(57)【要約】本発明は、単球由来の移植片受容誘導細胞、その産生、およびこの細胞を用いて移植片受容を産生するための移植片受容誘導細胞の使用に関する。また、本発明は、本発明のヒト移植片受容誘導細胞を特異的に認識するモノクロナール抗体ＧＭ−７に関する。さらに、本発明は、移植片受容誘導細胞を検出および／または選択するための抗体ＧＭ−７の使用に関する。単球由来ＴＡＩＣを調製するための本発明による方法の主要な工程は、以下：（ａ）血液、好ましくはヒト血液から単球を単離すること；（ｂ）増殖促進因子としてのマクロファージコロニー刺激因子（本明細書中以下、Ｍ−ＣＳＦと称する）を含む適切な培養培地中でこの単球を増殖させること；（ｃ）この単球をγ−インターフェロンで賦活化すること；および（ｄ）この細胞を培養培地から分離することにより、工程ｃ）で形成された移植片受容誘導細胞を得ることを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）血液から単球を単離する工程、
ｂ）細胞増殖因子Ｍ−ＣＳＦを含む適切な培地中で該単球を増殖させる工程、
ｃ）γ−ＩＦＮを含む培地中で、工程ｂ）と同時に、もしくは工程ｂ）の後で該単球を培養する工程、および
ｄ）工程ｃ）において形成された移植片受容誘導細胞を、該培地から分離することにより該細胞を得る工程
を特徴とする単球由来の移植片受容誘導細胞を調製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記単球がヒト由来であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１もしくは２に記載の方法であって、前記単球の次にリンパ球も単離物内に総細胞数を参照して少なくとも１０％の量で存在するような方法で、該単球を該血液から単離することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の方法であって、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２により産生される抗体に結合させることによって、工程ｃ）で形成され、もしくは工程ｄ）で得られる前記移植片受容誘導細胞を選択することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の方法であって、請求項１の工程ｃ）で形成されるか、もしくは請求項１の工程ｄ）で得られるか、または請求項４に記載の選択工程で得られる前記移植片受容誘導細胞の中で、その細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現している細胞を選択することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記培地のＭ−ＣＳＦ濃度が１〜２０μｇ／ｌであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法であって、工程ｂ）の後に、前記単球をγ−ＩＦＮ含有培地で２４〜７２時間培養し、γ−ＩＦＮ存在下の培養が培養工程ｂ）の開始の３〜６日後に開始されるものとすることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記培地のγ−ＩＦＮ濃度が０．１〜２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法であって、工程ｂ）および工程ｃ）の合計培養期間が４〜８日間であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜８に記載の方法であって、請求項１の工程ｄ）の後、もしくは請求項４および５に記載の選択工程の後、前記細胞を適切な細胞培地またはＰＢＳもしくはＮａＣｌ溶液に懸濁することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記細胞を寒剤中に懸濁し、次いで深冷凍結することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記寒剤がウシ胎仔血清（ＦＣＳ）もしくはヒトＡＢ血清およびＤＭＳＯを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法のうちの任意の方法により得ることができる単球由来の移植片受容誘導細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の移植片受容誘導細胞であって、これがその細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現することを特徴とする移植片受容誘導細胞。
【請求項１５】
請求項１３もしくは１４に記載の移植片受容誘導細胞であって、これがヒト由来であることを特徴とする移植片受容誘導細胞。
【請求項１６】
適切な培地中に請求項１３〜１５に記載の移植片受容誘導細胞を含有する細胞調製物。
【請求項１７】
単球由来の移植片誘導細胞を含有する医薬配合物。
【請求項１８】
請求項１３〜１５に記載の移植片受容誘導細胞もしくは請求項１６に記載の細胞調製物を含有する医薬配合物。
【請求項１９】
移植片拒絶反応を抑制するための医薬配合物を作製するための、請求項１３〜１５に記載の移植片受容誘導細胞もしくは請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２０】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調節性Ｔリンパ球を産生／または増殖させるための請求項１３〜１５に記載の移植片受容誘導細胞もしくは請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２１】
請求項２０に記載の使用であって、前記調節性Ｔリンパ球がその細胞表面に抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現する使用。
【請求項２２】
ａ）請求項１３〜１５に記載の移植片受容誘導細胞もしくは請求項１６に記載の細胞調製物をＴリンパ球調製物と共培養する工程、および
ｂ）該培地から任意選択的に調節性Ｔリンパ球を得る工程
を特徴とする、調節性Ｔリンパ球を産生および／または増殖させる方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記調節性Ｔリンパ球がその細胞表面に抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２もしくは２３に記載の方法であって、前記調節性Ｔリンパ球をＦＡＣＳソーティングにより前記培地から得ることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２２〜２４の方法によって得ることができる調節性Ｔリンパ球。
【請求項２６】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２。
【請求項２７】
前記ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２によって産生される抗体。
【請求項２８】
移植片受容誘導細胞の検出および／または選択のための請求項２２に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球由来の移植片受容誘導細胞およびその調製方法ならびに移植片受容を形成するためのこの細胞の使用に関する。
【０００２】
好ましくは、本発明は、ヒト単球由来の移植片受容誘導細胞（以下、ＴＡＩＣとも称する）に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、ヒト由来の本発明による移植片受容誘導細胞を特異的に認識するモノクロナール抗体ＧＭ−７に関する。
【０００４】
さらに、本発明は、移植片受容誘導細胞を検出および／または選択するための抗体ＧＭ−７の利用に関する。
【背景技術】
【０００５】
免疫学の分野では、「移植」という用語は、ある生体の細胞、組織もしくは臓器を別の生体に移入することに対して用いられている。移植の必要性は、幾多の疾患が、健常な臓器、組織もしくは細胞をこの点において健常なある個体（ドナー）から当該疾患に罹患している個体（レシピエント、即ち宿主）に移入（移植）することにより治癒させ得るという知見に基づいている。
【０００６】
ドナーとレシピエントとの間の関係に応じて、移植片のタイプは以下のように分類することができる：
１．自家移植片：これは、ある同一個体内で、体のある部位から別の部位へ移植される組織もしくは細胞のことである。
２．同系移植片：これは、遺伝的に同一の個体間で移入を行うものである。これらの例としては、近交系のラットもしくはマウスがある。ヒトの場合、同系（同系内）移植は、遺伝的に同一の（一卵性の（ｍｏｎｏｃｙｇｏｔｉｃ））双生児間で考慮することができる。
３．同種移植片：この用語は、例えば、あるヒト個体から別のヒト個体へ、または実験動物の場合、ある近交系から別の近交系へといった、同一種の遺伝的に異なる構成員間における移植片のことを指している。
４．異種移植片：これは、例えば、サルの心臓をヒトに移入するなど、異なる種間の移入を含む。
【０００７】
一般に、自家および同系移植片では、拒絶反応という意味での免疫学的な問題は生じない。しかしながら、このことは、同種および異種移植片の場合には当てはまらない。このような移植片は、レシピエントの免疫系によって異物として認識され、比較的短期間の後に拒絶される。同種／異種拒絶反応の場合、Ｔリンパ球（以下、Ｔ細胞と称する）が中心的な役割を果たす。この細胞は、その主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によって異質細胞を認識する。異物であるＭＨＣ−複合体は、レシピエントの抗原反応性Ｔ細胞を感作し、続いて、こうして賦活化されたＴ細胞は、それぞれのドナー細胞もしくはドナー組織の破壊をもたらす。異なるＭＨＣ−複合体を有する細胞は、「ＭＨＣが異なる」とも呼ばれる。
【０００８】
同種または異種の細胞、組織もしくは臓器を移植すると、２つの異なる個体の細胞、即ち、ＭＨＣが異なる細胞が同時にレシピエントの血中に存在するという状況が、必然的に生じる。この現象は、「キメラ現象」と呼ばれている。これはマイクロキメラ現象とマクロキメラ現象とに分類される。マイクロキメラ現象とは、例えば、血液もしくは骨髄の注入後または小腸もしくは肝臓などのリンパ球に富んだ臓器の移植後のドナー由来細胞はＭＨＣが異なる宿主に存続し続けるが、いくつかの極端な例でのみ検出可能であるような状態のことを意味する。マクロキメラ現象という用語は、レシピエントにおいて検出される細胞の５％超がドナー由来であり、レシピエントの血液もしくは臓器におけるドナー細胞のこれに相当する検出に関して血液キメラ現象と臓器キメラ現象との間で両者を区別する必要がある場合に用いられる。
【０００９】
キメラ現象は、ある程度まで、移植片に対する寛容をもたらすことができる。従って、白血病またはリンパ腫疾患のため、例えば、ドナーとレシピエントとの間でＭＨＣパターンが大部分一致する同種骨髄移植を受ける必要があった人の場合、相当する骨髄機能廃絶前処置（ｍｙｅｌｏ−ａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）（その個体自体の骨髄およびこれに由来する血液細胞の破壊）およびこれに続く幹細胞移植を行った後に、「ドナー・キメラ現象」が認められた。こうした患者の場合、血中に検出可能な細胞の９９％超はドナーの幹細胞に由来するものであり、このキメラ現象はこのドナーから移植される全ての臓器に対する寛容の基礎となった。この知見は、その後、腎臓、肝臓および肺の一部提供による一連の臨床例において確認された［Ｄｅｙ，Ｂ．ら、「Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．」Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）７７、ｐ３５５−３６９（１９８９年）］。これに関連して、寛容を誘導するためには、完全なドナー・キメラ現象（異種レシピエントの末梢血における９０％超のドナー細胞の存在と定義される）が存在することが決め手となるのではなく、寛容の誘導にはわずか５％のドナー細胞（「混合（ｍｉｘｅｄ）」キメラ現象と呼ばれる）で十分であることが見出されている［Ａｃｈｏｌｏｎｕ，Ｉ．Ｎ．、Ｉｌｄｓｔａｄ，Ｓ．Ｔ．、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：Ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒａｆｔｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ４、ｐ１８９−１９６（１９９９年）の概説参照］。
【００１０】
従って、基本的には、骨髄移植（ＢＭＴｘ）に伴って生じるドナー・キメラ現象が寛容を誘導する証拠が提供されているが、それでもなお、ＭＨＣが完全に異なるドナー群とレシピエント群との場合に同種ＢＭＴｘに成功することは、これまでのところ可能ではなかった。このことは、これに必要なプレ前処置（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、即ち、レシピエントの前処置（上記参照）にはレシピエントに対する３つの重要なタイプのリスクがあるという事実によるものである。第１に、さらに放射線療法と併用して、または併用しないで投与される化学療法剤の使用による骨髄毒性がかなりの死亡率をもたらすことであり、第２に、事前の前処置にもかかわらず、移植した骨髄が拒絶されるリスクがあることであり、最後に、移植片と共に宿主に移入されたＴ細胞が宿主の生体に不利に働く場合、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を生じるリスクがあることである［Ｗｏｌｆｆ  Ｓ．Ｎ．、「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｆｒｏｍ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒｓ：Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ．」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５、ｐ３７２−３８１（２０００年）参照］。この疾患は、骨髄と共に移入されたＴ細胞がレシピエントに致死的な拒絶を引き起こすことができる程度に事前の前処置によってレシピエントの免疫系が弱体化した場合に、必ず起こる。
【００１１】
上記のような問題を解決するために、現在、レシピエントの前処置ができる限り軽度なものとなるようにデザインする努力がなされている。しかしながら、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣの相違が大きいほど、移植骨髄の拒絶を防止するために強い前処置療法を選択しなければならず、このことにより、この場合もやはり移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を生じるリスクが増大する。
【００１２】
これまでのところ、ドナー臓器に対する安定な寛容状態を確保するために、誘導されたキメラ現象がレシピエントの血中で検出可能な状態を維持しなければならない期間に関しては、詳細な研究は行われていない。しかしながら、マウスモデルを用いて得られた信頼性のあるデータは、寛容が生じるにはマクロキメラ現象が２週間検出可能となることですでに十分であることを示す［Ｗｅｃｋｅｒｌｅ，Ｔ．ら）、「Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｍａｃｒｏ−ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｈｏｓｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、ｐ４６４−４６９（２０００年）］。
【００１３】
現在使用可能な免疫抑制剤に代わる手段を開発することにより寛容を生じさせる必要性は、２つの主な観点の角度から生じている。一方においては、現在までに臨床的に使用可能な免疫抑制剤は、移植片拒絶を長期的に防止することができておらず、他方では、免疫抑制剤を永続的に服用すると、患者をウイルス、細菌および真菌感染に罹りやすくし、腫瘍（ｍａｌｉｇｎｏｍａ）ならびに特に心筋梗塞および心不全による心血管系疾患の形成によって相当なリスクを生じるかなりの副作用を伴う［Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｄ．Ｃ．およびＳｔｅｉｇｅｒ，Ｊ．「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ）」Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０、ｐ４１−４５（２０００年）参照］。
【００１４】
Ｍｕｎｎらは、Ｔ細胞周囲の環境においてトリプトファンが選択的に除去され、そして／または１種以上のトリプトファン代謝体が増加することに基づいてマクロファージ誘導性にＴ細胞が抑制されることを報告している［Ｍｕｎｎら「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９、１３６３−１３７２（１９９９年）参照］。著者は、この観察結果が発端となって、局所細胞外トリプトファン濃度を変化させることにより、特にＩＤＯ媒介性トリプトファン代謝を阻害もしくは増強することによってＴ細胞媒介性免疫反応を修飾することを提案しており、例えば、米国特許第６，４８２，４１６号および第６，４５１，８４０号を参照されたい。従って、この方法では、単に、Ｔ細胞を標的とした別の抗原非依存性、非特異的免疫抑制が得られるに過ぎない。
【００１５】
しかしながら、緊急に必要とされているのは、ドナー特異的な寛容を誘導するための臨床的に妥当なコンセプト、即ち、ドナ―から移入された臓器の組織抗原に対する宿主の免疫反応は特異的に抑制されるが、その他の点で宿主の免疫能力は完全に維持されることを示すようなコンセプトである。
【００１６】
このようなコンセプトによれば、上記のようにして急性および慢性的な拒絶プロセスによる臓器の損傷がかなり少なくなるので、臓器の需要と臓器の供給との間の不一致は大幅に緩和されるものと考えられる。適切な臓器が不足していることについては、以下の２００１年２月以降の米国の統計によって説明することができる：
【００１７】
【表１】
2005532803.tif 000002
表１：「ＵＮＯＳ（全米臓器配分登録（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ））臓器移植順番待ち患者名簿（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｗａｉｔｉｎｇ  Ｌｉｓｔ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）（２００１年２月）」からの最新の試料
このことから、ドナー特異的な寛容を誘導するコンセプトの開発に、国内外で膨大な努力がなされていることが明らかである。
【００１８】
従って、レシピエント生体のＴ細胞に対し、これが当該の外来性細胞、組織もしくは臓器を長期に拒絶を示すことなく耐容性を示し、および／または受容するように影響を与えるための手段を提供することは、本発明の基礎をなす課題である。こうした手段およびその調製法もしくは利用法の構成は倫理的および／または法的問題を生じてはならず、そして、目的とする治療的用途に対してその目的に必要な量を許容可能な製造コストで迅速にこれを調製することが可能でなければならない。
【００１９】
この問題を解決するために、本発明による、脊椎動物、特に哺乳動物、より好ましくはヒトからの単球由来移植片受容誘導細胞（ＴＡＩＣ）を提供する。驚くべきことに、本発明により修飾したドナー（臓器ドナー）の血液からの単球は、術前および／または術後投与した場合に、レシピエントの生体に対し外来性ＭＨＣ−複合体により賦活化されたその体内のＴ細胞から保護することによって移植片に対する拒絶反応を防止することができることが分かった。この修飾細胞は、「細胞性治療剤」として移植片に対する寛容を誘導するのに用いても、当該患者に対して細胞性拒絶反応、腫瘍（特に悪性腫瘍）の誘発および移植片対宿主疾患の誘発といった副作用を全く、もしくは大して生じない。
【００２０】
意外なことに、本発明による方法では、単球をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で修飾することにより、免疫が抑制されていない同種レシピエントへの注射後、そのドナーの細胞もしくは組織に対して本来生じる免疫反応を防止することができ、従って、少なくとも３週間は末梢血を循環することができる細胞が得られることが分かった。約１０５個／ｋｇ体重（ＢＷ）の細胞を投与することにより、得られるキメラ現象を示すＧＭ−７陽性細胞（下記参照）は、５〜２０％の範囲にある。この一過性のキメラ現象は、以下を誘導する：
ａ）その後、好ましくはこの細胞の静脈内投与後１０日以内で、同じドナーからの臓器移植の長期の受容、および
ｂ）この細胞を臓器移植の後に用いた場合には、短期の免疫抑制療法との併用での長期の受容。
【００２１】
実施例１０に示したように、本発明の細胞の免疫抑制効果は、マンら（Ｍｕｎｎ，ｅｔ  ａｌ．）により観察されたような、トリプトファン分解酵素インドールアミン−２，３−ジオゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現によるマクロファージ誘発性Ｔ細胞抑制（上記参照）を伴わない。むしろ、本発明のＴＡＩＣは、一方で同種反応性Ｔ細胞を不活性化し、他方でレシピエントにおいて調節性Ｔ細胞の形成を誘起することにより、ドナーに対する特異的な寛容を誘導するものであり、実施例１２および１３を参照されたい。
【００２２】
従って、Ｔ細胞周辺の環境からトリプトファンをＩＤＯを媒介して除去することによってＴ細胞の増殖を阻害する単球由来のマクロファージは、本発明に含まれない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要旨）
単球由来ＴＡＩＣを調製するための本発明による方法の主要な工程は、以下：
（ａ）血液、好ましくはヒト血液から単球を単離すること；
（ｂ）増殖促進因子としてのマクロファージコロニー刺激因子（本明細書中以下、Ｍ−ＣＳＦと称する）を含む適切な培養培地中でこの単球を増殖させること；
（ｃ）この単球をγ−インターフェロン（以下、γ−ＩＦＮと称する）で賦活化すること；および
（ｄ）この細胞を培養培地から分離することにより、工程ｃ）で形成された移植片受容誘導細胞を得ること
を包含する。
【００２４】
本発明では、このγ−ＩＦＮによる賦活化はＴＡＩＣの調製において決定的に重要な工程になることが分かっている（実施例７参照）。
【００２５】
本発明に関連して、「ＴＡＩＣ」（単球由来の移植片受容誘導細胞）という用語は、上記方法の工程（ｄ）から得られる細胞集団を指す。この細胞集団は、本発明により有効な単球由来の細胞とは別に、リンパ球（実施例１１参照）、および必要に応じて、例えば顆粒球のようなバフィコートから得られる別の細胞を含む。このＴＡＩＣ集団内の単球由来の細胞の量は、総細胞数に関して、好ましくは５０〜９０％、より好ましくは６０〜７０％である。
【００２６】
本発明に関連して、「総細胞数」という用語は、検討対象の細胞集団中の生細胞の量のことを意味する。この量は、「トリパンブルー色素排除法」により測定することができる。何故なら、この色素により、光学的手段を用いて、非生細胞から生細胞を識別することができるからである。
【００２７】
通常、本発明によるＴＡＩＣは、移植片受容を誘導するのに、キログラム体重当たり１０４〜１０６個、好ましくはキログラム体重当たり１０５個の細胞量を用いることができる。ＴＡＩＣ投与は反復して行うことができ、ＭＨＣの相違が大きい場合は、好ましくは約１０日の間隔で３回投与することができ、こうした場合、これらの細胞の投与は移植の前もしくは後で実施することができる（下記を参照のこと）。このために必要な細胞の総数は、血液採取後６〜８日以内に得ることができる。
【００２８】
本発明によるこれらの細胞（ＴＡＩＣ）は、動物実験および培養の両者において、腫瘍（ｍａｌｉｇｎｏｍａ）の形成に関しリスクのないことが分かったが、このことは、本発明のこの細胞が由来する元の単球細胞の性質からみて決して予想することができなかったかもしれない結果である。
【００２９】
以下に説明するように、ＴＡＩＣ中に存在する単球由来の細胞のフラクションから、本発明により効果的に最適化したさらなる亜集団の細胞を単離することができる。
【００３０】
元の細胞（単球）をγ−インターフェロンと共にインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養して賦活化する後、ある細胞の亜集団（実施例９参照）を含むＴＡＩＣが形成され、この細胞は、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２により発現されるモノクローナル抗体ＧＭ−７に結合する。このモノクロナール抗体ＧＭ−７は、免疫グロブリン・アイソタイプＩｇＧ２ａの抗体であり、その軽鎖はカッパ−アイソタイプを示す。この抗体の特徴的な性質は、本発明による培養条件で修飾した単球への正確な結合能である。何故なら、元の単球細胞は認識されない、即ち、この抗体は元の細胞には結合しないからである（実施例９参照）。さらに、ＧＭ−７はヒト末梢血の細胞に結合しないことが、２０名のボランティアにおいて示された（図１０参照）。
【００３１】
この抗体は、当業者に公知の方法（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、１９９５年）を用いてヒト単球由来のＴＡＩＣでマウスを免疫することによって調製した。次に、この抗体を産生するＢ細胞とマウス由来の骨髄腫細胞を融合させることによりハイブリドーマ細胞株を作製した。このような細胞株の調製に用いる方法は、当該分野の技術水準において公知である（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、１９９５年；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、ｐ４９５−４９７（１９７５年））。抗体ＧＭ−７を産生するハイブリドーマ細胞株は、ブタペスト条約の規則に従い、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２で寄託した。
【００３２】
図１は、本発明によるインビトロ修飾後の単球に対するＧＭ−７の結合能について、フローサイトメトリーにより測定した結果を示す。バフィコートから直接得られるＣＤ１４陽性単球は抗体ＧＭ−７を結合しないことが観察され得る（灰色の陰影部分は非陰影部分の抗体対照と一致している）。これに対して、Ｍ−ＣＳＦの存在下に培養し、γ−ＩＦＮによる刺激を行った後では、この単球の一部は、モノクロナール抗体ＧＭ−７により認識される抗原を発現する。このモノクロナール抗体ＧＭ−７は、アイソタイプκ−ＩｇＧ２ａとして特徴付けられた。従って、本発明による方法は、この修飾した単球の細胞膜における抗原発現の表現型パターンの変化をもたらす（図１）。
【００３３】
モノクロナール抗体ＧＭ−７は、本発明による方法で作製した細胞の中で、最も効果的に移植片受容を誘導する細胞集団に対して特異的に結合する（図９参照）。
【００３４】
従って、本発明の好ましい実施形態は、抗体ＧＭ−７を結合することができるこのようなＴＡＩＣに関する。この細胞のことを、以後ＴＡＩＣＧＭ７と称する。
【００３５】
従って、本発明による抗体ＧＭ−７は、移植片受容を誘導する細胞（ＴＡＩＣ）の選択および精製のための極めて効果的で扱いやすい因子を表す。この抗体を用いることによって、本発明により、均質で極めて効果的なＴＡＩＣ集団を作製することが可能である。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗体ＧＭ−７に結合する抗原を発現する、本発明の上記の方法の工程ｃ）で形成される移植片受容誘導細胞は、工程ｃ）後の培養培地から直接選択され得るか、あるいはこの細胞は、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２により産生される抗体ＧＭ−７に結合させることにより本発明の上記方法の工程ｄ）により培養培地からこの細胞を分離した後に得られる細胞集団から選択され得る。
【００３７】
本発明によるＴＡＩＣを選択するには、この抗体と試料とを、この試料中に存在する移植片受容誘導細胞へのこの抗体の結合を可能にする条件下で接触させる。次いで、この結合反応により生じた反応複合体をこの試料から分離する。このために、この抗体は、試料と接触させる前にキャリア物質上に固定化することができ、例えば、クロマトグラフィー方法用に適したマトリクス、またはいわゆる「磁性ビーズ」に結合させることができる。こうした方法によって、大量の試料から移植片受容誘導細胞を選択および濃縮することが可能である。
【００３８】
移植片受容誘導細胞を得るには、試料から反応複合体を単離した後、この抗体と移植片受容誘導細胞との間の結合を分離する。これは、例えば、競合的置換もしくは塩溶液による洗浄などの当該分野の技術水準において公知の方法によって行うことができる。これに該当する方法については、例えば、Ｕｔｚ  Ｕ．らによって記載されている（「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１  （ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＴＬＶ−１  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６年２月号、ｐ８４３−８５１）。
【００３９】
さらに、モノクロナール抗体ＧＭ−７を用いることによって、患者の血液試料および／または組織試料中の本発明による単球由来の移植片受容誘導細胞をインビトロで定性的および定量的に検出することが可能になる。この患者は、例えば、未だ移植されていないかまたは既に移植された器官のレシピエントであり得る。移植片受容誘導細胞の存在および、該当する場合、その量を示す試料中の反応複合体の形成は、公知の方法によって検出される。
【００４０】
この反応複合体を検出するために、この場合、抗体ＧＭ−７を、例えば、この抗体と共有結合している検出可能な分子に直接カップリング（「標識」）することが可能である。好適な検出可能分子については、分子診断の分野で数多く記載されており、これらとしては、特に、フルオレセインイソチオシアネートもしくはテトラメチルローダミン−５−イソチオシアネートなどの蛍光色素、発光染料、放射性標識した分子、およびペルオキシダーゼなどの酵素が挙げられる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルグ−ベルリン、１９９８年参照）。
【００４１】
この抗体の検出は、この抗体の標識用に選んだ分子に応じて行う。本発明と関連して、フローサイトメトリーおよび／または蛍光顕微鏡法により抗体検出を実行し得るように、抗体ＧＭ−７は蛍光性分子フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とカップリングさせた。抗体をＦＩＴＣで標識する方法は、当業者には公知である。
【００４２】
あるいは、上記反応複合体を、二次抗体を用いる２段プロセスによって検出することもできる。これに関しては、標識していない抗体ＧＭ−７を、別の標識抗体との反応複合体として検出することができる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．、Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．「Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ」Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ、１９９８年参照）。この２段検出法は、１つのＧＭ−７抗体にいくつかの標識二次抗体を結合させることができる（シグナル増幅）ので、本発明による抗体の結合を直接検出するよりもかなり感度が良い。
【００４３】
従って、抗体ＧＭ−７を用いることによって、例えば、末梢血の細胞数を特定の時間間隔で測定する「モニタリング」の形態で、ＴＡＩＣで処理された患者の末梢血のＴＡＩＣを検出することが可能になる。本発明によって、移植片レシピエントの末梢血を用いた動物実験において、ドナーの単球から調製したＴＡＩＣの存在は移植器官の寛容と関連付けられることが見出された。従って、この知見に基づき、臨床家は、任意選択的に投与される免疫抑制剤の投与を中止するかもしくは投与量を段階的に低減させることが可能になる。これまでは、移植後のある時点で患者の免疫系が寛容を示すかどうかに関して正確な証拠を提供することは、臨床的観点から可能ではなかった。
【００４４】
当業者には自明であるように、本発明により修飾した非ヒト脊椎動物の単球（特に霊長類およびブタの単球）由来のＴＡＩＣに対してもモノクロナール抗体を調製することは可能である。これに関して、これらに該当する宿主動物の免疫化およびこれに対応するハイブリドーマ細胞株の作製は、ヒト由来ＴＡＩＣについて上記したようにして行う。他の種からの有効なＴＡＩＣ集団を作製することは、異種移植医学の分野における重要な貢献を提供する。
【００４５】
本発明の特に好ましい実施形態は、細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現する本発明のＴＡＩＣの部分集団に関する。以下、この細胞をＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋と称する。このような細胞は、従来技術では現在まで報告されていない。単球および単球由来の既知の細胞は、表面マーカーＣＤ１４を有するが、これらはさらに表面マーカーＣＤ３を同時に有することはない。
【００４６】
表面抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現するＴＡＩＣは、本発明の上記方法の工程ｃ）で形成される移植片受容誘導細胞から直接選択され得るか、または、これは、本発明の上記方法の工程ｄ）により培養培地からこの細胞を分離した後に得られる細胞集団から選択され得、あるいは、これは、ＴＡＩＣＧＭ７集団から選択され得る。
【００４７】
さらに、本発明によって、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋が遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７を強力に発現することが示された（実施例１２参照）。これに対して、これらの遺伝子は、元の単球によっては発現されないか、ほんのわずか発現されるに過ぎない。従って、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現の上方制御は、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の特徴である。
【００４８】
実施例１２で考察されるように、マーカーＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現は、これまで調節性Ｔリンパ球に関して記載されただけである。表面抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現するＴリンパ球は、「サプレッサー細胞」とも示される調節性Ｔリンパ球の部分集団である。身体の免疫反応を抑制することが、その機能である。特に、Ｆｏｘｐ３は、特異的な転写因子と考えられており、これは、調節性Ｔ細胞の発生に対する制御遺伝子の役割を果たし、かつこの細胞により特異的に発現される。本発明によって、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞は、Ｆｏｘｐ３−ＲＮＡを全ＲＮＡ  １μｇ当たり、少なくとも１×１０−９μｇ、より好ましくは少なくとも５×１０−９μｇ、特に好ましい様式では少なくとも１×１０−８μｇ発現することが、好ましい。
【００４９】
同様に、ＣＴＬＡ４は、Ｔリンパ球（特にＣＤ４／ＣＤ２５陽性Ｔリンパ球）の調節機能を検出するためのマーカーと考えられている（実施例１２において引用される文献参照）。本発明によると、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞は、ＣＴＬＡ４−ＲＮＡを全ＲＮＡ  １μｇ当たり、少なくとも５×１０−７μｇ、より好ましくは少なくとも３×１０−６μｇ、特に好ましくい様式では少なくとも５×１０−６μｇ発現することが好ましい。
【００５０】
上皮カドヘリンを認識するインテグリンαＥβ７は、上皮環境と相互作用する極めて強力な調節性Ｔリンパ球の部分集団に対する新しいマーカーであると、最近ＬｅｈｍａｎｎらがＰＮＡＳ  ９９、ｐ  １３０３１−１３０３６  （２００２年）に記載した。本発明によって、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞におけるインテグリンαＥβ７−ＲＮＡの発現は、全ＲＮＡ  １μｇ当たり、好ましくは少なくとも１×１０−１２μｇ、より好ましくは少なくとも１×１０−１１μｇ、特に好ましい様式では１×１０−１０μｇ、最も好ましくは少なくとも１×１０−９μｇである。
【００５１】
実施例１２の表に示すように、本発明のＴＡＩＣをリンパ球と直接共培養すると、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現が強く上方制御されたリンパ球集団内において調節性Ｔリンパ球（特にＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性細胞）の数が大きく増加する。さらに、この実施例では、この効果は、ＴＡＩＣをリンパ球と間接的に共培養しても認められないことが明らかにされている。
【００５２】
以上の結果から、調節性Ｔリンパ球の形成および／または増殖のＴＡＩＣによる賦活化は、本発明のＴＡＩＣによる移植片受容の誘導に関与していることが分かる。
【００５３】
実施例１３はこの仮説を確認する。この実施例では、実施例３、４、５、６および７のレシピエント動物からのリンパ球をそれぞれのドナー動物からのＴＡＩＣと共にインビトロでインキュベートした。寛容を誘導するために、ＴＡＩＣの代わりに、このレシピエントからのリンパ球と共にプレインキュベートしたＴＡＩＣをその動物に注射した。このような方法でもドナー特異的な寛容を誘導することができたが、ドナー由来ＴＡＩＣと共培養しなかったレシピエントのリンパ球を投与した動物では寛容は生じなかった。
【００５４】
本発明のＴＡＩＣは、それ自体で医薬調製物として用いることができる。前述した本発明の方法の工程ｄ）から得られる細胞は直接用いることができる。このようにして得られる集団の全細胞の約１０〜５０％は、最初の単球単離物（バフィコート）に由来するリンパ球および顆粒球によって構成される。これらの細胞は、培養工程で単球由来の本発明のＴＡＩＣが形成されるのを支持し（実施例１１参照）、また、本発明のＴＡＩＣを医薬調製物として用いても寛容誘導を妨害しない。
【００５５】
しかしながら、本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、本発明のプロセスから得られるＴＡＩＣ集団全体から亜集団ＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋を単離することができ（前記参照）、これらを寛容誘導のために用いることができる。
【００５６】
培養培地中では（実施例２参照）、ＴＡＩＣあるいはＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋は、これらの寛容誘導効果を失うことなく少なくとも４８時間維持することができる。
【００５７】
医薬調製物として用いるには、ＴＡＩＣあるいは亜集団ＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋は、例えば、（広く使用に適している）ヒトＡＢ血清に懸濁して静脈内に短時間注入の形で投与することができる。同種異系移植において移植片受容を誘導するには、ドナーの単球から調製したＴＡＩＣあるいは亜集団ＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋を、ＭＨＣが異なるレシピエントに術前もしくは術後に注射することができる。術前投与の場合、ＴＡＩＣは、手術の約１週間前に１〜３回注射する必要がある。術後投与の場合は、手術からこの細胞の単回投与までの期間は７日間より長くするべきではない。これに従えば、本発明によるＴＡＩＣもしくはその亜集団ＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋は、移植片に対するレシピエントの免疫系のＴ細胞応答を阻止することができ、長期移植片受容を保証するのに十分長い間レシピエントの血中に存続することになる。
【００５８】
生体個体からの臓器提供の場合は術前の静脈内注射を考慮することができるが、死体臓器提供（死体からの血液および臓器）が課題となっている場合には、本発明によるＴＡＩＣもしくはその亜集団ＴＡＩＣＧＭ７および／またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋の術後投与が好適であり得る。死体からの臓器提供の場合には、臓器保存のためにドナーの遺体にその主動脈の疎通により潅流培地を流す。この場合、静脈血は、通常大静脈から吸い出され、廃棄する。本発明による使用対象のＴＡＩＣを得るには、静脈血を採集し、実施例１に記載したようにして処理することができる。あるいは、死体からの臓器提供の場合には、ＴＡＩＣは、ドナーの脾臓の細胞（リンパ球および単球）から得ることもできる。
【００５９】
死体からの臓器提供に伴う本発明によるＴＡＩＣの術後適用の場合、移植とドナー血から得られるＴＡＩＣの提供との間の合間において臓器の急性拒絶を防止するために免疫抑制剤を併用することにより、移植とこの細胞の適用との間の合間を克服し得る。これに関しては、従来の免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）もしくはタクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤との、またはアザチオプリン（ＡＺＡ）、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、モノクロナール抗体（ＡＴＧ、ＡＬＧ、但し、ジクリジウマブ（Ｄｉｃｌｉｚｉｕｍａｂ）、バジリキシマブのいずれとも併用しない）もしくはステロイド（ＳＴＥ）との治療的併用を考慮することができる。レシピエントの血中に（ジクリジウマブ、バジリキシマブなどの既知のＩＬ−２受容体αモノクロナール抗体以外の）免疫抑制剤が存在しても、一方ではこれらの免疫抑制剤の有効性に対し、他方ではＴＡＩＣの有効性に対し悪影響を及ぼさない。
【００６０】
この意味で、本発明により改変した単球由来の細胞は、（島細胞、肝細胞、成熟幹細胞などの、および任意の他のプログラム細胞型もしくは組織型の）あらゆる細胞性移植片ならびに（例えば、腎臓、肝臓、心臓などの）臓器に対して、これが移植されるべき細胞（臓器）と遺伝的に同じである限りにおいて（即ち、これはドナー自体もしくはその一卵性双生児に由来するものでなければならない）、「寛容移入のビヒクル」として用いることができる。ＴＡＩＣは、移植された細胞／臓器が新しい環境内に接着するようになるのを可能にし、従って、レシピエントが長期免疫抑制療法の副作用を被ることから保護することによってその保護的機能を満たす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
（発明の詳細な説明）
本発明のプロセスのための出発細胞は血液の単球である。これはヒト血液からの単球であることが好ましい。移植片受容を誘導するためには、この細胞は移植片のドナー（もしくはその一卵性双生児）に由来しなければならない。従って、例えば、サルもしくはブタの臓器をヒトに移植するといった異種移植の場合、本発明によるＴＡＩＣは、関係したドナー動物の単球由来でなければならない。
【００６２】
単球を得るには、先ず、血液を、抗凝血剤で通常の処理を行った後、当該分野で公知の方法を用いて、好ましくは遠心分離により、血漿と白血球および赤血球とに分離することができる。遠心分離後の血漿は上清中に存在し、その下方には、全体に白血球を含む層がある。この層は、バフィコートとも呼ばれる。これの下方には、赤血球を含む相（ヘマトクリット）がある。
【００６３】
本発明によるプロセスとの関連では、先ず、このバフィコート層を、例えば、公知の方法により遠心分離することによって、単離、分離して単球を得る。好ましいプロセスの実施形態では、リンパ球分離培地（フィコール−ハイパーク）上にバフィコート層を適用した後、これを遠心する（実施例１参照）。実施例１は、本発明のこの好ましい実施形態を説明したものであり、この場合、バフィコートになお含まれている赤血球および死細胞が遠心分離により分離された後も、単球を含む白血球は分離培地上に単離物として存在する。その後、単球の白色相をピペットで注意深く取り、単離物内の単球を濃縮するため、遠心分離と洗浄を繰り返す。このプロセスの過程で、単球は、リンパ球の一部と共に遠心管の底においてアセンブリされる。
【００６４】
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、単球を含む単離物を得る条件は、単離物が、細胞総数を基準として、単球とは別に約１０〜５０％のリンパ球を含むように制御される。この単離物は、それぞれ総細胞数を基準として、好ましくは約５０〜９０％、特に好ましい様式では６０〜７０％の単球、および好ましくは約１０〜５０％、特に好ましくは２０〜５０％のリンパ球を含み、その差分は必要により顆粒球により形成される。
【００６５】
実施例１１に示したとおり、元の単球とＭＣＳＦおよびγ−インターフェロンとの培養において、総細胞数を基準として２０〜３０％程度のリンパ球が存在すると、ごくわずかなリンパ球（約５％）が存在する場合と同様に、ＣＤ３／ＣＤ１４−ダブルポジティブＴＡＩＣの生成量が大幅に増加する。
【００６６】
十分な量のＴＡＩＣを調製するには、第一に単球の増殖を可能にすることが必要である。このために、単球に適した公知の成長培地を用いることができるが、この培地には増殖因子Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージ・コロニー刺激因子）が含まれていなければならない。Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）は単球、線維芽細胞、リンパ球および内皮細胞によって産生される。培養培地のＭ−ＣＳＦ濃度は、好ましくは２〜２０μｇ／ｌ培地、より好ましくは４〜６μｇ／ｌ、特に好ましい様式では５μｇ／ｌとすることができる。
【００６７】
その後、または同時に、この細胞は、γ−ＩＦＮにより刺激、即ち、γ−ＩＦＮの存在下にて培養されなけれなならない。γ−ＩＦＮによる単球の刺激は、上記増殖因子を含む培養培地において３〜６日間持続する最初の増殖相の後で行う。γ−ＩＦＮによる刺激は培養開始後４日目に行うのが好ましく、この刺激は、インキュベータ条件下、即ち、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で、好ましくは２４〜７２時間、より好ましくは４８時間にわたって継続される。
【００６８】
培地のγ−ＩＦＮ濃度は、０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは５ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６９】
γ−ＩＦＮによる刺激は、上記増殖因子を含む培地中の単球の増殖と同時に開始することができる。しかしながら、前述のように、３〜６日にわたる最初の増殖相の後で刺激することが好ましい。この細胞の増殖およびγ−ＩＦＮによる刺激には、好ましくは、全体として、８日間より長くかけるべきではない。いずれにせよ、γ−ＩＦＮによる処理は、この増殖相の後、少なくとも２４時間、最長でも７２時間、好ましくは４８時間継続するように実施するべきである。従って、この細胞の増殖および刺激期間は、好ましくは計４〜８日間継続する必要がある。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、増殖およびγ−ＩＦＮによる刺激は、実施例２に示したように、先ず前記増殖因子を含む培養培地で単球を増殖させ、３〜６日後にこの培養培地にγ−ＩＦＮを加えてその培地中の濃度が０．１〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは５ｎｇ／ｍｌとなるような量にして行う。
【００７１】
本発明によるプロセスは、表面が前もってウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはヒトＡＢ血清で被覆された培養容器を用いて実施することが好ましい（実施例２参照）。ＦＣＳによる被覆は、培養容器の表面を使用前にＦＣＳで被覆し、数時間、特に４〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間、特に好ましくは２４時間相互作用させた後、その表面に付着しなかったＦＣＳを適切な様式で除去することにより行うことができる。
【００７２】
培養工程において、細胞は約２４時間後に培養容器の底部に集まる。このとき、単球、およびこのプロセスの間に単球から得られたＴＡＩＣは、それらの付着性によって、それぞれの培養容器の底部に付着することになる。実施例２で述べるように、培養培地を培養中に交換した場合には、初めに上清を、例えば、ピペットで取るかデカントすることにより、注意深く除去した後、新鮮な培養培地を充填する。しかしながら、底部に付着した細胞については、存在するリンパ球が除去されないように、洗浄を行わないか、極めて注意深く行うことが好ましい。
【００７３】
付着細胞の除去は、機械的に、例えば、細いセルスクレーパもしくはスパーテルを用いて行うことができる。
【００７４】
しかしながら、本発明によるプロセスの好ましい実施形態では、この細胞は、適切な酵素、例えば、トリプシンによる処理によって完全に除去される（実施例２参照）。トリプシン溶液（０．１〜０．０２５ｇ／ｌ、好ましくは０．０５ｇ／ｌ）は、５％ＣＯ２の存在下に３５℃〜３９℃、好ましくは３７℃で２〜１０分間細胞に作用させることができる。
【００７５】
次いで、酵素活性を通常の様式でブロックし、このとき自由に浮遊しているＴＡＩＣを遠心分離を用いて常法により得ることができる。この場合、これは、必要に応じて、適切な培地、例えば、ＰＢＳに懸濁して直ぐにも使用できる。しかしながら、これは、培養培地に数日間、特に約２〜３日間保存することもできる（実施例２参照）が、この保存用培地には増殖因子もγ−ＩＦＮも含まれるべきではない。この細胞は、ＴＡＩＣのような培養液に少なくとも４８時間保存することができる。
【００７６】
さらに長期間貯蔵するには、この細胞を深冷凍結することができる。生細胞を深冷凍結するプロトコルについては、技術水準において公知であり、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｍ．らの文献（「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｒｎｅａ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｔａｌａ，Ａ．、Ｌａｎｚａ  Ｒ．Ｐ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２年、第４章、ｐ１３１−１４０）を参照されたい。本発明によるこの細胞を深冷凍結するための好ましい懸濁培地は、ＤＭＳＯを含むＦＣＳである。
【００７７】
本発明の一実施態様では、工程ｃ）もしくはｄ）から得られる移植片受容誘導細胞を含む細胞懸濁液を、さらに、抗体ＧＭ−７に結合する細胞に関して精製することにより亜集団ＴＡＩＣＧＭ７を得ることができる。このような精製の方法についての詳細は前述の通りである。
【００７８】
本発明の別の好ましい実施態様では、このような細胞は、細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現しているＴＡＩＣ集団から選択する。このような細胞を選択する方法は当該分野で公知である。このような方法の例には、「蛍光励起細胞分離（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」（ＦＡＣＳ）、「免疫磁気ビーズ分離（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」および「磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）」（ＭＡＣＳ）またはいわゆる「ロゼッティング法（Ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ）」がある［グメリグ−メイリング・Ｆ．ほか（Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）「ヒトＴおよび非Ｔ細胞の簡易分離法（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｔ−ｃｅｌｌｓ）」フォックス・サンギニス（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．）３３、ｐ５−８（１９７７年）参照］。
【００７９】
ＴＡＩＣ亜集団ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋の選択は、本発明の前記方法の工程ｃ）もしくはｄ）から得られるＴＡＩＣ集団から直接、またはＴＡＩＣＧＭ７から行う。後者の進め方は、ＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋の段階的濃縮を行うことを意味する。
【００８０】
本発明の好ましい実施態様では、移植片拒絶をインビボで抑制するための医薬配合物の製造に、本発明によるＴＡＩＣ自体を用いる。
【００８１】
このような医薬調製物には、本発明の方法の工程ｄ）から得られる本発明による生きたＴＡＩＣを、医薬用として許容可能な担体中に約１×１０５〜１×１０７個／ｍｌ調製物、より好ましくは約１×１０６個／ｍｌ調製物の量で懸濁して含ませることができる。
【００８２】
本発明のさらに好ましい実施態様では、移植片拒絶をインビボで抑制するための医薬配合物の製造に、本発明によるＴＡＩＣＧＭ７亜集団の細胞自体を用いる。
【００８３】
このような医薬調製物には、抗体ＧＭ−７に結合する本発明による生きたＴＡＩＣＧＭ７細胞を、医薬用として許容可能な液状担体中に好ましくは約１×１０６〜１×１０８個／ｍｌ調製物、より好ましくは約１×１０６個／ｍｌ調製物の量で懸濁して含ませることができる。
【００８４】
本発明の特に好ましい実施態様では、移植片拒絶をインビボで抑制するための医薬配合物の製造に、本発明によるＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋亜集団の細胞自体を用いる。
【００８５】
このような医薬調製物には、抗原ＣＤ３および抗原ＣＤ１４を同時発現している本発明による生きたＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞を、好ましくは約５×１０５〜５×１０７個／ｍｌ調製物、より好ましくは約５×１０６個／ｍｌ調製物の量で懸濁して含ませることができる。
【００８６】
上記の医薬調製物には、本発明による細胞を、生理学的に耐容性良好な培地に懸濁して含ませることができる。好適な培地には、例えば、リンゲル液、生理食塩水もしくは５〜２０％ヒト・アルブミン溶液などがある。
【００８７】
本発明による細胞調製物には、本発明の方法の工程ｄ）から得られる生きたＴＡＩＣを含ませることができる。あるいは、こうした調製物には、抗体ＧＭ−７に結合するＴＡＩＣＧＭ７細胞の亜集団、または細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現しているＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の亜集団に属する細胞を含ませることができる。これらの調製物には、それぞれの細胞を、好ましくは少なくとも１×１０５、より好ましくは少なくとも５×１０５、最も好ましくは少なくとも１×１０６／ｍｌの量で液状担体培地に懸濁して含ませることができる。この培地は、５〜２０％ヒト・アルブミン溶液などの細胞による耐容性の良好な細胞培養培地もしくは輸送培地とすることができる。また、調製物内の細胞は、例えば、５０％ヒト・アルブミン溶液および１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩなどの適切な貯蔵培地中に深冷凍結して含ませることができる。
【００８８】
最後に、本発明はまた、本発明の移植片受容誘導細胞（ＴＡＩＣ、ＴＡＩＣＧＭ７またはＴＡＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋）を用いることにより、インビトロで調節性Ｔリンパ球を調製し、もしくは増殖させる方法に関する。実施例１２に示したが、ＴＡＩＣをリンパ球とインビトロで直接共培養すると、調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の著しい増殖が生じる（ウッド（Ｗｏｏｄ）、サカグチ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ）：「移植寛容における調節性細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」、ネイチャー・レビュー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）３、ｐ１９９−２１０（２００３年）参照）。従って、実施例１２で説明したように、ＴＡＩＣをリンパ球と直接共培養することにより、調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球を調製し、および／または増殖させることが可能である。
【００８９】
直接インビトロで培養するとは、後述する実施例１２に例示したが、本発明では、ＴＡＩＣとリンパ球とを同一培地内で物理的に直接接触させて共培養することを意味する。
【００９０】
この方法において、培地は、それぞれの細胞、即ち、ＴＡＩＣおよびリンパ球をほぼ同じ細胞数とし、各々を好ましくは少なくとも１×１０５個／ｍｌ、より好ましくは少なくとも５×１０５個／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１×１０６個／ｍｌの量で液状担体培地に懸濁して含むことが望ましく、この場合、培地は、５〜２０％ヒト・アルブミン溶液などの細胞による耐容性が良好な細胞培養培地もしくは輸送培地とすることができる。この共培養は、約３７℃の生理的条件下、例えば、インキュベータを用いて、好ましくは約３〜５日間、より好ましくは４日間行うべきである。
【００９１】
実施例１３に示したが、移植片に対する受容は、ドナーの単球から調製したＴＡＩＣをレシピエントに投与することによって誘導することができるばかりでなく、前述のようにドナーの単球から調製したＴＡＩＣと前もってインビトロで直接共培養したレシピエントのリンパ球をレシピエントに再投与することによっても誘導することができる。
【００９２】
従って、本発明の別の実施態様によれば、調節性Ｔリンパ球は、移植片のドナーに由来するＴＡＩＣとレシピエントからのリンパ球とを直接共培養することにより、移植片のレシピエントに由来するリンパ球からインビトロで調製することができる。レシピエントにこの共培養したリンパ球を再投与すると、実施例１３に示したように、移植片はレシピエントにより受容される。
【００９３】
このようにして調製したレシピエント由来調節性Ｔリンパ球は、本明細書で説明したようにして（前記参照）ＦＡＣＳにより単離することができ、また、前述のように、この細胞を薬理学的に許容可能な担体中に懸濁した、レシピエントの拒絶防止用医薬調製物として用いることができる。
【実施例】
【００９４】
実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【００９５】
使用する培地および物質の組成については、実施例内で定義されていない場合、次のとおりである：
１．ペニシリン／ストレプトマイシン溶液
生理的食塩水（ＮａＣｌ  ０．８５％）１ｍｌ当たり、ペニシリンＧのナトリウム塩としてのペニシリン１０，０００単位およびの硫酸ストレプトマイシンとしてのストレプトマイシン１，０００μｇ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号１５１４０１２２）。
【００９６】
２．トリプシン−ＥＤＴＡ
トリプシン０．５ｇおよびＥＤＴＡ（４Ｎａ）０．２ｇ／ｌ
３．ＲＰＭＩ１６４０（１×、液体（１１８７５））  Ｌ−グルタミン含有
ＲＰＭＩ（ローズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））培地１６４０は、哺乳動物細胞に対して広く使用することができる濃縮処方物である。
【００９７】
【表２】
2005532803.tif 000003
【００９８】
４．ＰＢＳ（ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９８：１６７（１９５４）参照：
【００９９】
【表３】
2005532803.tif 000004
【０１００】
５．フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）：
リンパ球分離培地（サッカロース／エピクロロヒドリンコポリマーＭｇ  ４００，０００；比重１．０７７、ジアトリゾエート酸ナトリウムで調整）
６．Ｌ−グルタミン
液：２９．２ｍｇ／ｍｌ
７．マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）
大腸菌からの組換えヒトＭ−ＣＳＦ；モノマー（１８．５ｋＤ）として、Ｎ−末端メチオニンを有する１３５個のアミノ酸残基を含み、３７ｋＤのモル質量を有するホモダイマーとして存在する；（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）カタログ番号Ｍ６５１８）
８．γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）
大腸菌からの組換えヒトγ−ＩＦＮ；１４３個のアミノ酸残基を含む１６．７ｋＤの蛋白質（ケミコン社（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）カタログ番号ＩＦ００２）
（実施例１）
全血からの単球の分離
血液凝固を防止し、細胞に栄養を与えるために、トリプルチャンバ・バッグセット内で、ヒト全血４５０ｍｌを、水１リットル当たりクエン酸３．２７ｇ、クエン酸三ナトリウム２６．３ｇ、デキストロース２５．５ｇおよびジヒドロキシリン酸ナトリウム２２．２２ｇを含むスタビライザー溶液６３ｍｌと混合した。この溶液のｐＨは５．６〜５．８であった。
【０１０１】
次いで、血液成分を分離するため、４，０００ｒｐｍで７分間、２０℃においてこの混合液の「シャープ遠心分離」を行った。これによって、血球および非血球成分が３層以内の層を形成した。次いで、このために用意した圧縮機内にバッグセットを入れて用いることにより、赤血球を下部のバッグに圧入し、血漿を上部のバッグに圧入した結果、いわゆるバフィコートは中間のバッグに留まり、約５０ｍｌの容積を有した。
【０１０２】
次に、新たに得られたバフィコートの５０ｍｌの量を２５ｍｌずつに２分割し、前もって２本の５０ｍｌファルコン・チューブに入れておいた２５ｍｌのフィコール−ハイパーク分離培地にこれらをそれぞれ重層した。
【０１０３】
この調製品は、２，５００ｒｐｍで３０分間、制動することなく遠心分離した。この後、バフィコートになお存在する赤血球および死細胞はフィコール相の下方にあったが、単球を含む白血球はフィコール上に白色界面相として分離された。
【０１０４】
次いで、単球を含む白色界面相をピペットにより注意深く取り出し、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌと混合した。
【０１０５】
次に、この調製品に対して、１，８００ｒｐｍで１０分間、制動しながら遠心分離を３回行い、各遠心分離処理後に上清をピペットにより取り除き、新しいＰＢＳを添加した。
【０１０６】
細胞ペレットは遠心管（ファルコン・チューブ）の底部に集まり、単核細胞フラクション、即ち、単球を含んでいた。
【０１０７】
ラットによる実験に必要な単球を調製するために、４匹の遺伝的に同じドナーラットからそれぞれ２５ｍｌの全血を単離し、このそれぞれを２５ｍｌのフィコール−ハイパーク分離培地上に重層した。その後、この手順を前記と同じ方法で続行した。あるいは、フィコールを用いた類似の分離工程を脾細胞の懸濁液に適用することもできる。
【０１０８】
（実施例２）
（単球の増殖および修飾）
単球の培養および増殖は、下記の組成を有する培養液を用いて行った：
【０１０９】
【表４】
2005532803.tif 000005
この培養液には、２．５μｇ／５００ｍｌのＭ−ＣＳＦを含んだ。
【０１１０】
実施例１で単離した単球は、この培養液１０ｍｌに全量１０６個を懸濁し、ペトリ皿（直径１００ｍｍ）に移した。このペトリ皿には、前もって純粋な不活化ＦＣＳを満たし、２４時間後にＦＣＳを流し去ることにより皿をＦＣＳで被覆しておいた。
【０１１１】
ペトリ皿を、適当なカバーで覆い、３７℃のインキュベータに３日間入れておいた。この細胞は、２４時間後にはペトリ皿の底部に沈殿した。２日目に、上清をピペットで取り除き、ペトリ皿を再度１０ｍｌの新しい培養液で満たした。
【０１１２】
４日目に、５０ｎｇのγ−インターフェロンを１０ｍｌの培養液に溶かした溶液を加え、再度皿を閉じた上、３７℃のインキュベータにさらに４８時間入れておいた。
【０１１３】
次いで、ＰＢＳで１：１０希釈した各トリプシン溶液１０ｍｌをピペットに取り、ペトリ皿に入れた。このペトリ皿は、閉じた上で、３７℃のインキュベータに１０分間入れておいた。
【０１１４】
その後、ペトリ皿の底部に付着した細胞をセルスクレーパを用いて脱着させることにより、細胞の大部分（９０％超）を上清に浮遊させた。
【０１１５】
全上清（１０ｍｌのトリプシン溶液＋１０ｍｌの培地）をピペットで取り、５０ｍｌのファルコン・チューブ内で混ぜ合わせ、１，８００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、上清を捨て、沈殿物（残存細胞ペレット）に新しい培養液（前記参照）を１０６個の細胞当たり１ｍｌ加えた。正確な投与量を決定するための細胞数の測定は、公知の方法により行ったが、こうした方法については、「Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００２年、第４章、Ｓ．５５−８４を参照されたい。
【０１１６】
この細胞懸濁液を遠心分離（１，８００ｒｐｍ、１０分、前記参照）し、得られた細胞ペレットをＰＢＳに、もしくはヒトに使用する場合はＮａＣｌ（生理的食塩水）のいずれかに取り込んだ。その後は、これをすぐに、または４８時間以内に静脈内投与することができる。
【０１１７】
あるいは、遠心分離してトリプシンを含む上清を捨てた後、寒剤としてＦＣＳ／ＤＭＳＯを細胞に加え、これを１０ｍｌの容量にして深冷凍結した。
【０１１８】
この寒剤は９５％のＦＣＳおよび５％のＤＭＳＯを含むものを用いた。いずれの場合にも、寒剤１ｍｌに約１０６個の細胞を取り込み、以下の工程により冷却した：
氷上で３０分間；
前もって冷却しおいた−２０℃のスチロポール（Ｓｔｙｒｏｐｏｒ）ボックス内で２時間；
−８０℃のスチロポール内で２４時間；
小型チューブに入れて−１８０℃の液体窒素（Ｎ２）中に貯蔵。
【０１１９】
図１は、元の単球細胞の培養およびγ−ＩＦＮによる刺激後に用いた単球の抗原発現の表現型変化についてフローサイトメトリーにより測定した結果を示したものである。
【０１２０】
（実施例３）
（移植片レシピエントの免疫系をプレ前処置するための移植片受容誘導細胞（ＴＡＩＣ）の使用）
レシピエントとなり得るものに対し移植前の処置のためにＴＡＩＣが使用されるのは、例えば、臓器提供者が誰であり、誰がその臓器の提供を受けるのかが、臓器移植に先だって明らかにされている生存者による臓器提供の臨床例の場合である。
【０１２１】
こうした場合のために、オノ（Ｏｎｏ）、リンズレイ（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ）によって報告されている技術［Ｏｎｏ，Ｋ、Ｌｉｎｄｓｌｅｙ，Ｅ．Ｓ．「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ」Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５７、ｐ２２５−２２９（１９６９年）参照］を使用して、系の組合せＬＥＷ［ＲＴ１．１］（本発明との関連では「ＬＥＷ」と称する）→ＤＡ［ＲＴ１．ａｖ１］（本発明との関連では「ＤＡ」と称する）の雄性近交系ラットを用いたラット・モデルにおいて異所性心臓移植を実施した。移植の７日前に、ＤＡレシピエント動物に、ＬＥＷ単球由来の１０６個のＴＡＩＣを１ｍｌのＰＢＳに懸濁して静脈内投与した。次に、ＬＥＷ系ラットから心臓を摘出した７日後に移植を行い、このＤＡレシピエント・ラットの腹部（腹腔）内にこの心臓を異所移植した。用いたラットの系は近交系であったので、本発明によるＴＡＩＣは、移植したＬＥＷの心臓と同じ組織抗原を発現した。
【０１２２】
対照として、いわゆる第三系の移植（ｔｈｉｒｄ  ｓｔｒａｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を行った。このために、同じＬＥＷドナー動物に由来するＴＡＩＣ（１０６個）を、この場合も同様に、７日前（即ち、外科的介入の７日前）に静脈内注射した。７日後に、ＣＡＰ［ＲＴ１．ｃ］（本発明との関連では「ＣＡＰ」と称する）近交系ラットから摘出した心臓の移植を行った。ＣＡＰラットはハロタイプＲＴ１．ｃを発現しており、従って、ＬＥＷドナー動物とは完全にＭＨＣ不一致である（ＭＨＣが異なる）。以下は、異所性心臓移植を行った個々の試験群（ｎ＝１０）の詳細である：
１．ＬＥＷ→  ＤＡ；処置せず；
２．ＬＥＷ→  ＤＡ；ＬＥＷの心臓を移植する７日前に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与；
３．ＣＡＰ→  ＤＡ；ＬＥＷの心臓を移植する７日前に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与；
４．ＣＡＰ→  ＤＡ；処置せず；
５．ＬＥＷ→  ＬＥＷ、処置せず；
６．ＬＥＷ→  ＬＥＷ、ＬＥＷの心臓を移植する７日前に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与。
【０１２３】
心臓のカプラン−マイヤー生存曲線から分かるように（図２Ａ）、ＬＥＷの心臓は１０例中９例がＤＡレシピエント動物により長期に（＞１５０日間）受容されたが、第三系（ｔｈｉｒｄ  ｓｔｒａｉｎ）のＣＡＰの心臓は６．７±０．８日後、急性に拒絶された。ＴＡＩＣの前投与を行わなかった場合、ＬＥＷの心臓も７．２±１．０日後、急性に拒絶された。ＤＡ動物において賦活化された免疫系による６．７±０．８日後のＣＡＰの心臓の拒絶は、非処置対照群と同じタイム・スパンで起こった。即ち、この対照群では、ＤＡラットにおけるＣＡＰの心臓は６．９±１．０日後に拒絶された。これらについては、それぞれ群３および群４と比較されたい。ＬＥＷ→ＬＥＷスキームで同系移植した心臓は全て、ＴＡＩＣ前投与の有無に関わらず、長期（＞１５０日間）生存した。以上のことから、ＴＡＩＣを投与することによって、レシピエントの生体は移植片対宿主疾患発症という意味におけるリスクに曝されなくなると結論することができる。さらに、以上の結果から、移植の１週間前に１０６個のＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与することにより、長期の臓器受容を誘導する可能性が開かれると結論することが可能である。ＤＡラットに対しＬＥＷ由来ＴＡＩＣの上記に相当する前処置を行っても第三系（ｔｈｉｒｄ  ｓｔｒａｉｎ）のＣＡＰ心臓移植片に対する寛容が誘導されないので、寛容の誘導はドナー特異的である。同系ＬＥＷ＞ＬＥＷスキームでは、ＴＡＩＣをさらに投与しても、レシピエント動物の生存にも移植片の生存にも影響を及ぼさない。
【０１２４】
図２Ｂは、ＤＡレシピエントラットの腹部内へ異所性移植を行った後の術後日数（ＰＯＤ）１５０日目のＬＥＷ異種移植片の組織学的評価を示したものである。このレシピエントラットには、移植の７日前に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣを前処置した。この移植片は、レシピエント・ラットから摘出した（ＰＯＤ）１５０日目まで、十分に機能（心臓が強く鼓動）していた。この組織調製物（×４０）では、心筋の形態は良好で、血管内皮組織は正常であり、急性および慢性の拒絶経過の徴候もなく、単核細胞のごくわずかな浸潤が認められるに過ぎなかった。
【０１２５】
また、これに関連して注目に値するのは、１年という長期にわたって、ＤＡレシピエントラットの胸腺に（ＬＥＷ−ＭＨＣクラスＩ特異的抗体Ｉ１．６９を用いる免疫組織化学的検出法により検出される）ドナー由来の細胞を検出することができたという事実である。図２Ｃは、１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣで前処置したＤＡラットの、ＰＯＤ  １５０日目に切除した胸腺の組織プレパラートを示したものである。このプレパラートは、ＬＥＷ−ＭＨＣクラスＩに特異的なモノクロナール抗体Ｉ１．６９で標識した。図から明らかなように、ＴＡＩＣを投与すると、ドナー由来ＭＨＣ抗原の成熟Ｔ細胞への提示が行われる胸腺のコロニー形成がもたらされるので、上記抗体で標識することができる小さな細胞巣をはっきりと認めることができる。
【０１２６】
（実施例４）
（レシピエントにおけるドナー由来修飾単球の検出）
当該ＤＡ動物においてＬＥＷ由来ＴＡＩＣの静注により混合（ｍｉｘｅｄ）キメラ現象が誘導されることが、本発明により誘導される寛容の原因とも考えることができる。従って、ＬＥＷ由来ＴＡＩＣの注射後、レシピエント動物の血中に５％超の細胞がフローサイトメトリー法により長期的に（＞４５日間）検出することができるかどうかを調べるための実験を行った。フローサイトメトリーは、従来技術において報告されている通りに実施した［Ｐｒｅｆｅｒ  Ｆ．Ｉ．、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｖｉｎ  ＲＢ、Ｂｈａｎ  ＡＫ、ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，ＲＴ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐ７２５−４４９（１９９４年）参照］。ＤＡレシピエント血中のＬＥＷドナー細胞の検出は、ＬＥＷ−ＭＨＣクラスＩ抗原を特異的に検出するモノクロナール抗体Ｉ１．６９を用いておこなった［フェンドリッヒ・Ｆほか（Ｆａｅｎｄｒｉｃｈ，Ｆ．ら）ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．）８、ｐ１７１−１７８（２００２年）を参照のこと］。１０６もしくは１０４個／ｋｇ×ＢＷのＴＡＩＣをそれぞれ投与した後の、実施例３に記載したＬＥＷ→ＤＡ移植の４例についてそのレシピエント動物の末梢血を用いて測定したキメラ現象に関するデータを図２Ｄに示した。
【０１２７】
免疫抑制に供されていない４匹のＤＡレシピエントラットにＬＥＷ由来ＴＡＩＣ（ラット１〜３には１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ラット４には１０４個／ｋｇ×ＢＷ）を注射すると、ラット１〜３では、ドナー由来の細胞によるものとすることができるキメラ現象がＤＡレシピエント血中において長期に（６０〜８０日間）認められた。ドナー由来の細胞の検出は、ＬＥＷ−ＭＨＣクラスＩ特異的抗体Ｉ１．６９（ＬＥＷ系ラットのＭＨＣクラスＩ陽性細胞にのみ結合し、ＤＡ系のラットの細胞と交差反応しないモノクロナール抗体）を用いるサイトメトリー測定法により行った。ほぼ全ての末梢血細胞が細胞表面にＭＨＣクラスＩ抗原を発現するので、ＤＡラットの末梢血におけるドナー細胞の割合は、Ｉ１．６９を用いることによって極めて正確に測定することができる。図２０のグラフから明らかなように、４匹中３匹の動物において、１０％超の細胞が、ＴＡＩＣの静注後最初の６週間以内に、Ｉ１．６９により標識したドナー抗原を発現する。注射の６０日後では、これらのＤＡラットの末梢血におけるキメラ現象のこの割合は、大きく減少し、１００日目には完全に消失する。しかしながら、この一過性のキメラ現象は、（１００日後の）ドナー・キメラ現象の欠如にもかかわらず、もはや拒絶されない倍の期間後（即ち、ＴＡＩＣ注射の７日後）に移植したＬＥＷの心臓の移植片生存と密接な関連がある（実施例において、ラット１〜３）。一方、１０４個／ｋｇ×ＢＷの細胞を投与することにより短期のキメラ現象を誘導しても（ラット４；＜２０日間）、移植心臓の長期的な移植片受容は確保されない。
【０１２８】
（実施例５：移植後のドナー由来細胞の投与）
次いで、死体（遺体）の臓器提供の臨床例についての評価を実施し、ＴＡＩＣの術後投与がレシピエントにおいて移植臓器の前記に相当する長期的な受容をどの程度誘導することができるかを決定した。このために、ＬＥＷ→ＤＡラット近交系モデルにおいて異所性心臓移植を実施した。このＤＡレシピエント・ラットに対しては、移植後０、１、２および３日目の４回、サイクロスポリンＡ（ＣＳＡ）の５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷを静脈投与した。７日目に、このＤＡレシピエント・ラットの尾静脈から１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣを静脈投与した。以下の実験群は対照として用いた（ｎ＝６〜１０）。
【０１２９】
１．ＬＥＷ  →  ＤＡ；投与せず；
２．ＬＥＷ  →  ＤＡ；０、１、２および３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与
３．ＬＥＷ  →  ＤＡ；０、１、２および３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与、および７日目に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣ、
ｉ．ｖ．投与
４．ＬＥＷ  →  ＤＡ；７日目に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣ、ｉ．ｖ．投与
５．ＣＡＰ  →  ＤＡ；０、１、２および３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与、および７日目に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣ、
ｉ．ｖ．投与
ＤＡレシピエント・ラットに対しＰＯＤ（術後日数）７日目に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣを術後静脈内投与すると、０〜３日目に４回のＣＳＡ（５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．）初期投与を行っていた場合、長期的な寛容がもたらされた。ＰＯＤ７日目（術後日数）の１０６個ＴＡＩＣ初期投与だけでは６例中１例で急性の拒絶が防止されるに過ぎないので、ＣＳＡの初期投与は必要である。この場合に選択したＣＳＡの用量は、このＣＳＡ単独投与では移植片の生存が延長されることはあっても長期にわたる受容は誘導されないので、治療量以下の効果を有するに過ぎない。ＤＡラットに対するＬＥＷ由来ＴＡＩＣの前記に相当する投与ではＣＡＰ−第三系（ｔｈｉｒｄ−ｓｔｒａｉｎ）心臓移植片に対する寛容が得られないので、この移植片受容の誘導はドナー特異的である。
【０１３０】
図３に示したように、実験群１の心臓は７．０±０．８日後、急性に拒絶された。群３の心臓は６例中５例で１５０日間を超えて受容された。ラットの系では、近交系ラットの平均推定寿命が２年位に過ぎないので、１００日間を超えて臓器が受容されることは長期の受容と考えられる。単にＴＡＩＣ（１０６個）を術後投与しただけでは、６例中１例で急性の拒絶が防止できたに過ぎず、２２．６±３１．６日後には心臓の拍動が止まった（群４）。ＣＡＰの心臓を用いた第三系の対照群においても、第三系心臓がやはり７．４±２．２日後、急性に拒絶されたので、移植片受容誘導の特異性が示された。また、以上の結果から、さらにＴＡＩＣを投与しても、ＣＡＰの心臓に対する急性拒絶を防止しなかった一般的な免疫抑制が生じることはあり得ないことも明らかである。
【０１３１】
（実施例６：ＴＡＩＣにより誘導される長期的受容の臓器特異性に関する検討）
ＴＡＩＣが、心臓移植片のみについて、ドナー抗原に対するレシピエントの同種特異的免疫反応に対して防御効果を示す可能性を排除するために、強い拒絶を示すＤＡ→ＬＥＷラット近交系の下記の実験群（ｎ＝６）において以下の臓器を移植した：
１．ＤＡ（腎臓）    →  ＬＥＷ；投与せず
２．ＤＡ（腎臓）    →  ＬＥＷ；移植７日前および１日前に１０６個のＤＡ由来
ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与
３．ＬＥＷ（腎臓）  →  ＬＥＷ；投与せず
４．ＤＡ（肝臓）    →  ＬＥＷ；投与せず
５．ＤＡ（肝臓）    →  ＬＥＷ；移植７日前および１日前に１０６個のＤＡ由来
ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与
６．ＬＥＷ（肝臓）  →  ＬＥＷ；投与せず
７．ＤＡ（皮膚）    →  ＬＥＷ；投与せず
８．ＤＡ（皮膚）    →  ＬＥＷ；移植７日前および１日前に１０６個のＤＡ由来
ＴＡＩＣをｉ．ｖ．投与
９．ＬＥＷ（皮膚）  →  ＬＥＷ；投与せず
図４Ａ〜Ｃに示したカプラン−マイヤー・プロットから明らかなように、腎臓の６例中６例、肝臓の６例中５例および皮膚移植片の６例中５例は、ＬＥＷレシピエント・ラットにより長期（＞１５０日間）受容された。同系臓器移植は全て、合併症を生じずにこの手法を遂行する対照として用い、制限なくドナー・ラットにより受容された（生存曲線には示されていない）。従って、また、これらの実験スキームから明らかなように、２×１０６個のＴＡＩＣを静脈内に前注射すると、移植臓器の８０％超に対して長期の臓器受容が誘導される。
【０１３２】
次いで、上記の腎臓、肝臓および皮膚の移植片の移植においてＴＡＩＣを前投与した場合としなかった場合とでこれらの移植片を組織学的に比較した。図４Ｄから明らかなように、１０６個／ｋｇ体重のＴＡＩＣを移植の７日前と１日前の２回静注することによって移植腎臓の形態は無傷であることが分かるが（対照腎臓および同系移植片ＬＥＷ→ＬＥＷと比較されたい）、非投与異種対照群ＤＡ→ＬＥＷでは、（術後１４日目に）間隙に移植片の浸潤をはっきりと認めることができる。ＴＡＩＣを前投与せずにＰＯＤ１２日に完全に拒絶されていた（ＴＡＩＣ非投与のＤＡ→ＬＥＷ）同種肝臓移植片（図４Ｅ）も同様な様相を示すが、ＴＡＩＣを前投与すると、肝臓移植片は、同系移植片と比較しても完全に均質で無傷の様相を呈することが可能になる。また、同種皮膚移植片（ＤＡ）も合併症もなく修復する（同系ＬＥＷ移植片と比較参照）が、同時に移植したＣＡＰ第三系移植片は、早くも術後１２日目に急性の拒絶を受けた。ＬＥＷレシピエント・ラットに対し７日前および１日前にＤＡ由来ＴＡＩＣを前投与すると、ＤＡ移植片は受容されるが、０日目に同時に移植したＣＡＰの皮膚移植片は急性に拒絶される（図４Ｆ）ので、上記の例はＴＡＩＣにより誘導される寛容の特異性を立証するものである。
【０１３３】
（実施例７Ａ：ＴＡＩＣにより誘導される長期臓器受容のハロタイプ特異性に関する検討）
ＴＡＩＣが、選択されたラット近交系の組合せＬＥＷ→ＤＡにおいてのみ長期の臓器受容を誘導する可能性を排除するために、以下の別の近交系の組合せについて、異所性心臓移植片モデル（ｎ＝６）を用いて検討した。このために、特に、近交系ＢＮ［ＲＴ１．ｎ］（本発明との関連では「ＢＮ」と称する）も用いた。
【０１３４】
１．ＤＡ  →  ＬＥＷ；  投与せず
２．ＤＡ  →  ＬＥＷ；  術後０、１、２、３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与ならびに術後７および１０日目にＤＡ由来
ＴＡＩＣを１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
３．ＣＡＰ  →  ＬＥＷ；  投与せず
４．ＣＡＰ  →  ＬＥＷ；  術後０、１、２、３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与ならびに術後７および１０日目にＣＡＰ由来
ＴＡＩＣを１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
５．ＢＮ    →  ＬＥＷ；  投与せず
６．ＢＮ    →  ＬＥＷ；  術後０、１、２、３日目にＣＳＡ、５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与ならびに術後７および１０日目にＢＮ由来
ＴＡＩＣを１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
ラット近交系モデルで知られている最も強い拒絶反応を伴ういわゆる「高レスポンダ」の組合せ（ＤＡ→ＬＥＷ）でも、１０６個のＴＡＩＣを術後に１回ｉ．ｖ．投与することでは長期の受容を達成できないことは、すでに予備的な実験で分かっていた。従って、レシピエント体内のＴＡＩＣの存在量を、これを２回投与することによって増加させる試みを行った。図５Ａに示したこれに相当する生存曲線から明らかなように、ＴＡＩＣを術後７および１０日目の２回投与すると、実験群２では６例中４例で、群４では６例中５例で長期の臓器受容が認められた。ＢＮ→ＬＥＷ系の組合せでは、移植臓器は全て、急性拒絶を示すことなく長期生存した。移植心臓が長期（＞１５０日間）受容された全ての例のレシピエント・ラットにおいて、ＴＡＩＣ投与後の最初の２０〜４５日間に混合キメラ現象を検出することができた。しかしながら、早期の臓器不全は、常にレシピエントの末梢血におけるドナー細胞の欠如を伴った。以上のデータから、ＴＡＩＣのｉ．ｖ．投与では、この細胞が、少なくとも２１日間検出することができる混合ドナー・キメラ現象を誘導する場合にのみ、長期の臓器受容がもたらされると結論することができる。また、このことは、図２Ｄに示した実験結果を裏付けるものである。
【０１３５】
レシピエント動物に対して７および１０日目にＴＡＩＣをｋｇ体重当たり１０６個術後静脈内投与することによって、さらにＣＳＡを４回初期投与する場合には、３つの近交系の組合せ全てにおいて８０％を超える例で長期の寛容を誘導することが可能であった。
【０１３６】
（実施例７Ｂ：インビボ寛容誘導に対するＭ−ＣＳＦ処理単球のγ−ＩＦＮによる賦活化の意義に関する検討）
寛容発生に対するＭ−ＣＳＦ処理血液単球のγ−インターフェロンによるさらなる賦活化の効果をインビボでより詳細に特徴付けることができるように、ＬＥＷ→ＤＡラット近交系モデルを用い、以下の実験群について異所性心臓移植を検討した（ｎ＝６例／群）：
１．ＬＥＷ  →  ＤＡ；  心臓移植の７日前にＬＥＷ由来血液単球（培養しなかった単
球）を１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
２．ＬＥＷ  →  ＤＡ；  心臓移植の７日前に（Ｍ−ＣＳＦで処理した）ＬＥＷ由来血
液単球を１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
３．ＬＥＷ  →  ＤＡ；  心臓移植の７日前に（γ−ＩＦＮで賦活化した）ＬＥＷ由来
血液単球を１０６個／ｋｇ×ＢＷ、ｉ．ｖ．投与
４．ＬＥＷ  →  ＤＡ；  心臓移植の７日前に（Ｍ−ＣＳＦ処理およびγ−ＩＦＮ賦活
化を行った）ＬＥＷ由来血液単球を１０６個／ｋｇ×ＢＷ、
ｉ．ｖ．投与
図５Ｂのカプラン−マイヤー生存曲線に示されるように、ＤＡドナー・ラットにおいて、培養しなかった新鮮なＬＥＷ由来血液単球を心臓移植の７日前に静脈内投与しても、ＬＥＷ心臓に対する急性異種移植片拒絶を防止することができなかった。この実験群の移植片は平均値（±ＳＤ）として７．８±０．８日後に拒絶された。しかしながら、Ｍ−ＣＳＦと６日間培養した単球を前投与した場合では、臓器の生存期間は有意に延長され、この実験群の拒絶は平均３５±５１．５日後になってやっと認められた。単にＭ−ＣＳＦを含まないＲＰＭＩ培地で４８時間γ−ＩＦＮにより新鮮な血液単球を賦活化しただけでは、心臓移植片の急性拒絶を防止することができず、この心臓は平均７．８±１．２日後に拍動を停止した。新鮮血液単球を６日間Ｍ−ＣＳＦで処理し、この細胞をさらにγ−ＩＦＮで４８時間（５および６日目に）賦活化した場合にのみ、移植片の６例中４例で長期（＞１５０日間）の臓器寛容がもたらされた。以上の結果から明らかなように、インビボにおいて寛容を形成させるには、Ｍ−ＣＳＦで処理した単球をさらにγ−ＩＦＮで賦活化することが決定的に重要である。
【０１３７】
（実施例８）
（ＴＡＩＣにより誘導される長期臓器受容の種特異性に関する検討）
ＴＡＩＣがラットという選ばれた動物種においてのみ、長期臓器受容を効果的に誘導するという可能性を排除するために、実施例２に詳述した方法と同様にしてドナーのブタから単球起源の細胞を単離し、これを用いて、１０００単位／１０ｍｌのγ−ＩＦＮを２４時間培養培地に加えることにより賦活化を行った。次に、ヒトに匹敵する臓器拒絶能を有する「ＳＬＡ不一致ミニブタ」を用いた左側肺移植のモデルにおいて、急性拒絶を抑制するＴＡＩＣの有効性についての検討を実施した。この場合、ドナー・ブタの左肺を切除し、これを遺伝的に異なるレシピエント・ブタへ同所性に（即ち、レシピエント・ブタから左肺を切除した後、その左胸腔内に）移植した。肺の切除時には、同時にドナー血を５００ｍｌ採取し、これをこのブタの単球由来ＴＡＩＣを調製するのに用いた。
【０１３８】
ドナー動物は全て体重が３０〜３５ｋｇであった。
【０１３９】
このブタでは以下の実験群を設定した（ｎ＝４）：
１．５ｇ／日のＣＳＡ、５０ｍｇ／日のアザチオプリン、２５ｍｇ／日のメチルプレドニゾロンを計２８日間
２．群１の場合に加えて、ドナー・ブタの骨髄細胞（ＢＭ）１０８個／ｋｇ×ＢＷレシピエント・ブタ、および４．５Ｇｙのレシピエント・ブタ全身照射（ＷＢＩ）
３．群１の場合に加えて、肺移植後の術後７および１０日目にドナー・ブタ由来ＴＡＩＣ  １０６個／ｋｇ×ＢＷ。
【０１４０】
図６Ａに示されるように、群１では、肺移植片の拒絶は、免疫抑制終了後、平均５０．３±９．９日目に起こった。一方、群２において、臓器は、１０２．３±８１．０日後に拒絶された。３剤による免疫抑制と２回繰り返すＴＡＩＣ投与とを併用すると、この臓器の生存期間は２９２±１３５．５日間まで延長され、４匹の動物のうち３匹ではその臓器の長期臓器受容（＞３５０日間）が認められた。群３では全例においてレシピエント血液に混合ドナー・キメラ現象が＞２１日間観察されたが、群１および２の動物では６〜８日間の短期間のみの混合キメラ現象を示した。図６Ｂは、実験群１のブタの肺移植片（ＰＯＤ４１）および群３のＴＡＩＣで処置されたブタの肺移植片（移植後５５日目；Ｂ）を示す。実験群１のブタの肺移植の拒絶を示すものとして、心臓の輪郭周囲での、左胸壁に対する投影において、透明性の目に見える低下（陰影）を認めることができるが、ＴＡＩＣを投与した動物の胸部Ｘ線写真では、心臓の輪郭に対して十分区別できるが、Ｘ線では見分けが付きにくい肺および移植片所見がそれぞれ得られる。
【０１４１】
（実施例９）
（ＴＡＩＣに対する抗体ＧＭ−７の結合）
このモノクロナール抗体ＧＭ−７を、実施例２に記載した方法により調製したヒトＴＡＩＣでマウスを免疫することによって作製した。この抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、「ドイツ微生物保存施設（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）」に受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２で寄託された。以下に報告する結果から、本発明によりＭ−ＣＳＦでの６日間のエクスジッツ（ｅｘ  ｓｉｔｕ）修飾に供し、２日間γ−ＩＦＮで賦活化したＣＤ１４＋細胞にのみ発現される抗原に対して、上記抗体は特異的に結合することが分かる。
【０１４２】
図１は、インビトロで修飾後の、即ち、ＴＡＩＣへ転換後の単球細胞に対するＧＭ−７の結合能をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。バフィコートから直接得たＣＤ１４陽性単球は抗体ＧＭ−７に結合しないことが分かる（灰色の陰影部分が抗体対照に相当する）。これに対して、この単球の一部は、Ｍ−ＣＳＦ溶液中で培養してγ−ＩＦＮで賦活化した後に、抗原を発現し、この抗原はモノクロナール抗体ＧＭ−７によって認識される。この転換した単球を実施例２に記載した方法により培養した後、その約８０％はモノクロナール抗体ＧＭ−７に結合することができる。
【０１４３】
さらなる実験では、リンパ球混合培養物（ＭＬＣ）においてＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞の抑制活性をＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞と比較した。ＭＬＣを、カーニック・Ｊ．Ｔ．（Ｋｕｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｔ．）、「細胞アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｓｓａｙｓ）」ダイアグノスティック・イムノパソロジー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、［コルビン・Ｒ．Ｂ．（Ｃｏｌｖｉｎ  Ｒ．Ｂ．）、バーン・Ａ．Ｋ．（Ｂｈａｎ  Ａ．Ｋ．）、マッククラスキー・Ｒ．Ｕ．（ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｒ．Ｕ．）編、ラーベンプレス社（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）ニューヨーク、ｐ７５１−７７１（１９９４年）］に記載されている方法により実施した。
【０１４４】
この例では、ＴＡＩＣは個体Ｂに由来するものである。図７に示されるように、ＧＭ−７陽性ＴＡＩＣとＧＭ−７陰性ＴＡＩＣとの抑制活性には有意な差が存在する。Ｍ−ＣＳＦによる６日間の処理およびγ−ＩＦＮによる２日間の賦活化の後にＴＡＩＣ集団が得たあるＧＭ−７陽性フラクションのみが、Ｂの細胞による賦活化後の個体Ａのレスポンダ細胞のＴ細胞増殖活性に対して有意な抑制効果を示す。
【０１４５】
以上のデータから、モノクロナール抗体ＧＭ−７が利用可能なことにより元の単球のＭ−ＣＳＦとの培養およびγ−ＩＦＮによる賦活化後に得られるＴＡＩＣ集団から、臨床目的で、抑制活性を最適化した細胞集団を単離することができることが分かる。
【０１４６】
（実施例１０）
（ＴＡＩＣの免疫抑制活性に対するＩＤＯ阻害剤１−メチル−トリプトファンの影響の測定）
酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）が、「Ｍｏ」および「Ｍｏ＋Ｌｙ」構成（ｓｅｔ  ｕｐ）（実施例１１参照）において形成されるＴＡＩＣの抑制活性に影響を与えるかどうかを明らかにするために、１−ＭＴの存在および非存在下で、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）賦活化Ｔ細胞との種々のリンパ球混合培養（ＭＬＣ）を設定した。
【０１４７】
これらのリンパ球混合培養では、５０，０００個のリンパ球を２μｇのＰＨＡと共に９６ウェルプレートのウェルに移した後、１４４時間にわたって増殖させた（「ＰｈａＬｙ」と称する）。ＰＨＡを加えない培地で単独で培養したリンパ球を別の対照として用いた（「Ｌｙ」と称する）。
【０１４８】
これらの異なる共培養液におけるＰＨＡ賦活化リンパ球の増殖を測定するために、以下の４つの構成を用い、検討した：
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」；
ＰＨＡ賦活化リンパ球およびＴＡＩＣ［実施例１１による構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの細胞１０５個］。
【０１４９】
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」＋１−ＭＴ；
２μｍｏｌの１−ＭＴの存在下、ＰＨＡ賦活化リンパ球およびＴＡＩＣ［実施例１１による構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの細胞１０５個］。
【０１５０】
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」；
ＰＨＡ賦活化リンパ球およびＴＡＩＣ［実施例１１による構成「Ｍｏ」からの細胞１０５個］。
【０１５１】
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」＋１−ＭＴ；
２μｍｏｌの１−ＭＴの存在下、ＰＨＡ賦活化リンパ球およびＴＡＩＣ［実施例１１による構成「Ｍｏ」からの細胞１０５個］。
【０１５２】
１４４時間培養した後、全ての対照もしくは共培養物を、さらに３［Ｈ］−チミジンの存在下で２４時間培養し（「パルス（ｐｕｌｓｅｄ）」）、その後、取り込まれた放射性標識チミジンの量をカウント毎分（ｃｐｍ）として測定した（図８参照）。この例では、測定された放射能の量は、ＤＮＡに取り込まれた標識チミジンの量の尺度であり、従って、リンパ球の増殖速度の尺度である。図８に報告した値は、３回の実験の３回の測定値の平均値およびそれぞれの標準偏差を表す。
【０１５３】
これらの結果から、ＰＨＡで賦活化しなかったリンパ球（「Ｌｙ」）は有意には増殖せず、観察された平均放射能は３６７ｃｐｍであることが示された（図８参照）。これに対して、２μｇのＰＨＡで賦活化した場合、リンパ球（「ＰｈａＬｙ」）の増殖速度は有意に増加し、測定された最大の取り込み量はこれらの試料の平均値として１８４５９ｃｐｍであった。
【０１５４】
リンパ球の培養液にＴＡＩＣを添加すると、実施例１１の構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの細胞を加えた場合、その増殖速度は明らかに大きく低下し（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」、測定値１４９８ｃｐｍ）、実施例１１の構成「Ｍｏ」からの細胞を加えた場合は、その低下の程度はより少なかった（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」、測定値３３６９ｃｐｍ）。
【０１５５】
リンパ球が賦活化された「Ｍｏ＋Ｌｙ」および「Ｍｏ」を含む構成に２μｍｏｌの１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）を加えた後に得られた結果から、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）はＴＡＩＣの抑制機能を相乗的に増強し、これによって、上記低下は、構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」からのＴＡＩＣでは（測定値２６７ｃｐｍ）、構成「Ｍｏ」からのＴＡＩＣの場合（測定値３９０ｃｐｍ）よりも大きいことが明らかとなった。
【０１５６】
（実施例１１）
（単球培養におけるＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の形成に対するリンパ球の影響）
ＴＡＩＣとして有効なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の形成に対する単球フラクション中に存在するリンパ球の影響について、２つの異なる構成を比較することにより決定した。
【０１５７】
第１の構成（以下、「Ｍｏ」と称する）の場合、最初に、実施例１に記載されるようにバフィコートの界面相から単球フラクションを採取した。次に、実施例２に記載されるように、Ｍ−ＣＳＦとともに培養工程にこの細胞を移した。この培養の開始時点から１時間以内に、組織培養フラスコの底部に付着した単球をそれぞれ１０ｍｌのＰＢＳで５回洗浄することにより、培養液に存在するリンパ球の量が＜５％（４．８±２．４％）まで減少し、これにより得られた濃縮単球（ＣＤ１４＋）の量は９０％超（９２±５．６％）であった。この構成内の別の細胞成分はＢリンパ球および顆粒球であった。
【０１５８】
また、第２の構成（以下、「Ｍｏ＋Ｌｙ」と称する）の細胞も、実施例１に記載されるように、単球フラクションとして「バフィコート」の界面相から採取した。しかしながら、構成「Ｍｏ」とは異なり、組織培養フラスコの底部に付着したこの細胞を、実施例２に記載されるように、培養段階の開始時から２４時間後に１回だけ洗浄した。その結果、４５±５．３％のＣＤ１４＋単球および２３．５±８．９％のＣＤ２＋リンパ球からなる細胞集団が得られた。また、構成「Ｍｏ」の場合と同様に、この構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」にはリンパ球および顆粒球も存在した。
【０１５９】
３つの実験構成のそれぞれについて、構成当たりの細胞集団全体の各細胞型の量の決定をフローサイトメトリーにより実施した（図９参照）。その結果を、標準偏差を含む平均値として報告する。
【０１６０】
培養開始時のＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞については、構成「Ｍｏ」でも構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」でも決定することはできない（ｄ  ０＝０日目）。５日間の培養期間後、実験を終了し、実施例２に記載されるように組織培養フラスコの底部から細胞を脱着させた後、ＦＡＣＳ分析によって細胞の性質を決定した。これらの構成ではＣＤ１４＋細胞の相対量は減少し、構成「Ｍｏ」では９２％から４２％、構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」では４５％から２８％となることが分かった。リンパ球は単球より速やかに増殖するように思われ、リンパ球の相対量は構成「Ｍｏ」では４．８％から６９．８％に、構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」では２３．５％から５０．６％に増加した。培養の間、両培養液にはＴＡＩＣとして有効なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞が形成される。これに関連して、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞は、構成「Ｍｏ」ではわずか７．２±３．２％であるのに対して構成「Ｍｏ＋Ｌｙ」では３２．０±５．３％と有意に増加するのが認められることは重要である。
【０１６１】
以上の結果から、細胞を精製して培養開始時の単球を９０％超の相対量にまで濃縮すると、ＴＡＩＣ集団内の免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の形成に悪影響があるが、実施例１および２に記載した方法によると、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の収率が有意に高くなることが分かる。
【０１６２】
（実施例１２：調節性Ｔ細胞の調製のための、ヒトＴＡＩＣおよび同種リンパ球のインビトロ共培養）
レシピエントにおいてＴＡＩＣが調節性Ｔ細胞、即ち、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の形成を誘導するかどうかを調べるために、ＴＡＩＣとリンパ球とのいくつかの異なるインビトロ培養を行い、これによりもたらされる調節性Ｔ細胞の形成について分析した。
【０１６３】
この目的のために、ドナーＡのＴＡＩＣをドナーＢのリンパ球と共にインビトロで直接または間接的に共培養した。直接共培養では（ドナーＡの）ＴＡＩＣと（ドナーＢの）リンパ球との直接的な細胞間接触が可能であったのに対し、間接共培養では膜（「セル・カルチャー・インサート」、細孔口径０．４μｍ、ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ）、製造番号３５３０９０）により培地の交換が可能であったが、２つの細胞集団の物理的な接触は阻止された。この直接もしくは間接共培養は、インキュベータ条件下、即ち、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で、好ましくは３〜５日間、より好ましくは４日間行う。
【０１６４】
培養後、両構成、およびＴＡＩＣもしくはリンパ球をそれぞれ単独で培養した対照において、それぞれの調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋）数を測定した。さらに、ＴＡＩＣを単独で培養した対照構成について、リンパ球混合培養物中最も顕著な抑制機能を有するＴＡＩＣ細胞集団の成分であるＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の数を測定した。
【０１６５】
全ての構成において、細胞の表面抗原をＦＡＣＳにより定量し、総細胞量中の各細胞集団の量を分析した。
【０１６６】
さらに、それぞれの細胞集団について、調節性Ｔ細胞により特異的に発現される３種の新規なマスター遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）の相対発現量をＰＣＲによって測定した（表参照）。Ｆｏｘｐ３は特異的な転写因子であり、これは調節性Ｔ細胞形成の制御遺伝子と考えられていて、この細胞によって特異的に発現される［ホリ・Ｓ．ほか（Ｈｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）、「転写因子Ｆｏｘｐ３による調節性Ｔ細胞形成の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３）」、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２９９、ｐ１０５７−１０６１（２００３年）参照］。
【０１６７】
ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋−Ｔ細胞の調節性機能を測定するためのマーカとして用いられる別の因子である（カトリー・Ｒ．ほか（Ｋｈａｔｔｒｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、「ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋−Ｔ調節性細胞におけるスカーフィンの本質的役割（Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｓｃｕｒｆｉｎ  ｉｎ  ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、オンライン出版、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ９０９（２００３年）；シミズ・Ｊ．ほか（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）、「ＧＩＴＲによるＣＤ２５＋／ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の賦活化は自己免疫寛容を妨害する（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２５＋／ＣＤ４＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＧＩＴＲ  ｂｒｅａｋｓ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」、ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、オンライン出版、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ７５９（２００３年）；コボルド・Ｓ．Ｐ．ほか（Ｃｏｂｂｏｌｄ，Ｓ．Ｐ．ｅｔａｌ．）、「末梢移植寛容の誘導および維持における調節性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」、トランスプランテーション・インターナショナル（Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．）１６（２）、ｐ６６−７５（２００３年）参照］。
【０１６８】
インテグリンαＥβ７は、上皮カテリン（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ）に結合し、調節性ＣＤ２５＋−Ｔ細胞の中の最も強力な亜集団のマーカとして用いることができるインテグリンである［レーマン・Ｊ．ほか（Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）、「インテグリンαＥβ７の発現によるＣＤ２５＋およびＣＤ２５−調節性Ｔ細胞の固有のサブセットの同定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＥβ７  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ＣＤ２５＋  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ＣＤ２５−  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」、ＰＮＡＳ、９９（２０），ｐ１３０３１−１３０３６（２００２年）参照］。
【０１６９】
Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７の発現の測定は、対照として２種の「ハウスキーピング遺伝子」ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンを用いる定量的ＰＣＲによって行った。即ち、一方では、測定値は互いに関連づけて設定し、ＣＤ１４＋／ＣＤ３−細胞について得られた値を１とすると共に、他方では、インビトロでＴＡＩＣにより生じた抑制の測定値およびＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ダブルポジティブ細胞の形成をそれぞれの遺伝子の発現率と関連づけるために、ＲＮＡの絶対量をμｇトータルＲＮＡ当たりのμｇで表した。定量的ＰＣＲには、当業者に公知の標準的な方法を用いた（ロッツパイヒ・Ｆ．（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．）、ゾーバス・Ｈ．（Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．）「バイオアナリティーク（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ）」スペクトルム・アカデミッシェル・フェアラーク社（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ）、ハイデルベルグ−ベルリン、１９９８年参照）。
【０１７０】
表は、直接共培養から得られるリンパ球の集団内では、ダブルポジティブ細胞ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋のパーセンテージは、それぞれ２．８％および２．６５％とほぼ等しい間接共培養もしくは対照から得られるＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量に比し、数倍の８．７％の値にまで増加することを示している。
【０１７１】
ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の亜集団は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞における発現に比し、調べた全てのマスター遺伝子からｍＲＮＡを最も高い相対量で発現する（表参照）。Ｆｏｘｐ３の発現量は約１０倍に増加する（３７対３．７５）が、ＣＴＬＡ−４の発現はさらに高い最大発現量に達する（４，６９９対０．３７６）。共培養時のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞における第３のマスター遺伝子インテグリンαＥβ７の発現量の増加は、ＣＴＬＡ−４の場合とほぼ同じ位高く、インテグリンαＥβ７ｍＲＮＡの絶対量は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞ではμｇトータルＲＮＡ当たり３．４×１０−１２μｇであるのに対し、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞では１．４×１０−９にまで増加する。
【０１７２】
間接共培養後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋亜集団におけるＦｏｘｐ３−ｍＲＮＡの相対量はわずか１０であり、相対量１５のＦｏｘｐ３−ｍＲＮＡを発現する対照のリンパ球による相対発現量とほぼ同じ位低い。
【０１７３】
対照のリンパ球により発現されたＣＴＬＡ−４−ｍＲＮＡの相対量は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋集団の場合の０．３７５およびＣＤ４＋／ＣＤ２５−集団の場合の０．１と同じ位低い。
【０１７４】
【表５】
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表：表面マーカＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ２５に基づく、直接および間接共培養後
の総細胞量中の特定細胞集団の量の測定、ならびにこれらの細胞集団における３種の
遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）のＲＮＡの相対発現
量および絶対量の測定。
【０１７５】
ＴＡＩＣ細胞のＣＤ１４＋／ＣＤ３＋亜集団におけるＣＴＬＡ−４発現は、Ｆｏｘｐ３の発現量と同様であり、また、他の全ての細胞集団の場合よりも有意に高かった。なお、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋亜集団では、Ｆｏｘｐ３発現量が相対値５０を示したのに対し、ＣＴＬＡ−４発現量はこれより多数倍高かった（相対値１２．５００）ことは注目に値する。
【０１７６】
ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３−亜集団ではインテグリンαＥβ７の発現は検出できなかったが、分析した他の２種の遺伝子の発現挙動と同様に、ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３＋亜集団のこのインテグリンの発現量は、μｇトータルＲＮＡ当たりのμｇＲＮＡの絶対値として測定した時、最大の値（３．４×１０９μｇ／μｇトータルＲＮＡ）に達した。
【０１７７】
単球由来ＴＡＩＣにおいて３種のリンパ球マーカＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７の発現量が、通常のリンパ球に比し有意に増加したことは、全く予想外であり、これまで単球もしくは単球由来細胞では認められていなかった。
【０１７８】
結論として、この実施例の上記に示した結果から以下のことが明らかになった。即ち、Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７の発現レベルがそれぞれの細胞の免疫調節性と相関するとの仮定から出発すると、ＴＡＩＣのＣＤ３＋／ＣＤ１４＋亜集団の抑制活性はこれらの遺伝子の高度の発現を伴うということが、本実施例から明らかとなった。これらのマーカがこれまでリンパ球に関してしか報告されておらず、単球由来の細胞では報告されていないことを考慮すると、以上のことはさらに驚くべきことである。
【０１７９】
さらに、ＴＡＩＣをリンパ球と直接共培養することにより、間接共培養およびリンパ球単独の培養の場合に比し、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量が有意に増加することが示された。このことは、インビボでも（即ち、患者においても）ＴＡＩＣの投与により調節性Ｔ細胞が形成されるとの仮説を裏付けるものである。こうした結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の既知の免疫調節機能、ならびにこの細胞のＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７のｍＲＮＡ含量が間接共培養したリンパ球もしくは対照リンパ球の場合よりも有意に高いという事実と符合している。
【０１８０】
（実施例１３：ＴＡＩＣとインビトロで共培養したリンパ球による移植片寛容のインビボ誘導）
実施例１２で示した結果および結論を、インビボ動物実験で確認を行った。実施例３、４、５、６および７で説明した方法とは異なり、寛容誘導のために、選ばれたＬＥＷ→ＤＡの近交系組合せの動物にＬＥＷ由来ＴＡＩＣを注射したのではなく、ドナーからの（ＬＥＷ）由来ＴＡＩＣと前もって５日間直接共培養したＤＡリンパ球、または対照として培地中で単独培養したＤＡリンパ球をこの実施例の動物に注射した。
【０１８１】
同種心臓移植の前に共培養した自家ＤＡリンパ球の投与を受けた動物は、ドナー特異的寛容を形成したのに対し、共培養しなかった未処置の対照ＤＡリンパ球の投与を受けた対照動物では、１０〜１４日以内に移植心臓に対し急性の拒絶を生じた。
【０１８２】
これらの結果は、ドナー・ＴＡＩＣとレシピエント・リンパ球との物理的な細胞間相互作用によって調節性Ｔ細胞の形成が誘導され、このＴ細胞がそれ自体でレシピエントの同系免疫系を修飾することにより潜在的に同種反応性のＴ細胞が抑制され、これにより臓器拒絶が防止されることを示している。
【０１８３】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１Ａ】本発明による細胞の修飾前（左側のグラフ）および修飾後（右側のグラフ）における元の単球細胞に対するＧＭ−７の結合能のフローサイトメトリーによる測定。ｘ軸は結合細胞数を示す。
【図１Ｂ】本発明による細胞の修飾前（左側のグラフ）および修飾後（右側のグラフ）における元の単球細胞に対するＧＭ−７の結合能のフローサイトメトリーによる測定。ｘ軸は結合細胞数を示す。
【図２Ａ】ラットモデルにおける、ドナー由来ＴＡＩＣの術前投与施行および非施行による異所性心臓移植後の心臓移植片のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝１０例／群）。
【図２Ｂ】術前７日目に１０６個のＬＥＷ由来ＴＡＩＣを投与したＤＡレシピエント・ラットにおける腹部内異所移植後ＰＯＤ（術後日数）１５０日のＬＥＷ同種移植片の組織プレパラート。拡大比率：４０。
【図２Ｃ】ＬＥＷ−ＭＨＣクラスＩ特異的モノクロナール抗体Ｉ１．６９での調製物の標識に続く、１０６個ＬＥＷ由来ＴＡＩＣ前処置ＤＡラットの胸腺の組織プレパラート。拡大比率：４０。
【図２Ｄ】ＬＥＷ由来ＴＡＩＣの注射（ラット１〜３では１０６個／ｋｇ×ＢＷ；ラット４では１０４個／ｋｇ×ＢＷ細胞）後の、免疫を抑制しなかった４匹のＤＡレシピエント・ラットにおけるドナー由来細胞のフローサイトメトリーによる検出。
【図３】ラットモデルにおける、４サイクルのシクロスポリンＡ（ＣＳＡ；５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ）の初期投与を併用したドナー由来ＴＡＩＣの術後投与施行および非施行による異所性心臓移植後の心臓移植片のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６〜１０例／群）。
【図４Ａ】それぞれドナー由来ＴＡＩＣの術前投与施行および非施行による異所性（ＡおよびＣ）もしくは同所性（Ｂ）移植後の心臓（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腎臓（Ｃ）移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６例／群）。
【図４Ｂ】それぞれドナー由来ＴＡＩＣの術前投与施行および非施行による異所性（ＡおよびＣ）もしくは同所性（Ｂ）移植後の心臓（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腎臓（Ｃ）移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６例／群）。
【図４Ｃ】それぞれドナー由来ＴＡＩＣの術前投与施行および非施行による異所性（ＡおよびＣ）もしくは同所性（Ｂ）移植後の心臓（Ａ）、肝臓（Ｂ）および腎臓（Ｃ）移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６例／群）。
【図４Ｄ】ＬＥＷレシピエント・ラットへの異所性移植後の腎臓（Ｄ）、肝臓（Ｅ）および皮膚（Ｆ）のＤＡ移植片の組織プレパラート。
【図４Ｅ】ＬＥＷレシピエント・ラットへの異所性移植後の腎臓（Ｄ）、肝臓（Ｅ）および皮膚（Ｆ）のＤＡ移植片の組織プレパラート。
【図４Ｆ】ＬＥＷレシピエント・ラットへの異所性移植後の腎臓（Ｄ）、肝臓（Ｅ）および皮膚（Ｆ）のＤＡ移植片の組織プレパラート。
【図５Ａ】ラットモデルにおける、４サイクルのＣＳＡ（５ｍｇ／ｋｇ×ＢＷ）の初期投与を併用したドナー由来ＴＡＩＣの術後投与施行および非施行による種々の組合せの近交系の異所性心臓移植後の心臓移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６例／群）。
【図５Ｂ】ＬＥＷドナー動物からの種々の処理を施した血液単球の投与７日後に異所性心臓移植を行った心臓移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝６例／群）。
【図６Ａ】ＣＳＡ、アザチオプリン（ＡＺＡ）およびステロイド（ＳＴＥ）の３剤併用により免疫を抑制したブタ（「非近交系ミニブタ」）において同所性左側肺移植を行った肺移植のカプラン−マイヤー生存曲線（ｎ＝４例／群）。
【図６Ｂ】ＰＯＤ（術後日数）４１日および５５日における２匹の片側左肺移植ブタ（「非近交系ミニブタ」）の胸部Ｘ線写真（前後像）。ＣＳＡ、ＡＺＡおよびステロイドの３剤併用による免疫抑制は、移植後２８日に中止した。
【図７】個体ＢのＣＤ１４＋単球（ＧＭ−７−：灰色カラム：ＧＭ−７＋黒色カラム）、ＭＨＣ不一致ドナーＡのレスポンダー細胞およびドナーＢの放射線照射細胞のリンパ球混合培養によるＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞とＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞の抑制活性の比較。
【図８】インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤（１−ＭＴ）を用いて２実験でプレインキュベートしたＰＨＡ賦活リンパ球（ＰｈａＬｙ）およびＴＡＩＣ（「Ｍｏ＋Ｌｙ」もしくは「Ｍｏ」）のリンパ球混合培養による、ＴＡＩＣの抑制活性に及ぼす１−ＭＴの影響の検討。
【図９】単球フラクション中のＣＤ１４＋単球とＣＤ２＋リンパ球の量およびＴＡＩＣとして有効なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の量のフローサイトメトリー測定による、免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の形成に及ぼす培養開始時の上記細胞精製による単球濃縮の影響の検討。
【図１０Ａ】ＴＡＩＣの注射前（左図）および注射後（右図）に手術後の患者の血中ＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定による、血液細胞のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＧＭ−７発現に及ぼすＴＡＩＣの影響の検討。
【図１０Ｂ】ＴＡＩＣの注射前（左図）および注射後（右図）に手術後の患者の血中ＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定による、血液細胞のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＧＭ−７発現に及ぼすＴＡＩＣの影響の検討。
【図１０Ｃ】ＴＡＩＣの注射前（左図）および注射後（右図）に手術後の患者の血中ＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定による、血液細胞のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＧＭ−７発現に及ぼすＴＡＩＣの影響の検討。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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2005532803.tif 000012
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月18日(2004.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）血液から単球を単離する工程、
ｂ）細胞増殖因子Ｍ−ＣＳＦを含む適切な培地中で該単球を増殖させる工程、
ｃ）γ−ＩＦＮを含む培地中で、工程ｂ）と同時に、もしくは工程ｂ）の後で該単球を培養する工程、および
ｄ）工程ｃ）において形成された移植片受容誘導細胞を、該培地から分離することにより該細胞を得る工程
を特徴とする単球由来の移植片受容誘導細胞を調製する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記単球がヒト由来であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１もしくは２に記載の方法であって、前記単球の次にリンパ球も単離物内に総細胞数を参照して少なくとも１０％の量で存在するような方法で、該単球を該血液から単離することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の方法であって、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２により産生される抗体に結合させることによって、工程ｃ）で形成され、もしくは工程ｄ）で得られる前記移植片受容誘導細胞を選択することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４に記載の方法であって、請求項１の工程ｃ）で形成されるか、もしくは請求項１の工程ｄ）で得られるか、または請求項４に記載の選択工程で得られる前記移植片受容誘導細胞の中で、その細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現している細胞を選択することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法であって、前記培地のＭ−ＣＳＦ濃度が１〜２０μｇ／ｌであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法であって、工程ｂ）の後に、前記単球をγ−ＩＦＮ含有培地で２４〜７２時間培養し、γ−ＩＦＮ存在下の培養が培養工程ｂ）の開始の３〜６日後に開始されるものとすることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記培地のγ−ＩＦＮ濃度が０．１〜２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法であって、工程ｂ）および工程ｃ）の合計培養期間が４〜８日間であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜８に記載の方法であって、請求項１の工程ｄ）の後、もしくは請求項４および５に記載の選択工程の後、前記細胞を適切な細胞培地またはＰＢＳもしくはＮａＣｌ溶液に懸濁することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記細胞を寒剤中に懸濁し、次いで深冷凍結することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記寒剤がウシ胎仔血清（ＦＣＳ）もしくはヒトＡＢ血清およびＤＭＳＯを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の方法のうちの任意の方法により得ることができる単球由来の移植片受容誘導細胞であって、該細胞は、その細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現することを特徴とする移植片受容誘導細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の移植片受容誘導細胞であって、これがヒト由来であることを特徴とする移植片受容誘導細胞。
【請求項１５】
適切な培地中に請求項１３もしくは１４に記載の移植片受容誘導細胞を含有する細胞調製物。
【請求項１６】
単球由来の移植片誘導細胞を含有する医薬配合物であって、該移植片誘導細胞が、その細胞表面に抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を同時発現することを特徴とする医薬配合物。
【請求項１７】
請求項１３または１４に記載の移植片受容誘導細胞あるいは請求項１５に記載の細胞調製物を含有する医薬配合物。
【請求項１８】
移植片拒絶反応を抑制するための医薬配合物を作製するための、請求項１３または１４に記載の移植片受容誘導細胞あるいは請求項１５に記載の細胞調製物の使用。
【請求項１９】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調節性Ｔリンパ球を産生／または増殖させるための請求項１３または１４に記載の移植片受容誘導細胞あるいは請求項１５に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用であって、前記調節性Ｔリンパ球がその細胞表面に抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現する使用。
【請求項２１】
ａ）請求項１３または１４に記載の移植片受容誘導細胞あるいは請求項１５に記載の細胞調製物をＴリンパ球調製物と共培養する工程、および
ｂ）該培地から任意選択的に調節性Ｔリンパ球を得る工程
を特徴とする、調節性Ｔリンパ球を産生および／または増殖させる方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記調節性Ｔリンパ球がその細胞表面に抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を同時発現することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１もしくは２２に記載の方法であって、前記調節性Ｔリンパ球をＦＡＣＳソーティングにより前記培地から得ることを特徴とする方法。
【請求項２４】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２。
【請求項２５】
前記ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ２５４２によって産生される抗体。
【請求項２６】
移植片受容誘導細胞の検出および／または選択のための請求項２１に記載の抗体の使用。
【国際調査報告】
2005532803.tif 000032
2005532803.tif 000033
2005532803.tif 000034