(57)【要約】本発明は、複雑な混合物、特に食品混合物に含まれる微生物の核酸を抽出する方法であって、少なくとも以下のステップ：混合物（１０）を浄化するステップ、微生物をろ過カートリッジに保持するステップ（１２）、前記微生物を溶解するステップ（１４）、核酸を回収し（１６）、濃縮し、精製する（１８）ステップを含む方法に関する。本発明はまた、本発明の抽出法を実施するために使用されるろ過カートリッジ及び装置に関する。同じく開示されるものは、複雑な混合物に含まれる微生物の核酸を抽出し、検出し、適宜、定量するための装置である。
2005526509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に食品の複雑な混合物又は水に含まれる微生物から核酸を抽出する方法であって、少なくとも以下のステップ：
（１２）混合物に含まれる微生物をカートリッジタイプろ過装置４０に保持するステップ、
（１４）微生物をその場で溶解させるステップ、及び
（１６）ろ過カートリッジ４０から核酸を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（１２）の前に、複雑な混合物をろ過によって浄化するステップ（１０）を実施し、その後、ステップ（１０）からのろ液に対して前記ステップ（１２）を実施する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
複雑な混合物を浄化するステップ（１０）を、平均孔径が１．２〜１２μmの範囲、好ましくは５μmである使い捨て可能なポリカーボネート又は硝酸セルロースフィルターを使用して実施する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１６）ののち、液体固体吸着クロマトグラフィーによって核酸を濃縮し、精製するステップ（１８）を実施する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ステップ（１２）及び（１４）で使用されるカートリッジ（４０）が保持フィルター（４２）を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ステップ（１８）をシリカカラムで実施する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ステップ（１８）が、少なくとも以下のサブステップ：
１８１）核酸抽出物を希釈するサブステップ、
１８２）混合物をシリカカラムに装填するサブステップ、
１８３）前記カラムを１回以上洗浄したのち乾燥させるサブステップ、及び
１８４）シリカカラムに保持された核酸を溶出させるサブステップ
を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
サブステップ（１８１）〜（１８４）を真空下で実施する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１２）が、カートリッジ（４０）に含まれる保持フィルター（４２）を使用して実施される十字流精密ろ過からなり、前記フィルター（４２）が、硝酸セルロース又はポリカーボネートから形成され、０．２２〜０．５５μm、好ましくは０．４５μmの平均孔径を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（１４）が、
・トリスＨＣｌ（pH７〜９、好ましくは約８、濃度約２５〜４００mM、好ましくは約１００mM）、
・Chelex-100（約３％〜６０％、好ましくは約１５％）、及び
・適宜、組み合わせた以下の３成分：
○ＥＤＴＡ（pH約７〜９、好ましくは約８、濃度約１０〜１００mM、好ましくは約４０mM）、
○ＮａＣｌ（５０〜８００mM、好ましくは約２００mM）、
○ＳＤＳ（約０．５％〜８％、好ましくは約２％）
を含む溶解バッファーに含まれる洗浄剤の、特に７０℃の熱の作用からなる化学溶解処理を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（１４）が、ＴＥＮＳ及びChelex-100、好ましくはＴＥＮＳ２Ｘ及び１５％Chelex-100を含むバッファー中での微生物の超音波処理からなる機械的溶解処理を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
超音波処理を約７０℃の高温で実施する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（１４）が、微生物の無水音波処理からなる機械的溶解処理を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（１４）が、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の機械的溶解処理及び請求項１０記載の化学的溶解処理を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
以下の予備ステップ：
２６）特に食品の複雑な試料を粉砕するステップ、及び
２７）得られた粉砕混合物を酵素的及び化学的に前処理するステップ
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法を実施する際に使用するための、微生物から核酸を抽出するためのカートリッジ（４０）であって、硝酸セルロース又はポリカーボネートから形成され、０．２２〜０．５５μm、好ましくは０．４５μmの平均孔径を有する保持フィルター（４２）を含むカートリッジ。
【請求項１７】
特に食品の複雑な混合物又は水に含まれる微生物から核酸を抽出するための、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法を実施するためのオートマトン。
【請求項１８】
少なくとも３個のモジュール（８０、８２、８４）を含み、前記モジュールの第一のモジュールが、請求項１〜１５のいずれか１項記載の抽出法のステップ（１２）、（１６）及び（１８）を実施し、第二及び第三のモジュール（８２）及び（８４）が、請求項１〜１５のいずれか１項記載の抽出法のステップ（１４）を実施する、請求項１７記載のオートマトン。
【請求項１９】
第一のモジュール（８０）がまた、請求項１〜１５のいずれか１項記載の抽出法のステップ（１０）を実施することができる、請求項１８記載のオートマトン。
【請求項２０】
複雑な混合物、特に食品、又は水に含まれる微生物の核酸を抽出し、検出し、適宜、定量するための装置であって、請求項１７〜１９のいずれか１項記載の核酸を抽出するためのオートマトンを、前記核酸の熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンと合わせて含む装置。
【請求項２１】
熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンがロータリータイプである、請求項２０記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料の分析の分野に関し、より具体的には、特に食品試料からの複雑な混合物の細菌含有量の分析に関する。
【０００２】
本発明は、複雑な混合物に含まれる微生物から核酸を抽出する方法に関する。
【０００３】
本発明はまた、複雑な混合物又は水に含まれる微生物から核酸を抽出するための、本発明の抽出法を実施するために使用されるろ過カートリッジ及びオートマトンに関する。
【０００４】
最後に、本発明は、複雑な混合物に含まれる微生物の核酸を抽出し、検出及び／又は定量するための装置であって、本発明にしたがって核酸を抽出するためのオートマトンを、前記核酸の熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンと合わせて含む装置に関する。
【０００５】
市場に出ている製品の安全性、品質及び出所に関する保証の要求が絶えず増大しているため、潜在的消費者を代表する一般大衆の現在の雰囲気は、全般的な健全性及び安全性に関する先入観を象徴するものである。さらには、この現象は、近ごろいっそう強くなり、強まり続けている。したがって、大衆は、確信及び保証の必要性を満たすための肯定的な答えを必要としている。
【０００６】
これに関して、公共団体ならびに一般大衆の健康及び健康管理を担う他の当局及び組織が、特に食品産業における、生産者、製造業者、流通業者及び飲食店経営者による安全性及び品質規格への厳密な遵守を確認するため、定期的な検査を実施している。微生物監視の質は、生産者から消費者までの連鎖をたどりながら監視されなければならない非常に重要なポイントである。
【０００７】
このような検査は、クロマトグラフィー、核磁気共鳴及び質量分光測定をはじめとする現在の分析化学又は生化学技術ならびにプローブを使用するＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって生物、特に病原性生物に特異的な核酸をたとえば検出することができる分子生物学技術から発展させた分析法に基づく。
【０００８】
これらの検査は、特に農業又は製造業に関連して大規模に実施することができる。さらに、これらの検査は、ときには緊急措置として実施される。疑わしい製品がすでに売りに出ている場合、起こりうる集団汚染を回避するため、適切ならば市場からの回収を命じるために、そのような製品の安全性レベルはできるだけ速やかに判定されるべきである。
【０００９】
特に、健全性検査は、危険にさらされる食品、たとえば肉、魚、乳製品及び「コールドチェーン」の種々のステップを経る際に起こりうる温度感受性変動から生じる変化を起こしているかもしれない食品の汚染のレベルの測定に関連して、また、環境の保全及び監視において、たとえば飲用水源及び配水ネットワークにおける汚染のレベルを検査する場合に実施される。
【００１０】
より医療的な用途では、危険な状態にある患者又は被験者の生物学的試料からの核酸抽出物の純度は、診断法を実施する際に、特に遺伝子疾患又はその素因を検出するための試験を実施する際に不可欠な基準である。
【００１１】
いずれにしても、最適な効能及び安全性を保証するためには、その場で取り出した試料をできるだけ速やかに処理しなければならない。
【００１２】
生物学的試料を処理する際の第一のステップの一つは、定性及び/又は定量分析のための核酸のインビトロ操作、より正確には、当該核酸をその細胞環境から単離することからなることができる。
【００１３】
核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡは、当該核酸が根本的な役割を演じる生物学的方法に関連した多数の相互作用の標的である。一例として、これらは、遺伝子発現を担う酵素及び当該発現を規制するタンパク質因子とで直接相互作用し、これが、細胞生存、発育及び再生に寄与する根本的な生物学的方法を構成する。
【００１４】
対象の核酸をタンパク質及び／又は他の核酸と会合させるこのような複合体が、調査される核酸だけを単離し、精製することを相当に複雑化する。
【００１５】
この難題を解決するため、従来の核酸抽出法は一般に、得られる抽出物の純度のための処理時間を犠牲にしている。原則的に、このような方法は、少なくとも以下の３ステップ：（ｉ）細胞外被を溶解させて核酸を媒体中に放出するステップ、（ii）核酸−タンパク質複合体を変性させるステップ、及び（iii）対象の核酸を他の高分子から分離するステップを含む（Sambrook and Russel, 2001: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００１６】
前記従来法は、上述した３ステップによって代表される骨組みを主に踏襲しながらも、達成すべき異なる目標の関数として経験的に改変される。したがって、それらの実施態様は、目的が（ｉ）ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを（ii）原核生物から単離することからなるのか、真核生物の細胞から単離することからなるのかに依存して（原核生物の場合、（iii）プラスミド性又は染色体性のＤＮＡを区別することが適切であるかもしれないことを知りながら）実質的に異なる。
【００１７】
前述の骨組みの中には、有機溶媒、たとえばフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール又はそれらの混合物を使用して核酸を抽出することからなる必須ステップがある。そして、遠心分離によって有機相と水相とを分離したのち、水相に含まれる目的の核酸を回収する。
【００１８】
このようなステップを具現化することは、従来技術の核酸抽出法の、主なものではないにしても、一つの制限を表す。有機相と水相との分離に必要な遠心分離は、第一に、操作者による介入を必要とすることにより、また第二に、装置が高価で大きいため、その実施に要する高額なコストにより、方法の自動化に対して大きな障害となる。
【００１９】
最後に、従来の細胞溶解法の大部分は、核酸を、その天然の形態ではなく、大きな断片（５０kb）の形態で抽出することができる。その後、有機溶媒、たとえばフェノール−クロロホルム混合物を使用して核酸抽出物を精製すると、当該核酸の剪断を生じさせることができ、それが、５０kb未満の不均一性の断片を生成する。
【００２０】
特に当業者が、たとえばゲル電気泳動技術を使用して、抽出から導出した産物をそのサイズだけに基づいて区別する場合、このような「実験の気まぐれ」が結果の解釈を妨げたり誤らせたりするおそれがある。この場合、ゲル電気泳動技術はスメアリングをこうむり、これが、核酸断片を、完全に別個のバンドとして見せるのではなく、いくつかの核酸断片に対応するいくつかのバンドが集合したマークとして見せる。この「アーチファクト」はまた、特に膜上でのハイブリダイゼーション法によって抽出された核酸の検出中の感度の実質的な低下を生じさせることができる。
【００２１】
この従来技術の欠点を解消するため、細胞から核酸を抽出し、精製するためのオートマトンがヨーロッパ特許ＥＰ−Ａ−０２４５９４５に記載されている。このオートマトンは、フェノール系の有機溶媒を使用して抽出ステップを実施して、それまで必要であった多数の遠心分離ステップを省いている。簡潔に言うと、溶媒を細胞溶解産物に加えることによってエマルションを生成し、そのエマルションを加熱して相分離を起こさせる。最終的なクロロホルム抽出ステップを実施する。
【００２２】
その可能な自動化にもかかわらず、この方法は、従来技術の問題、特に有機溶媒の使用に関連する問題を解消しない。当該溶媒を使用する抽出は、汚染物質、すなわち細胞及びタンパク質を溶解させるステップで使用される洗浄剤を効果的に除去するが、なおも毒性は高いままである。その結果、その操作は、警戒と注意を要し、適切な通気を有する安全な場所に閉じ込められなければならない。
【００２３】
現代の産業及び分析研究室の安全性、効能及び信頼性の規格とで調和させることが困難である従来技術の核酸抽出法について認められる上述した欠点を解消するため、代替の手法が国際特許出願ＷＯ−Ａ−９３／０１３１２に記載されている。
【００２４】
この出願は、血液試料、細胞組織試料又は培養細胞組織試料、換言するならば、生物学的流体又は培地中の比較的均質な真核細胞の懸濁液から核酸、特にゲノムＤＮＡを調製するためのカートリッジを開示している。
【００２５】
国際特許出願ＷＯ−Ａ−９３／０１３１２もまた、そのようなカートリッジを使用する装置及び方法を記載している。
【００２６】
このカートリッジは、透析膜によって画定される透析室を含む。必要ならば、カートリッジはまた、細胞核を保持するためのフィルターを含む。
【００２７】
国際特許出願ＷＯ−Ａ−９３／０１３１２は、真核細胞を含有する試料から核酸を調製する、すなわち単離し、精製する方法であって、核を溶解させ、タンパク質を分解し、透析によって核酸を精製することによる方法を発案している。
【００２８】
しかし、国際特許出願ＷＯ−Ａ−９３／０１３１２に記載されている抽出カートリッジに関する技術は、たとえば乾燥による変性を受けていない、成分の一部が固体であり、一部が液体である異質複合混合物、たとえば未処理の食品試料の中に存在することができる原核生物から核酸を抽出するのには適さない。
【００２９】
事実、本発明は、原核生物から核酸を抽出するための、自動化することができ、複雑な出発媒体の処理に適している方法を発案する。
【００３０】
したがって、全体として自動化することができる本発明の方法は、（ｉ）組成及び構造の点で複雑かつ異質なものであるとしても、未精製の試料からの核酸の抽出に直接適用可能であり、（ii）３時間未満で完了する速やかな抽出を可能にし、（iii）再現精度の高い結果を供給し、（iv）ステップごとでトレーサビリティを保証しながら６種までの異なる試料を同時に処理することができ、（ｖ）資格のない人員によって実施されることができ、（vi）非常に短時間な場合は別として、操作者による介入又は監視を必要とせず、したがって、操作者は、抽出の過程で他の処理又は研究を実施することができ、（vii）設備に関して多大な投資を要することなく分析研究室又は工業規模で日常的に実施することができることにおいて、合理化及び経済性の基準を満たす。
【００３１】
したがって、本発明は、複雑な混合物、特に食品に含まれる微生物から核酸を抽出する方法であって、少なくとも以下のステップ：
（１２）混合物に含まれる微生物をカートリッジタイプろ過装置４０（図３を参照）に保持するステップ、
（１４）微生物をその場で溶解させるステップ、
（１６）ろ過カートリッジ４０（図１）から核酸を回収するステップ
を含む方法に関する。
【００３２】
分析される試料（固体／液体粉砕食品又は水、たとえば飲用水）の性質に依存して、第一のステップ：
（１０）前記混合物をカートリッジタイプ予備ろ過装置で浄化するステップ（図１、トラックＡ）が必要であり、その後、ろ液に対してステップ（１２）が実施される。
【００３３】
核酸を定量のために抽出する場合、補足的なステップ：
（１８）液体固体吸着クロマトグラフィーによって核酸を濃縮し、精製するステップ（図１、トラックＢ）
が必要である。
【００３４】
ステップ１２、１４及び１６は、「カートリッジタイプろ過装置」４０（図３）に関する。この呼称ならびに等価の用語及び表現「カートリッジ」、「抽出カートリッジ」及び「ろ過カートリッジ」は、２個のスクリーンの間に閉じ込められているか、１個のスクリーンに接着されている保持フィルター４２を含むシステムをいう。スクリーンは、何らかの手段、たとえば接着、ねじ込み又は挟み込みされた２個のリングによって保持されているか、リングに取り付けられている。
【００３５】
前記カートリッジは、溶解処理を受けることができる（図４）。この場合、ろ過カートリッジが配置されているプラスチック部品をろ過ステーションから外し、カートリッジの下面、すなわち、細菌と接しない面をカバーによってシールする。ろ過カートリッジの上面は、漏斗、アダプタ、溶解産物浄化フィルター及び１５mlコニカルボトム管を含む装置によってシールする。アダプタを漏斗にねじ込む。漏斗は、アダプタに挿入された溶解産物浄化フィルターを含む。１５mlコニカルボトム捕集管は、図４に示すように、アダプタの自由端にねじ込まれる。
【００３６】
前記システムは、それを構成するフィルターの特性のおかげで、独自の特徴を有している。以下に記す発明の詳細な説明で理解されるように、フィルターの選択が、期待される結果を得る際の必須要素である。本発明のろ過カートリッジ４０の記載は後で提供する。
【００３７】
本発明に関して、核酸の「抽出」とは、核酸の、その自然な生物学的環境からの単離、精製及び濃縮を包含する。本発明の方法を使用して抽出される核酸の純度及び濃度は、その核酸を、ＰＣＲと同じくらい高感度である方法を使用する検出のために、その方法、特にＰＣＲ反応の特異性及び感度を抑制又は変化させるおそれのある残留汚染物質を除去するための補足的な処理に頼ることなく直接使用することができるような純度及び濃度である。
【００３８】
「核酸」とは、通常どおり、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。前記方法が、ＤＮＡ及びＲＮＡに加えて、当業者が容易に選択することができるステップでＲＮＡ分解酵素を加えることによってＤＮＡだけを検出するために使用することもできるし、ＤＮＡ分解酵素及びアンチＲＮＡ分解酵素を加えることによってＲＮＡだけを検出するために使用することもできるということは明白である。
【００３９】
「対象の核酸」、「調査される」、「所望の」又は他の等価の呼称は、当業者により、本発明の抽出法の標的核酸として容易に認識されることができる。このような核酸は、後続の定性及び／又は定量分析処理のための出発原料となる。
【００４０】
本明細書で使用する「微生物」とは原核生物をいい、この定義は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌ならびに細胞壁をもたない細菌、さらには芽胞形態の細菌を包含する。
【００４１】
本発明で使用される「複雑な混合物」とは、原核生物の細胞を含有する組成物であって、おそらくは、異質性の組成物（一例は、一部が液体であり、他の部分が固体である多少の数の異なる成分を含むことを特徴とする未処理の食品試料である）又はより均質性であり、たとえば多少の純度の細菌培養物に対応する組成物をいう。
【００４２】
本発明の抽出法は、その選択性及びふるい効果を有するバリヤの機能に類似したその機能を参照して選択性透過膜と呼ばれる多孔質膜を使用する膜又はろ過分離技術を使用する。膜の平均孔径に一致する所与のしきい値を超えるおおよそのサイズを有する分子又は粒子は保持され、そのしきい値未満のサイズを有する分子又は粒子は、圧力勾配の適用によって発生する溶媒の流束の作用の下、「バリヤ」を透過する。
【００４３】
これに関して、多孔質膜によって構成されるふるいに通す透過が、二つの液体、すなわち前記膜の孔を通過した透過物又はろ液と、種の中の初期液体に関して濃縮されている、孔の平均直径を超える直径を有する保持物とを分けることができる。
【００４４】
限外ろ過又は精密ろ過が、区別されるべきである特定のろ過技術を構成する。
【００４５】
限外ろ過は、一般に１〜１００nmの範囲の孔径を有する微孔質膜を使用する。このような膜は、小さな分子（水、塩）を透過させ、高分子量の分子（ポリマー、タンパク質、コロイド）を保持する。上記の孔径に関する範囲にかかわらず、限外ろ過分野で膜を特徴づけるためには、孔径ではなく分画しきい値の概念を使用することが普通である。分画しきい値は、当該膜によって９０％又は９５％が保持される分子の、ダルトン単位で表した分子量と定義される。
【００４６】
精密ろ過は、約０．１〜１０μmの範囲にある平均孔径を有する膜を用いる固液分離の方法からなる。したがって、この方法は、懸濁液中の粒子を保持することができる。
【００４７】
ろ過方法は、異なる形態及び配置で使用することができ、膜を収容する装置のタイプ及び形状寸法が、分離収率に対して決定的な影響を及ぼす。可能な形態及び配置の例を以下に記す。
【００４８】
正面ろ過では、分離する種を含有する液体を膜に対して垂直に供給し、その間、タンジェントモードで、多孔質膜を前記液体によって十字流にスイープする。
【００４９】
平面配置は、組み立て／分解作業を容易にし、粘稠な流体とで使用することができる。しかし、ろ過方法を平面配置で具現化する場合、以下に記載するように発生する制限的現象、特に目詰まりの危険を考慮しなければならない。
【００５０】
らせん配置は、自らを中心に巻かれた平面膜からなる。この場合、ろ液は中心のルーメンから捕集される。この配置は、コンパクトさの観点から有利であるが、膜の清浄を困難にし、ろ過システムを分解することは不可能である。さらに、無視できない程度の目詰まり現象を発生させる。
【００５１】
管状配置では、膜は、多孔質鋼又グラスファイバの円柱形マトリックスの内面に沿って延びる。ろ過される溶液はマトリックスの内側から供給され、その後、圧力下で膜を透過したのち、ろ液がマトリックスの外側で回収される。このシステムは、ろ過流束を逆にするだけで簡単に清浄することができる利点を有するが、大容量のユニットを必要とする。
【００５２】
ろ過方法の作業条件の選択は一般に、膜の閉塞もしくは目詰まり及び濃度分極をはじめとする制限的現象を減らす必要性によって支配される。
【００５３】
目詰まりは、膜−溶液界面で起こる物理的、化学的及び生物学的現象からなる。これは、主に、孔の中、次いで膜の表面への物質の蓄積を生じさせる付着及び／又は吸着現象のせいである、使用中の膜のろ過特性の変化を特徴とする。したがって、目詰まりは、ただちに孔の閉塞を生じさせ、それが透過度及び選択率の変化を生じさせる。分離効能に対する影響は深刻であり、ときには劇的であることもある。
【００５４】
使用される膜は、分子又は粒子規模で分離を実施する性質を有するため、膜の表面で徐々に減速し、そして停止する種（分子又は粒子）の蓄積は、ろ過方法に固有の不可避な現象である。「濃度分極」と呼ばれる前記現象は、膜から処理される溶液のコアへと向かう、すなわち、操作者が前記溶液に課すことを望むろ過流束の方向とは逆方向の拡散流束を発生させる。こうして、濃度分極は、蓄積に関連する付着物がおそらくは「第二の膜」として作用することによるろ過流束の低下及び選択性の変化ならびに蓄積した種が準固体の外観を示すネットワークを形成することによる表面沈殿又はゲル化による膜孔の目詰まりを誘発する。
【００５５】
本発明の抽出法のステップ１０（分析される材料が水である場合は不可欠ではない）では、出発原料、すなわち複雑な混合物をろ過して、約５μmを超える、好ましくは約８μmを超える平均孔径の粒子を保持する。
【００５６】
本発明で使用する「膜」又は「フィルター」とは、上記の「選択性透過膜」の定義を満たす装置をいう。
【００５７】
ステップ１０で実施されるろ過方法は正面精密ろ過タイプであり、この精密ろ過は、真空下、平面モードで実施される。
【００５８】
この精密ろ過ステップの実行パラメータは、達成すべき二つの目標、すなわち、複雑な混合物に含まれる、真核細胞（除去されるべき）及び原核細胞（許容される損失レベルが最小限でなければならない）を含有するかもしれないデブリをサイズによって分別する目標と、制限的現象、たとえば目詰まり及び濃度分極を回避する目標とによって決まる。
【００５９】
このために、ステップ１０は、ポリカーボネート及び硝酸セルロースのような粒子を高濃度で添加された粘稠な液体を処理するのに適した材料によって構成されているフィルターであって、同時に処理されるかもしれない異なる試料の間での汚染の危険を避けるために使い捨て可能であるフィルターを使用して実施される。前記フィルターの平均孔径は、１．２〜１２μmの範囲、好ましくは実質的に５μmである。
【００６０】
本発明の抽出法のステップ１２は、真空下、平面モードで十字流で実施される精密ろ過からなる。
【００６１】
ろ過カートリッジ４０に組み込まれた、このステップで使用される保持フィルター４２は、ステップ１０からのろ液に含まれる種を選択的に分別し、それを微生物で濃縮しながらも、できるだけ多くのデブリ及び望ましくない種を透過させるように選択される。
【００６２】
フィルターの選択を導く基準、すなわちろ液中の微生物の最小限の損失率及びろ過効能を制限するおそれのある現象の不在が、本発明者らを、その孔構造の均一性及びその高い非特異的吸着力のため、ポリカーボネート又は硝酸セルロースを選択するよう導いた。選択されたフィルター４２は、０．２２〜０．５５μmの範囲の平均孔径を有し、好ましい値は０．４５μmのオーダである。
【００６３】
本発明の抽出法のステップ１４は、当該方法のステップ１２からの保持物に含まれる微生物の化学的及び／又は機械的溶解に関する。上述したように、このステップは、その場で、すなわち、ろ過カートリッジ４０のレベルで実施される。
【００６４】
本発明者らは、（ｉ）効果的であり、（ii）従来の方法を使用しても溶解は長く困難である、おそらくはグラム陽性菌及び胞子を含む複雑な出発混合物の生物多様性に適合し、最後に（iii）方法全体の自動化に適した溶解方法を開発することを目標にした。
【００６５】
「化学的溶解」とは、原核細胞に対する洗浄剤の作用をいう。この洗浄剤は、たとえば、
・トリスＨＣｌ（pH７〜９、好ましくは約８、濃度約２５〜４００mM、好ましくは約１００mM）、
・適宜、以下の３成分：
○ＥＤＴＡ（pH約７〜９、好ましくは約８、濃度約１０〜１００mM、好ましくは約４０mM）、
○ＮａＣｌ（５０〜８００mM、好ましくは約２００mM）、
○ＳＤＳ（約０．５％〜８％、好ましくは約２％）、
（上記４成分の混合物がＴＥＮＳとして知られるバッファー（Kuskeら、1998, Appl Environ Microbiol 64: 2463-2472）を形成する）ならびに
・Chelex-100（約３％〜６０％、好ましくは約１５％）
を含む溶解バッファーに含まれる。
【００６６】
機械的処理は、保持フィルターに固着した原核細胞を超音波処理することからなる。この超音波処理は、化学的溶解と同じ緩衝条件下、超音波浴中、６０℃〜１００℃の範囲の温度、好ましくは約７０℃で実施される。あるいはまた、前記機械的処理は、周囲温度かつ無水状態で、すなわち、浴を使用することなく、溶解させる溶液を含有する受け器を超音波発生器に直接固定し、各溶解カートリッジが独立したソノトロードの上に直接位置するようにすることによって実施することもできる。
【００６７】
機械的処理の代りに、又はそれに続いて実施される化学的処理は、高温で実施される。本発明で使用する「高温」とは、８０℃〜１２０℃の範囲、好ましくは１００℃に近い温度を包含する。
【００６８】
本発明の好ましい実施態様では、抽出法のステップ１４は、周囲温度かつ無水で機械的に処理したのち、上記のような化学的に処理を実施することを含む。
【００６９】
場合によっては、高変性性カオトロピック剤を溶解バッファーに加えて、核酸の抽出収率を下げるおそれのあるＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素の活動を阻害してもよい。本発明の方法で使用することができるカオトロピック剤の非限定的な例は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、尿素、過塩素酸、トリクロロ酢酸、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジン及び臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含む。
【００７０】
本発明の抽出法を具現化するための一つの形態（図１、トラックＡ）では、ステップ１６で、真空を適用することにより、対象の核酸を含有する溶液をカートリッジ４０から回収する。有利には、少なくとも一度、前記カートリッジ４０をＴＥ１Ｘバッファーで洗浄して核酸の損失を最小限にする。
【００７１】
ステップ１８の目標は、シリカカラムで核酸を濃縮し、精製することである。この場合、溶質を固定吸着剤と移動液相とに分配することに基づく分離形態である液体固体吸着クロマトグラフィーが使用される。シリカは二極性吸着剤である。吸着による固定は、吸着剤と吸着される分子との間に二次的な表面結合又は双極子−イオン結合が確立することによる。
【００７２】
したがって、ステップ１８は、少なくとも四つのサブステップ：
１８１）特に無水エタノールの存在で核酸抽出物を希釈して、前記核酸のシリカへの結合を最適化するサブステップ、
１８２）混合物をシリカカラムに装填するサブステップ、
１８３）前記カラムを１回以上洗浄したのち乾燥させるサブステップ、及び
１８４）シリカカラムに保持された核酸を溶出させるサブステップ
に分かれる。
【００７３】
サブステップ１８２中、核酸は、溶質の水和分子から水を除去する高濃度のカオトロピック塩の存在でシリカに吸着される。
【００７４】
多糖類及びタンパク質は吸着されず、サブステップ１８３で除去される。
【００７５】
サブステップ１８４では、精製した核酸を低塩度条件下で溶出させる。
【００７６】
好ましくは、サブステップ１８１〜１８４は、特に洗浄バッファー及び核酸の溶液を溶出させるのに遠心分離に頼ることを避けるため、真空下で実施する。
【００７７】
好ましい実施態様では、本発明の抽出法は、たとえばミンチ肉タイプの肉製品又はチーズタイプの乳製品のような食品試料によって代表される複雑な混合物の後続の処理を容易にするためのさらなる予備ステップを含む。
【００７８】
この予備ステップは、
２６）複雑な試料、特に食品試料を粉砕すること、及び
２７）得られた粉砕混合物を酵素的及び化学的に前処理すること
からなる。
【００７９】
本発明はまた、微生物から核酸を抽出する方法のステップ１２及び１４（図１、トラックＡ）を実施する際に使用するためのろ過カートリッジ４０に関する。
【００８０】
濃縮精製ステップがクロマトグラフィーによって実施される場合（ステップ１８）、カートリッジ４０は、２個のろ過支持体（スクリーン）の間に挿入され、図３に示すように全体が２個のポリマーリングによって維持されている、平均孔径が好ましくは０．４５μmであるポリカーボネート保持フィルター４２を含む。このカートリッジをシールして溶解処理を受けさせることもできるし（図４）、あるいは、保持フィルターを、注入されたポリマーリングに取り付ける。この場合、ろ過カートリッジが位置している部品をろ過ステーションから外し、カートリッジの下面、すなわち、細菌と接しない面をカバーによってシールする。ろ過カートリッジの上面は、漏斗、アダプタ、溶解産物浄化フィルター及び１５mlコニカルボトム管を含む装置によってシールする。アダプタは漏斗にねじ込む。漏斗は、アダプタにすでに挿入されている溶解産物浄化フィルターを含む。１５mlコニカルボトム捕集管は、図４に示すように、アダプタの自由端にねじ込まれる。
【００８１】
さらなる態様で、本発明は、複雑な混合物、特に食品又は水に含まれる微生物から核酸を抽出するための、本発明の抽出法を実施するのに適したオートマトンを提供する。
【００８２】
「オートマトン」とは、たとえば二つの必須ステップの間の接続を保証するための短時間又は本質的でないものを除き、操作者の支援、介入又は監視を要することなく、必須ステップを自律的に連結させながら方法を実施することができる装置をいう。
【００８３】
本発明はまた、特に食品の複雑な混合物に含まれる微生物から核酸を抽出し、検出し、適宜、定量するための装置であって、本発明にしたがって核酸を抽出するためのオートマトンを、前記核酸の熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンと合わせて含む装置に関する。
【００８４】
好ましい実施態様では、本発明の装置に組み込まれる熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンはロータリータイプである。
【００８５】
本発明の装置で使用するための核酸シーケンスの熱依存性連鎖増幅のためのオートマトンが、フランス国特許第００１００２９号の優先権を主張する米国特許出願ＵＳ−０９／９８１０７０号に記載されている。このような装置の一例は、（ｉ）特異的核酸シーケンスを増幅するためのプライマーの対を含有する複数の反応室を含み、前記増幅の間にマトリックスとして働く精製された核酸抽出物を供給するためのタンクが接続されているカートリッジと、（ii）それぞれが増幅サイクル中の所与のステップ、すなわち変性ステップ、ハイブリダイゼーションステップ又は伸長ステップに対応する少なくとも二つの異なる温度に加熱され、一定に維持されることができる少なくとも二つの別々の区域を有する加熱プラテンと、（iii）カートリッジとプラテンとを相対的に移動させ、その移動によってプラテンの各区域の温度への反応室の循環的暴露を保証して、前記反応室の内側で起こる増幅反応のサイクルを自動的に連結させることを可能にするための手段とを含む。
【００８６】
本発明は図面によって非限定的に例示されている。
【００８７】
例としてのみ記す以下の実施例から本発明がより明確に理解されよう。本発明が決してこの実施例に限定されないということが理解されるべきである。
【００８８】
実施例
２種の複雑な食品混合物、すなわちミンチステーキタイプ肉製品及び商標Babybel（登録商標）の下で販売されているソフトチーズならびに飲用水の試料に対して本発明の核酸抽出法を試験した。２種の複雑な食品混合物は、本発明の図１のトラックＡを例示し、水道水試料は、本発明の図１のトラックＢを例示する。
【００８９】
既知の量の２種の異なる微生物（Listeria monocytogenes及びSalmonella ser. Enteritidis）を２種の複雑な混合物に接種した。これらの微生物は、本発明の方法を使用してグラム陽性菌及びグラム陰性菌からの核酸の抽出の効能を立証するために選択したものである。飲用水試料には、既知の量のLegionella pneumophila血清型１の株を接種した。
【００９０】
Ｉ−食品試料の粉砕
Association Francaise de Normalisation（ＡＦＮＯＲ）（フランス規格協会）及びFederation Internationale de Laiterie（ＦＩＬ）（国際酪農連盟）によって設定され、配布されている現行規格にしたがって、Stomacherを使用して食品試料を粉砕して懸濁母液を調製した。
【００９１】
規格ＮＦＶ０８−０１０（１９９６年３月、ＡＦＮＯＲ、フランス、パリ）、ＮＦＶ０４−５０１（１９９８年４月、ＡＦＮＯＲ）及びＦＩＬ１２２Ｃ：１９９６（１９９６年１２月、ＦＩＬ、ベルギー、ブリュッセル）にしたがって、食品試料のアリコート２５gを希釈剤に１／１０で懸濁させた。これらの規格によると、希釈剤の組成は、考慮される食品のタイプの関数である。この場合、ミンチステーキ及びチーズをそれぞれ緩衝ペプトン化水及びクエン酸ナトリウム２０g/lに懸濁させた。
【００９２】
得られた懸濁液を３分間粉砕処理した。
【００９３】
出発食品１gに相当する粉砕材料の１０mlアリコートを取り出して核酸を抽出した。
【００９４】
また、食品マトリックスを、調査される微生物に依存する特定の培地中、標的微生物で濃縮したのち、現行のＡＦＮＯＲ規格にしたがって処理することもできる。この場合は、濃縮培地１０mlに酵素的前処理を直接適用した。
【００９５】
II−食品試料の酵素的及び化学的前処理
このステップは、後続のろ過ステップの収率を下げるおそれのある、目詰まりのような現象を避けるため、脂肪小球及びタンパク質ミセルを加水分解した。
【００９６】
前処理溶液の組成は、書誌的研究から経験的に決定した（Driehus and Teemstra 1992, Neth Milk Dairy J 46: 209-215、Starbuck et al, 1992, Lett Appl Microbiol 15: 248-252、Yang and Lundahl, 1994, Anal Biochem 281: 210-221, Rijpens et al, 1996, Appl Environ Microbiol 62: 1683-1688）。
【００９７】
各１０mlアリコートに供給された添加物は、ミンチステーキ粉砕材料の場合にはトリプシン０．２gで構成され、チーズ粉砕材料の場合にはパンクレアチン０．２g、ＥＤＴＡ１０mM、Triton５％及びコール酸４％で構成されていた。
【００９８】
試料は、ミンチステーキ粉砕材料の場合には２５℃で１時間インキュベートし、チーズ粉砕材料の場合には３０℃で１時間３０分インキュベートした。このインキュベーションステップは、有意な細菌増殖をも生じさせず、原核細胞の「早期」溶解をも生じさせなかった。これらの二つの現象は、処理の収率を損なうおそれがある。
【００９９】
III−粉砕食品材料の精密ろ過（ステップ１０）
III−１−プロトコルの概要
目詰まりを回避するという要件を考慮して、平均孔径８μmの硝酸セルロースフィルターを選択した。
【０１００】
真空下、平面モードで精密ろ過を実施した。
【０１０１】
前処理した粉砕食品それぞれ１０mlをろ過した。ミンチステーキであるかチーズであるかに依存して、精密ろ過装置をそれぞれＴＥ１Ｘバッファー（トリスＨＣｌ  １０mM  pH８．０及びＥＤＴＡ  １mM  pH８．０）４０ml又は５０℃に予熱しておいた０．５％Triton（無菌蒸留水で希釈）１０mlで洗浄した。この洗浄ステップは、材料、特に対象の細菌の損失を抑制することと、試料を希釈して、特に後続のフィルター保持ステップの間の目詰まりを避けることとを狙ったものである。
【０１０２】
精密ろ過ステップののち、初期の粉砕チーズ及びミンチステーキ材料それぞれ１０mlに関して、標的細菌を含有するろ液２０及び５０mlを回収した。
【０１０３】
III−２−オートマトン実行条件
このステップは、ポンプに接続されたろ過ステーションで、上から順に、使い捨て漏斗、使い捨て前ろ過カートリッジ、プラスチックシリンダ及び使い捨て保持カートリッジを含むアセンブリを使用して実施した。このアセンブリは、プラスチック部品を介してろ過ステーション８０に接続されていた（図２）。
【０１０４】
平面モードで精密ろ過を実施した。
【０１０５】
液体（洗浄バッファーを補足した粉砕食品材料）を手作業で分配した。
【０１０６】
IV−微生物の保持（ステップ１２）
IV−１−プロトコルの概要
目詰まり回避の基準に関して多数の保持フィルター試験を実施したのち、平均孔径０．４５μmのポリカーボネートフィルターを用いた場合に最良の結果が認められた。
【０１０７】
ろ液４０mlを、選択した保持フィルター４２に通してろ過した。
【０１０８】
ろ液を取り出し、保持フィルター４２をポリプロピレン管に入れた。
【０１０９】
飲用水試料に関しては、試料を粉砕するステップならびに酵素的及び化学的前処理のステップは不要であった（図１、トラックＢ）。ＡＦＮＯＲによって作成され、配布されている現行規格によると、飲用水のための試験アリコートは、２５０ml〜２リットルの範囲、好ましくは１リットルであった。この試料を平均孔径０．４５μmのポリカーボネートフィルターに通して直接ろ過して、Legionella属の細菌を保持した。
【０１１０】
IV−２−オートマトン実行条件
前ろ過及び保持を順に実施したため、前ろ過の最後で、ろ液４０mlを、シリンダを介して、抽出装置のモジュール８０への入口に位置する保持カートリッジ４０に直接供給した（図２）。
【０１１１】
ろ液を抜くための廃物タンクが設けられていた。
【０１１２】
Ｖ−標的微生物の溶解（ステップ１４）
Ｖ−１−プロトコルの概要
直前のステップが終了すると、保持フィルター４２をポリプロピレン管に装填した。この材料は、ろ過カートリッジ４０を製造するために要したポリマーに近いものであった。
【０１１３】
保持フィルター４２に固着した保持物を、トリスＨＣｌ  １００mM、pH８．０−Chelex-100、２５％溶解バッファー１mlに懸濁させた。
【０１１４】
保持フィルター４２を含有するポリプロピレン管及び溶解バッファーを１２０Ｗ音波処理浴に入れた。７０℃で４０分間、ソニケータの最大出力の８０％で音波処理を実施して、８０〜１２０Ｗの範囲、好ましくは１００Ｗの出力を得た。
【０１１５】
そして、管を水浴中１００℃で１０分間インキュベートした。
【０１１６】
Ｖ−２−オートマトン実行条件
ろ過カートリッジが接続されたポンプのろ過ステーションに配置されたプラスチック部品を外した。ろ過カートリッジの下面をカバーによって閉じた。トリスＨＣｌ  １００mM、pH８．０−Chelex-100、２５％溶解バッファー２mlをろ過カートリッジに装填した。溶解物浄化カラムを含むアダプタ及び１５ml管をねじ込んでおいた漏斗によってろ過カートリッジの上面を閉じた（図４）。
【０１１７】
そして、溶解を実施するためのアセンブリをモジュール８２のソノトロードの上に周波数３５KHzで４０分間配置した。カートリッジをモジュール８４の乾燥浴中、１００℃で１０分間インキュベートした。
【０１１８】
VI−核酸の回収（トラックＡ及びＢ、ステップ１６）
VI−１−プロトコルの概要
ポリプロピレン管に含まれた細菌溶解物を１mlピペットによって回収し、ろ過カラムを備えた新たな管に装填した。そして、同じく取り出し、ろ過カラムに装填したＴＥ１Ｘ１mlで溶解管をすすいだ。そして、溶解物をろ過カラムに通して重力下でろ過した。ろ過した溶解物を取り出し、ＰＣＲを使用して直接分析するか、トラックＢのステップ１８（図１）にしたがって濃縮し、精製した。
【０１１９】
VI−２−オートマトン実行条件
ろ過カートリッジ４０を含む、溶解を実施するために必要なアセンブリをモジュール８０のろ過ステーションに配置した。カバーを小さなタンクに取り替えたのち（図５）、ポンプを接続して溶解物を「ろ過」カラムに通してろ過した。そして、ＴＥ１Ｘ１mlをろ過カートリッジ４０に装填して、ＴＥによって保持フィルター４２をすすいだ。ろ過した溶解物を含有するポリプロピレン管を取り出し、ＤＮＡを、ＰＣＲによって直接分析するか、トラックＢのステップ１８（図１）にしたがって濃縮し、精製した。
【０１２０】
VII−液体固体クロマトグラフィーによる核酸の濃縮及び精製（トラックＢ、ステップ１８）
VII−１−プロトコルの概要
「Nucleospin Plant L」システム（Macherey-Nagel、ドイツDuren）として市販されているようなシリカカラムを使用して核酸を精製し、濃縮した。
【０１２１】
複数の試料を同時に処理することができる真空室にシリカカラムを配置した。この真空室は、マノメータ及びポリプロピレンカバーを備えたガラスタンクによって構成され、前記カバーの外面がカラムを受け、その内面が、液移動を可能にする使い捨てニードルを受けた。
【０１２２】
適宜、可動タップを使用して各カラム中の真空を調節した。
【０１２３】
ガラスタンクの中には、管を各ニードルの下方に配置して種々の液体（結合バッファー及びエタノール、洗液、溶出液）を回収することを可能にする支持体があった。
【０１２４】
核酸（１容量）を、結合バッファー（上記した市販システムのバッファー「Ｃ４」）１容量及び無水エタノール１容量と混合した。この混合物を３０秒間激しく攪拌したのち、上記のようにカラムに装填した。
【０１２５】
シリカカラムを、まず「ＣＱＷ」洗浄バッファー１mlで洗浄し、次に「Ｃ５」バッファー２mlで洗浄した。これらのバッファーは、「Nucleospin Plant L」システムで提供されている。
【０１２６】
洗浄ステップからの廃物を含有する、ガラスタンクに配置された管を空にした。
【０１２７】
そして、真空を１２分間適用してカラムを乾燥させた。
【０１２８】
７０℃に予熱しておいた「ＣＥ」バッファー２００μlをカラム上で５分間インキュベートした。
【０１２９】
新たな管で真空溶出させたのち、直前のステップを一度繰り返した。そして、核酸を真空下で５分間溶出させた。
【０１３０】
このようにして精製した核酸の量は、１５〜２５０μl、好ましくは２００μlであった。
【０１３１】
VII−２−オートマトン実行条件
ろ過ステーションで、ろ過された溶解物を捕集するためのポリプロピレン管を含有するアダプタ及びろ過カラムを外した。ろ過カラムを取り除き、ＤＮＡを濃縮し、精製するためのシリカカラムに取り替えた。この段階で、廃物容器に直接捕集された溶解物（シリカ上に保持されたであろうＤＮＡをそれ以上含有しない）及び洗液の除去を可能にするため、カラムは管の中にパッケージングされていなかった。
【０１３２】
ポリプロピレン管に含まれていたろ過溶解物（１容量）を、結合バッファー（Macherey-Nagelによって販売されているシステムの「Ｃ４」バッファー）１容量及び無水エタノール１容量と混合した。この混合物を３０秒間激しく攪拌したのち、ろ過ステーションで、新たに設置したシリカカラムに装填した。ポンプを接続して溶解物をシリカラムでろ過することができるようにしたのち、シリカに保持されたＤＮＡを「ＣＱＷ」洗浄バッファー１mlで洗浄し、次に「Ｃ５」バッファー２mlで洗浄した。これらのバッファーは、「Nucleospin Plant L」システムで提供されており、操作者が手作業で分配した。
【０１３３】
そして、真空を１５分間適用してカラムを乾燥させた。
【０１３４】
濃縮し、精製したＤＮＡを回収するための新たな管をアダプタの自由端にねじ込んだ。
【０１３５】
７０℃に予熱しておいたＴＥ１Ｘバッファー２００μlをカラム上で５分間インキュベートした。新たな管で１分間真空溶出させたのち、直前のステップを一度繰り返した。
【０１３６】
このようにして精製した核酸の量は、１００〜３００μl、好ましくは２００μlであった。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】核酸抽出法の図である。
【図２】核酸を抽出するためのオートマトンの図である。３個のステーション、すなわち、抽出法のステップ１０（省略可能）、１２、１６及び１８を実施するステーション８０ならびにステップ１４を実施するためのステーション８２及び８４を示す。
【図３】ろ過カートリッジの図である。
【図４】抽出法のステップ１４を実施するためのアセンブリの図である。
【図５】抽出法のステップ１６を実施するためのアセンブリの図である。
【図１】
2005526509.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2005526509.tif 000008
2005526509.tif 000009
2005526509.tif 000010
2005526509.tif 000011
2005526509.tif 000012
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