(57)【要約】本発明は、神経細胞損傷および神経細胞損傷に関連する変化の予防または処置のためのアルテミンの使用に関する。より詳細には、本発明は、アルテミンまたはアルテミンアゴニストを約０．０１ｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量範囲で投与することによって、機械的痛覚過敏または温熱性痛覚過敏を伴わずに、損傷により誘導される病的変化から哺乳動物中のニューロンを保護する方法、および哺乳動物中の神経損傷を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機械的痛覚過敏または温熱性痛覚過敏を伴わずに、損傷により誘導される病的変化から哺乳動物中のニューロンを保護するための医薬の製造におけるアルテミンまたはそのアゴニストの使用であって、約０．０１ｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量範囲で投与する、使用。
【請求項２】
機械的痛感過敏または温熱性痛覚過敏を伴わずに、哺乳動物中のニューロン損傷を処置するための医薬の製造におけるアルテミンまたはそのアゴニストの使用であって、約０．０１ｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量範囲で投与する、使用。
【請求項３】
前記用量範囲が、約０．１ｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記用量範囲が、約０．１ｍｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記投与が、少なくとも２週間の間に、１週間に少なくとも２回繰り返される、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記投与が、少なくとも２週間の間に、１週間に少なくとも３回繰り返される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記投与が全身性である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項８】
前記投与が局所的である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記ニューロンが、中枢ニューロン、末梢ニューロンおよび運動ニューロンからなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
前記末梢ニューロンが、交感ニューロン、副交感ニューロン、感覚ニューロンおよび腸ニューロンからなる群より選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記感覚ニューロンが、脊髄神経節からの感覚ニューロン、三叉神経節からの感覚ニューロンおよび下神経節からの感覚ニューロンからなる群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記中枢ニューロンが、脳ニューロンまたは脊髄ニューロンである、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記損傷が、外傷、毒性薬剤、他の治療薬剤の有毒な副作用、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養欠乏、または悪性疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記損傷が、末梢神経障害に関連する、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
前記損傷が、神経障害または神経変性疾患から生じる、請求項２に記載の使用。
【請求項１６】
前記神経障害が、末梢感覚神経障害である、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記末梢感覚神経障害が糖尿病性の神経障害である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１８】
前記アルテミンが、ネイティブ配列のアルテミンポリペプチドである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項１９】
前記アルテミンが、ネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記アルテミンが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記アルテミンが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
前記アルテミンが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項２４】
前記アルテミンが、免疫付着因子である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項２５】
製品であって、以下：
（ａ）  容器；
（ｂ）  容器内のアルテミンを含む薬学的組成物；および
（ｃ）  該薬学的組成物を約０．０１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与するための使用説明書、
を含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経細胞損傷および神経細胞損傷に関連する変化の予防、改善または処置のための、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アルテミンは、最近同定され、そして特徴付けられた、神経栄養因子である。アルテミンは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーであり、ＧＦＲ−３レセプターを通してシグナル伝達を行うと考えられる（Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ，２１：１２９１−１３０２（１９９８））。ＧＤＮＦファミリーの全ての公知のメンバーのように、アルテミンは、インビトロでドーパミン作動性中脳ニューロンおよび末梢ニューロンの両方の生存を支持することが見出されている（Ｂａｌｏｈら（上述））。さらに、アルテミンはまた、インビボで黒質線状体のドーパミン作動性ニューロンを保護すると考えられる（Ｒｏｓｅｎｂｌａｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：１９９−２１４（２０００））。
【０００３】
タンパク質神経栄養因子またはニューロトロフィンは、脊椎動物神経系の増殖および発達に影響する。さらに、脳および末梢でのニューロンの種々の群の分化、生存、および機能を促進する重要な役割を果たすと考えられている。多くの神経栄養因子は、特定の神経細胞生存を強化するための強力な手段として提唱されている。従って、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、発作、癲癇、ハンティングトン病、パーキンソン病および末梢神経障害のような、神経変性疾患の処置において、これらが有用であり得ることが示唆されている。
【０００４】
神経栄養因子は、神経増殖因子（ＮＧＦ）を用いて以前に確立された因子に一部基づいて、神経組織において重要なシグナル伝達機能を有すると考えられている。ＮＧＦは、インビトロおよびインビボの両方において、発達中の動物の交感ニューロン、感覚ニューロン、および前脳脳幹ニューロン（ｂａｓａｌ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｎｅｕｒｏｎ）の生存を支持する。外因性ＮＧＦの投与は、発達の間の細胞死からニューロンを救う。逆に、抗ＮＧＦ抗体の投与による内因性ＮＧＦの除去または隔離によって、そのような細胞死は促進される（Ｈｅｕｍａｎｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．、１３２：１３３〜１５０（１９８７）；Ｈｅｆｔｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、６：２１５５〜２１６２（１９８６）；Ｔｈｏｅｎｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、６０：２８４〜３３５（１９８０））。
【０００５】
神経栄養因子の特徴に基づき、ＮＧＦは、多くの研究の対象であった。（総説に関しては、Ｈｅｆｔｉら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１０：５１５−５３３（１９８８）およびＬｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：１１５４−１１６４（１９８７）を参照のこと）。しかし、神経保護性効果および神経再生効果に加えて、ＮＧＦはまた、静脈内（ｉｖ）注射、皮下（ｓｑ）注射もしくは皮内（ｉｄ）注射または脳室内（ｉｃｖ）投与もしくは髄腔内（ｉｔ）投与の後で、動物およびヒトの両方で、痛覚過敏および疼痛を引き起こす（Ｌｅｗｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３：２１３６−２１４８（１９９３），Ｌｅｗｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３−１９１２（１９９４），Ａｎｄｒｅｅｖら、Ｐａｉｎ，６３：１０９−１１５（１９９５）；Ｐｅｔｔｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３６：２４４−２４６（１９９４）；Ｈａｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２８６：２０８−２１２（２０００））。この発見は、ＮＧＦ処置に関連する疼痛によって、ＮＧＦの臨床的効果が限定されている、ヒトにおける臨床試験において、生じた。例えば、Ｅｒｉｋｓｄｏｔｔｅｒら、Ｄｅｍｅｎｔ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｃｏｇｎ．Ｄｉｓｏｒｄ，９：２４６−２５７（１９９８），Ｐｅｔｔｙら、（上述）およびＡｐｆｅｌら、ＪＡＭＡ，２８４：２２１５−２２２１（２０００）を参照のこと。
【０００６】
脊髄神経節（ＤＲＧ）における小直径感覚ニューロンの多くは、高親和性のＮＧＦレセプターを発現し（Ｖｅｒｇｅら、Ｊ，Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，１８：５８３−５９１（１９８９），ＭｃＭａｈｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，１２：１１６１−１１７１（１９９４））、そして、ニューロンを発現するこれらのＮＧＦレセプターは、ほとんど、感覚神経ペプチド（特にサブスタンスＰおよびＣＧＲＰ）もまた発現する（Ｖｅｒｇｅら、（上述）およびＡｖｅｒｉｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７：１４８４−１４９４（１９９５））。これらのペプチド作動性ニューロン上のＮＧＦレセプターの局在化と一致して、ＮＧＦを用いた処理によって、これらのニューロン内でのこれらペプチドの発現が改変され得ることが示された。ＮＧＦを用いた処理によって、インビボでの、過剰レベルのペプチドＣＧＲＰおよびサブスタンスＰが誘導され得る（Ｇｏｅｄｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８：５８９５−５８９８（１９８１）およびＡｍａｎｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．，２０３：１７１−１７４（１９９６））。インビトロで増殖するＤＲＧニューロンに対するＮＧＦの効果を試験する実験によって、これが直接の効果であることが示された（ＬｉｎｄｓａｙおよびＨａｒｍａｒ、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：３６２−３６４（１９８９））。さらに、ＮＧＦ処置は、感覚ニューロンの突起から後角へのサブスタンスＰおよびＣＧＲＰの放出の増加を引き起こす（Ｍａｌｃａｎｇｉｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，９：１１０１−１１０４（１９９７）およびＭａｌｃａｎｇｉｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：１３９−１４４（２０００））。
【０００７】
これらのペプチド含有ニューロンに対する損傷は、ニューロン細胞体だけでなく、これらの末梢突起および脊髄の後角への突起でも、ペプチド含量の不足が導かれることが示された。例えば、坐骨神経離断は、坐骨神経突起に対応する領域において、脊髄のＤＲＧおよび後角の両方におけるサブスタンスＰ含量の減少を導く。損傷後のＮＧＦ投与によって、ＤＲＧ内（Ｖｅｒｇｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２０８１−２０９６（１９９５））および脊髄後角の突起内（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：２１１−２２０（１９９６））のペプチド含量における、この損傷が誘導する変化を阻止することが示されている。これらのニューロンに対する損傷はまた、化学的（化学療法剤またはカプサイシン）傷害または代謝的（糖尿病）傷害によって引き起こされ得、これら全ての場合において、ニューロンのペプチド含量は、損傷によって減少し、ＮＧＦ処置が、この減少を復帰または予防し得る（Ａｐｆｅｌら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２９：８７−８９（１９９１），Ａｐｆｅｌら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３１：７６−８０（１９９２），Ｄｏｎｎｅｒｅｒら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７４１：１０３−１０８（１９９６）およびＡｐｆｅｌら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，６３４：７−１２（１９９４））。
【０００８】
ＮＧＦによるサブスタンスＰの調節は、サブスタンスＰが、疼痛に長く関連付けられているので興味深い。実際に、サブスタンスＰの末梢性投与または中枢性投与のいずれかによって、ヒトおよび実験動物の両方において、疼痛および疼痛関連挙動の増加が引き起こされる（Ｍａｅｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ、９６：１２５−１３３（１９９４）、Ｈｏｎｇら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６３：８２７−８３６（１９９４）、ＤｉｒｉｇおよびＹａｋｓｈ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．、２２０：９３−９６（１９９６）、ＨｅｐｐｅｌｍａｎｎおよびＰａｗｌａｋ、Ｎｅｕｒｓｃｉ．Ｌｅｔ．、２２３：９７−１００（１９９７）、Ｈｏｌｔｈｕｓｅｎら、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ、３１：４４５−４４８（１９９７）、Ｙｏｏｎら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６２：３１９−３２５（１９９８）、Ｈｉｔｏｓｕｇｉら、Ｍｅｔ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．、２１：４０９−４１３（１９９９））。結果として、ＮＧＦによって引き起こされる、サブスタンスＰの増加、およびサブスタンスＰの放出の増加が、ＮＧＦ投与に関連する疼痛および痛覚過敏の原因であると提案されている。この見解に一致して、増加したＮＧＦに関連する疼痛は、サブスタンスＰ作用のアンタゴニストによってブロックされ得る。例えば、ＮＧＦを過剰発現するマウスは、後角におけるサブスタンスＰ線維の過剰増殖を示し、痛覚過敏および異痛症を示す。これらの疼痛挙動は、サブスタンスＰレセプターアンタゴニストで予防される（Ｍａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、７：２０２１−２０３５（１９９５））。さらに、Ｈａｏらは、ＮＧＦ処理後にラット中に存在する機械的痛覚過敏（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）および熱痛覚過敏（ｈｅａｔ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）が、サブスタンスＰレセプターＮＧＦに選択的であるアンタゴニストによって軽減され得ることを報告した（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．，２８６：２０８−２１２（２０００））。
【０００９】
従って、ＮＧＦ処置を非実用的であるものにする副作用を生じることなく、神経損傷および神経学的障害を有効に処置する方法について、当該分野において必要性が存在する。特に、ペプチド作動性感覚ニューロンの有効な処置について必要性が存在する。これらの細胞は、損傷の結果としてのこれらのペプチドの発現を減少する。損傷からこれらの細胞を保護するか、または損傷後にこれらの細胞を修復する処置はまた、これらの細胞のペプチド発現を増加しなければならない。しかし、ペプチドの発現の増加は、疼痛のような有害な出来事を導くことが予想される。
【００１０】
ＮＧＦに関連するいくつかのさらなる神経栄養因子が、同定され、そして特徴付けられている。これらは、いわゆるニューロトロフィンファミリーのうちの１０個のメンバーであり、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｌｅｉｂｒｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１：１４９−１５２（１９８９）），ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）（Ｋａｉｓｈｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２６６：１８７（１９９０）；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４４６（１９９０）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎｅｕｒｏｎ，４：７６７（１９９０）），ニューロトロフィン  ４／５（ＮＴ−４／５）（Ｂｅｒｋｅｍｅｉｅｒら、Ｎｅｕｒｏｎ，７：８５７−８６６（１９９１））を包含する。また、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２（１９９３））が同定されたが、これは、別の分子ファミリーに属する。ＮＧＦに類似して、ＧＤＮＦ投与は、体重減少および異痛症に関連する（Ｈｏａｎｅら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１６０：２３５−２４３（１９９９））。
【００１１】
同定された神経栄養因子は、それらのアミノ酸類似性および構造類似性に基づくファミリーにグループ化され得る。ＧＤＮＦファミリーは、ＧＤＮＦだけでなく関連分子であるニューツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）およびペルセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）も含むことが見出された（Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２（１９９３）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０６２−１０６４（１９９４）；Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏら、Ｎｅｕｒｏｎ，１５：８２１−８２８（１９９５）；Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３８４：４６７−４７０（１９９６）；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，２０：２４５−２（１９９８））。
【００１２】
ＧＤＮＦ、ニューツリンおよびペルセフィンは、全て、インビボおよびインビトロで、ドーパミン作動性中脳ニューロンの生存を支持することが見出された（Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：１１３０−１１３２（１９９３）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０６２−１０６４（１９９  ）Ｈｏｒｇｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：４９２９−４９３７（１９９８）；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３７３：３４４−３４６（１９９５）；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，２０：２４５−２５３（１９９８））。この能力によって、これらの化合物が、その基礎が神経損傷または神経変性である障害を処置することに有用であり得ることが示唆される。興味深いことに、ＧＤＮＦおよびニューツリンは、培養中のいくつかの型の末梢ニューロンの生存を増加することもまた可能であるのに対して、同じことがペルセフィンに当てはまることは示されていない（Ｂｕｊ−Ｂｅｌｌｏら、Ｎｅｕｒｏｎ，１５：８２１−８２８（１９９５）；Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３８４：４６７−４７０（１９９６）；Ｅｂｅｎｄａｌら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｒｅｓ．４０：２７６−２８４（１９９５），Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００：１１６−１２９（１９９８）；Ｔｒｕｐｐら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ，１３０：１３７−１４８（１９９５）；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、Ｎｅｕｒｏｎ，２０：２４５−２５３（１９９８））。
【００１３】
神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーの全てのメンバーは、ＧＦＲと呼ばれるＰＩ結合性リガンド結合タンパク質、およびＲＥＴと呼ばれるタンパク質チロシンキナーゼである膜貫通シグナル伝達タンパク質を含む、レセプター複合体を介してシグナル伝達するようである。ＲＥＴがＧＤＮＦ神経栄養因子ファミリーの全てのメンバーについての共通のシグナル伝達要素であるようであるのに対して、その各々が異なるリガンドに対して比較的特異的であるような、４つの異なるＧＦＲ（ＧＦＲ１〜４）が存在する。ＧＦＲ  １−ＲＥＴは、優先的にＧＤＮＦに結合するのに対して、ＧＦＲ  ２−ＲＥＴは、ニューツリンに優先的に結合する（Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒ  １８：７９３−８０２（１９９７）；Ｊｉｎｇら、Ｃｅｌｌ，８５：１１１３−１１２４（１９９６）；Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３８７：７１７−７２１（１９９７）；Ｓａｎｉｃｏｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：６２３８−６２４３（１９９７）；Ｓｕｖａｎｔｏら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６：１２６７−１２７３（１９９７）；Ｔｒａｅａｎｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３８２：８０−８３（１９９６））。しかし、最近、ＧＤＮＦに対するＧＦＲ  １のおよびニューツリンに対するＧＦＲ  ２のこの明らかな特異性は、多少過剰に単純化されているかもしれない、いくつかの証拠がある（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，６１：１−９（２０００））。さらに、ＧＦＲ  １レセプターがＲＥＴ非存在下でさえも、ＧＤＮＦからのシグナルを変換でき得ることを示す証拠が公表された（Ｔｒｕｐｐら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２０８８５−２０８９４（１９９９））。ペルセフィンは、ＧＦＲ  ４に結合することが報告され、従って、ＧＦＲ  ４−ＲＥＴを介して作用する可能性がある（Ｅｎｏｋｉｄｏら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１０１９−１０２２（１９９８））。他方、ＧＦＲ  ３の分析によって、ＧＦＲ  ３がＧＤＮＦ、ニューツリンまたはペルセフィンによって活性化され得るＲＥＴを伴う、機能的レセプターを形成し得ないことが示された（Ｂａｌｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９５：５８０１−５８０６（１９９８））。このことは、ＧＤＮＦファミリーの第４のメンバーが同定されることを示唆した。
【００１４】
ＧＤＮＦファミリーの第４のメンバーは、最近同定され、特徴付けられており、そしてアルテミンと呼ばれる（Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ，２１：１２９１−１３０２（１９９８））。アルテミンと同一またはほぼ同一である、いくつかの他の因子がまた、同定され、エノビン（Ｍａｓｕｒｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６６：８９２−９０２（１９９９））およびニューブラスチン（Ｒｏｓｅｎｂｌａｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：１９９−２１４（２０００））と呼ばれる。推定全長アルテミンタンパク質は、分泌のためのシグナルペプチド、およびいくつかの保存されたＲＸＸＲフリンプロテアーゼ切断部位によって成熟領域から分離されるプロ領域を含む。さらに、ヒトアルテミン遺伝子は、２つの可能な開始メチオニンを含み、２つの異なる全長ヒトアルテミンポリペプチドの代替的な産出を導く。しかし、プロ領域の切断により生じる、ヒトアルテミンの成熟形態は、両形態で同一である。マウスアルテミン遺伝子は、代替的なメチオニンを含まない。アルテミンは、ＧＤＮＦ（３６％同一）よりもニューツリンおよびペルセフィン（４５％同一）とアミノ酸レベルで類似している（Ｂａｌｏｈら、（上述））。
【００１５】
上で簡単に記載されるように、Ｂａｌｏｈら（上述）は、アルテミンが、培養物中でドーパミン作動性中脳ニューロンの生存を支持することを報告した。アルテミンはまた、インビボで、黒質線状体のドーパミン作動性ニューロンを保護することが見出されている（Ｒｏｓｅｎｂｌａｄ、（上述））。さらに、ＧＤＮＦおよびニューツリンのように、アルテミンは、インビトロで末梢ニューロンを維持し得、この末梢ニューロンは、脊髄神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節（ＴＧ）の両方由来の感覚ニューロン、下神経節（ＮＧ）由来の内臓感覚ニューロン、および上頸神経節（ＳＣＧ）の交感ニューロンのサブセットを含む（Ｂａｌｏｈら（上述））。
【００１６】
アルテミンは、ＧＦＲ  ３に結合し得、ＧＦＲ  ３−ＲＥＴレセプター複合体を活性化し得ることが報告された（Ｂａｌｏｈら（上述））。一貫して、４つのＧＤＮＦファミリーニューロトロフィンのうち、アルテミンは、ＧＦＲ  ３レセプターのパターンと最も一致するパターンで発現される（Ｂａｌｏｈら（上述））。類似する結合および発現の結果が、同一分子のエノビンを使用して得られた（Ｍａｓｕｒｅら、（上述））。従って、ＧＦＲ  ３は、アルテミンに対する機能的レセプターであるようである。
【００１７】
ニューロンの発達および生存に伴う問題は、急性損傷から長期変性までにわたる多くの神経性障害に対する主要な一因である。従って、アルテミンを使用して、ＮＧＦ処置で見られる付随する有害な副作用を伴わずにニューロンの死を予防しニューロンの生存を増加する手段を提供することが、本発明の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、アルテミンが、哺乳動物中のニューロン（特に、小感覚ニューロン）における損傷誘導性変化の予防、改善または処置において高度に効率的であり、実際、損傷後のサブスタンスＰの損失からペプチド作動性ニューロンを保護するというという発見に基づく。アルテミン投与が、ＮＧＦと類似してペプチド含量を増加し得るが、他の神経栄養因子（例えば、ＮＧＦ）の投与にしばしば関連する有害な副作用（特に、痛覚過敏）が意外に全くない。
【００１９】
１つの局面において、本発明は、損傷誘導性病理変化から、哺乳動物中のニューロンを保護する方法を提供する。この方法は、哺乳動物にアルテミンまたはアルテミンアゴニストを投与することを包含する。アルテミンが投与される哺乳動物は、ヒトであり得る。特定の実施形態において、アルテミンまたはアルテミンアゴニストの投与量は、約０．０１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である。アルテミンまたはアルテミンアゴニストの投与には、機械的痛覚過敏および温熱性痛覚過敏（ｔｈｅｒｍａｌ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）が伴わない。
【００２０】
１つの実施形態において、投与量は、約０．１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である。代替的な実施形態において、投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である。
【００２１】
投与は、当業者に公知の任意の方法によってなされ得る。好ましい実施形態において、投与は全身的であり、そして、静脈内注射、皮内注射、髄腔内注射または皮下注射によってなされ得る。代替的な実施形態において、投与は局所的であり得る。
【００２２】
アルテミンまたはアルテミンアゴニストの投与は、当該分野で公知の方法によって決定されるように、繰り返される。１つの実施形態において、投与は、少なくとも２週間の持続期間に対して、１週間に少なくとも２回繰り返される。別の実施形態において、投与は、少なくとも２週間の持続期間に対して、１週間に少なくとも３回繰り返される。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、アルテミンに影響されるニューロンは、末梢ニューロンである。より好ましくは、ニューロンは、交感ニューロン、副交感ニューロン、感覚ニューロンおよび内臓ニューロンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、ニューロンは、小線維感覚ニューロンである。
【００２４】
本発明のなお別の実施形態において、ニューロンは、運動ニューロンまたは中枢ニューロンである。このニューロンが、中枢ニューロンである場合、これらは、好ましくは、脳ニューロンまたは脊髄ニューロンであり得る。
【００２５】
本発明の第１の局面において企図される損傷は、外傷、毒性薬剤、他の治療薬剤の有害な副作用、手術、発作、虚血、感染、代謝性疾患、栄養欠乏、または悪性疾患に関連し得る。損傷は、末梢神経障害、より好ましくは、末梢感覚神経障害およびさらにより好ましくは糖尿病神経障害にもまた関連し得る。
【００２６】
本発明の方法で使用されるアルテミンは、ネイティブ配列のアルテミンポリペプチドまたはネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。このネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドはまた、配列番号３または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含み得る。
【００２７】
本発明の別の局面は、哺乳動物において、神経損傷を処置する方法である。この方法は、哺乳動物に約０．０１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量で、アルテミンまたはアルテミンアゴニストを投与することを包含する。代替的な実施形態において、この用量は、約０．１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間または約０．１ｍｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間である。この投与は、機械的痛覚過敏および温熱性痛覚過敏を伴わない。アルテミンが投与される哺乳動物は、ヒトであり得る。
【００２８】
本発明のこの局面において企図される神経損傷は、神経障害または神経変性疾患に由来し得る。１つの実施形態において、この神経障害は末梢神経障害であり、別の実施形態において、この神経障害は糖尿病神経障害である。なお別の実施形態において、この神経障害は小線維感覚神経障害である。より具体的には、この神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症であり得る。
【００２９】
１つの実施形態において、ネイティブ配列のアルテミンポリペプチドが投与される。別の実施形態において、ネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドが投与される。このネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。さらに、このネイティブ配列のヒトアルテミンポリペプチドは、配列番号３または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含み得る。アルテミンの投与は、全身的または局所的であり得、好ましくは、２週間の持続期間に対して、１週間に少なくとも２回繰り返される。
【００３０】
本発明の第３の局面は、容器、その容器内にアルテミンを含む薬学的組成物、およびその薬学的組成物を約０．０１μｇ／ｋｇと約１ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与する指示書を含む、製品である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本明細書中に使用される場合、用語「アルテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）」および「アルテミンポリペプチド」（これらは、交換可能に使用される）は、ネイティブな配列のアルテミン、アルテミン改変体、およびキメラアルテミン（これらの各々が、本明細書中に規定される）をいう。随意、アルテミンは、ネイティブなグリコシル化と関連していない。「ネイティブなグリコシル化」は、哺乳動物細胞中（特に、天然にアルテミンがその中で産生される細胞中）で産生された場合に炭水化物部分がアルテミンに共有結合していることをいう。従って、非ヒト細胞において産生されたヒトアルテミンは、「ネイティブなグリコシル化と関連し得ない」アルテミンの例である。ときどき、アルテミンは、例えば、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生される場合に全くグリコシル化され得ない。
【００３２】
アルテミン核酸は、上記のようなアルテミンポリペプチドをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡであるか、またはこのようなＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズし、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらに安定に結合したままであり、かつ約１０ヌクレオチド長よりも長い、ＲＮＡもしくはＤＮＡである。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低いイオン強度かつ高い温度（例えば、５０℃において０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ＮａＤｏｄＳＯ４）を使用するか、または（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使用する（例えば、４２℃において、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドおよび０．１％  ウシ血清アルブミン／０．１％  フィコール／０．１％  ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含む、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５））条件である。
【００３３】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、作動可能に連結される。アルテミン核酸は、ベクター中で別の核酸配列と作動可能に連結され得、その結果、アルテミン核酸は、特定の宿主生物中で発現され得る。これは、当該分野で周知の方法によって実施され得る。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーターまたはエンハンサーが、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結され；または、リボソーム結合部位が、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が、連続的であることを意味し、分泌リーダーの場合は、連結されるＤＮＡ配列が、連続的かつリーディングフレームがあっていることを意味する。しかし、エンハンサーが連続的である必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが従来の実施に従って使用される。
【００３４】
「ネイティブ配列のアルテミン」は、その調製形態にかかわらず、天然に由来するアルテミンと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、ネイティブ配列のアルテミンは、天然に存在するラットアルテミン、マウスアルテミン、ヒトアルテミン、または任意の他の哺乳動物種由来のアルテミンのアミノ酸配列を有し得る。例えば、２つのネイティブ配列の全長ヒトアルテミンアミノ酸配列が、図３および図５（配列番号３および配列番号５）に示される。これらの２つの配列は、ヒトアルテミン遺伝子における２つの可能性のある開始メチオニンの存在の結果である。ネイティブ配列のマウスアルテミンアミノ酸配列が、図７（配列番号７）に示される。このようなネイティブ配列のアルテミンポリペプチドは、天然から単離され得るか、または組換え手段および／もしくは合成手段によって産生され得る。用語「ネイティブ配列のアルテミン」は、詳細には、天然に存在するプレプロ形態、プロ形態、成熟形態および短縮形態のアルテミン、天然に存在する改変体形態（例えば、選択的スプライシング形態）、ならびに天然に存在する対立遺伝子改変体を含む。好ましいネイティブ配列のアルテミンは、図１（配列番号１）に示されるような成熟ヒトネイティブ配列のアルテミンである。成熟形態のヒトアルテミンは、２つの全長ネイティブ配列の各々において見出される大きいプロ領域のタンパク質分解切断の産物である。
【００３５】
「アルテミン改変体」は、そのネイティブ配列（例えば、図１（配列番号１）の配列）内の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、改変、および／または置換によって、成熟ヒトアルテミンについて図１に示されるようなネイティブ配列のアルテミンポリペプチドの配列と異なるアミノ酸配列を有する、生物学的に活性なアルテミンポリペプチドである。アルテミン改変体は、一般的に、図１（配列番号１）の成熟ヒトアルテミンのようなネイティブ配列のアルテミンと１００％未満の配列同一性を有する。しかし、通常、生物学的に活性なアルテミン改変体は、図１（配列番号１）の成熟ヒトアルテミンのような天然に存在するアルテミンのアミノ酸配列と少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％のアミノ酸配列同一性、（優先度を増大しながら１％ずつの漸増で）少なくとも約８５％〜少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。このアルテミン改変体は、対応するネイティブ配列のアルテミンポリペプチドの生物学的活性を保持する、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸のペプチドフラグメントを含む。アルテミン改変体はまた、１つ以上のアミノ酸残基がネイティブアルテミン配列のＮ末端もしくはＣ末端、または内部に付加された、アルテミンポリペプチドを含む。アルテミン改変体はまた、多数のアミノ酸残基が欠失され、そして必要に応じて１つ以上のアミノ酸残基によって置換されている、アルテミンポリペプチドを含む。アルテミン改変体はまた、例えば、天然に存在するアミノ酸以外の部分での置換によってか、または天然に存在しないアミノ酸残基を産生するようにアミノ酸残基を改変することによって、共有結合的に改変され得る。
【００３６】
アルテミン配列に関して「アミノ酸配列同一性のパーセント」とは、本明細書中において、配列をアラインメントし、そして必要に応じてギャップを導入して最大の配列同一性のパーセントが達成されるようにし、かつ配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しなかった後の、アルテミン配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして規定される。候補アルテミン配列へのいかなるＮ末端、Ｃ末端、または内部における伸長、欠失または挿入も、配列同一性または配列相同性に影響を与えるものとして解釈されるべきではない。アラインメントに関する方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。１つのこのようなコンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．に著作権がある「ＡＬＩＧＮ−２」（これは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．２０５５９においてユーザー文書とともに保管され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている）である。
【００３７】
「キメラアルテミン」分子は、異種ポリペプチドと融合または結合した、全長アルテミンまたはその１つ以上のドメインを含むポリペプチドである。このキメラアルテミン分子は、一般的に、天然に存在するアルテミンと共通して少なくとも１つの生物学的特性を共有する。キメラアルテミン分子の例は、精製目的のためにエピトープタグ化されたアルテミン分子である。別のキメラアルテミン分子は、アルテミン免疫付着因子である。
【００３８】
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中に使用される場合、「タグポリペプチド」と融合したアルテミンを含むキメラポリペプチドをいう。このタグポリペプチドは、抗体が作製されるエピトープを提供するのに十分な残基を有し、かつ、アルテミンの生物学的活性を妨害しないような短い長さである。タグポリペプチドは、好ましくは、そのタグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、適切に特有である。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、そして通常約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約９〜３０残基の間）を有する。記載されるように（例えば、Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｎｅｕｒｏｎ  １７：５７１−５７４（１９９６）を参照のこと）Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによってタグ化タンパク質の単離を可能にする、ニッケルに結合するポリ−ヒスチジン配列が、好ましい。
【００３９】
アルテミン「アゴニスト」は、ネイティブ配列のアルテミンの１つ以上の生物学的特性を有する分子または化合物である。これらとしては、低分子の有機分子、ペプチド、およびアゴニスト抗アルテミン抗体が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４０】
「単離されたアルテミン」は、アルテミン供給源から精製されたか、または組換え方法もしくは合成方法によって調製され、そして精製された、アルテミンを意味する。精製されたアルテミンは、他のポリペプチドまたはペプチドを実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、本明細書中において、他の供給源タンパク質が約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、なおより好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満混入することを意味する。
【００４１】
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、そのタンパク質の少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、なおより好ましくは少なくとも約９５重量％を含む組成物を意味する。「本質的に相同な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、タンパク質の少なくとも約９９重量％を含む組成物を意味する。
【００４２】
「生物学的特性」は、「アルテミン」または「単離されたアルテミン」またはアルテミンの「アゴニスト」と組み合わせて使用される場合、ネイティブ配列のアルテミン（そのネイティブコンフォメーションまたは変性コンフォメーションにかかわらず）によって直接的または間接的にもたらされるかまたは実行される、エフェクター機能もしくは抗原性機能または活性を有することを意味する。エフェクター機能としては、レセプター結合（好ましくは高い親和性にて）、ならびに生存、分化および／または細胞増殖の増強、ならびに細胞（特にニューロン）における損傷誘導性の変化の予防が挙げられる。
【００４３】
「生物学的に活性な」は、「アルテミン」または「単離されたアルテミン」またはアルテミンのアゴニストと組合わせて使用される場合、ネイティブ配列のアルテミンのエフェクター機能を示すかまたは共有するアルテミンポリペプチドを意味する。アルテミンの主要なエフェクター機能は、ニューロンの生存を刺激する能力である。アルテミンの別の主要なエフェクター機能は、ニューロンにおいて損傷誘導性の変化を予防する能力である。限定されないが、好ましい生物学的活性としては、インビトロまたはインビボで、傷害を受けたニューロン細胞（末梢ニューロン（交感神経、副交感神経、感覚、および腸）、運動ニューロン、および中枢ニューロン（脳および脊髄）を含む）の発生、増殖、維持および／または再生を促進する能力が挙げられる。特に好ましい生物学的活性は、神経障害（末梢神経障害）もしくは他の神経変性疾患を改善する（処置および予防を含む）ため、または損傷を受けた神経細胞を修復する能力である。損傷を受けたニューロンは、感覚ニューロン、交感神経ニューロン、副交感神経ニューロン、または腸ニューロン（例えば、脊髄神経節ニューロン）、運動ニューロン、および中枢ニューロン（例えば、脊髄由来のニューロン）であり得る。その損傷は、任意の原因の損傷（外傷、毒性薬剤、他の治療剤の有害な副作用、手術、発作、虚血、感染、代謝性疾患、栄養素欠乏、および種々の悪性腫瘍を含む）であり得る。
【００４４】
「アルテミンレセプター」は、アルテミンが結合し、かつアルテミンの生物学的特性を媒介する分子である。
【００４５】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および抗原特異性を欠く他の抗原様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低いレベルで産生され、そして骨髄腫によって高いレベルで産生される。
【００４６】
「ネイティブな抗体」および「ネイティブな免疫グロブリン」は、通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質であり、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１つの共有結合のジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖もまた、一様に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、後に、多数の定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を１端に有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他方の端に定常ドメインを有し；この軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。
【００４７】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分が、抗体間の配列において広範囲にわたって異なる事実をいい、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用される。しかし、変動性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するわけではない。これは、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのこのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、シート形態を広範囲に採用し、３つの超可変領域によって連結され、シート構造と連結するループを形成し、そしていくつかの場合、シート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、他の鎖由来の超可変領域と共に、ＦＲに非常に近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），６４７−６６９頁を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与するわけではないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与）を示す。
【００４８】
用語「超可変領域」は、本明細書中に使用される場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいて残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））を含むか、そして／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおいて残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおいて２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」の残基は、本明細書中に規定されるような超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４９】
抗体のパパイン消化は、各々が、単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと称される２つの同一な抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成し、この名前「Ｆｃ」は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプチン処理によって、２つの抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を有し、そしてなおも抗原と架橋結合し得るＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００５０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密接な非共有結合的な会合による、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。これは、各可変ドメインの３つの超可変領域が、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用するような配置にある。ひとまとめにすると、６つの超可変領域が、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識しそして結合する能力を有するが、これは結合部位全体よりも低い親和性である。
【００５１】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基を付加している点で、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中においてＦａｂ’を示し、ここで、定常ドメインのシステイン残基は、遊離のチオール基を保有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来、ヒンジシステインをその間に有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた、公知である。
【００５２】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」が、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の内の一方に割り当てられ得る。
【００５３】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、そしてこれらのうちのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、    、    、    、    、および    、と呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置が、周知である。
【００５４】
用語「抗体」は、本明細書中において、最も広い意味で使用され、そして詳細には、ヒト、非ヒト（例えば、マウス）およびヒト化された、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ならびに所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメントにわたる。
【００５５】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含有する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される複数特異性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が挙げられる。
【００５６】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわちこの集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して指向し、高度に特異的である。さらに、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含む、慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。この修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００５７】
本明細書中におけるモノクローナル抗体は、詳細には、「キメラ」の抗体（免疫グロブリン）を含む。キメラの抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、あるいは相同であるが、残りの鎖は、別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこれらが所望される生物学的活性を示す限りは、このような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、あるいは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ヒト免疫グロブリンにおいて、レシピエントの超可変領域残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類）由来の超可変領域残基により置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトの残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含有し得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、可変ドメインにおいて、全てまたは実質的に全ての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、少なくとも一部の免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。さらに詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００５９】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有し、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含有する。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００６０】
用語「ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同一の鎖上の２つのドメイン間での対形成が不可能なリンカーを使用することによって、このドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成を強いられて、２つの抗原結合部位を生成する。ジアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより完全に記載される。
【００６１】
表現「線状（ｌｉｎｅａｒ）抗体」とは、本出願を通じて使用される場合、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載される抗体をいう。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異的かまたは単一特異的であり得る。
【００６２】
用語「エピトープ」は、タンパク質抗原上の（モノクローナルまたはポリクローナルの）抗体に対する結合部位についていうために使用される。
【００６３】
「アゴニスト抗体」は、アルテミンアゴニストであり、従ってネイティブ配列のアルテミンの１つ以上の生物学的特性を保有する抗体を意味する。
【００６４】
用語「アルテミン免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、用語「アルテミン免疫グロブリンキメラ」と交換可能に使用され、そして少なくとも一部のアルテミン分子（ネイティブまたは改変体）を免疫グロブリン配列と結合するキメラ分子についていう。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必須ではない。免疫付着因子は、ヒト抗体の多くの有益な化学的特性および生物学的特性を保有し得る。免疫付着因子が、適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン（Ｆｃ）に連結される所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、ヒト成分全体を使用して達成され得る。このような免疫付着因子は、患者に対して最小限に免疫原性であり、そして長期および繰返しの使用に安全である。
【００６５】
治療的使用について記載されてきたホモ多量体の免疫付着因子の例は、細胞表面ＣＤ４に対するＨＩＶの結合をブロックするためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子を含む。ＣＤ４−ＩｇＧが出産直前の妊娠女性に投与された第１相臨床試験から得られたデータは、この免疫付着因子が、ＨＩＶの母体−胎児移動の予防に有用であり得ることを示唆する（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９−２２７（１９９３））。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する免疫付着因子もまた開発されてきた。ＴＮＦは、敗血症性ショックの主要な媒介物質であることが示されてきた炎症誘発性サイトカインである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免疫付着因子は、敗血症性ショックの処置における臨床使用のための候補としての見込みを示されてきた（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、（１９９１）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９）。ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合されるＴＮＦレセプター配列を含む免疫付着因子、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））は、慢性関節リウマチの処置について、１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可された。慢性関節リウマチの処置において、新たに拡張されたＥＮＢＲＥＬ（登録商標）の使用は、２０００年６月６日にＦＤＡにより認可された。ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）を含むＴＮＦブロッカーに関する最近の情報については、Ｌｏｖｅｌｌら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：７６３−１６９（２０００）、および８１０−８１１頁上の添付論説；ならびにＷｅｉｎｂｌａｔｔら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：２５３−２５９（１９９９）；ＭａｉｎｉおよびＴａｙｌｏｒ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１：２０７−２２９（２０００）における論評を参照のこと。
【００６６】
免疫付着因子構造の２つのアームが、異なる特異性を有する場合、この免疫付着因子は、二重特異性抗体への類似性により「二重特異性免疫付着因子」と呼ばれる。Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６２：１２３（１９９３）は、接着分子Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン（これらの各々は、天然において異なる細胞型で発現される）の細胞外ドメインに結合するこのような二重特異性免疫付着因子を記載する。結合研究は、このようにして形成された二重特異性免疫グロブリン融合タンパク質が、誘導された単一特異的免疫付着因子と比較して、骨髄性細胞株に対して増強された結合能力を有することを示した。
【００６７】
用語「ヘテロ付着因子」は、表現「キメラヘテロ多量体付着因子」と交換可能に使用され、そしてそれぞれのキメラ分子が、生物学的に活性な部分（例えば、それぞれのヘテロ多量体レセプターのモノマーの細胞外ドメイン）を多量体ドメインと組合わせるキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体をいう。「多量体化ドメイン」は、ヘテロ多量体複合体内部のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。この多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラヘテロ多量体のキメラ分子間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離のチオールを介して相互作用し得る。多量化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含み得る。さらに、多量化領域は、立体相互作用が、安定な相互作用を促進するようにだけでなく、さらにモノマーの混合物からホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成を促進するように操作され得る。「隆起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」は、第一のポリペプチドの境界からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することによって構築される。隆起に対して同一または類似のサイズの代償的な「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」は、必要に応じて、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって第二のポリペプチドの境界上に生成される。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必須ではない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン成分は、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプまたはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから入手され得るが、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３から入手され得る。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、有益または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益または望ましい臨床結果としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：検出可能または検出不能に関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の回復または緩和、および寛解（部分的または全体に関わらない）。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存が延長することを意味し得る。「処置」は、障害の発生を予防するかまたは障害の病理を変更する意図で実施される介入である。従って、「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）な手段の両方についていう。処置を必要とするものは、すでに障害を有するもの、および障害が予防されるべきものを含む。具体的には、処置は、損傷の細胞性変性の病理（例えば、神経細胞の病理）を直接的に予防、鈍化させる、もしくは別の方法で減少させ得るか、または細胞（例えば、ニューロンに他の治療剤による処置に対するさらなる感受性）を与え得る。好ましい実施形態において、処置は、標的ニューロンの機能の低下を減少させるかもしくは鈍化させ、および／または回復を刺激する。
【００６９】
（慢性）神経変性疾患または急性神経系損傷の「病理」は、患者の健康な生存に影響する全ての現象を包含し、限定なしに、神経性の機能障害、変性、損傷および／または死を含む。
【００７０】
用語「神経変性疾患」および「神経変性障害」は、全ての障害を含む最も広範な意味において使用され、これらの病理は、神経性の変性および／または機能障害に関し、これらの病理としては、限定なしに以下が挙げられる：末梢神経障害；運動神経（ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎ）障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ルー・ゲーリグ病、ベル麻痺、および脊髄性筋萎縮症または脊髄性筋萎縮麻痺に関する種々の状態）；および他のヒト神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴、およびメニエール病）。
【００７１】
「末梢神経障害」は、ほとんどの場合、運動、感覚、感覚運動、もしくは自律神経性の機能障害の１つまたは組合わせとして示される、末梢神経に影響する神経変性障害である。末梢神経障害は、例えば、遺伝的に獲得され得るか、全身性疾患から生じ得るか、神経毒性薬物（例えば、抗新生物剤、または産業もしくは環境の汚染物質）のような毒性因子により誘導され得る。「末梢感覚神経障害」は、末梢感覚神経の変性により特徴付けられ、これは、特発性であり得、例えば、糖尿病（糖尿病性神経障害）、癌における細胞増殖抑制薬物治療のアルコール中毒症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、または遺伝的疾病素質の結果として生じ得る。癌における細胞増殖抑制薬物治療としては、化学療法剤（例えば、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサート、３’−アジド−３’−デオキシチミジン、またはタキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））での処理が挙げられる。遺伝的に獲得される末梢神経障害としては、例えば、レフスム症候群、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、ドゥジュリーヌ−ソッタ症候群、無β−リポ蛋白血症、およびシャルコー−マリー−ツース（ＣＭＴ）病（Ｐｒｏｎｅａｌ筋肉萎縮症または遺伝性運動性感覚性神経障害（ＨＭＳＮ）としても知られる）が挙げられる。末梢神経障害の多くのタイプは、数ヵ月または数年の経過にわたってゆっくりと発生する。臨床的慣例において、このような神経障害は、慢性と呼ばれる。時折、末梢神経障害は、数日の経過にわたって迅速に発生し、そしてこれは、急性といわれる。末梢神経障害は、通常、感覚神経と運動神経との一緒に影響して、混合した感覚および運動の神経障害を引き起こすが、純粋な感覚神経障害および純粋な運動神経障害もまた知られる。
【００７２】
用語「毒性因子」とは、本発明の文脈において使用される場合、その化学作用を通じて、神経系の成分の活性を損傷、障害、または阻害する物質をいうことを意味する。毒性因子（「神経毒性因子」ともいう）の長い一覧は、限定なしに、上記に列挙されるもののように、化学療法剤、アルコール、金属、産業毒素、食品および医薬の混入物などが挙げられる。
【００７３】
処置の目的のために「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、ならびに動物園の動物、娯楽動物または愛玩動物（例えば、イヌ、ウマ、ヒツジ、ネコ、乳牛など）を含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００７４】
本発明の文脈において、表現「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」は、交換可能に使用され、そして全てのこのような命名は、子孫を含む。従って、単語「形質転換株」および「形質転換（宿主）細胞」は、一次被験体細胞および移入の数に対する考慮なしにそれらに由来する培養物を含む。全ての子孫は、意図的な変異または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ含量において正確に同一でないかもしれないこともまた理解される。本来の形質転換細胞についてスクリーニングした場合と同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫は、含まれる。個別の命名が企図される場合、このことは、文脈から明らかである。
【００７５】
「外因性」要素は、細胞に対して外来であるか、または細胞に対して相同であるが、この要素が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にある核酸配列を意味するために本明細書中に規定される。
【００７６】
（Ｂ．本発明を実施するための方法）
（１．アルテミン改変体の同定）
本明細書中に記載される全長のネイティブな配列のアルテミンポリペプチドに加えて、アルテミン改変体が、本発明において、同定、調製および使用され得ることが企図される。アルテミン改変体は、適切なヌクレオチド変化のアルテミンＤＮＡへの導入、および／または所望されるアルテミンポリペプチドの合成によって調製され得る。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数または位置の変化のような、アルテミンの翻訳後プロセスを変更し得ることを認識する。アルテミン改変体の産生の方法は、好ましくは、以下に詳細に記載されるようなネイティブ配列アルテミンについてと同じであり、唯一の違いは、ネイティブ配列アルテミンをコードする核酸に対して、アルテミン改変体をコードする核酸の置換である。
【００７７】
アルテミンをコードする核酸分子は、本発明の方法において使用される。ヒトアルテミンの２つの全長改変体をコードするｃＤＮＡは、図２および図４（配列番号２および配列番号４）において提供され、そして対応する推定アミノ酸配列は、図３および図５（配列番号３および配列番号５）において提供される。マウスアルテミンをコードするｃＤＮＡは、図６（配列番号６）において提供され、そして対応する推定アミノ酸配列は、図７（配列番号７）において提供される。本発明において使用されるポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションスクリーニングおよびＰＣＲの方法論のように、当業者に周知の標準的な技術を用いて入手され得る。
【００７８】
アルテミンのアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列は、アルテミンの発現を指示する組換え分子を生成するために使用され得る。さらに、本発明の方法はまた、アルテミンコード配列と異種タンパク質についての第二のコード配列との間の融合ポリヌクレオチドを利用し得る。
【００７９】
アルテミンｃＤＮＡ全体をコードする任意の種由来の全長相同性のｃＤＮＡ配列をクローン化するためにか、またはファミリーのメンバーもしくは対立遺伝子改変体のような改変形態をクローン化するために、本明細書中に開示されるｃＤＮＡ配列の任意の部分に対応するフラグメントから作製された標識ＤＮＡプローブは、アルテミンを発現すると考えられる細胞または組織の型に由来するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。より詳細には、コード配列の５’末端または３’末端のいずれかに対応するオリゴヌクレオチドは、より長いヌクレオチド配列を得るために使用され得る。
【００８０】
全長ｃＤＮＡを得るために、異なる組織由来の複数のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが必要とされ得る。完全に５’末端コード領域をコードするｃＤＮＡクローンを同定することは困難である（ｃＤＮＡクローニングにおけるしばしば遭遇される局面）場合、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）技術が使用され得る。ＲＡＣＥは、不完全なｃＤＮＡの５’末端を増幅するための、実証されたＰＣＲベースのストラテジーである。独特なアンカー配列を含むヒト胎盤から合成された５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＲＮＡは、市販である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ｃＤＮＡの５’末端を入手するために、ＰＣＲは、提供されるアンカープライマーおよび３’プライマーを使用して５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを実施される。次いで、第二のＰＣＲは、製造業者の説明書に従う、アンカープライマーおよび入れ子（ｎｅｓｔ）の３’プライマーを用いて実施される。一旦入手されると、全長ｃＤＮＡ配列は、アミノ酸配列中に翻訳され得、そして翻訳開始部位および翻訳停止部位により隣接した連続なオープンリーディングフレーム、本明細書中に開示されるアルテミンに対する潜在的なシグナル配列および最終的に全体の構造類似性といった特定の目標について試験され得る。
【００８１】
あるいは、標識プローブは、以下に記載されるような適切なストリンジェント条件を使用して目的の生物のいずれかに由来するゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【００８２】
アルテミンコード配列または相同配列の単離は、本明細書中に開示される配列をコードするアルテミンに基づいて設計された２つの変性したオリゴヌクレオチドのプライマープールを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施され得る。反応のための鋳型は、例えば、アルテミン遺伝子対立遺伝子を発現することが知られるかまたは考えられる、ヒトまたは非ヒトの細胞株または組織から調製されるｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）により得られるｃＤＮＡであり得る。
【００８３】
このＰＣＲ産物は、増幅した配列がアルテミンコード配列の配列を示すことを確実にするために、サブクローン化され得、そして配列決定され得る。次いで、ＰＣＲフラグメントは、種々の方法によって、全長ｃＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。例えば、増幅されたフラグメントは、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために標識化および使用され得る。あるいは、標識化フラグメントは、ゲノムライブラリーのスクリーニングを介して、ゲノムクローンを単離するために使用され得る。
【００８４】
ＰＣＲ技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するために使用され得る。例えば、ＲＮＡは、標準的な手順に従って、適切な細胞または組織の供給源から単離され得る。ＲＴ反応は、第一鎖合成のプライミングのために増幅されたフラグメントの最も５’末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡに対して実施され得る。次いで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準的な末端転移酵素反応を使用してグアニンで「テイル（ｔａｉｌ）」され得、このハイブリッドは、ＲＮＡａｓｅ  Ｈで消化され得、次いで第二鎖合成は、ポリＣプライマーでプライムされ得る。従って、増幅されたフラグメントのｃＤＮＡ配列上流は、容易に単離され得る。
【００８５】
アルテミン遺伝子の変異体または対立遺伝子の改変体のｃＤＮＡクローンは、例えば、ＰＣＲの使用によって単離され得る。この場合において、第一のｃＤＮＡ鎖は、オリゴｄＴオリゴヌクレオチドを、変異体アルテミン対立遺伝子を推定上保有する個体において発現されることが既知または考えられる組織から単離されたｍＲＮＡとハイブリダイズさせることにより、そして新たな鎖を逆転写酵素で伸長させることによって、合成され得る。次いで、ｃＤＮＡの第二の鎖は、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成される。これらの２つのプライマーを使用して、次いで産物は、ＰＣＲにより増幅され、適切なベクター中にクローン化され、そして当業者に周知の方法を介してＤＮＡ配列分析に供される。この変異アルテミン対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なアルテミン対立遺伝子と比較することによって、変異アルテミン遺伝子産物の機能の損失または変更の原因である変異が、確認され得る。
【００８６】
あるいは、ゲノムライブラリーは、変異体アルテミン対立遺伝子を保持することが疑わしい個体または公知の個体から得られるＤＮＡを用いて構築され得るか、あるいは、ｃＤＮＡライブラリーが、変異体アルテミン対立遺伝子を発現することが公知の組織由来または疑わしい組織由来のＲＮＡを用いて構築され得る。次いで、対でないアルテミン遺伝子またはその任意の適切なフラグメントは、標識されそしてこのようなライブラリーにおいて対応する変異体アルテミン対立遺伝子を同定するプローブとして使用され得る。次いで、変異体アルミン遺伝子配列を含むクローンは、精製され、そして当業者に周知の方法に従って配列分析に供され得る。
【００８７】
さらに、発現ライブラリーは、例えば、このような変異体対立遺伝子を保持することが疑わしい個体、または公知の個体における変異アルテミン対立遺伝子を発現することが、公知の組織、または疑わしい組織から単離されるＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを利用して構築され得る。この様式において、推定の変異体組織によって作製された遺伝子産物は、発現され、そして以下に記載されるように、正常なアルテミン遺伝子産物に対して惹起される抗体と組み合わせた標準的な抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングされ得る。本明細書中で使用される場合、用語、核酸、ポリヌクレオチド、およびヌクレオチドは、互換性があり、そしてデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから構成される任意の核酸、およびホスホジエステル結合または修飾された結合（例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋したホスホルアミデート、架橋したメチレンホスホネート、架橋したホスホルアミデート、架橋したホスホルアミデート、架橋したメチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホエート、ホスホロジチオエート、架橋したホスホロチオエートまたはスルトン結合、およびこのような結合の組合せ）から構成される任意の核酸をいう。
【００８８】
用語、核酸、ポリヌクレオチド、およびヌクレオチドはまた、５つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）以外の塩基から構成される任意の核酸を特異的に含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される：少なくとも１つの修飾された塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン、シュードウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【００８９】
さらに、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾された糖部分を含み得る：アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【００９０】
本発明の方法が、ポリヌクレオチドの供給源によって制限されることは、意図されない。ポリヌクレオチドは、インビトロで合成されたか、または化学合成による、任意の組換え供給源から誘導された、ヒト、または非ヒト哺乳動物に由来し得る。ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして２本鎖、１本鎖または部分的に２本鎖の形態で存在し得る。
【００９１】
本発明において有用な核酸としては、制限なしの例として、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）；リボザイム；遺伝子治療のためのＤＮＡ；ＤＮＡキメラおよび／またはＲＮＡキメラ；種々の構造形態のＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ，スーパーコイルＤＮＡおよび／または３重ヘリックスＤＮＡを含む）；ならびにＺ−ＤＮＡなどが挙げられる。核酸は、大容量で核酸を調製するために代表的に使用される任意の従来法によって、調製され得る。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、市販の試薬および当該分野において周知の方法による合成機を用いて化学的に合成され得る（例えば、Ｇａｉｔ，１９８５，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと）。ＲＮＡは、ＳＰ６５（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなプラスミドを用いるインビトロでの転写を介して高い収率で生成され得る。
【００９２】
アルテミン核酸配列によってコードされる任意のｍＲＮＡ転写物は、本発明の方法において使用され得、詳細には、ｍＲＮＡ前駆体の代替のスプライシングまたはプロセシングから生じるｍＲＮＡ転写物を含む。
【００９３】
いくつかの状況において、増大されたヌクレアーゼ安定性が所望される場合、修飾されたヌクレオシド間結合を有する核酸が、好ましい。修飾されたヌクレオシド間結合を含む核酸はまた、当該分野において周知の試薬および方法を用いて合成され得る。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホキシド（−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２）、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸合成方法が、当該分野において周知である（Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３〜５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５およびその中で引用された参考文献を参照のこと）。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態において、使用されるヌクレオチドは、アノマーヌクレオチドである。アノマーヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ（通常の単位と反対に、互いに平行にはしる鎖）と特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１）。ヌクレオチドは、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）である。
【００９５】
核酸は、当該分野において周知の任意の適切な手段によって精製され得る。例えば、核酸は、逆相ＨＰＬＣもしくはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動によって精製され得る。当然、当業者は、精製の方法が、精製されるＤＮＡのサイズに一部依存することを認識する。
【００９６】
アルテミンコード配列またはその相補体の少なくとも１０ヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズ可能部分）を有する単離または精製されたポリヌクレオチドはまた、本発明の方法において使用され得る。他の実施形態において、このポリヌクレオチドは、アルテミンコード配列の少なくとも２５（連続する）ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド、あるいは全長アルテミンコード配列を含む。核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。さらに、本発明は、前記のコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、このポリヌクレオチドは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０もしくは２００ヌクレオチドまたは全長のアルテミンコード配列を含む。
【００９７】
アルテミンの変異体、アルテミンのペプチドフラグメント、アルテミンの切断形態、およびアルテミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、本発明の方法において有用であり得る。融合タンパク質をコードするヌクレオチドは、以下を含むがそれらに限定されない：全長アルテミン配列、アルテミンの切断形態、または関連しないタンパク質またはペプチドに融合するアルテミンのペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド（例えば、血流中で生じる融合タンパク質（例えば、アルテミン−Ｉｇ）の安定性および半減期を増加するＩｇ  Ｆｃドメインに融合するドメイン）；あるいは酵素（例えば、マーカーとして使用され得る蛍光タンパク質または発光タンパク質）。
【００９８】
さらに、少なくとも１部、指向される進化のいくつかの型（例えば、本明細書中で、その全体を参考として援用される、米国特許第５，６０５，７９３号、および同第５，８３７，４５８号に記載される、遺伝子シャッフリングおよび／または帰納的配列組換え）によって生成される、アルテミンポリヌクレオチド改変体は、本発明の方法において使用され得る。例えば、このような技術を用いて、アルテミンコード配列、または複数のアルテミンコード配列が、変更された機能的特性および／または構造的特性を有する機能的および／または構造的に類似のタンパク質をコードする新規配列の生成のための開始点として使用され得る。
【００９９】
上記のアルテミンコードポリヌクレオチド配列の高度に関連した遺伝子ホモログもまた、本発明において有用であり得る。高度に関連する遺伝子ホモログは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、このタンパク質は、天然に存在するアルテミン（例えば、図１の成熟ヒトアルテミン）のアミノ酸配列（配列番号１）に少なくとも約６０％アミノ酸配列が同一であり、好ましくは、約６５％、７０％、７５％、８０％同一であり、さらに好ましくは、１％の増分で少なくとも約８５％〜少なくとも約９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。高度に関連するホモログは、アルテミンと機能的活性を共有するタンパク質をコードし得る。
【０１００】
本発明の方法はまた、以下の使用に便利である：（ａ）任意の前記のアルテミンコード配列および／またはその相補体（すなわち、アンチセンス）を含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現を指向する調節エレメントと作動可能に関連する任意の前記のアルテミンコード配列を含むＤＮＡ発現ベクター；（ｃ）宿主細胞中のコード配列の発現を指向する調節エレメントと作動可能に関連する任意の前記のアルテミンコード配列を含む、遺伝的に操作された宿主細胞；ならびに（ｄ）細胞外に導入された調節エレメントの調節（すなわち、遺伝子活性）下で、内因性アルテミン遺伝子を発現する遺伝的に操作された宿主細胞。
【０１０１】
ネイティブな配列のアルテミンにおける改変、または本明細書中に記載されるアルテミンの種々のドメインにおける改変は、例えば、前記の保存的変異および非保存的変異についての任意の技術および標準書（例えば、米国特許第５，３６４，９３４号）を用いて作製され得る。改変は、ネイティブな配列のアルテミンと比較してアルテミンのアミノ酸配列における変化を生じるアルテミンをコードしている１つ以上のコドンの置換、欠失または挿入であり得る。必要に応じて、少なくとも１つのアミノ酸が、アルテミンの１つ以上のドメインにおける任意の他のアミノ酸と置換されることによって改変される。どのアミノ酸残基が、所望の活性に不利に影響せずに挿入、置換または欠失され得るかを決定する標準書は、アルテミンの配列を相同な公知のタンパク質分子の配列とを比較すること、および高い相同性の領域においてなされるアミノ酸の変化の数を最小化することによって見出され得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似の構造特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置換すること（例えば、ロイシンをセリンで置換（すなわち、保存的アミノ酸置換））の結果であり得る。挿入または欠失は、必要に応じて約１〜５アミノ酸の範囲にあり得る。改変は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に作製すること、および全長配列または成熟したネイティブな配列によって示される活性について、生じた改変体を系統的に試験をすることによって決定され得る。
【０１０２】
アルテミンポリペプチドフラグメントはまた、本発明の方法において有用である。このようなフラグメントは、Ｎ末端またはＣ末端で切断され得るか、あるいは例えば、全長のネイティブタンパク質と比較した場合に、内部の残基を欠き得る。特定のフラグメントは、アルテミンポリペプチドの所望の生物学的活性について必須でないアミノ酸残基を欠く。
【０１０３】
アルテミンフラグメントは、任意の多数の従来技術によって調製され得る。所望のペプチドフラグメントは、化学合成され得る。代替のアプローチとしては、酵素消化によって（例えば、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を切断することが公知の酵素を用いてタンパク質を処置することによってか、または適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、そして所望のフラグメントを単離することによって）アルテミンフラグメントを生成することが挙げられる。なお別の適切な技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望のポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを単離および増幅することが挙げられる。ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマーおよび３’プライマーで使用される。好ましくは、アルテミンポリペプチドフラグメントは、図１に示されるネイティブなアルテミンポリペプチド（配列番号１）と少なくとも１つの生物学的活性および／または免疫学的活性を共有する。
【０１０４】
特定の実施形態において、目的の保存的置換は、好ましい置換のヘッディング下で表１に示される。このような置換が、生物学的活性における変化を生じる場合、より多くの置換的変化、表１において称される例示的な置換、またはアミノ酸クラスに対する参考においてさらに以下に記載される置換が、導入され、そして生成物をスクリーニングする。
【０１０５】
【表１】
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アルテミンポリペプチドの機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は、以下を維持する効果において有意に異なる置換基を選択することによって達成される：（ａ）置換の範囲におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シート構造またはヘリックス構造）、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のかさ高さ。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて以下の群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１０６】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換する。このような置換残基はまた、保存的置換部位に導入され得るか、またはより好ましくは残り（非保存）部位に導入され得る。
【０１０７】
改変は、当該分野において公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位指向性）変異誘発、アラニンスキャン、およびＰＣＲ変異）を用いて作製され得る。部位指向性変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術が、アルテミン改変体ＤＮＡを生成するためにクローン化ＤＮＡにおいて実行され得る。
【０１０８】
スキャンアミノ酸分析法はまた、連続配列の間の１つ以上のアミノ酸配列を同定するために使用される。アミノ酸の中でも、比較的小さく、中性のアミノ酸が、好ましい。このようなアミノ酸として、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンは、β炭素の先には側鎖を持たず、改変体の主鎖のコンフォメーションをあまり変えそうにないので、この群の中で代表的に好まれるスキャンアミノ酸である［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。アラニンはまた、最も一般的なアミノ酸であるため、代表的に好まれる。さらに、アラニンは、しばしば埋もれた位置および曝露される位置の両方において見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量の改変体を与えない場合、類似の（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸が、使用され得る。
【０１０９】
（２．アルテミンおよびアルテミン改変体の産生）
アルテミンおよびアルテミン改変体の産生のための適切な技術は、当該分野で周知である。この好ましい技術は、アルテミンおよびアルテミン改変体について同一であるので、以下に記載される技術を、アルテミン改変体ならびにネイティブ配列のアルテミンに適用する。
【０１１０】
産生のための好ましい方法は、ポリペプチドの内因性の源からのアルテミンの単離、ペプチド合成（ペプチド合成機を使用する）および組換え技術（またはこれらの技術の任意の組合せ）が挙げられる。組換え技術を使用するアルテミン調製の方法は、Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：１２９１−１３０２（１９９８）およびＷＯ００／１８７９９において記載される。他の組換え技術を、以下に記載する。
【０１１１】
以下の議論の大部分は、アルテミン核酸を含むベクターで形質転換された細胞を培養し、この細胞培養物からポリペプチドを回収することによるアルテミンの組み換え産生に関する。本発明のアルテミンは、１９９１年５月１６日に公開された国際出願ＷＯ  ９１／０６６６７に与えられるような相同組換えによって産生され得ることが、さらに予見される。
【０１１２】
簡単に言うと、この方法は、構築物（すなわちベクター）でアルテミンをコードする遺伝子を含有する始原ヒト細胞の形質転換する工程を包含し、この構築物は、増幅可能な遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）または以下に議論されるその他）およびアルテミン遺伝子の増幅を提供するためのアルテミン遺伝子のコード領域の遺伝子座のＤＮＡ配列と相同な少なくとも約１５０ｂｐの長さの少なくとも１つの隣接領域を含む。この増幅可能な遺伝子は、アルテミン遺伝子の発現を妨害しない部位になければならない。形質転換は、構築物が、増幅領域を規定するために、始原細胞のゲノムの中に相同的に統合されるように、行われる。
【０１１３】
次いで、構築物を含む始原細胞が、増幅可能な遺伝子または構築物中に存在する他のマーカーによって選択される。マーカー遺伝子の存在は、宿主細胞の中への構築物の存在および統合を、立証する。選択は第２の宿主においてなされるので、始原細胞のさらなる選択は、必要とされない。所望の場合、相同組換え事象の発生は、ＰＣＲの使用、および、増幅され得られたＤＮＡ配列の配列決定、または、適切な相同的成分由来のＤＮＡが存在し、そしてこのようなフラグメントを含むこれらの細胞のみを拡大する場合、適切な長さのＰＣＲフラグメントの決定により決定され得る。また所望の場合、選択される細胞は、標的遺伝子の多数のコピーが得られるように、この時点で、適切な増幅因子（例えば、増幅可能な遺伝子が、ＤＨＦＲの場合、メトトレキサート）を用いて細胞にストレスを掛けることにより増幅され得る。しかし、好ましくは、増幅工程は、以下に記載される第二の形質転換の後まで行われない。
【０１１４】
選択工程の後、増幅可能な領域全体を含むように十分に大きいゲノムのＤＮＡ部分が、選択された始原細胞から単離される。次いで、第２の哺乳動物発現宿主細胞は、これらのゲノムＤＮＡ部分を用いて形質転換され、そしてクローン化され、そして増幅可能な領域を含むクローンが選択される。次いで、増幅可能な領域が、まだ始原細胞において増幅されていない場合、増幅因子によって増幅される。最後に、アルテミンを含む増幅可能な領域の多数のコピーをこの時点で含む第２の発現宿主細胞が、この遺伝子を発現しそしてそのタンパク質を産生するために増殖される。
【０１１５】
アルテミンをコードするＤＮＡは、アルテミンｍＲＮＡを有し、そしてそれを検出可能なレベルにおいて発現すると考えられる組織から調製される任意のｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。従って、アルテミンＤＮＡは、例えば、多数のヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから都合よく得られ得る。アルテミンをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーまたはオリゴヌクレオチド合成によって得られ得る。
【０１１６】
ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれがコードするタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、アルテミンに対する抗体または約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いて、スクリーニングされる。選択されたプローブを用いるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の１０〜１２章に記載されるような標準的な手順を用いて行われ得る。アルテミンをコードする遺伝子を単離するための代替法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述の１４章に記載されるＰＣＲ手順の使用である。
【０１１７】
アルテミンｃＤＮＡを単離するための好ましい方法は、種々のヒトの組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために慎重に選択されたオリゴヌクレオチド配列の使用である。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性が最小化されるように、十分な長さを有し、そして十分に明白であるべきである。好ましい配列は、本明細書中に開示される天然に存在するアルテミンから得られる。
【０１１８】
スクリーニングされるライブラリーにおいて、ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションが検出の際に得るように、オリゴヌクレオチドは、標識されなければならない。標識化の好ましい方法は、当該分野で周知のような、オリゴヌクレオチドを放射性同位元素標識するためにポリヌクレオチドキナーゼを用いる３２Ｐ−標識ＡＴＰの使用である。しかし、他の方法が、オリゴヌクレオチドを標識するために使用され得、これにはビオチン化または酵素標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
アルテミンをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。多くのベクターが、利用可能である。ベクターの構成要素は、一般的に、１つ以上の下記の成分を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。
【０１２０】
本発明のアルテミンは、直接的に組換え産生されるだけではなく、異種ポリペプチポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても産生され得、この融合ポリペプチドは、好ましくは、シグナル配列であるかあるいは成熟タンパク質または成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである。概して、このシグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されアルテミンＤＮＡの一部であり得る。選択された異種のシグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって、認識され、そして処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。ネイティブアルブミンシグナル配列を認識も処理もしない、原核生物の宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列によって置換される。酵母での分泌のために、ネイティブシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、リーダー因子（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓリーダー因子を含む、後者は、１９９１年４月２３日に公表された米国特許第５，０１０，１８２に記載される）、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミダーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ  ３６２，１７９）、あるいは１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６において記載されるシグナルに、置換され得る。哺乳動物細胞での発現において、ネイティブシグナル配列（例えば、インビボにおいてヒト細胞からのアルテミンの分泌を、通常指向するアルテミンプレ配列）が、申し分ないが、他の哺乳動物シグナル配列（他の動物のアルテミン由来のシグナル配列）および同一または関連する種の分泌型ポリペプチドに由来するシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダ（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）も、適切であり得る。
【０１２１】
このような前駆体領域についてのＤＮＡは、成熟アルテミンまたはその可溶性の改変体をコードするＤＮＡにリーディングフレームで連結される。
【０１２２】
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、１つ以上の選択される宿主細胞においてベクターの複製を可能とする核酸配列を含む。概して、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立にベクターの複製を可能とする配列であり、複製起点または自律的複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、２プラスミド起点は、酵母に対して適切であり、そして種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに対して有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクター（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを有するので、代表的には単独で使用される）については必要とされない。
【０１２３】
大部分の発現ベクターは、「シャトル」ベクター、すなわち、少なくとも１つの綱（ｃｌａｓｓ）の生物体において複製可能であるが、発現のために、別の生物体の中にも形質転換され得る。例えば、ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローン化され、次いで、同一のベクターが、発現のために、（たとえ、ベクターが、宿主細胞染色体とは独立に複製できないとしても）酵母または哺乳動物細胞の中にもトランスフェクトされる。
【０１２４】
ＤＮＡは、宿主細胞ゲノムへの挿入によって増幅される。これは、宿主としてＢａｃｉｌｌｕｓ種を使用して、例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓゲノムＤＮＡにおいて見出される配列と相補的なＤＮＡ配列をベクター中に含ませることによって、容易になされる。このベクターを用いるＢａｃｉｌｌｕｓのトランスフェクションは、ゲノムにおける相同的組換えおよびアルテミンＤＮＡの挿入を生じる。しかし、アルテミンをコードするゲノムＤＮＡの回収は、アルテミンＤＮＡを切断するために制限酵素消化が必要とされるので、外因的に複製されたベクターより面倒である。
【０１２５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ばれる）を含むべきである。この遺伝子は、選択培養培地において増殖される形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培養培地中では生き残らない。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるタンパク質、（ｂ）栄養欠乏を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｅｄｉａ）からは利用可能ではない重要な栄養素（例えば、ＢａｃｉｌｌについてＤ−ａアラニンラセマーゼをコードする遺伝子）を供給するタンパク質、をコードする。
【０１２６】
選択スキームの一つの例は、宿主細胞の増殖を阻止するための薬物を利用する。異種の遺伝子を用いて十分に形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、従って、選択レジメンにおいて生き残る。このような優性の選択の例は、薬物（ネオマイシン、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびハイグロマイシン）を使用する。
【０１２７】
哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの別の例は、アルテミン核酸を取り込む能力を有する細胞成分の同定を可能とする選択マーカー（例えば、ＤＨＲＦまたはチミジンキナーゼ）である。哺乳動物細胞形質転換株は、マーカーを取り込んだことによって形質転換株のみが独自に生き残るように適合される、選択圧の下におかれる。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変えられる条件下で形質転換株を培養することによって、課せられる、ここでそれによって選択遺伝子およびアルテミンをコードするＤＮＡの両方の増幅が導かれる。増幅は、増殖のために必須のタンパク質の産生のためにより必要である遺伝子が、組換え細胞の連続世代の、染色体内で並行して反復されるプロセスである。アルテミンの増加量は、増幅されたＤＮＡから合成される。増幅可能な遺伝子の他の例として、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどが挙げられる。好ましいベクター系は、米国特許第５，５６１，０５３号において提供される。
【０１２８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地において全ての形質転換株を培養することによって、はじめに同定される。野生型ＤＨＦＲが、使用される場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）において記載されるように調製および増殖される。次いで、形質転換された細胞は、増加したレベルのメトトレキサートに曝される。これは、ＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピーの合成、そして、同時に発現ベクターを含む他のＤＮＡ（例えば、アルテミンをコードするＤＮＡ）の多数のコピーを導く。この増幅技術は、例えば、Ｍｔｘに対して高度に抵抗性である、変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用される場合、内因性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず任意の別の適切な宿主（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１  ＣＨＯ−Ｋ１）を用いて使用され得る（ＥＰ  １１７，０６０）。
【０１２９】
あるいは、アルテミンをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＲＦタンパク質、および別の選択マーカー（例えば、アミノグリコシド  ３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ））を用いて形質転換されたまたは同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＲＦを含む野生型宿主）は、選択マーカーに対する選択因子（例えば、アミノ配糖体の抗生物質（例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８）を含む培地中の細胞増殖によって選択され得る。（米国特許第４，９６５，１９９を参照のこと。）
酵母における使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９））。このｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンを生成する能力を欠乏する酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６またはＰＥＰ４−１）に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１の損傷の存在は、トリプトファン非存在下での増殖による形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補われる。
【０１３０】
さらに、１．６ｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換のために使用され得る。Ｂｉａｎｃｈｉら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：１８５（１９８７）。より最近、組換え仔ウシキモシンの大規模産生のための発現系が、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業用株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー数型発現ベクターはまた、開示される。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０１３１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体に認識され、そしてアルテミン核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、特定の核酸配列（例えば、アルテミン核酸配列）の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐの範囲内にある）の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列であり、この特定の核酸配列にプロモーターが作動可能に連結される。このようなプロモーターは、代表的には、誘導性および構造性の、２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件におけるのいくらかの変化（例えば、栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答してその制御下のＤＮＡから、増加されたレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが、周知である。制限酵素消化によって供給源のＤＮＡからプロモーターを除去し、そして単離されたプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、これらのプロモーターは、アルテミンをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブアルテミンプロモーター配列および多くの異種のプロモーターの両方が、アルテミンＤＮＡの直接的な増幅および／または発現のために使用され得る。しかし、異種のプロモーターが、好ましい。なぜならこれは、ネイティブアルテミンプロモーターと比較して、一般的に、より多くの転写およびより高いアルテミンの収量を可能にするためである。
【０１３２】
原核生物の宿主における使用に適切なプロモーターとして、ラクタマーゼおよびラクトースプロモータ系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６）、およびｔａｃプロモーターのような、ハイブリッドプロモーターが挙げられる。ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３）。しかし、他の既知の細菌のプロモータは、適切である。そのヌクレオチド配列は、公開されており、それによって当業者は、このヌクレオチド配列を、任意の必要な制限酵素部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、アルテミンをコードするＤＮＡに作動可能に連結できる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ，２０：２６９（１９８０））。細菌の系における使用のためのプロモーターはまた、アルテミンをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１３３】
真核生物のためのプロモーター配列は、公知である。事実上全ての真核生物の遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始地点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｘは、任意のヌクレオチドであり得る。大部分の真核生物の遺伝子の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、これは、コード配列の３’末端に対するポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターの中に適切に挿入される。
【０１３４】
酵母宿主において使用するための適切なプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼについてのプロモータ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０））；または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビル酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼが挙げられる。
【０１３５】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性のプロモーターである、他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター部分である。酵母発現における使用のために適するベクターおよびプロモーターは、さらにＥＰ７３，６５７に記載される。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターとともに都合よく使用される。
【０１３６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのアルテミン転写は、例えば、ウイルスのゲノムから得られたプロモーターによって制御され、これらのウイルスは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４、１９８９年７月５日に公開された）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスそして最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）であり、これらは異種の哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）、熱ショックプロモーター、およびアルテミン配列と通常は結合したプロモーター由来であり、ただしこのようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性である。
【０１３７】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、またＳＶ４０ウイルス複製起点を含む、ＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる。Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８）；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１４２２−１４２７（１９８０）；Ｐａｖｌａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７３９８−７４０２（１９８１）。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして、都合よく得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙら、Ｇｅｎｅ，１８：３５５−３６０（１９８２）。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用する哺乳動物宿主細胞においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号において開示される。この系の改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ，２９５：５０３−５０８（１９８２）（サル細胞における免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現に関して）；Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９７：５９８−６０１（１９８２）（単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒト−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関する）；Ｃａｎａａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：５１６６−５１７０（１９８２）（培養マウスおよびウサギ細胞におけるヒトインターフェロン１遺伝子の発現に関する）；ならびにＧｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：６７７７−６７８１（１９８２）（プロモーターとしてラウス肉腫ウイルス長い末端反復を使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌のＣＡＴ配列の発現に関する）を参照のこと。
【０１３８】
高等真核生物による本発明のアルテミンをコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサーの挿入によってしばしば増強される。エンハンサーは、シスに作用するＤＮＡのエレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであり、その転写を増強するようにプロモーターに作用する。エンハンサーは、相対的な方向でありそして位置非依存的であり、イントロン（Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，３３：７２９（１９８３））の範囲内ならびにそれ自身のコード配列の範囲内で、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：９９３（１９８１））および３’（Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，３：１１０８（１９８３））であることが見い出されている。Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，４：１２９３（１９８４）。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインシュリン）由来の多くのエンハンサー配列が、現在既知である。しかし、代表的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。例として、複製起点（１００〜２７０ｂｐ）の後期側面（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側面上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが、挙げられる。Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７−１８（１９８２）（真核生物プロモーターの活性化のための促進エレメントに関する）を参照のこと。このエンハンサーは、アルテミンコード配列の５’位または３’位においてベクターにスプライシング接合され得るが、好ましくは、プロモータから５’の部位に位置する。
【０１３９】
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５’から、そして場合によって３’から利用可能である。これらの領域は、アルテミンをコードするｍＲＮＡの非翻訳領域においてポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１４０】
上記に列挙された１つ以上の成分を含む適切なベクターの構築物は、標準的な連結技術を利用する。単離されたプラスミドまたはＤＮＡフラグメントは、必要とされるプラスミドを生成するために所望の形態に、切断され、変更され、そして再連結される。
【０１４１】
構築されたプラスミド中の正しい配列を確認する分析のために、連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）を形質転換し、そして、成功した形質転換株を、適切な場合、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって、選択する。形質転換株からプラスミドが、調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、そして／またはＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９（１９８１）の方法によってかもしくはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８０）の方法によって配列決定される。
【０１４２】
アルテミンをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞における一過的な発現を提供する発現ベクターは、アルテミンおよびアルテミン改変体の調製において、特に有用である。概して、一過的な発現は、宿主細胞において効果的に複製し得る発現ベクターの使用を包含し、その結果、このような宿主細胞は、発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、そして同様に、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述、ｐｐ．１６．１７−１６．２２。一過的な発現系は、適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含み、好都合な、クローン化されたＤＮＡによってコードされるポリペプチドの簡便でポジティブな同定、ならびに、このようなポリペプチドの、所望の生物学的性質または生理学的な性質についての迅速なスクリーニングを可能とする。従って、一過的な発現系は、生物学的に活性なアルテミンである、アルテミンのアナログおよび改変体の同定の目的ために特に本発明において有用である。
【０１４３】
組換え脊椎動物細胞培養物においてアルテミンの合成の適用のために適切な他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；およびＥＰ１１７，０５８に記載される。アルテミンの哺乳動物細胞培養発現のために特に有用なプラスミドは、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂである。１９９１年６月１３日に公開された、ＷＯ９１／０８２９１。
【０１４４】
本明細書中のベクターにおけるＤＮＡクローニングまたは発現のために適切な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、または高等真核生物である。この目的に適切な原核生物としては、真正細菌、またはグラム陰性もしくはグラム陽性生物体、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開された、ＤＤ２６６，７１０に開示される、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主の１つは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）であるが、他の株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５））は、適切である。これらの例は、限定するのではなく、例証となるものである。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるので、特に好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきである。例えば、Ｗ３１１０株は、タンパク質をコードする遺伝子における遺伝的変異に作用するように、改変され得、このような宿主の例として、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７が挙げられる。２７Ｃ７の全遺伝子型は、ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｏｍｐＴ  ｄｅｇＰ４１ｋａｎｒである。２７Ｃ７株は、１９９１年１０月３０日にＡＴＣＣ第５５，２４４として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。あるいは、１９９０年８月７日に公表された米国特許第４，９４６，７８３号に開示される、変異体ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉの株が、使用され得る。あるいはさらに、クローニングの方法（例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応）が、適切である。
【０１４５】
原核生物に加えて、真核生物微生物（例えば、線状の真菌または酵母）は、アルテミンをコードするベクターに適切なクローニングまたは発現宿主である。Ｓｈａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、低級真核生物の宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかし、多数の他の属、種および株は、一般的に入手可能でありかつ本明細書において有用である（例えば、
【０１４６】
【数１】
2005502582.tif 000004
）。
【０１４７】
グリコシル化アルテミンの発現に適する宿主細胞は、多細胞生物由来である。そのような宿主細胞は、複合的なプロセシングおよびグリコシル化活性を可能とする。原理的に、任意の高等な真核生物細胞培養物は、脊椎動部培養物由来または非脊椎動物培養物由来のいずれも、機能し得る。非脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および改変体ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：４７〜５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｅｔｌｏｗら編、Ｖｏｌ  ８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６）、ｐｐ．２７７〜２７９；およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５；５９２〜５９４（１９８５）を参照のこと。トランスフェクションのための種々のウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）は、公的に入手可能であり、そしてそのようなウイルスは、本明細書中において、本発明に従うウイルスとして、特にＳｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いられ得る。
【０１４８】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物は、宿主として使用され得る。代表的に、植物細胞は、特定の株の細菌であるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アルテミンをコードするＤＮＡを含有するように予め操作されている）とともにインキュベートすることによって、トランスフェクトされる。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いる植物細胞のインキュベーションの間、アルテミンをコードするＤＮＡは、植物細胞宿主に移入され、その結果、それは、トランスフェクトされ、そして適切な条件下でアルテミンをコードするＤＮＡを発現する。さらに、植物細胞に適合可能な調節配列およびシグナル配列（例えば、ノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：５６１（１９８２）））が入手可能である。さらに、Ｔ−ＤＮＡ  ７８０遺伝子の上流領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織における植物の発現可能遺伝子の転写レベルを活性化または増加させ得る（欧州特許第３２１，１９６号（１９８９年６月２１日公開）。
【０１４９】
しかし、最も興味深いのは脊椎動物細胞においてであり、そして培養物中の脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は、慣用の手順になっている。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ（編）（１９７３）を参照のこと。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁液培養中の２９３または増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９（１９７７））；胎仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞およびヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）である。
【０１５０】
宿主細胞は、アルテミン産生のためにトランスフェクトされ、好ましくは上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０１５１】
トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるか否かに限らず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みをいう。トランスフェクションの多数の方法（例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーション）は、当業者に公知である。好首尾なトランスフェクションは、一般的に、このベクターの操作の任意の指標が宿主細胞内で生じる場合、認識される。
【０１５２】
形質転換とは、染色体外要素としてか、または染色体成分によってかのいずれかで、ＤＮＡが複製可能であるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適する標準的な技術を用いて行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、の１．８２節に記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理またはエレクトロポレーションは、一般的に、原核生物または実質的な細胞壁障壁を含有する他の細胞について用いられる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いる感染は、特定の植物細胞の形質転換のために用いられる（Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ、２３：３１５（１９８３）およびＷＯ８９／０５８５９（１９８９年  ６月２９日公開）により記載される）。さらに、植物は、超音波処理を用いてトランスフェクトされ得る（ＷＯ  ９１／００３５８（１９９１年１月１０日公開）に記載される）。
【０１５３】
そのような細胞壁を有さない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が、好ましい。哺乳動物宿主系形質転換の一般的な局面は、米国特許第４，３９９，２１６号（１９８３年８月１６日発行）に記載されている。酵母への形質転換は、代表的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら、、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７６：３８２９（１９７９）の方法に従い実施される。しかし、細胞へとＤＮＡを導入するための他の方法（例えば、核のマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞と細菌のプロトプラストとの融合、またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）による）もまた用いられ得る。哺乳動物を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１５４】
本発明のアルテニンポリペプチドを産生するために用いられる原核生物細胞は、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような適切な培地中で培養される。
【０１５５】
本発明のアルテニンポリペプチドを産生するために用いられる哺乳動物宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。市販の培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））は、宿主細胞の培養に適する。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号または；同第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ    ８７／００１９５；あるいは米国特許再発行３０，９８５号に記載される任意の培地は、これらの宿主細胞のための培養培地として用いられ得る。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬物）、微量元素（通常、μＭの範囲の最終濃度で存在する無機化合物として規定される）、そしてグルコースまたは等価なエネルギー供給源を補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は、発現について選択された宿主細胞に予め用いられた条件であり、当業者に明らかな条件である。
【０１５６】
一般的に、哺乳動物細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコル、および実施上の技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ、編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）に見出され得る。
【０１５７】
本開示において言及される宿主細胞は、培養物中の細胞および宿主動物中にある細胞を包含する。
【０１５８】
サンプル中の遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、例えば、本明細書中に提供される配列に基づく、適切に標識化されたプローブを用いた、従来のサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって直接的に測定され得る。種々の標識が用いられ得、最も一般的には、放射性同位体（特に３２Ｐ）が用いら得る。しかし、例えば、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾されたヌクレオチドを用いた、他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体と結合するための部位として作用し、アビジンまたは抗体は、種々の広範な標識（例えば、放射性核種、蛍光物質、酵素など）で標識され得る。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む、特定の二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、この抗体は、標識され得、そしてどこでこの二重鎖が表面に結合しているかのアッセイが実施され得、その結果、表面上での二重鎖の形成の際に、この二重鎖に結合している抗体の存在が検出され得る。
【０１５９】
あるいは、遺伝子発現は、免疫学的方法（例えば、遺伝子産物発現を直接的に定量するための、組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養物または体液のアッセイ）によって測定され得る。免疫組織化学染色技術を用いて、細胞サンプルは、代表的には、脱水および固定化、続くカップリングした遺伝子産物に特異的な標識化抗体との反応によって調製される。ここで、この標識は、通常、視覚的に検出可能（例えば、酵素標識、蛍光標識、発光標識など）である。本発明における使用に適する特に感度のよい染色技術は、Ｈｓｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、７５：７３４−７３８（１９８０）に記載される。
【０１６０】
免疫組織化学染色および／またはサンプル液体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、本明細書中に記載されるように調製され得る。
【０１６１】
好ましくは、アルテミンは分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、アルテミンはまた宿主細胞溶解物からも回収され得る。アルテミンが膜結合である場合、アルテミンは、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて、膜から放出され得る。
【０１６２】
ヒト起源の細胞以外の組換え細胞においてアルテミンが産生される場合、このアルテミンは、ヒト起源のタンパク質またはポリペプチドを全く含まない。しかし、アルテミンと実質的に相同な調製物を得るために、組み換え細胞タンパク質または組み換え細胞ポリペプチドからアルテミンを精製する必要がある。第１の工程として、この培養培地または溶解物は遠心分離されて、特定の細胞の細片を除去し得る。次いでアルテミンは、以下の手順を用いて可溶性汚染タンパク質および可溶性汚染ポリペプチドから精製され得る。これらの手順は、以下：イオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；免疫親和性；エピトープタグ結合樹脂；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲル濾過；およびＩｇＧのような汚染物質を除去するためのプロテインＡ  Ｓｐｈａｒｏｓｅカラム、による適切な精製手順の例示である。
【０１６３】
（３．アルテミンの修飾）
アルテミンおよびアルテミン改変体の共有結合的修飾は、本発明の範囲に含まれる。１つの型の共有結合的修飾は、アルテミンポリペプチドの標的化アミノ酸残基と、アルテミンの選択される側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導剤との反応を含む。二官能性薬剤を用いる誘導は、例えば、抗アルテミン抗体を精製するための方法に用いるために、非水溶性支持マトリクスまたは非水溶性支持表面にアルテミンを架橋するために有用であり、その逆も同様である。一般的に用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）のようなジスクシニミジルエステルを含む）、二官能性のマレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートが挙げられる。
【０１６４】
他の修飾としては、各々、対応するグルタミル残基およびアスパラギル残基へのグルタミニル残基およびアスパラギニル残基の脱アミド、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリン残基またはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１６５】
本発明の範囲内に含まれるアルテミンポリペプチドの別の型の共有結合的修飾は、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを変化させる工程を包含する。「ネイティブなグリコシル化パターンを改変する工程」は、ネイティブの配列のアルテミンにおいて見出される１つ以上の炭水化物部分を欠失させる手段（存在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学的手段および／もしくは酵素的手段によりグリコシル化を欠損させることのいずれかによる）ならびに／あるいはネイティブ配列のアルテミンにおいて存在しない１つ以上のグルコシル化部位を付加する手段に対して、本明細書中の目的のために意図される。さらに、このフェーズは、ネイティブなタンパク質のグリコシル化の質的変化を含み、天然での変化および存在する種々の炭水化物部分の割合における変化を含む。
【０１６６】
アルテミンポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変化させることによって達成され得る。この変化は、例えば、（Ｏ連結したグリコシル化部位について）ネイティブの配列のアルテミンへの１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または、ネイティブの配列のアルテミンへの１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基による置換によってなされ得る。このアルテミンアミノ酸配列は、必要に応じて、特に、アルテミンポリペプチドをコードするＤＮＡを、所望のアミノ酸に翻訳するようなコドンが作製されるように予め選択された塩基で変異させることによるＤＮＡレベルでの変化を通じて変化され得る。
【０１６７】
アルテミンポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、このポリペプチドへのグリコシドの化学カップリングまたは酵素カップリングによる。そのような方法は、当該分野において（例えば、ＷＯ  ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において）記載される。
【０１６８】
アルテミンポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的にか、またはグリコシル化のための標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野において公知であり、そしてＨａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０（１９８７）によって記載されるような種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１６９】
アルテミンの別の型の共有結合的修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；同４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に示される様式で、種々の非タンパク質のポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つにアルテミンポリペプチドを連結する工程を包含する。
【０１７０】
本発明のアルテミンはまた、別の異種ポリペプチド配列または異種アミノ酸配列と融合されたアルテミンを含むキメラ分子を形成するような様式で改変され得る。
【０１７１】
１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供する、アルテミンとタグポリペプチドとの融合物を含む。このエピトープタグは、一般的に、アルテミンのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。そのようなエピトープタグ化された形態のアルテミンの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出され得る。また、エピトープタグの供給は、エピトープタグに結合する抗タグ抗体または別の型のアフィニティーマトリクスを用いたアフィニティー精製によるアルテミンの容易な精製を可能とする。種々のタグポリペプチドおよびそのそれぞれの抗体は、当該分野おいて周知である。例としては、以下：ポリヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；フル（ｆｌｕｅ）ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体、および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純疱疹ウイルスグリコプロテインＤ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、以下：Ｆｌａｇペプチド［Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４−１２１０（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２−１９４（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３−６３９７（１９９０）が挙げられる。
【０１７２】
代替的な実施形態において、このキメラ分子は、アルテミンと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合物を含み得る。二価形態のキメラ分子（イムノアドヘジンとも呼ばれる）については、そのような融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対する融合物であり得る。
【０１７３】
最も単純かつ最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、ヒンジを有する「アドへシン」タンパク質の結合領域と免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域とを結合させる。通常、本明細書中で使用されるアルテミン−免疫グロブリンキメラを調製する場合、アルテミンをコードする核酸は、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端で融合されるが、Ｎ末端融合物もまた可能である。
【０１７４】
代表的には、そのような融合において、コードされたキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の定常領域のうち少なくとも機能的に活性なヒンジならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対してか、またはこの重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域のすぐＮ末端に対してなされ得る。
【０１７５】
この融合がなされる正確な部位は、重要ではない；特定の部位は、周知であり、そしてアルテミン−免疫グロブリンキメラの生物学的活性を最適化するために選択され得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、このアルテミン−免疫グロブリンキメラは、実質的にＷＯ  ９１／０８２９８に例示されるように、モノマーとしてか、またはヘテロ−マルチマーもしくはホモ−マルチマーとして、特にダイマーまたはテトラマーとして、アセンブリされる。
【０１７７】
好ましい実施形態において、アルテミン配列は、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１））のエフェクター機能を含む抗体（特にＦｃドメイン）のＣ末端部分のＮ末端に融合される。アルテミン配列に重鎖の定常ドメイン全体を融合することは可能である。しかし、より好ましくは、パパイン切断部位（これは、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に規定する；重鎖定常領域の第１の残基を１１４とすると残基２１６または他の免疫グロブリンのアナログ部位）の直前の上流のヒンジ領域で開始する配列が、この融合に用いられる。特に好ましい実施形態において、アルテミンアミノ酸配列は、このヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３に融合されるかまたはＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖、もしくはＩｇＧ３重鎖のＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに融合される。この融合がなされる正確な部位は、重要ではなく、そしてその最適な部位は、慣用の実験により決定され得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、アルテミン−免疫グロブリンキメラは、マルチマー、特にホモダイマーまたはホモテトラマーとしてアセンブリされる。一般的に、これらのアセンブリされた免疫グロブリンは、公知の単位構造を有する。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する形態である。４単位は、より高い分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは、一般的に、ジスルフィド結合により一緒に保持される基本的な４単位のペンタマーとして存在する。ＩｇＡグロブリン、時にはＩｇＧグロブリンはまた、血清中にマルチマー形態で存在する。マルチマーの場合、各々の４単位は、同じでも異なっていてもよい。
【０１７９】
あるいは、アルテミン配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように免疫グロブリン重鎖配列と軽鎖配列との間に挿入され得る。この実施形態において、このアルテミン配列は、免疫グロブリンの各アーム（ヒンジとＣＨ２ドメインとの間かまたはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のいずれか）において、免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合される。類似の構築物が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：１０２７〜１０３７（１９９１）によって報告されている。
【０１８０】
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明の免疫付着因子において必要とされないが、免疫グロブリン軽鎖は、アルテミン−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に会合されるかまたはアルテミンに直接融合されるかのいずれかで存在し得る。前者の場合において、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、典型的にはアルテミン−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際に、このハイブリッド重鎖および軽鎖は、２つのジスルフィド連結された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供するために共有結合的に会合される。このような構造の調製のために適切な方法は、例えば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０１８１】
好ましい実施形態において、本発明の免疫付着因子の構築に使用される免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖定常ドメイン由来である。ヒト免疫付着因子のためには、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主な利点は、ＩｇＧ１免疫付着因子が、固定化されたプロテインＡにおいて効率的に精製され得るということである。対照的に、ＩｇＧ３の精製は、プロテインＧ（有意により低い汎用性の媒質）を必要とする。しかし、特定の免疫接着因子構築のためのＩｇ融合パートナーを選択する際に、免疫グロブリンの他の構造特性および機能特性を考慮するべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジは、より長くそしてより可可撓性であり、そのため、ＩｇＧ１に融合される場合に、折り畳まれないかもしれないし、適当に機能しないかもしれない、より大きい接着因子ドメインに適応し得る。別の考慮は、結合価であり得る；ＩｇＧ免疫接着因子は、２価のホモ二量体であるが、それにもかかわらずＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、それぞれ、基本のＩｇホモ二量体単位の二量体構造または五量体構造を生じ得る。インビボでの適用のために設計されたアルテミン免疫接着因子について、薬物動態学的な特性およびＦｃ領域によって特定されるエフェクター機能が、同じように重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の全ては２１日のインビボでの半減期を有するが、相補系を活性化する際のこれらの相対的な効力は異なる。ＩｇＧ４は、相補体を活性化させず、そしてＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも補体活性化において有意に弱い。さらに、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は、単核細胞または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は、補体活性化に最適であるが、そのインビトロでの半減期は、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。ヒト治療薬として使用されるために設計された免疫接着因子に関する別の重要な考慮は、特定のアイソタイプのアロタイプ改変体の数である。一般的には、より少ない血清学的に規定されたアロタイプを有するＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は、４つの血清学的に規定されたアロタイプ部位のみを有し、これらのうちの２つ（Ｇ１ｍおよび２）は、Ｆｃ領域に配置される；そしてこれらの部位のうちの１つであるＧ１ｍ１は、非免疫原性である。対照的に、ＩｇＧ３において１２個の血清学的に規定されたアロタイプが存在し、これらのすべてはＦｃ領域にあり、これらの部位のうち３つのみ（Ｇ３ｍ５、１１および２１）が非免疫原性である１つのアロタイプを有する。従って、３つの免疫接着因子の潜在的な免疫原性は、１つの免疫接着因子の免疫原性よりも大きい。
【０１８２】
親の免疫グロブリンに関して、有用な接合部は、２つの重鎖間にジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインのすぐ上流である。頻繁に使用される設計において、分子のアルテミン部分のＣ末端残基についてのコドンは、ＩｇＧ１ヒンジ領域の配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰについてのコドンの上流に直接配置される。
【０１８３】
免疫接着因子の構築および発現に適切な一般的な方法は、アルテミンに関して上に記載されたものと同じである。アルテミン免疫接着因子は、Ｉｇ  ｃＤＮＡ配列に対してインフレームでアルテミン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合することによって、もっとも都合良く構築される。しかし、ゲノムのＩｇフラグメントへの融合もまた、使用され得る（例えば、Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２９３６−２９４０（１９８７）；Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ，６１：１３０３−１３１３（１９９０）；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ，６６：１１３３−１１４４（１９９１）を参照のこと）。後者のタイプの融合は、発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、脾臓または末梢血リンパ球から誘導されるｃＤＮＡライブラリー由来の公開された配列に基づいて単離され得る。アルテミンｃＤＮＡおよび免疫接着因子のＩｇ部分をコードするは、選択された宿主細胞において有効な発現を指向するプラスミドベクターにタンデムに挿入される。哺乳動物細胞における発現のためには、ｐＲＫ５ベースのベクター（Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、６１：３６１−３７０（１９９０））およびＣＤＭ８ベースのベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０（１９８９））が使用され得る。この正確な接合は、オリゴヌクレオチド指定欠失変異誘発を使用して設計された接合コドンの間の追加配列を除去することによって作製され得る（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９））。合成オリゴヌクレオチドが使用され得、この合成オリゴヌクレオチドの各々半分が、所望の接合部のいずれかの側の配列に相補的である；理想的には、これらは３６〜４８マーである。あるいは、ＰＣＲ技術が適切なベクターを用いて分子の２つの部分をインフレームで結合するのに使用され得る。
【０１８４】
アルテミン免疫接着因子の発現のための宿主細胞株の選択は、主に発現ベクターに依存する。別の考慮は、必要とされるタンパク質の量である。ミリグラム量は、しばしば、一過性のトランスフェクションによって生成され得る。例えば、アデノウイルスＥＩＡにより形質転換された２９８ヒト胚性腎臓細胞株は、有効な免疫接着因子発現を可能にするためのリン酸カルシウム法の改変によって、ｐＲＫ５ベースのベクターで一過性にトランスフェクトされ得る。ＣＤＭ８ベースのベクターは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクトするために使用され得る（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ，６１：１３０３−１３１３（１９９０）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳ，９：３４７−３５３（１９９０））。より大量のタンパク質が望まれる場合、この免疫接着因子は、宿主細胞株の安定なトランスフェクション後に発現され得る。例えば、ｐＲＫ５ベースのベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードし、Ｇ４１８への耐性を与える、さらなるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に導入され得る。Ｇ４１８に耐性のクローンは、培養において選択され得る；これらのクローンは、漸増レベルのＤＨＦＲインヒビターメトトレキセートの存在下で増殖する；クローンが、選択され、このクローンにおいて、ＤＨＦＲおよび免疫接着因子配列をコードする遺伝子コピーの数が、同時増幅される。免疫接着因子が、そのＮ−末端において疎水性のリーダー配列を含有する場合、形質転換された細胞によってプロセスおよび分泌されるようである。より複雑な構造を有する免疫接着因子の発現は、独特の適した宿主細胞を必要とし得る；例えば、軽鎖またはＪ鎖のような構成要素は、特定の骨髄腫またはハイブリドーマ宿主細胞によって提供され得る（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、１９８７、前出、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：３５６１−３５６８（１９９３））。
【０１８５】
免疫接着因子は、アフィニティークロマトグラフィーによって都合良く精製され得る。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、キメラ中で使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒト１、２、または４重鎖に基づく免疫接着因子を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプおよびヒト３について推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５：１５６７−１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリクスとしては、アガロースが最も頻繁に使用されるが、他のマトリクスも、利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成され得るよりも、より速い流速、およびより短いプロセシング時間を可能にする。免疫接着因子をプロテインＡまたはプロテインＧの親和性カラムに結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴（すなわち、その種およびアイソタイプ）によって全体的に決定される。一般的に、適切なリガンドが選択される場合、効率的な結合は、非順化培養液から直接生じる。免疫グロブリンの区別可能な特徴の１つは、ヒト１分子について、プロテインＡに対する結合能が、同じＦｃ型の抗体に対していくらか減少されることである。結合した免疫接着因子は、酸性ｐＨ（３．０以上）または温和なカオトロプ塩を含む中性ｐＨの緩衝液のいずれかで効率的に溶離され得る。このアフィニティークロマトグラフィー工程は、９５％よりも高い純度の免疫接着因子調製物を生じ得る。
【０１８６】
当該分野における他の方法が、免疫接着因子を精製するためにプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィーに代えて、または追加して使用され得る。免疫接着因子は、チオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー（Ｈｕｔｃｈｅｎｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５９：２１７−２２６（１９８６））および固定化された金属キレートクロマトグラフィー（ＡＩ−Ｍａｓｈｉｋｈｉら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、７１：１７５６−１７６３（１９８８））における抗体と同様にふるまう。しかし、抗体とは対照的に、イオン交換カラムにおけるこれらの挙動は、等電点によって影響されるのみならず、これらのキメラ性質に起因して分子中に存在し得る電荷双極子によってもまた影響される。
【０１８７】
所望の場合、この免疫接着因子は、二重特異性であり得る。従って、本発明の免疫接着因子は、アルテミンドメインと別のサイトカインまたは神経栄養性因子由来のドメインのようなドメインとを組合せ得る。二重特異性分子について、三量体分子（これは、抗体様構造における一つのアーム内のキメラ抗体重鎖および、他のアーム内のキメラ抗体重鎖−軽鎖の対から構成されている）は、精製の容易さに起因して有利である。二重特異性免疫接着因子の産生に伝統的に使用される抗体産生クアドロマー（これは、１０個の四量体を産生する）とは対照的に、三量体免疫接着因子構造の３つの鎖をコードする核酸で形質転換された細胞は、３個の分子のみの混合物を産生し、そしてこの混合物からの所望の産物の精製は、それに相応してより容易である。
【０１８８】
（４．アルテミンアゴニストの調製および同定）
ａ．低分子スクリーニング
低分子は、アルテミンアゴニストとして作用する能力を有し得、従って、神経細胞傷害の予防および処置に有用である。このような低分子としては、天然に発生する低分子、合成有機化合物または無機化合物およびペプチドが挙げられ得る。しかしながら、本発明における低分子は、これらの形態に限定されない。低分子の広範なライブラリが、市販されており、そして広範な種々のアッセイが、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングするために当該分野において周知である。
【０１８９】
候補アルテミンアゴニスト低分子は、好ましくは、潜在アゴニストの迅速な同定を可能にするアッセイにおいて最初に同定される。このようなアッセイの例は、タンパク質−タンパク質結合アッセイであり、このアッセイにおいて、候補分子のＧＦＲレセプターに結合する能力が測定される。別の例において、候補分子のＧＦＲに結合するアルテミンと干渉する能力が測定される。
【０１９０】
好ましい実施形態において、低分子アルテミンアゴニストは、アルテミンの１つ以上の生物学的活性を模倣する能力によって同定される。例えば、低分子は、Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：１２９１−１３０２（１９９８）に記載されるように、培地におけるドーパミン作用性の中脳ニューロンの生存を支持する能力についてスクリーニングされる。これらはまた、実施例６に記載されるように、実施例１〜４で与えられる方法において測定されるような痛みや痛覚過敏を伴わずに、軸索切断に続いて、脊髄の後角において軸索切断によって誘導されるサブスタンスＰの損失を防ぐこれらの能力についてスクリーニングされ得る。
【０１９１】
アルテミンアゴニストとして同定される化合物は、本発明の方法（例えば、損傷から誘導される病理学的変化からの哺乳動物における神経の保護）において使用され得る。
【０１９２】
ｂ．アゴニスト抗体の調製および同定
アルテミンの生物学的特性を模倣する、アゴニストヒトポリクローナル抗体およびアゴニストヒトモノクローナル抗体ならびに非ヒトポリクローナル抗体および非ヒトモノクローナル抗体（非ヒトモノクローナル抗体のヒト化された形態を含む）もまた、本発明において意図される。これらは、アミノ酸配列改変体、グリコシル化改変体および抗体のフラグメントを含む。このような抗体の産生およびアゴニスト抗体の選択のための一般的な技術は、当該分野において公知であり、以下に簡単に記載される。
【０１９３】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野において公知である。ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、免疫化剤（および所望される場合、アジュバント）の１回以上の注射によって惹起され得る。代表的には、免疫化剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射により哺乳動物中に注射される。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが既知のタンパク質（例えば、血清アルブミン、またはダイズトリプシンインヒビター）に免疫化剤を結合体化することは、有用であり得る。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭが挙げられる。
【０１９４】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されるハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１９５】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはマカクザル）が、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘起することを記載した上記のように免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して、骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１９６】
このように調製されるハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合されていない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む、適切な培養培地において播種および増殖され得る。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）（この条件下では、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる）。
【０１９７】
好ましい骨髄腫細胞は、効率良く融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。これらの中で好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡより入手可能であるＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍由来のもの）、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡより入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７））。
【０１９８】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対して指向されるモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））により決定される。
【０１９９】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定され得る。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生することを確認された後、この細胞は、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって増殖され得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０２０１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）により、培養培地、腹水または血清から適切に分離される。
【０２０２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定される。このハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いで、このベクターは、他の状態では免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、コード配列を、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインに置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１（１９８４））かまたは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって改変され得る。このように、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は、本明細書中に記載されるように、アルテミンアゴニストモノクローナル抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０２０３】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用してインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用するかまたはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０２０４】
抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載する。
【０２０５】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からこのヒト化抗体に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基といわれ、これは、代表的には、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」可変ドメインから得られる。ヒト化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列にヒト抗体の対応する配列を置換することによって、実行され得る。
【０２０６】
従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙ，前出）、ここでは、インタクトなヒト可変ドメインより実質的により少ないドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、代表的にはいくつかのＣＤＲ残基、および、おそらくは、いくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。
【０２０７】
抗体が、抗原および他の好ましい生物学的特性に対する高い親和性を保持しながらヒト化されることが、重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化された抗体は、親配列、ならびにこの親配列およびヒト化された配列の三次元モデルを使用する種々の概念的なヒト化産物の分析の処理によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、通常、利用可能であり、そして当業者に良く知られている。コンピュータプログラムが利用可能であり、これらは、選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配置構造を図示および表示する。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込みのある役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがこの抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析）を可能にする。このように、ＦＲ残基は、コンセンサス配列および移入（ｉｍｐｏｒｔ）で重要な配列から選択および結合され得、その結果所望の抗体特徴（例えば、標的抗原に対する親和性の増加）が達成される。一般的に、このＣＤＲ残基は、直接的にかつ最も実質的に、抗原結合に影響を与えることに関与する。さらなる詳細については、１９９２年８月２１日に出願された米国特許出願番号０７／９３４，３７３号（これは１９９１年６月１４日に出願された出願番号０７／７１５，２７２の一部係属出願である）を参照のこと。
【０２０８】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法により作成され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３、３００１（１９８４）、およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍｅｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）により記載されている。
【０２０９】
免疫化に際し、内因性の免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウス中の抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失が内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異体マウス中のヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原投与に際し、ヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２、２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。
【０２１０】
Ｍｅｎｄｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７））は、この技術をさらに改良し、そして抗原投与されたとき、高親和性の完全ヒト抗体を生成する、「ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＩＩ」と称されるトランスジェニックマウスの系統を生成した。これは、メガベースのヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の、上記のような欠失をもつマウスの内因性ＪＨセグメント中への生殖細胞系組込みにより達成された。このＸｅｎｏｍｏｕｓｅＩＩは、約６６のＶＨ遺伝子、完全ＤＨおよびＪＨ領域ならびに３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座をもち、そしてまた、３２のＶκ、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座をもつ。これらマウスで産生された抗体は、遺伝子再配置、アセンブリ、およびレパートリーを含むすべての局面において、ヒトで見られる抗体に緊密に似ている。ヒト抗体は、マウス遺伝子座において遺伝子再配列を防ぐ内因性ＪＨセグメントにおける欠失に起因して、内因性抗体に対して優先的に発現される。
【０２１１】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生し得る。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのような、繊維状細菌ファージの主要またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれか中インフレームでクローン化され、そしてファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示される。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づく選択はまた、これらの性質を示す抗体をコードする遺伝子選択をももたらす。従って、このファージは、Ｂ細胞のいくつかの性質を模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で実施され得る；これらの総説には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために用いられ得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体が、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）により記載の技法に本質的に従って単離され得る。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い割合で変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された変化のいくつかは、より高い親和性を与え、そして高親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、次の抗原投与の間に優先的に複製および分化する。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３［１９９２］）として知られる技法を採用することにより模倣され得る。この方法では、ファージディスプレイにより得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫化ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する改変体（レパートリー）のレパートリーで逐次的に置き換えることにより改良され得る。この技法は、ｎＭ範囲で親和性をもつ抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「すべてのライブラリーの母」としても知られる）を作成するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）により記載され、そしてこのような大ファージライブラリーからの直接的な高親和性ヒト抗体の単離は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）印刷中、により報告されている。遺伝子シャフリングはまた、げっ歯類抗体からヒト抗体を派生するために用いられ得、ここで、このヒト抗体は、出発げっ歯類抗体に類似の親和性および特異性をもつ。この方法によれば、「エピトープインプリンティング」とも称される、ファージディスプレイ技法により得られるげっ歯類抗体の重鎖および軽鎖Ｖドメイン遺伝子が、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換され、げっ歯類−ヒトキメラを生成する。抗原に対する選択は、機能的な抗原結合部位を回復し得るヒト可変ドメインの単離をもたらす。すなわち、エピトープが、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残存するげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスが繰り返されるとき、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基のない完全なヒト抗体を提供する。
【０２１２】
（ｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体はモノクローナルであり、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、ヒトまたはヒト化抗体である。現在の場合、この結合特異性の１つは、アルテミンレセプターに対し、アゴニスト抗体を提供し、他は、任意の他の抗原に対し、そして好ましくは、別のレセプターまたはレセプターサブユニットに対する。
【０２１３】
二重特異性抗体を作成する方法は、当該分野で公知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム組合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の可能な混合物を生成し、そのうち１つのみが正確な二重特異性構造をもつ。正確な分子の精製は、これは、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われ、むしろ厄介であり、そして産物収率は低い。類似の手順が、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）中、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  １０、３６５５−３６５９（１９９１）中に開示されている。
【０２１４】
異なるおよびより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）をもつ抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。好ましくは、この融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の部分を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとである。融合の少なくとも１つ中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、そして所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクター中に挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。これは、構築において使用される等しくない割合の３つのポリペプチド鎖が最適の収率を提供するとき、実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの互いの性質を調節することに大きな柔軟性を提供する。しかし、等しい割合の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率を生じるとき、または割合に特に有意差がないとき、１つの発現ベクター中に２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。このアプローチの好適な実施形態では、二重特異性抗体は、１つのアームに第１の結合特異性をもつハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームに（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアから構成される。この非対称構造構造が、所望されない免疫グロブリン鎖組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。なぜなら、二重特異性分子の２分の１つのみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在は、分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、１９９４年３月３に公開された、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。
【０２１５】
二重特異性抗体を生成するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１、２１０（１９８６）を参照のこと。
【０２１６】
（ｖｉ）ヘテロ接合抗体
ヘテロ接合抗体は、２つの共有結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、所望されない細胞に免疫系細胞を標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置に（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）提案されている。ヘテロ接合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作成され得る。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号に、多くの架橋技法とともに開示されている。
【０２１７】
（ｖｉｉ）抗体フラグメント
特定の実施形態では、（マウス、ヒトおよびヒト化抗体および抗体改変体を含む）アルテミンアゴニスト抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントの産生のために種々の技法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトの抗体のタンパク質分解消化に由来した（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的に結合されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態では、このＦ（ａｂ’）２は、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進する。別のアプローチによれば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換え宿主細胞培養から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技法は、当業者に明らかである。
【０２１８】
（ｖｉｉｉ）アゴニスト抗体の同定
可能なアルテミンアゴニスト抗体は、ＧＦＲ３レセプターとのそれらの相互作用を基に同定され得る。例えば、当該分野で周知のウェスタンブロット技法を用いて、ＧＦＲ３を結合するそれらの能力について種々の抗体をスクリーニングし得る。アルテミンは、ＧＦＲ３を通じて作用するようであり（実施例８を参照のこと）、抗体とＧＦＲ３との間の任意の相互作用は、この抗体がアルテミンアゴニストとして作用し得ることを示し得る。
【０２１９】
実際のアルテミンアゴニスト抗体は、それらの生物学的活性を基に同定される。１つの実施形態では、アルテミンアゴニスト抗体は、実施例８に記載のような、インビトロの新生児後根神経節ニューロンの生存を誘導するそれらの能力により同定される。
【０２２０】
アルテミンアゴニスト抗体はまた、実施例６に記載のような、軸索切断後の脊髄の背面角における軸索切断で誘導される物質Ｐの損失を防ぐそれらの能力を基に同定され得る。
【０２２１】
（５．アルテミンと相互作用するタンパク質のスクリーニングアッセイ）
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために適切な任意の方法が、アルテミンと相互作用する、膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質を含むがこれに制限されないタンパク質を同定するために採用され得る。伝統的な方法の中で、アルテミンと相互作用するタンパク質を同定するために採用され得るのは、同時免疫沈澱、架橋およびグラジエントまたはクロマトグラフィーカラムによる同時精製である。このようなアッセイのために、アルテミン成分は、完全長タンパク質、その可溶性誘導体、目的のドメインに対応するペプチド、またはアルテミンの特定領域を含む融合タンパク質であり得る。
【０２２２】
アルテミンと相互作用し得るタンパク質をコードする遺伝子の同時同定をもたらす方法が採用され得る。これらの方法は、例えば、標識されたアルテミンまたはその改変体を用い、ｇｔ１１ライブラリーの抗体プロービングの周知の技法に類似の様式の発現ライブラリーのプロビングを含む。
【０２２３】
インビボでタンパク質相互作用を検出する１つの方法である、ツーハイブリッド系は、例示のみのためにそして制限するためにではなく、詳細に記載される。この系の１つのバージョンが記載され（Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８−９５８２）、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から市販されている。
【０２２４】
簡単に述べると、このような系を利用して、２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築され：１つのプラスミドは、アルテミン、またはそれ由来のポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合された転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチドからなり、そして他方のプラスミドは、ｃＤＮＡライブラリーの部分としてこのプラスミド中に組換えられた未知タンパク質をコードするｃＤＮＡに融合された転写活性化タンパク質の活性化ドメインをコードするヌクレオチドからなる。このＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーは、その調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含む、レポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳまたはｌａｃＺ）を含む酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株中に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質単独では、このレポーター遺伝子の転写を活性化し得ず：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、それが活性化機能を提供しないからであり、そして活性化ドメインハイブリッドは、それがアクチベーター結合部位に局在化し得ないからである。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能的アクチベータータンパク質を再構築し、そしてレポーター遺伝子産物に対するアッセイにより検出されるレポーター遺伝子の発現をもたらす。
【０２２５】
このツーハイブリッド系または関連する方法は、「餌」遺伝子産物と相互作用するタンパク質のための活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために用いられ得る。例を挙げれば、制限することなく、アルテミンが餌遺伝子産物として用いられ得る。全体ゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合される。このライブラリー、およびＤＮＡ結合ドメインに融合された餌アルテミン遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドを、酵母レポーター株中に同時形質転換し、そして得られる形質転換体を、このレポーター遺伝子を発現する形質転換体についてスクリーニングする。例えば、制限することなく、餌アルテミン遺伝子配列、例えば、遺伝子オープンリーディングフレームを、ベクター中に、それが、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳により融合されるようにクローン化され得る。これらのコロニーを精製し、そしてレポーター遺伝子を発現するライブラリープラスミドを単離する。次いで、ＤＮＡ配列決定を用い、このライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質を同定する。
【０２２６】
餌アルテミン遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されるはずの細胞株のｃＤＮＡライブラリーは、当該分野で慣用的に実施される方法を用いてなされ得る。例えば、本明細書に記載される詳細な系に従って、ｃＤＮＡフラグメントが、ベクター中に、それらがＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳により融合されるように挿入され得る。このライブラリーは、餌アルテミン遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドとともに、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターにより駆動されるｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株中に同時形質転換され得る。餌アルテミン遺伝子産物と相互作用する、ＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡでコードされるタンパク質は、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成し、そしてそれによって発現を駆動する。発現を駆動するコロニーは、当該分野で慣用的な方法により検出され得る。次いで、これらの株からｃＤＮＡが精製され得、そして当該分野で慣用的に実施される技法を用いて、餌アルテミン遺伝子−相互作用タンパク質を生成および単離するために使用され得る。
【０２２７】
ａ．アルテミン発現または活性を調整する化合物のアッセイ
以下のアッセイは、アルテミンと相互作用（例えば、結合）する化合物、その結合パートナー、同族または基質とともにアルテミンの相互作用を妨害する化合物、およびアルテミン遺伝子発現の活性を調整（すなわち、アルテミン遺伝子発現のレベルを調整）するか、身体中のアルテミンのレベルを調整する化合物を同定するために設計される。アルテミン遺伝子調節配列（例えば、プロモーター配列）に結合し、そしてその結果、アルテミン遺伝子発現を調整し得る化合物を同定するアッセイがさらに利用され得る。例えば、その全体が参考として本明細書中に援用される、Ｐｌａｔｔ，Ｋ．Ａ．、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２８５５８−２８５６２を参照のこと。
【０２２８】
本発明に従ってスクリーニングされ得る化合物は、制限されずに、アルテミンまたはアルテミンレセプターに結合し、そして天然リガンドにより誘発される活性を模倣するか（すなわちアゴニスト）または天然リガンドにより誘発される活性を阻害する（すなわちアンタゴニスト）かのいずれかの、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、およびその他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣物）を含む。
【０２２９】
このような化合物は、制限されずに、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｒ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照のこと）、およびＤ−および／またはＬ−形態アミノ酸から作成されるコンビナトリアル化学由来分子ライブラリー、ホスホペプチド類（ランダムまたは部分的に縮重した指向ホスホペプチドライブラリー；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ、Ｚ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照のこと、を含むがこれに制限されない）、抗体類（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは単鎖抗体類、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを含むがこれらに制限されない）を含むがこれらに限定されない、例えば、可溶性ペプチドのようなペプチド、および有機低分子または無機低分子を含み得る。
【０２３０】
本発明に従ってスクリーニングされ得るその他の化合物は、制限されずに、血液−脳関門を通り、適切な細胞中への侵入を得（例えば、脈絡叢、下垂体、視床下部などの中）、そしてアルテミン遺伝子またはアルテミン媒介経路に関与するいくつかの他の遺伝子の発現に影響し得る（例えば、遺伝子発現に関与する調節領域または転写因子との相互作用による）、有機低分子；あるいはアルテミンの活性もしくはアルテミンシグナル伝達、異化、または代謝経路に関与するいくつかの他の細胞内因子の活性に影響するか、または置換するような化合物を含む。
【０２３１】
コンピューターモデリングおよびサーチング技術は、アルテミン発現または活性を調整し得る、化合物の同定、または既に同定された化合物の改良を可能にする。このような化合物または組成物を同定すれば、活性部位または領域が同定される。代表的には、このような活性部位は、リガンド結合部位であり得る。この活性部位は、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、またはその天然リガンドとの関係ある化合物または組成物の複合体の研究からを含む、当該分野で公知の方法を用いて同定され得る。後者の場合には、化学的またはＸ線結晶学的方法を用いて、因子上のどこに複合体化リガンドが見出されるかを見出すことにより、活性部位を見出し得る。
【０２３２】
次に、活性部位の三次元幾何学的構造を決定する。これは、Ｘ線結晶解析（これは、完全な分子構造を決定し得る）を含む公知の方法によって行われ得る。一方、固相ＮＭＲまたは液相ＮＭＲを使用して、特定の分子内距離を決定し得る。構造決定の任意の他の実験的方法を使用して、部分的または完全な幾何学的構造を取得し得る。この幾何学的構造を、天然の、または人工的な複合体化リガンドを用いて測定し得、これは、決定される活性部位構造の正確度を増大し得る。
【０２３３】
不完全または不十分な正確度の構造を決定する場合、コンピューターに基づく数値モデル化の方法を使用して、構造を完全にし得、またはその正確度を改良し得る。任意の公認のモデル化方法を使用し得、このモデル化方法は、以下を含む：特定のバイオポリマー（例えば、タンパク質または核酸）に特異的なパラメーター化されたモデル、分子運動の計算に基づく分子力学モデル、熱集団に基づく統計力学モデル、または組み合わせたモデル。モデルの大半の型にとって、標準的分子力場（これは、構成原子と構成基との間の力を示す）は、必要であり、そして、物理化学において公知の力場から選択され得る。不完全な実験的構造、またはほとんど正確度のない実験的構造は、これらのモデル化法によって計算された完全な構造およびより正確度のある構造に対する制約として機能し得る。
【０２３４】
最後に、実験的に、モデル化によって、またはその組合せによってのいずれかで活性部位（または結合部位）の構造を決定したら、候補調節化合物を、化合物の分子構造の情報とともに化合物を含むデータベースを検索することによって、同定し得る。これらの検索は、決定された活性部位構造とマッチし、そして、活性部位を決定する基と相互作用する構造を有する化合物を探索する。このような検索は手動であり得るが、好ましくは、コンピューター介助される。この検索から見出された化合物は、アルテミン活性の潜在的な調節因子である。
【０２３５】
あるいは、これらの方法を使用して、既に公知の調節化合物またはリガンドから改良された調節化合物を同定し得る。公知の化合物の組成物を改変し得、そして、改変の構造効果を、上記の実験的方法およびコンピューターモデル化法を新規な組成物に適用して使用して、決定し得る。次いで、改変された構造を、改良された適合または相互作用が生じるかどうかを決定するために、化合物の活性部位構造と比較する。この様式において、組成物における系統的改変物（例えば、側基を変化することによって）を、迅速に評価し得、改良された特異性または活性の、改変された調節化合物またはリガンドを取得し得る。
【０２３６】
アルテミンならびに関連する形質導入および転写因子の活性部位（または結合部位）の同定に基づいて調節化合物を同定するのに有用なさらなる実験的方法およびコンピューターモデル化法は、当業者に明白である。
【０２３７】
分子モデル化系の例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（ＰｏｌｙｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフモデル化および分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、相互の分子の挙動の対話式構築、改変、可視化および分析を可能にする。
【０２３８】
多くの文献（例えば、以下）は、特定のタンパク質との薬物の相乗効果のコンピューターモデル化を論評する：Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７（Ｊｕｎｅ  １６，１９８８）ＭｃＫｉｎａｌｙ  およびＲｏｓｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１〜１２２；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ、ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １８９〜１９３頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ，１９８９  Ｐｒｏｃ．Ｒ  Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５〜１４０および１４１〜１６２；ならびに、核酸成分に対するモデルレセプターに関して、Ａｓｋｅｗら、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２〜１０９０。化学物質をスクリーニングし、そしてグラフ的に表す他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）の様な企業から利用可能である。特定のタンパク質に特異的である薬物への適用のために本来設計されたものもあるが、これらは、一旦ＤＮＡまたはＲＮＡの領域が同定されると、ＤＮＡまたはＲＮＡの領域に特異的な薬物の設計に適用され得る。
【０２３９】
結合を改変し得る化合物の設計および生成に関して上記したが、インヒビターまたはアクチベーターである化合物に対して、天然の生成物、合成化学物質、および生物学的活性物質（タンパク質を含む）を含む公知の化合物のライブラリーがまた、スクリーニングされ得る。
【０２４０】
本明細書中で記載したようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、アルテミン遺伝子産物の生物学的機能を解明する際に有用であり得る。このような化合物は、種々の任意の生理学的障害または精神障害を処置するために、治療有効用量が患者に投与され得る。治療有効用量は、任意の生物学的症状の任意の改善、障害、予防または改変を生じるのに十分な化合物量をいう。
【０２４１】
（ｂ．アルテミンに結合する化合物のためのアッセイ）
アルテミンと相互作用し得る（例えば、アルテミンに結合し得る）か、もしくはアルテミンを模倣し得る、または同族レセプター、結合パートナーもしくは基質へのアルテミンの結合を妨害し得る化合物を同定するためにシステムを、設計し得る。同定された化合物は、例えば、野生型および／または変異アルテミン遺伝子産物の活性を調節する際に有用であり得；アルテミンの生物学的機能を詳細にする際に有用であり得；正常なアルテミン相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングの際に利用され得；または、それ自身を破壊し得、もしくはこのような相互作用を活性化し得る。
【０２４２】
アルテミン、またはアルテミン同族レセプターまたは基質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、アルテミンおよび試験化合物を相互作用させ、そして結合させるのに十分な条件下および時間で、これら２つの成分の混合反応物を調製し、これによって、取りだしおよび／または反応混合物中で検出され得る複合体を形成する工程を包含する。使用されるアルテミン種はスクリーニングアッセイの目的に依存して変化し得る。例えば、天然レセプターのアゴニストが所望される場合、全長アルテミン、または可溶性切断アルテミン、ペプチド、または本アッセイ系（例えば、標識化、得られた複合体の単離など）において有用であるタンパク質もしくはポリペプチドに融合された１つ以上のアルテミンドメインを含む融合タンパク質が利用され得る。直接アルテミンと相互作用する化合物が探索される場合、アルテミンに対応するペプチドおよびアルテミンを含む融合タンパク質が使用され得る。
【０２４３】
スクリーニングアッセイは、種々の方法で実施され得る。例えば、このようなアッセイを実施する１つの方法は、アルテミン、ポリペプチド、ペプチド、もしくはそれらの融合タンパク質、または、試験物質を固相上に固定する工程、反応の最後に固相上に固定されたアルテミン／試験化合物複合体を検出する工程を包含する。このような方法の１つの実施形態において、アルテミン反応物質は、固体表面に固定され得、そして、試験化合物（これは、固定されない）は、直接的にかまたは間接的に標識され得る。
【０２４４】
実際には、マイクロタイタープレートが、固相として通常利用され得る。固定された成分は、非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は、タンパク質溶液を用いて固体表面を単にコート化し、そして、乾燥させることによって達成され得る。あるいは、固定化されるタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくは固定化モノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を固定化するために使用され得る。表面は、前もって調製され得、そして保存され得る。
【０２４５】
このアッセイを実施するために、非固定化成分は、固定化成分を含むコート化表面に添加される。反応が終了した後、未反応成分は、形成したいずれの複合体も固体表面上に固定化されたままとなるような条件下で、（例えば、洗浄によって）除去される。固体表面上に固定化されなかった複合体の検出は、多くの方法によって達成され得る。以前には固定化されなかった成分が予備標識される場合、表面上に固定化された標識の検出は、この複合体が形成されたことを示す。以前には固定化されなかった成分が予備標識されない場合、間接標識が、表面上に固定化された複合体を検出するために使用され得；これは、例えば、以前には固定化されなかった成分に対して特異的な標識抗体を使用する（この抗体は、次に、標識化抗Ｉｇ抗体を使用して直接的に標識され得るか、または間接的に標識され得る）。
【０２４６】
あるいは、反応は液相で実施され得、反応生成物は、未反応成分から分離され得、そして複合体が検出され得る；これは、例えば、アルテミンタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質に特異的な固定化抗体、または溶液中で形成されたいずれかの複合体を固定化するような試験化合物、および固定化複合体を検出するような潜在的複合体の他の成分に特異的な標識化抗体を使用する。
【０２４７】
（ｃ．アルテミン相互作用を妨害する化合物のアッセイ）
アルテミンと相互作用する高分子はこの討論の目的で、「結合パートナー」と称される。これらの結合パートナーは、アルテミン媒介生物学的経路に関連しそうである。よって、体内でアルテミン活性を調節もしくは増強させる際、および／またはこの活性（もしくは、その欠損）に関連する障害を制御する際に有用であり得るような結合パートナーの相互作用を妨害するか、または破壊する化合物を同定することが、所望される。
【０２４８】
アルテミンとその結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ系の基本原理は、アルテミン、またはその何らかの改変体、および結合パートナーを相互作用および結合させるのに十分な条件下および時間で、アルテミン、またはその何らかの改変体、および結合パートナーを含む反応混合物を調製し、これによって、複合体を形成する工程を包含する。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を、試験化合物の存在下または非存在下で調製する。この試験化合物は、最初に反応混合物中に含まれ得るか、またはアルテミンおよびその結合パートナーの添加後同時に添加され得る。コントロール反応混合物は、試験化合物なしでかまたはプラシーボとともにインキュベートされる。次いで、アルテミンと結合パートナーとの間の任意の複合体形成が検出される。コントロール反応中（試験化合物を含む反応混合物中ではない）での複合体形成は、化合物が、アルテミンと相互作用性結合パートナーとの相互作用を妨害するということを示す。さらに、試験化合物および正常アルテミンタンパク質を含む反応混合物内の複合体形成はまた、試験化合物および変異体アルテミンを含む反応混合物内の複合体形成と比較され得る。この比較は、正常タンパク質ではなく変異体アルテミンまたは変異されたアルテミンの相互作用を特異的に破壊する化合物を同定することが所望される場合において、重要であり得る。
【０２４９】
アルテミンと結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物についてのアッセイは、不均質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）形式または均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）形式において実施され得る。不均質アッセイは、固相上にアルテミンまたは結合パートナーのいずれかを固定する工程、および反応の最後に固相上に固定された複合体を検出する工程を包含する。均質アッセイにおいて、全体の反応は、液相で実施される。いずれのアプローチにおいても、反応物質の添加の順序は、試験される化合物についての異なる情報を取得するために変化され得る。例えば、競合によって相互作用を妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を実施することによって、すなわち、アルテミンと相互作用性結合パートナーに添加する前、または同時に、試験物質を反応混合物に添加することによって、同定され得る。あるいは、予め形成された複合体を破壊する試験化合物（例えば、複合体からの成分の１つを置換するより高い結合定数を有する化合物）は、複合体が形成された後に、試験化合物を反応混合物に添加することによって試験され得る。種々の形式が、以下に簡単に記載される。
【０２５０】
不均質アッセイ系において、アルテミンまたは相互作用性結合パートナーのいずれかは、固体表面上に固定される一方、非固定化種は、直接的にかまたは間接的に標識される。実際に、マイクロタイタープレートが通常利用される。固定化種は、非共有結合または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は、固体表面をアルテミンまたは結合パートナーの溶液でコート化し、そして乾燥することによって、簡単に達成され得る。あるいは、固定化される種に特異的な固定化抗体は、この種を固体表面に固定化するために使用され得る。この表面は前もって調製され得、そして保存され得る。
【０２５１】
アッセイを実施するために、固定化種のパートナーは、試験サンプルを有するかまたは有さないコート化表面に曝露される。反応の完了後、未反応成分を（例えば、洗浄によって）除去し、そして、形成されたいずれの複合体も、固体表面上に固定化されたままである。固体表面上に固定化された複合体の検出は、多くの方法によって達成され得る。非固定化種が予備標識される場合、表面上に固定化された標識の検出は、この複合体が形成されたことを示す。固定化されない成分が予備標識されない場合、間接標識が、表面上に固定化された複合体を検出するために使用され得；これは、例えば、最初に固定化されない成分に対して特異的な標識抗体を使用する（この抗体は、次に、標識化抗Ｉｇ抗体を使用して直接的に標識される得か、または間接的に標識され得る）。反応成分の添加の順序に依存して、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物は、検出され得る。
【０２５２】
あるいは、反応は、試験化合物の存在下または非存在下で、液相で実施され得、反応生成物は、未反応成分から分離され得、そして、複合体が検出され得る；これは、溶液中で形成された任意の複合体を固定化するような結合成分の１つに特異的な固定化抗体、および固定化複合体を検出するような他のパートナーに特異的な標識化抗体を使用する。同様に、液相への反応物質の添加の順序に依存して、複合体を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物が同定され得る。
【０２５３】
本発明の代替の実施形態において、均質アッセイが使用され得る。このアプローチにおいて、アルテミンおよび相互作用性結合パートナーの予め形成された複合体は、アルテミンまたはその結合パートナーのいずれかが標識されるが、標識により生成されたシグナルが、この複合体の形成に起因してクエンチされるように調製される（例えば、イムノアッセイのためにこのアプローチを使用するＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎによる米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと）。予め形成された複合体からの種の１つと競合し、そして置換する試験物質の添加は、バックグラウンドを越えるシグナルの生成を生じる。この方法において、相互作用を破壊する試験物質が同定され得る。
【０２５４】
特定の実施形態において、アルテミン融合物が、固定化のために調製され得る。例えば、アルテミン、またはそのペプチドフラグメントは、その結合活性が生じた融合タンパク質において維持されるような様式において、融合ベクター（例えば、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１）を使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合され得る。相互作用性結合パートナーは、当該分野において慣用的に実施され、そして上記に記載された方法を使用して、精製され得、モノクローナル抗体を産生するために使用され得る。この抗体は、例えば、当該分野で慣用的に実施される方法によって、放射性同位体１２５Ｉを用いて標識され得る。不均質アッセイにおいて、融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズに固定化され得る。次いで、相互作用性結合パートナーは、相互作用および結合を生じさせる様式で、試験化合物の存在下または非存在下で添加され得る。反応期間の最後に、未結合物質が洗浄され得、そして、標識化モノクローナル抗体は、この系に添加され得、そして、複合体化成分へ結合される。アルテミンと相互作用性結合パートナーとの間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに会合したままである放射能量を測定することによって検出され得る。試験化合物による相互作用の首尾良い阻害は、測定される放射能の減少を生じる。
【０２５５】
あるいは、ＧＳＴ融合タンパク質および相互作用性結合パートナーは、固体グルタチオン−アガロースビーズの非存在下で、液体中でともに混合され得る。試験化合物は、種が相互作用し得る間、またはその後のいずれかに添加され得る。次いで、この混合物は、グルタチオン−アガロースビーズに添加され得、そして、未結合物質が洗浄される。同様に、アルテミンと結合パートナーとの間の相互作用の阻害の範囲は、標識化抗体を添加し、そして、ビーズの放射能を測定することによって検出され得る。
【０２５６】
本発明の別の実施形態において、これらの同一の技術は、全長タンパク質の１つまたは両方に代わって、アルテミンおよび／または相互作用性もしくは結合パートナー（結合パートナーがタンパク質の場合）の結合ドメインに対応するペプチドフラグメントを使用して、使用され得る。当該分野で慣用的に実施される多数の方法は、結合部位を同定し、そして単離するために使用され得る。これらの方法としては、タンパク質の１つをコードする遺伝子の突然変異、および同時免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。次いで、複合体中の第２の種をコードする遺伝子における補完的変異が選択され得る。各タンパク質をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用的結合に関するタンパク質の領域に対応する変異を示す。あるいは、１つのタンパク質は、上記の方法を使用して固体表面に固定化され得、そして、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）で処理されたその標識化結合パートナーと相互作用させ、そして結合させる。洗浄後、そして結合ドメインを含む比較的短い標識化ペプチドは、固体物質と会合したままであり得、これは、単離され得、そしてアミノ酸配列決定によって同定され得る。また、一旦細胞内結合結合パートナーをコードする遺伝子が取得されると、短い遺伝子セグメントは、タンパク質のペプチドフラグメントを発現するように操作され得、次いで、結合活性について試験され得、そして、精製され得るかまたは合成され得る。
【０２５７】
例えば、そして、限定されないが、アルテミンは、ＧＳＴ融合タンパク質を作製し、これをグルタチオンアガロースビーズに結合させることによって、上記のような固体物質に固定化され得る。相互作用性結合パートナーは、放射性同位体（例えば、３５Ｓ）で標識され得、そして、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）で切断され得る。次いで、切断生成物は、固定化融合タンパク質に添加され得、そして、結合させられる。未結合ペプチドを洗浄後、標識化結合物質（細胞内結合パートナーに結合するをドメイン示す）は溶出され得、精製され得、そして、周知の方法によってアミノ酸配列を分析され得る。そのように同定されたペプチドは、合成的に生成され得るか、または組換えＤＮＡ技術を使用して、適切な介助タンパク質に融合され得る。
【０２５８】
（６．薬学的組成物）
精製形態のアルテミンは、例えば、コアセルベーション技術によってかもしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン製のマイクロカプセル、およびポリ（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）中か、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン、ミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中か、またはマクロエマルジョン中に捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０（Ａ．Ｏｓｏｌ編）に開示されている。
【０２５９】
アルテミンの治療的処方物は、凍結乾燥ケーク（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃａｋｅ）または水溶液の形態において、所望される程度の純度（好ましくは、本質的に純粋）を有するアルテミンを、任意の生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することによって調製される。受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度で曝露された細胞または哺乳動物に対して、無毒性である。例としては、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸を含む）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓまたはＰＥＧ）が挙げられる。
【０２６０】
インビボ投与のために使用されるアルテミンは、無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構築の前または後で、当該分野で公知の任意の方法（例えば、滅菌濾過膜を通した濾過）により、容易に達成される。アルテミンは、凍結乾燥形態で保存され得る。治療的アルテミン組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル）中に配置される。
【０２６１】
アルテミンは、必要に応じて、他の神経栄養性因子（ＮＧＦ、ＮＴ−３および／またはＢＤＮＦが挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせられるかまたは協調的に投与され、そして変性性神経障害に対する他の従来の治療剤と共に使用される。
【０２６２】
アルテミンは、ＣＮＳの液体貯蔵所（ｆｌｕｉｄ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中への注入によって持続的に投与され得るが、ボーラス注射も受け入れ可能である。１つの実施形態では、アルテミンは、好ましくは、脳の脳室中に投与されるか、さもなくばＣＮＳもしくは脊髄液中に導入される。アルテミンは、持続的投与手段（例えば、ポンプ）を使用して留置カテーテルにより投与され得るか、またはアルテミンは、持続放出性ビヒクルの移植（例えば、大脳内移植）によって投与され得る。より詳細には、アルテミンは、長期間にわたり移植されたカニューレを通して注入され得るか、または浸透圧ミニポンプの補助によって長期間にわたり注入され得る。小チュービングを通してタンパク質を脳室に送達する皮下ポンプが利用可能である。高度に精密なポンプが、皮膚を通して補充され得、そしてその送達速度は、外科的介入を伴わずに設定され得る。
【０２６３】
適切な投与プロトコール、および皮下ポンプデバイスまたは完全に移植される薬物送達系を通した持続的な脳室内注入を含む送達系の例は、アルツハイマー病患者およびパーキンソン病についての動物モデルへのドパミン、ドパミンアゴニストおよびコリン作用性アゴニストの投与のために使用されるものである（Ｈａｒｂａｕｇｈ，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．補遺２４：２７１（１９８７）；およびＤｅＹｅｂｅｎｅｓら，Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．，２：１４３（１９８７）に記載される）。アルテミンアゴニスト抗体は、同じ様式においてか、または血流中もしくはリンパ中への投与によって、投与される。
【０２６４】
持続放出調製物の適切な例としては、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。持続放出マトリクスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）に記載されるような、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート））、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３））、非分解性エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）、または分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される、注射可能なミクロスフェア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）。
【０２６５】
エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間を超えて分子を放出することを可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短期間でタンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が長期間身体内に残存する場合、それらは３７℃で湿気に曝露される結果として変性または凝集し得、生物学的活性の損失、そしておそらく免疫原性の変化を生じる。合理的なストラテジーが、関与する機構に依存して、タンパク質安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であると発見された場合には、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、含水量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成され得る。
【０２６６】
持続放出アルテミン組成物としてはまた、リポソームに捕捉されたアルテミンが挙げられる。アルテミンを含有するリポソームは、当該分野で公知の方法によって調製される（Ｅｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；ＤＥ  ３，２１８，１２１  Ａ；ＥＰ  ５２３２２Ａ；ＥＰ  ３６６７６Ａ；ＥＰ  ８８０４６Ａ；ＥＰ  １４３９４９Ａ；ＥＰ  １４２６４１Ａ，日本国特許出願番号第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ  １０２，３２４Ａ）。通常、リポソームは小さな（約２００〜８００Å）の単層型であり、ここで脂質含量は約３０モル％コレステロールよりも高く、選択される比率は、最適なアルテミン治療のために調整される。
【０２６７】
局所的に適用される場合、アルテミンは適切なように、他の成分（例えば、キャリアおよび／またはアジュバント）と組み合わせられる。そのような他の成分は、生理学的に受容可能でなければならずかつその意図される投与のために有効でなければならず、かつその組成物の活性成分の活性を低下させ得ないという点を除いて、そのような他の成分の性質に制限はない。適切なビヒクルの例としては、精製されたコラーゲンを有するかまたは有さない、軟膏、クリーム、ゲルまたは懸濁物が挙げられる。組成物はまた、経皮パッチ、硬膏剤および包帯中に、好ましくは液体または半液体の形態で、浸透され得る。
【０２６８】
ゲル処方物を得るために、液体組成物に処方されたアルテミンは、有効量の水溶性ポリサッカリドまたは合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と混合されて、局所適用されるために適切な粘度を有するゲルを形成し得る。使用され得るポリサッカリドとしては、例えば、以下が挙げられる：セルロース誘導体（例えば、エーテル化セルロース誘導体（アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、およびアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含む））；デンプンおよび断片化デンプン（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）；寒天；アルギン酸およびアルギネート；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコゲン；グルカン；および合成生体高分子；ならびにゴム（例えば、キサンタンゴム）；ガーゴム；ローカストマメゴム；アラビアゴム；トラガカントゴム；およびカラヤゴム；ならびに、それらの誘導体および混合物。本明細書中で好ましいゲル化剤は、生体系に対して不活性であり、非毒性であり、調製が容易であり、そしてさほど易流動性（ｒｕｎｎｙ）でも粘着性でもなく、かつ内部に保持されるアルテミンを不安定化しないものである。
【０２６９】
好ましくは、ポリサッカリドは、エーテル化セルロース誘導体、より好ましくは、十分に規定され、精製され、およびＵＳＰに列挙されたもの（例えば、メチルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース））である。本明細書中で最も好ましいのはメチルセルロースである。
【０２７０】
ゲル化のために有用なポリエチレングリコールは代表的に、適切な粘度を得るために、低分子量のＰＥＧと高分子量のＰＥＧとの混合物である。例えば、分子量４００〜６００のＰＥＧと分子量１５００のＰＥＧとの混合物は、ペースト剤を得るために適切な比率で混合される場合、この目的のために有効である。
【０２７１】
用語「水溶性」は、ポリサッカリドおよびＰＥＧに適用される場合には、コロイド性溶液および分散物を含むことを意味する。一般的に、セルロース誘導体の溶解度は、エーテル基の置換の程度によって決定され、そして本明細書中で有用な安定化誘導体は、その誘導体を水溶性とするために、そのセルロース鎖において無水グルコース１単位につき十分な量のこのようなエーテル基を有するべきである。無水グルコース１単位につき少なくとも０．３５のエーテル基でのエーテル置換程度は、一般に十分である。さらに、セルロース誘導体は、アルカリ金属塩（例えば、Ｌｉ塩、Ｎａ塩、Ｋ塩、またはＣｓ塩）の形態であり得る。
【０２７２】
メチルセルロースがゲルにおいて使用される場合、好ましくは、これは、そのゲルの約２〜５％、より好ましくは約３％を含み、そしてアルテミンは、ゲル１ｍｌあたり約３００〜１０００ｍｇの量で存在する。
【０２７３】
半透性の移植可能な膜デバイスは、特定の状況下で薬物を送達するための手段として有用である。例えば、アルテミン、アルテミン改変体、アルテミンキメラ、またはアルテミンアゴニストを分泌する細胞がカプセル化され得、そしてそのようなデバイスが患者に移植され得る。例えば、それらは、パーキンソン病に罹患している患者の脳に移植され得る。米国特許第４，８９２，５３８号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；米国特許第５，０１１，４７２号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；米国特許第５，１０６，６２７号（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／１０４２５；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９１／１０４７０；Ｗｉｎｎら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１１３：３２２−３２９（１９９１）；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏら，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３（１９９２）を参照のこと。従って、ニューロンに対する損傷を予防または処置するための方法もまた包含され、この方法は、特定の状態のために必要とされ得るアルテミン、そのアゴニストまたはアンタゴニストを分泌する細胞を、それを必要とする患者の身体内に移植する工程を包含する。最終的に、本発明は、半透性の膜およびその膜内にカプセル化されたアルテミン（または特定の状態のために必要とされ得るそのアゴニストまたはアンタゴニスト）を分泌する細胞を含む移植片の患者への移植によって、神経損傷を予防または処置するためのデバイスを包含し、そしてこの膜は、アルテミン（またはそのアゴニストまたはアンタゴニスト）に対して透過性であり、かつ細胞に対して有害である患者由来の因子に対して不透過性である。エキソビボでアルテミンを産生するように形質転換された、患者自身の細胞は、必要に応じてこのようなカプセル化をせずに、その患者に直接移植され得る。生存細胞の膜カプセル化のための方法論に当業者は精通しており、そしてカプセル化された細胞の調製および患者へのそれらの移植は、過度な実験を伴わずに達成され得る。
【０２７４】
アルテミンまたはアルテミンアゴニストを含む薬学的組成物は、好ましくは、適切な容器中に配置される。この容器は、好ましくは、この薬学的組成物の適切な使用および投薬を詳述した指示書を付属する。当業者は、これらの指示書が、処置方法に依存して変動することを理解する。
【０２７５】
（７．処置方法）
アルテミンは、神経細胞の生存を増強するための薬剤としての用途を見出すと考えられる。従って、アルテミンは、神経系の変性障害（「神経変性疾患））（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、ＡＬＳ、末梢神経障害、および、中枢神経であるか末梢神経であるか運動神経であるかに関わらずニューロンの壊死または損失によって特徴付けられる他の状態のような障害が挙げられるが、これらに限定されない）の予防、改善、または処置において有用である。さらに、アルテミンは、損傷を受けた神経細胞（例えば、やけどおよび創傷のような外傷的な状態、糖尿病、腎機能不全、ならびに癌およびＡＩＤＳを処置するために使用される化学療法剤の毒性作用によって損傷を受けた神経）を処置するために有用であり得る。適切な場合には、アルテミンはまた、神経損傷または損傷を受けていない細胞における神経損傷に対する有害な応答を予防または改善するにおいて有用であり得る。
【０２７６】
本発明は、哺乳動物におけるアルテミンの処置の利益が、ＮＧＦ処置で観察される問題となる副作用を付随しないという発見に基づく。本明細書中に記載された実験は、アルテミンが、神経保護的な特性（例えば、傷害に関連した病理学的変化からニューロンを保護する能力、およびウイルスにより誘導される死からニューロンを保護する能力）を有するということを実証する。しかし、アルテミンの保護的効果には、疼痛も痛覚過敏も付随しない。
【０２７７】
本発明の１つの実施形態では、神経損傷を有する患者は、治療的有効量のアルテミンを投与される。神経細胞および／またはその軸索の生存または機能が損なわれている場合に、疾患または医学的障害は神経損傷であるとみなされる。このような神経損傷は、以下に挙げられる状態の結果として起こる：（ａ）物理的傷害（これは、傷害部位付近の軸索および／または神経細胞体の変性を引き起こす）；（ｂ）虚血（例えば、発作）；（ｃ）神経毒（例えば、癌およびＡＩＤＳの化学療法剤（それぞれ、シスプラチンおよびジデオキシシチジン（ｄｄＣ）など））への曝露；（ｄ）慢性的な代謝疾患（例えば、糖尿病または腎機能不全）；ならびに（ｅ）神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ））（これは、特定のニューロン集団の変性を引き起こす）。神経損傷を含む状態としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化症、発作、糖尿病性多発ニューロパシー、中毒性ニューロパシー、ならびに、脳および脊髄の物理的傷害、または腕および手または身体の他の部位への挫傷もしくは切断傷害（発作におけるような、神経系の部分への血流の一時的または永続的な停止を含む）によって引き起こされるような、神経系への物理的傷害が挙げられる。
【０２７８】
従って、本発明は、神経損傷の予防、改善または処置を必要とする患者の身体内に細胞を移植することによって、神経損傷を予防、改善または処置する方法を包含し、この細胞は、アルテミンを産生するその天然での能力について選択されるかまたはアルテミンを分泌するように操作される。好ましくは、患者がヒトである場合には、分泌されるアルテミンは可溶性の成熟ヒトアルテミンである。移植片は、好ましくは、非免疫原性であり、および／または、移植された細胞の免疫原が免疫系によって認識されるのを妨げる。ＣＮＳ送達のために、移植片に好ましい位置は、脊髄の脳脊髄液である。
【０２７９】
１つの実施形態では、上記の５節におけるスクリーニングアッセイによって同定される化合物を使用して、アルテミンの活性または発現のレベルを調節し得る。具体的には、アルテミンのそのレセプターへの結合を刺激し得ると同定された化合物は、アルテミン活性の上昇レベルが所望される処置のために有用であり得る。同様に、アルテミン遺伝子発現を増加させ得ると同定された化合物は、刺激性の処置のために有用あり得る。
【０２８０】
１つの実施形態では、末梢神経損傷（特に、末梢感覚神経障害）に罹患している患者が、アルテミン投与によって処置される。特に、糖尿病性ニューロパシーに罹患している患者がアルテミン投与により処置されることが意図される。
【０２８１】
別の実施形態では、アルテミンは、傷害により誘導される病理学的変化から末梢ニューロンを保護するために患者に投与される。しかし、アルテミンが、傷害により誘導される病理学的変化から中枢神経および運動神経を保護するために患者に投与されることもまた意図される。
【０２８２】
さらに別の実施形態では、アルテミンは、癌の処置などにおいて、１つ以上の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される。アルテミンが、化学療法剤での処置前、化学療法剤での処置中、または化学療法剤での処置後に投与され得、その結果、神経損傷が予防または処置されることが意図される。好ましい化学療法剤としては、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキサート、３’−アジド−３’−デオキシチミジン、タキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｅｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））および／またはアントラサイクリン抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。製造業者による指示書が、このような化学療法剤についての調製および投薬スケジュールを決定するにおいて追従され得るか、またはこれらは、当業者によって経験的に決定され得る。このような化学療法の調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）に記載されている。
【０２８３】
治療に使用されるアルテミンの有効量は、例えば、治療上の難点、投与経路、および患者の状態に依存する。従って、最適な治療効果を得るために必要とされるように、投薬量を力価決定し、そして投与経路を改変することが、療法士に必要とされる。代表的には、臨床医は、所望される効果を達成する投薬量に到達するまでアルテミンを投与する。
【０２８４】
全身的処置のために代表的な一日投薬量は、上記で言及した要因に依存して、約０．０１ｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたはそれより多くの範囲であり得る。代替的な一般的提案として、アルテミンは、有効であるが過度に毒性ではないアルテミンのレベルを組織において確立し得る投薬量で処方され、そして標的部位または組織に送達される。この組織内濃度は、可能であるならば、持続的注入、持続放出、局所的適用、アルテミン発現細胞の移植、または経験的に決定される頻度での注射によって維持されるべきである。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。
【０２８５】
傷害により誘導される病理学的なニューロン変化は、好ましくは、約０．０１ｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇのアルテミンまたはアルテミンアゴニストの投与によって、哺乳動物において予防または処置される。１つの実施形態では、傷害により誘導されるニューロン変化は、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇのアルテミンまたはアルテミンアゴニストの投与によって、哺乳動物において予防または処置される。より好ましくは、約１ｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、そしてさらにより好ましくは、約１０ｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇのアルテミンまたはアルテミンアゴニストが投与される。別の実施形態では、傷害により誘導されるニューロン変化は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与によって、哺乳動物において予防または処置される。より好ましくは、約０．２５〜約１ｍｇ／ｋｇ、およびさらにより好ましくは、約０．７５〜約１ｍｇ／ｋｇのアルテミンまたはアルテミンアゴニストが投与される。アルテミン投与経路は、公知の方法に従う（例えば、静脈内、皮内、腹腔内、大脳内、筋内、眼内、動脈内、もしくは病変内の経路による注射もしくは注入、局所的投与、または持続放出系）。好ましい実施形態では、アルテミンは、静脈内、皮内、鞘内または皮下での注射によって投与される。しかし、別の実施形態では、アルテミンは局所的に投与される。
【０２８６】
投薬レジメンは、個々の状況に基づいて決定されなければならない。しかし、好ましい実施形態では、アルテミンまたはアルテミンアゴニストは、毎日、より好ましくは、一日おき、そしてさらにより好ましくは、１週間に少なくとも２回、投与される。処置は好ましくは、６ヶ月間、より好ましくは、１ヶ月間、そしてさらにより好ましくは、少なくとも２週間続けられる。当業者は、正確な投薬レジメンが、個々の状況に基づいて療法士により決定されなければならないことを理解する。
【０２８７】
１つの例では、アルテミンまたはアルテミンアゴニストは、糖尿病性ニューロパシーに罹患している患者に投与される。約０．５ｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間の用量が、少なくとも２週間にわたり、１週間につき少なくとも３回で静脈内注射によって投与される。患者は、この注射に関連する疼痛も痛覚過敏も受けない。
【０２８８】
（８．製造品）
別の局面では、本発明は、ニューロン損傷の処置または予防のために有用な物質を含む製造品を意図する。この製造品は、容器、およびこの容器上にあるかまたはこの容器に付属したラベルまたは添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、注射器などが挙げられる。この容器は、種々の物質（例えば、ガラスおよびプラスチック）から形成され得る。この容器は、アルテミンを含有する組成物、およびこの組成物が、約０．０１ｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与されるべきであることを示したラベルまたは添付文書を保持する。必要に応じて、このラベルはまた、この組成物が、ニューロン損傷の処置および／または予防のために有用であることを示し得る。
【実施例】
【０２８９】
（実施例１）
（全身性ＮＧＦは、温熱性および機械的な痛覚過敏を引き起こすが、アルテミンは引き起こさない）
熱性（ｔｈｅｒｍａｌ）および機械的な疼痛閾値に対するＮＧＦおよびアルテミンの効果を、全身送達の後に決定した。ＮＧＦ、アルテミン、または生理食塩水のいずれかを、雌性Ｆｉｓｃｈｅｒラットの首筋に皮下注射した。このラットは、予め馴らされており、そして有害な熱性または機械的な刺激に対するその撤退閾値（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を決定するために試験されていた。次いで、それらのラットを、処置から２時間後、２４時間後、または４８時間後に再試験した。その動物の処置に対して盲目である人物が、すべての試験を実施した。熱の撤退までの潜伏期（熱撤退潜伏期）（ｔｈｅｒｍａｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）を、ハーグリーブスの方法によって測定し、そして機械的な閾値を、フォンフライ毛の電気的バージョンを使用して測定した。ＮＧＦの用量は１ｍｇ／ｋｇであり、アルテミンの用量は５ｍｇ／ｋｇであった。図８および９に提示される結果は、明らかに、生理的食塩水のみで処置された動物と比較して、ＮＧＦで処置された動物において熱性の潜伏期および機械的閾値における迅速かつ長期に及ぶ減少を示しているが、アルテミンで処置された動物において有意な変化は示されない。図８は、ＮＧＦで処置された動物において熱の撤退までの潜伏期は、前処置での値の約７５％まで落ち込んだが、アルテミンで処置された動物においては、潜伏期はその前処置での値の９０％〜９５％に留まったことを示している。生理食塩水で処置された動物は、その前処置でのスコアの約９５％の試験潜伏期を示した。機械的感受性の試験において、ＮＧＦで処置された動物は、その撤退閾値は、その前処置でのレベルの約６０％まで落ち込んだが、生理食塩水またはアルテミンのいずれかで処置された動物は、徐々に、その前処置でのスコアの約９０％まで落ちた（図９）。
【０２９０】
（実施例２：ＮＧＦの局所投与は、温熱性痛覚過敏および機械的痛覚過敏を引き起こすが、アルテミンは引き起こさない）
熱疼痛閾値および機械的疼痛閾値の両方に対するＮＧＦおよびアルテミンの効果を、局所送達の後に決定した。ＮＧＦ、アルテミンまたは生理食塩水のいずれかを、予め順化された、雌性Ｆｉｓｃｈｅｒラットの一方の後足の足底表面に注入し、そして有害な熱刺激または機械的刺激に対するその撤退閾値を決定するために試験した。次にラットを、処置後８時間、２４時間、および４８時間で、再試験した。動物の処理について知らない人間が、全ての試験を実行した。熱撤退潜伏時間を、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓの方法を用いて測定し、そして機械的閾値を、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ毛の電子的バージョンを使用して測定した。ＮＧＦの用量は１ｇであり、アルテミンの用量は５ｇであった。図１０および１１に示される結果は、生理食塩水のみで処理した動物と比較して、ＮＧＦを用いて処理された動物における熱潜伏期間および機械的閾値における、迅速かつ長期の減少を明確に示すが、アルテミン処理した動物においては、顕著な変化を示さない。ＮＧＦで処理した動物における熱撤退潜伏期間は、２４時間で約６秒から約４．５秒まで下降したが、アルテミンまたは生理食塩水で処置した動物における潜伏期間は、前処理値の６秒のままであった（図１０）。機械的感受性の試験において、ＮＧＦで処置した動物は、前処理値の２７ｇから約２２ｇまで撤退閾値が下降したが、生理食塩水またはアルテミンのいずれかで処置した動物においては、この撤退閾値は有意に下降しなかった（図１１）。
【０２９１】
（実施例３：全身のＮＧＦ処置は体重の減少を引き起こすが、アルテミンは引き起こさない）
体重減少を、ＮＧＦ、アルテミンまたは生理食塩水での全身処置により誘導される慢性疼痛の一般基準として使用した。雌性Ｆｉｓｃｈｅｒラットを、ＮＧＦ（１ｍｇ／ｋｇ）、アルテミン（５ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水で１週間に１回処置した。頸部筋の皮下に送達した。１回目の注射前、および処置の１週間後および２週間後に動物の体重を測定した。図１２で見られるように、ＮＧＦで処置した動物は、２週間で約７％体重が減少したが、アルテミンまたは生理食塩水のいずれかで処置した動物は、開始体重の２％未満の減少だった。
【０２９２】
（実施例４：アルテミン処置は、疼痛関連挙動の発生を減少する）
神経障害性疼痛に対するアルテミンの効果を、ラットにおける予備神経損傷モデルを使用して評価した。このモデルにおいて、頸骨神経および腓骨神経を切断し、そして坐骨三分枝のちょうど末端に連結し、そして、腓腹神経および伏在神経は無処置のままとした。これは、後肢の上端および足底表面を除神経し、そして、持続性の神経障害性疼痛状態を引き起こす。手術直後に開始するために、１週間に３回、アルテミン（５ｇ）、ＮＧＦ（５ｇ）または生理食塩水（各々、２０ｌ）を足底内注射して、動物を処置した。処置した動物を、神経が露出されているが切断も連結もされていない偽動物と比較した。自発的な疼痛挙動を、処置の１２日後に測定した。小さなＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ箱に配置し、そして、足の保護、持ち上げ、または振ることの全ての場合を、５分間隔でカウントした。正常な動物または偽性の手術動物は、このような挙動が非常に低速度であるが、予備神経損傷動物は、これらの挙動を相対的に高頻度で示す。図１３で見られるように、ＮＧＦを用いた一定の処置は、生理食塩水で処置した手術したラットと比較して、手術の１２日後にこれらの挙動の頻度を増大する。一方、アルテミンでの処置は、これらの疼痛挙動の発生を減少する（図１３）。
【０２９３】
（実施例５：アルテミンおよびＮＧＦの両方は単純ヘルペスウイルスにより誘導される死から成体ＤＲＧニューロンを保護する）
ＮＧＦまたはアルテミンの単純ヘルペスウイルスにより誘導される死からニューロンを保護する能力を、インビトロで評価した。成体ラット脊髄神経節由来のニューロンを、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、アルテミン（１ｇ／ｍｌ）、または基本的培地の存在下で１１日間培養し、次いで、異なる濃度の単純ヘルペスウイルスで感染させた。感染の２日後の生存細胞をカウントした。図１４は、ＮＧＦおよびアルテミンの両方が、ウイルスの毒性作用からニューロンを保護したことを示す。
【０２９４】
（実施例６：アルテミン処置は、脊髄の後角中の軸索切断により誘導されるサブスタンスＰの損失を防止する）
損傷に関連した病的変化から細線維感覚ニューロンを保護するアルテミンの能力を、通常軸索切断後に生じる感覚神経ペプチドの減少に対するアルテミン投与の効果を検査することで、試験した。脊髄の後角の表層への細線維感覚ニューロンの中央の突起を、感覚ニューロンの線維内に含まれる種々の神経ペプチドの存在により可視化し得る。座骨神経の切断後、この層におけるペプチド含量は、線維の脱離症状および線維中のペプチド含量の減少との組合せに起因して、減少する。アルテミン（１２ｇ／日）のクモ膜下腔内間への送達は、本質的にこの減少を完全にブロックする。図１５において、サブスタンスＰについて染色した脊髄後角の切片を示す。生理食塩水処置した動物において、対側と比較して、軸索切断と同側での染色強度は減少している一方、この強度の差異は、アルテミン処置側では本質的に消滅する。
【０２９５】
図１６は、この結果を定量する方法を示す。平均染色強度を、後角の上端で始まる１５０個の１ピクセル幅のストライプにおいて測定する。簡単に言うと、バーを、図示するように、後角の中間領域および中外側領域に配置する。各垂直方向のバーは、１５０の水平方向のピクセル幅の線からなる。各線に沿う平均強度を算出した。従って、後角下の深さにより染色強度の差を導いた。次いで、これらの値を、対側の無傷の後角染色強度の％として表し、そして図１６にプロットした。
【０２９６】
図１７において、１つの座骨神経切断を有するラットについて、サブスタンスＰ染色の強度（Ｙ軸）を後角の表面からの深さ（Ｘ軸）に対してプロットした。坐骨損傷側では、手術していない側と比較して、後角でのサブスタンスＰ免疫染色が有意に減少する。連続注射を介して、アルテミン１２ｇ／日をクモ膜下腔に処置した動物において、この軸索切断により誘導されるペプチドの減少が防止される。
【０２９７】
（実施例７）
（アルテミンは、軸索切断後のＣ線維導電速度の変化を防ぐ）
図１８は、坐骨神経のＣ線維導電速度のＱの合計プロットを示す。ラットを、片側坐骨神経切断に供し、１週間回復させた。この週の間に、ラットを、１２ｇ／日の用量の連続的な髄腔内注入によって、生理食塩水またはアルテミンのいずれかで処置した。坐骨神経切断または偽手術の７日後、動物を、ウレタンで麻酔し、そして椎弓切除を行って、ランバー領域の後根を曝露した。Ｌ４およびＬ５の後根を、個々の線維に掻き裂き（ｔｅａｓｅｄ）、そして個々の線維の活動電位を、坐骨神経を刺激することによって同定した。個々のＣ線維に対する導電速度を、１００〜２００線維／動物について決定した。初期研究との一致において、軸索切断および生理食塩水での処置は、軸索切断後のＣ線維の導電速度の緩徐化に対応して、Ｑの合計曲線（図１８）において、明確な左側へのシフトを生じた。しかしながら、軸索切断し、そしてアルテミンで処置した動物は、非常にわずかなシフトを示し、このことは、損傷からの保護が導電速度のシフトを誘導することを示す。
【０２９８】
（実施例８）
（新生期ＤＲＧニューロンのアルテミンにより誘導される生存は、ＧＦＲ３を必要とする）
野生型マウスまたはＧＦＲ３欠損マウス由来の新生期ニューロンを、脊髄神経節から分離し、そして２４時間培地中に置いた。生存細胞を、この時間の終わりに計数した。野生型動物由来の培地において、アルテミンは、因子を添加しなかったものと比較して、多数のニューロンの生存を可能にした（図１９）。しかしながら、図１９に示されるように、ＧＦＲ３ノックアウトマウスのニューロンにおいて、アルテミンの添加によって、コントロール培地において見られる生存を上回るさらなる生存は生じなかった。一方、ＮＧＦは、野生型マウスのニューロンとノックアウトマウスのニューロンとの両方において、類似の程度まで生存を誘導した。このことは、新生期ニューロン生存に対するアルテミンの効果がＧＦＲ３の機能を必要とすることを示している。
【０２９９】
（実施例９）
（ＧＦＲ３は、軸索切断後のほとんど全ての小細胞に存在する）
約４０％の脊髄神経節（ＤＲＧ）細胞が、ＧＦＲ３  ｍＲＮＡを発現する。ＧＦＲ３を発現するＤＲＧ細胞の大部分は、小さい直径の細胞である。図２０に見られるように、末梢神経損傷は、ＧＦＲ３発現のアップレギュレートを誘導し、その結果、ほとんど全ての小さいＤＲＧ細胞は、レセプターを発現する（全細胞の６６％）。遠位断端において、アルテミンのアップレギュレートが付随する。これらのデータは、アルテミンが、損傷した小さい感覚性ニューロンに対する神経保護活性を有し得ることを示唆する。
【０３００】
（実施例１０）
（末梢に送達されたアルテミンは、カプサイチン由来のペプチド作用性ニューロンを保護する）
ラットを、全身性カプサイチン（５０ｍｇ／ｋｇ）で処置して、小さい直径の線維に損傷を与えた。数匹の動物を、アルテミン（５ｇの送達移植片（ｉｎｔｒａｐｌａｎｔａｒ））で５日間にわたって毎日処置した。５日後、脊髄を取り除き、後角の外側領域および中央領域を、サブスタンＰの免疫反応性について染色した。図２１に示されるように、カプサイチン処置は、この後角の外側領域および中央領域の両方のサブスタンＰ含量における顕著な欠損を引き起こした。外側後角における欠損を、アルテミンの足への投与によって完全にブロックし、一方、このアルテミンの足への投与により、中央後角におけるサブスタンＰの過剰なレベルを得た。従って、抹消アルテミン投与は、カプサイチンの有害な影響に由来する、後角中への感覚ニューロン突出のペプチド含量を完全に保護した。
【０３０１】
（実施例１１）
（ＩＣＶアルテミンは、坐骨軸索切断後の後角サブスタンＰの欠損を防止する）
マウスの側脳室に、カニューレを用いて移植し、左坐骨神経を切断した。アルテミンまたはビヒクルのいずれかを、浸透圧ミニポンプを備えるカニューレを介して、１２ｇ／日の割合で注入した。８日後、脊髄を取り除き、後角の外側領域および中央領域を、サブスタンＰの免疫反応性について染色した。図２２は、ビヒクルで処置した、軸索切断した動物が、コントロール側（緑色）と比較して、病変側（青色）でのサブスタンＰに対する染色強度の損失を示したことを示す。この影響は、坐骨神経の公知の突出パターンを維持する際に、中央後角において最も明白であった。アルテミン注入は、病変側（赤色）でのサブスタンＰのこの欠損を大いに防止し、かつコントロール側（黒色）で染色したペプチドの増加を引き起こした。
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】図１は、成熟ヒトアルテミンのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】図２は、全長ヒトアルテミンの１形態のポリヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３】図３は、図２のポリヌクレオチド配列によってコードされるヒトアルテミンの形態のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】図４は、ヒトアルテミンの第２の改変体をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図５】図５は、図４のポリヌクレオチド配列によってコードされるヒトアルテミン改変体のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図６】図６は、マウス由来の全長アルテミンをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図７】図７は、図６のポリヌクレオチド配列によってコードされるマウスアルテミンのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図８】図８は、ＮＧＦおよびアルテミンで、全身処置された動物における、熱撤退潜伏期間を示す。ＮＧＦ処置動物において、熱撤退潜伏期間が、処置前の値の約７５％に減少した一方、アルテミンで処置された動物における潜伏期間は、減少しなかった。
【図９】図９は、機械的感受性の試験を示す。ＮＧＦで全身処置された動物は、処置前のレベルの約６０％に減少した撤退閾値を有する一方、生理食塩水またはアルテミンのいずれかで処置された動物は、処置前のスコアの約９０％に徐々に減少した
【図１０】図１０は、ＮＧＦおよびアルテミンで、局所的に処置された動物における熱撤退潜伏期間を示す。ＮＧＦで処置された動物において熱撤退潜伏期間は、減少したが、アルテミンで処置された動物において熱撤退潜伏期間は、処置前レベルのままであった。
【図１１】図１１は、機械的感受性の試験を示す。ＮＧＦで局所的に処置された動物において、撤退閾値が処置前の値の２７ｇから約２２ｇまで減少したのに対して、生理食塩水またはアルテミンのいずれかで局所的に処置された動物において、撤退閾値は、目に見える程には減少しなかった。
【図１２】図１２は、ＮＧＦで処置された動物が、２週間で、その体重の約７％を減少したのに対して、アルテミンまたは生理食塩水のいずれかで処置された動物は、その体重の２％未満減少したことを示す。
【図１３】図１３は、ＮＧＦでの定常処置が、与えられた（ｓｐａｒｅｄ）神経損傷を有するラットにおける疼痛挙動の頻度を上昇したのに対して、アルテミンでの処置は、疼痛挙動の発生率を減少したことを示す。
【図１４】図１４は、ＮＧＦおよびアルテミンの両方が、単純ヘルペスウイルス誘導死からニューロンを保護することを示す。
【図１５】図１５は、アルテミン処置が、坐骨神経離断後に見られる小感覚ニューロンのペプチド含量の減少を発することを示す。
【図１６】図１６は、ペプチド作動性含量を定量する方法を示す。各線に沿った染色の平均強度を計算することによって、後角下の深さによる染色強度の変化を計算した。
【図１７】図１７は、坐骨神経損傷を有するラットに関する後角の表面からの深さに対してプロットしたサブスタンスＰ染色の強度を示す。アルテミンは、軸索切断誘導性ペプチド損失を阻止する。
【図１８】図１８は、アルテミンが、Ｃ線維伝導速度における軸索切断誘導性シフトからニューロンを保護することを示す。
【図１９】図１９は、新生児ニューロン生存に対するアルテミンの生存強化効果が、ＧＦＲα３の機能を要求することを示す。ＧＦＲα３ノックアウトマウスからのニューロンにおいて、アルテミンの添加は、コントロールで見られる生存を越える生存増加を引き起こさなかった。
【図２０】図２０は、末梢神経損傷が、ほとんどの小ＤＲＧ細胞がレセプターを発現するように、ＧＦＲα３発現におけるアップレギュレーションを誘導することを示す。アルテミンの同時にアップレギュレーションは、遠位断端において見られる。
【図２１】図２１は、カプサイシン処置が、内側後角および外側後角におけるサブスタンスＰ含量の深い欠乏を起こすことを示す。アルテミン投与は、後角への感覚ニューロン突起のペプチド含量を完全に保護する。
【図２２】図２２は、脳室へのアルテミン注入が、坐骨神経離断に関連するサブスタンスＰの損失を阻止することを示す。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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