(57)【要約】ヘラオオバコの主要アレルゲン、Pla l 1の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子であり、核酸分子は、a)配列ID番号３の配列を有し、b)配列ID番号３のフラグメントであり、c)配列ID番号４のアミノ酸配列をコードする配列又はそのフラグメントを有し、d)配列ID番号３にハイブリダイズする配列を有し、e)配列ID番号３の変性によって導き出せる配列を有し、またはf)配列a)〜e)の相補鎖を有する。
2005502327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘラオオバコの主要アレルゲンであるPla l 1の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、ａ）配列ＩＤ番号３の配列を有し、ｂ）配列ＩＤ番号３の配列のフラグメントであり、ｃ）配列ＩＤ番号４のアミノ酸配列をコードする配列又はそのフラグメントを有し、ｄ）ストリンジェントな条件下で配列ＩＤ番号３にハイブリダイズする配列を有し、ｅ）配列ＩＤ番号３の変性によって導き出せる配列を有し、又はｆ）配列ａ）〜ｅ）の相補鎖を有することを特徴とする、核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、オオバコ科から選択された植物が起源である、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
前記配列ｄ）が、高いストリンジェントな条件下で、配列ＩＤ番号３にハイブリダイズする配列である、請求項１又は２記載の核酸分子。
【請求項４】
前記配列ｄ）が、配列ＩＤ番号３と少なくとも約６７％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項５】
ヘラオオバコの主要アレルゲンであるPla l 1の少なくとも１つのエピトープを含む組換えタンパク質又はペプチドであって、配列ＩＤ番号４のアミノ酸１〜１６から成るアミノ酸配列及びそのフラグメントを除く、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸配列に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、組換えタンパク質又はペプチド。
【請求項６】
配列ＩＤ番号４と比べて変更性のアミノ酸配列を含み、ＩｇＥ結合親和性が減少している、請求項５記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項７】
オレア・ヨーロッパエアのアレルゲンOle e 1のエピトープと同じＩｇＥ結合特異性を有する少なくとも１つのエピトープを含む、請求項５又は６記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項８】
前記タンパク質又はペプチドが、それらの誘導体である、請求項５〜７のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項９】
医薬品として使用するための、請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチド。
【請求項１０】
患者のアレルギー反応を、予防し、軽減し又は治療する医薬品の製造のための、請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質の使用。
【請求項１１】
宿主の形質転換に適合された発現ベクターであって、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸分子を含むことを特徴とする、ベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが、プラスミドである、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１４】
ヘラオオバコの主要アレルゲンであるPla l 1の少なくとも1つのエピトープを含む組換えペプチド又はタンパク質を生成する方法であって、前記Pla l 1ヌクレオチド配列が発現し、かつ前記ペプチド又はタンパク質が生成されるような条件下で、請求項１３記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記ペプチド又はタンパク質を単離する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項５〜８のいずれか１項記載の組換えペプチド又はタンパク質を、有効成分として含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項５〜８のいずれか１項記載の組換えペプチド又はタンパク質又は請求項１５記載の医薬組成物を、患者に投与することを含む、患者のアレルギー反応を予防し、軽減し又は治療する方法。
【請求項１７】
患者からのサンプルを集める工程、及び請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチドに対するＩｇＥ抗体のレベルを測定する工程を含む、患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーを診断又は予知するインビトロ方法。
【請求項１８】
患者を請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチドに曝す工程、及び患者の反応をモニターする工程を含む、患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーを診断又は予知するインビボ方法。
【請求項１９】
患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーのインビトロ又はインビボでの診断又は予知に使用する試薬であって、前記試薬が、請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチドを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
請求項５〜８のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチドを使用することを含む、アレルギーワクチン接種の効果を予測する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘラオオバコ（Plantago  lanceolata)の主要アレルゲン、Pla l 1の少なくとも１つのエピトープを含む核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイプ１アレルギーは、世界中で何百万の人々に影響を与え、その発生率は先進国でここ数年に渡って増加しており、人と経済コストを上げる原因となっている（１）。花粉アレルゲンは、IgE介在アレルギー疾患、例えば花粉症、喘息等を誘発できるタンパク質又は糖タンパク質であり、人口のおおよそ１７％が、遺伝的にアレルギーになりやすい。
これらの疾患に対する従来の治療は、主に症候に関する軽減にある。患者は、ＩｇＥ抗体の形成を抑制せず、有害な副作用をしばしば有する、抗ヒスタミンやステロイドなどの薬物で治療される。ＷＨＯの方針説明書に述べられているように（２）、免疫療法は、アレルギー疾患の自然な経過に影響を及ぼすことができるただ1つの治療であり、またアレルギー性鼻炎の患者において喘息に発展するのを防ぐことができる（２）。免疫療法は、適切なアレルゲン抽出物の量を増加して投与することにより患者の免疫応答を変える。しかしながら、治療的に使用されるアレルゲン抽出物は、天然源から単離されたタンパク質及び非タンパク質成分の粗製混合物であり、患者の過敏性の原因であるアレルゲン又は幾つかのアレルゲンに無関係な多くの組成を含む。ここ数年、ハイブリドーマ技術の出現で、モノクローナル抗体ベースイムノアッセイの主要アレルゲン含有量の測定によるアレルゲン抽出物の標準化において、重大な進歩がなされたが（３）、所定のアレルゲン抽出物に感受性の患者はみんな、抽出物の全ての成分を含む同一の複合混合物を受け取り続ける。これは、主要アレルゲンPla l 1と異なるアレルゲンを含む抽出物のタンパク質成分全てに対する追加のＩｇＥ抗体を上昇させる副反応の開始を起こさせ得る。
アレルギー診断に関する限り、皮膚試験の全アレルゲン抽出物の使用は、患者の感作の原因である特異的抗原の確認を不可能にする。
これら全ての欠点を回避するために多くの研究者によって採用されたアプローチは、個々のアレルゲンを単離する生化学的分離及び精製技術を使用することであった。このアプローチは、アレルゲンの特徴づけに非常に有用であるにも関わらず、工業規模でのアレルゲンの調製に適しておらず、工程が極度に労働集約的であり、通常高価な天然源から精製されるアレルゲンの収率が非常に低い。これらの理由により、アレルゲンタンパク質の合成における組換えDNA技術に大きな注意が払われている。組換えアレルゲンは、大きい発酵槽で育てられる微生物発現システムを使用することにより、大きいスケールで得られる。このように、これらの技術は、より良い収率で一貫して純粋状態で組換えアレルゲンの製造を可能にする。その上、rDNAアプローチを使用することにより、アレルギー疾患の診断又は治療に簡便に使用するためのエピトープのフラグメント又は変更されたアレルゲンを発現できる。増加した研究者達は、現在では、アレルゲンの研究のためのrDNA技術を使用して、例えば、最近、ダニ、草、木、かびなどのアレルゲンを複製し、それぞれの組換えアレルゲンを発現した（４）。
【０００３】
オオバコ(Plantago)属に属する植物の花粉は、エアロアレルゲンの主な原因を構成し、世界中の多くの国での花粉症の関連比率を説明することができる。オオバコ属は、オオバコ(Plantaginaceae)科に属し、約２５０種を含む。最もありふれた種の1つは、ヘラオオバコ（イギリスオオバコ(English plantain)又はオオバコ(ribwort)）であり、ヨーロッパ、オールトラリア及び北アメリカの温帯に分布する（５〜８）。ヘラオオバコの花粉は、今世紀の初めから花粉症に関連しており（９〜１１）、この雑草はアレルギー疾患を起こす最も重要な双子葉植物の１つとして考えられている。
ここ数年、異なる国での幾つかの研究が、この種の臨床的な重要性を示した。ヘラオオバコに対するアレルギーの最も高い発生率は、オーストラリア（１３）と地中海領域（１４）で記述された。例えば、Bousquetらは、花粉症の患者を試験し、３６％がモンペリエ（フランス）のイギリスオオバコに感作されたことが分かった（１５）。イギリスでは、二つの異なる研究が、季節性の呼吸性アレルギーの患者の２０％以上がオオバコに対して陽性の皮膚反応だったことを示した（１６、１７）。同様に、この花粉に対するアレルギーの高い罹患率が、スペインの異なる都市で報告された（１８〜２０）。にもかかわらず、オオバコのみの感作は珍しいため、花粉症の病因論におけるヘラオオバコ花粉の真の役割ははっきりしない。また、オオバコに感作した患者は、通常、同じ季節に受粉する他の植物、特に草の花粉に感受性である（１７〜２１）。
上記に述べた刊行物に関わらず、主なオオバコアレルゲンの性質のデータはほとんど報告されておらず、今までにヘラオオバコアレルゲンの確認を扱うたった数件の研究が刊行された（１７、２１、２２）。
国際特許出願第98/59051号は、オリーブからのOle e 1アレルゲンの複製を開示する。この配列は、Pla l 1の８つのアミノ酸配列との相同性を共有することが知られている。
カバノキ（Betula verrucosa）の配列は、目録番号Y14038のデータベースで入手可能である。この配列は、Ole e 1アレルゲンとの高度の相同性を共有するタンパク質をコードする。
ヘラオオバコの花粉の主要アレルゲンが最近確認され、精製されて、物理化学的な面から部分的に特徴づけられた（２３）。Pla l 1は、１６〜２０kDaの見かけ上のタンパク質を有する微小異種性糖タンパク質である。N末端から１６アミノ酸残基が決定された。オオバコ感受性患者の純粋Pla l 1に対する特異的IgEの罹患率は、８６％であり、オオバコ花粉抽出物の全IgE結合能力の約８０％に寄与する。これらのデータは、Pla l 1が、ヘラオオバコ花粉からの最も臨床的に関連したアレルゲンであることを証明した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要約
本発明の目的は、Pla l 1のヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供することである。
この目的は、本発明で得られ、ヘラオオバコの主要アレルゲン、Pla l １の少なくとも１つのエピトープを含むペプチド又はタンパク質をコードする核酸分子に関し、核酸分子が、a)配列ID番号３の配列を有し、b)配列ID番号３のフラグメントを有し、c)配列ID番号４のアミノ酸配列をコードする配列を有し、d)ストリンジェントな条件下で、配列ID番号３にハイブリダイズする配列を有し、e)配列ID番号３の変性(degeneration)によって導き出せる配列を有し、又は配列a)〜e)の相補鎖を有する。
分子複製技術は、Pla l 1アレルゲンをコードするcDNAを単離すること及びクローンのヌクレオチド配列を決定するのに使用された。アミノ酸配列は、タンパク質の完全な化学的構造を得るために、ヌクレオチド配列から推定される。工程には、ヘラオオバコ花粉からRNAを単離する工程と、逆転写酵素を使用するｃDNAを合成する工程が含まれる。Pla l 1をコードするcDNAは、天然アレルゲンのN末端配列か由来の特異的プライマーを使用するPCRで特異的に増幅される。最後に、Pla l 1-cDNAは、成熟タンパク質のN及びC末端の両方に特異的なプライマーを使用するPCRで増幅され、Pla l 1をコードする完全長クローンがベクターに挿入されて、形質転換された宿主で組換えアレルゲンが発現される。
花粉粒は、多くの細胞を囲いこむ強固な外壁から成り、タンパク質アレルゲンが細胞内に存在する。従って、花粉からmRNAを単離するためには、強固な外壁が粉砕されなければならず、細胞を溶解して、mRNAを、結果物の混合物から抽出しなければならない。単離は、mRNAの揮発性の性質のため部分的に困難であり、典型的には、生きている細胞に数分間存在するのみである。
本発明の前に、ヘラオオバコのPla l 1のmRNAを単離する試みがなされたが成功しなかった。特に、粒壁を破壊する多くの異なる方法、即ち細胞溶解及びmRNA抽出が成功しなかった。本発明に従って、Pla l 1のmRNAの単離は、方法の選択された組合せを使用して達成された。特に、粒壁は、変更されたソニフィケーション手順を使用して破壊され、処理の期間は、従来技術のソニフィケーション手順と比べて強く延長された。この変更されたソニフィケーションは、グアニジウムチオシアネートを含有する溶解バッファーと組み合わせて、またフェノールクロロホルムをベースにした抽出試薬と組み合わせて使用された。
【０００５】
本発明は、上述したように、アレルゲン又はペプチドのアレルゲン性部分に対応する純粋なアレルゲン又はペプチドの不足を克服する方法を提供することにより、アレルギー疾患の診断と治療の改善を示す、ヘラオオバコの花粉の主要アレルゲンのエピトープをコードする単離された核酸分子を提供する。このアレルゲンは、本発明以前に、残された未複製の分子の、オオバコの花粉の主要アレルゲンを構成すると考えられた。
得られた材料及び情報は、核酸分子の変更を可能にし、よって、特異的なIgE-結合エピトープを確認するためのタンパク質の特異的なアミノ酸残基の改変を可能にする。IgE-結合エピトープの確認は、IgE-結合能力の減少した変更された組換えアレルゲンの製造を可能にする。IgE-結合能力の減少した変更された組換えアレルゲンが、アレルギー患者の効果的な治療に使用することができ、投与量が多くても、逆の副反応、例えばアナフィラキシー性反応のリスクを低くして投与することができる。同様に、アレルギー患者のIgE抗体産生をコントロールするT細胞反応を調節することにより、ワクチンとして使用できるかもしれないPla l 1由来の短いペプチドに設計することも可能である。また、組換えアレルゲンは化学的に変更され得る。本発明の追加の態様は、ヘラオオバコ及び交差反応性種の花粉に対するアレルギー性反応を診断するための組換えアレルゲンの使用である。診断方法は、抗原−抗体反応に基き、インビボ及びインビトロテストの両方のために設計され得る。
【０００６】
更に、本発明は、以下に関する。
ヘラオオバコの主要アレルゲンである、Pla l 1の少なくとも１つのエピトープを含む組換えタンパク質又はペプチドであって、配列ＩＤ番号４のアミノ酸１〜１６から成るアミノ酸配列及びそのフラグメントを除く、本発明の核酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質又はペプチドに関する。
医薬品として使用するための、本発明のタンパク質又はペプチドに関する。
患者のアレルギー反応を、予防し、軽減し又は治療する医薬の製造のための、本発明のタンパク質の使用に関する。
宿主の形質転換に適合させた発現ベクターであって、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
ヘラオオバコの主要アレルゲンであるPla l 1の少なくとも1つのエピトープを含む組換えペプチド又はタンパク質を生成する方法であって、Pla l 1ヌクレオチド配列が発現し、かつペプチド又はタンパク質が生成されるような条件下で、本発明の宿主細胞を培養する工程、及びペプチド又はタンパク質を単離する工程を含む方法に関する。
本発明の組換えペプチド又はタンパク質を、有効成分として含む医薬組成物に関する。
本発明の組換えペプチド又はタンパク質又は本発明の医薬組成物を、患者に投与することを含む、患者のアレルギー反応を予防し、軽減し又は治療する方法に関する。
患者からのサンプルを集める工程、及び本発明のタンパク質又はペプチドに対するＩｇＥ抗体のレベルを測定する工程を含む、患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーを診断又は予知するインビトロの方法に関する。
患者を本発明のタンパク質又はペプチドに曝す工程、又は患者の反応をモニターする工程を含む、患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーを診断又は予知する、インビボの方法に関する。
患者のPla l 1アレルゲンに対するアレルギーのインビトロ又はインビボでの診断又は予知に使用する試薬であって、試薬が、本発明のいずれか１項記載のタンパク質又はペプチドを含む方法に関する。
本発明のタンパク質又はペプチドを使用することを含む、アレルギーワクチン接種の効果を予測する方法に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明
ヘラオオバコの花粉（イギリスオオバコ）の主要アレルゲンである、Pla l 1.0101、Pla l 1.0102及びPla l 1.0103の３つのイソアレルゲン変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列ID番号３に述べられ、それらのアミノ酸配列は、配列ID番号４に述べられる。イソアレルゲン変異体Pla l 1.0101を発現し、精製して特徴づけした。Pla l 1変異体のヌクレオチド配列は、１３１残基の成熟処理されたタンパク質をコードする。組換えPla l 1.0101は、天然のPla l 1アレルゲンに似た抗原性を示す。このアレルゲンは、感受性個体のアレルギー反応を起こすことができるIgE抗体合成を誘発する。組換えPla l 1タンパク質は、オオバコ花粉によって誘導されたアレルギー疾患の診断と治療を対象とする調製で活性成分として使用することができる。
【０００８】
核酸分子
本発明の核酸分子は、オオバコ科から選択された植物から生じた分子である。オオバコ科の植物には、Plantaginaceae Arnoglossum S.F. Gray, Plantaginaceae Asterogeum S.F. Gray, Plantaginaceae Bougueria Decne, Plantaginaceae Coronopus Miller, Plantaginaceae Coronopus Reichb., Plantaginaceae Lagopus Fourr., Plantaginaceae Litorella Aschers., Plantaginaceae Littanella Roth, Plantaginaceae Littorella Berg., Plantaginaceae Plantaginella Fourr., Plantaginaceae Plantago L.及び Plantaginaceae Plantago Linn.,が含まれ、インターネットhttp://www.ipni.org（2001年5月21日にアクセス）で公表された、国際植物名インデックス(IPNI)の、植物名プロジェクト(1999)を参照されたい。好ましくは、本発明の核酸分子は、約1759の亜種を含むオオバコ属から選択された植物が起源である。国際植物名インデックス（IPNI;www.ipni.org）を参照されたい。
本発明の核酸分子は、ストリンジェントな条件下、好ましくは高いストリンジェントな条件下で、配列ID番号３にハイブリダイズする配列でよい。
好ましくは、前記配列が約５０％を超える、より好ましくは７０％を超える、更に好ましくは８５％を超える、また更に好ましくは９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える、配列ID番号３との配列同一性を有する。
【０００９】
タンパク質又はペプチド
上述したように、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を、配列ID番号４と比べて、部分的又は全体的にIgE結合親和性を減じるように変更してもよい。非IgE結合親和性のアレルゲンは、抗体媒介B細胞応答を生じさせない。しかしながら、このようなアレルゲンは、T細胞応答を誘発することができるので、非IgE結合親和性のアレルゲンはまだワクチンとして役立つと信じられる。血清反応性が無くても、感作のリスクなしで予防のための免疫化を可能にするであろう。
本発明による組換えタンパク質又はペプチドを、高いレベルの純度で製造することができる。このように、組換え技術がタンパク質／ペプチドを製造するのに使用されるので、花粉の抽出によって得られたアレルゲン調製物と異なり、生じた製造物を、アレルゲンの別のイソ型が全くないように、製造することができる。その上、生じた製造物を、全タンパク質に基いて９５％を超える純度で製造することができる。このように、本発明の好ましい態様において、タンパク質又はペプチドは、全タンパク質に基いて７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％を超える、最も好ましくは９５％を超える純度を有する。なお、本発明のタンパク質又はペプチドには、単量体、二量体、グリコシル化及び非グリコシル化の形を含む、存在し得るあらゆる形が含まれる。
アミノ酸配列の変更は、１つ以上の置換及び／又は欠失及び／又はアミノ酸の追加を含んでもよい。
好ましくは変更されたアミノ酸配列は、配列ID番号３と比べて５０％を超える、好ましくは約６７％、より好ましくは８０％を超える、更に好ましくは９０％を超える、及び最も好ましいのは９５％を超える同一性のレベルを有する。
アレルゲンのアミノ酸配列が一度決定されると、従来技術を使用したアレルゲンのエピトープの位置、構造及び配列を決定するのは、当業者に可能である。アレルゲンのエピトープの位置、構造及び配列を決定するために行われる実験について、例７に詳細に述べる。
好ましくは、本発明の組換え変更されたアレルゲンは、前記の自然に発生するアレルゲンと同一のα-炭素主鎖を有する。
変更されたアレルゲンに対する特異的IgE結合は、ソース特異的IgE反応アレルギー患者の血清又はそれらのプールのイムノアッセイで自然発生のイソアレルゲン又は同様の組換えタンパク質と比較して、好ましくは少なくとも５％、より好ましくは２５％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上に減少される。
減少されたIgE結合を評価する別の方法は、ヒスタミン放出（HR)を開始する変更されたアレルゲンの能力である。ヒスタミンの放出を、幾つかのヒスタミン放出アッセイで測定できる。変更されたアレルゲンの減少したヒスタミン放出は、架橋を促進する減少した能力と同様に、細胞表面に結合した特異的IgEへの減少した親和性から起こる。HRは、天然に発生するアレルゲンと比較して本発明の変更されたアレルゲンにおいて好ましくは５〜１００％、より好ましくは２５〜１００％、更に好ましくは５０〜１００％、最も好ましくは７５〜１００％に減少される。
【００１０】
本発明の好ましい態様は、１つ以上の置換が部位特異的突然変異誘発によって行われることを特徴とする。
本発明の別の好ましい態様は、1つ以上の置換がランダム突然変異誘発によって行われることを特徴とする。
核酸配列の変更は、例えば、国際特許出願99/47680及びデンマーク特許出願PA200001718に述べられている方針で行われ得る。
本発明の好ましい態様において、タンパク質及びペプチドは、Pla l 1と異なるアレルゲンのエピトープと同じ結合特異性を有する少なくとも1つのエピトープを含む。
このようなハイブリッドアレルゲンは、問題になっているPla l 1及び他のアレルゲンの両方の抗原性を示し、Pla l 1及び他のアレルゲンの両方に対するアレルギーを同時に治療又は診断するのに使用されうる利点を有する。
得られた配列をタンパク質データベースの他の配列と比較すると、Pla l 1が最も類似性を示すタンパク質の中で、オレア・ヨーロパエア(Olea europaea)の花粉からのOle e 1が、臨床的に最も重要であることがわかった。例８を参照されたい。参照により、例８を、Pla l 1とその最も関連するアレルゲンとの間の配列の類似性のより詳細な根拠にする。
本発明の好ましい態様において、タンパク質とペプチドが、オレア・ヨーロパエアからのアレルゲンOle e 1のエピトープと同じ結合特異性を有する少なくとも１つのエピトープを含む。
本発明のこの好ましいタンパク質又はペプチドとして、Pla l 1及びOle e 1の両方の抗原性を示し、Pla l 1及びOle e 1アレルギーの両方に対するアレルギーを同時に治療又は診断するのに使用しうる利点を有する。
Pla l 1は、Ole e 1との交差反応性を有することが示された（３０）。このように、本発明で提供される組換えPla l 1アレルゲンは、Pla l 1及びOle e 1アレルギーの両方の同時治療及び診断を果たすのに使用され得るという利点を有する。
本発明による組換え変更アレルゲンは、Pla l 1をコードする核酸分子のDNAシャッフル（分子増殖）により得られたDNA配列を使用して製造され得る。DNAシャッフルは、Punnonen J：「アレルギーワクチンの分子増殖と抗アレルギー性サイトカイン」、Int Arch Allergy Immunol 2000; 121:173-182及びここで述べた論文（この参照によってここにすべて含まれる）に開示された手順に従って行われる。
DNAシャッフルは、Pla l 1をコードする核酸分子及び潜在的に関連する抗原性を有するアレルゲンをコードする他のDNA分子の間で行うことができ、２つ以上の異なるアレルゲンのエピトープ、例えば、Pla l 1及びOle e 1のエピトープを含むアレルゲン分子をコードするDNAハイブリッドを製造できる。
本発明の他の好ましい態様は、タンパク質又はペプチドはそれらの誘導体である。このような誘導体は、不変の又は減少したIgE結合親和性を有し得る。
このような誘導体は、化学的に変更されたタンパク質及びペプチド、例えばグルタルアルデヒドを使用する架橋により変更されたタンパク質及びペプチドを含む。このような化学的に変更されたタンパク質及びペプチドを、標準的なタンパク質化学の方法によって得ることができる。
アレルギー治療に潜在的に有用な他の化学的に変更されたタンパク質は、J. Allergy Clin. Immunol. 2001;107;339-350に記載されているようにCpGモチーフを含むアレルゲン−DNAコンジュゲートを含む。またその組成物は混合物として与えられる。
【００１１】
医薬組成物及び治療方法
活性物質のほかに、本発明の医薬組成物は、多くの賦形剤と補助剤を含むことができる。使用される賦形剤は、タンパク質及びペプチドの製剤に従来使用されている、どんな賦形剤でもよい。補助剤は、アレルゲンの製剤に従来使用されている、どんな補助剤でもよい。
好ましくは、本発明の医薬組成物はワクチンである。ワクチンの調製は、当業界で一般的に周知である。ワクチンは、典型的には、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射可能物質として調製される。また、このようなワクチンは、経鼻投与及び頬側及び舌下を含む経口で可能であるように乳化され又は処方され得る。問題となる免疫原性の成分（ここで明確にされた組換えアレルゲン）は、製薬的に許容でき、更に活性成分に適合性がある賦形剤と好適に混合され得る。好適な賦形剤の例は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールエタノール及びこれらの組合せなどである。ワクチンは、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤又はワクチンの有効性を高める補助剤等の他の物質を更に含んでもよい。
ワクチンは、皮下又は筋肉内に、非経口的に最もしばしば投与される。このようなワクチンにおいて、活性物質は、固体支持体の上に吸収されるか、水溶性の形で存在してもよい。別のルートによる投与に好適な調剤は、経口の製剤及び坐剤を含む。経口投与用ワクチンは、このような製剤、例えばマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等に普通に使用される賦形剤で好適に調剤される。組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、マイクロパーティクル、リポソーム調製物、持続性放出剤形、エアゾール、散剤、顆粒等として調剤され得る。本発明のワクチンは、例えば、国際特許出願00/45847、デンマーク特許出願PA200001194に記載されている方法に従って調剤することができる。
ワクチンは、投与製剤形態に適合するような方法で、治療的に効果があり免疫原性であるような量で投与される。ワクチンに含まれる活性化された成分の量は、治療されるべき患者、すなわち治療、投与のルート、患者の年齢及び体重に応答する患者の免疫システムの能力に依存する。好適な投与量の範囲は、約0.0001μｇ〜1000μｇ以内で変えることができる。
上述のように、増加した効果は、調剤に補助剤を添加することによって得られる。このような補助剤の例は、リン酸緩衝生理食塩水の0.05〜0.1％の溶液の水酸化アルミニウム、リン酸化（アルミニウム）又はリン酸化カルシウム、0.25％溶液として使用される糖又はポリ乳酸グリコリド（glycolid）（PLG)の合成ポリマーである。また、C. parvum等の細菌細胞、グラム陰性細菌のエンドトキシン又はリポポリサッカライド成分、マンニドモノアレエート(mannide monoaleate)(Aracel A)等の生理学的に可能なオイルビヒクルのエマルジョン、又はブロック置換として使用されるペルフルオロカーボン（例えばFluosol-DA)の２０％溶液とのエマルジョンとの混合物を使用できる。MF-59等のオイルエマルジョンも使用できる。また、フロイントの完全な及び不完全な補助剤及びQuilA、Qs-21及びISCOMのようなサポニン、及びRIBIのような他の補助剤も使用できる。
たびたびのワクチンの複数の投与は、効果を確実にするのに必要であろう。しばしば、ワクチンは最初の投与として投与され、引き続く接種又は他の投与が続く。ワクチンの数は、典型的には１〜５０の範囲であり、通常、３５のワクチン接種を超えない。ワクチンは、２ヶ月から５年の期間で隔週から隔月で通常行われる。これは、予防的又は治療的効果の所望レベルを与えることを企図される。
組換えアレルゲンは、医薬品として使用でき、症状が発生するその年の期間中にアレルギー反応に対して一定の保護を提供するのに好適である（予防法）。幾つかの場合において、治療は、保護効果を維持するために毎年繰り返されなければならないであろう。経鼻、経口及び舌下適用用に調剤された医薬品は、この目的に特に適合される。
最後に、本発明の組換えアレルゲンは、免疫系の特定の細胞又は粘膜表面に送達するためのターゲット分子との組合せとして提供され得る。
【００１２】
ベクター及び宿主
本発明の発現ベクターは、プラスミド又はファージを含む、Pla l 1を発現することができる発現ベクターである。好ましくは、本発明の発現ベクターは、プラスミド、例えばpPIC9、pROEX HT（製造者：ライフテクノロジーズ）、pGAPZ（製造者：インビトロゲン）及びpSFV1（製造者：ライフテクノロジーズ）である。
本発明の宿主は、細菌細胞、哺乳類細胞及び酵母細胞を含む、使用されるベクターをホストすることのできる宿主であればよい。本発明の好ましい態様において、本発明の宿主は、酵母ピチア・パストリス（Pichia Pastoris）又は細菌E. coliである。
【００１３】
診断方法
本発明のインビトロ診断又は予後方法は、アレルゲン物質に特異的なIgEのレベルを測定できるイムノアッセイであればよい。
好ましくは、インビトロアッセイは、国際特許出願第94/11734号、99/67642号及び第00/37941号に述べられているアッセイの中から選択され、これらは参照によってここに組み込まれる。
本発明のインビボ診断又は予後方法は、例えばスキンプリックテスト及び皮内テストの皮膚テスト、及び気管支吸入誘発等の、アレルゲン物質に対する患者の感受性を評価できるテストでもよい。
アレルギーワクチン接種の効果を予測する方法は、国際特許出願第99/67642号で述べられている方法等の、予測することが可能な公知の方法でもよい。
【００１４】
定義
本発明に関し、語句「エピトープ」は、少なくとも５つのアミノ酸の主要アミノ酸配列のフラグメント又は少なくとも５つのアミノ酸から成る成熟した折りたたまれたタンパク質（三次元、三次構造）の表面暴露領域のいずれかの形の抗体結合構造を意味する。用語「エピトープ」は、Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープの両方を含む。抗体は、クラスIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに属するどのイムノグロブリンでもよい。
語句「配列ＩＤ番号３のフラグメント」は、少なくとも１５塩基対を含むフラグメントを意味する。
語句「核酸分子はアミノ酸配列をコードする配列を有し、」は、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸分子配列を意味する。
語句「ストリンジェントな条件」は、以下の条件、0.15〜0.9Ｍ NaClの塩濃度及び20〜55℃の条件を意味する。
語句「高いストリンジェントな条件」は、0.02〜0.15Ｍ NaClの塩濃度及び50〜70℃の条件を意味する。
語句「変性」は、核酸分子配列によってコードされたアミノ酸の配列を変えない、核酸分子配列におけるヌクレオチドの１つ以上の置換を意味する。
語句「配列ＩＤ番号３の配列」は、配列ＩＤ番号３を示す３つの配列の変異体のいずれかを意味する。同様に、語句「配列ＩＤ番号４の配列」は、配列ＩＤ番号４に示された３つの配列変異体のいずれかを意味する。
語句「組換えタンパク質又はペプチド」は、合成タンパク質／ペプチド、即ち化学合成によって調製された分子、及び組換え技術を使用して調製されたタンパク質／ペプチドを含む。
語句「減少したIgE結合親和性」は、IgE結合親和性が部分的または全体的に減少されたことを意味する。
【実施例１】
【００１５】
例
本発明のより完全な理解は、以下の特定の例を参照することによって得られる。これらの例は、説明の目的のために単に説明されるのであって、本発明の範囲を制限するものではない。特定の用語がここで使用されるが、このような用語は、説明的な意味に意図され、制限する目的ではない。
特に指示が無ければ、組換えDNA技術は（２４）で説明される標準的な手順に従って行われる。
【００１６】
例１
この例は、ヘラオオバコの花粉のRNAの単離、Pla l 1特異的cDNAの3'-フラグメントの第一鎖cDNA合成及び増幅を説明する。
全RNAを、変性溶液での花粉粒子の延長された超音波処理により、ヘラオオバコから抽出し、続いて懸濁液をフェノール−クロロフォルム抽出した。花粉（0.6ｇ）を、4Mグアニジウムトリシアネート、25ｍMクエン酸ナトリウムpH7.0、0.5％（w/v)ラウリルサルコシネート及び100ｍMβ−メルカプトエタノールを含む変性溶液7ｍｌに懸濁し（２５）、懸濁液を、バイブラセルソニファーモデルVC300で、負荷サイクル５０％超音波暴露、セッティング９で３０分超音波処理した。２M酢酸ナトリウムpH4.0（0.7ml)、水−飽和フェノール(7ml)及びクロロホルム：イソアミルアルコール（49：1(v/v、1.4ml)を、超音波処理した懸濁液に添加し、ときどきシェイクして４℃で１５分インキュベートした。相を、４℃、１００００ｇで２０分遠心して分けた。水相をきれいな試験管に移し、RNAを、―２０℃で同量のイソプロパノールを添加することにより沈澱させ、−２０℃で１時間インキュベートした。ペレットを0.3ｍｌの変性溶液に溶解し、前と同じようにイソプロパノールで再び沈澱させた。ペレットを75％エタノールで洗浄して乾燥させた。最後にRNAペレットをDEPC処理水に溶解して使用するまで-70℃で、アリコートで冷凍保存した。
第一鎖cDNAを、3'-RACEシステムキット（ギブコ-BRL)で提供される、スーパースクリプト逆転写酵素とAPプライマーとを使用して、製造者の指示に従って、１０μｇのRNAから合成した。APプライマーは、指示されたクローニングにふさわしい制限酵素認識部位を有する、5'末で延長された１７ｄT残基を含む（5'GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT3')。
RNAアーゼH処理後、Pla l 1特異的cDNA（3'-フラグメント）を、センスプライマーとして、位置５〜１０でPla l 1のN末端アミノ酸配列から推定される（２３）変性したオリゴヌクレオチドと、アンチセンスプライマーとして、３’RACEシステムキットで供給されるUAP(5'CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC3')とを使用する第一鎖cDNA合成反応混合物２μｌから増幅した。通常、この仕事を通して行うDNA増幅を、最終反応混合物量５０μｌで、濃度１０μMのプライマーと酵素タグDNaポリメラーゼ（ギブコ−BRL)２．５ユニットとを使用するポリメラーゼ連鎖反応法（PCR)で行った。DNA増幅の条件は、酵素の製造者によって推奨される条件であり、各反応で使用される特定のプライマーの機能としてアニーリング温度を調節した。この特定の反応において、アニーリング温度を５１℃に調節した。遺伝子ATAQ（ファルマシア）プログラム可能サーマルコントローラを、PCR増幅に使用した。
PCR生成物を、1.2%アガロース／TAEゲルの電気泳動で分析して、タンパク質の分子量から見積もって予想される大きさに基いて、分子量マーカー(100bpラダー、MBI Fermentas)と比較すると、約700bpの大きさを示した。
【００１７】
【表１】
2005502327.tif 000003
Nは、A、T、C又はGのどれかがその位置に存在し得ることを意味する。
Yは、C又はTのどれかがその位置に存在し得ることを意味する。
Rは、A又はGのどれかがその位置に存在し得ることを意味する。
【００１８】
例２
この例は、Pla l 1-cDNAの3'フラグメントのクローニングと配列決定を説明する。
3'-RACE  PCRによって増幅されたPla l 1-cDNAの3'フラグメントを、アガロースゲルから精製し、適合Tヌクレオチドの張り出し末端を有するpGEM T Easyベクター（プロメガ）の中にクローニングするのに使用した[26]。このプラスミドは、形質転換体とクローニング部位の両側に配置された幾つかの制限部位の選択を可能にするアンピシリン抵抗性の遺伝子を運ぶ。連結反応を、T4 DNAリガーゼ（プロメガ）の存在下で４℃で１６時間インキュベーションを行うことによって行った。連結生成物をE.coli菌株DH5αで形質転換した。プラスミドDNAをウイザードプラスミニプレップ（プロメガ）を使用する組換え形質転換体から調製した。選択された形質転換体が挿入断片を有することを確かめるため、プラスミドDANからのサンプルをEcoRI（ベーリンガー）で切断し、アガロースゲル電気泳動で分析した。幾つかのクローンの両鎖の完全なヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーティング法で決定した[27]。DNA配列をABI PRISMダイターミネーターシステムとABI 377自動シークエンサー(アプライドバイオシステム）を使用して行った。
Pla l 1をコードするcDNAフラグメントの配列は、ポリAテイルが続く3'未翻訳配列を有した。異なるクローン間の幾つかの違いが、コード及び非コード領域の両方に観察された。これらの違いは、完全なPla l 1アレルゲンをコードするクローンの配列を参照したときに、より大きな範囲で明らかにされ、議論されるであろう（例４）。得られた配列は、多型位置をもたない、配列伸張の特異的プライマーの設計を可能にした。これらのプライマーは、以下の例に述べるように、タンパク質のN末端及びシグナルペプチドに対応するヌクレオチド配列（Pla 2及びPla 3、表１）に対応するヌクレオチド配列をはっきり解明するために、5'-RACEに使用した。
【００１９】
例３
この例は、リーダーペプチド及びタンパク質のN末端を含む、Pla l 1-cDNAの5'-フラグメントの合成、増幅、クローニング及び配列決定を説明する。
第一鎖cDNA合成及びPla 1-cDNAの5'フラグメントの増幅を、5'RACEシステムキット（ギブコ-BRL）と、例２で述べたようにして得られた3'フラグメントの配列由来の特異的プライマーPla 2及びPla 3、表１）を使用して達成した。簡単に言えば、第一鎖cDNAを、遺伝子特異的アンチセンスプライマー(Pla 2、表１）及びスーパースクリプト逆転写酵素（ギブコ−BRL)を使用して１０μｇのRNAから合成した。第一鎖ｃDNA合成後、もとのｍRNAテンプレートを、RNAアーゼミックス（RNAアーゼHとRNAアーゼT1の混合物、ギブコ−BRL)で処理することによって除去した。非取り込み型のｄNTP、Pla 2及びタンパク質を、キットで提供されるグラスマックススピンカートリッジを使用してｃDNAから分離した。次に、ホモポリマーテイルを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びｄCTPを使用してｃDNAの3'末に加えた。テーリング反応を１時間氷でインキュベーションすることにより行った。このテーリング反応をPCR適合バッファーで行い、反応のアリコート部分を、中間精製工程無しでPCRによる増幅に直ちに使用した。dC-cDNAを、Taq DNAポリメラーゼ、ネスト化した、Pla l 1特異的プライマー（Pla 3、表１）及びこのシステムで提供されるデオキシイノシン含有アンカープライマー（AP2、5'GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3')を使用して増幅した。この反応において、アニーリング温度を６５℃にセットした。PCR生成物を１．２％アガロース／TAEゲルで電気泳動で分析し、予想された大きさに従った、分子量マーカーと比較すると、約３００bpの大きさを示した。PCRで増幅されたPla l 1-cDNAの5'フラグメントをアガロースゲルで精製し、pGEM T Esayベクター（プロメガ）にクローニングするのに使用し、例２で述べたように配列決定した。３つのクローンの両鎖の完全なヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーティング法で決定した。これらの配列を、配列ID番号１で示した。リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列決定されたクローン全てにおいて同じ長さ（２５アミノ酸残基に対応する75塩基）を持つ。アミノ酸変化を意味するリーダーペプチド配列ストレッチのたった１つの塩基置換（配列ID番号２）が、1つのクローンで観察された（クローン１４）。成熟タンパク質に対応する配列ストレッチに関し、最初の８６塩基に可変性が無いことが分かった。位置８７において、ヌクレオチド変化がクローン１４に観察された。この変化について例４で深く議論する。非変性２０ヌクレオチド長プライマー(Pla 4、表１）を、成熟タンパク質のN末端のために確立された明確な配列から設計した。このプライマーを、例４及び５で説明したように、Pla l 1発現と同じように配列決定するのに使用される、成熟タンパク質をコードする完全長クローンを得るために、3'伸張に使用した。
【００２０】
例４
この例は、成熟タンパク質のN末端から開始するPla l 1特異的ｃDNAのクローニングと配列を説明する。
花粉RNAからの第一鎖ｃDNA合成及びPla l 1特異的ｃDNAの3'RACE増幅を、使用したプライマーが成熟Pla l 1アレルゲンのアミノ酸配列の位置１−７に対応するPla 4（表１）であり、増幅のアニーリング温度が５５℃であることを除いて、例１に述べたように行った。PCR生成物を、アガロースゲルから精製して、pGEM T Easyベクターへのクローニング及び配列決定を、例２に述べたように行った。幾つかのクローンからの両鎖の完全なヌクレオチド配列を、ジヌクレオチドチェーンターミネーティング方法で決定した。ヌクレオチド配列の長さは、６７４〜７０４bpの範囲であった。これらの違いは、各クローンのポリ(A)トラクトの異なる長さと3'未翻訳領域の幾つかの相違によって生じる。ヌクレオチド配列分析の塩基において、これらのｃDNAクローンは、３つのグループに分類され、それぞれは、Pla l 1のイソアレルゲン変異体をコードする。配列ID番号３において、各グループの1つのクローンの代表のヌクレオチド配列が与えられる。これらのクローンの配列は、これらの全てが１３１アミノ酸残基成熟タンパク質をコードすることを示した。コード領域において、配列多型が、4つの位置（８７、１７３、２４４、２９７）で観察された。また、位置８７の多型は、5'RACE増幅後に得られたクローンで観察された（例３）。その位置のヌクレオチド置換及び位置２９７の変化は、推定されたアミノ酸配列のアミノ酸変化を導かない。しかしながら、位置１７３及び２４４の多型は、それぞれ、アミノ酸配列の位置５８及び８２でのアミノ酸変化を意味する。配列決定されたクローンの３つのグループの代表のクローンによってコードされた成熟タンパク質の推定されたアミノ酸配列の比較は、配列ID番号４で描かれる。クローン１．２は、位置５８のグルタミン酸及び位置８２のセリンを有するアミノ酸配列をコードする。クローン１．６は、位置５８のグリシン及び位置８２のセリンをコードし、クローン１．４は、両方の位置でグリシンをコードする。アレルゲンの命名法のためのIUISのルールによれば、これらのクローンによってコードされるタンパク質は、変異体として考えられるべきである。従って、これらは以下のように命名される。Pla l 1.0101は、Pla 1.2で示されるクローンのグループによってコードされるアレルゲンであり、Pla l 1.0102は、Pla l 1.6によって示されるクローンのグループによってコードされるアレルゲンであり、Pla l 1.0103は、Pla l 1.4によって示されるクローンのグループによってコードされるアレルゲンである。全ての変異体は、配列で６つのシステイン残基と位置１０７の潜在的Nグリコシル化部位を示した。成熟Pla l 1アレルゲンのポリペプチド主鎖の評価された分子量値は、変異体０１０１、０１０２及び０１０３のそれぞれで、１４５２１、１４４６３及び１４４３３である。Pla l 1変異体のアミノ酸配列から推定された親水性の性質の比較により、アミノ酸配列の変化は、表面の性質に重大な変化を意味せず、よって、タンパク質の抗原性の特徴をおそらく変えないことが示された。
【００２１】
例５
この例は、組換えPla l 1アレルゲン、酵母ピチア・パストリス(Pichia pastoris)の変異体０１０１の発現を説明する。
P.パストリスは、他に役立たなくても、炭素源としてメタノールを使用することができるメチルトローフ酵母である。アルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする２つの遺伝子、AOX1及びAOX2は、P.パストリスゲノムに存在する。メタノールがただ1つの有用な炭素源である場合、AOX1生成物は、発現された全タンパク質の約８０％を示す。この特徴を利用するとき、P.パストリス発現システムは、本質的に、興味ある遺伝子に対するAOX1遺伝子の置換にある。一方、使用された酵母菌株、GS115 his4の成長は、培地のヒスチジンの利用能に依存される。
P.パストリスの発現に使用される発現ベクターpPIC9（インビトロゲン）は、挿入断片が組み込まれる複数のクローニング部位の前に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−接合因子のリーダー配列をコードするDNAを運搬する。このシグナルペプチドは、酵母によって効率的に認識され、高い収率で非相同的タンパク質の分泌を可能にする。DNAと複数のクローン部位をコードするシグナルペプチドは、AOX1遺伝子座の5'末及び3'末の間に配置され、組換えを導く。更に、ベクターは、酵母で形質転換体を選択するために、細菌の複製開始点、（細菌の形質転換体の選択のための）アンピシリン抵抗性遺伝子及びヒスチジンフリー培地で細胞成長可能にする、ヒスチドールデヒドロゲナーゼgen HIS4を含む。
発現のため、まず、Pla l 1遺伝子のコード領域を、(ギブコ−BRLの市販の3'-RACEシステムキットを持つ）PCRで、テンプレートとして花粉mRNAの第一鎖ｃDNAと、２つの非変性プライマーである、センスプライマーCTCGAGAAAAGAGAGACACAAACATCTCATCCCGC(Pla 5)及びアンチセンスプライマーGGGAATTCTTAACACCCAGGGGC(Pla 6)とを使用して増幅し、プライマーは、それぞれ、タンパク質コード領域の5'及び3'末と、α−接合因子のプレプロ配列をコードする配列とフレーム単位でハイブリダイズし、プラスミドｐPIC9に存在する。また、Pla 5は、Xho I配列部位（下線部）及び酵母によるシグナルペプチドの工程を可能にするグルタミン酸のコドンを含む。アンチセンスプライマーは、ストップコドン及びEcoRI制限酵素認識部位（下線部）を含む。増幅のアニーリング温度を６５℃にセットした。
PCR生成物をアガロースゲルから単離し、例２に述べたように、適合性Tヌクレオチド張り出し末端を持つpGEM T Easyベクターへのライゲーションに直ちに使用した。この構築物を、DH5α E.coli細胞を形質転換するのに使用し、形質転換体をアンピシリン抵抗性によって選択した。幾つかのクローンからの両鎖のヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーティング方法で決定し、リーダー配列及びPla l 1のフレーム単位アレインジメントを、開始配列からの変化の不存在と同様に、確認した。
プラスミドDNAを単離し、Xhol-ecoRI制限酵素で切断した。DNAフラグメントを、pPIC/9Pla l 1.0101を示すプラスミドｐPIC9の同じ部位にサブクローニングした。
プラスミドpPIC/Pla l 1.0101を、Bgl II制限酵素で直線化し、精製した大きいフラグメントをエレクトロポレーションによるGS115細胞を形質転換するのに使用した。形質転換した細胞を、コロニーが出現するまで４〜６日間、３０℃で最小限のブドウ糖平板でインキュベーションした。(His+ Muts)フェノタイプを示す、AOX1遺伝子座での相同組換えによる構造物の遺伝子置換スクリーニングを、最小限のブドウ糖対最小限のメタノール平板上にレプリカプレーティングでHis+コロニーをパッチすることによって、行った。遅延した成長速度のこれらの形質転換体を、rPla l 1生産用に選択した。
選択された(His+ Muts)形質転換菌株を、緩衝グリセロール複合培地で３０℃で４日間培養した。次に、細胞を、遠心分離して集め、AOX1プロモーターの誘発のための緩衝メタノール複合培地の原体積の５分の１に再懸濁した。この培地を、４日間維持し、培地１リットル当たり５ｍｌのメタノールで毎日補充した。GS115誘発細胞の培地を、４℃で３０００ｇで遠心分離し、酵母細胞を取り除いた。培地の上清のrPla l 1の生成物を、SDS/PAGEと、Pla l 1の定量化のために特別に設計されたモノクローナル抗体のELISAとで、異なる回数で分析した(29)。組換えPla l 1の最も高い発現レベルには、誘発後４日で到達した。
rPla l 1の大きいスケールの生成物を、小さいスケールの実験で最も良い収率を示したコロニーを使用して、同様の条件下で行った。培地１リットル当たり、組換えアレルゲンの２０ｍｇの収率を得た。
【００２２】
例６
この例は、培地からの組換えPla l、変異体０１０１の生成及び生成されたタンパク質の特徴付けを述べる。
例５に述べたようにして得られた培地を、水で透析し、rPla l 1を精製する出発物質として使用した。精製を、トリスバッファーでの酢酸ナトリウム塩勾配で、DEAE-5PWカラム（ウオータースクロマトグラフィー）を使用してアニオン交換クロマトグラフィーで行った。次に、精製した組換えアレルゲンを、水で大規模に透析した。また、サイズ排除クロマトグラフィー(23)及びモノクローナル抗体を使うアフィニティークロマトグラフィー(29)等の、天然アレルゲンを精製するのに使用される別の精製方法を、高い純度で産生する組換えアレルゲンに適用した。SDS-PAGEで精製された組換えアレルゲンPla l 1の分析は、天然Pla l 1アレルゲンの分析と同様の電気泳動パターンを示し、アレルゲンのグリコシル化及び非グリコシル化単量体の形に対応する、１７及び２２ｋDaのはっきりした分子量を有する２つの主要バンドを有し（図１）、PNGアーゼF（ベーリンガーマンハイム）の脱グリコシル化実験により証明された。この酵素での処理は、２２ｋDaのバンドの１７ｋDa（非グリコシル化）への変換を起こした（図１）。これらの結果を、MALDI-TOF質量分析で確認した。また、これは、SDS-PAGE分析で分子量３２〜３６ｋDaの範囲で検出された広く拡散したバンドは、単量体ユニットの二量体への会合から起こったことを証明した。N末端アミノ酸配列決定及び精製された組換えアレルゲンのアミノ酸組成分析は、P.パストリスで発現されたタンパク質がPla l 1であったことを確認した。追加のグルタミン酸残基を、タンパク質のN終端で暴露し、変更の結果、酵母の発現用組換えDNA構造物に含まれた。
また、発現された組換えアレルゲンを特徴づけるのに使用される技術は、その純度の程度についての情報を提供する。クマシーブルー染色SDS-PAGEゲルの濃度測定は、rPla l 1が＞95％純粋であったことを示した。純度の同様の値を、HPLCクロマトグラフィーとMALDI-TOF質量スペクトルの集約後に、推定した。更に、検出可能な混入物のない、たった一つの配列を、タンパク質のエドマン分解で得た。これは、実際に生成物が約９９％の純度を有することを示す。
また、組換えPla l 1を、モノクローナル抗体とオオバコアレルギー患者の血清を使用して免疫化学的に特徴づけした。組換えタンパク質を、天然抗原に対して上昇するモノクローナル抗体2A10(2)により認識し、同じ抗原決定基を持つことを証明した。これは、組換えタンパク質の折りたたみが天然抗原の折りたたみと同様であることを示唆する。円偏光二色性実験の結果は、この仮定を支持し、組換えアレルゲンの遠UVでのCDスペクトルは、天然アレルゲンのスペクトルと区別がつかなかった（図２）。一方、rPla l 1を、オオバコアレルギー患者の個々の血清の一群に対してテストし、血清の殆どが陽性反応であった。更に、nPla l 1に対する、血清プールからの特異的IgEの結合の抑制実験において、組換えアレルゲンは、天然アレルゲンの抑制カーブと平行な抑制カーブを与え、IgE結合の８０％抑制まで到達できた（図３）。これらの結果は全て、天然アレルゲンに存在する殆どのアレルゲンのエピトープは、組換えアレルゲンに保存され、従ってオオバコアレルギー患者の診断の適切なツールになるだろう。
【００２３】
例７
本例は、アレルゲンPla l 1のエピトープの位置、構造及び配列を決定する方法を説明する。
Pla l 1の連続したエピトープの一及び配列の決定は、完全なアミノ酸配列にわたっている重複ペプチドを使用することにより達成される。これらのペプチドのアミノ酸配列は、配列ID番号４に示された配列から推定される。これらのペプチドを、化学的に合成するか、又は適切なベクターに対応するヌクレオチド配列を挿入することにより組換えペプチドとして製造して、宿主で発現する。B細胞エピトープを、特異的抗体（アレルギー患者の血清のIgE、モノクローナル抗体等）に結合する能力を持つこれらのペプチドをイムノアッセイ又は他の免疫化学技術で検出することによって、確認する。更に、ペプチドを、T細胞エピトープの一部を形成するペプチドを検出するため、T細胞増殖アッセイでテストする。
Pla l 1のヌクレオチド配列の有用性と発現された組換えアレルゲンは、アレルゲンの立体配置的なエピトープの確認を容易にする。従って、三次元構造のデータは、X線結晶学及び核磁気共鳴を使用する組換えアレルゲンの構造的分析によって得られる。それとは別に、アミノ酸配列を、エピトープの一部を形成し得る潜在的表面残基を目標とする予測コンピューターアルゴリズムを使用して分析する。このように、部位特異的突然変異誘発を、B細胞エピトープに潜在的に含まれるアミノ酸残基の置換でPla l 1変異体を生成するのに使用する。これらの変異体の抗体結合能力の分析は、エピトープを構成するこれらの残基の確立を可能にする。
IgE結合能力を有するこれらのペプチドとrPla l 1変異体は、オオバコアレルギーの、より安全でより効果的な治療における優れた候補を構成する。
【００２４】
例８
Pla l 1の３つの変異体を、タンパク質配列データベースを使用する公知のタンパク質配列と比較した。結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
2005502327.tif 000004
表２：Pla l 1に対するアレルゲン相同性の分子の特性である。配列同一性(%I)及び類似性(%S)パーセンテージである。PIは、等電点、Mmは、分子質量、NoRは、残基の数である。３つの最初のアレルゲンのアミノ酸配列は、スイス−プロットデータバンクにある。目録番号は、カバノキの推定上のOle e 1のO49813、Lig v 1のO82016及びOle e 1のP19963である。Lol p 11配列は、NCBIデータバンクにあり、目録番号は、A54002である。
【００２６】
文献
1. Jarvis D, Burney P (1997) アトピー及びアトピー性疾患の疫学（Epidemiology of a
topy and atopic disease） In Allergy and allergic Diseases, 1st edn, pp 1208-24. Blackwell Science, Oxford
2. Bousquet J, Lockey RF, Malling H-J. WHO Position Paper. アレルゲン免疫療法：アレルギー性疾患の治療用ワクチン（Allergen Immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases） Allergy 1998; 53 Suppl:1-42
3. Carreira J, Lombarder M, Ventas P. インビトロ方法の新開発、大量ユニットでの臨床的関連アレルゲンの定量化（New developments in in vitro methods. Quantification of clinically relevant allergens in mass units） Arb Payl Ehrlich Inst Bundesant Sera Impstoff Frank AM 1994; 87:155-64
4. Valenta R, Vrtala S, Laffer S, Spitzauer S, Kraft D. 組換えアレルゲン（Recombinant allergens） Allergy 1998; 53: 552-61
5. Spieksma FThM, Charpin H, Nolard N, Stix E. ヨーロッパ経済界（EEC)の都市の胞子濃度（City spore concentration in the European Economic Community (EEC)）. Clom Allergy 1980; 10:319-29
6. Negrini AC, Arobba D. イタリアのアレルゲン花粉及び花粉症：近年の進歩（Allergenic pollens and pollinosis in Italy: recent advances） Allergy 1992; 47:371-9
7. Peat JK, Woodcock AJ. 一般的なアレルゲンの感受性：オーストラリアの３つの異なる気候地域の子供における呼吸症状及び気道感応性の関連（Sensitivity to common allergens: relation to respiratory symptoms and bronchial hyper-responsiveness in children from three different climatic areas of Australia）Clin Exp Allergy 1991;21:573-81
8. Lewis WH, Imber WE. ミズーリ地域のセントルイスのアレルギー疫学（Allergy epidemiology in the St. Louis Missouri area） IV. Weeds. Ann Allergy 1975;35:180-7
9. Bernton HS. オオバコ花粉症及び喘息（Plantain hay fever and asthma） JAMA 1925; 84:944-6
10. Blumstein GI, Tuft L. オオバコ花粉症、その発生率と重要性（Plantain hay fever. Its incidence and importance） JAMA 1937; 108:1500-2
11. Derrick E. オーストラリアの花粉症及び喘息の因果関係における様々な植物の相対的重要度（Relative importance of various plants in causation of hay fever and asthma in Australia） Med J Aus 1962; 1:972-7
12. Bryant DH, Burns MW. 喘息患者における吸入アレルゲンのスキンプリックテスト反応（Skin-prick test reactions to inhalant allergens in asthmatic patients） Med J Aust 1976; 1: 918-24
13. Krilis S, Baldo BA, Basten A. 341人のアレルギー患者におけるアレルゲン特異的IgE反応の詳細な分析、アレルゲングループと臨床的診断との関連（Detailed analysis of allergen specific IgE responses in 341 allergic patients. Associations between allergens and between allergen groups and clinical diagnoses） Aust NZJ Med 1985; 15:421-6
14. D'Amato G, Lobefalo G. 南地中海地域のアレルゲン花粉（Allergenic pollens in the southern Mediterranean area） J Allergy Clin Immunol 1989; 83: 116-22
15. Bousqet J, Cour P, Guerin B, Michel FB. 地中海地域Iのアレルギー、モンペリエの花粉量と花粉症（Allergy in the Mediterranean area I. Pollens counts and pollinosis of Montpellier） Clin Allergy 1984; 14: 249-58
16. Merrett TG, Pantin CFA, Dimond AH, Merrett J. IgE介在アレルギーのスクリーニング（Screening for IgE-mediated allergy） Allergy 1980;35:491-501
17. Mehta V, Wheeler AW. 季節性呼吸性アレルギーにおけるイギリスオオバコに対するIgE介在感作：アレルゲン成分の同定と部分的特徴づけ（IgE-mediated sensitization to English Plantain pollen in seasonal respiratory allergy: identification and partial characterization of its allergenic components） Int Arch Allergy Appl Immunol 1991; 96:211-7
18. Subiza J, Jerez M, Jimenez JA, Narganes MJ, Cabrera M, Varela S, Subiza E. アレルギー疾患の臨床的特徴、マドリッドのアレルギ源花粉及び花粉症（Clinical aspects of allergic disease. Allergenic pollen and pollinosis in Madrid） J Allergy Clin Immunol 1995; 96:15-23
19. Gonzalez FJ, Herrero B, Candau P. ２つのスペインの都市におけるアレルゲン花粉の緯度的研究（Latitudinal study of allergic pollen in two Spanish cities） J Invest Allergol Clin Immunol 1993; 3: 304-10
20. Garcia-Gonzalez JJ, Vega-Chicote JM, Rico P, Moscoso del Plado J, Carmona MJ, Miranda A et al. スペイン、マラガの生徒におけるアトピーの罹患率（Prevalence of atopy in students from Malaga, Spain） Ann Allergy Asthema Immunol 1998;80:237-44
21 Baldo BA, Chense QJ, Howden MEH, Sharp PJ. オオバコ（ヘラオオバコ）のアレルゲン、花粉と植物抽出物の研究（Allergens from Plantain (Plantago lanceolata). Studies with pollen and plant extracts） Int Archs Allergy Appl Immun 1982; 68:295-304
22. Drborg S, sjogren I, Erikson EN, Einarsson R. ヨモギとイギリスオオバコの花粉アレルゲン抽出物／調製物の標準化により実証された生物学的検定法のための患者の選択（Selection of patients for biological standardization as exemplified by standardization of mugwort goosefoot and English Plantain pollen allergen extracts/preparations） Allergy 1987; 42: 485-95
23. Calabozo B, Barber D, Polo F. ヘラオオバコ花粉の主要アレルゲンPla l 1の精製と特徴づけ（Purification and characterization of the main allergen of Plantago lanceolata pollen, Pla l 1） Clin Exp Allergy 2001; 31: 322-30
24. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(1989) 分子クローニング：実験室マニュアル
（Molecular Cloning: a Laboratory Manual） 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
25. Chomczynski P, Sacchi N. 酸グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出によるRNA単離のシングルステップ法（Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction） Analyt Biochem 1987; 162, 156-9
26 Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collis FS. Tベクターの作成、未修飾PCR生成物の直接クローニングのための迅速かつ一般的なシステム（Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products） Nucleic Acids Res 1991; 19, 1154
27. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 読み終わりインヒビターのDNA配列決定（DNA sequencing with chain-terminating inhibitors） Proc Natl Acad Sci USA 1977;74,5463-7
28. King TP, Hoffman D, Lowenstein H, Marsh DG, et al. アレルゲン命名法（Allergen nomenclature） Clin Exp Allergy 1995; 25: 27-37
29. Calabozo B, Duffort O, Carpizo JA, Barber D, Polo F. ヘラオオバコ花粉の主要アレルゲンPla l 1に対するモノクローナル抗体、アレルゲンのアフィニティークロマトグラフィー精製とPla l 1測定用ELISA法の開発(Monoclonal antibodies against the major allergen of Plantago lanceolata pollen, Pla l 1. Affinity chromatography purification of the allergen and development of an ELISA method for Pla l 1 measurement） Allergy 2001; 56: 429-35
30. Calabozo B, Diaz-Perales A., Salcedo G. Barber D., Polo F. Pla l 1とOle e 1、イギリスオオバコとオリーブの花粉の主要アレルゲン間の構造的及び抗原性の類似性（Structural and antigenic similarity between Pla l 1 and Ole e 1, the major allergens of English Plantain and Olive pollens） Abstract No. 51, Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001), Vol. 107, No.2, page S15
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】SDS-PAGEの図である。精製nPla l 1(レーン1）及びrPla l 1.0101(レーンｂ）の分析である。レーンｃはＰＮＧアーゼＦ処理後のrPla l 1.0101である。８μｇのタンパク質を１レーンに流した。染色はクマシーブリリアントブルーで行った。
【図２】遠ＵＶでの天然及び組換えPla l 1の円偏光二色性スペクトルである。値は、Pla l 1の平均残基質量として１１３の塩基で平均残基楕円率（θmrw)で示す。
【図３】nPlal 1への特異的IgE-結合の抑制である。９６穴ELISAプレートを、純粋な天然Pla l 1でコートし、オオバコアレルギー患者からの血清プールの特異的IgEの結合を、rPla l 1.0101の添加で抑制した。天然アレルゲンの抑制カーブを比較のために使用した。結合IgEの検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgEウサギ抗体及びorto-フェニレンジアミン（OPD)で行った。吸光度を650nmのリファレンスフィルターで490nmで測定した。
【図４】配列ID番号１  5'RACEシステムを使用して得られた３つのcDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、この３つの配列の配列同一を示す。翻訳開始コドンを下線で示し、リーダーペプチド配列をイタリック体で示し、成熟タンパク質のN末端をコードするオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（プライマーPla4、表１）を太字で示す。5'RACEで使用されたプライマーPla 3のN末端に相補的なヌクレオチド配列は、各クローンの配列の最後で観察される（不連続の下線）。
【図５】配列ID番号１  5'RACEシステムを使用して得られた３つのcDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、この３つの配列の配列同一を示す。翻訳開始コドンを下線で示し、リーダーペプチド配列をイタリック体で示し、成熟タンパク質のN末端をコードするオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（プライマーPla4、表１）を太字で示す。5'RACEで使用されたプライマーPla 3のN末端に相補的なヌクレオチド配列は、各クローンの配列の最後で観察される（不連続の下線）。
【図６】配列ID番号２  ３つのcDNAクローンのヌクレオチド配列由来のPla 1のリーダーペプチドのアミノ酸配列である。ダッシュは、上の行のアミノ酸残基との同一を示す。
【図７】配列ID番号３  成熟タンパク質のN末端から始まるPla l 1をコードするｃDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、クローン間の配列同一性を示す。成熟タンパク質に対応する配列は、大文字であり、3'未翻訳領域は、低いケースである。ストップコドンは太字である。IUIS命名法によるクローンの名前は、配列の最後に太字で示す。
【図８】配列ID番号３  成熟タンパク質のN末端から始まるPla l 1をコードするｃDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、クローン間の配列同一性を示す。成熟タンパク質に対応する配列は、大文字であり、3'未翻訳領域は、低いケースである。ストップコドンは太字である。IUIS命名法によるクローンの名前は、配列の最後に太字で示す。
【図９】配列ID番号３  成熟タンパク質のN末端から始まるPla l 1をコードするｃDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、クローン間の配列同一性を示す。成熟タンパク質に対応する配列は、大文字であり、3'未翻訳領域は、低いケースである。ストップコドンは太字である。IUIS命名法によるクローンの名前は、配列の最後に太字で示す。
【図１０】配列ID番号３  成熟タンパク質のN末端から始まるPla l 1をコードするｃDNAクローンのヌクレオチド配列である。アスタリスク(*)は、クローン間の配列同一性を示す。成熟タンパク質に対応する配列は、大文字であり、3'未翻訳領域は、低いケースである。ストップコドンは太字である。IUIS命名法によるクローンの名前は、配列の最後に太字で示す。
【図１１】配列番号４  Pla l 1-cDNAクローンのヌクレオチド配列から翻訳されたアミノ酸配列である。ダッシュは、上行のアミノ酸残基との同一性を示す。潜在的N-グリコシル化部位はボックスである。IUIS命名法による各クローンの名前は、配列の最後に太字で示す。
【図２】
2005502327.tif 000005
【図３】
2005502327.tif 000006
【図４】
2005502327.tif 000007
【図６】
2005502327.tif 000008
【図７】
2005502327.tif 000009
【図１１】
2005502327.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2005502327.tif 000011
2005502327.tif 000012
2005502327.tif 000013
2005502327.tif 000014
2005502327.tif 000015
2005502327.tif 000016
2005502327.tif 000017
2005502327.tif 000018
2005502327.tif 000019
2005502327.tif 000020
2005502327.tif 000021
2005502327.tif 000022
2005502327.tif 000023
2005502327.tif 000024
2005502327.tif 000025
2005502327.tif 000026
2005502327.tif 000027
2005502327.tif 000028
2005502327.tif 000029
2005502327.tif 000030
2005502327.tif 000031
2005502327.tif 000032
2005502327.tif 000033
2005502327.tif 000034
2005502327.tif 000035
2005502327.tif 000036
2005502327.tif 000037
2005502327.tif 000038
2005502327.tif 000039
2005502327.tif 000040
2005502327.tif 000041
2005502327.tif 000042
2005502327.tif 000043
2005502327.tif 000044
2005502327.tif 000045
2005502327.tif 000046
2005502327.tif 000047
2005502327.tif 000048
2005502327.tif 000049
2005502327.tif 000050
2005502327.tif 000051
2005502327.tif 000052
2005502327.tif 000053
2005502327.tif 000054
2005502327.tif 000055
2005502327.tif 000056
2005502327.tif 000057
2005502327.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502327.tif 000059
2005502327.tif 000060
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502327.tif 000061
2005502327.tif 000062
2005502327.tif 000063
2005502327.tif 000064
2005502327.tif 000065
2005502327.tif 000066
2005502327.tif 000067
2005502327.tif 000068
2005502327.tif 000069
2005502327.tif 000070
2005502327.tif 000071
2005502327.tif 000072
2005502327.tif 000073
2005502327.tif 000074
2005502327.tif 000075
2005502327.tif 000076
2005502327.tif 000077
2005502327.tif 000078
2005502327.tif 000079
2005502327.tif 000080
2005502327.tif 000081
2005502327.tif 000082
2005502327.tif 000083
2005502327.tif 000084
2005502327.tif 000085
2005502327.tif 000086
2005502327.tif 000087
2005502327.tif 000088
2005502327.tif 000089
2005502327.tif 000090
2005502327.tif 000091
2005502327.tif 000092
2005502327.tif 000093
2005502327.tif 000094
2005502327.tif 000095
2005502327.tif 000096
2005502327.tif 000097
2005502327.tif 000098
2005502327.tif 000099
2005502327.tif 000100
2005502327.tif 000101
2005502327.tif 000102
2005502327.tif 000103
2005502327.tif 000104
2005502327.tif 000105
2005502327.tif 000106
2005502327.tif 000107
2005502327.tif 000108
【国際調査報告】
2005502327.tif 000109
2005502327.tif 000110
2005502327.tif 000111
2005502327.tif 000112
2005502327.tif 000113
2005502327.tif 000114