(57)【要約】本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、メチオニンアミノ酸残基から開始し、抗原決定基を含み、７を超えるアミノ酸残基を含むもの、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
2005533855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項２】
該病原性ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項３】
少なくとも１の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項４】
Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項５】
少なくとも１のＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項６】
ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項７】
表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるポリペプチドまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項８】
表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコアを有する断片を含むかまたは該断片からなるポリペプチド。
【請求項９】
表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片。
【請求項１０】
担体、とりわけ免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１１】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートしていることを特徴とする、請求項１ないし１０のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１２】
少なくとも１のＴ細胞エピトープを含むことを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１３】
該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレームによってコードされることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１４】
表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１５】
治療剤として使用することを特徴とする、請求項１ないし１４のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１６】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１７】
Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸からなるテールを含み、該アミノ酸がＥまたはＤから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１８】
５０またはそれ以上のスコア、さらに好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有し、表７に列挙したペプチドの群から選ばれるペプチドを含むことを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から好ましくは選択される免疫修飾物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片をさらに含むことを特徴とする、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１ないし１８のいずれかに記載の１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含むことを特徴とする、請求項１９ないし２１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ワクチンとして調合することを特徴とする、請求項１９ないし２２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２４】
さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１９ないし２３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２６】
補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１９ないし２５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬を製造するための請求項１ないし１８のいずれかに記載のポリペプチドまたは断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性ウイルスに由来するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのウイルス感染については、宿主からウイルス感染を克服ないし排除するには大抵のコードされたウイルスタンパク質に対する初期の有効で強力なＣＴＬ応答が重要であることがますます明らかになってきている。
【０００３】
ＨＩＶのＣＴＬエピトープ内の変異に対する選択はＣＴＬがウイルス複製に対してインビボで圧力を及ぼすことを示しており、またマカークザルにおける研究は急性および慢性の両シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）感染におけるウイルス血症を制御するうえでのＣＤ８＋Ｔ細胞の役割についての興味深い（compelling）インビボデータを提供している。急性感染の際に治療を受けたＨＩＶ感染個体は、治療の中断後にその後のウイルス制御と関連してＨＩＶに対するＣＴＬおよびＴヘルパー細胞の両応答の亢進を示す。
【０００４】
それゆえ、大抵の（全てではないにしても）ウイルスタンパク質の正確なエピトープの同定は宿主の免疫応答を理解する観点からの主たる目標であり、これら病原体に対する新規かつ有効なワクチンをデザインするうえで最も重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでのところ、これらエピトープの同定のための大抵の研究は、実際に転写されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）でコードされるウイルスタンパク質、すなわち構造タンパク質およびウイルスの何らかの機能（たとえば制御、複製または再生産）を有するタンパク質に主として向けられていた。
【０００６】
病原体の可能な別のリーディングフレームを調べるべくある種の研究はなされてはきたが、ＨＣＶ（Walewskiら（RNA 7 (2001) 710-721）およびＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら（J. Exp. Med. 186(7)(1997), 1051-1058）、Malarkannanら（Immunity 10 (1999) 681-690）およびShastriら（J. Biol. Chem. 270 (3)(1995) 1088-1091））での重複リーディングフレームに関する幾つかの報告にもかかわらず、これまでのそのような別のリーディングフレームについての話題は、ウイルス病原体にではなく腫瘍抗原に関連のあるものとしか認められてこなかった。これら報告されたウイルスポリペプチドはすべてＡＵＧまたはＡＴＧ以外の開始コドンを有しており、たとえばＡｌａ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｙで開始されるペプチドに導く。さらに、これら従来技術によるウイルスペプチドはＴ細胞エピトープではなく、せいぜい抗体応答を惹起しうるのみであった。
【０００７】
本発明の目的は、ウイルス感染に対抗するためのさらなる手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、ウイルス病原体、とりわけヒト病原体に対する既存のまたは提唱されたワクチンを置換または改善する手段を提供することである。本発明の特別の目的は、ウイルス病原体に対する有効なＴ細胞エピトープを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それゆえ、本発明は、病原性ウイルスの別のリーディングフレームによりコードされるポリペプチドであって、
メチオニンアミノ酸残基から開始され、
抗原決定基を含み、かつ
７を超えるアミノ酸残基を含む
ことを特徴とするポリペプチド、および７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片を提供する。
【０００９】
驚くべきことに、そのようなエピトープ（抗原決定基）は病原性ウイルスによる感染と極めて関係が深いことがわかった。実際、そのような別にコードされたエピトープに対するＴ細胞応答をそのような感染を患う患者において検出することができる。ウイルスが宿主細胞に感染すると、ウイルスタンパク質を生成するウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、ゲノムの他のフレームによりコードされるある種のタンパク質または断片もまた転写されるように思われる。
【００１０】
そのような本発明によるポリペプチドは、ゲノムのＯＲＦ内ではあるが所定の病原性ウイルスで主として（主）転写されるＯＲＦの範囲外にある抗原性配列として定義することができる。
【００１１】
本発明との関連において使用する別のリーディングフレームとは、たとえば構造タンパク質や非構造タンパク質の発現のために使用される生物やウイルスのコドンをコードするオープンリーディングフレーム（主フレーム）とは異なるリーディングフレームとして定義することができる。
【００１２】
典型的に、しかし必ずしも全ての場合にそうではないが、主フレームは、たとえばメッセンジャーＲＮＡや（＋）／（−）鎖ＲＮＡウイルスからのＲＮＡの核酸の最初のコード開始コドン、たとえばＡＵＧやＧＵＧから開始する。本発明において記載する別のフレームは、それぞれ主フレームによって使用されるこれら開始コドンまたは他のいかなるコドンを使用することはない。
【００１３】
本発明は、５つのそのような別のリーディングフレームを想定しており、これらは上記の主フレームと区別して第二の呼び方として非コードオープンリーディングフレーム（ｎｃＯＲＦ）とも称する。そのような別のリーディングフレームの１つは＋１フレームであり、このものは主フレームコドンの５’プライムヌクレオチドの３’プライムのつぎのヌクレオチドから開始するコドンを使用する。そのような第二のフレームは＋２フレームであり、このものは５’プライムヌクレオチドが主コードフレームのコドンの３’プライムヌクレオチドと同一であるコドンを使用する。別のリーディングフレーム４、５および６は、それぞれ別のリーディングフレーム１および２をコードする核酸に相補的な核酸によりコードされる。フレーム４コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームのコドンの真中のヌクレオチドに相補的である。フレーム５コドンの５’プライムヌクレオチドは＋１フレームコドンの５’プライムヌクレオチドに相補的であり、フレーム６コドンの５’プライムヌクレオチドは＋２フレームコドンの３’プライムヌクレオチドに相補的である。
【００１４】
さらに、別のリーディングフレームは、主フレームの翻訳に関与しないゲノムの領域、たとえば、いわゆる非翻訳５’プライムまたは３’プライム領域に位置していてよい。
【００１５】
これら「ｎｃＯｒｆ」（「非コードＯＲＦ」）は病原体について（これまで）知られた機能を示さないが、これら「ｎｃＯｒｆ」は抗原決定基（Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープ）をコードする。
【００１６】
ＨＣＶ（Walewskiら、ＷＯ９９／６３９４１を参照）および他のウイルスまたは抗原（Bullockら、Malarkannanら、Shastriら）での別にコードされたＯＲＦに関する全ての使用可能な報告と対照的に、本発明によるポリペプチドはすべて開始コドンとしてＡＵＧまたはＡＴＧ（メチオニンをコードする）を有する。さらに、本発明により提供されるペプチドはＴ細胞エピトープを含み、抗体応答を生起させるもののみに限られることを意図するものではない。
【００１７】
本発明により提供される原理はウイルス感染において一般的なものであると思われる。それゆえ、本発明はある種のウイルスまたはウイルス群に限定されるものではない。この点に関し、本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、主要なおよび著名な（ヒト）病原性ウイルスまたは現在のところ適切な治療または活性な免疫プロトコールの存在しない病原性ウイルス、たとえば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウイルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（たとえば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、エボラウイルス、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＳＩＶ、パルボウイルス、パピローマウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、麻疹ウイルスおよび発癌ウイルスからのものである。
【００１８】
本発明では全く新規な世代の免疫原性エピトープが提供され、該エピトープは本発明の好ましい態様によれば本発明によるポリペプチドおよび断片が少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含むことを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、Ａ０２０１、Ａ１、Ａ２４、Ａ３、Ａ３１、Ｂ３５０１、Ｂ４４０３、Ｂ７、Ｂ８、とりわけＡ０２０１、またはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【００２０】
好ましい態様によれば、本発明によるポリペプチドまたは断片は少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２１】
好ましくは、本発明によるポリペプチドまたは断片は、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲまたはそれらの混合物よりなる群から選ばれたＨＬＡ対立遺伝子に対するＴヘルパー細胞エピトープを含む。
【００２２】
本発明による好ましいエピトープは、表２ａ）〜２ｎ）（配列番号１〜８２２）に列挙した群から選ばれるかまたは７を超えるアミノ酸を含む該ポリペプチドの断片および／または表４ａ）〜４ｎ）に列挙した群から選ばれた断片、好ましくは５０またはそれ以上のスコアを有する断片、さらに好ましくは２００を超えるスコアを有する断片、とりわけ５００を超えるスコア（表に示したスコア（Parkerら（J. Immunol. 152 (1994) 163）により報告されたアルゴリズムにより決定した）による）を有する断片を含むかまたは該断片からなるエピトープである。
【００２３】
本発明によるさらに好ましいエピトープは、表６に列挙され７を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチド（配列番号８２３〜８７４）または７を超えるアミノ酸残基を含む該ポリペプチドの断片である。
【００２４】
本発明によるポリペプチドまたは断片は、担体、とりわけ免疫修飾（immunomodulating）物質にコンジュゲートすることができる。ある種の応用においては、そのような結合はこれらペプチドの作用の改善という結果となる。また、ＷＯ０１／７８７６７に記載のように、これらペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に選択した疎水性（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、Ｗ、Ｃ）または酸性（ＤまたはＥ）アミノ酸残基を結合させるのが好ましい。
【００２５】
それゆえ、好ましいポリペプチドまたは断片は、Ｎ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＦ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＣから選ばれる）からなるテール；またはＮ末端またはＣ末端の少なくとも一方に２ないし７のアミノ酸（該アミノ酸はＤまたはＥから選ばれる）からなるテールを含む。
【００２６】
特に好ましいコンジュゲートでは、本発明のポリペプチドまたは断片は、ポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択される免疫修飾物質にコンジュゲートする。
【００２７】
好ましくは、ポリカチオン性物質は、ポリマー、好ましくはポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンまたは抗菌性ペプチドである。
【００２８】
本発明に従って用いるポリカチオン性化合物は、ＷＯ９７／３０７２１による特徴的な作用を示すあらゆるポリカチオン性化合物であってよい。好ましいポリカチオン性化合物は、塩基性ポリペプチド、有機ポリカチオン、塩基性ポリアミノ酸またはその混合物から選ばれる。これらポリアミノ酸は、少なくとも４アミノ酸残基の鎖長を有していなければならない。特に好ましいのは、ポリリシン、ポリアルギニン、および８を超える、とりわけ２０を超えるアミノ酸残基の範囲に２０％を超える、とりわけ５０％を超える塩基性アミノ酸を含むポリペプチドまたはその混合物のようなペプチド結合を含む物質である。他の好ましいポリカチオンおよびその医薬組成物は、ＷＯ９７／３０７２１（たとえば、ポリエチレンイミン）およびＷＯ９９／３８５２８に記載されている。好ましくは、これらポリペプチドは２０〜５００アミノ酸残基、とりわけ３０〜２００残基を含む。
【００２９】
これらポリカチオン性化合物は化学的にまたは組換えにより製造してよく、あるいは天然の採取源に由来してもよい。
【００３０】
カチオン性（ポリ）ペプチドはまた、ポリカチオン性で抗菌性の微生物ペプチドであってもよい。これら（ポリ）ペプチドは、原核生物または動物または植物起源のものであってよく、化学的にまたは組換えにより製造されてよい。ペプチドはまたデフェンシンのクラスに属していてもよい。そのような宿主防御ペプチドまたはデフェンシン（defensives）もまた、本発明によるポリカチオン性ポリマーの好ましい形態である。一般に、好ましくはＡＰＣ（樹状細胞を含む）によって媒介される獲得免疫系を最終生成物として活性化（またはダウンレギュレーション）することを可能にする化合物はポリカチオン性ポリマーとして用いる。
【００３１】
本発明においてポリカチオン性物質として使用するのに特に好ましいのは、カテリシジン（cathelicidin）由来の抗菌ペプチドまたはその誘導体（ＷＯ０２／１３８５７、参照のため本明細書中に引用する）、とりわけ哺乳動物、好ましくはヒト、ウシまたはマウスのカテリシジンに由来する抗菌ペプチド、または（ヒト）成長ホルモンなどの神経刺激性の化合物である（たとえば、ＷＯ０１／２４８２２に記載）。
【００３２】
天然の採取源に由来するポリカチオン性化合物としては、ＨＩＶ−ＲＥＶまたはＨＩＶ−ＴＡＴ（由来のカチオン性ペプチド、アンテナペディア（antennapedia）ペプチド、キトサンまたはキトサンの他の誘導体）または生化学的な製造または組換え製造によりこれらペプチドまたはタンパク質に由来する他のペプチドが挙げられる。他の好ましいポリカチオン性化合物は、カテリン（cathelin）またはカテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質、とりわけマウス、ウシまたは特にヒトのカテリンおよび／またはカテリシジンである。カテリンの関連物質またはカテリンに由来する物質はカテリン配列の全部または一部を含み、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基を有する。誘導体化は、２０の標準アミノ酸以外のアミノ酸による天然アミノ酸の置換または修飾を含む。さらに、さらなるカチオン性残基がそのようなカテリン分子中に導入されてよい。これらカテリン分子は、本発明による抗原／ワクチン組成物と組み合わせるのが好ましい。しかしながら、これらカテリン分子は驚くべきことに、さらなるアジュバントを加えなくとも抗原に対するアジュバントとして有効なことがわかった。それゆえ、そのようなカテリン分子は、さらなる免疫促進性物質を用いまたは用いることなく、本発明の医薬において有効なアジュバントとして用いることが可能である。
【００３３】
本発明に従って用いることのできる他の好ましいポリカチオン性物質は、３〜７の疎水性アミノ酸、とりわけＬのリンカーによって隔てられた少なくとも２つのＫＬＫモチーフを含む合成ペプチドである（ＷＯ０２／３２４５１、参照のため本明細書中に引用する）。
【００３４】
本発明に従って用いる免疫修飾核酸は、合成したもの、原核生物および真核生物由来のものであってよい。真核生物由来である場合は、ＤＮＡは系統樹に基づいて進化の遅れた種（たとえば昆虫、しかし他の種も可能）からのものでなければならない。本発明の好ましい態様において、免疫原性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は合成により製造したＤＮＡ分子またはそのような分子の混合物である。たとえば米国特許第５,７２３,３３５号および同第５,６６３,１５３号に記載されているようなチオホスフェート置換アナログ（チオホスフェート残基がホスフェートを置換する）などのＯＤＮの誘導体または修飾物、および好ましくは免疫促進組成物を安定化させるがその免疫学的特性は変化させない他の誘導体および修飾物も含まれる。好ましい配列モチーフは、２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンによりフランキングされた（非メチル化）ＣｐＧジヌクレオチドを含む６塩基ＤＮＡモチーフ（５’−Ｐｕｒ−Ｐｕｒ−Ｃ−Ｇ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−３’）である。本発明によるＯＤＮに含まれるＣｐＧモチーフは高等脊椎動物ＤＮＡよりも微生物において一般的であり、メチル化のパターンにおいて差異を示す。驚くべきことに、マウスＡＰＣを促進する配列はヒトの細胞に対しては特に有効というわけではない。本発明に従って用いる好ましいパリンドローム性または非パリンドローム性ＯＤＮは、たとえばオーストリア特許出願Ａ１９７３／２０００、Ａ８０５／２００１、ＥＰ０４６８５２０Ａ２、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５２５８１、ＷＯ９８／５２９６２、ＷＯ９９／５１２５９およびＷＯ９９／５６７５５（すべて参照のため本明細書に引用する）に開示されている。免疫系を促進させることとは別に、ある種のＯＤＮはある種の免疫応答を中和する。これら配列もまた、たとえば自己免疫疾患の治療に応用するために本発明に含まれる。ＯＤＮ／ＤＮＡは、化学的にまたは組換えにより製造することができ、または天然源に由来するものであってよい。好ましい天然源は昆虫である。
【００３５】
あるいは、ヒポキサンチンおよびシトシンに基づく核酸（たとえばＷＯ０１／９３９０５に記載のようなもの）やデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸（ＰＣＴ／ＥＰ０２／０５４４８（参照のため本明細書に引用する）に記載）を本発明の免疫促進核酸として用いるのが好ましい。
【００３６】
もちろん、異なる免疫原性核酸の混合物も本発明に従って用いることができる。
【００３７】
上記の物質は、本発明のペプチドまたは断片または混合物とのコンジュゲートとして用いることができる。混合物は、すでに混合した形態かまたは適用前に混合することを意図した単一成分のキットとして提供できる。
【００３８】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片はＴ細胞エピトープを含む。
【００３９】
驚くべきことに、本発明により、シフトしたリーディングフレーム（すなわち、リーディングフレーム２および３）を有するポリペプチドまたは断片のみならず、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち本明細書において一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされるペプチドおよび断片もまた臨床的に関連するペプチドとして提供される。このことは、既知の（機能的または構造）遺伝子の反対の端に位置する、たとえばその調節配列に位置するリーディングフレームも重要であることを意味する。
【００４０】
それゆえ、本発明の１つのさらなる側面は、該病原性ウイルスの機能的なリーディングフレームの相補鎖を読みとる別のリーディングフレーム、すなわち一般にリーディングフレーム４〜６と称するものによってコードされる全ての抗原からなる。
【００４１】
本発明による好ましいポリペプチドまたは断片は、表４ａ、４ｃ、４ｅ、４ｇ、４ｉ、４ｋおよび４ｍに列挙され、５０またはそれ以上のスコア、より好ましくは２００を超えるスコア、とりわけ５００を超えるスコアを有するペプチドの群から選択される少なくとも１のペプチドを含む。
【００４２】
本発明の好ましい側面によれば、ポリペプチドまたは断片は治療剤として使用する。とりわけＴ細胞エピトープが予防的な使用のためのワクチンとして使用できることが知られている。しかしながら、本発明によるペプチドおよび断片を用い、とりわけリーディングフレーム２および３のＨＣＶ由来ペプチドを用い、ＨＣＶなどの病原性ウイルスの（慢性）感染症を克服するための治療手段が提供される。
【００４３】
本発明によるペプチドおよび断片はまた、所定のエピトープの好ましくは１または２のアミノ酸がたとえばTourdotら（Eur.J.Immunol. 30 (2000), 3411-3421）に開示の法則に従って修飾または置換されている修飾エピトープ、並びにそのような修飾エピトープをコードする核酸配列をも含む。
【００４４】
好ましい側面によれば、本発明はまた本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を含む医薬組成物にも関する。この医薬組成物は、予防および治療の両目的に使用できる。
【００４５】
上記に記載したように、本発明の医薬組成物は、免疫修飾物質、好ましくはポリカチオン性物質、とりわけポリカチオン性ポリペプチド、および免疫修飾核酸、とりわけデオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジン含有オリゴデオキシヌクレオチドよりなる群から選択されるものをさらに含むのが好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物においては、本発明のペプチドまたは断片は単独または所定の病原性ウイルス（または異なる病原体の抗原の組み合わせ）の「通常の」ポリペプチド（エピトープ、抗原決定基）と組み合わせて用いることができる。それゆえ、好ましい態様は、病原性ウイルスの構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片、とりわけ抗原決定基を含む構造的または機能的ポリペプチドまたはその断片を包含する。
【００４７】
本発明による医薬組成物の投与は、他の既知のポリペプチドワクチンの投与に従って行うことができる。好ましくは、該組成物は、本発明による１またはそれ以上のポリペプチドまたは断片を単位投与当たり１ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ１０μｇ〜１ｍｇ含む。
【００４８】
好ましくは医薬組成物はワクチンとして調合する。
【００４９】
本発明による医薬組成物は、さらなる活性成分、とりわけ免疫強化サイトカイン、抗炎症物質、抗菌物質またはそれらの組み合わせを含んでいるのが好ましい。
【００５０】
本発明の医薬組成物はさらに、ポリカチオン性ペプチド、とりわけポリアルギニン、ポリリシンよりなる群から選ばれたポリカチオン性ポリマー、または抗菌ペプチド、とりわけカテリシジン由来の抗菌ペプチド、または成長ホルモン、とりわけヒト成長ホルモンを含んでいるのがさらに好ましい。
【００５１】
さらに、補助物質、とりわけ薬理学的に許容しうる担体、緩衝物質、安定化剤またはそれらの組み合わせが医薬組成物に提供される。
【００５２】
他の側面によれば、本発明はまた、該病原性ウイルスの感染の治療または予防用医薬の製造のための本発明によるポリペプチドまたは断片の使用にも関する。
【００５３】
ウイルスが宿主細胞に感染したときに、ウイルスタンパク質を生じるウイルスゲノムのＯＲＦが転写されるのみならず、該ゲノムの他のフレームによってコードされるタンパク質または断片の幾つかもまた転写されることは、従来技術の範囲では予測できなかった。このことは、リーディングフレーム４〜６についてはさらに一層驚くべきことであった。
【００５４】
本発明を以下の実施例および図面によりさらに詳細に記載するが、本発明はこれら特定の態様に限られるわけではない。
【００５５】
実施例：
実施例１：ＨＣＶ
ＨＣＶを本発明のモデルウイルスとして用いた。しかしながら、本実施例に記載する原理はいかなるウイルスにも応用できる。
【００５６】
ＨＣＶポリプロテインのリーディングフレーム以外の全てのリーディングフレームにおいて７アミノ酸残基よりも長くＡＵＧ（Ｍｅｔ）コドンで開始される全てのＯＲＦを決定するため、ＨＣＶの７つの臨床的に関連のある株（１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂおよびＨ７７）の全ゲノムを分析した。ＨＣＶゲノム配列は、ジーンバンクデータベース（アクセッション番号：ＡＦ３８７８０６（１ａ）、Ｄ１１３５５（１ｂ）、ＡＦ２３８４８５（２ａ）、ＡＢ０３０９０７（２ｂ）、ＡＦ０４６８６６（３ａ）、Ｄ４９３７４（Ｄ２６５５６）（３ｂ）、ＡＦ０１１７５１（Ｈ７７））から得た。全部で８２２の新規なＯＲＦがこの研究で同定された（表１の要約を参照）。
【００５７】
【表１】
2005533855.tif 000003
【００５８】
以下の表２は、ポリペプチドの全配列を含む。
【００５９】
本実施例に適合させるのが好ましい他のＨＣＶサブタイプとしては、サブタイプ１ｃ、２ｃ、２ｄ、３ｃ〜ｆ、４ａ〜ｊ、５ａまたは６ａが挙げられる。
【００６０】
表２ａ（配列番号１〜４２）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ３８７８０６
【表２】
2005533855.tif 000004
【００６１】
【表３】
2005533855.tif 000005
【００６２】
表２ｂ（配列番号４３〜１１０）
ＨＣＶ１ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表４】
2005533855.tif 000006
【００６３】
【表５】
2005533855.tif 000007
【００６４】
【表６】
2005533855.tif 000008
【００６５】
表２ｃ（配列番号１１１〜１６６）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ
【表７】
2005533855.tif 000009
【００６６】
【表８】
2005533855.tif 000010
【００６７】
表２ｄ（配列番号１６７〜２４１）
ＨＣＶ１ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表９】
2005533855.tif 000011
【００６８】
【表１０】
2005533855.tif 000012
【００６９】
【表１１】
2005533855.tif 000013
【００７０】
表２ｅ（配列番号２４２〜２８８）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ２３８４８５
【表１２】
2005533855.tif 000014
【００７１】
【表１３】
2005533855.tif 000015
【００７２】
表２ｆ（配列番号２８９〜３５９）
ＨＣＶ２ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１４】
2005533855.tif 000016
【００７３】
【表１５】
2005533855.tif 000017
【００７４】
【表１６】
2005533855.tif 000018
【００７５】
表２ｇ（配列番号３６０〜４０４）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＢ０３０９０７
【表１７】
2005533855.tif 000019
【００７６】
【表１８】
2005533855.tif 000020
【００７７】
表２ｈ（配列番号４０５〜４７９）
ＨＣＶ２ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表１９】
2005533855.tif 000021
【００７８】
【表２０】
2005533855.tif 000022
【００７９】
【表２１】
2005533855.tif 000023
【００８０】
表２ｉ（配列番号４８０〜５１７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０４６８６６
【表２２】
2005533855.tif 000024
【００８１】
【表２３】
2005533855.tif 000025
【００８２】
表２ｊ（配列番号５１８〜５８７）
ＨＣＶ３ａ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２４】
2005533855.tif 000026
【００８３】
【表２５】
2005533855.tif 000027
【００８４】
【表２６】
2005533855.tif 000028
【００８５】
表２ｋ（配列番号５８８〜６４０）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：Ｄ４９３７４，Ｄ２６５５６
【表２７】
2005533855.tif 000029
【００８６】
【表２８】
2005533855.tif 000030
【００８７】
表２ｌ（配列番号６４１〜７１２）
ＨＣＶ３ｂ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表２９】
2005533855.tif 000031
【００８８】
【表３０】
2005533855.tif 000032
【００８９】
【表３１】
2005533855.tif 000033
【００９０】
表２ｍ（配列番号７１３〜７５２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ１〜３
ジーンバンクアクセッション番号：ＡＦ０１１７５１
【表３２】
2005533855.tif 000034
【００９１】
【表３３】
2005533855.tif 000035
【００９２】
表２ｎ（配列番号７５３〜８２２）
ＨＣＶＨ７７ ｎｃＯｒｆ４〜６
【表３４】
2005533855.tif 000036
【００９３】
【表３５】
2005533855.tif 000037
【００９４】
【表３６】
2005533855.tif 000038
【００９５】
異なるＨＬＡ対立遺伝子について可能なＣＴＬエピトープの予測のためにウエブベースのコンピューターソフトウエアを用い、１０またはそれ以上の（相対的）カットオフ値となる（Parkerら（上記）により）（おそらく）コードされているエピトープの存在について単一のＯＲＦをすべて分析した。
【００９６】
【表３７】
2005533855.tif 000039
【００９７】
以下の表４には、試験したＨＬＡ対立遺伝子に関して認められたエピトープの正確な（最小の）配列を、所定のエピトープが所定のＨＬＡ型に有効に結合する能力を同定する（相対的）スコアとともに示す。
【００９８】
表４ａ
１ａ（１〜３）
【表３８】
2005533855.tif 000040
【００９９】
【表３９】
2005533855.tif 000041
【０１００】
【表４０】
2005533855.tif 000042
【０１０１】
【表４１】
2005533855.tif 000043
【０１０２】
【表４２】
2005533855.tif 000044
【０１０３】
表４ｂ
１ａ（４〜６）
【表４３】
2005533855.tif 000045
【０１０４】
【表４４】
2005533855.tif 000046
【０１０５】
【表４５】
2005533855.tif 000047
【０１０６】
【表４６】
2005533855.tif 000048
【０１０７】
【表４７】
2005533855.tif 000049
【０１０８】
【表４８】
2005533855.tif 000050
【０１０９】
【表４９】
2005533855.tif 000051
【０１１０】
【表５０】
2005533855.tif 000052
【０１１１】
【表５１】
2005533855.tif 000053
【０１１２】
【表５２】
2005533855.tif 000054
【０１１３】
【表５３】
2005533855.tif 000055
【０１１４】
表４ｃ
１ｂ（１〜３）
【表５４】
2005533855.tif 000056
【０１１５】
【表５５】
2005533855.tif 000057
【０１１６】
【表５６】
2005533855.tif 000058
【０１１７】
【表５７】
2005533855.tif 000059
【０１１８】
【表５８】
2005533855.tif 000060
【０１１９】
表４ｄ
１ｂ（４〜６）
【表５９】
2005533855.tif 000061
【０１２０】
【表６０】
2005533855.tif 000062
【０１２１】
【表６１】
2005533855.tif 000063
【０１２２】
【表６２】
2005533855.tif 000064
【０１２３】
【表６３】
2005533855.tif 000065
【０１２４】
【表６４】
2005533855.tif 000066
【０１２５】
【表６５】
2005533855.tif 000067
【０１２６】
【表６６】
2005533855.tif 000068
【０１２７】
【表６７】
2005533855.tif 000069
【０１２８】
【表６８】
2005533855.tif 000070
【０１２９】
【表６９】
2005533855.tif 000071
【０１３０】
表４ｅ
２ａ（１〜３）
【表７０】
2005533855.tif 000072
【０１３１】
【表７１】
2005533855.tif 000073
【０１３２】
【表７２】
2005533855.tif 000074
【０１３３】
【表７３】
2005533855.tif 000075
【０１３４】
【表７４】
2005533855.tif 000076
【０１３５】
表４ｆ
２ａ（４〜６）
【表７５】
2005533855.tif 000077
【０１３６】
【表７６】
2005533855.tif 000078
【０１３７】
【表７７】
2005533855.tif 000079
【０１３８】
【表７８】
2005533855.tif 000080
【０１３９】
【表７９】
2005533855.tif 000081
【０１４０】
【表８０】
2005533855.tif 000082
【０１４１】
【表８１】
2005533855.tif 000083
【０１４２】
【表８２】
2005533855.tif 000084
【０１４３】
【表８３】
2005533855.tif 000085
【０１４４】
【表８４】
2005533855.tif 000086
【０１４５】
【表８５】
2005533855.tif 000087
【０１４６】
【表８６】
2005533855.tif 000088
【０１４７】
【表８７】
2005533855.tif 000089
【０１４８】
表４ｇ
２ｂ（１〜３）
【表８８】
2005533855.tif 000090
【０１４９】
【表８９】
2005533855.tif 000091
【０１５０】
【表９０】
2005533855.tif 000092
【０１５１】
【表９１】
2005533855.tif 000093
【０１５２】
【表９２】
2005533855.tif 000094
【０１５３】
【表９３】
2005533855.tif 000095
【０１５４】
表４ｈ
２ｂ（４〜６）
【表９４】
2005533855.tif 000096
【０１５５】
【表９５】
2005533855.tif 000097
【０１５６】
【表９６】
2005533855.tif 000098
【０１５７】
【表９７】
2005533855.tif 000099
【０１５８】
【表９８】
2005533855.tif 000100
【０１５９】
【表９９】
2005533855.tif 000101
【０１６０】
【表１００】
2005533855.tif 000102
【０１６１】
【表１０１】
2005533855.tif 000103
【０１６２】
【表１０２】
2005533855.tif 000104
【０１６３】
【表１０３】
2005533855.tif 000105
【０１６４】
【表１０４】
2005533855.tif 000106
【０１６５】
【表１０５】
2005533855.tif 000107
【０１６６】
表４ｉ
３ａ（１〜３）
【表１０６】
2005533855.tif 000108
【０１６７】
【表１０７】
2005533855.tif 000109
【０１６８】
【表１０８】
2005533855.tif 000110
【０１６９】
【表１０９】
2005533855.tif 000111
【０１７０】
【表１１０】
2005533855.tif 000112
【０１７１】
表４ｊ
３ａ（４〜６）
【表１１１】
2005533855.tif 000113
【０１７２】
【表１１２】
2005533855.tif 000114
【０１７３】
【表１１３】
2005533855.tif 000115
【０１７４】
【表１１４】
2005533855.tif 000116
【０１７５】
【表１１５】
2005533855.tif 000117
【０１７６】
【表１１６】
2005533855.tif 000118
【０１７７】
【表１１７】
2005533855.tif 000119
【０１７８】
【表１１８】
2005533855.tif 000120
【０１７９】
【表１１９】
2005533855.tif 000121
【０１８０】
【表１２０】
2005533855.tif 000122
【０１８１】
【表１２１】
2005533855.tif 000123
【０１８２】
表４ｋ
３ｂ（１〜３）
【表１２２】
2005533855.tif 000124
【０１８３】
【表１２３】
2005533855.tif 000125
【０１８４】
【表１２４】
2005533855.tif 000126
【０１８５】
【表１２５】
2005533855.tif 000127
【０１８６】
【表１２６】
2005533855.tif 000128
【０１８７】
表４ｌ
３ｂ（４〜６）
【表１２７】
2005533855.tif 000129
【０１８８】
【表１２８】
2005533855.tif 000130
【０１８９】
【表１２９】
2005533855.tif 000131
【０１９０】
【表１３０】
2005533855.tif 000132
【０１９１】
【表１３１】
2005533855.tif 000133
【０１９２】
【表１３２】
2005533855.tif 000134
【０１９３】
【表１３３】
2005533855.tif 000135
【０１９４】
【表１３４】
2005533855.tif 000136
【０１９５】
【表１３５】
2005533855.tif 000137
【０１９６】
【表１３６】
2005533855.tif 000138
【０１９７】
【表１３７】
2005533855.tif 000139
【０１９８】
表４ｍ
Ｈ７７（１〜３）
【表１３８】
2005533855.tif 000140
【０１９９】
【表１３９】
2005533855.tif 000141
【０２００】
【表１４０】
2005533855.tif 000142
【０２０１】
【表１４１】
2005533855.tif 000143
【０２０２】
【表１４２】
2005533855.tif 000144
【０２０３】
【表１４３】
2005533855.tif 000145
【０２０４】
表４ｎ
Ｈ７７（４〜６）
【表１４４】
2005533855.tif 000146
【０２０５】
【表１４５】
2005533855.tif 000147
【０２０６】
【表１４６】
2005533855.tif 000148
【０２０７】
【表１４７】
2005533855.tif 000149
【０２０８】
【表１４８】
2005533855.tif 000150
【０２０９】
【表１４９】
2005533855.tif 000151
【０２１０】
【表１５０】
2005533855.tif 000152
【０２１１】
【表１５１】
2005533855.tif 000153
【０２１２】
【表１５２】
2005533855.tif 000154
【０２１３】
【表１５３】
2005533855.tif 000155
【０２１４】
【表１５４】
2005533855.tif 000156
【０２１５】
【表１５５】
2005533855.tif 000157
【０２１６】
【表１５６】
2005533855.tif 000158
【０２１７】
【表１５７】
2005533855.tif 000159
【０２１８】
【表１５８】
2005533855.tif 000160
【０２１９】
実施例１.２：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドの免疫原性
本発明により提供されるペプチドが免疫原性を有する可能性があるか否かを決定するため、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子についてＨＣＶ１ｂからの３つのペプチドを選び、これらペプチドでＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ）にワクチン接種した。
【０２２０】
実施例１.２.１：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
【０２２１】
ワクチン接種の７日後、水切りしたリンパ節を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図１からわかるように、全てのペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２２２】
実施例１.２.２：本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１４４５、Ｉｐｅｐ１４４７）によるマウスのワクチン接種
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４４５（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＲＬＬＱＬＫＹＣＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（２）１４４７（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（１−３）３６ ＦＬＹＬＰＬＳＦＡＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
【０２２３】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図２からわかるように、両ペプチドが多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した（「バックグラウンド」は「培地対照」、すなわちペプチドなしで培養した細胞を意味する）。
【０２２４】
実施例１.３：本発明によるｎｃＨＣＶペプチドのＨＣＶ患者のインビボ関連性
本発明によるｎｃＯＲＦペプチドはｔｇ−マウスにおいて免疫原性であるので、本発明のペプチドをＨＣＶ＋患者からのＰＢＬでＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【０２２５】
実施例１.３.１：ＨＣＶ患者由来細胞および本発明によるｎｃＯＲＦ（Ｉｐｅｐ１３７１、Ｉｐｅｐ１３７２、Ｉｐｅｐ１３７３）を用いたＥｌｉｓｐｏｔ
患者は１９９２年に慢性ＨＣＶに感染しており、１９９３年から１９９４年にＩＦＮ−アルファ単一療法で治療した。１９９６年に凍結した患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍して以下のペプチドを用いてＩＦＮ−ｇ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行った：
（１）１３７１（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１１ ＴＬＷＡＧＰＬＫＶ）
（２）１３７２（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）１３ ＬＬＬＱＲＷＡＬＶ）
（３）１３７３（ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ（１−３）２７ ＦＭＬＧＡＬＬＰＩ）
（４）１００６（ＨＣＶ由来） ＭＷＮＦＩＳＧＩＱＹＬＡＧＬＳＴＬＰＧＮ
（５）８４（ＨＣＶ由来） ＧＹＫＶＬＶＬＮＰＳＶＡＡＴ
（６）ＣＭＶｐｐ６５ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ
（７）インフルエンザＡマトリックス（アミノ酸５８〜６７） ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ
【０２２６】
表５および図３からわかるように、ペプチド１３７１、１３７２および１３７３は、正の対照ペプチド（ＣＭＶ由来、インフルエンザ由来）と同様に多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発した。
【０２２７】
【表１５９】
2005533855.tif 000161
【０２２８】
実施例１.４：フレーム４〜６からのペプチドはトランスジェニックマウスにおいて免疫原性である
（Ｉｐｅｐ１４９０；Ｉｐｅｐ１４９１；Ｉｐｅｐ１４９２；Ｉｐｅｐ１４９３；Ｉｐｅｐ１４９４；Ｉｐｅｐ８２）
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウス（１群当たり５匹）を以下のようにして皮下にてワクチン接種した：
（１）１４９０（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＬＮＲＲＶＬＷＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（２）１４９１（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＶＬＬＭＣＱＬＰＬＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（３）１４９２（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＭＬＮＲＲＶＬＷＶＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（４）１４９３（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＴＩＬＥＬＥＱＳＦＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（５）１４９４（ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ（４−６） ＫＭＭＳＰＨＡＡＶ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
（６）    ８２（ＥＢＶ、対照 ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）  ＋  ＣｐＧ１６６８
【０２２９】
ワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、細胞をペプチドでイクスビボにて活性化してＩＦＮ−ｇを産生するペプチド特異的なＴ細胞の数を決定した（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）。図４からわかるように、４つのペプチドのうちの２つ（＃１４９１、＃１４９４）が多数のペプチド特異的なＴ細胞を誘発する。
【０２３０】
実施例１による本発明のＨＣＶモデルを用い、以下のことを明らかに示すことができた：
ウイルスゲノムの異なるＯＲＦ内に、可能なコードされたＣＴＬエピトープを同定することができる；
これらＯＲＦのペプチドは、とりわけリーディングフレーム４〜６においても、ｔｇ−マウスで免疫原性である；
ＨＣＶ＋患者において陽性のＥＬＩｓｐｏｔの結果を与える、すなわちＨＣＶ感染において関連のある病理学的パラメーターである。
【０２３１】
実施例２：ＨＩＶ
本実施例ではＨＩＶのゲノムをその非コードＯＲＦに関して本発明に従って分析した。その結果を表６に示す。これらから、ＨＩＶワクチンの製造に抗原として用いるのが好ましい最小長の７アミノ酸残基を有するＨＩＶ−ｎｃＯＲＦまたは７アミノ酸残基よりも長いＨＩＶ−ｎｃＯＲＦを得ることができる。
【０２３２】
さらに好ましくは、最小長の９アミノ酸残基を有するＯＲＦが、とりわけＴ細胞抗原、Ｂ細胞抗原またはその両者である場合に表６から選択される。
【０２３３】
それゆえ、ＨＩＶ−ＯＲＦは表６中のＯＲＦ−Ｎｏ．１３、２３、２７、６９および８０から選択するのが好ましい。
【０２３４】
【表１６０】
2005533855.tif 000162
【０２３５】
【表１６１】
2005533855.tif 000163
【０２３６】
【表１６２】
2005533855.tif 000164
表６：非コードＨＩＶ−ＯＲＦ  ＝  ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＶＩＦ、ＶＰＲ、ＴＡＴ、ＲＥＶ、ＶＰＵ、ＥＮＶおよびＮＥＦ（表６中のＯＲＦ番号１、１４、１６、４９、５５、５９、６０、６２、６３および８７）以外はすべてのＯＲＦ
【０２３７】
ＨＩＶの選択したＯＲＦ：表６中のＯＲＦ番号２、３、６、９、１１、１２、１３、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３１、３２、３４、３５、３７、３８、４０、４３、４４、４６、４８、５０、５６、５７、５８、６４、６７、６９、７０、７１、７３、７４、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８８、８９、９０および９１。
【０２３８】
実施例３．ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
本実施例では、実施例１でＨＣＶエピトープについて記載したのと同様にしてＨＰＶの優れた免疫特性を備えた可能なｎｃＯＲＦエピトープを同定する。その結果を以下の表７に示す。
【０２３９】
【表１６３】
2005533855.tif 000165
【０２４０】
【表１６４】
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【０２４１】
【表１６５】
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【０２４２】
【表１６６】
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【０２４３】
【表１６７】
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【０２４４】
【表１６８】
2005533855.tif 000170
【０２４５】
【表１６９】
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【０２４６】
【表１７０】
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【０２４７】
【表１７１】
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【０２４８】
【表１７２】
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【０２４９】
【表１７３】
2005533855.tif 000175
【０２５０】
【表１７４】
2005533855.tif 000176
【０２５１】
【表１７５】
2005533855.tif 000177
【０２５２】
【表１７６】
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【０２５３】
【表１７７】
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【０２５４】
【表１７８】
2005533855.tif 000180
【０２５５】
【表１７９】
2005533855.tif 000181
【０２５６】
【表１８０】
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【０２５７】
【表１８１】
2005533855.tif 000183
【０２５８】
【表１８２】
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【０２５９】
【表１８３】
2005533855.tif 000185
【０２６０】
【表１８４】
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【０２６１】
【表１８５】
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【０２６２】
【表１８６】
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【０２６３】
【表１８７】
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【０２６４】
【表１８８】
2005533855.tif 000190
【０２６５】
【表１８９】
2005533855.tif 000191
【０２６６】
【表１９０】
2005533855.tif 000192
【０２６７】
【表１９１】
2005533855.tif 000193
【０２６８】
【表１９２】
2005533855.tif 000194
【０２６９】
【表１９３】
2005533855.tif 000195
【０２７０】
【表１９４】
2005533855.tif 000196
【０２７１】
【表１９５】
2005533855.tif 000197
【０２７２】
【表１９６】
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【０２７３】
【表１９７】
2005533855.tif 000199
【０２７４】
【表１９８】
2005533855.tif 000200
表７
【０２７５】
実施例４．インフルエンザ
ＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３とともにインフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドを用いたマウスのワクチン接種。ワクチン接種の７日後に特異的なＴ細胞応答を測定し、その後、被験動物を致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス（×３１）で攻撃する。生存を１５日間モニターする。
【０２７６】
材料
マウス：Ｃ５７Ｂ１／６（Harlan-Winkelmann、ドイツ）
ペプチド：ｐ８２（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）：ＥＢＶ；ＨＬＡ−Ａ＊０２０１；アミノ酸開始２８０からの対照ペプチド
ｐ１５７４（ＩＡＳＮＥＮＭＥＴＭ）：インフルエンザ核タンパク質、アミノ酸開始３６５からの対照ペプチド
ｐ１５６９（ＴＭＬＹＮＫＭＥＦ）：セグメント１、フレーム１、ＯＲＦ１、アミノ酸開始５６９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６００（ＳＳＩＡＡＱＤＡＬ）：セグメント３、フレーム６、ＯＲＦ２、アミノ酸開始８３からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
ｐ１６６４（ＶＴＩＬＮＬＡＬＬ）：セグメント４、フレーム５、ＯＲＦ６、アミノ酸開始９からのＦｌｕ ｎｃＯＲＦ由来ペプチド
投与量：１００μｇ／ペプチド／マウス。
【０２７７】
ｏ−ｄ（ＩＣ）１３（＝ＯＤＮ１ａ）：ＯＤＮ ５’ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣＩ ＣＩＣ ＩＣ３’をPurimex Nucleic Acids Technology、ゲッチンゲンにより合成した。
投与量：５ナノモル／マウス。
【０２７８】
ＫＬＫ：ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ−ＣＯＯＨをMPS（Multiple Peptide System、米国）により合成した。
投与量：１２７ナノモル／マウス。
調合：２７０ｍＭソルビトール／１０ｍＭ Hepes
【０２７９】
インフルエンザＡウイルス：×３１、マウス適合インフルエンザＡウイルス、Ａ／Ｐｒ／８／３４（セグメント１、２、３、５、７、８）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（セグメント４、６）からの組換え（rec.）ウイルス
【０２８０】
実験条件（１５匹のマウス／群）
１．ｐ１５７４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
２．ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
３．ｐ１６００ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
４．ｐ１６６４ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
５．ｐ１６００ ＋ ｐ１５６９ ＋ ＫＬＫ ＋ ｏ−ｄ（ＩＣ）１３
【０２８１】
第０日目にマウスの両後肢に上記化合物を含む全量１００μｌ（５０μｌ／足）を皮下注射した。第７日目に、各実験群についてペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の数を計数するために５匹のマウスからの分離していない脾細胞を９６ウエルＥＬＩｓｐｏｔプレートで刺激した。残りの１０匹のマウスはマウス適合×３１インフルエンザＡウイルス（５＊１０Ｅ５ ｐｆｕ）で攻撃した。生存を１５日間モニターした。
【０２８２】
結果（ＥＬＩｓｐｏｔ；図５ａ）
１群および３群（ペプチドｐ１５７４およびｐ１６００）の脾細胞は、各ペプチドで再刺激した後に特異的なスポットを示さない。２群および４群（ｐ１５６９およびｐ１６６４）は再刺激後にＩＦＮ−γを特異的に放出する。５群は２つの個々のペプチド（混合物としてではなく、ｐ１６００およびｐ１５６９）でワクチン接種した。両ペプチドの混合物かまたはｐ１５６９のいずれかで再刺激すると特異的なサイトカイン放出が検出される。対照的に、ｐ１６００単独で再刺激するとＩＦＮ−γスポットは検出できない。これは３群（ｐ１６００単独）と一致するものである。
【０２８３】
結果（攻撃；図５ｂ）
図５ｂは、致死量のマウス適合インフルエンザＡウイルス×３１で攻撃したマウスの生存率を示す。１群（ｐ１５７４、Ｈ２−Ｄｂについて報告された防御ペプチド）は攻撃した全マウスの３０％を防御する。ペプチドｐ１５６９は全く防御を与えない。対照的に、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４は、それぞれ攻撃した動物の５０％および６２％を防御する。動物を２つの異なるペプチドでワクチン接種すると（５群、ペプチドｐ１６００およびｐ１６６４）、動物の７０％が防御される。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−Ｈ７７ ｎｃＯＲＦ１１、１３、２７由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【０２８５】
【図２】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｔｇマウス＋ＨＣＶ−１ｂ ｎｃＯＲＦ３６由来ペプチドを用いた実験からのＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【０２８６】
【図３】ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＨＣＶ陽性患者のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す。
【０２８７】
【図４】トランスジェニックマウスにおけるＨＣＶ１ｂリーディングフレーム４〜６からのペプチドの免疫原性を示す。
【０２８８】
【図５ａ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【０２８９】
【図５ｂ】インフルエンザＡウイルスからのｎｃＯＲＦ由来ペプチドをＫＬＫ／ｏ−ｄ（ＩＣ）１３と組み合わせて用いたワクチン接種は、強力なＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびウイルスの攻撃に対する防御を誘発することを示す。
【図１】
2005533855.tif 000201
【図２】
2005533855.tif 000202
【図３】
2005533855.tif 000203
【図４】
2005533855.tif 000204
【図５ａ】
2005533855.tif 000205
【図５ｂ】
2005533855.tif 000206
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月20日(2004.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005533855000001.app
【国際調査報告】
2005533855.tif 000207
2005533855.tif 000208
2005533855.tif 000209
2005533855.tif 000210
2005533855.tif 000211
2005533855.tif 000212