(57)【要約】本発明は、極性基を有する環状頭基を含む前記両親媒物質である、生物学的活性分子の細胞への輸送を促進することができる新しいカチオン性両親媒質および生物学に活性な治療上の分子を体細胞へ伝達するのに有用な製薬組成物を提供する。
2005532278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)で表される、生物活性カチオン性親媒質。
【化１】
2005532278.tif 000009
ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義される可能性を除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、ｎは1、2または3、Xは無機または有機アニオンである。
【請求項２】
一般式(II)により表される、生物活性カチオン性親媒質。
【化２】
2005532278.tif 000010
ただし、R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、または以下に示すような組み合わせである。
n=1
R1=R2=CH3-(CH2)10CH2-、CH3-(CH2)12CH2-、CH3-(CH2)14CH2-、CH3-(CH2)16CH2-および/またはCH3-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH2
R3=R4=ヒドロキシル基。
【請求項３】
Xが、ハロゲン原子、トシル基およびアセタート基から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
R1が水素であり、R2がC8-22の飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
R1がC8-22飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基であり、R2が水素原子またはC8-22の飽和アルキル基または１から３の二重不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
R3およびR4が、それぞれ水素、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアミノまたは第１級アミンから選択される基による組み合わせのいずれかを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ヒドロキシアルキルおよび第１級アミンが、1-5の炭素原子からなる、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
それぞれ、R1が水素原子を表し、R2が飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子により表される、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
それぞれ、R1が飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表し、R2が水素原子を表す、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
R1およびR2が共に、飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表す、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
疎水性基を有する前記化合物が、極性置換基を含む環の一部により、正電荷の窒素原子と直接連結している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の工程を含む、式(I-II)の生体活性カチオン性両親媒質の調製方法。
(a)対応する脂肪族疎水性第２級アミンを得る為に、塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、適切な飽和または不飽和脂肪好性脂肪族ブロマイドと、飽和または不飽和脂肪好性脂肪族アルキルアミンとをカップリングする工程、
(b)極性非プロトン性溶媒中で、追加の極性官能基性を含む脂肪族アルコールの末端第１級アルコール基を適切な保護基で保護する工程、
(c)第4級(quaternized)親媒質化合物を得る為、有機塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、工程(b)で得られた前記第１級ヒドロキシルで保護された脂肪族極性中間体と、工程(a)で得られた前記第２級アミンとを反応させる工程、
(d)必要な前記カチオン性親媒質を得る為、工程(c)で得られた前記第4級(quaternized)両親媒化合物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーに通し、極性有機溶媒の混合物で溶離する工程。
【請求項１３】
前記脂肪族飽和アルキルブロマイドが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１４】
前記脂肪族飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１５】
使用される前記脂肪族不飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１６】
工程(c)の置換された第１級ヒドロキシル基が、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノまたは第１級アミノからなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシルまたはアミノである、請求項１２に記載の工程。
【請求項１７】
前記アミノ基が、t-boc、f-mocまたはその他のいずれかの適切な保護試薬で保護されている、請求項１２に記載の工程。
【請求項１８】
反応が行われる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、トリエチルアミンを含む群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１９】
前記反応が、無機アルカリ金属炭酸塩から選択される弱塩基存在下において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２０】
前記第１級アルコール保護基が、トシルクロライド、メシルクロライドから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２１】
工程(a)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２２】
工程(a)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２３】
工程(b)の末端第１級ヒドロキシル基の保護が、-10℃から50℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２４】
第１級アルコールが、エリトリトールまたはその同族体から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２５】
工程(c)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２６】
工程(c)で用いられる前記有機塩基が、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジンから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２７】
工程(c)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２８】
工程(d)で用いられる前記アニオン交換樹脂が、交換に有利なクロライドまたはブロマイドイオンを有する樹脂から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２９】
工程(d)において前記極性溶出液の成分として用いられる前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項３０】
生物学的活性分子の細胞内伝達の為の製薬組成物であり、少なくともカチオン性親媒質、生体活性分子、補脂質(colipid)および任意の添加物を含む組成物。
【請求項３１】
以下の構造式を有する、生物活性分子の前記細胞内伝達を促進する為に用いる生体活性カチオン性親媒質である、請求項３０に記載の製薬組成物。
【化３】
2005532278.tif 000011
ただし、
R1およびR2は、R1およびR2が同時に水素原子であると定義される可能性を除き、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは、1、2または3、Xは、無機または有機アニオンである。
【請求項３２】
前記生物活性分子が、治療上重要なタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする、リボソームRNA、DNAまたはRNAのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムDNAのポリヌクレオチド、cDNAまたはmRNAからなる群から選択される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３３】
前記核酸が、環状、鎖状プラスミドまたはRNAである、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３４】
前記補脂質が、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールからなる群から選択される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３５】
カチオン性親媒質および補脂質の好ましい範囲が、1：0-1：2.5の比である、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３６】
投与される前記組成物が、in vitro系の50000個の細胞について0.1-0.5 μgの範囲の実質的な量のDNAを含む、請求項３２に記載の製薬組成物。
【請求項３７】
前記組成物を、静脈内、筋肉内および腹腔内（intraperitonially）に投与することができる、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３８】
前記添加物が、生理学的に許容できる添加物から選択される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３９】
前記添加物が、前記組成物（formulation）の安定化および生物活性分子の効果的な伝達に用いられる、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル（docetaxel）および5-フルオロウラシルから選択される、脂肪好性治療抗がん剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、アシクロビアから選択されるウイルス製剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、アンフォテリシンBから選択される抗生物質に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、感染症の第1部位である肺に伝達する為の抗インフルエンザ剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４４】
生物学的活性分子の細胞内伝達の為の使用であり、下記式で表される少なくとも一つの生物活性化合物を被検体に投与する工程を含む使用。
【化４】
2005532278.tif 000012
ただし、
R1およびR2が同時に水素原子であると定義されることを除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは、1、2、3または4、Xは、無機または有機アニオンである。
【請求項４５】
前記被検体が、ヒトおよびネズミ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジを含むその他の種または非ヒト霊長類から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記使用が、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患の治療に用いられる、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
前記組成物を、静脈内、筋肉内および腹腔内（intraperitonially）に投与することができる、請求項４４に記載の使用。
【請求項４８】
細胞毒性が、最低限であり、前記細胞生存度が80%以上である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４９】
前記使用が、前記被検体における遺伝子治療適用のためのセルラインを構築するために使用される、請求項４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状頭基を含む新しいカチオン性両親媒質に関する。本発明はまた、生物学的活性治療分子を、哺乳類の体細胞/組織中への伝達に有用な、前記カチオン性両親媒質を含む製薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の遺伝子の疾患に関係する多くの欠陥のある遺伝子が、特定され、特徴付けられているにもかかわらず、細胞膜の選択的浸透性が原因で、目的体細胞へ治療上重要な遺伝子を必要量伝達することは、しばしば困難な挑戦となる。
【０００３】
従って、遺伝子疾患の治療における遺伝子治療のアプローチの成功は、主に、患者の特定体細胞への治療遺伝子の前記細胞内伝達を促進する、効果的で安全な遺伝子伝達試薬の開発に依存する。従って、体細胞への機能遺伝子の侵入を促進できる、安全で効果的な遺伝子伝達試薬および方法の開発は、医学的な意味が大きい。
【０００４】
分子構造内に極性と非極性との両方の部位を含む両親媒分子は、治療上重要な分子を細胞へ伝達するために使用される。これは、生物学上の細胞膜における極性と非極性との両方の部分の存在を与えられる理にかなっている。カチオン性両親媒質は、多くの生物学的活性治療化合物の細胞内伝達を高めるために最も広く用いられる両親媒化合物の中でも特に重要な種である。全般的に言うと、生理学的なpHにおいて、前記カチオン性両親媒質の前記極性部位は、DNA、RNA、タンパク質等のポリアニオン性巨大分子を含む前記治療上重要な分子と相互作用し、一方で、前記カチオン性両親媒質の非極性部分は、前記細胞膜の非極性部分を通して、前記治療化合物の通過を促進する。
【０００５】
下記の参考文献は、治療上重要な分子の前記細胞内伝達を高めるために有用な従来技術である、カチオン性両親媒質の例である。前記分子構造に加え、これらの先行技術は、担体特性の助けになると信じられている、前記カチオン性両親媒質の性質の有用な情報および議論を含む。
【０００６】
フェルグナー等(Felgner et al.), Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 84, 7413-7417 (1987)(非特許文献1)は、前記DNAトランスフェクションベクターとしての高効率的なカチオン性液体、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド(DOTMA)の最初の使用を報告している。
【０００７】
米国特許第4,897,355号(特許文献1)および第4,946,787号(1990)(特許文献2)は、前記N-[.オメガ..(.オメガ.-1)-ジアルキルオキシ]-とN-[..オメガ..(.オメガ.-1)-ジアルケニルオキシ]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstitutedアンモニウム両親媒物質との合成および使用、並びに効率的なトランスフェクションベクターとしてのそれらの製薬製剤を報告している。
【０００８】
レベンチスおよびシルビウス(Leventis, R.and  Silvius), J.R Biochim. Biophys. Acta. 1023, 124 -132, (1990)(非特許文献2)は、新しい代謝できるカチオン性両親媒質を含む脂質分散液と前記哺乳動物細胞との相互作用を報告している。
【０００９】
米国特許第5,264,618号(1993)(特許文献3)は、生物学的活性分子の細胞内伝達のための高効率的なカチオン性脂質の更なるシリーズの合成および使用を報告している。
【００１０】
フェルグナー等(Felgner et al.) J.Biol.Chem. 269, 2550-2561 (1994)(非特許文献3)は、カチオン性脂質製剤の新しいシリーズでの高められた遺伝子伝達および機械論的な研究を報告している。
【００１１】
米国特許第5,283,185号(1994)(特許文献4)は、クロラムフェニコールアセチル転移酵素の遺伝子を運ぶプラスミドを、培養された哺乳類細胞へ伝達する、"DC-Chol"と言われる3([N-(N1,N1-ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロールの合成および使用を報告している。
【００１２】
米国特許第5,283,185号(1994)(特許文献4)は、遺伝子伝達に最も広く用いられるカチオン性脂質の一つである、N-[2-[[2,5-ビス[(3-アミノプロピル)アミノ]-1-オキソペンチル]アミノエチル]-N,N-ジメチル-2,3-ビス-(9-オクタデケニロキシ)-1-プロパナミニウム テトラ(トリフルオロアセテート)の使用を報告している。このカチオン性脂質を含む前記製薬製剤は、"リポフェクタミン(Lipofectamine)"という商品名で商業的に売られている。
【００１３】
ソロディン等(Solodin et al.) Biochemistry 34,13537-13544, (1995)(非特許文献4)は、in vitroおよびin vivo遺伝子伝達の為の両親媒性イミダゾリニウム化合物の新しいシリーズを報告している。
【００１４】
ウィーラー等(Wheeler et al.) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A 93, 11454-11459, (1996)(非特許文献5)は、マウスの肺中でプラスミドDNA伝達および発現を非常に高める、新しいカチオン性脂質を報告している。
【００１５】
米国特許第5,527,928号(1996)(特許文献5)は、N,N,N,N-テトラメチル-N,N-ビス(ヒドロキシエチル)-2,3-ジ(oleolyoxy)-1,4-ブタンジアンモニウムアイオダイド、すなわち、トランスフェクションベクターとしての製薬製剤の合成および使用を報告している。
【００１６】
米国特許第5.698,721号(1997)(特許文献6)は、マクロ分子の細胞内伝達の為の、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンのようなジアシルホスフェイト化合物のアルキルO-ホスフェイトエステルの合成および使用を報告している。
【００１７】
米国特許第5,661,018号(特許文献7)、第5,686,620号(特許文献8)および第5,688,958号(1997)(特許文献9)は、核酸のリポフェクションに有効な、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質のホスホトリエステル誘導体を含むカチオン性リン脂質の新しい種を開示している。
【００１８】
米国特許第5,614,503号(1997)(特許文献10)は、核酸と結合できるカチオン性ポリアミン頭基および細胞膜と結合できるコレステロール脂質尾を有する、本質的に無毒で、生物分解性であるカチオン性化合物を含む、細胞への核酸伝達の為の、両親媒性輸送体の合成および使用を報告している。
【００１９】
米国特許第5,705,693号(1998)(特許文献11)は、原核生物または真核生物の細胞への核酸またはペプチドのトランスフェクトに有用である、新しいカチオン性脂質およびそれらの合成における中間体の調製および使用方法を開示している。これらの脂質は、脂質部分と連結した、１または２つがアルギニン、リシンまたはオルニチン残基、もしくはそれらの誘導体で置換されたものを含む。
【００２０】
米国特許第5,719,131号(1998)(特許文献12)は、細胞への遺伝子の輸送を促進する、カチオン性両親媒質の新しいシリーズの合成を報告している。前記両親媒物質は、ステロイド、モノまたはジアルキルアミン、アルキルアミン、ポリアルキルアミンから誘導される脂肪好性基を含む。
【００２１】
米国特許第5,527,928号(1996) (特許文献13)は、新しいカチオン性脂質、すなわち、N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2,3-ジ(oleoyloxy)-1,4-ブタンアンモニウムアイオダイドの合成およびトランスフェクションバイオロジーを報告している。
【００２２】
他の刊行物
非特許文献６〜非特許文献２６参照。
【特許文献１】米国特許第4,897,355号
【特許文献２】米国特許第4,946,787号
【特許文献３】米国特許第5,264,618号
【特許文献４】米国特許第5,283,185号
【特許文献５】米国特許第5,527,928号
【特許文献６】米国特許第5.698,721号
【特許文献７】米国特許第5,661,018号
【特許文献８】米国特許第5,686,620号
【特許文献９】米国特許第5,688,958号
【特許文献１０】米国特許第5,614,503号
【特許文献１１】米国特許第5,705,693号
【特許文献１２】米国特許第5,719,131号
【特許文献１３】米国特許第5,527,928号
【非特許文献１】フェルグナー等(Felgner et al.), Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 84, 7413-7417 (1987)
【非特許文献２】レベンチスおよびシルビウス(Leventis, R.and  Silvius), J.R Biochim. Biophys. Acta. 1023, 124 -132, (1990)
【非特許文献３】フェルグナー等(Felgner et al.) J.Biol.Chem. 269, 2550-2561 (1994)
【非特許文献４】ソロディン等(Solodin et al.) Biochemistry 34,13537-13544, (1995)
【非特許文献５】ウィーラー等(Wheeler et al.) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A 93, 11454-11459, (1996)
【非特許文献６】Behr, J.P., Demeneix, B., Loeffler, J.P. and Perex-Mutul, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 124-132.
【非特許文献７】Levantis, R., and Silvius, J.R.  Biochim. Biophys. Acta., 1990, 1023, 124-132.
【非特許文献８】Gao, X. and Huang, L. Biochim. Biophys. Res. Commun., 1991, 179, 280-285.
【非特許文献９】Akao, T., Nakayama, T., Takeshia, K. and Ito, A., Biochem. Mol. Biol. Int., 1994, 34, 915-920.
【非特許文献１０】Felgner, J. H.; Kumar, R.; Sridhar, C. N.; Wheeler, C. J.; Tsai, Y-J.; Border,  R.;
【非特許文献１１】Ramsey, P.; Martin, M.; Felgner, P. L.  J. Biol. Chem., 1994, 269, 2550-2561.
【非特許文献１２】Wheeler, C.J.; Felgner, P.L.; Tsai, Y.J.; Marshall, J.; Sukhu, L.; Doh, S.G.; Hartikka, J.; Nietupski, J.; Manthorpe. M.; Nichols, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93, 11454-11459.
【非特許文献１３】Bennett, M. J.; Aberle, A. M.; Balasubramaniam, R. P.; Malone, J. G.; Malone, R.W.; Nantz, M. H.  J. Med. Chem. 1997, 40, 4069-4078.
【非特許文献１４】Blessing, T.; Remy, J.-S.; Behr, J.-P.;  J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 8519-8520.
【非特許文献１５】Wang, J.; Guo, X.; Xu, Y.; Barron, L.; Szoka, F.C., J. Med. Chem, 1998, 41, 2207- 2215
【非特許文献１６】Lim, Y.; Choi, Y. H.; Park, J. J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 5633-5639.
【非特許文献１７】Lim, Y.; Kim, C.; Kim, K.; Kim, S. W.; Park, J. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 6524-6525.
【非特許文献１８】Zhu, J.;  Munn, R. J.; Nantz, M. H. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 2645-2646.
【非特許文献１９】Vandenburg, Y. R.; Smith, B. D.; Perez-Payan, N.; Davis, A. P.; J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 3252-3253.
【非特許文献２０】Lynn, D. M.; Langer, R.; J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 10761-10768.
【非特許文献２１】Ferrari, M. E.; Rusalov, D.; Enas, J.; Wheeler, C. J.; Nuc. Acid. Res. 2001, 29, 1539-1548.
【非特許文献２２】Banerjee, R.; Das, P. K.; Srilakshmi, G.V.; Chaudhuri, A.; Rao, N. M.  J. Med.  Chem.1999, 42, 4292-4299.
【非特許文献２３】Banerjee, R.; Mahidhar, Y. V.; Chaudhuri, A.; Gopal, V.; Rao, N. M. J. Med. Chem. 2001, 44, 4176-4185.
【非特許文献２４】Singh, S. R.; Mukherjee, K.; Banerjee, R.; Chaudhuri, A.; Hait, S. K.; Moulik, S. P.;  Ramadas, Y.; Vijayalakshmi, A.; Rao, N. M. Chem. Eur. J. (in press).
【非特許文献２５】Floch, V.; Bolc'h, G. Le.; Gable-Guillaume, C.; Bris, N. Le.; Yaouanc, J-J.; Abbayes,  H. Des.; Fe'rec, C.; Cle'ment, J-C.  Eur. J. Med. Chem., 1998, 33, 923-934.
【非特許文献２６】Solodin, I.; Brown, C.; Bruno, M.; Chow, C.; Jang, E-H.; Debs, R.; Heath, T.  Biochemistry, 1995, 34, 13537-13544.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的
本発明の主な目的は、極性環状頭基を含む新しいカチオン性両親媒化合物を提供することである。
【００２４】
本発明の更なる目的は、治療上効果的な量の生物学的活性分子の哺乳類細胞/組織への伝達に有用な、新しいカチオン性両親媒化合物を提供することである。
【００２５】
本発明の更なる目的は、疎水性基が、２つのヒドロキシル基を含む環状の中にある正電荷の窒素原子と直接連結している、カチオン性両親媒化合物を提供することである。
【００２６】
本発明の更なる目的は、その構造の中にグリセロール骨格をもたない、新しいカチオン性両親媒化合物を提供することである。
【００２７】
本発明の更なる目的は、一つまたはそれ以上の本発明のカチオン性両親媒化合物を含む、新しい治療製剤を提供することである。
【００２８】
本発明の更なる目的は、遺伝子治療および生物学的活性分子の哺乳類細胞/組織への伝達に有用な、治療上の製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
発明の概要
本発明は、生物学的活性(治療上の)分子の前記細胞内伝達を促進する、新しいカチオン性両親媒化合物に関する。本発明はまた、生物学的活性治療分子の体細胞への伝達に有用であるカチオン性両親媒質を含む製薬組成物に関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の前記新しいカチオン性脂質は、特に非ウイルス性遺伝子治療により遺伝子の疾患を治療するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、一般式(I)により表されるような、生物活性カチオン性親媒質を提供する。
【００３２】
【化１】
2005532278.tif 000003
ただし、R1およびR2は、同時に水素原子であると定義される可能性を除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは1、2または3、Xは無機または有機アニオンである。
本発明はまた、一般式(II)により表されるような、生物活性カチオン性親媒質を提供する。
【００３３】
【化２】
2005532278.tif 000004
ただし、R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、または以下に示すような組み合わせである。
n=1
R1=R2=CH3-(CH2)10CH2-、CH3-(CH2)12CH2-、CH3-(CH2)14CH2-、CH3-(CH2)16CH2-および/またはCH3-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH2
R3=R4=ヒドロキシル基。
【００３４】
本発明の実施形態において、Xは、ハロゲン原子、トシル基およびアセタート基から選択される。
【００３５】
さらに本発明の他の実施形態において、R1は水素であり、R2はC8-22の飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基である。
【００３６】
さらに本発明の他の実施形態において、R1はC8-22飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基であり、R2は水素原子またはC8-22の飽和アルキル基または１から３の二重不飽和度を有する不飽和アルキル基である。
【００３７】
さらに本発明の他の実施形態において、R3およびR4は、それぞれ水素、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアミノまたは第１級アミンから選択される基による組み合わせのいずれかを表す。
【００３８】
さらに本発明の他の実施形態において、ヒドロキシアルキルおよび第１級アミンは、1-5の炭素原子からなる。
【００３９】
さらに本発明の他の実施形態において、それぞれ、R1は水素原子を表し、R2は飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子により表される。
【００４０】
さらに本発明の他の実施形態において、それぞれ、R1は飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表し、R2は水素原子を表す。
【００４１】
さらに本発明の他の実施形態において、R1およびR2は共に、飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表す。
【００４２】
さらに本発明の他の実施形態において、疎水性基を有する前記化合物は、極性置換基を含む環の一部により、正電荷の窒素原子と直接連結している。
【００４３】
本発明はまた、生物学的活性分子の細胞内伝達の為の製薬組成物を提供し、前記組成物は、少なくともカチオン性親媒質、生物活性分子、補脂質(colipid)および任意の添加物を含む。
【００４４】
本発明の他の実施形態において、次の構造式を有する、生物活性分子の前記細胞内伝達を促進する為に用いる生物活性カチオン性親媒質である製薬組成物である。
【００４５】
【化３】
2005532278.tif 000005
ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義される可能性を除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは1、2または3、Xは無機または有機アニオンである。
【００４６】
さらに本発明の他の実施形態において、製薬組成物は、前記生物活性分子が、治療上重要なタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをコードする、リボソームRNA、DNAまたはRNAのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムのDNAのポリヌクレオチド、cDNAまたはmRNAからなる群から選択される。
【００４７】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記核酸が、環状、鎖状プラスミドまたはRNAである。
【００４８】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記補脂質が、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールからなる群から選択される。
【００４９】
さらに本発明の他の実施形態は、請求項１０による製薬組成物において、カチオン性親媒質および補脂質の好ましい範囲が、1：0−1：2.5の比である。
【００５０】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、投与される前記組成物が、in vitro系の50000個の細胞について0.1-0.5μgの範囲の実質的なDNAの量を含む。
【００５１】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記組成物が、静脈内、筋肉内および腹腔内（intraperitonially）に投与されることができる。
【００５２】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記添加物が、生理学的に許容できる添加物から選択される。
【００５３】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記添加物が、前記製剤を安定化させることおよび生物活性分子の効果的な伝達に用いられる。
【００５４】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記組組成物が、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル(docetaxel)および5-フルオロウラシルから選択される、脂肪好性治療上の抗がん剤に処方される。
【００５５】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記組成物が、アシクロビアから選択されるウイルス製剤に処方される。
【００５６】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記組成物が、アンフォテリシンBから選択される抗生物質に処方される。
【００５７】
さらに本発明の他の実施形態は、製薬組成物において、前記組成物が、感染症の第1部位である肺に伝達する為の抗インフルエンザ剤に処方される。
【００５８】
本発明はまた、以下の工程を含む、式(I-II)の生物活性カチオン性両親媒質の調製の為の方法を提供する。
(a)対応する脂肪族疎水性第２級アミンを得る為に、塩基存在下における極性非プロトン性溶媒中で、適切な飽和または不飽和脂肪好性脂肪族ブロマイドと、飽和または不飽和脂肪好性脂肪族アルキルアミンとをカップリングする工程、
(b)極性非プロトン性溶媒中で、追加の極性官能基性を含む脂肪族アルコールの末端第１級アルコール基を適切な保護基で保護する工程、
(c)第4級(quaternized)親媒質化合物を得る為、有機塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、工程(b)で得られた前記第１級ヒドロキシルで保護された脂肪族極性中間体と、工程(a)で得られた前記第２級アミンとを反応させる工程、
(d)必要な前記カチオン性親媒質を得る為に、工程(c)で得られた前記第4級(quaternized)両親媒化合物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーに通し、極性有機溶媒の混合物で溶離する工程。
【００５９】
本発明の他の実施形態は、工程において、前記脂肪族飽和アルキルブロマイドが、10-30炭素原子からなる群から選択される。
【００６０】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、前記脂肪族飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される。
【００６１】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(c)の前記置換された第１級ヒドロキシル基が、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノまたは第１級アミノおよび最も好ましくはヒドロキシルまたはアミノからなる群から選択される。
【００６２】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、前記アミノ基が、t-boc、f-mocまたはその他のいずれかの適切な保護試薬で保護されている。
【００６３】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、用いられる前記脂肪族不飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される。
【００６４】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、反応が行われる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、トリエチルアミンを含む群から選択される。
【００６５】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、前記反応が、無機アルカリ金属炭酸塩から選択される弱塩基存在下において行われる。
【００６６】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、前記第１級アルコール保護基が、トシルクロライド、メシルクロライドなどから選択される。
【００６７】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(a)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどから選択される。
【００６８】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(a)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる。
【００６９】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、前記工程(b)の末端第１級ヒドロキシル基の保護が、-10℃から50℃の間の温度において行われる。
【００７０】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、第１級アルコールが、エリトリトールまたはその同族体から選択される。
【００７１】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(c)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどから選択される。
【００７２】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(c)で用いられる前記有機塩基が、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジンから選択される。
【００７３】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(c)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる。
【００７４】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(d)で用いられる前記アニオン交換樹脂が、交換に有利なクロライドまたはブロマイドイオンを有する樹脂から選択される。
【００７５】
さらに本発明の他の実施形態は、工程において、工程(d)で前記極性溶出液の成分として用いられる前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルから選択される。
【００７６】
本発明はさらに、生物学的活性分子の細胞内伝達の為の使用を提供する。前記使用は、以下の構造式により表される少なくとも一つの生物学的活性化合物の被検体への投与を含む。
【００７７】
【化４】
2005532278.tif 000006
ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義されることを除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは1、2、3または4、Xは無機または有機アニオンである。
【００７８】
本発明の他の実施形態は、使用において、前記被検体が、ヒトおよびネズミ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジを含むその他の種または非ヒト霊長類から選択される。
【００７９】
さらに本発明の他の実施形態は、使用において、前記使用が、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患の治療に用いられる。
【００８０】
さらに本発明の他の実施形態は、使用において、前記組成物を、静脈内、筋肉内および腹腔内（intraperitonially）に投与することができる。
【００８１】
さらに本発明の他の実施形態は、使用において、細胞毒性が、最低限であり、前記細胞生存度が80%である。
【００８２】
さらに本発明の他の実施形態は、前記使用が、前記被検体における遺伝子治療適用のためのセルラインを構築するのに使用される。
【００８３】
本発明を、さらに、好ましい実施形態により説明している。
【００８４】
本発明で開示された前記カチオン性両親媒質に共通の特有の新しい構造的特長は、以下の内容を含む。
(１)前記正電荷の窒素原子と直接連結している疎水性基の存在;
(２)前記正電荷の窒素原子は、前記環状頭基の一部である;および
(３)ここで開示されているカチオン性脂質は、遺伝子を細胞へ伝達するために使用する、他の多くの商業的に利用できるグリセロール骨格をベースとするカチオン性両親媒質と異なり、それらの分子構造にグリセロール骨格を有していない。これらの独特の構造的特長は、ここで開示される前記カチオン性両親媒質の遺伝子伝達能力の増加に非常に寄与すると考えられている。
【００８５】
本発明の実施によると、前記正電荷を意味する“カチオン性”は、第4級(quaternized)窒素上および／または前記環状頭基のプロトン化置換基上のいずれかである。本両親媒物質の前記カチオン特性は、核酸のような生物学的活性分子とおよび／または形質膜糖タンパク質のような細胞成分との前記両親媒物質の相互作用の増進に寄与する。前記カチオン性両親媒質と治療上活性な生物学マクロ分子および／または細胞膜成分との間のそのような相互作用の増進は、前記治療分子を前記細胞へうまく輸送することにおいて鍵となる役割を果たす。
【００８６】
本発明のカチオン性脂質は、水溶液中で脂質複合体または凝集体の形成を促進する、脂肪好性領域を有する。前記疎水性領域の前記脂肪好性および前記極性頭基領域の前記親水性は、前記カチオン性脂質が水溶液と面している時、第二の化合物存在下または非存在下で、脂質凝集体が形成されるようなものである。模範的な脂肪好性R1およびR2基は、(1)飽和C8-C22アルキル基、および(2)１〜３の不飽和度含有の不飽和C8-C22アルキル基を含む。
【００８７】
本開示のカチオン性脂質の好ましい実施形態の一つは、n=1、R1およびR2は、共にC8-C22飽和アルキル基から選択され、R3およびR4は、ともにそれぞれ水素、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノまたは第１級アミンから選択される置換基の組み合わせのいずれかで表され、X-は、クロライドまたはブロマイドイオンから選択される。
【００８８】
前記カチオン性脂質の合成
表1は、５員環状頭基を含む本発明の前記カチオン性脂質の調製(共通の構造式(Ｉ)においてn=1)に用いられる合成ストラテジーの概要である。同様の合成スキームが、７および９員環状頭基カチオン性脂質の合成に用いられる(共通の構造式(Ｉ)においてそれぞれn=2および3)。
【００８９】
【表１】
2005532278.tif 000007
前記出発アルコールの両方の前記第１級ヒドロキシル基は、最初に、塩基としてピリジン存在下、p-トルエンスルホニルクロライドとの反応によって、トシル誘導体に変換される。生じるジ-トシル誘導体(表1における中間体ＩＩ)は、トシレイト対イオンを含む本カチオン性脂質の類似体、前記カチオン性親媒質(III)を形成する為に、N．N-ジメチルホルムアミドのような極性非プロトン性溶媒中で、適切な第２級アミンとの反応を受ける。前記中間体IIIとのクロライドイオン交換樹脂の最後の処理は、本発明の前記標的カチオン性親媒質(I)を生じる。表１に示すように、前記環状頭基に２つのヒドロキシル官能基性を持つカチオン性脂質を合成する為に、前記出発物質の第２級ヒドロキシル基の保護は必要ない。しかし、前記環状頭基に２つのアミノ官能基性を持つカチオン性脂質の合成する為に、表１の実行は、前記出発物質の両方の第１級アミノ基の保護および後の脱保護工程が必要である。
【００９０】
製剤
本発明は、また、ここで開示される前記カチオン性両親媒化合物、生物学的活性な分子および補脂質を治療上効果的な量含んでいる新しい治療製剤を提供する。一つまたはそれ以上の追加の生理学的に適切な物質は、前記製剤の貯蔵を安定させるため、または前記生物学的活性分子の細胞内伝達をうまく促進するための本発明の製薬製剤に含まれる。本発明の前記実施による補脂質は、一つまたはそれ以上のカチオン性両親媒質と混合するのに有用である。コレステロールは、前記生物学的活性分子の細胞内伝達をうまく促進するための前記カチオン性脂質との組み合わせに用いる優秀な補脂質である。カチオン性親媒質と補脂質のモル比の好ましい範囲は、1:0〜1:2.5である。前記範囲をかなり広い範囲に変更することは技術の範囲内である。
【００９１】
本発明の前記カチオン性両親媒化合物を用いて、治療上の量を細胞内に投与できる生物学的活性分子は、治療上重要なタンパク質をエンコードする、リボソームRNA、RNAまたはDNAのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムのDNAのポリヌクレオチド、cDNAもしくはmRNAを含む。前記例示の一つまたはそれ以上が、前記生物学的活性分子が細胞/組織へ入ることを促進するための組み合わせに用いられるので、本発明の前記カチオン性両親媒質を混合できる。
【００９２】
本発明によると、前記両親媒物質は、純粋な形態か、他の脂質またはコレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール等のようなヘルパー脂質との組み合わせかのいずれかに用いられる。前記治療製剤は、0℃-4℃で前記生物学的活性治療分子と複合されるまで貯蔵できる。バクテリアの成長を妨げ、貯蔵寿命を増加する作用物質は、例えば、低濃度のグリセロールのような、調製を安定化させる試薬と一緒に含まれる。冷凍および解凍のサイクルは、前記製剤の能力の低下を引き起こすことが特に警告される。
【００９３】
本発明は、また、生物学的活性分子の細胞内伝達を促進する様々な製剤を提供する。
【００９４】
本発明は、また、カチオン性両親媒質の製剤を提供し、核酸は、筋肉中および腹腔内(intraperitonial)のような他のルートに加えて静脈内に投与される。さらに、両親媒物質の前記製剤は、in vitro系において50000個の細胞に対するDNAの比が0.1-0.5マイクログラムで細胞へ投与される。前記親媒質の量は、一つのヌクレオチド塩基の負電荷に対する一つの親媒質分子の正電荷がを考慮すれば、脂質とDNAとの間で、電荷比0.1から10に変動できる。
【００９５】
前記使用したプラスミドは、米国のGibco BRL Life Technologies(cat no.10586-014)によって提供される、リポーター遺伝子β-ガラクトシダーゼに連結しているCyto Megaloウイルスプロモーターの構成物である。前記プラスミドは、いかなる構造でもあってもよく、与えられる前記例は、単に前記両親媒製剤の能力を示す為である。プラスミドの類似した例は、PromegaのPGL-2、PGL-3およびその他を含む。
【００９６】
本発明は、さらに、下記工程を含む前記製剤の調製方法を提供する。すなわち、本発明に開示されたカチオン性親媒質の分散液を調製する工程、前記分散液を生物学的活性分子と接触させ、前記両親媒物質と前記分子との複合体を形成するする工程、および細胞を前記複合体と接触させ、それにより前記生物学的活性分子の前記細胞への移動を促進する工程。
【００９７】
本発明によって開示された前記両親媒物質の細胞毒性
ここに開示された、様々なカチオン性両親媒質存在下における前記細胞の生存能力が、"動物細胞培養、2nd Edition. Ed. I. R. L. Press, Oxford University Press (1977)"で説明されている一般的なプロトコルによって検査された。前記カチオン性脂質のトランスフェクション能力は、0-10nmolの範囲において研究され、この制限内で、前記細胞細胞毒性は最小限度に観測され、前記細胞生存能力は80%以上であると決定された。前記カチオン性両親媒質は、前記中性補脂質としてコレステロールを用いて、脂質とDNAのモル比を変化させて使用した。
【００９８】
応用
本発明の前記工程は、極性環状頭基を備えるカチオン性トランスフェクション脂質の調製に利用できる。本発明の脂質は、ポリアニオン、ポリペプチドまたはヌクレオポリマーを細胞へ伝達するのに有用である。ここで開示される前記カチオン性脂質は、工業的または治療上の使用において、発現ベクターを細胞へ伝達する為に使用できる。前記発現ベクターは、公知の使用によるワクチンまたはその他の免疫調節(immunomodulatory)効果ためのホスト中での免疫応答を生じることができる、治療上有用なタンパク質を細胞へ伝達するため、または治療上有用なタンパク質分子をコードする核酸を伝達するための遺伝子治療プロトコルに用いられる。前記ベクター−形質転換細胞は、治療タンパク質または酵素(例えばエリトロポイエチン)、成長因子(例えばヒト成長ホルモン、G-CSFまたはインターロイキン)またはその他のタンパク質を製造する為のセルラインのような、商業的に有用なセルラインの製造に用いることができる。
【００９９】
本発明の脂質-核酸複合体は、ヒトまたはネズミ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジまたは非ヒト霊長類を含むその他の種のような被検体への遺伝子治療に適用する為のセルラインの構築に使用できる。本発明の脂質は、血清存在下で使用でき、従って、ポリアニオンをin vitroまたは動物in vivoにおいて血清を含む組織培養培地で細胞へ伝達する。
【０１００】
本発明のヌクレオポリマーと複合した脂質は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞へ伝達することによって、細胞中の遺伝子発現のアンチセンス阻害に使用できる。特定遺伝子の発現を妨げられる細胞は、工業的および治療上の応用に有用である。模範的な工業的使用は、治療上のまたは診断上の応用の為、タンパク質の生成の増加(すなわち、前記プロテアーゼによって引き起こされる目的タンパク質分解の減少)の為の細胞内でのプロテアーゼ合成を抑制することを含む。模範的な治療上の応用は、被検体へ移植された後または前記細胞がin vivoで感染されたとき、拒絶を減少するため、および／または前記細胞の寛容を誘導する為の細胞表面抗原(MHCクラスII遺伝子のような組織適合性抗原等)の合成を抑制することを含む。
【０１０１】
本発明の脂質は、本発明の脂質および治療剤を含む複合体を得る為に、ドキソルビシン、脂肪好性化合物のような抗がん剤を含む、アニオン性、両親媒イオン性および脂肪好性の治療作用物質と処方することができる。本発明の脂質は、抗ウイルス性剤との脂質複合体を得る為に、HPMPC(9-(3-ヒドロキシ-2-ホスホニルメトキシ)プロピル)シトシン)、PMEA(9-(2-ホスホニルメトキシ)エチル)アデニン)、PMEG PMEA(9-(2-ホスホニルメトキシ)エチル)グアニン)、PMPA(9-(2-ホスホニルメトキシ)プロピル)アデニン)、AZT、3TC、およびそれらの誘導体のような公知の抗ウイルス性剤と処方することができる。本発明の脂質は、アンフォテリシンBのようなポリエン抗生物質と処方することができる。そのような製剤は、前記治療剤をin vitroまたはin vivoの細胞の細胞質へ伝達するのに有用である。発明のカチオン性脂質および抗インフルエンザ剤からなる複合体は、前記抗ウイルス性剤を、感染の第１部位である肺へ伝達するのに使用できる。これらの複合体は、治療剤を含む脂質複合体を調製する為の、公知または後に発展するいかなる技術によっも調製できる。
【０１０２】
実施例
以下の実施例は、本発明の例示の方法によって与えられている。従って、本発明の範囲を制限して解釈すべきでない。本発明によって開示された例示のカチオン性両親媒質1-5の合成手順は、以下の実施例1-5で説明している。カチオン性脂質1-5の構造を、以下に示す。
【０１０３】
【化５】
2005532278.tif 000008
【実施例１】
【０１０４】
N,N-ジ-n-ドデシル-3,4-ジヒドロキシピロリジニウムクロライド(親媒質1)の合成
工程(a)  5gのn-ドデシルアミン(27mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.7gのn-ドデシルブロマイド(27mmol)および3.7gの炭酸カリウム(27mmol)を加えた。前記混合物を80℃で２４時間撹拌し続けた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第２級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-ドデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
【０１０５】
工程(b)  エリトリトール(4g、33.9mmol)を100mlの乾燥ピリジンに溶かし、トシルクロライド(11.6g,61mmol)、少量のDMAPの結晶を加えた。前記混合物を-5℃で１時間撹拌しつづけた。ピリジンをロータリー蒸発装置を用いて除去し、前記残渣を25-30%酢酸エチルを含むpet-エーテル(v/v)を用い、カラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。前記溶出液は、粗標記化合物7gを与えた。精製ジトシレイト中間体(4g、収率27.4%)が、前記粗生成物のクロロホルム:pet-エーテル(4:6、25ml)からの最終的な再結晶によって得られた。
【０１０６】
工程(c)  トリエチルアミン40ml中で、前記精製ジトシレイト(0.5g、1.2mmol)と5等量の工程(a)の第２級アミン(2.0g、5.8mmol)とを、80℃で72時間反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を、60-120メッシュサイズシリカおよび溶出液としてクロロホルム中の10-15%メタノールを用いて行った。粗標記化合物No.1が、前記第4級(quaternized)塩をクロライドイオン交換樹脂の処理を繰り返す(3回)ことによって得られた。いずれも新しいAmberlyst A-26 クロライドイオン交換カラムおよび前記溶出液として約75mlのメタノールを用いた。最後に、精製第4級(quaternized)標的両親媒物質塩1(0.08g、収率14.5%)が、クロロホルム:pet-エーテル10ml3:7を用いる前記粗生成物の結晶化によって得られた。全ての単離された前記中間体は、それらの同定された構造と一致する分光学的データを得た。
【０１０７】
親媒質1の1H-NMR(200 MHz, CDCl3):(/ppm = 0.9 [6H, t, 2x-CH3]; 1.20-1.45 [36H, m, 18x- CH2]; 1.5-1.8 [4H, m, 2x- CH2]; 3.4-3.6 [8H, m, -N- CH2]; 4.05-4.2 [2H, m, - CH-OH]; 4.75-4.8 [1H, m, -CH-OH]; 5.5-5.6 [1H, m, -CH-OH]。
【実施例２】
【０１０８】
N,N-ジ-n-テトラデシル-3,4-ジヒドロキシピロリジニウムクロライド(親媒質No.2)の調製手順
工程(a)  5gのn-テトラデシルアミン(23.4mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.4gのn-テトラデシルブロマイド(23.4mmol)および3.2gの炭酸カリウム(23.4mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第２級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-テトラデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
【０１０９】
工程(b)  エリトリトール(4g、33.9mmol)を100mlの乾燥ピリジンに溶かし、トシルクロライド(11.6g,61mmol)、少量のDMAPの結晶を加えた。前記混合物を-5℃で１時間撹拌しつづけた。ピリジンをロータリー蒸発装置を用いて除去し、前記残渣を25-30%酢酸エチルを含むpet-エーテル(v/v)を用い、カラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。前記溶出液は、粗標記化合物7gを与えた。精製ジトシレイト中間体(4g、収率27.4%)が、前記粗生成物のクロロホルム:pet-エーテル(4:6、25ml)からの最終的な再結晶によって得られた。
【０１１０】
工程(c)  トリエチルアミン40ml中で、前記精製ジトシレイト(0.5g、1.2mmol)と5等量の工程(a)の第２級アミン(2.4g、5.8mmol)とを、80℃で72時間反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を、60-120メッシュサイズシリカおよび溶出液としてクロロホルム中の10-15%メタノールを用いて行った。粗標記化合物No.1が、前記第4級(quaternized)塩をクロライドイオン交換樹脂の処理を繰り返す(3回)ことによって得られた。いずれも新しいAmberlyst A-26 クロライドイオン交換カラムおよび前記溶出液として約75mlのメタノールを用いた。最後に精製第4級(quaternized)標的両親媒物質塩2(0.06g、収率9.7％)が、クロロホルム:pet-エーテル10ml3:7を用いる前記粗生成物の結晶化によって得られた。全ての単離された前記中間体は、それらの同定された構造と一致する分光学的データを得た。
【０１１１】
親媒質2の1H-NMR(200MHz,CDCl3):(/ppm = 0.9 [6H, t, 2x- CH3]; 1.20-1.45 [48H, m, 24x- CH2]; 3.4-3.75 [8H, m, 4xN- CH2]; 4.05-4.20 [2H, m, 2x- CH-OH]; 4.75-4.80 [1H, m, -CH-OH]; 5.5-5.6 [1H, m, -CH-OH]。
【実施例３】
【０１１２】
N,N-ジ-n-ヘキサデシル-3,4-ジヒドロキシピロリジニウムクロライド(親媒質No.3)の調製手順
工程(a)  5gのn-ヘキサデシルアミン(20.7mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.3gのn-ヘキサデシルブロマイド(20.7mmol)および2.9gの炭酸カリウム(20.7mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、前記クロロホルム層を過剰の無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過を行った。クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第２級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-ヘキサデシルアミン(3.4g、収率35%)を与えた。
【０１１３】
工程(b)  エリトリトール(4g、33.9mmol)を100mlの乾燥ピリジンに溶かし、トシルクロライド(11.6g,61mmol)、少量のDMAPの結晶を加えた。前記混合物を-5℃で１時間撹拌しつづけた。ピリジンをロータリー蒸発装置を用いて除去し、前記残渣を25-30%酢酸エチルを含むpet-エーテル(v/v)を用い、カラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。前記溶出液は、粗標記化合物7gを与えた。精製ジトシレイト中間体(4g、収率27.4%)が、前記粗生成物のクロロホルム:pet-エーテル(4:6、25ml)からの最終的な再結晶によって得られた。
【０１１４】
工程(c)  トリエチルアミン40ml中で、前記精製ジトシレイト(0.5g、1.2mmol)と5等量の工程(a)の第２級アミン(2.7g、5.8mmol)とを、80℃で72時間反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を、60-120メッシュサイズシリカおよび溶出液としてクロロホルム中の10-15%メタノールを用いて行った。粗標記化合物No.1が、前記第4級(quaternized)塩をクロライドイオン交換樹脂の処理を繰り返す(3回)ことによって得られた。いずれも新しいAmberlyst A-26 クロライドイオン交換カラムおよび前記溶出液として約75mlのメタノールを用いた。最後に、精製第4級(quaternized)標的両親媒物質塩3(0.13g、収率17.3％)が、クロロホルム:pet-エーテル10ml3:7を用いる前記粗生成物の結晶化によって得られた。全ての単離された前記中間体は、それらの同定された構造と一致する分光学的データを得た。
【０１１５】
親媒質3の1H-NMR(200MHz、CDCl3):(/ppm =0.90 [6H, t, 2x-CH3]; 1.20-1.80 [56H, m, 28x- CH2]; 3.40-3.75 [8H, m4x-N- CH2]; 4.05-4.20 [2H, m, 2x- CH-OH]; 4.75-4.80 [1H, m, -CH- OH]; 5.5-5.6 [1H, m, -CH-OH]。
【実施例４】
【０１１６】
N,N-ジ-n-オクタデシル-3,4-ジヒドロキシピロリジニウムクロライド(親媒質No.4)の調製手順
工程(a)  5gのn-オクタデシルアミン(18.5mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.2gのn-オクタデシルブロマイド(18.5mmol)および2.6gの炭酸カリウム(18.5mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第２級アミン中間体、すなわち、N,N-ジ-n-オクタデシルアミン(3.6g、収率37%)を与えた。
【０１１７】
工程(b)  エリトリトール(4g、33.9mmol)を100mlの乾燥ピリジンに溶かし、トシルクロライド(11.6g,61mmol)、少量のDMAPの結晶を加えた。前記混合物を-5℃で１時間撹拌しつづけた。ピリジンをロータリー蒸発装置を用いて除去し、前記残渣を25-30%酢酸エチルを含むpet-エーテル(v/v)を用い、カラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。前記溶出液は、粗標記化合物7gを与えた。精製ジトシレイト中間体(4g、収率27.4%)が、前記粗生成物のクロロホルム:pet-エーテル(4:6、25ml)からの最終的な再結晶によって得られた。
【０１１８】
工程(c)  トリエチルアミン40ml中で、前記精製ジトシレイト(0.5g、1.2mmol)と5等量の工程(a)の第２級アミン(3.0g、5.8mmol)とを、80℃で72時間反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を、60-120メッシュサイズシリカおよび溶出液としてクロロホルム中の10-15%メタノールを用いて行った。粗標記化合物No.4が、前記第4級(quaternized)塩をクロライドイオン交換樹脂の処理を繰り返す(3回)ことによって得られた。いずれも新しいAmberlyst A-26 クロライドイオン交換カラムおよび前記溶出液として約75mlのメタノールを用いた。最後に、精製第4級(quaternized)標的両親媒物質塩4(0.08g、収率10.7％)が、クロロホルム:pet-エーテル10ml3:7を用いる前記粗生成物の結晶化によって得られた。全ての単離された前記中間体は、それらの同定された構造と一致する分光学的データを得た。
【０１１９】
親媒質4の1H-NMR(200MHz、CDCl3):(/ppm = 0.90 [6H, 5, 2x- CH3]; 1.20-1.45 [64H, m, 32x- CH2]; 3.40-3.75 [8H, m, 4x-N- CH2]; 4.05-4.20 [2H, m, 2x- CH-OH]; 4.75-4.8 [1H, m, -CH- OH]; 5.5-5.6 [1H, m, -CH-OH]。
【実施例５】
【０１２０】
N-n-オクタデシル-N-オレイル-3,4ジヒドロキシピロリジニウムクロライド(親媒質No.5)の調製手順
工程(a)  5gのn-オレイルアミン(18.7mmol)を10mlのDMSOに溶かし、6.2gのn-オクタデシルブロマイド(18.7mmol)および2.6gの炭酸カリウム(18.7mmol)を加えた。前記混合物は、80℃で24時間撹拌しつづけた。前記反応混合物をクロロホルム100ml中に入れ、水で洗浄し(2x150ml)、クロロホルムをロータリー蒸発装置を用いて前記ろ液から除去し、クロロホルム中に1-2%のメタノールを含む溶媒を用いて前記残渣のカラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。溶出液から前記所望の第２級アミン中間体、すなわち、N-n-オクタデシル-N-オレイルアミン(2.7g、収率27.8%)を与えた。
【０１２１】
工程(b)  エリトリトール(4g、33.9mmol)を100mlの乾燥ピリジンに溶かし、トシルクロライド(11.6g,61mmol)、少量のDMAPの結晶を加えた。前記混合物を-5℃で１時間撹拌しつづけた。ピリジンをロータリー蒸発装置を用いて除去し、前記残渣を25-30%酢酸エチルを含むpet-エーテル(v/v)を用い、カラムクロマトグラフィー精製(60-120メッシュサイズシリカを用いて)を行った。前記溶出液は、粗標記化合物7gを与えた。精製ジトシレイト中間体(4g、収率27.4%)が、前記粗生成物のクロロホルム:pet-エーテル(4:6、25ml)からの最終的な再結晶によって得られた。
【０１２２】
工程(c)  トリエチルアミン40ml中で、前記精製ジトシレイト(0.5g、1.2mmol)と4等量の工程(a)の第２級アミン(2.4g、4.7mmol)とを、80℃で72時間反応させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー精製を、60-120メッシュサイズシリカおよび溶出液としてクロロホルム中の10-15%メタノールを用いて行った。粗標記化合物No.4が、前記第4級(quaternized)塩をクロライドイオン交換樹脂の処理を繰り返す(3回)ことによって得られた。いずれも新しいAmberlyst A-26 クロライドイオン交換カラムおよび前記溶出液として約75mlのメタノールを用いた。最後に、精製第4級(quaternized)標的両親媒物質塩5(0.05g、収率7.1％)が、クロロホルム:pet-エーテル10ml3:7を用いる前記粗生成物の結晶化によって得られた。全ての単離された前記中間体は、それらの同定された構造と一致する分光学的データを得た。
【０１２３】
親媒質5の1H-NMR(200MHz、CDCl3):(/ppm = 0.90 [6H, t, x2- CH3]; 1.20-1.45 [56H, m, 28x- CH2]; 1.90-2.00 [4H, m, 2x-CH=CH-CH2]; 3.40-3.75 [8H, m, 4x-N- CH2]; 4.05-4.20 [2H, m, -CH-OH]; 4.75-4.80 [1H, m, -CH-OH]; 5.20-5.40 [1H, m, -CH-OH]。
【実施例６】
【０１２４】
細胞トランスフェクション
COS-1細胞は、前記トランスフェクションの１８時間前に、96-ウェルプレートに15,000細胞/ウェルの濃度でシードされた。0.15μgのプラスミドDNAを、13μlの平らなDMEM培地において、30分間、様々な量の脂質(0.05-4.3ナノモル)と結合させた。前記電荷比は、前記脂質のこの範囲を超えて、0.1：1から9：1(+/-)へと変化させた。前記複合体は、平らなDMEMで100μlに希釈され、および前記ウェルに加えられた。培養から3時間後、10%FCS含有の100μlのDMEMを前記細胞に加えた。前記培地は、24時間後に10%完全培地へ移され、前記レポーター遺伝子活性が、48時間後に測定された。前記細胞を、PBSで2度洗浄し、50μlの溶解緩衝液(0.25M Tris.HCl、pH8.0および0.5% NP40)で溶解させた。注意すべき点は、完全な溶解を確実に行うことである。ウェルごとの前記β-ガラクトシダーゼ活性は、50μlの2X基質溶液(1.33mg/mlのONPG、0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.15および2mM塩化マグネシウム)を96-ウェルプレート中の前記溶解物へ加えることにより測定された。405nmの吸収が、純粋な市販のβ-ガラクトシダーゼ酵素によって作成された検量線を用いて、β-ガラクトシダーゼユニットに変換された。
【０１２５】
同日に分析された同型プレートにおける前記β-ガラクトシダーゼユニットの値は、30%以下に変化した。報告された前記トランスフェクション能力の値は、同日に分析された４つの同型トランスフェクションプレートからの平均値であった。いずれのトランスフェクション実験も、異なる３日間で３回繰り返され、同様に処理された同型トランスフェクションプレートの平均トランスフェクション能力値の日々の変化は、2-3倍であり、前記細胞密度および前記細胞の条件に依存した。図１は、カチオン性脂質1-5から得られたトランスフェクションの結果を例示している。図１が示すように、in vitroにおけるカチオン性脂質2のトランスフェクション能力は、in vitroにおける遺伝子伝達に使用される商業的に最も広く用いられる有効なカチオン性トランスフェクション脂質の一つであるDMRIEのものと同様またはより良いものであった。
【実施例７】
【０１２６】
脂質:DNA相互作用分析
インターカレーション-起因性蛍光増加およびDNAと結合するカチオン性脂質との競合は、カチオン性脂質-DNA相互作用の研究を行う優れたツールであるエチジウムブロマイド(EtBr)を用いた。前記例示の本発明のカチオン性脂質の脂質:DNA相互作用を評価する為に、我々は、カチオン性脂質1-5の量を増加させてEtBr:pCMV β-gal複合体を滴定した。
【０１２７】
前記DNAと結合しているEtBrの範囲は、前記蛍光の変化によってモニターされた。EtBr蛍光は、518nmの励起波長および585nmの発光波長にセットしたHitachi4500蛍光計でモニターした。１mlのTE緩衝剤(pH8.0)と0.78nmolのDNAと2.5 nmolのEtBrとが加えられた。前記蛍光の変化は、少量の脂質1-5を前記EtBr:DNA複合体へ加えた後にモニターした。任意の蛍光値は、平衡になるための十分な時間を経た後に記録された。EtBrまたは脂質をDNAへ添加する順序は、平衡が添加の順序に依存せず、数分以内に達することを示す、最終的な値を変化させなかった。蛍光の割合は、脂質がない場合の蛍光値を100とみなして計算した。
【０１２８】
図２のデータは、脂質1、4および5が、DNAからエチジウムブロマイドを取り除く能力が比較的低いことより、DNAと不十分にしか相互作用しないことを示している。脂質2および3は、脂質:DNA比が1.25程度に至るまで、平等にDNAと相互作用する(図2)。3:1の電荷比での前記EtBr蛍光の減少は、脂質1-5の全てにおいて80%以上であった。図1に示される前記トランスフェクションの結果および図2に示される脂質:DNA相互作用のグラフを共に解釈すると、ここで述べられているカチオン性脂質の強い脂質:DNA 相互作用は、より細胞内の遺伝子伝達を生じると思われる。
【実施例８】
【０１２９】
毒性分析
MTTに基づいた生存能力分析は、以前説明されているCOS-1細胞を用いて(Banerjee, R. et al. 1999)、様々な脂質:DNA電荷比における前記脂質1-5の細胞毒性を評価する為に行われた。脂質1を除き、他の全ての脂質(2-5)について、9:1の脂質:DNA電荷比においてでさえ、わずかな細胞毒性を示した(図3)。3:1の電荷比での脂質1、4および5については、毒性を処理された細胞の15-25%に変化させた。前記脂質2(短いアルキル鎖を有する)の毒性は、おそらく洗浄のような細胞-溶解活性から起こる。図３で示されるように、前記本発明の脂質2-5の細胞毒性のグラフは、リポフェクチン(lipofectin)、リポフェクタミン(lipofectamine)およびDMRIEを含むいくつかの商業的に利用できるカチオン性トランスフェクション脂質のものよりも優れている。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
有利な点
１  本発明の新しいカチオン性脂質は、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患を治療するのに特に有用である。
２  本発明のカチオン性両親媒質は、分子構造中にグリセロール骨格を有しない。
３  前記カチオン性両親媒質は、ポリアニオン、ポリペプチドおよびヌクレオポリマーを細胞へ伝達するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、本発明において開示された前記カチオン性両親媒質1-5および最も広く商業的に有効に用いられるトランスフェクション脂質の一つであるDMRIEについて、一定の条件下におけるin vitroでの遺伝子伝達能力の要約である。
【図２】図２は、本発明において開示されたカチオン性両親媒質1-5について、脂質:DNA相互作用のいくつかの例を示している。
【図３】図３は、本発明において開示された前記カチオン性両親媒質1-5のin vitroにおける細胞毒性のデータを提供している。
【図１】
2005532278.tif 000013
【図２】
2005532278.tif 000014
【図３】
2005532278.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月13日(2004.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)で表される、生物活性カチオン性親媒質。
【化１】
2005532278.tif 000016
ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義される可能性を除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、ｎは1、2または3、Xは無機または有機アニオンである。
【請求項２】
一般式(II)により表される、生物活性カチオン性親媒質。
【化２】
2005532278.tif 000017
ただし、R1、R2、R3およびR4はそれぞれ、または以下に示すような組み合わせである。
n=1
R1=R2=CH3-(CH2)10CH2-、CH3-(CH2)12CH2-、CH3-(CH2)14CH2-、CH3-(CH2)16CH2-および/またはCH3-(CH2)7-CH=CH(CH2)7CH2
R3=R4=ヒドロキシル基。
【請求項３】
Xが、ハロゲン原子、トシル基およびアセタート基から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
R1が水素であり、R2がC8-22の飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
R1がC8-22飽和アルキル基または１から３の不飽和度を有する不飽和アルキル基であり、R2が水素原子またはC8-22の飽和アルキル基または１から３の二重不飽和度を有する不飽和アルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
R3およびR4が、それぞれ水素、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキルおよびアミノまたは第１級アミンから選択される基による組み合わせのいずれかを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ヒドロキシアルキルおよび第１級アミンが、1-5の炭素原子からなる、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
それぞれ、R1が水素原子を表し、R2が飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子により表される、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
それぞれ、R1が飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表し、R2が水素原子を表す、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
R1およびR2が共に、飽和アルキルまたは１から３の二重結合を有する不飽和アルキル鎖から選択されるC8-22炭素原子を表す、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
疎水性基を有する前記化合物が、極性置換基を含む環の一部により、正電荷の窒素原子と直接連結している、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
以下の工程を含む、式(I-II)の生体活性カチオン性両親媒質の調製方法。
(a)対応する脂肪族疎水性第２級アミンを得る為に、塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、適切な飽和または不飽和脂肪好性脂肪族ブロマイドと、飽和または不飽和脂肪好性脂肪族アルキルアミンとをカップリングする工程、
(b)極性非プロトン性溶媒中で、追加の極性官能基性を含む脂肪族アルコールの末端第１級アルコール基を適切な保護基で保護する工程、
(c)第4級(quaternized)親媒質化合物を得る為、有機塩基存在下、極性非プロトン性溶媒中で、工程(b)で得られた前記第１級ヒドロキシルで保護された脂肪族極性中間体と、工程(a)で得られた前記第２級アミンとを反応させる工程、
(d)必要な前記カチオン性親媒質を得る為、工程(c)で得られた前記第4級(quaternized)両親媒化合物をアニオン交換カラムクロマトグラフィーに通し、極性有機溶媒の混合物で溶離する工程。
【請求項１３】
前記脂肪族飽和アルキルブロマイドが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１４】
前記脂肪族飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１５】
使用される前記脂肪族不飽和アルキルアミンが、10-30炭素原子からなる群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１６】
工程(c)の置換された第１級ヒドロキシル基が、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、アミノまたは第１級アミノからなる群から選択され、最も好ましくはヒドロキシルまたはアミノである、請求項１２に記載の工程。
【請求項１７】
前記アミノ基が、t-boc、f-mocまたはその他のいずれかの適切な保護試薬で保護されている、請求項１２に記載の工程。
【請求項１８】
反応が行われる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、トリエチルアミンを含む群から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項１９】
前記反応が、無機アルカリ金属炭酸塩から選択される弱塩基存在下において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２０】
前記第１級アルコール保護基が、トシルクロライド、メシルクロライドから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２１】
工程(a)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２２】
工程(a)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２３】
工程(b)の末端第１級ヒドロキシル基の保護が、-10℃から50℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２４】
第１級アルコールが、エリトリトールまたはその同族体から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２５】
工程(c)で用いられる前記極性非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフランから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２６】
工程(c)で用いられる前記有機塩基が、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジンから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２７】
工程(c)の前記反応が、50℃から100℃の間の温度において行われる、請求項１２に記載の工程。
【請求項２８】
工程(d)で用いられる前記アニオン交換樹脂が、交換に有利なクロライドまたはブロマイドイオンを有する樹脂から選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項２９】
工程(d)において前記極性溶出液の成分として用いられる前記有機溶媒が、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルから選択される、請求項１２に記載の工程。
【請求項３０】
少なくとも以下に示すカチオン性親媒質、生体に影響する分子、補脂質(colipid)および任意の添加物を含む、生物学的に活性な分子の細胞内伝達の為の製薬組成物。
以下の構造式を有する、生物活性分子の前記細胞内伝達を促進する為に用いる生物活性カチオン性親媒質:
【化３】
2005532278.tif 000018
（ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義される可能性を除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは1、2または3、Xは無機または有機アニオンである。）
治療上重要なタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチドおよびペプチドをエンコードする、リボソームRNA、DNAまたはRNAのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムのDNAのポリヌクレオチド、cDNAまたはmRNAからなる群から選択される、前記生物活性分子：
コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールからなる群から選択される、前記補脂質。
【請求項３１】
前記核酸が、環状、鎖状プラスミドまたはRNAである、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３２】
カチオン性親媒質および補脂質の好ましい範囲が、1：0−1：2.5の比である、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３３】
投与される前記組成物が、in vitro系の50000個の細胞について0.1-0.5 μgの範囲の実質的な量のDNAを含む、請求項３２に記載の製薬組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、静脈内、筋肉内および腹腔内(intraperitonially)に投与できる、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３５】
前記添加物が、生理学的に許容できる添加物から選択される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３６】
前記添加物が、前記組成物の安定化および生物活性分子の効果的な伝達に用いられる、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３７】
前記組成物がドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル(docetaxel)および5-フルオロウラシルから選択される、脂肪好性治療抗がん剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、アシクロビアから選択されるウイルス製剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項３９】
前記組成物が、アンフォテリシンBから選択される抗生物質に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、感染症の第１部位である肺に伝達する為の抗インフルエンザ剤に処方される、請求項３０に記載の製薬組成物。
【請求項４１】
生物学的に活性な分子の細胞内伝達の為の使用であり、下記式で表される少なくとも一つの生物活性化合物を被検体に投与する工程を含む使用。
【化４】
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ただし、R1およびR2が同時に水素原子であると定義されることを除き、R1およびR2は、それぞれ水素原子または脂肪好性部を表し、R3およびR4は、それぞれ水素または極性基を表し、nは1、2、3または4、Xは無機または有機アニオンである。
【請求項４２】
前記被検体が、ヒトおよびネズミ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジを含むその他の種または非ヒト霊長類から選択される、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記使用が、非ウイルス遺伝子治療により遺伝子の疾患の治療に用いられる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４４】
前記組成物が、静脈内、筋肉内および腹腔内(intraperitonially)に投与することができる、請求項４１に記載の使用。
【請求項４５】
細胞毒性が、最低限であり、前記細胞生存度が80%以上である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
前記使用が、前記被検体の遺伝子治療適用のためのセルラインを構築するために使用される、請求項４１に記載の使用。
【国際調査報告】
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