(57)【要約】      （修正有）【課題】観察対象の位置からの光を高精度で検出する顕微鏡を提供する。【解決手段】顕微鏡１は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって光を放射する試料Ｓに対して、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを照射する対物レンズ２０と、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域に第１光Ｌ１が入射し、かつ対物レンズの瞳面において第１領域の少なくとも一部と重複しない第２領域に第２光Ｌ２が入射するように、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定する光路設定部１４と、試料からの光を検出する検出部６，７と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１光と第２光との照射によって光を放射する試料に対して、前記第１光と前記第２光とを照射する対物レンズと、
前記対物レンズの瞳面における第１領域に前記第１光が入射し、かつ前記対物レンズの瞳面において前記第１領域の少なくとも一部と重複しない第２領域に前記第２光が入射するように、前記第１光の光路と前記第２光の光路とを設定する光路設定部と、
前記試料からの光を検出する検出部と、を備える顕微鏡。
【請求項２】
前記第１領域と前記第２領域とは互いに重複しないように設定される、請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記第１領域および前記第２領域は、それぞれ、前記対物レンズの光軸を中心とする円を周方向に分割した領域を含む、請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記第１領域および前記第２領域は、それぞれ、前記対物レンズの光軸を中心とする円を径方向に分割した領域の少なくとも一部を含む、請求項１から請求項３の少なくとも一項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記光路設定部は、前記第１光と前記第２光とで共通する光路に設けられ、前記第１光と前記第２光とが選択的に透過する選択部を備える、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記選択部は、
前記対物レンズの瞳共役面において前記第１領域と共役な位置に配置され、前記第１光が透過し前記第２光を遮る第１選択部と、
前記対物レンズの瞳共役面において前記第２領域と共役な位置に配置され、前記第２光が透過し前記第１光を遮る第２選択部と、を備える、請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記第１選択部は、前記第１光の波長に対する透過率が前記第２光の波長に対する透過率よりも高く、
前記第２選択部は、前記第２光の波長に対する透過率が前記第１光の波長に対する透過率よりも高い、請求項６に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記選択部は、
前記対物レンズの瞳共役面に配置され、光の遮光状態と透過状態とを領域ごとに可変なマスクと、
前記マスクの前記遮光状態と前記透過状態とを制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記第１光が前記マスクに入射する際に、前記マスクにおいて前記第１領域と共役な位置を前記透過状態に制御し、前記マスクにおいて前記第２領域と共役な位置を前記遮光状態に制御し、
前記第２光が前記マスクに入射する際に、前記マスクにおいて前記第１領域と共役な位置を前記遮光状態に制御し、前記マスクにおいて前記第２領域と共役に位置な前記透過状態に制御する、請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記マスクは空間光変調器を含む、請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記光路設定部は、
前記第１光の光路のうち前記第２光の光路と重複しない位置に配置され、前記第２領域と光学的に共役な領域において前記第１光を遮る第１マスクと、
前記第２光の光路のうち前記第１光の光路と重複しない位置に配置され、前記第１領域と光学的に共役な領域において前記第２光を遮る第２マスクと、を備える、請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記第１光と前記第２光とのうち、一方の光は前記試料に含まれる蛍光物質を活性状態にする活性化光であり、他方の光は前記活性状態の前記蛍光物質を励起する励起光である、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記活性状態の前記蛍光物質を不活性状態にする不活性化光を前記試料に照射し、
前記活性化光の照射タイミング、前記励起光の照射タイミング、及び前記不活性化光の照射タイミングを制御する制御部を備える、請求項１１に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記制御部は、前記活性化光と前記励起光とを前記試料に照射させて前記試料からの蛍光の検出を前記検出部に実行させた後に、前記試料に前記不活性化光を照射させる、請求項１２に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記試料を前記第１光と前記第２光とで走査する走査部と、
前記走査部を制御する制御部と、を備える請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記走査部によって前記第１光および前記第２光が前記試料に入射する位置の情報と、前記検出部の検出結果とに基づいて前記試料の画像を生成する処理部を備える、請求項１４に記載の顕微鏡。
【請求項１６】
第１光と第２光との照射によって光を放射する試料に対して、前記第１光と前記第２光とを対物レンズから照射することと、
前記対物レンズの瞳面における第１領域に前記第１光が入射し、かつ前記対物レンズの瞳面において前記第１領域の少なくとも一部と重複しない第２領域に前記第２光が入射するように、前記第１光の光路と前記第２光の光路とを設定することと、
前記試料からの光を検出することと、を含む観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡および観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含まれる蛍光物質からの蛍光を検出する顕微鏡が知られている（例えば、下記の非特許文献１、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ingaramo M、他４名、“Two-photon-like microscopy with orders-of-magnitude lower illumination intensity via two-step fluorescence.”、２０１５年９月３日、Nature Communications vol. 6, Article number 8184
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様に従えば、第１光と第２光との照射によって光を放射する試料に対して、第１光と第２光とを照射する対物レンズと、対物レンズの瞳面における第１領域に第１光が入射し、かつ対物レンズの瞳面において第１領域の少なくとも一部と重複しない第２領域に第２光が入射するように、第１光の光路と第２光の光路とを設定する光路設定部と、試料からの光を検出する検出部と、を備える顕微鏡が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様に従えば、第１光と第２光との照射によって光を放射する試料に対して、第１光と第２光とを対物レンズから照射することと、対物レンズの瞳面における第１領域に第１光が入射し、かつ対物レンズの瞳面において第１領域の少なくとも一部と重複しない第２領域に第２光が入射するように、第１光の光路と第２光の光路とを設定することと、試料からの光を検出することと、を含む観察方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図２】第１実施形態に係る対物レンズの瞳面および光路設定部を示す図である。
【図３】第１実施形態に係る第１光の光路および第２光の光路を示す図である。
【図４】実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。
【図５】変形例に係る第１領域、第２領域、及び背景光のレベルを示す図である。
【図６】変形例に係る第１領域および第２領域を示す図である。
【図７】変形例に係る光路設定部を示す図である。
【図８】第２実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図９】第２実施形態に係る対物レンズの瞳面および光路設定部を示す図である。
【図１０】第２実施形態に係る第１光の光路および第２光の光路を示す図である。
【図１１】第３実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図１２】第３実施形態に係る光路設定部を示す図である。
【図１３】第３実施形態に係る制御部の動作を示すタイミングチャートである。
【図１４】第４実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図１５】第４実施形態に係る活性化光、励起光、及び不活性化光を示す図である。
【図１６】実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。
【図１７】第５実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
［第１実施形態］
第１実施形態について説明する。図１は、本実施形態に係る顕微鏡を示す図である。顕微鏡１（顕微鏡システム）は、蛍光物質で標識（ラベル）された試料Ｓの蛍光観察に利用される。顕微鏡１は、試料Ｓに含まれる蛍光物質が発する蛍光を検出する。顕微鏡１は、走査型の共焦点顕微鏡および多光子励起顕微鏡として利用可能である。
【０００８】
試料Ｓは、生きた細胞（ライブセル）を含んでもよいし、ホルムアルデヒド溶液等の組織固定液を用いて固定された細胞を含んでもよく、組織等でもよい。試料Ｓは、観察対象物を保持する保持部材（例、カバーガラス、シャーレ）を含んでいてもよい。
【０００９】
上記の蛍光物質は、例えば、フォトスイッチャブル  プローブ（ＰＰ）を含む。蛍光物質は、例えば、活性化光が照射されることで不活性状態から活性状態に遷移する。蛍光物質は、活性状態において励起光が照射されることによって、基底状態から励起状態に遷移する。蛍光物質は、励起状態において蛍光を発して、基底状態に遷移する。また、蛍光物質は、不活性化光が照射されることによって活性化状態から不活性状態に遷移する。不活性状態において、蛍光物質は、励起光が照射されても励起状態に遷移せず、蛍光を発しない。不活性化光は、励起光と同じ波長である場合もあるし、励起光と異なる波長である場合もある。
【００１０】
上記の蛍光物質は、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料等の蛍光色素でもよいし、蛍光タンパク質でもよい。試料Ｓに含まれる蛍光物質の種類は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。本実施形態では、標識に用いられる蛍光物質が１種類であるとする。蛍光色素は、例えば、レポータ色素を含む。レポータ色素は、活性状態において励起光を受けた場合に蛍光を発する。蛍光色素は、例えば、アクティベータ色素を含む。アクティベータ色素は、活性化光を受けてレポータ色素を活性状態にする。蛍光色素がアクティベータ色素を含まない場合、レポータ色素は、活性化光を受けて活性状態になる。
【００１１】
蛍光色素は、例えば、２種類のシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料を結合させた染料対（例、Ｃｙ３−Ｃｙ５染料対（Ｃｙ３、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ２−Ｃｙ５染料対（Ｃｙ２、Ｃｙ５は登録商標）、Ｃｙ３−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７染料対（Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））、１種類の染料（例、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒは登録商標））である。蛍光タンパク質は、例えばＰＡ−ＧＦＰ、Ｄｒｏｎｐａなどである。
【００１２】
顕微鏡１は、第１光源２、第２光源３、照明光学系４、検出光学系５、検出部６、検出部７、ステージ８、処理部９、及び制御部１０を備える。第１光源２は、第１光Ｌ１を発する。第１光Ｌ１は、例えば、蛍光物質を活性状態にする活性化光である。第１光源２は、例えば、ＬＤ（レーザダイオード）あるいはＬＥＤ（発光ダイオード）などの固体光源を含む。第２光源３は、第２光Ｌ２を発する。第２光Ｌ２は、例えば、第１光Ｌ１と波長が異なる。第２光Ｌ２は、例えば、活性状態の蛍光物質を励起する励起光である。第２光源３は、例え、ばＬＤ（レーザダイオード）あるいはＬＥＤ（発光ダイオード）などの固体光源を含む。
【００１３】
試料Ｓに含まれる蛍光物質は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって蛍光を発する。例えば、蛍光物質は、第１光Ｌ１が照射されて活性化状態となり、さらに第２光Ｌ２が照射されて励起状態になることで、蛍光を発する。試料Ｓに含まれる蛍光物質は、例えば、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とが照射されることによって、選択的に蛍光を発する。例えば、試料Ｓに含まれる蛍光物質は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との一方が照射されない場合に、所望の蛍光を発生しない。なお、第１光Ｌ１が励起光であって第２光Ｌ２が活性化光でもよい。
【００１４】
照明光学系４は、照明光を試料Ｓへ導き、照明光で試料Ｓを照明する。上記の照明光は、第１光源２からの第１光Ｌ１と、第１光源２と異なる第２光源３からの第２光Ｌ２とを含む。照明光学系４は、第１光源２の光出射側に配置されたミラー１１、及び第２光源３の光出射側に配置されたミラー１２を備える。
【００１５】
ミラー１１およびミラー１２は、第１光源２からの第１光Ｌ１と第２光源からの第２光Ｌ２とを同じ光路へ導く導光部である。ミラー１１は、例えば折り曲げミラーである。第１光源２からの第１光Ｌ１は、ミラー１１で反射して光路が折れ曲がり、ミラー１２に入射する。ミラー１２は、例えば、ダイクロイックミラーである。ミラー１２は、第１光Ｌ１が透過し、第２光Ｌ２が反射する特性を有する。ミラー１２に入射した第１光Ｌ１は、ミラー１２を透過する。ミラー１２に入射した第２光Ｌ２は、ミラー１２で反射して、第１光Ｌ１と同じ光路を通る。
【００１６】
また、照明光学系４は、ミラー１２から試料Ｓへ向かう順に、レンズ１３、光路設定部１４、レンズ１５、ミラー１６、走査部１７、レンズ１８、ミラー１９、及び対物レンズ２０を備える。以下の説明において、パワーを有する光学部材（例、レンズ）の焦点について、適宜、光学部材に対して試料Ｓと同じ側の焦点を試料側の焦点と称し、光学部材に対して試料Ｓと反対側の焦点を光源側の焦点と称する。レンズ１３は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２を、それぞれ瞳共役面Ｐ１に導く。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれ、レンズ１３で屈折して瞳共役面Ｐ１に入射する。瞳共役面Ｐ１は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０と光学的に共役な面である。瞳共役面Ｐ１は、例えば、レンズ１３の光軸に垂直であって、レンズ１３の試料側の焦点を含む面である。
【００１７】
光路設定部１４は、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定する。光路設定部１４は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで共通する光路に設けられる選択部２１を備える。選択部２１は、例えば、ミラー１２と対物レンズ２０との間の光路に配置される。選択部２１は、例えば、瞳共役面Ｐ１の位置またはその近傍に配置される。選択部２１は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とが選択的に透過する特性を有する。選択部２１は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで共通する光路に対して、固定されていてもよいし、挿脱可能に設けられてもよい。
【００１８】
図２（Ａ）は、本実施形態に係る対物レンズの瞳面を示す図である。光路設定部１４（図１参照）は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１に第１光Ｌ１が入射するように、第１光Ｌ１の光路を設定する。第１領域Ａ１の外縁の位置は、例えば、瞳面Ｐ０における第１光Ｌ１の光強度分布において、第１光Ｌ１の強度がピーク値の１／ｅ２になる位置である。
【００１９】
また、光路設定部１４（図１参照）は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２に第２光Ｌ２が入射するように、第２光Ｌ２の光路を設定する。第２領域Ａ２の外縁の位置は、例えば、瞳面Ｐ０における第２光Ｌ２の光強度分布において、第２光Ｌ２の強度がピーク値の１／ｅ２になる位置である。第１領域Ａ１は、例えば、瞳面Ｐ０における第１光Ｌ１の光強度分布の重心が第２領域Ａ２の外側になるように、設定される。また、第２領域Ａ２は、瞳面Ｐ０における第２光Ｌ２の光強度分布の重心が第１領域Ａ１の外側になるように、設定される。
【００２０】
第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とは、例えば、互いに重複しないように設定される。図２において、第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａ（照明光学系４の光軸）を中心する円を周方向に分割した扇状の領域を含む。例えば、第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心する円を２分割した扇状（半円状）の領域である。第２領域Ａ２は、対物レンズ２０の光軸２０Ａを含む線を境界として、第１領域Ａ１と接している。
【００２１】
図２（Ｂ）は、本実施形態に係る光路設定部（選択部）を示す図である。選択部２１は、第１選択部２１Ａおよび第２選択部２１Ｂを備える。第１選択部２１Ａは、瞳共役面Ｐ１（図１参照）において第１領域Ａ１と光学的に共役な位置に配置される。第１選択部２１Ａは、例えば、第１領域Ａ１と相似な形状（例、扇状、半円状）である。第１選択部２１Ａは、図１の第１光Ｌ１が透過し第２光Ｌ２を遮る特性を有する。第１選択部２１Ａは、例えば波長選択性を有するフィルタあるいはダイクロイックミラーを含む。第１選択部２１Ａは、第１光Ｌ１の波長に対する透過率が第２光Ｌ２の波長に対する透過率よりも高い。
【００２２】
第２選択部２１Ｂは、瞳共役面Ｐ１（図１参照）において第２領域Ａ２と光学的に共役な位置に配置される。第２選択部２１Ｂは、例えば、第２領域Ａ２と相似な形状（例、扇状、半円状）である。第２選択部２１Ｂは、例えば、照明光学系４の光軸４Ａ（レンズ１３の光軸）を通る直線を境界として、第１選択部２１Ａと接している。第２選択部２１Ｂは、図１の第２光Ｌ２が透過し第１光Ｌ１を遮る特性を有する。第２選択部２１Ｂは、例えば波長選択性を有するフィルタあるいはダイクロイックミラーを含む。第２選択部２１Ｂは、第２光Ｌ２の波長に対する透過率が第１光Ｌ１の波長に対する透過率よりも高い。
【００２３】
選択部２１において、第１選択部２１Ａと第２選択部２１Ｂとを除いた部分は、例えば遮光部２２である。遮光部２２は、例えば、第１光Ｌ１を遮り、かつ第２光Ｌ２を遮る特性を有する。遮光部２２は、第１光Ｌ１の波長に対する透過率が第１選択部２１Ａよりも低い。例えば、第２選択部２１Ｂおよび遮光部２２は、それぞれ、第１光Ｌ１を遮ることで、対物レンズ２０の試料側の焦点に入射する際の第１光Ｌ１の方位角を定める。また、遮光部２２は、第２光Ｌ２の波長に対する透過率が第２選択部２１Ｂよりも低い。例えば、第１選択部２１Ａおよび遮光部２２は、それぞれ、第２光Ｌ２を遮ることで、対物レンズ２０の試料側の焦点に入射する際の第２光Ｌ２の方位角を定める。
【００２４】
図１の説明に戻り、光路設定部１４（選択部２１）を通った第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれ、レンズ１５に入射する。レンズ１５は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２を、対物レンズ２０の試料側の焦点と共役な位置ＦＰ１に導く。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、レンズ１５で屈折して、対物レンズ２０の試料側の焦点と共役な位置ＦＰ１に入射する。第１光および第２光Ｌ２は、それぞれ、レンズ１５を通った後にミラー１６に入射する。ミラー１６は、例えばダイクロイックミラーである。ミラー１６は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が反射し、試料Ｓで発生した蛍光Ｌ５（後述する）が透過する特性を有する。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれミラー１６で反射し、走査部１７に入射する。
【００２５】
走査部１７は、試料Ｓを第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで走査する。走査部１７は、例えば、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを、対物レンズ２０の光軸２０Ａと交差する２方向に偏向させる。走査部１７は、例えば、対物レンズ２０の光軸に対する傾きが可変の偏向ミラー２４（走査ミラー）を含む。偏向ミラー２４は、例えば、ガルバノミラーとＭＥＭＳミラーとの少なくとも一方を含む。偏向ミラー２４は、例えば、対物レンズ２０の試料側の焦点と光学的に共役な位置ＦＰ１またはその近傍に配置される。偏向ミラー２４で反射した第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれ、レンズ１８に入射する。
【００２６】
レンズ１８は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２をそれぞれ対物レンズ２０の瞳面Ｐ０に導く。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれ、レンズ１８で屈折して対物レンズ２０の瞳面Ｐ０に入射する。レンズ１８は、例えば、その試料側の焦点が対物レンズ２０の瞳面Ｐ０と一致するように配置される。レンズ１８を通った第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれ、ミラー１９に入射する。ミラー１９は、例えばダイクロイックミラーである。ミラー１９は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が透過し、試料Ｓで発生した蛍光Ｌ６（後述する）が反射する特性を有する。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、それぞれミラー１９を透過して対物レンズ２０に入射する。
【００２７】
対物レンズ２０は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって光を放射する試料Ｓに対して、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを照射する。対物レンズ２０は、照明光（第１光Ｌ１および第２光Ｌ２）によって、試料Ｓを照明する。対物レンズ２０は、その試料側の焦点が試料Ｓにおける観察対象の位置に配置されるように、対物レンズ２０の光軸方向において試料Ｓとの相対位置が調整される。例えば、ステージ８は、対物レンズ２０の光軸方向に移動可能であり、光軸方向において、試料Ｓと対物レンズ２０との相対位置を調整する。上記の光軸方向は、対物レンズ２０の光軸２０Ａと平行な方向である。
【００２８】
なお、対物レンズ２０は、対物レンズ２０の光軸方向に移動可能でもよい。この場合、対物レンズ２０は、対物レンズ２０と試料Ｓとの相対位置を調整してもよい。また、ステージ８は、例えばＸＹＺステージ、ＸＹステージ、Ｘステージのように、対物レンズ２０の光軸方向に交差する１方向または２方向に移動可能でもよい。
【００２９】
図３は、本実施形態に係る第１光の光路および第２光の光路を示す図である。図３（Ａ）に示すように、第１光源２からの第１光Ｌ１は、選択部２１に入射する。選択部２１のうち第１選択部２１Ａに入射した第１光Ｌ１は、第１選択部２１Ａを通って、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１に入射する。選択部２１のうち第２選択部２１Ｂに入射した第１光Ｌ１は、第１選択部２１Ａによって遮られ、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０に向かう光路から除かれる。選択部２１のうち第２選択部２１Ｂに入射した第１光Ｌ１は、その少なくとも一部が第２領域Ａ２に入射しない。
【００３０】
図３（Ｂ）に示すように、第２光源３からの第２光Ｌ２は、選択部２１に入射する。選択部２１のうち第２選択部２１Ｂに入射した第２光Ｌ２は、第２選択部２１Ｂを通って、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２に入射する。選択部２１のうち第１選択部２１Ａに入射した第２光Ｌ２は、第１選択部２１Ａによって遮られ、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０に向かう光路から除かれる。選択部２１のうち第１選択部２１Ａに入射した第２光Ｌ２は、その少なくとも一部が第１領域Ａ１に入射しない。
【００３１】
図３（Ｃ）において、符号ＦＰは、対物レンズ２０の試料側の焦点である。第１光Ｌ１および第２光Ｌ２は、焦点ＦＰに対して互いに異なる方位から焦点ＦＰに入射する。焦点ＦＰおよびその近傍における蛍光物質は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２の双方が照射されることによって、蛍光を発する。図３（Ｃ）において、符号Ｚ１および符号Ｚ２は、対物レンズ２０の光軸２０Ａに平行な方向において、焦点ＦＰから離れた位置である。位置Ｚ１あるいは位置Ｚ２において、第１光Ｌ１の光路は、その少なくとも一部が第２光Ｌ２の光路と空間的に分かれている。位置Ｚ１あるいは位置Ｚ２における蛍光物質は、第１光Ｌ１または第２光Ｌ２が照射されないことによって、蛍光の発生が低減される。
【００３２】
図１の説明に戻り、試料で発生した蛍光の検出について説明する。まず、検出部６による蛍光の検出について説明する。検出光学系５は、試料Ｓからの蛍光Ｌ５を検出部６へ導く。蛍光Ｌ５は、例えば、１光子励起によって発生する蛍光（基本波の蛍光）である。検出光学系５は、試料Ｓから検出部６に向かう順に、対物レンズ２０、ミラー１９、レンズ１８、走査部１７、ミラー１６、レンズ３１、絞り部材３２、レンズ３３、及びフィルタ３４を備える。試料Ｓで発生した蛍光Ｌ５は、対物レンズ２０を通って、ミラー１９に入射する。ミラー１９（例、ダイクロイックミラー）は、蛍光Ｌ５が透過する特性を有する。蛍光Ｌ５は、ミラー１９を透過してレンズ１８に入射し、レンズ１８を通って走査部１７（偏向ミラー２４）に入射する。蛍光Ｌ５は、偏向ミラー２４で反射してミラー１６に入射する。
【００３３】
ミラー１６（例、ダイクロイックミラー）は、蛍光Ｌ５が透過する特性を有する。蛍光Ｌ５は、ミラー１６を通ってレンズ３１に入射する。レンズ３１は、蛍光Ｌ５を、対物レンズ２０の試料側の焦点と光学的に共役な位置ＦＰ２に集光する。絞り部材３２は、対物レンズ２０の試料側の焦点（図３（Ｂ）の焦点ＦＰ）と光学的に共役な位置ＦＰ２に、例えばピンホールなどの開口３２Ａを有する。試料側の焦点からの蛍光Ｌ５は、絞り部材３２の開口３２Ａを通ってレンズ３３に入射する。試料側の焦点とずれた位置（例、図３（Ｂ）の位置Ｚ１、位置Ｚ２）からの蛍光Ｌ５は、その少なくとも一部が絞り部材３２における開口３２Ａの周囲の遮光部によって遮られる。
【００３４】
レンズ３３は、蛍光Ｌ５を検出部６の受光位置（例、光電変換素子）に集光する。レンズ３３を通った蛍光Ｌ５は、フィルタ３４を介して検出部６に入射する。フィルタ３４は、蛍光Ｌ５が透過し、蛍光Ｌ５と異なる波長の光（例、外光、迷光）を遮る特性を有する。検出部６は、蛍光Ｌ５を検出する。検出部６は、例えば光電子倍増管（Photo Multiplier Tube；ＰＭＴ）を含む。検出部６は、ＰＭＴの代わりに、光電変換素子が線状に並ぶラインセンサを含んでもよい。また、検出部６は、ＰＭＴの代わりに、二次元的に光電変換素子が並ぶイメージセンサを含んでいてもよい。イメージセンサは、例えば、ＣＣＤセンサ、あるいはＣＭＯＳセンサなどである。
【００３５】
次に、検出部７による蛍光の検出について説明する。検出光学系５は、試料Ｓからの蛍光Ｌ６を検出部７へ導く。蛍光Ｌ６は、例えば、多光子励起によって発生する蛍光（高調波の蛍光）である。検出光学系５は、試料Ｓから検出部７に向かう順に、対物レンズ２０、ミラー１９、及びフィルタ３５を備える。試料Ｓで発生した蛍光Ｌ６は、対物レンズ２０を通って、ミラー１９に入射する。ミラー１９は、蛍光Ｌ６が反射する特性を有する。蛍光Ｌ６は、ミラー１９で反射してフィルタ３５に入射する。フィルタ３５は、蛍光Ｌ６が透過し、蛍光Ｌ６と異なる波長の光（例、外光、迷光）を遮る特性を有する。検出部７は、蛍光Ｌ６を検出する。検出部７は、例えば光電子倍増管（Photo Multiplier Tube；ＰＭＴ）を含む。
【００３６】
なお、検出部７は、ＰＭＴの代わりに、光電変換素子が線状に並ぶラインセンサを含んでもよい。また、検出部７は、ＰＭＴの代わりに、二次元的に光電変換素子が並ぶイメージセンサを含んでいてもよい。イメージセンサは、例えば、ＣＣＤセンサ、あるいはＣＭＯＳセンサなどである。また、検出部７は、１光子励起によって発生する蛍光の検出に利用可能である。例えば、１光子励起によって発生する蛍光の検出において、検出部６は、所望の位置以外からの光をカットすることを優先する場合に用いられ、検出部７は、試料Ｓからの光のうち検出部に入射する光の光量を優先する場合に用いられてもよい。
【００３７】
制御部１０は、顕微鏡１の各部（例、走査部１７、検出部６、検出部７）を制御する。制御部１０は、走査部１７を制御し、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２による走査を走査部１７に実行させる。顕微鏡１によって１光子励起による観察が行われる場合、制御部１０は、検出部６を制御し、試料Ｓからの蛍光Ｌ５の検出を検出部６に実行させる。検出部６は、検出結果を処理部９に供給する。また、制御部１０は、走査部１７によって第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が試料Ｓに入射する位置の情報（検出位置の情報）を処理部９に供給する。処理部９（例、画像処理部）は、検出位置の情報と、検出部６の検出結果とに基づいて、試料Ｓからの蛍光の画像を生成する。処理部９は、生成した画像のデータを出力する。
【００３８】
また、顕微鏡１によって多光子励起による観察が行われる場合、制御部１０は、検出部７を制御し、試料Ｓからの蛍光Ｌ６の検出を検出部７に実行させる。検出部７は、検出結果を処理部９に供給する。また、制御部１０は、走査部１７によって第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が試料Ｓに入射する位置の情報（検出位置の情報）を処理部９に供給する。処理部９は、検出位置の情報と、検出部７の検出結果とに基づいて、試料Ｓからの蛍光の画像を生成する。処理部９は、生成した画像のデータを出力する。
【００３９】
顕微鏡１には、例えば、液晶ディスプレイなどの表示装置が設けられる。制御部１０は、例えば、処理部９が生成した画像のデータを表示装置に供給し、この画像を表示装置に表示させる。また、顕微鏡１には、例えば、ハードディスクなどの記憶装置が設けられる。制御部１０は、例えば、処理部９が生成した画像のデータを記憶装置に記憶させる。顕微鏡１は、上記の表示装置と記憶装置との一方または双方を備えてもよい。
【００４０】
上記の制御部１０は、例えばコンピュータシステムを含む。このコンピュータシステムは、記憶部に記憶された制御プログラムを読み出し、制御プログラムに従って顕微鏡１の各部の制御を実行する。また、上記の処理部９は、例えばコンピュータシステムを含む。このコンピュータシステムは、記憶部に記憶された処理プログラムを読み出し、処理プログラムに従って検出部（検出部６または検出部７）の検出結果を処理する。この処理プログラムは、コンピュータシステムに、走査部１７によって第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が試料Ｓに入射する位置の情報と、検出部の検出結果とに基づいて、試料Ｓからの蛍光の画像を生成させる。
【００４１】
次に、上述の顕微鏡１の構成に基づき、実施形態に係る観察方法（検出方法）について説明する。図４は、実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。顕微鏡１の構成については、適宜、図１等を参照する。ステップＳ１において、光路設定部１４（図３参照）は、第１光Ｌ１が第１領域Ａ１に入射し、第２光Ｌ２が第２領域Ａ２に入射するように、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定する。例えば、光路設定部１４は、選択部２１が光路に配置されることで、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定（規定）する。
【００４２】
ステップＳ２において、対物レンズ２０は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との照射によって蛍光を発する蛍光物質を含む試料Ｓに対して、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを照射する。例えば、制御部１０は、第１光源２からの第１光Ｌ１の照射を開始させ、また第２光源３からの第２光Ｌ２の照射を開始させる。ステップＳ３において、検出部６は、試料Ｓからの蛍光Ｌ５を検出する。ステップＳ３において、検出部７は、検出部６による蛍光Ｌ５の検出の代わりに、蛍光Ｌ６を検出してもよい。
【００４３】
本実施形態において、第１光Ｌ１は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１に入射し、第２光Ｌ２は、対物レンズ２０の瞳面において第１領域Ａ１の少なくとも一部と重複しない第２領域Ａ２に入射する。したがって、対物レンズ２０の試料側の焦点に向かう第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とが空間的に分かれる。よって、焦点ＦＰからずれた位置において蛍光物質から蛍光が発せられることが抑制される。顕微鏡１は、例えば、観察対象の位置以外において蛍光（例、背景光）の発生が低減され、観察対象の位置からの蛍光を高精度に検出することができる。顕微鏡１は、例えば、観察対象の位置からの蛍光を高精度に検出することができ、蛍光の検出結果に基づいて試料Ｓの高品質な画像を生成可能である。
【００４４】
図５は、変形例に係る第１領域、第２領域、及び背景光のレベルを示す図である。図２（Ａ）において、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０において、第１光Ｌ１が入射する第１領域Ａ１の数は１つであり、第２光Ｌ２が入射する第２領域Ａ２の数は１つである。第１領域Ａ１の数および第２領域Ａ２の数は、それぞれ、任意に設定可能である。
【００４５】
図５（Ａ）において、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０には、２つの第１領域Ａ１および２つの第２領域Ａ２が設定される。第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円を周方向に４分割した扇状である。第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とは、上記の円の周方向に交互に配置される。第１領域Ａ１は、隣の第２領域Ａ２と接している。
【００４６】
図５（Ｂ）において、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０には、３つの第１領域Ａ１および３つの第２領域Ａ２が設定される。第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円を周方向に６分割した扇状である。第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とは、上記の円の周方向に交互に配置される。第１領域Ａ１は、隣の第２領域Ａ２と接している。
【００４７】
図５（Ｃ）において、横軸は、対物レンズ２０の光軸方向の位置である。符号Ｚａは、対物レンズ２０の試料側の焦点ＦＰ（図３（Ｃ）参照）の位置である。図５（Ｃ）において、対物レンズ２０の光軸方向の各位置で発生する蛍光の強度である。蛍光の強度は、位置Ｚａで発生する蛍光の強度を基準（例、１）として規格化されている。符号Ｄ１は、比較例であり、第１光Ｌ１と第２光とが瞳面上の同じ領域に入射する場合の蛍光の強度に相当する。符号Ｄ２は図２に対応し、第１領域Ａ１が１つであり、第２領域Ａ２が１つである場合（領域の分割数が２）の蛍光の強度である。符号Ｄ３は図５（Ａ）に対応し、第１領域Ａ１が２つであり、第２領域Ａ２が２つである場合（領域の分割数が４）の蛍光の強度である。符号Ｄ４は図５（Ｂ）に対応し、第１領域Ａ１が３つであり、第２領域Ａ２が３つである場合（領域の分割数が６）の蛍光の強度である。
【００４８】
図５（Ｃ）に示すように、実施形態に係る蛍光の強度Ｄ２、強度Ｄ３、及び強度Ｄ４は、いずれも、対物レンズ２０の焦点ＦＰ（位置Ｚａ）からずれた位置Ｚｂにおいて比較例の強度Ｄ１よりも小さい。例えば、位置Ｚａにおける蛍光の強度を信号とし、位置Ｚｂにおける蛍光の強度をノイズとした場合、実施形態によれば、比較例よりもＳ／Ｎ比が高い検出結果が得られる。なお、図５（Ｃ）では、分割数が少ない場合（例、分割数が２の強度Ｄ２）、Ｓ／Ｎ比が高い検出結果が得られる。また、分割数が多い場合（例、分割数が４、６）、発生する蛍光の分布（実効ＰＳＦ）の光軸に関する軸対称性が高くなる。
【００４９】
図６は、変形例に係る第１領域および第２領域を示す図である。図２（Ａ）において、第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、光軸を中心とする円を周方向に分割した領域である。第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心する円を径方向に分割した領域の少なくとも一部を含んでもよい。例えば、図６（Ａ）において、第１領域Ａ１は、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円環状の領域である。第２領域Ａ２は、第１領域Ａ１の内側に配置され、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円状の領域である。
【００５０】
図６（Ｂ）において、第１領域Ａ１は、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円環状の領域と、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円状の領域とである。第２領域Ａ２は、２つの第１領域Ａ１の間に配置され、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心とする円環状の領域である。第１領域Ａ１と第２領域Ａ２との一方または双方が円環状の領域である場合、例えば、、発生する蛍光の分布（実効ＰＳＦ）の軸対称性が高く、また光軸からずれた位置での蛍光の発生が低減される。
【００５１】
なお、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心する円を径方向に分割した領域を、第１領域Ａ１または第２領域Ａ２に設定する場合、対物レンズ２０の光軸２０Ａに関する放射方向において第１領域Ａ１、第２領域Ａ２の並ぶ順番は任意に設定される。また、図６（Ｃ）に示すように、第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、それぞれ、対物レンズ２０の光軸２０Ａを中心する円を径方向に分割し、かつこの円の周方向に分割した領域を含んでもよい。
【００５２】
図５、図６などに示したように第１領域Ａ１および第２領域Ａ２を設定するには、例えば、第１領域Ａ１と光学的に共役な位置に第１選択部２１Ａを配置し、第２領域Ａ２と光学的に共役な位置に第２選択部２１Ｂを配置すればよい。なお、第１領域Ａ１は、第２領域Ａ２に対して、形状、寸法、及び面積の少なくとも１つが異なってもよい。また、第１領域Ａ１の数は、第２領域Ａ２の数と異なってもよい。
【００５３】
図７は、変形例に係る光路設定部（選択部）を示す図である。図７（Ａ）において、第１選択部２１Ａと第２選択部２１Ｂとは接していない。例えば、第１選択部２１Ａと第２選択部２１Ｂとの間は、遮光部２２である。この場合、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０において、第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とが離れて配置される。このように、光路設定部１４は、第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とが接しないように、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定してもよい。
【００５４】
図７（Ｂ）において、第１選択部２１Ａと第２選択部２１Ｂとの間は、透過部３６である。透過部３６は、例えば、第１光Ｌ１の波長に対する透過率が第２選択部２１Ｂよりも高い。透過部３６は、例えば、第２光Ｌ２の波長に対する透過率が第１選択部２１Ａよりも高い。この場合、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０において、第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とが一部重複する。このように、光路設定部１４は、第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とで一部が重複するように、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定してもよい。例えば、第１領域Ａ１の一部が第２領域Ａ２の外側に配置され、かつ第２領域Ａ２の一部が第１領域Ａ１の外側に配置されてもよい。
【００５５】
なお、上述の実施形態において、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２は、一方が活性化光であり、他方が励起光である。実施形態に係る顕微鏡１は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２の双方が励起光であり、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２を用いた多光子励起よって発生する蛍光を検出してもよい。この場合、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで波長が同じでもよいし、波長が異なってもよい。顕微鏡１は、多光子励起によって発生する蛍光を、例えば検出部７によって検出可能である。
【００５６】
なお、実施形態に係る顕微鏡１は、多光子励起による蛍光を検出しなくてもよい。この場合、顕微鏡１は、ミラー１９、フィルタ３５、及び検出部７の少なくとも一部を備えなくてもよい。また、実施形態に係る顕微鏡は、多光子励起による蛍光を検出し、１光子励起による蛍光を検出しなくてもよい。この場合、顕微鏡１は、レンズ３１、絞り部材３２、レンズ３３、フィルタ３４、及び検出部６の少なくとも一部を備えなくてもよく、ミラー１６は折り返しミラーなどでよい。また、実施形態に係る顕微鏡１は、共焦点以外の手法で蛍光を検出する顕微鏡でもよい。
【００５７】
なお、試料Ｓは、蛍光物質を含まなくてもよい。例えば、実施形態に係る顕微鏡１は、第１光と第２光との照射によって試料Ｓから誘導放出によって放射される光を検出してもよい（後に第５実施形態で説明する）。また、実施形態に係る顕微鏡１は、第１光と第２光との照射によって試料Ｓから発生するコヒーレント反ストークスラマン散乱（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＣＡＲＳ）光を検出する顕微鏡（ＣＡＲＳ顕微鏡）でもよい。
【００５８】
なお、上述の実施形態において説明した走査部１７は、一例であり、適宜変更可能である。例えば、走査部１７の少なくとも一部は、位置ＦＰ１と異なる位置に配置されてもよい。例えば、走査部１７が２つの偏向ミラー２４を備える場合、２つの偏向ミラー２４の間に位置ＦＰ１が配置されるように、走査部１７が設けられてもよい。また、２つの偏向ミラー２４のうち一方は、位置ＦＰ１またはその近傍に配置され、他方は、位置ＦＰ１と光学的に共役な位置またはその近傍に配置されてもよい。
【００５９】
実施形態に係る顕微鏡１は、走査型の顕微鏡である場合、照明光で１次元的に走査してもよいし。照明光で２次元的に走査してもよい。顕微鏡１は、照明光で１次元的に走査する場合、検出対象の領域が線状でもよいし面状でもよい。例えば、検出対象の領域は、対物レンズ２０の光軸２０Ａに交差する第１方向に延びる線状（例、帯状）である場合、顕微鏡１は、検出対象の領域で点状の照明光を用いて、この照明光を上記の第１方向に走査してもよい。また、検出対象の領域は、対物レンズ２０の光軸２０Ａに交差する第１方向および第２方向のそれぞれに広がる面状（例、矩形状）である場合、検出対象の領域で上記の第１方向に延びるライン状の照明光を用いて、この照明光を上記の第２方向に走査してもよい。
【００６０】
顕微鏡１は、走査型の顕微鏡である場合、ステージ８と対物レンズ２０とを、上記の第１方向と第２方向との一方または双方に相対移動させ、試料Ｓを照明光で走査してもよい。例えば、顕微鏡１は、偏向ミラー２４によって照明光で上記の第１方向に走査し、ステージ８と対物レンズ２０との相対移動によって照明光で上記の第２方向に走査してもよい。また、顕微鏡１は、走査型顕微鏡である場合、絞り部材３２として複数のピンホールを有する回転体（例、ニポウディスク）を用いる顕微鏡でもよい。また、顕微鏡１は、走査型の顕微鏡でなくてもよい。
【００６１】
本実施形態において、選択部２１は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との偏光の違いによって、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを設定してもよい。例えば、図１に示したミラー１２は、ＰＢＳ（偏光ビームスプリッタ）などの偏光分離素子でもよい。ミラー１２は、例えば、ミラー１２に対するＰ偏光（以下、単にＰ偏光という）が透過し、ミラー１２に対するＳ偏光（以下、単にＳ偏光という）が反射する特性を有してもよい。
【００６２】
この場合、第１光源２からの第１光Ｌ１のうちＰ偏光は、ミラー１２を透過する。第１光源２は、例えば、Ｐ偏光の直線偏光を発するレーザ光源などでもよい。また、第２光源３からの第２光Ｌ２のうちＳ偏光は、ミラー１２で反射して第１光Ｌ１のＰ偏光と同じ光路を通る。第２光源３は、例えば、Ｓ偏光の直線偏光を発するレーザ光源などでもよい。
【００６３】
また、第１選択部２１Ａおよび第２選択部２１Ｂは、例えば、直線偏光が通る偏光板などでよい。例えば、第１選択部２１Ａは、Ｐ偏光（第１光Ｌ１）が透過し、Ｓ偏光（第２光Ｌ２）を遮る特性を有する偏光板でよい。また、第２選択部２１Ｂは、例えば、Ｓ偏光（第２光Ｌ２）が透過し、Ｐ偏光（第１光Ｌ１）を遮る特性を有する偏光板でよい。上記の構成の場合、Ｐ偏光の第１光Ｌ１は、第１選択部２１Ａを透過し、第２選択部２１Ｂに遮られる。また、Ｓ偏光の第２光は、第１選択部２１Ａに遮られ、第２選択部２１Ｂを透過する。このように、選択部２１は、第１光Ｌ１の光路と第２光Ｌ２の光路とを偏光によって設定してもよい。
【００６４】
なお、顕微鏡１は、第１光源２を備えなくてもよい。例えば、第１光源２は、顕微鏡１に外付けされる外部装置でもよい。顕微鏡１は、第１光源２を備えない状態で提供され、第１光源２は、顕微鏡１による観察が実行される際に顕微鏡１に取り付けられてもよい。第１光源２は、交換可能な外部装置でもよい。第２光源３についても同様に、顕微鏡１は、第２光源３を備えなくてもよい。
【００６５】
［第２実施形態］
第２実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図８は、本実施形態に係る顕微鏡を示す図である。光路設定部１４は、第１マスク４１および第２マスク４２を備える。第１マスク４１は、第１光Ｌ１の光路のうち第２光Ｌ２の光路と重複しない位置に配置される。第１マスク４１は、例えば、第１光源２とミラー１２との間の光路に配置される。
【００６６】
本実施形態において、照明光学系４は、第１光源２の光出射側にレンズ４３およびレンズ４４を備える。レンズ４３は、第１光源２からの第１光Ｌ１を、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０と光学的に共役な瞳共役面Ｐ２に導く。第１光源２からの第１光Ｌ１は、レンズ４３で屈折して瞳共役面Ｐ２に入射する。第１マスク４１は、例えば、瞳共役面Ｐ２の位置またはその近傍に配置される。レンズ４４は、第１マスク４１を通った第１光Ｌ１を瞳共役面Ｐ１に導く。第１マスク４１を通った第１光Ｌ１は、レンズ４４で屈折して瞳共役面Ｐ１に入射する。
【００６７】
第２マスク４２は、第２光Ｌ２の光路のうち第１光Ｌ１の光路と重複しない位置に配置される。第２マスク４２は、例えば、第２光源３とミラー１２との間の光路に配置される。本実施形態において、照明光学系４は、第２光源３の光出射側にレンズ４５およびレンズ４６を備える。レンズ４５は、第２光源３からの第２光Ｌ２を、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０と光学的に共役な瞳共役面Ｐ３に導く。第２光源３からの第２光Ｌ２は、。レンズ４５で屈折して瞳共役面Ｐ３に入射する。第２マスク４２は、例えば、瞳共役面Ｐ３の位置またはその近傍に配置される。レンズ４６は、第２マスク４２を通った第２光Ｌ２を瞳共役面Ｐ１に導く。第２マスク４２を通った第２光Ｌ２は、レンズ４６で屈折して瞳共役面Ｐ１に入射する。
【００６８】
図９は、本実施形態に係る対物レンズの瞳面および光路設定部（第１マスク、第２マスク）を示す図である。図９（Ｂ）に示すように、第１マスク４１は、第１領域Ａ１と光学的に共役な領域Ａ３において第１光Ｌ１が通過可能である。例えば、領域Ａ３には、第１光Ｌ１が通る開口４１Ａが設けられる。第１マスク４１は、第２領域Ａ２と光学的に共役な領域Ａ４において第１光を遮る。例えば、第１マスク４１において、領域Ａ３を除く部分（領域Ａ４を含む部分）は、第１光Ｌ１を遮る遮光部４１Ｂである。
【００６９】
図９（Ｃ）に示すように、第２マスク４２は、第２領域Ａ２と光学的に共役な領域Ａ５において第２光Ｌ２が通過可能である。例えば、領域Ａ５には、第２光Ｌ２が通る開口４２Ａが設けられる。第２マスク４２は、第１領域Ａ１と光学的に共役な領域Ａ６において第２光Ｌ２を遮る。例えば、第２マスク４２において、領域Ａ５を除く部分（領域Ａ６を含む部分）は、第２光Ｌ２を遮る遮光部４２Ｂである。
【００７０】
図１０は、本実施形態に係る第１光の光路および第２光の光路を示す図である。第１光源２からの第１光Ｌ１は、第１マスク４１に入射する。第１光Ｌ１の一部は、第１マスク４１の開口４１Ａを通って、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１に入射する。第１光Ｌ１の一部は、第１マスク４１の遮光部４１Ｂに遮られ、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２に向かう光路から除かれる。遮光部４１Ｂに入射した第１光Ｌ１の少なくとも一部は、第２領域Ａ２に入射しない。
【００７１】
第２光源３からの第２光Ｌ２は、第２マスク４２に入射する。第２光Ｌ２の一部は、第２マスク４２の開口４２Ａを通って、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２に入射する。第２光Ｌ２の一部は、第２マスク４２の遮光部４２Ｂに遮られ、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１に向かう光路から除かれる。遮光部４２Ｂに入射した第２光Ｌ２の少なくとも一部は、第１領域Ａ１に入射しない。このように、光路設定部１４（第１マスク４１、第２マスク４２）は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで重複しない光路に配置されてもよい。
【００７２】
［第３実施形態］
第３実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１１は、本実施形態に係る顕微鏡を示す図である。本実施形態において、選択部２１は、マスク５０および制御部１０を備える。
【００７３】
マスク５０は、対物レンズ２０の瞳共役面Ｐ１またはその近傍に配置される。マスク５０は、光の遮光状態と透過状態とを領域ごとに可変である。制御部１０は、マスク５０の遮光状態と透過状態とを制御する。本実施形態において、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とは、時分割で試料Ｓに照射される。例えば、第２光Ｌ２は、第１光Ｌ１が試料Ｓに照射される期間の少なくとも一部と重複しない期間において、試料Ｓに照射される。制御部１０は、第１光Ｌ１が照射されるタイミングと、第２光が照射されるタイミングとに基づいて、マスク５０の遮光状態と透過状態とを制御する。
【００７４】
また、制御部１０は、第１光源２から第１光Ｌ１が照射されるタイミング（照射タイミング）を制御する。例えば、第１光源２の光射出側にはシャッタ５１が設けられる。シャッタ５１は、例えば音響光学素子（ＡＯＭ）などである。シャッタ５１は、第１光源２からの第１光Ｌ１が通る状態と、第１光源２からの第１光Ｌ１を遮る状態とを切替可能である。制御部１０は、シャッタ５１を制御することによって、試料Ｓに第１光Ｌ１が照射されるか否かを切替可能である。
【００７５】
また、制御部１０は、第２光源３から第２光Ｌ２が照射されるタイミング（照射タイミング）を制御する。例えば、第２光源３の光射出側にはシャッタ５２が設けられる。シャッタ５２は、シャッタ５１と同様である。制御部１０は、シャッタ５２を制御することによって、試料Ｓに第２光Ｌ２が照射されるか否かを切替可能である。
【００７６】
図１１は、本実施形態に係る光路設定部を示す図である。光路設定部１４は、図１１に示したマスク５０として空間光変調器５０Ａ（ＳＬＭ）を備える。空間光変調器５０Ａは、例えば液晶パネルである。空間光変調器５０Ａは、複数の画素ＰＸが配列された構造である。空間光変調器５０Ａは、画素ＰＸごとに光の透過率を可変である。図１１（Ａ）において、領域Ａ１１は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１と共役な領域である。また、領域Ａ１２は、対物レンズ２０の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２と共役な領域である。
【００７７】
制御部１０は、空間光変調器５０Ａを制御し、空間光変調器５０Ａにおける透過率の分布（マスクパターン）を変更する。図１１（Ｂ）に示すマスクパターンＭ１において、第１領域Ａ１と共役な領域Ａ１１における透過率は、第２領域Ａ２と共役な領域Ａ１２における透過率よりも高い。制御部１０は、第１光Ｌ１が照射される際に、空間光変調器５０Ａにおける透過率の分布をマスクパターンＭ１に設定する。また、図１１（Ｃ）に示すマスクパターンＭ２において、第２領域Ａ２と共役な領域Ａ１２における透過率は、第１領域Ａ１と共役な領域Ａ１１における透過率よりも高い。制御部１０は、第２光Ｌ２が照射される際に、空間光変調器５０Ａにおける透過率の分布をマスクパターンＭ２に設定する。
【００７８】
図１３は、本実施形態に係る制御部の動作を示すタイミングチャートである。制御部１０は、シャッタ５１を制御して、期間Ｔ１において第１光の照射を実行させる（「第１光の照射」；ＯＮ）。制御部１０は、シャッタ５２を制御して、期間Ｔ１において第２光の照射を停止させる（「第２光の照射」；ＯＦＦ）。制御部１０は、第１光Ｌ１がマスク５０（空間光変調器５０Ａ）に入射する際に、マスク５０において第１領域Ａ１と共役な位置を透過状態に制御し、マスク５０において第２領域Ａ２と共役な位置を遮光状態に制御する。例えば、制御部１０は、期間Ｔ１において、「マスクパターン」を図１２（Ｂ）に示したマスクパターンＭ１に設定する。
【００７９】
また、制御部１０は、シャッタ５１を制御して、期間Ｔ２において第１光の照射を停止させる（「第１光の照射」；ＯＦＦ）。制御部１０は、シャッタ５２を制御して、期間Ｔ２において第２光Ｌ２の照射を実行させる（「第２光の照射」；ＯＮ）。制御部１０は、第２光Ｌ２がマスク５０（空間光変調器５０Ａ）に入射する際に、マスク５０において第２領域Ａ２と共役な位置を透過状態に制御し、マスク５０において第１領域Ａ１と共役な位置を遮光状態に制御する。例えば、制御部１０は、期間Ｔ２において、「マスクパターン」を図１２（Ｃ）に示したマスクパターンＭ２に設定する。
【００８０】
制御部１０は、検出部（例、検出部６、検出部７）を制御し、期間Ｔ３において蛍光の検出を検出部に実行させる（「蛍光の検出」；ＯＮ）。期間Ｔ３は、第２光Ｌ２の照射が開始された後の期間に設定される。図１３において、期間Ｔ３は、期間Ｔ２の少なくとも一部と重複する。期間Ｔ３は、期間Ｔ２の終了後の期間でもよい。期間Ｔ３は、例えば、期間Ｔ２の終了後から次の期間Ｔ１の開始までの間に、設定されてもよい。
【００８１】
なお、シャッタ５１とシャッタ５２との一方または双方は、機械式のシャッタでもよい。また、制御部１０は、シャッタ５１を制御する代わりに、第１光源２の点灯および消灯を制御してもよい。この場合、シャッタ５１が設けらなくてもよい。また、制御部１０は、シャッタ５２を制御する代わりに、第２光源３の点灯および消灯を制御してもよい。この場合、シャッタ５２が設けらなくてもよい。
【００８２】
なお、制御部１０は、第１光Ｌ１の照射タイミングおよび第２光Ｌ２の照射タイミングを制御しなくてもよい。例えば、検出部６は、検出動作を行う際にトリガー信号を出力し、シャッタ５１およびシャッタ５２は、それぞれ、上記のトリガー信号に応じたタイミングで遮光と通過とを切替てもよい。
【００８３】
なお、空間光変調器５０Ａは、音響光学素子でもよいし、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）でもよい。また、マスク５０は、開口の形状と位置の一方または双方を可変な機械式のシャッタなどでもよい。また、第１光の照射の有無を制御する制御部と、第２光の照射の有無を制御する制御部と、検出部（例、検出部６）を制御する制御部と、走査部１７を走査する制御部と、マスク５０を制御部とのうち、一部の制御部は他の制御部と別の装置に設けられてもよい。
【００８４】
［第４実施形態］
第４実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１４は、本実施形態に係る顕微鏡を示す図である。顕微鏡１は、第３光Ｌ３を発する第３光源６１を備える。第３光Ｌ３は、活性状態の蛍光物質を不活性状態にする不活性化光である。顕微鏡１は、第３光Ｌ３（不活性化光）を試料Ｓに照射可能である。第３光源６１の光出射側にはシャッタ６２が設けられる。シャッタ６２は、シャッタ５１およびシャッタ５２と同様である。シャッタ６２は、第３光源６１からの第３光Ｌ３が試料Ｓに照射されるか否かを切替可能である。
【００８５】
照明光学系４は、ミラー１２と試料Ｓとの間の光路に配置されるミラー６３を備える。ミラー６３は、例えば、ミラー１２と光路設定部１４との間の光路に配置される。ミラー６３は、例えばダイクロイックミラーである。ミラー６３は、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２が透過し、第３光Ｌ３が反射する特性を有する。本実施形態において、光路設定部１４（選択部２１）は、第３光Ｌ３が透過するように、設定される。シャッタ６２を通った第３光Ｌ３は、ミラー６３で反射し、第１光Ｌ１および第２光Ｌ２と同じ光路を通って試料Ｓに照射される。制御部１０は、活性化光（第１光Ｌ１）の照射タイミング、励起光（第２光Ｌ２）の照射タイミング、及び不活性化光（第３光Ｌ３）の照射タイミングを制御する。
【００８６】
図１４は、本実施形態に係る活性化光、励起光、及び不活性化光を示す図である。制御部１０は、シャッタ５１およびシャッタ５２を制御して、図１５（Ａ）に示すように活性化光（第１光Ｌ１）と励起光（第２光Ｌ２）とを並行して、試料Ｓに照射させる。制御部１０は、シャッタ６２を制御して、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２との一方または双方が照射される期間において、不活性化光（第３光Ｌ３）の照射を停止させる。制御部１０は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とが照射された試料Ｓからの蛍光の検出を検出部（例、検出部６、検出部７）に実行させる。制御部１０は、蛍光の検出の終了後に、シャッタ５１およびシャッタ５２を制御して、第１光Ｌ１の照射と第２光Ｌ２の照射とを停止させる。制御部１０は、シャッタ６２を制御して、図１５（Ｂ）に示すように第３光Ｌ３の照射を実行させる。
【００８７】
照明光学系４（図１４参照）は、例えば、試料Ｓのうち少なくとも活性化光（第１光Ｌ１）が入射した範囲に対して第３光Ｌ３を照射する。光路設定部１４は、例えば、選択部２１と試料Ｓとの間において、第３光Ｌ３の光路が第１光Ｌ１の光路と同じになるように、または第３光Ｌ３の光路が第１光Ｌ１の光路全体を含むように、第３光Ｌ３の光路を設定する。
【００８８】
照明光学系４、例えば、第３光Ｌ３を試料Ｓ上の領域Ａ１３（図１５（Ｂ）参照）に照射する。領域Ａ１３は、例えば、試料Ｓにおいて第１光Ｌ１が入射する範囲（図１５（Ａ）参照）を含む。領域Ａ１３は、第１光Ｌ１が入射する範囲よりも広くてもよい。また、領域Ａ１３は、第２光Ｌ２が入射する範囲の少なくとも一部を含んでもよい。
【００８９】
不活性化光が試料Ｓに照射されると、活性状態の蛍光物質の比率が低下する。したがって、次に励起光が試料Ｓに照射された際に、例えば観察対象の位置以外の領域における蛍光物質が迷光、外光などによって発する蛍光が低減される。上記の迷光は、例えば、観察対象の位置までの光路において散乱した励起光などを含む。
【００９０】
制御部１０は、所定の期間に第３光Ｌ３を照射させた後、シャッタ６２を制御して第３光Ｌ３の照射を停止させる。また、制御部１０は、走査部１７によって検出対象の領域を変更する。制御部１０は、次の検出対象の領域についても同様に、励起光および活性化光を照射させ、蛍光の検出を実行させた後に、不活性化光を照射させる。制御部１０は、検出対象の領域を変更し、検出対象の領域からの蛍光を検出する処理を繰り返し実行させる。
【００９１】
なお、制御部１０は、図１３などで説明したように、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを時分割で照射させてもよい。また、上記の不活性化光として励起光を用いることもできる。この不活性化光は、第２光源３から照射されてもよいし、第２光源３と異なる第３光源６１から照射されてもよい。不活性化光が第２光源３から照射される場合、顕微鏡１は、第３光源６１およびミラー６３の少なくとも一部を備えなくてもよい。
【００９２】
なお、光路設定部１４は、第３光Ｌ３の光路を設定しなくてもよい。例えば、顕微鏡１（照明光学系４）は、選択部２１を介することなく第３光Ｌ３を試料Ｓに照射してもよい。第３光Ｌ３の光路は、第１光源２から対物レンズ２０までの光路の一部と重複してもよい。また、第３光Ｌ３の光路は、第１光源２から対物レンズ２０までの光路と重複しなくてもよい。例えば、第３光Ｌ３は、対物レンズ２０を介することなく試料Ｓに照射されれもよい。第３光Ｌ３を試料に照射する光学系は、照明光学系４と別に設けられてもよい。
【００９３】
図１６は、実施形態に係る観察方法を示すフローチャートである。図１６において、ステップＳ１からステップＳ３の処理は、図４と同様であり、その説明を省略する。ステップＳ４において、制御部１０は、次の検出があるか否かを判定する。ステップＳ４において、制御部１０は、予定された検出対象の領域のうち一部について蛍光の検出が完了していない場合、次の検出があると判定する（ステップＳ４；Ｙｅｓ）。
【００９４】
制御部１０は、次の検出があると判定した場合（ステップＳ４；Ｙｅｓ）、ステップＳ５において、シャッタ６２を制御して、試料Ｓに対して第３光Ｌ３の照射を実行させる。制御部１０は、例えば第３光Ｌ３の照射の開始から所定の時間が経過した後に、シャッタ６２を制御して、試料Ｓに対する第３光Ｌ３の照射を停止させる。ステップＳ６において、制御部１０は、走査部１７を制御して、検出対象の領域を、予定された次の検出対象の領域へ変更する。ステップＳ６の処理の終了後に、制御部１０は、ステップＳ２からステップＳ４の処理を繰り返す。
【００９５】
制御部１０は、ステップＳ４において次の検出がないと判定した場合（ステップＳ４；Ｎｏ）、一連の処理を終了する。また、次の検出がないと制御部１０が判定した場合（ステップＳ４；Ｎｏ）、図１４の処理部９は、検出部６からの検出結果と、制御部１０からの検出対象の位置情報とを用いて、試料Ｓの画像を生成する。
【００９６】
［第５実施形態］
第５実施形態について説明する。本実施形態において、上述の実施形態と同様の構成については、同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１７は、本実施形態に係る顕微鏡を示す図である。顕微鏡１は、誘導放出によって試料Ｓから放射される光（以下、誘導放出光という）を検出する。試料Ｓは、例えば染色されていない試料である。試料Ｓは、励起光（第１光）が照射されることで励起状態になる。試料Ｓは、励起状態において誘導光（第２光）が照射されることで誘導放出光を放射し、基底状態に遷移する。
【００９７】
顕微鏡１は、第１光源２、第２光源３、空間光変調器７１、タイミング調整部７２、対物レンズ７３、フィルタ７４、検出部７５、ロックインアンプ７６、画像処理部７７、及び制御部７８を備える。第１光源２は、第１光Ｌ１として励起光を発生する。第２光源３は、第２光Ｌ２として誘導光を発生する。第１光源２および第２光源３は、それぞれ、制御部７８に制御され、光強度がパルス状に時間変化する光（パルス光）を発生する。例えば、制御部７８は、所定の周波数の波形を生成する波形生成部７９を備える。制御部７８は、波形生成部７９が生成した第１周波数の波形を制御信号に用いて、第１光源２および第２光源３のそれぞれに第１周波数のパルス光を発生させる。
【００９８】
空間光変調器７１は、第１光源２からの第１光Ｌ１を強度変調する。空間光変調器７１は、第１光Ｌ１の光路のうち、第２光Ｌ２の光路と重複しない位置に配置される。空間光変調器７１は、制御部７８に制御されて、第１光Ｌ１を強度変調する。空間光変調器７１は、例えば音響光学素子（ＡＯＭ）を含む。制御部７８は、波形生成部７９が生成した第２周波数の波形を制御信号に用いて空間光変調器７１に強度変調を実行させ、第１光Ｌ１の強度を第２光Ｌ２の強度と異なる周波数で変化させる。
【００９９】
空間光変調器７１は、第１光源２からの第１光Ｌ１を強度変調する。空間光変調器７１は、第１光Ｌ１の光路のうち、第２光Ｌ２の光路と重複しない位置に配置される。空間光変調器７１は、制御部７８に制御されて、第１光Ｌ１を強度変調する。空間光変調器７１は、例えば音響光学素子（ＡＯＭ）を含む。制御部７８は、波形生成部７９が生成した第２周波数の波形を制御信号に用いて空間光変調器７１に強度変調を実行させ、第１光Ｌ１の強度を第２光Ｌ２の強度と異なる第３周波数で変化させる。
【０１００】
タイミング調整部７２は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とでパルスのタイミングを調整する。タイミング調整部７２は、例えば、第２光Ｌ２の光路のうち第１光Ｌ１の光路と重複しない位置に配置される。タイミング調整部７２は、例えば複数の折り曲げミラーを含み、第２光Ｌ２の光路長を調整する。タイミング調整部７２は、第２光Ｌ２の光路長を調整することによって、試料Ｓにおいて第２光Ｌ２のパルスが立ち上がるタイミングを、試料Ｓにおいて第１光Ｌ１のパルスが立ち上がるタイミングに対して調整する。
【０１０１】
第１光Ｌ１は、対物レンズ２０（図３参照）の瞳面Ｐ０における第１領域Ａ１を通る。また、第２光Ｌ２は、対物レンズ２０（図３参照）の瞳面Ｐ０における第２領域Ａ２を通る。第１領域Ａ１と第２領域Ａ２とを設定する手法は、上述した実施形態のいずれの手法でもよい。対物レンズ２０は、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とを試料Ｓに照射する。本実施形態において、ステージ８は走査部を兼ねている。ステージ８は、対物レンズ２０の光軸方向に対する交差方向において、対物レンズ２０と相対移動する。これにより、試料Ｓは、第１光Ｌ１と第２光Ｌ２とで走査される。なお、走査部は、偏向ミラー２４（図１参照）によって走査する構成でもよい。
【０１０２】
試料Ｓは、第１光Ｌ１が照射されることによって励起状態になり、励起状態で第２光Ｌ２が照射されることによって誘導放出光Ｌ８を発生する。誘導放出光Ｌ８は、第１光Ｌ１と波長が異なり、第２光Ｌ２と同じ波長の光である。試料Ｓから放射される光は、試料Ｓを経由した第１光Ｌ１および第２光Ｌ２、並びに試料Ｓで発生した誘導放出光Ｌ８を含む。試料Ｓから放射された第１光Ｌ１、第２光Ｌ２、及び誘導放出光Ｌ８は、対物レンズ７３を介してフィルタ７４に入射する。
【０１０３】
フィルタ７４は、第１光Ｌ１に対する透過率が第２光Ｌ２に対する透過率よりも低い特性を有する。フィルタ７４は、試料Ｓから放射される光のうち第１光Ｌ１（励起光）を選択的に遮る。フィルタ７４を透過した第２光Ｌ２および誘導放出光Ｌ８は、検出部７５に入射する。光検出部７５は、第２光Ｌ２および誘導放出光Ｌ８を検出する。検出部７５は、第２光Ｌ２および誘導放出光Ｌ８を検出した検出結果をロックインアンプ７６に出力する。
【０１０４】
ロックインアンプ７６は、検出部７５の検出結果から誘導放出光Ｌ８の成分を抽出する。検出部７５の検出結果は、空間光変調器７１によって強度変調された第１光Ｌ１の光強度の時間変化の周波数（第３周波数）の成分を含む。ロックインアンプ７６は、第３周波数でロックイン検出を実行することによって、誘導放出光Ｌ８の成分を抽出する。
【０１０５】
ロックインアンプ７６は、制御部７８によって制御されてロックイン検出を実行する。例えば、制御部７８の波形生成部７９は、第３周波数の波形を生成する。制御部７８は、第３周波数の波形をロックインアンプ７６に供給する。ロックインアンプ７６は、制御部７８から供給された第３周波数の波形を参照信号に用いて、ロックイン検出を実行する。ロックインアンプ７６は、第３周波数の波形（参照信号）と、検出部７５の検出結果（検出信号）とを掛け合わせて積算することによって、誘導放出光Ｌ８の成分を抽出する。ロックインアンプ７６は、ロックイン検出の検出結果を画像処理部７７に出力する。画像処理部７７は、ロックインアンプ７６の検出結果に基づいて、試料Ｓの画像を生成する。
【０１０６】
なお、ロックインアンプ７６は、検出部７５と同じ装置に設けられてもよい。また、ロックインアンプ７６は、コンピュータが演算を行うことで実現されてもよい。例えば、このコンピュータは、検出部７５の検出信号のレベルを示すデジタルデータと、第３周波数の参照信号のレベルを示すデジタルデータとを乗算し、その乗算値を積算することによって、ロックイン検出を実行してもよい。また、ロックインアンプ７６は制御部７８と同じ装置に設けられてもよい。例えば、ロックインアンプ７６および制御部７８は、コンピュータを含み、このコンピュータは、制御プログラムに従って上記の各種制御を実行し、検出プログラムに従って上記のロックイン検出に係る演算を実行してもよい。
【０１０７】
なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１０８】
１・・・顕微鏡、６、７・・・検出部、９・・・処理部、１０・・・制御部、１４・・・光路設定部、１７・・・走査部、２０・・・対物レンズ、２１・・・選択部、２１Ａ・・・第１選択部、２１Ｂ・・・第２選択部、４１・・・第１マスク、４２・・・第２マスク、５０・・・マスク、５０Ａ・・・空間光変調器、Ａ１・・・第１領域、Ａ２・・・第２領域、Ｌ１・・・第１光、Ｌ２・・・第２光、Ｌ３・・・第３光、Ｌ５、Ｌ６・・・蛍光、Ｐ０・・・瞳面、Ｐ１・・・瞳共役面、Ｓ・・・試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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