(57)【要約】本発明は、遺伝子機能の解明と新規遺伝子の同定のための方法及び組成物に関する。詳細には、本発明は、改良された機能性ゲノムスクリーニング、特異的な必須又は非必須遺伝子の機能的不活性化、及び特異的刺激に応じて調節され、又は認識可能な表現型形質をコードする遺伝子の同定に関する。特に、本発明の組成物は、限定するものではないが、配列とは関係なく、ヘアピンsiRNAの両鎖をコードする単一転写単位の迅速な構築を可能にする新規なポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーを含んでなる発現カセットを包含する。さらに、本発明は、複製-欠損レトロウイルスベクターのような形質転換細胞用ベクターを含む、本発明の発現カセットを含んでなるライブラリーを包含する。本発明は、siRNAライブラリーの製造及びスクリーニング方法、並びに本発明によって発現したsiRNAsの治療的使用をも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の要素：
（ａ）5'及び3'末端を有し、かつ第１セグメント及び第２セグメントを含む、部分的にランダム化した核酸配列であって、
前記第１セグメントは、3'を11〜27塩基長のランダム化核酸配列に連結する少なくとも４個の連続した複数のアデニリル残基に3'を連結する一連の０〜23個の塩基を含み；
第２セグメントは、前記第１セグメント配列に相補的な配列から成り、かつ前記第１セグメントの前記3'末端に、その5'末端を介して、配列Ｎ1nＮ2mＮ3n（ここで、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上の数であり；かつ
ｍは１〜40の数である）
を有するポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーによって連結している、
前記部分的にランダム化した核酸配列；及び
（ｂ）前記部分的にランダム化した核酸配列に作動可能に連結しているTATAボックスを有するpol IIIプロモーターであって、該pol IIIプロモーターは、該プロモーターから前記ランダム化核酸配列の最初の塩基で転写を開始できるように修飾されている、pol IIIプロモーター；
を含んでなるDNA発現カセット。
【請求項２】
前記一連の０〜23個の塩基が少なくとも１個の塩基であり、かつ制限部位を含む、請求項１のDNA発現カセット。
【請求項３】
前記pol IIIプロモーターが、H1 RNAプロモーター、U6 snRNAプロモーター、tRNA遺伝子用プロモーター、及びアデノウイルスVA遺伝子用プロモーターから成る群より選択される、請求項１のDNA発現カセット。
【請求項４】
前記pol IIIプロモーターが誘導性である、請求項１のDNA発現カセット。
【請求項５】
さらに、前記発現カセットを含む核酸を包むためのウイルス粒子を含む、請求項１のDNA発現カセット。
【請求項６】
さらに誘導性オペレーター配列5'〜TATAボックスを含む、請求項４のDNA発現カセット。
【請求項７】
前記誘導性オペレーター配列がtetOオペレーターである、請求項６のDNA発現カセット。
【請求項８】
前記Ｎ2の最初の２個のヌクレオチドが、２個のチミジル残基の配列である、請求項１のDNA発現カセット。
【請求項９】
DNA発現カセットのライブラリーであって、各発現カセットは、以下の要素：
（ａ）5'及び3'末端を有し、かつ第１セグメント及び第２セグメントを含む、部分的にランダム化した核酸配列であって、
前記第１セグメントは、3'を11〜27塩基長のランダム化核酸配列に連結する少なくとも４個の連続した複数のアデニリル残基に3'を連結する一連の０〜23個の塩基を含み；
第２セグメントは、前記第１セグメント配列に相補的な配列から成り、かつ前記第１セグメントの前記3'末端に、その5'末端を介して、配列Ｎ1nＮ2mＮ3n（ここで、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上の数であり；かつ
ｍは１〜40の数である）
を有するポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーによって連結している、
前記部分的にランダム化した核酸配列；及び
（ｂ）前記部分的にランダム化した核酸配列に作動可能に連結しているTATAボックスを有するpol IIIプロモーターであって、該pol IIIプロモーターは、該プロモーターから前記ランダム化核酸配列の最初の塩基で転写を開始できるように修飾されている、pol IIIプロモーター；
を含む、前記ライブラリー。
【請求項１０】
前記pol IIIプロモーターが誘導性である、請求項９のライブラリー。
【請求項１１】
前記各DNA発現カセットがウイルス粒子中に包まれている、請求項９のライブラリー。
【請求項１２】
前記各DNA発現カセットが細胞ゲノム内に包含される、請求項９のライブラリー。
【請求項１３】
前記各DNA発現カセットが自己-複製性である、請求項９のライブラリー。
【請求項１４】
さらに誘導性オペレーター配列5'〜TATAボックスを含む、請求項１０のライブラリー。
【請求項１５】
前記Ｎ2の最初の２個のヌクレオチドが、２個のチミジル残基の配列である、請求項９のライブラリー。
【請求項１６】
DNA発現カセットのライブラリーの製造方法であって、以下の工程：
（ａ）それぞれ5'及び3'末端を有し、かつ以下の要素：
配列Ｎ1nＮ2mＮ3n（ここで、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上の数であり；かつ
ｍは１〜40の数である）
を有するポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーに、
その3'末端で連結している11〜27塩基長のランダム化核酸配列に、
その3'末端で連結している少なくとも４個の連続した複数のアデニリル残基に、
その3'末端で連結している一連の０〜23個の塩基；
を含む複数の部分的にランダム化した核酸配列を合成する工程
（ここで、前記ランダム化核酸配列は、前記ライブラリー中の前記各核発現カセットで異なる）；
（ｂ）部分的にランダム化した各核酸配列を、鋳型として核酸配列5'〜前記ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーを用いて該ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーから伸長させる工程；
（ｃ）この伸長した部分的にランダム化した各核酸配列を変性させる工程；
（ｄ）この変性した部分的にランダム化した各核酸配列の5'末端に5'プライマーを、3'末端に3'プライマーをアニールする工程；
（ｅ）アニールした部分的にランダム化した各核酸配列を、TATAボックスを有する修飾したpol IIIプロモーターを含む別個の発現カセット中に連結する工程（ここで、前記修飾したpol IIIプロモーターは、前記伸長した部分的にランダム化した核酸配列に作動可能に連結しており、該pol IIIプロモーターは、前記ランダム化核酸配列の最初の塩基で該プロモーターから転写が開始するように修飾されている）；及び
（ｆ）部分的にランダム化した各核酸配列に対する相補鎖を生成し、それによって完全なDNA発現カセットを形成する工程；
を含む前記方法。
【請求項１７】
前記合成工程の前記一連の０〜23個の塩基が少なくとも１個の塩基であり、かつ制限部位を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記生成工程が、さらに、前記部分的にランダム化した核酸配列を含有する発現ベクターでコンピテント細菌を形質転換させる工程を含む、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記生成工程が、DNAポリメラーゼを用いる、前記部分的にランダム化した各核酸配列に対する相補鎖のインビトロ合成を含む、請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記Ｎ2の最初の２個のヌクレオチドが、２個のチミジル残基の配列である、請求項１６の方法。
【請求項２１】
１個以上の容器に封入されたsiRNA発現カセットのライブラリーを含んでなるキットであって、前記ライブラリーの各発現カセットが、以下の要素：
（ｉ）5'及び3'末端を有し、かつ第１セグメント及び第２セグメントを含む、部分的にランダム化した核酸配列であって、
前記第１セグメントは、3'を11〜27塩基長のランダム化核酸配列に連結する少なくとも４個の連続した複数のアデニリル残基に3'を連結する一連の０〜23個の塩基を含み；
第２セグメントは、前記第１セグメントに相補的な配列から成り、かつ前記第１セグメントの前記3'末端に、その5'末端を介して、配列Ｎ1nＮ2mＮ3n（ここで、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上の数であり；かつ
ｍは１〜40の数である）
を有するポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーによって連結している、
前記部分的にランダム化した核酸配列；及び
（ii）前記部分的にランダム化した核酸配列に作動可能に連結しているTATAボックスを有するpol IIIプロモーターであって、該pol IIIプロモーターは、該プロモーターから前記ランダム化核酸配列の最初の塩基で転写を開始できるように修飾されている、pol IIIプロモーター；
を含む、前記キット。
【請求項２２】
さらに、ベクター、プライマー及び前記ライブラリーを構築するための他の試薬を含む、請求項２１のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対するクロスレファレンス）
この出願は、米国特許商標庁で2002年7月24日に提出した仮出願第60/399,040号の優先権を主張する。
（発明の分野）
一般的に、本発明は機能性ゲノムの分野に関する。詳細には、本発明は、ランダム化siRNA遺伝子ライブラリーの新規な製造方法及び該ライブラリーの病気プロセスに関連する細胞遺伝子の発見のための使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ヒトゲノムプロジェクト及び同類の関心は、まもなく完全なヒトゲノムの配列を解明するだろう[Coxら, Science, 265:2031-2031 (1994); Guyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:10841-10848 (1995)]。この予想される進歩は刺激的であるが、推定上の遺伝子のこの莫大な配列の遺伝子産物の機能の知識なしで、オープンリーディングフレーム及び遺伝子コード領域の配列を知ることはヒトゲノム中に非常に限定された見識を与えるだけなので誤解を招きやすくもある。ゲノムの完全な知識は、推定上の遺伝子コード配列の各遺伝子産物の機能の知識を必要とする。遺伝子機能決定は、分子遺伝学の分野で進行中であるが、遺伝子の機能を決定できる速度は、遺伝子を配列決定できる速度よりずっと遅い。従って、機能の調査には遺伝子配列の大量の残務が差し迫っている。
【０００３】
小さい干渉性(small interfering)RNAs（siRNA）は、RNA干渉（RNAi）として知られるプロセスを誘発する短い二本鎖RNA断片（dsRNA）であり、配列特異的遺伝子サイレンシングの形態である。Zamore, Phillipら, Cell, 101:25-33 (2000); Elbashir, Sayda M.ら, Nature 411:494-497 (2001)。siRNAsは、RNA-誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られる多成分複合体に構築される。siRNAsはRISCを相同体mRNAsに導き、それらを破壊の標的にする。Hammondら, Nature Genetics Reviews 2:110-119 (2000)。RNAiは、植物、昆虫及び哺乳類を含む種々の生物内で観察され、これら生物由来の細胞を培養してきた。有効なsiRNAsをスクリーニングする効率的な方法の開発は、Inverse Genomics(登録商標)として知られるこの出願の譲受人によって開発された技術である減法表現型分析の方法によって、該siRNAsによってサイレントにさせられている遺伝子の機能的特徴を同定する手段を提供する。効率的なスクリーニング法の発見は、siRNA分子を含む治療の可能性のある化合物をスクリーニングし、ひいては遺伝子治療の分野を進歩させる方法をも提供するだろう。RNAiとsiRNA発現のレビューには、Hammond, Scott Mら, Nature Genetics Reviews, 2:110-119; Fire, Andrew, TIG, 15(9):358-363 (1999); Bass, Brenda L., Cell, 101:235-238 (2000)を参照せよ。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、ヘアピンsiRNA発現カセット及びランダム化ヘアピンsiRNA発現カセットの製造のための組成物及び迅速で効率的な方法を提供する。本発明の生成物は、種々の目的、例えば、機能性ゲノム研究を行うための調査ツールとして有用である。
【０００５】
siRNAsを発現させるために有用な本発明の一実施形態は、３つのセグメント（5'から3'の順に列挙）：好ましくは少なくとも４個の連続したアデニリル残基をその3'末端に有する４〜27ヌクレオチド長の5'リーダー配列；好ましくは11〜27ヌクレオチド長の、siRNAの“センス”鎖用コード配列；及びポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーを含んでなる自己-プライミング(priming)オリゴヌクレオチドから構成される発現カセットである。siRNAコード配列を持っているオリゴヌクレオチドの発現カセット中への連結を促進するための制限部位を含むように5'リーダー配列を設計することができる。コード配列はランダム化又は部分的にランダム化したヌクレオチド配列又は既知のヌクレオチド配列でよい。ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーは、配列Ｎ1nＮ2mＮ3nを有し、ここで、Ｎ3はＮ1に相補的であり；ｎは２以上（典型的に20まで）の数であり；かつｍは１〜40、好ましくは３〜20、さらに好ましくは４〜９の数である。従って、ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーは、自己-プライミングオリゴヌクレオチドの3'末端を含む短いステム-ループ構造を形成する。siRNAの対応する“アンチセンス”鎖をコードする配列及び5'リーダー配列の補体は、DNAポリメラーゼを用いてポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーの3'末端からのプライマー伸長によって生成される。プライマー伸長反応の生成物は、単一分子内に、ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーで連結されている、ヘアピンsiRNAの両鎖用のコード領域を含む。
【０００６】
プライマー伸長反応の生成物は、完全分子の相補鎖を合成することによって、発現カセットの構築を完成するために使用できる二重鎖DNAを生成するため、変性（“融解”）ししなければならないステム-ループ構造を有する。線状化分子がステム-ループ構造に跳ね返ることから維持するため、変性したDNAの5'及び3'末端に遮断プライマーをアニールする。遮断プライマーの配列は、自己-プライミングオリゴヌクレオチドの5'リーダー配列及び線状化分子の3'末端にあるその補体の既知ヌクレオチド配列によって決まる。慎重な配列選択によって、遮断プライマーのアニーリングは、線状化分子の末端に5'又は3'オーバーハング末端を有する二重鎖DNAの短いセグメントを生成しうる。これら5'又は3'オーバーハング末端を、えり抜きの制限酵素による消化によって生成されるオーバーハング末端と調和するように設計することができ、本方法の次工程、すなわち、修飾したpol IIIプロモーターを含む発現カセット中にアニールした線状化分子を連結する工程で使用する。連結は、後述するように、修飾したpol IIIプロモーターが線状化分子に作動可能に連結されるように行う。遮断プライマー間の一本鎖領域は、連結したベクターをコンピテント細菌中に形質転換することによって“修復”される。そして、細菌が一本鎖領域に相補的な鎖を生成する。代わりに、相補鎖を連結の前か後にインビトロ合成することができる。相補鎖合成は、ステム-ループ分子が変性し、それに遮断プライマーがアニールした後、本方法のどの時点でも起こりうる。このような方法は詳細に後述する。また本明細書に含まれる引用文献に記載されている。
【０００７】
pol IIIプロモーターに対する修飾を設計して、プロモーターとsiRNAコード領域が作動可能に連結されるように、pol IIIプロモーターを持つ構成物へのsiRNAコード領域を持つオリゴヌクレオチドの連結を容易にする。これら修飾は、典型的にプロモーターの3'末端に存在するヌクレオチドの、制限部位を導入するため及びsiRNAコード配列の最初のヌクレオチドで転写を開始させるための置換を含む。コード配列の最初のヌクレオチドはいずれの塩基でもよいが、必要ならば、該限定がカセットからの発現を高める場合特定のヌクレオチドでよい。例えば、いくつかのプロモーターは、転写される最初のヌクレオチドがアデニリル又はグアニリル残基であることを好む。
pol IIIプロモーターは、この出願で後述する制限と適合性のいずれのpol IIIプロモーターでもよく、H1 RNA及びU6 snRNAプロモーターが好ましい。本発明のいくつかの局面では、プロモーターは誘導性であり、5'〜TATAボックスに位置する誘導性オペレーター配列を含む実施形態が挙げられる。好ましい誘導性オペレーター配列はテトラサイクリン(tet)オペレーターである。
【０００８】
発現カセットは、本明細書で述べる種々の方法でコンピテント細胞に導入することができる。最適な形質導入／形質移入効率のため本発明の発現カセットを適切な核酸構成物中に導入することに加え、発現カセット及び該カセットの5'末端及び／又は3'末端に連結した最小限の追加配列を含む裸のDNAとしてそれらを導入することができる。本発明の発現カセットを送達する好ましい方法は、逆転写酵素の作用によってdsDNAプロウイルス型に変換されるとき、該発現カセットを包含するゲノムを含んでなる組換えレトロウイルスを用いることによる。
本発明の発現カセットを用いて一時的に細胞を形質移入することができ、或いは該発現カセットを細胞ゲノム中に組み込ませることによって、細胞ゲノムの一部になり、或いは該カセットに、高コピー数であり、及び／又は独立的な複製起点及び／又は発現カセットのコピーが細胞分割時に各娘細胞に分割されることを保証するいくつかの独立的な手段を所有するベクターの一部を形成させることによって、安定した細胞系を生じさせることができる。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、上述した発現カセットのライブラリーである。ライブラリーは、該ライブラリーによって生成されるべき所定配列長のsiRNAsについて、すべての可能なヌクレオチド配列順序の提示を可能にする。siRNAライブラリーを細胞系の形質移入／形質導入研究で用いて、コード化siRNAの発現によって引き起こされる表現型の変化を同定することができる。有効なsiRNA遺伝子を単離かつ配列決定し、結果のヌクレオチド配列を用いてsiRNA-標的遺伝子を同定することができる。この方法では、表現型の発現はその遺伝子起源に起因しうる。ライブラリーは、ランダム化又は部分的にランダム化したコード領域を含む複数の自己-プライミングオリゴヌクレオチド（上述したような）を合成することによって構築することができる。この複数の自己-プライミングオリゴヌクレオチドを用い、単一カセット構成について上述したのと同じ方法で発現カセットの混合物を生成する。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、siRNA配列の発現を、該siRNAによって細胞遺伝子の発現を阻害することに起因する表現型の変化と相関させる方法である。ここで、細胞遺伝子の発現は、これまでに表現型の変化に寄与すると特徴づけされていない。この方法は、まず本発明の発現カセットのライブラリーを細胞集団に導入する工程を含む。そして、細胞の集団をスクリーニングして、ライブラリーに導入された細胞と、ライブラリーに導入されず、或いは対照siRNA用の発現カセットに導入された対照試料中の当該細胞との間の表現型の差異を検出する。表現型の変化の原因であるsiRNA遺伝子を、本明細書で述べるようにまず単離し、次いで配列決定することで同定する。この実施形態の局面はプラスミド中のライブラリーを構築することである。これらプラスミドは、細胞中への組込みを促進しうるウイルス粒子中に発現カセットを包むことを可能にするウイルス要素を含むことができる。
【００１１】
siRNA発現に起因するいずれの表現型の変化も前のパラグラフで述べた方法を実施してモニターすることができる。例えば、siRNA遺伝子のライブラリーに導入された集団の細胞と、ライブラリーに導入されない当該細胞との間の細胞成長の差異を検出することができる。他の代替法としては、細胞分割の差異、ウイルス遺伝子発現、細胞表面マーカー発現又は第２遺伝子の遺伝子発現を抑制する系の活性の阻害を検出することである。別の代替法は、蛍光タンパク質のような、siRNA遺伝子のライブラリーに導入された集団の細胞によって生成される検出可能マーカーである。ここで、該検出可能マーカーはライブラリーのメンバーに連結している。
本発明のさらに別の実施形態は、細胞中のsiRNA遺伝子の転写を制御する方法である。この方法は、まず細胞に、誘導性プロモーター配列で制御される、本発明の発現カセットを含有するベクターを導入する工程を含む。一旦細胞が形質導入／形質移入されると、オペレーター配列によって引き起こされる転写の阻害を和らげることによって該カセットの発現が誘発さる。該カセットからの発現を誘発すると、siRNAの生成をもたらし、分子が発現している特定の細胞型内で該分子の存在に関連することが分かっているいずれかの表現型の変化を惹起しうる。
【００１２】
レトロウイルスベクターを含む組換えウイルスベクターも本発明の実施形態である。このようなウイルスベクターは本発明の発現カセットを含む。
これらウイルスベクターを構築する方法も本発明に包含される。該一方法は、本発明の発現カセットと、該発現カセットを含有する組換えウイルスゲノムのウイルス粒子中へのパッケージングに必要な最小のウイルス遺伝子とを含むDNAベクターを構築する工程を含む。任意に、パッケージング“ヘルパー”ウイルスを用いて、発現カセットを含有するウイルスゲノムをウイルス粒子中に包むことができる。
別の実施形態は、本発明の組換えウイルスで細胞を形質導入する方法である。この方法は、本発明の発現カセットをコードするゲノムを含むトランスジェニックレトロウイルスを得る工程、細胞をトランスジェニックレトロウイルスで形質導入する工程、及び形質導入が起こったか決定する工程。形質導入は、siRNAの発現の結果としてのいずれかの表現型の変化、又は発現カセットに関連するマーカー（リポーター）遺伝子の発現によって明らかにすることができる。
【００１３】
（定義）
特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術の当業者が一般的に解釈する意味を有する。以下の参考文献は、この発明で用いる多くの用語の一般的な定義に１つのスキルを提供する：Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Riegerら(eds.), Springer Verlag (1991); 及びHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用する場合、以下の用語は、別に特定しない限り、それらに基づく意味を有する。
【００１４】
“アニーリング”は、相補的配列を含む核酸の溶液を、相補鎖の塩基対をワトソン-クリック塩基対合によって一緒に結合させるような様式で冷却するプロセスを指す。
用語“5'プライマー”及び“3'プライマー”は、どちらのプライマーより長い、多くの場合、5'及び3'の両プライマーを合わせた長さより長い核酸の、それぞれ5'及び3'末端に相補的な配列を有する短い核酸分子を指す。用語“遮断プライマー”は、5'及び3'の両プライマーを合わせた長さより長い核酸の、それぞれ5'及び3'末端に相補的である１対の5'及び3'プライマーを指す。
用語“塩基”は、ポリヌクレオチドを構成する個々のヌクレオチドを意味する。
用語“細胞集団”は、一般的に、典型的には普通の前駆体を有する普通の型の細胞のグルーピングを意味するが、この句は異種細胞集団にも適用できる。
用語“細胞分割”は、生化学事象に先行し、２つの自律性単位に分裂するという細胞内で完結する物理的な細胞事象を意味する。
用語“細胞成長”は、細胞の質量、体積又は数の増加につながる当該細胞プロセスを意味する。
用語“細胞遺伝子”又は“遺伝子”は、特異的転写産物をコードし、かつ転写性発現を制御するコード領域に先行する制御配列（5'非-コーディング）と追従する制御配列（3'非-コーディング）を含む核酸断片を意味する。
【００１５】
用語“細胞ゲノム”は細胞の内因性遺伝物質、及び内因性遺伝物質中に挿入され、或いは内因性遺伝物質と置換されたいずれの外因性遺伝物質をも指す。
用語“細胞表面マーカー”は、細胞膜の外側の表面と関連し、かつ物理的又は化学的に検出可能ないずれの生物学的分子をも意味する。
用語“相補的”又は“相補性”は、塩基対合規則によって関係づけれるポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列“5'-AGT-3'”は、配列“5'-ACT-3'”に相補的である。相補性は、核酸の塩基のいくつかだけが塩基対合規則に従って調和している“部分的”でよい。或いは、核酸間に“完全”又は“全体的”相補性があってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と長さに有意な影響を及ぼす。このことは、核酸間の結合に依存する方法で特に重要である。
“相補的終止配列”は、所定プロモーターの転写終止配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸配列を指す。
【００１６】
用語“作動可能に連結”は、機能的関係のポリヌクレオチド要素の連結を指す。本発明については、用語“作動可能に連結”は、核酸発現制御配列（プロモーター、又は転写因子結合部位の配列のような）と、第２の核酸配列との間の機能的連結を意味する。ここで、発現制御配列は第２配列に対応する核酸の転写を指揮する。従って、核酸が別の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、核酸は“作動可能に連結”している。
用語“コンピテント細菌”は、外因性核酸で形質転換でき、或いはウイルス系を用いて形質移入できる原核生物細胞を意味する。
タンパク質の関係で、用語“変性”は、タンパク質分子の二次又は三次構造の損失を指す。二本鎖核酸の関係で、変性は、以前に塩基対合していたポリヌクレオチドの部分的又は全体的に、２つの別々のポリヌクレオチド鎖への解離を指す。ヘアピン構造の場合のように、変性は、分子内の塩基対合ヌクレオチドの解離をも意味する。
【００１７】
句“独立的に誘導された”は、他の事象又は組成物の惹起又は進行によって完全に影響されない２つ以上の事象又は組成物の起源を指す。例えば、相互に独立的に誘導された２つの核酸配列は、両方ともその決定が他方の核酸の組成物又は配列に影響されない配列を有する。
用語“検出可能マーカー”、“検出可能形質”及び“検出可能細胞形質”は、観察又は試験によって同定できる、細胞によって発現されるいずれの物理的又は化学的特徴をも意味する。
“DNA発現カセット”又は単に“発現カセット”は細胞内の核酸の発現を指揮できるDNA配列を意味する。“DNA発現カセット”は、問題の核酸に作動可能に連結しているプロモーターを含み、さらに終止配列に作動可能に連結している。線状DNA発現カセットの場合、コード配列の3'末端が分子の末端に位置するときは終止配列を省くことができる。この場合、RNAポリメラーゼが分子の該末端を走り去るとき“終止”が起こる。
【００１８】
“dsRNA”及び“dsRNA分子”は、塩基対合相互関係によって一緒にハイブリダイズしている２本の相補的RNA鎖を含むRNA分子を指す。“siRNA”は、好ましくは16〜29、さらに好ましくは17〜23、最も好ましくは18〜21塩基対長のdsRNAを指し、その各鎖は２個以上のヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。機能的に、他形態のdsRNAとsiRNAを区別する特徴は、siRNAがRNA干渉と呼ばれるプロセスによって遺伝子又は密接に関連するファミリーの遺伝子の遺伝的発現を特異的に阻害できる配列を含むことである。
本明細書では、用語“ヘアピンsiRNA”を用いて、一方のsiRNA鎖の3'末端が他方のsiRNA鎖の5'末端に非対合塩基のループで連結されているsiRNA-様分子を表す。ヘアピンsiRNAsは、“短いヘアピンRNAs”又は“shRNAs”としても知られる。ヘアピンsiRNAsは、単一転写物として発現される。細胞内では、それらは内因性細胞ヌクレアーゼの作用によって、塩基対合した２本の独立的な鎖を含むsiRNAsに変換される。(Brummelkampら(2002) Science 296: 550-553; Paulら(2002) Nat. Biotechnol. 20: 505-508; Paddisonら(2002) Genes and Development 16: 948-958.)
【００１９】
用語“外因性”は、現在の環境以外の起源から発生し、誘導され、又は発達することにおけるように、その現在の環境にとって外来性であるいずれの分子又は物質をも指す。
用語“真核生物細胞集団”は、核エンベロープ内又は分裂周期の“Ｓ”期の場合は膜内に包まれたそのゲノムDNAを有する特徴がある１個又は複数個の細胞を指す。
“発現ベクター”は、宿主細胞内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定核酸要素を有する、組換え的又は合成的に生成された核酸構成物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部でよい。典型的に、発現ベクターの組換え発現カセット部は、転写すべき核酸とプロモーターを含む。
用語“細胞外タンパク質”は、細胞の外側にあり、少なくとも部分的にタンパク性のいずれの物質をも意味する。
用語“蛍光タンパク質”は、電磁エネルギーによる刺激に応じて蛍光エネルギーを発することができ、少なくとも部分的にタンパク性のいずれの物質をも意味する。
用語“遺伝子発現”は、生物学的に活性な物質をコードする核酸から、核酸であれ又はタンパク質であれ、生物学的に活性な物質を生成することに関与するすべてのプロセスを意味する。遺伝子発現は、成熟物質を生成するのに必要なすべての転写後及び／又は翻訳後プロセシングを包含する。
用語“遺伝子サプレッサー”は、遺伝子発現を阻害又は妨げる遺伝的に活性な物質を意味する。
用語“宿主細胞”は、発現ベクターを含み、かつ該発現ベクターの複製又は発現を補助する細胞を指す。宿主細胞は、大腸菌のような原核生物細胞、又は酵母菌、昆虫、若しくは哺乳類細胞のような真核生物細胞でよい。
【００２０】
用語“誘発性”は、プロモーター配列、ひいてはその発現が制御する核酸配列が、“誘発物質”として作用する因子に応じて制御を受けやすいことを意味する。これら因子は、タンパク質、核酸、小分子又は物理的刺激、例えばＵＶ照射でよい。制御された核酸配列の誘発は、直接活性を刺激する因子の結合を含み、或いは代わりに核酸配列の発現を抑制するように因子の除去を必要としうる。例えば細胞を潜在的な誘発物質で処理し、該誘発物質で処理しない対照試料内の同一の核酸配列の活性に対する誘発細胞内の核酸配列の発現を比較することによって誘発を測定できる。対照試料（誘発物質で未処理）を100％の相対活性値に割り当てる。対照（誘発物質で未処理）に対する活性値が110％、さらに好ましくは150％、さらに好ましくは200〜500％（すなわち、対照に対して２〜５倍高い）、さらに好ましくは1000〜3000％高い場合に、核酸配列の誘発が達成される。
句“細胞遺伝子の発現をsiRNAで阻害”は、特異的なmRNA(s)の分解で特徴づけられる小さい干渉性RNA分子(siRNA)による遺伝子発現の配列特異的な阻害を指す。このプロセスはRNA干渉又はRNAiをも意味する。
用語“クレノウポリメラーゼ”は、プロテアーゼサブチリシンで大腸菌DNAポリメラーゼＩを処理してホロ酵素の5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を除去後に残存しているポリメラーゼ活性である。
この発明の文脈で、用語“連結”及びその文法的な派生語は、１つの分子の別の分子への共有結合を指す。例えば、２個のポリヌクレオチドは、一方の5'末端が他方の3'末端に共有結合しているとき、連結していると言われる。
【００２１】
“ライブラリー”は、定義した生物学的単位の代表である核酸配列の集合を指す。例えば、核酸のライブラリーは、定義した長さにわたって可能性のある核酸配列のすべての構成の代表でありうる。代わりに、核酸ライブラリーは、定義した長さの核酸の可能性のある配列構成の特定サブセットを代表する配列の集合でよい。ライブラリーは、特定生物の遺伝情報のすべて又は一部をも表す。典型的に、核酸“ライブラリー”は、ベクター中にクローン化されるが、これが必要なわけではない。
本発明の核酸“ライブラリー”は、完全にランダム化することができ、該集団のメンバーは、どの位置にも配列優先性又は定常性を示さない。代わりに、核酸ライブラリーが偏ってもよい。すなわち、配列内のいくつかの位置が一定に保たれ、或いは限定数の確率から選択される。例えば、好ましい実施形態では、所定生物内の塩基の比率を好むバイアスでヌクレオチドをランダム化する。ランダム化した核酸混合物の起源は、天然に存在する核酸若しくはその断片、化学合成した核酸、酵素的に合成した核酸、又は前述の方法を併用して調製した核酸由来でよい。
【００２２】
用語“核酸”は、一本鎖又は二本鎖のどちらかの形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、別に限定していない限り、天然に存在するヌクレオチドに対するのと同様に核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知類似体を包含する。別に指示しない限り、特定の核酸配列は、その相補配列を包含する。
用語“核酸配列”は、ポリヌクレオチド内で現れるような、相互に関連するヌクレオチド塩基の特定の配置を意味する。
問題の核酸配列に“作動可能に連結”しているプロモーター、ターミネーター及び制御要素は、問題の核酸配列の発現に影響を及ぼしうる。制御要素が作用してコード配列の発現を指揮する限り、制御要素はコード配列に相接している必要はない。従って、例えば、プロモーター又はターミネーターがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコード配列に“作動可能に連結”している。
用語“オペレーター配列”は、特異的タンパク質又は核酸によって認識され、結合すると隣接オペレーター配列からの転写を阻害又は妨げるDNA配列を指す。例えば、テトラサイクリン（tet）オペレーター／リプレッサー系。
本明細書で使用する場合、用語“パッケージング”は、適切な宿主細胞の形質導入を促進するように、核酸をウイルス被膜内に包み込むプロセスを意味する。
用語“表現型の変化”は、観察又は試験によって同定できる、細胞の物理的、形態学的、生化学的又は挙動の特徴のいずれの変化をも意味する。
味する。
用語“表現型の差異”は、同一株又は種の２つ以上の細胞又は生物間で発現された遺伝子ベースの物理的、形態学的、生化学的又は挙動の特徴の差異を指す。
【００２３】
句“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”は、配列Ｎ1nＮ2mＮ3nを有する核酸を指す。ここで、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上（典型的に20まで）の数であり；かつ
ｍは１〜40、好ましくは３〜20、さらに好ましくは４〜９の数である。本明細書でヌクレオチド配列について使用する命名“Ｎ”はいずれのヌクレオチドをも表す。本明細書でヌクレオチド配列について使用する命名“Ｘ”は、ランダム化ヌクレオチドを表す。
“プロモーター”は、核酸の転写を指揮する配列を制御する核酸の配列を指す。本明細書で使用する場合、プロモーターは、III型RNAポリメラーゼIIIプロモーターの場合TATA要素のような転写の開始部位近傍に必要な核酸配列を含む。プロモーターは、任意に近位、及び転写の開始部位から数百もの塩基対離れた位置でもよい遠位の配列要素をも含む。“構成的”プロモーターは、多くの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。“誘発性”プロモーターは、環境又は発生制御下で活性なプロモーターである。従って、用語“プロモーター”は、問題のDNA配列に作動可能に連結している場合、当該DNA配列の転写を促進するヌクレオチド配列を意味する。
用語“プロモーター領域”は、DNA制御配列を含むヌクレオチド領域を指し、制御配列は、RNAポリメラーゼと結合して所定の核酸配列の転写を開始できる遺伝子から誘導される。所定の遺伝子又は遺伝子セットの“プロモーター領域”は、３種の真核生物RNAポリメラーゼのどれが当該遺伝子又は核酸配列を転写するという仕事に恵まれるか決定する。本発明は、主に真核生物RNAポリメラーゼIIIによって転写される遺伝子及び核酸配列に関連する。
【００２４】
真核生物RNAポリメラーゼIIIは、5SRNA、tRNA、7SL RNA、U6 snRNA及びいくつかの他の小さい安定なRNAsを含む限定セットの遺伝子を転写する。効率的に機能するため、ほとんどのRNAポリメラーゼIIIプロモーターは、転写領域内に＋１転写開始部位の下流に配列要素を必要とする。しかし、III型RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、機能するためにいずれの遺伝子内配列要素をも必要としない。代わりに、III型RNAポリメラーゼIIIプロモーターからの効率的が発現は、以下の上流配列要素の存在に依存する：-30〜-24のTATAボックス、-66〜-47の近位配列要素(PSE)、及び場合によっては-265〜-149の遠位配列要素(DSE)。最もよく特徴づけられているIII型RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、ヒトH1 RNA遺伝子及びU6 snRNA遺伝子と関連するプロモーターである。
【００２５】
いずれかの核酸配列を参照するとき、用語“ランダム化”又は“ランダム化配列”は、ランダム化していると言及される配列内のいずれかの所定の位置に出現するヌクレオチド塩基が、所定長さでランダム化した核酸の完全セットが該所定長さにわたってあらゆる塩基配列順序を有するメンバーから成るように、RNA及びDNAに天然に存在する５個のヌクレオチドのいずれか１つであり、又はそのいずれかの相同体であることを示す。ランダム化配列は、全体的にランダム化することができ（すなわち、４つのうち１つであるいずれかの位置に塩基を見つける確率）、又は部分的にだけランダム化することができる（例えば、いずれかの位置で塩基を見つける確率を０〜100パーセントのいずれかのレベルに選択できる）。
【００２６】
核酸配列変異体は、ランダム化核酸配列の化学合成及びランダムに切断した細胞性核酸からの大きさの選択を含む多くの方法で生成することができる。通常、ランダム核酸を、該配列がいずれの位置にもいずれのヌクレオチドも組み込めるように化学的に合成する。しかし、そうすることが望ましい場合、ランダム化配列中に故意にバイアスを導入してもよい。例えば、合成反応の前駆体ヌクレオチド（又はデオキシヌクレオシド）三リン酸のモル比を変えることによって。例えば、所定生物内の個々の塩基の比率に近づけるため、又は二次構造に影響を及ぼすためには故意のバイアスが望ましいかもしれない。従って、ランダム化核酸配列は、完全又は部分的なランダム化配列を含んでよく；或いはランダム化配列と共に組み込まれた保存配列の亜部を含みうる。従って、合成プロセスを設計して、配列の長さにわたって可能ないずれの組合せの編成も可能にし、それによってランダム化した候補核酸のライブラリーを形成することができる。
【００２７】
“部分的にランダム化した核酸配列”は、ランダム化配列及び予め定めた配列の両者から成る核酸配列を指す。ランダム化部分の配列は、上述したように、完全にランダム化されている。部分的にランダム化した配列の合成前に本発明の使用者は、予め定めた部分の配列を知っている。本明細書で述べるように、予め定めた配列は、主として相補的な核酸鎖のクローニングと合成を容易にするために含まれる。
用語“制限部位”は、特異的な制限酵素によって認識かつ切断されうるDNA配列を意味する。
用語“セグメント”又は“配列セグメント”は、核酸の部分及びその配列を指し、配列セグメントはより大きい核酸の配列の部分列である。典型的に、セグメントは機能的特徴、例えば遺伝子発現の制御を有し、或いは該核酸のコード配列又は構造ドメインを形成する。コードセグメントの場合、セグメントは、コード化分子の構造的及び／又は機能的特徴をコードしうる。
【００２８】
“シグナル伝達”は、細胞外の物理的又は化学的シグナル（例えば、ホルモン又は成長因子）内に含まれる情報を特異的受容体の活性化によって細胞が受け取り、原形質膜を横断し、かつ種々の成分の細胞内鎖に沿って運ばれ、適切な細胞応答を刺激するプロセスを指す。
“シグナル伝達経路成分”、“経路成分”、又は“シグナル伝達経路の成分”は、細胞によって受け取られた細胞外シグナルに応じて滝のように活性化される（特定の見掛け分子量の）細胞内又は膜貫通生体分子を指す。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞上で突き当たる化学的又は物理的事象を元の化学的又は物理的事象に応じて細胞の物理的又は代謝状態に変化をもたらす細胞プロセスに伝達される当該生化学的事象を指す。
用語“自己-プライミング”は、遺伝要素を複製しうる細胞プロセスの一部として細胞内で機能する１個以上の独立的な複製起点を有する遺伝要素を指す。
句“表現型の変化の原因であるライブラリーのsiRNA”は、本明細書で述べるようなRNA干渉のプロセスを通じて特異的な遺伝子抑制を誘発するdsRNAライブラリーのdsRNAを指し、上述したように、該遺伝子抑制は表現型の差異として明かである。
【００２９】
“TATAボックス”又は“TATA要素”は、一般的な転写因子と結合して、転写が開始する位置を特定する、多くのプロモーターで共通のヌクレオチド配列要素を指す。TATAボックスは、その発現がIII型RNAポリメラーゼIIIプロモーターに依存する配列の転写に重要な要素である。その名称が示すように、TATAボックスは、典型的に核酸配列5'-TATA-3'（又は技術的に知られるその変異形）を含む。
“ターミネーター”又は“終止配列”は、核酸配列の転写を終わらせる当該DNA配列を指す。終止配列は、本質的にポリメラーゼによって認識され、或いは終止は効果のあるさらなる終止因子を必要とすることがある。３種の各真核生物ポリメラーゼは、異なる終止配列に応じてRNAの合成を停止する。真核生物RNAポリメラーゼＩ及びIIは、通常転写の終止を果たすため、核酸配列要素に加えて因子を必要とする。しかし、真核生物RNAポリメラーゼIIIは、他の因子の明白な非存在下で正確かつ効率的に終止配列を認識する。ほとんどの場合、４個以上のチミジン残基の単純なクラスターがターミネーターとして有効に働く。
【００３０】
用語“ウイルス伝達系”は、細胞内に外因性核酸を導入するためのウイルスベクターの使用を指す。ウイルス伝達系は、DNA又はRNA-ベースでよいが、一般的に細胞ゲノムの組込み部として又はエピソーム遺伝要素として感染細胞中にDNA形態で組み込まれる。
“ウイルス粒子”は、核酸コア、タンパク質性キャプシド、及び外側エンベロープを含む完全なウイルスを指す。
用語“ベクター”は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等のような、正確な制御要素と関わると複製でき、かつ細胞間の遺伝子配列を伝達できるいずれの遺伝要素をも指す。従って、この用語はクローニング及び発現媒体、並びにウイルスベクターを包含する。
【００３１】
（詳細な説明）
Ｉ．序文
本発明は、ヘアピンsiRNA発現ベクターの新規な製造方法に関する。本方法は、その3'末端で短いステム-ループ又はヘアピン構造の5'末端に連結している問題のsiRNAの“センス”鎖用コード領域を含む自己-プライミングオリゴヌクレオチドを化学合成する工程を含む。ステム-ループ領域は、siRNA“センス”鎖用コード領域の補体（すなわち、“アンチセンス”鎖）を生成する分子内プライマー伸長反応でプライマーとして働く。この生成物を変性させ、適切なアダプターオリゴに（又は全長相補鎖に）アニールし、かつヘアピンsiRNAコード配列を転写するため及び細胞内でヘアピンsiRNAを発現するために適合させたプロモーターを含む適切な発現ベクター中に連結する。本発明により、siRNA“センス”鎖用コード配列のいかなる知識もなしで、siRNA“アンチセンス”鎖用コード配列を合成することができる。こういう訳で、本発明は、機能的ゲノム解析で使用しうるランダム化siRNA遺伝子のライブラリーの製造方法及び病気プロセスに関与する細胞遺伝子の発見方法を提供する。
【００３２】
II．自己-プライミングオリゴヌクレオチド
本発明の方法を実施する第１工程は、図２Ａに示されるような自己-プライミングオリゴヌクレオチド（例えば、Uhlmann (1988) Gene 71:29-40参照）の合成である。このオリゴヌクレオチドは27〜100塩基長、好ましくは50〜95塩基長、さらに好ましくは44〜68塩基長でよい。本発明の実施で使うのに好適な自己-プライミングオリゴヌクレオチドは、一連の核酸セグメントを含み、各セグメントは別個の構造と機能を有する。各セグメントについて、配列の5'末端から3'末端の順に図２Ａを参照しながら以下に述べる。
【００３３】
5'リーダー配列
自己-プライミングオリゴヌクレオチドの第１セグメントは5'リーダー配列であり、図２Ａに配列5'-GGCCGCNNNNAAAAA-3'で示される。このセグメントは、転写終止配列の補体、及びクローニング目的に必要かつ有用な配列単位を含め、遺伝子制御要素を含む。5'リーダー配列は４〜27、好ましくは10〜20ヌクレオチド長の核酸である。これらヌクレオチドの少なくとも４個は、好ましくは該リーダー配列の3'末端に位置する連続したアデニリル残基である。（図２Ａには５個のアデニリル残基が示されている）。これらアデニリル残基5'のsiRNAコード配列への位置決め及び転写終止配列の補体としてのその機能については、さらに詳細に後述する。5'リーダー配列の残部は（図２Ａの例では、これらはヌクレオチド5'-GGCCGCNNNN-3')、siRNA転写を制御するための任意の制御要素、下流のプロモーター要素から適切な距離にsiRNA遺伝子を位置づけるためのスペーサーを含み、及び／又はsiRNA発現カセット又はその一部の構築及び／又は回収を促進するための制限部位（又はその一部）として構成しうる。これら追加要素は、典型的に20個以下の塩基を含み、5'〜少なくとも４個のアデニリル残基に位置する。5'リーダー配列を新たに化学合成することができ、或いは代わりに所望のヌクレオチド位置に存在する核酸の部位特異的突然変異によって生じさせうる（例えば、Adelmanら, DNA, 2:183, (1983)）。
【００３４】
5'リーダー配列は、本発明によって構築した発現カセットで使うために修飾したプロモーターの3'領域を含み、siRNAsの発現に利用した（後述するように）。プロモーターの天然の3'ヌクレオチドを5'リーダー配列と置換することによって、本発明の実施に必要なクローニング及び遺伝要素をプロモーター自体の中に組み込むことができる。また、5'リーダー配列は、核酸プライマーをアニールしうる既知配列と、本発明によってsiRNAsを発現させるための発現カセットを構築するいくつかの方法で使用するクローニング工程を促進する既知配列の一本鎖末端との両方を与える。
一旦生成したら、5'リーダー配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR９、QB-レプリカーゼ増幅及び他の既知のRNAポリメラーゼ媒介法のような技術的に周知の方法で増幅することができる。
【００３５】
“センス”鎖コード配列
自己-プライミングオリゴヌクレオチドの第２セグメントは、siRNAの“センス”鎖用のコード配列を含み、図２Ａに一連の“Ｘ”で示される。このセグメントは、好ましくは11〜27塩基長、さらに好ましくは14〜22塩基長、最も好ましくは16〜19塩基長である。このセグメントは、ヌクレオチドの既知配列、又はランダム配列（上の例“Ｘ”で示され、各“Ｘ”は４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴの１つを表す）。“センス”鎖コード配列を含むヌクレオチドの配列は、5'リーダー配列の3'末端に直接連結している。
【００３６】
“センス”鎖コード配列の第１ヌクレオチドは、典型的に、本発明のヘアピンsiRNA発現から転写される最初のヌクレオチド（すなわち、転写開始部位）である。一般的に、ヌクレオチドが占める第１ヌクレオチド位置に何ら制限はないが、この位置にアデニリル又はグアニリル残基が存在すると、本発明の実施で使用しうるいくつかのプロモーターの転写開始の効率を高めうる。転写開始部位に特定のヌクレオチドを必要としない（ほとんどの環境下で）ポリメラーゼ用プロモーターを使用することによって、また遺伝子内要素を必要としないプロモーターを使用することで、ランダム化配列として完全な“センス”鎖コードセグメントを操作することができる。完全にランダム化した配列を有するsiRNAコードセグメントを生成すると、すべての可能性のある配列順序を含むsiRNA遺伝子のライブラリーの構築を可能にし、それによって機能的ゲノム解析のために本発明の有用性を高めることは明かである。
“センス”コードセグメントは、既知ヌクレオチド配列をも含み、それによって既知配列をサイレンスにするsiRNAsを生成するsiRNA発現ベクターの構築を斟酌しうる。このようなsiRNAs用コード領域は、技術的に周知な標準的な方法を用いて生物学的起源（例えば、ゲノムDNA又はcDNAライブラリー）から単離することができ、或いはヌクレオチド配列データベースで同定し、かつ化学的に合成することができる。
【００３７】
ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー
自己-プライミングオリゴヌクレオチドの第３セグメントは“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”であり、図２Ａに配列5'-GGGTTCGccc-3'で示されている。図２Ａから分かるように、このセグメントは“センス”コードセグメントの3'末端に付加して短いステム-ループ構造を形成している。図２Ａに示される配列は本発明の実地で使うために操作しうる多くの単なる１つにすぎない。一般的に、“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”は式5'-Ｎ1nＮ2mＮ3n-3'で表される配列を含み、式中、
Ｎ3はＮ1に相補的であり；
ｎは２以上（典型的に20まで）の数であり；かつ
ｍは１〜40、好ましくは３〜20、さらに好ましくは４〜９の数である。
図２Ａでは、配列GGGがＮ1、TTGGがＮ2、かつcccがＮ3である。ｎが５より大きい場合、実施例５でさらに後述するように、配列内に制限部位を含めて、“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”のより短いリンカーとの置換（後の段階で）を容易にすることができる。さらに、ｎが５より大きい場合、Ｎ1及びＮ3の配列内にいくつかのミスマッチを組み込んで、この置換プロセスを促進することができる。
【００３８】
構造的に、“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”は、Ｎ2配列によって形成される非塩基対合ループと、Ｎ1及びＮ3配列の分子内塩基対合によって形成される二本鎖ステム構造の両者を含む。
これら構造の特徴の結果としていくつかの重要な機能的特徴が生じる。これらの最も重要な特徴は、Ｎ1とＮ3との間の塩基対合から生じる。Ｎ1とＮ3との間の分子内相互作用によって形成される二重鎖DNAの短い配列が、鋳型として“センス”鎖コード配列と5'リーダー配列を用い、“センス”鎖コード配列に相補的な鎖と5'リーダー配列のプライマー伸長によって合成できるように位置づけられる有効なポリメラーゼプライマーを生成することは明かである。このプロセスについては、さらに詳細に後述する。
プライマーとしての“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”の有効性を最大にするため、Ｎ1及びＮ3が少なくとも３個の塩基対を含むことが好ましい。Ｇ-Ｃ対合が好ましい（図２Ａに示されるように）。Ａ-Ｔ対では２個の塩基間水素結合を形成するのと対照的に、このヌクレオチド対は３個の塩基間水素結合を形成するからであるが、転写を妨げないという条件で、他の相補的ヌクレオチド配列を使用しうる。
“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”セグメントの設計では、ヘアピンループセグメントＮ2の長さも考慮すべきである。Ｎ2ヘアピンループセグメントの好ましい特徴は、Ｎ3セグメントがＮ1セグメントと塩基対合するのに十分に長いことである。また、ヘアピンループは、Ｎ1-Ｎ3塩基対合を妨げ、又は二重鎖DNA分子内で見られる場合DNAポリメラーゼ活性を終結させるであろう二次構造を簡単に形成すべきでない。RNAポリメラーゼIII用転写ターミネーターとして作用しうる配列は特に望ましくない。これらパラメーター内で、Ｎ2セグメントはいずれのヌクレオチド配列も持ちうる。
【００３９】
本発明の特定の局面では、２個のチミジル残基をＮ2の一番端の5'末端に供給する（図２Ａに示されるように）。これら残基が存在する場合、これらは対応するヘアピンsiRNA転写物内のエンドヌクレアーゼ切断部位をコードする。本発明の実地でヘアピンsiRNAが発現されるとき、さらに完全に後述するように、転写物内のこの部位でのヘアピンループの切断が、発生期のsiRNAの“センス”鎖の3'末端に２-ヌクレオチドの3'オーバーハングを生成する。少なくとも２ヌクレオチド長の3'オーバーハングは、siRNAsのRNAi効果を高めると報告されている（Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-448; Miyagishi及びTaira, 同書, 497-500; Elbashirら. (2001) EMBO J. 20: 6877-6888)。
【００４０】
III．ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーからのプライマー伸長
siRNA“アンチセンス”鎖用コード配列の合成は、自己-プライミングオリゴヌクレオチドのプライマー伸長によって行う。ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーのステム-ループ構造は、siRNA“センス”鎖用コード領域の3'末端に自己-プライミングオリゴヌクレオチドの一番端の3'末端を位置づける（図２Ａ）。従って、プライマー伸長反応はsiRNA“センス”鎖用コード領域に相補的な核酸セグメントを生成する（図２Ｂでは一連の“ｘ”で表され、各“ｘ”は４個の塩基、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴの１つを表す）。このセグメントはsiRNA“アンチセンス”鎖をコードする。
【００４１】
プライマー伸長反応は、5'リーダー配列を通って続き、ポリメラーゼが自己-プライミングオリゴヌクレオチド鋳型の末端を走り去るとき終了する。従って、プライマー伸長反応は5'リーダー配列に相補的なセグメントも生成する（図２Ｂで配列5'-tttttnnnngcggcc-3' で表される）。上述したように、5'リーダー配列は、転写終止配列に相補的な、好ましくは5'リーダー配列の一番端の3'末端（典型的に、本発明の実施で使用しうる発現カセットプロモーターの一番端の3'末端でもある）に位置する少なくとも４個の連続したアデニリル残基を含む。従って、プライマー伸長反応はsiRNA“アンチセンス”鎖コードセグメントの3'末端で開始し、かつ少なくとも４個のチミジル残基を含む終止配列をも生成する。
【００４２】
図２Ｂに示されるように、プライマー伸長反応の生成物は、ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーのＮ2セグメントから形成されたループと、その相補セグメント（すなわち、siRNA“アンチセンス”鎖コードセグメント）にハイブリダイズしたsiRNA“センス”鎖コードセグメント及び5'リーダー配列の相補セグメントにハイブリダイズした5'リーダー配列を含むステムとから成るヘアピン分子である。
このタイプのプライマー伸長は複数のDNAポリメラーゼで触媒することができ、かつ技術的に周知の方法（例えば、Sambrookら 1989, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. and Uhlmann (1988) Gene 71:29-40に記載されているような大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ホロ酵素又はクレノウ断片）又はT7、T4、若しくはTaq DNAポリメラーゼ）を用いて達成できることは明かである。さらに、逆転写酵素を使用してもDNA鋳型から相補DNA鎖を合成できる。
【００４３】
IV．ヘアピンsiRNA発現ベクターの構築
上述したプライマー伸長反応で生成されるヘアピン分子は、ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーによって、相互にかつ“アンチセンス”siRNA鎖コード配列の3'末端で転写終止配列に作動可能に連結している“センス”及び“アンチセンス”siRNA鎖の両者用のコード配列を含む部分的な転写単位を含有する。この一本鎖核酸は、その相補鎖だけを欠き、かつ機能性プロモーター要素を形成するために必要な5'ヌクレオチド配列が残存している、本発明の部分的な発現カセットを表す。欠いている5'ヌクレオチド配列を作動可能に連結し、相補鎖を合成し、その構築物を細胞中に導入するのに好適なベクター系中に組み込むため、図２Ｃで例示されるように、まず部分的な発現カセットのステム-ループ構造を融かして線状一本鎖核酸を形成しなければならない。
【００４４】
二重鎖核酸の融解方法は技術的に周知である（例えば、Sambrookら 1989,in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.）。ステム-ループ構造が再形成するのを防止するため、5'リーダー配列の既知ヌクレオチド配列を利用する。この既知配列を用いて遮断プライマーを構築し、部分的な発現カセットの3'末端で5'リーダー配列とその補体の両者をアニールする（図２Ｃ）。これら遮断プライマーを分子の5'及び3'末端にアニールすると、“センス”及び“アンチセンス”コードセグメント間の塩基対合を破壊し、部分的発現カセットの相補配列の細胞間及び細胞内の両ハイブリダイゼーションを防止する。ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーに相補的なさらなる遮断プライマーを利用してもよい（図示せず）。
【００４５】
5'リーダー配列及び遮断プライマーの構築で用いるヌクレオチド配列の慎重な選択によって、5'又は3'オーバーハング末端を有する二重鎖DNAの短いセグメントを部分的発現カセットのどちらかの末端に組み込むことができる。これら5'又は3'オーバーハング末端は、えり抜きの制限酵素による消化で生じるオーバーハング末端と調和するように設計することができ、機能性プロモーター要素を形成するために必要な残存5'ヌクレオチド配列を含有する適切に消化した構成物中にそれを連結するとき、部分的発現カセットを正しく配向させることによってクローニングを促進することができる。このことは、部分的な転写単位を機能性プロモーター要素を形成するために必要な残存5'配列に作動可能に確実に連結するため（すなわち、構成物内に位置する該プロモーターの5'部分が、5'リーダー配列によってコードされるプロモーターの3'末端に正確に結合することを保証するため）に重要である。
【００４６】
そして、アニールした遮断プライマーを有する部分的な発現カセットを、技術的に周知の標準的方法を用いて、機能性プロモーター要素を形成するために必要な残存5'配列を含有する適切に消化した構成物中に連結する（図３）。２個の遮断プライマー配列（図４）間の一本鎖領域に相補的な核酸セグメントをインビトロ又はインビボ合成して発現カセットを完成する。
これとは別に、完成発現カセットを含むことになる構成物中への組込み前に、アニールした遮断プライマーを有する部分的発現カセットの一本鎖領域に相補的な鎖を合成してもよい。しかし、好ましい構築方法は、完成発現カセットを含むことになる構成物中へのコード領域の組込み後に、相補鎖を合成することである。この方法は、5'又は3'オーバーハング末端のような、カセットの構築に有用な分子の構造面を保護する。構成物中へのコード領域の組込み前に相補鎖を合成する一般的な方法は、平滑末端化挿入断片をもたらし、これを用いて平滑末端連結法で機能性カセットを構築できるが（例えば、Sambrookら, 上記; Ausubelら,上記参照）、これら方法は、相補的挿入断片／ベクター配列を用いる方向性クローニングほど効率的でない。さらに、平滑末端連結は、約50％の時間、逆方向の挿入断片の連結となる。
【００４７】
さらなる代替法として、終止トランスフェラーゼ（TdT）を用いて、プライマー伸長反応で生じたステム-ループ分子の3'末端にホモポリマー尾部を付加することができる。TdT反応は２つの機能に役立つ。第１に、TdT反応で生じたホモポリマー尾部は、ステム-ループ分子の相補鎖の生成用プライミング部位として働きうる。例えば、ステム-ループ分子がオリゴ(dG)を“尾部に持つ”場合、鎖置換反応を遂行できるポリメラーゼ、例えばSequenase version 2.0 T7 DNAポリメラーゼ(Amersham, Piscataway, NJ)、T4遺伝子32タンパク質を有するT4 DNAポリメラーゼ(Amersham, Piscataway, NJ)、又はSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)による相補鎖の合成用プライマーとしてオリゴ(dC)を使用することができる。第２に、ステム-ループ分子（TdT反応前）の5'リーダー配列を適切に設計し、かつTdTによって適切なホモポリマー尾部を3'末端に付加した場合、この反応は、ステム-ループ分子の3'末端にユニークな制限部位に相当する配列を導入することができる。例えば、ステム-ループ分子が5'-CCC-3'で終わる場合、ヌクレオチド基質としてTdT及びdGTPを尾部に持つと、XmaI部位をコードする配列5'-CCCGGG…G-3'を生じる。このXmaI認識配列はステム-ループ分子の3'末端にだけ存在し、5'末端には存在しない。上述したような相補鎖の合成後、このユニークな制限部位は、完成発現カセットを含むことになるベクター中への二本鎖コード領域の非方向性連結を促進することができる。この代替戦略の特定例を実施例５で提供する。
【００４８】
Ｖ．一般的な組換え方法
本発明の発現カセット及びベクターは、本技術の当業者に周知の標準的方法を利用して構築することができる（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatus, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (1989); Gelvin, S. B., Schilperoort, R. A., Varma, D. P. S., eds.  Plant Molecular Biology Manual (1990)）。
本発明の発現カセットの調製では、種々のDNA配列を細菌プラスミド中に普通に挿入又は置換することができる。細菌複製系、形質転換した細菌の選択を可能にするマーカー、及び通常１種以上の都合よく配置されるユニークな制限部位を有することで特徴づけられるいずれの便利なプラスミドも利用できる。ベクターと呼ばれるこれらプラスミドとしては、pACYC184、pACYC177、pBR322、pUC9、又はpBluescript II (KS又はSK)のようなベクターが挙げられ、マーカーの性質、好都合な制限部位の利用能、コピー数などに基づいて特定のプラスミドを選択する。従って、配列を適切な制限部位でベクター中に挿入し、生じたプラスミドを用いて大腸菌宿主を形質転換し、大腸菌を適切な栄養培地内で増殖し、細胞を収集かつ溶解してプラスミドを回収することができる。そして、異なる断片の段階的組合せを斟酌する戦略を定義する。
【００４９】
本発明の実施が、部位特異的突然変異、変性オリゴヌクレオチドを用いるPCR増幅、突然変異を起こしうる物質又は放射線への核酸配列含有細胞の暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、連結及び／又はクローニングと共に大きい核酸を生成）及び他の周知技術を含む、本技術の当業者が知っているいずれの方法を利用しても達成しうる核酸配列の変化を生じさせる工程を含む。例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrookら, Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook) (1989); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.及び John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement) (Ausubel); Pirrungら, 米国特許第第5,143,854号；及びFodorら, Science, 251:767-77 (1991)参照。これら技術を用いて、いずれの長さのポリヌクレオチドも随意に本発明の発現カセット中に挿入又は欠失させることができる。
【００５０】
本発明の実施は、技術的に周知の方法を利用して遂行しうる線状オリゴヌクレオチドの化学合成をも含む。選択される合成法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さを含む種々の因子によって決まり、該選択は当業者のスキルの範囲内である。オリゴヌクレオチドは、典型的に、Beaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862 (1981)に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法によって、例えば、Needham-VanDevanterら, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)に記載されているような自動合成機を用いて化学合成する。オリゴヌクレオチドは、当業者に知られる種々の市販供給元に外注製造及び注文することもできる。
【００５１】
合成線状オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又はゲルクロマトグラフィー及び高圧液体クロマトグラフィーを含む多くのクロマトグラフ法のいずれかで精製することができる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam and Gilbert in Grossman and Moldave (eds.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560(1980)の化学分解法を用いて検証することができる。修飾した塩基をオリゴヌクレオチド中に組み込む場合、特に修飾したホスホジエステル結合を用いる場合、合成手順は既知手順に従い、必要に応じて変える。この関連では、Uhlmannら, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)が、参考文献及び修飾した塩基と修飾したホスホジエステル結合でオリゴヌクレオチドを作る手順の概要を提供する。短いオリゴヌクレオチドの配列は、レーザー脱着質量スペクトル法又は高速原子衝撃法によっても分析することができる(McNealら, J. Am. Chem. Soc., 104:976 (1982); Viariら, Biomed. Enciron. Mass Spectrom., 14:83 (1987); Grotjahnら, Nuc. Acid Res., 10:4671 (1982))。
【００５２】
示されるように、本発明のコード核酸の第２鎖は典型的には酵素的に合成される。DNAオリゴヌクレオチド合成の酵素的方法は、記載されているように（Sambrookら(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.）、T7、T4又はTaq DNAポリメラーゼ若しくは大腸菌DNAポリメラーゼＩ（ホロ酵素又はクレノウ断片）を利用することが多い。RNAオリゴヌクレオチド合成の酵素的方法は、Sambrookら(1989)に記載されているように、SP6、T3、又はT7 RNAポリメラーゼを利用することが多い。逆転写を用いてRNA又はDNA鋳型からDNAを合成することもできる(Sambrookら, 1989)。
線状オリゴヌクレオチドは、例えば、Saikiら, Science, 239:487 (1988)によって記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によっても調製できる。ヌクレオチド配列の増幅に好適なインビトロ増幅法は技術的に周知である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅法及び他のRNAポリメラーゼ媒介法(例えば、NASBA)を含むこのような方法の例は、Berger, Sambrook, 及びAusubel, 並びにMullisら, (1987)米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innisら, eds) Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1990年10月１日) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research, 3:81-94 (1991); (Kwohら, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173; Guatelliら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990); Lomellら, J. Clin. Chem, 35:1826(1989); Landegrenら, Science, 241:1077-1080 (1988); Van Brunt, Biotechnology, 8:291-294 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989); Barringerら, Gene, 89:117 (1990),及びSooknanan and Malek, Biotechnology, 13:563-564 (1995)に記載されている。インビトロ増幅した核酸をクローニングする改良方法は、Wallaceらの米国特許第5,426,039号に記載されている。
【００５３】
VI．プロモーター
本発明の発現カセットは、単一プロモーター及びヘアピンsiRNAの両鎖用コード配列を有する転写単位を含む。この転写単位から、単一転写物としてヘアピンsiRNAが生成される。発現カセットで使うために選択する特定のプロモーターは、該発現カセット内でコードされるsiRNAによって標的される生物又は細胞型によって決まる。例えば、植物細胞がsiRNAの標的である場合、植物プロモーターを使用すべきである。哺乳類細胞がsiRNAの標的である場合、哺乳類プロモーターを使用すべきである。プロモーターは構成性、誘発性、又は細胞依存性でよく、用途及び望まれる結果によって決まる。
【００５４】
本発明の発現カセットにはpol IIIプロモーターが好ましい。Ｉ型及びII型のpol IIIプロモーター（例えば、tRNA遺伝子及びアデノウイルスVA遺伝子用プロモーター）は、転写開始部位（すなわち、関連構造遺伝子内）の下流に位置する要素を必要とする。対照的に、III型pol IIIプロモーター（例えば、U6小核(sn)RNA及びH1 RNAプロモーター）は遺伝子内プロモーター要素の必要条件を欠く。それらは伝統的なTATAボックス(Mattajら, Cell, 55:435-442 (1988))、近位配列要素(PSE)及び状況によっては遠位配列要素(DSE；Gupta and Reddy, Nucleic Acids Res., 19:2073-2075 (1991))を含む、転写開始部位の上流にすべてのシス-作用プロモーター要素を含む。特定の用途では、カセットのコード領域を設計するとき、遺伝子内プロモーター要素の非存在は、より大きいフレキシビリティーを許すので、III型プロモーターが好ましい。追加の考慮すべき事項が最優先される他の用途では（例えば、siRNAsの細胞質局在化）、他のpol IIIプロモーターが好ましいかもしれない。II型とIII型の両pol IIIプロモーターを用いてsiRNAsを発現させている(Brummelkampら (2002) Science 296: 550-553; Paddisonら (2002), Genes and Development 16: 948-958; Miyagishi and Taira (2002), Nature Biotechnology, 20:497-500; Leeら,同書:500-505; Paulら,同書: 505-508; Kawasaki and Taira (2003), Nucleic Acids Res. 31:700-707)。
【００５５】
本発明のプロモーターは、好ましくは転写開始点で特定のヌクレオチドを必要とせず、それによってsiRNAコード配列の設計でのフレキシビリティーを最適化するが、いくつかのポリメラーゼによる最初の位置におけるＧ又はＡの特異的要求を含め、いくつかの特異性は許容される。
異種プロモーター／リーディングフレーム組合せの構築では、プロモーターは、その自然設定内の転写開始部位からの距離と異種転写開始部位からの距離が同じ当たりに位置することが好ましいが、この距離のいくらかの変更は特定条件下でプロモーター機能を失わずに果たすことができる。
【００５６】
プロモーターの単離のいくつかの方法が知られている。例えば、該プロモーターの一部又は対応する遺伝子配列が分かっている場合、全長プロモーター配列を単離することができる。当業者は、種々の大小の挿入ゲノムDNAライブラリーをハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術でスクリーニングし、所望の配列を含有するライブラリークローンを同定しうることを認識している。典型的に、ハイブリダイゼーションプローブとして所望の配列を用いて既知配列を含有する個々のライブラリークローンを同定することができる。代わりに、既知配列を基礎とするPCRプライマーを設計し、かつ他のプライマーと併用して既知DNAポリヌクレオチド配列に隣接した配列を増幅することができる。その結果、隣接DNA配列を含有するライブラリークローンを同定することができる。結果のライブラリークローンのDNA挿入断片の制限地図作成及びハイブリダイゼーション分析は、既知DNAポリヌクレオチド配列に隣接したDNA配列の同定を可能にする。従って、プロモーター配列の一部だけが分かればプロモーターを単離することができる。
本発明のプロモーター領域は、典型的に、内部及び隣接する両制限配列を含めてクローニングプロセスで補助するように操作する。
【００５７】
転写ターミネーター
一旦発現カセットのコード配列が転写されると、転写ターミネーターは転写の効率的な停止を斟酌する。本発明の転写ターミネーターは、好ましくは最小の構造複雑性を有し、ポリアデニル化のような転写後プロセシング事象に信号を送らない。転写ターミネーターは、理想的には、終止配列に相補的であり、かつコード領域の第１転写塩基と該プロモーターの間に位置するような最小構造が好ましく、最も好ましくは該プロモーター配列の3'末端の一部を形成する（図５参照）。ターミネーターのこの矛盾した位置決めは、siRNA用コード領域を合成する方法の結果である。上で説明したように、プライマー伸長を開始するために“ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー”を使用する場合、siRNAの“センス”鎖用コードセグメントをsiRNAの“アンチセンス”鎖を合成するための鋳型として使用する。“センス”鎖用コードセグメントの上流は転写終止配列の補体を含有する5'リーダー配列である。siRNAの“センス”鎖用コードセグメントを読み取った後、DNAポリメラーゼは、この5'リーダー配列を鋳型として用いて“アンチセンス”コードセグメントを越えて重合を続け、転写終止配列3'〜“アンチセンス”コードセグメントを生成する。
【００５８】
本発明の新規プロモーター系によって形成される所望産物は少なくとも２個のヌクレオチドの3'オーバーハングを有するdsRNAなので、この転写物の3'末端の転写後プロセシングは好ましくない。Tuschl, Thomas, Nature Biotechnology, 20:446-448 (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnology, 20:497-500 (2002)。従って、好ましい転写ターミネーターは、４〜25個の核酸を含み、その少なくとも４個の連続した核酸はチミジル残基である(Miyagishi及びTaira,上記参照)。好ましいターミネーターとしては、pol III用最小終止配列、III型ポリメラーゼ、４個の連続したチミジル残基の配列が挙げられる。このような終止配列の相補配列は図２Ａに示され、この例では、本発明のプロモーターの3'遠位末端の好ましい位置に操作されている。図２Ａを参照すると、本明細書で述べるようにプロモーター中に操作した場合でさえ、相補的なターミネーター配列は４個のアデニリル残基に限定されない。5'リーダー配列内のいずれかのヌクレオチドを置換してより大きい終止配列を収容することができる。技術的に周知の方法で制限部位をこの領域に含めてもこのような置換の取込みを楽にすることができる(Sambrookら, 前出; Ausubelら,前出)。当業者は、転写されたヘアピンsiRNAのループ領域が内因性細胞ヌクレアーゼによって転写後にプロセシングされて２本の別個の相補鎖から成るsiRNAが生じることに気づくだろう（Brummelkampら(2002) Science 296: 550-553; Paulら(2002) Nat. Biotechnol. 20: 505-508; Paddisonら(2002) Genes and Development 16: 948-958.)。
一般的に、発現カセットのプロモーターで開始されるポリメラーゼ反応の転写を終止しうるいずれの終止配列も使用できる。好適な3'終止配列は、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅法によってゲノムライブラリーから単離することができ、或いは上述したように化学的に構築することができる。
【００５９】
発現制御要素
本発明のいくつかの実施形態は、転写の開始のみならず転写が進行する速度を調節するために機能する発現制御要素を含む。これら配列は、プラスミドコピー数、組換え特性（例えば、細胞ゲノムへの部位特異的又は無差別組込み）及びプロモーター活性のような発現の状況を制御する。発現制御配列は、本発明の発現カセットが安定的又は過渡的に細胞中に組み込まれるかを決定し、かつ一旦発現カセットが組み込まれたら、発現カセット内にコードされているsiRNAがどのレベルで発現されるかを決定するので重要である。
このような制御要素の１つは、トランス-作用因子によって認識されるシス-作用オペレーター配列である。このオペレーター配列は、プロモーター自体の中に、又はオペレーター配列を認識するトランス-作用因子が存在するとき、プロモーター由来のポリメラーゼ活性の調節を斟酌する適切な位置に該プロモーターを含有するベクター中に、操作しうる１個以上のヌクレオチド配列を含む。トランス-作用因子は、本発明の発現カセットと同じベクター又は染色体中にコードされ、或いは他のベクター又は染色体内にコードされうる。
【００６０】
トランス-作用因子によって認識されるオペレーター配列は、本明細書で述べる二重プロモーター系のプロモーターからの発現に誘発性の特徴を与える。発現の誘発は、利用する特定のオペレーター系によって決まる種々の手段で達成できる。例えば、いくつかのオペレーター系は組織特異的発現特性をプロモーターに与える。他のオペレーターは、小分子及びホルモンで活性化される。典型的なオペレーター系としては、エクジソン／グルココルチコイド応答要素(GRE)(Invitrogen, Carlsbad, CA)；Tetオペロン(Clontech, Palo Alto, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA)；及びLacオペロン(Hu and Davidson (1987) Cell, 48:555-556)が挙げられる。さらなる制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。他の例示哺乳類発現制御配列は、SV-40プロモーター(Science, 222:524-527 (1983))、CMV I.E.プロモーター(Proc. Natl. Acad. Sci., 81:659-663 (1984))又はメタロチオネインプロモーターから得られる(Nature, 296:39-42 (1982))。
【００６１】
本発明の発現カセットで使う好ましい発現制御要素(オペレーター配列)はテトラサイクリン(tet)オペレーター配列(tet O)である。図６に示されるように、本発明で使うために修飾したU6 snRNAプロモーター中にtet Oを操作することができる。tet Oがテトラサイクリン-感受性トランス-作用タンパク質（テトラサイクリンリプレッサー、Tet R）によってつながれると、プロモーターの転写開始が妨害される。tet OがTet Rにつながれない場合、プロモーターからの転写が進行し、プロモーターに作動可能に連結しているコード配列を発現させる(Ohkawa and Taira, Human Gene therapy, 11:577-585 (2000); van de Wetering, EMBO Reports, 4:609-615 (2003)参照)。
【００６２】
VII．組換えベクター
本発明の別の局面は、本発明の発現カセットを含有するベクターに関係する。特定タイプのベクターは、本発明の発現カセットを増幅させることができる。他のタイプのベクターは、発現カセットの細胞への効率的な導入のため、及び一旦導入したらその安定した発現のために必要である。本発明のDNA発現カセットを受容できるいずれのベクターも本発明の目的で好適な組換えベクターとして考慮される。ベクターは宿主ゲノム中に組み込まれ或いはエピソーム形態で操作されるいずれの環状又は線状長さのDNAでもよい。ベクターは、宿主細胞中に効率的に組み込むためのさらなる操作又は特定の条件を必要とし(例えば、多くの発現プラスミド)、或いは自己組み込みする細胞特異系（例えば、組換えウイルス）の一部でよい。
【００６３】
各ベクター系は、とりわけ、宿主細胞範囲、細胞内位置の選定、dsRNA発現のレベルと持続時間、及びスケールアップ／精製の容易さに対して利点と欠点を有する。最適な送達系は以下の特徴がある：１）広範な宿主範囲；２）高い力価／μg DNA；３）安定した発現；４）宿主細胞に無毒；５）宿主細胞内で複製なし；６）理想的にはウイルス遺伝子発現なし；７）娘細胞への安定した伝達；８）高い救出(rescure)収率；９）その後の分析と干渉しうる、続いて起こる複製-コンピテントウイルスの欠如。ベクターの選択は、意図した用途にも依存しうる。
【００６４】
エピソームベクターは、一般に、その元の機能に加え、細胞分割で娘細胞間の複製分子の均等な分布を保証する機能をコードする染色体外レプリケーターを有する。高等生物では、染色体外レプリケーターの分割の異なるメカニズムが存在する。例えば、酵母菌の人工(ARS-含有)プラスミドは、染色体外レプリケーターとして染色体セントロメアを利用する(Struhlら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 76:1035-1039 (1979))。後生動物細胞では、よく研究された安定的な染色体外レプリケーターの一例は、Epstein-Barrウイルス(EBV)由来の潜在性起源oriPである(Yatesら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:3806-3810 (1984); Yatesら, Nature, 313:812-815 (1985), 及びKrysanら, MoL Cell. Biol., 9:1026-1033 (1989)参照)。
【００６５】
特定のベクターは、導入された宿主細胞（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）内で自律性複製が可能である。他のベクター（例えば、非-エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞中に導入されるとすぐ宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、宿主ゲノムと共に複製される。
特定のベクター、“発現ベクター”は、遺伝子の発現を指揮することができる。本発明の発現カセットを含むいずれの発現ベクターも本発明の発現カセットとみなす。一般に、組換えDNA法用途の発現ベクターはプラスミドの形態である。しかし、本発明の好ましいベクター系は、ウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス、バキュロウィルス、CaMVなどであり、さらに詳細に後述する。
【００６６】
例として、本発明の哺乳類標的細胞で使う発現ベクター構成物は以下のものが挙げられる。
１．上述したように、哺乳類細胞内で転写を指揮する哺乳類U6遺伝子由来のもの（RNAポリメラーゼIIIプロモーター）のような、選択した標的細胞内で機能するプロモーターを含む発現カセット。
２．Epstein-Barrウイルス由来の複製起点のような、エピソーム（非-組込み）複製を可能にする哺乳類複製起点（任意）。
３．pBR322プラスミド由来の複製起点のような、必要量の本発明のDNA発現カセットを生成するために細菌細胞内で機能性の複製起点。
４．ネオマイシン又はハイグロマイシン抵抗性のような、該構成物で形質移入／形質導入される哺乳類細胞の選択を可能にする哺乳類選択マーカー（任意）。
５．カナマイシン又はアンピシリン抵抗性のような、プラスミドベクターで形質転換される細菌細胞の選択を可能にする細菌抗生物質抵抗性マーカー。
【００６７】
本発明のDNA発現カセットを受容するように操作できる好適な大腸菌発現ベクターの例としては、pTrc(Amannら, Gene, 69:301-315 (1988))及びpBluescript(Stratagene, San Diego, CA)が挙げられる。酵母菌S. cerevisiae内での発現用ベクターの例としては、pYepSec1(Baldariら, EMBO J., 6:229-234 (1987))、pMFa(Kurjan及びHerskowitz, Cell, 30:933-943 (1982))、pJRY88(Schultzら, Gene, 54:113-123 (1987))、pYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA)、及びpPicZ (Invitrogen, Carlsbad, CA)が挙げられる。バキュロウィルスベクターは、昆虫細胞内で培養したdsRNAsの発現に好ましい系であり(例えば、Sf9細胞,米国特許第4,745,051号参照)、pAcシリーズ(Smithら, Mol. Cell Biol., 3:2156-2165 (1983))、pVLシリーズ(Lucklow及びSummers, Virology, 170:31-39 (1989))及びpBlueBac (Invitrogen, San Diegoから入手可能)が挙げられる。原核生物及び真核生物の両細胞に好適な他の発現系については、上記Sambrookらの16及び17章を参照せよ。好ましい哺乳類ベクターは、一般にウイルス起源のベクターであり、詳細に後述する。
【００６８】
哺乳類ウイルスベクター
ウイルスベクターによる細胞の感染は細胞中に本発明の発現カセットを導入する好ましい方法である。ウイルスベクターアプローチは、高割合の細胞が発現カセットを受け入れ、形質移入に成功した細胞の選択の必要を排除できるという利点を有する。典型的な哺乳類ウイルスベクター系としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連型１（“AAV-1”）又はアデノ関連型２（“AAV-2”）ベクター、肝炎デルタベクター、生きた弱毒化デルタウイルス及びヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
【００６９】
（ａ）レトロウイルス
レトロウイルスは、安定的に宿主細胞ゲノム中に遺伝情報を組み込むために有用なRNAウイルスである。レトロウイルスが細胞を感染すると、そのRNAゲノムがdsRNA型に変換される（ウイルス酵素逆転写酵素によって）。ウイルスDNAは効率的に宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが永続的に存在し、各細胞分割で宿主DNAと共に複製する。組み込まれたプロウイルスが、ゲノムの末端に位置する強力なプロモーターからウイルスRNAを定常的に産生する（ロングターミナルリピート又はLTRと呼ばれる配列内）。このウイルスRNAが、ウイルスタンパク質の生産用mRNA及び新しいウイルス用ゲノムRNAとして働く。細胞質内でウイルスが集合し、通常ほとんど細胞の健康に影響を及ぼさずに細胞膜から発芽する。そして、レトロウイルスゲノムが宿主細胞ゲノムの永続部分になり、レトロウイルス内に置かれるいずれの外来遺伝子も細胞内で無期限に発現されるはずである。その結果、レトロウイルスは細胞内で外来遺伝子を永続的に発現できるので魅力的ベクターである。宿主ゲノムのほとんどすべて或いは可能な限りすべての領域がレトロウイルス組込みに近づきうる(Withers-Wardら, Genes Dev., 8:1473-1487 (1994))。さらに、レトロウイルスは事実上あらゆる種類の哺乳類細胞を感染し、例外的に可変性にすることができる。
【００７０】
レトロウイルスベクター粒子は、本発明の発現カセットをレトロウイルスベクター中に組換え的に挿入し、かつパッケージング細胞系を用いて或いはレトロウイルスタンパク質を発現するレトロウイルスベクターと追加ベクターと共に非-パッケージング細胞系を共-形質移入してレトロウイルスタンパク質でベクターを包むことによって調製される。結果のレトロウイルルベクター粒子は、一般的に宿主細胞内で複製できず、dsRNAをコードする核酸を含有する発現カセットを含むプロウイルス配列として宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。結果として、発現カセットの核酸によってコードされるdsRNAを宿主細胞が産生する。図７に、本発明の発現カセットを導入するために有用なレトロウイルス構成物を示す。図７は、発現カセットの位置決め（対のロングターミナルリピート間）と、この場合ピューロr内の選択可能マーカーの存在を示す。発現カセットは、3'LTR内に配置そてもよい(Barton及びMedzhitov (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14943-14945;Gervaixら (1997) J. Virol. 71: 3048-3053)。
【００７１】
一般的にパッケージング細胞系を用いてレトロウイルスベクター粒子を調製する。パッケージング細胞系は、パッケージングに要求される必要なウイルス構造タンパク質を産生するが、感染性ビリオンを産生できない、遺伝的に構築された哺乳類組織培養細胞系である。他方、レトロウイルスベクターは、該構造遺伝子を欠いているが、パッケージングに必要な核酸配列を有する。パッケージング細胞系を調製するため、パッケージング部位が欠失している、所望レトロウイルスの感染性クローンを構築する。この構成物を含む細胞は、すべての構造タンパク質を発現するが、導入されたDNAを包み込めないだろう。代わりに、適切な核とエンベロープタンパク質をコードする１個以上の発現プラスミドを細胞系中に導入することによって、パッケージング細胞系を生成することができる。これら細胞内では、gag、pol、及びenv遺伝子が同一又は異なるレトロウイルスから誘導しうる。
【００７２】
本発明に好適な多くのパッケージング細胞系は先行技術から入手可能である。これら細胞系の例としては、Crip、GPE86、PA317及びPG13が挙げられる。Millerら, J. Virol., 65:22202224 (1991)(参照によって本明細書に取り込まれる)を参照せよ。他のパッケージング細胞系の例は、Cone and Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81:63496353 (1984)及びDanos and Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 85:64606464 (1988); Eglitisら, Biotechniques, 6:608614 (1988); Millerら, Biotechniques, 7:981990 (1989)（これらも参照によって本明細書に取り込まれる）に記載されている。PA317及びGPXパッケージング細胞系によって産生されるタンパク質のような両栄養性又は異種栄養性エンベロープタンパク質を使用してもレトロウイルスベクターを包むことができる。
【００７３】
欠損レトロウイルスは、哺乳類細胞への遺伝子伝達用によく特徴づけられている（レビューのため、Miller, A.D., Blood, 76:271(1990)参照）。レトロウイルスゲノム中に挿入した本発明の発現カセットをコードする核酸を有する組換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してレトロウイルスを複製欠損にすることができる。この複製欠損レトロウイルスをビリオン中に包み、これを用いて標準的方法でヘルパーウイルスの使用によって標的細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスの生成手順及び該ウイルスで細胞をインビトロ又はインビボ感染させる手順は、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M.ら(eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14及び他の実験室マニュアルに記載されている。
【００７４】
本発明に包含されるレトロウイルスの例としては、技術的に周知なpLJ、pZIP、pWE及びpEMが挙げられる。好適なパッケージング細胞系の例としては、Ψ Crip、Ψ Cre、Ψ 2、及びΨ Amが挙げられる。レトロウイルスを用いて種々の遺伝子が、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多くの異なった細胞型中にインビトロ及び／又はインビボ導入されている（例えば、Eglitisら, Science, 230:1395-1398 (1985); Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464 (1988); Wilsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3014-3018 (1988); Armentanoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6141-6145 (1990); Huberら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8039-8043 (1991); Ferryら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8377-8381 (1991); Chowdhuryら, Science, 254:1802-1805 (1991); van Beusechemら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7640-7644 (1992); Kayら, Human Gene Therapy, 3:641-647 (1992); Daiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10892-10895 (1992); Hwuら, J. Immunol., 150:4:104-115 (1993); 米国特許第4,868,116号; 米国特許第4,980,286号; PCT出願WO 89/07136; PCT出願WO 89/02468; PCT出願WO 89/05345;及びPCT出願WO 92/07573; EPA 0 178 220;米国特許第4,405,712; Gilboa, Biotechniques, 4:504512 (1986); Mannら, Cell, 33:153159 (1983); Cone and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:63496353 (1984); Eglitisら, Biotechniques 6:608614 (1988); Millerら, Biotechniques, 7:981990 (1989); Miller, Nature (1992), 前出; Mulligan, Science, 260:926-932 (1993); 及びGouldら, 及び表題“遺伝子治療で有用なレトロウイルスベクター”の国際特許出願番号WO 92/07943参照）。これら特許文献及び出版物の教示は、参照によって本明細書に取り込まれる。
【００７５】
（ｂ）アデノウイルス
アデノウイルスのゲノムを操作して、それが本発明の発現カセットをコードするが、普通の溶菌性ウイルスライフサイクルで複製するその能力という点で不活性化することができる。例えば、Berknerら, BioTechniques, 6:616 (1988); Rosenfeldら, Science, 252:431-434 (1991); 及びRosenfeldら., Cell, 68:143-155 (1992)を参照せよ。アデノウイルス株Ad型5 d1324又はアデノウイルスの他の株(例えば、Adz、Ad3、Ad7など)から誘導される好適なアデノウイルスベクターは技術的に周知である。組換えアデノウイルスは、細胞を分割して効率的な遺伝子送達媒体にする必要がなく、かつ気道上皮(既に引用したRosenfeldら (1992))、内皮細胞(Lemarchandら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89):6482-6486 (1992))、肝細胞(Herz and Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2812-2816 (1993))及び筋細胞(Quantinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992))を含む種々多様な細胞型を感染させるために使用できるという点で有利である。
【００７６】
（ｃ）アデノ関連ウイルス
アデノ関連ウイルス(AAV)は、効率的な複製と生産ライフサイクルのためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルス又はヘルパーウイルスのような別のウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである。（レビューのため、Muzyczkaら, Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158:97-129 (1992)参照)。アデノ関連ウイルスは、高頻度の安定した組込みを示す(例えば、Flotteら, Am. J Respir. Cell. Mol. Biol., 7:349-356 (1992); Samulskiら, J. Virol., 63:3822-3828 (1989);及びMcLaughlinら, J. Virol, 62:1963-1973 (1989); Flotteら, Gene Ther., 2:29-37 (1995); Zeitlinら, Gene Ther., 2:623-31 (1995); Baudardら, Hum. Gene Ther., 7:1309-22 (1996)参照；これらは参照によって本明細書に取り込まれる)。300塩基対程度のAAVを含有するベクターを包んで組み込むことができる。外因性核酸用の空間は、本発明の発現カセットの全体的な大きさを優に超える約4.5kbに制限される。Tratschinら, Mol. Cell. Biol.,5:3251-3260 (1985)に記載されているようなAAVベクターを用いて細胞中に発現ベクターを導入できる。AAVベクターを用いて種々の核酸が異なる細胞型中に導入されている(例えば、Hermonatら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470 (1984); Tratschinら, Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081 (1985); Wondisfordら, Mol. Endocrinol., 2:32-39 (1988); Tratschinら, J. Virol., 51:611-619 (1984);及びFlotteら, J. Biol. Chem., 268:3781-3790 (1993)参照)。
【００７７】
一旦細胞を選択し、問題のdsRNAコード配列を含むことが分かれば、宿主細胞ゲノムから完全なdsRNA発現カセットを容易に“救出(rescued)”して、AAVウイルスタンパク質と野生型アデノウイルスを導入して増幅することができる(Hermonat. and Muzyczka, PNAS. USA, 81:64666470 (1984); Tratschinら, Mol. Cell. Biol., 5:32513260 (1985); Samulskiら, PNAS USA, 79:20772081 (1982); Tratschinら, Mol. Cell. Biol., 5:32513260 (1985))。これは、選択したdsRNA'sの単離、精製及び同定を他の分子生物学法よりもかなり容易にする。
【００７８】
（ｄ）レンチウイルス
本発明の発現カセットをレンチウイルスベクター中に組み込んでもよい。この関係では、Qinら(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 183-188; Miyoshiら(1998) J. Virol. 72: 8150-8157; Tisconiaら(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1844-1848;及び Pfeiferら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 2140-2145を参照せよ。レンチウイルスベクターキットは、Cell Genesys, Inc.の特許ライセンスに基づいてIncInvitrogen(Carlsbad, CA)から入手可能である。
【００７９】
VIII．選択可能マーカー遺伝子
本発明の核酸構成物をうまく組み込んだ細胞を同定する方法を有することは、繁く望ましい。これは、好ましくは形質転換プロセスで用いるベクター中に選択可能マーカー遺伝子を含めることで達成する。このような選択可能マーカーの例は、図２に示されるようなピューロr遺伝子である。選択可能マーカーは、形質転換するDNA上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について、操作した物質を選択又はスクリーニングすることによって、形質転換した細胞、組織又は動物を同定かつ単離することを可能にする。例えば、操作した細胞を、形質転換マーカー遺伝子構成物が抵抗性を与える抗生物質を阻害量含有する培地上で増殖することによって選択を果たすことができる。さらに、本発明の組換え核酸構成物上に存在しうるいずれかの可視マーカー遺伝子（例えば、β-グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｂ又はC1遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって、形質転換した細胞を同定することもできる。このような選択及びスクリーニング方法論は技術的に周知である。
【００８０】
物理的及び生化学的方法を用いても本発明の遺伝子構成物を含有する細胞形質転換体を同定することができる。この方法としては、限定するものではないが、以下の方法が挙げられる：１）組換えDNA挿入断片の構造を検出かつ決定するためのサザン分析又はPCR増幅；２）遺伝子構成物のRNA転写物を検出かつ調査するためのノーザンブロット、S-1 RNアーゼタンパク質、プライマー-伸長又は逆転写酵素-PCR増幅；３）該遺伝子産物が遺伝子構成物によってコードされている酵素活性を検出するための酵素検定法；４）遺伝子構成産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット法、免役沈降法、又はエンザイム-リンクドイムノアッセイ；５）導入した遺伝子構成物の発現の結果として産生される化合物の生化学的測定。インサイツハイブリダイゼーション、蛍光活性化細胞選別(FACS)、酵素染色、及び免疫染色のようなさらなる方法を使用しても特異的な細胞、生物及び組織内の組換え構成物の存在又は発現を検出することができる。すべてのこれら検定を行う方法は技術的に周知である。
【００８１】
限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, Cell, 11:223 (1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026 (1962))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, Cell, 22:817 (1980))遺伝子を含む多くのさらなる選択系をそれぞれtk-、hgprt-又はaprt-細胞内で使用することもできる。また、メトトレキセートに対する抵抗性を与えるdhfr(Wiglerら, Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567 (1980); O'Hareら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981));ミコフェノール酸に対する抵抗性を与えるgpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981));アミノグルコシドG-418に対する抵抗性を与えるneo(Colberre-Garapinら, J. Mol. Biol., 150:1 (1981));及びハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるhygro(Santerreら, Gene, 30:147 (1984))の選択の基礎として代謝拮抗物質抵抗性を使用することができる。最近、さらなる選択可能遺伝子について、すなわち細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させるtrpB；細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるhisD(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047 (1988));及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン、DFMO(McConlogue L., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)に対する抵抗性を与えるODC (オルニチンデカルボキシラーゼ)について記述されている。
【００８２】
IX．宿主細胞
本発明の発現カセットを用い、限定するものではないが、発現カセット配列の増幅、Inverse Genomics(登録商標)研究及び遺伝子治療を含む種々の目的のため、いずれの真核生物又は原核生物細胞も形質転換させることができる。好ましい細胞型としては、骨髄幹細胞及び造血細胞が挙げられる。これら細胞型は、比較的容易にヒトから除去かつ置換され、伝達された発現カセット増殖用の細胞の自己再生集団と、コードされたdsRNAの、細胞代謝に及ぼす効果に関する研究を提供する。このような細胞は、発現カセットをコードするレトロウイルスベースベクターによってインビトロ又はインビボ形質移入／形質導入することができる。本発明の発現カセットを含有するベクター用標的として役立ちうる真核生物細胞型としては、器官及び生物全体の一次細胞培養、細胞系、酵母菌、及び細胞集団が挙げられる。
【００８３】
本発明は、dsRNAが発現される生物のタイプ又は細胞型に限定されない。DNA配列の機能を決定することが求められているいずれの生物も本発明の範囲内であると考えられる。このような生物としては、限定するものではないが、動物（例えば、脊椎動物、無脊椎動物毒）、植物（例えば、単子葉植物、双子葉植物、維管束、無維管束、種子のない、種子植物）、原生生物（例えば、藻類、シトリエート(citliates)、珪藻類）、及び真菌（多細胞型及び単細胞型酵母菌を含む）が挙げられる。
さらに、発現ベクターを導入しうるいずれの細胞型もこの発明の範囲内に明白に包含される。このような細胞は、胚細胞（例えば、卵母細胞、精細胞、胚幹細胞、2-細胞胚嚢、プロトコルム(protocorm)様体細胞、脳梁細胞）、成人細胞（例えば、脳細胞、果実細胞）、未分化細胞（例えば、胎児細胞、腫瘍細胞）、分化細胞（例えば、皮膚細胞、肝細胞）、分割細胞、老化細胞、培養細胞などによって例示される。
いずれかの適切な手段を用いて宿主細胞を本開示ベクターによって形質転換させ、かつプロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、又は発現を検出するのに適するように変性した通常の栄養培地内で培養することができる。温度やｐＨのような宿主細胞に好適な培養条件は周知である。好ましくは、細胞の形質移入に用いるプラスミドの濃度を滴定して、個々の細胞中に導入される異なる影響因子siRNA分子をコードするベクターの数を限定する。
【００８４】
本開示方法で使う好ましい真核生物宿主細胞としては、限定するものではないが、SV40で形質転換されたサル腎臓CVI系(COS-7, ATCC CRL 1651)；ヒト胚性腎細胞(293, Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 新生児ハムスター腎細胞(BHK, ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣-細胞-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216 (1980));マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サル腎細胞(CVI ATCC CCL 70);アフリカングリーンサル腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頚癌細胞(HeLa, ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34);バファローラット肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(hep G2, HB 8065);マウス乳癌(MMT 060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Matherら, Annals N. Y. Acad. Sci, 383:44-68 (1982));ヒトＢ細胞(Daudi, ATCC CCL 213);ヒトＴ細胞(MOLT-4, ATCC CRL 1582);及びヒトマクロファージ細胞(U-937, ATCC CRL 1593)が挙げられる。これら細胞は、技術的に周知の標準的な方法で維持することができる(例えば、Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, (3d ed.) WileyLiss, New York (1994); Kuchlerら, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology (1977), Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.及びその中で引用される参考文献を参照せよ)。培養した細胞系は、細胞の単層形態であることが多いが、細胞懸濁液も使用される。
好ましい実施形態では、１個以上のリポーター遺伝子を用い、形質移入又は形質導入が成功している当該細胞を同定する。dsRNAを発現させる発現カセットによって、同一又は異なるリポーター遺伝子を発現させて、実際のdsRNA発現の同定を与えることができる。
【００８５】
Ｘ．形質移入法
本発明の特定の局面内では、媒体を利用し、或いは種々の物理的方法によって細胞中に発現カセットを導入することができる。該方法の代表例としては、リン酸カルシウム沈降(Dubenskyら, PNAS, 81:7529-7533 (1984))、無傷標的細胞中への該核酸の直接微量注入 (Acsadiら, Nature, 352:815-818 (1991))、及び導電性溶液内に懸濁している細胞を強電磁場にさらして一時的に膜に極性を与えて核酸分子の流入を可能にするエレクトロポレーションを用いる形質転換が挙げられる。他の手順としては、不活性アデノウイルスに連結した核酸分子(Cottonら, PNAS, 89:6094 (1990))、リポフェクション(Felgnerら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417 (1989))、微粒子銃(Williamsら, PNAS, 88:2726-2730 (1991))、ポリリジンのようなポリカチオン化合物、受容体特異性リガンド、該核酸分子を取り込むリポソーム、及び該核酸分子を含有する大腸菌を外側の細胞壁から外し、ポリエチレングリコールを用いて動物細胞に融合させるスフェロプラスト融合の使用が挙げられる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドの直接細胞摂取（それがDNA又はRNAで構成され、或いはその両者で構成されるかいずれにしても）自体は、現在のところあまり好ましくない方法とみなされている。siRNA及びアンチセンス分子の場合、オリゴヌクレオチドの直接投与はRNアーゼのような細胞ヌクレアーゼによる攻撃と消化という問題を随伴するからである。本発明の発現カセットの投与の好ましい態様は、既知ベクター（上述したような）を利用して発現カセットが所望の標的細胞によって発現されるように発現カセットの送達を促す。
宿主細胞が植物細胞の場合、発現ベクターは、粒子媒介遺伝子伝達によって導入することができる(米国特許第5,584,807号)。代わりに、本発明の発現カセットを含有する発現ベクターで予め形質転換した、限定するものではないが、アグロバクテリウム株を含む細菌で植物細胞を感染させることによって、植物細胞のゲノム中に発現カセットを挿入することができる(米国特許第4,940,838号)。
【００８７】
XI．siRNA遺伝子ライブラリー
本発明の主な用途の１つは、Inverse Genomics(登録商標)分析の目的でランダム化siRNAsを発現させるために使用しうる発現カセットのライブラリーの構築である。このようなライブラリーは、そのsiRNAによるサイレンシングが、siRNA遺伝子ライブラリーが発現される細胞系の表現型の特徴の検出できる変化を生じさせる未知の細胞遺伝子を同定する高効率的な方法を提供する。
概括的に述べると、この方法はランダム化siRNAs発現ライブラリーによって細胞の集団を形質移入又は形質導入する工程を含む。次いで、細胞集団の１つ以上の生物学的活性をモニターする。モニターした活性の変化を示す細胞を単離し、かつ問題の作動可能なsiRNAを含有する発現カセットを選択する。これらカセットのsiRNAは、その後のスクリーニングラウンドのため拡大することができる。最初のラウンド及び／又は次のスクリーニングラウンドから選択したsiRNAsの配列を決定し、このデータを、モニターした特徴の変化と関連する標的核酸を探査するために核酸データベースを検索し、及び／又はプローブを製造するために使用し、或いは他の用途で使う。
【００８８】
本発明のsiRNA遺伝子ライブラリーの構築は、上述したようなsiRNAの“センス”鎖をコードする異なるコード領域をそれぞれ含む自己-プライミングオリゴヌクレオチドの合成を必要とする。コード配列は既知又はランダムでよい。配列がランダムの場合、単一のバッチ合成から、（理論的に）ランダム化配列長で可能なすべての塩基順序を含むランダム化配列のファミリーが得られる。一般に、これは４Nの異なるライブラリーメンバーが生成されることを意味し、ここで、Ｎ＝各ランダム化配列内のヌクレオチド数である。ライブラリーのメンバーを増幅用の細菌ベクター中にクローン化し、又は技術的に周知の方法でPCR増幅することができる。Sambrookら, Molecular Cloning  A Laboratory Manual (2nd ed.) Vols. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook) (1989); 及びF.M. Ausubelら, (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. (1994)とJohn Wiley & Sons, Inc.の間のジョイントベンチャー(1994 Supplement) (Ausubel)。
【００８９】
そして、上述したように、ランダム化核酸配列を含有する各自己-プライミングオリゴヌクレオチドを本発明の方法で処理し、伸長及び変性後、発現カセット中に連結すると、細胞内で転写される。
本発明の他の実施形態では、既知配列のsiRNA遺伝子ライブラリーを生成する。このようなsiRNAライブラリーを生成するため、上記方法と類似の方法を利用し、既知siRNAsをコードする核酸配列を用い、これらをカセット内に挿入する。
【００９０】
siRNAライブラリーの検証
本発明のsiRNA遺伝子ライブラリーは、定性的及び定量的の両方で検証することができる。定性的検証は、ある反応で完全発現ライブラリーをインビトロ転写してからその細胞及びウイルスの両起源の種々の異なる既知遺伝子の発現を阻害する能力を評価することを含む。さらに、発現ライブラリーをDNAシークエンシングに供すると、正確に調製されたライブラリーは、各ランダム化位置のすべての４つのシークエンシングレーンにわたって均等なバンド強度をもたらす。
定量分析は、各分子内の各塩基位置の信頼区間を構築するための個々dsRNAs（拡張ライブラリーから選んで配列した）の統計分析を含み、そして各個のdsRNAコード配列を手動で配列決定することなく、ライブラリーの複雑性を評価することができる。両側の近接した２項信頼区間の式は、Ｅ＝1.96＊平方根(Ｐ＊(１−Ｐ)/Ｎ)であり、式中、Ｐは所定位置の各ヌクレオチドの予測比率であり（DNA塩基では25％に等しい、つまりＰ＝0.25）、ＥはＰ付近の所望信頼区間であり（すなわちＰ±Ｅ）、かつＮは必要な試料サイズである(Callahan Associates Inc., La Jolla, CA)。例えば、５％（Ｅ＝0.05）以内の各塩基の比率を知りたい場合、必要な試料サイズは289である。
【００９１】
１つ以上の表現型の特徴の変化の検出
説明したように、siRNA遺伝子ライブラリーを挿入断片の細胞系中に導入し、この細胞系をモニターして１つ以上の検出可能な表現型の特徴の差異又は変化を検出することができる。特定の性質（活性）及びそれを測定する方法は、調査中の遺伝子の種類で変わる。例えば、本発明の方法を用いて、選択した定義済み化学物質に対する感受性と抵抗性を媒介する遺伝子（例として、薬物毒性遺伝子；発癌性化学薬品に対する抵抗性又は感受性をコードする遺伝子；及び特異的なウイルスや細菌病原による感染に対する抵抗性又は感受性をコードする遺伝子が挙げられる）を検出することができる。本発明の方法を用いて、ホルモン受容体、ウイルス受容体、及び細胞表面マーカーのようなリガンドへの結合を媒介する未知遺伝子を検出することもできる。本発明の方法を用いて未知の腫瘍サプレッサー、形質転換体、及び分化遺伝子を検出することもできる。
【００９２】
表現型の変化は形態学的、生化学的、又は挙動性でよい。形態学的変化は、典型的に、形質移入した生物の肉眼解剖学の変化で明らかになる。生化学的変化は、例えば、既知酵素の活性、特定物質の蓄積又は利用の割合、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのタンパク質パターン等によって決定することができる。siRNA発現に応じたこのような変化は、その転写物がsiRNAの標的である遺伝子は、その活性が変わっている酵素と同一経路内、或いはこれら経路に基質を供給し、又はそれによって生成した産物を利用する関連経路内で作用することを示唆する。
【００９３】
分子生物学的変化は、例えば、ディファレンシャルディスプレイ逆転写-PCR（DDRT-PCR）によって決定することができる。該変化は、その発現がsiRNAによって阻害される遺伝子は、転写因子のような転写調節分子をコードすることを示唆する。
DDRT-PCR法は、Mullisら, 米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,965,188号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応に基づく。簡単には、PCRプロセスは、所望の標的配列を含有するDNA混合物にモル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入することから成る。この２つのプライマーは二本鎖配列のそれぞれの鎖に相補性である。混合物を変性させてハイブリダイズを可能にする。ハイブリダイゼーション後、プライマーを熱安定性DNAポリメラーゼで伸長して相補鎖を形成する。相対的に高濃度の所望標的配列のセグメントを得るのに必要なだけ、変性、ハイブリダイゼーション、及びポリメラーゼ伸長の工程を繰り返すことができる。
【００９４】
DDRT-PCRを使用する場合、標的はmRNAであるが、PCRプロセス前にオリゴ(dT)プライマーの存在下でmRNAを逆転写酵素で処理してcDNAを生じさせる。PCRはcDNA合成で用いるオリゴ(dT)プライマーとランダムプライマーを併用して行う。理論では、mRNAだけが（間接的に）増幅されるので、発現した遺伝子だけが増幅される。２つの試料を比較する場合、増幅産物をゲルの並列レーン内に置き；電気泳動後、産物を比較し、或いは“差次的に表示”することができる。
改良されたDDRT-PCR法は技術的に記載されており、例えば、E. Haagら, "Effects of Primer Choice and Source of Taq DNA Polymerase on the Banding Patterns of Differential Display RT-PCR," Biotechniques, 17:226-228 (1994)に記載されている改良が挙げられる。別の例は、O.C. Ikonomovら, "Differential Display Protocol With Selected Primers That Preferentially Isolate mRNAs of Moderate to Low Abundance in a Microscopic System," Biotechniques, 20:1030-1042 (1996)に記載されている改良が挙げられる。
【００９５】
さらに別の代替法は、生物内の挙動変化の決定である。生物が単細胞、例えば、酵母菌の場合、このような変化としては光向性、化学薬品向性などが挙げられ、その発現がsiRNAの存在によって減少する遺伝子はこれら事象を調節することを示唆する。多細胞生物内で挙動変化、例えば、空間メモリの損失、攻撃性等を観察する場合、このような変化は、神経経路内でその転写物がsiRNA機能によって標的される遺伝子が該挙動の制御に関与したことを示す。
【００９６】
上述したように、調査中の特定の表現型の特徴は、利用する検定法のタイプを決める。例えば、受容体（例えば、血小板誘導成長因子受容体のようなホルモン又は薬物受容体）をコードする核酸に及ぼすsiRNAsの効果は、結合特性、分化、又は成長の差異について測定する。転写調節因子への効果は、影響された遺伝子の転写レベルに関するsiRNAsの効果について測定する。キナーゼへの効果は、リン酸化のレベルとパターンの変化として測定する。腫瘍サプレッサー及び発癌遺伝子への効果は、形質転換、腫瘍化、形態学、侵襲性、接着性及び／又は成長パターンの変化として測定する。変化を受けやすい遺伝子機能のタイプと表現型のリストは、ウイルス感受性−HIV感染；自己免疫性−リンパ球の不活性化；薬物感受性−薬物の毒性と効力；移植片拒絶−MHC抗原提示などに基づく。実施例４では本発明の方法を用いる遺伝子機能の研究における生物学的特徴のモニタリングについて説明する。
【００９７】
細胞分化に及ぼすsiRNAsの効果は、細胞成長／増殖の変化、表面タンパク質（FACSで選別）の変化、付着／差次的トリプシン化の損失又は増加、細胞サイズの変化（FACSで選別）等によって検定することができる。従って、例えば、その分化がsiRNAsによって阻害されるPC12細胞は分裂終了細胞にならず、分割を停止する。
細胞死も有用な指標である。例えば、薬物抵抗性（例えば、多薬物抵抗性癌細胞）である細胞をsiRNA発現ライブラリーで形質移入又は形質導入し、細胞毒性薬物（例えば、シスプラチン、ビンクリスチン、メトトレキセート、ドキソルビシン等のような癌治療薬）の存在下で細胞死について検定する。
標的収集研究でスクリーニングできる種々の特徴は事実上無限にあるので、モニターしうる特徴の前記リストは説明用であり、かつ排他的であることを意図しない。
【００９８】
遺伝子同定分析における対照の使用
siRNA発現ライブラリーのメンバーによる形質移入又は形質導入が特定の性質／生物学的活性の変化をもたらす場合、該変化は、通常“無変化”の負の対照と、任意に、故意に変化させた“正の”対照と比較して測定する。このような対照の使用は、当業者に周知である。典型的には、負の対照は、siRNA発現ライブラリーで形質移入又は形質導入していない本質的に同一の細胞、組織、器官、又は動物モデルによって与えられる。対照と分析系との間の測定可能な差異、好ましくは統計的に有意な差異は、siRNAが効果を有することを示す。
しかし、選択系内では、選択が選択自体の対照であることは明白である。従って、例えば腫瘍化細胞が生存し、かつ正常細胞が死ぬか（例えば、軟寒天上で）、又は薬物抵抗性細胞が生存しながら薬物感受性細胞が死ぬ場合、生存という単純な事実が表現型の特徴の有意な変化を示しうる。
【００９９】
表現型の変化を示す細胞の単離とsiRNA遺伝子の回収
siRNAによる形質移入／形質導入に起因する、モニターした活性の変化を示す細胞は、当業者に周知の標準的方法で単離することができる。インビトロ培養内の細胞は、例えば、形質転換した適切な細胞を新しい培養基中に単に斑点をつけることによって、簡単に物理的に単離かつ増幅することができ、或いは可視的に検出できるマーカーがある場合、それらを可視的に単離でき、或いは例えば細胞選別（FACS）によって機械的に単離することができる。細胞が組織、器官、又は生物内に存在する場合、該細胞を犠牲にした後、必要ならば、懸濁液内のフリーな細胞を得るために組織又は器官の均質化後、これら手段のいずれかで細胞を単離することができる。
【０１００】
当業者に周知な標準的方法によってsiRNA遺伝子ライブラリーを回収できる。細菌宿主からのプラスミド（又は他の構成物）の回収方法は、上記Sambrookら(1989)及び上記Ausubel ら,(ed.)(1987)に記載されている。
所望の表現型を表示する細胞の単離と選択後、応答性siRNA発現カセット（又はその一部）を選択細胞から“救出”することができる。救出したsiRNA発現カセットを、siRNA-依存性表現型を検証するめの新鮮な細胞への再適用と、標的遺伝子を同定するためのsiRNA発現カセットの直接シークエンシングの両方で使用する。
１つのアプローチでは、ゲノムDNAのPCR又はウイルスゲノム（例えば、AAV又はレトロウイルス）の救出のどちらかでsiRNA遺伝子を組織培養細胞から救出できる。PCRで救出するため、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を含有する溶解緩衝液内に細胞を溶かす。プロテアーゼを不活性化する（例えば、95℃で５分間のインキュベーションによって）。次いで、siRNA遺伝子をPCRで単離できる。PCRプライマーの選択は開始ライブラリーベクターによって決まり、siRNA配列を含有する1000bpまでに増幅するように設計することができる。増幅したsiRNA遺伝子断片をゲル精製する（アガロース又はPAGE）。
【０１０１】
このPCR産物は直接シークエンシング（fmole Sequencing Kit, Promega）で使用でき、或いは適切な制限酵素で消化し、クローニング又は本発明の発現ベクターに再クローン化することができる。このPCR救出操作を用いてクロナール細胞集団から単siRNA遺伝子を単離できるのみならず、この操作を用いて表現型的に選択した細胞集団内に存在するsiRNA遺伝子のプールを救出できる。siRNA遺伝子を再クローン化した後、結果のプラスミドは、標的細胞形質移入及びウイルスベクターの生産に直接使用できる。
siRNA遺伝子救出の代替法は、必要なすべてのウイルスヘルパー機能を与えることによる、選択した細胞からのウイルスゲノムの“救出”を含む。レトロウイルスベクターの場合、選択した細胞を、レトロウイルスgag、pol及び両栄養性（又はVSV-G）エンベロープタンパク質を発現するプラスミドで一時的に形質移入する。数日の期間にわたり、siRNA遺伝子を含有する安定して発現されるLTR転写物を新しいレトロウイルス粒子中に包み込んでから培養上清中に放出する。この形質導入された細胞を野生型の複製-コンピテントレトロウイルスで形質移入することによって、ウイルスゲノムを“救出”することもできる。AAVの場合、選択した細胞を、AAV rep及びcapタンパク質を発現するプラスミドで形質移入し、かつ野生型アデノウイルスで共-感染させる。ここで、安定的に組み込んだAAVゲノムを切除し、新しいAAV粒子中に再び包む。収集の時、凍結／解凍サイクルを３回行って細胞を溶解させ、粗製ライセート中の野生型アデノウイルスを55℃で２時間加熱不活性化する。結果のウイルス含有媒体（レトロウイルス又はAAV救出のどちらか由来）を用いて直接、表現型の伝達を検証するため、及びそれらを表現型の選択の追加ラウンドに供するため、必要ならばさらに表現型のsiRNA遺伝子をリッチにするための両方のために新鮮な標的細胞を形質導入する。上述したPCR法と同様に、siRNA遺伝子のウイルス救出は、非-クロナール集団からの単一のsiRNA遺伝子又はsiRNA遺伝子の“プール”の救出を斟酌する。
上述したように、救出したsiRNA遺伝子は、siRNA-依存性表現型の検証のための新鮮な細胞への再適用と、表現型の変化と関連する標的遺伝子の同定を可能にするためのsiRNA遺伝子の直接シークエンシングの両方で使用する。さらに、非-クロナール集団からのsiRNA遺伝子の“プール”の救出は、その後の選択ラウンドで使用できる濃厚(enriced)siRNA発現ライブラリーを与える。
【０１０２】
siRNAでサイレンス化された遺伝子の同定
一旦siRNA遺伝子を単離すると、それを配列決定し、その配列を用いてsiRNAで標的される核酸の配列データベースを検索することができる。ヌクレオチド配列同一性を比較するのに好適な多くのアルゴリズムを当業者は利用できる。例えば、好ましいアルゴリズムとしては、それぞれAltschulら, Nuc. Acids Res., 25:3389-3402 (1977)及びAltschulら, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)に記載されているBLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムが挙げられる。BLAST分析を行うソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(そのウェブサイトncbi.nlm.nih.govで)を通じて公に入手可能である。BLASTプログラムの代替は、GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wis.)PILEUPプログラムである。PILEUPは、関係と配列同一性の割合を示すための漸進的なペアワイズアラインメントを用いて１群の関連配列から複数の配列アラインメントを生成する。また、アラインメントを生成するために使用するクラスター化関係を示す系図又は樹状図にプロットする。PILEUPは、Feng及びDoolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360(1987)の漸進的アラインメント法の簡単にしたものを利用する。
【０１０３】
データベース検索がsiRNA標的の同定に失敗しないように、siRNA配列を用いて標的mRNAs及び遺伝子を同定かつ単離するためのプローブ及びプライマーを構築することができる。例えば、siRNA配列を用いて、標的分子のmRNAs、cDNAs及びゲノム配列を検出するための放射標識化プローブを構築することができる。内因性核酸の試料は、例えば、技術的に公知の種々の方法で部分的に精製することができ、かつsiRNA配列を有するプローブにハイブリダイズできる当該フラクションとして同定された標的核酸を含有するフラクションでよい。
siRNAヌクレオチド配列を用いてsiRNAsの標的核酸を単離する典型的な方法を実施してプライマーを構築し、それをポリメラーゼ連鎖反応、又は他のインビトロ増幅法で使用する(米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)参照)。PCR反応で増幅したヌクレオチドは、アガロースゲルから精製し、適切なベクター中にクローン化することができる。
【０１０４】
特に有用なPCR法としては、5'及び／又は3'PAGE法が挙げられ、両方法とも適切なcDNAライブラリーから全長cDNA配列を生成できる(Frohmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002 (1988))。この戦略は、標的ヌクレオチドのPCR増幅のため、siRNA配列に基づいた特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。配列特異的プライマーを用いる3'及び5'RACE法を含むPCR増幅を行うためのキットは、商業的に入手可能である(PanVera, Discovery Center, Madison, WI, 3'及び 5'Full RACE Core Sets, Prod #s TAK 6121及び6122; Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, CAT. NO. 18373019, CAT. NO. 10630010)。
【０１０５】
XII．本発明の治療用途
上記用途に加え、本発明の発現カセット及びベクター構成物を治療薬、研究試薬として、また遺伝子治療用途で使用することができる。
治療用途では、この発明のsiRNAを生成する発現ベクターを投与することによって、遺伝子に基づく病気を有する疑いのある動物を治療する。当業者は容易に最適な投与量、投与方法及び繰返し数を決定することができる。このような治療は、一般的に病状の治癒又は減少が果たされるまで続ける。病気によっては長期治療もありうる。HIVを含むウイルス疾患の治療は、本発明の発現カセットの特に好ましい治療用途である。
生体細胞形質導入は、HIV感染によって引き起こされるAIDSのような慢性感染症、及び癌のような非-感染疾患と戦う方法を提供する。Yuら,Gene Therapy, 1:13-26 (1994)及びその中の参考文献は、HIV感染症の遺伝子治療戦略に対する一般的な指標を提供する。また、Sodroskiら, PCT/US91/04335も参照せよ。Wong-Staalら, WO/94/26877は、レトロウイルス遺伝子治療ベクターについて述べている。
【０１０６】
本発明のsiRNAを生成する発現カセットを含有する好適なベクター、及びいくつかの用途では、本発明に従って生成された裸のsiRNAsを、直接薬学的に許容しうる担体と併用して患者を治療するのに適した医薬組成物を製造することができる。
直接送達は、通常、細胞膜と抗体又は他の小リガンドのような他の分子の交差を容易にしてターゲティングを最大にするため脂質複合体（リボソーム）の助けを借りて発現カセット又は裸のsiRNAsを標的細胞中に挿入することを含む。多くの場合、分解に対するRNAの感受性のため、上述したように、直接送達されるsiRNA分子を化学的に修飾して、それらをヌクレアーゼ-抵抗性にすることができる。この送達方法論は、治療投与量のより正確なモニタリングを可能にする。
【０１０７】
ベクター媒介送達は、本明細書で述べるようなベクターの発現カセット内で運ばれる配列中にコードされている大量のsiRNAを生成する、修飾ウイルスベクター又はプラスミドのような自己-複製又は非-複製系による標的細胞の感染を含む。細胞のターゲティング及び侵入のメカニズムは該ウイルスによって与えられ、或いはプラスミドを用いる場合は、siRNA分子の直接送達について述べた方法と同様の方法を使用できる。ベクター媒介送達は、持続的量のsiRNAを生成する。それは、実質的に安価であり、かつsiRNA分子の静脈内注射のような直接送達より少ない頻度の投与しか必要でない。
感染の急性の臨界的状態の間、直接送達法を使用することができる。好ましくは、静脈内又は皮下注射でsiRNA分子を直接送達する。オリゴヌクレオチドが意図した標的部位に達する前にオリゴヌクレオチドが分解するのを最小にする形態で有効量のオリゴヌクレオチドを送達することが必須である。
【０１０８】
最も好ましくは、医薬担体は、特異的にsiRNAを患部細胞に送達する。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは肝細胞に作用するので、好ましい医薬担体は抗-肝炎siRNA分子を肝細胞に送達する。
本発明のsiRNAsを生成する発現カセットは、遺伝子治療ベクターの成分として有用である。例えば、HIVエンベロープ中に包まれたレトロウイルスベクターは、主に、マクロファージのような非-分割DC4+細胞を含むDC4+細胞を感染させる（すなわち、HIVエンベロープ糖タンパク質とCD4“受容体”との間の相互作用によって）。
【０１０９】
XIII．キット
さらに別の実施形態では、この発明はこの発明の方法の実施用キットを提供する。キットは、好ましくは、この発明のsiRNA遺伝子ライブラリー及び／又はsiRNA遺伝子ベクターライブラリーを含有する１個以上の容器を含む。キットは、任意に、緩衝液、培養基、ベクター、ベクター、シークエンシング試薬、標識、マーカー選択用抗体などを含みうる。
キットは、さらにこの発明の検定法の実施のための指導（すなわち、手順）を含む使用説明書を含みうる。使用説明書は、限定するものではないが、通常書かれた又は印刷された資料を含む。このような使用説明書を記憶かつそれらを末端使用者に伝達可能ないずれの媒体もこの発明で考慮される。このような媒体としては、限定するものではないが、電子的記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）等が挙げられる。このような媒体は、このような使用説明書を提供するインターネットサイトへのアドレスを包含しうる。
この明細書で引用したすべての出版物及び特許出願は、各個々の出版物又は特許出願が具体的かつ個々に参照によって取り込まれると指示されたように、参照によって本明細書に取り込まれる。
前記発明について説明のため及び明白性と理解のための例としていくつか詳細に述べたが、この発明の教示に照らし、本技術の当業者は添付の請求項の精神及び範囲から逸脱することなく、さらに特定の変化及び変更を為しうることが容易に分かるだろう。
上で提供した開示から明らかなように、本発明は種々多様な用途を有する。従って、以下の実施例は、説明目的のためであり、いかなる場合にも本発明の限定と解釈することを意図しない。本技術の当業者には、変更又は修正して本質的に同一の結果をもたらしうる種々の非-臨界的パラメーターが容易に分かるだろう。
【０１１０】
（実施例）
実施例１：ランダム化siRNA遺伝子ベクターライブラリーの構築
この実施例は、ランダム化siRNA遺伝子ベクターライブラリーの構築方法を示す。ここで、該ライブラリーの発現は単一のU6 snRNAプロモーターの制御下である。
この方法の第１工程では、PCR増幅用鋳型としてヒトゲノムDNA又はクローン化野生型U6プロモーターDNAのどちらかを用いて、突然変異したU6 snRNAプロモーター断片を創造することである。このプロモーターを創造するため、U6プロモーターの5'末端の外側にHind III部位(上流の-265)を含むように修飾した上流プライマーと、U6プロモーターの3'末端にSph I制限部位を含むように修飾した下流プライマーを用いてPCR断片を生成する。これら修飾が“TATAボックス”の下流でプロモーター内の突然変異を引き起こす。
Hind III U6-265：5'-TGCTAAGCTTAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3'(配列番号:１)
S-U6-20: 5'-ATCGGCATGCAGATATATAAAGCCAA-3'(配列番号:２)
増幅と精製後、突然変異したU6 snRNAプロモーターを含むPCR断片をSph IとHind IIIで消化させる。消化した断片を、Hind III及びSph I消化及びゲル単離によってHind III-Sph I断片を除去したベクター（例えば、図７に示されるベクター）中に挿入する。最終産物は、Sph I及びMlu I部位を含有する発現ベクター（pLPR-U6）であり、後述するようにこれを用いてクローン化し、siRNA遺伝子ライブラリーを発現させる。
自己-プライミングオリゴヌクレオチドのライブラリーを化学的に合成し、各化学合成したオリゴは以下の塩基構造を有する。
siRNA-LIBh：
5'-pCGACCACTCTAAAAANNNNNNNNNNNNNNNNNNGCGTTCGCGC-3'(配列番号:３)
各オリゴは以下の塩基特徴を有する。
１）リン酸化した5'-末端；
２）オリゴUniv-1hにアニーリング後、引き続くクローニング工程でSph I生成付着末端として作用する5'末端のＣ、
３）天然プロモーターの最後の５個のヌクレオチドを置換する、５個のＡの配列(AAAAA)、pol IIIプロモーターIII型終止シグナル(TTTTT)の補体、
４）ヘアピンsiRNA用“センス”コード配列を含む、18個のヌクレオチドのランダム化配列(いずれかの位置に４個のヌクレオチド(dT、dA、dG、dC)のいずれか)、
５）ヘアピンsiRNA遺伝子の“アンチセンス”鎖の合成用リンカー及びプライマーの両者として機能するGCGTTCGCGCの配列。
【０１１１】
そして、合成したオリゴライブラリー(siRNA-LIBH)を1xKlenow緩衝液(Invitrogen, Carlsbad, CA)に再懸濁させ、70度に加熱し、徐々に室温に戻してルーピングによって自己-プライミングさせる。反応にクレノウ大断片DNAポリメラーゼ(Invitrogen)及び4xdNTPsを添加してヘアピン構造の相補鎖を合成する。結果のヘアピンオリゴ産物(siRNA-LIBヘアピン)をエタノール沈降法で精製する。
以下のように、２つのさらなるユニバーサルオリゴヌクレオチドも合成する。
Univ-1h (Sph I): 5'-TTTTTAGAGTGGTCGCATG-3'(配列番号:４)
Univ-2h (Bam HI): 5'-pGATCCGACCTCTCTAAAAA-3'(5'末端がリン酸化されている；配列番号:５)。
【０１１２】
次に、ランダム化siRNA遺伝子ライブラリー(siRNA-LIBh)の各メンバーをUniv-1とUniv-2にアニールし、クローニングベクターに連結する(pLPR-U6-スタッファー)。オリゴヌクレオチドとベクターDNAsのモル比は、Univ-1:Univ-2:siRNA-LIB:pLPR＝100:100:5:1である。この連結産物を、ライブラリーの複雑性を最大にするように最適化した形質転換条件で、エレクトロ-コンピテント細菌(DH12S)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中に形質転換する。連結産物中の一本鎖ギャップを細菌でインビボ充填する。（代わりに、クレノウDNAポリメラーゼ(Promega, Madison, WI, USA)と４個のdNTPsを用いて連結産物中の一本鎖ギャップを充填してもよい。）形質転換した細菌をLB寒天プレート上に１×105／150mmプレート未満の密度で塗布し、終夜培養する。終夜培養した細胞を収集し、ライブラリー細菌原料として用いる。最適には、5×107を超える全クローンが生成される。
【０１１３】
実施例２：特異的siRNAの発現による遺伝子発現の下方制御
この実施例は、siRNAで標的される遺伝子の下方制御をもたらすように特異的siRNAを発現させるための実施例１のベクターの使用を示す。具体的には、この実施例は乳癌細胞系中のホタルルシフェラーゼ(MCF7-Luc)の下方制御を実証する。
実施例１で述べたようにベクターを構築する。ベクター創造後、実施例１のsiRNA遺伝子ライブラリーを含むオリゴヌクレオチドと同じ塩基構造を有する以下のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する。
siRNAh-lucB：5'-pCGACCACTCTAAAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTTCGGGG-3'
(配列番号:６)
siRNAh-SCRAMBLE：5'-pCGACCACTCTAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGCGTTCGCGC-3'
(配列番号:７)
最初のオリゴヌクレオチドは、ルシフェラーゼ特異性siRNA遺伝子の生成用鋳型として働き、２番目のオリゴヌクレオチドは対照siRNA遺伝子を与える。実施例１で述べたように、これら各オリゴヌクレオチドを２つのユニバーサルオリゴヌクレオチド：Univ-1h及びUniv-2hとアニールし、pLPR-U6ベクターに連結し、そこからSph I/Mlu I断片を除去する。結果の一本鎖ギャップは、形質転換後細菌で充填する。
結果のプラスミド、pLPR-U6-lucB-siRNAh及びpLPR-2U6-スクランブル-siRNAhは、ホタルルシフェラーゼを発現する乳癌細胞系(MCF7-Luc)中への形質移入によってそれぞれ別個に導入する。形質移入２日後、形質移入した各細胞系から両細胞ライセート及び全RNAを調製する。ルシフェラーゼ活性のレベルはルシフェラーゼ検定キット(Promega, Madison, WI, USA)を用いて測定し、全RNAはTaqman(登録商標)検定法(Li, Q.ら (2000), Nucleic Acids Research 28:2605)で分析する。代わりに、形質移入10日後、安定な形質転換体をピューロマイシン選択(1ug/ul)で選び、前記同様にルシフェラーゼ活性と全mRNAレベルを測定する。ルシフェラーゼ検定は、対照と比較したとき、pLPR-U6-lucB-siRNAhで形質移入した細胞系内におけるルシフェラーゼ活性の下方制御を示し、このことは、Taqman(登録商標)検定で示されるように、mRNAレベルの減少によって確証される。
【０１１４】
実施例３：ランダム化ヘアピンsiRNAライブラリー又は特異的siRNA遺伝子の発現用誘発性プロモーターの生成
この実施例は、ランダム化ヘアピンsiRNAライブラリー又は特異的ヘアピンsiRNA遺伝子のどちらかの発現を制御するための誘発性プロモーターの生成を示す。この実施例では、大腸菌Tn10のテトラサイクリンオペロン由来の制御配列を用いてヒトU6 snRNAプロモーター被動ヘアピンsiRNA遺伝子又はヘアピンsiRNA遺伝子ライブラリーの発現を制御する。
誘発性プロモーターを生成するため、テトラサイクリンが培地中に存在するときだけヘアピンsiRNA遺伝子を発現するように、実施例１及び２の構成物をさらに修飾する。このテトラサイクリン制御発現ベクターの構築に関与する工程は、以下の２つの追加必要条件を除き、実施例１及び２の工程とほぼ同一である。第１に、テトラサイクリンオペレーター配列を用い、U6プロモーター領域のTATAボックスと近位配列要素（PSE）との間の野生型プロモーター配列を置換する。これは、U6プロモーター配列をPCRに使用するプライマー中にテトラサイクリンオペレーター配列を組み込むことによって達成される（以下参照）。第２に、ヘアピンsiRNA遺伝子に加え、テトラサイクリンリプレッサー遺伝子を宿主細胞内にシス又はトランスで供給する。
【０１１５】
この実施例の発現ベクターは、実施例１のプライマーS-U6-20の代わりに以下のプライマーを用いること以外、実施例１で述べたとおりに構築する突然変異したU6プロモーターを利用する。
S-U6-TET-o：
5'-ATCGGCATGCAGATATATAACTCTATCAATGATAGAGTACTTTCAAGTTACGGT-3'(配列番号:８)
テトラサイクリンオペレーター配列を、PCRから生じるプロモーターがTATAボックスと近位配列要素（PSE）との間に挿入されたテトラサイクリンオペレーターを有するようにプライマー中に組み込む（図６参照）。次いで、実施例１及び２で述べたように、特異的siRNA遺伝子又はランダム化遺伝子ライブラリーをテトラサイクリン誘発性発現ベクター中にクローン化する。
テトラサイクリンリプレッサー遺伝子をトランスで供給する場合、siRNA遺伝子又は遺伝子ライブラリーベクター(例えば、pLPR-siRNA(luc)-tet)に加え、pTET-O(Clontech, CA, USA)のようなリプレッサーを発現する別個のベクターを宿主中に同時導入する。テトラサイクリンリプレッサー遺伝子をシスで供給する場合、LTR中のpol IIIプロモーターの制御下、リプレッサー遺伝子をpLPRベクター中にクローン化し、最終構成物はpLPR-siRNA(luc)-tet-repである。
【０１１６】
上述したように、誘発性プロモーター(例えば、pLPR-siRNA(luc)-tet-rep)を含有するベクターの構築後、細胞系(例えば、MCF7-luc)を安定的に形質移入し、この安定した形質移入体を48時間テトラサイクリンで処理する。並行してテトラサイクリンで処理しない対照を用意する。実施例２で述べたようにルシフェラーゼ活性とルシフェラーゼmRNAを測定する。テトラサイクリンによる誘発が存在しない場合、リプレッサーによるテトラサイクリンオペレーター配列の結合のためsiRNA発現が抑制されることは明かである。従って、ルシフェラーゼ活性の増加が簡単に検出される。しかし、細胞を48時間テトラサイクリンで処理すると、siRNA遺伝子発現が誘発され、未処理の対照細胞に比し、ルシフェラーゼ活性が減少する。
実施例４：特異的表現型に関与する遺伝子を同定するためのヘアピンsiRNA遺伝子ライブラリーの使用
以下の実施例は、ヘアピンsiRNA遺伝子ライブラリーを用いて問題の細胞系内の特異的表現型に関与する遺伝子を同定する方法を示す。具体的には、この実施例では、siRNA遺伝子ライブラリーで形質移入した細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、CD4表面分子遺伝子発現の下方制御に関与する遺伝子を検出する。
ヒトＴ細胞系、Molts-4は、その表面上でCD4分子を発現する。CD4は容易に検出され、蛍光標識化抗-CD4抗体とFACS分析を用いてその量を測定する。また、表面CD4発現のレベルが異なる細胞は相互にFACS選別によって容易に分離される。
【０１１７】
表面CD4発現を下方制御するsiRNAを同定するため、形質移入又はレトロウイルス形質導入によって、実施例１又は実施例３のヘアピンsiRNA遺伝子ライブラリーをMolts-4細胞中に導入する。表面CD4発現の反映である蛍光強度により、形質移入／形質導入された細胞をFACS選別する。形質移入／形質導入された集団内の低CD4-発現体を選択する。siRNA遺伝子をPCRで救出し、再クローン化し、Molts-4細胞中に再導入する。数ラウンドの同一選択スキームを行って、CD4発現を下方制御するsiRNAsに富ませる。
単離されるsiRNAsは、直接CD4 mRNAを標的するものであり、或いは二者択一的に別のやり方でCD4発現を制御するタンパク質をコードするmRNAsである。siRNAsの配列情報に基づき、公共若しくは私有データベースのBLAST検索又は同定したsiRNA配列をプローブとして用いる直接遺伝子クローニングによって標的遺伝子情報を決定する。
【０１１８】
実施例５：siRNA遺伝子ベクターライブラリーの構築（代替法）
この実施例は、ランダム化siRNA遺伝子ベクターライブラリーを構築する代替方法を示す。この方法では、修飾したpol IIIプロモーターを運ぶベクター中への連結前に、末端トランスフェラーゼ(TdT)を用いて部分的発現カセットに相補的な鎖の合成を促進する。この手順は、図８及び９に示す。
自己-プライミングオリゴヌクレオチド(HpLib)を化学的に合成し、各オリゴヌクレオチドは以下の塩基構造を有する。
5'-TTCTAGAGGCGCGCCGGGCCGCCAAAAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
CTTCAAGCGAAGAGCGCCTCCGGTTACGGAGGCGCTCTTCGAAGAGAG-3'
(配列番号:９)。
このオリゴヌクレオチドの各セグメントを5'末端から3'末端の順に以下に述べる。
【０１１９】
配列5'-TTCTAGA-3'は、制限消化とゲルエレクトロポレーションによるプライマー伸長の分析を容易にするためのスペーサーである（すなわち、この断片はAscI消化で除去され、ゲル上での流動性の増加をもたらす）。この断片は、修飾したpol IIIプロモーターを運ぶベクター中への連結前に除去されるので、5'リーダー配列の一部とみなされない。
配列5'-GGCGCGCC-3'はAscI制限部位である。
配列5'-GGG-3'はXmaI部位の一部であり、以下の手順でTdTの作用によって完成する。
配列5'-CCGCC-3'は、修飾したpol IIIプロモーターのTATAボックスから適宜離して転写開始部位を位置づけるためのスペーサーである。
配列5'-AAAAAA-3'は転写ターミネーターの補体である。“Ｇ”残基を転写開始部位に位置づけて、修飾したpol IIIプロモーターからの発現を最大にする。
配列5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'はsiRNAコード配列のランダム化領域である。
配列5'-CTTCAAGCGAAGAGCGCCTCCG-3'は、ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーのＮ1セグメントである。この配列の5'末端の“Ｃ”残基が、発現される予定のヘアピンsiRNAのdsRNA領域中に組み込まれる。
配列5'-GTTA-3'はポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーのＮ2セグメントである。
配列5'-CGGAGGCGCTCTTCGAAGAGAG-3'はポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーのＮ3セグメントである。この配列の3'末端の“Ｇ”残基が、発現される予定のヘアピンsiRNAのdsRNA領域中に組み込まれる。この自己-プライミングオリゴヌクレオチドの予測される二次構造を図８に示す。いくつかのミス対合した“塩基対”が、Ｎ1及びＮ3セグメントによって形成されたステム構造中に組み込まれている（図８中、四角で囲んだ残基）。これらミス対合が、Ｎ2セグメントの、ヘアピンsiRNAの成分として発現するであろうより短いループ領域との置換を促進する(以下参照)。この手順の工程１〜７を図８に示し、工程８〜10を図９に示す。
【０１２０】
工程１：自己-プライミングオリゴヌクレオチドを0.1xTE中に溶かし、dNTPsを最終濃度３mMまで添加し、かつ５分間65℃で加熱後、氷上で１分以上急冷することによって、オリゴヌクレオチドを“自己-アニール”させる。製造業者の使用説明書に従って“5X First Strand Buffer”、0.1M DTT、及びSuperScript III RNaseH- 逆転写酵素(RT)を添加する（Invitrogen, カタログ #18080-044）。反応を55℃で１時間インキュベートし、70℃で15分間加熱して酵素を変性させる。
工程２：プライマー伸長反応の産物をAscIで消化させ、奥まった3'末端を得る。消化は、1/10th容量のAscI(New England Biolabs, Beverly, MA)を直接プライマー伸長反応混合物に添加後、37℃で２時間インキュベートすることで達成する。消化した産物は、次工程の前にSephadex G25カラム上(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)で脱塩する。
工程３：CoCl2に代えてMgCl2を用いること以外、製造業者の使用説明書に従って終止トランスフェラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてオリゴ(dG)ホモポリマー“尾部”をAscI-消化したオリゴヌクレオチドの3'末端に付加する。反応を37℃で15分間インキュベートし、70℃で10分間の熱インキュベーションによって停止させる。この“尾部を付けた”産物は、次工程の前にSephadex G25カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上で脱気する。
【０１２１】
工程４：“尾部を付けた”オリゴヌクレオチドのステム-ループ構造を変性させ、約250倍過剰の以下の2nd Strand Primer：
5'-CCCCCCCCCCCCCCCCCGGGCCGCCAAAAAAG-3'(配列番号:10)
にアニールする。
この工程では、前工程のオリゴ(dG)の“尾付け”が、変性したオリゴヌクレオチドの5'末端が存在しない変性したオリゴヌクレオチドの3'末端にXMal認識配列を導入することに留意すべきである。変性及びアニーリングは、上記工程１のように行う。
工程５：2nd Strand Primerからプライマー伸長によって相補鎖を生成する。反応は、上記工程１のように逆転写酵素を用いて行う。産物をエタノール沈降させ、最少量の緩衝液中で再懸濁させる。
工程６：T4 DNAリガーゼ及び技術的に周知の条件を用い、XmaI部位に遠位の平滑末端にAscIリンカー(New England Biolabs, Beverly, MA)を連結する。この産物は、次工程前にSephadex G25カラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上で脱気する。(注意：この末端が平滑である当該分子のXmaI部位に近位の分子の末端にAscIリンカーを連結してもよい。しかし、続いて起こるXMalによる消化が、これら分子からAscIリンカー配列を除去するだろう。)
工程７：産物をAscIとXmaIで消化させ、分子の各末端に別個の5'オーバーハングを得て、次工程における修飾したpol IIIプロモーターを有するベクター中への一方向性連結を促進する。所望断片を寒天ゲル上でゲル精製し、Freeze N Squeezeスピンカラム(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて単離し、エタノール沈降させ、かつ最少量の緩衝液中で再懸濁させる。
【０１２２】
工程８：TATAボックスの下流にAscI及びBspEI制限部位を含むように修飾したU6 snRNAプロモーターを有するベクター中にAscI/XmaI-消化産物を連結する。（BspEI消化はXmaI-生成オーバーハングに適合性のオーバーハングを与え、ここにはベクター骨格中にさらなるXmaI部位が存在するためBspEI消化を用いる。U6プロモーターの修飾は、実施例１で述べてのと同様の方法で行う。）連結後、細菌を形質転換し、LB寒天プレート上に150-mmプレート当たり１×105コロニー未満の密度で塗布し、終夜37℃でインキュベートする。プレートを破片にしてコロニーを収集し、LBの接種及び37℃(250rpm)でのさらに３〜４時間のインキュベーションによって最小限に増幅する。プラスミドDNA単離キット(Qiagen, Valencia, CA)でプラスミドDNAを単離する。
工程９：ポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーに相当する配列の大多数はSapIによる消化で除去される。最初の自己-プライミングオリゴヌクレオチド中に存在するSapI部位は変性及び相補鎖合成時に複製された(図８中の工程４及び５)。従って、今は２個のSapI部位がポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー由来の配列の大多数を一括して扱う。さらに、SapIはIIS型制限酵素である。SapIは非パリンドローム認識部位を有し、かつこの認識部位の一側面に固定距離で切断する。従って、工程８で生じたベクターのSapI消化は、認識部位によって一括して扱われる領域のみならず、認識部位自体をも除去する。
工程10：ベクターの分子内再連結は、ヘアピンsiRNAの成分として発現するであろうループ用のコード領域を形成する。この再連結事象が、ヘアピンsiRNAのコード鎖内の配列、5'-TTCAAGAGA-3'を形成する。この9-ヌクレオチドセグメントは、pol IIIプロモーターから発現されるヘアピンsiRNAs内でループとして効率的に機能することが分かっている（Brummelkampら(2002) Science 296: 550-553)。最初の自己-プライミングオリゴヌクレオチド内でミス対合した塩基対を慎重に選択することで（図８の工程１中、四角で囲まれた残基）、他のループ領域も設計することができる。細菌を再連結物質で形質転換し、150-mmプレート当たり１×105コロニー未満の密度でLB寒天プレート上に塗布し、かつ37℃で終夜インキュベートする。プレートを破片にしてコロニーを収集し、細菌原料として貯蔵する。プラスミドDNA単離及び宿主細胞の形質移入又はウイルスのパッケージング前にLBの接種及び37℃(250rpm)で３〜４時間のインキュベーションによる最少増幅を行う。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明のヘアピンコード配列に作動可能に連結しているU6 snRNAプロモーターの概略図であり、TATAボックス、PSE及びDSE要素、並びにクローニングを促進するように位置づけられた２つの制限部位の位置が示される。
【図２Ａ】5'リーダー配列、ランダム化siRNAコード配列、及びポリメラーゼプライマーヘアピンリンカー配列を含む本発明の自己-プライミングオリゴヌクレオチドの概略図である。
【図２Ｂ】ランダム化siRNAコード配列及び5'リーダー配列に相補的な配列を生成してステム-ループ構造を形成するための、図２Ａの配列のプライマー伸長を示す。
【図２Ｃ】図２Ｂのステム-ループ構造の変性工程及びベクター中への連結を容易にするための１対のプライマーのアニーリング工程を示す。
【図３】図２Ｃの変性したステム-ループ構造を、コード配列の転写のために正しい方向にU6プロモーターに作動可能に連結する方法を示す。
【図４】宿主細胞内のギャップ修復メカニズムによる一本鎖領域の充填後の図３のカセットを示す。
【図５】U6プロモーターを示し、該プロモーターの一番端の3'末端にヘアピンコード配列を転写するポリメラーゼ用終止配列に相補的な４個のアデニリル残基が示され、5'〜この終止配列及び3'〜TATAボックスは、制限部位用核酸配列、オペレーター要素、又はクローニングを促進し若しくは発現を制御するために望ましい他の配列を組み込むように置換しうる23塩基までの領域である。
【図６】オペレーター配列、この場合はテトラサイクリンオペレーター配列を含むように修飾したU6プロモーターを示す。
【図７】本発明の実施用に好適なレトロウイルスウイルスの略図であり、ロングターミナルリピート領域（LTRs）、選択可能マーカー（ピューロr）、及びクローニングを促進するためにベクター中に操作した制限部位が示される。
【図８】終止トランスフェラーゼを利用して相補鎖及びユニークな制限部位の合成のためのプライミング部位を生成する、本発明の部分的発現カセットを含む二本鎖挿入断片の構築の種々の工程を示す略図である。
【図９】修飾したpol IIIプロモーターを持つベクター中への図８の部分的発現カセットの連結及び大多数のポリメラーゼプライマーヘアピンリンカーの、ヘアピンsiRNAのループ領域をコードする配列との置換を示す。
【図１】
2005533504.tif 000002
2005533504.tif 000003
【図３】
2005533504.tif 000004
【図４】
2005533504.tif 000005
【図５】
2005533504.tif 000006
【図６】
2005533504.tif 000007
【図７】
2005533504.tif 000008
【図８】
2005533504.tif 000009
【図９】
2005533504.tif 000010
【配列表】
2005533504000001.app
【国際調査報告】
2005533504.tif 000011
2005533504.tif 000012
2005533504.tif 000013