(57)【要約】  マウスにおけるヘム調節性ｅＩＦ２キナーゼ（ＨＲＩ）をコードする遺伝子の標的化された破壊は、赤血球で主に発現されるＨＲＩが、基本翻訳開始因子ｅＩＦ２を阻害することによって、赤血球前駆体においてαグロビンおよびβグロビンの両方の合成を調節することをことを確立する。ＨＲＩは、赤血球系統における遺伝子発現の生理学的調節因子であり、そしてヘムのセンサーおよび翻訳開始を制御するエフェクターの両方として作用する。従って、ＨＲＩの調節は、細胞（特に造血起源の細胞）の増殖を、ＨＲＩ欠損マウスを使用して同定された組成物および化合物を使用して、制御するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＲＩの役割について、またはＨＲＩ活性に影響を与える化合物についてスクリーニングするため動物モデルであって、ＨＲＩをコードする１つ以上の不活性遺伝子を含む細胞を含むか、またはその不活性な調節配列を含む、動物モデル。
【請求項２】
前記動物が、ＨＲＩ−についてヘテロ接合体である、請求項１に記載の動物モデル。
【請求項３】
前記動物が、ＨＲＩ−についてホモ接合体である、請求項１に記載の動物モデル。
【請求項４】
前記動物が、マウスである、請求項１に記載の動物モデル。
【請求項５】
ＨＲＩ活性を変更する化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）動物モデルにおいて、ＨＲＩの役割について、またはＨＲＩ活性に影響を与える化合物についてスクリーニングする工程であって、該動物モデルは、ＨＲＩをコードする１つ以上の不活性遺伝子を含む細胞を含むか、またはその不活性な調節配列を含む、工程、
（ｂ）該動物を、スクリーニングされるべき化合物に曝露する工程、ならびに
（ｃ）該動物モデルにおける影響を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記ＨＲＩ活性が、誘導されるか、抑制されるか、または減弱される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＲＩ活性が、遺伝子発現、タンパク質合成、ｅＩＦ−２のリン酸化活性またはキナーゼ活性、あるいは細胞表現型によって測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記動物がマウスである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスが、ＨＲＩ−についてヘテロ接合体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記マウスが、ＨＲＩ−についてホモ接合体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法であって、前記化合物が、乾癬、慢性骨髄性白血病、癌および細胞増殖障害からなる群より選択される状態の処置のために有用である、方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の方法によって同定される、ＨＲＩ活性を変更するための、化合物。
【請求項１３】
ＲＢＣがより脆弱な障害を処置する方法であって、該方法は、ＨＲＩまたはＨＲＩ誘導性の発現もしくは活性を誘導する化合物、またはＨＲＩ活性を模倣する化合物を、このような処置を必要とする患者に投与する工程を包含し、ここで、
該障害は、サラセミア、鎌状赤血球疾患、不安定ヘモグロビン、マラリアおよび他の感染症、極端な気候条件、ならびに天然の毒素、重金属もしくは薬物の摂取からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
前記ＨＲＩが、薬学的組成物中のタンパク質として投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＲＩが、核酸中にコードされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が、ウイルスベクター中にコードされる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、２００１年１２月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３３９，３６０に対する優先権を主張する。
【０００２】
米国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＤＫ−１６２７２からＪ−Ｊ  Ｃｈｅｎへの助成金によって本発明において権利を有する。
【０００３】
本発明は、ヘム制御真核生物開始因子２αキナーゼの使用、およびその処方物、およびこのキナーゼの活性を変更する化合物をスクリーニングするためのノックアウト動物である。
【０００４】
ヘムは、網状赤血球におけるタンパク質の合成を制御する。ヘム欠乏症において、ポリリボソームの解体を伴うタンパク質合成の開始の減少が存在する。タンパク質合成の開始の阻害の主な機構は、真核生物開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ−２α）のリン酸化である。ヘム欠損に加えて、酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）および低レベルの二本鎖ＲＮＡは、ｅＩＦ−２αのリン酸化を促進することによって開始を阻害する。
【０００５】
真核生物細胞におけるｍＲＮＡの翻訳は、細胞質ゾルにおいて生じる。開始の第１工程において、遊離８０Ｓリボソームは、これらの４０Ｓサブユニットおよび６０Ｓサブユニットとの平衡にある。ｅＩＦ−３の存在下で、４０Ｓサブユニットは、ｅＩＦ−３およびｅＩＦ−４Ｃを結合し、４３Ｓリボソーム複合体を形成し；ｅＩＦ−３およびｅＩＦ−４Ｃの４０Ｓサブユニットに対する結合は、６０Ｓサブユニットの結合を阻害する。
【０００６】
次の工程において、ｅＩＦ−２は、三元複合体において、ＧＴＰおよび開始因子ｔＲＮＡ、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆを結合する。ｅＩＦ−２による結合は、グアニンヌクレオチドおよびＭｅｔ−ｔＲＮＡｆの両方に対して特異的である。三元複合体は、ここで、４３Ｓリボソーム複合体に結合し、４３Ｓ開始前複合体を形成する。４３Ｓ開始前複合体は、ＡＴＰ依存性反応においてｍＲＮＡを結合し、ここで、ｅＩＦ−４Ａ、ｅＩＦ−４Ｂ、およびｅＩＦ−４Ｆは、ｍＲＮＡと複合体を形成する。ｍＲＮＡの４３Ｓ構造への結合の生成物は、リボソームの近くに結合され、ＡＵＧ開始コドンは、キャップ構造の下流に存在する。
【０００７】
４８Ｓ開始前複合体と６０Ｓサブユニットとの結合は、リボソーム依存性ＧＴＰａｓｅ活性を有するｅＩＦ−５によって触媒される。結合反応は、開始因子（ｅＩＦ−３およびｅＩＦ−４Ｃ）の遊離を伴い、ｅＩＦ−２は、二元複合体（ｅＩＦ２−ＧＤＰ）として６０Ｓサブユニットにトランスロケートされる。結合反応の生成物は、８０Ｓ開始複合体である。活性８０Ｓ開始複合体の形成は、開始の最終工程である。Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆは、ポリペプチド伸長の開始のためのリボソーム上のＰ（ペプチジル）部位に配置される。
【０００８】
開始のプロセスにおける工程の順序は、制御のためのいくつかの機会を提供する。これらは、ｅＩＦ−２−ＧＤＦ複合体としてのその放出後のｅＩＦ−２の再生工程；三元複合体の形成；およびｍＲＮＡの翻訳の相対速度を決定する工程におけるｅＩＦ−２ならびにｅＩＦ−４Ａ、ｅＩＦ−４Ｂ、およびｅＩＦ−４Ｆに対するｍＲＮＡの相対的親和性を含む。
【０００９】
タンパク質合成の開始を阻害するヘム欠損性は、短い期間の制御線状合成、続く、この速度での不意の減衰およびポリリボソームの解体によって特徴付けられ、ｅＩＦ−２−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ−ＧＴＰ三元複合体および４０Ｓ−ｅＩＦ−２Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ−ＧＴＰ  ４３Ｓ開始複合体の形成の減少と関連する。阻害に対する基本的な機構は、ｅＩＦ−２の３８ｋＤａのαサブユニット（ｅＩＦ−２α）を特異的にリン酸化するｃＡＭＰ非依存性タンパク質キナーゼの活性化である。ｅＩＦ−２αの脱リン酸化は、阻害されたヘム欠損溶解物へのヘミンの添加の際にタンパク質合成の回復を伴う。
【００１０】
ヘム制御真核細胞開始因子２α（ｅＩＦ−２）キナーゼ（ヘム制御インヒビター（ＨＲＩ）ともいわれる）は、このαプロセスにおいて主要な役割を果たす。ＨＲＩは、真核細胞開始因子２（ｅＩＦ−２）のサブユニット（ｅＩＦ−２）を特異的にリン酸化するｃＡＭＰ非依存性Ｐαプロテインキナーゼである。網状赤血球中のｅＩＦ−２αのリン酸化は、ＲＦ−ｅＩＦ−２（αＰ）複合体における逆転因子（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）（ＲＦ）（グアニンヌクレオチド交換因子またはｅＩＦ−２Ｂとも示される）の結合および隔離を生じ；これは、ｅＩＦ−２の再生において、そしてｅＩＦ−２−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｆ−ＧＴＰ三元複合体の形成において、ＧＴＰをＧＤＰへ交換するために必要なＲＦの非入手可能性によって、タンパク質合成の開始の中止を生じる。
【００１１】
調節遺伝子が哺乳動物における遺伝子発現を制御する機構に対する調査は、主に転写に対して集中し、そしてより低い程度に、特異的なｍＲＮＡの運命およびこれらの細胞局在化に関連する転写後事象に対して集中する。それにも関わらず、生化学的な事象の増加は、体細胞分化および生殖細胞分化の間の別のレベルの制御（すなわち、翻訳制御）に指向する。翻訳制御は、基本的翻訳因子の濃度もしくは活性を改変すること（Ｍａｔｈｅｗｓら、（２０００）．Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，．Ｗ．Ｂ．，およびＭａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））によってまたはｍＲＮＡ上に存在するシス作用性配列とのトランス活性化因子の相互作用に依存するｍＲＮＡ特異的様式（Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒｉ．２０，６２７−６６２；ＲｏｕａｕｌｔおよびＨａｒｆｏｒｄ（２０００）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．，およびＭａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），第６５５頁−第６７０頁）においてのいずれかで達成され得る。全動物の背景におけるその生理学的役割の直接的証拠は不足しているが、開始因子２のαサブユニット（ｅＩＦ２α）のリン酸化は、インビトロでの翻訳開始の包括的阻害の重要な機構として認識される。ｅＩＦ２は、３つのサブユニット（α、α、およびα）から構成される基本的翻訳開始因子である。ｅＩＦ２は、２つの型の二元複合体（活性のｅＩＦ２．ＧＴＰおよび不活性のｅＩＦ２．ＧＤＰ）を形成する。ｅＩＦ２．ＧＴＰは、アクセプターステム（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｅｍ）の末端で特定の塩基を認識することによって延長因子ｔＲＮＡと開始因子ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ）を区別し、このｅＩＦ２．ＧＴＰは、開始因子ｔＲＮＡに結合する（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，Ａ．Ｇ．（２０００）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  Ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．，およびＭａｔｔｈｅｗｓ，Ｍ．編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），第１８５頁−第２４３頁において概説される）ｅＩＦ２、ＧＴＰおよびＭｅｔ−ｔＲＮＡｉは、リボソームに結合するために必要とされる。三元複合体を形成する。続いて、ｅＩＦ２は、ｅＩＦ２．ＧＤＰ二元複合体としてリボソームを出、リボソーム上に開��因子ｔＲＮＡを残す。その活性形態を再生し、別のＭｅｔ−ｔＲＮＡｉを結合するために、ｅＩＦ２．ＧＤＰは、ｅＩＦ２Ｂによって触媒されるグアニル酸交換反応によってｅＩＦ２．ＧＴＰへと転換されなければならない。ｅＩＦ２は、ＧＴＰよりもＧＤＰに対して４００倍より大きな親和性を有する。固く結合したＧＤＰをＧＴＰへと交換することは、ｅＩＦ２Ｂを必要とし、これは、制限された濃度で存在し、ｅＩＦ２の１５〜２５％の量で存在する（Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．（１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０，７１７−７５５；Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，２０００；Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９１；Ｔｒａｃｈｓｅｌ，Ｈ．（１９９６）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｔｏ  ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｉｎ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｍ．Ｂ．Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），第１１３頁−第１３８頁中に概説される）。
【００１２】
ｅＩＦ２の再循環は、そのα−サブユニットのリン酸化によって阻害される。セリン５１残基におけるこのｅＩＦ２のα−サブユニットのリン酸化は、ｅＩＦ２αキナーゼのファミリーによって行われる。リン酸化ｅＩＦ２（αＰ）．ＧＤＰは、ｅＩＦ２．ＧＤＰよりもｅＩＦ２Ｂにより密接に結合し、かつｅＩＦ２Ｂを機能しないようにする。従って、一旦、リン酸化ｅＩＦ２の量がｅＩＦ２Ｂの量を超えると、そのタンパク質合成は遮断される（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，２０００において総説される）。４つのｅＩＦ２αキナーゼが、哺乳動物において同定されている：ｄｓＲＮＡ依存性ｅＩＦ２αキナーゼ（ＰＫＲ）、ＧＣＮ２プロテインキナーゼ、小胞体（ＥＲ）常在性キナーゼ（ＰＥＲＫ）およびヘム調節された（ｈｅｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）ｅＩＦ２αキナーゼ（ＨＲＩ）。これら全てが、ｅＩＦ２αのリン酸化によってタンパク質合成を阻害するが、異なる効果が、これらの組織分布およびそれらが応答するシグナルの結果として生じ得ることが予測される。これらのｅＩＦ２αキナーゼは、それらのキナーゼ触媒ドメインにおいて広範な相同性を共有する（Ｂｅｒｌａｎｇａら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，３２３４０−３２３４６；Ｃｈｅｎら（１９９１ｂ）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，７７２９−７７３３；Ｃｈｏｎｇら（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１，１５５３−１５６２；Ｈａｒｄｉｎｇら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７，２７１−２７４；Ｍｅｕｒｓら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２，３７９−３９０；Ｒａｍｉｒｅｚら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，３０２７−３０３６；Ｓｈｉら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，７４９９−７５０９）。しかし、このｅＩＦ２αキナーゼの各々は、特有の調節ドメインを有し、このドメインは、特定の刺激に対するセンサーとして作用する。ＰＫＲは、遍在的に発現され、インターフェロンによって誘導され、そして２つのＮ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメインを介して、ｄｓＲＮＡによって調節される（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２０００）．Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，ＰＫＲ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｍ．編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．５０３−５２８において総説される）。ＧＣＮ２は、肝臓および脳において高度に発現され（Ｂｅｒｌａｎｇａら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５，７５４−７６２；Ｓｏｏｄら（２０００）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５４，７８７−８０１）、そしてＣ末端ドメイン（このドメインは、Ｈｉｓ−ｔＲＮＡ合成様配列を含む）を介して、アミノ酸窮乏条件下で活性化される（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ，１９９６において総説される）。ＰＥＲＫは、分泌組織、特に、膵臓において高度に発現され、そしてＥＲストレスによって活性化される。ＰＥＲＫは、ＥＲストレスキナーゼＩｒｅｌのセンサードメインと類似である管腔ドメインを含む（Ｒｏｎら（２０００）．ＰＥＲＫ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｙ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｈ．Ｊ．Ｗ．Ｂ．ａ．Ｍ．Ｍ．Ｂ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ  Ｎ．編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．５４７−５６０；Ｈａｒｄｉｎｇら、１９９９；Ｓｈｉら、１９９８において総説される）。ＨＲＩは、赤血球系細胞において優性に発現され、そしてＮ末端に局在化される２つのヘム結合ドメインおよびキナーゼ挿入を介して、ヘム（ヘモグロビンの補欠分子族）によって調節される（Ｃｈｅｎ，Ｊ．−Ｊ．（２０００）．Ｈｅｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅＩＦ−２ａ  ｋｉｎａｓｅ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｍ．Ｂ．Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．５２９−５４６；Ｃｈｅｆａｌｏ編（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５８，８２０−８３０；Ｒａｆｉｅ−Ｋｏｌｐｉｎ，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，５１７１−５１７８において総説される）。
【００１３】
ＨＲＩは、生物学的に、広範に研究されている。インタクトな網状赤血球およびそれらの溶解物におけるタンパク質合成は、ヘムの有効性に依存していることは、十分に実証されている。ヘムの欠損において、タンパク質合成の阻害は、ＨＲＩの活性化と関連する（Ｃｈｅｎ，２０００およびＣｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．（１９９６）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ  ｅＩＦ−２  ａｎｄ  ｅＩＦ−２Ｂ，ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｍ．Ｂ．Ｍａｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ：（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）），ｐｐ．１３９−１７２において総説される）。昆虫Ｓｆ９細胞におけるＨＲＩの発現は、タンパク質合成の全体的な阻害を引き起こす（Ｃｈｅｆａｌｏら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５７８８−２５７９４）。さらに、バキュロウイルス発現ＨＲＩは、その活性がインビトロおよびインビボの両方でヘミンのマイクロモル濃度によって調節される血液タンパクである（Ｃｈｅｆａｌｏら、１９９８；Ｃｈｅｆａｌｏ，１９９４）。
【００１４】
ＨＲＩは、２つの別個のヘム結合部位を含む。Ｎ末端ドメインに結合されたヘムは、安定であり、かつ均一になるまでＨＲＩとともに同時精製する。対照的に、ヘムは、キナーゼ挿入ドメインに可逆的に結合し、そして結合の際にＨＲＩキナーゼ活性を阻害し、それによって細胞内ヘム濃度に従ってＨＲＩ活性を調節する（Ｃｈｅｆａｌｏら、１９９８；Ｒａｆｉｅ−Ｋｏｌｐｉｎら、２０００）。ＨＲＩタンパク質、ＨＲＩ活性およびＨＲＩ  ｍＲＮＡは、赤血球前駆体において優性に検出され（Ｃｒｏｓｂｙら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４，３９０６−３９１４）、そしてＨＲＩ  ｍＲＮＡレベルは、マウス赤白血病（ｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ）（ＭＥＬ）細胞の赤血球分化の間に増加される（Ｃｒｏｓｂｙら、１９９４）。少量のＨＲＩ  ｍＲＮＡもまた、非赤血球組織において見出されるが、ＨＲＩタンパク質発現の証拠は、報告されていない（Ｂｅｒｋｌａｎｇａら、１９９８；Ｍｅｌｌｏｒら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１０２０１−１０２０４）。これが達成される機構、および阻害を制御するため、またはＨＲＩタンパク質発現の阻害を刺激するための手段は、依然として十分には特徴付けされていない。
【００１５】
ＨＲＩは、１９６０年に網状赤血球におけるタンパク質合成のインヒビターとして最初に同定された（Ｃｈｅｎ，Ｊ．−Ｊ．（１９９３）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅＩＦ−２  Ａｌｐｈａ  ｋｉｎａｓｅ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ２，Ｊ．Ｉｌａｎ，編（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．３４９−３７２において総説される）。ＨＲＩは、生物学的に、広範に研究されているが、動物全体におけるその生理学的機能は、未知であった。今日まで、ヒトまたはマウスにおける疾患が、ＨＲＩ遺伝子における変異に関連していることは知られていない。なお、ＨＲＩのオルトログは、魚類からヒトまで広範に保存されているようであり、このことは、ＨＲＩについての重要な役割を示唆する。
【００１６】
従って、本発明の目的は、ＨＲＩがノックアウトである動物モデルを提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物細胞におけるＨＲＩを発現させるための方法、および発現の変更について化合物をスクリーニングするための方法を提供することである。
【００１８】
本発明のなお別の目的は、同定された化合物を使用して、タンパク質合成を阻害することによって細胞増殖を阻害する方法を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
マウスにおけるヘム調節性ｅＩＦ２ キナーゼ（ＨＲＩ）をコードする遺伝子の標的化された破壊は、ＨＲＩ（これは、赤血球細胞において優勢に発現される）が、一般の翻訳開始因子ｅＩＦ２を阻害することによって、赤血球細胞前駆体におけるαグロビンおよびβグロビンの両方の合成を調節することを証明する。この阻害は、ヘムの細胞内濃度が低下した場合に生じ、それによって、過剰のグロビンポリペプチドの沈殿を防止する。鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスにおいて、グロビンは、赤血球細胞およびその前駆体内で凝集したヘムを欠き、骨髄および脾臓における代償性赤血球の増殖を伴う高色素性溶血性貧血を生じる。従って、ＨＲＩは、赤血球系統における遺伝子発現の生理学的調節因子であり、そしてヘムのセンサおよび翻訳の開始を制御するエフェクターの両方として働く。従って、ＨＲＩの調節は、ＨＲＩノックアウトマウスの試験における効力により同定される組成物を使用して、細胞、特に、造血系由来の細胞の増殖を制御するために使用され得る。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
米国特許第５，５２５，５１３号（Ｃｈｅｎら）において記載されるように、ＨＲＩ  ｃＤＮＡを、ウサギ網状赤血球のλ  Ｚａｐ  ＩＩ  ｃＤＮＡライブラリからクローニングした。以下でより詳細に記載されるように、このｃＤＮＡは、ＨＲＩをコードするヒトＤＮＡに高度に相同であり、そしてヒトＨＲＩおよび他の種（例えば、マウス）由来のＨＲＩをコードするクローンを得るために使用されている（しかし、ウサギＨＲＩとマウスＨＲＩとの間よりウサギとヒトとの間の相同性の方がわずかに大きいようである）。ウサギＨＲＩ  ｃＤＮＡは、２７２９ヌクレオチドを含み、そして６２６アミノ酸をコードする。核酸配列は、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  データベースに寄託されている（登録番号Ｍ６９０３５）。ＨＲＩ  ｃＤＮＡから転写されたＨＲＩ  ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ｅＩＦ−２αキナーゼ活性を有する９０ｋＤａのポリペプチドを生じる。この９０ｋＤａのポリペプチドは、抗ＨＲＩモノクローナル抗体によって認識される。これらの特性は、標準のＨＲＩに特徴的である。
【００２１】
ＨＲＩ  ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム配列は、保存された触媒ドメインＶＩおよびＶＩＩＩにおけるセリン／チロシンプロテインキナーゼのコンセンサス配列を有するプロテインキナーゼの１１個全ての触媒ドメインを含む。ＨＲＩ  ｃＤＮＡはまた、触媒ドメインＶとＶＩとの間に約１４０アミノ酸の挿入物を含む。ＨＲＩ  ｃＤＮＡコード配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＣＮ２プロテインキナーゼおよびヒト二本鎖ＲＮＡ依存性ｅＩＦ−２αキナーゼに対する広範な相同性を有する。従って、ＧＣＮ２プロテインキナーゼは、酵母におけるｅＩＦ−２αキナーゼであり得ると考えられる。最近、ＧＣＮ２によるｅ２Ｆ−２αのリン酸化が、酵母ＧＣＮ４の翻訳制御に必要であることが示された（Ｄｅｖｅｒら，Ｃｅｌｌ  ２８，５８５−５９６（１９９２））。さらに、ＨＲＩは、３つのプロテインキナーゼ（Ｎｉｍ  Ａ、Ｗｅｅ１およびＣＤＣ２（これらは、細胞周期の調節に関与する））に対する異常に高い程度の相同性を有する。
【００２２】
（単離されたｃＤＮＡ由来のＨＲＩの発現および特徴付け）
ＨＲＩ  ｃＤＮＡの５’非翻訳リーダー配列を、ＰＣＲを使用することによって置換して、開始メチオニン（ｎｔ１１３）において特有のＮｃｏｌ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を導入し、続いて、コード配列を、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）非翻訳リーダー配列（これは、開始メチオニンおよび３’末端Ｎｃｏｌ部位の両方を提供するように操作されている）を含むベクターに連結した。このＮｃｏｌ部位の導入は、ＨＲＩの２番目のアミノ酸をロイシンからバリンに変更し、保存的置換を構築する。
【００２３】
線状化ＨＲＩ  ｃＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを使用して転写した。ＨＲＩ  ｍＲＮＡ（４０μｇ／ｍｌ）のインビトロ翻訳を、Ｐｒｏｍｅｇａにより記載されるようにして、［３５Ｓ］−メチオニンの存在下で、ヌクレアーゼで処理した網状赤血球溶解物またはコムギ胚抽出物を使用して行った。プロテインキナーゼアッセイを、１０ｍＣｉの［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１．５μｌの翻訳混合物および示されるような精製されたウサギｅＩＦ−２（１μｇ）を含む４０μｌの反応物で、３０℃（網状赤血球溶解物）または２５℃（コムギ胚抽出物）で、１０分間、Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｊら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５５９−９５６４（１９８９）により記載されるようにして、行った。
【００２４】
インビトロの転写および翻訳を、ＨＲＩ  ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の見かけの分子サイズを決定するため、およびタンパク質キナーゼ活性について試験するために実施した。ヌクレアーゼ処理されたウサギ網状赤血球溶解物中の５つのＨＲＩクローンｍＲＮＡ全ての翻訳は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察されるような優性な９０ｋＤａの産物を生じた。
【００２５】
ヌクレオチド配列データは、この５’非翻訳リーダー配列が、非常にＧ−Ｃリッチであり、有意な２次構造を形成する可能性を有していることを示す。ｍＲＮＡの５’末端における２次構造は、ｍＲＮＡの翻訳効率を減少させることが知られている。このＨＲＩ  ｍＲＮＡは、麦芽抽出物中では翻訳可能でなかった。網状赤血球溶解物とは異なり、この麦芽抽出物は、内因性ＨＲＩ酵素を含まない。従って、麦芽系におけるＨＲＩタンパク質の発現は、ＨＲＩ翻訳産物中のキナーゼ活性の分析を容易にするはずである。ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率は、ＴＭＶのようないくつかの植物ウイルスＲＮＡの非翻訳リーダー配列の使用によって増加され得る。このＴＭＶは、Ｇａｌｌｉｅら，（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，８６９３−８７１１，ならびにＧｅｈｒｋｅ，Ｌ．およびＪｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，（１９９０）：ＭｃＣａｒｔｈｙ，ＪＥＧ  Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｈ：Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｕｉｔｅ，Ｍ．（編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ），Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．３８９−３９８によってｃｉｓ中で作用することが示されている。従って、このＧ−ＣリッチなＨＲＩ非翻訳リーダー配列は、ＴＭＶの非翻訳リーダー配列と置換された。このキメラＴＭＶ−ＨＲＩ  ｍＲＮＡを、網状赤血球溶解物中のＨＲＩ  ｍＲＮＡよりも約１０倍大きい効率で翻訳し、そして麦芽抽出物における翻訳は、明確に明らかであった。全ての場合において、ＨＲＩ  ｍＲＮＡの翻訳産物は、ＳＤＳゲル電気泳動上で真の精製リン酸化ＨＲＩよりもわずかに早く移動した。移動度におけるこのわずかな差異は、この翻訳産物中のより低いレベルのリン酸化に最も起因するようである。
【００２６】
このＨＲＩ  ｃＤＮＡのｍＲＮＡ由来の翻訳産物がｅＩＦ−２αキナーゼであるか否かを決定するために、総翻訳混合物のわずかな部分をタンパク質キナーゼアッセイ条件下で、さらなるヘミンの非存在下で、精製ウサギ網状赤血球ｅＩＦ−２および［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰと共にインキュベートし、ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって分析した。
【００２７】
この結果は、ＨＲＩ  ２ＡおよびＨＲＩ  ２ＢのｍＲＮＡの翻訳産物は、さらなるｍＲＮＡの非存在下でコントロールと比較した場合に増強されたｅＩＦ−２αキナーゼ活性を有することを示す。キナーゼアッセイ条件（０．７５ｉＭの最終へミン濃度）下で、新しく合成されたＨＲＩの活性は、ヌクレアーゼ処理された溶解物中の予備形成された内因性ＨＲＩの低い活性を超え、ｅＩＦ−２αの増強されたリン酸化を検出することを可能にすることが強調されるべきである。さらなる精製ウサギｅＩＦ−２の非存在下において、ｅＩＦ−２α領域中のごくわずかなリン酸化のみが観察される。さらに、麦芽抽出物中で合成されるＨＲＩポリペプチドは、精製ＨＲＩを示すようにｅＩＦ−２αキナーゼ活性を示す。哺乳動物動物ｅＩＦ−２αキナーゼ活性は、麦芽抽出物中には存在せず、かつ精製網状赤血球ＨＲＩは、麦芽ｅＩＦ−２αを非常に非効率的にリン酸化することに注目すべきである。さらに、ＨＲＩ  ｃＤＮＡから発現される９０ｋＤａポリペプチドは、ＨＲＩに対するモノクローナル抗体によって免疫沈降される。
【００２８】
（他の哺乳動物種中でＨＲＩをコードするｃＤＮＡの単離）
ＤＮＡヌクレオチド配列データを、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡによって提供される、ＭａｃＩｎｔｏｓｈＴＭコンピュータ用のＣＡＤ  ＧｅｎｅＴＭソフトウエアを使用して部分的に分析した。ウサギおよびヒトのｄｓＲＮＡ依存性ｅＩＦ−２αキナーゼ（ｄｓＩ）のアミノ酸配列は、８３％類似しており、７６％は同一である。ヒトとウサギとの間の開始因子（ｅＩＦ−２α、およびｅＩＦ−２ａ  ｅＩＦ−４Ａ、ｅＩＦ−４Ｅ、ＥＦ−１ａ）の類似のまたはより高い程度の相同性が示されている。ヒトとウサギとの間のＨＲＩの予測される相同性は、８０％よりも大きい。従って、ヒトまたは他の種においてＨＲＩをコードする配列は、Ｍａｎｉａｔｉｓら，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇによって概説されるような標準的な条件下でのハイブリダイゼージョンによって単離され得る。ライブラリーからのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌは、他の種の網状赤血球から調製される。次いで、単離された配列はウサギ網状赤血球から単離されたＨＲＩ  ｃＤＮＡと同じ様式で発現される。
【００２９】
ＨＲＩ  ｃＤＮＡは、触媒ドメインＶとＶＩとの間（アミノ酸２７６〜４１３）の約１４０のアミノ酸の挿入を含む。類似の大きい挿入物は、サブクラスＩＩＩおよびＩＶのレセプターチロシンキナーゼについて報告されており、これは、ＰＤＧＦレセプター、ＣＳＦ−１レセプターおよびｃ−ｋｉｔプロト癌遺伝子産物を含み、その中で、このキナーゼドメインは、Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．およびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．，（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：２０３−２１２に概説されるように、１００個までのほとんど親水性のアミノ酸残基を挿入することによって、２つに分割される。キナーゼ挿入配列は各特定のレセプターについて種間で高度に保存されるので、このキナーゼ挿入は、レセプターキナーゼの作用において重要な役割を果たし得る。確かに、このＰＤＧＦレセプターキナーゼ挿入は、自己リン酸化部位（Ｔｙｒ−７５１）を含み、ＰｈｅまたはＧＬｙに対するＴｙｒ−７５１の変異は、ＰＤＧＦレセプターの、ホスファチジルイノシトールキナーゼおよび他の３つの細胞タンパク質との結合をブロックする。ＨＲＩの場合において、ヘムは、ＨＲＩに結合し、そしてそのキナーゼ活性を調節する。ＨＲＩのキナーゼ挿入配列が、ヘムの結合ならびに自己キナーゼおよびｅＩＦ−２αキナーゼの活性の調節に関与すると考えられる。
【００３０】
（細胞増殖および細胞分化ならびにウイルス活性の阻害、ならびにＨＲＩまたはｄｓＩを使用する、分化の誘導）
ＨＲＩがタンパク質合成の潜在的なインヒビターであるので、ＨＲＩは、天然において自己増殖性であり、そしてコントロールされない細胞増殖が持続する、種々の癌（例えば、慢性骨髄性白血病）の処置に有用であるはずである。ＨＲＩはまた、乾癬のような他の増殖性障害の処置にも有用であるはずである。
【００３１】
タンパク質合成の開始はまた、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＩ）によって活性化される別のｅＩＦ−２αキナーゼによっても、調節され得る。ＨＲＩおよびｄｓＩは共に、同じ部位でｅＩＦ−２αをリン酸化する。しかし、ＨＲＩとｄｓＩとは、異なる分子である。ｄｓＩは、インターフェロンによって誘導され、そしてウイルス感染に対するインターフェロン媒介性の応答を示す。しかし、ｄｓＩを不活化する機構は、ｄｓＩの抗ウイルス作用を損なうように、種々のウイルスにおいて進化している。ＨＲＩおよびｄｓＩは共に、ｅＩＦ−２αキナーゼであるので、両方とも、天然には抗ウイルス性であるはずである。しかし、ｄｓＩによってウイルスを不活化する機構は、ＨＲＩ活性に同じようには影響を与えないはずである。従って、適切な標的細胞に導入された場合、ＨＲＩは、抗ウイルス剤として、ｄｓＩと同等以上に強力であり得る。
【００３２】
ＨＲＩは、正常には、細胞質において、そして赤血球分化の特定の期間の間に、非常に少量が発現されるだけなので、タンパク質合成を阻害し、分化を誘導し、そしてウイルスおよび寄生生物による感染を阻害するのに、少量のタンパク質が有効であると予測される。
【００３３】
（好ましくは処置される細胞と同じ種の）ｃＤＮＡから発現されるＨＲＩは、注射によって、または処置されるべき細胞もしくは患者への移植を介して、局所的に投与され得る。その投与および使用のための適切な薬学的組成物および方法は、当業者に周知である。ＨＲＩは、公知の技術を使用して、適切なエンハンサーおよびプロモーターの制御下で、任意の適切な哺乳動物発現系において発現され得る。
【００３４】
あるいは、処置されるべき細胞は、ＨＲＩをコードする配列で「感染」される。好ましい実施形態において、これは、ＨＲＩ配列をレトロウイルスベクター中に挿入し、次いでこのベクターで細胞を感染させることによって、達成される。例えば、遺伝子移入およびＨＲＩ  ｃＤＮＡの発現のためのレトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターの骨格として、ＬＮＣＸベクター（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．およびＲｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０）に記載される）を使用して、構築され得る。これは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーを含む。ＴＭＶリーダー配列を含むＨＲＩ  ｃＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの下流のポリリンカー領域によって、ＬＮＣＸベクター中に導入される。
【００３５】
【化１】
2005511085.tif 000002
レトロウイルスベクターによる遺伝子移入はまた、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ，Ｂｉｒｉｕｙｉ，Ｌ．Ｕ．，Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｒ．Ｕ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｒａｆｔｓ  Ｌｉｎｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６（１９８０）の方法、またはＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ｇａｌｉｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｈｏｌｍｅｒ，ら、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ−Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：７４１３−７４１７（１９８７）によって記載されるようなプラスミド移入技術を使用する、ウイルスベクターによるトランスフェクションによって達成され得る。
【００３６】
具体的には、細胞を収集し、コンフルエント未満（６０〜７０％）まで増殖させ、そして複製欠損性マウスモロニー白血病レトロウイルスベクターと共にインキュベートする。ＨＲＩのＤＮＡ配列は、ウイルスゲノム中に挿入され、そしてウイルス長末端反復（ＬＴＲ）のプロモーター制御下にある。感染細胞を、トリプシン処理し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｉｇ／ｍｌ）を含有する生理食塩水中に再懸濁し、そして処置を必要とする患者へと移植する。培養培地中または移植部位におけるＨＲＩの存在は、ラジオイムノアッセイによって決定され得る。
【００３７】
（ヘムに対して非感受性であるか、種特異性が低いか、または過剰発現される、ＨＲＩ  ｃＤＮＡの欠失変異体の構築）
ヘムによる制御に感受性でないＨＲＩ  ｃＤＮＡの欠失変異体は、ヘム結合領域が、上記で考察されたＨＲＩ特異的インサート内、および／または１７０個のＮ末端アミノ酸中に見出されるという予測に基づいて、構築され得る。このヘム非感受性ＨＲＩは、その抗ウイルス作用および抗増殖作用において、ネイティブのＨＲＩよりも有効であり得る。
【００３８】
種特異性の低いＨＲＩ  ｃＤＮＡの欠失変異体もまた、構築され得る。種間に、８０％よりも高い相同性が存在する（ヒトｄｓＩとウサギｄｓＩとの間で、８６％）。種のバリエーションの主な領域は、ドメインＶ中である。これらの変異を構築およびスクリーニングする方法は、当業者に公知である。
【００３９】
（ＨＲＩ二重ノックアウトマウスの構築）
全動物の文脈での哺乳動物における、ＨＲＩの生理学的役割を解明するために、ＨＲＩ遺伝子を、マウスＥＳ細胞において破壊した。ＨＲＩ−／−マウスは、正常に見え、繁殖可能であり、そして血液学的パラメータの大きな異常は示さない。しかし、食餌誘導性の鉄欠乏によって、ヘムの細胞内プールが枯渇されると、赤血球の血色素減少症および小赤血球症によって特徴づけられる、野生型マウスの適応応答は、劇的に変更された。ＨＲＩ−／−マウスにおいて、赤血球の大きさは、低色素性貧血ではなく、高色素性貧血に関して、正常のままであった。赤血球およびその前駆体内での封入体としての凝集したヘムを欠くグロビンは、骨髄および脾臓における補償的赤血球過形成を伴う、溶血性貧血を生じた。ＨＲＩ−／−マウスの網状赤血球において、ｅＩＦ２αのリン酸化は、劇的に低減される。タンパク質合成の全体的速度は、数倍増加し、そしてヘムに非依存性になった。考え合わせると、これらの結果は、赤血球細胞前駆体中のヘムの利用可能性と、αグロビンおよびβグロビンの合成との平衡を取ることにおける、ＨＲＩの生理学的役割を確立し、そして、全動物の文脈で、遺伝子発現の制御が、体細胞分化の翻訳制御において重要な役割を果たすという証拠を提供する。従って、これらの動物（ヘテロ接合体またはホモ接合体）は、ＨＲＩの発現もしくは活性を変更するか、またはＨＲＩ活性を模倣する化合物についてスクリーニングするために使用され得、そして、従って、細胞増殖およびキナーゼ活性を変更するために使用され得る。遺伝子発現、細胞表現型、ｅＩＦ−２のリン酸化、またはｅＩＦ−２に対するキナーゼ活性は、ＨＲＩ関連プロセスに影響を与える化合物についてスクリーニングするための方法において／その方法として使用され得る、容易にアッセイされる状態の例である。
【００４０】
（実験手順）
（マウスＨＲＩ遺伝子の標的化破壊）
マウス株１２９／ＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）のλＦｉｘＩＩファージゲノムＤＮＡライブラリーを、ウサギＨＲＩ  ｃＤＮＡの全コード配列をプローブとして使用して、ＨＲＩ遺伝子についてスクリーニングした（Ｃｈｅｎら、１９９１）。７５０，０００の組換えファージをスクリーニングした後、３つのポジティブクローンを単離した。クローン１９（これは、５つのエキソンを含む）を、標的化構築物調製のために使用した。ＨＲＩの３つのエキソン（キナーゼドメインＶＩｂ〜Ｘをコードする）を含む５ＫＢフラグメントを、ＮｄｅＩで切り出し、そしてフロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）ＰＧＫ−Ｎｅｏで置換した（図１Ａ）。ＨＳＶ−ＴＫを、ＥｃｏＲ  Ｖ部位に連結した。ＨＲＩ標的化構築物を、ＳａｌＩで直線化し、そして胚性幹（ＥＳ）細胞中にエレクトロポレーションした。２つの相同組換えＥＳクローンのうち、正常な核型を有する１つのクローンを、線維芽細胞に注入して、キメラマウスを生成し、引き続いて、ヘテロ接合体ＨＲＩ＋／−マウスを生成した。ヘテロ接合体を、ＧＡＴＡ−１／Ｃｒｅマウスと交配して、生殖細胞系列中のＰＧＫ−Ｎｅｏ遺伝子を除去した（Ｍａｏら、（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６，５０３７−４２）。これらのＰＧＫ−ＮｅｏマイナスのＨＲＩ＋／−ヘテロ接合体を、雑種交配して、ＨＲＩ−／−ホモ接合体を作製した。遺伝子型決定を、テイルＤＮＡのＰＣＲによって実施した。２つのＰＣＲ反応を実施して、遺伝子型を決定した。図２に示されるように、ＰＣＲ反応１を、プライマー１（５’ＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴＡ３’）（配列番号２）およびプライマー２（５’ＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴ３’）（配列番号３）を使用して実施し、そしてＰＣＲ反応２を、プライマー１およびプライマー３（５’ＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＡＡＡＴＡＧＴ３’）（配列番号４）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）、５ｐｍｏｌの各プライマー、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、および４００ＭのｄＮＴＰを使用する、９５℃で２分間の変性、その後の、３０サイクルの増幅（９５℃で１分間変性、６０℃で１分間アニーリング、そして７２℃で２分間の伸長）、および引き続く７２℃で１０分間の伸長であった。
【００４１】
このようなキメラマウス、ヘテロ接合体（ＨＲＩ−／＋）および／またはホモ接合体（ＨＲＩ−／−）は、ＨＲＩ活性に影響を与える化合物をスクリーニングする際に使用される、有用な動物モデル系である。
【００４２】
（マウスＨＲＩ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＨＲＩノックアウトマウスの表現型の特徴付けのために、マウスＨＲＩ  ｃＤＮＡを、マウス赤白血（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ）細胞（ＭＥＬ）からクローニングした。ＤＭＳＯ誘導されたＭＥＬ細胞のλｇｔｌｌ  ｃＤＮＡライブラリー（Ａｎｄｒｅｗｓら、（１９９３ａ）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，７２２−７２８）を、ウサギＨＲＩ  ｃＤＮＡの全コード配列を用いて、スクリーニングした（Ｃｈｅｎら、１９９１ｂ）。いくつかのポジティブクローンを単離し、そして最も長い部分的マウスＨＲＩ  ｃＤＮＡを、組換えλファージＤＮＡ（クローン１３）から、ＰＣＲによって増幅した。クローン１３のヌクレオチド配列は、アミノ酸３９１〜６１９をコードする配列＋３’ＵＴＲの６７５ヌクレオチドを含む。全長マウスＨＲＩ  ｃＤＮＡを獲得するために、マウスＥＳＴデータベースを、クローン１３の５’側上流のＨＲＩ配列について検索した。マウス筋細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＡＡ６９２３８４）由来の第一の開始メチオニンを含むＥＳＴ配列を見出した。次いで、マウスＮ末端ＨＲＩ  ｃＤＮＡ配列を、ＨＲＩ  ｃＤＮＡの５’側の二次構造を克服するための、ＰＣＲ反応中の１０％ＤＭＳＯと共に、第一ＡＴＧの直前の配列を有する５’プライマー（５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＡＣ  ＧＧＣ  Ａ３’）（配列番号５）およびクローン１３の５’配列由来のプライマー（５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣ  ＴＧＧＣＣＡＴＡＡＣＡＴＡＧ  ３’）（配列番号６）を使用するＰＣＲによって、ＭＥＬ  ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲに使用したＭＥＬ  ｃＤＮＡテンプレートを、ＨＲＩ特異的プライマー（ＨＲＩ  ３’プライマー）を用いて、ＤＭＳＯ誘導したＭＥＬ細胞のｍＲＭＡから逆転写した。構築された全長マウスＨＲＩ  ｃＤＮＡは、６１９アミノ酸をコードし、そしてウサギＨＲＩに対する高い相同性（８２％）を示す。
【００４３】
（抗ＨＲＩポリクローナル抗体の産生）
マウスＨＲＩのＮ末端配列およびキナーゼ挿入配列に対する抗体を、産生して、ＨＲＩノックアウトマウスを特徴付けするのを助けた。マウスＮ末端１３９アミノ酸およびキナーゼ挿入配列（アミノ酸２４１−４０５）を、ｐＥＴ  ２８ａベクターにサブクローニングして、精製を容易にするためのＮ末端（Ｈｉｓ）６タグおよびＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有する融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１細胞において発現させた。Ｈｉｓタグ化Ｎ末端およびＫＩを、Ｎｉ＋＋アガロースカラムで精製した。この精製タンパク質のＨｉｓタグを、ＴＥＶプロテアーゼにより除去し、次いでＨＲＩドメインを使用して、ウサギを免疫した。これらの抗体を、ＨＴＩ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）により調製した。
【００４４】
（マウス網状赤血球の産生、タンパク質合成、プロテインキナーゼアッセイおよびウエスタンブロット分析）
マウスに、フェニルヒドラジンを４０ｍｇ／ｋｇで、０、１および３日目に注射して、溶血、およびその後の赤血球生成および網状赤血球の血流への放出を誘導した。血液サンプルを、心臓穿刺によって７日目に収集し、この時点で、網状赤血球数は、８５〜９５％であった。網状赤血球を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（５ｍＭのグルコースを補充）で２回洗浄した。タンパク質合成アッセイについて、網状赤血球を、ＤＭＥＭ（２×１０８細胞／ｍｌ）（１／１０の濃度のメチオニンおよび２％の透析ウシ胎仔血清を含む）に再懸濁し、そして３７℃で３０分間、回復のために予めインキュベートした。次いで、網状赤血球を、示されるように、ヘミン（４０μＭ）またはシクロへキシミド（２μＭ）で処理し、そして［３５Ｓ］−メチオニン（５μＣｉ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。２００μｌの細胞懸濁液を、ＳＤＳ−サンプル緩衝液（ＥＤＴＡ（１ｍＭ）およびＮａＦ（５０ｍＭ）を含む）中で溶解し、ＨＲＩおよびｅＩＦ２ａＰのさらなるリン酸化または脱リン酸化を防止した。グロビン鎖および他のタンパク質中の［３５Ｓ］−メチオニンの組み込みを、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いて、ニトロセルロース膜に移した。網状赤血球におけるタンパク質合成を、グロビン鎖を含むニトロセルロースストリップのシンチレーションカウンティングによって定量した。単離された網状赤血球中のＨＲＩおよびｅＩＦ２ａのリン酸化を、ウエスタンブロット分析、続く、それぞれ、７５％および１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。基質として内在性ｅＩＦ２を使用するインビトロプロテインキナーゼアッセイを、Ｃｈｅｎら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，９５５９−９５６４により記載されるようにして行った。
【００４５】
（食餌誘導性鉄欠乏症ならびに血液学的分析および病理学的分析］
鉄欠乏症の状態を、離乳後の新生マウスに、５ｐｐｍのＦｅを含有する低鉄食餌を与えることによって誘導した。同腹子の何匹かに、コントロールとして１９６ｐｐｍのＦｅを含有する通常の食餌を与えた。各性別の４〜６匹のマウスを、４つのグループの各々に使用し、Ｗｔマウスには正常な食餌を、Ｗｔには、鉄欠乏食餌を、ノックアウトマウス（Ｋｏ）には正常な食餌を、Ｋｏには鉄欠乏食餌を与えた。尾静脈から収集した末梢血の血液学的分析を、Ｈｅｍａｖｅｔ（８００機器（ＣＤＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．））を使用する、ＭＩＴのＤｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって、二週毎に実施した。
【００４６】
末梢血の細胞形態を、血液スメアのＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色によって試験した。網状赤血球数を、新たなメチレンブルーで染色したスメアについて、記載されるようにして、手動で計数した（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．（１９８３）．Ｈｅｉｎｚ  ｂｏｄｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｂｌｏｏｄ，ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．，Ｅｒｓｌｅｖ，Ａ．Ｊ．、およびＬｉｃｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．編：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  ｃｏｍｐａｎｙ，ｐｐ．１６０３−１６０４）。血液サンプル中のハインツ体を、生きた細胞をクリスタルバイオレットで染色することによって決定した（Ｂｅｕｔｌｅｒ，１９８３）。組織を、ホルマリンに固定し、そしてＭＩＴ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる標準的な手順を使用して、パラフィン包埋および断片化のために処理した。電子顕微鏡検査を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける標準的な方法を使用して、Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ固定ＥＤＴＡ抗凝固血液に実施した。
【００４７】
（結果）
（マウスＨＲＩ遺伝子のクローニングおよびＨＲＩ−／−マウスの生成）
１９ｋｂのマウスゲノムＤＮＡフラグメントを、ウサギＨＩＲ  ｃＤＮＡをプローブとして使用して、ファージライブラリーからクローニングした（Ａ）ＨＲＩ野生型遺伝子座（上）、標的化構築物（中央）、ならびにネオマイシン耐性遺伝子のＣｒｅ媒介性の切り出しの前後のＨＲＩ遺伝子座での標的化相同組換え（下））。ＨＲＩ遺伝子座中に３つのエキソン（塗りつぶされた長方形で示される）を含む５ＫＢのＤＮＡフラグメントを、ネガティブ選択マーカーとしてＨＳＶ−ＴＫも有する標的化構築物中のＰＧＫ−ｎｅｏで置換した。標的化破壊マウスの遺伝子型決定を、ＰＣＲによって実施した。これらのプライマーは、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３として示される。Ｐ１およびＰ２を、６２５ｂｐのＨＲＩ＋／＋ＤＮＡの増幅のために使用した。Ｐ１およびＰ３を、約１０００ｂｐのＨＲＩ−／−ＤＮＡの増幅のために使用した。ＰＣＲ反応を、両方のセットのプライマーについて別々に行い、そして同じマウスのＤＮＡについての両方の反応のＰＣＲ産物を、一緒に電気泳動した。
【００４８】
総ＲＮＡを、ＨＲＩ＋／＋およびＨＲＩ−／−の胚のＥ２０の胎児肝臓から単離した。ＨＲＩ  ｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ＨＲＩタンパク質の既知の構成に基づいて、このゲノムフラグメントは、マウスＨＲＩ遺伝子の５つのエキソンを含む。これらのエキソンは、キナーゼドメインＶＩａ〜ＸＩおよび全Ｃ末端を有する、ＨＲＩの第二の保存されたキナーゼ葉（ｌｏｂｅ）をコードする。ＨＲＩ遺伝子は、マウス第５染色体の非常に遠位の端部（これは、ヒト染色体７ｐ１３ｑに対応する）にマッピングされた。ヒトゲノムのデータベース検索は、ＨＲＩ遺伝子の位置を確認した。これまで、これらの染色体遺伝子座と連鎖したヒトまたはマウスの疾患は知られていない。この標的化構築物を、キナーゼ触媒ドメインＶＩｂ〜Ｘをコードする３つのエキソンを含む５ｋｂのＤＮＡセグメントを、ホスホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＰＧＫ−Ｎｅｏ）で置換することによって、調製した。これら３つのエキソンは、ＨＲＩのキナーゼ活性に必須の領域をコードするので、欠失させた。従って、この内部欠失を有するＨＲＩタンパク質が、標的化ＨＲＩ遺伝子から生成される場合、このタンパク質は、不活性である。マウスＨＲＩ遺伝子の正確な標的化を、テイルＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した。
【００４９】
ＨＲＩ−／−マウスは、生存可能かつ繁殖可能であり、巨視的な形態学的異常を有さない。表現型をさらに特徴付ける前に、ＨＲＩ  ｍＲＮＡを、１９．５日齢の胚の肝臓から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって、＋／＋マウスおよび−／−マウスにおいて試験した。＋／＋胎児肝臓由来のＲＮＡは、全コード配列を含む、診断的な１８６７ｂｐのＤＮＡフラグメントを生じた。−／−胎児肝臓由来のＲＮＡは、標的化ＨＲＩ遺伝子の３つの欠失されたエキソンにわたる、ｍＲＮＡの正確なスプライシングを有する、１４６３ｂｐの予測サイズの、より小さいＤＮＡフラグメントを生じた。ＨＲＩタンパク質は、赤血球系統中で優勢に、そして網状赤血球において最も豊富に発現されるので、＋／＋マウス、＋／−マウスおよび−／−マウスの網状赤血球におけるＨＲＩタンパク質の発現を、マウスＨＲＩのＮ末端の１３８アミノ酸（そのコードエキソンは、ゲノム標的化によって除去されていない）に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析によって試験した。ＨＲＩ＋／＋マウス、ＨＲＩ＋／−マウスおよびＨＲＩ−／−マウスの１×１０６個の網状赤血球の溶解物におけるＨＲＩタンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって試験した。網状赤血球溶解物におけるＨＲＩのＩＦ２αキナーゼ活性を、インビトロのプロテインキナーゼアッセイを使用して決定した。ｅＩＦ２αリン酸化の程度を、リン酸化ｅＩＦ２αに特異的な抗体を使用するウエスタンブロット分析によって決定した。タンパク質合成を、等価なＨＲＩ＋／＋またはＨＲＩ−／−の網状赤血球（２×１０８個の網状赤血球／ｍｌ）を、［３５Ｓ］−メチオニンで９０分間標識することによって実施した。サンプル（３×１０５個の網状赤血球）を、１５分毎に採取して、タンパク質合成およびｅＩＦ２αリン酸化の速度を、示されるように分析した。ＨＲＩ＋／＋網状赤血球におけるグロビン合成、およびＨＲＩ−／−網状赤血球におけるヘム依存性のグロビン合成の損失を、測定した。ＨＲＩ＋／＋マウスおよびＨＲＩ−／−マウス由来の網状赤血球を、ヘミン（Ｈ）またはシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下で、［３５Ｓ］−メチオニンと共に９０分間インキュベートした。「Ｃ」は、未処置のコントロール網状赤血球を示す。サンプルを、３０分毎に採取し、グロビン合成の速度について分析した。
【００５０】
ＨＲＩタンパク質は、＋／＋マウスおよびヘテロ接合体マウスにおいて検出されたが、−／−ホモ接合体では検出されなかった（図３）。これらのデータは、標的化遺伝子によってコードされる短縮型ＨＲＩタンパク質が不安定であることを示唆し、そしてＨＲＩヌルマウスが獲得されたことを実証する。
【００５１】
（ストレスの非存在下での、別の点では正常なＨＲＩ−／−マウスにおける弱い大赤血球症および血色素増加症）
ストレスの非存在下では、ＨＲＩ−／−マウスの血液学的パラメータには、最小の異常しか検出されなかった。平均赤血球容積（ＭＣＶ）における僅かな増加が存在し、これには、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）の中程度ではあるが有意な増加が伴った（図４）。赤血球１個当たりのヘモグロビン濃度は、正常には密に調節されるので、血色素増加症と称される、上昇したＭＣＨの例は、ヒトにおいても他の哺乳動物においても報告されていない。ハインツ小体を含む赤血球の数の増加がまた、ＨＲＩ−／−マウスにおいて存在した（以下を参照のこと）。
【００５２】
（ＨＲＩ−／−網状赤血球における、インビボでのｅＩＦ２＿リン酸化の顕著な減少）
ＨＲＩは、網状赤血球および有核赤血球前駆体における優勢なｅＩＦ２＿キナーゼであるが、一方で、他の遍在性ｅＩＦ２αキナーゼ（例えば、ＰＫＲ）は、ＨＲＩ−／−マウスにおいてＨＲＩを置換し得る。ｅＩＦ２αリン酸化の程度を、リン酸化ｅＩＦ２に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットによって決定した（ＤｅＧｒａｃｉａら、（１９９７）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．１７，１２９１−１３０２）。インタクトな網状赤血球におけるｅＩＦ２αリン酸化のレベルは、ＨＲＩ＋／＋マウスと比較して、ＨＲＩ−／−ホモ接合体マウスにおいて劇的に減少した（図２Ｂ）が、全体的なｅＩＦ−２αタンパク質レベルは、有意には変更されなかった。ＨＲＩ−／−網状赤血球における低レベルのｅＩＦ２のリン酸化は、ウサギ網状赤血球中に存在することが公知である他のｅＩＦ２（ＰＫＲのようなキナーゼ）に由来する（Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．，Ｂａｌｋｏｗ，Ｋ．，Ｈｕｎｔ，Ｔ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｒａｃｈｓｏ，Ｈ．（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１，１８７−２００）。インビトロでのＨＲＩ活性を評価するために、ｅＩＦ２αリン酸化アッセイを、基質として内因性ｅＩＦ２を使用して、過剰な外因性ＡＴＰの存在下で、網状赤血球溶解物を用いて実施した。インビトロのｅＩＦ２αリン酸化は、＋／＋マウスα由来の網状赤血球溶解物中で生じ、そして＋／−ヘテロ接合体のαにおいては、より低い程度まで生じた。対照的に、ＨＲＩ−／−マウスの網状赤血球溶解物中では、ｅＩＦ２のリン酸化はほとんど検出されなかった。これらのデータは、これらの実験条件下で網状赤血球において通常見出されるｅＩＦ２キナーゼ活性のほとんどが、ＨＲＩ−／−マウスにおいて排除され、そして他のｅＩＦ２αキナーゼが、網状赤血球におけるＨＲＩ機能の喪失を補償することができないことを示す。従って、ＨＲＩ活性の誘導、抑制または減弱は、容易にアッセイされ得る。
【００５３】
（ＨＲＩ−／−網状赤血球におけるタンパク質合成の増加およびヘムによる調節の消滅）
ＨＲＩは、タンパク質合成のインヒビターであるので、ＨＲＩ＋／＋マウスおよびＨＲＩ−／−マウスの単離されたインタクトな網状赤血球におけるタンパク質合成速度を、新たに翻訳されたタンパク質への［３５Ｓ］−メチオニンの取り込みを測定することによって試験した。＋／＋マウスと比較して、全てのタンパク質について全体的に見られたタンパク質合成速度の顕著な増加が存在した。
【００５４】
この観察は、ｅＩＦ２が基本的翻訳因子であるという現在の知見と一致する。しかし、この効果は、αグロビンおよびβグロビンの両方（これらは、網状赤血球において最も豊富に発現されるタンパク質である）について最も顕著であった。グロビン鎖における［３５Ｓ］−メチオニンの取り込みの量は、ＨＲＩ＋／＋マウス由来の網状赤血球と比較して、ＨＲＩ−／−網状赤血球における、グロビン合成の７倍の増加が存在することを示した。
【００５５】
次いで、ＨＲＩ＋／＋網状赤血球およびＨＲＩ−／−網状赤血球におけるタンパク質合成に対するヘムの影響を試験した。グロビンへの［３５Ｓ］−メチオニンの取り込みは、［３５Ｓ］−メチオニンの添加前の、３０分間の４０＿Ｍのヘミンを用いた＋／＋網状赤血球の前処理によって、コントロールの２０８％まで増加した。ＷｔおよびＨＲＩ−／−の両方の網状赤血球のタンパク質合成は、シクロヘキシミド（これは、翻訳の伸長を阻害し、ＨＲＩに非依存的である）によって同様に十分に阻害された。対照的に、ＨＲＩ−／−網状赤血球におけるタンパク質合成は、ヘミンの添加によって影響を受けなかった。
【００５６】
合わせて考えると、これらの結果は、ＨＲＩの非存在下において、網状赤血球におけるタンパク質合成の一定状態のレベルが、過剰なαグロビン鎖およびβグロビン鎖（これらの細胞において翻訳される最も豊富なタンパク質）の蓄積に対する主な影響を伴って、ヘム非依存的な様式でかなり増加したことを示す。
【００５７】
（食餌誘導性の鉄欠乏に対する、ＨＲＩ−／−マウスの血液学的応答の変更：赤血球過形成を伴う溶血性貧血）
上記のＨＲＩ−／−網状赤血球における顕著な生化学的変化は、ストレスの非存在下でのマウスの血液学における微小な変更と対照的である。ＨＲＩは、赤血球前駆体において翻訳を調節するヘムセンサーとして作用し得ると仮定されているので、ＨＲＩが活性化される条件下で、ＨＲＩ−／−マウスの表現型を、特にヘム欠乏において悪化させ得ると予測される。マウスを、長期の研究についてヘム欠乏にする選択肢は、限られている。マウス赤血球の寿命は、約４０〜５０日であるので（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｆｅｚｅｒら、（１９９３）Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．６７，８１−８７）、ヘム生合成経路のインヒビター（例えば、サクシニルアセトン）を用いたマウスの長期の処置は、副作用を引き起こし得、従って、所望されない。ヘムは、ヘム生合成の後期段階の間の、フェロケラターゼを介したプロトポルフィリンＩＸへの鉄の挿入によって合成されるので、ヘム欠乏を誘導するために、マウスを低鉄食餌にした。さらに、鉄欠乏は、ヒトおよび他の動物において見出される非常に一般的な状態であり、そして実際、ＨＲＩは、鉄欠乏の主な有害結果のいくつかから、赤血球を保護するために存在するといってよい。
【００５８】
鉄欠乏に対する正常な適応応答は、ヒトおよびマウスにおいて十分特徴付けられている。ＭＣＶおよびＭＣＨ疾患の両方が、赤血球計数における緩やかな減少を伴って、かなり減少し、古典的な小球性貧血（低いＭＣＶ）および低色素性貧血（低いヘモグロビン）を生じた（図４Ａ〜Ｄ、Ｗｔ−Ｆｅ）。ＨＲＩ−／−マウスにおいて、この鉄欠乏に対する生理学的応答は、劇的に変更された（図４Ａ〜Ｄ、Ｋｏ−Ｆｅ）。ＭＣＶは、正常な食餌のＨＲＩ−／−マウスと比較して、ほんの僅かしか減少しないが（図４Ａ〜Ｄ、Ｋｏ＋Ｆｅ）、正常な食餌のＷｔマウスとなお類似した（Ｗｔ＋Ｆｅ）。ＭＣＨは、正常食餌のＷｔマウスと比較して僅かに上昇したが、赤血球計数は、かなり減少し、赤血球計数の減少を伴う、非常に異常な高色素性の正球性貧血を生じた。上記のように、ＭＣＨの増加（血色素増加症）は、ヒトにおいてもマウスにおいても全く報告されてこなかった。正常な応答が、顕著な血色素減少症によって特徴づけられる場合に、鉄欠乏の設定において赤血球の色素増加症を観察するということは、なおさら驚くべきことである。鉄欠乏ＨＲＩ＋／＋マウスおよびＨＲＩ−／−マウス由来の脾臓の、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片を、４３日間の正常食餌および鉄欠乏食餌の両方の、ＷｔマウスおよびＨＲＩ−／−マウスの両方から分析した。末梢血スミアを、３３日間にわたって鉄欠乏食餌で維持したＨＲＩ＋／＋マウスおよび−／−マウスから調製した。Ｗｔ脾臓とＨＲＩ−／−脾臓と正常食餌の血液との間には、有意な差異は観察されなかった。低鉄食餌を受けて９２日後の、４つ全ての群のマウス由来の血液を収集し、そしてハインツ小体の存在について、クリスタルバイオレットで染色した。
【００５９】
高色素性ＲＢＣにもかかわらず、鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスは、顕著なＲＢＣ数の減少に起因して、貧血性である。この特徴を調査するために、ＲＢＣ数の減少が、減少さした赤血球生成によって引き起こされたのか、増加した赤血球破壊によって引き起こされたのかを決定した。ＨＲＩ−／−マウスの脾臓は、鉄欠乏のＨＲＩ−／−マウスの網状赤血球における封入体の電子顕微鏡試験によって示されるように、食餌誘導性の鉄欠乏を有する＋／＋マウスおよび有さない＋／＋マウスの両方よりも、低鉄食餌の８１日目にて、平均して１０倍大きかった。低鉄食餌を受けて５９日後の、４つ全ての群のマウス由来の血液を収集し、そしてＥＭについて処理した。封入体は、他の群の血液サンプル中には観察されなかった。鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスの骨髄および脾臓の組織切片は、脾臓および骨髄の両方における赤血球前駆体による、赤色脾髄の顕著な拡大を示した。さらに、網状赤血球計数は、正常食餌（８．６％）および鉄欠乏食餌（１１．５％）の両方のＨＲＩ−／−マウスにおいて、正常または鉄欠乏の食餌のいずれのＨＲＩ＋／＋マウス（２．３％）と比較しても、上昇した。
【００６０】
正常食餌および鉄欠乏食餌のＨＲＩ＋／＋マウスおよび−／−マウスの両方由来のＲＢＣの半減期を、（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９１）．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ，Ｈ．Ｔｒａｃｈｓｅｌ編（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｂａｋｅｒら、（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５６，１７−２５）に記載されるような尾部静脈注射によって、ビオチンでのＲＢＣのインビボでの標識によって試験した。正常食餌または鉄欠乏食餌のいずれかの、ＷｔマウスおよびＨＲＩ−／−マウス由来のＲＢＣの生存において、明らかな差異は存在しない。ＲＢＣの半減期は、約２２日であり、他の公開された結果（Ｌｅｖｉｎ，１９９９）とよく一致している。全てのこれらの特徴は、赤血球計数におけるかなりの減少が、造血器官の補償的過形成を伴う、赤血球前駆体の異常な破壊によって引き起こされたことを示す。同様の血液学的変化が、１７〜８４日日間の低鉄食餌で継続的に試験した全ての動物において見出された。血小板計数には、差異は観察されなかった。他の組織の一般的な病理学的調査は、４３〜８４日間の低鉄食餌においた−／−マウスと＋／＋マウスとの間に、有意な形態学的差異を明らかにしなかった。ＨＲＩ−／−マウスの心臓は、Ｗｔ＋Ｆｅマウス、Ｗｔ−ＦｅマウスまたはＫｏ＋Ｆｅマウスと比較して、鉄欠乏マウスにおいて、約５０％拡大した。この心臓肥大は、ＨＲＩが心臓において発現されないという事実を考慮して、貧血に対する二次的応答である可能性が最も高い。
【００６１】
これらの知見は、ＨＲＩ−／−マウスは、赤血球体積および細胞内ヘモグロビン含量の適合性減少から、代償性造血過形成を伴う異常に濃い赤血球の生成増加へとシフトすることによって、食餌誘導性鉄欠乏症に対する正常応答が劇的に変化し、その後、ヘム欠乏症が劇的に変化したことを示す。
【００６２】
（鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスの赤血球における非結合グロビンの沈殿）
その後、ＨＲＩ−／−ＲＢＣの異常な密度についての分子的基礎を試験した。ライト−ギームザ染色した血液塗抹を光学顕微鏡下で試験すると、鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスにおいて、網状赤血球内に、そしてそれよりもわずかな程度、完全成熟ＲＢＣ内に、複数の種々のサイズの好酸球封入物が存在することが示された。これらの封入物は、＋／＋マウスのＲＢＣにおいて識別可能ではない。血液塗抹をクリスタルバイオレットで染色した際、ハインツ体に類似する顆粒体が、鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウス由来のＲＢＣのうち８０％において観察された。ハインツ体はまた、よりわずかな程度（９．６％）ではあるが、正常な食餌を摂取したＨＲＩ−／−マウス由来の血液サンプルにおいても観察された。対照的に、正常な食餌または低鉄食餌のいずれかを摂取した＋／＋マウス由来のＲＢＣは、ハインツ体を含まなかった。ハインツ体は、不安定ヘモグロビン症候群であるヒト患者由来のＲＢＣ、ヘキソース一リン酸短絡の遺伝子欠損を有するヒト患者由来のＲＢＣ、サラセミアであるヒト患者由来のＲＢＣ、および種々の化学物質（特に酸化剤）傷害を有するヒト患者由来のＲＢＣにおいて、広範に特徴付けられている。全ての場合において、ハインツ体は、変性タンパク質（主に、グロビン）から構成されている（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．（１９８３）Ｈｅｉｎｚ  ｂｏｄｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ；Ｂｌｏｏｄ，ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）。
【００６３】
Ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｊ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．，Ｅｒｓｌｅｖ，Ａ．Ｊ．，およびＬｉｃｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，編：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  ｃｏｍｐａｎｙ），第ｌ６０３頁−第１６０４頁）。ＨＲＩ−／−マウスの網状赤血球において見出される好酸性封入体をさらに特徴付けるために、血球を、透過型電子顕微鏡によって試験した。封入体は、電子密度が一様であり、膜に結合しなかった。同様の封入物は、サラセミアを罹患する患者に存在する（Ｐｏｌｌｉａｃｋら、（１９７３）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔ．２４，３１９−３２６；Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅら、（１９８４）Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ５６，４７３−４８２；Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅら、（１９７５）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔ．３０，３９５−３９９；Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅら、（１９８０）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔ．４５，４０１−４０４）。これらの場合において、封入物は、α−サラセミアまたはα’−サラセミアにおいて、
【００６４】
【数１】
2005511085.tif 000003
を含むことが示された（Ｈｏら、（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ８９，３２２−３２８；Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅら、（１９９６）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍｏｔ．９３，５７６−５８）。ヘム組込みを減少する変異によって引き起こされる不安定なヘモグロビンの研究（Ｄａｃｉｅら、（１９６７）Ｎａｔｕｒｅ  ２１６，６６３−５；Ｗａｊｃｍａｎら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１３８，１２７−３２）から、そして生化学的研究（Ｗａｋｓら、（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４８，６４６２−６４７０；Ｙｉｐら、（１９７２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７，７２３７−７２４４）から、グロビンが、ミスフォールドし、ヘムへの適切な結合の非存在下で沈殿することが良好に記載される。封入物を有するＲＢＣおよび後期赤血球前駆体は、破壊に対してより感受性であることもまた十分に確立されている。従って、データは、ＨＲＩの非存在下での、ＲＢＣおよびこれらの後期前駆体内のグロビン欠損ヘム沈殿が、これらの破壊を生じるという仮説と一致する。
【００６５】
（溶血性試薬に対するＨＲＩ−／−−ＲＢＣの感受性の増加）
鉄欠乏症の状態は、ヒトにおいて非常に一般的であり続けた。従って、ＲＢＣをより脆弱にする状況に曝露することは、鉄欠乏症（例えば、サラセミア、鎌状赤血球症、マラリアおよび他の感染症、極限気候条件、天然毒素、重金属または薬物の摂取）と同時に生じ得る。従って、ＨＲＩ−／−マウスが、正常なマウスより溶血性薬剤に対してより感受性であるかどうかを調査した。図５は、フェニルヒドラジン誘導性溶血におけるＨＲＩ−／−の生存の減少を示す。ＷｔマウスおよびＨＲＩ−／−マウスの両方に、フェニルヒドラジンを示された投薬量で、第０日、第１日および第３日に注射した。マウスを毎日観察した。図５Ａは、最初のフェニルヒドラジン注射の６日後の種々の投与量での生存％を示す。各遺伝子型の６匹のマウスを、投与用量について使用した。図５Ｂは、鉄を欠乏するＷｔマウスおよびＨＲＩ−／−マウスの５０ｍｇ／Ｋｇの投与量での生存の時間経過を示す（ｗｔマウスについてｎ＝１２；ＨＲＩ−／−マウスについてｎ＝１１）。図５Ａに示されるように、フェニルヒドラジン誘導溶血赤血球ストレスに対する鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスの生存率は、劇的に減少する。標準フェニルヒドラジンレジメンは、第０日、第１日および第３日でのフェニルヒドラジンの３回の注射を使用する。２回の注射後、９０％の鉄欠乏ＨＲＩ−／−マウスは死亡し、対照的に、鉄欠乏症を有するＷｔマウスのほぼ１００％は生存した。鉄誘導ヘム欠損症の非存在下でさえ、ＨＲＩ−／−マウスは、既に、５５ｍｇ／野生型マウスのＫｇに比べて、フェニルヒドラジンに対して５０ｍｇ／ＫｇのＩＣ５０でより感受性であった（図５Ｂ）。従って、ＨＲＩ−／−ＲＢＣが、鉄欠損飼料に対して正常な半減期を有するが、これらのＲＢＣは、フェニルヒドラジンの投与によって誘導される酸化的ストレスのようなさらなるストレスに対して、さらにより感受性である。この発見は、ＨＲＩが、特に、さらなるストレスと一緒の鉄欠乏症の合わせた攻撃の間、成熟赤血球の完全性を維持することにおける保護的役割を提供することを示す。従って、ＨＲＩが、成熟赤血球中でもはや発現されないが、赤血球分化の間のその効果は、成熟ＲＢＣに持続する。集合的に、これらの発見は、低鉄分飼料に対してＨＲＩ−／−マウスにおいて見られる細胞破壊の増加が、ヘムに結合されないグロビン鎖の過剰な蓄積および沈殿によって引き起こされることを強く示唆する。ＨＲＩの欠損は、ヘム濃度が減少する場合において発揮されるグロビン翻訳に対する正常な負の制御を和らげる。さらに、ＨＲＩの非存在下において、ＲＢＣは、特に鉄欠乏症において、溶血性薬剤に対してさらにより感受性になる。
【００６６】
本明細書中に示される結果は、ＨＲＩ遺伝子の標的化された破壊を有するマウスの表現型を分析することによってＨＲＩの明確な生理学的機能を同定する。ヌルＨＲＩ表現型を有するマウスの産生を、ウェスタンブロット分析による検出可能なＨＲＩタンパク質の非存在およびＨＲＩ−／−同型接合体の網状赤血球におけるデノボｅＩＦ２αリン酸化の顕著な減少によって示した。ＨＲＩが、赤血球において利用可能なヘムを用いるαグロビンおよびα’グロビンの合成のバランスをとるために必須であることを示す。赤血球において優先的に発現されるタンパク質から予想されるように、ＲＢＣおよびこれらの前駆体のみが、ＨＲＩの欠損によって直接影響を受けることが見出された。
【００６７】
本出願人らの発見は、図５に示されるモデルにおいて要約される。ヘムは、赤血球の発達のために必須である（Ｓａｓｓａ，Ｓ．（１９８８）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２５，３１２−３２０；Ｆｕｋｕｄａら、１９９４；Ｎａｋａｊｉｍａら、（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １８，６２８２−６２８９に概説される）。１分子のヘムは、安定なヘモグロビンテトラマーの形成において、αグロビン鎖およびα’グロビン鎖の各々に組込まれる。ＨＲＩは、ヘムを検知することによってグロビン合成のフィードバックインヒビターとして役に立つ。ヘムが、ＨＲＩのキナーゼ挿入ドメインに結合し、自己リン酸化によってその活性化を阻害する。一旦ＨＲＩが活性化されると、これは、ｅＩＦ−２をリン酸化し、そして別のラウンドのタンパク質合成に対するその再生を阻害する。以前の生化学的研究（Ｃｈｅｎ，２０００に概説される）に一致して、ヘムに対して非感受性にもなるタンパク質合成の７倍増加を、ｅＩＦ−２αリン酸化の対応する減少を有するＨＲＩ−／−マウスの網状赤血球において観察した。
【００６８】
図６Ａおよび６Ｂは、赤血球分化の間のＨＲＩの役割のモデルの概略図である。図６ＡはＨＲＩおよびヘムによるαグロビン合成およびβグロビン合成の制御を示す。図６Ｂは、鉄欠乏に対するＨＲＩ−／−マウスの改変血液学的応答を示す。図７Ｂに示されるように、ストレスの無いＨＲＩ−／−マウスにおいて観察されるＲＢＣの穏やかな改変は、ヘムの細胞内濃度を低下させる、食餌誘導鉄欠乏の条件下において深刻になった。小血性貧血および低色性貧血により特徴付けられる、鉄欠乏に対する野生型マウスの正常な血液学的応答は、後期赤血球前駆体および代償赤血球増殖の破壊の増加と共に高色素性貧血および溶血性貧血に転換した。成熟赤血球の破壊は、溶血薬の存在において悪化した。それと共に、これらのデータは、グロビン鎖が、利用可能なヘムの量についてヘモグロビンテトラマーに会合され得る量を超えて翻訳されないことをＨＲＩは、正常に保証する、上記のモデルと一致する。従って、ＨＲＩの重要な役割は、鉄欠乏において一般的に見出されるように、ＲＢＣ前駆体中のヘム濃度が低下する場合のみ明らかになる。
【００６９】
（２つの弊害のうち軽い方：溶血性貧血でなくて小球性貧血）
ヘムは、全細胞の一般的な代謝において重要な役割を果たすが、特にヘモグロビンの生成についてのＲＢＣにおいて十分な役割を果たす。ヘムの生合成における制限された工程の１つは、酵素フェロケタラーゼによるプロトポルフィリンへの鉄の取り込みである。過剰な遊離鉄は、酸化性の特徴に起因して細胞に対して非常に毒性であるので、その腸管吸収は、厳重に制御され、鉄フェリチン複合体における組織の貯蔵は、制限される（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ．（２０００）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １，２０８−２１７に概説される）。鉄欠乏は、世界中で約２０億症例の発生率で非常に一般的である。これは、低鉄食品または失血の結果が最も多い。結果として、利用可能な鉄およびヘムが特定の閾値より低下する場合、低下したヘモグロビンテトラマー生成による貧血の発生率は、避けられない。しかし、このデータは、ＨＲＩの非存在下における鉄欠乏の結果がＨＲＩの存在下よりももっと有害であることを示す。これらの発見は、最少の有害な順応性応答がグロビン生成を低下させ、その結果、グロビン翻訳を続けることを可能にするのではなく穏やかな小球性貧血および低色性貧血を生じるという仮説に一致する。これが起こった場合、ＨＲＩ−／−マウスのように、遊離グロビン（ヘムに結合していない）は、沈殿し、そして重要な血液学的構成要素を貧血の病理生理学に追加する。小球症および低色素症は、ヒト医薬において同定される第１の生物学的徴候の１つであり、患者において見出される最も多い奇形の１つのままである。しかし、この現象についての分子機構は同定されていない。このデータは、ＨＲＩが、鉄欠乏に対してＲＢＣのこの生理学的適応を担うことを示す。さらに、ＲＢＣをより脆弱にする状況の発生は、サラセミア、鎌状赤血球症、不安定なヘモグロビン、マラリアおよび他の感染症、極端な気候条件、天然毒素、重金属または薬剤の摂取としてしばしば共存する。ＨＲＩの非存在下において、これらの状態の１つと鉄欠乏との組み合わせは、急速に命取りになり得る。
【００７０】
（基本的翻訳因子、ｅＩＦ−２によるグロビン遺伝子の発現の制御）
単一遺伝子の遺伝子発現の制御は、単離における遺伝子特異的シス作用性エレメントにおいてまたは因子の複合体の一部として作用する特定のトランス作用性因子を標的化する制御の形態を最も多く含む。従って、ヘムによるαグロビンおよびβグロビンの発現の制御が、基本的翻訳因子ｅＩＦ２に対して究極的に作用することは、驚くべきことであり得る。この場合、この特異性は、グロビンｍＲＮＡが、網状赤血球におけるタンパク質合成についてのはるかに主なテンプレートであるという事実に連関して、赤血球系統についてのセンサー／レギュレーターＨＲＩの発現の制限により達成される。グロビンタンパク質合成の少なくとも２５％が、核が突出した後に網状赤血球において生じるので、翻訳制御は残存する主なレベルの制御のままである（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｅ．（２００１）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ．  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  Ｅ．  Ｂｅｕｔｌｅｒら編：  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  ｃｏｍｐａｎｙ），ｐｐ．３５５−３６８）。
【００７１】
造血器官の過形成が鉄欠乏のＨＲＩ−／−マウスにおける加速度的な赤血球細胞破壊に対する代償性の反応であり得るが、これはまた、ＲＢＣ前駆体におけるＨＲＩの欠損により引き起こされる増殖性の影響または抗アポトーシスの影響に直接起因し得る。
【００７２】
レトロウイルス媒介性遺伝子転移によるマウス赤白血症（ＭＥＬ）細胞におけるドミナントネガティブ変異体の過発現は、ジメチルスルホキシドによる末端分化の誘導の際に、これらの細胞の増殖能力を増加させることが示されている（Ｃｒｏｓｂｙら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６、３２４１−３２４７）。
【００７３】
（環境ストレスを防ぐ特異的なセンサーおよびエフェクターとしてのｅＩＦ２α）
ＨＲＩに加えて、３つの他のｅＩＦ２ａキナーゼ（ＰＫＲ、ＧＣＮ２およびＰＥＲＫ）が、哺乳動物細胞において発見されている。節食が誘導する鉄欠乏の状態下で明らかにされるマウスＨＲＩ遺伝子の破壊の病理学的結果であるこの観察は、全てのｅＩＦ２αキナーゼが、種々のストレス状態下で活性化されるという事実に一致する。遍在するキナーゼＰＲＫについてヌルのマウスはまた、ウイルス感染にチャレンジされるまで、有意な表現型の変化無しに生存する［Ｙａｎｇ、１９９５＃１３２０；（Ａｂｒａｈａｍら、（１９９９）ＰＫＲ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４、５９５３−５９６２；Ｓｔｏｊｄｌら、（２０００）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４、９５８０−９５８５）］。酵母において、ＧＣＮ２は、最適な増殖条件下で必須ではない（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ、１９９６）。従って、キナーゼのこのクラスのメンバーの生理学的役割は、特異的な外因性のシグナルに応答してタンパク質合成を最終的に調節することによって、主要な環境ストレスに対して恒常性を守るもの（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｇｕａｒｄｉａｎ）として働くことであり得る。
【００７４】
これらの知見は、ＨＲＩがインビボでのヘムの濃度に対して赤血球前駆体におけるグロビンの合成を調整することによる分子機構に関する重要な見識を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、１１個のドメイン、ＨＲＩ特異的挿入領域および、以前に配列決定されＨＲＩに特有であると同定された以下の３個のペプチドの位置を示すＨＲＩ  ｃＤＮＡの概略図である：Ｐ−５２（アミノ酸４５４−４６７に対応、Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙを含む、これはプロテインキナーゼの触媒ドメインＶＩＩにおける最も高度に保存された短いストレッチである）；Ｐ−７４（アミノ酸５０６−５２５に対応、プロテインキナーゼの触媒ドメインＩＸにおいて見出される保存されたアミノ酸残基Ａｓｐ−（Ｍｅｔ）−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−（Ｖａｌ）−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号１）を含む）：およびＰ−５６（アミノ酸１６６−１７８に対応、米国特許第５，５２５，５１３号（Ｃｈｅｎら）において示される）。
【図２】図２は、ＨＲＩ遺伝子の標的化された破壊の概略図である：上は、ＨＲＩ野生型遺伝子座であり；真ん中は、標的化構築物であり；そして下は、ネオマイシン耐性遺伝子のＣｒｅ媒介性切除の前および後のＨＲＩ遺伝子座の標的化された相同組換えである。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ヘム（Ｈ）またはシクロへキシミド（ＣＨＸ）およびコントロール（Ｃ）の未処置の網状赤血球の存在下における、時間（分）に対する、ＨＲＩ−／−網状赤血球におけるヘム依存性グロビン合成の減少のグラフである。サンプルを、３０分ごとに採取して、グロビン合成について分析した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、鉄欠乏症のＨＲＩ＋／＋マウスの血液学的分析を示すグラフである。ＲＢＣ数および赤血球細胞指数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＨｂおよびＨＣＴは、尾静脈から収集した血液から得た。１７日目〜８４日目までのこれらの変化の時間経過を示す。４〜６匹のマウスを、各グループに使用した。ＭＣＶ数およびＭＣＨ数よびＲＢＣ数における差異は、低鉄食餌（これら３つの全てのパラメーターについて、ｐ＝０．００１）に対して統計学的に有意である。
【図５】図５は、フェニルヒドラジン誘導性溶血のＨＲ−／−マウスの減少した生存率のグラフ（図５Ａ）、および最初のフェニルヒドラジン注射の６日後の、異なる投薬量における生存率％のグラフである（図５Ｂ）。
【図６】図６は、赤血球分化の間のＨＲＩの役割のモデルの概略図である。図６Ａは、ＨＲＩおよびヘムによるαグロビン合成およびβグロビン合成の調節を示す。図６Ｂは、鉄欠乏に対するＨＲＩ−／−マウスの変更された血液学的応答を示す。
【配列表】
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2005511085.tif 000005
【図１】
2005511085.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005511085.tif 000010
【図６】
2005511085.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月9日(2004.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005511085000001.app
【国際調査報告】
2005511085.tif 000012
2005511085.tif 000013
2005511085.tif 000014