(57)【要約】本発明は、その治療が免疫応答の増強により改善されるあらゆる疾患、例えば感染症、原発性および転移性の新生物疾患(すなわち、癌)、または神経変性疾患もしくはアミロイド病の予防および治療に有用な方法ならびに医薬組成物に関する。特に、意図される発明は、熱ショック/ストレスタンパク質(HSP)またはHSP複合体を、単独で、または互いに組み合わせて、免疫反応性試薬の投与と組み合わせて投与することを含む方法を対象とする。本発明は、免疫反応性試薬と組み合わせた1種または複数種のHSPまたはHSP複合体を含む医薬組成物も提供する。さらに、本発明は、受動免疫療法およびエフェクター細胞機能を増強または改善するための、本発明の方法および組成物の使用を意図する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法を必要とする被験体に精製されたHSP製剤および精製された免疫反応性試薬を投与することを含む、免疫療法の方法。
【請求項２】
免疫反応性試薬を投与されている被験体に精製されたHSP製剤を投与することを含む、該被験体において受動免疫化治療の結果を改善する方法。
【請求項３】
癌をその治療を必要とする被験体において治療する方法であって、精製されたHSP製剤および癌に治療効果のある精製された免疫反応性試薬を該被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
感染症をその治療を必要とする被験体において治療する方法であって、精製されたHSP製剤および該感染症に治療効果のある精製された免疫反応性試薬を該被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
神経変性/アミロイド疾患または障害をその治療を必要とする被験体において治療する方法であって、HSP製剤および該神経変性/アミロイド疾患または障害に治療効果のある精製された免疫反応性試薬を該被験体に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
下記ステップ：
(a)免疫応答がそれに対して生じるのが望まれる成分の抗原を認識する精製された免疫反応性試薬を被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体に熱ショックタンパク質製剤を投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記免疫反応性試薬によって認識される前記成分の抗原性を示さない、前記ステップ；
を含み、それにより前記被験体において免疫応答が生じる、免疫療法の方法。
【請求項７】
被験体において免疫反応性試薬による免疫応答を増強または誘導する方法であって、下記ステップ：
(a)前記被験体に熱ショックタンパク質製剤を投与するステップ；および
(b)前記被験体に、免疫応答がそれに対して誘導されることが望まれる成分の抗原を認識する精製された免疫反応性試薬を投与するステップであって、ただしその免疫反応性試薬の量がステップ(a)を行わない場合に前記成分に対して最適量未満の量である、前記ステップ；
を含み、それにより前記被験体において免疫応答が誘導され、かつ前記熱ショックタンパク質製剤が前記成分の抗原性を示さないものである、前記方法。
【請求項８】
下記ステップを含む、感染症をそれを必要とする被験体において治療または予防する方法：
(a)前記感染症を引き起こす感染性因子と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；および
(b) 前記ステップ(a)と組み合わせた場合に前記感染性因子に対する免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記因子の抗原性を示さない、前記ステップ。
【請求項９】
下記ステップを含む、被験体において癌を治療または予防する方法：
(a)癌細胞と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体において免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の抗原性を示さない、前記ステップ。
【請求項１０】
下記ステップを含む、被験体において神経変性疾患を治療または予防する方法：
(a)前記障害と関連する分子を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体において免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記分子の抗原性を示さない、前記ステップ。
【請求項１１】
下記ステップ：
(a)免疫応答がそれに対して生じることが望まれる成分の抗原を認識する免疫反応性試薬を被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体に熱ショックタンパク質製剤を投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記成分の抗原性を示さない、前記ステップ；
を含み、それにより免疫応答が前記被験体で生じる、免疫療法の方法。
【請求項１２】
被験体において免疫反応性試薬によって免疫応答を誘導する方法であって、下記ステップ：
(a)被験体に熱ショックタンパク質製剤を投与するステップ；および
(b)前記被験体に、免疫応答がそれに対して誘導されることが望まれる成分の抗原を認識する免疫反応性試薬を投与するステップであって、ただしその免疫反応性試薬の量がステップ(a)を行わない場合に前記成分に対して免疫原性未満となる量である、前記ステップ；
を含み、それにより前記被験体において免疫応答が誘導され、かつ前記熱ショックタンパク質製剤が前記成分の抗原性を示すものである、前記方法。
【請求項１３】
下記ステップを含む、感染症をそれを必要とする被験体において治療または予防する方法：
(a)前記感染症を引き起こす感染性因子と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；および
(b)前記ステップ(a)と組み合わせた場合に前記感染性因子に対する免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記因子の抗原性を示す、前記ステップ。
【請求項１４】
下記ステップを含む、被験体において癌を治療または予防する方法：
(a)癌細胞と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体において免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の抗原性を示す、前記ステップ。
【請求項１５】
下記ステップを含む、被験体において神経変性疾患を治療または予防する方法：
(a)前記疾患と関連する分子を認識する免疫反応性試薬を被験体に投与するステップ；および
(b)前記被験体において免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記熱ショックタンパク質製剤が前記分子の抗原性を示す、前記ステップ。
【請求項１６】
前記免疫反応性試薬の投与の結果として前記被験体に生じた免疫応答が、ステップ(b)を行わない場合の免疫応答と比較して増大している、請求項６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
下記ステップ：
(a)免疫応答がそれに対して生じることが望まれる成分上の抗原を認識する免疫反応性試薬を、免疫療法を必要とする被験体に投与するステップ；および
(b)活性化抗原提示細胞を含む組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と接触させたものであり、かつ前記熱ショックタンパク質製剤は前記成分の抗原性を示す、前記ステップ；
を含む、それにより前記成分に対する免疫応答が前記被験体で生じる、免疫療法の方法。
【請求項１８】
免疫応答を、それを必要とする被験体において免疫反応性試薬によって誘導する方法であって、下記ステップ：
(a)活性化抗原提示細胞を含む組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；
(b)前記被験体に、免疫応答がそれに対して誘導されることが望まれる成分上の抗原を認識する免疫反応性試薬を投与するステップであって、ただしその免疫反応性試薬の量がステップ(a)を行わない場合に前記成分に対して最適量未満の量である、前記ステップ；
を含み、それにより前記被験体において前記成分に対する免疫応答が誘導される、前記方法。
【請求項１９】
下記ステップを含む、感染症をそれを必要とする被験体において治療または予防する方法：
(a)前記感染症を引き起こす感染性因子と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を、前記被験体に投与するステップ；および
(b)活性化抗原提示細胞を含むある量の組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されており、そして前記活性化抗原提示細胞を含む組成物の量がステップ(a)と組み合わせた場合に前記被験体において前記因子に対する免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量である、前記ステップ。
【請求項２０】
下記ステップを含む、癌をそれを必要とする被験体において治療または予防する方法：
(a)癌細胞と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；および
(b)活性化抗原提示細胞を含むある量の組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されており、そして前記活性化抗原提示細胞を含む組成物の量がステップ(a)と組み合わせた場合に前記被験体において前記細胞に対する免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量である、前記ステップ。
【請求項２１】
下記ステップを含む、神経変性疾患をそれを必要とする被験体において治療または予防する方法：
(a)前記疾患と関連する分子を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；
(b)活性化抗原提示細胞を含むある量の組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されており、そして前記活性化抗原提示細胞を含む組成物の量がステップ(a)と組み合わせた場合に前記被験体において前記分子に対する免疫応答を誘導または増大させるのに有効な量である、前記ステップ。
【請求項２２】
前記活性化抗原提示細胞を前記免疫反応性試薬の投与の前に投与する、請求項１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化抗原提示細胞を前記免疫反応性試薬の投与と同時に投与する、請求項１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化抗原提示細胞を前記免疫反応性試薬の投与の後に投与する、請求項１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２６】
下記ステップ：
(a)免疫応答がそれに対して誘導されることが望まれる成分の抗原を認識する免疫反応性試薬を被験体に投与するステップ;
(b)前記被験体に第1の熱ショックタンパク質製剤を投与するステップ；および
(c)活性化抗原提示細胞を含むある量の組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は第2の熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；
を含み、それにより前記成分に対する免疫応答が前記被験体で生じる、免疫療法の方法。
【請求項２７】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
被験体において免疫反応性試薬によって免疫応答を誘導する方法であって、下記ステップ：
(a)被験体に第1の熱ショックタンパク質製剤を投与するステップ；
(b)活性化抗原提示細胞を含むある量の組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は第2の熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；および
(c)前記被験体に、免疫応答がそれに対して誘導されることが望まれる成分上の抗原を認識する免疫反応性試薬を投与するステップであって、ただしこの免疫反応性試薬の量がステップ(a)および/またはステップ(c)を行わない場合に前記成分に対して最適量未満の量である、前記ステップ；
を含み、それにより前記成分に対する免疫応答が前記被験体で誘導される、前記方法。
【請求項３２】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記成分の免疫原性を示さない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
被験体において感染症を治療または予防する方法であって、下記ステップ：
(a)前記感染症を引き起こす感染性因子と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；
(b)ステップ(a)および/またはステップ(c)と組み合わせて前記因子に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の第1の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップ；ならびに
(c)ステップ(a)および/またはステップ(b)と組み合わせて前記病原体に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の、活性化抗原提示細胞を含む組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は第2の熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；
を含み、それにより前記因子に対する免疫応答が前記被験体で生じる、前記方法。
【請求項３９】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示さない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示さない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記感染性因子の免疫原性を示さない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
被験体において癌を治療または予防する方法であって、下記ステップ：
(a)癌細胞と関連する抗原を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；
(b)前記ステップ(a)および/またはステップ(c)と組み合わせて前記癌細胞に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の第1の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップ；ならびに
(c)ステップ(a)および/またはステップ(b)と組み合わせて前記癌細胞に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の、活性化抗原提示細胞を含む組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；
を含み、それにより前記癌細胞に対する免疫応答が前記被験体で生じる、前記方法。
【請求項４６】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示さない、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示さない、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記癌細胞の免疫原性を示さない、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
被験体において神経変性疾患を治療または予防する方法であって、下記ステップ：
(a)前記神経変性疾患と関連する分子を認識する免疫反応性試薬を前記被験体に投与するステップ；
(b)ステップ(a)および/またはステップ(c)と組み合わせて前記分子に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の第1の熱ショックタンパク質製剤を前記被験体に投与するステップ；ならびに
(c)ステップ(a)および/またはステップ(b)と組み合わせて前記分子に対する免疫応答を前記被験体で誘導または増大させるのに有効な量の、活性化抗原提示細胞を含む組成物を前記被験体に投与するステップであって、ただし前記抗原提示細胞は第2の熱ショックタンパク質製剤と前記抗原提示細胞とを接触させることにより活性化されている、前記ステップ；
を含み、それにより前記分子に対する免疫応答が前記被験体で生じる、前記方法。
【請求項５３】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示さない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第1および第2の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示す、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示さない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記第2の熱ショックタンパク質製剤が前記分子の免疫原性を示さない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
精製されたHSP製剤と1種または複数種の精製された免疫反応性試薬を含む組成物。
【請求項６０】
活性化APCをさらに含む請求項６０に記載の組成物。
【請求項６１】
前記組成物がエフェクター細胞機能を増強する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
下記(a)および(b)を含むキット：
(a) それに対する免疫応答が望まれる免疫反応性試薬の成分に対してこの免疫反応性試薬によって惹起される免疫応答を増大させるのに有効な量の精製された熱ショックタンパク質製剤を含有する第1の容器；および
(b) (a)の前記熱ショックタンパク質製剤の投与の前、または投与と同時にまたは投与後に投与された場合に、前記成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の免疫反応性試薬を精製された状態で含有する第2の容器。
【請求項６３】
前記免疫反応性試薬が予防用または治療用抗体である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６４】
前記免疫反応性試薬がモノクローナル抗体である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫反応性試薬がポリクローナル抗体である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６６】
前記免疫応答が、増強されたエフェクター細胞機能である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６７】
前記免疫応答が、増強されたサイトカイン放出である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫応答が、細胞、病原体または抗体によって認識されるエピトープを有するタンパク質を標的にした、増強された抗体依存性細胞傷害または抗体媒介オプソニン処理もしくは食作用である、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項６９】
前記熱ショックタンパク質製剤が、hsp60、hsp70、hsp90、gp96、カルレティキュリンまたはそれらの組合せからなる群から選ばれる熱ショックタンパク質を含む、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７０】
前記熱ショックタンパク質製剤が、hsp60-ペプチド複合体、hsp70-ペプチド複合体、hsp90-ペプチド複合体、gp96-ペプチド複合体、カルレティキュリン-ペプチド複合体またはそれらの組合せからなる群から選ばれる熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含む、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７１】
前記熱ショックタンパク質製剤が、熱ショックタンパク質-ペプチド複合体および精製された熱ショックタンパク質を含む、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７２】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤および第2の熱ショックタンパク質のそれぞれが、hsp60、hsp70、hsp90、gp96、カルレティキュリンまたはそれらの組合せからなる群から選ばれる熱ショックタンパク質を含む、請求項２６、３１、３８、４５または５２に記載の方法。
【請求項７３】
前記第1の熱ショックタンパク質製剤および第2の熱ショックタンパク質のそれぞれが、hsp60-ペプチド複合体、hsp70-ペプチド複合体、hsp90-ペプチド複合体、gp96-ペプチド複合体、カルレティキュリン-ペプチド複合体またはそれらの組合せからなる群から選ばれる熱ショックタンパク質-ペプチド複合体を含む、請求項２６、３１、３８、４５または５２に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験体がヒトであり前記熱ショックタンパク質製剤が哺乳類の熱ショックタンパク質を含む、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７５】
前記熱ショックタンパク質製剤が前記免疫反応性試薬の投与の前に投与される、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７６】
前記熱ショックタンパク質製剤が前記免疫反応性試薬の投与と同時に投与される、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７７】
前記熱ショックタンパク質製剤が前記免疫反応性試薬の投与の後に投与される、請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項７８】
前記感染症が、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスI型ウイルス、単純ヘルペスII型ウイルス、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全症ウイルスI型(HIV-I)、ヒト免疫不全ウイルスII型(HIV-II)、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レジオネラ、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマおよびクラミジアからなる群から選ばれた感染性因子に起因する、請求項２、８、１３、１９または３８に記載の方法。
【請求項７９】
前記癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病(骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性および赤白血病)；慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ球性白血病)；ならびに、真性多血症、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ヴァルデンシュトレームマクログロブリン血症および重鎖病、からなる群から選ばれた、請求項３、９、１４、２０または４５に記載の方法。
【請求項８０】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、加齢と関係した認知機能の低下、老人性痴呆症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性小児麻痺、進行性核上性麻痺、グアム病、レーヴィ小体痴呆、プリオン病、海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ポリグルタミン病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、フリードリッヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作疾患、癲癇、慢性発作疾患、脳卒中、脳外傷、脊髄外傷、AIDS痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経性機能障害、高血圧、神経精神病性障害、統合失調症または分裂情動障害からなる群から選ばれた、請求項５、１０、１５、２１または５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  発明の分野
本発明は、その治療が免疫応答の増強により改善されるあらゆる疾患、例えば感染症、原発性および転移性の新生物疾患(すなわち、癌)、または神経変性もしくはアミロイド疾患の予防および治療に有用な方法および医薬組成物に関する。特に、意図される発明は、熱ショック/ストレスタンパク質(HSP)またはHSP複合体を、単独で、または互いに組み合わせて、免疫反応性試薬の投与と組み合わせて投与することを含む方法を対象とする。本発明は、免疫反応性試薬と組み合わせた1種または複数種のHSPまたはHSP複合体を含む医薬組成物も提供する。さらに、本発明は、受動免疫療法およびエフェクター細胞機能を増強または改善するための、本発明の方法および組成物の使用を意図する。
【背景技術】
【０００２】
本特許出願は、2002年5月2日出願の米国特許仮出願第60/377,483号（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）の利益を請求する。
【０００３】
2.  発明の背景
2.1  免疫応答
生物の免疫系は、病原体または他の有害な因子に対して2種類の応答、すなわち体液性応答と細胞媒介性応答で反応する(Alberts, B.他、1994年、Molecular Biology of the Cell.、1195〜96頁を参照)。休止B細胞が抗原によって活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に成熟すると、それらは固有の抗原結合部位を有する抗体を産生して分泌する。この抗体分泌反応は、体液性応答として知られる。他方、T細胞の多様な応答は、細胞媒介免疫応答と総称される。T細胞には細胞傷害性T細胞とヘルパーT細胞の2つの主なクラスがある。細胞傷害性T細胞は、ウイルスまたは他の細胞内微生物に感染した細胞を直接殺す。ヘルパーT細胞は、対照的に、他の細胞の応答を刺激するのを助ける。それらは、例えば、マクロファージ、樹状細胞およびB細胞の活性化を助ける(Alberts, B.他、1994年、Molecular Biology of the Cell.、1228頁を参照)。細胞傷害性T細胞とヘルパーT細胞は、標的細胞中の外来タンパク質抗原の分解により生成されたペプチド断片の形態として抗原を認識するので、したがって両者は、これらのペプチド断片と結合し、それを細胞表面へ運び、そこでT細胞にそれを提示する主要組織適合複合体(MHC)分子に依存する(Alberts, B.他、1994年、Molecular Biology of the Cell.、1228を参照)。MHC分子は、一般的に抗原提示細胞(APC)上に多数見られる。
【０００４】
上で議論された獲得免疫に加えて、先天性免疫も生物の免疫応答に貢献する。先天性免疫系は、病気に対する最初の防御ラインであり、獲得免疫の特徴である抗原特異性と免疫学的記憶の特性を欠いた、広範に及ぶが比較的非特異性の宿主防御を提供する。先天性免疫のエフェクター機構には、適応免疫応答と相互作用してそれを制御する抗菌ペプチド、顆粒球および食細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびに代替補体経路が含まれる。MedzhitovおよびJaneway、2000年、New England J.Med 343:338〜344頁;Moretta、2002年、Nature Reviews Immunology 2:957〜964頁。
【０００５】
2.2  抗原提示
抗原提示細胞(APC)、例えばマクロファージや樹状細胞は、先天性および適応免疫応答の主要構成要素である。抗原は、通常、別の細胞であるAPCの表面でT細胞に「提示」される。APCはリンパ系および血管系で運ばれる抗原を捕捉し、インターナリゼーションと分解の後、主要組織適合複合体(MHC)の細胞表面分子と結合した抗原のペプチド断片をT細胞に提示する。APCは次にT細胞(細胞媒介応答)を活性化してクローン増殖させることができ、これらの娘細胞は細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞に発達でき、これらは次に同じMHC結合抗原を有するB細胞(体液性応答)を活性化してクローン増殖させおよび特異的抗体を産生させる(Alberts, B.他、1994年、Molecular Biology of the Cell.、1238〜45頁を参照)。
【０００６】
2種類の抗原プロセシング機構が認められている。最初のタイプは、APCによるエンドサイトーシスを通じたタンパク質の取込み、小胞内の抗原断片化、MHCクラスII分子との結合、および細胞表面での発現を含む。この複合体は、CD4を発現しているヘルパーT細胞によって認識される。他のタイプは、ウイルス抗原などの、細胞内で合成されるタンパク質に対して用いられ、細胞質内でのタンパク質断片化を伴うようである。このようにして産生するペプチドはMHCクラスI分子と結合するようになり、CD8を発現する細胞傷害性T細胞によって認識される(Alberts, B.他、1994年、Molecular Biology of the Cell.、1233〜34頁を参照)。
【０００７】
T細胞の刺激にはT細胞とAPCの両方によって発現される多くのアクセサリー分子を必要とする。共刺激分子は、T細胞の増殖と活性化を促進するアクセサリー分子である。刺激により、共刺激分子はT細胞増殖と表面受容体の発現を促進するサイトカイン、例えばインターロイキン1(IL-1)またはインターロイキン2(IL-2)、インターフェロン等の放出を誘導する(Paul、1989年、Fundamental Immunology、109〜10頁を参照)。
【０００８】
通常、APCは休止しており、機能するためには活性化を必要とする。APCを活性化するシグナルの正体は、重要で未解決の問題である(Banchereau他、1998年、Nature 392:245〜252頁;Medzhitov他、1998年、Curr. Opin. Immunol. 10:12〜15頁を参照)。
【０００９】
2.3  受動免疫療法
受動免疫療法(受動免疫化とも呼ばれる)は、患者へ直接、免疫反応性試薬、例えば、病原体、腫瘍または病原性タンパク質上のエピトープに対する抗原結合領域を含む分子、およびFc受容体結合領域、補体結合領域またはエフェクター細胞作用を媒介する領域を有するドメインを含む分子、例えば抗体を、投与することを指す。免疫反応性試薬は、予防のために、例えば感染症を阻止するために投与することができ、あるいは、感染を低減するかもしくは排除するために、癌細胞を低減するかもしくは排除するために、または病原性タンパク質、例えば、神経変性疾患および/またはアミロイド形成性疾患で生じるようなタンパク質凝集体または沈着物を、一掃するか取り除くために、治療のために投与できる。受動免疫療法は、in vivo免疫応答を誘導するために、例えば抗体または細胞傷害性Tリンパ球を産生するために、抗原で患者を免疫化することを含む能動免疫療法とは区別される。むしろ、受動免疫療法では、免疫反応性試薬、例えば抗体を患者に投与し、その結果エフェクター細胞、例えば、投与された抗体または他の免疫反応性試薬のFc部分(すなわちFc受容体結合領域)と相互作用できるFc受容体を有する細胞が刺激され、その結果、細胞性免疫機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害(例えば、ADCC)、あるいはその抗体によって認識されるエピトープを有している細胞、病原体またはタンパク質に向けられた抗体媒介オプソニン処理および/または食作用がもたらされる。FcRエフェクター細胞機能に依存する抗体を介する腫瘍治療の効果は、特定のサイトカインの使用によって変化させることができる。Keler他、2000年、J. Immunol. 164:5746〜5752頁。治療用および/または予防用抗体には、それには限定されないが、細胞表面分子と結合して正常な機能と拮抗する抗体(例えばブロッキング抗体)、細胞表面分子と結合して正常機能を模倣する抗体(抗体アゴニスト)、および金属イオン封鎖抗体が含まれる。
【００１０】
2.4  CTLA-4
細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)は、活性化T細胞の表面で低レベルで発現する糖タンパク質である。CTLA-4はCD28と類似するが、B7ファミリーメンバー(例えばB7-1およびB7-2)に対する結合親和性はCD28より大きい。Tリンパ球上のCTLA-4のB7リガンドへの結合は負のシグナルを媒介し、IL-2分泌と細胞増殖を抑制する。要するに、CTLA-4を介したT細胞活性化の阻害は、T細胞調節免疫応答、特に初期のT細胞活性化事象を「スイッチオフ」することになる。(Brunner他、1999年、J. Immunol. 162:5813〜5820頁)
抗CTLA-4抗体での処理によるCTLA-4機能の阻止は各種免疫応答を増強し、腫瘍免疫の誘導に寄与することが最近発見された(Leach他、1996年、Science 271:1734〜1736頁;国際出願第00/322231号および第01/14424号)。B16メラノーマ細胞を移植されたマウスは、抗CTLA-4 mAbとGM-CSF生産腫瘍細胞ワクチンを組み合わせて治療した場合、腫瘍退縮およびCD8+ T細胞レベルの上昇を示した。予防の場面(すなわち、腫瘍チャレンジの前)でのこの組み合わせ療法の適用は、CD8+ T細胞の不在下でも完全な保護を可能にしたことに注目されたい。データは、治療的自己反応性CD8+ T細胞を担癌マウス内で誘導できることを証明している(Van Elsas他、2001年、J. Exp. Med. 194:481〜489頁)。抗CTLA-4抗体とGM-CSF腫瘍細胞ワクチンとの併用投与は樹立B16-BL6メラノーマ細胞に対して有効性を示したが、いずれかの治療法を単独で投与したときにはほとんど効果を認めなかった(Van Elsas他、1999年、J. Exp. Med. 190:355〜366頁)。さらに、CTLA-4の阻害はヘルパー機能の増強と相関し、CD4+ T細胞の増殖を誘導することにも留意されたい(Hernandez他、2001年、J. Immun. 3908〜3914頁)。抗CTLA-4抗体の投与による阻害が、細胞内病原体に対する宿主抵抗性の増加、肝臓および脾臓におけるIFN-gおよびIL-4産生細胞数の増加、ならびにその結果としての肝臓肉芽腫性応答の増加をもたらすことが観察されている(Murphy他、1998年、J. Immun. 4153〜4160頁)。
【００１１】
2.5  熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質(HSP)は、本明細書で互換的にストレスタンパク質とも呼ばれ、以下の基準を満たすいかなる細胞性タンパク質からでも選択できる。熱ショックタンパク質は、細胞がストレス刺激に曝されたときにその細胞内濃度が高まるタンパク質であり、他のタンパク質またはペプチドと結合でき、またアデノシン三リン酸(ATP)の存在下または低いpH下でその結合したタンパク質またはペプチドを放出できる。さらに、HSPには、構成的に発現される、ストレスによって誘導されるタンパク質の保存された細胞性相同体が含まれる。Hsp-60、Hsp-70およびHsp-90ファミリーがアミノ酸配列上ストレスタンパク質に関連したタンパク質、例えば35%を超えるアミノ酸同一性を示すタンパク質で構成されているが、その発現レベルはストレス刺激によって変化しないことが発見されている。したがって、本明細書で使われるストレスタンパク質の定義は、その細胞内発現量がストレス刺激に応じて上昇するその3つのファミリーの構成メンバーと少なくとも35%から55%、好ましくは55%から75%、最も好ましくは75%から85%のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、突然変異蛋白質、類似体およびその変異体を包含するものとする。
【００１２】
同定された最初のストレスタンパク質はHSPであった。その名前が意味するように、HSPは熱ショックに応答して細胞が合成する。現在までに、分子量に基づいてHSPの3つの主要なファミリーが同定されている。これらのファミリーは、hsp60、hsp70およびhsp90と呼ばれ、その数字はキロダルトンで示したストレスタンパク質のおよその分子量を表す。これらのファミリーの多くの構成メンバーは、他のストレス刺激、例えばそれには限定されないが、栄養素欠乏、代謝破壊、酸素ラジカルおよび細胞内病原体による感染に応じて誘導されることが後に分かった(Welch、1993年5月、Scientific American 56〜64頁;Young、1990年、Annu. Rev. Immunol. 8:401〜420頁;Craig、1993年、Science 260:1902〜1903頁;Gething他、1992年、Nature 355:33〜45頁;およびLindquist他、1988年、Annu. Rev. Genetics 22:631〜677頁を参照)。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。これらの3つのファミリーのすべてに属するhsp/ストレスタンパク質が、本発明の実施にあたり利用できるものと意図される。
【００１３】
HSPは、多量に存在する、可溶性の、高度に保存された細胞内分子である。細胞内シャペロンとして、HSPはストレスおよび通常の細胞内ホメオスタシスの間に活性なタンパク質成熟および機能に関する多くの生化学経路に関与する。多くのストレスは細胞のタンパク質の三次元構造、または折り畳みを、崩壊させることができる。修正されずに放置されると、誤って折り畳まれたタンパク質は集塊を形成し、これらはいずれ細胞を殺すかもしれない。HSPはそれらの損傷を受けたタンパク質と結合し、それらが再び正しい高次構造に折り畳まれるのを助ける。通常の(ストレスを受けていない)細胞のホメオスタシスでは、HSPは細胞代謝のために必要である。HSPは、新しく合成されたポリペプチドが折り畳まれのを助け、他のタンパク質との成熟前の相互作用を防止する。また、HSPは細胞のいろいろな区画間のタンパク質の輸送を手伝う。
【００１４】
主要なHSPはストレスを受けた細胞内で非常に高いレベルで蓄積しうるが、ストレスを受けていない細胞内では低レベルから中レベルである。例えば、高度誘導性の哺乳類hsp70は常温でほとんど検出されないが、熱ショックを与えると細胞内で最も活発に合成されるタンパク質の1つになる(Welch他、1985年、J. Cell. Biol. 101:1198〜1211頁)。対照的に、hsp90とhsp60タンパク質は、常温下ですべてではないもののほとんどの哺乳類の細胞内に多量に存在し、それらは熱によりさらに誘導される(Lai他、1984年、Mol. Cell. Biol. 4:2802〜2810頁;vanBergen en Henegouwen他、1987年、Genes Dev. 1:525〜531頁)。
【００１５】
HSPは免疫学的特性および抗原性を有することが分かった。特定の腫瘍から単離したgp96またはp84/86によるマウスの免疫化により、そのマウスはその特定の腫瘍に対し免疫化されたが、免疫原性の異なる腫瘍に対しては免疫化されなかった(Srivastava, P.K.他、1988年、Immunogenetics 28:205〜207頁;Srivastava, P.K.他、1991年、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109〜123頁)。さらに、hsp70はそれが単離された腫瘍に対する免疫を惹起するが、免疫原性が異なった腫瘍に対する免疫は惹起しないことが示された。しかし、ペプチドを欠くhsp70はその特異的な免疫原性活性を失うことが判明した(Udono, M.およびSrivastava, P.K.、1993年、J. Exp. Med. 178:1391〜1396頁)。これらの観察結果は、熱ショックタンパク質自体が抗原性ではなく、抗原性のペプチドと非共有結合性複合体を形成し、この複合体がこの抗原性ペプチドに対する特異的免疫を惹起することができることを示唆した(Srivastava, P.K.、1993年、Adv. Cancer Res. 62:153〜177頁;Udono, H.他、1994年、J. Immunol. 152:5398〜5403頁;Suto, R.他、1995年、Science 269:1585〜1588頁)。最近、hsp60とhsp70が、単球、マクロファージまたは細胞傷害性T細胞による炎症誘導性サイトカイン、例えばTNFαおよびIL-6の産生を刺激することが分かった(Breloer他、1999年、J. Immunol. 162:3141〜3147頁;Chen他、1999年、J. Immunol. 162:3212〜3219頁;Ohashi他、2000年、J. Immunol. 164:558〜561頁;Asea他、2000年、Nature Medicine、6:435〜442頁;Todryk他、1999年、J. Immunol. 163:1398〜1408頁)。Hsp70は未成熟な樹状細胞を標的にして、抗原を捕捉するその能力を高めることも分かった(Todryk他、1999年、J. Immunol. 163:1398〜1408頁)。例えば細胞死によるhsp60とhsp70の放出、または発現の誘起は、免疫反応を引き起こす必要があることのシグナルとして役立つかもしれないと仮定された(Chen他、1999年、J. Immunol. 162:3212〜3219頁;Ohashi他、2000年、J. Immunol. 164:558〜561頁;Todryk他、1999年、J. Immunol. 163:1398〜1408頁;Basu他、2000年、Intl. Immunol. 12:1539〜1546頁)。
【００１６】
癌細胞から精製されたHSPとペプチドの非共有結合性複合体の、癌の治療と予防のための使用は、米国特許第5,750,119号、第5,837,251号および第6,017,540号に記載されている。
【００１７】
養子免疫療法に使用するためにin vitroで抗原提示細胞を感作するためのHSP-ペプチド複合体の使用は、米国特許第5,985,270号および第5,830,464号に記載されている。
【００１８】
HSP-ペプチド複合体は病原体に感染した細胞からも単離され、ウイルスなどの病原体ならびに細菌、原生動物、真菌類および寄生虫を含む他の細胞内病原体に起因する感染症の治療および予防のために使用できる。米国特許第5,961,979号および第6,048,530号を参照されたい。
【００１９】
免疫原性HSP-ペプチド複合体は、HSPと抗原性ペプチドのin vitroでの複合体化によっても調製でき、癌および感染症の治療および予防のためのそのような複合体の使用が、米国特許第5,935,576号および第6,030,618号に記載されている。癌および感染症の治療のための、所定の抗原と組み合わせた熱ショックタンパク質の使用も、1997年2月27日付けの国際公開第97/06821号に記載されている。
【００２０】
細胞溶解物からのHSP-ペプチド複合体の精製は既に記載されている。例えば、米国特許第5,750,119号および第5,997,873号を参照されたい。
【発明の開示】
【００２１】
3.  発明の概要
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)製剤を免疫反応性試薬と共に投与することを含む、免疫応答を生じさせるかまたは増強するために有用な方法および組成物に関するものである。これらの方法と組成物は、このHSP製剤を単独で、および/またはこの免疫反応性試薬を単独で投与される被験体における治療結果を改善するのに役立つ。特に、本発明は免疫反応性試薬によって誘導される免疫応答を生じさせるかまたは増強するために、かつ/または免疫反応性試薬の有効性を改善するために役立つ、HSP製剤の投与を含む方法および組成物を提供する。したがって、本発明の方法と組成物は、受動免疫療法を増強するためにHSP製剤を投与することを含む。特定の実施形態において、そのような方法と組成物はHSP製剤の投与を含み、エフェクター細胞機能を刺激する免疫反応性試薬の能力を増強することに役立つ。本発明は、免疫反応性試薬の投与を含む、HSP製剤によって誘導された免疫応答を増強するために役立つ方法および組成物も企図する。本発明によると、本発明の方法と組成物は、その治療または予防が免疫応答の増強により改善される疾患および障害、例えば感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患の予防および治療に有用である。このように、本発明はHSP製剤と組み合わせて1種または複数種の免疫反応性試薬を投与することを含む、感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患を治療および予防するようにデサインされた方法および組成物を包含する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は免疫反応性試薬で誘導される免疫応答をHSP製剤の使用により生じさせるかまたは増強する方法を提供し、この際、このHSP製剤は、それを使用しなかった場合に単独使用で免疫応答を誘導するための最適用量を下回る用量の免疫反応性試薬による免疫応答を、増強する。ある実施形態では、免疫応答を引き出すためにHSP製剤が免疫反応性試薬と併用されなかった場合、前記HSP製剤を単独で投与してもこの免疫応答は生じないか増強されない。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬の両者は単独および/または組み合わせて投与されたときも免疫応答を引き出すことができる。
【００２３】
ある実施形態では、HSP製剤は相加的に免疫反応性試薬の効果を増強することができる。好ましい実施形態では、HSP製剤は相乗的に免疫反応性試薬の効果を増強する。他の実施形態では、免疫反応性試薬は相加的にHSP製剤の効果を増強する。好ましくは、その効果は相乗的に増強される。このように、ある実施形態では、本発明は、HSP製剤単独投与および/または免疫反応性試薬単独投与より優れた治療プロフィールをもたらす病気の治療または予防の方法を包含する。本発明に包含されるのは、相加的効果または相加的治療効果を示しながら望ましくないかまたは有害な作用を減らすか回避した併用療法である。本発明は、治療効果が相加効果より高く、望ましくないまたは有害な作用を減らすか回避した相乗的併用療法も含む。ある実施形態では、本発明の方法は、免疫反応性試薬および/またはHSPの単独使用によって引き起こされる望ましくないもしくは有害な作用の発生を減らす一方で、治療の効果を維持もしくは増強し、好ましくは患者のコンプライアンスを向上させ、治療を改善し、かつ/または望ましくないかまたは有害な作用を減少させるために、より低い用量および/またはより少ない投与回数で免疫反応性試薬および/またはHSPを使用して、増強された免疫応答によって治療を改善する疾患および障害の治療または予防を可能にする。
【００２４】
本発明の方法と組成物は未処置患者に役立つだけでなく、HSPの単独投与または免疫反応性試薬の単独投与に対して一部もしくは完全に不応性の患者の治療にも役立つ。様々な実施形態において、本発明は免疫反応性試薬および/またはHSPのいずれかまたは両方の投与を含む療法に対して難治性もしくは不応性であることが分かった、もしくはその可能性のある患者における疾患または障害の治療に役立つ方法および組成物であって、増強された免疫応答によって治療が向上する方法および組成物を提供する。
【００２５】
本発明の方法と組成物に役立つHSP製剤には、それには限定されないが、いかなる分子とも結合していない遊離のHSP、および、別の分子、例えばペプチドとHSPとの分子複合体が含まれる。HSP-ペプチド複合体は、ペプチドと共有結合または非共有結合で結合したHSPを含む。HSP-ペプチド複合体は、腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来するペプチドと結合したHSPで構成されていてもよい。一実施形態では、前記ペプチドは免疫反応性試薬によって認識されるものと同じ標的であるか、あるいは腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来する。あるいは、HSP-ペプチド複合体は内因性のペプチドと結合したHSPから成ってもよいが、免疫反応性試薬の標的と同じ供与源からのペプチドである必要はない。本発明のある方法では、被験体への投与の前に、HSPと特異性抗原または抗原性ペプチドとの共有結合および非共有結合を必要としない。本発明の方法および組成物に役立つHSP製剤には、HSP融合タンパク質も含まれる。HSP融合タンパク質はいかなる抗原性ペプチド配列と融合したHSPから構成されてよく、このペプチド配列は腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来する。一実施形態では、前記ペプチド配列は免疫反応性試薬によって認識されるものと同じ標的であるか、あるいは腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来する。
【００２６】
本発明の方法と組成物において有用な免疫反応性試薬には、それには限定されないが、抗体、抗体の抗原結合部位を含むように作製された分子またはタンパク質、抗体依存性免疫応答を媒介する抗原結合ドメインを含むように作製された分子またはタンパク質、目的の抗原と特異的に相互作用するペプチドもしくはドメインまたは目的の抗原/エピトープと相互作用するあらゆる抗原結合ドメインを有する分子、および抗体依存性免疫応答、例えばエフェクター細胞応答もしくはプロセスを媒介する抗体の定常領域のドメインが含まれる。抗原結合領域は特異的な標的を認識し、定常領域のドメインは抗体依存性免疫エフェクター細胞応答を媒介する。
【００２７】
好ましい実施形態では免疫反応性試薬は、抗体、好ましくはin vivo治療または予防のための用途を有する抗体であり、本発明はHSP製剤の投与を含むそのような治療用または予防用抗体の有効性の増強に役立つ方法および組成物を提供する。ある実施形態では、エフェクター細胞機能を刺激する抗体の能力は、HSP製剤を投与することによって増強される。特定の実施形態では、抗体依存性細胞傷害、および/または腫瘍細胞もしくは病原体もしくは病原体タンパク質およびペプチドの食作用は、治療用抗体とHSP製剤との併用により増強される。好ましくは、治療用抗体は細胞傷害性および/またはオプソニン作用性抗体である。したがって、本発明はHSP製剤が免疫反応性試薬と併用され、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞および多形核細胞のエフェクター細胞機能(すなわち、抗体依存性細胞傷害作用と食作用)を増強する方法および組成物を提供する。好ましくは、この免疫反応性試薬は抗体であり、より好ましくは細胞傷害性および/またはオプソニン作用性抗体である。一実施形態では、HSPを介した受動免疫療法の増強は、エフェクター細胞の刺激、すなわちそのような細胞上のFc受容体の誘起および/または活性化を通して起こる。
【００２８】
本発明の方法で使われる抗体には、それには限定されないものの、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体)、ならびに上記いずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。特に、本発明の方法で使用される抗体には、免疫グロブリン分子と免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、目的の標的と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれの型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)、またはサブクラスであってよい。
【００２９】
いかなる理論にも束縛されないが、HSPの濃度増加は、サイトカインの産生と抗原提示分子および共刺激分子の表面発現を誘導するかもしれない。したがって、被験体に投与されたHSP製剤は、抗原提示の効率と効果を向上させることによって免疫反応性試薬の有効性を促進することができる。
【００３０】
他の好ましい実施形態では、治療結果を改善するために、免疫反応性試薬を、HSP製剤を投与されている被験体に投与する。特定の実施形態では、この免疫反応性試薬は、HSP製剤の投与によって引き出された免疫応答を増強する。
【００３１】
本発明の特定の一実施形態では、抗体は抗CTLA-4抗体である。他の具体的な一実施形態では、抗体は抗c-erb-2抗体であり、好ましくはHer2/neuオンコジーンを発現する癌の治療または予防に特に有用な、ヒトrhu 4D5(Herceptin)である。他の特定の実施形態では、抗体は、限定されないがNK細胞耐性リンパ腫などの癌の治療に有用な、抗腫瘍MoAb(MS11G6)のIgG2a抗イディオタイプ抗体である。
【００３２】
一実施形態では、HSP製剤は、癌に対する抗腫瘍または抗癌抗体療法と組み合わせて投与される。他の実施形態では、HSP製剤は、病原体に対する抗体療法と組み合わせて投与される。他の実施形態では、HSP製剤は、神経変性もしくはアミロイド疾患または障害の影響を受けた病原性もしくは好ましくないタンパク質または細胞に対する抗体療法と組み合わせて投与される。
【００３３】
他の実施形態では、本発明の方法と組成物を用い、個体に免疫反応性試薬とHSP製剤の治療量を投与することによって、神経変性もしくはアミロイド疾患、癌または感染症の病原体と関連するエピトープに対して、あるいは前記疾患と関連したエピトープを有する任意の成分、細胞もしくは分子に対して免疫応答を引き起こすことができる。ある種の癌に対する免疫応答が望まれる場合、この種の癌の抗原、例えば腫瘍関連抗原に特異的に結合する(または「認識する」)免疫反応性試薬が使用される。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、ある種の癌の抗原と特異的に結合する免疫反応性試薬を、前記種類の癌の治療または予防のためのHSP製剤と組み合わせて投与することを含む。ある感染症の病原体に対して免疫応答を惹起することが望まれる場合、この感染症の病原体の抗原または病原性タンパク質(例えば毒素)と特異的に結合する免疫反応性試薬を投与する。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、ある感染症病原体と特異的に結合する免疫反応性試薬を、前記感染症の治療または予防のためのHSP製剤と組み合わせて投与することを含む。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、神経変性疾患またはアミロイド疾患に関連した抗原性分子と特異的に結合する免疫反応性試薬を、前記神経変性疾患またはアミロイド疾患の治療または予防のためのHSP製剤と組み合わせて投与することを含む。好ましくは、この免疫反応性試薬は抗体である。
【００３４】
本発明は、免疫反応性試薬とHSP製剤を組み合わせて、他の種類の薬物療法、例えば抗癌剤、抗生物質および抗感染症薬剤を過去に投与されたか現在投与されている患者に投与することを含む方法と組成物も包含する。
【００３５】
他の実施形態では、本発明は抗原提示細胞を活性化する方法を提供し、この方法にはAPCをHSP製剤と接触させ、そのようにして活性化されたAPCを免疫反応性試薬の投与と組み合わせて投与することが含まれる。したがって、本発明は、活性化APCおよび/またはHSP製剤の投与を含む、免疫反応性試薬によって引き出された免疫応答を増強するための方法と組成物を提供する。好ましくは、このHSP製剤は、免疫反応性試薬が投与されない場合には効率よく免疫応答を誘導しないものである。ある実施形態では、このHSP製剤は、免疫反応性試薬によって認識される標的の免疫原性を示さない。他の実施形態では、HSP製剤の免疫原性は免疫反応性試薬が認識する標的の免疫原性を示す。HSP製剤の免疫原性は、当技術分野で知られている任意の方法によってin vivoまたはin vitroで試験できる。
【００３６】
特定の実施形態において、活性化APCおよび/またはHSP製剤の投与を組み合わせた免疫反応性試薬の投与を含む本発明の方法および組成物は、免疫応答、特に抗体媒介免疫応答の増強によってその疾患の治療が改善されるいかなる疾患または障害、例えば、それには限定されないが、感染症、癌あるいは神経変性またはアミロイド疾患もしくは障害の治療に役立つ。
【００３７】
また、本発明に含まれるものとして、免疫反応性試薬と組み合わせて1種または複数種のHSPを補助療法として送達する方法；1種または複数種のHSP製剤と1種または複数種の免疫反応性試薬を含む投与用の医薬組成物と製剤；前記医薬組成物を含むキット；および、免疫応答の増強により改善される疾患、例えば感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患を本発明の予防用または治療用医薬組成物を使用して治療または予防する方法がある。そのような方法、キットおよび組成物は、さらに活性化APCの投与を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
4.  発明の詳細な説明
本発明は、熱ショックタンパク質(HSP)製剤を免疫反応性試薬と共に投与することを含む、免疫応答を生じさせるかまたは増強するために役立つ方法および組成物に関するものである。これらの方法と組成物は、このHSP製剤を単独で、かつ/またはこの免疫反応性試薬を単独で投与された被験体における治療結果の改善に役立つ。特に、本発明は免疫反応性剤の予防的または治療的効果を改善する方法と組成物を提供する。本発明は、HSP製剤の投与を含む、免疫反応性試薬によって引き出された免疫応答を生じさせるかまたは増強するために有用な方法と組成物も提供する。したがって、本発明の方法と組成物は、受動免疫療法を増強するためのHSP製剤を投与することを含む。特定の実施形態において、そのような方法と組成物はHSP製剤の投与を含み、エフェクター細胞機能を刺激する免疫反応性試薬の能力を増強することに役立つ。本発明は、免疫反応性試薬の投与を含む、HSP製剤によって誘導された免疫応答を増強するために役立つ方法および組成物も考慮する。本発明によると、本発明の方法と組成物は、その治療または予防が免疫応答の増強により改善される疾患および障害、例えば感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患の予防および治療に有用である。このように、本発明はHSP製剤と併用して1種または複数種の免疫反応性試薬を投与することを含む、感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患を治療または予防するための方法および組成物を包含する。
【００３９】
一実施形態では、本発明はHSP製剤の使用により免疫反応性試薬で誘導される免疫応答を生じさせるかまたは増強する方法を提供し、このHSP製剤はそれを使用しなかった場合に単独使用で免疫応答を誘導するためには不十分な用量の免疫反応性試薬による免疫応答の誘導を助ける。ある実施形態では、免疫応答を引き出すためにHSP製剤が免疫反応性試薬と併用されなかった場合、前記HSP製剤を単独で投与してもこの免疫応答は生じないか増強されない。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬の両者は単独および/または併用で投与されたときも免疫応答を引き出すことができる。
【００４０】
ある実施形態では、HSP製剤は相加的に免疫反応性試薬の効果を増強するかもしれない。好ましい実施形態では、HSP製剤は相乗的に免疫反応性試薬の効果を増強する。他の実施形態では、免疫反応性試薬は相加的にHSP製剤の効果を増強する。好ましくは、その効果は相乗的に増強される。このように、ある実施形態では、本発明は、HSP製剤単独投与および/または免疫反応性試薬単独投与より優れた治療像を提供する病気の治療または予防の方法を包含する。本発明に包含されているのは、相加的効果または相加的治療効果を示しながら望ましくないまたは有害な作用を減らすか回避するかした併用療法である。本発明は、治療効果が相加効果に勝り、望ましくないまたは有害な作用を減らすか回避した相乗的併用療法も含む。ある実施形態では、本発明の方法は、免疫反応性試薬および/またはHSPの単独投与によって引き起こされる望ましくないもしくは有害な作用の発生を減らす一方で、治療の効果を維持もしくは増強し、好ましくは患者のコンプライアンスを向上させ、治療を改善し、かつ/または望ましくないまたは有害な作用を減少させるために、より低い用量および/またはより少ない投与回数で免疫反応性試薬および/またはHSPを使用して、増強された免疫応答によって治療が改善する疾患および障害の治療または予防を可能にする。
【００４１】
本発明の方法と組成物は未治療者に役立つだけでなく、HSPの単独投与または免疫反応性試薬の単独投与に対して一部もしくは完全に不応性の患者の治療にも役立つ。様々な実施形態において、本発明はいずれかの薬剤の単独投与を含む療法に対して難治性もしくは不応性であることが分かった、もしくはその可能性のある患者における疾患または障害の治療に役立つ方法および組成物であって、増強された免疫応答によって治療が向上する方法および組成物を提供する。
【００４２】
本発明の方法と組成物に役立つHSP製剤には、それには限定されないが、いかなる分子とも結合していない遊離のHSP、および、別の分子、例えばペプチドとHSPとの分子複合体が含まれる。HSP-ペプチド複合体は、ペプチドと共有結合または非共有結合で結合したHSPを含む。HSP-ペプチド複合体は、腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来するペプチドと結合したHSPで構成されてよく、好ましくは前記ペプチドは免疫反応性試薬によって認識されるのと同じ標的である。あるいは、HSP-ペプチド複合体は内因性のペプチドと結合したHSPから成ってもよいが、免疫反応性試薬の標的と同じ供与源からのペプチドである必要はない。本発明のある方法は、被験体への投与の前に、HSPと特異性抗原および抗原性ペプチドとの共有結合および非共有結合を必要としない。本発明は、in vitroで作製され、共有結合または非共有結合により外因性ペプチドと複合体を形成したHSPを含むHSP-ペプチド複合体の利用、ならびに細胞内供与源から分離された内因性のHSP-ペプチド複合体の利用を含む。
【００４３】
本発明の方法と組成物に役立つ免疫反応性試薬には、それには限定されないが、抗体、抗体の抗原結合部位を含むように作製された分子またはタンパク質、抗体依存性免疫応答を媒介する抗原結合ドメインを含むように作製された分子またはタンパク質、目的の抗原と特異的に相互作用するペプチドもしくはドメインあるいは目的の抗原/エピトープと相互作用するあらゆる抗原結合ドメインが含まれる。抗原結合ドメインは、好ましくは抗体依存性免疫応答、免疫エフェクター細胞応答またはプロセスを媒介する抗体の定常領域のドメインと結合している。好ましくは、この免疫反応性試薬は精製されている。
【００４４】
好ましい実施形態では免疫反応性試薬は抗体であり、好ましくはin vivoでの治療的または予防的使用に利用でき、本発明はHSP製剤の投与を含む、そのような治療的または予防的抗体の効果の増強に役立つ方法および組成物を提供する。そのような実施形態では、エフェクター細胞機能を刺激する抗体の能力は、HSP製剤を投与することによって増強される。特定の実施形態では、抗体依存性細胞傷害および/または腫瘍細胞もしくは病原体もしくは病原性タンパク質およびペプチドの食作用は、治療的抗体とHSP製剤との併用により増強される。好ましくは、治療的抗体は細胞傷害性および/またはオプソニン作用性抗体である。したがって、本発明はHSP製剤が免疫反応性試薬と併用され、マクロファージ、ナチュラルキラー(NK)細胞および多形核細胞のエフェクター細胞機能(すなわち、抗体依存性細胞傷害作用と食作用)を増強する方法および組成物を提供する。好ましくは、この免疫反応性試薬は抗体であり、より好ましくは細胞傷害性および/またはオプソニン作用性抗体である。一実施形態では、HSPを介した受動免疫療法の増強は、エフェクター細胞の刺激、すなわちそのような細胞上のFc受容体の誘起および/または活性化を通じて起こる。
【００４５】
他の好ましい実施形態では、治療結果を改善するために免疫反応性試薬はHSP製剤を投与されている被験体に投与される。特定の実施形態では、この免疫反応性試薬はHSP製剤の投与によって引き出された免疫応答を増強する。他の実施形態では、この免疫反応性試薬は、HSPによって引き出されたT細胞活性化を増強する。
【００４６】
本発明の具体的な一実施形態では、抗体は抗CTLA-4抗体である。他の具体的な一実施形態では、抗体は抗c-erb-2抗体であり、好ましくはHer2/neuオンコジーンを発現する癌の治療または予防に特に有用なヒトrhu 4D5(Herceptin)である。他の特定の実施形態では、抗体は、それには限定されないがNK細胞耐性リンパ腫などの癌の治療に有用な、抗腫瘍MoAb(MS11G6)のIgG2a抗イディオタイプ抗体である。一実施形態では、抗体はトール様受容体(Toll-Like Receptor:TLR)、例えばTLR 2、7、8または9のアゴニストである。他の実施形態では、抗体は41BB(例えば、Miller他、2002年、J. Immunol. 169:1792〜1800頁を参照)、OX40、ICOSまたはCD40のアゴニストである。他の実施形態では、抗体はFasリガンドまたはPD1のアンタゴニストである。他の実施形態では、抗体は不変性NKT細胞のT細胞受容体(TCR)のCDR3ループと結合してこれらの細胞を増殖および/または活性化するMab 6B11である。2002年11月7日に発行されたUS 2002/0164331を参照されたい。
【００４７】
一実施形態では、HSP製剤は、癌に対する抗腫瘍抗体療法と組み合わせて投与される。他の実施形態では、HSP製剤は、病原体に対する抗体療法と組み合わせて投与される。他の実施形態では、HSP製剤は、神経変性もしくはアミロイド疾患もしくは障害の影響を受けた細胞に対する抗体療法と組み合わせて投与される。
【００４８】
いかなる理論にも束縛されないが、HSPの濃度増加は、サイトカインの産生と抗原提示分子および共刺激分子の表面発現を誘導するかもしれない。したがって、被験体に投与されたHSP製剤は、抗原提示の効率と効果を向上させることによって免疫反応性試薬の有効性を促進することができると考えられる。ある実施形態では、HSP製剤が細胞エフェクター機能のような抗体を介した応答を増強することができると考えられる。
【００４９】
他の実施形態では、本発明の方法と組成物を用い、個体に免疫反応性試薬とHSP製剤の治療量を投与することによって、神経変性もしくはアミロイド疾患、癌または感染症の病原体と関連するエピトープに対して、あるいは前記疾患と関連したエピトープを有する任意の成分、細胞もしくは分子に対して免疫応答を引き起こすことができる。ある種の癌に対する免疫応答が望まれる場合、この種の癌、すなわち癌の免疫原性を示す抗原に特異的に結合する(または「認識する」)免疫反応性試薬が使用される。そのような抗原の例としては、腫瘍関連抗原(すなわち、腫瘍細胞内で比較的過剰に発現される)または腫瘍特異的抗原(すなわち、腫瘍細胞内にのみ存在する)がある。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、ある種の癌の抗原と特異的に結合する免疫反応性試薬を前記種類の癌の治療または予防のためのHSP製剤と併用して投与することを含む。ある感染症の病原体に対して免疫応答を引き出すことが望まれる場合、この感染症病原体の抗原または病原性タンパク質(例えば毒素)と特異的に結合する免疫反応性試薬が投与される。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、ある感染症病原体と特異的に結合する免疫反応性試薬を前記感染症の治療または予防のためのHSP製剤と併用して投与することを含む。他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、神経変性疾患またはアミロイド疾患に関連した抗原性分子もしくはタンパク質と特異的に結合する免疫反応性試薬を前記神経変性疾患またはアミロイド疾患の治療または予防のためのHSP製剤と併用して投与することを含む。好ましくは、この免疫反応性試薬は抗体である。
【００５０】
本発明は、免疫反応性試薬とHSP製剤を組み合わせて、他の種類の薬物療法、例えば抗癌剤、抗生物質および抗感染症薬剤を過去に投与されたかまたは現在投与されている患者に投与することを含む方法と組成物も包含する。
【００５１】
他の実施形態では、本発明は抗原提示細胞を活性化する方法を提供し、この方法にはAPCをHSP製剤と接触させ、そのようにして活性化されたAPCを免疫反応性試薬の投与と組み合わせて投与することが含まれる。したがって、本発明は、活性化APCおよび/またはHSP製剤の投与を含む、免疫反応性試薬によって引き出された免疫応答を増強するための方法と組成物を提供する。好ましくは、このHSP製剤は、免疫反応性試薬が投与されない場合には効率よく免疫応答を誘導しない。ある実施形態では、このHSP製剤は、免疫反応性試薬によって認識される標的の免疫原性を示さない。他の実施形態では、HSP製剤の免疫原性は免疫反応性試薬が認識する標的の免疫原性を示す。HSP製剤の免疫原性は、当技術分野で知られている任意の方法によってもin vivoまたはin vitroで試験できる。
【００５２】
特定の実施形態において、活性化APCおよび/またはHSP製剤の投与と組み合わせた免疫反応性試薬の投与を含む本発明の方法および組成物は、免疫応答の増強によってその疾患の治療が改善されるいかなる疾患または障害、例えば、それには限定されないが、感染症、癌あるいは神経変性またはアミロイド疾患もしくは障害の治療に役立つ。
【００５３】
また、本発明に含まれるものとして、免疫反応性試薬と併用して1種または複数種のHSPを補助療法として送達する方法；1種または複数種のHSP製剤と1種または複数種の免疫反応性試薬を含む投与のための医薬組成物と製剤；および前記医薬組成物を含むキット；ならびに、免疫応答の増強により改善される疾患、例えば感染症、原発性および転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド形成疾患を本発明の予防的または治療的医薬組成物を使用して治療または予防する方法がある。そのような方法、キットおよび組成物は、さらに活性化APCの投与を含むことができる。
【００５４】
4.1  予防/治療の方法
本発明は、HSP製剤と免疫反応性試薬との併用投与を含む、免疫反応性試薬によって引き出される免疫応答を生じさせるかまたは増強するための方法を提供する。本発明は、その治療または予防が増強された免疫応答によって改善される病気および障害を治療または予防する方法を含む。好ましい実施形態では、増強された免疫応答には、例えば抗体依存性細胞傷害(例えばADCC)または抗体媒介オプソニン作用、および/または細胞、病原体もしくは抗体によって認識されるエピトープを有しているタンパク質に対する食作用、ならびにエフェクター細胞機構に作用することによる補体を介した細胞殺傷などの応答の増強が含まれる。ある実施形態では、HSP製剤はT細胞活性化を誘導し、免疫反応性試薬、例えば抗体は、T細胞活性化を増強することによって免疫応答を増強することができる。
【００５５】
一実施形態では、「治療」または「治療する」は、癌、感染症または神経変性もしくはアミロイド疾患、またはその少なくとも1つの識別可能な症状の、改善を指す。他の実施形態では、「治療」または「治療する」は、癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患に関連した、必ずしも被験体によって識別されるとは限らない少なくとも1つの測定可能な身体的パラメータの改善を指す。他の実施形態では、「治療」または「治療する」は、癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患の進行を、例えば識別可能な症状の安定化のように物理的に、または、例えば身体的パラメータの安定化のように生理的に、あるいはその両方により阻止することを指す。他の実施形態では、「治療」または「治療する」は、癌、神経変性またはアミロイド疾患の発病を遅らせることを指す。
【００５６】
ある実施形態では、本発明の方法と組成物は、癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患の予防手段として有用である。本明細書で使われる「予防」または「予防する」ことは、所定の癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患に罹る危険を減らすことを指す。この実施形態の1つの態様では、本発明の方法と組成物は、癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患に遺伝的素因を有するヒト被験体に対して、予防的手段としてHSP製剤を免疫反応性試薬の投与と併用して投与することを含む。この実施形態の他の態様では、本発明の方法と組成物は、癌に対して非遺伝的素因を有する被験体、または感染症病原体に対する曝露に直面している被験体に対する予防的手段として有用である。
【００５７】
他の実施形態では、本発明の方法と組成物は、癌、感染症、神経変性またはアミロイド疾患の臨床徴候または発病を治療または予防するために有用である。
【００５８】
ある実施形態では、本発明は、感染症、癌、神経変性もしくはアミロイド疾患、またはタンパク質沈着もしくはアミロイド疾患を治療または予防するための、HSP製剤を1種または複数種の免疫反応性試薬と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、HSP製剤は、1種または複数種の免疫反応性試薬と同時に、哺乳類、好ましくはヒトに投与される。
【００５９】
一実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬は同時に投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬は、連続的に、また、HSP製剤が免疫反応性試薬と一緒に作用してそれらが単独で投与されたときよりも有効性が増大するような時間間隔内に被験体に投与される。例えば、各々(例えば、HSP製剤と免疫反応性試薬)は同時に、または異なる時点で任意の順番で連続的に、投与できる。しかし、同時に投与されない場合、所望の治療効果または予防効果が得られるようにそれらは十分短い時間間隔内に投与されなければならない。各々は、適当な任意の剤形で任意の経路で別々に投与することができる。一実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬は同じ投与様式で投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬は異なる投与経路で投与される。各々の投与部位は同じであっても、または、例えば腕と脚のように異なっていてもよい。
【００６０】
様々な実施形態において、予防用薬剤または治療用薬剤を、1時間間隔未満、1時間間隔、1〜2時間間隔、2〜3時間間隔、3〜4時間間隔、4〜5時間間隔、5〜6時間間隔、6〜7時間間隔、7〜8時間間隔、8〜9時間間隔、9〜10時間間隔、10〜11時間間隔、11〜12時間間隔、24時間間隔以内、または48時間間隔以内で投与する。他の実施形態では、予防用薬剤または治療用薬剤を、1、2、4、8、12、24または48時間間隔で投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬を、2〜4日間隔で、1週間隔で、1〜2週間隔で、2〜4週間隔で、1カ月間隔で、1〜2カ月間隔で、または2カ月以上の間隔で投与する。好ましい実施形態では、2つ以上の成分を同じ来院時に投与する。好ましくは、HSP製剤と免疫反応性試薬を、HSP製剤と免疫反応性試薬の両者が同時に活性となるような時間枠内で被験体に投与する。当業者は、HSP製剤と免疫反応性試薬の半減期を測定することによって、そのような時間枠を決定することができよう。
【００６１】
具体的な一実施形態では、HSP製剤は免疫反応性試薬の投与より前に投与される。他の特定の実施形態では、HSP製剤は免疫反応性試薬の投与に続いて投与される。
【００６２】
ある実施形態では、HSP製剤および/または免疫反応性試薬は、被験体に周期的に投与される。周期的治療では、HSP製剤を一定期間投与し、その後免疫反応性試薬および/または第3の薬剤を一定期間投与し、そしてこの連続的投与を繰り返す。周期的治療は、1つかそれより多くの療法に対する耐性の生起を減らし、療法の内の1つの副作用を回避するかまたは減らし、かつ/または治療の有効性を改善する。そのような実施形態では、本発明はHSP製剤の投与から4〜6日後、好ましくは2〜4日後、より好ましくは、1〜2日後に免疫反応性試薬を投与し、その後HSP製剤を4〜6日後、好ましくは2〜4日後、より好ましくは1〜2日後に投与するような代替的方法を意図する。そのような周期は所望の回数繰り返すことができる。
【００６３】
他の実施形態では、HSP製剤は免疫反応性試薬と合理的な程度に同じ時間に被験体に投与される。好ましくは、この2つの投与は、例えば同じ診療機会に、互いに1分未満〜約5分、約5分〜約10分、約10分〜30分、約30分〜最大約60分の時間枠内に実施される。
【００６４】
他の実施形態では、免疫反応性試薬とHSP製剤は同時に投与できる。ある実施形態では、免疫反応性試薬とHSP製剤は単一の医薬組成物として投与される。そのような実施形態では、本発明の医薬組成物は日に1回、日に2回または日に3回投与される。他の実施形態では、この医薬組成物は週に1回、週に2回、2週に1回、1カ月に1回、6週に1回、2カ月に1回、1年に2回、または1年に1回投与される。また、治療のために使われる免疫反応性試薬の有効量を特定の治療経過において増減できることも理解されよう。
【００６５】
他の治療方法も提供される。この実施形態では、HSP製剤は被験体のAPCが活性化状態にあることが望まれる場合に被験体に投与される。HSP製剤は定期的にある期間、例えば数週間、例えば1〜2週間、2〜4週間、4〜6週間、最高2カ月まで毎日投与でき、この投与は免疫反応性試薬の治療計画に先行して行ってもよく、重複して行ってもよく、かつ/またはその後に行ってもよい。HSP製剤は、治療の結果を改善することができる。いかなる理論および機構にも束縛されないが、被験体へのHSP製剤の投与は、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞の数を増やし、かつ/または樹状細胞の成熟を促進することにより、この被験体の非特異的免疫機構の反応を増強することができる。ある実施形態では、HSP製剤によるAPCの活性化をex vivoで行い、その後そのような活性化APCを本発明の方法と組成物によって投与する。投与されるHSP製剤と同じか異なるHSP製剤がAPCの活性化に使用できる。各HSP製剤は、免疫反応性試薬によって認識される抗原性分子の免疫原性を示してもよいし示さなくてもよい。
【００６６】
他の実施形態では、HSP製剤は、免疫反応性試薬の投与から1時間〜24時間後までの時間枠内で被験体に投与される。この時間枠は、徐放性または持続的放出型の免疫反応性試薬が使われる場合は拡張できる。この方法は、エフェクター細胞、例えば、投与部位またはその近くに存在する、免疫反応性試薬の存在によってまだ活性化されていないかもしれないAPCの活性化を助けると考えられる。
【００６７】
他の実施形態では、HSP製剤は、免疫反応性試薬の投与前の1時間〜12時間、12時間〜24時間、24時間〜48時間までの時間枠内で被験体に投与する。この方法は、免疫反応性試薬と遭遇する前に被験体のAPCを前活性化すると考えられる。
【００６８】
他の実施形態では、治療単位を同時に投与し、すなわちHSP製剤と免疫反応性試薬の個々の用量を、HSP製剤がまだ免疫反応性試薬と共に作用できるような時間間隔内で、別々に投与する。例えば、HSP製剤は、2週に1回または3週に1回投与する免疫反応性試薬と組み合わせて、1週に1回投与してもよい。言い換えると、HSP製剤と免疫反応性試薬の投薬計画は、たとえ各々が同時にまた同じ診療機会に投与されないとしても、同時に実行される。
【００６９】
ある実施形態では、HSP製剤は、1種または複数種の免疫反応性試薬と同じ医薬組成物に含めて、同時に投与される。他の実施形態では、HSP製剤は、1種または複数種の免疫反応性試薬と、異なる医薬組成物として、同時に投与される。他の実施形態では、HSP製剤は1種または複数種の免疫反応性試薬の投与より前か後に投与される。本発明では、1種または複数種の免疫反応性試薬と組み合わせた、同じかまたは異なる投与経路によるHSP製剤の投与を意図している。好ましい一実施形態では、HSP製剤は皮内投与される。他の好ましい実施形態では、免疫反応性薬剤は静脈内に投与される。特に好ましい実施形態では、HSP製剤は皮内に投与され、免疫反応性薬剤は静脈内に投与される。ある実施形態では、潜在的に有害または望ましくない副作用、例えばそれには限定されないが、毒性を生じる免疫反応性試薬と同時にHSP製剤を投与するとき、前記免疫反応性試薬は有害副作用が誘導される閾値以下の用量で有利に投与することができる。
【００７０】
他の実施形態では、本発明は最適用量未満の用量の免疫反応性試薬で免疫応答を誘導する方法を提供し、そこにおいてHSP製剤はそれを使用しなかった場合には単独使用で免疫応答を誘導するためには不十分な用量の免疫反応性試薬による免疫応答の誘導を助ける。ある実施形態では、最適用量未満の量は、そうしなかった場合には免疫応答または所望の予防もしくは治療上の効果を効率的に誘導するには不十分な量である。特に、本方法は、(a)被験体にある量の熱ショックタンパク質製剤を投与するステップと、(b)被験体に、それに対する免疫応答の誘導が望まれる免疫反応性試薬を(a)のステップを行わない場合には適量に満たない量で投与するステップであって、それにより被験体において免疫応答が誘導されるステップと、を含む。HSP製剤は、免疫反応性試薬によって認識される抗原性分子の免疫原性を示すことも示さないこともある。
【００７１】
他の実施形態では、本発明は免疫原性未満の量のHSP製剤で免疫応答を誘導する方法を提供し、そこにおいて免疫反応性試薬は単独使用で免疫応答を誘導するためにはより効率の悪い量のHSP製剤による免疫応答の誘導を助ける。このHSP製剤は、免疫反応性試薬によって認識される抗原性分子の免疫原性を示すことも示さないこともある。
【００７２】
本発明は、被験体に免疫反応性試薬とHSPを含んでいる医薬組成物を投与することによる、病気、障害または感染症と関連する1種または複数種の症状の治療、予防および改善方法を提供する。好ましい態様では、免疫反応性試薬とHSPは実質的に精製されている(すなわち、その効果を制限するか望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。本発明に従って、免疫反応性試薬とHSPを含む本発明の組成物は、癌、感染症または神経変性もしくはアミロイド疾患を有するヒトの患者に、治療薬として投与される。
【００７３】
本発明は、感染症、原発性もしくは転移性新生物疾患(すなわち、癌)、神経変性もしくはアミロイド疾患、タンパク質沈着/アミロイド形成症の治療、または増強された免疫応答によって改善される疾患のいかなる他の治療のために本発明の組成物を使用する方法にも関する。
【００７４】
4.2  患者集団
HSP製剤と免疫反応性試薬が投与される被験体は、好ましくは哺乳類、例えば非霊長類(例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、その他)および霊長類(例えばサル、例えばカニクイザル、およびヒト)である。好ましい一実施形態では、被験体はヒトである。
【００７５】
他の様々な実施形態では、本発明の方法と組成物を使用して、治療的または予防的免疫反応性試薬が治療または予防に役立ついかなる病気または障害を治療または予防する。好ましくは、この病気または障害は、増強された免疫応答による治療または予防に感受性であり、より好ましくは感染症、癌または神経変性もしくはアミロイド疾患である。
【００７６】
この組成物は、例えば、家族歴の結果として素因を有する個人または環境要因のために癌のリスクが高い個人において各種癌の予防のために、また例えば、感染症の病原体に曝される危険性の高い個人において感染症の予防のために、ならびに、例えば神経変性もしくはアミロイド疾患への遺伝的素因を有する個人において神経変性もしくはアミロイド疾患を予防するために利用できる。
【００７７】
本発明の方法と組成物は、治療前歴のない患者、HSP製剤による治療を以前に受けたかもしくは現在受けている患者、免疫反応性試薬による治療を以前受けたかもしくは現在受けている患者、または他の製薬もしくは併用薬、例えば、それには限定されないが、抗癌剤、抗生物質、抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤による治療を以前受けたかもしくは現在受けている患者に対して使用できる。本発明の具体的な一実施形態では、HSP製剤は免疫療法試薬による治療を以前に受けたか現在受けている患者に投与される。他の実施形態では、免疫療法試薬はHSP製剤による治療を以前に受けたかもしくは現在受けている患者に投与される。本発明の他の実施形態では、HSP製剤は、それには限定されないが、抗癌剤、抗生物質、抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤などによる治療を、任意に免疫反応性試薬と併用して以前に受けたかもしくは現在受けている患者に投与される。他の実施形態では、免疫療法試薬は、それには限定されないが、抗癌剤、抗生物質、抗細菌剤、抗真菌剤または抗ウイルス剤などの治療を、任意にHSP製剤と併用して以前に受けたかもしくは現在受けている患者に投与される。
【００７８】
好ましい一実施形態では、免疫療法試薬とHSP製剤からなる本発明の医薬組成物は、それには限定されないが、抗癌剤、抗生物質、抗細菌剤、抗真菌剤または抗ウイルス剤などの治療を以前に受けたかもしくは現在受けている患者に投与される。
【００７９】
本発明の方法と化合物を用いて、以前HSP製剤または免疫反応性試薬による治療を受けて、現在はそれぞれの単独投与では有効に治療されない患者を治療できる。
【００８０】
一実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬からなる本発明の組成物は、HSP製剤単独による単剤治療に十分な感受性を持たない患者に投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬からなる本発明の組成物は、免疫反応性試薬単独による単剤治療に難治性の患者に投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬からなる本発明の組成物は、一緒には用いないHSP製剤単独使用と免疫反応性試薬単独使用の両者による治療に難治性の患者に投与される。他の実施形態では、HSP製剤と免疫反応性試薬からなる本発明の組成物は、いかなる様式の薬物療法も受けていない患者に投与される。
【００８１】
4.3  癌の治療と予防
本発明は、被験体の癌または転移を治療または予防するための方法を含み、この方法はこの被験体に癌細胞の抗原もしくはエピトープ(例えば、免疫原性量の癌抗原、例えば、それには限定されないが、腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原、またはその抗原性を示す分子)を認識する成分を含んでいる免疫反応性試薬を投与するステップと、免疫反応性試薬によって認識される成分に対する免疫応答をこの被験体内で誘導または増大させるのに有効な量のHSP製剤をこの被験体に投与するステップとを任意の順序で含む。
【００８２】
ある実施形態では、本発明の組成物と方法を用いて、癌細胞の増殖または転移を予防するか、抑制するか、または減らすことができる。特定の実施形態では、免疫反応性試薬と併用したHSP製剤の投与は、この免疫反応性試薬と併用したこのHSP製剤の投与を行わない場合の癌細胞の増殖または転移と比較して、癌細胞の増殖または転移を少なくとも99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%。少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも45%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも35%、少なくとも30%、少なくとも25%、少なくとも20%または少なくとも10%抑制または低減する。
【００８３】
本発明の方法によって治療できる癌には、それには限定されないが、白血病(例えば急性白血病、例えば急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病)、新生物、腫瘍(例えば非ホジキンリンパ腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫)、重鎖病(B細胞リンパ腫)、転移疾患または無制限細胞増殖を特徴とするいかなる病気または障害も含まれる。
【００８４】
腫瘍抗原または腫瘍関連抗原には、癌-生殖細胞(CG)抗原(MAGE、NY-ESO-1)、突然変異抗原(M-UM-1、p53、CDK-4)、過剰発現自己抗原(p53、HER2/NEU)、ウイルス抗原(乳頭腫ウイルス、エプスタイン・バーウイルス由来)、オープン・リーディング・フレームの非一次mRNA配列に由来する腫瘍タンパク質(NY-ES01、LAGE1)、MelanA、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、チロシナーゼ、gp100、gp75、HER-2/neu、c-erb-B2、CEA、PSA、MUC-1、CA-125、Stn、TAG-72、KSA(17-1A)、PSMA、p53(点突然変異および/または過剰発現)、RAS(点突然変異)、EGF-R、VEGF、GD2、GM2、GD3、Anti-Id、CD20、CD19、CD22、CD36、アベラント・クラスII、B1、CD25(IL-2R)(抗TAC)、またはHPVが含まれる。
【００８５】
好ましい一実施形態では、被験体の癌または転移を治療または予防するために、HSP製剤と免疫反応性試薬の投与を含む本発明の方法または組成物が用いられるが、そこにおいてこの免疫反応性試薬は抗CTLA-4抗体または抗41BB抗体である。他の好ましい実施形態では、被験体の癌または転移を治療または予防するために、HSP製剤と免疫反応性試薬の投与を含む本発明の方法または組成物が用いられるが、そこにおいてこの免疫反応性試薬は抗腫瘍モノクローナル抗体である。他の好ましい実施形態では、被験体の癌または転移を治療または予防するために、HSP製剤と免疫反応性試薬の投与を含む本発明の方法または組成物が用いられるが、そこにおいてこの免疫反応性試薬はハーセプチン(Herceptin)である。
【００８６】
4.4  感染症の治療
本発明は、被験体の感染症を治療または予防するための方法を含み、この方法はこの被験体に免疫反応性試薬を投与するステップと、この免疫反応性試薬と併用してその成分に対する免疫応答をこの被験体内で誘導または増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤をこの被験体に投与するステップとを任意の順序で含む。
【００８７】
免疫反応性試薬を本発明の方法と共に使用して治療または予防できる感染症は、それには限定されないが、ウイルス、細菌、真菌類、原生動物および寄生虫などの感染性因子によって引き起こされる。感染症に対して一般的に使用されている免疫反応性試薬の一部とその適当な用量および用途は当技術分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第56版、2002年)などの文献に記載されている。
【００８８】
本発明によって治療できる感染性因子には、それに限定されないが、ウイルス、細菌、真菌類および原虫症の病原体が含まれる。
【００８９】
免疫反応性試薬を本発明の方法と組み合わせて使用して治療または予防できるウイルス性疾患には、それには限定されないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペスI型(HSV-I)、単純ヘルペスII型(HSV-II)、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-I)、ヒト免疫不全ウイルスII型(HIV-II)、およびウイルス病、例えばウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘の病原体などによって引き起こされるものがある。
【００９０】
免疫反応性試薬を本発明の方法と組み合わせて使用して治療または予防ができる細菌性疾患は、それには限定されないが、マイコバクテリア・リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、S.ニューモニエ、ボレリア・バーグドオルフェリー(ライム病)、バシラス・アンスラシス(炭疽)、破傷風、連鎖球菌、ブドウ球菌、マイコバクテリウム、破傷風、百日咳、コレラ、ペスト、ジフテリア、クラミジア、S.アウレウスおよびレジオネラなどの細菌によって引き起こされる。
【００９１】
免疫反応性試薬を本発明の方法と組み合わせて使用して治療または予防ができる原虫症および/または寄生虫症は、それには限定されないが、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマ、マラリア、クラミジア、リケッチア、シャーガス病、フィラリア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症および条虫類によって引き起こされる病気などの原虫および/または寄生虫によって引き起こされる。
【００９２】
4.5  神経変性疾患の治療
神経変性またはアミロイド疾患の特徴である、細胞または構造中またはその表面上、例えば、ペプチドおよび/またはタンパク質繊維を含む細胞外の沈着物もしくはプラーク中もしくはその表面上の抗原性分子に特異的に結合する免疫反応性試薬も、利用できる。好ましくは、神経変性またはアミロイド疾患の治療または予防が望まれる場合、それには限定されないが繊維ペプチドもしくはタンパク質をはじめとする、神経変性疾患と関連する抗原性分子のエピトープ、またはアミロイド疾患と関連する抗原性分子のエピトープ、を含む分子と特異的に結合する免疫反応性試薬を使用する。そのような神経変性疾患関連の抗原性分子は、アルツハイマー病、加齢と関係した認知機能の低下、老人性痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性小児麻痺、進行性核上性麻痺、グアム病、レーヴィ小体痴呆、プリオン病、海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ポリグルタミン病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、フリードリッヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作疾患、癲癇、慢性発作疾患、脳卒中、脳外傷、脊髄外傷、AIDS痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経性機能障害、高血圧、神経精神病性障害、統合失調症または分裂情動障害などに関連した分子でありうる。
【００９３】
そのような抗原性分子の例は、2001年7月26日発行の国際公開第01/52890号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で開示されており、その例としては、それに限定されないが、β-アミロイドまたはその断片、オリゴマーAβ複合体またはその断片、ApoE4-Aβ複合体、タウタンパクまたはその断片、アミロイド前駆体タンパク質またはその断片、変異体アミロイド前駆体タンパク質またはその断片、プレセニリン(presenillin)またはその断片、プレセニリン変異体またはその断片、α-シヌクレイン(synuclein)またはその断片、あるいはプリオンタンパク質またはその断片、および前記タンパク質またはその断片のいずれかの抗原性誘導体が含まれる。アミロイド疾患関連の抗原性分子は、アミロイド沈着物もしくはプラークを形成するタンパク質および/またはペプチド繊維の細胞外沈着を特徴とする疾患（限定されないが、インスリン非依存型糖尿病、ならびに慢性炎症もしくは感染症状態および悪性新生物、例えば骨髄腫と関連したアミロイドーシス）と関連した分子が含まれる。ある種のアミロイド疾患、例えばそれには限定されないが、アルツハイマー病、およびプリオン病、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病も、神経変性疾患である。
【００９４】
4.6  HSP製剤
当技術分野で公知の任意のHSPまたはHSP製剤を、本発明の組成物および方法で用いることができる。本発明においては、HSP製剤には、それには限定されないが、いかなる分子とも結合していない遊離のHSP；別の分子、例えばペプチドとHSPとの分子複合体；およびHSP融合タンパク質が含まれる。HSP-ペプチド複合体は、ペプチドと共有結合または非共有結合で結合したHSPを含む。HSP-ペプチド複合体は、腫瘍、病原体または細胞型および/または目的のタンパク質に由来するペプチド(例えば、抗体によって認識されるのと同じ標的)と結合したHSPで構成されてよい。あるいは、このHSP-ペプチド複合体は内因性のペプチドと結合したHSPから成ってもよいが、治療的抗体の標的と同じ供与源からのペプチドである必要はない。本発明の方法は、被験体への投与の前に、特異性抗原または抗原性ペプチドとの共有結合および非共有結合を必要としない。前記HSP製剤は、その製剤が投与される被験体から得られるものでもよいし、そうでなくてもよい。前記HSP、HSP-ペプチド複合体またはHSP融合タンパク質は、好ましくは精製されている。HSP製剤にはHSPを含んでいる粗細胞溶解物が挙げられるが、その溶解物の量は100〜108の細胞等価量に相当する。ペプチドがHSPに結合している場合、このペプチドはいかなるペプチドでもよく、HSPと非共有結合、共有結合していてもよくまたは融合していてもよい。HSPは大部分の細胞性供与源から、非共有結合でHSPと結合した異なるペプチドの複合体集団として都合よく精製できる。このHSPは、非共有結合で結合したペプチドから、低pHおよび/またはアデノシン三リン酸で処理することにより、または当技術分野で公知の他の方法によって分離することができる。一般的に、HSP製剤は免疫反応性試薬とは別個に投与される。前記ペプチドは、免疫反応性試薬、または当の感染症もしくは障害に無関係でもよい。被験個体の便宜と快適さのために、このHSP製剤は投与の直前に免疫反応性試薬と混合してもよい。
【００９５】
様々な実施形態において、HSPの供与源は、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。したがって、本発明の方法によって使われるHSP製剤には、真核生物HSP、哺乳類のHSPおよびヒトのHSPが含まれる。HSP製剤が由来する真核生物供与源とこのHSP製剤を投与される被験体は、好ましくは同じ生物種である。
【００９６】
本発明の様々な実施形態において、HSP製剤は、それには限定されないが、hsp60、hsp70、hsp90、hsp110、gp96、grp170またはカルレティキュリンなどのHSPを、単独にもしくは組合わせて含むことができる。好ましくは、前記HSPはhsp60、hsp70、hsp90、hsp 110、gp96、grp170またはカルレティキュリンである。本発明には、HSP-ペプチド複合体、例えばhsp60-ペプチド複合体、hsp70-ペプチド複合体、hsp90-ペプチド複合体、hsp110-ペプチド複合体、gp96-ペプチド複合体、grp170-ペプチド複合体またはカルレティキュリン-ペプチド複合体なども含まれる。本発明には、HSP融合タンパク質、例えばhsp60融合タンパク質、hsp70融合タンパク質、hsp90融合タンパク質、hsp110融合タンパク質、gp96融合タンパク質、grp170融合タンパク質またはカルレティキュリン融合タンパク質も含まれる。
【００９７】
好ましい一実施形態では、HSP製剤は単体のHSP、HSP複合体またはHSP融合タンパク質を含む。本発明の他の実施形態では、HSP製剤は、HSP、HSP複合体またはHSP融合タンパク質の混合物を含む。好ましくは、HSP、HSP複合体および/またはHSP融合タンパク質の混合物は、2つ以上の実質的に純粋なHSP、HSP複合体および/またはHSP融合タンパク質を含む。本明細書で使われる「実質的に純粋」は、自然状態でHSPまたはHSP複合体と通常結合している、一定の再現性のあるクロマトグラフィー反応、溶出プロフィールおよび生物学的活性を示す化合物を実質的に含まないことを意味する。実質的に純粋なHSP複合体は、共有結合または非共有結合によりHSPと複合体化したペプチド、および内因的にHSPと複合体化したペプチドは除かれてはいない。用語「実質的に純粋」は、HSP、HSP複合体もしくはHSP融合タンパク質と他の化合物との人工混合物または合成混合物を排除することを意味しない。それには限定されないが、HSP、HSP複合体およびHSP融合タンパク質、ならびにそれらの調製法のいくつかの例が以下で提供される。
【００９８】
一実施形態では、特異的免疫応答を引き出すためにHSP製剤が免疫反応性試薬と併用されなかった場合、前記HSP製剤を単独で投与しても前記免疫反応性試薬で誘導されたであろう抗原特異的免疫応答が誘導されない。他の実施形態では、HSP製剤は前記免疫反応性試薬で誘導されたであろう抗原特異的免疫応答を誘導する。
【００９９】
hsp60、hsp70およびhsp90ファミリーに属するすべてのHSPは、そのようなHSPの断片を含めて、本発明の実施において使用できることを意図している。
【０１００】
本発明では、精製された未結合のHSP、共有結合または非共有結合で特異的なペプチドまたは非特異的なペプチドと結合したHSP(本明細書では総称してHSP-ペプチド複合体と称される)、HSP融合タンパク質、およびそれらの複合体が使われる。複合体を形成しているか形成していないHSPの精製が、以下のサブセクションで記載される。さらに、当業者は組換え発現またはペプチド合成によってHSPとHSP融合タンパク質を合成できるが、それらも以下に記す。
【０１０１】
他の実施形態では、HSPは、その細胞内発現量がストレス刺激に応答して上昇するストレスタンパク質の3つの主要なファミリーの構成メンバーと少なくとも35%〜55%、好ましくは55%〜75%、最も好ましくは75%〜85%のアミノ酸同一性を有する他のタンパク質、突然変異蛋白質、類似体およびその変異体でもよいことが意図される。HSPクラスに属しているストレスタンパク質の調製、単離および精製は当技術分野で公知であり文献にも記載されており、例えばカルレティキュリンの調製と精製が、BasuおよびSrivastava、1999年、J. Expt. Med. 189:797〜802頁（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に記載されている。本発明は、HSPとHSP-ペプチド複合体を調製および精製する方法も含み、以下に記載するが、それらは例示的に提示されており制限するためのものではない。
【０１０２】
4.6.1  Hsp70またはHsp70-ペプチド複合体の調製と精製
hsp70-ペプチド複合体の精製は既に記載されており、例えば、Udono他、1993年、J. Exp. Med. 178:1391〜1396頁を参照されたい。使用できる手法を、制限するためではなく例示として次に提示する。
【０１０３】
最初に、ヒトまたは哺乳動物の細胞を5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、2mMのMgCl2および1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)からなる1×溶解緩衝液3容に懸濁する。次に、鏡検で観察して>99%の細胞が溶解するまで、ペレットを氷上で超音波処理する。超音波処理の代わりに、細胞は機械的分断によって溶解してもよく、この手法では、細胞は一般的に30mMの重炭酸ナトリウム(pH7.5)、1mMのPMSFで再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、次に、Dounceホモジナイザーで>95%の細胞が溶解するまでホモジナイズする。
【０１０４】
その後、溶解物を1,000gで10分間遠心分離して、未破壊の細胞、核および他の細胞破片を取り除く。得られた上清を100,000gで90分間さらに遠心分離し、上清を収集して2mMのCa2+と2mMのMg2+を含有しているリン酸緩衝食塩水(PBS)で平衡化したCon Aセファロース(商標)と混合する。細胞を機械的分断で溶解する場合、上清をCon Aセファロース(商標)との混合の前に等量の2×溶解緩衝液で希釈する。次に、上清を4℃で2〜3時間、Con Aセファロース(商標)と結合させる。結合しない物質を回収し、36時間(3回、それぞれ100容)、10mMトリス-アセテート(pH7.5)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して透析する。その後、透析物を17,000rpm(Sorvall SS34ローター)で20分間遠心分離する。得られた上清を回収して、20mMのトリス-アセテート(pH7.5)、20mMのNaCl、0.1mM EDTAおよび15mMの2-メルカプトエタノールで平衡化されたMono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)にかける。カラムは次に20mMから500mMのNaCl濃度勾配で展開し、溶出画分をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、適当な抗hsp70抗体(例えばStressGenからのクローンN27F3-4に由来する)を用いたイムノブロッティングによって特性解析を行う。
【０１０５】
抗hsp70抗体との免疫反応性が強い画分をプールし、hsp70-ペプチド複合体を硫酸アンモニウム、特に50%-70%硫酸アンモニウムで沈殿させる。得られた沈降物は、次に17,000rpm(SS34 Sorvallローター)での遠心分離で回収し、70%の硫酸アンモニウムで洗浄する。洗浄した沈降物を次に可溶化し、残留する硫酸アンモニウムもSephadex(登録商標)G25カラム(Pharmacia)を用いたゲル濾過によって除去する。必要に応じて、このように得たhsp70製剤を、前記したようにMono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)を通してさらに精製することができる。
【０１０６】
hsp70-ペプチド複合体は、この方法により見かけ上均一に精製できる。一般的に、1mgのhsp70-ペプチド複合体は、1gの細胞/組織から精製できる。
【０１０７】
hsp70-ペプチド複合体の精製のための改善された方法は、細胞性タンパク質を固相基質に付着させたADPまたはATPの加水分解抵抗性類似体と接触させ、溶解物中のhsp70が前記ADPまたは加水分解抵抗性ATP類似体と結合できるようにし、次に結合したhsp70を溶出させることを含む。好ましい方法では、固相基質(例えばADP-アガロース)に付着させたADPを用いたカラムクロマトグラフィーを使用する。得られたhsp70製剤は、純度がより高く、HSP-ペプチド複合体のHSPと結合した内因的に結合したペプチドではない混入タンパク質は含んでいない。hsp70複合体の収率も、約10倍以上著しく向上する。あるいは、ADPの代わりにATPの加水分解抵抗性類似体をクロマトグラフィーに用いて、hsp70-ペプチド複合体の精製ができる。限定するものではなく例示として、ADP-アガロースクロマトグラフィーによるhsp70-ペプチド複合体の精製は、次のように実行できる。
【０１０８】
Meth A肉腫細胞(5億個の細胞)を低張緩衝液中でホモジナイズし、溶解物は100,000gで90分間、4℃で遠心分離する。上清をADP-アガロースカラムに加える。カラムは緩衝液で洗浄して5カラム容の3mMのADPで溶出させる。hsp70-ペプチド複合体は、溶出する計15画分の内2〜10画分で溶出する。溶出した画分は、SDS-PAGEによって分析する。hsp70-ペプチド複合体は、この方法により見かけ上均一に精製できる。
【０１０９】
hsp70-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPまたは低いpHの存在下で実行可能である。これら2つの方法は、hsp70-ペプチド複合体からペプチドを溶出させるために用いることができる。最初の方法では、hsp70-ペプチド複合体製剤をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他の方法では、hsp70-ペプチド複合体製剤を低いpHの緩衝液中でインキュベートすることを含む。これらの方法および当技術分野で公知の他のいかなる方法でも、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドを分離するために適用できる。
【０１１０】
4.6.2  Hsp90またはHsp90-ペプチド複合体の調製と精製
使用できる手法を、制限するためではなく例示として次に提示する。
【０１１１】
最初に、ヒトまたは哺乳動物の細胞を5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、2mMのMgCl2および1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)からなる1×Lysis緩衝液3容で懸濁する。次に、鏡検で観察して>99%の細胞が溶解するまで、ペレットを氷上で超音波処理する。超音波処理の代わりに、細胞は機械的分断によって溶解してもよく、この手法では、細胞は一般的に30mMの重炭酸ナトリウム(pH7.5)、1mMのPMSFで再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、次に、Dounceホモジナイザーで>95%の細胞が溶解するまでホモジナイズする。
【０１１２】
その後、溶解物を1,000gで10分間遠心分離して、未破壊の細胞、核および他の細胞破片を取り除く。得られた上清は100,000gで90分間さらに遠心分離し、上清を回収して、2mMのCa2+と2mMのMg2+を含有しているPBSで平衡化したCon Aセファロース(商標)と混合する。細胞を機械的分断によって溶解する場合、上清はCon Aセファロース(商標)との混合の前に等量の2×溶解緩衝液で希釈する。次に、上清は4℃で2〜3時間、Con Aセファロース(商標)と結合させる。結合しない物質を回収してから36時間(3回、それぞれ100容)、10mMトリス-アセテート(pH7.5)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSFに対して透析する。その後、透析物は17,000rpm(Sorvall SS34ローター)で20分間遠心分離する。得られた上清を回収して、溶解緩衝液で平衡化されたMono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)にかける。タンパク質は、次に200mM〜600mM NaClの塩濃度勾配で溶出する。
【０１１３】
溶出画分は、SDS-PAGEで分画し、hsp90-ペプチド複合体を含有している画分は3G3(Affinity Bioreagents)のような抗hsp90抗体を用いたイムノブロッティングで同定する。hsp90-ペプチド複合体は、この方法により見かけ上均一に精製できる。一般的に、150〜200μgのhsp90-ペプチド複合体が、1gの細胞/組織から精製できる。
【０１１４】
hsp90-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPまたは低いpHの存在下で実行可能である。これら2つの方法は、hsp90-ペプチド複合体からペプチドを溶出させるために用いることができる。最初の方法では、hsp90-ペプチド複合体製剤をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他の方法では、hsp90-ペプチド複合体製剤を低いpHの緩衝液中でインキュベートすることを含む。これらの方法および当技術分野で公知の他のいかなる方法でも、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドを分離するために適用できる。
【０１１５】
4.6.3  gp96またはgp96-ペプチド複合体の調製と精製
使用できる手法を、制限するためではなく例示として次に提示する。
【０１１６】
ヒトまたは哺乳類の細胞のペレットを、30mMの重炭酸ナトリウム緩衝(pH7.5)と1mMのPMSFからなる緩衝液3容に再懸濁し、細胞を氷上で20分間膨張させる。次に細胞ペレットを、>95%の細胞が溶解するまで、氷上でDounceホモジナイザー(ホモジナイザーの適当なクリアランスは、各細胞型によって異なる)を用いてホモジナイズする。
【０１１７】
その後、溶解物を1,000gで10分間遠心分離して、未破壊の細胞、核および他の破片を取り除く。この遠心分離からの上清を、次に100,000gで90分間再遠心分離する。gp96-ペプチド複合体は、100,000のペレットからでも上清からでも精製できる。
【０１１８】
上清から精製するときは、上清を等量の2×溶解緩衝液で希釈し、4℃で2〜3時間、2mMのCa2+と2mMのMg2+を含有するPBSで平衡化したCon Aセファロース(商標)と混合する。その後、スラリーをカラムに詰め、OD280がベースラインに低下するまで1×溶解緩衝液で洗浄する。次に、カラムを2mMのCa2+と2mMのMg2+を含有するPBSに溶かした10%のα-メチルマンノシド(α-MM)の1/3カラムベッド容で洗浄し、カラムをパラフィルム片で密封後、37℃で15分間インキュベートする。次に、カラムを室温に冷却後、パラフィルムをカラムの底から取り除く。5カラム容のα-MM緩衝液をカラムに加え、溶出液をSDS-PAGEで分析する。一般的に、得られる物質は純度が約60〜95%であるが、純度は用いる細胞型と組織対溶解緩衝液比に依存する。次に、試料を5mMのリン酸ナトリウムを含む緩衝液(pH7)で平衡化されたMono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)にかける。タンパク質は、次に0〜1M NaCl濃度勾配でカラムから溶出され、gp96画分は400mM〜550mMのNaCl濃度に溶出する。
【０１１９】
しかし、この方法は2つの追加のステップを単独でまたは組み合わせることで変更でき、見かけ上均一なgp96-ペプチド複合体を一貫して生産することができる。オプションの1つのステップはCon A精製段階の前に硫安沈殿を含み、他のオプションのステップはCon A精製段階の後かつMono Q FPLC(商標)段階の前にDEAE-セファロース(商標)精製を含む。
【０１２０】
最初のオプションのステップでは、以下に例示として記載すると、100,000gの遠心段階から生じる上清に、硫酸アンモニウムを添加して、硫酸アンモニウムの最終濃度を50%にする。硫酸アンモニウムは、氷水の入ったトレー中に置かれたビーカー中で溶液を穏やかに攪拌しながら、ゆっくりと添加する。溶液を4℃で約1/2〜12時間攪拌し、得られる溶液を6,000rpm(Sorvall SS34ローター)で遠心分離する。この段階から生じる上清を取り出し、硫酸アンモニウム溶液の添加により70%の飽和硫酸アンモニウムにし、6,000rpm(Sorvall SS34ローター)で遠心分離する。この段階から生じるペレットを収集した後、このペレットを洗浄するために70%の硫酸アンモニウムを含有するPBSに懸濁する。この混合液を6,000rpm(Sorvall SS34ローター)で遠心分離し、ペレットは2mMのCa2+とMg2+を含有するPBSに溶解させる。溶解しない物質は15,000rpm(Sorvall SS34ローター)で短時間遠心分離して除去する。その後、この溶液はCon Aセファロース(商標)と混合し、前記した手順に従う。
【０１２１】
第2のオプションのステップでは、例示として記載すると、Con Aカラムから溶出したgp96含有画分をプールし、緩衝液は透析により、または好ましくはセファデックスG25カラムによる緩衝液交換により、5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、300mM NaClに交換する。緩衝液交換の後、溶液を、5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、300mM NaClで予め平衡化したDEAE-セファロース(商標)と混合する。タンパク質溶液とビーズを緩やかに1時間混ぜ合わせ、カラムへ注入する。その後、280nmの吸光度がベースラインに低下するまで、カラムを5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、300mM NaClで洗浄する。その後、結合したタンパク質は、5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、700mM NaCl、5容で溶出する。タンパク質を含有している画分をプールし、塩濃度を175mMまで下げるために、5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)で希釈する。次に、得られた物質を、5mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)で平衡化されたMono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)にかけ、Mono Q FPLC(商標)イオン交換クロマトカラム(Pharmacia)と結合するタンパク質は前記したように溶出される。
【０１２２】
しかし、当業者が通常の実験によって第2のオプションのステップを精製プロトコルに取り込むことの利点を評価できるかもしれないことは理解されよう。さらに、オプションの各ステップを加えることの利点が出発物質の由来に依存することも理解されよう。
【０１２３】
gp96画分を100,000gのペレットから単離する場合、このペレットを1%のデオキシコール酸ナトリウムか1%のoxtylグルコピラノシド(しかし、Mg2+とCa2+は含まない)を含有するPBSの5容に懸濁し、氷上で1時間インキュベートする。懸濁液を20,000gで30分間遠心分離し、得られる上清を、PBS(同じく、Mg2+とCa2+を含まない)を数回交換して透析して、界面活性剤を除去する。透析物を100,000gで90分間遠心分離し、上清を回収し、カルシウムとマグネシウムをこの上清に加えてそれぞれ2mMの最終濃度にする。次に、変更されていない方法もしくは改変法によってこの試料を精製し、100,000g上清からgp96-ペプチド複合体を単離する(上記参照)。
【０１２４】
gp96-ペプチド複合体は、この方法により見かけ上均一に精製できる。約10〜20μgのgp96が、1gの細胞/組織から単離できる。
【０１２５】
gp96-ペプチド複合体からのHSPの分離は、ATPまたは低いpHの存在下で実行可能である。これら2つの方法は、gp96-ペプチド複合体からペプチドを溶出させるために用いることができる。最初の方法では、gp96-ペプチド複合体製剤をATPの存在下でインキュベートすることを含む。他の方法では、gp96-ペプチド複合体製剤を低いpHの緩衝液中でインキュベートする。これらの方法および当技術分野で公知の他のいかなる方法でも、hsp-ペプチド複合体からHSPとペプチドを分離するために適用できる。
【０１２６】
4.6.4  Hsp110-ペプチド複合体の調製と精製
限定するためではなく例示として提示する、利用可能なWang他、2001年、J. Immunol. 166(1):490〜7頁によって記載された方法は、次の通りである:
細胞または組織、例えば腫瘍細胞組織のペレット(40〜60ml)を、5容の低張緩衝液(30mN重炭酸ナトリウム、pH7.2およびプロテアーゼインヒビター)中でDounceホモジナイゼーションによりホモジナイズする。溶解物を、4,500×g、次に100,000×gで2時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓起源であるならば、得られる上清を最初にブルーセファロースカラム(Pharmacia)に負荷してアルブミンを除去する。そうでなければ、得られる上清を、結合緩衝液(20mMのトリス-HCl、pH7.5;100mMのNaCl;1mMのMgCl2;1mMのCaCl2;1mMのMnCl2;および15mMの2-ME)で事前に平衡化したCon A-セファロースカラム(Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)に加える。結合したタンパク質は、15%のα-D-o-メチルマンノシドを含有する結合緩衝液(Sigma、St. Louis、MO)で溶出する。
【０１２７】
Con A-セファロースから分離した物質は、先ず20mMのトリス-HCl、pH7.5;100mMのNaCl;および15mMの2-MEの溶液に対して透析し、次に、DEAE-セファロースカラムに加え、100〜500mMのNaClの塩勾配により溶出する。hsp 110を含有している画分を集めて透析し、20mMのトリス-HCl、pH7.5;200mMのNaCl;および15mMの2-MEで平衡化したMono Q(Pharmacia)10/10カラムにかける。結合したタンパク質は、200〜500mMのNaClの勾配で溶出する。画分は、Wang他、1999年、J. Immunol. 162:3378頁に記載されているように、SDS-PAGE、次にhsp110のAbを用いたイムノブロッティングで分析する。プールされたhsp110を含有している画分は、Centriplus(Amicon、Beverly、MA)で濃縮し、Superose 12のカラム(Pharmacia)に加える。タンパク質は、40mMのトリス-HCl、pH8.0;150mMのNaCl;および15mMの2-MEで0.2ml/分の流速で溶出する。
【０１２８】
4.6.5  産生されたGrp170-ペプチド複合体の調製と精製
限定するためではなく例示として提示する、利用可能なWang他、2001年、J. Immunol. 166(1):490〜7頁によって記載された方法は、次の通りである:
細胞または組織、例えば腫瘍細胞組織のペレット(40〜60ml)を、5容の低張緩衝液(30mN重炭酸ナトリウム、pH7.2およびプロテアーゼインヒビター)中でDounceホモジナイゼーションによりホモジナイズする。溶解物を、4,500×g、次に100,000×gで2時間遠心分離する。細胞または組織が肝臓起源であるならば、得られる上清を最初にブルーセファロースカラム(Pharmacia)に負荷してアルブミンを除去する。そうでなければ、得られる上清を、結合緩衝液(20mMのトリス-HCl、pH7.5;100mMのNaCl;1mMのMgCl2;1mMのCaCl2;1mMのMnCl2;および15mMの2-ME)で事前に平衡化したCon A-セファロースカラム(Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)に加える。結合したタンパク質は、15%のα-D-o-メチルマンノシドを含有する結合緩衝液(Sigma、St. Louis、MO)で溶出する。
【０１２９】
Con A-セファロースに結合した物質は、最初に20mMのトリス-HCI、pH7.5と150mMのNaClで透析し、次に、Mono Qカラムに加えて150〜400mMのNaClの勾配で溶出する。プールされた画分は濃縮し、Superose 12のカラム(Pharmacia)に加える。均一なgrpl70を含有している画分を採取する。
【０１３０】
4.6.6  HSPの組換え発現
当技術分野で公知の方法を用いて、組換え法によりHSPを産生できる。HSPをコードしている核酸配列を、宿主細胞内での増殖と発現のための発現ベクターに挿入することができる。
【０１３１】
本明細書で使われる発現構築物は、1種または複数種の調節領域と機能しうるように連結したHSPをコードしているヌクレオチド配列を指し、これは適切な宿主細胞での前記HSPの発現を可能にするものである。「機能しうるように連結する」とは、調節領域と発現させるべきHSP配列が、転写および、究極的には翻訳を可能にするような方法で結合し、配置される結合を指す。
【０１３２】
HSPの転写のために必要な調節領域は、発現ベクターによって提供される。コグネイト開始コドンを欠いているHSP遺伝子配列を発現させようとするならば、翻訳開始コドン(ATG)も提供されうる。適合する宿主-構築物系では、細胞の転写因子、例えばRNAポリメラーゼは、宿主生物内で発現構築物上の調節領域と結合して修飾されたHSP配列の転写を実行する。遺伝子発現のために必要とされる調節領域の正確な性質は、宿主細胞によって異なる。通常、RNAポリメラーゼと結合して機能しうるように連結した核酸配列の転写を促進するプロモーターが必要である。そのような調節領域には、転写および翻訳の開始に関係する5'非コード配列、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などが含まれる。コード配列の3'側非コード領域は、転写終結調節配列、例えばターミネーターおよびポリアデニル化部位などを含んでもよい。
【０１３３】
調節機能を有するDNA配列、例えばプロモーターをHSP遺伝子配列に結合させるため、あるいは、HSP遺伝子配列をベクターのクローニング部位に挿入するために、適当な適合性のある制限部位を提供するリンカーまたはアダプターを、当技術分野で公知の手法でcDNA末端に連結してもよい(Wu他、1987年、Methods in Enzymol. 152:343〜349頁)。制限酵素による開裂の後に修飾を行い、ライゲーションの前に一本鎖DNA末端を逆方向消化(digesting back)するかまたは充填することによって平滑末端を形成することができる。あるいは、所望の制限酵素部位を含有しているプライマーを用いたPCRの使用によるDNAの増幅によって、この所望の制限酵素部位をDNA断片に導入することができる。
【０１３４】
機能しうるように調節領域と連結したHSP配列を含んでいる発現構築物は、さらにクローニングすることなく、HSP-ペプチド複合体の発現と産生のために適当な宿主細胞に直接導入してもよい。例えば、米国特許第5,580,859号を参照されたい。発現構築物は、例えば、相同組み換えにより宿主細胞のゲノムへのHSP配列の組み込みを促進するDNA配列を含有してもよい。この場合、適当な宿主細胞でHSPを増殖させ発現させるために、この宿主細胞に適する複製起点を含む発現ベクターを必ずしも使用する必要はない。
【０１３５】
様々な発現ベクターが利用でき、それらには、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミドまたは改変ウイルスが含まれるが、これには限定されない。一般的に、そのような発現ベクターは、適切な宿主細胞内でのベクターの増殖のための機能的複製起点、HSP遺伝子配列の挿入のための1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位、および1種または複数種の選択マーカーを含む。発現ベクターは適合性のある宿主細胞とともに使用しなければならないが、このような細胞は、限定されないが、細菌、酵母、昆虫、哺乳類およびヒトなどの原核生物または真核生物に由来する。
【０１３６】
適切にプロセシングされたHSPまたはHSP-ペプチド複合体の長期にわたる高収率生産のためには、哺乳類の細胞における安定した発現が好ましい。安定してHSPまたはHSP-ペプチド複合体を発現する細胞系は、選択可能なマーカーを含有するベクターを用いて作製できる。限定するものではなく例示として提示するが、発現構築物の導入の後に、作製された細胞は富化培地で1〜2日間増殖させた後に、選択培地に切り替えて増殖させることができよう。発現構築物中の選択マーカーは選択に対する耐性を与え、細胞が安定して発現構築物をその染色体に組み込んで培地中で増殖し、細胞系へと増殖させるのを最適な状態で行う。そのような細胞はHSPを連続的に発現しながら長期間培養ができる。
【０１３７】
組換え細胞は、標準の温度条件、インキュベーション時間、光学的密度および培地組成下で培養できる。しかし、組換え細胞の生育条件は、HSPおよび抗原性タンパク質の発現のそれとは異なっていてもよい。変更された培養条件と培地を使用してもHSPの産生を増強できる。例えば、HSPとそのコグネイト・プロモーターを含有する組換え細胞は、熱または他の環境ストレスまたは化学ストレスに曝してもよい。当技術分野で公知のいかなる方法も、HSPまたはHSP-ペプチド複合体を生産するための最適な条件を確立するために適用できる。
【０１３８】
4.6.6.1  HSP融合タンパク質の組換え発現
当技術分野で公知の方法を用いて、熱ショックタンパク質配列および抗原性タンパク質配列からなる融合タンパク質を組換え法により生産できる。そのような組換え融合タンパク質を生産するために、抗原性のペプチドをコードしている配列と融合した熱ショックタンパク質をコードしている核酸配列を用い、前記第4.6.6節で記載されているような当技術分野で公知の組換え法を使用して、発現ベクターを構築する。次に、HSP-抗原性ペプチド融合体を発現させ、単離する。そのような融合タンパク質を使用して免疫応答を引き出すことができる。Suzue他、1997年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:13146〜51。分子の抗原性ペプチド部分を特異的に設計することによって、そのような融合タンパク質は免疫応答を引き出すために、また標的疾患または障害に対する免疫療法で用いることができる。
【０１３９】
4.6.7  ペプチド合成
組換え手法によるHSP生産に代わるものは、ペプチド合成である。例えば、HSP全体、またはHSPの一部に対応するペプチドは、ペプチド合成装置を使用して合成できる。従来のペプチド合成または当技術分野で公知の他の合成プロトコルを使用できる。
【０１４０】
HSPまたはその一部のアミノ酸配列を有するペプチドは、Merrifield、1963年、J. Am. Chem. Soc. 85:2149頁に記載の方法と類似の方法を用いた固相ペプチド合成で合成できる。合成の間、保護側鎖を有するN-α保護されたアミノ酸を、C末端によって不溶性のポリマー支持体、すなわちポリスチレンビーズに結合している伸長中のポリペプチド鎖に段階的に付加する。N-α脱保護されたアミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることによって活性化されたN-α保護されたアミノ酸のα-カルボキシル基に結合させることによってペプチドを合成する。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の結合によりペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるN-α保護された基には、酸に弱いBocおよび塩基に弱いFmocが含まれる。適当な化学的手法、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬の詳細は、当技術分野で周知であるので、本明細書で詳述しない(以下を参照、Atherton他、1989年、Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach、IRL Press、およびBodanszky、1993年、Peptide Chemistry、A Practical Textbook、第2版、Springer-Verlag)。
【０１４１】
得られたHSPの精製は従来の方法、例えば、ゲル透過を用いた分取HPLC、分配および/またはイオン交換クロマトグラフィーを使って実施する。適当なマトリックスおよび緩衝剤の選択は、当技術分野で周知であるので、本明細書で詳述しない。
【０１４２】
4.7  活性化抗原提示細胞(APC)
前記様々な実施形態において、HSP製剤の代わりに活性化APCを被験体に投与して類似の結果を得ることができる。本発明は抗原提示細胞を活性化する方法を含み、この方法にはAPCをHSP製剤と接触させることが含まれる。APCを活性化するためのHSP製剤による処理の前に、細胞は任意に濃縮または精製することができ、かつ/または当技術分野で周知の方法によりex vivoで増殖させることができる。APCは被験体、好ましくは、処理されたAPCが再投与されるのと同じ被験体(すなわち、自己APCが使われる)から得られるが、非自己APCも使用できる。非自己APCは、同系(すなわち、活性APCが投与される個体の一卵性双子に由来)、または同種異系(すなわち、活性APCが投与される個体と少なくとも1つの共通のMHC対立遺伝子を共有する個体)であってもよい。
【０１４３】
APCの活性化は、当技術分野で周知の手法によりモニターでき、これには、それには限定されないが、第6節に記載されているCD11b+細胞を試験するための方法などが含まれる。特定の実施形態において、活性APCをin vivoで用いて、被験体に合理的な程度に同じ時間に投与される免疫反応性試薬によって引き出される免疫応答を生じさせるかまたは増強することができる。あるいは活性APCは、前記したように様々な時間枠内で投与することができ、例えば、限定されないが、免疫反応性試薬の投与の前または後の1〜24時間の時間枠内に、または徐放性もしくは持続性の免疫反応性試薬を使用した後の2、3日以上の間に周知的に投与できる。好ましくは、処理されたAPCは免疫反応性試薬の投与部位、またはその近くに投与される。活性APCの投与は、当技術分野で公知のいかなる手法によっても実施できる。
【０１４４】
4.8  免疫反応性試薬
免疫反応性試薬には、抗体、抗体の抗原結合部分を含むように作製された分子またはタンパク質、目的の標的抗原を認識する抗原結合ドメインおよび抗体依存性免疫応答を媒介する定常領域ドメインを含むように作製された分子またはタンパク質、目的の抗原と特異的に相互作用するペプチドもしくはドメイン、または目的の抗原/エピトープと相互作用するあらゆる抗原結合ドメイン、および抗体依存性免疫エフェクター細胞応答もしくはプロセスを媒介する抗体の定常領域ドメインが含まれる。本発明で使用できる、抗体定常領域内のそのようなドメインまたは領域の例として、Reddy他、2000年、J. Immunol. 164(4):1925〜33頁;Coloma他、1997年、Nat. Biotechnol. 15(2):159〜63頁;Carayannopoulos他、1994年、Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(18):8348〜52頁;Morrison他、1992年、Annu.Recombinant Expression Vector Immunol. 10:239〜65頁;Traunecker他、1992年、Int. J. Cancer Suppl. 7:51〜2頁;Gillies他、1990年、Hum. Antibodies Hybridomas 1(1):47〜54頁（これらはそれぞれ参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に開示されているものが含まれる。
【０１４５】
好ましくは、本発明の免疫反応性試薬は、1)抗原結合領域、および2)1種または複数種の抗体依存性免疫プロセスを媒介する領域を含む。この抗原結合領域は、抗体の抗原結合領域を含むものでもよいし、それから成るものでもよい。この抗原結合領域は、目的の抗原と特異的に相互作用するあらゆるペプチドまたはドメインを含んでもよい。例えば、抗原結合領域は、リガンドでも目的の抗原の他の特異的結合パートナーでもよく、またはそのようなリガンドもしくは結合パートナーの断片でもよく、またはそのようなリガンドもしくは結合パートナーに由来するものでもよい。
【０１４６】
1種または複数種の抗体依存性免疫プロセスを媒介する領域は、Fc受容体と結合可能な領域、例えばFc受容体と結合する抗体部分、または補体と結合する領域、例えば抗体の補体結合領域を含むものでもよいし、それから成るものでもよい。この領域は、Fc受容体または補体と結合する抗体の抗原結合ドメインでもよい。
【０１４７】
このような抗体依存性プロセスには、それには限定されないが、抗体依存性細胞傷害、補体の活性化、オプソニン作用および食作用が含まれる。ある種の抗体依存性プロセスを媒介するエフェクター細胞には、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞および多形核細胞が含まれる。特定の機構には縛られないが、HSPは抗体依存性応答の媒介を担うエフェクター細胞上の受容体を増やすことができると考えられている。これらの受容体には、FcアルファおよびFcガンマ受容体、そのアイソフォーム、またはそのいかなる組合せも含まれる。このように、特定の実施形態では、1種または複数種の抗体依存性免疫プロセスを媒介する免疫反応性試薬の領域は、Fc受容体、好ましくはFcアルファ受容体もしくはFcガンマ受容体またはその両者に対するリガンドである領域を含むものでもよいしそれから成るものでもよい。他の実施形態では、1種または複数種の抗体依存性免疫プロセスを媒介する免疫反応性試薬の領域は、予防および/または治療の効果が達成されるように、免疫エフェクター細胞、好ましくは単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、多形核細胞またはそのような細胞の2つ以上の任意の組合せの機能を刺激する領域を含むものでもよいし、それから成るものでもよい。ある実施形態では、HSP製剤がサイトカイン放出および/またはT細胞活性化などの免疫応答を誘導する場合、免疫反応性試薬はそのような免疫応答を増強または共刺激する。
【０１４８】
好ましい一実施形態では、免疫反応性試薬は抗体、または血清のような抗体を含む組成物である。特定の一実施形態では、免疫反応性試薬は、IgA、IgGまたはIgM抗体であるか、そのフラグメントを含む。特に好ましい一実施形態では、免疫反応性試薬はモノクローナル抗体であるか、モノクローナル抗体のフラグメントを含む。免疫反応性試薬は、また、B型肝炎の治療のためにヒトの免疫グロブリンを含むかまたはそれから成るものでもよく;RSVの治療のためにレスピガム(Respigam)を含むかまたはそれから成るものでもよく;SandoglobulinまたはImmuneGlobulin IV(IGTV)を含むかまたはそれから成るものでもよい。他の実施形態では、免疫反応性試薬は単一のエピトープに対するものではなく、代わりに、エピトープの集団と結合する1種または複数種の分子の混合体を含む。そのような免疫反応性試薬の例は血清、または血清または血漿から濃縮した抗体である。そのような血清または血漿は、特定の抗原に対して免疫化された被験体からのものでも、そのようには免疫化されていない被験体からのものでもよい。
【０１４９】
本発明の方法で使われる抗体には、限定されないものの、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体)、ならびに上記いずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。特に、本発明の方法で使われる抗体には、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、目的の標的と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれの型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)、またはサブクラスであってもよい。
【０１５０】
他の実施形態では、免疫反応性試薬は異なる特異性の2つの抗原結合領域を有する二重特異性分子であり、すなわち、抗原結合領域の1つは標的細胞上のエピトープまたはタンパク質を認識し、他方はエフェクター細胞のエピトープ、例えばFcRのエピトープを認識する。他の実施形態では、免疫反応性試薬は、標的細胞/タンパク質上の異なるエピトープのための2つの抗原結合ドメインと、抗体依存性免疫応答を媒介するドメインを有する二重特異性分子である。このような癌細胞または病原体を標的にする二重特異性分子とその治療効果は、in vivoおよびin vitroで検討されてきている(例えば、Wallace他、2001年、J Immunol. Methods 248(1-2):167〜82頁;Sundarapandiyan他、2001年、J. Immunol. Methods 248(1-2):113〜23頁;Honeychurch他、2000年、Blood 96(10):3544〜52頁;Negri他、1995年、Br J Cancer 72(4):928〜33頁;Wang他、1994年、Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 16(2):83〜7頁、中国語)(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【０１５１】
好ましい一実施形態では、免疫反応性試薬は精製されている。ある種のペプチド、抗体、分子、タンパク質、抗原、HSP、HSP-ペプチド複合体などを記載するのに本明細書で用いられている「精製された」とは、分子、タンパク質、抗原などが、ペプチド、抗体、分子、タンパク質、抗原、HSP、HSP-ペプチド複合体などが自然界で通常結合しているタンパク質、多糖類および/または脂質から1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上分離されている状態を超えた状態を指す。単離された分子、タンパク質、抗原、HSP、HSP-ペプチド複合体などが合成されたものならば、それらには、その分子、タンパク質、抗原、HSP、HSP-ペプチド複合体などを合成するのに用いた化学前駆体または合成試薬が50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%または0.1%未満混入する。好ましい実施形態では、ペプチド、抗体、分子、タンパク質、抗原、HSP、HSP-ペプチド複合体などの純度は、少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、または100%である。本明細書で使われる用語「純度(%)」は目的の分子で構成される総組成物の重量パーセントを表したものである。このように、目的の分子50グラムを含有している100グラムの組成物は、目的の分子に関して純度50%である。
【０１５２】
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の多種多様な手法を使って調製でき、これにはハイブリドーマ法、組換え法、およびファージディスプレイ技法、またはそれらの組合せが含まれる。例えば、モノクローナル抗体は当技術分野で公知であり、そして例えば、Harlow他、Antibodies:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年);Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、pp. 563〜681(Elsevier、N.Y、1981年)中のHammerling他(その両方が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に教示されているものを含むハイブリドーマ法を使って生産できる。本明細書で使われる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ法によって生産された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、いかなる真核性、原核性またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それを生産する方法を指すわけではない。
【０１５３】
4.8.1  免疫反応性試薬の調製
本発明の免疫反応性試薬は、当技術分野で公知の抗体合成のための任意の方法、特に化学合成法、または好ましくは組換え発現法によって生産できる。そのような方法は、抗体免疫反応性試薬に関して以下に記すが、他の免疫反応性試薬の生産に容易に適用できる。
【０１５４】
ハイブリドーマ法を用いた特異的抗体の生産およびスクリーニングの方法は、当技術分野で慣用されており周知である。例としては、これには限定されないが、マウスを目的の抗原またはそのような抗原を発現する細胞で免疫化できる。一旦免疫応答が検出されれば、例えば、その抗原に特異的な抗体がマウス血清で検出されれば、マウスの脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次に脾細胞を周知の手法により任意の適当なミエローマ細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローン化する。ハイブリドーマクローンは、次に当技術分野で公知の方法で、その抗原と結合する抗体を分泌する細胞についてアッセイする。一般的に抗体を高濃度で含む腹水液は、マウスの腹腔内に陽性のハイブリドーマクローンを接種することによって作製できる。
【０１５５】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の手法によって作製できる。例えば、FabとF(ab')2フラグメントは、酵素、例えば（Fabフラグメントの生産のためには）パパインまたは（F(ab')2フラグメントの生産のためには）ペプシンを用いて、免疫グロブリン分子のタンパク加水分解切断によって生成できる。F(ab')2フラグメントは、完全な軽鎖と、重鎖の可変部、CH1領域およびヒンジ領域とを含む。
【０１５６】
例えば、抗体は当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用しても作製できる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインはそれらをコードしているポリヌクレオチド配列を持つファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えばヒトまたはマウス)から発現される、FabおよびFv、またはジスルフィド結合安定化Fvなどの抗原結合ドメインの提示に利用することができる。目的の抗原と結合する抗原結合領域を発現するファージは、抗原を用いて選択または同定することができ、例えば、標識抗原、または固相表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いる。これらの方法で用いるファージは、一般的に繊維状ファージであり、fdおよびM13が挙げられる。抗原結合ドメインは、組換えでファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのタンパク質と融合させたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの作製に使用できるファージディスプレイ法の例には、以下の文献に開示されている方法が含まれる：Brinkman他、1995年、J. Immunol. Methods 182:41〜50頁;Ames他、1995年、J. Immunol. Methods 184:177〜186頁;Kettleborough他、1994年、Eur. J. Immunol. 24:952〜958頁;Persic他、1997年、Gene 187:9〜18頁;Burton他、1994年、Advances in Immunology 57:191〜280頁;国際出願番号PCT/GB91/01134;国際公開第90/02809号;第91/10737号;第92/01047号;第92/18619号;第93/1 1236号;第95/15982号;第95/20401号;および米国特許第5,698,426号;第5,223,409号;第5,403,484号;第5,580,717号;第5,427,908号;第5,750,753号;第5,821,047号;第5,571,698号;第5,427,908号;第5,516,637号;第5,780,225号;第5,658,727号;第5,733,743号および第5,969,108号（これらは参照により本明細書にそれらの全体が組み込まれる）。
【０１５７】
上記文献に記載されているように、ファージ選択の後、ファージ由来の抗体コード領域を単離して、ヒト抗体などの完全抗体または他のいかなる所望のフラグメントも作製でき、これらは任意の所望の宿主、例えば哺乳類の細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌などで発現させることができるが、これは以下で詳述する。例えば、以下の文献に開示されている方法などの当技術分野で公知の方法を用いた、組換え法によりFab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを生産する手法も利用できる：国際出願第92/22324号;Mullinax他、1992年、BioTechniques 12(6):864〜869頁;Sawai他、1995年、AJRI 34:26〜34頁;およびBetter他、1988年、Science 240:1041〜1043頁（これらは参照により本明細書にその全体が組み込まれる）。一本鎖Fvおよび抗体を生産するために利用できる手法の例として、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号;Huston他、1991年、Methods in Enzymology 203:46〜88頁;Shu他、1993年、PNAS 90:7995〜7999頁;およびSkerra他、1988年、Science 240:103 8〜1040頁に記載の方法が含まれる。
【０１５８】
ヒトにおける抗体のin vivo使用を含めて一部の用途では、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使うことが好ましいであろう。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、可変領域がネズミのモノクローナル抗体に由来し定常領域がヒト免疫グロブリンに由来する抗体などがその例である。キメラ抗体の生成法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison、1985年、Science 229:1202頁;Oi他、1986年、BioTechniques 4:214頁;Gillies他、1989年、J. Immunol. Methods 125:191〜202頁;米国特許第5,807,715号;第4,816,567号;および第4,816,397号（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。ヒト化抗体は、ヒト以外の生物種由来の1種または複数種の相補性決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子由来の枠組み領域とを有する、所望の抗原に結合するヒト以外の生物種に由来する抗体分子である。しばしば、ヒトの枠組み領域の枠組み残基は、抗原との結合を変更、好ましくは改良するために、CDRドナー抗体からの対応する残基で置換されている。これらの枠組み置換は、当技術分野で周知の方法、例えば、CDRと枠組み残基の相互作用のモデリングによって、抗原結合にとって重要な枠組み残基を同定し、配列比較により特定の位置の異常な枠組み残基を同定することなどによって同定される。例えば、Queen他、米国特許第5,585,089号;Reichmann他、1988年、Nature 332:323頁（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。抗体は当技術分野で公知の各種手法でヒト化でき、この手法には、例えば以下の方法が含まれる：CDR移植法(欧州特許第239,400号;国際公開第91/09967号;米国特許第5,225,539号;第5,530,101号および第5,585,089号)、ベニヤリング法(veneering)およびリサーフェイシング法(resurfacing)(欧州特許第592,106号;第519,596号;Padlan、1991年、Molecular Immunology 28(4/5):489〜498頁;Studnicka他、1994年、Protein Engineering 7(6):805〜814頁;Roguska他、1994年、Proc Natl. Acad. Sci. USA、91:969〜973頁、およびチェーンシャッフリング法(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)。これらの文献は全て参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【０１５９】
治療用および/または予防用抗体の長期間の使用は、その機能のパフォーマンスと使用を制限する宿主免疫応答を誘起する抗体の免疫原性によって制限されるかもしれない。モノクローナル抗体を改変して抗体の免疫原性を減らし、それによって、宿主免疫系による中和を避けつつ抗体療法の持続的および/または繰返しの投与を可能にするために、TolerMab (商標)技術(TolerRx、Cambridge、MA)などの方策が開発された。したがって、それ自体に寛容性を誘導しつつ抗原を標的にしてその機能をin vivoで発揮する能力を維持することができるようになった「トレライズされた(tolerized)」モノクローナル抗体が、本発明に従った患者の治療的または予防的処置にとって望ましいであろう。Gilliland他、1999年、J. Immunol. 162:3663〜71頁。
【０１６０】
完全にヒト由来の抗体は、特にヒトの患者の治療的または予防的処置にとって望ましい。ヒトの抗体は、当技術分野で公知の様々な方法によって作製でき、これには上述のヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使ったファージディスプレイ法が含まれる。米国特許第4,444,887号と第4,716,111号;国際出願第98/46645号;第98/50433号;第98/24893号;第98/16654号;第96/34096号;第96/33735号;および第91/10741号（それらはそれぞれ参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。
【０１６１】
ヒト抗体は、内因性の機能的免疫グロブリンを発現できないがヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使っても作製できる。この、ヒト抗体を作製するための技術の概要については、LonbergおよびHuszar、1995年、Int. Rev.Immunol. 13:65〜93頁を参照されたい。この、ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するための技術、ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルに関する詳細な考察については、例えば国際公開第98/24893号;国際公開第92/01047号;国際公開第96/34096号;国際公開第96/33735号;欧州特許第0 598 877号;米国特許第5,413,923号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,569,825号;第5,661,016号;第5,545,806号;第5,814,318号;第5,885,793号;第5,916,771号;および第5,939,598号（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。さらに、Abgenix(登録商標)社(Freemont、CA)、Medarex(登録商標)(NJ)およびGenpharm(登録商標)(San Jose、CA)のような会社と契約して、上記と類似した技術を用い、選択された抗原に対するヒト抗体を供給してもらうことができる。
【０１６２】
選択されたエピトープを認識する完全にヒト由来の抗体は、「誘導選抜」と称される手法を使って作製できる。この手法では、選択されたヒト以外のモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全にヒト由来の抗体の選択を導く(Jespers他、1988年、Bio/technology 12:899〜903頁)。
【０１６３】
好ましい一実施形態では、抗体はin vivoでの治療的および/または予防的用途を有する。治療的および予防的抗体の例として、限定されないが、以下が含まれる。現在前立腺癌の治療のために臨床上使用されているヒト化抗CTLA-4抗体であるMDX-010(Medarex(登録商標)、NJ);RSV感染症患者の治療のためのヒト化抗呼吸器合胞体ウイルス(RSV)モノクローナル抗体である、SYNAGIS(登録商標)(MedImmune(登録商標)、MD);転移性乳癌患者の治療のためのヒト化抗HER2モノクローナル抗体である、HERCEPTIN(登録商標)(Trastuzumab)(Genentech(登録商標)、CA);クローン病の患者の治療のためのキメラ抗TNFαモノクローナル抗体である、REMICADE(登録商標)(infliximab)(Centocor(登録商標)、PA);クロット形成の予防のための血小板上の抗糖タンパク質IIb/IIIa受容体である、REOPRO(登録商標)(abciximab)(Centocor(登録商標);急性の腎性同種異系移植片拒絶反応の予防のための免疫抑制性ヒト化抗CD25モノクローナル抗体である、ZENAPAX(登録商標)(daclizumab)(Roche Pharmaceuticals(登録商標)、スイス)。他の例としては以下が挙げられる;ヒト化抗CD 18 F(ab')2(Genentech(登録商標));ヒト化抗CD18 F(ab')2であるCDP860(Celltech(登録商標)、英国);CD4と融合した抗HIV gp120抗体であるPR0542(Progenics(登録商標)/Genzyme Transgenics(登録商標));ヒト抗B型肝炎ウイルス抗体であるOstavir(Protein Design Lab(登録商標)/Novartis(登録商標));ヒト化抗CMV IgG1抗体であるPROTOVIR(商標)(Protein Design Lab(登録商標)/Novartis(登録商標));マウスの抗TNF-α-F(ab')2であるMAK-195(SEGARD(登録商標))(Knoll Pharma(登録商標)/BASF(登録商標));抗CD14抗体であるIC14(ICOS Pharm(登録商標));ヒト化抗VEGF IgG1抗体(Genentech(登録商標));マウスの抗CA 125抗体であるOVAREX(商標)(Altarex(登録商標));マウスの抗17-IA細胞表面抗原IgG2a抗体であるPANOREX(商標)(Glaxo Wellcome(登録商標)/Centocor(登録商標));マウスの抗イディオタイプ(GD3エピトープ)IgG抗体であるBEC2(ImClone System(登録商標));キメラ抗EGFR IgG抗体であるIMC-C225(ImClone System(登録商標));ヒト化抗αVβ3インテグリン抗体であるVITAXIN(商標)(Applied Molecular Evolution(登録商標)/MedImmune(登録商標));ヒト化抗CD52 IgG1抗体であるCampath 1H/LDP-03(Leukosite(登録商標));ヒト化抗CD33 IgG抗体であるSmart M195(Protein Design Lab(登録商標)/Kanebo(登録商標));キメラ抗CD20 IgG1抗体であるRITUXAN(商標)(IDEC Pharm(登録商標)/Genentech(登録商標)、Roche(登録商標)/Zettyaku(登録商標));ヒト化抗CD22 IgG抗体であるLYMPHOCIDE(商標)(Immunomedics(登録商標));ヒト化抗HLA抗体であるSmart ID 10(Protein Design Lab(登録商標));マウスの放射性標識抗HLA DIAGNOSTIC REAGENT抗体であるONCOLYM(商標)(Lym-1)(Techniclone(登録商標));ABX-IL8は、ヒト抗IL8抗体である(Abgenix(登録商標));抗CD11aは、ヒト化抗IgG1抗体である(Genentech(登録商標)/Xoma(登録商標));ICM3は、ヒト化抗ICAM3抗体である(ICOS Pharm(登録商標));IDEC-114は、プライマタイズされた(primatized)抗CD80抗体である(IDEC Pharm(登録商標)/Mitsubishi(登録商標));ZEVALIN(商標)は、マウス放射性標識抗CD20抗体(IDEC(登録商標)/Schering AG(登録商標));IDEC-131は、ヒト化抗CD40L抗体である(IDEC(登録商標)/Eisai(登録商標));IDEC-151は、プライマタイズされた(primatized)抗CD4抗体である(IDEC);IDEC-152は、プライマタイズされた抗CD23抗体である(IDEC(登録商標)/Seikagaku(登録商標));SMART抗CD3は、ヒト化抗CD3 IgGである(Protein Design Lab(登録商標));5G1.1は、ヒト化抗補体第5因子(C5)抗体である(Alexion Pharm(登録商標));D2E7は、ヒト化抗TNE-α抗体である(CAT(登録商標)/BASF(登録商標));CDP870は、ヒト化抗TNF-αFabフラグメントである(Celltech(登録商標));IDEC-151は、プライマタイズされた(primatized)抗CD4 IgG1抗体である(IDEC Pharm(登録商標)/SmithKline Beecham(登録商標));MDX-CD4は、ヒト抗CD4 IgG抗体である(Medarex(登録商標)/Eisai(登録商標)/Genmab(登録商標));CDP571は、ヒト化抗TNF-α IgG4抗体である(Celltech(登録商標));LDP-02は、ヒト化抗α4β7抗体である(LeukoSite(登録商標)/Genentech(登録商標));OrthoClone OKT4Aは、ヒト化抗CD4 IgG抗体である(Ortho Biotech(登録商標));ANTOVA(商標)は、ヒト化抗CD40L IgG抗体である(Biogen(登録商標));ANTEGREN(商標)は、ヒト化抗VLA-4 IgG抗体である(Elan(登録商標));MDX-33は、ヒト抗CD64(FcγR)抗体である(Medarex(登録商標)/Centeon(登録商標));SCH57000は、ヒト化抗IL-5 IgG4抗体である(Celltech(登録商標)/Schering(登録商標));SB-240563とSB-240683は、それぞれヒト化抗IL-5と抗IL-4抗体である(SmithKline Beecham(登録商標));rhuMab-E25は、ヒト化抗IgE IgG1抗体である(Genentech(登録商標)/Norvartis(登録商標)/Tanox Biosystems(登録商標)));ABX-CBLは、マウス抗CD-147 IgM抗体である(Abgenix(登録商標));BTI-322は、ラット抗CD2 IgG抗体である(Medimmune(登録商標)/Bio Transplant(登録商標));Orthoclone/OKT3は、マウス抗CD3 IgG2a抗体である(ortho Biotech(登録商標));SIMULECT(商標)は、キメラ抗CD25 IgG1抗体である(Novartis Pharm(登録商標));LDP-01は、ヒト化抗β2-インテグリンIgG抗体である(LeukoSite);抗LFA-1は、マウス抗CD 18 F(ab')2である(Pasteur-Merieux(登録商標)/Immunotech(登録商標));CAT-152は、ヒト抗TGF-β2抗体である(Cambridge Ab Tech(登録商標));および、Corsevin Mは、キメラ抗第VII因子抗体である(Centocor(登録商標))。上にリストした免疫反応性試薬、ならびに他の任意の免疫反応性試薬が、免疫反応性試薬の供給元によって推奨される計画を含めて当業者に周知のいかなる計画によっても投与できる。
【０１６４】
抗体または他の免疫反応性試薬をコードしているヌクレオチド配列は、当業者が利用できる情報から得ることができる(すなわち、Genbank、文献から、または通常のクローニングにより)。特定の抗体もしくはそのエピトープ結合性フラグメントをコードしている核酸を含むクローン、および他の免疫反応性試薬は利用できないが、前記抗体分子もしくはそのエピトープ結合性フラグメントの配列または他の免疫反応性試薬が公知である場合には、免疫グロブリンをコードしている核酸または他の免疫反応性試薬は化学的に合成できるか、あるいは配列の3'および5'末端にハイブリダイズする合成プライマーを用いたPCR増幅により、または、例えば、その抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより、適当な供与源(例えば、抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製された抗体cDNAライブラリーまたはcDNAライブラリー、あるいはそれらから単離された核酸、好ましくはポリA+ RNA)から得られる。PCRによって生成された増幅核酸は、その後当技術分野で周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクター中にクローニングできる。自然界に存在しない免疫反応性試薬の場合、免疫反応性試薬の異なる領域をコードしている核酸は、既存のライブラリーまたは公知の遺伝子から得られるか、または合成できる。
【０１６５】
一旦抗体または他の免疫反応性試薬のヌクレオチド配列が決定されると、この抗体または他の免疫反応性試薬のヌクレオチド配列は、当技術分野で周知のヌクレオチド配列操作法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどの方法(例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれるSambrook他、1990年、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY;およびAusubel他編、1998年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYを参照)を用いて操作し、例えば、抗体または他の免疫反応性試薬のエピトープ結合ドメインに、あるいは免疫エフェクター細胞との相互作用に関わる抗体または他の免疫反応性試薬の定常領域(Fc)にアミノ酸置換、欠失および/または挿入を導入することによって、異なるアミノ酸配列を有する抗体または他の免疫反応性試薬を作製できる。
【０１６６】
抗体または他の免疫反応性試薬の組換え発現は、その抗体または他の免疫反応性試薬をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部分(必ずしも必要ではないが、好ましくは、重鎖もしくは軽鎖の可変領域を含有する)をコードするヌクレオチド配列、あるいは他の免疫反応性試薬が得られたならば、その抗体分子または他の免疫反応性試薬の生産のためのベクターが当技術分野で周知の手法を用いた組換えDNA技術で作製できる。このように、抗体、またはヌクレオチド配列をコードしている他の免疫反応性試薬を含有しているポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が、本明細書で記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体または他の免疫反応性試薬コード配列および適切な転写および翻訳調節シグナルを含有している発現ベクターを構築できる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成手法およびin vivo遺伝子組換えが含まれる。このような発現ベクターには、重鎖の可変領域もしくは定常領域、軽鎖の可変領域もしくは定常領域、重鎖および軽鎖の両方の可変領域、重鎖および/または軽鎖の可変領域のエピトープ結合性フラグメント、または抗体もしくは他の免疫反応性試薬の1種または複数種の相補性決定領域(CDR)をコードするヌクレオチド配列をクローニングできる。発現ベクターは従来の手法によって宿主細胞へ導入され、トランスフェクションされた細胞は次に従来の手法によって培養される。
【０１６７】
様々な宿主-発現ベクターシステムを利用して、本発明の抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現できる。そのような宿主-発現系は、それにより目的のコード配列が産生され続いて精製される運搬体を表すが、また、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換されるかトランスフェクションされるとin situで本発明の抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現する細胞も表す。これらには、限定されないが、以下を含む：微生物、例えば、抗体または他の免疫反応性試薬コード配列を含有している組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば大腸菌と枯草菌);抗体または他の免疫反応性試薬コード配列を含有している組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えばサッカロミセスとピキア(Pichia));抗体または他の免疫反応性試薬コード配列を含有している組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞システム;組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV);タバコモザイクウィルス(TMV))に感染させた植物細胞系、または抗体もしくは他の免疫反応性試薬コード配列を含有している組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;ならびに、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)または哺乳類のウイルスに由来するプロモーター(例えばアデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を含む哺乳類の細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3およびNSO細胞)。好ましくは、大腸菌などの細菌細胞、および、特に組換え抗体分子または他の免疫反応性試薬全体の発現のためには、より好ましくは真核細胞が、組換え抗体または他の免疫反応性試薬分子の発現のために使われる。ヒトサイトメガロウイルスからの主要中期初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞が、抗体の効果的発現系である(Foecking他、1986年、Gene 45:101頁およびCockett他、1990年、Bio/Technology 8:2頁)。
【０１６８】
細菌系においては、発現しようとする抗体分子または他の免疫反応性試薬の使用目的に応じて、いくつかの有利な発現ベクターが選択される。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のためにそのようなタンパク質を大量に生産するときは、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターには、それには限定されないが、抗体または他の免疫反応性試薬コード配列が、融合タンパク質が生産されるように個々にベクターのlacZコード領域とイン・フレームで連結された大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther他、1983年、EMBO 12:1791頁);および、pINベクター(Inouye & Inouye、1985年、Nucleic Acids Res. 13:3101〜3109頁、およびVanHeeke & Schuster、1989年、J. Biol. Chem. 24:5503〜5509頁)が含まれる。
【０１６９】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてAutographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が使われる。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞内で増殖する。抗体または他の免疫反応性試薬コード配列は、ウイルスの必須ではない領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローニングされ、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に配置される。
【０１７０】
哺乳類の宿主細胞においては、いくつかのウイルスベースの発現系を利用して、本発明の抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、目的の抗体または他の免疫反応性試薬コード配列はアデノウイルスの転写/翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターと三部リーダー配列に連結できる。このキメラ遺伝子は、次にin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)への挿入により、生存可能で、感染宿主内で抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現できる組換えウイルスが形成される(例えば、LoganおよびShenk、1984年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355〜359頁を参照)。特異的開始シグナルも、挿入抗体または他の免疫反応性試薬コード配列の効率的な翻訳のために必要かもしれない。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、インサート全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と同じ相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルと開始コドンは、天然であれ合成であれ、様々な起源に由来してもよい。発現効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強できる(例えば、Bitter他、1987年、Methods in Enzymol. 153:516〜544頁を参照)。
【０１７１】
さらに、抗体もしくは他の免疫反応性試薬配列の発現をモジュレートするか、または抗体もしくは他の免疫反応性試薬を所望の特異的様式で修飾しプロセシングする宿主細胞株を選ぶこともできる。タンパク質生成物のそのような修飾(例えばグリコシル化)およびプロセシング(例えば切断)は、抗体または他の免疫反応性試薬の機能にとって重要かもしれない。異なる宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを持つ。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現される抗体または他の免疫反応性試薬の正しい修飾とプロセシングを確実にすることができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞内機構を備えている真核宿主細胞を使うことができる。そのような哺乳類の宿主細胞には、限定されないが、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、ならびに、特にNSO細胞などのミエローマ細胞、および関連した細胞系が含まれる。例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれるものとするMorrison他、米国特許第5,807,715号を参照されたい。
【０１７２】
組換え抗体または他の免疫反応性試薬の長期にわたる高収率生産のために、安定した発現が望ましい。例えば、安定して抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現する細胞系を作製しうる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使うよりはむしろ、宿主細胞を、適当な発現調節エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNAと選択可能なマーカーで形質転換することができる。外来DNAの導入の後に、作出された細胞は増強培地で1〜2日間増殖させ、次に選択培地に切り替えて増殖させるようにしてもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がこのプラスミドをその染色体に安定的に組み込んで増殖し叢を形成し、次にこれがクローニングされて細胞系に増殖することを可能にする。この方法を有利に用いて、抗体分子または他の免疫反応性試薬を発現する細胞系が生成できる。そのようにして作製された細胞系は、特に、直接または間接的に抗体分子または他の免疫反応性試薬と相互作用する組成物のスクリーニングと評価に役立つであろう。
【０１７３】
いくつかの選択系が使用でき、これには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler他、1977年、Cell 11:223頁)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalska & Szybalski、1992年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202頁)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy他、1980年、Cell 22:8〜17頁)は、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞で使用される。また、代謝拮抗物質耐性を、選択の基礎として以下の遺伝子で使用できる:メトトレキサートに耐性を付与するdhfr(Wigler他、1980年、Natl. Acad. Sci. USA 77:357頁、および O'Hare他、1981年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527頁);ミコフェノール酸に耐性を付与するgpt(Mulligan & Berg、1981年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072頁);アミノグリコシドG-418に耐性を付与するneo(WuおよびWu、1991年、Biotherapy 3:87〜95頁;Tolstoshev、1993年、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573〜596頁;Mulligan、1993年、Science 260:926〜932頁;およびMorganおよびAnderson、1993年、Ann. Rev. Biochem. 62:191〜217頁;およびMay、1993年、TIB TECH 11(5):155〜215);ならびに、ハイグロマイシンに耐性を付与するhygro(Santerre他、1984年、Gene 30:147頁)。当技術分野で一般的に公知の組換えDNA技術の方法は、所望の組換え体クローンの選択のために慣用的に適用でき、そのような方法は、例えば、Ausubel他編、1993年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY;Kriegler、1990年、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY;Chapters 12および13、Dracopoli他編、1994年、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY;および、Colberre-Garapin他、1981年、J. Mol. Biol. 150:1頁（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に記載されている。
【０１７４】
抗体分子または他の免疫反応性試薬の発現量は、ベクター増幅により増加できる(概要については、BebbingtonおよびHentschel、1987年、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、Vol.3. Academic Press、New Yorkを参照)。抗体または他の免疫反応性試薬を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質の濃度の増加がマーカー遺伝子のコピー数を増やす。増幅された領域は抗体または他の免疫反応性試薬遺伝子と結合しているので、抗体または他の免疫反応性試薬の生産も増加する(Crouse他、1983年、Mol. Cell. Biol. 3:257頁)。
【０１７５】
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクターで同時トランスフェクションできるが、ここで第1のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第2のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードしている。この2つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカーを含むか、または両方のプラスミドの維持を確実にするための異なる選択マーカーを含むことができる。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードし、発現できる、単一のベクターを使用してもよい。そのような状況において、有毒な遊離の重鎖が過剰になるのを避けるために、軽鎖は重鎖の前に置かれなければならない(Proudfoot、1986年、Nature 322:52頁;および、Kohler、1980年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197頁)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでもよい。
【０１７６】
一旦本発明の抗体または他の免疫反応性試薬分子が組換え発現によって生産されたならば、それは免疫グロブリン分子または他の免疫反応性試薬の精製のための当技術分野で公知の任意の方法で精製でき、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA精製後の特異性抗原とのアフィニティーによるもの、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準手法によっても精製できる。さらに、本発明の抗体または他の免疫反応性試薬、あるいはその断片は、精製を容易にするために、本明細書で記載されているかそうでなければ当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合してもよい。
【０１７７】
本発明は、融合タンパク質を作製するために、異種ポリペプチドに(もしくはその部分に、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90もしくは少なくとも100アミノ酸のポリペプチドに)組換え法により融合させたかまたは化学的に結合(共有および非共有結合の両方を含む)させた抗体またはそのフラグメントの使用を含む。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介したものでもよい。例えば、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に抗体を融合させるか結合させることによって、その抗体を用いてin vitroまたはin vivoで異種ポリペプチドを特定の細胞型に標的化することができる。異種ポリペプチドに融合または結合させた抗体は、当技術分野で公知の方法を用いたin vitroイムノアッセイおよび精製法で用いることもできる。例えば、参照により本明細書にその全体が組み込まれる国際公開第93/21232号);欧州特許第439,095号;Naramura他、Immunol. Lett. 39:91〜99頁(1994);米国特許第5,474,981号;Gillies他、PNAS 89:1428〜1432頁(1992);および、Fell他、J. Immunol. 146:2446〜2452頁(1991)を参照されたい。
【０１７８】
本発明は、さらに、抗体フラグメントと融合または結合させた異種ポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、この異種ポリペプチドは、Fabフラグメント、Fcフラグメント、Fvフラグメント、F(ab)2フラグメント、またはその一部分に融合もしくは結合することができる。抗体部分にポリペプチドを融合または結合させる方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号;欧州特許第307,434号;欧州特許第367,166号;国際公開第96/04388号および第91/06570号;Ashkenazi他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535〜10539頁 (1991);Zheng他、J. Immunol. 154:5590〜5600頁 (1995);およびVil他、Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341(1992)を参照(これらは参照によりその全体が組み込まれる)。
【０１７９】
本発明は、さらに治療薬と結合した抗体またはそのフラグメントの使用も含む。
【０１８０】
抗体またはそのフラグメントは、細胞毒などの治療成分、例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療薬またはα放射体などの放射性金属イオンと結合させることができる。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害である任意の薬剤が含まれる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンスラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体がある。治療薬には、限定されないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)とロムスチン(CCNU)、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミンプラチナ(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))ならびに細胞分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が含まれる。
【０１８１】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、所定の生物応答を改変する治療薬または医薬成分と結合させることができる。治療薬または医薬成分は、古典的な化学療法剤に限られるとみなされるものではない。例えば、医薬成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質には、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラトキシンまたはジフテリア毒素;タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベータ、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際公開第97/33899号)、AIM II(国際公開第97/34911号)、Fas Ligand(Takahashi他、1994年、J. Immunol.6:1567〜1574頁)、およびVEGI(国際公開第99/23105号)、血栓剤または抗血管形成剤、例えばアンギオスタチンもしくはエンドスタチン;あるいは、生体応答調節剤、例えばリンフォカイン(例えばインターロイキン1(「IL-1」)、インターロイキン2(「IL-2」)、インターロイキン6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(「GM-CSF」)および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、または増殖因子(例えば成長ホルモン(「GH」))が含まれる。
【０１８２】
さらに、抗体を治療成分、例えば、放射性金属イオン、例えば、213Biのようなα-放射体、またはそれには限定されないが131In、131LU、131Y、131Ho、131Smなどの放射性金属イオンをポリペプチドに結合させるのに役立つ大環状キレート化剤と結合させることができる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子によって抗体に付着させることができる、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"'-四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は当技術分野で公知であり、Denardo他、1998年、Clin Cancer Res. 4(10):2483〜90頁;Peterson他、1999年、Bioconjug. Chem. 10(4):553〜7頁;およびZimmerman他、1999年、Nucl. Med. Biol. 26(8):943〜50頁（各々は参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。
【０１８３】
抗体に治療成分を結合させる手法は周知である。例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld他編、243〜56頁(Alan R. Liss, Inc.、1985年)中のArnon他、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」;Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinson他編、623〜53頁(Marcel Dekker, Inc.、1987年)中のHellstrom他 「Antibodies For Drug Delivery」;Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications、475〜506頁(1985)中のThorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」;Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin他編、303〜16頁(Academic Press 1985)中の「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、ならびに、Thorpe他、1982年、Immunol. Rev. 62:119〜58頁を参照されたい。
【０１８４】
あるいは、米国特許第4,676,980号（これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる）でSegalが記載しているように、抗体を第2の抗体とコンジュゲートさせ、ヘテロコンジュゲート形態の抗体を形成できる。
【０１８５】
4.9  治療/予防的有用性
HSP処理後の免疫反応性試薬の免疫原性の測定
任意の手順において、本発明のHSP製剤とともに使用される免疫反応性試薬の免疫原性の生起または増加は、当技術分野で周知の様々な方法で評価でき、その例は第5節で示されている。
【０１８６】
他の方法では、「四量体染色」アッセイ(Altman他、1996年、Science 274:94〜96頁)が抗原特異的T細胞を同定するのに使用できる。例えば、一実施形態では、特異的ペプチド抗原、例えば腫瘍特異的抗原を含むMHC分子を多量体化して可溶性ペプチド四量体を形成させ、例えばストレプトアビジンとの複合体化により標識した。MHC-ペプチド抗原複合体は、次に免疫反応性試薬とHSP製剤で治療された患者から得られたT細胞集団と混合された。次にビオチンを用いて、目的の腫瘍特異的抗原を発現するT細胞を染色する。
【０１８７】
さらに、混合したリンパ球標的培養アッセイを用いて、T細胞の細胞毒性を4時間の51Cr-放出アッセイで試験できる(Palladino他、1987年、Cancer Res. 47:5074〜5079頁を参照)。このアッセイでは、混合リンパ球培養物を標的細胞懸濁液に添加して、様々なエフェクター対標的(E:T)比を生成する(通常1:1〜40:1)。この標的細胞は、1×106の標的細胞を1mlにつき51Crを500μCi含有している培地で、37℃で1時間インキュベートすることによって予備標識する。細胞は、標識後3回洗浄する。各アッセイ点(E:T比)は3反復で行い、適当な対照を組み込んで51Crの自然放出(リンパ球をアッセイに加えない)と100%の放出(細胞を界面活性剤で溶解させる)を測定する。細胞混合物を4時間インキュベートした後に、細胞を200gで5分間遠心分離してペレット化させる。上清に放出される51Crの量を、ガンマカウンターで測定する。細胞傷害性％は、試験試料中のcpmから自然放出cpmを引いた値を、界面活性剤によって放出された全cpmから自然放出cpmを引いた値で割ることにより測定する。MHCクラスIカスケードをブロックするために、K-44ハイブリドーマ細胞(抗MHCクラスIハイブリドーマ)に由来する濃縮したハイブリドーマ上清を、12.5%の最終濃度まで測定用試料に加える。
【０１８８】
あるいは、免疫反応性試薬とHSP製剤による刺激の後に、in vitroにおける細胞傷害性T細胞によるサイトカイン放出を測定するために、ELISPOTアッセイを使用することができる。サイトカイン放出は、特定のサイトカイン、例えばインターロイキン2、腫瘍壊死因子αまたはインターフェロン-γに特異的な抗体で検出される(例えば、Scheibenbogen他、1997年、Int. J. Cancer 71:932〜936頁を参照)。このアッセイは、目的のサイトカインに特異的でT細胞によって分泌されるこのサイトカインを補足する抗体で予め被覆した、マイクロタイター・プレートで実施する。コーティングしたウェルで24〜48時間にわたりT細胞をインキュベーションした後、細胞傷害性T細胞を取り除き、サイトカイン上の異なるエピトープを認識する第2の標識抗体と交換する。結合していない抗体を除去するために十分洗浄した後、着色した反応生成物を生じる酵素基質をプレートに加える。サイトカイン生産細胞の数は、顕微鏡下で数える。この方法は、アッセイ時間が短い利点と、多数の細胞傷害性T細胞を必要としない感度という利点を有する。
【０１８９】
4.10  医薬組成物
本発明は医薬組成物も提供する。こうした予防的または治療的に有効な組成物は、免疫反応性試薬とHSP、および製薬上許容される担体を含む。特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められている動物、および特にヒト用の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬用担体は、水と油などの無菌の液体、例えば石油、動物、野菜または合成に由来する油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、胡麻油などが利用できる。医薬組成物が静脈内に投与されるときは、水は好ましい担体である。生理食塩水と水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、液体担体として、特に注射溶液として利用できる。適当な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。この組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤、徐放性製剤等の形態であってもよい。経口製剤には、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、繊維素、炭酸マグネシウム、などの標準的担体が含まれてもよい。適当な医薬用担体の例は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、免疫反応性試薬とHSPの予防的または治療的有効量を、好ましくは精製された形態で、患者への適切な投与用の剤形にするために適量の担体と共に含む。剤形は、投与様式に適合しなければならない。
【０１９０】
本発明の免疫反応性試薬とHSPは、疾患、障害または感染症を治療するのに用いられる1種または複数種の薬物、例えば抗癌剤、消炎剤または抗細菌剤／抗真菌剤、抗ウイルス剤と組み合わせて有利に利用できる。抗癌剤の例としては、限定されないが、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、CPT-11、トポテカン、ゲムシタビン、オンコビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロイコボリン、レバミゾール、BCNU、ビノレルビン、テモダール、ビンクリスチンおよびタキソールなどがある。
【０１９１】
様々な送達系が公知であり、本発明が包含する治療および予防用薬剤、すなわち、免疫反応性試薬とHSPを投与するのに用いることができ、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへのカプセル封入；免疫反応性試薬、HSP製剤、抗体もしくは抗体フラグメントを発現する組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス(例えば、WuおよびWu、1997年、J. Biol. Chem. 262:4429〜4432頁を参照)、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部としての核酸の構築、などがある。免疫反応性試薬またはHSP製剤またはこれらを含む医薬組成物を投与する方法には、限定されないが、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下)、硬膜外投与、ならびに粘膜投与(例えば、鼻腔および経口経路)が含まれる。特定の実施形態において、免疫反応性試薬、例えば抗体は、筋内、静脈内または皮下に投与される。投与は、全身投与でも局所投与でもよい。さらに、肺投与も、吸入器または噴霧器の使用により、およびエアロゾル化剤による製剤化により利用できる。例えば、米国特許第6,019,968号;第5,985,320号;第5,985,309号;第5,934,272号;第5,874,064号;第5,855,913号;第5,290,540号;および第4,880,078号;ならびに国際公開第92/19244号;第97/32572号;第97/44013号;第98/31346号;および第99/66903号（それぞれは参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。一実施形態では、治療用または予防用薬剤はAlkermes AIR(商標)肺薬剤送達技術(Alkermes社、Cambridge、MA)を使って投与される。
【０１９２】
溶解性と投与部位は、投与経路を選ぶときに考慮されなければならない要素である。投与様式は、様々であってもよく、これには、それには限定されないが、例えば皮下、静注、腹腔内、筋肉内、皮内、または粘膜投与が含まれる。粘膜経路は、さらに経口、直腸および鼻腔投与の形式をとることもできる。上記要素を考慮に入れて、第1の治療用または予防用薬剤は、第2の薬剤の投与部位と同じかまたは近接した部位に投与することが好ましい。腫瘍を治療するための方法では、HSP製剤は腫瘍に近接して、最も好ましくは腫瘍内注射によって投与される。
【０１９３】
本発明の一実施形態において、HSP製剤と免疫反応性試薬は、所望の任意の投与経路によって投与できる。皮内投与の利点には、それぞれ少ない投与用量と速やかな吸収が含まれる。皮下または筋肉内投与の利点には、それぞれ不溶性の懸濁液と油性懸濁液に対する適合性が含まれる。粘膜投与経路には、限定されないが、経口、直腸および鼻腔投与が含まれる。粘膜投与のための製剤は、以下に記すように様々な剤形が適当である。
【０１９４】
他の実施形態では、本発明の治療用または予防用薬剤は、筋内、静脈内または皮下に投与される。その組成物は、任意の都合のよい経路、例えば輸液もしくはボーラス注射、上皮もしくは皮膚粘膜ライニング(例えば口腔粘膜、直腸および腸の粘膜、その他)による吸収によっても投与でき、また他の生理活性物質と共に投与することもできる。
【０１９５】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を治療または予防が必要な部位に局所投与することが望ましいかもしれない。一実施形態では、治療または予防は、例えば、それにより限定するものではないが、局所注入、注射、またはインプラントによって達成でき、このインプラントは多孔性、無孔性、もしくはゲル状材料、例えばシアラスティック(sialastic)膜などの膜または繊維などの材料から形成されるものであってよい。好ましくは、薬剤を吸着しない材料を使うように注意する。
【０１９６】
他の実施形態では、本発明の組成物は小胞、特にリポソームに入れて送達できる(Langer、1990年、Science 249:1527〜1533頁;Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-Beresteinおよび Fidler編、Liss、New York、353〜365頁(1989)中のTreat他;Lopez-Berestein、同上、317〜327頁を参照;一般的に同上を参照)。
【０１９７】
他の実施形態では、本発明の組成物は放出制御系または徐放系で送達することができる。当業者に公知の任意の手法を用いて、1種または複数種の抗体または1種または複数種の融合タンパク質を含む徐放性製剤を製造することができる。例えば、米国特許第4,526,938号;国際公開第91/05548号;国際公開第96/20698号;Ning他、1996年、「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」、Radiotherapy & Oncology 39:179〜189頁;Song他、1995年、「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372〜397頁;Cleek他、1997年、「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」、Pro. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853〜854頁;および、Lam他、「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759〜760頁、1997年（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）を参照されたい。一実施形態では、制御放出系でポンプが使用できる(Langer、上記;Sefton、1987年、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20頁;Buchwald他、1980年、Surgery 88:507頁;およびSaudek他、1989年、N. Engl. J. Med. 321:574頁を参照)。他の実施形態では、ポリマー物質を用いて免疫反応性試薬またはHSP製剤の制御放出を達成できる(例えば、Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise編、CRC Pres.、Boca Raton、Florida、(1974);Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall編、Wiley、New York、(1984);RangerおよびPeppas、1983年、J.Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61頁を参照;また、以下も参照、Levy他、1985年、Science 228:190頁;During他、1989年、Ann. Neurol. 25:351頁;Howard他、1989年、J:Neurosurg. 7 1:105頁);米国特許第5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;国際公開第99/15154号;および、国際公開第99/20253号)。他の実施形態では、制御放出系は治療標的(例えば肺)の近くに配置することができ、これによりわずかな全身用量しか必要でなくなる(例えば、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115〜138頁、(1984)のGoodsonを参照)。
【０１９８】
他の制御放出系は、Langerによるレビュー、1990年、Science 249:1527〜1533頁で議論されている。
【０１９９】
好ましい一実施形態では、HSP製剤は免疫反応性試薬の投与と組み合わせて投与される。HSP製剤と免疫反応性試薬の並行投与は、このHSPまたはHSP-ペプチド複合体が免疫反応性試薬と、混合物として同時投与されること、あるいは、合理的な程度に同じ時間に別々に投与されることを意味する。この方法は、この2つの投与が、例えば同じ診療機会に、互いに1分未満〜約5分、または最大約60分までの時間枠内に実施されることを条件とする。
【０２００】
好ましい実施形態では、本発明は、それには限定されないが、hsp60、hsp70、hsp90、hsp110、gp96、grpl70またはカルレティキュリンなどのHSP製剤を単独で、または互いに組み合わせて、同じ部位もしくは近接部位への免疫反応性試薬の投与と同時に被験体に導入する方法を提供する。
【０２０１】
意図する治療用または予防用薬剤が水溶性であるならば、それは適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水もしくは他の、好ましくは無菌の生理的に適合性のある溶液中に製剤化することができる。あるいは、得られた複合体が水性溶媒に難溶性の場合、その複合体は非イオン性界面活性剤、例えばTween、またはポリエチレングリコールで製剤化すればよい。このように、これら化合物とその生理的に許容できる溶媒和物は、吸入または吹入法(経口もしくは経鼻)による投与、または経口、バッカル、非経口、または直腸投与用に製剤化でき、あるいは腫瘍の場合、充実性腫瘍に直接注射することもできる。
【０２０２】
経口投与では、医薬製剤は液体形態、例えば液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤でもよいし、使用前に水または他の適当なビヒクルで再構成するための医薬品として提供してもよい。そのような液体製剤は、製薬上許容される添加物、例えば、懸濁化剤(例えばソルビトール・シロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂);乳化剤(例えばレシチンまたはアカシア);非水性ビヒクル(例えば、アーモンドオイル、油性エステルまたは分画植物油);および、保存剤(例えば、メチル-p-ヒドロキシベンゾアート、プロピル-p-ヒドロキシベンゾアートまたはソルビン酸)とともに従来の手法で調製できる。医薬用製剤は、例えば錠剤またはカプセルのような、製薬上許容される賦形剤とともに従来の手段で調製された剤形をとってもよく、このような賦形剤としては、例えば結合剤(例えば、プレゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);充填剤(例えばラクトース、微晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ジャガイモ・デンプンまたはナトリウム・デンプン・グリコール酸塩);あるいは湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)がある。錠剤は当業界周知の方法によってコーティングしてもよい。
【０２０３】
経口投与のための組成物は、適切に製剤化して活性化合物の放出を制御することができる。
【０２０４】
バッカル投与では、組成物は従来の方法で製剤した錠剤またはロゼンジの形状をとってもよい。
【０２０５】
薬剤は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に製剤化できる。注射用製剤は、保存剤を加えた単位剤形、例えばアンプルまたは複数用量容器の剤形で提供してもよい。製剤は、油性または水性ビヒクルに溶かした懸濁剤、液剤または乳剤のような形態をとることができ、また懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤のような製剤用薬物を含むことができる。あるいは、活性成分は、適当なビヒクル、例えば発熱性物質を含まない無菌水で使用前に構成するための散剤の形態でもよい。
【０２０６】
本発明の組成物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する、坐薬または停留浣腸などの直腸製剤の形態でも製剤化できる。
【０２０７】
前記製剤に加えて、本発明の薬剤は、デポー製剤として製剤化することができる。このような長時間作用性製剤は、植込み(例えば、経皮的もしくは筋肉内)、または筋肉内注射により投与できる。このように、例えば、製剤は適当なポリマー物質または疎水性材料(例えば、許容できる油に溶かした乳剤として)、またはイオン交換樹脂で製剤化でき、あるいはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩としてとして製剤化できる。リポソームと乳剤は、親水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。
【０２０８】
吸入による投与では、本発明に従う用途の製剤は、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使った加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧の形で便利に送達される。加圧式エアゾールの場合、用量単位は、計量した量を送達するためのバルブを備えることにより決めることができる。吸入器または吹入器において使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と適当な粉状基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉状混合物を含んで製剤化してもよい。
【０２０９】
HSPを含む医薬組成物の製剤およびその製造方法は、文献および参照により本明細書に組み込まれている米国特許に記載されている。
【０２１０】
本発明は、また、免疫反応性試薬、例えば抗体、またはHSP製剤が、免疫反応性試薬の量を表示している密封容器、例えば、アンプルまたはサッシェにパッケージングして提供する。一実施形態では、免疫反応性試薬とHSPは1個または複数個の密封容器に入った殺菌された凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、一緒にまたは別々に供給され、例えば水または生理食塩水により被験体への投与に適当な濃度に再構成することができる。各々の免疫反応性試薬の有効量は、先ずin vitroアッセイから推定することができる。有効用量は標的抗原の性質、腫瘍における抗原の密度、腫瘍型、投与方法に応じて決まり、これらは当業者であれば過度の実験をすることなく最適化することができる。注射の通常の有効量は、約0.1から5mg/kg/日、好ましくは約1から4mg/kg/日、より好ましくは2から4mg/kg/週の範囲である。好ましくは、免疫反応性試薬は密封容器に入った無菌の乾燥凍結乾燥粉末として供給され、その投薬単位は少なくとも5mg、より好ましくは少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも25mg、少なくとも35mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、または少なくとも75mgである。
【０２１１】
特定の実施形態において、ある動物に投与される免疫反応性試薬は、その動物と同じ生物種に由来するものまたは同じ種反応性のものである。このように、好ましい実施形態では、ヒト抗体またはヒト化抗体が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０２１２】
投与経路とHSP製剤中のHSPの種類に応じて、HSP製剤中のHSPの量を変えることができ、例えば1回の投与当たり0.1から1000μgまでの幅があってよい。gp96またはhsp70の好ましい量は、1回の投与当たり10〜600μgの範囲であり、またHSP製剤が皮内投与される場合は0.1〜50μg、好ましくは10〜25μgの範囲にある。hsp 90では、好ましい量は1回の投与当たり約50〜1000μg、また皮内投与では約5〜50μgである。
【０２１３】
他の実施形態では、熱ショックタンパク質はhsp60、hsp70、hsp90、gp96またはカルレティキュリンである。投与されるHSP製剤の投薬量は、大部分は投与される被験体の条件と大きさ、ならびに投与される免疫反応性試薬の量、治療の頻度と投与経路に依存する。部位、用量と頻度を含む継続的な治療のための投薬計画は、初期の応答と臨床上の診断によって導くことができる。
【０２１４】
本発明の特異的組成物で使用する特異的HSPの最適量は様々でありうる。所与の組成物の特異的HSPの量の最適化は、上記引用例で示されているように、当業者の能力範囲内に十分に入るものである。
【０２１５】
HSP製剤の投与のために、被験体で免疫応答を引き出すために必要な免疫反応性試薬の量をより少なくすることができる。HSP製剤と併用される免疫反応性試薬の量は、最適未満の範囲の量を含めて、当技術分野で公知の方法による動物モデルで行う用量反応実験で決定することができる。
【０２１６】
好ましい一実施形態では、熱ショックタンパク質はhsp70である。医薬組成物中のhsp70の量は、好ましくは1回の投与につき10〜600μgの範囲であり、またHSP製剤が皮内投与される場合は0.1〜50μg、好ましくは10〜25μgの範囲にある。
【０２１７】
特に好ましい一実施形態では、熱ショックタンパク質はgp96である。医薬組成物中のgp96の量は、好ましくは1回の投与につき10〜600μgの範囲であり、またHSP製剤が皮内投与される場合は0.1〜50μg、好ましくは10〜25μgの範囲にある。
【０２１８】
他の実施形態では、免疫反応性試薬とHSPは、そのHSPと免疫反応性試薬の量と濃度を表示している密封容器に入った液体の状態で供給される。好ましくは、免疫反応性試薬の液体剤形は、少なくとも1mg/ml、より好ましくは少なくとも2.5mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも8mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも15mg/mlまたは少なくとも25mg/mlの濃度で密封容器で供給される。好ましくは、HSPの液体剤形は、少なくとも0.1mg/ml、より好ましくは少なくとも1.0mg/ml、少なくとも5mg/ml、少なくとも10mg/ml、少なくとも25mg/ml、少なくとも50mg/ml、少なくとも100mg/ml、または少なくとも250mg/mlの濃度で密封容器で供給される。
【０２１９】
好ましい一実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として慣用手順に従って製剤化される。一般的に、静脈内投与のための組成物は、無菌の等張性緩衝液に溶かした液剤である。必要な場合、組成物は可溶化剤、および注射部位の痛覚を緩和するためにリグノカインのような局所麻酔薬を含んでもよい。
【０２２０】
通常、本発明の組成物の成分は、単位剤形として、例えば活性薬剤の量を表示しているアンプルまたはサッシェなどの密封容器に入った乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々にもしくは混合して含まれたキットとして供給される。組成物を注入により投与する場合は、無菌の医薬品等級の水または生理食塩水を含有する注入ボトルにより調剤される。組成物が注射によって投与される場合は、成分を投与前に混合できるように、注射用蒸留水または生理食塩水のアンプルが提供される。他の実施形態では、本発明のキットはさらに組成物を注射するための、好ましくは無菌包装の針または注射器、および/または包装されているアルコールパッドを含む。臨床医または患者による本発明の組成物の投与のために、任意に使用説明書が含まれる。
【０２２１】
本発明の組成物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンで作られた塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、などに由来するカチオンで生成された塩が含まれる。
【０２２２】
疾患、障害または感染症と関連する1種または複数種の症状の治療、予防または改善に有効な本発明の組成物の量は、標準の臨床手法で決定することができる。製剤で使用される正確な用量は、投与経路、被験体の年齢、および疾患、障害または感染症の重症度に依存するので、臨床医の判断および各々の患者の状況に応じて決定されなければならない。有効量は、in vitroまたは動物モデル(例えば、コットンラットまたはCynomolgousマンキー)試験系から導かれた用量反応曲線から推定できる。HSPと抗体、または他の免疫反応性試薬の効果を評価するためのモデルおよび方法は、当技術分野で公知である。(Wooldridge他、1997年、Blood 89(8):2994〜2998頁、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる)。
【０２２３】
抗体に関しては、被験体に投与される治療的または予防的に有効な投薬量は、一般的に被験体の体重に対して0.1mg/kg〜200mg/kgである。好ましくは、被験体に投与される投薬量は、被験体の体重に対して0.1mg/kg〜20mg/kgであり、より好ましくは被験体に投与される投薬量は被験体の体重に対して1mg/kg〜10mg/kgである。しかし、投薬量は分子の血清中の半減期が延長される程度に依存する。通常、外来ポリペプチドへの免疫応答のために、ヒトの抗体のヒト体内の半減期は異種に由来する抗体よりも長い。このように、ヒトの抗体ではより低い投薬量と少ない投与回数が可能となることがしばしばある。さらに、免疫反応性試薬の投与の投薬量と頻度は、例えば脱脂など、免疫反応性試薬の取込みと組織透過(例えば、肺に)を増強することによっても、減らすことができる。特異的抗体投薬量に関する情報は、前記抗体の製造業者の説明書、またはPhysician's Desk Reference(第56版、2002年)でも記載されている。
【０２２４】
免疫反応性試薬とHSPの治療的または予防的有効量による被験体の治療には、単回治療、または好ましくは一連の治療が含まれる。好ましい実施例では、被験体は約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらにより好ましくは約4、5、もしくは6週間の間に週1回、約0.1〜30mg/kg体重の免疫反応性試薬で治療される。免疫反応性試薬とその投薬量、投与経路、および推奨用途は当技術分野で公知であり、Physician's Desk Reference(第56版、2002年)などの文献に記載されている。好ましい実施例では、被験体は約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらにより好ましくは約4、5、もしくは6週間の間に週1回、約0.1〜1000mg、より好ましくは1〜500mg、最も好ましくは2〜250mgのHSPで治療される。当業者は、治療される病態、および投与される免疫反応性試薬ならびに被験体に応じた、適当なHSP投薬量を推定することが可能であろう。
【０２２５】
本発明のある実施形態では、本発明の組成物は賦形剤と組み合わせたHSPを含む。好ましくは、熱ショックタンパク質はhsp60、hsp70、hsp90、gp96またはカルレティキュリンであり、賦形剤は非イオン性界面活性剤、ポリビニルピロリドン、ヒト血清アルブミン、および様々な非修飾および誘導体化シクロデキストリンから選択される。より好ましくは、これらの実施形態では、非イオン性界面活性剤はポリソルベート 20、ポリソルベート-40、ポリソルベート-60とポリソルベート-80から選ばれる。ポリビニルピロリドンは、好ましくは、ポリビニルピロリドンの医薬品の等級であるPlasdone C15である。好ましいシクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-γ-シクロデキストリンおよびメチルβ-シクロデキストリンである。好ましくは、シクロデキストリンはβ-シクロデキストリンである。好ましくは、本発明の組成物は、HSP製剤または免疫反応性試薬の予防的または治療的有効量と製薬上許容される担体を含む。
【０２２６】
特定の実施形態において、用語「製薬上許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されていること、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められている動物、および特にヒト用の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント(完全および不完全)、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬用担体は、水と油などの無菌の液体、例えば石油、動物、野菜または合成に由来する輸、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、胡麻油などが利用できる。医薬組成物が静脈内に投与されるときは、水は好ましい担体である。生理食塩水と水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、液体担体として、特に注射溶液として利用できる。適当な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。この組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、徐放性製剤などの剤形をとることができる。
【０２２７】
製剤は、必要に応じて、HSP製剤を含有している1種または複数種の単位剤形を含んでいるパックまたはディスペンサー装置で提供されてもよい。このパックには、例えば、ブリスターパックのように、金属またはプラスチックのホイルが含まれてもよい。このパックまたはディスペンサー装置には、投与のための使用説明書が添付されてもよい。
【０２２８】
本発明の組成物は、疾患、障害または感染症と関連する1種または複数種の症状を治療、予防、または改善するために、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトに投与できる。好ましい一実施形態では、本発明の組成物は体の外部に存在する。好ましくは、本発明の免疫反応性試薬は、熱ショックタンパク質がない場合、若干の治療上の有益性を有することが確認されており、疾患、障害または感染症の原因または症状と関連する細胞または分子上のエピトープを認識する。
【０２２９】
組成物は、免疫反応性試薬(すなわち、抗原結合領域と、1種または複数種の抗体依存性免疫過程を媒介する領域、例えばFc受容体結合領域を含んでいる抗原結合タンパク質)とHSPを含む。
【０２３０】
本発明の各組成物は少なくとも1つの免疫反応性試薬(本明細書で定義されているように、例えば抗体)とHSPを含む必要があり、本発明の組成物は、特定の疾患のための他の形態の治療と組み合わせて使用できる。免疫特異的に1種または複数種の標的抗原と結合する1種または複数種の免疫反応性試薬が、予防薬または治療薬として生体において局所または全身的に使用できる。
【０２３１】
4.11  キット
本発明の方法を実施するために、キットも提供される。特定の実施形態において、キットは、それに対する免疫応答が望まれる標的である免疫反応性試薬に対してこの免疫反応性試薬によって惹起される免疫応答を増大させるのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を含有している第1の容器と；第1の容器の前記熱ショックタンパク質製剤の投与の前、または投与と同時または投与の後に投与されたときに、前記標的に対する免疫応答を誘導するのに有効な量の免疫反応性試薬を含有している第2の容器と；を含む。
【０２３２】
ある容器に疾患または障害を治療または予防するのに有効な量の免疫反応性試薬を含み、他の容器にこの免疫反応性試薬によって惹起される免疫応答を増大させるかまたは促進するのに有効な量の熱ショックタンパク質製剤を含んだ、本発明のキットが提供される。一実施形態において、容器内の免疫反応性試薬の量は、他方の容器の熱ショックタンパク質製剤とは独立して投与された場合、被験体において免疫応答を誘導するための最適量には及ばない量である。キットには、任意に使用説明書が添付されてもよい。
【０２３３】
本発明は、1つまたは複数の本発明の医薬組成物の成分が入っている1個または複数の容器を含んでいるキットも提供する。そのようなキットには、場合により、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を管理している政府機関が規定した様式の注意書を添付することがあり、これはその機関によるヒトへ投与するための製造、使用または販売の承認を表すものである。一実施形態において、キットはさらに任意に、所定量の免疫反応性試薬(すなわち、抗原結合領域と、1種または複数種の抗体依存性免疫プロセスを媒介する領域、例えばFc受容体結合領域を含んでいる抗原結合タンパク質)とHSPを含んでもよい。好ましい一実施形態では、キットは別々の容器に入った免疫反応性試薬とHSPを含む。
【実施例】
【０２３４】
5.  実施例
5.1  抗体を介したin vitro溶解の増強
マウスの脾細胞(エフェクター細胞)を、6〜8週齢のナイーブマウスの脾臓から生成する。これらのエフェクター細胞は、適当量のHSP製剤と適当量のモノクローナル抗体と一緒に24〜72時間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、標的細胞(E.G7-OVAまたはM04)に51Crをロードする。エフェクター細胞と標識された標的細胞は、SIINFEKL/MHCクラスIに対する抗体の存在下(1〜10μg/ml)および非存在下で、所定のエフェクター対標的比率で、4℃で30〜60分間インキュベートする。HSPと抗体の存在下での溶解を、HSPを含まない対照、抗体を含まない対照、またはそれらを両方含まない対照と比較する。
【０２３５】
5.2  腫瘍チャレンジモデルにおける保護の向上
C57B1/6マウスに対して、SC経路によりM04腫瘍(1×105)またはEG7-OVA腫瘍を側面に接種する。接種後24〜48時間に、マウスに対してSIINFEKL/MHCクラスIに対する適当な量の免疫反応性試薬(すなわち、抗体)をIP経路によって注射するか、または適当量のHSP製剤の存在下もしくは非存在下で局所SC経路によって注射する。30〜60日間にわたって腫瘍の増殖をモニターすることによって(キャリパーによる計測)、併用治療の抗腫瘍効果を抗体治療単独のそれと比較する。生存数を決めて、死亡までの時間に関する有意性を、コックス回帰分析を使って評価する。マウスは毎日、活動レベル、体毛の乱れ、下痢および全身の外観などを含む毒性徴候に関して観察する。抗体または他の免疫反応性試薬の効果を評価するためのモデルおよび方法は当技術分野で公知である。(Wooldridge他、1997年、Blood 89(8):2994〜2998頁、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【０２３６】
5.3  細菌のオプソニン処理の向上
HSP製剤を治療的抗体治療へ追加することにより細菌のオプソニン処理が向上することは、オプソニン食作用アッセイのためのエフェクター細胞(HL-60)をHSP製剤とインキュベートすることによってin vitroで証明される。その細胞について、所定の抗体価でS. pneumoniaまたはS. aureusをオプソニン処理する上で効果がより高いかどうか評価する(例えば、S. pneumoniaまたはS. aureusのそれぞれに特異的なオプソニン処理活性を有するヒト血清サンプル)。
【０２３７】
5.4  Fc受容体のアップレギュレーション
単球、ナチュラルキラー細胞または多形核細胞を、適当量のHSP製剤の存在下または非存在下でインキュベートする。トリプシン処理された細胞を、FcαR、FcガンマR1、FcガンマRIIまたはFcガンマRIIIに特異的なモノクローナル抗体とともに4℃で60分間インキュベートする。次に、その細胞を抗マウスIgG FITCプローブとともにインキュベートし、洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定してFACScanによって分析する。これらの細胞上のFc受容体のアップレギュレーションをモニターする。
【０２３８】
さらに、マクロファージ細胞内のHSP製剤によるTNF-α、IL-6およびMIP-1-αのアップレギュレーションもモニターする。
【０２３９】
本明細書において引用したすべての文献は、個々の刊行物、または特許、または特許出願のそれぞれが全ての目的のためにその全体が参照により具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２４０】
本発明には、その精神および範囲から逸脱することなく、多くの修正および変更を加えることができることは、当業者には明らかであろう。本明細書に記載されている特定の実施形態は例示として提供されているにすぎず、本発明は添付の特許請求の範囲の用語およびその特許請求の範囲の権利対象である均等物の範囲全体によってのみ限定されるものとする。
【国際調査報告】
2005533015.tif 000002
2005533015.tif 000003