(57)【要約】本発明は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の新規な株（ＨＩ−７０と命名）、並びにこの株からのシクロドデカノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子（ｃｄｎＢと命名）の単離、クローニング及び配列決定に関する。本発明はまた、新規なシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ、及びこのシクロドデカノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の使用の方法に関する。
2005502380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）又はその酵素活性部分をコードすることを特徴とする単離ＤＮＡ。
【請求項２】
シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）又はその酵素活性部分をコードする単離ＤＮＡであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７に示されるＤＮＡの相補体と特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする単離ＤＮＡ。
【請求項３】
シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする単離ＤＮＡであって、
（ａ）配列番号７で示される核酸配列；
（ｂ）該核酸配列に対して遺伝子コードの縮重の範囲で相当し、かつシクロドデカノンモノオキシゲナーゼをコードする配列；又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）由来の配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、さらにシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする配列
を含むことを特徴とする単離ＤＮＡ。
【請求項４】
シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）、又はその酵素活性部分をコードする単離ＤＮＡであって、配列番号７を有することを特徴とする単離ＤＮＡ。
【請求項５】
前記ＤＮＡが、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）から単離されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の単離ＤＮＡ。
【請求項６】
酵素活性シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードし、請求項１〜５のいずれか記載のＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターが前記ＤＮＡの１つ以上のコピーを含むことを特徴とする請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが原核生物ベクターであることを特徴とする請求項６又は７記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記発現ベクターがプラスミドであることを特徴とする請求項６又は７記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、又は５記載のＤＮＡを含むことを特徴とする生物学的に機能的なプラスミド又はウイルスＤＮＡベクター。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１２】
酵素活性シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする異種ＤＮＡ発現構築物を用いて形質転換された細胞であって、該構築物が請求項１〜５のいずれか記載の単離ＤＮＡを含み、一旦形質転換された該細胞が、該ＣＤＭＯを発現することを特徴とする細胞。
【請求項１３】
細胞が原核生物細胞であることを特徴とする請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
細胞が大腸菌（E.coli）であることを特徴とする請求項１２記載の細胞。
【請求項１５】
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とするシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）。
【請求項１６】
前記ＣＤＭＯがシュードモナス・プチダから調製されることを特徴とする請求項１５記載のシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）。
【請求項１７】
前記ＣＤＭＯが配列番号８に示される配列を有することを特徴とする請求項１６記載のシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）。
【請求項１８】
唯一の炭素源としてのシクロドデカノール又はシクロドデカノンの存在下においてインビトロで細胞を増殖させる方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項６、７、８、若しくは９記載の発現ベクター、又は請求項１０記載の生物学的に機能的なプラスミド若しくはウイルスＤＮＡベクターのいずれかを用いて細胞を形質転換する工程；及び
（ｂ）唯一の炭素源としてのシクロドデカノール又はシクロドデカノンを含む培地において、適切な条件下で工程ａ）の該細胞を増殖させる工程、
を包含することを特徴とする方法。
【請求項１９】
アクセッション番号ＩＤＡＣ−１８０９０２を有することを特徴とするシュードモナス・プチダ株ＨＩ−７０。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（ａ）発明の分野
本発明は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）の新規の株（ＨＩ−７０と命名）、並びにこの株からのシクロドデカノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子（ｃｄｎＢと命名）の単離、クローニング及び配列決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
概して酵素のバイヤービリガー（Baeyer-Villiger）モノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）は、広範な種々のケトンからラクトンへの古典的な（１００年前の）有機バイヤービリガー酸化をなぞることのできるフラボタンパク質であって、その多くが有益なキラル構成単位である。リポ酸及びガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡとしての方が有名）のアンタゴニストである、バクロフェン（Baclofen）のような天然物の合成における微生物のＢＶＭＯの配置によって、この種の酵素の力及び有用性が実証される（非特許文献１）。バイオ試薬としての酵素の使用は、特異性、廃棄物最小限化、及び環境配慮性の利点を有する。持続的な発展がますます重要な問題となっている世界では、種々の工業的適用において必須の産物の合成を駆動する生体触媒の使用は、経済協力開発機構（Organization for Economic Co-operation and Development）（ＯＥＣＤ）によって優先的に選択されてきている。
【０００３】
今日まで、ＢＶＭＯを生成することがわかっている微生物（細菌及び真菌）のリストは限られている（非特許文献２〜４）。異なる基質特異性を有する産物をコードする２〜３のＢＶＭＯ−コード遺伝子がクローニングされている（非特許文献４、非特許文献５〜７）。
【０００４】
増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることが可能な新規の土壌微生物を提供することが極めて望ましい。
【０００５】
上記の微生物が、増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることを可能にする単離ＤＮＡ配列を提供することがまた望まれている。
【非特許文献１】
ケリー・ディーアール（Ｋｅｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．）ら、１９９８、「バイオトランスフォーメーション（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｉ，ｐ５３５〜５８７
【非特許文献２】
スチュワート・ジェイ・ディー（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｄ．）カレントオーガニックケミストリー（Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）２：１９５〜２１６，１９９８
【非特許文献３】
ケリー（Ｋｅｌｌｙ）ら、（前出）；シューマッハー・ジェイ・ディー（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｊ．Ｄ．）及びファコウサ・アール・エム（Ｆａｋｏｕｓｓａ，Ｒ．Ｍ．）アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）５２：８５〜９０，１９９９；
【非特許文献４】
カメルビーク・エヌ・エム（Ｋａｍｅｒｂｅｅｋ，Ｎ．Ｍ．）ら、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６８：２５４７〜２５５７，２００１
【非特許文献５】
イワキ・エイチ（Ｉｗａｋｉ、Ｈ）ら、アプライドアンドエンバイロメンタルマイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）６５：５１５８〜５１６２，１９９９
【非特許文献６】
チェン・キュー（Ｃｈｅｎｇ，Ｑ）ら、ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１８２：４７４４〜４７５１，２０００
【非特許文献７】
ブルゾストウィック・ピー・シー（Ｂｒｚｏｓｔｏｗｉｃｚ  Ｐ．Ｃ．）ら、ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１８２：４２４１〜４２４８，２０００
【非特許文献８】
カメルビーク・エヌ・エム（Ｋａｍｅｒｂｅｅｋ，Ｎ．Ｍ．）ら、ヨーロピアンジャーナルオブバイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２６８：２５４７〜２５５７，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの目的は、増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることができる新規の土壌微生物を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、上記の微生物が、増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることを可能にする単離ＤＮＡ配列を提供することである。本発明において、上記の微生物が、増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることを可能にするＤＮＡは、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼであることが見出された。
【０００８】
従って、本発明の別の目的は、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、増殖及びエネルギーの唯一の炭素源としてシクロドデカノール及びシクロドデカノン（１２員環の化合物）を用いることができる、シュードモナス・プチダのＨＩ−７０株として同定された、新規な土壌微生物が提供される。この微生物は、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を有する。今日まで、ＨＩ−７０株のシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする、クローニングされたｃｄｎＢ遺伝子は、１０以上の員環を有するシクロケトンに対する配列及び基質特異性によって、その種類の最初のものであると考えられている。また、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｃｄｎＢ遺伝子の過剰発現によって、種々の生体内変化において使用する、この組み換え酵素の豊富な供給源が得られる。
【００１０】
本発明によれば、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）又はその酵素活性部分をコードする単離ＤＮＡがまた提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）又はその酵素活性部分をコードする単離ＤＮＡが提供され、この単離ＤＮＡは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号７に示されるＤＮＡの相補体と特異的にハイブリダイズする能力によって特徴付けられる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする単離ＤＮＡが提供され、このＤＮＡは、：
（ａ）配列番号７に示される核酸配列；
（ｂ）該核酸配列に対して遺伝子コードの縮重の範囲内で相当し、かつシクロドデカノンモノオキシゲナーゼをコードする配列；又は
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）由来の配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、さらにシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする配列、
を含む。
【００１３】
本発明はさらに、シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）、又はその酵素活性部分をコードする単離ＤＮＡであって、配列番号７を有する単離ＤＮＡを提供する。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、本発明の酵素活性シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）は、上記のようなＤＮＡを含む発現ベクターによってコードされてもよい。この発現ベクターは、酵素活性シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードするＤＮＡの１つ以上のコピーを含んでもよい。この発現ベクターは、原核生物ベクターであっても、真核生物ベクターであってもいずれでもよい。このベクターは、いくつかの実施形態においては、プラスミドであってもよく、次に、このプラスミドが宿主細胞を形質転換するために用いられてもよいし、これらの宿主細胞に組み込まれてもよい。
【００１５】
従って、本発明はさらに、上記のようなＤＮＡを含む生物学的に機能的なプラスミド又はウイルスＤＮＡベクターを提供する。
【００１６】
さらに、本発明によれば、酵素活性シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードする異種ＤＮＡ発現構築物を用いて形質転換された細胞も提供される。この構築物は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離ＤＮＡを含み、この細胞は一旦形質転換されれば、このＣＤＭＯを発現する。この細胞は、原核生物細胞であってもよい。この細胞はまた、イー・コリ細胞であってもよい。
【００１７】
さらに、本発明によれば、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するシクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）が提供される。
【００１８】
さらに、本発明によれば、炭素の唯一の供給源としてシクロドデカノール又はシクロドデカノンの存在においてインビトロで細胞を増殖するための方法も提供され、この方法は、：
（ａ）請求項６、７、８、若しくは９に記載の発現ベクター、又は請求項１０に記載の生物学的に機能的なプラスミド若しくはウイルスＤＮＡベクターのいずれかを用いて細胞を形質転換する工程；及び
（ｂ）炭素の唯一の供給源としてシクロドデカノール又はシクロドデカノンを含む培地中、適切な条件下で工程ａ）の細胞を増殖させる工程、
を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明により、唯一の炭素源としてシクロドデカノン又はシクロドデカノールを用いることができる、シュードモナス・プチダの新規な株（ＨＩ−７０株と表す）の単離、この株からのシクロドデカノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子（ｃｄｎＢと名付ける）のクローニング及び配列決定、異種の系（イー・コリ）におけるこのｃｄｎＢ遺伝子の発現、並びにこの酵素の活性アッセイを記載する。大型の員環の単環式ケトン（少なくとも１０、好ましくは１２以上の環を有する）からラクトンへの酸化のための本発明のＣＤＭＯの特異性スペクトル及び利用、他の酵素にはみられないものが、これらのアッセイによって決定された。
【００２０】
シクロドデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＤＭＯ）をコードするシュードモナス・プチダの新規な株の単離
シクロドデカノン（１リットルあたり１．０ｇ）を含有する最小塩培地（ＭＳＭ）（ｐＨ７．０）を用いて選択的強化することによって、日本の大阪由来の土壌サンプルから生物体を単離した。唯一の炭素源としてシクロドデカノンを含有する液体又は固体の最小塩培地のいずれかにおいて、この生物体を維持した。ＭＳＭは、（蒸留水１リットルあたり）１．０ｇのＮＨ4ＮＯ3、１．５ｇのＫＨ2ＰＯ4、１．５ｇのＮａ2ＨＰＯ4、０．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．００５ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００２ｇのＭｓＳＯ4・４Ｈ2Ｏ、及び０．０５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含んだ。単離体を同定して、株式会社エヌシーアイエムビージャパン（日本、静岡）によってＰ．ｐｕｔｉｄａのメンバーであると分類した。この株をＨＩ−７０株と命名した。
【００２１】
シュードモナス・プチダ  ＨＩ−７０  ＣＤＭＤコード遺伝子のクローニング
シュードモナス・プチダＨＩ−７０を、０．３％のシクロドデカノンを含有する、ルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）（ＬＢ）ブロス、又は最小塩培地（ＭＳＭ）ｐＨ７．０中において３０℃で増殖させた。１プレートあたり１．５％までアガーを添加した。ＨＩ−７０株のゲノムＤＮＡを、マーマー（Marmur）法によって調製した。ＢＶＭＯ（アシネトバクター（Acinetobacter）種ＮＣＩＭＢ９８７１のＣＨＭＯ、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）ＮＣＩＭＢ９８７２のＣＰＭＯ、ロドコッカス・マリス（Rhodococcus maris）ＨＩ−３１のＣＨＭＯ、及びロドコッカス・ロドキュラス（Rhodococcus rhodochrous）ＩＦＯ３３３８のＳＴＭＯ）の２つの保存領域（ＷＹ／ＨＷＮＲ／ＣＹＰ（配列番号１及びＡＴＧＦＤＡ（配列番号２））に基づいて、２つの変性されたＰＣＲプライマー（それぞれ、Acinetobacter ＣＨＭＯ４６〜５２、及び３７７〜３８２のアミノ酸に相当する、５’−ＴＧＧＹＡＹＴＧＧＡＡＹＨＧＩＴＡＹＣＣ−３’（配列番号３）及び５’−ＧＣＲＴＣＲＡＡＮＣＣＮＧＴＩＧＣ−３’（配列番号４）；Ｉ＝イノシン；Ｎ＝Ｔ、Ｃ、Ａ又はＧ；Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ）を合成して、ＨＩ−７０株から調製された総ＤＮＡ由来の約１ｋｂの産物を増幅した。
【００２２】
パーキン・エルマー（Parkin Elmer）-Model 2400 Thermal CyclerTMにおいて、ＰＣＲ増幅を実施し、この増幅条件は、９４℃１分、５０℃１分、及び７２℃２分、３０サイクルであった。遺伝子プローブとして増幅した産物を用いる前に、そのヌクレオチド配列を確認した。タック・ジデオキシ（Taq DyeDeoxy）ターミネーターサイクル配列決定キット、及びエービーアイ・プリズム（ABI Prism）３１０ジェネティックアナライザー（Genetic Analyzer）（パーキン・エルマー）によってヌクレオチド配列決定を決定した。
【００２３】
可能性のあるＢＶＭＯコード遺伝子のＰＣＲ増幅で使用するために、これまでで初めて、プライマーの特別なセットを２つ設計した。このストラテジーでは、進化的に別個の起源のタンパク質であって、ただし共通の生物学的活性又は機能を有するタンパク質の間で保存されたアミノ酸配列のブロックが、遺伝子クローニングのための情報の貴重な供給源であるという事実を利用した。本出願に記載されたｃｄｎＢの首尾よいクローニングによってこのアプローチを確証する。各々２つのセットのプライマーによって生成された増幅遺伝子産物をプローブとして用いた。この設計されたプローブのセットは、任意の他のＢＶＭＯ関連遺伝子のクローニングに有用であると期待される。
【００２４】
ＣＤＭＯ含有遺伝子をクローニングするために、製造業者の指示に従って、ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ系（ベーリンガー・マンハイム・ジーエムビーエイチ（Boehringer Mannheim GmbH））によって、増幅されたフラグメントを標識して、種々の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩ、及びＸｂａＩ）で切断されたＨＩ−７０株のゲノムＤＮＡのサザーンハイブリダイゼーションをプローブするために用いた。結果として、約４．２ｋｂのＢｃｌＩフラグメント、及び４．０ｋｂのＳｔｕＩフラグメントの単一のハイブリダイズするバンドを得た。ハイブリダイゼーション条件は、サンブロック（Sambrook）らに従って６８℃で実行した。引き続き、０．８％アガロースゲル上で分離されたＢｃｌＩ又はＳｔｕＩで切断した総ＤＮＡの３．５ｋｂ〜４．５ｋｂのサイズの精製画分を、イー・コリプラスミド  ｐＵＣ１９に対して連結して、これを直線化して脱リン酸化した。
【００２５】
プローブとしてＰＣＲ産物を用いるコロニーハイブリダイゼーションによって、４．２ｋｂのＢｃｌＩ及び４．０ｋｂのＳｔｕＩのインサートを含有するクローンをスクリーニングした；これらの組み換えプラスミドを、ｐＣＤ２００（４．２ｋｂ  ＢｃｌＩ）、及びｐＣＤ１００（４．０ｋｂ  ＳｔｕＩ）と命名した。図１において図示される遺伝子マップが確認されている。
【００２６】
イー・コリにおけるｃｄｎＢ遺伝子の発現
以下の配列（配列番号５、及び配列番号６）の２つのプライマーを合成してｃｄｎＢ遺伝子を増幅し、得られた１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントをｐＳＤ８０プラスミドにクローニングしてｐＣＤ１０１を得た。プラスミドｐＳＤ８０は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流にｔａｃプロモーター、ＭＣＳの下流にｕｎｃターミネーター配列、及びプラスミド上のいずれかにｌａｃｌｑを含む、市販のｐＫＫ２２３−３ベクター（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の第三世代の誘導体である。このプライマーは、以下のとおりであった：ｐＳＤ８０ベクターの互換性の部位（ＥｃｏＲＩ）におけるクローニングを容易にするために、ＥｃｏＲＩ制限部位を内蔵する５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣ−３’（配列番号５）及び５’ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＡＣＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号６）。Ｐｆｕポリメラーゼを用い、増幅条件を、９４℃１分、５０℃１分、及び７２℃３分の３０サイクルとした。アガロースゲルから、増幅されたＤＮＡフラグメントを精製して、ＥｃｏＲＩで消化した。
【００２７】
得られた組み換えプラスミドの１つを、ｐＣＤ１０１と命名した。ＤＮＡ配列決定によって、ＰＣＲ増幅の間にｃｄｎＢ遺伝子中に変異は導入されなかったことを確認した。
【００２８】
ｃｄｎＢ遺伝子のＤＮＡ配列を、配列番号７のとおり決定した：
2005502380.tif 000003
配列番号７の配列から、本発明のＣＤＭＯのアミノ酸配列を、配列番号８のとおり決定した：
2005502380.tif 000004
2005502380.tif 000005
ｃｄｎＢ遺伝子は、実験から決定された６６ｋＤａの分子量を有する６００アミノ酸残基をコードする（図２）。
【００２９】
ＣＤＭＯに存在する顕著な配列モチーフ及び関連のタンパク質は、フラボタンパク質水酸化酵素において見出されたものと類似であるＦＡＤ結合フィンガープリント（ＧＸＧＸＸＧ：）である。
【００３０】
イー・コリ及び天然のＨＩ−７０におけるＣＤＭＯ活性の比較
イー・コリ  ＤＨ５α（ｐＳＤ−ｃｄｎＢ）由来のＣＤＭＯ活性は、０．４８Ｕ／タンパク質ｍｇであると決定された。この値は、もとのＰ．ｐｕｔｉｄａのＨＩ−７０株について得られた値（０．１４Ｕ／タンパク質ｍｇ）の約３倍である。
【００３１】
クローニングされたＣＤＭＯの基質特異性：
シクロドデカノン（１００％の相対活性）
シクロトリドデカノン（１３８％）
シクロペンタデカノン（１４４％）
シクロウンデカノン（５６％）
シクロデカノン（１０％）
小型の員環（４〜９）を有する脂環式ケトンに対するＣＤＭＯの活性は、相対的に不十分であって、検出できない。クローニングされたＣＤＭＯの基質特異性は、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＨＩ−７０株由来の天然のＣＤＭＯの基質特異性と同一である。
【００３２】
少なくとも１０員環を有するシクロ化合物に対するＣＤＭＯの特異性スペクトルは、任意の他の公知のＢＶＭＯとは異なり、この酵素に特徴的なものである。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
産業分野におけるＣＤＭＯ組み換え生体触媒の有用性
従来のケトンからラクトンへの生体内変換以外に、ＢＶＭＯは概して、いくつかのヘテロ原子酸化が可能である。これらの反応としては、スルホ酸化、ホスホ酸化、アミン酸化、ホウ素酸化、及びセレノ酸化が挙げられる（ケリー（Kelly）ら、（前出）；Stewart、前出）。例えば、スルホ酸化（スルフィドからスルホキシド）を実施するためのＢＶＭＯの使用は、非対称的な合成におけるキラル補助剤としてスルホキシドが重要であることから、かなり興味深い。
【００３４】
上述の基質に加えて、ＣＤＭＯの基質範囲は、ヘテロ原子含有化合物におよぶことが期待される。特に興味深いのは、悪臭を放つ虫であるピエゾドラウス・ハイブネリ（Piezodorus hybneri）の性フェロモン成分である１５−ヘキサデカノライドの生成である（クワハラ（Kuwahara）ら（前出））。後者の虫は、大豆及びインゲンマメのようなマメ科植物の悪名高い害虫である。いままでのところ、１５−ヘキサデカノライドは、５段階でエチル（Ｒ）−β−ヒドロキシ酪酸塩から調製された（Ｒ）−１５−ヒドロキシヘキサデカン酸のヤマグチ（Yamaguchi）又はミツノブ（Mitsunobu）のマクロラクトン化反応を用いて化学的に合成することができる（図３；クワハラ（Kuwahara）ら、（前出））。ＣＤＭＯ触媒化の単一反応工程によって、毒性であるか又は「原子不経済的な（atom-uneconomical）」、すなわち浪費的である、種々の溶媒及び化学物質の使用を回避する。図３における比較を参照のこと。
【００３５】
シクロドデカノンのような大型の員環化合物は、石炭の構造のように記載されている。炭素環が大きいほど、その環はより可塑性であり（環状アルカンのボート及びイス型構造を念頭に置くこと）、そしてその環は、開鎖アルカンの構成のような構成をとる可能性が高くなる。大型の環に向かうＣＤＭＯの特異性によって、さらなる付加価値的な産物を生成するための、石炭において見出される構造のような脂肪族架橋構造に対する触媒性の攻撃の能力が示される。
【００３６】
本発明の新規なシュードモナス・プチダのＨＩ−７０株は、２００２年９月１８日に、カナダの国際寄託機関（International Depositary Authority）（ナショナルマイクロバイオロジーラボラトリー・ヘルス（National Microbiology Laboratory,Health）カナダ（Canada），カナディアンサイエンスセンターフォーヒューマンアンドアニマルヘルス（Canadian Science Centre for Human and Animal Health），１０１５  アーリントン州（Arlington St.）、スイート（Suite）Ｈ３１３０，ウィニペグ（Winnipeg），ＭＢ  Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２）に寄託されて、アクセッション番号ＩＤＡＣ−１８０９０２を付与された。
【００３７】
本発明は、その特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる改変が可能であって、本出願は、概して本発明の原理に従う本発明の任意のバリエーション、用途又は適合を包含することを意図している。これには、本発明が属しておりかつ本明細書において前記される本質的な特徴に適用され得るところの、公知の範囲内に収まるか、又は当該分野の範囲内の習慣的な実施のような、そして添付の特許請求の範囲内に従う、本開示からの逸脱を包含することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、４．２−ｋｂのＢｃｌＩ及び４．０−ｋｂのＳｔｕＩのインサートを含むクローンの遺伝子マップであって、プローブとしてＰＣＲ産物を用いてコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングした遺伝子マップを図示する。
【図２】対照品サンプル及び分子サイズ標準に対して比較した、イー・コリにおいて過剰発現されたＣＤＭＯのポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクマーシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie Brilliant Blue）染色したタンパク質ゲルの写真である。
【図３】ヘキサデカノライドの５段階化学合成対１段階ＣＤＭＯ触媒化反応を図示する。
【図１】
2005502380.tif 000006
【図２】
2005502380.tif 000007
【図３】
2005502380.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2005502380.tif 000009
2005502380.tif 000010
2005502380.tif 000011
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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