(57)【要約】【課題】血液に触れた場合に表面血液境界面においてｉｎ  ｓｉｔｕで一酸化窒素（ＮＯ）を放出する能力を有する生体適合性材料を提供する。【解決手段】ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、シリコーンゴム）、ステンレス鋼等の金属、または炭素等からなる基材の表面上に、亜硝酸塩、硝酸塩および／またはニトロソチオール還元能力を有する生体触媒、またはバイオミメティック触媒を設ける。例えば、前記触媒は前記基材の表面に吸着または固定化される。前記触媒は、血液内の内因性亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールに作用し、材料の表面におけるＮＯレベルの局所増加を生み出すことができる。酵素の生体触媒の例は哺乳類のキサンチンオキシダーゼである。別の例示的実施形態では、バイオミメティック触媒はＣｕ(II)−リガンド錯体、例えばジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラフェニル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンである。場合によっては、亜硝酸／硝酸の親油性塩（例えば、亜硝酸トリドデシルメチルアンモニウム（ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-／ＮＯ3-））またはニトロソチオール等の塩をポリマー材料、または基材をなすポリマーフィルム内にドープすることで、亜硝酸塩またはニトロソチオールを固定化触媒層内へ持続的に漏れ出させるリザーバを形成することができる。血液内には十分なレベルの内因性還元等価体が存在するため、血小板粘着または活性化を防ぐのに必要と言われている閾値以上のＮＯが、表面に触媒によって生成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒表面を有する材料であって、
前記触媒表面は、
亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する触媒を基材に対して固定化するか、前記触媒を基材の表面で利用可能とすることで形成されたものであり、
前記触媒表面が血液に触れたときに亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールを一酸化窒素に変換するものである。
【請求項２】
前記触媒が生体触媒である請求項１に記載の材料。
【請求項３】
前記生体触媒が、亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する酵素である請求項２に記載の材料。
【請求項４】
前記酵素が、亜硝酸還元酵素、硝酸還元酵素、ニトロソチオール還元活性を有する酵素、およびキサンチンオキシダーゼ、またはそれらの組合せの群から選択される請求項２に記載の材料。
【請求項５】
前記酵素がキサンチンオキシダーゼである請求項３に記載の材料。
【請求項６】
前記触媒がバイオミメティック（biomimetic）触媒である請求項１に記載の材料。
【請求項７】
前記バイオミメティック触媒が、金属イオンと配位子とを有する錯体であり、前記金属イオンが、亜硝酸塩、硝酸塩、ニトロソチオール、および他の窒素含有血液分子種のうちの１つまたは複数を一酸化窒素に還元できる請求項６に記載の材料。
【請求項８】
前記バイオミメティック触媒が、Ｃｕ(II)からなる金属イオンと配位子とを有する錯体である請求項７に記載の材料。
【請求項９】
Ｃｕ(II)からなる金属イオンの配位子が、ジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラフェニル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエン、ジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエン、およびジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラエチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンからなる群から選択される請求項８に記載の材料。
【請求項１０】
前記基材が、ポリマー、金属または炭素（グラファイト）からなる群から選択される請求項１に記載の材料。
【請求項１１】
前記基材がポリマーからなる請求項１０に記載の材料。
【請求項１２】
前記ポリマーが、ポリ（塩化ビニル）、ポリウレタン、およびシリコーンゴムの群から選択される請求項１１に記載の材料。
【請求項１３】
前記ポリマーは、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、ポリマーマトリックス内に亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩をさらに含む請求項１１に記載の材料。
【請求項１４】
亜硝酸塩／硝酸塩の親油性塩が亜硝酸／硝酸トリドデシルメチルアンモニウム（ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-／ＮＯ3-）である請求項１３に記載の材料。
【請求項１５】
前記基材が金属である請求項１０に記載の材料。
【請求項１６】
前記金属が、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金および合金、またはそれらの組合せからなる群から選択される請求項１５に記載の材料。
【請求項１７】
前記触媒が金属の表面に共有結合で接合されている請求項１５に記載の材料。
【請求項１８】
前記金属の表面は、触媒を有するポリマーフィルムでコーティングされており、前記触媒は、ポリマーフィルムのマトリックス中に組み入れられているか、ポリマーフィルムの表面に接合されている請求項１５に記載の材料。
【請求項１９】
前記ポリマーフィルムは、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、ポリマーマトリックス内に亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩を有する請求項１８に記載の材料。
【請求項２０】
疎水性ポリマーからなる基材と、
亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する触媒であって、前記疎水性ポリマー基材の表面に接合されて触媒表面を形成する触媒と、を有する材料。
【請求項２１】
前記疎水性ポリマーからなる基材は、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、ポリマーマトリックス内に、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩を有する請求項２０に記載の材料。
【請求項２２】
金属からなる基材と、
前記基材の表面に共有結合で接合されたバイオミメティック触媒と、を有する材料。
【請求項２３】
前記バイオミメティック触媒が金属イオンと配位子とを有する錯体であり、前記金属イオンは、亜硝酸塩、硝酸塩、ニトロソチオール、および他の血液分子種のうちの１つまたは複数を一酸化窒素に還元できる請求項２２に記載の材料。
【請求項２４】
前記バイオミメティック触媒がＣｕ(II)イオンと配位子とを有する錯体である請求項２３に記載の材料。
【請求項２５】
ポリマーフィルムをさらに備え、
前記ポリマーフィルムは、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、ポリマーマトリックス内に、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩を有する請求項２２に記載の材料。
【請求項２６】
材料表面と血液との境界面で、前記表面と血液との接触により反応が生じて、ｉｎ  ｖｉｖｏで一酸化窒素（ＮＯ）を生成する方法であって、
亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する触媒を、前記材料の表面に設ける工程と、
血液中の亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールを一酸化窒素に変換するために、前記材料の表面を血液に接触させる工程と、を備えた方法。
【請求項２７】
前記材料上にポリマーフィルムを付与する工程をさらに備え、
前記ポリマーフィルムは、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、ポリマーマトリックス内に、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩の供給源を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記触媒を設ける工程として、血液中の亜硝酸塩／硝酸塩／ニトロソチオールを一酸化窒素（ＮＯ）に還元するためのＣｕ(II)錯体を、前記表面上に共有結合させるか、接合させるか、または前記表面上で利用可能にする工程を有する請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記触媒を設ける工程として、血液中の亜硝酸塩／硝酸塩／ニトロソチオールを一酸化窒素（ＮＯ）に還元するための亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する酵素を、前記表面上に共有結合させるか、接合させるか、または前記表面上で利用可能にする工程を有する請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
触媒が固定化されているか表面で利用可能になっている材料を備えた機器であって、
前記触媒は、亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有し、血液に触れたときに亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールを一酸化窒素に変換するものである。
【請求項３１】
請求項３０に記載の機器であって、
動脈ステント（arterial stent）、ガイドワイヤ、カテーテル、骨アンカ（bone anchors）および骨ねじ、保護用平板（protective platings)、股関節インプラント（hip and joint implants）、脊椎矯正装置（spine appliances）、導線、バイオセンサおよびプローブからなる群から選択される医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーまたは金属などの生体適合性材料、より具体的には、血液中の内因性亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールと接触したときに、ｉｎ  ｓｉｔｕで、生体触媒により、またはバイオミメティックに一酸化窒素を生成することができる、血液と相互作用を及ぼす表面を有する生体適合性材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外回路および血液透析チューブなどの医療機器が臨床で広く使用されているが、このような機器を組み立てるのに通常使用されるポリマー（ＰＶＣ、ポリウレタン、シリコーンゴムなど）は、依然としてそれらの材料の表面上に血小板の凝集および粘着を受けやすい。したがって、これらの機器の表面における血栓形成を軽減するために、抗凝固剤（すなわちヘパリン）が患者に投与されることが多い。
【０００３】
同様に、ステンレス鋼または他の合金製の埋込型機器は、たとえ炭素製であっても、血液と直接接触した場合には血栓形成の原因になることがある。したがって、抗凝血剤を投与する必要性をなくすために、血管の内側を覆う内皮細胞の抗血栓性をより厳密にシミュレートする材料が必要である。
一酸化窒素（ＮＯ）は、血小板の抗活性化、血管の弛緩、神経伝達、および免疫応答で重要な生理学的役割を果たしている、重要な細胞内および細胞間メッセンジャー分子である。したがって、低レベルのＮＯを放出する合成材料は、内皮細胞の自然な活性をより厳密にシミュレートしており、生体適合性を改善するであろうと提案されてきた。
【０００４】
現在、数種類のＮＯ放出材料が世界中で研究されている。それらにはＮＯ供与体（すなわちジアゼニウムジオレート（ｄｉａｚｅｎｉｕｍｄｉｏｌａｔｅ）、ニトロソチオール）があるが、これらは、合成するのが比較的面倒であり、保存にも厳しい条件が必要である。したがって、作製して保存することが容易な改善された材料が求められている。
現在、ＮＯ生成は、水の取り込み（ジアゼニウムジオレートの場合など）または光の強度（鉄ニトロシルのように）によって測定される。しかしながら、血液はすでに、ＮＯへ還元することができる血液に由来する、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生理学的に生成される分子種のホストを含有している。それらの分子種には、亜硝酸塩、硝酸塩、およびニトロソチオールのホスト（例えば、ニトロソグルタチオン、ニトロソアルブミンなど）が含まれる。このことは、これらの分子種をもとの一酸化窒素に再利用する可能性を高めている。したがって、これらの分子種を基材／血液境界面で局所的に一酸化窒素に還元することができる材料が求められている。
【０００５】
本発明の一目的は、血液と接触する表面材料からＮＯを放出することができる、生物医学的用途のために改善された材料を提供し、血小板活性化およびそれらの表面上への血小板の粘着を防ぎ、それによって血液と異物の相互作用に伴う血栓形成および他の合併症を低減することである。
本発明の他の目的は、製造するのが比較的安価で改善された生体適合性を有する、生物医学的用途のために改善された材料を提供することである。
【０００６】
本発明のもう１つの目的は、血液中の亜硝酸塩／硝酸塩およびニトロソチオールと反応して血液と接触する表面材料からＮＯを放出することができる、生物医学的用途のための材料を提供することである。
【発明の開示】
【０００７】
前記のおよび他の目的は、人体または動物体への埋め込みおよび／または身体もしくは血液との長期接触に適したタイプの、材料の生体適合性を向上させる新規手法を提供する本発明によって達成される。本発明の幅広い態様によれば、材料は、血液と接触した場合に、触媒表面／血液境界面において、生理学的に有意な量のＮＯを生成することができる触媒表面を有するように開発された。亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する触媒を、固定化、吸着、接着するか、材料の表面で利用できるようにする。
ある実施形態では、触媒は、酵素などの亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する生体触媒である。例えば、亜硝酸還元酵素、硝酸還元酵素、ニトロソチオール還元能力を有する酵素、およびキサンチンオキシダーゼ、またはそれらの組合せである。市販のキサンチンオキシダーゼ（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を入手するのが容易なため、キサンチンオキシダーゼが好ましい実施形態である。他の有用である可能性のある固定化生体触媒には、植物または細菌からの亜硝酸還元酵素および硝酸還元酵素が含まれるであろう。
【０００８】
他の実施形態では、触媒はバイオミメティック触媒である。本明細書で使用する用語「バイオミメティック触媒」は、亜硝酸還元酵素様活性、または血液と接触した場合にニトロソチオールを還元し、内因性もしくは外因性亜硝酸塩／硝酸塩もしくはニトロソチオールをＮＯに変換する能力を有する分子種を指す。
例えば、バイオミメティック触媒は、金属イオンリガンド錯体（金属イオンと配位子とを有する錯体）であり、前記金属イオンは、１つまたは複数の硝酸塩、硝酸塩、ニトロソチオール、および他の血液分子種を一酸化窒素に還元することができる。特に好ましい実施形態では、金属イオンリガンド錯体はＣｕ(II)錯体である。
【０００９】
中性のキャリア型リガンドは本発明の実施に適している。前記リガンドは、特に銅に対する高い金属結合親和性を有する。好ましくは、銅イオンがＣｕ(II)からＣｕ(I) へ容易に還元されるように、中心金属に対する電子供給源（例えば、アスコルビン酸塩またはＮＡＤＨ）の接近に対する立体障害が最小限である平面正方形型の錯体を使用する。
その例には、サイクレン、サイクラムおよびそれらの誘導体などのＮｘ−供与体大環状リガンド（ｘ＝２、４、５、６、８）、ならびにクラウンエーテルおよびＳｘ−供与体マクロサイル（ｍａｃｒｏｃｙｌｅ）型リガンド（ｘ＝２、４、５、６、８）などの窒素またはイオウ供与性化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
具体的に説明するための実施形態では、バイオミメティック触媒は、ジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラフェニル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエン、ジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエン、およびジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラエチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンからなる群から選択される配位子を有するＣｕ(II)錯体である。
【００１１】
本発明において、触媒表面を提供する基材は如何なる材料からなるものであってもよいが、生物の身体および／または体液、特に血液との接触に適している、例えば生理学的に許容され、無毒性である材料からなることが好ましい。一部の実施形態では、前記材料は長期の接触、または留置使用に適していなければならない。広い意味で言えば、このような材料は、ポリマー、金属および合金、ならびに炭素（グラファイト）を包含する。
【００１２】
多くのポリマー材料が本発明の実施に適しており、生物医学的用途に使用されてきたポリマーを以下例示的に列挙するが、いかなる場合にも限定を意図していない。この例には、ポリウレタン、ポリジメチルシロキサン、エチレンビニルアセテート、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、および酢酸セルロースなどの合成ポリマーが含まれる。
【００１３】
具体的な好ましい実施形態では、本発明による材料は、ポリ（塩化ビニル）、ポリウレタン、およびシリコーンゴムなどの疎水性ポリマー基材、および疎水性ポリマー基材の表面に接合された、亜硝酸還元酵素および／または亜硝酸還元酵素様活性、またはニトロソチオール還元酵素活性を有する触媒の層を含む。この接合は、吸着、共有結合などによるものでよい。
【００１４】
一部の実施形態では、ポリマー基材は、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールが触媒表面へ持続的に漏れ出ることを可能にするリザーバを形成するために、マトリックス内に亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩を含むことができる。
基材がポリマーからなる実施形態では、ＮＯ放出ポリマーは、薬物デポ等の埋め込み可能な機器等からなるモノリシック機器、もしくはカテーテルなどの留置機器、または体外チュービングセット（腎臓透析または心臓切開手術人口心肺を含む）を具備するように作製、成型、形成することができる。また、ポリマー以外の基材上、または金属機器の表面等の、別の表面上のフィルムとして、ポリマーを塗布することができる。
【００１５】
基材をなす金属としては、ステンレス鋼、ニッケル、チタン、アルミニウム、銅、金、銀、白金およびそれらの組合せが好適であるが、これらに限定されるものではない。
基材が金属材料であり、本発明の原理による触媒が設けられている医療機器としては、以下のタイプの機器、例えば、動脈ステント、ガイドワイヤ、カテーテル、骨アンカ（ｂｏｎｅ  ａｎｃｈｏｒｓ）および骨ねじ、保護用平板（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｌａｔｉｎｇｓ）、股関節（ｈｉｐ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ）インプラント、脊椎矯正装置（ｓｐｉｎｅ  ａｐｐｌｉａｎｃｅｓ）、導線、バイオセンサおよびプローブが例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
具体的な好ましい実施形態としては、金属基材の表面にバイオミメティック触媒が共有結合で接合された材料が挙げられる。前述のように、バイオミメティック触媒は、硝酸塩、硝酸塩、ニトロソチオール、および他の血液分子種のうちの１つまたは複数を一酸化窒素に還元することができる、金属イオンリガンド錯体（金属イオンと配位子とを有する錯体）である。特に好ましい実施形態では、バイオミメティック触媒はＣｕ(II)錯体である。金属表面への金属イオンリガンド錯体の接合は、当業者に知られている手段によって行うことができる。そのための１つの方法として、金属の表面をシラン処理することで、前記錯体が結合する反応基を設ける方法がある。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの外因性供給源をポリマーマトリックス内に付与して、材料の触媒表面へ持続的に漏れ出すことができる亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールのリザーバを作る。これらの実施形態では、外因性の供給源、例えば亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの親油性塩をポリマーマトリックス材料内に分散させる。一部の実施形態では、亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの外因性供給源を含有するポリマー材料を、コーティングとして触媒表面に塗布する。亜硝酸塩／硝酸塩またはニトロソチオールの供給源の例には、亜硝酸トリドデシルメチルアンモニウム（ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-／ＮＯ3-）などの４級アンモニウム塩、トリメチルフェニルアンモニウム、ジメチルジオクタデシルアンモニウムなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。４級アンモニウム塩の他に、４級ホスホニウム塩または４級アルソニウム塩を本発明の実施に使用することができる。
【００１８】
本発明の材料の作製方法としては、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）またはシリコーンなどのポリマーを、適当な亜硝酸塩／硝酸塩を含有する有機溶媒の存在下に膨潤させ、亜硝酸塩／硝酸塩含有ポリマーを得る方法が挙げられる。次いで、この亜硝酸塩／硝酸塩含有ポリマーを固定化した酵素、例えばキサンチンオキシダーゼなどの亜硝酸還元酵素の層でコーティングする。酵素を固定化するためには多くの技法が利用可能である。例えば、Ｈａｓｓｅｌｂｅｒｇｅｒ、「Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  I ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｎｅｌｌｓｏｎ−Ｈａｌｌ」Ｃｈｉｃａｇｏ（１９７８）またはＧｕｉｌｂａｕｌｔ、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  I ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）を参照されたい。
【００１９】
他の方法の実施形態では、ＮＯのバイオミメティックな生成は、材料の表面上に金属イオンリガンド錯体を固定化するか、ポリマー等の基材内に、前記錯体を分散することによって達成することができる。一部の実施形態では、追加の親油性亜硝酸塩／硝酸塩、またはニトロソチオールを、基材をなすポリマーマトリックス材料に添加するか、材料上のコーティングもしくは追加の層として設ける。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の理解は、付属する図面と併せて以下の説明を読むことによって容易になる。
改善されたＮＯ放出ポリマーを製造する方法の一実施形態としては、親油性の亜硝酸／硝酸塩を含有する有機溶液中で所望のポリマーを膨潤させる方法が挙げられる。前記方法の他の実施形態としては、所望の最終製品をポリマー材料から成形または成型する加工段階で、前記塩を前記ポリマー材料に添加する方法が挙げられる。
【００２１】
前記方法の更なる他の実施形態としては、血液に触れるポリマー材料の表面、例えばカテーテルの外部表面もしくは体外回路で使用されるタイプのチュービングの内部表面、または金属ステントの表面を、浸漬法または別の方法により、硝酸塩をＮＯに、亜硝酸塩をＮＯに、またはニトロソチオールをＮＯに還元することができる生体触媒（酵素）またはバイオミメティック触媒で、コーティングする方法が挙げられる。また、生体触媒またはバイオミメティック触媒を、基材の表面に共有結合で接合する方法が挙げられる。
【００２２】
具体的な例示的実施形態では、亜硝酸塩をＮＯに還元するために、表面触媒として哺乳類のキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）を用いる。前記表面触媒は、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または血液中の他の還元性等価体の存在下で、血液内の塩素イオンおよび重炭酸イオンとの交換により、基材から表層中への亜硝酸イオンを漏出させて、ＮＯを生成する。
【００２３】
本発明のこの実施形態の概略図を図１に例示する。図１を参照すると、親油性のトリドデシルメチルアンモニウムの亜硝酸／硝酸塩（Ｒ+ ＮＯ2-）１２が添加されたポリマーマトリックス１１が、亜硝酸イオン（ＮＯ2-）の供給源となっている。キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）のコーティングを符号１３で示す。
本発明の基本概念を明らかにするため、予備的な実現可能性試験を行った。亜硝酸還元酵素活性のモデル酵素としてキサンチンオキシダーゼを用い、ＰＶＣにＴＤＭＡ+ ＮＯ2-を添加したポリマー材料でフィルムを形成し、次いで、このポリマーフィルムの表面にコーティング法により、ＸＯの固定化層を形成した。
【００２４】
例えば、ＰＶＣポリマーからなるフィルムまたは膜は、例えばＭａｔｈｉｓｏｎ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１巻、４６１４〜４６２１ページ（１９９９年）または本明細書で参照する特許に記載されているカクテル溶液キャスティング法によって形成できる。カクテル溶液は、適切な量の膜成分（ポリマー、可塑剤および場合によってはイオン交換体）を溶剤、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かすことによって調製する。
【００２５】
このカクテル溶液キャスティング法を採用し、前記カクテル溶液を、鋳型の中で最終的に約１５０μｍの厚さとなるように成形することにより、ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-が添加されたＰＶＣポリマーからなる膜を得た。次いで、グルタルアルデヒドの存在下で、ＸＯをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と架橋することによってヒドロゲル状の架橋生成物を調製し、この架橋生成物を、得られた膜（ＰＶＣポリマー基材）上に浸漬法によりコーティングした。
【００２６】
電気化学センサーを用い、コーティングしたフィルムを生理学的ｐＨでＮＡＤＨを含有する緩衝溶液中に置いて、生成するＮＯの表面濃度を調べた。これらの条件の下で、フィルムの表面において有意なレベルのＮＯが生成された。ポリマーフィルムの表面近傍におけるＮＯの生成は、フィルム中の亜硝酸塩が緩衝相中の陰イオンと交換しながら数時間にわたって続いた。
【００２７】
この具体的実施形態では、使用した電気化学ＮＯセンサーは、従来のＣｌａｒｋ型酸素センサーと類似の形式であった。ガラスでコーティングした白金（Ｐｔ）線は陽極としての役割を果たし、Ａｇ／ＡｇＣｌ線（直径０．２５ｍｍ）を陰極として使用した。内部充填溶液は、０．３ｍＭ  ＨＣｌおよび３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５で構成された。外部のガス透過膜（Ｇｏｒｅｔｅｘ、空隙率５０％および孔径０．２μｍのポリテトラフルオロエチレン）を内部充填溶液と試料溶液の間に置いた。電気化学分析器を用い、電流によるＮＯ測定を行った。
【００２８】
図２は、ＸＯでコーティングされた類似のフィルムがヒツジの全血に触れた場合に、ＮＡＤＨの形態でいかなる還元性等価体も加えることなく測定可能なレベルのＮＯが、前述の電気化学ＮＯセンサーによって検出される程度に、フィルムの表面で生成されたことを示すグラフである。このデータは、本発明に従って調製したポリマーの表面における生体触媒反応の電子供給源としての機能を果たす、十分な内因性の還元性等価分子種が、血液中に存在することを示唆している。
【００２９】
別の例示的実施形態では、Ｃｕ(II)−リガンド錯体などのバイオミメティック触媒、例えばジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラフェニル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンを、ポリマーまたは金属などからなる基材に組み入れるかその表面に接合した。この実施形態の例を図３および４に示す。
図３は、親油性のＣｕ(II)リガンド錯体３２と、ポリマー中に亜硝酸イオン（ＮＯ2-）の供給源を付与する、親油性のトリドデシルメチルアンモニウムの亜硝酸／硝酸塩（−Ｎ+ ＮＯ2-）３３と、が添加されたポリマーマトリックス３１、例えばＰＶＣを示す概略図である。このポリマーが、アスコルビン酸塩（ＡＳＣ）またはアスコルビン酸を含有する水溶液に接触したときに、アスコルビン酸はリガンド錯体３２中のＣｕ(II)をＣｕ(I) まで還元する。Ｃｕ(I) はフィルム中の亜硝酸塩をＮＯまで還元する。
【００３０】
図４は、Ｃｕ(II)リガンド錯体４２を基材４０の表面に接合することによって作製した、触媒表面４１を有する材料を示す概略図である。触媒表面４１が、アスコルビン酸を含有する水溶液（血液でもよい）に触れたときに、アスコルビン酸がリガンド錯体４２中のＣｕ(II)をＣｕ(I) まで還元する。Ｃｕ(I）はＣｕ(II)に戻ることによって、例えば溶液中の亜硝酸塩およびニトロソチオール（ＲＳＮＯ）をＮＯに変換する。
【００３１】
図５は、亜硝酸塩およびアスコルビン酸塩を含有するバルク溶液におけるＣｕ(II)リガンド錯体含有ポリマーフィルムからの、ＮＯの表面生成を示すグラフである。このグラフは、各データを、秒で表した時間と、ｐｐｂ（１０億分の１）で表したＮＯ濃度との関数としてプロットして得られた。
以下の処方を有する３種類のフィルムを前述の方法に従って調製した。
【００３２】
この処方は、ＰＶＣポリマー６６．７重量％（１３２ｍｇ）と、例えばニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）からなる可塑剤３３．３重量％（６６ｍｇ）と、Ｃｕ(II)リガンド錯体であるＣｕＬx Ｃｌ2 （２ｍｇ）（Ｌx は図６に示すリガンドＬ1 〜Ｌ3 ）と、からなる。
図６に示す三種類のＣｕ(II)錯体を構成するリガンド（配位子）Ｌ1 〜Ｌ3 は、Ｌ1 がジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラフェニル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンであり、Ｌ2 がジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンであり、Ｌ3 がジベンゾ［ｅ，ｋ］−２，３，８，９−テトラエチル−１，４，７，１０−テトラアザ−シクロドデカ−１，３，７，９−テトラエンである。
【００３３】
これらの錯体を塩化物として示しているが、他の対イオンも適していることは理解されるであろう。活性、すなわちアスコルビン酸塩による亜硝酸塩のＮＯへの還元を媒介する能力について評価したその他の金属イオンには、Ｃｏ(II)、Ｎｉ(II)、Ｚｎ(II)、Ｍｎ(II)、Ａｌ(II)、およびＦｅ(III）がある。これらのイオンのうち、検出可能なレベルのＮＯが得られたのはＦｅ(III）のみであったが、同一条件でＣｕ(II)によって観察されるよりずっと少なかった。
【００３４】
Ｖ(III）、Ｃｒ(III）、およびＴｉ(III）などのその他の金属も亜硝酸塩をＮＯに還元することができると推測されていた。しかしながら、Ｃｕ(II)（またはＦｅ）とは異なり、これらの金属はｉｎ  ｖｉｖｏ、生理学的液体内および特殊化した細胞小胞内のどちらにも測定可能なほど存在しない。したがって、本発明の実施には現在のところＣｕ(II)が好ましい金属イオンである。
【００３５】
図５に戻り、図５のトレース６１、６２、および６３は、それぞれ配位子がＬ１、Ｌ２、Ｌ３の場合のグラフである。この具体的実験では、バルク溶液は、７．４のｐＨを有する脱酸素リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とした。ｔ＝０に亜硝酸塩１ｍＭおよびアスコルビン酸塩１ｎＭをＰＢＳ溶液に加え、ＮＯ生成を化学発光検出器で測定した。その結果は、本発明の材料に相当するフィルムが、亜硝酸塩およびアスコルビン酸塩がバルク溶液中にあるときに、前記溶液との境界面においてＮＯを生成できることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏ状況において、前記フィルムが血液と接触するように置かれているときに生じると推定されるように。
【００３６】
図７は、ポリマーフィルム中にドープされた亜硝酸イオン対／Ｃｕ(II)錯体、具体的には図６にＬ2 と表された錯体を用いた場合の、ＮＯ生成を示すグラフである。このグラフは、各データを、秒で表した時間と、ｐｐｂ（１０億分の１）で表したＮＯ濃度との関数としてプロットして得られた。
この実験で用いたポリマーフィルム組成は以下の通りである。
【００３７】
フィルム１：
ＰＶＣが６６ｍｇ、ＮＰＯＥが１３２ｍｇ、Ｃｕ(II)錯体が４ｍｇ、およびイオン対（ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-）が２０ｍｇ。
フィルム２：
ＰＶＣが１００ｍｇ、ＮＰＯＥが１００ｍｇ、Ｃｕ(II)錯体が４ｍｇ、およびイオン対２０ｍｇ。
【００３８】
フィルム３：
ＰＶＣが１３２ｍｇ、ＮＰＯＥが６６ｍｇ、Ｃｕ(II)錯体が４ｍｇ、およびイオン対が２０ｍｇ。
これらの結果は、高度に可塑化された実施形態の場合に、ポリマーフィルムによるＮＯの生成が良好であることを示している。
【００３９】
ポリマーまたは他の材料の表面で局所的にＮＯを生成するための技術として、この実施形態の技術が有する主要な利点は、生体触媒またはバイオミメティック触媒からなる触媒層が、基材に対して単に浸漬法でコーティングすることでられるため、従来の方法よりも簡単に得られることにある。前記触媒層は、単一の触媒からなるか、還元酵素活性を有する物質の混合物からなるものである。生物のタンパク質（酵素）、または酵素機能を模倣する金属イオンリガンド錯体（金属イオンと配位子とを有する錯体）からなるものであってもよい。
【００４０】
或いは、ＴＤＭＡ+ ＮＯ2-／ＮＯ3-もしくは他の亜硝酸／硝酸塩、またはニトロソシステインなどのニトロソチオールを、基材であるポリマー内に組み込んだ実施形態の場合でも、前記分子種の安定性は、従来法で用いられているジアゼニウムジオレート等のＮＯ供与体の安定性よりも優れていると考えられる。
臨床状況では、たとえ血液中の還元性等価分子種の量が被験者によって異なることがあっても、血液に還元当量の代替電子供与体を、例えばアスコルビン酸の形態で、患者に低用量のビタミンＣを投与することによって加えることが可能であることに注目すべきである。このことは、十分なレベルの還元等価体が存在することを保証する。
【００４１】
具体的な実施形態および用途に関して本発明を説明してきたが、当業者は、本教示を踏まえて、本明細書に記載の本発明の範囲を越えることなく、または精神を逸脱することなく追加の実施形態を作成することができる。したがって、本開示における図面および説明は、本発明の理解を容易にするために提供されていると理解すべきであって、本発明の範囲を限定していると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】亜硝酸塩が添加されたポリマーの触媒表面からの、亜硝酸還元酵素活性による溶液でのＮＯ生成を例示する図である。
【図２】ヒツジ血液の存在下での、表面上に固定化ＸＯを有し亜硝酸イオン対がドープされたポリマーフィルムからの、ＮＯ放出プロフィールを示すグラフである。
【図３】本発明による硝酸塩およびＣｕ(II)リガンド錯体が添加されたポリマーマトリックスからの、ＮＯ生成を示す概略図である。
【図４】Ｃｕ(II)リガンド錯体が共有結合で基材の表面に接合されている、本発明に係る材料を示す概略図である。
【図５】亜硝酸塩およびアスコルビン酸塩を含有するバルク溶液における、Ｃｕ(II)リガンド錯体含有ポリマーの表面からの、ＮＯの生成を示すグラフである。
【図６】Ｃｕ(II)錯体の３つの例を示す図である。
【図７】亜硝酸イオン対／Ｃｕ(II)錯体、具体的には図６にＬ２で示された錯体からのＮＯ生成を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４３】
１１：ポリマーマトリックス
１２：トリドデシルメチルアンモニウムの亜硝酸／硝酸塩
１３：キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）のコーティング
３１：ポリマーマトリックス
３２：親油性のＣｕ(II)リガンド錯体
３３：親油性のトリドデシルメチルアンモニウムの亜硝酸／硝酸塩（−Ｎ+ ＮＯ2-）
４０：基材
４１：触媒表面
４２：Ｃｕ(II)リガンド錯体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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