(57)【要約】特定の癌、好ましくは、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレーションの結果生じる癌、より好ましくは、慢性骨髄性白血病、および好ましくは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼであるイマティニブの阻害に耐性である癌を処置するための材料および方法が、記載される。具体的には、本発明の方法は、癌を患っている患者を治療するための方法であって、ここでこの患者の癌は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレートを示し、このＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターの効果的な用量を該癌患者に投与する工程を包含する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を患っている患者を治療するための方法であって、ここで該患者の癌は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレートを示し、該方法は、該ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターの効果的な用量を該癌患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記癌がＣＭＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＭＬ癌が、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼのインヒビターに耐性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＭＬ癌が、イマティニブに耐性である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路インヒビターが、ＲＡＦインヒビターまたはＭＥＫインヒビターからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼのインヒビターを投与する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の少なくとも１つのインヒビターおよびＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼのインヒビターを含む、薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路インヒビターが、ＲＡＦインヒビターである、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＲＡＦインヒビターが、ＢＡＹ９３−００６である、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路インヒビターがＭＥＫインヒビターである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＭＥＫインヒビターがＣＩ−１０４０である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本明細書中に記載される発明は、癌治療の分野、好ましくは慢性骨髄性白血病の処置に対する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
現代の癌治療の目的は、細胞増殖に影響を与えるシグナル伝達経路における分子、特に正常細胞が癌性になることを引き起こす分子を同定することである。このような経路の１つは、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路であり、そして１つ以上のこのメンバーのアップレギュレーションが、多くの癌の原因であると考えられる。例えば、典型的な慢性期または芽細胞期のいずれかである、慢性骨髄性白血病（本明細書中以降、ＣＭＬといわれる）を有する患者は、市販薬ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（またイマティニブまたはＳＴＩ５７１（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２４４，１０３１［２００１］；Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ２４４，１０３８［２００１］）といわれる）に応答して回復に達する。ＣＭＬは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質を生じるフィラデルフィア染色体転座（Ｐｈ＋）によって特徴付けられる。イマティニブは、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性をブロックすることによってＣＭＬを処置する。
【０００３】
ＣＭＬの慢性期中にイマティニブによって達成した回復は、持続性である一方、芽細胞期中に回復した患者は、通常２〜６ヶ月以内に再発する（Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２４４，１０３８［２００１］）。Ｉｍａｔｉｎｉｂ耐性は、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ活性の再活性化を生じる。近年、これらの再発が通常、転座したＢｃｒ／Ａｂｌ遺伝子の過剰発現またはイマニティブ標的遺伝子、すなわちＡｂｌキナーゼの変異のいずれかによって生じるイマニティブ耐性に起因していることが示されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３、８７６［２００１］）。耐性は、しばしばＴ３１５ＩおよびＥ２５５Ｋを含むＡｂｌキナーゼドメイン内の変異と相関する。
【０００４】
Ａｂｌキナーゼを癌に対する処置における分子標的として選択した。なぜなら、ＣＭＬを有する患者の９５％が、ＢｃｒおよびＡｂｌ遺伝子の融合を生じる染色体転座を起こすＡｂｌ経路の活性を有するからである。上述したように、イマニティブ耐性であるＣＭＬ細胞内でアップレギュレートされる主要な経路は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路である。それゆえ、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターによる処置は、イマニティブ耐性ＣＭＬを患っている患者に回復を導くはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の要旨）
本明細書中に記載される発明は、経路：ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ中の１つ以上の分子のアップレギュレーションを含む癌の処置に対する方法および組成物を示す。
【０００６】
本発明の目的は、癌、好ましくはＣＭＬの特定の形態、より好ましくはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼインヒビターに耐性であるＣＭＬの形態、最も好ましくはＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼインヒビターすなわちイマニティブに耐性であるＣＭＬの形態の処置に有利に適用されるＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターの記載である。
【０００７】
本発明の別の目的は、単独でか、またはＣＭＬ処置に対するＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼインヒビター、好ましくはイマニティブと組み合わせたＲＡＦインヒビター、好ましくはＢａｙ４３−９００６の記載である。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、単独でか、またはＣＭＬ処置に対するＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼインヒビター、好ましくはイマニティブと組み合わせたＭＥＫインヒビター、好ましくはＣＩ−１０４０の記載である。
【０００９】
本発明の別の目的は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターを、好ましくはＢｃｒーＡｂｌキナーゼインヒビターと組み合わせて、そしてより好ましくは、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼインヒビターであるイマニティブと共に処方および投与するための方法および組成物の記載である。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の十分な考慮に基づいて当業者に明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の説明）
本明細書中に記載される、特許および特許出願を含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が、その全体が参考として援用されると具体的にかつ個々に指示されたのと同程度まで本明細書中に参考として援用される。
【００１２】
図１に示された経路に基づいて、Ｒａｆ、ＭＥＫまたはＥＲＫがアップレギュレートされる癌内でこれらの分子の活性を阻害する化合物が、このような癌処置に対して有利な影響を有することが理解される。このような１つの癌の例は、図１にも示されるように、慢性骨髄性白血病である。従って、ＲａｆキナーゼインヒビターＢＡＹ４３−９００６の非毒性用量、好ましくは２００〜４００ｍｇおよびより高い用量で患者を処置すること（Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ８，２１９［２００１］）は、回復を生じるか、または癌の増殖の安定を最小限にする。さらに、ＭＥＫインヒビターＰＤ１８４３５２（現在、ＣＩ−１０４０と称する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，６５９４［２０００］））の非毒性用量、好ましくは２００〜４００ｍｇおよびより高い用量で患者を処置することはまた、これらの患者の回復または癌増殖の安定性に導く。
【００１３】
（定義）
他の方法で定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当業者に共通に理解される意味と同じ意味を有する。一般的に、本明細書中で使用される命名法および以下に記載される実験室手順は、周知であり、当該分野で一般的に使用される。
【００１４】
多くの他のＲＡＦキナーゼインヒビターがそうであるように、ＢＡＹ４３−９００６は、米国特許出願ＵＳＳＮ０９／４２５，２２８およびＰＣＴ／ＵＳ００／００６４８に記載される。
【００１５】
ＭＥＫインヒビターである、ＣＩ−１０４０は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，６５９４（２０００）に記載される。
【００１６】
イマニティブまたはＧｌｅｅｖｅｃＴＭは、米国特許第５，５２１，１８４号に記載される。
【００１７】
「アップレギュレートされる」またはＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の「アップレギュレーション」は、ＲＡＦ、ＭＥＫまたはＥＲＫのうちの１つ以上のタンパク質のいかなる分子機構による上昇したレベル、それらの酵素活性の増加または正常細胞と比較した場合、それらの正常な基質親和性の変化を意味する。
【００１８】
ＲＡＦ、ＭＥＫまたはＥＲＫに影響を与える化合物が、単独でか、または組み合わせて使用され得ることが理解される。それらは、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路が、アップレギュレートされる、特定の癌に影響を与えることが知られる他の化合物と組み合わせてもまた使用され得る。例えば、イマニティブ（ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ）が、ＣＭＬ患者を処置するために使用される；従って、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のアップレギュレーションを引き起こす特定の進行期のＣＭＬ患者において発生するイマティニブ耐性は、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路において適切な分子のアップレギュレーションを制御する適切な化合物によって処置され得る。このような化合物は、イマティニブ耐性が発生する前か、または耐性が発生した後イマティニブ無しでＣＭＬ患者の処置のためにイマティニブと組み合わされ得る。問題の経路およびＢＡＹ４３−９００６、ＣＩ−１０４０およびイマティニブの作用部位は、図１に図示される。
【００１９】
ＣＭＬの処置についてＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路にインヒビターを適用することに対するいくつかの重要な理論的説明が存在する。第１に、白血病患者（Ｒｈ＋）由来の細胞は、ＲＡＦキナーゼ活性の上昇またはアップレギュレートによって、少なくとも部分的にホスホ−ＥＲＫレベルを上昇した。第２に、イマティニブ処置は、低下したホスホ−ＥＲＫレベルを生じる。また、イマティニブ耐性患者由来の細胞は、ホスホ−ＥＲＫレベルを再上昇した。
【００２０】
（薬学的組成物および投与の様式）
本発明はまた、単独か、またはイマティニブと組み合わせたＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターを含む、ヒトへの投与のための薬学的組成物に関する。このような薬学的組成物は、経腸投与（例えば、経鼻投与、口腔内投与、直腸投与または特に経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与））のための組成物を含む。この組成物は、それ自体または好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアとともにインヒビターを含む。インヒビターの用量は、処置されるべき疾患、好ましくはＣＭＬ、より好ましくはイマティニブ耐性ＣＭＬならびに患者の年齢、体重および個々の状態ならびに投与の様式に依存する。
【００２１】
本発明はまた、プロセスおよび薬学的組成物の調製において、単独か、またはイマティニブと組み合わせてＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターの使用に関する。プロテインチロシンキナーゼの阻害に応答する癌を患っているヒトに投与するのに適切である薬学的組成物に優先度が与えられる。癌は、好ましくはＣＭＬであり、さらに好ましくは組成物は、イマティニブ耐性ＣＭＬであり、その組成物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリアと共にプロテインチロシンキナーゼを阻害する際に効果的である量のインヒビターまたはそれらの塩を含み、ここで、塩形成基が存在する。
【００２２】
予防または特に、好ましくはＣＭＬおよびより好ましくはイマニティブ耐性ＣＭＬの治療的処置のための薬学的組成物にもまた、優先度が与えられる。この組成物は、予防的に、または特に、記載した疾患に対して治療的に効果的である量で活性成分として、インヒビターまたは薬学的に受容可能なそれらの塩を含む。
【００２３】
薬学的組成物は、適切なインヒビターの約１％〜約９５％、単一の投与形態において、好ましくは約２０％〜約９０％の活性成分を含む投与形態、および単一の投与形態ではない、好ましくは約５％〜約２０％の活性成分を含む投与形態を含む。単位用量形態は、例えば、糖衣錠、錠剤、アンプル、バイアル、坐剤またはカプセルである。他の投与形態は、例えば、軟膏、クリーム、ペースト、発泡体、点滴剤、スプレー剤、散布剤などである。本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の混合、顆粒形成、糖剤形成、溶解または凍結乾燥プロセスによって本質的に知られる様式で調製される。
【００２４】
例えば、活性成分を単独またはキャリア（例えば、マンニトール）と共に含む凍結乾燥した組成物の場合に、使用前に調製され得る懸濁液または分散液、特に等張な水溶性溶液、分散液または懸濁液を含む、好ましくは、適切なインヒビターと共に使用され得る溶液が存在する。この薬学的組成物は、滅菌され得、そして／または賦形剤（例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、および／または乳化剤）、可溶化剤、浸透圧を制御するための塩および／または緩衝化剤を含み得、そして本質的に、例えば、従来の溶解または凍結乾燥プロセスによって公知の様式で調製される。この溶液または懸濁液は、粘性増加物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチン）または可溶化剤（例えば、．ＲＴＭ．Ｔｗｅｅｎ  ８０  ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート；ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ，ＵＳＡの登録商標）を含み得る。
【００２５】
当該分野で公知のように合成油または半合成油は、適切なインヒビターの注入に対して使用され得る。特に、８〜２２個、特に１２〜２２個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸を含む液体脂肪酸エステルは、有用であり得る。
【００２６】
薬学的組成物は、好ましくは経口形態において使用され、そして例えば、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路インヒビターをＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビター有りか、または無しで1つ以上の固体キャリアと合わせ、適切な場合、その結果生じた混合物を顆粒化し、そして必要に応じて、適切な場合、さらなる賦形剤を追加してその混合物または顆粒剤を処理し、錠剤または糖衣錠の核を形成することによって得られ得る。適切なキャリアは、特に充填剤（例えば、糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マンニトールまたはソルビトール）、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム）および結合剤（例えば、澱粉（例えば、トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、ｆｌｅｅ澱粉またはイモ澱粉）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン）および／または必要に応じて崩壊薬（例えば、上述の澱粉およびまたカルボメチル澱粉、架橋結合したポリビニルピロリドンまたはアルギニン酸またはそれらの塩（例えば、アルギニン酸ナトリウム）））である。さらなる賦形剤は、特に流動添加物および滑沢剤（例えば、ケイ酸、タルク、ステアリン酸もしくはそれらの塩（例えば、ステアリン酸カルシウムまたはステアリン酸マグネシウム）および／またはポリエチレングリコールもしくはそれらの誘導体）である。
【００２７】
経口投与に対する薬学的組成物はまた、硬いゼラチンカプセル剤およびゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）からなる柔らかい密封したカプセル剤である。この硬いゼラチンカプセル剤は、顆粒の形態（例えば、充填剤（例えば、トウモロコシ澱粉）、結合剤および／または滑り剤（glidant）（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）および適切な場合安定剤と混合して）にある適切なインヒビターを含み得る。柔らかいカプセル剤では、活性成分は、好ましくは適切な液体賦形剤（例えば、脂肪油、パラフィン油または液体ポリエチレングリコールあるいはエチレングリコールもしくはプロピレングリコールの脂肪酸エステル）中に溶解または懸濁され、同様に安定剤および界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル型）を添加される可能性がある。
【００２８】
他の経口用量形態は、例えば、適切なインヒビター（例えば、懸濁された形態でかつ濃度が約５％〜２０％、好ましくは約１０％または投与する場合に、適切な単一用量（例えば、５ｍｌまたは１０ｍｌの単位）を提供する同様の濃度で）を含む、慣習的様式で調製されたシロップ剤である。例えば、シェイクの調製物（例えば、乳）のための粉になったかまたは液体の濃縮物もまた、適切である。そのような濃縮物はまた、単一用量の量にパックされる。
【００２９】
適切なインヒビターの非経口投与について、特に、水溶性形態（例えば、水溶性塩の形態）の活性成分の水溶溶液または粘性増加物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストラン）および必要に応じて安定剤を含む水性注入懸濁液）中の活性成分の水性溶液が適切である。活性成分は、適切な場合、賦形剤と共に、凍結乾燥物の形態中にも存在し得、そして適切な溶媒の添加による非経口投与の前に溶液に作られ得る。
【００３０】
この本発明は、上述の病理的状態、特にチロシンプロテインキナーゼ、好ましくはＣＭＬ、およびより好ましくはＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターに耐性であるＣＭＬの阻害に応答的である状態の処置のための方法に関する。従って、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼインヒビターあり、または無しにおけるＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路インヒビターは、予防的または治療的、よって、または薬学的組成物の形態で投与され得る。
【００３１】
以下に続く実施例は、本発明の特定の実施形態の解説およびそれらの種々の使用である。それらは、例示的な目的のためだけに示し、本発明を限定するとは解釈されない。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
（イマティニブ耐性ＣＭＬ細胞におけるＲＡＦキナーゼインヒビターの影響）
ＣＭＬ細胞および特にイマティニブ耐性ＣＭＬ細胞が、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路の阻害に感受性か否かを試験するために、本発明者らは、ＲａｆインヒビターＢＡＹ４３−９００６およびイマティニブに対するこれらの細胞の応答を分析した。親のＩＬ３依存Ｂａ／Ｆ３マウス造血性細胞および野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌの外因性発現または２つの最も頻繁に報告されるＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン変異体である、Ｅ２５５ＫおよびＴ３１５Ｉに起因してＩＬ３とは無関係の派生細胞株（Ｌｏｓ  ＡｎｇｅｌｓにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓから得、そして、Ｔｉｐｐｉｎｇ  Ａ．Ｊ．らによってＬｅｕｋｅｍｉａ  ２００２  Ｄｅｃ；１６（１２）：２３４９〜５７に記載されている）は、イマティニブまたはＢＡＹ４３−９００６のいずれかに曝した。Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼドメイン変異体Ｅ２５５ＫおよびＴ３１５Ｉは、イマティニブに耐性である。
【００３３】
手短に言えば、細胞培養方法は、以下のとおりであった。空の発現ベクター（Ｂａ／Ｆ３）もしくは安定的に発現する野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｐ２１０ＷＴ）、またはイマティニブ耐性Ｔ３１５ＩもしくはＥ２５５Ｋ変異体（Ｐ２１０、Ｔ３１５Ｉ、Ｐ２１０Ｅ２５５Ｋ）を含むＢａ／Ｆ３マウス前Ｂ細胞、１０％血清を含むＲＰＭＩ培地中で培養した。細胞増殖アッセイを以下のように実施した。１日目に、２×１０５個の細胞を培地が１．２ｍｌ入った２４ウェルプレートにプレートした。次いで、選択された濃度で適切な化合物を最終濃度が０．２％のＤＭＳＯを含んだ培地に添加した。３日目に、その細胞を再懸濁し、０．５ｍｌのその細胞懸濁液をＰＢＳで希釈（１：２）した。最後に、細胞増殖（細胞生存度）をＣＥＤＥＸシステム（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ）を使用してトリパンブルー色素排除によって測定した。
【００３４】
その結果を図３に示す。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現するＢａ／Ｆ３細胞だけがイマティニブに感受性だった。イマティニブによる阻害に対するＩＣ５０は、野生型発現細胞については０．５μＭであり、そして他の３つの細胞株については１０倍を超えた。対照的に、図４に示すように、４つすべての細胞株の増殖は、４〜８μＭの範囲のＩＣ５０でＢＡＹ４３−９００６によって阻害された。
【００３５】
従って、これらの結果は、イマティニブに耐性であるか、または耐性でないＣＭＬ患者が、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビター（例えば、ＲａｆインヒビターであるＢＡＹ４３−９００６）に有利に応答することを示す。
【００３６】
（実施例２）
（ＥＲＫリン酸化におけるＲａｆインヒビターの影響）
第２の実験を、Ｅｒｋリン酸化の測定によって決定される場合、イマティニブおよびＢＡＹ４３−９００６に対する感受性が、ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターと相関することをさらに設定するように実施した。この実験は、親のＩＬ３依存Ｂａ／Ｆ３マウス造血性細胞および野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌの外因性発現または２つの最も頻繁に報告されるＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼイマティニブ耐性ドメイン変異体である、Ｅ２５５ＫおよびＴ３１５Ｉに起因してＩＬ３とは無関係の派生細胞株（Ｌｏｓ  ＡｎｇｅｌｓにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｓａｗｙｅｒｓから得、そして、Ｓｈａｈ，Ｎ．らによって（Ａｕｇｕｓｔ  ２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｖｏｌ．２；ｐａｇｅｓ１１７〜１２５に記載されている）を使用して実施した。この実験は以下のとおり実施した。１日目に２×１０６個の細胞を６ウェルプレートの１０％血清を含む培地中にプレートし、そして２日目にこの細胞をＤＭＳＯに溶解した適切な化合物で処理した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．２％だった。次に、その細胞を沈降させて、２ｍｌの氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で１回洗浄し、次いで１５０ｍｌ緩衝液に溶解した。次に、細胞可溶化物の５０μｌを１０％トリス−グリシンゲルにて電気泳動し、次いで１：１０００希釈で使用されるホスホ−ＥＲＫポリクローナルウサギ抗体である１次抗体で処理した。それはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから得た。その１次抗体の次に、１：１０００の希釈で使用される２次抗体である、ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体で処理した。最後に、ウェスタン分析をＡｍｅｒｓｈａｍから得られたＥＣＬキットで発色させた。
【００３７】
図５は、その結果を示す。野生型Ｂｃｒ−Ａｂｌを発現するＢａ／Ｆ３細胞だけがイマティニブに感受性だった。対照的に、これらの細胞内のホスホ−ＥＲＫレベルおよびＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼイマティニブ耐性ドメイン変異体であるＥ２５５ＫおよびＴ３１５Ｉはまた、ＢＡＹ４３−９００６の存在においてホスホ−ＥＲＫレベルが減少することを示した。
【００３８】
これらの結果は、イマティニブに耐性であるか、または耐性でないＣＭＬ患者が、ＲＡＦインヒビターＢＡＹ４３−９００６のようなＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路のインヒビターに応答することを示唆する。
【００３９】
本発明は、ここで十分に記載され、多くの変更および改変が、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、慢性骨髄性白血病を含む特定の癌細胞内でアップレギュレートされるＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を示す。また、ＲＡＦおよびＭＥＫにそれぞれ影響を与える化合物ＢＡＹ４３−９００６およびＣＩ−１０４０ならびにＲＡＦおよびＭＥＫに影響を与える経路におけるタンパク質も示す。
【図２】図２は、ＢＡＹ４３−９００６の構造を示す。
【図３】図３は、イマニティブ耐性ＣＭＬ細胞におけるＲＡＦキナーゼインヒビターであるＢＡＹ４３−９００６およびイマニティブの影響を示す。
【図４】図４は、イマニティブ耐性ＣＭＬ細胞におけるＲＡＦキナーゼインヒビターであるＢＡＹ４３−９００６の影響を示す。この結果は、３つの実験からの結果である。
【図５】ＥＲＫリン酸化におけるＲＡＦキナーゼインヒビターであるＢＡＹ４３−９００６の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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