(57)【要約】本発明は、TGF-βの発現を特異的に阻害する精製された共有結合閉環アンチセンス分子を提供するものである。本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子（あらゆる配列に対する）、およびアンチセンス分子の導入に用いられるtatおよびtat様ペプチドを特許請求するものである。
2005529581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-βの発現を特異的に阻害する精製共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項２】
該分子は、ステム構造によって分けられる少なくとも２つのループをもち、少なくとも１つのループはTGF-βの発現を阻害する標的アンチセンスの配列を含む請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項３】
TGF-βがTGF-β1である請求項２に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項４】
SEQ ID NO:1と実質的に同一である配列を含む請求項３に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項５】
実質的に双方が相補的であり、5'あるいは3'末端あるいはその両方をもち、ステム-ループ構造を持つ少なくとも二つの直線アンチセンス分子を共にリゲートさせ、その結果、共有結合閉環アンチセンス分子が作られる請求項２に記載の化合物を調製する方法、
【請求項６】
直線アンチセンス分子が、同一の標的核酸あるいは異なる標的核酸に対して特異的である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子とTGF-β発現細胞を含むサンプルを接触することを含むTGF-βの発現阻害方法。
【請求項８】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を、その必要に応じて対照に投与することを含むTGF-βの発現によって引き起こされた状態の処置方法。
【請求項９】
該状態が、繊維症である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該繊維症が、腎臓におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該繊維症は尿細管間質性の繊維症である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該繊維症は、肝臓におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該繊維症は、肺におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を含む組成物を、その必要に応じて対照に投与することを含む、一側性(unilateral)尿管閉塞症の処置方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を、その必要に応じて対照に投与することを、損傷部位における細胞外マトリックスタンパク質の蓄積防止方法。
【請求項１６】
共有結合閉環アンチセンス分子、tat若しくはtat様ペプチド及び担体組成物を含む組成物。
【請求項１７】
該担体が、リポソームである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
該共有結合閉環アンチセンス分子が、TGF-βを標的とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞と、該共有結合閉環アンチセンス分子、tat若しくはtat様ペプチド及び担体組成物を接触させることを含む該共有結合閉環アンチセンス分子の細胞への運搬方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGF-βを標的とする共有結合閉環アンチセンス分子を使用するバイオテクノロジーおよび特にアンチセンス療法の分野に関するものである。本発明は、また細胞にアンチセンス分子を導入する方法にも関するものである。本発明は、さらに、TGF-βが産生されることによって引き起こされる疾病を治療する方法にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスタンパク(ECM)の蓄積によって特徴づけられる腎臓の尿細管間質性の繊維症は、進行性の腎疾患の共通の結果としてみられる(Kuncio et al., Kidney Int. 39, 550-556(1991))。一側性の尿管の閉塞(UUO)を伴う腎臓閉塞は、尿細管間質性繊維症による腎臓の傷害を起こす動物モデルのシステムとしてよく確立されている(Klahr et al., Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿管の結紮による機械的な障害は、水腎症、腎実質の欠失、および尿細管の肥大、萎縮およびアポトーシスのような変化を引き起こす(Gonzalez-Avila et al., Pathobiology 66, 196-204(1998); Truong et al., Kidney Int. 50, 200-207(1996))。尿細管間質性の繊維症の進行の基礎的なメカニズムは完全には解明されていないが、UUOを伴う腎臓中の多数のサイトカインが尿細管間質性の繊維症を仲介するものとされている。これらのサイトカインの中で、形質転換成長因子-β1(TGF-β1)が、腎臓の繊維症で重要な働きをしていることが、糸球体硬化症および尿細管間質性の繊維症によって証拠づけられるている(Schiffer et al., J. Clin. Invest. 108, 807-816(2001); Wang et al., Kidney Int. 60, 96-105(2001))。TGF-β1は、正常な修復のための組織損傷に応答するECMの蓄積に関係し、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよび糖タンパク質のようなECMの異常な過剰生産による繊維症変化に関わっている(Branton et al., Microbes Infect. 1, 1349-1365(1999); Okuda et al., J. Clin. Invest. 86, 453-462(1990))。TGF-β1は、プロテアーゼ阻害剤の合成を促進することにより、また、マトリックス分解プロテアーゼの合成を抑制することにより、新たに合成されたマトリックスタンパクの分解を阻害する。したがって、TGF-β1の産生あるいは機能を効果的に遮断することは、いくつかの報告から提示されているとおり、繊維化する条件を妨げることが有効な方法であると考えられる(Border et al., Nature 360, 361-364(1992); Akagi et al., Kidney Int. 50, 148-155(1996); Isaka et al., Nat. Med. 2, 418-423(1996); Isaka et al., Kidney Int. 55, 465-475(1999))。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotides、以下「アンチセンスオリゴ」と称する)は、塩基配列特異的な遺伝子発現の減少により、遺伝子産物に関する機能的な研究において有用であった。しかしながら、オリゴヌクレオチドの使用には、ヌクレアーゼに対する不安定性、配列非特異的および細胞の取り込み効率の低さのようないくつかの重大な問題がまだ残っている。ホスホロチオネート(phosphorothioate) オリゴヌクレオチドやメチルホスホネート(methylphosphonate) オリゴヌクレオチドのような様々な化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために開発された。しかしながら、それぞれ修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、配列特異性の欠如や、RNaseHの非感受性、および部分トロンボプラスチン時間 (partial thrombosis time)の延長をきたすなど、自身が抱える問題もある。さらに、再利用加水分解修飾ヌクレオチドが、ゲノムDNAの修復や複製の際にゲノムに取り込まれてしまい、ゲノムDNAの変異を引き起こす原因となる恐れがあった。我々が以前に報告した、共有結合閉環構造をしているリボン型のアンチセンス(ribbon-type antisense、以下「RiAS」と称する)-オリゴは、非常に安定で、標的c-myb mRNAの特異的な切断において、効果的な働きを示した。そして、他の修飾されたアンチセンスオリゴに関連してみられた問題は殆ど持っていなかった (Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); and PCT/KR00/00305)。これらは、参照によりこれらの全体に組み入れられる。
【０００４】
米国特許第5,683,874号において、共有結合閉環タイプの核酸配列を形成するには、平行あるいは逆平行な核酸配列が三重らせん構造を形成するループの反対側に存在することが必要であることを開示している。しかしながら、そのような構造は、主としてゲノムのプロモーター領域に結合するのには有用であるが、RNaseHによる標的分解のための相補的mRNAの結合には有用でない。このように、米国特許第5,683,874号では、そのような平行および逆平行の配列を伴っているあるいは伴っていない、共有結合閉環アンチセンス構造は、標的の核酸の発現を効果的に切断することを開示又は示唆もされていない。
【０００５】
アンチセンスオリゴの細胞への取り込みは、リポソームと複合体を形成することにより、増強することができる。リポソームは低毒性、免疫原性の欠如および生産の単純性のようないくつかの長所を持つが、リポソームは比較的細胞への取り込み効率が低いことが示されている。ヒト免疫不全ウィルス (HIV)のtatポリペプチドのトランスダクションドメイン (transduction domain)を融合させたタンパクは、効率良くマウスの全ての組織、脳を含めても導入されることが示されている (Schwarze et al., Science 285, 1569-1572(1999))。リポソームの表面に共有結合でtatペプチドを結合させると、細胞内への輸送が増加する (Torchilin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8786-8791(2001))。さらに、tatタンパクの小さな領域である、２つのリジンと６つのアルギニンを含む49から57残基が、核内の局在化する性質をもつ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アンチセンス分子を効率よく導入するためのシステムとともに、特異的で安全で効果的な治療のためのアンチセンス分子をこれからも作る必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記の必要としている事項を満たしている。
【０００８】
発明の一つの特徴として、TGF-β1を特異的に標的とするRiAS分子 (TGF-β1 RiAS)に関する。もう一つの発明の特徴は、TGF-β1 RiASが腎臓での繊維症および組織の損傷を防ぐことが出来るかをアンチセンス活性としてテストし、設計したことである。さらに一つの本発明の実施形態として、アンチセンス分子を導入するための混合物の細胞への取り込み効率の改良に関する。特に、TGF-β1 RiASをtat様ペプチドと混合し、それからリポソームとの複合体を形成させることである。TGF-β1 RiASとtatあるいはtat様ペプチドとカチオンリポソームの三者複合体はTGF-βの発現を阻害するのに効果的であること、そして、UUOを伴った腎臓の組織の整合性を保つことがわかった。
【０００９】
本発明は、TGF-βの発現を特異的に阻害する精製共有結合閉環アンチセンス分子に関する。共有結合閉環アンチセンス分子は、ステム構造により分離した少なくとも２つのループを持っていてもよく、１つのループは、TGF-β発現を阻害する標的アンチセンス配列を含むでいる。この場合、TGF-βは特にTGF-β1でも良い。
【００１０】
上述した共有結合閉環アンチセンス分子は、SEQ ID NO:1と本質的に相同配列を含んでいても良い。
【００１１】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子形成のために互いに実質的に相同的な5'側、3'側のどちらか一方あるいは両端を持つステム-ループ構造による少なくとも２つの直鎖アンチセンス分子を互いに結合することを含む上述したアンチセンス化合物を作製する方法にも関する。この方法において、直鎖アンチセンス分子は、同一の標的となる核酸、あるいは異なった標的となる核酸にとって、特異的でも良い。しかし、一つの特徴として示しているのであって、これに限定されるわけではく、配列の長さや、相補的な領域は、約１−１００塩基、１ー５０塩基、１ー２０塩基でも良い。
【００１２】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子とTGF-β発現細胞を一緒にすることを含んだサンプルの接触方法を含んだTGF-βの発現阻害方法に関する。
【００１３】
本発明は、上記述べた共有結合閉環アンチセンス分子を必要とする患者に投与することを含むTGF-βの発現によって引き起こされる容態の治療方法に関する。その容態は、限定されるものでなく、繊維症、腎臓の繊維症、尿細管間質性の繊維症、肝繊維症、肺繊維症でも良い。
【００１４】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子を含む組成物投与を含む一側性の尿管の閉塞の治療方法に関する。
【００１５】
本発明は、また上述した共有結合閉環アンチセンス分子の投与を含む損傷部位における細胞外マトリックスタンパクの蓄積を防ぐ方法に関する。
【００１６】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチド及び担体組成物を含む組成物に関する。その担体は、リポソームであってもよいし、共有結合閉環アンチセンス分子は、TGF-βを標的としても良い。
【００１７】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物を含む組成物を細胞への接触方法を含む共有結合閉環アンチセンス分子を細胞へ導入する方法に関する。本発明の一つの特徴として、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物は、細胞に接触させる前に混合しても良い。
【００１８】
本発明のこれら又はその他の対象は、下記のここに添付された参照とする図面、付属する請求項及び発明の記述から、もっと完全に理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本願発明において、単数形で書かれているものは、単数のものにも、複数のものにも適用される。
【００２０】
ここで用いられている「アンチセンス」あるいは「AS」という用語は、アンチセンス核酸（DNAあるいはRNA）あるいはそれと相同するものを意味し、標的配列あるいは、標的配列の核酸塩基と水素結合相互作用による配列部分のポリヌクレオチドを認識する核酸塩基の範囲をもつ化学種の範囲を意味する。その標的配列は、一本鎖若しくは二本鎖RNAまたは一本鎖若しくは二本鎖DNAでも良い。
【００２１】
そのようなRNAあるいはDNAのは限定するわけではないが、以下のような類似体を含む。2'-Oアルキル糖修飾、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロチオネート（phosphorothioate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）、ホルムアセタル（formacetal）、３'-チオホルムアセタル（3'-thioformacetal）、スルホン（sulfone）、スルファミン酸塩（sulfamate）および窒素酸化物（nitroxide）バックボーン修飾、塩基部分が修飾されたアミドおよび類似体。さらに、分子の類似体は、限定するわけではないが、糖の部分が他の適切な部位によって修飾又は置換によって、結果としてモルホリノ類似体やペプチド核酸（peptide nucleic acid）類似体を含むポリマーであっても良い。そのような類似体は、RNaseHが介する標的RNAの分解、結合親和力、ヌクレアーゼ耐性、あるいはまた標的特異性の向上のために糖や塩基の連鎖群あるいはまた構造的な修飾を含む上記のような修飾の様々な組み合わせを含む。
【００２２】
ここに使用される「アンチセンス療法」は、in vitro あるいは in vivoにおいて、RNA配列を標的として不活性化あるいは切断する標的遺伝子のアンチセンスの断片を含む特異的に結合する共有結合閉環アンチセンス核酸分子を含む総括的な遺伝学的用語である。
【００２３】
ここで使用される「細胞増殖」は細胞分裂を意味する。用語「成長」は、ここに使用されたとおり、細胞分裂がより早い為あるいは、例えば細胞死のようなアポトーシスの割合がより遅いために、細胞の数が増加する両者の意味を包含する。制御不能となった細胞分裂は、ガンあるいは異常な細胞タイプのマーカーである。通常、非ガン細胞は規則的に分裂を行い、細胞の種類に特異的な特徴を見せる場合がしばしばある。例えば、細胞が悪性腫瘍に形質転換したとき、制御不能な細胞分裂および増殖が起きる。さらに、損傷後においても、細胞外細胞マトリックスは成長しすぎる。増殖あるいは成長の阻害は制御不能となった細胞の増殖あるいは組織密度の形成を調節する。
【００２４】
ここで使用される「繊維症」は、前段階である組織損傷あるいは疾病に反応して、高密で堅い瘢痕組織を生み出すことを意味する。
【００２５】
ここで使用される「遺伝子」は遺伝子の完全なヌクレオチド配列、あるいは遺伝子の配列部分を意味する。
【００２６】
ここで使用される用語「阻害」および「減少」は、遺伝子発現、細胞増殖、組織成長あるいは他の表現型の特性の低下を示すためのものと同義的に使用される。
【００２７】
ここで使用される「実質的相補的」は、それ自体が標的RNAと相補的あるいは特異的に結合するアンチセンス複合体と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性があるアンチセンスの配列を意味する。一般的には、完全相補は要求されない。どのようなアンチセンス分子も適当と考えられる標的核酸との安定な２重鎖、３重鎖を形成するのに十分な相補性を持っている。それゆえ、安定な２重鎖の形成は、配列およびハイブリダイズするアンチセンス分子の長さおよびアンチセンス分子と標的配列の相補性の度合いに依存するので、従来用いられるおよそ１３塩基から３０塩基からなる短い直鎖状のオリゴヌクレオチドより大きなものでも相補性において適応度が低くても寛容なシステムである。
【００２８】
ここで使用される「実質的相同」とは、他の核酸に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性がある核酸配列を持つことを意味する。あるアンチセンス分子が同一の標的となる別のアンチセンス分子と実質的相同配列を持つということは、重要なのは実質的相同分子が標的に対する阻害活性を示すことであり、これが実質的相同分子の機能的な能力である。
【００２９】
３重鎖構造の形成が本発明の範囲内にあってもよい一方、そのような形成が本発明の有利な特徴を実行し得ることは必要ではないことは理解できる。例えば、米国特許第5,683,874号に開示されているようなループの反対側の平行あるいは逆平行の配列をもつオリゴヌクレオチドのループ構造を設計することは、必要ではない。
【００３０】
ここに使用される「標的」あるいは「標的とする」ことはアンチセンス分子が作られる特異的な個々の遺伝子を意味する。ある状況においては、「標的とする」ことは結合することを意味し、あるいは標的遺伝子の発現が失われるようにするために内在性の発現の転写産物にアンチセンス分子を結合させる結果となることを意味する。その標的ヌクレオチド配列は、TGF-β（とりわけTGF-β1）に属する遺伝子を含む遺伝子の異常な発現から引き起こされる免疫疾患、感染症、代謝異常、遺伝病、繊維症、あるいは他の疾病のような様々な疾病の開始や進行に関わる遺伝子を含むさまざまな悪性腫瘍に関連する遺伝子から選別されてもよい。
【００３１】
本発明のアンチセンス分子は、生化学的あるいは生物学的な活性をもつ従来の直鎖状の合成AS-オリゴより優れたものとして見出された。一方、従来のAS-オリゴはDNAシンセサイザーで、容易に合成することが可能であるが、それらは標的部位の選別を必要とする。その標的部位の選別過程は、よく「AS-オリゴの設計」といった用語で表現される。この過程は、時間を消費し、しばしば決定的でない場合がある。さらに、合成したAS-オリゴはヌクレアーゼに対して不安定で、頻繁な配列の間違いが起こり、高い生産費用を要し、リポソームと複合体とした後でさえも、細胞への取り込みが低い。
【００３２】
ここで使用される「tatペプチド」あるいは「tat様ペプチド」は関連する用語である。特に、tatペプチドは可能性のある修飾を受けているtatタンパクの一部を意味する。tat様ペプチドは、tatペプチドとして似たような態様で細胞中に核酸の挿入を促進するペプチドを意味する。一つの特徴として、tat様ペプチドは良く似た配列を有していても良い、もう一つの特徴として、tatペプチドは本発明のアンチセンス複合体の細胞への導入が促進される限り、立体的にあるいは電荷が類似している特徴を有しても良い。本出願の全体にわたって、tatペプチドは細胞へのアンチセンス分子の取り込みを促進するものとして用いられ、tat様ペプチドも同様の意味で用いられると考えられる。
【００３３】
TGF-β1
TGF-β1は、ジスルフィド結合によって、互いに結合する１２．５kDaのサブユニット２つで構成される、２５kDa のホモダイマーである。TGF-β1は、元来ラットの繊維芽細胞の形質転換の表現型を引き起こす能力によって定義された。TGF-β1は、細胞および用量に依存的活性な複数の働きをもつサイトカインである。TGF-β1は多くの細胞において、成長を阻害するものとして働くが、いくつかの細胞のタイプにとっては、成長を促進する働きをもつものとして機能する。TGF-β1は、生体の至る所に分布している。TGF-β1のレビューとしては、 Massague, J. Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597. (1990); Letterio et al., Ann. Rev. Immunol. 16, 137 (1998)を参照できる。TGF-β1は、広範囲な細胞のタイプにおいて制御する効果を示し、胚発生、骨形成、哺乳類の発生、損傷の治癒、造血（haematopoiesis）、血管新生（angiogenesis）、細胞周期の進行そして、細胞外マトリックスの産生を調節している。免疫系において、TGF-β1はT細胞、B細胞の増殖を阻害し、in vitroあるいはin vivoの両方において、抗炎症機能を持つ分子として働いている。TGF-β1は、マクロファージの成熟および活性化を阻害し、ナチュラルキラー細胞やリンフォカイン活性化キラー細胞(lymphokine-activated killer cell）の活性化をも阻害し、そしてサイトカイン産生をブロックする。
【００３４】
事実上、すべての細胞は、細胞の様々な機能を制御するTGF-β1の受容体を持っている。TGF-βに結合する９つの膜タンパクが、現在までに同定されている（８つが再調査された）。これらの中で、もっとも広範に分布しているのが、TGF-β受容体IとIIでそれぞれ、５３kDa、７０kDaの分子量のタンパクである。タイプI型の受容体及び／又はタイプII型の受容体の欠失は、TGF-βの細胞反応性への欠失と相関する。タイプII型の受容体はクローニングされ、機能的なセリン/スレオニンキナーゼドメインを含むことが示されている。TGF-β1はin vivoにおいて不活性型で産生され、その後に25kDaの成熟したダイマーを形成し、７５kDaのプロペプチドダイマー（a latency-accociated propeptide）と非共有結合する。TGF-β1はマウス、ウシ、ブタ、アカゲザルの細胞で種を越えて交差反応する。
【００３５】
形質転換成長因子-β (TGF-β) のスーパーファミリー
形質転換成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーは、胚発生の間の広範囲な分化の過程に影響を与える構造上関係するタンパクのグループを含む。そのファミリーは以下のも含んでいる、しかし限定はされない。正常な男性の性発生に必要とされるミュラー管抑制物質（Mullerian inhibiting substance; MIS）(Behringer et al., Nature, 345:167, 1990)、成虫原器の背腹軸形成や形態形成に必要とされるショウジョウバエdecapentaplegic（DPP）遺伝子産物 (Padgett et al., Nature, 325:81-84, 1987)、卵の植物極側へ局在するアフリカツメガエルVg-1遺伝子産物 (Weeks et al., Cell, 51:861-867, 1987)、アフリカツメガエル胚の中胚葉の形成や前方構造の形成を誘導可能なアクチビン(Thomsen et al., Cell, 63:485, 1990)  (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986)、デノボ軟骨 (de novo cartilage)や骨形成を誘導可能な (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990) 骨形成タンパク（BMP; BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7そして-8、オステオゲニン (osteogenin)、OP-1）。TGF-β遺伝子産物は、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、造血作用、上皮細胞の分化を含む (for a review, see Massague, Cell 49:437, 1987) 様々な分化過程で影響を与えることが可能であり、それは参照によってその全体をここに組み入れられる。
【００３６】
TGF-βスーパーファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆タンパクとして合成され、順次その前駆タンパクのC末端側からおよそ１１０ー１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターで、タンパク質分解を受ける。タンパク質のC末端領域は全て構造上関連づけられ、異なるファミリーのメンバーは、その相同性の程度に基づいて別個のサブグループに分類することができる。独自のサブグループ内の相同性は、７０％から９０％のアミノ酸配列の同一性にまで及ぶが、２０％から５０％まで一般的に変動して、サブグループ間の相同性は著しくより低い。どちらの場合においても、活性型のものにはC末端側の断片のジスルフィド結合によるダイマーの形成であるように思われる。研究されたほとんど多くのファミリーにおいて、ホモダイマーに生物学的な活性が見出されたが、インヒビン(Ung et al., Nature, 321:779, 1986)や、TGF-β'S (Cheifetz et al., Cell, 48:409, 1987)のような、その他のファミリーにおいては、ヘテロダイマーが検出され、それぞれのホモダイマーに比べて、異なった生物学的な特徴をもつように思われる。
【００３７】
TGF-β遺伝子のスーパーファミリーメンバーは、以下のものを含むが限定されない。TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4（ニワトリ）、TGF-β1、TGF-β5（アフリカツメガエル）、BMP-2、BMP-4、ショウジョウバエDPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、ショウジョウバエ60A、GDF-1、アフリカツメガエル Vgf、BMP-3、Inhibin-βA、Inhibin-βB、Inhibin-αそしてMIS。これらの遺伝子については、Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998で議論されている。それは参照によってその全体がここに組み入れられる。
【００３８】
TGF-βタンパク質のスーパーファミリーメンバーは、TGF-βとするのが好ましい。より好ましくは、そのメンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7あるいはBMP-8とすることである。さらにより好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-βのメンバーである。よりさらに好ましくは、ヒトあるいはブタのTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3のメンバーである。最も好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-β1のメンバーである。
【００３９】
共有結合閉環アンチセンスオリゴ
アンチセンス療法の分野における一般的通念として、長いアンチセンス分子を用いることは奨励されていない。なぜなら、長くなればなるぼどAS-オリゴは特異性が低下し、合成するのが困難となり、細胞への取り込みが低下する傾向にあると考えられていたからである。実際、ホスホロチオエート（phosphorothioate）修飾されたオリゴのような、化学的に修飾した２次生産物であるAS-オリゴは、AS-オリゴの長さが長くなるに伴って配列特異性が低下した。さらに、直鎖状のAS-オリゴの合成は、次第に困難になり、配列の忠実度はAS-オリゴの長さが長くなるにつれて著しく低下する。他方、共有結合閉環アンチセンスオリゴヌクレオチド分子はその分子が長くなっても、追加された標的部位を含んでいても短い直鎖状のオリゴヌクレオチドと比較して優れた安定性を示した。
【００４０】
本発明のRiAS オリゴは、同一、異なる遺伝子、又は一つの直鎖オリゴヌクレオチド内の複数を標的としたアンチセンスを所有する少なくとも２つの直鎖状のオリゴヌクレオチドを結合することにより形成されても良い。結合は、両端でも良く、好ましくはリン酸化された5'末端であり、該5'末端の数塩基が結果としてリボン型のオリゴヌクレオチド形成を起こすハイブリダイゼーション及び結合のために互いに実質的相同になっている。分子の長さは、特に限定されないが、約２０ー１０００塩基、約２０ー７００塩基、約２０ー６００塩基、約２０ー５００塩基、約２０ー４００塩基、約２０ー３００塩基、好ましくは、約２０ー１５０塩基、もっと好ましくは２０ー１２０塩基からなる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、TGF-β1 mRNAに対するリボン型アンチセンスが配列特異的な様式で標的mRNAを除去し、UUOを伴う腎臓の全体の組織の損傷を緩和することが示された。本研究の成果は、TGF-β1 RiASオリゴが、組織の繊維化あるいはUUOの条件と密接に関係する様々な腎臓の疾病の治療薬として用いられるかもしれないことを示唆する。本研究結果は、リボン型のアンチセンス分子は選りすぐれた特性を持つことを示す。TGF-β1 RiASの効果的な尿細管上皮細胞への導入は、尿細管のTGF-β1の発現を効果的に抑制することができる。そして、それによって、UUOを伴う腎臓での萎縮、肥大そしてアポトーシスを含む一連の尿細管の損傷をブロックする。
【００４２】
TatおよびTat様ペプチド
一般に、アンチセンスオリゴは、その重合体の骨格に陰イオンの電荷を持つので、細胞への取り込みが低いことが示されている。オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みはリポソームとの複合体と一緒にすることで、十分に改良可能である(Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11454-11459(1996))。しかし、リポソームを含む非ウィルス性の運搬媒体では、特に初代培養の多くの細胞のタイプを満足させる効率的な取り込みは示さない。このように、改良したトランスフェクション試薬を開発することは、in vitroでの細胞系統の研究およびin vivoでの応用の両方において有用である。我々は、アンチセンスオリゴ、tat様ポリペプチドそしてリポソーム若しくはRiASオリゴの細胞への取り込みを増強するその他の担体を含む単純な混合物のシステムを発明した。tatタンパクの短い断片は、核酸縮合、膜貫通、核移行の特性を持つことが示された。これらの特性は、共役タンパクと同様にヌクレオチド分子の細胞への取り込みの増強においても有効であるかもしれない(Efthymiadis et al., J. Biol. Chem. 273, 1623-1628(1998); Schwartz et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 162-167(2000))。tatペプチドは、SV40 large T 抗原ペプチドような同様な性質の短鎖ペプチドと比較してもより効果的であるものとして見出されている(他に報告されているデータ)。
【００４３】
本発明において、特に例示したtatペプチドは、アミノ酸配列:RKKRRQRRRPPQC（配列４）を持つ。しかし、本発明のtatタンパクの範囲で他の配列も含まれると理解される。例えば、RKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO: 5)(tatタンパクの４９ー５９）が使用されても良い。さらに、８６tatタンパクも使用されても良い。tatペプチドへの修飾は許容されるが、RKKRRQRRRPPQのカルボキシル基の修飾（例：tat-RGD）のようなものに限定されるものではない。さらに、tatタンパクの第一エクソン部分の（４８ー７２アミノ酸）のような他の配列も使用されても良い。
【００４４】
本発明の別の特徴は、他のtat様ペプチドが使用されても良い。Antp、W/R、NLS、AlkCWK16、DiCWK18、Transportan、K16RGD、VP22、SCWKn、(LARL)n、HA2、RGD、Lオリゴマー、SV40等に限定されるわけではないが、細胞中へのアンチセンス化合物の取り込みを促進するペプチドである限り、使用できる。
【００４５】
本発明の実施態様の一つとして、担体はtatあるいはtat様タンパク、あるいは他の担体ペプチドに共有的に結合されても良く、あるいは、tatあるいはtat様タンパクあるいは他の担体ペプチドと複合体又は混合体を形成しても良い。
【００４６】
TGF-β1と関連づけられる疾病
本発明は、TGF-β1発現によって起こされる疾病、又は症状の治療若しくは緩和がある部位でのTGF-β1発現の休止によってもたらされる疾病の治療並びに予防に関する。そのような疾病は下記のものでも良いが、これらに限定されるわけではない。強皮症のような皮膚の損傷、骨髄増殖性の障害のような骨髄繊維症、腎臓の繊維症、肝繊維症、肺繊維症、化学療法/放射線が引き起こした繊維症、狭窄、移植（同種移植片拒絶）、ペイロニー病、慢性膵炎、血管性の疾病、肝硬変（アルコール、HCV）、喘息、肺気腫、腸疾患、クローン病、ゴーシェ病、血管性の病気、拡張型心筋症、全身性強皮症(systemic sclerosis)など。
【００４７】
糸球体硬化症（Glomerulosclerosis）および繊維症
UUOを伴う腎臓におけるTGF-β1の主な生産源は、間質性の繊維芽細胞および尿細管の上皮細胞である (Isaka et al., Kidney Int. 58, 1885-1892(2000))。我々は、輸尿管を介して注入したオリゴ複合体が、尿細管の上皮細胞において、蛍光シグナルを発するのを検出した。HVJリポソームを用いた、輸尿管を介したアンチセンスオリゴの逆行性インフュージョンは、間質性の繊維芽細胞への選択的なトランスフェクションを引き起こすことを以前に報告した (Tsujie et al., Kidney Int. 57, 1973-1980(2000))。別の報告では、カニューレを用いて、腎臓の動脈を介して腎臓にHVJ/リポソームと複合体を形成したSV40 large T 抗原遺伝子を導入したところ、糸球体の細胞において、遺伝子発現が検出された (Tomita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 15, 129-134(1992))。腎臓内への骨盤の逆行性注入（intra-renal pelvic retrograde)、腎実質への注入（parenchymal injection）および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)の３つの異なるルートの注入が、リポソーム（DOTMA/DOPE)を介した遺伝子導入方法として研究された(Lai et al., Gene Ther. 4, 426-431(1997))。皮質及び外延髄細胞中においては、腎実質への注入（parenchymal injection）ではなく、骨盤の逆行性注入（pelvic retrograde)および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)によって、β-ガラクトシダーゼ活性は検出された。我々の観察および他のグループの観察から、腎臓の標的細胞タイプを決定する重要な要素は輸送経路およびベクターの指向性の両者であることがわかった。
【００４８】
本研究で、TGF-β1 RiAS処理により、TGF-β1発現および腎臓の尿細管のアポトーシスが有意に減少し、その結果、全体の組織の損傷が回復した。組織繊維化は腎臓、肝臓そして肺などで起こる多くのタイプの疾患の進行において重大な様相であるから、これらの器官の繊維化障害はこれらの他の条件においてTGF-β1に対するリボン型アンチセンスオリゴを投与することによって、治療されることが予期される。
【００４９】
一側性の尿管の閉塞(UUO)
UUOは多くの先天的な疾病の進行あるいは後天的な疾病の進行から生じうる臨床的な容態である。それは、閉塞された腎臓の機能の減少と関係している(Klahr, S. Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿細管の損傷を媒介する因子の同定は、損傷を受けた腎臓の保持あるいは回復可能性において価値のあることかもしれない。機械的閉塞によって引き起こされるUUOを伴う腎臓では、繊維化促進性あるいはアポトーシス促進性の媒体因子である、とりわけTGF-β1を過剰に生産する (Kaneto et al., Kidney Int. 44, 313-321(1993))。TGF-β1は腎臓の皮質や髄質外部の尿細管細胞において主に発現しているだけでなく、管周囲の間質性の細胞においても発現していることが報告されている (Fukuda et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281, F513-F521(2001))。TGF-βは機械的な緊張にさらされている尿細管の細胞のアポトーシスにも関わっている(Miyajima et al., Kidney Int. 58, 2301-2313(2000))。
【００５０】
治療組成物
1つの実施態様として、本発明は、繊維症、TGF-βスーパーファミリーのメンバーが正常あるいは異常に発現しており、その遺伝子の発現の抑制が望まれているような疾病のような細胞外マトリックスの過剰な形成によって特徴づけられる様々な疾病の治療に関する。このように、本発明における治療のための合成物は、疾病を被っているあるいは被りがちなヒト患者に対して、TGF-βスーパーファミリーに属するメンバーの発現を阻害する合成物を投与するものである。特に、この疾病はとりわけ腎臓、肝臓そして肺中の繊維症に関係している。
【００５１】
治療用合成物の調製法は、当業者に一般に知られおり、Remington's Pharmaceutical Sciences(第１７版、Mack Publishing Co., USA)を参照することによって簡便に作製することができる。例えば、一日分は体重１kgにつき約０．０５μgー約２０mg投与でも良い。投与量レジメは最適な治療の反応に応じて与える量が調整されても良い。例えば、いくつかにわけられた投与量を毎日あるいは治療状況の緊急性に比例して投与量が減らされても良い。活性化された合成物は、簡便な方法で投与されるかもしれない。例えば、経口、静脈注射（水溶性）、筋肉注射、皮下注射、経鼻、皮内注射あるいは座薬経路あるいは移植（例：腹腔内の経路による徐放型 分子を用いる、あるいはin vitroで単球や樹状細胞で感作した細胞を用いる、あるいは養子性でレシピエントに移植した細胞を用いる）。投与の経路に依存して、酵素活性、酸、不活性化する成分などの他の普通に考えられる条件から保護するために、ペプチドは物質でコートされる必要があるかもしれない。
【００５２】
例えば、アンチセンス分子の低親油性は、ペプチド結合を分解することができる酵素による消化管で、胃の中で酸による加水分解によって、それらが破壊されることを可能にするだろう。非経口投与以外の方法によって、アンチセンス分子を投与するために、それらは以下のもので覆われるか、あるいはその不活性化を防ぐための物質と一緒に投与される。例として、アンチセンス分子はアジュバントと一緒に投与されても良いし、あるいはリポソーム中で酵素阻害剤と共に投与されても良い。ここに示されるアジュバントは、レソルシノール 、非イオン性の界面活性剤であるポリオキシエチレンオレイルエーテル(polyoxyethylene oleyl ether)及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテル（n-hexadecyl polyethylene ether)を含む。酵素阻害剤は、膵トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸 (diisopropylfluorophosphate(DEP))およびトラジロール (trasylol）を含む。リポソームは従来のリポソームと同様にwater-in-oil-in-water型CGFエマルションを含む。
【００５３】
活性型の合成物も、非経口的にあるいは腹腔内で投与されても良い。ディスパージョン (dispersion、以下同じ。)も、そのグリセリン溶液であるポリエチレングリコール中で調製することが可能であり、また、その混合物も油中で調製することが可能である。保存方法ならびに使用条件は通常の条件下で行い、これらの製剤は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含む。
【００５４】
注射可能使用に適した製薬剤には、滅菌水溶液（水溶性）あるいはディスパージョンまたは注射可能な水溶液あるいはディスパージョンを即座に調製可能である滅菌パウダーが含まれる。全ての場合において、その形式は無菌でなければならないし、容易にシリンジに注入できるように流動体でなければならない。製造、保存の過程で安定でなければならないし、細菌やカビのような微生物の混入を防いでなければならない。その担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコールそして液体のポリエチレングリコールなど同種のもの）、そしてこれらの適切な混合液、あるいは植物性油を含む溶液あるいはディスパージョンの媒体であることが可能である。適当な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用、ディスパージョンの場合において必要とされる粒子の大きさを保持、スーパーファクタント（superfactant）の使用によって保持できる。微生物の活性を防ぐのには、様々な抗生物質や抗菌物質、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、theomersal、そしてそれと同種のものを用いることによって可能である。多くの場合、それは等張性の溶液、例えば、砂糖や塩化ナトリウムの水溶液中にあることが望ましい。注射可能である組成物の遅延吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンような遅延吸収剤の組成の使用によって可能である。
【００５５】
無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙された他の成分と共に必要量の適切な溶媒中に活性化合物を導入し、必要に応じて続いてフィルター滅菌によって調製される。一般に、ディスパージョンは、基本的なディスパージョンの溶媒および必要な上記に列挙された他の成分を含んでいる無菌の媒体に、様々な無菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のために用いられる無菌パウダーの場合、好ましい調製方法は、前もってフィルター滅菌した溶液に望みの成分を加えて、活性成分のパウダーを生成する真空乾燥あるいは凍結乾燥技術である。
【００５６】
上述されているように、アンチセンス分子が適切に保護される場合、活性のある合成物は、例えば、不活性な希釈媒体と共に、あるいは同化可能な食用の担体と共に、あるいは、固いもしくは柔らかい外殻のゼラチンカプセルで封入されて、あるいは、圧縮されてタブレットに詰め込まれて、あるいは、食品に直接組み入れられて経口投与されても良い。経口治療投与については、活性合成物が賦形剤に組み入れられ、摂取できるタブレット、バッカル・タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースおよびその他同種のものとして使用されても良い。そのような組成および調製において、活性のある合成物の重量の少なくとも１%は含まれているべきである。組成および調製のパーセンテージはもちろん変えても良い、またその組成は簡便にユニットの重量の約５％ー約８０％までの間に合っても良い。そのような治療上有用な組成中の活性合成物量は、適切な投与量を達成させうるものである。本発明による好ましい組成あるいは調製は、経口投与のユニット形式が活性のある合成物の約０．１μgー２０００mg間に含有しているように形成される。
【００５７】
タブレット、錠剤、カプセルおよびその他同種のものはさらに下記のものを含む:トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチあるいはゼラチンのような結合剤;リン酸ジカルシウムのような賦形剤;コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸およびその他同種のもののような分解物質;ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤;また、ショ糖、ラクトースのような甘味料あるいはサッカリンあるいはペパーミント、サリチル酸メチルのような香料あるいはチェリー風味は加えても良い。投与量ユニット形式がカプセルである場合、それは上記のタイプの用品に加えて、液体の担体を含んでいても良い。様々な他の物質がコーティングとして、あるいはそうでなければ投与量ユニットの物理的な形式を修飾するために存在しても良い。例えば、タブレット、錠剤あるいはカプセルはセラックで、または砂糖、あるいはその両方でコートされていても良い。シロップかエリキシル剤は、活性合成物、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチルパラベンまたはプロピルパラベン、染料あるいは香料としてのチェリーやオレンジ風味を含んでいても良い。もちろん、どんな投与量ユニット形式を調製するのに使用される物質は、薬学的に純粋で、使用された量において本質的に無毒であるべきである。さらに、その活性合成物は持続リリース調製および処方で組み入れられても良い。
【００５８】
ここに使用された「薬剤として利用可能な担体及び／又は希釈剤」は、全ての溶媒を含んでおり、ディスパージョン溶媒、抗生物質や抗菌物質でのコーティング、等張液あるいは吸収遅延溶媒その他同種のものも含む。薬剤活性物質に用いる溶媒の使用は、当業者によく知られている。どんな従来の溶媒あるいは物質も活性成分と不適合であれば除外され、それについて治療用組成物の中で使用することが熟考される。補助活性成分も組成物の中に組み入れることができる。
【００５９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のため投与量のユニット形式の非経口投与の成分を処方化するのは特に有利である。この中で用いられている、投与量のユニット形式とは、哺乳動物に治療を施した場合の投与量の単位として物理的に個別の適合するユニットを指す。活性のある物質の前もって定義した量を含んでいる各ユニットは、要求される製薬としての担体と関連する望まれる治療の効果を生み出すために計算された。本発明の投与量のユニット形式の特異性は以下のことによって決めらた。(a) 活性物質の特異的な特徴および特徴的な治療の効果は達成されている。(b) 肉体の健康が害される病気を被って生活をしている人の病気の治療のためこのような活性のある物質の本質的な合成技術をここに限定する。
【００６０】
主要活性成分は、投与量ユニット形式中の適切な薬学的に利用可能な担体を備えた有効な量中の簡便で有効な投与のために合成される。ユニット投与の形式は例えば、約０．５μgー約２０００mgに及ぶ範囲の量に主要な活性のある合成物を含むことができる。割合を表記すると、活性のある合成物は、一般に担体の中で約０．５μg/mlの割合で存在する。補助的活性成分を含んでいる組成の場合には、その投与量は、前述の成分の投与の通常の投与量および投与の方法を参照して決定される。
【００６１】
共有結合閉環アンチセンス分子の導入担体
本発明のアンチセンスの導入担体は、目的の細胞へ本発明のアンチセンス化合物の導入を促進する様々な化合物あるいは方法を含んでいる。本発明の中で使用される核酸導入方法あるいは担体は、以下のものを含むが限定するわけではない。カチオンリポソーム、PEG脂質、PEG、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、デンドリマー、ポリ(D、L-乳酸)、ビロソーム、エレクトロポレーション、magnetofection、naked  DNA、脂質-ポリカチオン-DNA(LPD)、folate-conjugated nanometric particles、カチオンのナノパーティクル(NP)結合型インテグリンαβ３標的リガンド、(修飾された)DNA結合型ウィルス、両親媒性の短いペプチド、遺伝子活性型マトリックス(GAM)、poly(alpha-(4-aminobutyl)- L-glycolic acid)(PAGA)、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、ゼラチン、アテロコラーゲン、poly((D), (L)-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)、シクロデキストリンを骨格とするポリマー、ヒスチジンおよびリジン(HK)のポリマー、糖標的とした(glycotargeted)導入システム、多孔性のポリマー微粒子およびこれらと同種のものである。
【００６２】
様々な導入システムは知られており、本発明の化合物の投与に用いることができる。例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、アンチセンス化合物を発現可能な組換細胞、受容体を介するエンドサイトーシス、レトロウィルスの一部あるいはベクターとしての核酸の作製、などである。導入方法は以下のものを含んでいるが、制限されない。皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口のルート。化合物あるいは成分は、任意の簡便なルートによって投与されても良い。例えば、インフュージョンあるいはポーラス投与注射、あるいは上皮または粘膜皮膚の内側 (例えば口内の粘膜、直腸あるいは腸管の粘膜など)による吸収による。また、他の生物学的活性のある物質と一緒に投与されても良い。投与は全体的でも良いし、局所的でも良い。さらに、本発明の薬剤の化合物あるいは組成を中枢神経系に脳室内、くも膜下腔内（くも膜下腔内への注射は脳室内へのカテーテル（例えば、Ommaya reservoirのようなreservoirの取り付け）によって促進されても良い）への注射を含むあらゆる適合する手段で、導入することが望ましい。例えば、吸入器かネビュライザーの使用およびエアロゾル化した物質を製剤とすることによって肺へ投与する手段も利用可能である。
【００６３】
特定の実態形態において、本発明の薬剤アンチセンスの化合物あるいは成分を局所的に治療の必要な場所に投与することが望まれる。これは以下の方法によって達成される。しかし、これは本発明を限定するものではない。外科的手法を用いた局所へのインフュージョン、局所への処置によって。例えば、外科手術後の包帯をした傷口に、注射によって、カテーテルによって、坐薬によって、あるいは多孔性、非多孔性、ゼラチン（シリコンの膜、繊維のような膜を含む）による移植によって。好ましくは、本発明の抗体あるいはペプチドを含むタンパクを投与する際には、タンパクが吸収されない物質を使用するのに注意するに違いない。別の実施形態として、本発明の化合物あるいは成分は放出系を制御することによって輸送されるかもしれない。また、別の実施形態では、ポンプが使用されてもよい。別の実施形態において、重合体を材料に用いるかもしれない。別の実施形態において、制御された放出系は、系統への投与量の一部を必要とするだけで、治療の標的（つまり脳）への近くに設置することが可能となる。
【００６４】
成分は、レシピエント動物が投与を許容することができる場合、あるいは、その動物への投与が適合している場合に、「薬理学的にあるいは生理学的に利用可能」と言う。そのような試薬は投与された量が生理学上重要な場合に「治療上有効な量」が投与されたと言われる。その物質が、レシピエント患者の生理的な変化を検出できた存在をもって、生理学的に重要であるといえる。
【００６５】
本発明はここに記述された特定の実施例によって範囲が制限されない。。確かに、ここに記述されたものに加えての発明の様々な修正、先の記述及び添付図面から、当業者は明白に理解できる。そのような修正は、添付したクレームの範囲以内にあるように意図される。次の実施例は、本発明の実施例の提供であって、これによって発明の範囲の制限をうけるものではない。
【実施例１】
【００６６】
実施例1-細胞系および動物
ラット肝臓癌細胞系H4-IIEをATCC (American Type Culture Collection、米国)から得て、非働化した１０％FBS (fetal bovine serum)(JBI、韓国)、ペニシリン(100U/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)を含んでいるEMEM培養液中において、温度３７℃、湿度５％のCO2インキュベーターで維持した。
【００６７】
オスのラットSprague-Dawley (SD)は日本SLC社から供給されたものを使用した。動物は、標準の餌および水を与え、そこへは自由に行き来できるようにし、6匹ずつグループとして飼育した。重さ２００?２５０gのオスのラットSDをこれらの実験において使用した。腹腔内注入によるペントバルビタール (5mg/100gの体重)による麻酔の後に、腹部の正中線切り口から左の腎臓を露出させた。ラットは、左の腎臓にTGF-β1 RiASあるいはコントロールオリゴを２４-ゲージカテーテル注射器を使用して逆行注射した後に、近位の尿管の結紮を行った。
【実施例２】
【００６８】
実施例 2-ラットTGF-β1 RiASの作製
オリゴは、DNA自動合成機ExpediteTM8909 (Applied Biosystems、米国)を使用して合成された。AS オリゴのための標的部位は、DNAsis program (Hitachi Software、 米国)を使用して、２次構造の連続する重複するシミュレーションによって選択された (Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106(1996))。TGF-β1のアンチセンス配列およびスクランブルオリゴ配列は以下のとおり:アンチセンス配列:5'-GAT CCA GGA CTG TGT GTG ATG TCT TTG GTT TTG TCA TAG ATT GCG TTG TTG CGG CCT G-3'(SEQ ID NO: 1)、スクランブル配列:5'-GAT CCG CTG TCG TGC TGG TCT TGA GTT AAT TCG TTG TTG TTG TCT GAG TTG GTA TGC G-3'(SEQ ID、NO:2)。表1を参照。
【００６９】
【００７０】
TGF-β1アンチセンスオリゴおよびスクランブルオリゴの両者はステム-ループ構造を形成すると考えられる。ステムは、互いのオリゴの両端の相補的な配列によって形成される。ステムの5'末端は、４塩基からなる一本鎖の配列5'-GATC-3'を持つ。ステム-ループ構造を持つ２つのTGF-β1アンチセンスオリゴマーは、分子の5'末端に4つの相補的な配列があることによって、リボン型アンチセンス分子を形成するように繋がる。T4 DNAリガーゼ(宝酒造、日本) の１ユニットを加えて、2分子対称で共有結合によって結合した分子を生成した。従って、TGF-β1 RiASは2つのループおよび1つの介在するステムから成る。各ループはTGF-β1のアンチセンス配列を含んでいる。RiAS オリゴは変性の１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけられ、アクリルアミドゲル上でエキソヌクレアーゼIIIに対する抵抗性および流れる速度の遅滞を調べた。２つのスクランブルオリゴは、またリボン型のコントロールオリゴ（便宜上、「SC RiAS」と表示する）を共有結合によって、形成した。
【実施例３】
【００７１】
実施例3-リポソーム/tat ペプチド複合体によるRiASのトランスフェクション
Opti-MEM (GibcoBRL、米国) １００μl 中の４μgのDOTAP/DOPE (Avanti、米国) を、Opti-MEM 懸濁液、tatペプチドとアンチセンスオリゴを含んでいるチューブ中で、tatペプ。その混合液は１０分間インキュベートした。９６穴のそれぞれの穴に１万の細胞を加え、１００μlの容量で、オリゴ-tat-リポソームの３者複合体を扱った。アンチセンスオリゴは０．１あるいは０．３μgの量を使用した。H4-IIE細胞は５％CO2の濃度で、３７℃のインキュベーターで５時間インキュベートした。それから、２０％FBSを含むOpti-MEMを１００μl加え、さらにアッセイまで１６時間３７℃でインキュベートを行った。
【実施例４】
【００７２】
実施例4-RNAの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)
トータルRNAはTripureTM Isolation Reagent (Roche、米国)で単離した。トータルRNAを抽出するために、回収した細胞へ、Tripure 試薬の０．４ml、１０μlのグリコーゲン (1mg/ml)および８０μlのクロロホルムを加えた。RT-PCRは、AccessTM RT-PCR kit (Promega、米国)の単一の反応チューブ中で行った。RNA、PCRプライマー、トリ骨髄芽球症ウィルス (AMV) 逆転写酵素 (5 units/μl)、Tfl DNAポリメラーゼ (5 units/μl)、dNTP (10 mM、1μ l)およびMgSO4 (25mM、2.5μ l)を、PCRチューブに加え、最終容量が５０μlになるように水を加えた。cDNAは４８℃で４５分処理し、DNAサーマルサイクラー (MJ Research、米国)で増幅サイクル (94℃で30秒、56℃で1分、68℃で2分)を３０サイクルで増幅した。増幅されたPCR産物は、１．５%アガロースゲル上で確認し、gel documentation program (Bio-Rad、米国)を用いて定量化した。PCR産物はニトロセルロースメンブレンに転写し、Fluorescein-11-dUTP (Amersham、米国)でラベルした内部オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行った。シグナルはECL検出キットを用いて検出した。
【実施例５】
【００７３】
実施例5-腎臓へのFITCオリゴヌクレオチドの導入
メーカーが推奨するLabelITTM fluorescein nucleic acid labeling kit (Mirus、米国) を使用して、一本鎖のオリゴにフルオレセインをラベルした。FITCでラベルしたオリゴ、tatポリペプチド、DOTAP/DOPEの複合体を含んでいる混合溶液を、尿細管を介して左側の腎臓に注射した。その腎臓は２４時間後に取り除かれ、液体窒素下において、Tissue-TekTM OCT compound (Miles、米国) に包埋した。灌流固定した腎臓の組織ブロックは１０μmの厚さで凍結切片にし、Poly-PrepTM slides (Sigma、米国)にマウントした。その組織は顕微鏡観察のために、Synthetic MountantTM (Shandon、米国) で、マウントした。遺伝子導入の効率は、腎臓の凍結切片を蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【実施例６】
【００７４】
実施例 6-アポトーシスを検知するTUNELアッセイ
UUOを伴う腎臓の細胞において、断片化したDNAを検出するために、小さな改変が施されているin situ cell death detection kit (Roche、米国) を用いて、TUNELアッセイを行った。スライドは脱パラフィン化し、メタノール中０．３%H2O2を含むメタノールで、３０分間内在性のペルオキシダーゼ活性をクエンチングした。スライドは１０分間１０mMクエン酸バッファーで煮沸し、PBSでリンスをした後、フルオレセイン-dUTPでラベルしたデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)を加えて１時間インキュベートした。その反応は停止バッファーで止められた。その後、スライドはPBSで洗浄され、アルカリフォスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体で室温で３０分間インキュベートした。結合しなかった酵素結合抗体を洗浄により取り除き、そのスライドにNBT/BCIP (Sigma、米国) を加え、１?５分間反応させた。陽性の腎臓の尿細管細胞は、高性能の顕微鏡の４００倍の視野で観察して数を数えた。
【実施例７】
【００７５】
実施例 7-TGF-β1の免疫染色
凍結切片は連続してBouin's fixativeで４℃で５分間、アセトンで-２０℃で１０分間、メタノールで１５分間、２％パラホルムアルデヒドで２分間、４％パラホルムアルデヒドで４分間そして７０％エタノールで１０分間インキュベートし、その後、エタノールで段階的に再水和させた。その組織切片はPBSで洗浄し、０．３% H2O2を含むメタノールでインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を取り除いた。ブロッキングは、１０％FBSを含むPBSで１時間行い、そしてその組織切片を０．５％BSA、２％FCSを含むPBS中において、抗TGF-β1抗体 (Santa Cruz Biotechnology、米国)を加えて４℃で一晩インキュベートした。翌日に、その組織切片にHRP結合抗ウサギ抗体（Sigma、米国）を加えて、室温で１時間インキュベートした。その組織切片はDiamine benzidine (Sigma、米国）で５分間インキュベートし、エタノールで脱水した後、顕微鏡観察前に、Synthetic MoutantTMにマウントした。
【実施例８】
【００７６】
実施例 8-統計的解析
結果は、平均±標準偏差 (SD)として表示する。統計的な意義はスチューデント検定を用いて、P<0.05を有意であると、決定した。
【実施例９】
【００７７】
実施例 9-結果
実施例 9.1-TGF-β1に対する安定したRiASオリゴの構築
メッセンジャーRNAは、細胞質中において、２次構造、３次構造を形成する。これらのmRNAの構造の複雑さは、RNA結合タンパクとの結合や、mRNA自信が持つ塩基配列同士で互いにペアを形成することにより生じる。この理由により、効果的な標的部位の選別はアンチセンスオリゴをデザインする重要な課程であると考えられている。我々は、連続し重複した方式での２次構造のシミュレーションは、標的mRNAの標的配列に沿ったアンチセンスを見つけるのに効果的に利用されうることを見出したことを以前に示した(Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106 (1996))。TGF-β1の全長のmRNAに対して、アンチセンス分子が容易に結合可能なアンチセンスの標的部位を探索するために調べた。
【００７８】
TGF-β1特異的なアンチセンスオリゴは、ステム-ループ構造を形成し、５'末端突出のGATCの配列を持つ。２つの同一のASオリゴが共有結合で繋がって、TGF-β1 RiASと呼んでいるリボン型アンチセンス分子を形成する（図１）。予想通りに二量体のTGF-β1 RiASは、単量体の一本鎖の前駆体と比較して、変性ポリアクリルアミドゲル上で、泳動速度が遅いことが示された(図2)。RiASオリゴは、エキソヌクレアーゼIIIに耐性で、ポリアクリルアミドゲル上で、メジャーバンド（１１６mer）として、観察された(レーン４)。対照的に、TGF-β1 RiASの一本鎖の前駆体は、２ 時間で、エキソヌクレアーゼIIIによって完全に分解された(レーン３)。これらの結果から、TGF-β1 RiAS分子は、リボン型の閉じた構造をとっており、エキソヌクレアーゼによる攻撃を受けうる開いた末端の構造をとっていないことが説明される。
【００７９】
実施例 9.2-TGF-β1 RiASによるin vitroにおけるTGF-β1 mRNA特異的な減少
次に我々は、TGF-β1 RiASが配列特異的に標的mRNAを効果的に除去することができるかを調べた。TGF-β1 RiASはトランスフェクション効率を高めるためにtatペプチドおよびリポソームと複合体を形成させた。H4-IIEラット肝臓癌細胞に、TGF-β1 RiASあるいはSC RiASを、それぞれ０．１μgあるいは０．３μgをトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。トータルRNAはトランスフェクションを行った細胞から単離し、TGF-β1 mRNAをRT-PCRによって増幅し、TGF-β1 RiASのアンチセンスの活性を調べた。TGF-β1 RiASで処理したH4-IIE細胞は、０．１μgで約３０％のTGF-β1 mRNAの減少を示し、０．３μgで７０％以上のTGF-β1 mRNAの減少をそれぞれ示した（図３A）。これとは対照的に、H4-IIE細胞をSC RiASで処理した場合、TGF-β1 mRNAの発現
は有意な影響が見られなかった。コントロールとして図の下のパネルに示したGAPDHの発現は、TGF-β1 RiASの処理によって影響を受けなかった。これらの結果は、増幅したDNA断片の中間部分にハイブリダイズするDNAを用いてサザンブロッティングを行うことによって再度確認された(図３B)。
【００８０】
実施例 9.3-腎臓の組織中へのFITCラベルしたASオリゴの効率的な導入
アンチセンス活性をin vivoにおいてもうまく働かせるために、標的組織へのアンチセンスオリゴの効率的に取り込まれることが必要である。５８merの一本鎖の前駆体分子であるTGF-β1 RiASは、in vivoでの組織の取り込みをみるために、FITCでラベルした。FITCラベルした１０μgのアンチセンスオリゴは、２６-ゲージカテーテルを使用して、尿細管を介して左の腎臓へ注射した。腎臓はアンチセンス処理後６時間で回収し、細胞の取り込みを調べた。アンチセンスオリゴ、tatペプチド、リポソームが複合体を形成したとき、尿細管の上皮細胞で強い蛍光が観察た(図４A)。しかし、アンチセンスオリゴだけで、担体のリポソームを用いなかった時には、組織において、蛍光シグナルは検出されなかった(図４B)。偽物で処理を行ったコントロールの腎臓は蛍光シグナルを示さなかった。
【００８１】
実施例 9.4-TGF-β1 RiASによる組織損傷の有意な緩和
in vitroでTGF-β1 mRNAの効果的な減少が観察された後、そして、in vivoでのFITCラベルしたアンチセンスオリゴの効果的な組織への取り込みがで観察された後、TGF-β1 RiASは動物モデルにおいて、損傷した尿細管を効果的に防ぐことができるかを試した。一側性の尿管の閉塞 (UUO)は急速な尿細管の損傷を引き起こし、UUOを伴う腎臓は確立された臨床関連の動物モデルシステムである。
【００８２】
【００８３】
6匹のSDラットが、近位の輸尿管を介したTGF-β1 RiASのインフュージョンの後に、左側の近位の輸尿管の結紮を行った。５日目に、左側と右側の両側の腎臓を回収した。それらの重量を計測し、その形態を観察した。腎臓の重量は一個体の重量における腎臓の重量のパーセンテージで示すと、偽物のコントロールは、0.47%±0.03、UUOを伴ったものは、0.99%±0.10であった。UUO操作後の腎臓の重量には、顕著な増加が見られた。UUOを伴う腎臓は輸尿管への注入によって、TGF-β1 RiAS処理された時、一個体の体重あたりの腎臓の重量は、顕著に減少したが0.68%±0.09 (P<0.005)、PBS処理単独のものでは、0.95%±0.08であり、スクランブルRiASでの処理では、1.07%±0.12であった。結果は、６匹のSDラット標準偏差によるもので示している。#P<0.005における、UUOのみ、PBS＋UUOそしてSC RiAS＋UUOに対するTGF-β1 RiAS＋UUOのグループ（表２）。コントロールの腎臓は互いのグループ間では、有意な違いは見られなかった。TGF-β1 RiASで処理した腎臓は、UUOのみ、UUOにその他のものを加えたコントロールの処理と比較して、より一層肥大が見られなかった（図５）。さらに、UUOを伴ったラットのRiASで処理した腎臓の縦方向の切片は、全体の腎臓の構造の保持が見られたが、コントロールのグループのUUOで処理した腎臓においては、腎臓の髄質および腎乳頭の一部において腎実質の欠失が見られた。
【００８４】
実施例 9.5-腎臓の微細構造の保持が免疫組織化学的手法および組織学的解析によって示された。
【００８５】
我々は配列特異的なアンチセンスの活性および腎臓の微視的な構造の変化およびTGF-β1 RiASによる腎臓への広範な損傷の有意な回復を観察した。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、見せかけの処理をしたコントロールのグループのそれぞれのグループの中で２匹の典型的なラットから腎臓を回収した。免疫組織化学は、UUOを伴った腎臓において、TGF-β1 RiASで処理することによりTGF-β1の発現が消失したかを調べるために行われた（図６A-６E）。TGF-β1の免疫組織化学によって、損傷した腎臓において、ポジティブな茶色い染色が明らかとなり、影響のあった組織において、TGF-β1の発現が増強されたことが示された。TGF-β1タンパクのポジティブな染色はPBSやSC RiASで処理したUUOを伴った腎臓において同様に検出された。これとは対照的に、TGF-β1はTGF-β1 RiASで処理したUUOを伴った腎臓においてはるかに減少していることがわかった（図６E)。
【００８６】
UUOを伴った腎臓の顕著な物理的特徴は、尿細管の萎縮あるいは肥大、そしてそれは増強されたTGF-β1の発現を介していると考えられている。UUOを伴った腎臓の切片をPAS染色し、光学顕微鏡で観察したところ、急速に促進された様子で皮質や髄質の中間の空間が増大したことがわかった。大多数の腎臓の尿細管は、肥大しており、いくつかの尿細管においては上皮の扁平化がみられた（図７A-７E）。それとは対照的に、PBS、SC RiAS、偽物で処理したUUOを伴ったコントロールの腎臓の切片においては、広範囲で尿細管の萎縮および肥大がみられ、TGF-β1 RiASで処理したグループにおいては、有意に萎縮や肥大が消失していた。予想されたとおり、偽物で操作したラットのコントロールの腎臓の切片は正常に見えた。
【００８７】
実施例 9.6-in situ TUNELアッセイで検出されたアポトーシスによる細胞死の減少。
【００８８】
UUOを伴った腎臓が尿細管の広範囲な萎縮および肥大を示すので、我々は、腎臓の尿細管の細胞はアポトーシスを受けているか否かを調べることにした。UUOを伴った腎臓がTGF-β1 RiASで処理されると、アポトーシスを起こした細胞は腎臓の尿細管の細胞において、他のコントロール処理をしたものと比較してそれほど大量にあるわけではないことがわかった（図８A-８E）。正常な腎臓において、アポトーシスポジティブな細胞数は3±3.3 細胞数/顕微鏡視野 (400X)（以下、単に細胞数と略す）、偽物で処理した腎臓において、アポトーシスポジティブな細胞数は、280.9±24.6細胞数みられた。TGF-β1 RiASで処理すると、尿細管のアポトーシスポジティブな細胞数は21.3±12.1細胞数のレベルにまで減少した (P<0.001)。これとは対照的に、SC RiASで処理したものでは、236.8±29.6細胞数、PBSで処理したものでは、260.4±41.3細胞数のレベルで尿細管のアポトーシス細胞数は増加していた。
【００８９】
ここに引用された参照はすべて、参照によってそれらの全体に組み入れられます。
【００９０】
当業者は、前記記載で開示された概念および特定の実施態様は、本発明の同一な目的を遂行するのために異なる実施態様を修飾するまたは設計するための基礎として容易に利用出来ると考えるであろう。また、当業者は、そのような等価な実施態様は、請求の範囲で範囲から逸脱いないものであると考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
本発明は、後述する詳細な記述、実例して添付した図面によって、より完全に理解されるだろう、しかしながらそれらに本発明は限定されるもではない。
【００９２】
【図１】TGF-β１に対するリボン型のアンチセンス分子（以下、「TGF-β1 RiAS」と称する場合がある）、特に、116-mer (SEQ ID NO: 3)を示す。TGF-β1のモノマーのオリゴ (SEQ ID NO: 1)は、ステム-ループ構造をとることが予想される。そのステムは互いのオリゴの両末端の相補的配列によって形成される。そのステムの５'末端は5'-GATC-3'の４塩基からなる一本鎖の突出した構造を持つ。２つのTGF-β１モノマー分子は２分子対称による共有結合閉環アンチセンス分子を形成するように繋がる。RiASオリゴは、２つのループおよび１つの介在ステムからなる。各ループは、TGF-β１に対するアンチセンス配列を含んでいる。
【図２】TGF-β1 RiASオリゴのエキソヌクレアーゼIIIに対する耐性を示す。オリゴは変性１５％ポリアクリルアミドゲルで分析した。レーン１；５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン２；１１６mer TGF-β1 RiAS、レーン３；エキソヌクレアーゼIIIで処理した５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン４；エキソヌクレアーゼIIIで処理した１１６mer TGF-β1 RiAS。
【図３】A-Bは、TGF-β1 RiASによるTGF-β1 mRNA特異的な分解を示す。細胞にオリゴ（０．１あるいは０．３μg）-tat-リポソームの三量体からなる複合体をトランスフェクトし、後にRT-PCRアッセイに用いた。（A）RT-PCRはTGF-β1 RiASのアンチセンス活性を測定するために行った。（B）下のパネルに見られるバンドが、内部でハイブリダイズするプライマーをプローブとしてサザンブロッティングを行った結果である。レーン１；偽物、レーン２；TGF-β1 RiAS ０．１μg、レーン３；TGF-β1 RiAS ０．３μg、レーン４；SC RiAS ０．１μg、レーン５；SC RiAS ０．３μg
【図４】A-Bは、輸尿管を通し、腎臓へアンチセンスオリゴが運搬されることを示す。３'末端をFITCでラベルしたアンチセンスオリゴは、尿管結紮後、輸尿管を通して左側の腎臓にインフュージョン(infusion)した。灌流固定した複数の組織を凍結切片にし、組織は、顕微鏡観察（倍率  ２５０倍）するため、シンセティックマウンタント（synthetic mountant)で標本にした。A、tatペプチドおよびリポソームと複合体を形成したFITCオリゴ；B、FITCオリゴ単独
【図５】２匹の代表的なラットのUUOを伴う腎臓の縦方向への切片を示す。麻酔をしたオスのSDラットに輸尿管を通してTGF-β1 RiASあるいは、コントロールをインフュージョンした。５日目に、縦方向への切片を作製した後、形態的な変化を検査、分析した。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図６】A-Eは、抗TGF-β1抗体によるTGF-β1の免疫組織化学的染色を示す。免疫組織化学的染色は腎臓組織の凍結切片を用いて行った。固定し、脱水処理をした組織は、顕微鏡観察の為にシンセティックマウンタントで標本にした。ブラウン染色によりTGF-β1の存在を示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図７】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓 において尿細管が萎縮および肥大した組織学的観察を示した。尿細管の萎縮および肥大は、PAS染色した組織切片で示された。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、尿管の閉塞のみのもので、それぞれ処理した腎臓の切片を、尿細管の萎縮および肥大を見るために示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図８】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓において、アポトーシス細胞の検出を示す。TUNELアッセイは腎臓の尿細管細胞のアポトーシスの度合いを決定する為に行われた。UUOを伴った腎臓は、TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、UUO単独の条件のもので処理された。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図１】
2005529581.tif 000003
【図２】
2005529581.tif 000004
【図３】
2005529581.tif 000005
【図４】
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【図５】
2005529581.tif 000007
【図６】
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【図７】
2005529581.tif 000009
【図８】
2005529581.tif 000010
【配列表】
2005529581000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年9月1日(2004.9.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TGF-βの発現を特異的に阻害する精製共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項２】
該分子は、ステム構造によって分離される少なくとも２つのループをもち、少なくとも１つのループはTGF-βの発現を阻害する標的アンチセンスの配列を含む請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項３】
TGF-βがTGF-β1である請求項２に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項４】
SEQ ID NO:1と実質的に同一である配列を含む請求項３に記載の共有結合閉環アンチセンス分子。
【請求項５】
共有結合閉環アンチセンス分子形成のために、互いに実質的相補的である5'若しくは3'末端又はその両末端を持つステム-ループ構造の少なくとも二つの直線アンチセンス分子を共に結合させることを含む請求項２に記載の化合物を調製する方法。
【請求項６】
直線アンチセンス分子が、同一の標的核酸あるいは異なる標的核酸に対して特異的である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子とTGF-β発現細胞を含むサンプルを接触することを含むTGF-βの発現阻害方法。
【請求項８】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を、必要としている対象に投与することを含むTGF-βの発現によって引き起こされた容態の治療方法。
【請求項９】
該容態が、繊維症である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該繊維症が、腎臓におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該繊維症は尿細管間質性の繊維症である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該繊維症は、肝臓におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該繊維症は、肺におけるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を含む組成物を、必要としている対象に投与することを含む、一側性(unilateral)尿管閉塞症の処置方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の共有結合閉環アンチセンス分子を、必要としている対象に投与することを含む損傷部位における細胞外マトリックスタンパク質の蓄積防止方法。
【請求項１６】
共有結合閉環アンチセンス分子、tat若しくはtat様ペプチド及び担体組成物を含む組成物。
【請求項１７】
該担体が、リポソームである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
該共有結合閉環アンチセンス分子が、TGF-βを標的とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞と、共有結合閉環アンチセンス分子、tat若しくはtat様ペプチド及び担体組成物を接触させることを含む該共有結合閉環アンチセンス分子の細胞への運搬方法。
【請求項２０】
該tat若しくはtat様ペプチド及び該担体組成物を細胞と接触する前に混合する請求項１９の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGF-βを標的とする共有結合閉環アンチセンス分子を使用するバイオテクノロジーおよび特にアンチセンス療法の分野に関するものである。本発明は、また細胞にアンチセンス分子を導入する方法にも関するものである。本発明は、さらに、TGF-βが産生されることによって引き起こされる疾病を治療する方法にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスタンパク(ECM)の蓄積によって特徴づけられる腎臓の尿細管間質性の繊維症は、進行性の腎疾患の共通の結果としてみられる(Kuncio et al., Kidney Int. 39, 550-556(1991))。一側性の尿管の閉塞(UUO)を伴う腎臓閉塞は、尿細管間質性繊維症による腎臓の傷害を起こす動物モデルのシステムとしてよく確立されている(Klahr et al., Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿管の結紮による機械的な障害は、水腎症、腎実質の欠失、および尿細管の肥大、萎縮およびアポトーシスのような変化を引き起こす(Gonzalez-Avila et al., Pathobiology 66, 196-204(1998); Truong et al., Kidney Int. 50, 200-207(1996))。尿細管間質性の繊維症の進行の基礎的なメカニズムは完全には解明されていないが、UUOを伴う腎臓中の多数のサイトカインが尿細管間質性の繊維症を仲介するものとされている。これらのサイトカインの中で、形質転換成長因子-β1(TGF-β1)が、腎臓の繊維症で重要な働きをしていることが、糸球体硬化症および尿細管間質性の繊維症によって証拠づけられるている(Schiffer et al., J. Clin. Invest. 108, 807-816(2001); Wang et al., Kidney Int. 60, 96-105(2001))。TGF-β1は、正常な修復のための組織損傷に応答するECMの蓄積に関係し、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよび糖タンパク質のようなECMの異常な過剰生産による繊維症変化に関わっている(Branton et al., Microbes Infect. 1, 1349-1365(1999); Okuda et al., J. Clin. Invest. 86, 453-462(1990))。TGF-β1は、プロテアーゼ阻害剤の合成を促進することにより、また、マトリックス分解プロテアーゼの合成を抑制することにより、新たに合成されたマトリックスタンパクの分解を阻害する。したがって、TGF-β1の産生あるいは機能を効果的に遮断することは、いくつかの報告から提示されているとおり、繊維化する条件を妨げる有効な方法であると考えられる(Border et al., Nature 360, 361-364(1992); Akagi et al., Kidney Int. 50, 148-155(1996); Isaka et al., Nat. Med. 2, 418-423(1996); Isaka et al., Kidney Int. 55, 465-475(1999))。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotides、以下「アンチセンスオリゴ」と称する)は、塩基配列特異的な遺伝子発現の減少により、遺伝子産物に関する機能的な研究において有用であった。しかしながら、オリゴヌクレオチドの使用には、ヌクレアーゼに対する不安定性、配列非特異的および細胞の取り込み効率の低さのようないくつかの重大な問題がまだ残っている。ホスホロチオネート(phosphorothioate) オリゴヌクレオチドやメチルホスホネート(methylphosphonate) オリゴヌクレオチドのような様々な化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために開発された。しかしながら、それぞれ修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、配列特異性の欠如や、RNaseHの非感受性、および部分トロンボプラスチン時間 (partial thrombosis time)の延長をきたすなど、自身が抱える問題もある。さらに、再利用加水分解修飾ヌクレオチドが、ゲノムDNAの修復や複製の際にゲノムに取り込まれてしまい、ゲノムDNAの変異を引き起こす原因となる恐れがあった。我々が以前に報告した、共有結合閉環構造をしているリボン型のアンチセンス(ribbon-type antisense、以下「RiAS」と称する)-オリゴは、非常に安定で、標的c-myb mRNAの特異的な切断において、効果的な働きを示した。そして、他の修飾されたアンチセンスオリゴに関連してみられた問題は殆ど持っていなかった (Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); and PCT/KR00/00305)。これらは参照として、ここの全体に組み入れられる。
【０００４】
米国特許第5,683,874号において、共有結合閉環タイプの核酸配列を形成するには、平行あるいは逆平行な核酸配列が三重らせん構造を形成するループの反対側に存在することが必要であることを開示している。しかしながら、そのような構造は、主としてゲノムのプロモーター領域に結合するのには有用であるが、RNaseHによる標的分解のための相補的mRNAの結合には有用でない。このように、米国特許第5,683,874号では、そのような平行および逆平行の配列を伴っているあるいは伴っていない、共有結合閉環アンチセンス構造は、標的の核酸の発現を効果的に切断することを開示又は示唆もされていない。
【０００５】
アンチセンスオリゴの細胞への取り込みは、リポソームと複合体を形成することにより、増強することができる。リポソームは低毒性、免疫原性の欠如および生産の単純性のようないくつかの長所を持つが、リポソームは比較的細胞への取り込み効率が低いことが示されている。ヒト免疫不全ウィルス (HIV)のtatポリペプチドのトランスダクションドメイン (transduction domain)を融合させたタンパクは、効率良くマウスの全ての組織、脳を含めても導入されることが示されている (Schwarze et al., Science 285, 1569-1572(1999))。リポソームの表面に共有結合でtatペプチドを結合させると、細胞内への輸送が増加する (Torchilin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8786-8791(2001))。さらに、tatタンパクの小さな領域である、２つのリジンと６つのアルギニンを含む49から57残基が、核内での局在化する性質をもつ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アンチセンス分子を効率よく導入するためのシステムとともに、特異的で安全で効果的な治療のためのアンチセンス分子をこれからも作る必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記の必要としている事項を満たしている。
【０００８】
発明の一つの特徴として、TGF-β1を特異的に標的とするRiAS分子 (TGF-β1 RiAS)に関する。もう一つの発明の特徴は、TGF-β1 RiASが腎臓での繊維症および組織の損傷を防ぐことが出来るかをアンチセンス活性としてテストし、設計したことである。さらに一つの本発明の実施形態として、アンチセンス分子を導入するための混合物の細胞への取り込み効率の改良に関する。特に、TGF-β1 RiASをtat様ペプチドと混合し、それからリポソームとの複合体を形成させることである。TGF-β1 RiASとtatあるいはtat様ペプチドとカチオンリポソームの三者複合体は、TGF-βの発現を阻害するのに効果的であること、そして、UUOを伴った腎臓の組織の整合性を保つことがわかった。
【０００９】
本発明は、TGF-βの発現を特異的に阻害する精製共有結合閉環アンチセンス分子に関する。共有結合閉環アンチセンス分子は、ステム構造により分離した少なくとも２つのループを持っていてもよく、１つのループは、TGF-β発現を阻害する標的アンチセンス配列を含むでいる。この場合、TGF-βは特にTGF-β1でも良い。
【００１０】
上述した共有結合閉環アンチセンス分子は、SEQ ID NO:1と実質的に相同配列を含んでいても良い。
【００１１】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子形成のために互いに実質的に相同的な5'側、3'側のどちらか一方あるいは両末端を持つステム-ループ構造による少なくとも２つの直鎖アンチセンス分子を互いに結合することを含む上述したアンチセンス化合物を作製する方法にも関する。この方法において、直鎖アンチセンス分子は、同一の標的となる核酸、あるいは異なった標的となる核酸にとって、特異的でも良い。しかし、一つの特徴として示しているのであって、これに限定されるわけではく、配列の長さや、相補的な領域は、約１−１００塩基、１ー５０塩基、１ー２０塩基でも良い。
【００１２】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子とTGF-β発現細胞を一緒にすることを含んだサンプルの接触方法を含んだTGF-βの発現阻害方法に関する。
【００１３】
本発明は、上記述べた共有結合閉環アンチセンス分子を必要とする対象に投与することを含むTGF-βの発現によって引き起こされる容態の治療方法に関する。その容態は、限定されるものでなく、繊維症、腎臓の繊維症、尿細管間質性の繊維症、肝繊維症、肺繊維症でも良い。
【００１４】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子を含む組成物投与を含む一側性の尿管の閉塞の治療方法に関する。
【００１５】
本発明は、また上述した共有結合閉環アンチセンス分子の投与を含む損傷部位における細胞外マトリックスタンパクの蓄積を防ぐ方法に関する。
【００１６】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチド及び担体組成物を含む組成物に関する。その担体は、リポソームであってもよいし、共有結合閉環アンチセンス分子は、TGF-βを標的としても良い。
【００１７】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物を含む組成物を細胞への接触方法を含む共有結合閉環アンチセンス分子を細胞へ導入する方法に関する。本発明の一つの特徴として、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物は、細胞に接触させる前に混合しても良い。
【００１８】
本発明のこれら又はその他の対象は、ここに添付された参照とする図面、付属する請求項及び以下の発明の記述から、もっと完全に理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本願発明において、単数形で書かれているものは、単数のものにも、複数のものにも適用される。
【００２０】
ここで用いられている「アンチセンス」あるいは「AS」という用語は、アンチセンス核酸（DNAあるいはRNA）あるいはそれらの類似体を意味し、標的配列あるいは標的配列の核酸塩基と水素結合相互作用による配列部分のポリヌクレオチドを認識する核酸塩基の範囲をもつ化学種の範囲を意味する。その標的配列は、一本鎖若しくは二本鎖RNAまたは一本鎖若しくは二本鎖DNAでも良い。
【００２１】
そのようなRNAあるいはDNAは限定するわけではないが、以下のような類似体を含む。2'-Oアルキル糖修飾、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロチオネート（phosphorothioate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）、ホルムアセタル（formacetal）、３'-チオホルムアセタル（3'-thioformacetal）、スルホン（sulfone）、スルファミン酸塩（sulfamate）および窒素酸化物（nitroxide）バックボーン修飾、塩基部分が修飾されたアミドおよび類似体。さらに、分子の類似体は、限定するわけではないが、糖の部分が他の適切な部位によって修飾又は置換によって、結果としてモルホリノ類似体やペプチド核酸（peptide nucleic acid）類似体を含むポリマーであっても良い。そのような類似体は、RNaseHが介する標的RNAの分解、結合親和力、ヌクレアーゼ耐性、あるいはまた標的特異性の向上のために糖や塩基の連鎖群あるいはまた構造的な修飾を含む上記のような修飾の様々な組み合わせを含む。
【００２２】
ここに使用される「アンチセンス療法」は、in vitro あるいは in vivoにおいて、RNA配列を標的として不活性化あるいは切断する標的遺伝子のアンチセンスの断片を含む特異的に結合する共有結合閉環アンチセンス核酸分子を含む総括的な遺伝学的用語である。
【００２３】
ここで使用される「細胞増殖」は細胞分裂を意味する。用語「成長」は、ここに使用されたとおり、細胞分裂がより早いため、あるいは、例えば細胞死のようなアポトーシスの割合がより遅いために、細胞の数が増加する両者の意味を包含する。制御不能となった細胞分裂は、ガンあるいは異常な細胞タイプのマーカーである。通常、非ガン細胞は規則的に分裂を行い、細胞の種類に特異的な特徴を見せる場合がしばしばある。例えば、細胞が悪性腫瘍に形質転換したとき、制御不能な細胞分裂および増殖が起きる。さらに、損傷後においても、細胞外細胞マトリックスは成長しすぎる。増殖あるいは成長の阻害は制御不能となった細胞の増殖あるいは組織密度の形成を調節する。
【００２４】
ここで使用される「繊維症」は、前段階である組織損傷あるいは疾病に反応して、高密で堅い瘢痕組織を生み出すことを意味する。
【００２５】
ここで使用される「遺伝子」は、遺伝子の完全なヌクレオチド配列、あるいは遺伝子の配列部分を意味する。
【００２６】
ここで使用される用語「阻害」および「減少」は、遺伝子発現、細胞増殖、組織成長あるいは他の表現型の特性の低下を示すためのものと同義的に使用される。
【００２７】
ここで使用される「実質的相補的」は、それ自体が標的RNAと相補的あるいは特異的に結合するアンチセンス複合体と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性があるアンチセンスの配列を意味する。一般的には、完全相補は要求されない。どのようなアンチセンス分子も適当と考えられる標的核酸との安定な２重鎖、３重鎖を形成するのに十分な相補性を持っている。それゆえ、安定な２重鎖の形成は、配列およびハイブリダイズするアンチセンス分子の長さおよびアンチセンス分子と標的配列の相補性の度合いに依存するので、従来用いられるおよそ１３塩基から３０塩基からなる短い直鎖状のオリゴヌクレオチドより大きなものが相補性において適応度が低くても、寛容なシステムとなる。
【００２８】
ここで使用される「実質的相同」とは、他の核酸に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性がある核酸配列を持つことを意味する。あるアンチセンス分子が同一の標的となる別のアンチセンス分子と実質的相同配列を持つということは、重要なのは実質的相同分子が標的に対する阻害活性を示すことであり、これが実質的相同分子の機能的な能力である。
【００２９】
３重鎖構造の形成が本発明の範囲内にあってもよい一方、そのような形成が本発明の有利な特徴を実行し得るために必要ではないことは理解できる。例えば、米国特許第5,683,874号に開示されているような、ループの反対側の平行あるいは逆平行の配列をもつオリゴヌクレオチドのループ構造を設計することは、必要ではない。
【００３０】
ここに使用される「標的」あるいは「標的とする」ことはアンチセンス分子が作られる特異的な個々の遺伝子を意味する。ある状況においては、「標的とする」ことは結合することを意味し、あるいは標的遺伝子の発現が失われるようにするために内在性の発現の転写産物にアンチセンス分子を結合させる結果となることを意味する。その標的ヌクレオチド配列は、TGF-β（とりわけTGF-β1）に属する遺伝子を含む遺伝子の異常な発現から引き起こされる免疫疾患、感染症、代謝異常、遺伝病、繊維症、あるいは他の疾病のような様々な疾病の開始や進行に関わる遺伝子を含むさまざまな悪性腫瘍に関連する遺伝子から選別されてもよい。
【００３１】
本発明のアンチセンス分子は、生化学的あるいは生物学的な活性をもつ従来の直鎖状の合成AS-オリゴより優れたものとして見出された。一方、従来のAS-オリゴはDNAシンセサイザーで、容易に合成することが可能であるが、それらは標的部位の選別を必要とする。その標的部位の選別過程は、よく「AS-オリゴの設計」といった用語で表現される。この過程は、時間を消費し、しばしば決定的でない場合がある。さらに、合成したAS-オリゴはヌクレアーゼに対して不安定で、頻繁な配列の間違いが起こり、高い生産費用を要し、リポソームと複合体とした後でさえも、細胞への取り込みが低い。
【００３２】
ここで使用される「tatペプチド」あるいは「tat様ペプチド」は関連する用語である。特に、tatペプチドは可能性のある修飾を受けているtatタンパクの一部を意味する。tat様ペプチドは、tatペプチドとして似たような態様で細胞中の核酸の挿入を促進するペプチドを意味する。一つの特徴として、tat様ペプチドは良く似た配列を有していても良い、もう一つの特徴として、tatペプチドは本発明のアンチセンス複合体の細胞への導入が促進される限り、立体的にあるいは電荷が類似している特徴を有しても良い。本出願の全体にわたって、tatペプチドは細胞へのアンチセンス分子の取り込みを促進するものとして用いられ、tat様ペプチドも同様の意味で用いられると考えられる。
【００３３】
TGF-β1
TGF-β1は、ジスルフィド結合によって、互いに結合する１２．５kDaのサブユニット２つで構成される、２５kDa のホモダイマーである。TGF-β1は、元来ラットの繊維芽細胞の形質転換の表現型を引き起こす能力によって定義された。TGF-β1は、細胞および用量に依存的活性な複数の働きをもつサイトカインである。TGF-β1は多くの細胞において、成長を阻害するものとして働くが、いくつかの細胞のタイプにとっては、成長を促進する働きをもつものとして機能する。TGF-β1は、生体の至る所に分布している。TGF-β1のレビューとしては、 Massague, J. Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597. (1990); Letterio et al., Ann. Rev. Immunol. 16, 137 (1998)を参照できる。TGF-β1は、広範囲な細胞のタイプにおいて制御する効果を示し、胚発生、骨形成、哺乳類の発生、損傷の治癒、造血（haematopoiesis）、血管新生（angiogenesis）、細胞周期の進行そして、細胞外マトリックスの産生を調節している。免疫系において、TGF-β1はT細胞、B細胞の増殖を阻害し、in vitroあるいはin vivoの両方において、抗炎症機能を持つ分子として働いている。TGF-β1は、マクロファージの成熟および活性化を阻害し、ナチュラルキラー細胞やリンフォカイン活性化キラー細胞(lymphokine-activated killer cell）の活性化をも阻害し、そしてサイトカイン産生をブロックする。
【００３４】
事実上、すべての細胞は、細胞の様々な機能を制御するTGF-β1の受容体を持っている。TGF-βに結合する９つの膜タンパクが、現在までに同定されている（８つが再調査された）。これらの中で、もっとも広範に分布しているのが、TGF-β受容体IとIIでそれぞれ、５３kDa、７０kDaの分子量のタンパクである。タイプI型の受容体及び／又はタイプII型の受容体の欠失は、TGF-βの細胞反応性への欠失と相関する。タイプII型の受容体はクローニングされ、機能的なセリン/スレオニンキナーゼドメインを含むことが示されている。TGF-β1はin vivoにおいて不活性型で産生され、その後に25kDaの成熟したダイマーを形成し、７５kDaのプロペプチドダイマー（a latency-accociated propeptide）と非共有結合する。TGF-β1はマウス、ウシ、ブタ、アカゲザルの細胞で種を越えて交差反応する。
【００３５】
形質転換成長因子-β (TGF-β) のスーパーファミリー
形質転換成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーは、胚発生の間の広範囲な分化の過程に影響を与える構造上関係するタンパクのグループを含む。そのファミリーは以下を含んでいる、しかし限定はされない。正常な男性の性発生に必要とされるミュラー管抑制物質（Mullerian inhibiting substance; MIS）(Behringer et al., Nature, 345:167, 1990)、成虫原器の背腹軸形成や形態形成に必要とされるショウジョウバエdecapentaplegic（DPP）遺伝子産物 (Padgett et al., Nature, 325:81-84, 1987)、卵の植物極側へ局在するアフリカツメガエルVg-1遺伝子産物 (Weeks et al., Cell, 51:861-867, 1987)、アフリカツメガエル胚の中胚葉の形成や前方構造の形成を誘導可能なアクチビン(Thomsen et al., Cell, 63:485, 1990)  (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986)、デノボ軟骨 (de novo cartilage)や骨形成を誘導可能な (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990) 骨形成タンパク（BMP; BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7そして-8、オステオゲニン (osteogenin)、OP-1）。TGF-β遺伝子産物は、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、造血作用、上皮細胞の分化を含む (for a review, see Massague, Cell 49:437, 1987) 様々な分化過程で影響を与えることが可能であり、それは参照として、全体がここに組み入れられる。
【００３６】
TGF-βスーパーファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆タンパクとして合成され、順次その前駆タンパクのC末端側からおよそ１１０ー１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターで、タンパク質分解を受ける。タンパク質のC末端領域は全て構造上関連づけられ、異なるファミリーのメンバーは、その相同性の程度に基づいて別個のサブグループに分類することができる。独自のサブグループ内の相同性は、７０％から９０％のアミノ酸配列の同一性にまで及ぶが、２０％から５０％まで一般的に変動して、サブグループ間の相同性は著しくより低い。どちらの場合においても、活性型のものにはC末端側の断片のジスルフィド結合によるダイマーの形成であるように思われる。研究されたほとんど多くのファミリーにおいて、ホモダイマーに生物学的な活性が見出されたが、インヒビン(Ung et al., Nature, 321:779, 1986)や、TGF-β'S (Cheifetz et al., Cell, 48:409, 1987)のような、その他のファミリーにおいては、ヘテロダイマーが検出され、それぞれのホモダイマーに比べて、異なった生物学的な特徴をもつように思われる。
【００３７】
TGF-β遺伝子のスーパーファミリーメンバーは、以下のものを含むが限定されない。TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4（ニワトリ）、TGF-β1、TGF-β5（アフリカツメガエル）、BMP-2、BMP-4、ショウジョウバエDPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、ショウジョウバエ60A、GDF-1、アフリカツメガエル Vgf、BMP-3、Inhibin-βA、Inhibin-βB、Inhibin-αそしてMIS。これらの遺伝子については、Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998で議論されている。それは参照として、全体がここに組み入れられる。
【００３８】
TGF-βタンパク質のスーパーファミリーメンバーは、TGF-βとするのが好ましい。より好ましくは、そのメンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7あるいはBMP-8である。さらにより好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-βのメンバーである。よりさらに好ましくは、ヒトあるいはブタのTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3のメンバーである。最も好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-β1のメンバーである。
【００３９】
共有結合閉環アンチセンスオリゴ
アンチセンス療法の分野における一般的通念として、長いアンチセンス分子を用いることは奨励されていない。なぜなら、長くなればなるぼどAS-オリゴは特異性が低下し、合成するのが困難となり、細胞への取り込みが低下する傾向にあると考えられていたからである。実際、ホスホロチオエート（phosphorothioate）修飾されたオリゴのような、化学的に修飾した２次生産物であるAS-オリゴは、AS-オリゴの長さが長くなるに伴って配列特異性が低下した。さらに、直鎖状のAS-オリゴの合成は、次第に困難になり、配列の忠実度はAS-オリゴの長さが長くなるにつれて著しく低下する。他方、共有結合閉環アンチセンスオリゴヌクレオチド分子はその分子が長くなっても、追加された標的部位を含んでいても、短い直鎖状のオリゴヌクレオチドと比較して優れた安定性を示した。
【００４０】
本発明のRiAS オリゴは、同一、異なる遺伝子、又は一つの直鎖オリゴヌクレオチド内の複数を標的としたアンチセンスを所有する少なくとも２つの直鎖状のオリゴヌクレオチドを結合することにより形成されても良い。結合は、両末端でも良く、好ましくはリン酸化された5'末端であり、該5'末端の数塩基が結果としてリボン型のオリゴヌクレオチド形成を起こすハイブリダイゼーション及び結合のために互いに実質的相同になっている。分子の長さは、特に限定されないが、約２０ー１０００塩基、約２０ー７００塩基、約２０ー６００塩基、約２０ー５００塩基、約２０ー４００塩基、約２０ー３００塩基、好ましくは、約２０ー１５０塩基、もっと好ましくは２０ー１２０塩基からなる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、TGF-β1 mRNAに対するリボン型アンチセンスが配列特異的な様式で標的mRNAを除去し、UUOを伴う腎臓の全体の組織の損傷を緩和することが示された。本研究の成果は、TGF-β1 RiASオリゴが、組織の繊維化あるいはUUOの容態と密接に関係する様々な腎臓の疾病の治療薬として用いられるかもしれないことを示唆する。本研究結果は、リボン型のアンチセンス分子は選りすぐれた特性を持つことを示す。TGF-β1 RiASの効果的な尿細管上皮細胞への導入は、尿細管のTGF-β1の発現を効果的に抑制することができる。そして、それによって、UUOを伴う腎臓での萎縮、肥大そしてアポトーシスを含む一連の尿細管の損傷をブロックする。
【００４２】
TatおよびTat様ペプチド
一般に、アンチセンスオリゴは、その重合体の骨格に陰イオンの電荷を持つので、細胞への取り込みが低いことが示されている。オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みはリポソームとの複合体と一緒にすることで、十分に改良可能である(Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11454-11459(1996))。しかし、リポソームを含む非ウィルス性の運搬媒体では、特に初代培養の多くの細胞のタイプを満足させる効率的な取り込みは示さない。このように、改良したトランスフェクション試薬を開発することは、in vitroでの細胞系統の研究およびin vivoでの応用の両方において有用である。我々は、アンチセンスオリゴ、tat様ポリペプチドそしてリポソーム若しくはRiASオリゴの細胞への取り込みを増強するその他の担体を含む単純な混合物のシステムを発明した。tatタンパクの短い断片は、核酸縮合、膜貫通、核移行の特性を持つことが示された。これらの特性は、共役タンパクと同様にヌクレオチド分子の細胞への取り込みの増強においても有効であるかもしれない(Efthymiadis et al., J. Biol. Chem. 273, 1623-1628(1998); Schwartz et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 162-167(2000))。tatペプチドは、SV40 large T 抗原ペプチドと同様な性質の短鎖ペプチドと比較してもより効果的であるものとして見出されている(他に報告されているデータより)。
【００４３】
本発明において、特に例示したtatペプチドは、アミノ酸配列:RKKRRQRRRPPQC（配列４）を持つ。しかし、本発明のtatタンパクの範囲で他の配列も含まれると理解される。例えば、RKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO: 5)(tatタンパクの４９ー５９）が使用されても良い。さらに、８６tatタンパクも使用されても良い。tatペプチドへの修飾は許容されるが、RKKRRQRRRPPQのカルボキシル基の修飾（例：tat-RGD）のようなものに限定されるものではない。さらに、tatタンパクの第一エクソン部分の（４８ー７２アミノ酸）のような他の配列も使用されても良い。
【００４４】
本発明の別の特徴は、他のtat様ペプチドが使用されても良い。Antp、W/R、NLS、AlkCWK16、DiCWK18、Transportan、K16RGD、VP22、SCWKn、(LARL)n、HA2、RGD、Lオリゴマー、SV40等に限定されるわけではないが、細胞中へのアンチセンス化合物の取り込みを促進するペプチドである限り、使用できる。
【００４５】
本発明の実施態様の一つとして、担体はtatあるいはtat様タンパク、あるいは他の担体ペプチドに共有的に結合されても良く、あるいは、tatあるいはtat様タンパクあるいは他の担体ペプチドと複合体又は混合体を形成しても良い。
【００４６】
TGF-β1と関連づけられる疾病
本発明は、TGF-β1発現によって起こされる疾病、又は症状の治療若しくは緩和がある部位でのTGF-β1発現の休止によってもたらされる疾病の治療並びに予防に関する。そのような疾病は下記のものでも良いが、これらに限定されるわけではない。強皮症のような皮膚の損傷、骨髄増殖性の障害のような骨髄繊維症、腎臓の繊維症、肝繊維症、肺繊維症、化学療法/放射線が引き起こした繊維症、狭窄、移植（同種移植片拒絶）、ペイロニー病、慢性膵炎、血管性の疾病、肝硬変（アルコール、HCV）、喘息、肺気腫、腸疾患、クローン病、ゴーシェ病、血管性の病気、拡張型心筋症、全身性強皮症(systemic sclerosis)など。
【００４７】
糸球体硬化症（Glomerulosclerosis）および繊維症
UUOを伴う腎臓におけるTGF-β1の主な生産源は、間質性の繊維芽細胞および尿細管の上皮細胞である (Isaka et al., Kidney Int. 58, 1885-1892(2000))。我々は、輸尿管を介して注入したオリゴ複合体が、尿細管の上皮細胞において、蛍光シグナルを発するのを検出した。HVJリポソームを用いた、輸尿管を介したアンチセンスオリゴの逆行性インフュージョンは、間質性の繊維芽細胞への選択的なトランスフェクションを引き起こすことを以前に報告した (Tsujie et al., Kidney Int. 57, 1973-1980(2000))。別の報告では、カニューレを用いて、腎臓の動脈を介して腎臓にHVJ/リポソームと複合体を形成したSV40 large T 抗原遺伝子を導入したところ、糸球体の細胞において、遺伝子発現が検出された (Tomita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 15, 129-134(1992))。腎臓内への骨盤の逆行性注入（intra-renal pelvic retrograde)、腎実質への注入（parenchymal injection）および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)の３つの異なるルートの注入が、リポソーム（DOTMA/DOPE)を介した遺伝子導入方法として研究された(Lai et al., Gene Ther. 4, 426-431(1997))。皮質及び外延髄細胞中においては、腎実質への注入（parenchymal injection）ではなく、骨盤の逆行性注入（pelvic retrograde)および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)によって、β-ガラクトシダーゼ活性は検出された。我々の観察および他のグループの観察から、腎臓の標的細胞タイプを決定する重要な要素は輸送経路およびベクターの指向性の両者であることがわかった。
【００４８】
本研究で、TGF-β1 RiAS処理により、TGF-β1発現および腎臓の尿細管のアポトーシスが有意に減少し、その結果、全体の組織の損傷が回復した。組織繊維化は腎臓、肝臓そして肺などで起こる多くのタイプの疾患の進行において重大な様相であるから、これらの器官の繊維化障害はこれらの他の容態においてTGF-β1に対するリボン型アンチセンスオリゴを投与することによって、治療されることが予期される。
【００４９】
一側性の尿管の閉塞(UUO)
UUOは多くの先天的な疾病の進行あるいは後天的な疾病の進行から生じうる臨床的な容態である。それは、閉塞された腎臓の機能の減少と関係している(Klahr, S. Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿細管の損傷を媒介する因子の同定は、損傷を受けた腎臓の保持あるいは回復可能性において価値のあることかもしれない。機械的閉塞によって引き起こされるUUOを伴う腎臓では、繊維化促進性あるいはアポトーシス促進性の媒体因子である、とりわけTGF-β1を過剰に生産する (Kaneto et al., Kidney Int. 44, 313-321(1993))。TGF-β1は腎臓の皮質や髄質外部の尿細管細胞において主に発現しているだけでなく、管周囲の間質性の細胞においても発現していることが報告されている (Fukuda et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281, F513-F521(2001))。TGF-βは機械的な緊張にさらされている尿細管の細胞のアポトーシスにも関わっている(Miyajima et al., Kidney Int. 58, 2301-2313(2000))。
【００５０】
治療組成物
1つの実施態様として、本発明は、繊維症、TGF-βスーパーファミリーのメンバーが正常あるいは異常に発現しており、その遺伝子の発現の抑制が望まれているような疾病のような細胞外マトリックスの過剰な形成によって特徴づけられる様々な疾病の治療に関する。このように、本発明における治療のための化合物は、疾病を被っているあるいは被りがちなヒト対象に対して、TGF-βスーパーファミリーに属するメンバーの発現を阻害する化合物を投与するものである。特に、この疾病はとりわけ腎臓、肝臓そして肺中の繊維症に関係している。
【００５１】
治療用化合物の調製法は、当業者に一般に知られおり、Remington's Pharmaceutical Sciences(第１７版、Mack Publishing Co., USA)を参照することによって簡便に作製することができる。例えば、一日分は体重１kgにつき約０．０５μgー約２０mg投与でも良い。投与量レジメは最適な治療の反応に応じて与える量が調整されても良い。例えば、いくつかにわけられた投与量を毎日あるいは治療状況の緊急性に応じて投与量が減らされても良い。活性化された化合物は、簡便な方法で投与されるかもしれない。例えば、経口、静脈注射（水溶性）、筋肉注射、皮下注射、経鼻、皮内注射あるいは座薬経路あるいは移植（例：腹腔内の経路による徐放型 分子を用いる、あるいはin vitroで単球や樹状細胞で感作した細胞を用いる、あるいは養子性でレシピエントに移植した細胞を用いる）である。投与の経路に依存して、酵素活性、酸、不活性化する成分などの他の普通に考えられる条件から保護するために、ペプチドは物質でコートされる必要があるかもしれない。
【００５２】
例えば、アンチセンス分子の低親油性は、ペプチド結合を分解することができる酵素による消化管で、胃の中で酸による加水分解で、破壊されることを可能である。非経口投与以外の方法によって、アンチセンス分子を投与するために、それらは以下のもので覆われるか、あるいはその不活性化を防ぐための物質と一緒に投与される。例として、アンチセンス分子はアジュバントと一緒に投与されても良いし、あるいはリポソーム中で酵素阻害剤と共に投与されても良い。ここに示されるアジュバントは、レソルシノール 、非イオン性の界面活性剤であるポリオキシエチレンオレイルエーテル(polyoxyethylene oleyl ether)及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテル（n-hexadecyl polyethylene ether)を含む。酵素阻害剤は、膵トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸 (diisopropylfluorophosphate(DEP))およびトラジロール (trasylol）を含む。リポソームは従来のリポソームと同様にwater-in-oil-in-water型CGFエマルションを含む。
【００５３】
活性型の化合物も、非経口的にあるいは腹腔内で投与されても良い。ディスパージョン (dispersion、以下同じ)も、そのグリセリン溶液であるポリエチレングリコール中で調製することが可能であり、また、その混合物も油中で調製することが可能である。保存方法ならびに使用条件は通常の条件下で行い、これらの製剤は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含む。
【００５４】
注射可能使用に適した製薬剤には、滅菌水溶液（水溶性）あるいはディスパージョンまたは注射可能な水溶液あるいはディスパージョンを即座に調製可能である滅菌パウダーが含まれる。全ての場合において、その形式は無菌でなければならないし、容易にシリンジに注入できるように流動体でなければならない。製造、保存の過程で安定でなければならないし、細菌やカビのような微生物の混入を防いでなければならない。その担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコールそして液体のポリエチレングリコールなど同種のもの）、そしてこれらの適切な混合液、あるいは植物性油を含む溶液あるいはディスパージョンの媒体であることが可能である。適当な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用、ディスパージョンの場合において必要とされる粒子の大きさを保持、スーパーファクタント（superfactant）の使用によって保持できる。微生物の活性を防ぐのには、様々な抗生物質や抗菌物質、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、theomersal、そしてそれと同種のものを用いることによって可能である。多くの場合、それは等張性の溶液、例えば、砂糖や塩化ナトリウムの水溶液中にあることが望ましい。注射可能である組成物の遅延吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンような遅延吸収剤の組成の使用によって可能である。
【００５５】
無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙された他の成分と共に必要量の適切な溶媒中に活性化合物を導入し、必要に応じて続いてフィルター滅菌によって調製される。一般に、ディスパージョンは、基本的なディスパージョンの溶媒および必要な上記に列挙された他の成分を含んでいる無菌の媒体に、様々な無菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のために用いられる無菌パウダーの場合、好ましい調製方法は、前もってフィルター滅菌した溶液に望みの成分を加えて、活性成分のパウダーを生成する真空乾燥あるいは凍結乾燥技術である。
【００５６】
上述されているように、アンチセンス分子が適切に保護される場合、活性化合物は、例えば、不活性な希釈媒体と共に、あるいは同化可能な食用の担体と共に、あるいは、固いもしくは柔らかい外殻のゼラチンカプセルで封入されて、あるいは、圧縮されてタブレットに詰め込まれて、あるいは、食品に直接組み入れられて経口投与されても良い。経口治療投与については、活性化合物が賦形剤に組み入れられ、摂取できるタブレット、バッカル・タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースおよびその他同種のものとして使用されても良い。そのような組成および調製において、活性化合物の重量の少なくとも１%は含まれているべきである。組成および調製のパーセンテージはもちろん変えても良い、またその組成は簡便にユニットの重量の約５％ー約８０％までの間に合っても良い。そのような治療上有用な組成中の活性化合物量は、適切な投与量を達成させうるものである。本発明による好ましい組成あるいは調製は、経口投与のユニット形式が活性のある化合物の約０．１μgー２０００mg間に含有しているように形成される。
【００５７】
タブレット、錠剤、カプセルおよびその他同種のものはさらに下記のものを含む:トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチあるいはゼラチンのような結合剤;リン酸ジカルシウムのような賦形剤;コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸およびその他同種の分解物質;ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤;また、ショ糖、ラクトースのような甘味料あるいはサッカリンあるいはペパーミント、サリチル酸メチルのような香料あるいはチェリー風味。投与量ユニット形式がカプセルである場合、それは上記のタイプの用品に加えて、液体の担体を含んでいても良い。様々な他の物質がコーティングとして、あるいはそうでなければ投与量ユニットの物理的な形式を修飾するために存在しても良い。例えば、タブレット、錠剤あるいはカプセルはセラックで、または砂糖、あるいはその両方でコートされていても良い。シロップ又はエリキシル剤は、活性合化合物、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチルパラベンまたはプロピルパラベン、染料、香料としてのチェリーやオレンジ風味を含んでいても良い。もちろん、どのような投与量ユニット形式を調製するのに使用される物質は、薬学的に純粋で、使用された量において本質的に無毒であるべきである。さらに、その活性化合物は持続リリース調製および処方で組み入れられても良い。
【００５８】
ここに使用された「薬剤として利用可能な担体及び／又は希釈剤」は、全ての溶媒を含んでおり、ディスパージョン溶媒、抗生物質や抗菌物質でのコーティング、等張液あるいは吸収遅延溶媒その他同種のものも含む。薬剤活性物質に用いる溶媒の使用は、当業者によく知られている。どんな従来の溶媒あるいは物質も活性成分と不適合であれば除外され、それについて治療用組成物の中で使用することが熟考される。補助活性成分も組成物の中に組み入れることができる。
【００５９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のため投与量のユニット形式の非経口投与の成分を処方化するのは特に有効である。この中で用いられている投与量のユニット形式とは、哺乳動物を対象に治療を施した場合の投与量単位として物理的に個別の適合するユニットを指す（ここで、各ユニットは必要とする薬理学的担体と関連し、望まれる治療効果を産出するために計算された活性物質の予定量を指す）。本発明の投与量ユニット形式に対する記述は、(a)活性物質の特異的な特徴および達成された特定の治療効果、(b)肉体の健康が害される病気容態を被って生活をしている人の病気の治療のための活性物質の合成技術制限によって決定され又は依存する。
【００６０】
主要活性成分は、投与量ユニット形式中の適切な薬学的に利用可能な担体を備えた有効量中において簡便で有効な投与のために合成される。ユニット投与の形式は例えば、０．５μgー約２０００mgの範囲の量に主要な活性化合物を含むことである。割合を表記すると、活性化合物は、一般に担体の約０．５μg/mlで存在する。補助的活性成分を含んでいる組成の場合には、その投与量は、通常の投与量を参照にして及び該成分の投与方法によって決定される。
【００６１】
共有結合閉環アンチセンス分子の導入担体
本発明のアンチセンスの導入担体は、目的の細胞へ本発明のアンチセンス化合物の導入を促進する様々な化合物あるいは方法を含んでいる。本発明の中で使用される核酸導入方法あるいは担体は、以下のものを含むが限定するわけではない。カチオンリポソーム、PEG脂質、PEG、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、デンドリマー、ポリ(D、L-乳酸)、ビロソーム、エレクトロポレーション、magnetofection、naked  DNA、脂質-ポリカチオン-DNA(LPD)、folate-conjugated nanometric particles、カチオンのナノパーティクル(NP)結合型インテグリンαβ３標的リガンド、(修飾された)DNA結合型ウィルス、両親媒性の短いペプチド、遺伝子活性型マトリックス(GAM)、poly(alpha-(4-aminobutyl)- L-glycolic acid)(PAGA)、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、ゼラチン、アテロコラーゲン、poly((D), (L)-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)、シクロデキストリンを骨格とするポリマー、ヒスチジンおよびリジン(HK)のポリマー、糖標的とした(glycotargeted)導入システム、多孔性のポリマー微粒子およびこれらと同種のものである。
【００６２】
様々な導入システムは知られており、以下本発明の化合物の投与に用いることができる。例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、アンチセンス化合物を発現可能な組換細胞、受容体を介するエンドサイトーシス、レトロウィルスの一部あるいはベクターとしての核酸の作製、などである。導入方法は以下のものを含んでいるが、制限されない。皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口のルートである。化合物あるいは組成物は、任意の簡便なルートによって投与されても良い。例えば、インフュージョンあるいはポーラス投与注射、あるいは上皮または粘膜皮膚の内側 (例えば口内の粘膜、直腸あるいは腸管の粘膜など)による吸収による。また、他の生物学的活性のある物質と一緒に投与されても良い。投与は全体的でも良いし、局所的でも良い。本発明の薬剤化合物あるいは組成物を中枢神経系への導入は、脳室内、くも膜下腔内（くも膜下腔内への注射は脳室内へのカテーテル（例えば、Ommaya reservoirのようなreservoirの取り付けによって促進されても良い）への注射を含むあらゆる適合する手段が望ましい。肺投与は、例えば吸入器又はネビュライザーの使用、およびエアロゾル化試薬で製剤化することも適用可能である。
【００６３】
特定の実態形態において、本発明の薬剤アンチセンスの化合物あるいは組成物を局所的に治療に必要な場所に投与することが望まれる。これは以下の方法によって達成される。しかし、これは本発明を限定するものではない。例えば、外科手術中に局所インフュージョン、外科手術後の創傷包帯結合での局所使用、注射、カテーテルによる方法、坐薬による方法、シリコン膜、繊維のような膜を含む多孔性、非多孔性、ゼラチンでの移植方法である。好ましくは、本発明の抗体あるいはペプチドを含むタンパクを投与する際には、タンパクが吸収されない物質を使用することに注意しなければいけない。別の実施形態として、化合物又は組成物は、小胞特にリポソーム内で輸送できる。さらなる別の実施形態として、化合物又は組成物は、放出制御系内で輸送できる。また、別の実施形態では、ポンプが使用されてもよい。さらに、別の実施形態において、高分子材料を使用してもよい。
別の実施形態において、放出制御系は、全身投与のフラクションのみを要求する脳のような治療標的の近接に設置することが可能である。
【００６４】
組成物は、レシピエント動物に投与を許容することができる場合、あるいは、その動物への投与が適合している場合に、「薬理学的にあるいは生理学的に利用可能」と言う。そのような試薬は投与された量が生理学上重要な場合に「治療上有効な量」が投与されたと言われる。その物質が、レシピエント対象の生理的な変化を検出できた結果をもって、生理学的に重要であるといえる。
【００６５】
本発明はここに記述された特定の実施例によって範囲が制限されない。。確かに、ここに記述されたものに加えて、発明の様々な修正、先の記述及び添付図面から、当業者は明確に理解できる。そのような修正は、添付したクレームの範囲以内にあるように意図される。次の実施例は、本発明の実施例の提供であって、これによって発明の範囲の制限をうけるものではない。
【実施例１】
【００６６】
実施例1-細胞系および動物
ラット肝臓癌細胞系H4-IIEをATCC (American Type Culture Collection、米国)から得て、非働化した１０％FBS (fetal bovine serum)(JBI、韓国)、ペニシリン(100U/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)を含むEMEM培養液中において、温度３７℃、湿度５％のCO2インキュベーターで維持した。
【００６７】
オスのラットSprague-Dawley (SD)は日本SLC社から供給されたものを使用した。動物は、標準の餌および水を与え、そこへは自由に行き来できるようにし、6匹ずつグループとして飼育した。重さ２００ー２５０gのオスのラットSDをこれらの実験で使用した。ペントバルビタール の腹腔内注入(5mg/100gの体重)による麻酔の後に、腹部の正中線切り口から左の腎臓を露出させた。ラットは、TGF-β1 RiASあるいはコントロールオリゴを２４-ゲージカテーテル注射器を使用して逆行注射した後に、左腎臓近位の尿管の結紮を行った。
【実施例２】
【００６８】
実施例 2-ラットTGF-β1 RiASの作製
オリゴは、DNA自動合成機ExpediteTM8909 (Applied Biosystems、米国)を使用して合成された。AS オリゴのための標的部位は、DNAsis program (Hitachi Software、 米国)を使用して、２次構造の連続する重複するシミュレーションによって選択された (Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106(1996))。TGF-β1のアンチセンス配列およびスクランブルオリゴ配列は以下のとおりである:アンチセンス配列:5'-GAT CCA GGA CTG TGT GTG ATG TCT TTG GTT TTG TCA TAG ATT GCG TTG TTG CGG CCT G-3'(SEQ ID NO: 1)、スクランブル配列:5'-GAT CCG CTG TCG TGC TGG TCT TGA GTT AAT TCG TTG TTG TTG TCT GAG TTG GTA TGC G-3'(SEQ ID、NO:2)。表1を参照。
【００６９】
【表１】
2005529581.tif 000011
【００７０】
TGF-β1アンチセンスオリゴおよびスクランブルオリゴの両者はステム-ループ構造を形成すると考えられる。ステムは、互いのオリゴの両末端の相補的な配列によって形成される。ステムの5'末端は、配列5'-GATC-3'の一本鎖の４塩基を持つ。ステム-ループ構造を持つ２つのTGF-β1アンチセンスオリゴマーは、分子の5'末端に4つの相補的配列があることによって、リボン型アンチセンス分子を形成するように繋がる。T4 DNAリガーゼ(宝酒造、日本) の１ユニットを加えて、2分子対称共有結合分子を生成した。従って、TGF-β1 RiASは、2つのループおよび1つの介在するステムから成る。各ループは、TGF-β1のアンチセンス配列を含んでいる。RiAS オリゴは変性１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけられ、アクリルアミドゲル上でエキソヌクレアーゼIIIに対する抵抗性および流速度の遅滞を調べた。２つのスクランブルオリゴは、またリボン型コントロールオリゴ（便宜上、「SC RiAS」と表示する）を形成するために結合させた。
【実施例３】
【００７１】
実施例3-リポソーム/tat ペプチド複合体によるRiASのトランスフェクション
Opti-MEM (GibcoBRL、米国) １００μl 中の４μgDOTAP/DOPE (Avanti、米国) を、Opti-MEM 懸濁液、tatペプチド及びアンチセンスオリゴを含んでいるチューブ中に加えた。その混合液は、１０分間インキュベートした。１万の細胞が入った９６穴のそれぞれの穴に、１００μlの容量のオリゴ-tat-リポソームの３者複合体を処理した。アンチセンスオリゴは０．１あるいは０．３μgの量を使用した。H4-IIE細胞は５％CO2の濃度で、３７℃のインキュベーターで５時間インキュベートした。続いて、２０％FBSを含むOpti-MEMを１００μl加え、さらにアッセイまで１６時間３７℃でインキュベートを行った。
【実施例４】
【００７２】
実施例4-RNAの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)
トータルRNAは、TripureTM Isolation Reagent (Roche、米国)で単離した。トータルRNAを抽出するために、回収した細胞へ、Tripure 試薬０．４ml、１０μlグリコーゲン (1mg/ml)および８０μlクロロホルムを加えた。RT-PCRは、AccessTM RT-PCR kit (Promega、米国)の単一の反応チューブ中で行った。RNA、PCRプライマー、トリ骨髄芽球症ウィルス (AMV) 逆転写酵素 (5 units/μl)、Tfl DNAポリメラーゼ (5 units/μl)、dNTP (10 mM、1μ l)およびMgSO4 (25mM、2.5μ l)を、PCRチューブに加え、最終容量が５０μlになるように水を加えた。cDNAは、４８℃で４５分処理し、DNAサーマルサイクラー (MJ Research、米国)で増幅サイクル (94℃で30秒、56℃で1分、68℃で2分)を３０サイクルで増幅した。増幅されたPCR産物は、１．５%アガロースゲル上で確認し、gel documentation program (Bio-Rad、米国)を用いて定量化した。PCR産物はニトロセルロースメンブレンに写し、Fluorescein-11-dUTP (Amersham、米国)でラベルした内部オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行った。シグナルはECL検出キットを用いて検出した。
【実施例５】
【００７３】
実施例5-腎臓へのFITCオリゴヌクレオチドの導入
メーカーが推奨するLabelITTM fluorescein nucleic acid labeling kit (Mirus、米国) を使用して、一本鎖のオリゴにフルオレセインをラベルした。FITCでラベルしたオリゴ、tatポリペプチド、DOTAP/DOPEの複合体を含んでいる混合溶液を、尿細管を介して左側腎臓に注射した。その腎臓は、２４時間後に取り除かれ、液体窒素下において、Tissue-TekTM OCT compound (Miles、米国) に包埋した。灌流固定した腎臓の組織ブロックは１０μmの厚さで凍結切片にし、Poly-PrepTM slides (Sigma、米国)で標本した。その組織は顕微鏡観察のために、Synthetic MountantTM (Shandon、米国) で標本した。遺伝子導入の効率は、腎臓の凍結切片を蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【実施例６】
【００７４】
実施例 6-アポトーシスを検知するTUNELアッセイ
UUOを伴う腎臓の細胞において、断片化したDNAを検出するために、小さな改変が施されているin situ cell death detection kit (Roche、米国) を用いて、TUNELアッセイを行った。スライドは脱パラフィン化し、メタノール中０．３%H2O2を含むメタノールで、３０分間内在性のペルオキシダーゼ活性をクエンチングした。スライドは１０分間１０mMクエン酸バッファーで煮沸し、PBSでリンスをした後、フルオレセイン-dUTPでラベルしたデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)を加えて１時間インキュベートした。その反応は停止バッファーで止められた。その後、スライドはPBSで洗浄され、アルカリフォスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体で室温で３０分間インキュベートした。結合しなかった酵素結合抗体を洗浄により取り除き、そのスライドにNBT/BCIP (Sigma、米国) を加え、１ー５分間反応させた。陽性の腎臓の尿細管細胞は、高性能の顕微鏡の４００倍の視野で観察して数を数えた。
【実施例７】
【００７５】
実施例 7-TGF-β1の免疫染色
凍結切片は連続してBouin's fixativeで４℃で５分間、アセトンで-２０℃で１０分間、メタノールで１５分間、２％パラホルムアルデヒドで２分間、４％パラホルムアルデヒドで４分間そして７０％エタノールで１０分間インキュベートし、その後、エタノールで段階的に再水和させた。その組織切片はPBSで洗浄し、０．３% H2O2を含むメタノールでインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を取り除いた。ブロッキングは、１０％FBSを含むPBSで１時間行い、そしてその組織切片を０．５％BSA、２％FCSを含むPBS中において、抗TGF-β1抗体 (Santa Cruz Biotechnology、米国)を加えて４℃で一晩インキュベートした。翌日に、その組織切片にHRP結合抗ウサギ抗体（Sigma、米国）を加えて、室温で１時間インキュベートした。その組織切片はDiamine benzidine (Sigma、米国）で５分間インキュベートし、エタノールで脱水した後、顕微鏡観察前に、Synthetic MoutantTMで標本した。
【実施例８】
【００７６】
実施例 8-統計的解析
結果は、平均±標準偏差 (SD)として表示する。統計的な意義はスチューデント検定を用いて決定した。P<0.05を有意であるとした。
【実施例９】
【００７７】
実施例 9-結果
実施例 9.1-TGF-β1に対する安定したRiASオリゴの構築
メッセンジャーRNAは、細胞質中において、２次構造、３次構造を形成する。これらのmRNAの構造の複雑さは、RNA結合タンパクとの結合や、mRNA自信が持つ塩基配列同士で互いにペアを形成することにより生じる。この理由により、効果的な標的部位の選別はアンチセンスオリゴをデザインする重要な過程であると考えられている。我々は、連続し重複した方式での２次構造のシミュレーションは、標的mRNAの標的配列に沿ったアンチセンスを見つけるのに効果的に利用されうることを見出したことを以前に示した(Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106 (1996))。TGF-β1mRNAの全長は、効果的にアンチセンス分子が容易に利用可能なアンチセンス標的部位を探索するために調べた。
【００７８】
TGF-β1特異的なアンチセンスオリゴは、ステム-ループ構造を形成し、５'末端突出のGATCの配列を持つ。２つの同一のASオリゴが共有結合で繋がって、TGF-β1 RiASと呼んでいるリボン型アンチセンス分子を形成する（図１）。予想通りに二量体のTGF-β1 RiASは、単量体の一本鎖の前駆体と比較して、変性ポリアクリルアミドゲル上で、泳動速度が遅いことが示された（図２）。RiASオリゴは、エキソヌクレアーゼIIIに耐性で、ポリアクリルアミドゲル上で、メジャーバンド（１１６mer）として、観察された（レーン４）。対照的に、TGF-β1 RiASの一本鎖の前駆体は、２ 時間で、エキソヌクレアーゼIIIによって完全に分解された（レーン３）。これらの結果から、TGF-β1 RiAS分子は、リボン型の閉環構造をとっており、エキソヌクレアーゼによる攻撃を受けうる開いた末端の構造をとっていないことが説明される。
【００７９】
実施例 9.2-TGF-β1 RiASによるin vitroにおけるTGF-β1 mRNA特異的減少
次に我々は、TGF-β1 RiASが配列特異的に標的mRNAを効果的に除去することができるかを調べた。TGF-β1 RiASは、トランスフェクション効率を高めるためにtatペプチドおよびリポソームと複合体を形成させた。H4-IIEラット肝臓癌細胞に、TGF-β1 RiASあるいはSC RiASを、それぞれ０．１μgあるいは０．３μgをトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。トータルRNAは、トランスフェクションを行った細胞から単離し、TGF-β1 mRNAをRT-PCRによって増幅し、TGF-β1 RiASのアンチセンスの活性を調べた。TGF-β1 RiASで処理したH4-IIE細胞は、０．１μgで約３０％のTGF-β1 mRNAの減少を示し、０．３μgで７０％以上のTGF-β1 mRNAの減少をそれぞれ示した（図３A）。これとは対照的に、H4-IIE細胞をSC RiASで処理した場合、TGF-β1 mRNAの発現は有意な影響が見られなかった。コントロールとして図の下のパネルに示したGAPDHの発現は、TGF-β1 RiASの処理によって影響を受けなかった。これらの結果は、増幅したDNA断片の中間部分にハイブリダイズするDNAを用いてサザンブロッティングを行うことによって再度確認された（図３B）。
【００８０】
実施例 9.3-腎臓の組織中へのFITCラベルしたASオリゴの効率的導入
アンチセンス活性をin vivoでも効率的に達成するために、標的組織へのアンチセンスオリゴの効率的に取り込まれることが必要である。TGF-β1 RiASの５８mer一本鎖の前駆体分子は、FITCでラベルし、in vivoでの組織の取り込みのために使用した。FITCラベルした１０μgのアンチセンスオリゴは、２６-ゲージカテーテルを使用して、尿細管を介して左腎臓へ注射した。腎臓は、アンチセンス処理後６時間で回収し、細胞の取り込みを調べた。アンチセンスオリゴが、tatペプチド、リポソームと複合体を形成したとき、尿細管の上皮細胞で強い蛍光が観察された（図４A）。しかし、アンチセンスオリゴのみで、担体のリポソームを用いなかった時には、組織中の蛍光シグナルは検出されなかった（図４B）。偽物で処理を行ったコントロールの腎臓は蛍光シグナルを示さなかった。
【００８１】
実施例 9.4-TGF-β1 RiASによる組織損傷の有意な軽減
in vitroでTGF-β1 mRNAの効果的な減少が観察、そしてin vivoでのFITCラベルしたアンチセンスオリゴの効果的な組織への取り込みが観察された後、TGF-β1 RiASは、動物モデルにおいて、損傷した尿細管を効果的に防ぐことができるかを試みた。一側性の尿管の閉塞 (UUO)は、急速な尿細管の損傷を引き起こし、UUOを伴う腎臓は臨床関連の動物モデルシステムとして確立した。
【００８２】
【表２】
2005529581.tif 000012
【００８３】
6匹のSDラットが、近位輸尿管を介したTGF-β1 RiASのインフュージョンの後に、左側の近位輸尿管の結紮を行った。５日目に、左側と右側の両側の腎臓を回収した。それらの重量を計測し、その形態を観察した。腎臓の重量は、一個体の重量当たり腎臓重量のパーセンテージで示すと、偽物コントロールは0.47%±0.03、UUOを伴ったものは0.99%±0.10であった。UUO操作後の腎臓の重量には、顕著な増加が見られた。UUOを伴う腎臓は輸尿管注入によって、TGF-β1 RiAS処理された時、一個体の体重当たりの腎臓重量は、顕著に0.68%±0.09 (P<0.005)に減少したが、PBS処理単独のものでは、0.95%±0.08であり、スクランブルRiASでの処理では、1.07%±0.12であった。結果は、６匹のSDラット平均±標準偏差によるものである。UUOのみ、PBS＋UUOそしてSC RiAS＋UUOに対するTGF-β1 RiAS＋UUOのグループは、#P<0.005であった（表２）。コントロール腎臓は、互いのグループ間では、有意な違いは見られなかった。TGF-β1 RiASで処理した腎臓は、UUOのみ、UUOにその他のものを加えたコントロールの処理と比較して、肥大が見られなかった（図５）。さらに、UUOを伴ったラットのRiAS処理した腎臓の縦方向の切片は、全体の腎臓の構造の保持が見られたが、コントロールのグループのUUOで処理した腎臓においては、腎臓の髄質および腎乳頭の一部において腎実質の欠失が見られた。
【００８４】
実施例 9.5-免疫組織化学的手法および組織学的解析によって腎臓の微細構造の保持が示された。
【００８５】
我々は、配列特異的なアンチセンス活性および腎臓の微視的な構造の変化並びにTGF-β1 RiASによる腎臓への広範な損傷の有意な改善を観察した。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、偽物処理をしたコントロールグループ中の２匹の典型的なラットから腎臓を回収した。免疫組織化学は、UUOを伴った腎臓において、TGF-β1 RiASで処理することによりTGF-β1の発現が消失したかを調べるために行われた（図６A-６E）。TGF-β1の免疫組織化学によって、損傷した腎臓において、ポジティブな茶染色が明らかとなり、影響のあった組織において、TGF-β1の発現が増強されたことが示された。TGF-β1タンパクのポジティブ染色は、PBSやSC RiASで処理したUUOを伴った腎臓において同様に検出された。これとは対照的に、TGF-β1はTGF-β1 RiASで処理したUUOを伴った腎臓においてはるかに減少していることがわかった（図６E）。
【００８６】
UUOを伴った腎臓の顕著な物理的特徴は、増強TGF-β1の発現を介して尿細管の萎縮あるいは肥大である。UUOを伴った腎臓の切片をPAS染色し、光学顕微鏡で観察したところ、急速に促進された様子で皮質や髄質の中間の空間が増大したことがわかった。大多数の腎臓の尿細管は、肥大しており、いくつかの尿細管においては上皮の扁平化がみられた（図７A-７E）。それとは対照的に、PBS、SC RiAS、偽物で処理したUUOを伴ったコントロール腎臓の切片においては、広範囲で尿細管の萎縮および肥大がみられ、TGF-β1 RiASで処理したグループにおいては、有意に萎縮や肥大が消失していた。予想されたとおり、偽物処理したラットのコントロール腎臓の切片は正常に見えた。
【００８７】
実施例 9.6-in situ TUNELアッセイで検出されたアポトーシス細胞死の減少。
【００８８】
UUOを伴った腎臓が、尿細管の広範囲な萎縮および肥大を示すので、我々は、腎臓の尿細管の細胞はアポトーシスを受けているか否かを調べた。UUOを伴った腎臓が、TGF-β1 RiASで処理されると、アポトーシス細胞は腎臓の尿細管の細胞において、他のコントロール処理をしたものと比較してそれほど大量に存在しないことがわかった（図８A-８E）。正常腎臓において、アポトーシスポジティブ細胞数は3±3.3 細胞数/顕微鏡視野 (400X)（以下、単に細胞数と略す）、偽物処理した腎臓において、アポトーシスポジティブ細胞数は、280.9±24.6細胞数であった。TGF-β1 RiAS処理は、尿細管のアポトーシスポジティブ細胞数を、21.3±12.1細胞数レベルにまで減少させた (P<0.001)。これとは対照的にUUOを伴ったグループでは、SC RiAS処理したものでは236.8±29.6細胞数、PBS処理したものでは260.4±41.3細胞数のレベルで尿細管のアポトーシス細胞数は増加していた。
【００８９】
ここに引用された参照はすべて、参照として全体をここに組み入れられる。
【００９０】
当業者は、前記記載で開示された概念および特定の実施態様は、本発明の同一な目的を遂行するのために異なる実施態様を修飾するまたは設計するための基礎として容易に利用出来ると考えるであろう。また、当業者は、そのような等価な実施態様は、請求の範囲から逸脱しないものであると考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
本発明は、詳細な記述、実例として添付した図面によって、より完全に理解されるだろう、しかしながらそれらに本発明は限定されるもではない。
【００９２】
【図１】TGF-β１に対するリボン型のアンチセンス分子（以下、「TGF-β1 RiAS」と称する場合がある）、特に、116-mer (SEQ ID NO: 3)を示す。TGF-β1のモノマーのオリゴ (SEQ ID NO: 1)は、ステム-ループ構造をとることが予想される。そのステムは互いのオリゴの両末端の相補的配列によって形成される。そのステムの５'末端は5'-GATC-3'の４塩基からなる一本鎖の突出した構造を持つ。２つのTGF-β１モノマー分子は２分子対称による共有結合閉環アンチセンス分子を形成するように繋がる。RiASオリゴは、２つのループおよび１つの介在ステムからなる。各ループは、TGF-β１に対するアンチセンス配列を含んでいる。
【図２】TGF-β1 RiASオリゴのエキソヌクレアーゼIIIに対する耐性を示す。オリゴは変性１５％ポリアクリルアミドゲルで分析した。レーン１；５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン２；１１６mer TGF-β1 RiAS、レーン３；エキソヌクレアーゼIIIで処理した５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン４；エキソヌクレアーゼIIIで処理した１１６mer TGF-β1 RiAS。
【図３】A-Bは、TGF-β1 RiASによるTGF-β1 mRNA特異的な減少を示す。細胞にオリゴ（０．１あるいは０．３μg）-tat-リポソームの三量体からなる複合体をトランスフェクトし、後にRT-PCRアッセイに用いた。（A）RT-PCRはTGF-β1 RiASのアンチセンス活性を測定するために行った。（B）下のパネルに見られるバンドが、内部でハイブリダイズするプライマーをプローブとしてサザンブロッティングを行った結果である。レーン１；偽物、レーン２；TGF-β1 RiAS ０．１μg、レーン３；TGF-β1 RiAS ０．３μg、レーン４；SC RiAS ０．１μg、レーン５；SC RiAS ０．３μg
【図４】A-Bは、輸尿管を通し、腎臓へアンチセンスオリゴが運搬されることを示す。３'末端をFITCでラベルしたアンチセンスオリゴは、尿管結紮後、輸尿管を通して左側の腎臓にインフュージョンした。灌流固定した複数の組織を凍結切片にし、該組織は、顕微鏡観察（倍率  ２５０倍）するため、シンセティックマウンタント（synthetic mountant)で標本にした。A、tatペプチドおよびリポソームと複合体を形成したFITCオリゴ；B、FITCオリゴ単独
【図５】２匹の代表的なラットのUUOを伴う腎臓の縦方向への切片を示す。麻酔をしたオスのSDラットに輸尿管を通してTGF-β1 RiAS、あるいはコントロールをインフュージョンした。５日目に、縦方向への切片を作製した後、形態的な変化を検査、分析した。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図６】A-Eは、抗TGF-β1抗体によるTGF-β1の免疫組織化学的染色を示す。免疫組織化学的染色は腎臓組織の凍結切片を用いて行った。固定し、脱水処理をした組織は、顕微鏡観察の為にシンセティックマウンタントで標本にした。ブラウン染色によりTGF-β1の存在を示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図７】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓 において尿細管が萎縮および肥大した組織学的観察を示した。尿細管の萎縮および肥大は、PAS染色した組織切片で示された。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、尿管の閉塞のみのもので、それぞれ処理した腎臓の切片を、尿細管の萎縮および肥大を見るために示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図８】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓において、アポトーシス細胞の検出を示す。TUNELアッセイは腎臓の尿細管細胞のアポトーシスの度合いを決定する為に行われた。UUOを伴った腎臓は、TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、UUO単独の条件のもので処理された。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  WELGENE, INC.
Park, Jong-gu
Moon, Ik-Jae
Choi, Young-kook
Park, Kwankyu
<120>  TGF-BETA-SPECIFIC COVALENTLY CLOSED ANTISENSE MOLECULE
<130>  4-1080786
<140>  PCT/IB02/05685
<141>  2002-12-30
<150>  KR 10-2001-0086765
<151>  2001-12-28
<160>  5     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  58
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctg       58
<210>  2
<211>  58
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Scramble sequence
<400>  2
gatccgctgt cgtgctggtc ttgagttaat tcgttgttgt tgtctgagtt ggtatgcg       58
<210>  3
<211>  116
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  ribbon-type antisense molecule specific for TGF-beta 1
<400>  3
gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctgga     60
tccaggactg tgtgtgatgt ctttggtttt gtcatagatt gcgttgttgc ggcctg        116
<210>  4
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 
1               5                   10              
<210>  5
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 
1               5                   10          
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月23日(2005.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】誤訳訂正書
【補正対象項目名】誤訳訂正２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGF-βを標的とする共有結合閉環アンチセンス分子を使用するバイオテクノロジーおよび特にアンチセンス療法の分野に関するものである。本発明は、また細胞にアンチセンス分子を導入する方法にも関するものである。本発明は、さらに、TGF-βが産生されることによって引き起こされる疾病を治療する方法にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスタンパク(ECM)の蓄積によって特徴づけられる腎臓の尿細管間質性の繊維症は、進行性の腎疾患の共通の結果としてみられる(Kuncio et al., Kidney Int. 39, 550-556(1991))。一側性の尿管の閉塞(UUO)を伴う腎臓閉塞は、尿細管間質性繊維症による腎臓の傷害を起こす動物モデルのシステムとしてよく確立されている(Klahr et al., Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿管の結紮による機械的な障害は、水腎症、腎実質の欠失、および尿細管の肥大、萎縮およびアポトーシスのような変化を引き起こす(Gonzalez-Avila et al., Pathobiology 66, 196-204(1998); Truong et al., Kidney Int. 50, 200-207(1996))。尿細管間質性の繊維症の進行の基礎的なメカニズムは完全には解明されていないが、UUOを伴う腎臓中の多数のサイトカインが尿細管間質性の繊維症を仲介するものとされている。これらのサイトカインの中で、形質転換成長因子-β1(TGF-β1)が、腎臓の繊維症で重要な働きをしていることが、糸球体硬化症および尿細管間質性の繊維症によって証拠づけられるている(Schiffer et al., J. Clin. Invest. 108, 807-816(2001); Wang et al., Kidney Int. 60, 96-105(2001))。TGF-β1は、正常な修復のための組織損傷に応答するECMの蓄積に関係し、プロテオグリカン、コラーゲン、フィブロネクチンおよび糖タンパク質のようなECMの異常な過剰生産による繊維症変化に関わっている(Branton et al., Microbes Infect. 1, 1349-1365(1999); Okuda et al., J. Clin. Invest. 86, 453-462(1990))。TGF-β1は、プロテアーゼ阻害剤の合成を促進することにより、また、マトリックス分解プロテアーゼの合成を抑制することにより、新たに合成されたマトリックスタンパクの分解を阻害する。したがって、TGF-β1の産生あるいは機能を効果的に遮断することは、いくつかの報告から提示されているとおり、繊維化する条件を妨げる有効な方法であると考えられる(Border et al., Nature 360, 361-364(1992); Akagi et al., Kidney Int. 50, 148-155(1996); Isaka et al., Nat. Med. 2, 418-423(1996); Isaka et al., Kidney Int. 55, 465-475(1999))。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(antisense oligonucleotides、以下「アンチセンスオリゴ」と称する)は、塩基配列特異的な遺伝子発現の減少により、遺伝子産物に関する機能的な研究において有用であった。しかしながら、オリゴヌクレオチドの使用には、ヌクレアーゼに対する不安定性、配列非特異的および細胞の取り込み効率の低さのようないくつかの重大な問題がまだ残っている。ホスホロチオネート(phosphorothioate) オリゴヌクレオチドやメチルホスホネート(methylphosphonate) オリゴヌクレオチドのような様々な化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために開発された。しかしながら、それぞれ修飾を受けたオリゴヌクレオチドは、配列特異性の欠如や、RNaseHの非感受性、および部分トロンボプラスチン時間 (partial thrombosis time)の延長をきたすなど、自身が抱える問題もある。さらに、再利用加水分解修飾ヌクレオチドが、ゲノムDNAの修復や複製の際にゲノムに取り込まれてしまい、ゲノムDNAの変異を引き起こす原因となる恐れがあった。我々が以前に報告した、共有結合閉環構造をしているリボン型のアンチセンス(ribbon-type antisense、以下「RiAS」と称する)-オリゴは、非常に安定で、標的c-myb mRNAの特異的な切断において、効果的な働きを示した。そして、他の修飾されたアンチセンスオリゴに関連してみられた問題は殆ど持っていなかった (Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); and PCT/KR00/00305)。これらは参照として、ここの全体に組み入れられる。
【０００４】
米国特許第5,683,874号において、共有結合閉環タイプの核酸配列を形成するには、平行あるいは逆平行な核酸配列が三重らせん構造を形成するループの反対側に存在することが必要であることを開示している。しかしながら、そのような構造は、主としてゲノムのプロモーター領域に結合するのには有用であるが、RNaseHによる標的分解のための相補的mRNAの結合には有用でない。このように、米国特許第5,683,874号では、そのような平行および逆平行の配列を伴っているあるいは伴っていない、共有結合閉環アンチセンス構造は、標的の核酸の発現を効果的に切断することを開示又は示唆もされていない。
【０００５】
アンチセンスオリゴの細胞への取り込みは、リポソームと複合体を形成することにより、増強することができる。リポソームは低毒性、免疫原性の欠如および生産の単純性のようないくつかの長所を持つが、リポソームは比較的細胞への取り込み効率が低いことが示されている。ヒト免疫不全ウィルス (HIV)のtatポリペプチドのトランスダクションドメイン (transduction domain)を融合させたタンパクは、効率良くマウスの全ての組織、脳を含めても導入されることが示されている (Schwarze et al., Science 285, 1569-1572(1999))。リポソームの表面に共有結合でtatペプチドを結合させると、細胞内への輸送が増加する (Torchilin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8786-8791(2001))。さらに、tatタンパクの小さな領域である、２つのリジンと６つのアルギニンを含む49から57残基が、核内での局在化する性質をもつ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アンチセンス分子を効率よく導入するためのシステムとともに、特異的で安全で効果的な治療のためのアンチセンス分子をこれからも作る必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記の必要としている事項を満たしている。
【０００８】
発明の一つの特徴として、TGF-β1を特異的に標的とするRiAS分子 (TGF-β1 RiAS)に関する。もう一つの発明の特徴は、TGF-β1 RiASが腎臓での繊維症および組織の損傷を防ぐことが出来るかをアンチセンス活性としてテストし、設計したことである。さらに一つの本発明の実施形態として、アンチセンス分子を導入するための混合物の細胞への取り込み効率の改良に関する。特に、TGF-β1 RiASをtat様ペプチドと混合し、それからリポソームとの複合体を形成させることである。TGF-β1 RiASとtatあるいはtat様ペプチドとカチオンリポソームの三者複合体は、TGF-βの発現を阻害するのに効果的であること、そして、UUOを伴った腎臓の組織の整合性を保つことがわかった。
【０００９】
本発明は、TGF-βの発現を特異的に阻害する精製共有結合閉環アンチセンス分子に関する。共有結合閉環アンチセンス分子は、ステム構造により分離した少なくとも２つのループを持っていてもよく、１つのループは、TGF-β発現を阻害する標的アンチセンス配列を含むでいる。この場合、TGF-βは特にTGF-β1でも良い。
【００１０】
上述した共有結合閉環アンチセンス分子は、SEQ ID NO:1と実質的に相同配列を含んでいても良い。
【００１１】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子形成のために互いに実質的に相同的な5'側、3'側のどちらか一方あるいは両末端を持つステム-ループ構造による少なくとも２つの直鎖アンチセンス分子を互いに結合することを含む上述したアンチセンス化合物を作製する方法にも関する。この方法において、直鎖アンチセンス分子は、同一の標的となる核酸、あるいは異なった標的となる核酸にとって、特異的でも良い。しかし、一つの特徴として示しているのであって、これに限定されるわけではく、配列の長さや、相補的な領域は、約１−１００塩基、１ー５０塩基、１ー２０塩基でも良い。
【００１２】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子とTGF-β発現細胞を一緒にすることを含んだサンプルの接触方法を含んだTGF-βの発現阻害方法に関する。
【００１３】
本発明は、上記述べた共有結合閉環アンチセンス分子を必要とする対象に投与することを含むTGF-βの発現によって引き起こされる容態の治療方法に関する。その容態は、限定されるものでなく、繊維症、腎臓の繊維症、尿細管間質性の繊維症、肝繊維症、肺繊維症でも良い。
【００１４】
本発明は、上述した共有結合閉環アンチセンス分子を含む組成物投与を含む一側性の尿管の閉塞の治療方法に関する。
【００１５】
本発明は、また上述した共有結合閉環アンチセンス分子の投与を含む損傷部位における細胞外マトリックスタンパクの蓄積を防ぐ方法に関する。
【００１６】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチド及び担体組成物を含む組成物に関する。その担体は、リポソームであってもよいし、共有結合閉環アンチセンス分子は、TGF-βを標的としても良い。
【００１７】
本発明は、共有結合閉環アンチセンス分子、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物を含む組成物を細胞への接触方法を含む共有結合閉環アンチセンス分子を細胞へ導入する方法に関する。本発明の一つの特徴として、tatあるいはtat様ペプチドおよび担体組成物は、細胞に接触させる前に混合しても良い。
【００１８】
本発明のこれら又はその他の対象は、ここに添付された参照とする図面、付属する請求項及び以下の発明の記述から、もっと完全に理解されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本願発明において、単数形で書かれているものは、単数のものにも、複数のものにも適用される。
【００２０】
ここで用いられている「アンチセンス」あるいは「AS」という用語は、アンチセンス核酸（DNAあるいはRNA）あるいはそれらの類似体を意味し、標的配列あるいは標的配列の核酸塩基と水素結合相互作用による配列部分のポリヌクレオチドを認識する核酸塩基の範囲をもつ化学種の範囲を意味する。その標的配列は、一本鎖若しくは二本鎖RNAまたは一本鎖若しくは二本鎖DNAでも良い。
【００２１】
そのようなRNAあるいはDNAは限定するわけではないが、以下のような類似体を含む。2'-Oアルキル糖修飾、メチルホスホネート（methylphosphonate）、ホスホロチオネート（phosphorothioate）、ホスホロジチオネート（phosphorodithioate）、ホルムアセタル（formacetal）、３'-チオホルムアセタル（3'-thioformacetal）、スルホン（sulfone）、スルファミン酸塩（sulfamate）および窒素酸化物（nitroxide）バックボーン修飾、塩基部分が修飾されたアミドおよび類似体。さらに、分子の類似体は、限定するわけではないが、糖の部分が他の適切な部位によって修飾又は置換によって、結果としてモルホリノ類似体やペプチド核酸（peptide nucleic acid）類似体を含むポリマーであっても良い。そのような類似体は、RNaseHが介する標的RNAの分解、結合親和力、ヌクレアーゼ耐性、あるいはまた標的特異性の向上のために糖や塩基の連鎖群あるいはまた構造的な修飾を含む上記のような修飾の様々な組み合わせを含む。
【００２２】
ここに使用される「アンチセンス療法」は、in vitro あるいは in vivoにおいて、RNA配列を標的として不活性化あるいは切断する標的遺伝子のアンチセンスの断片を含む特異的に結合する共有結合閉環アンチセンス核酸分子を含む総括的な遺伝学的用語である。
【００２３】
ここで使用される「細胞増殖」は細胞分裂を意味する。用語「成長」は、ここに使用されたとおり、細胞分裂がより早いため、あるいは、例えば細胞死のようなアポトーシスの割合がより遅いために、細胞の数が増加する両者の意味を包含する。制御不能となった細胞分裂は、ガンあるいは異常な細胞タイプのマーカーである。通常、非ガン細胞は規則的に分裂を行い、細胞の種類に特異的な特徴を見せる場合がしばしばある。例えば、細胞が悪性腫瘍に形質転換したとき、制御不能な細胞分裂および増殖が起きる。さらに、損傷後においても、細胞外細胞マトリックスは成長しすぎる。増殖あるいは成長の阻害は制御不能となった細胞の増殖あるいは組織密度の形成を調節する。
【００２４】
ここで使用される「繊維症」は、前段階である組織損傷あるいは疾病に反応して、高密で堅い瘢痕組織を生み出すことを意味する。
【００２５】
ここで使用される「遺伝子」は、遺伝子の完全なヌクレオチド配列、あるいは遺伝子の配列部分を意味する。
【００２６】
ここで使用される用語「阻害」および「減少」は、遺伝子発現、細胞増殖、組織成長あるいは他の表現型の特性の低下を示すためのものと同義的に使用される。
【００２７】
ここで使用される「実質的相補的」は、それ自体が標的RNAと相補的あるいは特異的に結合するアンチセンス複合体と約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性があるアンチセンスの配列を意味する。一般的には、完全相補は要求されない。どのようなアンチセンス分子も適当と考えられる標的核酸との安定な２重鎖、３重鎖を形成するのに十分な相補性を持っている。それゆえ、安定な２重鎖の形成は、配列およびハイブリダイズするアンチセンス分子の長さおよびアンチセンス分子と標的配列の相補性の度合いに依存するので、従来用いられるおよそ１３塩基から３０塩基からなる短い直鎖状のオリゴヌクレオチドより大きなものが相補性において適応度が低くても、寛容なシステムとなる。
【００２８】
ここで使用される「実質的相同」とは、他の核酸に対して約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%あるいは99%の相同性がある核酸配列を持つことを意味する。あるアンチセンス分子が同一の標的となる別のアンチセンス分子と実質的相同配列を持つということは、重要なのは実質的相同分子が標的に対する阻害活性を示すことであり、これが実質的相同分子の機能的な能力である。
【００２９】
３重鎖構造の形成が本発明の範囲内にあってもよい一方、そのような形成が本発明の有利な特徴を実行し得るために必要ではないことは理解できる。例えば、米国特許第5,683,874号に開示されているような、ループの反対側の平行あるいは逆平行の配列をもつオリゴヌクレオチドのループ構造を設計することは、必要ではない。
【００３０】
ここに使用される「標的」あるいは「標的とする」ことはアンチセンス分子が作られる特異的な個々の遺伝子を意味する。ある状況においては、「標的とする」ことは結合することを意味し、あるいは標的遺伝子の発現が失われるようにするために内在性の発現の転写産物にアンチセンス分子を結合させる結果となることを意味する。その標的ヌクレオチド配列は、TGF-β（とりわけTGF-β1）に属する遺伝子を含む遺伝子の異常な発現から引き起こされる免疫疾患、感染症、代謝異常、遺伝病、繊維症、あるいは他の疾病のような様々な疾病の開始や進行に関わる遺伝子を含むさまざまな悪性腫瘍に関連する遺伝子から選別されてもよい。
【００３１】
本発明のアンチセンス分子は、生化学的あるいは生物学的な活性をもつ従来の直鎖状の合成AS-オリゴより優れたものとして見出された。一方、従来のAS-オリゴはDNAシンセサイザーで、容易に合成することが可能であるが、それらは標的部位の選別を必要とする。その標的部位の選別過程は、よく「AS-オリゴの設計」といった用語で表現される。この過程は、時間を消費し、しばしば決定的でない場合がある。さらに、合成したAS-オリゴはヌクレアーゼに対して不安定で、頻繁な配列の間違いが起こり、高い生産費用を要し、リポソームと複合体とした後でさえも、細胞への取り込みが低い。
【００３２】
ここで使用される「tatペプチド」あるいは「tat様ペプチド」は関連する用語である。特に、tatペプチドは可能性のある修飾を受けているtatタンパクの一部を意味する。tat様ペプチドは、tatペプチドとして似たような態様で細胞中の核酸の挿入を促進するペプチドを意味する。一つの特徴として、tat様ペプチドは良く似た配列を有していても良い、もう一つの特徴として、tatペプチドは本発明のアンチセンス複合体の細胞への導入が促進される限り、立体的にあるいは電荷が類似している特徴を有しても良い。本出願の全体にわたって、tatペプチドは細胞へのアンチセンス分子の取り込みを促進するものとして用いられ、tat様ペプチドも同様の意味で用いられると考えられる。
【００３３】
TGF-β1
TGF-β1は、ジスルフィド結合によって、互いに結合する１２．５kDaのサブユニット２つで構成される、２５kDa のホモダイマーである。TGF-β1は、元来ラットの繊維芽細胞の形質転換の表現型を引き起こす能力によって定義された。TGF-β1は、細胞および用量に依存的活性な複数の働きをもつサイトカインである。TGF-β1は多くの細胞において、成長を阻害するものとして働くが、いくつかの細胞のタイプにとっては、成長を促進する働きをもつものとして機能する。TGF-β1は、生体の至る所に分布している。TGF-β1のレビューとしては、 Massague, J. Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597. (1990); Letterio et al., Ann. Rev. Immunol. 16, 137 (1998)を参照できる。TGF-β1は、広範囲な細胞のタイプにおいて制御する効果を示し、胚発生、骨形成、哺乳類の発生、損傷の治癒、造血（haematopoiesis）、血管新生（angiogenesis）、細胞周期の進行そして、細胞外マトリックスの産生を調節している。免疫系において、TGF-β1はT細胞、B細胞の増殖を阻害し、in vitroあるいはin vivoの両方において、抗炎症機能を持つ分子として働いている。TGF-β1は、マクロファージの成熟および活性化を阻害し、ナチュラルキラー細胞やリンフォカイン活性化キラー細胞(lymphokine-activated killer cell）の活性化をも阻害し、そしてサイトカイン産生をブロックする。
【００３４】
事実上、すべての細胞は、細胞の様々な機能を制御するTGF-β1の受容体を持っている。TGF-βに結合する９つの膜タンパクが、現在までに同定されている（８つが再調査された）。これらの中で、もっとも広範に分布しているのが、TGF-β受容体IとIIでそれぞれ、５３kDa、７０kDaの分子量のタンパクである。タイプI型の受容体及び／又はタイプII型の受容体の欠失は、TGF-βの細胞反応性への欠失と相関する。タイプII型の受容体はクローニングされ、機能的なセリン/スレオニンキナーゼドメインを含むことが示されている。TGF-β1はin vivoにおいて不活性型で産生され、その後に25kDaの成熟したダイマーを形成し、７５kDaのプロペプチドダイマー（a latency-accociated propeptide）と非共有結合する。TGF-β1はマウス、ウシ、ブタ、アカゲザルの細胞で種を越えて交差反応する。
【００３５】
形質転換成長因子-β (TGF-β) のスーパーファミリー
形質転換成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーは、胚発生の間の広範囲な分化の過程に影響を与える構造上関係するタンパクのグループを含む。そのファミリーは以下を含んでいる、しかし限定はされない。正常な男性の性発生に必要とされるミュラー管抑制物質（Mullerian inhibiting substance; MIS）(Behringer et al., Nature, 345:167, 1990)、成虫原器の背腹軸形成や形態形成に必要とされるショウジョウバエdecapentaplegic（DPP）遺伝子産物 (Padgett et al., Nature, 325:81-84, 1987)、卵の植物極側へ局在するアフリカツメガエルVg-1遺伝子産物 (Weeks et al., Cell, 51:861-867, 1987)、アフリカツメガエル胚の中胚葉の形成や前方構造の形成を誘導可能なアクチビン(Thomsen et al., Cell, 63:485, 1990)  (Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135:957-964, 1986)、デノボ軟骨 (de novo cartilage)や骨形成を誘導可能な (Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265:13198, 1990) 骨形成タンパク（BMP; BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7そして-8、オステオゲニン (osteogenin)、OP-1）。TGF-β遺伝子産物は、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、造血作用、上皮細胞の分化を含む (for a review, see Massague, Cell 49:437, 1987) 様々な分化過程で影響を与えることが可能であり、それは参照として、全体がここに組み入れられる。
【００３６】
TGF-βスーパーファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆タンパクとして合成され、順次その前駆タンパクのC末端側からおよそ１１０ー１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターで、タンパク質分解を受ける。タンパク質のC末端領域は全て構造上関連づけられ、異なるファミリーのメンバーは、その相同性の程度に基づいて別個のサブグループに分類することができる。独自のサブグループ内の相同性は、７０％から９０％のアミノ酸配列の同一性にまで及ぶが、２０％から５０％まで一般的に変動して、サブグループ間の相同性は著しくより低い。どちらの場合においても、活性型のものにはC末端側の断片のジスルフィド結合によるダイマーの形成であるように思われる。研究されたほとんど多くのファミリーにおいて、ホモダイマーに生物学的な活性が見出されたが、インヒビン(Ung et al., Nature, 321:779, 1986)や、TGF-β'S (Cheifetz et al., Cell, 48:409, 1987)のような、その他のファミリーにおいては、ヘテロダイマーが検出され、それぞれのホモダイマーに比べて、異なった生物学的な特徴をもつように思われる。
【００３７】
TGF-β遺伝子のスーパーファミリーメンバーは、以下のものを含むが限定されない。TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4（ニワトリ）、TGF-β1、TGF-β5（アフリカツメガエル）、BMP-2、BMP-4、ショウジョウバエDPP、BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、ショウジョウバエ60A、GDF-1、アフリカツメガエル Vgf、BMP-3、Inhibin-βA、Inhibin-βB、Inhibin-αそしてMIS。これらの遺伝子については、Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998で議論されている。それは参照として、全体がここに組み入れられる。
【００３８】
TGF-βタンパク質のスーパーファミリーメンバーは、TGF-βとするのが好ましい。より好ましくは、そのメンバーは、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7あるいはBMP-8である。さらにより好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-βのメンバーである。よりさらに好ましくは、ヒトあるいはブタのTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3のメンバーである。最も好ましいのは、ヒトあるいはブタのTGF-β1のメンバーである。
【００３９】
共有結合閉環アンチセンスオリゴ
アンチセンス療法の分野における一般的通念として、長いアンチセンス分子を用いることは奨励されていない。なぜなら、長くなればなるぼどAS-オリゴは特異性が低下し、合成するのが困難となり、細胞への取り込みが低下する傾向にあると考えられていたからである。実際、ホスホロチオエート（phosphorothioate）修飾されたオリゴのような、化学的に修飾した２次生産物であるAS-オリゴは、AS-オリゴの長さが長くなるに伴って配列特異性が低下した。さらに、直鎖状のAS-オリゴの合成は、次第に困難になり、配列の忠実度はAS-オリゴの長さが長くなるにつれて著しく低下する。他方、共有結合閉環アンチセンスオリゴヌクレオチド分子はその分子が長くなっても、追加された標的部位を含んでいても、短い直鎖状のオリゴヌクレオチドと比較して優れた安定性を示した。
【００４０】
本発明のRiAS オリゴは、同一、異なる遺伝子、又は一つの直鎖オリゴヌクレオチド内の複数を標的としたアンチセンスを所有する少なくとも２つの直鎖状のオリゴヌクレオチドを結合することにより形成されても良い。結合は、両末端でも良く、好ましくはリン酸化された5'末端であり、該5'末端の数塩基が結果としてリボン型のオリゴヌクレオチド形成を起こすハイブリダイゼーション及び結合のために互いに実質的相同になっている。分子の長さは、特に限定されないが、約２０ー１０００塩基、約２０ー７００塩基、約２０ー６００塩基、約２０ー５００塩基、約２０ー４００塩基、約２０ー３００塩基、好ましくは、約２０ー１５０塩基、もっと好ましくは２０ー１２０塩基からなる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、TGF-β1 mRNAに対するリボン型アンチセンスが配列特異的な様式で標的mRNAを除去し、UUOを伴う腎臓の全体の組織の損傷を緩和することが示された。本研究の成果は、TGF-β1 RiASオリゴが、組織の繊維化あるいはUUOの容態と密接に関係する様々な腎臓の疾病の治療薬として用いられるかもしれないことを示唆する。本研究結果は、リボン型のアンチセンス分子は選りすぐれた特性を持つことを示す。TGF-β1 RiASの効果的な尿細管上皮細胞への導入は、尿細管のTGF-β1の発現を効果的に抑制することができる。そして、それによって、UUOを伴う腎臓での萎縮、肥大そしてアポトーシスを含む一連の尿細管の損傷をブロックする。
【００４２】
TatおよびTat様ペプチド
一般に、アンチセンスオリゴは、その重合体の骨格に陰イオンの電荷を持つので、細胞への取り込みが低いことが示されている。オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みはリポソームとの複合体と一緒にすることで、十分に改良可能である(Wheeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11454-11459(1996))。しかし、リポソームを含む非ウィルス性の運搬媒体では、特に初代培養の多くの細胞のタイプを満足させる効率的な取り込みは示さない。このように、改良したトランスフェクション試薬を開発することは、in vitroでの細胞系統の研究およびin vivoでの応用の両方において有用である。我々は、アンチセンスオリゴ、tat様ポリペプチドそしてリポソーム若しくはRiASオリゴの細胞への取り込みを増強するその他の担体を含む単純な混合物のシステムを発明した。tatタンパクの短い断片は、核酸縮合、膜貫通、核移行の特性を持つことが示された。これらの特性は、共役タンパクと同様にヌクレオチド分子の細胞への取り込みの増強においても有効であるかもしれない(Efthymiadis et al., J. Biol. Chem. 273, 1623-1628(1998); Schwartz et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 162-167(2000))。tatペプチドは、SV40 large T 抗原ペプチドと同様な性質の短鎖ペプチドと比較してもより効果的であるものとして見出されている(他に報告されているデータより)。
【００４３】
本発明において、特に例示したtatペプチドは、アミノ酸配列:RKKRRQRRRPPQC（配列４）を持つ。しかし、本発明のtatタンパクの範囲で他の配列も含まれると理解される。例えば、RKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO: 5)(tatタンパクの４９ー５９）が使用されても良い。さらに、８６tatタンパクも使用されても良い。tatペプチドへの修飾は許容されるが、RKKRRQRRRPPQのカルボキシル基の修飾（例：tat-RGD）のようなものに限定されるものではない。さらに、tatタンパクの第一エクソン部分の（４８ー７２アミノ酸）のような他の配列も使用されても良い。
【００４４】
本発明の別の特徴は、他のtat様ペプチドが使用されても良い。Antp、W/R、NLS、AlkCWK16、DiCWK18、Transportan、K16RGD、VP22、SCWKn、(LARL)n、HA2、RGD、Lオリゴマー、SV40等に限定されるわけではないが、細胞中へのアンチセンス化合物の取り込みを促進するペプチドである限り、使用できる。
【００４５】
本発明の実施態様の一つとして、担体はtatあるいはtat様タンパク、あるいは他の担体ペプチドに共有的に結合されても良く、あるいは、tatあるいはtat様タンパクあるいは他の担体ペプチドと複合体又は混合体を形成しても良い。
【００４６】
TGF-β1と関連づけられる疾病
本発明は、TGF-β1発現によって起こされる疾病、又は症状の治療若しくは緩和がある部位でのTGF-β1発現の休止によってもたらされる疾病の治療並びに予防に関する。そのような疾病は下記のものでも良いが、これらに限定されるわけではない。強皮症のような皮膚の損傷、骨髄増殖性の障害のような骨髄繊維症、腎臓の繊維症、肝繊維症、肺繊維症、化学療法/放射線が引き起こした繊維症、狭窄、移植（同種移植片拒絶）、ペイロニー病、慢性膵炎、血管性の疾病、肝硬変（アルコール、HCV）、喘息、肺気腫、腸疾患、クローン病、ゴーシェ病、血管性の病気、拡張型心筋症、全身性強皮症(systemic sclerosis)など。
【００４７】
糸球体硬化症（Glomerulosclerosis）および繊維症
UUOを伴う腎臓におけるTGF-β1の主な生産源は、間質性の繊維芽細胞および尿細管の上皮細胞である (Isaka et al., Kidney Int. 58, 1885-1892(2000))。我々は、輸尿管を介して注入したオリゴ複合体が、尿細管の上皮細胞において、蛍光シグナルを発するのを検出した。HVJリポソームを用いた、輸尿管を介したアンチセンスオリゴの逆行性インフュージョンは、間質性の繊維芽細胞への選択的なトランスフェクションを引き起こすことを以前に報告した (Tsujie et al., Kidney Int. 57, 1973-1980(2000))。別の報告では、カニューレを用いて、腎臓の動脈を介して腎臓にHVJ/リポソームと複合体を形成したSV40 large T 抗原遺伝子を導入したところ、糸球体の細胞において、遺伝子発現が検出された (Tomita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 15, 129-134(1992))。腎臓内への骨盤の逆行性注入（intra-renal pelvic retrograde)、腎実質への注入（parenchymal injection）および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)の３つの異なるルートの注入が、リポソーム（DOTMA/DOPE)を介した遺伝子導入方法として研究された(Lai et al., Gene Ther. 4, 426-431(1997))。皮質及び外延髄細胞中においては、腎実質への注入（parenchymal injection）ではなく、骨盤の逆行性注入（pelvic retrograde)および腎臓の動脈への注入（renal arterial injection)によって、β-ガラクトシダーゼ活性は検出された。我々の観察および他のグループの観察から、腎臓の標的細胞タイプを決定する重要な要素は輸送経路およびベクターの指向性の両者であることがわかった。
【００４８】
本研究で、TGF-β1 RiAS処理により、TGF-β1発現および腎臓の尿細管のアポトーシスが有意に減少し、その結果、全体の組織の損傷が回復した。組織繊維化は腎臓、肝臓そして肺などで起こる多くのタイプの疾患の進行において重大な様相であるから、これらの器官の繊維化障害はこれらの他の容態においてTGF-β1に対するリボン型アンチセンスオリゴを投与することによって、治療されることが予期される。
【００４９】
一側性の尿管の閉塞(UUO)
UUOは多くの先天的な疾病の進行あるいは後天的な疾病の進行から生じうる臨床的な容態である。それは、閉塞された腎臓の機能の減少と関係している(Klahr, S. Kidney Int. 54, 286-300(1998))。尿細管の損傷を媒介する因子の同定は、損傷を受けた腎臓の保持あるいは回復可能性において価値のあることかもしれない。機械的閉塞によって引き起こされるUUOを伴う腎臓では、繊維化促進性あるいはアポトーシス促進性の媒体因子である、とりわけTGF-β1を過剰に生産する (Kaneto et al., Kidney Int. 44, 313-321(1993))。TGF-β1は腎臓の皮質や髄質外部の尿細管細胞において主に発現しているだけでなく、管周囲の間質性の細胞においても発現していることが報告されている (Fukuda et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281, F513-F521(2001))。TGF-βは機械的な緊張にさらされている尿細管の細胞のアポトーシスにも関わっている(Miyajima et al., Kidney Int. 58, 2301-2313(2000))。
【００５０】
治療組成物
1つの実施態様として、本発明は、繊維症、TGF-βスーパーファミリーのメンバーが正常あるいは異常に発現しており、その遺伝子の発現の抑制が望まれているような疾病のような細胞外マトリックスの過剰な形成によって特徴づけられる様々な疾病の治療に関する。このように、本発明における治療のための化合物は、疾病を被っているあるいは被りがちなヒト対象に対して、TGF-βスーパーファミリーに属するメンバーの発現を阻害する化合物を投与するものである。特に、この疾病はとりわけ腎臓、肝臓そして肺中の繊維症に関係している。
【００５１】
治療用化合物の調製法は、当業者に一般に知られおり、Remington's Pharmaceutical Sciences(第１７版、Mack Publishing Co., USA)を参照することによって簡便に作製することができる。例えば、一日分は体重１kgにつき約０．０５μgー約２０mg投与でも良い。投与量レジメは最適な治療の反応に応じて与える量が調整されても良い。例えば、いくつかにわけられた投与量を毎日あるいは治療状況の緊急性に応じて投与量が減らされても良い。活性化された化合物は、簡便な方法で投与されるかもしれない。例えば、経口、静脈注射（水溶性）、筋肉注射、皮下注射、経鼻、皮内注射あるいは座薬経路あるいは移植（例：腹腔内の経路による徐放型 分子を用いる、あるいはin vitroで単球や樹状細胞で感作した細胞を用いる、あるいは養子性でレシピエントに移植した細胞を用いる）である。投与の経路に依存して、酵素活性、酸、不活性化する成分などの他の普通に考えられる条件から保護するために、ペプチドは物質でコートされる必要があるかもしれない。
【００５２】
例えば、アンチセンス分子の低親油性は、ペプチド結合を分解することができる酵素による消化管で、胃の中で酸による加水分解で、破壊されることを可能である。非経口投与以外の方法によって、アンチセンス分子を投与するために、それらは以下のもので覆われるか、あるいはその不活性化を防ぐための物質と一緒に投与される。例として、アンチセンス分子はアジュバントと一緒に投与されても良いし、あるいはリポソーム中で酵素阻害剤と共に投与されても良い。ここに示されるアジュバントは、レソルシノール 、非イオン性の界面活性剤であるポリオキシエチレンオレイルエーテル(polyoxyethylene oleyl ether)及びn-ヘキサデシルポリエチレンエーテル（n-hexadecyl polyethylene ether)を含む。酵素阻害剤は、膵トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸 (diisopropylfluorophosphate(DEP))およびトラジロール (trasylol）を含む。リポソームは従来のリポソームと同様にwater-in-oil-in-water型CGFエマルションを含む。
【００５３】
活性型の化合物も、非経口的にあるいは腹腔内で投与されても良い。ディスパージョン (dispersion、以下同じ)も、そのグリセリン溶液であるポリエチレングリコール中で調製することが可能であり、また、その混合物も油中で調製することが可能である。保存方法ならびに使用条件は通常の条件下で行い、これらの製剤は、微生物の成長を防ぐための保存剤を含む。
【００５４】
注射可能使用に適した製薬剤には、滅菌水溶液（水溶性）あるいはディスパージョンまたは注射可能な水溶液あるいはディスパージョンを即座に調製可能である滅菌パウダーが含まれる。全ての場合において、その形式は無菌でなければならないし、容易にシリンジに注入できるように流動体でなければならない。製造、保存の過程で安定でなければならないし、細菌やカビのような微生物の混入を防いでなければならない。その担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例：グリセロール、プロピレングリコールそして液体のポリエチレングリコールなど同種のもの）、そしてこれらの適切な混合液、あるいは植物性油を含む溶液あるいはディスパージョンの媒体であることが可能である。適当な流動性は、レシチンのようなコーティングの使用、ディスパージョンの場合において必要とされる粒子の大きさを保持、スーパーファクタント（superfactant）の使用によって保持できる。微生物の活性を防ぐのには、様々な抗生物質や抗菌物質、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、theomersal、そしてそれと同種のものを用いることによって可能である。多くの場合、それは等張性の溶液、例えば、砂糖や塩化ナトリウムの水溶液中にあることが望ましい。注射可能である組成物の遅延吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンような遅延吸収剤の組成の使用によって可能である。
【００５５】
無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙された他の成分と共に必要量の適切な溶媒中に活性化合物を導入し、必要に応じて続いてフィルター滅菌によって調製される。一般に、ディスパージョンは、基本的なディスパージョンの溶媒および必要な上記に列挙された他の成分を含んでいる無菌の媒体に、様々な無菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のために用いられる無菌パウダーの場合、好ましい調製方法は、前もってフィルター滅菌した溶液に望みの成分を加えて、活性成分のパウダーを生成する真空乾燥あるいは凍結乾燥技術である。
【００５６】
上述されているように、アンチセンス分子が適切に保護される場合、活性化合物は、例えば、不活性な希釈媒体と共に、あるいは同化可能な食用の担体と共に、あるいは、固いもしくは柔らかい外殻のゼラチンカプセルで封入されて、あるいは、圧縮されてタブレットに詰め込まれて、あるいは、食品に直接組み入れられて経口投与されても良い。経口治療投与については、活性化合物が賦形剤に組み入れられ、摂取できるタブレット、バッカル・タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースおよびその他同種のものとして使用されても良い。そのような組成および調製において、活性化合物の重量の少なくとも１%は含まれているべきである。組成および調製のパーセンテージはもちろん変えても良い、またその組成は簡便にユニットの重量の約５％ー約８０％までの間に合っても良い。そのような治療上有用な組成中の活性化合物量は、適切な投与量を達成させうるものである。本発明による好ましい組成あるいは調製は、経口投与のユニット形式が活性のある化合物の約０．１μgー２０００mg間に含有しているように形成される。
【００５７】
タブレット、錠剤、カプセルおよびその他同種のものはさらに下記のものを含む:トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチあるいはゼラチンのような結合剤;リン酸ジカルシウムのような賦形剤;コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸およびその他同種の分解物質;ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤;また、ショ糖、ラクトースのような甘味料あるいはサッカリンあるいはペパーミント、サリチル酸メチルのような香料あるいはチェリー風味。投与量ユニット形式がカプセルである場合、それは上記のタイプの用品に加えて、液体の担体を含んでいても良い。様々な他の物質がコーティングとして、あるいはそうでなければ投与量ユニットの物理的な形式を修飾するために存在しても良い。例えば、タブレット、錠剤あるいはカプセルはセラックで、または砂糖、あるいはその両方でコートされていても良い。シロップ又はエリキシル剤は、活性合化合物、甘味料としてのショ糖、保存料としてのメチルパラベンまたはプロピルパラベン、染料、香料としてのチェリーやオレンジ風味を含んでいても良い。もちろん、どのような投与量ユニット形式を調製するのに使用される物質は、薬学的に純粋で、使用された量において本質的に無毒であるべきである。さらに、その活性化合物は持続リリース調製および処方で組み入れられても良い。
【００５８】
ここに使用された「薬剤として利用可能な担体及び／又は希釈剤」は、全ての溶媒を含んでおり、ディスパージョン溶媒、抗生物質や抗菌物質でのコーティング、等張液あるいは吸収遅延溶媒その他同種のものも含む。薬剤活性物質に用いる溶媒の使用は、当業者によく知られている。どんな従来の溶媒あるいは物質も活性成分と不適合であれば除外され、それについて治療用組成物の中で使用することが熟考される。補助活性成分も組成物の中に組み入れることができる。
【００５９】
投与の容易さおよび投与量の均一性のため投与量のユニット形式の非経口投与の成分を処方化するのは特に有効である。この中で用いられている投与量のユニット形式とは、哺乳動物を対象に治療を施した場合の投与量単位として物理的に個別の適合するユニットを指す（ここで、各ユニットは必要とする薬理学的担体と関連し、望まれる治療効果を産出するために計算された活性物質の予定量を指す）。本発明の投与量ユニット形式に対する記述は、(a)活性物質の特異的な特徴および達成された特定の治療効果、(b)肉体の健康が害される病気容態を被って生活をしている人の病気の治療のための活性物質の合成技術制限によって決定され又は依存する。
【００６０】
主要活性成分は、投与量ユニット形式中の適切な薬学的に利用可能な担体を備えた有効量中において簡便で有効な投与のために合成される。ユニット投与の形式は例えば、０．５μgー約２０００mgの範囲の量に主要な活性化合物を含むことである。割合を表記すると、活性化合物は、一般に担体の約０．５μg/mlで存在する。補助的活性成分を含んでいる組成の場合には、その投与量は、通常の投与量を参照にして及び該成分の投与方法によって決定される。
【００６１】
共有結合閉環アンチセンス分子の導入担体
本発明のアンチセンスの導入担体は、目的の細胞へ本発明のアンチセンス化合物の導入を促進する様々な化合物あるいは方法を含んでいる。本発明の中で使用される核酸導入方法あるいは担体は、以下のものを含むが限定するわけではない。カチオンリポソーム、PEG脂質、PEG、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、デンドリマー、ポリ(D、L-乳酸)、ビロソーム、エレクトロポレーション、magnetofection、naked  DNA、脂質-ポリカチオン-DNA(LPD)、folate-conjugated nanometric particles、カチオンのナノパーティクル(NP)結合型インテグリンαβ３標的リガンド、(修飾された)DNA結合型ウィルス、両親媒性の短いペプチド、遺伝子活性型マトリックス(GAM)、poly(alpha-(4-aminobutyl)- L-glycolic acid)(PAGA)、イミダゾール含有ポリマー、キトサン、ゼラチン、アテロコラーゲン、poly((D), (L)-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)、シクロデキストリンを骨格とするポリマー、ヒスチジンおよびリジン(HK)のポリマー、糖標的とした(glycotargeted)導入システム、多孔性のポリマー微粒子およびこれらと同種のものである。
【００６２】
様々な導入システムは知られており、以下本発明の化合物の投与に用いることができる。例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、アンチセンス化合物を発現可能な組換細胞、受容体を介するエンドサイトーシス、レトロウィルスの一部あるいはベクターとしての核酸の作製、などである。導入方法は以下のものを含んでいるが、制限されない。皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口のルートである。化合物あるいは組成物は、任意の簡便なルートによって投与されても良い。例えば、インフュージョンあるいはポーラス投与注射、あるいは上皮または粘膜皮膚の内側 (例えば口内の粘膜、直腸あるいは腸管の粘膜など)による吸収による。また、他の生物学的活性のある物質と一緒に投与されても良い。投与は全体的でも良いし、局所的でも良い。本発明の薬剤化合物あるいは組成物を中枢神経系への導入は、脳室内、くも膜下腔内（くも膜下腔内への注射は脳室内へのカテーテル（例えば、Ommaya reservoirのようなreservoirの取り付けによって促進されても良い）への注射を含むあらゆる適合する手段が望ましい。肺投与は、例えば吸入器又はネビュライザーの使用、およびエアロゾル化試薬で製剤化することも適用可能である。
【００６３】
特定の実態形態において、本発明の薬剤アンチセンスの化合物あるいは組成物を局所的に治療に必要な場所に投与することが望まれる。これは以下の方法によって達成される。しかし、これは本発明を限定するものではない。例えば、外科手術中に局所インフュージョン、外科手術後の創傷包帯結合での局所使用、注射、カテーテルによる方法、坐薬による方法、シリコン膜、繊維のような膜を含む多孔性、非多孔性、ゼラチンでの移植方法である。好ましくは、本発明の抗体あるいはペプチドを含むタンパクを投与する際には、タンパクが吸収されない物質を使用することに注意しなければいけない。別の実施形態として、化合物又は組成物は、小胞特にリポソーム内で輸送できる。さらなる別の実施形態として、化合物又は組成物は、放出制御系内で輸送できる。また、別の実施形態では、ポンプが使用されてもよい。さらに、別の実施形態において、高分子材料を使用してもよい。
別の実施形態において、放出制御系は、全身投与のフラクションのみを要求する脳のような治療標的の近接に設置することが可能である。
【００６４】
組成物は、レシピエント動物に投与を許容することができる場合、あるいは、その動物への投与が適合している場合に、「薬理学的にあるいは生理学的に利用可能」と言う。そのような試薬は投与された量が生理学上重要な場合に「治療上有効な量」が投与されたと言われる。その物質が、レシピエント対象の生理的な変化を検出できた結果をもって、生理学的に重要であるといえる。
【００６５】
本発明はここに記述された特定の実施例によって範囲が制限されない。。確かに、ここに記述されたものに加えて、発明の様々な修正、先の記述及び添付図面から、当業者は明確に理解できる。そのような修正は、添付したクレームの範囲以内にあるように意図される。次の実施例は、本発明の実施例の提供であって、これによって発明の範囲の制限をうけるものではない。
【実施例１】
【００６６】
実施例1-細胞系および動物
ラット肝臓癌細胞系H4-IIEをATCC (American Type Culture Collection、米国)から得て、非働化した１０％FBS (fetal bovine serum)(JBI、韓国)、ペニシリン(100U/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)を含むEMEM培養液中において、温度３７℃、湿度５％のCO2インキュベーターで維持した。
【００６７】
オスのラットSprague-Dawley (SD)は日本SLC社から供給されたものを使用した。動物は、標準の餌および水を与え、そこへは自由に行き来できるようにし、6匹ずつグループとして飼育した。重さ２００ー２５０gのオスのラットSDをこれらの実験で使用した。ペントバルビタール の腹腔内注入(5mg/100gの体重)による麻酔の後に、腹部の正中線切り口から左の腎臓を露出させた。ラットは、TGF-β1 RiASあるいはコントロールオリゴを２４-ゲージカテーテル注射器を使用して逆行注射した後に、左腎臓近位の尿管の結紮を行った。
【実施例２】
【００６８】
実施例 2-ラットTGF-β1 RiASの作製
オリゴは、DNA自動合成機ExpediteTM8909 (Applied Biosystems、米国)を使用して合成された。AS オリゴのための標的部位は、DNAsis program (Hitachi Software、 米国)を使用して、２次構造の連続する重複するシミュレーションによって選択された (Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106(1996))。TGF-β1のアンチセンス配列およびスクランブルオリゴ配列は以下のとおりである:アンチセンス配列:5'-GAT CCA GGA CTG TGT GTG ATG TCT TTG GTT TTG TCA TAG ATT GCG TTG TTG CGG CCT G-3'(SEQ ID NO: 1)、スクランブル配列:5'-GAT CCG CTG TCG TGC TGG TCT TGA GTT AAT TCG TTG TTG TTG TCT GAG TTG GTA TGC G-3'(SEQ ID、NO:2)。表1を参照。
【００６９】
【表１】
2005529581.tif 000013
【００７０】
TGF-β1アンチセンスオリゴおよびスクランブルオリゴの両者はステム-ループ構造を形成すると考えられる。ステムは、互いのオリゴの両末端の相補的な配列によって形成される。ステムの5'末端は、配列5'-GATC-3'の一本鎖の４塩基を持つ。ステム-ループ構造を持つ２つのTGF-β1アンチセンスオリゴマーは、分子の5'末端に4つの相補的配列があることによって、リボン型アンチセンス分子を形成するように繋がる。T4 DNAリガーゼ(宝酒造、日本) の１ユニットを加えて、2分子対称共有結合分子を生成した。従って、TGF-β1 RiASは、2つのループおよび1つの介在するステムから成る。各ループは、TGF-β1のアンチセンス配列を含んでいる。RiAS オリゴは変性１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけられ、アクリルアミドゲル上でエキソヌクレアーゼIIIに対する抵抗性および流速度の遅滞を調べた。２つのスクランブルオリゴは、またリボン型コントロールオリゴ（便宜上、「SC RiAS」と表示する）を形成するために結合させた。
【実施例３】
【００７１】
実施例3-リポソーム/tat ペプチド複合体によるRiASのトランスフェクション
Opti-MEM (GibcoBRL、米国) １００μl 中の４μgDOTAP/DOPE (Avanti、米国) を、Opti-MEM 懸濁液、tatペプチド及びアンチセンスオリゴを含んでいるチューブ中に加えた。その混合液は、１０分間インキュベートした。１万の細胞が入った９６穴のそれぞれの穴に、１００μlの容量のオリゴ-tat-リポソームの３者複合体を処理した。アンチセンスオリゴは０．１あるいは０．３μgの量を使用した。H4-IIE細胞は５％CO2の濃度で、３７℃のインキュベーターで５時間インキュベートした。続いて、２０％FBSを含むOpti-MEMを１００μl加え、さらにアッセイまで１６時間３７℃でインキュベートを行った。
【実施例４】
【００７２】
実施例4-RNAの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)
トータルRNAは、TripureTM Isolation Reagent (Roche、米国)で単離した。トータルRNAを抽出するために、回収した細胞へ、Tripure 試薬０．４ml、１０μlグリコーゲン (1mg/ml)および８０μlクロロホルムを加えた。RT-PCRは、AccessTM RT-PCR kit (Promega、米国)の単一の反応チューブ中で行った。RNA、PCRプライマー、トリ骨髄芽球症ウィルス (AMV) 逆転写酵素 (5 units/μl)、Tfl DNAポリメラーゼ (5 units/μl)、dNTP (10 mM、1μ l)およびMgSO4 (25mM、2.5μ l)を、PCRチューブに加え、最終容量が５０μlになるように水を加えた。cDNAは、４８℃で４５分処理し、DNAサーマルサイクラー (MJ Research、米国)で増幅サイクル (94℃で30秒、56℃で1分、68℃で2分)を３０サイクルで増幅した。増幅されたPCR産物は、１．５%アガロースゲル上で確認し、gel documentation program (Bio-Rad、米国)を用いて定量化した。PCR産物はニトロセルロースメンブレンに写し、Fluorescein-11-dUTP (Amersham、米国)でラベルした内部オリゴヌクレオチドでハイブリダイゼーションを行った。シグナルはECL検出キットを用いて検出した。
【実施例５】
【００７３】
実施例5-腎臓へのFITCオリゴヌクレオチドの導入
メーカーが推奨するLabelITTM fluorescein nucleic acid labeling kit (Mirus、米国) を使用して、一本鎖のオリゴにフルオレセインをラベルした。FITCでラベルしたオリゴ、tatポリペプチド、DOTAP/DOPEの複合体を含んでいる混合溶液を、尿細管を介して左側腎臓に注射した。その腎臓は、２４時間後に取り除かれ、液体窒素下において、Tissue-TekTM OCT compound (Miles、米国) に包埋した。灌流固定した腎臓の組織ブロックは１０μmの厚さで凍結切片にし、Poly-PrepTM slides (Sigma、米国)で標本した。その組織は顕微鏡観察のために、Synthetic MountantTM (Shandon、米国) で標本した。遺伝子導入の効率は、腎臓の凍結切片を蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【実施例６】
【００７４】
実施例 6-アポトーシスを検知するTUNELアッセイ
UUOを伴う腎臓の細胞において、断片化したDNAを検出するために、小さな改変が施されているin situ cell death detection kit (Roche、米国) を用いて、TUNELアッセイを行った。スライドは脱パラフィン化し、メタノール中０．３%H2O2を含むメタノールで、３０分間内在性のペルオキシダーゼ活性をクエンチングした。スライドは１０分間１０mMクエン酸バッファーで煮沸し、PBSでリンスをした後、フルオレセイン-dUTPでラベルしたデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT)を加えて１時間インキュベートした。その反応は停止バッファーで止められた。その後、スライドはPBSで洗浄され、アルカリフォスファターゼ結合抗フルオレセイン抗体で室温で３０分間インキュベートした。結合しなかった酵素結合抗体を洗浄により取り除き、そのスライドにNBT/BCIP (Sigma、米国) を加え、１ー５分間反応させた。陽性の腎臓の尿細管細胞は、高性能の顕微鏡の４００倍の視野で観察して数を数えた。
【実施例７】
【００７５】
実施例 7-TGF-β1の免疫染色
凍結切片は連続してBouin's fixativeで４℃で５分間、アセトンで-２０℃で１０分間、メタノールで１５分間、２％パラホルムアルデヒドで２分間、４％パラホルムアルデヒドで４分間そして７０％エタノールで１０分間インキュベートし、その後、エタノールで段階的に再水和させた。その組織切片はPBSで洗浄し、０．３% H2O2を含むメタノールでインキュベートし、内在性のペルオキシダーゼ活性を取り除いた。ブロッキングは、１０％FBSを含むPBSで１時間行い、そしてその組織切片を０．５％BSA、２％FCSを含むPBS中において、抗TGF-β1抗体 (Santa Cruz Biotechnology、米国)を加えて４℃で一晩インキュベートした。翌日に、その組織切片にHRP結合抗ウサギ抗体（Sigma、米国）を加えて、室温で１時間インキュベートした。その組織切片はDiamine benzidine (Sigma、米国）で５分間インキュベートし、エタノールで脱水した後、顕微鏡観察前に、Synthetic MoutantTMで標本した。
【実施例８】
【００７６】
実施例 8-統計的解析
結果は、平均±標準偏差 (SD)として表示する。統計的な意義はスチューデント検定を用いて決定した。P<0.05を有意であるとした。
【実施例９】
【００７７】
実施例 9-結果
実施例 9.1-TGF-β1に対する安定したRiASオリゴの構築
メッセンジャーRNAは、細胞質中において、２次構造、３次構造を形成する。これらのmRNAの構造の複雑さは、RNA結合タンパクとの結合や、mRNA自信が持つ塩基配列同士で互いにペアを形成することにより生じる。この理由により、効果的な標的部位の選別はアンチセンスオリゴをデザインする重要な過程であると考えられている。我々は、連続し重複した方式での２次構造のシミュレーションは、標的mRNAの標的配列に沿ったアンチセンスを見つけるのに効果的に利用されうることを見出したことを以前に示した(Moon et al., J. Biol. Chem. 275, 4647-4653(2000); Matsuda et al., Mol. Biol. Cell 7, 1095-1106 (1996))。TGF-β1mRNAの全長は、効果的にアンチセンス分子が容易に利用可能なアンチセンス標的部位を探索するために調べた。
【００７８】
TGF-β1特異的なアンチセンスオリゴは、ステム-ループ構造を形成し、５'末端突出のGATCの配列を持つ。２つの同一のASオリゴが共有結合で繋がって、TGF-β1 RiASと呼んでいるリボン型アンチセンス分子を形成する（図１）。予想通りに二量体のTGF-β1 RiASは、単量体の一本鎖の前駆体と比較して、変性ポリアクリルアミドゲル上で、泳動速度が遅いことが示された（図２）。RiASオリゴは、エキソヌクレアーゼIIIに耐性で、ポリアクリルアミドゲル上で、メジャーバンド（１１６mer）として、観察された（レーン４）。対照的に、TGF-β1 RiASの一本鎖の前駆体は、２ 時間で、エキソヌクレアーゼIIIによって完全に分解された（レーン３）。これらの結果から、TGF-β1 RiAS分子は、リボン型の閉環構造をとっており、エキソヌクレアーゼによる攻撃を受けうる開いた末端の構造をとっていないことが説明される。
【００７９】
実施例 9.2-TGF-β1 RiASによるin vitroにおけるTGF-β1 mRNA特異的減少
次に我々は、TGF-β1 RiASが配列特異的に標的mRNAを効果的に除去することができるかを調べた。TGF-β1 RiASは、トランスフェクション効率を高めるためにtatペプチドおよびリポソームと複合体を形成させた。H4-IIEラット肝臓癌細胞に、TGF-β1 RiASあるいはSC RiASを、それぞれ０．１μgあるいは０．３μgをトランスフェクションし、２４時間インキュベートした。トータルRNAは、トランスフェクションを行った細胞から単離し、TGF-β1 mRNAをRT-PCRによって増幅し、TGF-β1 RiASのアンチセンスの活性を調べた。TGF-β1 RiASで処理したH4-IIE細胞は、０．１μgで約３０％のTGF-β1 mRNAの減少を示し、０．３μgで７０％以上のTGF-β1 mRNAの減少をそれぞれ示した（図３A）。これとは対照的に、H4-IIE細胞をSC RiASで処理した場合、TGF-β1 mRNAの発現は有意な影響が見られなかった。コントロールとして図の下のパネルに示したGAPDHの発現は、TGF-β1 RiASの処理によって影響を受けなかった。これらの結果は、増幅したDNA断片の中間部分にハイブリダイズするDNAを用いてサザンブロッティングを行うことによって再度確認された（図３B）。
【００８０】
実施例 9.3-腎臓の組織中へのFITCラベルしたASオリゴの効率的導入
アンチセンス活性をin vivoでも効率的に達成するために、標的組織へのアンチセンスオリゴの効率的に取り込まれることが必要である。TGF-β1 RiASの５８mer一本鎖の前駆体分子は、FITCでラベルし、in vivoでの組織の取り込みのために使用した。FITCラベルした１０μgのアンチセンスオリゴは、２６-ゲージカテーテルを使用して、尿細管を介して左腎臓へ注射した。腎臓は、アンチセンス処理後６時間で回収し、細胞の取り込みを調べた。アンチセンスオリゴが、tatペプチド、リポソームと複合体を形成したとき、尿細管の上皮細胞で強い蛍光が観察された（図４A）。しかし、アンチセンスオリゴのみで、担体のリポソームを用いなかった時には、組織中の蛍光シグナルは検出されなかった（図４B）。偽物で処理を行ったコントロールの腎臓は蛍光シグナルを示さなかった。
【００８１】
実施例 9.4-TGF-β1 RiASによる組織損傷の有意な軽減
in vitroでTGF-β1 mRNAの効果的な減少が観察、そしてin vivoでのFITCラベルしたアンチセンスオリゴの効果的な組織への取り込みが観察された後、TGF-β1 RiASは、動物モデルにおいて、損傷した尿細管を効果的に防ぐことができるかを試みた。一側性の尿管の閉塞 (UUO)は、急速な尿細管の損傷を引き起こし、UUOを伴う腎臓は臨床関連の動物モデルシステムとして確立した。
【００８２】
【表２】
2005529581.tif 000014
【００８３】
6匹のSDラットが、近位輸尿管を介したTGF-β1 RiASのインフュージョンの後に、左側の近位輸尿管の結紮を行った。５日目に、左側と右側の両側の腎臓を回収した。それらの重量を計測し、その形態を観察した。腎臓の重量は、一個体の重量当たり腎臓重量のパーセンテージで示すと、偽物コントロールは0.47%±0.03、UUOを伴ったものは0.99%±0.10であった。UUO操作後の腎臓の重量には、顕著な増加が見られた。UUOを伴う腎臓は輸尿管注入によって、TGF-β1 RiAS処理された時、一個体の体重当たりの腎臓重量は、顕著に0.68%±0.09 (P<0.005)に減少したが、PBS処理単独のものでは、0.95%±0.08であり、スクランブルRiASでの処理では、1.07%±0.12であった。結果は、６匹のSDラット平均±標準偏差によるものである。UUOのみ、PBS＋UUOそしてSC RiAS＋UUOに対するTGF-β1 RiAS＋UUOのグループは、#P<0.005であった（表２）。コントロール腎臓は、互いのグループ間では、有意な違いは見られなかった。TGF-β1 RiASで処理した腎臓は、UUOのみ、UUOにその他のものを加えたコントロールの処理と比較して、肥大が見られなかった（図５）。さらに、UUOを伴ったラットのRiAS処理した腎臓の縦方向の切片は、全体の腎臓の構造の保持が見られたが、コントロールのグループのUUOで処理した腎臓においては、腎臓の髄質および腎乳頭の一部において腎実質の欠失が見られた。
【００８４】
実施例 9.5-免疫組織化学的手法および組織学的解析によって腎臓の微細構造の保持が示された。
【００８５】
我々は、配列特異的なアンチセンス活性および腎臓の微視的な構造の変化並びにTGF-β1 RiASによる腎臓への広範な損傷の有意な改善を観察した。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、偽物処理をしたコントロールグループ中の２匹の典型的なラットから腎臓を回収した。免疫組織化学は、UUOを伴った腎臓において、TGF-β1 RiASで処理することによりTGF-β1の発現が消失したかを調べるために行われた（図６A-６E）。TGF-β1の免疫組織化学によって、損傷した腎臓において、ポジティブな茶染色が明らかとなり、影響のあった組織において、TGF-β1の発現が増強されたことが示された。TGF-β1タンパクのポジティブ染色は、PBSやSC RiASで処理したUUOを伴った腎臓において同様に検出された。これとは対照的に、TGF-β1はTGF-β1 RiASで処理したUUOを伴った腎臓においてはるかに減少していることがわかった（図６E）。
【００８６】
UUOを伴った腎臓の顕著な物理的特徴は、増強TGF-β1の発現を介して尿細管の萎縮あるいは肥大である。UUOを伴った腎臓の切片をPAS染色し、光学顕微鏡で観察したところ、急速に促進された様子で皮質や髄質の中間の空間が増大したことがわかった。大多数の腎臓の尿細管は、肥大しており、いくつかの尿細管においては上皮の扁平化がみられた（図７A-７E）。それとは対照的に、PBS、SC RiAS、偽物で処理したUUOを伴ったコントロール腎臓の切片においては、広範囲で尿細管の萎縮および肥大がみられ、TGF-β1 RiASで処理したグループにおいては、有意に萎縮や肥大が消失していた。予想されたとおり、偽物処理したラットのコントロール腎臓の切片は正常に見えた。
【００８７】
実施例 9.6-in situ TUNELアッセイで検出されたアポトーシス細胞死の減少。
【００８８】
UUOを伴った腎臓が、尿細管の広範囲な萎縮および肥大を示すので、我々は、腎臓の尿細管の細胞はアポトーシスを受けているか否かを調べた。UUOを伴った腎臓が、TGF-β1 RiASで処理されると、アポトーシス細胞は腎臓の尿細管の細胞において、他のコントロール処理をしたものと比較してそれほど大量に存在しないことがわかった（図８A-８E）。正常腎臓において、アポトーシスポジティブ細胞数は3±3.3 細胞数/顕微鏡視野 (400X)（以下、単に細胞数と略す）、偽物処理した腎臓において、アポトーシスポジティブ細胞数は、280.9±24.6細胞数であった。TGF-β1 RiAS処理は、尿細管のアポトーシスポジティブ細胞数を、21.3±12.1細胞数レベルにまで減少させた (P<0.001)。これとは対照的にUUOを伴ったグループでは、SC RiAS処理したものでは236.8±29.6細胞数、PBS処理したものでは260.4±41.3細胞数のレベルで尿細管のアポトーシス細胞数は増加していた。
【００８９】
ここに引用された参照はすべて、参照として全体をここに組み入れられる。
【００９０】
当業者は、前記記載で開示された概念および特定の実施態様は、本発明の同一な目的を遂行するのために異なる実施態様を修飾するまたは設計するための基礎として容易に利用出来ると考えるであろう。また、当業者は、そのような等価な実施態様は、請求の範囲から逸脱しないものであると考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
本発明は、詳細な記述、実例として添付した図面によって、より完全に理解されるだろう、しかしながらそれらに本発明は限定されるもではない。
【００９２】
【図１】TGF-β１に対するリボン型のアンチセンス分子（以下、「TGF-β1 RiAS」と称する場合がある）、特に、116-mer (SEQ ID NO: 3)を示す。TGF-β1のモノマーのオリゴ (SEQ ID NO: 1)は、ステム-ループ構造をとることが予想される。そのステムは互いのオリゴの両末端の相補的配列によって形成される。そのステムの５'末端は5'-GATC-3'の４塩基からなる一本鎖の突出した構造を持つ。２つのTGF-β１モノマー分子は２分子対称による共有結合閉環アンチセンス分子を形成するように繋がる。RiASオリゴは、２つのループおよび１つの介在ステムからなる。各ループは、TGF-β１に対するアンチセンス配列を含んでいる。
【図２】TGF-β1 RiASオリゴのエキソヌクレアーゼIIIに対する耐性を示す。オリゴは変性１５％ポリアクリルアミドゲルで分析した。レーン１；５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン２；１１６mer TGF-β1 RiAS、レーン３；エキソヌクレアーゼIIIで処理した５８mer TGF-β1 ASオリゴ、レーン４；エキソヌクレアーゼIIIで処理した１１６mer TGF-β1 RiAS。
【図３】A-Bは、TGF-β1 RiASによるTGF-β1 mRNA特異的な減少を示す。細胞にオリゴ（０．１あるいは０．３μg）-tat-リポソームの三量体からなる複合体をトランスフェクトし、後にRT-PCRアッセイに用いた。（A）RT-PCRはTGF-β1 RiASのアンチセンス活性を測定するために行った。（B）下のパネルに見られるバンドが、内部でハイブリダイズするプライマーをプローブとしてサザンブロッティングを行った結果である。レーン１；偽物、レーン２；TGF-β1 RiAS ０．１μg、レーン３；TGF-β1 RiAS ０．３μg、レーン４；SC RiAS ０．１μg、レーン５；SC RiAS ０．３μg
【図４】A-Bは、輸尿管を通し、腎臓へアンチセンスオリゴが運搬されることを示す。３'末端をFITCでラベルしたアンチセンスオリゴは、尿管結紮後、輸尿管を通して左側の腎臓にインフュージョンした。灌流固定した複数の組織を凍結切片にし、該組織は、顕微鏡観察（倍率  ２５０倍）するため、シンセティックマウンタント（synthetic mountant)で標本にした。A、tatペプチドおよびリポソームと複合体を形成したFITCオリゴ；B、FITCオリゴ単独
【図５】２匹の代表的なラットのUUOを伴う腎臓の縦方向への切片を示す。麻酔をしたオスのSDラットに輸尿管を通してTGF-β1 RiAS、あるいはコントロールをインフュージョンした。５日目に、縦方向への切片を作製した後、形態的な変化を検査、分析した。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図６】A-Eは、抗TGF-β1抗体によるTGF-β1の免疫組織化学的染色を示す。免疫組織化学的染色は腎臓組織の凍結切片を用いて行った。固定し、脱水処理をした組織は、顕微鏡観察の為にシンセティックマウンタントで標本にした。ブラウン染色によりTGF-β1の存在を示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図７】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓 において尿細管が萎縮および肥大した組織学的観察を示した。尿細管の萎縮および肥大は、PAS染色した組織切片で示された。TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、尿管の閉塞のみのもので、それぞれ処理した腎臓の切片を、尿細管の萎縮および肥大を見るために示す。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【図８】A-Eは、TGF-β1 RiASで処理したUUOを伴う腎臓において、アポトーシス細胞の検出を示す。TUNELアッセイは腎臓の尿細管細胞のアポトーシスの度合いを決定する為に行われた。UUOを伴った腎臓は、TGF-β1 RiAS、SC RiAS、PBSあるいは、UUO単独の条件のもので処理された。A；ネイティブ、B；UUO単独、C；UUO+PBS、D；UUO+SC RiAS、E；UUO+TGF-β1 RiAS
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  WELGENE, INC.
Park, Jong-gu
Moon, Ik-Jae
Choi, Young-kook
Park, Kwankyu
<120>  TGF-BETA-SPECIFIC COVALENTLY CLOSED ANTISENSE MOLECULE
<130>  4-1080786
<140>  PCT/IB02/05685
<141>  2002-12-30
<150>  KR 10-2001-0086765
<151>  2001-12-28
<160>  5     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  58
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctg       58
<210>  2
<211>  58
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Scramble sequence
<400>  2
gatccgctgt cgtgctggtc ttgagttaat tcgttgttgt tgtctgagtt ggtatgcg       58
<210>  3
<211>  116
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  ribbon-type antisense molecule specific for TGF-beta 1
<400>  3
gatccaggac tgtgtgtgat gtctttggtt ttgtcataga ttgcgttgtt gcggcctgga     60
tccaggactg tgtgtgatgt ctttggtttt gtcatagatt gcgttgttgc ggcctg        116
<210>  4
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys 
1               5                   10              
<210>  5
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 
1               5                   10          
【国際調査報告】
2005529581.tif 000015
2005529581.tif 000016
2005529581.tif 000017
2005529581.tif 000018