(57)【要約】  本発明は、均質なリゾスタフィンを発現する組換えＤＮＡ分子、及びこれらのＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞を用いた、均質形態での組換えリゾスタフィンの製造に関する。得られるリゾスタフィン調製物は、ブドウ球菌に感染した又はその感染リスクのある者に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断型リゾスタフィンタンパク質をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結されたプロモーター領域を含む、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記切断型リゾスタフィンの発現によって、「ＭＴＨＥ．．．」及び「ＴＨＥ．．．」の一方又は両方から選択されるＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質分子の集合が得られる、請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記切断型リゾスタフィンタンパク質をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結されたシグナルペプチドをさらに含み、該シグナルペプチドが切断型リゾスタフィンタンパク質の分泌を指令する、請求項１又は２記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記切断型リゾスタフィンタンパク質が配列番号７のアミノ酸２〜２４５又はその活性なリゾスタフィン変異体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
大腸菌（E. coli）、乳酸菌（L. lactis）、又はＢ．スファエリカス（B. sphaericus）である、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
均質な組換え切断型リゾスタフィンの製造方法であって、
（ａ）請求項５又は６記載の宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）切断型リゾスタフィンの発現を誘導するステップ、
（ｃ）前記宿主細胞を溶解するステップ、及び
（ｄ）前記溶解した宿主細胞から均質な切断型リゾスタフィンを単離するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項８】
均質な組換え切断型リゾスタフィンの製造方法であって、
（ａ）請求項５又は６記載の宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）切断型リゾスタフィンの発現を誘導するステップ、
（ｃ）前記宿主細胞の培地を濃縮するステップ、及び
（ｄ）前記濃縮した宿主細胞の培地から均質な切断型リゾスタフィンを単離するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項９】
均質な切断型リゾスタフィン。
【請求項１０】
「ＭＴＨＥ．．．」及び「ＴＨＥ．．．」の一方又は両方から選択されるＮ末端アミノ酸配列を有するリゾスタフィン分子を含む、請求項９記載のリゾスタフィン。
【請求項１１】
前記分子の少なくとも５０％がアミノ酸「ＴＨＥ．．．」からなるＮ末端アミノ酸配列を有する、請求項１０記載のリゾスタフィン。
【請求項１２】
前記分子の実質的に全ての分子がアミノ酸「ＴＨＥ．．．」からなるＮ末端アミノ酸配列を有する、請求項１１記載のリゾスタフィン。
【請求項１３】
（ａ）請求項９〜１２のいずれか１項に記載の均質な切断型リゾスタフィン、及び
（ｂ）薬学的に許容される担体、
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月２１日に提出された米国特許仮出願第６０／３４１，８０４号（弁理士整理番号07787.6007）の優先権に基づき、これを主張するものである。上記特許仮出願の全開示内容は本明細書に引用され、参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
リゾスタフィンは、１９６４年にスタフィロコッカス・シムランス（Staphylococcus simulans）（以前S. stapylolyticusとして知られていた）において最初に確認された抗菌性酵素である。リゾスタフィンは、ブドウ球菌の細胞壁における架橋ペンタグリシン結合を特異的に切断することができるエンドペプチダーゼである（２７）。ポリペプチド一本鎖として表すと、リゾスタフィンは約２７ＫＤａの分子量を有する。
【０００３】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）の細胞壁架橋は高比率のグリシンを含有しているため、リゾスタフィンは、凝結酵素陽性ブドウ球菌である黄色ブドウ球菌を溶解するのに特に有効である（２７）。リゾスタフィンに関する初期の研究から、この酵素が凝結酵素陰性ブドウ球菌である表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を溶解できることが明らかにされた。しかし、後の研究によって、黄色ブドウ球菌と比較して、表皮ブドウ球菌の溶解には、各表皮ブドウ球菌株に応じて高い濃度の酵素又は長いインキュベーション時間を必要とすることがわかった（２７）。この表皮ブドウ球菌におけるリゾスタフィンに対する菌株特異的な感受性は、各株の細胞壁に含まれるグリシンの量の違いによるものと考えられる。リゾスタフィンに対して耐性の高い株は、細胞壁にグリシンより高い比率のセリンを含有する（２７）。
【０００４】
ブドウ球菌感染（黄色ブドウ球菌により引き起こされるものなど）は、特に病院、学校及び診療所のような環境において、罹患及び死亡の大きな原因である。特にリスクのある患者として、小児、高齢者、免疫無防備状態、免疫抑制状態にある者、並びに頻繁に入院する必要がある慢性病状を有する者が挙げられる。さらに、黄色ブドウ球菌の多剤耐性株が出現すると、このような感染をタイミングよく阻止し、治療する上での懸念、またその必要性が高くなる。実際、世界保健機関の”Overcoming Astionicro Oral Resistance”と題する近年の報告には、薬物耐性レベルの上昇が数十年来の医学的進歩を妨げる恐れがあるという懸念が詳述されている。提起された問題の中に、入院患者の感染がある。米国だけをとっても、病院で獲得した薬物耐性菌によって、毎年およそ１４，０００人が感染し、死亡している。世界中で、院内感染の６０％もが薬物耐性菌によるものである。
【０００５】
最もリスクの大きい患者は、入院又は外来手術を受ける患者、集中治療室（ＩＣＵ）の患者、連続的血液透析を受ける患者、ＨＩＶ感染やＡＩＤＳを有する患者、熱傷患者、治療又は疾患のために生来の免疫が低下した人、慢性疾患又は衰弱患者、老年層、免疫系が未熟な小児、並びに血管内装置を付けている人である（２、３、４、７、８、９、１３、２５、２６）。
【０００６】
黄色ブドウ球菌によって起こる感染に際し、黄色ブドウ球菌の主な生態学的ニーチェはヒトの前鼻腔である。ブドウ球菌の鼻内保菌は、感染の疫学及び病因に重要な役割を果たしている（２、３、７、１３、２３、２４、２５、２６）。健康な被験者において、時間が経過すると、以下に挙げる３つのパターンの黄色ブドウ球菌鼻内保菌を識別することができる。すなわち、約２０％の人が存続性保菌者で、約６０％が間欠性保菌者であり、約２０％は黄色ブドウ球菌を保有することがないようである（７）。
【０００７】
Changら（１）は、肝移植病棟に入院している８４人の肝硬変患者について試験した。全体で、３９人（４６％）が黄色ブドウ球菌の鼻内保菌者で、これらの患者のうち２３％が後に黄色ブドウ球菌感染を発現したのに対し、非保菌者は４％に過ぎなかった。ＨＩＶ患者の試験（１３）により、患者の４９％（２９６人のうち１１４人）が黄色ブドウ球菌の少なくとも１つの陽性鼻内培養菌を有することがわかった。２０１人の患者のうち３４％が鼻内保菌者で、そのうちの３８％が存続性保菌者、６２％が間欠性保菌者であるとみなされた。これらの患者のうち１３人に２１回の黄色ブドウ球菌感染の発現が起こった。分子株タイピングにより、７人の感染患者のうち６人について、感染部位から単離した黄色ブドウ球菌株が、以前鼻腔から培養したものと同じであることがわかり、明らかに良性の鼻内コロニー形成であっても阻止する必要性が強調されている。鼻内黄色ブドウ球菌保菌患者は、黄色ブドウ球菌感染を発現する可能性が有意に高い（Ｐ＝０．０４；オッズ比、３．６；寄与危険度、０．４４）。この知見から、著者は、鼻内保菌がＨＩＶ患者における黄色ブドウ球菌感染の重要な危険因子であると結論づけている（１３）。
【０００８】
関連する特許出願、すなわち、本明細書と同時に提出され、具体的に本明細書に参照として組み込まれる”Methods and Formulations for Eradicating or Alleviating Staphylococcal Nasal Colonization Using Lysostaphin” では、リゾスタフィンは、粘稠な製剤として前鼻腔に直接適用すれば、黄色ブドウ球菌による鼻でのコロニー形成を阻止及び軽減する上で有効であることが明らかにされている。このリゾスタフィン製剤は、コトンラットモデルにおける黄色ブドウ球菌と同時に、又はこの動物モデルに鼻内コロニー形成が樹立した後に適用すると、鼻内コロニー形成に対して有効であった。
【０００９】
またリゾスタフィンは、皮膚、血液、及び固形組織の活性黄色ブドウ球菌感染に対する治療薬となりうる。このような治療薬として、心内膜炎（２８）及び全身性黄色ブドウ球菌（２９）感染のための治療薬がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（１）黄色ブドウ球菌感染は一般集団において蔓延している；（２）現在の抗生物質に対して耐性の黄色ブドウ球菌株が一般集団に出現している；（３）リゾスタフィンは黄色ブドウ球菌（多剤耐性株を含む）に対して非常に活性である；並びに（４）リゾスタフィン粘稠製剤は鼻でのコロニー形成（黄色ブドウ球菌感染の主要蓄積部位）を阻止及び軽減する上で有効であることから、当分野では、ブドウ球菌感染及びコロニー形成を阻止及び軽減するのに用いるための大量のリゾスタフィンを製造する手段が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、１）組換え切断型リゾスタフィンと、２）均質形態でのリゾスタフィンの製造方法に関する。本発明のリゾスタフィンは、ブドウ球菌感染のリスクのある患者に使用することを目的とする。リスクのある集団として、免疫系が未熟な小児、入院又は外来手術のために入院している患者、ブドウ球菌コロニー形成及び／又は感染の素因となる様々な状態を被る患者、あるいは、退院前の患者が挙げられる。前放出（pre-release）処置として鼻内にリゾスタフィンを使用すると、個体感染を抑制とすると共に、院内感染したブドウ球菌株の群生拡大を阻止するのに役立つ。
【００１２】
本発明のリゾスタフィンは、皮膚、創傷、眼、耳、肺、鼻又は胃腸管の粘膜への適用により投与することができる。一実施形態では、本発明のリゾスタフィンは、患者の鼻腔又は前鼻腔への吸入若しくはその他の点滴注入により投与する。
【００１３】
リゾスタフィンは、様々な剤形で患者に投与することができる。一実施形態では、リゾスタフィンを粘稠なクリーム又は液体製剤に添加する。粘稠なクリーム又は液体は鼻内投与、並びにその他の経路による投与に許容される。考えられるその他の担体は、天然ポリマー、半合成ポリマー、合成ポリマー、リポソーム、並びに半固体投与剤形を含む（１０、１１、１２、１４、１６、１９、２１、２２）。天然ポリマーには、例えば、タンパク質及び多糖がある。半合成ポリマーは、改変された天然ポリマーであり、例えば、キトサンが挙げられるが、これは天然の多糖、キチンの脱アセチル化形態である。合成ポリマーとして、例えば、デドリマー、ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリスチレンスルホネート、並びにポリ（ラクチドコグリコリド）が挙げられる。半固体投与剤形としては、例えば、クリーム、軟膏、ゲル、並びにローションが挙げられる。
【００１４】
本発明は、組換え切断型リゾスタフィンからなる組成物を包含する。本発明はまた、リゾスタフィンの一均質形態（切断型でも切断型でなくてもよい）をコードする組換えＤＮＡ分子、これらのＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞、並びにこれらの形質転換細胞からリゾスタフィンを製造する方法を包含する。一実施形態では、組換えＤＮＡ分子から発現したリゾスタフィンは、その最終形態で、形質転換宿主細胞内に蓄積する。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子から発現させたリゾスタフィンを、その最終形態で宿主細胞培地中に分泌させる。このように、本発明の方法により製造されるリゾスタフィン分子は、その最終状態に到達するのにタンパク質分解を必要としない。また、本発明の方法をリゾスタフィンのあらゆる切断型又は突然変異した機能的形態に適用して、リゾスタチン分子の均質集団の発現及び製造を達成することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
リゾスタフィンは、プロ酵素として細菌により自然に産生されるが、このプロ酵素を切断することにより、リゾスタフィンの成熟形態が生成する。このプロ酵素は、上記酵素の分泌のためのシグナル配列、タンデム反復モチーフ（典型的には、１３アミノ酸の７回の反復配列からなる）、並びに２４６個のアミノ酸の最終全長（成熟）タンパク質を含む。プロリゾスタフィンを切断する酵素は、分子を切断する箇所が一貫していない。しかし、不正確に切断されたリゾスタフィンは、アミノ酸”ＡＡＴＨＥ”で開始する最終形態が製造される（配列番号１７）まで、再度同じ酵素で切断されうる。このように、当業者は、成熟全長リゾスタフィンが、通常切断されるプロ配列のすぐ後のアミノ酸で開始することを認めている。従って、成熟リゾスタフィンは、アミノ酸配列、”ＡＡＴＨＥ・・・”で開始する。リゾスタフィンを細菌から単離すると、単離の時点で細菌に存在するあらゆる形態のリゾスタフィンの断片（snap shot）が生じる。得られた調製物には、以下に示すような複数の形態のリゾスタフィンが存在する：１）活性の低いプロリゾスタフィン；２）活性成熟リゾスタフィン（”ＡＡＴＨＥ”形態）；並びに３）リゾスタフィンの中間形態、すなわち、成熟の各段階での分子であって、分子からまだ切断されていない様々な程度のプロ配列を有する分子。従って、天然供給源からの調製物により、様々なアミノ酸で開始する活性及び低活性リゾスタフィンの異種集団が得られる。
【００１６】
リゾスタフィンの低活性形態が存在すると、調製物中の十分に活性のあるリゾスタフィンの濃度が薄くなるため、天然由来のリゾスタフィンを含む組成物の比活性は低下する。対照的に、組換えリゾスタフィン調製物は、十分に活性のある成熟又は切断型形態のリゾスタフィンしか含有しない。このような調製物では、組換え分子の活性を弱めるような低活性の形態は存在しない。従って、組換えリゾスタフィンを用いて調製した組成物の比活性は、天然由来のリゾスタフィンで調製したものより高い。
【００１７】
現在の製造方法では、リゾスタフィンは、遺伝子工学的に作製したプラスミドから、プロタンパク質としてＢ．スファエリカス（B. sphaericus）において発現させ、このプロタンパク質を翻訳後プロセシングすることにより全長活性形態にする。次に、この活性酵素を増殖培地から単離する。しかし、天然形態のリゾスタフィンと同様、この産物は、プロ酵素の示差的タンパク質分解のために、長さが２４８〜２４４アミノ酸のポリペプチドの混合物から構成される（５）。このように、リゾスタフィン配列、例えば、アンビシンＬ（Ambicin L；Ambi, Purchase NY）に含まれる配列は、配列”ＲＡＡＴＨＥ・・・”、”ＬＲＡＡＴＨＥ・・・”、”ＡＡＴＨＥ・・・”若しくは”ＴＨＥ・・・”（配列番号１５〜１７；配列番号１３）で開始すると考えられる。
【００１８】
本発明の一態様は、均質の組換え切断型リゾスタフィンを含む組成物に関する。この実施形態の一態様では、リゾスタフィンの遺伝子を遺伝工学的に切断することにより、全長リゾスタフィンアミノ酸配列におけるリゾスタフィンシグナル配列、反復エレメント（「プロ」ドメイン）、並びに最初の２つのアラニンアミノ酸を除去した。この切断型リゾスタフィン配列は、アミノ酸配列”ＴＨＥ・・・”で開始するが、これを細胞内発現のための開始メチオニン、又はシグナル配列と融合させることにより、大腸菌の周辺腔中に単一種の切断型リゾスタフィンを分泌できるようにした。本発明者らは、成熟リゾスタフィン配列の最初の２つのアミノ酸（ａｌａ−ａｌａ）を除去することにより、成熟全長タンパク質と比較して抗ブドウ球菌活性が向上したリゾスタフィンの形態を作製した。その他の実施形態は上記以外の切断を含むこともある。
【００１９】
本発明の別の形態では、ブドウ球菌鼻内コロニー形成の治療のための医薬組成物において、又は多様な黄色ブドウ球菌感染の治療薬として、均質の切断型リゾスタフィンを用いることができる。政府基準は、医薬組成物に添加する成分が均質形態であることを要求している。上記成分が様々な化学的形態の混合物である場合には、医薬組成物に組み込みにくい。従って、本発明の均質な切断型リゾスタフィンは医薬組成物での使用に極めて好適である。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体と一緒に、治療上有効な量の本発明のリゾスタフィンを含む。薬学的に許容される担体とは、滅菌液体、例えば、水、油（例：石油、動物油、植物油、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）でありうる。また、特に注射液の場合には、生理食塩水、水性デキストロース、並びにグリセロール溶液を液体担体として用いることもできる。好適な医薬担体は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版（１３）（参照として本明細書に組み込む）に記載されている。
【００２１】
治療上有効な量とは、感染の治療において、ある程度の軽減、補助、予防、あるいは、予防的効果をもたらすと合理的に考えられる量である。治療上有効な量は、細菌のコロニー形成又は感染を阻止するのに十分と考えられる量でありうる。同様に、治療上有効な量は、既存の細菌感染を軽減するのに十分と考えられる量でありうる。
【００２２】
本発明の別の態様は、均質なリゾスタフィンの製造方法に関する。前述したこれまでの製造方法とは異なり、本発明は、組換えタンパク質の発現後、タンパク質分解の必要性をなくすことにより、すべてが同じアミノ酸で開始するリゾスタフィンタンパク質を発現するよう設計される。本発明の方法は、全長又は切断型のいずれであっても、リゾスタフィンをその最終形態で発現するＤＮＡ分子（以下に説明する）を用いる。得られるリゾスタフィン分子は、その最終形態に到達するのに予測不可能なタンパク質分解を必要としないため、本発明では、すべての分子が同じアミノ酸で開始する、リゾスタフィンの実質的に均質な調製物が得られる。加えて、本発明の均質なリゾスタフィンには、混入物質の検出を単純化するという利点もある。具体的には、リゾスタフィンを発現する細菌細胞に由来する混入物質が調製物に残存することがある。調製物中の汚染因子の検出又は除去は、純度を試験する化学的分析が必要となるため、調製物に複数の形態のリゾスタフィンが存在すればますます困難になる。従って、均質なリゾスタフィンを発現する系は、臨床用途に用いるための、混入物質を含まない純粋なリゾスタフィンの製造にこれまでより容易に適合させることができる。
【００２３】
本発明の別の態様は、リゾスタフィンの均質な形態をコードする組換えＤＮＡ分子に関する。一実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、複製起点、形質転換した宿主細胞に抗生物質耐性を賦与する遺伝子、リゾスタフィンをコードするＤＮＡ配列に機能的に連結されたプロモーター領域、シグナル配列、並びに終結配列から構成されるプラスミドである。組換えＤＮＡ分子は、コスミド又は線状化ＤＮＡのような別の形態でもよい。また、商業用医薬品を製造する間の安定化の目的で、組換えＤＮＡを宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。別の実施形態では、組換えＤＮＡ分子は、全長リゾスタフィン、切断型リゾスタフィン、若しくは変異型リゾスタフィンをコードするものでもよい。本発明の組換えＤＮＡ分子は、細胞内部に局在するリゾスタフィンをコードする（すなわち、細胞内発現）ものであってもよいし、又は宿主細胞培地にリゾスタフィンを分泌するためのシグナルと共にリゾスタフィンをコードする（すなわち、細胞外発現）ものでもよい。
【００２４】
本発明の組換えＤＮＡ分子は、リゾスタフィンタンパク質は発現しないが、適切な遺伝子制御エレメント（すなわち、プロモーター）に機能的に連結すれば、リゾスタフィンタンパク質を発現することができるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子も包含する。
【００２５】
本明細書で用いる用語「リゾスタフィン」とは、全長リゾスタフィン、あらゆるリゾスタフィン突然変異体又は変異型、あらゆるリゾスタフィン切断型、組換えにより発現させたあらゆるリゾスタフィンタンパク質、若しくはブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンにおけるグリシン含有架橋に対するタンパク質分解攻撃のタンパク質分解能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで保持する関連酵素を意味する。改変された全長リゾスタフィン又は変異型リゾスタフィンは、タンパク質の翻訳後プロセシング（宿主細胞株に存在する酵素により、又は工程のあらゆる段階で導入される酵素若しくは試薬を用いて）により、あるいは、構造遺伝子の突然変異により、作製することができる。
【００２６】
突然変異は、欠失、挿入、ドメイン除去、点及び置換突然変異を含んでよい。リゾスタフィンには、例えば、Ｓ．シムランス（S. simulans）から精製されたリゾスタフィン、アンビシンＬ（Nutrition 21, Inc.）、Ｂ．スファエリカスから精製されたリゾスタフィン、又は組換え発現系（本発明のものを含む）から精製されたリゾスタフィンがある。切断型リゾスタフィンには、１以上のアミノ酸がタンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、若しくはその両方から除去されているあらゆるリゾスタフィンを包含する。また、変異型リゾスタフィンを切断形態として発現させてもよい。
【００２７】
本明細書で用いる用語「発現」とは、ＤＮＡ鋳型からメッセンジャーＲＮＡが転写され、次にこのメッセンジャーＲＮＡがアミノ酸配列に翻訳されて、タンパク質を形成する過程を意味する。従って、ＤＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡに転写することができるヌクレオチド配列を含み、このメッセンジャーＲＮＡをリゾスタフィンタンパク質に翻訳するときに、リゾスタフィンを発現する。本発明の目的に関して、用語「発現」は、用語「機能的にコードする」と本質的に同等である。
【００２８】
本明細書で用いる用語「複製起点」とは、ＤＮＡの染色体外部分（例えば、プラスミド）が、染色体の複製とは独立にそれ自体で複製できるようにするＤＮＡ配列を意味する。複製起点は、細胞においてＤＮＡ複製に関与する宿主細胞タンパク質と結合することが多い。
【００２９】
本明細書で用いる用語「プロモーター」とは、転写過程においてメッセンジャーＲＮＡの生成を促進するＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは、プロモーターでの転写過程の開始によって、遺伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡの生成が起こるとき、その遺伝子に「機能的に連結され」ている。
【００３０】
本明細書で用いる用語「シグナル配列」とは、宿主細胞に、得られたタンパク質と共に特定の機能を果たすよう信号を送るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。例えば、シグナル配列は、コードされるタンパク質を細胞内に保持するのではなく、分泌するよう宿主細胞に指示する。本明細書で用いる用語「終結配列」とは、転写の過程を終結させるＤＮＡ配列を意味する。終結配列は、通常、プラスミドにおいて目的とする遺伝子のＤＮＡ配列の後に位置する。
【００３１】
別の態様は、リゾスタフィンをコードする組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換することを含む。本明細書で用いる用語「宿主細胞」とは、本発明の組換えＤＮＡで形質転換又はトランスフェクションすることができる、原核又は真核のあらゆる細胞（動物及び植物細胞を含む）を意味する。本発明の一実施形態では、宿主細胞は細菌、例えば、大腸菌、乳酸菌（Lactococcus lactis）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、並びに関連生物である。本発明の組換えＤＮＡにおける遺伝的エレメント、例えば、複製起点、プロモーター、シグナル配列及び終結配列などは、多くの場合、宿主細胞に特異的なものとすることができる。従って、別の実施形態は、使用する特定の宿主細胞で機能する上記機能のエレメントを含む組換えＤＮＡ分子を含む。
【００３２】
本明細書で用いる用語「形質転換」とは、細菌細胞へのＤＮＡ分子の導入を意味する。細菌細胞は、外来のＤＮＡ分子を容易に受けるとき、「コンピテント」とみなされる。細菌細胞をコンピテントにする方法及びこのようなコンピテント細胞を形質転換する方法は標準的であり、当業者には公知である。細菌をエレクトロポレーションにより形質転換することもできる。本明細書で用いる用語「トランスフェクションする」とは、哺乳動物宿主細胞へのＤＮＡ分子の導入を意味する。哺乳動物宿主細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン、及びリポソーム試薬（すなわち、リポフェクチン）など複数の一般的方法により、トランスフェクションすることができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、リゾスタフィンを発現する組換えＤＮＡ分子で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞からの活性で均質なリゾスタフィン及び活性で均質な切断型リゾスタフィンの製造に関する。本明細書で用いる用語「均質なリゾスタフィン」とは、すべてのリゾスタフィン分子がリゾスタフィンタンパク質配列において同じアミノ酸で開始するリゾスタフィンの調製物を意味する。細菌において生産される組換えリゾスタフィンは、いくつかの分子のＮ末端に切断されていない残留Ｆ−Ｍｅｔを有することがあり、近年の研究では、乳酸菌及び大腸菌において生産される組換え分子の２０％及び２％が残留Ｆ−Ｍｅｔ部分を含むことが明らかにされている。その結果、組換え均質リゾスタフィンは、Ｎ末端Ｆ−Ｍｅｔ残基を含む又は含まない細菌生産リゾスタフィン又は切断型リゾスタフィンを含むこともある。特定の実施形態では、組換え分子の５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％以上が残留Ｆ−Ｍｅｔ部分を含まない。
【００３４】
本発明で用いる用語「不均質なリゾスタフィン」とは、リゾスタフィン配列においてそれぞれ異なるアミノ酸で開始するリゾスタフィン分子の混合物を含むリゾスタフィンの調製物を意味する。活性で均質のリゾスタフィンは、全長リゾスタフィン又は切断型リゾスタフィンのいずれでもよい。
【００３５】
リゾスタフィンタンパク質は、それが、ブドウ球菌の細菌壁内の特定の架橋ポリグリシン結合を切断する、in vitro及びin vivoでのタンパク質分解活性を呈示するとき、「活性」であるという。リゾスタフィンタンパク質は、全長リゾスタフィンと比較して、ブドウ球菌の細菌壁内のポリグリシン架橋に対し高いタンパク質分解活性を発揮するとき、「増強されたブドウ球菌分解活性」を有する。リゾスタフィンを宿主細胞内に発現させる場合には、宿主細胞を溶解し、得られた細胞抽出物からリゾスタフィンを単離することができる。リゾスタフィンを宿主細胞培地に分泌させる場合には、リゾスタフィンを濃縮してから、標準的方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、疎水性精製、及びイオン交換クロマトグラフィーなど）により精製することができる。大規模製造のためには、宿主細胞を例えば、大型ローラーボトル又は大容量発酵装置において増殖させることができる。
【００３６】
均質な組換えリゾスタフィンを様々な担体に添加してもよい。このようなビヒクルは、鼻腔への点滴注入の後、鼻腔内でのリゾスタフィンの半減期を長くする。これらの担体として、天然ポリマー、半合成ポリマー、合成ポリマー、リポソーム、並びに半固体投与形態が挙げられる（１０、１１、１２、１４、１５、１８、２０、２１）。天然ポリマーとしては、例えば、タンパク質及び多糖が挙げられる。半合成ポリマーは、キトサン（天然多糖であるキチンの脱アセチル化形態である）のような修飾天然ポリマーである。合成ポリマーとしては、例えば、デドリマー、ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリスチレンスルホネート、並びにポリ（ラクチドコグリコリド）が挙げられる。半固体投与形態としては、例えば、クリーム、軟膏、ゲル、並びにローションが挙げられる。これらの担体を用いてリゾスタフィン分子を微小封入する、あるいは、これらの担体をリゾスタフィンに共役結合させることもできる。
【００３７】
得られたリゾスタフィン化合物は、ブドウ球菌感染のリスクのある患者に様々な経路により投与することができる。リスクのある患者には、医療関連従事者、新生児及び未熟児、入院する又は外来手術を受ける人、熱傷患者、留置カテーテル、ステント、関節置換などを受容する患者、老人病患者、並びに遺伝子学的に、化学的に若しくはウイルスにより免疫系が抑制された患者が含まれる。ヒト以外の患者のうち、リスクのある者として、動物園の動物、獣群、並びに近隣地区で飼育される動物が挙げられる。
【００３８】
典型的患者として、黄色ブドウ球菌若しくはその他のブドウ球菌感染にさらされる哺乳動物、又は保菌する哺乳動物が挙げられ、ヒト及び非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、霊長類、反芻動物（肉牛及び乳牛など）、スイギュウ、ラクダ、並びに毛皮獣、群獣、実験室動物、動物園の動物及び酪農動物、畜犬及び厩舎動物、家庭のペット、並びに家畜が含まれる。
【００３９】
一実施形態では、リゾスタフィン組成物を患者の鼻腔に点滴注入する。別の実施形態では、リゾスタフィン組成物を皮膚にすり込む、開口した創傷部に適用する、又は注射して全身投与する。さらに、これらのリゾスタフィン組成物を抗生物質抗ブドウ球菌薬と一緒に投与することもでき、このような薬物として、以下のものが挙げられる：抗生物質（例：ムピロシン及びバシトラシン）；抗ブドウ球菌剤（例：リゾチーム、ムタノリシン、及びセロジルムラミダーゼ）；抗菌ペプチド（例：ニシン）；並びにランチビオティックス又はその他のランチオン含有分子（例：スブチリン）。また本発明の組成物は、抗ブドウ球菌モノクローナル抗体を含むこうブドウ球菌薬などが含まれてもよく、例えば、ペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）に対する抗体が挙げられるが、これは、２００１年１２月２１日に提出された米国特許仮出願第６０／３４３，４４４号、並びに本発明と一緒に提出されたMultifunctional Monoclonal Antibodies Directed To Peptidoglycan of Gram-Positive Bacteriaに記載されており、両文献とも本明細書に参照として組み込まれる。
【００４０】
本発明の組換えリゾスタフィン及び医薬組成物は、静脈内、腹腔内、体内注射、関節内、心室内、鞘内、筋内若しくは皮下注射、又は鼻内、皮膚、皮内、膣内、経口、又はその他の有効な投与方法により投与することができる。また、局所的に、例えば、筋内又は皮下のいずれかの注射により感染部位に組成物を投与してもよい。投与には、綿棒での塗布、液浸、浸漬、若しくは患者への直接塗布による医薬組成物の投与が含まれる。また、治療薬は、患者内に配置しようとする物体に適用することもでき、このような物体として、以下のものが挙げられる：留置カテーテル、心臓弁、髄液短絡、関節プロテーゼ、その他の身体内インプラント、あるいは、ブドウ球菌に感染するリスク、又はこのような感染を患者に導入するリスクのあるその他のあらゆる物体、装置若しくは機器。
【００４１】
当業者に本発明の実施方法を教示する以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。以下に挙げる実施例は、本発明を例示し、本発明の特定の実施形態の様々な有益な特性を開示するに過ぎない。以下の実施例が、特許請求の範囲に示す本発明を制限すると解釈すべきではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１
均質な切断型リゾスタフィンの細胞内発現のための発現プラスミドの構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、リゾスタフィン遺伝子の断片を増幅し、得られた断片をｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ発現ベクター（Invitrogen）にクローニングした。切断型リゾスタフィンの一形態を作製し、翻訳開始メチオニンに直接融合させて、大腸菌において細胞内発現を実施した。図１は、この実施例と実施例２のプラスミド作製に用いたクローニング手法を示す。
【００４３】
リゾスタフィン発現カセットの融合を完了するため、５’及び３’末端をそれぞれ別の鋳型から増幅し、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＤＥ−ＰＣＲ）を用いて連結させた。具体的には、上流発現構成要素を含む５’断片はｐＢＡＤ／ｇＩＩＩプラスミドから増幅し、リゾスタフィンコード配列を含む３’末端は、リゾスタフィン遺伝子を含む宿主細胞のサンプル（Ambi, Inc.から提供される）から増幅した。５’断片のＰＣＲ増幅反応物は、５０μｌの反応容量中、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌのプライマーＪＳＢＸ−２９及びＪＳＢＸ−５３（表１を参照）、２．５単位のＥｘＴａｑポリメラーゼ（PanVera）、１×ＥｘＴａｑ反応バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有していた。得られた産物を、９６℃で３分の初期インキュベーションにより鋳型を変性した。９６℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒からなるサーマルサイクルを２５回実施することにより増幅した。３’断片のＰＣＲ増幅反応物は、５０μｌの反応容量中、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２０ｐｍｏｌのプライマーＪＳＢＸ−３４及びＪＳＢＸ−５２（表１を参照）、２．５単位のＥｘＴａｑポリメラーゼ、１×ＥｘＴａｑ反応バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有していた。９６℃で３分の初期インキュベーションにより鋳型を変性した。その産物を、９６℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３０秒からなるサーマルサイクルを２５回実施することにより増幅した。良好な反応から得られたＰＣＲ産物をヌクレオスピン（Nucleospin）ＰＣＲ精製装置（Clontech）により製造者の手順に従って精製した。
【表１】
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【００４４】
次に、５０μｌの反応容量中、２μＬの精製５’断片、０．５μＬの精製３’断片、２０ｐｍｏｌのプライマーＪＳＢＸ−２９及びＪＳＢＸ−３４、２．５単位のＥｘＴａｑポリメラーゼ、１×ＥｘＴａｑ反応バッファー、２００μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて、ＯＬＥ−ＰＣＲを実施した。９６℃で３分の初期インキュベーションにより鋳型を変性した。９６℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒からなるサーマルサイクルを３０回実施することにより、産物を増幅した。初めの５回のサイクルは、５’及び３’部分が、変性したときに、ほぼ重複して、リゾスタフィンの全長配列と付随エレメント（すなわち、シグナル配列）の増幅が行われる可能性を最適化するために、プライマーＤＮＡを添加せずに実施した。良好な反応から得られたＰＣＲ産物をヌクレオスピンＰＣＲ精製装置により製造者の手順に従って精製した。
【００４５】
次に、長さが約１，０００塩基対のＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＸｂａｌで消化し、タンパク質発現のための細菌ベクターｐＢＡＤ／ｇＩＩＩにクローニングした。消化したＰＣＲ断片を脱リン酸化したＢａｍＨＩ及びＸｂａｌ消化ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩと連結させるが、その際、リガーゼ（Promega）を用い、インサート対ベクターのモル比３：１を用いる製造者の指示に従った。連結反応物の半分（５μｌ）を用いて、製造者の指示に従い、コンピテントＴＯＰ１０細胞（Introgen）を形質転換した。Ｐｆ／ＭＩ（New England Biolabs）を用いた診断用制限酵素消化により、ＤＮＡインサートを有するプラスミドを含む細菌クローンを同定した。この診断用消化物におけるバンド形成の予想パターンは、ｐＪＳＢ２０については４，０００ｂｐでの１バンドと８００ｂｐでの１バンド、またｐＪＳＢ２８については４，０００ｂｐと７５０ｂｐであった。ＪＳＢＸ−３５（配列番号５）とＪＳＢＸ−３６（配列番号６）により反応を開始し、ＣＥＱ２０００キャピラリーシークエンサー（Beckman/Coulter）で分析したサイクル配列決定反応により、ＤＮＡ配列決定を実施した。５００ｎｇのプラスミド調製物、１０ｎｇの配列決定用プライマー、並びに８μｌのＣＥＱ２０００配列決定用ミックス（Beckman Coulter PN608000）を混合することにより、配列決定を実施した。配列決定サンプルを９６℃で２分インキュベートした後、９６℃で２０秒、５０℃で２０秒及び６０℃で４分のサイクルを合計４０回繰り返すことにより増幅した。
【００４６】
得られたプラスミドｐＪＳＢ２８を図２に示す。この図は、このプラスミドに存在する切断型リゾスタフィン遺伝子の配列（アミノ酸配列は配列番号９、ヌクレオチド配列は配列番号１０）も示す。
【００４７】
実施例２
切断型リゾスタフィンの細胞外発現のための発現プラスミドの構築
前記と同様、ＰＣＲを用いて、リゾスタフィン遺伝子の断片を増幅し、得られた断片をｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ発現ベクター（Invitrogen）にクローニングした。この実施例では、切断型リゾスタフィンの一形態を作製し、大腸菌の周辺腔への分泌のためのシグナル配列に融合させた。５’断片が上流発現構成要素と細胞外発現のためのシグナル配列を含む以外は前記と同様に、ＯＬＥ−ＰＣＲを用いてリゾスタフィン発現カセットの融合を完了した。これら５’構成要素もｐＢＡＤ／ｇＩＩＩプラスミドから増殖した。５’断片のＰＣＲ増幅反応は、プライマーＪＳＢＸ−２９とＪＳＢＸ−３２を用いる以外は前記と同じであった。同様に、ＪＳＢＸ−３４とＪＳＢＸ−３３を用いる以外は前記のように、３’断片を増幅した。ＯＬＥ−ＰＣＲ、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩベクターへの切断型リゾスタフィンインサートのクローニング、診断消化物、並びにその後の配列決定はすべて前記のように実施した。
【００４８】
得られたプラスミドｐＪＳＢ２０を図３に示す。この図は、切断型リゾスタフィン遺伝子の配列と、このプラスミドに存在するシグナル配列（アミノ酸配列は配列番号１１、ヌクレオチド配列は配列番号１２）も示す。
【００４９】
実施例３
大腸菌における活性切断型リゾスタフィンの小規模製造
ｐＪＳＢ２０又はｐＪＳＢ２８で形質転換したＴＯＰ１０細胞を３７℃で一晩増殖させた培養物を１００μｇ／ｍＬアンピシリンで添加した２００ｍｌのＬＢ培地において１：１００に希釈した。ＯＤ６００が０．５に達したら、アラビノーズを０．２％まで添加することにより、リゾスタフィンタンパク質の発現を誘導した。次に、培養物を３０℃で４８時間増殖させた。５，０００×ｇで１５分の遠心分離により細胞をペレット化した。細胞内リゾスタフィン（ｐＪＳＢ２８）の場合には、製造者の指示に従って、０．１２５Ｍ ＮａＣｌを添加したＢ−Ｐｅｒ抽出試薬（Pierce）で細胞ペレットを処理し、上清を回収し、リゾスタフィンの存在、及び酵素が活性であるか否かについて分析した。分泌されたリゾスタフィン（ｐＪＳＢ２０）の場合には、培地の上清を回収し、アミコンらせん型限外ろ過濃縮装置（１０ＫＤカットオフのＳ１Ｙ−１０）を用いて濃縮してから、リゾスタフィンの存在及びリゾスタフィンの活性について分析した。
【００５０】
リゾスタフィンの発現が細胞内であるのか、宿主細胞培地への分泌によるものであるのかを決定するために、得られたサンプルにおけるリゾスタフィンの存在をＥＬＩＳＡにより分析した。１００μｇのリゾスタフィンをウサギの膝窩リンパ節に一次ワクチン接種することにより、ウサギにおいてポリクローナル抗リゾスタフィンを産生させた。これに続く３ヶ月間、毎月１回ウサギに１００μｇブースター注射を投与した後、採血してポリクローナル血清を製造した。ＥＬＩＳＡにおいて、得られたウサギのポリクローナル抗リゾスタフィン血清１００μｌをＰＢＳ中１：１０，０００に希釈し、これを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（NUNC, Macrosorb）のウェルを４℃で一晩コーティングした。これらのプレートをＰＢＳで洗浄し、１ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中１％ＢＳＡにより室温で３０〜６０分ブロッキングした。実験サンプルとリゾスタフィン標準物（Ambicin L, AMBI, Inc.）を０．１％Ｔｗｅｅｎ及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡ）で希釈した。抗リゾスタフィンでコーティング及びブロッキングしたプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。サンプルと標準希釈物を抗リゾスタフィンでコーティングしたプレート上に移し（１００μｌ／ウェル）、室温で３０〜６０分インキュベートした。次に上記プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。また、コーティング用のポリクローナル抗体も、製造者の指示に従い、ビオチン−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカプリレート（Bioaffinity Systems, Inc.）で該抗体をビオチニル化することにより、検出抗体として用いた。ビオチニル化抗体調製物をＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで１：８００に希釈し、１００μＬ／ウェルで添加した。このプレートを室温で３０〜６０分インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Sigma Cat# E2886）をＰＢＳ−Ｔ−ＢＳＡで１：８，０００に希釈してから、１００μｌ／ウェルをプレートに添加し、このプレートを３０〜６０分インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄した。１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ−マイクロウェル基質（BioFx Cat# TMBW 0100-01）を添加し、反応を３〜５分進行させた後、ＴＭＢ停止試薬（BioFx Cat# STPR 0100-01）の添加により停止した。その時点で読み取った吸光度は４５０ｎｍであった。図４に示すように、ｐＪＳＢ２８及びｐＪＳＢ２０  ＤＮＡプラスミドは、大腸菌宿主細胞に形質転換すると、両者共にリゾスタフィンを発現した。
【００５１】
ｐＪＳＢ２８及びｐＪＳＢ２０により発現させたリゾスタフィンが活性であるか否かを決定するために、溶解アッセイを用いた。このアッセイでは、黄色ブドウ球菌を高温死滅させ、様々な濃度のリゾスタフィン調製物と一緒にインキュベートした。実験調製物によって細菌懸濁液の濁りがなくなり、透明になったとき、リゾスタフィン活性が検出された。具体的には、リゾスタフィン陽性対照（Ambicin L）とサンプルを５０μｌのＰＢＳで２００、１００、５０及び１０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。黄色ブドウ球菌５は、５６℃で３時間のインキュベーションにより高温死滅させた。高温死滅させたこれらの細菌をＰＢＳ中ＯＤ６５０が約０．９〜１．０となるまで懸濁させた。次に、４５０μｌの懸濁液を使い捨てキュベットに入れ、ＯＤ６５０を決定した。これは０時点であった。次に、５０μｌのサンプル又は対照を添加し、サンプル中のリゾスタフィンの最終濃度を２０、１０、５及び１μｇ／ｌにした。その後、６０秒毎に１０分間懸濁液のＯＤ６５０を測定した。図５は、ｐＳＪＢ２８及びｐＳＪＢ２０により発現させたリゾスタフィンの１０μｇ／ｍＬのサンプルに関する典型的な動力学的曲線である。ＰＢＳ単独を用いて、アッセイの陰性対照とした。このアッセイでは、ＯＤ６５０は、サンプルの完全な溶解後も残留する細菌残屑の存在のために決して０になることはない。
【００５２】
実施例４
切断型リゾスタフィンは、全長リゾスタフィンと比較して増強されたブドウ球菌分解活性を有する
Klineら（６）に記載されているように、蛍光発光アッセイにより、リゾスタフィンの切断型”ＴＨＥ”形態のブドウ球菌分解活性をリゾスタフィンの全長”ＡＡＴＨＥ”形態のブドウ球菌分解活性と比較した。本アッセイでは、ＴＮＢＳの代わりにフルオレサミンを用いて、リゾスタフィンがＮ−アセチルヘキサグリシン基質を切断するときに出現するアミンを検出した。
【００５３】
ＯＤ２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）で分光光度計を用いて、初めに酵素の光学密度を測定することにより、リゾスタフィンサンプルを調製した。リゾスタフィン希釈バッファーで分光光度計を０の目盛に合わせた。９００μｌのリゾスタフィン希釈バッファー（２０ｍＭ酢酸ナトリウムと、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ４．５）に１００μｌの酵素溶液を添加してから、ボルテックスで混合することにより、１：１０希釈物を調製した。こうして得られたサンプルをＯＤ２８０で読み取った。得られたＯＤ２８０値に、希釈係数１０と吸光係数０．４１を掛けることにより、酵素サンプル中のリゾスタフィンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を算出した。次に、このアッセイで使用するために、リゾスタフィン希釈バッファーを用いて各リゾスタフィンサンプルを４０μｇ／ｍｌに希釈した。
【００５４】
Klineら（６）に記載されているように、ヘキサグリシン基質を調製した。具体的には、１ｍｌの水に４０．２ｍｇのＮ−アセチルヘキサグリシン（Ｎ−Ａｃ−Ｈｅｘ；ＦＷ＝４０２）を再懸濁し、固体が溶液に溶解するまで水酸化ナトリウムを添加することにより、１０ｍＭストックを調製した。基質／アッセイバッファー（５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１ｍＭ二ナトリウムＥＤＴＡ、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を添加することにより、Ｎ−Ａｃ−Ｈｅｘストックの最終容量を１０ｍｌに調節した。アッセイに使用する前に、さらにこのストックのアリコートを基質／アッセイバッファーにより１：１０に希釈した。
【００５５】
各リゾスタフィンサンプルをマイクロウェルプレートに移し、希釈バッファー中で１：３（４０μｇ／ｍｌから出発）に希釈した。希釈が完了した時点で、各ウェル中の最終容量は６０μｌであった。各成分を含まないブランクウェルも調製した。各サンプルについて３回繰り返して実験した。リゾスタフィンサンプル希釈物を調製したら、６０μｌのＮ−Ａｃ−Ｈｅｘ基質を各ウェルに添加した。
【００５６】
次にアッセイプレートを３７℃で１時間インキュベートした。アセトン中０．３ｍｇ／ｍｌフルオレサミン（Molecular Probes）４０μｌを各ウェルに添加し、その直後サンプルの読取りを実施した。サンプルの読取りは、３９０ｎｍ励起、４７５ｎｍ発光、及び４２０ｎｍカットオフに設定した蛍光プレート読取り装置（Molecular Devices）を用いて実施した。陰性対照は、リゾスタフィン、バッファー、及びフルオレサミンを含むが、Ｎ−Ａｃ−ヘキサグリシンを含まない照合ウェルから構成される。対応する濃度のリゾスタフィンを含むが、Ｎ−Ａｃ−Ｈｅｘ基質を含まないウェルの蛍光を各読取り値から差し引いた。各サンプルについて３回繰り返して実験し、得られた値を平均し、標準偏差を算出した。この実験の結果を図６Ａに示す。
【００５７】
各実験ウェルで均質濃度のリゾスタフィンを用いて、時間経過実験も実施した。前述したように、陰性対照は、リゾスタフィン、バッファー、及びフルオレサミンを含むが、Ｎ−Ａｃ−ヘキサグリシンを含まない照合ウェルから構成される。実験ウェルは、最終濃度が２０μｇ／ｍｌのリゾスタフィンを含有した。サンプルを３７℃で５分、２０分、４０分、６０分、及び９０分インキュベートした。インキュベーション時間が経過したら、アセトン中０．３ｍｇ／ｍｌフルオレサミン４０μｌを各ウェルに添加し、その直後にサンプルの読取りを実施した。サンプルの読取り及び分析は前記と同様に行なった。この実験の結果を図６Ｂに示す。
【００５８】
図６Ａ及び６Ｂは、リゾスタフィンの切断型”ＴＨＥ”形態が全長”ＡＡＴＨＥ”形態より活性であることを示している。比色分析アッセイは、基質分子に対する各リゾスタフィン分子の作用をモニタリングするのに対し、黄色ブドウ球菌生存能アッセイでは、黄色ブドウ球菌を死滅させるのに十分なリゾスタフィン活性が存在するか否かを単純に判断するだけである。図６Ａ及び６Ｂから、切断型リゾスタフィンは、全長”ＡＡＴＨＥ”形態に比較して高いブドウ球菌分解活性を有することがわかる。従って、この切断型リゾスタフィンを用いて製造したリゾスタフィン組成物は、異種リゾスタフィン又は相同全長リゾスタフィンで調製した組成物に対して、増強された高いブドウ球菌分解活性を提供すると考えられる。
【００５９】
実施例５
リゾスタフィン遺伝子の乳酸菌（L. lactis）クローニングにおける活性切断型リゾスタフィンの大規模精製
概要を前述したように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、全リゾスタフィン遺伝子をプラスミドｐＲＮ５５５０から増幅した。ｐＲＮ５５５０は、以前AMBI, Inc. Purchase, NYでのリゾスタフィン製造に用いられていた。得られたＰＣＲ増幅産物は、リゾスタフィンを生産するためのコード領域、翻訳開始のための５’ＴＴＧコドン、並びにクローニングのための３’ＸｂａＩ制限部位を含んでいた。このＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、標準的乳酸菌発現プラスミド、ｐＮＺ８１４８ＳｃａＩ（ＳｃａＩおよびＸｂａＩで切断されている）と連結させた。この連結により、発現プラスミドｐＬｓｓ１Ｃを作製した。
【００６０】
配列分析により、ｐＬｓｓ１Ｃにおけるリゾスタフィンをコードする配列は正しいことが確認された。これは、ｐＲＮ５５５０におけるリゾスタフィンコード配列に存在する２５６位（ＴからＣ；ＡｓｎからＡｓｎ）における既知のサイレント突然変異を含んでいた（アミノ酸は配列番号１３、ヌクレオチド配列は配列番号１４）。次に、ｐＬｓｓ１Ｃを鋳型として用いたＰＣＲにより、切断型リゾスタフィン（野生型成熟タンパク質の２つの５’末端（most）Ａｌａコドンを含まない、成熟リゾスタフィンコード配列）を増幅した。こうして得られた増幅産物は、切断型リゾスタフィンのコード領域、翻訳開始のための５’ＴＧコドン（切断された制限部位ＳｃａＩの最後のＴと一緒に、ラクトコッカス属菌における開始コドンとして働くＴＴＧコドンが構成される）、並びにクローニングのための３’ＸｂａＩ制限部位を含んでいた。このＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、ＳｃａＩおよびＸｂａＩで切断されているｐＮＺ８１４８ＳｃａＩと連結させることにより、プラスミドｐＬｓｓ１２Ｃ（図示していない）を取得した。最終的に、制限部位ＳａｌＩ及びＮｓｐＶを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子をｌａｃＦ遺伝子（プラスミドｐＮＺ８１４８Ｆ−１に由来する；図示していない）と交換することにより、プラスミドｐＬｓｓ１２Ｆを取得した。図７Ａ〜Ｄに、それぞれｐＲＮ５５５０、ｐＮＺ８１４８ＳｃａＩ、ｐＬｓｓ１Ｃ、及びｐＬｓｓ１２Ｆの制限マップを見いだすことができる。
【００６１】
ｐＬｓｓ１２Ｆでは、切断型リゾスタフィンの理論上のＮ末端アミノ酸配列はｆ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕである。多くの場合、ｆ−Ｍｅｔは専用のペプチダーゼにより切除される。これまでのＮ末端アミノ酸配列決定により、確かにこの５’ｆ−Ｍｅｔは切除される場合もあることが示されている。
【００６２】
Sambrook, Jら（１７）に記載されているように、標準的方法によりｐＬｓｓ１２Ｆを単離し、精製した。
【００６３】
発現プラスミドによる宿主細胞の形質転換：
ＭＧ１３６３株（pepN::nisRK, lac+lacF、プロファージ除去済）の誘導体である乳酸菌サブスピーシーズクレモリス（L. lactis subsp. cremoris）ＮＺ３９００株をｐＬｓｓ１２Ｆで形質転換し、１％ラクトースで添加したエリカー（Elliker）寒天上で平板培養した。この寒天上での増殖する能力及びラクトースを発酵させる能力に基づいて、形質転換体を選択した。適正なプラスミド保持についてスクリーニングした後、得られた菌株をＮＺ３９００（ｐＬｓｓ１２Ｆ）と称した。
【００６４】
実験室でのシードトレイン（seed train）の開始
２つのバイアルのＮＺ３９００（ｐＬｓｓ１２Ｆ）初期細胞バンク実験ストック（Initial Cell Bank Working Stock）の各々を３００ｍｌのダイズペプトン／酵母抽出物培地に接種し、これを３０±３℃で一晩（１６〜２４時間）インキュベートした。
【００６５】
シードトレイン−３０Ｌ発酵：
一晩の培養物を用いて、Ｃｈｅｍａｐ７５発酵器内の３０Ｌのダイズペプトン／酵母抽出物培地に接種した。この発酵器を３０±３℃で一晩（１６〜２０時間）運転した。
【００６６】
シード製造−３０００Ｌ発酵：
３０リットルのシード培養物を、４，０００リットル発酵器内の３，０００リットルのダイズペプトン／酵母抽出物培地に接種した。リゾスタフィン活性には亜鉛が必要であるため、発酵培地中約３．４μｍの亜鉛を含有させると、リゾスタフィン活性を維持又は増強することができる。発酵を３０±２℃及びｐＨ６．５±０．２で進行させ、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨを調節した。培養物が、約１．０のＯＤ６００に到達したとき、濃度が１０ｎｇ／ｍＬのニシンを用いた誘導を実施した。リゾスタフィン生産を６時間実施した後、発酵器内容物を１０℃以下に冷却することにより、生産工程を停止した。
【００６７】
バイオマスの濃度：
発酵の全乳酸菌バイオマスを精密ろ過により３．８ｍ２の０．８μｍ膜上で濃縮させた。次に細胞を水に対してダイアフィルトレーション（２００％）を行った。
【００６８】
リゾスタフィンの放出−ホモジネート：
１０℃未満のＡＰＶホモジナイザーにおける１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）バッファー中で、濃縮した細胞を３回ホモジネートすることにより、リゾスタフィンをホモジネート中に放出させた。
【００６９】
細胞残屑の除去：
５００〜７５０ｋＤａ限外ろ過膜を用いた限外ろ過により細胞残屑を液体ホモジネートから除去した。限外ろ過の後、溶解物は、約１５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中にあったが、これを水で１：２に希釈した。希釈により、溶液伝導率は１０ｍＳ／ｃｍ以下に低下するが、これによって、カチオンクロマトグラフィー樹脂上での効率的リゾスタフィンの捕獲が可能になる。
【００７０】
捕獲−ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー：
０．４Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４で透過物をｐＨ７．２に調節し、ＳｔａｒｔｏｂｒａｎＰフィルターカプセルでろ過してから、２カラム容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化させておいたＢＰＧ３０００カラム中のＳＰ−セファロース上で精製した。３カラム容量の上記バッファーで洗浄した後、２カラム容量の２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．２５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）で上記リゾスタフィンを溶離させた。リゾスタフィンを含む溶離画分を回収し、−２０℃未満で保存した。
【００７１】
希釈／ろ過：
約１２リットルのＳＰ−溶出液を冷凍庫から取り出し、室温で約１８時間解凍させた。この材料を単一の容器にプールしてから、穏やかに混合することにより、均質な溶液を形成した。１２リットルのＱ平衡バッファー（０．０５Ｍトリス、ｐＨ７）をＳＰ−溶出液プールに添加し、溶液の伝導率を目標の範囲８〜１６ｍＳ／ｃｍにした。混合物を、０．４５μｍ Ｓａｒｔｏｃｌｅａｎフィルターユニットを介して、５０リットルのＳｔｅｄｉｍバッグ中に流し込むことにより、ろ過済ＳＰ−溶出液プールを調製した。
【００７２】
Ｑ−セファロース精製：
事前に最適化したＱ−セファロースＦＦクロマトグラフィーカラム（約２カラム容量のＱ再生バッファー（０．０５Ｍトリス、０．０４Ｍ ＮａＯＨ、１Ｎ ＮａＣｌ）で再生しておいたもの）でろ過済ＳＰ−溶出液プールを精製した後、約３カラム容量のＱ平衡バッファー（０．０５Ｍトリス、０．０４Ｍ ＮａＯＨ）で平衡化した。廃物容器中に６リットルのＱフロースルー（ＱＦ−Ｔ１）を回収するまで、ろ過済ＳＰ−溶出液プールをカラム上にローディングした。残ったプールした材料をカラム上にローディングし、残ったフロースルー（ＱＦ−Ｔ２）をラインド（lined）タンク中に回収した。約１２リットルのＱ平衡バッファーをカラムに注いだ。合計２９．３８リットルのＱＦ−Ｔ２材料を回収した。
【００７３】
Ｑフロースルー−希釈／ろ過：
硫酸アンモニウム（３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を１５分かけて溶液［添加した硫酸アンモニウムの量＝（ＱＦ−Ｔ２）÷２．７５］と混合し、リン酸を用いて、溶液のｐＨを６〜７に調節した。ＱＦ−Ｔ２を単一バッグにろ過し（０．４５μＭ）、２〜８℃で一晩保存した（ろ過済Ｑ溶出液）。
【００７４】
フェニルセファロース精製：
翌日、事前に最適化したフェニル−セファロースＨＰカラム（約２カラム容量のフェニル平衡バッファー（０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．８Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）で均衡しておいたもの）で、ろ過済Ｑ溶出液を精製した。
【００７５】
ろ過済Ｑ溶出液をカラムにローディングした後、約２カラム容量のフェニルすすぎバッファー（０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）ですすいだ。精製したリゾスタフィンＡＰＩをフェニル溶離バッファー（０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．２５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）で溶離した。約５１リットルのフェニル溶出液を回収した（溶出液のＯＤ２８０＞０．２）。材料を周囲温度で一晩保存した。
【００７６】
限外ろ過／ダイアフィルトレーション：
翌日、２０ｆｔ２５ＫＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）ペリコンカセットを備える衛生化ミリポアペリコン限外ろ過アセンブリーを３リットルのフェニル再生バッファーで平衡化し、排水した。リゾスタフィンの目標濃度である約２５ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ２８０値により決定される）が達成されるまで、フェニル溶出液を限外ろ過により濃縮した。濃縮したフェニル溶出液をＷＦＩに対してダイアフィルトレーションを行った。材料の伝導率が０．５〜０．６ｍＳ／ｃｍに低下するまで、透過物をラインドタンクに回収した。ダイアフィルトレーション濃縮物のタンパク質濃度をＯＤ２８０により決定し、さらなる透過物を回収して、リゾスタフィンの目標濃度である約２５ｍｇ／ｍＬを達成した。ペリコン装置をすすぎ、排水して、回収した透過物にすすぎ液容量を加えた（ダイアフィルトレーションを行ったフェニル溶出液、製剤化濃縮物）。
【００７７】
ろ過：
製剤化濃縮物をミリパック２００ユニット（０．２μＭフィルター）を介して、２つの個別のＳｔｅｄｉｍ５リットルバック（バッグ１及びバッグ２）にろ過することにより、バルクＡＰＩを調製した。サンプルを各バッグから回収し、分析、バイオバーデン、及びエンドトキシン試験に供した。
【００７８】
バルクＡＰＩ（活性医薬成分）：
バルクＡＰＩ、すなわち、ダイアフィルトレーションを行ったＱ及びフェニルセファロース精製リゾスタフィンを２〜８℃で保存した。図９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルでのリゾスタフィンＡＰＩの例を示す。
【００７９】
実施例６
様々な濃度のリゾスタフィンを用いた殺菌アッセイによる均質な成熟リゾスタフィンと均質な切断型リゾスタフィンの比較
前記とほぼ同様に調製した均質な成熟リゾスタフィン（ＡＡＴＨＥ）と均質な切断型リゾスタフィン(THE)を以下のように標準効力アッセイで比較した：
アッセイのためのリゾスタフィン実験ストックの調製：
約１ミリグラムのリゾスタフィン粉末を各々１ｍｌのＰＢＳに溶解させることにより、ストックサンプルを調製した。ストックサンプルを１：５及び１：１０（８００μｌ中２００μｌと９００μｌ中１００μｌ）に希釈した。ＰＢＳをブランクとして用いたＢｉｏＲａｄ  ＳｍａｒｔＳｐｅｃ３０００分光光度計で、１：５及び１；１０希釈物のＡ２８０を読み取った。各希釈物の吸光度に０．４９（吸光係数の逆数）と希釈係数（５又は１０）をかけることにより、ストック溶液の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を決定した。ストック溶液は、各希釈物の決定濃度が互いの１０％以内にあるときだけ用いた。５〜６ｎｇ／μｌ実験ストックが得られるまでＰＢＳでさらにストック溶液を希釈し、使用するまで氷上に維持した。実験ストックのアリコートを−７０℃で保存した。
【００８０】
細菌調製物：
黄色ブドウ球菌５ＡＴＣＣ４９５２１型の凍結ストックを血液寒天に線状に塗り、一晩インキュベートした。３つのコロニーを１ｍｌのＤＩＦＣＯトリプシン（tyrptic）ダイズブロスに移し、３７℃で振盪しながら一晩インキュベートすることにより、細菌ストックを調製した。ＯＤ６５０が０．７５０〜０．７９０になるまで、細菌ストックをＰＢＳで基準化した。基準化ストックの１０倍連続希釈物をＰＢＳで調製した。３５０μｌの基準化ストックと６５０μｌのＰＢＳを混合し、１００μｌの血液寒天上で平板培養することにより、実際の出発ＣＦＵを決定した。
【００８１】
リゾスタフィン希釈物：
３つの独立したセットの希釈物を各リゾスタフィンについて調製した（１サンプルにつき１８本の試験管、１セットにつき６本、１系列につき３本）。各セットは、４８、２４、１２ｎｇ／ｍｌリゾスタフィンと３２、１６、８ｎｇ／ｍｌリゾスタフィンの２つの希釈系列を含んでいた。その結果、各サンプルにつき１試験管当たり６５０μｌのリゾスタフィンを含む試験管１８本が得られ、１サンプルは３つのセットに分けられる（各セットは、４８、３２、２４、１６、１２及び８ｎｇからなる）。
【００８２】
アッセイの性能：
反応を開始するために、３５０μｌの実験ストック細菌を、サンプルセットに含まれる１８本の試験管各々に添加し、ボルテックスにより混合した。サンプルを室温で２０分インキュベートし、さらに１０分混合した直後に平板培養した。２０分後、各試験管から１００μｌのサンプルを血液寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを数え、結果をプロットした。３つのアッセイの結果を図１０〜１２に示したが、これらから、広い濃度範囲にわたって、成熟形態（ＡＡＴＨＥ・・・）と比較して、切断型のリゾスタフィン（ＴＨＥ・・・）の殺菌活性が全般に高いことが明らかである。
【００８３】
実施例７
全血において増殖させた培養物に対する時間経過殺菌アッセイによる均質な成熟リゾスタフィンと均質な切断型リゾスタフィンの比較
リゾスタフィンは一般にバッファーよりも全血において活性が低い。全長リゾスタフィンに対する切断型リゾスタフィンの活性の増強をさらに調べるために、以下に示すように、全血における時間経過殺菌アッセイで、均質な成熟及び切断型リゾスタフィンを比較した。黄色ブドウ球菌の培養物をＤＩＦＣＯトリプシンダイズブロスにおいて一晩増殖させた。黄色ブドウ球菌の一晩培養物の５０μｌアリコートを用いて、各々１ｍｌの新鮮なヒト血液を含む６本の試験管に接種した。接種を受けた血液を振盪しながら３７℃で一晩増殖させ、翌日プールした。プールした血液培養物の１ｍｌアリコートを１マイクログラムの均質な成熟（ＡＡＴＨＥ）又は切断型（ＴＨＥ）リゾスタフィンと混合し、室温でインキュベートした。示した時点で、各々の１００μｌサンプルをＰＢＳ中で１：１００に希釈した。１００μｌの各ＰＢＳ希釈物を血液寒天プレートに載せ、３７℃で一晩培養することにより、コロニーを増殖させた。コロニーを数え、その結果を図１３及び１４にプロットした。これらの結果から、成熟形態（ＡＡＴＨＥ・・・）と比較して、切断型のリゾスタフィン（ＴＨＥ・・・）の高い殺菌活性は、インキュベーション時間が長いほど顕著に現れることがわかる。
【００８４】
実施例８
光学密度低下アッセイによる均質な成熟リゾスタフィンと均質な切断型リゾスタフィンの比較
以下に示すように、時間経過濁度低下アッセイで均質な成熟及び切断型リゾスタフィンを比較した。
【００８５】
試験サンプル調製：
前記のように、リゾスタフィンストック溶液をＰＢＳ中で調製し、ＰＢＳで希釈することにより、約０．１ｍｇ／ｍｌ実験ストックとした。
【００８６】
アッセイ用細菌の調製：
スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）の３〜５ｍｌ培養物を血液寒天プレート（調製から１週間以内のもの）からのＤＩＦＣＯトリプシンダイズブロスにおいて一晩増殖させた。Ｓ．カルノサスの一晩培養物１．５ミリリットルを最大ｒｐｍで５分マイクロ遠心することによりペレット化した。細菌ペレットを等量のＰＢＳで洗浄し、再度ペレット化した。洗浄したペレットを３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＰＢＳで希釈することにより、最終ＯＤ６５０を１．５５＋／−０．０４とした。使用するまで、希釈した細菌を氷上に保存した。
【００８７】
アッセイの性能：
ＢｉｏＲａｄ  ＳｍａｒｔＳｐｅｃ３０００により、再懸濁したＳ．カルノサスの濁度低下を追跡したが、この装置はＰＢＳに対してブランクを除き、以下のパラメーター：６５０ｎＭ、合計持続時間９００秒、間隔３０秒、及びバックグラウンド差引きなしを用いて、「動力学」アッセイのために設定しておいたものである。各リゾスタフィン調製物について、５００μｌの約１．５５吸光度細菌をピペットで新鮮なキュベットに入れ、室温まで温めた。ゼロ読取り値を決定した後、速やかに１μｇ（１０μｌ）のリゾスタフィン（ＡＡＴＨＥ又はＴＨＥのいずれか）の添加及び混合を行なった。各混合物のＯＤ６５０を６０分にわたって決定し、以下の式に従いリゾスタフィン活性を決定した：
（基準リゾスタフィンのOD650に対する時間（分）×添加量μg）  ×100＝単位/μg
（サンプルリゾスタフィンのOD650に対する時間（分）×添加量μg）
図１５及び１６に示す、２つの光学密度低下アッセイの結果から、切断型リゾスタフィン（ＴＨＥ・・・）の殺菌活性は成熟形態（ＡＡＴＨＥ・・・）より高速であることがわかる。このアッセイは６０分で終了したことに留意されたい。インキュベーション時間が何時間・何日も測定されるin vivoでは、切断型リゾスタフィンの活性は成熟形態のものよりはるかに高いと考えられる。
【００８８】
結論
従って、実施例１及び２は、リゾスタフィンの均質な形態を発現する組換えＤＮＡ分子の設計及び製造について説明する。これらのプラスミドにより、リゾスタフィンの細胞内発現又はリゾスタフィンの細胞外分泌のいずれかが可能になる。実施例３から、これらのプラスミドを細菌宿主細胞に形質転換させると、リゾスタフィンを発現し、このリゾスタフィンが酵素として活性であることがわかる。実施例４は、リゾスタフィンの切断形態がその「成熟」全長形態と比較して、高い抗ブドウ球菌活性を発揮することを明らかにしている。実施例５は、組換えリゾスタフィンの大量精製プロトコルについて説明する。実施例６、７及び８からは、リゾスタフィンの切断ＴＨＥ形態が、リゾスタフィンの成熟したＡＡＴＨＥ形態より優れた抗ブドウ球菌活性を有することがわかる。
【００８９】
当業者は、本発明の組換えＤＮＡ分子が前記実施例に記載したものだけに限定されないことを認識するであろう。当業者であれば、前記以外の宿主細胞を発現に使用できることがわかる。当業者は、組換えＤＮＡ分子に関する遺伝エレメント、例えば、プロモーター及び複製起点に代わり、別の宿主細胞で同じ機能を達成する別の配列を用いることができることもわかるであろう。このような別の配列は、当業者にはよく知られている。さらに、本発明は、前記の方法により精製したリゾスタフィンに限定されるわけではない。当業者であれば、別のタンパク質精製方法を用いて、本発明の同じ目的を達成することができるであろう。
【００９０】
以下の文献は、参照により本明細書に明確に組み入れるものとする： 
１．Chang, F. Y., N. Singh, T. Gayowski, S. D. Drenning, M. M. Wagener and I. R. Marino.  1998.  Staphylococcus aureus nasal colonization and association with infections in liver transplant recipients.  Transplantation  65:1169-1172. 
２．Chapoutot, C., G.-P. Pageaux, P. F. Perrigault, Z. Joomaye, P. Perney, H. Jean-Pierre, O. Jouquet, P. Blanc and D. Larrey.  1999.  Staphylococcus aureus nasal carriage in 104 cirrhotic and control patients A prospective study.  J. Hepatol.  30:249-253. 
３．Fierobe, L., D. Decre, C. Muller, J.-C. Lucet, J.-P. Marmuse, J. Mantz and J.-M. Demonts.  1999.  Methicillin-resistant Staphylococcus aureus as a causative agent of postoperative intra-abdominal infection: relation to nasal colonization.  Clin. Infect. Dis.  29:1231-1238. 
４．Frebourg, N., B. Cauliez and J.-F. Lemeland.  1999.  Evidence for nasal carriage of methicillin-resistant staphylococci colonizing intravascular devices.  J. Clin. Micro.  37:1182-1185. 
５．Heinrich, P., R. Rosenstein, M. Bohmer, P. Sonner , and F. Gotz  1987.  The molecular organization of the lysostaphin gene and its sequences repeated in tandem.  Mol. Gen. Genet.  209:563-9. 
６．Kline SA, J. de la Harpe , and P. Blackburn.  1994.  A colorimetric microtiter plate assay for lysostaphin using a hexaglycine substrate. Anal Biochem. 217:329-31. 
７．Kluytmans, J., A. van Belkum and H. Verbrugh.  1997.  Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks.  Clin. Micro. Rev.  10:505-520. 
８．Kluytmans, J. A., J. W. Mouton, M. VandenBergh, M.-J. Manders, A. Maat, J. Wagenvoort, M. Michel and H. Verbrugh.  1996.  Reduction of surgical-site infections in cardiothoracic surgery by elimination of nasal carriage of Staphylococcus aureus. Infect. Control.Hosp. Epidem.  17:780-785. 
９．Martin, J., F. Perdreau-Remington, M. Kartalija, O. Pasi, M. Webb, J. Gerberding, H. Chambers, M. Tauber and B. Lee.  1999.  A randomized clinical trial of mupirocin in the eradication of Staphylococcus aureus nasal carriage in human immunodeficiency virus disease.  J. Infect. Dis.  180:896-899. 
10．Merkus, F.W., J.C. Verhoef, N.G. Schipper, and E. Marttin.  1999.  Cyclodextrins in nasal drug delivery.  Advan. Drug Deliv. Rev.  36:41-57. 
11．Nakamura, K. et al.  1999.  Uptake and Release of Budesonide from Mucoadhesive, pH-sensitive Copolymers and Their Application to Nasal Delivery.  J. Control. Release  61:329-335. 
12．Natsume, H., S. Iwata, K. Ohtak, M. Miyamoto, M. Yamaguchi, K. Hosoya, and D. Kobayashi.  1999.  Screening of cationic compounds as an absorption enhancer for nasal drug delivery.  Int. J. Pharma.  185:1-12. 
13．Nguyen, M. H., C. Kauffman, R. Goodman, C. Squier, R. Arbeit, N. Singh, M. Wagener and V. Yu.  1999.  Nasal carriage of and infection with Staphylococcus aureus in HIV-infected patients.  Ann. Int. Med.  130:221-225. 
14．Ramkissoon-Ganorkar, C. et al.  1999.  Modulating insulin-release profile from pH/thermosensivite polymeric beads through polymer molecular weight.  J. Contr. Release  59:287-298. 
15．Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (A. Gennaro編, Mack Pub., Easton, Pa., 1990). 
16．Ribeiro, A.J. et al.  1999.  Microencapsulations of lipophilic drugs in chitosan-coated alginate microspheres.  Int. J. Pharm.  187:115-123. 
17．Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989).  Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Edition.,  Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour. 
18．Schwab, U. E., A. E. Wold, J. L. Carson, M. W. Leigh, P.-W. Cheng, P. H. Gilligan and T. F. Boat.  1993.  Increased adherence of Staphylococcus aureus from cystic fibrosis lungs to airway epithelial cells.  Am. Rev. Respir. Dis.  148:365-369. 
19．Soane, R.J.  et al.  1999.  Evaluation of the clearance characteristics of bioadhesive systems in humans.  Int. J. Pharm.  178:55-65. 
20．Soto, N., A. Vaghjimal, A. Stahl-Avicolli, J. Protic, L. Lutwick and E. Chapnick.  1999.  Bacitracin versus mupirocin for Staphylococcus aureus nasal colonization.  Infect. Cont. Hosp. Epidem.  20:351-353. 
21．Suzuki, Y. and Y. Makino.  1999.  Mucosal drug delivery using cellulose derivative as a functional polymer.  J. Control. Release.  62:101-107. 
22．Takenaga, M., Y. Sirizawa, Y. Azechi, A. Ochiai, Y. Kosaka, R. Igarashi, and Y. Mizushima.  1998.  Microparticle resins as a potential nasal drug delivery system for insulin.  J. Control. Release.  52:81-87. 
23．VadenBergh, M., E. Yzerman, A. Van Belkum, H. Boelens, M. Simmons and H. Verbrugh.  1999.  Follow-up of Staphylococcus aureus nasal carriage after 8 years: redefining the persistent carrier state.  J. Clin. Micro.  37:3133-3140. 
24．White, A. and J. Smith.  1963.  Nasal reservoir as the source of extranasal staphylococci.  Antimicrob. Agent. Chem.  3:679-683. 
25．Yano, M., Y. Doki, M. Inoue, T. Tsujinaka, H. Shiozaki and M. Monden.  2000.  Preoperative intranasal mupirocin ointment significantly reduces postoperative infection with Staphylococcus aureus in patients undergoing upper gastrointestinal surgery.  Surg. Today  (Japan). 30:16-21. 
26．Yu, V. L., A. Goetz, M. Wagener, P. B. Smith, J. D. Rihs, J. Hanchett and J. J. Zuravleff.  1986.  Staphylococcus aureus nasal carriage and infection in patients on hemodialysis.  New Engl. J. Med. 315:91-96. 
27．Zygmunt, W. A. and P. A. Tavormina.  1972.  Lysostaphin: Model for a Specific Enzymatic Approach to Infectious Disease.  Prog. Drug Res. 16:309-333.
28．Climo, M. W., R. L. Patron, B. P. Goldstein, and G. L. Archer. 1998. Lysostaphin treatment of experimental methicillin-resistant Staphylococcus aureus aortic valve endocarditis. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1355-1360.
29．Kokai-Kun, J., T. Chanturiya, and J. Mond. 2002. Lysostaphin as a therapy for systemic Staphylococcus aureus infection. Presented at the American Society for Microbiology 102nd General Meeting, Salt Lake City, Utah.
30．本明細書及び本明細書に開示された本発明の実施を考慮すれば、当業者には本発明の他の実施形態が明らかでありうる。本明細書及び実施例は例示として考えられ、本発明の真の範囲及び精神は添付の特許請求の範囲によって示されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】オーバーラップ伸長ＰＣＲクローニング方法の概要を示す略図である。
【図２】プラスミドｐＪＳＢ２８、ｐＪＳＢ２８によりコードされる切断型リゾスタフィンタンパク質のアミノ酸配列、並びにｐＪＳＢ２８において切断型リゾスタフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列の制限マップを提供する。
【図３Ａ】プラスミドｐＪＳＢ２０、ｐＪＳＢ２０によりコードされる切断型リゾスタフィンタンパク質及びシグナルポリペプチドのアミノ酸配列、並びにｐＪＳＢ２０において切断型リゾスタフィンタンパク質及びシグナルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の制限マップを提供する。下線を引いたアミノ酸はシグナルポリペプチド配列を示している。
【図３Ｂ】図３Ａの続きを示す。
【図４】ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｐＪＳＢ２８又はｐＪＳＢ２０で形質転換した宿主細胞が細胞内及び細胞外切断型リゾスタフィンをそれぞれ生産することを示す図である。
【図５】黄色ブドウ球菌溶解アッセイにより、ｐＪＳＢ２８又はｐＪＳＢ２０で形質転換した宿主細胞が機能的切断型リゾスタフィンを生産することを示す図である。
【図６Ａ】比色分析アッセイにより、リゾスタフィンの切断形態が成熟全長形態より活性が高いことを示す図である。
【図６Ｂ】比色分析アッセイにより、リゾスタフィンの切断形態が成熟全長形態より活性が高いことを示す図である。
【図７Ａ】それぞれ、プラスミドｐＲＮ５５５０、ｐＮＺ８１４８Ｓｃａｌ、ｐＬＳＳ１Ｃ、及びｐＬｓｓ１２Ｆの制限マップを提供する。ｐＬｓｓ１２Ｆは、リゾスタフィンの切断形態をコードし、これは、本発明で開示する方法を用いて大量精製される。
【図７Ｂ】それぞれ、プラスミドｐＲＮ５５５０、ｐＮＺ８１４８Ｓｃａｌ、ｐＬＳＳ１Ｃ、及びｐＬｓｓ１２Ｆの制限マップを提供する。ｐＬｓｓ１２Ｆは、リゾスタフィンの切断形態をコードし、これは、本発明で開示する方法を用いて大量精製される。
【図７Ｃ】それぞれ、プラスミドｐＲＮ５５５０、ｐＮＺ８１４８Ｓｃａｌ、ｐＬＳＳ１Ｃ、及びｐＬｓｓ１２Ｆの制限マップを提供する。ｐＬｓｓ１２Ｆは、リゾスタフィンの切断形態をコードし、これは、本発明で開示する方法を用いて大量精製される。
【図７Ｄ】それぞれ、プラスミドｐＲＮ５５５０、ｐＮＺ８１４８Ｓｃａｌ、ｐＬＳＳ１Ｃ、及びｐＬｓｓ１２Ｆの制限マップを提供する。ｐＬｓｓ１２Ｆは、リゾスタフィンの切断形態をコードし、これは、本発明で開示する方法を用いて大量精製される。
【図８Ａ】プラスミドｐＬｓｓ１２Ｆにみいだされる切断型リゾスタフィンをコードする核酸配列を提供する。この核酸配列は、２５５位にＴからＣへのサイレント突然変異を含んでいる。
【図８Ｂ】図８Ａの続きを示す。
【図９】大量精製プロトコルに従うＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルでのリゾスタフィンの切断形態を示す図である。
【図１０】広範なリゾスタフィン濃度にわたって均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１１】広範なリゾスタフィン濃度にわたって均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１２】広範なリゾスタフィン濃度にわたって均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１３】培養したヒト血液において、６０分の時間経過による均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１４】培養したヒト血液において、６０分の時間経過による均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１５】ＯＤ低下アッセイにおいて均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【図１６】ＯＤ低下アッセイにおいて均質切断型及び均質成熟リゾスタフィンの殺菌活性を比較する図である。
【配列表】
2005519628.tif 000003
2005519628.tif 000004
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2005519628.tif 000014
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【図１】
2005519628.tif 000016
【図２】
2005519628.tif 000017
【図３Ａ】
2005519628.tif 000018
【図３Ｂ】
2005519628.tif 000019
【図４】
2005519628.tif 000020
【図５】
2005519628.tif 000021
【図６Ａ】
2005519628.tif 000022
【図６Ｂ】
2005519628.tif 000023
【図７Ａ】
2005519628.tif 000024
【図７Ｂ】
2005519628.tif 000025
【図７Ｃ】
2005519628.tif 000026
【図７Ｄ】
2005519628.tif 000027
【図８Ａ】
2005519628.tif 000028
【図８Ｂ】
2005519628.tif 000029
【図９】
2005519628.tif 000030
【図１０】
2005519628.tif 000031
【図１１】
2005519628.tif 000032
【図１２】
2005519628.tif 000033
【図１３】
2005519628.tif 000034
【図１４】
2005519628.tif 000035
【図１５】
2005519628.tif 000036
【図１６】
2005519628.tif 000037
【国際調査報告】
2005519628.tif 000038
2005519628.tif 000039
2005519628.tif 000040