(57)【要約】本発明は、増殖可能なマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデル、及びマイコプラズマ・ボビス培養物の有効量を動物に投与することにより、マイコプラズマ・ボビスに感染することによって発生する疾病又は障害を高信頼で誘発及び確立する方法を提供する。本発明のチャレンジ培養物は、マイコプラズマ・ボビス特異的細胞性又は体液性免疫応答を誘発するのに充分な量で投与される。本発明によるマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルは、効力のあるワクチンの有効性を評価するのに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のマイコプラズマ・ボビス培養物を投与すること、及び、疾病の臨床的徴候を決定することを含む、動物において疾病又は障害を誘発する方法。
【請求項２】
前記疾病又は傷害が、肺炎、呼吸器感染症、肺病変、関節炎、乳腺炎、耳炎、及び繁殖障害からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物が、去勢雄ウシ、非去勢雄ウシ、雌ウシ、及び子ウシからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物が、雌ウシである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記動物が、子ウシである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記のマイコプラズマ・ボビス培養物の有効量が、チャレンジ投与量当たりコロニー形成単位（ＣＦＵ）約１ｘ１０６〜約５ｘ１０１１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記のマイコプラズマ・ボビス培養物の有効量が、約１ｘ１０８〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／投与量を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のマイコプラズマ・ボビス培養物の有効量が、約１ｘ１０１０〜約５ｘ１０１０ＣＦＵ／投与量を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
疾病の前記臨床的徴候が、肺におけるマイコプラズマ・ボビスの上昇したレベル、上昇した温度、又は減少した体重増加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記の上昇した温度が、直腸温度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）第１の動物にマイコプラズマ・ボビスワクチンを投与すること；
（ｂ）前記動物にマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量をチャレンジすること；
（ｃ）第２の動物にマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量をチャレンジすること；
（ｄ）前記マイコプラズマ・ボビスによって生じた疾病の臨床的徴候を決定すること；及び
（ｅ）前記第１の動物に存在する疾病の臨床的徴候と、前記第２の動物に存在する疾病の臨床的徴候とを比較すること
を含む、マイコプラズマ・ボビスに対するワクチンの効果の評価方法。
【請求項１２】
前記チャレンジ培養物が、チャレンジ投与量当たりコロニー形成単位（ＣＦＵ）約１ｘ１０６〜約５ｘ１０１１を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記チャレンジ培養物が、約１ｘ１０８〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／投与量を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記チャレンジ培養物が、約１ｘ１０１０〜約５ｘ１０１０ＣＦＵ／投与量を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
疾病の前記臨床的徴候が、肺におけるマイコプラズマ・ボビスの上昇したレベル、上昇した温度、又は減少した体重増加を含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ・ボビス［Mycoplasma
bovis］チャレンジモデル法、並びにマイコプラズマ・ボビスの投与方法、マイコプラズマ・ボビスによって生じる動物における疾病又は障害の確立方法、及び誘発方法に関する。本発明によるマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルは、効力のあるワクチンの有効性を評価するのに用いることができる。
【０００２】
［発明の背景］
マイコプラズマ・ボビス［Mycoplasma bovis］は、構内又は集約飼育された肉牛及び乳牛における重要で包括的なウシ族の病原体である。最も頻繁に報告される臨床的発現は、子ウシの肺炎であり、これは、しばしば関節炎を伴い、肺炎−関節炎症候群としても知られている。その病因学的役割は、乳腺炎、耳炎、及び雌ウシ及び非去勢雄ウシの生殖疾病又は障害にも関係している。ウシ呼吸器疾患（ＢＲＤ：bovine
respiratory disease）による死亡率の３６％までにマイコプラズマ・ボビスが関与していることから、重大な経済的損失が、マイコプラズマ・ボビスにより誘発される呼吸器疾患に関係している。現在、完全に認可されたマイコプラズマ・ボビスワクチンが存在していないので、死亡率を減少させる目的には、しばしば抗生物質治療が用いられる。また、マイコプラズマ・ボビス疾病の予防は、その動物の他の呼吸器疾患への罹りやすさも減らすことができる。若い子ウシに非常に有効且つ安全であるマイコプラズマ・ボビス細菌ワクチンは、畜牛業界にとって非常に貴重であろう。従って、重篤な肺病変及び他の臨床的徴候を誘発し、増殖可能なマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルが、効力のあるマイコプラズマ・ボビスワクチンの有効性を評価するのに必要とされている。
【０００３】
［発明の要約］
本発明は、マイコプラズマ・ボビス培養物の有効量を動物に投与することにより、マイコプラズマ・ボビスに感染することによって発生する疾病又は障害を高信頼で誘発及び確立する方法及び増殖可能なマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルを提供する。本発明のチャレンジ培養物は、マイコプラズマ・ボビス特異的細胞性又は体液性免疫応答を誘発するのに充分な量で投与する。或る観点では、前記動物は子ウシである。本発明によるマイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルは、効力のあるワクチンの有効性を評価するのに用いることができる。
また、本発明は、適切な培地中における培養状態でマイコプラズマ・ボビスの単離物を生存可能な数量まで増殖させることを含むマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の調製方法、及び前記培養物を動物に実験的に投与して、肺炎性病変及び疾病の臨床的徴候を誘発させる方法も提供する。
【０００４】
［図面の簡単な説明］
図１は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビスチャレンジされた子ウシ(処理群Ａ及びＣ）は、第１日から第２０日の間、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より高い平均体温であった。Ｂ群のチャレンジされた子ウシは、第３日から第５日の間、第７日から第１４日の間、及び第１７日に、Ｄ群（無チャレンジ対照動物）と比較して、より高い平均体温であった。
【０００５】
図２は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビスチャレンジされた子ウシ（処理群Ａ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、第１５日、第１７日、及び第１８日に、より高い平均体温であった。
【０００６】
図３は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビスチャレンジされた子ウシ（処理群Ｂ及びＣ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、第４日から第２１日の間に、より高い平均体温であった。Ａ群のチャレンジされた子ウシは、Ｄ群（無チャレンジ対照動物）と比較して、第７日から第２１日の間に、より高い平均体温であった。
【０００７】
図４は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの３〜２０日後の群平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビスワクチン２投与量を投与された子ウシ（処理群Ａ及びＣ）及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、偽薬チャレンジされた群（処理群Ｄ）と比較して、第７日から第２０日の間に、より低い平均体温であった。処理群Ｂのワクチン接種された子ウシは、偽薬チャレンジ群（処理群Ｄ）と比較して、第７日から第１２日及び第１４日から第２０日の間により低い平均体温であった。
【０００８】
［発明の詳細な説明］
本発明は、マイコプラズマ・ボビス培養物の有効量を動物に投与することを含む、マイコプラズマ・ボビスに感染することによって動物において発生する疾病又は障害を誘発する方法、及びチャレンジモデルを包含する。本発明は、マイコプラズマ・ボビス培養物の製造方法及び投与方法も包含する。マイコプラズマ・ボビス株としては、例えば、ＡＴＣＣ２５０２５（１９６８年１０月８日にＲ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒにより寄託）、２５５２３（１９６９年１０月２２日にＲ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒにより寄託）、及び２７３６８（１９７２年７月５日にＲ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒにより寄託）を挙げることができる。好ましい態様では、前記チャレンジ培養物のマイコプラズマ・ボビス単離物には、以下の菌株、すなわち、２３００（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５５８）、３６２５（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５５９）、１６１５０（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５６０）、２０５１８（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５６１）、又は５０６３が含まれる。
【０００９】
本発明は、任意のマイコプラズマ・ボビス単離物を、有効チャレンジ培養物として用いることができることを企図する。或る好ましい態様では、前記マイコプラズマ・ボビス単離物を、Ｂｅｇ４培地中で充分な細胞密度まで増殖し、そして有効量を動物に投与して、肺炎性病変及び疾病の臨床的徴候を誘発させる。マイコプラズマ・ボビス株２３００（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５５８）、３６２５（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５５９）、１６１５０（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５６０）、２０５１８（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３５６１）、及び５０６３単離物の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，バージニア州２０１１０−２２０９）によって実施した。
開示を明瞭にする目的で、本発明の詳細な説明を、本発明の或る特徴、態様、又は適用を説明する後出の小区分に分けるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
［定義及び略語］
種名の前に記載される略語Ｍ．は、マイコプラズマ属（genus Mycoplasma）を意味する。
本明細書において、マイコプラズマ・ボビス感染に関する用語「疾病又は障害」は、マイコプラズマ・ボビス細菌の複製をおこすか、マイコプラズマ・ボビスの脱粒又は伝染を誘発するか又は宿主内でマイコプラズマ・ボビス感染を確立すること、及び、マイコプラズマ・ボビス感染の症状をおこすことを意味する。チャレンジモデルは、細菌量が増加する場合、肺の感染が増加する場合、肺病変が増加する場合、臨床的徴候が増加した場合、すなわち、直腸温度が増加した場合、及び／又は体重増加及び／又は成長が減少する場合に有効であると考えられる。本発明の方法は、例えば、動物、特に畜牛における、肺炎、呼吸器感染症、及び肺病変の誘発、肺中のマイコプラズマ・ボビスレベルの増加、温度の増加、及び体重増加の減少に有効である。また、本発明は、マイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量を動物（好ましくは畜牛）に投与することにより、前記動物において肺炎、関節炎、乳腺炎、耳炎、及び繁殖障害などの障害を誘発させることも企図する。
【００１１】
本明細書において、用語「マイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物」は、マイコプラズマ・ボビス感染によって発生する障害又は疾病を引き起こすのに有用な培養物を意味する。前記マイコプラズマ・ボビス培養物としては、畜牛においてマイコプラズマ・ボビスによって感染症をおこすのに有効な任意の培養物を挙げることができる。本発明で使用することのできるマイコプラズマ・ボビス培養物としては、例えば、新鮮な、冷凍された、又は凍結乾燥されたマイコプラズマ・ボビス細胞調製物を挙げることができる。
【００１２】
本明細書において、用語「マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデル」は、マイコプラズマ・ボビス感染によりおこる障害又は疾病を引き起こすのに有用なマイコプラズマ・ボビス培養物を投与する方法を意味する。前記マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルとしては、畜牛においてマイコプラズマ・ボビスによって感染症をおこすのに有効な任意の投与方法を挙げることができる。本発明で使用することのできる投与方法としては、例えば、経口投与、鼻腔内投与、口鼻（ｏｒａｎａｓａｌ）投与、局所投与、経皮投与、エアロゾル、及び非経口投与（例えば、静脈内投与、腹腔内投与、気管内投与、皮内投与、皮下投与、又は筋肉内投与）を挙げることができる。
【００１３】
本明細書において、用語「動物」は、哺乳動物を含むヒト以外の全ての動物を意味する。
本明細書において、用語「畜牛」は、ウシ科動物を意味し、以下に限定されるものでないが、去勢雄ウシ（ｓｔｅｅｒ）、非去勢雄ウシ（ｂｕｌｌ）、雌ウシ（ｃｏｗ）、及び子ウシ（ｃａｌｆ）を挙げることができる。本発明の方法は、好ましくは、ヒト以外の哺乳動物、最も好ましくは子ウシに適用する。
用語「有効量」は、投与された対象において疾病を誘発又は確立するのに充分なマイコプラズマ・ボビス培養物の量を意味する。マイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量とは、例えば、マイコプラズマ性肺炎をおこすチャレンジ培養物を意味する。
【００１４】
本明細書において、用語「マイコプラズマ・ボビスワクチン」は、マイコプラズマ・ボビスの感染によりおこる障害又は疾病の予防又は治療において有用なワクチンを意味する。マイコプラズマ・ボビスワクチンとしては、畜牛における有毒のマイコプラズマ・ボビスの感染を治療又は予防するのに有効な任意のワクチンを挙げることができる。本発明で使用することができるマイコプラズマ・ボビスワクチンとしては、例えば、全体的又は部分的マイコプラズマ・ボビス細胞調製物、不活性化又は改質化生ワクチン、マイコプラズマ・ボビス由来ポリペプチド若しくはタンパク質又は前記タンパク質若しくはポリペプチドの免疫原性フラグメント１つ以上か、マイコプラズマ・ボビス由来ポリペプチド若しくはタンパク質又はその免疫原性フラグメント１つ以上をコードするマイコプラズマ・ボビス遺伝子若しくは核酸１つ以上（この遺伝子又は核酸は、畜牛中イン・ビボで発現することができる）を有するサブユニットワクチンを挙げることができる。前記マイコプラズマ・ボビスポリペプチド、タンパク質、前記ポリペプチド及びタンパク質の免疫原性フラグメント、又はマイコプラズマ・ボビス遺伝子又は核酸は、当業者に知られている技術を使用して合成又は組み換え技術によって生成することができる。
【００１５】
本明細書において、用語「アジュバント」は、免疫応答の増強剤である。適切なアジュバントとしては、以下に限定されるものでないが、鉱質ゲル、例えば水酸化アルミニウム；表面活性物質、例えばリソレシチン；グリコシド、例えばサポニン誘導体、例えばクイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）又はＧＰＩ−０１００；カチオン系界面活性剤、例えばＤＤＡ、プルロニックポリオール；ポリアニオン；ノニオン系ブロックポリマー、例えば、プルロニックＦ−１２７（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．，米国）；ペプチド；鉱油、例えば、モンタニデ［Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ］ＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ，フランス）、カルボポル［ｃａｒｂｏｐｏｌ］、アムフィゲン［Ａｍｐｈｉｇｅｎ］（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ  Ｏｍａｈａ，ネブラスカ州，米国）、アルヒドロゲル［Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ］（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，デンマーク）オイルエマルジョン、例えば、鉱油のエマルジョン、例えば、ＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａ及び水、又は植物油のエマルジョン、水、及び乳化剤、例えばレシチン；アラム［ａｌｕｍ］、コレステロール、サイトカイン、及び複数のアジュバントの組合せを挙げることができる。また、前記免疫源は、リポソーム中に含まれていることができるか、あるいは、ワクチン製剤中で使用するための多糖類及び／又は他の重合体に抱合していることができる。
【００１６】
［チャレンジ培養物］
本発明は、マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデル、及び適切な培地中における培養状態でマイコプラズマ・ボビスの単離物を充分な細胞密度まで増殖させることを含むマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の製造方法及び投与方法；並びに動物に前記培養物を実験的に投与して、肺炎性病変及び疾病の臨床的徴候を誘発させる方法に関する。或る態様では、マイコプラズマ・ボビスが、肺組織から単離されたものである。別の態様では、マイコプラズマ・ボビスが、リンパ節組織から単離されたものである。種々の培地が当業者に周知であり、Ｆｒｉｉｓ、Ｂｅｇ４、Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓ、及びＭＨＰを挙げることができる。或る好ましい態様では、前記チャレンジ培養物のマイコプラズマ・ボビス単離物が、以下の菌株：２３００、３６２５、１６１５０、２０５１８、又は５０６３の１種以上を含む。
【００１７】
マイコプラズマ・ボビス単離物が増殖する条件は、培地の組成及び増殖させる特定の単離物に応じて変動しても良い。しかしながら、典型的には、単離物は、以下のとおりに増殖させる。冷凍瓶中の前記単離物を急速解凍するか、又は凍結乾燥された瓶をＢｅｇ４培地１〜１０ｍＬ中に再懸濁する。次に、無菌Ｂｅｇ４培地に、０．１％〜３０％のマイコプラズマ・ボビス種原液を播種する。次に、その培養物を３０℃〜４０℃で１２時間〜約７２時間インキュベートし、インキュベーションの時間から収集の時間までを測定する。或る好ましい態様においては、前記マイコプラズマ・ボビス培養物を３７℃で２４時間〜４８時間増殖させる。各チャレンジ日に対して、別々のチャレンジ播種物を調製する。各チャレンジ日において、Ｂｅｇ４培地中の連続希釈によって、チャレンジ培養物の生菌数［コロニー形成単位（ＣＦＵ）］を決定し、そしてハート・インフュージョン寒天培地（ＨＩＡ：Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ａｇａｒ）寒天プレート上に各連続希釈物を播いた。次に、前記ＨＩＡプレートを３７℃で４８〜１６８時間、好ましくは１２０時間インキュベートし、そして生菌数を得るためにコロニー数を測定する。
【００１８】
得られたマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物を、濃縮することができる。前記生物の濃縮には、種々の方法が当業者に知られている。例えば、遠心（例えば、超遠心）によるか又はろ過（例えば、限外濾過）によって、前記生物を濃縮することができる。次いで、得られた濃縮したマイコプラズマ・ボビス培養物を、当業者に周知の方法を用いて回収する。また、前記チャレンジ培養物も、当業者に容易に知られる前記方法にいくつかの何らかの変形を加えることによって調製することができる。
【００１９】
本発明で使用することのできるマイコプラズマ・ボビス培養物としては、例えば、新鮮な、冷凍された、又は凍結乾燥されたマイコプラズマ・ボビス細胞調製物を挙げることができる。
また、マイコプラズマ・ボビス単離物は、公知の方法を用いて、感染した畜牛の肺病変から直接得ることができる。また、マイコプラズマ・ボビス単離物は、感染した畜牛の鼻腔、気管、肺洗浄液、リンパ節、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、血液、及び関節から、公知の方法を用いて直接的に得ることもできる。
【００２０】
［投与作業：投与及び処理の方法］
本発明に従って、有効量のマイコプラズマ・ボビス培養物の少なくとも１投与量を、動物、好ましくは、約３週〜２８週齢の子ウシに投与して、マイコプラズマ・ボビス感染をおこす。好ましくは、前記マイコプラズマ・ボビス培養物を、連続する３日間投与する。マイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量は、チャレンジ投与量あたり約１ｘ１０６〜約５ｘ１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。充分な疾病を提供するマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物は、好ましくは、約１ｘ１０８〜約１ｘ１０１１ＣＦＵ／投与量を含み、より好ましくは、約１ｘ１０１０〜約５ｘ１０１０ＣＦＵ／投与量を含む。本発明により、マイコプラズマ・ボビス感染が、再現可能に誘発され、そして約１〜４９日で、畜牛中で臨床的疾病が確立される。好ましくは、マイコプラズマ・ボビス臨床疾病は、約１〜２１日で再現可能に確立され、より好ましくは約１〜１４日で再現可能に確立される。
【００２１】
本発明によれば、投与するためのマイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量は、約０．５〜約３０．０ｍＬであり、好ましくは約５ｍＬ〜約２０ｍＬであり、そしてより好ましくは、約１０〜１２ｍＬである。
本発明によれば、経口、鼻腔内、口鼻、局所、経皮、エアロゾル、及び非経口（例えば、静脈内、腹腔内、気管内、皮内、皮下、又は筋肉内）を含む公知の経路によって投与を実施することができる。好ましい投与経路は、鼻腔内投与である。
【００２２】
また、本発明は、マイコプラズマ・ボビス誘発疾病を引き起こすための追加のチャレンジ投与量の子ウシへの投与の必要性を解消する単回投与量チャレンジ方法も企図している。
本発明によれば、約３〜２８週齢の子ウシに投与されたマイコプラズマ・ボビスチャレンジの有効量の投与は、肺炎を含む有効な呼吸器感染を提供し、肺中におけるマイコプラズマ・ボビスレベルを増加し、温度を増加し、そして体重増加を減少させる。１ｘ１０６〜約５ｘ１０１１は、信頼でき且つ再現可能に、畜牛に感染を起こし、そして約１〜４９日で臨床的疾病を確立するような前記チャレンジ培養物中のマイコプラズマ・ボビスの量は今回はじめて決定された。
【００２３】
本発明は、子ウシ中にマイコプラズマ・ボビス感染を投与する方法であって、前記子ウシに前記培養物の少なくとも１投与量、好ましくは３チャレンジ投与量を投与して、前記子ウシ中でマイコプラズマ・ボビス感染を起こすことを含む、前記方法を提供する。或る好ましい態様では、前記チャレンジ培養物を鼻腔内投与する。更に、前記チャレンジ投与量は、前記培養物約１０〜１２ｍＬ（１ｍＬあたり約１．０×１０９マイコプラズマ・ボビスコロニー形成単位を含む）を含むことが好ましい。前記チャレンジ培養物は、連続する３日間で子ウシに投与することが望ましい。
【００２４】
また、本発明は、マイコプラズマ・ボビスチャレンジ培養物の有効量を動物、好ましくは畜牛に投与して、前記動物において障害（肺炎、関節炎、乳腺炎、耳炎、及び繁殖障害を含むがこれらに限定されないもの）を起こす、前記投与も企図する。
以下の実施例によって、本発明を更に説明する。
【００２５】
［実施例１］
《材料及び方法》
〈動物〉
各実験チャレンジ用に、健康な雑種の乳牛又は肉牛の子ウシを入手した。各実験の開始前に最低７日間にわたり子ウシを順化させた。全ての子ウシには、毎日、公知の汚染物質や駆虫剤が含まれておらず、薬剤添加されていない濃縮された食物を与え、水は自由に摂取させた。
【００２６】
《チャレンジ方法》
各子ウシには、鼻腔内径路によって、新鮮なマイコプラズマ・ボビス培養物１０〜２０ｍＬ［約１×１０８〜１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）］を連続する３日間受容させた。各実験チャレンジの完了後短時間の内に、チャレンジ播種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。チャレンジ培養物の生菌数は、Ｂｅｇ４培地中で連続希釈し、そして各連続希釈物をＨＩＡ寒天培地上に播くことによって測定した。次いで、前記ＨＩＡプレートを３７℃で１２０時間インキュベートし、そして生菌数を得るため、コロニー数を測定した。
【００２７】
《実験手順》
耳に独自の識別札を付けて、それぞれの子ウシの個体を区別した。歳によって動物を無作為に檻群と治療群とに分けた。
全ての動物の体重を、チャレンジの１日前、チャレンジの７日後、チャレンジの１４日後、及びチャレンジの約３週間後に測定した。
直腸温度を、チャレンジの１日前、チャレンジ直前、及びチャレンジの２０日後のそれぞれの朝に測定した。
【００２８】
各子ウシの頸静脈から血液サンプルを収集した。チャレンジの約１日前、チャレンジの７日後、チャレンジの１４日後、及び検死時（チャレンジの約３週間後）に、子ウシから採血した。Ｂｏｍｍｅｌｉ  ＡＧ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｒｏｕｓｓｅｌ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｉｅｂｅｆｅｌｄ−Ｂｅｒｎ，スイス）製のマイコプラズマ・ボビスＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｋｉｔ  Ｍ．ｂｏｖｉｓ  Ｓｅｒｏ)で評価するまで、各血液サンプルからの血清を、−２０℃で貯蔵した。マルチスキャンリーダーを用いて、４０５ｎｍの波長で、前記ＥＬＩＳＡプレートを読み取った。光学密度（ＯＤ）値を、以下の数式：
百分率＝（サンプルOD−陰性血清OD）／（陽性血清OD−陰性血清OD）*100
を用いて陽性対照血清のＯＤ値に対する％値に変換した。６０％よりも低い値を陰性とみなした。６０％〜８０％の血清を容疑対象とみなし、一方、８０％よりも高いＯＤ値を示す血清を陽性として許容した。
【００２９】
前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの約３週間後に、全ての動物を検死した。子ウシを安楽死させ、そして中枢神経系を除く全ての主要な器官を、肉眼で試験した。
肺を摘出し、そしてマイコプラズマ・ボビス感染に帰すことのできる特徴的な病変について、肉眼で評価した。標準的な肺の図形上に、病変をスケッチした。下記の総肺質量に対する個々の肺葉の比率を使用して、各肺葉ごとのパーセントグロスインボルブメント（percent gross involvement）を重み付けした。
2005500845.tif 000002
【００３０】
次に、重み付けした肺葉の各値を合計して、著しい病変を有する肺全体の百分率を決定した（Ｐｏｉｎｔｏｎら，１９９２）。更に、下記の数式：
2005500845.tif 000003
を用いて、肺損傷（病変）における％減少を計算した。
【００３１】
更に、各肺をＰＢＳ５０ｍＬで洗浄した。気管支洗浄液からのマイコプラズマ・ボビス生菌数の単離及び測定を行った。気管支洗浄液の適切な連続希釈液を調製し、サンプルを適切な寒天培地上に播くことによってマイコプラズマ・ボビス生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。
【００３２】
［実施例２］
この実施例では、若い子ウシにおいて、異なるマイコプラズマ・ボビスチャレンジ方法を評価した。マイコプラズマ・ボビスに対する母由来の抗体を持たない健康な雑種乳牛（ホルスタイン／フリーシアン雑種，約７週齢）２４頭を入手し、表１に記載されているとおり、年齢によって無作為に割り当てた。本実験の開始前３週間に亘り全ての子ウシを順化させた。
【００３３】
【表１】
2005500845.tif 000004
【００３４】
約１０週齢の時点で前記のとおり子ウシにチャレンジした。各子ウシには、連続２日間又は３日間、マイコプラズマ・ボビス株５０６３の新鮮な培養物１０ｍＬ（鼻孔ごとに５ｍＬ）を受容させた。Ａ群及びＢ群の動物には、マスクを介するエアロゾルによってブロス培養物をチャレンジした。Ｃ群の子ウシには、単純なスプレー装置（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｅｌｍｗｏｏｄ，ウィスコンシン州）によってチャレンジし、そしてＤ群の動物は、無チャレンジの対照子ウシとして放置しておいた。
各マイコプラズマ・ボビスの実験的チャレンジの完了後１時間以内に、チャレンジ播種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2005500845.tif 000005
【００３６】
チャレンジの１日前、チャレンジの７日後、チャレンジの１４日後、及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２０日後に、全ての動物の体重を測定した。結果を表３にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ)は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、体重増加が減少していた。
【００３７】
【表３】
2005500845.tif 000006
【００３８】
チャレンジ３日前、チャレンジ２日前、チャレンジ１日前、チャレンジ直前、及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後の１９日間の毎朝、直腸温度を測定した。結果を図１にまとめる。マイコプラズマ・ボビスチャレンジした子ウシ（処理群Ａ及びＣ）は、臨床的徴候、すなわち、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より高い平均体温を、第１日〜第２０日に示した。Ｂ群のチャレンジされた子ウシは、第３日〜第５日、第７日〜第１４日、及び第１７日に、Ｄ群（無チャレンジ対照動物）と比較して、より平均体温が高かった。
【００３９】
マイコプラズマ・ボビス特異的血清抗体応答（ＩｇＧ）を、表４にまとめる。陽性対照血清の０．８０よりも大きい％光学密度（ＯＤ）値を有する血清サンプルを、マイコプラズマ・ボビスに対して陽性と見なした。実験的チャレンジ前には、全ての子ウシが、マイコプラズマ・ボビス陰性であった。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを受容した子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２０日後において、血清陽性であった。処理群Ｄの動物（無チャレンジ対照動物）は、この実験中ずっと実質的に陰性であった。
【００４０】
【表４】
2005500845.tif 000007
【００４１】
前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２０日目に、全ての動物を検死した。肺を摘出し、そしてマイコプラズマ・ボビス感染に帰すことのできる特徴的な病変について、肉眼で評価した。％肺損傷スコアを表５にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より％肺損傷スコアが高かった。これらの結果は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが、マイコプラズマ・ボビス感染に帰することのできる特徴的肺病変を誘発することができたことを示している。
【００４２】
【表５】
2005500845.tif 000008
【００４３】
ＰＢＳ５０ｍＬで各肺を洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２０日における気管支洗浄サンプルからのマイコプラズマ・ボビスの単離の結果を、表６にまとめる。前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ)は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、肺洗浄サンプルにおける生きているマイコプラズマ・ボビスの発生率が増していた。
【００４４】
【表６】
2005500845.tif 000009
【００４５】
結論として、前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを受容した子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、肺病変が発達し、直腸温度が増加し、体重増加が減少し、そして肺洗浄サンプルから単離された生きているマイコプラズマ・ボビスの発生率が増加していた。この結果は、前記マイコプラズマ・ボビス培養物が、血清学的応答を誘発可能であり、及び実験的チャレンジ後に、マイコプラズマ・ボビス感染に帰する特徴的肺病変を誘発することができることを示している。
【００４６】
［実施例３］
この実施例では、５〜７月齢の子ウシにおいて、マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルを評価した。マイコプラズマ・ボビスに対する母由来の抗体を持たない健康な乳牛又は肉牛の雑種の子ウシ（約４週齢）２２頭を入手し、そして表７に記載されているとおり、年齢によって無作為に割り当てた。本実験の開始前に全ての子ウシを順化させた。
【００４７】
【表７】
2005500845.tif 000010
【００４８】
約５〜７月齢の時点で、前記のとおり子ウシにチャレンジした。Ａ群の子ウシには、マイコプラズマ・ボビス株５０６３の新鮮な培養物２０ｍＬ（鼻孔ごとに１０ｍＬ）を連続した３日間受容させ、前記チャレンジは、単純なスプレー装置（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｅｌｍｗｏｏｄ，ウィスコンシン州）で投与した。Ｂ群の動物は、無チャレンジ対照子ウシとして放置した。
各マイコプラズマ・ボビスの実験的チャレンジの完了後１時間以内に、チャレンジ播種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。結果を表８に示す。
【００４９】
【表８】
2005500845.tif 000011
【００５０】
チャレンジの１日前及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２１日後に、全ての動物の体重を測定した。結果を表９にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを投与された子ウシ（処理群Ａ)は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、同等の体重増加であった。
【００５１】
【表９】
2005500845.tif 000012
【００５２】
チャレンジ１日前、チャレンジ直前、及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後の２１日間の毎朝、直腸温度を測定した。結果を図２にまとめる。マイコプラズマ・ボビスチャレンジした子ウシ（処理群Ａ）は、臨床的徴候、すなわち、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、より高い平均体温を、第１５、１７、及び１８日に示した。
【００５３】
マイコプラズマ・ボビス特異的血清抗体応答（ＩｇＧ）を、表１０にまとめる。陽性対照血清の８０％よりも大きい平均％光学密度（ＯＤ）値を有する血清サンプルを、マイコプラズマ・ボビスに対して陽性と見なした。実験的チャレンジ前には、全ての子ウシが、マイコプラズマ・ボビス陰性であった。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを受容した子ウシ（処理群Ａ）は、マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２１日後において、血清陽性であった。処理群Ｂの動物（無チャレンジ対照動物）は、第２１日目で陰性であった。
【００５４】
【表１０】
2005500845.tif 000013
【００５５】
前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２１日目に、全ての動物を検死した。肺を摘出し、そしてマイコプラズマ・ボビス感染に帰すことのできる特徴的な病変について、肉眼で評価した。％肺損傷スコアを表１１にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが投与された子ウシ（処理群Ａ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、より％肺損傷スコアが高かった。これらの結果は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが、マイコプラズマ・ボビス感染に帰することのできる特徴的肺病変を誘発することができたことを示している。
【００５６】
【表１１】
2005500845.tif 000014
【００５７】
ＰＢＳ５０ｍＬで各肺を洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２１日における気管支洗浄サンプルからのマイコプラズマ・ボビスの単離の結果を、表１２にまとめる。前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが投与された子ウシ（処理群Ａ)は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、肺洗浄サンプルにおける生きているマイコプラズマ・ボビスの発生率が増していた。
【００５８】
【表１２】
2005500845.tif 000015
【００５９】
結論として、前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを受容した子ウシ（処理群Ａ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｂ）と比較して、肺病変が発達し、チャレンジ後第１５、１７、及び１８日目に直腸温度が増加しており、そして肺洗浄サンプルから単離された生きているマイコプラズマ・ボビスの発生率が増加していた。この結果は、前記マイコプラズマ・ボビス培養物が、血清学的応答を誘発可能であり、且つ実験的チャレンジ後に、マイコプラズマ・ボビス感染に帰する特徴的肺病変を誘発することができたことを示している。
【００６０】
［実施例４］
この実施例では、若い子ウシにおいて、マイコプラズマ・ボビス３系統を評価した。マイコプラズマ・ボビスに対する母由来の抗体を持たない健康な雑種乳牛（ホルスタイン／フリーシアン雑種，約６週齢）の子ウシ２４頭を入手し、そして表１３に記載されているとおり、年齢によって無作為に割り当てた。本実験の開始前３週間に亘り全ての子ウシを順化させた。
【００６１】
【表１３】
2005500845.tif 000016
【００６２】
約９週齢の時点で前記のとおり子ウシにチャレンジした。Ａ群、Ｂ群、及びＣ群の各子ウシには、連続３日間、適切なマイコプラズマ・ボビス株の新鮮な培養物１２ｍＬ（鼻孔ごとに６ｍＬ）を受容させ、そして前記チャレンジは、単純なスプレー装置（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｅｌｍｗｏｏｄ，ウィスコンシン州）によって投与した。Ｄ群の動物は、無チャレンジの対照子ウシとして放置しておいた。
各マイコプラズマ・ボビスの実験的チャレンジの完了後１時間以内に、各チャレンジ播種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。結果を表１４に示す。
【００６３】
【表１４】
2005500845.tif 000017
【００６４】
チャレンジの１日前及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２１日後に、全ての動物の体重を測定した。結果を表１５にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジを投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ)は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、体重増加が減少していた。
【００６５】
【表１５】
2005500845.tif 000018
【００６６】
チャレンジ１日前、チャレンジ直前、及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後の２１日間の毎朝、直腸温度を測定した。結果を図３にまとめる。マイコプラズマ・ボビスチャレンジした子ウシ（処理群Ｂ及びＣ）は、臨床的徴候、すなわち、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より高い平均体温を、第４日〜第２１日に示した。Ａ群のチャレンジされた子ウシは、第７日〜第２１日に、Ｄ群（無チャレンジ対照動物）と比較して、より平均体温が高かった。
【００６７】
マイコプラズマ・ボビス特異的血清抗体応答（ＩｇＧ）を、表１６にまとめる。陽性対照血清の８０％よりも大きい平均％光学密度（ＯＤ）値を有する血清サンプルを、マイコプラズマ・ボビスに対して陽性と見なした。実験的チャレンジ前には、全ての子ウシが、マイコプラズマ・ボビス陰性であった。マイコプラズマ・ボビス株５０６３、３６２５、又は１６１５０いずれかのチャレンジ培養物を受容した子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、前記実験的チャレンジの２０日後において、血清学的応答があった。処理群Ｄの動物（無チャレンジ対照動物）は、第２０日に陰性であった。
【００６８】
【表１６】
2005500845.tif 000019
【００６９】
前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２１日目に、全ての動物を検死した。
肺を摘出し、そしてマイコプラズマ・ボビス感染に帰すことのできる特徴的な病変について、肉眼で評価した。％肺損傷スコアを表１７にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジが投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、無チャレンジ対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より％肺損傷スコアが高かった。これらの結果は、各マイコプラズマ・ボビス単離物が、マイコプラズマ・ボビス感染に帰することのできる特徴的肺病変を誘発することができたことを示している。
【００７０】
【表１７】
2005500845.tif 000020
【００７１】
［実施例５］
この実施例では、前記マイコプラズマ・ボビスチャレンジモデルにおいて、種々のマイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンの効果を評価した。マイコプラズマ・ボビスに対する母由来の抗体を持たない健康な雑種乳牛（ホルスタイン／フリーシアン雑種，約１４日齢）の子ウシ６６頭を入手し、年齢によって無作為に割り当てた。本実験の開始前１週間に亘り全ての子ウシを順化させた。
前記細胞ワクチンは、投与量ごとに、適切な濃度で、ＢＥＩ不活性化完全細胞マイコプラズマ・ボビス細菌を含んでいた。更に、各ワクチン調製物は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）及び適切なアジュバントを含んでいた（表１８を参照されたい）。表中の偽薬は、ＰＢＳを含む。
動物には、第０日（左首）及び第２１日（右首）に、適切なワクチン又は偽薬２ｍＬを皮下経路で接種した。前記実験処理群及び使用したワクチンを表１９に示す。
【００７２】
【表１８】
2005500845.tif 000021
【００７３】
約９週齢（第２回ワクチン接種から３週間後）の時点で、前記のとおり子ウシにチャレンジ（第４２日）した。Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、及びＤ群の動物には、単純なスプレー装置（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｅｌｍｗｏｏｄ，ウィスコンシン州）を用いることによってブロス培養物をチャレンジした。各子ウシには、連続３日間、マイコプラズマ・ボビス株５０６３の新鮮な培養物１２ｍＬ（鼻孔ごとに６ｍＬ）を受容させた。Ｅ群の動物は、無チャレンジの対照子ウシとして放置しておいた。
各マイコプラズマ・ボビスの実験的チャレンジの完了後１時間以内に、各チャレンジ播種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を測定した。結果を表１９に示す。
【００７４】
【表１９】
2005500845.tif 000022
【００７５】
チャレンジの１日前、チャレンジの７日後、チャレンジの１４日後、及び実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの２０日後に、全ての動物の体重を測定した。結果を表２０にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンを投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ)及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、チャレンジした対照群（処理群Ｄ）と比較して、体重増加が増加していた。
【００７６】
【表２０】
2005500845.tif 000023
【００７７】
処理群Ｄに関する体重増加データを確認されたい。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後第３日〜第２０日の毎朝、直腸温度を測定した。結果を図４にまとめる。マイコプラズマ・ボビスワクチンの２投与量を投与した子ウシ（処理群Ａ及びＣ）及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、臨床的徴候、すなわち、チャレンジした対照群（処理群Ｄ）と比較して、より低い平均体温を、第７日〜第２０日に示した。ワクチン接種した処理群Ｂの子ウシは、第７日〜第１２日及び第１４日〜第２０日に、チャレンジした対照群（処理群Ｄ）と比較して、より平均体温が低かった。
【００７８】
マイコプラズマ・ボビス特異的血清抗体応答（ＩｇＧ）を、表２１にまとめる。陽性対照血清の８０％よりも大きい平均％光学密度（ＯＤ）値を有する血清サンプルを、マイコプラズマ・ボビスに対して陽性と見なした。ワクチン接種前には、全ての子ウシが、マイコプラズマ・ボビス陰性であった。実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンを受容した子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）は、第２回ワクチン接種前にマイコプラズマ・ボビスに対して血清陽性であり、そして実験中ずっと血清陽性のままであった。処理群Ｄの動物（チャレンジした対照群）は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２０日までは血清陰性であった。処理群Ｅの子ウシ（無チャレンジ対照動物）は、この実験中ずっと血清陰性であった。
【００７９】
【表２１】
2005500845.tif 000024
【００８０】
前記実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２０日目に、全ての動物を検死した。肺を摘出し、そしてマイコプラズマ・ボビス感染に帰すことのできる特徴的な病変について、肉眼で評価した。％肺損傷スコア及び肺病変の％減少を表２２にまとめる。実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンが投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、チャレンジした対照動物（処理群Ｄ）と比較して、より％肺損傷スコアが低かった。これらの結果は、実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンの２投与量が、実験的チャレンジ後の子ウシにおいて、保護を誘発することができたことを示している。
【００８１】
【表２２】
2005500845.tif 000025
【００８２】
ＰＢＳ５０ｍＬで各肺を洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ後２０日における気管支洗浄サンプルからのマイコプラズマ・ボビスの単離の結果を、表２３にまとめる。前記実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンが投与された子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ)及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、チャレンジした対照子ウシ（
処理群Ｄ）と比較して、肺洗浄サンプルにおける生きているマイコプラズマ・ボビスの発生率及びレベルが減少していた。
【００８３】
【表２３】
2005500845.tif 000026
【００８４】
処理群Ｂに関するｃｆｕ／ｍＬデータを確認されたい。結論として、前記実験的マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンを受容した子ウシ（処理群Ａ、Ｂ、及びＣ）及びＥ群の動物（無チャレンジ対照動物）は、チャレンジした対照動物（処理群Ｄ）と比較して、肺病変の発達が少なく、直腸温度が減少しており、体重増加が増加しており、そして肺洗浄サンプルから単離された生きているマイコプラズマ・ボビスのレベルが減少していた。この結果は、前記マイコプラズマ・ボビス細胞ワクチンの２投与量が、血清学的応答を誘発することができ、且つ実験的チャレンジモデル系においてマイコプラズマ・ボビスから保護することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。
【図２】図２は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。
【図３】図３は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジ前後の群平均体温を示すグラフである。
【図４】図４は、実験的マイコプラズマ・ボビスチャレンジの３〜２０日後の群平均体温を示すグラフである。
【図１】
2005500845.tif 000027
【図２】
2005500845.tif 000028
【図３】
2005500845.tif 000029
【図４】
2005500845.tif 000030
【国際公開パンフレット】
2005500845.tif 000031
2005500845.tif 000032
2005500845.tif 000033
2005500845.tif 000034
2005500845.tif 000035
2005500845.tif 000036
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2005500845.tif 000040
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2005500845.tif 000042
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2005500845.tif 000057
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500845.tif 000058
【国際調査報告】
2005500845.tif 000059
2005500845.tif 000060
2005500845.tif 000061
2005500845.tif 000062
2005500845.tif 000063