(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、フェチュインを調製するある改善された方法を提供し、その方法ではあるキレート化剤を用いて、フェチュインから亜鉛、カルシウム、バリウム等の無機イオン類を除いた後、その「裸」フェチュインを酢酸亜鉛を添加して主にフェチュイン−亜鉛から成るある産物を得る。フェチュイン−亜鉛または亜鉛を過剰添加したフェチュインを調製する、この改善された方法は、癌細胞でアポトーシスを誘導する効果性を３〜４倍増加させる。この特別に調製された、亜鉛を添加したフェチュインから、ある特定のペプチド断片が得られた。このポリペプチドは、ＣＣＤ１８ｃｏ（正常な大腸）細胞に影響を与えずに、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）細胞とＨＴ−２９（大腸癌）細胞でアポトーシスを強力に誘導した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養の研究は、アポトーシスを誘導するのに関して、該ポリペプチドはその母体分子（亜鉛を添加した全長のフェチュイン）より約１０倍効力があることを実証した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛を過剰添加したフェチュインの精製方法であって、
（ａ）キレート化剤を含む溶液中でフェチュインをインキュベーションするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から裸フェチュインを単離するステップと、
（ｃ）酢酸亜鉛を含む溶液中で裸フェチュインのインキュベーションをするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）での溶液から、亜鉛を過剰添加したフェチュインを単離するステップと
を有する方法。
【請求項２】
フェチュインは約０．２ｍｌの溶液中に７００μgある、請求項１の亜鉛を過剰添加したフェチュインの精製方法。
【請求項３】
キレート化剤が０．１ＥＤＴＡである、請求項１の亜鉛を過剰添加したフェチュインの精製方法。
【請求項４】
約０．２ｍｌの溶液中の裸フェチュインが約０．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸亜鉛と３時間インキュベーションされる、請求項１の亜鉛を過剰添加したフェチュインの精製方法。
【請求項５】
亜鉛を過剰添加したフェチュインの精製方法であって、
（ａ）約０．２ｍｌの溶液中の７００μgのフェチュインを、約０．５ｍｌの約０．１ＥＤＴＡとインキュベーションするステップと、
（ｂ）前記のインキュベーション混合液に生理食塩水を加えて、モレキュラーシーブと遠心力を用いて前記の混合液をほとんど乾燥状態になるまで濃縮化し、前記の生理食塩水、モレキュラーシーブ、および遠心力を複数回使用して、前記の濃縮化を繰り返し、モレキュラーシーブ上で裸フェチュインを得るステップと、
（ｃ）約０．２ｍｌの溶液中に含まれる、その裸フェチュインを、約０．５ｍｌの約０．５Ｍの酢酸亜鉛とインキュベーションするステップと、
（ｄ）モレキュラーシーブと遠心力を用いて遊離の酢酸亜鉛を除き、亜鉛を過剰添加したフェチュインを得るステップと
を有する方法。
【請求項６】
以下のステップを用いて調製された、亜鉛を過剰添加したフェチュイン：
（ａ）溶液中のフェチュインをあるキレート化剤とインキュベーションするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から裸フェチュインを単離するステップと、
（ｃ）溶液中の裸フェチュインを酢酸亜鉛とインキュベーションするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の溶液から、亜鉛を過剰添加したフェチュインを単離するステップ。
【請求項７】
約０．２ｍｌの溶液中にフェチュインが７００μgある、請求項６の亜鉛を過剰添加したフェチュイン。
【請求項８】
キレート化剤が０．１ＥＤＴＡである、請求項６の亜鉛を過剰添加したフェチュイン。
【請求項９】
約０．２ｍｌの溶液中の裸フェチュインが、約０．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸亜鉛と３時間インキュベーションされる、請求項６の亜鉛を過剰添加したフェチュイン。
【請求項１０】
フェチュインから単離された、アポトーシスを有するポリペプチドを調製する方法であり：
（ａ）溶液中のフェチュインをキレート化剤と共にインキュベーションするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）から裸フェチュインを単離するステップと、
（ｃ）溶液中の前記の裸フェチュインを亜鉛と共にインキュベーションするステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で製作した溶液から亜鉛を添加したフェチュインを単離するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から、亜鉛を添加したフェチュインを乾燥させるステップと、
（ｆ）前記の乾燥させた、亜鉛を添加したフェチュインを水に溶解させ、溶液を作製するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）で作製した溶液から、癌細胞でアポトーシス活性を有するとわかっている濾液を単離するステップと
を有する方法。
【請求項１１】
キレート化剤が０．１ＥＤＴＡである、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１２】
亜鉛が酢酸亜鉛である、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）から裸フェチュインの単離にモレキュラーシーブと遠心力の使用を含む、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）からの亜鉛を添加したフェチュインの乾燥が真空下で行われる、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１５】
ステップ（ｆ）で作製された溶液から、癌細胞でアポトーシス活性を有するとわかっている濾液の単離に、１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するモレキュラーシーブの使用を含む、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１６】
癌細胞が前立腺癌と大腸癌の細胞である、請求項１０のフェチュインから単離されたアポトーシス活性を有するポリペプチドの精製方法。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するポリペプチドから成る、大腸癌と前立腺癌の治療用の化合物。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、およびそれらの類似体を有するポリペプチド群から成るグループから選択された、大腸癌と前立腺癌の治療用の化合物。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のペプチド配列を含むフェチュインペプチド断片で、前記のペプチド配列が大腸癌と前立腺癌の細胞でアポトーシスを起こすようなペプチド断片。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
人類は癌に対して長い戦いを行ってきた。癌は非常に広まっており、また非常に異なる仕方で現れ、非常に執拗であるため、効果的な癌治療の潜在的市場は莫大である。米国で１０００万の人々が癌にかかっているか、または以前にかかったことがあると、見積もられている。米国国立癌研究所（ＮＣＩ）は、１９９５年に米国で約１２０万の新しい癌の症例が診断されることになり、５３８，０００人が癌のため死亡することを予測した。
【０００２】
癌は、現在、手術、化学療法、および放射線治療を組み合わせることによって、低い程度の成功率で治療されている。化学治療での低い程度の成功率の理由は、現在の化学治療方法が急速に分裂している腫瘍細胞を標的としているからである。このアプローチは、休止状態の癌、またはゆっくり成長する癌に対し効果的でない。また、このような治療は、急速に分裂する非癌細胞に影響し、有害な副作用を起こす。
【０００３】
数年前から、癌に対する戦いで、ある新しいアプローチが現れるようになった。このアプローチは、「アポトーシス」と呼ばれる新しく発見された生物学的現象に基づく。アポトーシスは、「プログラムされた細胞死」または「細胞自殺」とも呼ばれる（Ｋｒａｍｍｅｒら、「Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｉｎ  ｔｈｅ  ＡＰＯ-１  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ、８７−９９ページ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）。細胞損傷（ｃｅｌｌ  ｉｎｊｕｒｙ）によって起こされる細胞死とは対照に、アポトーシスは、遺伝子によって指図される細胞の自己破壊の能動的過程であり、生物学的に有意義な機能を果たす（Ｋｅｒｒ、Ｊ．ｆ．ｒおよびＪ．Ｓｅａｒｌｅ、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１０７：４１、１９７１）。アポトーシスの生物学的に有意義な機能群の１つの例は、胚の形態形成である（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１５、１９８７）。彫刻物を彫刻するのに粘土の追加と同時に除去が必要であるように、胚の器官形成（形態形成）は、細胞成長（粘土の追加）と共に細胞死（粘土の除去）に依存する。実際、アポトーシスは胚発生の初期段階から老齢に関連する必然的な衰退に至るまで、人間の体で重要な役割を果たしている（Ｗｙｌｌｉｅ、Ａ．ｈ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．６８：２５１、１９８０）。免疫系、胃腸系、および造血系の正常な機能はアポトーシスの正常な機能に依存する。アポトーシスの正常な機能が働かない時、その原因、またはその結果は、癌、ウイルス感染、自己免疫疾患／アレルギー、神経変性疾患、または心血管疾患を含む、いくつかの疾患群の１つでありうる。人間の疾患でアポトーシスが果たすこの役割のため、アポトーシスが製薬研究分野で顕著な流行語になりつつある。アポトーシスがどのように作動するか、どのようにしてアポトーシスを促進されうるか、または阻害しうるか、実際の医学にとってどういう意味があるのかを理解するために、膨大な時間と巨額の金が使われている。この発生期の分野での研究を市場性の高い薬剤製品に転換することを主な目的とする、少数の会社が形成されている。いくつかの革新的な若い会社が現れたことに加え、確立された産業界の有力会社によって取られた試験的なステップによって、アポトーシス研究が、医学の学問の最も急速に成長し、最も期待できる分野となることを確かなものにしている。
【０００４】
癌が不十分なアポトーシスによって起こり得るという考えは、比較的最近現れた（Ｃｏｐｅ、ｆ．Ｏ．及びＷｉｌｌｅ、Ｊ．Ｊ．、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、６１ページ、１９９１）。この考えは、癌治療で新しい概念、すなわちアポトーシスを促進することで癌細胞を殺し得るという概念への扉を開いた。正常な発生に存在する過程に基づくアポトーシス調節は、腫瘍細胞の成長を制御する潜在的なメカニズムである。腫瘍細胞でアポトーシスを回復することは魅力的なアプローチである。その理由は、少なくとも理論的に、アポトーシスが細胞に自殺をするようにさせるからである。それにもかかわらず、癌の治療の目的がホストを殺さずに癌細胞を殺すことであることから、この治療の成功は、正常な細胞に影響を与えずに、腫瘍細胞でアポトーシスを選択的に誘導できる薬剤の利用性に依存する。この特許出願では、正常な細胞に影響を与えずに、癌細胞でアポトーシスを特異的に誘導するタンパク質類の単離の方法を記述する。これらのタンパク質類は、癌細胞でアポトーシスを誘導する、新しいクラスの抗癌剤を提供し、したがって癌治療での飛躍的な進歩をもたらす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１．ウシのフェチュインの単離、および腫瘍細胞株でのそのアポトーシス効果
フェチュインは、その最も高い濃度が胚と胎児の血清と体液に見られるという意味で、主に胎児タンパク質である。例えば、ウシ血清でのフェチュインの濃度は、おそらく生後２〜３日以内に胎児レベルの１〜２％まで、急速に減少する（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ．１１３０、１４９−１５６、１９９２）。ある組織化学の研究は、フェチュインが胚発生中に組織リモデリングと生理学的細胞死を制御している可能性があることを示した（Ｖｏｎ  Ｂｕｌｏｗら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９９：１３−２２、１９９３）。この結果は、フェチュインが細胞死（アポトーシス）を誘導する作用を含む可能性を高めている。
【０００６】
したがって、フェチュインが調製され、アポトーシス活性に関して検査された。興味深いことに、その結果は、ある特別の方法で調製されたウシのフェチュインのみが腫瘍細胞株でアポトーシスを誘導しうることを示した。硫安沈殿とＥＤＴＡ処理によって調製された市販のフェチュインは、腫瘍細胞でアポトーシスを誘導する点で非常に低い活性を有することが見つけられた。
【０００７】
１Ａ．ウシフェチュインの調製
ウシフェチュインは、以下のステップにしたがって、修正されたＳｐｉｒｏの方法（Ｓｐｉｒｏ  ｒ．Ｇ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３５、１０：２８６０、１９６０）によって調製された。
【０００８】
１．１００ミリリットルのウシ胎児血清（ＦＢＳ）
２．３０％（Ｖ/Ｖ）エタノールを含む、０．０５Ｍ酢酸亜鉛の２００ミリリットルを加え、アンモニウム−塩化アンモニウムでｐＨ６．４に調節し、−５℃で１５時間保つ。  
３．遠心により上澄みを収集し、１．０Ｍの酢酸バリウムと９５％エタノールを加えて、０．０３Ｍ酢酸バリウム、２５％エタノールにする。−５℃で２時間保つ。  
４．遠心により上澄みを収集し、９５％エタノールを加えて４０％エタノールにし、−１０℃で１５時間保つ。  
５．沈殿物を収集する。そのペレットをリン酸緩衝食塩水で溶解する。
【０００９】
このように精製されたフェチュインは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）で６３Ｋダルトンのみかけの分子量を有する１つのタンパク質バンドを示した。
【００１０】
１Ｂ．ウシフェチュインを使用して腫瘍細胞でのアポトーシス誘導
上記に記述された手順によってウシ胎児血清から精製されたフェチュインを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。遊離の酢酸亜鉛と酢酸バリウムを繰り返し濃縮化することによって除いた。フェチュインは、ＬＮＣａＰとＨＬ-６０の細胞で検査された。ＬＮＣａＰまたはＨＬ−６０（１，０００細胞）を、３７℃、５％の二酸化炭素下で、マイクロトレイプレート（２５μｌウエル、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中で、１５％または２０％のウシ胎児血清、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含む、１０μlのＲＰＭＩに蒔いた。細胞が蒔かれた後の３〜４時間後に、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でフェチュイン（１０μlのＰＢＳ中）を加えた。該検査サンプルを細胞と１５時間インキュベーションした後、２μlのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）色素（ＰＢＳ中で０．０３ｎｇ/ｍｌ）を加えた。２時間後に、ヘキスト色素で染色された細胞を蛍光顕微鏡下で検査した。アポトーシス状態の細胞の核はＤＮＡ濃縮化と断片化を示したが、これらはヘキスト色素染色で容易に同定可能であった。以下の式によって、アポトーシス状態の細胞の割合（％）を計算した。
【００１１】
アポトーシス状態の細胞（％）＝DNA濃縮化と断片化を示す細胞数／全細胞数
【００１２】
対照サンプル（ＰＢＳ）と共にインキュベーションされたＬＮＣａＰ細胞の核は正常で健全であった。しかし、フェチュイン（ＰＢＳ中で１００ｎｇ/ｍｌ）と共にインキュベーションされたＬＮＣａＰ細胞の核は、アポトーシスの特徴を示した。第一に、フェチュイン存在下での細胞は、対照の核と比較して、より強度な蛍光によって実証されるように核の濃縮化を示した。第二に、核濃縮は、核の切断によって実証されるように、ＤＮＡの断片化を伴っていた。核の濃縮化とＤＮＡ断片化は、アポトーシス下にある細胞の２つの形態的特徴であるため、これらの結果は、フェチュインがＬＮＣａＰ細胞でアポトーシスを誘導する活性を含むことを示唆する。
【００１３】
同様に対照緩衝液（ＰＢＳ）と共にインキュベーションされたＨＬ−６０細胞の核は正常で健全であった。しかし、フェチュインと共にインキュベーションされたＨＬ−６０細胞の核は、アポトーシスの特徴を示した。フェチュインは、対照の核と比較して、より強度な蛍光によって実証されるように核の濃縮化を起こした。第二に、核濃縮は、核の切断によって実証されるように、ＤＮＡの断片化を伴っていた。上記したように、核の濃縮化とＤＮＡ断片化は、アポトーシス下にある細胞の２つの形態的特徴である。したがって、これらの結果は、フェチュインがHL−６０細胞でアポトーシスを誘導する活性を含むことを示唆する。
【００１４】
１Ｃ．ウシフェチュインは、正常な細胞株に影響を与えずに、癌細胞にアポトーシスを選択的に誘導する。 
種々の細胞株で、フェチュインのアポトーシス誘導の効果を比較した。上記のように調製されたフェチュインは、５０μg/ｍｌの濃度で、以下の腫瘍細胞株で強力にアポトーシスを誘導した。それらは、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＰＣ−３（前立腺癌）、ＨＬ−６０（白血病）、ＭＣＦ−７（乳癌）、Ｃｏｌｏ２０５（大腸癌）、Ｃａｌｕ−１（肺癌）である。
【００１５】
フェチュインは、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）、ＨＬ−６０（白血病）、およびＭＣＦ−７（乳癌）で高度にアポトーシスを誘導する濃度（２５μg/ｍｌ）で、ＣＣＤ３９Ｌｕ細胞（正常な肺の繊維芽細胞）でアポトーシスを誘導するのに不活性であることが見つかった。上記にように調製されたフェチュイン（２５μg/ｍｌ）を、マイクロトレイプレート中でMEM中で成長されたＣＣＤ３９Ｌｕ細胞と１５時間インキュベーションした。これらのＣＣＤ３９Ｌｕ細胞はフェチュインの存在下で形態的に変化しなかった。
【００１６】
１Ｄ．上記の方法で調製されたフェチュインのみが腫瘍細胞株でアポトーシスを誘導できる。 
Ｓｉｇｍａ社から購入したフェチュインはＬＮＣａＰ細胞でのアポトーシス誘導に関して非常に低い活性を有する。しかし上記のセクション１Ａで説明した方法によって我々の研究室で調製したフェチュイン（２５μg/ｍｌ）は、４時間内にＬＮＣａＰ  細胞で９０％までアポトーシスを誘導する。Ｓｉｇｍａ社から購入したフェチュインでは、アポトーシス誘導活性は、非常に高濃度（２５０μg/ｍｌ以上）で長いインキュベーション期間（２日）のみに見られる。当初、我々の研究室で調製したフェチュインの活性は、他の方法で調製されたフェチュインの活性より５０,０００倍以上高かった。
【００１７】
これらの初期の発見に引き続いた何年もの研究で、セクション１Ａで調製されたようなフェチュインは、他の方法で調製されたフェチュインより１００倍以上高いアポトーシス活性を有すると、控えめに見積もられている。これは当初報告された５０，０００倍の増加ほど劇的ではないが、インキュベーション時間とＬＤ５０値に関して以前に使用可能なフェチュインより有意なアポトーシス性有利性を、なお示している。
【００１８】
Ｓｉｇｍａ社フェチュインの調製方法のある調査は、これらのフェチュインが硫安沈殿とＥＤＴＡ処理を含む方法で調製されていることを明らかにした。これらの処理の両者も、タンパク質から亜鉛イオンの剥奪を起こす可能性があり、その剥奪がタンパク質活性の不可逆的損失を起こす可能性がある。
【００１９】
１Ｅ．胎児フェチュインの、Ｉｎ  ｖｉｖｏでの白血病細胞への効果
我々の以前のデータは、フェチュインがＩｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞中でアポトーシスを誘導することを実証した。以下に提供するデータは、白血病を有するマウスでフェチュインのＩｎ  ｖｉｖｏでの試験の成功を示す。その結果は、フェチュインがマウスで抗白血病効果を有することを示す。表１は、白血病をもつマウスでの胎児フェチュインの使用を説明する試験データを表し、胎児フェチュインで治療された、白血病を有するマウスの生存の増加を示す。
【００２０】
方法
４０匹のＤＢＡ/２メスマウス（１７〜２０グラム；Ｓｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇｉｌｒｏｙ、ＣＡ）は標準餌料と水を自由に摂取できるように保たれ、腫瘍細胞株Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ細胞株番号：ＣＣＬ４６）で接種された。これらのマウスは無作為に１０匹づつのグループに分離された。亜鉛を加えた胎児フェチュイン（１０ｍｇ/ｍｌ）を、グループ１でマウス一匹当たり０．００２ｍｌ、グループ２でマウス一匹当たり０．０２ｍｌ、グループ３でマウス一匹当たり０．２ｍｌを、マウスの腹膜に注射した。グループ４は対照グループであり、０．５ｍｌの食塩水を注射した。これらの注射は１０日間続けた。６０日間、死亡率を記録した。結果を以下のように定義された延命率（ＩＬＳ）として表した。
【００２１】
ＩＬＳ＝１００×（処置されたマウスの平均生存期間−対照マウスの平均生存期間）／対照マウスの生存期間
【００２２】
表１は、白血病を有するマウスの未処理の１００％が２４日後に死亡したが、フェチュインの高い投与量、すなわち１００ｍｇ／Ｋｇの胎児フェチュインで処理されたマウスの８０％は、５８日以上生存した。このＩｎ  ｖｉｖｏ実験は、胎児フェチュインで処理された、白血病を有するマウスが、１４１％の増加した生存期間をもつことを実証する。
【００２３】
１Ｆ．過剰に亜鉛を加えたフェチュインの調製方法
亜鉛を含むフェチュインを調製する方法は洗練され、改良されてきた。上述されたように、セクション１Ａで記述された方法で調製されたフェチュインは、腫瘍細胞株でアポトーシスを誘導できる。しかし、Ｓｉｇｍａ社からのような市販のフェチュインは、腫瘍細胞でのアポトーシス誘導、およびＬＮＣａＰ細胞でのアポトーシス誘導で非常に低い活性を有することが見つけられている。Ｓｉｇｍａ社からのフェチュインに関して、アポトーシス誘導活性は、非常に高濃度（２５０μg/ｍｌ以上）で長いインキュベーション期間（２日）のみに見られる。一方、セクション１Ａで調製されたフェチュイン（２５μg/ｍｌ）は、４時間内にＬＮＣａＰ細胞で９０％までアポトーシスを誘導した。当初、セクション１Ａで調製されたフェチュインの活性は、他の方法で調製されたフェチュインの活性より５０,０００倍以上高かった。この根本的に異なる結果は、市販のフェチュインとセクション１Ａでの手順に従って調製されたフェチュインの化学的組成物での基本的な差を示唆する。
【００２４】
当初の発見に続く、何年もの研究で、Ｓｉｇｍａ社からのフェチュインは非常に高濃度（５ｍＭ以上）で長いインキュベーション時間（２日）でアポトーシスを誘導する一方、上記のセクション１Ａで調製されたフェチュイン（約５０μＭ）は、ＬＮＣａＰ細胞で４時間内に９０％までアポトーシスを誘導したことを観察した。控えめに見積もって、セクション１Ａで調製されたフェチュインは、他の方法で調製されたフェチュインより１００倍以上高い活性を有する。これは、当初報告された５０，０００倍の増加ほど劇的ではないが、インキュベーション時間とＬＤ５０値に関して、なお、以前に利用可能なフェチュインより有意なアポトーシス有利性を表す。
【００２５】
市販のフェチュインの調製に使用された方法に関する調査は、フェチュインの調製に硫安沈殿とＥＤＴＡ処理が使用されていることを明らかにした。この硫安沈殿とＥＤＴＡ処理によってタンパク質からイオン類の剥奪を起こし、タンパク質活性の不可逆的損失を起こす可能性がある。しかし、市販のフェチュインでの減少したアポトーシス活性の原因が、亜鉛イオンだけの損失であるのか、または他のイオンの損失との組み合わせであるのかは知られていなかった。フェチュイン−Ｃａがアポトーシスの誘導に不活性であるのは実証されており（ここにデータは示されていない）、またバリウムはほんの微量しか存在しないが、どのイオンまたはどのイオン類の組み合わせがフェチュインのアポトーシス能力を増加するのに最も効果的であるかを決定するために、上記のセクション１Ａで調製されたフェチュインを、ＥＤＴＡのようなキレート化剤で処理し、亜鉛、カルシウム、およびバリウムを含むすべての無機イオン類をタンパク質から取り除いた。これらの無機イオン類が取り除かれた後、この「裸（ｎａｋｅｄ）」フェチュインを０．５Ｍの酢酸亜鉛で処理するか、インキュベーションして、亜鉛のみをフェチュインを再添加させるか、または結合させた。この洗練化された過程の結果が、ＬＤ５０値を決定に関して、表２〜３の例で示されている。表２〜３は、フェチュイン−亜鉛、または「過剰添加した（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）亜鉛フェチュイン」が、パート１Ａで調製されたような、亜鉛を結合する元来のフェチュインと比較して、癌細胞でのアポトーシス誘導するフェチュインの能力を３〜４倍高めたことを示している。以前にカルシウムとバリウムしていたフェチュインは、そのタンパク質の不活性なある型を与えると仮定される。すべてのイオンを取り除き、それらを亜鉛で置き換えることによって、不活性なフェチュイン分子が活性型に変換され、そのようにしてアポトーシス活性の劇的な増加を説明できる。そのような亜鉛を過剰添加したフェチュインは、癌に対する戦いで貴重な前進である。
【００２６】
本調製過程の好適な実施様態では：
１．インキュベーション混合液：７００μgのフェチュイン（０．２ｍｌ；セクション１Ａで上述されたような方法で調製されたもの）を、０．５ｍｌの０．１ＥＤＴＡで約１時間インキュベーションした。
【００２７】
２．このインキュベーション混合液に１．５ｍｌの生理食塩水を加え、モレキュラーシーブと遠心力を使用してほぼ乾燥状態まで濃縮する。この過程を４回繰り返し、無機イオン類のほとんどが取り除かれる。この「裸」フェチュインが、フィルター（モレキュラーシーブ）の上に残る。
【００２８】
３．その「裸」フェチュイン（０．２ｍｌ）を０．５ｍｌの０．５Ｍ酢酸亜鉛と約３時間インキュベーションする。
【００２９】
４．上記のステップ２で記述したように、生理食塩水、モレキュラーシーブ、および遠心力の組み合わせを用いて遊離の酢酸亜鉛を取り除く。
【００３０】
２．癌細胞でアポトーシスを起こすフェチュイン−亜鉛からの特異的なペプチド断片
ａ．フェチュイン断片の調製
セクション１Ｆ（亜鉛を過剰添加したフェチュインの調製方法）で上述されたように、亜鉛を添加したフェチュイン、または亜鉛を過剰添加したフェチュインが、ウシ胎児のフェチュインをあるキレート化剤（ＥＤＴＡ）で前処理することによって調製され、亜鉛イオン、カルシウムイオン、およびバリウムイオンを含む無機イオン類をフェチュインから取り除く。このようにして得られた、剥奪されたフェチュインを０．５Ｍ酢酸亜鉛とインキュベーションして、フェチュインを亜鉛で「過剰添加（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ）」、すなわち装填（ｌｏａｄ）した。亜鉛を添加（ｃｈａｒｇｅ）したフェチュインの３００μｇを、５０μlの生理食塩水中に溶解した後、真空下で試験管中で乾燥させた。この乾燥化段階が亜鉛を添加したフェチュインをペプチド断片に分解すると仮定される。
【００３１】
乾燥された断片（亜鉛を添加したフェチュインの断片）を５０μlの水中で再構成した。この断片溶液を、１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するモレキュラーシーブ膜に通した。そのようにして得られた断片の濾液を収集し、細胞でアポトーシスアッセイの検査した。図２に示されるように、ＬＮＣａＰ細胞を、亜鉛を添加したフェチュインの断片濾液と共に６時間インキュベーションすると、これらのＬＮＣａＰ細胞がはがれ、死ぬ。図１で示されるようにコントロール（濾液を含まないＬＮＣａＰ細胞）に比較して、図２は、亜鉛を添加したフェチュインの濾液と共に前立腺癌細胞をインキュベーションすると、癌細胞でアポトーシスが起こることを示している。図４は、亜鉛を添加したフェチュインの濾液で処理されたＬＮＣａＰ細胞にもまた、アポトーシス中の細胞に典型的な特徴である、膜の「膨らみ」が見られることを示している。図３は、亜鉛を添加したフェチュインの濾液なしのＬＮＣａＰ細胞を示すが、このような膜の「膨らみ」とアポトーシスの特徴を欠く。
【００３２】
ｂ．プロテアーゼ感受性を有する
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１のアポトーシス誘導活性は、プロテアーゼ感受性を有することが見つかった。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１とプロテイナーゼＫとのインキュベーションは、アポトーシス誘導活性を失わせた。プロテイナーゼＫはペプチド結合を開裂させる酵素であり、クエン酸とＥＤＴＡのようなキレート化剤は、プロテイナーゼＫの酵素活性に影響を与えない。
【００３３】
セクション１Ｆで記述したように、亜鉛を過剰添加したフェチュイン、または亜鉛を添加したフェチュインを調製した後、得られた組成物を試験管中で真空下で乾燥した。このように、亜鉛を過剰添加し、乾燥させたフェチュインを５０μlの水に再構成した。この溶液をモレキュラーシーブ膜（１０，０００ダルトンの分子量を有するＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０試験管）を通して濾過した。その濾液を収集し、５μl（１ユニット/μl）のプロテイナーゼＫで３７℃で３時間、処理した。プロテイナーゼＫでの処理後、プロテイナーゼKを除くために、処理された濾液をモレキュラーシーブ膜（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０試験管）を通して濾過した。プロテイナーゼＫはその膜に残り、処置された濾液はその膜を通過した。
【００３４】
この濾液のアポトーシス活性に関するプロテアーゼの効果を検査するために、プロテイナーゼＫで処理した濾液を癌細胞で検査した。これらの結果を、プロテイナーゼＫで処理されなかった濾液と比較した。
【００３５】
フェチュイン−亜鉛の断片のアポトーシス能力に関するプロテイナーゼＫの効果が、表４で要約されている。実験１と実験２は、亜鉛を添加したフェチュインの濾液の一組で行い、実験３は、亜鉛を添加したフェチュインの濾液の別の組で行った。表４は、プロテアーゼとのインキュベーションによって、亜鉛を添加したフェチュインの断片のアポトーシス効果が不活性化されることを示している。プロテイナーゼＫのようなプロテアーゼはペプチド結合を開裂するので、表４の検査結果は、フェチュインのペプチドまたはタンパク質は癌細胞でアポトーシス誘導に関与することを強く示唆する。
【００３６】
ｃ．該濾液はフェチュインから由来する２つの主要なペプチドを含む。 
乾燥して再構成した濾液は、ペプチド断片を含んでいることがわかった。アミノ酸配列分析は該濾液中に２つの主要なペプチド断片を明らかにした。：
（１）フェチュインのＨ−Ｔ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ａ−Ｓ−Ｖ−Ｅ（アミノ酸番号３００−３０９；Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１）と、
（２）Ｓ‐Ａ−Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ａ−Ｆ−Ｈ（アミノ酸番号３１０−３１７；Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
【００３７】
これらのペプチド断片のどちらが、アポトーシス誘導活性に関与するかを同定するために、これらの２つの断片、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２が化学的に合成された。これらの化学的に合成されたペプチド活性のＩｎ  ｖｉｔｒｏ検査で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１がより高いアポトーシス活性を有することが示された。ＬＮＣａＰ（前立腺癌細胞）をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と共にインキュベーションした。図６に見られるように、化学的に合成されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は３時間のインキュベーション後にＬＮＣａＰ細胞で膜の「膨らみ」を起こした。図５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含まないＬＮＣａＰ細胞のコントロールを示す。これらの結果は、アポトーシスを誘導し、該濾液に存在するペプチド断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応することを示す。
【００３８】
３．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の特徴
a．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は選択的に癌細胞でアポトーシスを誘導し、正常な細胞では誘導しなかった。 
以前に、フェチュインと亜鉛を添加したフェチュインは、いくつかの正常な細胞に影響せずに、種々の癌細胞でアポトーシスを誘導したことが知られていた。フェチュインから由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が癌細胞でアポトーシスを誘導し、正常な細胞に影響しない、この選択性を保持しているかを検査するために、種々の濃度のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を、ＨＴ−２９（大腸癌）細胞、ＣＣＤ−１８Ｃｏ（正常な大腸）細胞、およびＬＮＣａＰ（前立腺癌）細胞で検査した。図７に示されるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はＣＣＤ−１８Ｃｏ細胞には影響を与えず、ＨＴ−２９細胞とＬＮＣａＰ細胞でアポトーシスを誘導した。これらの結果は、選択的に癌細胞でアポトーシスを誘導し、正常細胞でアポトーシスで誘導しない点に関して、該断片がフェチュインと亜鉛を添加したフェチュインに類似していることを示唆する。
【００３９】
ｂ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はＨＴ−２９（大腸癌）細胞でアポトーシスを急速に誘導した。 
図８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるアポトーシス誘導の時間の効果を示す。４時間で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は０．４μＭの濃度で、ＨＴ−２９大腸癌細胞の５２％でアポトーシスを誘導した。６時間では、ほとんどすべてのＨＴ−２９細胞でアポトーシスが誘導された。たとえ、少しだけ長いインキュベーション時間（４時間から６時間まで）でも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアポトーシス能力が、この短い期間内に急速に増加する。
【００４０】
ｃ．フェチュインから由来したペプチド断片は、アポトーシス誘導に関してフェチュインまたは亜鉛を添加したフェチュインより強力である。 
以前に、ＬＮＣａＰ細胞で全長の亜鉛を添加したフェチュインのＬＤ５０（５０％細胞死の誘導のための用量）は、３〜１０μＭであると判定された。しかし、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＬＤ５０は、０．３〜０．４μＭであると判定された。したがって、癌細胞で同じ程度のアポトーシス活性を誘導するのに、全長の、亜鉛を添加したフェチュインで必要なより、ずっと少量のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１しか必要でない。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、その母体の分子よりアポトーシスを誘導するのに強力である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、フェチュインと種々のフェチュイン断片に対するＬＤ５０値の表である表５を参照）。
【００４１】
以下の以前の推定を考慮すると、
（１）上記のセクション１Ａで調製されたようなフェチュインは、他の方法で調製されたフェチュインより約１００倍強力である、
（２）亜鉛を「過剰添加」したフェチュイン（亜鉛を添加したフェチュイン）は、セクション１Ａで調製したフェチュインより約３〜４倍強力である（表２〜３を参照）、
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、亜鉛を「過剰添加」したフェチュインより約８〜１０倍強力である（表５を参照）、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１が他の方法で調製されたフェチュインより約数千倍強力であることが予測される。
【００４２】
４．他の源泉に由来するフェチュインの他の配列
さらに、ブタ、ヒツジ、およびマウスを含む他の動物の血清からのペプチド配列が決定された（ｋ．Ｍ．Ｄｚｉｅｇｉｅｌｅｗｓｋａら、Ｆｅｔｕｉｎ、１６−１７、（ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏ．１９９５））。これらのペプチド配列は、ウシ血清から単離されたフェチュインと６０〜９０％の類似性を有する。現在の応用法から、これらの類似のフェチュインペプチドもまた、価値のあるアポトーシス活性を有することがわかっている。他の種からのフェチュインアミノ酸番号３００−３０９のペプチド配列は：
ヒト（Ｈ‐Ｔ‐Ｆ‐Ｍ‐Ｇ‐Ｖ‐Ｖ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｇ；Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；
ブタ（Ｈ‐Ｓ‐Ｆ‐Ｓ‐Ｇ‐Ｖ‐Ａ‐Ｓ‐Ｖ‐Ｅ；Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
ヒツジ（Ｈ‐Ｔ‐Ｆ‐Ｓ‐Ｇ‐Ｖ‐Ａ‐Ｓ‐Ｖ‐Ｅ；Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
ラット（Ｈ‐Ｔ‐Ｆ‐Ｓ‐Ｇ‐Ｖ‐Ａ‐Ｓ‐Ｖ‐Ｅ；Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
マウス（Ｈ‐Ａ‐Ｆ‐Ｓ‐Ｐ‐Ｖ‐Ａ‐Ｓ‐Ｖ‐Ｅ；Ｈｉｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）Ｉｄ．
これらの類似体もまた、本出願によって学んだように、請求される。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
【表２】
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【００４５】
【表３】
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【００４６】
【表４】
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【００４７】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液の処置を行わなかったＬＮＣａＰ（前立腺癌）細胞の１つのスライドを示す。
【図２】図２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液と共に６時間、インキュベーションしたＬＮＣａＰ細胞の１つのスライドを示す。
【図３】図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液の処置を行わなかったＬＮＣａＰ（前立腺癌）細胞の、もう１つの別のスライドを示す。
【図４】図４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液と共にインキュベーションしたＬＮＣａＰ細胞の１つのスライドを示し、また、アポトーシスに入った細胞の指標である、膜の膨らみ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｕｂｂｌｉｎｇ）を表すＬＮＣａＰ細胞をも示す。
【図５】図５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液を含まないＬＮＣａＰ細胞の１つのスライドを示す。
【図６】図６は、ＬＮＣａＰ細胞の１つのスライドであり、これらのＬＮＣａＰ細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１を含む濾液と共に３時間、インキュベーションされたが、アポトーシスに入った細胞の指標である、膜の「膨らみ（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）」を表している。
【図７】図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１（断片の濃度、ｎＭ）に対する、ＨＴ−２９、ＣＣＤ‐１８  Ｃｏ、およびＬＮＣａＰの各細胞でのアポトーシスの割合（％）のグラフである。
【図８】図８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１の濾液のインキュベーション時間に対する、ＨＴ−２９細胞とＣＣＤ‐１８  Ｃｏ細胞でのアポトーシスの割合（％）のグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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