(57)【要約】ＨＳＰ９０ファミリーの成員の結合ポケットにおける構造的差異は、少なくとも１種のＨＳＰ９０ファミリーに関して、ＡＤＰよりも高くかつアンサマイシン系抗生物質と異なる親和性で、Ｎ末端結合ポケットと相互作用する設計小分子の使用により、キナーゼおよび他のシグナル伝達タンパク質の差次的分解を達成するのに利用することができる。さらに、これらの小分子は、水性媒質に可溶性であるように設計することができ、したがってアンサマイシン系抗生物質の使用を上回るさらなる利点を提供する。薬学的に許容可能なキャリアおよびＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の少なくとも１つの成員のＮ末端ポケットに結合する結合部分を含む小分子を含有する薬学的組成物を配合することができる。かかる結合部分は、機能にとって、ＨＳＰ９０のシャペロンが必要であるタンパク質に依存する腫瘍細胞に対する抗増殖活性を有することが見出された。しかしながら、異なる化学種は、異なる活性を有し、例えばＲａｆキナーゼの分解なしでのＨｅｒ２分解の選択を可能とする。したがって、結合部分は、固有のターゲッティング能力を保有する。さらに、小分子をターゲッティング部分と連結させて、特定種類の細胞に対する活性のターゲッティングを提供することができる。したがって、本発明はさらに、これらの組成物の投与による、癌を含めた疾患の治療方法を提供する。二量体形態の結合部分を使用してもよい。
2005519848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員のＮ末端ポケットに結合する結合部分を含む化合物であって、該化合物は、合成分子であり、該結合部分は、アンサマイシン系抗生物質またはラディシコール(radicicol)あるいはそれらの誘導体ではない化合物。
【請求項２】
前記化合物は、水溶性である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記結合部分は、置換プリンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記結合部分は、タンパク質受容体またはマーカーに特異的に結合するターゲティング部分に結合される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記結合部分は、以下の：
2005519848.tif 000007
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、またはＣＯであり、Ｘ１は、疎水鎖またはＣＯＲであり、Ｒは、疎水鎖であり、Ｘ２は、１〜５個の水素受容体／供与体官能基（同じであっても異なってもよい）であり、Ｘ３は、アルキル基（飽和、不飽和、環式または線状）、アルコキシ基、ハロゲン、ＳＭｅ、およびＳＥｔの中から選択される小型基であり、Ｘ４は、ＨであるかまたはＸ３と同様であり、Ｘ５は、ＨであるかまたはＸ１と同様であり、Ｘ６は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏアルキル、−ＣＯＮＨ２、または同様の水素供与体官能基であり、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルである）
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記結合部分は、下記式：
2005519848.tif 000008
（式中、Ｙは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＯ−Ｃであり、Ｘ１は、疎水鎖またはＣＯＲであり、Ｒは、疎水鎖であり、Ｘ２は、１〜５個の水素受容体／供与体官能基（同じであっても異なってもよい）であり、Ｘ３は、アルキル基（飽和、不飽和、環式または線状）、アルコキシ基、ハロゲン、ＳＭｅ、およびＳＥｔの中から選択される小型基であり、Ｘ４は、ＨであるかまたはＸ３と同様であり、Ｘ５は、ＨであるかまたはＸ１と同様であり、Ｘ６は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏアルキル、−ＣＯＨ２、または同様の水素供与体官能基であり、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルである）
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記結合部分は、下記構造：
2005519848.tif 000009
（式中、Ｘ７は、水素またはハロゲンであり、Ｘ３は、ハロゲンである）
を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記結合部分は、下記構造：
2005519848.tif 000010
を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記結合部部分は、下記構造：
2005519848.tif 000011
を有する、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
第１の結合部分は、二量体を形成するために第２の結合部分に結合される、請求項１ないし９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容可能なキャリア、およびＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員のＮ末端ポケットに結合する結合部分を含む化合物を含む薬学的組成物であって、前記結合部分は、該ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員のＮ末端ポケット内に配置されるとフォールディングされたＣ配置を達成することができる主鎖、および該結合部分が、該ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の少なくとも１つの成員に関して、ＡＤＰよりも高くかつゲルダナマイシンと異なる該Ｎ末端ポケットに対する親和性を有し、また該ＨＳＰファミリーのシャペロンを必要とするタンパク質の差次的分解を提供する程度に、該Ｎ末端ポケット中の複数の潜在的結合部位と相互作用するための配向性で方向付けられた該主鎖上の置換基を有する組成物。
【請求項１２】
前記結合部分は、請求項１ないし８のいずれかに記載の化合物の一部または全部である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記結合部分は、請求項９に記載の化合物の一部または全部である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
機能にとってＨＳＰファミリーの成員が必要であるタンパク質または受容体に依存する細胞の成長を阻害する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物で該細胞を処理する工程を含む方法。
【請求項１５】
機能にとってＨＳＰファミリーの成員が必要であるタンパク質または受容体に依存する細胞の成長を阻害する方法であって、請求項９に記載の組成物で該細胞を処理する工程を含む方法。
【請求項１６】
下記式：
2005519848.tif 000012
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＨ２、またはＣＯであり、Ｘ１は、疎水鎖またはＣＯＲであり、Ｒは、疎水鎖であり、Ｘ２は、１〜５個の水素受容体／供与体官能基（同じであっても異なってもよい）であり、Ｘ３は、アルキル基（飽和、不飽和、環式または線状）、アルコキシ基、ハロゲン、ＳＭｅ、およびＳＥｔの中から選択される小型基であり、Ｘ４は、ＨであるかまたはＸ３と同様であり、Ｘ５は、ＨであるかまたはＸ１と同様であり、Ｘ６は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏアルキル、−ＣＯＮＨ２、または同様の水素供与体官能基であり、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルである）
を有する化合物。
【請求項１７】
下記式：
2005519848.tif 000013
（式中、Ｙは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、またはＯ−Ｃであり、Ｘ１は、疎水鎖またはＣＯＲであり、Ｒは、疎水鎖であり、Ｘ２は、１〜５個の水素受容体／供与体官能基（同じであっても異なってもよい）であり、Ｘ３は、アルキル基（飽和、不飽和、環式または線状）、アルコキシ基、ハロゲン、ＳＭｅ、およびＳＥｔの中から選択される小型基であり、Ｘ４は、存在しないか、ＨであるかまたはＸ３と同様であり、Ｘ５は、ＨであるかまたはＸ１と同様であり、Ｘ６は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−Ｏアルキル、−ＣＯＮＨ２、または同様の水素供与体官能基であり、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルである）
を有する化合物。
【請求項１８】
８−ベンジルプリン組成物を作製する方法であって、以下の：
（ａ）カルボン酸出発原料を酸ハロゲン化物に変換する工程と、
（ｂ）該酸ハロゲン化物を、アミノ置換ピリミジンと反応させる工程であって、それによって、中間生成物を生成し、それを閉環して８−ベンジルプリンを製造する、反応させる工程と
を含む方法。
【請求項１９】
９位の窒素にて前記８−ベンジルプリンをアルキル化する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルキル化は、光延アルキル化反応を用いて実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＳＰ９０ファミリーの成員のＮ末端ポケットの結合親和性に関して試験化合物をスクリーニングする方法であって、以下の：
（ａ）該試験化合物および該ＨＳＰ９０ファミリーの成員を、基板上に固定化されたｈｓｐ結合部分を有する該基板と接触させる工程と、
（ｂ）固定化されたアンサマイシン系抗生物質により結合される該ＨＳＰファミリーの成員の量を観察する工程であって、該試験化合物の非存在下で結合される量と比較した場合に、結合される該ＨＳＰの成員の量の減少は、該試験化合物が、該ＨＳＰ９０ファミリーの成員に結合することを示す、観察する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
前記ｈｓｐ結合部分は、アンサマイシン系抗生物質またはラディシコールである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｈｓｐ結合部分は、ゲルダナマイシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｈｓｐ結合部分は、請求項１ないし９、１６、または１７のいずれかに記載の化合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｈｓｐ９０−αまたはβへの選択的結合に関して化合物をスクリーニングする方法であって、以下の：
（ａ）非特異的ＨＳＰ９０結合部分を有する支持体を、スクリーニングされるべき該化合物の存在下にて、Ｈｓｐ９０−αおよびβの両方を含むＨｓｐ９０調製物を含有する溶液と組み合わせる工程と、
（ｂ）該支持体に結合するＨｓｐ９０−αおよびβの量を検出する工程であって、差次的結合選択性を有する化合物は、異なる度合いで該支持体へのＨＳｐ９０−αおよびβの結合を阻害する、検出する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
前記非特異的ＨＳＰ９０結合部分は、ゲルダナマイシンである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１１月２日に提出された米国仮出願第６０／２４５，１７７号（これは、参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
［発明の背景］
本出願は、ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質に結合する小分子、ならびにかかる小分子の作製方法および使用方法に関する。
【０００３】
ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質には、哺乳類細胞では４つの認識される成員：Ｈｓｐ９０αおよびβ、Ｇｒｐ９４ならびにＴｒａｐ−１がある。Ｈｓｐ９０αおよびβは、多数の他のタンパク質と関連して、細胞質ゾルおよび核に存在する。Ｈｓｐ９０は、最も豊富な細胞シャペロンであり、変性タンパク質すなわち「アンフォールディングされた」タンパク質のＡＴＰ依存性リフォールディングに必要とされることが実験系でわかっている。したがって、ＨＳＰ９０は、ストレスに対する細胞防御の一部として機能することが提唱されている。細胞が、熱または他の環境ストレスに暴露される場合、アンフォールディングされたタンパク質の凝集は、それらのリフォールディングまたは分解を触媒する経路により阻止される。このプロセスは、複数のシャペロン（Ｈｓｐ６０、９０および７０、ならびにｐ２３）との、規則正しい様式でのアンフォールディングされたタンパク質の会合、「リフォールドソーム(refoldosome)」の形成、および最終的にはリフォールディングされたタンパク質からのシャペロンのＡＴＰ依存性放出に依存する。
【０００４】
Ｈｓｐ９０はまた、突然変異タンパク質の安定性および機能を維持するのにも役割を果たし得る。Ｈｓｐ９０は、突然変異ｐ５３およびｖ−ｓｒｃの発現にとって、それらの野生型対応物よりも相当高い程度で必要とされると思われる、このことは、タンパク質アンフォールディングを引き起こす突然変異の表現型のｈｓｐ９０媒介性抑制の結果として起きると示唆されている。
【０００５】
Ｈｓｐ９０はまた、細胞外因子に対する細胞の成長応答に関与する幾つかの重要なタンパク質の立体配座的成熟に必須である。これらとしては、ステロイド受容体ならびに特定の膜貫通キナーゼ（すなわち、Ｒａｆセリンキナーゼ、ｖ−ｓｒｃおよびＨｅｒ２）が挙げられる。ｈｓｐ９０がこれらのタンパク質に影響を及ぼす機構は完全には理解されていないが、タンパク質のリフォールディングでのその役割と類似していると思われる。プロゲステロン受容体の場合では、ｈｓｐ９０の結合および受容体からの放出は、他のシャペロンおよびイムノフィリンの放出と呼応して、循環的様式で起き、受容体へのステロイドの高親和性の結合に必要であることがわかっている。したがって、ｈｓｐ９０は、ストレスの非存在下でさえも、シグナル伝達経路の生理学的調節因子として機能することができる。
【０００６】
Ｈｓｐ９０はまた、複数の腫瘍型において、また発癌遺伝子の悪性転換の機能として過剰発現されることがわかっている。Ｈｓｐ９０が、悪性転換を維持するのに必須の役割を果たすかどうかは未知であるが、それは、この点に関して少なくとも３つの機能を有し得る。癌細胞は、低酸素、低ｐＨ、および低栄養濃度の環境で成長する。それらはまた、放射線および細胞障害性化学療法剤に迅速に順応するか、またはそれらに対して耐性となるように選択される。したがって、ストレス下でのタンパク質の安定性を維持する際のｈｓｐ９０の一般的な役割は、これらの条件下での細胞生存度に必須であり得る。第２に、癌細胞は、突然変異発癌遺伝子タンパク質を保有する。これらの幾つかは、悪性転換した表現型に必須の機能獲得型突然変異である。Ｈｓｐ９０は、これらのタンパク質のフォールディングされた機能的に活性な立体配座を維持するのに必要とされ得る。第３に、ステロイド受容体、Ｒａｆおよび他のｈｓｐ９０標的に媒介されるシグナル伝達経路の活性化は、多くの腫瘍の成長および生存に必須であり、したがって機能性ｈｓｐ９０を必要とする可能性が高い。
【０００７】
ｈｓｐ９０のこれらの特徴は、ｈｓｐ９０を、治療薬の実行可能な標的としている。ＨＳＰ９０ファミリー成員は、細菌から哺乳類までのすべてのｈｓｐ９０に特異的であり、かつそれらに保存されるが、他の分子シャペロンには存在しないそれらのＮ末端領域中の特有のポケットを保有する。このポケットに関する内因性リガンドは知られていないが、それは、低親和性でＡＴＰおよびＡＤＰを結合し、弱いＡＴＰ分解酵素活性を有する。さらに、アンサマインン系抗生物質であるゲルダナマイシン（ＧＭ）およびハービマイシン（ＨＡ）は、この保存ポケットに結合することがわかっている。この結合親和性は、ＨＳＰ９０ファミリーの成員すべてに関してわかっている。国際特許公開公報第９８／５１７０２号（これは、参照により本明細書に援用される）は、標的細胞におけるタンパク質の分解および標的細胞の死を引き起こすアンサマイシンの標的送達を提供するためのターゲッティング部分に結合したアンサマイシン系抗生物質の使用を開示する。国際特許公開公報第００／６１５７８号は、特にアンサマイシン系抗生物質のホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、シャペロンタンパク質ｈｓｐ９０と相互作用する２つの部分を有する二官能性分子に関する。これらの二官能性分子は、ＨＥＲファミリーのチロシンキナーゼの分解および／または阻害を促進するように作用し、Ｈｅｒキナーゼを過剰発現する癌の治療に効果的である。
【０００８】
ゲルダナマイシンおよび他のアンサマイシン系抗生物質ならびにそれらの誘導体の使用は、多数のキナーゼおよび他のシグナル伝達タンパク質の効果的な分解を提供するものの、それらは一般に、有意な選択性を欠如しており、むしろ広範囲のタンパク質を分解するのに有効である。これは、望ましくない副作用の危険性を増大させ得る。さらに、アンサマイシン系抗生物質は、水性媒質に不溶性であるか、またはせいぜい難溶性である。このことが、投与を複雑にする。したがって、ＨＳＰ９０ファミリーのシャペロンタンパク質の成員との相互作用を介した、キナーゼおよび他のシグナル伝達タンパク質の分解をもたらす治療薬には依然として改良の余地がある。
【０００９】
［発明の概要］
ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員は、高度に保存された特有のＮ末端結合ポケットを特徴とするものの、各種成員のポケット間には構造的差異が存在する。今回、これらの構造的差異が、ＡＤＰよりも高くかつアンサマイシン系抗生物質と異なる親和性で、Ｎ末端結合ポケットと相互作用する設計小分子の使用により、キナーゼおよび他のシグナル伝達タンパク質の差次的分解を達成するのに利用することができることを見出した。さらに、これらの小分子は、水性媒質に可溶性であるように設計することができ、したがって、アンサマイシン系抗生物質の使用を上回るさらなる利点を提供する。
【００１０】
ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質のＮ末端ポケットは、５つの潜在的結合部位を含有する。ｈｓｐ９０αの場合、これらの結合部位は、以下の：
（ａ）Ｌｙｓ１１２を含む上部の結合部位、
（ｂ）Ｌｙｓ５８、Ａｓｐ５４、Ｐｈｅ１３８骨格、Ｇｌｙ１３５、およびＡｓｎ１０６を含む第２の上部の結合部位、
（ｃ）Ａｓｐ９３、Ｓｅｒ５２、およびＡｓｎ５１を含む底部結合部位、
（ｄ）Ｖａｌ１５０、Ｍｅｔ９８、Ｖａｌ１８６、Ｐｈｅｌ１３８、Ｌｅｕ１０７、Ｌｅｕ１０３、Ｖａｌ１８６、およびＴｒｐ１６２を含む疎水性側方結合部位、および
（ｅ）Ｔｈｒ１８４、Ｖａｌ１８６、Ｖａｌ１５０、およびＩｌｅ９１を含む小疎水性底部結合部位
である。本発明は、薬学的に許容可能なキャリア、およびＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の少なくとも１つの成員のＮ末端ポケットに結合する結合部分を含む分子を含む薬学的組成物を提供する。この結合部位は、ＨＳＰ９０ファミリー中の少なくとも１つの特定タンパク質に関して、ＡＤＰよりも高いが、ゲルダナマイシンよりも低い親和性で、Ｎ末端ポケットと相互作用する。さらに、結合部分は、ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員のＮ末端ポケット内に配置されると、フォールディングされたＣ配置を達成することができる主鎖を有する。結合部分はまた、Ｎ末端ポケット内の複数の潜在的結合部位と相互作用するための配向性で方向付けられた主鎖上の置換基を有する。
【００１１】
本発明の結合部分は、機能にとって、ＨＳＰ９０ファミリーのシャペロンが必要であるタンパク質に依存する腫瘍細胞に対する抗増殖活性を有することが見出された。しかしながら、異なる化学種は、異なる活性を有し、例えばＲａｆキナーゼの分解なしでのＨｅｒ２分解の選択を可能とする。したがって、本発明の結合部分は、固有のターゲッティング能力を保有する。さらに、小分子をターゲッティング部分に連結させて、特定種類の細胞の活性のターゲッティングを提供することができる。したがって、本発明はさらに、これらの組成物の投与により、癌を含めた疾患の治療方法を提供する。二量体形態の結合部分を使用してもよい。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、１つまたは複数のＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の成員、例えば、１つまたは複数のｈｓｐ９０αまたはβ、Ｇｒｐ９４およびＴｒａｐ−１、あるいは同様のポケットを有するタンパク質、例えば、ＤＮＡジャイレースおよびＭｕｔＬのＮ末端ポケットと、優先的に、ＡＤＰよりも高くかつゲルダナマイシンよりも低い親和性で結合する小分子に関する。本出願の明細書および特許請求の範囲において用いられるとき、「ＨＳＰ９０のＮ末端ポケット」との用語は、ゲルダナマイシンおよび他のアンサマイシン系抗生物質が結合し、ＡＴＰ／ＡＤＰによって占められているポケットを指す。
【００１３】
図１は、ＨＳＰ９０ファミリーのタンパク質の既知の成員それぞれの構造を比較する、整列配列を示す。ｈｓｐ９０αの場合、５つの潜在的結合部位は、
（ａ）Ｌｙｓ１２を含む上部結合部位、
（ｂ）Ｌｙｓ５８、Ａｓｐ５４、Ｐｈｅ１３８骨格、Ｇｌｙ１３５およびＡｓｎ１０６を含む第２の上部結合部位、
（ｃ）Ａｓｐ９３、Ｓｅｒ５２およびＡｓｎ５１を含む底部結合部位と、
（ｄ）Ｖａｌ１５０、Ｍｅｔ９８、Ｖａｌ１８６、Ｐｈｅ１３８、Ｌｅｕ１０７、Ｌｅｕ１０３、Ｖａｌ１８６およびＴｒｐ１６２を含む疎水性側方結合部位と、
（ｅ）Ｔｈｒ１８４、Ｖａｌ１８４、Ｖａｌ１８６、Ｖａｌ１５０およびＩｌｅ９１を含む小疎水性底部結合部位
である。
図１に示されているように、ＨＳＰファミリーのタンパク質では高度に保存されているものの、Ｎ末端ポケットは種々の成員間で違いを有する。本発明の結合部分は、これらの違いを利用して、キナーゼおよび他のシグナル伝達タンパク質の差次的分解を可能とする組成物を提供する。本出願の明細書および請求の範囲において用いられるとき、「差次的分解」との用語は、キナーゼまたはシグナル伝達タンパク質の、別のキナーゼまたはシグナル伝達タンパク質よりも多量の分解（ともにゲルダナマイシンの存在下で分解される）か、またはキナーゼまたはシグナル伝達タンパク質のゲルダナマイシンの存在下で得られる異なった産物への分解のいずれかを指す。
【００１４】
Ｎ末端結合ポケットのサイズおよび形状は、Stebbins et al., 「Crystal Structure of an Hsp90-Geldanamycin Complex: Targeting of a Protein Chaperone by an Antitumor Agent」 Cell 89: 239-250 (1997)に記載されている。これには、「ポケットは平坦な底部を有する三角錐として表すことができ、その深さは約１５Å、直径は表面付近で１２Å、中ほどまで下がった所で８Åであり、底部は３つの水分子を保有するのに十分な広さを有する。」と観察されている。本発明の薬学的組成物中の結合部分は、このポケット内部に適合するように、かつＮ末端ポケット内の複数の潜在的結合部位と相互作用するように設計されている。
【００１５】
図２は、分子設計工程の可視化を補助するために配置された、図４中に示される種類の結合部分を有するポケットの３次元図を示す。図３ＡおよびＢは、Ｘ線結晶学により決定された、ｈｓｐ９０ポケット内部のプリン核（ＰＵ３）に基づく設計された結合部分の立体配座を示し、これらはそれぞれポケット内部と、ポケットを示していないものとである。ポケットの開口１０は図の下方付近に配置されている。ポケット自体は４本のアームを有し、ここで、アーム１１は開口１０の最も近くにあり、底部結合部位を含む。図４に反映されているように、このアームの内部はプリン核のアミノ置換基と相互作用する。
【００１６】
第２のアーム１３は、第１のアームと約９５〜１１０°の角度で接続している。第３のアーム１２は、第１のアーム１１と約１００〜１２０°の角度で接続している。これら２本のアームは２つの結合部位を保存し、かつ一般的に元来親水性である。置換基Ｘ2（図４）は、これら２本のアームの一方の内部に適合し、これにより結合部分の屈曲は特徴的なＣ形となる。結合部分として働く分子を選択するときには、このＣ形を受け入れる能力を考慮に入れなければならない。図２に記すように、アーム１１と１３との間の分離間隔（９．５〜１１Å）は、アーム１１と１２との間の分離間隔（８〜９Å）よりも大きい。したがって、より長い置換基（Ｘ2）を選択する場合には、アーム１２よりもアーム１３への分子の挿入が好ましい。第４のアームは、側方の疎水性ポケットを保持し、かつ置換基Ｘ3を受容する（図４）。このポケットはおよそ１００Å3の容積を有し、特性は一般的に疎水性である。したがって、置換基Ｘ1（図４）はこのポケットを充填し、かつ疎水性残基と相互作用するように選択される。
【００１７】
本発明の第１の実施形態では、結合部分は完全な分子である。図４は、プリン核に基づくこの種類の例示的構造を示し、置換基とＮ末端結合ポケット内部の結合部位との間の相互作用を示す。図４中、置換基Ｘ1は任意の疎水性鎖（線状、分枝状脂肪族、芳香族、非環式または環式であって、ポケット内部に適合するＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏおよび／またはＳ原子を含むもの）であり、Ｘ2は、ポケット内部に適合し、かつ、かかる基の活性を強めることのできるハロゲンのような電子供与基を任意に加えたＯＲ、ＯＣＯＲ、ＮＣＯＲ等のような１〜５個の水素受容体官能基であり、Ｘ3は、ポケット内部に適合する任意の小型置換基、例えば、フッ素のような基である。本発明の実施形態では、本発明の分子とゲルダナマイシン抗生物質およびその誘導体との間の構造的差異は、これらの結合部分と疎水性側方結合部位および小疎水性結合部位との間の相互作用である。Stebbinsらにおいて観察されているように、これらの部位はポケットの底部に位置し、ゲルダナマイシンはこれらの部分を充填しない。むしろ、ゲルダナマイシンのメチル基は側方のポケット中に部分的にのみ延伸し、ポケットの底部には水分子のための余地が残される。逆に、本発明の組成物においては、置換基はポケット内の少なくとも疎水性側方結合部位を充填するように選択され得る。本明細書中で用いられるとき、「充填する」との用語は、水分子の収容のために残されている余地がない程度に、結合部位が占められていることを指す。
【００１８】
ＨＳＰ９０タンパク質のＮ末端ポケット内部に適合し、かつ、少なくとも１つのＨＳＰファミリーの成員に関してＡＤＰとゲルダナマイシンとの間の親和性でポケットと相互作用する、本発明の範囲内の結合部分の付加的な例が、図５に示されている。これらの組成物において、Ｘ1は疎水性鎖（線状、分枝状脂肪族、芳香族、非環式または環式であって、ポケット内部に適合するＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏおよび／またはＳ原子を含むもの）またはＣＯＲ（Ｒは疎水性鎖）であり、１〜５個の水素受容体／供与体官能基（Ｘ2は、同じでも異なっていてもよい）であり、Ｘ3は、アルキル（飽和、不飽和、環式または線状）、アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）、ハロゲンまたはＳＲ（Ｒはメチルまたはエチル）のような小型基であり、Ｘ4はＨであるかまたはＸ3と同様であり、Ｘ5はＨであるかまたはＸ1と同様であり、Ｘ6は−ＮＨ2、−ＯＲ（ＲはＨまたはアルキル）、または−ＣＯＮＨ2あるいは同様の水素供与体官能基であり、Ｒ1はＨまたはアルキルである。これらの分子はすべてＣ形の配置にフォールディングすることが可能であり、疎水性側方部位を含む少なくとも３つの潜在的結合部位と相互作用する。異なる核を有するがこれに匹敵する全体の容積（およそ２００〜５００Å3未満）および寸法を有する他の化合物が同じように設計可能であり、本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。
【００１９】
図５中でＰＵファミリーとして示す構造を有する組成物は、図６Ａに略述した手順を用いて合成可能である。出発原料であるカルボン酸は、ピリジン／ＤＣＭ中でシアヌル酸フッ化物との反応により酸フッ化物に、あるいは、ＳＯＣｌ2との反応により酸塩化物に変換される。この酸ハロゲン化物はアミノ置換ピリミジン（例えば、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中の４，５，６−トリアミノピリミジン硫酸塩またはＮａＯＨ水溶液中の２，４，５，６−テトラアミノピリミジン硫酸塩、あるいはＤＭＦ中のＫ2ＣＯ3を含むいずれかの硫化物）と反応され、中間生成物（図１中のＰＹ−Ａ、ＰＹ−Ｂ、ＰＹ−Ｃ）が生成され、これは閉環して置換８−ベンジルプリン誘導体（ＰＵ−Ａ、ＰＵ−Ｂ、ＰＵ−Ｃ）を生成し、これは本発明による有用な組成物である。所望の場合には、光延アルキル化のようなアルキル化反応を行って、アルキル基Ｒ（官能置換基の有無は問わない）を９位の窒素に付加してもよい。ＰＵファミリー前駆体ＰＵ−Ｃの９−Ｎアルキル化により作られる例示的化合物は、図６Ｂに示されている。
【００２０】
図７Ａおよび図７Ｂは、小疎水性結合部位との相互作用のための、Ｘ３位置における官能基の導入のための合成スキームを示す。図８Ａおよび図８Ｂは、Ｘ２部位での導入の変化のための合成スキームを示す。
【００２１】
図９は、図５からの化合物のＲＤ類の合成のための合成スキームを示す。図５中に示される他の種類は、これと似た合成アプローチを用いて作成可能である。
【００２２】
本発明の組成物は、癌および他の疾患の治療における治療的利益を提供するために直接用いられ得る。以下の実施例に示されるように、本発明の組成物は、ＳＫＢｒ３中のＨｅｒ２キナーゼ、ＭＣＦ−７およびＢＴ４７４乳癌細胞の分解を誘発することが示されている。加えて、本発明の組成物は、Ｒｂ−陽性ＳＫＢｒ３およびＭＣＦ−７乳癌細胞系のＧ１停止の発生に有効であり、かつ、これらの細胞系ならびにＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ４６８および前立腺癌細胞系ＴＳＵＰｒおよびＬＮＣａＰに対する抗増殖効果を有することが示されている。
【００２３】
ＰＵファミリーの化合物について、Ｈｓｐ９０への結合、Ｈｅｒ２の全タンパク質の分解およびその抗増殖効果を試験した。表１は、９−Ｎ鎖がこの活性に与える影響をまとめたものである。表に挙げられていないＰＵファミリー化合物（図６Ｂ）は、不活性または不溶性であった。
【００２４】
ＰＵファミリー化合物は、図７Ｂに示す反応プロトコルを用いて置換基Ｘ３としてフッ素基を付加することにより（Ｃ−２フッ素化）修飾した。結果は表２にまとめた。示されているように、フッ素置換基の導入により、共通のＸ１基を有する組成物の活性は上昇し、その活性が表１には報告されていないＸ１置換基を有する組成物の活性／可溶性は増強された。
【００２５】
活性の変化は、図８Ｂに示される反応スキームを用いてフェニル環に付加的なハロゲン置換基を付加したときにも観察される。表３に示されるように、ＰＵ３中のメトキシ基により占められていない一方の（両方ではない）位置でのハロゲン化物の導入は、ＰＵ３と比較して活性の上昇をもたらす。
【００２６】
化合物ＰＵ３ＰｈＣｌ中のような塩素置換基、および、ＰＵ２４ＦまたはＰＵ２９Ｆ中のようなフッ素置換基で、化合物を調製した。表４に示されるように、これらの化合物は、これまで試験したもののうちで最も活性があった。
【００２７】
ＰＵファミリー分子における可能な変化の別の位置は、プリンとフェニル基の間の架橋の長さおよび性質中にある。図１０は、かかる変化を達成するための合成スキームを示す。化合物６９を試験すると、ｈｓｐ９０−βに対して弱い結合を有したが、ｈｓｐ９０−αに対して検出可能な結合を有しなかった。これは、化合物１８に関して観察される結合選択性の逆である。これは、これら２つのタンパク質間の選択性を提供する。
【００２８】
本発明の組成物を個別に使用する代わりとして、組成物は、図５に一般構造で示されるｈｓｐ結合核が、細胞の標的母集団に見出されるタンパク質、受容体またはマーカーに特異的に結合するよう選択された標的部分と連結することにより誘導体化される連結組成物であってもよく、またはそれは、二量体化してもよい（図１１参照）。標的部分は、ホルモン、ホルモン類似体、タンパク質受容体またはマーカー特異的抗体、あるいは所定の標的に特異的に結合する任意の他のリガンドであってもよい。特定の標的部分は、ステロイド受容体に結合し、これには、エストロゲンおよびアンドロゲンならびにプロゲステロン受容体、および膜貫通チロシンキナーゼ、ｓｒｃ関連チロシンキナーゼ、ｒａｆキナーゼおよびＰＩ−３キナーゼが含まれる。特異的チロシンキナーゼには、ＨＥＲ−２受容体および表皮成長因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーの他の成員、ならびにインシュリンおよびインシュリン様成長因子受容体が含まれる。特異的標的部分の例には、エストロゲン、エストラジオール、プロゲスチン、テストステロン、タモキシフェンおよびウォルトマニン（wortmannin）が含まれる。標的部分はまた、受容体に特異的に結合する抗体、例えば、国際特許公開ＷＯ９６／３２４８０号、ＷＯ９６／４０７８９号およびＷＯ９７／０４８０１号（参照により本明細書に援用される）に開示されているようなＨｅｒ２受容体に結合する抗体であってもよい。
【００２９】
細胞的機能に不可欠なタンパク質の分解をもたらす、すなわち、成長を遅らせ、かつ／または細胞死を促進するその能力のため、本発明のｈｓｐ結合化合物は、標的部分の有無にかかわらず、種々の疾患症状の治療上の処置に使用可能である。適切な治療は、疾患関与細胞中で増強量で見いだされるかまたは突然変異されるキナーゼまたはタンパク質を分解するもの、または、かかる細胞の生存能力に依存するものである。たいていの癌細胞の悪性の維持におけるＨＳＰ９０タンパク質の一般的役割は、抗癌作用物質の発達におけるこの標的の重要性を指摘する。このため、治療的な本発明の小分子は、ＨＳＰ９０タンパク質により必要とされるかまたは容易とされるすべての癌の治療に関する新規な様式を提供する。例えば、本発明の組成物は、種々の形態の癌の治療、特に、Ｈｅｒ２あるいは突然変異または野生型ステロイド受容体を過剰発現するもの、または、機能的ＲＢタンパク質が欠損したものの処置に使用可能である。かかる癌には、乳癌および前立腺癌が含まれるがこれに限られない。加えて、本発明の組成物は、選択的分解に関する病気の発生に関与する標的タンパク質による他の疾患の治療に用いられ得る。かかる標的とすることができるタンパク質の例には、自己免疫疾患に関与する抗体およびアルツハイマー病に関与する病原性タンパク質が含まれる。
【００３０】
本発明の組成物は、所定の疾患状態または症状に関与する特異的タンパク質の分解に適切に利用され得る。本発明の組成物は特異的キナーゼまたはシグナル伝達タンパク質を分解するために選択され得るため、適切な治療は、疾患細胞中の増強量で見出されるキナーゼまたはタンパク質を分解するものである。このため、例えば、Ｈｅｒ２キナーゼを分解するが、他のキナーゼまたはＲａｆキナーゼを分解しない結合部分の選択が、Ｈｅｒ２陽性乳癌の治療に適切であろう。以下の実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察される特異性に基づいた特異的化合物の選択についての手引きを提供する。加えて、スクリーニング技法が、結合親和性および差次的分解についての構造の評価を容易とするため、以下に記載されている。
【００３１】
本発明の組成物は、ヒト患者を含む治療の必要がある被験体に、所望の治療結果をもたらすのに効果的な量で投与される。適切な投与経路は、静脈投与であり、これは、今では化学療法に一般的に用いられている。加えて、本発明の組成物は小型の可溶性分子であるため、経口投与に適している。経口的投与経路の使用可能性は、頻繁な、例えば、毎日のスケジュールの治療を提供する必要がある場合に、特に望ましい。投与されるべき任意の所与の化合物の量は、毒性試験および標準設計の臨床試験を用いて決定され、リスク便益分析から導かれる結果を表すであろう。かかる分析は、当業者により日常的に行われ、過度の実験を伴わない。
【００３２】
本発明による結合部分としての使用のための分子設計の代わりまたは付属として、本発明者らは、ＨＳＰ９０のＮ末端ポケットに対するその結合親和性に関して化合物を試験するのに、または、ＨＳＰ９０型ポケットの存在に関してタンパク質を試験するのに用いられ得る迅速なスクリーニングアッセイを開発した。図１２にまとめるように、固体基板（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）の表面は、Ｎ−オキシスクシンイミジル（N-oxysuccinimidyl）官能基で官能基化される。これらは、アミノ官能基化ＧＭ（または他のアンサマイシン系抗生物質）を含むイソプロパノール中で反応する。ウェルに結合するＧＭの量は、３４５ｎｍでの分光光度吸光測定により評価可能である。結合したＧＭをウサギ網状赤血球溶解産物とともにインキュベートすると、比色法により検出可能なｈｓｐ９０が捕捉されるが、より明確な検出方法が好ましい。例えば、結合したｈｓｐ９０は、標識抗ＨＲＰ抗体を用いて検出可能である。ＨＳＰ９０結合効力のアッセイのため、試験化合物をウサギ網状赤血球溶解産物（または他のｈｓｐ９０源）とともにウェルに添加し、捕捉したｈｓｐの量の任意の差異に留意する。試験化合物がｈｓｐ９０とＧＭよりも強い親和性で結合する場合には、それは固定されたＧＭに匹敵し、捕捉されたｈｓｐ９０の量は低減するであろう。アッセイに用いるＨＳＰ９０ファミリーの成員を変えることにより、これらの同じプレートを、試験化合物の特異性の差異の評価に用いることができる。プレートは、ＨＳＰ９０型の結合ポケットを保有するタンパク質の、タンパク質／ペプチドライブラリーのスクリーニングにも使用可能である。
【００３３】
Ｈｓｐ９０−αおよびＨＳＰ９０−βと差次的に相互作用する化合物の同定を可能とする試験もまた設計された。この試験では、ゲルダナマイシン（あるいは、他のアンサマイシン系抗生物質またはラディシコールのような他の強い非特異的ｈｓｐ９０バインダー）は必要に応じて修飾され、固体支持体、例えば、ビーズに固定される。αおよびβ型を含有するＨｓｐ９０タンパク質の調製物を、評価される化合物の存在下または非存在下で支持体とともにインキュベートする。化合物がＨｓｐ９０タンパク質に結合するときには、それはタンパク質の固体支持体への結合を競争的に阻害する。洗浄後、支持体に結合した物質を溶出し、溶出物をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で分離し、抗Ｈｓｐ９０−αおよび抗Ｈｓｐ９０−βとともに免疫ブロット法により可視化し、結合した物質の量を決定する。あるいは、Ｈｓｐ９０タンパク質調製物の定量的量またはＨｓｐ９０のα型とβ型との既知の比を最初に用いるときには、非結合物質を同様の技法により分析可能である。
【００３４】
本発明による候補化合物もまた、Stockwellet al., Chem Biol. 6: 71-83 (1999)の細胞ベースアッセイを用いて、癌細胞系パネルにおける、癌細胞中に増強量で見出されるタンパク質、または生存能力に関して依存する細胞のタンパク質（例えば、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｒａｆ−１、ＥＲ、Ｒｂ、ｃｄｋ−４、Ｈｓｐ９０、Ｔｒａｐ−１およびＧｒｐ９４）を減少または誘発する能力について評価することができる。このアッセイでは、細胞はウェルの底で育成され、固定される。固定された細胞は、溶液中の特異的な一字抗体を用いて、特異的な一次抗原（発癌遺伝子タンパク質）の存在についてプローブされる。ホースラディッシュペルオキシダーゼに共有結合させた二次抗体が添加され、得られる複合体は、ルミノール、過酸化水素およびｐ−ヨードフェノールのようなエンハンサーの添加により引き起こされる化学発光反応を介して検出される。薬物の存在下での検出された発光レベルの違いは、標的タンパク質の分解または誘導に関する薬物の活性を示す。
【００３５】
薬物もまた、細胞形態学において、観察される非常に特徴的な変化に基づいてアッセイ可能である。ＰＵ３に暴露されたＭＣＦ−７細胞は、平坦化し、サイズが増大し、明確な細胞境界を有する。サイズの増大は、ほとんどは細胞質中のアバンダンスによるものである。これらの形態学的変化は、成熟上皮の分化および形質変換の逆転の特徴である。
【００３６】
第３の代案として、免疫蛍光検査（ＩＦ）およびヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）を、薬物の効果の評価に用いることができる。細胞を８ウェルチャンバースライド（Fisher Scientific）に平板培養し、２４時間接種した。薬物またはビヒクルをその後５日間添加し、ここで、ＩＦについては、スライドは氷冷したＰＢＳで２度洗浄し、メタノール／アセトン溶液（１：１）で１５秒間固定した。固定された単層を蒸留水で洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロックした。ブロック後、細胞を一次抗体（抗ＭＦＭＧ、Chemicon、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１００）とともに３７℃でインキュベートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３度洗浄し、続いて、ローダミンで標識した二次抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。核は、ＤＡＰＩ１ｍｇ／ｍｌで染色した。Ｈ＆Ｅについては、細胞をパラホルムアルデヒド（４％）で１０分間室温で固定させ、標準的Ｈ＆Ｅ染色プロトコルに従って染色した。種々の操作によるＧ１停止の誘発は、いくつかの乳タンパク質の発現の誘発に十分である。しかし、アンサマイシン、ＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡおよびｈｓｐ９０結合分子のみが、大きな形態学的よおび生物学的変化を引き起こす。
【００３７】
本発明の治療方法での使用に関して、本発明の組成物は、薬学的に許容可能なキャリアとして製剤される。注射可能な配合物について、これは滅菌溶液（例えば、滅菌生理食塩水）であってもよく、またはこの化合物は脂質性担体に配合されてもよい。経口配合物用に、本発明の組成物は、例えば、適切な賦形剤を含む錠剤またはカプセルとして、または液体配合物として、便利な投薬単位形態でパッケージ化されてもよい。後者の場合には、液体医薬品は、風味を増すための香料物質を適切に含むであろうし、着色料および他の慣例的な添加剤を含んでもよい。
【００３８】
実施例１
一般式１を有する組成物を、図６Ａに示すスキームに従って合成した。酸フッ化物を精製するため、フェニル酢酸誘導体（３ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（不活性雰囲気下）１５ｍＬ溶液に、１．５等量のシアヌル酸フッ化物およびピリジン（３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１．５時間攪拌し、その後、さらにＣＨ2Ｃｌ2３０ｍＬを添加した。得られた溶液を水０．５ｍＬで一度洗浄し、溶媒の除去から得られた粗製酸フッ化物物質を次の工程に用いた。
【００３９】
酸フッ化物を、以下のように、ＰＹ−Ａ、ＰＹ−ＢおよびＰＹ−Ｃ誘導体の生成に用いた。ＤＭＡ１．５ｍＬ中の４，５，６−トリアミノピリミジン硫酸塩６７５ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）に、ＤＩＥＡ１．５ｍＬ（９ｍｍｏｌ）、ＣＨ2Ｃｌ2５ｍＬに溶かした酸フッ化物（上記のようにして得たもの）および触媒量のＤＭＡＰ（０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をアルゴン下で１時間攪拌した。形成した固体をろ別し、ろ液を乾燥するまで濃縮した。残留物質にＥｔＯＡｃ１０ｍＬを添加し、形成した沈殿物をＥｔＯＡｃおよびＣＨ2Ｃｌ2で数度洗浄し、わずかに黄色の物質を、収率６０〜８０％で得た。この物質を次の工程に用いた。より高い純度を望むときには、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝７：１（１％ＴＥＡ）を用いたフラッシュクロマトグラフィーを行うことができる。
【００４０】
ＰＹ化合物から、ＰＵ−Ａ、ＰＵ−ＢおよびＰＵ−Ｃ誘導体を以下のように生成した。ＭｅＯＨ１３ｍＬ中の５−アセチル化−４，５，６−ピリミジン５００ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）に、ＮａＯＭｅの２５％ＭｅＯＨ溶液１３ｍＬを添加し、得られた溶液を５時間還流させた。冷却後、水５ｍＬを添加し、溶液を５ｍＬまで濃縮した。得られた水溶液をＴＨＦ４×１０ｍＬおよびＥｔＯＡｃ２×１０ｍＬで抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、乾燥するまで濃縮し、わずかに黄色の固体を、収率８０〜９０％で得た。より高い純度を望むときには、得られた生成物をシリカゲルカラムに添加して、ＣＨ2Ｃｌ2：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝４：４：１で溶出させることができる。
【００４１】
置換基を、以下のように、光延アルキル化を用いて９−Ｎ位置に付加させた。トルエン５ｍＬおよびＣＨ2Ｃｌ2１ｍＬ中のプリン誘導体０．１６ｍｍｏｌに、２．２等量のＰＰｈ3および１．３等量のＲＯＨ、次いで、５等量のＤＥＡＤを添加した。反応はＴＬＣでモニターし、１５分〜１時間進行させた。混合物をＩＳＣＯ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ系（シリカゲルカラム）にかけて、ＣＨ2Ｃｌ2／アセトンの勾配で溶出させ、３０〜７５％の単離生成物を得た。この手順は、図６に示す、４０の非分枝状および分枝状、線状および環式、飽和および不飽和第一および第二アルコールを用いて行った。これらの合成では、２つのアルコール、ネオペンチルアルコールおよびシクロヘキサノールのみが、この反応により生成物を得ないことがわかった。
【００４２】
４つの化合物（ＰＵ−Ａ−４、ＰＵ−Ｂ−４、ＰＵ−Ｃ−４およびＰＵ−Ｃ−１５）を初期試験に用いた。便宜的に、これらの４つの構造は、それぞれ図１３に示すように、ＰＵ１、ＰＵ２、ＰＵ３およびＰＵ４と示す。
【００４３】
実施例２
ヒト癌細胞系ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から得て、２ｍＭのグルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０ユニット／ｍＬのストレプトマイシンおよび５％（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８について）または１０％（ＳＫＢｒ３について）の熱不活性化ウシ胎児血清（Gemini Bioproducts）を補足したＤＭＥ：Ｆ１２の１：１混合物中に保持し、３７℃、５％ＣＯ2中でインキュベートした。
【００４４】
タンパク質レベルのアッセイのため、指示された期間薬物およびＤＭＳＯビヒクルに暴露される、６０〜７０％集密にまで細胞を成長させた。溶解産物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２％ＳＤＳおよび１０％グリセロール溶解緩衝液を用いて調製した。タンパク質濃度は、製造業者の説明書に従って、ＢＣＡキット（Pierce Chemical Co.）を用いて決定した。清澄化したタンパク質溶解産物（２０〜５０ｍｇ）を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動的に分離し、ニトロセルロースに転写し、以下の一次抗体でプローブした。抗Ｈｅｒ２（Ｃ−１８）、抗Ｈｅｒ３（Ｃ−１７）、抗Ｒａｆ−１、抗サイクリンＤ１、抗Ｒｂ（Ｃ−１５）（Santa Cruz）、抗ｈｓｐ９０、抗ｈｓｐ７０、抗ＥＲ（Stressgen）、抗Ｔｒａｐ−１（MSK81）、抗ｂ−アクチン、抗チューブリン（Sigma）、抗ＰＩ３Ｋ（ｐ８５）（Upstate Biotechnologies）。
【００４５】
抗増殖指数を決定するため、６ウェル皿にウェル当り１０，０００細胞を接種し、薬物処置前に２４時間インキュベートすることにより、成長アッセイを行った。薬物またはビヒクルは、各実験について略述されたように投与し、細胞は記載された期間インキュベートし、次いで、クールター計数器でカウントした。
【００４６】
細胞周期分布は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ蛍光活性化細胞分類器を用いてNusseらに従ってアッセイし、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｙｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Phoenix Flow System, San Diego, CA）により分析した。
【００４７】
実験１
ＭＣＦ−７細胞を種々の濃度（０、１０、５０、１００または２５０μｍ）のＰＵ３または対照プリンＡｄ−Ｂｕｔで２４時間で処置し、溶解させた。Ｈｓｐ９０、Ｔｒａｐ１およびＨｓｐ７０のレベルを、ウエスタンブロットにより評価した。結果は、ＰＵ３が、ＧＭのように、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０の細胞レベルを上昇させることを示した。ＰＵ３での細胞の処置では、Ｔｒａｐ−１よりも速く移動し、抗Ｔｒａｐ−１抗体により認識されるタンパク質バンドが誘発される。このタンパク質バンドの正体は未知であるが、その出現はＨｓｐ９０阻害剤への細胞の暴露のマーカーであると思われる。Ａｄ−Ｂｕｔは、同一の濃度で研究したタンパク質レベルに何の影響も与えなかった。
【００４８】
実験２
ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の細胞培養物を、いくつかの濃度のうちの１つのＰＵ３で、または、ＤＭＳＯ対照で処置し、抗増殖効果の発生について試験した。図１４Ａ〜図１４Ｃは、細胞数と時間の相関関係の結果を示す。示されるように、ＰＵ３は、これらの胸部癌細胞系の成長を明白に阻害する。
【００４９】
実験３
ＳＫＢｒ３細胞の細胞培養物を、濃度０、１０、５０、１００および２５０μＭのＰＵ１、ＰＵ２、ＰＵ３またはＰＵ４で処置した。２４時間後、細胞を溶解させ、細胞中のＨｅｒ２およびＲａｆ−１の量を評価した。化合物は構造的に非常に類似するものの、これらは２つのタンパク質の分解の促進において異なった効力を有することがわかった。ＰＵ１は試験したどの濃度でもいずれのタンパク質の分解もほとんど示さず、ＰＵ２はＨｅｒ２を分解したが、２５０μＭではＲａｆ−１を分解しなかった。ＰＵ３は１００μＭを超える濃度ではＨｅｒ２を分解したが、２５０μＭではＲａｆ−１は部分的にしか失われなかった。ＰＵ４は、５０μＭを超える濃度でＨｅｒ２を分解し、２５０μＭの濃度でＲａｆ−１を分解した。
【００５０】
実験４
分解の時間経過を試験するため、ＭＣＦ−７細胞を１００μＭのＰＵ３で処置した。細胞のアリコートを１．５、３、６、１２および２４時間で回収し、Ｈｅｒ２、Ｒａｆ−１、Ｈｓｐ９０およびＴｒａｐ−１の量を評価した。化合物は、Ｈｅｒ２の急速な分解（投与３時間以内で５０％超が失われた）、および、Ｈｓｐ９０および２４時間以内のＨｓｐ７０の有意な合成を誘発することがわかった。Ｒａｆ−１の量は、この時間内では有意に変化しなかった。
【００５１】
実験５
ＭＣＦ−７細胞の細胞培養物を、濃度０、１０、５０、１００および２５０μＭのＰＵ１、ＰＵ２、ＰＵ３またはＰＵ４で処置した。２４時間後、細胞を溶解させ、細胞中のＨｅｒ２の量を評価した。化合物は構造的に非常に類似するものの、これらはＨｅｒ２の分解の促進において異なった効力を有することがわかった。ＰＵ１は５０μＭを超える濃度で部分的な分解のみを示したが、ＰＵ２は２５０μＭでＨｅｒ２を完全に分解した。ＰＵ３は、１０μＭを超える濃度でＨｅｒ２を実質的に分解した。ＰＵ４は、１００μＭを超える濃度でＨｅｒ２を実質的に分解した。
【００５２】
実験６
ＭＣＦ−７細胞の細胞培養物を、濃度０、１０、５０、１００および２５０μＭのＰＵ１、ＰＵ２、ＰＵ３またはＰＵ４で処置した。２４時間後、細胞を溶解させ、細胞中のエストロゲン受容体の量を評価した。化合物は構造的に非常に類似するものの、これらはエストロゲン受容体の分解の促進において異なった効力を有することがわかった。ＰＵ１は試験した濃度で実質的に全く分解を示さなかったが、ＰＵ２は２５０μＭでエストロゲン受容体を完全に分解した。ＰＵ３は５０μＭを超える濃度でエストロゲン受容体を部分的に分解した。ＰＵ４は、１００μＭを超える濃度でＨｅｒ２を実質的に分解した。
【００５３】
実験７
ＳＫＢｒ３およびＭＣＦ−７細胞の培養物を、種々の濃度（０、１０、５０、１００または２５０μＭ）のＰＵ３で２４時間処置した。細胞を溶解させ、Ｈｅｒ２、Ｒａｆ１、Ｈｅｒ３、エストロゲン受容体（ＥＲ）、ｐ８５（ＰＩ３Ｋ）、チューブリンおよびアクチンのレベルをウェスタンブロットにより分析した。その機能（Ｈｅｒ２、Ｒａｆ１、Ｈｅｒ３およびＥＲ）がｈｓｐ９０に依存するシグナル伝達タンパク質の量の低減が観察された。ＰＩ３Ｋ、チューブリンまたはアクチンについての影響は観察されず、これらのタンパク質は、他のシグナル経路に関係する。
【００５４】
実施例３
実施例２の実験は、本発明による合成化合物ＰＵ１、ＰＵ２、ＰＵ３およびＰＵ４の、キナーゼＨＥＲ３、エストロゲン受容体（ＥＲ）、Ｈｅｒ２、Ｒａｆ、Ｒｂおよびｐ８５（分解されるべきではない、または分解されない参照タンパク質として）の差次的分解を提供する能力を示す。いくつかの重要な観察が、このデータからなされ得る。
【００５５】
ＰＵ３は、エストロゲン受容体複合体を不安定化し、タンパク質の用量依存性分解を誘発する。ＰＵ３はまた、Ｈｅｒ２レベルの急速な減少を引き起こし、かつ、低分子量（１７０ｋＤａ対１８０ｋＤａの成熟タンパク質）のＨｅｒ−２バンドの蓄積を引き起こすが（ＧＭについても同様に見られる）、これは、小胞体中でｉｎ  ｖｉｖｏで隔絶される、不完全にグリコシル化されたＨｅｒ２であると考えられる。ＲａｆおよびＨｅｒ３のレベルはＰｕ３に対してより感受性が低いが、より高濃度で分解される。ＰＵ２はまた、高リン酸化Ｒｂと考えられる、より低分子量のＲｂバンドを誘発する。
【００５６】
これに反し、ＰＵ２は、低分子量バンドの蓄積なくＨｅｒ２の実質的な分解を示し、かつ、Ｒａｆキナーゼの分解により効果的でなかった。低分子量バンドは、ＰＵ１が結合部分として用いられるときにも存在しない。ＰＵ２はＥＲの分解により効果的でないが、ＰＵ１は、ＥＲに実質的に全く影響を与えなかった。これらの違いは、ＰＵ３がＨＳＰ９０ファミリーのＰＵ１およびＰＵ２とは異なる成員に結合することを示唆する証拠を提供し、これにより異なった特異性が説明される。ＰＵ４はまた、Ｈｅｒ２をＥＲまたはＲａｆよりも分解する能力を示す。
【００５７】
実施例４
ＰＵ−Ｃファミリーの６つの化合物（Ｘ４＝Ｈ、Ｘ２＝１、２、３ＯＭｅ、Ｘ３＝Ｈ、および図１５に示されるような可変のＸ１基）を調製し、ＭＣＦ−７細胞中のＨｅｒ２、ＨＥＲ３およびＴＲＡＰ−１への効果について試験した。細胞は、２４時間、各化合物１０、５０、１００および２５０μＭで処置した。Ｘ１基の性質およびサイズは、化合物の活性に有意な効果を有する。Ｎ末端ポケットをより十分に充填するであろう大型の、疎水性基は、Ｈｅｒ２を分解する能力を示すが、Ｈｅｒ３についてはそうではなかった。加えて、これらの化合物について、Ｈｅｒ２を分解する能力とＴｒａｐ−１合成の誘発との間には相関関係がある。
【００５８】
一方、巨大な、剛性の、いくぶん極性のＸ１基を有する化合物は、あまり有利に相互作用せず、試験した濃度ではＨｅｒ２を有意に分解しない。
【００５９】
実施例５
ＰＵ３を、図１６ＡおよびＢに示される合成スキームに従って中間のＯＨを介してビオチンに結合させた。ＰＵ３−ビオチンは、セファロース−ストレプトアビジンビーズ上に固定化させた。これらのビーズをＰＵ３の、Ｔｒａｐ−１およびＨｓｐ９０αとの相互作用を示すために用いた。
【００６０】
実施例６
ＰＵ３を、ＭＣＦ−７異種移植片中で、その安全性および効力について試験した。化合物は、ＩＰを５００ｍｇ／ｋｇまで有意な毒性を示すことなく投与された。樹立腫瘍を有するマウスを、５０、１００および５００ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内にＰＵ３の単回用量で処置した。対照マウスは、ＤＭＳＯ単独で処置した。マウスは、処置後１２時間で屠殺した。免疫ブロット法のため、腫瘍組織を２％ＳＤＳ溶解緩衝液（ｐＨ７．４）中で均質化した。すべての場合で、Ｈｅｒ２レベルの低減が、免疫ブロット法の結果で観察された。ＰＩ３キナーゼ（ｐ８５）のレベルには変化は観察されなかった。
【００６１】
実施例７
いくつかの９−アルキル−８−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（４〜４６）を、ＰＵ−Ｃ（図６Ｂ）の９−Ｎ−アルキル化により作成した。さらに、３（図７Ｂ）の２−アミノ基を、ＨＦ／ピリジン中の亜硝酸ｔｅｒｔ−ブチルを用いる非水性媒質中でのジアゾ化反応を介してフッ素に変換した。得られるプリンをアルキル化して、２−フルオロ−９−アルキル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン４７〜５９を得た。アルキル化は、光延反応を用いて行ったが、その方法論は多くの第１および第２アルコールに適応可能である。２−フルオロ誘導体を、対応するアルコールとＮａＯＭｅ中で還流することにより、２−アルコキシプリン６０および６１に変換した。プリン部分の位置２での修飾の大部分は、（３）で開始した。ヨウ素を、ジヨードメタン中の亜硝酸イソアミルを用いてその位置に導入し、６２を得た。２−ヨウ素誘導体を、ＤＭＦ中のトリ−ｎ−ブチルシアノスタナンとテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を用いてシアン誘導体６３に変換し、ビニルトリブチルスズと（ＭｅＣＮ）2ＰｄＣｌ2を用いてビニル誘導体６４に変換する。
【００６２】
ベンジル部分を、ポケットのリシンとの相互作用を強めるため、電子供与基に富ませた。塩素および臭素を、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドおよび対応する酸ハロゲン化物を用いるラジカル反応を介して添加した。塩素の場合には、一置換体のみが観察され（６５）、臭素からは一置換体（６６）および少量の二臭素置換生成物（６７）を得た。
【００６３】
プリンとフェニル環との間の架橋の性質および長さを、付加的に修飾した。出発原料として、８−Ｂｒ−アデニンを利用した。これを、アニリン−、フェノール−またはベンジル誘導体と高温で反応して、対応する生成物６８〜７０を得た（図１０）。
【００６４】
十分に置換された誘導体７１および７２の組立てを、３で開始した。上記ラジカル反応により塩素を最初に付加し、７３を得た。その後、２−アミノ基をフッ素に変換し、得られるプリン（７４）は光延反応を介してアルキル化した。
【００６５】
種々の化合物についての具体的な反応を以下に示す。
３（ＤＡＡＣ）：８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−２，６−ジアミン：ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のトリメトキシフェニル酢酸（１．０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）（不活性雰囲気下）に、シアヌル酸フッ化物（３７１ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）とピリジン（３５６ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を1時間室温で攪拌し、その後、さらに３０ｍＬのＤＣＭを添加した。得られた溶液を水（５ｍＬ）で一度洗浄し、溶媒の除去から得られた酸フッ化物をＤＭＦ（１０ｍＬ）中から取り出し、次の工程に用いた。別に、２，４，５，６−テトラアミノピリミジン硫酸塩（０．９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）をＮａＯＨ（４５６ｍｇ、１１．４ｍｍｏｌ）を含有する水（４０ｍＬ）に溶解させた。得られた溶液を７０℃に加熱し、酸フッ化物を２０分間かけて滴下した。反応混合物を１．５時間、７０℃で攪拌し、その後、乾燥するまで濃縮させた。粗製物質に、ＭｅＯＨ（１６ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１６ｍＬ）中のＮａＯＭｅの２５％溶液を添加し、得られた溶液を９０℃で１８時間加熱した。冷却後、濃ＨＣｌの添加により溶液のｐＨを７に調整した。この水溶液を除去し、粗製物質をＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に取り出した。不溶固体をろ別し、生成物（４７０ｍｇ、３７％）をシリカゲルカラム上でＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝４：４：２で精製した。
【００６６】
ＦＡＣ：２−フルオロー８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：３（５００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）に、ピリジン（２ｍＬ）中のＨＦの７０％溶液、ピリジン（８ｍＬ）、続いて亜硝酸ｔ−ブチル（２００ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。混合物を２時間攪拌し、次いで、水（１５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中、ＣａＣＯ3８ｇで一晩クエンチした。溶液を乾燥するまで濃縮し、得られた粗製物質をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）中に取り出した。不溶固体をろ別し、溶媒を除去して粗製生成物を得た。これをシリカゲルカラム上でヘキサン：ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：０．７５で溶出させて精製した（２４０ｍｇ、５０％）。
【００６７】
アルキル化は、上述したように（参照）、光延反応により行った。基本的には、トルエン：ＤＣＭ＝５：１のＦＡＣに、１．３等量の対応するアルコール、２等量のＰＰｈ3、３等量のアゾジカルボン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを添加し、得られた溶液を室温で１０分間〜１時間（転化率をＴＬＣによりモニタする）攪拌して、以下のものを得た。
４８（ＰＵ３Ｆ）：２−フルオロ−９−ブチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率６０％
５２（ＰＵ２９Ｆ）：２−フルオロ−９−（２−イソプロポキシ−エチル）−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率８６％
５４（ＰＵ４７Ｆ）：２−フルオロ−９−ペンタ−４−エニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率８６％
５９（ＰＵ２０Ｆ）：２−フルオロ−９−（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリンー６−イルアミン：収率５３％
５０（ＰＵ４４Ｆ）：２−フルオロ−９−（２−メトキシ−エチル）−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率２８％
４７（ＰＵ４３Ｆ）：２−フルオロ−９−プロピルー８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率６６％
５７（ＰＵ２４Ｆ）：２−フルオロ−９−ペンタ−４−イニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率７６％
５３（ＰＵ８Ｆ）２−フルオロ−９−ブタ−３−エニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率４２％
５５（ＰＵ４８Ｆ）：２−フルオロ−９−ブタ−３−イニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率３６％
５６（ＰＵ４９Ｆ）：２−フルオロ−９−ペンタ−３−イニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率２５％
５８（ＰＵ１６Ｆ）：２−フルオロ−９−シクロブチルメチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率３３％
５１（ＰＵ２６Ｆ）：２−フルオロ−９−[（Ｓ）−２−メチル−ブチル]−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率６８％
４９（ＰＵ２１Ｆ）：２−フルオロ−９−ペンチル−８−(３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：収率６５％
ＰＵ２４ＤＡ：９−ペンタ−４−イニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−２，６−ジアミン：トルエン（２０ｍＬ）およびＤＣＭ（４ｍＬ）中のＤＡＡＣ（２００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）に、ＰＰｈ3（３３０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、４−ペンチン−１−オール（７５ｍＬ、０．８ｍｍｏｌ）およびアゾジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル（６００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。生成物を、シリカゲルカラム上でヘキサン：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ＝１０：８：４：４で溶出させるカラムクロマトグラフィーにより単離した（１２０ｍｇ固体、４９％）。
６２（ＰＵ２４Ｉ）：２−ヨード−９−ペンタ−４−イニル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：ＰＵ２４ＤＡ（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）に、ＣＨ2Ｉ2（２．５ｍＬ）および亜硝酸イソアミル（１００ｍＬ、０．７８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を８０℃で１時間加熱した。冷却後、溶液を濃縮し、次いで、シリカゲルカラムに添加した。生成物を、溶出液ヘキサン：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ＝１０：４：４：０．７５を用いて単離した（４０ｍｇ、６１％）。
６３（ＰＵ２４ＣＮ）：２−シアノ−９−ペンタ−４−イニル−８−(３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：乾燥ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中のＰＵ２４Ｉ（２０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（７ｍｇ、６．３ｘ１０-3ｍｍｏｌ）およびトリブチルスズシアン化物（１４ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を、１８０℃で６時間加熱した。冷却および溶媒の除去の後、生成物（１３ｍｇ、８１％）を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ＝１０：８：４０．７５）により単離した。
６４（ＰＵ２４Ｖ）：９−ペンタ−４−イニル−８−（３，４，５−トリメチル−ベンジル）−２−ビニル−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＰＵ２４Ｉ（２０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、（ＭｅＣＮ）2ＰｄＣｌ2（２×１０-3ｍｍｏｌ）およびトリブチルビニルスズ（１２．５ｍＬ、０．０４１ｍｍｏｌ）を、１００℃で１時間加熱した。冷却および溶媒除去の後、生成物（１５ｍｇ、９２％）をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ＝１０：８：４：１）により単離した。
６０（ＰＵ３ＯＭｅ）：２−メトキシ−９−ブチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中のＰＵ３Ｆ（２０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）中のＮａＯＭｅの２５％溶液を添加した。得られた混合物を８５℃で２時間加熱した。冷却後、混合物を４Ｎ  ＨＣｌで中和し、次いで、乾燥するまで濃縮させた。粗製物質を、シリカゲルカラム上でヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１を用いて精製し、固体（１１ｍｇ、５１％）を得た。
６１（ＰＵ３ＯＥｔ）：２−エトキシ−９−ブチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：ＥｔＯＨ（２ｍＬ）中のＰＵ３Ｆ（２０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）に、ＮａＯＭｅ（１５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２時間還流させた。冷却およびＨＣｌでの中和の後、溶液を乾燥するまで濃縮させた。生成物（１２ｍｇ、５６％）を上記のように精製した。
６５（ＰＵ３Ｃｌ）：９−ブチル−８−(２−クロロ−３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中のＰＵ３（３７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）に、濃ＨＣｌ（３３ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃まで冷却し、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドの９０％水溶液（４４ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を一晩還流させた。冷却および溶媒除去の後、生成物（３１ｍｇ固体、７２％）を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１．５で溶出）により単離した。
６６および６７（ＰＵ３ＰｈＢｒおよびＰＵ３ＰｈＢｒ２）：ＭｅＯＨ（３ｍＬ）中のＰＵ３（３７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）に、ＨＢｒ（４５ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）の４８%水溶液を添加した。混合物を０℃まで冷却し、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（４４ｍＬ、０．４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を３０分間０℃で攪拌し、次いで、さらに１時間還流させた。冷却および溶媒除去の後、混合物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１．５で溶出）により分離し、主として一臭素化生成物（３１ｍｇ、６９％）、および微量の二臭素化生成物（２．３ｍｇ、４．４％）を得た。６６（ＰＵ３Ｂｒ）：９−ブチル−８−（２−ブロモ−３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン、６７（ＰＵ３Ｂｒ２）：９−ブチル−８−（２，６−ジブロモ−３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン。
７３（ＤＡＡＣＰｈＣｌ）：ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中のＤＡＡＣ（１ｇ、３．０ｍｍｏｌ）のスラリーに、濃ＨＣｌ（１．５ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を０℃まで冷却し、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドの７０％水溶液（２．５ｍＬ、８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。混合物を３０分間０℃で攪拌し、次いで、２０時間還流させた。溶媒を高真空下で除去し、清澄な生成物（１．０９ｇ、９８％）を得た。
７４（ＦＤＡＡＣＰｈＣｌ）：ピリジン（６．５ｍＬ）中のＨＦの２０％溶液に、ピリジン（１３．５ｍＬ）を、続いてＤＡＡＣＰｈＣｌ（１ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を添加した（不活性雰囲気下）。混合物を５時間攪拌し、その後、亜硝酸ｔ−ブチル（４５０ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。攪拌はさらに３０分間続けた。反応物を、水（１０ｍＬ）：ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中ＣａＣＯ3（１６．５ｇ）の添加によりクエンチし、２時間攪拌した。溶液を濃縮し、得られたスラリーをＤＣＭ（５０ｍＬ）：ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に取り出した。不溶の固体をろ別し、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１：１（２×２５ｍＬ）で洗浄した。溶媒の除去後、生成物をシリカゲルカラム上でヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１で溶出させて精製した（３７０ｍｇ固体、３７％）。７１（ＰＵ２４Ｃｌ）：２−フルオロ−９−ペンタ−４−イニル−８−（２−クロロ−３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン（３０８ｍｇ、７６％）。
７２（ＰＵ２９ＦＣｌ）：２−フルオロ−９−（２−イソプロポキシ−エチル）−８−（２−クロロ−３，４，５−トリメトキシ−ベンジル）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン。
６８（ＰＡＭ３）：９−ブチル−Ｎ*８*−（３，４，５−トリメトキシ−フェニル）−９Ｈ−プリン−６，８−ジアミン：ＢｒＡｄ３（５０ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）およびトリメトキシアニリン（１２０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の混合物を１６０度で３０分間加熱した。冷却後、固体をＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５ｍＬ）中に取り出し、すべての不溶固体をろ別した。生成物（５７ｍｇ、８３％）をシリカゲルカラム上でＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝７：４：１で溶出させて精製した。
７０（ＰＵ３ＯＢｎ）：９−ブチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−ベンジルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−イルアミン：ベンジルアルコール（２５０ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）の２５％ＮａＯＭｅを含むＭｅＯＨ溶液（５０ｍＬ）を、５分間攪拌する。メタノールの除去後、ＢｒＡｄ３（２６ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）およびＣｕ粉末（１０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２分間１８０℃で加熱した。生成物をシリカゲルカラム上でヘキサン：ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１（５．５ｍｇ、１４％）で精製した（５．５ｍｇ、１４％）。
６９（ＰＵ３ＯＰｈ）：９−ブチル−８−（３，４，５−トリメトキシ−フェノキシ）−９Ｈ−６−イルアミン：トリメトキシフェノール（７５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ｔ−ＢｕＯＫ（３４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、Ｃｕ粉末（１０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）およびＢｒＡｄ３（２６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の混合物を１時間１４０℃で加熱した。生成物（１３ｍｇ固体、３５％）を、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１０：５：５：１）で単離した。
【００６８】
実施例８
ヒト癌細胞系ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から取得し、２ｍＭのグルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０ユニット／ｍＬのストレプトマイシンおよび５％（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８について）または１０％（ＳＫＢｒ３について）の熱不活性化ウシ胎児血清（Gemini Bioproducts）を補足したＤＭＥ：Ｆ１２の１：１混合液中に保持し、３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベートした。
【００６９】
タンパク質アッセイ：細胞を６０〜７０％集密にまで成長させ、薬物またはＤＭＳＯビヒクルに指示された期間暴露させた。５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２％ＳＤＳおよび１０％グリセロール溶解緩衝液を用いて、溶解産物を調製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Pierce Chemical Co.）を用い、製造業者の説明書に従って決定した。清澄化されたタンパク質溶解産物（２０〜５０ｍｇ）を、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース上に転写し、以下の一時抗体でプローブした。抗Ｈｅｒ２（Ｃ−１８）、抗Ｈｅｒ３（Ｃ−１７）、抗Ｒａｆ−１、抗サイクリンＤ１、抗Ｒｂ（Ｃ−１５）（Santa Cruz Biotechnology）、抗ｈｓｐ９０、抗ｈｓｐ７０（Stressgen）、抗Ｔｒａｐ−１（ＭＳＫ８１）、抗ｂ−アクチン、抗チューブリン（Sigma）、ＥＲ、抗ＰＩ３Ｋ（ｐ８５）（Upstate Biotechnologies）。
【００７０】
抗増殖指数：６ウェル皿にウェル当り１００００細胞（ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）および２００００細胞（ＳＫＢｒ３）を接種し、薬物処置前に２４時間インキュベートすることにより、成長アッセイを行った。薬物またはビヒクルを各実験毎に略述したように投与し、細胞を記述した期間インキュベートし、次いで、数をクールター計数器で定量化した。
【００７１】
組織培養物ＩＣ50の研究：成長阻害研究を、上述したスルホロダミンＢアッセイを用いて行った。実験は、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７およびＴＳＵ−Ｐｒ１を用いて行った。貯蔵培養物を、３０ｍＬのＤＭＥ（ＨＧ、Ｆ−１２、非必須アミノ酸ならびペニシリンおよびストレプトマイシン）、グルタミン、および１０％ＦＢＳを含むＴ−１７５のフラスコ中で成長させた。ＴＳＵ−Ｐｒ１は、グルタミンおよび１０％ＦＢＳとともにＲＰＭＩ１６４０中で成長させた。細胞は、ＰＢＳ中に０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで、カルシウムおよびマンガンなしで解離させた。
【００７２】
実験培養物を、ウェル当り１０００の密度で、１００μＬの成長培地でマイクロタイタープレート（Nunc）に平板培養したが、ＢＴ−４７４については、ウェル当り３０００の細胞濃度で平板培養した。ウェルの１行は、細胞を入れずにおき、ブランク対照として用いた。細胞を一晩付着させた（ＢＴ−４７４は４８時間付着させた）。翌日、さらに成長培地１００μＬを各ウェルに添加した。貯蔵薬物またはＤＭＳＯを成長培地中に、所望の初期濃度の二倍で溶解させた。薬物またはＤＭＳＯを、マイクロタイタープレート中で１：１の比で順次希釈し、元のウェルに添加した。７２時間の成長後、処置ウェルと対照ウェルとにおける細胞数を、１０％トリクロロ酢酸で処置し、かつ１％酢酸中の０．４％スルホロダミンＢで染色した後、見積もった。ＩＣ50は、対照の成長と比較して５０％細胞成長を阻害する薬物濃度として算出される。
【００７３】
Ｈｅｒ２分解。全タンパク質アッセイ：細胞を、６０〜７０％集密にまで成長させ、薬物またはＤＭＳＯビヒクルに指示された期間暴露した。５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２％ＳＤＳおよび１０％グリセロール溶解緩衝液を用いて、溶解産物を調製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Pierce Chemical Co.）を用いて、製造業者の説明書に従って決定した。清澄化タンパク質溶解産物（２０〜５０μｇ）を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロースに転写し、抗Ｈｅｒ２一次抗体（Ｃ−１８）（Santa Cruz Biotechnology）でプローブした。
【００７４】
結合の研究。固相競合アッセイ：ＧＭを、Ａｆｆｉｇｅｌ１０樹脂（BioRad）上に記載のように2固定化した。ＧＭビーズを、プロテアーゼ阻害剤を含有するＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０）で洗浄し、次いで、０．５％ＢＳＡを含むＴＥＮ緩衝液中で４５分間４℃で遮断した。StressgenからのＨｓｐ９０タンパク質（ＳＰＰ−７７０）を、氷上で１７分間、薬物とともに、または薬物なしでインキュベートした。各サンプルに、ＧＭビーズ２０μＬを添加し、混合物を４℃で１時間回転させ、その後、氷冷ＴＥＮ５００μＬでそれぞれ３回洗浄した。タンパク質に結合したＧＭビーズは、１×ＳＤＳ６５μＬ中での加熱により固相から溶出した。サンプルを、Ｈｓｐ９０αの分析用の２０μＬのアリコートと、Ｈｓｐ９０βの分析用の４０μＬのアリコートとに分け、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルにかけて、Ｈｓｐ９０α（Stressgen # SPA-840）およびＨｓｐ９０β（NeoMarkers # RB-118）でそれぞれ免疫ブロット法により可視化した。
【００７５】
化合物ＰＵ４〜７２を、Ｈｓｐ９０との結合、Ｈｅｒ２全タンパク質の分解、およびその抗増殖効果について試験した。結果を表１、２、３および４にまとめる。
【００７６】
表１
2005519848.tif 000003
【００７７】
表２
2005519848.tif 000004
【００７８】
プリン部分の位置２への、ＣＮ、ビニル、ヨウ素、メトキシ、エトキシ、ＮＨ2のいずれかの付加は、活性を低下させるかまたはなくさせた。
【００７９】
表３
2005519848.tif 000005
【００８０】
最適置換基の同化により、誘導体７１および７２を得た（表４）。
【００８１】
表４
2005519848.tif 000006
【００８２】
実施例９
ＰＵ３およびＰＵ２４ＦＣｌがＡｋｔタンパク質の分解を誘発する能力。図１７Ａおよび図１７Ｂに示されるように、Ｈｅｒ２の分解について観察された活性の３０倍の差はまた、Ａｋｔの分解にも反映された。約３０倍の差が、Ｈｓｐ９０の結合親和性においても同様に見られた。
【００８３】
実施例１０
データを分析し、Ｈｅｒ２分解の誘発に効果的なＰＵシリーズの化合物の濃度とＭＣＦ−７細胞系の成長阻害に必要な濃度との間に、そして、Ｈｓｐ９０の結合定数と成長阻害に必要な濃度との間に、相関関係があるかどうかを見た。図１８Ａおよび図１８Ｂに示されるように、実験結果は、成長の停止と、Ｈｅｒ２全体タンパク質の分解と、Ｈｓｐ９０の結合効力との間の良好な相関関係を示唆した。
【００８４】
実施例１１
細胞培養物：ヒト癌細胞系ＭＣＦ−７、ＳＫＢｒ３およびＢＴ−４７４を、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から取得し、２ｍＭのグルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０ユニット／ｍＬのストレプトマイシンおよび５％（ＭＣＦ−７について）または１０％（ＳＫＢｒ３およびＢＴ−４７４について）の熱不活性化ウシ胎児血清（Gemini Bioproducts）を補足したＤＭＥ：Ｆ１２の１：１混合液中に保持し、３７℃で５％ＣＯ2中でインキュベートした。
【００８５】
Ｈｅｒ２分解。全体タンパク質アッセイ：細胞を６０〜７０％集密にまで成長させ、薬物またはＤＭＳＯビヒクルに指示された期間暴露した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、２％ＳＤＳおよび１０％グリセロール溶解緩衝液を用いて溶解産物を調製した。タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（Pierce Chemical Co.）を用い、製造業者の説明書に従って決定した。清澄化タンパク質溶解産物（２０〜５０μｇ）を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロースに転写し、抗Ｈｅｒ２一次抗体（Ｃ−１８）（Santa Cruz Biotechnology）でプローブした。図１９に示すように、ＰＵ２４ＦＣｌは、低濃度（ＳＫＢｒ３、ＭＣＦ−７およびＢＴ−４７４についてそれぞれＩＣ50：１．７、２、４．５μＭ）で、発癌遺伝子タンパク質Ｈｅｒ２の効果的分解を誘発する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＳＰ９０ファミリーのシャペロンタンパク質の既知の成員であるＨｓｐ９０α（配列番号１）、ＧＲＰ９４（配列番号２）、Ｈｓｐ９０β（配列番号３）、およびＴｒａｐ１（配列番号４）中のＮ末端結合ポケットに寄与するアミノ酸の整列配列を示す。
【図２】
ポケットに配置させた本発明の結合部分を有するポケットの三次元図を示す。
【図３ＡおよびＢ】
分子モデリングにより決定される場合のｈｓｐ９０ポケット内部、およびｘ線結晶学により決定される場合のポケットの外部のＰＵ３の立体配座を示す。
【図４】
プリン核に基づく例示的結合部分／化合物を示し、ＨＳＰ９０ファミリーの成員のＮ末端ポケット中の結合部位との様々な置換基の相互作用を示す。
【図５】
本発明に係る化合物の構造を示す。
【図６Ａ】
本発明に係る化合物を作製する合成手順を示す。
【図６Ｂ】
本発明に係る例示的９−Ｎアルキル化化合物を示す。
【図７Ａ】
小さな疎水性結合部位と相互作用するためのＸ３位での官能基の導入に関する合成スキームを示す。
【図７Ｂ】
小さな疎水性結合部位と相互作用するためのＸ３位での官能基の導入に関する第２の合成スキームを示す。
【図８ＡおよびＢ】
Ｘ２部位での変形の導入に関する合成スキームを示す。
【図９】
本発明に係る結合部分の製造に関する合成スキームである。
【図１０】
ＰＵファミリー化合物中のプリンおよびフェニル基との間の架橋の長さおよび性質における変形の導入に関する合成スキームを示す。
【図１１】
二量体化またはターゲッティング部分の付加を示す。
【図１２】
結合部分の相対的親和性を評価するための模式的方法論を示す。
【図１３】
ＰＵ１〜ＰＵ４の特定構造を示す。
【図１４Ａ〜Ｃ】
乳癌細胞系に対するＰＵ３の抗増殖効果を示す。
【図１５】
一実施例で試験した化合物のＸ１置換基を示す。
【図１６ＡおよびＢ】
固定化のためにＰＵ３を修飾すること、およびビオチン化を使用することに関する手順を示す。
【図１７】
ＰＵ３およびＰＵ２４ＦＣｌによるＡｋｔタンパク質の分解を示す。
【図１８】
成長停止、Ｈｅｒ２全タンパク質分解、およびＨｓｐ９０結合効率との間の相関関係を示す。
【図１９】
ＰＵ２４ＦＣｌによるＨｅｒ２の分解を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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