(57)【要約】本発明は、コンビナトリアルアレイを用いて薬物-薬物相互作用をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、下記の工程を含む：(a)(i)被験薬物；(ii)薬物ライブラリー；および、(iii)アッセイ、を提供する工程、(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物を、薬物ライブラリーからの少なくとも数種のライブラリー薬物と接触する工程、(c)アッセイにおける被験薬物およびライブラリー薬物の接触の結果を記録する工程、ならびに(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なるアッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程。本方法に従い、同定された組合せの各々は、被験薬物とライブラリー薬物との間の相互作用を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、2つの薬物間の相互作用を同定する方法：
(a)(i)被験薬物；(ii)少なくとも200種の異なる薬物を有する薬物ライブラリー；および、(iii)アッセイ、を提供する工程であり、ここで該ライブラリー薬物の少なくとも200種は、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、工程；
(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下での該アッセイにおいて、該被験薬物を、該薬物ライブラリー由来の少なくとも200種のライブラリー薬物と接触する工程；
(c)該接触工程(b)の結果を記録する工程；ならびに
(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、該アッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程であり、ここで同定された各組合せは、該組合せの該被験薬物と該ライブラリー薬物との間の相互作用を示す、工程。
【請求項２】
政府の規制当局が米国食品医薬品局である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、2つの薬物間の相互作用を同定する方法：
(a)(i)被験薬物；(ii)少なくとも200種の異なる薬物を有する薬物ライブラリー；および、(iii)アッセイ、を提供する工程；
(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下での該アッセイにおいて、該被験薬物を、該薬物ライブラリー由来の少なくとも200種のライブラリー薬物と接触する工程；
(c)該接触工程(b)の結果を記録する工程；ならびに
(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、該アッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程であり、ここで同定された各組合せは、該組合せの該被験薬物と該ライブラリー薬物との間の相互作用を示す、工程。
【請求項４】
工程(a)の該ライブラリー薬物の少なくとも200種が、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
被験薬物が、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、請求項1または3記載の方法。
【請求項６】
政府の規制当局が、米国食品医薬品局である、請求項4または5記載の方法。
【請求項７】
被験薬物が、政府の規制当局により承認されていない薬物である、請求項1または3記載の方法。
【請求項８】
組合せが、その組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して増大されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項1または3記載の方法。
【請求項９】
組合せが、その組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して減少されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項1または3記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、2つの薬物またはより高次の組合せを生物活性についてスクリーニングする方法：
(a)少なくとも200種の異なる2つの薬物またはより高次の組合せのアレイを作成する工程；
(b)接触する各薬物組合せ／アッセイが他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、少なくとも200種の該組合せを試験する工程；
(c)該試験工程(b)の結果を記録する工程；ならびに
(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、該アッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程であり、ここで同定された各組合せは、該組合せの該薬物間の相互作用を示す、工程。
【請求項１１】
工程(a)の薬物の少なくとも200種が、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
政府の規制当局が、米国食品医薬品局である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
組合せが、その組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して増大されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
組合せが、その組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して減少されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
ライブラリーが、少なくとも500種の異なる薬物を含む、請求項1、3または10記載の方法。
【請求項１６】
ライブラリーが、少なくとも1000種の薬物を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも3種の異なるアッセイを用い、少なくとも3回繰り返される、請求項1、3、または10記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも10種の異なるアッセイを用い、少なくとも10回繰り返される、請求項1、3、または10記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、患者に同時処方される2つの薬物間の相互作用を同定する方法：
(a)(i)被験薬物；(ii)同時処方される薬物を含む薬物ライブラリー；および、(iii)アッセイ、を提供する工程；
(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物およびライブラリー薬物の少なくとも数種を接触する工程；
(c)アッセイにおける被験薬物とライブラリー薬物との接触の結果を記録する工程；ならびに
(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、アッセイの結果を生じる被験薬物／ライブラリー薬物の組合せを同定する工程。
【請求項２０】
被験薬物が、少なくとも1種のライブラリー薬物と同時処方される薬物である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
被験薬物が、政府の規制当局により承認されていない薬物である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
ライブラリーが、少なくとも3種の異なる薬物を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
ライブラリーが、少なくとも10種の異なる薬物を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ライブラリーが、少なくとも25種の異なる薬物を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
組合せが、その組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して増大されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
組合せが、組合せのいずれかの薬物それ自身の活性に対して減少されるようなアッセイの活性を発揮する、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
提供する工程(a)が、依頼者の管理下にあり、接触工程(b)、記録工程(c)および同定工程(d)の各々が、サービス提供者の管理下にある、請求項1、3、または19記載の方法。
【請求項２８】
アッセイが、1種または複数の生存しているヒトまたは非ヒト細胞を含む、請求項1、3、10、または19記載の方法。
【請求項２９】
細胞が、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、または線維芽細胞である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
アッセイが、細胞不含システムを使用する、請求項1、3、10、または19記載の方法。
【請求項３１】
アッセイが、薬物組合せの毒性を測定するアッセイである、請求項1、3、10、または19記載の方法。
【請求項３２】
下記アッセイの少なくとも1種を利用する、請求項1、3、10、または19記載の方法：サイトブロットアッセイ；レポーター遺伝子アッセイ；および、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ。
【請求項３３】
アッセイが、蛍光カルシウム結合指示色素、蛍光顕微鏡、または遺伝子発現プロファイリングを含む、請求項1、3、10、または19記載の方法。
【請求項３４】
以下のものを含む、被験薬物がアッセイにおいて薬物ライブラリーのメンバーと相互作用するかどうかを決定するためのライブラリースクリーニングシステム：
(i)被験薬物；
(ii)政府の規制当局により承認された少なくとも200種の薬物を含む薬物ライブラリー；
(iii)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下のアッセイにおいて、該被験薬物および該薬物ライブラリーの少なくとも200種の薬物を接触する手段；
(iv)この接触の結果を記録する手段；ならびに
(v)その組合せのいずれかの薬物それ自身の結果と異なる結果を生じる被験薬物／ライブラリー薬物の組合せを同定する手段。
【請求項３５】
政府の規制当局が、米国食品医薬品局である、請求項34記載のシステム。
【請求項３６】
以下のものを含む、被験薬物がアッセイにおいて薬物ライブラリーのメンバーと相互作用するかどうかを決定するためのライブラリースクリーニングシステム：
(i)被験薬物；
(ii)少なくとも200種の薬物を含む薬物ライブラリー；
(iii)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、該被験薬物および該薬物ライブラリーからの少なくとも200種の薬物を接触する手段；
(iv)この接触の結果を記録する手段；ならびに
(v)その組合せのいずれかの薬物それ自身の結果と異なる結果を生じる被験薬物／ライブラリー薬物の組合せを同定する手段。
【請求項３７】
薬物ライブラリー中の薬物の少なくとも200種が、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、請求項36記載のシステム。
【請求項３８】
被験薬物が、政府の規制当局により患者への投与が承認された薬物である、請求項36記載のシステム。
【請求項３９】
政府の規制当局が、米国食品医薬品局である、請求項37または38記載のシステム。
【請求項４０】
被験薬物が、政府の規制当局により承認されていない薬物である、請求項36記載のシステム。
【請求項４１】
薬物ライブラリーが、少なくとも500種の異なる薬物を含む、請求項36記載のシステム。
【請求項４２】
薬物ライブラリーが、少なくとも1000種の薬物を含む、請求項36記載のシステム。
【請求項４３】
記録手段が、サイトブロットアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、または蛍光カルシウム結合指示色素アッセイを利用する、請求項36記載のシステム。
【請求項４４】
接触手段および記録手段の少なくとも1つが、ロボットシステム、微小溶液化、またはインクジェットプリンター技術を利用する、請求項36記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、創薬および疾患治療の分野に関する。
【０００２】
多くの疾患状態が、表現型の変化の大きさに関連している。このことは、臨床において長く明らかとなっているが、最近のゲノム学における進歩により、分子レベルでこの知見が確認されている。例えば癌細胞の発現プロファイリングにより、複数の体細胞突然変異により引き起こされた遺伝子発現の数百の変化が明らかにされている。更にヒトの細胞および組織は、重複し(redundant)かつ自己緩衝的な(self-buffering)シグナル伝達システムを含むことが多い、ホメオスタシス機構を発達させている。細胞の状態に変化を生じる天然のシグナルは、単独の標的ではなく、標的の正確な組合せに送られることが多い。従って複数の変量の中等度の変化は、高度に特異的な作用を持つことができる。
【０００３】
対照的に、歴史的および技術的理由から、薬学、化学、および生物学の分野では、単独の、個別の、生物学的作用を生じる分子に、主に焦点を当てている。この歴史的パラダイムは、特異的タンパク質に影響を及ぼす小有機分子を同定し、生物学および医薬の両方に価値のある試薬を提供している。これらの分子は、治療に関連があるタンパク質の生物学的機能のプローブとしても有用であり、化学タンパク質のノックアウトとして作用させてタンパク質の機能喪失を惹起することによりシグナル伝達経路の解明にも有効である。加えて、これらの小分子の特定の生物学的標的との相互作用およびそれらの特異的生物学的機能へ影響を及ぼす能力より、これらは治療薬開発の候補薬剤として利用することもできる。
【０００４】
どの小分子が生物学的標的と相互作用するかを予想することは不可能であるので、多数の小有機分子の作成に集中的努力が払われている。そしてこれらは、適当な望ましい特性を有する「多様なライブラリー」を構築するという目的で、このような化合物の「ライブラリー」と称されるものに収集される。このような多様なライブラリーは、小分子の既に存在する集合から構築することができ、あるいは「コンビナトリアルケミストリー」を用いて作成することができる。これらのライブラリーは、活性分子を同定するための高感度スクリーンに結びつけることができる(Stockwellら、Chem. Biol.、6:71-83(1999))。
【０００５】
多くの場合、研究者らは、バイアスのかかったライブラリーを開発している。つまり、ライブラリー中の全てのメンバーが、標的タンパク質と相互作用する能力のような特定の特性、または天然の化合物のクラスの特定の局面を模倣するようにデザインされた特徴的構造特徴を共有している。例えば多くのライブラリーが、天然のペプチドの1種または複数の特徴を模倣するようにデザインされている。このような「ペプチド模倣」ライブラリーは、フタルイミドライブラリー(国際公開公報第97/22594号)、チオフェンライブラリー(国際公開公報第97/40034号)、およびベンゾジアゼピンライブラリー(米国特許第5,288,514号)を含む。構造的特徴が天然の産物を連想させ縮小された細胞ベースのアッセイに適合性のあるひとつのライブラリーが、合成されている(Tanら、J. Am. Chem. Soc.、120:8565(1998))。
【０００６】
最近の薬物発見プロセスは、生物学的プロセスに対する化合物の作用について迅速にそれらをアッセイする能力の上に大規模に構築されている。製薬産業においては、生物学的分子間の相互作用を阻止、低下または増強さえする化合物を同定することに、注意が集中している。特に生物学的システムにおいて、受容体とそのタンパク質リガンドとの間の相互作用はしばしば、直接的またはいくつかの下流の事象を通じて、そのシステムに対する、および結果的には治療が求められる患者に対する、有害または有益のいずれかの作用を生じることがある。従って研究者らは、このような受容体／リガンド相互作用を低下、阻止または増強さえする化合物を長い間探し求めている。
【０００７】
既存の生化学的および細胞ベースのアッセイの処理能の実践上の限界を克服するために、高処理能スクリーニングシステムがデザインされた。有機化合物の従来の合成および従来の生物学的アッセイは、かなりの時間、労力および技術を必要とする。最大数の化合物のスクリーニングは、各スクリーンに関連する時間および労力の要求を削減することを必要としている。
【０００８】
従って分子の多様な集合の高処理能スクリーニングは、新規薬学的物質の開発のためのリード化合物の検索において中心的役割を果たしている。これらの高処理能スクリーンへのインプットは、既存の化学的に合成された分子(例えば製薬会社が独自に開発したライブラリー由来)、天然の産物(例えば微生物発酵ブロス)、およびコンビナトリアルケミストリー技術により作成された新規ライブラリーから集成されている化合物のライブラリーである(Tanら、J. Am. Chem. Soc.、120:8565(1998))。このライブラリーは、最大百万個の化合物からなり、これはリード薬物候補として利用するための望ましい特性を有するひとつの化合物を見つける可能性を増大する(Tanら、J. Am. Chem. Soc.、121:9073-9087(1999))。
【０００９】
従来の薬物発見のパラダイムを増強しているコンビナトリアルケミストリーは、スクリーニングに利用可能である化合物の数を劇的に増加させ、ヒトゲノム研究により、スクリーニングのための多数の新規分子標的が明らかにされている。スクリーンは、様々な方法でこれらの新規標的を使用し、酵素インヒビター、受容体アゴニストまたはアンタゴニストを検索することができる。従来からの目標は、生物学的システムにおける単独の重要な相互作用を低下、阻止または増強する化合物を発見することである(Weberら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、34:2280-2282(1995))。加えて、多くの研究者が、表現型を基にしたアッセイシステムを適合させており、ここでスクリーニングは、全生存細胞において行われ、およびこのスクリーンの読み値は、この細胞の何らかの検出可能な特性である(Stockwellら、Chem. Biol.、6:71-83(1999)；Mayerら、Science、286:971-974(1999))。
【００１０】
今日までに開発されている高処理能スクリーニング法は、製薬産業を支配している「1-薬物-1-標的」パラダイムを基にデザインされている。歴史的理由により、ならびに規制的考慮事項および認知されているリスク因子により、最新の薬物発見プロセスは、薬物候補として利用するために一度にひとつの活性分子を見つけようとすることに主眼をおいている。臨床医は、「1-薬物-1-標的」法が、多くの疾患の治療について十分ではないことを長い間認識している。彼らは、同じ状態を治療する物質、または明らかに論理的関連のある物質のいくつかの明らかな組合せを試験している。HIV療法および化学療法において、例えば、複数の活性物質の組合せが必要となってきている(de rigeur)。全ての時点で最も有望な薬物のひとつは、組合せ剤--プレマリン(Premarin)であり、これは閉経後の女性の複合的変化の治療に使用され、22種を超える個別の活性成分で構成されている。
【００１１】
可能性のある有益な相互作用に加え、2種の薬物が共に投与される場合、望ましくない相互作用をすることも考えられる。ひとつの例において、一方または両方の薬物の活性が全体的に増強され、許容できない副作用または薬物過量を生じる。別の例において、ひとつの薬物の存在が、第二の薬物と対抗または拮抗し、投与される第二の薬物が不充分な量となる。更に別の例において、2種またはそれよりも多い薬物が相互作用し、相加的ではない量で毒性を生じる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、薬物-薬物相互作用を同定する方法を発明した。これらの方法は、生物学的アッセイにおいて相互作用する組合せを発見するための、薬物の組合せの高処理能スクリーンに関連する。本発明の方法は、これまで不明の作用を発揮する薬物の組合せを、各薬物の組合せがこれまではこれらの作用はほとんどまたは全く示されていないとしても、同定することができる。
【００１３】
従って第一の局面において、本発明は、2つの薬物間の相互作用を同定する方法を特徴とする。この方法は、以下の工程を含む：(a)(i)被験薬物；(ii)少なくとも200種の異なる薬物を有する薬物ライブラリー；および、(iii)アッセイ、を提供する工程、(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物を、薬物ライブラリー由来の少なくとも200種のライブラリー薬物と接触する工程、(c)アッセイにおける被験薬物およびライブラリー薬物の接触の結果を記録する工程、ならびに(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なるアッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程。本方法に従い、同定された各組合せは、被験薬物とライブラリー薬物との間の相互作用を示す。
【００１４】
第二の局面において、本発明は、薬物が、薬物ライブラリーのメンバーと相互作用するかどうかを決定する別の方法を特徴とする。この方法において、依頼者(例えば、製薬会社、バイオテック会社、学術研究機関の実験室、または政府の規制当局)は、被験薬物(例えば、FDAにより承認された薬物または開発中の薬物)をサービス提供者に提供する。依頼者、サービス提供者、または他の事業実体は、少なくとも200種の異なるライブラリー薬物を有する薬物ライブラリー、および1種または複数のアッセイを提供する。その後サービス提供者は、(a)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物および薬物ライブラリー由来の少なくとも200種のライブラリー薬物を接触し、(b)このアッセイにおける被験薬物およびライブラリー薬物の接触の結果を記録し、ならびに(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、少なくとも1種のアッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する。第一の方法のように、同定された組合せの各々は、被験薬物とライブラリー薬物との間の相互作用を示す。
【００１５】
第三の局面において、本発明は、2つの薬物またはより高次の組合せを生物活性についてスクリーニングする方法を特徴とする。この方法は、下記の工程を含む：(a)少なくとも200種の異なる2つの薬物またはより高次の組合せのアレイを作成する工程、(b)接触する各薬物組合せ／アッセイが他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、少なくとも200種の組合せを試験する工程、(c)アッセイにおける組合せの試験の結果を記録する工程、ならびに(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、アッセイの結果を生じる薬物の組合せを同定する工程、同定された各組合せは、その組合せの被験薬物とライブラリー薬物との間の相互作用を示す。
【００１６】
第一、第二、または第三のいずれの局面においても、薬物ライブラリーは、ヒトへの投与に関する米国食品医薬品局(FDA)または他の米国もしくは米国以外の政府の規制当局により承認された薬物を含むことができる。このライブラリーは、例えば100、200、1000種の承認された薬物、もしくはそれよりも多くを含むことができる。ひとつの態様において、ひとつの試験において試験される薬物ライブラリーの全ての薬物が、承認された薬物である。第一、第二、または第三のいずれかの局面の別の態様において、この方法は、少なくとも3、5、10種またはそれよりも多い異なるアッセイを使用して繰り返される。
【００１７】
前記局面のいずれにおいても、相互作用は、望ましいもののひとつであることができる。ひとつの例において、この相互作用は、第二の望ましくない生物活性の付随する増加は伴わずに、望ましい生物活性の増加を生じる。別の例において、この相互作用は、第二の望ましい活性の量の低下を伴わずに、望ましくない生物活性の低下を生じる。これらの例のいずれかにおいて、これらの薬物の組合せは、特に治療的目的のために同時処方されうる。
【００１８】
この相互作用は望ましくないものである可能性もある。例えば相互作用は、組合せにおける1種または複数の薬物の望ましい活性を低下するかもしれない。この低下は、特異的(すなわち、望ましい活性は低下されるが、望ましくない活性は維持される)または非特異的(すなわち、多くのまたは全ての活性が低下される)でもよい。この範疇の相互作用は、同定された薬物組合せの禁忌を示しうる。
【００１９】
第四の局面において、本発明は、患者(例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えばイヌ、ネコ、もしくはウマ)へ同時処方される2つの薬物の間の相互作用を同定する方法を特徴とする。この方法は、以下の工程を含む：(a)(i)被験薬物；(ii)同時処方される薬物(例えば、同じ疾患に処方される2つの薬物、同じ患者の2つの異なる疾患に処方される2つの薬物、疾患を治療するための薬物および関連した同時に存在する病的状態を治療するための第二の薬物、または疾患を治療するための薬物およびリスク因子を低下するための第二の薬物)を含む薬物ライブラリー；ならびに、(iii)アッセイ、を提供する工程、(b)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物およびライブラリーの少なくともいくつかの薬物を接触する工程、ならびに(c)アッセイにおける被験薬物およびライブラリー薬物の接触の結果を記録する工程、ならびに、(d)その組合せのいずれかの薬物それ自身が生じた結果と異なる、アッセイの結果を生じる被験薬物／ライブラリー薬物の組合せを同定する工程。
【００２０】
前述の方法において、被験薬物は、ライブラリー薬物が同じく処方された疾患を有する患者に処方された薬物であることができ、あるいは被験薬物は、政府の規制当局により承認されている、そのような患者へ処方されるものであってもよい。このアッセイは、1種または複数の薬物の活性を検出することが公知のアッセイであることができ、あるいは、ライブラリーのいずれの薬物の活性をも検出することが公知でないアッセイであることができる。
【００２１】
第一、第二、第三または第四のいずれかの局面において使用されるアッセイは、1種または複数の生存しているヒトまたは非ヒト細胞(例えば、癌細胞、免疫細胞、神経細胞、または線維芽細胞)を含むことができ、または細胞不含システムを使用することができる。ひとつの望ましいアッセイは、被験薬物／ライブラリー薬物組合せの毒性を測定するアッセイである。これらの方法の記録工程は、例えば、サイトブロット（cytoblot）アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、蛍光カルシウム結合指示色素、蛍光顕微鏡、または遺伝子発現プロファイリングを使用することができる。
【００２２】
本発明の方法において、接触工程および記録工程の各々は、手作業でまたはロボットシステムを用いて行うことができる。これらの方法は、微小溶液化（microfluidics）および／またはインクジェットプリンター技術を利用することもできる。薬物は、任意の順番でアッセイへ添加することができる、すなわち、ひとつの薬物がアッセイへ添加された後、薬物の添加が続く、あるいはその代わりに2つの薬物を合わせて、被験要素と接触させることができる。
【００２３】
別の局面において、本発明は、被験薬物が、アッセイにおける薬物ライブラリーのメンバーと相互作用するかどうかを決定するライブラリースクリーニングシステムを特徴とする。このスクリーニングシステムは、以下のものを含む：(i)被験薬物；(ii)少なくとも200種の薬物を有する薬物ライブラリー；(iii)接触する各被験薬物／ライブラリー薬物が他のものから隔離されることを確実にする条件下でのアッセイにおいて、被験薬物および薬物ライブラリーの少なくとも200種の薬物を接触する手段；(iv)接触の結果を記録する手段；ならびに、(v)その組合せのいずれかの薬物それ自身の結果と異なる結果を生じる被験薬物／ライブラリー薬物組合せを同定する手段。
【００２４】
本発明の方法では、スクリーニングシステムの薬物ライブラリーは、承認された薬物を含むことができる。ひとつの態様において、薬物ライブラリーは、少なくとも100、200、または1000種もの承認された薬物(例えば、FDAにより承認された薬物)を含む。記録手段は、例えば、生存細胞または細胞不含システムを使用する、サイトブロットアッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ、または蛍光カルシウム結合指示色素アッセイを利用することができる。接触手段および／または記録手段は、ロボットシステム、微小溶液化および／またはインクジェットプリンター技術を利用することができる。
【００２５】
本発明の別の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２６】
定義
「薬物」：本明細書において使用される「薬物」は、疾患を治療または予防するために、あるいは副作用および関連したリスク因子および共存症を含むが、これらに限定されるものではない疾患の症状発現を改善するために使用される物質である。この定義には、疾患の治療もしくは予防のために、または疾患の症状発現の改善のために開発されている物質も含まれる。多くの場合において、薬物は、小分子である。医療技術者は特に薬物に関心があるので、「被験薬物」は医療技術者により選択された薬物である。
【００２７】
「同時処方される」：本明細書において使用される「同時処方される」とは、ヒトが薬物を同時に服用するように処方されることが多い薬物を意味する。この用語は、例えば、状態の同じ局面を治療するために処方される薬物(例えば、2種の抗炎症薬)、状態を治療するための薬物および副作用を治療するための薬物(例えば、化学療法薬および制吐薬)、状態を治療する薬物および疼痛を緩和する薬物、ならびに同一患者において一般に発生する2種の異なる状態(例えば、変形性関節症および2型糖尿病)を治療するために処方される2種の薬物、ならびに状態を治療するための薬物およびリスク因子を治療するための薬物を含む。
【００２８】
「小分子」：本明細書において使用される「小分子」は、実験室において合成されたかまたは自然において発見されたかのいずれかであり、2個またはそれよりも多い炭素-炭素結合を含み、分子量が1500g/モル未満である、有機薬物を意味する。
【００２９】
「アッセイ」：本明細書において使用される「アッセイ」は、薬物の1種または複数の活性を決定するために、薬物の組合せが試験されるプロセスである。
【００３０】
「薬物プリンティング」：本明細書において使用される「薬物プリンティング」は、cDNAマイクロアレイ作成において使用されるような高精密ロボットを使用する表面(例えば、ガラス)への薬物の塗布を意味する(J. Am. Chem. Soc.、121:7967-7968(1999))。薬物スポットは、直径250ミクロンまたはより小さいことができ、薬物は、静電気的または疎水性相互作用を介して、表面に共有結合されるかまたは接着されるかのいずれかであることができる。
【００３１】
「微小溶液化」：本明細書において使用される「微小溶液化」装置は、従来のフォトリソグラフィー(例えば、Caliper Technologies, Mountain View, CA；http://www.calipertech.com)または従来型でない方法(例えば、Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、37:550-575(1998)に説明されているソフトリソグラフィー)を含む、フォトリソグラフィー法のいずれかにより製造されたチャネル化された構造である。
【００３２】
「インクジェット」：本明細書において使用される「インクジェット」技術は、小容量の液体を送達するための、サーマルインクジェットおよび圧電噴霧技術の両方を意味する。
【００３３】
詳細な説明
本発明は、それらの独自の組合せにおいてのみ存在する薬物作用を同定する関連する生物学的アッセイを使用する、高処理能スクリーニングシステムにおける薬物-薬物相互作用を同定するための、相互作用プロファイリング法を提供する。このような組合せは、直接的生物学的用途を有しうる。いくつかの例において、この組合せは、ヒトまたは動物の治療薬として利用することができる望ましい活性を示す。他の例において、この組合せは、望ましい活性の喪失または望ましくない活性の増加を生じ、重要な禁忌および関連した投薬計画が明らかとなる。従って本発明は、生物学的システムにおける望ましいまたは望ましくない特性を有する組合せを発見するために、薬物の組合せの高処理能スクリーンを体系的に行う強力な方法を提供する(図5Aおよび5B)。
【００３４】
いくつかの例において、薬物間の相互作用は、組合せて投与される場合に薬物の一方または両方の増加したまたは減少した活性のいずれかにより、有害であることがある。従って本発明は、これらの有害な相互作用を同定する方法も提供する。
【００３５】
組み合わせて試験される薬物
前述のように、多種多様な薬物を、本発明に従って組み合わせて試験することができる。本発明に従いスクリーニングされる薬物の有力なクラスは、小有機分子である。これらの薬物は、合成(例えば、組換えオリゴヌクレオチド、タンパク質、または抗体、有機または無機化合物など)または天然(例えば、プロスタグランジン、レクチン、天然の二次代謝産物、ホルモンなど)のいずれかであることができる。このような分子の大きいライブラリーは、精製された形態で、製薬会社、化学会社、および学術研究機関の実験室から入手可能である。小有機分子に加え、本発明に従い組合せにおいてスクリーニングすることができる他の薬物は、DNAおよびRNA(例えば、アンチセンスRNAまたはRNA干渉に使用されるRNA(RNAi))；ポリペプチド(抗体、酵素、受容体、リガンド、構造タンパク質、ヒトタンパク質の突然変異体アナログ、およびペプチドホルモン)；脂質；炭水化物；および多糖を含む、生体高分子を含む。
【００３６】
薬物ライブラリーは、FDAまたはEMEAのような政府の規制当局により承認された薬物を含むことが望ましい。その他の政府の規制当局を、以下に国別に列記する：オーストラリア(Therapeutics Goods Administration)、オーストリア(Federal Ministry of Labour, Health and Social Affairs)、ベルギー(Ministry of Public Health)、カナダ(Health Products and Food Branch)、デンマーク(Danish Medicines Agency)、フィンランド(National Agency for Medicines)、フランス(Agence du Medicament)、ドイツ(BfArM/Paul-Erlich-Institut)、ギリシア(National Drug Organisation)、アイスランド(The State Drug Inspectorate)、アイルランド(Irish Medicines Board)、イスラエル(Ministry of Health)、イタリア(Ministry of Health)、日本(Ministry of Health and Welfare-Koseisho)、ルクセンブルグ(Division De La Farmacie Et des Medicamentes)、オランダ(Medicines Evaluation Board)、ニュージーランド(Medicines and Medical Devices Safety Authority)、ノルウェー(Statens Legemiddelkontroll)、中華人民共和国(State Drug Administration)、ポルトガル(INFARMED--Instituto National da Farmacia e do Medicamento)、スペイン(Agencia Espaniola del Medicamento)、スウェーデン(Medical Products Agency)、およびイギリス(Medicines Control Agency)。
【００３７】
他の同時処方される薬物との相互作用は、薬物の商業的実行可能性(commercially viable)をより多くまたは少なくすることがあるので、製薬会社は、どの薬物が開発中の薬物と相互作用するかを決定することを望むかもしれない。従ってひとつの態様において、2種の同時処方された薬物の間の相互作用を同定するために、通常同時処方される薬物の組合せは、本発明の方法でスクリーニングされる(図7)。例えばアルツハイマー病(AD)は、通常、不安、鬱病、異常な運動活動、食欲の変化、睡眠障害、妄想、および幻覚に関連している。従って、コリンエステラーゼインヒビター(例えば、ドネペジル、タクリン、メトリフォネート、およびリバスチグミン)、抗精神病薬(例えば、リスペリドン、クロザピン)、およびコリン様作用薬を、認知障害および関連する行動または精神的変化の両方を治療するために、AD患者へ同時投与することができる。ひとつのシナリオにおいて、抗精神病薬は、ドネペジルのコリンエステラーゼ活性を特異的に増加する(副作用の増大を伴うまたは伴わずに)ことがあり、これはドネペジルは抗精神病薬と同時処方される場合はより低用量で投与されなければならないことを示している。第二のシナリオにおいて、抗精神病薬は、コリンエステラーゼインヒビターに拮抗する可能性があり、このことは、コリンエステラーゼの投与量を増加しなければならないことを示している。別のシナリオにおいて、ひとつの薬物の副作用は、望ましい薬物活性の認知可能な増加を伴わずに、第二の薬物の存在により増加される。更に別のシナリオにおいて、2種またはそれよりも多い薬物の組合せは、各薬物が単独で投与される場合には存在しない活性を示す。これらの後者2つのシナリオは、2種の薬物はめったに同時処方されてはならないことを示している。広範な臨床試験の前に薬物-薬物相互作用を決定することにより、薬物開発業者が時間と金銭の両方を節約することができる。
【００３８】
薬物-薬物相互作用について同時処方された薬物をスクリーニングする場合は、一方または両方の薬物の活性を検出するために公知のアッセイに加え、いずれの薬物の公知の活性にも関連しないアッセイの両方を使用することが望ましい。一例において、変形性関節症および2型糖尿病の一般的関係(common association)により、ロシグリタゾンおよびロフェコキシブは同時処方することができる。これら2種の薬物が相互作用するかどうかを決定するために、これらの薬物は、抗炎症活性に関するアッセイおよびロシグリタゾン媒介性インスリン利用に関するアッセイにおいて試験することができる。加えて、組合せた2種の薬物は、いずれかの薬物単独で試験した場合には認められない活性を示すことがあるので、これらの薬物が禁忌である適応症とは関係のない作用を測定する他のアッセイにおいて、この組合せを試験することも望ましい。例えば、2種またはそれよりも多い薬物を、3、5、10種、またはそれよりも多いアッセイにおいて試験することができる。高処理能スクリーニングを実行する能力により、200種またはそれよりも多い組合せについて、25、50、または100種もの異なるアッセイを行うことは、本発明の範囲内である。
【００３９】
相互作用プロファイリングから得ることができる情報の型、およびいかにしてより良い治療を提供するために使用することができるかということについての一例において、セレコキシブおよびロフェコキシブのような抗炎症薬は、例えばその組合せの抗炎症活性を報告するアッセイにおいて、2型糖尿病の治療または管理のために通常処方される薬物と組合せて、各々試験される。このデータは、薬物の1種が、例えばロシグリタゾンと組合せた場合に、より少ない抗炎症活性を発揮することを示すことができる。臨床レベルで、医療技術者は、この知見を、変形性関節症および2型糖尿病を有する患者にとって適当な治療投薬計画を考案するために使用することができる。規制レベルで、FDAのような規制当局は、仮に使用するとすると、薬物が特定の適応症のために承認されるべきかどうかを決定するために、この情報を使用することができる。薬物発見の段階では、企業はこの情報を、臨床試験およびFDA承認のために薬物を選択するかどうかを決定するために使用することができる。
【００４０】
一旦薬物-薬物相互作用が同定されれば、その組合せにおける各薬物の構造的または機能的アナログも、その組合せにおいて相互作用するかどうかを決定することが望ましいと考えられる。例えば、AD治療の前記例を用いてドネペジルとクロザピンとの間の有害な相互作用を同定し、どの組合せが有害な活性が少ないかまたはないかを決定するために、コリンエステラーゼインヒビターおよび抗精神病薬の全ての可能な対の組合せをスクリーニングすることが望ましいかもしれない。同様に、AriceptおよびProzacがADに関するアッセイにおいて望ましい活性を示す場合、この組合せは、ADの治療または管理に関する新規の治療の選択肢となりうる。
【００４１】
相互作用プロファイリング
本明細書に説明されたように、本発明は、アッセイにおける相互作用に関する薬物組合せをスクリーニングする方法を提供し、プロセスは「相互作用プロファイリング」と称される。相互作用プロファイリングは、任意の数のアッセイにおける2種またはそれよりも多い薬物の相互作用に関する情報を含むデータベースの構築を可能にする。これらのデータベースに含まれた情報は、治療的組合せを決定するために、理論的薬物デザインからリード化合物選択のいずれのためにも使用することができ、医薬開発者および臨床医にとって同様に価値がある。
【００４２】
ライブラリースクリーニングシステム
本発明のライブラリースクリーニングシステムは、被験薬物、薬物ライブラリー、ならびに、アッセイ、アッセイを実行する手段、およびアッセイ結果を記録する手段を含む、薬物-薬物相互作用スクリーニング法を行うための構成要素の全てを含む。これらの後者の各構成要素を、以下により詳細に説明する。
【００４３】
アッセイ
組合せの作用を検出するために使用される生物学的アッセイは、ほとんどの場合、複数の構成要素で構成される。一部のアッセイは、特にアッセイが表現型ベースのアッセイである場合に、全細胞を含む。このような全細胞アッセイは、薬物活性の基礎を形成する可能性の高い複合分子相互作用の完全なセットを提供する。他のアッセイは、多くの望ましい複合システムを含み、恐らくそれについてアッセイされるコンビナトリアル作用を基にした何らかのレポーター作用を含みうる、再構成された細胞不含培地を利用する。他のアッセイは、細胞、組織、および動物モデルのクラスターのような、より高次の生物学的システムを利用する。
【００４４】
個別の薬物のアッセイに有用である生物学的アッセイはいずれも、本発明のコンビナトリアルスクリーニングに容易に適合することができる。アッセイ測定は、例えば、毒性、細胞膜を越える薬物輸送、電位、活動電位の発生、細胞増殖、細胞死、細胞特定、細胞分化、細胞移動、遺伝子発現またはタンパク質レベル(例えば、mRNA、タンパク質、またはレポーター遺伝子の検出により測定される)、酵素活性、リン酸化、メチル化、アセチル化、タンパク質の細胞核移行(または他のタンパク質局在の変化)、病原体(例えば、ウイルスまたは細菌)に対する抵抗能、ならびに免疫応答の形成能を含むことができる。全生物体のアッセイにおいて、動物の挙動は、レポーターとして利用することができる。
【００４５】
一例において、アッセイは、非破壊アッセイ(例えば、細胞に害を与えずに薬物作用を測定することができる、細胞ベースのアッセイ)である。このようなアッセイにより、ウェルあたり複数の組合せで複数の濃度でアッセイを行うことが可能となる。例えば薬物Aは、漸増濃度でウェルに添加され、測定は、薬物の各添加後に行われる。薬物Aの望ましい濃度に到達した時(薬物の望ましいアッセイ反応または公知の特性(例えば、毒性、溶解度)を基に決定される)、薬物Bが、漸増濃度で添加され、各添加後にアッセイ測定が行われる。このプロセスは、単独のウェルにおいて多数回反復することができ、数百回、数千回、または数百万回ものアッセイを単独のプレートで行うことも可能である。
【００４６】
タンパク質、炭水化物、および脂質のような複合生体分子を含有する細胞不含培地は、公知の方法、例えば、哺乳類、カエル、酵母、もしくは細菌細胞を溶解して全細胞溶解液を提供することにより、またはこのような細胞溶解液から特異的画分を精製することにより、市販のウサギの網状赤血球溶解液を使用することにより(一般にインビトロ転写および／または翻訳反応を行うために使用される)、または下側にある細胞の溶解を伴わずに哺乳類、酵母もしくは細菌細胞から培養上清を収穫することにより、作成される。
【００４７】
サイトブロットアッセイ
活性を検出するひとつの方法は、サイトブロットアッセイである。この方法において、細胞は、アッセイプレートのウェルに播種される。これらの細胞は、好ましくは接着細胞であり、そのためこれらはウェルの底に接着して成長する。薬物を、先に説明された方法を用い添加する。例えば、サイトブロットを行い、BrdUの取込みを測定することにより、増殖を検出することができる。この例において、細胞は、設定された期間(例えば、4〜72時間)インキュベーションする。その後培地を、例えば、ロボット式液体移動装置または16もしくは8チャネルワンド(wand)を用いて吸引する。細胞を、70％エタノールおよびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の4℃で1時間の添加により固定する。固定液を除去し、細胞をPBSで1回洗浄する。PBS洗浄後、2N HClを0.5％Tween 20と共に、各ウェルへ20分間添加する。HClは、10容量％2N NaOHを含有するハンクス平衡塩溶液(HBSS)で中和する。この溶液を除去し、細胞をHBSSで2回洗浄し、その後1度0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1％Tween 20を含有するPBSで洗浄する。この洗浄液を除去し、抗BrdU抗体を、0.5％ウシ血清アルブミン(BSA)および0.1％Tween 20を含有するPBS中の0.5μg/mLマウス抗BrdU抗体として適用する。この抗体溶液は、マウスIg抗体(例えば、マウスの抗BrdU抗体)を認識する二次抗体(1:2000の希釈)も含有し；この二次抗体は、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に複合されている。1時間インキュベーションした後、抗体溶液を除去し、細胞をPBSで2回洗浄する。2回目のPBS洗浄後、HRP基質(これはルミノール、過酸化水素、およびパラヨードフェノールのようなエンハンサーを含む)を各ウェルへ添加する。その後各ウェルの光量を、フィルムへの露光(プレートの表面に1枚のフィルムを配置することにより)を用いて、またはルミノメーターもしくはルミノセンスプレートリーダーを用いて、標準の条件(例えば、ウェルにつき0.3秒の曝露)で、各ウェルからの発光量を読みとることにより検出する。各ウェルから放出される光量は、そのウェルにおいて発生したDNA合成量を示している。物質の組合せは、対照と比べ光発生の増加または減少のいずれかが存在する場合に同定される。例えば、光発生を減少する組合せは、DNA合成の速度を減少し、その結果細胞増殖の阻害または妨害に効果的かもしれない。あるいは、光発生の増加は、DNA合成の増加を表わす。例えば、初代細胞を、例えば、200x1の薬物アレイにおいて使用することができる(ここで1種の固定された構成要素は、DNA合成を阻止し、その結果細胞に対する毒性作用を有した)。このアレイを用いて、第一の薬物の毒性作用をさらに悪化させる第二の薬物をスクリーニングすることができる。様々な細胞型の感度に応じて、この情報は、抗癌剤(新生物細胞が選択される場合)を開発することができる、あるいは所定の2種の薬物の組合せが有害であることを示しうる。
【００４８】
活性を検出する他の方法
前述のサイトブロットアッセイは、BrdU以外の抗原の検出に容易に適合される。更に、様々な細胞内の翻訳後修飾を検出することができる。例えば、ヌクレオリンまたはヒストンH3のリン酸化型に対する抗体は、細胞周期のM(有糸分裂)期にある細胞を検出するために有用である。従ってサイトブロットアッセイにおいてリン酸化されたヌクレオリンまたはヒストンH3の増加を引き起こす薬物の組合せは、M期の細胞に抵抗する組合せであろう。アセチル化されたヒストンH4を特異的に認識する抗体を用い、例えば、ヒストンH4のアセチル化の減少を検出するためにサイトブロットアッセイを使用することもできる。ヒストンH4の過剰アセチル化の減少を引き起こす薬物または薬物の組合せは、新生物形成性物質である可能性がある。
【００４９】
前述の例において、手順は、培地を除去し、固定液(PBSまたはトリス緩衝生理食塩水中の70％エタノールまたは4％ホルムアルデヒド)を添加する点を変更することができる。その後、固定液を除去し、透過化物質(例えば、Tween 20、トリトンX-100、またはメタノール)を添加することにより、細胞膜を透過性とする。この膜透過化物質を除去し、その後細胞を、PBSまたはトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、次に一次抗体を添加する。これらの他のサイトブロット態様を使用する、酸による変性工程は通常行わない。
【００５０】
レポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子を使用してアッセイを行いうる場合、結果を記録する。この方法は、一旦試薬(例えば、安定してトランスフェクションされた細胞株)が調製されれば、アッセイが容易に行われ、例えばサイトブロットアッセイよりも必要な時間が少ないという利点を提供する。レポーター遺伝子は、比色、蛍光、発光または酵素特性により容易に検出されるポリペプチドをコードするレポーター要素、ならびにレポーター遺伝子の発現に特異性を付与するエンハンサー／プロモーター要素を含む。レポーター要素は、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、βガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むが、これらに限定されるものではない。エンハンサー／プロモーター要素は、例えば、NFAT、p53、TGF-β、もしくはその他の任意のシグナル伝達経路、またはそれに対する反応性のプロモーター／エンハンサーがわかっている刺激に反応するものを含む。
【００５１】
レポーター遺伝子は、トランスフェクション、ウイルスまたはレトロウイルス感染、遺伝子銃注入、および裸のDNAの細胞取込みを含むが、これらに限定されるものではない多くの技術のいずれかを用い、細胞へ導入することができる。当業者は、レポーター遺伝子をアッセイされる細胞へ導入するいずれの方法も、本明細書に説明されたスクリーニング法と適合性があることを認識するであろう。
【００５２】
一旦レポーター遺伝子を有する細胞が利用可能になれば、これらは、ピペット、マルチチャネルピペット、384ウェルMultidrop platefiller(Labsystems, Franklin, MA)、または他の液体操作装置により、アッセイプレート(96ウェル、384ウェルなど)に播種される。薬物を添加し、いくつかの方法のひとつにより、組合せを形成する。4〜72時間後、培地を取除き、細胞をHBSSで2回洗浄し、溶解緩衝液を添加し(Stockwellら、J. Amer. Chem. Soc.、121:10662-10663(1999)参照)、ATP/ルシフェリンを添加し、プレートリーダーまたはルミノメーター(例えば、LJL BioSystems Inc., Analyst AD, Sunnyvale, CA)により発光を測定する。
【００５３】
蛍光共鳴エネルギー転移アッセイ
別の例において、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用い、関心のある2つのタンパク質の相互作用を検出および測定する。この例において、第一および第二のタンパク質は、標準分子生物学的方法を用い、各々、緑色蛍光タンパク質(GFP)および青色蛍光タンパク質(BFP)に融合される。2つの融合タンパク質をコードするDNA構築体は、前述のトランスフェクション技術または他の同等の方法を用い、哺乳類細胞、酵母、蠕虫(worm)、または他の細胞もしくは生物において同時発現される。薬物の組合せを添加する。このプレートを、プレートリーダーに配置し、蛍光を以下のように測定する。ドナー発蛍光団(すなわち、BFP)を励起し、アクセプター発蛍光団(すなわち、GFP)の放出を測定する。2種のタンパク質の増大した近接性(proximity)は、アクセプター発蛍光団の放出の増加を生じる。従って、互いに近傍にある関心のある2種のタンパク質を生じる薬物の組合せが、アクセプター発蛍光団の蛍光の増加により同定される。
【００５４】
例えば、Smad2およびSmad4を含む発現ベクターを得る。GFPのcDNAを、Smad2の5'末端に融合し、BFPのcDNAを、Smad4の5'末端に融合する。これらの発現ベクターを、哺乳類細胞へ安定してまたは一過性にトランスフェクションし、細胞を、薬物の組合せにより処理し、プレートを、BFPを励起するがGFPは励起しない光により照射する。GFPの蛍光(例えば、512nm光)を測定し、この波長での光放出の増加を生じる薬物の組合せを同定する。このような組合せは、Smad2およびSmad4が、互いに近傍に局在するようにし、かつTGF-βシグナル伝達を活性化する可能性があるため、癌化学療法の粘膜炎および自己免疫疾患の治療に有用でありうる。
【００５５】
蛍光カルシウム指示色素
被験要素の特性の変化の別の読みとりは、蛍光カルシウム指示色素、例えばfluo-3(Molecular Probes, Eugene WA；http://www.molecularprobes.com)、fura-2、およびindo-1などを利用する。fluo-3は、Ca2+に結合しない限りは、本質的に非蛍光であり、飽和Ca2+約0.14の、量子収量を示す。従って、fluo-3 AMの完全なアセトキシメチルエステル誘導体(fluo-3 AM)もまた、非蛍光である。Ca2+結合したfluo-3の緑色蛍光放出(約525nm)は、従来どおりにフルオレセイン(FITC)のためにデザインされた光学フィルターセットを用いて検出される。製造業者の指示に従い、fluo-3は、少なくとも100倍のCa2+依存性蛍光増強を示す。
【００５６】
細胞をウェルへ播種し、製造業者の指示に従いfluo-3を細胞へ添加し、薬物を添加し、プレートリーダーを用いて蛍光を測定する。蛍光の増加を生じる薬物(しかしそれ自身は蛍光性ではない)の組合せは、こうして細胞内カルシウム濃度の増加を引き起こす。
【００５７】
蛍光顕微鏡
別のアッセイは、薬物組合せと接触された細胞における蛍光のレベルまたは局在化の変化を検出するために、通常の蛍光顕微鏡を使用する。一例において、GFPタグ付きSmad2を発現している安定してトランスフェクションされた細胞株を使用する。細胞を播種し、薬物を添加し、1時間インキュベーションし、自動式ステージを装着した蛍光顕微鏡を使用して各ウェルの細胞を撮像する。タグ付きタンパク質の局在化に変化を生じる薬物の組合せを同定する。例えば、GFP-Smad2に核の外側から核の内側への移行を生じる組合せを、このようにして同定することができる。これらの組合せは、TGF-βシグナル伝達を活性化する可能性があるので、癌、自己免疫疾患、および粘膜炎の治療に有用でありうる。
【００５８】
cDNAアレイによる発現プロファイリング
共にアッセイにおける変更を生じる薬物を検出する別のアッセイは、発現プロファイリングである。この例において、細胞を播種し、薬物の組合せを添加し、細胞を2〜24時間インキュベーションする。ポリA RNAを、常法を用い、各ウェルから収集する。蛍光色素(例えば、Cy3-dUTP)を逆転写の間に組込むこと以外は、常法を用いて、RNAをcDNAへ逆転写する。Cy3標識したcDNAを、未処理の細胞から得たCy5標識したcDNAと混合し、DNAマイクロアレイ(例えば、Affymetrix, Santa Clara, CAまたはIncyte, Palo Alto, CAから市販されているDNAマイクロアレイ、Nature Genet. 補遺21、1999年1月(本明細書に参照として組入れられる)において検証されている)へハイブリダイズする。マイクロアレイの各スポットにおけるCy3およびCy5蛍光の相対レベルは、各遺伝子の発現における変化が存在することを示している。この方法を用い、遺伝子発現の望ましくない変化を引き起こす組合せを同定する。
【００５９】
全生物体
本明細書に説明したスクリーニングアッセイと適合性のある別のバイオアッセイは、全動物体を使用する。一例において、線虫C. elegansを個別のウェルに入れ(好ましくは1個のウェル当り1匹より多い線虫)、この生物の特性の変化を検出することにより、薬物の活性を検出する。例えば線虫は、生活環の特定の段階で、または休眠期(dauer state)のみに、緑色蛍光タンパク質を発現するように操作することができる。自動式顕微鏡システムを使用し、各ウェル内の線虫を撮像し、緑色蛍光タンパク質を測定するか、または特定の薬物組合せにより引き起こされた蠕虫の形態学的変化を検出する。
【００６０】
別の全動物体のアッセイは、皮膚表面またはその近傍に腫瘍を有するヌードマウスのような、大きな動物を使用する。薬物の組合せは、DMSO中に混合し、これを皮膚にこすりつけ、皮膚に浸透させ、腫瘍に到達させることができる。あるいは、薬物を、静脈内、筋肉内または経口により投与することができる。活性を検出する別の全生物体法は、限定培地において発生する受精したXenopus卵母細胞由来の小さいオタマジャクシ、器官を限定培地においてある期間培養することができる器官型培養物(マウスまたは他の動物からの外植片)、および様々な動物由来の卵(受精または未受精)の使用を含むことができる。別のアッセイは、2つのバネの間で伸張された心臓組織または筋肉組織の張力を測定する；収縮を変調する薬物組合せは、これらのバネ上で増大したまたは減少した張力を生じるであろう。
【００６１】
薬物標識
一部のアッセイは、標識する組合せ実体のいずれをも標識せずに行うことができるが、一部の態様においては、アッセイにおける組合せの作用を記録することができるように、1種または複数の組合せ実体を標識する。例えば、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用またはヘキサヒスチジンタグ付けしたタンパク質を使用する、タンパク質アフィニティークロマトグラフィーに関して生化学において広範に使用されている技術などの、多種多様な公知の標識のいずれかを使用することができる(Janknectら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:8972(1991)；Wilcheckら、Methods in Enzymology、Wilcheck, M；Bayer, E.A.編集、Academic Press Inc. San Diego, 1990；123-129頁)。
【００６２】
薬物の組合せ
本発明の方法は、現存のロボットシステム、96-ウェル、384-ウェル、1536-ウェルまたは他の高密度ストックプレート、ならびに96-、384-、もしくは1536-ウェルまたは他の高密度アッセイプレートを使用することができ、これらにより、1週間に最大150,000個の薬物またはそれよりも多くをスクリーニングすることが可能である。この技術の自動操作は、分子の組合せをスクリーニングするために、本発明に適合させることができる。本発明の方法は、プロセスを縮小するために、一般的なフォトリソグラフィーまたは一般的でない方法(例えばソフトリソグラフィーまたはnear-field光学リソグラフィー)のいずれかにより作成された、微小溶液化システムを使用することもできる。本発明の方法は、インクジェットプリンティングまたは薬物プリンティング技術を使用することもできる。加えて本発明の方法は、ロボットシステムと同じ結果および処理量を達成するために、訓練を受けた技術者の労働力を使用することができる。薬物の組合せは、被験要素と接触する前に作成することができ、あるいはこれらは被験要素存在下でのインサイチューで行うことができる。これらの配置法を、より詳細に以下に説明する。
【００６３】
手作業配置
薬物は、手作業により配置することができる(すなわち、試験される細胞へ添加される)。一例において、精製した化学的薬物を、7x7のコンビナトリアルアレイ中で手作業で組合せて試験する。この場合7種の薬物を含む薬物は、ストックプレート中にある。薬物を、アッセイプレートにおいて組合わせる。オペレーターは、ストックプレートのウェルから第一の薬物(または複数の薬物)を、アッセイプレートの一列に配置し、次にアッセイプレートの一行に配置する。これを、ストックプレートからの第二のウェルについて繰返し、アッセイプレートにおける配置のみを、第一の薬物が配置されたものの次の列および次の行にする。このプロセスを、組合せの完全なセットが配置されるまで繰り返す。
【００６４】
ロボットによる配置
コンビナトリアルアレイを形成するために薬物をウェルへ添加する多くの方法があり、下記例は例証を目的とするものであり限定するものではないことを、当業者は認識するであろう。
【００６５】
ロボット配置の一例において、ロボット液体移動システムが使用される。移動システムは、例えば、Beckman Coulter(Fullerton, CA)、Tecan(Research Triangle Park, NC)またはZymark(Hopkinton, MA)から市販されている。ロボットシステムは、特定量の薬物の第一のセットを、例えば列1が同じ薬物を有し列2が同じ薬物を有するように、所定の列の各ウェルへ配置する。その後、この液体移動装置は、各行が同じ薬物を受ける(しかし異なる行は異なる薬物を有する)ように、薬物の同じセットを行に沿って配置する。移動システムは、少量(例えば、1nL)を移動するように適合させることができる。
【００６６】
効果的に移動するための別の方法は、インクジェットプリンティング技術を利用する(Gordonら、J. Med. Chem.、13:1385-1401(1994)；Lemmoら、Curr. Opin. Biotechnol.、9:615-617(1998))。インクジェットプリンターは、被験薬物を含む複数の容器からくみ出し；給源ウェルからの各薬物を、各薬物について個別の列および行においてその表面にプリントまたは射出する。前述のように、次の薬物は、次の列および次の行にプリントされ、これは全グリッドに薬物の組合せが配置されるまで繰り返される。
【００６７】
薬物をアッセイプレートへ添加する更に別の方法は、DNAをスポッティングするために、スタンフォード大学のPatrick Brownにより開発されたマイクロアレイスポッターを利用する。この装置は、8-クイルペン（quill pen）プリンティングヘッドおよびストックプレートに浸漬した8個の直線状クイルヘッドを使用し、各列に沿ってプリントする。続いて、このプレートを90度回転するか、またはプリンティングヘッドを90度回転し；その後プリントヘッドは、行に沿ってプリントする。例えば、標準384ウェルプレート用の、2、4または16プリントヘッドを用いてプリントヘッドのサイズを変えることができ、より高密度のプレートのために、より大きい数へ変更することができる。
【００６８】
薬物をアッセイプレートに添加する更に別の方法は、薬物の標準ストックプレートから既知量を滴下することが可能である384個の個別のシリンジを装着することができる、Hydra(Robbins Scientific, Sunnyvale, CA)と称される市販の装置を使用する。
【００６９】
被験薬物を配置する別法は、Caliper Technologies(Mountain View, CA)から市販されているものなどの微小溶液化システムを使用し、このシステムを、この組合せを生じるアレイの作成に直接適用する。この場合、マイクロスケールでの組合せアレイは、薬物溶液をマトリックス上の交差点に分配するために、キャピラリーフローを用いて作成される。
【００７０】
代替配置法
あらゆるプレート配置を本発明のスクリーニング法に適合することができることを、当業者は認識するであろう。例えば、16x24プレートの384ウェルの代わりに、16x16正方形プレートは、256ウェルを有する。この正方形プレートは簡単に90度回転させてもう一方の方向に添加することができるので、液体が列に沿ってのみまたは行に沿ってのみ添加されるような任意の液体添加システムを適合させることができるであろう。標準96ウェルまたは384ウェルマイクロタイタープレートの寸法またはフットプリント(footprint)を有する正方形プレートホルダーを、適合させるマイクロ正方形プレートが任意の現存のプレート液体操作システム内に嵌合されるように、このデザインに組込むこともできると考えられる。
【００７１】
組合せにおいて試験される薬物または要素を提供する別の方法は、液体形態よりもむしろ、例えば少量の乾燥粉末のような固形形態でこれらを提供する。従って2種の乾燥構成要素(または、一方は湿潤、一方は乾燥構成要素)を混合し、その後、この組合せを培地中の細胞へ添加することができる(一緒にされた実体は可溶性である)。固形薬物は、その上に異なる薬物が追加されるコンビナトリアル合成からのビーズを含む。例えば、ビーズは、ビーズピッカーにより添加することができる。一例において、これらのビーズは磁性であり、磁石を用いて添加される。
【００７２】
本発明のロボット適用の高処理能アッセイにおいて、各ウェルは、独立に空間的にアドレス可能でなければならず、ストックプレートから各薬物を大(最大100μL)および小(最小1nL)量抜き取ることが可能であることが好ましい。本発明のコンビナトリアルスクリーニングアッセイを行うためのロボットプラットフォームの例を、以下に説明する。
【００７３】
2ステーションロボットプラットフォームを作製する。第一のステーションは、VWR(カタログ番号62409-608)を介して入手可能であるような、装着されたピン移動装置を有する単純なXYZロボット型アームを収容する。ストックプレートおよびアッセイプレートがこのステーションへ進入し、ロボット型アームがピンをストックプレートへ落下させ、これらのピンをアッセイプレートへ移動し、これによりピンのサイズに応じて1〜1000nLを送達する(最も典型的には、50nLを送達する)。異なるピン装置により、先の例において説明されたような、異なる薬物の組合せの移動が可能となる。ロボットの第二のステーションは、単独の薬物のストックウェルから大容量(最大10μL)を抜き取り、その後アッセイプレートの各ウェルへ少量を分注することが可能である、圧電ディスペンサーである。例えば、Ivek Digispense 2000システム (http://www.ivek.com/digi2000.html)は、10nLの分離能(resolution)を有しており、この目的には十分である。
【００７４】
ライブラリーサイズ
小さい薬物ライブラリー(＜1000種の薬物)に対して、全ての二成分の（binary）組合せ(最大50万個の組合せ)および三成分の（tertiary）組合せ(最大数億個の組合せ)を、本明細書に説明したシステムを用いて試験することができる。
【００７５】
この指数(power)組合せにより、薬物-薬物相互作用を同定するための効果的なライブラリーが迅速に作成される。対の（pair-wise）組合せの200種の薬物のライブラリーは、19,900種の組合せのデータセットを作成する。3つ組(3-way)の組合せでの300種の薬物のライブラリーは、およそ450万種の別個の薬物組合せを生じる。
【００７６】
アッセイプレート
3種のアッセイプレートが使用される。先に説明されたピン移動装置中のピンのサイズは、各サイズのアッセイプレートに収容されるように適合させる。
1)市販の384ウェルプレート(例えば、NalgeNunc白色不透明ポリスチレン細胞培養処理した滅菌プレート、蓋付き、カタログ番号164610)
2)市販の1536ウェルプレート(例えば、GreinerまたはCorning)
3)注文作成した1536または6144ウェルプレート(ポリジメチシロキサン製、Dow Corning)およびdelran型、ならびにOmniトレイ。
【００７７】
薬物添加を管理するソフトウェア
Microsoft Visual Basicまたはプログラム言語を、通常のプログラミング技術を用い、前述の装置を操作するためのソフトウェアを作成するために使用する。ソフトウェアは、この装置がストックプレートまたはアッセイプレートのバーコードを読みとり、アッセイデッキ上のプレートの位置を追跡し、かつ正確な薬物を正確なアッセイウェルへ適量を移すことを可能にする。このように、スクリーニングされる全ての組合せは前もって決定または選択され、この装置は、自動化された形式で組合せスクリーニングを実行し、アッセイデッキ上に特定のプレートを配置する工程や、特定のプレートをアッセイデッキから取り外してインキュベーターへ移す工程などの、簡単なオペレーター工程のみを必要とする。
【００７８】
バーコードリーダーおよびプリンター
バーコードプリンターを、標準の技術を用い、各プレートについて独自の識別番号を作成し、ラベル上にバーコードをプリントし、アッセイまたはストックプレート上にラベルをスタンプするために使用する。ソフトウェアは、各アッセイプレートおよびストックプレートの各ウェル中の各薬物のアイデンティティーを記録する。アッセイデッキに連結されたバーコードリーダーは、アッセイデッキに進入および離れる際に、各プレートを走査する。
【００７９】
下記実施例は、例証目的で提供され、決して限定することを意図するものではない。
【００８０】
実施例1
図1は、いかにして2種の異なる試薬が細胞内で相乗的に作用しうるかを示す概念図であり、ここで試薬は同じ細胞内において異なる標的に結合する。この図において、化合物A 10および化合物B 12は、哺乳類細胞の形質膜14を越えて、細胞質ゾル領域に自在に拡散する。化合物Aは、キナーゼであるタンパク質X 16に結合し、このキナーゼの活性を阻害する。キナーゼXは、通常リン酸基を転写因子Y 18へ付加することにより、Yを不活性化する。一旦化合物AがキナーゼXを阻害すると、転写因子Yは活性化され、Yは核へ移行し、インスリンのような治療的遺伝子のエンハンサー領域でDNAに密に結合する。しかし転写因子Yは、第二の転写因子Z 20の存在がなければ、インスリンの発現を活性化することができない。しかしこの図において、化合物Bは転写因子Zに結合し、この転写因子上の自己阻害ループ(autoinhibitory loop)を除去し、これによりこの転写因子Zの核への移行を引き起こし、転写因子Yへ結合する。YおよびZは共に、治療的遺伝子インスリンの発現を活性化することができるが、単独ではできない。
【００８１】
図2は、いかにして2種の異なる試薬が、それらの試薬が異なる細胞または組織内の標的に結合するように、生物内部で相乗的に作用しうるかを説明する概念図である。この図において、化合物A 50は、膵臓54のβ島細胞52へ拡散する。化合物Aは、これらの細胞において発現されるインスリン56をコードしている治療的遺伝子を生じる。しかしインスリンは、脂肪組織の標的脂肪細胞上にインスリン受容体が存在しないと無効である。一方で、化合物Bは、脂肪組織60内の脂肪細胞58に拡散し、これらの細胞におけるインスリン受容体62の発現を開始する。AおよびBは共に、インスリン活性をこの個体において回復させることを可能にするが、いずれも単独ではできない。
【００８２】
図3A〜3Eは、本発明者らが本特許出願において記載する検索のコンビナトリアルスクリーンから得られる実験データの例を示す。5種の異なる384ウェルプレートの結果が示されている。これらの結果は、AからPとラベルした16列および1から24とラベルした24行のプレート形式で示されている。活性のレベルを、数値として各ウェルに示し、ここで1は基底活性(作用なし)を示し、5は活性な組合せを示す。プレート1は、A549ヒト癌腫細胞(以下に説明する)における細胞周期停止活性に関する、ブロモデオキシウリジンサイトブロットアッセイにおいて4μg/mLで試験した場合の、化合物1〜384の活性を示す。プレート2は、同じアッセイにおいて2μg/mLで試験した場合の、化合物1〜384の活性を示す。プレート3は、同じアッセイにおいて4μg/mLで試験した場合の、化合物385〜768の活性を示す。プレート4は、同じアッセイにおいて2μg/mLで試験した場合の、化合物385〜768の活性を示す。プレート1〜4においては、どの化合物もいかなる活性も示さないことに注意されたい。プレート5は、2μg/mLで試験した場合の、化合物1〜768の384種の対をなす組合せの活性(すなわち、化合物1〜384および385〜768が共に、アッセイプレートへ各化合物2μg/mLで同時に添加され、384種の異なるランダムに対をなす組合せを生じる)を示す。ウェルA1が活性を示していることに注意されたい。これは、化合物1(化合物1〜384のプレートのウェルA1)それ自身は活性を有さず、化合物385(化合物385〜768のプレートのウェルA1)それ自身は活性を有さないが、化合物1および385は協働して活性な組合せを生じることを示している。
【００８３】
実施例2
全般的方法
図4は、現在市販されている技術を使用し、薬物相互作用スクリーニングを行う方法を例示している。ヒト細胞を、適当な培養培地において培養する。4000個の細胞を、白色不透明な384-ウェルプレート100(Nalge Nunc International, Rochester, NY)の各ウェルに、Multidrop 384液体ディスペンサー110(Labsystems Microplate Instrumentation Division, Franklin, MA)を用いて播種する。5％CO2、37℃で16時間後、10％培地中の関心のある薬物の50μMストックの10μLを、各ウェルに添加し、総ウェル容量を40μLとし、この薬物の最終濃度を10μMとする。その前、直後、または数時間もしくは数日後のいずれかに、薬物ライブラリーからの薬物のセットを、ピンアレイ130上の小さいピンを、ストックプレート140または150の各ウェルに浸し、その後アッセイプレート100の各ウェルに浸すことにより添加する。Matrix Technologies Pin Transfer装置130(384または96ピン)で十分である(カタログ番号350500130および350510203)。この2工程プロセスは、1個の特異的薬物を、多くの対をなす組合せにおいて多数の他の薬物に対して試験することを可能にする。新規特性がこの組合せにより達成されるかどうかを決定するために、ピンで移した薬物のセットが当初の薬物(全てのウェルに存在するもの)の非存在下で試験されるプレートも必要である。
【００８４】
このアッセイにおいて薬物の組合せを提供するために、異なる方法を使用することもできる。例えば、前述したように対をなす組合せを通じて固定された1種の薬物を維持する代わりに、そのセットの全ての対をなす組合せを実現するように、薬物ライブラリーからの薬物のセットをピン移動することが可能である。16種の薬物セットは、ストックプレート140から384ウェルアッセイプレート100の16の列へピン移動される。次に同じ16種の薬物のセットが、同じアッセイプレートの16の行へ移され、異なる対をなす組合せを有する256ウェルマトリックス(重複ウェルおよび同じ薬物が2回添加されたウェルを含む)を提供する。
【００８５】
実施例3
増殖を阻害する薬物の組合せの同定を、以下に説明する。
【００８６】
7種の化合物を、それらの細胞周期進行に対する作用に関してBrdUサイトブロットアッセイ(下記参照)において、単独でおよび21種の可能な対の組合せ全てにおいて試験した。7種の化合物(ポドフィロトキシン、パクリタクセル、キナクリン、ベプリジル、ジピリダモール、プロメタジン、およびアグロクラビン；各々、Sigma Aldrich Corp., St. Louis, MOから購入)を、1ドラムガラス容器に秤量し、ジメチルスルホキシドに溶解し、4mg/mLストック液を作成した。6000個のA549肺癌腫細胞を、384白色不透明NalgeNunc細胞培養処理プレート(カタログ番号164610)の各ウェルに、10％培地(10％ウシ胎仔血清、100ユニット/mLペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、および2mMグルタミンを含有する、ダルベッコ変法イーグル培地、全てLife Technologiesから入手)30μL中に播種した。各化合物を、4倍希釈し、10％培地中に最終アッセイ濃度とした(最終アッセイ濃度は、0.25％DMSO、240nMポドフィロトキシン、60nMパクリタクセル、420nMキナクリン、25μMベプリジル、400nMジピリダモール、25μMプロメタジン、および840nMアグロクラビン)。培地中の各化合物の4Xストックを15μL、8行8列の正方形の1列および1行に添加し(この第8レーンは、ビヒクルDMSOのみを含有する)、7種の化合物の全ての可能な二成分の組合せ、更に単独の物質それ自身を試験した。細胞を、37℃、5％二酸化炭素で46時間インキュベーションした。10％培地中のBrdUの50μM溶液の15μLを添加することにより、BrdUを最終濃度10μMとなるよう添加した。細胞を、37℃、5％二酸化炭素で一晩インキュベーションした。
【００８７】
16時間後、本プロトコールを通じて使用される容器真空源(house vacuum source)に連結した24チャネルワンド(V&P Scientific)により、培地を各ウェルから吸引した。70％エタノール/30％リン酸緩衝生理食塩水(4℃)50μLを、Multidrop 384プレート充填装置(Labsystems)により各ウェルに添加し、これはその後の液体添加工程すべてにおいて使用した。このプレートを、室温で1時間インキュベーションし、その後ウェルを吸引し、0.5％Tween 20を含む2M HClの25μLを各ウェルに添加した。プレートを室温で20分間インキュベーションした。その後、2M NaOH 25μLを各ウェルに添加した。各ウェルの液体を吸引し、ウェルを、ハンクス平衡塩溶液75μLで2回洗浄した。ウェルを再度、75μLのPBSTB(0.5％ウシ血清アルブミンおよび0.1％Tween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。抗体溶液20μLを、各ウェル(0.5μg/mL抗BrdU抗体(PharMingen)および1:2000希釈した抗マウスIg-HRP(Amersham)を含有)に添加した。プレートを、抗体溶液と共に室温で1時間インキュベーションし、その後抗体溶液を吸引除去し、各ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄した。最後に、ECL検出試薬20μLを各ウェルへ添加した(AmershamのECL検出試薬からの溶液1および2の同等混合物)。各ウェルの発光を、ウェルあたり0.2秒インテグレーション時間でLJL Analystプレートリーダーで読み取った。実験を、2つのプレートで繰返し、各々の対のある組合せを、合計16回の反復実験において試験した。表1に示したデータは、化合物の各組合せの平均抗増殖活性を示す。5つの統計学的に有意な組合せ(p＜0.001)が強調されている。全ての活性は、どのような処理も施していない細胞を含むウェルのセットに対して、標準化されている。従って値1は、不活性物質を表し、1よりも大きい値は、抗増殖活性の何らかのレベルを表している。
【００８８】
【表１】
2005502049.tif 000002
【００８９】
このチャートは、個々の成分のものとは異なる、抗増殖活性を有する現在FDAが承認している薬物の5種の組合せを示す。ポドフィロトキシンおよびパクリタクセルは、両方とも、有糸分裂期の細胞を停止する微小管安定化剤であり、ジピリダモールは抗血小板薬であり、ベプリジルはカルシウムチャネルブロッカーであり、プロメタジンはH1ヒスタミン受容体アンタゴニストで、CNS抑制剤および抗コリン作用薬としても使用される。ジピリダモールは一般に、ヒト治療薬として、特にパクリタクセルおよびポドフィロトキシンの毒性副作用と比較して、比較的高い安全性プロファイルを有すると考えられている。従ってこのアッセイにおいて、ジピリダモールは、ヒト肺癌細胞に対するパクリタクセルおよびポドフィロトキシンの両方の抗増殖作用を増強する。更にベプリジルは、ポドフィロトキシンの作用は増強するが、パクリタクセルの作用は阻害する。この結果は、先験的に予想されてはおらず、薬物間の予想外の相互作用を観察するための組合せの実験による高処理能試験の重要性が強調される。例えば、ベプリジルおよびプロメタジンは、いずれも現在の治療適応症において抗増殖薬としては使用されないが、組合せると肺癌細胞の増殖を強力に阻害する。
【００９０】
実施例4
TNFα分泌を阻害する薬物の組合せの同定を、以下に示す。
【００９１】
アモキサピン(16mg/ml)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO；カタログ番号A129)およびプレドニソロン(1.6mg/ml)(Sigma-Aldrich、カタログ番号P6004)のストック液を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中に作成した。アモキサピンマスタープレートを、濃縮ストック液25μlを、75μLの無水DMSOを予め充填したポリプロピレン384ウェル貯蔵プレートの行3、9および15(列CからN)へ添加することにより作成した。TomTec Quadra Plus液体ハンドラーを用い、25μlのアモキサピンストック液を、隣の行へと4回2倍連続希釈した(行4〜7、10〜13、16〜19)。6番目の行(8、14および20)には、いずれの化合物も加えず、ビヒクル対照として利用した。プレドニソロンのマスタープレートを、濃縮プレドニソロンストック液25μLを、適当なプレドニソロンマスターポリプロピレン384-ウェル貯蔵プレートの適当なウェルへ添加することにより作成した(列C、行3〜8；列C、行9〜14；列C、行15〜20；列I、行3〜8；列I、行9〜14；列I、行15〜20)。これらのマスタープレートは、75μlの無水DMSOを予め充填していた。TomTec Quadra Plus液体ハンドラーを用い、25μlを、隣の列(列D〜G、およびJ〜M)へと4回2倍連続希釈した。6番目の列(HおよびN)は、いずれの化合物も加えず、ビヒクル対照として利用した。マスタープレートは密封し、使用時まで-20℃で保管した。
【００９２】
最終的なアモキサピン/プレドニソロン組合せプレートを、アモキサピンおよびプレドニソロンマスタープレートの各々から1μlを、培地100μl(RPMI；Gibco BRL、#11875-085)、10％ウシ胎仔血清(Gibco BRL、#25140-097)、2％ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL、#15140-122))を含有する希釈プレートへ、TomTec Quadra Plus液体ハンドラーを用いて移すことにより作成した。その後この希釈プレートを混合し、アリコート10μlを、TNFα分泌を活性化する適当な刺激剤(下記参照)を含有するRPMI培地を40μl/ウェルで予め充填した最終アッセイプレートへ移した。
【００９３】
この化合物希釈マトリックスは、TNFαELISA法を用いてアッセイした。簡単に述べると、ポリスチレン384ウェルプレート(NalgeNunc)の各ウェル内に含まれた希釈ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の懸濁液100μlを、最終濃度10ng/mlホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩(Sigma)および750ng/μlイオノマイシン(Sigma)による処理により刺激してTNFαを分泌させた。様々な濃度の各被験化合物を刺激の同時点で添加した。加湿したインキュベーター内で37℃で16〜18時間インキュベーションした後、プレートを遠心し、抗TNF抗体(PharMingen、#18631D)で被覆した白色不透明のポリスチレン384ウェルプレート(NalgeNunc, Maxisorb)に上清を移した。2時間インキュベーションした後、プレートを、0.1％Tween 20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し(Tecan PowerWasher 384)、更に1時間ビオチン標識した別の抗TNF抗体(PharMingen、18642D)およびストレプトアビジンに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(PharMingen、#13047E)と共にインキュベーションした。プレートを0.1％Tween 20/PBSで洗浄した後、HRP基質(これはルミノール、過酸化水素、およびパラヨードフェノールのようなエンハンサーを含有する)を各ウェルに添加し、光の強度を、LJL Analystルミノメーターを用いて測定した。対照ウェルは、最終濃度1μg/mlのシクロスポリンA(Sigma)を含有した。
【００９４】
アモキサピンおよびプレドニソロンは、共に、血中におけるホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸塩およびイオノマイシンにより誘導されたTNFα分泌を抑制することができた。表2および3に示したように、アモキサピンは、ほぼ2倍まで、プレドニソロンの用量反応を増強することができる。濃度1.11μMで、プレドニソロンは単独で、TNFα分泌を28％まで阻害することができる。0.2μMアモキサピンの添加により、1.11μMプレドニソロンのTNFα阻害が51％まで増大される。活性の82％というこの大きな増加は、総薬物種のわずかに18％と比較的小さい増加によりもたらされる。
【００９５】
【表２】
2005502049.tif 000003
【００９６】
【表３】
2005502049.tif 000004
【００９７】
プレドニソロン活性のアモキサピン増強は、フォローアップ二次スクリーンにおいても認められた。濃度9nMでのプレドニソロンのTNFα阻害は、400nMアモキサピンの存在下で40％まで2.9倍増加した。これらの濃度でのプレドニソロンおよびアモキサピン単独のTNFα阻害活性は、各々、わずかに14および16％であった。更に、398nMアモキサピン(40％)と組合せた9nMプレドニソロンにより達成されたTNFα阻害のレベルは、1110nMプレドニソロン単独(35％)よりも少なくはなかった。このTNFα阻害の増加は、プレドニソロン単独と比べ、この組合せの100倍にも及ぶ効力のシフトを構成している。
【００９８】
LPS刺激された血液からのTNFα分泌を阻害するアモキサピンおよびプレドニソロンの能力を、表4に示した。
【００９９】
【表４】
2005502049.tif 000005
【０１００】
実施例5
ひとつの薬物が第二の薬物の作用と拮抗する薬物の組合せの同定を以下に説明する。
【０１０１】
デキサメタゾンおよびエコナゾールの組合せは、それらの治療的相互作用が実験またはそれが適用された臨床的状況において示された薬物の興味深い例を提供する。PMA-イオノマイシン刺激の場合(これは主に免疫系のT細胞アームを活性化する)、これら2種の薬物は相乗的に相互作用し；281nMエコナゾールの存在下デキサメタゾン用量4nMで、TNFα分泌の45％阻害が達成されたのに対し、エコナゾールの非存在下では、デキサメタゾン用量が32nMに到達するまで、このレベルのTNAα抑制は達成されなかった。従ってステロイドデキサメタゾンの効能は、抗真菌薬エコナゾールの存在により、少なくとも8倍増大される(表5)。
【０１０２】
【表５】
2005502049.tif 000006
【０１０３】
リポ多糖刺激(これは主にマクロファージを活性化する)の場合、デキサメタゾンおよびエコナゾールの相互作用は、TNF-α分泌レベルで拮抗する。デキサメタゾン単独は、より強力なマクロファージインヒビターであり、用量4nMでTNF-α分泌を40％まで阻害する。高用量のエコナゾールが存在する場合、TNF-α抑制は、拮抗され、同レベルの活性を達成するには、より高用量のデキサメタゾンが必要である。例えば、エコナゾール用量9μMで、同じTNF-αの40％阻害を達成するために、デキサメタゾン127nMが必要であり、これは30倍よりも大きい拮抗作用を表している(表6)。
【０１０４】
【表６】
2005502049.tif 000007
【０１０５】
他の態様
前述の明細書において言及された全ての刊行物および特許は、本明細書に参照として組入れられる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、説明された本発明の方法およびシステムの様々な修飾および変更が、当業者には明らかであろう。本発明は、特に好ましい態様と組合せて説明されているが、特許請求された本発明は、このような特定の態様に過度に制限されないことは理解されるべきである。実際、創薬分野または関連分野の業者には明らかである本発明を実行するための説明された様式の様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図1は、2種の異なる薬物が同じ細胞内の異なる標的に結合している細胞内において、いかにしてこれらの薬物が相乗的に作用することができるかを説明する概念図である。
【図２】図2は、2種の異なる薬物が異なる細胞または組織における標的に結合している生物内部で、いかにしてこれらの薬物が相乗的に作用することができるかを説明する概念図である。
【図３】図3A〜3Eは、本明細書において説明された検索のコンビナトリアルスクリーンにおいて得る実験データの例を示す。5個の異なる384ウェルプレートからの結果を示す。これらの結果は、AからPとラベルされた16列、および1から24とラベルされた24行がある、プレート形式で示されている。活性レベルは、各ウェル内に数値で示し、ここで1は基底活性(作用なし)を意味し、5は活性な組合せが認められることを示す。
【図４】図4は、現在市販されている技術を用いる、コンビナトリアルスクリーニングを実行する方法の図解である。
【図５】図5Aおよび5Bは、相互作用(増強または抑制)および選択性の種類に応じて変動する、様々な相互作用組合せの利用性を示す、概略図による説明である。
【図６】図6は、薬物(「A」)の200種のFDA承認薬物(「1」〜「200」)に対する相互作用プロファイリングの結果を示す概略図による説明であり、ここで数値は、対照(添加なしまたはプラセボ添加)に対する活性比を表す。この説明において、薬物Aおよび薬物3の組合せは、いずれかの薬物単独の活性に対する生物活性の増強を生じている(組合せ：7.5；薬物Aおよび3：各々、2.2および1.2)のに対し、薬物6(望ましい活性を有さない)の薬物Aとの組合せは、薬物Aの生物活性の抑制を生じている(組合せ：1.2；薬物A単独：2.2)。
【図７】図7は、変形性関節症を治療するために通常同時処方される8種の薬物の相互作用プロファイリングの結果を示す、概略図による説明である。数値は、インビトロアッセイにおいて測定した、対照と比較した抗炎症活性の比を表す。この例において、薬物5および6のみが、炎症それ自身の治療のために処方され、他のものは、この疾患または変形性関節症患者において通常発生する疾患に関連する副作用の治療または予防のために投与される。薬物3は単独では抗炎症性生物学的活性をほとんど有さず2型糖尿病の治療のために処方され、薬物6の活性を抑制または拮抗するが、薬物5についてはそうではない。この知識から、医療技術者は、変形性関節症および2型糖尿病の両方に罹患した患者に、薬物6の代わりに薬物5を処方することを選択することができる。新規薬物組合せも同定され得る。例えば、薬物1および2の組合せは、強力な抗炎症活性を示すが、いずれの薬物も単独では十分な生物活性を示さない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2005502049.tif 000012
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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