(57)【要約】本発明は、ＣＮＡオリゴマーの新規の製造方法ならびに人工超分子ＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡ対形成システムに関する。本発明はまた、特に生物工学的アッセイにおけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＡオリゴマーの製造方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＮＡモノマー構成単位のカルボキシル官能基を活性化する工程、
ｂ）続いて、塩基条件下で、該モノマー構成単位と支持体の遊離の水酸基とをエステル化させる工程、ならびに
ｃ）その後、最初にＣＮＡモノマーのシクロヘキシル環のアミノ基上の保護基を脱離し、続いて、式（Ｉ）
【化１】
2005500391.tif 000060
（式中、Ａ、ＤおよびＦは、互いに独立してＣＲ3Ｒ4−、−ＮＲ5−、−Ｏ−あるいは−Ｓ−基であり得、Ｅは−ＣＲ6−基であり得、ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6は互いに独立して、水素原子もしくはＣ1〜Ｃ12アルキル基であり、式中、Ｂは、第１級アミノ基が保護されていないかまたはＢｏｃ−保護形態にあり得る核酸塩基である。）
のＣＮＡモノマーを用いて、さらに活性化されたＣＮＡモノマーと結合させる反復サイクルによってオリゴマーを集成する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
核酸塩基Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イソグアニン、イソシトシン、キサンチンまたはヒポキサンチンから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩＩ））、Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（ＩＶ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（Ｖ））、Ｎ4−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩＩ））、Ｎ2−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＶＩＩＩ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＩＸ））から成る群より選択されるＣＮＡモノマーが使用されることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
ＣＮＡモノマー構成単位のカルボニル官能基を活性化するためにＨＡＴＵ、ＤＩＣ、ＴＢＴＵまたはＨＢＴＵが使用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＮＡオリゴマーまたはＣＮＡモノマー構成単位を疎水性基、マーカーまたは生物学的に活性な物質にさらにカップリングさせることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
リン酸化された酪酸はカップリングのためのリンカーとして使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＣＮＡオリゴマーを合成するためのＣＮＡモノマーの製造方法であって、以下の工程：
ａ）式（ＸＩＩＩ）
【化２】
2005500391.tif 000061
（式中、Ａ、ＤおよびＦは、互いに独立してＣＲ3Ｒ4−基であり得、Ｅは−ＣＲ6−であり得、ここで、Ｒ3、Ｒ4またはＲ6は、チミン、アデニン、Ｎ6−ベンゾイルアデニン、Ｎ6−ジメチルアミノエチレンアデニン、シトシン、Ｎ4−ベンゾイルシトシンまたは２−アミノ−６−クロロプリンから成る群由来の核酸塩基に対する塩基の存在下で上記の意味を有する。）
のヨードラクタムをカップリングさせる工程、
ｂ）続いて、Ｂｏｃ保護基でラクタム環の窒素を保護する工程、
ｃ）求核的環開裂により所望のＣＮＡモノマーを生成させ、２−アミノ−６−クロロプリンを使用する場合、塩素置換基がケト基に変換される工程、
を含む、方法。
【請求項８】
８−ヨード−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−３−オンがヨードラクタムとして使用されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＮＡモノマーを生成させるための求核的環開裂は、ＬｉＯＨまたはＬｉＯＯＨによって行われることを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｂｏｃ保護基は、トリエチルアミンおよびＤＭＡＰの存在下、ピロ炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの添加を介して導入されることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
チミンモノマーの生成において、チミンのリチウム塩を前駆体として用いることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
グアニンモノマーの生成において、（ＣＨ3）3Ｎ、３−ＯＨ−プロピオニトリルおよびＤＢＵの存在下で塩素置換体がケト基に変換されることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
構造３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩＩ））、Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（ＩＶ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（Ｖ））、Ｎ4−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩＩ））、Ｎ2−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＶＩＩＩ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＩＸ））による直接オリゴマー化のために選択される、ＣＮＡモノマー。
【請求項１４】
ＣＮＡオリゴマーおよびそれに相補的なｐ−ＲＮＡオリゴマーを含むヘテロ二重鎖。
【請求項１５】
２’−４’−シクロヘキシル−ポリアミド骨格を有するＣＮＡオリゴマーを含む、請求項１４に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項１６】
ＣＮＡオリゴマーは、構造式（ＸＩ）
【化３】
2005500391.tif 000062
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ１はＮＨ2基であり、Ｒ２はＣＨ2−ＣＯＯＨ基であり、Ａ、ＤおよびＦは互いに独立してＣＲ3Ｒ4−、−ＮＲ5−、−Ｏ−または−Ｓ−基であり得、Ｅは−ＣＲ6−基であり得、ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6は互いに独立して水素原子もしくはＣ1〜Ｃ12アルキル基である。）
のモノマーから集成されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項１７】
構造式（ＸＩＩ）
【化４】
2005500391.tif 000063
（式中、ＢおよびＢ’は相補的な核酸塩基対である。）
を有する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項１８】
ＣＮＡオリゴマーまたはｐ−ＲＮＡオリゴマーは修飾されることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項１９】
ＣＮＡオリゴマーおよび／またはｐ−ＲＮＡオリゴマーは、ペプチド、タンパク質、放射性マーカーもしくは染料で修飾され、ならびに／あるいはＣＮＡオリゴマーはＮ−末端リン酸基で修飾されることを特徴とする、請求項１８に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項２０】
修飾は末端であることを特徴とする、請求項１８または１９のいずれか１項に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項２１】
Ｎ−末端ヒドロキシカルボン酸残基または末端リジン残基は、ＣＮＡオリゴマー上のリンカーとして存在することを特徴とする、請求項１８〜２０に記載のヘテロ二重鎖。
【請求項２２】
蛍光染料に共有結合されることを特徴とする、修飾されたＣＮＡオリゴマー。
【請求項２３】
生物工学的アッセイにおけるＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖の使用。
【請求項２４】
生物工学アッセイにおける請求項２２に記載の修飾されたＣＮＡオリゴマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＮＡオリゴマーおよびポリマーの製造方法、およびそれに必要なＣＮＡモノマー構成単位の製造方法、ならびに特に生物工学的アッセイにおける人工的超分子対形成システムの形成のためのＣＮＡオリゴマーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップ技術に基づく多くの新規の方法は、最近、臨床診断の領域または製薬学的標的および有効成分のスクリーニングの分野において、それら自体を確立することが可能である。ハイブリダイゼーションによって、例えば、サンプル中の特定の核酸配列の存在を検出するために、現在のところ特にＤＮＡチップが注目されている。
【０００３】
このことから明らかに導かれる見解は、例えば、（特許文献１）に記載されているような生物工学的アッセイのために、熱力学的に制御可能に超分子集成体を作製することについても分子対形成システムを使用することであった。この目的のために、一般に、例えば、ペプチドまたはタンパク質などの目的の化学物質は、特定の配列を有する核酸誘導体上に固定化される。次いで、対応する配列を有する核酸フラグメントとの対形成を介して、所望される超分子システムの中間体の作製が可能である。この場合、既知の配列を有するフラグメントがレセプターとしての表面上の規定された部位に付着するならば、相補的配列を有するフラグメントに付着した化学物質を、事実上、空間的に明確に捕捉することが可能である。
【０００４】
しかし、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの天然に存在する核酸が分子の自己編成システムにおいて捕捉可能な「キャリア」として適切であるのは、生理学的条件が維持される場合のみである。この理由の１つは、例えば、ヌクレアーゼまたは塩基性もしくは酸性条件に対する天然に存在する核酸の化学的安定性は非常に低いことであり、もう１つの理由は、それらの対形成挙動は、例えば、媒体の塩の含有量および温度などの方法に関連する因子の影響を受け、従って、生物工学的アッセイにおけるそれらの使用が一般に制限されることである。
【０００５】
この理由のため、しばらくの間、超分子のアーキテクチャーを構築し、同時に広範なアッセイ条件を認容するのに適切な人工的分子対形成システムの調査が行われた。
【０００６】
長い間公知である対形成システムは、ｐ−ＲＮＡオリゴマーによって代表される［（非特許文献１）、（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）］。それらはリン酸骨格が修飾されるため、酵素、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖などのそれらの生物学的に活性な物質との特定の相互作用は排除されるが、例えば、サンプル媒体における塩濃度に対する相補的ｐ−ＲＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションの感受性には、ｐ−ＲＮＡの使用に関する問題も依然として残っている。
【０００７】
特に（特許文献２）に記載のようなシクロヘキシルまたはヘテロシクロヘキシルヌクレオアミドオリゴマー（ＣＮＡオリゴマー）は、それらのペプチド骨格が電荷を有さないため、電荷を有するリン酸含有対形成システムの適切な代替物となる。そのようなＣＮＡ対形成システムの使用は、特に、生理学的媒体で作動することができないアッセイにおいての使用に適切であるようである。しかし、欠点は、ＣＮＡは疎水性の性質が高く、例えば、水などの極性溶媒におけるそれらの使用可能性が制限されることである。
【０００８】
さらに、（特許文献２）に記載されているようなＣＮＡオリゴマーの製造は、現在のところ困難である。特に、特に複合的な保護基戦略による複雑な多段階合成ルートおよび激しい条件下で行われる反応のため、ＣＮＡオリゴマーの収率は低い。収率が低いため、ＣＮＡオリゴマーは大規模では未だ製造されておらず、従って、現在までのところ生物工学的アッセイでの使用が妨げられている。さらに、ＣＮＡを合成するのに必要なモノマー構成単位の製造は複雑で、平均的収率でのみ可能であり［（特許文献２）］、そのため、これらの前駆体の利用可能性もまた、ＣＮＡオリゴマー産物の技術的使用を妨げている。
【０００９】
【特許文献１】
国際公開第９９／１５８９３号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９９／１５５０９号パンフレット
【非特許文献１】
Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９３，  ７６，  ２１６１−２１８３
【非特許文献２】
Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９５，  ７８，  １６２１−１６３５
【非特許文献３】
Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  １９９６，  ７９，  ２３１６−２３４５
【非特許文献４】
Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９７，  ８０，  １９０１−１９５１
【非特許文献５】
Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  ２０００，  ８３，  Ｎｏ．  ６，  １０７９−１１０７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、合成によってより大量のＣＮＡオリゴマーが得られ、かつ高収率のＣＮＡオリゴマーを達成することが可能なＣＮＡオリゴマー化のための方法を提供することが目的であった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
該目的は、ＣＮＡオリゴマーの製造方法であって、以下の工程：
ａ）ＣＮＡモノマー構成単位のカルボキシル官能基を活性化する工程、
ｂ）続いて、塩基条件下で、該ＣＮＡモノマー構成単位と支持体の遊離の水酸基とをエステル化させる工程、ならびに
ｃ）その後、最初にＣＮＡモノマーのシクロヘキシル環のアミノ基上の保護基を脱離し、続いて、式（Ｉ）
【化１】
2005500391.tif 000002
（式中、Ａ、ＤおよびＦは、互いに独立してＣＲ3Ｒ4−、−ＮＲ5−、−Ｏ−あるいは−Ｓ−基であり得、Ｅは−ＣＲ6−基であり得、ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6は互いに独立して、水素原子もしくはＣ1〜Ｃ12アルキル基であり、式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イソグアニン、イソシトシン、キサンチンあるいはヒポキサンチンから成る群より好適に選択される核酸塩基であり、その第１級アミノ基は保護されていないかまたはＢｏｃ−保護形態にあり得る、ＣＮＡモノマーを用いて、さらに活性化されたＣＮＡモノマーと結合させる反復サイクルによってオリゴマーを集成すること、を含む、上記方法によって達成することができる。Ａ、ＤおよびＦ基は好ましくは炭素原子であり、ラジカルＲ4〜Ｒ6は好ましくは水素原子である。式（Ｉ）のへテロ環化合物は、好ましくはＡ、ＤおよびＦ位で合計で１個の酸素原子または１個のイオウ原子または１〜２個の窒素原子を有する。
【発明の効果】
【００１２】
驚くべきことに、従来のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマー化方法とはまったく対照的に、本明細書に記載のＣＮＡオリゴマー化は、単にＢｏｃ−により保護され、かつそれまでに塩基によって保護されていないＣＮＡモノマーで行うことが可能である。従って、該方法では、通常、５５℃で数時間、２ＭのＮａＯＨをｐＭＢｚ保護オリゴマーを添加する処置（国際公開第９９／１５５０９号パンフレット）によって保護基を脱離するための最終工程を回避することが可能である。従って、過酷なｐＭＢｚ脱保護条件下での断片化により生じる大規模な収率の消失を回避することが可能である。対照的に、ＣＮＡオリゴマーを製造するための本発明の方法は、約１００％の収率で進行する。各カップリング工程は定量的に進行するため、合成サイクルの終了時に遊離のシクロヘキシルアミノ基の中間体が存在せず、従って、不必要な末端配列も阻止される。従って、より大きなＣＮＡオリゴマーをより大量に合成することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
好適な実施態様では、適切なモノマー構成単位からのＣＮＡオリゴマーの合成を、固相、例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ペプチド合成（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９６３，  ８５，  ２１４９）に基づくテンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）樹脂（テンタゲル（Ｔｅｎｔａｇｅｌ）Ｓ−ＨＭＢ、Ｒａｐｐ−ポリマー（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ））上で行うことが可能である。この目的のために、はじめに、例えば、ヒドロキシメチルベンゾイルリンカー（ＨＭＢリンカー）などのリンカーで誘導した固相を用い、モノマー構成単位の１つ、例えば、ＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）（３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ（４，５ｂ）ピリジン−３−イルオキシ）メチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸）、ＤＩＣ、ＴＢＴＵまたはＨＢＴＵのカルボキシル官能基を活性化し、続いて、塩基性条件下で、ポリマー支持体の遊離の水酸基に結合させることによって、支持体の充填が行われる。次いで、支持体に対してシクロヘキシル環上に共有結合したモノマー構成単位のアミン官能基上の一時的Ｂｏｃ保護基の脱離から成る反復サイクルおよび溶液中において活性化されたモノマーのその後の結合によって、続いて、オリゴマーが集成される。好適なカップリング時間は３〜６時間である。合成スキームの例を表１に詳述する。
【００１４】
【表１】
2005500391.tif 000003
【００１５】
この場合におけるこの合成の１つの利点は、既に述べたように、ＣＮＡオリゴマーを集成するために使用することができるモノマー構成単位に関する。従って、核酸塩基上において単にＢｏｃで保護されるかまたはまったく保護されていないモノマー構成単位を使用するのが有利である。ここでグアニン構成単位の場合、Ｂｏｃ保護を有する核酸塩基の２−アミノ官能基を使用するのが好ましい。オリゴマー化のために、好ましくは、核酸塩基上にＮ4−Ｂｏｃ保護を有するシトシン構成単位が用いられ、好ましくは、核酸塩基上にＮ6−Ｂｏｃ保護を有するかまたはそうでなければ保護されていないかのいずれかであるアデニン構成単位が用いられ、好ましくは、核酸塩基上にＮ3−Ｂｏｃ保護を有するかまたはそうでなければ保護されていないチミン構成単位が用いられる。モノマー構成単位がＢｏｃ−保護形態にある全ての場合において、各カップリング工程後に全ての核酸塩基が保護されていない形態にあるように、Ｂｏｃ−脱保護工程中に、再度、Ｂｏｃ保護基が直接除去される（このことに関しては、表１、工程１を参照のこと）。ＣＮＡモノマー構成単位の塩基が既にＢｏｃ−保護されていない形態にある場合、それらを直接用いてオリゴマーを集成させることもできる。
【００１６】
従って、３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン（式（ＩＩＩ））、Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（ＩＶ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン（式（Ｖ））、Ｎ4−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩ））、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン（式（ＶＩＩ））、Ｎ2−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＶＩＩＩ））、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン（式（ＩＸ））から成る群より選択されるＣＮＡモノマーを使用するのが好ましい。
【化２】
2005500391.tif 000004
【化３】
2005500391.tif 000005
【００１７】
原則として、オリゴマー化は、ＣＮＡモノマー構成単位の立体選択性を考慮することなく可能であり、従って、例えば、ＣＮＡモノマーのラセミ混合物を使用するかまたはオリゴマー化のための前駆体として任意の配列における鏡像的に純粋なＣＮＡモノマー構成単位を使用することが可能である。しかし、例えば、ＣＮＡ−ＣＮＡ重鎖またはＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖は、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−ＣＮＡモノマー構成単位のいずれか一方から集成されているオリゴマーのみで成功するため、鏡像的に純粋または少なくとも鏡像体富化されたＣＮＡオリゴマーを使用して、ＣＮＡオリゴマーが作製される。そのようなＣＮＡオリゴマーの立体選択的製造は、単純に、オリゴマー化のための前駆体として鏡像的（Ｒ）−または（Ｓ）−ＣＮＡモノマーを使用することによって可能である。
【００１８】
極性溶媒、特に水性媒体に対するＣＮＡオリゴマーの溶解度を上昇させるために、適切なリンカーを介して親水性基を導入することが可能である。例えば、米国特許第５６０５６６２号明細書およびＰ．Ｎ．ギレス（Ｐ．Ｎ．Ｇｉｌｌｅｓ）ら［Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３６５−３７０（１９９０）］に記載のように、ＣＮＡオリゴマーのＮまたはＣ末端の基は、電場の適用によって、これらの分子の能動輸送をさらに可能にする。
【００１９】
Ｎ末端のリン酸基を導入するのに有用であることが判明しているリンカーは、例えば、酪酸などのヒドロキシカルボン酸誘導体である（国際公開第９９／１５５０９号パンフレット９９／１５５０９）。既にリン酸化された形態にあるヒドロキシカルボン酸誘導体の改善された合成変異体を使用することによって、リン酸化されたＣＮＡオリゴマーの合成は顕著に簡素化することができ、収率を上昇させることができる。従って、例えば、使用した標準的なカップリング条件下でリン酸化された酪酸を使用することによって、高収率でこの基を直接導入することが可能である。
【００２０】
ＣＮＡオリゴマーの親水性を増加するためのさらなる代替的方法は、末端のリジンまたはオリゴリジン残基をＣＮＡオリゴマーのＣおよび／またはＮ末端に結合することによって提供される。
【００２１】
極性媒体においてより良好な溶解度を生じるＣＮＡペプチドまたはＣＮＡタンパク質の簡単な製造もまた、類似的に可能である。しかし、そのようなコンジュゲートは、生物工学的アッセイにおける機能的成分として特に興味深い。特に抗体、その機能的ドメイン、ペプチド抗原、レセプター、構造タンパク質、糖タンパク質または酵素を含むコンジュゲートは、バイオチップ表面の構築に興味深い。
【００２２】
例えば、蛍光染料、放射性アミノ酸またはビオチンなどの多くのマーカーをＣＮＡオリゴマーの末端に結合させることがさらに可能である。
【００２３】
本発明はさらに、オリゴマー化に特に適切であり、所望のオリゴマー化を行うのに直接使用することができるＣＮＡモノマーを製造するための有利な方法に関する。オリゴマー化のためのＣＮＡモノマー産物を直接使用する可能性の他に、本発明の合成のさらなる利点は、改善された保護基戦略に基づく高収率である。
【００２４】
ＣＮＡモノマーの製造のための本発明の方法では、第１の段階で、式（ＸＩＩＩ）
【化４】
2005500391.tif 000006
式中、Ａ、ＤおよびＦは、互いに独立してＣＲ3Ｒ4−であり得、Ｅは−ＣＲ6−であり得、ここで、Ｒ3、Ｒ4またはＲ6は上記の意味を有し、ヨードラクタムは好ましくは８−ヨード−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−３−オンである、のヨードラクタムが塩基の存在下で核酸塩基にカップリングされる。適切な塩基の例は、ＤＢＵ、ＤＢＮ、または炭酸アルカリ金属およびアルカリ土類金属などの炭酸塩などの有機塩基であり、好適な塩基はＮａＨ、ＯＢｕおよびＫ2ＣＯ3である。ＮａＨは、ラクタムに対して１：１の相対比で塩基として特に好ましく用いられる。
【００２５】
チミン、好ましくはそのリチウム塩、アデニン、Ｎ6−ベンゾイルアデニン、Ｎ6−ジメチルアミノエチレンアデニン、シトシン、Ｎ4−ベンゾイルシトシンまたは２−アミノ−６−クロロプリンがこの目的のための核酸塩基として適切である。次いで、ラクタム環の第２級アミン基がＢｏｃにより保護される。この場合、塩基の他の第１級および第２級アミン基についてもＢｏｃ保護することが可能である。驚くべきことに、モノマーの塩基部分のアミノ官能基を他の保護基で標的化して予め保護しておく必要はない。従って、これらの保護基を脱離する必要性も省かれる。
【００２６】
ラクタムのＮ2上のＢｏｃ保護基の導入後、環は、リチウム塩、好ましくは、水酸化リチウム一水和物で開裂され、所望のＣＮＡモノマーを生じる。グアニン構成単位を合成するためには、ラクタム開裂の前に、プリンの塩素置換基をカルボニル基に変換する必要がある。
【００２７】
この方法において製造されるＣＮＡモノマーは、さらなる誘導体化を伴わずに、ＣＮＡオリゴマーの合成に直接使用することができる。従って、本発明は、シクロヘキサン環の２−アミノ官能基が単純にＢｏｃ保護され、塩基部分の窒素原子が保護されていないかまたは部分的にＢｏｃ保護された形態にあるＣＮＡモノマーにさらに関する。特に好適なＣＮＡモノマーは、３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン、Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン、Ｎ4−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン、１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン、Ｎ2−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン、９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニンから成る群由来のモノマーである。
【００２８】
ＣＮＡオリゴマー化のための本発明の方法を使用して、例えば、生物工学的アッセイにおける対形成システムとして用いるための十分量のＣＮＡオリゴマーを提供することが可能である。
【００２９】
驚くべきことに、ここで、ＣＮＡオリゴマーは、相補的配列を有するｐ−ＲＮＡオリゴマーと極めて特異的に対形成し、化学特性および構造が生物学的サンプルの影響をほとんど受けない超分子ヘテロ二重鎖を形成する。従って、ヘテロ二重鎖の単鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡと対形成しない。相補的ＣＮＡおよびｐ−ＲＮＡはヘテロ二重鎖で、天然に存在する核酸よりも安定であり、特異的対形成が、例えば、使用する溶媒などの外的要因にそれほど依存しないラダー構造を形成する。このことから、ハイブリダイゼーションおよび脱ハイブリダイゼーションの極めて良好な制御が広範な媒体で生じ、特に、該制御は、天然に存在する会合プロセスに非依存的に発揮され得る。ＣＮＡオリゴマーの相補的ｐ−ＲＮＡオリゴマーとの分子内結合の高い安定性は、比較的短い配列がなお配列特異的に対形成することを可能にする。ＣＮＡオリゴマーの相補的ｐ−ＲＮＡオリゴマーとの安定性は、塩基ミスマッチによって顕著に減少するという事実もこのことに寄与する。さらに、ｐ−ＲＮＡおよびＣＮＡはワトソン−クリックモデルで排他的に対形成し、従って、その選択性は上昇する。ＣＮＡオリゴマーのさらなる利点は、相補的ｐ−ＲＮＡオリゴマーとの熱力学的に安定な選択的対形成が生じるため、低塩濃度の媒体中でそれらを使用することができることである。さらに、ＣＮＡオリゴマーは、高温ならびに塩基性および酸性媒体でＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖を安定化する。
【００３０】
人工的オリゴマー骨格および直線的ラダー構造のため、ＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖分子は酵素で分解されず、例えば、ヒストン、転写因子、リプレッサー、リボソームなどの二本鎖核酸と結合する生物学的分子の会合は最小限である。
【００３１】
従って、アッセイ条件に従って適応され、ＣＮＡ−ＣＮＡ、ｐ−ＲＮＡ−ｐ−ＲＮＡホモ重鎖またはＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖から成る対形成システムを利用することが今回可能である。
【００３２】
適切なシクロヘキシルまたはヘテロシクロヘキシルヌクレオアミドオリゴマー（ＣＮＡオリゴマー）はＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成に適切であり、以下の構造式（Ｘ）において例示的に示されるペプチドシクロヘキシルアミド骨格を含む。
【化５】
2005500391.tif 000007
【００３３】
構造式（Ｘ）中Ｂは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イソグアニン、イソシトシン、キサンチンまたはヒポキサンチンなどの任意の核酸塩基を表す。核酸塩基は１’位でシクロヘキシルラジカルに結合する。シクロヘキシルまたはヘテロシクロヘキシルラジカルは、２’−４’アミド結合で結合し、ＣＮＡオリゴマーを生じる。原則として、立体化学的に規則正しいＣＮＡオリゴマー構造は、ｐ−ＲＮＡオリゴマーとの対形成に有利であり、（Ｓ）−ＣＮＡオリゴマーは（Ｌ）−ｐ−ＲＮＡと、（Ｒ）−ＣＮＡオリゴマーは（Ｄ）−ｐ−ＲＮＡとハイブリダイゼーションを生じる。
【００３４】
対応するオリゴマー（構造式（ＸＩ））を集成するのに使用することができる多くのモノマーシクロヘキシルまたはヘテロシクロヘキシルヌクレオアミン構成単位（ＣＮＡモノマー）およびその製造方法については国際公開第９９／１５５０９号パンフレット９９／１５５０９に記載されている。
【化６】
2005500391.tif 000008
【００３５】
構造式（ＸＩ）中Ｂは核酸塩基であり、Ｒ１はＮＨ2基である。Ｒ２はＣＨ2−ＣＯＯＨ基である。Ａ、ＤおよびＦは互いに独立してＣＲ3Ｒ4−、−ＮＲ5−、−Ｏ−または−Ｓ−基であり得、Ｅは−ＣＲ6−基であり、ここで、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5またはＲ6は互いに独立して水素原子もしくはＣ1〜Ｃ12アルキル基である。ラジカルＲ3およびＲ4が水素原子であるＣＮＡモノマーは特に好適である。
【００３６】
例えば、（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９３，７６，２１６１−２１８３、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５，７８，１６２１−１６３５、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９６，７９，２３１６−２３４５、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，８０，１９０１−１９５１）に記載のオリゴマーのようなｐ−ＲＮＡオリゴマーは、本発明のヘテロ二重鎖の形成に適切である。当業者に公知であるペプチド、タンパク質またはマーカーを含み得るｐ−ＲＮＡコンジュゲートが生成されるように、ｐ−ＲＮＡオリゴマーを同様に修飾することができる。ＤＥ  １９７  ４１  ７３８  Ａ１に記載のリンカーのようなリンカーは、そのようなコンジュゲートの生成に使用される。
【００３７】
記載されているＣＮＡオリゴマーは、ｐ−ＲＮＡオリゴマーにハイブリダイズして、構造式（ＸＩＩ）（式中、ＢおよびＢ’はそれぞれ相互に相補的塩基である）に例示的に示されるヘテロ二重鎖を生じることができる。
【化７】
2005500391.tif 000009
【００３８】
ＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖は比較的高い融点を有するが、これは、対形成が比較的安定であることを意味する。従って、例えば、５マーなどの短いオリゴマーであっても水溶液中で安定なヘテロ二重鎖を形成することができる。しかし、７〜１２マーから成るヘテロ二重鎖が好適である。もちろん、ヘテロ二重鎖形成のためのより長いオリゴマーの使用を妨げるものはない。
【００３９】
低い塩濃度条件下で短いＣＮＡおよびｐ−ＲＮＡオリゴマーを使用する場合であっても、ＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡヘテロ二重鎖形成はかなり高いことがさらに示され得る。塩濃度は、例えば、ＤＮＡまたはタンパク質などの生物学的物質のコンホメーションおよび活性に顕著に影響を及ぼすため、低塩条件で作動することは、特に生物工学的方法において重要である。ＣＮＡ−ＣＮＡおよびＣＮＡ−ｐ−ＲＮＡ対形成システムを変動することによって、重鎖に対して負の電荷を飽和するようにカチオンを添加することを最小限にすることができる。
【実施例】
【００４０】
例示的実施態様に対する一般的緒言
使用した全ての純粋な溶媒（フルカ（Ｆｌｕｋａ））は分子ふるいに掛けて保存し、さらなる精製を行わずに使用する。
【００４１】
固相合成によるオリゴマー化は、０．２３ｍｍｏｌ／ｇのキャパシティーを有する「ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＨＭＢ（テンタゲルＳ  ＨＭＢ）」樹脂（ラップポリマー（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ））を使用して行う。反応は、フリットフィルター挿入物を有するチラナ（Ｃｈｉｒａｎａ）シリンジ（１００ｍｇを超える樹脂に対して５ｍｌ容量または１００ｍｇ未満の樹脂に対して２ｍｌ容量）内で行う。
【００４２】
ＨＰＬＣ検査は、プログラム可能な「１２６」溶液モジュールおよび「１６８」ダイオードアレイＵＶ／Ｖｉｓ検出器モジュールを有するベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）TMクロマトグラフィーシステムで行う。
【００４３】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、１ｍｌ／分の流速でリクロスファーＣ−１８ハイバー（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｃ−１８  Ｈｉｂａｒ）カラム（５μｍ、４×２５０ｍｍ、メルク（Ｍｅｒｃｋ））を使用して分析スケールで、および１ｍｌ／分の流速でリクロスファーＣ−１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｃ−１８）カラム（１０μｍ、４×２５０ｍｍ、メルク（Ｍｅｒｃｋ））を使用して半調製スケールで行う。
【００４４】
溶出には次の溶媒を使用する：溶出Ａ：水、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）；溶出Ｂ：ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）。
【００４５】
分析用ＨＰＬＣの稼動のために溶出Ａおよび溶出Ｂ溶液の次の勾配を選択する：方法Ａ：３０分間以内での溶出Ｂ溶液の割合の１０％から６０％への連続増加；方法Ｂ：３０分間以内での溶出Ｂ溶液の割合の１０％から４０％への連続増加；方法Ｃ：４０分間以内での溶出Ｂ溶液の割合の１０％から３０％への連続増加。
【００４６】
半調製用ＨＰＬＣの稼動のために溶出Ａおよび溶出Ｂ溶液の次の勾配を選択する：方法Ｄ：３０分間以内での溶出Ｂ溶液の割合の１０％から４０％への連続増加。
【００４７】
例示的実施態様において示されるＵＶデータは、ジャスコＶ  ５３０  ＵＶ／Ｖｉｓ（Ｊａｓｃｏ  Ｖ  ５３０  ＵＶ／Ｖｉｓ）分光光度計を使用して得、ＣＤスペクトルは、ジャスコＪ７１０（Ｊａｓｃｏ  Ｊ７１０）分光偏光計を使用して記録し、融解曲線（Ｔｍ曲線）は、温度制御可能な石英キュベットホルダー、および測定用キュベットに導入することができる固定型マイクロ温度素子（ケイスレー・インスツルメント（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）ＤＡＳ−８０１−ＡＴ−Ｂｕｓ  ＤＡＱボード（クイック−ベイシック（Ｑｕｉｃｋ−Ｂａｓｉｃ）４．０ドライバー））を具備するパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）λ２ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用するＵＶ測定によって決定した。
【００４８】
Ｔｍ曲線の測定は、１℃／４０ｓの加熱または冷却速度で５℃〜９０℃の温度勾配により行う。この目的のために、サンプルを脱気したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５ｍＭ；ｐＨ７．０）に溶解し、石英キュベット（１０×１０ｍｍ、１×１０ｍｍ、ヘルマ（Ｈｅｌｌｍａ）；ｄ＝１０またはｄ＝１）に配置する。多項式回帰（６００ポイント、９次）を使用するマイクロカル（ＭｉｃｒｏＣａｌ）由来のソフトウェアを用いて、測定データを評価する。
【００４９】
質量スペクトルは、溶媒として０．１％ＴＦＡを含有するＭｅＣＮ／水（１：１）混合物を伴うエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）（フィニガンＬＣＱイオントラップＭＳ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ＭＳ）（フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）、米国））を使用して記録した。
【００５０】
モノマー構成単位の合成
（Ｒ）−チミン構成単位
【化８】
2005500391.tif 000010
【００５１】
実施例１
１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン２
【化９】
2005500391.tif 000011
１．２６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のチミンを５０ｍｌのＴＨＦに０℃で導入し、ヘキサン中４ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の２．５Ｍブチルリチウムを注意深く添加する。溶液を１０分間、撹拌後、減圧下でＴＨＦを蒸留分離し、残渣（チミンのモノリチウム塩）を１０ｍｌのＤＭＦ中に採取する。０．４ｇ（１０  ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％）を第２のフラスコに導入し、０℃で、２．６５ｇ（１０  ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加する。約３０分後にＨ2の放出が終了したら、上記のリチウム塩溶液を添加することができる。次いで、混合物を室温で１晩（約１６時間）撹拌する。減圧下で溶媒を蒸留分離し、残渣を水に溶解し、ＸＡＤ−１６カラムに配置する；最初に、無機構成成分（未反応のチミンを含む）を水で取り出し、次いで、有機生成物をメタノールでカラムから溶解分離する。メタノール画分をエバポレーションすると残渣が得られ、これを塩化メチレン中で撹拌し、次いで、吸引によるろ過分離によってさらに精製する。（１．３３ｇ）
【００５２】
クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）によって、母液からさらなる量の生成物を単離することができる。
（０．６５ｇ）
１．９８ｇ（７５％）
融点＞３００℃（分解）
ＲF＝０．５５（アセトン：ＣＨ2Ｃｌ2：ＣＨ3ＯＨ：ＥｔＯＡｃ：Ｈ2Ｏ：ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）
ＨＰＬＣ：＞９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝８０：２０］
【数１】
2005500391.tif 000012
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．５２−１．６５（ｍ，３Ｈ）；１．８０−１．８８（ｍ，４Ｈ）；１．９６−２．１２（ｍ，３Ｈ）；２．１６−２．２３（ｍ，１Ｈ）；２．４０−２．４８（ｍ，１Ｈ）；３．６１＆４．１７（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．５２（ｄ，１Ｈ，＝ＣＨ）；７．９４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；１１．２７（ｓ，１Ｈ，ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ）
【００５３】
実施例２
１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン２
【化１０】
2005500391.tif 000013
１．２６ｇ（１０ｍｍｏｌ）のチミン、２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−３−オン１および５０ｍｌのＤＭＳＯ中３．５ｇ（２５ｍｍｏｌ）のＫ2ＣＯ3を室温で４８時間撹拌する。精密検査のために、最初に、減圧下でＤＭＳＯを蒸留分離し、残渣をテトラクロロメタンで煮沸する。残った残渣を水に溶解し、ＸＡＤ−１６カラムに配置する；最初に、無機構成成分（未反応のチミンを含む）を水で取り出し、次いで、有機生成物をメタノールでカラムから溶解分離する。メタノール画分をエバポレーションすると残渣が得られ、これをクロマトグラフィー（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ＝５：１）によってさらに精製する。
１．０  ｇ  （３８％）
物理的データについては実施例１を参照のこと。
【００５４】
実施例３
３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン３
【化１１】
2005500391.tif 000014
２．１ｇ（８ｍｍｏｌ）の１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン２、１．３８  ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン、４．３６ｇ（２０ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび５０ｍｇのＤＭＡＰを５０ｍｌの塩化メチレン中還流下で約４時間煮沸し、室温で１晩静置する（ＴＬＣ確認：ＥｔＯＡｃ）。反応が終了したら、５０ｍｌの水を添加し、約１０分間、激しく撹拌する。次いで、有機相を分離し、水相を塩化メチレンで抽出し、あわせた有機相を乾燥し、溶媒をエバポレート分離する。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製する。（ＳｉＯ2、ＥｔＯＡｃ）
２．８５ｇ（７７％）
融点  １１６°Ｃ
ＲＦ＝０．４１（ＥｔＯＡｃ）
ＨＰＬＣ：＞９８％［リクロスファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝７５：２５］
【数２】
2005500391.tif 000015
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．３４＆１．４３（２ｓ，１８Ｈ，２  ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．３４−１．３６（ｍ，１Ｈ）；１．６７−１．８３（ｍ，６Ｈ）；１．９０−２．０８（ｍ，２Ｈ）；２．１３−２．２６（ｍ，２Ｈ）；２．５７−２．６９（ｍ，１Ｈ）；４．２２＆４．３０（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．５６（ｄ，１Ｈ，＝ＣＨ）
【００５５】
実施例４
３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン４
【化１２】
2005500391.tif 000016
１．５ｇ（３６ｍｍｏｌ）の水酸化リチウム一水和物を２５ｍｌの水に溶解し、０℃で、３．１ｍｌ（３６ｍｍｏｌ）のＨ2Ｏ2（３５％）を添加する。次いで、１６５ｍｌのＴＨＦに溶解した５．６ｇ（１２ｍｍｏｌ）の３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン３を０℃で滴下する；その後、５０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を室温で約１８時間撹拌する。過酸化物が溶液中になお存在する場合、それらを少量のＮａ2ＳＯ3溶液で破壊する；次いで、減圧下でＴＨＦ／ＣＨ3ＯＨを蒸留分離し、水および塩化メチレンを残りの水相に添加し、混合物を希ＨＣｌでｐＨ３に調整し、有機相を分離し、水相を塩化メチレンで抽出する。溶媒を乾燥および蒸留分離すると残渣が得られ、これをクロマトグラフィーで精製する。（ＳｉＯ2，  ＥｔＯＡｃ）
４．２ｇ（７３％）
ＲＦ＝０．７１（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
ＨＰＬＣ：９６％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９２．５：７．５］
【数３】
2005500391.tif 000017
1Ｈ−ＮＭＲ（４００  ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）１．０５−１．２５（ｍ，２Ｈ）；１．３２＆１．５９（２ｓ，１８Ｈ，２  ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．５７−１．６８（ｍ，１Ｈ）；１．８０−２．０８（ｍ，３Ｈ）；１．９１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；２．１０−２．２３（ｍ，１Ｈ）；２．２２−２．３７（ｍ，２Ｈ）；３．８６＆４．３３（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；４．７３（ｄ，１Ｈ，ＨＮ−ＣＯ）；７．１５（ｓ，１Ｈ，＝ＣＨ）；約１０．０（ブロードｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）
【００５６】
実施例５
１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］チミン５
【化１３】
2005500391.tif 000018
９．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）の３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］チミン３を４５０ｍｌのＴＨＦに導入し、−１０℃で、１００  ｍｌの水中４．２ｇ（１００ｍｍｏｌ）の水酸化リチウム一水和物の溶液を３０分間かけて滴下する。次いで、７０ｍｌのメタノールを添加し、混合物を、−１０℃で、もはや出発物質が存在しなくなるまで撹拌する（約５時間；ＴＬＣ確認：ＥｔＯＡｃ）。次いで、室温で１２時間、４５〜５５℃で１５〜２０時間撹拌する。（ＴＬＣ確認：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ３ＯＨ＝５：１）。溶媒ＴＨＦ／ＣＨ3ＯＨを減圧下で蒸留分離し、水性残渣を希ＨＣｌでｐＨ３に調整し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥し、エバポレートし、残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ２：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
３．５ｇ（４６％）
融点２４５℃（分解）
ＲF＝０．３６（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
ＨＰＬＣ：９８．７％［リクロソファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｏｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ、（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）、勾配（９０％〜６０％、３０分間）、流量１ｍｌ／ｍｉｎ］
【数４】
2005500391.tif 000019
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．３−１．３２（ｍ，２Ｈ）；１．２６（ｓ，９Ｈ，ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．６３−１．９４（ｍ，５Ｈ）；１．７３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）；２．０６  ２．２１（ｍ，２Ｈ）；３．７５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］）；４．１８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ）；６．７４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−ｂｏｃ）；７．５５（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ＝）；１１．０６（ｓ，１Ｈ，ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ）；１２．０５（ｓ，１Ｈ，
【００５７】
（Ｒ）−アデニン構成単位
【化１４】
2005500391.tif 000020
【００５８】
実施例６
Ｎ6−ベンゾイル−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン６
【化１５】
2005500391.tif 000021
０．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％）を５０ｍｌのＤＭＦに０℃で導入し、２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加する。約３０分後にＨ2の放出が終了したら、２．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ6−ベンゾイルアデニンを添加することができる。次いで、冷却装置を取り出し、混合物を室温で１晩（約１５時間）撹拌する。次いで、ＤＭＦを減圧下で蒸留分離し、残渣を約１００ｍｌの水中に採取し、塩化メチレンで反応生成物を数回抽出する。有機相を飽和ブラインで洗浄し、乾燥し、エバポレートする。固体残渣をイソプロパノール中に採取し、残りの固体生成物を吸引によりろ過分離する。［０．４ｇ（１７％）のＮ6−ベンゾイルアデニン］。ろ過物をエバポレートし、クロマトグラフィーにかける。（ＳｉＯ2：はじめにＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５．１、次いでＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
２．８５ｇ（７５．８％）
融点＞３００℃
ＲF＝０．５７（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【数５】
2005500391.tif 000022
ＨＰＬＣ：９４％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９０：１０］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．５２−１．７４（ｍ，３Ｈ）；２．０５−２．３４（ｍ，５Ｈ）；２．４８−２．５６（ｍ，１Ｈ）；４．２５＆４．６２（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．５２−８．０７（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；８．１１（ｄ，１Ｈ，ＨＮ−［ＣＨ］）；８．６８＆８．７５（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）；１１．１５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）
【００５９】
実施例７
Ｎ6−（ジメチルアミノメチレン）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン８
【化１６】
2005500391.tif 000023
０．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％）を１００ｍｌのＤＭＦに０℃で導入し、５．３ｇ（１０  ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加する。約３０分後にＨ2の放出が終了したら、３．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮ6−（ジメチルアミノメチレン）アデニンを添加することができる。次いで、冷却装置を取り出し、混合物を室温で約４８時間撹拌する。次いで、ＤＭＦを減圧下で蒸留分離し、残渣を水中に採取し、ＸＡＤ１６カラムに配置して、無機構成成分を取り出す；水で洗浄後、生成物をメタノールでカラムから溶解分離する。溶媒のエバポレーション後の残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
５ｇ（７６．５％）
ＲF＝０．２４（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝１０：１）
【数６】
2005500391.tif 000024
ＨＰＬＣ：＞９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝８０：２０］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．４５−１．７４（ｍ，３Ｈ）；２．０２−２．２９（ｍ，５Ｈ）；２．４６−２．５５（ｍ，１Ｈ）；３．１２＆３．１８（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ3）；４．２２＆４．５１（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；８．０５（ｄ，１Ｈ，ＨＮ−［ＣＨ］）；８．４２＆８．４４（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）；８．９２（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００６０】
実施例８
９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン７
【化１７】
2005500391.tif 000025
０．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％）を５０  ｍｌのＤＭＦ０℃で導入し、５．３ｇ（２０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加する。約３０分後にＨ2の放出が終了したら、２．３ｇ（２０  ｍｍｏｌ）のアデニンを添加することができる。次いで、冷却装置を取り出し、混合物を室温で１晩（約１５時間）撹拌する。次いで、ＤＭＦを減圧下で蒸留分離し、残渣を約１００ｍｌの水に溶解し、酢酸エチルで数回抽出し、副産物を取り出す；水相を約５ｇのＮａＨＣＯ3と共に煮沸し、冷却し、ＸＡＤ１６カラム上に配置する；はじめに、水で、無機塩をカラムから洗浄分離し、次いで、メタノールで反応生成物を分離する。メタノール相のエバポレーション後の残渣を、一度、酢酸エチル中で煮沸し、冷却し、吸引によってろ過分離する。
４．４ｇ（８０％）
融点＞３００°Ｃ
ＲF＝０．６（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【数７】
2005500391.tif 000026
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝７０：３０］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００  ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．４７−１．７３（ｍ，３Ｈ）；２．０４−２．２８（ｍ，５Ｈ）；２．４７−２．５６（ｍ，１Ｈ）；４．２２＆４．４８（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．３０（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２）；８．１３（ｄ，１Ｈ，ＨＮ−ＣＯ）；８．１６＆８．３７（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）
【００６１】
実施例９
９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン７
【化１８】
2005500391.tif 000027
１．３５ｇ（１０ｍｍｏｌ）のアデニン、２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１および２．１ｇ（１５ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムを５０ｍｌのジメチルスルホキシド中、室温で２日間撹拌する。次いで、良好な減圧下、中等度の温度で、ジメチルスルホキシドの大部分を蒸留分離し、残渣を水中に採取し、ＸＡＤ１６カラムに配置する。無機構成成分を未反応のアデニンと共に水で洗浄することができる；次いで、予め精製した反応生成物をメタノールでカラムから洗浄分離する。メタノール相由来の残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ２：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５．１）２．０ｇ（７３％）
物理的データについては実施例８を参照のこと。
【００６２】
実施例１０
Ｎ6−ベンゾイル−Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン１３
【化１９】
2005500391.tif 000028
１．８８ｇ（５ｍｍｏｌ）のＮ6−ベンゾイル−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−５−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン６、３．２７ｇ（１５ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび１００ｍｇのＤＭＡＰを５０ｍｌのアセトニトリル中、室温で２４時間、撹拌する。溶媒のエバポレーション後の残渣をクロマトグラフィーにかける。（ＳｉＯ２：ＥｔＯＡｃ）
２．１４ｇ（７４．２％）
ＲF＝０．７７（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５．１）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．２５＆１．５２（２ｓ，１８Ｈ，２−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．６１−１．９２（ｍ，３Ｈ）；２．０２−２．１５（ｍ，２Ｈ）；２．２０−２．２８（ｍ，１Ｈ）；２．３１−２．４５（ｍ，２Ｈ）；２．７６−２．８８（ｍ，１Ｈ）；４．８９＆５．１５（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．５２−７．８１（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；８．８７＆８．８８（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）
【００６３】
実施例１１
Ｎ6−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン１１
【化２０】
2005500391.tif 000029
３５０  ｍｌの塩化メチレン中１０ｇ（３６．７ｍｍｏｌ）の９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン７を５．０８ｍｌ（３６．７ｍｍｏｌ）のＴＥＡ、３２ｇ（１４７ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび２００ｍｇのＤＭＡＰと室温で混合し、次いで、還流下で約４時間、撹拌する。（ＴＬＣ確認：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）。溶媒を蒸留分離した後の残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ）
１６．３ｇ（７７．５％）
ＲF＝０．５８（ＥｔＯＡｃ）
【数８】
2005500391.tif 000030
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）１．４８＆１．６１（２ｓ，２７Ｈ，３−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．７６−１．９５（ｍ，３Ｈ）；２．１５−２．４５（ｍ，４Ｈ）；２．５０−２．５７（ｍ，１Ｈ）；２．８０−２．９０（ｍ，１Ｈ）；４．９３＆５．２５（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；８．３２＆８．８７（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）
【００６４】
実施例１２
Ｎ6−（ジメチルアミノメチレン）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン９
【化２１】
2005500391.tif 000031
５ｇ（１３．４  ｍｍｏｌ）のＮ6−（ジメチルアミノメチレン）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン８を２５０ｍｌの塩化メチレン中で１．８６ｍｌのＴＥＡ、５．８５ｇ（２６．８ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび２０ｍｇのＤＭＡＰと共に、室温で約６０時間、撹拌する。溶媒のエバポレーション後の残渣をクロマトグラフィーにかける。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
５ｇ（８７．５％）
ＲF＝０．２３（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．６（ｓ，９Ｈ，ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．７５−２．５６（ｍ，８Ｈ）；２．７８−２．８９（ｍ，１Ｈ）；３．２２＆３．２７（２ｓ，６Ｈ，２ＣＨ3）；４．８７＆５．３０（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；８．１２＆８．５４（２ｓ，２Ｈ，２−ＣＨ＝）；８．９５（ｓ，１Ｈ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ）
【００６５】
実施例１３
Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン１２
【化２２】
2005500391.tif 000032
２．１４ｇ（３．７ｍｍｏｌ）のＮ6−ベンゾイル−Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン１３を８０ｍｌのＴＨＦに導入する。０℃で、２０ｍｌの水に溶解した０．９ｇ（２１．５ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物を３０分間かけて滴下する。次いで、１３ｍｌのメタノールを添加し、混合物を室温で約１６時間、撹拌する。有機溶媒を減圧下で蒸留分離した後、少量の水を残渣に添加し、ｐＨを希ＨＣｌで３に調整し、反応生成物を吸引によりろ過分離し、水およびアセトンで洗浄する。
１．０ｇ（５５．５％）
融点＞３００℃
ＲF＝０．６（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【数９】
2005500391.tif 000033
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９５：５］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．０４＆１．４７（２ｓ，１８Ｈ，２−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．０８−１．３３（ｍ，２Ｈ）；１．７８−２．０３（ｍ，４Ｈ）；２．１４−２．２９（ｍ，３Ｈ）；４．０１＆４．３１（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；６．８５（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−［ＣＨ］）；８．４＆８．５４（２ｓ，２Ｈ，−ＣＨ＝）９．９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ）：１２．１３（ｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）
【００６６】
実施例１４
Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン１２
【化２３】
2005500391.tif 000034
１１．２４ｇ（１９．６ｍｍｏｌ）のＮ6−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン１１を３９０ｍｌのＴＨＦに導入する。−１０℃で、１００ｍｌの水に溶解した４．１１ｇ（９８ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物を３０分間かけて滴下する。次いで、６５ｍｌのメタノールを添加し、はじめに、混合物を−１０℃で２時間、次いで、室温で約１６時間撹拌する。減圧下で有機溶媒を蒸留分離した後、少量の水を残渣に添加し、ｐＨを希ＨＣｌで３に調整し、反応生成物を吸引によりろ過分離し、水およびアセトンで洗浄する。
６．６  ｇ（６８．５％）
物理的データについては実施例１３を参照のこと。
【００６７】
実施例１５
Ｎ6−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン１２
【化２４】
2005500391.tif 000035
５．３ｇ（９．２５ｍｍｏｌ）のＮ6−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン１１を１８０ｍｌのメタノールに導入する。−１５℃で、１００ｍｌの水に溶解した１．８９ｇ（４５ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物を３０分間かけて滴下する。出発物質が認められなくなるまで、混合物を−１５℃で撹拌し、次いで、室温で約１６時間撹拌する。減圧下で有機溶媒を蒸留分離した後、水性残渣を希ＨＣｌでｐＨ３に調整し、反応生成物を塩化メチレンで抽出する。生成物をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
３．８ｇ（８４％）
０．５３ｇ（１６％）Ｎ6−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン
物理的データについては実施例１３を参照のこと。
【００６８】
実施例１６
９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］アデニン１０
【化２５】
2005500391.tif 000036
５．０ｇ（１２ｍｍｏｌ）のＮ6−（ジメチルアミノメチレン）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン９を２４０ｍｌのメタノールに導入する。−１５℃で、６０ｍｌの水に溶解した２．５２ｇ（６０ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物をを３０分間かけて滴下する。出発物質が認められなくなるまで、混合物を−１５℃で撹拌し、次いで、室温で約１６時間撹拌する。減圧下で有機溶媒を蒸留分離した後、水性残渣を希ＨＣｌでｐＨ３に調整し、反応生成物を塩化メチレンで抽出する。生成物をクロマトグラフィーにより精製する。
（ＳｉＯ2：アセトン／ＣＨ2Ｃｌ3／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）
２．４ｇ（５１．３％）
融点  ２２１℃（分解）
ＲF＝０．３１（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
ＨＰＬＣ：＞９８％［リクロスファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝１５：８５］
【数１０】
2005500391.tif 000037
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．０９（ｓ，９Ｈ，ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．０５−１．３１（ｍ，２Ｈ）；１．７６−２．０１（ｍ，４Ｈ）；２．０８−２．２６（ｍ，３Ｈ）；３．９８＆４．２２（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；６．７９（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；７．０７（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2）；８．０７＆８．１１（２ｓ，２Ｈ，＝ＣＨ）；１２．２（ブロードｓ，１Ｈ，ＣＯ2Ｈ）
【００６９】
１．３ｇ（４０％）の９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシロ（ａｚａｂｉｃｙｌｏ）−［３．３．１］ノナン−８−イル］アデニン７は副産物として単離される。
【００７０】
（Ｒ）−シトシン構成単位
【化２６】
2005500391.tif 000038
【００７１】
実施例１７
Ｎ4−ベンゾイル−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１７
【化２７】
2005500391.tif 000039
０．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）の  ＮａＨ（６０％）を５０ｍｌのＤＭＦに０℃で導入し、２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加する。約３０分後にＨ2の放出が終了したら、２．１５ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ4−ベンゾイルシトシンを添加することができる。次いで、冷却装置を取り出し、混合物を室温で１晩（約１８時間）撹拌する。ＤＭＦを減圧下で蒸留分離し、残渣を塩化メチレン中に採取して、飽和ブラインで２回洗浄する。有機相を乾燥し、エバポレートする。固体残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
２．５５ｇ（７２％）
融点＞３００℃
ＲF＝０．５２（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【数１１】
2005500391.tif 000040
ＨＰＬＣ：＞９７％［リクロスファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ＝３０：７０、流量１ｍｌ／分］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００  ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．４９−１．６９（ｍ，３Ｈ）；１．８５−１．９８（ｍ，１Ｈ）；２．０１−２．２５（ｍ，４Ｈ）；２．４４−２．５３（ｍ，１Ｈ）；３．７５＆４．３８（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．３２−８．３（ｍ，８Ｈ，Ｐｈ，Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ，ＮＨ−［ＣＨ］）；１１．２３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）
【００７２】
実施例１８
１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］−シトシン１４
【化２８】
2005500391.tif 000041
０．９６ｇ（２４ｍｍｏｌ）の  ＮａＨ（６０％）を７５ｍｌのＤＭＦに導入し、２．２２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のシトシンを添加する；次いで、Ｈ２の放出が終了するまで、混合物を撹拌する。次いで、５．３ｇ（２０  ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルコ（ａｚａｂｉｃｙｌｌｃｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を添加し、混合物を、室温でさらに１５時間、撹拌する。ＤＭＦを減圧下で蒸留分離し、残渣を、１００ｍｌの水に溶解した２．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）のＫＨ2ＰＯ4と混合する。はじめに、水相を酢酸エチルで２回洗浄し、次いで、ＸＡＤ１６カラム上に配置する。カラムを水で徹底的に洗浄し、次いでメタノールで洗浄する。生成物はメタノール画分から得られ、酢酸エチルと共に撹拌し、吸引によりろ過分離し、乾燥した。
３．４２ｇ（６９％）
融点＞３００℃
ＲF＝０．２６（アセトン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２１）
【数１２】
2005500391.tif 000042
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ  ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝７５：２５］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．４５−１．６３（ｍ，３Ｈ）；１．７−１．８３（ｍ，１Ｈ）；１．９−２．１（ｍ，３Ｈ）；２．１２−２．２（ｍ，１Ｈ）；２．３９−２．４８（ｍ，１Ｈ）；３．６５＆４．２１（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；５．７１＆７．７１（２ｄ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ）；６．８０−７．１５（“ｍ”，２Ｈ，ＮＨ2）；７．９２（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−［ＣＨ］）
【００７３】
実施例１９
１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１４
【化２９】
2005500391.tif 000043
５０ｍｌのＤＭＳＯ中の１．１１ｇ（１０ｍｍｏｌ）のシトシン、２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１および２．１ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＫ2ＣＯ3を室温で２日間、撹拌する。ＤＭＳＯを良好な減圧下でできるだけ蒸留分離し、残渣を水中に採取し、ＸＡＤ１６カラム上に配置する；はじめに、後者を水で徹底的に洗浄し、続いて、反応生成物をメタノールで溶解分離することができる。最終精製はクロマトグラフィーにより行われる。
（ＳｉＯ2：アセトン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）
１ｇ（４０％）
物理的データについては実施例１８を参照のこと。
【００７４】
実施例２０
Ｎ4−ベンゾイル−Ｎ4−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１８
【化３０】
2005500391.tif 000044
３．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＮ4−ベンゾイル−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１７、６．５５ｇ（３０ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび２５０ｍｇのＤＭＡＰを１００ｍｌのアセトニトリル中、室温で２４時間、撹拌する。反応混合物を減圧下でエバポレートし、残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ）
３．８６  ｇ（７０％）
融点  １８１℃
ＲF＝０．６１（ＥｔＯＡｃ）
【数１３】
2005500391.tif 000045
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９８：２］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００  ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．２７＆１．４１（２ｓ，１８Ｈ，２−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．４５−１．５４（ｍ，１Ｈ）；１．７２−１．８２（ｍ，１Ｈ）；１．８３−１．９７（ｍ，３Ｈ）；１．９９−２．１２（ｍ，１Ｈ）；２．２−２．３６（ｍ，２Ｈ）；２．６５−２．７５（ｍ，１Ｈ）；４．３７＆４．４１（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；６．９７＆８．３１（２ｄ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ）；７．５５−７．８８（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）
【００７５】
実施例２１
Ｎ4−ジ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１５
【化３１】
2005500391.tif 000046
３００ｍｌの  塩化メチレン中の９．０ｇ（３６．２ｍｍｏｌ）の１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシン１４、５  ｍｌ（３６．５ｍｍｏｌ）のＴＥＡ、３１．６ｇ（１４５ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび２００ｍｇのＤＭＡＰを還流下で約４時間、煮沸する。（ＴＬＣ確認：アセトン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）。エバポレーション後の残渣を約５０ｍｌのＥｔＯＡｃと共に撹拌し、冷却し、吸引によりろ過分離する。（９．８ｇ）。クロマトグラフィーにより、母液からさらに４．１ｇを単離することができる。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ）。
１３．９ｇ（７０％）
融点  ２０８℃
ＲF＝０．６２（ＥｒＯＡｃ）
【数１４】
2005500391.tif 000047
ＨＰＬＣ：＞９８％［リクロスファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ＝６０：４０、流量１ｍｌ／分］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ3）１．５３＆１．５６（２ｓ，２７Ｈ，３−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．５３−１．５６（ｍ，１Ｈ）；１．７８−１．８８（ｍ，１Ｈ）；１．９６−２．２（ｍ，４Ｈ）；２．３１−２．４８（ｍ，２Ｈ）；２．６８−２．７９（ｍ，１Ｈ）；４．３５＆４．６３（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；７．０３＆７．７２（２ｄ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ）
【００７６】
実施例２２
Ｎ4−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］シトシン１６
【化３２】
2005500391.tif 000048
５ｇ（９ｍｍｏｌ）のＮ4−ベンゾイル−Ｎ4−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］シトシンを１８０ｍｌのＴＨＦに導入する。−１０℃で、４５ｍｌの水中１．９ｇ（４５ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物を３０分間かけて滴下する。３０ｍｌのメタノールを添加した後、−１０℃で２時間、室温で約１８時間撹拌する。有機溶媒を減圧下で蒸留分離し、水相を希ＨＣｌでｐＨ３に調整し、塩化メチレンで抽出する。後者を乾燥し、エバポレートし、残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝９５．５）
１．８ｇ（４３％）
融点＞３００°Ｃ
ＲF＝０．７（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【数１５】
2005500391.tif 000049
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９０：１０］
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．０５＆１．２５（２ｓ，１８Ｈ，２−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．０−１．１４（ｍ，１Ｈ）；１．４−１．７８（ｍ，６Ｈ）；１．９−２．０５（ｍ，２Ｈ）；３．６＆４．２２（２ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］＆ＣＨ−Ｎ）；６．６２（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−［ＣＨ］）；６．７＆７．８９（２ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ＝ＣＨ）９．５−１２．５（２Ｈ，ＮＨ−Ｃ，ＣＯ2Ｈ）
【００７７】
（Ｒ）−グアニン構成単位
スキーム７
【化３３】
2005500391.tif 000050
【００７８】
実施例２３
２−アミノ−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン１９
【化３４】
2005500391.tif 000051
２ｇ（５０ｍｍｏｌ）のＮａＨ（６０％）を１５０ｍｌのＤＭＦに導入する。０℃で、１３．２５ｇ（５０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１を短時間の間に少しずつ添加する；０℃で約３０分後にＨ2の放出が終了したら、８．５ｇ（５０  ｍｍｏｌ）の２−アミノ−６−クロロプリンを添加する。次いで、反応混合物を室温で２４時間、撹拌する。ＤＭＦを減圧下で蒸留分離した後、約７０ｍｌの水で固体残渣をペースト状にし、吸引によりろ過分離し、アセトンで洗浄する：７．８ｇの純粋な反応生成物；クロマトグラフィーにより、ろ過物からさらに３．９ｇの生成物を単離することができる（ＳｉＯ2：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝９：１）。
１１．７ｇ（７６％）
融点  ２７５℃
ＲF＝０．５５（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
ＨＰＬＣ：９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９２．５：７．５］
【数１６】
2005500391.tif 000052
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．５７−１．７３（ｍ，３Ｈ）；１．９２−２．２８（ｍ，５Ｈ）；２．４７−２．５６（ｍ，１Ｈ）；４．２４（ｍ，１Ｈ，ＨＣ−［ＮＨ］）；４．３９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ）；６．８２（ｓ，２Ｈ，ＮＨ2）；７．９２（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ）；８．３６（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ＝）
【００７９】
実施例２４
２−アミノ−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン１９
【化３５】
2005500391.tif 000053
５０ｍｌのＤＭＳＯ中の２．６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−８−ヨード−２−アザビシルクロ（ａｚａｂｉｃｙｌｃｌｏ）［３．３．１］ノナン−３−オン１、１．７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の２−アミノ−６−クロロプリンおよび２．１ｇ（１５ｍｍｏｌ）のＫ2ＣＯ3を、室温で２４時間、撹拌する。ＤＭＳＯを減圧下で蒸留分離した後、５０ｍｌの水で残渣をペースト状にし、吸引によりろ過分離し、アセトンで洗浄する；１．８ｇの純粋な生成物が得られ、クロマトグラフィーにより、ろ過物からさらに０．３ｇの生成物が単離される（ＳｉＯ2：ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝９：１）
２．１ｇ（６９％）
物理的データについては実施例２８を参照のこと。
【００８０】
実施例２５
２−［ジ（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）アミノ］−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン２０
【化３６】
2005500391.tif 000054
２５０  ｍｌの塩化メチレン中の１２．７３ｇ（４１．５ｍｍｏｌ）の２−アミノ−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン１９、５．７５ｍｌ（４１．５ｍｍｏｌ）のＴＥＡ、３１．７ｇ（１４５  ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ピロ炭酸ブチルおよび１５０ｍｇのＤＭＡＰを、還流下で約１２時間煮沸する。（ＴＬＣ確認：（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）。精密検査のために、溶媒を蒸留分離し、残渣をクロマトグラフィーにより精製する。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ）
１８．６ｇ（７４％）
ＲF＝０．７４（ＥｔＯＡｃ）
ＨＰＬＣ：＞９８％［リクロスファーＲＰ１８（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ  １８）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９０：１０］
【数１７】
2005500391.tif 000055
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．３６＆１．４８（２ｓ，２７Ｈ，３−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．６０−１．８５（ｍ，３Ｈ）；２．０２−２．１３（ｍ，２Ｈ）；２．１７−２．２７（ｍ，１Ｈ）；２．３５−２．４９（ｍ，２Ｈ）；２．７７−２．８９（ｍ，１Ｈ）；４．８５（ｍ，１Ｈ，ＨＣ−［ＮＨ］）；５．２１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−Ｎ）；８．９９（ｓ，１Ｈ，−ＣＨ＝）
【００８１】
実施例２６
Ｎ2−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−９−［（１Ｒ，２Ｒ，４Ｒ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−カルボキシメチルシクロヘキシ−１−イル］グアニン２２
【化３７】
2005500391.tif 000056
４．１ｇ（６．７５  ｍｍｏｌ）の２−［ジ（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）アミノ］−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン２０を３０ｍｌの塩化メチレンに０℃で導入する。次いで、２．３ｇ（３２．５ｍｍｏｌ）の３−ヒドロキシプロピオニトリル、３．８４ｇ（６５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンおよび１．５ｇ（９．２５ｍｍｏｌ）のＤＢＵを添加し、混合物を室温で１６時間撹拌する。全ての揮発性構成成分を減圧下で蒸留分離した後の残渣を、ＫＨ2ＰＯ4水溶液で酸性にし、塩化メチレンで数回抽出する。有機相を乾燥およびエバポレーションすることによって、固体残渣（４．２６ｇ）が得られ、これを１４５ｍｌのメタノールに溶解し、これに−１５℃で、３６ｍｌの水中１．５２ｇ（３６．２ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ一水和物の溶液を３０分間かけて添加する。次いで、混合物を−１０℃で２時間、室温で２０時間、撹拌する。精密検査のために、メタノールを減圧下で蒸留分離し、水性の残渣を少量の水で希釈し、次いで、希塩酸でｐＨ３に調整し、塩化メチレンで抽出する。反応生成物をクロマトグラフィーにより精製する。
（ＳｉＯ２：アセトン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）
２．８７ｇ（８４％）
融点＞３００℃（分解）
ＲＦ＝０．７９（アセトン／ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ＝９：６：２：２：２：１）
ＲF＝０．３７（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
ＨＰＬＣ：＞９８％［シクロボンドＩ（Ｃｙｃｌｏｂｏｎｄ  Ｉ）、ＣＨ3ＣＮ／（Ｈ2Ｏ＋０．０１Ｎ  ＴＢＡＳ）＝９０：１０］
【数１８】
2005500391.tif 000057
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ｄ6−ＤＭＳＯ）１．１８＆１．４８（２ｓ，１８Ｈ，２−ｔｅｒｔ−Ｂｕ）；１．１−１．２２（ｍ，１Ｈ）；１．７４−１．８４（ｍ，１Ｈ）；１．８５−１．９８（ｍ，４Ｈ）；２．１０−２．２５（ｍ，３Ｈ）；３．８７−４．１３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ−［ＮＨ］，ＣＨ−Ｎ）；６．７８（ｄ，１Ｈ，ＮＨ−Ｃ［Ｈ］）；７．７９（ｓ，１Ｈ，Ｎ−ＣＨ＝Ｎ）；１１．０２，１１．２８＆１２．１（３ｓ，３Ｈ，ＮＨ，ＮＨ，ＣＯ2Ｈ）
【００８２】
実施例２７
Ｎ2−ジ（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］グアニン２１
【化３８】
2005500391.tif 000058
３７．８ｇ（６２．３ｍｍｏｌ）の２−［ジ（ｔｅｒｔ−ブチルカルボニル）アミノ］−６−クロロ−９−［（１Ｒ，５Ｒ，８Ｒ）−３−オキソ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−アザビシクロ［３．３．１］ノナン−８−イル］プリン２０を１９０ｍｌの塩化メチレンに導入する。０℃で、２１．４ｍｌ（３１３ｍｍｏｌ）の３−ヒドロキシプロピオニトリル、６２．３ｍｌ（約６６０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンおよび９．１３ｍｌ（５９  ｍｍｏｌ）のＤＢＵを添加し、次いで、混合物を室温で１５時間撹拌する。次いで、全ての揮発性構成成分を減圧下で蒸留分離し、残渣を３００ｍｌのＫＨ2ＰＯ4水溶液と混合し、塩化メチレンで抽出する。有機相を乾燥およびエバポレーションすることによって、固体残渣が得られ、これをジイソプロピルエーテルで処理し、吸引によりろ過分離する。（約２７．２ｇ）。クロマトグラフィーにより精製が行われる。（ＳｉＯ2：ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝１０：１）
２５．５  ｇ（６９．５％）
ＲＦ＝０．２８（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨ＝５：１）
【００８３】
実施例２８
（Ｒ，Ｒ，Ｒ）−エナンチオマーまたは（Ｓ，Ｓ，Ｓ）−エナンチオマーＣＮＡオリゴマーの固相合成
２８．１  ＣＮＡオリゴマー（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］の固相合成  ２８．１．１  Ｃ末端モノマー５または１０による支持体の充填
テンタゲルＳ  ＨＭＢ（Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＨＭＢ）樹脂（１００ｍｇ；２８μｍｏｌ；キャパシティー＝０．２８ｍｍｏｌ／ｇ）を２ｍｌシリンジに配置し、無水ＤＭＦ（１．５  ｍｌ）により室温で５分間、膨潤させ、次いで、溶媒を取り出す。モノマー５（３２ｍｇ、８４μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２００μｌ）に懸濁し、無水ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡ（３６ｍｇ、２８０μｍｏｌ）中のＨＡＴＵ（３２ｍｇ、８４μｍｏｌ）溶液を２００μｌ添加する。５分間、穏やかに振とうすると、淡黄色の溶液が生じる。樹脂に溶液を添加した後に生じる懸濁液を室温で８時間、振とうする。次いで、反応溶液を取り出し、ＤＭＦ（６×１．５ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（６×１．５ｍｌ）で樹脂を洗浄し、減圧下で乾燥する。
【００８４】
化学量論的に等しい量の反応物を使用し、室温で１晩、モノマー５または１０と共に固相のインキュベーションを行うことにより、記載の反応サイクルを反復する。反応終了後、過剰の反応物を取り出す。得られる樹脂付加物を、ＤＭＦ（６×１．５ｍｌ）、ＣＨ2Ｃｌ2（６×１．５ｍｌ）およびジエチルエーテル（３×１．５ｍｌ）で洗浄し、次いで、減圧下で徹底的に乾燥する。
【００８５】
樹脂支持体に付着したモノマーのサンプルを切断分離した後、ＨＰＬＣ分析（方法Ａ）は、０．１１〜０．１４ｍｍｏｌ／ｇの充填を提供する。それぞれのモノマーを有する樹脂の充填を定量的に決定するために、規定量（約３〜４ｍｇ）の樹脂（ｍ樹脂）を、２Ｎ  ＮａＯＨ（１５０μｌ）により室温で３０分間処理する。次いで、樹脂をろ過分離し、同じ量の２Ｎ  ＮａＯＨ（１５０μｌ）で２回洗浄する。ろ過物を合わせて、２Ｎ  ＮａＯＨで１ｍｌの容積までにする。この１００μｌサンプルを該溶液から採取し、ろ過物の分光測定のために２Ｎ  ＮａＯＨで１  ｍｌに希釈する。この方法で希釈されたろ過物の吸光度Ｅは、ＣＮＡチミン誘導体が存在する場合、２７３ｎｍで決定される（Ｅ273nm＝１１５００｜・ｍｏｌ-1・ｃｍ-1）か、またはＣＮＡアデニン誘導体が存在する場合、２６０ｎｍで決定される（Ｅ260nm＝１５４００｜・ｍｏｌ-1・ｃｍ-1）。樹脂のキャパシティーＸ［ｍｍｏｌ／ｇ］は、以下の式に従って得られる値によって算出することができる：
Ｘ＝Ｖ×Ｅ／（ε×ｄ×ｍ樹脂）
【００８６】
遊離の水酸基にキャップするために、樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（７００μｌ）に懸濁し、Ａｃ2Ｏ（２０６．７ｍｇ；２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２５６．７ｍｇ；２．０ｍｍｏｌ）による処置を室温で、アデニンモノマーが存在する場合は１５分間、またはチミンモノマーが存在する場合は１時間行う。次いで、過剰の反応物を取り出し、樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（１０×１．５  ｍｌ）で洗浄し、次いで、徹底的に乾燥する。
【００８７】
２８．１．２  モノマー５および１０の前活性化
ＨＡＴＵ（４２μｍｏｌ）（パースペプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｐｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を、無水ＤＭＦ（１５０μｌ）中のモノマー５または１０（４２μｍｏｌ）の溶液に添加する。次いで、混合物を１分間、振とうする。得られる懸濁液をＤＩＥＡ（１０．９ｍｇ、８４μｍｏｌ）と共に室温で５分間インキュベーションすると、淡黄色の溶液が得られる。この方法で活性化されるモノマーは、現在、固相反応（オリゴマー化）のために用いることができる。
【００８８】
２８．１．３  カップリング効率の確認
カップリング反応の効率は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（方法Ｃ）によって確認される。この目的のために、樹脂のサンプル（約１ｍｇ）を反応混合物から採取し、２Ｎ  ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ（９０μｌ、１：１）で５〜１０分間処理する。次いで、サンプル溶液を２Ｎ  ＨＣｌ（９０μｌ）で中和し、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析する。
【００８９】
２８．１．４  合成プロトコル（表１を参照のこと）：
モノマー５または１０を充填された１００ｍｇの樹脂（１４μｍｏｌ；キャパシティー：０．１４ｍｍｏｌ／ｇ）をシリンジ（２  ｍｌ）に配置する。次いで、Ｎ末端Ｂｏｃ保護基を、ＴＦＡ−ＣＨ2Ｃｌ2  １：１（１．５ｍｌ、工程１）、室温、５分間で脱離させる。反応溶液を取り出し、新鮮な脱保護試薬［ＴＦＡ−ＣＨ2Ｃｌ2  １：１（１．５ｍｌ）］を新たに添加し、室温でさらに３０分間インキュベートする。樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（２×１．５ｍｌ）で洗浄し、ＤＭＦ中１Ｍ  ＤＩＥＡ（４×１．５ｍｌ）で中和し、次いで、新たにＤＭＦ（６×１．５ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（６×１．５ｍｌ）で洗浄する（工程２〜４、表１）。Ｂｏｃ−脱保護樹脂を減圧下で乾燥し、次いで、無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）で５分間処理する。ＤＭＦを取り出した後、活性化されたモノマー５または１０（４２μｍｏｌ）の溶液（１．１．２を参照のこと）を添加する。懸濁液を４時間振とうする（工程５、表１）。カップリングの終了後、上清をろ過分離し、樹脂をＤＭＦ（６×１．５ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（６×１．５ｍｌ）で洗浄する（工程６、表１）。ＨＰＬＣ分析のために、樹脂−結合性カップリング生成物のサンプルを採取する（上記の方法Ｃを参照のこと）。カップリングは定量的に進行するため、遊離末端のアミノ官能基はその後キャッピングする必要がない。
【００９０】
２８．１．５  Ｎ末端が置換されたオリゴマーの支持体からの脱離
オリゴマー化の終了後、樹脂に結合したオリゴマーをＭｅＯＨ（１：１）中２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液の２ｍｌにより室温で２時間処理することによって、支持体から生成物を脱離させる。２Ｍ  ＨＣｌで溶液を中和した後、得られるオリゴマーをＲＰ−ＨＰＬＣで精製することができる（方法Ｄ）。生成物含有画分を合わせて、凍結乾燥によって濃縮する。
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］（１３６０．７  ［Ｍ＋Ｈ］+、Ｍ計算値＝１３６０．７  ＲＰ−ＨＰＬＣ
（方法Ｃ）：（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］（Ｒt＝１５．０分）。Ｔｍ値＝２７．４°。
【００９１】
この方法で合成される全てのＣＮＡオリゴマーを以下の表２に列挙する。
【００９２】
【表２】
2005500391.tif 000059
【００９３】
２８．１．６  ＣＮＡ／ｐ−ＲＮＡハイブリダイゼーション
５μｍのＣＮＡ濃度および５μｍの等モルのｐ−ＲＮＡが存在するように、ＣＮＡおよびｐ−ＲＮＡのオリゴヌクレオチド鎖を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解した。次いで、３５℃〜−８℃の温度範囲における２６５ｎｍの波長での吸収分光学によって、溶液を調べた（ランプ速度８０秒／℃）。吸収値は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）装置（λ２）で記録した。図１Ａは、短い５マーのヘテロ二重鎖（図１Ｂ）との安定な対形成が存在することを示す。融点は１４℃である。さらに、本実施例は、低塩条件であっても対形成が生じることを示す。
【００９４】
実施例２９
ブチロリン酸（ｂｕｔｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）基を導入することによるＣＮＡの溶解度の改善
２９．１  樹脂結合性パートナー（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］のＮ末端に対するジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル−保護された４−ヒドロキシブタン酸の付加
ＤＩＥＡ（２７ｍｇ、２１０μｍｏｌ）を添加する前に、ＤＭＦ（４００μｌ）中の４−（４，４−ジメトキシトリチルオキシ）ブタン酸（５７ｍｇ、１４０μｍｏｌ）［１４］およびＨＡＴＵ（５３ｍｇ、１４０μｍｏｌ）を１０分間撹拌し、さらに２分後、該溶液を、パートナー残基（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］を充填した１００ｍｇのテンタゲルＳ  ＨＭＢ（Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＨＭＢ）樹脂支持体（０．１４ｍｍｏｌ／ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）に添加する。次いで、樹脂を工程１〜４と同様に処理する（表１）。最後に、上清をろ過分離し、修飾された樹脂をＤＭＦ（４×４ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２×４ｍｌ）で洗浄する。
【００９５】
２９．２  脱トリチル化
脱トリチル化のために、修飾された樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2中ジクロロ酢酸の６％強度の溶液でそれぞれ２分間、５回処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×４ｍｌ）およびＭｅＣＮ（４×４ｍｌ）で洗浄し、最後に、高減圧下で１晩、Ｐ2Ｏ5で乾燥させる。
【００９６】
２９．３  リン酸化および酸化：
乾燥させた修飾した樹脂を無水ＭｅＣＮ中ピリジニウム塩酸塩の０．５Ｍ溶液の２ｍｌで１０分間膨潤させる。続いて、反応容器をＡｒ大気下に配置し、ＭｅＣＮ中ピリジニウム塩酸塩の０．５Ｍ溶液（７８０μｌ）およびＭｅＣＮ（１４５μｌ）を添加する。次いで、無水ＭｅＣＮ中ビス（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミデートの溶液（７５μｌ、３００ｍＭ）を修飾された樹脂上にピペッティングし、４５分間振とうする。上清を取り出した後、新鮮なリン酸化試薬を再度樹脂に添加し、４５分間処理する。記載の反応サイクルは合計４回行われる。次いで、樹脂から上清を除き、ＭｅＣＮ（６×１ｍｌ）で洗浄し、次いで、ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ中５ｍｍｏｌのヨウ素、２２３ｍｍｏｌのコリジン（６４：３６）から成る１．５  ｍｌのヨウ素含有酸化溶液で２分間の処理を３回行う。酸化の終了後、リン酸化されたオリゴマーを無水ＭｅＣＮ中ピリジニウム塩酸塩の０．５Ｍ溶液の１．５ｍｌで５回洗浄し、１．５ｍｌのＭｅＣＮで５回洗浄する。
【００９７】
２９．４  シアノエチル基の脱離
充填された樹脂を、ＭｅＣＮ中ＤＢＵの２．７Ｍ  溶液の１．５ｍｌで室温で１５時間処理し、次いで、ＭｅＣＮ（６×１．５ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（６×１．５ｍｌ）で洗浄する。
【００９８】
２９．５  Ｎ末端が置換されたオリゴマーの支持体からの脱離
合成の終了後、ＭｅＯＨ（１：１）中２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液の２ｍｌにより室温で２時間処理することによって、支持体からリン酸化された生成物を脱離させる。２Ｍ  ＨＣｌによる中和後、リン酸化された粗オリゴマー生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製する（方法Ｄ）。得られるオリゴマー画分を合わせて、凍結乾燥によって濃縮する。
【００９９】
ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｒ）−ＣＮＡ［ｐｈｂａ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］（１５２７．０［Ｍ＋Ｈ］+、７６４．５［Ｍ＋Ｈ］2+；Ｍ計算値＝１５２６．６  ＲＰ−ＨＰＬＣ（方法Ｃ）：（Ｒ）ＣＮＡ［ｐｈｂａ（ＡＡＴＡＴ）ＯＨ］（Ｒt＝２２．９  ｍｉｎ）。Ｔｍ値＝３３．６°。
【０１００】
実施例３０
４−［（ビス（フェニルメトキシ）ホスフィニル］オキシ］ブタン酸の直接導入によるＣＮＡの溶解度の改善
３０．１  ４−ヒドロキシブタン酸メチルの合成
ブチロラクトン（１２ｇ、１４０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（１３０ｍｌ）および濃硫酸（８滴）を、還流下で８時間、共に加熱する。混合物を室温まで冷却し、氷／塩中で冷却する一方、ＮａＨＣＯ3（１ｇ）を添加し、混合物をさらに１０分間撹拌する。固体残渣をろ過分離し、溶媒をロータリーエバポレーターで取り出す。得られる無色の液体をシリカゲル上クロマトグラフィー（１４×５．５ｃｍ、Ｅｔ2Ｏ／ＣＨ2Ｃｌ2  ３：２）により精製する。純粋なエステル画分を合わせると、溶媒を取り出した後、１．５ｇ（１２．７ｍｍｏｌ、９％）のエステルを得る。
【０１０１】
３０．２  ４−［［ビス（フェニルメトキシ）ホスフィニル］オキシ］ブタン酸メチルの合成
６．９ｇ（１９．７ｍｍｏｌ）の亜リン酸トリベンジルを無水ＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍｌ）に溶解し、０℃で、少しずつヨウ素（４．５９ｇ、１８ｍｍｏｌ）を添加する。ヨウ素は３０分以内に溶解し、無色透明な溶液を生じる。ＨＢＵメチルエステル（１．９４ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ2Ｃｌ2（１５０  ｍｌ）に溶解し、氷／塩混合物で−１０℃まで冷却し、ピリジン（５．３ｍｌ＝５．１８ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、リン酸化試薬の溶液を３０分間かけて滴下し、さらに１０分間撹拌する。２０％強度のクエン酸（３×８０ｍｌ）を添加し、続いて、抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた水（８０ｍｎｌ）で２回処理する。シリカゲル上でのクロマトグラフィー（１１．５×５．５ｃｍ、４００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2、各２００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ  ２０：１および１５：１、次いで、生成物が溶出するまで、１０：１）により、所望の生成物（４．７５ｇ、１２．１ｍｍｏｌ、７４％）が得られる。
【０１０２】
３０．３  ４−［［ビス（フェニルメトキシ）ホスフィニル］オキソ］ブタン酸
４−［［ビス（フェニルメトキシ）ホスフィニル］オキシ］ブタン酸メチル（２ｇ、５．３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）に溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ（１５ｍｌ）と混合し、混合物を室温で６時間撹拌する。室温でのエバポレーターで反応容積を２分の１にまで濃縮し、１Ｍ  ＮａＯＨ（６０ｍｌ）を添加し、溶液をＥｔ2Ｏで３回抽出する。水相を単離し、濃ＨＣｌで酸性化（ｐＨ１〜２）し、酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、得られる乳状の懸濁液を、シリカゲル（８×５．５ｃｍ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ８：１）上で精製する。１．２ｇの所望の生成物が得られる（３．３ｍｍｏｌ、６２％）。
【０１０３】
３０．４  （Ｒ）−ＣＮＡ［ｐｈｂａ（ＡＴＡＴＴ）ＯＨ］の合成
（Ｒ）−ＣＮＡ［Ｈ（ＡＴＡＴＴ）ＯＨ］オリゴマーをチャージした６５ｍｇ（６μｍｏｌ）の支持体をシリンジ（２ｍｌ）内に導入する。ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２  １：１（１．５ｍｌ）を５分間作用させることによって、Ｎ末端Ｂｏｃ保護基を取り出す。新鮮脱保護試薬を添加し、さらに３０分間、室温でＢｏｃ脱保護反応を行う。反応溶液を取り出し、支持体をＣＨ２Ｃｌ２（２×１．５ｍｌ）で洗浄し、ＤＭＦ中１Ｍ  ＤＩＰＥＡ（４×１．５ｍｌ）で中和し、ＤＭＦ（６×１．５ｍｌ）およびＣＨ２Ｃｌ２（６×１．５ｍｌ）で洗浄する（操作２〜４）。次いで、Ｂｏｃ−脱保護された支持体を無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）で５分間膨潤させ、溶媒をろ過分離する。４−［［ビス（フェニルメトキシ）ホスフィニル］オキシ］ブタン酸（６．６ｍｇ、１８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２５０μｌ）に溶解し、ＨＡＴＵ（６．９ｍｇ、１８μｍｏｌ）を添加し、ＤＩＰＥＡ（６．３μｌ、３６μｍｏｌ）をピペットで添加する。約２分後、透明な淡黄色の溶液が得られ、Ｂｏｃ−脱保護に添加される。カップリングは室温で４時間行われる。ＴＦＡ−Ｈ2Ｏ−トリエチルシラン（２ｍｌ；９５：２，５：２．５）によるベンジル保護基の脱離後、リン酸化パートナーはほとんど定量的な収率をもたらす。
【０１０４】
実施例３１
溶液中ＣＮＡオリゴヌクレオチドのＣ末端ペプチドのコンジュゲーション
３１．１  リジンのεアミノ官能基における（Ｓ）−ＣＮＡ［Ａｃ（ＡＡＴＡＴ）−Ｌｙｓ−ＯＨ］のヨードアセチル化
６９０ｎｍｏｌの（Ｓ）−ＣＮＡ［Ａｃ（ＡＡＴＡＴ）−Ｌｙｓ−ＯＨを８００μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム／ＤＭＦ（１：２）に溶解し、遮光して、１５０等価量のＮ−スクシンイミジルヨード酢酸（１０２μｍｏｌ、２８．９ｍｇ）と共に２時間振とうさせる。生成物（Ｓ）−ＣＮＡ［Ａｃ（ＡＡＴＡＴ）−Ｌｙｓ（Ｎε−ヨードアセチル）−ＯＨ］を、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで直接精製し、ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上で脱塩する。やや溶けにくいオリゴヌクレオチドに使用することができる溶媒混合物は、用いるオリゴヌクレオチドに基づいて３等価量のピリジンを有するＤＭＳＯである。
【０１０５】
３１．２  （Ｓ）−ＣＮＡ［Ａｃ（ＡＡＴＡＴ）−Ｌｙｓ（Ｎε−ヨードアセチル）−ＯＨ］とＨ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＨとのコンジュゲーション（コンジュゲート１）
１０６ｎｍｏｌの（Ｓ）−ＣＮＡ［Ａｃ（ＡＡＴＡＴ）−Ｌｙｓ（Ｎε−ヨードアセチル）−ＯＨ］を２０μｌのＤＭＦに溶解し、次いで、２０μｌのＤＭＦ／ＥＤＴＡ−ホウ砂−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）中のＨ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２５６ｎｍｏｌ、１６２μｇ）の溶液を添加する。オリゴヌクレオチドが完全に反応するまで、混合物を遮光して２時間振とうする。次いで、ＣＮＡコンジュゲート（コンジュゲート１）をＲＰ−ＨＰＬＣによって直接精製し、ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上で脱塩する。
【０１０６】
実施例３２
樹脂−結合性ＣＮＡオリゴヌクレオチドのＮ末端ペプチドのコンジュゲーション（コンジュゲート２）
Ｃ末端が樹脂に結合した（Ｓ）−ＣＮＡ［Ｌｙｓ（ＴＴＴＴＴ）ＯＨ］（オリゴヌクレオチドに基づいて２００ｎｍｏｌ、充填度０．１１ｍｍｏｌ／ｇ、２ｍｇの樹脂）を、３００μｌの０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム／ＤＭＦ（１：２）溶液および１５０等価量のＮ−スクシンイミジルヨード酢酸（３０μｍｏｌ、８．５ｍｇ）と混合し、遮光して２時間振とうする。次いで、樹脂ビーズをろ過し、ＤＭＦで洗浄する。次いで、得られるヨードアセチル誘導体（Ｓ）−ＣＮＡ［（Ｎε−ヨードアセチル）−Ｌｙｓ（ＴＴＴＴＴ）−樹脂］を２００μｌのＤＭＦ／ＥＤＴＡ−ホウ砂−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ＝  ７．５）（２：１）中の４００ｎｍｏｌのＨ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ2と反応させる。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、２Ｍ  ＮａＯＨで生成物を樹脂から脱離させることができる。１Ｍ  ＨＣｌでのＮａＯＨ溶液の中和後、粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって直接精製し、ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上で脱塩する。
【０１０７】
実施例３３
溶液中ＣＮＡオリゴヌクレオチドの蛍光標識
５０μｌのＤＭＦおよび７８０ｎｍｏｌのＤＩＰＥＡの溶液を、５０μｌのＤＭＦ中１３０ｎｍｏｌの（Ｒ）−ＣＮＡ［Ａｃ−（ＣＴＧＡＡ）−Ｌｙｓ］の溶液に添加する。次いで、合わせた溶液をＣｙ５標識キット（約１５０ｎｍｏｌ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、製品番号：ＰＡ１５００１）と反応させる。オリゴヌクレオチドが完全に反応するまで、反応物を遮光して２４時間振とうする。標識されたオリゴヌクレオチドはＲＰ−ＨＰＬＣによって直接精製し、ＲＰ−Ｃ１８カートリッジ上で脱塩することができる。得られる化合物を相対的質量スペクトルと共に図２ＡおよびＢに掲載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、実施例２８の実験において短い５マーのヘテロ二重鎖との安定な対形成が存在することを示す
【図２】図２は、実施例３３で得られる化合物の構造を相対的質量スペクトルと共に示す。
【図１】
2005500391.tif 000064
【図２】
2005500391.tif 000065
【国際公開パンフレット】
2005500391.tif 000066
2005500391.tif 000067
2005500391.tif 000068
2005500391.tif 000069
2005500391.tif 000070
2005500391.tif 000071
2005500391.tif 000072
2005500391.tif 000073
2005500391.tif 000074
2005500391.tif 000075
2005500391.tif 000076
2005500391.tif 000077
2005500391.tif 000078
2005500391.tif 000079
2005500391.tif 000080
2005500391.tif 000081
2005500391.tif 000082
2005500391.tif 000083
2005500391.tif 000084
2005500391.tif 000085
2005500391.tif 000086
2005500391.tif 000087
2005500391.tif 000088
2005500391.tif 000089
2005500391.tif 000090
2005500391.tif 000091
2005500391.tif 000092
2005500391.tif 000093
2005500391.tif 000094
2005500391.tif 000095
2005500391.tif 000096
2005500391.tif 000097
2005500391.tif 000098
2005500391.tif 000099
2005500391.tif 000100
2005500391.tif 000101
2005500391.tif 000102
2005500391.tif 000103
2005500391.tif 000104
2005500391.tif 000105
2005500391.tif 000106
2005500391.tif 000107
2005500391.tif 000108
2005500391.tif 000109
2005500391.tif 000110
2005500391.tif 000111
2005500391.tif 000112
2005500391.tif 000113
2005500391.tif 000114
2005500391.tif 000115
2005500391.tif 000116
2005500391.tif 000117
2005500391.tif 000118
2005500391.tif 000119
2005500391.tif 000120
2005500391.tif 000121
2005500391.tif 000122
2005500391.tif 000123
2005500391.tif 000124
2005500391.tif 000125
2005500391.tif 000126
2005500391.tif 000127
2005500391.tif 000128
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500391.tif 000129
【国際調査報告】
2005500391.tif 000130
2005500391.tif 000131
2005500391.tif 000132
2005500391.tif 000133
2005500391.tif 000134
2005500391.tif 000135
2005500391.tif 000136
2005500391.tif 000137