(57)【要約】不死化された抗体分泌細胞を製造する方法であって、（ａ）１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞であり、刺激の不存在下では非不死化状態にあり、刺激に曝されるとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、（ｂ）該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、かつ（ｃ）その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞を１以上の導入遺伝子により不死化することを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化された抗体分泌細胞を製造する方法であって、
（ａ）１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞であり、刺激の不存在下では非不死化状態にあり、刺激に曝されるとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
（ｂ）該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、かつ
（ｃ）その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞を１以上の導入遺伝子により不死化すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により不死化された抗体分泌細胞を製造し、そして該細胞から抗体を収集することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項３】
モノクローナル抗体を産生する不死化細胞のクローン集団を製造する方法であって、
（ａ）１以上の導入遺伝子を発現可能であり、刺激の不存在下に非不死化状態であり、そして該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化させることができる抗体分泌細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
（ｂ）該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、
（ｃ）その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞をその１以上の導入遺伝子により不死化させること、
（ｄ）抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞を選別すること、かつ
（ｅ）その不死化された抗体分泌細胞から不死化細胞のクローン集団を製造すること
を特徴とする方法。
【請求項４】
抗体分泌細胞における導入遺伝子の発現が誘起可能なプロモーターの制御下にあり、かつ刺激によりプロモーターの活性及び導入遺伝子の発現が調節可能である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
刺激によりプロモーター活性及び導入遺伝子の発現を促進する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
刺激によりプロモーター活性及び導入遺伝子の発現を阻害する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が刺激の存在下で不死化を促進し、かつ刺激の不存在下では不死化を促進しない、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
導入遺伝子が癌遺伝子である、請求項１から５又は請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
癌遺伝子がラージＴ抗原の遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子導入動物が不死化マウスである、請求項１から５又は請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が刺激の不存在下では不死化を阻害し、かつ刺激の存在下では不死化を阻害しない、請求項１から４又は請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
導入遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物が細胞において腫瘍抑制機能を阻害する、請求項１から５又は請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
導入遺伝子がｍｄｍ２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
導入遺伝子がｃｒｅレコンビナーゼを含み、腫瘍抑制機能が腫瘍抑制遺伝子に起因し、かつ腫瘍抑制遺伝子又はその機能的部分がｌｏｘｐ部位に隣接している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
導入遺伝子の産生物が、腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害できるアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムＲＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍抑制遺伝子又は腫瘍抑制機能がｐ５３を含む、請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
癌遺伝子が、ｍｙｃ、ａｂｌ、ｂｃｌ−２、ｖ−ｒｅｌ、ｒａｓ、パピローマウイルスＥ６タンパク質、パピローマウイルスＥ７タンパク質、アデノウイルスＥ１Ａ、ＰＩＭ１、ＲｈｏＨ／ＴＴＦ又はＰＡＸ５を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子導入動物が、腫瘍抑制遺伝子を欠損した抗体分泌細胞を含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれかに記載の方法であって、該方法が工程（ｂ）の前に遺伝子導入動物を抗原で免疫化する更なる工程を含む方法。
【請求項２１】
工程（ｄ）が、抗原を認識する抗体を産生する抗体分泌細胞を選別することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）が蛍光標識細胞選別法（FACS）を含む、請求項３から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子導入動物を免疫化しない、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
刺激が温度変化を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
刺激が化学的刺激を含む、請求項１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
抗体分泌細胞がＢリンパ球を含む、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗体がヒト化抗体である、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれかに記載の方法であって、抗体分泌細胞を動物から抽出した後、かつ該抗体分泌細胞を刺激に曝す前又は後に、０℃以下の温度で抗体分泌細胞を貯蔵する更なる工程を含む方法。
【請求項２９】
モノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項３から２８のいずれかに記載の方法によって不死化細胞の集団を製造し、かつ該不死化細胞の集団からモノクローナル抗体を製造することを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項３から２８のいずれかに記載の方法によって得られる不死化された抗体分泌細胞のクローン集団。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法によって得られるモノクローナル抗体。
【請求項３２】
遺伝子導入動物に由来する単離された不死化された抗体分泌細胞であって、該細胞は１以上の導入遺伝子を発現し、刺激の存在下ではその１以上の導入遺伝子により不死化状態を維持することができ、かつ刺激の不存在下では非不死化状態に変化することができる細胞。
【請求項３３】
モノクローナル抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞の単離されたクローン集団であって、請求項３２に記載の不死化された抗体分泌細胞の集団を含む集団。
【請求項３４】
不死化された抗体分泌細胞の製造のための遺伝子導入動物の使用であって、該遺伝子導入動物は１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞は刺激の不存在下では非不死化状態にあり、そして該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる使用。
【請求項３５】
抗体の製造のための遺伝子導入動物の使用であって、該遺伝子導入動物は１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞は刺激の不存在下では非不死化状態にあり、そして該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができ、該遺伝子導入動物を使用して抗体産生可能な不死化された抗体分泌細胞を得るのに使用できる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選ばれた抗体を分泌するクローン細胞株を遺伝子導入マウスから単離するための方法に関する。本発明の一態様では、遺伝子導入動物は“不死化マウス”である。第二の態様は、誘導可能な癌遺伝子又は癌遺伝子の組み合わせと、腫瘍抑制配列に対する遺伝子発現用アンチセンス、その産生物が腫瘍抑制タンパク質を不活性化する遺伝子、あるいは腫瘍抑制遺伝子を不活性化してある遺伝子導入マウスとを適切に組み合わせて発現させる不死化マウスである。全ての場合において目的は、抗体分泌細胞、例えば脾臓細胞、と骨髄腫とを融合させてハイブリドーマを作成する必要なしに、モノクローナル抗体を得ることである。本発明の更なる態様では、本明細書に記載の遺伝子導入マウスとマウスＩｇ遺伝子座がヒト化されている遺伝子導入マウスとを交配させることによってヒト化抗体の製造を達成する。
【０００２】
本発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を遺伝子導入マウスから製造する方法を記載している。前記方法によれば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５によって初めて記述され、現在もほとんど改変されずに広範に使用されているｍＡｂ方法体系に対し非常なる改善をほどこすことができる。要点をいえば、本明細書に記載の発明の方法によれば、骨髄腫／脾臓細胞融合工程の排除により調査及び治療での使用のためのモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を、より迅速かつ効率的に製造する手段が得られる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
モノクローナル抗体は、学術分野と商業的な医薬分野及び生物操作分野との両者において広範に利用されている。モノクローナル抗体は、通常は抗原と呼称される特異的な存在物、例えば、必ずしも限定されないが、タンパク質又はペプチドを、エピトープとして知られる前記存在物の特異的部位との相互作用を通じて検出するのに使用される。別々のタンパク質に同一のエピトープが存在することがあり、同様に任意の１つのタンパク質が幾つかの異なるエピトープを提示することがある。かかる反応物は、基礎研究、診断、アッセイ開発及び、近年では治療用途において一般に使用されている。
【０００４】
抗体特異性とは、抗体が１つのエピトープ（又はエピトープのサブセット）を多種多様な他のエピトープの中から認識し識別する度合いとして定義される。抗体に要求される特異性の絶対的な度合いは用途に特異的であると言えるが、一般的に研究者が抗体から希望するものは最大の特異性、従って非特異的相互作用の結果として誤った結果を得るおそれを最小限にすることである。特異性の要求が増せば増すほど、かかる反応物を作成することはより困難となる。従って、モノクローナル抗体を分泌する細胞を製造、選択及びクローニングする効率が改善されれば、所望の用途に特異的な特性を有する反応物を得ることができる可能性は高まる。
【０００５】
十分に確立され、そして広範に利用されてはいるが、脾リンパ球と骨髄腫細胞との融合によって抗体を製造する基本方法は過去２５年間にわたり大きく改変されずにいる。この手法には固有の幾つかの制限があるために、従来のモノクローナル抗体に類似の特性があり、場合により類似の構造を有するタンパク質（抗原／エピトープ）認識反応物を製造する多くの新規の技術が開発されている。これらの技術は、ファージディスプレイ、ファージミドディスプレイ、ｓｃＦＶ及びその他の技術（Adams及びSchier  1999;  Walter  et  al.2001）などである。これらの多くの新規技術の潜在的な長所及び将来性にも拘わらず、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって開発されたハイブリドーマ法、又はその変法によって抗体を製造することが、大部分の社内研究所及び委託研究所でいまだに選ばれている方法である。従って、本発明に記載されるような方法によって、有用な反応物を操作する効率、信頼性及び究極的にはその可能性が大きく改善される進歩があれば、重要なブレークスルーが得られる。
【０００６】
モノクローナル抗体製造の現行法及びその限界
βリンパ球が活性化すれば所与の抗原に特異的な抗体の製造に至ることができる。しかしながらこれらβリンパ球は、かかる細胞が細胞培養において短命であるため、インビトロでの抗体反応物製造に利用するには限界がある（Kohler及びMilstein  １９７５）。こうして、これら抗体分泌細胞の培地での生存を可能にするために、自力で培地中で無期限に増殖できる不死化細胞株（骨髄腫）とそれらを結合させる方法が開発された。今日使用される多くの骨髄腫細胞株、例えばＳｐ２細胞は当初はそれ自体、抗体を分泌するものであった。ゆえに、モノクローナル抗体技術の先駆者が直面した課題には３つあった：１）抗体をそれ自体分泌しないが、骨髄腫／βリンパ球のハイブリドーマの不死化増殖を可能にする好適な不死化細胞株を開発すること、２）βリンパ球と骨髄腫細胞株との融合を最適化すること、３）融合されていない骨髄腫とβリンパ球との両者にからハイブリドーマ細胞を餞別する方法を工夫すること。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）は、センダイウイルスを用いてβリンパ球と骨髄腫細胞株とを融合させることにより前記の目標を達成する方法を初めて記述した。後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も同じ目標を達成できることが発見された。ＰＥＧは今日では、第一選択の細胞融合剤として広範に使用され；該試薬はしばしば“ヒューゾゲン（fusogen）”と呼称される。
【０００７】
モノクローナル抗体の製造のために使用される宿主は、骨髄腫細胞株の殆どがＢａｌｂ／ｃマウスから得られるので、殆どの場合にＢａｌｂ／ｃ又はＢａｌｂ／ｃ雑種マウスである。抗原は、ペプチド、純粋タンパク質、部分精製されたタンパク質が用いられるが、あるいは未精製組織試料ですら使用可能である。また抗原は可溶性又は不溶性であってもよい。免疫化工程には、しばしば免疫応答を誘導する補助のためにフロイントアジュバントのようなアジュバントを同時注入することが含まれる。更に免疫原性の少ない抗原及びペプチドは、その免疫原性を高めるために、しばしばスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリヤーと結合させる。免疫原性の程度により、抗原が所望の免疫応答を誘導する可能性が定まる。免疫応答の進度を測定するには、免疫化工程を通じて血清を採取し、そして酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又はウェスタンブロッティングのような方法により対象の抗原に特異的な抗体の存在について試験する。対象の抗原に対して強い免疫応答が検出されたら、βリンパ球を（通常、脾臓から）回収し、骨髄腫と融合させる。最終免疫から脾臓採取までの時間設定を正確にすることが細胞融合の効率に影響を及ぼすことがある（Stahl  et  al.  1983;  Cianfriglia  et  al.  1986;  Cianfriglia  et  al.  1987）。
【０００８】
細胞融合
脾由来βリンパ球と骨髄腫細胞株との間の細胞融合の成否は、少なくともある程度は、多くの要素によって支配されていると言える。これらの要素とは、必ずしも限定されないが、ヒューゾゲン、温度、細胞混合プロトコール、脾細胞と骨髄腫細胞との比、細胞融合時間、細胞融合回収プロトコール、培地／バッファー混合物、並びに当然ながら、研究者などである。プロトコールの正確な詳細及び細胞融合の成否はしばしば研究所ごとに異なり、そして実験ごとにも異なる（Igarashi及びBando、１９９０）。
【０００９】
細胞融合は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を脾細胞と骨髄腫細胞の懸濁液に添加することによって触媒される。前記の手順の成否は、融合されたての細胞は機械的かつ化学的に破壊されやすいので、極めて技師の熟練及び経験に左右される。細胞にＰＥＧを添加する方法と使用されるＰＥＧの配合とは、約６×１０-6〜３×１０-5の細胞融合頻度が達成されるよう最適化されてきている（Lane  et  al.  1984;  Lane  1985;  Lane  et  al.  1986）。細胞融合頻度は、生成するハイブリドーマの数を細胞融合で使用したリンパ球細胞の数で割ったものとして定義される（脾臓１個から全体で１×１０8細胞）。
【００１０】
ヒューゾゲンとしてＰＥＧを使用することに代わる方法は、電場を使用して脾細胞と骨髄腫とを融合させる“電気的細胞融合”である。最適な条件下に、細胞融合頻度を１０-3〜１０-4（Schmitt  et  al.  1989）又は１０-3（van  Duijn  et  al.  1989）へと高めることができ、前記の古典的なＰＥＧ法に対して約８０倍の改善が可能であった。抗原特異的ハイブリドーマの数並びにハイブリドーマの全数を同様に前記方法によって増加させることはできたが、この改善は免疫化手順、抗原又はリンパ球の起源には関係がない。Ｈｕｉ他（１９９３）は、ＰＥＧ法と電気的細胞融合法とを同じ実験で直接比較している幾つかの文献を分析している。彼らは、作成されたＨＡＴ耐性クローン又は抗体産生クローンの数のいずれかを測定することによって、概して電気的細胞融合法は融合率に改善をもたらすと結論している。他の報告書では、３６の実験を通して、電気的融合技術を用いることでＰＥＧ法と比較して約１０倍の融合率の改善が示されている（Karsten  et  al.  1993）。しかしながら成功率は全ての研究所にわたり一貫しておらず、このように依然として方法体系及びその再現性において依然として改善の余地があることを裏付けている。
【００１１】
前記のような方法によって達成される細胞融合率の増大にも拘わらず、かなりの比率のハイブリドーマが抗体を全く分泌しない。このことは、骨髄腫とＴ細胞との融合のせいであるとは考えられない。その理由は、生存可能なハイブリッドに由来する骨髄腫×Ｔ細胞の異核共存体が存在する証拠はないからである（Kohler  et  al.  1977;  Clark及びMilstein  1981）。また、融合細胞を播種後には、マクロファージ、線維芽細胞及びＰ細胞由来のハイブリッド細胞の過剰成長という問題も起きる（van  Mourik  et  al.  1984）。前記の問題点を克服するのを助ける１つの試みは、骨髄腫細胞との融合前に密度勾配遠沈法（van  Mourik及びZeijlemaker,  1986）のような方法によって免疫グロブリン分泌脾細胞を濃縮することである。
【００１２】
脾細胞が提示する（マウスの免疫化に使用される）抗原に対する細胞表面受容体を骨髄腫細胞に極めて近接させることによって、細胞融合の効率を、密度勾配分離工程を要することなく更にいっそう増大させることができる。この手順は２つの様式で細胞融合の効率を改善する。第一は、所望しない細胞融合、すなわち抗体分泌が不可能な骨髄腫細胞と脾臓由来細胞との間の融合を減らすことによる。第二は、対象の抗原に結合する細胞表面受容体だけを提示する抗原分泌細胞を選択的に融合させることによる（Lo  et  al.  1984;  Tsong  及びTomita,  1993）。前記の様式は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の強い相互作用を利用して２つの細胞間に“架橋”を生じさせることによって達成されている（Yuan  et  al.  2000）。こうして、脾リンパ球上の細胞表面抗体受容体に結合するアビジン−抗原コンジュゲートが生じる。骨髄腫細胞のビオチン化は、該細胞をアビジン−抗原コンジュゲートとの強い相互作用を通じて抗原認識リンパ球と極めて近接させる。こうして対象のリンパ球と不死化骨髄腫細胞株とがＰＥＧ細胞融合によって効果的に融合する機会が増大する（Reason  et  al.  1987）。
【００１３】
架橋された脾細胞と骨髄腫細胞との融合を触媒するためのＰＥＧ使用に代替する方法は電気的細胞融合技術である（Lo  et  al.  1984;  Hewish及びWerkmeister  1989;  Conrad  及びLo  1990;  Werkmeister  et  al.  1991）。両者の方法を組み合わせることによって、電気的細胞融合法単独よりも１０-2倍又は１０倍（Tornita  及びTsong  1990）高く改善された細胞融合効率が得られる（van  Duijn  et  al.  1989）。
【００１４】
細胞を近接に接触させることで細胞融合率を高める更なる試みは、細胞膜からシアル酸を除去するためのノイラミダーゼの利用である（Igarashi  及びBando  1990）。細胞外の膜性シアル酸が細胞間の近接の接触を妨げ、従ってＰＥＧで促進される細胞融合の可能性を妨げると考えられる。まさにかかる処理により、未処理の細胞に対して約２倍多いＨＡＴ耐性クローンが得られ、そして未処理の細胞に対して８倍も抗原特異的なクローンが得られる。前記の技術を組み合わせると、更に細胞融合法の信頼性及び効率を改善できる。細胞融合効率を１０倍〜５０倍増大させると示された他の方法には、例えば免疫化された動物からの脾細胞をＸ線照射された同系宿主に養子免疫細胞移入させ、引き続き抗原追加免疫を行い、そして細胞融合の前に脾細胞を抗原と一緒に培養することがある（Siraganian  et  al.  1983）。
【００１５】
前記の多くの改良された方法を用いても達成可能な細胞融合頻度が低いことに加えて、βリンパ球を不死化させる前記の試みには別の固有の制限が存在する。前記の細胞融合法では、細胞融合する相手の細胞周期がどの段階にあるかを識別しない。したがって細胞融合が分裂期と間期の細胞の間に生じることがある。その結果、早熟染色体凝縮又はＰＣＣ（Westerwoudt,  1985）として知られる現象が誘導され、ある環境下では、細胞分裂の中断に到るおそれがある。
【００１６】
細胞融合の最終的な成否に影響しうる更なる要素は染色体の安定性である（Westerwoudt,  1986）。細胞融合後の新たな細胞には両方の親細胞からの染色体の完全組がある。この染色体組は持続的増殖のためには正常な染色体組に減らなければならない。このためには１染色体組に相当する組の損失が避けられず、それが抗体発現遺伝子を有する染色体であるかもしれない。首尾よく細胞融合された後に当初は抗体を発現しながら、ハイブリドーマの約５０％は染色体を損失して、その抗体発現能力を失うことが推定される（Clark及びMilstein  1981）。更にハイブリドーマは、もしＸ染色体上に位置する脾由来ＨＰＲＴ遺伝子を損失すると、ＨＡＴ選択培地中で生存できない（Taggart及びSamloff  1982）。
【００１７】
細胞を首尾よく融合させることができ、そして雑種の染色体の核型を採用できたとしても、ハイブリドーマ細胞株はしばしばある程度の核型不安定性を示す。しばしばこの理由から、見掛上は安定なハイブリドーマ細胞株が突然抗体分泌を停止する。従って任意のハイブリドーマ細胞株の長期核型安定性は各雑種に固有の特徴であり、そして、少なくともその一部は、２つの親ゲノムの組み込み過程の結果である（Westerwoudt,  1986）。細胞の凍結−融解は、どの細胞株が不安定であるかを測定するのに効果的に使用されている。その理由は、該方法によって不安定な細胞株は抗体産生を失うからである（Pravtcheva及びRuddle,  1983）。
【００１８】
ハイブリドーマの選別
ハイブリドーマの選別には脾細胞と骨髄腫細胞の両者の特異的な増殖特性を利用する。まず前記のように脾細胞は培養において増殖できない、従って未融合の細胞は死滅する。骨髄腫細胞は、酵素ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損するのでヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培地）中では増殖できないことから、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって最初に選ばれた。ＤＮＡ合成に主要な経路がアミノプテリンによって遮断されるので、救済経路が外来のヒポキサンチン及びチミジンを利用するためにはＨＰＲＴが要求である。骨髄腫細胞はＨＡＴ培地中で死滅するのに対し、ハイブリドーマは脾細胞が提供するＨＰＲＴによって増殖することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
精密な実験細部に若干の改善はなされているが、骨髄腫との細胞融合を通じてβリンパ球を不死化するための基本方法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５による技術の記述から変わらずにいる。本発明の１つの態様により、不死化の効率を理論上１００％に高めると同時に、全体的な手順を大いに簡素化する方法、すなわち癌遺伝子／アンチセンスの誘起可能な発現を使用して融合工程を省略する、あるいは遺伝子導入技術を使用して癌遺伝子の翻訳後活性化を省略する方法が得られる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の概要
従って本発明は、不死化された抗体分泌細胞を製造する方法であって、
（ａ）１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞であり、刺激の不存在下では非不死化状態にあり、刺激に曝されるとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
（ｂ）該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、かつ
（ｃ）その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞を１以上の導入遺伝子により不死化すること
を特徴とする方法を提供する。
【００２１】
更なる態様では、本発明は、モノクローナル抗体を産生する不死化細胞のクローン集団を製造する方法であって、
（ａ）１以上の導入遺伝子を発現可能であり、刺激の不存在下に非不死化状態であり、そして該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化することができる抗体分泌細胞を有する遺伝子導入動物を用意すること、
（ｂ）該動物から抗体分泌細胞を抽出すること、
（ｃ）その抗体分泌細胞を刺激に曝し、それによりその抗体分泌細胞をその１以上の導入遺伝子により不死化させること、
（ｄ）抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞を選別すること、かつ
（ｅ）その不死化された抗体分泌細胞から不死化細胞のクローン集団を製造すること
を特徴とする方法を提供する。
【００２２】
更なる態様では、本発明はモノクローナル抗体を製造する方法であって、前記の方法によって不死化細胞の集団を製造し、かつ該不死化細胞の集団からモノクローナル抗体を製造することを特徴とする方法を提供する。
【００２３】
更なる態様では、本発明は前記の方法によって得られる不死化された抗体分泌細胞のクローン集団を提供する。
【００２４】
更なる態様では、本発明は前記の方法によって得られるモノクローナル抗体を提供する。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、遺伝子導入動物から得られる単離され不死化された抗体分泌細胞であって、該細胞は１以上の導入遺伝子を発現し、該細胞は刺激の存在下ではその１以上の導入遺伝子により不死化状態に維持することができ、かつ刺激の不存在下では非不死化状態に変化させることができる細胞、を提供する。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、前記の不死化された抗体分泌細胞の集団を含む、モノクローナル抗体を産生する不死化された抗体分泌細胞の単離されたクローン集団を提供する。
【００２７】
更なる態様では、本発明は、不死化された抗体分泌細胞の製造のための遺伝子導入動物の使用であって、該遺伝子導入動物は１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞は刺激の不存在下では非不死化状態にあり、そして該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化させることができる使用、を提供する。
【００２８】
更なる態様では、本発明は、抗体の製造のための遺伝子導入動物の使用であって、該遺伝子導入動物が１以上の導入遺伝子を発現可能な抗体分泌細胞を有し、かつその抗体分泌細胞が刺激の不存在下では非不死化状態にあり、該細胞を刺激に曝すとその１以上の導入遺伝子により不死化状態に変化させることができ、かつ遺伝子導入動物を使用することによって抗体産生可能な不死化された抗体分泌細胞が得られる使用、を提供する。
【００２９】
“遺伝子導入動物”とは、遺伝子を改変された任意の動物を意味する。一般に遺伝子導入動物は、異種の遺伝物質を有するように改変される。好ましくは該動物は、生殖細胞系遺伝子導入動物であって、その動物のその遺伝物質中に１以上の導入遺伝子が永久かつ安定的に組み込まれ、その結果この導入遺伝子は子孫に伝播可能である。一般にこの異種の遺伝物質は、かかる遺伝子導入動物の、実質的に全ての二倍体細胞の核中に存在する。この導入遺伝子は、少なくとも幾つかの抗体分泌細胞中で発現可能であれば、動物における全ての細胞又は幾つかの細胞中だけで発現可能であってよい。
【００３０】
しかしながらこの遺伝子導入動物は必ずしも生殖細胞系遺伝子導入動物である必要はない。別の態様では、異種の遺伝物質を、形質導入、リポソーム又はウイルスによる移入（例えばアデノウイルスを介して）のような経路によって体細胞中に導入してよい。これらの態様では、この導入遺伝子は、抗体分泌細胞中で発現可能であれば、動物における幾つかの細胞中だけで発現可能であってよい。一態様では、この導入遺伝子を動物にレトロウイルスベクター、好ましくはリンパ球又はＢ細胞に選択的に感染するレトロウイルスベクターを用いて導入する。別の態様では、この導入遺伝子を抗体分泌細胞又はその前駆細胞にインビトロで導入し、次いでその抗体分泌細胞を動物に導入する。抗体分泌細胞は、この細胞を再導入する動物から又は異なる動物から得ることができる。一態様では、導入遺伝子をインビトロで（多能）造血幹細胞、免疫幹細胞又は他のＢ前駆細胞中に導入する。次いで、抗体を分泌する遺伝子導入前駆細胞を、一態様では骨髄移植により、動物に導入する。その動物を任意に処理して（例えば照射し、その後に移植することにより、放射線で誘導した骨髄キメラを作成して）それ自身の抗体分泌細胞を除去し、その後に遺伝子導入細胞を移植してもよい。
【００３１】
前記の態様において、導入遺伝子の発現は一過的であってよい。ただし、導入遺伝子を動物の抗体分泌細胞中に導入してから、その抗体分泌細胞を動物から抽出し（動物を免疫化するのであれば、動物を免疫する前に）、かつその抗体分泌細胞が該導入遺伝子を抽出後の十分な時間発現可能であり、その結果不死化細胞のクローン集団が単一の不死化細胞から製造できることが条件である。前記の方法のいずれを採用するかに拘わらず（生殖細胞系遺伝子導入動物を作成すること、導入遺伝子を細胞中にインビトロで導入し、次いで該細胞を動物中に導入すること、又はインビボでウイルスにより移入させることの如何に拘わらず）、本発明においては導入遺伝子を動物にインビボで導入し、それにより遺伝子導入動物を作成して、該動物から細胞を取り出すことが重要である。必要に応じて、該導入遺伝子を、不死化状態に維持するために細胞中にインビトロで再導入してよい。
【００３２】
“導入遺伝子”とは、一般に、動物中に導入されている異種遺伝子を意味する。異種遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムの発現をもたらす遺伝子を含むこともある。幾つかの態様では、異種遺伝子は、異種の調節可能な（誘起可能な）プロモーターを含むこともある。導入遺伝子は、異種の構成的又は誘起可能のプロモーターの制御下にある突然変異遺伝子を含むこともある。しかしながら用語“導入遺伝子”はまた異種の誘起可能なプロモーターの制御下に発現される本来の（野生型の）遺伝子を含むことを意図している。一態様では、遺伝子導入動物は、適切な癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の本来のプロモーター配列が異種の誘起可能なプロモーターによって置換されているプロモーター置換遺伝子導入動物であってよい。
【００３３】
刺激は、抗体分泌細胞の不死化を開始させることができるのならば、如何なる種類の刺激であってよい。好適な刺激は、一般に導入遺伝子の性質に従って、かつ該導入遺伝子が如何ように調節されうるかに従って選択される。特定の態様によれば、刺激は、細胞が曝される温度変化（上昇又は低下）又は化学的刺激（例えば薬剤、ホルモン又は他の化学物質の投与又は投与停止）であってよい。一態様では、化学的刺激は、該化学刺激に感受性の誘起可能なプロモーターを通じて導入遺伝子の発現を調節する。選択的な態様では、温度変化は、抗体分泌細胞の不死化を促進又は阻害するタンパク質の活性を調節する。一般に、刺激は、抗体分泌細胞が動物中で非不死化状態であり続けるために、その刺激が通常の条件下では動物中に存在しないように選択される。例えば、刺激が発癌性タンパク質の活性を調節する温度変化である場合に、該発癌性タンパク質は動物の通常の体温では不活性であるべきである。刺激がホルモン又は薬剤である場合に、そのホルモン又は薬剤は、実質的に存在しないか、又は抗体分泌細胞が動物中で非不死化状態であり続けるように十分に低濃度でのみ動物中に存在すべきである。
【００３４】
好ましくは抗体分泌細胞を動物から抽出してから、これに刺激を加える。しかしながら別の態様では、刺激は抗体分泌細胞に、それらが依然として動物中にあるうちに加える。前記の態様では、好ましくは刺激は（動物が免疫化されるのであれば）免疫後に加える。かかる方法は、抗体分泌細胞の不死化の開始を、該細胞が動物中にあるうちにもたらすことがある。次いで刺激を抗体分泌細胞に、それらが動物から抽出された後に、加え続ける。前記の態様では、抗体分泌細胞を免疫化直後に動物から取り出すことが有利である。動物が被る不必要な腫瘍増殖と苦痛を回避するために、抗体分泌細胞の不死化の前に刺激を取り除き、他の細胞が大きくなり過ぎるのを防ぐために、免疫化開始の直後に動物を屠殺する必要があることもある。
【００３５】
一態様では、抗体分泌細胞における導入遺伝子の産生物は、細胞中の腫瘍抑制機能を阻害する。“腫瘍抑制機能”とは、細胞における細胞の不死化を阻害する任意の機構又は活性を意味する。腫瘍抑制機能は、一般に腫瘍抑制遺伝子産生物、例えばｐ５３遺伝子のタンパク質産物の活性によりもたらされる。腫瘍抑制機能は種々の方法、例えば遺伝子産生物の活性阻害によって又は腫瘍抑制遺伝子の転写又は翻訳の阻害によって阻害することができる。
【００３６】
本発明は、免疫されたマウス及び免疫されていない（ナイーブ）マウスの関連の組織又は細胞から、抗原及びエピトープに特異的なモノクローナル抗体を産生するβリンパ球を迅速に不死化させ単離し及びクローニングする方法を提供する。マウスは、選ばれた宿主としての例示の目的にのみ利用されている。本発明の範囲はマウスの利用に制限されるものではなく、実際には当業者であれば本明細書に記載の方法を応用できる如何なる動物宿主も本発明により包含される。
【００３７】
特に本発明は、厳密に調節されたプロモーターの制御下にあるか、あるいは又はその活性自体が細胞培養温度の変化によって調節可能な、任意の不死化癌遺伝子を発現する遺伝子導入マウスの使用に関する。癌遺伝子を活性化すると、関連細胞、特に制限されないが、脾臓、循環リンパ球、リンパ節、骨髄、扁桃及びリンパ系の他の組織を含む組織から得られる抗体分泌細胞が不死化する。従って遺伝子導入マウスは前記の不死化された抗体分泌βリンパ球を産生する。本発明の更なる態様は、適切な腫瘍抑制遺伝子機能を同時にターゲティングすることにより癌遺伝子が対象の細胞を不死化する能力を増強させることに関する。これは、腫瘍抑制ｍＲＮＡをターゲティングするアンチセンス又はリボザイムを発現させるか、又は腫瘍抑制タンパク質分解の不活性化又は該タンパク質の分解速度の増大をもたらす腫瘍抑制タンパク質をそれ自体がターゲティングするタンパク質を発現するかにより達成することができる。更なる態様では、腫瘍抑制遺伝子を既に除去した遺伝子導入マウスを使用してこれを達成する。次いで、かかる遺伝子導入マウスを本明細書に記載のマウスと交配させれば、研究者の介入によりその癌遺伝子を活性化することができる。
【００３８】
本発明の更なる態様は、これに限定はされないが、かかる不死化された抗体分泌リンパ球の迅速な選別及び単離のために、蛍光活性化細胞選別（FACS）又は双極磁場フローソーティング（dipole  magnetic  flow  sorting）を含む方法を提供する。更に、１以上の抗原で免疫化した単一の動物から、複数のエピトープ特異性を有する抗体分泌細胞を単離する方法が記載されている。本実施形態の更なる態様は、ナイーブマウス（免疫化されていないマウス）から採取した細胞を使用して、事前に決められた興味の対象となる抗原への特異性を有する細胞を同定することである。更なる実施形態として、幾つかの動物から“ナイーブ”細胞をプールし、これら細胞の採取後に該細胞の一部を抗原識別選別のために凍結させる方法が提供される。本発明の更なる態様は、非マウス抗体の配列及び免疫原特性を有する抗体を、マウス中で製造する方法を提供する。前記の態様の望ましい実施形態は、適切な選別及び精製の後に抗体を治療用途に使用できるようにしたヒト化抗体、又は標準的な分子生物学的手法により抽出され、次いで全体として又は断片的に選ばれた宿主中で発現される遺伝子、を製造することである。
【００３９】
特定の実施形態の詳細な説明
対象の抗体を分泌するβリンパ球の不死化細胞株の作成
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）の方法体系（前記参照）に代わるハイブリドーマ製造の方法は、免疫化されたマウスの脾臓（又は他の組織）から採取したβリンパ球の範囲内で必要な遺伝物質を獲得し、特定の環境条件を変更することによって不死化の誘発を可能にすることである。本発明では、この遺伝物質の獲得は遺伝子導入技術（Ryding  et  al.  2001）の使用により達成し、確実に全ての子孫を改変された染色体ＤＮＡについてホモ接合性にする。遺伝物質を染色体ＤＮＡに導入する方法は他にもあり、例えばリポトランスフェクションやウイルスによる運搬が挙げられる。しかしながらこれらの方法では、生殖系列を用いて遺伝子導入動物に移入するようには、１００％の標的細胞が対象の遺伝物質を含有しているとの保証ができない。したがって本明細書に記載の発明の目的のために必要な遺伝子導入動物についての２つの特質を定義する必要がある。
【００４０】
第一に、転写された場合及び／又はβリンパ球において該細胞を不死化させる特定のシグナル経路を何らかの方法で活性化もしくは不活性化した場合に、その経路を活性化又は不活性化する遺伝子産生物又はアンチセンスＲＮＡ分子を発現する遺伝子又は遺伝子の組み合わせを選択する必要がある。第二に、調節可能な様式で、所望の遺伝子、遺伝子産生物又はアンチセンスＲＮＡを発現させあるいはそれらの活性化を起動かつ維持する必要がある。これらの遺伝子産生物及びアンチセンスＲＮＡの発現及び／又は活性化は、対象の組織又は細胞が動物中の本来の位置に存在する場合でも採取後の場合でも厳密に調節できることが重要である。そうすれば、細胞は、動物中の本来の位置にある通常の場合でも、培地中の不特定な位置にある場合でも、増殖能が付与されていれば、その間は対象の抗体を分泌し続ける。
【００４１】
本発明において、最も好ましい実施形態は、リンパ球を含有する組織（例えば脾臓、扁桃、リンパ節、咽頭扁桃、虫垂、パイエル板、気管支関連リンパ、粘膜関連リンパ組織、骨髄又は前記の細胞又は組織の種類の任意の組み合わせ）又は循環βリンパ球の採取物のいずれかを取り出し、次に前記の方法によりこれらを不死化することである。
【００４２】
βリンパ球遺伝子を不死化させるのに使用しうる遺伝子産生物
活性化されたときに特定の細胞型の不自然な不死化をもたらす遺伝子はしばしば癌遺伝子と呼称される。その活性化はしばしば癌に結びつき、そしてそれ自体は腫瘍形成に関連する。特定の癌の分子基盤が、少なくとも部分的に不適切な活性化に、又は何らかの他の様式で癌遺伝子の調節に結びついている場合が多々ある。特に、本発明に関しては癌遺伝子が免疫系の癌に関連していることに留意する。殊に、リンパ球の癌及びそれらの腫瘍形成に関与する遺伝子の同定である。かかる遺伝子の異常な活性化又は不活性化は、しばしば癌遺伝子の正常な転写調節が改変された異常な染色体転座の結果である。癌遺伝子ｃ−ｍｙｃはそういった事例である。
【００４３】
ｃ−ｍｙｃがＩｇＨ３遺伝子座又はＬ鎖遺伝子座に転座すると、ｃ−ｍｙｃは活性化し、これがヒトにおけるバーキットリンパ腫（Klein,  1981;  Adams  及びCory  1985;  Gauwerky  et  al.  1988）、マウスにおける形質細胞腫（Stanton  et  al.  1983）及びラットにおける免疫細胞腫（Klein  1988）の分子的基盤であると考えられる。Ｌｙ−１マウスＢ細胞は、しばしば腫瘍性Ｂ細胞疾患への関与が見られているが、その特徴は定常状態のｍｙｃのＲＮＡ濃度が１０〜４５倍増大し、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座が２〜１０倍増幅することである。ｃ−ｍｙｃの発現が増大すると、インビトロでは細胞株は死なずに増殖する能力を獲得し、インビボでは該細胞は悪性形質転換を好発すると考えられる（Citri  et  al.  1987）。これらのリンパ球の分子基盤における活性化されたｃ−ｍｙｃの役割は、遺伝子導入技術及び酵母人工染色体技術の適用を通して更に裏付けられている。こうして、ｃ−ｍｙｃ遺伝子のコピーをヒトのＩｇＨ重鎖遺伝子座のコア領域に連結し、そのゲノム中に安定に組み込んだマウスが作成された（Palomo  et  al.  1999）。この腫瘍形成細胞はβ細胞リンパ芽球の表現型特性を顕示していた。これらの遺伝子導入マウスは脾臓の他に腹部、頭部及び胸部に腫瘍を発生した。同様に、遺伝子導入ウサギを遺伝子操作して、Ｉｇ鎖エンハンサーの制御下にｃ−ｍｙｃを発現させている（Sethupathi  et  al.  1994）。これらのウサギから発生した幾つかの腫瘍は、βリンパ球系のリンパ腫として診断され、インビトロで維持することができた。ｃ−ｍｙｃとＮ−ｍｙｃの機能の潜在的な互換性の証拠は、ｃ−ｍｙｃがＮ−ｍｙｃで交換されている遺伝子導入マウスにおいて証明された（Malynn  et  al.  2000）。これらのマウスにおけるｃ−ｍｙｃの増殖と分化の機能（沈静化された場合）はＮ−ｍｙｃの発現によって蘇生できる。免疫グロブリン重鎖エンハンサー（Ｅμ）の制御下でＮ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入マウスではクローン性のリンパ球系腫瘍が生ずる（Rosenbaum  et  al.  1989）。クローン性があるということは、不死化が発生する前に更なる遺伝的異常が必要かもしれないことを示唆している。１つの遺伝子候補はｐ５３遺伝子である。すなわちｍｙｃ発現ウイルスで感染したｐ５３−ヌル−／−マウス（Jacks  et  al.  1994）に由来する骨髄細胞をＣ５７ＢＬ６マウス中に再移植した後に得られるＢリンパ腫は、Ｉｇ遺伝子ＤＪ領域のＰＣＲ分析によって測定すると、遺伝子的に多クローン性である（Yu及びThomas-Tikhonenko  2002）。このことから、この細胞型の不死化には唯２つの遺伝子的事象、すなわちこの特定の事例ではｐ５３活性の消失及びｍｙｃの活性化が必要であることが判る。
【００４４】
ｍｙｃ遺伝子の産生物が他の細胞を不死化させる幅広い能力、この場合にはｖ−ｍｙｃによる後根神経節（ＤＲＧ）細胞を不死化させる能力は、Ｒａｙｍｏｎ他（１９９９）によって証明された。これらの実験においてヒト胎児の後根神経節細胞の初代培養物は、テトラサイクリン感受性トランスアクチベーターの制御下にｖ−ｍｙｃを発現するレトロウイルスベクターでの感染によって不死化されている。クローン細胞株は限定希釈によって単離され、次いで不死化細胞株として培養中に維持することができた。培地にテトラサイクリンを添加した後（テトラサイクリンの添加はｖ−ｍｙｃ転写を不活性化させる）にこれらの不死化細胞株がカプサイシン感受性ＤＲＧに再分化する能力は、クローン細胞株の少なくとも６５倍加の間は維持された。前記のｃ−ｍｙｃ発現により少なくとも部分的にも腫瘍形成前の表現型が失われることはなく、このことは、ｃ−ｍｙｃの活性化によって誘発されたβ細胞由来の腫瘍が表面ＩｇＭの発現を維持することから明らかである（Kovalchuk  et  al.  2000）。
【００４５】
Ｅμ免疫グロブリン重鎖エンハンサーの制御下にｖ−ａｂｌを生殖細胞系導入遺伝子にて発現させることにより、ＩｇＡ又はＩｇＧのいずれかを分泌するクローン性プラズマ細胞腫を発生する傾向のある３つの遺伝子導入細胞株が得られた（Rosenbaum  et  al.,  1990）。これらのプラズマ細胞腫の大部分では、担持しているｃ−ｍｙｃ遺伝子が再配列されており、それは明らかにＩｇＨ遺伝子座に自然転座した結果であった。類似のＥμ−ｍｙｃマウスと交配した子孫では、オリゴクローン性のプラズマ細胞腫を迅速に発生するが、プレβリンパ腫を発生しないマウスが得られた。この理由は、重鎖エンハンサーがプレＢ細胞中で活性でないことによる可能性が大きい。Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ腫瘍抑制遺伝子座にヘテロ接合性（＋／−）が付随すると、Ｂ細胞がａｂｌで形質転換されることも容易になると推測される（Mostecki  et  al.  2000）。
【００４６】
ｖ−ａｂｌとＮ−ｍｙｃ（Sμｇiyama  1994）又はｃ−ｍｙｃ（Spieker-Polet  et  al.  1995）を組み合わせて発現するのはプラズマ細胞腫系統を作成する強力なアプローチである。更に、Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ他（１９９５）は、Ｅμエンハンサー（Rosenbaum  et  al.  1990）及びκ−鎖エンハンサー（Ｅκ；Sethupathi  et  al.  1994）の制御下でそれぞれｖ−ａｂｌ及びＮ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入ウサギからＨＡＴ感受性プラズマ細胞腫細胞株を選別している。この細胞株を作成する狙いは、融合相手の提供であって、その目的は非遺伝子導入の免疫化ウサギから得られる脾細胞との融合によりモノクローナル抗体を作成することであった。
【００４７】
ＳＶ４０のラージＴ抗原で不死化された細胞株は幾つかのアプローチで作成されている。ＳＶ４０ウイルスは、肺炎球菌ワクチンの静注により過免疫されたウサギから採取された脾細胞と骨髄細胞との両者に感染させるために使用されたことがある（Collins  et  al.  1974）。細胞株（ＴＲＳＣ−１）は、感染した脾細胞の１つの培地の表面で増殖が確認された細胞の小集団から単離された。該ＴＲＳＣ−１細胞はＳＶ４０のラージＴ抗原を発現し、そして（等電点電気泳動によって測定される）モノクローナル抗体を分泌していると見られ、かつこの抗体は、肺炎球菌ワクチンの成分を特異的に識別した（Strosberg  et  al  1974）。ラージＴ抗原が細胞の不死化をもたらしうるメカニズムの１つは、これが腫瘍抑制タンパク質ｐ５３に結合してそれを不活性化することである（Pipas及びLevine  2001）。
【００４８】
より特異的にはラージＴ抗原遺伝子を細胞に形質導入して、不死化細胞株を作成することができる（Katakura  et  al.  1998）。このアプローチの更なる拡張は、組織特異的プロモーターの制御下にＳＶ４０のラージＴ抗原を発現させることであった。Ｗｉｎｄｌｅ他（１９９０）は、ヒトの糖タンパク質ホルモンのαサブユニット遺伝子プロモーター／エンハンサーの制御下にラージＴ抗原を発現させることによって下垂体前葉腫瘍をマウスに発生したと記載している。
【００４９】
熱不安定性ラージＴ抗原（ｔｓＡ５８）を発現する遺伝子を担持するＳＶ４０突然変異体を使用して、ラット胚線維芽細胞から作成した細胞株（Jat及びSharp,  1989）、ヒト線維芽細胞株（Radna  et  al.  1989）及びこの突然変異体のウイルスでマウス肝細胞を感染することによって齧歯類肝細胞株（Lee  et  al.  1995）が作成されている。これらの細胞は３３〜３５℃の許容温度では不死細胞株として増殖できるが、３７〜３９℃では熱不安定性ラージＴ抗原の機能が失われるために増殖できない。
【００５０】
前記の熱不安定性ラージＴ抗原の有用性は、“不死化マウス”と呼ばれる遺伝子導入マウスの作成を通して更なる段階を迎えている（Jat  et  al.  1991;  Noble  et  al.  1995;  Jat  et  al.  (1997)  米国特許第５，６８８，６９２号；  Jat  et  al.  (1999)  米国特許第５，８６６，７５９号）。不死化マウスでは、ラージＴ抗原ｔｓＡ５８遺伝子が、恒常的に発現するマウス主要組織適合遺伝子複合体Ｈ−２ＫbクラスＩプロモーターの制御下に広範に発現される（Weiss  et  al.  1983）。このプロモーターは更にインターフェロンγの存在下に更に活性化させることができる。かかる遺伝子導入動物を作成する目的は、動物から採取できる潜在的に全ての組織から不死化細胞の源を提供することであった。全ての起源組織が試験されている訳ではないが、この手法が成功している多くの例が文献にある（Noble  et  al  1995）。この系を使用して首尾よく不死化した細胞には、線維芽細胞及びサイトケラチン＋胸腺上皮細胞（Jat  et  al.  1991）、腎臓集合管（Takacs-Jarrett  et  al.  1998）、蝸牛毛細胞（Jagger  et  al.  1999;  Jagger  et  al.  2000）、ＣＡ１海馬（Virley  et  al.  1999）、脳毛細管上皮（Kanda  et  al.  2000）、骨髄由来間葉細胞（Dennis及びCaplan,  1996）、肝細胞（Lee  et  al.  1995;  Allen  et  al.  2000）、骨髄（Chambers  et  al.  1993;  Matsumoto  et  al.  1995;  Liu  et  al.  1998）、腸上皮（Tavelin  et  al.  1999;  Whitehead  et  al.  1993）、皮膚線維芽細胞、膵臓細胞、星状細胞、神経皮質細胞、内皮細胞、結腸上皮細胞及び筋芽細胞（Jat  et  al.  (1997)  米国特許第５，６８８，６９２号）などがある。
【００５１】
前記の技術は１０年間の文献に存在していたのであるが、モノクローナル抗体を産生するクローン性細胞株を直接的に得ることを目的に、不死化されたβリンパ球を“不死化マウス”から得るということは、本発明の一つの実施態様における発想であって、先行技術からは示唆も教示もされない。
【００５２】
幾つかの細胞株、例えば成人の乳房線維芽細胞及び上皮細胞はＳＶ４０のラージＴ抗原単独では不死化させることができない。前記の場合には、テロメラーゼとの同時形質転換によって不死化細胞株の増殖が可能となる（O-Hare  et  al.  2001）。ＩｇＧを分泌するヒトの形質細胞を不死化させることはＫａｎｋｉ及びＴａｋｅｕｃｈｉ（１９９５）によって記載されている。前記のことは、ＳＶ４０のラージＴ抗原を発現するプラスミドで細胞を形質転換させてから、慣用的に相手の細胞、好ましくはヒト由来の細胞と融合させることによって実現された。
【００５３】
βリンパ球の不死化はまたエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）による感染によっても実現できる。ＥＢＶは、感染すると正常な細胞周期を活性化するプログラムを利用するように見える（Hollyoake  et  al.  1995）。特にＣａｎｎｅｌ他（１９９６）は、細胞周期タンパク質ｐＲｂ（網膜芽細胞腫）がＥＢＶによるβリンパ球の不死化と同時に過リン酸化されることを確認した。殊にＥＢＶの核抗原２（ＥＢＮＡ２）を使用することによって、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター及びＥＢＮＡ２プロモーターの制御下でＥＢＮＡ２を発現する遺伝子導入マウスに腫瘍を誘発させている（Tornell  et  al.  1996）。特定の不死化因子を使用すれば、ＥＢＮＡ２であれ、ＥＢＶ由来タンパク質の組み合わせであれ、βリンパ球の不死化に使用可能なはずである。
【００５４】
ｐ５３、ｖ−ａｂｌ、ｂｃｌ２及びｒａｓという癌遺伝子と腫瘍抑制因子のどのような組み合わせがβリンパ球細胞の不死化に協調的に作用しうるかということの体系的評価がＫｕｍａｒ他（１９９９）によって実施された。彼らは、ｖ−ａｂｌ／ｂｃｌ２という組み合わせが脾臓β細胞を効果的に不死化させる唯一の組み合わせであることを見いだした。Ｏｖｅｒｅｌｌ他（１９８９）は、ｖ−Ｈａ−ｒａｓとｖ−ｍｙｃＭＣ２９を発現するレトロウイルスを使用してβリンパ球を不死化させることを記載している。この場合に、彼らは、初代前駆β細胞が成熟β細胞より優先的に不死化されることを見いだした。幾つかのβ細胞腫瘍の進行と維持に関連し、したがって本発明で不死化遺伝子としての使用が考えられる更なる癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子不活性化因子には、例えばｖ−ｒｅｌ（Zhang  1995）、ｂｃｌ−２（Adams  et  al.  1999）、ｂｃｒ−ｖ−ａｂｌキメラ（Hariharan  et  al.  1989;  Harris  et  al.  1990）、ＳＶ４０ラージＴ、パピローマウイルスＥ６及びＥ７、アデノウイルスＥ１Ａ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヘルペスウイルス−サイミリ、ｐ５３（Katakura  et  al.  1998）、ＰＩＭ１、ＲｈｏＨ／ＴＴＦ（ＡＲＨＨ）、ＰＡＸ５（Pasqualucci  et  al.  2001）、ｍｄｍ２（Haupt  et  al.  1997;  Kubbutat  et  al.  1997;  Xirodimas  et  al.  2001）がある。このリストから本発明の好ましい実施態様が提示され、当業者であれば他の癌遺伝子／腫瘍抑制因子不活性化因子を選択することができる。この導入遺伝子の性質は特に制限されないが、但し、この方法では、調節された癌遺伝子／腫瘍抑制因子不活性化因子の発現を利用して不死化βリンパ球が獲得され、次に所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞株が製造されなければならない。
【００５５】
細胞の不死化に到ると推測される経路の活性化
βリンパ球不死化の更なる方法は、活性化すると該細胞の不死化を惹起する適当なシグナル経路の引き金を引くことである。この一例では、抗ＣＤ４０  ｍＡｂとエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）と間の相乗作用現象をヒトβリンパ球の活性化及び形質転換において利用することができた（Tsuchiyama  et  al.  1997;  Niedbala及びStott  1998;  Rush及びHodgkin  2001）。βリンパ球は、抗ＣＤ４０抗体に暴露されると感受性が高まるので、ＥＢＶで不死化される可能性が増大する。ＣＤ４０とＣＤ２１の複合体（ＥＢＶのための受容体）が同時に連結すれば、ヒトβリンパ球の短期増殖と長期形質転換率は共に増大する。あるいは、この相乗効果の根底にある分子機構の細胞内基盤を解明すれば、不死化する導入遺伝子を発現する戦略が得られるはずである。
【００５６】
細胞の不死化に関わる経路の不活性化
アップレギュレーションすれば腫瘍形成及び細胞不死化に到ると推測される癌遺伝子に加えて、腫瘍抑制因子タンパク質が存在し、その活性には主として該癌遺伝子とは正反対の表現型効果があり、したがって細胞の腫瘍形成的増殖が抑制される。これら２つのクラスのタンパク質の活性の均衡が望ましい細胞増殖特性を維持するための鍵となる。すなわち、その抑制因子タンパク質が不活性化すれば、当該細胞は不死化するか、又は癌遺伝子の同時過剰発現／活性化により不死化が達成される可能性が高まると推定される。実際にこれは事実である（Mostecki  et  al.  2000;  Yu及びThomas-Tikhonenko  2002）。原則的に２つの方法のうちの１つによって不活性化を達成できる。第一には、それ自身が腫瘍抑制因子を不活性化するか、あるいはそれが腫瘍抑制因子の不活性化を媒介するタンパク質の発現による方法、あるいは又、腫瘍抑制因子遺伝子をコードする配列を標的とするアンチセンスｍＲＮＡ／リボザイム又はオリゴヌクレオチドの適切な転写又は導入によるものでよい。
【００５７】
ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現は、細胞株、例えば脾臓由来の抗体分泌細胞の不死化をもたらすことができる（Collins  et  al.  1974;  Srtosberg  et  al.  1974）。ラージＴ抗原が細胞の不死化をもたらしうるメカニズムの１つは、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３に結合してこれを不活性化することである（Pipas及びLevine  2001）。発現するとｐ５３が不活性化に到るタンパク質のほかの例としてはｍｄｍ２が挙げられる。ｍｄｍ２腫瘍性タンパク質は、ｐ５３の転写活性化ドメインに結合し、ｐ５３が抗増殖的な役割を果たすために標的プロモーターを調節するのを抑制する（Symonds  et  al.  1993;  Haupt  et  al.  1997）。ｍｄｍ２の更なる機能はｐ５３を標的にしてこれをユビキチン化し、プロテアソームで分解させることである（Kubbutat  et  al.  1997;  Maki及びHowley  1997;  Fuchs  et  al.  1998;  Xirodimas  et  al.  2001）。ｐ５３（Maki及びHowley  et  al.  1997）の半減期（３０〜６０分）は短いので、迅速且つ同調された不死化が望まれる場合には標的としては理想的な候補である。
【００５８】
ランダムなｐ５３アンチセンス配列を発現するレトロウイルスライブラリーを用いて、マウス胎児線維芽細胞におけるｐ５３ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに極めて効果的な特異的配列が同定された（Carnero  et  al.  2000）。ｐ５３が減少した結果、これら線維芽細胞は培地中で生存する能力を増大し、通常ならば野生型細胞が細胞老化する継代回数を超えて生存した。幾つかの他の研究では、ｐ５３に対するアンチセンスが使用され、細胞増殖におけるｐ５３の役割を研究するのに有効であることが確認された（Ferreira及びKosik  1996;  Matsushita  et  al.  2000;  Arora及びIversen  2000;  Zhu  et  al.  2002;  Shih  et  al.  2002）。このことから、細胞ベースのアッセイでｐ５３を減少させるかかるアプローチが有効であることが判る。
【００５９】
ｐ５３活性が動物個体の生存力に重要でないことは、生存可能なｐ５３ノックアウトマウスの作成によって実証されている（Jacks  et  al.  1994）。このマウスは生存可能であるが、予想通りに悪性腫瘍に対して極めて感受性である。Ｙｕ及びＴｈｏｍａｓ−Ｔｉｋｈｏｎｅｎｋｏ（２００２）はこのｐ５３−／−遺伝子導入マウスから骨髄細胞を採取し、そして該細胞をｍｙｃ発現ウイルスで感染させた。次いで該細胞をＣ５７ＢＬ６マウス中に皮下注入した。ｐ５３−／−由来のｍｙｃ感染細胞で感染された全てのマウスが腫瘍を発生し、一方でｍｙｃ感染されていないコントロールは腫瘍形成増殖の徴候は見られなかった。切除した腫瘍の組織病理学的染色により、全ての腫瘍がβリンパ球のリンパ腫であることが示された。更にＩｇ遺伝子のＤＪ結合のＰＣＲによる遺伝子分析により複数の断片が示され、これは腫瘍が事実上多クローン性であることを示している。この結果は、ｐ５３活性の損失とｍｙｃ活性の取得が腫瘍形成性の、従って不死化された増殖、特にリンパ球の不死化された増殖を誘発するのに必要な全てであることを示唆している。一方で、ｍｙｃ単独がＢ細胞において過剰発現されるときに見受けられるクローン性（Langdon  et  al.  1986;  Pelicci  et  al.  1986）は、腫瘍形成性表現型を誘発するには更なる遺伝子改変が必要であることを示唆している。従って本明細書に記載の本発明の目的のためには、ノックアウトマウス、ｐ５３に対するアンチセンス、又はｍｄｍ２の発現によりｐ５３の活性を失わせることと、誘導可能なプロモーター制御下に特定の癌遺伝子の発現をする遺伝子導入マウスとを、以下に記載される本発明の詳細な説明のように組み合わせて使用すれば、所望の特異性の抗体を分泌する不死化細胞が得られる。
【００６０】
ｐ５３は本発明の特に好ましい実施態様で使用されるが、ｐ５３腫瘍抑制因子を標的にするのは例として挙げているに過ぎない。別の腫瘍抑制因子タンパク質／遺伝子又は腫瘍抑制因子タンパク質／遺伝子の調節因子を標的にしても、本明細書に記載の本発明の目的に必要な望ましい細胞表現型が得られることは当業者には自明である。標的にすることができる他の腫瘍抑制因子遺伝子は、例えばｐ１６Ink4aが挙げられる（Sharpless  et  al.  2001;  Mostecki  et  al.  2000）。
【００６１】
βリンパ球を不死化させる遺伝子、タンパク質又はアンチセンスＲＮＡの発現を調節する方法
アンチセンスＲＮＡを使用して標的とするべき幾つかの遺伝子又は遺伝子は上に概説したが、それらの産生物によって、発現、活性化又は不活性化のいずれかの際に、それら遺伝子を発現する細胞は不死化に到ることができる。本発明の場合には、不死化のために特に対象とする細胞型は抗体分泌βリンパ球である。遺伝子産生物の活性化により細胞不死化がもたらされる場合には、これらの不死化因子を活性化する２つの方法が選択肢として存在する。これらは以下のように分類できる。第一は、遺伝子転写レベルでの制御による活性化であり、第二は、遺伝子産生物の活性化の制御である。遺伝子転写レベルでの制御を使用すれば、不死化タンパク質の発現の他にアンチセンスＲＮＡ／リボザイムの転写の調節も可能である。
【００６２】
細胞の不死化がマウスから採取した後のβリンパ球で活性化され、反対に採取する前では不活性化されているのであれば、これら２つの制御機構のどちらを選択するかは実質的に重要ではない。選択したアプローチにとって重要な要件は、マウスにおいて野生型細胞の増殖を制御する系がβリンパ球を採取しそれの不活性化が必要となる時点まで維持されることである。次いでその後に該細胞を不死化させれば、動物を屠殺する前に組織／細胞タイプの起源中に存在した細胞の多様性を十分に反映できる細胞のプールから、βリンパ球を選択し、増殖させることができる。、で。更に要件は、不死化の時点でこれらの細胞は対象の抗体を分泌し続け、好ましくはその細胞表面に同じ抗原に対する受容体が存在することである。
【００６３】
転写レベルでの細胞不死化の制御
細胞不死化の活性化が転写／翻訳レベルでの制御に依存する系の所望の特徴は以下の通りである。その活性化法は厳密に（“リーク”なく）調節され、その結果不死化が望まれる時点まで細胞増殖機構が正常に機能していなければならない。細胞不死化が十分迅速に活性化され、その結果対象の細胞全てが短時間の間に、好ましくは同時に確実に不死化状態になることである。そのような活性化因子又は不死化因子は、単クローンがβリンパ球由来の抗体を分泌し続けるのを絶対妨害しないことである。更にそのような活性化因子又は活性化の方法は、その過程を標的にすることが細胞の不死化にとって必要がないような細胞の生理的過程をなんらかの機構によって阻害しないことが必要である。また、そのような不死化は活性化因子の添加により構成的に活性化できること、又はそのような活性化因子が十分な量、入手可能であり、その結果選択したクローン細胞株全てを不死化増殖することができることである（Pollock及びRivera  1999;  Wang  et  al.  1999）。
【００６４】
上に列記した多数の要件を満たすためには、対象の特定組織／細胞型に、この場合にはβリンパ球中に通常は存在しないプロモーター系を使用するのが望ましい。より好ましくは該プロモーター系は宿主種中に全く存在しないプロモーター系であってよい。
【００６５】
上に概述した基準を満たす多数の誘起可能なプロモーター系が解析されている。動物において、条件に応じて遺伝子産生物を発現する幾つかの系及び技術がＲｙｄｉｎｇ他（２００１）によって論じられている。例として、以下のプロモーター系、すなわちテトラサイクリン、ＧＡＬ４、エクジソン及びＦＫ５０６結合タンパク質により誘起可能な発現系の制御機構のみを記載する。しかしながら他の類似した系が最近では入手可能であり、将来入手可能となると推測され、そして当業者によって開発されるのが認められる。本発明にとって重要なことは、特定のプロモーター系を使用することではなく、かかる系を使用して、重要なプロモーターを緊密に“リークなく”調節する要件を満たしている遺伝子導入動物から不死化されたβリンパ球細胞株を作成することである。しかしながら、プロモーターの“リーク度”を絶対的に制御することが必ずしも重要ではなく、それが極めて好ましいということに留意すべきである。
【００６６】
テトラサイクリンにより調節される発現系（Brent  et  al.  (1989)  米国特許第４，８３３，０８０号）では、２つのテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔ−Ｏ）が強力なＣＭＶ（サイトメガロウイルス）真核性プロモーターのＴＡＴＡボックスと転写開始部位との間に挿入されている。これらの配列にはＣＭＶプロモーターへの直接的な作用はない。しかしながらＣＭＶにより駆動される転写、従って発現は、テトラサイクリン抑制タンパク質がこれらのｔｅｔ−Ｏ部位に結合した場合には封鎖される。しかしながらテトラサイクリンが細胞培養培地に添加されると、テトラサイクリンが細胞に浸透して抑制タンパク質に結合するので、抑制タンパク質は立体構造が変化し、ｔｅｔ−Ｏ部位から遊離される。その結果、発現が発動する。不死化する癌遺伝子がこのようなＣＭＶ／ｔｅｔプロモーターの制御下にある場合には、テトラサイクリン抑制タンパク質を発現する他の導入遺伝子を全ての細胞又は、少なくとも引き続き不死化が望まれる細胞において構成的に同時発現する必要がある。使用するプロモーターがＣＭＶプロモーターであってもよいが、この場合には、ｔｅｔの制御下にはない。
【００６７】
あるいは他のプロモーターを使用して、ＣＭＶの代替としてｔｅｔ抑制タンパク質を発現させてよい。更に他の哺乳動物のプロモーター（調節可能なまたは構成的に活性な）をｔｅｔ−Ｏ部位と結合させて、代替の誘起可能な発現系を作成することは当業者には想到可能である。ｔｅｔプロモーター系を使用して、ＳＶ４０ラージＴ抗原の肝臓特異的発現を効果的に制御している（Manickan  et  al.  2001）。該ラージＴ抗原が発現した結果、肝細胞の腺腫及び過形成が進展した。
【００６８】
上記テトラサイクリン法よりも更に緊密な調節が可能な他の誘起可能な発現系はＧａｌ４遺伝子スイッチである。この手順では、癌遺伝子は、アデノウイルスＥ１ｂ遺伝子からの１０塩基対のＴＡＴＡボックス配列と酵母ＧＡＬ４タンパク質のための６つの結合部位からなるハイブリッドＧＡＬ４  ＵＡＳ／Ｅ１ｂプロモーターの転写制御下にある。このプロモーターは遺伝子スイッチトランスアクチベーターの不存在下では転写に関して不活動である。該トランスアクチベーターは３つの機能的ドメインからなる：ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４  ＵＡＳ／Ｅ１ｂプロモーターに結合する）、ヒトのプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン（ｈＰＲ−ＬＢＤ、誘導剤のミフェプリストンに結合する）及びＮＦκＢ  ｐ６５活性化ドメイン（ＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｅ１ｂ最少プロモーターを離れて転写を活性化する）。ミフェプリストンの不存在下では、ｈＰＲ−ＬＢＤは、遺伝子スイッチタンパク質の転写活性化を妨げる立体構造を有する。ミフェプリストンに結合すると、ｈＰＲ−ＬＢＤはそれがプロモーターに結合して転写を刺激しうる立体構造になる。遺伝子スイッチタンパク質それ自体の発現は４つの上流ＧＡＬ４結合部位を有し活性が最少のＴＫプロモーターの制御下にある。ミフェプリストン活性化遺伝子スイッチタンパク質が前記のプロモーターに結合すると、遺伝子スイッチそれ自体は更に発現し、最終的には正方向にフィードバックする癌遺伝子発現促進となる。
【００６９】
更なる“遺伝子スイッチ”機構はその上、真核性転写因子のモジュール性、すなわち該因子は別個のＤＮＡ結合ドメインと転写活性ドメインに分割できるという特性を利用する。これらのドメインは、たとえ非共有的な相互作用によって一緒にした場合でも、配列特異的な転写活性化因子を再構築することができる（Spencer  1996）。すなわちこれら転写因子ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメイン）のそれぞれが異種のリガンド結合ドメインに融合すると、細胞浸透性の二量体リガンドの添加に応答して活性化転写因子が再構築可能となる（Rivera  et  al  1996;  Pollock及びRivera  1999）。
【００７０】
天然の生成物ＦＫ５０６の誘導体は、高い親和性でＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）−１２に結合するが（Schreiber  1991）、他方、共有結合で結合した２つのＦＫ５０６分子からなる分子ＦＫ１０１２は２つのＦＫＢＰドメインを二量体化することができる。この分子（ＦＫ１０１２）を使用することによって、ＤＮＡ結合ドメイン−ＦＫＢＰ融合タンパク質及び活性化ドメイン−ＦＫＢＰ融合タンパク質の他に好適なリポーター遺伝子を発現する細胞中で遺伝子転写が用量に依存して効果的に活性化されている（Ho  et  al.  1996）。ＦＫ５０６のＦＫＢＰ結合界面だけの結合モノマーからなる改変された形のＦＫ１０１２が開発された（ＡＰ１５１０）（Amara  et  al.  1997）。しかしながらＡＰ１５１０の１つの欠点は、野生型のＦＫＢタンパク質と相互作用するということである。
【００７１】
ＦＫＢＰ転写活性化系に対し多くの改良がなされてきた結果、主に前に概説した所望の基準を満たす遺伝子スイッチが作成されるようになった（Pollock及びRivera  1999）。使用する選択的な転写因子（ＺＦＨＤ１）は、公知の哺乳動物の転写因子の特異性とは異なる配列特異性を有し（Pomerantz  et  al.  1995）、従って外因性のＤＮＡ結合タンパク質により標的発現が不適切に調節されるのが回避される。ＦＫＢＰタンパク質とＡＰ１５１０には改変が加えられており、新規のリガンド系列（ＡＰ１８８９）は改変されたＦＫＢＰ（ＦＫＢＰF36V）タンパク質とのみを結合し、未改変のＦＫＢＰと結合しない（Clackson  et  al  1998）。最少プロモーター、例えばヒトのインターロイキン−２−（ＩＬ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びＳＶ４０初期遺伝子由来の最少プロモーターの上流にＺＦＨＤ１結合部位を配置することにより、前記の系を用いて調節できるプロモーターが作成される。より強力なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターは、活性化因子の不存在下では相当の基礎活性を示すが、他方、ＩＬ−２プロモーターがもたらす基礎発現は非常に低いが、二量化因子に誘導される発現レベルは高い（Pollock及びRivera  1999）。
【００７２】
モジュール様のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインを有する更なる遺伝子スイッチでは、プロゲステロン結合活性は欠くが、プロゲステロン拮抗物質アンチプロゲスチン（RU486;  Wang  et  al.  1999）と結合する能力を有するＣ末端欠損型のヒトのプロゲステロン受容体が利用されている。（Ｎ末端から）単純ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ１６、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（例えば前記のもの）、続いて欠損型ＲＵ４８６応答受容体からなる融合タンパク質は雑種の転写調節因子を形成する。この融合タンパク質はＨｅｐＧ２細胞において構成的なトランスチレティンエンハンサー／プロモーターによって発現が駆動される。ヒトの成長ホルモンの発現を駆動する最少Ｅ１Ｂプロモーターの上流にある４つのＧＡＬ４結合ドメインのコピーは同一の安定に組み込まれたプラスミド上に存在した、従って十分に誘導可能なヒトの成長ホルモンの発現系が得られた（Wang  et  al.  1997b）。１０ｎＭのＲＵ４８６により１２０倍の誘導レベルが達成されたが、それとともにＲＵ４８６インデューサーの不存在下では基礎発現レベルは非常に低かった。また遺伝子導入マウスにおけるこの誘起可能な発現系の効果的な利用が証明されている。そこでＷａｎｇ他（１９９７ａ）は、２５０μｇ／ｋｇのＲＵ４８６の投与後に血清中に１５００倍のｈＧＨ発現の誘導を測定している。
【００７３】
エクジソンにて誘導可能な発現系には、前記の発現系に優る２つの主要な利点がある（Saez  et  al.  2000）。第一に、該プロモーターは非常に緊密に調節されるので、従って活性化因子の不存在下には  “リーク”又はプロモーター活性は非常に僅少である。第二に、この系はショウジョウバエのプロモーターと転写因子とのペアに基づいており、結果としてこの系は“自足的”であり、かつ真核細胞において野生型のプロモーター機能との相互作用がない。ＣＶ−１細胞での一過性発現実験において、Ｎｏ他（１９９６）は、テトラサイクリン誘起可能なプロモーターの場合には５９倍の増大があるのに比較して、改変されたエクジソン誘起可能なプロモーターに結合した場合には遺伝子のレポーター活性が１０００倍まで増大すると報告している。更に、エクジソンにて誘導可能なプロモーターの基礎活性はテトラサイクリン誘起可能なプロモーターよりも２０倍も低い。ＨＥＫ−２９３安定細胞株を利用する発現実験において、インデューサーであるムリステロン１ｕＭによるホルモン受容体の活性化により、３時間後に１００倍の発現誘導がもたらされ、８時間後に１０００倍の発現誘導がもたらされ、そして２０時間後に２００００倍の発現誘導がもたらされた。インデューサーの不存在下では基礎活性が非常に低いことと合わせて、この系及びこれと類似の特性プロフィールを有する他の系は、本発明に記載の目的のために抗体分泌細胞における癌遺伝子発現の理想的な活性化法を提供する。
【００７４】
更にＮｏ他（１９９６）は、ＥＳＨβ、すなわちホルモン受容体ドメインの発現を駆動する胸腺特異的プロモーターを使用して遺伝子導入マウスにおける該系の有用性を証明した。彼らは、１０ｍｇのムリステロンでそのマウスを処理することでプロモーター活性が誘導されることを証明した。この結果として、エクジソン誘起可能なプロモーターにより相当の誘導がもたらされるが、一方でムリステロンの不存在下と、ＥＳＨβプロモーターが活性でない組織中の両者において低い基礎活性が観察された。インビトロジェン株式会社は前記の系をキット型（種々のキットコンポネントのカタログ番号Ｋ１００１−０１、Ｋ１００１−０２、Ｋ１００１−０３、Ｋ１００２−０１、Ｋ１００２−０２、Ｋ１００２−０３、Ｋ１００３−０１、Ｋ１００３−０２、Ｋ１００３−０３、Ｋ１００４−０１、Ｋ１００５−０１）で提供し、ムリステロン、ポナステロンＡに代わる活性化因子（Saez  et  al.  2000）を利用可能にしている。この系は、エクジソン受容体（ＶｇＥｃＲ）及び哺乳動物のレチノイド受容体（ＲＸＲ）のヘテロ二量体を利用し、該ヘテロ二量体は、ポナステロンＡの存在下にエクジソン応答エレメント（Ｅ／ＧＲＥ）と結合し、そうして対象の遺伝子の発現を活性化する。例示の目的で本明細書に記載のβリンパ球において、この系を使用して癌遺伝子発現が調節され、従って細胞の不死化が調節されている。
【００７５】
この系を効果的に使用して、ＨＥＫ−２９細胞でのＭＫＫ７の構成的に活性な形の発現の効果が研究されている（Wolter  et  al.  2001）。最も重要なことには、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫沈降法、共焦点検鏡法及びＦＡＣＳ分析により、活性化因子（インデューサー）の不存在下にＧＦＰ−ＭＫＫ７３Ｅ融合タンパク質の発現があまり高くないことが示された。ポナステロンＡに誘導されるβ−ガラクトシダーゼ活性の発現を遺伝子導入マウスの乳腺にターゲティングした別の例においては、基礎（ポナステロンＡ不投与）活性（例えばファーストレッド染色で測定される）は乳房組織から採取された組織化学的切片で検出されなかった。一方、β−ガラクトシダーゼ活性は動物に活性化因子を投与した後に同様の組織において検出された（Albanese  et  al.  2000）。
【００７６】
第三の例では、エクジソン遺伝子スイッチを使用して、ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞株（Hennigan及びStambrook  2001）中に形質導入された優性阻害型ｃ−ｊｕｎ突然変異体／ＧＦＰ誘導タンパク質ＧＦＰ−ＴＡＭ６７の発現が調節されている。この研究では、活性化因子のポナステロンＡの不存在下に非常に低いＧＦＰ−ＴＡＭ６７の基礎発現が検出された。
【００７７】
レノジェン社（RheoGene  Inc.）は、エクジソン遺伝子スイッチ技術の使用に関し、実施許諾された特許を有し、この技術は、例えば米国特許第６，２５８，６０３号（Carlson  et  al.  2001）、同第６，２４５，５３１号（Hogness  et  al.  2001）及び同第５，５１４，５７８号（Hogness  et  al.  1996）に記載されている。これらの特許の一般的な利用は記載されているが、本発明で概説したような明確な応用は実現されていない。レノジェン社によって開発されたエクジソン遺伝子スイッチ技術の改良（Karns  et  al.  2001）によって改良された発現系が提供されているが、その系は本明細書に記載の本発明に適用してもよい。かかる改良は、例えば、より潜在的な発現誘導リガンド、活性化因子の不存在下に一層低い基礎発現レベル並びに、特別に操作されたエクジソンプロモーター、受容体及びＲＸＲタンパク質を特定のスイッチ活性化因子で活性化できる多重スイッチング、いわゆるＲｈｅｏＣｈｅｍ／ＲｈｅｏＲｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｉｒｓの開発である。かかる多重化の選択肢により、β細胞について本発明に記載される複数の癌遺伝子の発現レベルを精密に調節することが可能になった。このスイッチ系を更に改良してより高いレベルの誘導を可能にするには、ＥｃＲリガンドであるポナステロンＡの他にＲＸＲリガンド、例えばＬＧ２６８の同時投与が必要である（Saez  et  al.  2000）。これら２つのリガンドは相乗作用を示し、その結果ポナステロンＡ単独で見られる誘導レベルは４倍増大する。
【００７８】
前記の誘起可能なプロモーター系は例としてのみ意図されるものである。この分野に熟練した研究者は、必要な場合に癌遺伝子を選択的に発現する類似の誘起可能な発現系を同定、開発又は考案してもよい。したがって本発明は前記の系の１以上の使用に限定されない。むしろ前記の方法又は若干の他の方法の１つによってモノクローナル抗体の製造のためにあらゆるβ−リンパ球／抗体分泌細胞株を不死化させることが発明の進歩性であり、それは任意の特定の誘起可能な発現系を利用して任意の特定の癌遺伝子又は癌遺伝子の組み合わせ自体を発現するのとは異なる。
【００７９】
タンパク質活性化レベルでの細胞不死化の制御
遺伝子産生物の転写制御の代わりとして、条件的に不活性な形で、該遺伝子を構成的に発現する方法がある。外部条件の操作によって活性化させることができる遺伝子産生物の例は、温度感受性ラージＴ抗原（前記のｔｓＡ５８）である。遺伝子導入マウス、“不死化マウス”（Jat  et  al.  1991;  Noble  et  al.  1995;  Jat  et  al.  (1997)  米国特許第５，６８８，６９２号;  Jat  et  al.  (1999)  米国特許第５，８６６，７５９号）では、ラージＴ抗原ｔｓＡ５８遺伝子は、構成的なマウス主要組織適合遺伝子複合体Ｈ−２ＫbクラスＩプロモーターの制御下で広範に発現される（Weiss  et  al.  1983）。このプロモーターは更にインターフェロンγの存在下に更に活性化させることができる。全ての起源組織が試験されている訳ではないが、この手法が不死化された細胞株の作成に効果的であるといった多くの例が文献にある（Noble  et  al  1995）。不死化された細胞株を提供するための“不死化マウス”の利用性の議論については前記参照のこと。
【００８０】
細胞を（条件により）不死化させる幾つかの他の方法を当業者は開発できる。本発明は特定の不死化法に制限されるものではないが、但し、該方法は特定の抗体分泌β細胞及び抗体の単離を前記のβ細胞の不死化により迅速に行うような不死化のアプローチを利用する必要がある。
【００８１】
必要な特異性を有する抗体を分泌する不死化されたβリンパ球細胞のスクリーニング
どの不死化法を選択したとしても、これらの方法は全てクローン性増殖が可能な細胞の集団を得ることを意図するものである。クローンの数は採取された細胞の数によってのみ制限され、それは恐らく脾細胞又は他のリンパ組織、例えばリンパ節から採取された細胞の全数であると思われる。この細胞集団は、非分泌性細胞（T細胞、マクロファージなど）及び抗体分泌細胞の両者からなる。抗体分泌細胞の中で、１つだけの集団がマウスの免疫化に使用される抗原を分泌しており、またある場合には、細胞表面上にそれを提示している。このように、後者の細胞型について、対象の抗体を分泌する細胞が抗原と結合する細胞表面受容体を提示しているかどうかを選択する迅速なスクリーニング法が必要とされている。これは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の技術を利用して達成できる。
【００８２】
対象のモノクローナル抗体を分泌し、またこの抗原を識別する細胞表面免疫グロブリンを提示するハイブリドーマはＦＡＣＳ技術を用いて選択的に単離されている。これは抗原を蛍光標識し、該抗原とハイブリドーマとを混合し、そして蛍光特性の変化が測定される抗原と結合する細胞を選別することによって達成されている（Parks  et  al.  1979;  Dangl及びHerzenberg  1982;  Jantscheff  et  al.  1993;  Martel  et  al.  1988）。ＦＡＣＳを使用して、モノクローナル抗体を分泌するが、抗原に特異的な細胞表面免疫グロブリンを発現しないハイブリドーマを選別する方法も開発されている（Gray  et  al.  1995）。ビオチン化されたアガロースの１つの微小滴内に単一のハイブリドーマを捕捉する。ビオチン化され、かつ蛍光標識された抗原とアビジンとを前記の小滴混合物に添加すると、抗原に特異的な抗体を分泌する単一のハイブリドーマを係留する微小滴が蛍光標識される。特定の小滴の標識、従ってハイブリドーマの標識は、微小滴中の分泌された抗体を抗体−抗原−アビジン−ビオチン化アガロース架橋を介して捕捉することにより達成されている。前記の技術の更なる開発において、ＦＡＣＳで２色検出モードを利用して、独特のエピトープに対する抗体を分泌する細胞が選別されている（Kenney  et  al.  1995）。
【００８３】
本発明では、リンパ系の、例えばリンパ節又は脾臓組織（ただし他の起源を除外しない）から採取された不死化された細胞を、ＦＡＣＳ又は同様の細胞選別能力を有する装置を使用して前記の方法と同様の方法により選別する。しかしながら前記で用いられたＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）の従来法を介して作成したハイブリドーマではんく、本発明に記載の方法で不死化したリンパ球を用いる。抗原及びエピトープの差別標識が、従って特異的なＩｇ分泌β細胞の検出及び単離が可能な蛍光色素は広範に選択できる。組み合わせて使用するのに適切な標識を賢明に選択するためには、多くの要素、例えば装置の励起波長及び発光波長、ダイクロイックミラー、及び他の装置パラメーター、例えば標識間の識別能を考慮に入れる必要がある。使用する精確な標識は、本発明の中核ではないが、例示すれば、以下は利用してよい蛍光標識の非網羅的なリストである：ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、ルシファーイエロー、Ｒ−フィコエリチン、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｒｅｄ６１３、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、Ｃｙ３、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミン、ローダミンＢ、ＰｅｒＣＰ、テキサスレッド、アロフィコシアニン、ＴｒｕＲｅｄ、フィコビリプロテイン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び以下のＧＦＰ誘導体；Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、ＥＢＦＰ、ＧＦ  Ｐｕｖ、ＥＣＦＰ、Ｙ６６Ｗ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＥＧＦＰ及びＥＹＦＰ。これらの全ては、種々の方法、例えば限定されないが、アミン基、スルフヒドリル基又はカルボキシル基を介して同種二官能性リンカー又は異種二官能性リンカーのいずれかを用いてカップリングさせることにより、選ばれた抗体に結合させてよい。
【００８４】
本発明の更なる実施態様では、免疫化されたマウスから最初に採取されたβ−リンパ球を細分化することにより、これらのリンパ球の小亜集団が選別のために繰り返し利用可能となる。細分化により、同じ蛍光体を繰り返し使用して、種々の抗原特異性を有するβ−リンパ球の選別が可能となる。このことは、種々の抗原を同じ蛍光体で標識することによって達成されるが、これら抗原に特異的な細胞は、同じマウスから採取されたβ−リンパ球の別個の集団を用いてFACSにより別々に選別する。
【００８５】
本発明の更なる実施態様は、β−リンパ球をナイーブ（免疫化されていない）マウス（該マウスからは前記のアプローチの１つによって不死化されたβ−リンパ球を得ることができる）から採取し、そしてそれを使用して、対象の抗原／エピトープと結合する表面及び／又は分泌Ｉｇを提示するものを直接的に選択することである。
【００８６】
本発明の非常に簡単な実施態様では、マウスを単一の抗原で免疫化し、そしてその抗原に特異的な表面免疫グロブリン又は分泌性免疫グロブリンを発現する細胞を選別し、かつ不死化させる。しかしながら、このプロトコールの変法を利用すれば、更なる反応物を作成することができることは当業者には明らかである。以下の改良は例示のみを意図して示されるものである：複数の抗原でマウスを免疫化し、そして各抗原に対する特異性を有する細胞を選択すること、単一の抗原で免疫化し、そして同じ抗原で複数のエピトープ特性を有する細胞を選択すること、複数の抗原で免疫化し、そしてこれらの抗原のそれぞれで複数のエピトープ特異性を有する細胞を選択すること。
【００８７】
更なる実施態様は、同様に操作されたマウス（前記のアプローチの１つを使用して不死化したβ−リンパ球を得ることができる）から得られ、ナイーブか又は対象の抗原で免疫化されているマウスからの脾細胞を凍結させること（Marusich  1988;  Bennich  et  al.  1991）に関する。すなわち、細胞を部分に分けて凍結し、それらにFACSスクリーニングを必要に応じて実施する態様を含む。ナイーブマウス由来の細胞の場合には、任意の抗原に対してスクリーニングを実施できたが、所望のクローンを首尾よく単離できるチャンスは理論的には同じである。この技術は、幾つかの“ナイーブ”脾臓を一緒に採取し、全細胞集団を混合し、次いで最大の多様性を有する“ライブラリー”が作成されるように部分に分けた場合に、より強力なものにすることができる。
【００８８】
β−リンパ球に特異的な細胞表面マーカーを提示する細胞のスクリーニング
本発明の更なる実施態様は、ＦＡＣＳの双検出能又は多検出能を利用することにより、マウスから採取された混合細胞集団からのβ−リンパ球を、蛍光標識された抗β細胞特異的ｍＡｂを使用して選別することである。以下の任意の抗原又は該抗原の組み合わせに特異的な蛍光標識されたモノクローナル又はポリクローナル抗体を利用して、適切なβ−リンパ球集団を選択的に濃密にしてよい：Ｂ２２０、ＣＤ１９、ｓＩｇＭ、ｓＩｇＤ、ｓＩｇＧ、ＣＤ２３、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＭＨＣクラスＩＩ（Hardy  et  al.  1991;  Allman  et  al.  1993;  Erickson  et  al.  1996）。次いで前記の選択手順をすでに概説した抗原特異的な任意の手順と組み合わせて使用して、選別された細胞集団が確かにβ−リンパ球細胞株であることを更に確認できる。
【００８９】
ＦＡＣＳ以外の代替装置を使用するβ−リンパ球の選別
代替の細胞選別システムでは、磁性コロイドが利用されるが、これは対象の細胞に特異性を有する抗体に結合した場合にその抗体に磁性標識を付与する。次いで該細胞を双極磁場フローソーターに導通させると、その磁性特性により細胞が分別され、その細胞が今度はコロイド標識された抗体との相互作用によって特定される（Moore  et  al.  1998）。この方法を使用してTリンパ球の亜集団が効果的に選別されている。FACS選別で必要とされるように蛍光マーカーで対象の抗原を標識するのではなく、該抗原は磁性コロイドで標識される。このようにして、適切な特異性を有する抗体を分泌する不死化されたβ−リンパ球を、それらが細胞表面免疫グロブリンを発現するしないにかかわらず標識し、選択することができる。
【００９０】
他の種でのモノクローナル抗体の作成
モノクローナル抗体の製造のため第一選択の宿主はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）による技術が創作されて以来マウスのままである。しかしながら抗体は、他の種、特にラット、ウサギ及びヒツジにおいても製造されている。ラット骨髄腫細胞株は、ラット−ラット融合のために開発されている（De  Clercq  et  al.  1986）。Ｓｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ他（１９９５）はウサギ−ウサギハイブリドーマの製造を可能にする融合相手を得ることを記載している。該細胞株は、ｖ−ａｂｌ癌遺伝子をＥν重鎖エンハンサー（Rosenbaum  et  al.  1990）の制御下に発現し、かつＮ−ｍｙｃ癌遺伝子をＥκＫ鎖エンハンサー（Sμｇiyama  1994）の制御下に発現する二重遺伝子導入動物の作成によって得られた。ＨＡＴに感受性の融合相手は、８−アザグアニンの存在下にＸ線照射した後に腫瘍性脾臓から得られる細胞の好適な選択によって作成された。抗体を製造するために宿主として、ウシを使用する方法（Guidry  et  al.  1986）、ヒツジを使用する方法（Flynn  et  al.  1989）、ブタを使用する方法（Lumanglas及びWang  1995）及びハムスターを使用する方法（Sanchez-Madrid及びSpringer  1986）も記載されている。これらのアプローチは、マウス骨髄腫と免疫をした宿主由来の脾細胞間の種間ヘテロハイブリドーマの形成を工程として含む方法を利用している。本明細書に記載の発明を、前記の任意の種及び他の種に同様に適用でき、適切な遺伝子技術が開発されていることは当業者には明らかである。
【００９１】
ヒト化抗体の作成
マウス由来のモノクローナル抗体をヒトの治療用途に適用することは成功していない。その理由は、マウス抗体はそれの抗原特異性とは別にヒトにそれの免疫原性があるからである。そのようなヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は投与された抗体を中和し、そして患者に毒性をもたらすおそれがある。したがって特に治療用途のためにヒト化されたモノクローナル抗体を製造することに対しては大きな期待がある。ヒト化されたモノクローナル抗体の作成のために幾つかのアプローチが採られている。これらのアプローチは、例えばヒト血液由来のβ細胞と標準的なマウス骨髄腫（Foung及びPerkins  1989;  Foung  et  al.  1990）、又はＳＰＡＺ−４異種骨髄腫（Ostberg  1986）、ＳＰＡＭ−８異種骨髄腫（Gustafsson  et  al  1995  Panova及びGustafsson  1995）、Ｈａｂ−１異種骨髄腫（Faller  et  al.  1990）又はＣＢＦ７異種骨髄腫（Grunow  et  al.  1990;  Walper  et  al.  1990;  Niedbala及びStott  1998）とのＥＢＶ／電気的融合を用いて行う細胞融合である。これらの異種骨髄腫はＩｇＧ非分泌性ヒト／マウス雑種である。他の方法は、例えばヒトのβ−リンパ球を抗ＣＤ４０ｍＡｂとＥＢＶに曝すことである（Tsuchiyama  et  al.  1997;  Niedbala及びStott  1998）。純粋なヒトの細胞融合相手も樹立されており、例えばＨＡＴ感受性細胞株ＨＫ−１２６（Kawahara  et  al.  1990）であり、これはヒトプラズマ細胞腫細胞株及びＡ４Ｈ１２細胞（Kawahara  et  al.  1992）から樹立されている。
【００９２】
ヒトのＩｇＧを分泌する雑種の収率改善は、細胞融合前に培養されたリンパ球をインビトロで抗原により初回免疫することによって達成されている（Boerner  et  al,  1991）。ヒトのリンパ球由来のハイブリドーマの作成方法の更なる改良には、ヒトＴ細胞上清と照射されたマウス胸腺腫ヘルパー細胞の存在下に単一のβ−リンパ球からクローン増殖させることが必要である（Steenbakkers  et  al.  1992）。
【００９３】
本発明の更なる態様には、本明細書中に記載の抗体製造技術を用いるヒト化抗体の誘導が記載されているが、使用する宿主遺伝子導入動物ではその内因性免疫グロブリン遺伝子をヒト版の同遺伝子に置き換えてある。しかしながら本発明の範囲はヒト化抗体の提供のみに制限されるものではない。マウスＩｇ遺伝子座又はその機能的部分を他の種のＩｇ遺伝子座と交換できることは当業者には明らかである。本発明では、ヒト化抗体の製造は、本明細書中に記載の遺伝子導入マウスと、マウスＩｇ遺伝子がそのヒトの等価物と交換されている遺伝子導入動物系との交配によって達成してよい。そのような系は、アブジェニックス社によって開発されたＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他、２０００（米国特許第６，１１４，５９８号）によって記載された“ゼノマウス”の形で入手される。“ゼノマウス”は確立された方法として例示する。ゼノマウス技術の拡張は米国特許第６，２０７，４１８号（Hori  et  al.  2001）。この発明では、免疫化されたマウス、例えばゼノマウスから採取されたβ−リンパ球の免疫グロブリン重鎖と軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、そして別個の細胞で発現させる方法を記載している。重鎖及び軽鎖を発現する細胞を次いで融合させて、機能的な抗体を発現する細胞を作成している。
【００９４】
ジェンファームインターナショナル社（現在のメダレックス）は、ヒト化モノクローナル抗体を作成するために使用できる同様のマウス技術（ＨｕＭａｂ）を開発した（Lonberg及びKay  (1999)  米国特許第５，８７７，３９７号;  Lonberg及びKay  (1999)  米国特許第５，８７４，２９９号）。内因性Ｉｇ発現を抑制するための代替方法が記載されており、例えば内因性Ｉｇ遺伝子座を破壊すること、又は内因性Ｉｇ転写物もしくはタンパク質のいずれかをそれぞれ標的とするアンチセンスポリヌクレオチドもしくは抗血清を使用することである。
【００９５】
前記のアプローチの２つの変法は以下の通りである。第一にヒト化抗体の製造のために異なる宿主種を使用することである。従って本発明に記載されるような不死化技術は、適切な遺伝子導入技術を利用できる任意の他の種においても開発できるが、その種は、例えばラット、ウサギ及びヒツジに限定されるものではない。同様にＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他（２０００年、米国特許第６，１１４，５９８号）に記載される技術は、ラット、ウサギ及びヒツジのような種においても開発され得た。同一種、好ましくは同質遺伝子型の種、２つの各技術（本文中にかつＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他、２０００によって記載されている）についてはそれぞれ生殖系列遺伝子導入種の間の交配により、前記の有用性と同様の有用性を有する子孫が得られることがある。
【実施例】
【００９６】
実施例
実施例１
エクジソン受容体とＲＸＲ受容体を発現する遺伝子導入マウスの誘導
ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ  ＤＮＡ断片の調製
適当な転写及び翻訳の調節制御エレメント並びにこれらのエレメントの５′及び３′の両者に隣接する２５塩基対のベクター配列を含むＶｇＥｃＲ遺伝子とＲＸＲ遺伝子をコードする領域（CMVプロモーター、ＶｇＥｃＲ遺伝子、ＴＫポリアデニル化シグナル、ＲＳＶプロモーター、ＲＸＲ遺伝子及びＢＧＨポリアデニル化シグナル）をベクターｐＶｇＲＸＲ（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ７３０−２０）から、以下のプライマー、５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＧ−３′（配列番号１；５′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲプライマー）及び５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧ−３′（配列番号２；３′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲプライマー）を使用してＰＣＲ増幅させる。これらのプライマーはＳｐｅＩ制限部位“テイル”を含む。増幅されたＰＣＲ産物中には他のＳｐｅＩ部位は存在しない。次いで６１３４塩基対のＰＣＲ産物をＳｐｅＩで消化させ、６１２４塩基対の産物を得て、これをＳｐｅＩ消化された脱リン酸化されたｐｃＤＮＡ２．１（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ４００−２０）にクローニングする。次いで該ＰＣＲ産物のコピーを含有する陽性クローン（ｐｃＤＮＡ２．１−ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ）の組み換え挿入物を含む領域の配列を決定し、ＰＣＲの精度を確認する。
【００９７】
マウス卵子に注入するためのＤＮＡ断片の調製
キアゲンマキシプレップキット（キアゲン  カタログ番号１２３６２）を使用して、＞５００μｇのｐｃＤＮＡ２．１ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲプラスミドＤＮＡを調製する。前記ＤＮＡの３００μｇをＳｐｅＩで消化させ、そして６１２４塩基対の挿入物（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ）と２９８１塩基対の断片とをゲル電気泳動で分離したのち、キアクイックゲル抽出キット（キアゲン  カタログ番号２８７４０）を使用して抽出する。次いで抽出されたＤＮＡを１×ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５／１ｍＭのＥＤＴＡ）中で１０ｍｌにし、そして１０ｇのＣｓＣｌを添加し、緩慢に混合して溶解させる。該試料を超遠心管に装填し、６５０００ｒｐｍで室温において垂直ローター中で６時間遠心分離する。管の底部から約１ｃｍのところに挿入されたニードルを用いてフラクション（０．５ｍｌ）を回収する。各フラクションの一部（５μｌ）を１％アガロースゲル（１×ＴＡＥ）に流し、ゲルを紫外線に曝すことによってＤＮＡを含有するフラクションを測定する。次いでこれらのＤＮＡ含有フラクションをまとめて、１００倍容量の微量注射バッファー（５ｍＭのトリス  ｐＨ７．４／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に対して８時間透析する。この透析を更に３回繰り返す。次いでＤＮＡの濃度を、透析されたＤＮＡ試料の濃度を１：１０希釈及び１：１００希釈したもの（微量注射バッファー中）の２６０ｎｍでの吸収を測定し、式：二本鎖ＤＮＡの２６０ｎｍでの吸収の１単位（１ｃｍの光路長）＝５０μｇ／ｍｌに適用することによって、測定する。次いでＤＮＡの試料を、微量注射のために、微量注射バッファー中で２μｇ／ｍｌに希釈し、そして０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルタ（ミリポア；カタログ番号ＳＬＧＶ  Ｒ２５  ＬＳ）を通して滅菌濾過することによって調製する。
【００９８】
ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲについてホモ接合性の遺伝子導入マウス系列の作成
ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／１０交雑から得られる受精卵の前核に、前記で精製された〜２ｐｌのＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ挿入物を微量注射する。次いで微量注射された卵を偽妊娠の雌に移植し（Kollias  et  al,  1986の方法を参照のこと）、生まれてきたマウスについてゲノムＤＮＡ中に導入遺伝子が存在するかを以下のように分析する。ゲノムＤＮＡを、１０日齢の仔マウスから採取された１００μｌの血液からフェノールクロロホルム法により抽出し、エタノール沈殿することによって調製する。配列番号１６と配列番号２のプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを実施し、１５９４塩基対の産物を導入遺伝子の存在を示す評価として使用する。βグロビン遺伝子（予想される断片サイズ４９４塩基対）の断片の増幅を、ポジティブコントロールとして、前記の反応のそれぞれにおいて並行して、プライマー５′−ＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＧ−３′（配列番号１１；５′ベータグロビンプライマー）及び５′−ＣＣＴＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧ−３′（配列番号１２；３′ベータグロビンプライマー）を使用して実施する。ＰＣＲ反応のための増幅条件は、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で１２０秒を３５サイクル繰り返し、最終延長を７２℃で１０分間行う。陽性のＧ０（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ陽性）初代マウスを親マウスと戻し交雑させ、引き続き子孫（Ｇ１）をＰＣＲによって同様に分析する。次いで雄と雌のＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ陽性マウスを交雑させ、そしてホモ接合型マウスが同定されるまで（ＰＣＲ産物のバンド強度の比較により）ゲノムＤＮＡの試料を前記のように調製、分析する。次いでこれらのマウスを、ホモ接合型のマウス連続継代系列の初代として使用し、これをＶｇＥｃＲ−ＲＸＲホモ接合体と呼称する。
【００９９】
実施例２
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にｃ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入マウスの誘導
ｃ−ｍｙｃ  ＤＮＡ断片の調製
ｃ−ｍｙｃをコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ０１０２３）を、マウス脾臓ライブラリー（クロンテック；カタログ番号７１３４−１）から、以下のＰＣＲプライマー、５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＣ−３′（配列番号３；５′ｃ−ｍｙｃプライマー）及び５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＡＡＧ−３′（配列番号４；３′ｃ−ｍｙｃプライマー）を用いてＰＣＲ増幅する。次いで１３４４塩基対のＰＣＲ産物を５′と３′のそれぞれでコーディング配列に隣接する位置にあるＰＣＲプライマー中のＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化する。また５′プライマーはＮｈｅＩ部位とｃ−ｍｙｃのＡＴＧ開始コドンとの間にコザックコンセンサス配列をコードしている。１３３２塩基対の消化されたＰＣＲ産物をｐＩＮＤ（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ７０５−２０）のＮｈｅＩとＸｈｏＩでの消化によるゲル精製された４９３４塩基対のＤＮＡ断片中にクローニングし、６２６６塩基対の産物を得る。これをｐＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃと呼称する。クローニングされたＰＣＲ産物の両鎖を配列決定することによってｐＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃの挿入物を確認する。適切な発現制御エレメントに加えて、５つの雑種Ｅ／ＧＲＥ結合部位、ＨＳｐプロモーター、ＢＧＨポリＡシグナル及び前記の発現、制御エレメントに隣接する２５塩基対のベクター配列を含む挿入物を以下のプライマー５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣ−３′（配列番号９；５′ｐＩＮＤプライマー）及び５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣ−３′（配列番号１０；３′ｐＩＮＤプライマー）を用いてＰＣＲ増幅する。次いでこの２１２４塩基対のＰＣＲ産物をＳｐｅＩで消化させ、２１１４塩基対の産物を得て、これをＳｐｅＩ消化された脱リン酸化されたｐｃＤＮＡ２．１（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ４００−２０）にクローニングして、５０８５塩基対の構築物を得る。これをｐｃＤＮＡ２．１−ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃと呼称する。このＳｐｅＩ挿入物の両鎖の配列決定によってＰＣＲの精度を確認する。
【０１００】
マウス卵子中に注入するためのＤＮＡ断片の調製及びＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃと呼称するホモ接合性の遺伝子導入マウスの作成
受精卵への注入のために実施例１（マウス卵子に注入するためのＤＮＡ断片の調製）に記載のように少量のＳｐｅＩ挿入物を製造するが、この場合には精製されるべきＳｐｅＩ断片は２１１４塩基対である。次いで受精卵にＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃのＳｐｅＩ断片を注入し、そして実施例１（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲについてホモ接合性の遺伝子導入マウス系列の作成）に記載のように、組み込まれたＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃについてホモ接合性のマウス（ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃホモ接合体と呼称する）を誘導する。尚、血液由来のゲノムＤＮＡ調製物中の挿入物の存在はプライマー５′−ＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＣ−３′（配列番号１３；５′ｃ−ｍｙｃ導入遺伝子確認プライマー）及び配列番号１０を利用して確認し、そして予測された３０９塩基対のＰＣＲ産物がプライマー配列番号２及び５′−ＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＡＧＣ−３′（配列番号１６；５′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ導入遺伝子確認プライマー）を代わりに用いることにより、得られる。
【０１０１】
次いで前記のＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃホモ接合体を実施例１に記載されるＶｇＥｃＲ−ＲＸＲホモ接合体と交配させ、二重ホモ接合系列を得て、これをＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃと呼称する。頸椎脱臼による屠殺後に、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃマウスから抗体分泌細胞を組織から（例えば脾臓、扁桃、リンパ節、咽頭扁桃、虫垂、パイエル板、気管支関連リンパ組織、骨髄、粘膜関連リンパ組織又は循環β−リンパ球など）採取する。一般には脾細胞から採取する。必要であれば、２５ゲージ針付きシリンジを使用して、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ；カタログ番号Ｒ０８８３）ですすいで細胞を組織から緩慢に解離させる。次いで該細胞を４つの小分画に分け、そして４つの別個の５０ｍｌフラスコ（グライナー；カタログ番号６９０１７５）中に入れる。２つのフラスコは、２ｍMのグルタミン（ライフテクノロジーズ；カタログ番号２５０３０−０２４）、１０％の仔ウシ血清（ライフテクノロジーズ；カタログ番号１６０００−０３６）及び１００単位のペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ；カタログ番号１５１４０−１１４）を含む１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を含有する。他の２つのフラスコは、前記と同じものを含有するが、更に５μＭのポナステロンＡ（インビトロジェン；カタログ番号Ｈ１０１−０１）を含有する。注、ムリステロンＡ（インビトロジェン；カタログ番号Ｈ１０１−０１）をポナステロンＡの代わりとして使用してよい。次いで４つのフラスコを３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。次いで細胞がポナステロンＡの存在下で増殖している１つのフラスコから、そしてポナステロンＡが存在しない１つのフラスコから、細胞スクレーパーを用いて平板培養２４時間後に細胞を採取する。次いで細胞を洗浄し、そして１０ｍｌのPBS中で２回遠心分離（３０００×ｇ）して、その後、試料のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質アッセイ（バイオラド；カタログ番号；５００−０００２）を使用して測定する。種々の濃度の細胞（１０〜０．１μｇの全タンパク質）を還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして標準的なウェスタンブロット技術によってニトロセルロースに転写する。抗−ｃ−ｍｙｃ抗体（サンタクルスバイオテクノロジー；カタログ番号ｓｃ−７６４）と当業者に公知の標準的なウェスタンブロット技術を用いて、活性化因子のポナステロンＡと一緒にインキュベートされた細胞試料におけるｃ−ｍｙｃ発現の相対的な増大を確認する。前記の細胞は、少なくとも部分的に、不死化されたβ−リンパ球の集団を含み、これはウェスタンブロットによって、かかる細胞に特異的な抗体、例えば抗ＣＤ１９（サンタクルス；カタログ番号８５００）で検出することにより測定される。更にポナステロンＡの存在下に培養された細胞の不死化とポナステロンＡを欠いた細胞では不死化が見られないことが確認され、そのため前者の細胞は繰り返しの細胞の継代後に増殖するが、一方で後者の細胞は数日後に死滅し、こうして無期限に継代できない。すなわちポナステロンＡを使用することにより、不死化する脾細胞についてｃ−ｍｙｃ発現を調節可能であることが証明される。
【０１０２】
実施例３
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にａｂｌを発現する遺伝子導入マウスの誘導
この手順は、実施例２に記載されるｃ−ｍｙｃ遺伝子導入マウスの誘導について記載されたものと同じであるが、以下の変更がある。ａｂｌをコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｖ０１５４１）を、アベルソンのマウス白血病ウイルスで感染されたマウスから得られたマウス脾臓ライブラリーから、以下のＰＣＲプライマー、５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣ−5′（配列番号５；５′ａｂｌプライマー）及び５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣ−３′（配列番号６；３′ａｂｌプライマー）を用いてＰＣＲ増幅する。次いで５１６塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、そして５０４塩基対の消化された産物を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩでｐＩＮＤ（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ７０５−２０）を消化してゲル精製された４９３４塩基対の断片中にクローニングし、５４３８塩基対のプラスミドを得て、これをｐＩＮＤ−ａｂｌと呼称する。クローニングされたＰＣＲ産物の両鎖を配列決定することによってｐＩＮＤ−ａｂｌの挿入物を確認する。該挿入物を適切な発現制御エレメントと一緒に実施例２に記載のようにｐｃＤＮＡ２．１中にクローニングするが、但し、プライマーの配列番号９及び１０を用いてもたらされたＰＣＲ産物はＳｐｅＩ消化後では１２９６塩基対と１２８６塩基対である。次いでＳｐｅＩ消化された産物をＳｐｅＩで直鎖化されたｐｃＤＮＡ２．１中にクローニングし、４２５８塩基対のプラスミドを得て、これをｐｃＤＮＡ２．１−ＩＮＤ−ａｂｌと呼称する。次いでＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌと呼称されるホモ接合性の二重遺伝子導入マウスを実施例２に記載されるｃ−ｍｙｃに関するものと同様に製造するが、この実施例ではマウスに注入するＤＮＡとしてＳｐｅＩ  ＩＮＤ−ａｂｌ断片を使用する。血液のゲノムＤＮＡ試料中にＩＮＤ−ａｂｌ挿入物が存在することは、プライマー５′−ＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧ−３′（配列番号１４；５′ａｂｌ導入遺伝子確認プライマー）及び配列番号１０を用いて、７３３塩基対のＰＣＲ産物が得られることで確認される。ポナステロンＡの存在下でのａｂｌ発現の誘導は実施例２に記載されるようにｃ−ｍｙｃと同様に証明される。但し、誘導後のａｂｌの発現が増大することを検出するために抗−ａｂｌ抗体（サンタクルス；カタログ番号１３０７６）が使用される。ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌマウス系統で不死化された脾細胞を生じさせる能力は、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ系統について実施例２に記載される方法と同様に確認される。
【０１０３】
実施例４
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にａｂｌとｃ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入マウスの誘導
ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ遺伝子導入マウス（実施例２参照）及びＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ遺伝子導入マウス（実施例３参照）を交配させて、三重ホモ接合性遺伝子導入マウスを得て、これをＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃと呼称する。全ての３つの導入遺伝子の存在は、それぞれＶｇＲＸＲ（１５９４塩基対）、ＩＮＣ−ｃ−ｍｙｃ（３０９塩基対）及びＩＮＤ−ａｂｌ（７３３塩基対）の存在確認のための以下のプライマー対；配列番号１６及び２、配列番号１３及び１０、並びに配列番号１４及び１０を使用して、遺伝子導入マウスから採取された血液試料から得られるゲノムＤＮＡ試料から規定サイズのＰＣＲ産物を生じさせることで確認する。プライマー対の配列番号１１及び１２は４９４塩基対のベータグロビン遺伝子産生物を増幅するので、これを前記のＰＣＲのそれぞれでコントロールとして使用し、反応液中にＰＣＲ鋳型としてマウスゲノムの存在を確認する。
【０１０４】
ｃ−ｍｙｃとａｂｌの両者のポナステロンＡ誘起可能な発現並びに三重遺伝子導入マウスから採取された対象の細胞の不死化された増殖をｃ−ｍｙｃについて実施例２に記載されるプロトコールとａｂｌについて実施例３に記載されるプロトコールに従って実施する。
【０１０５】
実施例５
エクジソン誘起可能な発現系の制御下に誘起可能なＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入マウスの誘導
この手順は、実施例２に記載されるｃ−ｍｙｃ遺伝子導入マウスの誘導について記載されたものと同じであるが、以下の変更がある。ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＢ５９９０１．１”／ｄｂ＿ｘｒｅｆ＝”ＧＩ：３３２７５３”）を、ＳＶ４０ウイルスで感染されたマウスから得られたｃＤＮＡライブラリーから、以下のＰＣＲプライマー、５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧ−３′（配列番号７；５′ＳＶ４０ラージＴプライマー）及び５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣ−３′（配列番号８；３′ＳＶ４０ラージＴプライマー）を用いてＰＣＲ増幅する。次いで２３８２塩基対のＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、そして２３７０塩基対の消化された産物を、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩでｐＩＮＤ（インビトロジェン；カタログ番号Ｖ７０５−２０）を消化してゲル精製された４９３４塩基対の断片中にクローニングし、７３０４塩基対のプラスミドを得て、これをｐＩＮＤ−ラージＴと呼称する。クローニングされたＰＣＲ産物の両方の鎖を配列決定することによってｐＩＮＤ−ラージＴの挿入物を確認する。該挿入物を適切な発現制御エレメントと一緒に実施例２に記載のようにｐｃＤＮＡ２．１中にクローニングするが、但し、プライマーの配列番号９及び１０を用いてもたらされたＰＣＲ産物は３１６１塩基対であり、これはＳｐｅＩ消化後に３１５１塩基対の産物をもたらす。次いで消化された産物をｐｃＤＮＡ２．１中にクローニングし、６１２２塩基対のプラスミドを得て、これをｐｃＤＮＡ２．１−ＩＮＤ−ラージＴと呼称する。次いでＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ラージＴと呼称されるホモ接合性の二重遺伝子導入マウスを実施例２に記載されるｃ−ｍｙｃに関するものと同様に製造するが、この実施例ではＳｐｅＩ  ＩＮＤ−ラージＴ断片をマウスへ注入する。血液のゲノムＤＮＡ試料中にＩＮＤ−ラージＴ挿入物が存在することは、プライマー５′−ＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＧＣＴＣ−３′（配列番号１５；５′ラージＴ導入遺伝子確認プライマー）及び配列番号１０を用いて、１０６９塩基対のＰＣＲ産物が得られることで確認される。
【０１０６】
ポナステロンＡの存在でのＳＶ４０ラージＴ抗原の発現の誘導は実施例２に記載されるようにｃ−ｍｙｃと同様に証明されるが、但し、誘導後のラージＴ抗原の発現が増大することを検出するために抗−ＳＶ４０ラージＴ抗原抗体（サンタクルス；カタログ番号ｃ１４７）が使用される。ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ラージＴマウス系統で不死化された脾細胞を生じさせる能力は、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ系統について実施例２に記載される方法と同様に確認される。
【０１０７】
実施例６
エクジソン誘起可能な発現系の制御下にａｂｌ、ｃ−ｍｙｃ及びラージＴ抗原を発現する遺伝子導入マウスの誘導
実施例４で得られたＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ三重遺伝子導入マウス及び実施例５で得られたＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ラージＴ二重遺伝子導入マウスを交配させて、四重ヘテロ接合性遺伝子導入マウスと得て、これをＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ／ラージＴと呼称する。全ての４つの導入遺伝子の存在は、それぞれＶｇＲＸＲ（１５９４塩基対）、ＩＮＣ−ｃ−ｍｙｃ（３０９塩基対）、ＩＮＤ−ａｂｌ（７３３塩基対）及びＩＮＤ−ラージＴ（１０６９塩基対）の存在確認のための以下のプライマー対；配列番号１６及び２、配列番号１３及び１０、配列番号１４及び１０、並びに配列番号１５及び１０、を使用して、遺伝子導入マウスから採取された血液試料から得られるゲノムＤＮＡ試料から規定サイズのＰＣＲ産物を生じさせることで確認する。プライマー対の配列番号１１及び１２は４９４塩基対のベータグロビン遺伝子産生物を増幅するので、これを前記のＰＣＲのそれぞれでコントロールとして使用し、そうして試料におけるＰＣＲ鋳型としてのマウスゲノムの存在を確認する。
【０１０８】
ポナステロンＡの存在下でのｃ−ｍｙｃ、ａｂｌ及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現の誘導は、ｃ−ｍｙｃについて実施例２に記載されるプロトコール、ａｂｌについて実施例３に記載されるプロトコール及びＳＶ４０ラージＴ抗原について実施例５に記載されるプロトコールに従って確認される。ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ／ラージＴマウス系統で不死化された脾細胞を生じさせる能力は、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ系統について実施例２に記載される方法と同様に確認される。
【０１０９】
実施例７
不死化マウスからの不死化された脾細胞株の誘導
脾臓（他の組織あるいは細胞種も同様に使うことができるが、それには例えば扁桃、リンパ節、咽頭扁桃、虫垂、パイエル板、気管支関連リンパ組織、骨髄、粘膜関連リンパ組織又は循環β−リンパ球などが含まれる）を、頸椎脱臼により屠殺された不死化マウス（Jat  et  al.  (1999)  米国特許第５，８６６，７５９号;  Jat  et  al.  (1997)  米国特許第５，６８８，６９２号）から採取する。必要であれば、２５ゲージ針付きシリンジを使用して、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ；カタログ番号Ｒ０８８３）ですすいで細胞を組織から緩慢に解離させる。次いで該細胞を２つの小分画に分け、そして２つの別個の５０ｍｌフラスコ（グライナー；カタログ番号６９０１７５）中に入れる。両者のフラスコは、２ｍMのグルタミン（ライフテクノロジーズ；カタログ番号２５０３０−０２４）、１０％の仔ウシ血清（ライフテクノロジーズ；カタログ番号１６０００−０３６）及び１００単位のペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ；カタログ番号１５１４０−１１４）を含む１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０を含有する。１つのフラスコは３３℃／５％ＣＯ2でインキュベートするが、もう一方は３７℃／５％ＣＯ2で保持する。ｔｓＡ５８の許容温度（３３℃）で増殖する細胞は不死化され、そして更に継代できる。
【０１１０】
実施例８
実施例２、３、４、５及び６で製造される、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、ｃ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入動物、ａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ及びａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ、ａｂｌ及びＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物からの、標準的なマウス免疫工程を利用する、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
対象抗原によるマウスの免疫
実施例２、３、４、５又は６で作成された遺伝子導入マウスを対象抗原で、当業者に公知の標準的プロトコールに従って免疫する。抗原はマウスと異種の任意の分子であってよいが、通常はタンパク質又は小ペプチドである。小ペプチドを免疫原として使用するときには、該ペプチドの免疫原性を改善するために、これをスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）のような抗原キャリヤータンパク質と化学的に結合させてもよい。ＫＬＨと小ペプチドとを結合させるには多くの方法が存在する。通常の経路は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに唯一のシステイン残基を操作し、そして該ペプチドを、ジスルフィド結合を介して当業者に公知の方法を利用してＫＬＨに結合させることである。
【０１１１】
例としては、以下の免疫プロトコールをあげられる。まず免疫前にマウスの尾からの採血により血清試料を採取する。１日目にマウスを抗原（０．１〜０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中１〜１００μｇ）によりフロイントの完全アジュバント（シグマ；Ｆ５８８１）との１：１混合物で免疫する。抗原と等容量のフロイントの不完全アジュバント（シグマ；Ｆ５５０６）とを混合し、１４日目に、第二回目の免疫を行う。最初の試験採血を２１日目に行い、２８日目に追加免疫を行う。更なる試験採血及び追加免疫を２週間周期で陽性の抗体応答が試験採血から得られるまで実施する（以下参照）。
【０１１２】
採血試料を用いて、当業者に公知の多くの方法によって、期待された応答があるかを分析できる。例えば、これはＥＬＩＳＡ法を用いて行うことができる。すなわち、マイクロタイタープレート中のウェルを対象の抗原で被覆し、かつブロッキングする。試験採血の血清試料を被覆されたウェルでインキュベートし、次いで洗浄する。次いでこれらのウェルを二次酵素結合抗体と一緒にインキュベートする。通常使用される二次酵素結合抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス抗体（シグマ；カタログ番号Ａ３６７３）である。ウェルを更に洗浄した後に、ＨＲＰ複合体の存在（抗原を認識するマウス抗体の存在を示す）は発色基質、例えばＯＰＤ（シグマ；カタログ番号Ｐ６６６２）の添加によって測定できる。前記の技術を利用して、対象の抗原に対する免疫応答を効果的に生じるマウスを同定できる。
【０１１３】
抗原の標識
抗体分泌細胞をＦＡＣＳによって選別するために、対象の抗原を適切な蛍光体で標識する必要がある。セルソーターにおいて利用できる、ソートする試料の“励起”と“発光”ののための波長の種類により、蛍光標識の種類が選別される。例としては、励起極大〜４９４ｎｍ及び蛍光極大〜５１９ｎｍを有するフルオレセインで抗原による標識があげられる。このように特異的な結合特性を有する抗体を分泌する細胞及び適当な細胞表面免疫グロブリンを提示する細胞は、特異的な抗原又は単一抗原のエピトープを、様々な励起蛍光特性を有する種々の蛍光体で標識することによって、別々に単離される。蛍光体の選択肢は、セルソーターの検出システムの試料中の異なる蛍光体を識別する能力によって、決定される。
【０１１４】
脾細胞の採取
尾採血サンプルのＥＬＩＳＡ試験により対象の抗原に対する十分な応答が達成されることが示されたら、そのマウスから脾臓を採取する。更に屠殺の２日前に最終免疫化を実施する。マウスは頸椎脱臼によって屠殺され、そして皮膚はエタノールで滅菌される。他の全ての操作は滅菌条件下に実施される。脾臓を取り出し、そして該組織の長手方向に沿って切断する。２５ゲージ針を用いて、１０ｍｌのＲＰＭＩ培地を使用し、脾臓から細胞を洗出する。１０ｍｌの細胞懸濁液を回収し、そしてこの工程を繰り返す。細胞を１０００ｇで３分間遠心分離し、そして２０ｍｌのＲＰＭＩ中に再懸濁し、次いで再び１０００ｇで３分間遠心分離する。次いで細胞を４０ｍｌのＤＭＥＭ／５μＭのポナステロンＡ中に再懸濁する。この工程で脾細胞を後の使用のために凍結させてよい（Bennick  et  al.  1991;  Marusich  1988）。蛍光標識された抗原を細胞懸濁液に添加し、これを緩やかに回転する台上で３７℃において１時間インキュベートして、フローサイトソーター、例えばベクトン−ディキンソン社のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、において分析をする。標識された抗原は、対象の蛍光標識された抗原を特異的に認識する細胞表面免疫グロブリンを発現するリンパ球を決定する細胞表面受容体に結合する。あるいは対象の抗原を分泌するが細胞表面抗原は提示しない細胞を、蛍光標識されかつビオチン化された抗原を使用するＧｒａｙ他（１９９５）により記載された方法によって選別することもできる。対象となる単一の細胞を、組織培養用９６ウェルマイクロタイタープレート（０．１ｍｌのＲＰＭＩ／１０％の仔ウシ血清／５ｕＭのポナステロンＡを１ウェルあたりに含有する）の単一のウェル中に接種する。次いでそのマイクロタイタープレートを３７℃及び５％ＣＯ2でインキュベートし、その後数日間にわたり細胞の増殖を観察する。３日おきに又は細胞コロニーが約５０〜７０％の集密度になるまでに、培地を０．１ｍｌの新しいＲＰＭＩ／１０％の仔ウシ血清／５ｕＭのポナステロンＡと交換する。この時点で、２０μｌの細胞上清を、所望の特異性を有する抗体の存在について試験する。かかる試験は前記のＥＬＩＳＡ試験の形態を採用できるが、あるいは抗体の最終的な用途に非常に近いより高度なアッセー法、例えばシンチレーション近接アッセー、蛍光アッセー又は蛍光偏光アッセーを使用することもできる。次いで目的にあうクローンをマイクロタイタープレートから６ウェルプレート、次いでＴ７５フラスコ中でＲＰＭＩ／１０ＦＣＳ／５μＭのポナステロンＡ中で継代培養する。更に必要とされる十分な抗体を得るために継代培養を、フラスコ中又はバイオリアクター規模でのいずれかで実施できる。更に、必要であればＦＡＣＳを使用して、細胞上に存在する表面ＩｇＧとは無関係に、全てのβ−リンパ球を同定することもできる。このことは、蛍光標識された抗β細胞特異的ｍＡｂ、例えば抗−Ｂ２２０、ＣＤ１９、ｓＩｇＭ、ｓＩｇＤ、ｓＩｇＧ、ＣＤ２３、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＭＨＣクラスＩＩ（Hardy  et  al.  1991;  Allman  et  al.  1993;  Erickson  et  al.  1996）を使用して達成できる。この手法は、蛍光標識された抗原をβ−リンパ球に結合させること又はＧｒａｙ他（１９９５）によって記���される方法に従って対象の抗体を分泌する単一の細胞を保持する微小滴に結合させることと組み合わせて使用しできる。
【０１１５】
実施例９
マウスの免疫工程を用いない：実施例２、３、４、５及び６に記載されるような、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、ｃ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入動物、ａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ及びａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ、ａｂｌ及びＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物からの、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
脾細胞（又は他の抗体分泌細胞）を、（実施例８に記載される方法；脾細胞の採取に従って）ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ（実施例２参照）、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ（実施例３参照）、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ（実施例４参照）、ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ラージＴ（実施例５参照）又はＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ／ラージＴ（実施例６）の細胞系統のそれぞれのナイーブマウス（免疫されていない）から採取する。前記の任意の系統から得られる不死化された脾細胞株を、対象とする抗体を分泌するかを指標にして、実施例８に記載の方法（抗原の標識と脾細胞の採取）により選別する。あるいは脾細胞を後の使用のために採取後に凍結させることもできる（Bennick  et  al.  1991;  Marusich  1988）。従って、大量のナイーブ脾細胞（幾つかの脾臓由来）を後の使用のために幾つかの小分画として凍結させることにより、細胞スクリーニングの手法が単純化される。なぜなら、次の実験の際には、１バイアルの細胞の溶融を必要とするのみであり、新たなマウスの屠殺、そして細胞試料の調製を必要としないからである。
【０１１６】
実施例１０
マウス免疫工程を用いての、実施例７に記載されるような不死化マウスから所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
不死化マウスを実施例８に記載される方法（対象の抗原でのマウスの免疫）に従って対象の抗原で免疫する。適切な免疫応答が検出されたら、実施例８に記載される方法（抗原の標識と脾細胞の採取）に従って抗原を標識し、かつ脾細胞を採取する。但し、細胞培養はポナステロンＡの存在下及び３３℃で実施する。
【０１１７】
実施例１１
マウス免疫工程を用いない、実施例７に記載されるような不死化マウスから所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
脾細胞を実施例８に記載される方法（脾細胞の採取）に従ってナイーブマウス（免疫されていない）から採取するが、但し、細胞培養はポナステロンＡの不存在下及び３３℃で実施する。所望の細胞のクローン選択は実施例８に記載される方法（抗原の標識と脾細胞の採取）に従ってセルソーターを使用して実施するが、但し、細胞培養はポナステロンＡの不存在下及び３３℃で実施する。あるいは脾細胞を後の使用のために採取後に凍結させることもできる（Bennick  et  al.  1991;  Marusich  1988）。従って大量のナイーブ脾細胞（幾つかの脾臓由来）を後の使用のために幾つかの小画分としてで凍結させると、スクリーニング法が単純化される。なぜなら、次の実験は１バイアルの細胞の溶融を必要とするのみであり、新たなマウスの屠殺、そして細胞試料の調製を必要としないからである。
【０１１８】
実施例12
実施例２、３、４、５及び６で製造される、エクジソン誘起可能な発現系の制御下に、ｃ−ｍｙｃを発現する遺伝子導入動物、ａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ及びａｂｌを発現する遺伝子導入動物又はＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物又はｃ−ｍｙｃ、ａｂｌ及びＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する遺伝子導入動物又は実施例７に記載される不死化マウスから、これらのマウスをｐ５３腫瘍抑制遺伝子の完全欠失変異体であるマウスと交配させてホモ接合性にした後に、実施例８、９、１０及び１１に記載される方法体系を利用する、所望の特異性を有する抗体を分泌する不死化された脾細胞株の誘導
Ｊａｃｋｓ他（１９９４）に記載されるホモ接合性ｐ５３完全欠失変異体を実施例２〜７に記載される任意の１種の遺伝子導入マウスと交配し、二重のホモ接合する。次いで所望の特異性を有する抗体を分泌する細胞を適切な実施例８、９、１０又は１１に記載されるように得る。
【０１１９】
実施例１３
実施例８、９、１０、１１及び１２に記載される方法体系及び実施例２、３、４、５、６、７又は１２に記載される遺伝子導入マウスを利用する、ヒト化された抗体を提供する遺伝子導入マウスの誘導
ヒト化されたモノクローナル抗体を、実施例２（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ｃ−ｍｙｃ）、実施例３（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ）、実施例４（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ）、実施例５（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ラージＴ）、実施例６（ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ／ＩＮＤ−ａｂｌ／ｃ−ｍｙｃ／ラージＴ）、実施例７（不死化マウス）又は実施例１２（実施例２〜７と同様であるが、ｐ５３−／−）のいずれかに記載される遺伝子導入マウスの１つと、免疫グロブリンをコードする配列の全て又は一部が等価のヒトの配列で交換されているマウスとの交配によって作成できる。２種の選択されたマウス系統を交配させ、そして子孫の血液から採取されたゲノムＤＮＡから得られるＤＮＡのＰＣＲ分析を行い、スクリーニングすることで、子孫が両者の遺伝子導入初代マウスから提供される所望の遺伝情報を有することを確認する。実施例２、３、４、５、６又は７に記載されるマウスと交配させるのに使用できるヒト化された免疫グロブリン配列を有するマウスの例は、例えばＡｂｇｅｎｉｘゼノマウスＴＭ（Green  et  al.  1994;  Mandez  et  al.  1997;  Kucherlapati  et  al.  (2000)  ヒト化ゼノマウスから得られるヒト抗体,  米国特許第６，１５０，５８４号;  Kucherlapati  et  al.  (2000)  異種抗体の産生．  米国特許第６，１１４，５９８号）及びメダレックスＨｕＭａｂマウス（Lonberg  et  al.  (2001)  米国特許第６，３００，１２９号）である。次いで、マウスを免疫する工程を行う又は行わないのいずれかの後に、エクジソンプロモーターの制御下に癌遺伝子を発現させることによって不死化を達成する実施例８又は９に記載される方法、あるいは、マウス免疫を行うか又は行わないかの選択の後に、不死化マウスから抗体を得る実施例１０及び１１に記載される方法、の何れかによってモノクローナル抗体を得る。
【０１２０】
理解を明確にする目的で説明及び実施例により本発明をいくらか詳細に記載したが、条件、配合及び他のパラメーターが広範かつ均等であり、かつ本発明の範囲又はその特定の実施態様に影響しない範囲内で本発明を修正及び改変して本発明を実施することができること、およびかかる修正及び改変の目的は添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることは当業者には自明である。
【０１２１】
参考資料
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配列
配列番号１
５′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲプライマー
５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＡＧ−３′
配列番号２
３′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲプライマー
５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧ−３′
配列番号３
５′ｃ−ｍｙｃプライマー
５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＴＴＣ−３′
配列番号４
３′ｃ−ｍｙｃプライマー
５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＧＡＡＧ−３′
配列番号５
５′ａｂｌプライマー
５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣ−３′
配列番号６
３′ａｂｌプライマー
５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣ−３′
配列番号７
５′ＳＶ４０ラージＴプライマー
５′−ＧＴＡＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＧ−３′
配列番号８
３′ＳＶ４０ラージＴプライマー
５′−ＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣ−３′
配列番号９
５′ｐＩＮＤベクタープライマー
５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣ−３′
配列番号１０
３′ｐＩＮＤベクタープライマー
５′−ＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣ−３′
配列番号１１
５′ベータグロビンプライマー
５′−ＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＧ−３′
配列番号１２
３′ベータグロビンプライマー
５′−ＣＣＴＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧ−３′
配列番号１３
5′ｃ−ｍｙｃ導入遺伝子確認プライマー
５′−ＡＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＧＣ−３′
配列番号１４
5′ａｂｌ導入遺伝子確認プライマー
５′−ＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧ−３′
配列番号１５
5′ラージＴ導入遺伝子確認プライマー
５′−ＡＡＣＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＡＴＧＣＴＣ−３′
配列番号１６
５′ＶｇＥｃＲ−ＲＸＲ導入遺伝子確認プライマー
５′−ＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＡＧＣ−３′
【配列表】
2005527211000001.app
【国際調査報告】
2005527211.tif 000002
2005527211.tif 000003
2005527211.tif 000004
2005527211.tif 000005
2005527211.tif 000006
2005527211.tif 000007