(57)【要約】本発明は、目的の遺伝子内の１塩基多型を検出する方法に関する。複数のプローブを平面導波路上に固定化する。プローブは、目的の遺伝子の野生型配列に相補的な配列、および目的の遺伝子内の既知のＳＮＰの配列に相補的な配列からなる。蛍光標識した検体を平面導波路上に流す。標識した検体と各プローブとの間の結合は、蛍光シグナルに変化を引き起こす。各プローブと検体とのハイブリダイゼーション反応速度を比較することによってＳＮＰを検出する。ハイブリダイゼーションで配列決定することにより目的の遺伝子中の１塩基多型を検出する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子内の１塩基多型（「ＳＮＰ」）を検出する方法であって、
平面導波路上に複数の野生型プローブおよび複数のＳＮＰプローブを固定化する工程、
該平面導波路上に検体を流す工程、
該複数の野生型プローブへの該検体の結合、および該複数のＳＮＰプローブへの該検体の結合を検出する工程、
検体とＳＮＰプローブのハイブリダイゼーション反応速度を、検体と野生型プローブのハイブリダイゼーション反応速度と比較する工程、および
目的の遺伝子内のＳＮＰを検出する工程
からなる方法。
【請求項２】
平面導波路上に複数の野生型プローブを固定化する工程が、目的の遺伝子の野生型配列に相補的な複数のヌクレオチド配列を固定化する工程からなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
平面導波路上に複数のＳＮＰプローブを固定化する工程が、野生型配列のＳＮＰを含む配列に相補的な複数のヌクレオチド配列を固定化する工程からなる請求項１および２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の野生型プローブへの前記検体の結合、および前記複数のＳＮＰプローブへの前記検体の結合を検出する工程が、該結合をリアルタイムに検出する工程からなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記目的の遺伝子内の前記ＳＮＰを検出する工程が、ＫＶＬＱＴ１遺伝子内の前記ＳＮＰを検出する工程からなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的の遺伝子内の前記ＳＮＰを検出する工程が、ＫＶＬＱＴ１遺伝子の７６０位におけるグアニンのアデニンへの変化を検出する工程からなる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の野生型プローブへの前記検体の結合、および前記複数のＳＮＰプローブへの前記検体の結合を検出する工程が、蛍光変化を検出する工程からなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記平面導波路上に検体を流す工程が、蛍光標識したＤＮＡ試料またはＰＣＲ産物を含む溶液を前記平面導波路上に流す工程からなる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の野生型プローブへの前記検体のハイブリダイゼーション速度と、前記複数のＳＮＰプローブへの前記検体のハイブリダイゼーション速度との識別を実現する工程からさらになる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションによる配列決定（「ＳＢＨ」）により目的の遺伝子内の１塩基多型（「ＳＮＰ」）を検出する方法であって、
平面導波路上に捕捉プローブを固定化する工程、
該捕捉プローブと共に１組の検体プローブをインキュベートする工程、
該平面導波路上に１組の配列決定プローブの溶液を流す工程、
該捕捉プローブ、該１組の検体プローブの各検体プローブ、および該１組の配列決定プローブの各配列決定プローブの間でＤＮＡ複合体を形成する工程、および
該捕捉プローブ、該１組の検体プローブの各検体プローブ、および該１組の配列決定プローブの各配列決定プローブの間でハイブリダイゼーション速度を比較することにより、
目的の遺伝子内のＳＮＰを検出する工程
からなる方法。
【請求項１１】
前記平面導波路上に捕捉プローブを固定化する工程が、前記平面導波路上に１０ヌクレオチドの配列を固定化する工程からなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
目的の遺伝子がＫＶＬＱＴ１である請求項１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉プローブと共に１組の検体プローブをインキュベートする工程が、前記捕捉プローブと共に前記１組の検体プローブの各検体プローブをインキュベートする工程からなり、各検体プローブは目的の遺伝子由来であって１箇所異なるヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記平面導波路上に１組の配列決定プローブの溶液を流す工程が、前記平面導波路上に前記１組の配列決定プローブの各配列決定プローブを流す工程からなり、各配列決定プローブは５ｍｅｒからなることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記平面導波路上に１組の配列決定プローブの溶液を流す工程が、前記平面導波路上に前記１組の配列決定プローブの各配列決定プローブを流す工程からなり、各配列決定プローブは５’位に固有のヌクレオチドを有し残りの部位は縮重されていることを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント波バイオセンサを使用する試料分析に関する。より具体的には、本発明は、エバネッセント波バイオセンサを使用しＤＮＡ試料中の１塩基多型を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明を裏付ける研究は、国立予防衛生研究所（National Institute of Health）助成金ＨＬ３２１３２から一部資金提供を受けている。米国政府は本発明において一部権利を有し得る。
【０００３】
本出願は、２００２年１月１８日出願の米国仮出願第６０／３５０，６３３号の優先権を主張する。
（現況最新技術）  過去１０年にわたって、分子生物学は遺伝性疾患の分子的機序を理解するために使用されてきた。ある疾患に関与する１つまたは複数の遺伝子を同定することによって、罹患者の遺伝子を非罹患者の遺伝子と比較する。多くの疾患では、罹患者と非罹患者の遺伝子間の唯一の相違はＤＮＡ配列中の１塩基多型（「ＳＮＰ」）である。このＳＮＰまたは突然変異に基づき疾患をスクリーニングすることが可能な場合がある。分子生物学者らによって調査されてきたいくつかの疾患には、不整脈源性右室異形成、家族性肥大心筋症、特発性心室細動、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群などの遺伝性心血管疾患が含まれる。これらの心血管疾患のうち家族性肥大心筋症（「ＨＣＭ」）、ＱＴ延長症候群（「ＬＱＴＳ」）、およびマルファン症候群（「ＭＦＳ」）は分子レベルで最も理解されている。これらの疾患の遺伝は常染色体優性であり、罹患個体は前兆を伴わないことの多い心臓突然死の危険に曝される。こうした心臓疾患に関与する多くの遺伝子およびこれらの遺伝子内のいくつかの突然変異は同定されているので、心臓突然死の危険性のある個人をスクリーニングするために分子診断法を使用することが可能である。
【０００４】
ＬＱＴＳには、ＫＶＬＱＴ１、ＨＥＲＧ、ＳＣＮ５Ａ、ＫＣＮＥ１を含む４つの遺伝子が関与している。これらの遺伝子では、ＫＶＬＱＴ１中の７５個、ＨＥＲＧ中の８４個、ＳＣＮ５Ａ中の８個、ＫＣＮＥ１中の７個の突然変異を含む多数の突然変異が目録化されている。４個の遺伝子のうちＫＶＬＱＴ１遺伝子は非常に重要である。というのも、この遺伝子は罹患個体について遺伝子型を決定して観察したＬＱＴＳ症例のほぼ５０％に関与しており、罹患個体のＤＮＡ配列を決定することによってこの遺伝子内に非常に多くのミスセンスや欠失の突然変異が同定されており、この遺伝子のハイスループット（高処理）スクリーニング検定の発達が治療および患者の予後に著しい効果をもたらし得るからである。ＫＶＬＱＴ１は、心筋のカリウムチャネル、または少なくとも同チャネルのαサブユニットをコードする。ＫＶＬＱＴ１中で生じる多数のＳＮＰがＬＱＴＳに関連付けられている。ＫＶＬＱＴ１遺伝子は、大きさが第１４エクソンの４７塩基対から第１エクソンの３８６塩基対の範囲にある１６個のエクソンからなる。第７エクソンにおいて偏った数のこうしたＳＮＰが観察されており、第７エクソンが突然変異のホットスポットである可能性を示唆している。しかし、ＳＮＰは他のエクソン中にも観察されている。１つの多型がＫＶＬＱＴ１の第３エクソンに生じるＧ７６０Ａであり、Ｇ７６０Ａではヌクレオチド配列の７６０位に位置するグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されている。この突然変異によって、ＫＶＬＱＴ１蛋白質のアミノ酸配列中２５４位のバリンがメチオニンに置換される。
【０００５】
現在、ヒトでの多型の評価には、ポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）を使用し罹患個体から目的の遺伝子を単離すること、その遺伝子の配列を決定すること、次いで観察さ
れた全ての多型または突然変異を目録化する必要がある。しかし、日常的な患者スクリーニングにこの手順を使用するには高価で時間もかかりすぎる。こうした欠点から、単一の基材上に２次元アレイの状態に固定化された数百または数千の核酸プローブ分子を含むＤＮＡチップが開発された。これらの核酸プローブは、ミスセンス突然変異や欠失など、既に目録化されている既知の突然変異に相当する。これらの核酸プローブは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）として知られている。しかし、ＤＮＡチップで患者をスクリーニングするには、なおＰＣＲを使用して患者のＤＮＡから目的の遺伝子を単離して増幅し、次いでＰＣＲ産物をＤＮＡチップに結合可能にする必要がある。次いで、チップを洗浄し、通常、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用してＤＮＡのハイブリダイゼーションを蛍光検出する。ＡＳＯアレイ中の各要素を順次画像化するには数秒以上かかるので、この検出法も時間がかかる。すなわち、この検出法はリアルタイムではない。さらに、ＤＮＡチップの読取りに必要な機器は一般的な一式で１００，０００ドルから２００，０００ドルの価格であり、非常に高価である。
【０００６】
複数の塩基対の変化を含む多型もあるが、その他の多型はＳＮＰとして知られている１塩基対の変化だけを含む。たとえば、ＫＶＬＱＴ１遺伝子中に同定された突然変異の多くは、単一の不適合（ミスマッチ）塩基対を伴うミスセンス突然変異である。伝統的には、ホモ２本鎖（２本の野生型オリゴヌクレオチドのハイブリッド）の融解温度Ｔｍより低いが、ヘテロ２本鎖（野生型オリゴヌクレオチドおよび突然変異オリゴヌクレオチドのハイブリッド）のＴｍよりも高い温度でハイブリダイゼーション反応を実施することにより、不適合塩基を識別した。しかし、所与のＤＮＡ２本鎖の融解温度はＡ・Ｔ塩基対の含有量によって変化する。したがって、ＤＮＡチップに固定化された数百または数千のオリゴヌクレオチドに最適な温度を見出すことは困難である。
【０００７】
この問題の１つの解決策は、ハイブリダイゼーション緩衝液にテトラメチルアンモニウム（「ＴＭＡ」）塩化物などのＴＭＡ塩またはベタインのいずれかを加えることである。これらの化合物は、Ａ・Ｔ含有量による融解温度の差を最小限に抑え、それによって全てのハイブリダイゼーション反応を不適合塩基の識別に最適な単一温度で実施することを可能にすると考えられる。しかし、これらの化合物が高濃度（１〜２Ｍ）でなければならず、それにより化合物は粘稠なものとなる。この粘稠性が操作上の問題を招き、濃度の高さが酵素反応を妨害する恐れがある。別の解決策では、Ａ・Ｔ塩基対の安定性を増大させるために、またはＧ・Ｃ塩基対の安定性を減少させるために修飾ヌクレオチドを使用する必要がある。この手法の別法は、Ａ・Ｔに富むオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために同オリゴヌクレオチドの末端に数個の万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）塩基（５‐ニトロインドール）を付加することである。別の解決策は、ハイブリダイゼーション反応を低温（たとえば、−２０℃）でその最大限まで進行させ、次いでＤＮＡチップの温度を６０℃まで徐々に一定して高めるものである。これによりチップ上に形成されたあらゆるＤＮＡ２本鎖について独立した融解曲線の測定が可能になる。この手法が最も確実であるが、これは非常に時間がかかり完全な融解曲線を得るには数時間を要する。
【０００８】
ＡＳＯプローブを使用するハイブリダイゼーション技法は遺伝子内の既知の突然変異をスクリーニングするために使用されるが、同定も目録化もされていない突然変異をスクリーニングするためには代替技法が必要である。未知の突然変異を検出するための現在の技法はかなり手間がかかり、１本鎖高次構造多型（「ＳＳＣＰ」）と称される技法が必要となる。この技法では、ＰＣＲを使用して目的の領域、通常はエクソンを増幅する。次いで、ＰＣＲ産物を変性しゲル電気泳動を行う。１本鎖状態では、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列がその移動度に影響を及ぼすので、突然変異を含むオリゴヌクレオチドは野生型配列と異なる速度でゲル上を移動する。次いで、突然変異を含むオリゴヌクレオチドをゲルから単離し配列決定して突然変異の位置および組成を決定する。しかし、電気泳動工程およ
び配列決定工程には極めて時間がかかる。
【０００９】
遺伝子内の未知の突然変異を検出する代替策はハイブリダイゼーションによる配列決定（「ＳＢＨ」）である。新規な（ｄｅ  ｎｏｖｏ）ＳＢＨでは、ゲノムＤＮＡ（通常８０〜２００ヌクレオチド長）の断片を、考えられる配列の順列全てを含む短いオリゴヌクレオチド（通常６〜８塩基長）のマイクロアレイに曝露する。ＳＢＨは、遺伝的多型を含む既知配列の遺伝子の一部の再配列決定にも使用されており、部分的に重複する一連のオリゴヌクレオチドを合成してマイクロアレイ上に固定化する（またはｉｎ  ｓｉｔｕでチップ上に合成する）。これらの各オリゴヌクレオチドの配列は目的の遺伝子に相補的であり、一連のオリゴヌクレオチドの中で前方にあるオリゴヌクレオチドに対して１位分だけ位置がずれている。突然変異によって変化している１つまたは複数の塩基の配列を決定（または「呼出し（ｃａｌｌｉｎｇ）」）するための２つの戦略が記載されている。第１の呼出し戦略では、目的の遺伝子内の各位置を２５塩基長の４種の異なるオリゴヌクレオチドによって探査するが、各オリゴヌクレオチドは中央（１３番目）の位置で４種のヌクレオチドのうち１種により置換されている。
【００１０】
第２の呼出し戦略は２種類のオリゴヌクレオチド・プローブを使用するが、該プローブは、部分的に重複する一連の捕捉オリゴヌクレオチド一組、および蛍光標識された４種の異なる配列決定オリゴヌクレオチドの混合物である。蛍光標識された配列決定オリゴヌクレオチドはそれぞれその５’位に固有のヌクレオチドを含むが、その他の４つの部位は縮重させてある。再配列決定は、最初に目的の遺伝子由来のオリゴヌクレオチドをマイクロアレイにハイブリダイズし、次いで蛍光標識された配列決定オリゴヌクレオチドの混合物を加えることによって遂行される。蛍光標識された配列決定オリゴヌクレオチドは、通常、それ自体でハイブリダイズするには短すぎるが、捕捉オリゴヌクレオチドのうちの１つのすぐ隣に縦列してハイブリダイズし、安定しているがニックの入ったＤＮＡ２本鎖を形成することが可能である。このニックの入った２本鎖は熱力学的に安定していることが示されているとはいえ、安定性を改善するためにポリヌクレオチドリガーゼを使用して捕捉オリゴヌクレオチドと蛍光標識された配列決定オリゴヌクレオチドとを連結することも可能である。
【００１１】
エバネッセント波バイオセンサなどの光センサが、診断および研究の環境において様々な物質すなわち検体を検出するために一般的に使用されている。たとえば、ビアコアエービー社（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）（スウェーデン国ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在）製のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）バイオセンサは、表面プラズモン共鳴に基づいており、蛍光標識または放射標識を使用せずに生体分子の相互作用をリアルタイムでモニタするために使用される。サーモバイオアナリシスコーポレーション社（Ｔｈｅｒｍｏ  ＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｐ．）の１部門であるアフィニティセンサーズ社（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）（英国ケンブリッジ所在）は、「共振ミラー」と称する若干異なる光学構造を利用するＩＡｓｙｓ（登録商標）と呼ぶ同様のシステムを製造している。これらのシステムはいずれも、エバネッセント波の屈折率の変化に応答する。変化は、水よりも大きい屈折率を有するリガンドが、センサ表面上に固定化された捕捉分子に結合するときに起きる。そのような結合の例には、可溶性抗原の固定化抗体への結合や１本鎖ＰＣＲ産物の固定化オリゴヌクレオチドへの結合が含まれる。ビアコアエービー社製およびアフィニティセンサーズ社製の装置は質量センサである。というのも、エバネッセント場に結合した質量に比例してシグナルが変化するからである。ビアコアエービー社およびアフィニティセンサーズ社はいずれもセンサに結合する質量の反応速度論をモデル化し、バルク溶液中のリガンド濃度と結合速度との関係を割り出している。
【００１２】
表面プラズモン共鳴センサおよび共振ミラーセンサは、固体／液体界面に結合させた試料をエバネッセント波によって選択的に調査する、全反射減衰法（「ＡＴＲ」）と呼ばれ
るより一般的な表面感受性光学技法を、特化して適用する方法に相当する。ほとんどのＡＴＲの構成では、調査用の照射光を厚い導波路内に閉じ込めるが、その中では光が単純なジグザグパターンで伝播する。最初の近似の結果に対し、エバネッセント波と表面結合試料との相互作用は、導波路‐溶液界面における光の１センチメートル当たりの反射数（Ｎ）と共に直線的に増加する。この反射数は、単純な式Ｎ＝ｃｏｔθ／２Ｄ［式中、Ｄおよびθはそれぞれ導波路厚およびモード伝播角である（図Ｂ．１）］を使用し算出することが可能である。したがって、特定の反射角における所与の表面光学測定については、１μｍ厚のガラス導波路は、１５０μｍ厚のカバーガラスの１５０倍の感度、１ｍｍ厚の顕微鏡スライドガラスの１０００倍の感度であり得る。
【００１３】
エバネッセント波バイオセンサには、ファイバ導波路および平面導波路も含まれるが、それらの導波路は非常に薄いので、結合された（ｉｎｃｏｕｐｌｅｄ）光はもはや単純光線として伝播しない。その代わりに、導波路厚がおよそ数μｍ（ミクロン）であるとき、結合された（ｉｎｃｏｕｐｌｅｄ）光は、強め合う干渉パターンおよび弱め合う干渉パターンを形成する。導波モードは、光が導波路へ伝播することを可能にする個別の１組の強め合う干渉パターンである。一般に、導波光の９５％超は、導波路自体に閉じ込められる。エバネッセント波とは、導波路表面に隣接する屈折率の低い媒体中にちょうど１ミクロンの数割程度だけ浸透する、残る５％またはそれ以下の光強度をさす。
【００１４】
平面導波路は当技術分野では周知であり、一般に間を空けて置いた２つの平面からなる平面形をしている。射出成形厚膜導波路や一体型薄膜光導波路（「ＩＯＷ」）を含め、様々な型の平面導波路センサが当技術分野では周知である。平面導波路は、特許文献１〜４［全てヘロンら（Ｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に発効］、および特許文献５，６［いずれもライヒェルトら（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）に発効］に記載されており、これらを本願明細書に援用する。
【００１５】
エバネッセント波バイオセンサは、蛍光標識の有無に関わらず機能するように設計されている。先に述べたように、表面プラズモン共鳴およびその他の標識不要の光センサはエバネッセント波中の質量変化に応答する。しかし、質量センサには、蛍光センサに比べて少なくとも２つの制限がある。第１に、質量センサは、特異的にせよ非特異的にせよエバネッセント波内で結合しているいかなる分子にも応答する。このような理由で非特異的結合（「ＮＳＢ」）は質量センサでは重大な問題である。ビアコアエービー社およびアフィニティセンサーズ社は共に、ＮＳＢが少ない固定化の化学手法の開発に多大な努力を傾けてきた。第２の制限は、質量検出が蛍光検出よりも感度が低いので、所与の濃度の検体を測定するためには質量センサは蛍光センサに比べはるかに広い感受領域を必要とすることである。したがって、低濃度の検体を検出するためには蛍光検出の感度のほうが好ましい。
【００１６】
それに反して、蛍光バイオセンサでは、検出は蛍光標識した「トレーサ」分子をリガンド‐捕捉分子複合体に特異的に結合させることによって実現する。特異的結合は、可溶性抗原を固定化抗体に、または１本鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチド・プローブに結合させることを含むがそれだけには限らない親和性相互作用によって実現される。あるいは、蛍光標識した検体またはリガンド分子を固定化捕捉分子に直接結合させる。この後者の条件は、核酸ハイブリダイゼーション検定には好ましい。というのは、ＰＣＲを使用して蛍光標識を検体分子中に直接組み込むからである。いずれの場合にせよ、ＮＳＢはエバネッセント波中に生じる何らかの分子に伴う問題というよりは、蛍光標識した分子に伴う問題にほかならない。したがって蛍光が好ましい検出方法である。
【００１７】
より具体的には、光バイオセンサは、分子診断またはＭＤｘ検定としても知られている核酸プローブ検定を実施するために使用される。ヘテロ２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼー
ション反応速度は、ホモ２本鎖ＤＮＡのそれと比べて緩慢であり低い定常値に達することが知られている。さらに、Ａ・Ｔ含有量およびオリゴヌクレオチド長の変動はハイブリダイゼーション反応速度に影響を及ぼす。野生型プローブおよび突然変異体プローブの対を使用し、２つのハイブリダイゼーション速度の比（Ｒｍｕｔ／Ｒｗｔ）を割り出し、それによってＡ・Ｔ含有量およびオリゴヌクレオチド長を標準化することで、こうした要因を制御することが可能である。
【００１８】
当技術分野で周知のバイオセンサの大多数は、蛍光光ファイバセンサまたは無標識表面プラズモン共鳴センサであるが、干渉法、回折法、およびエバネッセント照射光散乱器を含む他の無標識エバネッセント波方式も記載されている。最近では、臨床適用でのエバネッセント波バイオセンサの使用が開示されている。ニルソンら（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の非特許文献１では、表面プラズモン共鳴を使用して乳房腫瘍生検材料中のヒト腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の存在を検出している。臨床ＤＮＡ試料中のＳＮＰを、ＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション速度と野生型のハイブリダイゼーション速度とを比較することによって検出する。不適合塩基を含んでいたＰＣＲ産物は、野生型と比較してハイブリダイゼーションのレベルが低くなる。
【００１９】
ピレバーら（Ｐｉｌｅｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．）の非特許文献２では、２５ｐＭ濃度のヘリコバクターピロリＲＮＡを蛍光光ファイバセンサを使用して検出し、蛍光エバネッセント波センサで高感度ＭＤｘ検定を実施可能であることが示されている。
【００２０】
非特許文献３は、リアルタイムで核酸ハイブリダイゼーションを検出するためにＨａｒｔｍａｎ干渉計を使用することを開示している。Ｈａｒｔｍａｎ干渉計は、直線偏光の単一平面波を使用して相補的１本鎖プローブへの標的核酸のハイブリダイゼーションを検出する光センサである。この検定は、４塩基対の不適合を有する配列を区別することが可能である。
【００２１】
非特許文献４では、光導波路を使用して、オリゴヌクレオチド複合体のオリゴヌクレオチド・プローブへの結合反応速度および解離反応速度をモニタリングすることによってＳＮＰを検出する。ＳＮＰは、セレン結合体により生じるシグナルによって検出される。
【００２２】
非特許文献５は、ハイブリダイゼーション反応速度を使用してペプチド核酸（「ＰＮＡ」）‐ＤＮＡ２本鎖やＰＮＡ‐ＲＮＡ２本鎖などの核酸模倣体間のＳＮＰを検出することを開示している。ＳＮＰは表面プラズモン共鳴を使用して検出される。
【００２３】
非特許文献６では、核酸ハイブリダイゼーション検定に表面プラズモン共鳴を使用してＨＩＶ‐１ゲノム配列中の突然変異を検出する。この検定は、突然変異を検出するためにハイブリダイゼーション反応速度およびリアルタイム・モニタリングを使用する。
【００２４】
非特許文献７は、ヌクレオチドのハイブリダイゼーション検定を使用して核酸配列中の小さな変異を検出することを開示している。この変異は光ファイバセンサを使用して蛍光検出される。
【００２５】
特許文献７は、核酸ハイブリダイゼーション検定に平面導波路を使用して標的ポリヌクレオチドを検出することを開示している。この検定はハイブリダイゼーションを検出するために蛍光を使用する。
【００２６】
特許文献８〜１０は、少なくとも１つの平面導波路を使用して不透明流体中の目的の検体を定量検出する検定を開示している。これらの検定は、核酸ハイブリダイゼーションを判定しリアルタイムにデータを取得するために蛍光色素を使用する。
【特許文献１】米国特許第５，５１２，４９５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７７，１９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４６，８４２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２２２，６１９号明細書
【特許文献５】米国特許第８，８３２，１６５号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８１４，５６５号明細書
【特許文献７】国際公開第９９／４７７０５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９６／３５９４０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９５／３３１９７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９５／３３１９８号パンフレット
【非特許文献１】ニルソン、ピー（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｐ．）、ビー  パーソン（Ｂ．Ｐｅｒｓｓｏｎ）、エー  ラーソン（Ａ．Ｌａｒｓｓｏｎ）、エム  ウーレン（Ｍ．Ｕｈｌｅｎ）、およびピー  エー  ニグレン（Ｐ．Ａ．Ｎｙｇｒｅｎ）「表面プラズモン共鳴による臨床試料由来ＰＣＲ産物中の突然変異の検出（Detection of mutations in PCR products from clinical samples by surface plasmon resonance ）」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、第１０巻、７〜１７ページ、１９９７年
【非特許文献２】ピレバー  エス（Ｐｉｌｅｖａｒ，Ｓ．）、シー  シー  デービス（Ｃ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ）、およびエフ  ポーチュガル（Ｆ．Ｐｏｒｔｕｇａｌ）「ハイブリダイゼーションを検定するための近赤外線フルオロフォアを用いる先細光ファイバセンサ（Tapered optical fiber sensor using near-infrared fluorophores to assay hybridization）」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第７０巻、２０３１〜７ページ、１９９８年
【非特許文献３】シュナイダーら（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４３巻（９）：１７５７〜１７６３ページ、１９９７年
【非特許文献４】スティンプソンら（Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１３巻：７３〜８０ページ、１９９６年
【非特許文献５】イェンセンら（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻：５０７２〜５０７７ページ、１９９７年
【非特許文献６】ビアンキら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第８巻：１９９〜２０８ページ、１９９７年
【非特許文献７】アベルら（Ａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第６８巻：２９０５〜２９１２ページ、１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
したがって、エバネッセント波センサを使用しＳＮＰを検出する方法の改善が依然として必要とされている。さらに、蛍光検定に平面導波路を使用するＳＮＰの検出方法も依然として必要とされている。方法は、リアルタイムに蛍光をモニタリングすることによって検定時間を短縮することが好ましい。さらに、目的の遺伝子内の既知および未知の突然変異を検出するためのハイスループット遺伝子スクリーニング検定も依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、目的の遺伝子中のＳＮＰを検出する方法に関する。複数の野生型プローブおよびＳＮＰプローブを平面導波路上に固定化する。次いで、蛍光標識した検体を平面導波路上に流す。野生型プローブおよびＳＮＰプローブへの検体の結合をリアルタイムで検出し、これらのハイブリダイゼーション反応速度を比較する。野生型プローブは、目的の遺伝子の野生型配列に相補的なヌクレオチド配列からなり、ＳＮＰプローブは野生型配列の
ＳＮＰを含む配列に相補的なヌクレオチド配列からなる。
【００２９】
本発明は、ハイブリダイゼーションによる配列決定で目的の遺伝子中のＳＮＰを検出する方法も開示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、蛍光標識したＤＮＡ試料中の目的の遺伝子中のＳＮＰを検出することに関する。平面導波路蛍光バイオセンサ技術を使用し、複数のＳＮＰプローブおよび野生型プローブを導波路上に固定化する核酸ハイブリダイゼーション検定を使用してＳＮＰを検出する。ＳＮＰプローブおよび野生型プローブに結合するＤＮＡ試料のハイブリダイゼーション反応速度をリアルタイムにモニタリングすることによってＳＮＰを検出する。
【００３１】
本発明は、エバネッセント波バイオセンサを使用し合成オリゴヌクレオチド試料中のＳＮＰを検出することにも関する。目的の遺伝子に相補的なヌクレオチド配列からなる捕捉プローブを平面導波路上に固定化する。２種の検体を合成し蛍光標識する。野生型検体は捕捉プローブの配列に相補的なヌクレオチド配列からなる。ＳＮＰ検体は、野生型検体の配列に比べてＳＮＰを有する配列からなる。捕捉プローブに結合する検体のハイブリダイゼーション反応速度をリアルタイムにモニタリングすることによってＳＮＰを検出する。
【００３２】
ＳＢＨによってＳＮＰを検出する方法も開示される。捕捉プローブを平面導波路上に固定化し、４種の異なる蛍光標識した縮重配列決定プローブ（ＡＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、ＣＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、ＧＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、およびＴＸＸＸＸ‐Ｃｙ５）を合成する。捕捉プローブに目的の遺伝子由来の検体プローブをハイブリダイズすることによって再配列決定を実現する。次いで、配列決定プローブを加える。検体プローブ、捕捉プローブ、および配列決定プローブの組合せはそれぞれ異なるハイブリダイゼーション速度を示す。配列決定プローブ中のヌクレオチドに適合（マッチング）する中央の変異ヌクレオチドを有する検体プローブが最高のハイブリダイゼーション速度を示し、不適合（ミスマッチ）対では速度が遅くなる（リジェクション）。４種の異なる蛍光標識した非縮重配列決定プローブを合成し再配列決定に使用することも可能である。
【００３３】
１実施形態では、複数のＳＮＰプローブを平面導波路上に固定化すればよい。それぞれが目的の遺伝子の野生型配列に相補的な配列からなる複数の野生型プローブも平面導波路上に固定化してよい。野生型プローブの配列とＳＮＰプローブの配列とは、１つの塩基が異なっていればよい。次いで、蛍光標識した検体を含む溶液を平面導波路上に流す、または通過させればよい。検体と、野生型プローブおよびＳＮＰプローブのそれぞれとの間の結合は、検出可能な蛍光シグナルの変化を引き起こし得る。蛍光量は、検体とＳＮＰプローブ、および検体と野生型プローブとの間の結合レベルに応じて変わりうる。検体中のＳＮＰの存在は、検体とＳＮＰプローブのハイブリダイゼーション反応速度、および検体と野生型プローブのハイブリダイゼーション反応速度を比較することによって検出することが可能である。
【００３４】
検体は、１本鎖ＰＣＲ産物や患者から単離したＤＮＡなどのＤＮＡ試料からなり得る。検体は、患者から単離した目的の遺伝子またはその領域でよい。検定を最適化する際に２種の検体を使用可能なことも意図される。これらの２種の検体は、患者ＤＮＡから単離増幅した１本鎖オリゴヌクレオチドに類似する合成オリゴヌクレオチドでよい。検体の１種、野生型検体は野生型プローブに相補的であり、他方第２の検体、ＳＮＰ検体はＳＮＰプローブに相補的である。
【００３５】
光源から発せられる光の波長によって刺激を受けて蛍光を発する蛍光色素で検体を標識すればよい。たとえば、光源が赤色光を発する場合、赤色波長域の波長による励起で蛍光
が刺激される蛍光色素によって検体の５’末端を標識すればよい。そのような色素がＣｙ５であり、バイオロジカル・ディテクション・システムズ・インコーポレイテッド社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ所在）またはアマシャムバイオサイエンシズ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入可能な赤色蛍光色素である。しかし、赤色波長域の波長による励起で蛍光が刺激され得る他の色素も使用可能であることも考えられる。検体はＰＣＲによる調製が可能であり、Ｃｙ５標識プライマーを使用してＤＮＡ合成を開始することができる。従って、ＰＣＲ産物はその５’末端にＣｙ５色素を含みうる。
【００３６】
ＳＮＰプローブは、目的の遺伝子内の既知のＳＮＰ配列に相補的（結合という意味で）であるヌクレオチド配列からなっていればよい。すなわち、ＳＮＰプローブは野生型配列のＳＮＰを含む配列に相補的であってよい。ＳＮＰプローブおよび野生型プローブは、当技術分野で周知の手段によって平面導波路上に固定化することが可能である。ＳＮＰプローブおよび野生型プローブを、アビジンやニュートラアビジンなどの蛋白質耐性コーティングを使用して導波路上に固定化することが好ましい。ＳＮＰプローブおよび野生型プローブは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）プローブとしても知られている。ＳＮＰプローブおよび野生型プローブは、配列の中央付近に変異部位を有する１５〜２５ヌクレオチド長のものであってよい。
【００３７】
別の実施形態では、１種類のプローブ、捕捉プローブを平面導波路上に固定化しうることが意図される。捕捉プローブは、目的の遺伝子またはその領域に相補的なヌクレオチド配列からなり得る。２種の検体、野生型検体およびＳＮＰ検体は、患者からＤＮＡまたはＰＣＲ産物を得るのではなく、合成する。野生型検体は、捕捉プローブの配列に相補的なヌクレオチド配列からなる。ＳＮＰ検体は、１箇所に１つの不適合対があることを除いて野生型検体の配列とほぼ同一の配列からなる。
【００３８】
本発明の平面導波路は、射出成形厚膜導波路またはＩＯＷを含みうる。平面導波路の基板は、正方形または長方形の顕微鏡スライドガラスまたはカバーガラスでよい。基板用の他の材料には、それだけには限らないが、高鉛ガラス、石英、または光学プラスチックが含まれうる。射出成形厚膜導波路は、オプコル・インコーポレイテッド社（Ｏｐｋｏｒ，Ｉｎｃ．）（米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在）から購入可能である。これらの導波路は使い捨てで比較的低価格なので、目的の遺伝子内の既知および未知の突然変異用の検定の開発に好ましいかもしれない。本発明で使用されるＩＯＷは、特許を取得した設計に基づくものであり、ライヒェルト博士（Ｄｒ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）［デューク大学、米国ノースカロライナ州ダラム（Ｄｕｒｈａｍ）所在］から購入可能である。１センサにつき数百または数千のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション検定が必要なときはＩＯＷが使用可能である。
【００３９】
本発明のハイスループットスクリーニングの特徴を得るため、平面導波路上に固定化するハイブリダイゼーション・プローブの密度を劇的に上げることが可能である。密度を上げるためには、プローブを様々な技法によって平面導波路上にパターン化すればよい。固体表面へハイブリダイゼーション・プローブのマイクロアレイを固定化するには、プリント法、スタンプ法、および光パターニングを含むいくつかのパターン化法が知られている。プリント法では、インクジェット・プリンタを使用し平面導波路表面上にハイブリダイゼーション・プローブを噴霧することができる。スタンプ法では、アレイ状のピンまたはマイクロピペットを使用し平面導波路表面上にハイブリダイゼーション・プローブをスポットすることが可能である。プリント法およびスタンプ法によって単一平面導波路上に１００〜２００個のアレイ要素をパターン化することが可能となる。１０００個以上のアレイ要素のパターン化に関しては、光パターニングまたはフォトリソグラフィを使用することが可能である。
【００４０】
平面導波路を、ヘロン博士（Ｄｒ．Ｈｅｒｒｏｎ）、クリステンセン博士（Ｄｒ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、およびライヒェルト博士（Ｄｒ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔ）により開発されたフローセルと併せて使用する。フローセルは、２個の別々の部品、アルミニウム製の天板および底板で構築される。天板を工作処理して１個、２個、または３個の並列流路チャンバを作出し、各流路チャンバは小さな流入ポートおよび排出ポートを備えるものとする。底板内部は、導波路を支持し底部に透明な視界を提供するために工作処理する。フローセル全体を陽極酸化して黒色平面とする。導波路に隣接する低屈折率のＴｅｆｌｏｎ（商標）層と、天板に隣接するシリコンゴム層との複合ガスケットを使用し、天板を導波路に対して密閉する。フローセルの４隅に位置する４個の刻み目付きボルトを締めることによって、システムを密閉するための機械的圧力を加える。
【００４１】
カブロサイエンティフィックインコーポレイテッド社（Ｃａｖｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）製のコンピュータ制御３筒式シリンジ・ポンプを使用して、試料を流路チャンバ中に注入する。各チャンバの試料量は１００μＬである。フローセルの温度は、フローセルの天板上に装着されたコンピュータ制御ペルチェ素子によって制御する。温度は、−１０℃〜８０℃にわたる範囲で変化する。シリンジ・ポンプおよびペルチェ素子は共に、ラブビュー（ＬａｂＶｉｅｗ）マクロ言語で記載された、機器制御およびデータ取得用のプログラムによって制御される。このソフトウェアは、ＭａｃＯＳまたはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のプラットフォームで作動する。
【００４２】
異なる天板（１‐、２‐、または３‐チャンバ）を利用できることによって実験設計は柔軟なものになる。たとえば、１人の患者から入手したＰＣＲ産物を目的の遺伝子内の多数の突然変異に関して１つのチャンバフローセルを使用してスクリーニングしてもよいし、または３人の異なる患者から入手したＰＣＲ産物を少数の突然変異に関して３‐チャンバフローセルを使用してスクリーニングしてもよい。あるいは、較正目的で余ったチャンバを使用することも可能である。たとえば、患者から入手したＰＣＲ産物を１つのチャンバに注入する一方、他の２つのチャンバに正の対照および負の対照を注入する。
【００４３】
ＳＮＰプローブまたは野生型プローブへの検体のハイブリダイゼーションによって生じる蛍光変化を検出するどんな手段も使用可能である。検出器は、当技術分野で周知なように、発した蛍光の波長域中の光を検出するのに有用な光検出器からなり得る。蛍光の変化を、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）カメラを使用してリアルタイムでモニタリングすることが好ましい。
【００４４】
ハイブリダイゼーション反応速度は、オリゴヌクレオチド長、検定温度、ハイブリダイゼーション緩衝液などの要因を最適化することによって様々な実験条件下で検査することが可能である。通常の条件下では、検体は異なる反応速度および平衡２本鎖濃度でＳＮＰプローブおよび野生型プローブの両方とハイブリダイズすることが可能である。既に述べたように、ヘテロ２本鎖（野生型オリゴヌクレオチドおよび突然変異型オリゴヌクレオチドのハイブリッド）ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応速度は、ホモ２本鎖（２本の野生型オリゴヌクレオチドのハイブリッド）ＤＮＡの反応速度と比べて遅いことが知られている。したがって、ＳＮＰプローブへの検体のハイブリダイゼーション速度は、野生型プローブへの検体のハイブリダイゼーション速度よりも遅い。２種のプローブの配列は１塩基対だけ異なっているので、ハイブリダイゼーション速度の比較によってＳＮＰを検出することが可能である。
【００４５】
野生型プローブおよびＳＮＰプローブは１塩基しか違わないので、検体と両プローブとの間では、特にそれらの融解温度より十分低い場合に著しいレベルのハイブリダイゼーションが予想される。ハイブリダイゼーション反応速度間の差異をさらに増大するために、
またはハイブリダイゼーション反応速度を識別するために、温度、ｐＨ、対イオン濃度などのハイブリダイゼーション条件を変更することが可能である。望ましいハイブリダイゼーション速度の識別は、ハイブリダイゼーション緩衝液にＴＭＡ塩またはベタインを加えることによって実現可能である。さらに、修飾ヌクレオチドを使用してＡ・Ｔ塩基対の安定性を増大させることも可能である。さらに、ＰＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドはＤＮＡ／ＤＮＡ２本鎖よりも安定している可能性があること、不適合塩基は２本鎖ＤＮＡの融解温度よりもＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの融解温度に対して高い不安定化作用を有することも知られている。したがって、本発明のハイブリダイゼーション・プローブをそのＰＮＡの同等物に置き換えてもよいことも考慮される。
【００４６】
ハイブリダイゼーション反応速度は、検定温度およびハイブリダイゼーション・プローブ長を最適化する手段として使用することも可能である。検定の最適化に際し、ＰＣＲで増幅させた患者ＤＮＡの代わりに１組の蛍光標識したモデル検体を使用することが可能である。各突然変異に対して２種の異なる検体が必要となり得る。たとえば、１検体、野生型検体が野生型配列を含む一方で、第２の検体ＳＮＰ検体はＳＮＰを含む。モデル検体は、ＰＣＲを使用して患者ＤＮＡから単離増幅した１本鎖オリゴヌクレオチド配列に類似する合成オリゴヌクレオチドでよい。モデル検体は、Ｃｙ５で５’末端を標識することが可能であり、蛍光色素で５’末端を標識した開始プライマーを使用して生成させたＰＣＲ産物のようなものでよい。検定条件および導波路パターン化手順を一度最適化してしまえば、平面導波路技術の多チャネルの性質によって数百のプローブを１つの平面導波路上に固定化することが可能となる。
【００４７】
蛍光は、ユタ大学のダグラス  クリステンセン博士（Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）によって構築されたＭａｒｋ１．５エバネッセント波イメージング蛍光計で測定する。先に述べたように平面導波路をフローセル中に装着してセンサ部を形成する。次いで、励起光に対する導波路の位置合わせ精度の高いＭａｒｋ１．５蛍光計上の装着プレートに、該センサ部を固着する。１２ｍＷの６３５ｎｍの赤色光を発するダイオードレーザーを光源として使用する。このレーザーの出力を一連のコリメートレンズを使用してシートビームに成形し、次いで鏡で反射してＩＯＷの回折格子中に（または厚膜導波路の場合にはカップリングレンズに）送る。光が一度平面導波路の内側に閉じ込められると、導波路の側面から側面へ反射して各反射点でエバネッセント場を作り出す。
【００４８】
このエバネッセント場は、フローセル中の溶液中へと約１００ｎｍ減衰し捕捉プローブにハイブリダイズしているＣｙ５標識検体を励起する。蛍光発光は全方向に放射される。平面導波路を通って移動しフローセル底部の窓を通る蛍光発光の部分を収集し、ＣＣＤカメラ［サンタバーバラインスタルメントグループ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ）］によって画像化する。このカメラは、焦光用５５ｍｍ  ｆ／２．８マクロレンズ［ニコン社（Ｎｉｋｏｎ）］、散乱光の阻止用６７０ｎｍバンドパス干渉フィルタ［オリオン（Ｏｒｉｏｎ）］を装備している。ＣＣＤ像を収集し、前述のラブビューマクロ言語で記載されている機器制御およびデータ取得プログラムによって加工する。このソフトウェアは、異なる空間分解センサ帯に像を「まとめ入れ（ｂｉｎ）」し、また非線形最小二乗フィッティングルーチンを使用して検定時間５分にわたる１組のデータセットの平均ハイブリダイゼーション速度を算出する。
【００４９】
さらに別の実施形態では、ＫＶＬＱＴ１遺伝子中のＳＮＰを検出することが可能である。既に述べたように、ＫＶＬＱＴ１中の多くの突然変異はＳＮＰである。ＳＮＰの存在によって２つのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションが変化するので、先に述べたようにハイブリダイゼーション反応速度をモニタリングすることによってＫＶＬＱＴ１遺伝子中のＳＮＰの検出が可能である。ＫＶＬＱＴ１中のＳＮＰを検出するためには、ＫＶＬＱＴ１中の既知のＳＮＰのそれぞれについて１組の捕捉プローブを合成すればよい。捕捉
プローブの１つはＳＮＰプローブでよく、ＫＶＬＱＴ１中の既知のＳＮＰ配列に相補的なヌクレオチド配列からなりうる。第２のプローブは野生型プローブでよく、ＫＶＬＱＴ１またはその領域に相補的な配列からなる。２つのプローブの配列は１ヌクレオチドだけ異なっていることが好ましい。各プローブの５’末端をビオチン化し、ニュートラアビジンでコーティングした平面導波路に固定化することができる。次いで、患者から得たＤＮＡ試料を含む溶液を平面導波路上に通過させて、該ＤＮＡ試料が既知のＳＮＰを含むかどうか判定することが可能である。ＬＱＴＳは常染色体優性なので、ほとんどの罹患個体は突然変異に関してヘテロ接合であり、１つの野生型遺伝子と１つの突然変異対立遺伝子を有している可能性がある。野生型配列に関してホモ接合である個体はハイブリダイゼーションの比が低くゼロに近いが、ヘテロ接合の個体は１に近い比を有しうる。突然変異に関してホモ接合の個体で稀に１をはるかに超える比であることもある。
【００５０】
上記の対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション手法を使用してＫＶＬＱＴ１遺伝子内の既知の突然変異について患者をスクリーニングすることが可能であるが、予め目録化されていないＫＶＬＱＴ１内の突然変異を同定するためにはＳＢＨが必要となるかもしれない。ＳＢＨはＩＯＷセンサ形式に適用可能であるが、ＫＶＬＱＴ１遺伝子に対して完全に遂行するには、導波路に固定化するための約２０００個のデカヌクレオチド（１０ｍｅｒ）のハイブリダイゼーション・プローブのアレイが必要となり得る。そのハイブリダイゼーション・プローブ数はＩＯＷセンサの受入れ能力内にあるが実現可能性の検討には巨大すぎるかもしれない。
【００５１】
ＳＨＢがハイスループットスクリーニング検定で成功し得るかどうか判定するためには、単一点突然変異を含む短い配列（５〜１０ヌクレオチド長、好ましくは４〜８ヌクレオチド長）をスクリーニングすればよい。さらに、野生型配列および再配列決定しようとする位置のそれぞれで考えられる突然変異全てを含む一連のモデル検体を合成することも可能である。単一多型を含む目的の遺伝子の目的の部分を再配列決定するために、平面導波路バイオセンサを使用してハイブリダイゼーション速度をモニタすることが可能である。１０ｍｅｒの捕捉プローブを平面導波路上に固定化すればよく、４種の異なる蛍光標識した縮重配列決定プローブ（ＡＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、ＣＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、ＧＸＸＸＸ‐Ｃｙ５、ＴＸＸＸＸ‐Ｃｙ５）を合成すればよい。目的の遺伝子に由来する検体プローブ（２１ｍｅｒ）を導波路表面上の捕捉プローブに最初にハイブリダイズさせることによって、再配列決定が実現可能となる。次いで、配列決定プローブを加えればよい。中央（１１番目）位置で４種のヌクレオチドの１つに置換されている検体プローブは、それぞれ異なるハイブリダイゼーション速度をもたらし得る。配列決定プローブ中のヌクレオチドに適合する中央の変異ヌクレオチドを有する検体プローブが最も高いハイブリダイゼーション速度をもたらし得る一方で、不適合対は低い速度（リジェクション）を示し得る。４種の異なる蛍光標識した非縮合配列決定プローブを合成し再配列決定に使用することも可能である。
【００５２】
ＳＢＨがうまくいくかどうかはホモ２本鎖およびヘテロ２本鎖形成のハイブリダイゼーション速度をいかに首尾よく識別するかにかかっており、望みどおり識別するためには、既に述べた通り、ハイブリダイゼーション緩衝液へのＴＭＡ塩またはベタインの添加、ヌクレオチドの修飾、またはＰＮＡプローブの使用が必要となるかもしれない。
【００５３】
これらの短い配列でＳＢＨがうまくいくならば、ＫＶＬＱＴ１遺伝子に由来する単一転写領域（エクソン）など、より大きな遺伝子領域を再配列決定した後、ＫＶＬＱＴ１遺伝子全体を再配列決定することも可能である。患者ＤＮＡからＫＶＬＱＴ１遺伝子（および他のＬＱＴＳ遺伝子）を単離するために使用したヌクレオチドプライマーはエクソンのレベルで用意されているので、ＫＶＬＱＴ１中の異なるエクソンに対応する再配列決定アレイを作製すればよい。したがって、これらのエクソンのいずれかの再配列決定は、捕捉プ
ローブの中密度アレイで実現することが可能である。
【００５４】
既に述べた通り、多数のＳＮＰがＫＶＬＱＴ１の第７エクソンにマッピングされており、第７エクソンが突然変異のホットスポットである可能性がある。したがって、第７エクソンは、ＳＢＨの実行可能性を判定するための優れた候補である可能性がある。第７エクソンは長さが１１１塩基対にすぎないので、第１の呼出し法での使用には約４００個のオリゴヌクレオチドの再配列決定アレイが必要であるが、第２の呼出し法での使用には約１００個のオリゴヌクレオチドしか必要でない。しかし、他のエクソン中のＳＮＰが使用可能なことも考慮される。
【００５５】
遺伝子全体の再配列決定は、８０〜２００ヌクレオチド長でありうるＫＶＬＱＴ１遺伝子由来のオリゴヌクレオチドを最初にマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いで配列決定プローブの混合物を加えることによって実現し得る。配列決定プローブ（５ｍｅｒ）は、それ自体がハイブリダイズするには短すぎるが、捕捉プローブ（１０ｍｅｒ）のうちの１個のすぐ隣に縦列してハイブリダイズし、１５ヌクレオチド長の安定だがニックの入ったＤＮＡ２本鎖を形成する。このニックの入ったＤＮＡ２本鎖が熱力学的に安定していることが示されているとはいえ、安定性を改善するためにポリヌクレオチドリガーゼを使用して捕捉プローブおよび配列決定プローブを連結することも可能である。この戦略の冗長さは、捕捉プローブ中ではなく配列決定プローブ中にあるので、ＫＶＬＱＴ１の全遺伝子スクリーニングには約２０００個の捕捉プローブが必要となり得る。
【００５６】
ＫＶＬＴＱ１中のＳＮＰの検出の他に、これらの技法を、ＬＱＴＳに関与している残りの３つの遺伝子（ＨＥＲＧ、ＳＣＮ５Ａ、ＫＣＮＥ１）中のＳＮＰの検出にも適応させ得る。さらに、該技法を使用して４つ全ての遺伝子中のＳＮＰを同時にスクリーニングすることも可能である。さらに、遺伝性心血管疾患に関与する遺伝子内のＳＮＰの検出について述べてきたが、この技術を任意の疾患に関与する遺伝子内のＳＮＰの検出に適応させることができる。したがって、この技法は、分子診断におけるほぼ全てのハイスループットスクリーニングへの適用にも十分適している。
【００５７】
本発明を以下の例示的実施例によってさらに説明する。
【実施例１】
【００５８】
２つの相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションをリアルタイムにモニタするために、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモータ部位をモデル系として選択した。Ｔ３部位は、以下の配列を有する２０塩基にわたる領域である：５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ３’（配列番号１）。Ｔ３配列およびその相補的配列アンチＴ３の両方に対するオリゴヌクレオチドプライマーは市販されている。これらは蛍光標識もされており核酸配列決定に使用される。
【００５９】
アビジンが一体型光導波路および射出成形導波路の両方に等しく良好に吸着するという先の観察に基づき、導波路にＴ３オリゴヌクレオチドを固定化するためにアビジン／ビオチン系を使用した。２０ｍｅｒのＴ３を、６炭素原子のスペーサを介して５’末端でビオチン化し、次いで予めアビジンまたはニュートラアビジンでコーティング済みの射出成形平面導波路または一体型光導波路に固定化した。２０ｍｅｒのアンチＴ３の５’末端を、赤色蛍光発光色素Ｃｙ５により標識した。得られたＣｙ５標識検体は、ＭＤｘ臨床検定に使用可能な検体に非常に類似していた。
【００６０】
Ｔ３／アンチＴ３ハイブリダイゼーション反応用の射出成形バイオセンサの反応速度応答を、３つの対照と共に図１に示す。４例全てにおいて１０ｎＭのＣｙ５標識アンチＴ３溶液をフローセル中に注入したが、各例において異なる捕捉分子または複合体を検査した
。アビジンまたはニュートラアビジンへのＣｙ５‐アンチＴ３の非特異的結合を、それぞれ白抜きの丸および白抜きの四角で表す。興味深いことに、かなりの程度のＮＳＢがアビジンで観察されたが、ニュートラアビジンでは観察されなかった。これは、おそらく、アビジンはｐＩ値が高くｐＨ７．４で正に荷電し、これにより負に荷電したトレーサオリゴヌクレオチドとの間に静電相互作用をもたらし得るためである。この観察に基づきその後の研究ではアビジンの代わりにニュートラアビジンを使用した。第３の対照では、同じヌクレオチド配列の２つのオリゴヌクレオチド間に非特異的結合が存在するかどうかを検査した。この場合は、ビオチン化アンチＴ３をニュートラアビジンでコーティングした導波路に固定化した（黒菱形）。類似オリゴヌクレオチド間の結合は無視することができた。最後に、相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを、ニュートラアビジンでコーティングした導波路にビオチン化Ｔ３を固定化することにより検査した（黒丸）。非常に強力な結合が観察され、２分より短い間に１０７センサ単位に達した。平面導波路としてＩＯＷを使用しても同様の結果が得られた（データは図示せず）。
【実施例２】
【００６１】
Ｔ３／アンチＴ３ハイブリダイゼーション検定を、室温で１０ｐＭ〜１００ｎＭの範囲の多種類の濃度のＣｙ５標識アンチＴ３について実施した。図２では、結合速度をトレーサオリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。検定のダイナミックレンジが広い（４桁）ので両対数プロットを使用した。同じデータを差込図のリニア軸上にプロットする。データは、ミカエリス定数約７８ｎＭでミカエリス‐メンテンのモデルに合うことが判明した（曲線のフィッティングパラメータも図中に示す）。これらのデータに関して分析感度値１．４ｐＭが算出された。これらの結果からこのバイオセンサがＭＤｘ検定の実施に理想的なプラットフォームであることが示された。というのは、このバイオセンサは感度が高く（数ピコモル濃度）かつ迅速（５分間検定）であり、リアルタイムにハイブリダイゼーション反応をモニタすることが可能というさらなる利点を提供するからである。
【実施例３】
【００６２】
不適合塩基がオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度に変化を引き起こすかどうか判定するために、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）モデル系を使用した。ＰＳＡは、ヒト蛋白質腺性カリクレイン（ｈＧＫ２）に高度の相同性を示すが、この蛋白質も前立腺によって分泌される。したがって、ハイブリダイゼーション研究においては、固定化したハイブリダイゼーション・プローブがＰＳＡメッセージ由来のｃＤＮＡにしか結合せず、ｈＧＫ２メッセージ由来のｃＤＮＡには結合しないことが重要である。ＰＳＡ遺伝子の第４エクソン中の領域は、２０部位のうちの７つの位置でｈＧＫ２と異なっている配列を含んでいる。この配列を認識するアンチＰＳＡと称するハイブリダイゼーション・プローブ（５’‐ＧＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＧ‐３’）（配列番号２）を合成し５’末端でビオチン化した。さらに２個のオリゴヌクレオチドを合成し、Ｃｙ５で標識し、モデル検体として使用した。これらのオリゴヌクレオチドの１つ（５’‐ＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＣ‐３’）（配列番号３）はＰＳＡと称するが、ＰＳＡのｃＤＮＡ配列に由来するものとした。ｈＧＫ２と称する他方のオリゴヌクレオチド（５’‐ＣＣＡ・ＣＡＡＧＴＧＴＣＴＴＴＡＣＣＡＣ‐３’）（配列番号４）は、ｈＧＫ２のｃＤＮＡ配列に由来するものとした。
【００６３】
ビオチン化アンチＰＳＡプローブをニュートラアビジンでコーティングした射出成形導波路に固定化した。Ｃｙ５標識ＰＳＡまたはＣｙ５標識ｈＧＫ２の１ｎＭ溶液をフローセル中に注入した。これらの反応の両方についてのハイブリダイゼーション反応速度曲線を図３に示す。ホモ２本鎖に対して非常に速いハイブリダイゼーション速度が観察され（白抜きの丸として示す）、他方ヘテロ２本鎖に対して観察された速度（白抜きの四角として示す）は統計学的にバックグラウンドを超えるものではなかった。７個の不適合塩基によりハイブリダイゼーション速度におけるこのような大きな差異があることから、単一突然
変異について有意な差異が観察される可能性がある。
【実施例４】
【００６４】
Ｇ７６０Ａ多型は、ＫＶＬＱＴ１遺伝子の第３エクソンに生じる。この多型を検出するために５’ビオチン化捕捉プローブを合成した。捕捉プローブは２１ヌクレオチド長であり、ＫＶＬＱＴ１遺伝子の位置番号７５０〜７７０に相補的であった。捕捉プローブの配列を以下に示す。
【００６５】
捕捉プローブ：５’ビオチン‐ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧ‐３’（配列番号５）
検定の開発と実現可能性の試験の間は、ヒト供給源由来のＰＣＲ産物ではなく合成オリゴヌクレオチドを検体として使用した。アマシャムバイオテクノロジー社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手した検体は、２１ヌクレオチド長であり５’をＣｙ５標識したものであった。検体の配列は、７６０位（合成検体では１１位）にＧ（野生型検体）またはＡ（Ｇ７６０Ａ多形検体）を含むことを除き、ＫＶＬＱＴ１遺伝子の７５０〜７７０位に相当していた。野生型検体およびＳＮＰ検体の配列を以下に示す。
【００６６】
野生型検体：５’‐Ｃｙ５‐ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴ（配列番号６）
Ｇ７６０Ａ検体：５’‐Ｃｙ５‐ＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴ（配列番号７）
検体はいずれもユタ大学のペプチドおよび核酸合成施設で合成した。次いで、生成物は全て、高圧液体クロマトグラフィを用いて精製し、過剰な塩および１塩基が欠失している「ｎ−１」オリゴヌクレオチドを除去した。次いで、生成物それぞれについて質量スペクトル分析を実施し純度を確認した。質量スペクトルが不十分な生成物は、生成物が全て純粋になるまで再合成し、精製し、分析を実施した。
【００６７】
ハイブリダイゼーション検定を図４に図式的に示す。複数の１本鎖捕捉プローブを平面導波路上に固定化し、可溶性１本鎖検体をその５’末端でＣｙ５により蛍光標識する。検体はバルク溶液を通って拡散し、捕捉プローブとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション事象によって形成される２本鎖ＤＮＡのサイズは検体のサイズによって変化するが、２本鎖ＤＮＡは一般にバイオセンサシステムのエバネッセント場の貫通深度（約１１０ｎｍ）よりも小さい。一度ハイブリダイズすると、検体はエバネッセント場によって選択的に励起され蛍光シグナルを生じる。シグナルを干渉フィルタ［６７０ｎｍ、オメガ社（Ｏｍｅｇａ）］によって集め、収集軸が導波路平面の法線となるように向けたＣＣＤカメラ［（モデルＳＴ‐６  Ｏｐｔｏ‐ｈｅａｄ、サンタバーバラインスツルメンツ社（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）］により検出する。
【００６８】
射出成形平面導波路センサはオプコル・インコーポレイテッド社（Ｏｐｋｏｒ、Ｉｎｃ）［（米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在］によりポリスチレンで作製されたものである。このセンサは、２５×２５×０．５ｍｍの平面導波路および光カップリングレンズ（導波路平面に対して約２０°傾斜）から構成され、両者が単一の部品に成形されている一体型光学デバイスであった。光源は、６３８ｎｍで放射する１５ｍＷ半導体レーザーであった。レーザー光を負の焦点距離レンズによってシート状の光線（２０ｍｍ×ｌｍｍ）に成形し、一体型カップリングレンズによって導波路に結合させた。一度結合させると、光は導波路の上面と下面との間を往復してはね返りながら平面導波路の長さを横断した。光は各反射点で平面導波路内に定在波を生じる。この定在波は、導波路表面に明確な境界を持たなかったが、その代わりに周囲の媒体中に数百ｎｍ入り込む。このいわゆるエバネッセント場の強度は周囲の媒体中に浸透するにつれ指数関数的に減衰する。
【００６９】
平面導波路バイオセンサは、リアルタイムの連続的データ取得に対して潜在能力を有する。しかし、データ収集手順（以下に記述する）ではサンプリング時間は６秒であり、毎分約１０個のデータポイントの収集が可能であった。連続的ではないが、これはｎＭ濃度範囲でのハイブリダイゼーション反応速度のモニタリングには妥当であった。反応速度測定の別の利点は、該測定により終点における単回測定で得られる精度よりも高い精度が得られることである。反応速度測定によってハイブリダイゼーション曲線の形（すなわち、反応速度プロファイル）についての情報も得られ、この情報を利用して２本鎖ＤＮＡ中の不適合塩基の検出が可能となる。最後に、反応速度測定はポリスチレン導波路材料が本来有する蛍光には本質的に非感受性であり、よって検定ノイズ源を低減する。
【００７０】
データ収集サイクルは、以下の４つの工程から構成された。制御コンピュータ［Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａモデル６３６０、アップルコンピュータ社（Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）］による最初の指示により、シャッタを閉じて光源を消灯した状態の平面導波路の「暗像（ｄａｒｋ  ｉｍａｇｅ）」をＣＣＤカメラが撮影した。この暗像を使用し背景ノイズを修正した。次いで、シャッタを開放し光源を点灯した状態で導波路の「明像（ｌｉｇｈｔ  ｉｍａｇｅ）」を撮影した。次いで、明像から暗像を差し引いてシグナルを得た。導波路の３つのチャネルにわたり個々のピクセルを合計して［まとめて（ｂｉｎｎｅｄ）］各区域に関して強度値を得た。このサイクルを６秒間隔で２０回繰り返し、ちょうど２分かけて２１個のデータポイントを得た。機器全ての制御操作に関しては、ＬａｂＶｉｅｗバージョン４．０．１［ナショナルインスツルメンツコーポレーション社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．１９９６年）］を使用した。
【００７１】
反応速度データを２‐パラメータ非線形曲線のフィッティング手法で処理し、ハイブリダイゼーション反応速度曲線の切片（Ａ０）および平均ハイブリダイゼーション速度（Ａ１）を得た。以下の反応速度論モデルが該ハイブリダイゼーションデータにあてはまることが判明した。該モデルにおいて、Ｙは蛍光強度、ｋは使用者が定義した曲線形状係数（実験全てに対して０．３とし、ｔｍｉｄはデータ収集期間の時間中間点、およびｔは時間）である。
【００７２】
【数１】
2005519593.tif 000002
各溶液について数回のハイブリダイゼーション反応をそれぞれ異なる温度で実施した。ハイブリダイゼーション反応の傾きまたは速度を温度に対してグラフ化し、これを使用して個々の配列についての「傾きゼロ」の温度または融点を推定する。
【００７３】
図５に示すように、野生型（プロットＡ）検体およびＧ７６０Ａ（プロットＢ）検体の２本鎖形成では熱力学的には異なるが反応速度は類似している。３２℃における固定化捕捉プローブへの１００ｐＭのＣｙ５標識検体の結合に関する典型的なハイブリダイゼーション反応速度曲線を示す。初期ハイブリダイゼーション速度は速いが、反応が平衡に近づくにつれて連続的に減少するという点で、曲線形は１次反応を示すものである。特に、２本鎖ＤＮＡの平衡濃度（センサ応答は２本鎖ＤＮＡ濃度に比例する）はヘテロ２本鎖よりもホモ２本鎖で高いが、いずれの反応も平衡に達するのにほぼ同じ長さの時間を要する。該ハイブリダイゼーション反応は擬似的な１次反応である。というのは、捕捉プローブが検体に対して１００倍モル過剰に存在するので検体ＤＮＡの溶液濃度が律速となるからで
ある。曲率は、２分よりも長い時点または高温において最も顕著である（データ示さず）。表１に示す通り、極めて短時間または極めて長時間のとき野生型（プロットＡ）検体とＧ７６０Ａ（プロットＢ）検体とが良く識別される。しかし、短時間のときは、最初の数ポイントに依存し過ぎるために精度は低い。
【００７４】
【表１】
2005519593.tif 000003
反応速度曲線が擬似的な１次反応の性質を有することから、１次モデル（方程式１）は、時間データに対する蛍光強度のフィッティング（あてはめ）について律速検体濃度を仮説として導かれた。方程式１は３つのパラメータを含む：強度切片Ａ０、ハイブリダイゼーション速度Ａ１、および技術上の速度定数ｋである。速度定数ｋは、反応速度曲線の曲率の程度について示す実験上の形状係数ｋとも見なし得る。ｋがゼロに近づくにつれて、線は直線に近づく。切片値（Ａ０）は、（検体をフローセル中に注入した直後の）センサの初期強度応答である。切片値は、導波路が本来有する蛍光、干渉フィルタを通る散乱レーザー光の漏れ、散乱レーザー光によるバルク溶液中の非結合Ｃｙ５標識検体の励起などの要因により生じる。モニタするハイブリダイゼーション反応には直接関係しないが、切片値を使用して導波路および／または光収集システムについての品質管理情報を得ることも可能である。ハイブリダイゼーション速度値（Ａ１）は、曲線の時間中間点（ｔｍｉｄ）において（データポイント全てに基づいて）求められた平均速度値である。非線形最小二乗法を使用して、方程式１を図５に示すハイブリダイゼーション反応速度データセットにフィッティングした。様々な中間点を使用してＡ１を求めた結果を表１に示す。野生型およびＳＮＰの結合は極めて短時間または極めて長時間のときに最も良く識別される。極めて短時間のときは最初の数ポイントに大きく依存し精度の低下をもたらす。しかし、長時間待たなければならないようでは高速検定の目的を台無しにする。検定時間および精度の良好な妥協策は２分間検定においては１分である。
【００７５】
非線形曲線フィッティングは計算処理手順であり、連続的に反復して収束させるためには数秒を要する。したがって、非線形曲線フィッティングはハイブリダイゼーション反応速度データのリアルタイムのフィッティングにはあまり適さない。しかし、方程式１を、形状係数を固定しパラメータ時間変数（Ｚ）を定義することによって、以下の方程式２および３に示すように線形化することができる。
【００７６】
定数ｋに関して、Ｚ＝ｅ−ｋｔ    （２）
【００７７】
【数２】
2005519593.tif 000004
この線形化が成功するためには、形状係数ｋがデータセット間でほとんど均一であるか、またはハイブリダイゼーション速度Ａ１に弱くしか連動していないことが必要である。図５のプロットＡおよびＢはそれぞれ、ｋ値０．２１分−１および０．３０分−１を示した。プロットＢはより高い曲率を示したが、低い平衡センサ応答に達した。より広い範囲のデータセットでは、形状係数は０〜０．５に変化した。したがって、形状係数はデータセット間で特に一定ではなかった。
【００７８】
図６および表１、２では、形状係数とハイブリダイゼーション速度との間の連動の程度を検査する。図６に示すプロットは、図５に示したハイブリダイゼーション反応速度曲線の最初の５分間の拡大図である。高速（＜５分）ＳＮＰ検定を実現するために、反応の最初の５分間に焦点を当てた。というのは、野生型配列および多形配列のハイブリダイゼーション反応速度がこの時間ではよく識別できるからである。両データセット（ホモ２本鎖およびヘテロ２本鎖）にフィッティングした実際の３つのパラメータ（Ａ０、Ａ１、ｋ）を表２に示す。
【００７９】
【表２】
2005519593.tif 000005
次いで、２つのデータセットを予め選択した０．１〜０．５の数個のｋ値について２パラメータ・フィッティング（方程式３）を使用して解析した。
【００８０】
表２の結果によれば、完璧な結果をもたらす単一のｋ値はないが、０．３が良好な妥協
値であり、ハイブリダイゼーション速度における誤差は悪いほうで３．６％である。したがって、ハイブリダイゼーション速度は形状係数に弱くしか連動しないと思われる。このような理由で、その後の実験全てにおいて形状係数ｋを０．３に固定した。同様に、計算すべき変数を２つだけ用いて、本発明者らはリアルタイムで傾きの計算を実施することができた。
【００８１】
図５に示すデータは、３２℃において標準的ＰＣＲ緩衝液中で得たものであるが、この温度はホモ２本鎖の融解温度（約５５℃）およびヘテロ２本鎖の融解温度（約５３℃）よりも十分低い。より早く正確な検定を実現するために、検定条件を最適化して野生型検体およびＧ７６０Ａ検体の間の識別を高めた。ハイブリダイゼーション速度は対イオン濃度および融解温度範囲によって変動するので、これらの要因の両方を呼応させて最適化した。２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション速度および融解温度はいずれもイオン濃度によって決まる。ハイブリダイゼーション速度に対するイオン濃度の作用を図７に示す。融解温度に対するイオン濃度の作用を図８に示す。これらの各図において、３つの値におけるナトリウムの作用しか示されていないが、マグネシウムおよびカリウムの作用は記載の範囲内で連続的である。
【００８２】
対イオン混合物を用いると、結果は多様で予測不可能な可能性がある。あるイオンの添加によって別のイオンの作用が遮蔽される場合もあれば（図９プロットＢ、ナトリウムがΔＴｍに対するマグネシウムの作用を弱める）、２つのイオンが相乗効果を有する場合もあり（図７プロットＢ、１Ｍカリウムおよび１００μＭマグネシウムで最大の傾き）、イオンが互いに競合する場合もあった（図７プロットＣ、１：１０００の比でマグネシウムとカリウムを添加すると傾きに全く作用を及ぼさない）。一部の濃度では、あるイオンが主として融解温度を決定する（図８プロットＢ、マグネシウム）一方、他のイオンがハイブリダイゼーション速度を決定する（図７プロットＢ、カリウム）ように見えた。ＤＮＡハイブリダイゼーションに対するイオン作用の機構は、主鎖の安定化から、イオンが鎖のジッパー形成（ｚｉｐｐｉｎｇ）またはジッパー分解（ｕｎｚｉｐｐｉｎｇ）の水素結合間の架橋形成にいたるまで多い。
【００８３】
ハイブリダイゼーション速度は、標識ＤＮＡ濃度、対イオン濃度、および温度を含むいくつかの要因によって低下した。シグナルが下降するにつれて、シグナル対ノイズ比も低下し、データの信頼性は低下した。ハイブリダイゼーション検定の検出限界は、ハイブリダイゼーション速度対検体オリゴヌクレオチド濃度の検量線、およびＮＣＣＬＳによって定義した背景ノイズ（ゼロ濃度点の標準偏差）とから決定することが可能である。このような決定について、ＰＣＲ反応で通常使用される条件、すなわち１０ｍＭトリス、４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８、および２５℃で実施した野生型検体に関するハイブリダイゼーション検定について図１０に示す。上記の条件下では、算出された検出限界は３４ｐＭであった。
【００８４】
所与の１組の対イオン濃度の相対的成果をホモ２本鎖およびヘテロ２本鎖の融点間の差異を測定することによって評価した。多くの標準的な緩衝液（ＰＣＲ緩衝液など）で良好な結果がもたらされた。融解温度の差異（ΔＴｍ）を増大するために、最適化プログラムＭｕｌｔｉＳｉｍｐｌｅｘ（登録商標）を使用して系統的にＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２の濃度を変化させた。数度繰り返した後、主としてゼロでないΔＴｍ値をもたらしたイオン濃度範囲を同定した。
【００８５】
ＥＣＨＩＰプログラムを使用してΔＴｍと対イオン濃度とを対比した等高線図を生成した。このようなプロットは、単純に最大のΔＴｍ絶対値を決定する以上に情報を与えてくれる。というのは、これらのプロットからΔＴｍと対イオン濃度の間の固有の関係についての情報が得られるからである。ＥＣＨＩＰ計算のパラメータは以下の通りであった。濃
度範囲はＫＣｌについては０〜１０００ｍＭ、ＮａＣｌは０〜１００ｍＭ、およびＭｇＣｌ２は０〜１０００μＭであった。ＥＣＨＩＰ用に得られたデータの分析を部分的三次方程式にフィッティングした。変数（イオン濃度）間のより複雑な相互作用を試験するためには、部分的三次方程式は他の種類に比べさらにデータが必要であった。
【００８６】
ＥＣＨＩＰ実験の結果を図９に示す。これらのプロットはΔＴｍの３次元表示である。３つのプロットそれぞれにおいて１つのイオン濃度を一定に維持しながら、ΔＴｍに対する作用を他の２つに関して示す。本発明者らはΔＴｍの最大化を試みていたので、単純化するために０．５℃未満のΔＴｍ値をゼロにセットした。検査した対イオン濃度の範囲内で観察された最大のΔＴｍ値は、約２．５℃であった。
【００８７】
ナトリウムの非存在下では（図９Ａ）、ΔＴｍは、カリウムが低濃度または高濃度ではマグネシウム濃度の増加に伴い規則的に増加した。中間的なカリウム濃度では、マグネシウムはほとんど作用しなかった。図９Ｂに示す通り低いナトリウム濃度（１０μＭ）では、やはりマグネシウムはΔＴｍにほとんど作用せず、ΔＴｍは主としてカリウム濃度に依存するように見えた。しかし、より高いナトリウム濃度（１００μＭ、図９Ｃに示す）ではΔＴｍ曲線は凹形であった。マグネシウムおよびカリウムの濃度が中間的なときは、イオン間の競合作用により野生型配列と多形配列間との間のあらゆる融点の差異が隠されるようであった。２つのＴｍ値を有意に識別できたのは非常に高濃度または非常に低濃度の場合だけであった。
【００８８】
この検定に最適な結果をもたらした温度範囲は、検出限界であったため重要であった。ハイブリダイゼーション速度が高まるにつれて検出限界も向上した。図７は、融解温度より２度低い場合の、完全に適合した２本鎖のハイブリダイゼーション速度を示す。図７と図９との比較により（同じデータを異なる側面から見ることになる）、イオン濃度がハイブリダイゼーション速度および融解温度の変化に異なる作用をもたらし得ることが示される。
【００８９】
ＳＮＰおよび野生型のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度は、野生型の融点よりわずか１度下で互いに同程度（１０倍以内）であった。すなわち、ＳＮＰの融点より１度低い温度未満では、ほとんど、またはまったく識別されなかった。
【実施例５】
【００９０】
ＳＢＨを使用してＫＶＬＱＴ１遺伝子の領域を再配列決定した。実験には以下の緩衝液を使用した。リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）（４０ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４）を、平面導波路上のポリスチレン表面のニュートラアビジン・コーティングに使用した。トリスＥＤＴＡ（「ＴＥ」）（１０ｍＭのトリスベース、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を洗浄工程に使用した。ＤＮＡ結合緩衝液（８００ｍＭの塩化カリウム、７４ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化カルシウム、および１ｍＭの塩化マグネシウムを含むＴＥ、ｐＨ８．５）を使用した。０．１％トレハロースを含むＴＥを平面導波路表面のポストコーティングに使用した。これらの試薬は全て、シグマケミカルコーポレーション社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．）（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００９１】
ＤＮＡ試料は全て、アール  ダブリュー  シャックマン博士（Ｄｒ．Ｒ．Ｗ．Ｓｃｈａｃｋｍａｎｎ）が率いるユタ大学のＤＮＡおよびペプチド合成施設で合成した。以下の配列の捕捉プローブ：
捕捉プローブ：５’‐ＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧ‐３’‐ビオチン（Ｃ１０）（配列番号８）
を合成した。
【００９２】
ＬＱＴＳ遺伝子部分由来の４種の検体プローブを合成した。検体プローブは以下の配列である。
【００９３】
【化１】
2005519593.tif 000006
以下の配列のＣｙ５標識された配列決定プローブを合成した。
【００９４】
【化２】
2005519593.tif 000007
清浄なポリスチレン平面導波路［２．５４×２．５４センチメートル（１×１インチ）］を、励起光用の一体型フロントレンズおよび光の後部反射を防止するためのナイフエッジ形バックレンズとともに、ガスケットを補助として室温で６０分間ニュートラアビジン（１．５ｅ−７Ｍ、ＰＢＳ）でコーティングした。ＴＥで３度洗浄後、平面導波路を室温でさらに６０分間Ｃ１０（１ｅ−７Ｍ、ＴＥ）でコーティングした。ＴＥで２度洗浄後、平面導波路の表面を室温で３０分間０．１％トレハロースを含むＴＥでポストコーティングした。ポストコーティング溶液を廃棄し、平面導波路を、ガスケットを取り付けた真空チャンバ中で乾燥させた。
【００９５】
ニュートラアビジンを介して導波路表面上に固定化された捕捉プローブ（Ｃ１０）（配列番号８）を、４種の検体プローブ［Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、またはＰ４（それぞれ配列番号：９〜１２）、５ｅ−１０Ｍ、結合緩衝液、４℃、１０分間］のうちの１種とともにインキュベートした。検定を開始するために、標識した配列決定プローブ溶液をフローセル内に注入した。ハイブリダイゼーションが開始されるとすぐに、エバネッセント場の厚みの範囲内で導波路表面上に捕捉された蛍光色素がレーザー励起下で蛍光を発し始めた。光学システムおよびＣＣＤカメラを使用して蛍光発光を検出した。ＣＣＤカメラは、導波路のイメージを５分間にわたり１５秒間隔で記録した。ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアで書かれた操作プログラム（Ａｓｓａｙ  ＳｔａｎｄＡｌｏｎｅ  １．２Ｓｉｄｅ）を使用して、Ｃａｖｒｏ（商標）ポンプによる試料注射、ＣＣＤカメラによる蛍光イメージの記録、およびデータ転送を作動させた。時間と共に非直線的に変化する蛍光の増大を迅速に反映するデータは、特定の時点（ｔｉ）での検体結合の平均速度（Ｒｔｓ）の結果であり、方程式１で示された。
【００９６】
【数３】
2005519593.tif 000008
［式中、Ｉ（ｔ）はセンサの蛍光強度応答である。］  一度平均速度が算出されると、それを使用して検量線を構築することが可能であった。一般に、結合速度対検体濃度データに対してミカエリス‐メンテン方程式を使用することが可能であった。
【００９７】
【数４】
2005519593.tif 000009
［式中、ＲＣは、濃度Ｃのオリゴヌクレオチドについて観察されたハイブリダイゼーション速度であり、Ｒｍａｘは可能な最大ハイブリダイゼーション速度であり、Ｒ０は検体非存在下での速度であり、Ｋｄは見かけのミカエリス定数であった。］  Ｃ＜＜Ｋｄであるとき、この方程式は検体濃度についての直線式に単純化される。
【００９８】
【数５】
2005519593.tif 000010
捕捉プローブＣ１０と、ＬＱＴＳ遺伝子部分に由来する４種の検体プローブＰ１、Ｐ２、Ｐ３、またはＰ４との間のハイブリダイゼーションは同じである。ＳＮＰは１１番目に位置する。Ｐ１のＳＮＰはＧであるので、８種の配列決定プローブのうちの２種、ＣＸＸＸＸ‐Ｃｙ５（ｐｃ）（縮重）またはＣＡＣＣＡ‐Ｃｙ５（ｓｐｃ）（非縮重）は、完全に相補的な１５ｍｅｒの２本鎖ＤＮＡを生成する。これは全ての塩基対の完全な適合（マッチング）である。同時に、Ｐ１はＣ１０およびその他の配列決定プローブとの間に完全なハイブリッドを生じないであろう。そのような場合、その対は不適合（ミスマッチ）ということになる。導波路表面上でのハイブリダイゼーション中に放射された蛍光の測定から、完全な適合対は常に反応速度が速く蛍光の純増加量（光子カウント数）が大きいことが示された。図１１ａおよびｂは、測定された蛍光の純増加量（光子カウント）と時間（分で測定）との対比で示した典型的なハイブリダイゼーション過程の曲線を示す。
【００９９】
完全な適合対と比較して不適合対のハイブリダイゼーションを減少させる度合いは、完全対のハイブリダイゼーションを１とした比率で表すことが可能である。この比率はリジェクションとして知られる。表３および表４には、完全適合の場合と比較した、Ｃ１０と４種の検体プローブと不適合配列決定プローブのリジェクションを示す。
【０１００】
【表３】
2005519593.tif 000011
【０１０１】
【表４】
2005519593.tif 000012
捕捉プローブＣ１０をリン酸化する効果についても検査した。捕捉プローブＣ１０およびＣ１０ＰＯ４は同じ配列であるが、Ｃ１０ＰＯ４はその５’末端にリン酸基を有する。リン酸基を使用して５ｍｅｒの配列決定プローブと連結（ライゲーション）することは可能であろうが、連結反応には４℃で１２時間のインキュベーションを要し、簡便法ではハイブリダイゼーションはわずか５分間だけモニタされた。したがって、捕捉プローブのリン酸化の効果を後者の条件下で検査した。蛍光の純増加および２分間の反応速度を比較すると、Ｃ１０ＰＯ４が強力なハイブリダイゼーション応答と一層速い速度をもたらすことが示された。連結させた場合のように最終的に共有結合を形成しはないが、形成される水素結合によってリン酸基がハイブリダイゼーションに役立つのかもしれない。検体プローブおよび配列決定プローブとのＣ１０ＰＯ４のハイブリダイゼーションの、２分の時点の速度、および対応するリジェクションを表５および表６に示す。
【０１０２】
【表５】
2005519593.tif 000013
【０１０３】
【表６】
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まとめると、Ｃ１０捕捉プローブおよびＣ１０ＰＯ４捕捉プローブについて、４種の２１ｍｅｒ検体プローブおよび８種のＣｙ５標識配列決定プローブを用いてそれぞれ３２種のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド２本鎖を生成した。これらの２本鎖は１６群に分かれる。各群には、１つの完全適合例と、単一塩基の違いまたはＳＮＰを有する３つの不適合例とがある。識別を表すためにリジェクション係数を使用して、平均リジェクション係数が０．５であればＳＮＰが検出されたことを明瞭に示すものとした。Ｃ１０およびＣ１０ＰＯ４の２つの捕捉プローブを比較すると、Ｃ１０捕捉プローブの平均リジェクション係数（０．５８）はＣ１０ＰＯ４の場合（０．４３）よりわずかに高く、これは一種の水素結合が形成される可能性によってリン酸基がハイブリダイゼーションを補助しているかもしれないことを示した。縮重配列決定プローブは、それぞれ等しい確率で４つの核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうち１つである４つの塩基を含む。ある特定のＤＮＡプローブ配列については、同配列に適合する確率は１／２５６にすぎない。ゆえに、検出法で使用した縮重プローブ濃度（１ｅ−８Ｍ）は非縮重プローブ濃度（１ｅ−１０Ｍ）より約１００倍より高い。しかし、縮重プローブはより多くのＤＮＡプローブについてはるかに高い対応能力を有し、非縮重プローブより一層強力な応答を示したので、縮重配列決定プローブを使用することが好ましい。
【実施例６】
【０１０４】
ハイブリダイゼーション法によるこの配列決定を使用して新規な突然変異体を検出するという意味では、配列決定プローブが４種の異なる蛍光色素で標識され、かつ平面導波路が様々な捕捉体アレイを有していれば、本発明者らの研究室で開発されたこの方法は明らかに非常に好都合かつ高速な方法である。
【０１０５】
本発明は、様々な変更形態および代替形態が可能であり得るが、特定の実施形態について例として図面に示し、本明細書中で詳細に説明してきた。しかし、当然のことであるが
本発明は開示された特定の形態のみに限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲に属する全ての変更形態、同等物、ならびに代替物を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】いくつかの異なる捕捉プローブへのＣｙ５標識アンチＴ３の結合を示す図。白抜きの丸：固定化アビジンへの非特異的結合。白抜きの四角：ニュートラアビジンへの非特異的結合。黒菱形：固定化したビオチン‐アンチＴ３／ニュートラアビジン複合体への非特異的結合。黒丸：固定化したビオチン‐Ｔ３／ニュートラアビジン複合体へのハイブリダイゼーション。
【図２】固定化したＴ３へのＣｙ５‐アンチＴ３のハイブリダイゼーションの検量線を示す図。射出成形厚膜導波路を使用するＴ３／アンチＴ３ハイブリダイゼーション検定の感度を、ＰＢＳ中にヒトのＣｙ５標識アンチＴ３を加えることによって調査した。Ｃｙ５‐アンチＴ３濃度に対して結合速度をプロットして検量線を作図した。分析感度（２σ／傾きと定義した。σは速度ゼロの標準偏差である。）の値の１．４ｐＭを検定用に割り出した。
【図３】固定化したオリゴヌクレオチド（アンチＰＳＡ）への、２種のＣｙ５標識オリゴヌクレオチド（ＰＳＡおよびｈＧＫ２）のハイブリダイゼーション反応速度を示す図。ＰＳＡおよびアンチＰＳＡは完全に相補的であり、高速のハイブリダイゼーション速度（毎分１．５×１０６センサ単位）を示した。ｈＧＫ２オリゴヌクレオチドおよびアンチＰＳＡオリゴヌクレオチドは、２０位中７位に不適合塩基を有し、極めて低速のハイブリダイゼーション速度（２８００ＳＵ／分）を示した。実際、この速度は本検定の非特異的結合速度（５１３±１４１６ＳＵ／分）と有意な違いがない。
【図４】屈折光により作り出され、導波路表面から約１２０ｎｍ伸展して蛍光標識された検体を励起するエバネッセント場を示す、平面導波路の例を表す図。
【図５】完全に適合した２本鎖ＤＮＡ（プロットＡ）、および単一塩基対不適合（プロットＢ）の平衡に至る時間を比較する、バイオセンサ応答曲線を示す図。両２１ｍｅｒを濃度１Ｅ−１０とし、７４ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、およびｐＨ８．５の１０ｍＭのトリス溶液中３２℃で実施した。２０秒毎に読取りを行った。
【図６】図５の最初の２１ポイント（５分間）の分解プロットの図。
【図７】完全に適合した２本鎖ＤＮＡの、その融点より２℃低い温度における典型的なセンサ応答を描写する等高線図。ＮａＣｌ濃度を０Ｍ（上）、１０ｍＭ（中間）、または１００ｍＭ（下）に固定し、ＭｇＣｌ２濃度およびＫＣｌ濃度を変化させた。
【図８】完全に適合した２本鎖ＤＮＡの融点が塩濃度と共に変化するのを示す等高線図。ＮａＣｌ濃度を０Ｍ（上）、１０ｍＭ（中間）、または１００ｍＭ（下）に固定し、ＭｇＣｌ２濃度およびＫＣｌ濃度を変化させた。
【図９】完全に適合した２本鎖ＤＮＡの融点および１塩基対の不適合を有する２本鎖ＤＮＡの融点の差異（℃）を描写する等高線図。ＮａＣｌ濃度を０Ｍ（上）、１０ｍＭ（中間）、または１００ｍＭ（下）に固定し、ＭｇＣｌ２濃度およびＫＣｌ濃度を変化させた。
【図１０】注入したＤＮＡの濃度に対するバイオセンサの出力結果を示してセンサの検出限界の計算について示す図。条件は、１０ｍＭのトリス、４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８、および２５℃であった。曲線の勾配は３．３Ｅ＋１６Ｍ／ＡＵ、ゼロの標準偏差は９Ｅ＋３ＡＵであり、検出限界は６６ｐＭとなる。
【図１１Ａ】検体プローブＰ１の中央（１１番目）位置のハイブリダイゼーションによる配列決定に関するハイブリダイゼーション反応速度曲線を示す図。捕捉プローブ（Ｃ１０ＰＯ４）に５’リン酸基を含めた。４種の異なるＣｙ５標識した縮重配列決定プローブ（ｐｃ、ｐｔ、ｐｇ、ｐａ）を使用した。プロット１は、野生型配列決定プローブ（ＣＸＸＸＸ‐Ｃｙ５）のハイブリダイゼーション反応速度である。プロット２〜４は、配列決定プローブの５’ヌクレオチドをそれぞれＡ、Ｇ、およびＴとした単一塩基不適合についてのハイブリダイゼーション反応速度である。
【図１１Ｂ】検体プローブＰ１の中央（１１番目）位置のハイブリダイゼーションによる配列決定に関するハイブリダイゼーション反応速度曲線を示す図。この場合は、捕捉プローブ（Ｃ１０）には５’水酸基を含めた。４種の異なるＣｙ５標識した縮重配列決定プローブ（ｐｃ、ｐｔ、ｐｇ、ｐａ）を使用した。プロット１は、野生型配列決定プローブ（ＣＸＸＸＸ‐Ｃｙ５）のハイブリダイゼーション反応速度である。プロット２〜４は、配列決定プローブの５’ヌクレオチドをそれぞれＡ、Ｇ、およびＴとした単一塩基不適合についてのハイブリダイゼーション反応速度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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