(57)【要約】増殖性疾患の処置のための、治療用結合剤を調製するための材料および方法が提供される。本発明の治療用結合剤は、治療的部分と結合した標的化部分を含む。本発明の結合体の治療的部分は、細胞障害性効果を有し、そして増殖性疾患の処置において有用である。  また、本発明において、細胞障害性部分と結合体化した標的化部分を含む、アプタマー−毒素結合体治療剤であって、ここで標的化部分は、細胞表面マーカーに結合する、治療剤が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞障害性部分と結合体化した標的化部分を含む、アプタマー−毒素結合体治療剤。
【請求項２】
前記標的化部分がアプタマーである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記標的化部位が核酸センサー分子である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
請求項２に記載の治療剤であって、ここで、前記細胞障害性部分は、細胞障害性ペプチド、細胞障害性タンパク質、低分子化学治療剤、および放射性同位元素治療用分子からなる群から選択される、治療剤。
【請求項５】
請求項３に記載の治療剤であって、ここで、前記細胞障害性部分は、細胞障害性ペプチド、細胞障害性タンパク質、低分子化学治療剤、および放射性同位元素治療用分子からなる群から選択される、治療剤。
【請求項６】
請求項４に記載の治療剤であって、ここで、前記標的化部分が、共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【請求項７】
請求項５に記載の治療剤であって、ここで、前記標的化部分が、共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【請求項８】
請求項４に記載の治療剤であって、ここで、前記標的化部分が、非共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【請求項９】
請求項５に記載の治療剤であって、ここで、前記標的化部分が、非共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、核酸の分野に関し、より具体的には、核酸アプタマーを細胞障害性薬剤に連結し、そしてアプタマー−毒素結合体を標的に送達することによって、細胞に対して、細胞障害性薬剤を送達するための組成物および方法に関する。同様に、核酸センサー分子（ＮＡＳＭ）を、毒素に連結し、そしてＮＡＳＭ−毒素結合体を標的に送達し得る。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、古典的なワトソン−−クリック対形成以外の相互作用を通して、非核酸または核酸分子に対する特異的親和性を有する核酸分子である。アプタマーは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号；第５，２７０，１６３号；第５，５８９，３３２号；第５，５８９，３３２号；および第５，７４１，６７９号に記載される（これらの各々の全体を、本明細書において参考として援用する）。
【０００３】
アプタマーは、ファージディスプレイによって生成されたペプチドまたはモノクローナル抗体（ＭＡＢ）と同様に、選択された標的に対して、特異的に結合し得、そして結合を通じて、その標的が機能する能力をブロックし得る。ランダムな配列のオリゴヌクレオチドのプール（図１）からのインビトロ選択プロセスによって生成されることによって、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む１００を越えるタンパク質についてのアプタマーが、生成されている。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズであり（３０〜４５ヌクレオチド）、ナノモル未満の親和性でその標的に結合し、そして密接に関連する標的に対して識別する（例えば、代表的には、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には結合しない）。一連の構造研究によって、アプタマーが抗体−抗原複合体における親和性および特異性をもたらすのと同一のタイプの結合相互作用（水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体排除など）を使用し得ることが、示された。
【０００４】
アプタマーは、治療剤としての使用のための多くの望まれる特徴（高い特異性および親和性、生物学的効力、および優れた薬物動態学的特徴）を有する。さらに、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物学的製剤と比較して、特定の優れた利点を提供する、例えば、：
１）速度および制御。アプタマーは、完全にインビトロのプロセスで産生されるので、迅速な、初期治療用リードの生成を可能にする。インビトロでの選択は、アプタマーの特異性および親和性を厳密に制御することを可能にし、そして毒性の標的および非免疫源性の標的の両方に対するリードの生成を可能にする。
【０００５】
２）毒性および免疫源性。部類としてのアプタマーは、毒性および免疫源性をほとんど有さないか、または全く有さないことが実証されている。高レベルのアプタマー（毎日１０ｍｇ／ｋｇを９０日）を用いたラットまたはウッドチャックへの慢性の投与において、臨床的尺度、細胞での尺度、生化学的尺度のいずれにおいても、毒性が観察されなかった。多くのモノクローナル抗体の効力は、抗体自身に対する免疫応答のために、厳しく限定されている一方で、アプタマーに対する抗体を惹起することは非常に困難である（おそらくは、アプタマーが、ＭＨＣを介してＴ細胞に提示され得ず、そして免疫応答は、核酸フラグメントを認識しないように教育を受けるからである）。
【０００６】
３）投与。現在承認を受けた抗体治療薬の全ては、静脈内注入によって投与される（代表的には、２〜４時間にわたって）、アプタマーは、皮下注射によって投与され得る。この差異は、主に、ほとんどの治療用ＭＡＢは溶解度が低いため、大容量を必要とすることに起因する。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ＫＤ；抗体：１５０ＫＤ）によって、アプタマーの毎週の用量は、０．５ｍｌ未満の容量における注射によって、送達され得る。皮下投与を介するアプタマーのバイオアベイラビリティーは、サルでの研究において＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒ、１９９９）。
【０００７】
４）スケールおよび費用。治療用アプタマーは、化学的に合成され、その結果、生産の受容を満たす必要に応じて、容易に規模の変更をすることができる。一方、生産の規模を変更することの困難性のために、現在、いくつかの生物学的製剤（例えば、Ｅｎｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）の利用可能性が制限され、そして大規模タンパク質生産プランとの資本費用は、莫大であり（例えば、＄５００ＭＭ、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、単一の大規模生産合成機は、１年あたり１００ｋｇ以上のオリゴヌクレオチドを生産することができ、そして比較的多くない初期投資を必要とする（例えば、＜＄１０ＭＭ、Ａｖｅｃｉａ）。アプタマー合成のための商品の現在の費用は、キログラムのスケールで＄５００／ｇと推定され、高度に最適化された抗体についての費用に匹敵する。プロセスの開発における改善を続けることによって、商品の費用を、５年間で＜＄１００／ｇに低減することが予測される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは、化学的に強靭である。アプタマーは、本質的に、熱、変性剤等に曝露された後に、活性を回復し、そして、凍結乾燥した粉末として、室温で長期間（＞１年）保存され得る。それとは対照的に、抗体は、冷蔵保存しなければならない。
【０００９】
細胞障害剤は、細胞に対して、致死的な効果、または増殖阻害効果を有する。細胞障害剤または化学的治療剤は、チューブリン安定剤または不安定化剤、抗代謝剤、プリン合成インヒビター、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤または他のＤＮＡ修飾剤として分類され得る。そのような薬剤は、増殖性疾患（例えば、癌、固形腫瘍、炎症性疾患、過敏性瘢痕障害、および狼瘡のような自己免疫疾患）の治療において使用され得る。その細胞障害性効果のために、これらの化学的治療剤は、健常細胞または非標的細胞にもまた、影響するか、またはこれらの細胞を阻害して、被験体または処置される患者において、望まれない病的状態または副作用をもたらす傾向がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
健常細胞または正常細胞または周囲の組織に対する細胞障害性を並行して生じることなく、罹患した悪性の細胞または標的細胞に対する細胞障害性を最大化する、増殖性疾患を処置するための細胞障害剤または化学的治療剤が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の材料および方法は、細胞障害剤または治療剤の効力を増加し、そして、非標的細胞に対する損傷を最小限とする、標的特異的治療剤−アプタマー複合体を提供する。本発明のアプタマー−毒素複合体および方法は、これらおよび他の要求を満たす。
【００１２】
（発明の要旨）
アプタマーの特異性のために、標的に対する高い結合親和性を有するアプタマーと別の分子を連結することによって、アプタマーを所定の標的に対する別の分子の特異性を増加する分子「シャペロン」として使用することが可能である。
【００１３】
１つの実施形態において、細胞障害剤または毒素が、アプタマーに連結され、所定の標的に対する細胞障害剤部分の特異性を増加する毒素−アプタマー結合体分子を形成する。毒素−アプタマー結合体の１つの実施形態において、毒素または細胞障害剤は、ケモトキシンである。
【００１４】
１つの実施形態において、アプタマー−毒素結合体を、増殖性疾患（限定されることはないが、例えば、炎症性疾患、瘢痕、固形腫瘍、および狼瘡のような自己免疫疾患）の治療において化学治療剤として使用される。
【００１５】
別の実施形態において、毒素結合体は、タンパク質毒素である。１つの実施形態において、タンパク質は、抗体または抗体画分である。別の実施形態において、毒素は、別の分子に対する結合特異性および親和性を有するタンパク質である。
【００１６】
別の実施形態において、毒素は、核酸毒素である。
【００１７】
別の実施形態において、ケモトキシン結合体は、低分子治療剤（チューブリン安定剤／不安定化剤、抗代謝剤、プリン合成インヒビター、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤または他のＤＮＡ修飾剤（例えば、ドキソルビシンが挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない）である。
【００１８】
別の実施形態において、ケモトキシン結合体としては、カリコマイシン（ｃａｌｉｃｈｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキセート、ジェンシタジン（ｇｅｎｃｉｔａｄｉｎｅ）、ＡｒａＣ（シタラビン）、ビンブラスチン、ダウノルビシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
別の実施形態において、毒素剤は、放射性同位元素である。
【００２０】
別の実施形態において、毒素−アプタマー結合体は、細胞表面レセプターであり、レセプターチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ｈｅｒ２  ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、およびＭｕｃ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
ＮＡＳＭの特異性のために、標的を高い特異性で認識するＮＡＳＭと別の分子を連結することによって、ＮＡＳＭを所定の標的に対する別の分子の特異性を増加する分子「シャペロン」として使用することが可能である。
【００２２】
１つの実施形態において、細胞障害剤または毒素が、ＮＡＳＭに連結され、所定の特異的標的に対する細胞障害剤部分の特異性を増加する毒素−ＮＡＳＭ結合体分子を形成する。毒素−ＮＡＳＭ結合体の１つの実施形態において、毒素または細胞障害剤は、ケモトキシンである。
【００２３】
１つの実施形態において、ＮＡＳＭ−毒素結合体を、増殖性疾患（限定されることはないが、例えば、炎症性疾患、瘢痕、固形腫瘍、および狼瘡のような自己免疫疾患）の治療において化学治療剤として使用される。
【００２４】
別の実施形態において、毒素結合体は、タンパク質毒素である。１つの実施形態において、タンパク質は、抗体または抗体画分である。別の実施形態において、毒素は、別の分子に対する結合特異性および親和性を有するタンパク質である。
【００２５】
別の実施形態において、毒素は、核酸毒素である。
【００２６】
別の実施形態において、ケモトキシン結合体は、低分子治療剤（チューブリン安定剤／不安定化剤、抗代謝剤、プリン合成インヒビター、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤または他のＤＮＡ修飾剤（例えば、ドキソルビシンが挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない）である。
【００２７】
別の実施形態において、ケモトキシン結合体としては、カリコマイシン（ｃａｌｉｃｈｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキセート、ジェンシタジン（ｇｅｎｃｉｔａｄｉｎｅ）、ＡｒａＣ（シタラビン）、ビンブラスチン、ダウノルビシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
別の実施形態において、毒素剤は、放射性同位元素である。
【００２９】
別の実施形態において、毒素−ＮＡＳＭ結合体は、細胞表面レセプターであり、レセプターチロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ｈｅｒ２  ｎｅｗ、ＰＳＭＡ、およびＭｕｃ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において定義される場合、「毒素」は、別の分子または生細胞に対して悪影響を有する分子であり、究極的な細胞の死を生じる可能性がある。
【００３１】
本明細書において定義される場合、「核酸」とは、ＤＮＡ，ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およびそれらの任意の化学的修飾物を意味する。修飾としては、さらなる荷電、分極率、水素結合、静電的相互作用、ならびに、核酸リガンドベースに対するか、または全体としての核酸リガンドに対する流出性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取りこむ他の化学基を提供する修飾が挙げられるがこれらに限定されない。そのような修飾としては、２’位糖の修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環の外のアミンの修飾、４チオ−ウリジン置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシル置換；骨格修飾、メチル化、通常ではない塩基対の組み合わせ（例えば、イソ塩基類（ｉｓｏｂａｓｅｓ）、イソシチジン（ｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、および、イソグアニジン（ｉｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）など）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾はまた、キャッピングのような３’修飾および５’修飾を含む。
【００３２】
本明細書において定義される場合、「オリゴヌクレオチド」は、用語「核酸」と互換可能に使用され、１つ以上のヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のいずれかの形態における、ＲＮＡまたはＤＮＡ（またはＲＮＡ／ＤＮＡ）配列を含む。「修飾オリゴヌクレオチド」としては、以下のいずれかを有する少なくとも１ヌクレオチド残基が挙げられる：改変ヌクレオチド内結合（単数または複数）、改変糖（単数または複数）、またはこれらの組み合わせ。
【００３３】
本明細書において定義する場合、「標的」とは、核酸リガンドが存在するか、または核酸リガンドが生成される、目的の任意の化合物または分子を意味する。標的分子は、天然に存在しても、人工的に作製されてもよく、この標的分子としては、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ポリサッカライド、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態のアナログ、補因子、インヒビター、薬物、色素、栄養素、増殖因子、などが限定されることなく挙げられる。
【００３４】
本明細書において定義される場合、「標的分子を認識する」核酸センサー分子は、標的調節ドメインに対する標的分子の結合の際に、任意の非標的分子の結合による場合か、または標的分子が存在しない場合よりも大きな程度で、その活性が調節される核酸分子である。核酸センサー分子と標的分子との間の認識事象は、結果としてのアロステリックな修飾が生じる時間の間に永続する必要はない。従って、認識事象は、核酸センサー分子のアロステリックな修飾（例えば、コンフォメーションの変化）を確実にすることに関して、一過性であり得る。
【００３５】
本明細書において定義されるように、「ＤＮＡまたはＲＮＡに、天然において結合する」分子は、天然において見出される、細胞内または生物内に見出される分子である。
【００３６】
本明細書において定義される場合、「ランダムな配列」または「ランダム化された配列」は、完全にランダムな配列または部分的にランダムな配列の１つ以上の領域を有する核酸のセグメントである。完全にランダムな配列は、配列の各々の位置において、各塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）が、ほぼ同じ確率で存在する配列である。部分的にランダムな配列において、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ塩基が各位置において存在する２５％の確率の代わりに、均一でない確率が存在する。
【００３７】
本明細書において定義される場合、「アプタマー」は、非ワトソン−クリック塩基対を介して、非核酸標的分子または核酸標的に結合する核酸である。
【００３８】
本明細書において定義される場合、「標的分子を認識する」アプタマー核酸分子は、標的分子に特異的に結合する核酸分子である。
【００３９】
本明細書において定義される場合、「核酸センサー分子」または「ＮＡＳＭ」とは、触媒性核酸センサー分子および光学的核酸センサー分子の、いずれか、または両方をいう。
【００４０】
本明細書において定義される場合、「核酸リガンド」とは、アプタマーまたはＮＡＳＭの、いずれか、または両方をいう。
【００４１】
本明細書において定義される場合、「触媒性核酸センサー分子」は、標的調節ドメイン、リンカー領域、および触媒ドメインを含む核酸センサー分子である。
【００４２】
本明細書において定義される場合、「光学的核酸センサー分子」は、触媒性ドメインが光学的シグナル生成ユニットを含むことによる触媒の結果、および／または触媒の代わりに、光学的シグナルを放射するように修飾された、触媒性核酸センサー分子である。
【００４３】
本明細書において定義する場合、「標的調節ドメイン」（ＴＭＤ）は、標的分子を認識する核酸センサー分子の部分である。標的調節ドメインはまた、ときとして、本明細書において、「標的活性化部位」または「エフェクター調節ドメイン」という。
【００４４】
本明細書において定義する場合、「触媒性ドメイン」は、標的調節ドメインに対する標的分子の結合に応答して調節される触媒活性を保有する、核酸センサー分子の部分である。
【００４５】
本明細書において定義する場合、「リンカー領域」または「リンカードメイン」は、「標的調節ドメイン」および「触媒ドメイン」が結合する原因、または結合する場所である、核酸センサー分子の部分である。リンカー領域としては、限定することはないが、種々の長さのオリゴヌクレオチド、塩基対形成ホスホジエステル、ホスホロチオエート、および他の共有結合、化学部分（例えば、ＰＥＧ）、ＰＮＡ、フォルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、ビスマレイミド、ジスルフィド、および他の二機能性リンカー試薬が挙げられる。リンカードメインはまた、ときとして、本明細書において、「コネクター」または「ステム」ともいう。
【００４６】
本明細書において定義する場合、「光学的シグナル生成ユニット」は、標的調節ドメインによる標的分子の認識の後の、核酸センサー分子のコンフォメーションまたは活性の変化に応答して、光学的特性または電気化学的特性を変化するか、あるいは、それに密接に近くにある分子の光学的特性または電気化学的特性を変化する、１つ以上の核酸配列および／または非核酸配列分子実体を含む、核酸センサー分子の部分である。
【００４７】
本明細書において定義する場合、「特異的」とは、本発明の核酸が、競合するか、または密接に関連する標的またはリガンドの中から、認識および識別する能力をいう。所定の核酸の特異性の程度は、所定の分子の結合親和性に必ずしも限定される必要はなく、また、必ずしも直接的に相関する必要はない。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の疎水的相互作用は、高い結合親和性を有するが、低い程度の特異性を有する。標的Ａに対して、標的Ｂに対するよりも１００倍特異的である核酸は、標的Ｂを認識および識別するよりも、１００倍より良好に、優先的に、標的Ａを認識および識別する。
【００４８】
本明細書において定義する場合、「選択的」とは、標的分子に対して高い程度の特異性を有する分子をいう。
【００４９】
本発明は、部分的には、細胞障害剤と連結した核酸部分を含む組成物を見出したことに基づく。この核酸部分は、所望の細胞または細胞表面マーカーに結合する。従って、連結した細胞障害剤は、細胞に密接に近接し、このことによって、細胞障害剤が、細胞に対して細胞障害効果を発揮することを可能にする。これらアプタマー−毒素結合体は、細胞障害性分子を標的細胞に選択的に送達することを可能にする。
【００５０】
１つの局面において、本発明は、毒素がケモトキシンである、アプタマー−毒素結合体を提供する。いくつかの実施形態において、毒素は、タンパク質毒素である。他の実施形態において毒素は、核酸毒素である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、毒素は、共有結合を介して、アプタマーに付着する。望まれる場合、毒素は、加水分解可能な結合を介して、および／または酵素活性を通じて切断可能な結合を介して、アプタマーに付着する。
【００５２】
他の実施形態において、毒素は、非共有結合を介して、アプタマーに付着する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、アプタマー−毒素結合体は、標的に結合し、それによって、毒素を標的の近傍に送達する。毒素は、いくつかの標的、または第１の標的の近傍にある第２の標的と相互作用してもよい。
【００５４】
いくつかの実施形態において、標的への結合は、アプタマーおよび会合した毒素の転位を生じる。例えば、標的への結合は、アプタマーおよび会合した毒素の、細胞膜を横切る転位を生じる。いくつかの実施形態において、標的への結合は、器官、組織または細胞中での構造を介した、アプタマーおよび会合する毒素の転位を生じる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、アプタマー−毒素結合体は、標的に結合し、標的への結合が、アプタマー−毒素のコンフォメーションの変化を生じる。このコンフォメーションの変化は、アプタマー−毒素の活性の変化を生じる。
【００５６】
例えば、いくつかの実施形態において、標的に対するアプタマー−毒素結合体の結合は、アプタマー−毒素結合体のコンフォメーションの変化を生じ得、その変化は、毒素の放出を生じ得る。
【００５７】
あるいは、または、さらに、標的に対するアプタマー−毒素結合体の結合は、アプタマー−毒素結合体のコンフォメーションの変化を生じ得、ここで、このコンフォメーション変化は、毒素の活性化を生じ得る。
【００５８】
さらなる実施形態において、アプタマー−毒素結合体は、標的に結合し、ここで、標的への結合は、アプタマー−毒素結合体のコンフォメーション変化を生じ、そしてこの変化は、毒素の不活性化を生じる。
【００５９】
種々の実施形態において、その半減期が、毒素の半減期よりも短い、同程度の、またはより長いアプタマー−毒素結合体が提供される。
【００６０】
本発明においてまた、毒素をアプタマーに付着する工程を含む、アプタマー−毒素結合体の生成方法が提供される。いくつかの実施形態において、部分の中のアプタマーは、「指数関数的な富化によるリガンドの体系的進化」（「ＳＥＬＥＸプロセス」）と」称するプロセスを使用して作製される。ＳＥＬＥＸプロセスは、標的分子に対して高度の特異的結合を有する核酸分子のインビトロ進化方法であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」）、および米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３もまた参照のこと）（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載される。
【００６１】
例えば、本発明は、毒素を核酸のランダムなプールに付着して、次に、ランダムなプールの中から、最適なアプタマー−毒素結合体を見出すＳＥＬＥＸプロセスを用いることによって、アプタマー−毒素結合体を生成する方法を含む。あるいは、選択後に、毒素を、アプタマーに付着し得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、アプタマー−毒素結合体の生成方法は、その半減期が毒素の半減期と一致するように操作されたアプタマーを生じる。例えば、本発明は、アプタマー中のヌクレアーゼ耐性塩基の割合を調整することによって、アプタマーの半減期が毒素の半減期に一致するように操作されたアプタマー−毒素結合体を生成する方法を含む。別の実施形態において、本発明は、５’および／または３’末端キャッピングを変更することによって、アプタマーの半減期が毒素の半減期に一致するように操作されたアプタマー−毒素結合体を生成する方法を含む。
【００６３】
また、本発明には、毒素がケモトキシンである、ＮＡＳＭ−毒素結合体が含まれる。いくつかの実施形態において、毒素は、タンパク質毒素である。別の実施形態において毒素は、核酸毒素である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、毒素は、共有結合を介して、ＮＡＳＭに付着する。望まれる場合、毒素は、加水分解可能な結合を介して、および／または酵素活性を通じて切断可能な結合を介して、ＮＡＳＭに付着する。
【００６５】
他の実施形態において、毒素は、非共有結合を介して、ＮＡＳＭに付着する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ＮＡＳＭ−毒素結合体は、標的に結合し、それによって、毒素を、その標的の近傍に送達する。毒素は、同一の標的と相互作用してもよいし、または第１の標的の近傍の第２の標的と相互作用してもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、標的への結合は、ＮＡＳＭおよび会合した毒素のトランスロケーションを生じる。例えば、標的への結合は、ＮＡＳＭおよび会合した毒素の、細胞膜を横切った転位を生じる。いくつかの実施形態において、標的への結合は、器官、組織または細胞内での構造を介した、ＮＡＳＭおよび会合した毒素の転位を生じる。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＮＡＳＭ−毒素結合体は、標的に結合し、そして標的への結合は、ＮＡＳＭ−毒素結合体のコンフォメーションの変化を生じる。このコンフォメーションの変化は、ＮＡＳＭ−毒素の活性の変化を生じる。
【００６９】
例えば、いくつかの実施形態において、標的に対するＮＡＳＭ−毒素結合体の結合は、ＮＡＳＭ−毒素結合体のコンフォメーションの変化を生じ得、その変化は、毒素の放出を生じ得る。
【００７０】
あるいは、または、さらに、標的に対するＮＡＳＭ−毒素結合体の結合は、ＮＡＳＭ−毒素結合体のコンフォメーションの変化を生じ得、ここで、このコンフォメーション変化は、毒素の活性化を生じ得る。
【００７１】
さらなる実施形態において、ＮＡＳＭ−毒素結合体は、標的に結合し、ここで、標的への結合は、ＮＡＳＭ−毒素結合体のコンフォメーション変化を生じ、そしてこの変化は、毒素の不活性化を生じる。
【００７２】
種々の実施形態において、その半減期が、毒素の半減期よりも短い、同程度の、またはより長いＮＡＳＭ−毒素結合体が提供される。
【００７３】
本発明においてまた、毒素をＮＡＳＭに付着する工程を含む、ＮＡＳＭ−毒素結合体の生成方法が提供される。いくつかの実施形態において、部分の中のＮＡＳＭは、上記に記載されたＳＥＬＥＸプロセスと類似のプロセス使用して作製される。しかし、増加した結合親和性を有する分子について選択するよりもむしろ、分子は、その触媒能力（すなわち、ＮＡＳＭのスイッチを入れるか、または切る能力）に基づいて選択される。
【００７４】
例えば、本発明は、毒素を核酸のランダムなプールに付着して、次に、ランダムなプールの中から、最適化されたＮＡＳＭ−毒素結合体を見出す上記のＳＥＬＥＸプロセスを用いることによって、ＮＡＳＭ−毒素結合体を生成する方法を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＮＡＳＭ−毒素結合体の生成方法は、その半減期が毒素の半減期と一致するように操作されたＮＡＳＭを生じる。例えば、本発明は、ＮＡＳＭ中のヌクレアーゼ耐性塩基の割合を調整することによって、ＮＡＳＭの半減期が毒素の半減期に一致するように操作されたＮＡＳＭ−毒素結合体を生成する方法を含む。別の実施形態において、本発明は、５’末端および／または３’末端キャッピングを変更することによって、ＮＡＳＭの半減期が毒素の半減期に一致するように操作されたＮＡＳＭ−毒素結合体を生成する方法を含む。
【００７６】
アプタマー−毒素結合体および／またはＮＡＳＭ−毒素結合体を操作し、その結果、核酸部分は、トランスポーター（例えば、葉酸トランスポーターまたはアミノ酸トランスポーター（バリントランスポーター、アルギニントランスポーター、リジントランスポーター、またはヒスチジントランスポーターを含む）、ペプチドトランスポーター、ヌクレオチドトランスポーター、あるいは、糖または炭水化物トランスポーター）を認識する。あるいは、または、さらに、例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦ、グルコースのようなレセプターに対するリガンドの結合に際して、内在化されるレセプターを認識するように、核酸部分を操作し得る。
【００７７】
他にそうであると定義しないかぎり、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、共通に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と同様または等価である方法および材料を、本発明の実施および試験に用い得るが、適切な方法および材料を、以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が、本明細書において参考として援用される。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示的なものであり、本発明を限定することを意図しない。
【００７８】
（核酸組成物）
遺伝的情報を保持することに加えて、核酸は、複雑な三次元構造を取り得る。これらの三次元構造は、標的分子の特異的認識を可能にし得、そしてさらに、化学反応を触媒し得る。従って、核酸は、多様な標的分子（天然には、ＤＮＡにもＲＮＡも、認識も結合もしない分子を含む）について候補検出分子を提供する。
【００７９】
アプタマーの選択において、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを、インビトロでスクリーニングして、予め選択した標的に対して高い親和性で結合するオリゴヌクレオチドを同定する。ＮＡＳＭ選択において、他方、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを、インビトロでスクリーニングして、標的の存在下で増加した触媒活性を示すオリゴヌクレオチドを同定する。アプタマーおよびＮＡＳＭの両方の可能な標的としては、天然および合成のポリマー（タンパク質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、および細胞表面が挙げられる）、ならびに低分子（例えば、薬物、代謝物、遷移状態のアナログ、特異的リン酸化状態、および毒素）が挙げられる。低分子（例えば、トロンビン、Ｋｕ、ＤＮＡポリメラーゼ）は、アプタマー、本明細書において考察される触媒性ＲＮＡ（リボザイム）（例えば、ハンマーヘッドＲＮＡ、ヘアピンＲＮＡ）ならびにＮＡＳＭにとっての効果的な標的である。
【００８０】
記載されるアプタマー選択プロセスは、親和性ベースの（結合）選択を通してアプタマーを同定するが、ＮＡＳＭについて記載される選択プロセスは、リボザイムの触媒性コアの標的修飾を通して、核酸センサー分子を同定する。ＮＡＳＭ選択において、ＮＡＳＭの開始集団（開始プールサイズは、１０１４〜１０１７分子の大きさ）に対する選択圧は、増強した触媒特性を有するが、必ずしも増強した結合特性を有さない核酸センサー分子を生じる。具体的には、ＮＡＳＭ選択手順は、標的濃度および反応時間の依存性の両方を調節することによって、可能性のあるＮＡＳＭの触媒効力に対して、選択圧を与える。選択を通じて最適化される場合、いずれかのパラメーターが、特注で設計した触媒特性を有する核酸センサー分子（例えば、高いスイッチ係数を有するＮＡＳＭ、および／または高い特性を有するＮＡＳＭ）をもたらし得る。
【００８１】
（アプタマー）
指数関数的な富化によるリガンドの体系的進化（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）は、任意の所望の標的についての核酸リガンドを作製する方法である（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，６７０，６３７号；同第５，６９６，２４９号；同第５，２７０，１６３号；同第５，７０７，７９６号；同第５，５９５，８７７号；同第５，６６０，９８５号；同第５，５６７，５８８号；同第５，６８３，８６７号；同第５，６３７，４５９号；同第５，７０５，３３７号；同第６，０１１，０２０号；同第５，７８９，１５７号；同第６，２６１，７７４号、ＥＰ０５５３８３８号、およびＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号において記載され、これらの各々は、具体的に、本明細書において参考として援用される）。
【００８２】
ＳＥＬＥＸＴＭ技術は、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成するのに十分な能力を有し、そして、実質的に任意の化合物に対して（化合物のサイズが大きいかまたは小さいかに関わらず）リガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）ために、そのモノマー内に利用可能な、十分な化学的汎用性を有するという事実に基づく。
【００８３】
この方法は、同一の一般的な選択スキームを用いて、候補物の混合物からの選択、および、構造の改善の段階的な繰り返しによって、結合親和性および選択性についての、任意の所望される判断基準に達成する工程を包含する。核酸の混合物から出発して、好ましくは、ランダム化された配列のセグメントを含み、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、結合工程、標的分子に結合した核酸からの非結合核酸の分配工程、核酸−標的対の解離工程、リガンドが富化した核酸の混合物を生じるための核酸−標的対から解離した核酸の増幅工程、次に、所望される回数の、結合工程、分配工程、解離工程、および増幅工程の繰り返しを包含する。
【００８４】
大量の可能な配列および構造を含む核酸混合物内には、所定の標的に対して、広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化されたセグメントを含む核酸混合物は、４２０の候補の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有する核酸が、標的に結合する可能性が最も高い。分配、解離、および増幅の後、より高い結合親和性候補が富化された、第２の核酸混合物を生成する。生じた核酸混合物が、もっぱら１または数個の配列から構成されるまで、さらなる選択の回を行って、最も良好なリガンドをもたらす。次に、これらの核酸をクローニング、配列決定し、そして、純粋なリガンドとして結合親和性について個別に試験し得る。
【００８５】
選択と増幅のサイクルを、所望の目的が達せられるまで、繰り返す。最も一般的な場合において、選択／増幅は、サイクルの繰り返しにおいて、結合強度における顕著な改善が達成されなくなるまで、続けられる。この方法を、約１０１８個の異なる核酸種のサンプルに使用し得る。試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列部分、および効率的な増幅のために必要な保存された配列を含む。核酸配列改変体を、種々の方法（ランダム化された核酸配列の合成、およびランダムに切断した細胞の核酸のサイズによる選択）において、産生し得る。可変配列部分は、完全にランダムな配列を含んでも、部分的にランダムな配列を含んでもよく；また、ランダム化された配列に取り込まれた、保存的配列の一部分を含んでもよい。試験核酸中の配列の多様性は、選択／増幅の繰り返しの前、またはその間に、変異導入によって、導入または増加され得る。
【００８６】
ＳＥＬＥＸＴＭの１つの実施形態において、選択プロセスは、選択された標的に対して最も強力に結合する核酸リガンドの単離において、非常に効率的であるので、１サイクルのみの選択および増幅が必要とされる。そのような効率的な選択は、例えば、核酸がカラム上に結合した標的と会合する能力が、カラムが最も高い親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にし得る様式で作用するクロマトグラフィー型のプロセスにおいて、生じ得る。
【００８７】
多くの場合、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸＴＭの反復する工程を実行することは、必ずしも望まれない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存された配列、および核酸リガンドがその標的に結合する能力に対して顕著に影響することなく、置換または富化され得る多数の配列を有する、核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了前にＳＥＬＥＸＴＭプロセスを終結することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。
【００８８】
種々の核酸の、一次構造、二次構造、および三次構造が存在することが、公知である。非ワトソン−クリック型の相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対象バルジおよび非対象バルジ、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）、およびこれらの無数の組み合わせに起因する。そのようなモチーフのほとんど全ての場合において、３０ヌクレオチド以下の核酸配列において形成され得ることが示唆されている。この理由のために、連続するランダム化配列を用いるＳＥＬＥＸＴＭ手順を、約２０〜５０ヌクレオチドのランダム化されたセグメントを含む核酸配列を用いて開始することが、しばしば好まれる。
【００８９】
基本的なＳＥＬＥＸＴＭ法が、多数の特定の目的を達成するために、改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭを使用して、特定の構造的特徴（例えば、ベント（ｂｅｎｔ）ＤＮＡ）を有する核酸分子を選択することを記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子を、結合および／または光架橋および／または光不活性化し得る光反応性基を含む核酸リガンドの選択のためのＳＥＬＥＸＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許出願第０８／７９２，０７５号（１９９７年１月３１日出願；発明の名称「Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ」）は、標的分子に対して、高親和性を有するオリゴヌクレオチドと、低親和性を有するオリゴヌクレオチドとの分配を高効率で達成するＳＥＬＥＸＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，４９６，９３７号は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを実行した後に、改善された核酸リガンドを得る方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、リガンドのその標的への共有結合のための方法を記載する。これらの特許および出願の各々が、具体的に、本明細書において、参考として援用される。
【００９０】
ＳＥＬＥＸＴＭを使用して、標的の１つより多い部位、および標的の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドに結合する核酸を得ることができる。
【００９１】
カウンターＳＥＬＥＸＴＭ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）は、核酸リガンド配列が１つ以上の非標的分子と架橋することを排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターＳＥＬＥＸＴＭは、以下の工程を含む：ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；ｂ）候補混合物を、標的と接触させる工程であって、ここで、候補混合物と比較して、標的に対して増加した親和性を有する核酸が、候補混合物の残りから分配され得る、工程；ｃ）増加した親和性の核酸を、候補混合物の残りから分配する工程；ｄ）増加した親和性の核酸を、１つ以上の非標的分子と接触させ、その結果、非標的分子について特異的親和性を有する核酸リガンドが除去される、工程；およびｅ）標的分子に対して特異的親和性を有する核酸を増加して、標的分子に対する結合について、比較的高い親和性および特異性を有する核酸配列について富化された核酸の混合物を生じる工程。
【００９２】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分が、オリゴヌクレオチド集団の全ての分子に共有される配列を含む、少なくとも１つの固定された配列によって、隣接される。固定された配列としては、ＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６など）、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡ鎖またはポリＴ鎖）、触媒コア（以下にさらに記載される）、親和性カラムへの選択的結合部位、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にする他の配列が挙げられる。
【００９３】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドのランダム化された配列部分は、約１５〜７０（例えば、３０〜４０）ヌクレオチド長であり、そして、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから合成され得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｆｔ．２７．５５７５−５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法（Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８））のような液相方法を使用して、合成され得る。代表的な合成は、１０１５〜１０１７の分子を生じる、自動化ＤＮＡ合成装置において行われ。配列設計中の十分に大きなランダム配列の領域は、各合成された分子が独特の配列を表す可能性を高める。
【００９４】
ランダム化された配列を合成するために、全ての４ヌクレオチドの混合物が、合成プロセスの間の各ヌクレオチド添加工程において、添加され、ヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含むが、他の実施形態においては、ランダムなオリゴヌクレオチドは、ランダムでない配列、または部分的にランダムな配列の部分を含み得る。部分的にランダムな１５配列を、各添加工程において、異なるモル比で４つのヌクレオチドを添加することによって、生成し得る。
【００９５】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、リガンドに対して改善された特徴（例えば、改善されたインビボでの安定性、または改善された送達特徴）を与える修飾されたヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例としては、リボースの位置および／またはホスフェートの位置および／または塩基の位置における化学的置換が挙げられる。修飾されたヌクレオチドを含む、ＳＥＬＥＸＴＭで同定された核酸リガンドは、ピリミジンの５’位および２’位において化学的に修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第５，６６０，９８５号に記載される。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’フルオロ−（２’−Ｆ）、および／または、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換を用いて修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する。
【００９６】
ＳＥＬＥＸＴＭ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および同第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドと、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位とを組み合わせることを包含する。ＳＥＬＥＸＴＭ法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されるように、選択された核酸リガンドと脂肪親和性または非免疫原性の高分子化合物を診断または治療複合体中で組み合わせることを包含する。
【００９７】
診断または治療複合体中で、脂肪親和性化合物（例えば、ジアシルグリセロルまたはジアルキルグリセロル）と会合したＳＥＬＥＸＴＭで同定された核酸リガンドが、米国特許第５，８５９，２２８号に記載される。脂肪親和性化合物（例えば、グリセロル脂質）、または非免疫原性高分子化合物（例えば、ポリアルキレングリコール）と会合した核酸リガンドはさらに、米国特許第６，５０１，６９８号に記載される。ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８４８０もまた参照のこと。これらの特許および特許出願は、他の分子の所望される特性を有するオリゴヌクレオチドの、形態および他の特性の広範なアレイ、ならびに効率的な増幅および複製特性の組み合わせを可能にする。
【００９８】
ＳＥＬＥＸＴＭ法を介した、小さな柔軟なペプチドに対する核酸リガンドの同定が、探求されている。小ペプチドは、柔軟な構造を有し、そして通常、溶液中で、複数の配座異性体の平衡で存在し、従って、最初は、結合親和性は、柔軟なペプチドの結合の際に失われるコンフォメーションのエントロピーによって限定され得ると考えられていた。しかし、溶液中の小さな１６ペプチドに対する核酸リガンドの同定の実現可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号において実証された。この特許において、１１アミノ酸ペプチドであるサブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【００９９】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、修飾したオリゴヌクレオチドを使用して、そして１つ以上の置換ヌクレオチド間結合、改変糖、改変塩基、またはこれらの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、  ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）あるいはＹ−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）（ここで、ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは置換アルキルもしくは非置換アルキルである）によって置換されたものが提供される。結合基が、−Ｎ−または−Ｓ−結合を通じて、隣接するヌクレオチドに付着し得る。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。
【０１００】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖基（例えば、１つ以上の水酸基がハロゲン、脂肪族基と置換されているか、またはエーテルまたはアミンとして官能性を持たされている）を含む。１つの実施形態において、フラノース残基の２’−位を、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル、またはハロ基で置換する。２’−修飾糖の合成方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載される。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子の使用は、置換されていないリボオリゴヌクレオチドまたはデオキシリボオリゴヌクレオチドを用いて生成されるアプタマーと比較して、１０倍から１００倍、標的分子についてのアプタマーの感受性を増加し（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））、標的分子とのさらなる結合相互作用を提供し、そしてアプタマーの二次構造の安定性を増加する（（Ｋｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；  Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：６８−７３（１９９７））。
【０１０１】
核酸アプタマー分子は、一般に、５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態において、不均一性が、最初の選択段階において導入され、そして、複製プロセスを通じて生じない。
【０１０２】
ＤＮＡ配列の開始ライブラリーは、自動化化学合成またはＤＮＡ合成機によって、生成される。この配列のライブラリーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに転写され、そして精製される。１つの例において、５’−固定：ランダム３’−固定の１７配列が、３０〜５０ヌクレオチドを有するランダムな配列から分離される。あるいは、開始ライブラリーはまた、ＲＮＡ合成機において合成されたＲＮＡ配列であり得る。
【０１０３】
莫大なアプタマー候補の中から分類して、所望の分子を見出すことは、複雑な配列プールから開始し、これによって、所望のアプタマーが、インビトロ選択プロセスの反復を通して、単離される。選択プロセスは、非特異的なタイプの夾雑物および結合しない夾雑物の両方を除去する。以下の増幅段階において、生き残った配列の数千のコピーが生成され、次の段階の選択を可能にする。増幅の間、ランダム配列をコピーされた分子に導入し得る−この「遺伝子ノイズ」は、機能的な核酸アプタマー分子が、進化し続け、そしてなおより良好なアプタマーになることを可能にする。実験全体は、プールの複雑度を、１０１７分子から、詳細な特徴付けを必要とする約１００アプタマー候補にまで、減少する。
【０１０４】
アプタマー選択は、オリゴヌクレオチドの溶液を、標的分子を含むカラムに通すことによって達成される。標的に結合し得る分子を含むフロースルーが捨てられる。カラムを洗浄し、そして洗浄溶液を捨てる。次に、カラムに結合したオリゴヌクレオチドを、特異的に溶出し、逆転写し、ＰＣＲ（または、他の適切な増幅技術）によって増幅し、ＲＮＡに転写し、次に、選択カラムに再度アプライする。標的結合において富化されたアプタマーのプールが得られるまで、連続する回のカラムへの添加が、行われる。
【０１０５】
選択プロセスの間、ネガティブ選択工程もまた、実行し得る。そのような選択工程の添加は、所望の標的に加えて、標的に結合するアプタマーを除去するにおいて有用である。さらに、標的カラムが、不純物を含むことが既知でる場合、ネガティブ選択工程を実行して、不純物に選択的に結合するか、または不純物と所望の標的に選択的に結合するアプタマーを結合プールから除去し得る。例えば、所望の標的が公知である場合、密接に関連した分子またはアナログに結合するアプタマーを除去することに、注意をはらわなけらばならない。ネガティブ選択工程の例としては、例えば、緩衝液中のアナログを用いるカラム洗浄工程の取り込み、または標的選択カラムの前のアナログカラムの添加が挙げられる（例えば、アナログカラムからのフロースルーは、アナログに結合しないアプタマーを含む）。
【０１０６】
選択の完了後、標的特異的アプタマーが、ＤＮＡに逆転写され、クローニングされ、そして増幅される。
【０１０７】
アプタマーは、さらに、例えば、ＷＯ００／７０３２９に記載されるように、アプタマービーコンを含む。この公報は、アプタマービーコンを用いて、サンプル中の１つ以上の異なる化合物の存在および量を、同時に検出するための、組成物、システム、および方法を開示する。アプタマービーコンは、非ヌクレオチド標的分子（例えば、タンパク質、ステロイド、無機分子）に結合し得る結合領域を有する。異なる標的分子に結合するように構成された結合領域を有する新規のアプタマービーコンを、溶液ベースおよび固体の、アレイベースのシステムにおいて使用し得る。アプタマービーコンは、固相（例えば、二次元アレイ中の異なる所定の点）に付着され得る。
【０１０８】
（核酸センサー分子（ＮＡＳＭ））
核酸センサー分子は、標的認識ドメイン、触媒ドメイン、および、必要に応じて、
触媒ドメインを連結するリンカードメインを含む核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）である。従って、ＮＡＳＭとしては、その活性が特異的標的の存在によって、スイッチがオンまたはオフとなるアロステリックリボザイムが挙げられる。アロステリックリボザイムは、直接、分子の検出と化学反応の誘発とを共役させるレポーター分子として作用し得る。これらはまた、標的分子特異的であるが、これらは、アプタマーとほとんど同様の様式（例えば、毒素を標的に送達すること）において使用され得る。単一分子におけるこれら特徴の組み合わせは、これらを、広範な適用における強力なツールとする。
【０１０９】
本発明の組成物および方法における使用のために適切な核酸センサー分子が、例えば、ＷＯ０３／０１４３７５に記載される（本明細書において、参考として援用される）。
【０１１０】
核酸ベースの検出スキームは、いくつかの核酸（例えば、リボザイム）の、リガンドに感受性の触媒特性を利用する。リボザイム−ベースの核酸センサー分子は、操作によって、およびインビトロでの選択方法によって、設計されている。いくつかの操作方法は、例えば、二本鎖リンカーまたは部分的に二本鎖のリンカーを用いて、単純に個々の標的調節ドメインと触媒ドメインとを結合することによって、分子認識とシグナル伝達を共役させることによって、核酸のモジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）性質を利用する。例えば、ＡＴＰセンサーが、以前に選択されたＡＴＰ−選択配列を、ハンマーヘッド由来のセンサーとして、自己切断するハンマーヘッドリボザイムに対して添加するか（Ｔａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：４５３−４５９（１９９７））、またはリガーゼ由来のセンサーとして、Ｌ１自己連結リボザイムに添加すること（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１７５１−１７５９（２０００））によって、作製されている（例えば、Ｓａｓｓａｎｆａｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：５５０−５５３（１９９３）を参照のこと）。ヘアピン由来のセンサーもまた、意図される。一般に、標的調節ドメインは、標的分子を認識する三次元構造を作製するのに十分な、最小数のヌクレオチドによって、規定される。
【０１１１】
ランダム化オリゴヌクレオチドのプールまたは部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチドのプールから、標的分子感受性触媒活性（例えば、自己切断）を有する触媒核酸センサー分子（ＮＡＳＭ）が、選択される。触媒性ＮＡＳＭは、標的分子、および標的分子の標的調節ドメイン認識によって誘導される触媒反応を媒介するための触媒ドメインを認識する標的調節ドメインを有する。標的調節ドメインによる標的分子の認識は核酸センサー分子のコンフォメーション変化および／または触媒活性の変化を誘発する。１つの実施形態において、少なくとも触媒ドメインの一部を修飾すること（例えば、除去すること）、およびそれを、光学的シグナル生成ユニットと結合させることによって、その光学的特性が標的調節ドメインによる標的分子の認識の際に変化する光学的核酸センサー分子が生成される。１つの実施形態において、ランダム化されたオリゴヌクレオチドのプールは、リボザイムの触媒部位を含む。
【０１１２】
ランダム化された配列を含むオリゴヌクレオチド分子の不均一な集団をスクリーニングして、標的分子との相互作用の際に修飾される（例えば、活性化される）触媒活性を有する核酸センサー分子を同定する。アプタマー核酸を用いる場合、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合したＲＮＡ／ＤＮＡであり得、そして修飾ヌクレオチドもしくは非天然ヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログを含み得る。
【０１１３】
集団中の各オリゴヌクレオチドは、ランダム配列を含み、そして、少なくとも１つの固定化された配列を、その５’および／または３’末端に含む。１つの実施形態において、集団は、固定化した配列として、特定の標的に特異的に結合することが公知のアプタマー、およびランダム化されたオリゴヌクレオチド配列によって連結された触媒性リボザイムまたはリボザイムの触媒部位を含むオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、固定された配列は、化学反応を触媒し得るオリゴヌクレオチド分子（例えば、リボザイム）の触媒部位の少なくとも一部を含む。
【０１１４】
触媒部位は、当該分野において周知であり、そして、例えば、ハンマーヘッドリボザイムの触媒コア（例えば、米国特許第５，７６７，２６３号；米国特許第５，７００，９２３号を参照のこと）、またはヘアピンリボザイム（例えば、米国特許第５，６３１，３５９号を参照のこと）を含む。他の触媒部位は、米国特許第６，０６３，５６６号；Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５−２８８（１９８８）；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９（１９８８）；ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−４９３３  （１９８９）；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：５９６−６００（１９８７）；ならびにＦｅｄｏｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６６８−１６７２（１９９０）に開示される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、部分的にランダム化されたオリゴヌクレオチドの集団が、ランダム化されたオリゴヌクレオチドに結合した公知のアプタマーおよびリボザイム配列から生成される。このプールのほとんどの分子は、機能的ではないが、ごく少数が、所定の標的に応答し、そして核酸センサー分子として有用である。触媒性ＮＡＳＭが、上記の繰り返しプロセスによって単離される。全ての実施形態において、増幅の間、ランダムな変異を、コピーされた分子に導入し得、この「遺伝子ノイズ」は、機能的なＮＡＳＭが連続して進化し、標的に活性化された分子として、なおさらにより良好なアプタマーになることを可能にする。
【０１１６】
別の実施形態において、集団は、触媒性リボザイムである固定された配列に連結するランダム化オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、ここで、リボザイムの触媒部位、または、オリゴヌクレオチド分子（例えば、リボザイム）の触媒部位の少なくとも一部は、化学反応を触媒し得る。次に、他の分子の存在下、または標的の非存在下における活性と比較した場合に、標的分子の認識に際して、触媒活性を示すか、または増強された触媒を示す分子についての、複数回（複数サイクル）の選択において、オリゴヌクレオチドの開始集団を、スクリーニングする。
【０１１７】
インビトロ選択（例えば、上記の選択）を通して同定された核酸センサー分子は、標的調節ドメイン（すなわち、標的分子を認識し、そして分子認識事象を検出可能なシグナルの生成に変換するドメイン）と結合した触媒ドメイン（すなわち、シグナル生成部分）を含む。さらに、本発明の核酸センサー分子は、分子認識のエネルギーを用いて、核酸センサー分子の触媒特性またはコンフォメーション特性を調節する。
【０１１８】
核酸センサー分子は、一般に、５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態において、最初の選択段階においてのみ不均一性が導入され、そして複製プロセスを通して、不均一性は生じない。図２は、標的分子で活性化し得るリガーゼ活性を含む核酸センサー分子についてのオリゴヌクレオチド集団のスクリーニングの、模式図を示す。図３は、ハンマーヘッド核酸センサー分子選択の方法論を示す。これら方法の各々は、他の触媒活性を有するＮＡＳＭの選択のために、容易に修飾される。
【０１１９】
さらなる手順（予備スクリーニング、ネガティブ選択、などが挙げられる）を、種々の選択スキームに組み込み得る。例えば、選択実験から単離された個々のクローンを、予備スクリーニングとして、標的を枯渇した抽出物の存在下におけるアロステリック活性化について、初期に試験し、そして、内在性の非特異的活性化に応答する分子を、標的によって調節されるＮＡＳＭとしてのさらなる考慮から除外し；全ての単離されたＮＡＳＭが、標的を枯渇した抽出物によって活性化される程度まで、枯渇した抽出物を、選択プロセスのネガティブ選択工程に含ませ；市販のＲＮａｓｅインヒビターおよび競合するＲＮａｓｅ基質（例えば、ｔＲＮＡ）を、試験サンプルに添加して、ヌクレアーゼを阻害し得るか；またはヌクレアーゼの存在下において選択を行うことによって（例えば、ネガティブ選択工程の間に枯渇した抽出物を含ませることによって）、実験を、本質的に、分解に耐性な分子に好都合にし；ＲＮＡを高度にヌクレアーゼ耐性にし得るような、ＲＮＡの共有的修飾を実行して（例えば、２’−Ｏ−メチル化）、生物学的サンプル中に存在する非特異的切断を最小化し得る（例えば、Ｕｓｍａｎら、（Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１１９７〜２０２（２０００））を参照のこと）。
【０１２０】
１つの実施形態において、同定された生物学的活性（例えば、公知の酵素活性、レセプター活性、または公知の構造的役割）を有する分子を含む標的分子によって活性化される核酸センサー分子を、選択する；しかし、別の実施形態において、標的分子の少なくとも１つの生物学的活性は、未知である（例えば、標的分子は、ＥＳＴ配列のオープンリーディングフレームから発現するポリペプチドであるか、または推定されたオープンリーディングフレームに基づいて合成された特徴付けされていないポリペプチドであるか、または機能が未知である精製されたタンパク質もしくは半ば精製されたタンパク質である）。
【０１２１】
１つの実施形態において、標的分子は、天然には核酸に結合しないが、別の実施形態においては、標的分子は、核酸リガンドに配列特異的に結合も、非特異的様式において結合もしない。さらなる実施形態において、複数の標的分子は、核酸センサー分子に結合する。複数の標的分子に対して特異的に応答する（すなわち、複数の標的の内の、単一の標的によって活性化されない）ＮＡＳＭについての選択は、標的分子のサブセットが提供される少なくとも２つのネガティブ選択工程を含むことによって、達成され得る。修飾された標的分子に特異的に結合するが、密接に関連する標的分子に結合しない核酸センサー分子が、選択され得る。分子の立体化学的に異なる種もまた、標的とされ得る。
【０１２２】
（毒素）
本発明において有用な毒素としては、細胞障害効果を有するケモトキシンが挙げられる。これらは、その作用態様によって、分類され得る：１）チューブリン安定剤／不安定化剤；２）抗代謝剤；３）プリン合成インヒビター；４）ヌクレオシドアナログ；および５）ＤＮＡアルキル化剤またはＤＮＡ修飾剤。放射性同位元素もまた、本発明において有用な細胞障害性効果を有する。
【０１２３】
適切な毒素の例としては、例えば、化学治療剤が挙げられる。化学治療剤は、代表的には、化学合成によって産生された小さな化学的実体であり、細胞障害性薬物、細胞増殖抑制性薬物、ならびに、他の方法（例えば、形質転換した状態の分化した状態への逆転、または細胞の複製を阻害する方法）において細胞に影響する化合物が挙げられる。化学治療剤の例としては、メトトレキセート（アメトプテリン）、ドキソルビシ（アドリマイシン）、ダウノルビシン、シトシンアラビノシド、エトポシド、５−４フルオロウラシル、メルファラン、クロラムブシル、および他のナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド）、シスプラチン、ビンデシン（および他のビンカアルカロイド類）、マイトマイシンおよびブレオマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
毒素としては、種々の生物（細菌、植物など）の複合体毒素産物が挙げられ得る。毒素の例としては：リシン、リシンＡ鎖（リシン毒素）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ウシすい臓リボヌクレアーゼ（ＢＰＲ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、アブリン、アブリンＡ鎖（アブリン毒素）、コブラ毒液因子（ＣＶＦ）、ゲロニン（ＧＥＬ）、サポリン（ｓｐｏｒｉｎ（ＳＡＰ））、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）およびフォルケンシン（ｖｏｌｋｅｎｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質毒素は、本発明のペプチドを含む融合タンパク質として、組換えＤＮＡ技術を用いて産生され得る。タンパク質毒素はまた、非ペプチジル結合によって、本発明の化合物と結合体化され得る。さらに、光増感剤およびサイトカインもまた、本発明において使用し得る。
【０１２５】
本発明において使用し得る細胞障害性分子は、細胞障害剤のアントラサイクリンファミリー（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ））である。ドキソルビシンは、アントラサイクリン部分のインターカレーション、金属イオン、キレート化、またはフリーラジカルの生成によって、ＤＮＡを損傷する。ＤＯＸは、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害することが示されている。ドキソルビシンは、広範な活性のスペクトルおよび毒性の副作用（両方が、用量依存性であり、予測可能である）を有することが、臨床において示されており、これら両者は、用量に関連し、そして予測可能である。ＤＯＸの効力は、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）および心臓毒性（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に限定される。標的化部分（例えば、アプタマー）との錯体は、腫瘍内の蓄積を増加する一方で、全身での曝露を減少する。
【０１２６】
マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）は、非常に毒性の化学治療分子であり、本発明の治療的部分として使用され得る。マイタンシノイドは、チューブリンの重合を阻害し、それによって、細胞の分裂および増殖を阻害することによって、その細胞障害性を発揮する。マイタンシノイド誘導体ＤＭ１は、ジスルフィドリンカー化学を介して、他の標的部分（例えば、ＭＵＣ−１に対するマウスＩｇＧ１  ｍＡｂ）、および内在化する抗ＰＳＭＡマウスモノクローナル抗体８Ｄ１１（ｍＡｂ））と結合体化されている。
【０１２７】
エネダイン（Ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ）は、本発明の治療剤として使用され得る別のクラスの細胞障害分子である。エネダインは、非常に低い薬物濃度において、二重鎖ＤＮＡ切断を生じることによって、細胞障害性を発揮する。エネダインのクラスの化合物としては、カリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎｓ）、ケダルシジン（ｋｅｄａｒｃｉｄｉｎ）、および、マズロペプチン（ｍａｄｕｒｏｐｅｐｔｉｎ）が挙げられる。これら化合物の連結化学としては、例えば、カリチアマイシンのヒドラジド誘導体との反応後の炭水化物残基の過ヨウ素酸酸化が挙げられる。これら結合体は、標的部分（例えば、モノクローナル抗体）に対する、酸に不安定なヒドラゾン結合を利用して、リソソームへのインターナライゼーション後の加水分解を確実にし、そして、カリチアマイシンに対する立体的に保護されたジスルフィド結合が、循環中に安定性を増す。
【０１２８】
腫瘍治療としてはまた、放射性核種、特に、高エネルギーのα粒子放出体が挙げられる。α粒子は、強力であるが、なお選択的な細胞障害性であり得る、高エネルギーの高い線エネルギー付与（ＬＥＴ）ヘリウム核である。約１００の放射性核種が、α放出に伴って、崩壊する。α粒子を放出する１つの原子は、１つの細胞に対して、致死性の細胞障害性を有し得る。ｍＡｂに対する放射性核種の結合体が、白血病および前立腺癌の臨床前モデルにおいて、使用されており、そしてフェーズＩの臨床試験が、悪性グリオーマに対する２１１Ａｔで標識された抗テナシンｍＡｂを用いて、行われている。
【０１２９】
放射性同位元素は、本発明の化合物に結合体化され得る。放射線治療において有用な放射性同位元素の例としては、例えば、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉが挙げられる。いくつかのα粒子を放出する放射性同位元素は、ほとんどの腫瘍に対して治療的に有効であるには、あまりにも短い半減期を示す。例えば、２１３Ｂｉは、４６分の半減期を有し、このことは、最も接近可能な癌細胞に対してのみに、その効力が限定され、そして、時期を得た出荷および投与のような実際的な障害を課する。別の放射性同位元素である２２５Ａｃは、放射線治療により適切である。なぜなら、各２２５Ａｃ原子は、いくつかの娘原子に崩壊し、その４つもまた、α粒子を放射するからである。
【０１３０】
（毒素に対する核酸（アプタマーおよび／またはＮＡＳＭ）の付着）
本発明は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞または新脈管構造）に局在化する標的化部分（ここで、この標的化分子は、標的細胞に対して細胞障害性効果を発揮する治療的部分と結合されている）からなる二官能性の分子を産生する材料および方法を提供する。本発明は、核酸標的化部分、および治療剤（例えば、細胞障害剤（小有機分子）、放射性核種、植物および細菌毒素、酵素、光増感剤、およびサイトカイン）を提供する。
【０１３１】
本発明の核酸標的化部分は、当該分野において公知の方法を用いて、治療的部分（例えば、毒素）と付着され得る。例えば、核酸リガンドにさらなる機能を提供するために添加される機能的単位から構成される、ブレンドされた核酸リガンドの生成方法は、米国特許第５，６８３，８６７号、米国特許第６，０８３，６９６号、および米国特許第５，７０５，３３７号に記載される。後者の特許は、目的の標的と共有結合的に相互作用し得る核酸リガンドの同定方法を開示する。核酸は、種々の機能的単位と会合し得る。この方法はまた、核酸（その会合した機能性単位を含む）とその標的との間の共有結合の形成を促進するその能力によって測定されるような促進活性を有する核酸の同定を可能にする、
（細胞障害剤−小有機分子連結化学）
本発明の核酸アプタマーとカルボン酸基を含む低分子細胞障害剤とを連結するために、後者を、従来の合成有機化学反応によってアミン反応性プローブ（例えば、ＮＨＳエステル）に置換し、次に、アミンオリゴヌクレオチドアプタマーに結合する。アミン含有低分子は、活性化されたオリゴ（例えば、Ｇｌｅｎ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｕｌｌｅｔｉｎに従う、５’−カルボキシ−修飾因子Ｃ１０（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に結合され得る。あるいは、アミンオリゴは、インサイチュで、架橋試薬（ＤＳＳ、ＢＳ３または関連する試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない）によって、活性化され、そしてさらに、アミンと結合され得る。
【０１３２】
チオールを含む低分子を、２，２−ジチオ−ビスピリジン活性化チオールを含むアプタマーまたはＳＰＤＰ−活性化（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）アミンオリゴと結合し得る。
【０１３３】
好ましくは、カルボン酸塩、アミン、またはチオール基を含まない低分子は、当業者に公知の方法によって、従来の合成有機化学によって、そのように変換される。
【０１３４】
さらに、カプセル化された（例えば、リポソーム中）細胞傷害剤はまた、当該分野においてリポソームを反応性部分（例えば、活性化オリゴヌクレオチド）に連結するために使用される、酸に不安定なリンカー、酵素切断可能なリンカーを用いて、アプタマーまたはＮＡＳＭに連結され得る。
【０１３５】
酸に不安定なリンカーとしては、例示てきではあるが、非限定的に、アントラサイクリン、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、またはダウノルビシン（ＤＮＲ）を、いくつかのｍＡｂ（例えば、抗メラノーマｍＡｂ  ９．９２７）のような免疫結合体に対して連結するために使用され；リソゾームの環境中へ放出された細胞障害剤を生じる、シス−アコニチルリンカーが挙げられる。
【０１３６】
ＤＮＲ、モルホリノ−ＤＯＸを含む低分子細胞障害剤を、抗−αｖβ３  ｍＡｂ  ＬＭ６０９、および抗Ｌｅｙ  ｍＡｂ  ＢＲ９６に結合させるために、ヒドラゾンリンカーが使用される。これらのヒドラゾンリンカーは、ｐＨ４で酸に不安定である。他の酸感受性のアントラサイクリン結合体が、Ｃ−１３カルボニル基の修飾を通して得られ、アシルヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンおよびオキシムを生じる。
【０１３７】
（細胞障害剤−ペプチド（合成）連結化学）
ペプチド細胞障害剤の場合において、合成ペプチドの結合方法は、アミン−オリゴに結合する、ペプチドのアミン反応性活性化エステル（例えば、ＮＨＳ）の合成（アミンオリゴへの結合）を含む。
【０１３８】
ペプチド細胞障害性部分の本発明の標的部分への、別の連結方法としてはまた、細胞障害性ペプチド部分と、特別のＣ末端またはＮ末端システインの合成が挙げられる。これは、２，２−ジチオ−ビスピリジンを用いて活性化され得、そして、チオール修飾されたアプタマーオリゴと結合される（標準的な自動化合成、最終的なチオール修飾因子との結合［Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ］）。あるいは、チオール−修飾アプタマーは、２，２−ジチオ−ビスピリジンによって活性化され、そしてｃｙｃ−ペプチドに結合される。最後に、アミノで終結するオリゴを、ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて活性化し、そして、ｃｙｓ含有ペプチドと結合し得る。これら３つの全ての方法は、ジスルフィド結合を通して結合した結合体を生成する。
【０１３９】
ペプチド細胞障害性部分を本発明の標的部分と連結する別の方法はまた、マレイミド試薬（例えば、ＧＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））とアミノ−オリゴからなる標的化部分の修飾、およびその後のｃｙｓペプチドとの結合を含む。
【０１４０】
ペプチド細胞障害性部分を本発明の標的部分と連結する別の方法はまた、５’−カルボキシ−修飾因子Ｃ１０（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で修飾されたオリゴからなる標的化部分の合成、および、当該分野で公知の方法に従う、インサイチュでのアミン含有分子（例えば、ペプチド）との結合を含む。
【０１４１】
ペプチド細胞障害性部分を本発明の標的化部分と連結する別の方法はまた、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて３’−リボの末端を有するオリゴを酸化し、そして還元試薬存在下でアミンペプチドと反応したアルデヒドを生じることを含む。さらに、還元試薬を用いなくても、Ｃ−末端ペプチドヒドラジドを、酸化したＲＮＡと結合し得る。
【０１４２】
（細胞障害剤−タンパク質連結化学）
本発明の細胞障害性タンパク質部分を、本発明の標的化部分と連結する方法は、原則として、ペプチドを連結するために使用した方法と同一である。
【０１４３】
本発明のタンパク質細胞障害性タンパク質部分を連結する方法は、例えば、ＳＰＤＰまたはＧＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いるアミノ末端を有するオリゴからなる本発明の標的化部分の活性化、または２，２−ジチオ−ビスピリジンを用いるチオール−オリゴからなる本発明の標的化部分の活性化、およびｃｙｓ−含有タンパク質への結合を含む。
【０１４４】
本発明の細胞障害性タンパク質部分を、本発明の標的化部分と結合する別の方法は、架橋試薬（ＤＳＳ、ＢＳ３または関連する試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））を用いる、タンパク質アミンのアミン含有オリゴへの結合を含む。
（放射性同位元素の細胞障害性部分の連結化学）
放射活性金属イオン（例えば、Ｔｃ、Ｙ、Ｂｉ、Ａｃ、Ｃｕなどの同位体）からなる本発明の細胞障害性部分の、本発明の標的化部分への連結方法は、適切なリガンド（例えば、ＤＯＴＡ（Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，１３，１１７８））を用いるキレート化を含む。一般的な標識スキームは、５’−アミノ−修飾したアプタマーオリゴ（標準的な自動化合成、最終的なアミノ修飾因子との結合［Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ］）の合成で開始する。次に、キレート剤を、アミン反応性の活性化エステルに変換し、そして、次に、Ｌｅｗｉｓらに記載される方法と類似の方法で、オリゴに結合する。
【０１４５】
本発明の放射性核種の細胞障害性部分を、本発明の標的化部分と連結する別の方法は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて３’−リボの末端を有するオリゴを酸化し、そして還元試薬存在下でアミン含有キレート剤または放射性標識と反応したアルデヒドを生じることを含む。あるいは、キレート剤または放射性標識のヒドラジン誘導体、ヒドラジド誘導体、セミカルバジド誘導体、およびチオセミカルバジド誘導体を用いることができる。
【０１４６】
核酸を非核酸分子に付着するさらなる方法は、例えば、ＷＯ００／７０３２９に記載されている。この公報は、アプタマービーコンを用いて、サンプル中の１つ以上の異なる化合物の存在または量を同時に検出するための、組成物、システム、および方法を開示する。アプタマービーコンは、非ヌクレオチド標的分子（例えば、タンパク質、ステロイド、または無機分子）に結合し得る結合領域を有するオリゴヌクレオチドである。異なる標的分子に結合するように構成された結合領域を有する新規のアプタマービーコンを、溶液ベースのシステム、および固相のアレイベースのシステムにおいて使用し得る。これらのアプタマービーコンは、固相支持体に（例えば、二次元アレイにおける異なる所定の点で）付着し得る。
【０１４７】
（薬学的組成物）
本発明はまた、アプタマー−毒素分子を含む薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、内部の使用に適切であり、そして、薬理学的に活性な本発明の化合物の有効量を含み、単独で、または、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせられる。これら化合物は、毒性があったとしても、それらは非常に低いという点において、特に有用である。
【０１４８】
実際に、化合物またはその薬学的に受容可能な塩は、所望の細胞の溶解を誘導するのに十分な量において、投与される。
【０１４９】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態における経口投与のために、活性薬物成分を、経口の、非毒性の薬学的に受容可能な不活性なキャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と組み合わせられ得る。さらに、所望される場合、または必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた、混合物中に取り込まれ得る。適切な結合剤は、スターチ、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、スターチペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβラクトース、穀物の甘味料、天然および合成のゴム（例えば、アラビアゴム）、トラガカントゴム、またはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの投薬形態において用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩またはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、限定されることはないが、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムスターチ、アガー、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性の混合物などが挙げられる。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
注射可能な組成物は、好ましくは水性の等張液または懸濁液であり、そして坐剤が、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。組成物は、滅菌され得るか、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤）、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング方法にそれぞれ従って調製され、そして活性成分の約０．１％から７５％、好ましくは約１％から５０％を含む。
【０１５１】
本発明の化合物はまた、時間を限定した放出性の（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）または徐放性の錠剤またはカプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ、およびエマルジョンとして経口投薬形態において投与され得る。
【０１５２】
液体、特に注入可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、など）に溶解されるか、混合され、それによって、注入可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注入前に液体に溶解するために適切な固体形態が、処方され得る。注入可能な組成物は、好ましくは、水性の等張液または懸濁液である。組成物は、滅菌され得るか、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤）、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。
【０１５３】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスおよび注入）、腹腔内、皮下または筋肉内の形態において投与され得、これらの全ては、薬学の分野の当業者に周知の形態を用いる。注入可能な薬剤は、従来の形態（液体溶液または懸濁液のいずれか）において調製され得る。
【０１５４】
非経口注入可能な投与は、一般に、皮下、筋肉内、または静脈内の注射または注入に使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書において参考として援用される）に従う一定レベルの投薬を確実にする遅延放出性または徐放性システムが維持される移植物を用いる。
【０１５５】
さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局部的使用を介する鼻腔内形態においてか、または経皮経路を介した、当該分野で当業者に周知の経皮パッチの形態を用いて、投与され得る。経皮送達システムの形態において投与するために、投薬の投与は、当然、投薬レジメを通じて、断続的というよりはむしと、連続的である。他の好ましい局所的調製物としては、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレイおよびジェルが挙げられ、活性成分の濃度は、０．０１％から１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）である。
【０１５６】
固形組成物のために、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなど含む賦形剤を使用し得る。上記に規定される活性化合物はまた、キャリアとしての、例えば、ポリエチレングリコール、例えば、プロピレングリコールを使用する坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪酸エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。
【０１５７】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達システムの形態において（例えば、小さな単膜小胞、大きな単膜小胞、多重膜小胞として）投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（コレステロール、ステアリルアミン、ホスファチジルコリンを含む）の形態で形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムが、薬物の水溶液で水和され、薬物をカプセル化する脂質層を形成する（例えば、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されている）。例えば、本明細書に記載されるアプタマー−毒素および／またはＮＡＳＭ分子は、親油性化合物または非免疫原性の、当該分野で公知の方法を使用して構築された、高分子量化合物を有する複合体として、提供され得る。核酸に会合した複合体の例が、米国特許第６，０１１，０２０号に記載される
本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとしての可溶性のポリマーと結合され得る。そのようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミデフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、またはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御された放出を達成するにおいて有用な生分解性ポリマー（例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋されたブロックコポリマーか、またはその両親媒性ブロックコポリマー）のクラスと結合され得る。
【０１５８】
所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、少量の非毒性の補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。
【０１５９】
これらの化合物を用いる投薬養生法は、種々の因子（患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；処置される状態の重篤度；投与の経路；患者の腎機能および肝機能；使用される特定の化合物またはその塩）に従って選択される。通常のレベルの医師または獣医は、状態の予防、反撃、または進行の停止をするために必要とされる薬物の有効量を、容易に決定または処方できる。
【０１６０】
本発明の経口投薬量は、示された効果のために使用される場合、約０．０５から１０００ｍｇ／日の経口での範囲である。組成物は、好ましくは、スコアされる錠剤で、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０および１０００．０ｍｇの活性成分を含む形態において提供される。本発明の化合物の効果的な血漿レベルは、１日あたり、１ｋｇの体重あたり、０．００２ｍｇから５０ｍｇの範囲である。
【０１６１】
本発明の化合物は、１日１回の投与で投与され得るか、または１日の総投薬量が、毎日２回、３回、または４回の投与に分割されて投与され得る。
【０１６２】
上記は、本発明を詳細に記載してきたが、当業者は、以下の実施例が、本発明の局面の実施形態の例示であることを理解する。当業者はまた、以下の実施例が本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではないことも、理解する。従って、本発明は、以下の例示的な記載によっては規定されず、その代わりに、添付の請求の範囲によって、規定される。
【実施例１】
【０１６３】
（ＰＤＧＦアプタマー−９０Ｙ結合体）
患者は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がマーカーであるか、または病原性において関連付けられる疾患の症状を示すとして同定される。ＰＤＧＦに特異的なアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法に従って生成されるか、および／または従来技術において同定される。そのようなアプタマーの例は、米国特許第５，７２３，５９４号に記載される（本明細書において参考として援用する）。アプタマーは、ホスホロアミダイト合成法を含む当該分野で当業者に公知の標準的な方法に従って合成され、その結果、アミン末端が、アプタマーに存在する。アミン誘導体化されたアプタマーを、次に、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）リンカー試薬と結合して、９０Ｙ放射性同位元素を、Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，１２，３２０−３２４に従って、誘導体化したＤＯＴＡアプタマー複合体にキレート化する。
【０１６４】
アプタマー−９０Ｙ結合体を、次に、被検体または患者に対して、被検体または患者における疾患状態を阻害する治療有効量において、投与する。
【実施例２】
【０１６５】
（ＰＤＧＦアプタマー−アリンＡペプチド結合体）
患者は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がマーカーであるか、または病原性において関連付けられる疾患の症状を示すとして同定される。ＰＤＧＦに特異的なアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法に従って生成されるか、および／または従来技術において同定される。そのようなアプタマーの例は、米国特許第５，７２３，５９４号に記載される（本明細書において参考として援用する）。アプタマーは、ホスホロアミダイト合成法を含む当該分野で当業者に公知の方法に従って合成される。オリゴヌクレオチド合成における最後の結合は、ＯＰｅＣＴＭ試薬ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いてなされる。このことは、以下のＳｔｅｔｓｅｎｋｏら、Ｎｅｗ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ（２０００）１９，１７５１−１７６４の方法に従って、行われる。細胞障害性ペプチドを、ペンタフルオロフェニルＳ−ベンジルスクシネート（標準的なＦｍｏｃ−べースの固相ペプチドアセンブリにおける最終結合工程におけるペプチド修飾試薬（ＰＭＲ））を用いる標準的な方法に従って合成する。反応性のアプタマーおよびアリンＡ細胞障害性ペプチドの結合は、Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏらに記載される方法によって、行われる。
【０１６６】
一旦、アプタマーペプチド結合体が、合成されると、治療的な結合体を、被検体または患者に対して、被検体または患者における疾患状態を処置する治療有効量において、投与する。ＰＤＧＦアプタマー標的化部分は、細胞障害性ペプチドを、標的細胞に密接に近接して運び、そしてこのペプチドは、その細胞障害性効果を、ＰＤＧＦマーカーを有する細胞に対して、発揮する。
【実施例３】
【０１６７】
（ＰＤＧＦアプタマー−タンパク質結合体）
患者は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がマーカーであるか、または病原性において関連付けられる疾患の症状を示すとして同定される。ＰＤＧＦに特異的なアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法に従って生成されるか、および／または従来技術において同定される。そのようなアプタマーの例は、米国特許第５，７２３，５９４号に記載される（本明細書において参考として援用する）。アプタマーは、ホスホロアミダイト合成法を含む当該分野で当業者に公知の方法に従って合成され、その結果、システイン反応性末端からのチオールが、結合されるべき修飾されたアプタマー中に存在する。このことは、Ｔｕｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，１１，６０５−６１８による方法に従ってなされる。システイン誘導体化アプタマーを、次に、修飾されたオリゴの−ＳＨ反応性末端と共有結合を形成する反応基を有する、ペプチド修飾試薬リンカーによって、細胞障害性タンパク質に結合する。これは、Ｔｕｎｇらに記載されるオリゴヌクレオチド−ペプチド結合体を生じる。
【０１６８】
一旦、治療的結合体が合成されると、治療的結合体を、被検体または患者に対して、被検体または患者における疾患状態を処置する治療有効量において、投与する。ＰＤＧＦアプタマー標的化部分は、細胞障害性タンパク質を、標的細胞に密接に近接して運び、そしてこのタンパク質は、その細胞障害性効果を、ＰＤＧＦマーカーを有する細胞に対して、発揮する。
【実施例４】
【０１６９】
（ＰＤＧＦアプタマー−ＤＮＲ／ＤＯＸケモトキシン有機分子結合体）
患者は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がマーカーであるか、または病原性において関連付けられる疾患の症状を示すとして同定される。ＰＤＧＦに特異的なアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭ法に従って生成されるか、および／または従来技術において同定される。そのようなアプタマーの例は、米国特許第５，７２３，５９４号に記載される（本明細書において参考として援用する）。アプタマーは、ヒドラジドホスホロアミダイト合成法を含む当該分野で当業者に公知の方法に従って合成され、その結果、カルボニル反応性末端が存在する。この方法は、Ｒａｄｄａｔｚら（Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｈｉｐ  ａｒｒａｙ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２  Ｎｏｖ  １：３０（２１）：４７９３−８０２）に記載される方法に従って、行われる。ヒドラジド誘導体アプタマーを、次に、Ｔｒａｉｌら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，（２００３）５２：３２８−３３７）（本明細書において参考として援用する）に従って、ＤＯＸまたはＤＮＲケモトキシン有機分子のカルボニル官能基に結合する。
【０１７０】
一旦、ＰＤＧＦアプタマー−ＤＯＸ／ＤＮＲ結合体が生成されると、治療的な結合体を、ＰＤＧＦがマーカーであり、そしてＰＤＧＦが病原性に関与する増殖性疾患を有する被検体または患者に対して、投与する。一旦、ＤＯＸ／ＤＮＲが、ＰＤＧＦ特異的アプタマーによって、標的細胞に密接に近接して運ばれると、ＤＯＸ／ＤＮＲ細胞障害性部分は、その細胞障害性効果を、非標識細胞または周辺組織への非特異的な付随的損傷を減少して、標的組織に対して、発揮する。
【０１７１】
引用された参考文献は、その全体を、本明細書において参考として援用する
本発明を、上記の詳細な説明および非限定的な例によって記載してきたが、ここで、本発明は、添付の請求の範囲の思想および範囲によって、規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからの、インビトロでのアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ）プロセスを示す。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチド集団が、標的分子活性化可能リガーゼ活性を含む核酸センサー分子についての、オリゴヌクレオチド集団のスクリーニングを、模式的に示す。
【図３】図３は、ハンマーヘッド核酸センサー分子選択方法論を示す。
【図２】
2005533794.tif 000002
【図１】
2005533794.tif 000003
【図３】
2005533794.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月22日(2004.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞障害性部分と結合体化した標的化部分を含む、アプタマー−毒素結合体治療剤であって、ここで標的化部分は、細胞表面マーカーに結合する、治療剤。
【請求項２】
前記標的化部分がアプタマーである、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記細胞表面マーカーが標的細胞と会合する、請求項２に記載の治療剤。
【請求項４】
請求項３に記載の治療剤であって、ここで、前記結合体化した細胞障害性部分は、細胞に対して、細胞障害性効果を発揮する、治療剤。
【請求項５】
請求項４に記載の治療剤であって、ここで、前記細胞障害性部分は、細胞障害性ペプチド、細胞障害性タンパク質、低分子化学治療剤、および放射性同位元素治療用分子からなる群から選択される、治療剤。
【請求項６】
請求項４に記載の治療剤であって、ここで、前記細胞表面マーカーが、レセプターである、治療剤。
【請求項７】
請求項６に記載の治療剤であって、ここで、前記レセプターが、チロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ｈｅｒ２  ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、およびＭｕｃ１からなる群から選択される、治療剤。
【請求項８】
請求項５に記載の治療剤であって、ここで、前記細胞表面マーカーが、チロシンキナーゼ、ＥＧＦＲ、ｈｅｒ２  ｎｅｕ、ＰＳＭＡ、およびＭｕｃ１からなる群から選択されるレセプターである、治療剤。
【請求項９】
請求項２に記載の治療剤であって、ここで、前記アプタマーが、共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【請求項１０】
請求項２に記載の治療剤であって、ここで、前記アプタマーが、非共有結合によって細胞障害性部分に結合体化している、治療剤。
【請求項１１】
請求項２に記載の治療剤であって、ここで、前記治療剤の前記細胞表面マーカーへの結合が、細胞膜を横切った治療剤のトランスロケーションを生じる、治療剤。
【請求項１２】
請求項７に記載の治療剤であって、ここで、前記治療剤の前記細胞表面マーカーへの結合が、細胞膜を横切った治療剤のトランスロケーションを生じる、治療剤。
【国際調査報告】
2005533794.tif 000005