(57)【要約】本発明は、コネキシン43（Cx43）タンパク質のようなコネキシンタンパク質を発現するように遺伝子操作された心筋細胞と組換え細胞との間の電気的カップリングを確立するための方法を提供する。本発明は、組換えコネキシンを発現する骨格筋細胞の遺伝的改変が、その遺伝的に改変された細胞にギャップジャンクションを介する心筋細胞との電気的コミュニケーションを確立することを可能にするという知見に基づく。この組換えコネキシン発現細胞は、心臓組織の修復および心臓組織への移植による心臓疾患の治療のために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え哺乳動物細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立するための方法であって、
心筋細胞を、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え哺乳動物細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立される段階を含む、方法。
【請求項２】
組換え細胞が、骨格筋細胞、幹細胞、線維芽細胞、および心臓細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組換え細胞が骨格筋細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
コネキシンタンパク質がコネキシン43タンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
接触させる段階が組換え細胞を被験体の心筋組織に移植する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立された後で、該組換え細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法であって、
心筋細胞を、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え骨格筋細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え骨格筋細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え骨格筋細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立される段階を含む、方法。
【請求項１０】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
骨格筋細胞が骨格筋芽細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立された後で、該組換え細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法であって、
心筋細胞を、組換えコネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された組換え骨格筋芽細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え骨格筋芽細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え骨格筋芽細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立され、その結果、該組換え骨格筋芽細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する段階を含む、方法。
【請求項１４】
宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法であって、
治療的に有効な量の組換え哺乳動物細胞を宿主の心臓組織に導入する段階であって、該組換え細胞はコネキシンタンパク質を発現するように遺伝的に改変されており、該組換え細胞と該宿主心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効であり、該宿主中の心臓伝導障害が治療される段階を含む、方法。
【請求項１５】
組換え細胞が、骨格筋細胞、幹細胞、線維芽細胞、および心臓細胞からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
組換え細胞が骨格筋細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
コネキシンタンパク質がコネキシン43タンパク質である、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
導入する段階が組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
組換え細胞が宿主に対して自系である、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法であって、
コネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された治療的に有効な量の骨格筋細胞を宿主の心臓組織に導入する段階であって、導入された組換え骨格筋細胞と宿主の心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効であり、該心臓伝導障害が治療される段階を含む、方法。
【請求項２３】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
導入する段階が組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
組換え骨格筋細胞が宿主に対して自系である、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府から後援された研究に関する言明
本発明は、NIHより授与された助成金番号DK47766の下で政府の援助でなされた。政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、心臓伝導障害の治療の分野に関し、より特定には、心臓組織の置き換えまたは修復を容易にするための組換え細胞移植に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
心不整脈は、西半球において死亡率の主要な原因である。悪性心室頻拍性不整脈の発症のリスクは、心筋損傷の程度と関連し、すべての心臓血管の約50％の主要な死因であると考えられている（Myerburg RJ, Kessler KM, Castellanos A., Circulation Jan, (85) I 補遺：I2-10, 1992）。通常の加齢プロセスから生じ得る徐脈および心臓ブロックは、心不整脈と関連する罹患率にさらに加わり、そして米国において年間160,000個を超えるペースメーカーの永久的な移植を生じる。
【０００４】
従来の医学的治療は、主として対症療法であり、一般的には心不整脈と関連する罹患率および死亡率の妨害および予防に失敗している。虚血性心室頻拍の高周波カテーテル除去は、治癒的なものではなく補助的治療と考えられている。除細動器およびペースメーカーの移植は、一般的には効果的であるが、以下を含む問題を有する：（1）機械的デバイスの移植および4〜7年毎のその置き換えの必要性、（2）そのデバイスの移植から生じる外科的かつ機械的合併症、（3）移植された機械的デバイスのネガティブな物理的かつ心理学的効果、ならびに（4）同時発生的な抗不整脈的治療および／または高周波調節／除去を使用する一般的な必要性。
【０００５】
いくつかの例において、および、とりわけ、伝導障害が虚血に起因する場合、外科手術のようなより過激な選択肢のみが利用可能である。しかし、外科手術の技術でさえ、患者における心機能を回復させる治療的な目的には十分に及び得ない。例えば、冠状動脈バイパス手術は、しばしば、梗塞領域において目に見える生存している筋細胞をほとんど有しない患者における機能を回復させるのには不十分である。従って、現在の治療方法のネガティブな局面を克服する、心筋梗塞の治療のための代替的な治療を開発する必要性が存在する。心臓の生理学的なプロセスを刺激するよう試みる従来的な治療の様式とは対照的に、伝導障害を矯正するための組織操作の適用は、自然な生理学的なプロセスを増強する。
【０００６】
組織操作技術は、このような従来の治療に対する魅力的な代替物である。組織操作技術は、一般的に、特定の心臓機能を模倣し得る細胞を、心臓組織に移植して心筋修復をもたらす段階を包含する（Soonpaa, M., Koh GY, Klug MG, Field LJ, Science, 1994. 264:98-101頁；Orlic D, Kajstura J, Chimenti, S, Jakonluk I, Anderson SM, Li, B, Pickel J, McKay, R, Nadal-Ginard, B, Bodine, D, Leri A, Anversa P, Nature (2001) 410: 701-705. Chiu RC-J, Zibaitis A, Kao RL, Ann Thorac Surg (1995) 60: 12-18）。
【０００７】
例えば、心筋修復をもたらすための骨格筋芽細胞の移植を包含する組織操作技術は、骨格筋芽細胞が生存し、かつ正常および損傷した心筋において収縮性の筋線維を形成するという実証と伴って、増加した注目を得ている（Weisel RDら、J. Thoracic Cardiovascular Surgery 2001, 121: 835-836；Murry C, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD, J Clin Invest, 1996. 98: 1512-2523頁；Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka S., J Clin Invest (1996) 98: 2512-2523）。骨格筋芽細胞および幹細胞の細胞移植および組織操作は、限定された利用可能な筋細胞を用いて、患者に対して、機能を回復する見込みを提供する。しかし、今日までの心筋修復の強調は、心筋の収縮の保持に焦点が置かれており、心臓伝導に対する組織操作の効果にはほとんど関心が払われていなかった。心筋修復のための骨格筋芽細胞移植の使用を伴う1つの関心は、骨格筋芽細胞が心筋細胞に対する電気的活性を伝播するか否かである。
【０００８】
心筋細胞は、アドヘレンおよびギャップジャンクションからなる挿入ディスクによって電気機械的にカップリングする。N-カドヘリンは主要なアドヘレンジャンクションタンパク質であるのに対して、コネキシン43（Cx43）は、心室の心筋における主要なギャップジャンクションタンパク質である（Verheule Sら、Circ. Res. 1997, 80: 673-81）。心臓細胞および骨格筋細胞の細胞の電気生理学的特性の違いに起因して、心臓細胞および骨格筋細胞の強固なカップリングは、同期化した電気的コミュニケーションのために必要とされる（Leeら、Annals of Biomedical Engineering 28-1: S54, 2000）。
【０００９】
骨格筋芽細胞は、筋芽細胞を複製する際にN-カドヘリンおよびコネキシン43を発現し、次いで、分化および管状筋細胞形成の後で、これら2種のタンパク質の発現をダウンレギュレートする。機能的なギャップジャンクションは、骨格筋発生の初期段階の間に検出されており、ギャップジャンクションの細胞内コミュニケーションは、筋芽細胞融合および分化において重要な役割を果たすことが示唆されてきた（MacCalman, C.D.ら、Dev. Dyn. 1992, 195: 127-132）。複数の研究は、骨格筋芽細胞が心臓移植の後も生き残りかつ管状筋細胞を形成することを示してきたが、これらの研究は、骨格線維が、宿主細胞と移植された細胞との間の電気的コミュニケーションを可能にする、周囲を取り囲む心筋細胞との機能的ジャンクションを形成するか否かを示してこなかった。これらの研究の大部分は、コネキシン43（Cx43）およびN-カドヘリンが、移植細胞と心筋細胞との間の電気機械的カップリングの欠如により、細胞の分化（管状筋細胞形成）の後では宿主心筋に移植された骨格筋細胞中で検出可能でないことを示してきた（Murry CEら、J. Clin, Invest. 1996, 98: 2512-2217；Robinsonら、Cell Transplantation 1996, 5(1) 77-91；MacCalman, C.D.ら、Dev. Dyn. 1992 195: 127-132；Knudsen, KAら、Exp. Cell Res. 1990, 188: 175-184；Balogh, S.ら、Dev. Biol. 1993, 155: 351-360；Dahl,E.ら、Anat. Embryol. 1995, 191: 267-278）。骨格筋細胞を心筋に移植する以前の試みは、心筋の協調した活性のために必要である心臓細胞との電気的カップリングを欠いてきた。
【００１０】
骨格筋芽細胞および心筋細胞、または管状筋細胞および心筋細胞がインビトロで同時培養された場合には、これらの細胞は電気機械的にカップリングされることが見い出された（Reinecke, H.ら、J. Cell Biology, 2000, 149(3), 731-740）。Reineckeらは、心筋細胞がいくつかの骨格管状筋細胞とインビトロで電気機械的なジャンクションを形成し得、ギャップジャンクションを介してそれらの同期的な収縮を誘導したことを報告した。N-カドヘリンとコネキシン43の両方は、このインビトロ研究において、心筋細胞と骨格管状筋細胞との間の接触部位で検出されたが、これらのタンパク質の役割もしくは重要性、またはギャップジャンクションの形成に関与する機構は決定されないままで残っていた。これらの研究は、コネキシン43発現およびインビトロでの心筋細胞との機能的ギャップジャンクションの関連を例示するが、最小のCx43発現を有する成体骨格筋細胞が、心臓組織において機能的ギャップジャンクションを形成し得ることを示す証拠は提示されていない。
【００１１】
従って、心臓修復をもたらすための、心筋細胞と移植細胞（例えば、成体骨格筋細胞）との間の電気的カップリングの誘導および増強のための方法および組成物を提供する必要性が当該分野において存在する。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、心筋細胞と、コネキシン43（Cx43）タンパク質のようなコネキシンタンパク質を発現するように遺伝子操作された組換え細胞との間の電気的カップリングを確立するための方法を提供する。本発明は、組換えコネキシンを発現するための骨格筋細胞の遺伝子改変が、遺伝子改変した細胞に、ギャップジャンクションを介する心臓細胞との電気的コミュニケーションを確立することを可能にするという発見に基づいている。組換えコネキシン発現細胞は、心臓組織の修復のため、および心臓組織への移植による心臓病の治療のために使用され得る。
【００１３】
1つの局面において、本発明は、組換え哺乳動物細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法を特徴とし、上記方法は、上記心筋細胞を、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え哺乳動物細胞と接触させる段階を包含し、ここで細胞の接触段階は、上記心筋細胞と上記組換え細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式である。特定の実施態様において、組換え細胞は、骨格筋細胞、幹細胞、線維芽細胞、または心臓細胞である。関心対象の実施態様において、組換え細胞は、骨格筋細胞、特に成体骨格筋細胞または筋芽細胞である。特に関心対象の実施態様において、コネキシンタンパク質はコネキシン43タンパク質である。
【００１４】
さらなる実施態様において、接触させる段階は、組換え細胞を被験体の心筋組織に移植する段階を包含する。さらなる特定の実施態様において、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立され、上記組換え細胞は上記心筋細胞と類似する伝導特性を有する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法を特徴とし、上記方法は、上記心筋細胞を、組換えコネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え骨格筋細胞と接触させる段階を包含し、ここで接触段階は、上記心筋細胞と上記組換え骨格筋細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式である。特定の実施態様において、骨格筋細胞は成体骨格筋細胞または骨格筋芽細胞である。なおさらなる実施態様において、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立され、上記組換え細胞は上記心筋細胞と類似する伝導特性を有する。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法を特徴とし、上記方法は、上記心筋細胞を、組換えコネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された組換え骨格筋芽細胞と接触させる段階を包含し、ここで接触段階は、上記心筋細胞と上記組換え骨格筋芽細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、上記組換え骨格筋芽細胞は心筋細胞と類似する伝導特性を有する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法を特徴とし、上記方法は、治療的に有効な量の組換え哺乳動物細胞を宿主の心臓組織に導入する段階を包含し、上記組換え細胞は、コネキシンタンパク質を発現するように遺伝的に改変されており、ここで導入する段階は、上記組換え細胞と上記宿主心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効である。特定の実施態様において、上記組換え細胞は、骨格筋細胞、幹細胞、線維芽細胞、または心臓細胞である。骨格筋細胞、特に成体骨格筋細胞また筋芽細胞が、特に関心対象のものである。なおさらなる実施態様において、コネキシンタンパク質はコネキシン43タンパク質である。別の実施態様において、組換え細胞は、治療される宿主に対して自系である。関連する実施態様において、導入する段階は、組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階によって達成される。
【００１８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法を特徴とし、上記方法は、組換えコネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された、治療的に有効な量の骨格筋細胞を宿主の心臓組織に導入する段階を包含し、ここで導入する段階は、導入された組換え骨格筋細胞と宿主の心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効であり、それによって、上記心臓伝導障害が治療される。特定の実施態様において、骨格筋細胞は成体骨格筋細胞または筋芽細胞である。関連する実施態様において、導入する段階は、組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階によって達成される。特定の実施態様において、組換え骨格筋細胞は宿主に対して自系である。
【００１９】
本発明の1つの局面は、組換えの移植された細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法である。上記方法は、一般的には、心筋細胞と遺伝子改変された細胞との間の電気的接続の産生を提供する様式で、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝子改変された細胞を心筋細胞と接触させる段階を包含する。特に関心対象の1つの実施態様において、コネキシンタンパク質はコネキシン43である。
【００２０】
特定の実施態様において、本発明の方法は、一般的には、組換えコネキシンの産生、例えば、発現または過剰発現、心筋細胞と組換え細胞との間の接続を提供する様式で、コネキシンタンパク質（例えば、コネキシン43）を産生するように遺伝子改変された組換え哺乳動物細胞を、心筋細胞と接触させる段階を包含し、その結果、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立される。特に関心対象の実施態様において、接触段階は、インビボで組換え細胞を被験体の心筋組織に移植する段階を包含する。特定の実施態様において、組換え細胞は骨格筋細胞または筋芽細胞であり、および特定には、成体骨格筋細胞である。組換えコネキシンタンパク質（例えば、コネキシン43）は、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続を誘導および／または維持するために十分な量の組換え細胞による。特定の実施態様において、組換え細胞は、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立する後に、心筋細胞と類似の誘導特性を有する。特に関心対象の1つの実施態様において、コネキシンタンパク質はコネキシン43である。
【００２１】
別の局面において、本発明は、心臓組織における伝導を改善するため（例えば、心臓病を治療するため）の方法を特徴とし、この方法は、宿主の心臓組織に、コネキシンタンパク質を発現するように遺伝子改変した哺乳動物細胞を導入する段階を包含する。この導入する段階は、導入された遺伝子改変された細胞と、心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するために有効である。ここで、心臓組織における伝導が減少される。特定の実施態様において、この方法は、コネキシン43タンパク質を発現するように遺伝子改変された骨格筋細胞を導入する段階を包含する。特定の実施態様において、骨格筋細胞は成体骨格筋細胞または筋芽細胞である。特に関心対象の実施態様において、宿主はヒトである。多くの例において、組換え細胞の導入は、心筋修復のために心臓組織の梗塞領域に細胞を外科的に移植する段階を包含する。特定の実施態様において、遺伝子改変された細胞は宿主からの生検に由来し、生検細胞は組換えコネキシンを発現するためにインビトロで遺伝子改変される。他の実施態様において、遺伝子改変された細胞は、組換えコネキシンタンパク質を発現するようにインビトロで遺伝子改変された細胞株由来である。
【００２２】
本発明のこれらならびに他の、局面、利点、および特徴は、以下により十分に示される本発明の詳細を読むことによって、当業者には明らかとなる。ここで本発明はより詳細に記載される。
【００２３】
本発明を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、細胞株、ベクター、および試薬それ自体に限定されるものではなく、当然変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、この本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００２４】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「a」、「an」、および「the」）は、文脈が明白に他を意図しない限りは、複数形の言及をも含むことに留意されたい。従って、例えば、「細胞」（「a cell」）との言及は、このような複数の細胞およびその機能的等価物を含み、そして「ポリヌクレオチド」（「the polynucleotide」）との言及は、1つまたは複数のポリヌクレオチドおよび当業者に公知であるその等価物への言及を含む、などである。
【００２５】
他に定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同じかまたは等価な任意の方法、装置、および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料はここで記載される。
【００２６】
本明細書中に言及されるすべての刊行物は、記載および開示の目的のために参照として組み入れられ、例えば、刊行物の中に記載される細胞株、ベクター、および方法論は、現在記載される本発明と関連して使用され得る。本明細書において議論される刊行物は、単に、本発明の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本明細中で、これらの発明者らが、先行する発明によるこのような開示が先に出願されたものとして権利を与えられるものとして解釈されるべきではない。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、心筋細胞を、組換えコネキシン43を発現するように改変された成体骨格筋細胞のような組換え細胞と接触させることが（例えば、内因性コネキシン43発現の存在下または非存在下で）、心筋細胞への改変された骨格筋細胞の電気的カップリングを可能にするという発見に基づく。従って、本発明は、組換え細胞と心筋細胞との間の永続的な機能的ギャップジャンクションを生成して、これらの細胞間の電気的コミュニケーションを得るためにコネキシンタンパク質を産生するように遺伝子改変された組換え細胞を使用するための方法を提供する。組換えCx43（または他のコネキシンタンパク質）を発現する組換え細胞の使用は、組換え細胞と心筋細胞との間のコミュニケーションを増大および維持し、従って、心筋収縮の効力の増大を伴う、改善および協調した電気的カップリングを提供する。本発明は、心筋修復をもたらすために心臓組織にコネキシンを発現するように改変された組換え細胞を移植すること（transplantingまたはgrafting）による心臓病の治療のための方法を提供する。うっ血性心不全は、本発明の方法に従って治療され得る例示的な心臓病である。
【００２８】
定義
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分、ならびにペプチド核酸（PNA）、そのフラグメント、部分、またはアンチセンス分子、ならびに、一本鎖または二本鎖であり得、およびセンス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを指す。「ポリヌクレオチド」が特定のポリヌクレオチド配列（例えば、コネキシン43ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を言及するために使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、列挙されたポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、縮重改変体（すなわち、同じアミノ酸配列をコードするが、遺伝コードの縮重に起因するポリヌクレオチド配列が異なる）であるポリヌクレオチド、または列挙されたポリペプチドの生物学的に活性な改変体もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド（本明細書中に提供される配列と比較して実質的な配列類似性または配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む）を含むことを意味する。同様に、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、またはタンパク質をいう。「ポリペプチド」が天然に存在するタンパク質分子のアミノ酸配列をいうために本明細書中で列挙される場合、「ポリペプチド」および同様の用語は、列挙されたタンパク質分子と関連する、完全な、天然のアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定することを意味されず、その代わりに、本明細書中に提供されたアミノ酸配列と比較して実質的な配列類似性または配列同一性を有するポリペプチドを含む、生物学的に活性な改変体またはフラグメントもまた含むことが意味される。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」とは、i）天然のポリペプチド、ii）ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメント、iii）ポリペプチドの生物学的に活性なポリペプチド類似体、またはiv）ポリペプチドの生物学的に活性な改変体のアミノ酸配列を有する、組換えまたは非組み換えポリペプチドのアミノ酸配列を指す。本発明において有用なポリペプチドは、任意の種、例えば、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類（例えば、ニワトリ））、特に哺乳動物（ヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマを含む、好ましくはラットまたはヒト）から、天然、合成、半合成、または組換えである任意の供給源から得られ得る。例えば、「ヒトコネキシン43ポリペプチド」とは、ヒトから得られた単離されたヒトCx43ポリペプチドのアミノ酸配列をいい、かつ天然に存在するすべての対立遺伝子改変体を含むことを意味し、かつ、そのアミノ酸配列を、列挙されたタンパク質分子と関連する完全な、天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００３０】
ポリペプチドの「改変体」は、1つまたは複数のアミノ酸によって変化させられた（例えば、欠失、付加、挿入、および／または置換によって）アミノ酸配列として定義される。一般的に、「付加」とは、分子の末端に加えられたヌクレオチドまたはアミノ酸残基をいうのに対して、「挿入」とは、天然に存在する分子の残基間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基をいう。改変体は、「保存性」変化を有し得、ここでは、置換されたアミノ酸が同様の構造的または化学的特性を有する（例えば、ロイシンのイソロイシンでの置換）。よりまれには、改変体は、「非保存性」変化を有し得る（例えば、グリシンのトリプトファンでの置換）。同様のマイナーなバリエーションはまた、アミノ酸欠失または挿入、あるいはその両方を含み得る。どれほどの数のアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を消滅することなく置換、付加、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイドラインは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、DNAStarソフトウェア）を使用して見い出され得る。
【００３１】
「関心対象の核酸」とは、細胞間の電気的カップリングを導入または維持するために所望されるタンパク質または他の分子をコードする任意の核酸（例えば、DNA）を意味する。一般的に、核酸は、プロモーターおよび調節エレメントのような、その調節および発現に必要とされる他の配列に作動可能に連結される。
【００３２】
用語「生物学的に活性である」とは、特に、コネキシンポリペプチドを発現するように改変された細胞と心筋細胞との間の電気化学的接続の確立を容易にすることに関して、例えば、天然に存在するコネキシンポリペプチドの構造的、調節的、または生化学的機能を有するヒトコネキシンポリペプチドをいう。同様に、「免疫学的に活性である」とは、天然の、組換えの、または合成のヒトコネキシンポリペプチド、あるいはそれらの任意のオリゴペプチドの、適切な動物または細胞において特定の免疫応答を誘導する能力、およびコネキシン特異的な抗体と結合する能力をいう。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」とは、ポリペプチドをコードする核酸またはコードされたポリペプチドの化学修飾をいう。このような修飾の例証は、アルキル基、アシル基、またはアミノ基による水素の置換である。核酸誘導体は、天然のポリペプチドに必須の生物学的特性を保持するポリペプチドをコードする。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された」とは、化合物が天然に存在する環境とは異なる環境にある関心対象の化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）を記載することを意味する。「単離された」は、関心対象の化合物で実質的に富化された試料中にある化合物、および／または関心対象の化合物が部分的もしくは実質的に精製された試料中にある化合物を含むことを意味する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」とは、その天然の環境から取り出されており、かつ化合物が天然に付随している他の成分を、少なくとも60％、好ましくは75％、および最も好ましくは90％含まない、化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれか）をいう。
【００３６】
「形質転換」、「形質導入」、または「トランスフェクション」は、新規な核酸の取り込み（例えば、細胞への外因性のDNAまたはRNA）の後に細胞において誘導された、永続性または一過性の遺伝的変化、好ましくは永続性の遺伝的変化を意味する。遺伝的な変化は宿主細胞のゲノムへの新規な核酸の取り込みによって、またはエピソームエレメントとしての新規なDNAの一過性もしくは安定な維持によってのいずれかで達成され得る。
【００３７】
「形質転換細胞」、「トランスフェクト細胞」、または「形質導入細胞」とは、組換えDNA技術によって、関心対象のタンパク質をコードするDNA分子が導入された細胞（またはその祖先の細胞）を意味する。
【００３８】
「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列の発現の目的のために生成されたか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築物において使用される組換え核酸、一般的には組換えDNAを意味する。本発明において有用である構築物は、形質転換された細胞においてコネキシンタンパク質の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結されたコネキシンをコードする遺伝子配列を含むものである。本発明に従うヒトおよびラットCx43の発現のために有用な例示的な構築物は、Shinoura, Nら、J Neurosurg. 1996 5月；84 (5): 839-45およびSuzukiら、Ann. Thorac. Surg., 2001, 71: 1724-33にそれぞれ記載されている。
【００３９】
「プロモーター」とは、組換え細胞において転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。「プロモーター」はまた、細胞型特異性、組織特異性、または外部のシグナルまたは因子による誘導性が制御可能である、プロモーター依存的遺伝子発現のために十分なエレメントを含むことを意味する；このようなエレメントは、天然の遺伝子の5'または3'領域に位置し得る（例えば、エンハンサーエレメント）。
【００４０】
「作動可能に連結された」または「作動できるように連結された」は、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合している場合に発現を可能にするような様式で、DNA配列および調節配列が接続されることを意味する。
【００４１】
「コネキシン遺伝子」は、コネキシンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、またはイントロン、またはその生物学的に活性なフラグメントを意味する。「コネキシン遺伝子」は、発現の調節に関与する隣接する5'および3'非コードヌクレオチド配列、コード領域を超えた約10kbまでを含むが、おそらくいずれかの方向においてそれ以上をさらに含む。コネキシンをコードするDNA配列は、cDNAまたはゲノムDNAまたはそれらのフラグメントであり得る。その遺伝子は染色体外の維持のため、または宿主への組み込みのために適切なベクターに導入され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「cDNA」は、天然の成熟mRNA種において見い出される配列エレメントの配置を共有するすべての核酸を含むことが意図され、ここで、配列エレメントは、エキソン（例えば、コードされたポリペプチドのオープンリーディングフレームをコードする配列）、ならびに3'および5'非コード領域である。通常、mRNA種は、介在性のイントロンが核RNAスプライシングによって除去された、隣接したエキソンを有し、関心対象のポリペプチドをコードする隣接したオープンリーディングフレームを生成する。
【００４３】
「心筋細胞」は、心筋の細胞である、心臓の収縮細胞を意味する。心筋細胞は、インビトロで単離および培養され得るか、または宿主の心筋の一部であり得る。
【００４４】
「骨格筋細胞」は、筋芽細胞、管状筋細胞、および成熟骨格筋細胞を含むがこれらに限定されない、骨格筋において見い出される細胞を意味する。
【００４５】
「組換え細胞」は、細胞には通常付随しない核酸を含む細胞（例えば、特定のタンパク質（例えば、コネキシンタンパク質）をコードする構築物で形質転換、形質導入、またはトランスフェクト細胞）を意味する。
【００４６】
「移植された細胞」は、宿主中の細胞と接触させるために宿主に導入された細胞を意味する。例えば、組換え細胞は、宿主の心臓組織中に移植（graftおよび／またはimplant）され得る。
【００４７】
心臓伝導障害の治療の文脈における「治療的に有効な量」とは、心臓伝導障害の症候を減少させるか、および／または心臓伝導（伝導の尺度）を改善するために有効な量を意味する。
【００４８】
遺伝子産物（例えば、Cx43タンパク質）の「過剰発現すること」または「過剰発現」は、例えば、特定の発達段階または分化の段階において、特定の細胞または細胞型についてのタンパク質発現の通常のレベルを超えたタンパク質発現のレベルの増加を意味する。特定の例において、過剰発現は、内因性遺伝子および組換え遺伝子からのタンパク質発現、または組換え遺伝子からの必須のタンパク質発現の累積的な効果であり得る。コネキシン（例えば、Cx43）の過剰発現は、分化の特定の段階において正常または野生型細胞に通常付随するコネキシン発現レベルより上である、特定の細胞中でのコネキシンタンパク質の発現をいうことを意味する。通常、有意なまたは検出可能な量のコネキシンを発現しない細胞について（例えば、成体骨格筋細胞または管状筋細胞におけるCx43について）、コネキシンタンパク質の過剰発現は、コネキシンの検出可能な任意の発現を意味し、特に、コネキシン発現が上昇している組換え細胞と心筋細胞との間の電気化学的な接続の確立を促進するのに十分な発現のレベルを意味する。特定の実施態様において、コネキシンの過剰発現は、少なくとも約2倍の因子、他の実施態様において、少なくとも約5倍、およびなおさらに他の実施態様において、少なくとも約10倍の発現の増加を意味する。
【００４９】
用語「被験体」、「患者」、「宿主」、および「個体」は、診断または治療あが所望される任意の哺乳動物被験体、特にヒトをいうために本明細書中で交換可能に使用される。他の被験体は、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを含み得る。特に関心対象のものは、組換えコネキシン（例えば、Cx43）を発現する細胞の被験体への移植によって（例えば、インビボで被験体への組換えコネキシン発現細胞の導入によって、またはコネキシンを発現する細胞（例えば、成体骨格筋芽細胞、幹細胞（例えば、間葉性、造血性）、線維芽細胞、心臓細胞などを被験体に移植することによって）、治療を受容可能な（例えば、障害に関連する症候を緩和するために）心筋関連の障害を有する被験体である。多くの実施態様において、宿主はヒトである。
【００５０】
「電気的カップリング」は、細胞間の電気的伝導を提供するために細胞間の細胞内コミュニケーションを可能にする細胞間の相互作用を意味する。インビボでの電気的カップリングは、電気機械的なカップリングのための基礎を提供し、および一般的には、電気機械的なカップリングを伴う。ここでは、筋肉中のギャップジャンクションを通した細胞の電気的励起が筋肉収縮をもたらす。
【００５１】
「心臓伝導障害」は、心筋収縮を開始する電気的活性の正常な生成および伝達の障害を意味する。電気的伝導障害から生じる心不整脈は、生命に危険を及ぼす、心室性頻拍、血行力学的に損なわれる徐脈、および心臓ブロックをもたらし得る。
【００５２】
「心臓伝導障害と関連する状態」は、心臓伝導障害と関連する状態、症候、または障害を意味する。心臓伝導障害と関連する状態の例には、不規則な心拍、疲労、息切れ、および同調した心筋収縮の欠如である。
【００５３】
「治療」、「治療すること」、または「治療する」とは、少なくとも、宿主を苦しめる状態に関連する症候の寛解が達成されることを意味し、ここで、寛解は、パラメーター、例えば、治療される状態と関連する症候（例えば、不規則な心拍、疲労、息切れ、失神は、心臓ブロック、心室性頻拍としての伝導障害と関連するか、うっ血性心不全（すなわち、同調した収縮の欠如）と関連する症候であり得る）の少なくとも強度の減少を広い意味でいうために使用される。このようなものとして、治療はまた、病理学的な状態、または少なくともそれらに関連する症候が完全に阻害された状態（例えば、宿主が、状態、または少なくとも状態を特徴付ける症候をもはや苦しまないように、発生を妨害し、または停止し、例えば終結させる）を含む。
【００５４】
コネキシン過剰発現細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立するための方法
本発明は、コネキシンを発現する組換え細胞と、心筋細胞との間の電気的接続を確立するための方法を提供する。この方法は、一般的に、心筋細胞と組換え細胞との間の電気的接続の産生を提供するような様式で、コネキシン組換え細胞（例えば、骨格筋芽細胞、幹細胞（例えば、間葉性、造血性）、線維芽細胞、心臓細胞など）を心筋細胞と接触させる段階を包含する。この細胞は組換えであり、例えば、これは、生物学的に活性なコネキシンタンパク質（例えば、コネキシン43（Cx43）タンパク質）を産生するように遺伝的に改変される。組換え細胞におけるコネキシンの産生は電気的な接続、従って、組換え細胞と心筋細胞との間の電気機械的な接続を提供する。
【００５５】
コネキシンをコードする核酸
上記に要約したように、本発明の方法は、ゲノムおよびcDNA核酸組成物を含む核酸組成物を利用し、これは、組換え細胞における発現のために適切な、生物学的に活性なコネキシン43タンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは類似体をコードし、この細胞は引き続いて心臓細胞との電気化学的な接続を形成し得る。
【００５６】
「コネキシンタンパク質」とは、ホモまたはヘテロ六量体アレイとしてギャップジャンクションのコネキシンにおいて見い出される相同タンパク質のファミリーからのタンパク質を意味する。コネキシンタンパク質は、細胞の電気的カップリングに関与するメジャーなギャップジャンクションタンパク質である。ギャップジャンクションは、分子（無機イオンおよびセカンドメッセンジャーを含む）の細胞間通過を調節し、従って、細胞の電気的カップリングを達成する。15を超えるコネキシンサブユニットアイソフォームが知られており、これらは、約25kDaと60kDaの間のサイズで変化し、そして一般的に、4つの推定の膜貫通αヘリックススパナを有する。異なるコネキシンが、心臓の種々の部分に特異的である。心臓血管系において見い出されたコネキシンファミリータンパク質には、Cx37、Cx40、Cx43、およびCx45が含まれる（van Veen, AA; van Rijen, HV; Opthof, T., Cardiovascular Research 2001年8月1日, 51 (2): 217-29.; Severs, NJ; Rothery, S; Dupont, E; Coppen, SR; Yeh, HI; Ko, YS; Matsushita, T; Kaba, R; Halliday, D., Microscopy Research and Technique 2001年2月1日, 52 (3): 301-22; Kwong, KF; Schuessler, RB; Green, KG; Laing, JG; Beyer, EC; Boineau, JP; Saffitz, JE., Circulation Research 1998年3月23日, 82 (5): 604-12）。
【００５７】
本明細書中で交換可能に使用される場合、「コネキシン43」および「Cx43」とは、ギャップジャンクションおよび電気機械的なカップリングと関連する、構造的、調節的、または生化学的機能を有する、単離されたCx43ポリペプチドのアミノ酸配列をいう。これは、任意の種、特に哺乳動物（ヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマ、好ましくはヒト）から得られ、そしてこれは、天然、合成、半合成、または組換えであり得、天然に存在するすべての対立遺伝子改変体を含むことを意味するが、そのアミノ酸配列は、列挙されたタンパク質分子と関連する完全な、天然のアミノ酸配列に限定されることを意味しない。Cx43は、生物学的に活性なCx43フラグメントを含む。Cx43の例には、ヒトCx43（Genbankアクセッション番号XP_027460、XP_027459、XP_004121、P17302、AAD37802、A35853、NP_000156、AF151980、M65188、およびAAA52131）、マウスCx43（Genbankアクセッション番号P23242、P18246、A39802、A36623、NP_034418、NM_012567、NM_010288、CAA44640）が含まれ、ならびに、ラットCx43は、Genbankアクセッション番号P08050、S00532、NP_036699、AAA75194、および1404339Aに見い出される。
【００５８】
関心対象のコネキシンゲノム配列は、開始コドンと終止コドンの間に存在する核酸を含み、コネキシン43遺伝子が特に関心対象であり、天然の染色体に通常存在するイントロンのすべてを含む。これは、成熟mRNAにおいて見い出される3'および5'非翻訳領域をさらに含み得る。これは、特定の転写調節配列および翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）をさらに含み得、転写領域の5'末端または3'末端のいずれかにおいて、約10kb、しかしおそらくそれより大きな、隣接ゲノムDNAを含む。このゲノムDNAは100kbpまたはそれ以上の大きなフラグメントとして、または隣接する染色体配列を実質的に含まないより小さなフラグメントとして単離され得る。別の実施態様において、コネキシンDNAは、ゲノムDNAにおいて見出され得るイントロン性の配列を欠くcDNAである。このcDNAは、コネキシン配列に通常付随するプロモーター（例えば、コネキシン遺伝子について内因性であるプロモーター）、またはコネキシン配列に対して異種であるプロモーター（すなわち、コネキシン配列以外の供給源からのプロモーター）に作動可能に連結され得る。
【００５９】
この5'領域の配列、ならびにさらなる5'上流配列および3'下流配列は、エンハンサー結合部位を含む、プロモーターエレメントのために利用され得、これは、コネキシンポリペプチドが通常発現される組織における発現を提供する。使用されるコネキシン配列は、任意の種（例えば、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類（例えば、ニワトリ））、特に哺乳動物（ヒト、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、またはウマ、好ましくはラットまたはヒトを含む））のヌクレオチド配列に基づき得、天然、合成、半合成、または組換えである任意の供給源から単離または産生され得る。組換え細胞がヒト細胞である場合、または細胞が移植される心臓組織がヒトである場合、コネキシンは、好ましくはヒトコネキシン、またはヒトコネキシン由来である。
【００６０】
本発明において使用される核酸組成物は、適切なコネキシンポリペプチドのすべてまたは一部、通常少なくとも実質的にすべてをコードし得る。DNA配列のフラグメントは、制限酵素消化による、PCR増幅による、などの従来の方法に従って化学的に合成されるオリゴヌクレオチドによって得られ得る。大部分は、DNAフラグメントは、少なくとも約100の連続するヌクレオチド、通常少なくとも約200の連続するヌクレオチド、より通常には少なくとも約250ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドである。
【００６１】
コネキシン遺伝子は、一般的にインタクトな哺乳動物染色体以外として、実質的に純粋に単離および入手される。通常、Cx43またはそのフラグメントをコードする配列を含まない、他の核酸配列を実質的に含まないDNAが得られ、これは、一般的に少なくとも約50％、通常少なくとも約90％純粋であり、そして代表的には「組換え」である（すなわち、天然に存在する染色体上で通常結合していない、1つまたは複数のヌクレオチドが隣接している）。
【００６２】
コネキシンタンパク質の配列（隣接するプロモーター領域およびコード領域を含む）は、当該分野で公知の種々の方法において変異され得、プロモーターの強度、コードされたタンパク質の配列などの標的化された変化を生成する。DNA配列またはこのような変異の生成物は、本明細書中で提供される1つまたは複数の配列と実質的に類似であり、すなわち、少なくとも1つのヌクレオチドもしくはアミノ酸がそれぞれ異なり、そして少なくとも2つ、または少なくとも10個もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸が異なり得る。一般的に、配列の変化は、付加、置換、挿入、または欠失であり得る。欠失は、ドメインもしくはエキソンの欠失のようなより大きな変化をさらに含み得る。このような改変されたコネキシン配列は、例えば、電気化学的な接続の産生を促進する目的のための細胞への導入のための構築物を生成するために使用され得る。
【００６３】
好ましくは、コネキシン遺伝子は、宿主の属および種に従って選択されることが注記されるべきである（例えば、ヒトがCx43改変細胞を受容する場合、Cx43配列はヒトCx43である）。
【００６４】
コードされたコネキシンが生物学的に活性であり、例えば、骨格筋細胞中で産生される場合、生物学的に活性なCx43ポリペプチドは、骨格筋細胞と心筋細胞との間の接続の確立を容易にする。理論に拘束されることなく、コネキシンタンパク質（例えば、Cx43）は、細胞表面で発現され、そしてギャップジャンクションの一部として原形質膜に挿入される。細胞間の電気的カップリングを確立するために、コネキシンは、ギャップジャンクションの細胞間コミュニケーション（GJIC）を形成するための機能的ギャップジャンクションでなければならない。2つの細胞（例えば、成体骨格筋細胞および心筋細胞）間の電気的接続の同定は、当業者によって容易に決定され得る。ギャップジャンクションは、ギャップジャンクション透過性の色素、例えば、ルシファーイエロー（Molecular Probes, Or.）（これは、機能的ギャップジャンクションが存在する場合に、1つの細胞から別の細胞に移動する）を用いるマイクロインジェクション細胞によって評価され得る。機能的ギャップジャンクション（すなわち、Cx43の機能的発現）を検出するためのマイクロインジェクションプロトコールは、実施例のセクションに示される。
【００６５】
組換え細胞は、選択的に、他のタンパク質（例えば、N-カドヘリンタンパク質）を発現するように遺伝的に改変され得る。しかし、この細胞は、好ましくは、移植される細胞のさらなる遺伝子操作を回避するために改変されない。さらに、組換え細胞は、N-カドヘリンを発現または過剰発現するように改変される必要がない。なぜなら、本発明者らは、本明細書中で、外因性の（例えば、導入されたかまたは組換えの）コネキシンの発現（任意の内因性コネキシンの発現の存在下または非存在下のいずれかで）が十分であることを示したからである。
【００６６】
コネキシン核酸のため構築物
コネキシン核酸を含む構築物は当該分野で周知である。例えば、コネキシン43遺伝子を含む構築物は、El Oakleyら、Ann. Thorac. Surg., 2001, 71: 1724-33によって記載されている。コネキシンをコードする核酸を含む構築物は、関心対象の特定の細胞を形質転換、トランスフェクション、または形質導入するために利用され、改変された細胞中で導入されたコネキシンをコードする核酸分子の発現を可能にする。
【００６７】
発現される核酸がDNAである場合、関心対象のDNAに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、真核細胞中で機能的なプロモーター）を有する任意の構築物が、本発明において使用され得る。本発明に従って使用され得るDNA配列（または対応するRNA配列）を含む構築物は、哺乳動物細胞における使用のために適切で、かつ関心対象のDNA配列またはRNA配列を含む任意の発現構築物であり得る。このような構築物は、プラスミドまたはウイルス構築物（例えば、アデノ関連ウイルス、アデノウイルスなど）の核酸を含み得、そして環状または直鎖状であり得る。好ましくは、構築物は、真核生物および／または原核生物の宿主中での複製が可能である。適切な構築物は当該分野で公知であり、そして市販されている。この構築物は、当該分野で周知の技術を使用して調製され得る。同様に、遺伝的に変化された宿主における外因性のDNA配列またはRNA配列の発現を得るための技術は、当該分野で公知である。
【００６８】
1つの実施態様において、DNA構築物は、哺乳動物細胞中で、関心対象のDNAの発現を容易にするためのプロモーターを含む。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）、マウス乳腺癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、レンチウイルス、またはアデノウイルス由来のプロモーターのような、哺乳動物細胞中で機能する強力なプロモーターであり得る。より詳細には、例示的なプロモーターには、ヒトCMVの最初期遺伝子からのプロモーター（Boshartら、Cell 41: 521-530, 1985）およびRSVの長末端反復（LTR）からのプロモーター（Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781, 1982）が含まれる。あるいは、使用されるプロモーターは、アクチン遺伝子プロモーターのような、強力な一般的な真核生物プロモーターであり得る。1つの実施態様において、使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。例えば、構築物中で使用されるプロモーターは、心臓細胞特異的なプロモーター、筋芽細胞特異的プロモーター、または成体骨格筋細胞特異的プロモーターであり得る（Luoら、Development 2001年2月、128 (4): 459-69；Leeら、J. Thor. Card. Sur. 1999年7月、118 (1): 26-4, 考察34-5）。新生仔ラットからの初代心筋細胞は、ラットのアシルコエンザイムシンテターゼ遺伝子のCプロモーター（Kandaら、Heart Vessels 2000, 15 (4): 191-6）ならびにα-およびβ-心臓ミオシン重鎖遺伝子プロモーター（Jamesら、Circulation 2000年4月11日、101 (14): 1715-21）によって駆動されるレポーター構築物でトランスフェクションされた。
【００６９】
本発明の構築物はまた、プロモーターに加えて、改変された細胞におけるコネキシン発現を増強および調節する配列を含み得る。例えば、血清応答因子（SRF）遺伝子は、多数の筋肉遺伝子および成長因子誘導性遺伝子の転写を調節することが示されてきた。SRFは筋肉特異的でないので、筋原性のアクセサリー因子を補充することによって筋肉遺伝子を活性化することが想定されてきた。ミオカーディンは筋肉転写因子のクラスのメンバーであり、それによってSRFが筋肉遺伝子に筋原性活性を伝達し得る機構を提供する（Wangら、Cell. 2001年6月29日; 105 (7): 851-62）。
【００７０】
別の実施態様において、プロモーターは、テトラサイクリン調節プロモーターのような調節されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）であり、それからの発現は、外因性の基質（例えば、テトラサイクリン）への曝露によって調節され得る。本発明において有用な調節されたプロモーター系の別の例は、哺乳動物プロモーターを調節するためのlacオペレーター−リプレッサー遺伝子調節系である（Croninら、Genes Dev. 2001年6月15日、15 (12): 1506-17）。
【００７１】
真核生物発現のために、構築物は、関心対象のDNAに作動可能に連結された最小の真核生物プロモーターを含むべきである。これは次には、ポリアデニル化シグナル配列に作動可能に連結される。ポリアデニル化シグナル配列は、当該分野で公知の種々のポリアデニル化シグナル配列のいずれかから選択され得る。例示的なポリアデニル化シグナル配列は、SV40初期ポリアデニル化シグナル配列である。この構築物はまた、適切である場合、特に関心対象のDNAがcDNAである場合に（例えば、天然に存在する配列のイントロンを含まない）、1つまたは複数のイントロンを含み得、これは、関心対象のDNAの発現のレベルを増加させ得る。当該分野において公知の種々のイントロンのいずれかが使用され得る（例えば、ヒトβ-グロビンイントロン、これは、関心対象のDNAに対して5'の位置で構築物中に挿入される）。
【００７２】
代替的な実施態様において、細胞に送達される核酸はコネキシンタンパク質をコードするRNAである。この実施態様において、RNAは、標的細胞中での発現（すなわち、RNAの翻訳）のために適合される。関心対象のタンパク質をコードするRNA（例えば、mRNA）の産生のための方法は当該分野で周知であり、そして本発明において有用であるコネキシンをコードするRNAの産物に容易に適用され得る。
【００７３】
組換えコネキシン細胞の産生
組換えコネキシンを発現するように改変された細胞には、コネキシン媒介ギャップジャンクションを介して心筋細胞とカップリングし得る任意の細胞が含まれ、これらには、骨格筋細胞、幹細胞（例えば、間葉性、造血性）、線維芽細胞、心臓細胞などが含まれ、細胞中での組換えコネキシン（例えば、Cx43）の発現を提供するように遺伝的改変に従う。特に関心対象の1つの実施態様において、細胞は、骨格筋細胞である。
【００７４】
細胞は、宿主（例えば、内因性細胞）または適切な培養細胞株から得られ得る。細胞は、宿主に関して、自系、同種、または異種（例えば、霊長類、ブタなど）であり得る。特定の実施態様において、細胞は、生検（例えば、筋肉生検）を介して、被験体または患者から収集される。この後者の実施態様は、宿主の心筋への組換えコネキシン発現細胞の自系移植を可能にする。
【００７５】
組換えコネキシン発現細胞を産生するための使用に適切な細胞には、骨格筋細胞、特に成体骨格筋細胞、幹細胞（例えば、間葉性、造血性）、線維芽細胞、心臓細胞などが含まれる。次いで、コネキシン（例えば、Cx43）の産生を提供する発現構築物は、心筋組織への移植に利用可能である組換えコネキシン発現細胞の数を増加させるために、形質転換の前および／または後に、インビトロで、増殖および培養され得る細胞に導入される。
【００７６】
1つの実施態様において、細胞は、コネキシン（例えば、Cx43）の発現のために、増殖および適切なベクターで形質転換された、骨格筋細胞または細胞株である。これらの組換えコネキシン発現細胞は、インビトロで培養され、そして心筋への移植のために利用される。別の実施態様において、細胞は、新鮮な一次培養物または凍結培養物の細胞である。
【００７７】
哺乳動物細胞へコネキシン構築物を導入するための方法には、当業者に公知の標準的なプロトコールが含まれる。
【００７８】
コネキシン発現の調節は、改変された細胞をトランスフェクションするために使用されるコネキシン遺伝子を含む構築物に作動可能に挿入される調節エレメントを使用して達成され得る。コネキシン発現を調節する他の方法には、組換え細胞に対して内因性であるか、またはコネキシン発現を調節する化合物の付加（例えば、組換え細胞を移植するとき、またはその後のいずれかで）によるゲノム調節エレメントが含まれ得る。
【００７９】
改変された細胞におけるコネキシン発現は、組換えコネキシンに特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティングのような技術によって検出され得る。形質転換された細胞における組換えコネキシンの発現を確証するための他の方法には、コネキシンmRNAに特異的なプライマーを利用するRT-PCR、または培養中の形質転換細胞に対する免疫蛍光技術が含まれ得る。組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続の産生を容易にする、コネキシンポリペプチドの能力は、インビボモデルにおいて試験され得る。
【００８０】
組換えコネキシン細胞と心筋細胞との間の機能的ギャップジャンクションの産生
組換えコネキシン発現細胞は、インビトロで細胞の数を拡張するために培養され得る。所望の数の組換え細胞が得られた後で、細胞は心筋組織に導入される。代替的にまたは加えて、組換えコネキシン細胞および心筋細胞は、インビトロで同時培養され、次いで移植される。
【００８１】
コネキシンの産生は、改変された細胞がギャップジャンクションを介する心筋細胞との電気的接続を誘導することを可能にする。細胞の違い、ならびに、心筋細胞および非心筋細胞の電気生理学的特性に起因して、心筋細胞および非心筋細胞の強固なカップリングは、同調する電気的コミュニケーションのために必要とされる。本発明は、2つの異なる細胞型間の独特かつ新規な相互作用を実証し、これは、心筋の疾患および障害の治療および治療を可能にする。
【００８２】
心臓の状態を治療する方法
本発明は、心臓伝導障害の矯正のための方法、および心臓伝導障害に関連する心臓状態を治療するための方法を提供する。本発明は、細胞から細胞へのコミュニケーションを増加させることによる、標準的な細胞移植を超える進歩であり、従って、より同期化した収縮を可能にする。本発明の方法は、一般的に、宿主の心臓組織を、コネキシンタンパク質（例えば、Cx43）を発現する組換え細胞と接触させる段階を包含し、その結果、コネキシンタンパク質は、組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続の産生を容易にする。この接続は、心臓における伝導を改善することによって、心臓伝導障害の矯正を容易にする。特に関心対象の実施態様において、組換え細胞は、骨格筋細胞である。
【００８３】
本発明の方法は、心筋細胞の同調した伝導の増加が所望される、種々の異なる状態の治療において用途を見い出す。
【００８４】
本発明の方法による治療を受けることのできる例示的な疾患には、完全な心臓ブロック、興奮回帰性の不整脈（例えば、心室性頻拍）、うっ血性心不全などが含まれるがこれらに限定されない。改善された同期化された収縮からの利点を受ける任意の心臓疾患または障害は、本発明の方法を用いて治療を受けることができる。
【００８５】
組換えコネキシン細胞の移植
被験体の心筋細胞への組換えコネキシン細胞の移植は、心臓への組織および／または単離された細胞を移植するための周知の外科技術を使用し得る。一般的に、被験体の心臓組織に組換え細胞を導入するための2つの方法：1）外科的な、直接的な注入；または2）米国特許第6,059,726号（LeeおよびLesh、「Method for locating the AV junction of the heart and injecting active substances therein」）において記載される経皮的な技術が存在する。
【００８６】
組換えコネキシン細胞は、伝導障害が発生した心臓の任意の領域に移植され得る。移植される組換え細胞の量は、治療される心臓病の型、心筋組織の全体的な損傷、および移植される細胞におけるコネキシン発現のレベルによって決定される。
【００８７】
特定の実施態様において、組換えコネキシン発現細胞は、経皮的な方法によって移植される。損傷を受けた心臓組織の部位が、非侵襲的な診断技術によって被験体中で正確に決定される場合、組換えコネキシン細胞は、当該分野で周知の、心筋への経皮的注入のための一般的な方法を使用して、損傷を受けた心筋組織に直接的に注入され得る。治療的に有効であることが必要な組換え細胞の量は、治療される障害の型ならびに発生した心臓の損傷の程度で変動する。
【００８８】
免疫抑制剤は、移植拒絶（例えば、同種細胞または異種細胞）の可能性を最小化するために宿主に由来しないCx43-過剰発現細胞の移植と合わせて使用され得る。
【００８９】
他の治療との組み合わせ
本発明の方法はまた、適切な場合に、他の心臓治療と組み合わせて利用され得る。特定の実施態様において、特定の型の誘導の欠損を治療するために使用される薬物が、損傷を受けた心筋への組換えコネキシン細胞の移植と組み合わせて投与され得る（例えば、移植の前、移植の間、および／または移植の後に）。本発明の方法との組み合わせ治療における使用に適切な心臓薬物には、以下が含まれるがこれらに限定されない：成長因子、成長因子をコードするポリヌクレオチド、血管形成因子、カルシウムチャンネルブロッカー、高血圧治療剤、有糸分裂阻害剤、筋収縮剤、抗アテローム形成剤、抗凝血剤、β-ブロッカー、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張剤、血栓溶解剤、強心配糖体、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、原生生物を阻害する薬剤、抗不整脈剤（心室性頻拍の治療のために使用される）、硝酸塩、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤；脳ナトリウム排泄増加ペプチド（BNP）；抗新生物剤、ステロイドなど。
【００９０】
本発明はまた、冠動脈バイパス移植（CABG）への補足的手順であり得る。血管新生化とともに、非機能的な心筋傷跡の、機能的な筋肉での置換は、血管新生化（バイパス手術）単独よりも、心筋の性能をより改善する。CABGと合わせた、組換えコネキシン細胞の移植は、壁のストレスおよび虚血性の負荷を減少させることによって継続する心筋再構築を妨害することによって、外科手術の間の付加的な治療を提供する。心筋への組換え細胞の送達のためのさらなる外科的な手順は、CABG外科手術の時点で組換え細胞を移植することによって回避され得る。
【００９１】
治療の評価
本発明の方法に係る治療の効果は、種々の方法においてモニターされ得る。一般的に、心臓ブロック障害については、心電図（ECG）またはホルターモニターが治療の効力を決定するために利用される。心臓の収縮は、心臓内で生成される電気的インパルスに起因して発生する；ECGは、心拍および電気的インパルスの尺度である。従って、ECGは、治療が、被験体の心臓における電気的な伝導の劣化を改善もしくは維持、妨害、または遅延させたか否かを決定するための、非常に効果的かつ非侵襲的な方法である。ホルターモニター、心臓の異常、不整脈障害、などをモニターするために長時間の間、装着され得るポータブルECGの使用もまた、治療の有効性を評価するための信頼できる方法である。
【００９２】
心臓の伝導特性を評価するための心臓内でのカテーテルの経皮的な配置を含む電気生理学的試験もまた、治療を評価するために使用され得る。
【００９３】
治療される状態がうっ血性心不全である場合、心エコー図または核研究が、心室の機能の改善を決定するために使用され得る。組換えコネキシン細胞の、心筋組織への移植の前および後の心エコー図の比較は、治療の信頼できる評価を可能にする。
【００９４】
治療の効力を評価するための上記の方法は単に例示であり、限定を意味するものではない。同期化されたカップリングを検出するための多くの適切なアッセイ（例えば、心臓機能をモニターすることによる）は、当該分野で周知であり、そして使用のために適合され得る。
【００９５】
実施例
以下の実施例は、当業者に、本発明をいかにして作製および使用するかの完全な開示および記載を提供するために記載され、本発明者らが本発明として見なす範囲を限定することを意図するものではなく、また、これらは、以下の実験がすべてであるか、または実行されただけの実験であることを表すことを意図するものではない。使用された数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを確証するための努力がなされたが、いくらかの程度の実験的誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限りは、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、および圧力は大気圧または大気圧近くの圧力である。
【００９６】
本発明は、その特定の実施態様に関して記載されてきたが、種々の変更を加えることができ、そして等価物が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置換され得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、組成物、方法、方法の段階を、本発明の目的、精神、および範囲に適合することがなされ得る。すべてのこのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の中にあることが意図される。
【００９７】
実施例１：骨格筋芽細胞／管状筋細胞の、心臓組織を電気的に励起する能力の特徴分析
組織操作技術は、最終段階の心臓病および伝導異常の治療のための従来的な治療に対する魅力的な代替技術である。細胞移植は、患者に対して機能を回復する見込みを提供する。
【００９８】
生検の骨格筋細胞はサテライト細胞、骨格筋芽細胞を有し、これらは、分裂および増殖が可能である。骨格筋芽細胞は最初にCx43を発現する。しかし、細胞が成熟しかつ管状筋細胞（収縮性の筋線維に導く基本的単位）に分化した場合、Cx43発現は骨格管状筋細胞において最少である。
【００９９】
骨格筋芽細胞および管状筋細胞は、異なる細胞の電気生理学的特性を有する。筋芽細胞の管状筋細胞への分化の異なる期間の間での活動電位パラメーターの特徴付けを決定した。骨格筋芽細胞を、2〜5日齢の新生仔ラットの後肢の筋肉から酵素分散によって単離した。筋芽細胞を、増殖培地を分化培地（DM）（98％ DMEM、2％ウマ血清（HyClone）、ペニシリンG 100U/ml、およびストレプトマイシン 100μg/ml）で置き換えることによって、培養中に多核性の管状筋細胞に分化させた。DM中で2〜14日間インキュベートした筋芽細胞および管状筋細胞を研究した。パッチクランプ技術の全細胞配置を使用して、活動電位を記録した。以下の測定値を得た：静止膜電位（RMP）、活動電位振幅（APA）、50％の活動電位持続時間（APD50）再分極（表1）。
【０１００】
筋芽細胞は、4日で多核性の管状筋細胞に分化し始め、10〜14日までに自発的な収縮性の線維のネットワークを形成する。
【０１０１】
（表１）  DM中での異なる日数の間の活動電位パラメーターの変化
2005527482.tif 000002
【０１０２】
新鮮に単離された骨格筋芽細胞は、測定可能な活動電位を有さず、そして電気的に刺激されることができなかった。
【０１０３】
RMP．8日目と10〜14日目との間で有意な差は存在しなかった（図1A）。
【０１０４】
APA：管状筋細胞のRMPが発生の間によりネガティブになるのに伴って、活動電位の振幅もまた増大し、10〜11日でピークの値に到達した。次いで、APAは13〜14日目まで並行して減少した。10日目と、８日目、11〜14日目との間に有意な差異は見い出されなかった（図1B）。
【０１０５】
Vmax：APAの変化と同様の変化が記録された（図1C）。
【０１０６】
APD50：11〜12日目でAPD50の最小値となり、次いで増加した。2日目以外では各群間で有意な変化は存在しなかった（図1D）。
【０１０７】
従って、活動電位パラメーターは、筋芽細胞から管状筋細胞への分化の異なる期間の間で変化した。
【０１０８】
パッチクランプ法によるデータは、7日間未満のDM中での筋芽細胞の相対的な電気的励起の可能性がないことを強調する。これらの結果の意味は、移植された骨格筋芽細胞／管状筋細胞は、ギャップジャンクションを介する細胞のカップリングの増強なしでは電気的なインパルスを伝播しないことである。
【０１０９】
コンピューターモデリングを使用して、骨格筋芽細胞と、心臓の心筋細胞を有する筋線維との間の細胞から細胞への電気的励起を評価した（Lee Rら、Annals of Biomedical Engineering 28-1: S54, 2000）。このモデリングは、各細胞型の測定された細胞パラメーターを取り込むことによって実行される。このコンピューターモデリングの結果は、骨格細胞の活動電位時間（APD）が、心臓細胞と比較して短いこと（筋芽細胞および筋線維について、それぞれ、1.6msおよび2.8ms）、ならびに、骨格から骨格、および骨格から心臓への励起の主要な制限であることを決定した。高度な細胞間カップリングが、それら自体の再分極の前に、2.5ms以内で、十分に速く、それらの下流に隣接する細胞を励起するために骨格細胞に必要とされた。心臓APDは長く（178ms）、そして電荷を帯びた細胞が再分極する前にそれらの下流の隣接細胞に電荷を与えるために、心臓細胞にとって長い時間が存在した。細胞間のカップリングの減少は、隣接する細胞に電荷を与えるために必要な時間を増大させた。均質な鎖における細胞から細胞への励起をなお可能にするための細胞間カップリングの減少の比は、心室、骨格筋芽細胞、および骨格筋線維の細胞型について、それぞれ、45：5：1であった。混合した鎖において、励起の限定要因は骨格細胞が供給源の細胞であったといういくつかの例であった。
【０１１０】
これらの結果は以下のことを実証している：1）短い骨格活動電位は、心臓細胞に十分な励起電荷を提供する容量を制限することによって、骨格から心臓への伝導を制限すること；2）骨格筋芽細胞の筋線維への分化は、励起容量をさらに制限すること；3）ギャップジャンクションの非常に高レベルのカップリングが、骨格から心臓への首尾よい伝導のために必要であること。
【０１１１】
従って、細胞間カップリングを減少させる状態は、移植された骨格細胞と、隣接する心筋との間の電気的な伝達を顕著に減少させる。電気的な伝導の遅延またはブロックは、潜在的に生命に脅威となる不整脈をもたらし得る。
【０１１２】
実施例2：骨格筋移植の電気生理学的結果
心筋への骨格筋移植の電気生理学的結果を評価するために、本発明者らは、心臓伝導を評価するためのインビボモデルを利用した。心臓伝導系の特定の領域への遺伝子移入の実行可能性は、以前に実証されてきた（Leeら、1198 PACE 21-II: 606; Gallinghouseら、1996年11月、Am Heart Assoc.; 米国特許第6,059,726号）。例えば、ラットおよびブタの房室結節における組換えβ-ガラクトシダーゼの高度に効率的および特異的に局在化した発現が記載されてきた。房室結節の注入の正確さおよび再現性は、ラットにおける房室ブロックの産生によって確認されてきた（Leeら、1998 J Appl Physiol. 85(2): 758-763）。心房と心室との間の電気的伝達のための電気的に絶縁された電線として、房室伝導軸は、心臓電気生理学の研究のための戦略的な位置にある。
【０１１３】
骨格筋移植が房室結節の電気生理学的特性への伝導を変化させるか否かを決定するために、房室結節注入についてのラットモデルを利用した（Leeら、1998 J Apl Physiol. 85(2): 758-763）。動物を化学的に脱神経させ（アトロピンおよびプロパノールを使用して、自律神経系の影響を阻害する）、そして右心房過剰駆動ぺーシングおよび心房プログラムされた超刺激を用いて、注入前および屠殺の時点での両方で研究した。表面ECG PR間隔を、房室結節のブロックサイクル長（AVBCL）（房室伝導が連続的により長くなり、次いで伝導し損なう速度）、および有効不応期（ERP）（心房超刺激が房室結節を通して伝導し損なうカップリング間隔）とともに測定した。骨格筋芽細胞（1×105, 15μl）またはビヒクルの単一の注入を、ラットの房室結節に注入した（n=8）。
【０１１４】
房室ジャンクションの電気生理学的特性は、骨格筋芽細胞の移植を伴う動物において有意に変化した。Wenkebachサイクル長（70.0±4.4対57.0±5.0m秒；p<0.01）および房室結節不応期（113.8±5.6対87.0±6.2m秒；p<0.005）の有意な変化を、対照動物に対して比較して、骨格筋芽細胞を注入したラットにおいて記録した。房室結節の組織学的試験は、炎症が最少から炎症を含まない、約10％の房室結節が含まれたことを示した。組織学的に、房室伝導軸は対照のビヒクル注入において正常に現れた。興味深いことに、PR間隔は、有意な変化を示さず、これは、心臓伝導特性についての表面EKGマーカーの非感受性を反映する。
【０１１５】
これらの結果は、移植された骨格筋芽細胞が（房室結節の小さな部分を含む場合でさえ）心臓伝導を変化させ、かつ遅い伝導または伝導ブロックの領域をもたらし得るという証拠をさらに加える。従って、骨格筋芽細胞は管状筋細胞に分化し、ギャップジャンクションを形成するそれらの能力を損失するので、電気的インパルスを伝播する能力は減少する。
【０１１６】
材料および方法
以下の材料および方法を実施例3〜7のために使用した。
【０１１７】
骨格筋芽細胞の単離および培養
このプロトコールは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物研究についての委員会によって認可され、連邦政府のガイドラインに従って行われた。新生仔骨格筋芽細胞を、以前に記載されたように、2〜5日齢C3H新生仔マウスから酵素分散によって単離し、そして以前に記載されたように培養した（Rando, T., およびBlau, H.M.(1994), J. Cell. Biol. 125, 1275-1287）。単離後、細胞を増殖培地（GM）（80％ F-10培地 (GIBCO BRL), 20％ FBS (HyClone Laboratories, Inc.), ペニシリンG 100U/ml, およびストレプトマイシン 100μg/ml, β-FGF 2.5ng/ml (ヒト, Promega Corp)）を用いて培養した。骨格筋芽細胞を、加湿した95％空気および5％CO2中で、GM培地中で維持した。一旦培養が75％コンフルエンシーを達成したら（0日目）、筋芽細胞を、GM培地または分化培地（DM）（98％DMEM、2％ウマ血清（HyClone）、ペニシリンG 100U/ml, およびストレプトマイシン 100μg/ml）に変更するかのいずれかで培養した。DM中で培養した筋芽細胞を、加湿した95％空気および10％CO2中でインキュベートした。筋芽細胞を、0日目、2日目、4日目、7日目にそれぞれ、RNAおよびタンパク質の抽出のために収集した。
【０１１８】
コネキシン43の産生
ラットコネキシン43（Cx43）cDNAを、MFGレトロウイルスベクターにクローニングし；そして以前に記載されたように、マウス筋芽細胞に形質導入した（Springer ML, Chen AS, Kraft PE, Bednarski M, Blau HM., Molecular Cell. 1998, 2: 549-558）。このベクターは、筋肉において安定に発現されることが示されてきた（Dhawan J., Pan LC, Pavlath GK, Travis MA, Lanctot AM, Blau HM, Science 1991: 254, 1509-1512）。あらかじめE.coli β-ガラクトシダーゼ（β-gal）遺伝子（TR/Z）を発現する初代筋芽細胞を、対照筋芽細胞として使用した（Springer, M.L., およびBlau, H.M., Som. Cell. Mol. Genet. 1997: 23, 203-209）。
【０１１９】
RT-PCRを使用するmRNAレベルの決定
培養細胞からのRNAを、Qiagenキット（Qiagen,Inc.CA）を使用して調製し、分光光度法によって定量した（A260およびA280測定）。各試料のRNA（1μg）を、オリゴ-dTを使用して37℃で1時間逆転写し、そして同じ量のcDNAを、コネキシン43、ミオゲニン、myoD、デスミン、およびGAPDHについて、それぞれ増幅した。この研究において使用した異なるプライマーを表2に記載した。94℃で5分間の変性後、増幅を、特定のサイクル（94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間）について行い、続いて、別の5分間、72℃のサイクルを行った。GAPDHおよびコネキシン43についての生成物を半定量するための最適サイクルは25であり；ミオゲニン、myoDおよびデスミンについては22であった。PCR産物を、2％アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、そしてNIHソフトウェアを用いるデンシトメトリーによって分析した。コネキシン43、ミオゲニン、myoD、およびデスミン発現のレベルを、GAPDHのレベルに規準化し；0日目のレベルを1に設定した。
【０１２０】
（表２）  実験的研究において使用したプライマーの概要
2005527482.tif 000003
【０１２１】
ウェスタンブロッティングを用いるタンパク質発現の検出
全可溶性タンパク質を培養細胞から抽出し、そしてBradford法によって定量した。可溶性タンパク質（40μg）を、コネキシン43、MHC、P21タンパク質の検出のために、10〜20％分離ゲルを使用するSDS-PAGEを介して分離した。タンパク質を、HYBOND（商標）-ECLニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットし、そして免疫反応を、ECL検出キットを使用して、記載されたように実行した。コネキシン43を、抗コネキシン43ウサギポリクローナル抗体（Zymed Laboratories, Inc. Ca.）（1:1000）を使用して検出した。ミオシン重鎖タンパク質を、Mf-20抗体（Developmental studies hybridoma bank, University of Iowa）（1:2000希釈）を用いて検出した。P21タンパク質を、P21抗体（Chemicon international, Inc. Cz.）（1:500希釈）を用いて検出した。
【０１２２】
免疫蛍光分析
コネキシン43、MHC、デスミンについての免疫蛍光法を、Tomakidi P, Cheng H, Kohl A, Komposch G, Alonso A, Cell Tissue Res, 2000; 301(2): 323-327によって記載されるように実行した。手短に述べると、筋芽細胞をGM培地とともにチャンバースライド上に配置した。70〜80％コンフルエンスで、培地を、GM中に維持するか、またはDMに変更するかのいずれかを行った。細胞を、0日目、2日目、4日目、および7日目に収集した。PBS中、4％パラホルムアルデヒドを用いる固定化の後、および0.2％triton X-100/PBSを用いる固定液透過化処理の後に、細胞を3％ BSAで1時間ブロックし、そして一次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。PBSを用いる3回の洗浄の後に、FITC-結合体化二次抗体を使用して1時間インキュベーションした。デスミン抗体（Sigma, St. Louis, MO）、コネキシン43（Zymed Laboratories, Inc. Ca）、およびMF-20（Developmental studies hybridoma bank, University of Iowa）についての希釈は、それぞれ、1:100、1:100、および1:50であった。
【０１２３】
マイクロインジェクション技術
ギャップジャンクションは、ギャップジャンクション透過性の色素、ルシファーイエロー（Molecular Probes, Or.）を用いてマイクロインジェクションした細胞によって評価した。マイクロインジェクションを、以下において実行した：1）対照（TR/Z）およびCx43筋芽細胞、70-80％コンフルエンシーで、2）TR/ZおよびCX43管状筋細胞、ならびに3）同時培養した、成体ラット心筋細胞（ARC）および成体骨格筋芽細胞または管状筋細胞。色素溶液は、滅菌蒸留水中、2％ルシファーイエロー（ギャップジャンクション透過性）および1％テトラメチルローダミン−デキストラン（ギャップジャンクション不透過性；Molecular Probes）からなった。マイクロインジェクションを、Micromanipulator 5171、FemtoJet、Eppendorfを用いて、0.5±0.2μmチップマイクロピペット（Femtopips、Eppendorf）を通して、0.3秒の時間の80hpaのパルス圧によって実行した。培養細胞を、10％FBSを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で、洗浄および培地の置き換えを行った。インジェクションを、位相および蛍光光学機器を備えたNikon TE300顕微鏡を用いて行った。
【０１２４】
実施例3：ギャップジャンクションタンパク質の発現
コネキシン43をコードする核酸を、上記のように骨格筋細胞に導入した。組換えCx43-発現筋芽細胞または管状筋細胞に分化した組換えCx43-発現筋芽細胞の間の機能的ギャップジャンクションの形成を、他の型の筋芽細胞または管状筋細胞とともに評価した。最初にCx43を発現し、次いで管状筋細胞への分化の間にCx43発現をダウンレギュレートする対照（TR/Z）筋芽細胞を、機能的ギャップジャンクションおよび対照筋芽細胞における色素移動についての対照として利用したが、対照管状筋細胞においては利用しなかった。
【０１２５】
図2A〜2Dにおいて、対照細胞およびCx43細胞におけるCx43 mRNA（図2AおよびB）およびタンパク質の変化（図2CおよびD）を示す。図2Aは、RT-PCR実験のアガロースゲル電気泳動の写真であり、0日目、2日目、4日目、および7日目での対照細胞（TR/Z）および組換えCx43-発現細胞のmRNA Cx43レベルを示す。図2Bは、0日目、2日目、4日目、および7日目での、3つの対照試料および3つの組換えCx43-発現細胞試料についてのRT-PCRによって決定されたCx43 mRNAの平均レベルの図解的説明である。図2Aおよび2Bは、コネキシン43mRNAレベルが、TR/Z対照（形質転換されていない）骨格管状筋細胞において7日目までに有意にダウンレギュレートされたことを示すのに対して、対照的に、Cx43-改変された細胞は、0日目と７日目との間にCx43 mRNA発現の有意な違いを示さなかった。このことは、コネキシン43遺伝子を用いるレトロウイルス形質導入が達成され、そしてCx43が対照管状筋細胞とは違って成熟管状筋細胞中で発現されたことを示す（7日目）。
【０１２６】
図2Cおよび2Dは、図2Aおよび2Bにおいて示されたCx43 mRNAについて分析された同じ細胞に関連するCx43タンパク質レベルを示す。図2Cは、Cx43タンパク質についてのウェスタンブロットの写真であり、これは、0日目、2日目、4日目、および7日目での対照細胞およびCx43-発現細胞に存在するCx43-タンパク質の相対量を示す。図2Dは、0日目、2日目、4日目、および7日目での3つの対照細胞試料および3つの組換えCx43発現細胞試料中のCx43タンパク質の相対量を決定するためのCx43ウェスタンブロッティング実験の図解的説明である。タンパク質発現結果は、RT-PCR結果と一致し、このことは、組換えCx43の発現が、7日目で対照細胞におけるコネキシン43の損失をレスキューし得ることを確証する（図2Cおよび2D）。図2Aおよび2Bに示されたRT-PCRの結果は、対照細胞において予測されたCx43 mRNAレベルは次第に低下し、そして7日目にはほぼなくなったのに対して、組換えCX43発現細胞についてのCx43 mRNAのレベルは、0日目から7日目を通して変化しなかったことを実証する。GAPDHを、これらのRT-PCR研究における内部標準として利用した。対照細胞において、Cx43についての抗体を用いるウェスタンブロッティングは、CX43発現が、2日目でダウンレギュレートされ、そして4日目（管状筋細胞形成の間）より後はほぼなくなったのに対して、組換えCx43-発現細胞はいかなるダウンレギュレーションをも示さず、そして7日目ではアップレギュレーションさえ検出され得たことを示した。N-カドヘリンのmRNAおよびタンパク質発現レベルの違いは、分化の前後で、骨格筋芽細胞において見い出されなかった。
【０１２７】
機能的ギャップジャンクションの形成を調べるためのマイクロインジェクション研究を、対照細胞（筋芽細胞および管状筋細胞）および組換えCx43-発現細胞（筋芽細胞および管状筋細胞）で完了させた。インジェクトした細胞を、ローダミンデキストロンおよびルシファーイエローで標識した。ルシファーイエローは1つの細胞から別の細胞に、機能的ギャップジャンクションを通しての移動が可能である。図3の位相差パネルにおける黒の矢印は、実験の各々のセットにおけるインジェクトされた細胞を示す。図3は、骨格筋芽細胞または管状筋細胞の間のマイクロインジェクション研究の写真を示し、これは、ローダミンまたはルシファーイエロー色素の相対的な移動を示す。図3の各パネルは、ローダミンまたはルシファーイエロー蛍光色素のいずれかについての位相差顕微鏡および適切な蛍光照射の下での関心対象の細胞を示す。図3の行Aは、他の対照筋芽細胞を接触させた、Cx43を発現する対照筋芽細胞の写真である；行Bは、Cx43筋芽細胞からCx43筋芽細胞の写真である；行Cは、対照管状筋細胞（Cx43発現なし）から対照管状筋細胞を示し、そして行DはCx43管状筋細胞からCx43管状筋細胞の写真を示す。
【０１２８】
これらのマイクロインジェクション研究は、骨格筋芽細胞において、色素移動（ルシファーイエロー）が、対照（TR/Z）およびCx43筋芽細胞の両方において観察され得ることを示す（図3；行AおよびB）。DM培地を用いる培養の7日目より後では、対照筋芽細胞から形成した管状筋細胞において色素の移動は観察され得なかった（図3；行C）。色素移動は、分化培地中に置かれたCx43形質導入された骨格細胞において7日間保持された（図3；行D）。要約すれば、これらのマイクロインジェクション実験は、色素移動が、分化培地中に置かれたCx43形質導入された骨格筋芽細胞において起こったが、対照管状筋細胞においては起こらなかったことを示した。
【０１２９】
実施例4：ギャップジャンクション機能および同時培養実験
筋芽細胞と、培養した成体ラット心筋細胞（ARC）との間のギャップジャンクション形成を評価するために、単一の成体ラット心室筋細胞を、200〜250g体重の雌のSprague-Dawleyラットから、標準的な方法によって酵素的に単離した。手短に述べると、腹腔内麻酔（フェノバルビタール100mg/kg）の後に、ラット心臓を迅速に摘出し、Langendorff技術を使用して、大動脈を介して、逆行的に灌流した。灌流を、溶液A（通常のCa2+を含まない溶液、NaCl 134mM、KCl 5.4mM,Hepes 10mM、グルコース 10mM、MgCl2 1mM、NaH2PO4 0.33mM、NaOHでpH 7.4に滴定）を使用して37℃で5分間実行し、後で、1mg/mlコラゲナーゼ（タイプB、Boehringer Mannheim, Germany）を有する溶液A、0.1mM CaCl2で約15分間灌流し、次いで、溶液AおよびCaCl2 0.2mMで5分間、洗い流した。その後で、左心室を取り出し、小さな断片に切り刻み、これを振盪しながら37℃で10分間、ガラスのコニカルフラスコ中で、20ml 溶液Aおよび0.1mM CaCl2とともにインキュベートした。細胞懸濁液を濾過し（200ミクロンメッシュ）、濾液を5分間沈殿させた。上清のCa2+濃度を、1mM Ca2+含有溶液を用いて、0.5mMの最終濃度まで、漸進的に増加させた。ARCを、10％FBS、ペニシリンG 100U/ml、およびストレプトマイシン 100μg/mlを補充したHAM-F-12/M119（1:1）中で、ラミニンコートしたディッシュ中で、104ロッド形状細胞cm-1の密度で増殖させた。
【０１３０】
血清含有培地中で、ARCは、脱分化／再分化として記載され、ロッド形状の損失および筋原線維の分解および引き続く拡散、ならびに収縮性装置の再組織化によって証明される形態学的変化を受ける。3日目に、シトシンアラビノウラノシド（5μM）を、線維芽細胞の過剰増殖を妨害するために加えた。ARCの大部分は、7日目までに再分化し、そして収縮活性が観察された。分化／再分化の完了後、骨格筋芽細胞（104/cm2）をARC培養に加えた。これらを、HAM-F-12/M199培地中に一晩保持し、次の日に、マイクロインジェクションを、筋芽細胞とARCとの間の色素移動を評価するために実行した。管状筋細胞形成を誘導するために、培地をDMに変更し、そしてマイクロインジェクションを、管状筋細胞形成後に実行した（7日目）。
【０１３１】
心筋細胞と対照細胞（骨格筋芽細胞および管状筋細胞）との間の、または組換えCx43-発現細胞（骨格筋芽細胞および管状筋細胞）を用いる、機能的ギャップジャンクションの形成を調べるためのマイクロインジェクション研究を完了させた。インジェクトした細胞を、ローダミンデキストロンおよびルシファーイエローで標識した。ルシファーイエローは1つの細胞から別の細胞に、機能的ギャップジャンクションを通しての移動が可能である。図4における黒の矢印は、実験の各々のセットにおけるインジェクトされた細胞を示す。同時培養実験において、色素の移動は、成体ラット心筋細胞（ARC）と対照筋芽細胞との間で（これは、CX43を発現する、図4、行A）、またはCx43筋芽細胞を用いて（図4、行B）観察され得る。分化培養において、7日目の後でさえ、Cx43細胞はARCとの色素移動が可能であった。このことは、機能的ギャップジャンクションを示す（図4。行D）。対照的に、図4、行Cに示されるように、対照骨格管状筋細胞とARCとの間の色素移動はなかった。要約すると、これらの実験は、1つの細胞において組換えコネキシンを発現することによって、2つの異なる細胞型間の機能的ギャップジャンクションを形成することが可能であることを実証することによって、本発明の独特かつ新規な特徴を示す。特に、機能的ギャップジャンクションは、Cx43を過剰発現するように改変された成体骨格筋細胞と心筋細胞との間で形成され得る。
【０１３２】
実施例5：骨格筋芽細胞分化に対するコネキシン43発現の効果
骨格筋芽細胞の分化に対するCx43発現の効果を決定するために、他のタンパク質の発現レベルを分析した。図5は、対照細胞およびCx43細胞における、管状筋細胞への筋芽細胞の分化についての強力な2つのマーカーである、MHCおよびデスミンの発現レベルを分析する免疫蛍光研究からの結果を示す（MHC：図5、上のパネルおよびデスミン：図5、下のパネル）。対照の骨格筋芽細胞は、DMを用いる7日間のインキュベーションの後に多核性の管状筋細胞に分化した。コネキシン43群においては、管状筋細胞はDM中で14日目より後でさえ形成しなかった。明確に、組換えCx43の発現は、筋芽細胞が管状筋細胞を形成することを妨害した。図5に示した免疫蛍光研究は、MF-20（MHC）およびデスミン（管状筋細胞への筋芽細胞の分化についての強力な2つのマーカー）が、対照試料中では7日目に存在し、そしてCX43発現試料においては存在しなかったことを実証する。MHCおよびデスミンの結果を、それぞれ、図5の上のパネルおよび下のパネルに示す。ウェスタンブロッティング研究からのMF-20発現は、免疫蛍光研究と一致した。P21発現（細胞有糸分裂静止のマーカー）は、これらの群の間と一致した変化を有し、そして0日目から7日目まで、漸進的にアップレギュレートされた。このことは、TR/ZおよびCx43細胞の両方が、培地がDMに切り換えられた場合に、分裂をやめることを反映する。
【０１３３】
組換えコネキシン43の発現が管状筋細胞に対して有害であるか、または筋芽細胞から管状筋細胞への分化の間にのみ有害であるかを決定するために、骨格筋芽細胞および管状筋細胞を、Cx43遺伝子を有する複製欠損アデノウイルス（Ad Cx43）でトランスフェクションした。Ad Cx43でトランスフェクションし、分化培地に移した筋芽細胞は、管状筋細胞形成をし損なった。対照的に、Ad Cx43でトランスフェクションした十分に分化した管状筋細胞は、対照管状筋細胞と類似した、順序立ったアレイ中で、正常な外見およびそれ自体整列した状態のままであった。Cx43を有しない対照アデノウイルスでのトランスフェクションは、正常に発達した。
【０１３４】
実施例6：骨格筋におけるCx43発現は房室結節における電気的伝導を改善する
コネキシンの強制的な発現が心臓伝導を改善するか否かを決定するために、骨格筋細胞にCx43を形質導入し（インビトロ実験において使用したのと同じ細胞）、そして免疫欠損ラットの房室結節にインジェクトした（Leeら、1998 J Appl Physiol. 85(2): 758-763）。Cx43形質導入された骨格筋芽細胞をインジェクトした動物（2.5×106細胞／25μl；n=8）を、対照骨格筋芽細胞をインジェクトした動物（2.5×106細胞／25μl；n=5）と比較した。表面ECG PR間隔を、房室結節のブロックサイクル長（AVBCL）（房室伝導が連続的により長くなり、次いで伝導し損なう速度）、および房室結節有効不応期（AVN ERP）（心房超刺激が房室結節を通して伝導し損なうカップリング間隔）とともに測定した。
【０１３５】
PR間隔の有意な短縮化が、Cx43形質導入した骨格筋芽細胞をインジェクトした動物において、対照骨格筋細胞をインジェクトした動物と比較した場合に観察された（40.6±1.9ms対47.6±2.5ms；p<0.0001、対応のあるt検定）。AVBCL（96.7±10ms対112.0±11.0ms；p<0.03、対応のあるt検定）およびAVN ERP（80.0±9.2ms対100.0±16.0ms；p<0.001、対応のあるt検定）は、Cx43形質導入した骨格筋芽細胞をインジェクトした動物において、対照骨格筋芽細胞をインジェクトした動物と比較した場合に、有意に改善された。
【０１３６】
これらの結果は、AVジャンクションを通しての電気的な伝導が、Cx43形質導入した骨格筋芽細胞をインジェクトした動物において、対照骨格筋芽細胞をインジェクトした動物と比較した場合に、有意に改善されたことを実証する。従って、組換え細胞におけるコネキシン産生は、組換え細胞と、隣接する心筋細胞との間の電気的接続を提供し、次には、心房と心室との間のより良好な電気機械的な同調性を提供する。
【０１３７】
実施例7：以前に心筋梗塞を有する患者におけるCx43-発現細胞の自系移植
ヒトにおける心筋症の治療は以下のようにして実行される。筋肉生検が、前方、側方、または下方の壁の心筋梗塞を経験した患者から得られ、この患者は、冠動脈バイパス移植（CABG）手術を必要とする患者であってもよいし、そうでなくてもよい。生検から集められた骨格筋細胞をエキソビボで培養し、そして上記の方法によってヒトコネキシン（例えば、Cx43）を発現するように遺伝的に改変される。改変された骨格筋を、組換えコネキシン発現について、コネキシンタンパク質についての免疫蛍光アッセイによって分析する。特定の例において、細胞を、上記のインビトロルシファー色素アッセイによって、心筋細胞を用いて機能的ギャップジャンクションを形成する能力について分析する。
【０１３８】
改変された筋肉細胞の分析後、治療的に有効な量の改変筋肉細胞を患者の心臓組織に移植する。特定の例において、患者自身の骨格筋細胞が心臓治療のために使用され得ない場合に、組換えヒトCx43を発現する組換え筋肉細胞株が、当業者に公知の免疫抑制剤の適切な使用とともに利用される。次いで、Cx43発現筋肉細胞が血管内に注入カテーテルを用いて移植され、このカテーテルは、種々の供給源（例えば、Johnson＆JohnsonのNOGAシステムのような注入可能なカテーテル、BioHeartのMyocath、Biocardia, Boston ScientificのStilleto、Transvascular catheterなど）から入手され得るか、またはCABG手順のための皮下注射器を用い得る。患者は、手術後に、治療の効力を評価するためにモニターされる。
【０１３９】
患者
患者は、以前の心筋梗塞または非虚血性の心筋症の診断を有する、一般的に18〜75歳の間の男性および女性である。
【０１４０】
生検
骨格筋生検を、その手順が保証される場合に、患者についての予測された冠動脈バイパスの数週間以内に（例えば、3-4週間）得る。自系の骨格筋細胞（筋芽細胞および管状筋細胞）を骨格筋生検から単離する。無菌外科条件の下で、オープン生検技術を利用し、腹部筋肉から骨格筋を切除する。生検を、患者の大腿（大腿四頭筋−外側広筋）または中部ふくらはぎ（腓腹筋）から得る。生検から夾雑する筋膜を除去する試みを行う。
【０１４１】
大腿四頭筋−外側広筋
切開を、大腿の下3分の1で大腿の前外側の面に沿って長軸方向で行う。解剖を、軟組織および筋膜を通して実行し、そして大腿四頭筋−外側広筋を同定および露出させる。筋肉のセグメントを、筋肉線維の長軸に沿って、長軸方向で切除し、そして輸送培地の容器に配置する。
【０１４２】
腓腹筋
切開を、中部ふくらはぎにおける後外側の腓腹筋領域で長軸方向で行う。解剖を、深い筋膜を通して、腓腹筋を露出させるように行う。筋肉のセグメントを、筋肉線維の長軸に沿って、長軸方向で切除し、そして輸送培地の容器に配置する。  
【０１４３】
自系細胞のエキソビボ伝播および遺伝的改変
ヒトコネキシン構築物を有するエキソビボでの自系骨格筋細胞の単離、増大、および形質導入のために使用される方法およびプロトコールは上記に記載した通りである。例えば、ヒトコネキシン（例えば、Cx43）cDNAは、MFGレトロウイルス構築物にクローニングされ、そしてSpringer MLら、Molecular Cell. 1998, 2: 549-558によって記載されたものと同様の様式で自系骨格筋細胞に形質導入される。この構築物は、自系筋肉細胞において、一般的に安定に発現される。
【０１４４】
遺伝的に改変された細胞は、約106-109細胞/mlの濃度を提供するために培養される。改変された細胞は、患者への移植の前に、冷蔵（通常、0℃付近）で貯蔵され得る。トリパンブルー染料排除を介する細胞生存度が、細胞生存度アッセイとして使用され得る。効力は、上記のような、免疫蛍光および／または機能的ギャップジャンクションアッセイによってCx43発現の検出を介して確認される。
【０１４５】
経皮的アプローチを介する組換えコネキシン発現細胞の移植
心筋への組換えコネキシン発現細胞の移植は、カテーテル送達システムを使用することによって、組換え細胞を投与する段階を包含する。この組換え細胞は、以前の梗塞の部位における無動の心筋傷跡中に注入される。標的とされた梗塞の領域のサイズに依存して、4億個〜10億個の間の細胞が懸濁液として注入される。複数回の注入が、組換え細胞を送達するために使用され得る。
【０１４６】
注入は、あらかじめ決定された深さに、カテーテルの末端の穴を通して針を進ませることによって実行される。針の管腔の近位の末端が、組換え細胞懸濁液を含む目盛り付きシリンジに装着される。蛍光透視的、心臓内心エコー図の、または磁気共鳴画像の誘導による心臓内表面に対する適切な位置決めの後、針が心筋に進行し、そして細胞懸濁液が注入される。注入の完了の際に、針はカテーテルに引き込まれる。この方法は、細胞の移入が完了するまで標的領域で反復される。傷跡の全体の領域（その周辺を含む）をカバーするような試みが行われる。細胞治療がCABGの間に送達される場合、針およびシリンジは、心外膜的に細胞を上記の無動領域に送達するために使用される。
【０１４７】
治療のモニタリングおよび評価
臨床状態、有害事象、12のリード心電図、24時間の移動性の心電図、および日常的な臨床実験試験を、局所的な左心室壁機能の評価のために、当業者に公知の方法および技術によって実行する。追跡調査を、移植後の選択した期間に（例えば、1、2、3、4、6、および12ヶ月）実行し得、ベースライン（すなわち、治療前）と比較する。特定の例において、治療の評価は、局所的な壁の動作のドブタミンストレス性の心電図の上昇、および移植の領域（梗塞領域）における壁の厚さ、コントラスト心室機能造影、または磁気共鳴画像を含み得る。治療後のモニタリングおよび評価は、梗塞内における、機能的筋肉の再生のレベルおよび同調した電気機械的伝導を決定するために使用され得る。
【０１４８】
実施例8：心臓伝導疾患を有する患者における組換えCx43-発現細胞の自系移植
患者
患者は、心臓伝導疾患（すなわち、心臓ブロック）の診断を有する、1〜90歳の間の男性および女性である。心臓ブロックは、先天的、後天的、医原性（例えば、バルブ手術またはカテーテル切除の合併症として）、または通常の加齢プロセスの一部であり得る。実施例7において記載した方法を利用して、100万から1億の改変細胞を、0.2〜0.5mlの容量で房室結節領域に注入し得る。組換えコネキシン細胞は、25ゲージシリンジを介して、房室結節動脈を介して、または経皮送達系を介して外科的に送達され得る（例えば、米国特許第6,059,726号を参照されたい）。
【０１４９】
治療のモニタリングおよび評価
心臓ブロック（およびその治療）の検出は、表面ECGによって容易に検出され得る。運動ストレス試験、ホルターモニタリング、または電気生理学的研究は、治療を評価するための代替的な補足的な試験である。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図1A〜1Dは、筋芽細胞の管状筋細胞への分化の異なる期間での活動電位パラメーターの図解的説明である。図1A：14日間にわたる静止膜電位（RMP）；図1B：14日間にわたる活動電位振幅（APA）；図1C：14日間にわたる最大上昇速度（Vmax）；図1D；14日間にわたる、50％の活動電位持続時間（APD50）再分極。
【図２】図2Aは、0、2、4、および7日目の対照細胞（TR/Z）およびCx-43発現細胞のmRNA Cx43 RT-PCR実験のアガロースゲル電気泳動の写真である。  図2Bは、0、2、4、および7日目の3つの対照試料および3つの組換えCx43-発現細胞試料についてのRT-PCRによって決定されたCx43 mRNAの平均レベルの図解的説明である。  図2Cは、0、2、4、および7日目の対照細胞およびCx-43発現細胞に存在するCx43タンパク質の相対量を示す、Cx43タンパク質についてのウェスタンブロットの写真である。  図2Dは、0、2、4、および7日目の3つの対照細胞試料および3つのCx-43発現細胞試料中でのCx43タンパク質の相対量を決定するためのCx43ウェスタンブロット実験の図解的説明である。
【図３】図3は、ローダミンまたはルシファーイエロー色素の相対的な移動を示す骨格筋芽細胞または管状筋細胞の間のマイクロインジェクション研究の結果を示す一連の写真である。行A：対照筋芽細胞から対照筋芽細胞；行B：Cx43筋芽細胞からCx43筋芽細胞；行C：対照管状筋細胞から対照管状筋細胞；行D：Cx43異常管状筋細胞からCx43異常管状筋細胞。
【図４】図4は、成体ラット心筋細胞（ARC）と骨格筋芽細胞または管状筋細胞との間のマイクロインジェクション研究の結果を示す一連の写真である。インジェクションされた細胞はローダミンおよびルシファーイエローで標識された。行A：ARCから対照筋芽細胞；行B：ARCから組換えCx43発現細胞；行C：ARCから対照管状筋細胞；行D：ARCから組換えCx43発現異常管状筋細胞。
【図５】図5は、対照細胞およびCx43細胞において、管状筋細胞への筋芽細胞の分化についての2つの強力なマーカーである、MHCおよびデスミンの発現レベルを分析する免疫蛍光研究からの結果を示す一連の写真である。
【図１】
2005527482.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月14日(2004.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え哺乳動物細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立するための方法であって、
心筋細胞を、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え哺乳動物細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立される段階を含む、方法。
【請求項２】
組換え細胞が、骨格筋細胞、幹細胞、および心臓細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組換え細胞が骨格筋細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
コネキシンタンパク質がコネキシン43タンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
接触させる段階が組換え細胞を被験体の心筋組織に移植する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立された後で、該組換え細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法であって、
心筋細胞を、コネキシンタンパク質を産生するように遺伝的に改変された組換え骨格筋細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え骨格筋細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え骨格筋細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立される段階を含む、方法。
【請求項１０】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
骨格筋細胞が骨格筋芽細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
組換え細胞と心筋細胞との間の電気的接続が確立された後で、該組換え細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
組換え骨格筋細胞と心筋細胞との間の電気的接続を確立する方法であって、
心筋細胞を、組換えコネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された組換え骨格筋芽細胞と接触させる段階であって、該心筋細胞と該組換え骨格筋芽細胞との間での電気的な接続の産生を提供するために十分な様式であり、該組換え骨格筋芽細胞と該心筋細胞との間の電気的接続が確立され、その結果、該組換え骨格筋芽細胞は該心筋細胞と類似する伝導特性を有する段階を含む、方法。
【請求項１４】
宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法であって、
治療的に有効な量の組換え哺乳動物細胞を宿主の心臓組織に導入する段階であって、該組換え細胞はコネキシンタンパク質を発現するように遺伝的に改変されており、該組換え細胞と該宿主心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効であり、該宿主中の心臓伝導障害が治療される段階を含む、方法。
【請求項１５】
組換え細胞が、骨格筋細胞、幹細胞、および心臓細胞からなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
組換え細胞が骨格筋細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
コネキシンタンパク質がコネキシン43タンパク質である、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
導入する段階が組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階を含む、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
組換え細胞が宿主に対して自系である、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物宿主中の心臓伝導障害を治療するための方法であって、
コネキシン43タンパク質を発現するように遺伝的に改変された治療的に有効な量の骨格筋細胞を宿主の心臓組織に導入する段階であって、導入された組換え骨格筋細胞と宿主の心臓組織の心筋細胞との間の電気的接続を確立するのに有効であり、該心臓伝導障害が治療される段階を含む、方法。
【請求項２３】
骨格筋細胞が成体骨格筋細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
骨格筋細胞が筋芽細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
導入する段階が組換え細胞を心臓組織の梗塞領域に移植する段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
組換え骨格筋細胞が宿主に対して自系である、請求項22記載の方法。
【国際調査報告】
2005527482.tif 000009
2005527482.tif 000010