(57)【要約】粒子はシェルによってマイクロカプセル化されたイオン交換コアを含み、シェルは反応性モノマーの重合生成物を含むサイズ排除イオン交換粒子、およびこの粒子を使用する装置を提供する。このシェルは少なくとも部分的に架橋重合体でもよい。このシェルは、例えば１０ｎｔｓｓＤＮＡ分子以上の大きさの分子、または１００ｎｔｓｓＤＮＡ分子以上の大きさの分子を排除することができ、このコアはイオン交換を行うことが可能である。この粒子を使用して精製する方法とともに、サイズ排除イオン交換粒子を製造する方法も提供する。
2005533646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアおよびシェルを備えるサイズ排除イオン交換粒子であって、該コアはイオン交換物質を有し、さらに該シェルはサイズ排除物質を有する、サイズ排除イオン交換粒子。
【請求項２】
前記シェルは少なくとも部分的に架橋結合したポリマーを含む、請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【請求項３】
前記ポリマーは少なくとも部分的に共有結合的に架橋結合さている、請求項２に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【請求項４】
前記イオン交換コアは固体コア物質を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
前記固体コア物質はマクロポーラスシリカ、制御された細孔ガラス、マイクロポーラスポリマーミクロスフィア、メソポーラスポリマーミクロスフィア、およびマクロポーラスポリマーミクロスフィアを少なくとも１つ備える、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
前記固体コア物質はイオン交換が可能である、請求項４に記載の粒子。
【請求項７】
前記固体コア物質は３級アンモニウム基、４級アンモニウム基、カルボン酸基、およびスルホン酸基の少なくとも１つを備える、請求項６に記載の粒子。
【請求項８】
前記固体コア物質は多孔性である、請求項４に記載の粒子。
【請求項９】
前記固体コア物質は５００μｍ以下の平均径を有する、請求項４に記載の粒子。
【請求項１０】
前記固体コア物質はイオン交換体で被覆されている、請求項４に記載の粒子。
【請求項１１】
前記コアは中性、水溶性ポリマー、あるいは有機溶解性ポリマーを含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１２】
前記コアは、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）ポリマー物質、ポリ（酢酸ビニル−コ−ビニルアルコール）物質、ポリアクリルアミド物質、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−ビニルアミド）物質、ポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）物質、両親媒性ジブロックコポリマー、および両親媒性ブロックコポリマーの１以上を含む、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
前記イオン交換コアは表面活性化されている、請求項１に記載の粒子。
【請求項１４】
前記イオン交換コアは凝集を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１５】
前記シェルは水溶性モノマーの架橋結合重合生成物を備える、請求項１に記載の粒子。
【請求項１６】
請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子であって、前記シェルは、ポリ（（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−イソ−プロピル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）物質、ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）物質、ポリ（Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド）物質、ポリ（ビニルアルコール）物質、ポリ（２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）物質、ポリ（３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート）物質、ポリ（ビニルピロリドン）物質、ポリ（エチレンオキシド）物質、ポリ（ビニルメチルエーテル）物質、ポリ（Ｎ−（メタ）アクリルイルシナミド）物質、ポリ（ビニルオキサゾリドン）物質、ポリ（ビニルメチルオキサゾリドン）物質、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）物質、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）物質、水溶性多糖類、ポリ（エチレングリコール）アクリレートのポリマー、ポリ（エチレングリコール）メタクリレートのポリマー、水溶性多糖類、およびこれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、サイズ排除イオン交換粒子。
【請求項１７】
前記シェルは、架橋結合されたヒドロゲルを備える、請求項１に記載の粒子。
【請求項１８】
前記シェルはアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの反応生成物を含む、請求項１に記載の粒子。
【請求項１９】
前記シェルはアクリルアミドおよび２，２−ビス（アクリルアミド）酢酸の反応生成物を含む、請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【請求項２０】
前記シェルはポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリレートの反応生成物を含む、請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【請求項２１】
前記シェルは複数の細孔を備え、前記細孔の少なくとも５０％は、１０ｎｔｓｓＤＮＡ以上のサイズの分子を排除することができる、請求項１に記載の粒子。
【請求項２２】
請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子を含むイオン交換物質を備える混合物であって、前記混合物は陽イオン性イオン交換物質および陰イオンイオン交換物質を含む混合物。
【請求項２３】
前記サイズ排除イオン交換粒子は陽イオン性であり、前記混合物は陰イオン性サイズ排除イオン交換粒子を含む請求項２２に記載の混合物。
【請求項２４】
前記混合物は混合床の形態である、請求項２２に記載の混合物。
【請求項２５】
前記陽イオン性イオン交換物質および陰イオン性イオン交換物質は化学量論的に等価な量で存在する、請求項２２に記載の混合物。
【請求項２６】
容器、および前記容器に配置されている、請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子を備える、精製装置。
【請求項２７】
容器、および前記容器に配置されている、請求項２２に記載の混合物を備える精製装置。
【請求項２８】
１以上のカラムを備える微量流体装置であって、該１以上のカラムのうちの少なくとも１つにおいて請求項１に記載の粒子が配置された、微量流体装置。
【請求項２９】
前記１以上のカラムの各々が、注入口と排出口を備える、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
１以上のカラムを備える微量流体装置であって、該１以上のカラムのうちの少なくとも１つにおいて請求項２２に記載の混合物が配置された、微量流体装置。
【請求項３１】
サイズ排除イオン交換粒子を形成する方法であって、
イオン交換コアを提供する工程；および
サイズ排除物質でイオン交換コアをマイクロカプセル化する工程
を包含する、
サイズ排除イオン交換粒子を形成する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、
前記イオン交換コアをマイクロカプセル化する工程が、
前記イオン交換コアの周囲に、少なくとも１つのモノマー、プレポリマー、またはコポリマーを含む水性水ジャケットを形成する工程および
該水性水ジャケット中の少なくとも１つのモノマー、プレポリマー、またはコポリマーの逆乳化によって、該イオン交換コアの周囲にシェルを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、
前記コアを提供する工程は、
外面を備える固体コア物質を提供する工程；
第１のモノマーを該外面に結合させる工程；および
結合した該第１のモノマーを第２のモノマーに接触させて、該外面の少なくとも一部にイオン交換物質を形成する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、
前記固体コアは、内面をさらに有し、結合工程が、該内面上の第１のモノマーを結合する工程をさらに包含し、
前記結合した第１のモノマーを第２のモノマーと接触する前記工程は、前記内面の少なくとも一部分でイオン交換物質を形成することをさらに包含する、
方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、
前記コアを提供する工程は、
外面を備える固体コア物質を提供する工程および、
該外面をイオン交換物質で被覆する工程
を包含する、
方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、ここで、
前記固体コアは、内面をさらに備え、
前記被覆する工程は、該内面の少なくとも一部分にイオン交換物質を被覆する工程
を含む、方法。
【請求項３７】
前記コアを提供する工程は、該コアを表面活性化させる工程を含む、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、
前記コアを表面活性化する工程は、該コアの表面に中性の水溶性ポリマーまたは有機溶解性ポリマーを吸着させる工程
を包含する、
方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記表面活性化コアは、
ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）ポリマー物質、ポリ（酢酸ビニル−コ−ビニルアルコール）物質、ポリアクリルアミド物質、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）物質、ポリ（Ｎ−ビニルアミド）物質、ポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）物質、両親媒性ジブロックコポリマー、および両親媒性ブロックコポリマーのうちの１以上
を備える、方法。
【請求項４０】
前記コアを提供する工程は、コア物質を凝集させる工程を包含する、
請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法であって、
前記イオン交換コアをマイクロカプセル化させる工程は、
該コアを重合可能なモノマーと接触させる工程；および
該モノマーを反応させて、前記サイズ排除物質を形成する工程
を包含する、
方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、
前記コアを重合可能なモノマーと接触させる工程は、
前記コアを、加熱する工程；
前記コアを、開始剤および触媒の少なくとも１つと接触させる工程；および
前記コアを、アクリルアミドおよびＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドのうちの少なくとも１つと接触させる工程
を包含する、
方法。
【請求項４３】
請求項３１に記載の方法であって、
前記イオン交換コアをマイクロカプセル化する工程は、
重合可能なモノマーを含む乳濁液中に前記コアを配置する工程；
該モノマーを重合させ、該コアをマイクロカプセル化する工程；および
を包含する、
方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記重合工程が、
逆乳化重合する工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記重合可能なモノマーが水溶性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記重合する工程は、架橋剤を前記モノマーと接触させる工程を包含し、
ここで、前記架橋剤はモノマーの重量に基づき１〜９５重量パーセントの量で存在する、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記重合する工程は、該モノマーを共有結合的に架橋結合させる工程を包含する、
請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
サイズ排除イオン交換粒子を形成する方法であって、
イオン交換コアを提供する工程；
該コアを、重合可能なモノマーを含む乳濁液と接触させる工程；
該モノマーを重合して、該コアをマイクロカプセル化する工程であって、ここで、該重合は、複数の細孔を備えるシェルを形成し、該複数の細孔はあらかじめ決定したサイズより大きな物質を排除するものとする工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記シェルは少なくとも部分的に共有結合的に架橋結合された、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記あらかじめ決定されたサイズは、１０ｎｔのｓｓＤＮＡ以上である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
試料を精製する方法であって、
複数のサイズ排除イオン交換粒子を提供する工程であって、粒子の各々はイオン交換のためのコアおよびサイズ排除のためのシェルを備えるものとする工程；
該試料が該粒子と接触し精製試料を形成する工程；および
該精製試料を該粒子から分離する工程
を包含する、
方法。
【請求項５２】
該精製試料は、１０ｎｔ  ｓｓＤＮＡ以上の分子サイズを有する物質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記精製試料は、１００ｎｔ  ｓｓＤＮＡ以上の分子サイズを有する物質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記接触は、向心力を使用して前記試料が前記複数の粒子を通過する工程を含む、
請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
請求項５１に記載の方法であって、
前記複数のサイズ排除イオン交換粒子は、第１の体積を有し、
前記生体試料は、第２の体積を有し、
第１の体積は、第２の体積以下である、
方法。
【請求項５６】
前記精製試料は５０μＭ以下の塩濃度を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
請求項５１の方法であって、
前記複数のサイズ排除イオン交換粒子は、
化学量論的に等価な量のサイズ排除陰イオン交換粒子および
サイズ排除陽イオン交換粒子を含む、
方法。
【請求項５８】
請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子であって、
前記シェルはアクリルアミドとＮ，Ｎ’−ジ（メタ）アクリロイルピペラジンとの反応生成物を含む、
サイズ排除イオン交換粒子。
【請求項５９】
前記シェルは、アクリルアミドとトリ（メタ）アクリロイルパーヒドロ−ｓ−トリアジンとの反応生成物を含む、
請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【請求項６０】
前記シェルは、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、酢酸２，２−ビス（アクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、Ｎ，Ｎ’−ジ（メタ）アクリロイルピペラジン、トリ（メタ）アクリロイルパーヒドロ−ｓ−トリアジンの少なくとも２つの反応生成物
を含む、請求項１に記載のサイズ排除イオン交換粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００２年７月２６日出願の米国仮特許出願第６０／３９８，８５２号明細書、および米国特許出願第１０／４１４，１７９号、同第１０／４１３，７９７号、および同第１０／４１３、９３５号（これらの全ては、２００３年４月１４日に出願）（これらの、全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張するものである。
【０００２】
（分野）
本発明は、イオン交換技術の使用により試料を濾過および／または精製するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
例えばポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）あるいは塩基配列決定反応から得られた反応生成物の精製では、後続の下流の処理においていくつかの課題が存在する。不純物が後続の処理工程において人為的な結果を引き起こす場合がある。人為的な結果を取り除くための多くの精製工程は、厄介で非効率であり得る。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによる精製では、正確な試料導入技術と同様に、それぞれクラック、気泡、あるいはチャネルのない適切な樹脂床を必要とする。精製、例えば、サイズ排除による精製で使用される樹脂床は、サイズが試料の体積の１０倍以上である必要があり、より多くのスペースが必要であり、精製コストが増加する。またイオン交換樹脂は、樹脂が除去しようとするイオンと相互作用することに対立して、標的分析物と好ましくない相互作用を起こすことが多い。さらに、イオン交換物質を使用する精製では、高い塩溶離剤を使用して分析物を溶出する必要があり、後続の分析および／または反応には好ましくない可能性がある。精製に関する従来の技術に付随したこれらの問題および他の問題に対処する精製方法に関する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
多様な実施形態において、コアおよびシェルを含むことができるサイズ排除イオン交換（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ；ＳＥＩＥ）粒子が提供され、このコアはイオン交換物質を備え、このシェルはサイズ排除物質を備える。
【０００５】
多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換粒子を形成する方法が提供される。この方法はイオン交換コアを提供する工程と、サイズ排除物質を有するイオン交換コアをマイクロカプセル化する工程とを含むことができる。多様な実施形態において、このコアは重合可能なモノマーを備える乳濁液中で特定の場所に置くことができ、またこのコアは、モノマーを重合することによりマイクロカプセル化し、あらかじめ規定されたサイズより大きな物質を排除することができる細孔を有するシェルを形成することができる。
【０００６】
多様な実施形態において、試料を精製する方法が提供される。この方法は、このような試料を提供する工程と、精製試料を形成するために１以上のサイズ排除イオン交換粒子を備えた試料と接触する工程と、サイズ排除イオン交換粒子から精製試料を除去／分離する工程とを含むことができる。
【０００７】
多様な実施形態のさらなる特性および利点は、以下に続く説明で部分的に述べるものとし、さらに部分的にその説明から明らかであるものとし、あるいは多様な実施形態の実施によって把握してもよい。多様な実施形態に関する目的およびその他の利点は、特に本明細書の説明および添付されている特許請求の範囲で指摘された要素および組み合わせにより、認識され達成されるであろう。
【０００８】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、代表的なもののみ、および説明のためのみであることを理解すべきであり、本発明の多様な実施形態の説明を行うことを意図するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（多様な実施形態の説明）
本明細書および添付されている請求の項において、他に指示のない限り、成分量、物質の割合または比率、反応条件、および本明細書および請求項で使用される他の数値を表す全ての数字は、すべての事例において「約（およそ）」という用語により修飾されるものと把握されるべきものである。このため、それとは反対の指示がない限り、以下に示す明細書および添付されている請求項に示される数値パラメータは、本発明によって求め得た所望の特性に依存して変動する近似値であることを表す。少なくとも、本願の特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではなく、少なくとも各々の数値パラメータは、報告された有効数字の桁数を考慮し、および通常の丸め技術の適用により解釈すべきである。
【００１０】
本発明の広い範囲を表す数値域および数値パラメータは近似値であるものの、特定の実施例を表したこの数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それらの各々の試験測定で認められた標準偏差から必然的に得られたある一定の誤差を本質的に含んでいる。さらに、本明細書に開示された全ての範囲は、本明細書に包括された下位の範囲をどれも皆含んでいるものと理解すべきである。例えば、「１〜１０」の範囲は、（最小、最大値も含む）最小値の１と最大値の１０の間の下位の範囲をどれも含んでおり、すなわち下位の範囲をどれも、最小値の１以上、最大値の１０以下、例えば５．５〜１０である。
【００１１】
本明細書と添付されている請求項において使用されるように、１つの指示物に制限することを特別に明記する以外は、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。したがって、例えば「モノマー（ａ  ｍｏｎｏｍｅｒ）」は、２つ以上のモノマー（ｔｗｏ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）を含むことを示す。
【００１２】
多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換（ＳＥＩＥ）粒子では、サイズ排除能を有するシェルによってマイクロカプセル化されたイオン交換コアが提供される。「マイクロカプセル化」、「マイクロカプセル化された」、または類似の用語は、個々の粒子レベルにおけるカプセル化プロセスを意味する。一実施形態において、液体、固体、および／または気体のコアは、コアへのアクセスをコントロールするためのシェルによりマイクロカプセル化されている。多様な他の実施形態において、マイクロカプセル化により、コアの全外面（および任意に内面）を覆うこと、あるいはコアの外面（および任意に内面）の一部を覆うことが可能である。多様な他の実施形態において、コアのマイクロカプセル化により、永続的にコアを不可逆なコーティングを行うことができ、あるいはこの可逆的なコーティングの溶解に続いてコアを放出させることができる。多様な実施形態において、マイクロカプセル化ではシェル内にコア物質凝集物のカプセル化を含むことができる。この凝集物は、コア物質とともに溶融したり、焼結したり、加圧したり、圧縮したり、あるいは別な方法で形成することができる。多様な実施形態において、コア物質は凝集物ではなく単一粒子であることができる。本明細書で云う「コア」あるいは「コア物質」との用語は、単一粒子あるいは粒子の凝集物を指す。「シェル」という用語は、コアの外面および／または内面の任意の部分のコーティングを指す。シェルの寸法および形成は以下に述べる。「物質」という用語は、分子レベルで、あるいはバルク中での任意の物質を指す。以下で使用されるように、物質は液体および／または固体、例えば、乳剤または樹脂が可能である。
【００１３】
本明細書で使用される「混合物」は、例えば充填カラム、混合床、均質床、流動床、連続流れを有するスタティックカラム、またはバッチ混合物中で一緒に使用される１つを越えるＳＥＩＥ粒子を指す。この混合物では、サイズ排除陽イオン交換粒子およびサイズ排除陰イオン交換粒子、サイズ排除陽イオン交換粒子および陰イオン交換粒子、サイズ排除陽イオン交換粒子および陽イオン交換粒子、ＳＥＩＥ粒子および不活性成分、またはこれらの組み合わせを含めることができる。この混合物は、分離に関する当技術分野において公知の任意の物理的構造、およびイオン交換に関する当技術分野において公知の任意の化学混合物を含むことができる。
【００１４】
例えば無機イオンおよびヌクレオチドなどの低分子は、サイズ排除シェルを浸透するかまたはそれらを透過することができ、イオン交換コアにより保持されるかまたはイオン交換することができる。このシェルは、例えばＤＮＡフラグメントなどのより大きなイオンが、シェルを通って浸透するか透過してイオン交換コアと反応することを防止することができる。
【００１５】
多様な実施形態において、ＳＥＩＥ粒子は例えば生体分子の精製などにおいて多様に使用することができる。用途としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の精製、ＤＮＡ塩基配列決定反応液の精製、およびＲＮＡの精製などが挙げられる。ＳＥＩＥ粒子は、例えばオリゴヌクレオチド、リガーゼ連鎖反応生成物、タンパク質、抗体結合反応生成物、オリゴヌクレオチド連結反応分析生成物、ハイブリッド形成生成物、および抗体の精製および／または分離に使用することができる。ＳＥＩＥ粒子は、生物学的製剤または反応混合物の脱塩にも使用することができる。
【００１６】
多様な実施形態によるＳＥＩＥ粒子は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の利点とサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の利点とを組み合わせる。ＳＥＣとＩＥＣの両者は、生体分子の精製に使用することができる。多様な実施形態において、ＳＥＣでは、流体力学的体積に基づいて分子を分離することができ、より大きな分子に要する溶離液は少なく、例えばより小さな分子よりも溶出量は少ない。ＳＥＣでは、より大きな分子を最初に溶出させることができる。ＳＥＣは、生体分子精製のための「スピンカラム」形式で使用することができ、このカラムは連続的に溶出させる必要がなく、例えば、試料中の体積などの一定体積で溶出させることが可能である。スピンカラムフォーマットＳＥＣでは、より小さな分子がカラムに残留している間に、より大きな分子をカラムから溶出させることができ、後で廃棄することができる。ＳＥＣはグループ分離に使用することができる。例えば、ＤＮＡ塩基配列決定反応の精製またはＰＣＲ生成物の精製において、不要な生成物、例えば目的としないプライマーおよびイオンがカラムに捕捉されている間に、所望の生成物、例えば配列決定ラダーあるいはＰＣＲ生成物はカラムを通過させることができる。ＳＥＣは、塩がカラムに保持される脱塩用途に使用することもできる。
【００１７】
例えばカラムからの化学種の溶出順序において、ＩＥＣはＳＥＣと異なる可能性がある。多様な実施形態において、ＩＥＣの選択性は、例えば分析物の電荷に基づくことができる。より大きな分子はより高い電荷を有し、したがってより小さな分子よりもＩＥＣ樹脂に対してより高い親和性を保有することができる。生体高分子、例えば、ＤＮＡでは、より大きな分子が小さな分子よりも高い電荷を持つことができるように、この化学種の電荷は分子サイズに比例して増加するので、ＩＥＣ樹脂に対して高い親和性を有している。より小さく、少ない荷電の化学種、例えば塩およびヌクレオチドは、ＩＥＣカラムから速やかに溶出させることができるが、一方、例えば、ＰＣＲ生成物またはＤＮＡ塩基配列決定ラダーなどのより大きな化学種は、ＩＥＣカラムに強固に結合し、遅れて溶出されるか、または全く溶出されない。したがって、ＳＥＣではより大きな分子を最初に溶出し、ＩＥＣでは小さな分子を最初に溶出し、ＩＥＣおよびＳＥＣは異なる溶出順序を示す可能性がある。
【００１８】
多様な実施形態において、ＳＥＣとＩＥＣ効果の併用により生体分子の高品位な分離が可能となる。ＳＥＩＥ粒子では、大きな分子がイオン交換コアと相互作用する機能を制限するためにサイズ排除シェルを使用することができる。ＳＥＩＥ粒子では、ＳＥＣのサイズ排除の利点と、ＩＥＣ樹脂の高い選択性および結合能力とを組み合わせることができる。ＳＥＩＥ粒子のサイズ排除シェルを浸透することができる低分子は、イオン交換コアと相互作用することができ、そのコア上にこの低分子を保持させることができる。より大きく、高い荷電を有する化学種では、この粒子のサイズ排除シェルによってイオン交換コアと相互作用することが制限されうる。このように大きな、高い荷電を有する化学種は、イオン交換コアと結合せずに、溶液内に残ることができる。溶液中に残留するより大きな化学種は溶出させることができる。結合した物質はこのＳＥＬＥ粒子のイオン交換コア上に保持されるため、ＳＥＩＥカラムまたは床における追加体積により結合した物質は任意に溶出されないことから、ＳＥＬＥ溶出粒子はＳＥＣカラムの溶出とは異なる可能性があり、また溶離液と反応し、カラムまたは床から除去されることを防止できる。
【００１９】
ＳＥＩＥ粒子相互作用の一例を図１および２に示す。図１および２では、スケール化して表示しておらず、図中のコア細孔径とシェル細孔径との関係などオブジェクト間の関係をスケール化しておらず、コア細孔径がシェル細孔径より大きいなど実際には逆になる可能性もある。図１で分かるように、長い一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）などの大きな分子は、サイズ排除陰イオン交換粒子３０におけるサイズ排除シェル２０の細孔２５を通過するには大きすぎる。代わりに、このシェル２０の外面２１からすり抜け、あるいは跳ね返り、陰イオン交換粒子３０とイオン交換されずに溶液内に残留することができる。デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、色素標識デオキシヌクレオチド三リン酸、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）、色素標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸三リン酸、および塩素イオンなどの小イオンなどの低分子は、サイズ排除シェル２０の細孔２５を通過することができ、シェルおよびイオン交換コア１１の界面２３あるいはその界面の近傍で、またはイオン交換コア１１の細孔内で、陰イオン交換樹脂１３によりイオン交換させることができる。図１は陰イオン交換樹脂１３で被覆されたイオン交換コア１１の表面を表す部分外皮切断部３３を示す。陰イオン交換樹脂１３、例えば、架橋結合されたメチルメタクリレートと２−ヒドロキシ−３−メタクリロキシプロピルトリメチル塩化アンモニウムとのマクロ孔質コポリマーは、固体コア物質１２の全ての内面および外面上に存在することができる。陰イオン交換樹脂および固体コア物質、または支持体１２は、ともに陰イオン交換コア１１を形成する。水酸化物などの陰イオン交換コア１１から遊離される対陰イオンは、ＳＥＩＥ粒子３０を備える混合物中で提供することができる陽イオン交換体３５の対陽イオン、例えばヒドロニウムイオンなどと反応することができ、水などの中性分子を生成する。シェルとコア構造の外皮切断図を図２に示す。
【００２０】
ＳＥＩＥ粒子は、粒子の混合物、混合床、または均質床中で使用することができる。そこでは陰イオン性または陽イオン性ＳＥＩＥ粒子の均質床が使用され、対イオンはイオン交換に続いて、試料液中に直接遊離される。ある場合には、試料液中の対イオンの存在は、試料の一層の処理あるいは反応に影響を与えない。
【００２１】
多様な実施形態において、ＳＥＩＥ粒子の選択性は、サイズ排除シェルの特性、イオン交換コアの電荷、および対イオンの特性によって決定することができる。サイズ排除シェルの特性は、例えば得られたシェルの細孔径に影響を及ぼすことができる適切な合成条件を選定することにより、変更することができる。サイズ排除シェルの有効細孔径のコントロールにより、ＳＥＩＥ粒子を別のサイズ排除用途に最適化させることが可能である。
【００２２】
多様な実施形態において、サイズ排除シェルはヒドロゲルなどの架橋結合または重合させたモノマーでもよい。本明細書で云う「ポリマー化（する）」、「重合」、「重合する」、「架橋結合された生成物」、架橋結合すること」、「架橋結合」、および他の同様な用語は、特に規定のない限り、重合生成物および方法と、架橋結合された生成物および方法との両方を含むことを意味し、例えば線状ポリマーとは反対に、得られた生成物は三次元構造を有する。「ポリマー」という用語は、オリゴマー、ホモポリマー、およびコポリマーを指す。シェルの細孔サイズを変えるためにシェルの架橋結合度を変更することができる。例えば、シェルの細孔径は、例えば塩化物イオン、ヌクレオチド、あるいは他の低分子などの比較的小さなイオンをシェルを通して透過させることができるように、十分な大きさを持たせることができる。シェルの細孔径は、ＤＮＡなどの任意の比較的大きな分子がシェルを透過することを防止するために十分小さくすることができる。多様な実施形態において、例えば、ｓｓＤＮＡフラグメントなどの生体分子の受動吸着または吸収を減少させるために、このシェルを親水性とすることができる。
【００２３】
多様な実施形態において、シェルは２つ以上の反応性モノマー単位の架橋結合された生成物でもよい。モノマー単位は水溶性モノマー単位でもよい。本明細書で云う、「水溶性」という用語は、わずかに水溶性から高度な水溶性までの任意の水への溶解度を有する物質、および水中で膨潤する物質を含む。モノマー単位は、窒素を含むか、酸素を含むか、あるいはその両方でもよい。シェルは、ホモポリマー、コポリマー、三元コポリマー、あるいは他のポリマーでもよい。このシェルはポリアクリルアミドなどのアクリルアミドの反応生成物でもよい。このシェルは、アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドとの、あるいはアクリルアミドと酢酸２、２−ビス（アクリルアミド）との反応生成物でもよい。このシェルは、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートおよびポリ（エチレングリコール）ジアクリレートの反応生成物でもよい。多様な実施形態において、代表的な水溶性ポリマーは、ポリ（メタ）（アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−メチル（メチル）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチル（メチル）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−イソ−プロピル（メタ）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド）；ポリ（Ｎ−ビニルホルムアミド）；ポリ（Ｎ−ビニルアセトアミド）；ポリ（Ｎ−メチル−Ｎ―ビニルアセトアミド）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）；ポリ（３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（ビニルメチルエーテル）；ポリ（Ｎ−（メタ）アクリルイルシナミド）；ポリ（ビニルオキサゾリドン）；ポリ（ビニルメチルオキサゾリドン）；ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）；ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）；水溶性多糖体、例えば、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース；ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートのポリマー類；ポリ（エチレングリコール）メタクリル酸塩のポリマー類；架橋結合が可能な他の適切なポリマー；あるいはこれらの組み合わせ、などがあるがこれに限定されない。シェルは中性、陰イオン性あるいは陽イオン性でもよい。多様な実施形態において、シェルは親水性でもよい。シェルは、例えばヒドロゲルなどの水中で膨潤することができるポリマーの架橋重合体ネットワークでもよい。代表的なヒドロゲルは、例えば参照によってその内容全体を本明細書に引用された米国特許第６，３８０，４５６Ｂ１号明細書番の中で記載されている。一度形成されたシェルは非水溶性になり得る。多様な実施形態において、このシェルはｓｓＤＮＡフラグメントおよび／または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントの吸着を防止することができる。多様な実施形態において、熱的に、光化学的に、イオンにより、あるいはポリマー化学の当業者において公知の任意の手段により、重合を開始させることができる。多様な実施形態において、重合は、縮合（または工程）重合、ラジカル重合、原子移動フリーラジカル重合、リビングフリーラジカル重合あるいは開環重合法が可能である。
【００２４】
多様な実施形態において、あらかじめ決めたサイズの細孔でシェルを形成させることができる。単一のＳＥＩＥ粒子の種々の細孔は、同じ大きさまたは異なるサイズとすることができる。この細孔は、一定の大きさより大きな分子が、シェルを通過しシェルによりマイクロカプセル化されたイオン交換コアまで達することを防止するためのサイズ排除開口部として機能することができる。多様な実施形態において、架橋剤、例えば、Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミドまたは酢酸２，２−ビス（アクリルアミド）の添加による１以上の反応性モノマーの架橋結合によって、シェルを形成することができる。架橋結合することができる反応性モノマー単位のモル数に基づいて、０．１ｍｏｌ％から９５ｍｏｌ％までの量の架橋剤または開始剤を添加することができる。多様な実施形態において、架橋結合することができる反応性モノマー単位のモル数に基づいて、０．１ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％まで、２．０ｍｏｌ％から５０ｍｏｌ％まで、５ｍｏｌ％から３０ｍｏｌ％まで、あるいは１０ｍｏｌ％から２０ｍｏｌ％まで架橋剤を加えることができる。シェルを形成するために使用される架橋剤の量は、シェルの細孔サイズを決定し、シェルのサイズ排除能の少なくとも１つの要因となる可能性がある。多様な実施形態において、架橋剤の選定、および／または反応条件の選択により、シェルの架橋結合量をコントロールすることができる。例えば、種々の量の官能性を有する多様な多官能性架橋剤を使用することができる。所望のシェル細孔径を形成するために使用する架橋剤の適正量は、選択された架橋剤の官能性、反応条件、当業者において公知の他の因子基づいて、当業者により決定することができる。シェル細孔径はｓｓＤＮＡ１０ｎｔ以下がよい。シェル細孔径はｓｓＤＮＡ１００ｎｔ以下がよい。
【００２５】
多様な実施形態において、架橋結合された反応生成物を提供する下記のうち任意の２つの反応によりシェルを形成することができる；Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、酢酸２，２−ビス（アクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、Ｎ、Ｎ’−ジ（メタ）アクリロイルピペラジン、トリ（メタ）アクリロイルパーヒドロ−ｓ−トリアジン。
【００２６】
サイズ排除シェルの細孔の５０％以上が１０ｎｔのｓｓＤＮＡ以上の大きさの分子を排除することができる細孔径を有する多様な実施形態によると、このシェルはヌクレオチド、サイズが１００ｎｔ未満のオリゴヌクレオチドプライマー、および緩衝塩をイオン交換コアへ通過させることができるが、サイズが１００ｎｔ以上はシェルにより偏向される。ここでサイズ排除シェルの細孔の５０％以上が１００ｎｔのｓｓＤＮＡ以上の大きさの分子を排除することができる細孔径を有し、生体試料、例えばＰＣＲ生成物の精製にＳＥＩＥ粒子を使用し、より大きなＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡ、遊離のヌクレオチド、塩およびイオンから分離する。シェル細孔径が１００ｎｔのｓｓＤＮＡより大きい、例えば、３００ｎｔ、８００ｎｔ、あるいは１５００ｎｔの場合、そのシェルでは、それぞれ、３００ｎｔ、８００ｎｔ、あるいは１５００ｎｔ未満のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、塩およびプライマーを通過させることが可能となる。
【００２７】
サイズ排除シェルの細孔の５０％以上が１００ｎｔのｓｓＤＮＡ以上の大きさの分子を排除することができる細孔径を有する多様な実施形態によると、このシェルでは、塩およびより小さなヌクレオチドがサイズ排除シェルを通過することを可能となり、イオン交換コアと反応する。サイズ排除シェルの細孔の５０％以上が１０ｎｔのｓｓＤＮＡ以上の大きさの分子を排除することができる細孔径を有する実施形態において、生体試料、例えば配列決定反応から得られた試料の精製にＳＥＩＥ粒子を使用することができる。配列決定反応試料の精製では、標識ジデオキシヌクレオチドおよび塩成分がこのシェルを通過し、イオン交換コアと反応することを可能とし、あらかじめ濾過された量に対するｓｓＤＮＡ量、すなわち７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上を含む精製試料を残すことにより、配列決定反応試料からこのような成分を取り除くことができる。このシェル細孔径が１０ｎｔのｓｓＤＮＡより大きい、例えば３０ｎｔの場合、このシェルは３０ｎｔ未満のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、塩およびプライマーを通過させることができる。細孔径が連鎖停止剤、色素、または試料から分離することが必要な他の付着物を有するプライマーの通過を許容する限り、このシェル細孔径を１０ｎｔ未満とすることもできる。例えば、細孔径は５ｎｔのｓｓＤＮＡ以上とすることができる。
【００２８】
この粒子が通過するか偏向されるかは、必ずしも正確に所定の「細孔径」である必要はないことが分かる。この細孔を通過するか排除されるかは、実際の細孔径（シェルの細孔はそれぞれ異なるサイズを有することができる）、立体障害因子、イオン引力、分極、およびその類似因子をはじメタする多くの因子に基づいている。したがって、「細孔径」平均の測定値であり、細孔径より大きな粒子はシェルを通過できない機会が高くなり、一方より小さな粒子はシェルを通過する機会がより高くなるという指針が提供される。
【００２９】
多様な実施形態において、イオン交換コアのマイクロカプセル化と同時にシェルを形成させることができる。例えば、ヒドロゲルを形成するための水溶性反応性モノマー、例えば、アクリルアミドの逆エマルジョン重合によってシェルを形成させることができる。図３に示すように、イオン交換コア１０を容器４０中の水性モノマー溶液に入れることができる。このイオン交換コア１０は、表面活性化（界面活性化）イオン交換コアでもよい。水性モノマー溶液は、例えば１以上のモノマー、例えばアクリルアミドまたはＮ−ビニルピロリドン、架橋剤、例えば酢酸２，２−ビス（アクリルアミド）、および／または、フリーラジカル開始剤、例えば過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、またはアゾ化合物を含んでもよい。その溶液は、１以上の触媒、停止剤、連鎖停止剤、連鎖移動剤、プロモータ、緩衝液、および促進剤さらに含むことができる。
【００３０】
次に、油相４２を容器４０に加えることができる。この油相４２は油および界面活性剤、または界面活性剤を含む油を含むことができる。代表的な油相４２は石油スペシャルＰｅｔｒｏｌｅｕｍ  Ｓｐｅｃｉａｌ（フルカ、ブーフＳＧ、スイス）であり、低い親水性親液性バランス（ＨＬＢ）値を有する界面活性剤、例えば、ソルビタンモノオレイン酸塩（ＨＬＢ＝４．３）を含んでいる。容器内容物を逆乳化および重合に供することができ、容器４０の水溶液４６中で部分的に架橋結合されたサイズ排除シェル２０によりマイクロカプセル化されたイオン交換コア１０を有するサイズ排除イオン交換粒子３０が形成される。逆エマルジョン重合により生成されたＳＥＩＥ粒子は、球状またはほぼ球状、もしくはイオン交換コアの形状に依存してその他の形状となる可能性がある。
【００３１】
多様な実施形態において、開始剤、触媒、またはその両者を浸透させた加熱されたイオン交換コアをシェルを形成するのに適した１以上の反応性モノマーの流動床に通すことによりシェルを形成することができる。流動床は、例えばアクリルアミドおよびＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含むことができる。流動床のモノマーおよび／またはポリマーは、粉末形状であってもよく、イオン交換コア内およびコア上を流動および／または溶融することができる。流動床反応によって生成されたＳＥＩＥ粒子は、不規則な形状となる可能性がある。
【００３２】
イオン交換コアを取り囲むシェルを形成する他の方法を使用することができる。シェルのサイズ排除特性を、調整し、修飾し、変更し、あるいはその他、シェルを形成するために使用されるプロセスの反応パラメータの変更により変化させることができる。
【００３３】
多様な実施形態において、シェルがイオン交換コアの直径の２％から３００％までの厚さ、またはイオン交換コアの直径の２５％から２００％までの厚さを有するように、このシェルをイオン交換コア上で形成することができる。シェルの厚さはイオン交換コアの表面上で異なっていてもよく、あるいはシェルの厚さはイオン交換コアの全表面上で均一であってもよい。
【００３４】
シェルは、少なくとも部分的にイオン交換コアをマイクロカプセル化させることができる。シェル物質では、少なくとも部分的に１以上の細孔またはイオン交換コアの表面特性、例えば細孔、クラック、凹部、壁孔、チャネル、穴、くぼみ、または溝を埋め込むことができる。例えば、イオン交換コアの全ての内面および外面上をシェルを形成するのに適したモノマーで覆うことができる。このモノマーは１以上の第２のモノマー、触媒、または開始剤と反応し、イオン交換コアの全ての表面に架橋結合されたサイズ排除ポリマーを形成し、またサイズ排除ポリマーの最表面と反応し、サイズ排除シェルの最表面を形成することができる。イオン交換コアの全ての表面にサイズ排除シェルを形成するポリマーの存在のために、大分子はイオン交換コアと接触できない。
【００３５】
多様な実施形態において、イオン交換コアは陰イオン性または陽イオン性物質でもよい。イオン交換コアは、ポリマー、架橋ポリマー、あるいは無機物質、例えばシリカでもよい。イオン交換コアは、イオン交換が可能な固体コア物質、あるいはイオン交換樹脂で処理された固体コア物質でもよい。イオン交換コアを表面活性化させることができる。イオン交換コアは非磁性、常磁性、あるいは磁性を有してもよい。代表的な陰イオン性イオン交換コア材料としては、以下に列挙されたものが挙げられる。陽イオン性イオン交換物質、およびイオン交換に関する当業者において公知であるイオン交換機能を構成することができる物質などを含むその他のイオン交換物質も使用することができる。
【００３６】
表１は、様々な製造業者より購入することができるイオン交換物質の例を示す。表１にコア物質の組成、ミクロン単位の粒径、１ｍｌ当たりのマイクロ当量単位の陰イオン交換体積、ＢＳＡ１ミリリットル当たりのミリグラム単位のタンパク結合能、および物質のイオン形態をリストする。この用途のために購入するか製造することができる唯一のイオン交換物質のサブセットであることは、当業者において明らかである。
【００３７】
【表１】
2005533646.tif 000003
【００３８】
イオン交換コアがイオン交換の可能な固体コア物質を含む多様な実施形態において、固体コア物質は、マクロポーラスシリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、内部細孔を有するマクロポーラスポリマーミクロスフィア、イオン交換分離に関する当業者において公知の他の多孔性物質、またはこれらの組み合わせが可能である。固体コア物質は例えば、細孔、クラック、凹部、壁孔、チャネル、穴、くぼみ、あるいは溝などの多様な表面特徴を有していてもよい。固体コア物質は、酸化ナトリウム、二酸化ケイ素、ホウ酸ナトリウム、あるいはこれらの組み合わせを含むことができる。イオン交換が可能なように、例えば陽イオン交換あるいは陰イオン交換が可能なように固体コア物質を改質することができる。固体コア物質の改質は、固体コア物質の表面で陽イオンまたは陰イオン性置換基を形成するための固体コア物質の処理を含むことができる。本明細書で使用される、「表面」という用語は、外面および／または内表面を含む。内表面は例えば、固体コア物質内の空隙か細孔の表面でもよい。固体コア物質は、１以上の４級官能基、少なくとも１つのカルボン酸基、少なくとも１つのスルホン酸基、イオン交換分離に関する当業者において公知のその他の陽イオンあるいは陰イオン性官能基、またはこれらの組み合わせを固体コア物質の表面に修飾することができる。
【００３９】
多様な実施形態において、固体コア物質は、マイクロポーラス、メソポーラス、および／またはマクロポーラスなものでもよい。固体コア物質は１０００オングストローム以下の平均細孔径、例えば１００オングストロームから１０００オングストロームまで、あるいは１００オングストローム以下でもよい。固体コア物質の平均径は、例えば０．１μｍから５００μｍまで、１μｍから２５０μｍまで、１μｍから１５０μｍまで、１μｍから１００μｍまで、あるいは２μｍから２０μｍまででもよい。固体コア物質の平均径は、２５０μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、あるいは２０μｍ以下でもよい。
【００４０】
多様な実施形態において、固体コア物質は、イオン交換コアを形成するために、固体コア物質の外面、内面、あるいは外面および内面の両方にイオン交換樹脂を吸着させることができる。本明細書で使用される「樹脂」という用語は樹脂またはゲルを含む。イオン交換樹脂は陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂でもよい。イオン交換樹脂は、１以上の４級化（ｑｕａｒｔｅｒｎｉｚｅｄ）官能基、１以上の非４級化アミン基、少なくとも１つのカルボン酸基、少なくとも１つのスルホン酸基、またはこれらの組み合わせを含む。本開示を考慮すると、イオン交換の当業者は、好ましい陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂が分かるであろう。
【００４１】
多様な実施形態において、イオン交換樹脂を固体コア物質の細孔、例えばマクロポーラスシリカ粒子内に閉じ込めることができる。イオン交換樹脂を固体コア物質の細孔の少なくとも一部に充填し、および／または固体コア物質の外面をイオン交換樹脂でコーティングすることにより、従来のイオン交換樹脂と比較して、ＳＥＩＥ粒子のイオン交換体積を増加させることができる。ＳＥＩＥ粒子のイオン交換体積は、イオン交換コアの細孔の外面および／または内面上の４級アンモニウム樹脂などのイオン交換樹脂の量を増加させることにより改善することができる。固体コア物質の外面、内面、または外面と内面との両方における陽イオンまたは陰イオン性官能基の適切な選択により、ＳＥＩＥ粒子のイオン交換体積を改善することができる。
【００４２】
多様な実施形態において、固体コア物質上の原位置でイオン交換樹脂を形成させることができる。例えば、図４に示すように、第１のモノマー１６、プレポリマーまたはポリマーを、細孔３２の表面に接触するように固体コア物質１２中に含浸させることができる。細孔３２の内面を含む固体コア物質１２内および固体コア物質１２上の原位置で架橋結合されたイオン交換樹脂１４を形成させるために、含浸された第１のモノマー１６、プレポリマーまたはポリマーを第２のモノマー、化合物、あるいはプレポリマー、および任意に開始剤と反応させることができる。イオン交換コア１０が生じる。多様な実施形態において、イオン交換樹脂は、１以上のモノマー、１以上のプレポリマーおよび／またはポリマー、あるいはこれらの組み合わせの生成物が可能である。例えば、逆乳化および重合により、細孔２５を有するシェル２０により、形成されたイオン交換コア１０をマイクロカプセル化することができ、サイズ排除イオン交換粒子３０が形成される。
【００４３】
多様な実施形態において、陰イオン交換コアはシェルによって形成され、マイクロカプセル化される。陰イオン交換コアを形成するために、固体コア物質の細孔の内面上を含む固体コア物質の表面上でポリエチレンイミンを含浸することができる。例えば、平均細孔径１０００オングストローム、空隙体積０．９５ｃｃ／ｇ、および直径５μｍを有するＳｉＯ２固体コア物質をポリエチレンイミンメタノール溶液に添加し、このコア内、および実質的に固体コア物質の全ての内面および外面上にポリエチレンイミンを含浸させるのに十分な時間インキュベートすることができる。多様な実施形態において、固体コア物質中のシラノール基による水素結合により、固体コア物質上でポリエチレンイミンを吸着させることができる。続いて、吸着されたポリエチレンイミンを、溶媒、例えば、ジオキサン中で、例えば１，３−ジブロモプロパンなどの第２の化合物と反応させ、陰イオン交換体として機能する架橋結合されたネットワークを形成させることができる。水を加えると、この架橋結合されたネットワークは膨潤ゲルを形成する。多様な実施形態において、陰イオン交換体は、ハロゲン化アルキルを有する架橋結合されたネットワークの反応により４級化され、強い陰イオン交換体が得られる。シェル、例えばポリアクリルアミドにより、得られた陰イオン交換コアをマイクロカプセル化することができ、サイズ排除陰イオン交換粒子が形成される。イオン交換分離の当業者において公知の方法により、少なくとも内面部分、少なくとも外面部分、あるいは少なくともイオン交換コアの固体コア物質の全ての表面部分上で他の陰イオン交換樹脂あるいは陽イオン交換樹脂を含浸させるか保持させることができる。
【００４４】
イオン交換コアは表面凝集によって調製された薄膜イオン交換コアでもよい。例えば、大きなスルホン化された陽イオン交換ビーズを、例えば高体積陰イオン交換粒子の０．１μｍの層で覆うことができ、陽イオン交換ビーズの表面で高体積陰イオン交換物質の薄いシェルを形成させることができる。薄膜のイオン交換コアを形成する方法は、例えば、Ｊ．Ｗｅｉｓｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９８６年、およびＣ．Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ  Ｂｏｎｄｅｄ  Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  Ｐｈａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７４年に記載されており、この両者を本明細書に参照によってその内容全体を引用する。
【００４５】
多様な実施形態において、イオン交換コアの周囲におけるシェル形成を増強するか援助するために、イオン交換コアを表面活性化することができる。イオン交換コアの表面活性化には、例えば、モノマーによるイオン交換コア官能基の誘導体化、イオン交換コアのイオン交換樹脂によるイオン相互作用によるイオン交換コア上へのポリアニオンの吸収、中性および水溶性あるいは少なくとも部分的に水溶性のオリゴマー、ポリマー、またはコポリマーのイオン交換コア上への受動的吸着、イオン相互作用またはこれらの組み合わせによる荷電開始剤、などが含まれる。
【００４６】
多様な実施形態において、アクリル酸またはアクリロイルクロライドによるイオン交換コア官能基の誘導体化によって、イオン交換コアを表面活性化することができる。例えば、図５に示すように、ＢｉｏＲａｄ製のＭａｃｒｏ−ＰｒｅｐＴＭ陰イオン交換樹脂のイオン交換コアを誘導体化することができる。この陰イオン交換樹脂１００は、エポキシコモノマー結合を介して主鎖に結合した陰イオン交換４級アンモニウム基で形成されている。ヒドロキシル基は４級化後も陰イオン交換樹脂１００上に残留し、ヒドロキシル基はさらに修飾される。陰イオン交換樹脂１００のアクリロイルクロライド１０５との反応により、陰イオン交換コア上にシェルポリマーをグラフト重合するのに有用なアクリロイル基を有する表面活性化陰イオン交換樹脂１１０が提供される。図５に示すように、プラスの電荷を有する陰イオン交換樹脂１００の表面上へのイオン相互作用により、マイナスの電荷を有するアクリル酸１１５、またはその陰イオンバージョンが吸着することによって、陰イオン交換樹脂１００も表面活性化される。この表面活性化により、プレポリマーまたはモノマーと共同重合することができる表面活性化陰イオン交換樹脂１２０が提供され、陰イオン交換コアの周囲にシェルが形成される。ポリマー化学の当業者において公知の他の誘導体化を使用し、陽イオンまたは陰イオン性イオン交換コアを表面活性化することもできる。
【００４７】
多様な実施形態において、イオン交換コアの部分を少なくとも形成するイオン交換樹脂の表面上への荷電したまたは中性のポリマーの吸収によりイオン交換コアを表面活性化することができる。例えば、陰イオン交換樹脂は、マイナス荷電ポリマー、例えばポリアニオンの吸着により表面活性化することができる。ポリアニオンとしては、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸、１以上の（メタ）アクリルアミドを備えた（メタ）アクリル酸コポリマー、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソ・プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、ＮメチルＮ−ビニルアセトアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メチル）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）メタクリル酸塩、ビニルメチルエーテル、ビニルアルコール前駆物質、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、Ｎ−（メタ）アクリルイルシナミド；またはこれらの組み合わせが挙げられる。ポリアニオンのアクリル成分は、イオン相互作用によって陰イオン交換樹脂の表面上にポリアニオンを固定することができる。理論的には不明であるが、ポリアニオンが（メタ）アクリルアミド成分あるいはＮ，Ｎ’−ジメチル（メタ）アクリルアミド成分である多様な実施形態において、これらの成分はコア樹脂の表面上でモノマー、コモノマー、およびそれらの重合生成物、例えばオリゴマーの分配を可能とすると考えられている。これらの分配されたモノマー、コモノマー、およびそれらの重合生成物は、マイクロカプセル化プロセスにおけるシェルに不可欠な部分となる。
【００４８】
図６に示すように、例えば、反応性（重合可能）ポリアニオン１５０は、アクリルアミド１３０、アクリル酸１３５、およびアクリル酸１４０のＮＨＳエステルの共重合により形成することができる。図７に示すように、マイナス電荷のＣＯ２−基（Δと示す）を有する得られた反応性ポリアニオン１５０を、陰イオン交換コア１２の陰イオン交換樹脂の表面上に固定することができ、この樹脂は表面および／またはコア１２の細孔内で、＋ＮＸ３および／または＋ＮＨＹ２プラス電荷の基（＊で示す）を有し、ここでＸおよびＹはＣｎＨ２ｎ＋１から独立に選択され、ｎは１以上の整数であり、またこの樹脂はコアの細孔中でマイナス電荷の塩化物イオンＣｌ−基（白四角で示す）を有する。逆乳化により、陰イオン交換コア１２および反応性ポリアニオン１５０の周囲に、水シェルまたは水ジャケット２００が形成される。水シェル２００は、反応性モノマー、コモノマー、架橋剤、およびそこに溶解された開始剤を有する。水シェル２００の重合により、イオン交換コア１２の周囲にシェル２０が形成され、ＳＥＩＥ粒子３０が形成される。ポリアニオン１５０の反応性アリル基またはアクリルアミド基は、イオン交換コア１２の陰イオン交換樹脂上でのシェルのグラフト重合に提供される。
【００４９】
多様な実施形態において、イオン交換コア上の中性、水溶性、または有機溶解性ポリマーの受動的吸着によりイオン交換コアを表面活性化することができる。中性、水溶性、または有機溶解性ポリマーは、例えば、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）またはそのコポリマー；ポリ（酢酸ビニル−コ−ビニルアルコール）；ポリアクリルアミドまたはそのコポリマー；ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド）またはそのコポリマー；ポリ（Ｎ−ビニルアミド）またはそのコポリマー；ポリ（エチレンオキシド−コ−プロピレンオキシド）；両親媒性ジブロックおよび両親媒性ブロックコポリマー、例えば、ポリ（スチレン−ｂ−２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）、ポリ（スチレン−ｂ−アクリルアミド（メチル））、ポリ（スチレン−ｂ−Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（スチレン−ｂ−エチレンオキシド）、ポリ（ジメチルシロキサン−ｂ−２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチル（メタ）アクリレート−ｂ−アクリルアミド（メタ））、ポリ（メチル（メタ）アクリレート−ｂ−Ｎ（Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド））、ポリ（メチル（メタ）アクリレート−ｂ−エチレンオキシド）、およびポリ（メチル（メタ）アクリレート−ｂ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）；またはこれらの組み合わせ、などが可能である。
【００５０】
多様な実施形態において、イオン交換コアは、荷電開始剤、例えば１以上のマイナスの電荷を有する官能基を含む光開始剤、または熱開始剤とのイオン相互作用によって表面活性化することができる。例えば、図８に示すように、開始剤１５５は１分子当たり２つのカルボン酸基を含む４、４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）の形式で提供することができる。イオン性基ＣＯ２−を備えた開始剤１５５（△で示す）は、＋ＮＭＥ３（＊で示す）およびＣｌ−（白四角印で示す）のイオン性基を有する陰イオン交換コア１２の表面上に吸着することができ、表面活性化イオン交換コア１６０を形成する。表面活性化イオン交換コア１６０の周囲の水シェル、または水ジャケット２００を形成するために、表面活性化イオン交換コア１６０は逆乳化させてもよい。水シェル２００は、反応性モノマー、コモノマー、およびそこに溶解された架橋剤を有する。水シェル２００およびコア１６０は構造１７０を形成し、熱重合されシェル２０を有するＳＥＩＥ粒子１９０が形成される。図８に示すように多様な実施形態により、イオン交換コア１６０の表面の開始剤１５５は、モノマー、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、架橋剤、例えば２、２−ビスアクリルアミド酢酸を含む水性あるいは非水性のモノマー溶液中で熱分解を受け、シェル２０を有するＳＥＩＥ粒子１９０を形成するためのフリーラジカル重合を開始させる表面結合フリーラジカル（白丸印で示す）を有する構造１８０を形成する。
【００５１】
イオン交換コア内の試料の精製は、イオン交換による。イオン交換コア上で吸収することができる各々の電荷当量は、適切な溶液内へ等価な電荷を遊離することができる。多様な実施形態において、このイオン交換コアからの対イオンの置換により、試料液中への多量の対イオンが遊離される。例えば塩化物イオン形式のイオン交換コアの場合、試料液は塩化物イオン濃度を増加させる可能性がある。試料液から取り除かれるべきイオンにおいて、イオン交換コアの選択性はイオン交換コアの対イオンよりも大きくなる可能性がある。例えば、イオン交換コアが塩化物イオン形式の陰イオン交換コアである場合、対イオンは塩化物イオンであり、樹脂中の塩化物イオンを置換し、試料液へ塩化物イオンを遊離するために、試料液から取り除かれるべきイオンは、陰イオン交換コアに対して、塩化物対イオンよりも高い親和性を有する。対イオンが塩化物イオンである場合、これらの陰イオンの陰イオン交換コアに対する親和性が塩化物イオンよりも弱いので、水酸化物またはリン酸のようないくつかのイオンを、少ない量で陰イオン交換コアに保持させることができる。
【００５２】
多様な実施形態において、陰イオン交換コアに対して親和性を有するイオンが陰イオン交換コアに保持されると水酸化物が遊離されるように、陰イオン交換コアは水酸化物対イオンを有してもよい。水酸化物対イオンが使用される場合、塩化物と水酸化物は電荷に対して同様の親和性を有するので、塩化物イオンは陰イオン交換コアに弱く付着する。プロトン化された形態の陽イオン交換体またはサイズ排除陽イオン交換粒子を、水酸化物対イオンを有するサイズ排除陰イオン交換粒子と共に使用し、試料液の正反応を進行させ、塩化物イオンなどの低親和性イオンの保持を改善することができる。
【００５３】
多様な実施形態において、イオン交換コアは、より低い移動度の対イオン、例えばオクタンスルホン酸塩を含むことができる。イオン交換コアは、揮発性の対イオン、例えば、陰イオン交換物質用酢酸塩、または陽イオン交換物質用アンモニウムを含むことができる。酢酸塩またはアンモニウムなどの揮発性の対イオンは、後で試料液から取り除くことができる。陰イオン交換コア用の対イオンは、例えばハロゲン化物または水酸化物でもよい。陽イオン交換コア用の対イオンは、例えば水素でもよい。
【００５４】
多様な実施形態において、ＳＥＩＥ粒子から放された塩イオンおよび対イオンなどのイオンの試料液からの除去を促進するために、ＳＥIＥ粒子およびイオン交換樹脂を含む混合床が好ましい。例えば、ＳＥＡＥ粒子から遊離された対イオンが陽イオン交換樹脂から遊離された対イオンと反応し、反応中に混合床から移動することのできる水または揮発性物質などの中性化合物を形成するように、サイズ排除陰イオン交換（ＳＥＡＥ）粒子は裸の陽イオン交換樹脂と結合することができる。中性かまたは揮発性かにかかわらず、このような不活性成分または分離可能な生成物の生成は、試料液からのＳＥＡＥ粒子によるイオンの保持を進行させる。サイズ排除陽イオン交換（ＳＥＣＥ）粒子および裸の陰イオン交換樹脂の混合床を使用することができる。ＳＥＡＥ粒子およびＳＥＣＥ粒子は混合床を形成することができる。
【００５５】
多様な実施形態において、混合床イオン交換体は、水酸化物形態の陰イオン性イオン交換コアを有するＳＥＡＥ粒子を含むことができる。混合床は、試料液のバルク相脱塩に使用することができる。混合床を形成するために、ＳＥＡＥ粒子は水酸化物形態で調製することができ、水素形態で調製されたＳＥＣＥ粒子または陽イオン交換樹脂と混合することができる。試料液の陰イオンはＳＥＡＥ粒子から水酸化イオンを置換することができ、そのイオン交換コアと結合する。水酸化イオンにより、試料液が塩基性となる可能性がある。混合床により、試料液から水酸化物およびヒドロニウムイオンを連続的に除去し、試料液の低いイオン強度を維持するように、ＳＥＡＥ粒子から遊離された水酸化イオンおよび陽イオン交換樹脂またはＳＥＣＥ粒子から遊離されたヒドロニウムイオンは、不可逆的に反応し水を形成する。混合床は、溶液から、例えば塩化物などのより低親和性の陰イオンの除去を促進することができる。混合床は試料液の安定なｐＨ値を維持することができる。混合床は、試料液からそれぞれのＳＥＡＥおよびＳＥＣＥ粒子上に陰イオンおよび陽イオンの吸着を促進することができる。混合床は試料液を脱塩することができる。多様な実施形態において、水酸化物形態のイオン交換コアを備えたＳＥＡＥ粒子は、水素形態の化学量論的に等量の陽イオン交換樹脂またはＳＥＣＥ粒子と混合することができる。
【００５６】
多様な実施形態において、ＳＥＡＥ粒子の混合物、例えば、水酸化物形態では、陰イオン交換樹脂、例えば水酸化物形態において、プロトン化された従来の陽イオン交換樹脂またはプロトン化されたＳＥＣＥ粒子によって高体積の脱塩／洗浄剤を形成することができる。脱塩／洗浄剤の体積は樹脂のイオン化能力の関数であり、試料液の体積未満であり、試料液の脱塩／洗浄に影響を及ぼす。
【００５７】
多様な実施形態において、混合床は、例えば化学量論的に等価な量のＳＥＡＥ粒子およびＳＥＣＥ粒子、例えば化学量論的に等価な量のＳＥＡＥ粒子および陽イオン交換樹脂、または例えば化学量論的に等価な量のＳＥＣＥ粒子および陰イオン交換樹脂を含むことができる。混合床において、陰イオン交換の可能な物質、例えばＳＥＡＥ粒子または陰イオン交換樹脂の量は、陽イオン交換可能な物質、例えばＳＥＣＥ粒子または陽イオン交換樹脂の量と化学量論的に異なっていてもよい。
【００５８】
多様な実施形態において、混合床は、例えば化学量論的に非等価な量のＳＥＡＥ粒子およびＳＥＣＥ粒子、例えば化学量論的に非等価な量のＳＥＡＥ粒子および陽イオン交換樹脂、または例えば化学量論的に非等価な量のＳＥＣＥ粒子および陰イオン交換樹脂を含むことができる。化学量論的に非等価な量の混合されたイオン交換体は、陰イオン交換または陽イオン交換のいずれかに過剰な能力を提供する。
【００５９】
代表的なＰＣＲ生成物溶液は、増幅標的配列（単位複製配列）、緩衝塩、金属イオン、酵素（例えば重合酵素）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、および他の成分を含むことができる。多様な実施形態において、ＰＣＲ生成物を分析でき、あるいはＰＣＲ生成物を含む試料液中で認められる少なくともいくつかの人為的な結果に感度を有する後続の酵素反応にＰＣＲ生成物を使用することができる。例えば、遊離のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、下流の酵素反応を妨害することができる。ＳＥＩＥ粒子のサイズ排除限界は、例えば１００ｎｔｓｓＤＮＡが可能である。ＳＥＩＥ粒子は、例えば、１００ｎｔまたは同等サイズ未満であるヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、および緩衝液塩を捕捉し除去することができる。得られた溶液は、脱塩された環境において精製ＰＣＲ生成物を含み、下流の反応および分析に使用することができる。ＰＣＲ精製は、より小さなｓｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ（例えば、プライマー−二量体、ｄｓＤＮＡである不要な副反応生成物)、遊離のヌクレオチド、および塩から、より大きな二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を分離することを目的とすることができる。ＳＥＩＥ粒子を使用するＰＣＲ生成物精製は、例えば２５０−６００ｂｐ単位複製配列を単離することができ、４４ｎｔのプライマー、ヌクレオチド、またはその両方を除去することができる。
【００６０】
ＤＮＡ塩基配列決定反応溶液は、例えば、緩衝液塩、金属イオン、重合酵素、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、および他の成分を含むことができる。しかしながら、配列決定反応溶液の精製のためのＳＥＩＥ粒子は、ＰＣＲ反応溶液の精製で使用されるものと異なっていてもよい。例えば多様な実施形態において、配列決定反応生成物は、電気泳動法およびＤＮＡ塩基配列決定、またはベースコーリング(ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ)の前に除去することができる残りの取り込まれない色素標識ジデオキシヌクレオチド（停止剤）を含むことができる。このような化合物の除去の失敗は、ＤＮＡ塩基配列決定またはベースコーリング（ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ）においてエラーを引き起こす可能性がある「しみ」を生じる。キャピラリー塩基配列分析装置では、ＤＮＡ塩基配列決定反応試料を導入する手段として、界面動電注入を使用することができる。試料中での塩の存在は、キャピラリー内への試料の導入に影響を及ぼす可能性があり、キャピラリーへの導入のために塩濃度を減少させる必要がある。ＤＮＡ塩基配列決定反応試料は、ＳＥＩＥ粒子による精製により脱塩することができる。ＳＥＩＥ粒子で精製された試料液は、１００μＭ以下の塩濃度を有してもよい。ＳＥＩＥ粒子で精製された試料液は、５０μＭ以下の塩濃度を有してもよい。ＳＥＩＥ粒子によって精製された試料液は、界面動電キャピラリー注入に好ましい。この目的および他の目的において、ＳＥＩＥ粒子は例えば１０ｎｔｓｓＤＮＡ未満のサイズ排除限界を有し、溶液内で遊離ｓｓＤＮＡが残っている間に、試料液由来の塩および色素標識されたヌクレオチドなどの小イオンを除去することができる。ＳＥＩＥ粒子を使用する塩基配列決定反応精製を使用し、例えば１０ｎｔ〜１５００ｎｔ、またはそれ以上のサイズを有するｓｓＤＮＡを、例えば色素標識ヌクレオチドおよび塩などの小さな成分から分離することができる。
【００６１】
多様な実施形態において、ＤＮＡ精製はＳＥＩＥ粒子を使用してバルクモードで行うことができる。ＳＥＩＥ粒子の適切なクロマトグラフ床は必ずしも必要ではない。
【００６２】
多様な実施形態において、本明細書で述べたようにＳＥＩＥ粒子を含む装置が提供される。装置は１以上の経路を有する微量流体装置であり、少なくとも１経路の少なくとも１部分がＳＥＩＥ粒子を含む。装置はＳＥＩＥ粒子との流体コミュニケーションにおいて注入口と排出口を有する。この粒子は例えばカラム中に存在する。本明細書で使用される、カラムは水平および垂直方向に向いており、あるいは水平および垂直方向の間の任意の位置にある。カラムは空洞、室、貯蔵部位、反応領域、床、くぼみ、あるいはＳＥＩＥ粒子および試料液を含むか保持するのに適するその他の容器を含んでもよい。カラムは１以上のＳＥＩＥ粒子を含んでもよい。装置の排出口は、精製試料ウェル、管、ガラスプレート、あるいは精製試料を収集する別の手段などの容器を備える流体コミュニケーション内に設けてもよい。
【００６３】
多様な実施形態において、このような装置を使用する方法は、試料液の精製のために提供される。装置は、サイズ排除陰イオン交換粒子、サイズ排除陽イオン交換粒子、またはこれらの組み合わせなどのサイズ排除イオン交換粒子を含む。この方法は粒子を装置のカラムに添加するプロセスを含む。裸の陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、またはその両者を、随意、この装置のカラムへ加えることができる。試料、例えばＰＣＲ精製生成物溶液または塩基配列決定反応生成物溶液を、装置の注入口に置くか導入することができる。試料は注入口から、ＳＥＩＥ粒子およびオプションの追加のイオン交換樹脂を含むカラムまで移動することができる。試料は、サイズ排除分離およびイオン交換の組み合わせに供され、試料の濾過および／または精製が行われる。濾過されおよび／または精製された溶液は、カラムから排出口まで溶出するか除去することができ、分析および／または次のプロセスのための容器に向けることができる。試料は向心力によってカラムを通って移動することができる。
【００６４】
多様な実施形態において、ＳＥＩＥ粒子を使用する試料の精製は、試料の少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のイオン交換の適切なイオン交換体積を提供するのに十分なＳＥＩＥ粒子の体積を使用して達成することができる。精製は１０分以下、５分以下、あるいは２分以下で行うことができる。精製は、ＳＥＩＥ粒子が試料とイオン交換するのに十分な時間、試料がＳＥＩＥ粒子と接触し、ＳＥＩＥ粒子から精製された試料を除去するプロセスを含む。
【００６５】
多様な実施形態において、精製された試料を粒子から分離するプロセスは、粒子から精製試料を取り除き、精製試料から粒子を取り除き、および／または粒子および精製試料の混合物から精製試料を抽出することを含む。粒子および精製試料の混合物から精製試料を抽出するプロセスの例としては、キャピラリーを試験管内で直接浸漬し、塩基配列決定装置へ注入することにより、試験管内で生成物を分析するプロセスを含む。
【００６６】
本発明の多様な態様の代表的な実施形態を本明細書で述べる。上記の記載および以下の実施例は代表的なもののみを示し、方法および物質に関する本明細書に記載の様々な修正および置換は、当業者において明白であり、本明細書の記載に含まれるものとする。
【実施例】
【００６７】
（ＳＥＩＥ粒子および混合床の形成：）
溶液は、水(ミリＱウォーターシステム、マサチューセッツ州ミリポアビレリカ)１１．９３９１ｇ中にアクリルアミド（純度９９＋％、アルドリッチケミカル社、ミズーリ州セントルイス）２．４９５７ｇ（３５．１１ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド(純度９９＋、アルドリッチケミカル)０．７０２１ｇ（４．５５ｍｍｏｌ）から調製した。攪拌しながら、水（ミリＱウォーターシステム、ミリポア）２．００７５ｇ中のＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ  ＨＱマクロポーラス陰イオン交換コア（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ヘルクレス）０．７１５８ｇの懸濁液をこの溶液に、加えた。ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ  ＨＱの懸濁液は、使用の３０分前に時折攪拌しながら調製した。モノマー溶液とＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ懸濁液との混合物を、ＰＥＴＲＯＬＥＵＭ  ＳＰＥＣＩＡＬ（ｂｐ１８０〜２２０°Ｃ、フルカ）２０．１０ｇ中にＳＰＡＮ−８０（ソルビタンモノオレイン酸塩、フルカブーフ、スイス）１．００７２ｇを含む溶液へ注ぎ、３６００ｒｐｍで攪拌した。室温で２．５分間、乳化を実施した。水冷コンデンサ、パージ用のブリージング管、および１”のステンレス鋼３枚羽プロペラを備えたメカニカルスターラーを装備した２４／４０三つ口丸底フラスコに乳濁液を加えた。１００ｒｐｍの攪拌速度で、乳濁液を超高純度ヘリウムを用い、１００ｍＬ／分の流量で３０分間パージした。パージの開始時に、水（ミリＱウォーターシステム、ミリポア）２２．１６５２ｇの中に硫酸アンモニウム（純度９９．９９＋％、アルドリッチケミカル）０．４５０７ｇを含む溶液０．５ｍＬ（０．０４４ｍｍｏｌ）を加えた。パージ終了時に、４５±１℃の油浴中で冷却し、Ｎ、Ｎ、Ｎ’Ｎ’−テトラメチレンエチレンジアミン５０μＬ（０．３３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに添加した。４５±１℃、５．５時間、重合を行った。反応時間の終わりに、この反応液をアセトン１５０ｍＬを含む容器に移し、５分間撹拌した。この反応混合物を５ミクロンの濾紙で吸引濾過し、過剰のＰＥＴＲＯＬＥＵＭ  ＳＰＥＣＩＡＬおよびアセトンで洗浄し、空気吸引で乾燥させ、粉末状ＳＥＡＥ粒子３．９２ｇ（定量的収率）を得た。この乾燥したＳＥＡＥ粒子を、ポリビニルアルコール（８０％加水分解、分子量９−１０Ｋｄａ、アルドリッチケミカル）０．５重量％を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７、ニュージャージー州Ｊ．Ｔベイカーフィリップスバーグ）２５ｍＬ中に分散した。使用前にこのリン酸緩衝液を０．２ミクロンフィルター膜で濾過した。
【００６８】
１ＭＮＨ４ＯＨ（超高純度グレード、ニュージャージー州ギブスタウンＥＭＤ）で繰り返し洗浄することにより、ＳＥＡＥ粒子を水酸化物形態に変換した。所定量の樹脂を１つの形態から別の形態に変換するために必要な酸または塩基の体積は、酸または塩基の濃度、および樹脂のイオン体積を知ることにより計算することができ、実際に、必要とされる酸または塩基の１０倍過剰量で変換される。実施例の方法により、粒子１００μＬを１ＭＮＨ４ＯＨ８００ｕＬと混合し、マイクロ遠心分離機により１０００×ｇで遠心分離し、上澄み液をピペットで取り除いた。このプロセスを１０回繰り返した。この工程は任意であるが、この粒子をスピンカラムに移し、１００μＬアリコートの１ＭＮＨ４ＯＨで３回洗浄した。溶出液のｐＨが中性となるまで(ＤＩ水の５００μＬアリコートでおよそ１０回洗浄)、樹脂床を脱イオン（ＤＩ）水で繰り返し洗浄した。
【００６９】
混合床のためのＳＥＣＥ粒子を同様のプロセスにより調製した。プロトン化された形態の市販のマクロポーラス陽イオン交換コア、ＡＧ５ＯＷ−Ｘ８、４００メッシュ（カリフォルニア州、ヘルクレス、ＢｉｏＲａｄ）を得た。この樹脂はプロトン化された形態で提供されるが、樹脂を再度変換すると、より良好な結果が得られることに注意すること。ＮＨ４ＯＨのかわりに１ＭＨＣｌ（試薬グレード、Ｊ．Ｔ．ベーカー）で洗浄することを除いて、ＳＥＡＥ粒子を水酸化物形態に変換するために述べたものと同じプロセスを使用してＳＥＣＥ粒子を水素イオン形態に変換した。ＨＣl洗浄に続いて、溶出液のｐＨが中性となるまで水洗浄を行った。ＳＥＡＥ粒子およびＳＥＣＥ粒子を１０００×ｇで１分間回転させることにより半乾燥させた。ＳＥＡＥ粒子およびＳＥＣＥ粒子を各々５００μＬのＤＩ水でスラリー化した。それぞれ陰イオンおよび陽イオン交換ビーズのイオン体積に基づいた理論混合比でこの粒子を互いに混合し、ボルテックスして混合床スラリーを形成させた。ビーズ混合物中へのＤＮＡの吸着を最小とするため、ＤＩ水中で１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製された剪断サケ精子ＤＮＡ溶液（エッペンドルフＡＧ、ハンブルク、ドイツ）で混合床を２回洗浄した。剪断サケ精子ＤＮＡの体積は、樹脂床の体積とほぼ同等のものを各洗浄に使用した。ビーズ床は１０００μＬアリコートのＤＩ水で３回洗浄した。１０００×ｇで１分間回転させることにより、スラリーを半乾燥させ、４℃で貯蔵した。本明細書に記載するように、使用前に混合床をサケ精子ＤＮＡで洗浄することに注意すること。ただし、混合前の構成ビーズの洗浄は同様に有効である。ＳＥＡＥおよびＳＥＣＥ樹脂を単独で（すなわち混合床の中ではなく）使用する場合、サケ精子ＤＮＡで洗浄することも同様に有用である。
【００７０】
（ＰＣＲ精製：）
ＰＣＲ精製では、ＰＣＲマスター混合液１０２μＬ、ＦＡＭ標識フォワードプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）４μＬ、リバースプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）４μＬ、ｈｇＤＮＡＣＥＰＨ１３４７−０２（５０μｇ／μＬ）２０μＬ、および脱イオン水（ＤＩ）７０μＬを含む試料を調製した。このマスター溶液を熱サイクラープレート中のウェルに、２０μＬ／ウェル体積の一定量を加えた。その混合物を９５℃、５分間加熱し、続いて加熱を４０サイクル行い、それぞれのサイクルでは、９５℃、３０秒、続いて６０℃、１２０秒間加熱させた。
【００７１】
精製を行なうために、上述の実施例(半乾燥、上述のとおり)で述べたように混合床ＳＥＩＥ粒子２４ｍｇを形成させ、マイクロ遠心分離管中で秤量した。原ＰＣＲ生成物３０μＬを加え、混合物を５分間震盪した。マイクロ遠心分離管を５０００ｘｇで回転させ、５μＬの上澄みを除去し、ＡＢＩ３１００塩基配列決定装置による分析のため、９６ウェルプレートへピペットで移した。ＰＯＰ６ポリマーおよびＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ分析ソフトウェア、両者ともアプライドバイオシステムズ社製、カリフォルニア州、フォスターシティーを備えた５０ｃｍアレイを使用してＡＢＩ３１００により試料を分析した。
【００７２】
（ＤＮＡ塩基配列決定反応精製：）
ＤＮＡ塩基配列決定反応精製では、ＢＩＧＤＹＥ  ＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ  ＲＥＡＤＹ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸ（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州、フォスターシティー）(ｖ．３)４００μＬ、Ｍ１３ユニバーサルリバースプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）５０μＬ、テンプレート単位複製配列（約１００μｇ／μＬ）２５μＬ、ＤＩ水５２５μＬを含む試料を調製した。このマスター溶液を熱サイクラープレート中のウェルに、２０μＬ／ウェル体積の一定量を加えた。その混合物に２５サイクルの加熱を行い、それぞれのサイクルでは９５℃で１０秒の加熱、５０℃で５秒の加熱、および６０℃で１２０秒の加熱を含む。
【００７３】
精製を行なうために、上述の実施例(半乾燥、上述のとおり)で述べたように混合床ＳＥＩＥ粒子２４ｍｇを形成させ、マイクロ遠心分離管中で秤量した。原ＰＣＲ生成物３０μＬを加え、混合物を５分間震盪した。マイクロ遠心分離管を５０００×ｇで回転させ、５μＬの上澄みを除去し、ＡＢＩ３１００塩基配列決定装置による分析のため、９６ウェルプレートへピペットで移した。５０ｃｍアレイ、アプライドバイオシステムズ社製ＰＯＰ６、および標準塩基配列決定モジュールを使用してＡＢＩ３１００により試料を分析した。
【００７４】
塩基配列決定反応の精製を小規模で行うこともできる。ＤＮＡ塩基配列決定反応精製では、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）８μＬ、Ｍ１３ユニバーサルリバースプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）１．０μＬ、テンプレート単位複製配列（約１００μｇ／μＬ）０．５μＬ、ＤＩ水１０．５μＬを含む試料を調製した。この溶液をＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９７００（アプライドバイオシステムズ社）に配置した。この混合物に２５サイクルの加熱を行い、それぞれのサイクルでは９５℃で１０秒の加熱、５０℃で５秒の加熱、および６０℃で１２０秒の加熱を含む。すでに記載したように、ＳＥＡＥ／陽イオン交換混合床を調製した。ビーズを堆積させ、続いて床上のすべての水を除去することにより、この混合物を堆積床として調製した。この堆積床をボルテックスし、１μＬアリコートを５０μＬＭｉｃｒｏＡｍｐ管（アプライドバイオシステムズ社）に移した。すでに調製した塩基配列決定反応１．０μＬをこのビーズに加え、１５秒間ピペット混合した。この管をボルテクサーに移し、１分間ボルテックスした。この管にＤＩ水６μＬを加え、ピペット混合し、ベンチ遠心分離機で５００×ｇ、３０秒遠心分離した。上澄をピペットで除去し、ＡＢＩ３１００ＤＮＡ塩基配列決定装置を動作させる。試料は非常に高度に脱塩されるので、データがスケールアウトしないように、塩基配列決定装置上の注入電位および時間を４結合因子（ａ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ４）だけ減少させた。
【００７５】
（実験結果:）
ＰＣＲ精製の結果はＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアを使用して分析され、図９に示される。この実験は、二本鎖ＤＮＡ単位複製配列を保持する間に、５６０ｂｐＰＣＲ生成物から大多数の色素標識３８ｎｔプライマーの除去が観察されるようにデザインした。データが示すように、このプライマーは最初は試料中に高濃度で存在したが（図９のグラフ（ａ）参照）、ＳＥＩＥ粒子との接触によって濃度が減少した。図９のグラフ（ａ）〜（ｄ）で見られるように、５０と表示した５０００〜７０００スキャンからのピークはＦＡＭ標識３８ｎｔのプライマーに由来し、６０と表示した２３，０００スキャンのピークはＦＡＭ標識ＰＣＲ生成物である。２分間のＳＥＩＥ粒子との接触により（図９グラフ（ｂ））、ＰＣＲ生成物に影響を及ぼさずに大半のプライマーが除去された。５分間(図９グラフ（ｃ）)、または数分間(図９グラフ（ｄ）)のＳＥＩＥ粒子との接触により、プライマーの量は検出限界以下に減少した。各試料にスパイクされたＲＯＸ標識７ｎｔ一本鎖ＤＮＡ内部標準の比較では脱塩度は各試料間で同等であり、各キャピラリーに注入された量はほぼ等しいことが分かった。これらの結果は、混合床ＳＥＩＥ樹脂との短時間の接触により、ＰＣＲ生成物を含む溶液を脱塩しプライマーを除去すること、標的単位複製配列の濃度への影響は最小であることが分かる。
【００７６】
ＳＥＩＥ粒子を使用して精製されたＰＣＲ生成物のＤＮＡ塩基配列決定を図１０ａおよび１０ｂに示す。精製、および未精製において過剰のプライマーおよびヌクレオチドでスパイクされたＰＣＲ生成物の塩基配列決定を行った。両ケースとも、塩基配列決定反応はＣｅｎｔｒｉＳｅｐスピンカラム（プリンストンセパレーション社、米国、ニュージャージー州、プリンストン）を使用して精製された。図１０ａは、未精製のＰＣＲ生成物で検出された配列を図示する。このグラフは多くのノイズおよび多数の配列を含んでいる。いくつかのミスコールおよびアンビギュイティーが認められ、全般的な品質は低い。図１０ｂは、同じＰＣＲ生成物であるが、配列分析前に１０分間、ＰＣＲ生成物をＳＥＩＥ樹脂と接触させることにより精製させた生成物で検出された配列のグラフを示す。図１０ｂの配列は、図１０ａの配列と異なり、明確に判読可能である。
【００７７】
図１１ａ〜ｄのデータは、ＤＮＡ塩基配列決定反応生成物精製へのＳＥＩＥの適用を示す。グラフは、無処置ＤＮＡ塩基配列決定反応生成物配列（図１１ａ）では、配列データを不明瞭にする大きな人為的な結果（「しみ」）を有することを示す。図１１ｂは、標準ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを使用したＤＮＡ塩基配列決定反応の処理結果を示す。明らかに図１１ｂのデータは、図１１ａより明瞭である。図１１ｃおよび１１ｄは、配列分析を行う３分前に、混合床ＳＥＩＥ粒子でＤＮＡ塩基配列決定反応生成物を処置した結果を示す。図１１ｃおよび１１ｄで分かるように、ＳＥＩＥ精製により、図１１ａの中で存在する「しみ」の大部分は認められなくなり、また、図１１ｂに示すグラフと比較した場合、より良好なピーク分離が認められる。図１１ｃにおいて２９５ｎｔのスパイクは、キャピラリー中の気泡によって引き起こされたことに注意すべきである。図１１ｃに示すように、グラフの開始時点で反映されているように、ＳＥＩＥ精製により、小さな反応生成物フラグメントがフィルタリングされる結果を示す。図１１ｄは、上述のｄローダミンの塩基配列反応の精製に関する結果を示す。この精製は異なるバッチのＳＥＩＥ樹脂上で行なわれ、より小さなスケールで実施された（１μＬの樹脂による１μＬの反応）。この結果は、樹脂に対する試料の比が１未満である場合でも、優れた精製を達成できることを示している。
【００７８】
図１２および１３は、イオン交換コアとサイズ排除イオン交換粒子との間のサイズの増加を示している。図１２は、ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰＨＱ陰イオン交換樹脂（半径２５μｍ）と、この樹脂で作製されたＳＥＩＥ粒子との間のサイズの相違を示す。図１３は、ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ２５Ｑ陰イオン交換樹脂（平均半径１２．５μｍ）と、実施形態（平均半径１９μｍ）に従ってこの樹脂で作製されたＳＥＩＥ粒子との間のサイズの相違を示す。図１２および１３により、ＳＥＩＥ粒子はイオン交換コアに関してより大きなサイズを有することが分かる。
【００７９】
本教示の精神および範囲から逸脱せずに様々な修正および変形を、本明細書に記載された種々の実施実施形態に対して行うことができることは当業者において明白である。したがって、本明細書に記載された多様な実施形態は、添付されている特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内の他の修正および変形を対象とすることを意図している。
【００８０】
以下の図は実寸を表していないと解釈すべきである。物体間の関係も実際のサイズを表しておらず、実際に図中のサイズが逆転する場合がある。この図は、表示した各物体の構造を把握し、明確化することを目的とし、したがって特定の構造特性を説明するために、いくつかの特性が誇張されている場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換粒子との陰イオン種の相互作用の模式図を示す。
【図２】図２はサイズ排除イオン交換コアのコアシェル構造の模式図であり、コアの表面およびコアの内部を示すための破断図を有する。
【図３】図３は、多様な実施形態において、逆乳化および重合によるイオン交換コア上のシェルの形成を示す模式図である。
【図４】図４は、多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換粒子の形成を示す図である。
【図５】図５はイオン交換樹脂の誘導体化を示す図である。
【図６】図６は反応性ポリアニオンの形成を示す図である。
【図７】図７は、多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換粒子の形成を示す模式図であり、１工程はイオン交換コアの表面活性化である。
【図８】図８は、多様な実施形態において、サイズ排除イオン交換粒子の形成のための２つの経路を示す模式図であり、共通の１工程はイオン交換コアの表面活性化である。
【図９】図９は、（ａ）色素標識単位複製配列および色素標識プライマーの混合物を含む生試料から得られたデータ、および多様な実施形態において、色素標識されたプライマーを除去するためにサイズ排除イオン交換粒子を有する試料を（ｂ）２分間、（ｃ）５分間、および（ｄ）１０分間、インキュベーションした後に得られたデータに関する一連のグラフである。
【図１０】図１０ａと１０ｂは、サイズ排除イオン交換粒子を使用して精製されたＰＣＲ生成物の塩基配列分析結果を示し、図１０ａは生ＰＣＲ生成物の塩基配列分析データであり、図１０ｂは多様な実施形態によるサイズ排除イオン交換粒子との接触により精製されたＰＣＲ生成物の塩基配列分析データである。
【図１１】図１１ａ−ｄは、標準の精製技術と比較したサイズ排除イオン交換粒子との接触による塩基配列決定反応の精製を示し、図１１ａは未精製試料の生データであり、図１１ｂはＣｅｎｔｒｉＳｔｅｐカラムで精製された試料のデータであり、図１１ｃおよび１１ｄは、多様な実施形態によるサイズ排除イオン交換粒子との接触により精製された試料からのデータである。
【図１２】図１２は、粒子数において、多様な実施形態による陰イオン交換コアと、陰イオン交換コアを含む得られたＳＥＩＥ粒子との間のサイズの相違を示すグラフであり、また、
【図１３】図１３は、粒子数において、多様な実施形態による陰イオン交換コアと、陰イオン交換コアを含む得られたＳＥＩＥ粒子との間のサイズの相違を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【図８】
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【国際調査報告】
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