(57)【要約】本発明は、トランスジェニック動物においてAD病状を誘導することができるアルツハイマー病(AD)由来tauタンパク質をコードするヒトDNA配列を保有するトランスジェニック非ヒト動物および非ヒト哺乳類体および胚細胞を提供する。アルツハイマーtauタンパク質は神経変性と関連し、AD発現の危険因子と考えられる高血圧、糖尿病、高コレステロール血症を含む種々のヒトの疾患をシミュレーションすることができる特定の遺伝的背景に発現する。本発明のトランスジェニック動物および細胞は神経原繊維的病状を示し、タウオパシーおよびADの治療および予防物質ならびに診断用マーカーおよびプローブをスクリーニングおよび開発するためのin vivoおよびin vitroアッセイ系としても用いることができよう。さらに、これらトランスジェニック動物およびそれ由来の細胞系は高血圧のような他の疾患および神経変性の過程と関連する危険因子を示す他の疾患の組み合わせの結果である神経変性性疾患、好ましくはタウオパシーおよびADのin vivoおよびin vitroアッセイ系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NおよびC末端トランケートtau分子をコードするDNA分子を含むDNA構築物であって、
-該分子がGene-Bankの寄託番号NM 173727で示される4反復配列および3反復配列tauタンパク質をコードする完全長tau cDNA配列の開始コドン下流の少なくとも30ヌクレオチドおよび終止コドン上流の少なくとも30ヌクレオチドがそれぞれトランケートされており、
-最小トランケートtauコアがヌクレオチド nr 744-930(配列番号9；tauタンパク質アイソフォーム43に従って番号付け)によりコードされるタンパク質断片を含む、
-動物の脳細胞に発現すると神経原繊維的(NF)病状を生じる活性を有するタンパク質をコードする該DNA構築物。
【請求項２】
胚および/または体細胞が請求項1記載のDNA構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
胚および体細胞が該請求項1記載のDNA構築物を一時的または安定に発現し、脳のNF病状を示す非ヒト動物。
【請求項４】
好ましくはラットである、該DNA分子によりコードされる該タンパク質が脳に発現する請求項2または3記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
請求項1記載のトランスジェニックトランケートtauに特異的なオリゴヌクレオチドを用いる請求項2〜4のいずれかに記載のトランスジェニック動物の遺伝子型別方法。
【請求項６】
NF病状を発現し、ADに関連する危険因子を生じさせる遺伝子背景を有することによりヒトの疾患モデルである請求項4記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
ADの危険因子として高血圧を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
ADの危険因子として糖尿病を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
ADの危険因子として高コレステロール血症を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
−請求項2〜4および6〜9のいずれかに記載の動物の神経原繊維病状の変化を検出し、該動物の神経行動学的変化を測定し、該動物の認知スコアを測定することによる物質の評価、
−タウオパシー、好ましくはADを治療および予防するための物質の検証系、
−タウオパシー、好ましくはADを検出するための診断マーカーおよびプローブを開発するための検証系、
−高血圧、糖尿病、脂質代謝異常、および高コレステロール血症をタウオパシー、好ましくはADと組み合わせて治療するための物質の検証系を含む
アルツハイマー病を治療、予防、および診断するための物質のスクリーニングアッセイ系および検証系。
【請求項１１】
タウオパシーおよび関連神経変性プロセス、好ましくはADにおける新規薬剤標的を同定するための請求項10記載の実験モデル系。
【請求項１２】
物質の有効性または療法、具体的には神経原繊維的病状を減少させる療法を試験するためのin vivoアッセイとして請求項2〜4および6〜9のいずれかに記載の動物の使用。
【請求項１３】
該物質または療法が神経変性性疾患、具体的にはタウオパシー、好ましくはAD、および神経原繊維的病状に伴う他の神経変性性疾患のためのものである請求項12記載の使用。
【請求項１４】
請求項1記載の構築物で形質転換するかまたは請求項2〜4および6〜9のいずれかに記載のトランスジェニック動物由来の細胞系。
【請求項１５】
該細胞系がトランスジェニックラット胚由来のラット細胞系であることを特徴とする請求項14記載の細胞系。
【請求項１６】
アルツハイマー病の治療的予防用および診断用化合物およびマーカーを発見するためのスクリーニングおよび検証手段として用いる請求項14または15に記載の細胞系を含むin vitroアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
神経変性性疾患は中年から高齢期にかけて発症する重症で進行性の認知および運動障害を生じる異質な遺伝性および後天性神経学的疾患群を表す(1)。痴呆の最も一般的な原因はアルツハイマー病である。該症例の5%以下にアルツハイマー病の遺伝因子が関与しており、残りの症例は散発性である。
【０００２】
tauタンパク質は中枢神経系に発現し、細胞内微小管ネットワークを安定させることによりニューロンの構造に重要な役割を演じるタンパク質である。トランケーション、過剰リン酸化、または6つの天然のtau(タウ)アイソフォームのバランスを妨げることによるtauタンパク質の生理学的役割の不全は神経原繊維変化(もつれ)(NFT)、ジストロフィー性神経炎、およびニューロフィルスレッドを生じる。これらの構造はアルツハイマー病の超微細構造的特質を表す。これら構造の主なタンパク質サブユニットは微小管関連タンパク質tau(2、3)である。AD患者の病理解剖で見られるNFTの量は、知能の衰退を含む臨床症状と関連する。したがって、tauタンパク質はAD病状に重要な役割を果たす。17番染色体と結合したパーキンソニズムを伴う疾患の前頭側頭性痴呆を伴うtau遺伝子の特異的突然変異(FTDP-17)の同時分離(cosegregation)の最近の発見により、tauタンパク質のある種の異常が罹患個体における神経変性および痴呆の根本原因であり得ることが確認された(4、5)。しかしながら、ADの病因におけるtauタンパク質の役割の詳細に直接取り組む実験モデルはない。
【０００３】
ADの最近のトランスジェニックモデルは突然変異するかしていないFAD (APP、PS1、ApoE etc.)関連タンパク質の発現に基づいている。それは単一および多重遺伝子ヒト化動物を含む。しかしながら、いずれのモデルもADの両特質を再現せず、通常、神経原繊維的病状を示さず、そのいずれもADの発現における主要な役割を演じる環境的危険因子の機能の観察の可能性を含まない。
【０００４】
いくつかの神経原繊維的変化を示す現在利用可能な動物モデルは単に17番染色体と結合した前頭側頭性痴呆由来の突然変異tau(FTDP17)のトランスジェニック発現に基づいている。この群の典型例はJNPL3トランスジェニックマウスである(6)。突然変異tauの役割に関する別の証拠が最近GoedertおよびSpillantini(7)により報告されている。
【０００５】
別のトランスジェニック動物モデルにおいて、4反復配列tauタンパク質の過剰発現が観察された。脳および脊髄における顕著な軸索障害が報告され、4反復配列tauタンパク質アイソフォームの過剰発現がニューロンの生理機能を変化させるのに十分であることが示された。該モデルにおいて、ニューロフィラメントの蓄積を伴う軸索の拡張が中枢神経系のニューロンに見られたが、ニューロン内の神経原繊維変化は伴わなかった(8)。
【０００６】
tauの正常細胞機能およびその病因における役割を試験するためにもトランスジェニックマウスを作製した。該トランスジェニックマウスはゲノムtauトランス遺伝子およびtau cDNAトランス遺伝子を過剰発現する。2モデルの比較はtauの分布が両トランスジェニック系で同様であることを示す。後肢の異常に関連するTau免疫反応性軸索腫張が該cDNAマウスの脊髄にみられたが、神経病状はゲノミックマウスにはみられなかった(9)。
【０００７】
神経生理学における実験モデルとしてマウスに比べてラットが好都合であるにも関わらず、神経原繊維病状のtauトランスジェニックモデルが作製されなかったことは驚くべきことである。一般に、今までに作製された神経変性のトランスジェニックラットモデルの量はかなり低い。それらはいずれもADに典型的なtau病状を再現しない。
【０００８】
Czech Cら(12)はプレセニリン1(SP1)をコードする遺伝子の突然変異を含むトランスジェニックラットモデルについて記載している。PS1は初期発症家族性アルツハイマー病症例の大多数の原因であると考えられるが、公表されたモデルはAD関連病状の十分な徴候を示さなかった。Echeverria VおよびCuello AC. (13)はβアミロイドの細胞内蓄積の役割およびアルツハイマー病における細胞内アミロイド-βの蓄積の考えられる神経病理学的役割について記載している。海馬および皮質のニューロンにおけるA-β断片の細胞内蓄積の表現型を有するラットトランスジェニックモデルからの最近の観察結果を示しているがプラークおよびNFT形成は示していない。したがって、マウス同様にトランスジェニック研究において二番目に最も頻繁に使用されるラットに関して、トランケートtauタンパク質を発現することが科学論文に記載され、NFT形成を示したトランスジェニックラットはない。
【０００９】
今まで高血圧またはADに関連する糖尿病および異脂肪血症のような他の危険因子に関連するADの病因の観察に利用可能な実験モデルはない。実験的トランスジェニック動物の遺伝的背景は適切なトランスジェニックモデルの開発に役割を果たす。
【００１０】
ADにはある種の環境的危険因子が関連することがよく知られている。疫学的試験において、血管疾患および卒中の危険因子は認知機能障害およびアルツハイマー病と関連し、さらに脳血管疾患の存在がアルツハイマー病の臨床症状の存在および重症度を増大することが示された(14)。高血圧とADタイプの痴呆の別の関連がRotterdam Study(15)に示されている。
【００１１】
したがって、該疾患の主な病的特徴によく似たADの病因と関連した環境因子を同時に発現させるADの実験モデルの開発が重要である。
【００１２】
したがって、本発明の目的は可能な限りADの特性を反映した実験モデルおよびADの治療、予防、および診断のための物質のアッセイ系を提供することである。
【００１３】
本発明はトランスジェニック動物の脳内にアルツハイマーtauタンパク質をコードするcDNAを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。該動物は脳内にNF病的活性を生じる。さらに本発明は、学習および記憶を改善し、神経変性を阻害し、神経原繊維変化(NFT)の形成速度を減少させ、それを脳から除去する物質を同定する過程においてスクリーニングアッセイ系として用いることができるトランスジェニック動物に関する。該動物は神経変性性疾患、好ましくはタウオパシーおよびADの予防、治療および診断のための物質を同定するのに用いることができる。トランスジェニック動物はADの発現におけるAD関連危険因子の影響を検討するためにも用いることができる。動物の他の用途は薬剤標的同定方法にある。
【００１４】
本発明は該動物のアルツハイマー病に似た特異的トランス遺伝子により生じるAD変化を生じるトランスジェニック動物の操作を説明する。これは薬剤の発見および開発ならびに診断、およびin vivoにおける正常および病的tauタンパク質の役割の研究のための研究手段を提供する。
【００１５】
本発明はトランスジェニック動物の脳におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現によってのみ動物の脳にNF病的活性を生じさせることによる。ADの特質は本発明の別の利点であるADの病因に関連する危険因子を生じさせる傾向がある動物に生じる。
【００１６】
好ましい態様の説明に用いているすべての技術および科学用語は特記しないかぎり本発明の属する技術の分野で一般的に理解されているものと同じ意味である。好ましい方法、細胞培養の実験方法、分子遺伝学、生化学、および核酸化学および物質を本発明に記載しているが、同様または等価なあらゆる方法および物質を本発明の試験において用いることができる。組換え核酸製造、生化学分析、細胞培養、およびトランス遺伝子取り込み、例えばエレクトロポーレーション、リポフェクション、およびマイクロインジェクションのような手順については標準的技術を用いる。
【００１７】
用語「アルツハイマーtau」はもっぱらAD罹患脳に存在するものに対応する遺伝子操作されたtauタンパク質の特異的トランケートアイソフォーム群を表す。アルツハイマーtauは、該脳にそれ自身でまたは他の分子との組み合わせでNF活性を生じさせることができる。本明細書で用いている用語 アルツハイマーtauタンパク質はAD罹患ヒト脳組織に存在するトランケートtau型群を表す。
【００１８】
用語「トランス遺伝子」は本明細書では生動物内に移植するために細胞、特に哺乳動物細胞のゲノム内に人工的に挿入された遺伝子物質を示すのに用いる。特定の国ではこの目的からある種の対象、例えばヒト全能幹細胞またはEC Directive 98/44/ECの6条(1)および(2)に該当する該細胞をもたらす方法を具体的に除外する必要があるかもしれない。
【００１９】
「アルツハイマー病」(本明細書では「AD」と略す)は神経原繊維変化およびβアミロイドプラークの形成、および学習および記憶両方の機能障害に関連する病状を意味する。本明細書で用いている「AD」はADおよびAD型病状、すなわちADと同様の症状を伴う中枢神経系の疾患を含むことを意味する。
【００２０】
「神経原繊維的活性」(本明細書では「NF」活性と略す)はADと同様の症状を伴う中枢神経系における神経原繊維変化の形成に関連する病状を意味する。
【００２１】
「ADと同様の症状」および「AD関連事象」はAD関連構造、分子、または機能的事象、詳細には動物モデルで容易に評価できるような事象を意味する。そのような事象には限定されるものではないが神経原繊維的病状、学習および記憶欠損、および他のAD関連特性が含まれる。
【００２２】
「トランスジェニック動物」はその細胞の部分の染色体外エレメントとして存在するかまたはその生殖細胞(胚細胞)系DNA(すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列)中に安定に統合された非内因性(すなわちヘテロローガスな)核酸配列を有する非ヒト動物、通常哺乳動物(例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど)を意味する。ヘテロローガスな核酸は該トランスジェニック動物の生殖細胞系、例えば宿主動物の胚に遺伝子操作により導入される。
【００２３】
「構築物」は、哺乳動物細胞の特定のヌクレオチド配列を発現させるために作製されるか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に用いられる組織特異的または一般的プロモーターと機能性に連結した組換え核酸配列、一般的には組換えDNA配列を意味する。
【００２４】
本発明は以下の特徴により特徴づけられるトランスジェニック動物の作製に用いるDNA構築物の構造、配列、および製造方法を提供する。
【００２５】
DNA構築物はNおよびC末端トランケートtau分子をコードするcDNA分子を含み、ここで、
-該分子はGene-Bankの寄託番号NM 173727で示される4反復配列および3反復配列tauタンパク質をコードする完全長tau cDNA配列の開始コドン下流の少なくとも30ヌクレオチドおよび終止コドン上流の少なくとも30ヌクレオチドがそれぞれトランケートされており、
-最小トランケートtauコアはヌクレオチド744-930(配列番号9；tauタンパク質アイソフォーム43に従って番号付け)によりコードされるタンパク質断片を含み、
-該DNA構築物は動物の脳細胞に発現すると神経原繊維的(NF)病状を生じる活性を有するタンパク質をコードする。
【００２６】
このNF病状を生じる活性は例えば立体学的方法を用い選択した脳領域当たりの神経原繊維変化の総数により定量することができる。あるいはまた、神経行動学的試験を学習記憶に関する作業における認知スコアの信頼できる評価に用いることができる。
【００２７】
本発明の特に好ましいtau cDNA分子は、配列番号1〜14の群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。該配列を図1に示す。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、該cDNA分子は以下のヌクレオチド配列を含むNおよびC末端二重トランケートcDNA群を表す。
(4反復配列tau(tau 43)由来の誘導体をR4で示し、3反復配列tau (tau 43)由来の誘導体をR3で示す。) ここで用いた番号付けはGoedertら(24)に記載の完全長tau cDNAに由来する。
配列番号1(91-1059、R4)
【００２９】
【化１】
2005532802.tif 000002
配列番号2(205-999、R4)
【００３０】
【化２】
2005532802.tif 000003
配列番号3(277-999、R4)
【００３１】
【化３】
2005532802.tif 000004
配列番号4(205-1089、R4)
【００３２】
【化４】
2005532802.tif 000005
配列番号5(277-1089、R4)
【００３３】
【化５】
2005532802.tif 000006
配列番号6(715-999、R4)
【００３４】
【化６】
2005532802.tif 000007
配列番号7(709-999、R4)
【００３５】
【化７】
2005532802.tif 000008
配列番号8(715-954、R4)
【００３６】
【化８】
2005532802.tif 000009
配列番号9(741-930、R4)
【００３７】
【化９】
2005532802.tif 000010
配列番号10(91-966、R3)
【００３８】
【化１０】
2005532802.tif 000011
配列番号11(205-906、R3)
【００３９】
【化１１】
2005532802.tif 000012
配列番号12(277-906、R3)
【００４０】
【化１２】
2005532802.tif 000013
配列番号13(205-996、R3)
【００４１】
【化１３】
2005532802.tif 000014
配列番号14(277-996、R3)
【００４２】
【化１４】
2005532802.tif 000015
該トランケートtau配列は構築物を伝達する特定の宿主細胞により適合させることができよう。(コドン使用、コドン選択、相同体適合、差が存在する場合は1またはそれ以上のヒトコドンを宿主細胞コドンと交換する。)
【００４３】
該構築物の好ましい特徴：
上記cDNA配列は脳内でトランケートtauタンパク質を発現させるために調節配列と結合している。Thy-1遺伝子の修飾(25)はT細胞中の発現をもたらす調節配列が欠失し、トランケートcDNA配列がSpe-IおよびXho制限部位間に導入されるように行われた。修飾構築物は原核性配列が除去され、マイクロインジェクションにより雄前核中に導入された。あらゆる機能的プロモーターまたはプロモーターエンハンサー複合体を上記トランケートtau cDNAの発現に用いることができよう。
【００４４】
別の局面によれば本発明は以下の工程を特徴とする本発明の分子の製造および試験方法を提供する：
(a) 3または4反復配列taucDNA分子の少なくとも最初の30および最後の30ヌクレオチドにわたる欠失を有する二重トランケートtau分子のコーディング配列を保持する組換え原核性クローニングプラスミドの構築、
(b) トランケートtau分子の各DNA配列およびその組み合わせならびに脳での発現または遍在性発現のための適切なプロモーターを有する真核性発現プラスミドの構築、
(c) 該プラスミドを含む細菌の増殖および該プラスミドの増幅および質の高いその抽出、
(d) 該遺伝子構築物のCOS-7細胞へのトランスフェクション、およびwesternブロット技術を用いるその分析、
(e) すべての原核性配列が排除されるように該遺伝子構築物の単離および生成、およびマイクロインジェクションに適した濃度に緩衝液で希釈 (実施例1参照)、
(f) マイクロインジェクションのための遺伝子構築物の確認。
【００４５】
これは制限分析、遺伝子シーケンシング、および哺乳動物細胞内への一時的トランスフェクション後のタンパク質分析、次いでタンパク質の正しいサイズおよびその特異的モノクローナル抗体との反応性を評価した(実施例1、図2b参照)。
【００４６】
本発明は、胚および/または体細胞がアルツハイマーtauタンパク質をコードするDNA構築物を含む、アルツハイマー病の適切な動物モデルとして使用できるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００４７】
したがって本発明の目的はすべての胚および/または体細胞がヒトトランケートtau cDNA分子を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。クローン化ヒトアルツハイマーtau cDNA配列はプロモーター配列と結合し、組織特異性または遍在性にアルツハイマーtauの発現をもたらす。
【００４８】
本発明のトランスジェニック動物は、マイクロインジェクションのよく知られた通常の手順を用いてラットの1日齢受精胚の雄前核内に操作される。該トランス遺伝子をトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポーレーションおよびレトロウイルスの使用を含む当該分野で知られた他の方法によるかまたは他の方法によっても胚細胞中に導入することができる。次に、該トランス遺伝子を保有する胚を偽妊娠動物に移植することができる。
【００４９】
したがって、本発明の目的は新生動物の遺伝子型別法を提供することである。したがってトランス遺伝子の標的配列を増幅させる特異的オリゴヌクレオチドを用いるPCR分析をこの目的に使用する。遺伝子型別に用いるオリゴヌクレオチドをATGコドンおよびKozak配列を含むトランス遺伝子の転写開始部位を最終的にPCR生成物のDNAシーケンシングにより確認できるように設計した(プライマー対A)。さらに、1プライマーを異種プロモーターとアニールし、別のプライマーをアルツハイマーtauタンパク質をコードするヌクレオチド配列とアニールする。同様の設計基準を終止コドン(プライマー対B)に適用した。したがって該トランス遺伝子の統合をこのようにモニターすることができる。したがって診断用オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：
プライマー対A:
センス:5'-GTGGATCTCAAGCCCTCAAG-3'
アンチセンス:5'-GATCCCCTGATTTTGGAGGT-3'
PCR生成物の予想サイズは235ヌクレオチドである。
プライマー対B：
センス:5'-AAGGTGACCTCCAAGTGTGG-3'
アンチセンス:5'-GGTATGCATGGAGGGAGAAG-3'
PCR生成物の予想サイズは438ヌクレオチドである。
【００５０】
したがって、PCR断片の存在は該ゲノム中に統合されたトランス遺伝子を有する動物に特異的である(実施例2参照)。founder(ファウンダー)動物を用いて野生型動物と交配させ、トランス遺伝子について異型接合のF1世代の動物を作製することができる。さらなる態様において、これら異型接合動物を異種交配し、体および胚細胞がアルツハイマーtauタンパク質をコードする遺伝と同型接合的である生存可能なトランスジェニック胚を得ることができる。
【００５１】
本発明の別の目的は、胚および体細胞がアルツハイマーtauタンパク質をコードする該DNA構築物を一時的または安定に発現し、脳のNF病状を示す非ヒト動物を提供することである。本発明の好ましい動物は該DNA分子によりコードされたタンパク質が脳に発現するラットである。
【００５２】
本発明の最も好ましい態様は、該DNA分子によりコードされるアルツハイマーtauタンパク質が該動物の脳に発現するトランスジェニック非ヒト動物である。アルツハイマーtauの発現は実施例3に記載の数種のモノクローナル抗体により検出され、図3に示す。トランスジェニック系統の異なる脳領域における該タンパク質の発現を図4に示す。
【００５３】
したがって本発明はアルツハイマーtauタンパク質をコードするDNA分子が該動物のゲノムに安定に統合されるかまたは転写するために細胞核中に存在するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。該動物は以下の特徴により特徴づけられる：
-トランス遺伝子がメンデルの法則に従ってトランスジェニック系統を形成する動物の次世代に伝達される(実施例4参照)、
-遺伝したトランス遺伝子は実施例3、図4に示すようにfounder動物および子孫の脳中にトランケートタンパク質を発現する。
【００５４】
したがって本発明は中枢神経系(CNS)の神経原繊維的病状を示すトランスジェニック非ヒト動物を提供する。該動物は以下の特徴により特徴づけられる：
-トランケートtauタンパク質の発現は神経原繊維的病状の形成を促進する(実施例5)、
-PHF1免疫反応性NFTは内因性正常ラットtauがNFTの形成に関与することを示した(実施例5)、
-神経原繊維変化はCNSのニューロン中の細胞内封入体およびフィラメントとして現れ、ヒトAD罹患脳中のNFTとホモローガスである、
-免疫蛍光法は、ヒト脳組織に観察される前臨床アルツハイマー病において見られるものと同様の小ロッド様構造の存在を示した(実施例5参照)。
【００５５】
本発明の好ましい態様において、トランスジェニック動物は神経原繊維変化、ゴーストタングル(ghost tanglue)、およびギ酸感受性のニューロフィルスレッドのような神経病状を示す。神経原繊維変化はニューロン内フィラメントの異常蓄積からなる。該変化(もつれ)成分はアルツハイマーtauおよび正常tau分子からなる。該トランスジェニック動物はアルツハイマー病の研究、および治療、予防、および診断用物質の開発のための適切なモデル系として働く。
【００５６】
本発明はNF病状を発現し、AD関連危険因子を誘導する遺伝的背景を有し、ヒトの疾患モデルに相当するトランスジェニック動物を提供する。
【００５７】
したがって本発明は、DNA分子が自然高血圧動物のゲノムに安定に統合されるかまたは細胞核中に存在し特定の遺伝的背景内に転写される遺伝的背景があるトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００５８】
本発明の別の局面は遺伝的因子と以下の他のAD関連危険因子の組み合わせを含む動物モデルを提供することである：
-ADの最も一般的な危険因子である高血圧、
-食習慣により誘発されうる糖尿病(糖尿病はADの重要な危険因子である。)、
-食習慣により誘導されうる高コレステロール血症(ADの別の重要な危険因子)。
【００５９】
該病的状況は得られた動物モデルに容易に誘導することができる。適切な例は以前に文献に報告された(例えば26、27、28)。
【００６０】
さらに得られた動物モデルはSHRの遺伝的背景において神経原繊維的病状を発現する最初の動物モデルである。
【００６１】
別の局面によれば本発明はADの発現に関連する危険因子の役割を評価することができる散発性アルツハイマー病の実験モデルに相当する動物を提供する。危険因子は大部分のAD症例に重要な役割を演じるので、該モデルはAD神経変性の全例の90%に相当する散発性ADのモデルと考えることができよう。
別の好ましい態様において、本発明は
−該動物の神経原繊維病状の変化を検出し、該動物の神経行動学的変化を測定し、該動物の認知スコアを測定し、動物組織および体液中のAD特異的マーカーを生化学的に測定することによる物質の評価、
−タウオパシー、好ましくはADを治療および予防するための物質の検証系、
−タウオパシー、好ましくはADを検出するための診断マーカーおよびプローブの開発の検証系、
−高血圧、糖尿病、異脂肪血症および高コレステロール血症をタウオパシー、好ましくはADと組み合わせて治療するための物質の検証系を含む
アルツハイマー病を治療、予防、および診断するための物質のスクリーニングアッセイ系を提供する。
【００６２】
従って本発明は物質の効果または治療、具体的にはNFTを減少または抑制する療法を評価するin vivoアッセイを提供する。該動物は神経変性性疾患、具体的にはタウオパシー、好ましくはADおよび神経原繊維変化の形成を伴う他の神経変性性疾患のための物質または療法をスクリーニングするために用いることができる。
【００６３】
したがって本発明はアルツハイマー病の病因および治療の研究に有用なトランスジェニック動物、細胞、およびアッセイからなるモデル系を提供する。該アッセイは神経原繊維的病状の形成を阻害する物質および該物質の他の治療効果をスクリーニングするのにも有用である。
【００６４】
本発明のトランスジェニック動物およびそれ由来の動物細胞は標準的方法論を用いるアルツハイマー病の治療に潜在的に有効な化合物をスクリーニングするのに用いられる。該化合物は一定期間および種々の用量で動物に投与されるかまたは培養液に導入され、次いで該動物または動物細胞のそれぞれ組織病理学的変化およびアルツハイマーtau発現を試験する。さらに、トランスジェニック動物に対する神経行動学的試験を実施できることにより潜在的治療剤による治療後に認知機能をモニターすることが可能になる。化合物のスクリーニングはアルツハイマー病の予防、治療または診断のための特異的薬剤の選択をもたらす。スクリーニング方法の多くのバリエーションが当該分野で知られており、本発明の範囲内で適用してよい。
【００６５】
本発明のトランスジェニック動物モデルを用いて神経変性およびアルツハイマー病をもたらす事象の分子カスケードを明らかにし、治療標的を同定することもできよう。
【００６６】
本発明のさらに別の局面は、アルツハイマー診断およびマーカーの発見および開発のためのスクリーニングおよび検証手段として用いる本発明のトランスジェニック動物由来細胞系またはトランスジェニックラット胚由来細胞系に基づくin vitroアッセイを提供することである。該in vitroアッセイは該細胞系に基づき、抗アルツハイマー治療および予防薬の発見のためのスクリーニングおよび検証手段としても用いることができよう。
【００６７】
以下の実施例は例示のために示し、種々の他の態様が当業者に明らかであるので下記は本発明の範囲を限定するものではない。
(図面の簡単な説明)
【００６８】
図1：本発明のトランスジェニック動物の作製に用いた遺伝子発現構築物の操作に用いるアルツハイマーtauタンパク質 cDNAsのスキーム。
【００６９】
図2：トランスジェニック動物の作製に用いた遺伝子構築物の製造および検証。トランスジェニック動物の構築はアルツハイマーtauのコーディング配列を含むクローン化遺伝子構築物の前核マイクロインジェクションにより行った。遺伝子構築物をトランス遺伝子特異的プライマーを用いる制限分析およびPCR(パネルA、増幅PCRおよびDNA断片のアガロースゲル)ならびに潜在的突然変異を制御するためのDNAシーケンシングにより確認した。確認に次いで遺伝子構築物の精製 (パネルB、純粋なトランス遺伝子断片のアガロースゲル)、および哺乳動物細胞への一過性トランスフェクション (パネルC、タンパク質発現のWesternブロット確認)を行った。該アッセイが完結した後、該構築物の原核性配列を除去し、1日齢ラット胚に注射した。下のフローチャートはトランスジェニック動物作製方法を簡略的に示す。
【００７０】
図3：トランスジェニックfounder動物およびトランスジェニック動物のF1世代の遺伝子型別。パネル「A」は遺伝子型別実験のコントロールを示す(+C、陽性コントロール；NAC、非増幅コントロール；NTC、非鋳型コントロール)。パネル「B」はPCR遺伝子型別の結果を示す。試料番号12はトランス遺伝子陽性動物を表す。パネル「C」はfounder動物を確認するために行った繁殖実験を示す。さらに該パネルはメンデルの法則に従ってトランス遺伝子を次世代に伝達した本発明のトランスジェニック系統を示す。
【００７１】
図4：トランスジェニックラットの脳におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現。左パネルはWesternブロット分析を示し、右パネルはレーンあたりの用いたタンパク質の総量を示す。アルツハイマーtauタンパク質は35kDのサイズで移動し(レーン1、矢印)、汎tauモノクローナル抗体DC25により検出された。WesternブロットではECL技術を用い、特異シグナルを1分間曝露後に観察した。トランスジェニック動物の脳溶解物由来の7.5μgの総タンパク質抽出物をロードし(レーン1)、野生コントロール動物由来のタンパク質25μgをロードした。M、分子サイズマーカー。
【００７２】
図5：トランスジェニックラットの異なる脳領域におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現。トランスジェニックラット脳領域由来の総タンパク質溶解物のWesternブロット分析。レーン1、founder動物(FO世代)の完全脳溶解物-10μgタンパク質; レーン2、F2世代のトランスジェニック動物の総脳溶解物；レーン3-6、F2世代のトランスジェニック動物由来のタンパク質溶解物；3-海馬、4-皮質下領域、5-大脳皮質、6-脊髄、および骨髄；レーン7-8はF2世代のコントロール非トランスジェニック同腹子由来の脳溶解物を示す: 7-皮質、8-小脳(レーン2-8当たりの総タンパク質ロードは20ugであった)。
【００７３】
図6：トランスジェニック動物および非トランスジェニックコントロール野生型動物由来の脳切片の銀染色。細胞内封入帯および神経原繊維的フィラメントがトランスジェニックラットのCNSのニューロンに検出された(パネルBおよびC、トランスジェニック動物)。野生型ラットはホモローガスな脳領域にこれらの構造を示さない(A、野生型コントロール)。倍率：200x (AおよびB)、400 x (C)。
【００７４】
図7：トランスジェニック動物の中枢神経系における汎tauモノクローナル抗体DC25を用いる神経原繊維変化の検出。mAbDC25はAD患者のニューロン内のNFTを認識する。同等の構造がトランスジェニックラットの脳に認められる(パネルBおよびD)。野生型ラットにはホモローガスな脳領域にいかなる同様の構造もみられなかった(A、C)。倍率: lOOx (A、B)、200x (C、D)。
【００７５】
図8：トランスジェニック動物の中枢神経系における神経原繊維変化のモノクローナル抗体PHF1による検出。PHF-1はtauリン酸化の特異的マーカーである。この抗体による免疫反応性はアルツハイマーtauの発現がNFTの形成過程において内因性tauを必要とすることを示す。さらに、免疫蛍光染色は前臨床アルツハイマー病脳組織で観察された物と同様の小ロッド様構造を示す。倍率：100x (A)、200x (B)、1000x (C、D)
【００７６】
図9：治療の手掛かりおよび薬剤候補を特徴づけるためのスクリーニングアッセイ系としての神経細胞培養。トランスジェニックおよび非トランスジェニックラットニューロンの一次培養をin vitro培養後にこの目的に使用でき、ミトコンドリア輸送に対する薬剤候補の効果はビデオ顕微鏡法を用いて評価することができる。3日間in vitro培養後の生体染色色素(例えばMito-trek)で染色した皮質(Cx)および海馬(Hipp)ニューロンを示す(3DIV)。ミトコンドリア(MT)が可視化される。
【００７７】
図10：本発明のトランスジェニック動物に再現されるアルツハイマー病の組織病理学的特徴。示した神経原繊維病状はアルツハイマー病の主要な特質の一つである。図10はGallyas銀技術(A、C)および免疫組織化学(E)で検出されたAD罹患ヒト脳の神経原繊維変化と本発明のトランスジェニック動物に観察された同等の病的構造との比較を示す。免疫化学的染色はタンデム反復領域の一般的tauエピトープを認識するモノクローナル抗体7.51を用いて行った(29)。
【実施例】
【００７８】
実施例1：アルツハイマーtauタンパク質をコードするDNA配列を含む遺伝子構築物の設計-ヒトトランケートtau遺伝子；トランスジェニック動物における遍在性および組織特異的発現のための遺伝子構築物の操作および確認
アルツハイマーtau発現ベクターの構築は以下を含む手順からなる：
− コーディング配列の設計、特に欠失およびトランケーションを1に示す、
− tau遺伝子のこれらの部分は適切な制限配列を備えたDNAポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドの校正の助けにより増幅されたPCRであり、該部分は真核性発現ベクター中に全般的または組織特異的プロモーターの下にクローンすることができ、クローニングは一般的細菌株を用い標準的手順を用いて行われる、
− 制限消化および/またはPCR分析により確認された挿入遺伝子の方向性を調べるためにクローン化遺伝子の確認を行った (図2A)。さらに、該構築物は考えられる突然変異型を排除するために部分的にシーケンシングした、
− マイクロインジェクションのための断片の精製 (図2B)、
− トランス遺伝子の哺乳動物細胞、主としてCOS-7およびC6ラットグリオーマ細胞へのトランスフェクションを用いるタンパク質発現の確認、およびwesternブロット法による真核性細胞におけるタンパク質発現の分析(図2C)。
【００７９】
該方法はすべてマニュアル：Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989 (14)に記載されている。
実施例2：トランスジェニックラットの作製
【００８０】
アルツハイマーtauコーディング配列を含むクローン化遺伝子構築物を1日齢胚の雄前核内に注射した。受精卵をルチーン的技術を用いて別個の実験でSHRドナー雌から抽出した(15)。DNAをマイクロインジェクションした後、接合体をCO2インキュベーター中で約12時間in vitro培養し、偽妊娠フォスターマザーの卵管に移植した。ファウンダー(founder)をゲノムDNA由来のトランス遺伝子特異的標的配列のPCRにより同定した。tau遺伝子型を決定するため、ゲノムDNAを各ラットから得た尾約0.5cmから精製した。PCR分析を用いて該トランス遺伝子を含む子孫を同定した。診断的PCRスクリーニングのためのオリゴヌクレオチドをトランス遺伝子の統合が容易に決定できるように設計した。ラットゲノムに統合されたトランス遺伝子コピーの数を決定するためにリアルタイムPCR分析を用いた。
例えばTg系統#318はトランス遺伝子4コピーを含み、これをSybre Green法およびBioRad PCR装置を用いるリアルタイムPCRにより決定した。
実施例3: フォスターマザーへの胚移植後に生まれた動物の遺伝子型別、トランスジェニック動物の同定およびトランス遺伝子の次世代への伝達の評価
【００８１】
尾先端から抽出したDNA：ゲノムDNAはDNeasy組織キット、Qiagenから抽出した。
遺伝子型別：二重トランケート型をコードするトランス遺伝子の特異的増幅をトランスジェニック動物の親世代由来のゲノムDNAについて行い、図3Aおよび3Bに示す。F1世代のゲノムDNAのさらなる分析は、トランス遺伝子が親世代の子孫にも同定されたことから遺伝性であることを証明した。したがってアルツハイマーtauをコードするトランス遺伝子は該動物の染色体DNAに固定される。遺伝子型別は図3Aに示すように2つの陽性(プラスミドおよびTG陽性ゲノムDNA)および2つの陰性コントロール(非増幅コントロールヘテロローガスゲノムDNA；化学物質のコントロール用の非テンプレートコントロール)を用いて行った。
トランス遺伝子発現の分析:トランス遺伝子由来のmRNAの発現をRT-PCRおよびアガロースゲル電気泳動を含む一般に知られた方法を用いるRT-PCR分析により評価した。RNAをトランスジェニック動物の瞬間凍結組織から抽出し、逆転写次いでcDNAの特異的増幅にかけた。
【００８２】
ラットの交配および異型接合および同型接合的ラットの作製:トランス遺伝子陽性ラットを野生型SHRと交配させた。生殖細胞伝達をいくつかの系統で達成した。この実施例ではTg系統#318を示す。それぞれトランケートヒトtauタンパク質遺伝子4コピーを含む雄および雌のトランスジェニックラットを互いにおよび野生型SHRラットと交配しトランスジェニックコロニーを拡大した。該子孫のトランス遺伝子のメンデルの分離率が観察された(図3C)。
【００８３】
本発明のトランスジェニック動物を用いて、家族性アルツハイマー病(FAD)突然変異またはPS1を含むヒトAPPの過剰発現トランスジェニック動物と交雑させることができる(13)。得られるラットは高血圧の遺伝的背景に関するFAD突然変異を持つかまたは持たないAPPおよびPS1の両方を発現するであろう。NFT形成に対するPS1およびAPPの効果はin vivoおよびin vitroの両方で試験することができる。具体的には、AD関連病状の発現および重症度は免疫組織学により試験することができる。
実施例4：トランスジェニックラットの脳におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現
【００８４】
タンパク質発現はtauタンパク質特異的モノクローナル抗体を用いるwesternブロット分析を用いて行った。本発明者らはトランス遺伝子が遺伝的に陽性であったラットの脳組織を分析し、トランス遺伝子を次世代に伝達させることができた。実験はトランス遺伝子陰性年齢対応ラットおよびトランス遺伝子陰性同腹子からの脳抽出物の同時分析をコントロールとした。
【００８５】
組織資料の調製：約2mgの新鮮単離脳組織を完全EDTA不含プロテアーゼインヒビター混合物(Roche)を含む改良Hunt溶解様緩衝液(20mM Tris、pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5% Igepal CA630、0.5% Triton X-100)30μl中で機械的にホモゲナイズした。170μlの溶解用緩衝液を加え、ホモゲネートをシリンジと針(22G)でトリチュレートし、液体窒素で凍結した。氷上で徐々に解凍した後、溶解物を超音波処理し、+4℃で10000g、15分間遠心した。試料中のタンパク質含有量をBeckman分光光度計を用いるBradfordアッセイにより測定した。
【００８６】
PAGEおよびWesternブロット。タンパク質を0.1% (w/V) SDS含有12%変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。電気泳動をTris-グリシン緩衝液(25mM Tris、192mMグリシン、0.1% SDS)中で行った。タンパク質分離に次いで半乾燥ブロッティングを行った。Tris-グリシン-イソプロパノール緩衝液系(25mM Tris、192mMグリシン、20%イソプロパノール)を用いた。Tauタンパク質をmAb 7.51(29)と同様にtauタンパク質を認識する抗tauモノクローナル抗体DC25およびmAb Tau-1 (21)で染色した。陽性シグナルを抗マウスHRP抗体およびECL法を用いて測定した。ブロッティング法の効果はPonceau染色で調節した。タンパク質分析は、トランスジェニックラット脳の総タンパク質抽出物中のアルツハイマーtauタンパク質の特異的発現(図4)、およびトランスジェニックラットの異なる脳領域におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現 (図5)を証明した。
実施例5：トランスジェニックラット脳の免疫組織学的分析
【００８７】
トランスジェニックラットの免疫組織学的分析を行うために数種のtauタンパク質およびアルツハイマー特異的モノクローナル抗体を用いた。これら試験に用いたモノクローナル抗体の簡単な説明：PHF1はリン酸化エピトープSer396-Ser404を認識する；mAb DC25はホスフェート独立エピトープLys347-Ile353を認識する；mAb AT8はリン酸化エピトープSer198-Ser202を認識する、mAb Tau1は非リン酸化エピトープを認識する、mAb Tau5はホスフェート独立エピトープを認識する(15、16、17、18、19、20、21、22)。
【００８８】
光学顕微鏡検査および免疫蛍光：
組織を以下のごとく調製し、薄切した。トランスジェニックおよびコントロール動物をエーテルで麻酔し、速やかに緩衝4%パラホルムアルデヒドを心臓内に還流し、脳を取り出し、20%ショ糖で凍結保護し、急速凍結し、クリオスタットで50μmの厚さに薄切した。切片のいくつかをすぐに70%ギ酸で前処理し、次いで染色した。ラット脳組織切片をPBS中1%H2O2とインキュベーションし、非特異的結合部位をブロッキング培地(PBS、0,1% Triton、5%正常ウマ血清)中でインキュベーションしてブロックした。免疫染色を上記抗体を用いて実施し、次いでビオチン化ウマ抗マウス抗体、次いでアビジン-ビオチン複合体とインキュベーションし、次いでVIPおよびDAB溶液で可視化した。組織切片をゼラチンコートスライドにマウントし、乾燥し、段階的アルコール、キシレンで処理し、Entellanで封入した。
【００８９】
銀染色：
先に記載のGallyas銀染色法(23)を遊離浮遊50μm切片に適応し、金調色(gold toning)した。
【００９０】
免疫蛍光染色：
間接免疫蛍光標識のため切片を1% NaHBO4で30分間前処理し、脳組織の自己蛍光を減少させた。次に、一次抗体で4℃で一夜染色し、ウマ抗マウスビオチン化抗体、次いでストレプトアビジン-Alexa488コンジュゲートとインキュベーションした。
【００９１】
AD罹患患者の脳に見られるNF病状と本発明のトランスジェニック動物の脳に見られる該病状の比較を図10に示す。
実施例6：アルツハイマー病の治療および予防のための薬剤リードおよび薬剤候補のためのスクリーニングアッセイ系
【００９２】
本発明のトランスジェニック動物を細胞培養用の細胞の供給源として用いることができる。動物および細胞両方を本発明のアッセイに用いることができる。トランケートtau遺伝子を発現する脳組織の細胞を標準的技術を用いて培養することができる。該動物および培養細胞は、細胞構造、細胞分割、およびアポトーシス、ならびに一次培養ニューロンの形態、神経突起の萌芽、一次培養における軸索の分岐、および軸索の伸長に対する薬剤候補の役割、およびオルガネラの移動の観察のための研究にin vivoおよびin vitro系として用いることができる(図9)。それらは被検物質の神経栄養効果の試験系として用いることもできる。
【００９３】
試験は、tauとチューブリンの相互作用ならびに被検物質により調節することができるオルガネラトラフィッキング(trafficking)との相互作用の定量的または定性的変化をスクリーニングするために設計することができる。
【００９４】
試験は、シナプス結合の構築の過程における細胞骨格タンパク質の発現または活性を調節する化合物をスクリーニングするために設計することもできる。
【００９５】
試験は、NFT形成またはタンパク質-タンパク質相互作用に影響を及ぼすことができ、最終的にNFT形成の減衰、阻害、または排除をもたらし得る化合物をスクリーニングするために設計することもでき、これはタウオパシーおよび他の神経変性性疾患、好ましくはADのための治療薬の可能性がある物質をスクリーニングするための有用なアッセイであろう。該化合物の効果は細胞培養および神経病理学的、神経生理学的、および行動学的分析により動物を用いてin vivoで評価することができる。スクリーニング方法の多くのバリエーションが当業者に知られており、本発明の範囲内で適用することができよう。
【００９６】
これら実施例は本発明の特定の局面および態様を例示するために記載しており、以下の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
(参考文献)
【００９７】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明のトランスジェニック動物の作製に用いた遺伝子発現構築物の操作に用いるアルツハイマーtauタンパク質 cDNAsのスキーム。
【図２】トランスジェニック動物の作製に用いた遺伝子構築物の製造および検証。
【図３】トランスジェニックfounder動物およびトランスジェニック動物のF1世代の遺伝子型別。
【図４】トランスジェニックラットの脳におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現。
【図５】トランスジェニックラットの異なる脳領域におけるアルツハイマーtauタンパク質の発現。
【図６】トランスジェニック動物および非トランスジェニックコントロール野生型動物由来の脳切片の銀染色。
【図７】トランスジェニック動物の中枢神経系における汎tauモノクローナル抗体DC25を用いる神経原繊維変化の検出。
【図８】トランスジェニック動物の中枢神経系における神経原繊維変化のモノクローナル抗体PHF1による検出。
【図９】治療の手掛かりおよび薬剤候補を特徴づけるためのスクリーニングアッセイ系としての神経細胞培養。
【図１０】本発明のトランスジェニック動物に再現されるアルツハイマー病の組織病理学的特徴。
【配列表】
2005532802.tif 000016
2005532802.tif 000017
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2005532802.tif 000023
2005532802.tif 000024
【図１】
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【図２】
2005532802.tif 000026
【図３】
2005532802.tif 000027
【図４】
2005532802.tif 000028
【図５】
2005532802.tif 000029
【図６】
2005532802.tif 000030
【図７】
2005532802.tif 000031
【図８】
2005532802.tif 000032
【図９】
2005532802.tif 000033
【図１０】
2005532802.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月14日(2005.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532802000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月24日(2005.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚および/または体細胞がNおよびC末端トランケートtau分子の発現をもたらすコーディング領域を含むDNA構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、
-該分子がGene-Bankの寄託番号NM 173727で示される4反復配列および3反復配列tauタンパク質をコードする完全長tau cDNA配列の開始コドン下流の少なくとも30ヌクレオチドおよび終止コドン上流の少なくとも30ヌクレオチドがそれぞれトランケートされており、
-最小トランケートtauコアがヌクレオチドno.744-930(配列番号9；tauタンパク質アイソフォーム43に従って番号付け)によりコードされるタンパク質断片を含み、
-該DNA構築物が該動物の脳細胞に発現すると神経原繊維的(NF)病状を生じる活性を有するタンパク質をコードするものである
該動物。
【請求項２】
胚および体細胞が請求項1記載の該DNA構築物を一時的または安定に発現し、脳のNF病状を示す非ヒト動物。
【請求項３】
該DNA分子によりコードされる該タンパク質が脳に発現する請求項1または2記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
ラットである請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
請求項1記載のトランスジェニックトランケートtauに特異的なオリゴヌクレオチドを用いる請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック動物の遺伝子型別方法。
【請求項６】
NF病状を発現し、ADに関連する危険因子を生じさせる遺伝子背景を有することによりヒトの疾患モデルである請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
ADの危険因子として高血圧を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
ADの危険因子として糖尿病を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
ADの危険因子として高コレステロール血症を生じることができるADの動物モデルである請求項6記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
−請求項1〜4および6〜9のいずれかに記載の動物の神経原繊維病状の変化を検出し、該動物の神経行動学的変化を測定し、該動物の認知スコアを測定することによる物質の評価、
−タウオパシー、好ましくはADを治療および予防するための物質の検証系、
−タウオパシー、好ましくはADを検出するための診断マーカーおよびプローブを開発するための検証系、
−高血圧、糖尿病、脂質代謝異常、および高コレステロール血症をタウオパシー、好ましくはADと組み合わせて治療するための物質の検証系を含む
アルツハイマー病を治療、予防、および診断するための物質のスクリーニングアッセイ系および検証系。
【請求項１１】
タウオパシーおよび関連神経変性プロセス、好ましくはADにおける新規薬剤標的を同定するための請求項10記載の実験モデル系。
【請求項１２】
物質の有効性または療法、具体的には神経原繊維的病状を減少させる療法を試験するためのin vivoアッセイとして請求項1〜4および6〜9のいずれかに記載の動物の使用。
【請求項１３】
該物質または療法が神経変性性疾患、具体的にはタウオパシー、好ましくはAD、および神経原繊維的病状に伴う他の神経変性性疾患のためのものである請求項12記載の使用。
【請求項１４】
請求項1記載の構築物で形質転換するかまたは請求項1〜4および6〜9のいずれかに記載のトランスジェニック動物由来の細胞系。
【請求項１５】
該細胞系がトランスジェニックラット胚由来のラット細胞系であることを特徴とする請求項14記載の細胞系。
【請求項１６】
アルツハイマー病の治療的予防用および診断用化合物およびマーカーを発見するためのスクリーニングおよび検証手段として用いる請求項14または15に記載の細胞系を含むin vitroアッセイ。
【国際調査報告】
2005532802.tif 000035
2005532802.tif 000036
2005532802.tif 000037