを含む。炭素の同位体は、１２Ｃ及び１４Ｃが含まれる。
【００１９】
「アルキル」という語は、分枝状及び直鎖状の、特定の炭素数の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図されている。アルキルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、n―プロピル、i―プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t−ブチル、n―ペンチル及びｓ−ペンチルが含まれる。さらにこの語は、置換されていないアルキル基と置換されたアルキル基の双方を含むことが意図されており、後者は、1以上の水素置換基が、限定されないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル、アルコキシ、エステル、エーテル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、チオエステル、スルホニル、ニトロ、複素環（heterocyclo）、アリール又はヘテロアリールによって置換されたアルキル部分を言う。適切であれば、置換された部分自身は同様に置換され得るということも当該技術分野の当業者に理解されるだろう。「低級アルキル」という語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を有するアルキル基を意味する、また、「低級アルコキシ」という語は、酸素原子に付着したそのような低級アルキル基を意味する。
【００２０】
本明細書で用いられるところの「ハロ」又は「ハロゲン」という語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【００２１】
「アリール」という語は、限定されないが、フェニル、インダニル、又はナフチルなどの、特定数の炭素原子を含有する芳香族部分を意味することが意図されている。
【００２２】
「シクロアルキル」及び「ビシクロアルキル」という語は、あらゆる安定な環系を意味することが意図されている。それは、飽和されていてもよく、又は部分的に不飽和であってもよい。その例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、ビシクロ[２  ２１ノナンビシクロ (bicycle[2 21nonane)、アダマンチル、又はテトラヒドロナフチル（テトラリン）が含まれる。
【００２３】
本明細書で用いられる「炭素環（carbocycle）」又は「炭素環式残基（carbocyclic residue）」は、あらゆる安定な、３員から７員の単環もしくは二環、又は、７員から１３員の二環もしくは三環を、そのいずれも飽和されていてもよく、部分的に不飽和であってもよく、又は芳香族を意味することが意図されている。そのような炭素環の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロオクチル、[３．０]ビシクロオクタン、[４．０]ビシクロノナン、[４．０]ビシクロデカン（デカリン）、[２．２]ビシクロオクタン、フルオレニル、フェニル、ナフチル、インダニル、アダマンチル、又はテトラヒドロナフチル（テトラリン）が含まれる。
【００２４】
本明細書で用いられるところの、「複素環」又は「複素環系」という語は、安定な、５員から７員の単環もしくは二環、又は、７員から１０員の二環の複素環式（へテロ環式の環）を意味することが意図され、それは飽和されていてもよく、部分的に不飽和であってもよく、又は不飽和（芳香族）であってよい。かつ、それは炭素原子及び、Ｎ，Ｏ及びＳからなる群からそれぞれ独立に選択され、上記へテロ環式の環のいずれかがベンゼン環に融合している二環基を含む１〜４のヘテロ原子からなる。窒素、硫黄へテロ原子は、任意に酸化されていてもよい。へテロ環式の環は、あらゆるヘテロ原子もしくは炭素原子において、安定な構造を結果として示すそのペンダント基に付着していてもよい。本明細書に記載のヘテロ環式の環は、得られた化合物が安定である場合、炭素原子又は窒素原子において置換されていてもよい。特に記載されている場合、複素環中の窒素は、任意に四分割されていてもよい。複素環中のＳ及びＯの原子の総数は１より大きく、これらのヘテロ原子は、互いに隣接しないことが好ましい。複素環中のＳ原子の総数は１以下であることが好ましい。本明細書で用いられるところの、「芳香族複素環系」という語は、炭素原子とＮ、Ｏ及びＳからそれぞれ独立に選択された１〜４個のヘテロ原子からなる、安定な５員から７員の単環もしくは二環、又は、７員から１０員の二環複素の環芳香族環を意味することが意図されている。芳香族複素環中のＳとＯ原子の総数は１より大きいことが好ましい。芳香族複素環中のＳおよびＯの原子の総数は１以下であることが好ましい。複素環の例としては、限定されないが、１Ｈ-インダゾール、２-ピロリドニル（２-pyrrolidonyl）、２Ｈ１６Ｈジチアジニル（２Ｈ１６Ｈ dithiazinyl）、２Ｈ-ピロリル、３Ｈ-インドリル、 ４-ピペリドニル（4-piperidonyl）、４ａＨ-カルバゾール、４Ｈ-キノリジニル、6H-1, 2, 5-チアジアジニル、アクリジニル、アゾシニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾテトラゾリル(benztetrazolyl)、ベンゾイソオキサゾリル（benzisoxazolyl）、 ベンゾイソチアゾリル（benzisothiazolyl）、ベンゾイミダザロニル（benzimidazalonyl）、カルバゾリル、４ａＨ-カルバゾリル、 P-カルボリニル（Ｐ-carbolinyl）、クロマニル、クロメニル（chromenyl）、シノノリニル（cinnolinyl）、デカヒドロキノリニル（decahydroquinolinyl）、２Ｈ，６Ｈジチアジニル、ジヒドロフロ[2、3-b]テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル（furazanyl）、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ-インダゾリル、インドレニル（indolenyl）、インドリニル、インドリジニル（indolizinyl）、インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル（isothiazolyl）、イソオキサゾリル（isoxazolyl）、モルホリニル、ナフチリジニル（naphthyridinyl）、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル, 1,2,3-オキサジアゾリル,1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニルペリミジニル（oxazolidinylperimidinyl）、フェ��ントリジニル（phenanthridinyl）、フェナントロリニル（phenanthrolinyl）、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル（phenoxathiinyl）、フェノキサジニル（phenoxazinyl）、フェタラジニル（phthalazinyl）、ピペラジニル、ピペリジニル、ピテリジニル（pteridinyl）、 ピペリドニル（piperidonyl）、 4-ピペリドニル、ピテリジニル（pteridinyl）、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾニル（pyrazolinyl）、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドキサゾール（pyridooxazole）、ピリドイミダゾール（pyridoimidazole）、 ピリドチアゾール（pyridothiazole）、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、 ピロリニル（pyrrolinyl）、ピロリル（pyrrolyl）、キナゾリニル、キノリニル、 4H-キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、カルボリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、6H-1,2,5-チアジアジニル、1,2,3-チアジアゾリル、 1,2,4-チアジアゾリル、 1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、チアンスレニル（thianthrenyl）、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル（thienothiazolyl）、チエノオキサゾリル（thienooxazolyl）、チエノイミダゾリル（thienoimidazolyl）、チオフェニル、トリアジニル（triazinyl）、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,5-トリアゾリル、 1,3,4-トリアゾリル、キサンテニルが含まれる。好ましい複素環は、限定されないが、ピリジニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、1H-インダゾリル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル（benzisoxazolyl）、オキシンドリル（oxindolyl）、ベンゾオキサゾリニル（benzoxazolinyl）、またはイサチノイル（isatinoyl）が含まれる。融合環、例えば、上記複素環を含有するスピロ化合物もまた含まれる。
【００２５】
本明細書に記載されているところの、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が酸又は塩基塩を作製することによって改変された、開示された化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが、アミンのような塩基残基の鉱塩もしくは有機酸塩、カルボン酸のような酸残基のアルカリもしくは有機塩などが含まれる。薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機もしくは有機の酸から作製された親化合物の従来からの非毒性塩又は四級アンモニウム塩が含まれる。
【００２６】
例えば、そのような従来の非毒性の塩には、塩酸、臭素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機の酸由来のもの、及び、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモイック酸（pamoic）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、オキサル酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。
【００２７】
本発明の薬学的に許容される塩は、塩基部分又は酸部分を含有する親化合物から従来の化学的な方法によって合成することができる。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基の形態を、水中もしくは有機溶媒中又はその２つの混合物中の化学量論的な量の適切な塩基もしくは酸、通常、好ましくは、エーテル、ＥｔＯＡｃ、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水系の媒体と反応させることによって調製することができる。好適な塩のリストがRemington's Pharmaceutical Sciences、18th 版、Mack Publishing Company、Easton、PA、1990、p. 1445に挙げられている。この開示を引用によって本明細書中に援用する。
【００２８】
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、過渡の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、合理的な利益/リスク比率に適うようにヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内の化合物、物質、組成物及び/又は用量形態を意味するものとして用いられる。
【００２９】
本明細書において用いられるところの「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが哺乳動物被験体に投与されたとき、インビボで本発明の活性的な親薬物を放出させる、共有結合したあらゆる担体を含むことが意図されている。プロドラッグは、無数の望ましい薬剤の質（溶解性、生分解性、製造など）を高めることが知られているので、本発明の化合物をプロドラッグの形態で送達してもよい。したがって、本発明は、現在クレームされている化合物、その送達方法及びそれを含有する組成物を包含することが意図されている。本発明のプロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、改変体が切断されて親化合物になるようにルーチンの操作で、あるいはインビボで、改変することによって調製される。プロドラッグは、本発明の化合物を含む。そこでは、ヒドロキシ基、アミノ基、又はスルフヒドリル基があらゆる基に結合しており、本発明のプロドラッグが哺乳動物被験体に投与されたとき、切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシ基、遊離アミノ基、又は遊離スルフヒドリル基になる。プロドラッグの例としては、限定されないが、酢酸塩、ギ酸塩及び安息香酸塩のアルコール誘導体及び本発明の化合物中のアミン官能基が含まれる。
【００３０】
「置換された」は、指定された原子の正常の原子価が過剰でなく、置換基が安定な化合物になると仮定した場合、「置換された」という表現を用いて指定された原子上の１以上の水素が、指定された基の中から選択されたもので置換されていることを意味する。置換基がケト基又はオキソ基（すなわち＝Ｏ）であるとき、原子上の２個の水素が置換されている。ケト／オキソ置換基は、芳香族部分には存在しない。
【００３１】
本発明の「治療的有効量」の化合物という語は、サイクリン依存性キナーゼとして既知のクラスの酵素を阻害し、又はホストにおいて癌又はその他の増殖性疾患を治療するのに有効な量を意味する。
【００３２】
本明細書において用いられる、「抗癌」剤又は「抗増殖」剤は、限定されないが、アルトレタミン、ブスルファン、クロランブシル、シクロフォスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、チオテパ、クラドリビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、シタラビン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾトシン、カルボブラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、イプロプラチン、テトラプラチン（tetraplatin）、ロバプラチン（lobaplatin）、ＪＭ２１６、ＪＭ３３５、フルダラビン（fludarabine）、アミノグルテチミド、フルタミド、ゴセレリン、ロイプロリド、メゲストロールアセテート、シプロテロンアセテート、タモキシフェン、アナストロゾール、ビカルタミド、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、プレドニゾン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（doxirubicin）、イダルビシン、ミトキサントロン、ロソキサントロン（losoxantrone）、マイトマイシン−Ｃ、プリカマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、９−アミノカンプトテカン（9-amino camptothecan）、９−ニトロカンプトテカン（9-nitro camptothecan）、ＧＳ−２１１、エトポシド、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プロカルバジン、アスパラギナーゼ、ペガスパラガーゼ（pegaspargase）、オクトレオチド、エストラムスチン、及びヒドロキシ尿素を含む。
【００３３】
ｉｉｉ.用量及び製剤
本発明のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、癌又は増殖性疾患を治療するために、哺乳動物の体内のその作用物質の活性部位に、該作用物質を接触させることができるあらゆる方法によって投与される。それらは、薬剤と組み合わせて用いることが可能な常法によって、個別の治療剤として、あるいは、治療剤との組み合わせにおいて投与することができる。本明細書に記載の阻害剤の化学的特徴は、化合物に好ましい溶解性の特徴を付与し、それらを、以下により詳細に述べるように、静脈製剤、局所製剤、経口製剤その他として投与するのに好適なものにしている。それらは単独で投与することもできるが、選択された投与経路及び標準的な薬学的プラクティスに基づいて選択された薬学的担体とともに投与することが好ましい。好ましい賦形剤及びそれらの製剤については、例えば、書籍Remington's Pharmaceutical Sciences （Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company、Easton、Pa.、USA 1985）に記載がある。
【００３４】
別の局面において、本発明は、１以上の薬学的に許容される単体（添加物質）及び/又は希釈剤を用いて上記のように製剤された、治療的有効量の本発明の１以上の化合物を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。以下において詳細に述べるように、本発明の薬学的組成物は下記の投与形状に適合される形状を含む、固体又は液体形状で投与するように特別に製剤することができる。（１）経口投与、例えば、水薬（水溶性又は非水溶性溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌下投与のための糊剤、（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁液として、例えば、皮下、筋肉内又は静脈内注射など（３）局所投与、例えば、皮膚に投与するためのクリーム、軟膏又はスプレー、（４）膣内又は直腸内（intravectally）、例えば、ペッサリー、クリーム又は泡剤。いくつかの態様において、薬学的製剤は、非発熱性、すなわち、患者の体温を上げないものであってもよい。
【００３５】
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料及び芳香性物質、保存剤及び抗酸化剤を組成物中に存在させることもできる。
【００３６】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システインヒドロクロリド、ナトリウムビサルフェート、ナトリウムメタビサルファイト（sodium metabisulfite）、ナトリウムサルファイトなどのような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート（ascorbyl palmitate）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピル没食子酸塩、α―トコフェノールなどのような油溶性抗酸化剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、リン酸などのような金属キレート剤が含まれる。
【００３７】
投与される用量は、もちろん、特定の薬剤の薬力学的特性やそのモードや投与経路、レシピエントの年齢、健康状態及び体重、症状の性質及び広がり、併用する治療の種類、治療回数、及び望まれている効果といった公知の因子によって変わる。活性成分の１日用量は、体重１ｋｇあたり約０．００１〜約１０００ｍｇであることが期待され、好ましい用量は、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇである。 
【００３８】
投与に適した用量形態は、１ユニットあたり約１ｍｇ〜１００ｍｇの活性成分を含有する。これらの薬学的組成物において、活性成分は、組成物の総重量に基づき、通常、約０．９５重量％存在するだろう。活性成分は、カプセル、錠剤及び散剤などの固形剤型、あるいは、エリキシル剤、シロップ及び懸濁液などの液体剤型で経口投与することができる。それは、無菌液体用量の剤型で非経口投与することもできる。
【００３９】
本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（頬側、舌下を含む）、直腸、膣内及び/又は非経口投与に好適なものを含む。製剤は、単位用量形態ごとに好都合に存在することができ、薬学分野の当業者に公知のあらゆる方法で調製することができる。担体物質と混合して単一の用量形態を形成することができる活性成分の量は、治療されるホスト、特定の投与モードによって変わるだろう。単一の用量形態を形成する担体物質と混合することができる活性成分の用量は、通常、治療効果をもたらす阻害剤の量である。一般的に、この量は、１００％中、約１％〜約９９％の活性成分の範囲であり、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％である。
【００４０】
これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明の化合物を、担体及び任意には、１以上の副成分と結合させるステップを含む。一般的に、製剤は、本発明の阻害剤を液体担体、又は細かく分割した固体担体、又はその両方を、均一かつ密接に結合させ、その後、必要であれば、その製品の形を整えることによって調製することができる。
【００４１】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味付け基剤、通常は、スクロース、アカシア、トラガカントを用いる）、散剤、顆粒剤、又は水溶性もしくは非水溶液中の溶液もしくは懸濁液、又は油中水もしくは水中油液体乳化剤、又はエリキシル剤もしくはシロップ、又は香錠（ゼラチンやグリセリンなどの不活性基剤、又はスクロース及びアカシアを使用）及び/又はマウスウォッシュなどとして投与することができ、それぞれは所定量の本発明の化合物を活性成分として含む。本発明の阻害剤はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして投与することもできる。
【００４２】
経口投与に好適な本発明の固体剤型（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒剤など）においては、活性成分を１以上の薬学的に許容される担体、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム及び/又は下記（１）〜（１０）のいずれかとともに混合される。即ち（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸などの充填剤又は増量剤、（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリニビルピロリドン、スクロース及び/又はアカシアなどの結合剤、（３）グリセロールなどの湿潤剤、（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカのデンプン、アルギン酸、いくつかのケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（５）パラフィンなどの溶解延剤、（６）四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（７）例えば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（８）カオリン及びベントナイト・クレイなどの吸収剤、（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物などの潤滑剤、及び（１０）着色剤。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、該薬学的組成物は緩衝剤を含んでもよい。同種の固体組成物を、充填剤として、ラクトースや乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを用いたゼラチン軟カプセル剤及び硬カプセル剤中に用いてもよい。
【００４３】
錠剤は、任意に１以上の副成分を用いて、圧縮又は成形によって作製してもよい。圧縮によって成る錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤又は分散剤などを用いて調製してもよい。成形によって成る錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿潤させた粉末状の阻害剤の混合物を好適な機械で成形することによって作製してもよい。
【００４４】
本発明の薬学的組成物の錠剤及び糖衣丸、カプセル、丸剤及び顆粒といった他の固形の剤型は、任意に切れ込みを入れてもよいし、又は、腸溶コーティング及びその他の、医薬品調剤の技術分野において公知のコーティングなど、コーティングやシェルを用いて調剤してもよい。それらはまた、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な比率で用いるなどにより、所望の放出特性、その他のポリマーマトリクス、リポソーム、及び／又は、小球体を提供できるよう、含まれる活性成分を徐放させることや、放出をコントロールされるよう調剤することもできる。これらは、例えば、細菌保持フィルタによる濾過、又は、使用直前に無菌水又はその他何らかの無菌の注射可能な媒質に溶解することの可能な無菌の固形組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。さらに、これらの組成物は、任意に乳白剤を含有してもよく、限定的又は優先的に、消化管の特定の部位において、任意に徐放によって、活性成分を放出するような組成物としてもよい。使用可能な包埋用組成物の例としては、ポリマー物質及びロウがある。さらに活性成分は、適宜、上記１以上の添加剤を含む微小カプセル形状としてもよい。
【００４５】
経口投与に好適な本発明の化合物の液体剤型には、薬学的に許容できるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。活性成分に加え、該液体剤型は、当該技術分野において通常用いられている不活性の希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油脂類（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル、及び、これらの混合物などを含むことができる。
【００４６】
不活性の希釈液の他に、経口投与用組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、着香料、着色剤、賦香剤、防腐剤などのアジュバントを含むことができる。
【００４７】
本発明の活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及び、これらの混合物などの懸濁化剤を含有してもよい。
【００４８】
本発明の薬学的組成物の直腸内投与用又は膣内投与用の剤型としては、坐剤をあげることができ、それは、本発明の１以上の化合物と、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ロウ又はサリチル酸を含む１以上の好適な非刺激性添加剤又は担体とを混合して調剤することができる。また、坐剤は、常温では固体であるが体温では液体となって、直腸腔又は膣腔で溶解し、活性阻害剤を放出する。
【００４９】
膣内投与に好適な本発明の製剤としては、当該技術分野において適切であることが既知の担体を含有したペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル剤、ペースト、フォーム又はスプレーがある。
【００５０】
本発明の化合物の局所投与又は経皮投与用の剤型としては、散剤、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル剤、溶液、貼付剤及び吸入剤がある。活性化合物は、無菌状態のもとで、薬学的に許容できる担体と混合してもよく、また、任意の防腐剤、緩衝剤、又は必要であれば噴霧剤と混合してもよい。
【００５１】
軟膏、ペースト、クリーム及びゲル剤は、本発明のププレニルトランスフェラーゼ阻害剤に加え、動物性油脂及び植物性油脂、油脂類、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物などの添加剤を含有してもよい。
【００５２】
散剤及びスプレーは、本発明の化合物に加え、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物といった添加剤を含有していてもよい。さらにスプレーは、例えば、クロロフルオロハイドロカーボン、及び、ブタン及びプロパンなどの揮発性の置換されていない炭化水素などの通常の噴霧剤を含有してもよい。
【００５３】
経皮貼付剤には、本発明の化合物をコントロールしながら生体へ送達できるという更なる利点がある。このような剤型は、本発明の阻害剤を適切な媒質中に溶解又は拡散させることによって作製できる。薬物の皮膚への流れをよくするために吸収促進剤を用いることもできる。このような流速は、速度調節膜を設けることによって、又はポリマーマトリックス又はゲル剤中に本発明の化合物を拡散させることによってコントロールすることができる。
【００５４】
眼科用調剤の眼軟膏、散剤、溶液なども、本発明の範囲内であると考えられる。
【００５５】
非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、１以上の本発明の阻害剤を、１以上の薬学的に許容される無菌の等張水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁剤又は乳剤と組み合わせて、又は、使用直前に無菌の注射可能な溶液又は分散液に溶かして再構成することができるような無菌散剤と組み合わせて含み、その中には抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、調剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、又は懸濁剤又は増粘剤を含有していてもよい。
【００５６】
本発明の薬学的組成物に使用することができる、好適な水性もしくは非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがあげられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材を用いたり、分散液の場合には、必要な粒径を維持したり、界面活性剤を用いるなどして維持することができる。
【００５７】
これらの組成物にはさらに、防腐剤、湿潤剤、乳濁化剤及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の活性は、種々の抗細菌剤、抗黴剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などによって確実に阻止することができる。さらに糖類、塩化ナトリウムのような等張剤などを組成物中に含むことも望ましいかもしれない。さらに、注射可能な剤型の吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの、吸収を遅らせる物質を含むことによって持続させることができる。
【００５８】
阻害剤の治療効果を持続させるために、該阻害剤の皮下注射又は筋肉注射からの吸収を遅らせることが望ましい場合がある。これは、低水溶性の結晶質又は非晶物質の懸濁液を使用することによって達成することができるかもしれない。そして阻害剤の吸収速度は、その溶解速度、ひいては、結晶の大きさ及び結晶の形状に依存することになる。あるいは、非経口投与用の阻害剤の剤型の吸収を遅らせることは、阻害剤を油性賦形剤に溶解又は懸濁させることによって達成することができる。
【００５９】
注射可能なデポー剤型は、当該阻害剤の微小カプセルマトリクスをポリラクチド−ポリグリコリドなどの生物分解性ポリマー中に形成することによって作製される。薬剤のポリマーに対する比、及び用いられる特定のポリマーの性質によって、薬剤の放出速度をコントロールすることができる。その他の生物分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水化物）があげられる。注射可能なデポーの製剤は、薬物を生体組織に適合性のあるリポソーム又はマイクロ乳剤中に混入させることによっても行うことができる。
【００６０】
本発明の化合物を医薬品としてヒト及び動物に投与する場合、それ自体を投与してもよいし、又は、例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分と薬学的に許容できる担体とを組み合わせて含有する薬学的組成物として投与してもよい。
【００６１】
本発明の製剤は、経口、非経口、局所又は直腸投与してもよい。それらはもちろん、各投与経路に好適な形状で投与する。例えば、それらは、錠剤又はカプセル形状としての投与、注射、吸入剤、点眼剤、軟膏、坐剤などや、注射、点滴又は吸入による投与や、ローション又は軟膏による局所投与、坐剤による直腸内投与などによって行われる。経口投与が好ましい。
【００６２】
本明細書で用いられるところの「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という表現は、腸管投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、皮膜下、クモ膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び点滴を含む。
【００６３】
ここで用いられる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」という表現は、化合物、薬物又はその他の材料の、患者の全身に入り、したがって代謝やその他の同様のプロセスを経るような、中枢神経系への直接的な投与以外の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【００６４】
選択される投与経路にかかわらず、当該方法に有用なＣＤＫ阻害剤は、好適な水和形態を用いてもよく、及び/又は、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される剤型で、当該技術分野において公知の従来の方法によって製剤される。
【００６５】
ゼラチンカプセルは、活性成分及び、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などの粉末担体を含有している。類似の希釈剤を用いて圧縮錠剤を作製することができる。錠剤もカプセルも双方とも、数時間かけて薬物の放出が続くように、放出を持続させた製品として製造することができる。圧縮錠剤は、あらゆる不快な味を隠し、錠剤を大気から保護するために、糖やフィルムでコーティングすることができる。同種の固体組成物を、充填剤として、ゼラチン軟カプセル剤及び硬カプセル剤中に用いてもよい。この関係において、好ましい材料は、ラクトース又は乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールもまた含む。好ましい製剤は、ゼラチン軟カプセルの、例えば、オリーブ油、Miglyol、又はCapmulといった油の溶液又は油の懸濁液である。適切であれば、長時間の崩壊を防ぐために抗酸化剤を含んでもよい。
【００６６】
経口投与のための液体剤型は、患者に受け入れられやすくするために、着色剤及び香味剤を含有することができる。通常、水、好適な油、食塩水、エタノール、水溶性ブドウ糖（グルコース）、及び関連する糖溶液、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール、又はこれらの混合物は、非経口用溶液として好適な担体である。
【００６７】
静脈内投与をするには、上記開示した化合物を活性成分の遊離又は塩の形態の無菌溶液、生理学的緩衝液又は無菌水において製剤してもよい。糖の含有量が望ましくないレベルの乳酸アシドーシスを引き起こさないことを前提として、望ましければ、糖含有担体液体（リンゲル乳酸、又は他のグルコース又はブドウ糖溶液）を用いることができる。静脈内投与は、ボーラス注射（好ましくは１日数回）又は持続的に時間をかけた連続注射によって行うことができる。ボーラス注射又は点滴の好ましい総用量は、患者の身体的状態にしたがって実質的に変えることができる。一般的には、それらは通常、約２５ｍｇ/ｋｇから２５０ｍｇ/ｋｇの範囲である。
【００６８】
非経口投与用溶液は、活性成分の水溶性塩、好適な安定化剤、及び必要であれば、緩衝剤を含有することが好ましい。ナトリウムビサルファイト（sodium bisulfite）、ナトリウムサルファイト、又はアスコルビン酸などの抗酸化剤を単独もしくは組み合わせると、好適な安定化剤となる。クエン酸及びその塩、及びナトリウムＥＤＴＡも用いられる。さらに、非経口用溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチル-もしくはプロピル-パラベン及びクロロブタノールなどの防腐剤を含有することができる。好適な薬学的担体は、この分野における標準的な引例であるRemington's Pharmaceutical Sciences、18th 版、Mack Publishing Company、Easton、PA、1990に記載がある。この開示を引用によって本明細書中に援用する。
【００６９】
ｉｖ.  治療的適用
一般的に、細胞増殖の調節におけるｃｄｋ類の重要な役割のために、本明細書に開示されている化合物は、癌、良性前立腺肥大症、家族性腺腫症ポリープ、神経線維腫症、乾癬、真菌感染、内毒素ショック、肥大性瘢痕形成（hypertrophic scar formation）、炎症性腸疾患、移植に対する拒絶反応、アテローム動脈硬化症、乾癬、肺繊維症、間接炎、糸球体腎炎、血管形成又は血管手術後の再狭窄に関する血管平滑筋細胞増殖、及びその他手術後の狭窄及び再狭窄などの、異常な細胞増殖を特徴とするあらゆる疾患の経過において有用かもしれない可逆的な細胞分裂停止剤として作用することができる。例えば、米国特許第6,114,365号、及び第6,107,305号を参照されたい。
【００７０】
本明細書に開示されている化合物は、癌、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患、神経変性障害及び心臓血管性疾患などの治療に有用であると期待されている。
【００７１】
より具体的には、本明細書に開示されている化合物は、（限定されないが）下記を含む種々の癌の治療において有用である。すなわち、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺癌を含む）、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、前立腺、及び皮膚（上皮細胞カルシノーマを含む）のカルシノーマ;白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン性リンパ腫、非ホジキン性リンパ腫,有毛細胞リンパ腫及びBurkett's リンパ腫を含むリンパ系統の造血性腫瘍;急性及び慢性の骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、及び急性前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血性腫瘍; 線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系腫瘍;星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫を含む中枢及び末端神経系の腫瘍；及びシュワン腫; メラノーマ、精上皮腫、テトラカルシノーマ、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトクタントーマ（keratoctanthoma）、甲状腺濾胞癌、及びカポジ肉腫の治療に有用である。
【００７２】
ｃｄｋ５がtau 蛋白質のリン酸化に関与しているという最近の知見（J. Biochem、117, 741-749 （1995））が示唆しているように、本発明に開示されている化合物は、アルツハイマー病の治療においても有用かもしれない。
【００７３】
本発明に開示されている化合物は、アポトーシスを誘導又は阻害することもある。アポトーシス反応は、種々のヒト疾患の異常型である。本明細書に記載されている化合物は、アポトーシスの調節剤として、（これらに限定されないが上記で述べた種類を含む）癌、ウイルス感染（限定されないが、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタンイン−バールウイルス、シンドビスウイルス及びアデノウイルスを含む）、ＨＩＶ感染患者のＡＩＤＳ発症予防、自己免疫疾患（限定されないが、全身性ろうそう、エリテマトーゼス、自己免疫系糸球体腎炎、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患及び自己免疫性真性糖尿病を含む）、神経変性疾患（限定されないが、アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連性痴呆症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、棘筋萎縮症及び大脳変性を含む）、脊髄形成異常症候群、再生不良性貧血、心筋梗塞関連虚血性損傷、突発性及び再潅流性損傷、不整脈、アテローム性動脈硬化、毒物由来又はアルコール関連肝臓疾患、血液性疾患（限定されないが、慢性貧血及び再生不良性貧血を含む）、筋骨格系変性疾患（限定されないが、骨粗鬆症及び関節炎を含む）、アスピリン感受性副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性動脈硬化、腎臓疾患及び癌性疼痛、の治療に有用である。
【００７４】
本明細書に開示されている化合物は、ｃｄｋの阻害剤として、細胞性ＲＮＡ及びＤＮＡ合成のレベルを調節することができる。従って、これらの作用物質はウイルス感染（限定されないが、ＨＩＶ、ヒト乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタンイン−バールウイルス、シンドビスウイルス、及びアデノウイルスを含む）の治療に有用である。
【００７５】
本明細書に開示されている化合物は、癌の化学防御に有用である。化学防御は、突然変異事象の誘発を阻害することによって、あるいは、既に発生している前−悪性細胞の進行を阻害したり、腫瘍の再発を阻害したりすることによって、侵襲性癌の発症を阻害することであると定義される。
【００７６】
本明細書に開示されている化合物は、腫瘍起因性血管形成及び転移の阻害に有用である。
【００７７】
本明細書に開示されている化合物はまた、他の蛋白質キナーゼ、例えば、蛋白質キナーゼＣ、ｈｅｒ２、ｒａｆ１、ＭＥＫ１、ＭＡＰキナーゼ、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＰＩ３キナーゼ、ウイールキナーゼ、Ｓｒｃ、Ａｂｌの阻害剤として有用であり、すなわち、他の蛋白質キナーゼ関連の疾患の治療に有効である。
【００７８】
本発明の化合物はまた、放射線治療のような既知の抗癌治療、又は細胞増殖抑制性もしくは細胞毒性物質と組み合わせる（一緒に、又は順次投与する）と有用である。細胞増殖抑制性もしくは細胞毒性物質の例としては、例えば、限定されないが、シスプラチン又はドキソルビシンなどのＤＮＡ相互作用剤；エトポサイドなどのトポイソメラーゼII阻害剤；ＣＰＴ−11又はトポテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；パシリタクセル、ドセタクセル又はエポチロン類などのツビュリン相互作用剤；タモキシフェンなどのホルモン剤；５−フルオロウラシルなどのチミジレート合成阻害剤；及びメトトレキセート（methoxtrexate）などの抗新陳代謝剤が挙げられる。そのような組み合わせにおいては、本発明の化合物及び製剤は、放射線治療又は化学療法によって引き起こされる脱毛症の発生を予防又は軽減するのに有用である。
【００７９】
固定された用量として製剤化される場合、そのような組合せ製品は、下記の用量範囲内の本発明の化合物及びその許容される用量範囲内の他の薬学的活性剤又は処置を用いている。例えば、ｃｄｃ２阻害剤オロムシンは、アポトーシスの誘発において公知の細胞毒性剤と相乗効果的に作用することがわかっている（J. Cell Sci.、108、2897 （1995））。本明細書に記載の化合物はまた、組合せ製剤が不十分である場合、公知の抗癌剤又は細胞毒性試剤と続けて投与することができる。本発明では投与の順序は限定されず、本明細書に記載の化合物は、公知の抗癌剤又は細胞毒性試剤の投与の前後のいずれにおいても投与することができる。例えば、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドールの細胞毒活性は抗癌剤との投与順序に影響される（Cancer Research、57、3375 （1997））。
【００８０】
ｖ．合成
本発明の化合物は、下記の方法を用いて、合成有機化学の技術分野で公知の方法、又は当該技術分野の当業者によって予測されるようなその変形を組み合わせて合成することができる。好ましい方法は、限定されないが下記の方法を含む。下記に引用された引用のそれぞれを引用によって本明細書中に援用する。
【００８１】
化学式Ｉの化合物を調製するための重要な中間物質は、ピラゾールアミノニトリルII、アミノカルボキシアミド（aminocarboxamides ）III、及びアミノエステルＩＶである。これらの中間物質の調製は、化学文献に先例がある。いくつかの方法をスキームＡ（A. O. Abdelhamidら、J. Heterocycl. Chem. 1984、21、1049）、Ｂ（C. C. ChengとR. K. Robins、J. Org. Chem. 1956、21、1240.）及びＣ（P. SchmidtとJ. Druey、Helv. Chem. Acta 1956、39、986.）にまとめた。Tominagaら、J. Heterocycl. Chem. 1990、27、775及びＰＣＴ出願WO 00/21926 号及びWO 99/54308号もまた参照されたい。広範な開始ヒドラジン及びアルデヒドは市販されており、または標準的な有機変換によって調製することができる。下記において用いられているように、置換基Ａｒは、置換されて化学式Ｉの対応するアリール置換基に一致する、又は、それに変換されたアリール環を示す。化学式Ｉの化合物はまた、ＰｒＣＯＣｌを塩基の存在下でＣＨ２（ＣＮ）２で処理し、得られた化合物をＰＣｌ５で処理し、その生成物をＡｒＮＨＮＨ２で反応させることによって調製することもできる。
【００８２】
スキームＡ
【化７】
2005511535.tif 000006
【００８３】
スキームＢ
【化８】
2005511535.tif 000007
【００８４】
スキームＣ
【化９】
2005511535.tif 000008
【００８５】
スキームＤに示されるように、アミノニトリルIIは、本発明のピラゾール［３，４−ｄ］ピリミジンに変換することができる。要するに、アミノカルボキシアミドは、ジクロロメタンのような好適な溶媒の存在下で任意に、トリエチルアミンなどの好適な塩基で処理し、続いて、式ＡｒＣＨ２ＣＯＸで表される酸ハライド、好ましくは酸クロリドで処理することによってアシル化され、カルボキサミドニトリルＶが得られる。あるいは、カルボキサミドニトリルＶは、アミノニトリルIIと一般式ＡｒＣＨ２ＣＯ２Ｈで表されるカルボン酸とを好適な塩基及び好適な溶媒中の結合物質の存在下で結合させることによって調製することができる。アミンとカルボン酸との結合については検討がなされており（KlausnewとBodansky、Synthesis 1972、453-463）、当該技術分野の当業者はそれに作用しうる種々の作用物質を認識することができる。
【００８６】
スキームＤ
【化１０】
2005511535.tif 000009
【００８７】
カルボキサミドニトリルＶの本発明の化合物への変換は、好適な塩基、好ましくは溶媒、好ましくは、水、アルコールもしくは水−アルコール混合物中金属水酸化物又はアルコキシド塩基の存在下で、約０℃〜約１００℃の温度での過剰な過酸化水素を用いた処理によって達成される。
【００８８】
あるいは、カルボキサミドニトリルＶは、好ましくは、濃縮された、強い酸、好ましくは８５％Ｈ３ＰＯ４中で、約１時間加熱することによって本発明の化合物に変換させることもできる。スキームＥは、本発明の化合物を調製するための別の手段を示している。好適な溶媒、好ましくは低級アルカノール中のアミノカルボキサミドIIIを、ＡｒＣＨ２ＣＯ２Ｒ（但し式中、Ｒは、例えば、低級アルキルであり、余剰の塩基は、好ましくは金属低級アルコキシドである）で表される余剰のエステルを用いて、好ましくは、溶媒の沸点において処理する。多くの酢酸アリールエステルは、市販されているか、又は、余剰のアルコール、ＲＯＨを用いて、好ましくは、Ｈ２ＳＯ４又はｐ−ＴｓＯＨなどの酸触媒の存在下で溶媒として用いられるエチルもしくはメチルアルコールを還流させてエステル化することによって、市販されている酢酸アリールから１ステップで調製することができる。あるいは、ＤＯＣのような結合物質を、好ましくは、ＤＭＡＰのような触媒を用いてＣＨ２Ｃ１２のような溶媒中で用いることもできる。
【００８９】
スキームＥ
【化１１】
2005511535.tif 000010
【００９０】
フェニル酢酸は、アリールアセトニトリルの酸又は塩基の加水分解によって調製してもよい。ひいては、アリールハライドをＣＮ−とくを、好ましくは、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ，ＥｔＯＨ、水、ＤＭＳＯ又はそれらの混合物などの溶媒中で処理することによって調製してもよい。さらに、アリール酢酸エステルの例としては、Arndt-Eistertの存在下（Meier とZeller、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975、14、 32）で、又は関連するホモロゲーション（homologation）条件下でアリールカルボン酸から調製してもよい。
【００９１】
式ＩＶで表されるアミノエステルは、式ＡｒＣＨ２ＣＮ及びナトリウムの余剰のニトリルを用いた反応によって本発明の化合物に変換することができる。
【００９２】
スキームＦ
【化１２】
2005511535.tif 000011
【００９３】
この反応は、加熱しながら手際よく行われることが好ましい。
【００９４】
本発明の更なる化合物を得るために、ピラゾロ[３，４-ｄ]ピリミジノンを以下に示すようにさらに合成してもよい。Ａｒ基上で求電子性芳香族置換反応を行い、置換を誘発することができる。そのような反応には、限定されないが、ニトロ化、アシル化（フリーデル・クラフト）、ハロゲン化、アルキル化（フリーデル・クラフト）、クロロメチル化、スルホン化、及びアミノメチル化（マンニッヒ反応）が含まれる。これらの反応を行うための条件は、有機合成の、一般的に求電子物質とアリール又はヘテロアリール基質との触媒の存在下での反応に関与する技術の当業者にはよく知られている。ニトロ化又はマンニッヒ反応の場合、求電子物質がインサイチュで硝石、アミン及びカルボニル成分からそれぞれ生成される場合、触媒は、溶媒として機能するプロトン性の酸であることが好ましい。その他の求電子性芳香族置換反応の場合、好ましい触媒は、ルイス酸であり、それには、限定されないが、ＦｅＸ３、ＡｌＸ３及びＺｎＸ２（式中、Ｘは、ハロゲンである）が含まれる。
【００９５】
アミノ基を持つ、上記調製された化合物は、限定されないが、アシルハライド、水酸化物、イソシアネート、クロロホルマート（chloroformates）、スルホニルハライド、アルキルハライド、ラクトン、又はエステルを含む求電子物質との反応によって誘導することができる。これらのさらなる反応を行うための条件は、有機合成、一般的に求電子物質を求核剤、好ましくは、０℃から室温の間の温度で溶媒中に添加することに関与する当業者にはよく知られている。塩基を添加することが必要かもしれない。これらの反応の生成物をさらにいくつかの求電子物質と、ピリミジノン窒素（Ｎ５）にて反応させる。得られた官能基（アミド、カルバメートなど）は、望ましいアニリノ基もしくは脂肪族基と比べて塩基性の加水分解に対する安定性が弱く、切断されてＮ５上にＨをもつピリミジノンに戻る。
【００９６】
アミノ基をもつ化合物とハロアシルハライド、α、β-不飽和酸ハライド、又はハロスルホニルハライドなどの物質とを反応させることによって、一級アミンもしくは二級アミン、ジアミン、アルコキシド、アミノアルコール、又はチオールなどの求核剤と反応し得る中間物質が得られる。
【００９７】
カルボキシル基を含む上記調製された化合物は、限定されないが、アミン及びアルコールを含む求核剤を用いた活性化及び反応によって誘導され、それぞれアミド及びエステルを得ることができる。カルボジイミドを用いたアミンとカルボン酸との結合が検討され（KlausnewとBodansky、Synthesis 1972、453-463）、それに作用を及ぼす種々の追加物質、ならびに反応の機能性を隠すための基（GreenとWuts、"Protective Groups in Organic Synthesis" Second Edition、John Wiley & Sons、1991）を保護するための潜在的な必要性について、当該技術分野の当業者は理解することができる。酸からのエステルの調製は上述した。これらのアミド及びエステルのアミン及びアルコールへの還元は、好適な水素化物還元物質を用いて行うことができる。
【００９８】
アミノ基を含む上記調製された化合物は、ホスゲンを用いた活性化によって求電子性種に変換することによって（Tetrahedron: Asymmetry 1995、61、 745；J. Org. Chem. 1994、59、1937）、Tetrahedron: Asymmetry 1995, 61, 745; J. Org. Chem. 1994, 59, 1937）、好ましくは、塩基の存在下で、限定されないが、アミン、アルコール及びスルホンアミドを含む求核剤と反応させることによって、尿素、カルバメート及びスルホニル尿素がそれぞれ得られる。これらの反応を行うための条件及びホスゲン及びホスゲン等価物を扱う際に伴う危険は、有機合成の分野の当業者には知られている。最善の注意を払うべきである。
【００９９】
本発明の化合物を調製するのに必要な更なる変換は、ケトン、アルデヒド、エステル、酸、アミドの還元、又はアルミノ作用物質及びホウ化水素作用による還元性アミノ化（J. Seyden-Penne, "Reductions by the Alumino and Borohydrides in Organic Synthesis" VCH Publishers、Inc.、1991）、限定されないが、アルコール、アルデヒド、オレフィン、チオエーテル、スルホキシド及びヘテロアリール基を含む基の酸化を含む（Milos Hudlicky、"Oxidations in Organic Chemistry" American Chemical Society、1990）。
【０１００】
アルケン、アルキン、窒素、ニトロ又はシアノ基などの官能基の還元は、触媒性水素化によって、又は金属還元を溶解することによって達成され得る。本発明の化合物に対する求電子性部位を含有する中間物質の更なる合成は、限定されないが、ＣＮ−、アミン、アルコキシド、メルカプタン、又はカルバニオンを含む求核剤と置換することによって達成することができる。本発明のさらに他の化合物は、アリールハライドもしくはトリフレートを適切なボロン酸又はスタンナンで調製することができる（Stille、 J.K.、 Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986、25、 508； Suzuki、A. Pure Appl. Chem. 1985、57、 1749）。カルボニル基をもつ上記調製された化合物は、求核剤とさらに反応させることによって誘導され、二級アルコールを得ることができる。そのような求核剤としては、限定されないが、グリニャール試薬、アルキル‐、アルケニル‐及びアルキニル‐リチウム試薬、及びアリルスタンナン、シランなどがあげられる。上記のように調製された化合物は、さらにBeckmann転位（Gawley in Org. React. 1988、35、1）又は他の転位によってさらに合成することができる。
【０１０１】
上記調製された化合物の更なる合成は、直接的な金属化による有機マグネシウム又は有機リチウム種の生成（BeakとMeyers、Acc. Chem. Res. 1986、 19、356-363；BeakとSnieckus、 Acc. Chem. Res. 1982、 15、306-312； Katritzky、LamとSengupta、Prog. Heterocycl. Chem. 1989、11、1-29）又はリチウム‐ハロゲン交換によるアリールハライド(Parham とBradsher、Acc. Chem. Res. 1982、15、300-305)から達成することができる。
【０１０２】
式IIで表される化合物の調製アプローチをスキーム１に示す。これは、本発明の化合物を調製するために用いることができる。置換基Ｚ、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、化学式IIに記載の置換基、又は標準的な有機変換を用いた置換基に変換される置換基をそれぞれ表す。ジメチルニトロフタレートのニトロ基を還元して、触媒的水素化を用いてアミンに還元した。基剤として無水酢酸及びピリジンを用いてアニリンをアシル化した。得られたアセトアミド２及びアセトフェノンの混合物を強塩基を用いて、適切な溶媒中で高温で処理し、所望のトリケトン３を得た。トリケトンを得るための追加的手段は、Kilgoreら、Industrial and Engineering Chemistry 34:494-497、1946に記載されているように、当該技術分野の当業者に公知である。トリケトンを高温で適切な溶媒中でヒドラジンを用いて処理し、インデノ[1,2-c]ピラゾロン環系を得た。
【０１０３】
インデノ[1,2-c]ピラゾロンを調製するための追加的手段は、Lemke ら、J. Heterocyclic Chem. 19:1335-1340、1982；Mosher and Soeder、 J. Heterocyclic Chem. 8:855-59、1971； Hrnciar及びSvanygova、Collect. Czech. Chem. Commun. 59:2734-40、1994に記載されているように当該技術分野の当業者に公知である。強酸を用いて適切な溶媒中で加熱することによってアミドを脱アシル化し、アニリン４を得た。このアニリンを、酸クロリドを用いた標準的な条件下で適切な溶媒中でアシル化し、所望の生成物５を得た。
【０１０４】
スキーム１
【化１３】
2005511535.tif 000012
【０１０５】
本発明の化合物を作製するための別の方法をスキーム２に示す。中間物質トリケトン３は、当該技術分野の当業者に公知の方法で、強酸を用いて脱アシル化し、適切な酸クロリドを用いて再アシル化することができる。続いて、トリケトン６は、スキーム１に既述したのと同じ条件でイデノ[1,2-c]ピラゾロン環系に変換することができる。
【０１０６】
スキーム2
【化１４】
2005511535.tif 000013
【０１０７】
スキーム２のトリケトン６を調製する別の方法は、RotbergとOshkaya、Zh. Organ. Khim. 8:84-87、1972；Zh. Organ. Khim. 9:2548 2550、1973に記載のように、1,3-ジケトン６ａと３-無水ニトロフタル酸との縮合を用いる。市販されていない場合、1,3−ジケトンは、必要なメチルケトンのアセチル化又はトリフルオロアセチル化によって、当該技術分野の当業者は容易に作製することができる。得られたニトロ誘導体のアニリン６ｂへの還元は、触媒水素化、酸性条件下での亜鉛又は鉄を用いた処理、又はジチオン酸ナトリウムもしくはスズクロリドなどの他の還元剤を用いた処理を含む種々の方法で達成することができる。続いて、アニリン６ｃを、アシル化、次いでスキーム２に既述したヒドラジンを用いた処理によって本発明のインデノ[1,2-c]ピラゾロンに還元することができる。
【０１０８】
インデノ[1,2-c]ピラゾロン環系を作製するための別の方法をスキーム３に示す。ジメチルヒドラジンを、溶媒を用いずに3−アセチルピリジンと反応させ、ヒドラゾン７を得た。これをスキーム１に記載の方法と同様の方法で処理し、所望の中間物質８を得た。
【０１０９】
スキーム３
【化１５】
2005511535.tif 000014
【０１１０】
あるいは、６ｂを活性化されたアシル化Ｎ−アミノモルホリン又はニトロフェニルカルバメートなどのピペラジン環を用いて処理することができる。同様の中間物質を作る更なる手段は、Rappoport、J. Org. Chem. 49:2948-2953、1984に記載されているように当該技術分野の当業者に公知である。この中間物質は、スキーム１に記載のものと同様に順次処理された。
【０１１１】
本発明の他の特徴は、下記の実施例の記載から明らかである。それらは、本発明を説明するためのものであり、それを限定することが意図されているものではない。
ｖ．実施例
【０１１２】
合成の手順
式Ｉ
【化１６】
2005511535.tif 000015
【０１１３】
1-ヒドロキシ-2-メチルプロピリデン）メタン-1,1-ジカルボニトリルの合成
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中マロノニトリル（４．０ｇ、６０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（７５ｍＬ）中ＮａＨ（９５％、３．０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で１時間かけて滴下した。その反応を室温まで温め、１時間撹拌した。次にその懸濁液を０℃に冷却し、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中塩化イソブチリル（６．３ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下処理した。添加は、内部の温度が約１０℃以上にならないようにコントロールした。添加完了後、その反応物を室温まで温め、２４時間撹拌した。その反応物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）を用いて急冷し、蒸発させた。次にその残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と１Ｎ ＨＣｌ（７５ｍＬ）に分けた。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を用いて水層を再び抽出し、結合有機層を塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ｃ）し、濾過し、蒸発させて、生成物を産出した（７．９５ｇ、９６％）。
【０１１４】
【化１７】
2005511535.tif 000016
【０１１５】
（1-クロモ-2-メチルプロピリデン）メタン-1,1-ジカルボニトリルの合成：
ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中（1-ヒドロキシ-2-メチルプロピリデン）メタン-1,1-ジカルボニトリル（５．１ｇ、３７ｍｍｏｌ）の水溶液に、五塩化リン（８．６ｇ、４１ｍｍｏｌ）を添加した。その反応を室温で１６時間撹拌した。次にその反応を氷（５０ｇ）に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）とＨ２Ｏ（７５ｍＬ）に分けた。ＣＨ２Ｃｌ２を用いて再び水層を抽出し、結合有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）と塩水（７５ｍＬ）で洗浄した。次にその有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させて、所望の塩化物を産出した（４．８５ｇ、８４％）。
【０１１６】
【化１８】
2005511535.tif 000017
【０１１７】
5-アミノ-1-（2,6-ジクロロフェニル）-3−イソプロピル-1H-ピラゾール-4-カルボニトリルの合成:
ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中（１−クロモ‐２-メチルプロピリデン）メタン-1,1−ジカルボニトリル（９．４ｇ、６１ｍｍｏｌ）の溶液を2,6-ジクロロフェニルヒドラジンヒドロクロリド（１３．０ｇ、６１ｍｍｏｌ）で処理し、次いでトリエチルアミン（１２．３ｇ、１２２ｍｍｏｌ）で処理した。次に、その反応を加熱し、１８時間還流した。次にその反応を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）と１Ｎ ＮａＯＨ（１００ｍＬ）に分けた。ＥｔＯＡｃ（２×１５０ｍＬ）を用いて水層を抽出し、その結合有機層を１０％クエン酸水溶液（１５０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１５０ｍＬ）及び塩水（１５０ｍＬ）で洗浄した。その有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして蒸発させた。その粗生成物をＥｔＯＡｃ/ヘキサンから再結晶化し、所望のピラゾール（１１．２ｇ、６２％）を産出した。
【０１１８】
【化１９】
2005511535.tif 000018
【０１１９】
5-アミノ-1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-イソプロピル-1Ｈ-ピラゾール-4-カルボン酸アミドの合成：
5-アミノ-1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-イソプロピル-1Ｈ-ピラゾール-4-カルボニトリル（１５ｇ、５０ｍｍｏｌ）を濃縮 Ｈ２ＳＯ４（４５ｍＬ）中に取り出し、室温で１６時間撹拌した。その反応を３Ｎ ＮａＯＨ（８５０ｍＬ）上に０℃で注いだ。得られた個体をろ過紙、Ｈ２Ｏ（１Ｌ）で洗浄した。次に、その生成物を真空乾燥して所望のアミド（１４ｇ、８８％）を産出した。
【０１２０】
【化２０】
2005511535.tif 000019
【０１２１】
1-（2,6-ジクロロフェニル）-6-（4-ヒドロキシベンジル）-3-イソプロピル-1,5-ジヒドロピラゾール[3,4-d]ピリミジン-4-オンの合成：
ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中5-アミノ-1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-イソプロピル-1Ｈ-ピラゾール-4-カルボン酸アミド（５．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、エチル 4-ヒドロキシフェニルアセテート（８．６ｇ、４８ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、ＮａＯＥｔ（２．６６Ｍ、ＥｔＯＨ中、３６ｍＬ、９６ｍｍｏｌ）を添加した。次にその反応を加熱し、３時間還流した。次にその反応を室温まで冷却し、１０％のＨＯＡｃ水溶液（１００ｍＬ）に注いだ。次に、得られた懸濁液を０℃に冷却し、濾過した。その析出物を１：１ＭｅＯＨ/Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）及び１：１ Ｅｔ２Ｏ/ヘキサン（７５ｍＬ）で洗浄した。その固体を真空乾燥し、所望の生成物を産出した（５．２ｇ、７６％）。
【０１２２】
【化２１】
2005511535.tif 000020
【０１２３】
tert-ブチル 4-{[1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-（メチルエチル）-4-オキソ-5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル]メチル}ベンゼンホスフェートの合成：
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中1-（2,6-ジクロロフェニル）-6-（4-ヒドロキシベンジル）-3-イソプロピル-1,5-ジヒドロピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-オン（２．５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）に、ジtert-ブチルN,N-ジイソプロピルホスホラミダイト（３．４ｍＬ、１０．７ｍｍｏｌ）及びテトラゾル（１．８２ｇ、２６ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物を室温で３時間撹拌し、次にＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中3-クロロ過安息香酸（５７〜８０％、２．２ｇ、７．２ｍｍｏｌ）の溶液で処理した。次にその反応物を室温で１５分間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）及び１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（７５ｍＬ）に分けた。その有機層を１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（５０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（５０ｍＬ）及び塩水（７５ｍＬ）で洗浄した。次に有機層を乾燥（MgSO4）し、濾過し、蒸発させた。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、５０％ＥｔＯＡｃ/ヘキサン）によって精製して所望のホスフェート（２．７ｇ、７５％）を産出した。 
【０１２４】
式ＩＩ
【化２２】
2005511535.tif 000021
【０１２５】
1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-（メチルエチル）-6-{[4-（ホスホノオキシ）フェニル]メチル}-5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-4-オンの合成：
tert-ブチル 4-{[1-（2,6-ジクロロフェニル）-3-（メチルエチル）-4-オキソ-5-ヒドロピラゾロ[5,4-d]ピリミジン-6-イル]メチル}ベンゼンホスフェート（２．７ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を９０％トリフルオロ酢酸水溶液（２５ｍＬ）に溶解した。その反応物を室温で１時間撹拌し、次いで蒸発させ、トルエン（３×５０ｍＬ）と共沸し、遊離ホスフェート（２．１５ｇ、９７％）を産出した。  
【０１２６】
【化２３】
2005511535.tif 000022
【０１２７】
1-[4-（2-クロロエトキシ）フェニル]エタノンの合成：
アセトン（８００ｍＬ）中4’-ヒドロキシアセトフェノン（１０１ｇ、０．７４ｍｏｌｅ）に、1-ブロモ-2-クロロエタン（６３８ｇ、４．４５ｍｏｌｅ）を添加し、次いでＫ２ＣＯ３（３０７ｇ、２．２２ｍｏｌｅ）を添加した。その反応物を４８時間加熱して還流させ、濾過した。Ｋ２ＣＯ３をアセトン（１Ｌ）で洗浄し、濾過物を蒸発させた。次に残留物をＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）と１Ｎ ＮａＯＨ（２５０ｍＬ）に分けた。有機層を１Ｎ ＮａＯＨ（２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、蒸発させて１４６ｇの所望の生成物を得た（収率９９％）。
【０１２８】
【化２４】
2005511535.tif 000023
【０１２９】
1-[4-（2-クロロエトキシ）フェニル]-4,4,4-トリフルオロブタン-1,3-ジオンの合成：
ＴＨＦ（４００ｍＬ）中1-[4-（2-クロロエトキシ）フェニル]エタノン（４０．５ｇ、２０４ｍｍｏｌ）の溶液中に、０℃でエチル2,2,2-トリフルオロアセテート（３４．８ｇ、２４５ｍｍｏｌ）を添加した。ＥｔＯＨ（７７ｍＬ、２０４ｍｍｏｌ）中ＮａＯＥｔの２１ｗｔ．％溶液を、添加漏斗を介して１時間かけて滴下した。氷浴を除去し、その反応物を一晩室温に温めた。Ｈ２Ｏ（４００ｍＬ）を添加し、濃ＨＣｌを添加することによってｐＨを２に調整した。混合物をＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）を用いて抽出した。結合有機層を塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、次に減圧下で濃縮してジケトンを黄褐色の固体として得た（５９．３ｇ、収率９８％）。
【０１３０】
【化２５】
2005511535.tif 000024
【０１３１】
2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]-4-ニトロインダン（nitroindan）-1,3-ジオンの合成：
無水酢酸（１１４ｍＬ）中1-[4-（2-クロロエトキシ）フェニル]-4,4,4-トリフルオロブタン-1,3-ジオン（５９．３ｇ、２０１ｍｍｏｌ）及び3-ニトロ無水フタル酸（３８．９ｇ、２０１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（４１ｇ、４０３ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物は、ゆっくりと深赤色になり、均質になった。その反応物を一晩室温まで温めた。その反応混合物を０℃に冷却し、２Ｎ ＨＣｌ（６００ｍＬ）をゆっくりと添加した。褐色の粒状ｐｐｔが得られるまで、その混合物を室温で４５分間激しく撹拌した。濾過によって褐色の固体を回収し、Ｈ２Ｏ （２５０ｍＬ）中に再懸濁し、２０分間撹拌した。その褐色の固体を濾過し、真空下で乾燥した。粗反応生成物をEtOH （５００ｍＬ）中に懸濁させ、次いで沸騰するまで加熱した。その溶液はゆっくりと深赤色になり、その固体は、明黄色になった。懸濁液を室温まで冷却させた。その生成物を濾過により回収し、真空下で乾燥し、明黄色の固体としてトリケトンを得た（４５ｇ、収率６０％）。
【０１３２】
【化２６】
2005511535.tif 000025
【０１３３】
4-アミノ-2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]インダン-1,3-ジオンの合成:
ＴＨＦ（１２００ｍＬ）中2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]-4-ニトロインダン（nitroindan）-1,3-ジオン（２７ｇ、７２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、アルゴン下で１０％ Ｐｄ/Ｃ（２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を添加した。アルゴンを抽出し、Ｈ２のバルーンで置換した。その反応を一晩撹拌し、触媒を濾過によって除去した。その溶液を減圧下で蒸発させ、所望のアニリンを黄色の固体として得た（２４ｇ、収率９８％）。
【０１３４】
【化２７】
2005511535.tif 000026
【０１３５】
モルフォリン-4-イルカルバミン酸4-ニトロフェニルエステルの合成:
ＣＨ２Ｃｌ２（３５０ｍＬ）中4-ニトロフェニルクロロホルマート （２７．８ｇ、０．１４ｍｏｌｅ）の溶液に、０℃でＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中4-アミノモルフォリン（１０．２ｇ、０．１ｍｏｌｅ）とトリエチルアミン（１０．２ｇ、０．１ｍｏｌｅ）の溶液を１時間かけて添加漏斗で添加した。添加中に白色ｐｐｔが形成された。添加完了後、氷浴を除去し、その反応物をさらに１時間撹拌した。固体を濾過によって回収し、Ｅｔ２Ｏに再懸濁し、濾過し、所望の生成物を白色の固体として得た（１５ｇ、収率６２％）。
【０１３６】
【化２８】
2005511535.tif 000027
【０１３７】
1-{2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]-1,3-ジオキソ-インダン-4-イル}-3-モルフォリン-4-イル-尿素の合成：
ＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）中4-アミノ-2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]インダン-1,3-ジオン（３６ｇ、１０５ｍｍｏｌ）に、モルフォリン-4-イルカルバミン酸4-ニトロフェニルエステル（４０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで4-ジメチルアミノピリジン（６４０ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を添加した。次に、その反応を加熱して４時間還流し、次いで室温まで冷却し、一晩撹拌した。明黄色の固体を濾過により回収し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、真空下で乾燥して所望のセミカルバジドを得る（４０．５ｇ、収率８２％）。
【０１３８】
【化２９】
2005511535.tif 000028
【０１３９】
1-{3-[4-（2-クロロエトキシ）フェニル]-4-オキソ-2,4-ジヒドロインデノ [1,2-c]ピラゾール-5-イル}-3-モルフォリン-4-イル尿素の合成：
ＥｔＯＨ（４２５ｍＬ）中1-{2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]-1,3-ジオキソ-インダン-4-イル}-3-モルフォリン-4-イル-尿素（３９ｇ、８２．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ヒドラジンモノヒドレート（２０．７ｇ、４１３ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＡｃＯＨ（９．９ｇ、１６５．３ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物を加熱し、４８時間還流した。その反応物を室温まで冷却した。黄色の固体を濾過によって回収し、ＥｔＯＨですすぎ、真空下で乾燥した。その固体をＴＨＦ（１０００ｍＬ）中に懸濁し、１Ｎ ＨＣｌ（５００ｍＬ）を添加した。得られた懸濁液を９０分間撹拌した。塩水（５００ｍＬ）を添加し、５０％ NaOHを用いてｐＨを１３に調整した。その層を分離し、水層をＴＨＦ（２×３００ｍＬ）で洗浄した。結合有機層を１Ｎ ＨＣｌ/塩水（１×２５０ｍＬ、１：１）で洗浄し、次いで塩水（１×２５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で濃縮した。黄色の固体をＥｔ２Ｏを用いて倍散し、次いで真空下で乾燥し、所望のピラゾールを得た（２３．５ｇ、収率６１％）。
【０１４０】
【化３０】
2005511535.tif 000029
【０１４１】
1-（3-{4-[2-（シクロプロピルメチループロピルアミノ）エトキシ]フェニル}-4-オキソ-2,4-ジヒドロインデノ[1,2-c]ピラゾール-5-イル）-3-モルフォリン-4-イル尿素の合成：
ＤＭＳＯ（２００ｍＬ）中1-{2-[4-（2-クロロエトキシ）ベンゾイル]-1,3-ジオキソ-インダン-4-イル}-3-モルフォリン-4-イル-尿素（３６ｇ、７７ｍｍｏｌ）の溶液に、（シクロプロピルメチル）プロピルアミン（３３ｍＬ、２３１ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物を６日間７０℃まで加熱し、次に室温まで冷却し、Ｈ２Ｏ（１Ｌ）に注いだ。得られた析出物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄した。次に粗生成物を３Ｎ ＨＣｌ（１．５Ｌ）中に取り出し、２０％ ＭｅＯＨ/ＣＨ２Ｃｌ２（３×１Ｌ）を用いて抽出した。次に水層を固体ＮａＯＨを用いて塩基性（ｐＨ＝１２）にした。次に得られた析出物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥し、３０．７ｇの所望の生成物を得た（収率７３％）。
【０１４２】
【化３１】
2005511535.tif 000030
【０１４３】
化合物Ｒの合成
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、酸（１．４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）及びアミン（０．８ｇ、２．６ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ（０．８ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＨＢＴＵ（１．５ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を室温で２４時間撹拌し、酢酸エチル/１Ｎ ＮａＯＨに分けて注いだ。酢酸エチルを用いて水層を抽出した。有機抽出物を１Ｎ ＨＣｌで洗浄し、乾燥し、濃縮して油を得た。粗油をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、アジ化物を無色の油（０．９ｇ）として得た。
【０１４４】
【化３２】
2005511535.tif 000031
【０１４５】
そのアジ化物（０．９ｇ、１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ/水（１０／０．５ｍＬ）に溶解した。Ｐｈ３Ｐ（０．４５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を５０％ＮａＯＨ溶液に注ぎ、酢酸エチルを用いて抽出した。有機抽出物を乾燥し、濃縮した。イソプロパノール中３N ＨＣｌを用いてヒドロクロリド塩を作成した。固体（化合物Ｒヒドロクロリド）をＭｅＯＨ中に取り出し、エーテルを用いて析出させた。その固体を濾過し、乾燥させて生成物を得た（０．７９ｇ）。
【０１４６】
アッセイプロトコル及び結果
ヨウ化プロピジウム及びＢｒｄＵを用いた細胞周期分析
ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより２Ｎ又は４Ｎ 相補ＤＮＡをもつ細胞の数を定量化することによって細胞周期のＧ１、Ｓ及びＧ２／Ｍの段階の細胞のパーセンテージを測定した。細胞周期全体にわたる、ｃｄｋ阻害剤への曝露に対応した細胞の分布の変化をこの方法で評価した。
【０１４７】
細胞をヨウ化プロピジウムで染色する方法
３セットのＨＣＴ−１１６細胞（100,000 個/セット）を試験化合物の存在下でＴ−２５フラスコ中で下記の表１にしたがって培養した。分析は、２４、４８、７２時間後に行った。トリプシン化することによって接着細胞を回収し、Falcon 12 x 75 フローサイトメトリックチューブ内で浮遊細胞と結合し、遠心分離によって回収した。培地を細胞ペレットからデカントし、１００μｌのＰＩ染色を加え、その細胞を３７℃で２０〜２５分間インキュベートした。好ましい細胞数は、２×１０6〜４×１０６/ｍｌ程度であった。次に等体積（１００μｌ）のＰＩ塩を細胞に添加し、これを４℃で１〜２時間インキュベートした。染色された細胞をBecton Dickinson FACScan フローサイクロメータで分析した。サンプルは、遮光しておいた。
表１：化合物の濃度
【０１４８】
【表１】
2005511535.tif 000032
【０１４９】
ＢｒｄＵのＤＮＡへの組み込みの決定
この方法は、ヌクレオチド類似体ＢｒｄＵを、新たに合成されたＤＮＡに細胞周期のＳ段階を進行する細胞として組み込んだ、細胞のパーセンテージを測定した。ＢｒｄＵ組み込みの阻害を、Ｓ段階の進行およびＤＮＡ複製に及ぼすｃｄｋ阻害剤の効果の測定値として用いた。
【０１５０】
ＢｒｄＵ標識の方法
３セットのＨＣＴ−１１６細胞（100,000 個/セット）をＴ−２５フラスコ中で平板培養し、上記試験化合物とともにインキュベートした。分析は、２４、４８、７２時間後に行った。１０ｍｇ／ｍｌの貯蔵物からＢｒｄＵを各Ｔ−２５フラスコに添加し、最終濃度を１０Ｍとし、その細胞を３７℃で１６〜１８時間さらにインキュベートした。次にその細胞を製造者のプロトコル（BrdU Flowキット、BD-Pharmingen カタログ# 2354KK）にしたがって、下記のようにフローサイトメトリック分析を行った。
【０１５１】
細胞（接着細胞及び浮遊細胞）を上記のようにＴ２５フラスコから直接Falcon 12 x 75 フローサイトメトリック管に収集し、次いで、さらに１００μｌのCytofix /Cytoperm緩衝剤を用いた固定及び透過処理（３０分間、室温）を行った。次にその細胞を１ｍｌのPerm Wash緩衝剤で洗浄し、その細胞ペレットを１００μｌのCytoperm Plus緩衝剤中に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。その細胞を１ｍｌのPerm Wash緩衝剤で再び洗浄し、１００μｌのCytofix /Cytoperm緩衝剤中で室温で１０分間、固定を繰り返した。次に、その細胞を１ｍｌのPerm Wash緩衝剤を用いて洗浄した。次にその細胞を３７℃で１時間１００μｌのDNaseを用いて処理して、組み込まれたＢｒｄＵを露出させ、次いで、１ｍｌのPerm Wash緩衝剤を用いた別の洗浄工程を行った。組み込まれたＢｒｄＵの存在は、α-ＢｒｄＵ-ＦＩＴＣ抗体（Perm Wash緩衝剤中抗体の５０μlの１：５０希釈液）によって明らかにされた。細胞を遮光し室温で２０〜３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を１ｍｌのPerm Wash緩衝剤で洗浄し、ＰＢＳ中３００μに１ｍｌの２％ＦＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメータで分析した。結果を表２に示す。
【０１５２】
【表２】
2005511535.tif 000033
【０１５３】
ヒト腫瘍細胞ラインのＮＣＩパネルにおけるＣｄｋ阻害剤の評価
National Cancer Instituteにおける、６０の細胞ラインのパネルの化合物の評価によって、広範な腫瘍の種類及び遺伝子的バックグラウンドの効力に関する豊富な情報が提供される。このパネルには、白血病、メラノーマ及び肺、結腸、脳、卵巣、乳房、前立腺及び腎臓の癌由来の細胞ラインが含まれている。このパネルを使用することによって、ｐ５３及びＨｅｒ２/Ｎｅｕを含む癌化と関連する多くの遺伝子、ならびに代謝に関与する遺伝子及び多剤耐性を付与する遺伝子の改変が、細胞中の化合物の効果の測定値に提供される。これらの細胞ラインにおいて生成されたデータは、下記のプロトコルとともに化合物の活性を評価するために用いることができる。
【０１５４】
インビトロ癌スクリーンの方法
１０％ ＦＣＳを含むRPMI-1640中で細胞を成長させ、５，０００〜４０，０００細胞/ウェルの密度範囲で、９６ウェルマイクロタイタープレート内で平板培養した。そのプレートを２４時間３７℃で、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。所望の最終濃度の２倍の化合物を含有する培地（５用量、４ログスパン）を調製し、１００μｌを、培地と細胞１００μｌを含有する各ウェルに添加して、所望の最終濃度とした。次にそのプレートをさらに４８時間インキュベートした。
【０１５５】
その化合物の細胞生存度に及ぼす効果を、蛋白質の合計を測定するSulforhodamine Ｂ（ＳＲＢ）アッセイを用いて測定した。細胞を冷ＴＣＡを用いて、最終濃度を１０％に固定し、４℃で６０分インキュベートした。上清を捨て、プレートを水で５回洗浄し、空気乾燥した。１％酢酸中４％（w/v） ＳＲＢ溶液を各ウェルに添加し、そのプレートを１０分間室温でインキュベートした。そのプレートを５回１％酢酸で洗浄し、空気乾燥した。その結合した染色剤を１０ｍＭのtrizma塩基で可溶化し、その吸収度をプレートリーダーで５１５ｎＭで読み取った。結果を下記の表３（ＮＣＩパネル）に示した。
【０１５６】
ＨＣＴ−１１６細胞を用いたクローン原性生存アッセイのプロトコル
このアッセイは、特定の露出期間後に生存度の不可逆的な損失をもたらす化合物の濃度を決定するために用いられた。
【０１５７】
培地（RPMI-1640、１０％ＦＣＳ、pen/strep）を水浴で３７℃に予め温めた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、成長させた。細胞をトリプシン処理によってサブコンフルエントプレートから回収し、血球計数器を用いて計数した。１５ｃｍの組織培養皿中２５ｍｌの培地で１×１０４個の細胞を平板培養した。１４個のプレートを各試験化合物のために準備し、３７℃で一晩インキュベートした。その化合物を希釈し、７つの濃度の培地とした。細胞上のその培地を試験化合物を含有するものと取り換えた。試験すべき化合物の各濃度に２つのプレートならびに化合物を含有しない２つの対照プレートを準備した。プレートを上記のように２４時間インキュベートし、培地を除去し、新鮮な培地と取り換え、そのプレートをさらに７日間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。コロニーを結晶バイオレット溶液（０．４％結晶バイオレット、２０％エタノール）で５分間染色し、希釈水で２回洗浄し、計数を行った。結果を表２に示す。
【０１５８】
血清蛋白質の存在下及び非存在下でのＣｄｋ阻害剤の評価のためのカルセインＡＭ生存度アッセイの使用
細胞生存度の損失によって測定されたＣｄｋ阻害剤の効力を、カルセインＡＭアッセイ（Molecular Probes）を用いて測定した。カルセインＡＭは、細胞内エステラーゼの基質であり、蛍光プレートリーダーを用いて定量することができる蛍光生成物を生成するために、生存可能な細胞のみにおいて切断される。蛍光シグナルは、製造可能な細胞の数、よって細胞のＣｄｋ阻害剤への露出に応答するシグナルの損失に比例する。このアッセイは、細胞周期の阻止と生存度の損失とを区別する。したがって、Ｃｄｋ阻害剤の評価に好適である。
【０１５９】
細胞のＩＣ50をヒト直腸結腸癌細胞ラインＨＣＴ−１１６、正常ヒト線維芽細胞ＩＭＲ９０６において測定した。ＩＣ50を調整された蛋白質もＨＣＴ−１１６中で測定した。結果を表３（ＨＣＴ−１１６（調整された、生存度/蛋白質） 及びＩＭＲ−９０）に示す。
【０１６０】
カルセインＡＭ生存度アッセイのためのプロトコル
ＨＣＴ−１１６又はＩＭＲ９０細胞をトリプシン処理によってサブコンフルエントプレートから回収し、１，０００又は４，０００細胞をそれぞれ２４ウェル皿で平板培養した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＨＣＴ−１１６細胞は、RPMI-1640、１０％ＦＣＳで培養し、ＩＭＲ９０細胞は、最小必須培地α１０％ＦＣＳで培養した。一晩インキュベートして接着させた後、その培地を各ウェルから吸引し、試験化合物を濃度０〜２５０ｎＭ、７つの用量の合計の範囲で含有する培地と取り換えた。そのプレートをインキュベータに戻し、さらに２日培養した。蛋白質調整ＩＣ50’の測定に用いられる培地は、RPMI-1640、１０％ＦＣＳ、及び１ｍｇ/ｍｌのα酸性糖蛋白質（Sigma G-9885）及び４５ｍｇ/ｍｌヒト血清アルブミン（Sigma A3782）であった。試験化合物とともに７２時間インキュベートした後、その細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、特殊の処置を施して、全ての残留緩衝剤を除去した。
【０１６１】
５０μｇアリコートのカルセイン（Molecular Probes catalog # C3100）を５０μｌのＤＭＳＯ中に溶解させることによって、５μＭカルセインＡＭ溶液を調製した。カルセインを完全に溶解した後（室温で１０分）、１０ｍｌのＰＢＳ中に希釈した。カルセイン/ＰＢＳ（０．５ｍｌ）を各ウェルに添加した。そのプレートを３７℃で７５分間インキュベートし（遮光）、蛍光シグナルを蛍光プレートリーダー上に読み取った（励起４８５/２０及び発光５３０／２５）。
【０１６２】
【表３】
2005511535.tif 000034
【０１６３】
阻止された細胞アッセイ
サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）活性は、細胞分裂周期の明確な段階を経る細胞の進行を促進することが要求されている。培養液中の正常の未変換型の細胞の増殖は、成長因子の存在が必要であり、血清の欠乏によりそれが除去されると、Ｃｄｋ活性の損失が起こり、その結果、細胞が静止段階Ｇ０に入ると細胞周期が終了する。したがって、メカニズムの見地から、Ｃｄｋ阻害剤は、それらのサイクルの対応物に関して阻止された細胞における効力を大いに減少させたはずである。
【０１６４】
阻止された腫瘍（HCT-116）及び正常（IMR90）細胞についての化合物効力の低下
化合物効力の評価のための血清飢餓によるHCT-116及びIMR90細胞の阻止
【０１６５】
ＨＣＴ−１１６細胞を３組平板培養し、そのそれぞれにおいて、１０％ウシ胎児血清を２４ウェル皿のウェル１個につき２００個もしくは２０００個の密度で細胞を含有するＲＰＭＩ1640培地中において試験される化合物の各濃度とし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。１ウェルあたり２０００個の細胞を含有するプレートからの培地を取り除き、細胞を、血清を含む培地で１回洗浄し、１ｍｌの血清を含まない培地を細胞上においた。細胞を含有するプレートを、血清の存在下及び非存在下の両方で、さらに６日間インキュベートした。
【０１６６】
ＩＭＲ９０細胞を３組平板培養し、そのそれぞれにおいて、１０％ウシ胎児血清を２４ウェル皿のウェル１個につき２０００個もしくは２００００個の密度で細胞を含有するＭＥＭα培地中において試験される化合物の各濃度とし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。１ウェルあたり２００００個の細胞を含有するプレートからの培地を取り除き、細胞を血清を含む培地で１回洗浄し、血清を含まない培地を細胞上においた。細胞を含有するプレートを、血清の存在下及び非存在下の両方で、さらに３日間インキュベートした。
【０１６７】
細胞周期阻止及び生存度の同時評価のための血清飢餓によるＨＣＴ−１１６及びＩＭＲ９０細胞の阻止
血清が離脱するとすぐ細胞が実際に細胞周期を励起したことを確認するために、Ｓ段階を経て進行する細胞を示すＢｒｄＵ陽性細胞のパーセンテージを各実験において測定した。この実験の目的のために、細胞生存度を、生存している細胞のみで活性を示す細胞内エステラーゼの蛍光基質であるSNARF-1を用いて同時に評価した。あわせて、ＢｒｄＵ組み込み及びSNARF-1切断のフローサイトメトリーによる評価は、単一細胞ベースで阻止された細胞の生存度を判定した。この分析のために、細胞を下記のようにSNARF-1で染色し、次いで上記のＢｒｄＵ組み込みの測定のための準備を行った。
【０１６８】
ＨＣＴ−１１６細胞及びＩＭＲ９０細胞を下記の濃度で血清含有培地（１０％ＦＣＳをそれぞれ有するＲＰＭＩ-1640又はＭＥＭα）の入ったＴ２５フラスコ中で平板培養した。成長２４時間後、この培地を除去し、その細胞を洗浄し、血清を含まない培地と取り換えた。
【０１６９】
HCT-116 + FCS 5,000細胞
HCT-116 - FCS 100,000細胞
IMR90 + FCS 100,000細胞
IMR90 - FCS  200,000細胞
【０１７０】
ＢｒｄＵでパルスする前に、ＩＭＲ９０細胞をさらに３日間、ＨＣＴ−１１６はさらに６日間成長させた。５０μｇのSNARF-1（Molecular Probes カタログ番号#C1272）アリコートを室温で１０分間５０μｌのＤＭＳＯに溶解し、次に１０ｍｌのＰＢＳ中に希釈した。SNARF-1をさらに1:64,000に希釈し、その後２００μｌを血清の存在下又は非存在下で各管の細胞に添加し、ＢｒｄＵとともに２０時間パルスした。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後３ｍｌのＰＢＳで洗浄した。
【０１７１】
次にこれらの細胞を固定し、上記のＢｒｄＵ組み込みの測定のための準備を行った。生存可能（FL-2）細胞及びＢｒｄＵ陽性 （FL-1）細胞のパーセンテージをFACScanフローサイトメータで測定した。結果を下記の表４に示す。
【０１７２】
【表４】
2005511535.tif 000035
【０１７３】
阻害アッセイ
酵素Ｃｄｃ２/サイクリンＢは、市販のものを取得した。Ｃｄｋ２/ｈｉｓ-サイクリンＥshortはＳｆ９細胞中で発現させた。Ｃｄｋ２/サイクリンＡ、ｃｄｋ４/サイクリンＤ１及びｃｄｋ６/サイクリンＤ２は、Ｓｆ９細胞中で発現させた。蛋白質キナーゼＡ（触媒性サブユニット、ウシ心臓由来）及び蛋白質キナーゼＣ（ラット脳由来のイソザイムと混合）を市販のものを取得した。 
【０１７４】
基質：Histone Ｈ１を市販のものを取得した。ＧＳＴ−Ｒｂは、Ｒｂ蛋白質の残基３７９〜９２８のＮ-末端に融合したグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼである。
【０１７５】
アッセイ：アデノシン[γ-32Ｐ]トリホスフェートからの放射性活性のHistone H1へのＴＣＡ沈降アッセイを用いた組み込みを測定することによって、Ｃｄｃ２/サイクリンＢ活性を測定した。Ｃｄｃ２/サイクリンＢキナーゼ及びHistone Ｈ１は市販のもを取得した。最終アッセイ溶液は、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、５０μＭアデノシントリホスフェート、２μＣｉ３２Ｐ、１０％ジメチルスルホキシド（化合物由来）、ｐＨ７．５の２０μｇのHistone Ｈ１、６Ｕ酵素を５０μＬ体積中に含有していた。化合物を１ｍＭ〜１０ｍＭの間の種々の濃度で添加した。酵素を添加し反応を開始し、２０分間３０℃で反応を続け、さらに２０μＬの停止溶液（２３７ｍＭエチレンジアミン四酢酸時ナトリウム、１０５ｍＭアデノシントリホスフェート、ｐＨ８．０）を添加することによってその反応を停止した。３５μＬの７０％（w/v）トリクロロ酢酸を添加することによって蛋白質を沈降させ、その沈降物を９６ウェルのガラスファイバフィルタプレート（Millipore, Inc.）上で捕獲し、それを２５％（w/v）トリクロロ酢酸を用いて湿潤させた。そのフィルタを２５％（w/v）トリクロロ酢酸を用いて１０回洗浄し、１００μＬのシンチラント（Microscint 20, Packard Instruments）を添加した後、組み込まれた３２Ｐの量をシンチレーション計数によって測定した。化合物の存在下で組み込まれた放射活性の量をＤＭＳＯのみを含有し、化合物を含まない対照実験において組み込まれた放射活性の量で割ることによって、相対的活性を測定した。化合物の代わりに５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む実験において測定されたバックグラウンドの放射活性は、計算する前に全ての結果から引いた。５０％阻害（ＩＣ50）を示す化合物の濃度は、データを標準式（下記数式１）に当てはめることによって測定した。
【０１７６】
P = min + （max ? min） （1/（1 + （IC50 / [I]）s））  （数1）  
【０１７７】
式中、Ｐ＝１、相対的活性は、相対的阻害率である。[Ｉ]は、化合物の濃度であり、max 及びmin は、最大及び最小相対的阻害率（それぞれ１及び０）を表し、ｓは、いわゆるHillスロープである。
【０１７８】
Ｃｄｋ２/サイクリンＥ、Ｃｄｋ４/サイクリンＤ１及びＣｄｋ６/サイクリンＤ２活性を、グルタチオン-セファロース捕獲アッセイを用いて測定した。酵素をＳｆ９インセクト細胞中でヘテロダイマーとして発現させた。基質（ＧＳＴ−Ｒｂ）は、E. coli.中で発現したＲｂ網膜芽細胞腫蛋白質の残基３７９〜９２８に融合したグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼである。アッセイ溶液は、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、５０μＭアデノシントリホスフェート、２μＣｉ[32Ｐ]アデノシントリホスフェート、１０％ジメチルスルホキシド（化合物由来）、ｐＨ７．５の４０μｇのＧＳＴ−Ｒｂ、及び酵素を体積１００μＬ中に含有していた。化合物を１ｍＭ〜１０ｍＭの間の種々の濃度で添加した。その反応を３０℃で１５分間進め、７０μＬの停止溶液（２３７ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム、１０５ｍＭアデノシントリホスフェート、ｐＨ８．０）を添加することによってその反応を停止した。グルタチオン−セファローズビーズ（Amersham）に結合させることによって、１１０分間ＧＳＴ−Ｒｂを捕獲した。その懸濁液を、ガラスファイバーフィルターを通して濾過した。保持されたビーズを０．３  ％（w/v）Tween-20を含有するリン酸緩衝液を用いて５回洗浄した後、１００μＬのシンチラントを添加した後、組み込まれた３３Ｐの量をシンチレーション計数によって測定した。化合物の存在下で組み込まれた放射活性の量をＤＭＳＯのみを含有し、化合物を含まない対照実験において組み込まれた放射活性の量で割ることによって、相対的活性を測定した。化合物の代わりに５０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ジナトリウムを含む実験において測定されたバックグラウンド放射活性を計算する前に全ての結果から引いておいた。５０％阻害（ＩＣ50）を示す化合物の濃度は、データを標準式（１）に当てはめることによって測定した。
【０１７９】
Histone Ｈ１を基質としたＴＣＡ沈降アッセイを用いて、蛋白質キナーゼＣと蛋白質キナーゼＡをアッセイした。蛋白質キナーゼＡについては、最終アッセイは、５０ｍＭ トリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．５の１２μＭアデノシントリホスフェート、１０％（w/v）ジメチルスルホキシド（化合物由来）、２０μｇのHistone Ｈ１、２μＣｉ[３２Ｐ]アデノシントリホスフェート、０．２Ｕ蛋白質キナーゼＡを１００μＬアッセイ中に含有していた。蛋白質キナーゼＣアッセイは、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、０．８ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５の５μＭアデノシントリホスフェート、１０％（w/v）ジメチルスルホキシド（化合物由来）、２０μｇのHistoneＨ１、２μＣｉ[３２Ｐ]アデノシントリホスフェート、０．０１Ｕ蛋白質キナーゼＣを５０μＬアッセイ中に含んでいた。酵素を添加することによってアッセイを開始し、３０℃で１０分間反応させ、０．４体積の２３７ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム、１０５ｍＭアデノシントリホスフェート、ｐＨ８．０を添加することによってその反応を停止した。０．５体積の７５％（w/v）トリクロロ酢酸を添加することによって、停止させた反応から蛋白質を沈降させ、９６ウェルガラスファイバー濾過器（Millipore）を介して濾過した。２５％（w/v）トリクロロ酢酸でフィルタを１０回洗浄し、組み込まれた[３２Ｐ]ホスフェートを１００μlの Microscintを添加して測定し、シンチレーション計数を行った。５０％阻害率（ＩＣ50）を示す化合物の濃度は、データを式（1）に当てはめることによって求めた。
【０１８０】
上記アッセイの結果を表５に示した。
【０１８１】
【表５】
2005511535.tif 000036
【０１８２】
ＨＣＴ１１６異種移植腫瘍モデル
本発明の薬剤、化合物を生物分解性の賦形剤中に合成し、静脈内投与用に調製した。ＣＰＴ−１１（Camptosar(商標名)、Pharmacia）を医薬品として取得し、５％デキストローゼ−水（Ｄ５Ｗ）中に調製した。全ての調剤は、１週間ごとに新鮮にし、注入量は体重によって調製した（０．２ｍｌ/２０ｇマウス）。
【０１８３】
Mice/Husbandry. メスnu/nuマウスは、Charles Riverから取得し、静的マイクロアイソレータ内に収容し、適宜に水及び照射された標準的なげっ歯動物用の食餌（Purina Pico-Lab Rodent Diet 20）を与えた。
【０１８４】
最大耐用量（ＭＴＤ）の測定。８週齢のマウスを５〜８例ずつの群に分け、未知の試験化合物を用いて予備毒性試験を行った。動物に対して連続１０日間、試験化合物を用いて静脈注射により処置し、週２回秤量した。薬物に関連するあらゆる副作用についてマウスの臨床徴候を頻繁に調べた。マウスにおける抗癌剤に対する許容可能な毒性は、ＮＣＩによって、２０％を超える群の平均体重減少がないこと、及び治療動物における中毒死が１０％以下であることと定義されている。
【０１８５】
腫瘍の移植。nu/nu マウスに１ｍｍ３のＨＣＴ１１６ヒト結腸カルシノーマ断片を皮下に隣接して移植した。あるいは、５〜１０×１０６組織培養由来の細胞を移植した。最初は週２回、その後腫瘍が所望の大きさである約１００ｍｇに達したときからは、毎日モニターした。腫瘍が計算された腫瘍重量で６２〜２２１ｍｇに成長したとき、その動物を適切な実験治療群（１０匹/群）に分け、試験化合物を用いた治療を開始した。
【０１８６】
デジタルキャリパーを用いて腫瘍の長さと幅を測定し、下記式を用いて推定腫瘍重量を計算した。
【０１８７】
腫瘍重量（ｍｇ）＝（w2 x l）/2 
【０１８８】
式中ｗは、ＨＣＴ１１6腫瘍の幅（ｎｍ）、ｌは、ＨＣＴ１１６腫瘍の長さ（ｎｍ）を表す。
【０１８９】
治療計画。前のＭＴＤ研究から集めたデータによって決定した用量を用いて、試験化合物をルーチン的にスクリーニングした。標準的な治療プロトコルには、１０日連続で毎日、試験化合物を静脈投与することが必要とされていた。Camptosar（登録商標）（３６ｍｇ/ｋｇ）を陽性対照として用いて、合計で５用量を隔日に静脈投与した。腫瘍重量を計算し、体重を週２回記録し、副作用がないか動物を頻繁に観察した。腫瘍の質量が１．５ｇに達した動物はすべて、直ちに安楽死させた。全ての治療は、１日目に開始した。実験は最長６１日目まで続けることを可能とした。図１は、このアッセイにおいて本発明のいくつかの化合物を達成するための結果を示す。
【０１９０】
標的分子と化合物との間のアフィニティの測定
本明細書に提案された使用のための所与の化合物が適切かどうかを確認するために、そのような化合物の、もしあればその公知の結合パートナーとの結合特性の特徴を明らかにすることが有用かもしれない。しかしながら、これは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１９１】
化学化合物の、それらの対応する結合パートナーに対するアフィニティを、例えば、BIACORE? アッセイシステム（Biacore AB、Uppsala、SE）を用いて測定してもよい。例えば、Affinity Sensors （Cambridge、UK）によって開発されたものなどの、定量的に類似する結果をもたらす他のシステムは、当該技術分野の当業者にとって容易に明らかとされる。
【０１９２】
代表的な手続きにおいて、結合化合物Ｒとその公知の結合パートナーであるＣＤＫ２/サイクリンＥとの結合を分析した。分析は、BIACORE 2000 SPR-Biosensorにおいて、２２℃で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ及び０．００５％Tween 20（蛋白質グレード、Calbiochem）を含有する流れる緩衝剤中で行った。化合物Ｒの１０μＭ溶液をｐＨ８．０でＣＭ５センサーチップ（リサーチグレード）のデキストラン表面に、アミド結合化学によって結合させた。化合物Ｒの蛋白質、例えば、ＣＤＫ２/サイクリンＥへの結合の特徴を明らかにするために、精製された蛋白質断片を流れる緩衝剤中に希釈し、９種の異なる蛋白質濃度を得た。それを、５分間ずつ連続的にセンサ表面上を通過させ、次いで、同じ流速で５分間流れる緩衝剤を通過させた。ＣＤＫ２/サイクリンＥ複合体のＣＭ５化合物Ｒ添加チップの表面への結合と解離を流速３０μｌ/分で測定した。各実験後、そのチップを３Ｍ グアニジニウム−ヒドロクロリド（２０秒、３０μｌ/分）を２回連続して注入することによって再構成し、その後次のサンプルを置いた。
【０１９３】
そのデータをBioevaluationソフトウェアバージョン3.1（Biacore AB、Uppsala、SE）を用いて分析した。曲線を注入開始、および対照表面によって得られるバックグラウンドに標準化した。結合と解離の速度は、Langmuir 1:1結合モデルを用いて、別々にもしくは全体として決定した。アフィニティ（ＫD）は、式：ＫD= kdiss/ kassを用いて計算した。
【０１９４】
上記の処置は、他の標的蛋白質、例えば、Ｃｄｋ９、Ｃｄｋ４などを用いて同様に行うことができる。Ｃｄｋ９の阻害剤は、例えば、ＨＩＶ及び/又はＡＩＤＳの治療又は予防に有用かもしれない。
【０１９５】
図２は、ＣＤＫ２/サイクリンＥのＣＭ５-化合物Ｒ添加チップへの結合ために得られた結果を一例として示している。これらのデータ量から計算されたＫD は、8,0 +/- 2,8 ｎＭであった。
【０１９６】
スリーハイブリッドアッセイ（Three-Hybrid Assay）
化合物Ｒを、ＰＥＧリンカーを介してメトトレキサートに融合した結果、化合物 ***が得られた。３種（脳、骨盤、肝臓）のヒトｃＤＮＡライブラリーを酵母スリーハイブリッド（Ｙ３Ｈ）技術を用いてスクリーニングした（米国特許出願第60/329,437号参照）。３つ全てのライブラリーにおいて、ヒト全長ＣＤＫ９を酵母系の高アフィニティ活性剤として同定した。本発明の化合物は、低ｎＭ範囲のＩＣ５０をもつＣＤＫ２を不活性化することがわかっている。比較として、図３にｈＣＤＫ２及びｈＣＤＫ９をもつＹ３Ｈ系の活性化との直接比較を示している。酵母ハロの直径は、化合物（データは示さず）に対する標的分子のアフィニティに比例する。ＣＤＫ９は、当該技術分野においては、レトロウイルスの複製を阻害するための潜在的なホスト標的として公知である。
【０１９７】
本出願全体にわたって引用された全ての参考文献、特許、及び特許出願の内容を、参考文献として本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、異種移植腫瘍アッセイの結果を示す。
【図２】図２は、ＣＤＫ２/サイクリンＥとＣＭ５阻害剤添加チップとの結合によって得られた結果を一例として示す。これらのデータから計算されたＫＤは、８．０＋／−２．８ｍＭである。
【図３】図３は、ＬｅｘＡ結合ドメイン（ＢＤ）−ジヒドロ葉酸融合蛋白質を発現させる酵母株Ｌ４０（インビトロゲン（Invitrogen）中で、ヒトＣＤＫ９及びＣＤＫ２のＧａｌ４活性化ドメイン（ＡＤ）融合体を発現させたものを示す。これらの細胞をｈｉｓ、ｌｅｕ及びｔｒｐを欠いたＳＤ寒天上で平板培養した。１μｍの化合物Ｒ−メトトレキセートで繋ぎ止められた化合物の１ｍＭ溶液を添加し、３０℃で３日間モニターした。その化学物質は、統合されたｌｅｘＡ-ｈｉｓレポーター遺伝子を活性化する転写因子を再構成するＡＤとＳＤの融合蛋白質の二量体化を誘発する。
【図１−１】
2005511535.tif 000041
【図１−２】
2005511535.tif 000042
【図１−３】
2005511535.tif 000043
【図１−４】
2005511535.tif 000044
【図１−５】
2005511535.tif 000045
【図１−６】
2005511535.tif 000046
【図１−７】
2005511535.tif 000047
【図２】
2005511535.tif 000048
【図３】
2005511535.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月21日(2004.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式Ｉによって表される構造を有する、化合物：
【化１】
2005511535.tif 000050
式中、Ｗは、Ｏ又はＮＲ”であり、
Ｘは、それぞれ個別に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩのようなハロゲンであり、
Ｙは、Ｈ又はＸであり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又は金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ１は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ2は、Ｒ１及びＲ２のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない、メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、
ｎは、１〜５の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基である。
【請求項２】
Ｘは、すべての場合においてＣｌである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ”は、Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｍは、それぞれ個別に、ＣＨ２、又はＷに付着している場合、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、もしくはＣ（＝Ｏ）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ｎは、Ｒ１の場合は２〜４の整数であり、Ｒ２の場合は１〜３の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｑは、ジアルキルアミンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｑは、置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物は、下記式Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤから選択される、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2005511535.tif 000051
【請求項９】
薬学的に許容される添加剤及び請求項１に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物を動物に投与することを含む、高増殖性障害の治療方法。
【請求項１１】
細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を請求項１に記載の化合物に接触させることを含む方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法。
【請求項１３】
前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１以上の化学療法又は放射線治療と合わせて請求項１に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、化学療法又は放射線治療によって誘発された脱毛症を治療又は予防する方法。
【請求項１５】
異性体、プロドラッグ、互変異性体、薬学的に許容される塩、Ｎ−オキシド、又はそれらの立体異性体形態を含み、式ＩＩによって表される、化合物：
【化３】
2005511535.tif 000052
式中、Ｗ及びＺは、Ｏ又はＮＲ”であり、
Ｒ’は、それぞれ個別に、Ｈ、低級アルキル、又は金属対イオンであり、
Ｒ”は、それぞれ個別に、Ｈ又は低級アルキルであり、
Ｒ5は、Ｈ、Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ’）２、又はＭｎＱであり、
Ｒ６は、Ｒ５及びＲ６のうちの１つだけがＨであることを条件として、Ｈ又はＭｎＱであり、
Ｒ７は、それぞれ個別に、ハロゲン化水素、メチルなどの低級アルキル、又は低級アルコキシルであり、
Ｍは、それぞれ個別に、置換された、もしくは置換されていない、メチレン基、ＮＲ”、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｓ）、Ｃ（＝Ｏ）、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ２）であり、
ｎは、１〜５の整数であり、
Ｑは、３級アミノ置換基である。
【請求項１６】
Ｒ”は、Ｈである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｍは、それぞれ個別に、ＣＨ２、又はＷに付着している場合、ＣＨ２、Ｓ（Ｏ２）、Ｃ（＝Ｓ）、又はＣ（＝Ｏ）である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
ｎは、Ｒ５の場合は２〜４の整数であり、Ｒ６の場合は１〜３の整数である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｑは、ジアルキルアミンである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｑは、置換された、もしくは置換されていない窒素含有複素環である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
前記化合物は、下記式Ｅ〜Ｑより選択される、請求項１５に記載の化合物。
【化４】
2005511535.tif 000053
【請求項２２】
薬学的に許容される添加剤及び請求項１５に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１５に記載の化合物を動物に投与することを含む、高増殖性障害の治療方法。
【請求項２４】
細胞の増殖を阻害する方法であって、該細胞を請求項１５に記載の化合物に接触させることを含む方法。
【請求項２５】
請求項１５に記載された化合物を哺乳動物に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法。
【請求項２６】
前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１以上の化学療法又は放射線治療と合わせて請求項１５に記載の化合物を哺乳動物に投与することを含む、化学療法又は放射線治療によって誘発された脱毛症を治療又は予防する方法。
【国際調査報告】
2005511535.tif 000054
2005511535.tif 000055
2005511535.tif 000056
2005511535.tif 000057