(57)【要約】本発明は、低アレルゲン活性を有する組換えDerP1/ProDerP1アレルゲン誘導体を提供することを含む、アレルギーの新規治療法を提供する。アレルギーまたは投薬経験の無い個体のTh1型免疫応答を刺激し、こうして野生型アレルゲンに接触した時にアレルギー応答の可能性を低下させる、該変異体アレルゲンを含む医薬組成物もまた提供される。
2005502339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アレルゲンと比較してアレルゲン活性が有意に低下している、組換えヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）DerP1またはProDerP1（DerP1/ProDerP1）タンパク質アレルゲン誘導体。
【請求項２】
熱処理されている、請求項１に記載の組換えDerP1/ProDerP1誘導体。
【請求項３】
遺伝的に変異されている、請求項１に記載の組換えDerP1/ProDerP1誘導体。
【請求項４】
以下のDerP1変異の１つ以上を含む、請求項３に記載の組換えDerP1/ProDerP1変異体：システイン４残基の変異、システイン31残基の変異、システイン65残基の変異、システイン71残基の変異、システイン103残基の変異、およびシステイン117残基の変異。
【請求項５】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号11、配列番号13よりなる群から選択されるいずれかの配列を有する組換え変異体アレルゲン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のアレルゲンの変異体をコードする単離された核酸分子。
【請求項７】
コドン使用パターンは高度に発現される哺乳動物遺伝子のコドン使用パターンに似ている、請求項６に記載の核酸配列。
【請求項８】
請求項６または７に記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項９】
請求項６もしくは７に記載の核酸配列または請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質もしくは変異体アレルゲン、または請求項６〜８のいずれか１項に記載のコードポリヌクレオチド、そしてアジュバントを含むかまたは含まない免疫学的組成物。
【請求項１１】
アジュバントは、Th1型免疫応答の優先的刺激物質である、請求項１０に記載の免疫学的組成物。
【請求項１２】
アジュバントは、3D-MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテルもしくはエステルの１つ以上、またはこれらのアジュバントの２つ以上の組合せを含む、請求項１０または１１に記載の免疫学的組成物。
【請求項１３】
アレルゲンは、水中油または油中水エマルジョンビヒクルで提供される。請求項１０から１２のいずれか1項に記載の免疫学的組成物。
【請求項１４】
医薬中で使用される本明細書に記載の免疫学的組成物。
【請求項１５】
アレルギー治療のための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質または変異体アレルゲンの使用。
【請求項１６】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の免疫学的組成物を患者に投与することを含む、アレルギー応答の患者を治療する方法、またはアレルギー応答を受けやすい患者を予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の予防製剤と治療製剤に関し、該製剤は、特異的アレルゲンに対するアレルギー応答の予防および／または緩和に有効である。さらに本発明は、ヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）からの主要タンパク質アレルゲンの低アレルゲン性組換え誘導体、アレルゲンDerP1とその前駆体型ProDerP1に関する。特に本発明の誘導体は、物理的に修飾されたDerP1またはProDerP1、例えば熱処理されたタンパク質；または、ジスルフィド結合形成に関与する１つ以上のシステイン残基が変異されている、遺伝子修飾された組換えDerP1もしくはProDerP1を包含する。DerP1とProDerP1誘導体を発現および精製する方法、および免疫原性組成物およびワクチンを調製する方法も記載される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのアレルギー応答は一般的であり、種々のアレルゲンにより引き起こされる。アレルギー性個体はアレルゲンに感作され、血清中の高レベルのアレルギー特異的IgEの存在を特徴とし、Th2型サイトカイン（IL-4、IL-5およびIL-13）を産生するアレルゲン特異的Ｔ細胞集団を有する。アレルゲンの存在下での、肥満細胞や好塩基球の表面に存在するFcεRI受容体へのIgEの結合は、細胞の迅速な脱顆粒と、以後のヒスタミンおよび炎症性反応の他のあらかじめ形成されているメディエーターおよび新生のメディエーターの放出を引き起こす。これ以外に、Ｔ細胞想起応答の刺激は、IL-4とIL-13の産生を引き起こし、これらは一緒に協力して、Ｂ細胞応答をアレルゲン特異的IgE産生にスイッチする。早期および後期アレルギー応答の発生の詳細については、Joost Van Neevenら、1996, Immunology Today, 17, 526を参照されたい。非アレルギー性個体では、同じ抗原に対する免疫応答は、INF-γのようなTh1型サイトカインをさらに含有してもよい。これらのサイトカインは、高レベルのTh2型免疫応答の阻害によりアレルギー応答（高レベルのアレルゲン特異的IgEを含む）の開始を防止することができる。この点で重要なことは、IgE合成は、Ｂ細胞上のCD23（FcεRII）受容体へのIgE／アレルゲン複合体の結合により仲介される阻害フィードバック機構により調節される（Luoら、J. Immunol., 1991, 146(7):2122-9; Yuら、1994, Nature, 369(6483):753-6）という事実である。細胞結合CD23が欠如した系では、IgE合成のこの阻害は起きない。
【０００３】
気管支喘息、アトピー性皮膚炎、および再発性鼻炎のようなアレルゲンに対するIgEにより仲介されるＩ型アレルギー疾患は、世界の人口の20％が罹患する。このようなアレルギー反応の現代の治療方策は、抗ヒスタミン治療および／または抗炎症コルチコステロイドの局所投与によるヒスタミン放出の症状を症状を予防する手段を含む。開発中の他の方策には、宿主の免疫系を使用して肥満細胞の脱顆粒を防止する方法がある（Stanworthら、EP0477231B1）。他の型の免疫療法が既に報告されている（Hoyneら、J. Exp. Med., 1993, 178, 1783-1788；Holtら、Lancet, 1994, 344, 456-458）。
【発明の開示】
【０００４】
即時的ならびに後期症状は薬剤治療で改善されるが、Ｉ型アレルギーにはアレルゲン特異的免疫療法が唯一の治療法である。しかし、この方法には解決すべきいくつかの問題がある。まず、現在免疫療法は総アレルゲン抽出物を用いて行われ、これはバッチ毎に異なる。さらにこれらのアレルゲン混合物は、個々の患者のプロフィール毎に計画されておらず、好ましくない毒性タンパク質を含有するかも知れない。第２に、高用量の未変性アレルゲンの投与は、重症のアナフィラキシー反応を引き起こすことがあり、従って免疫療法が成功するための最適に効率的な高用量のアレルゲンに達しないことがしばしばある。第１の問題に対しては、アレルゲン抽出物と比較して、より解析されたより再現性のある組換えアレルゲンを用いる代替ワクチン接種が行われている。第２の問題、すなわちアレルゲン抽出物の繰り返し注入により誘導されるアナフィラキシー反応のリスクは、欠失または突然変異誘発によりIgE反応性を改変した組換え「低アレルゲン」の使用により、最小にすることができる（Akdis, CAとBlaser, K. アレルゲンの化学的および構造的修飾による特異的免疫応答の制御、Int. Arch. Allergy Immunol., 2000, 121, 261-269）。
【０００５】
アレルギーの治療と予防のために製剤が報告されているが、これは、IgEの産生をダウンレギュレートする手段、ならびにTh2型からTh1型への応答のシフトによりアレルゲンに対する細胞介在応答を修飾することを提供する（IL-4：IFN-γを産生するDerP1特異的Ｔ細胞の比の低下、またはIL-5：IFN-γ比の低下により測定される）。これは例えば、WO99/25823に記載のように酵素活性の低下したrecDerP1のような組換えアレルゲンの使用により行われる。しかしこれらの組換えアレルゲンの免疫原性は、IgE合成誘導の点で野生型ProDerP1の免疫原性に似ていると考えられる。
【０００６】
IgE結合活性の低下した非アナフィラキシー型のアレルゲンが報告されている。アレルゲン工学により、アミノ酸残基の部位特異的突然変異誘発またはいくつかのアミノ酸配列の欠失により、アレルゲンタンパク質のIgE結合能の低下が可能になった。同時に、Ｔ細胞エピトープが保持されるため、Ｔ細胞活性化能は保存される。これは、結果に変動はあるが、異なるアレルゲンについていくつかのアプローチを使用して証明されている。その例は、チモシーグラス（tomothy grass）の花粉のアレルゲンPh1p5b（Schramm G ら、1999, J. Immunol., 162, 2406-14）、主要なハウスダストダニアレルゲンDerf2（Takaiら、2000, Eur. J. Biochem., 267, 6650-6656）、DerP2（SmithとChapman 1996, Mol. Immunol. 33, 399-405）、およびDerf1（Takahashi Kら、2001, Int Arch Allergy Immunol. 124, 454-60）について公表されている。ある研究は、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基のレベルで点突然変異を導入することにより、Derf1低アレルゲンの作成を報告している（Takahashi Kら、Int Arch Allergy Immunol. 2001, 124(4): 454-60、Takai T, Yasuhara T, Yokota T, Okumura Y）。しかしもし野生型ProDerf1がピー・パストリス（P. pastoris）によりうまく分泌されても、分子内ジスルフィド結合に関与するシステイン変異体は分泌されなかった。
【０００７】
ハウスダストダニであるヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）からのアレルゲンは、アレルギー性過敏症反応を引き起こす主要な原因因子の１つである。これらの分子の中で、DerP1は最も強いIgE介在免疫応答を引き起こす免疫優性なアレルゲン（Tophamら、1994, Protein Engineering, 7, 7, 869-894; Simpsonら、1989, Protein Sequences and Data Analyses, 2, 17-21）であり、ダストダニに対する75％を超えるアレルギー患者は、このアレルゲンに対するIgEを発現する。ハウスダストダニDerP1に由来する低アレルゲン、およびこのアレルゲンに対する予防用および治療用ワクチンは、報告されていない。
【０００８】
本発明は、野生型アレルゲンと比較してアレルゲン活性が低下した、ヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）DerP1アレルゲンの組換え誘導体、またはその前駆体型ProDerP1（以後「DerP1/ProDerP1」と呼ぶ）の提供と使用に関する。本発明の組換え型のDerP1誘導体（免疫賦活された組換えタンパク質またはNAVACに適したDerP1/ProDerP1をコードするプラスミド）は、強い予防性Th1を誘導するための、またはTh2からTh1免疫応答にシフトさせるための、予防または治療ワクチンとして使用される。低アレルゲン誘導体は、組換え発現系によりうまく産生され、これもまた本発明の１つの態様である。
【０００９】
DerP1は30KDaタンパク質であり、クローン化され配列決定されている（Chuaら、1988, J. Exp. Med., 167, 175-182）。これは、成熟タンパク質中に222のアミノ酸残基を含有することが知られている。DerP1の配列は、パパインと31％の相同性を有し、さらに詳しくは、酵素活性領域と、最も顕著にはCys34-His170イオン対と相同性を有する（Tophamら、前述）。DerP1は、ダニの中腸（ここでその役割はおそらく食物の消化に関連する）で産生される。0.2ngまでのまたはタンパク質分解活性のあるDerP1は各便ペレット（それぞれ直径が約10〜40μm）に取り込まれ、従って容易にヒト呼吸器官中に吸入される。精製DerP1調製物の室温での一晩の保存は、自己タンパク質分解性分解のために酵素活性がほとんど完全に失われる（Machadoら、1996, Eur. J. Immunol. 26, 2972-2980）。cDNA配列をコードするDerP1は、多くの哺乳動物および植物プロテイナーゼのように、DerP1が320アミノ酸残基の不活性化プレプロ酵素として合成され、これは次に処理されて222アミノ酸の成熟型となる（Chuaら、1988, J. Exp. Med. 167, 175-182; Chuaら、1993, Int. Arch Allergy Immunol 101, 364-368）ことを明らかにしている。ProDerP1の成熟は今日まで知られていないが、アレルゲンは80残基のプロ領域の切断により処理されると考えられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、組換えヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）DerP1/ProDerP1タンパク質アレルゲン誘導体を提供し、ここで該アレルゲン誘導体は、野生型アレルゲンと比較して有意に低下したアレルゲン活性を有する。アレルゲン活性は、細胞内ジスルフィド結合を破壊しこうして３次元構造を不安定化することによりタンパク質を破壊することを目的とする、いくつかの手段により障害される。改変されていない野生型アレルゲンに対して以下の利点を有する該アレルゲン誘導体は：1) 野生型アレルゲンにより刺激されるものと比較してTh1型の免疫応答（例えば、より高いIgG2a）を上昇させ、こうしてワクチン接種宿主のアレルギー可能性を抑制する、2) アレルゲン誘発性が低下しており（しかしＴ細胞反応性を保持している）、従って高用量の免疫原の全身性投与により適している、3) 未変性のDerP1への結合についてIgEと競合するDerP1特異的IgGを誘導する、4) エアゾル化したアレルゲン抽出物への暴露後でも、気道の好酸球を効率的に防御する。そのような誘導体は、医学での使用に適した治療および予防ワクチン製剤での使用に適しており、さらに詳しくはアレルギー反応の治療または予防に適している。
【００１１】
第１の態様において本発明は、組換えDerP1/ProDerP1（すなわち、DerP1またはProDerP1）アレルゲン誘導体であって、アレルギー活性が有意に低下している、例えば、好ましくは還元剤の存在下でタンパク質を熱処理するような物理的手段によりほとんどまたは完全に無くなっている、誘導体を提供する。典型的には、DerP1/ProDerP1タンパク質は、約100℃で還元剤の存在下で数分間処理される。好ましくは還元剤は、DTTのようなβ−メルカプトエタノールである。さらに好ましくはタンパク質は、約100℃で50mMβ−メルカプトエタノールの存在下で処理される。この処理は、タンパク質コンフォメーション性のIgE結合エピトープの安定性に悪影響を有する。
【００１２】
第２の態様において本発明は、そのアレルギー活性が、例えばコードしているcDNAまたはゲノムDNAへの特異的変異の導入により遺伝的に障害されている、組換えDerP1/ProDerP1タンパク質誘導体を提供する。従って本発明の１つの態様は、遺伝的に変異した組換えDerP1/ProDerP1自体を提供する。DerP1/ProDerP1のアレルゲン性の低下は、未変性の配列中に変異を導入した後に、低アレルゲン性変異体を組換え的に産生することにより行われる。これは、タンパク質の３次元コンフォメーションが失われるように、タンパク質の３次元構造中に置換、欠失または付加を導入することにより、またはこれを改変することにより行われる。これは特に、断片でタンパク質を発現するか、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基を欠失させるか、または残基を欠失させるか付加してタンパク質の３次構造実質的に改変することにより行われる。好ましくは、変異は、２つのシステイン残基の間の相互作用を改変して、典型的には未変性の（成熟）DerP1の４、31、65、71、103、および117位（これは、ProDerP1のそれぞれ84、111、145、151、183および197位に対応する）の１つの突然変異により作成される。本発明の変異タンパク質は、２つ以上（３、４、５または６つすべて）のシステイン変異を含んでよく、こうして異なるジスルフィド結合、例えば４と31位、４と65位、４と103位、31と65位、４と31と65位、または71と103位、71と117位、103と117位、31と117位、65と117位、または71と103と117位の変異に影響を与える。
【００１３】
好ましくは誘導体は、上記の任意の位置に単一の変異を含む。最も好適な変異はCys4（あるいは、またはこれ以外に、Cys117であり、これはCys4のジスルフィド結合パートナーであると考えられている）である。Cys変異は欠失でもよいが、好ましくは他の天然の19アミノ酸の任意のものの置換である。好適な置換は、陽性荷電したアミノ酸残基を導入して、生じるタンパク質の3D構造をさらに不安定化させる。例えば好適な置換はシステイン→アルギニン（またはリジン）置換を含む。
【００１４】
従って本発明は、特に限定されないが、低アレルゲン性DerP1/ProDerP1誘導体の例として示される６つの特異的変異により例示される。まずProDerP1のアレルゲン活性は実質的に低下し、好ましくはDerP1タンパク質配列のCys4位でシステイン残基の代わりにアルギニン残基を使用することにより完全に排除され、配列番号３に示される。第２に以下の任意の位置（成熟DerP1中の配列を参照して計算される）でシステイン残基の代わりにアルギニン残基を使用することにより実質的に排除される：DerP1タンパク質配列のCys31（配列番号５）、Cys65（配列番号７）、Cys71（配列番号９）、Cys103（配列番号11）、Cys117（配列番号13）。
【００１５】
DerP1/ProDerP1の変異体は、DerP1/ProDerP1タンパク質をコードするcDNAを、G. Winterら、Nature 1982, 299:756-758またはZollerとSmith 1982; Nucl. Acids Res., 19:6487-6500に記載のような従来法により部位特異的突然変異誘発をすることにより、またはChangとSmith、Nucleic Acids Res., 1984, 12:2407-2419もしくはG. Winterら、Biochem. Soc. Trans., 1984, 12:224-225に記載のような欠失突然変異誘発をすることにより調製される。
【００１６】
本発明は、具体的に開示された配列に限定されず、IgE結合反応性および／またはヒスタミン放出活性を低下させるかまたは排除するように変異されているが、その野生型アレルゲンに対する免疫応答を刺激するＴ細胞反応性および／または能力を保持する任意の低アレルゲン性アレルゲンを含む。変異アレルゲンのアレルゲン活性、従ってアレルゲン活性の低下は、以下の任意の方法により野生型と比較される：実施例の部分で詳述される方法に従う、ヒスタミン放出活性またはIgE結合反応性。
【００１７】
「実質的に低下したアレルゲン活性」とは、残存IgE結合活性により測定したアレルゲン活性が、未変性の（非修飾または非変異）タンパク質の最大50％に、好ましくは最大20％に、さらに好ましくは最大10％に、さらに好ましくは最大５％に、さらに好ましくは５％未満まで低下していることを意味する。あるいは「実質的に」はまた、変異体のヒスタミン放出活性が、未変性のタンパク質と比較して少なくとも100倍、好ましくは1000倍、さらに好ましくは10000倍低下していることを意味する。
【００１８】
変異アレルゲンの免疫原性は、種々の免疫測定法により野生型アレルゲンと比較される。変異アレルゲンと野生型アレルゲンの交差反応性は、変異アレルゲンまたは野生型アレルゲンでワクチン接種後にin vitroＴ細胞測定法により測定される。簡単に説明すると、ワクチン接種した動物から単離した脾臓Ｔ細胞を、変異アレルゲンまたは野生型アレルゲンでin vitroで再刺激し、次に市販のELISAアッセイによりサイトカイン産生を測定するか、またはアレルゲン特異的Ｔ細胞の増殖を、トリチウム化チミジンの取り込みにより経時的に測定する。また免疫原性はELISAアッセイにより測定され、その詳細は当業者により容易に測定される。簡単に説明すると、２種類のELISAアッセイが考えられる。まず、野生型DerP1で免疫したマウスの血清を用いる変異DerP1の認識；第２に、変異アレルゲンで免疫した動物の血清を用いる野生型DerP1アレルゲンの認識、を評価する。簡単に説明すると、各ウェルを100ngの精製した野生型もしくは変異DerP1で4℃で一晩被覆する。ブロッキング溶液（１％BSAを有する0.1％TBS-Tween）でインキュベート後に、血清の連続希釈物を37℃で１時間インキュベートする。ウェルを５回洗浄し、アルカリホスファターゼが結合した抗IgG抗体とともにインキュベートして総IgGを証明する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示のDerP1/ProDerP1アレルゲンの変異体をコードする単離した核酸を提供する。好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列であり、標準的DNA合成法、例えば、D.M. Robertsら、Biochemistry 1985, 24:5090-5098に記載の酵素結合法、化学合成法、in vitro酵素的重合、またはこれらの方法の組合せにより合成することができる。好ましくは核酸配列は、目的の発現宿主で使用されるもの、さらに好ましくは高度に発現される哺乳動物（例えばヒト）遺伝子に似ているものを模倣するように最適化されているコドン使用パターンを有する。好適なDNA配列は、コドンが最適化された配列であり、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号12、および配列番号14に記載されている。
【００２０】
DNAの酵素的重合は、in vitroで、必要に応じてdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPのヌクレオチド３リン酸を含有する適切なバッファー中でDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）のようなDNAポリメラーゼを使用して、10℃〜37℃の温度で一般的には50mlまたはそれ以下の容量で行われる。DNA断片の酵素的結合は、適切なバッファー、例えば0.05Ｍトリス（pH7.4）、0.01Ｍ MgCl2、0.01Ｍ ジチオスレイトール、１mMスペルミジン、１mM ATPおよび0.1mg/mlウシ血清アルブミン中のT4 DNAリガーゼのようなDNAリガーゼを使用して、４℃〜周囲温度で一般的には50mlまたはそれ以下の容量で行われる。DNAポリマーまたは断片の化学合成は、従来のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホラミダイト化学により、例えば、「遺伝子断片の化学的および酵素的合成−実験室マニュアル（Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A laboratory Manual）」（H.G. GassenとA. Lang編）、Verlag Chemie, Weinheim (1982)、または他の科学刊行物、例えば M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. SproatおよびR.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10:6243; B.S. SproatとW. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24:5771; M.D. MatteucciとM.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21:719; M.D. MatteucciとM.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103:3185; S.P. Adamsら、Journal of the American Chemical Society, 1983, 105:661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannusとH. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12:4539; およびH.W.D. Matthesら、EMBO Journal, 1984, 3:801に記載のような固相法を使用して行われる。
【００２１】
あるいはコード配列は、DerP1/ProDerP1 mRNAから公知の方法（例えば、mRNAを逆転写して相補的cDNA鎖を作成する）、および市販のcDNAキットを使用して得ることができる。
【００２２】
好ましくはヌクレオチド配列のコドン使用パターンは、高度に発現されるヒト遺伝子に典型的なものである。従って本発明のある態様において、変異DerP1/ProDerP1タンパク質をコードする複数のコドンを一緒に含むヌクレオチド配列であって、組換えダニタンパク質アミノ酸配列をコードするのに使用される可能なコドンの選択は、最適化された哺乳動物コドン使用を密接に模倣するように変化されおり、従って生じる遺伝子配列中のコドン使用の頻度は、同じタンパク質をコードするであろう哺乳動物遺伝子と実質的に同じである、ヌクレオチド配列が提供される。哺乳動物（ヒトを含む）のコドン使用パターンは、文献に記載されている（例えば、Nakamuraら、1996、Nucleic Acids Res. 24:214-215）。
【００２３】
DNAコードは４文字（A、T、CおよびG）有り、これらを使用して、生物の遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸である３文字の「コドン」を作成する。DNA分子に沿ったコドンの線形の配列は、これらの遺伝子にコードされるタンパク質中の線形のアミノ酸の配列に翻訳される。コードは高度に縮重しており、61コドンが20アミノ酸をコードし、３つのコドンは「停止」シグナルである。すなわちほとんどのアミノ酸は、２つ以上のコドンによりコードされ、実際いくつかは４つまたはそれ以上の異なるコドンによりコードされる。
【００２４】
あるアミノ酸をコードする２つ以上のコドンが利用できる時、生物のコドン使用パターンは非ランダム性が高いことが観察されている。異なる種は、そのコドン選択に異なる偏りが有り、さらに単一の種で高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間でコドンの利用が顕著に異なることがある。この偏りは、ウイルス、植物、細菌、昆虫、および哺乳動物細胞で異なり、ある種は、他の種よりランダムコドン選択からの大きな偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物は、ある細菌またはウイルスより偏りが少ない。これらの理由のために、大腸菌（E. coli）中で発現される哺乳動物遺伝子または哺乳動物細胞中で発現されるウイルス遺伝子が、効率的な発現のためのコドンの不適切な分布を有する可能性は高い。しかし大腸菌（E. coli）発現に適したコドン使用パターンを有する遺伝子は、ヒトで効率的に発現されるであろう。発現が起きる宿主中でまれにしか観察されないコドンの固まりの、異種DNA配列中の存在は、その宿主中での低い異種発現を予測させると考えられる。
【００２５】
コドンをその宿主中でまれなものから宿主が好むものに変化させる（「コドン最適化」）ことが、異種発現レベルを上昇させた例がいくつか有り、例えばBPV（ウシ乳頭腫ウイルス）後期遺伝子L1とL2は、哺乳動物コドン使用パターンに最適化され、これが、哺乳動物（Cao-1）細胞培養物中で野生型HPV配列の発現レベルを上昇させることが証明されている（Zhouら、J. Virol 1999, 73:4972-4982）。この研究では、BPV中では哺乳動物中より２倍以上多く（使用比＞２）現れたすべてのBPVコドンと、使用比＞1.5を有するほとんどのコドンは、優先的に使用される哺乳動物コドンにより保存的に置換された。WO97/31115号、WO97/48370号およびWO98/34640号（Merck & Co., Inc.）では、コドンが最適化された配列を、そのために最適化される宿主哺乳動物中でDNAワクチンとして使用すると、HIV遺伝子またはそのセグメントのコドン最適化が、タンパク質発現の上昇と免疫原性の改良を引き起こすことが証明されている。
【００２６】
この研究では、各ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）コドンは哺乳動物宿主の最適なコドンで保存的に置換されるため、配列は好ましくは完全に最適化コドンからなる（ただし、これが好ましくない制限部位、イントロンスプライス部位などをもたらす場合は除く）。驚くべきことにそのような最適化されたProDerP1/DerP1配列はまた、酵母の異なるコドン使用にもかかわらず酵母中でよく発現する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、変異DerP1/ProDerP1タンパク質の調製法であって、該タンパク質をコードするDNA（コドンが最適化されていてもいなくても）を組換え宿主細胞中で発現し、生成物を回収することを含む方法を提供する。
【００２８】
DerP1は、その酵素活性、アレルゲン誘発性および遺伝子クローニングについて充分解析されているが、DerP1の異種発現は、おそらくこのシステインプロテイナーゼがPreProDerP1前駆体として合成されるため、問題があると報告されている（ChapmanとPlatts-Mills、J. Immunol. 1980, 125:587-592）。さらに問題となるのは、タンパク質コンフォメーションに関与するサイクル残基が変異されているDerP1/ProDerP1配列の発現である。従って本発明はさらに、これらのすべての欠点を克服し、こうして変異タンパク質の産生とダニアレルギーに対する治療および予防用ワクチンの工業的開発を可能にする方法を提供する。
【００２９】
大腸菌（E. coli）でタンパク質発現の実質的な改善がされており、変異されているかまたはされていないDerP1/ProDerP1が、マルトース結合タンパク質（MBP）融合タンパク質として発現された。従って、変異ProDerP/DerP1タンパク質を大腸菌（E. coli）中でMBP融合タンパク質として発現する方法が提供される。さらに、ジスルフィド結合はピキア・パストリス（Pichia pastoris）中の分泌に必須であると言われている（Takaiら、2001, Int. Arch. Allergy Immunol. 124:454-460）が、驚くべきことに酵母中でのタンパク質発現の実質的な改善が、変異タンパク質について行われている。これは、Dermatophagoides 変異したProDerP/DerP1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作り替えて高度に発現されるヒト遺伝子中にあるコドン使用に適合させ、こうして未変性のProDerP/DerP1 Dermatophagoides アレルゲンと同じコンフォメーションと免疫学的性質を有するようにさせることにより行われた。驚くべきことに、以前はピキア・パストリス（Pichia pastoris）ではうまく行かないと報告されていた（Takaiら、2001, Int. Arch. Allergy Immunol. 124:454-460）にもかかわらず、哺乳動物細胞発現についてコドンが最適化された変異ProDerP1のクローニングと発現が、いくつかの部分が分泌されて、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中で行うことができた。
【００３０】
本発明の方法は、マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning - A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、1982-1989に記載のように従来の組換え法により行ってもよい。
【００３１】
特に、この方法は以下の工程を含む：
1. 宿主細胞中でDerP1/ProDerP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNAポリマーを発現することができる、複製可能なまたは組み込んでいる発現ベクターを調製する；
2. 部位特異的突然変異誘発を使用して、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を別の残基（好ましくはアルギニン残基）で置換して、生じるタンパク質のIgE結合活性を改変する；
3. 該ベクターで宿主細胞を形質転換する；
4. 形質転換した宿主細胞をDNAポリマーの発現を可能にする条件下で培養してタンパク質を産生させる；そして
5. タンパク質を回収する。
【００３２】
本明細書において用語「形質転換する」とは、例えば、「遺伝子工学（Genetic Engineering）」、S.M. KingsmanとA.J. Kingsman編；ブラックウェルサイエンティフィックパブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）；オックスフォード、イングランド、1988に記載のように従来法を使用して、適切なプラスミドまたはウイルスベクターを用いて形質転換、トランスフェクションまたは感染させて宿主細胞中に外来DNAを導入することを意味する。用語「形質転換した」または「形質転換体」は以後、目的の外来遺伝子を含有し発現することができる得られた宿主細胞に適用される。
【００３３】
発現ベクターは新規であり、また本発明の一部を構成する。本発明の１つの具体的な態様は、本発明のシステイン変異したDerP1/ProDerP1をコードするポリヌクレオチド配列を含有し、この発現を指令することができる発現ベクターを提供する。本発明の別の具体的な態様は、ポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンが、高度に発現される哺乳動物遺伝子、特に高度に発現されるヒト遺伝子に典型的な、システイン変異したDerP1/ProDerP1をコードするポリヌクレオチド配列を含有し、この発現を指令することができる発現ベクターを提供する。ベクターは、細菌、昆虫、酵母または哺乳動物細胞、特にヒト細胞中での異種DNAの発現を指令するのに適している。
【００３４】
複製可能な発現ベクターは、宿主細胞に適合性のあるベクターを切断して、無傷のレプリコンを有する線状DNAセグメントを得て、該線状セグメントを、所望の生成物をコードする該線状セグメントとともに所望の生成物をコードする１つ以上のDNA分子（例えば、DerP1/ProDerP1タンパク質をコードするDNAポリマー）と、結合条件下で組合せることにより、本発明に従って調製される。
【００３５】
すなわちDNAポリマーは、あらかじめ形成されるか、必要に応じてベクターの構築中に形成される。
【００３６】
ベクターの選択は、一部は宿主細胞（これは、原核細胞で真核細胞でもよい）により決定されるであろう。適当なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよび組換えウイルスがある。
【００３７】
複製可能な発現ベクターの調製は、従来法により、例えば、マニアティス（Maniatis）ら（前述）に記載の方法により、DNAの制限切断、重合、および連結のための適切な酵素を用いて行われる。組換え宿主細胞は、形質転換条件下で本発明の複製可能な発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、本発明に従って調製される。適当な形質転換条件は、従来法の通りであり、例えばマニアティス（Maniatis）ら（前記で引用）、または「DNAクローニング（DNA Cloning）」、第II巻、Glover編、アイアールエルプレス社（IRL Press Ltd.）、1985年に記載されている。
【００３８】
形質転換条件の選択は、宿主細胞により決定される。すなわち大腸菌（E. coli）のような細菌宿主は、CaCl2の溶液（Cohenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, 69:2110）を用いて、またはRbCl、MnCl2、酢酸カリウムおよびグリセロールを含む溶液を用いて処理し、次に[N-モルホリノ]-プロパンスルホン酸、RbClおよびグリセロールを用いて処理される。培養哺乳動物細胞は、細胞へのベクターDNAのカルシウム共沈殿により、リポフェクチンにより、または電気穿孔法により形質転換してもよい。酵母と適合性のあるベクターはまた、栄養要求性突然変異体に原栄養性を付与するか、または野生型に重金属に対する耐性を付与することにより、好ましい形質転換体の選択を可能にするマーカーを有する。酵母ベクターの対照配列は、解糖系酵素のプロモーター（Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7:149）、酸性ホスファターゼをコードするPHO5遺伝子、CUP1遺伝子、ARG3遺伝子、GAL遺伝子プロモータおよび合成プロモーター配列を含む。酵母発現に有用な他の制御要素は、ターミネーターとリーダー配列である。リーダー配列は、典型的には、細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードするため、特に有用である。適当なシグナル配列は、分泌される酵母タンパク質の遺伝子、例えば酵母インベルターゼおよびa-因子遺伝子、酸性ホスファターゼ、キラー毒素、a-接合因子遺伝子によりコードされ、より最近は、クロイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）のINU1A遺伝子から誘導される異種イヌリナーゼシグナル配列によりコードされることができる。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロミセスセレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）中での発現に適したベクターが開発されている。
【００３９】
種々の誘導性または構成性プロモーターに基づく種々のピー・パストリス（P. pastoris）発現ベクターが利用できる（CereghinoとCregg、FEMS Micorobiol. Rev. 2000, 24:45-66）。サイトゾルタンパク質および分泌タンパク質の産生のために、最も一般的に使用されるピー・パストリス（P. pastoris）ベクターは、非常に強いかつ厳密に制御されるアルコールオキシダーゼ（AOX1）プロモーターを含有する。このベクターはまた、his4宿主中の選択のためのピー・パストリス（P. pastoris）ヒスチジノール脱水素酵素（HIS4）遺伝子を含有する。融合タンパク質の選択は、シグナル配列の存在が必要であり、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）プレプロアルファ接合因子リーダー配列は、ピキア発現系で広くかつうまく使用されている。発現株の安定性を最大にするために、発現ベクターがピー・パストリス（P. pastoris）ゲノム中に組み込まれる。エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）と同様に、宿主ゲノムにより共有される配列（AOX1またはHIS4）内のピー・パストリス（P. pastoris）発現ベクターの切断は、相同的組換えイベントを刺激し、これは、ゲノム遺伝子座へのベクターの組み込みを効率的に標的とする。一般に、発現カセットの複数の組み込みコピーを含有する組換え株は、単一コピー株より多くの異種タンパク質を与えることができる。高コピー数形質転換体を得るための最も有効な方法は、スフェロプラスト法によるピキア（Pichia）受容体株の形質転換が必要である（Creggら、1985, Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385）。
【００４０】
本発明はまた、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。
【００４１】
DNAポリマーの発現を可能にする条件下での形質転換宿主細胞の培養は、従来法により、例えば上記のマニアティス（Maniatis）らおよび「DNAクローニング」に記載のように行われる。すなわち、好ましくは細胞は栄養物質とともに供給され、45℃未満の温度で培養される。
【００４２】
生成物は、宿主細胞に従って従来法により回収される。すなわち宿主細胞が例えば大腸菌（E. coli）のような細菌の場合、これは物理的、化学的、または酵素的に溶解され、生じる溶解物からタンパク質生成物が単離される。宿主細胞が哺乳動物である場合、生成物は栄養培地から単離されるかまたは無細胞抽出物から単離される。従来のタンパク質単離法には、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー（モノクローナル抗体アフィニティーカラムを含む）がある。
【００４３】
あるいは、バキュロウイルスのような適当なベクターを使用して、昆虫細胞中で、形質転換ショウジョウバエ細胞中で、または哺乳動物CHO細胞中で、行われる。本発明の新規タンパク質はまた、EP-A-0278941号のCSタンパク質について記載されているように酵母細胞中で発現してもよい。
【００４４】
本発明の低アレルゲン性DerP1/ProDerP1誘導体を含む医薬組成物、免疫組成物およびワクチン組成物、または該タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列（コドンが最適化されていてもいなくても）も提供される。好適な実施形態において、DNA組成物は、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含むDNAで被覆された複数の粒子（好ましくは金粒子）を含み、ここでポリヌクレオチド配列のコドン使用パターンは、高度に発現される哺乳動物遺伝子、特にヒト遺伝子に典型的である。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドおよびコードされるポリペプチドは、治療薬または予防薬として有用である。特に本発明のポリヌクレオチド（未変性のProDerP1のポリヌクレオチド配列を含む、好ましくはコドンが最適化されている）は、DNAワクチン接種（NAVAC）で使用され、このDNAはワクチン接種される哺乳動物、例えばヒトに投与される。RNAまたはDNAのような核酸、好ましくはDNAは、例えば上記したようなベクターの形で提供され、哺乳動物の細胞中で発現される。ポリヌクレオチドは、任意の利用できる方法で投与される。例えば、核酸は、針注入、好ましくは皮内、皮下または筋肉内注射により導入される。あるいは核酸は、粒子介在DNA送達（PMDD）のような核酸送達装置を使用して皮膚に直接投与される。この方法では、不活性粒子（例えば金ビーズ）は核酸で被覆され、例えば発射装置から高圧で放出することにより、受容者の表面（例えば皮膚）の貫通を可能にするのに充分な速度で加速される（本発明の核酸分子で被覆された粒子は、そのような粒子で充填された送達装置のように、本発明の範囲内である）。
【００４６】
患者に裸のポリヌクレオチドまたはベクターを導入するのに適した方法には、適切なビヒクルを用いる局所投与がある。核酸は局所的に皮膚に投与されるか、または粘膜表面に、例えば鼻内、経口、膣内、または直腸内投与される。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは、薬剤学的に許容される賦形剤、例えばリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）とともに存在してもよい。DNA取り込みは、別個にまたはDNA製剤中に取り込まれれて、ブピバカイン（bupivacaine）のような促進剤を使用してさらに促進してもよい。受容者に核酸を直接投与する他の方法には、超音波、電気刺激、電気穿孔法、およびUS-5,697,901号に記載のようにマイクロシーディング（microseeding）がある。典型的には核酸は、１pg〜１mg、好ましくは粒子介在遺伝子送達については１pg〜10μgの核酸の範囲の量、そして他の経路については10μg〜１mgの量で投与される。
【００４７】
本発明の核酸配列はまた、遺伝子治療に有用な特殊な送達ベクターを使用して投与される。遺伝子治療法は、例えばVermeら、Nature 1997, 389:239-242で考察されている。ウイルスベクター系と非ウイルスベクター系の両方を使用することができる。ウイルスベースの系には、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘（Canarypox）ウイルス、およびワクシニアウイルスベースの系がある。非ウイルスベースの系には、核酸の直接投与、微小球封入技術（ポリ（ラクチド-co-グリコリド）およびリポソームベースの系がある。ウイルスおよび非ウイルス送達系は組合せてもよく、ここでは、最初のワクチン接種後に追加免疫、例えばプラスミドのような非ウイルスベクターを使用して最初の「プライム」DNAワクチン接種後にウイルスベクターまたは非ウイルスベースの系を使用して１つ以上の「追加免疫」ワクチン接種をすることが好ましい。
【００４８】
こうして、本発明者らは、ProDerP1（好ましくはコドンが哺乳動物について最適化されている）をコードするDNAを用いてワクチン接種することは、マウスモデルでTh1応答を誘導（高力価の特異的IgG2a抗体と低力価の特異的IgG1）し、抗ProDerP1 IgEの非存在下で顕著であることを見いだした。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、アジュバント化合物、またはタンパク質に誘導された免疫応答を上昇させるのに有用な他の物質を含有してもよい。
【００５０】
本発明のワクチン組成物は、免疫防御量のDerP1/ProDerP1低アレルゲン性タンパク質の変異体を含む。用語「免疫防御」とは、アレルギー反応が避けられるかまたは緩和されるように、以後の抗原刺激に対する免疫応答を誘発するのに必要な量を意味する。本発明のワクチンにおいて、タンパク質の水溶液を直接使用することができる。あるいは、あらかじめ凍結乾燥したかまたは凍結乾燥していないタンパク質を、種々の公知のアジュバントと混合、吸着、または共有結合してもよい。
【００５１】
適当なアジュバントが利用でき、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（ディフコラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイト、ミシガン州）；メルクアジュバント65（メルクアンドカンパニー（Merck and Company, Inc.）、Rahway、ニュージャージー州）；AS-2（スミスクラインビーチャム（SmithKline Beecham）、フラデルフィア、ペンシルバニア州）；アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アセチル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；陽イオン的または陰イオン的に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性微小球；モノホスホリル脂質AおよびキルAがある。サイトカイン（GM-CSF、またはインターロイキン-2、-7または-12）およびケモカインもアジュバントとして使用される。
【００５２】
本発明の製剤において、アジュバント組成物は、主にTH1型の免疫応答を誘導することが好ましい。高レベルのTh1型サイトカイン（例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2およびIL-12）は、投与された抗原に対して細胞性免疫応答の誘発を促進しやすい。応答がTh1型である好適な実施形態において、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルより高い程度まで上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイ法を使用して容易に評価される。サイトカインのファミリーの総説については、MosmannとCoffman、Ann. Rev. Immnol. 7:145-173, 1989を参照されたい。
【００５３】
従って主にTh1型応答を誘発するのに使用される適当なアジュバントには、例えばモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Ａ（3D-MPL）をアルミニウム塩と組合せたものがある。TH1型免疫応答を誘導する他の公知のアジュバントには、CpG含有オリゴヌクレオチドがある。このオリゴヌクレオチドは、CpGジヌクレオチドがメチル化されていないことが特徴である。そのようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えばWO96/02555号に記載されている。免疫刺激性DNA配列もまた、例えばSatoら、Science 273:352, 1996に記載されている。CpG含有オリゴヌクレオチドはまた、単独でもしくは他のアジュバントと組合せて使用される。例えば増強系は、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組合せ、特にCpGとQS21（WO00/09159号およびWO00/62800号に開示されている）の組合せがある。好ましくは製剤はさらに、水中油エマルジョンおよび／またはトコフェロールを含む。
【００５４】
他の好適なアジュバントは、サポニン、好ましくはQS21（アキラバイオファーマシューチカルズインク（Aquila Biopharmaceuticals Inc.）, フラミンガム、マサチューセッツ州）であり、これは単独でまたは他のアジュバントと組合せて使用される。例えば増強系には、モノホスホリル脂質Aとサポニン誘導体の組合せ、例えばQS21と3D-MPL（WO94/00153号に記載）の組合せ、またはWO96/33739号に記載のようにQS21がコレステロールで排除される低レアトジニック（reactogenic）組成物がある。他の好適な製剤には、水中油エマルジョンとトコフェロールがある。水中油中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、WO95/17210号に記載されている。
【００５５】
WO95/17210号に記載されている水中油中にQS21、3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、好適な製剤である。
【００５６】
他の好適なアジュバントには、Montanide ISA720（セピック（Seppic）、フランス）、SAF（カイロン（Chiron）、カリホルニア州、米国）、ISCOMS（CSL）、MF-59（カイロン（Chiron））、Detox（リビ（Ribi）、ハミルトン、モンタナ州）、RC-529（コリクサ（Corixa）、ハミルトン、モンタナ州）、および他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート（AGPs）がある。
【００５７】
従って、本明細書に記載のDerP1/ProDerP1低アレルゲン性誘導体とアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、ここでアジュバントは、3D-MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、ポリエチレンエーテルもしくはエステル、またはこれらのアジュバントの２つ以上の組合せを含む、組成物が提供される。免疫原性組成物中のDerP1/ProDerP1低アレルゲン性誘導体は好ましくは、水中油または油中水エマルジョンビヒクル中で提供される。
【００５８】
さらなる態様において本発明は、Cys4、Cys31、Cys65、Cys71、Cys103またはCys117のような、ジスルフィド結合形成に関与する１つ以上のシステイン残基を変異させる工程を含む医薬組成物の製造法を提供する。本方法はさらに、高度に発現される哺乳動物遺伝子に典型的なコドン使用パターンを有し、本発明のコドンを最適化しシステイン変異したProDerP1/DerP1アミノ酸配列をコードする配列を産生するために、野生型DerP1/ProDerP1ヌクレオチド配列のコドン使用パターンを改変する工程、またはポリヌクレオチド配列を合成的に作成する工程を含む。ワクチン調製物は一般的に、ワクチン設計（Vaccine Design）（「サブユニットとアジュバントアプローチ（The subunit and adjuvant approach）」（Powell M.F. & Newman M.J.）編、(1995) プレナムプレス（Plenum Press）、ニューヨーク）に記載されている。リポソーム中の封入は、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合は、例えばLikhite、米国特許第4,372,945号およびArmorら、米国特許第4,474,757号に開示されている。
【００５９】
各ワクチン投与量中に存在する本発明のタンパク質の量は、典型的なワクチンで大きな副作用が無しで免疫防御性応答を誘導する量として選択される。そのような量は、どの特異的免疫原が使用されるか、およびワクチンが免疫賦活されるかどうかにより変動する。一般に各用量は、１〜1000μgのタンパク質、好ましくは１〜200μgを含むことが予測される。特定のワクチンの最適量は、被験体中の抗体力価と他の応答の観察を含む標準的方法により確認することができる。本発明のワクチンは、成人または幼児に投与してもよいが、出産後しばらくしてから実質的なTh2型の記憶応答が確立される前に、個体にワクチン接種することが好ましい。初期のワクチン接種後に、被験体に好ましくは約４週間後に追加免疫をし、次にアレルギー応答のリスクが存在する限り６ヶ月毎に追加免疫を繰り返す。
【００６０】
ワクチンと医薬組成物は、単位投与用または多回投与用容器（例えば、密封したアンプルまたはバイアル）で提供される。そのような容器は好ましくは、使用するまで製剤の無菌性を保持するために密封される。一般に、製剤は油性もしくは水性ビヒクル中で懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存される。あるいは、ワクチンまたは医薬組成物は、使用直前に無菌液体を加えるのみでよい凍結乾燥条件で保存される。
【００６１】
本発明はまた、本発明のDerP1/ProDerP1誘導体またはその誘導体を、本明細書に記載の方法で精製する工程、および生じるタンパク質を適当なアジュバント、希釈剤または他の薬剤学的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、ワクチンの製造法を提供する。
【００６２】
本発明はまた、本発明のタンパク質を薬剤学的に許容される賦形剤と混合する工程を含む、ワクチン製剤の製造法を提供する。
【００６３】
本発明の他の態様は、アレルギーに罹りやすいかまたは罹っている患者を免疫治療するためのワクチンを製造するための、本明細書で特許請求されるようなタンパク質またはポリヌクレオチドの使用である。本明細書に開示の薬剤学的に許容される量の免疫原性組成物を該患者に投与することを含む、アレルギーに罹りやすいかまたは罹っている患者を治療する方法は、本発明に包含される。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、ヒトのアレルギー疾患（特にハウスダストダニアレルギー）を予防または軽減する方法であって、必要な被験体に、免疫原性有効量の本発明の変異アレルゲン、または本発明のワクチンを投与することを含む方法を提供する。
【００６５】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって決してこれを限定するものではない。制限酵素と他の試薬は、実質的に販売業者の説明書に従って使用した。
【実施例１】
【００６６】
一般的方法
1. SDS-PAGEとウェスタンブロット解析
タンパク質を12.5％ポリアクリルアミドゲル上でSDS-PAGEにより分析した。電気泳動後、セミドライトランスブロットシステム（バイオラッド（Bio-Rad））を使用してタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜をTBS-T（50mM トリス塩酸（pH7.5）、150mM NaCl、0.1％Tween80）中の0.5％インスタゲル（Instagel）（PB Gelatins）で30分間飽和させ、ブロッキング溶液で希釈（1:5000）した変性または未変性のProDerP1に対して作成したマウスポリクローナル血清とインキュベートした。アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（プロメガ（Promega）、1:7500）と5-ブロモ,4-クロロ,3-インドリルホスフェート（BCIP、ベーリンガー（Boehringer））／ニトロブルーテトラゾリウム（NBT、シグマ（Sigma））を基質として使用して、免疫反応性物質を検出した。
【００６７】
2. グリカン分析
グリカン鑑別Kit（Glycan Differenciation Kit）（ベーリンガー（Boehringer））を使用して以下のレクチンを用いて炭水化物分析を行った：ガランタス・ニバリス（Galanthus nivalis）アグルチニン（GNA）、サンブクス・ニグラ（Sambucus nigra）アグルチニン（SNA）、マーキア・アムレンシス（Maackia amurensis）アグルチニン（MAA）、ピーナッツアグルチニン（PNA）およびシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Datura stramonium）アグルチニン（DSA）。簡単に説明すると、精製タンパク質をSDS-PAGEからニトロセルロース膜に移した。膜を、ジゴキシゲニンに結合した異なるレクチンとインキュベートした。アルカリホスファターゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて複合体を検出した。
【００６８】
3. 酵素アッセイ
総量１ml中に１mM EDTAと20mM L-システインを含有する50mM トリス塩酸（pH7）で酵素アッセイを行った。Cbz-Phe-Arg-7-アミノ-4-メチルクマリン（Cbz-Phe-Arg-AMC）とBoc-Gln-Ala-Arg-7-アミノ-4-メチルクマリン（Boc-Gln-Ala-Arg-AMC）（シグマ（Sigma））（両方の基質とも最終濃度100μM）の加水分解を、SLM8000分光蛍光計を使用して、λex＝380nmとλem＝460nmを用いて追跡した。システイン活性化アレルゲンを最終濃度100nMまで加えてアッセイを開始した。アッセイの前に、精製DerP1またはProDerP1を、アプロチニン-およびp-アミノベンズアミジン−アガロース樹脂（シグマ（Sigma））の混合物でインキュベートして、推定される微量のセリンプロテアーゼ活性を除去した。
【００６９】
4. タンパク質測定
総タンパク質濃度は、ビシンコニニック酸（bicinchoninic acid）法（MicroBCA、ピアス（Pierce））によりウシ血清アルブミンを標準物質として使用して測定した。
【００７０】
5. DerP1 ELISA
DerP1とProDerP1は、ELISAkitを用いて、DerP1特異的モノクローナル抗体5H8と4C1（インドア・バイオテクノロジーズ（Indoor Biotechnologies））を使用して検出した。アッセイで使用したDerP1標準物質（UVA93/03）は、2.5μg/mlの濃度であった。
【００７１】
6. IgE結合活性
イムノプレートをDerP1またはProDerP1（500ng／ウェル）を用いて４℃で一晩被覆した。次にプレートを100μl／ウェルのTBS-Tweenバッファー（50mM トリス塩酸（pH7.5）、150mM NaCl、0.1％Tween80）を用いて５回洗浄し、１％BSAを補足した150μlの同じバッファーを用いて37℃で１時間飽和させた。次に、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）に対するアレルギー患者からの1/8倍希釈した血清を、37℃で１時間インキュベートした。実験で使用した95の血清のうち16の血清は、58.1 kU/L〜99 kU/Lの特異的抗ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）IgE値（RASTアッセイ）の範囲内であり、79は100 kU/Lのカットオフ値より高かった。プレートをTBS-Tweenバッファーで５回洗浄し、マウス抗ヒトIgE抗体（サザンバイオテクノロジーアソーシエーツ（Southern Biotechnology Associates））とアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウスIgG抗体（希釈、TBS-Tweenバッファーで1/7500、プロメガ（Promega））でインキュベートした後、アレルゲン−IgE複合体を検出した。ジエタノールアミンバッファー（pH9.8）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ（Sigma））を使用して酵素活性を測定した。OD410nmをバイオラッドノバパス（BioRad Novapath）ELISAリーダーで測定した。
【００７２】
IgE阻害アッセイのために、プレートを同じ濃度（0.12μM）のDerP1またはProDerP1で被覆した。アレルギー患者（RAST値＞100 kU/L）からの20のヒト血清のプールを、種々の濃度（3.6〜0.002μM）のDerP1またはrecProDerP1をインヒビターとして４℃で一晩プレインキュベートし、ELISAプレートに加えた。IgE結合を上記したように測定した。
【００７３】
7. ヒスタミン放出
ヒスタミン放出を、アレルギードナーの末梢ヘパリン化血からの白血球を使用して、かつヒスタミン−ELISA Kit（イムノテク（Immunotech））により測定した。好塩基球を、recProDerP1またはDerP1の連続希釈物と37℃で30分間インキュベートした。界面活性剤IGEPAL CA-630（シグマ（Sigma））で細胞を破砕後、好塩基球中のヒスタミンの総量を定量した。
【００７４】
8. ProDerP1変性
組換えProDerP1を、50mMのβ-メルカプトエタノールの存在下で100℃で５分熱変性させた。
【００７５】
9. 免疫
CBA/Jマウス（６週齢）の群を、４週間毎に５μgの異なるタンパク質または100μgの異なるプラスミドDNAで免疫した。精製したアレルゲンを、アジュバントとしてミョウバンの存在下で注射した。対照として、マウスの群をミョウバンまたはpJW4304 DNAベクターで免疫した。マウスを７、14、21、28日に眼窩後静脈叢から出血させ、血清を採取した。
【００７６】
10. 気管支誘発
免疫の72時間後、すべてのマウスをプレキシガラスチャンバー（13×19×37.5cm）に入れ、７日間続けてエアゾル化粗ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物に20分間にわたって暴露した。粗ダニ抽出物の濃度は300μg/mlであった。超音波ネブライザー（Syst' AM）によりエアゾルを作成した。ネブライザーの出力は0.5ml／分であり、エアゾルの平均粒子サイズは１〜５μmであった。対照としてマウスにPBSを噴霧した。
【００７７】
11. DerP1特異的IgG、IgG1およびIgG2a
血清をELISAにより抗DerP1 IgG、IgG1、およびIgG2a抗体について測定した。イムノプレートをProDerP1（500ng／ウェル）で４℃で16時間被覆した。プレートをTBS-Tweenバッファー（50mM トリス塩酸（pH7.5）、150mM NaCl、0.1％Tween80）を用いて５回洗浄し、１％BSAを補足した150μlの同じバッファーを用いて37℃で１時間飽和させた。飽和バッファー中の血清の連続希釈物を37℃で１時間インキュベートした。プレートをTBS-Tweenバッファーで５回洗浄し、抗原が結合した抗体を、アルカリホスファターゼ（希釈、TBS-Tweenバッファー中1/7500）に結合した２次抗体（ヤギ抗マウスIgG、プロメガ（Promega）、アメリカ合衆国）を用いて検出した。ジエタノールアミンバッファー（pH9.8）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ（Sigma））を使用して酵素活性を測定した。OD415nmを、バイオラッドノバパス（BioRad Novapath）ELISAリーダーで測定した。
【００７８】
上記のように被覆したイムノプレートとIgG1−またはIgG2a特異的ビオチン標識モノクローナル抗体（ラット抗マウス、希釈、TBS-Tweenバッファーと１％BSA中1/7000、バイオソース（Biosource））を２次抗体としてマウス抗体サブクラスを測定した。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（1/1000 希釈、アマシャム（Amersham））を各ウェルに加えた。酵素活性のアッセイは上記したように行った。すべての場合に、ELISA力価は、最大OD415値の50％に対応するシグナルを与える希釈率の逆数として同定した。
【００７９】
12. DerP1特異的IgEの測定
イムノプレートをラット抗マウスIgE（10ng／ウェル）で４℃で16時間被覆した。プレートをTBS-Tweenバッファー（50mM トリス塩酸（pH7.5）、150mM NaCl、0.1％Tween80）を用いて５回洗浄し、１％BSAを補足した150μlの同じバッファーを用いて37℃で１時間飽和させた。飽和バッファー中の血清の連続希釈物を37℃で１時間インキュベートした。次にProDerP1を飽和バッファー中500ng/mlで加えた。結合したProDerP1を、ビオチン化抗DerP1モノクローナル抗体4C1（インドア・バイオテクノロジーズ（Indoor Biotechnologies））を添加して検出した。プレートをTBS-Tweenバッファーで５回洗浄し、抗体が結合した抗原を、アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン（希釈、TBS-Tweenバッファー中1/7500）を添加して検出した。ジエタノールアミンバッファー（pH9.8）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（シグマ（Sigma））を使用して酵素活性を測定した。OD415nmを、バイオラッドノバパス（BioRad Novapath）ELISAリーダーで測定した。
【００８０】
13. 増殖アッセイ
DerP1特異的Ｔ細胞増殖応答を測定するために、免疫したマウスを気管支誘発の前と後に屠殺した。脾臓からリンパ球を単離した。15mM ヘペスと30μM β-メルカプトエタノールを含有する10％ FCSを有するRPMI1640で培養した細胞（４×105／ウェル、三重測定）を、96ウェルプレート中で粗ダニ抽出物の連続希釈物またはProDerP1で刺激した（25μg/mlの濃度から出発して、10を基数とする２回の希釈の抗原を試験した）。対照として、細胞をRPMI培地のみでインキュベートした。４日後、細胞に１μCi／ウェルの［3Ｈ］チミジン（アマシャム（Amersham））を16時間パルスした。細胞を採取し、3H-チミジン取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。４重のウェルの平均として増殖応答を計算し、刺激指数（SI）として表した。刺激指数＞２を陽性と見なした。
【００８１】
14. サイトカインアッセイ
リンパ球培養上清中のIFNγとIL-5のレベルをELISAアッセイで測定した。プレートを１μg/mlの抗マウスIL-5モノクローナル抗体（ファーミンゲン（PharMingen））と抗マウスIFNγ（バイオソース（Biosource））ポリクローナル抗体で被覆した。プレートをTBS-Tweenで５回洗浄し、150μlのTBS-Tween−BSAで37℃で１時間飽和させた。脾細胞培養上清の連続希釈物を加え、37℃で90分インキュベートした。ビオチン化抗マウスIL-5（ファーミンゲン（PharMingen）、１μg/ml）または抗マウスIFNγ（バイオソース（Biosource）、0.2μg/ml）抗体を、プレートに37℃で１時間適用した。抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジン（希釈 1/10000、アマシャム（Amersham））とインキュベートして検出した。テトラメチルベンジジン（TMB）を基質（シグマ（Sigma））として使用して酵素活性を測定した。460nmでの吸光度をバイオラッドノバパス（BioRad Novapath）ELISAリーダーで測定した。サイトカイン濃度は、精製マウスIL-5またはIFNγで得た標準曲線から内挿して求めた。
【００８２】
15. 気管支肺胞洗浄
最後のエアゾル暴露の３日後に、マウスを放血させて屠殺した。直ちに気管カニューレを介して１mlのハンクス塩溶液（HBSS）で、これを注入し吸引して回収を３回繰り返して、肺を洗浄した。洗浄液を400ｇで４℃で10分遠心分離した。細胞ペレットを300μlのハンクス塩溶液（HBSS）に再懸濁し、細胞をトーマ血球計算器で計数した。50μlアリコートからのサイトスピン調製物を、鑑別細胞計数のためにMay-Grunwald Giemsa染色液で染色した。
【実施例２】
【００８３】
大腸菌（E. coli）中のMBP-ProDerP1の発現
1. MBP-ProDerP1発現ベクターの構築
ProDerP1（１〜302aa）をコードする完全な合成cDNA（配列番号１）を、真核生物発現プラスミドpNIV4846（ヒト化ProDerP1コードカセットを有するpEE 14由来発現プラスミド）（M. Massaerら、International Archives of Allergy and Immunology, 2001, 125:32-43）からEagIとXbaIで消化後に単離した。XbaIで制限切断する前に、大きい断片のDNAポリメラーゼ（クレノウ）を使用してDNAを平滑末端とした。921bpの断片をpMAL-c2E（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））のAsp718（平滑末端）−XbaI部位に挿入して、MBP遺伝子の下流にpNIV4854を得た。配列番号１のcDNAによりコードされるProDerP1のアミノ酸配列を図２に示す（配列番号２）。
【００８４】
2. 部位特異的突然変異誘発
変異を含有する合成オリゴヌクレオチドにより３つのシステインコドンの１つを有するDNA断片を置換した後に、４、31または65位（成熟ProDerP1番号付け、ProDerP1の84、111または145位に対応する）のDerP1システイン残基の突然変異誘発を行った。以下のオリゴヌクレオチドを使用した： 5'TTAAGACCCAGTTTGATCTCAACGCGGAGACCAACGCCCGTATCAACGGCAATGCCCCCGCTGAGATTGATCTGCGCCAGATGAGGACCGTGACTCCCATCCGCATGC3'（フォワード）と 5'CGGATGGGAGTCACGGTCCTCATCTGGCGCAGATCAATCTCAGCGGGGGCATTGCCGTTGATACTACGGGCGTTGGTCTCCGCGTTGAGATCGAAACTGGGTC3'（リバース）で、システイン残基４からアルギニンへの変異（C4R）のための110bpのAflII-SphI断片を作成する、5'CAAGGCGGCCGTGGGTCTTGTTGGGCCTTTTCAGGCGTGGCCGCGACAGAGTCGGCATACCTCGCGTATCGGAATCAGAGCCTGGACCTCGC3'（フォワード）と 5'TCAGCGAGGTCCAGG     CTCTGATTCCGATACGCGAGGTATGCCGACTCTGTCGCGGCCACGCCTGAAAAGGCCCAACAAGACCCACGGCCGCCTTGCATG3'（リバース）で、システイン残基31からアルギニンへの変異（C31R）のための98bpのSphI-BlpI断片を作成する、5'TGAGCAGGAGCTCGTTGACCGTGCCTCCCAACACGGATGTCATGGGGATACGATTCCCAGAGGTATCGAATACATCCAGCATA3'（フォワード）と 5'CTGGATGTATTCGATACCTCTGGGAATCGTAT CCCCCATGACATCCGTGTTGGGAGGCACGGTCAACGCGCTCCTGC3'（リバース）で、システイン残基65からアルギニンへの変異（C65R）のための82bpのAflII-SphI断片を作成する。
【００８５】
MBP遺伝子の下流にProDerP1カセットを含有し、それぞれ変異C4R、C31R、およびC65Rを有する得られたプラスミドを、pNIV4870、pNIV4871およびpNIV4872と呼んだ。すべての３つの変異をDNA配列決定により確認した。それぞれC4R、C31R、およびC65R変異を有する変異ProDerP1アミノ酸配列を、それぞれ配列番号３、配列番号５および配列番号７に示す。対応するコード核酸配列を配列番号４（C4R変異）、配列番号６（C31R変異）および配列番号８（C65R変異）に示す。
【００８６】
3. 野生型と変異体MBP-ProDerP1の発現と精製
異なる組換え発現ベクターを含有する大腸菌（E. coli）を、100μg/mlアンピシリンを有する869培地（A. Jacquentら、Prot. Exp. Purif. 1999, 17:392-400）中で37℃で一晩増殖させた。次に細胞を１：100希釈し、600nmでの光学密度0.4〜0.6まで37℃で増殖させた。イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度0.3mMまで加えた。２時間インキュベーション後、細胞を10000rpmで15分遠心分離して採取した。
【００８７】
１リットルの培養物からの細菌細胞ペレットを、１mMアプロチニンとAEBSFを含有する20mMトリス塩酸（pH7.5）に再懸濁し、細胞破砕機（コンスタントシステムズ社（Constant Systems Ltd.）、 ウォーウィック、英国）を使用して、1800バールの圧力で破砕した。溶解物を150,000ｇで60分超遠心分離した。超遠心分離から得られたペレットを20mMトリス塩酸（pH7.5）で洗浄した。不溶性タンパク質を、６Ｍ尿素を含有する20mMトリス塩酸（pH7.5）で４℃で一晩抽出した。懸濁液を150,000ｇで60分超遠心分離した。上清を、20mMトリス塩酸（pH7.5）、200mM NaCl、１mM EDTAに対して一晩直接透析した。溶液を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、同じバッファーで平衡化したアミロース樹脂（１×15cm）に直接かけた。A280nmがベースラインに達するまで、出発バッファーでカラムを洗浄した。カラムバッファー中10mMのマルトースを添加してタンパク質を溶出した。融合タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した。精製したタンパク質を-20℃で保存した。
【実施例３】
【００８８】
CHO細胞中の３つの異なるProDerP1変異体の発現
1. 部位特異的突然変異誘発
４、31または65位（成熟DerP1番号付け、ProDerP1の84、111または145位に対応する）のDerP1システイン残基の突然変異誘発を、プラスミドpNIV4846に導入した。MBP（実施例IIを参照）遺伝子の下流にDerP1カセットを含有し、それぞれ変異C4R、C31R、およびC65Rを有するプラスミドpNIV4870、pNIV4871、およびpNIV4872をそれぞれ、SfuI-XhoIで制限切断して、714 bpの断片を単離した。精製したDNA断片を、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミドp4846中に挿入した。DerP1変種C4R、C31RおよびC65Rを含有する得られたプラスミドをpNIV4873、pNIV4875、およびpNIV4874と呼んだ。
【００８９】
2. ProDerP1を産生する安定なCHO-K1株の一過性トランスフェクションと選択
プラスミドpNIV4873、pNIV4875、およびpNIV4874によるDerP1の産生を調べるために、COS細胞をリポフェクションにより一過性にトランスフェクトした。安定なDerP1発現のために、CHO-K1細胞をリポフェクションにより異なるプラスミドを用いてトランスフェクトした。３週間の25μM メチオニルスルホキシミン（MSX）選択後、100μM MSXで１ラウンドの遺伝子増幅を行った。
【実施例４】
【００９０】
変性したProDerP1はIgG結合反応性を示すが、アレルギー血清に対してIgE結合反応性を示さない。
【００９１】
変性型のProDerP1が低アレルゲン性ワクチンとして使用できるかどうかを調べるために、変性（50mM のβ-メルカプトエタノールの存在下で100℃で５分）ProDerP1のIgG−およびIgE結合反応性をELISA試験で測定した。図１に示すように、変性ProDerP1は、未変性のProDerP1上に存在するIgGエピトープの主要な部分を保存した。一方、変性アレルゲンはそのIgE結合反応性をほとんど無くした。我々のデータは、変性ProDerP1がProDerP1の低アレルゲン性変種であるかも知れないことを示唆する。
【実施例５】
【００９２】
MBP-ProDerP1のIgE反応性
実験の目的は、MBP-ProDerP1と天然のDerP1のIgE反応性を比較することであった。アレルギー患者の血清からの特異的IgEとのMBP-ProDerP1の反応性を、直接ELISA（ここで、イムノプレートをDerP1またはMBP-ProDerP1で直接被覆した）で測定した。図２は、DerP1とMBP-ProDerP1へのIgE結合の強い相関を示す。
【実施例６】
【００９３】
MBP-ProDerP1変異体のIgE結合反応性
MBP-ProDerP1変異体のIgE結合能を、イムノプレートを異なる型のMBP-ProDerP1で直接被覆した直接ELISAアッセイで測定した。RAST値＞100kU/Lの20人のヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）アレルギー患者の血清から作製した血清プールを、このアッセイで使用した。図３に示すように、種々のC31RとC65RのIgE結合反応性は、野生型のMBP-ProDerP1と比較して５％まで劇的に低下した。残基システイン４をアルギニンに変異させると、MBP-ProDerP1へのIgEの反応性が無くなった（残り０％）ことが目立つ。MBPまたは無関係のタンパク質と融合したMBPのIgE介在免疫認識は無かったため、IgE反応性はProDerP1残基に特異的であった。20人の他の患者から別の血清プールで同様の結果が得られた。
【実施例７】
【００９４】
種々の型のProDerP1のヒスタミン放出活性
天然のDerP1のアレルゲン活性をProDerP1の組換え変異誘導体のアレルゲン活性と比較するために、一人のアレルギー患者からの好塩基球を、種々の濃度のアレルゲンを用いてin vitroで抗原刺激し、放出されたヒスタミンを測定した。図４に示すように、天然のDerP1は、１ng/mlの濃度で好塩基球からのヒスタミン放出を誘導することができた。これに対して組換え変異型のProDerP1は、1000〜10000倍高い濃度でのみヒスタミンを放出することができた。これらの結果は、ProDerP1変異体が天然のDerP1より低いIgE結合反応性を示すことを明らかに証明した。
【実施例８】
【００９５】
種々の型のProDerP1を用いる免疫原性実験
1. ハウスダストダニアレルギーの動物モデル
ハウスダストダニアレルギーの動物モデルが開発されている。CBA/Jマウスにミョウバンをアジュバントとした精製したDerP1を注射した。１週間間隔で４回注射した後、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物を用いてマウスに一連の気管支誘発を行った（図５）。このモデルを使用して、異なる組換え型のDerP1ならびに異なるDNAを、ハウスダストダニアレルギーに対する予防ワクチンとして試験した。
【００９６】
2. ワクチン製剤
表１：図５に記載のハウスダストダニアレルギー動物モデルで試験したタンパク質およびDNAワクチン製剤
【表１】
2005502339.tif 000003
【００９７】
IP＝腹腔内注射
IM＝筋肉内注射
3. 抗体応答  −  結果
天然のDerP1を４回注射して免疫したマウスは、高力価のIgGとIgG1、低力価のIgG2a、および多量のIgE抗体を産生し、天然のDerP1が強いTh2免疫応答を誘発することを示す（表２と４）。
【００９８】
未変性のまたは変性ProDerP1を注射したマウスでは、抗DerP1 IgGとIgG1抗体応答もまた強かった。未変性のProDerP1を注射後、IgG2a力価は、DerP1で得られたものよりわずかに高く、IgE力価はDerP1で得られたものと同等であるかまたはわずかに低かった。未変性のProDerP1免疫マウスと比較して、変性ProDerP1を注射したマウスは、高いIgG2a力価および非常に低いIgE抗体を産生した。予測されたように、ミョウバンの非存在下でProDerP1により免疫すると、弱い免疫応答が誘導された（表４）。
【００９９】
MBP-ProDerP1野生型（WT）、C4R、C31RおよびC65R感作マウスは、特異的IgGおよびIgG1抗体の同様の産生を示した（表３）。最も高いIgG2a力価は、MBP-ProDerP1 WTとC31Rで免疫した群で観察された。どのMBP-ProDerP1変種を注射しても、特異的IgE力価は低かった。ProDerP1をコードするプラスミドでマウスを免疫した後に、同様の結果が得られた。
【０１００】
表２：異なる抗原で免疫したマウスからの特異的抗DerP1抗体の力価。IgE力価については結果を1/10希釈血清のOD415nm値として表す。PBSまたはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物（HDM）で気管支誘発した後にも力価を測定した。
【表２】
2005502339.tif 000004
【０１０１】
表３：異なる抗原で免疫したマウスからの特異的抗DerP1抗体の力価。IgE力価については結果を1/10希釈血清のOD415nm値として表す。PBSまたはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物（HDM）で気管支誘発した後にも力価を測定した。
【表３】
2005502339.tif 000005
【０１０２】
表４：異なる抗原で免疫したマウスからの特異的抗DerP1抗体の力価。IgE力価については結果を1/10希釈血清のOD415nm値として表す。PBSまたはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物（HDM）で気管支誘発した後にも力価を測定した。
【表４】
2005502339.tif 000006
【０１０３】
4. Ｔ細胞増殖応答  −  結果
エアゾル抗原刺激の前（対照）および後に、免疫マウスから単離した脾細胞を、ProDerP1またはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物で刺激してＴ細胞増殖応答について調べた。結果を表５（刺激指数）と表６（サイトカイン）に示す。
【０１０４】
異なる組換えProDerP1変異体で免疫したマウスでは、アレルゲン特異的Ｔ細胞応答が検出された。最も強い応答は、ProDerP1で脾細胞を刺激した時に観察された。Ｔ細胞反応性は、抗原刺激とは独立に現れた。
【０１０５】
表５のこれらの結果は、異なる型のProDerP1が天然のDerP1と共通のＴ細胞エピトープを有することを示す。さらに熱変性または部位特異的突然変異誘発によるProDerP1の破壊は、ProDerP1 Ｔ細胞反応性を変化させず、これらの型がＴ細胞応答を刺激することができる非常に低いIgE結合反応性を有する低アレルゲンであることを確認している。
【０１０６】
表５：
PBSまたはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物で抗原刺激したかまたはしなかったワクチン接種マウス。脾細胞を単離し、精製したProDerP1またはヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）抽出物でin vitroで再刺激した。刺激指数を［3Ｈ］チミジン取り込みにより測定した。−：データは無い。これらの結果は、１つだけではない異なる実験から得られる。従ってサイトカインアッセイはすべての群で比較することはできない。
【表５】
2005502339.tif 000007
【０１０７】
再刺激した脾細胞の培養上清中のサイトカインIL-5とIFNγの存在を、ELISAで測定した（表６）。比[IFNγ]/[IL-5]を比較すると、天然のDerP1またはミョウバンをアジュバントとしたProDerP1を用いるワクチン接種により、IFNγよりIL-5の良好な産生を誘導すると結論できた。異なる型のMBP-ProDerP1（変異体と野生型）ならびに変性ProDerP1は、同等レベルの両方のサイトカインを誘導した。
【０１０８】
表６：ProDerP1再刺激脾細胞の上清の[IL-5]と[IFNγ]。これらの結果は、１つだけではない異なる実験から得られる。従ってサイトカインアッセイはすべての群で比較することはできない。
【表６】
2005502339.tif 000008
【０１０９】
5. 気管支肺胞洗浄  −  結果
天然のDerP1による感作とエアゾル化ハウスダストダニ抽出物への以後の暴露は、有意に高い気管支肺胞細胞数を誘導した（表７）。エアゾル化ハウスダストダニ抽出物への７回の暴露は、DerP1をワクチン接種した動物でのみ気道の好酸球増加を誘導することが証明された。この群では、DerP1感作動物を噴霧しなかった時またはエアゾル化PBSに暴露しなかった時、気道の好酸球増加は観察されなかった。
【０１１０】
異なる型のProDerP1を用いるワクチン接種は、エアゾル化HDM抽出物への暴露後も気道の好酸球増加を防止した。
【０１１１】
表７：PBSまたはハウスダストダニ抽出物エアゾルに暴露した、異なる抗原で免疫したマウスの気管支肺胞洗浄液の性状解析
【表７】
2005502339.tif 000009
【実施例９】
【０１１２】
核酸ワクチン接種（NAVAC）のための発現プラスミド
1. 核酸ワクチン接種のためのプラスミドをコードするProDerP1の構築
ProDerP1コードカセット（１〜302aa）をプラスミドpNIV4846（上記参照）から切り出し、HindIIIとBglIIで制限切断し、あらかじめHindIIIとBglIIで切断しておいたプラスミドpJW4304中に挿入した。得られたプラスミド（pNIV4848と名付けた）を、DNA配列決定により証明した。
【０１１３】
2. 部位特異的突然変異誘発
４、31または65位（成熟ProDerP1番号付け、ProDerP1の84、111または145位に対応する）のDerP1システイン残基の突然変異を、プラスミドpNIV4846に導入した。MBP遺伝子の下流にProDerP1カセットを含有し、それぞれ変異C4R、C31R、およびC65Rを有するプラスミドpNIV4870、pNIV4871およびpNIV4872を、それぞれAflII-BamHIで制限切断して、699 bpの断片を単離した。pNIV4846をAflII-HpaIで消化して480 bpの断片を単離した。２つの精製DNA断片を、あらかじめHpaI-BamHIで切断しておいたプラスミドpJW4304中に挿入した。ProDerP1変種C4R、C31RおよびC65Rを含有する得られたプラスミドを、pNIV4879、pNIV4880、およびpNIV4881と呼んだ。
【実施例１０】
【０１１４】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中のProDerP1の発現
1. ProDerP1発現ベクターの構築
pNIV4846からのProDerP1コードカセット（最適化した哺乳動物コドン使用を有する完全長１〜302aa ProDerP1 cDNA）を以下のプライマーを使用してPCRにより増幅した：5'ACTGACAGGCCTCGGCCGAGCTCCATTAA3'（太字はStuI切断部位、フォワード）と 5'CAGTCACCTAGGTCTAGACTC  GAGGGGAT3'（太字はAvrII切断部位、リバース）。増幅した断片をpCR2.1 TOPOクローニングベクター中にクローン化した。正しいProDerP1カセットをDNA配列決定により証明した。組換えTOPOベクターをStuI-AvrIIで消化して918bp断片を作成し、これをStuI-AvrIIで制限切断したpPIC9K発現ベクター中に導入した。得られたプラスミド（pNIV4878）は、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）α因子の下流にProDerP1カセットを含有する。
【０１１５】
2. 部位特異的突然変異誘発
非グリコシル化ProDerP1産生のための発現プラスミド（N52Q、成熟DerP1番号付け）を、pNIV4878から重複伸長PCRにより４つのプライマーのセットを使用して得た。以下のプライマー：5'GGCTTTCGAACACCTTAAGACCCAG3'（プライマー１、太字はAflII制限部位、フォワード）と 5'GCTCCCTAGCTACGTA  TCGGTAATAGC3'（プライマー２、太字はSnaBI制限部位、リバース）を使用して、ProDerP1アミノ酸配列71〜176をコードする317bp断片を増幅した。以下のプライマー：5'CCTCGCGTATCGGCAACAGAGCCTGGACC3'（プライマー３、太字は変異N52Q、フォワード）と 5'GGTCCAGGCTCTGTTGCCGATACGCGAGG3'（プライマー４、太字は変異N52Q、リバース）を使用して、ProDerP1配列に変異N52Qを導入した。
【０１１６】
変異した317bpのAflII-SnaBI断片を３工程法により作成した。PCR no１では、プライマー１と４をpNIV4878と混合して〜200bpの断片を産生した。PCR no２では、プライマー２と３をpNIV4878と混合して〜140bpの断片を産生した。２つのPCR生成物をアガロースゲルで精製し、第３ラウンドのPCRの鋳型として使用して〜340bpの断片を得た。この精製した断片を、pCR2.1 TOPOクローニングベクター（インビトロゲン（Invitrogen））中にクローン化した。変異をDNA配列決定により証明した。組換えTOPOベクターをAflII-SnaBIで消化して317bpの断片を得て、これを同様に消化したpNIV4878に連結した。得られたプラスミド（pNIV4883）は、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）α因子のProDerP1 N52Qを含有する。４、31または65位（成熟DerP1番号付け）にDerP1システイン残基の変異を有するProDerP1の非グリコシル化変種を得るために、同じセットのプライマーを使用してpNIV4873、pNIV4875、およびpNIV4874を用いて重複伸長PCRを行った。得られたプラスミドpNIV4884、4885、および4886はそれぞれ、ProDerP1 N52Q C4R、N52Q C31R、およびN52Q C65Rをコードする。
【０１１７】
2. ピー・パストリス（P. pastoris）の形質転換
スフェロプラスト形質転換法を使用してプラスミドpNIV4878をピー・パストリス（P. pastoris）中に導入した。ヒスチジノールデスヒドロゲナーゼ（His+）原栄養性について形質転換体を選択した。上昇する濃度のG418を含有する寒天上にクローンを播いて、ゲネチシン（G418）耐性についてHis+形質転換体のスクリーニングを行った。同じ方法を使用してProDerP1 N52Q、ProDerP1 N52Q C4R、N52Q C31R、およびN52Q C65Rをコードするプラスミドを用いて形質転換を行った。
【０１１８】
3. 組換え酵母によるProDerP1の産生
G418耐性クローンを30℃でBMG培地でOD600nm＝２〜６まで増殖させた。遠心分離して細胞を集め、100mlのBMG培地でOD600nm＝１まで再懸濁した。メタノール0.5％を６日間毎日添加して、ProDerP1発現を誘導した。遠心分離して上清を集め、精製するまで-20℃で保存した。
【０１１９】
4. 酵母培養物上清からのProDerP1の精製
上清を水で10回希釈し、pHを９に調整後、20mM トリス塩酸（pH９）で平衡化したＱセファロースカラム直接にのせた。出発バッファーでカラムを洗浄した。バッファー中の段階的に上昇するNaCl濃度によりタンパク質溶出を行った。ProDerP1濃縮画分をプールし、フィルトロン（Filtron）膜（オメガセリエ（Omega serie）、カットオフ：10kD）で限外ろ過して濃縮した。PBS（pH7.3）で平衡化したスーパーデックス-75カラム（１×30cm、ファルマシア（Pharmacia））でゲル濾過クロマトグラフィーをしてProDerP1精製を行った。精製したProDerP1を濃縮し、-20℃で保存した。
配列情報
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【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】CHO細胞中で発現された変性ProDerP1のIgGとIgE結合反応性。イムノプレートを500ng／ウェルの精製した未変性のもしくは変性ProDerP1で被覆し、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）に対して放射性アレルゴソルベント陽性の血清（１：８希釈）とともにインキュベートした。結合したIgEまたはIgGを、抗ヒトIgEまたはIgGおよびアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体とともにインキュベートし、次に酵素アッセイを行って定量した。結果をOD410nm値として示す。
【図２】MBP-ProDerP1と天然のDerPのIgE反応性の相関。イムノプレートを500ng／ウェルの精製したDerPまたはMBP-ProDerP1で被覆し、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）に対して放射性アレルゴソルベント陽性の95の血清（１：８希釈）とともにインキュベートした。結合したIgEを、抗ヒトIgEおよびアルカリホスファターゼ標識抗マウスIg抗体とともにインキュベートし、次に酵素アッセイを行って定量した。結果をOD410nm値として示す。
【図３】突然変異C4R、C31RおよびC65Rを有するMBP-ProDerP1変異体のIgE結合反応性。イムノプレートを500ng／ウェルの野生型または突然変異MBP-ProDerP1で被覆し、ヤケヒョウヒダニ（D. pteronyssinus）に対して放射性アレルゴソルベント陽性の20の血清のプール（１：８希釈）とともにインキュベートした。結合したIgEを、抗ヒトIgEおよびアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgG抗体とともにインキュベートし、次に酵素アッセイを行って定量した。結果をOD410nm値として示す。
【図４】アレルゲンのヒスタミン放出活性。一人のアレルギー性ドナーの末梢血から単離した好塩基球を、異なるアレルゲンの連続希釈物で刺激した。細胞から放出されたヒスタミンをELISAにより測定した。界面活性剤IGEPAL CA-630で細胞を破砕後、好塩基球中のヒスタミンの総量を定量した。結果は、アレルゲンにより放出されたヒスタミンの総ヒスタミンに対する比として示す。
【図５】ハウスダストダニアレルギーの動物モデルの模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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