(57)【要約】ＣｐＧジヌクレオチドユニットを含む共有結合的に脂質化されたオリゴヌクレオチド、またはその類似体が、単独または免疫原および／または非免疫学的薬剤と組み合わせて、癌細胞または病原体による疾病に対する保護のための免疫刺激性薬剤として使用することができる。特別のバックボーンをもった脂質化オリゴヌクレオチド、８個未満のヌクレオチドをもつ脂質化オリゴヌクレオチド、および長いヌクレオシド間結合によって結合した複数のＣｐＧジヌクレオチド含有セグメントを含む脂質化オリゴヌクレオチドが特に関心をもたれる。これらの化合物もまたそれ自体新規である。
2005526497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）複数のヌクレオチドを含み、各ヌクレオチドは核酸塩基を含み、そしてそれによって少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニトオまたはその類似物を含む、少なくとも一のヌクレオチド配列、および（２）少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基、から構成される、少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖を含む、免疫刺激性分子の有効量を免疫学的に対象に投与することから構成される、対象の免疫系を刺激する方法。
【請求項２】
前記要素（１）がＣｘＧジヌクレオチドユニットから構成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＣｘＧジヌクレオチドユニットがＣｐＧユニットである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一の親油基が強親油基である、請求項１ないし３記載のいずれかの方法。
【請求項５】
少なくとも一の親油基が強親油基（Meylan）である、請求項１ないし４記載のいずれかの方法。
【請求項６】
少なくとも一の親油基が、Meylanアルゴリズムに従って、少なくとも4の、予測したlogＰをもつ、請求項１ないし５記載のいずれかの方法。
【請求項７】
少なくとも一の親油基が、Meylanアルゴリズムに従って、少なくとも7の、予測したlogＰをもつ、請求項１ないし５記載のいずれかの方法。
【請求項８】
少なくとも一の親油基が、Meylanアルゴリズムに従って、少なくとも10の、予測したlogＰをもつ、請求項１ないし５記載のいずれかの方法。
【請求項９】
（ａ）式中ｎは6から26の範囲の値をもつ整数である−(ＣＨ２)４ＮＨＣＯ−(ＣＨ２)ｎＣＨ３、（ｂ）式中ｍおよびｎは6から26の範囲の値をもつ整数である
【化１】
2005526497.tif 000019
（ｃ）式中Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であり、−Ｒが脂肪族である−ＸＲ、
（ｄ）式中Ｘが−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＨ−であり、−Ｒが少なくとも部分的に芳香族である−ＸＲ、からなるグループから少なくとも一の親油基が選択される、請求項１ないし８記載のいずれかの方法。
【請求項１０】
−Ｒが、下記の構造の一つから構成されるグループから選択される基である、請求項９記載の方法。
【化２】
2005526497.tif 000020
式中、ｍ、ｎ、およびｋは独立性の整数で、3から30の範囲の値である。
【請求項１１】
少なくとも一の親油基が、図２に描いた親油基のグループの一つである、請求項１ないし９記載のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記分子が少なくとも2個の親油基を含む、請求項１ないし１１記載のいずれかの方法。
【請求項１３】
前記分子が少なくとも2個の強親油基を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記分子が少なくとも2個の強親油基（Meylan）を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
各ヌクレオチド鎖につき8個未満の核酸塩基である、請求項１ないし１４記載のいずれかの方法。
【請求項１６】
各ヌクレオチド鎖につき5個未満の核酸塩基である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記各核酸塩基が、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、およびヒポキサンチンからなるグループから選択される、請求項１ないし１６記載のいずれか方法。
【請求項１８】
前記各核酸塩基が、アデニン、グアニン、チミン、およびシトシンからなるグループから選択される、請求項１ないし１６記載のいずれかの方法。
【請求項１９】
少なくとも一のヌクレオチドが、核酸塩基−炭水化物ヌクレオシドから構成される、請求項１ないし１８記載のいずれかの方法。
【請求項２０】
前記炭水化物が単糖類である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記単糖類の炭素原子数が３ないし８である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記単糖類がペントースである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記単糖類がアルドースである、請求項２０ないし２２記載のいずれかの方法。
【請求項２４】
前記単糖類が環化されている、請求項２０ないし２３記載のいずれかの方法。
【請求項２５】
前記単糖類がピラノースである、請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記単糖類がリボースまたは２−デオキシリボースである、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記一本鎖ヌクレオチドのすべてが、核酸塩基−炭水化物ヌクレオシドから構成される、請求項１ないし２６記載のいずれかの方法。
【請求項２８】
少なくとも一のヌクレオチドがさらにリン酸を含む、請求項１ないし２７記載のいずれかの方法。
【請求項２９】
少なくとも一のヌクレオチドがただ1個のリン酸のみを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも一の鎖はＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも一の親油基は、少なくとも一の鎖の自由末端に共有結合的に組み込まれる、請求項１ないし３０記載のいずれかの方法。
【請求項３２】
少なくとも一の親油基は、少なくとも一の鎖の３’末端に共有結合的に組み込まれる、請求項１ないし３１記載のいずれかの方法。
【請求項３３】
前記親油基がリン酸基を通して前記末端に付加している、請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも一の親油基がヌクレオシド間結合に組み込まれる、請求項１ないし３３記載のいずれかの方法。
【請求項３５】
少なくとも一の親油基が核酸塩基の置換体である、請求項１ないし３４記載のいずれかの方法。
【請求項３６】
少なくともオリゴヌクレオチドの一部が、ＤＮＡおよびＲＮＡのバックボーンとは異なるバックボーンをもつ、請求項１ないし３５記載の方法。
【請求項３７】
前記バックボーンが、ヌクレオシド間結合がリン酸基でないという点で異なる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記バックボーンが、少なくとも一のヌクレオチドがリボースまたは２−デオキシリボースを含まない通常でないヌクレオチドである、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記通常でないヌクレオシドが糖を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記通常でないヌクレオチドが糖を含まない、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが少なくとも一部ＰＮＡオリゴマーである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも一の通常でないヌクレオチドが、核酸塩基−Ｏ−アルキルの形の通常でないヌクレオシドを含み、式中−Ｏ−アルキルはポリオールの残基であり、そしてアルキルが6を越えない炭素原子である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリオールがグリセロールで、このため前記アルキルが3個の炭素原子である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも通常でないヌクレオシドがリン酸基に結合している、請求項３６ないし４０、４２または４３記載のいずれかの方法。
【請求項４５】
隣接する二つの前記通常でないヌクレオシドがあって、これらヌクレオシドの間の前記ヌクレオシド間結合がリン酸基である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
隣接する二つの前記通常でないヌクレオシドがあって、これらヌクレオシドの間の前記ヌクレオシド間結合が、−リン酸基−リンカーＺ−リン酸基−であり、式中リンカーＺが脂肪族である、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
リンカーＺが、−［小さなアルキル−Ｏ］ｎの形で、式中ｎは1から20で、そして小さなアルキルは6を越えない炭素である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
リンカーＺが、−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−の形である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記ジヌクレオチドユニットが非天然ヌクレオシドから構成され、またはヌクレオシド間結合がリン酸基でない、請求項１ないし４８記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
ＣｘＧジヌクレオチドユニットが、二つの非天然ヌクレオシドから構成され、そしてこれらヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合がリン酸基である、請求項１ないし４８記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
前記ジヌクレオチドユニットが、二つの非天然ヌクレオシドから構成され、そしてこれらヌクレオシド間の前記ヌクレオシド間結合が、−リン酸基−リンカーＺ−リン酸基−であり、式中リンカーＺが脂肪族である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
リンカーＺが、−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−でｎが1ないし20の、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記ジヌクレオチドユニットがＰＮＡオリゴマーである、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
前記ジヌクレオチドユニットがＧＮＡオリゴマーである、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
前記分子が二本鎖構造をもたない請求項１ないし５４記載のいずれかの方法。
【請求項５６】
前記分子が少なくともいくらかの二本鎖構造をもつ請求項１ないし５４記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
各オリゴヌクレオチド鎖につき7個を越えない核酸塩基がある、請求項１ないし５６記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
各オリゴヌクレオチド鎖につき4個を越えない核酸塩基がある、請求項１ないし５６記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５９】
前記分子がさらに、少なくとも一のエピトープを含む請求項１ないし５８記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも一のエピトープが炭水化物エピトープである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも一のエピトープがペプチドエピトープである請求項５９または６０記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも一のエピトープがＢ細胞エピトープである請求項５９ないし６１のいずれか１項記載の方法。
【請求項６３】
少なくとも一のエピトープがＴ細胞エピトープである請求項５９ないし６２のいずれか１項記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも一のエピトープがＭＵＣ１エピトープである請求項５９ないし６３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６５】
前記オリゴヌクレオチドが環化していて、このため自由末端がなく、そして親油基が前記分子中の任意の場所に組み込まれている、請求項１ないし６４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６６】
前記分子が二またはそれ以上のセグメントからなり、各セグメントは短いヌクレオシド間結合によって互いに結合しているヌクレオシドからなり、各セグメントは少なくも互いに長いヌクレオシド間結合によって結合していて、少なくとも前記セグメントの二つはそれぞれ少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットまたはその類似物からなる、請求項１ないし６４のいずれか１項記載のいずれかの方法。
【請求項６７】
前記セグメントが前記ヌクレオシド間結合によって結合して、一またはそれ以上の直鎖を形成する、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
二またはそれ以上のセグメントが、二またはそれ以上のヌクレオシド間結合によって環化されている、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも一のヌクレオシド間結合が高めの結合次数で、同時に二またはそれ以上のセグメントと互いに結合していて、それによって前記セグメントが結合して分枝構造をとる、請求項６６記載の分子。
【請求項７０】
少なくとも一のヌクレオシド間結合がペンタエリスリオールユニットからなる請求項６６記載の分子。
【請求項７１】
前記分子が以下の構造特性をもち、式中Ｒは親油基で、Ａ１、Ａ２、およびＡ３が独立して結合の腕が0ないし20原子長で、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立して水素原子、親油性基またはオリゴヌクレオチド残基からなる群から選択される、請求項６６記載の分子。
【化３】
2005526497.tif 000021
【請求項７２】
前記ヌクレオチド配列が、チミン二量体を形成するように二量体化される、少なくとも隣接する一対のチミン核酸塩基を含む、請求項１ないし７１のいずれか１項記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも一の親油基が、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に共有結合的に組み込まれる、請求項１ないし７２のいずれか１項記載の方法。
【請求項７４】
前記分子が癌細胞に対して細胞障害性の活性をもたない、請求項１ないし７３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７５】
対象がガンに罹患していない、請求項１ないし７４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７６】
対象が他のガン予防法を全く投与されていない、請求項１ないし７５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７７】
前記分子が、対象中に既に存在する病原体または癌に対する特異的生得的な免疫反応を増強する、請求項１ないし７６のいずれか１項記載の方法。
【請求項７８】
前記対象に対して免疫原からなる製薬的な組成の投与して、前記分子が前記免疫原に対して特異的に誘発した免疫反応を増強することをさらに含む、請求項１ないし７６のいずれか１項記載の方法。
【請求項７９】
前記分子および前記免疫原が同時に投与される請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記分子および前記免疫原が同じ組成中で投与される、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記免疫刺激性オリゴヌクレオチド分子が、前記病原体または癌に対する保護的な特異的免疫反応を誘発する免疫原でもある、請求項７８記載の方法。
【請求項８２】
免疫刺激する対象のための合成物の製造についての、請求項１ないし７４のいずれか１項記載で定義した免疫刺激性分子の使用。
【請求項８３】
少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖から構成され、前記鎖はヌクレオチド配列からなり、前記ヌクレオチド配列は複数のヌクレオチドからなり、各ヌクレオチドは核酸塩基からなり、そしてこれは少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットまたはその類似物からなり、ならびに（２）少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基から構成され、ここで前記鎖のヌクレオチドの数は8未満である、免疫刺激性分子。
【請求項８４】
前記分子の性質が、請求項２ないし７５記載のいずれかに従ってさらに限定される、請求項８３記載の分子。
【請求項８５】
（Ｉ）少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖からなり、これは（１）複数のヌクレオチドからなる少なくとも一のヌクレオチド配列からなり、各ヌクレオチド配列は核酸塩基からなり、そしてこれは少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットまたはその類似物からなり、および（２）少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基からなり、並びに（II）エピトープからなる、免疫刺激性分子。
【請求項８６】
少なくとも一のエピトープが炭水化物エピトープである請求項８５記載の分子。
【請求項８７】
少なくとも一のエピトープがペプチドエピトープである請求項８５または８６記載の分子。
【請求項８８】
少なくとも一のエピトープがＢ細胞エピトープである請求項８５ないし８７のいずれか１項記載の分子。
【請求項８９】
少なくとも一のエピトープがＴ細胞エピトープである請求項８５ないし８８のいずれか１項記載の分子。
【請求項９０】
少なくとも一のエピトープがＭＵＣ１エピトープである請求項８５ないし８９のいずれか１項記載の分子。
【請求項９１】
前記分子の性質が、請求項２ないし５９の記載のいずれかに従ってさらに限定される、請求項８５ないし９０のいずれか１項記載の分子。
【請求項９２】
（Ｉ）少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖から構成されていて、そのオリゴヌクレオチド鎖が（１）複数のヌクレオチドからなる少なくとも一のヌクレオチド配列からなり、各ヌクレオチドはヌクレオシドからなり、各ヌクレオシドは核酸塩基からなり、各ヌクレオシドは少なくとも一の他のヌクレオシドにヌクレオシド間結合によって結合していて、
ここで前記分子は二またはそれ以上のセグメントからなり、各セグメントは短いヌクレオシド間結合によって互いに結合しているヌクレオシドからなり、各セグメントは長いヌクレオシド間結合によって少なくとも他のセグメントに結合していて、
少なくとも二の前記セグメントがそれぞれ少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットまたはその類似物であり、
ならびに前記オリゴヌクレオチド鎖が（２）少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基からなる、
免疫刺激性分子。
【請求項９３】
前記セグメントが前記ヌクレオシド間結合によって一またはそれ以上の直鎖を形成する、請求項９２記載の分子。
【請求項９４】
一またはそれ以上のセグメントが一またはそれ以上の前記の長いヌクレオシド間結合によって結合して環式構造を形成する、請求項９２記載の分子。
【請求項９５】
少なくとも一のヌクレオシド間結合が高めの結合次数で、同時に三またはそれ以上のセグメントと互いに結合していて、それによって前記セグメントが結合して分枝構造をとる、請求項９２記載の分子。
【請求項９６】
少なくとも一のヌクレオシド間結合がペンタエリスリトールユニットからなる請求項９２記載の分子。
【請求項９７】
前記分子が以下の構造特性をもち、式中Ｒは親油基で、Ａ１、Ａ２、およびＡ３が独立して結合の腕が0ないし20原子長で、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が独立して水素原子、親油性基またはオリゴヌクレオチド残基からなる群から選択される、請求項９２記載の分子。
【化４】
2005526497.tif 000022
【請求項９８】
前記分子の性質が、請求項２ないし６４のいずれか１項記載に従ってさらに限定される、請求項９２ないし９７のいずれか１項記載の分子。
【請求項９９】
少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖から構成されていて、前記鎖が（１）ヌクレオチド配列からなり、前記ヌクレオチド配列は複数のヌクレオチドからなり、各ヌクレオチドは核酸塩基からなり、そしてこれは少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットまたはその類似物からなるもので、さらに前記鎖が（２）少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基からなり、ここで、前記ヌクレオチド配列は少なくとも隣接する一対のチミン核酸塩基をもっていて二量体化によりチミン二量体を形成している、免疫刺激性分子。
【請求項１００】
ヌクレオシド間結合が、ポリ（Ｎ−ビニル）、ポリ（メタクリルオキシエチル）、ポリ（メタクリルアミド）、およびポリ（エチレンイミン）からなる群からは選択されない、請求項１ないし８１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣｐＧジヌクレオチドユニット、またはその類似体、を構成する共有結合的に脂質化したオリゴヌクレオチドの免疫刺激剤としての使用に関する。特別なバックボーンをもつ脂質化したオリゴヌクレオチド、８以下のヌクレオチドをもつ脂質化したオリゴヌクレオチド、およびヌクレオシド間の長い結合によって結合した複数のジヌクレオチド含有ＣｐＧセグメントを構成する脂質化したオリゴヌクレオチドは、特に興味深い。
【背景技術】
【０００２】
侵入する微生物に対する効果的な宿主の防衛には、外来性の病原体の検知と微生物作動体応答の迅速な展開を必要とする（Krutzikら、2001）。特に、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）とも呼ばれる、微生物侵入者の分子サインとして見ることのできる、微生物代謝の構成的および保存的生成物を認識することによって、生得的な免疫系は、感染の存在および性質を検知することができる（Janeway、1992）。ＰＡＭＰｓは、生得的な免疫系の種々のパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）によって認識され、これは細胞表面、細胞内区分に発現されるか、または血流および組織液中に分泌される。そして、生得的な免疫系は、宿主防衛の第一線を提供し、そして順応性免疫応答のエフェクタークラスの開始および決定を制御する（Medzhitov、2001）。
【０００３】
Toll様受容体リガンド
（ＴＬＲ）ファミリーの最近の発見および性質決定よって、生得的免疫分野に新しい関心を駆り立てた。ＴＬＲｓもまたパターン認識受容体（ＰＲＲｓ）であり、動物免疫中で独特かつ必須の役割をもつ。哺乳動物種においては少なくとも１０種類のＴＬＲｓが現在まで知られており（Medzhitov、2001）、そしてそれぞれが生得的な免疫認識において異なる役割をもっているようである。数ダースのＴＬＲリガンドが同定されてきた（Akiraら、2001）。
構造および起源の多様性にかかわらず、ＴＬＲリガンドはいくつかの共通の性質をもつ。たとえば、ほとんどのＴＬＲリガンドは保存された微生物生成物（ＰＡＭＰｓ）で、これは感染の存在を合図する；そして多くの個々のＴＬＲｓは構造的に無関係なリガンドをいくつか認識することができる。ＴＬＲリガンドが生得的な免疫系の強力な活性化因子であることは明らかで、これは順々に順応性免疫反応を方向付けて決定する。
【０００４】
ＣｐＧモチーフ
パターン認識の最も不思議な例は、ＴＬＲ９によるバクテリアＤＮＡにおける非メチル化ＣｐＧモチーフの認識かもしれない（Hemmiら、2000）。実際、ある特定の配列中における非メチル化バクテリアＤＮＡ（いわゆるＣｐＧモチーフ）は、その強力な免疫刺激性活性によってかなり前から知られている（Kriegら、Nature、1995）。
WO98／18810（アイオワ大学研究財団）は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含んだ特定の核酸が、被験者のリンパ球を活性化し、被験者の免疫応答をＴｈ２からＴＨ１に向け直し、すなわち、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、およびＧＭ−ＣＳＦを含むＴｈ１サイトカインの生産を増やすということを、教示する。特に、これは式
５’Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２３’
によって「表現された」約８から３０塩基の単離された免疫刺激性核酸配列を開示していて、ここで式中少なくとも一のヌクレオチドが連続的なＣｐＧｓを分離し、Ｘ１はＡ、ＧまたはＴで、Ｘ２はＣまたはＴで、Ｎは任意のヌクレオチドで、そしてＮ１＋Ｎ２は０から２６のヌクレオチドであり、後者はＣＣＧＧ四量体または一のＣＣＧもしくはＣＧＧ三量体を含まないという条件付きである。マウス細胞の刺激に関して、二の５’プリン（好ましくはＧｐＡ）および二の３’ピリミジン（好ましくはＴｐＴまたはＴｐＣ）によって隣接されたＣｐＧについて優先が明示されている。
著者は、８塩基以下のオリゴマーは非刺激性で（25頁、16から17行）、調べたオリゴマーが７−マー（表１、４ｅ）であることを報告している。以下も参照のこと、Soneharaら、「５’−ＣＧ−３’モチーフをもつ六量体回文構造オリゴヌクレオチドのインターフェロンの生成誘発」、J.  Interferon  ＆  Cytokine  Res.,  16：799-803（1996）（「微々たる」ＡＣＧＴのIFN誘導活性）。対照的に、本発明においては、脂質化すれば、ジヌクレオチドそのものさえも活性をもつことを見出した。
WO98／40100（オタワ市ローブ研究所、チ−アジャン、およびアイオワ大学研究財団）、WO99／51259（アイオワ大学研究財団）、WO99／61056（オタワ病院のローブ健康研究所、ＣＰＧ免疫製薬会社）は、類似を教示している。WO98／40100が少なくともオチゴヌクレオチド５塩基の長さであることを限定している一方で、それでもなお、所望の免疫刺激活性のためには少なくとも８塩基を要することを教示している。WO01／97843は、免疫刺激性核酸が６ヌクレオチド以上の任意の長さを持つことができることを述べている（７頁、12行）。WO99／61056（3頁、30行）は、８ヌクレオチドが好ましくはあるが、６ヌクレオチドが粘膜の免疫を誘導することができることを暗示している（8頁、17行）。
WO01／12804（ハイブリドン社）は、ＣｐＧの５’末端に直に隣接している２塩基が２’−ＯＭｅ置換であることが望ましいことを教示している。
WO01／97843（アイオワ大学研究財団）は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが「Ｔリッチ」であることが望ましいことを教示している。すなわち、25％以上のＴ、より好ましくは、40％以上、50％以上、60％以上、80％以上、または90％以上のＴである。少なくとも３の連続したＴ塩基からなる少なくとも一のポリＴモチーフを構成することが望ましいことを教示している。長めのポリＴモチーフ（少なくとも４から９のＴ）および複数のポリＴモチーフ（少なくとも２から８）についての優先を明示している。同様に、ポリＡ、ポリＣ、およびポリＧモチーフの望ましさも開示している。
WO00／54803（Panacea  Pharmaceuticals、LLC）は免疫原に対するアレルギー反応を改善するためのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの使用に関する。Ｔｈ２タイプアレルギー免疫反応からＴｈ１タイプ免疫反応への転換についてのDeKruyff、ＵＳＰ6,086,898（2000）も参照。
WO01／07055は、インビボのより高い安定のための、特定のトポロジーをもつＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用を教示する。
【０００５】
リポテイコ酸；二本鎖リボ核酸
構造的に関連するグラム陽性バクテリアからのリポテイコ酸（ＬＴＡ）およびウイルスからの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）もまた、宿主生得的免疫を活性化する性質によってよく知られている。最近の研究は、ＴＬＲ４はＬＴＡ認識に関与し（Takeuchiら、1999）、ＴＬＲ３はｄｓＲＮＡについて細胞表面受容体として働く（Alexopoulouら、2001）ことを示している。
タイコ酸はポリオールリン酸ポリマーで、リン酸ジエステル結合によってリビトールまたはグリセロールのいずれかと結合している。天然のタイコ酸のポリオール鎖への置換基には、Ｄ−アラニン（エステル結合）、Ｎ−アセチルグルコサミン、およびグルコースを含む。リビトールタイコ酸中、１，５−リン酸ジエステル結合が存在する。グリセロールタイコ酸中、１，２−または１，３−リン酸ジエステル結合が存在する。グリセロールタイコ酸は非置換か、残りの部位で置換（たとえばアラニルまたはグリコシル）されている。
【０００６】
グリセロール核酸
Usman、JubyおよびOgilvie、「グリセロヌクレオシドホスホラミダイトシントンおよび非環式オリゴヌクレオチドの固相中合成におけるその使用」Tetrahedron  Lett.,  29：4831-4（1988）には、ヌクレオチドのホモオリゴマー（２から８ユニット長）合成が記述されていて、ここではアデニンあるいはチミンのいずれかはグリセロヌクレオシドの一部である。グリセロヌクレオシドそれ自体、特にプリン（アデニンおよびチミン）を塩基構成成分として含むものは、強力な抗ウイルス剤であることがついでに記述されている。
SchneiderおよびBenner、「柔軟なヌクレオシド類似物を含有するオリゴヌクレオチド」J.  Am.  Chem.  Soc.  112：453-55（1990）は、リボースがグリセロール誘導体によって置換されたオリゴヌクレオチドを開示している。しかしながら、バックボーン中の変更は、安定な二重鎖構造を形成するためのオリゴヌクレオチドの安定性を減じることを見出した。各グリセロールヌクレオシドは約９から１５℃、二重鎖ＤＮＡの融点を降下した。SchneiderおよびBennerによるオリゴヌクレオチド合成は、少なくとも９塩基長で、そしていずれも５’−ＣＧ−３’を構成していない。
【０００７】
他のオリゴヌクレオチド類似物
オリゴヌクレオチド類似物、特にヌクレオシド間の結合を修飾したものは、従来技術で知られている。たとえば、Cook、米国特許5,717,083；  Weis、米国特許5,677,439；Rosch、米国特許5,750,669；Cook、米国特許6,114,513；Cook、米国特許6,111,085；Uhlmannら、「ＰＮＡ：異常な結合性質をもった合成ポリアミド核酸」Angrew.  Chem.  Int.  Ed.  37：2796-2823（1988）。
【０００８】
化学的に修飾した核酸
EnglishおよびGauss、「プローブおよび阻害剤としての化学的に修飾したオリゴヌクレオチド」Angrew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.、30：613-29（1991）には、ソラレン、アクリジン、ビオチン、または酵素を含むように修飾したオリゴヌクレオチドが言及されている。
既知の末端遊離基（水酸基）には、１−エトキシエチル、エトキシメチル、ベンズヒドリル、ベンジル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、メチル、エチル、アセチル、トシル、テトラヒドロピラニル、トリフルオロアセチル、アミノアシル、グリシル、ロイシル、シアノエチル、アニシル、ベンジル、およびフェニル、ならびに二機能性保護基（一般に２’および３’を結合する）を含む。
既知の末端グリコール保護（二機能性）ラジカルは、他に断らない限り２’および３’水酸基を結合していて、イソプロピリジン、ホウ酸塩、およびカルボニル２’：３’−リン酸塩（環式）を含む。
合成過程で使用されるＮ−保護ラジカルには、ベンゾイル、ベンジル、トシル、トリチル、アニソイル、ベンズヒドリル（ジフェニルメチル）、モノメトキシトリチル（ｐ−アニシルジフェニルメチル）、ジメトキシトリチル（ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル）、テトラヒドロピラニル、ダンシル、およびＮ−シクロヘキシル−Ｎ’［−（４メチルモルフォリノ）アミジノ］が含まれる。
リン酸保護基には、５’−シアノエチル；３’（または２’）―シアノエチル、アニシル（MeOPh）、ベンジル、およびフェニルが含まれる。
【０００９】
脂質化核酸
Hostetler、米国特許5,827,831は、多くの種類の薬の経口投与が、１−Ｏ−アルキル、１−Ｏ−アシル、１−Ｓ−アシル、および１−Ｓ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸誘導体に適切な官能基を持った薬を変えることで促進されることを教示しており、これらの誘導体を脂質プロドラッグと呼んでいる。Hostetlerによって教示された薬の種類には、「たとえば、９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（以下、シトシンアラビノシドまたはアラ−Ｃ）、９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（以下、アデニンアラビノシドまたはアラ−Ａ）、５−フルオロウリジン、６−メルカプトプリンリボシド、または２’−アラー−フルオロ−２−クロロデオキシアデノシンといったヌクレオシド類似物を構成している抗がん剤」、および「抗ウイルスヌクレオシド、特に米国特許第5,223,263号に開示されている抗ウイルスヌクレオシドの、１−Ｏ−アルキルリン脂質誘導体」を含む。抗ウイルスのカテゴリーにおいて、３’デオキシ、３’−アジドチミジン（ＡＺＴ）、アシクロビル、フォスカーネット、ガンシクロビル、イドクスウリジン、リババリン、５−フルオロ−３’−チア−２’，３’−ジデオキシシチジン、トリフルリジン、およびビダラビンについて特に言及されている。いかなるオリゴヌクレオチドについての脂質化については言及はされていない。
Sridhar、米国特許5,756,352は、チオ陽イオン脂質化核酸共役体を開示している。陽イオン脂質は陰イオン核酸分子に非共有結合的に結合する。本発明は、オリゴヌクレオチドへの親油性基の共有結合性の付加を要する。
Chengら、米国特許5,646,126は、３’末端に付加した、親油性基をもった二本鎖オリゴヌクレオチド、好ましくはステロイド構造、を開示している。このオリゴヌクレオチドは８から１８塩基（鎖あたり）を構成している。これより短いオリゴヌクレオチド、または少なくとも一定の二本鎖構造をもついかなる分子についても、開示あるいは示唆していない。
Chengらは二本鎖構造をもった３種の分子を考えている。第１のタイプでは、オリゴヌクレオチドは回文構造であり、そのため２つの分子が共同で二重鎖を形成する。第２のタイプでは、２つの異なってはいるが実質的に相補的な鎖が、ハイブリッド形成して二本鎖を形成する。最後に、第三のタイプでは、オリゴヌクレオチドは少なくとも一部がそれ自体相補的であり、そのため「ヘアピン」で二本鎖構造を形成している。
彼らに興味を抱かせたオリゴヌクレオチドは抗がん作用をもつものである。彼らのオリゴヌクレオチドが免疫刺激作用をもつかどうかについてはいかなる開示も示唆もしていない。
これらのオリゴヌクレオチドのいくつか（たとえば、１２０Ｈ、１２８Ｈ、００１Ｈ、１６７Ｈ、００２Ｈ、０８９Ｈ、５８９Ｈ、１７８Ｈ、６７８Ｈ）は、５’−ＣＧ−３’を構成する。配列１２８Ｈ（ＣＡＣＡＣＧＴＧＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の３’修飾は、コレステロール＊、ヘキシルアミン、アクリジン、ヘキサノール、ヘキサデカン、コレスタノール＊、エルゴステロール、スチグマスタノール＊、スチグマステロール＊、およびメチルリサコール酸を含み、＊印の修飾のみが抗がん作用をもつ（Cheng  図１０参照）。このため、Chengらは、その図１のステロイド骨格をもったものの他にについてはそれ以上の３’親油性修飾をもったものの実験をやめている。Chengらは５’親油性付加物についてのいかなる開示も教示もしていない。
Chengらはバックボーン修飾、特にホスホロチオネート（Ｐ−Ｓ０）結合、の可能性について予想している一方で、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）バックボーンについて特には示唆していない。実際、ＧＮＡバックボーンは二重鎖の安定性を減じるので、ＧＮＡバックボーンの使用は、Chengらのオリゴヌクレオチド二重鎖の教示に反したであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
目標とした核酸
Manoharan、米国特許6,300,319は、細胞表面受容体リガンドをオリゴヌクレオチドに付着して、問題となる細胞へのオリゴヌクレオチドの運搬を促進することを開示している。Manoharanは、天然オリゴヌクレオチドはポリアニオンでかつ細胞への透過性に乏しい一方で、メチルホスホネートは中性でかつはるかに容易に摂取されることを記述している。Manoharanによって予想されたリガンドは、主にガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、マンノース、およびシアル酸といった炭水化物（標的細胞表面レクチン）である。親油性基については考慮されていない（下記、表Ｋ−２参照）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、免疫系を刺激する方法に関し、これはオリゴヌクレオチドの投与からなり、このオリゴヌクレオチドは、（１）一またはそれ以上の「ＣｘＧ」ジヌクレオチドユニット（すなわち、核酸塩基シトシンを提示しているヌクレオチドが直接、核酸塩基グアニンを提示しているヌクレオチドに結合している）、またはその免疫刺激的類似物、および（２）一またはそれ以上の共有結合的に付加して（組み入れられて）いる親油性基、から構成されている。
ＣｘＧジヌクレオチドユニットの存在は、オリゴヌクレオチドにＴＬＲリガンド能を与える。
親油性基は、直接的であるかあるいはリポソームの薬物送達処方への脂質化オリゴヌクレオチドの組み入れを通してかのいずれにしろ、細胞膜へのオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる。また、細胞表面脂質受容体と相互作用することもできる。
ＣｘＧを含有する５塩基以下のオリゴヌクレオチドが免疫刺激活性をもつことをも我々は見出し、そしてこれが親油性基の存在によるものであるとする。
このオリゴヌクレオチドが、グリセロール核酸バックボーンといったオルタナティブなバックボーンを構成することができ、そして免疫刺激活性をもつことをも見出した。
本発明のこのオリゴヌクレオチドは、Chengによって調べられたガン細胞のための細胞毒性を持つこともできるが、必要とするものではなく、そして、ガンに罹患している人同様そうではなく免疫系刺激作用を要する人にも投与することができる。
本発明はまた、脂質化オリゴヌクレオチドのある特定の種類についても、化合物それ自体で、関連する（用語「脂質化オリゴヌクレオチド」は、以下、単に一またはそれ以上の親油性基をもつオリゴヌクレオチドを意味する）。
一のクラスでは、脂質化オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数は８以下（Cheng、米国特許5,646,26、によって教示された脂質化オリゴヌクレオチドの最小）である。８は、免疫刺激剤として教示されている非脂質化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに関連するWO98／18810によって教示されているヌクレオチドの最小数でもある。さらに好ましくは５ヌクレオチド以下である。図７の１から７の化合物は、このクラスの非制限的な例であり、化合物１、２、６および７はジヌクレオチドであり、一方化合物３、４および５はヘキサヌクレオチドである。
二番目のクラスでは、脂質化オリゴヌクレオチドは複数のオリゴヌクレオチドセグメントを構成し、少なくとも２のセグメントのそれぞれは少なくとも一の「ＣｘＧ」ジヌクレオチドユニットを含み、直接または間接に、ヌクレオシド間の「長い」結合を構成する成分によって、このような「ＣｘＧ」含有セグメントの少なくとも２つが結合している。長いヌクレオシド間結合によって結合している二つのＣｐＧ含有セグメントをもった、このようなマルチセグメント脂質化オリゴヌクレオチドの非制限的な例は、図３に示されている。
三番目のクラスでは、脂質化オリゴヌクレオチドは、少なくとも一の「ＣｘＧ」ジヌクレオチドユニットをもつのみならず、少なくとも一対の隣接するチミン核酸塩基をもち、これは図１９に示されるように二量体化されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の免疫刺激分子は、修飾オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、以下で定義する、少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチド（好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチド）、またはその類似物であり、そして少なくとも一の共有結合的に組み込まれた親油基である。この親油基は、このオリゴヌクレオチドの遊離末端に結合することができ、またはオリゴヌクレオチド内部にある。このオリゴヌクレオチドは直鎖状、環状、または分枝状であることができ、そして非核酸成分を含むことができる（親油基を含むが、限定するものではない）。このヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に通常見られるヌクレオチドに限定されない。
【００１３】
分子
分子は共有または非共有結合によって結合した複数の原子からなる化学的な実在物である。それゆえ、二本鎖ＤＮＡ分子中では、二本のオリゴヌクレオチド鎖があり、非共有的な塩基対が保持しあって二重鎖を形成する。この二重鎖は、一の分子とみなされる。この二重鎖が解離すると、各鎖はそれ自体として一の分子とみなされる。
【００１４】
リンカーおよび結合作用因
分子の合成を議論するとき、「リンカー」および「結合作用因」を区別するのが有益である。「結合作用因」は、少なくとも二つの反応性機能性基をもつ単分子である。二つ（あるいはそれ以上）の（同一あるいは異なる）標的分子との反応後、「基質残基−リンカー−基質残基」という形の新規の分子を形成する。このため、リンカーは、その役割を終えた後は結合作用薬の残基となる。
【００１５】
免疫刺激性分子
用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖を形成する免疫刺激性分子を意味するものとする。
どんな方法でも免疫細胞を刺激するならば、分子は免疫刺激性と考えられる。たとえば、ナチュラルキラー細胞の溶菌活性を刺激することができ、Ｂ細胞もしくはＴ細胞増殖を刺激することができ、抗体生成を刺激することができる等のリンパ球によって、たとえばサイトカイン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ベータ、ＦＬＴ−３リガンド、ＣＤ４０リガンド）生成を刺激することができる。
好ましくは、この分子はＴ細胞増殖を引き起こす。しかしながら、免疫刺激活性の任意の従来技術に従って対象の免疫系を免疫刺激することができる。本明細書の「免疫反応の特徴付け」、WO98／18810の20頁、15から21行、26行から21頁3行、およびKriegら、1995（Ｂ細胞活性）、Alexopouloら、2001（ＮＦ−ｋＢ活性、タイプ１インターフェロン生成）、Hemmlら、2000（マクロファージおよび働いているリンパ節からのサイトカイン生成）、Takeuchiら、1999（マクロファージによるＩＬ６、一酸化窒素およびＴＮＦアルファの生成；Ｂ細胞増殖およびＭＨＣクラスII発現；セリン／スレオニンキナーゼＩＲＡＫの活性化）を、免疫刺激活性の様々な手段のために参照。
免疫刺激分子は、ある局面において免疫刺激性で、他の局面において免疫抑制であることができる。
用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、少なくとも一のオリゴヌクレオチド鎖を構成する免疫刺激性分子である。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、他の免疫刺激性分子と組み合わせて使うことができる。
必ずしも必要ではないが、免疫刺激性オリゴヌクレオチドはリポソーム中に存在することができる。
免疫刺激性分子は、製薬的に投与された免疫原なしに使用して、疾病に関連する生得的な免疫反応を増強することができ、これは既に発現しているか（この場合、使用は治療である）、あるいは対象が経験する危険にあるか（この場合使用は予防的である）にかかわらない。
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、製薬的に投与された免疫原と組み合わせて使用することができる。免疫原は一あるいはそれ以上のエピトープに対する特異的な免疫反応を誘発する。すなわち免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、免疫賦活剤として、その免疫反応を非特異的な方法で増強する。それ故、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、任意の免疫原とともに使用することができる。
幾つかの実施例では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび免疫原は同一の分子であり、すなわち、免疫原はオリゴヌクレオチドを成分として、また同様に関心のある特異的なエピトープを成分として構成される。このオリゴヌクレオチドは、次に直接的（親油基が直接にヌクレオチドに付加（組み込み）される）に脂質化され、あるいは間接的に脂質化、すなわち、ペプチド成分に付加、される。
好適な実施例では、免疫原のエピトープはＭＵＣ１ペプチドエピトープである。免疫原がオリゴヌクレオチドからなる場合、オリゴヌクレオチド成分のバックボーンは少なくとも一部がＰＮＡオリゴマーであることがさらに好ましい。択一的に、オリゴヌクレオチド成分はペプチド成分に付加することができる（エピトープを構成する）。
【００１６】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドはオリゴマーで、単量体のユニットはヌクレオチドあるいはモノヌクレオチドと呼ばれる。オリゴヌクレオチドは二あるいはそれ以上のモノヌクレオチドから構成される。これは任意の数の非ヌクレオチド化学的成分から構成され、そしてこのため本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも親油基を帯びる必要がある。本発明のオリゴヌクレオチドは、「ＣｘＧ」ジヌクレオチドユニット、またはその類似物を成分とするので、ヘテロオリゴマーでもある。
オリゴヌクレオチドは、以下により、構成されると考えることができる。
（１）一連のモノヌクレオチド、
（２）一連のモノヌクレオシド、各隣接する対はヌクレオシド間リンカーによって結合している、または
（３）一連の核酸塩基、各隣接する対は塩基間リンカーによって結合している。
用語「構成される」は、本発明のオリゴヌクレオチドが、少なくとも一の親油基を含まなければならず、そして、一あるいはそれ以上のアミノ酸残基、一あるいはそれ以上の核酸塩基には付加していない炭水化物、およびそのようなものといった他の化学的成分を含むことができるので、使用されている。
【００１７】
ヌクレオチド
本発明の目的のために、ヌクレオチドは単量体で、（１）以下に定義する核酸塩基、および（２）当該のヌクレオチドの核酸塩基を直接または間接に対応する（が同一である必要はない）少なくとも一の隣接するヌクレオチドの結合手段に結合する結合手段から構成される。（この結合手段は脊椎要素と呼ぶことができる。なぜなら、集団的に、これらの脊椎要素はバックボーンと呼ばれるからである。）この定義は、従来のヌクレオチドのＩＵＰＡＣ定義よりも故意に広いものである。
オリゴヌクレオチドの脊椎要素は、ＤＮＡおよびＲＮＡと同じであることができ、あるいは異なることができ、この場合、「オールタナティブなバックボーン」と呼ぶものを形成する。脊椎要素は、全ヌクレオチドが同一であることもでき、あるいは異なることもでき、ハイブリッドバックボーンをもたらす。
もし、ＤＮＡおよびＲＮＡの場合のようにオリゴヌクレオチド鎖が直線ならば、あるいは環状ならば、このとき結合手段（脊椎要素）は三価の手段であり、一の原子価は核酸塩基に結合し、他の二つの原子価は配列中の前および後のヌクレオチドの結合手段（脊椎要素）に直接結合する（オリゴヌクレオチドはジヌクレオチドであることもでき、この場合、脊椎要素はそれぞれ一の自由原子価をももつことに注意）。
オリゴヌクレオチドが枝分れする場合、結合手段は代わりに核酸塩基を分枝コア手段に結合する二価の手段となることができる。各分枝コア手段は少なくとも二つの脊椎要素に結合して、このためこのような要素に間接的に結合するようはたらく。各ヌクレオチドの結合手段間の限界、および分枝コア手段は、いくらか任意である。
ＤＮＡおよびＲＮＡ中では、各ヌクレオチドは本質的に窒素性塩基（核酸塩基）、糖、および糖の５’炭素に結合するリン酸基からなる。ＤＮＡおよびＲＮＡの配列の多様性は、窒素性塩基の位置間の多様性に起因する。ＤＮＡ中、塩基はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンである。ＲＮＡ中、チミンはウラシルに置換する。集団的に、これらの５つの塩基は、ここでは標準の核酸塩基として言及される。標準的でない核酸塩基を使用することもでき、これについては以下で議論する。
対応する標準的なヌクレオチドは、それぞれ糖およびリン酸基から構成され、アデニル酸（ＡＭＰ）、グアニル酸（ＧＭＰ）、シチジル酸（ＣＭＰ）、チミジル酸（ＴＭＰ）、およびウリジル酸（ＵＭＰ）と厳密に呼ばれる。しかしながら、対応する塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）に対応して同定されることが珍しくない。
適切な核酸命名法のためには、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢバイオケミカル命名委員会（ＣＢＮ）、「核酸、ポリヌクレオチドおよびその成分のための省略および記号」、勧告1970、www.chem.qmul.ac.uk／iupac／misc／naabb.html.。しかしながら、ここで熟慮するＤＮＡおよびＲＮＡのある類似物についての記述の単純性のために、ときに我々は通常の命名法から離れる。
ＤＮＡまたはＲＮＡの糖は、五炭糖で、５つのメンバーからなる環（４つの炭素および一の酸素）で、ＲＮＡの場合はリボースであり、ＤＮＡの場合は２−デオキシリボースである。これらは標準的な糖と考えられる。標準的でない糖を使用することもできて、これは以下に議論する。糖の代わりに、非炭水化物成分を使用することもできる。
ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの塩基−糖成分はヌクレオシドと呼ばれる。標準的なＤＮＡおよびＲＮＡのヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、およびウリジンと呼ばれる。
本発明中、ヌクレオシドは標準的でないこともできる。非標準は、非標準的な核酸塩基の使用、非標準的な糖相当物の使用、または糖相当物への核酸塩基の非標準的な付加の使用の形をとることができる。ＤＮＡおよびＲＮＡ中、ピリミジン塩基のＮ−３またはプリン塩基のＮ−９からのグリコシド結合によって、核酸塩基は糖に結合する。
リン酸基は、ＤＮＡおよびＲＮＡの標準的なヌクレオシド間結合を供する。非標準的なヌクレオシド間結合を使用することもでき、これは以下で議論する。
塩基間リンカーを可視化することもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡ中、塩基間リンカーは、糖−リン酸−糖である。これらの塩基間リンカーは重複する。
【００１８】
塩基間およびヌクレオシド間結合のトポロジー
ＤＮＡおよびＲＮＡ中の塩基間結合のトポロジーは、反転「Ｙ」トポロジーとして記述することができる。各核酸塩基は単糖に直接結合し、各糖は二つのリン酸基に結合する。塩基間リンカーは糖−リン酸−糖で、重複している。ヌクレオシド間リンカーはリン酸基で、個別的である。糖および／またはリン酸は、もちろん他の化学的成分に置換することができ、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマー中におけるように、これは「Ｙ」トポロジーを保存する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、他のトポロジーを持つことができる。「Ｖ」トポロジーにおいては、各核酸塩基は二つの付加部位をもつ。核酸塩基の一番目の付加部位は、隣接する核酸塩基の二番目の付加部位に、リンカーによって結合する。この塩基間リンカーは、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の糖およびリン酸両方の位置を占める。「Ｖ」トポロジー中の塩基間リンカーは個別的である。「Ｖ」トポロジー中、ヌクレオシドはちょうど核酸塩基であり、ヌクレオシド間リンカーは塩基間リンカーと同様である。
【００１９】
核酸塩基（窒素性塩基）
用語「核酸塩基」は、オリゴヌクレオチド中に次々と組み込まれるヌクレオチドの中に組み込むことのできる窒素性塩基を指す。
核酸塩基は、プリンまたはピリミジンの類似物であることもできるが、好ましくはプリンまたはピリミジンである。天然ＤＮＡにおいては、プリンはアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）で、ピリミジンはシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）である。天然ＲＮＡにおいては、ウラシル（Ｕ）がチミンの代わりに現れる。核酸は、窒素性塩基が上記５つ以外の一であるように調製される。たとえば、３７ＣＦＲ§1.822（ｐ）（１）中に列挙された非標準的塩基。
ピリミジンは６員環をもち、そして、ＤＮＡおよびＲＮＡ中、糖に直接結合するのはＮ−３である。Ｎ−２、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−５およびＣ−６上での置換が可能である。
置換基は、環の原子に付加する官能基である。置換基は、好ましくは水素以外の６以下の原子である。可能な置換基は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、アルキル、ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、カルボキシ（−ＣＯＯ−）、ホルミル（−ＣＨ＝Ｏ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、オキシ（またはオキソ）（＝Ｏ）、チオ（−ＳＨ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）、チオキソ（＝Ｓ）、セレノキソ（＝Ｓｅ）、アミノ（−ＮＨ２）、アミノオキソ（＝ＮＨ）、シアノ、ニトロ（−ＮＯ２）およびニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）官能基、ならびにそれらの組み合わせによって得られるそれ以上の置換体で、たとえばハロアルキル、ヒドロキシアルキルアルコキシ（−ＯＲ）、アミノアルキル（−ＮＨＲまたは−ＮＲ２）、アルキルアリル、およびチオアルキル（−ＳＲ）である。Ｒは好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、二級ブチルまたは三級ブチルである。
ゼロ、一、二、三、四または五の独立的な選択置換基であることができる。
シトシンは、２−オキシ、４−アミノ−ピリミジンである。チミンは、２，４−ジオキシ，５−メチルピリミジンである。ウラシルは、２，４−ジオキシピリミジンである。
プリンは融合した５員環および６員環をもち、そしてＤＮＡおよびＲＮＡ中では、糖に直接結合するのはＮ−９である。Ｎ−１、Ｘ−２、Ｎ−３、Ｃ−８、Ｎ−７、およびＣ−６上での置換が可能である。可能な置換基は、ピリミジンの場合と同じである。０から６の置換が可能である。
アデニンは６−アミノ−プリンである。グアニンは２−アミノ−６−オキシ−プリンである。
特に関心のある選択的なプリンは、ヒポキサンチン（６−オキシプリン）、キサンチン（２，６−ジオキシプリン）およびオロチン酸（２，４−ジオキシ，６−カルボキシプリン）である。
加えて、アザ（ＮがＣを置換）、デアザ（ＣがＮを置換）することもできる。
【００２０】
ＣｘＧジヌクレオチドユニット
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一の「ＣｘＧ」ジヌクレオチドまたはその類似物から構成される。用語「ＣｘＧ」ジヌクレオチドは、塩基シトシン（Ｃ）から構成される一番目のヌクレオチドが、「ｘ」で表されたリンカーによって、塩基グアニン（Ｇ）から構成される二番目のヌクレオチドに付加していることを示している。リンカー「ｘ」がリン酸基から構成されるかまたはヌクレオチドが糖成分から構成されるかは必要でない。
「ＣｘＧ」ジヌクレオチドは好ましくは「ＣｐＧ」ジヌクレオチドである。用語「ＣｐＧ」ジヌクレオチドは、塩基シトシン（Ｃ）から構成される一番目のヌクレオチドが、リン酸基（ｐ）から構成されるリンカーによって、  塩基グアニン（Ｇ）から構成される二番目のヌクレオチドに付加していることを示している。ヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ中のようにリン酸−糖ヌクレオチドである必要はない。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドである場合には、配向は５’−ＣｐＧ−３’として理解される。
選択的に、ＣｘＧ（ＣｐＧを含む）ジヌクレオチドはシトシン類似物によって置換することができ、これはピリミジンで、チミンまたはウラシルに対するよりもよりシトシンに類似している。シトシンは、以下に示すようにチミンおよびウラシルとは異なる。すなわち（１）１から６の位置で、シトシンは−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）−をもち、チミン（およびウラシル）は−ＨＮ−Ｃ（＝Ｏ）−をもち、（２）５の位置では、シトシンは置換されず、チミンはメチル化されている。シトシン類似物は、これらの特徴を保存している。しかしながら、シトシン類似物は、好ましくは５−メチルシトシンではなく、というのもこのメチル化は、非脂質化ＣｐＧオリゴヌクレオチド中で免疫刺激効果を大幅に減じるからである。
同様に、ＣｘＧ（ＣｐＧを含む）のグアニンは、グアニン類似物によって置換することができ、これはプリンで、アデニンに対するよりもグアニンに類似している。グアニンはアデニンとは以下のように異なる。すなわち、（１）１から６の位置で、グアニンは−ＨＮ−Ｃ（＝Ｏ）−をもち、アデニンは−Ｎ＝Ｃ（ＮＨ２）−をもつ。そして（２）２の位置で、グアニンはアミノ化されており、アデニンは置換されていない。グアニン類似物はこれらの特徴を保存している。好ましくは、グアニン類似物はグアニンのメチル化誘導体ではない。
これらの置換が一方または両方された場合、「ＣｘＧ」（または「ＣｐＧ」）ジヌクレオチドの類似物を得る。
ＣｘＧジヌクレオチドは標準的なＤＮＡまたはＲＮＡバックボーン（これはＣｐＧジヌクレオチドの特別な場合である）を持つことができ、または代替のバックボーンを持つことができる。代替のバックボーンはＣｐＧ結合に限定され、またはオリゴヌクレオチド中の他で同様に生じる。
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、複数のＣｘＧ（特にＣｐＧ）ジヌクレオチドから構成されることができる。たとえば、図３を参照。ＣｘＧは隣接または非隣接である。
【００２１】
全体的な塩基／ヌクレオチド配列
記号Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵを、特定の核酸塩基を構成するヌクレオシドを同定するものとしてのみここでは使用する。すなわち、ヌクレオシドは必ずしも、ＤＮＡまたはＲＮＡ中のようにリボースまたは２−デオキシリボースを構成する必要はない。
ＣｘＧにその５’末端（または、オリゴヌクレオチドがＤＮＡの場合は、５’末端と考えられるところ）で隣接している塩基は、たとえあったにしても、好ましくはＡＴ、ＧＡ、またはＧＴである。ＣｘＧにその３’末端（またはオリゴヌクレオチドがＤＮＡである場合は３’末端と考えられるところ）で隣接している塩基は、たとえあったにしても、好ましくはＴＡ、ＴＴ、またはＡＴである。
これら隣接する塩基は、WO01／12804によって教示されているように修飾（非標準的な）塩基であることができる。
ＣｘＧジヌクレオチドが他のヌクレオチドによって隣接されている実施例においては、最も好ましい配列は、以下の一またはそれ以上のコピーから構成される。すなわち、
（Ａ）Ｋモチーフ、これは単球およびＢ細胞を刺激し、ＴＣＧＴＡまたはＴＣＧＴＴといったＩＬ−６の分泌を刺激し、
（Ｂ）Ｄモチーフ、これはＮＫ細胞およびＩＦＮ−ガンマの分泌を刺激し、ＡＴＣＧＡＴのようなパリンドロームの配列といったものである。
特に興味深い配列にはＧＴＣＧＴＴ（ヒトに最適）、ＧＡＣＧＴＴ（マウスに最適）、およびＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）が含まれる。
オリゴヌクレオチドは、WO01／97843に教示されているようにＴリッチであることができる。
核酸塩基修飾の特別な場合は、チミンダイマーの修飾である。ＤＮＡ中、二つの隣接チミジンヌクレオシド（ＴＴ）が生体内で二量体化して、各々の一の六員環が結合して、融合した四つの六員環によって結合した二つの六員環を持つ構造の、新しい融合したポリ芳香族構造をとることができる。これをチミジンダイマーと呼ぶ。しかしながら、同じ反応がチミンヌクレオ塩基をもつ２つの非正常ヌクレオシド間に起きるので、さらに一般にチミン二量体と呼ばれる。
チミジン二量体化は、天然においてＤＮＡに対する紫外線の損傷の結果として生じる。免疫系は、このためチミジンダイマーの形成に敏感であると考えられている。このため、塩基配列にチミンダイマーを慎重に組み込むことで、オリゴヌクレオチドによって誘発される免疫反応を強めることができる。チミンダイマーの形成は、以下で表現することができる。
┌┐
ＴＴ
【００２２】
オリゴヌクレオチド長
従来技術は一般的に、免疫刺激性オリゴヌクレオチドがＣｐＧから構成され、少なくとも５、６または８の塩基長（鎖あたり、二重鎖の場合）であることを教示している。本発明がこれらの範囲を実施例として包含する一方（親油基の含有を教示している点で、従来技術と識別している）、我々は、ジヌクレオチドでさえ、脂質化されると、活性を持つことを見出した（参照、図７および１６）。このため、本発明は、一つの鎖上の核酸塩基数が８以下、すなわち２、３、４、５、６または７であるオリゴヌクレオチドをも含む。
本発明におけるオリゴヌクレオチド中の核酸塩基の最大数は100で、好ましくは50で、さらに好ましくは30で、いっそう好ましくは20で、最も好ましくは10である。本発明の好適な具体例では、前記の好ましい最小数と好ましい最大数の任意の割合の組み合わせを含む。
従来技術に使用されている非脂質化オリゴヌクレオチドの塩基よりも少ない塩基をもつ脂質化オリゴヌクレオチドは、すなわち、２から５または２から４塩基をもち、特に関心をもたれる。
【００２３】
鎖形成
本発明の分子は、一本鎖または二本鎖であることができる。二本鎖であるために、二本の鎖は、実質的に相補的な塩基（Ａ：Ｔ、Ｃ：Ｇ等）の配列の特徴をもたねばならず、そしてバックボーンは安定な二重鎖の構造に適合していなければならない。
少なくとも一部が相補的である二本の鎖を持つ場合、分子は二本鎖であると考えられる。このため、二本鎖分子は、一部が二本鎖であるかまたは完全に二本鎖であることができる。一の鎖が他よりも長いことにより、あるいは鎖中に整列した塩基が互いに水素結合をとらないことにより、分子は一部が二本鎖である分子であることができる。
分子は以下の場合二本鎖構造をもつ。すなわち（１）少なくとも一部が二本鎖の分子で、または（２）一本鎖の折りたたみの結果として少なくとも一部が自己相補的な構造であり、それにより安定な二本鎖の第二の構造をもつ場合である。
分子が少なくとも一部二本鎖であるとき、好適な具体例においては、一の鎖が二またはそれ以上のヒポキサンチンから構成され（ヒポキサンチンはヌクレオシドイノシン、Ｉ、に対応する塩基である）、そして他の鎖は二またはそれ以上の相補的なシトシンから構成される。さら好ましくは、このような塩基対が21を越えない。生成オリゴ（Ｉ：Ｃ）成分は、ｄｓＲＮＡのＴＬＲ−３リガンド活性を模倣することを意図する。
このＩ：Ｃ対形成は、多くの方法によって達成することができる。たとえば、一の鎖がＩｎから構成され、他の鎖がＣｎから構成されることができる。関心のある他の二本鎖の具体例は、一の鎖が（ＩＣ）ｎから構成され、そして他が、（ＣＩ）ｎから構成されて、Ｉ：Ｃ塩基対合が生じる。Ｉ：Ｃ塩基対合を生じるようなＩおよびＣの他の配列も可能である。
分子が一本鎖の形状で使用される場合、互いに自己相補的な部位を含むように設計することができて、このためオリゴヌクレオチドはこれらの部位が二次構造を形成するように折り畳まれる傾向をもつ。これらの二次構造は、酵素分解からヌクレオチドを守ることができる。
二本鎖分子の鎖が非共有結合（水素結合によるワトソン−クリック塩基対合）によって正常に保持される一方、一の鎖の５’末端を近位の他の鎖の３’末端に結合するヌクレオシド間結合によって二本鎖を安定化させることができる（これ以降、問題の末端は自由末端ではもはやなくなる）。これは末端の一対のみによりなされることができ、または両方の末端によりなされることができる。同様の方法で、自己相補性により折り畳まれた一本鎖分子は、このような結合によって折りたたみ構造を安定化させることができる。どちらの場合も、親油基をこの結合中に組み込むことができる。
択一的に、分子は一本鎖でありかつ安定な二次構造の形成を避けるようにデザインすることができる。
一般的に、二本鎖構造は、到達するまでの分解に対してより大きな耐性を供し、一本鎖構造は、ひとたび無事に到達した後のより大きな生得的な活性を供する。
【００２４】
選択的なバックボーン
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のいくらかまたは全部の一またはそれ以上の「選択的なバックボーン」（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡのバックボーン以外のバックボーン）によって特徴付けることも可能であるが、必要ではない。選択的なバックボーンは、酵素分解に対してより耐性があるオリゴヌクレオチド作るために、あるいは他の有用な効果を達成するために使用することができる。
選択的な（異常な）バックボーンは、一またはそれ以上の通常でないヌクレオシド間結合の導入により、または通常の糖を通常でない成分によって置換することによって与えられる。
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＬＴＡは、基本的にわずかに異なる建築成分（ＤＮＡに対してデオキシリボース、ＲＮＡに対してリボース、そしてＬＴＡに対してグリセロール）をもつジリン酸エステルポリマーであり、このため、ＰＡＭＰｓとしてこれらは互いに構造的に接近して関連している。これらの免疫活性の性質が、受容体−ＴＬＲｓの同一基によって媒介されるために、これのＴＬＲリガンドを分子構造の同一タイプにグループ化することは合理的である。さらには、ＴＬＲｓのリガンド特異性の要求が比較的小さいように思われる。このため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＴＡ、および／またはグリセロール−塩基核酸（ＧＮＡ）のハイブリッド構造は、複数のＴＬＲｓに対して強いリガンドである可能性があると我々は認知する。
【００２５】
糖およびリン酸の置換
標準的な脊椎の要素は、「糖相当物」および「リン酸相当物」から構成される。「糖相当物」はＤＮＡまたはＲＮＡの糖成分と構造的な役割が同一にはたらく任意の化学的な成分で、すなわち、核酸塩基を「リン酸相当物」に結合する。これは、標準的な糖成分２−デオキシリボースおよびリボースを含むが、限定はされない。同様に、「リン酸相当物」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのリン酸成分と構造的な役割が同一にはたらく任意の化学的な成分で、すなわち、隣接するヌクレオシドの「糖相当物」を結合する。これは、標準的なリン酸成分を含むが、限定はされない。
一般的に、リン酸相当物にリン酸が残存する場合に糖相当物を同定するのは困難ではなく、または糖相当物に糖が残存する場合にリン酸相当物を同定するのは困難ではない。しかしながら、両方が同時に変化する場合は、任意の分界が必要となる。
以下が示されている。すなわち（１）問題になるオリゴヌクレオチド鎖（または、セグメントか分枝のばあいは、セグメントそのもの）の中の一番長い鎖を同定する。（２）問題になる（１）の鎖中の核酸塩基から伸びている原子の一番短い鎖を同定する。そして（３）鎖（２）が鎖（１）のどの場所で付着しているかを同定する。すべての側鎖および付着部位を含む、すべての鎖（２）、さらに、（ａ）付着部位の原子と同一環の構成員（ＤＮＡおよびＲＮＡは、オリゴヌクレオチドの主鎖の核酸塩基に糖の二つの環状原子群を通じて付着している）、または（ｂ）付着部位の直近に隣接していているが六族原子（例えば酸素）ではないものである鎖（１）のすべての原子に、糖相当物は対応する。
この定義により、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の糖相当物は単に糖で、図５のグリセロール核酸中の糖相当物はグリセロール残基−ＣＨ２−ＣＨ（−Ｏ−）−ＣＨ２−であり、図５のペプチド核酸の糖相当物は−ＣＨ２−Ｎ（−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２−）−ＣＨ２−である。
次にリン酸相当物は、脊椎要素の残部として同定することができる。すなわち、図５のＤＮＡおよびＧＮＡのリン酸基、および図５のＰＮＡの−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−である。こららは、これら分子のためのヌクレオシド間リンカーでもある。すなわち、ヌクレオシド間リンカーは、一のヌクレオシドの糖相当物と他のヌクレオシドの糖相当物とをつなげる。
Ｖトポロジーをもつオリゴヌクレオチドにおいて、塩基間リンカーは、本願請求項の目的のための糖相当物およびリン酸相当物の両方として考えることができる。
【００２６】
ヌクレオシド間結合
標準的なヌクレオシド間結合は、Ｏ― −Ｐ（Ｏ３’）（Ｏ５’）＝Ｏである。
この構造中、３’と表示された酸素は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中、ヌクレオシド糖の３’炭素に付着していて、他の５’と表示された酸素は、同様に他のヌクレオシド糖の５’炭素に付着している。これら二つの酸素は、亜リン酸原子とともに、オリゴヌクレオチドの最も長い鎖上（または、分子がセグメントをもっていて分枝している場合はオリゴヌクレオチドセグメント）にあるので、主鎖原子と呼ぶことができる。他の二つの酸素は、ヌクレオシド間の最も直接の結合の部分ではないので、側鎖原子である。ヌクレオシド間結合のバリエーションは、（１）主鎖のみに影響する、（２）側鎖のみに影響する、および（３）両方に影響する、として類型化できる。
側鎖修飾があるところでは、側鎖中の非水素原子の数はそのままであることができる。たとえば、二重結合している酸素は、＝Ｓ、＝Ｓｅ、または＝Ｔｅ、ならびに／または単結合している酸素は、−ＣＨ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−ＴｅＨ、または−Ｘといった単一非水素原子をもった一価のラジカルによって置換することができる。
代わりに、側鎖の一またはそれ以上が、より大きな置換基であることができる。このような置換基は、核酸塩基と関連して述べたものを含むことができるが、限定されるものではない。この置換基は、炭素、ケイ素、酸素、窒素、硫黄、セレン、テルル、リン、およびホウ素からなる群から選択される非水素原子の、好ましくは50を越えないもの（さらに好ましくは25を越えない、もっと好ましくは10を越えない、最も好ましくは5を越えない）から構成される有機成分である。この置換基は、親油基、本開示中の他において定義した特に強力または高度に親油性の基であることができ、または含むことができる。
主鎖修飾があるところでは、非水素原子の数はそのまま変化しないでいることができる。このため、酸素（−Ｏ−）は、−ＣＨ２−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、または−Ｔｅ−にそれぞれ置換することができる。
同様に、リン原子を置換することができる。置換する原子の原子価が、リン原子の原子価よりも小さい場合、側鎖酸素の除去または修飾を強いることになる。置換原子は、たとえば、ホウ素、炭素、ケイ素、または窒素であることができる。
長くするために主鎖も修飾することができ、主鎖のもとからの酸素およびリン原子は保持または非保持している。このような修飾は、一またはそれ以上の成分延長の封入を伴い、これは好ましくは、−ＣＨ２−、−ＣＨＺ−、−ＮＨＺ−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｓｅ）−、−Ｃ（＝Ｔｅ）−、および−ＰＯ４−からなる群から独立に選択されるもので、式中、Ｚはハロゲンまたは、炭素、ケイ素、酸素、窒素、硫黄、セレン、テルル、リン、およびホウ素からなる群から選択される非水素原子の、好ましくは50を越えないもの（さらに好ましくは25を越えない、もっと好ましくは10を越えない、最も好ましくは5を越えない）から構成される有機成分である。
代替の結合には以下を含む：
【００２７】
【化５】
2005526497.tif 000003
【００２８】
３’−Ｏ−Ｐ−Ｏ−５’主鎖についての可能な置換には、３’−Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−５’、３’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−５’、および３’−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−ＣＨ２−５’を含む。
核酸分子全体は、このような修飾した結合によって形成することができ、またはある部分のみ影響されることができる。
このため、本発明中に使用するのに適した核酸分子は、リン酸メチル、Millら、Biochemistry、18：5134-43（1979）参照、ホスホロチオエート、Matsukuraら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.、84：7706-10（1987）参照、インターカレートする薬剤に共有結合的に結合したオリゴデオキシヌクレオチド、Zerialら、Nucleic  Acids  Res.、15：9909-19（1987）参照、ポリ（Ｌ−リシン）と接合するオリゴデオキシヌクレオチド、Leonettiら、Gene、72：32-33（1988）参照、およびリボース由来のサブユニットから集合したカルバメートに連結したオリゴマー、Summerton、J.、Antisense
Nucleic  Acids  Conference、37：44（ニューヨーク 1989）参照、を含むが、これに限定するものではない。ボラノリン酸エステル、ホルムアセタール、シロキサン、ジメチレンチオレート、スルホキシデートおよびスルホン酸エステルもまた、従来技術で知られている。
全体的な概説として、UhlmanおよびPeyman、"Antisense  Oligonucleotides：A  New  Therapeutic  Principle,"  Chem.  Revs.、90：544-84（1990）参照。架橋中に含まれていないリン酸の酸素が置換されている、修飾ヌクレオチド間リン酸残基（メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、およびリン酸エステル）をもったオリゴヌクレオチド、架橋中に含まれるリン酸の酸素が置換されている（架橋リン酸アミドエステル、架橋チオリン酸エステル、架橋メチレンホスフェート）オリゴヌクレオチド、ならびにシロキサン、炭酸、炭酸メチルエステル、アセトアミドエステル、カルバメート、およびチオエーテル架橋といったさらにラジカルなリン酸置換について、議論している。
これはまた、たとえば、ポリ（Ｎ−ビニル）、ポリ（メタクリルオキシエチル）、ポリ（メタクリルアミド）、およびポリ（エチレンイミン）といった合成ポリマーで、糖およびリン酸を置換する可能性についても議論している。本発明のいくつかの実施例では、ヌクレオシド間結合の少なくとも一つは、これらの構造の一つである。本発明の他の実施例では、ヌクレオシド間結合についてこれらの構造の一つもない。
【００２９】
ヌクレオシド間修飾
リボース（ＲＮＡ）糖または２−デオキシリボース（ＤＮＡ）糖を他の成分で置換することも可能で、これは少なくとも三機能である（これは核酸塩基、および二つのリン酸基ならびにこれらの置換基に結合しなければならない）。この成分は他の炭水化物（糖）、または無関係の成分であることができる。
成分が炭水化物の場合、これは単糖類であることが好ましい。単糖類は、炭素を３またはそれ以上もつポリヒドロキシアルデヒド（Ｈ［ＣＨＯＨ］ｎ−ＣＨＯ）もしくはポリヒドロキシケトン（Ｈ−［ＣＨＯＨ］ｎ−ＣＯ&shy;&shy;−［ＣＨＯＨ］ｍ−Ｈ）、または以下に議論するその誘導体である。三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖もしくは八炭糖、またはその誘導体であることが好ましく、さらに好ましくは五炭糖（５つの炭素）または六炭糖（６つの炭素）、ならびにその誘導体である。リボースは七炭糖である。
各単糖類ユニットは、アルドース（アルデヒドカルボニル基または潜在的なアルデヒドカルボニル基をもつ）またはケトース（ケトンカルボニル基または潜在的なケトンカルボニル基）であることができる。ケトースの場合、カルボニルケトン（またはケトース誘導体として、潜在的なケトンカルボニル）の位置は変化することができる。
単糖類ユニットは、さらに一以上のカルボニル（または潜在的なカルボニル）基をもつことができ、このため、ジアルドース、ジケトース、またはアルドケトースであることができる。用語「潜在的なアルデヒドカルボニル基」は、閉環から生じるヘミアセタール基、およびケトン相応物（ヘミケトン構造）を指す。
幾つかの好適な実施例において、単糖類ユニットは環状ヘミアセタール（環化アルドース）または環状ヘミケタール（環化ケトース）である。三員環をもつ環状構造はオキシロースで、四員環をもつ環状構造はオキセトースで、五員環をもつ環状構造はフラノースで、六員環をもつ環状構造はピラノースで、七員環をもつ環状構造はセプタノースで、八員環をもつ環状構造はオクタノースで、その他もろもろである。閉環の位置の割り振りは変わることができる。
単糖類は、直線または環状で、環状が好ましい。３−８の環原子をもつ環状構造が好ましく、フラノースおよびピラノースが特に好ましい。リボースはピラノースである（環原子の一つは酸素である）。
単糖類ユニットはさらに、制限なく、デオキシ糖（アルコール性水酸基が水素に置換）、アミノ糖（アルコール水酸基がアミノ基に置換）、チオ糖（アルコール性水酸基がチオールに置換、もしくはＣ＝ＯがＣ＝Ｓに置換、または環状構造の環酸素が硫黄に置換）、セレン糖、テルル糖、Ｃ−置換単糖類、不飽和単糖類、アザ糖（環炭素が窒素に置換）、アミノ糖（環酸素が窒素に置換）、アルジトール（カルボニル基がＣＨＯＨ基に置換）、アルドン酸（アルデヒド基がカルボキシル基に置換）、ケトアルドン酸、ウロン酸、およびその他であることができる。
特に興味のある炭水化物誘導体は、アルジトール、好ましくは３−８炭素原子、特にリビトールおよびグリセロールを含む。リビトールは、リボースに対応する５炭素アルジトールである。グリセロールは３つの炭素をもつ。核酸塩基は、直接または間接に、糖間結合に関与しない任意の炭素に付加することができる。
特に興味のあるＲＮＡ類似体はリボヌクレオチドが２’修飾、例えば２’Ｏ−メチル誘導体を含む。
ヌクレオシドが糖を含む場合、ヌクレオシド間結合は、必須ではないが、ＤＮＡまたはＲＮＡにおけるように３’ないし５’結合であってもよい。例えば、あるいは５’ないし５’および３’ないし３’結合でもよい。あるいは３’および５’炭素以外の炭素を含むことができる。
糖はまた非炭水化物部分により置換され、または置換なしで除去されても良い。
さらに若干の興味ある構造の参考には、Leuman、「ＤＮＡ類似体：超分子原理から生物学的性質」Bioorganic ＆ Medicinal Chem．，１０：８４１−５４（２００２）。収載した構造は４’−６’結合ヘキソピラノシル−ＮＡｓ、２’−４’結合ペントピラノシル−ＮＡｓ、３’−４’結合ペントピラノシル−ＮＡｓ、ヘキシトール−ＮＡｓ、ロックした核酸（例えば、ベータ−Ｄ−リボ−ＬＮＡ）、およびビシクロ−およびトリシクロ−ＤＮＡｓを含む。
【００３０】
ペプチド核酸オリゴマー
特定の間新のある代替の背景のカテゴリーはＰＮＡオリゴマーのように（図５および図７化合物７）ヌクレオシド間結合がペプチド（−ＮＨＣＯ−）結合からなる。ＰＮＡオリゴマーはここではヌクレオシド間結合がペプチド（−ＮＨＣＯ−）結合からなる近接する一連のヌクレオチドとして定義される。
古典的なＰＮＡオリゴマーは、（２−アミノエチル）グリシンユニットから構成され、核酸塩基がメチレンカルボニルリンカーに付加されている。すなわち、構造
Ｈ−（−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（−ＣＯ−ＣＨ２−Ｂ）−ＣＨ２−ＣＯ−）ｎ−ＯＨ
をもち、式中、かっこでくくった下部構造はＰＮＡモノマーである。
ＰＮＡオリゴマー中、核酸塩基ＢはバックボーンＮから３つの結合により分離していて、側鎖の付着部位は、６つの結合により分離している。塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣおよびＵが好ましい。
ＰＮＡオリゴマーは、さらに一またはそれ以上のアミノ酸残基、特にグリシンおよびプロリンから構成されることが好ましい。
以下であるような関連する分子を容易に想像することができる。（１）−ＣＯＣＨ２−リンカーが他のリンカー、特に以下に定義する小さい二価のリンカー要素から構成されるリンカーに置換し、（２）側鎖が、主鎖のうちペプチド結合に関与していない３つの炭素原子の一つに付加している（古典的なＰＮＡのＮに付加する側鎖に代わってあるいは加えて）；および／または（３）ペプチド結合がシュードペプチド結合に代えられている。
ペプチド結合は、二つの小さな二価のリンカー要素、−ＮＨ−および−ＣＯ−を持っている。このため、シュードペプチド結合の好ましいクラスは、二つの小さな二価のリンカー要素からなるものである。それぞれは、アミン（−ＮＨ−）、置換アミン（−ＮＲ−）、カルボニル（−ＣＯ−）、チオカルボニル（−ＣＳ−）、メチレン（−ＣＨ２−）、一置換メチレン（−ＣＨＲ−）、二置換メチレン（−ＣＲ１Ｒ２−）、エーテル（−Ｏ−）およびチオエーテル（−Ｓ−）からなるグループから独立に選択することができる。さらに好ましいシュードペプチド結合は、以下を含む。
Ｎ修飾  −ＮＲＣＯ−
カルバΨ  −ＣＨ２−ＣＨ２−
デプシΨ  −ＣＯ−Ｏ−
ヒドロキシエチレンΨ  −ＣＨＯＨ−ＣＨ２−
ケトメチレンΨ  −ＣＯ−ＣＨ２−
メチレンオキシ  −ＣＨ２−Ｏ−
還元型  −ＣＨ２−ＮＨ−
チオメチレン  −ＣＨ２−Ｓ−
チオペプチド  −ＣＳ−ＮＨ−
レトロ−インベルソ  −ＣＯ−ＮＨ−
単一分子は、一種類以上のシュードペプチド結合をもつことができる。
Uhlmannら、「PNA：Synthetic  Polyamide  Nucleic  Acids  with  Unusual  Binding  Properties」、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  37：2796-2823（1998）は、幾つかのＰＮＡ類似物を記述している。これらは、リン酸エステル核酸（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミノメチルリン酸バックボーンをもつ）、オルニチン、プロリン、ジアミノシクロヘキサン、および２−アミノプロパンジオールのリン酸アミドをもったバックボーンをもつＰＮＡ類似物、ならびに中心のアミド結合が立体配置的に決定されるＣ＝Ｃ二重結合によって置換されたＰＮＡ類似物を含む。その図１１および１２中のＡ−Ｏを参照。
オリゴヌクレオチドがさらにペプチドエピトープを含むように設計されているとき、少なくとも一部は、ＰＮＡオリゴマーバックボーンを使用することが特に有利であることができる。
【００３１】
グリセロール核酸オリゴマー
ポリオール由来核酸オリゴマーもまた興味をもたれる。このポリオールは通常のオリゴヌクレオチドの糖を置換する。グリセロールそのものは、１，２，３−プロパントリオールである。しかしながら、他のポリオールもまた興味を持たれる。このポリオールが３以上の炭素を持つ場合、塩基間の間隙は増大する。炭素数３から６のポリオールが好ましい。以降、用語「ＧＮＡオリゴマー」を高次ポリオールの使用を包含するものとして使う。
Leumannは、グリセロールＤＮＡの３’メチル類似物（１’、２’−セコＤＮＡ）を生成したと記述している。
１９７８年に、ZamecnikおよびStephenson（Zamecnik  ＆  Stephenson、1978）は、初めて治療目的の合成オリゴヌクレオチドの使用を提案した。この原理に関連する主な問題は、オリゴヌクレオチドの細胞外酵素および細胞内酵素に対するオリゴヌクレオチドの不安定性ならびに細胞膜を通じての透過の困難さである（Uhlmann  ＆  Peyman、1990）。このため、代替の化学的に修飾したオリゴヌクレオチドを、種々の酵素に対するより高い安定性および細胞膜を透過するための高い能力を達成するために、アンチセンスのオリゴヌクレオチドとして調製する。同様に、ＧＮＡはヌクレアーゼに対してより安定であることが期待され、そして親油性修飾を通じてＧＮＡは、より容易に細胞膜を透過しやすくなる。
幾つかの実施例において、標準的なリン酸ヌクレオシド間結合が保存されている。図６に見られるように、グリセロール結合作用薬は、−ＣＨ２−ＣＨ２（−Ｏ−）ＣＨ２−の形の三機能リンカーとなり、ここでＣ−２炭素は−Ｏ−を通じて核酸塩基結合している。図７、化合物６も参照。
他の実施例においては、標準的なリン酸結合が、−リン酸−リンカーＺ−リン酸の形の一つによって置換している。これらの実施例においては、Ｚは好ましくは脂肪性であり、さらに好ましくは−［（小さなアルキル）−Ｏ−］ｎで、式中「小さなアルキル」は６を越えない炭素数で、そしてｎは１から20である。さらに好ましくは、小さなアルキルは−ＣＨ２ＣＨ２−、および／またはｎ＝６で、図３、および図７化合物２に示されたとおりである。
【００３２】
分節オリゴヌクレオチド
以下に定義するように、長いヌクレオシド間結合の存在によってセグメントが画定される。
短いヌクレオシド間結合は、５原子を越えない主鎖をもつ結合である（ＤＮＡおよびＲＮＡ中、通常の結合はリン酸基で、３原子の主鎖Ｏ−Ｐ−Ｏをもつ）。この定義により、通常のＰＮＡヌクレオシド間結合、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、は主鎖に３原子しかもたないので（Ｃ−Ｎ−Ｃ）短い結合となる。
長いヌクレオシド間結合は、短い結合には適格でない任意のヌクレオシド間結合である。このため、図３に示された結合は長い結合である。図３に示されたとおり、長いヌクレオシド間結合は少なくとも一の親油基をもつ。
オリゴヌクレオチドのセグメントは、（１）二またはそれ以上のヌクレオシドの連続的な一連で、隣接部分は短いヌクレオシド間結合によって連結しているか、または（２）他のヌクレオシドへの連結が長いヌクレオシド間結合である単一ヌクレオシドであるものとして定義される。
このため、図３において、ＣｐＧ−長い結合−ＣｐＧの形の二つのセグメントオリゴヌクレオチドをみることができ、式中、各ＣｐＧはセグメントと考えられる。ＣｘＧ−長い結合−ＣｘＧの形の構造、式中「Ｘ」は短い結合である、もまた二つのセグメントオリゴヌクレオチドである。ＧｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴ−長い結合−ＧｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴの形の構造、すなわち化合物１（図７）のヘキサヌクレオチドが図３の化合物の各ＣｐＧを置換している、もまた同様に２つのセグメントオリゴヌクレオチドである。ＧｘＡｘＣｘＧｘＴｘＴ−長い結合−ＧｘＡｘＣｘＧｘＴｘＴ、式中「ｘ」はすべて短い結合（同一あるいは異なることができる）で、２つのセグメントオリゴヌクレオチドである。
多くの生物系では、リガンドの効果は単一の分子の部分が複数のコピーとして存在する場合に強められる。たとえば、集中発生したエピトープを伴う直鎖状の分子の形で、WO98／46246参照、またはいくつかのエピトープを呈する枝分れした分子の形で（たとえば、４つのエピトープが枝分れしたリシンコアに付加している、ＭＡＰ−４）で、免疫原が構成されている。
好ましい実施例においては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも二つのセグメントから構成され、そしてセグメントのうち少なくとも二つはそれぞれ少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットから構成される。望ましくは、セグメントのすべてがそれぞれ少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットから構成される。
好ましくは、直接あるいは間接に、長いヌクレオシド間結合によって、少なくとも一対のＣｘＧ含有セグメントが連結する。このため、稀なケースでは、（ＣｘＧ含有セグメント）−長い結合−（ＣｘＧ含有セグメント）を我々はもつ。たとえば、（ＣｘＧ含有セグメント）−長い結合−（他のセグメント）−長い結合−（ＣｘＧ含有セグメント）を我々はもつこともできる。
本発明の複数のセグメントからなるオリゴヌクレオチドは、二つ以上のセグメントをもつことができる。この場合、直鎖状であることができる。すなわち、セグメント（−長い結合−セグメント）ｎで、式中ｎは少なくとも２で好ましくは20を越えず、より好ましくは10を越えず、さらに好ましくは5を越えない。直鎖構造は非環式または環式である。後者の場合、たとえば次式を我々はもつことができる。
【００３３】
【化６】
2005526497.tif 000004
【００３４】
複数のセグメントからなる環式のオリゴヌクレオチドは、適切な結合によって、二つ以上のセグメントから構成されることができる。もちろん、本発明の単一セグメントのオリゴヌクレオチドも環式であることができる。たとえば以下である。
【００３５】
【化７】
2005526497.tif 000005
【００３６】
環式分子の利点は、安定な三次元構造を形成することができることにあり、これはレセプター結合親和性および特異性を強めることができる。
代替として、分枝であることもでき、たとえば３つのセグメントそれぞれが三価のコア成分に結合して、セグメントの３対のそれぞれについて長いヌクレオシド間結合としてはたらく。または、四つのセグメントが四価のコア成分に結合することができる。複数の分枝する場所をもつさらに複雑な分枝構造も可能である。
特に興味深い枝分れした長い結合は、ペンタエリスリトール（ＰＥＴ）構造から構成されるもので、このような構造はJiangら、U.S. Provisional Appl. No. 60／378,645、2002年5月9日申請（Docket：JIANG5-USA）に議論されていて、ここではその全てを参照として組み込む。
長い結合は、独立に、柔軟または強固であることができる。長い結合の長さは、ＣｘＧジヌクレオチドユニットの間隙が実質的に受容体結合成分の間隙に適するように調節できる。
セグメント中、内部のヌクレオシド間結合のすべてが化学的に同一である場合、単一のセグメントを得る。結合が変わる場合、ハイブリッドセグメントを得る。ＧｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴは単一のセグメントである。式中ｘがリン酸（ｐ）でない他の短い結合であることを示すＧｐＡｐＣｘＧｐＴｐＴは、ハイブリッドセグメントである。任意のセグメントは、単一のセグメントまたはハイブリッドセグメントである。
【００３７】
自由末端；５’および３’
この開示中、親油基が自由末端、または特に５’もしくは３’末端に付加すると述べられた場合、この基は共有結合的に末端に組み込まれると理解され、すなわち、これは末端の少なくとも一部になる。
直鎖オリゴヌクレオチドは二つの自由末端をもつ。ＤＮＡおよびＲＮＡ中、これら自由末端は５’末端および３’末端と同定される。ＤＮＡおよびＲＮＡ中、ヌクレオチドは５’から３’へのリン酸ジエステル結合（Ｃ−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ）によって結合しているということができて、これは前記リン酸基を利用する。特に、一のヌクレオチドの糖の５’炭素は、そのリン酸基の酸素に結合する。同一リン酸基の他の酸素は、順番に前のヌクレオチドの糖の３’炭素に結合する。
続いて、ＤＮＡまたはＲＮＡの最初のヌクレオチドは、５’炭素に付加する自由なリン酸基をもつ。同様に、対応するモノヌクレオチドの化学的性質のため、最後のヌクレオチドは３’末端に付加する自由な水酸基をもつ。このため、ＤＮＡおよびＲＮＡは通常５’リン酸および３’水酸基末端をもつ。
分子生物学の従来技術では、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’および／または３’末端を修飾することができることが知られている。最も一般的な修飾は、３’水酸基から３’リン酸への変換である。同様に、５’リン酸を５’水酸基に変換することができる。
用語５’末端および３’末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡのみならず、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖ユニットは保持していて、かつ、糖ユニット上の付着部位（５’および３’炭素）を変えることなくヌクレオシド間結合を変えているだけの類似物にも、直ちに適応できる。これらの用語は、親油基がＤＮＡまたはＲＮＡモノヌクレオチドに付加している限り（図６参照；３’末端への付加）、ハイブリッドバックボーンをもつオリゴヌクレオチドにも使用することができる。
オリゴヌクレオチドの５’末端への言及は、代替のバックボーンを使用しているためにオリゴヌクレオチドが実際には真の５’または３’末端を持たない場合には、もしあるならば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列内部の５’末端に最も近い末端として定義される。ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がない場合には、５’末端は、少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニットのシトシン（Ｃ）に最も近いオリゴヌクレオチド末端を意味するものと考え得る。内部ＤＮＡもしくはＲＮＡの３’末端への言及によっても３’末端は同様に定義され、または必要な場合、ＣｘＧジヌクレオチドユニットのグアニンの位置の参照により定義される。
環式オリゴヌクレオチド中、自由末端はない。しかしながら、親油基はヌクレオシド間結合中に組み込むことができる。
分枝オリゴヌクレオチド中、枝は一の自由末端をもち、そして、直接または間接に他の一端はオリゴヌクレオチドの残部に付着している。
【００３８】
親油基および強親油基
オリゴヌクレオチドは、通常、そのリン酸基のために強親水性（および疎油性）である。通常の窒素性塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルもまた親水性である。
本発明のオリゴヌクレオチドの親油性は、一またはそれ以上の親油基を共有結合的に組み込むことによって増大し、さらに好ましくは、以下に定義するように強親油性または高親油性である。
これらの親油基は、以下の部位の一またはそれ以上において組み込まれることができる：
分子の自由末端の一または両方の少なくとも一部（３’修飾について図２そして５’修飾について図４を参照）；
ヌクレオシドの置換基の少なくとも一部；または
ヌクレオシド間結合の少なくとも一部（図３参照）。
オリゴヌクレオチドは、以下に述べる基準によって水素でない少なくとも５原子からなる任意の成分が親油基として認められる場合に、親油基から構成されると考えられる。このため、親油基は、たとえば、末端成分上のまたはヌクレオシド間結合上の側鎖であることができ、これは全ての末端成分またはヌクレオシド間結合とは逆である。
組込みは直接もしくは間接であることができ、たとえば、親油基は５’もしくは３’末端に、リン酸基もしくは−Ｏ−結合（水酸基の残基）、もしくは他のリンカーを通じて付加することができる。
オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端が親油基から構成される場合、好ましくは、全５’末端または３’末端は、リン酸基、または、一またはそれ以上の酸素が硫黄、セレンもしくはテルル原子によって置換しているリン酸基の類似物をまったく排除して、親油基である。このため、図７の化合物１中、親油基はＳＭＩＬＥＳ記号ＣＣ（Ｏ）ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣをもつ。
図３は、通常の糖−リン酸バックボーンをもつＣｐＧジヌクレオチドに付加する親油基を示す。３’末端は、リン酸基を持つように修飾されていて、すなわちリン酸基は親油基に酸素の一つを通じて結合している。図４は、親油基が５’リン酸末端に付加しているオリゴヌクレオチドを示している。
親油性成分は、脂肪族または芳香族であることができ、直鎖状または分枝状であることができる。好ましい親油性成分の一部が、図２に描かれていて、そして以下のように特徴付けることができる：
直鎖脂肪族、14炭素
上記と同様だが、Ｃ−２でヒドロキシル化
分枝脂肪族、一の枝が14炭素、Ｃ−２で分枝し−Ｏ−を通じて他の14炭素鎖にいく
ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）（ＣＨ２−Ｏ−14炭素アルキル）２の形をした分枝脂肪族
（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６14炭素アルキルの形をした直鎖脂肪族
脂肪族と融合した芳香族混合物（図２参照）
以下の好ましい親油基を描いた図７も参照；
１）−ＣＨ２（ＯＨ）−10炭素アルキル
２）−ＰＯ４−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）６−ＰＯ４−ＣＨ２ＯＨ−10炭素アルキル
３）から５）−ＰＯ４−ＣＨ２ＯＨ−10炭素アルキル
６）14炭素アルキルである他は上記の通り
７）−ＣＨ２−Ｏ−14炭素アルキル
基の親油性は、分子ＨＺ（式中Ｚは問題となる基）の、非極性溶媒（たとえばエタノール、ジオキサン、アセトン、ベンゼン、ｎ−オクタノール）および水のあいだでの、ＳＴＰにおける分配係数を計ることで決定することができる。親油性は、この分配係数の対数として定義することができて、ここでは非極性溶媒を好む分子について正である。このため、親油基は、logＰがゼロよりより大きい基である。
分配係数（Ｐ）は、二つのほとんど混合することのできない溶媒からなる２相系中の溶解物質の平衡状態濃度の比として定義される。このような系の一つは、ｎ−オクタノール：水で、オクタノール相は約20％の水を含むとともに水相は0.008％のオクタノールを含む。このため、関連する分配係数（Ｐｏｗ）は、水（ｗ）で飽和したオクタノール（ｏ）中の溶質のモル濃度の、オクタノールで飽和した水中の溶質のモル濃度に対する比である。Ｎ−オクタノールは、多くの膜成分と同様に両親媒性であるために、生体膜の代用物として有用である。（logＰへの以後の言及は、とくに断らない限りはlog
Powを意味する）
少なくとも一の親油基は、好ましくは強親油基である。本開示の目的のために、強親油基は、ｎ−オクタノール：水の分配係数のlogとして計算される親油性が、遺伝的に符号化したアミノ酸の側鎖（以下、側鎖として言及）の任意のものについて、以下に（Ａ）−（Ｃ）として記述する従来技術である３方法の任意の一つによって計算されるものよりも、大きいものとして定義される。親油性側鎖をもつ遺伝的に符号化したアミノ酸は、脂肪性のアミノ酸アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンで、そして芳香性アミノ酸トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンである。（「強親油性」についての標準として、親油性の遺伝的に符号化したアミノ酸の使用をした根拠は、ＰＮＡｓの一部であるからである）
一の実施例では、問題となる側鎖は、その親油性、および関連する側鎖の親油性を以下の方法（Ａ）に従って決定する場合、関連する側鎖の任意に比してより親油性である。
二番目の具体例では問題となる側鎖は、その親油性、および関連する側鎖の親油性を以下の方法（Ｂ）に従って決定する場合、関連する側鎖の任意に比してより親油性である。
三番目の実施例では問題となる側鎖は、その親油性、および関連する側鎖の親油性を以下の方法（Ｃ）に従って決定する場合、関連する側鎖の任意に比してより親油性である。
四番目の実施例では問題となる側鎖は、その親油性、および関連する側鎖の親油性を、
分配係数を決定する好ましい方法、この方法は予測したlog Pow値に基づいて選択する、に従って決定する場合、関連する側鎖の任意に比してより親油性である。（この予測値そのものは、下記方法（Ｃ）よって決定される）
（Ａ）予測されたlog Pow値が0から4について、EPA  Product  Properties  Test  Guidelines  OPPTS  830.7550
EPA  712-c-96-038（August  1996）中に記述されている振盪フラスコ法（負のlog  Pow値は、化合物が親油性では全くないことを示す）
（Ｂ）予測されたlog  Pow値が4から6について、EPA  Product  Properties  Test  Guidelines  OPP13  830.7570  EPA  712-c-96-040（August  1996）中に記述されている液体クロマトグラフィー評価法。（この方法は予測したlog  Pow値が0から6と見積もられると使用することができる。）
（Ｃ）予測されたlog  Pow値が6以上について、Meylanら、「Atom／fragment  contribution  method  for  estimating  octanol-water  partition  coefficients」、J.  Pharm.  Sci.、84：83-92（1995）に記述されている予測的な方法。（予測したlog  Pow値が6以上の場合、実験的な決定が必要となることに注意。）
Meylanの方法中、予測したlog  Powは、各フラグメントについての加重係数（生の係数に、そのフラグメントのコピー数を乗じる）を定数0.2290に加えることで得られる。考慮のフラグメントは、−ＣＨ３（0.5473）、−ＣＨ２（0.4911）、−ＣＨ（0.3614）、−ＯＨ（-1.4086）、−ＮＨ２（-1.4148）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（-0.5236）、−ＳＨ（-0.0001）、−ＮＨ−（-1.4962）、−Ｎ＝Ｃ（-0.0010）、−Ｏ−（-1.2566）、アルデヒド−ＣＨＯ（-0.9422）、３＋Ｃ付加する第三級Ｃ（0.2676）、Ｈのない第三級でないＣ（0.9723）、芳香族のＣ（0.2940）、芳香族のＮ（５員環）（-0.5262）、および芳香族に付加している−ＯＨ（-0.4802）を含み、ここでは特に断らない限り脂肪族または脂肪族に付加している。
Powの決定法についてのより詳細な情報については、Sangster、J.、「Octanol-Water  Partition  Coefficients：Fundamentals  and  Physical  Chemistry」（April  1997）（ISBN  0471-9739）参照。
オクタノール−水分配係数の作表のため、EPA「Chemicals  in  the  Environment：OPPT  Chemicals  Fact  Sheets」  the  USDA  Pesticide  Properties  Database、Sangster、J.、「Octanol-Water  Partition  Coefficeints  of  Simple  Organic  Compounds」、J.  Phys.  Chem.  Ref.  Data、18：1111-1230（1989）；Verbruggen、E.M.J.ら、「Physiochemical  Properties  of  Higher  Nonaromatic  Hydrocarbons：Literature  Study」、J.  Phys.  Chem.  Ref.  Data、29：1435-46（2000）参照。さらなる情報として、ペン州立大学図書館、物理科学図書館、オクタノール−水分配係数（2001年8月21日更新）、URLは下記の通り。
libraries.psu.edu／crsweb／physic／coefficients.htm.。他の化合物について編集されたPow値は異なる方法論によって決定することができる。
Meylanアルゴリズムは、プログラムLogPow（KowWin）で実行される。このプログラムのオンライン版は、esc.syrres.com／interkow／kowdemo.htmにおいて利用可能で、CAS登録番号またはSMILES構造表示法のいずれかで受け入れられる。このプログラムは、そのデータベース中にある場合は実験的に決定した値も報告している。
基のlogPが、Meylanアルゴリズムによって予想したところ、ゼロよりも大きい場合、その基は親油性であると予想される。好ましくは、Meylanアルゴリズムによって予想されるlogPが少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、さらに高いことがより好ましい。
少なくとも一の親油基が好ましくは「強親油性（Meylan）基」である。本願発明の目的のために、「強親油性（Meylan）基」は、Meylanアルゴリズムによって計算した親油性が、少なくとも2.7であるものとして定義できる。遺伝的に符号化したアミノ酸の側鎖についてMeylanアルゴリズムによって予測されたもっとも高いlogPは2.60（Trp）であり、同一の側鎖について実験的に決定したもっとも高いlogPは2.89（ＩＬｅ）である。もっとも「強い親油基」はまた「高親油（Meylan）基」であり、逆も真である。
好ましくは、親油基は水素以外の100を越えない原子、より好ましくは80を越えない同様の原子、さらに好ましくは60を越えない同様の原子、いっそう好ましくは40を越えない同様の原子から構成される。
好ましくは、親油基は水素以外の少なくとも5原子（ロイシンはこのような原子を4つもつ）、より好ましくは少なくとも11の同様の原子（トリプトファンは10もつ）、さらに好ましくは少なくとも13の同様の原子、いっそう好ましくは少なくとも21の同様の原子から構成される。
好ましくは、側鎖は、成分炭素、ケイ素、水素、酸素、窒素、硫黄、およびリンに制限された基本構成成分をもつ。好ましくは、水素に関与しない側鎖中の結合の大部分は、炭素−炭素結合である。
好ましくは側鎖は、−Ｙ&shy;−がスペーサーで、−Ｚが一またはそれ以上の脂肪性および／もしくは一あるいはそれ以上の芳香性成分である、一般式−Ｙ−Ｚのものである。
スペーサーは、好ましくは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ−、−ＰＯ４−、−Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｃ（＝Ｓ）−からなる群から選択される。Ｚは好ましくは脂肪性である。代替として、スペーサーはＹ’であることができ、ここでＹ’は−アルキル−Ｙで、このアルキルは炭素数１から４の小さいアルキルである。他のスペーサー、および他の一般形も、許容できる。
脂肪性成分、たとえば−Ｚのようなもの、は独立した一またはそれ以上のスペーサーを含み、これは好ましくは、上に定義した群から選択される。
親油性側鎖は、すべて一または複数の脂肪性成分、すべて一または複数の芳香性成分、または少なくとも一の脂肪生成分および少なくとも一の芳香性成分の組み合わせであることができる。
各脂肪性成分は、個々に、直鎖状、環式、直鎖および環式の組み合わせ、分枝であるが非環式、または分枝であるが一もしくはそれ以上の枝が環式成分から構成されることができる。また、飽和または不飽和であることもできる。飽和している場合、一またはそれ以上の二重結合および／または一またはそれ以上の三重結合があることができる。
一の実施例では、側鎖は直鎖状側鎖で、これはエーテル、すなわち−（ＣＨ２）ｉ−Ｏ−（ＣＨ２）ｊで、式中「ｉ」は０または１で、ｊは６から26である。化合物１ａ中、「ｉ」は０で「ｊ」は14である。
他の好ましい実施例では、側鎖は２つの分枝脂肪性成分で、一般構造−Ｙ１Ｙ２（Ｚ１、Ｚ２）をもち、式中Ｙ１はヌル（すなわち、主鎖炭素が直接Ｙ２に結合している）、または上で定義したようなスペーサーで、Ｙ２はＹ１（またはＹ１がヌルの場合は、主鎖炭素）をＺ１およびＺ２に連結している小さな分枝アルキル基で、Ｚ１は−Ｏ（ＣＨ２）ｍＣＨ３で、そしてＺ２は−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３で、式中ｍおよびｎは独立して6から26の範囲の整数から選ばれる。好ましくは、Ｙ１は−Ｃ（＝Ｏ）−または−ＮＨ−、およびＹ２は−ＣＨ（ＣＨ２）−ＣＨ２−である。
他の好ましい実施例では、側鎖は３つの分枝脂肪性成分で、一般構造−Ｙ１Ｙ２（Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３）をもち、式中Ｙ１はヌル（すなわち、主鎖炭素はＹ２に直接結合している）、または上に記述したスペーサーであり、Ｙ２は小さな分枝アルキル基でＹ１（またはＹ１がヌルの場合は、主鎖炭素）をＺ１、Ｚ２およびＺ３に連結していて、Ｚ１は−Ｏ（ＣＨ２）ｍＣＨ３で、そしてＺ２は−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３で、Ｚ３は−Ｏ（ＣＨ２）ｋＣＨ３で、式中ｍ、ｎおよびｋは独立して6から26の間から選ばれる。Ｙ２は好ましくは−Ｃ（ＣＨ２−）（ＣＨ２−）ＣＨ２−である。
他の好ましい実施例では、側鎖は一またはそれ以上の脂肪酸成分からなる。このため、側鎖は−Ｙ１Ｙ２（Ｚ１．．．Ｚｉ）の形であることができ、式中ｉは１から２、Ｙ１は前記の通りで、Ｙ２はヌルまたは、Ｙ２を１−３Ｚ基に連結しているアルキル基で、そして少なくとも１のＺ基は−Ｏ−ＣＯ−Ｑの形の脂肪酸基であることができ、ここでＱは主にアルキルだがアルケニル、アルキニルまたはエーテル結合を含むことができる。脂肪酸はカルボン酸で、しばしば動物もしくは植物の脂肪もしくは油から抽出もしくは含有しているものである。すべての脂肪酸は、4から22の炭素原子を含む炭化水素基の鎖から構成されて、そして末端カルボキシルラジカルによって特徴付けられる。「炭素数：二重結合数」、および選択的にシス／トランス異性体の位置によって命名することができる。このため、適切な脂肪酸は、4：0、6：0、8：0、10：0、12：0、14：0、16：0、16：1（9c）、18：0、18：1（9c）、18：2（9c、12c）、18：3（9c、12c、15c）、18：4（6c、9c、12c、15c）、18：3（9c、11ｔ、13ｔ）、18：1（9c）、12−ＯＨ、20：1（9c）、20：1（11c）、20：4（8c、11c、14c、17c）、20：5（5c、8c、11c、14c、17c）、22：0、22：1（11c）、22：1（13c）、22：5（7c、10c、13c、16c、19c）および22：6（4c、7c、10c、13c、16c、19c）と命名されたものを含み、このすべては天然産グリコシドに見出される。
側鎖が複数の環状成分から構成される場合、これらは融合されている（ポリ環状成分）かあるいは融合されていないことができ、同一または異なる数の側鎖を持つことができる。典型的には、このそれぞれが3から6の側鎖をもつ。一またはそれ以上の側鎖は、二重または三重結合を持つことができる。環式成分は、特徴としてヘテロ環であることができる。一の好ましい実施例では、側鎖はステロイド成分から構成される。これは四つの融合環をもつ多環成分で、一つは５側であり三つは６側である。
脂肪性成分は、一またはそれ以上のホスホリル基から構成されることができ、そして、この場合、側鎖中のこのような基の数は、好ましくは２を越えないものである。ホスホリル基は、たとえばリピドモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）といったバクテリア膜のリピド中に見出される。
芳香性成分は、一またはそれ以上の環を構成することができる。一以上の環が存在する場合、この環は融合または非融合することができる。
プログラムLogKowを使用することで、いくつかの好ましい基（表１、２）、およびいくつかの参照化合物（表３、４）についてのlogPを計算した（以下を参照）。表Ｋ−２中の化合物は、不適切なものである必要はない。LogKowが供する実験的なデータベース値も、以下に与える。表３中、灰色にした列は親水性化合物である。
【００３９】
【表１】
2005526497.tif 000006
【００４０】
【表２】
2005526497.tif 000007
【００４１】
【表３】
2005526497.tif 000008
【００４２】
【表４】
2005526497.tif 000009
【００４３】
標的にする成分
本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに一またはそれ以上の細胞タイプ特異的標的成分を付加的に持って、特定の細胞タイプへの到達を改善することができる。たとえば、細胞表面受容体によって特異的に認識される炭水化物またはペプチド成分から構成されることができる。有用な炭水化物成分は、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（GalNAc）、フコース、マンノース、およびシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を含む。
【００４４】
他の免疫調節成分
本発明のオリゴヌクレオチドはさらに、一またはそれ以上の、ＣｘＧジヌクレオチドユニット以外の免疫調節成分から構成することができる。
たとえば、前記したようなチミジンダイマーから構成することができる。リポテイコ酸またはその誘導体から構成することもできる。ＬＴＡは、グラム陽性バクテリアの膜成分で、生得の免疫反応を活性化することができる。一の可能な誘導体は、Ｄ−アラニンおよびグリセロール成分の第二ヒドロキシル基の間のエステル結合が、アミン結合に置換したもので、これは加水分解に対する耐性を増加させる。ＬＴＡ類似の成分を、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端に付加することができ、または一またはそれ以上のヌクレオシド間結合に組み込むことができる。
【００４５】
免疫原
本発明の免疫原は、少なくとも一の疾病関連のＢ細胞またはＴ細胞エピトープで、これは以下に定義してあり、そして、対象（これは、ある場合には、リポソームとまたは抗原提示細胞と会合する）に対して適切に投与した場合、病気に対して保護性である体液性および／または細胞性免疫反応を誘発する。
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの投与および免疫原の投与の間隔が、免疫原に対するオリゴヌクレオチドの免疫反応を強めることができるよう、長くならないという条件下、免疫原とともに（同一または別々の組成として）投与することができ、または免疫原の投与前もしくは後に投与することができる。
もっとも好ましい免疫原性の組成は、Kogantyら、「Synthetic  Glyco-Lipo-Peptides  as  Vaccines」、U.S.  Provisional  Appl.  No.60／377,595、2002年５月６日出願（Docket：Koganty4.1-USA）、これは全体としてここに参照として組み込まれる、に記述されているBLP25リポソームワクチン製剤から構成される。このリポソーム製剤は、MUC1誘導25−マーリポペプチドからなり、これもそこに記述されていて、もっとも好ましい免疫原である。この組成は、オリゴヌクレオチドを免疫賦活剤として含むことができる。他の免疫賦活剤または他の免疫学的作用薬を含むこともできる（たとえば、サイトカイン）。
【００４６】
エピトープ
本発明のエピトープは、Ｂ細胞またはＴ細胞であることができ、制限なく、ペプチド、炭水化物、リピド、グリコペプチドおよび糖脂質を含む任意の化学的性質であることができる。このエピトープは、少なくとも実質的に天然エピトープと同様である。天然エピトープと同一、または天然エピトープの修飾した形であることができる。「ＭＵＣ１エピトープ」といった用語は、他の条件がない場合、ＭＵＣ１の天然エピトープのみならず、実質的に天然エピトープと同一である変異体エピトープを包含することを意図している。このような変異体エピトープは、天然ＭＵＣ１エピトープと交差反応する。同様に、「腫瘍関連エピトープ」のような用語は、天然および変異体エピトープの両方を含むが、変異体エピトープは天然腫瘍関連エピトープと交差反応するものである。
【００４７】
Ｂ細胞エピトープ
Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞によっておよび抗体によって認識されるエピトープである。
Ｂ細胞ペプチドは、典型的には長さが少なくとも５つのアミノ酸で、さらにしばしば少なくとも６のアミノ酸であり、なおしばしば少なくとも７または８のアミノ酸であり、そして連続的（「直鎖」）または非連続的（「立体配置的」）（後者は、一次アミノ酸配列の物理的に近接していない部分の配列を、近接するところへ持ってくる、タンパク質の折りたたみによって形成される）であることができる。
Ｂ細胞エピトープもまた、炭水化物エピトープであることができる。
【００４８】
Ｔ細胞エピトープ
Ｔ細胞エピトープは、もしあるとして、問題となる対立遺伝子による細胞免疫反応を刺激もしくは強めるのに、予防上もしくは治療上有用であることができる程度に病害もしくは有害な状態と関連のある、ハプテンを含む抗原のＴ細胞エピトープと少なくとも実質的に同一である任意のＴ細胞エピトープであることができる。このような病害および状態は、住血吸虫病および、レーシュマニアのような寄生虫病に限らないが、カンジダ症のような真菌感染症、ハンセン病のようなバクテリア感染症、ＨＩＶ感染のようなビールス感染症、および癌、特に固形腫瘍を含む。勿論、関連した病害または有害な状態に対しエピトープの特異性の度合いを高め、さらにエピトープに対する免疫応答の刺激が有害な影響から自由になるらしい。
エピトープは勿論、細胞免疫応答が起こるようにＴ細胞受容体によって認識されなければならない。ペプチドに対し、Ｔ細胞エピトープはクラスＩまたはクラスＩＩ
ＭＨＣ分子と相互作用することができる。クラスＩエピトープは通常８ないし１５、さらにしばしば長さが９−１１のアミノ酸である。クラスＩＩのエピトープは通常５−２４（２４量体はクラスＩＩグルーブにフィットできる最長ペプチドである）、さらにしばしば８−２４のアミノ酸である。免疫原がこれらのサイズよりも大きい場合、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子と相互作用するためにさらに適しているサイズのフラグメントに免疫系によって処理される。
炭水化物Ｔ細胞エピトープは単糖ユニット（例えば、Ｔｎ）と同じに小さくてもよい。好ましくは５糖よりも大きくない。
多くのＴ細胞エピトープが既知である。追加のＴ細胞エピトープを同定するいくつかの技術がこの分野では認識されている。一般に、これらはＴ細胞エピトープを潜在的に提供する分子を調製し、その分子に免疫応答することを特徴的に含む。免疫応答の特徴的方法は後述する。
ＨＬＡ−１のようなＭＨＣクラスＩ分子の特定の対立遺伝子によって「制限される」ようなＣＴＬエピトープ関連は、そのようなエピトープが問題の対立遺伝子によって結合され発現されることを示している。これは、前記エピトープが、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、またはＨＬＡ−Ｂ４４といったＭＨＣの形の異なる対立遺伝子によって結合および発現することができないということを意味するものではない。
【００４９】
疾病関連および疾病特異的エピトープ
疾病は、ウイルス、単細胞生物、もしくは多細胞生物の感染または寄生によって、またはガン（腫瘍）細胞の発生もしくは増殖によってもたらされる有害な臨床的な状態である。（興味深いガンには、WO98／18810およびWO99／51259に述べられているものを含む。）
単細胞生物は任意の単細胞病原体もしくは寄生虫であることができ、バクテリア、菌もしくは原虫を含む。（興味のあるウイルス、バクテリア、および菌は、WO98／18810およびWO99／51259に述べられているものを含む。）多細胞生物は、任意の病原体または寄生虫であることができ、原虫、虫、もしくは節足動物を含む。多細胞器官は内部寄生者と外部寄生者の両方を含む。内部寄生者は、免疫反応を誘発しやすいが、しかし、保護性の免疫反応を誘発する程度であり、外寄生生物およびその抗原は、本発明の範囲内にある。
エピトープは、ウイルス小片によって提示したか、またはウイルス性ゲノムによってエンコードされて感染細胞に発現した場合に、ウイルス性疾患に直接関連しているということができる。
エピトープは、原因生物の細胞内、表面、もしくは分泌抗原によって提示した場合に、単細胞もしくは多細胞生物による疾患に直接関連しているということができる。
エピトープは、特定の腫瘍の細胞内、表面、もしくは分泌抗原によって提示した場合に、その特定の腫瘍に直接関連しているということができる。問題となる腫瘍タイプのすべての株細胞によって、または特定の腫瘍の全細胞によって、または腫瘍の全生存期間を通じて提示される必要はない。問題となる腫瘍に特異的である必要はない。エピトープは、なんらかの腫瘍（ガン、新生物）と関連している場合は、一般的に「腫瘍に関連した」ということができる。
腫瘍は、間葉または上皮起源である。ガンは、大腸癌、直腸癌、頸癌、乳癌、肺癌、胃癌、子宮癌、皮膚癌、口癌、舌癌、口唇癌、喉頭癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、および白血病を含む。
エピトープは、対象の感染細胞によって特異的に産生もしくは過剰産生される場合、または、疾病に対して特異的ではあるが、非免疫的に対象の他の細胞によって特異的に産生もしくは過剰産生される、たとえば腫瘍により分泌される調節物質の結果として近接の細胞から過剰産生される血管形成ファクター、場合に、疾病に間接的に関連しているといえる。
用語「疾病に関連したエピトープ」は、天然の疾病エピトープを認識する抗体またはＴ細胞が類似の非天然エピトープをも認識するくらい問題となる疾病に天然に関連したエピトープと十分に類似している任意の非天然産生エピトープをも包含する。特定の疾病または疾病の程度に関連したエピトープについても同様のコメントを適用することができる。
エピトープが検出可能かつ臨床的に有用な程度に、他の原因よりもより頻繁に特定の原因に関連する場合、そのエピトープはその原因（疾病原因生物、または、より特定には、腫瘍といったもの）に特異的であるということができる。予防上、治療上または診断上の有用な効果が得られるならば、完全な特異性は必要ない。
「特異的腫瘍−特異的」エピトープの場合、他の腫瘍または正常細胞とよりも、その腫瘍とさらに頻繁に関連する。好ましくは、問題となる腫瘍と関連して発生する頻度ならびに、（ａ）腫瘍が除去されたタイプの正常細胞、および（ｂ）他の腫瘍の少なくとも一種に関連した発生頻度との間で、統計学的に有意な（ｐ＝0.05）違いが存在すべきである。エピトープは、正常細胞とともにある場合に比して、（どれかまたは全部の種類の）腫瘍とともにある場合により頻繁に関連する場合に、一般的に「腫瘍特異的」ということができる。すべての腫瘍と関連する必要はない。
用語「腫瘍特異的エピトープ」は、類似のエピトープによって刺激された抗体またはＴ細胞が、天然エピトープによって刺激されたＣＴＬｓと本質的に同様の特異性であるくらいに、問題となる腫瘍に特異的な（適切なら、腫瘍一般に特異的な）天然産生エピトープに十分類似している、任意の非天然産生エピトープをも包含する。
一般的に、より高い特異性は一般的により少ない反対の効果を導くので、（投薬の経路および影響を受けた正常組織に依存して）腫瘍対正常特異性は、腫瘍対腫瘍特異性よりも重要である。腫瘍対腫瘍特異性は、治療的使用とは逆に診断的使用に重要である。
用語「特異的」は、完全な特異性を意味するよう意図しているのではなく、単に、対応する正常な対象に比べて病原体または腫瘍に関連する発生の確率が、臨床的に有用な違いであることを意味するように意図している。
【００５０】
寄生虫関連エピトープ
一の実施例では、エピトープは寄生虫関連エピトープで、たとえばレーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バベシア症、または住血吸虫症に関連したエピトープといったものである。好適な寄生虫関連エピトープは、以下を含むが、これに制限されるものではない。
【００５１】
【表５】
2005526497.tif 000010
【００５２】
ウイルス関連エピトープ
他の実施例中、エピトープはウイルス性エピトープであり、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、または肝炎に関連したエピトープである。好適なウイルス性エピトープは、以下を含むが、これに制限されるものではない。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
細菌関連エピトープ
エピトープは、細菌性抗原と関連することもできる。好適なエピトープは、以下を含むが、これに限定されるものではない。
【００５５】
【表７】
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【００５６】
ガン関連エピトープ
他の実施例において、エピトープはガン（腫瘍）に関連していて、呼吸器系（肺、気管、喉頭）、消化器系（口、食道、胃、腸）、排泄系（腎臓、膀胱、大腸、直腸）、神経系（脳）、生殖系（卵巣、子宮、子宮頸部）、分泌系（乳房、肝臓、膵臓、前立腺）、皮膚等のガンを含むが、これに限定するものではない。ガンの二つの主要な群は、間葉由来かつ骨および筋肉に影響する肉腫、および上皮由来かつ乳腺、胃、子宮、皮膚および舌のガンの大部分を作る癌腫である。肉腫は、線維肉腫、リンパ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫および脂肪肉腫を含む。癌腫は、腺がん、基底細胞癌腫、およべ扁平上皮がんを含む。
ガン関連エピトープは、変異体p53、部位変異Rasオンコジーン遺伝子生成物、her
2／neu、c／erb2、およびMUC1コアタンパクといったペプチドエピトープ、ならびにシアリルTn（STn）、ＴＦ、Ｔｎ、ＣＡ125、シアリルＬｅｘ、シリアルＬｅａおよびＰ９７といった炭水化物エピトープを含むが、これに限定するものではない。
【００５７】
炭水化物エピトープ
炭水化物エピトープも興味深い。たとば通常のヒトガンに大いに発現する腫瘍関連炭水化物エピトープの３種のいずれもが示すことができる。これらは特に、ラクトシリーズタイプ１およびタイプ２鎖、ガン関連ガングリオ鎖、および中性スフィンゴ糖脂質を含む。ラクトシリーズタイプ１鎖およびタイプ２鎖の例は、以下の通りである。すなわち、ルイスa、二量体ルイスa、ルイスb、ルイスb／ ルイスa、ルイスx、ルイスy、ルイスa／ ルイスx、二量体ルイスx、ルイスy／ ルイスx、トリフコシルルイスy、トリフコシルルイスb、シアロシルルイスx、シアロシルルイスy、シアロシル二量体ルイスx、Tn、シアロシルTn、シアロシルTF、TFである。ガン関連ガングリオ鎖の例は、以下の通りである。すなわち、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ４、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＤ−１ａ、ＧＤ−１ｂである。中性スフィンゴ脂質は、グロボトリオース、グロボテトラオース、グロボペンタオース、イソグロボトリオース、イソグロボテトラオース、ムコトリオース、ムコテトラオース、ラクトトリオース、ラクトテトラオース、ネオラクトテトラオース、ガングリオトリオース、ガングリオテトラオース、ガラビオース、および９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３を含む。
多数の臨床的に重要な抗原は炭水化物決定基をもつ。このような抗原の一つの群は、腫瘍関連ムチンから構成される（Rousselら、Biochimie 70、1471、1988）。
一般的に、ムチンは唾液、胃液、等の中に見出される糖タンパク質で、粘性の溶液で、体の外部表面および内部表面上の潤滑剤または保護剤としてはたらく。ムチンは、典型的には高分子量（しばしば1,000,000ダルトンをこえる）で、大規模にグリコシル化されている。ムチンのグリカン鎖はＯ−結合（セリンまたはトレオニン残基に対して）で、糖タンパクの分子量の80％以上に達することができる。ムチンは管状上皮細胞および同一由来の腫瘍によって産生され、そして分泌され、または不可欠な膜タンパクとして細胞に結合する（Burchellら、Cancer  Res.、47、5476、1987；Jeromeら、Cancer  Res.、51、2908、1991）。
癌性の組織は、正常な対応物に比べてグリコシル化が比較的されていないことが知られている異常なムチンを産生する（Hullら、Cancer  Commun.、1、261、1989）。ガン細胞中のタンパク質グリコシル化機構の機能的変化のために、腫瘍関連ムチンは典型的には短く、不完全なグリカンを含む。このため、ヒト乳脂肪小球に関連した正常なムチンが基本的に四糖グリカン
、gal  β1-4  glcNAcp1-6（gal  β1-3）gal  NAcαおよびそのシアル酸付加類似物（Hullら）からなる一方で、腫瘍関連Tnハプテンは、単糖残基、α−２−アセトアミド−３−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシル、および二糖類β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−３）α−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノシルのＴ−ハプテンからのみなる。腫瘍関連ムチンの他のハプテンは、たとえばシアリル−Ｔｎおよびシアリル−（２−６）Ｔハプテンで、末端シアリル残基の短いＴｎおおびＴグリカンへの付加によって生じる（Hanischら、Biol.  Chem.  Hoppe-Seyler、370、21、1989；Hakormori、Adv.  Cancer  Res.、52：257、1989；Torbenら、Int.  J  Cancer、45、666、1980；Samuelら、Cancer  Res.、50、4801、1990）。
ＴおよびＴｎ抗原（Springer、Science、224、1198、1984）は、多くの初期癌腫細胞およびその転位（全ヒト癌腫の90％以上）の外表面膜上に免疫反応形で見出される。腫瘍マーカーとして、ＴおよびＴｎは、いくつかの癌腫の早期の免疫組織化学的検出および予後判定を可能とする（Springer）。最近では、腫瘍組織上のシアリル−Ｔｎハプテンの存在が、好ましくない予後のパラメータとして同定されている（Itzkowitzら、Cacer、66、1960、1990；Yonezawaら、Am.  J.  Clin.  Pathol.、98  167、1992）。異なる３種の腫瘍関連炭水化物抗原が、通常のヒト癌において高度に発現する。ＴおよびＴｎハプテンは、ラクト系列タイプ１、およびタイプ２中に含まれる。加えて、ガン関連ガングリオ鎖およびスフィンゴ糖脂質は、様々なヒトガン上に発現する。
腫瘍関連ムチンによって提示される変化したグリカン決定基は、患者の免疫系によって非自己または外部者として認識される（Springer）。特に、多くの患者において、Ｔハプテンに対する強力な自己免疫反応が観察される。これらの反応は、容易に測定することができ、従前可能だったよりも早期に、高い感応性および特異性で癌腫の検出が可能となる。最後に、ＴおよびＴｎの発現の程度は、癌腫の分化の程度としばしば関連する（Springer）。
炭水化物ハプテンの広範な議論が、Wong、USP  6,013,779において示されている。種々の炭水化物は、本発明に従っては、特に腫瘍の検出および治療における使用のために、合成糖リポタンパク免疫原中に組み込まれることができる。Ｔｎ、Ｔ、シアリルＴｎおよびシアリル（２→６）Ｔハプテンが特に好ましい。
特に、腫瘍を検出および治療するために、通常のヒト癌に高度に発現する３種類の腫瘍関連炭水化物エピトープがアミノ化化合物と接合する。これらは、特にラクト系列タイプ１およびタイプ２鎖、癌関連ガングリオ鎖および中性スフィンゴ糖脂質を含む。
ラクト系列タイプ１およびタイプ２鎖の例は以下の通りである。
【００５８】
【化８】
2005526497.tif 000013
【００５９】
【化９】
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【００６０】
【化１０】
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【００６１】
【化１１】
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【００６２】
【化１２】
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【００６３】
本発明に従ってアミノ化した化合物に接合する癌関連ガングリオ鎖の例は以下の通りである。
癌関連ガングリオ鎖
上記に加えて、本発明に従ってアミノ化した化合物に中性スフィンゴ糖脂質も接合できる。選択した中性スフィンゴ糖脂質
球形トリオース：         Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
球形テトラオース：       GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
球形ペンタオース：       GalNAcα1→3GalNAcβ1→3Galα→4Galβ1→4Glcβ1→
イソ球形トリオース：     Galα→3Galβ1→4Glcβ1→
イソ球形テトラオース：   GalNAcβ1→3Galα1→3Galβ1→4Glcβ1→         
ムコトリオース：         Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ムコテトラオース：       Galβ1→3Galβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ラクトトリオース：       GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ラクトテトラオース：     GalNAcβ1→3GalNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ネオラクトテトラオース： Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glcβ1→
ガングリオトリオース：   GalNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ガングリオテトラオース： Galβ1→GlcNAcβ1→4Galβ1→4Glcβ1→
ガラビオース：           Galα→4Galβ1→
9-O-アセチル-GD3：       9-O-Ac-NeuAcα2→8NeuAcα2→3Galβ1→4Glcβ1→
【００６４】
クラスター形成エピトープ
幾つかの実施例では、一以上のエピトープが与えられて、エピトープがクラスター形成している。
炭水化物エピトープクラスターが、文献中に報告されてきたが、その重要性についてはいまだ明らかに定義されてこなかった。Reddishら、Glycoconjugate  J.、14：549-60（1977）（クラスター形成  STn）、Ragapathiら、Cancer  Immunol.  Immunother、48：1-8（1999）参照。同様に、Ｏ−グリコシル化部位が報告されている。Gendlerら、J.  Biol.  Chem.、263：12820（1988）参照。
以下の米国特許は「クラスター形成したエピトープ」という表現を用いている。
6,376,463
6,258,937
6,180,371
5,929,220
5,888,974
5,859,204
5,744,446
以下の米国特許は、「クラスター形成した」および「炭水化物エピトープ」を列挙している。
6,365,124
6,287,574
6,013,779
5,965,544
5,268,364
4,837,306
【００６５】
ムチンエピトープ  
実施例中、エピトープは癌関連ムチンのエピトープである。ムチンは、高分子量（＞1,000,000ダルトン）および大規模なグリコシル化（80％以上）によって特徴付けられる糖タンパク質である。ムチンは、細胞外で発現することができ、または明瞭な外部の領域、膜貫通の領域、および細胞質領域のあるときの不可欠な細胞膜糖タンパクとして発現することができる。細胞膜ムチンは、柔軟な桿体として存在して、細胞表面から比較的大きな距離で突出して、糖衣の重要な構成要素を形成し（Jentoff、1990）、その炭水化物末端部位はおそらく抗体および免疫系の細胞と接触する最初の部位である。
異常なまたは癌関連ムチンは、比較的少ししかグリコシル化されていないことが知られていて（Hullら、1989）、そのため正常に陰性の炭水化物−エピトープ（Hashishら、1989；Torbenら、1990；Samuelら、1990）、ペプチド−エピトープ（Burchllら、1987）およびおそくらく糖タンパク−エピトープを発現する、対応するその正常細胞ムチンに抗原的に異なっている。このため、細胞表面ムチンが突出するので、これらそのものが免疫攻撃の標的としてはたらくことができる（Henningsonら、1987；Fungら、1990；Singhalら、1991；Jeromeら、1991；Oncogen,  EP
268,279；Biomembrane Institute、WO89／08711；Longenecker、USP 4,971,795）。幾つかの環境下では、癌関連細胞膜ムチンが、他の細胞表面抗原を「マスク」して癌細胞を免疫攻撃から防御することができる（Codingtonら、1983；Friberg、1972；Millerら、1977）。
ムチンエピトープは、コアペプチド、炭水化物、または糖ペプチドであることができる。エピトープを運搬することができるムチンの制限のない例は、ヒト腫瘍関連Thomsen-Friedenrieich抗原（Maclean、1992）、エピグリカニン関連糖タンパク（Codington、1984）ヒツジ下顎ムチン、ウシ下顎ムチン、乳癌ムチン（たとえば、乳癌肺瘍ムチンを含むヒト多型上皮ムチン、Gendler、1988、1990；乳癌上皮腫瘍抗原、Hareuveni、1990、乳癌、Hull、1989）、哺乳動物腫瘍ムチン（たとえば、マウス乳腺癌、Fung、1990）、腎臓（例えば、腎細胞癌）、卵巣（たとえば卵巣癌関連皮脂線性腺抗原、Layton、1990）、膀胱、大腸（たとえば、結腸直腸癌中のシアロシル−Ｔｎ、Itzkowitz、1990）、膵臓腫瘍ムチン（Lan、1990）、胆嚢、膀胱、大腸（たとえば、悪性大腸粘膜ムチン、Torbin、1980）および幾つかの肺細胞組織から発生するムチンのような癌ムチン、メラノーマムチン（たとえば、メラノーマ関連抗原、Kahn、1991）、上皮腫瘍細胞ムチン、白血病関連ムチン、癌胎児性の抗原、または、癌関連ムチンもしくは異常なグリコシル化（Hakomori、1989、およびSinghal、1990）といった異常なムチンの既知の特徴に従う異常な細胞に関連する任意の他のムチンである。
【００６６】
ＭＵＣ１エピトープ
ヒトＭＵＣ１遺伝子生成物は、種々の名前で言及されていて、ＭＡＭ６、乳ムチン；ヒト乳脂肪球形抗原（ＨＭＦＧ）；ヒト乳腺上皮抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９；エピシアリン；および多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）（Taylor-Papadimitriouら、1988に概説）（このセクションで不完全に引用された参照のための完全な参照は、Longeneckerら、08／229,606を参照）を含む。このムチンはヒト乳房（Gendlerら、1988）、膵臓（Lanら、1990）および特定の卵巣癌細胞（Laytonら、1990）に強力に発現する。種々の癌に発現するMUC1エンコードムチンは同一のタンデム反復コアペプチド配列を含んでいるが、グリコシル化の相違が存在する（Gendlerら、1988；Lanら、1990）。ガン細胞中のグリコシル化条件下、ガン細胞上のMUC-1分子は、正常上皮細胞上には発現しない（すなわち陰性である）陰性のエピトープを発現する。
MUC1は、クローン化およびマップ化された最初の癌関連ムチンで（Gendlerら、1990）、最近ではマウスの乳腺株細胞、410.4中に形質移入されている（Lalaniら、1991）。MUC1形質移入410.4細胞は、細胞表面上にMUC1遺伝子産生物を発現する。
グリコシル化のパターンは、ヒト癌関連MUC1によって発現する陰性のペプチドエピトープと同一のものを発現するムチンから誘導される悪性の細胞と類似であるが、異なっている（Taylor-Papadimitriouら、1988）。Lalaniおよび共同研究者（1991）は、マウスの410.4細胞形質移入体の免疫原性について調べている。これらの研究者は、細胞腫瘍発生形質移入体410.4細胞の低投与量を拒否したマウスが、形質移入していない野生型410.4では効果がみられない一方で、形質移入体410.4細胞の高投与量を連続的に移植した後に腫瘍を発生しなかったことを示した（Taylor-Papadimitirouら、1988）。（完全な参照のために、Longenecker5-USA、およびその参照4-11を参照）。
癌細胞上の陰性のMUC-1ペプチド配列を擬態する合成ペプチド抗原から構成される癌ワクチンが、マウスモデル中の腫瘍細胞を発現しているMUC-1に対する効果的な抗がん免疫療法を誘導する。Finnおよび共同研究者は、癌患者が、癌細胞上のMUC-1分子上に発現したペプチドエピトープを認識する特異的な非ＭＨＣ制限細胞障害性T-リンパ球（CTL）を産生することができることを示した（米国シリアル番号08／229,606、docket
Longenecker5-USA、ここで参考文献として組み込む、の参照12および53-551を参照）。特にMUC1配列ＳＡＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のAAs11-17）が、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方であることが示されている。チンパンジーの合成ＭＵＣ−１抗原を用いた免疫化が、ＭＵＣ−１に対する特異的抗体およびＣＭＩの発生を誘導することが示されている。
ヒト上皮ムチンＭＵＣ１が、乳腺、卵巣および膵臓の90％以上において過剰発現して、そしてこれらの腫瘍中で異常にグリコシル化されている。SM3抗体はMUC1のコアタンパクに結合し、腫瘍糖タンパクにも結合する。おそらくSM3エピトープが上述の異常なグリコシル化の結果として曝露されるからである。
ヒトＭＵＣ１のアミノ酸配列は、SWISS−PROTデータベース中にP15941として利用可能である。反復回数は、高度に多型性である。北欧人においては21から125に変化する。もっとも頻繁な対立遺伝子は、41および85繰り返す。タンデムに繰り返すイコサペプチドは、次のかっこで示されたように、三カ所で多型性の基底をなす。PAPGSTAP[P／A／Q／T]AHGVTSAP[D／E][T／S]R（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。一般的な多型性は、二重の突然変異ＤＴ→ＥＳおよび単一置換Ｐ→Ａ、Ｐ→ＱおよびＰ→Ｔに同等である。もっとも頻度の高い置換ＤＴ＞ＥＳは反復の50％以下おこる。マウスＭＵＣ１については、SWISS−PROT  Q02496参照。
Mollerら、Eur.  J.  Biochem.  269：1444-55（Mar.  2002）は、ＮＭＲ分光を使ってＳＭ３抗体のペンタペプチドMUC1エピトープPDTRPへの結合および、スレオニンがアルファ−ｄ−GalNAcへO-系列である関連糖ペンタペプチドへの結合を調査している。Mollerは、PDTがSM3抗体と、RPよりもより強く相互作用することを見出し、RPが変異に対して耐性のあること示唆している。対照的に、糖ペプチドは、もっとも強い効果はProlとの場合ではあるが、そのアミノ酸を使用してＳＭ３と相互作用する。ドッキング研究がなされていて、3D構造が推論可能でまたは決定できる変異ペプチドとのものについてなされている。
Hiltboldら、Cancer  Res.、58：5066-70（1988）は、100アミノ酸の合成MUC1ペプチドとインビトロで初回刺激を受けたCD4+  Ｔ細胞が、５回の非グリコシル化タンデム反復を示して、樹状突起細胞によって提示され、ＩＦＮ−ガンマおよび中程度の細胞学的活性を産生する。コアペプチド配列も同定していて、PGSTAPPAHGVT（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）で、HLA-DR3によって提示される場合この反応を誘発する。
Heukampら、Int.  J.  Cancer、91：385-92（2001）は、不定数の直列反復部位の外側に位置する３つのMUC1由来ペプチドをもつA2／K（b）遺伝子組換えマウス中でペプチド特異的ＣＴＬ免疫を導きだした。これらのペプチドは、ＭＵＣ（79-87）（TLAPATEPA）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＭＵＣ（167-175）（ALGSTAPPV）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＭＵＣ（264-72）（FLSFHISNL）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。すべてＨＬＡ−Ａ＊0201のペプチド結合モチーフに従う。
Engelmannら、J.  Biol.  Chem.  276：27764-9（Jul.  2001）は、ＭＵＣ１の直列反復部位の三つの配列変異形を報告している。変異形１はＤＴをＥＳに置換した。
Soaresら、J.  Immunol.  166：6555-63（Jun. 2001）は、七つの直列反復ＭＵＣ１ペプチドを使用して免疫反応を誘発した。樹状突起細胞上にペプチドが届くと、Ｔ細胞免疫のみが誘発された。可溶性ペプチドとともに注入した場合、Ａｂ産生も引き起こった。
Von  Mensdorff-Pouillyら、J.  Clin.  Oncol. 18：574-83（Feb.  2000）は、乳癌患者に、抗ＭＵＣ１抗体レベルの免疫測定において、ＢＳＡに結合するＭＵＣ１トリプル直列反復ペプチドを用いた。
Dentonら、Pept.  Res.  7：258-64（Sept.／Oct.  1994）、Ｔ−ＢおよびＢ−Ｔ両方の配向性において、既知のマウスＴ細胞エピトープにＭＵＣ１ムチンＢ細胞ペプチドエピトープがコリニアーに類似。
Brossartら、Blood、93：4309-17（June、1999）は、ＭＵＣ１アミノ酸配列を分析してＨＬＡ−Ａ２分子への高い結合可能性をもつ二つの新規のペプチドを同定した。一つは、不定直列反復部位からで、もう一つはそれ以外の部位からであった。
Carmonら、Int.  J.  Cancer、85：391-7（Feb.  2000）は、分子の非直列反復部位からのＨＬＡ−Ａ2.1選択モチーフペプチドの抗腫瘍能を評価している。Pieterszら、Vaccine、18：2059-71も参照（Apr.  2000）。
Keilら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  40：366-9（Jan.  2001）は、ＭＵＣ１エピトープを破傷風毒素エピトープに結合した。
Schreiberら、Anticancer  Res.  20：3093-8（Sep.
／Oct.  2000）は、五つのＭＵＣ１直列反復をもったペプチドが、一の反復のみをもつペプチドに比して、細菌性熱ショックタンパク質ＤｎａＫ（哺乳類熱ショックタンパク質は抗原プロセシングに関わる）への結合親和性が3倍であることを示した。
Von  Mensdorff-Pouillyら、Int.  J.  Cancer、86：702-12（Jun.  2000）は、天然ＭＵＣ１  ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のもっとも頻度の高い最小エピトープ配列がＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  9-14）、ＰＰＡＨＧＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：11；これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs1-3につながるAAs17-20に同等）。ＭＵＣ１ペプチドワクチン接種は、主に、直列反復のＰＤＴＲＰＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs6-12）およびＳＴＡＰＰＡＨＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のAAs1-9）配列に対して、それぞれ、IgMおよびIgG抗体の高タイターを誘起した。乳癌患者からの天然ＭＵＣ  absは、非グリコシル化ペプチドとに比して、GalNac-グリコシル化ペプチドとより強く反応した。欧州特許出願1,182,210；Sandrin、米国特許6,344,203；Finn、米国特許5,744,144も参照。Petrakouら、「Epitope  Mapping  of  Anti-MUC1  Mucin  protein  core  Monoclonal  Antibodies」（21-29）；Imaiら、「Epitope  Characterization  of  MUC1  Antibodies」（30-34）、Scholら、「Epitope  Fingerprinting  Using  Overlapping  20-mer  peptides  of  the  MUC1  Tandem  repeat  sequence」（35-45）、およびBlockzjil、「Epitope  characterization  of  MUC1  Antibodies」（46-56）、すべてＭＵＣ１に対するモノクローナル抗体についてのＩＳＯＢＭ
ＴＤ−４国際ワークショップ（Nov.  1996）中、Tumor  Biology、19 Suppl. 1：1-152（1998）に別刷、も参照。
Von  Mensdorff-Pouillyら、「Human  MUC1  Mucin：a  multifaceted  glycopotein」、Int.  J.  Biol.  Markers、15：343-56（2000）も参照。
このため本発明は、ＭＵＣの少なくとも一の天然Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞エピトープ、またはそのような天然エピトープと実質的に同一の少なくとも一の変異エピトープからなる免疫原を基としている。本発明は、さらに、エピトープの一部ではない付加的なＭＵＣ１配列を包含することができる。
好ましくは、前記免疫原は、ＭＵＣ１のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープ（それぞれの場合について、天然エピトープまたはその許容変異であることができる）の両方を包含し、そしてこれらエピトープは同一、重複、または異なっていることができる。
抗原のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは重複することができる。たとえば、ＭＵＣ−１の場合、ＳＡＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  4-10）はＴ細胞エピトープで、一方ＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  6-10）は単にＢ細胞エピトープである。
さらに、付加的なＢ細胞エピトープ、および／または付加的なＴ細胞エピトープを包含することができる。Ｂ細胞エピトープは、同一または異なることができ、そして同様にＴ細胞エピトープも同一または異なることができる。
本発明の抗原が、少なくとも5個のアミノ酸のＭＵＣ１配列と少なくとも実質的に同一のＭＵＣ１関連配列を包含する場合、前記ＭＵＣ１関連配列は、対応するＭＵＣ１配列中に見られた一またはそれ以上のグリコシル化部位を含むことができる。変異の結果として、可能なグリコシル化部位の数について対応するＭＵＣ１配列と異なることができ、または可能なグリコシル化部位の数について同一であることができる。
グリコシル化可能な部位は、（１）ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中の実際にグリコシル化している部位、（２）前記腫瘍糖タンパク中の実際にはグリコシル化されていないがグリコシル化される可能性のある部位、および／または（３）前記糖タンパクの隣接部位であることができる。同様に、実際のグリコシル化部位は、（１）ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中の実際にグリコシル化されている部位、（２）前記腫瘍糖タンパク中の実際にはグリコシル化されていないがグリコシル化される可能性のある部位、および／または（３）前記糖タンパクの隣接部位であることができる。ＭＵＣ１誘導腫瘍糖タンパク中で正常にグリコシル化される全グリコシル化部位のうちの全くないか、一か、幾つかまたは全部は、本発明の抗原においてグリコシル化されることができる。
ＭＵＣ１は多型性の抗原で、以下の配列の完全および不完全な反復の、変数（典型的には21-125、特に41または85）で特徴付けられる。
ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10）
この配列の複数の反復があるために、示される出発部位は任意で、そしてエピトープは二つの反復をつなぐ。
従って、本発明の免疫原は、前述の完全な反復配列またはその環状順列であることができる。さらに、前記反復またはその環状順列の二またはそれ以上のコピーを包含することもできる。このため、化合物１ａおよび１ｂにおいて、上記反復の環状順列（ＴＳＡ．．．で出発して、ＨＧＶで終了）の二つのコピーがあって、無関係のＳＳＬ配列が続く。
問題となっている各ＭＵＣ１エピトープは、不定の直列反復部位のエピトープか、または前記部位の外部にあるエピトープに相当する。前者はＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs 9-14）、ＰＰＡＨＧＶＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：11）およびＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  6-10）を含む。配列ＰＤＴＲＰＡＰＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  6-14）は、特に興味深く、なぜなら二つの重複エピトープを含んでいるからである。ＰＤＴＲＰ配列は、溶媒にさらされる突起した小頭部の先端部を形成して、安定タイプIIベータターンを形成する。
非ＶＮＴＲ部位エピトープは、ＭＵＣ（79-87）（ＴＬＡＰＡＴＥＰＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＭＵＣ（167-175）（ＡＬＧＳＴＡＰＰＶ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＭＵＣ（264-72）（ＦＬＳＦＨＩＳＮＬ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含む。
好ましくは、免疫原は多型性エピトープＰ［Ｄ／Ｅ］［Ｔ／Ｓ］ＲＰまたはその実質的に同一な変異体である。さらに好ましくは、ＰＤＴＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10のAAs  6-10）またはその実質的に同一な変異体を包含する。
幾つかの実施例において、免疫原は少なくとも一の20アミノ酸配列（効果的な直列反復）で、単にＭＵＣ１直列反復から一もしくはそれ以上の保存的な置換および／または単一の非保存的な置換によって異なり、そしてＭＵＣ１の不定直列反復部位のエピトープを包含する（ともに同一であるか、または変異形を許容する）。好ましくは、あったとしても、保存的な置換によってのみ異なり、さらに好ましくは、単一の保存的な置換によって以上は異ならず、より好ましくは、このような直列反復において同一である。ＭＵＣ１の直列反復は不完全で、このため配列は一の反復については同一であるが他については同一でないこともできるということに注意しなければならない。また、これらの反復中、対立遺伝子の配列が存在し、この配列は、対立遺伝子について同一であるが他については同一でないことができる。
これらの実施例のサブセットにおいて、免疫原は、２（全部で40のアミノ酸）、３（全部で60のアミノ酸）、４、５、６、７または８といった、複数の非重複有効性直列反復を包含する。これらの有効性直列反復は、それぞれ同一であることができるが、必要ではない（対照的に、天然ヒトＭＵＣ１ムチン、反復数は典型的には21-125、に注意）。
一またはそれ以上の有効性直列反復に加えて、免疫原のペプチド部分は付加的なアミノ酸部分配列を包含することができる。この場合、これらの部分配列は付加的なエピトープを包含することができ、これはＭＵＣ１不定直列反復部位エピトープ（有効性直列反復がだめになっている）、その部位の外側からのＭＵＣ１エピトープ、または他の癌抗原のエピトープであることができる。免疫調節性要素をも含むこともできる。Longeneckerら、08／229,606を参照。
好ましくは、ＭＵＣ１直列反復の一またはそれ以上のセリンおよび／またはスレオニンがグリコシル化されて、好ましくはＴｎまたはシアリルＴｎによってグリコシル化される。天然ヒトＭＵＣ１ムチン中、五つの正常なグリコシル化部位が反復ごとにある。正常ＭＵＣ１中、これら五つの部位のうち平均2.6が事実上占有されている。グリコシル化アミノ酸の反復ごとの平均数は、「天然値」と比して、それ以下、同じ、またはそれ以上であることができる。
好ましくは、Kogantyら米国仮出願60／377,595、2002年５月６日出願（登録書：Koganty4.1-USA）、参照として組み込む、に開示されているように、免疫原は脂質化されている。さらに好ましくは、そのＣ末端部位に、配列ＳＳＬを包含し、その両方のセリンは脂質化されている。
【００６７】
天然発生エピトープの同定
他の天然発生エピトープは、Kogantyら、米国仮出願60／377,595（Koganty4.1-USA）に述べられている方法によって同定することができる。
【００６８】
エピトープ変異体
一般的に、天然に発生する疾病または腫瘍特異的エピトープと同一のエピトープに加えて、本発明は、そのようなエピトープと異なってはいるが実質的に同一のエピトープを包含し、そしてこのため、当然に疾病または腫瘍特異的である。天然発生エピトープと実質的に同一ではないが、それでもなお3D立体配座の類似性の結果として、後者と交差反応性である。
ペプチド部分のアミノ酸配列の許容できる修飾の一つの種類は、アミノ酸置換である。保存的な置換は、アミノ酸を他の同様の大きさ、電荷および極性のアミノ酸で置き換える。これらはペプチドの立体配座を実質的に変更しやすくはない。本発明のタンパク質またはペプチド分子中で作ることのできる置換の種類は、異なる種の相同的なタンパク間のアミノ酸変化の頻度の分析に基づき、これはSchulzら、上記の表1-2、およびCreighton、上記の図3-9といったものである。このような分析に基づき、保存的置換は、以下の５つのグループの一の変化としてここに定義される。
表Ｖ
１．小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr（Pro、Gly）
２．極性、負荷電残基およびそのアミド：Asp、Asn、Glu、Gln
３．極性、正荷電残基：His、Arg、Lys
４．大きい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Met、Leu、Ile、Val（Cys）
５．大きい芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
グループ1から3のセットの範囲内のなんらかの関連物および変異体は、半保存的と考えることができる。同様に、グループ4および5の範囲内の変異体は半保存的と考えることができる。
残基Pro、GlyおよびCysは、タンパク質構築におけるその特別な役割のために括弧でくくられる。Proはペプチド鎖を強固にし、そしてアルファらせん構造と干渉する傾向にある。Glyはペプチド鎖を柔軟にし、そしてアルファらせんの間またはベータ鎖の間の「ループ」中よく見られる。システイン残基のチオールグループは、酸化されて隣接していないシステイン残基間のジスルフィド結合を形成する。
前記グループ中、以下の置換は「高度に保存的」であると考えられる。
Asp／Glu、His／Arg／Lys、Phe／Tyr／Trp、Met／Leu／Ile／Val
半保存的置換は、上記グループ（Ｉ）から（Ｖ）のうち二つの間の交換として定義され、上記（Ｉ）、（II）および（III）から構成される高次グループ（Ａ）に制限されるか、上記（IV）および（Ｖ）からなる高次グループ（Ｂ）に制限される。また、Alaは、グループＩでないすべてのアミノ酸について半保存的置換であると考えられる。
エピトープは基準エピトープの免疫学的な活性の少なくとも10％をもち、かつ一の非保存的置換を越えずに基準エピトープと異なる場合（下記を除く）に、基準エピトープ（たとえば天然発生エピトープ）と実質的に同一であると考えられる。好ましくは、任意の非保存的置換は、半保存的置換である。好ましくは、非保存的置換がない。
保存的置換が任意の数あることができる。好ましくは、そのような置換が3を越えず、さらに好ましくは、2を越えず、そしてより好ましくは、1を越えない。
高度に保存的な置換は、他の保守的な置換に比して活性に影響をおよぼしにくく、保存的置換は単なる半保存的置換に比して活性に影響をおよぼしにくく、そして半保存的置換は他の非保存的置換に比して活性に影響をおよぼしにくい。加えて、単一の置換は複数の変異体に比して活性に影響をおよぼしにくい。
興味のあるペプチドの置換変異体は、単一または複数のいずれについても、もとのペプチドの効力を完全には持つことはできないかもしれないが、このような変異体は有用であることができる。
置換は、遺伝的な符号化されたアミノ酸、または天然発生アミノ酸にも制限されない。ペプチド合成によってエピトープが調製されるとき、所望のアミノ酸を直接使用することができる。代替的に、遺伝的に符号化されたアミノ酸は、これを選択した側鎖または末端残基と反応する能力のある有機誘導剤によって、修飾されることができる。
他の交換グループに属する遺伝学的に符号化されたアミノ酸よりも、もとのアミノ酸、および同一交換グループ中の他のアミノ酸に大きさ（体積）および疎水性（親油性）において類似している場合、遺伝学的に符号化されていないアミノ酸は、遺伝学的に符号化されたアミノ酸の保存的置換と考えることができる。
エピトープ変異体を同定する方法は、Kogantyら、米国仮出願60／377,595（Koganty4.1-USA）に述べられている。
【００６９】
類似物
開示した化合物の類似物もまた興味深い。
類似物は、その化学的構造に基づき、化合物に細切れにしたビットマップ構造フィンガープリントを割り当てて、広範な化学的データベース中の各化合物のフィンガープリントに対する類似性を決定することで、同定することができる。前記フィンガープリントは、1999年１月８日現在の公開ソフトウェアに従って、Daylight  Chemical  Information  Systems,  Inc.からその目的で市販されているフィンガープリントソフトウェアによって決定することができる。本質的に、そのアルゴリズムは、各原子についてビットパターンを最も近い近隣で、７つの結合長までの筋道をもって、産生する。各パターンは、疑似乱数の産生器への種子としてはたらき、そのアウトプットはビットのセットで、発生するフィンガープリントに論理的に順序づけられる。このフィンガープリントは、固定あるいは不定の大きさであることができる。
このデータベースは、SPRESI'95（IfoChem  GmbH）、Index  Chemicus（ISI）、MedChem（Pomona／Biobyte）、World  Drug  Index（Derwent）、TSCA93（EPA）、May  bridge  organic
chemical  catalog（Maybridge）、Available  Chemicals  Direcory（MDLIS  Inc.）、NCI96（NCI）、Asinex  catalog  of  organic  compounds（Asinex
Ltd.）、またはIBIOScreen  SC  and  NP（Inter  BioScreen  Ltd.）、または社内データベースであることができる。
基準化合物のデイライトフィンガープリントに少なくとも0.85（Tanamoto係数）の類似であるデイライトフィンガープリントを持つ場合、その化合物は基準化合物の類似物である。
基準化合物から等配電子の置換によって概念的に誘導できる場合も、化合物は基準化合物の類似物である。
相同体は、アルキル成分中のメチレン基の数が増大または減少することによって異なる化合物である。
古典的なアイソスターは、Erlenmeyerの定義に合致する。すなわち、「電子の末梢性の層が同一と考えることのできる原子、イオンまたは分子」。古典的なアイソスターは以下を含む。
【００７０】
【化１３】
2005526497.tif 000018
【００７１】
非古典的なアイソスター対は-CO-および-SO2-、-COOHおよび-SO3H、SO2NH2および−PO（OH）NH2、ならびに−Ｈおよび−Ｆ、−ＯＣ（＝Ｏ）−およびＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＨおよび−ＮＨ２を含む。
免疫反応の特徴付け
細胞が媒介する免疫反応は、インビトロまたはインビボでアッセイすることができる。通常のインビトロアッセイはＴ細胞増殖アッセイである。血液試料を関心のある疾病に罹患した患者からとり、その疾病に関連した、またはワクチン接種した個人からとる。この個人のＴ細胞はこのため、増殖によりその抗原に新しくさらされることに反応するよう初回刺激を受ける。増殖は、ＤＮＡ複製におけるその役割のためにチミジンを要する。
一般的に、Ｔ細胞増殖はＢ細胞増殖に比して大規模であり、分離されていない細胞群においてさえも強いＴ細胞反応を検知することができる。しかしながら、Ｔ細胞の精製は、Ｔ細胞反応の検知を容易にするのに望ましい。その抗原特異的増殖を実質的に逆に影響しなければ、Ｔ細胞精製の任意の方法をとることができる。ここでの好ましい手順は、10.7の特別な密度の等密度の勾配で、すなわちFicoll-HypagueまたはPercoll勾配分離で、まず全リンパ球個体群を捕集により得る（血液、脾臓、リンパ節から）。この細胞の混合個体群を、次に数通りの方法を経てＴ細胞個体群にさらに精製する。もっとも簡便な分離は、Ｂ細胞および単球／マクロファージ個体群のナイロンウールカラムへの結合に基づくものである。Ｔ細胞個体群は、ナイロンウールを通過し、90％以上の精製Ｔ個体群を単一の経過により得ることができる。他の方法には、補体タンパク質の存在下、非Ｔ細胞個体群（ネガティブ選択）を溶解するために、Ｂ細胞に対する特異的抗体および／または単球抗原を使用することを含む。さらに他の方法は、抗Ｔ細胞抗体（ＣＤ３）が固相マトリックス（磁性ビーズといったもの）に結合して、このためＴ細胞が付着してこれを非Ｔ細胞個体群から分離する（すなわち、磁性的に）ことを可能にする、ポジティブ選択である。これらは、機械的または化学的分裂によってマトリックスから回収することができる。
精製Ｔ細胞個体群を得れば、照射を受けた抗原提示細胞（脾臓マクロファージ、Ｂ細胞、樹状突起細胞はすべて存在）の存在下、培養される（これらの細胞は、トリチウム化チミジンに反応および組み込まれることを防止するために照射を受ける）。生存可能なＴ細胞（20ユニットでIL2で補充される100μl培地中のウェルあたり100,000-400,000）は、次に試験ペプチドまたは他の抗原とともに、3から7日間、試験抗原とともに1から100μg／mlの濃度で培養される。
抗原刺激期間の終わりに、幾つかの方法で反応を測定することができる。まず、細胞のない上清を培養して、特異的サイトカインの存在を試験する。αインターフェロン、IL2またはIL12の存在は、Ｔｈヘルパータイプ１個体群反応を示す。IL4、IL6およびIL10の存在はともに、Ｔヘルパータイプ２免疫反応を示す。このため、この方法は、ヘルパーＴ細胞サブセットの同定を許容する。
ブラストジェネシスと名付けられた２番目の方法は、抗原刺激期間の終わりに、トリチル化チミジンを培養に加え（たとえば、ウェルごとに1μキュリー）、4から16時間かけて放射性標識をつけた代謝生成物を細胞に組み込ませ、続いてシンチレーションカウントのためにフィルター上で培養する。組み込まれた放射性チミジンの水準は、Ｔ細胞複製活性度の測定となる。ネガティブ抗原または抗原非存在対象ウェルが、刺激指標の面からブラストジェニック反応を算出するために使用される。これはＣＰＭテスト／ＣＰＭ対照である。好ましくは、達成する刺激指標は、少なくとも2で、より好ましくは少なくとも3で、さらに好ましくは5で、もっとも好ましくは少なくとも10である。CMIは、標準的な実験動物、たとえばマウスの、インビボで測定することもできる。マウスは初回刺激抗原で免疫化される。Ｔ細胞の反応をまったあと、このマウスをテスト抗原のフットパッド注射によって攻撃する。ＤＴＨ反応（テストマウスの腫脹）は、たとえば、生理食塩水溶液を注射した対照マウスと比較される。
好ましくは、反応は、少なくとも0.10mm、より好ましくは少なくとも0.15mm、さらにより好ましくは0.20mm、もっとも好ましくは少なくとも0.30mmである。
インビボで、体液性免疫反応は、免疫化したマウスからの血液をとり、関心のある抗原に結合する抗体の存在下、その血液をアッセイすることによって測定する。たとえば、テスト抗原は固定され試料とともに培養されて、それよって同族の抗体を捕獲し、そして捕獲抗体を次に、標識化した抗アイソタイプの抗体とともに固相で培養することによって測定する。
好ましくは、体液性免疫反応は、望まれる場合、少なくとも1／100の抗体タイターによって示されるのと少なくとも同じ強さで、より好ましくは少なくとも1／1000であり、さらにより好ましくは少なくとも1／10,000である。
【００７２】
製薬的組成および方法
対象
本発明のワクチンのレシピエントは、体液性免疫反応または細胞免疫反応を経て特異的免疫を取得することできる任意の脊椎動物であることができる。
哺乳動物においては、霊長目（ヒト、類人猿およびサルを含む）、偶蹄類（馬、ヤギ、ウシ、ヒツジ、豚を含む）、齧歯類（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）、および食肉目（猫、および犬を含む）の哺乳動物が好ましいレシピエントである。鳥においては、七面鳥、ニワトリおよび同目の他のメンバーが好ましいレシピエントである。もっとも好ましいレシピエントはヒトである。
本発明の好ましい対象動物は霊長類の哺乳類である。用語「哺乳類」によっては、哺乳綱に属するそれぞれの個体を意味し、これは、もちろん、ヒトを含む。本発明は、獣医学への使用も同様に意図しているが、特に、ヒト被検者の治療に対して有用である。用語「非ヒト霊長類」は、ヒト科をのぞく類人猿亜目の任意のメンバーを意図している。このような非ヒト霊長類は、新世界サル上科、オマキザル科（オマキザル、ホエザル、クモザルおよびリスザルを含むアメリカ大陸のサル）、およびマーモセット科（マーモセットを含む）；オナガザル上科（マカク、マンドリル、ヒヒ、テングザル、モナザル、およびインドの聖ヒトザルを含む）；およびヒト上科、ショウジョウ科（テナガザル、オランウータン、ゴリラ、およびチンパンジーを含む）を含む。アカゲザルはマカクの一メンバーである。
【００７３】
免疫刺激組成物
本発明は、上で開示したように、少なくとも一の免疫刺激性オリゴヌクレオチド分子からなる少なくとも一の製薬的組成物の使用を企図している。
この免疫刺激性組成物は、対象の免疫学的準備状態を非特異的に増大させるかさもなくば変更するのに使用することができる。
このため、製薬的に投与した免疫原と組み合わせて投与して、微生物もしくは非微生物、または腫瘍によって示された免疫原に対する生得的な免疫反応を強めることができる。このため、罹患した疾病に対する対象の抵抗性を増大し、または存在している疾病を治療するために使用することができる。これらの使用において、たとえば細菌感染の治療のための抗生剤といった前記疾病に対する非免疫学的薬剤と組み合わせて、選択的に使用することできる。
または、疾病に対して保護性の特異的免疫反応を誘発する、免疫原を構成する製薬的な組成の一部または組み合わせで使用することができて、この場合では疾病特異的反応を増強する効果をもつ。さらに、これらの免疫学的薬剤は、前記疾病に対する非免疫学的薬剤とともに使用することができる。
本発明の製薬的な組成物のいくつかは、少なくとも一の免疫原を、保護性の免疫反応を誘発するのに十分な量含んでいる。この反応は、体液性、細胞性、またはその組み合わせである。この組成物は複数の免疫原からなる。
少なくとも一の免疫原は、好ましくはそれ自体が免疫原性の糖脂質ペプチドで、またはリポソームへの組込みの結果として免疫原性となる糖脂質ペプチドである。糖脂質ペプチドは、米国仮出願60／377,595、2002年５月６日出願（ドケットKoganty4.1-USA）に述べられていて、これはすべてここに参照として組み込む。
前記免疫原は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与する前、投与した後、または投与と同時に投与することができる。同時に投与する場合、単一の組成としてあるか、または異なる組成としてあるかであり、異なる組成は異なる経路で投与することができる。オリゴヌクレオチド分子は、他の免疫賦活剤を使用することができる場合も、そして非特異的免疫刺激性の他に有用な活性を持つことができる場合も、免疫賦活剤として考えられる。
さらに、免疫原および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの役割を、少なくとも一のＣｘＧジヌクレオチドユニット、少なくとも一の親油基、および少なくとも一のエピトープからなる単一分子に組み込むことができる。
製薬的な組成は好ましくはさらにリポソームを含む。好ましいリポソームは、Jiangら、PCT／US00／31281、2000年11月15日出願（ドケットJIANG3A-PCT）、およびLogeneckerら、08／229,606、1994年４月12日出願（ドケットLONGENECKER5-USA、およびPCT／US95／04540、出願1995年4月12日（ドケットLONGENECKER5-PCT）に含まれる。
組成は、抗原提示細胞を含むことができ、この場合免疫原は、投与前に先立ち、より効果的な提示のために、細胞上にパルスで送ることができる。
組成は、従来技術に既知の補助的な薬剤または賦形剤を含むことができる。たとえば、Berkowら編、「The Merk Manual、第15版」、Merk  &  Co.、Rahway、N. J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第8版、Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.  Y.，（1990）；Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  linical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版、ADIS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.
（1987）、Katzung版、Basic  and  Clinical  Pharmacology、第5版、Appleton  and  Lange、Norwalik、Conn.（1992）、これら参考文献およびその中での引用は、ここに参照として完全に組み込まれる。
製薬的な組成は、即効性の免疫刺激脂質化オリゴヌクレオチドの他に、さらに免疫賦活剤を含んで、非特異的に免疫反応を強めることができる。幾つかの免疫賦活剤は、体液性免疫反応および細胞性免疫反応の両方を増強することができ、そして他のｓは一または他に特異的である。幾つかは一を増強し、他を阻害する。免疫賦活剤の選択は、このため、所望の免疫反応に基づく。
製薬的な組成は、細胞性もしくは体液性免疫反応のいずれかを支持または阻害するサイトカイン、またはこのようなサイトカインに対する阻害性抗体といった、他の免疫調節物質を含むことができる。
本発明に従う製薬的な組成は、少なくとも一のガン化学療法物質を含むことができ、たとえば抗代謝生成物、ブレオマイシンペプチド抗生物質、ポドフィリンアルカロイド、ビンカアルカロイド、アルキル化作用薬、抗生物質、シスプラチン、またはニトロソ尿素からなるグループから選択される。
製薬的な組成は、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、チオセミカルバゾン、メチサゾン、リファンピン、リブビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカーネット、ホスホ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、またはガンシクロビルから選択される、少なくとも一のウイルス性化学的療法化合物を含むことができる。Katzung、上記、およびそこで引用している参照、798から800頁および680から681頁、それぞれ、参照はここに完全に参照として組み込まれる。
製薬的な組成は、少なくとも一の抗バクテリア剤を含むことができる。このような薬剤は、ペニシリン、セファロスポリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ポリミキシン、スルホアミド、およびトリメトプリムを含む。特に関心のある特異的薬剤のいくつかは、アモキシシリン、アンピシリン、ベンジルペニシリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エンロフロキサシン、エリスロマイシン、リンコマイシン、およびリファンピシンである。
製薬的な組成は、少なくとも一の抗寄生虫薬を含むことができる。抗寄生虫薬は、節足動物、蠕虫（線虫、蟯虫、線虫、鈎虫、条虫、鞭虫、および住血吸虫を含む）、および原虫（アメーバ、およびマラリア、トキソプラズマ、およびトリコモナス生物体）に対して使われるのに適した薬剤を含む。実施例は、チアベナゾール、種々のピレトリン、プラジカンテル、ニクロスアミド、メベンダゾール、クロロキンＨＣｌ、メトロニダゾール、ヨードキノール、ピリメタミン、メフロキンＨＣｌ、およびヒドロキシクロロキンＨＣｌを含む。
製薬的な組成は、疾病の症状を改善する少なくとも一の薬剤を含むことができる。症状は、たとえば、痛みおよび発熱を含む。
これらの種々の活性薬剤は、前記免疫原または前記免疫刺激性脂質化オリゴヌクレオチド分子と同一の組成の一部として、同時に投与する別々の組成の一部として、または対象に異なるタイミングで投与される別々の組成の一部として、投与することができる。
【００７４】
製薬的な目的
本発明の目的は、疾病から対象を保護することである。「感染または疾病からの保護」にあるような、用語「保護」は、ここでは、「予防」、「抑制」または「治療」を包含して使用される。「予防」は、疾病の誘発に先立つ製薬的な組成の投与を含む。「抑制」は、疾病の臨床的な発現に先立つ製薬的な組成の投与を含む。「治療」は、疾病の出現後の製薬的な組成の投与を含む。治療は改善性または治癒であることができる。
ヒトおよび獣医学的な医薬において、「予防」および「抑制」の間を区別することは常には可能でないということを理解しなければならない。なぜなら、究極的な誘導的な現象は知られていない、潜在的、または現象の出現後にしか患者をよく確かめられないからである。このため、用語「防御」を使用して、「治療」とは異なるが、ここに定義した「予防」および「抑制」の両方を包含するようにするのが通常である。ここで使用する用語「保護」は、「防御」を包含するよう意図している。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記およびKatzung、上記、これらおよびこれらで引用されている参照はここに完全に参照として組み込まれる。
与えられる「保護」は、完全である必要はなく、すなわち、疾病が完全に予防または根絶される必要はなく、対象個体群に比較して統計的に有意な改善（p＝0.05）が存在すればよい。保護は、疾病症状の発症の重症度または急性度を軽減することに限定することができる。競合的な薬剤に比して比較的小さい程度の保護しか供さない薬剤も、特定の個人について他の薬剤が効果的でない場合、他の薬剤と組み合わせて保護の程度を増大できる場合、または競合的な薬剤に比して安全な場合は価値がある。
好ましくは疾病ステージの時期を一致させて、非治療対照群と治療完了群の疾病の持続時間、重症度、等を比較することで、治療の効果を判定することができる。
防御の効果は、通常、処置群の疾病の発生率および対照群の発生率を比較することで確認することができ、ここで処置群および対照群は等しいリスクであると考えられて、またはリスクの予想される違いについて補正をかける。
一般的に、防御は、家族歴、個人の既往歴、または原因薬物への曝露の上昇を鑑みて、疾病のについて高いリスクであると考えられた場合に与えられる。
【００７５】
製薬的な投与
本発明の少なくとも一の保護的薬剤を、前記の製薬的な組成を使用して、意図した目的を達成する任意の方法により、投与することができる。
投与は経口または非経口的で、そして、非経口的な場合、局所的または組織的のいずれでもよい。たとえば、このような組成の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または頬側経路といった種々の非経口的な経路によることができる。非経口的投与は、ボーラス注入によってまたは時間をかけての漸進的な灌流によることができる。本発明の製薬的組成を用いた好ましい方法は、皮下、筋肉内または静脈内による適用である。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記およびKatzung、上記を参照。これらは、その中に引用された参照も全て含んで、完全にここに参照として組み込まれる。
活性特異的免疫療法による免疫反応によって軽減することのできる疾病または状態を、予防、抑制、または治療するための典型的な療法は、上記の製薬的な組成の有効量投与することを含み、これは単一の治療として投与されるか、または増強またはブースター投与量として、一週間から約24ヶ月の間の期間内繰り返される。
効果的な投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、および体重、併用の治療、もしもあるなら、治療回数、そして所望の効果の性質に依存すると理解される。以下に用意した効果的な投与量の範囲は、本発明を制限することを意図せず、好ましい投与量の範囲を説明するためのものである。しかしがら、もっとも好ましい投与量は、個々の対象にあわせられていて、これは当業者にとって、過度の実験をせずに、理解および決定できるものである。これは、典型的には、標準の投与量の調製を含み、たとえば、患者が低体重の場合は投与量を減少する。たとえば、Berkowら編、「The  Merck  Manual、第15版」Merck  and  Co.、Rahway、N. J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第8版」Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.Y.、（1990）；「Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版」AIDS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Ebadi、「Pharmacology」、Little、Brown  and  Co.、Boston、（1985）；Chabnerら、上記；De  Vitaら、上記；Salmon、上記；Schroederら、上記；Sartorelliら、上記；およびKatsung、上記、これら参照およびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
ヒトに用いる前に、まず、安全性および効力について実験動物で評価する。ヒト臨床実験では、問題となる薬についての臨床前のデータに基づき、そして類似薬（あれば）についての通例の投与量に基づいて、ヒトで安全と考えられる投与量からはじめる。この投与量が効果的である場合、もし望まれるならば、投与量は減らされて、最小有効投与量を決定する。この投与量が有効でない場合、患者の副作用の徴候を観察しながら、慎重に増やされる。たとえば、Berkowら編、「The  Merck  Manual、第15版」、Merck  and  Co.、Rahway、N. J.、1987；Goodmanら編、「Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Thrapeutics、第8版」Pergamon  Press、Inc.、Elmsford、N.Y.、（1990）；「Avery's  Drug  Treatment：Principles  and  Practice  of  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics、第3版」AIDS  Press、LTD.、Williams  and  Wilkins、Baltimore、MD.（1987）、Ebadi、「Pharmacology」、Little、Brown  and  Co.、Boston、（1985）、これらの参照およびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
各治療に要する全投与量は、予め決定したかまたは臨時の免疫化の予定に従って、複数回の投与（同一または異なることができる）または単一の投与で与薬することができる。この予定は、免疫学的に効果的になるように、すなわち抗原に対する効果的な免疫反応を誘発し、そしてそれによって、可能ならば他の薬剤と組み合わせて、保護を供するように選択される。これを達成する投与量を、「治療上効果的な投与量」として定義する。（各投与量が、それだけで与薬した場合、効果的でなくとも、予定は免疫学的に有効であり、そして「治療上効果的な投与量」は免疫化の予定の前後関係においてもっともよく解釈されることに注意）。この使用に効果的な量は、たとえば、ペプチド成分、投与方法、治療する疾病の段階および重症度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師に依存する。
典型的には、70kgの大人について、医薬品の活性成分の一日量は、10ナノグラムから10グラムの範囲である。免疫原について、このような患者に対するより典型的な一日量は、10ナノグラムから10ミリグラムであり、さらに適当には1マイクログラムから10ミリグラムである。しかしながら、本発明はこれらの投与量の範囲に制限されるものではない。
留意すべきことは、本発明の組成は重篤な疾病段階においてもすなわち、生命を危うくするまたは生命を危うくする可能性のある状況においても、一般的に使用することができる。このような状況では、外来性物質の最小化およびペプチドの相対的な無毒性の観点から、治療医師にとって、これらのペプチド組成の実質的な超過投与が好ましく感じる可能性がある。
効果的である任意の間隔で投与されることができる。間隔が短すぎる場合、免疫麻痺または他の副作用が生じうる。間隔が長すぎる場合、免疫が苦しくなりうる。最適な間隔は、個々の投与量が大きい場合に長くすることができる。典型的な間隔は、１週間、２週間、４週間（または１ヶ月）、６週間、８週間、（または２ヶ月）および１年である。付加的な投与量の与薬の妥当性、および間隔の増加または減少の妥当性は、患者の免疫適格性（たとえば、関連する抗原に対する抗体の水準）の観点から、継続根拠を再評価することができる。
好適な与薬形式は、疾病、免疫原、および投与方法に依存する。可能性として、錠剤、カプセル、トローチ剤、歯科ペースト剤、坐薬、吸入剤、溶剤、軟膏および非経口的デポを含む。たとえば、Berker、上記、Goodman、上記、Avery、上記、およびEbadi、上記。これらの参照およびその中で引用された参照は、ここに完全に参照として組み込まれる。
免疫原性を強める方法で免疫原を投与することができ、たとえば、抗原提示の「内在性経路」が生じるように、抗原性の物質を細胞内区画に投与する。たとえば、免疫原はリポソーム（これは細胞と融合する）によって閉じこめることができ、またはウイルス性ベクター（これは細胞に感染する）のコートタンパク質に組み込まれることができる。
他のアプローチは、免疫原がペプチドの場合に適応できるのだが、免疫原をエンコードしているむきだしのＤＮＡを、筋肉内注射で宿主に注入するものである。このＤＮＡは内部移行して発現する。
本発明の組成により、自己のＰＢＬｓを初回刺激することも可能である。ＰＢＬｓは顕著かつ所望の反応をもつことを確認し、そしてＰＢＬｓ、またはそのサブセットを対象に投与する。
【００７６】
リポソーム製剤
リポソームは、水性区分の周りを囲む一またはそれ以上の脂質二重膜からなる顕微鏡的な小胞である。たとえば、Bakker-Woudenbergら、Eur.  J.  Clin.  Microbiol.  Inect.  Dis.12（補遺1）：S61（1993）およびKim、Drugs、46：618（1993）を参照。天然の細胞膜にも見出される大量の脂質分子で、リポソームを調剤することができるので、リポソームは通常安全に与薬することができ、かつ生分解性である。
リポソームは、極性脂質の物理的な自己組織化による球形の粒子で、これはリポソーム中の膜組織化を決定する。リポソームは、一層または多層の種々の大きさをもつ小胞として形成することができる。このようなリポソームは、それ自体免疫原性の性質を持たない小さな分子から構成されるが、巨大分子の粒子のごとく振る舞い、かつ強力な免疫原性の特徴を示す。
リポソームの調製には、種々の方法が利用可能であり、たとえば、Szokaら、「Ann.  Rev.  Biophys.  Bioeng.  ９：467（1980）、米国特許第4,235,871、4,501,728、4,837,028、および5,019,369に記述されていて、これはここに参照として組み込まれる。調製の方法に依存して、リポソームは一層または多層であることができ、そして約0.02マイクロメーターから約10マイクロメーターを越える範囲の直径をもつサイズで変化する。種々の薬剤は、リポソーム中に封入することができる。疎水性の薬剤は二重膜により仕切られ、親水性の薬剤は内部水溶性スペース内に仕切られる。たとえば、Machyら、「Lipsomes  in  Cell  Biology  and  Pharmacology（John  Libbey、1987）、およびOstroら、「American  J.  Hosp.  Pharm.」46：1576（1989）を参照。
リポソームは実質的に任意のタイプの細胞に吸収され、そして組み込まれた薬剤を放出する。代替的に、前記リポソームは標的細胞と融合して、それによってリポソームの内容物が標的細胞に移される。代替的に、リポソームは食細胞によりエンドサイトーシスによって取り込まれることができる。エンドサイトーシスに引き続き、リソソームによるリポソーム脂質の分解、そして封入薬剤の放出がある。Scherphofら、Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci.、446：368（1985）。
本発明の方法に使用される他の適切なリポソームは、多重層膜小胞（ＭＬＶ）、少層膜小胞（ＯＬＶ）、単層膜小胞（ＵＶ）、小単層膜小胞（ＳＵＶ）、中型単層膜小胞（ＭＵＶ）、大型単層膜小胞（ＬＵＶ）、巨大単層膜小胞（ＧＵＶ）、多小胞小胞体（ＭＶＶ）、逆相蒸発法（ＲＥＶ）によって作られた単一層もしくは少層小胞体、逆相蒸発法によって作られた多重膜小胞体（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定多数膜小胞体（ＳＰＬＶ）、凍結および解凍ＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押し出し法によって調製した小胞体（ＶＥＴ）、フレンチプレスによって調製された小胞体（ＦＰＶ）、融合により調製された小胞体（ＦＰＶ）、脱水−再水和小胞体（ＤＲＶ）、および気泡体（ＢＳＶ）を含む。当業者は、これらのリポソームの調製のための技術が従来技術に知られていることに気づく。「Colloidal  Drug  Delivery  Systems」、66巻（J. Kreuter編、Marcel  Dekker、Inc.、1994）。
「リポソーム製剤」は、インビトロで生成した脂質小胞体で、この中に本発明の抗原を組み込むことができる。このため、「リポソームに結合した」は、抗原がリポソームに一部組み込まれまたは付着していることをしめす。本発明の免疫原は、リポソームに結合した抗原であるが、前記リポソームについては、免疫原ではなく、またはリポソームなしの状態でも免疫原となることができる。
幾つかの異なる免疫原が、同一のリポソームに、またはそれぞれが異なるリポソームに組み込まれことができ、そしてリポソームは対象に対して、一緒に投与されるかまたは個別に投与される。
分子の脂質部位は自然に脂質二重膜中に組み込まれるので、脂質含有免疫原はリポソームに組み込まれることができる。このため、糖リポペプチドは、リポソームの「表面」上に提示されることができる。代替的に、ペプチドはリポソーム内に封入されることもできる。リポソームの調製技術およびペプチドといった分子を用いた調剤技術は、当業者によく知られているものである。
リポソームの形成には、一またはそれ以上の脂質を要する。単独または組み合わせで、リポソーム二重膜構造を形成することが可能な任意の脂質を使用することができる。一般的には、これらのリピドは少なくとも一のリン脂質を含む。前記リン脂質は、天然材料からのリン脂質、修飾された天然リン脂質、半合成リン脂質、完全合成リン脂質、または非天然頭部基をもったリン脂質（必然的に合成）であることができる。もっとも関心のあるリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチド酸、およびホスファチジルイノシトールである。
前記リポソームは中性、正荷電、および／または負荷電脂質を含むことができる。ホスファチジルコリンは、中性リン脂質である。ホスファチジルグリセロールは負荷電糖脂質である。Ｎ−[１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドは正荷電合成脂質である。他は、３ベータ−[Ｎ−（Ｎ’,Ｎ”−ジメチルアミノエタン）カルバモイル]−コレステロールである。
一般的に、脂質は、一またはそれ以上の脂肪酸群からなる。これらは飽和または不飽和で、炭素数が変わり、一般的には12−24の炭素である。特に関心のあるリン脂質は、下記脂肪酸をもつものである。C12：0、C14：0、C16：0、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3（アルファおよびガンマ）、C20：0、C20：1、C20：3、C20：4、C20：5、C22：0、C22：5、C22：6、およびC24：0であり、ここで第一の数字は脂肪酸鎖中の総炭素数で、第二の数字は二重結合の数を表す。哺乳動物または植物材料由来の脂肪酸は、すべて偶数の炭素数をもち、その不飽和は３つの炭素間隔で離れていて、それぞれ介在性のメチレン基をもつ。
リポソームは、特定の標的細胞に対して特別な親和性を持つ資質を含むことができる。たとえば、ラクトースセラミドは、肝細胞について（およびおそらく肝ガン細胞についても）特別の親和性を持つ。
好ましいリポソーム形成においては、成分脂質はホスファチジルコリンを含む。より好ましくは、コレステロールも含み、さらにより好ましくは、ホスファチジルグリセロールも含む。コレステロールは、「液体−結晶状態」二重膜の浸透性を減ずる。
脂質の自己組織化性質の利用で、極性脂質に一またはそれ以上の免疫原を付加することができ、次々にリポソーム粒子の一部となる。各免疫原は一またはそれ以上の抗原決定基（エピトープ）を含む。これらのエピトープは、Ｂ細胞エピトープ（抗体によって認識される）またはＴ細胞エピトープ（Ｔ細胞によって認識される）であることができる。リポソームは関連する免疫原によって誘発された免疫反応を免疫賦活するようはたらくことができる。免疫賦活剤を単に免疫原と混合するよりも、局所的に高い効果的な濃度をもつことで、より効果的になりやすくなる。
さらに、上述の免疫原の代わりに、ハプテンを付加することができる。免疫原のように、ハプテンは抗原決定基からなるが、しかしそれのみでは免疫反応を誘発するのには小さすぎる定義である（通常、ハプテンは5,000ダルトンよりも小さい）。この場合、脂質成分は免疫賦活剤としてのみならず、免疫原キャリアとしてはたらくことができ、ハプテンおよび脂質接合体は合成免疫原として振る舞う（すなわち、この物質に対して、体液性免疫反応および／または細胞免疫反応を誘発することができる）。
脂質が免疫原キャリアとしてはたらかない場合でも、ハプテンにになわれたリポソームはまだ合成抗原として振る舞うことができる（すなわち、たとえば抗体またはＴ細胞といった、体液性または細胞性免疫系の成分によって認識される物質である）。用語「抗原」はハプテンおよび免疫原の両方を含む。
【００７７】
免疫賦活剤
低分子量の合成抗原は、弱い免疫原であることができ、これは完全な合成のワクチンの成功に対する最大の障害であると一般的に理解される。このような合成抗原の免疫原としての性質を改善する一つの方法は、免疫賦活剤の環境中に送達することである。従来技術に通常知られているように、免疫賦活剤は、特異的な抗原刺激と組み合わせてはたらいて、抗原に対する特異的な反応を強める物質である。理想的な免疫賦活剤は、非特異的に宿主の免疫系を刺激するものと考えられていて、これは、任意の異質な抗原と引き続いて遭遇すると、その異質な抗原に対して強力かつ特異的な免疫反応を生じさせる。このような強力かつ特異的な免疫反応は、その記憶によっても特徴付けられるので、宿主免疫系のＴリンパ球（Ｔ細胞）が活性化したときのみ生じる。
Ｔ細胞ブラストジェネシスおよびＩＦＮ−ｇ生成は、免疫反応を測定する二つの重要なパラメーターである。実験的に、Ｔ細胞ブラストジェネシスは、Ｔ細胞増殖と直接関連するＤＮＡ合成を測定し、これは次には、Ｔ細胞活性の直接の結果となる。一方、ＩＦＮ−ｇは、活性化されたＴ細胞によって分泌される主要なサイトカインである。このため、Ｔ細胞ブラストジェネシスおよびＩＦＮ−ｇ生成はＴ細胞活性化を誘導し、これは、宿主免疫系を助けて任意のタンパク質をもととする抗原に対する強力かつ特異的な免疫反応を誘導する免疫賦活剤としての能力を示唆する。
免疫原単独によって誘発される水準に比して、少なくとも一のリポソーム／免疫原コンビネーションに対する反応において、Ｔ細胞ブラストジェネシスの生成水準またはインターフェロンガンマの生成水準のいずれかを有意に（ｐ＝0.05）上昇させる場合、この化合物は免疫賦活剤と考えられる。好ましくは、ともに上昇させる。好ましくは、上昇は、少なくとも10％であり、より好ましくは少なくとも50％であり、さらにより好ましくは少なくとも100％である。
多くの免疫賦活剤が当業者に知られており、これはフロイントの完全免疫賦活剤、サポニン、DETOX（Ribi  Immunochemicals）、Montanide  ISA-51、-50および-70、ＱＳ−２１、モノホスホリルリピドAおよびそれらの類似体を含む。脂質免疫賦活剤は、リポソームの状況で示されることができる。
いくつかの免疫賦活剤は、リポソーム−送達免疫原を免疫賦活するのに特に適応である。たとえば、モノホスホリルリピドA（ＭＰＬＡ）は、Ｔリンパ球に特異的なリポソームの抗原の増加した提示を引き起こす効果的な免疫賦活剤である。Alving、C.  R.、Immunobiol.、187：430-446（1993）。当業者は、たとえばリピドAおよびその誘導体といった、脂質に基づく免疫賦活剤も適当であることを認識するであろう。ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）も、リポソームに組み込まれると、免疫賦活性の上昇を示した（Gupta  RKら、「Adjuvants-A  balance  between  toxicity  and  adjuvancity」、Vaccine、11、293-306（1993））。
本発明のオリゴヌクレオチドはもちろん免疫賦活剤としてはたらくことができるが、他の免疫賦活剤も選択的に使用することができる。
【００７８】
実施例
全般：融点は補正していない。空気および水分感応性反応は、すべて窒素雰囲気下で行った。無水ＴＨＦ、ＤＭＦおよびジクロロメタンは、Aldrichから購入し、他の乾燥溶剤は通常の方法で調製した。ＡＣＳグレード溶媒はFisherから購入し、蒸留せずにクロマトグラフィーに使用した。ＴＬＣプレート（シリカゲル６０Ｆ２５４、厚さ0.25mm、Merck）およびカラムクロマトグラフィー用のフラッシュシリカゲル６０（35-75μｍ）は、Rose  Scientific、カナダ、から購入した。１Ｈおよび３１Ｐスペクトルは、Brucker  AM  300MHz、Brucker  AM  400MHz、Varian  Unity  500MHz、またはBrucker  DRX  600MHz分光器のいずれかを、プロトンケミカルシフトのための内部標準としてのＴＭＳとともに用いて記録した。電子噴霧マススペクトル分析を、ＭＳ５０ＢまたはＭＳＤ１  ＳＰＣマススペクトロメーターのいずれかを用いて行った。
【実施例１】
【００７９】
化合物８の調製
ＤＣＭ／ＴＨＦ(10：1、500mL)中、１，２−ドデカンジオール（5.0ｇ、24.7mmol）およびＤＩＰＥＡ（3.86ｇ、5.2mL、27.7mmol）の溶液に、0℃において2時間かけて、ゆっくりＤＭＴ−Ｃｌ溶液（100mLのＤＣＭ中、0.2ｇ、27.2mmol）を加えた。この混合物を0℃において3時間撹拌し、続いて通常の液体精密検査をした。生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、3：1）によって精製して化合物８を得た（6.5ｇ、52％）。Ｃ３３Ｈ４４Ｏ４（504.44）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.67（ヘキサン／酢酸エチル、2：1）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.88（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、3Ｈ）、1.24（br
s、16Ｈ）、1.37（m、2Ｈ）、2.32（d、J=3.5Hz、1Ｈ、ＯＨ）、3.00（dd、Ｊ＝9.0、7.0Hz、1Ｈ）、3.16（dd、J=9.0、3.5Hz、1Ｈ）、3.77（m、1Ｈ）、3.79（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、6.85-7.60（m、13Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例２】
【００８０】
修飾ＣＰＧ樹脂９の調製
長鎖アミノアルキル基（lcaa−ＣＰＧ）（0.6ｇ、57μmol）で修飾した調節細孔ガラス（ＣＰＧ）樹脂を、ＤＭＦ（1.5mL）中において無水コハク酸（57mg、0.57mmol）で一晩処理した。溶媒を排出して、樹脂をＤＭＦ（×5）で洗浄した。この過程をもう一度繰り返した。樹脂上の未反応遊離アミンを、ＮＭＩ／Ａｃ２Ｏ／ＴＨＦ（1：1：8、v/v/v）で5分間処理してキャップした。この樹脂を次に完全にＴＨＦ（×５）およびＣＨ３ＣＮ（×５）で洗浄し、高い減圧下乾燥してコハク酸付加担体を得た。
コハク酸付加ＣＰＧ樹脂（0.3ｇ、〜28.5μmol）をＴＨＦ（2mL）中で懸濁して、化合物８（43mg、85.5μmol）、ＤＩＣ（14μL）、およびＤＭＡＰ（cat.）を加えた。混合物を室温で12時間撹拌した。溶媒を排出して、この反応をもう一度繰り返した。樹脂上の未反応遊離カルボン酸を、メタノール／ＤＩＣ／ＤＭＡＰで3時間処理してキャップした。この樹脂を次に完全にＴＨＦ（×５）およびＤＣＭ（×５）で洗浄し、減圧下乾燥して脂質修飾ＣＰＧ樹脂９を得た。
【実施例３】
【００８１】
化合物１−５の調製
ａ）脱トリチル化
脂質修飾ＣＰＧ樹脂９（0.3ｇ、28.5μmol）をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（ＤＣＭ中1％、w/v）で5分間処理してＤＭＴ基を除去した。この過程をもう一度1分間繰り返してから、ＤＣＭ（×5）、アセトニトリル（×5）およびＴＨＦ（×3）で完全に洗浄した。
ｂ）カップリング
この樹脂を次に無水ＴＨＦ（2mL）中で膨張させ、そしてホスホラミダイト試薬（42.8μmol、1.5
eq.）およびテトラゾール（3.0mg、42.8 mol）を加えた。混合物にＮ２ガスの泡を16時間通した。溶媒の除去および樹脂の洗浄後、ホスホラミダイトとのカップリングをもう一度繰り返した。
ｃ）キャッピング
この樹脂上の未反応の遊離水酸基を、ＮＭＩ／Ａｃ２Ｏ／ＴＨＦ（1：1：8、v/v/v）で5分間処理してキャップした後、ＤＣＭ、アセトニトリルおよびＴＨＦで完全に洗浄した。
ｄ）酸化
この樹脂を次に２−ブタノンペルオキシド（ＤＣＭ中、2.0 mL、0.1 M）で5分間処理してから、ＤＣＭ、アセトニトリル、およびＴＨＦで完全に洗浄した。
合成は、脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよび酸化の段階を繰り返すことで続けられる。
ｅ）開裂および最終分解
合成が完成したら、この樹脂をまずＴＣＡ（ＤＣＭ中1％、w/v）で5分間処理して５’末端ＤＭＴ保護基を除去し、次にＤＣＭおよびアセトニトリルで完全に洗浄した。この樹脂を次に20％水酸化アンモニウム（水溶液）を用いて50−55℃で24時間処理した。この樹脂を濾過して濾液を減圧濃縮し、そして残渣は水―メタノール（1：1）中に再度溶解して、ＨＰＬＣにより精製して化合物１−５を得た（2.5〜5.0ｍｇ）。
ｆ）ＨＰＬＣの状態
カラム：Vydac  C4  semi-Prepカラム、10×250
mm；溶媒Ａ：50mMトリエチルアンモニウム酢酸（ＴＥＡＡ）を含む水中の５％アセトニトリル、ｐＨ＝7.0；溶媒Ｂ：50mMのＴＥＡＡを含む水中の50％アセトニトリル、ｐＨ＝7.0。グラジエント：30分で20％アセトニトリルから45％アセトニトリル。流速：3.0mL/分。ＵＶ検出はe260nm。
ｇ）構造確認
化合物１−５の構造を、電子噴霧マススペクトルデータによって確認した。
化合物１：Ｃ３１Ｈ５０Ｎ８Ｏ１４Ｐ２（820.44）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ、負のモード）実測値：819（Ｍ−Ｈ）
化合物２：Ｃ４３Ｈ７５Ｎ８Ｏ２３Ｐ３（1164.66）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ、負のモード）実測値：1163（Ｍ−Ｈ）
化合物３：Ｃ７３Ｈ１０４Ｎ２２Ｏ３９Ｐ６（2098.86）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ、負のモード）実測値：2098（Ｍ−Ｈ）、2121（Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ）
化合物４：Ｃ７１Ｈ１０１Ｎ１９Ｏ４１Ｐ６（2061.83）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ、負のモード）実測値：2060（Ｍ−Ｈ）、2083（Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ）、2105（Ｍ＋２Ｎａ−３Ｈ）、2127（Ｍ＋３Ｎａ−４Ｈ）、2171（Ｍ＋５Ｎａ−６Ｈ）、
化合物５：Ｃ７１Ｈ１００Ｎ２２Ｏ３８Ｐ６（2054.82）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ、負のモード）実測値：2054（Ｍ−Ｈ）、2076（Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ）、2098（Ｍ＋２Ｎａ−３Ｈ）。
【実施例４】
【００８２】
化合物１１の調製
無水ＤＭＦ中（200mL）の化合物１０の溶液（5.0ｇ、23.1
mmol）にゆっくりＮａＨ（2.2ｇ、91.7mmol）を0℃で加え、混合物を1時間撹拌した。ＤＭＦ（30mL）中の1−ブロモヘキサデカン（17.8ｇ、17.8mL、58.4mmol）を1時間かけて滴加し、得られた混合物を室温で16時間撹拌した。水（5.0mL）を加えて反応をクエンチして、ＤＭＦを減圧下に除去した。通常の水溶性精密検査により黄色シロップを得た（粗製23.0ｇ）。このシロップをＤＣＭ／ＴＦＡ／水（100：2.5：0.25、200mL）で室温にて3時間処理した。混合物を水で洗浄し（50mL×2）て、そして飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した（50mL）。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、4：1、次に2：1）で精製して化合物１１を得た（二過程で9.73ｇ、72％）。
Ｃ３７Ｈ７６Ｏ４（585.01）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.29（ヘキサン／酢酸エチル、3：1）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.88（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、6Ｈ、2ＣＨ３）、1.25（br  s、52Ｈ）、1.56（m、4Ｈ）、2.85（t、J=5.0Hz、2Ｈ、2ＯＨ）、3.42（t、Ｊ＝6.5Hz、4Ｈ）、3.51（s、4Ｈ）、3.65（d、J=5.0Hz、4Ｈ）。
【実施例５】
【００８３】
化合物１２の調製
化合物１１（2.33 ｇ、4.00mmol）を無水ピリジン（30mL）およびＤＣＭ（27m）に溶解し、ＤＭＡＰ（46mg、0.38mmol）を加えた。ＤＭＴ−Ｃｌ（1.49ｇ、4.40mmol）をＤＣＭ（13mL）中に溶解し、反応フラスコに滴下加えた。反応混合物を室温で3時間撹拌した。メタノール（5mL）を加えて反応をクエンチして、溶媒をトルエンで共蒸留により除去した。残渣をＤＣＭ（400mL）中に再度溶解し、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３（150mL）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、10：1、次に5：1）で精製して化合物１２を得た（3.05ｇ、86％）。
Ｃ５８Ｈ９４Ｏ６（886.94）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.57（ヘキサン／酢酸エチル、5：1）。１Ｈ  ＮＭＲ（500MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.86（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、6Ｈ、2ＣＨ３）、1.23（br  s、52Ｈ）、1.48（m、4Ｈ）、2.95（t、J=6.0Hz、1Ｈ、ＯＨ）、3.09（s、2Ｈ）、3.34（m、4Ｈ）、3.45（d、J=9.0Hz、2Ｈ）、3.49（d、J=9.0Hz、2Ｈ）、3.66（d、J=6.0
Hz、2Ｈ）、3.77（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、6.78-7.41（m、13Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例６】
【００８４】
化合物１３の調製
化合物１２（423 mｇ、0.48mmol）をピリジン（7mL）に溶解し、無水コハク酸アンジドライド（140mg、1.4mmol）およびＤＭＡＰ（120mg、1.0mmol）を加えた。混合物を室温で60時間撹拌して、次にトルエンで共蒸留により除去し濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、4：1：2％、0.1％ピリジン存在下）で精製して化合物１３を得た（425mg、94％）。Ｒｆ＝0.19（ヘキサン／酢酸エチル、5：1：2％）、Ｃ６２Ｈ９８Ｏ９（986.72）、ＥＳ−ＭＳ（ｍ／ｚ）実測値：1009.7（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.86（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、6Ｈ、2ＣＨ３）、1.25（br  s、52Ｈ）、1.48（m、4Ｈ）、2.46-2.59（m、4Ｈ）、3.09（s、2Ｈ）、3.32（t、J=6.
Hz、4Ｈ）、3.36（d、J=9.0Hz、2Ｈ）、3.42（d、J=9.0Hz、2Ｈ）、3.80（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、4.18（s、2H）、6.80-7.43（m、13Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例７】
【００８５】
化合物１４の調製
ＤＣＭ（10 mL）中、化合物１３（0.18ｇ、0.18mmol）およびｐ−ニトロフェノール（33.8mg、0.24mmol）の溶液に、ＤＣＣ（50mg、0.24mmol）を加えた。混合物を室温で6時間撹拌した。尿素を濾過して除去し、濾液を濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、4：1）で精製して化合物１４を透明なシロップ状で得た（0.18g、89％）。Ｃ６８Ｈ１０１Ｏ１１（1108.01）ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.75（ヘキサン／酢酸エチル、3：1）、１Ｈ  ＮＭＲ（500MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.88（ｔ、Ｊ＝6.5Hz、6Ｈ、2ＣＨ３）、1.25（br
s、52Ｈ）、1.47（m、4Ｈ）、2.59（t、J=6.5 Hz、2Ｈ）、3.10（s、2H）、3.32（m、4Ｈ）、3.37（d、J=9.0 Hz、2Ｈ）、3.41（d、J=9.0
Hz、2Ｈ）、3.78（s、6 H、2ＯＣＨ３）、4.20（s、2Ｈ）、6.80-8.20（m、17Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例８】
【００８６】
修飾ＣＰＧ樹脂１５の調製
lcaa−ＣＰＧ樹脂（1.0ｇ、95μmol）を、無水ＤＭＦ（3.0mL）中に懸濁し、化合物１４（0.26ｇ、235μmol）を加えた。ＤＩＰＥＡを加えてｐＨを９に調製し、この混合物にＮ２ガスの泡を3日間通した。溶媒を排出して、続いて樹脂をＤＭＦ（×５）およびＤＣＭ（×５）で洗浄した。樹脂上の未反応遊離アミンを、ＮＭＩ／Ａｃ２Ｏ／ＴＨＦ（1：1：8、v/v/v）で15分間処理してキャップした。この樹脂を次に完全にアセトニトリル（×５）およびＤＣＭ（×５）で洗浄し、高い減圧下乾燥して脂質修飾ＣＰＧ樹脂１５を得た。この樹脂をｐ−トルエンスルホン酸（アセトニトリル中0.1M）でテストすると、オレンジ色を示して、ＤＭＴ基の存在を示した。同様に、ニンヒドリンネガティブテストは、樹脂上の遊離アミンのないことを示した。
【実施例９】
【００８７】
化合物１８の調製
ナトリウム水素化物（817mｇ、34mmol）を無水ＤＭＦ中（20mL）および化合物１７（3.0ｇ、23mmol、20mLを無水ＤＭＦに溶解）に滴下によりゆっくり0℃で加えた。混合物を室温で30分間撹拌してから臭化ベンジル（4.3ｇ、2.97mL、25mmol）を滴下によりゆっくりと加えた。混合物を室温で2時間撹拌した。次に溶媒を高い減圧下除去して、続いて通常の水溶性精密検査を行った。粗製の生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、6：1）で精製して化合物１８を得た（4.65ｇ、94％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.46（ヘキサン／酢酸エチル、6：1）。Ｃ１３Ｈ１８Ｏ３（222.13）。ＥＳ−ＭＳ（正のモード、ｍ／ｚ）、実測値245（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.37（s、3Ｈ、ＣＨ３）、1.42（s、3Ｈ、ＣＨ３）、3.45（dd、Ｊ＝10.0、5.5Hz、1Ｈ）、3.55（dd、Ｊ＝10.0、5.5Hz、1Ｈ）、3.73（dd、Ｊ＝8.5、6.5Hz、1Ｈ）、4.04（dd、Ｊ＝8.5、6.5Hz、1Ｈ）、4.30（m、1Ｈ）、4.53（d、J=12.0Hz、1Ｈ）、4.59（d、Ｊ＝12.0Hz、1Ｈ）、7.35（m、5
Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例１０】
【００８８】
化合物１９の調製
化合物１８（4.6ｇ、20.7mmol）をＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ（4：1、40mL）に溶解し、40℃にて1.5時間撹拌した。溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：1：0.1）で精製して化合物１９を得た（3.6g、95％）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.36（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：2：0.1）。Ｃ１０Ｈ１４Ｏ３（182.09）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  3.55（dd、Ｊ＝10.0、6.5Hz、1Ｈ）、3.58（dd、Ｊ＝10.0、4.0Hz、1Ｈ）、3.64（dd、Ｊ＝11.0、5.5Hz、1Ｈ）、3.71（dd、Ｊ＝11.0、3.5Hz、1Ｈ）、3.90（m、1Ｈ）、4.55（s、２Ｈ）。
【実施例１１】
【００８９】
化合物２０の調製
化合物１９（5.4ｇ、29.6mmol）を無水アセトニトリル（700mL）に溶解し、トリエチルアミン（2.0ml）を加えた。混合物を-50℃に冷却して、ベンゾイルシアニド（3.5ｇ、26.7mmol、無水アセトニトリル150mL中に溶解）を窒素雰囲気下、ゆっくり滴下して加えた。反応混合物を-50℃で1時間さらに撹拌して、メタノール（20mL）で反応をクエンチした。溶媒を除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、4：1）で精製して化合物２０（5.1g、60％）を得、未反応開始物質１９（1.0ｇ、18％）を回収した。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.33（ヘキサン／酢酸エチル、3：1）、Ｃ１７Ｈ１８Ｏ４（286.12）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）実測値：287（Ｍ＋Ｈ）、309（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  2.65（ｄ、Ｊ＝5.0Hz、1Ｈ、ＯＨ）、3.59（dd、J=9.5、6.0Hz、1Ｈ）、3.65（dd、J=9.5、5.0Hz、1Ｈ）、4.18（m、1Ｈ）、4.39（dd、J=11.0、5.5Hz、1Ｈ）、4.44（dd、J=11.0、4.5Hz、1Ｈ）、4.59（s、2Ｈ）、7.26-8.04（m、10Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例１２】
【００９０】
化合物２１の調製
化合物２０（1.8ｇ、6.29mmol）を無水ジクロロエタン（20
mL）に溶解し、パラホルムアルデヒド（2.6ｇ）を加えた。混合物を0℃に保ち、ＨＣｌ（ｇ）の泡を3時間通した。次にＨＣｌ（ｇ）を除去して無水塩化カルシウムを加え、混合物を10分間撹拌した。固体を濾過してから無水ジクロロエタンで洗浄した。濾液を濃縮して残渣を高い減圧下簡単に乾燥して粗製化合物２１（2.0ｇ）を得た。これを直接次の反応段階に用いた。
【実施例１３】
【００９１】
化合物２３の調製
方法Ａ：  化合物２２（480mg、2.23mmol）を無水ＤＭＦ（10mL）に溶解し、ナトリウム水素化物（71mg、2.96mmol）を加えた。混合物を室温で40分間撹拌してから、粗製化合物２１（500
mg、〜1.48mmol、ＤＣＭの2mLに溶解）をゆっくり滴加した。混合物を60℃に加温して、20時間撹拌し、そしてメタノール（1mL）を加えて反応をクエンチした。溶媒を除去し、次に通常の水溶性精密検査を行った。有機層からは、種々の油状の残渣が得られ、これはフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：1：0.01）で精製して化合物２３（230mg、30％）を得た。
方法Ｂ：  化合物２２（480mg、2.23mmol）を無水ＤＣＭ（12mL）に溶解し、ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ、640mg、3.14mmol）を窒素雰囲気下に加えた。混合物を室温で45分間撹拌してから、透明な溶液を0℃に冷却した。化合物２１（500mg、〜1.48mmol、ＤＣＭの2mLに溶解）およびヨウ化テトラブチルアンモニウム（8.0mg、0.02mmol）を加えて、混合物を室温で16時間撹拌した。温度を60℃に上げ、混合物をさらに2時間撹拌した。ジクロロメタン（100mL）を加えて、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（20mL×3）および塩水（20mL）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥してから濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：1：0.01）で精製して化合物２３（255mg、34％）を得た。
ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.33（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：2：0.1）、Ｃ２９Ｈ２７Ｎ３Ｏ６（513.18）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）実測値：514（Ｍ＋Ｈ）、536（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（600MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  3.63（dd、J=10.5、6.0Hz、1Ｈ）、4.34（m、1Ｈ）、4.42（dd、J=12.0、6.5Hz、1Ｈ）、4.46（dd、J=12.0、4.0Hz、1Ｈ）、4.53（d、J=12.0
Hz、1Ｈ）、4.57（d、J=12.0Hz、1Ｈ）、5.44（d、J=10.5Hz、1Ｈ）、5.51（d、J=10.5Hz、1Ｈ）、7.26（m、1Ｈ）、7.34（m、4Ｈ）、7.41（m、2Ｈ）、7.49（m、1Ｈ）、7.53（m、2Ｈ）、7.63（m、1Ｈ）、7.76（br  s、1Ｈ）、7.88（br  s、2Ｈ）、7.96（m、1Ｈ）、7.98（m、1Ｈ）、8.55（br  s、1Ｈ）。
【実施例１４】
【００９２】
化合物２４の調製
化合物２３（800mg、1.56mmol）を無水ＤＣＭ（65mL）に溶解し、三塩化ホウ素（ＤＣＭ中1M溶液、2.5mL）を、窒素雰囲気下、-78℃でゆっくりと加えた。混合物を-78℃で1時間撹拌した。ＤＣＭ−ＭｅＯＨ（1：1、10mL）を加えて反応をクエンチしてから溶媒を除去した。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ジクロロメタン／メタノール、100：5）で精製して化合物２４（500mg、76％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.58（ジクロロメタン／メタノール、96：4）、Ｃ２２Ｈ２１Ｎ３Ｏ６（423.13）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）：424.1（Ｍ＋Ｈ）、446.1（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  3.30（br  s、1Ｈ、ＯＨ）、3.76（dd、J=12.0、6.0Hz、1Ｈ）、3.85（dd、J=12.0、4.0Hz、1Ｈ）、4.23（m、1Ｈ）、4.41（dd、J=12.0、6.0Hz、1Ｈ）、4.48（dd、J=12.0、4.5Hz、1Ｈ）、5.46（d、J=11.0Hz、1Ｈ）、5.51（d、J=11.0Hz、1Ｈ）、7.38-8.01（m、12Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、9.00（br  s、1Ｈ）。
【実施例１５】
【００９３】
化合物２５の調製
化合物２４（120mg、0.28mmol）をＤＣＭ（12mL）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、0.5mL）を加えた。ホスホルアミダイト
Ｃｌ−Ｐ(ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ)Ｎ(ｉＰｒ)２（93 mg、91.3μL、0.39mmol）を窒素雰囲気下室温で加えた。混合物を30分間撹拌してから、ＤＣＭ（50mL）で希釈した。このＤＣＭ層を10％ＮａＨＣＯ３溶液（15mL）および塩水（15mL）で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、1：2、0.1％Ｅｔ３Ｎとともに）で精製して化合物２５（140mg、79％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.54（ヘキサン／酢酸エチル、1：2）、Ｃ３１Ｈ３８Ｎ５Ｏ７Ｐ（623.25）。ＥＳ−ＭＳ（正モード）、実測値624.2（Ｍ＋Ｈ）、646.2（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.18（s、6Ｈ、2ＣＨ３）、1.20（s、6Ｈ、2ＣＨ３）、2.68（t、J=6.0Hz、2Ｈ）、3.60（m、2Ｈ）、3.85（m、4Ｈ）、4.31（m、1Ｈ）、4.38-4.55（m、2Ｈ）、5.40（dd、J=10.5、1.5Hz、1Ｈ）、5.57（dd、J=10.5、8.0Hz、1Ｈ）、7.35-8.00（m、12Ｈ）、9.00（br  s、1Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（500MHz、ＣＤＣｌ３）：&auml;   150 27、150.40。
【実施例１６】
【００９４】
化合物２６の調製
化合物１７（500mg、0.47mL、3.78mmol）、三級ブチルジフェニルシリルクロライド（ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ、1.25、1.18mL、4.536mmol）およびイミダゾール（309mg、4.536mmol）を無水ＤＭＦ（４mL）に溶解し、混合物を３時間室温で撹拌した。溶媒を除去して、続いて通常の水溶性精密検査を行った。生成物はフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、10：1）で精製して化合物２６（1.40ｇ、100％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.43（ヘキサン／酢酸エチル、9：1）、Ｃ２２Ｈ３０Ｏ３Ｓｉ（370.20）。ＥＳ−ＭＳ（正モード）、実測値393（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.05（s、9Ｈ、3ＣＨ３）、1.35（s、3Ｈ、ＣＨ３）、1.39（s、3Ｈ、
ＣＨ３）、3.65（dd、J=10.5、6.5Hz、1Ｈ）、3.74（dd、J=10.5、4.5Hz、1Ｈ）、3.92（dd、J=8.5、6.0Hz、1Ｈ）、4.07（dd、J=8.5、6.5Hz、1Ｈ）、4.20（m、1Ｈ）、7.35-7.68（m、10Ｈ）。
【実施例１７】
【００９５】
化合物２７の調製
化合物２６（31.0ｇ、83.78mmol）を、40℃においてＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ（4：1、100mL）で40分間処理した。溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、10：1と続いて4：1）で精製して化合物２７（23.8ｇ、95％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.40（ヘキサン／酢酸エチル、1：1）、Ｃ１９Ｈ２６Ｏ３Ｓｉ（330.20）。ＥＳ−ＭＳ（正モード）、実測値353（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（400MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.05（s、9Ｈ、3ＣＨ３）、2.60（br  s、2Ｈ、2ＯＨ）、3.64（dd、J=11.5、5.5Hz、1Ｈ）、3.69（dd、J=11.5、4.0Hz、1Ｈ）、3.70（dd、J=10.0、6.0Hz、1Ｈ）、3.74（dd、J=10.0、4.5Hz、1Ｈ）、3.81（m、1Ｈ）、7.37-7.67（m、10Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例１８】
【００９６】
化合物２８の調製
化合物２７（8.0ｇ、24.2mmol）およびＤＩＰＥＡ（3.12g、4.2mL、24.2mmol）の無水ＤＣＭ溶液（800mL）に、窒素雰囲気下、室温において４，４’−ジメトキシトリチルクロライド溶液（ＤＭＴ−Ｃｌ、200mLのＤＣＭに溶解）をゆっくり滴下して加え、そして混合物をさらに2時間撹拌した。溶媒を除去して、生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＤＣＭ／酢酸エチル、100：1、0.1％Ｅｔ３Ｎとともに）で精製して化合物２８（12.3ｇ、80％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.35（ＤＣＭ／酢酸エチル、100：2）、Ｃ４０Ｈ４４Ｏ５Ｓｉ（632.24）。ＥＳ−ＭＳ（正モード）、実測値655（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.99（s、9Ｈ、3ＣＨ３）、2.44（d、J=5.0Hz、1Ｈ、ＯＨ）、3.77（m、2Ｈ）、3.78（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、3.88（m、1H）6.80-7.85（m、23
Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例１９】
【００９７】
化合物２９の調製
化合物２８（3.20ｇ、5.06mmol）を無水ＴＨＦ（100mL）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（15mL）を加えた。メトキシメチルクロライド（ＭＯＭ−Ｃｌ、4.89ｇ、4.6mL、60.76mmol）を0℃にてゆっくりと滴下して加え、そして次に反応混合物を55℃にて5時間撹拌した。混合物を0℃に冷却して飽和ＮａＨＣＯ３（水性）（20mL）を加えた。有機層を分離して、水層を酢酸エチルで抽出した（3×40
mL）。あわせた有機層をＮａ２ＳＯ４を用いて乾燥してから濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル、10：1、0.1％Ｅｔ３Ｎとともに）で精製して化合物２９（2.7ｇ、79％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.57（ヘキサン／酢酸エチル、4：1）、Ｃ４２Ｈ４８Ｏ６Ｓｉ（676.20）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値699（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（300MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.00（s、9Ｈ、3ＣＨ３）、3.21（dd、J=10.0、6.0Hz、1Ｈ）、3.27（dd、J=10.0、4.5Hz、1Ｈ）、3.31（m、3Ｈ、ＯＣＨ３）、3.74（d、J=5.5Hz、2Ｈ）、3.77（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、3.91（m、1H）、4.72（d、J=11.5Hz、1Ｈ）、4.75（d、J=11.5Hz、1Ｈ）、6.70-7.60（m、23Ｈ、Ａｒ−Ｈ）。
【実施例２０】
【００９８】
化合物３１の調製
化合物２９（500mg、0.74mmol）を無水ＤＣＭ（10mL）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（2.0mL）を加えた。臭化ジメチルホウ素溶液（ＤＣＭ中1.5M、2.5mL、3.75mmol）を-78℃において加えてさらに1時間撹拌した。この反応は、ゆっくり室温にまで加温し、ヨウ化ナトリウムを加えた。混合物を室温にて16時間撹拌した。一方、化合物３０（246mg、1.11mmol）を無水ＤＭＦ（6mL）中に溶解して、ナトリウム水素化物（40mg、1.67mmol）を加えた。混合物を室温にて10分間撹拌し、上記反応フラスコへゆっくりと加えた。反応混合物を室温にて1時間撹拌し、次に、60℃にて16時間撹拌し、そして最後に、80℃にて6時間撹拌した。次に、溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン／メタノール、2：1.5：0.1）で精製して化合物３１（185mg、29％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.57（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、5：10：1）、Ｃ５０Ｈ５５Ｎ５Ｏ７Ｓｉ（865.40）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値866（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（600MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.95（s、9Ｈ、3ＣＨ３）、1.25（d、J=7.0Hz、3Ｈ、ＣＨ３）、1.26（d、J=7.0Hz、3Ｈ、ＣＨ３）、2.72（m、1H）、3.14（dd、J=10.0、6.5Hz、1Ｈ）、3.18（dd、J=10.0、4.0Hz、1Ｈ）、3.66（dd、J=5.5Hz、2Ｈ）、3.76（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、4.05（m、1H）、5.84（d、J=10.5Hz、1Ｈ）、5.87（d、J=10.5Hz、1Ｈ）、6.76（m、4Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、7.15-7.58（m、19Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、7.89（s、
1Ｈ）。
【実施例２１】
【００９９】
化合物３２の調製
化合物３１（220mg、0.254mmol）を無水ＴＨＦ（60mL）に溶解し、フッ化テトラブチルアンモニウム溶液（ＴＨＦ中1.0M、0.15mL、0.51mmol）を加えた。混合物を室温にて1時間撹拌して、次に溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、、1：2：0.5）で精製して化合物３２（140mg、91％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.36（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：2：0.5）、Ｃ３４Ｈ３７Ｎ５Ｏ７（627.28）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値650.3（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（600MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  1.16（2d、J=7.0Hz、各3H、2ＣＨ３）、2.55（m、1H）、3.05（dd、J=10.5、4.0Hz、1Ｈ）、3.09（dd、J=10.5、6.0Hz、1Ｈ）、3.46（dd、J=12.0、7.0Hz、1Ｈ）、3.49（dd、J=12.0、3.5Hz、1Ｈ）、3.69（s、6Ｈ、2ＯＣＨ３）、3.79（m、1H）、5.75（s、2H）、6.70-7.27（m、13H）、7.85（s、1H）。
【実施例２２】
【０１００】
化合物３３の調製
１−テトラデカノール（200mg、0.933mmol）およびＤＩＰＥＡ（0.5mL）を無水ＤＣＭ（10mL）に溶解し、ホスホルアミダイト試薬Ｃｌ−Ｐ(ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ)Ｎ(ｉＰｒ)２（265mg、260Ｌ、1.1mmol）を添加した。混合物を室温にて1時間撹拌して、ＤＣＭ（50mL）で希釈した。ＤＣＭ層を10％ＮａＨＣＯ３（水溶液）（10mL）および塩水（10mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥してから濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／1：4、1％のＥｔ３Ｎとともに）で精製して化合物３３（382mg、、100％）を得た。これは直接次の段階の反応に用いる。
【実施例２３】
【０１０１】
化合物３４の調製
無水ＤＣＭ（6mL）中の、化合物３２（50mg、0.080mmol）、化合物３３（70mg、0.160mmol）およびテトラゾール（20mg）の混合物を室温にて1時間撹拌した。次に２−ブタノンペルオキシド溶液（ＤＣＭ中、1M、1.0mL）を加えて、反応混合物を室温にて10分間撹拌した。溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：2：0.5）で精製して化合物３４（53mg、、79％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.22（ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、1：2：0.2）、Ｃ５１Ｈ６９Ｎ６Ｏ１０Ｐ（956.48）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値957（Ｍ＋Ｈ）、979（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（500MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.88（t、J=7.0Hz、3H、ＣＨ３）、1.25（m、28H、11ＣＨ２、2ＣＨ３）、1.64（m、2H）、2.75（m、2H）、2.88（m、1H）、3.20（m、2H）、3.80（s、6H、2ＯＣＨ３）、4.00（m、2H）、4.05-4.24（m、5H）、5.85（m、2H）、6.80（m、4H）、7.20（m、9H）、8.00（s、1H）、9.25（s、1H）、12.20（s、1H）。
【実施例２４】
【０１０２】
化合物３５の調製
化合物３４（150mg、0.157mmol）を、室温にて10分間、トリクロロ酢酸溶液（ＤＣＭ中3％、w／v、3mＬ）で処理した。混合物を減圧下濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ＤＣＭ／メタノール、2：8：0.5）で精製して化合物３５（101mg、、99％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.31（酢酸エチル／ＤＣＭ／メタノール、2：1：0.3）、Ｃ３１Ｈ５１Ｎ６Ｏ８Ｐ（654.34）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値655.4（Ｍ＋Ｈ）、677.4（Ｍ＋Ｎａ）。
【実施例２５】
【０１０３】
化合物３６の調製
無水ＤＣＭ（7mL）中の、化合物２５（140mg、0.225mmol）、化合物３５（100mg、0.153mmol）およびテトラゾール（20mg）の混合物を、室温にて3時間撹拌した。２−ブタノンペルオキシド溶液（ＤＣＭ中、1.0M、2.0mL、2.0mmol）を加えて、反応混合物を10分間撹拌した。溶液をＤＣＭ（100mL）で希釈して、有機層を10％のＮａＨＣＯ３（水性）（20mL）、および塩水（20mL）で続けて洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後に濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィ（酢酸エチル／ヘキサン／ＤＣＭ／メタノール、5：2：2：1）で精製して化合物３６（117mg、、64％）を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.34（ＤＣＭ／メタノール、9：1）、Ｃ５５Ｈ７４Ｎ１０Ｏ１６Ｐ２（1192.47）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値1193.5（Ｍ＋Ｈ）、1215.5（Ｍ＋Ｎａ）。１Ｈ  ＮＭＲ（600MHz、ＣＤＣｌ３）：δ  0.86（t、J=7.5Hz、3H、ＣＨ３）、1.25（m、28H、11ＣＨ２、2ＣＨ３）、1.65（m、2H）、2.75（m、5H）、3.30（m、2H）、4.10-4.60（m、14H）、5.44（m、1H）、5.58（m、1H）、5.82（m、2H）、5.88（m、2H）、7.38-8.20（m、13H）、9.40（br  s、1H、NH）、12.20（br  s、1H、NH）。
【実施例２６】
【０１０４】
化合物６の調製
化合物３６をエタノール（2.0mL）に溶解し、濃水酸化アンモニウム（58％、4.0mL）を加えた。混合物を55℃にて24時間撹拌し、次に減圧下、濃縮した。残渣を水（8.0）に再溶解し、0.22μmフィルターで濾過後、透明溶液を凍結乾燥して粗製生成物（80
mg）を得、これをさらにＨＰＬＣによって精製して化合物６（41.3mg、、61％）を得た（ＨＰＬＣの条件は、実施例３に与えられ、これは化合物1-5の精製のために述べられているとおりである）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝0.16（クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム、5：3：0.5：0.5）、Ｃ３１Ｈ５４Ｎ８Ｏ１３Ｐ２（808.33）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値831（Ｍ＋Ｎａ）、853（Ｍ＋2Ｎａ-Ｈ）、875（Ｍ＋3Ｎａ-2Ｈ）、897（Ｍ＋4Ｎａ-3Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（500MHz、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  0.85（t、J=7.0Hz、
3H、ＣＨ３）、1.22（br  s、22H、11ＣＨ２）、1.41（m、2H）、3.39（m、2H）、3.52-3.72（m、9H）、3.94（m、1H）、5.12（d、J=10.0Hz、1H）、5.16（d、J=10.0Hz、1H）、5.68（s、2H）、5.75（d、J=7.5Hz、1H）、6.25（br  s、2H）、7.12（s、1H）、7.48（s、1H）、7.68（d、J=7.5Hz、1H）、8.11（s、1H）。
【実施例２７】
【０１０５】
化合物７の調製
ペプチドおよびペプチド核酸のハイブリッド構造を、固相ペプチド合成の標準的な技術によってペプチドシンセサイザーを用いて調製した。Ｆｍｏｃ／Ｂｈｏｃ化学を用いて、固相支持体としてワング樹脂を選択した。反応大略と反応条件は図１５に記載されていて、樹脂からの開裂後、生成物をＨＰＬＣによって精製し、ＥＳ−ＭＳ分光データによって構造決定した。
化合物７：Ｃ４４Ｈ７２Ｎ１４Ｏ１０（956.55）。ＥＳ−ＭＳ（正モード、ｍ／ｚ）、実測値957.5（Ｍ＋Ｈ）、979.5（Ｍ＋Ｎａ）、1001.5（Ｍ＋2Ｎａ-Ｈ）、1023.5（Ｍ＋3Ｎａ-2Ｈ）、1045.5（Ｍ＋4Ｎａ-3Ｈ）。
【実施例２８】
【０１０６】
ＢＬＰ２５リポソームワクチンの調製
典型的には、リポソーム製剤は、生理食塩水１ml（0.9％ＮａＣｌ溶液）中、400μｇのＭＵＣ１ベースのリポペプチドＢＰ１−１４８（図１７）、Ｈ２Ｎ−ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（ＰＡＬ）Ｇ−ＯＨ、200μｇのＣｐＧ類似体１−６、6.94mgのコレステロール、1.46mgのジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＣ）および11.62mgのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から構成される。
このリポソーム構成物は、まず、リン脂質、コレステロールおよびＣｐＧ類似物１−６を三級ブタノールに53℃で溶解することによって構成する。次に、三級ブタノール溶液にリポペプチドおよび水（5％、ｖ／ｖ）を加えた。生成した透明の95％三級ブタノール溶液を、50℃にて、すばやく撹拌している約4倍の水に18ゲージニードルつきのガラス注射器で注入した。この方法により作られた小さな単層小胞（ＳＵＶ）を冷却し、0.22μmろ過膜に通して滅菌し、ガラス瓶にいれて冷却保存した。この乾燥粉末を注入前に無菌生理食塩水で再び水和して、多層大型小胞を形成した（ＭＬＶ）。形成リポソームはマウスの免疫化に使用した。
【実施例２９】
【０１０７】
リポソームワクチンによる免疫化マウス
ＭＵＣ１を主原料とするリポペプチドＢＰ１−１４８（図１７）の400μｇを含有するＢＬＰ２５リポソームワクチン、および一投与につき200μｇのＣｐＧ類似体によって皮下注射によりＣ５７−黒色マウスを免疫化した。ワクチン注入から９日後に、このマウスを犠牲にして、流入領域リンパ節（局所的反応）または脾臓（系統的反応）からリンパ球を採取して、各グループの免疫反応を決定した。免疫化マウスから採取したリンパ球を、ペプチド配列Ｈ２Ｎ−ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ−ＯＨ（配列番号１１）をもつＭＵＣ１を主原料とする追加免疫抗原ＢＰ１−１５１の存在下、インビトロ培地で培養した。
【実施例３０】
【０１０８】
Ｔ細胞増殖の測定
Ｔ細胞増殖を、標準３Ｈチミジン組込みアッセイを用いて評価した。簡単には、ナイロンウール通過鼠径リンパ節リンパ球を、0.25×10６／ウェル、各マウス群からプールし、抗原発現細胞（ＡＰＣｓ）としてはたらく未処置のマイトマイシンＣで処理した同質遺伝子的な脾細胞0.25×10６／ウェルを含む培地に加えた。各ウェルに、ＭＵＣ−１主材料２５−量体ペプチドの20μｇを追加免疫抗原として加えた。この培地を、300μＬ／ウェルの総量で７２時間培養し、続いて、50μＬ量中３Ｈ−チミジン１μＣｉを添加した。プレートをさらに18から20時間培養した。細胞を培養して［３Ｈ］ｄＴｈ組込みを液体シンチレーションカウンターによって測定した。化合物１−６または対照の天然Ｒ５９５リピドＡによって免疫賦活した種々のリポソームワクチンに対応するＴ細胞増殖の結果は、図１６に示されている。
Ｒ５９５リピドＡは、バクテリアSalmonella  minnesota、Ｒ５９５から単離した天然解毒化リピドＡ生成物である。この物質は、Avanti  Polar  Lipids、Inc.、ＵＳＡから市販されている。Ｒ５９５リピドＡは強いワクチン免疫賦活剤で、ヒトへの使用のための臨床的治験に現在あり、このため、化合物１−６の免疫刺激的な（免疫賦活的な）性質と比較するための参照としてここでは選ばれる。
図１６に示されるとおり、化合物１−６は、抗原特異的Ｔ細胞増殖を強めるための強力な免疫賦活活性を示す。これらすべてのＣｐＧ類似体は、Ｒ５９５リピドＡと比較して同一またはより大きい活性の量を示す。化合物３−６は、Ｒ５９５リピドＡに比して明らかに強力な活性を示す。興味深いことに、グリセロール主原料ＣｐＧ類似体６は、天然ＤＮＡバックボーンをもつ化合物１および２と比べて強力な活性をもつ。集団的に、これらのデータは、非メチル化ＣｐＧユニットを含有する短いオリゴヌクレオチド配列（ジヌクレオチドと同程度の小ささ）およびその構造類似体が、強力な親油基によって修飾される場合、強力な免疫刺激性の性質をもつことを示す。
化合物７の生物学的活性は、評価されていない。
【０１０９】
この明細書で引用された文書は、この明細書で引用された文書が適切な従来技術であることを認め、またはこの明細書で引用された文書が本願請求項のいずれについての特許性についても考え抜かれた材料と認めることを意図するものではない。日付についての全記述またはこれら文書の内容についての表現は、出願人が利用できる情報に基づいており、日付またはこれら文書の内容の正確さについてのいかなる承認をも構成することはない。
添付した請求項は、好適な実施例の詳説を制限しないものとして扱われなければならない。
他で述べたものに加えて、本願の出願時にもっとも最新である版で、以下の参照がここに参照として組み込まる：Kay、Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins：A  Laboratory  Manual；the  John  Eiley  and  Sons  Current  Protcols  series、including  Ausubel、Current  Protocols  in  Molecular  Biology；Coligan、Current  Protocols  in  Protein  Science；Coligan、Current  Protocols  in  Immunology；
Current  Protocols  in  Human  Genetics；Current  Protocols  in  Cytometry；Current  Protocols  in  Pharmacology；
Curret  Protocols  in  Neuroscience；Current  Protocols  in  Cell  Biology；Current  Protocols  in  Toxicology；Current  Protocols  in  Field  Analytical  Chemistry；Current  Protocols  in  Nucleic  Acid  Chemistry、および、Current  Protocols  in  Human  Genetics；ならびに、以下のCold  Spring  Harbor  Laboratory  Publications；Sambrook、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual；Harlow、Antibodies；A  Laboratory  Manual；Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual；Methods  in  Yeast  Genetics：A  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Course  Manual；Drosophila  Protocols；Imaging  Neurons：A  Laboratory  Manual；Early  Development  of  Xenopus  laevis：A  Laboratory  Manual；Using  Antibodies：A  Laboratory  Manual；At  the  Bench：A  laboratory  Navigator；Cells：A  Laboratory  Manual；Methods  in  Yeast  Genetics：A  Laboratory  course  Manual；Discovering  Neurons：The  Experimental  Basis  of  Neuroscience；Genome  Analysis：A  Laboratory  Manual  Series；Laboratory  DNA  Science；Strategies  for  Protein  Purification  and  Characterization：A  Laboratory  Course  Manual；Genetic  Analysis  of  Pathogenic  Bacteria：A  Laboratory  Manual；PCR  Primer：A  Laboratory  Manual；Methods  in  Plant  Molecular  Biology：A  Laboratory  Course  Manural；Manipulating  the  Mouse  Embryo：A  Laboratory  Manual；Molecular  Probes  of  the  Nervous  System；Experiments  with  Fission  Yeast：A  Laboratory  Course  Manual；A  Short  Course  in  Bacterial  Gnenetics：A  Laboratory  Manual  and  Handbook  for  Escherichia  coli  and  Related  Bacteria；DNA  Science：A  First  Course  in  Recombinant  DNA  Technology；Methods  in  Yeast  Genetics：A  Laboratory  Course  Manual；Molecular  Biology  of  Plants：A  Laboratory  Course  Manual.
ここで参考文献として引用された参考文献はすべて、学術誌の記事もしくは要約、刊行物、通信、以前もしくは他の関係する米国もしくは外国特許出願、刊行された米国もしくは外国特許、または任意の他の参考文献も含めて、参考文献として個々に組み込まれ、これはこれら参考文献中のすべてのデータ、表、図面、および文章をも含む。加えて、ここで引用した参考文献中に引用された参考文献のすべての内容もまた、ここに完全に参考文献として組み込まれる。
既知の方法過程、通常の方法過程、既知の方法または通常の方法への言及は、いかなる面においても、いかなる意味でも、本発明がその関連する技術によって開示、教示または示唆されることを記述または包含することを許容するものではない。
前述の特定の実施例は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにして、他の者が、当業者の通常の知識（ここで引用した参考文献の内容を含む）を適用することにより、本発明の一般的な概念から離れることなく、過度の実験なく、特定の実施のための種々の応用に容易に修正および／または適応することができる。このため、こような適用および修正は、ここで示された教示およびガイダンスに基づき、開示した実施例の同等物の意味するところおよび範囲のなかにある。ここでの表現または用語は、記載の目的のためであって制限のためではないと理解すべきであり、したがって本明細書の用語および表現は、一般的な当業者の一の知識と組み合わせて、ここで示された教示およびガイダンスの知識の観点から当業者によって解釈されるべきである。
本発明の実施に有用または好ましいものとしての部門または範囲のいかなる記述も、前記部門または範囲の各個々のメンバーもしくは値のそれぞの記述と同様に、任意の下位分類（たとえば、一またはそれ以上のメンバーの開示を省略したもの）またはそれに含まれる下位領域ものとして考えられるべきである。
好適な実施例の各記述は、不可能な組み合わせ（たとえば、本発明の要素に相互に排他的）または本明細書の記載によって排しているものをのぞいては、このような好適な実施例の任意の可能な組み合わせを意味していると考えられるべきである。
本発明の実施例が先行技術によって開示されている場合、本発明の記述は、そのような実施例を除いてここに開示している発明を包含するものと考えられなければならない。
本発明は、出願人によって企図したように、添付の請求項に述べられたもの、そして現在請求していない組み合わせを含むがそれに限定するものではない。従来技術において開示された一またはそれ以上の欠点を克服する範囲において制限される範囲で、本発明はさらに対象を含むものである。従来技術によって開示または示唆された対象を請求項が侵食する範囲において、本願出願人は、その請求項から侵食する範囲を除いて対応する発明を企図するものである。
本明細書中の任意の場所で引用した特許、特許出願、文献、記事、およびオンライン情報を含む全ての参考文献は、ここに参考文献として組み込まれ、前記参考文献中に引用された参考文献も同様である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】非メチル化ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列の、構造−活性関係である。
【図２】種々の親油性基で３’末端を修飾したＣｐＧジヌクレオチドである。
【図３】二価のリガンドとしての修飾ＣｐＧジヌクレオチドで、二つのセグメントは、それぞれＣｐＧを提示する。
【図４】５’末端を親油性基で修飾したヘキサヌクレオチドＡＴＣＧＡＴである。
【図５】ＧＮＡ（グリセロール核酸）、ＤＮＡ、およびＰＮＡ（ペプチド核酸）の構造比較である。
【図６】３’末端を親油性基で修飾したヘキサヌクレオチドＧｔｃｇＴＴで、式中ｃｇジヌクレオチドはグリセロールを基部とするバックボーンをもつ。
【図７】ＤＮＡ（化合物１から５）、ＧＮＡ（６）およびＰＮＡ（７）バックボーンをもつＣｐＧ含有脂質化オリゴヌクレオチドである。
【図８】ホスホラミダイト法による固体状ヌクレオチド合成のための基本構成要素である。
【図９】脂質化オリゴヌクレオチド合成のための、長鎖アミノアルキル管理下細孔ガラス（ｌｃａａ−ＣｐＧ）樹脂の修飾である。
【図１０】固相での脂質化ＣｐＧジヌクレオチド１の調製である。
【図１１】脂質化オリゴヌクレオチド１６の合成のための、ペンタエリスリトール誘導ジリポアルコール１１の調製およびその処理である。
【図１２】グリセロール−シトシンホスホラミダイト２５の調製である。
【図１３】グリセロール−グアノシン調製の基本構成要素３２である。
【図１４】グリセロール−塩基ＣｐＧジヌクレオチド６の合成である。
【図１５】Ｆｍｏｃ／Ｂｈｏｃ化学を使用した標準固相ペプチド合成によるＰＮＡ−基部ＣｐＧ類似物７の調製である。
【図１６】ＣｐＧ類似物１から６の免疫刺激補助剤の性質である。ＢＬＰ２５リポソームのワクチン製剤の単一投与をして免疫化したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の抗原特異的なＴ細胞の、インビトロの増殖。このワクチン投与は、抗原としてＭＵＣ１誘導２５−マーリポペプチド20μｇ、および免疫賦活剤として合成ＣｐＧ類似物１−６のひとつ10μｇを含む。免疫賦活剤Ｒ５９５リピドA（解毒したSalmonella  minnesota  R595由来のリピドA生成物）を比較に用いた。
【図１７】第一の配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：11である。第二の構造は、リポペプチドＢＰ１−１４８の構造で、腫瘍−結合ＭＵＣ１ムチンから誘導した修飾25アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）を構成する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、あとでＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：10中におかれるＭＵＣ１の直列の繰り返しである、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11のＡＡｓ1-25に対応し、ＡＡｓ14-20に対応し、ＡＡｓ1-18が続いている。前記ＢＬＰ25リポソームワクチン製剤は、前記免疫賦活剤の一つと組み合わせたこのリポペプチドである。
【図１８】ペンタエリスリトール要素を構成する長い多価のヌクレオシド間結合をもつ枝分かれした３つのセグメントのオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは親油基としてのコレステロール残基をさらに構成する。
【図１９】ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドで、フランキング塩基をもち、３’末端で脂質化されている。最後のオリゴヌクレオチドはＳＥＱＩＤ ＮＯ：３である。
【図２０】長いヌクレオシド間結合によって環化した脂質化オリゴヌクレオチドで、親油性基を構成している。
【図２１】ＣｐＧジヌクレオチド同様、チミジン二量体を構成する脂質化オリゴヌクレオチドである。
【図２２】ＧＮＡバックボーンをもった脂質化オリゴヌクレオチドである。
【図２３】リポタイコ酸由来の構造である。
【図２４】修飾リポテイコ酸バックボーンで、式中、Ｄ−アラニンおよびグリセロールユニットの第二級水酸基間のエステル結合が、アミド結合に置換したものである。これは、加水分解に対してより耐久性があると予想される。
【図２５】ＬＴＡ／ＧＮＡおよびＬＴＡ／ＤＮＡハイブリッドである。
【図２６】オリゴ（Ｉ：Ｃ）。脂質化オリゴ−イノシン酸およびオリゴ−シチジル酸は二本鎖複合体を形成してｄｓＲＮＡの働きを模倣することができる。ここでｄｓＲＮＡはＴＬＲ−３のリガンドである。示されてはいないが、このオリゴヌクレオチドはさらにＣｐＧを構成することができ、またはこのオリゴヌクレオチドはそれ自体もともと付加的な免疫賦活剤として使用することができる。
【図２７】自己相補的な領域を形成するオリゴヌクレオチド。図中、一のセグメントはオリゴイノシン酸で、第二のセグメントはオリゴシチジル酸であり、長いヌクレオシド間結合によって結合している。鎖はリンカーでヘアピン状になって二本鎖の二次構造を形成する。変数ｎは０から６である。示されてはいないが、このオリゴヌクレオチドはさらにＣｐＧを形成することができ、またはこのオリゴヌクレオチドはそれ自体もともと付加的な免疫賦活剤として使用することができる。
【図２８】自己相補的な領域を形成するオリゴヌクレオチド。オリゴヌクレオチドは二つのＩ（ＣＩ）ｎＣセグメントを構成する。これらは、挿入図に示されるように配向および整列すると、互いに補完しあう。変数ｎは０から４で、挿入図では、ｎ＝３である。示されてはいないが、このオリゴヌクレオチドはさらにＣｐＧを形成することができ、またはこのオリゴヌクレオチドはそれ自体もともと付加的な免疫賦活剤として使用することができる。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２４】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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