(57)【要約】本発明は、完全長インターフェロンタンパク質の切片のネイティブケミカルライゲーションによる１またはそれ以上のシステイン残基を含むインターフェロンタンパク質の化学合成法を提供する。タンパク質の切片はインターフェロンタンパク質中のシステイン残基の位置に基づいて選択され、システイン残基の位置はネイティブケミカルライゲーションの潜在部位である。完全長で完全に脱保護したポリペプチドはシステイン残基の酸化によって生物学的に活性なインターフェロンタンパク質に折り畳まれる。本発明はさらに、インターフェロン−アルファの合成における中間体として働く個々のペプチド断片の製造に関する。本発明はさらに、一緒になってインターフェロン−アルファおよびインターフェロン−アルファ様タンパク質を製造するのに利用することのできる、そのようなペプチド中間体の基に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれ以上のシステイン残基および２またはそれ以上のポリペプチドサブユニットを含む生物学的に活性なインターフェロンタンパク質の製造方法であって、工程：
（ａ）Ｎ末端残基としてＣｙｓまたはライゲーション補助基を有する該インターフェロンタンパク質の第一のポリペプチドサブユニットを固相ペプチド合成により合成し、および該サブユニットを精製し；
（ｂ）Ｎ末端に保護したＣｙｓまたは保護した補助基を、Ｃ末端にアルファ−カルボン酸チオエステルを有する該インターフェロンタンパク質の少なくとも１つのさらなるポリペプチドサブユニットを固相ペプチド合成により合成し、および該さらなるサブユニットを精製し；
（ｃ）該第一のポリペプチドサブユニットおよび該さらなるサブユニットをネイティブケミカルライゲーションによってライゲートして完全長のインターフェロンポリペプチドを生成し；
（ｄ）該インターフェロンポリペプチドから該保護残基を除去し；
（ｅ）該ポリペプチド中のシステイン残基を酸化し、および該インターフェロンポリペプチドをその天然のコンホメーションに折り畳み；ついで
（ｆ）リフォールディングした生物学的に活性なインターフェロンタンパク質を単離する
ことを含む方法。
【請求項２】
該生物学的に活性なインターフェロンタンパク質が、アルファ−インターフェロンタンパク質、ベータ−インターフェロンタンパク質、およびガンマ−インターフェロンタンパク質よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該生物学的に活性なインターフェロンタンパク質が、インターフェロンアルファ−２ａタンパク質、インターフェロンアルファ−２ｂタンパク質、インターフェロンアルファ−２ｃタンパク質、シンフェロン、インターフェロンアルファ−ｎ１タンパク質、インターフェロンアルファ−ｎ２タンパク質、およびインターフェロンアルファ−ｎ３タンパク質よりなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該第一のポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基９８−１６５を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該さらなるポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基１−９７を含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該さらなるポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基２９−９７および残基１−２８を含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該第一のポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基１３８−１６５を含み、該さらなるポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基１−９７および残基９８−１３７を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該第一のポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基１３８−１６５を含み、該さらなるポリペプチドサブユニットがインターフェロン−アルファの残基１−２８、残基２９−９７および残基９８−１３７を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該第一のポリペプチドサブユニットをカラムクロマトグラフィー法を用いて精製する、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該カラムクロマトグラフィー法が逆相カラムクロマトグラフィーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該さらなるポリペプチドサブユニットをカラムクロマトグラフィー法を用いて精製する、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該カラムクロマトグラフィー法が逆相カラムクロマトグラフィーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドを固相ペプチド合成により合成する、請求項１ないし１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドをＦｍｏｃ固相ペプチド合成により合成する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該さらなるサブユニットのＮ末端にあるＣｙｓまたは補助基を保護する基が、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、メチルスルホニルエチルオキシカルボニル（Ｍｓｃ）、チアゾリジン（Ｔｈｚ）、メチルベンジル、メトキシベンジル、ピコリル（Ｐｉｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、tert−ブチルチオ（ＳｔＢｕ）およびｔ−ブチル（ｔＢｕ）よりなる群から選ばれる、請求項１ないし１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該インターフェロンポリペプチドをその天然のコンホメーションに折り畳ませて生物学的に活性なインターフェロンタンパク質を生成することを、
（ａ）該ポリペプチドを、６Ｍグアニジン塩、０.１Ｍリン酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム塩を含む水性緩衝液に溶解し、ついで
（ｂ）該水性緩衝液を酸化型および還元型のグルタチオンを含む他の溶液で希釈して、グアニジン塩の最終濃度を１.５Ｍ、リン酸の最終濃度を０.１Ｍ、ＥＤＴＡの最終濃度を１ｍＭ、酸化型グルタチオンの最終濃度を０.５ｍＭ、および還元型グルタチオンの最終濃度を１ｍＭとする
ことにより行う、請求項１ないし１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
インターフェロンタンパク質の単離を逆相カラムクロマトグラフィーおよび凍結乾燥により行う、請求項１ないし１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドチオエステルの合成を４−スルファミルブチリルリンカーを用いて樹脂上でのＦｍｏｃ化学法により行う、請求項１ないし１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドチオエステルの樹脂からの開裂を、
（ａ）リンカーを活性化するためのジアゾメタンまたは（トリメチルシリル）ジアゾメタン；および
（ｂ）リンカーからポリペプチドを置換するためのチオフェノールのナトリウム塩
を用いた２工程により行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インターフェロン−アルファの残基１−２８、２９−９７、９８−１３７、１３８−１６５、１−９７、９８−１６５を含むポリペプチドよりなる群から選ばれたインターフェロンポリペプチドサブユニット。
【請求項２１】
インターフェロン−アルファの製造のための、残基１−２８、２９−９７、９８−１３７、１３８−１６５、１−９７、９８−１６５を含むポリペプチドよりなる群から選ばれた連続したポリペプチドサブユニットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、１またはそれ以上のシステイン残基および２またはそれ以上のポリペプチドサブユニットを含むインターフェロンタンパク質の化学合成による製造方法に関する。本発明はさらに、該インターフェロンタンパク質を構成するサブユニット、および生物学的に活性なインターフェロンの製造におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、ウイルスやある種の他の物質に侵入された細胞によって放出される一本鎖タンパク質である。インターフェロンは現在のところ、白血球インターフェロン（インターフェロン−アルファ、アルファ−インターフェロン、ＩＦＮ−アルファ、分子量１９ｋＤａ、約１６５アミノ酸）、繊維芽細胞インターフェロン（インターフェロン−ベータ、ベータ−インターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、分子量１９ｋＤａ、約１６５残基）、および免疫インターフェロン（インターフェロン−ガンマ、ガンマ−インターフェロン、ＩＦＮ−ガンマ、分子量１７ｋＤａ、約１４０残基）と称する３つの主要なクラスに分類されている。
【０００３】
公知のＩＦＮ−アルファは２つのジスルフィド結合を含み、ＩＦＮ−ベータは１つのジスルフィド結合を含み、ＩＦＮ−ガンマはジスルフィド結合を含まない。これらジスルフィド結合はシステイン残基の側鎖の酸化によって形成される。たとえば、成熟組換えＩＦＮ−アルファＡのアミノ酸配列は、１位、２９位、９８位および１３８位にシステイン残基を含む。分子内ジスルフィド結合は、１位と９８位のシステイン残基、および２９位と１３８位のシステイン残基間で生成される。
【０００４】
インターフェロンは、抗ウイルス特性、免疫調節特性および抗増殖特性を含む様々な生物学的活性を有するため、癌および種々のウイルス疾患、とりわけＣ型肝炎およびＢ型肝炎の制御における治療剤として多大な関心が払われている。それゆえ、治療剤として使用するためにインターフェロンの効率的な製造を提供する方法に対する必要性が存在する。
【０００５】
現在市販されているインターフェロンの製造方法は、細菌菌体または哺乳動物細胞内での組換えタンパク質の合成を含んでいる。たとえば、インターフェロン−アルファは、たとえば米国特許第５,７１０,０２７号、同第６,００５,０７５号、およびHochuli, Chimia 40, 408 (1986)に記載されているように、インターフェロン−アルファタンパク質の遺伝子をコードするプラスミドを含む細菌を回収することによって産生されている。ついで、インターフェロンプラスミドを含む細菌はインターフェロン−アルファを合成するように誘導され、適当な時点で細胞は溶解されて細胞の内容物が回収される。インターフェロン−アルファは還元形で存在し、多くの他のタンパク質が混入している。この粗製の混合物をシステイン残基を酸化する条件に供して生物学的活性に必須の２つの特定のジスルフィド結合を生成させる。ついで、この天然のインターフェロン、誤って折り畳まれたインターフェロンおよび細胞溶解液の他の内容物の混合物を一連の精製法に供して精製インターフェロンを得る。それにもかかわらず、所望のインターフェロンタンパク質を産生する細菌は同様のサイズおよび電荷分布のタンパク質を含んでおり、これらの混入タンパク質は精製プロセスを高価なものにし、しばしば所望のインターフェロンタンパク質の許容し難い損失や混入タンパク質の存在のいずれかなしには実行を不可能なものにする。
【０００６】
Staehelinら［J. Biol. Chem., 256, 9750-9754 (1981)］は、大腸菌からの組換えインターフェロン−アルファの製造、およびインターフェロン−アルファに結合する特異的抗体でカラムを誘導体化したイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いた細胞溶解液の精製を記載している。Staehelinらの方法に使用するイムノアフィニティーカラムはインターフェロン−アルファに選択的に結合するが、イムノアフィニティーカラムのコストは高く、カラムの使用できる寿命も限られている。
【０００７】
インターフェロン−アルファの組換え製造からの特に困難な混入物は、Ｎ末端にメチオニンが付加したインターフェロン−アルファ生成物である。この混入物は、電荷、サイズおよび三次元構造が極めて類似しているために精製に際して除去するのが困難である。この問題を克服するため、Hochuli (1986)はイムノアフィニティークロマトグラフィーおよびさらに３つの精製工程を用いることによってしか、この混入物を除去することはできなかった。さらに、組換えインターフェロン−アルファの精製のためにイムノアフィニティーカラムを使用することは、最終生成物においてウイルスまたはマウス免疫グロブリンの混入のリスクを導入することになる。
【０００８】
イムノアフィニティークロマトグラフィーに伴う費用および上記問題を回避するには、米国特許第５,７１０,０２７号およびEttlinら(1999)において多工程精製手順（各場合において４つの異なる方法）を用いる必要があることがわかった。
【０００９】
また、米国特許第５,９３５,５６６号において組換えインターフェロン−アルファが貯蔵の際に不安定であることも認識されている。たとえば、その調合物の１成分であるＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）がインターフェロン溶液において目に見える粒状物質の生成を防ぐことがわかった。このＥＤＴＡの有利な作用は、インターフェロンタンパク質を精製するための金属キレートクロマトグラフィーに使用するＣｕ2+などの微量金属カチオンをＥＤＴＡが捕捉するためであると考えられている（Ettlinら、1998）。それゆえ、組換えタンパク質からの高純度インターフェロンの製造には依然として多くの問題が存在することが明らかである。
【００１０】
ポリペプチドを化学的に合成するための種々の方法が当該技術分野で記載されている。ペプチド製造の最も一般的な方法は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によるものである。この方法では、巨視的な不溶性支持体上にアミノ酸を連続して付加していくことによってペプチド鎖が構築される。各アミノ酸の付加には、樹脂結合ペプチドのＮ末端の脱保護およびその結果得られた遊離アミノ基の続くＮ保護したＣアルファ活性化アミノ酸によるアシル化という２つの反応工程が必要である。各工程の後、過剰な試薬および副生物はポリマー樹脂を洗浄するだけで簡単に除去できる。側鎖保護したアミノ酸の所望の配列が組み立てられたらペプチドを樹脂から開裂し、同時に側鎖保護基を除去して逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）や当該技術分野で知られた他の方法により精製する。この一般的な原理を応用する種々の方法が知られている。２つの最も一般的な方法はＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル、Kent, 1988）法およびＦｍｏｃ（９−フルオレニルオキシカルボニル、FieldsおよびNoble, 1990）法であり、これら方法はＣ活性化アミノ酸のＮ−アルファ残基を保護するのに使用する基により名付けられたものである。
【００１１】
上記方法は、通常、短い長さのペプチドから中くらいの長さのペプチドの合成に有効である。しかしながら、一般に試薬を過剰に用いても反応収率は１００％未満であり、未反応の化学種が樹脂上に蓄積される。たとえば、５０残基のペプチドを合成するには非常に高い収率の１００の反応工程が必要である。各工程の効率がたとえ９９％であったとしても、標的ペプチドを有効に得ることはできない。さらに、側鎖保護基をも除去する最後の開裂工程は、標的ペプチドを修飾し得る化学種を生成することがある。樹脂からポリペプチドを開裂し、同時に側鎖保護基を除去した後、所望のペプチドは最初、より短いペプチド（欠失または先端欠失（truncation）配列）が混入して得られ、これら短いペプチドのあるものは標的ペプチドと極めて近似した物理化学的特性（サイズ、電荷、ハイドロフォビシティー）を有しており、それから所望のペプチドを純粋な形態で得ることは非常に困難である。それゆえ、ポリペプチドの配列が長くなるほど所望の配列を合成することも精製することもますます困難になり、所望のポリペプチドを実際的な量で得ることは困難になる。一般に、約５０アミノ酸よりも長いポリペプチドの合成は、可能ではあるが決してルーチンなものではないことが受け入れられている（たとえば、KochendoerferおよびKent, Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 665-671 (1999), Brikら、J. Org. Chem. 65, 3829-3835 (2000)を参照）。これらの非効率性は、インターフェロンタンパク質などのような大きなタンパク質の製造にとって段階的な合成を非実用的な商業的アプローチとしている。
【００１２】
ＳＰＰＳにより製造可能なペプチドの長さに対するこれら制限を克服するため、相補法（complementary techniques）が開発されている。本発明にとって興味がもたれるのは、タンパク質の断片を固相合成法を用いて合成し、ついでこれら断片をコンバインして完全長のタンパク質を生成させる方法である。それゆえ、Dawsonら、Science, 266: 776-779 (1994)および米国特許第６,１８４,３４４号は、大きなタンパク質の２つの切片をコンバインして完全長のタンパク質を生成するためのネイティブケミカルライゲーション（native chemical ligation）の使用を記載している。この方法により、ポリペプチドはある範囲の長さ（１１、３９、７２、９９および１１０アミノ酸長を含む）で調製される。ネイティブケミカルライゲーション反応は、Ｎ末端残基が還元されたスルフヒドリル残基を有するＣｙｓである第一のペプチドと、アルファ−カルボン酸がチオエステルに変換された第二のペプチドとをライゲートするために行う。およそ中性ｐＨの水溶液では、ペプチド−Ｃ−アルファ−チオエステルは第二のペプチドのＮ末端Ｃｙｓと化学選択的に反応して側鎖チオエステル結合した中間体を生成することができる。このものは自発的に分子内転位を引き起こしてライゲーション部位に天然のペプチド結合を生成し、Ｃｙｓ側鎖のスルフヒドリル基を再生する。この方法の利点は、ペプチド断片が完全に脱保護され、それゆえその精製およびライゲーション工程で使用した水性溶媒に非常に可溶性であることである。それにもかかわらず、Kentら(1995)は、１１０アミノ酸の大きさのタンパク質を生成する方法を教示するのみで、１６５アミノ酸残基を含むヒトインターフェロン−アルファのような一層大きなタンパク質を生成する方法は教示していない。
【００１３】
ネイティブケミカルライゲーションの制限は、Ｃ末端ペプチド断片のＮ末端にＣｙｓが必要なことであった。この制限を克服し、他の残基間でのライゲーションを可能とするため、補助基が開示されている。これら補助基は、β−アミノチオール［たとえば、Lowら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 6554, (2001), Kawakamiら、Org. Lett. 3: 1403 (2001)］またはｇ−アミノチオール［たとえば、Canneら、J. Am. Chem. Soc. 118, 5891 (1996)］を含んでいる。ライゲーション部位に天然の残基を再生させるため、補助基は、たとえば強酸によってペプチドからの補助基の開裂を可能とする残基を含んでいる。
【００１４】
ネイティブケミカルライゲーション法の開示以来、この方法はタンパク質を製造するためにしばしば用いられてきた。この方法によって調製したポリペプチドは、典型的に７０〜１１０残基の長さである［たとえば、SDFaN33A（６８残基）、Uedaら、J. Biol. Chem. 272, 24966 (1997)、Eglin C（７０残基）、W.-Y. Luら、Biochem. 39, 3575 (2000)およびbarnase（１１０残基）、米国特許第６,１８４,３４４号］。ネイティブケミカルライゲーションによって高純度で調製することが示された最長のポリペプチドは、ヒトII型分泌型ホスホリパーゼＡ２（１２４残基）（Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 845 (1997)）である。
【００１５】
さらに一層長いタンパク質を製造するため、連続（sequential）ネイティブケミカルライゲーションが開発されている（Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 10068 (1999)）。この方法はネイティブケミカルライゲーションと同じ反応を用いるが、３またはそれ以上の断片を連続的にライゲートさせる。Ｃ−アルファチオエステルおよびＮ末端Ｃｙｓ残基を含む中間の断片は、ペプチドがそれ自身と反応して環状ペプチドを生成したり同じ配列の他の分子と反応してオリゴマーを生成したりしないように保護基を有していなければならない。最初、使用された保護基は、アセトアミドメチル基、Ａｃｍ（Veberら、J. Am. Chem. Soc. 94: 5456 (1972)）またはメチルスルホニルエチルオキシカルボニル（Tesserら、Int. J. Peptide Protein Res., 7: 295 (1975)）であった。Ａｃｍ基の除去には、しばしば強酸条件下での水銀塩処理、ついでβ−メルカプトエタノール処理が必要である。これら条件はポリペプチドの修飾のリスクが伴う、たとえば、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列は強酸に感受性であり、これがペプチド骨格を開裂し得る。水銀がすべてポリペプチドから除去されるのを確実にするため、注意深い精製が必要である。Ｍｓｃ基は強塩基性条件下で除去され、これもまたポリペプチドを修飾し得る（たとえば、Ａｓｎ残基の脱水）。
【００１６】
第一のネイティブライゲーション反応が完了したら混合物を精製し、ついでライゲートしたペプチドのＮ末端Ｃｙｓを脱保護し、ついで混合物を精製する。ついで、第一のライゲーションの生成物はチオエステル基を有する第三のペプチドとの他のネイティブケミカルライゲーションに参画する。このプロセスが繰り返されてポリペプチドの全体の配列が組み立てられる。この方法は、理論的には、さらに一層長いポリペプチドを高純度で調製することを可能にする。しかしながら、開示されている例は、２つの断片のネイティブライゲーションによって生成されるものと同様の長さである、たとえばヒト分泌型ホスホリパーゼＡ２の３工程、４断片合成（１２４残基）（Hackengら、(1999)）。
【００１７】
連続ライゲーション法の不利な点は、さらなる精製工程が必要となり、かかる精製工程が時間がかかり、労力を要する、それゆえ精製法としては高価なものとなることである。ライゲーションした断片をポリマー樹脂上で組み立てることによりこの連続ライゲーションを促進する方法がCanneら、1999によって開示されており、Canneらはこの方法により１１８残基のヒトＶ型分泌型ホスホリパーゼＡ２を合成した。この「固相タンパク質ライゲーション」法の不利な点は、樹脂（その上でネイティブライゲーションによって断片を組み立てる）に精製Ｃ末端断片を付加するために非標準リンカーを調製し、使用しなければならないことである。
【００１８】
ネイティブライゲーションは２つの重要な工程に依存している。一つは２つのペプチドを結合させるライゲーション工程である。第二はペプチド−アルファ−チオエステルの調製である。Dawsonら(1994)によって開示された方法では、ペプチドチオエステルがリンカーを有する樹脂上で合成され、該リンカーはペプチドが開裂されるとペプチドチオ酸を生成した。このペプチドチオ酸基は、その後、溶液中でチオエステルに変換された。以後、開裂すると直接ペプチド−アルファ−チオエステルを生成するリンカーが開示されている（たとえば、Hackengら(1999)）。これらリンカーは、ペプチドの段階的な組み立てがＢｏｃ法による場合にのみ有用である。Ｂｏｃ法は中くらいの長さのペプチドの合成には有用であるが、一層長いペプチドの合成には効率が悪い。実際、ネイティブケミカルライゲーションでは、かなり高純度のペプチドの使用が必要であり、各ライゲーション工程で使用する前駆体断片の長さを３０〜３５残基に制限している（Villainら、(2001)を参照）。さらに、Ｂｏｃ化学法により妥当な純度のペプチドを得るには樹脂からのペプチドの開裂をＨＦにより行わなければならないが、ＨＦは極めて毒性が高い。
【００１９】
ＳＰＰＳの他の主要な方法であるＦｍｏｃは、Ｎ−アルファ保護基（Ｆｍｏｃ）の繰り返し除去に塩基性条件を必要とする。チオエステルはこれら条件下では安定ではなく、Ｆｍｏｃ法によって１０残基から２５残基のペプチドチオエステルが合成されたものの（Clippingdaleら、(2000)、Liら(1998)を参照）、修飾したリンカーおよび非標準Ｆｍｏｃ脱保護条件を使用しなければならなかった。そのようにしてもなお、Ｆｍｏｃ脱保護の際の相当量の物質の樹脂からのペプチドの早まった開裂による喪失は、これら樹脂を一層長いペプチドチオエステルを合成するのに実際的でないものにしている。
【００２０】
さらに最近になって、Ｆｍｏｃ化学法によるチオエステル合成を容易にする「セイフティー−キャッチ（safety-catch）」リンカーが報告されている（Ingenitoら(1999)、Shinら(1999)）。合成の間、該リンカーは求核試薬に非反応性である。ペプチド鎖が組み立てられた後、該リンカーは活性化され（それゆえ「安全装置」のスイッチが切られる）、ペプチドはチオールで開裂されて完全に保護されたペプチド−アルファ−チオエステルを生成する。ついでＴＦＡおよびスカベンジャーで処理すると完全に脱保護されたペプチド−アルファル−チオエステルが得られ、このものはＲＰ−ＨＰＬＣなどの標準法により精製することができる。これまでのところ、このセイフティー−キャッチリンカーは２４アミノ酸長までのペプチドの合成において報告されている（Ingenitoら(1999)、Shinら(1999)）。しかしながら、このリンカー上で合成した２１アミノ酸ペプチドの開裂は殆ど物質を生成しないこと（Huseら(2000)）、および所望の４７残基ペプチドを得ることはできなかったこと（Marcaurelleら(2001)）が報告されている。それゆえ、２４残基よりも長いポリペプチドを製造するうえでこのリンカーが安定か否かはわかっていない。
【００２１】
上記に記載したネイティブケミカルライゲーション法および連続ライゲーション法の可能性を考慮すると、このようにして高純度で合成した１１０残基を超えるポリペプチドの例がわずかしかないのは驚くべきことのように思われる。刊行された最長の合成は、上記Hackengら(1997)およびHackengら(1999)によって１２４残基ヒトII型分泌型ホスホリパーゼＡ２について得られたものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
明らかにネイティブケミカルライゲーションまたは連続ネイティブケミカルライゲーションによってさえも、高純度の長いポリペプチド（１２０＋アミノ酸）を製造するうえで課題が残っている。一つの困難は、とりわけＦｍｏｃ化学法による長いペプチドチオエステルの合成にある。Ｂｏｃ化学法はまた、ペプチドを樹脂から開裂するのに極めて毒性の高いＨＦを使用するというさらなる不利がある。他の理由は、ペプチドが長くなるに従って相対的に溶解度が低くなり、そのためライゲーション工程の速度が遅くなり、それゆえライゲーションの収率が低くなる傾向にあることである。
【００２３】
さらに、インターフェロンタンパク質に関してはネイティブライゲーションに必要なペプチドチオエステルの合成は困難な仕事である。たとえば、インターフェロン−アルファは、１位、２９位、９８位および１３７位に４つのＣｙｓ残基を有している。これらタンパク質をネイティブライゲーションの１工程により合成するには、９７アミノ酸のペプチド−チオエステルと６８残基のペプチドとの合成が必要である。ネイティブライゲーションの代わりの部位は、１３７アミノ酸を有するペプチドチオエステルかまたはペプチド酸の合成を必要とし、これは実際的な収率および純度で製造するのはさらに一層困難である。ＩＦＮ（２９−９７）およびＩＦＮ（９８−１６５）とをライゲートし、ついでライゲートしたＩＦＮ（２９−１６５）にＩＦＮ（１−２８）をライゲートすることによって２工程のネイティブライゲーションにより合成する場合も、６９アミノ酸のチオエステルを製造する必要があり、かかるチオエステルはこれまでに報告されたものよりも長いものである。該配列中の１位のＣｙｓは、たとえ２工程ライゲーションによってもこのＣｙｓはライゲーション工程に際して保護しなければならず、その後除去しなければならないので、他の問題を導入する。ポリペプチドをリフォールディングして天然のコンホメーションとするとともにＣｙｓを酸化して正しく対合したジスルフィド結合を生成した後、活性なタンパク質を単離しなければならない。上記で指摘したように、このことは組換えタンパク質の製造において主要な課題である。
【００２４】
従って、細胞溶解液中に存在するかまたはタンパク質精製の際に導入された物質による潜在的な混入を回避したインターフェロンタンパク質の製造方法に対する必要性が当該技術分野においてなお存在する。さらに、組換え法において必要とされる天然タンパク質の多大な精製を回避した方法の必要性が存在する。さらに、インターフェロンおよびネイティブライゲーションによるその合成に必要な長いチオエステルを合成することができる化学合成法に対する必要性が当該技術分野に存在する。
【００２５】
従って、本発明の目的は、マウス免疫グロブリン、ウイルス、Ｎ末端がＭｅｔにより伸長したインターフェロンおよび細胞中でのインターフェロンの製造に付随する他の不純物による混入のリスクを回避したインターフェロンタンパク質の製造方法を提供することである。本発明の他の目的は、リフォールディングおよびジスルフィド架橋の生成後に高純度でかつ活性を有するインターフェロンを１精製工程で得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、１またはそれ以上のシステイン残基および２またはそれ以上のポリペプチドサブユニットを含むインターフェロンタンパク質の改良された製造方法であって、工程：
（ａ）Ｎ末端残基としてＣｙｓまたはライゲーション補助基（ligation auxiliary）を有する該インターフェロンタンパク質の第一のポリペプチドサブユニットを固相ペプチド合成により合成し、および該サブユニットを精製し；
（ｂ）Ｎ末端に保護したＣｙｓまたは保護した補助基を、Ｃ末端にアルファ−カルボン酸チオエステルを有する該インターフェロンタンパク質の少なくとも１つのさらなるポリペプチドサブユニットを固相ペプチド合成により合成し、および該さらなるサブユニットを精製し；
（ｃ）該第一のポリペプチドサブユニットおよび該さらなるサブユニットをネイティブケミカルライゲーションによってライゲートして完全長のインターフェロンポリペプチドを生成し；
（ｄ）該インターフェロンポリペプチドから該保護残基を除去し；
（ｅ）該ポリペプチド中のシステイン残基を酸化し、および該インターフェロンポリペプチドをその天然のコンホメーションに折り畳み；ついで
（ｆ）リフォールディングした生物学的に活性なインターフェロンタンパク質を単離する
ことを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の方法は、とりわけ、インターフェロンタンパク質の２またはそれ以上の断片の固相合成を可能とするものであり、別々の部分をライゲートして完全長のインターフェロンタンパク質を生成するためにインターフェロン中に存在するシステイン残基を利用するものである。
【００２８】
本発明は、インターフェロンタンパク質が化学合成によって高純度でかつ生物学的活性を保持して合成することができるという予期せぬ発見に基づいている。本発明の方法は、Ｎ末端Ｍｅｔ、あるいは他のタンパク質、マウス免疫グロブリンまたは細胞性核酸の混入の問題、組換え手段により製造したインターフェロンに付随する全ての潜在的なリスクを回避するという利点を有する。
【００２９】
さらに、本発明者は驚くべきことに、リフォールディングおよびジスルフィド架橋生成の後に高純度で充分な生物学的活性を有するインターフェロンタンパク質が逆相ＨＰＬＣにより１精製工程で得られることを見出した。
【００３０】
さらに、驚くべきことに、インターフェロンタンパク質の長いポリペプチド断片をネイティブライゲーションに必要な高純度のＣ−アルファ−チオエステルとして合成できることがわかった。
【００３１】
本発明の好ましい側面によれば、生物学的に活性なインターフェロンタンパク質は、アルファ−インターフェロンタンパク質、ベータ−インターフェロンタンパク質、およびガンマ−インターフェロンタンパク質よりなる群から選ばれる。特に好ましいインターフェロンタンパク質は、インターフェロンアルファ２ａタンパク質、インターフェロンアルファ２ｂタンパク質、インターフェロンアルファ２ｃタンパク質、シンフェロン（synferon）、インターフェロンアルファ−ｎ１タンパク質、インターフェロンアルファ−ｎ２タンパク質、およびインターフェロンアルファ−ｎ３タンパク質である。ポリペプチドサブユニットはカラムクロマトグラフィー法を用いて精製するのが好ましく、逆相カラムクロマトグラフィーが好ましい。
【００３２】
ポリペプチドサブユニットは当該技術分野で知られた種々の手段により合成することができるが、Ｎ−アルファ保護残基が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）である固相合成法によって製造するのが好ましい。
【００３３】
本発明の一つの側面によれば、インターフェロン配列は潜在的なライゲーション部位に従って切断することができ、ライゲーションはいずれのシステイン残基にても可能である。たとえば、インターフェロン−アルファは１位、２９位、９８位および１３８位に４つのシステイン残基を有する。それゆえ、これら４つのシステイン残基は、完全長の４つもの多くの別々の部分である１−２８、２９−９７、９８−１３７、および１３８−１６５を連結して完全長インターフェロン−アルファを生成する可能性を残している。
【００３４】
本発明の一つの態様によれば、インターフェロン−アルファサブユニット１−９７および９８−１６５を通常の固相化学法を用いて調製し、樹脂から開裂し、一緒にライゲートし、脱保護し、ついで酸化して高純度で完全長のインターフェロン−アルファタンパク質を生成させた。
【００３５】
本発明の第二の態様によれば、インターフェロン−アルファサブユニット１−２８、２９−９７および９８−１６５を通常の固相化学法を用いて調製し、樹脂から開裂し、ついで精製した。断片２９−９７および断片９８−１６５を一緒にライゲートし、Ｎ末端を脱保護し、得られた断片２９−１６５を断片１−２８とライゲートし、Ｃｙｓ１を脱保護し、ついで完全長インターフェロン−アルファを精製した。このインターフェロン−アルファをリフォールディングおよびＣｙｓ残基を酸化して天然のインターフェロン−アルファを生成させ、これをリフォールディング混合物から単離して生物学的に活性なタンパク質を得た。
【００３６】
本発明の第三の態様によれば、インターフェロン−アルファサブユニット１−２８、２９−９７、９８−１３７および１３８−１６５を通常の固相化学法を用いて調製し、樹脂から開裂し、ついで精製し、その後、断片を一緒にライゲートし、Ｎ末端を脱保護し、ついで完全長インターフェロン−アルファを精製した。このインターフェロン−アルファをリフォールディングおよびＣｙｓ残基を酸化して天然のインターフェロン−アルファを生成させ、これをリフォールディング混合物から単離して生物学的に活性なタンパク質を得た。
【００３７】
本発明の第四の態様によれば、インターフェロン−アルファサブユニット１−９７、９８−１３７および１３８−１６５を通常の固相化学法を用いて調製し、樹脂から開裂し、ついで精製し、その後、断片を一緒にライゲートし、Ｎ末端を脱保護し、ついで完全長インターフェロン−アルファを精製した。このインターフェロン−アルファをリフォールディングおよびＣｙｓ残基を酸化して天然のインターフェロン−アルファを生成させ、これをリフォールディング混合物から単離して生物学的に活性なタンパク質を得た。
【００３８】
本発明は、その複雑さおよびサイズのゆえに当該技術分野に困難を提示するアルファ−インターフェロンの化学合成の課題の解決を提供するものである。
【００３９】
本発明は、完全長タンパク質を生成するためのインターフェロンタンパク質の切片のネイティブケミカルライゲーションと組み合わせた固相ペプチド合成法を使用することによるインターフェロンタンパク質の製造に関する。標的インターフェロンタンパク質は、インターフェロンタンパク質中に存在するシステイン残基を利用することにより合成する。標的インターフェロンタンパク質中に存在する各システイン残基は、完全長タンパク質の２つの切片を一緒にして完全長インターフェロンタンパク質の一層大きな切片とすることのできる潜在的なライゲーション部位である。このインターフェロンタンパク質の切片の段階的ライゲーションは、最終的に完全長インターフェロンタンパク質の生成に導くであろう。
【００４０】
本発明の方法の第一の工程は、標準固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）による完全長インターフェロンタンパク質の第一の切片の合成を含む。固相支持体上のペプチドの化学合成は、たとえばMerrifield (1963)、FieldsおよびNoble (1990)により記載されている。
【００４１】
本発明の実施によれば、完全長タンパク質の第一の切片の合成はペプチドがＣｙｓ残基まで伸長されたときに完了し、鎖の伸長はＣ末端からＮ末端へなされる。インターフェロンタンパク質の第一の切片が完了したら、この切片を樹脂から開裂させ、逆相カラムクロマトグラフィーを含む標準カラムクロマトグラフィー法を用いて精製する。
【００４２】
ついで、第二のポリペプチドを樹脂上で合成し、たとえばIngenitoら(1990)の方法に従って該樹脂から該ポリペプチドを開裂してペプチドチオエステルを生成させる。この樹脂上で第一のポリペプチドのＮ末端のシステイン残基の前の位置から他のＣｙｓまでＳＰＰＳによってポリペプチドを伸長させる。この第二のＣｙｓは、他の残基（このペプチドの他のＣｙｓを含む）の側鎖から保護基を除去するのに用いる条件に対して安定な保護基を有している。第二の切片は、樹脂から開裂後、逆相カラムクロマトグラフィーを含む標準カラムクロマトグラフィー法を用いて精製する。
【００４３】
インターフェロンタンパク質の個々の切片が完了したら、標的インターフェロンタンパク質の第一および第二の切片を一緒にライゲートする。この工程は、たとえば、Dawsonら(1994)によって開発されたライゲーション法を用いて行う。ついで、ライゲーション反応からの生成物のＮ末端Ｃｙｓを脱保護し、完全に脱保護した生成物を逆相カラムクロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィーを用いて精製する。
【００４４】
この固相での一連の合成とそれに引き続くライゲーションは、ただ一つのライゲーション工程で完全長インターフェロンタンパク質を生成することができ、そうでなければ完全長タンパク質が生成されるまで何回もこれを行うことができる。
【００４５】
完全長タンパク質が合成的に生成されたら、インターフェロンタンパク質の三次元構造を適切に生成させ、システインを酸化してジスルフィド結合を生成させる。ついで、生物学的に活性なＩＦＮをカラムクロマトグラフィーにより単離する。
【００４６】
インターフェロンタンパク質がインターフェロン−アルファであるのは本発明の好ましい態様である。インターフェロン−アルファがＩＦＮ−アルファ２ａ、ＩＦＮ−アルファ２ｂ、ＩＦＮ−アルファ２ｃおよびシンフェロンよりなる群から選ばれるのは本発明の特に好ましい態様である。
【００４７】
本発明の一つの態様において、完全長インターフェロン−アルファは、Ｎ末端残基として還元Ｃｙｓを有するＩＦＮ−アルファ（９８−１６５）とＮ末端に保護したＣｙｓを有するＩＦＮ−アルファ（１−９７）とを含む２つのペプチド断片をライゲートすることによって組み立てる。
【００４８】
本発明の他の態様において、完全長インターフェロンは、ＩＦＮ−アルファ（１−２８）、ＩＦＮ−アルファ（２９−９７）およびＩＦＮ−アルファ（９８−１６５）を含む３つのペプチド断片の２つのライゲーションによって組み立てる。この態様では、ＩＦＮ−アルファ（９８−１６５）およびＩＦＮ−アルファ（２９−９７）を含む断片をまずライゲートおよび精製してＩＦＮ−アルファ（２９−１６５）を生成させ、ついで第二のライゲーションをＩＦＮ−アルファ（１−２８）とＩＦＮ−アルファ（２９−１６５）との間で行ってＩＦＮ−アルファ（１−１６５）を生成させる。別法として、３つの断片は、ＩＦＮ−アルファ（１−９７）、ＩＦＮ−アルファ（９８−１３７）およびＩＦＮ−アルファ（１３８−１６５）である。
【００４９】
本発明のさらなる態様において、完全長インターフェロンは、ＩＦＮ−アルファ（１−２８）、ＩＦＮ−アルファ（２９−９７）、ＩＦＮ−アルファ（９８−１３７）およびＩＦＮ−アルファ（１３８−１６５）を含む４つのペプチド断片の３つのライゲーションによって組み立てる。
【００５０】
ポリペプチド断片を固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の方法により合成するのは本発明の好ましい態様である。ポリペプチド断片をＦｍｏｃ ＳＰＰＳにより合成するのは特に好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、さらなるポリペプチド断片のＮ末端Ｃｙｓを保護するのに用いる基は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基、メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基（Ｍｓｃ）またはチアゾリジン−４−カルボン酸残基（Ｔｈｚ）から選ばれる。
【００５２】
ポリペプチドを逆相ＨＰＬＣにより単離するのは本発明の好ましい態様である。
【００５３】
本発明の他の好ましい態様において、完全長で完全に脱保護したインターフェロンタンパク質のリフォールディングおよび酸化は、（ａ）インターフェロンポリペプチドを溶解するのに充分な濃度のグアニジン塩を含む水性緩衝液中に完全に脱保護したインターフェロンを溶解し；（ｂ）該水性緩衝液をレドックス対を含む他の溶液で希釈して、グアニジン塩の最終濃度が１.５Ｍまたはそれ以下、最終ｐＨが５〜８の範囲になるようにし；ついで（ｃ）該水性緩衝液を２０〜２５℃の温度にてインキュベートする、ことによって行う。
【００５４】
レドックス対が酸化型および還元型のグルタチオン、システインおよびシスチン、および酸化型および還元型のシステアミンよりなる群から選ばれるのは本発明の好ましい態様である。
【００５５】
リフォールディングおよび酸化したインターフェロンタンパク質を生物学的に活性なタンパク質として逆相ＨＰＬＣおよび凍結乾燥により単離するのは本発明の他の好ましい態様である。
【００５６】
本発明はさらに、インターフェロン−アルファの残基１−２８、２９−９７、９８−１３７、１３８−１６５、１−９７、９８−１６５を含むポリペプチドよりなる群から選ばれたインターフェロンポリペプチドサブユニット、およびインターフェロン−アルファの製造のためのこれら群から選ばれた連続的なポリペプチドサブユニットの使用に関する。
【００５７】
本発明を実施例においてさらに説明するが、これら実施例は本発明に従うものであり、いかなる意味でも本発明を限定することを意図するものではない。
【００５８】
実施例
材料および方法
１．ペプチド合成
ペプチドはすべてＦｍｏｃ法による固相ペプチド合成（Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ）により組み立てた。合成はApplied Biosystems 433A合成機により制御した。Ｂｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨはBachem（スイス）から購入した。他のアミノ酸はすべてNovabiochem（スイス）から購入した。
【００５９】
以下の側鎖保護基を用いた：ＣｙｓはＳｔＢｕ、ＡｃｍまたはＴｒｔ；Ｈｉｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎはＴｒｔ；ＡｒｇはＰｍｃ；Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒはｔＢｕ；ＧｌｕおよびＡｓｐはＯｔＢｕ；およびＬｙｓおよびＴｒｐはＢｏｃ。
【００６０】
カップリングは、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ） − Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）中、カップリング当たり１ミリモルのＤＩＣ−ＨＯＢｔおよび１ミリモルのＦｍｏｃアミノ酸を用いて行い、Ｆｍｏｃ脱保護はＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより行った。
【００６１】
各カップリング工程後の未反応アミノ基のキャッピングは、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の無水酢酸−エチルジイソプロピルアミンにより行った。
【００６２】
自動合成の完了後、樹脂をＤＭＦおよびイソプロパノールで洗浄し、真空下で乾燥させた。
【００６３】
２．ペプチド精製
特に断らない限り、ペプチドの精製は逆相ＨＰＬＣにより行った。分取ＨＰＬＣを、アセトニトリル−水中の０.１％トリフルオロ酢酸−０.１％トリフルオロ酢酸の線状勾配で溶出しWaters semi-prep ＨＰＬＣシステムにより制御したC8 Vydacカラム（２５０×２２ｍｍ、１０ｍｍ粒径、２０８ＴＰ１０２２）を１０ｍｌ／分にて用いて行った。精製はＵＶにより２１４ｍｍにてモニターした。
【００６４】
画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインおよび凍結乾燥して所望のペプチドを得た。必要なら画分を同じ方法により再精製した。
【００６５】
半分取ＨＰＬＣを、同じ溶媒を用いて同じシステムで行い、Vydac C8カラム（２５０×１０ｍｍ、５ｍｍ粒径、２０８ＴＰ５１０）で３ｍｌ／分にて溶出した。
【００６６】
３．ペプチドの分析
ペプチドの純度を、アセトニトリル−水中の０.０９％トリフルオロ酢酸−０.１％トリフルオロ酢酸の線状勾配で溶出しWaters Alliance ＨＰＬＣシステムにより制御したVydac C18カラム（２３８ＴＰ５４）で分析した。分析を２１４ｎｍでモニターした。ＭＡＬＤＩ−ＭＳをVoyagerTM Elite BiospectrometryTM Research Station（PerSeptive Biosystems）で行った。
【００６７】
実施例１
２つのインターフェロン−アルファサブユニットポリペプチドに基づくヒトインターフェロン−アルファ２ｂの製造
１．はじめに
この実施例では、２つのインターフェロン−アルファサブユニットポリペプチドを固相ペプチド合成により製造する方法に従ってヒトインターフェロン−アルファ２ｂを製造した。この実施例に採用したアプローチは、完全長インターフェロン−アルファタンパク質の２つの大きな切片の合成であり、１のライゲーション反応後に完全長のヒトインターフェロン−アルファタンパク質が生成された。
【００６８】
それゆえ、ヒトインターフェロン−アルファのアミノ酸１−９７を含むポリペプチドをＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いて合成した。９８−１６５位からのインターフェロン−アルファの他の切片もＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを用いて調製した。本実施例によれば、インターフェロン−アルファの９８位のシステイン残基を利用してこれら２つの切片を一緒にライゲートして完全長のヒトインターフェロン−アルファを生成させ、ついで該ヒトインターフェロン−アルファを天然の生物学的に活性な構造および天然のジスルフィド結合を再形成させ、単離した。
【００６９】
２．インターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）の調製
インターフェロン−アルファ（９８−１６５）は、インターフェロン−アルファホロタンパク質のアミノ酸配列中の９８位から１６５位までのヒトインターフェロン−アルファの６８アミノ酸の切片を含む。インターフェロン−アルファ（９８−１６５）の調製を、Fmoc-Glu(OtBu)-NovasynR TGA樹脂上、初期ローディング０.１３ミリモル／ｇ、０.０８ミリモルのスケールでの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行った。
【００７０】
ペプチドをＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−水−フェノール−ヨウ化アンモニウムの混合物（２１ｍｌ、３ｍｌ、１.２５ｍｌ、１.２５ｇ、０.４０ｇ）を用いて３時間、樹脂から開裂させた。樹脂を濾去し、冷メチルｔ−ブチルエーテルに開裂溶液を加えることによりペプチドを沈殿させた（３５ｍｌの３つのチューブ）。
【００７１】
沈殿を遠心分離によりペレット化し、冷メチルｔ−ブチルエーテルで３回洗浄した（チューブ当たり２×３０ｍｌおよび１×２０ｍｌ）。これにより、酢酸−水から凍結乾燥して白色粉末が得られた。この粗製の物質を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。凍結乾燥後にインターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）が得られた（１.９ｍｇ、分析的ＨＰＬＣによる純度７７％）。
【００７２】
３．インターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの調製
インターフェロン−アルファ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルは、ヒトインターフェロン−アルファ２ｂの最初の９７アミノ酸（図５；配列番号１）を含み、９７位の末端カルボキシル基がエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルに変換されている。Ｃ末端アミノ酸Ａｌａを、BackesおよびEllman (1999)の方法により４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（Novabiochem）にカップリングさせた。それゆえ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（６.０ｇ）およびエチルジイソプロピルエチルアミン（６.２ｍｌ）を、クロロホルム（３５ｍｌ）中の４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（３.２８ｇ、初期ローディング１.１２ミリモル／ｇ）の懸濁液に加えた。PyBOPR（１.５６ｇ）およびクロロホルム（５ｍｌ）を加え、攪拌を−１８℃で１.５時間続けた。
【００７３】
樹脂を濾過し、クロロホルム、イソプロパノールで洗浄し、高真空下で乾燥させた。未反応のスルホンアミド基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２×１５分）中のジ−ｔ−ブチルジカルボン酸（１.５ｇ）およびエチルジイソプロピルアミン（２.４ｍｌ）の溶液を用いてキャッピングした。各キャッピングの後に樹脂をジクロロメタンで洗浄し、２回目の後に高真空下で乾燥させた。
【００７４】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａのローディングは、固相ペプチド合成のためのNovabiochem 2000カタログの４頁に記載の方法を用いて０.３８ミリモル／ｇと測定された。この樹脂を固相合成の出発樹脂として０.１ミリモルのスケールで用いた。
【００７５】
プロトコールおよび試薬は、以下の点を除いてインターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）の合成と同じであった。Ｓｅｒ６８−Ｔｈｒ６９およびＩｌｅ２４−Ｓｅｒ２５をプソイドプロリン（pseudoproline）ジペプチドとしてカップリングした。Ｌｙｓ３１のカップリング後に樹脂の半分を反応容器から取り除いた。合成を続け、最後の残基をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）としてカップリングし、Ｆｍｏｃ脱保護し、上記のようにＢｏｃ基で再保護した。この樹脂を洗浄し、高真空下で乾燥させた（重量０.３７ｇ）。
【００７６】
４．インターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）−ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの開裂
ついで、上記で調製したインターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）のチオエステルをIngenitoら(1999)の方法を用いて樹脂から開裂した。それゆえ、炎乾燥させた１００ｍｌ容の丸底フラスコにアルゴンを満たし、Ｂｏｃ保護ペプチド樹脂（０.３７ｇ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１０ｍｌ）を加えた。１０分後、トリメチルシリルジアゾメタン（１０ｍｌ、ヘキサン中の２Ｍ溶液）を加え、混合物を周囲温度で２時間攪拌した。樹脂を濾過により分離し、ＴＨＦおよびＤＣＭで洗浄した。その後、樹脂を５０ｍｌ容の丸底フラスコに入れた。その後、樹脂を５０ｍｌ容の丸底フラスコに入れ、フラスコにアルゴンを満たした。ＤＭＦ（無水、７ｍｌ）、エチル−３−メルカプトプロピオン酸（２ｍｌ）およびチオフェノールナトリウム塩の溶液（１ｍｌの無水ＤＭＦ中に６６ｍｇ）をスポイトで加え、混合物をアルゴン下で２０時間穏やかに攪拌した。
【００７７】
揮発成分を高真空下で除去し、残渣をＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−水−フェノール−ヨウ化アンモニウム（１０.５ｍｌ、１.５ｍｌ、０.６ｍｌ、０.６ｇ、０.２５ｇ）とともに室温で３時間攪拌した。樹脂を濾去し、溶液を冷メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に加えた。白色沈殿を遠心分離によりペレット化し、ＭＴＢＥで３回洗浄し、得られた沈殿を５０−５０アセトニトリル−水に溶解し、凍結乾燥した。この粗製の物質を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥した。
【００７８】
必要なら画分を同じ方法により再精製した。インターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）−ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルが分析的ＨＰＬＣにより９６％の純度で得られた（２.８ｍｇ）。
【００７９】
５．インターフェロン−アルファ２ｂ−Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）の調製
ほぼ等モル量のインターフェロン−アルファ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３メルカプトプロピオン酸チオエステルとインターフェロン−アルファ（９８−１６５）との反応によりライゲーション反応が進行した。インターフェロン−アルファ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３メルカプトプロピオン酸チオエステル（２.８４ｍｇ）およびインターフェロン−アルファ（９８−１６５）（１.９ｍｇ）を、６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）の別々の溶液（ペプチド当たり０.１２ｍｌ）に溶解した。これら２つの溶液をコンバインし、チオフェノール（２.４μｌ）を加え、溶液を穏やかに攪拌した。１６時間後（２.４μｌ）および２４時間後（４.８μｌ）にさらにチオフェノールを加えた。４２時間後にジチオトレイトール（ＤＴＴ、１２０ｍｇ）を加えた。４４時間後に溶液を３ｍｌの１：２アセトニトリル：６Ｍ塩化グアニジンで希釈し、半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【００８０】
画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥してインターフェロン−アルファ２ｂ−Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）（１.０７ｍｇ）を得た。
【００８１】
６．Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）の脱保護によるインターフェロン−アルファ２ｂの調製
インターフェロン−アルファ２ｂＣｙｓ１（Ａｃｍ）（１.０７ｍｇ）を０.２ｍｌの５０％酢酸−水に溶解した。１５μｌの５０％酢酸−水中の０.８ｍｇの酢酸第二水銀の溶液を加え、溶液にアルゴンをスパージした。溶液を６時間穏やかに攪拌した。β−メルカプトエタノール（１８μｌ）を加え、溶液をさらに２３時間攪拌した。混合物を遠心分離にかけ、上澄み液を、アセトニトリル−水中の０.１％ＴＦＡ−０.１％ＴＦＡの線状勾配で溶出しWaters Allianceシステムにより制御したVydac C18カラム（２３８ＴＰ５４）でのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製をＵＶにより２１４ｎｍでモニターし、主要なピークの画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。所望のペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥して０.８１ｍｇを得た。
【００８２】
７．インターフェロン−アルファ２ｂの折り畳み
合成インターフェロン−アルファを、酸化型グルタチオン：還元型グルタチオンを１：２の比で含む酸化緩衝液中で生物学的に活性なインターフェロン−アルファ２ｂに折り畳ませた。それゆえ、項目６からの０.３４ｍｇの脱保護インターフェロン−アルファ２ｂをアルゴンをスパージしておいた０.２２ｍｌの緩衝液Ａ（０.１Ｍトリス、６Ｍ ＧｄｍＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム塩、ｐＨ７.５）に溶解した。この溶液を、各３０ｍｌの酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオンの溶液（各溶液は緩衝液Ｂ（０.１Ｍトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム塩、ｐＨ７.５）中に０.３ｍｇのグルタチオンを含む）、および０.６６ｍｌの緩衝液Ｂで希釈した。ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析のため、試料を折り畳みの開始時および２２時間後に取り出した。主要ピークの溶出時間は、開始時の４０.２分から２２時間後の３６.３分に変化し、タンパク質の折り畳みと一致していた。
【００８３】
２２時間後に折り畳み混合物を１３０００ｒｐｍにて１分間遠心分離した。ペレットは観察されず、溶液を、ＫＴａ ＦＰＬＣにより制御しＰＢＳ（ｐＨ７）で溶出するHi-TrapTMカラム（Pharmacia）で脱塩した。
【００８４】
精製をＵＶにより２８０ｎｍにてモニターし、最も濃縮された画分を生物学的活性の分析に用いた。濃度はAdvanced Protein Assay（Cytoskeleton Inc.）により０.０９±０.０.３ｍｇ／ｍｌと測定された。同様にして折り畳まれた調製物をＲＰ−ＨＰＬＣによりＣ１８カラムで精製し、主要ピークを単離し、凍結乾燥した。
【００８５】
この試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳは予期された質量のペプチドが存在することを示し、遊離Ｃｙｓ残基についてのＮＥＭ試験（Mantら(1997)）は陰性であり、両ジスルフィド結合が生成していることが確認された。純度は分析的ＨＰＬＣにより９５％であった。
【００８６】
８．インターフェロン−アルファ２ｂによる細胞変性作用の抑制の試験
項目７で調製したインターフェロン−アルファ２ｂを、Rubinsteinら(1981)の細胞変性作用抑制アッセイを用いて滴定した。この抗ウイルスアッセイにおいて、１単位／ｍｌのインターフェロンは、ウシＭＤＢＫ細胞で水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に５０％の細胞変性作用を引き起こすのに必要な量である。項目７で調製したインターフェロン−アルファ２ｂの最も濃縮した画分をＤＭＥＭで１×１０4に希釈し、９６ウエルプレート中のウシＭＤＢＫ細胞（５×１０4細胞／ｍｌの細胞（０.１５ｍｌ）に０.１８ｍｌのインターフェロン−アルファを加えた）に加えた。各ウエルに加えたインターフェロンのアリコートは、前のウエルのインターフェロンの濃度の１／３であった。２４時間後に細胞にＶＳＶを攻撃させた。攻撃の２４時間後に細胞を顕微鏡で調べ、細胞の５０％が生存したウエルを１単位のインターフェロン／ｍｌの濃度を有するものとした。この試験により測定したインターフェロン−アルファ２ｂの活性は、２.５±０.８×１０7Ｕ／ｍｇと計算された。
【００８７】
実施例２
１．インターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）の調製
この合成は実施例１と同様にして行った。
【００８８】
２．インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの調製
インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルは、ヒトインターフェロン−アルファ２ｂのアミノ酸２９−９７を含み、９７位の末端カルボキシル基がエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルに変換されており、２９位のシステインが（Ｌ）−チアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）残基として導入されている。Ｃ末端アミノ酸Ａｌａを、実施例１のインターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの合成について記載したように、BackesおよびEllman (1999)の方法により４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（Novabiochem）にカップリングさせた。この樹脂を固相合成の出発樹脂として０.１ミリモルのスケールで用いた。プロトコールおよび試薬は、最後の残基をＢｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨ（Ｂｏｃ−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸）としてカップリングすることによりＣｙｓ２９Ｔｈｚで合成を終えた他はインターフェロン−アルファ２ｂ（１−９７）Ｃｙｓ１（Ａｃｍ）エチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの合成と同じであった。樹脂を洗浄し、高真空下で乾燥させた（重量１.０７ｇ）。
【００８９】
３．インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの開裂
ペプチドのインターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルをIngenitoら(1999)の方法を用いて樹脂から開裂した。それゆえ、炎乾燥させた１００ｍｌ容の丸底フラスコにアルゴンを満たし、Ｂｏｃ保護ペプチド樹脂（０.５０ｇ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、７ｍｌ）を加えた。１０分後、トリメチルシリルジアゾメタン（７ｍｌ、ヘキサン中の２Ｍ溶液）を加え、混合物を周囲温度で２時間攪拌した。樹脂を濾過により分離し、ＴＨＦおよびＤＣＭで洗浄した。その後、樹脂を５０ｍｌ容の丸底フラスコに入れ、フラスコにアルゴンを満たした。ＤＭＦ（無水、７ｍｌ）、エチル−３−メルカプトプロピオン酸（２ｍｌ）およびチオフェノールナトリウム塩の溶液（１ｍｌの無水ＤＭＦ中に６５ｍｇ）をスポイトで加え、混合物をアルゴン下で２０時間穏やかに攪拌した。
【００９０】
揮発成分を高真空下で除去し、残渣をＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−水−フェノール−ヨウ化アンモニウムで室温にて３時間処理した。樹脂を濾去し、溶液を冷メチルｔ−ブチルエーテルに加えてペプチドを沈殿させた。白色沈殿を遠心分離によりペレット化し、冷ＭＴＢＥで３回洗浄し、得られた白色沈殿を５０−５０アセトニトリル−水に溶解し、凍結乾燥した。この粗製の物質を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【００９１】
画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥して１３.９ｍｇを得た。分析的ＨＰＬＣにより測定した純度は８２％であった。
【００９２】
４．インターフェロン−アルファ２ｂ（１−２８）Ｃｙｓ１Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの調製
インターフェロン−アルファ（１−２８）Ｃｙｓ１Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルは、ヒトインターフェロン−アルファ２ｂの最初の２８アミノ酸を含み、２８位の末端カルボキシル基がエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルに変換されている。Ｃ末端アミノ酸Ｓｅｒを、BackesおよびEllman (1999)の方法により４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（Novabiochem）にカップリングさせた。それゆえ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（４.１７ｇ）およびエチルジイソプロピルエチルアミン（３.７ｍｌ）を、クロロホルム（２０ｍｌ）中の４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（１.９５ｇ、初期ローディング１.１２ミリモル／ｇ）の懸濁液に加えた。混合物を−２０℃に冷却し、PyBOPR（５.６７ｇ）を加え、攪拌を−２０℃で３.５時間続けた。樹脂を濾過し、クロロホルムで洗浄した。未反応のスルホンアミド基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２×１５分）中のジ−ｔ−ブチルジカルボン酸（１.５ｇ）およびエチルジイソプロピルアミン（２.４ｍｌ）の溶液を用いてキャッピングした。
【００９３】
各キャッピングの後に樹脂をジクロロメタンで洗浄し、２回目の後に高真空下で乾燥させた。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）のローディングは、固相ペプチド合成のためのNovabiochem 2000カタログの４頁に記載の方法を用いて０.４６ミリモル／ｇと測定された。この樹脂を固相合成の出発樹脂として０.１ミリモルのスケールで用いた。
【００９４】
プロトコールおよび試薬は、以下の点を除いてインターフェロン−アルファ（９８−１６５）の合成と同じであった。Ｉｌｅ２４−Ｓｅｒ２５をｃ−プソイドプロリンジペプチドとしてカップリングした。残基Ａｒｇ１２、Ａｒｇ１３、Ｔｈｒ１４、Ｌｅｕ１５、Ｍｅｔ１６、Ｌｅｕ１７、Ｌｅｕ１８、Ａｌａ１９、Ａｒｇ２２およびＡｒｇ２３はすべて、二重にカップリングされた。Ｃｙｓ２９はＢ（Ｌ）−チアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）として導入された。最後の残基をＢｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨとしてカップリングすることにより合成をＣｙｓ１Ｔｈｚで終えた。樹脂を洗浄し、高真空下で乾燥させた（重量０.３７ｇ）。
【００９５】
５．インターフェロン−アルファ２ｂ（１−２８）Ｃｙｓ１Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルの開裂
ついで、上記で調製したインターフェロン−アルファ２ｂ（１−２８）をIngenitoら(1999)の方法を用いて樹脂から開裂した。それゆえ、炎乾燥させた５０ｍｌ容の丸底フラスコにアルゴンを満たし、Ｂｏｃ保護ペプチド樹脂（０.１８ｇ）および無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、７.５ｍｌ）を加えた。１０分後、トリメチルシリルジアゾメタン（７.５ｍｌ、ヘキサン中の２Ｍ溶液）を加え、混合物を周囲温度で２時間攪拌した。樹脂を濾過により分離し、ＴＨＦおよびＤＣＭで洗浄した。その後、樹脂を５０ｍｌ容の丸底フラスコに入れ、フラスコにアルゴンを満たした。ＤＭＦ（無水、７ｍｌ）、エチル−３−メルカプトプロピオン酸（２ｍｌ）およびチオフェノールナトリウム塩の溶液（１ｍｌの無水ＤＭＦ中に６５ｍｇ）をスポイトで加え、混合物をアルゴン下で２０時間穏やかに攪拌した。揮発成分を高真空下で除去し、残渣をＴＦＡ−フェノール−トリイソプロピルシラン−水−ヨウ化アンモニウムとともに室温で３時間攪拌した。
【００９６】
樹脂を濾去し、溶液を冷メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に加えてペプチドを沈殿させた。白色沈殿を遠心分離によりペレット化し、冷ＭＴＢＥで３回洗浄し、得られた白色沈殿を５０−５０アセトニトリル−水に溶解し、凍結乾燥した。この粗製の物質を、アセトニトリル−水中の０.１％ＴＦＡ−０.１％ＴＦＡの線状勾配で溶出しWaters semi-prep ＨＰＬＣシステムにより制御したVydac C8カラムでＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製をＵＶにより２１４ｎｍにてモニターした。
【００９７】
画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥して１７.０ｍｇの所望の生成物（分析的ＨＰＬＣによる純度９１％）を得た。
【００９８】
６．インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−１６５）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚの調製
ほぼ等モル量のインターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３−メルカプトプロピオン酸チオエステルとインターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）との反応によりライゲーション反応が進行した。インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３メルカプトプロピオン酸チオエステル（１０.６ｍｇ）およびインターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）（１３.７ｍｇ）を、６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）の別々の溶液（ペプチド当たり０.６０ｍｌ）に溶解した。これら２つの溶液を混合し、チオフェノール（２４μｌ）およびベンジルメルカプタン（２４μｌ）を加え、溶液を３７℃でインキュベートした。
【００９９】
６６時間後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、０３７ｇ）を３ｍｌの６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）中の溶液として加え、ライゲーション混合物を３７℃でさらに２時間インキュベートした。溶液を３ｍｌのアセトニトリルおよび２ｍｌの６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５）で希釈し、アセトニトリル−水中の０.１％ＴＦＡ−０.１％ＴＦＡの線状勾配で溶出しWaters semi-prep ＨＰＬＣシステムにより制御したVydac C8カラム（２０８ＴＰ５１０）でＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製をＵＶにより２１４ｎｍにてモニターした。画分をＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析し、標的ポリペプチドを含む画分をコンバインし、凍結乾燥して４.７ｍｇ（分析的ＨＰＬＣによる純度９７％）を得た。
【０１００】
７．Ｔｈｚ２９のＣｙｓへの変換によるインターフェロン−アルファ２ｂ（２９−１６５）の調製
Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩でｐＨ４.０にて処理することにより、インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−１６５）Ｃｙｓ２９ＴｈｚのＮ末端Ｃｙｓを再生させた。インターフェロン−アルファ２ｂ（２９−１６５）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚ（４.６ｍｇ）を、６Ｍ塩酸グアニジン、０.３Ｍ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩、０.１Ｍ酢酸（水酸化ナトリウムでｐＨ４.０に調整）に溶解した。２２〜２４℃で０.５時間後、溶液を３７℃でインキュベートした。この溶液を、ＫＴａ ＦＰＬＣにより制御し６Ｍ塩化グアニジン０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）で溶出するHi-TrapTMカラム（Pharmacia）で脱塩した。
【０１０１】
精製をＵＶにより２８０ｎｍにてモニターし、第一のピーク（１.８ｍｌ）をCentriconカートリッジ（Millipore、分子量カットオフ１０ｋＤａ）で０.４ｍｌに濃縮した。この溶液をインターフェロン−アルファ２ｂ（１−２８）Ｃｙｓ１Ｔｈｚとのライゲーションに直接用いた（実施例２、項目８）。
【０１０２】
８．インターフェロン−アルファ２ｂ（１−１６５）の調製
ほぼ等モル量のインターフェロン−アルファ２ｂ（２９−９７）Ｃｙｓ２９Ｔｈｚエチル−３メルカプトプロピオン酸チオエステルとインターフェロン−アルファ２ｂ（９８−１６５）との反応によりライゲーション反応が進行した。インターフェロン−アルファ２ｂ（１−２８）Ｃｙｓ１Ｔｈｚ（０.８ｍｇ）を６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０；０.１ｍｌ）に溶解し、Hi-TrapTMから得たインターフェロン−アルファ２ｂ（２９−１６５）の濃縮溶液（推定４.０ｍｇ）に加えた。チオフェノール（１０μｌ）およびベンジルメルカプタン（１０μｌ）を加え、溶液を混合し、３７℃でインキュベートした。３６時間後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、１５.７ｇ）を６Ｍ塩化グアニジン、０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）中の溶液（０.１ｍｌ）として加え、ライゲーション混合物を３７℃でインキュベートした。１.５時間後、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩（８.７ｍｇ）を固体として加え、ライゲーション混合物を６Ｍ塩酸グアニジン、０.３Ｍ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩、０.１Ｍ酢酸（水酸化ナトリウムでｐＨ４.０に調整）、アセトニトリル（０.２ｍｌ）およびトリフルオロ酢酸（５μｌ）の４ｍｌ溶液で希釈し、３７℃でインキュベートした。さらに３時間後、溶液をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、所望のペプチドをプールし、凍結乾燥して還元インターフェロン−アルファ２ｂ（１−１６５）（分析的ＨＰＬＣによる純度９２％）を得た。
【０１０３】
９．インターフェロン−アルファ２ｂの折り畳み
合成インターフェロン−アルファ２ｂを生物学的に活性なインターフェロン−アルファに折り畳ませた。それゆえ、インターフェロン−アルファ２ｂ（０.８８ｍｇ）をアルゴンをスパージしておいた０.５ｍｌの緩衝液Ａ（０.１Ｍトリス、６Ｍ ＧｄｍＣｌ、１ｎＭ ＥＤＴＡナトリウム塩、ｐＨ８.０）に溶解した。この溶液を、各６１μｌの酸化型グルタチオンおよび還元型グルタチオンの溶液（各溶液は６１μｌの緩衝液Ｂ（０.１Ｍトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム塩、ｐＨ８.０）中に０.６１ｍｇのグルタチオンを含む）、および１.５ｍｌの緩衝液Ｂで希釈した。溶液を混合し、室温（２２℃）で静置した。１６時間後に折り畳みタンパク質をVydac C18カラム（２３８ＴＰ５４）でＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、試料をプールし、凍結乾燥して天然のＩＦＮ−アルファ２ｂ（０.１５ｍｇ、分析的ＨＰＬＣによる純度１００％）を得た。遊離のＣｙｓについてのＮＥＭ試験は遊離のＣｙｓが存在しないことを確認した。
【０１０４】
本発明を特定の態様を参照して詳細に記載したが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく種々の変更および改変をなし得ることは当業者には明らかであろう。
【０１０５】
参照文献
【表１】
2005532267.tif 000002
【０１０６】
【表２】
2005532267.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】実施例１で合成したインターフェロン−アルファ２ｂのＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【０１０８】
【図２】実施例１で合成したインターフェロン−アルファ２ｂの分析的ＨＰＬＣを示す。
【０１０９】
【図３】実施例２で合成したインターフェロン−アルファ２ｂのＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【０１１０】
【図４】実施例２で合成したインターフェロン−アルファ２ｂの分析的ＨＰＬＣを示す。
【０１１１】
【図５】ヒトインターフェロン−アルファ２ｂのアミノ酸配列を示す。ジスルフィド結合は、Ｃｙｓ１とＣｙｓ９８との間、およびＣｙｓ２９とＣｙｓ１３８との間で生成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月20日(2004.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005532267000001.app
【国際調査報告】
2005532267.tif 000009
2005532267.tif 000010
2005532267.tif 000011