(57)【要約】本発明は、遺伝子治療およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその他の核酸配列の細胞内送達によって、感染症および遺伝病を治療するための組成物および方法に関する。本発明は、有効量の、核酸配列の機能を改変する能力を有する治療用化合物と、有効量の、次の一般式を有するブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、病態の治療に有効な、治療のための送達用組成物を含む：式中、ポリオキシプロピレンで示されるオクタブロック共重合体の部分の平均総分子量は約５０００から約７０００ダルトンの間であり、ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％から約４０重量％の間を占めるような数であり、そしてｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約３０〜６０重量％から約９０重量％の間を占めるような数である。本発明はまた、生物活性を有するリバース・ブロック共重合体を用いる組成物および方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式を有するオクタブロック共重合体：
【化１】
2005500340.tif 000028
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）で示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）で示される部分がこの化合物の約１０重量％から約４０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約６０重量％から約９０重量％の間を占めるような数である、
と混合した、核酸の機能を改変する能力を有する化合物を含有する、ヒトまたは動物を治療するための治療用組成物。
【請求項２】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約５重量％から約２０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約８０重量％から約９５重量％の間を占めるような数である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
次の式を有するオクタブロック共重合体：
【化２】
2005500340.tif 000029
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％から約４０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約６０重量％から約９０重量％の間を占めるような数である、
と混合した、核酸の機能を改変する能力を有する化合物を含有する、ヒトまたは動物を治療するための治療用組成物。
【請求項８】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
次の式を有するオクタブロック共重合体：
【化３】
2005500340.tif 000030
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％から約４０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約６０重量％から約９０重量％の間を占めるような数である、
と混合した、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物を含有する組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含む、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物をヒトまたは動物に送達する方法。
【請求項１３】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
次の式を有するオクタブロック共重合体：
【化４】
2005500340.tif 000031
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％から約４０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約６０重量％から約９０重量％の間を占めるような数である、
と混合した、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物を含有する組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含む、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物をヒトまたは動物に送達する方法。
【請求項１８】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレンで示される部分の平均総分子量は約５，０００から約７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレンで示される部分がこの化合物の約５重量％から約２０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体の総分子量のポリオキシプロピレン部分がこの化合物の約８０重量％から約９５重量％の間を占めるような数である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
次の式を有するブロック共重合体：
【化５】
2005500340.tif 000032
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，０００から約２０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１％から９０％の間となるような数を示す、
と混合した、核酸の機能を改変する能力を有する化合物を含有する、ヒトまたは動物を治療するための治療用組成物。
【請求項２４】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，０００となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約９０％となるような数を示す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，７５０となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，２２０となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，０００から１０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約６，７５０ダルトンとなるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
次の式を有するブロック共重合体、
【化６】
2005500340.tif 000033
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，０００から２０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１％から９０％の間となるような数を示す、
と混合した、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物を含有する組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含む、核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物をヒトまたは動物に送達する方法。
【請求項３１】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約６，７５０となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，７５０となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，２２０となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１０％となるような数を示す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が、核酸、ベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、またはリボザイムから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，０００から１０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示す、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療および核酸の細胞内送達によって、感染症および遺伝病を治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の新しく、潜在的に有用な技術が開発されており、このような技術は将来の医療用治療剤および治療法の基礎を形成するであろう。かかる技術の例としては、遺伝子置換、アンチセンス遺伝子治療、三重鎖遺伝子治療およびリボザイムに基づく治療法が挙げられる。しかしながら、成功させるためには、これらの技術は、細胞膜、核膜および微生物の膜を横切って治療剤を送達するための効果的な手段を必要とする。
【０００３】
最近になって現れた技術、および多数の遺伝子の構造と機能を理解する我々の能力の進歩によって、所定の遺伝子の活性を選択的に消失させたりまたは修飾することが可能となっている。多くの方法によって、遺伝子の活性を改変することが可能である。たとえば、特定の遺伝子メッセージまたはウイルスの配列と相補的なオリゴヌクレオチド（「アンチセンス」化合物として知られている）がウイルスに対する阻害作用を有することが示されてきた。細胞またはウイルスの、標的とされたＲＮＡメッセージとハイブリッド形成するアンチセンス化合物を作製することによって、そのメッセージのタンパク質への翻訳を妨害するかまたは防止することが可能である。このような方法で、遺伝子の活性を調節することが可能である。
【０００４】
特定の遺伝子を不活性化させる能力によって、治療上の素晴らしい利益が提供される。たとえば、ウイルス遺伝子産物を探し出して破壊するアンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を用いて、ウイルス病と闘うことが理論上可能である。組織培養においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスおよびＡＩＤＳを引き起こすヒト免疫不全ウイルスによる感染を阻害している。変異したガン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とすることも可能かもしれない。アンチセンス技術は成長と増殖を制御する可能性を保持してもいる。しかしながら、遺伝子治療が機能するためには、治療用のアンチセンス化合物が細胞の原形質膜を横切ってサイトゾルまで送達されなければならない。
【０００５】
遺伝子の活性は、遺伝子治療として知られる技術において、センスＤＮＡを用いても修飾される。不具合の対象ではない「良好な」すなわち正常な遺伝子を投与することによって、不具合のある遺伝子は置換されるかまたは補充される。染色体に挿入されるかまたは細胞外のＤＮＡ中に存在するかもしれない、投与された正常な遺伝子は、正常なＲＮＡを産生し、正常な遺伝子産物を次々にもたらす。このようなやり方によって、遺伝子産物の生産の際の不具合および欠乏が修正されるのであろう。さらに、遺伝子治療には、細胞の正常な遺伝子の補充量を増やす可能性がある。たとえば、ＨＩＶ感染に対する耐性を細胞に与える遺伝子を、感染者のＴ細胞内に導入するという、ＨＩＶに対抗する一つの方法が提案されている。遺伝子治療のこの形式は「細胞内免疫化」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドなどの遺伝物質を哺乳動物に投与して、投与される核酸配列の遺伝子産物に対する免疫応答を惹起してもよい。このような遺伝子ワクチンは、次のようにして免疫応答を惹起する。最初に、核酸配列をヒトまたは動物に投与する。次に、投与された配列が発現して、ヒトまたは動物の内部で遺伝子産物が形成される。ヒトまたは動物の内部のこの遺伝子産物が異物として認識され、そしてヒトまたは動物の免疫系が遺伝子産物に対する免疫応答を開始する。しかしながら、細胞膜および核膜の両方を横切って遺伝物質を送達するのを促進するような、効果的な遺伝子送達システムがないので、このアプローチは現在のところ実施可能ではない。
【０００６】
最後に、遺伝子治療は、インビボで薬物を送達する方法として、用いられうる。たとえば、治療用化合物をコードする遺伝子を内皮細胞に送達することができる場合、その遺伝子産物が血流に到達することが促進されるだろう。現在のところ、エクスビボで細胞に遺伝子を送達して、次いで動物に再導入している。
【０００７】
レトロウイルスベクターを用いて、分離された細胞に、エクスビボで遺伝子を送達することが可能であり、次いで、このものを注入して患者に戻す。しかしながら、レトロウイルスベクターにはいくつかの欠点、たとえば、分裂中の細胞にだけ遺伝子を送達することが可能なこと、送達される遺伝子のランダムインテグレーション、不必要な遺伝子の改変が起こる可能性、および感染性を持つ野生型のレトロウイルの形態に戻る可能性などがある。アンチセンス遺伝子治療の別の欠点は、メッセンジャーＲＮＡのレベルで効力を有するということであり、このことは、サイトゾル中のすべてのｍＲＮＡまたは相当数のｍＲＮＡと相互作用する量でアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなければならないこと、そしてこのような処理はｍＲＮＡが活発に合成されている時にのみ有効であることを意味する。さらに、長期間効果的にするには、オリゴヌクレオチドをこのような多量のレベルで、ｍＲＮＡの合成の間、維持しなければならない。
【０００８】
新たに開発された「三重鎖ＤＮＡ」技術は、遺伝子調節における改善された代表例である。三重鎖ＤＮＡ技術は、オリゴヌクレオチド、及び、二本鎖ＤＮＡの特定の領域と特異的に結合する化合物を利用する。それによって、標的の遺伝子を不活性化する。三重鎖ＤＮＡ技術の利点の一つは、遺伝子の発現を改変するために、オリゴヌクレオチドまたは化合物のわずか一つのコピーしか必要としないことである。というのは、結合はＤＮＡレベルで行われ、ｍＲＮＡレベルではないからである。しかしながら、三重鎖ＤＮＡ技術には、オリゴヌクレオチドまたは化合物が、細胞膜だけでなく、微生物の感染症を治療する場合には微生物の膜を、または真核細胞の遺伝子の機能もしくは染色体ＤＮＡ内に組み込まれる外因性ＤＮＡの発現を改変する場合には核膜を、通過しなければならないという欠点がある。
【０００９】
別の新たな技術は、遺伝病の治療のために、リボザイムを治療目的に使用することに関するものである。リボザイムとは、ハイブリッド形成領域と酵素領域とからなる触媒性のＲＮＡ分子である。核酸配列の標的領域に特異的に結合するように、及び、その発現または遺伝子産物への翻訳を改変するようにその配列を切断するか、さもなければ酵素的に修飾するように、リボザイムが将来的に操作されてもよい。
【００１０】
したがって、遺伝子、ポリヌクレオチド、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、遺伝子治療に用いることができる遺伝物質を送達するシステムを改良するという切実な要求がある。より具体的には、遺伝子化合物およびその他の薬物ならびに治療用化合物が細胞膜を横切って輸送されるのを促進することができる、界面活性を有する非毒性の組成物についての要求がある。
【００１１】
後天性免疫不全症候群（ヒトのレトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスすなわちＨＩＶとも呼ばれるヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）によって引き起こされると考えられている疾患）すなわちＡＩＤＳの効果的な治療法についての特に差し迫った要求がある。その他のレトロウイルスと同じく、ＨＩＶはその遺伝物質としてリボ核酸すなわちＲＮＡを有する。ウイルスが宿主細胞に侵入すると、逆転写酵素と呼ばれるウイルスの酵素は、そのウイルスのＲＮＡを鋳型として利用して対応するＤＮＡ分子を組み立てる。このＤＮＡが細胞核を移動して宿主の染色体の中に自らを挿入する。そこではウイルスの複製のための土台が供給される。
【００１２】
ＨＩＶのケースでは、多くの場合、宿主細胞はＴ４リンパ球（免疫系において主要かつ調節的な役割を有する白血球）である。一旦Ｔ４細胞内に至ると、リンパ球が二次感染によって免疫的に刺激されるまで、このウイルスは潜伏し続けるようである。次いで、このウイルスが速やかに自己を複製して、宿主細胞を死滅させるか無効なものにする。結果として生じるＴ４細胞の枯渇、そして活性の喪失によって、健康な人には通常は害を与えない病原体による「日和見」感染症に患者を罹りやすくする。このウイルスは、その他の多数のメカニズムによっても宿主にダメージを与える。
【００１３】
現在のところ、ＡＩＤＳ感染に対抗する多数の治療法が研究されている。これらの研究中の治療法のうちのいくつかは、逆転写酵素がウイルスになるように定められたウイルスのＤＮＡを組み立てる時に、逆転写酵素を妨害することに基づいている。この目的のために用いられる薬物は、ＤＮＡのサブユニットを形成する核酸の化学的な類似体である。この類似体を感染細胞に与えると、逆転写酵素によって、伸長しつつあるＤＮＡ鎖内に類似体が取り込まれることになる。しかしながら、類似体は次のサブユニットのための正しい付着点を欠いているために、鎖は終結してしまう。末端が切り取られたＤＮＡは自己を宿主染色体内に組み込むことができない、すなわちウイルス複製の土台を供給できないので、感染の蔓延が停止する。ヌクレオチドをまねることによって機能すると考えられる化合物の一つは、アジドチミジン、すなわちＡＺＴである。しかしながら、ＡＺＴは重大な副作用を伴うことが知られており、そしてＡＩＤＳ疾患を緩和するその効力には疑問を持たれている。治療剤を感染部位に送達するために改良された手段および方法が利用できれば、ＡＺＴおよびその他の抗ウイルス性薬物ならびに抗菌剤の効き目を向上させることができるであろう。
【００１４】
発明の概要
本発明は、例えば細菌感染や、ＨＩＶならびにその他のＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスによる感染症などであるが、これらに限定されない、病態を治療するために、治療用薬物をヒトまたは動物に送達する方法を含む。特に本発明は、遺伝子治療およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその他の核酸配列の細胞内送達によって、感染症および遺伝病を治療するための組成物および方法に関する。
【００１５】
本発明は、有効量の、核酸配列の機能を改変する能力を有する治療用化合物と、有効量の、次の一般式を持つ、界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、病態を治療するのに有効な、治療のための送達用組成物を含む。
【化１】
2005500340.tif 000002
【００１６】
式中、ａは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で示される疎水性部分が、約７５０から約１５，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間の分子量を持つような整数であり、そしてｂは、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から約２０重量％を占めるような整数である。
【００１７】
本発明の別の側面は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体をもまた含む、本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体を含有する。
【化２】
2005500340.tif 000003
【００１８】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，０００から２０，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約２％から３０％の間となるような数を示す。
【００１９】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体の別の実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化３】
2005500340.tif 000004
【００２０】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，５００から８，５００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約７％から２３％の間となるような数を示す。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化４】
2005500340.tif 000005
【００２２】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約３，０００から７，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約８％から２０％の間となるような数を示す。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態は、式のポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化５】
2005500340.tif 000006
【００２４】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，０００から６，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１４％から１６％の間となるような数を示す。
【００２５】
一般的に、“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示し、約７％から２３％となる範囲が好ましく、８％から２０％の間となる範囲が最も好ましい。
【００２６】
別の側面において、本発明は、有効量の、核酸配列の機能を改変する能力を有する治療用化合物と、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及び疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）との共重合体を含有する、有効量の、生物活性を有する共重合体との、投与可能な混合物を含有する、病態を治療するのに有効な、治療のための送達用組成物を含む。ブロック共重合体は、開始剤の四官能性エチレンジアミンを基礎として構築される。生物活性を有する本発明の共重合体の好ましい実施形態において、生物活性を有する本発明の共重合体を含むブロック共重合体は次の一般式を有する。
【化６】
2005500340.tif 000007
【００２７】
式中：
ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）からなる、オクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００２８】
本発明の別の側面において、生物活性を有する共重合体は、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体を含む。次いで、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体を親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックに添加する。この結果、次の一般式を有するオクタブロック共重合体が得られる。
【化７】
2005500340.tif 000008
【００２９】
式中：
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；
ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）からなるオクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００３０】
特に有用な組成物は、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳を改変する能力を有する化合物、たとえば核酸、ベクター構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、リボザイム、またはその他の核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物と、上記のブロック共重合体、上記のオクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせのいずれかとの混合物である。
【００３１】
経皮、経口、経粘膜、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射および筋肉注射などの多数の経路によって本発明の組成物を投与することが可能であるが、局所的な経路に限定されるものではない。
【００３２】
したがって、本発明の目的は、治療用薬物送達手段を提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、治療剤と混合した場合に、一種以上の治療用核酸配列の機能改変薬剤を、食細胞などの細胞の内部に送達することを促進する組成物を提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、一旦細胞内に送達された薬剤と相乗的に作用する組成物を提供することである。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、核酸配列および核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物が細胞の原形質膜を横切って透過することおよび導入されることを促進する、界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、核酸配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと組み合わせて用いることによる、遺伝病および生理的障害を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００３７】
本発明の別の目的は、核酸またはベクター構築物を用いて、遺伝子の発現を操作するのに有用な組成物および方法を提供することである。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、ＤＮＡワクチンを提供することである。
【００３９】
本発明の目的の一つは、感染症を患う患者の治療に用いることが可能な組成物を提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは動物におけるウイルス感染の治療方法を提供することである。
【００４１】
本発明の別の目的は、動物およびヒトの両方においてウイルスの複製を阻害するのに有効な化合物および方法である。
【００４２】
本発明の別の目的は、ＨＩＶならびにその他のＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの複製を阻害するのに有効な化合物および方法を提供することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは動物における微生物感染の治療方法を提供することである。
【００４４】
本発明の別の目的は、ヒトまたは動物に注入する前に血液製剤中のウイルスを不活性化することである。
【００４５】
本発明のこれらのおよびその他の目的、特徴ならびに利点は、開示された実施形態についての次の詳細な説明と添付の請求の範囲を検討した後に明らかとなるだろう。
【００４６】
詳細な説明
本発明は、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと、核酸配列または核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物との混合物である遺伝子治療用組成物、ならびに遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳をその細胞内で改変するために必要とする場合に、ヒトまたは動物にこれらの組成物を送達する方法を含む。
【００４７】
ポリオキシエチレンのパーセンテージが小さいポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体、ブロック共重合体、およびそれらの組み合わせが、ＤＮＡおよびその他の化合物の細胞内への輸送を促進し、したがって、それらが、病気を治療するために治療剤をインビボで細胞内に送達するのに有用であることが、思いがけなく見出された。ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体の両者は、膜を再閉鎖することに特に有用であると考えられ、したがって、この両者によって、核酸配列またはその他の化合物が細胞内に導入されている細胞の生存率が増加すると考えられる。驚いたことに、本発明の非イオン性ブロック共重合体および／またはオクタブロック共重合体と核酸配列とを含有する組成物は、核酸配列のみの場合よりもＤＮアーゼによる分解作用の影響を受けにくいことも、見出されている。
【００４８】
本発明はさらに、微生物を死滅させるか、または微生物の増殖を阻害する治療用組成物および方法、ならびに、核酸配列の発現または機能を改変する治療用組成物および方法をも含む。本発明が有効な細菌の一例としては、マイコバクテリア種、たとえば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、マイコバクテリウム・アビウム、およびマイコバクテリウム・レプレなどがある。本発明が有効なその他の微生物には、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・ニューモニエ、リステリア・モノサイトゲネス、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、トキソプラズマ・ゴンディ、ニューモシスティス・カリニ、単純ヘルペスウイルス１型、サイトメガロウイルス、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、ならびに呼吸器合胞体ウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスならびに感染、ならびに、ＨＩＶもしくはヘルペスまたはそれらの抗原的に関連する系統によって引き起こされる感染症を含む、このようなウイルスによってヒトまたは動物において引き起こされる感染症を治療するための治療用組成物ならびに治療方法を含む。抗原的に関連する系統は、ＨＩＶに対して特異的な抗体と交差反応する系統である。当業者であれば、抗−ＨＩＶ抗体と分析対象のウイルス系統とを用いる標準的な免疫測定試験を行い、そして交差反応性が陽性のものを探索することによって、ＨＩＶと抗原的に関連するウイルス系統を容易に割り出すことが可能である。本明細書で開示される、界面活性を有する共重合体および／またはオクタブロック共重合体を含有する治療用組成物は、細胞内のそのようなウイルスの複製の阻害または抑制に効果的である。
【００５０】
本発明は、抗菌剤の送達や病態の治療に有用な治療用組成物を含み、この治療用組成物は、界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体もしくはオクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物との混合物を含有し、そして抗生物質または治療用薬物をさらに含有しうる。核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物の例としては、核酸、発現ベクターまたは機能を有する核酸配列を含むベクターなどのベクター構築物、遺伝子、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖ＤＮＡ化合物、およびリボザイムが挙げられる。
【００５１】
本発明の非イオン性共重合体と一緒に用いることが可能な薬物としては、リファンピン、イソニアジド、エタンブトール、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ピラジナミド、ストレプトマイシン、クロファジミン、リファブチン、オフロキサシンおよびスパルフロキサシンなどのフルオロキノロン類、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ダプソン、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、アンピシリン、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、ピリメタミン、スルファジアジン、クリンダマイシン、アジスロマイシン、パロマイシン、ジクラザリル、クラリスロマイシン、アトバコン、ペンタミジン、アシクロビル、トリフルオロウリジン、ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ、およびその他の抗ウイルス性ヌクレオシド類似体、ホスカネット、ガンシクロビル、ウイルスプロテアーゼ  インヒビター、アンチセンスおよびその他の修飾オリゴヌクレオチド、ならびにリバビリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
種々の感染性微生物について用いられる好ましい薬物を表１に記載する。
【表１】
2005500340.tif 000009
2005500340.tif 000010
【００５３】
随意に、界面活性剤および低分子量のアルコールは、抗菌剤と非イオン性ブロック共重合体、ブロック共重合体、またはそれらの組み合わせとの治療用混合物に添加される。本発明において有用な界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ８０ならびにリン脂質などの脂肪酸、コール酸塩およびアミノ酸を伴うエマルジョンが挙げられる。好ましい界面活性剤はＴｗｅｅｎ８０である。界面活性剤は、約０.１％から約５％ｖ／ｖの範囲の濃度で、混合物に添加される。界面活性剤の好ましい濃度は、約２％である。本明細書において濃度の表示に適用される「約」という用語は、記載された濃度±１０％という意味である。「低分子量のアルコール」という用語は、２から８の炭素を有するアルコールという意味である。本発明において有用である低分子量のアルコールの一例はエタノールであり、エタノールは低分子量のアルコールとして好ましい。低分子量のアルコールは、約０.５％から約５％ｖ／ｖの範囲の濃度で、混合物に添加される。低分子量のアルコールの好ましい濃度は、約１％から約３％ｖ／ｖの間である。
【００５４】
本発明はさらに、動物またはヒトの免疫化、別の表現ではＤＮＡワクチンの接種のための組成物および方法をも含む。免疫化は、発現物中に含まれる免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子を含有する組成物を、細胞膜を横切る遺伝物質の取り込みを助長し促進させるブロック共重合体と組み合わせて投与することによって、成し遂げられる。導入される遺伝子が発現すると、抗原性遺伝子産物が産生する。
【００５５】
さらに、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせと、ガンを死滅させるか、縮小させるかまたはガンの成長を妨げるのに有効な化合物、たとえばリンホカイン類などをコードする遺伝子とを含有する組成物を、ガンの治療のためにヒトまたは動物に投与してもよい。
【００５６】
本発明は、好ましくは次の一般式を有するエチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合生成物である、界面活性を有する共重合体を含む。
【化８】
2005500340.tif 000011
【００５７】
式中、ａは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間の分子量を持つような整数であり、そしてｂは、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％を占めるような整数である。
【００５８】
本発明はさらに、有効量の、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその他の核酸配列と、有効量の、次の一般式を有する非イオン性ブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳の改変に有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【化９】
2005500340.tif 000012
【００５９】
式中、ａは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、最も好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間の分子量を持つような整数である。そしてｂは、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５％から約２０％を占めるような整数である。本明細書で用いられる混合物という用語は、治療用薬物と非イオン性ブロック共重合体とのあらゆる組み合わせを意味し、共重合体ミセル中の薬物の溶液、懸濁液、またはカプセル封入体も含まれる。有効量とは、活性を改変させるのに十分な量および／またはヒトまたは動物の内部で調節しようとする単数または複数の遺伝子によって産生する遺伝子産物の量である。
【００６０】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の、次の一般式を有する非イオン性ブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【化１０】
2005500340.tif 000013
【００６１】
式中、ａは、（Ｃ３Ｈ６Ｏ）で示される疎水性部分が約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、そして最も好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間の分子量を持つような整数である。そしてｂは、（Ｃ２Ｈ４Ｏ）で示される親水性部分がこの化合物の約１重量％から約５０重量％、好ましくは約５％から約２０％を占めるような整数である。有効量とは、ヒトまたは動物に投与される核酸配列の遺伝子産物に対して免疫応答を惹起するのに十分な量である。
【００６２】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１１】
2005500340.tif 000014
【００６３】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が、約７５０から約２０，０００の間、好ましくは約２，２５０から約１５，０００の間、より好ましくは約３，２５０から約１５，０００の間、好ましくは２，０００および１０，０００、そして好ましくは約１０，０００から約１５，０００の間となるような数を示す。そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約２％から３０％の間となるような数を示す。
【００６４】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体の別の実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１２】
2005500340.tif 000015
【００６５】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約２，５００から８，５００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約７％から２３％の間となるような数を示す。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１３】
2005500340.tif 000016
【００６７】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約３，０００から７，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約８％から２０％の間となるような数を示す。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態は、次の式を有するポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレンのリバース・トリブロック共重合体を含む。
【化１４】
2005500340.tif 000017
【００６９】
式中、“ｂ”は疎水性の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂの分子量が約５，０００から６，０００の間となるような数を示し、そして“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約１４％から１６％の間となるような数を示す。
【００７０】
一般的に、“ａ”は親水性の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａのパーセンテージが約５％から３０％の間となるような数を示し、約７％から２３％となる範囲が好ましく、８％から２０％の間となる範囲が最も好ましい。
【００７１】
ブロック共重合体について記述される分子量の範囲とパーセンテージの範囲は外側の範囲を考慮することになっていること、および記載された範囲内に含まれる分子の任意の集団は本発明の一つの実施形態であるとみなされることを理解すべきである。
【００７２】
ブロック共重合体の分子全体は、水への溶解性が不十分であり、そして実質的に非イオン性である。構成成分の化学的性質よりも、むしろこの分子の立体配置および生理化学的特性の方が、抗感染活性および治療のための送達活性の主な原因であると考えられる。本発明の組成物は水溶液、懸濁液または水中油型エマルジョンなどのエマルジョンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
重合体のブロックは、高温・高圧、触媒の存在下でエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均分子量の概算値であり、そしてこの与えられた分子量は測定の方法論および用いられる目盛標準に左右される。プロピレンオキシドとエチレンオキシドとのブロックは純粋でなくてもよいことを理解すべきである。全体的な物理化学的特性が実質的に変化しない限り、少量の他の材料を混合することも可能である。これらの生成物の調製に関するより詳細な考察は、米国特許第２、６７４、６１９号に見出され、その全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００７４】
本発明において用いてもよいエチレンオキシド−プロピレンオキシド縮合生成物は、表２に含まれる。これらの化合物は、本発明を実施するために用いることが可能な化合物の単なる代表例に過ぎないこと、そして、本発明を実施するために用いることが可能な、考えられるすべての化合物が含まれているわけではないことを理解すべきである。表２に記載の、ＢＡＳＦ社の商品名が無い高分子量の共重合体は、以前に合成されたことがない新規組成物である。
【表２】
2005500340.tif 000018
【００７５】
疎水性部分の分子量と親水性部分のパーセントに基づく、本発明が含む共重合体の範囲を図解し、そして選択された非イオン性ブロック共重合体を示すグリッドを、図１として表す。重合体のブロックは、高温・高圧、触媒の存在下でエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均サイズの概算値である。これらのブロック共重合体の調製についてのさらなる説明は、米国特許第２、６７４、６１９号に見出される（“Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｌｏｃｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”、Ｓｃｈｍｏｌｋａ  Ｉ.Ｒ.、Ｊ.Ａｍ.Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔ  Ｓｏｃ.、５４:１１０〜１１６（１９７７年）、およびＢｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｆｔ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第２巻、Ｒ.Ｊ.Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９７６年、も参照）。
【００７６】
治療のための送達用薬剤として特に効果的な共重合体は図２および図３に示されるものであることが分かった。図２および図３から明らかなように、治療のための送達用薬剤として最も効果的な共重合体は、高分子量かつＰＯＥのパーセンテージが小さいもの、一般的には２０％未満のＰＯＥである。
【００７７】
非イオン性ブロック共重合体は、それらの臨界ミセル濃度より高濃度で上記のミセルを形成する。この非イオン性共重合体は、溶解性の負の温度係数を有する。低温では、水分子の運動エネルギーが減少してＰＯＰブロックの酸素と弱い水素結合を形成する。疎水性物質のこのような水和によって、低温での溶解が促進される。温度を高めて「曇点」に到達すると、増加した水の運動エネルギーによって水素結合が切断されて、重合体が不溶化し、ミセルが形成される。
【００７８】
生物活性を有する本発明のオクタブロック共重合体には、四つの疎水性部分とわずかな割合の親水性部分とを有する、界面活性を有する化合物が含まれる。典型的な例は、八つの部分を有するもの、すなわち、疎水性または親水性のいずれかの中心構造からなるコアと親水性または疎水性の外部構造を備えたオクタブロック構造を有するものである。
【００７９】
分子全体は、水への溶解性が不十分であり、そして非イオン性界面活性剤またはわずかに陽イオン性の界面活性剤のいずれかである。構成成分の化学的性質よりも、むしろこの分子の立体配置および生理化学的特性の方が、共重合体の生物学的効果の原因であると考えられる。
【００８０】
本発明のオクタブロック共重合体は、開始剤のアルキレンジアミンを基礎として構築されるポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンとのブロックを含む。ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）とポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とのブロックは、次の構造を有する。
【化１５】
2005500340.tif 000019
【化１６】
2005500340.tif 000020
【００８１】
重合体のブロックは、高温・高圧、塩基性触媒の存在下、開始剤の四官能性エチレンジアミンにエチレンオキシドとプロピレンオキシドとが縮合することによって、形成される。それぞれの共重合体において結合して重合体鎖を形成するモノマー単位の数が統計的に異なるものがいくつか存在する。与えられた分子量は、それぞれの調製品における共重合体分子の平均分子量の概算値である。これらのブロック共重合体の調製についてのさらなる説明は、米国特許第２、６７４、６１９号および米国特許第２、９７９、５２８号に見出される（“Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｌｏｃｋ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ”、Ｓｃｈｍｏｌｋａ  Ｉ.Ｒ.、Ｊ.Ａｍ.Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔ  Ｓｏｃ.、５４:１１０〜１１６（１９７７年）、およびＢｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｆｔ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第２巻、Ｒ.Ｊ.Ｃｅｒｅｓａ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９７６年も参照）。
【００８２】
生物活性を有する本発明のオクタブロック共重合体の一つの側面において、ブロック共重合体には、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体が含まれる。次いで、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体は、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブロックを基礎として、構築される。この結果、次の一般式を持つオクタブロック共重合体が得られる。
【化１７】
2005500340.tif 000021
【００８３】
式中：
ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）からなるオクタブロック共重合体の疎水性部分の平均総分子量は、約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００８４】
本発明の別の側面において、オクタブロック共重合体には、開始剤のエチレンジアミンを基礎として構築される、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の重合体が含まれる。次いで、疎水性のポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）の重合体は、親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックを基礎として、構築される。この結果、次の一般式を持つリバース・オクタブロック共重合体が得られる。
【化１８】
2005500340.tif 000022
【００８５】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）からなる疎水性部分の分子量は約５，０００から７，０００ダルトンの間であり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約１０％から４０％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の総分子量の約６０％から９０％の間を占めるような数である。
【００８６】
このタイプの重合体は、その構造が、両端をポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックで挟まれた、中心部にポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を有するオクタブロック共重合体と逆になっているので、リバース共重合体と呼ばれている。
【００８７】
共重合体の（Ｃ３Ｈ６Ｏ）部分は、最大でオクタブロック共重合体の９５％まで占めることが可能である。共重合体の（Ｃ２Ｈ４Ｏ）部分は、オクタブロック共重合体の５％ほどを占めることが可能である。
【００８８】
生物活性を有する本発明の共重合体を含むオクタブロック共重合体には、ＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）が製造するブロック共重合体のＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）およびリバースのＴｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのものは：
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の総分子量の約５％から２０％を占めるような数であり；
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約８０％から９５％の間を占めるような数である、共重合体を含む。
【００８９】
生物活性を有する好ましい共重合体は、オクタブロック共重合体Ｔ１１０Ｒ１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化１９】
2005500340.tif 000023
【００９０】
式中、
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約５，２２０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９１】
生物活性を有する好ましい共重合体は、オクタブロック共重合体Ｔ１３０Ｒ２（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化２０】
2005500340.tif 000024
【００９２】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約５，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約２０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約８０重量％を占めるような数である。
【００９３】
生物活性を有する本発明の共重合体の別の好ましい実施形態は、Ｔ１５０１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）で表される化合物であり、これは次の式に該当する。
【化２１】
2005500340.tif 000025
【００９４】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９５】
生物活性を有する本発明の共重合体の最も好ましい実施形態は、オクタブロック共重合体Ｔ１５０Ｒ１（ＢＡＳＦ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）であり、これは次の式に該当する。
【化２２】
2005500340.tif 000026
【００９６】
式中：
オクタブロック共重合体の、ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）で示される疎水性部分の平均分子量は約６，７５０ダルトンであり；
ａは、ポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）で示される親水性部分がこの化合物の約１０重量％を占めるような数であり；そして
ｂは、オクタブロック共重合体のポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分がこの化合物の約９０重量％を占めるような数である。
【００９７】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の本発明のオクタブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【００９８】
本発明はまた、有効量の発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、有効量の本発明のオクタブロック共重合体との投与可能な混合物を含有する、特定の遺伝子産物に対して動物またはヒトを免疫化するのに有用な、治療のための送達用組成物をも含む。
【００９９】
本発明のオクタブロック共重合体は、その生物活性を含めて、米国特許第５、４９４、６６０号でさらに考察されており、その全体は引用により本明細書に取り込まれる。
【０１００】
したがって、本発明の非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体の両者（自身が治療用のものである）を含む共重合体は、追加される別個の治療剤を組み合わせることまたは装填することを可能なものとする、物理的構造を形成することができる。したがって、本発明の非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体を治療用薬物送達手段として用いることが可能である。治療用薬物と非イオン性ブロック共重合体およびオクタブロック共重合体との混合物は、少なくとも二種の治療剤の相乗的な活性という利点を有する。さらに、特定の治療用薬物と一緒に用いるために、特定の特徴を有する共重合体を選択することも可能である。たとえば、疎水性のＣＲＬ−８１３１は、リファンピンなどの疎水性の抗生物質について優れた担体である。しかしながら、本発明にしたがうことによって、際立って疎水性ではないその他の薬剤を用いることも可能である。
【０１０１】
本発明の界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体および／またはオクタブロック共重合体の任意のものを、種々の抗菌剤の任意のものと組み合わせて用いて、治療のための送達手段を調製する。一つの実施形態において、約３％から約５％の濃度のＣＲＬ−８１３１は、治療のための送達手段を構築するために用いられる。ＣＲＬ−８１３１よりも親水性が強い共重合体を用いて作られた、治療のための送達手段は通常、より高濃度（約５％から約１０％）の共重合体を必要とする。
【０１０２】
共重合体に基づいたミセルを治療用薬物送達手段として用いることは、ミセルが、マクロファージ内、ＨＩＶおよびその他のウイルスの感染部位ならびにウイルス療法の主な標的にすぐに集まり、そして長期間そこに存在することから、とりわけ望ましい。このような治療用共重合体に基づく治療用組成物の例としては、２％のＴｗｅｅｎ８０および１％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−８１３１、ならびに１％のＴｗｅｅｎ８０および５％のエタノールと組み合わせたＣＲＬ−８１４２が挙げられる。
【０１０３】
核酸配列またはその他の核酸配列の機能を改変する能力を有する化合物をヒトまたは動物に投与して、遺伝子発現の改変および／または遺伝子産物の量もしくは活性の変更を行う。たとえば、上記の共重合体のいずれかまたは両方と混合されたアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、遺伝子の発現および／またはタンパク質の翻訳を改変するかまたは調節することを目的とする、アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達に有用な組成物が得られる。さらに、不具合のある遺伝子を置換するかまたは増加させて染色体の中に組み込む、遺伝子などの核酸配列を投与することも可能である。あるいは、細胞内に投与される遺伝子が細胞内に留まって、染色体外の構成要素において発現しうる。
【０１０４】
本発明はまた、動物またはヒトを免疫化するための新規な組成物および方法をも提供する。この組成物は、発現ベクターと、発現ベクター内に含まれる、免疫化対象の遺伝子産物をコードする遺伝子と、ブロック共重合体とを含有し、非イオン性ブロック共重合体、オクタブロック共重合体、またはそれらの組み合わせを含むものであり、発現ベクターなどの遺伝物質を細胞膜を横切って移動させるのに効果的である。動物またはヒトを免疫化するための方法には、発現ベクターを含有する共重合体組成物を動物またはヒトに投与することが含まれる。好ましい投与方式は、腹腔内注射によるものである。本発明のこの実施形態によって、インビボまたはエクスビボのいずれかでのヒトまたは動物内へのその後の再導入を伴う、ヒトの細胞または動物細胞内に抗原性遺伝子産物を直接発現させる能力を有する遺伝子配列を送達するための手段が提供される。一旦細胞内に導入されると、抗原性遺伝子産物の産生によって、導入された遺伝子産物に対するヒトまたは動物による免疫応答が惹起され、それが維持される。
【０１０５】
次の特定の実施例によって、本発明の種々の側面、たとえば、遺伝子治療に有用な本発明の組成物および方法、ならびに遺伝子が介在する免疫化に有用な本発明の組成物および方法が説明される。当業者にとってはその他の実施形態および使用は明らかであろうこと、および本発明はこれらの特定の実施例には制限されないことを理解すべきである。
【０１０６】
実施例１
ＣＲＬ−８１３１などの界面活性を有する非イオン性ブロック共重合体のうちの任意のものを、核酸配列の機能を改変する能力を有する種々の化合物のうちの任意のものと組み合わせることによって、治療のための送達手段を調製する。ＣＲＬ−８１３１に関しては、治療用手段を構築するためには、３から５％ｗ／ｖの濃度が望ましい。より親水性が強い共重合体に関しては、５から１０％ｗ／ｖの濃度が望ましい。
【０１０７】
３００ｍｇのＣＲＬ−８１３１を、１０ｍｌの０.９％のＮａＣｌに添加し、そして清澄な溶液となるまで２〜４℃の温度で保管することによって、この混合物を可溶化する。核酸遺伝子の機能を改変する能力を有する化合物の適切な量をこの混合物に添加し、そして、温度を５℃より高い温度に上昇させ、およびミセルの懸濁液を平衡化させることによって、共重合体とこの化合物とが会合してなるミセルが形成される。この平衡化懸濁液は投与に適している。
【０１０８】
たとえば、Ｍａｔｓｕｋａｒａ、Ｍ.ら、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ８４:７７０６〜７７１０（１９８７年）によって開示されたもの（その全体が引用により本明細書に明白に取り込まれる）のうちの一つなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、共重合体と組み合わされて、ミセル組成物を生ずる。
【０１０９】
概要を述べれば、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＧ−３’を有するＨＩＶのａｒｔ/ｔｒｓ遺伝子の領域に相補的な配列のホスホロチオエート誘導体またはメチルホスホナート誘導体を、Ｍａｔｓｕｋｕｒａらの方法にしたがって調製する。３００ｍｇのＣＲＬ−８１３１を、１０ｍｌの０.９％のＮａＣｌに添加し、そして清澄な溶液となるまで２〜４℃の温度で保管することによって、この混合物を可溶化する。次いで、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチドを共重合体溶液と混合させて、ＨＩＶウイルスに感染した患者に投与した場合にウイルス活性を阻害するのに効果的な濃度のものを提供する。一般的に、アンチセンス化合物の有効量は、血液中の最終濃度が１μＭから１００μＭの範囲となるような量であろう。しかしながら、アンチセンス化合物のこの範囲外の他の有効量が、ある特定のアンチセンス化合物について見出されうる。当業者であれば、Ｍａｔｓｕｋｕｒａらのインビボ試験にしたがって、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの任意のものについての相対的な有効性を容易に試験することが可能である。
【０１１０】
平均的な人は約６.２５リットルの血液を有する。したがって、１ｍｌの注射にて投与する場合、組成物中に約６ｍＭから６００ｍＭの濃度のオリゴヌクレオチドが必要となる。投与量をさらに多くすることによって、用いるオリゴヌクレオチド組成物の量をより少なくすることが可能である。
【０１１１】
実施例２
実施例１の抗感染性アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、ウイルス活性を低減するのに効果的なあらゆる経路によってＨＩＶ患者に投与される。好ましい投与経路は静脈注射によるものである。このアンチセンス組成物を一日に複数回投与してもよく、それによって、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量が維持されることを確実にする。
【０１１２】
実施例３
不具合のある遺伝子または欠失した遺伝子の影響に苦しむ動物またはヒトを治療するための遺伝子治療用組成物を、ＣＲＬ−８１３１などの共重合体を不具合のある遺伝子の正常なコピーと組み合わせることによって作製する。たとえば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に苦しむ患者に関しては、アデノシンデアミナーゼ遺伝子の正常なコピーを含む遺伝子治療用組成物を作製する。上記の実施例１において記載されたようにして調製された共重合体を所望の遺伝子と混合することによって、この遺伝子治療用組成物を作製し、ヒトまたは動物から血液を除去し、ＡＤＡ遺伝子含有組成物を用いて血液細胞に形質導入し、そして形質導入された血液細胞をヒトまたは動物内へ再導入する。導入された遺伝子はインビボで発現し、もとの遺伝子欠損による影響が緩和される。
【０１１３】
実施例４
同様に、実施例３の遺伝子治療用組成物を、単離されたＴリンパ球と組み合わせて、ＡＤＡ遺伝子を含有するＴリンパ球を作製する。次いで、このＡＤＡ遺伝子含有Ｔリンパ球を、たとえば注射によって、アデノシンデアミナーゼ欠損症に苦しむ患者に投与する。投与された細胞はＡＤＡを発現して、アデノシンデアミナーゼを産生し、したがって、患者内でのこの酵素の供給量が増加し、欠乏状態が是正される。
【０１１４】
実施例５
ＤＮＡワクチンの接種は、基本的には実施例３または実施例４において遺伝子治療について記載されたようにして行う。ただし、宿主に導入される遺伝子は、宿主動物によって異物であると認識される抗原性遺伝子産物を発現するものであり、それゆえに免疫応答が惹起される。
【０１１５】
実施例６
形質導入の実験には、共重合体ＣＲＬ−８１３１と単純ヘルペスウイルス１型のｇＤ遺伝子を含む発現ベクターとを含有する組成物が用いられた。通常は、標準的な塩化カルシウム法やＤＥＡＥデキストラン沈殿法を用いて、ＤＮＡ形質導入を実行する。ＤＥＡＥデキストランは細胞膜を粗面にすることに用いられ、そしてカルシウムは細胞表面上にＤＮＡを沈殿させることに用いられ、その結果、細胞内へのＤＮＡの取り込みが促進される。しかしながら、この手法は一般的に細胞にとっては有毒であり、これによってかなりの数の細胞が死に至る。
【０１１６】
塩化カルシウムの代わりに本発明のブロック共重合体を用いるという、新規な形質導入システムを見出した。実際のところ、ＤＥＡＥデキストランが存在しない場合であってさえ、共重合体によって助力される形質導入が起こるということが、驚くべきことに発見された。
【０１１７】
ベロ細胞をＤＥＡＥデキストラン中で３０秒間インキュベートした。ＤＥＡＥデキストランの除去後、直ちに、共重合体と単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質ｇＤのＤＮＡを含有する発現ベクターとの混合物をベロ細胞に添加した。ｇＤ遺伝子によって、最大で４０％までの細胞が効果的に形質導入を受けたことが分かった。
【０１１８】
驚いたことに、ＤＥＡＥデキストランのインキュベート工程を省略した場合でさえ、四例の実験のうちの二例において、共重合体は、４０％未満の効率でベロ細胞に形質導入することができた。
【０１１９】
実施例７
ブロック共重合体が、インビボにて細胞膜を横切って遺伝物質を移動させることに効果的であるという、その他の研究も実証されてきた。ＤＮＡワクチンによって惹起される免疫化は、共重合体と組み合わされた、単純ヘルペスウイルス１型のｇＤ遺伝子を含有する発現ベクターを、ウサギの腹腔内に二週間ごとに注射した場合、成功した。血清を回収し、そして抗−ｇＤ抗体が存在するかどうかについて試験を行った。このやり方で注射の四週間後に、低濃度の抗−ｇＤ抗体が検出された。これらの結果から、共重合体送達手段と一緒に腹腔内に投与された遺伝物質は、インビボにて細胞に取り込まれ、そしてその遺伝物質が発現して免疫応答を惹起させるのに十分な量の遺伝子産物を生じさせることが、実証される。
【０１２０】
実施例８
ＤＮアーゼに対する防御実験。五種の異なる化合物（ＣＲＬ１１２２、３３６２、３６３２、９３５２、および８１３１）を用いて、防御の程度を試験する実験を行った。４℃にてＤＮＡを化合物と混合し、そして１５分後に３７℃でＤＮアーゼＩ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌ）を添加した。３７℃でのインキュベーションを３０分間した後、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液の３μｌ）で処理することによってＤＮアーゼＩを除去した。コントロールは、ＤＮアーゼＩがあって非イオン性ブロック共重合体がないものと、ＤＮＡのみがあってあらゆるＤＮアーゼＩによる処理を行わないもの、であった。
【０１２１】
非イオン性ブロック共重合体が存在したサンプルのすべてにおいて、ＤＮアーゼＩによる分解からＤＮＡが防御された。ＤＮＡを最も強く防御したのは、ＣＲＬ−３３６２および８１３１を伴うものであった。ＤＮＡ・共重合体組成物は、水平型アガロース電気泳動において移動せず、ウェル内に留まっていた（臭化エチジウムによる染色）。ＤＮアーゼＩの作用に対する効果的な防御は、１体積量のＤＮＡ溶液（１μｇ／ｍｌ）に対して５体積量の非イオン性ブロック共重合体（３０μｇ／ｍｌ）からなる溶液において、達成された。防御の推定値は実験ごとに変化し、総ＤＮＡの１５〜４０％の範囲内であると推定された。
【０１２２】
追加的な実験から、カルシウム法では、ＤＮＡ−共重合体化合物は大腸菌のコンピテント細胞を形質転換できないことが示された。また、フェノールは、ＤＮＡと分離している非イオン性ブロック共重合体を、溶解できなかった。５体積量のイソプロピルアルコールを添加することによって、ＮＢＣに結合したＤＮＡを沈殿させることが可能である。
【０１２３】
実施例９
形質導入実験。ヘルペスウイルスの糖タンパク質遺伝子およびその他の対象の遺伝子を一時的に発現させるための典型的な形質導入実験には、次の手法を必要とした。ＣＯＳ（アフリカザル腎臓細胞；ＣＶ１）などの細胞を６ウェルのプレート上に播種する。細胞が５０〜８０％コンフルエント（まだ対数増殖期の状態）となった時点で、形質導入を実行する。最初に細胞をＰＢＳバッファで洗浄し、これらの細胞を、０.５ｍｌのＤＥＡＥデキストラン溶液（５００ｍｇ／ｍｌ）で１〜２分間インキュベートする。この溶液を吸引し、そしてＤＮＡの沈殿物を細胞に添加する。形質導入するＤＮＡをＣａＣｌ２と一緒に、ｐＨがコントロールされた条件で室温にて３０分間混合し、純度の高い沈殿物を作製する。この溶液を１ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ）と混合し、そして細胞上に３７℃で４時間接触させる。この時点で、１５％のグリセロールによって細胞にショックを与え、次いでＰＢＳにて洗浄する。この浸透圧ショックによって、ＣａＣｌ２−ＤＮＡ沈殿物の細胞内への取り込みが促進される。次いで、細胞をＰＢＳにて再び洗浄し、そして増殖培地と一緒に、３７℃で４８時間インキュベートする。
【０１２４】
遺伝子の発現は、発現タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を用いる多くの場合において、間接免疫蛍光法を利用して検出される。この発現タンパク質を放射性トレーサーで標識したり、免疫沈降させたり、またはウエスタンブロット法で検出することも可能である。
【０１２５】
２５μｌのＤＮＡ（７μｇ）および２５μｌの非イオン性ブロック共重合体（３０μｇ／ｍｌ）を用いた。さらに、氷冷して非イオン性ブロック共重合体をＤＮＡと混合し、そして細胞に混合物を添加すると、これらを別個に添加した場合（すなわち、ＤＮＡを最初に添加し、次に非イオン性ブロック共重合体を添加した場合）と同様の結果が生じた。
【０１２６】
共重合体１１８３、１１８７、８１３１、１２３５、８９５０ＡＱおよび１１９０ＡＱ（ここで、ＡＱとは、非イオン性ブロック共重合体が１:１０に希釈され、その２５μｌを用いたことを指す）。代表的な結果は次の通りである。ＤＮＡのみ、デキストランのみ、共重合体のみ、およびＤＮＡ＋デキストランによる形質導入は、０.２％未満という無視できる程度の形質導入であった。対照的に、ＤＮＡ＋デキストラン＋グリセロールというポジティブコントロールでは２％の形質導入であるのに対して、表３に示すように、種々の共重合体＋ＤＮＡでは、このコントロールよりも最大で２.５倍まで高い程度にてＤＮＡを細胞内に形質導入することに成功した。
【表３】
2005500340.tif 000027
【０１２７】
弱い毒性を伴う１１８７以外に、毒性を伴う共重合体は存在しなかった。その他のものは、特にグリセロール処理の後で毒性を示した。
【０１２８】
上記の内容は本発明の好ましい実施形態に関することのみであること、ならびに添付の請求の範囲に記述された本発明の精神および範囲を逸脱することなく、無数の変更および改変がなされ得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによってブロック共重合体を説明するグリッドである。
【図２】図２は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによって、好ましい治療のための送達用ブロック共重合体を説明するグリッドである。
【図３】図３は、疎水性部分の分子量と親水性部分％とによって、より好ましい治療のための送達用ブロック共重合体を説明するグリッドである。
【図１】
2005500340.tif 000034
【図２】
2005500340.tif 000035
【図３】
2005500340.tif 000036
【図４】
2005500340.tif 000037
【図５】
2005500340.tif 000038
【国際公開パンフレット】
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2005500340.tif 000085
2005500340.tif 000086
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500340.tif 000087
【国際調査報告】
2005500340.tif 000088
2005500340.tif 000089