(57)【要約】本発明は、アデノウイルス配列およびレトロウイルス配列の両方を含む遺伝子療法用の単一核酸ベクターに関する。本明細書に記載のベクターは、レトロウイルスベクターの全てのシスおよびトランス成分を形質導入するので組替え体レトロウイルスベクターを高力価で作成することができる。このキメラ型ベクターは治療用構造物の配送および安定な組み込みに使用され、また生体内遺伝子輸送の適用が現在遭遇している制約事項を解消する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用遺伝子分子を標的組織に配送する方法であって、その遺伝子分子の非ウイルス形態を生体内でウイルスベクターを産生する前駆体と共にまたはそれに相当する前駆体として配送する方法。
【請求項２】
核酸配列を、ウイルスベクターを産生するのに必要な全ての要素を含んでいるプラスミド形態で配送することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プラスミドが、複合分子を追加することにより特定の標的組織を指向することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記複合分子が、多価陽イオン、ペプチド、抗体、単鎖抗体およびこれらの２以上の組み合わせからなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記核酸配列中に複製コンピテントウイルスを産生するのに必要な配列が含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
核酸がアデノウイルスの全ゲノムを含み、またそのウイルスの調節要素、例えばEI遺伝子、が組織関連配列の調節制御の下にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
転写後または翻訳後の組織効果、例えばイントロンの切除あるいは複合酵素の形成、によって遺伝子発現が媒介されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスベクターを標的とする核酸領域が前記前駆体として提供されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
（治療用遺伝子分子に追加される）追加のDNA配列が提供され、該追加の配列中に、カセットに隣接するレトロウイルス長末端反復フランキング領域が含まれており、該カセット中に治療に係る核酸領域が含まれていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記カセットの内容が、gag核酸配列、pol核酸配列、およびエンベロープ遺伝子の機能を提供することができる配列、例えば両種指向性env配列または水疱性口内炎Gタンパク質(VSV-G)、からなる群から選択されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
上述の核酸領域およびレトロウイルスベクターを標的する核酸配列が治療用遺伝子配列に追加して提供されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記生体内配送用のプラスミド配列が他の複製コンピテントウイルスまたは条件付けウイルス、例えばピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、リノウイルス、バクロウイルス、に必要な配列から構成されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記配送の一部として自殺核酸領域を更に含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記配送が、構造中に存在するトランス活性化因子核酸領域を含むことによって遺伝子発現が調節されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記トランス活性化因子がテトラサイクリントランス活性化因子であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
env核酸領域の発現が提供されることによって、誘起可能なプロモーター核酸領域が調節されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記誘起可能なプロモーター核酸領域が、テトラサイクリン、ガラクトース、グルココルチコイド、Ru487、および熱ショックからなる群から選択される刺激体により誘起されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
env核酸領域が、両種指向性エンベロープ、他種指向性エンベロープ、同種指向性エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)エンベロープ、ネコ免疫不全ウイルス (ＦIV)エンベロープ、サル免疫不全ウイルス1 (SIV)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス1(HTLV-1)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス2(HTLV-2)エンベロープ、および水疱性口内炎ウイルス-Gグリコプロテインからなる群から選択されて提供されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記自殺核酸領域が、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、酸化還元酵素、シトシン脱アミン酵素、チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk::Tmk)およびデオキシシチジンキナーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
カセットに隣接するレトロウイルス長末端反復フランキング領域を含むプラスミドが治療用遺伝子と共に提供され、該カセットには治療に係る核酸領域が含まれており、前記プラスミドには更にgag核酸領域、pol核酸領域、およびenv核酸領域、レトロウイルスベクターを擬態する核酸領域からなる群から選択される核酸が含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記キメラ型核酸プラスミド中に更に自殺核酸が含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記プラスミド中に更にトランス活性化因子核酸領域が含まれ、該トランス活性化因子核酸領域がenv核酸領域の転写を調節するポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記カセットに隣接するアデノ隋伴ウイルス末端反復フランキング領域を含む核酸ベクターが提供され、該カセット中に治療に係る核酸領域が含まれており、前記プラスミド中には更にrep核酸領域、cap核酸領域、およびアデノウイルスE1およびE4核酸領域が含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記他の成分に、両種指向性エンベロープ、他種指向性エンベロープ、同種指向性エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)エンベロープ、ネコ免疫不全ウイルス (ＦIV)エンベロープ、サル免疫不全ウイルス1 (SIV)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス1(HTLV-1)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス2(HTLV-2)エンベロープ、および水疱性口内炎ウイルス-Gグリコプロテインからなる群から選択されたenvポリペプチドが含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記他の成分に、標的組織で相補化されると切除される機能を持った遺伝子を介して自己スプライシング型イントロンを形成する配列が含まれることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２６】
選択された細胞が肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記治療用核酸領域が、レポーター領域、ras、myc、raf、erb、src、ms、 jun、trk、ret、gsp、hst、bcl abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p53、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL.-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-９、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF G-CSF、チミジンキナーゼ、CD40L、因子VIII、因子IX、CD40、多発性疾患耐性(MDR）、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、ICAM-1、HER2-neu、PSA、末端トランスフェラーゼ、キャスパーゼ、NOS、VEGF、FGF、bFGF、HIS、熱ショックタンパク質、IFNαおよびγ、TNFαおよびβ、テロメラーゼ、およびインシュリン受容体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に配送されることによってベクター産生細胞を生成するプラスミド中の複製可能なウイルスベクターの配列に関する。更に詳細には、本発明は遺伝子療法用のベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
過去三十年にわたる遺伝子および細胞生物学の研究の進歩は、ヒトの疾患の多くについてその分子的な根拠を説明する我々の能力を大幅に向上させている(刊行物4、5)。これには分子遺伝子技術が特に有効である。これらの技術によって、一個の遺伝子中での病変に由来する一般的な遺伝的疾患、例えばオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)欠損症、嚢胞性繊維症、血友病、免疫不全症候群等に関連する遺伝子、および更に複雑な疾患、例えば癌に関与する遺伝子の単離ができるようになった（刊行物6、7）。そこで、遺伝子療法、すなわち細胞の表現型または遺伝子型を変更する目的で細胞中に遺伝子的材料を導入することと定義される療法が、最近十二年にわたって熱心に研究されてきた(刊行物5、8)。
【０００３】
多くの遺伝的および後天的疾患に対して遺伝子療法が有効となるためには、治療用遺伝子を生体内の関連細胞に高能率で配送し、その治療用遺伝子の発現を長時間保持し、かつこの形質導入によって有害な効果を招来していないことを確認する必要がある。これらの指標を完遂するために各種のベクター系が評価されてきた。そうした系には、ウイルスベクターでは例えばレトロウイルス（レンチウイルス等）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス、また非ウイルス系では例えばリポソーム、分子複合体および他の微粒子ベクターが挙げられる(刊行物5、8)。ウイルス系は実験室での研究では有効であるが、臨床応用で明確に治療効果のあるものは未だない。
【０００４】
現行のウイルスベクター系の中では、アデノウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターは最も広範囲に使用され分析されているが、進捗達成が著しいのはアデノ随伴分野である。これらのベクターを使用することによって、外来遺伝子を効果的に生体外および生体内に導入し発現させることに成功している。またこれらのベクターは、細胞生理学、遺伝子およびタンパク質調節の研究用として、およびヒト疾患の遺伝子療法用として有力な道具である。実際に、これらは第I、IIおよびIII相の臨床実験で目下評価中である（刊行物9、10）。しかし、ウイルスベクター系には配送および能率の点での制約がかなりある。
【０００５】
遺伝子療法(遺伝子配送用担体）
遺伝子療法用ベクターは主要な二つのタイプ、すなわちウイルスおよび非ウイルスのタイプに分類される。両タイプは、Methods in Human Gene Therapy, T. Friedmann編 Cold Spring Harbor Press, 1999に詳細に概説されており、これを引用により本明細書に取り込む。最も一般的に使用されるウイルス系はレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターであり、そうなった理由の一部は歴史的な事情にもよるが、一部は臨床的に使用する量を製造するのが比較的に簡単であったからである。これらのベクターは共に広く臨床試験で使用されており、アデノ随伴ウイルスベクター、ラブドウイルス、ヘルペスウイルスベクター、およびワクチニアウイルスまたはポックスウイルスを基礎とするベクターを使用して行われた臨床試験もある。これらのウイルスの強度および弱度は多様であるが、全て遺伝子を標的組織に配送するのに比較的に有効である。ベクターの中には十分な量を製造するのが困難な物があるとか、生体内で遺伝子を正確に標的に配送できないとか、ウイルスの遺伝子産物が有毒で免疫学的な副作用をもっているとかの制約はある。しかし、留意して欲しいこととして、たとえ比較的に有効なウイルスベクターを使用した場合でも、遺伝子を各病的細胞に配送できると期待することは合理的ではない。したがって療法はこの課題を含んだままの手段によって完遂されなければならない。
【０００６】
非ウイルス系には、むき出しのDNA、リポソーム中に製剤化されたDNA、ポリカチオン濃縮化剤やハイブリッド系と共に製剤化されたDNA、およびペプチドやタンパク質、例えば単鎖抗体と複合することによって特定組織を標的するDNA等が挙げられる。これらの系を妥当な調節段階で構造物化することにより、生体内半減期の長期化、標的細胞/組織への配送、細胞質および核の中への搬入、引き続いて起こる発現と言った課題はいっそう処理し易くなる。これらの課題には個別に解決手段が可能であるが、未だそれらの解決手段が効果的に一体化してはおらず、生体内での能率的な遺伝子運搬は現在も依然として課題のままである。したがってこれらの系についても、遺伝子を各細胞、例えば腫瘍に配送できると予測するのは合理的ではない。
【０００７】
そこで、遺伝子配送担体を利用する遺伝子療法、例えば癌療法では、遺伝子配送事象のある種の増幅化を可能にするメカニズムを利用する必要がある。そうしたメカニズムには、免疫系の刺激、各種形態の第三者効果、アポトーシスの拡散、抗血管形成効果、前凝血効果、複製コンピテントウイルスベクター等が挙げられよう。
【０００８】
アデノウイルスベクター
アデノウイルス科はDNAウイルスの一ファミリーであり、1953年に子供の扁桃腺組織から最初に単離された（刊行物11）。ヒトにおける感染性薬剤としてアデノウイルスには六つの亜属(A、B、C、D、E、およびF)および49を越える血清型が同定されている(刊行物12)。動物の腫瘍に随伴するものは数種単離されているが、ヒトの腫瘍に随伴したものは単離されていない。遺伝子療法用に最も頻繁に使用されているアデノウイルスベクターは、C亜属の血清型2または5(Ad2またはAd5)に属する。これらの血清型は腫瘍の形成には随伴していない。Ad2またはAd5が感染すると、上部気道、眼、リンパ様組織に急性の粘膜感染症が起こり、一般の風邪に似た緩和な症状となる。C型アデノウイルスへの接触が人々の中に拡がると、成人の大部分の血清はこの型のアデノウイルスに陽性となる(刊行物12)。
【０００９】
アデノウイルス粒子は、直径が65ないし80nmの正二十面体であり、DNAを13％およびタンパク質を87％含有する(刊行物13)。このウイルスDNAは、長さが約36kbあり、天然には感染細胞の核の中に存在し、直線状ゲノムの各5’末端に共有結合で連結しているタンパク質の相互作用により環状エピソームの形態で保持されている。このアデノウイルスゲノムは機能的な環状クローンと共に動作可能であることにより、大いに分子的操作が容易になりまた複製不全ベクターの産生が可能となった。
【００１０】
未コンピテントアデノウイルスの一般に使用する複製ベクターを産生するには、アデノウイルスの二つの生物学的側面が重要である。第一は、そのアデノウイルスが生産できる必須調節タンパク質がトランス形であること、第二は、そのアデノウイルスのコアの収納能力がゲノム全長の105％を越えないことである(刊行物14)。第一の側面は、このウイルスゲノムのE1領域を含む左端から安定に組み込まれたアデノウイルス配列(0〜11マップ単位)で形質転換したヒト胚腎細胞株の293細胞の作成により最初に実現された(刊行物15)。これらの細胞からはトランス形のE1A生産物が得られるので、E1Aを欠いたゲノムを持ったウイルス粒子の産生が可能となった。すなわち、このようなウイルス粒子は、E1A遺伝子を欠く細胞中では活性な複製行為を維持できないので複製不全性であると考えられる（しかしベクター濃度が高ければ複製は起こるかもしれない）。293細胞は、これら複製不全ベクターの産生に許容的であるので、アデノウイルスベクターを使用する全ての認定プロトコールで利用されるようになった。
【００１１】
第二の側面は、105％限界を超えると所望の導入遺伝子を担持するシャトルプラスミドでの組換え作業が強要されるような骨格が作成されたことにより実現した(刊行物16)。現在使用されている大部分のアデノウイルスベクター系の基礎は、サブグループCのアデノウイルスの血清型2または5の骨格である(刊行物14)。領域E1/E3の単独またはE2/E4との組み合わせを削除することにより、第一または第二世代での複製が不全となるアデノウイルスベクターがそれぞれ生産された(刊行物14)。上記のごとく、アデノウイルス粒子は野生型ゲノムの105％までを収納することができるので、約1.8ｋｂの異種の追加DNAを挿入することが可能である。E1配列を削除すれば別の3.2kbが追加され、他方、E3領域を削除すれば外来DNAの3.1kb分の追加スペースが得られる。したがって、E1およびE3を削除したアデノウイルスベクターによって得られる全収納スペースは、異種DNA配列の約8.1kb分となる。
【００１２】
アデノウイルスの特徴は精力的に特徴付けされ、それが作成するベクターは遺伝子療法にとって魅力的である。その理由は、このウイルスの野生型に感染した場合でも症状は比較的に良性であり、生体外での組換え操作が簡単であり、力価の高い精製ウイルスを常に生産することができ、休止細胞を形質導入することができ、またこれらが標的する組織の範囲が広いからである。更にアデノウイルスDNAは宿主細胞の染色体に編入されないので、挿入による突然変異誘発あるいは病変菌株効果と言った懸念は最小化される。この理由からアデノウイルスベクターは、一時的な発現が望まれる腫瘍の遺伝子療法プロトコールおよびその他のプロトコールにとって大変に魅力的となっている。しかし、これらのベクターは、長時間の発現が望まれる代謝疾患等への適用にとっては大変有用ではない。E1AおよびE1B領域の全部または一部を欠くヒトのサブグループCアデノウイルスベクターを、癌、嚢胞性繊維症等の疾患を標的とする第I相臨床試験で評価しているが、重大な毒性は記述されていない（刊行物８、9、17、18）。これらベクターの安全性に対する主要な例外は、E1、E4削除ベクターの大用量を肝動脈内に直接受けた若い男性の死であった。大用量のアデノウイルス粒子によって肝毒性、DIC様応答、および最終的には呼吸困難と死に至ったのである。
【００１３】
癌療法のために「複製条件付き」アデノウイルスを使用すると、臨床試験において多少の効果を示している。「複製条件付き」ベクターまたはウイルスとは、正常細胞での複製では重要であるが標的細胞での複製には必須でないゲノム部分(例えば、p53に応答するE1B機能のない天然変異体Onyx015)を欠損しているか、または特定組織を標的する調節要素(例えば、ウイルスのE1A、E1B、E2またはE4領域を発現するための組織特異的プロモーター)を含むベクターまたはウイルスである。これらベクターの有効性に対する主な懸念は、複製不全アデノウイルスベクターの場合と同様に、配送されたウイルス粒子に対する応答が生来的なものであり、また抗ウイルス免疫応答のために反復投与の可能性が制限されることである。これは投与を受けた側のベクター/ウイルスに対する免疫応答であり、これによって初回およびそれに続く投与における効果が減弱される。ウイルスベクターの免疫的な中和化を課題として扱うには、ウイルス粒子の産生に必要な核酸配列を非ウイルス的な方法で配送するのが有利である。標的化方法で配送できる場合には特に有利である。
【００１４】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスには、近年最も精力的に検討されたウイルスグループがある。レトロウイルス科は、伝統的に三つの亜科に分割されており、その分割は系統発生的な関連ではなく、むしろ感染の病理的な効果に基づいている(刊行物20)。亜科に対する一般名は、腫瘍ウイルスまたは癌ウイルス、スローウイルスまたはレンチウイルス、および泡状ウイルスまたはスプマウイルスである。後の方の名称はなんら疾患には関連しておらず、あまり知られていない。また、レトロウイルスはそれらの指向性に基づいても記述され、すなわち、起源種または密接に関連する種にのみ感染するウイルスには同種指向性、ヒトおよび起源種を包含する広範囲の種を感染するウイルスには両種指向性、起源種を除く多くの種に感染するウイルスには異種指向性と記述される。
【００１５】
腫瘍ウイルスは、レトロウイルス亜科の最大を構成しており、急速な腫瘍産生(例えばラウス肉腫ウイルス)または緩慢な腫瘍産生(例えばマウスの乳房腫瘍ウイルス)に関連している(刊行物20)。癌ウイルスはA、B、C、またはDのタイプに細分類され、それはウイルス粒子の構造および成熟の過程に基づいている。現在までに開発されたレトロウイルスベクターの大部分はこのグループのCタイプに属している。これらにはネズミの白血病ウイルスおよびギボンサルウイルスが含まれ、調節遺伝子が少ない比較的に単純なウイルスである。他の大部分のレトロウイルスと同様に、Cタイプを基礎とするレトロウイルスベクターを組み込みかつ生産的に形質導入するためには標的細胞が分裂する必要がある。
【００１６】
細胞分裂を必要としない重要な例外はレンチウイルス亜科に見られる(刊行物21)。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、最もよく知られたレンチウイルスであり、後天性免疫不全症候群(AIDS)の病因剤であるが、非分裂細胞に組み込まれることが判った。レトロウイルスは分裂細胞にしか組み込まれないという制限は、あるプロトコール、例えば癌療法プロトコールにとっては安全因子となるが、先天的代謝エラーおよび退行性性格の治療に使用する場合には唯一最大の限界要因となる恐れがある。
【００１７】
レトロウイルスの例はほとんど全ての脊椎動物に見られ、非常に多種類のレトロウイルス株が単離され、それらは広範囲の疾患に関連しているが、レトロウイルスは全て同様な構造、ゲノム構成および複製の態様を共有している(刊行物20)。レトロウイルスは外皮膜で覆われたRNAウイルスであり直径100nmである。そのゲノムは二本のプラスRNA鎖からなり最大サイズは約10kbである。そのゲノムは二つの長い末端反復配列(LTR)で構成されその側面は構造遺伝子gag、pol、およびenvに接している。別の遺伝子(調節遺伝子あるいは癌遺伝子)が存在するとウイルス株は次々と広範囲に変化する。env遺伝子はウイルスの外皮膜に存在するタンパク質をコードする。それらのタンパク質はウイルス粒子の指向性（種および細胞に対する特異性）を担っている。pol遺伝子はウイルスの複製サイクルに重要な数種の酵素タンパク質をコードする。これらのタンパク質には、一本鎖RNAゲノムを二本鎖RNAに転換する逆転写酵素、二本鎖ウイルスDNAを宿主のゲノムに組み込むのに必要なインテグラーゼ、およびウイルス構造タンパク質を加工するのに必要なプロテナーゼが挙げられる。gag、ないし基特異的抗原遺伝子はウイルス粒子のヌクレオキャプシドを形成するのに必要なタンパク質をコードする。
【００１８】
組替え体レトロウイルスは、遺伝子材料を複製能のある哺乳動物細胞に安定に輸送するのに最も有効なベクターであると考えられる（刊行物22、23、24）。レトロウイルスベクターは分子レベルで加工した複製能のない配送系であり、約8kbの遺伝子情報をコードする能力がある。組替え体レトロウイルスベクターを組み立て、これを増殖するためには、ウイルスのgag-pol-env機能の欠損体がトランス形で供給される必要がある。
【００１９】
1980年代初期に開発されて以来、タイプCレトロウイルス由来ベクターは、ヒトおよび哺乳動物の細胞で遺伝子発現させるのに最も有用な遺伝子運搬ツールをいくつか提供してきた。それらが感染し遺伝子発現するメカニズムはよく解明されている(刊行物19)。レトロウイルスベクターの利点には、固有の細胞毒性が比較的にないこと、および複製能のある細胞のゲノムに組み込まれることが挙げられる(刊行物19)。しかし遺伝子配送系としてのレトロウイルスには多数の制約があり、例えば、宿主の範囲が制限されており、ウイルス粒子が不安定であり、細胞の複製能が必要であり、および力価が比較的に低い。
【００２０】
両種指向性レトロウイルスの宿主範囲は広いが、比較的に感染し難いタイプの細胞もある。レトロウイルスベクターの宿主範囲を拡大する一つの手段は、他のウイルスのエンベロープタンパク質を利用してこのベクターのゲノムおよびコアをキャプシド化することである(刊行物25)。そのような擬態ウイルス粒子は、エンベロープタンパク質の由来元ウイルスの宿主範囲と特性を呈する。レトロウイルスのエンベロープ遺伝子の生産物をVSV-Gに置換すれば、擬態ベクターが得られ、これは親ベクターが感染できなかった細胞を感染することができる。一般にレトロウイルスが感染するためには、ウイルスのエンベロープタンパク質と細胞表面の特定受容体との間に特異的な相互作用があることが必要であり、VSV-Gが細胞膜のフォスファチジルセリンおよび多分他のリン脂質成分と相互作用することにより、膜融合しウイルスの侵入を達成させる(刊行物26)。ウイルスの侵入は特定のタンパク質受容体の存在に依存していないので、VSVの宿主細胞の範囲は極めて広い（刊行物27、28、29）。更にVSVは、超遠心分離によって感染力損失を最小に抑えながら109コロニー形成ユニット(cfu)/mlを越える力価に濃縮することができる。他方、両種指向性レトロウイルスベクターを超遠心分離または他の物理的な手段によって濃縮しようと試みると、感染力損失が著しく最終力価の上昇は最小限に止まる(刊行物28)。
【００２１】
しかし,VSV-Gタンパク質は細胞融合を招来するので、これを発現する細胞にとっては有毒である。したがって安定な擬態レトロウイルスを収納した細胞株を生産することは技術的に困難であった(刊行物30)。VSV-G擬態ベクター粒子を生産する一つのアプローチとして、レトロウイルスのゲノムおよびレトロウイルスのgag/pol成分を発現させる細胞にDNAを形質転換後にVSV-G遺伝子を一時的に発現させている。しかしこの方法でベクター粒子を作成するのは、煩わしく手間がかかり、広く実験用にスケールアップするのが容易でない。最近Yoshidaらはアデノウイルスで遺伝子発現を誘起することによりVSV-G擬態化レトロウイルス収納体を産生した(刊行物31)。テトラサイクリン(tet)で制御可能な発現を利用して、細胞傷害性VSV-Gタンパク質をコードする組替え体アデノウイルスを作成した。三つの組替え体アデノウイルス、すなわち一つはtetプロモーターの制御下でVSV-G遺伝子をコードするもの、次はレトロウイルスgag/pol遺伝子、および三番目はテトラサイクリントランス活性化因子遺伝子をコードするもの、を同時に形質導入することによって安定に形質転換したレトロウイルスゲノムを救済した。この結果VSV-G擬態化レトロウイルスベクターが生産された。これらの系は共に擬態化レトロウイルスを産生するが、共に再現性のある確実なベクターの調製が必要な臨床用途への使用はありそうもない。
【００２２】
レトロウイルスベクターをヒトの遺伝子療法用途に使用するに当たっての別の制約は、それらの生体内半減期が短いことである（刊行物32、33）。この原因の一部は、ヒトおよびヒト以外の霊長類の血清はタイプCレトロウイルスを迅速に不活性化する事実である。ウイルスの不活性化は、古典的な補体経路の活性化に関与する抗体に依存しないメカニズムを経由して生起する。ヒト補体蛋白質Clqは、膜貫通エンベロープタンパク質p15Eとの相互作用によりMLVウイルス粒子に直接結合することが示された(刊行物34)。補体による不活性化の別のメカニズムが示唆されているが、その根拠はネズミ細胞で作成した表面糖タンパク質にはガラクトース-α-(1,3)-ガラクトース糖成分が含まれているという観察事実である(刊行物35)。ヒトおよび他の霊長類ではこの炭水化物部分に対する抗体が巡回している。Rotherと協働者によれば、これら抗炭水化物抗体は補体を固定化することができ、その補体によってヒト血清がネズミのレトロウイルスおよびネズミのレトロウイルス産生細胞を不活性化するに至ると提唱している(刊行物36)。したがって、Takeuchiらが述べているように、ヒト血清中の補体によってレトロウイルスベクターが不活性化したか否かは、このベクターの生産に使用する細胞株により、およびこのウイルスのエンベロープ成分により決定される(刊行物37)。最近、Pensieroらは、ヒト293およびHOS細胞株により、ヒト血清による不活性化に比較的に抵抗性のある両種指向性レトロウイルスベクターが作成されることを実証した (刊行物38)。同様な実験でOryらは、293収納用細胞株中に生産したVSV-G擬態レトロウイルスベクターは、PCRIPLZ細胞(NIH-3T3ネズミを基礎とするプロデューサー細胞株)中に作成され通常使用している両種指向性レトロウイルスベクターに比べてヒト血清による不活性化に対し遥かに抵抗性があることを見いだした(刊行物39)。これらの細胞株を使用し本明細書に記載の系によってレトロウイルスベクターを生産すれば、補体に対する抵抗性を容易に選択することができると推測される。更に生体内で産生したベクターであれば、補体による不活性化の課題を克服すると推測される。
【００２３】
Bilboaと協働者も多重アデノウイルスベクター系を使用しこれを一時的に細胞に形質導入することにより、レトロウイルスの子孫を生産した(刊行物41)。レトロウイルスの骨格（LTR、パッケージング配列、およびレポーター遺伝子）をコードするアデノウイルスベクターおよびトランス活性化レトロウイルス機能体（CMVプロモーター調節性gag、pol、およびenv）の全てをコードする別のアデノウイルスベクターによって、標的実質細胞への遺伝子の生体内運搬が高能率で達成され、その結果それら細胞は一時的なレトロウイルスプロデューサー細胞となった。胸腺欠損マウスにヒト卵巣癌細胞株SKOV3を正常位置に異種移植し、次に当該二つのアデノウイルスベクター系を腹腔内に与えた結果、アデノウイルスの導入が起こると共にレトロウイルス粒子がin situで作成され、これによって標的実質組織の隣接細胞が安定に形質導入されるという概念が証明された。こうした系によって、アデノウイルスベクターを使用すれば標的細胞を一時的にレトロウイルスベクター産生細胞とできる可能性があるという基盤が確立された。しかし再現性のある確実なベクターの調製が必要である臨床用途にこれらの系を簡単に利用できるという見込みはない。理由は生体内で単一の細胞に多重のベクターを導入するのは確実さに欠けるからである。
【００２４】
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルスは単純なDNA含有ウイルスであって、複製効率を完全にするためには他のウイルス(例えばアデノウイルスあるいはヘルペスウイルス)の働きを必要とすることが多い。このウイルス粒子はrep遺伝子とcap遺伝子から構成され、それらの側面には二つの逆方向末端反復配列(ITR)が接している。これらのベクターは細胞ゲノムの中に組み込まれれば安定に遺伝子輸送されることができる。これらベクターは生体外では大規模に生産できることが更なる使用にとっての支障となっている。しかしこれの試みの主要な障害は、rep遺伝子および必要なヘルパーウイルス遺伝子が細胞に対し有毒な効果を有することである。AAVベクターを生産する方法としては、例えばITRに接している治療に係る遺伝子を配送するプラスミドにrep-cap発現カセットおよびヘルパーウイルス遺伝子(ref)を共形質転換する、ITRに接している治療に係る遺伝子をヘルパーウイルス遺伝子と共にrep-capを安定に発現する細胞に共配送する、キメラ型ウイルスベクター、例えばヘルペスウイルスベクターを必要な全ての成分と共に配送する、等が挙げられる。ここには記述しないが、必要な要素を全て単一のプラスミドベクターで配送するのがもう一つの効率的な方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
治療用遺伝子を安全に配送するに当たり、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴要素を利用する方法に関し当分野に不足しているものは、例えば単一のベクターがないことである。本明細書に記載の文献が教示しているように、複数のベクターが必要であるということは、使用する抗生物質がますます多くなるということである。これではますます費用がかかり、またますます多数の細菌株が通常使用している抗生物質に対して耐性を獲得中である状況では更に望ましくない。更に複数のベクターを使用すると効率が減少する。理由は、個々の細胞に必要な形質転換が二以上である場合、それが生起する量は必要な形質転換が一つである場合に比較して統計的に減少するからである。そこで本発明の目標は、長らく充足されていない要請に由来する改良を当分野に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の一実施態様では、核酸配列は、ウイルスベクターを生産するのに必要な全ての要素を含んだプラスミドの形態で存在し、このプラスミドは生体内でウイルスベクターを生産することを意図して生体内に配送される。更にこのベクターを特定の標的組織に指向させるために、複合体分子、例えばポリカチオン、ペプチド、抗体、単鎖抗体あるいはこれらの組み合わせを添加してもよい。
【００２７】
別の実施態様では、核酸配列に複製コンピテントウイルスの産生に必要な配列が含まれており、前記の非ウイルス形態で生体内に配送される。
【００２８】
更に別の実施態様では、全アデノウイルスゲノムを含む核酸配列があり、そのウイルスの調節要素、例えばE1遺伝子は組織関連配列の調節制御の下にある。更に別の実施態様では、転写後または翻訳後の組織効果、例えばイントロンの切除あるいは複合酵素の形成が許容されることによって遺伝子発現が制御されている。
【００２９】
本発明の他の実施態様では、上記した核酸配列およびアデノウイルスベクターを標的とする核酸領域が存在する。
【００３０】
本発明の更なる実施態様では、DNA配列があり、その配列中に、カセットに隣接するレトロウイルス長末端反復フランキング領域が含まれており、そのカセット中に治療に係る核酸領域；gag核酸配列；pol核酸配列；およびエンベロープ遺伝子の機能を果たすことができる配列、例えば両種指向性env配列または水疱性口内炎Gタンパク質(VSV-G)が含まれる。
【００３１】
本発明の他の実施態様では、上記した核酸配列およびアデノウイルスベクターを標的とする核酸領域が存在する。
【００３２】
本発明の更に別の実施態様では、生体内配送用のプラスミド配列が、他の複製コンピテントウイルスまたは条件付けウイルス、例えばピコルナウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、リノウイルス、バクロウイルスに必要な配列から構成される。
【００３３】
更なる実施態様では、上記した配列および自殺核酸領域が存在する。
【００３４】
本発明の特定の実施態様では、トランス活性化因子核酸配列が構造中に置かれ遺伝子発現を調節する。別の特定の実施態様では、トランス活性化因子がテトラサイクリントランス活性化因子である。更なる実施態様では、env核酸配列の発現が誘起可能なプロモーター核酸領域により調節される。他の特定の実施態様では、誘起可能なプロモーター核酸領域が、テトラサイクリン、ガラクトース、グルココルチコイド、Ru487および熱ショックからなる群から選択される刺激体により誘起される。更なる特定の実施態様では、env核酸領域が、両種指向性エンベロープ、異種指向性エンベロープ、同種指向性エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)エンベロープ、ネコ免疫不全ウイルス (ＦIV)エンベロープ、サル免疫不全ウイルス (SIV)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス1(HTLV-1)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス2(HTLV-2)エンベロープ、および水疱性口内炎ウイルス-Gグリコプロテインからなる群から選択される。更に特定の実施態様では、自殺核酸領域が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、酸化還元酵素、シトシン脱アミン酵素、チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk::Tmk)およびデオキシシチジンキナーゼからなる群から選択される。
【００３５】
[034]本発明の一実施態様において、側面がカセットに隣接するレトロウイルス長末端反復フランキング領域を含むプラスミドが存在し、そのカセットには治療に係る核酸領域；gag核酸領域；pol核酸領域；およびenv核酸領域、レトロウイルスベクターを擬態する核酸領域およびレトロウイルスベクターを標的する核酸領域からなる群から選択される核酸領域が含まれる。特定の実施態様では、キメラ型核酸プラスミドに更に自殺核酸が含まれる。別の特定の実施態様では、プラスミドに更にトランス活性化因子核酸領域が含まれ、そのトランス活性化因子核酸領域はenv核酸領域の転写を調節するポリペプチドをコードする。
【００３６】
本発明の別の実施態様では、側面がカセットに隣接するアデノ隋伴ウイルス末端反復フランキング領域を含む核酸ベクターが存在し、そのカセット中に治療に係る核酸領域が含まれており、核酸ベクター中には更にrep核酸領域、cap核酸領域、およびアデノウイルスE1およびE4核酸領域が含まれる。
【００３７】
本発明の特定の実施態様では、envポリペプチドが、両種指向性エンベロープ、異種指向性エンベロープ、同種指向性エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)エンベロープ、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)エンベロープ、ネコ免疫不全ウイルス(ＦIV)エンベロープ、サル免疫不全ウイルス1(SIV)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス1(HTLV-1)エンベロープ、ヒトT細胞白血病ウイルス2(HTLV-2)エンベロープ、および水疱性口内炎ウイルス-Gグリコプロテインからなる群から選択される。
【００３８】
本発明の他の実施態様では、標的組織で相補化されると切除される機能を持った遺伝子が介在することにより機能的な自己スプライシング型イントロンが形成される配列が存在する。他の特定の実施態様では前記細胞が肝細胞である。他の特定の実施態様では、本発明の治療に係る核酸領域が、レポーター領域、ras、myc、raf、erb、src、fins、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p53、p57、p73、C-CAM、APC、 TS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL.-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL.-8、IL-９、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF、G-CSF、チミジンキナーゼ、CD40L、因子VIII、因子IX、CD40、多発性疾患抵抗(MDR）、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、ICAM-1、HER2-neu、PSA、末端トランスフェラーゼ、キャスパーゼ、NOS、VEGF、FGF、bFGF、HIS、熱ショックタンパク質、IFNαおよびγ、TNFαおよびβ、テロメラーゼ、およびインシュリン受容体からなる群から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本明細書で使用する「アデノウイルスの」の語は、アデノウイルスに関連すると定義される。
【００４０】
本明細書で使用する「アデノウイルスの逆方向末端反復フランキング配列」の語は、アデノウイルスのゲノムの５’および３’の両末端に天然に存在し、ウイルスの複製に必要な核酸領域と定義される。
【００４１】
本明細書で使用する「アデノウイルス」の語は、アデノビリダ科のDNAウイルスと定義される。
【００４２】
本明細書で使用する「cap」の語は、アデノ随伴ウイルスの被覆タンパク質に対応する核酸領域と定義される。
【００４３】
本明細書で使用する「カセット」の語は、治療に係るタンパク質、ポリペプチドまたはRNAを発現することができる核酸と定義される。好ましい実施態様では、この核酸は位置的および／または配列的に他の必要な要素と同じ方向に整列することによって複写および必要な場合には翻訳される。他の好ましい実施態様では、治療に係るタンパク質、ポリペプチドまたはRNAは治療、例えば疾患または医療条件の処理の目的用である。
【００４４】
本明細書で使用する「E4」の語は、アデノウイルスに由来し、アデノ随伴ウイルスが利用する核酸領域と定義され、当分野に公知の多数のポリペプチド、例えば核マトリックスに結合するポリペプチドおよびE1Bを含む複合体に関連するポリペプチドをコードする。
【００４５】
本明細書で使用する「env」（エンベロープとも呼ぶ）の語は、ある前駆体ポリペプチドをコードするenv核酸領域と定義され、この前駆体ポリペプチドは開裂して表面糖タンパク質（SU）およびより小さな膜貫通（TM）ポリペプチドを産生する。このSUタンパク質は細胞表面の受容体を認識するための責任を負っており、またTMポリペプチドは複合体をウイルス粒子の外皮に繋留せしめるのに必要である。gagおよびpolとは対照的に、envは標準的なスプライス受容配列を利用することによりスプライスされたサブゲノムRNAから翻訳される。
【００４６】
本明細書で使用する「フランキング」の語は、特定の核酸領域または要素の片側に存在することに言及している。
【００４７】
本明細書で使用する「gag」(基特異的抗原とも呼ばれる)の語は、開裂して３ないし5個のキャプシドタンパク質、例えばマトリクスタンパク質(MA)、キャプシドタンパク質(CA)および核酸結合性タンパク質(NC)を産生する前駆体ポリペプチドをコードするレトロウイルスの核酸領域と定義される。特定の実施態様では、gag核酸領域にはリボソームを整列させるための短い翻訳されたオープンリーディングフレームが多数含まれている。更に特定の実施態様では、細胞表面にあるgagポリペプチド変異体を生産するのに利用される追加の領域が開始コドンの上流のフレームコドンにある。一つの特定の実施態様では、gag核酸領域がpol核酸領域から分子的に分離している。別の特定の実施態様では、gag核酸領域の３’末端にはpolポリペプチドをコードする核酸領域が含まれており、翻訳機構がスリップまたはスタッターしてこれを翻訳すると、先行コドンは失われるが、翻訳はpolをコードする領域に進むことができる。
【００４８】
本明細書で使用する「内部領域」の語は、アデノウイルスまたはアデノ随伴逆方向末端反復フランキング配列またはレトロウイルスの長い末端反復配列の内部に存在する核酸領域と定義される。更なる実施態様では内部領域にもトランス活性化因子核酸領域および／または自殺核酸領域が含まれる。
【００４９】
[047] 本明細書で使用する「治療に係る核酸」の語は、本発明ベクター中の核酸であって、治療目的にあるいは遺伝子治療用ウイルス複製の制御に利用されるものと定義される。特定の実施態様では、この治療に係る核酸の配列は遺伝子または遺伝子の一部である。他の好ましい実施態様では、前記治療に係る核酸はウイルスの調節遺伝子である。特定の実施態様では、この治療に係る核酸の配列は遺伝子または遺伝子の一部である。別の特定の実施態様では、この核酸配列は遺伝子の発現を調節するプロモーター／エンハンサー領域である。好ましい実施例では、該治療に係る核酸はアデノウイルスのE1、E4またはE2遺伝子である。
【００５０】
本明細書で使用する「pol」の語は、逆転写酵素（RT）および組み込みポリペプチド（IN）をコードするレトロウイルスの核酸領域と定義される。特定の実施態様において、polポリペプチドは、gag／polの相関関係にある場合に翻訳機構がgagの３’末端の翻訳の間にスリップした時にのみ翻訳される。
【００５１】
本明細書で使用する「rep」の語は、アデノ随伴ウイルスのための複製核酸領域と定義される。
【００５２】
本明細書で使用する「レトロウイルスの」の語は、レトロウイルスに関連すると定義される。
【００５３】
本明細書で使用する「レトロウイルスの長末端反復フランキング配列」(長い末端反復配列またはLTRとも呼ぶ)の語は、レトロウイルスゲノム中の核酸領域であって、プロウイルスの組み込みおよび発現等の事象に必要なシス作用配列の殆んど全てが含まれているものと定義される。特定の実施態様では、これにはU3領域が含まれており、このU3領域は組み込みに必要な配列を含有し、U5の対応するシグナルのほぼ逆方向のコピーである。更にU3には細胞の転写機構が認識し、転写を最大に調節するのに必要な配列が含まれている。他の共通配列、例えば大多数の真核性プロモーターにとって標準的なシス配列が存在してもよい。別の実施態様では、LTRに含まれるR領域にポリ(A)付加シグナルが含まれてもよい。更なる特定の実施態様では、LTRにU5配列が含まれており、このU5配列は逆転写を受ける開始配列であって、最後はLTRの３’末端となる。U5配列には、逆転写を開始するためのシス配列、組み込み関連配列、およびパッケージング配列が含有されていてもよい。
【００５４】
本明細書で使用する「レトロウイルス」の語は、レトロビリダ科のRNAウイルスと定義される。
【００５５】
本明細書で使用する「自殺核酸領域」の語は、プロドラッグの投与の際に、遺伝子産物が宿主細胞を殺傷する化合物に変移するのを招来する核酸と定義される。使用してもよい自殺の遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ(HSV-tk)とガンシクロビア、アシクロビア、バラシクロビア、ペンシクロビアまたはFIAU；酸化還元酵素とシクロヘキシミド；シトシン脱アミノ酵素と5-フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk：Tmk)とAZT；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノサイドである。
【００５６】
本明細書で使用する「治療用核酸」の語は、遺伝子であってもよい核酸領域であって、疾患、医療条件または微生物の強化すべき特性に対する治療効果がこの領域によって得られるものと定義される。
【００５７】
本明細書で使用する「トランス活性化因子」の語は、核酸の発現を調節するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドあるいは核酸等の生物学的存在と定義される。特定の実施態様では、env核酸の発現がトランス活性化因子により調節される。別の特定の実施態様では、トランス活性化因子がtetトランス活性化因子である。
【００５８】
本明細書で使用する「ベクター」の語は、治療に係る核酸を細胞中に配送するための核酸担体と定義される。ベクターは直線状分子であっても円環状分子であってもよい。
【００５９】
本発明のプラスミドベクターは記述したウイルスベクターに現在付随している各種の危険を必ずしも増大しない。むしろ、プラスミド生産の容易化、プラスミド免疫原生の欠如化、プラスミドによる標的配送の有望化および生体内でのベクター増幅の可能化を招来することができる。また特異な利点が得られる。例えば、形質転換した肝細胞中でレトロウイルス成分を発現すると、免疫系によりこれらは除去される。その結果細胞に空隙ができ、それが刺激となって新たに肝が再生するであろう。その再生により、レトロウイルスを局所的に生産するのに必要な分裂細胞標的が得られると推察される。更にベクターの機能成分を全てコードするベクター構造物は、ベクターを反復して投与する必要を失わせると推察される。
【００６０】
ゲノム構成と複製を含めレトロビリダ、アデノビリダおよびパルボビリダ(例えばアデノ随伴ウイルス) については、当分野に公知の文献、例えばFields Virology(Fieldsら編)に詳細に説明されている。
【００６１】
本明細書で使用する「レトロウイルス」の語は、レトロビリダ科、例えばオンコビリナ亜科、レンチビリナ亜科およびスプマビリナ亜科のRNAウイルスと定義される。当業者は知っていることであるが、オンコビリナ亜科には更に鳥類の白血肉腫のグループがあり、それには例えばラウス肉腫ウイルス(RSV)、鳥類骨髄芽球症ウイルス(AMV)、およびラウス随伴ウイルス(RAV)-1から50が挙げられる。これも当業者は知っていることであるが、オンコビリナ亜科にも、哺乳動物Ｃ型ビールス、例えばモロニー種ネズミ白血病ウイルス(Mo-MLV)、ハーベイ種ネズミ肉腫ウイルス(Ha-MSV)、アベルソン種ネズミ白血病ウイルス(A-MuLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)、モンキー肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス(REV)、および脾臓壊死ウイルス(SNV)が挙げられる。また当業者は知っていることであるが、オンコビリナ亜科には、Ｂ型ビールス、例えばマウスの乳房腫ウイルス(MMTV)、D型ウイルス、例えばメイソンファイザーモンキーウイルス(MPMV)または「SAIDS」ウイルスおよびHTLV-BLVグループ、例えばヒトT細胞白血病(またはリンパ球指向性)ウイルス(HTLV)が挙げられる。また当業者は知っていることであるが、レンチビリナ亜科には、レンチウイルス、例えばヒト免疫不全症ウイルス(HIV-1および-2)、モンキー免疫不全症ウイルス(SIV)、ネコ免疫不全症ウイルス(FIV)、ビスナ／マエジウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス(EIAV)、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス(CAEV)が挙げられる。また当業者は知っていることであるが、スプマビリナ亜科には「泡状」ウイルス、例えばモンキー泡状ウイルス(SFV)が挙げられる。
【００６２】
本明細書で使用する「アデノウイルス」の語は、アデノビリダ科のDNAウイルスと定義される。当業者は知っていることであるが、多数のヒトアデノウイルス（マストアデノウイルスＨ）の免疫タイプは、タイプ１から42（7aを含む）まである。
【００６３】
当業者は知っていることであるが、本発明で使用するアデノ随伴ウイルス(AAV)はパルボビリダ科のディペンドウイルス属に含まれる。AAVのゲノムには145個のヌクレオチドからなる逆方向末端反復配列があり、その最初の125個はパリンドローム配列を形成しており、この配列を更に同定してみると二つの内部パリンドローム配列が含まれていて、その片面には更に大きなパリンドローム配列が連結している。AAVウイルス粒子には三つの被覆タンパク質、VP-1(87,000ダルトン)、VP-2(73,000ダルトン)およびVP-3(62,000ダルトン)が含まれている。VP-1およびVP-3には数種の亜種が含まれていることが判っている。更に三つの被覆タンパク質は比較的に酸性であり、普通のDNA配列または核酸領域によりコードされることが多い。
【００６４】
好ましい実施態様では、AAVで形質転換した細胞は、複製要件を満たすためには、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスにも感染する必要がある。あるいは、当分野で公知の各種化学的または物理的処理を施した細胞株を利用すれば、ヘルパーウイルスによる共同感染をしなくてもAAVの感染は可能である。
【００６５】
一つの実施態様で、治療に係る核酸は治療用薬物をコードする。「治療用」の語は包括的な意味で使用されており、治療薬物、予防薬物、および代替薬物を包含する。治療用薬物は、疾患または医学的状態の少なくとも１の症候を改善または予防すれば、治療用であると考えてよい。本発明のベクターおよび／または方法で治療してもよい遺伝子疾患には、治療用核酸が長期に発現することが望まれるものが挙げられる。それには、例えば、代謝疾患、糖尿病、退行性の疾患、OTC、ADA、SCID不全症、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、嚢胞性繊維症、および酵素欠損疾患が挙げられる。他の実施態様では本発明のベクターおよび／または方法を癌の治療に使用する。
【００６６】
治療用薬物をコードし、ベクター中に含まれてもよいDNA配列には、例えば腫瘍ネクローシス因子(TNF)、例えばTNF-をコードするDNA配列遺伝子；インターフェロン、例えばインターフェロン--、インターフェロン--、インターフェロン--をコードする遺伝子；インターロイキン、例えばIL-1、IL-1-、およびインターロイキン２から14をコードする遺伝子；GM-CSFをコードする遺伝子；オルニチントランスカルバミラーゼ、すなわちOTCをコードする遺伝子；アデノシン脱アミノ酵素、すなわちADAをコードする遺伝子；細胞増殖因子、例えばリンパ球の増殖因子であるリンフォカインをコードする遺伝子；上皮増殖因子(EGF)およびケラチン細胞増殖因子(KGF)をコードする遺伝子；可溶性CD4をコードする遺伝子；第VIII因子；第IX因子；チトクロームｂ；グルコセレブロシダーゼ；T細胞受容体；LDL受容体、アポE、アポC、アポAIおよびコレステロールの輸送および代謝に関連する他の遺伝子；アルファ−1アンチトリプシン(-1AT)遺伝子；インシュリン遺伝子；ヒポキサンチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；負の選択マーカー、すなわちウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の「自殺」遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルス ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、およびバリセラゾスターウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；抗体の抗原結合性領域のためのFc受容体、ウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列、例えば肝炎または非A非Bウイルスの複製を阻害するアンチセンス配列；アンチセンスc-mybオリゴヌクレオチド；および酸化防止剤、例えば超酸化マンガンディスミュターゼ(Mn-SOD)、カタラーゼ、超酸化銅亜鉛ディスミュターゼ(CuZn-SOD)、細胞外超酸化物ディスミュターゼ(EC-SOD)、およびグルタチオン還元酵素、ただしこれらに限定されない；組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)；尿プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ）；ヒルジン；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子；一酸化窒素シンセターゼ；バソアクティブペプチド；アンギオゲンペプチド；ドーパミン遺伝子；ジストロフィン遺伝子；-−グロビン遺伝子；-−グロビン遺伝子；HbA遺伝子；原癌遺伝子、例えばras、src、およびbcl遺伝子；腫瘍抑制遺伝子、例えばp53およびRb；LDL受容体；乳癌、卵巣癌、胃癌および子宮内膜癌の治療のためのヘレグリン−-タンパク質遺伝子；T細胞抗原受容体の-−鎖内に含まれるエピトープに特異的なモノクロナール抗体；多剤耐性(MDR)遺伝子；リボザイムをコードするDNA配列；アンチセンスポリヌクレオチド；血圧変換酵素、血管平滑筋カルシウムチャネルまたはアドレナリン受容体の競合的阻害剤として作用する分泌系ペプチドをコードする遺伝子、および中枢神経系内のアミロイドプラックを分解する酵素をコードするDNA配列、が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲は特定の治療用薬物に限定されないことを了解しなければならない。
【００６７】
特定の実施態様では、治療用核酸を使用することにより、それの生産物(ポリペプチドまたはRNA)が微生物の体内を循環するであろう。すなわち、治療用生産物は、細胞内に内在する欠陥コピーを代置または修復するのではなく、微生物を細胞レベルで強化または増大する。これにはEPO、抗体、GM-CSF，増殖ホルモン等が挙げられる。
【００６８】
治療用薬物をコードする核酸(またはトランスジーン)は、ゲノムDNAでもよく、またはcDNAでもよく、あるいはそれらの断片および誘導体でもよい。また核酸は天然のDNA配列またはそれのアレル変異体であってもよい。本明細書で使用する「アレル変異体」の語は、そのアレル変異体とは天然DNA配列の別の形態であって、天然DNA配列において１以上のヌクレオチドが置換、削除または付加しているが、それによってコードされたタンパク質またはポリペプチドあるいはそれらの断片または誘導体の機能には実質的な変化が生じていないことを意味する。一つの実施態様において、DNA配列には更にリーダー配列またはその部分、分泌シグナルまたはその部分が含まれてよくおよび／または更にトレーラー配列またはその部分が含まれていてよい。
【００６９】
少なくとも１の治療用薬物をコードするDNA配列は適切なプロモーターの制御下にある。採用してもよい適切なプロモーターには、限定はされないが、アデノウイルスのプロモーター、例えばアデノウイルスの主要な後期プロモーター；または異族のプロモーター、例えばサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター；ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター；誘起可能なプロモーター、例えばMMRプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター、およびアポAIプロモーター、が挙げられる。しかし本発明の範囲は特定の外来遺伝子またはプロモーターに限定されないことを了解しなくてはならない。
【００７０】
アデノウイルスの第一ポリヌクレオチド、第二ポリヌクレオチド、およびアデノウイルスベクターの複製とパッケージングのためのタンパク質をコードするDNAの各成分はどのようなアデノウイルスの血清型から得てもよく、例えばアデノウイルス２、アデノウイルス３、アデノウイルス４、アデノウイルス５、アデノウイルス12、アデノウイルス40、アデノウイルス41、およびウシアデノウイルス３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
一つの実施態様では、アデノウイルスの第一ポリヌクレオチド成分はアデノウイルス５から得られまたは誘導され、およびアデノウイルスの第二ポリヌクレオチド成分ならびにアデノウイルスベクターの複製とパッケージングに必要なDNA配列は、アデノウイルス５(ATCC番号VR-5)ゲノムまたはアデノウイルス5E3変異体Ad d1327（Thimmapaya, et al,Cell, Vol.31, pg.543(1983)）から得られまたは誘導される。
【００７２】
感染性アデノウイルスベクターによって感染されてもよい細胞には、主要な細胞、例えば、主要な核化血液細胞、例えば白血球、顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球(例えばTリンパ球およびBリンパ球)、全能性の幹細胞および腫瘍に浸潤性のリンパ球(TIL 細胞)；骨髄細胞；内皮細胞、活性化された内皮細胞；上皮細胞；肺細胞；ケラチン細胞；幹細胞；肝細胞、例えば肝前駆体細胞、繊維芽細胞；間葉細胞；中皮細胞；実質細胞；血管平滑筋細胞；脳細胞および他の神経細胞；消化管腸細胞；腸幹細胞；筋芽細胞および全ての腫瘍細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
感染を受けた細胞は各種疾患の治療に有用であり、その疾患には、例えばアデノシン脱アミン酵素欠損症、シックル細胞貧血、サラセミア、血友病Ａ，血友病Ｂ，糖尿病、A1−アンチトリプシン欠損症、脳疾患、例えばアルツハイマー病、フェニルケトン尿症、および他の疾患、例えば成長疾患および心臓疾患、例えばコレステロール代謝経路の変化および免疫系の不全が原因の疾患、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
一つの実施態様では、アデノウイルスベクターを使用して肺細胞を感染するが、そのアデノウイルスベクターにはCFTR遺伝子が含まれてもよく、これは嚢胞性繊維症の治療に有用である。別の実施態様ではアデノウイルスベクターに、肺表面活性剤タンパク質、例えばSP-A、SP-B、あるいはSP-Cをコードする遺伝子が含まれてよく、このアデノウイルスベクターを採用することによって肺表面活性剤タンパク質欠損の状態を治療する。
【００７５】
別の実施態様では、生産したアデノウイルスベクターを使用して肝細胞を感染するが、そのアデノウイルスベクターには凝固因子、例えば第VIII因子および第IX因子をコードする遺伝子が含まれていてよく、これはそれぞれ血友病Ａおよび血友病Ｂの治療に有用である。
【００７６】
別の実施態様では、アデノウイルスベクターを使用して肝細胞を感染するが、そのアデノウイルスベクターには後天的または遺伝的な肝細胞機能不全症の予防および治療に有用なポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が含まれていてよい。例えば、それらを使用することによって、低密度脂質タンパク質(LDL)受容体の遺伝的欠損またはオルニチントランスカルバミラーゼ欠損を矯正することができる。
【００７７】
別の実施態様では、アデノウイルスベクターを使用して肝細胞を感染するが、そのアデノウイルスベクターには後天的な感染疾患、例えばウイルス感染に由来する疾患の治療に使用する治療薬物をコードする遺伝子が含まれている。例えば、その感染性アデノウイルスベクターを使用することによって、ウイルス性肝炎、特にB型肝炎または非A非B型肝炎を治療することができる。例えば、感染性のアデノウイルスベクターにアンチセンス遺伝子をコードする遺伝子を含有させ、これを使用して肝細胞を感染すればウイルスの複製を阻害することが可能であろう。この場合に、この感染性アデノウイルスベクターに肝炎の構造遺伝子を逆ないし反対方向に含有させ、これを肝細胞中に導入すれば、結果的には感染肝細胞にアンチセンス遺伝子が生産され、これによって感染ウイルスまたはそれのRNA転写を不活性化することができるであろう。あるいは、例えば、＿−インターフェロン等のタンパク質をコードする遺伝子を含む感染性のアデノウイルスベクターで肝細胞を感染してもよく、これによって肝炎ウイルスに対する耐性が獲得され得る。
【００７８】
他の実施態様では、アデノウイルスベクターに治療薬物をコードする少なくとも１のDNA配列を含有させ、これを動物に投与することによって、その動物を疾病疾患およびその治療法を研究するモデルとして使用することができる。例えば、アデノウイルスベクターにある治療薬物をコードするDNA配列を含有させ、その治療薬物を欠いている動物に投与すればよい。その治療薬物をコードするDNA配列を含有するベクターを投与した後にその動物において前記治療薬物が発現するか否かを評価する。その研究の結果から、その治療薬物の欠損に伴う疾病疾患の治療のためにはそのアデノウイルスベクターをヒト患者にどのように投与すればよいかが決定されよう。
【００７９】
別の実施態様では、アデノウイルスベクターを使用して真核細胞を生体外で感染させてよい。この真核細胞は本明細書で前記したものでよい。その真核細胞の有効量を遺伝子治療操作の一部として宿主に投与し、治療的効果を宿主において獲得してよい。あるいはまた、所望のタンパク質または治療薬物をコードする遺伝子をベクターに含有させ、これを使用して所望の細胞株を生体外で感染させ、感染細胞に所望のタンパク質または治療薬物を生体外で生産させてもよい。
【００８０】
また本発明を使用して、各種アデノウイルスを基礎としたキャプシド構造に擬態化可能なアデノウイルスベクターを開発してもよい。すなわち、本発明により作成したアデノウイルスベクターを使用すれば、ヒトが既存の抗体を持たない、あるいは殆んど持っていない各種キャプシドを有するアデノウイルスベクターを作成することができる。例えば、アデノウイルス５から得たITRおよびパッケージングシグナルを有するプラスミド、およびアデノウイルス５から得たアデノウイルス成分を含むヘルパーウイルスから、本発明によりアデノウイルスベクターを作成し得る。この作成したウイルスベクターにはアデノウイルス５のキャプシドを持つであろう。しかし、アデノウイルス５は普通の風邪に随伴しているので、抗アデノウイルス５抗体が存在するヒトは多い。したがって、このアデノウイルスベクターに対する免疫応答の発生の可能性を減らすために、アデノウイルス５のキャプシドを有するアデノウイルスベクターを本発明方法により作成した場合には、このベクターを、アデノウイルス５以外のウイルス、例えばアデノウイルス４、アデノウイルス12、あるいはウシアデノウイルス3またはこれらの誘導体であるヘルパーウイルスを含むアデノウイルスパッケージング細胞株の中に形質転換するのがよい。こうすれば、アデノウイルス５のキャプシドではないキャプシドを有する新しいアデノウイルスベクターが作成され、従って、このベクターは免疫応答によって不活性化される恐れは少ない。あるいはまた、このベクターを、変異したアデノウイルスヘクソンをコードするDNAを有するヘルパーウイルスを含むアデノウイルスパッケージング細胞株の中に形質転換するのがよい。それにより新しいアデノウイルスベクターが作成され、これは変異したアデノウイルス５キャプシドを有しているので、抗アデノウイルス５抗体によっては認識されない。しかしこの実施例は具体的な擬態化アデノウイルスに限定されないことを了解しなければならい。
【００８１】
特定の実施態様で、gag/pol核酸領域においてpolポリペプチドの翻訳は、翻訳機構がgagを翻訳する際にスリップした場合にのみ可能である。しかし、当業者は判ることであるが、本発明の特定の実施態様においてpolをコードする核酸をgagをコードする核酸から分離してよく、それによりpolをコードする核酸はgag翻訳の必要要件から解放される。
【００８２】
細胞およびプラスミドの寄託に関して当業者は了知している。The American Type Culture Collection（http://phage.atcc.org/searchengine/all.html）には本明細書で使用した細胞および他の生物学的実物が包含されており、本発明方法で同等に機能する筈である他の細胞株を同定する手段をおそらく知っている。HEK293細胞は認識番号ATCC 45504により、またC3細胞は認識番号ATCC CRL-10741によりATCCにて入手してよい。本明細書に記述のHcpG2細胞はATCC HB-8065で入手される。本発明のベクターにおいて使用してよいアデノウイルスゲノムの多くには、The American Type Culture Collectionから入手可能なものがあり、アデノウイルス１型(ATCC VR-1)、アデノウイルス２型(ATCC CR-846)、アデノウイルス３型(ATCC VR-3またはATCC VR-847)、アデノウイルス５型(ATCC VR-5)等である。
【００８３】
具体的な一実施態様では、本発明ベクターを癌治療の遺伝子療法に使用している。この実施態様の一態様では、遺伝子療法が、ras、myc、raf、erb、src、fms、jun、trk、ret、gsp、hst、bcl abl、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p53、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL.-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL.-8、IL-９、IL-10、IL-11、IL-12、GM-CSF G-CSFおよびチミジンキナーゼからなる群から選択された核酸配列に向けられている。当業者は知っていることであるが、これらの配列および前記のごとく本発明で使用してよい任意の他の配列は、核酸配列寄託機関、例えばオンラインにおいてで利用可能なGenBankをサーチすることにより容易に入手することができる。
【００８４】
核酸を基礎とする発現系
1. ベクター
「ベクター」の語を使用した場合にこれは担体分子であって、これに核酸配列を挿入して細胞に導入し、その核酸配列を細胞にて複製可能にするものを指称する。好ましい実施態様ではこの担体分子は核酸である。核酸配列は外来性であってよい。このことは、その核酸配列はベクターを導入している細胞にとっては外来であること、あるいはその核酸配列は細胞中の配列と同族であるが、それが存在している宿主核酸内の位置が通常と違っていることを意味する。ベクターは当業者が修練をうければ標準的な組換え技術により構成されと思われ、その技術はManiatis et al., 1988 および Ausubel et al.,1994に記述されており、共に引用により本明細書に取り込む。
【００８５】
「発現ベクター」の語は、遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含み、転写可能なベクターを指称する。場合によっては、RNA分子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合には、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの生産においてはこれらの配列は翻訳されない。発現ベクターには各種の「制御配列」を含めることができるが、この語は、有効に結合させたコード用配列を特定の宿主微生物内で転写および翻訳するのに必要な核酸配列を指称する。制御は転写前、転写中、転写後または翻訳後であってよい。具体的には、調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー、イントロンあるいは分割「ターゲザイム」イントロンが含有されて発現を調節してもよい。転写および翻訳を支配する制御配列の他に、ベクターおよび発現ベクターには後記するような他の機能を果たす核酸配列も含有されてよい。
【００８６】
ａ．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、制御配列であって、核酸配列の一領域を言い、その領域で転写の開始および速度が制御される。配列は、調節的なタンパク質および分子が結合してもよい、例えばRNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような遺伝子的要素を含んでもよい。「有効に設置させた」、「有効に結合させた」、「制御下」および「転写制御下」の句は、プロモーターの核酸配列に関する位置および／または配列が正しく機能的であり、そのプロモーターにより配列の転写開始および／または発現が制御されることを意味する。プロモーターの使用は「エンハンサー」との組み合わせであってもなくてもよく、この語はシス活性化性制御配列を指称し、核酸配列の転写活性化に関与する。
【００８７】
プロモーターは遺伝子または配列に天然に随伴しているものであってもよく、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’-非コード配列を単離して入手してもよい。そのようなプロモーターは「内来性」と指称することができる。同様に、エンハンサーは核酸配列に天然に随伴しているものであってもよく、それは配列の下流か上流に位置している。あるいはまた、組替え体または異種プロモーター、すなわち天然環境で通常は核酸配列に随伴していないプロモーターと指称されるものの制御下にコード用核酸配列を配置すると、ある種の利点が得られる。組替え体または異種エンハンサーも天然環境で通常は核酸配列に随伴していないエンハンサーと指称される。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核性、ウイルス性、真核性細胞から単離したプロモーターまたはエンハンサー、および「天然起源」でないプロモーターまたはエンハンサーが含まれてもよく、すなわち転写調節領域の異なる別の要素および／または発現が変わる変異体が含有されてもよい。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に製造する以外に、組替え体のクローニングおよび／または核酸増幅技術、例えばPCR(商標)を利用し本明細書に開示の組成物と組み合わせて配列を生産する（米国特許4,683,202、 米国特許5,928,906参照、それぞれ引用により本明細書に取り込む）。更には、非核性オルガネラ、例えばミトコンドリア、クロロプラスト等の中で配列を転写および／または発現させる制御配列が同様に利用できる、ということが考えられる。
【００８８】
本発明の実施態様では、二方向性プロモーター、例えばBarski et al. (1999)が記述しているアルデヒド還元酵素プロモーターを含むベクターがあり、このベクターでは同一の調節配列から二つの遺伝子産物(RNAまたはポリペプチド)が転写されている。これにより、二つの遺伝子産物が化学量論的に比較的等しい量で生産される。
【００８９】
発現のために選定した細胞、オルガネラおよび微生物中でDNAセグメントを効果的に発現させるプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは当然重要である。分子生物学の分野の専門者は一般にタンパク質発現のためにプロモーター、エンハンサーと細胞型の組み合わせをどのように使用するかを了知しており、例えばSambrook et al. (1989)が参照され、引用により本明細書に取り込む。使用するプロモーターは、導入したDNAセグメントを高レベルで発現させるもの、例えば組替え体タンパク質および／またはペプチドを大規模に生産するのに有利なものであれば、構造成分、組織特異的、誘起可能、およびまたは適切な条件下で有用であってよい。プロモーターは外来性であっても内来性であってもよい。
【００９０】
表３には、本発明において、遺伝子発現を調節するために採用してよい数種の要素／プロモーターがリストされている。このリストは、発現の促進に関与する全ての可能な要素を網羅することを意図しておらず、単にこれらの例示である。表４には誘起可能な要素の例が提示されており、それらは特定の刺激に応答して活性化が可能な核酸配列領域である。
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【００９１】
組織特異的プロモーターまたは要素の同定ならびにそれらの活性の特性分析は当業者に周知である。そのような領域の例には、例えば、ヒト LIMK2 遺伝子 (Nomoto et al. 1999), ソマトスタチン受容体２遺伝子 (Kraus et al., 1998), ネズミ副睾丸レチノイン酸結合性遺伝子 (Lareyre et al., 1999), ヒトのCD4 (Zhao-Emonet et al., 1998), マウスのアルファ2 (XI)コラーゲン(Tsumaki, et al., 1998), D1A ドーパミン受容体遺伝子(Lee, et al., 1997), インシュリン様成長因子II (Wu et al., 1997), ヒト血小板内皮細胞付着分子-1 (Almendro et a1., 1996)が挙げられる。
【００９２】
ｂ．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
コード配列を効果的に翻訳するためには特別の開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルにはATG開始コドンまたは隣接配列が含まれている。外来の翻訳制御シグナル、例えばATG開始コドンは用意する必要があり得る。当業者であれば容易にこれを決定し、その必要なシグナルを用意することができよう。全挿入配列を確実に翻訳するためには、この開始コドンは所望のコード配列の読み枠の「枠内」に存在する必要があるのは周知である。外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成で可能である。適切な転写エンハンサー要素を含ませることによって、発現の効率を高めてもよい。
【００９３】
本発明のある実施態様では、内部リボソーム結合部位(IRES)要素を利用して多重遺伝子ないしポリシストロン性mRNAを作成している。IRES要素によれば、翻訳は５＿メチル化キャップ依存性翻訳機構のリボソーム走査モデルを回避してmRNAの内部部位から開始可能となる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。ピコルナウイルス科の二つのウイルス(ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス)由来のIRES要素は記述があり（PelletierおよびSonnenberg, 1988）、哺乳動物のmRNA由来IRESも同様である（MacejakおよびSarnow, 1991）。IRES要素は外来のオープンリーディングフレームに結合することができる。多重オープンリーディングフレームは一緒に転写されるが、それぞれIRESによって分離されてポリシストロン性mRNAを作成することができる。IRES要素のおかげで、各オープンリーディングフレームは個別にリボソームに接近し効果的な転写が可能となる。単一のプロモーター／エンハンサーを使用して多重遺伝子を発現すれば効果的に単一のmRNAを転写することができる（米国特許 5,925,565 および 5,935,819参照、引用により本明細書に取り込む）。
【００９４】
ｃ．マルチプルクローン化部位
ベクターにマルチプルクローン化部位(MCS)を含有でき、この核酸領域には多数の制限酵素部位があり、その中のいずれかを標準的な組換え技術と共に利用すると、そのベクターを消化することができる（Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998, および Cocea, 1997参照、引用により本明細書に取り込む）。「制限酵素消化」とは、核酸分子の特定部位にのみ作用する酵素をもって核酸分子を触媒的に開裂することを言う。これら制限酵素の多くは市販品として入手可能である。このような酵素の使用は広く当業者が了知している。しばしば、MSC内を切断する制限酵素を使用してベクターを線状化または断片化すれば、外来性の配列をそのベクターに連結することが可能である。「連結」とは、二つの核酸断片の間にリン酸ジエステル結合を形成するプロセスを言い、二つの核酸断片は相互に隣接性があってもなくてもよい。制限酵素および連結反応に関する技術は組替え体技術の当業者に周知である。
【００９５】
ｄ．スプライス部位
転写された真核性RNA分子は大部分がRNAスプライシングを受け、その結果イントロンが最初の転写配列から除去される。ベクター中にゲノムの真核性配列が含まれている場合、タンパク質発現のための転写のプロセスを確実に適切とするためには、スプライシングの供与および／または受容部位を必要とし得る（Chandler at al., 1997、引用により本明細書に取り込む）。更にスプライス領域、例えばテトラヒメナ属のイントロン１の機能領域1および２は、分離処理が容易であることが証明されている。これらイントロンの機能領域も展開可能なので、既存の細胞RNAを使用して、機能的なRNA自己スプライシング複合体を形成することができる。このようなアプローチは、組織指向性遺伝子の発現と制御に使用することができる。
【００９６】
ｅ．ポリアデニル化シグナル
一般に、発現の中にポリアデニル化シグナルが含まれると、転写物のポリアデニル化が適切に行われる。ポリアデニル化シグナルの性質が本発明実施の成功に重要であるとは考えられず、および／またはそのような配列は使用してもよい。好ましい実施態様ではSV40ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが便利よく使用され、および／または各種標的細胞で良好に機能していることが判った。転写終了部位も発現カセットの要素と考えられる。これらの要素の助けにより、mRNAのレベルが増加しおよび／またはカセットから他の配列への読み過ごしが最小に抑えられる。
【００９７】
ｆ．複製起点
ベクターを宿主細胞中で増殖するには、ベクター中に複製部位の１以上の起点（しばしば「オリ」と呼ばれる）が含まれているのがよく、この特別な核酸配列の場所から複製が開始される。
【００９８】
ｇ．選択可能およびスクリーンニング可能なマーカー
本発明のある実施態様で細胞中に本発明核酸構造が含まれている場合に、細胞を生体外または生体内で同定するにはその発現ベクター中にマーカーを含めるのがよい。そのようなマーカーによって同定可能な変化が細胞に付与されれば、そのベクターを含む細胞は簡単に同定できるであろう。一般に選択可能なマーカーでは、それによって付与される特性が選択を可能にする。正の選択可能マーカーでは、そのマーカーが存在することによって選択が可能になるが、一方負の選択可能マーカーでは、そのマーカーが存在することによって選択が防止される。正の選択可能マーカーの例は薬物耐性マーカーである。
【００９９】
一般に薬物選択性マーカーが含有されると形質転換体のクローニングおよび同定は容易になる。例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールへの耐性を付与する遺伝子は有用な選択可能マーカーである。マーカーには、表現型付与型マーカー、すなわち形質転換体が条件を満たすか否かを基礎にしてそれの識別を可能にするもの以外に、スクリーニング可能なマーカー、例えばGFPを含有し、比色分析を基礎とする別の型のマーカーも考えられる。あるいはまたスクリーニング可能な酵素、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(tk)あるいはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を利用するのもよい。当業者であれば、免疫マーカーをFACS分析との可能な組み合わせてどのように利用したらよいかを了知しているであろう。マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、どのようなマーカーを使用するかは重要でないと考えられる。選択可能およびスクリーンニング可能なマーカーの更なる例は当業者に周知である。
【０１００】
2. 宿主細胞
本明細書で使用する「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」の語は、互換可能に使用してよい。これらの語には全てそれらの子孫も包含されており、それは後続の全ての世代に及ぶ。変異が緩徐にあるいは偶然に起こるので子孫が全て同一ではないかもしれないことは了解される。異種性核酸配列を発現する際に、「宿主細胞」は原核性または真核性細胞を言い、それには形質転換可能な微生物であって、ベクターの複製および／またはベクターがコードする異種性遺伝子の発現が可能なものが包含される。宿主細胞はベクターの受容体として使用でき、また使用されている。宿主細胞は「形質導入され」あるいは「形質転換され」てよく、これらの語は外来性核酸が宿主細胞の中に搬入または導入されるプロセスを言う。
【０１０１】
宿主細胞は、所望する結果がベクターの複製であるのかあるいはベクターがコードする核酸配列の部分または全部の発現であるのかに応じて、原核細胞または真核細胞から誘導すればよい。多数の細胞株および培養物が宿主細胞としての使用に入手可能であり、それらはAmerican Type Culture Collection (ATCC)、すなわち生きている培養物および遺伝子材料のアーカイブとしてサービスする機関を介して入手することができる（www.atcc.org）。当業者は、適切な宿主をベクターの骨格および所望する結果に基づいて決定することができる。例えば、多数のベクターを複製するには、プラスミドまたはコスミドを原核細胞宿主に導入することができる。ベクターの複製および／または発現に宿主細胞として使用されるバクテリア細胞には、DH5α、JM109、およびKC8、ならびに市販品として入手可能な多数のバクテリア宿主、例えばSURE (登録商標) Competent Cells および SOLOPACK(商標)Gold Cells (STRATAGENE (登録商標)，La Jolla)が挙げられる。あるいはまた、バクテリア細胞、例えばE.coli LE392をファージウイルス用の宿主細胞として使用することができる。
【０１０２】
ベクターの複製および／または発現用の真核性宿主細胞の例には、HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, および PC12.が挙げられる。各種細胞型および微生物由来で入手可能な宿主細胞は多数あり、それらは当業者に既知であろう。ウイルスベクターを真核性または原核性の宿主細胞、とくにそのベクターの複製または発現に許容的な宿主細胞と組み合わせて使用するとよい。
【０１０３】
あるベクターでは、そのベクターを原核性および真核性の両方の細胞で複製および／または発現可能にする制御配列が利用されるのがよい。更に当業者は、上記宿主細胞の全てをインキュベートし、維持し、ベクターの複製を可能にするための条件を理解しているであろう。ベクターの大量生産、ならびにベクターがコードする核酸およびその系統のポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産を可能にするであろう技術および条件も理解されており、知られている。
【０１０４】
3. 発現系
以上説明した組成物の少なくとも１部または全部を包含する発現系は多数存在する。原核細胞および／または真核細胞を基礎とする系を本発明との使用に採用すれば、核酸配列またはその系統のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを生産することができる。市販品として広く入手可能なこのような系は多数ある。
【０１０５】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は、異種性核酸配列の発現によりタンパク質を高レベルで生産することができ、この系は例えば米国特許 5,871,986, 4,879,236に記載されており、共に引用により本明細書に取り込み、および例えば、INVITROGEN (登録商標)からMAXBAC (登録商標) 2.0 およびBacPack (商標) BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEM FROM CLONTECH (登録商標)の名称で購入することができる。
【０１０６】
発現系の他の例には、合成エクディゾーン誘起性受容体を含むSTRATA GENE (登録商標)の COMPLETE CONTROL (商標) Inducible Mammalian Expression System、あるいは大腸菌発現系であるpET Expression Systemが挙げられる。誘起可能な発現系の別の例は、INVITROGEN (登録商標)から入手可能であり、これにはT-REX(商標)(テトラサイクリン調節性発現)系が担持されている。この系は誘起可能な哺乳動物発現系であり、全長のCMVプロモーターが利用されている。INVITROGEN(登録商標)もPichia methanolica発現系と呼ばれる酵母発現系を提供しており、これは組替え体タンパク質をメチル指向性酵母Pichia methanolica中で高レベルに生産するように設計されている。当業者は、ベクター、例えば発現構造体を発現して核酸配列またはその系統のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを生産する方法を知っているであろう。
【０１０７】
Ｃ．核酸の検出
本明細書に開示の核酸配列には、治療に係る核酸由来のポリペプチド、例えばタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを発現する用途以外に各種の他の用途がある。例えば、核酸ハイブリダイゼーションが関与する実施態様でプローブまたはプライマーとしての利用がある。
【０１０８】
1. ハイブリダイゼーション
長さが13〜100ヌクレオチド、好ましくは17〜100ヌクレオチド、本発明のある態様では長さが１〜2キロ塩基以上のプローブまたはプライマーを使用すると、安定で選択性のある二本鎖分子が形成される。相補配列を隣接のまま伸張すると長さが20塩基を超える分子が一般に好ましく、それによって得られるハイブリッド分子の安定性および／または選択性は上昇する。一般に、ハイブリダイゼーション用の核酸分子は、20〜30ヌクレオチドあるいは所望ならば更に長いヌクレオチドの１以上の相補配列を有するようにデザインするのが好ましい。そのような断片は、例えば化学的手段により直接合成することによって、あるいは選択した配列を組替え体生産用の組替え体ベクターに導入することによって簡単に調製し得る。
【０１０９】
したがって、本発明ヌクレオチド配列、またはその断片または誘導体を使用すれば、DNAおよび／またはRNAの相補鎖を持つ二本鎖分子を選択的に形成することができ、あるいはサンプル由来のDNAまたはRNAを増幅するためのプライマーが得られる。どのような適用を目論むかに応じて、ハイブリダイゼーションの条件を変化し、それによって標的配列に対するプローブまたはプライマーの選択性の程度を変化させるのが望ましいであろう。
【０１１０】
高い選択性を必要とする適用の場合には、一般に緊縮度の比較的高い条件を採択してハイブリッドを形成するのが望ましい。例えば、比較的に塩濃度は低く、および／または温度は高い条件、例えば約0.02M〜約0.10Mの塩化ナトリウムで温度は約50℃〜約70℃により得られる。このように緊縮度の高い条件であれば、プローブまたはプライマーとテンプレートまたは標的の鎖との間のミスマッチは、たとえあるとしても容認可能な程度に小さくなり、特に特定の遺伝子を単離しあるいは特定のmRNA転写物を検出するには適切な条件である。追加するフォルムアミドの量を増加することによって条件をいっそう緊縮化できるというのが一般的な評価である。
【０１１１】
ある種の用途、例えば部位指向性突然変異の場合には、緊縮度が低い条件の方が好ましいと評価される。このような条件下では、ハイブリダイズする鎖の配列がたとえ完全に相補的ではなく、１以上の位置でミスマッチであっても、ハイブリダイゼーションは起こり得る。条件の緊縮度を少なくするために、塩濃度を増し、および／または温度を低下させてもよい。例えば中程度の緊縮度条件は、約0.1〜0.25M塩化ナトリウム、温度約37℃〜55℃によって得られ、他方低い緊縮度条件は約0.15M〜約0.9M塩、温度範囲約20℃〜約55℃によって得られるであろう。ハイブリダイゼーション条件は所望する結果に応じて簡単に変えることができる。
【０１１２】
他の実施態様では、ハイブリダイゼーションを達成する条件を、例えば、50mMトリス塩酸（pH8.3）、75mM塩化カルシウム、3mM塩化マグネシウム、1.0mMジチオスレイトール、温度およそ20℃〜約37℃としてよい。使用する他のハイブリダイゼーション条件としては、およそ10mMトリス塩酸（pH8.3）、50mM塩化カルシウム、1.5mM塩化マグネシウム、温度範囲およそ40℃〜約72℃が挙げられよう。
【０１１３】
ある実施態様では、本発明の一定配列の核酸を適当な手段、例えば標識と組み合わせて使用するとハイブリダイゼーションを決定するのに有利である。適切な標示手段は広く多様に当分野で既知であり、例えば蛍光、放射活性、酵素あるいはアビジン／ビオチン等のリガンドが挙げられ、これらは検出可能である。好ましい実施態様では、放射活性その他環境上望ましくない試薬は使用せず、代わりに蛍光ラベルあるいは酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリフォスファターゼまたはペルオキシダーゼを使用するのが望ましい。酵素タグの場合には、既知の比色分析用指示薬基質を使用すれば、視覚的または分光分析的に検出可能な検出手段が得られるので、サンプルを含んでいる相補的な核酸との特異的なハイブリダイゼーションを同定することができる。
【０１１４】
一般に、本明細書に記載のプローブまたはプライマーは、対応遺伝子の発現を検出するための溶液ハイブリダイゼーション、例えばPCR(商標)において、ならびに固相を利用する実施態様において試薬として有用である。固相を含む実施態様では、テストDNA(またはRNA)を選定したマトリックスまたは表面に吸着または固定する。次にこの固定した一本鎖核酸に選定したプローブを所望の条件下でハイブリダイゼーションする。条件は特定の環境に応じて(例えば、G＋C含量、標的核酸のタイプ、核酸の起源、ハイブリダイゼーション用プローブのサイズに応じて)選定する。治療に係る特定用途に対してハイブリダイゼーション条件を最適化するのは当業者には周知である。ハイブリッドした分子を洗浄して非特異的に結合したプローブ分子を除去した後に、結合した標識量を測定してハイブリダイゼーションを検出および／または定量する。代表的な固相ハイブリダイゼーション法は米国特許5,843,663, 5,900,481 および 5,919,626に記載されている。本発明の実施に使用してもよい他のハイブリダイゼーション法は、米国特許 5,849,481, 5,849,486 および 5,851,772に記載されている。本明細書のこの節で特定したこれら参照文献の関連部分は、引用により本明細書に取り込む。
【０１１５】
2. 核酸の増幅
増幅用テンプレートとして使用する核酸は、細胞、組織または他のサンプルから標準的な方法（Sambrook et al., 1989）に従って単離すればよい。ある実施態様では、全細胞または組織ホモジネートまたは生物学的液体サンプルについて、核酸テンプレートをほぼ精製することなしに分析を行う。その核酸はゲノムDNAであっても、あるいは分画されていても、あるいは全細胞RNAであってもよい。RNAを使用する場合には最初にそのRNAを相補的なDNAに変換するのが望ましいであろう。
【０１１６】
本明細書で使用する「プライマー」の語は、テンプレートに依存するプロセスにおいて最初の核酸の合成を手引きすることができる核酸は全て包含することを意図する。一般にプライマーは、長さが10から20および／または30塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、これより長い配列を採用することができる。用意するプライマーの形態は二本鎖でも、およびまたは一本鎖でもよいが、一本鎖の形態が好ましい。
【０１１７】
治療に係るベクターまたは核酸の配列に対応する核酸に選択的にハイブリッドするようにデザインしたプライマー対を、選択的なハイブリダイゼーションが可能となる条件下で核酸テンプレートに接触させる。所望の用途に応じて、プライマーに完全に相補的な配列にのみハイブリダイゼーションが可能となる緊縮度の高いハイブリダイゼーション条件を選定してよい。他の実施態様では、プライマー配列とのミスマッチが１以上含まれる核酸の増幅を許容するように、緊縮度を減少してハイブリダイゼーションを生起させてもよい。いったんハイブリダイズすると、テンプレートとプライマーの複合体は１以上の酵素に接触し、その酵素によってテンプレートに依存する核酸合成が促進される。「サイクル」とも指称されるが、十分な量の増幅体が得られるまで、増幅が複数ラウンド繰り返される。
【０１１８】
増幅体を検出または定量し得る。ある用途では検出を視覚手段により行ってよい。あるいはまた、増幅体の検出には間接的な同定が含まれてもよく、化学発光、導入した放射標識の放射性シンチグラフィー、蛍光標識を介して、あるいは電気的および／または熱的な刺激シグナルを介して行う（Affymax technology; Bellus, 1994）。
【０１１９】
与えられたテンプレートサンプル中に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するためのテンプレート依存プロセスは多数可能である。最もよく知られている増幅法の一つはポリメラーゼ連鎖反応(PCR(商標)と呼ぶ)であり、これは米国特許 4,683,195, 4,683,202 および 4,800,159, および Innis et al., 1990に詳細に記載されており、それぞれの全体を、引用により本明細書に取り込む。
【０１２０】
増幅したmRNAの量を定量するには、逆転写酵素PCR(商標)増幅法を行ってもよい。RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、Sambrook et al., 1989に記載されている。逆転写の別の方法では熱に安定なDNAポリメラーゼが利用される。その方法はWO 90/07641に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応の方法は当分野で周知である。RT-PCRの代表的な方法は米国特許 5,882,864に記載されている。
【０１２１】
増幅の別の方法はリガーゼ連鎖反応([LCR])であり、ヨーロッパ出願.320,308に記載されており、その全体を、引用により本明細書に取り込む。米国特許 4,883,750には、LCRに類似した方法であってプローブ対を標的配列に結合する方法が記載されている。PCR(商標)およびオリゴヌクレオチドリガーゼ測定法(OLA)を基礎とする方法が米国特許 5,912,148に開示されており、これも使用してよい。
【０１２２】
標的核酸配列を増幅する別の方法であって、本発明の実施で使用してもよいものは、米国特許 5,843,650, 5,846,709, 5,846,783, 5,849,546, 5,849,497, 5,849,547, 5,858,652, 5,866,366, 5,916,776, 5,922,574, 5,928,905, 5,928,906, 5,932,451, 5,935,825, 5,939,291 および 5,942,391, 英国出願 2 202 328, および PCT 出願 PCT/US89/01025に記載されており、それぞれ全体を、引用により本明細書に取り込む。
【０１２３】
PCT出願 PCT/US87/00880に記載のＱベータレプリカーゼも本発明での増幅方法として使用してもよい。この方法では、標的の配列に相補的な領域を有するRNAの複製配列をRNAポリメラーゼの存在下でサンプルに加える。このポリメラーゼにより複製配列がコピーされるので、次にこれを検出すればよい。
【０１２４】
等温増幅法も本発明における核酸の増幅において有用であってよく、この方法では制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、ヌクレオチド５’-[アルファ-チオ]-トリフォスフェートを制限部位のある鎖に含有している標的分子の増幅が達成されている（Walker et al., 1992）。米国特許 5,916,779に開示されている鎖置換増幅(SDA)は、核酸の等温増殖を実施する別の方法であり、この方法には鎖の置換と合成のラウンドを複数繰り返すこと、すなわちニックトランスレーションが含まれる。
【０１２５】
他の核酸増幅方法には、転写を基礎とする増幅系(TAS)、例えば核酸配列を基礎とする増幅(NASBA)および3SR（Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT 出願 WO 88/10315、全部を、引用により本明細書に取り込む）が挙げられる。Davey et al., ヨーロッパ出願 329 822には、一本鎖RNA(「ssRNA」)、ssDNA、および二本鎖DNAをサイクル的に合成することが含まれ、核酸増殖プロセスが開示されており、これも本発明にしたがって使用してもよい。
【０１２６】
Miller et al, PCT 出願 WO 89/06700(全部を、引用により本明細書に取り込む)には、プロモーター領域／プライマーの配列を標的一本鎖DNA(「ssDNA」)にハイブリダイズし、次にその配列の多数のRNAコピーを転写することを基礎とする核酸配列増幅スキームが開示されている。このスキームはサイクル的ではなく、すなわち得られたRNA転写体から新しいテンプレートは生産されない。他の増幅法には、「cDNA末端の迅速増殖」および「ワンサイド PCR」が挙げられる（Frohman, 1990; Ohara et al., 1989）。
【０１２７】
3. 核酸の検出
任意の増幅後、増幅体をテンプレートおよび／または過剰のプライマーから分離するのが望ましい。一実施態様では、増幅体をアガロース、アガロース−アクリルアミドまたは標準的な方法を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する（Sambrook et al., 1989）。分離した増幅体は切り出し、更なる組換え操作のためにゲルから溶出するのがよい。融点の低いアゲロースゲルを使用し、分離したバンドはこのゲルを加熱することによって除去し、次にその核酸を抽出してよい。
【０１２８】
当分野に既知のクロマトグラフィー技術によって核酸を分離してもよい。本発明の実施に使用してよいクロマトグラフィーの種類は多数あり、例えば吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシルアパタイト、分子篩、逆相、カラム、ペーパー、薄層、およびガスクロマトグラフィーならびにHPLCが挙げられる。
【０１２９】
ある実施態様では、増幅体が視覚化される。代表的な視覚化方法には、臭化エチジュウムでのゲルの染色化および紫外光の下でのバンドの視覚化が挙げられる。あるいはまた、放射線分析または蛍光分析用に標識されたヌクレオチドをもって増幅体を標識した場合には、分離した増幅体をX線フィルムに曝露させ、あるいは適切な励起スペクトルの下に視覚化することができる。
【０１３０】
一実施態様では、増幅体を分離した後に、標識した核酸プローブを増幅したマーカー配列に接触させる。プローブは発色団に結合するのが好ましいが、放射線標識化してもよい。別の実施態様では、プローブを結合性パートナー、例えば抗体あるいはビオチン、または検出可能な部分を担持する別の結合性パートナーに結合させる。
【０１３１】
特定の実施態様では、サザンブロッティングおよび標識化プローブとのハイブリダイゼーションにより検出する。サザンブロッティングに関する技術は当業者に周知である。Sambrook et al., 1989を参照。上述の一例は米国特許 5,279,721に記載されており、引用により本明細書に取り込むが、それには核酸の自動化電気泳動および輸送のための装置と方法が開示されている。その装置によれば、ゲルを外から操作しなくても電気泳動とブロッティングが可能であり、本発明方法を実施するには理想的に適合している。
【０１３２】
核酸検出の他の方法であって本発明の実施で使用してもよいものは、米国特許 5,840,873, 5,843,640, 5,843,651, 5,846,708, 5,846,717, 5,846,726, 5,846,729, 5,849,487, 5,853,990, 5,853,992, 5,853,993, 5,856,092, 5,861,244, 5,863,732, 5,863,753, 5,866,331, 5,905,024, 5,910,407, 5,912,124, 5,912,145, 5,919,630, 5,925,517, 5,928,862, 5,928,869, 5,929,227, 5,932,413 および 5,935,791に開示されており、それぞれ、引用により本明細書に取り込む。
【０１３３】
4. 他の測定法
遺伝子スクリーニングの他の方法を本発明の範囲内で使用することにより、例えばゲノムDNA、cDNAおよび／またはRNAのサンプル中の変異体を測定してもよい。点変異を検出するのに使用する方法には、変性濃度勾配ゲル電気泳動(「DGGE」)、制限断片長多型分析(「RFLP」)、化学的または酵素的開裂法、PCR(商標)(上記参照)により増幅した標的領域の直接的な配列決定、一本鎖高次構造多型分析(「SSCP」)、および当分野に周知の他の方法が挙げられる。
【０１３４】
点変異体をスクリーニングする一つの方法は、RNA／DNAまたはRNA／RNAヘテロ二本鎖体における塩基対のミスマッチをリボヌクレアーゼにより開裂することを基礎とする。本明細書で使用する「ミスマッチ」の語は、二本鎖RNA／RNA、RNA／DNAまたはDNA／DNA分子における１以上の不対または誤対のヌクレオチド領域と定義される。したがって、この定義には、挿入／削除変異ならびに１個または複数個の塩基の点変異を原因とするミスマッチが含まれる。
【０１３５】
米国特許 4,946,773には、リボヌクレアーゼAミスマッチ開裂測定法が記載されており、この方法には、一本鎖DNAまたはRNAのテストサンプルをRNAプローブにアニーリングし、続いてこの核酸二本鎖体をリボヌクレアーゼAで処理することが含まれる。ミスマッチを検出するために、リボヌクレアーゼA処理による一本鎖体を電気泳動によりサイズに従って分離し、同様に処理したコントロール二本鎖体と比較する。コントロール二本鎖体では見られないより小さな断片(開裂体)をサンプルが含有している場合には、そのサンプルは陽性であるとのスコアーを付ける。
【０１３６】
他に、ミスマッチ測定にリボヌクレアーゼIの使用を記述している研究者もいる。ミスマッチ検出にリボヌクレアーゼIを使用するのはPromega Biotechの文献に記載されている。PromegaはリボヌクレアーゼIを含有するキットを市販しており、これは四つの既知ミスマッチの中の三つを開裂すると報告されている。他に、一塩基のミスマッチを検出するためにMutSタンパク質または他のDNA修復酵素を使用することを記述している研究者もいる。
【０１３７】
削除、挿入または置換の変異体を検出する別の方法であって、本発明の実施に使用してもよいものは、米国特許 5,849,483, 5,851,770, 5,866,337, 5,925,525 および 5,928,870に記載されており、それぞれ、引用により全体を本明細書に取り込む。
【０１３８】
5. キット
試料中の本発明ベクター配列を検出するのに必要な材料および／または試薬は全てキットに組み合わせてもよい。一般にこのキットには、本発明の実施における治療に係る核酸個々に特異的にハイブリダイズするようにデザインされたプローブまたはプライマー、例えば治療に係る核酸配列が含まれる。また核酸を増幅するのに適当な酵素、例えば各種ポリメラーゼ(逆転写酵素、Taq等)、デオキシヌクレオチドおよび緩衝剤が含まれていてよく、これらによって増幅に必要な反応混合物が得られる。またこのようなキットには特定の核酸または増幅体を検出するのに適当な酵素および他の試薬が含まれていてもよい。一般にこのようなキットには各個別の試薬または酵素のための、ならびに各プローブまたはプライマー対のための個々の容器が適当な手段で含まれる。
【０１３９】
遺伝子療法のための投与
遺伝子療法のためには、利用するベクター中にプロモーターに有効に限定される治療に係る遺伝子が含まれなければならないことは当業者であれば認識しているであろう。アンチセンス遺伝子療法のためには、治療に係る遺伝子のアンチセンス配列がプロモーターに有効に結合するであろう。ある場合には他の配列、例えば３’UTR調節配列が治療に係る遺伝子の発現の際には有用であることを当業者は認識している。遺伝子治療ベクターは、当分野で既知の方法に従い固体、半固体、液体または気体の形態に製剤化することにより、それぞれの経路で投与することができる。当分野に既知の手段を利用すれば、組成物が標的器官に到達するまでその放出および吸着を抑制し、あるいは組成物を確実に時間放出させることができる。本発明組成物を無効化しないような医薬的に受容可能な形態を採用するのが望ましい。医薬的な投与形態での組成物は、それ単独、あるいは他の医薬的に活性な化合物との適切な関連ならびに組み合わせで使用することができる。治療用核酸配列を含むベクターを十分な量投与することによって、遺伝子体の薬理学的に有効な服用量が得られなければならない。
【０１４０】
ベクターを細胞に投与するのに利用してよい配送方法がいろいろあることを当業者は認識している。例えば、（１）物理的手段、例えば電気策穿孔(電気)、遺伝子銃(力学的力)あるいは大容積の液体(圧力)負荷を利用する方法；および（２）当該ベクターを他の存在、例えばリポソームまたは輸送体分子に結合させる方法、が挙げられる。
【０１４１】
したがって、本発明は、治療用遺伝子を宿主に輸送する方法であって、本発明ベクターを好ましくは組成物の一部として投与するに当たり、前記投与経路または当業者に既知で特定の用途に適切な別種経路のいずれかを使用することを特徴とする方法を提供する。本発明に従ってベクターが宿主細胞に効果的に遺伝子輸送されているか否かのモニターは、治療効果(例えば治療中の特定疾患に伴う症候の緩和)に基づいて、あるいは更に宿主内の輸送された遺伝子または遺伝子の発現の立証(例えば、配列決定と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションまたは転写アッセイを利用することによって宿主細胞中に核酸を検出すること、あるいは免疫ブロット分析法、抗体が介在する検出法、mRNAまたはタンパク質の半減期テスト、または特殊化されたアッセイ法を利用することによって輸送した核酸がコードし、またはその輸送の結果として濃度または機能が凝縮したタンパク質またはポリペプチドを検出すること)によって可能である。
【０１４２】
本明細書に記載のこれらの方法によって全てのケースが網羅されるのではなく、特別な用途に適合する一層の方法は当業者には明瞭であろう。更に所望の効果を発揮することが既知の化合物との類似性によって、組成物の有効量をいっそう近似することができる。
【０１４３】
また、実際の薬用量および投与スケジュールは、組成物を他の医薬組成物と組み合わせて投与するか否かに応じて、あるいは薬物動態、薬物排泄、および代謝における個体間差異に応じて変化させることができる。同様に、生体外用途での量は、使用する特定の細胞株に応じて（例えば、細胞表面に存在するベクター受容体の数、または遺伝子輸送用に採用した特別なベクターがその細胞株中で複製する能力に基づいて）変化させることができる。更に、付加するベクターの細胞当たりの量は、ベクターに挿入した治療用遺伝子の長さおよび安定性、ならびに配列の特質と共に変動する可能性があり、特にそれは経験的に決定する必要のあるパラメーターであるから、本発明方法に固有でない要因(例えば合成に係る費用)に基づいて変更することができる。当業者は特別な緊急状況に応じて必要な調整を容易にすることができる。
【０１４４】
可能性として、治療用遺伝子を含む細胞が自殺遺伝子(すなわち、細胞崩壊に使用可能な生産物、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子)も含んでよい。遺伝子治療の多くの状況では、治療目的の遺伝子が宿主細胞中で発現できるのが望ましいが、治療がいったん完了した後、制御不能になる、あるいは予測可能なまたは所望する結果を招来しない場合には、その宿主細胞を崩壊する能力を持つことも望ましい。したがって宿主細胞中の治療用遺伝子の発現はプロモーターにより駆動することができるが、自殺遺伝子の生産物はプロドラッグが存在しない状況では無害のままでいる。いったん治療が完了し、またはそれ以上の治療は所望されずあるいは必要もなくなってからプロドラッグを投与すれば、自殺遺伝子の生産物が細胞に死を招来するようになる。使用してよい自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)とガンシクロビア、アシクロビアまたはFIAU；酸化還元酵素とシクロヘキシミド；シトシン脱アミノ酵素と5-フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk::Tmk)とAZT；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノサイドが挙げられる。
【０１４５】
細胞治療法を当分野に既知の方法によって採用してもよく、この場合には治療に係る配列の核酸配列のコピーまたはアミノ酸配列を含有する培養細胞を導入する。
【０１４６】
4. 併用治療
特定の実施態様では、本明細書に記載のベクターおよび方法には癌治療に治療的な核酸が利用される。治療に係る抗癌性核酸配列での遺伝子療法の効果を増加するために、これら組成物を過増殖性疾患の治療に有効な他の薬剤、例えば抗癌剤と組み合わせるのが望ましい。「抗癌」剤は、対象者における癌に対し否定的な効果を招来することができ、例えば、癌細胞の殺傷、癌細胞におけるアポトーシスの誘起、癌細胞の増殖速度の減少、転移の発生または回数の減少、腫瘍サイズの減少、腫瘍増殖の抑制、腫瘍または癌細胞への血液供給の減少、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答の増加、または癌の進行の防止または抑制、あるいは癌を持つ対象者の寿命の上昇による。更に一般的には、これら他の組成物は、癌細胞を殺傷しまたはその増殖を抑制するのに効果的な組み合わせ量で与えられるであろう。このプロセスでは癌細胞を発現構造体と薬剤または多数の因子と同時に接触させることが含まれるのがよい。これを達成するには、この二つの薬剤を含有する１個の組成物または薬理学的製剤に癌細胞を接触させるか、または二つの別々の組成物または製剤であって、一方の組成物には発現構造体が含まれ、他方には第二の薬剤が含まれるものに癌細胞を同時に接触させればよい。
【０１４７】
化学療法剤および放射線療法剤に耐性のある腫瘍細胞は臨床癌医療における主要な難題を提起している。現在の癌研究の一つの目標は、化学療法および放射線療法の効果を遺伝子療法と組み合わせることによって向上させる方法を見出すことである。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ(HS-tk)遺伝子をレトロウイルスベクター系で脳の腫瘍に配送した場合に、抗ウイルス性薬剤ガンシクロビアに対する感受性の誘起に成功した（Culver, et al., 1992）。同様なことを本発明の関連で言えば、mda-7遺伝子療法は、アポトーシスまたは細胞サイクルを調節する薬剤に加えて、化学治療的、放射線治療的または免疫治療的な介入と組み合わせて使用することができると考えられる。
【０１４８】
あるいはまた、遺伝子療法を他の薬物治療と数分間から数週間の範囲の間隔を置いて先行または後行させてよい。他の薬剤と発現構造物とを別々に細胞に適用した実施態様であっても、それぞれの配送時間の間にかなりの時限が確実に経過しなかった場合には、その薬剤と発現構造体は有利な組み合わせ効果を細胞に及ぼすことができるであろう。このような事例では、癌細胞は前記薬剤と発現構造体に約12〜24時間以内に、更に好ましくは約６~12時間以内に相互に接触させればよいと考えられる。けれども、ある状況では治療時限を顕著に延長し、各投与の間に数日(2、3、4、5、6または７)から数週(1、2、3、4、5、6、7または８)が経過するのが望ましい。
【０１４９】
遺伝子療法を「A」、第二の薬剤、例えば放射性療法または化学療法を「B」とした場合各種の組み合わせを採用してよい。
A/B/A   B/A/B   B/B/A   A/A/B   A/B/B   B/A/A   A/B/B/B   B/A/B/B
B/B/B/A    B/B/A/B     A/A/B/B      A/B/A/B     A/B/B/A    B/B/A/A
B/A/B/A    B/A/A/B     A/A/A/B      B/A/A/A     A/B/A/A    A/A/B/A
【０１５０】
ベクターに多少とも毒性があることを考慮すれば、化学療法剤を投与する一般的なプロトコールに従って本発明の治療用発現構造体を投与することになる。治療サイクルを必要に応じて繰り返すことが期待される。各種の標準的な治療法ならびに手術的な介入を記述した過増殖細胞治療と組み合わせて適用してもよいことも考えられる。
【０１５１】
ａ．化学療法
癌療法には、化学物質および放射線を基礎とする治療との各種併用療法がある。組み合わせ化学療法剤には、例えばシスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロルエタミン、シクロフォスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロルアンブシル、ブスファン、ニトロスウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポサイド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムサイタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、トランスプラチナム、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、あるいは上記の類似または誘導の変異体が挙げられる。
【０１５２】
ｂ．放射線療法
DNA障害を惹起し広範に使用されている他の因子には、一般に、＿−線、X線、および／または腫瘍細胞を指向する放射性同位元素の配送が挙げられる。DNA障害性因子の他の形態、例えばマイクロ波および紫外照射も考えられる。これら因子の全てが、DNAに、DNAの前駆体に、DNAの複製および修復に、および染色体の組み立てと管理に、広範囲な障害を与えることは大いにあり得る。X線の用量範囲は、延長期間(3~4週)内1日当り用量50~200レントゲンから単回用量2000〜6000レントゲンに及ぶ。放射性同位元素の用量範囲は、広く変動し同位元素の半減期、放射線の強度および形式、および腫瘍性細胞の吸収量に依存する。
【０１５３】
本明細書で使用する、細胞に適用した場合の「接触された」および「曝露された」の語は、治療用構造体および化学療法剤または放射線治療剤が標的細胞に配送され、あるいは標的細胞に直接に並列する位置に置かれるプロセスを表現している。細胞を殺傷または静止させるために、両方の薬剤は細胞を殺傷しあるいは細胞分裂を阻止するのに有効な組み合わせ量で細胞に配送される。
【０１５４】
ｃ．免疫療法
一般に、免疫治療剤の根拠は、免疫エフェクター細胞および分子を使用して癌細胞を標的し崩壊することにある。免疫エフェクターは、例えば腫瘍細胞の表面にあるマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体単独で治療のエフェクターとして機能してもよいし、あるいは他の細胞を再生することによって癌細胞殺傷を実際に招来してもよい。また抗体は薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等）に結合し単に標的への配送剤として機能してもよい。あるいはまた、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であってもよい。各種エフェクター細胞には細胞傷害性T細胞およびNK細胞が挙げられる。
【０１５５】
したがって、免疫療法は、Ad-mda7遺伝子療法と組み合わせる併用療法の一部として利用することができるであろう。併用療法の一般的なアプローチを以下に説明する。一般に、腫瘍細胞には標的化可能な、すなわち他の大多数の細胞には存在しないマーカーが担持されていなければならない。腫瘍マーカーは多数存在し、それらは全て本発明における標的化に適しているとしてよい。共通の腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HFMG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbBおよびp155が挙げられる。
【０１５６】
ｄ．遺伝子
更に別の実施態様では、第二次治療が第二の遺伝子療法であり、この療法では、治療に係るbyckeuc acud配列の部分の全部を含む最初の治療用ポリヌクレオチドの前、後あるいは同時に二番目の治療用ポリヌクレオチドが投与される。全長または分断した治療に係るアミノ酸配列をコードするベクターを後続の遺伝子産物の一つをコードする二番目のベクターと併合して配送すると、標的組織に対し抗過剰増殖の併合効果が得られる。あるいはまた、両方の遺伝子をコードする単一のベクターを使用してもよい。各種のタンパク質が本発明の範囲内に包含されるので、そのいくつかを以下に説明する。
【０１５７】
ｉ．細胞増殖のインデューサー
細胞増殖を誘起するタンパク質は機能に応じて更に各種の範疇に分かれる。これらタンパク質全ての共通性は、それらが細胞増殖を調節することができる点である。例えば、PDFGの一形態であるsis癌遺伝子は分泌された増殖因子である。癌遺伝子は増殖因子をコードする遺伝子からは滅多に生起せず、現在ではsisが唯一の既知天然起源癌性増殖因子である。本発明の一つの実施態様では、細胞増殖の特別なインデューサーに向けられたアンチセンスmRNAを使用してこの細胞増殖インデューサーの発現を防止することが考えられている。
【０１５８】
タンパク質FMS、ErbA、ErbB、およびneuは増殖因子の受容体である。これら受容体に突然変異が生ずると、調整可能な機能が失われる結果となる。例えば、Neu受容体タンパク質の膜貫通領域を点変異が侵すと、結果的にはneu癌遺伝子が生ずる。erbA癌遺伝子は甲状腺ホルモンの分子内受容体から誘導される。修飾された癌性ErbA受容体は、内来性の甲状腺ホルモン受容体と競合し、その結果として増殖が制御不能となると考えられている。
【０１５９】
癌遺伝子の最大のクラスは、シグナル形質導入性タンパク質（例えば、Src、Abl、およびRas）を含んでいる。タンパク質Srcは細胞質タンパク質−チロシンキナーゼであり、それが或る場合にチロシン残基527での変異を経由して原癌遺伝子から癌遺伝子に形質転換する。その一方、GTPアーゼタンパク質rasは、その配列のアミノ酸12の位置でバリンがグリシンに変異すると、原癌遺伝子から癌遺伝子に形質転換し、ras GTPアーゼ活性が減少する。
【０１６０】
タンパク質Jun、FosおよびMycは、転写因子として核の機能に直接的に影響を及ぼすタンパク質である。
【０１６１】
ii．細胞増殖のインヒビター
腫瘍癌抑制遺伝子の機能は、過剰な細胞増殖の抑制である。これらの遺伝子が不活性化するとそれらの抑制的活性が崩壊し、増殖が調節できなくなる。腫瘍抑制因子p53、p16、およびC-CAMを以下に説明する。
【０１６２】
化学物質発癌、紫外線照射および数種のウイルスによって形質転換した多くの細胞には、変異体p53が高レベルで見いだされている。p53遺伝子は多様なヒトの腫瘍においてしばしば突然変異による不活性化の標的となっており、またヒトの一般的な癌において最も頻度高く突然変異した遺伝子であると既に記述されている。ヒトNSCLCの50％を超えて（Hollstein et al., 1991）、また他の腫瘍の広範なスペクトルにおいてp53は突然変異している。
【０１６３】
ｐ53遺伝子がコードするのは393個のアミノ酸のリンタンパク質であり、このタンパク質は宿主タンパク質、例えばラージT抗原およびE1Bと複合体を形成することができる。このタンパク質は正常な組織および細胞に見いだされるが、濃度は形質転換した細胞あるいは腫瘍組織に比較すると微少である。
【０１６４】
野生型p53は、多くの細胞型において重要な増殖調節因子であると認められている。p53遺伝子にとってミスセンス突然変異は普通に起こることであり、癌遺伝子が形質転換する能力にとっては必須である。点突然変異によって１個の遺伝子変化が惹起されると発癌性p53が生成可能になる。しかし、他の癌遺伝子と異なり、p53の点突然変異は少なくとも30個の離れたコドンで起こることが判っており、その結果しばしば生成する優性アレル体は、ホモ接合の状態には還元しないで細胞表現型が変移する。更に、これら優性ネガティブアレル体の多くは微生物中で耐性があるらしく、そのまま生殖細胞株中に回送される。各種突然変異アレル体が出現する範囲は、優性ネガティブアレル体であって、機能不全が最小のものから浸透性が強力なものまで及ぶ(Weinberg, 1991)。
【０１６５】
細胞増殖の別のインヒビターはp16である。真核性細胞サイクルの主要な転位はサイクリン依存性キナーゼ、すなわちCDKによって始動される。CDKの一種、サイクリン依存性キナーゼ４(CDK4)によってG1を経由する進行が調節される。この酵素の活性は後期G1でRbをリン酸化することであるらしい。CDK4の活性は活性化サブユニットであるD型サイクリンにより、また抑制性サブユニットであるp16INK4によって制御される。p16INK4の生化学的な特性は、CDK4に特異的に結合し阻害するタンパク質であり、したがってRbのリン酸化を調節している可能性がある（Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995）。p16INK4はCDK4のインヒビターである(Serrano, 1993)から、この遺伝子を削除するとCDK4の活性が増加し、結果的にはRbタンパク質が過リン酸化され得る。またp16はCDK6の機能を調節することが判っている。
【０１６６】
p16INK4はCDK阻害性タンパク質という新たに記述されるクラスに属し、このクラスにはp16B、p19、p21WAF1、およびp27KIP1も含まれている。p16INK4遺伝子は多くの腫瘍型において頻繁に削除される染色体領域9p21にマッピングされる。p16INK4遺伝子のホモ接合的な削除および突然変異はヒトの腫瘍細胞株では頻繁に起こっている。この証拠から、p16INK4遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であると示唆されている。しかしこの解釈には異論があり、最初の未培養の腫瘍においてp16INK4遺伝子が変異する頻度は培養細胞株に比較して遥かに低いという観察事実がある（Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al.,1995）。プラスミド発現ベクターで形質転換することにより野生型の機能が回復した結果、ヒトのある癌細胞株が形成するコロニーが減少した（Okamoto, 1994; Arap, 1995）。
【０１６７】
[168] 本発明が採用してよい他の遺伝子には、Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1 / PTEN, DBCCR-1, FCC, rsk-3, p27, p27/p16 融合体, p21/p27 融合体, 抗血栓症遺伝子 (例えば, COX-1, TFPI), PGS, Dp, E2F, ras, myc, neu, raf, erb, fms, trk, ret, gsp, hst, abl, ElA, p300, 新脈管形成に伴う遺伝子(例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンディン、BAI-1、GRAIF、またはこれらの受容体)およびMCCが含まれる。
【０１６８】
iii．プログラム化細胞死のレギュレーター
アポトーシス、すなわちプログラム化された細胞死は、正常な胎芽の成長、成人組織での身体的平衡状態の維持、および発癌現象の抑制のために必須ナプロセスである（Kerr et al., 1972）。Bcl-2科のタンパク質およびICE様のプロテアーゼは、他の組織でのアポトーシスの重要なレギュレーターであり、エフェクターであると証明されている。小胞性リンパ腫に随伴して発見されたBcl-2タンパク質は、さまざまなアポトーシス的刺激に応答してアポトーシスを制御し細胞生存を促進するのに主要な役割を果たしている（Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986）。進化的に保存されたBcl-2タンパク質は、現在では死のアゴニストあるいは死のアンタゴニストという範疇に類別できる関連タンパク質の科のメンバーであると認められている。
【０１６９】
この発見に続いて、Bcl-2の作用は各種刺激で始動した細胞死の抑制であることが判った。また、細胞死を調節するBcl-2タンパク質の科があり、そのタンパク質は共通の構造的、配列的相同性を共有していることが現在明らかである。科内の異なるメンバーは、Bcl-2に類似の機能を有する(例えば、Bc1XL, Bclw, Bcls, Mcl-1, A1, Bfl-1)か、またはBcl-2の機能に反発し細胞死を促進する(例えば、Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri)。
【０１７０】
ｅ．手術
癌を持つ人の約60%は何かのタイプの手術を受けることになるが、その手術には、予防的手術、診断的または前段的手術、治癒的手術および緩解的手術が挙げられる。治癒的手術は、他の療法、例えば本発明療法、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または別の療法と組み合わせて使用してもよい癌療法である。
【０１７１】
治癒的手術には切除が挙げられ、これでは癌組織の全部または部分が物理的に除去、切除、および／または崩壊される。腫瘍切除とは少なくとも腫瘍の一部を除去することを言う。腫瘍切除以外に手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電子手術、および顕微鏡で制御する手術（モース手術）が挙げられる。更に表皮癌、前癌または正常組織の偶発成長の除去と組み合わせて本発明を使用してもよいことが考えられる。
【０１７２】
癌性の細胞、組織または腫瘍の全部の部分を切除すると体に穴が形成される可能性がある。その領域に更なる抗癌療法をもって潅流、直接注射または局部投与することによって治療を完成してもよい。そのような治療は反復してよく、例えば、1、2、3、4、5、6、または7日毎に、あるいは1、2、3、4、および5週毎に、あるいは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12ヶ月毎に行う。これらの治療では薬用量も同様に変動してもよい。
【０１７３】
ｆ．他の薬剤
他の薬剤を本発明と併用することにより治療効率を向上してもよいと考えられる。これらの追加薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびGAP結合の上向き調節を招来する薬剤、細胞分裂抑制剤および分化薬剤、細胞接着阻害剤、または過増殖細胞のアポトーシスインデューサーに対する感受性を上昇する薬剤、が挙げられる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、同ベータおよび同ガンマ；インターロイキン-２および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカイン類似体；またはMIP-1、MIP-1ベータ、MCP-1、RANTES、および他のケモカインが挙げられる。細胞表面受容体またはそれらのリガンド、例えばFas／Fasリガンド、DR4またはDR5／TRAILが上向き調節されれば、過増殖細胞に対する自己分泌または近傍分泌の効果が確立されるので、本発明のアポトーシス誘起能は増強されると考えられる。GAP結合の数を増加することにより細胞間シグナル性が増大すれば、隣接の過増殖細胞群の過増殖に対する拮抗効果が増大する。他の実施態様では、細胞分裂抑制剤または分化薬剤を本発明と併用することによって治療における抗過増殖効果を上げることができる。細胞接着阻害剤は本発明の効果を上げると考えられる。細胞接着阻害剤の例は、病巣接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。更に、過増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤、例えば抗体c225を本発明と併用すれば、治療効果が上昇すると考えられる。
【０１７４】
ホルモン療法も本発明と併用、あるいは前記した任意の他の癌療法と併用してよい。ある種の癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または頸部癌の治療においてホルモンを採用することにより、ある種のホルモン、例えばテストステロンまたはエストロゲンのレベルを低下しあるいは効果を封鎖してもよい。治療のオプションとして、あるいは転移の危険性を減少する目的で、しばしばこの治療は少なくとも１の他の癌治療と併用されている。
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【０１７５】
本発明の実施態様では、キメラ型核酸ベクターが存在し、このベクターには、アデノウイルス逆方向末端反復フランキング配列；そのアデノウイルスフランキング配列間の内部配列、ここで前記内部配列にはカセットに隣接するレトロウイルス長末端反復フランキング配列が含まれており、前記カセットには治療に係る核酸配列が含まれている；および前記アデノウイルスフランキング配列間にgag／pol核酸配列またはenv核酸配列のいずれか、が含まれる。特定の実施態様では、アデノウイルス逆方向末端反復にSEQ ID NO:１が含まれる。別の特定の実施態様では、レトロウイルス長末端反復配列にSEQ ID NO:２が含まれる。更に特定の実施態様では、gag核酸配列にSEQ ID NO:３が、およびpol核酸配列にSEQ ID NO:４が含まれる。更に特定の実施態様では、env核酸配列にSEQ ID NO:５が含まれる。別の特定の実施態様では、tet-TA（トランス活性化因子配列）にSEQ ID NO:６が含まれる。追加の特定の実施態様では、自殺遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)(SEQ ID NO:７)、酸化還元酵素(SEQ ID NO:８)；シトシンデアミナーゼ(SEQ ID NO:９)；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk::Tmk)(SEQ ID NO:10)；およびデオキシシチジンキナーゼ(SEQ ID NO:11)が本発明において利用されている。
【０１７６】
特定の実施態様では、この系は、同一の宿主細胞中で治療用遺伝子および／または自殺遺伝子(すなわち、細胞崩壊に使用可能な生産物をコードする遺伝子、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)のいずれかを発現するのに特に有用である。遺伝子治療の多くの状況では、治療目的の遺伝子が宿主細胞中で発現されるが、いったん治療が完了した、それが制御不能になる、あるいは予測可能なまたは所望する結果が招来されない場合には、その宿主細胞を崩壊する能力を持つことが望ましい。これは、治療用遺伝子である第一のヌクレオチド配列を前記プロモーターに結合させ、自殺遺伝子である第二のヌクレオチド配列も前記プロモーターに結合させて本発明を使用すれば達成することができる。したがって、宿主細胞中の治療用遺伝子の発現は前記プロモーターにより駆動可能であるが、自殺遺伝子の生産物はプロドラッグが存在していない状況では無害のままでいる。いったん治療が完了し、またはそれ以上の治療は所望されず、あるいは必要もなくなってからプロドラッグを投与すれば、自殺遺伝子の生産物が細胞に死を招来するようになる。使用してよい自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-tk)とガンシクロビア、アシクロビアまたはFIAU；酸化還元酵素とシクロヘキシミド；シトシン脱アミノ酵素と5-フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ(Tdk::Tmk)とAZT；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノサイドが挙げられる。使用してもよい治療用遺伝子の例は、その生産物が癌、心臓疾患、糖尿病、嚢胞性繊維症、アルツハイマー疾患、肺疾患、筋肉ジストロフィー、あるいは代謝異常に関連する遺伝子である。
【０１７７】
アデノウイルスベクター系およびレトロウイルスベクター系は、外来遺伝子を哺乳動物細胞に配送し発現させるのに有用である(刊行物1、2、3)。この二つの系には相互に補足しあう特性と欠陥がある。本発明の目的として、アデノウイルスの全コード配列を欠いているが、レトロウイルスのシスおよびトランスの全成分を形質導入することができるキメラ型のアデノウイルスデルタベクターによって、組替え体レトロウイルスベクターが高力価で産生される。これらキメラ型ベクターは治療用構造体の配送および安定な組み込みに使用され、かつ生体内遺伝子輸送の適用において現在遭遇している制約事項はこれによって解消される。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
細胞と培地
HeLA、HEK293、C3、およびGP+envAM12細胞をGVL(Hyclone, Logan, UT)培地で増殖および維持する。必要によりG418およびZeocinを培地に加える。濃度10μg/mlのテトラサイクリン(Sigma)を培地に加える。
【０１７９】
ウイルス
150cm2プレートのHEK293細胞をヘルパーベクターAdLucをもって感染多重度５にて形質導入する。キメラ型デルタ−アデノ／レトロウイルスベクター、AdSTK3PGKまたはAdSTKPGKの救済をFisher et al.(刊行物45)が記載しているように行う。概要的には、形質転換の2時間後に、形質転換カクテル2.5ml中のAdSTK3PGKまたはAdSTKPGKの50μgを各プレートに加え、均等に配分する。Cullen(刊行物31)が記載するプロトコールに従って形質転換を行う。細胞をこれら溶液中に10〜14時間放置し、その後感染／形質転換培地を新しいGVL20mlで置換する。形質転換の約30時間後に、細胞を採取し10mMトリス-Cl(pH8.0)緩衝液(0.5ml／150cm2プレート)に懸濁し、−80℃で凍結する。細胞の凍結懸濁液を、凍結（エタノール−ドライアイス）と解凍(37℃)のサイクルを3回連続して行って溶解する。細胞屑を遠心分離（3000gを10分間）により除去する。透明の抽出液を塩化セシウムの段階式濃度勾配の上に層状化する。この濃度勾配は,5.0mlづつの三段からなり、各段の密度はトリス-Cl(pH8.0)緩衝液中に塩化セシウム1.45、1.36、および1.20g／mlである。Beckman SW-28ローターの20,000rpmにて2時間10℃で遠心分離を行う。目視可能なベクターバンドのある画分を集め、20mMトリス(pH8.0)、2mM塩化マグネシウムおよび4％シュークローズに対して透析し、次に10％グリセロールの存在下に−80℃で保存する。
【０１８０】
Gag／Pol細胞株
C3細胞を12μgのpEGFPN1 gag/polをもって、製造者のリポフェクチン用プロトコール（Gibco）により形質転換する。形質転換の48時間後に増殖培地を200μg／mlのZeocinを含有する増殖培地で置換する。形質転換の14日後に単離したZeocin耐性コロニーを集め、６個のウエルプレートに拡げる。各コロニーをRT産生レベルについてスクリーニングする(刊行物45)。RT活性について陽性および陰性コントロールは、それぞれGP+envAm12細胞および非形質転換C3細胞である。更に、サザン分析を利用してgag／polが選択クローンの中に完全に組み込まれたかを確認する。
【０１８１】
ポリメラーゼ連鎖反応
PCRを各プライマーセットにとって最適の条件で行う。
【０１８２】
サザン分析
５マイクログラムのDNAを適切な制限酵素で完全に消化し、0.7％アガロースゲル中でサイズ分画する。そのYを0.1μg／mlのEtBrで染色して分子マーカーの位置を決定する。分離したDNAを変性化し、標準的なプロトコールによりNytranフィルター（Schleicher および Schuell）に移す(刊行物52)。緊縮度の高いプローブハイブリダイゼーションを50℃で行い、洗浄を65℃で２倍の、次に１倍のSSC、および0.1％SDS中で行い、Kodak XARフィルムに曝露する。プローブは[32P]dATP（Dupont/NEN）で標識した適切なプラスミドである。
【０１８３】
ノーザン分析
全RNAをHwang et alの記載のごとく単離し、poly(A)mRNAをPoly(A)Quickカラム（Stratagene）上に選択する(刊行物53)。260nmでの吸光度で定めた等量(一般的には１〜２μg)を１％フォルムアルデヒドゲル中でサイズ分画し、標準的なプロトコールによりNytranフィルターに移す(刊行物42)。50％フォルムアルデヒドハイブリダイゼーション用緩衝液中で、ランダムにプライマーを標識したプローブを適切なプラスミドとハイブリダイゼーションする。[32P]dATPで末端標識したアルファチューブリンオリゴヌクレオチドプローブをコントロールとして使用することにより、等量のmRNAが輸送されたことを確認する。汚れを高い緊縮度（65℃、0.5倍のSSC、および0.1％SDS）で洗浄し、−80℃で増感スクリーンを使用してKodak XARフィルムに曝露する。
【０１８４】
ベータガラクトシダーゼ活性のための染色
増殖培地を除去した後に、細胞を、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で濯ぎ、氷冷10％フォルマリンで５分間固定し、再びPBSで濯ぎ、1mM塩化マグネシウム、10mM K4Fe(CN)6 3H2O、10mM K3Fe(CN)6および200μg/ml X-galを含有する液で覆う。
【０１８５】
脊椎動物
本発明の特定の実施態様では、アデノ／レトロウイルスベクター系であって、感染性があり、複製能が欠落した組替え体レトロウイルスを生体外および生体内で高力価に産生する系が利用されている。C57B1/6Jマウスが使用される。その理由は、これら動物は多くの肝指向性遺伝子療法研究で使用されているからである。
【０１８６】
動物使用の記述
ジャクソン研究所から入手する約100匹のC57B1/6Jマウスを生体内実験に使用する。餌および水を自由摂取させる状態で動物を収容し、12時間の明／暗サイクルを維持する。研究は全てNIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行われる。本発明のキメラ型ベクターを使用して治療用構造物の配送および安定な組み込みを行う。遺伝子輸送系の生体内適用が現在遭遇している制約事項のいくつかはこのキメラ型の系によって解消し得る。ウイルスが介在する遺伝子輸送の研究は生体内で行われるのが理想である。肝臓の生体内研究には組織調製物の起源としての動物が必要である。更に、ウイルス病理の研究は、ウイルスの変異、宿主の自然な耐性、および免疫性等の病因に関連する広範な相関因子が共存している場所でのみ行うことができる。組織培養系およびコンピュータモデルでは生体内で生起している複雑な現象は反映されない。
【０１８７】
動物介護、飼育、および実験的因子
0.02ml/gmのアベルチン(1.25％トリブロモエタノール／アミルアルコール溶液)の腹腔内(i.p.)注射により麻酔する。ベクター溶液の尾静脈点滴を27または30ゲージカテーテルを介して約５〜10分間にわたって行う。これらの操作は耐容可能であり、苦痛を生じない。安楽死後に組織を摘出する。
【０１８８】
安楽死
全動物は、ネンブタールナトリウムの1ml致死量を腹腔内注射して安楽死させる。
【０１８９】
文献
本明細書に記載の全ての特許および刊行物によって、本発明が属する分野の専門家のレベルが標示される。特許および刊行物は全て引用により本明細書に取り込むが、その編入の範囲は、引用により取り込むことを、各刊行物について特別にかつ個別に示した場合と同じである。
【０１９０】
米国特許
米国特許. 5,840,873, 発行 1998年11月24日
米国特許. 5,843,640, 発行 1998年12月1日
米国特許. 5,843,650, 発行 1998年12月1日
米国特許. 5,843,651, 発行 1998年12月1日
米国特許. 5,843,663, 発行 1998年12月1日
米国特許. 5,846,708, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,846,709, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,846,717, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,846,726, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,846,729, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,846,783, 発行 1998年12月8日
米国特許. 5,849,481, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,483, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,486, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,487, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,497, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,546, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,849,547, 発行 1998年12月15日
米国特許. 5,851,770, 発行 1998年12月22日
米国特許. 5,851,772, 発行 1998年12月22日
米国特許. 5,853,990, 発行 1998年12月29日
米国特許. 5,853,993, 発行 1998年12月29日
米国特許. 5,853,992, 発行 1998年12月29日
米国特許. 5,856,092, 発行 1999年1月5日
米国特許. 5,858,652, 発行 1999年1月12日
米国特許. 5,861,244, 発行 1999年1月19日
米国特許. 5,863,732, 発行 1999年1月26日
米国特許. 5,863,753, 発行 1999年1月26日
米国特許. 5,866,331, 発行 1999年2月2日
米国特許. 5,866,336, 発行 1999年2月2日
米国特許. 5,866,337, 発行 1999年2月2日
米国特許. 5,900,481, 発行 1999年5月4日
米国特許. 5,905,024, 発行 1999年5月18日
米国特許. 5,910,407, 発行 1999年6月8日
米国特許. 5,912,124, 発行 1999年6月15日
米国特許. 5,912,145, 発行 1999年6月15日
米国特許. 5,912,148, 発行 1999年6月15日
米国特許. 5,916,776, 発行 1999年6月29日
米国特許. 5,916,779, 発行 1999年6月29日
米国特許. 5,919,626, 発行 1999年7月6日
米国特許. 5,919,630, 発行 1999年7月6日
米国特許. 5,922,574, 発行 1999年7月13日
米国特許. 5,925,517, 発行 1999年7月20日
米国特許. 5,925,525, 発行 1999年7月20日
米国特許. 5,928,862, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,928,869, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,928,870, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,928,905, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,928,906, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,929,227, 発行 1999年7月27日
米国特許. 5,932,413, 発行 1999年8月3日
米国特許. 5,932,451, 発行 1999年8月3日
米国特許. 5,935,791, 発行 1999年8月10日
米国特許. 5,935,825, 発行 1999年8月10日
米国特許. 5,939,291, 発行 1999年8月17日
米国特許. 5,942,391, 発行 1999年8月24日
欧州特許出願. 320 308
欧州特許出願. 329 822
英国特許出願 2 202 328
PCT出願 PCT/US87/00880
PCT出願 PCT/US89/01025
PCT WO 88/10315
PCT WO 89/06700
【０１９１】
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【０１９２】
当業者は容易に認知することであるが、本発明によって、その目的は良好に達成され、また記載した結果と利点および本発明に固有の結果と利点が得られる。本明細書に記載の配列、方法、ベクター、プラスミド、複合体、化合物、突然変異体、治療法、医薬組成物、複合物、キット、操作および技術は、好ましい実施態様を表示しており、その意図は例示であって、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１９３】
当業者には明白なことであるが、他の実施態様、改良例、詳細例、および用途例は、均等論を含む特許法に従って解釈するならば、前記開示の文言および精神に一致し、かつ本特許の範囲の中に存在するとすることができる。本特許の範囲は以下に記載の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【国際調査報告】
2005526001.tif 000009
2005526001.tif 000010