(57)【要約】この発明は核酸タグ分子と核酸分子のようなポリマーを標識する核酸結合因子との結合体の使用に関連する。核酸分子のようなポリマーを標識する核酸結合因子。いくつかの実施形態において、核酸結合因子は核酸分子に非特異的に結合する核酸結合酵素である。結合体は直接的または間接的に、核酸タグ分子を核酸結合因子へ結合することで形成される。本発明は結合体組成物ならびに結合体を用いて核酸分子のようなポリマーを標識およびの分析する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマーを分析するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
該ポリマーと、核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体とを接触させる工程、
該核酸結合因子を該ポリマーに非特異的に結合させる工程、ならびに、
該核酸タグ分子を該ポリマーに特異的に結合させる工程、ならびに、
該ポリマーに対する該結合体の結合パターンを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記核酸結合因子を前記ポリマーに沿って転位させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸結合因子が前記ポリマーに非特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマーが核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマーがＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸タグ分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡ共ポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸タグ分子は５から５０残基の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸タグ分子および前記核酸結合因子が相互に共有結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸タグ分子および前記核酸結合因子がリンカー分子を用いて結合体化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸結合因子が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素は前記核酸タグ分子もしくは前記ポリマーを改変する能力を欠く、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸タグ分子は検出可能な部分で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸結合因子は検出可能な部分で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸タグ分子は第一検出可能部分で標識され、前記核酸結合因子は第二検出可能部分で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーは検出可能な部分で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な部分は骨格特異的標識である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸結合因子はそれ自体は検出可能な部分ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーに対する前記結合体の前記結合パターンは線状ポリマーの分析システムにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記線状ポリマー分析システムは、前記ポリマーに対する前記結合体の前記結合より生ずるシグナルを生じさせるために該ポリマーを露出させる工程、および、該シグナルを検出システムにより検出する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーに対する前記結合体の前記結合パターンは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な部分は電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷伝達分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノ結晶体、リガンド、マイクロビーズ、磁性体ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群より選択される、請求項１３、１４または１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な部分は電子スピン共鳴検出システム、電子結合素子（ＣＣＤ）検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択された検出システムによって検出される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリマーは非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸タグ分子はアンチセンス分子ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸タグ分子は細菌特異的配列もしくはウィルス特異的配列にはハイブリダイズしない、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸タグ分子が因子で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記因子は核酸分子を切断することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記因子は光切断因子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記因子は核酸分子を改変することができる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸結合因子は間接的に検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸結合因子は前記核酸結合因子特異的な抗体もしくは抗体フラグメントにより間接的に検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記線状ポリマー分析システムはシングルポリマー分析システムである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３４】
前記ポリマーに対する前記結合体の前記結合パターンはＧｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ、オプティカルマッピングおよびＤＮＡコーミングからなる群より選択された方法により決定される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３５】
ポリマーを光学的に分析するためのシステムであって、該システムは以下の工程：
光学的放射を発するための光源；
該光学的放射を受容し、該光学的放射に曝されるポリマーを受容して検出可能なシグナルを生成するための相互作用ステーション；および
該シグナルを含む該検出された放射に基ずいて、該ポリマーを分析するように構築および構成されたプロセッサ、
を備え、
ここで該ポリマーは、核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体に結合されている、システム。
【請求項３６】
前記ポリマーは核酸分子である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記ポリマーはＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記結合体の前記核酸タグ分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡ共ポリマーからなる群より選択される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３９】
前記核酸タグ分子は５〜５０残基の長さである、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４０】
前記核酸タグ分子と前記核酸結合因子は互いに共有結合する、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４１】
前記核酸タグ分子および核酸結合因子はリンカー分子を用いて互いに結合体化される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４２】
前記核酸結合因子は酵素である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４３】
前記酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼおよび、リガーゼからなる群より選択される、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記酵素は前記核酸タグ分子もしくは前記ポリマーを改変する機能を欠く、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
前記核酸タグ分子は検出可能な部分によって標識される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４６】
前記核酸結合因子は検出可能な部分によって標識される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記核酸タグ分子は第一検出可能な部分によって標識され、前記核酸結合因子は第二検出可能な部分によって標識される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４８】
前記ポリマーは検出可能な部分によって標識される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項４９】
前記検出可能な標識は骨格特異的標識である、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記検出可能な部分は、電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷伝達分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノ結晶体、リガンド、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質からなる群より選択される、請求項４５、４６または４７に記載のシステム。
【請求項５１】
前記検出可能な部分は電子結合素子（ＣＣＤ）検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、および全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択された検出システムによって検出される、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記ポリマーは非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項５３】
前記相互作用のステーションはスリット幅１ｎｍから５００ｎｍの範囲を有し、かつ局在化放射点をつくるスリットを備える、請求項３５に記載のシステム。
【請求項５４】
前記スリット幅は１０ｎｍから１００ｎｍの範囲である、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
前記局在的放射点ををつくりだすように前記スリットとともに配置されたマイクロチャンネルさらに包含し、該マイクロチャンネルは前記ポリマーを受け、該局所的放射点を通って進めるよう構成される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５６】
偏光子をさらに包含し、前記光源は放射線のビームを発するように構築されたレーザを備え、該偏光子は前記スリットに該ビームが到達する前に該ビームを偏光するよう配置されている、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５７】
前記偏光子は前記ビームが前記スリットの幅と平行になるよう配置されている、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
局所的放射点をつくるよう配置されたマイクロチャンネルをさらに包含し、該マイクロチャンネルは前記ポリマーを受け、該局所的放射点を通って進めるよう構築される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項５９】
偏光子をさらに包含し、前記光源は放射線のビームを発するように構築されたレーザーを備え、該偏光子は、該ビームが偏光するよう配置されている、請求項３５に記載のシステム。
【請求項６０】
前記光源はチップ上で一体化された光源である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項６１】
前記核酸タグ分子と前記核酸結合因子の前記結合体は特異的に前記ポリマーに結合する、請求項３５に記載のシステム。
【請求項６２】
前記核酸結合因子は非特異的に前記ポリマーに結合する、
請求項３５に記載のシステム。
【請求項６３】
前記核酸結合因子は間接的に検出される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項６４】
前記核酸結合因子は、該核酸結合因子特異的抗体若しくは抗体フラグメントにより間接的に検出される、請求項６３に記載のシステム。
【請求項６５】
前記検出システムはライナーポリマー分析システムに取り込むことができる、請求項５１に記載のシステム。
【請求項６６】
前記線状ポリマー分析システムはシングルポリマー分析システムである、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
前記ポリマーはＧｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ、オプティカルマッピングならびにＤＮＡコーミングからなる群より選択された方法を用いて分析される、請求項３５に記載のシステム。
【請求項６８】
ポリマーを分析するための方法であって、該方法は以下の工程：
局在的放射点をつくりだすために既知の波長光学的放射をつくりだす工程、
マイクロチャンネルの中にポリマーを通過させる工程、
該局所的放射点でポリマーを照射する工程、
該局所的放射点で該ポリマーと該光学的放射の相互作用から生じる放射を経時的に検出する工程、および
該ポリマーを該検出される放射に基づいて分析する工程であって、
該ポリマーは核酸タグ分子と核酸結合因子の結合体に結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記ポリマーは核酸分子である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
さらに前記核酸分子を前記マイクロチャンネルの中に通過させるために、電場を利用する工程を包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記検出は前記核酸分子が前記マイクロチャンネルを通過する間に経時的に前記シグナルを集める工程を包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記結合体の前記核酸タグ分子は特異的に前記ポリマーに結合し、前記核酸結合因子は非特異的に前記ポリマーに結合する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸分子はＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記結合体の前記核酸分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡ共ポリマーからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸分子は５〜５０残基の長さである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
前記核酸タグ分子と前記核酸結合因子は互いに共有結合する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記核酸分子および核酸結合因子はリンカー分子を用いて互いに結合する、請求項６８に記載される方法。
【請求項７８】
前記核酸結合因子は酵素である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
前記酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記酵素は核酸分子を改変する能力を欠くものである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記核酸タグ分子は検出可能な部分によって標識される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸結合因子は検出可能な部分によって標識される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸分子は一次検出可能な部分によって標識され、前記核酸結合因子は二次検出可能な部分によって標識される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
前記ポリマーは検出可能な部分によって標識される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
前記検出可能な部分は骨格特異的な標識である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記検出可能な部分は電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷伝達分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノ結晶体、リガンド、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、脂質からなる群より選択される、請求項８１、８２または８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出可能な成分は、電子スピン共鳴検出システム、電子結合素子検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記核酸は非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８９】
前記核酸結合因子は間接的に検出される、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
前記核酸結合因子は前記核酸結合因子特異的抗体もしくは抗体フラグメントにより間接的に検出される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
核酸分子を分析するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体に、核酸分子を曝す工程、
該核酸結合酵素を該核酸分子に結合させる工程、
該核酸タグ分子を該核酸分子に配列特異的様式により結合させる工程、ならびに、
該核酸分子に対する該結合体の結合パターンを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９２】
前記核酸結合酵素は非特異的に前記核酸分子に結合する、
請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記核酸分子はＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記核酸タグ分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡ、偽相補的ＰＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡ共ポリマーからなる群より選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記核酸タグ分子は５〜５０残基の長さである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記核酸タグ分子と前記核酸結合酵素は互いに共有結合される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記核酸タグ分子および前記核酸結合酵素はリンカー分子を用いて互いに結合される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記核酸結合酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸結合酵素は前記核酸分子もしくは前記タグ分子を改変する能力を欠くものである、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記核酸タグ分子は検出可能な部分によって標識される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記核酸結合酵素は検出可能な部分によって標識される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記核酸タグ分子は第一検出可能な部分によって標識され、前記核酸結合酵素は第二検出可能な部分によって標識される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記核酸分子は検出可能な部分によって標識される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記核酸分子は骨格特異的標識である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記核酸分子に対する前記結合体の結合パターンは線状核酸分析システムにより決定される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記線状核酸分析システムは前記ポリマーを前記ポリマーに対する前記結合体の結合することより生ずるシグナルを生じさせるために該ポリマーを露出させる工程、および検出システムを用いて該シグナルを検出する工程を包含する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記検出可能な部分は、電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷伝達分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノ結晶体、リガンド、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、ハプテン、抗原、抗体、抗体フラグメント、炭水化物、および脂質からなる群より選択される、請求項１００、１０１または１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記検出可能な部分は、電子スピン共鳴検出システム、電子結合素子検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択された検出システムによって検出される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記核酸分子は非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記核酸結合因子は間接的に検出される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記核酸結合因子は該核酸結合因子特異的抗体もしくは抗体フラグメントにより間接的に検出される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
組成物であって、該組成物は、
核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体、
を含み、ここで検出可能な部分は該核酸結合酵素に存在する、
組成物。
【請求項１１３】
組成物であって、該組成物は、
核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体、
を含み、ここで検出可能な部分は該核酸タグ分子に存在し、該核酸結合酵素は該検出可能な成分ではない、
組成物。
【請求項１１４】
前記核酸タグ分子および前記核酸結合因子は互いに共有結合される、請求項１１２もしくは１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記核酸タグ分子および前記核酸結合因子はリンカー分子を用いて互いに結合される、請求項１１２もしくは１１３に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記核酸タグ分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡ共ポリマーからなる群よりより選択される、請求項１１２もしくは１１３にの組成物。
【請求項１１７】
前記核酸結合酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択される、請求項１１２もしくは１１３に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記核酸結合酵素は核酸分子を改変する機能を欠くものである、請求項１１２もしくは１１３に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記核酸タグ分子は第二検出可能な部分によって標識される、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記核酸結合酵素は第二検出可能な部分によって標識される、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記検出可能な部分は、電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷伝達分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、リガンド、マイクロビーズ、磁性ビーズ、常磁性分子、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、ハプテン、抗原、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群より選択される、請求項１１２、１１３または１１９または１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記検出可能な部分は電子スピン共鳴検出システム、電子結合素子検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択された検出システムによって検出される、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記核酸結合因子は間接的に検出される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記核酸結合因子は該核酸結合因子特異的抗体もしくは抗体フラグメントにより間接的に検出される、請求項１２３に記載される方法。
【請求項１２５】
ポリマーを分析するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該ポリマーと、核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体とを接触させる工程、
該核酸結合因子を該ポリマーに結合させる工程、ならびに、
該核酸タグ分子を該ポリマーに特異的に結合させる工程であって、該核酸結合因子は、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択される、工程
を包含する、方法。
【請求項１２６】
ポリマーを標識するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該ポリマーと核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体とを接触させる工程、
該核酸結合因子を該ポリマーに結合させる工程および転位置させる工程、ならびに、
該核酸タグ分子を該ポリマーに特異的に結合させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１２７】
前記核酸結合因子は前記ポリマーに非特異的に結合する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ポリマーに対する前記結合体の結合パターンを決定する工程をさらに包含する、請求項１２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸分子のようなポリマーを標識および分析するための新規の組成物およびその使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ゲノムの配列決定および分析に関連する多くの技術は核酸分子を部位特異的に標識することを要する。多くの部位特異的標識は、標的分子内の相補的な配列にハイブリダイズする核酸を基盤としたプローブを用いることによって行われている。しかし、これらプローブの特異性は、その長さ、配列、ハイブリダイゼーションの条件などにより変化する。さらに、これらプローブは普通、蛍光団または放射性標識のような検出可能な標識によって標識されるため、これらを合成することは高価である。これらプローブの特異性を高め、同時に、これらを多く使わないことにより、標識反応をより能率的にまた、より安価に反応を進めることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は結合体を含む特定の核酸の使用、特に核酸のようなポリマーの標識および分析に広く関する。これら結合体は全て一般的にポリマー結合因子を含む。好ましい実施形態において、ポリマー結合因子は核酸結合酵素のような核酸結合因子である。本発明は、一部、核酸プローブ（本明細書中で「核酸タグ分子」と呼ぶ）が核酸結合因子と共に用いられる場合、効率的にその標的に結合するという発見に基づく。好ましくは、比較的非特異的に核酸分子に結合する核酸結合因子は、標識および／または分析される標的ポリマーの近傍の核酸タグ分子に集中する。そのため、ポリマーを標識または分析するために必要とされる核酸タグ分子は少ない。
【０００４】
一つの局面において、本発明はポリマーを標識するための方法を提供する。この方法は、核酸タグ分子と核酸結合因子を含む結合体とポリマーを接触する工程、前記核酸結合因子を前記ポリマーに結合させる工程、および、前記核酸タグ分子を特異的に前記ポリマーに結合させる工程を包含する。この方法は、必要に応じて、前記ポリマーに対する前記結合体の結合パターンを決定する工程をさらに包含する。
【０００５】
本発明は多くの同一の実施形態を共有する数々の局面を提供する。これらの実施形態を下記に示し、本明細書中に提供する全ての局面は同等に適用すると意図する。
【０００６】
したがって、一つの実施形態そして他に明記されない限り、前記核酸結合因子は前記ポリマーの長さに沿って転位置できる。転位置することには、ポリマーに沿って前進的または非前進的に移動することを包含する。いくつかの実施形態において、前記核酸結合因子は前記ポリマーに非特異的に結合する。他の実施形態において、前記核酸結合因子は前記ポリマーに通常は特異的（例えば、配列特異的様式）に結合し得るが、ポリマーに対するこの因子の結合が比較的非特異的になる様に、結合の条件は改変される。
【０００７】
重要な実施形態において、前記ポリマーは核酸分子であり、そして非インビトロで増幅された核酸分子であり得る。前記ポリマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得るが、それらに限定はされない。
【０００８】
前記ポリマーに対する前記結合体の接合パターンは、線状ポリマー分析システムを包含する様々なシステムを用いて決定することができる。いくつかの実施形態において、前記線状ポリマー分析システムは、シングルポリマー分析システムである。前記核酸分子または前記核酸分子に対する前記タグ分子の結合は、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ、光学マッピングおよびＤＮＡコーミングからなる群より選択された方法を使用して決定され得る。Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステムは、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３５０１２、ＷＯ００／０９７５７およびＷＯ０１／１３０８８（それぞれ１９９８年８月１３日，２０００年２月２４日，２００１年２月２２日発行）ならびに、米国特許第６，３５５，４２０Ｂ１号（２００２年３月１２日発行）（これら全ては、その全体が本明細書中に参考として採用される）に記載される。あるいは、前記パターンは蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて決定され得る。当業者は、前記ポリマーに対する前記結合体の結合パターンを決定するために用いられ得る他のシステムを理解する。
【０００９】
ある実施形態において、前記核酸タグ分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ビスＰＮＡ、偽相補的ＰＮＡ、およびＬＮＡ−ＤＮＡコポリマーからなる群より選択されるが、それに限定はされない。前記核酸タグ分子は、任意の長さであり得るが、いくつかの好ましい実施形態において、それらは５〜５０残基の長さであり、なおより好ましい実施形態において５〜２５残基の長さである。前記核酸タグ分子は好ましくは、核酸自体であり、それ故、ヌクレオチド単位から構成される。
【００１０】
前記核酸タグ分子は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎハイブリダイゼーションを使用して前記標的ポリマーに結合することができるものであり得る。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合は、標的核酸の一方の鎖が置き換えられた場合、二本鎖複合体の形成を生じ、一方、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合は核酸の鎖の置き換えを要しないため三本鎖複合体を形成する。ある実施形態においては、例えば、タグ分子がｂｉｓＰＮＡである場合には、一つの核酸タグ分子は標的核酸分子に対し、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合の両方で結合する。様々なタイプのハイブリダイゼーションは、以下：Ｓｉｎｄｅｎ  Ｒ．Ｒ．，ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１７−２２５（１９９４）に記載されている。ＰＮＡおよびｂｉｓＰＮＡハイブリダイゼーションについてはより詳細に以下：Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐ．１−１９（１９９９）；およびＫｕｈｎ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１３３７−１３４５（１９９９）に論述されている。
【００１１】
核酸タグ分子および核酸結合因子は直接的または間接的に相互に結合体化する。間接的結合体化とは、核酸タグ分子と核酸結合因子との間にリンカーまたはスペーサー分子が介在することをいう。好ましい実施形態において、核酸タグ分子と核酸結合因子は互い共有結合により結合体化する。
【００１２】
重要な実施形態において、核酸結合因子は酵素である。酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、制限酵素のようなヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択されるが、これらに限定はされない。重要な実施形態において、酵素は、核酸タグ分子またはポリマーを改変する能力を有さない。
【００１３】
実施形態に依存して、核酸タグ分子および／または、核酸結合因子および／または、ポリマーは、検出可能な部分により標識される。ポリマーは、骨格特異的な標識により標識されることが好ましい。核酸タグ分子と核酸結合分子が共に標識される実施形態において、それらの検出可能な部分は同一であり得るかまたは異なり得る。加えて、検出可能な部分は異なる検出システムを使用して検出され得る。核酸結合因子は、例えば、核酸結合因子に特異的な抗体または抗体フラグメントを使用して間接的に検出され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシル基）、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷移動分子、半導体ナノクリスタル、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノクリスタル、リガンド、マイクロビーズ、磁気ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色素基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質よりなる群より選択される。
【００１５】
関連する実施形態において、検出可能な部分は検出システムを使用して検出される。検出システムは、非電子的性質のもの（例えば、写真フィルム検出システム）、または電子的性質のもの（例えば、電子結合素子（ＣＣＤ）検出システム）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、検出システムは、電子結合素子検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、スキャニングトンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムからなる群より選択される。
【００１６】
さらにその他の実施形態において、核酸タグ分子は治療因子のような因子により標識される。一実施形態において、その因子は核酸分子を改変することができ、メチラーゼ、ヌクレアーゼなどが含まれ得る。また、因子にはＤＮＡ転写のインヒビターおよびアクチベーターおよびレギュレーターが含まれ得る。一実施形態においては、因子は核酸分子を切断するものである。いくつかの実施形態においては、因子は光分解因子である。
【００１７】
その他の局面において、本発明は光学的にポリマーを分析するシステムを提供する。該システムは以下：光学的放射を発するための光学的源；該光学的放射を受容し、該光学的放射に曝されるポリマーを受容して検出可能なシグナルを生成するための相互作用ステーション；および該シグナルを含む該検出された放射に基づいて、該ポリマーを分析するように構築および配置されたプロセッサ、を備える。本発明の上記局面のとおり、核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体に対しポリマーが結合する。
【００１８】
一つの実施形態において、相互作用のステーションは局所的な放射線スポットを含む。さらに他の実施形態において、該システムは、ポリマー単位を受けならびに局所的な放射線スッポトまでポリマー単位を進めるように構築された、マイクロチャンネルをさらに含み、そしてそれは必要に応じて局所的な放射線スポットをつくり得る。その他の実施形態において、該システムは偏光子をさらに含み、ここで光学的源は放射線ビーム発するよう構築されたレーザーを含み、該偏光子は該ビームを偏光するよう配置される。レーザービームは本質的に偏光されるが、あるダイオードレーザーは、偏光子の使用から利益を得る。いくつかの実施形態において、局在的放射線スポットは相互作用の場に存在するスリットの使用により形成される。該スリットはスリット幅が１ｎｍから５００ｎｍの範囲、もしくは１０ｎｍから１００ｎｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態においては、偏光子は該ビームが該スリットに到達する前に偏光するよう配置される。他の実施形態においては、偏光子は該ビームが該スリット幅に平行になるように偏光するよう配置される。
【００１９】
さらに他の実施形態において、光学的源はチップ上に統合された光源である。励起光はまた、外部ファイバーもしくは統合された光ガイドにより送達され得る。後者の場合には、該システムは該チップに送達される外部レーザーからの二次光源をさらに含む。
【００２０】
ポリマーは、好ましくは特異的に、核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体に結合する。
【００２１】
また他の局面において、本発明は、他のポリマー分析方法を提供する。この方法は以下の工程：局所的な放射線スポットを形成するために、既知の波長の光学的放射線を生じさせる工程、ポリマーにマイクロチャンネルを通過させる工程、該ポリマーを局在的放射線スポットで照射する工程、局在的放射線スポットで該ポリマーと光学的放射線の相互作用より生ずる放射線を継続して検出する工程、および、検出された放射線に基づいて該ポリマーを分析する工程、を包含する。該ポリマーは、好ましくは特異的に、核酸タグ分子と核酸結合因子との結合体に結合する。ある実施形態として、該結合体の核酸タグ分子は特異的に、該ポリマーに結合し、該核酸結合因子は非特異的に該ポリマーに結合する。
【００２２】
ある実施形態では、該方法は核酸分子を該マイクロチャンネルに通過させるために電場をさらに用いる。他の実施形態においては、検出する工程は、核酸分子がマイクロチャンネルを通過している間に経時的にシグナルを収集する工程を包含する。
【００２３】
また他の局面において、本発明は、核酸分子を分析する方法を提供する。この方法は以下の工程：核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体に核酸分子をさらす工程、該核酸結合酵素を該核酸分子に結合させる工程、該核酸タグ分子を該核酸分子に配列特異的様式により結合させる工程、ならびに、該核酸分子に対する該結合体の結合パターンを決定する工程、を包含する。
【００２４】
ある実施形態において、該ポリマーに対する結合体の結合パターンは、線状ポリマー分析システム（例えば、ダイレクト線状分析システム）を用いて決定される。関連する実施形態において、該線状ポリマー分析システムは以下の工程：該ポリマーに対し該結合体が結合することにより生ずるシグナルを発するように、ステーションに該ポリマーをさらす工程、および、該線状ポリマー分析システムに組み込まれた検出システムを用いて該シグナルを検出する工程、を包含する。
【００２５】
他の局面において、本発明は核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体を含む組成物であり、検出可能部分が該核酸結合酵素に存在する組成物を提供する。ある実施形態において、該核酸タグ分子は第二の検出可能な部分により標識される。好ましくは、該核酸結合因子は該検出可能部分ではない。
【００２６】
同等の局面において、本発明は核酸タグ分子と核酸結合酵素の結合体を含む組成物であり、検出可能部分が該核酸タグ分子に存在する組成物を提供する。ある実施形態において、該核酸結合酵素は第二の検出可能な部分により標識される。ある実施形態において、該核酸結合酵素はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ、および、リガーゼからなる群より選択される。
【００２７】
また他の局面において、本発明はポリマーを分析するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：該ポリマーと核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体とを接触させる工程、該核酸結合因子を該ポリマーに結合させる工程、ならびに、該核酸タグ分子を該ポリマーに特異的に結合させる工程、を包含する、方法である。核酸結合因子はＤＮＡ修復酵素、ヘリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ、およびリガーゼからなる群より選択された酵素である。
【００２８】
その他の局面において、本発明はポリマーを分析するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：該ポリマーと核酸タグ分子および核酸結合因子を含む結合体とを接触させる工程、該核酸結合因子を該ポリマーに結合させる工程および、該ポリマーに沿って転位させる工程、ならびに、該核酸タグ分子を該ポリマーに特異的に結合させる工程、を包含する、方法である。ある実施形態において、該核酸結合因子は該ポリマーに非特異的に結合する。その他の実施形態において、該方法は該ポリマーに対する該結合体の結合パターンを決定する工程をさらに包含する。
【００２９】
これらおよび他の本発明の実施形態について、本明細書中に詳細に記載する。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、タグ分子が核酸結合酵素のような核酸結合因子と結合した場合には、標的核酸に対する核酸タグ分子の結合についての効率、安定性、および／または、特異性が高めら得るという、発見に一部基づく。それゆえ、タグ分子と核酸結合因子の結合体はタグ分子のみ用いて標識した場合および、核酸分子を分析した場合に直面するいくつかの制限を克服する。これらの制限の例として、反応槽に対する非特異的結合、ハイブリダイゼーションの速度の低下、タグ分子により引き起こされる標的核酸分子の凝集、特定のタグ分子標識の困難性およびその費用などが挙げられる。本発明は、結合体の組成物、ならびに該結合体を用いて核酸分子のようなポリマーを標識および分析するための方法およびシステムを提供する。これら結合体は驚くほど先に触れた制限を克服する。結合体および核酸標的に対するその結合様式の略図は、図１に示す。
【００３１】
本明細書中に示す該組成物および方法は、核酸タグ分子（すなわち配列特異的プローブ）を標的核酸分子の近傍に配置させ、その結果標的核酸に対するハイブリダイゼーションの速度を高める。該方法はまた、核酸タグ分子を反応溶液中で自由で緩慢な状態におくのではなく、核酸標的の近傍に集中させるので、より少ない核酸タグ分子を使用する。
【００３２】
本発明はある局面において、核酸分子である標的ポリマーの標識および分析を目的としている。しかしながら、それだけに限定されることなく、非核酸ポリマーを標識および分析することにも使用することが可能である。アプタマー技術の到来により、核酸基盤のプローブ（つまり核酸タグ分子）は、ペプチドおよび炭水化物を含む様々な化合物を認識するため並びに構造的に、および配列特異的様式により結合させるために使用することが可能である。
【００３３】
「配列特異的」とは、核酸分子の文脈において用いられるときは、タグ分子が特定の線状の配置のヌクレオチド若しくはそれらの誘導体を認識することを意味する。類似する定義は、非核酸ポリマーにも適用される。好ましい実施形態において、線状の配置は、標的核酸上に存在する対応した相補的なヌクレオチドにそれぞれ結合する、連続するヌクレオチドまたはその誘導体を含む。しかしながら、ある実施形態においては、標的上に対応する相補的な残基を有さない一つ、二つ、またはそれより多くのヌクレオチドが存在し得るので、この配列は連続していないかもしれない。
【００３４】
標的として用いられる核酸分子は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を包含する、ＤＮＡまたは、ＲＮＡまたは、増幅産物または、それらの中間体であり得る。核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような手段を用いて事前に増幅させる必要なしに、生物学的サンプル（組織または細胞培養）より、直接的に収集および単離することができる。
【００３５】
本明細書中に提供される方法の感度は、一つの核酸分子を個々に分析することを可能にする。この核酸分子は、一本鎖および二本鎖の核酸であり得る。核酸分子の収集および単離は慣用的に当該分野で行われ、ならびに適切な方法が標準的な分子生物学の教科書（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ’Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）において見い出される。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（例えば、核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ）、ならびにある場合にはｃＤＮＡを含む。重要な実施形態において、核酸分子はゲノム核酸分子である。関連する実施形態においては、核酸分子はゲノム核酸分子のフラグメントである。核酸分子のサイズは本発明において重要ではなく、一般的に、使用される検出システムによってのみ制限される。
【００３６】
本発明の重要な実施形態において、核酸分子は非インビトロ下で増幅された核酸分子である。本明細書中で用いられているように、「非インビトロ下で増幅された核酸分子」とはポリメラーゼ連鎖反応法または組換えＤＮＡ方法のような方法を用いてインビトロ下で増幅されたものではない核酸分子のことを示す。しかしながら、非インビトロ下で増幅された核酸分子は、インビボでの自然な細胞の発生の結果として（この核酸分子が収集された生物学的サンプル中で）インビボで増幅された核酸分子であり得る。これは、非インビトロ核酸分子は遺伝子増幅の一部としてインビボで増幅されたものであり得る（これは変異または癌の発生の結果としていくつかの細胞型内で一般的に観察される）ことを意味する。
【００３７】
この標的核酸分子のサイズに制限はない。様々な長さのヌクレオチドが可能であり、数百、数千、または数百万の長さのヌクレオチドが可能である。ある実施形態においては、この核酸分子は染色体の長さであり得る。
【００３８】
「核酸」との用語は、複数のヌクレオチド（つまり、交換可能な有機塩基に結合した糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）（それは置換されたピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、もしくはウラシル（Ｕ））または置換されたプリン（例えばアデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））である））を意味するために本明細書中で使用される。「核酸」および「核酸分子」は交換可能に使用される。本明細書中で用いられている場合、この用語はオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドについて言及する。この用語はまた、ポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドからホスフェートを差し引いたもの）および他の有機塩基含有ポリマーを包含する。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えばゲノムもしくはｃＤＮＡ）または合成方法（例えば核酸合成による生成）により得ることが可能である。
【００３９】
本発明の結合体は核酸タグ分子を包含する。本明細書中で用いられている場合、核酸タグ分子は、標的核酸分子（すなわち、標識されるべきおよび／または分析されるべきことが意図される核酸分子）内の特定のヌクレオチド配列を認識し、結合することができる分子である。
【００４０】
好ましくは、本発明の核酸タグ分子はアンチセンスの核酸分子でない。本明細書中で用いられている場合、アンチセンス核酸分子とは、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴリボヌクレオチド、または、改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、特定の遺伝子を包含するＤＮＡまたはこの遺伝子のｍＲＮＡ転写物に生理学的な条件下でハイブリダイズし、それにより、この遺伝子の転写および／またはこのｍＲＮＡの翻訳を阻害する核酸である。このアンチセンス分子は、標的遺伝子または転写産物にハイブリダイゼーションすることで、この標的遺伝子の転写または翻訳を妨害するように設計される。
【００４１】
本発明の結合体は、本明細書中において「キメラのタグ」として呼ばれ得るが、しかしながら、これらは、単に本明細書中結合体の一つの成分を示す核酸タグ分子という用語と混同されない。
【００４２】
本発明の核酸タグ分子はそれ自体核酸分子であるか、または、その誘導体である。このようなタグ分子はＣ−５プロピン改変塩基（Ｗａｇｎｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４０−８４４，１９９６）のような置換されたプリンおよびピリミジンを包含し得る。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、２−チオウラシル、シュードイソシトシン、および、他の天然および非天然に存在する核酸塩基、置換および非置換の芳香族の部分が挙げられるが、これらに限定されない。他のそのような改変は、当業者に周知である。
【００４３】
これらのタグ分子はまた、塩基および、または糖のような置換または改変を包む。例えば、これらのタグ分子は、３’位のヒドロキシル基および５’位のリン酸基以外で、分子量の低い有機基と共有結合する骨格糖を有する核酸を含む。このように、改変された核酸には、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変された核酸は、リボースのかわりにアラビノースのような糖を包み得る。このように核酸は骨格の構成において不均一であり、それ故、ペプチド核酸（核酸塩基を有するアミノ酸骨格を有し、本明細書中に詳細に論述するもの）の様に、共に連結されたポリマー単位の任意の可能な組み合わせを含む。ある実施形態においては、この核酸は骨格の構成物において均一である。
【００４４】
本発明の結合体をインビボで使用する（例えば、生細胞へまたはエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む組織へ加える）場合には、このような酵素からの分解に耐性のあるタグ分子を用いることが好ましい。「安定性の核酸タグ分子」とは、インビボでの分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによるものなど）に対し比較的耐性を有するタグ分子を意味する。
【００４５】
構造的にまたは配列特異性を有する核酸分子を認識することができる任意の核酸分子アナログは、核酸タグ分子として使用することが可能であることが理解される。多くの場合、核酸タグ分子は少なくとも、核酸分子とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合を形成する。他の場合において、核酸タグ分子は、核酸タグ分子とＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を形成し、それによって、標的核酸と三重鎖を形成する。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合により結合する核酸配列は、標的核酸の主溝に侵入しそこの局在する塩基とハイブリダイズする。これら後者のタグ分子の例としては、核酸の副溝および主溝を認識し、ならびに結合する分子（例えば、抗生物質のいくつかの様式）を含む。好ましい実施形態において、核酸タグ分子は、標的核酸分子とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合およびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合の両者を形成することが可能である。後述する、ビスＰＮＡタグ分子は、核酸分子とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合およびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合をすることが可能である。多くの実施形態において、高い配列特異性を有するタグ分子が好ましい。
【００４６】
好ましい実施形態において、この核酸タグ分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ビスＰＮＡクランプ、偽相補的ＰＮＡ、ロック核酸（ＬＮＡ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ−ＤＮＡコポリマーのような上記のコポリマーである。
【００４７】
ＰＮＡはグリシンアミノ窒素およびメチレンカルボニルリンカーを通してヌクレオチド塩基に結合する２−アミノエチルグリシン残基で置換されるリン酸塩骨格を有する、ＤＮＡアナログである。ＰＮＡはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成により、ＤＮＡ標的にもＲＮＡ標的にも結合することができ、ならびにそのようにすることで、ＤＮＡもしくはＰＮＡに基づくタグ分子により可能なハイブリッドをより強固に形成できる。
【００４８】
ペプチド核酸は、図３に示すようにペプチド結合により結合されたモノマーから合成される（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１−１９（１９９９））。それは固相ペプチド合成技術により構築し得る。
【００４９】
ＰＮＡ化学および合成は、ＰＮＡ設計においてアミノ酸およびポリペプチド配列を含むことを可能にする。例えば、下記のとおり、リシン残基はＰＮＡ骨格において正電荷を導入するため用いることができる。アミノ酸側鎖の改変に用いることができる全ての化学的方法は直接的にＰＮＡに適用することができる。
【００５０】
ＰＮＡは、電荷中性の骨格を有し、この属性が、ＤＮＡに対するＰＮＡの迅速なハイブリダイゼーションの速度をもたらす（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１−１９（１９９９））。ＰＮＡ構造(例えばＰＮＡ骨格)において正電荷を導入することにより、または正に荷電している側鎖（例えばリジン）をもつアミノ酸を加えることによって、そのハイブリダイゼーションの速度はさらに高め得る。ＰＮＡは、ＤＮＡ分子と安定したハイブリッドを形成し得る。そのようなハイブリッドの安定性は、取り巻く環境のイオン強度に本質的に左右されず（Ｏｒｕｍ，Ｈ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９（３）：４７２−４８０（１９９５））、これは、おそらくＰＮＡの非荷電の性質によるものである。このことにより、インビボまたはインビトロにおいても様々に用いられるＰＮＡが提供される。しかしながら、正電荷を含むＰＮＡのハイブリダイゼーションの速度は、イオン強度に依存しており、それゆえ塩存在下ではより低い。
【００５１】
いくつかの型のＰＮＡデザインがあり、これらは、一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）、ビスＰＮＡ、偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）を含む。
【００５２】
ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体の構造は、特定のＰＮＡならびにその配列に依存する。一本鎖ＰＮＡ（ｓｓＰＮＡ）は、好ましくは逆平行の方向で（つまり、ｓｓＰＮＡのＮ末端がｓｓＤＮＡの３’末端と整列されて）、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成により、ｓｓＤＮＡと結合する。ＰＮＡは、またＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対形成によりＤＮＡと結合し得、それにより、ｄｓＤＮＡと共に三重鎖を形成する（Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：７９７３（１９９７））。
【００５３】
ミスマッチの存在は、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに比べて大きな程度で、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド不安定化させる（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８（１９９３））。この特異性の増加は、より短いＰＮＡタグ分子の使用により、増加され得る。
【００５４】
一本鎖ＰＮＡは、ＰＮＡ分子の最も単純なものである。このＰＮＡの形態は、核酸と相互作用しＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成を介してハイブリッド二重鎖を形成する。この二重鎖は、ｄｓＤＮＡとは異なる空間的構造およびｄｓＤＮＡよりも高い安定性を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１−１９（１９９９））。しかしながら、異なる濃度比が、用いられた場合および／または相補的なＤＮＡ鎖の存在下においては、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖またはＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖もまた、形成され得る（Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：７９７３（１９９７））。二重鎖の形成または三重鎖の形成は、さらにＰＮＡの配列に依存する。チミジンリッチホモピリミジンｓｓＰＮＡは、ｄｓＤＮＡ標的とＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖を形成し、この三重鎖において一方のＰＮＡ鎖は、逆平行Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対形成に関与し、もう一方は、平行性Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対形成に関与する。シトシンリッチホモピリミジンｓｓＰＮＡは、ＰＮＡ／ＤＮＡ／ＤＮＡ三重鎖を形成するｄｓＤＮＡに、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対形成を介して、好ましくは結合する。ｓｓＰＮＡ配列が混在していた場合、それはｄｓＤＮＡ標的に侵入し、そのＤＮＡ鎖を置換し、そしてＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型二重鎖を形成する。ポリプリンｓｓＰＮＡもまた、逆平行Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型対形成によりＰＮＡ／ＤＮＡ／ＰＮＡ三重鎖を形成する。
【００５５】
ビスＰＮＡは、可撓性リンカーに結合した二本鎖を含む。一つの鎖は、古典的Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型対形成によりＤＮＡとハイブリダイズするように設計され、そして、第二の鎖はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型対形成によりハイブリダイズするように設計される。標的配列は短い（例えば、８ｂｐ）ものであり得るが、ビスＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、全体で二倍多い（例えば１６ｂｐ）塩基対形成によりハイブリッドを形成するので、さらに安定である。ビスＰＮＡ構造は、それらの結合の特異性をさらに高める。例えば、一塩基のミスマッチを有するタグを８ｂｐの部位へ結合させると、全体的に１６ｂｐではなく１４ｂｐを生じる。
【００５６】
現行のモデルは、第一段階のハイブリダイゼーションにおいて、ビスＰＮＡ分子は、標的部位に結合したＨｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖を有し、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型鎖の侵入により、もとのＤＮＡ鎖の内の一つが置換された三重鎖（図４）を形成することを前提とする。第二段階を促進するため、ハイブリダイゼーション反応は、ＤＮＡへリックスが開口する（つまり局所的融解）頻度を高めるため高い温度で行う。このメカニズムは、全体のハイブリダイゼーション速度を劇的に高める、なぜならＤＮＡが開口した時、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型ビスＰＮＡ鎖は、ヘリックスへ侵入するように配置されるからである。
【００５７】
好ましくは、ビスＰＮＡは、ホモピリミジン配列を有し、そしてさらに好ましくは、シトシンは、グアノシンとＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型対を形成するためプロトン化される。それ故、チミジンおよびシトシンを有するビスＰＮＡは、ｐＨ６．５未満でＤＮＡだけとハイブリダイゼーションすることが可能である。最初の制限−ホモピリミジン配列だけ−は、ビスＰＮＡの結合様式に本来備わっている。プソイドイソシトシン（Ｊ）が、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型鎖において、広いｐＨ範囲を通してハイブリダイゼーションさせるためにシトシンの代わりに使用され得る（Ｋｕｈｎ，Ｈ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１３３７−１３４５  １９９９））。
【００５８】
ビスＰＮＡは、核酸に対し様々な結合様式を有する（Ｈａｎｓｅｎ，Ｇ．Ｉ．ら。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（１）：６７−７４（２００１））。一つのアイソマーは、一つのビスＰＮＡ分子の代わりに二つのビスＰＮＡ分子を含む。それは、より高いビスＰＮＡ濃度で形成され、単一のビスＰＮＡ分子を含む複合体へと再配置される傾向を有する。他のアイソマーは、標的ＤＮＡ鎖周辺のリンカーの位置が異なる。同定されたアイソマー全てが、同じ結合部位／標的になお結合する。
【００５９】
偽相補的ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）（Ｉｚｖｏｌｓｋｙ，Ｋ．Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０９０８−１０９１３（２０００））は、ｄｓＤＮＡに加えられた二本の一本鎖ＰＮＡを含む。一方のｐｃＰＮＡ鎖は、標的配列に対して相補的であり、もう一方のｐｃＰＮＡ鎖は、置換されたＤＮＡ鎖に対し相補的である（図５）。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖がより安定になるにつれて、置換されたＤＮＡは一般的に、ｄｓＤＮＡ構造を復元しない。ＰＮＡ／ＰＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＰＮＡ二重鎖よりも安定しており、ＰＮＡ成分は、相補的なＤＮＡ配列に対して設計されているので、自己相補的である。そのため、加えられたＰＮＡは、むしろ互いにハイブリダイズする。ｐｃＰＮＡ単位の自己ハイブリダイゼーションを防止するため、修飾塩基（アデニンの代わりの２，６−ジアミノプリン（Ｄ）およびチミンの代わりの２−チオウラシル（ｓＵ）を含む）が、ｐｃＰＮＡの合成に、使用される。ＤおよびｓＵはなお、ＴおよびＡとそれぞれハイブリダイズし得るが、それらの自己ハイブリダイゼーションは、立体的に阻害される（図５）。
このＰＮＡ構築物はまた、標的配列のヌクレオチドごと二塩基対を届ける。それ故に、ＰＮＡ構築物は、ビスＰＮＡ標的である配列と同様の短い配列に結合し得る。ｐｃＰＮＡ鎖は、ヒンジにより結合されず、ならびにｐｃＰＮＡ鎖は、異なる配列を有する。
【００６０】
ｐｃＰＮＡのハイブリダイゼーションは、ｐｃＰＮＡは複合体を形成するために三分子を要するので、ビスＰＮＡのハイブリダイゼーションに比べ、効率が低くなり得る。しかし、偽相補的鎖は、十分な長さでかつ可撓性のあるヒンジにより結合できる。
他のビスＰＮＡベースのアプローチは、置換されたＤＮＡ鎖の使用を伴う（Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１２３−１３１（２００１））。もし第二のビスＰＮＡが、第一のビスＰＮＡに十分密接してハイブリダイズしている場合、一連のＤＮＡ（２５ｂｐまで）が置換され、伸張したＰループを形成する（図４）。この連続は、タグ化するのに十分な長さである。この組合せは、ＰＤループと言われる（Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．Ｖ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３（２）：１２３−１３１（２００１））。開口の別の用途（位相的な標識または「イアリング」（図４）を含む）もまた、設計される。ＰＤループに基づくタグ化は、特異性の増加を含む重要な利点を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに比べて安定であることが報告されているので、ＰＮＡであるタグ分子を含む結合体は、好ましい。これは、特にゲノムＤＮＡのような二本鎖核酸を分析する（とくにインサイチュで行う場合）場合に重要である。なぜならば、ＰＮＡタグ分子は、標的分子の相補的なＤＮＡ鎖により置換されないからである。従って、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体は、室温において数日間存続し得る。さらに、ＰＮＡベースのタグ分子は、効率的かつ特異的なハイブリダイゼーション、安定な複合体の形成、可撓な化学、および別の酵素による分解に対する耐性、といった利点を提供する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、正電荷は、タグ分子とＤＮＡ標的との相互作用を向上させるため、そのようなタグ分子（例えば、ＰＮＡタグ分子）に組み込まれる。そのような改変は、正電荷を帯びたタグ分子と負電荷を帯びた標的核酸分子の骨格との静電気引力に起因して、ハイブリダイゼーション速度を速める。
【００６３】
ロック核酸（ＬＮＡ）分子は、ＤＮＡとハイブリッドを形成し、これは少なくともＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと同程度に安定である（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ら、Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ．８（１）：１−７（２００１））。従って、ＬＮＡは、ＰＮＡ分子と同じように使用され得る。本明細書中に記載したように、ある実施形態において、ＬＮＡ結合の効率は、正電荷を加えることにより高められる得る。ＬＮＡは、本質的に結合親和性が高められていると報告されている。本発明の結合体において使用された場合、これらのＬＮＡは、標的核酸分子領域に集中させ得、そのため標的に対する結合を高め得る。
【００６４】
商業的な核酸合成機および標準的なホスホロアミダイト化学は、ＬＮＡオリゴマーの生成に使用される。従って、混合したＬＮＡ／ＤＮＡ配列の生産は、混合したＰＮＡ／ペプチド配列の生産と同程度に単純である。ＬＮＡモノマー安定化効果は、付加的な効果ではない。このモノマーは、隣接するデオキシヌクレオチドの糖環の立体構造に影響して、より安定な構成へ移行させる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ：Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１−１９（１９９９））。また、配列中のＬＮＡ残基がより少なければ、劇的に合成の正確性を向上させる。当然ながら、核酸結合体に対する生化学アプローチのほとんどは、ＬＮＡ／ＤＮＡ構築物に適用可能である。
【００６５】
他の骨格改変の使用により、タグ分子はまた、一部安定化され得る。本発明は本明細書中で論述されるペプチドおよびロック核酸に加えて、他の骨格の改変、（例えば、これらに限定はされないが、ホスホロチオエート結合ホスホジエステル改変核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミダイト、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミド、カルボキシメチルエステル、メチルホスホノチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシル、およびそれらの組合せ）の使用を包含することを意図する。
【００６６】
他の骨格の改変（特にＰＮＡに関連する改変）としては、ペプチドおよびアミノ酸のバリエーションおよび改変が挙げられる。従って、ＰＮＡを構成する骨格は、ペプチド結合であり得るか、あるいは、非ペプチド結合であり得る。例としては、アセチルキャップ、Ｏ−リンカーのようなアミノスペーサー、リシン（ＰＮＡに正電荷が望まれる場合に特に有用である）のようなアミノ酸などが挙げられる。様々なＰＮＡ改変が知られておりそして、そのような改変を組み込むタグは、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のような供給源より市販され得る。
【００６７】
核酸ハイブリッドの安定性の制限は、タグ分子の長さがであり、より長いタグ分子ほど短いタグ分子よりも安定性が高い。ただし、本発明のタグ分子は、少なくとも４ヌクレオチドの長さから１０００ヌクレオチドを超える長さの範囲まで任意の長さであり得る。好ましい実施形態において、タグ分子は、６〜１００ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、５〜２５ヌクレオチドの長さであり、そしてさらにより好ましくは５〜１２ヌクレオチドの長さである。それぞれおよび全ての長さが本明細書中で明白に列挙されたかのように、タグ分子の長さは、本明細書中に列挙した範囲の間および範囲を含む任意の長さのヌクレオチドであり得る。タグ分子の全ての残基が標的核酸分子の相補的な残基にハイブリダイズする必要はないと理解されるべきである。例えば、タグ分子が５０残基の長さであったりすると、これらのうち２５残基だけが標的核酸とハイブリダイズする。好ましくは、ハイブリダイズする残基は互いに近接する。
【００６８】
タグ分子は好ましくは、一本鎖であるが、それに限定はされない。例えば、タグ分子がビスＰＮＡである場合、タグ分子は核酸標的と二次構造を形成し得、三重鎖高次構造を生じ、ビスＰＮＡクランプの一部域が標的分子の骨格とＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型結合を形成し、そしてビスＰＮＡクランプの別の領域は標的分子のヌクレオチド塩基とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合を形成する。
【００６９】
ビスＰＮＡクランプであるタグ分子は、一つのＤＮＡ鎖が置換されることなく標的核酸分子と結合し得る。なぜならこれらクランプは二重鎖へリックスの融解もしくは開口を伴うことなく、二重鎖ＤＮＡと直接的にハイブリダイズするからである。
【００７０】
タグ分子の長さ（および標的配列）は結合の特異性を決定する。タグ分子と核酸標的との間の単一ミスマッチのエネルギーコストは、短い配列のもののほうが長い配列のものに比べて高い。それ故に、短い配列のハイブリダイゼーションは長い配列のハイブリダイゼーションに比べてより特異的である。なぜならば、長い配列はミスマッチを含み得、そして条件によってはなお標的と結合し続け得るからである。しかし、短いタグ分子使用についての一つの潜在的な限定は、所定の温度および塩濃度で、本質的に安定性が低いことである。後者限定を避けるために、ビスＰＮＡタグ分子を使用することができ、これにより標的配列を短くすることおよび十分なハイブリッドの安定化を可能とし、分析される核酸分子に結合するタグ分子（および結合体）を検出する。ビスＰＮＡは標準的な核酸タグよりも長いが、より短い標的配列と結合できる。
【００７１】
適切なタグ分子の長さの決定に際し、他の考慮すべき事項は、検出すべき配列が特有であるか、否かである。該方法が標的核酸を配列決定することのみを想定する場合、特有の配列が他から離れたそれぞれの結合事象からのシグナルを検出できるように互いに十分に離れた間隔を空けているとすれば、特有の配列は重要ではないかもしれない。すなわち、該配列は、ポリマーに沿って離れた部位であると識別できる距離でランダムにあるべきである。さもなければ、シグナルは重なってしまう。標的ポリマーの長さに沿って、別個の結合体の結合の配置が識別できる限り、より短いタグ分子を使用することにより、より高い解像度が可能であることは明らかである。
【００７２】
ある実施形態において、タグ分子（および対応する結合体）のライブラリは、同一の長さのものを生じる。ライブラリは、好ましくは、組合せ可能な特定の長さの配列全てを含む。このようなライブラリは、長いタグ配列よりも、短いタグ配列について、より小さくなることはまた、明らかなはずである。なぜなら組合せ可能なものがより少ないからである。
【００７３】
他方、たとえば転位事象のような変異配列、または特定の疾患もしくは疾患の素因に関連する遺伝子変異の存在をテストするために該方法が使用される場合、真に相補的なものだけを捕らえるためにこのタグ分子はより長くあり得る。
【００７４】
本発明の方法は、一つ以上の結合体の使用を包含する。好ましい実施形態において、結合体は、それらが保有するタグ分子という点で異なる。すなわち、タグ分子は異なり、従って標的核酸の長さにそって異なる配列に結合する。また好ましくは、互いの結合が区別できるように、異なる結合体は別々に標識される。このように、多大な配列情報を得ることができる。
【００７５】
好ましくは、核酸タグ分子は、標的ポリマー（すなわち標識および／または分析されているポリマー）内の配列を認識し、結合する。ポリマー自体が核酸分子である場合、核酸タグ分子は、好ましくは、標的核酸内の相補的な配列へのハイブリダイゼーションにより認識し、結合する。結合の特異性は、ハイブリダイゼーションの条件に基づいて操作できる。例えば、塩濃度および温度は、核酸タグ分子によって認識される配列の幅を変化させるために改変され得る。
【００７６】
ある実施形態において、分析される核酸は非微生物供給源由来であり、そしてそれ故、タグ分子は非微生物のヌクレオチド配列に対し特異的である。本明細書中で用いられる場合、非微生物のヌクレオチド配列は、微生物種のみに見出され、非微生物種には見出されない配列である。本明細書中で用いられる場合、微生物種とは、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫である。他の実施形態において、タグ分子は、細菌、ウイルス（例えばＨＩＶ）、真菌もしくは寄生虫にだけ見出される配列に特異的である。
【００７７】
ある実施形態において、本発明は、核酸分子の副溝および／または主溝を認識し、結合するタグ分子の使用を包含する。さらにこの認識は核酸分子の決定的な配列に依存し、そしてそれ故にタグ分子の結合は、核酸配列の点で情報を与える。核酸溝に結合する化合物の種類の例は、抗生物質である。
【００７８】
ある例として、本発明の核酸タグ分子は、ヌクレオチド以外の基が結合され合成される。例えば、タグ分子はまた、一つ以上の反応性の基（下に記載されるように、例えば、核酸結合因子もしくはリンカーへの結合用）、一以上のアミノ酸（例えば、リンカーとの反応用）、または検出可能な部分（下記のような）を含む。
【００７９】
本発明の結合体は、核酸結合因子をさらに含む。本明細書中で用いられる場合、核酸結合因子は核酸分子に結合し、そして核酸分子の長さに沿って移動できる因子である、しかし、核酸の配列に対しては比較的感受性ではない。この点で、核酸結合因子は核酸分子長さを走査でき、タグ分子を核酸分子と相補的に接触させる。核酸分子上の結合体の最終的な配置が、結合因子ではなくタグ分子特異性の機能となることが好ましい。
【００８０】
好ましくは、核酸結合因子は核酸結合酵素である。核酸結合酵素としては、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを含むＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮａｓｅＩ、ヘリカーゼ、制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ（好ましくは、ヌクレアーゼ活性は取除かれたが、走査能力は保持するように操作されている）、トポイソメラーゼ、リガーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのようなメチラーゼ（ある実施形態においては、メチラーゼ活性を取除くが、走査能力は保持するよう操作されている）、ＤＮＡ修復酵素および機構などであり得るが、これらに限定されない。一本鎖核酸に結合する核酸結合因子の例は、ＳＰＰ１をコードする複製的ＤＮＡヘリカーゼ遺伝子４０産物（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｇｅｎｅ  ４０  ｐｒｏｄｕｃｔ）（Ｇ４０Ｐ）である。
【００８１】
特定のメカニズムにより束縛されることは意図していないが、ある局面において、本発明は、核酸結合因子の核酸分子に対し比較的配列非特異的な様式で結合する能力、ならびにタグ分子の相補体が見つかるまで核酸分子の長さに沿って転位する能力を利用すると考えられる。本明細書中において用いられているように、配列非特異的様式は、配列非依存的な結合を言う。本明細書中で用いられているように、用語「転位する」とは、核酸分子の長さに沿って核酸結合因子が移動することを意味する。結合因子は核酸分子の長さに沿って一次元的拡散様式で移動し得るか、あるいは、解離して核酸分子の別の領域に再結合し得る。転位は、核酸分子の長さに沿った前進的な移動、ならびに核酸分子の長さに沿った非前進的な移動の両方を含む。前進的な移動とは核酸結合因子が、ポリマーの長さに沿ってポリマーから解離することなく、連続的に移動することを意味し、他方、非前進的な移動とは核酸結合因子がポリマーに対しランダムに結合および解離することを意味する。特異的および非特異的な結合酵素の存続期間は、それぞれおよそ０．１〜１０秒および１時間であると報告されている（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｒ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（９）：１９７９−１９８６（２０００））。
【００８２】
核酸結合因子は、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子）を不安定化および変形さえし得る。これはＳａｍ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（２０）：６５７６−６５８６（１９９９）によって、ＥｃｏＲＶについて報告されている。この効果は標的核酸分子とタグ分子のハイブリダイゼーションをさらに増強し得、結果として低いタグ分子濃度および／または低い温度でさえハイブリダイゼーションが行われ得る。次にこれら後者の変化は、標的核酸分子の凝集により誘導されたタグ分子（特にＰＮＡ）を効率的に減少させ得る。
【００８３】
本発明のタグ分子が核酸結合酵素のような核酸結合因子に対し結合体化することにより、上記ハイブリッドの安定性を高め、そして半減期を増加することが可能である。例えば、結合安定性は核酸結合因子により与えられ得るため、短いビスＰＮＡタグ分子が使用され得る。さらに、核酸結合因子の使用は、全てのタグ分子が核酸分子の近傍に集中することを、効果的に防ぐ。これは、ポリマーを標識および分析するために使用されなければならないタグ分子の量を減少させる。なぜなら、タグ分子が浪費されたとしても少数であるためである。
【００８４】
核酸結合因子に対するタグ分子の結合体化はまた、タグ分子と標的ポリマーとの間のハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション能率を高め、そして時間を増加させることに役立つ。核酸結合因子は、核酸タグ分子のアンカーとして機能すると想定され、タグ分子がタグ分子と相補的な配列を見つけて結合し得るまで、標的核酸分子の近傍にタグ分子を維持する。核酸骨格に沿った結合体のスライドは、タグ分子と、スライドがなければ核酸の二次構造または三次構造内に隠れている、相補的な標的部位との相互作用を促進する。そのような部位には、溶液中の遊離したタグ分子は一般的に、到達しない。
【００８５】
ある実施形態において、酵素は、分析される核酸分子または結合体のタグ分子を、改変する能力を欠くように遺伝子操作される。
【００８６】
全ての上記の酵素は、核酸分子の特定の配列または構造に対する、特異性のレベルを有するが、そのような特異性は多くの方法、結合および転位が行われる条件を含む、により最小限に抑えられ得る。さらに、本発明はまた、配列特異性を欠く、そのような酵素の変異体の使用を含むが、それらは一般的に核酸を認識し得、核酸と結合し得る。例えば、いくつかの核酸結合酵素は、核酸分子の特定領域に対する結合を担う別個のドメインを有し、そしてこれらのドメインは、酵素が核酸分子に対して非特異的に結合するように変異させられ得る。なお別の代替的な方法としては、標的部位がすべて飽和状態である、いくらかの結合特異性を有する酵素を過剰に使用して、過剰な酵素を他の部位に結合させ得る。
【００８７】
いくつかの好ましい実施形態において、核酸結合酵素は、核酸標的の長さに沿って、非特異的に結合および転位（例えば「走査」）し得る。特異的配列および／または構造に結合する因子（例えば、副溝もしくは主溝の結合因子）は、核酸分子の長さに沿って転位し得る因子に比べ、核酸結合因子として望ましくない。
【００８８】
核酸結合因子がヌクレアーゼ活性を有する酵素である実施形態において、そのようなヌクレアーゼ活性は抑制されることが好ましい。これは化学的にまたはタンパク質工学により達成され得る。例えば、二価陽イオンをハイブリダイゼーション溶液から取除くことで、制限酵素の制限活性は、抑制され得る。なぜなら、このような酵素は、ヌクレアーゼ活性を二価陽イオンに依存しているからである。この活性はまた、この活性を取除くもしくは減少させるように遺伝子学的にタンパク質を操作することにより、抑制され得る。このような遺伝子操作は、タンパク質およびその核酸配列の構造の知識のレベルに依存して、方向付けされるか、またはランダムであり得る。ランダムに行われた場合、得られたクローンは、切断することなく核酸に結合する能力によりスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、当業者にとって慣習的である。
【００８９】
核酸結合酵素がポリメラーゼである実施形態において、そのような酵素のヌクレアーゼ活性を取除くだけではなく、新しい核酸分子を合成し得ないように、ポリメラーゼ活性も取除くことが望ましくあり得る。好ましくは、ポリメラーゼ自体は、核酸分子を合成する能力を通じて検出されない位置において検出可能な標識ではない。
【００９０】
本発明の核酸結合因子は、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、またはその両者に沿って結合および走査し得る。ある実施形態において、このような核酸結合因子の結合定数は、１０９Ｍ−１から１０１３Ｍ−１の範囲である。この結合親和性のため、核酸結合因子はタグ分子が結合体化すると同様に、核酸分子の近傍に凝集する。
【００９１】
核酸結合酵素自体は本来キメラであり得、すなわち、二つ以上の異なる酵素またはタンパク質から構成または遺伝子操作され得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、核酸結合因子は本質的に標識ではない。例えば、この因子は、その触媒活性に基づいて検出され得る酵素ではない。むしろ、視覚化および／または検出されるため、核酸結合因子は、検出可能な標識または部分と結合していなければならない。それ故に、例えば、核酸結合因子がＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼである場合、核酸結合因子は検出可能な部分へ結合する。
【００９３】
結合体は、タグ分子と核酸結合因子（例えば酵素）とを結合することにより形成される。この結合は、本質的には共有結合または非共有結合であり得るが、共有結合が好ましい。本明細書中で用いられるているように、結合体は、核酸タグ分子と核酸結合因子との間の物理的な結合である。しかし、これら二つの成分の結合体は、核酸タグ分子の相補的配列を認識して結合する能力と、または、核酸結合因子の核酸分子を認識して核酸分子に沿って転位する機能と、干渉しない。
【００９４】
核酸タグ分子をタンパク質である核酸結合因子に結合体化させる最も単純な方法は、結合因子の表面基を使用することである。化学的結合体化反応のサンプルは図２に示す。これらの基（例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基）は、一般にアミノ酸側鎖の部分であり、一般に溶液に露出している。他の化学的アプローチも同様に利用でき、それらは当業者に公知である。
【００９５】
核酸の架橋を防ぐため、一つの結合因子に対して一つのタグ分子を結合体化させることが望ましい。これは、ともにタンパク質において非常に一般的であるアミノ基、またはカルボキシル基よりもチオール基を使用して、結合酵素に対しタグ分子を結合させることにより達成され得る。さらに、アミノ基への結合は、核酸分子に結合する核酸結合酵素の能力と干渉する。なぜならこれらの基は、しばしば核酸結合に含まれるためである。例として、活性型のＥｃｏＲＩは、リジン残基を２０個およびシステイン残基を１−２個含む、分子量が約２９ｋＤの二つのサブユニットを有する（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：５８６６−５８７４（１９７６））。リジンおよびシステインは、それぞれ側鎖にアミノ基およびチオール基を有する。ＥｃｏＲＩサブユニットが使用される場合、タグ分子をシステイン残基に結合させることが好ましくあり得る。なぜならばそれらは少数であるためであり、それゆえ確実に一つのタグ分子のみを所定のサブユニットに結合させる。
【００９６】
結合した後結合体の選別を行うことがまた、可能である。例えば、核酸結合因子が活性型アミノ基を介してタグ分子に結合した結合体は、タグが非活性型アミノ基を介して結合した結合体から選別され得る。この選別は、例えばｄｓＤＮＡフラグメントが付されたカラムによる親和性クロマトグラフィーの使用により、ＤＮＡに結合できない前者の結合体はカラムを遅滞することなく通過し、他方ＤＮＡに結合できる後者の結合体は遅れて、後の分画に溶出されることで行われ得る。同様に、一つ以上のタグ分子を含む結合体は、一つのタグ分子のみ有するものから、例えば、ＨＰＬＣ法の使用により選別され得る。
【００９７】
また、酵素の核酸結合能に影響を与えることなく、タンパク質工学により、酵素内のチオール基の個数および位置を操作できる。
【００９８】
さらに、結合は、タグ分子と核酸結合因子との間にリンカー分子を含み得る。ある例において、スペーサー分子またはリンカー分子を介して核酸結合因子に対しタグ分子をつなぐことが望ましくあり得る。例えばこれは、タグ分子による核酸分子の相補的な配列への接近が妨げられるという、立体的な障害により引き起こされ得る問題を取除き得る。好ましくは、リンカーは、タグ分子が標的核酸分子と相互作用ができるように十分に長くかつ柔軟である。
【００９９】
これらのスペーサー分子は、種々の分子、好ましくは不活性型のもの（例えば、天然に存在するものまたは合成されたもので、直鎖型または分枝型炭素鎖のＣ１−Ｃ３０、飽和型または不飽和型、リン脂質、アミノ酸、および特に、グリシン、など、）であり得る。さらなるスペーサー分子はアルキルおよびアルケニルカーボネート、カルバメート、およびカルバミドを含む。これらは全て、上記のＣ１−Ｃ３０ようなスペーサー分子に関連し、そして極性の機能を付加し得る。
【０１００】
様々なスペーサーが使用でき、その多くは例えば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（現在Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のような供給源から、市販される。スペーサーは有機的なスペーサーに限定されず、およびむしろ無機的なもの（例えば、−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−もしくはＯ−Ｐ−Ｏ−）であり得る。さらに、これらは本質的に不均一であり得る（例えば、有機的エレメントおよび無機的エレメントから構成される）。本質的に、末端に反応性基を有する任意の分子は、スペーサーとして使用できる。スペーサーの例としては、Ｅリンカー（溶解性エンハンサーとしても機能する）、Ｅリンカーと類似のＸリンカー、グリコールリンカーであるＯリンカー、および一級芳香族アミノ基を含むＰリンカーを含め、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．により供給されるリンカーが挙げられる。ほかの適切なリンカーは、アセチルリンカー、リンカーを含む４−アミノ安息香酸、Ｆｍｏｃリンカー、４−アミノ安息香酸リンカー、８−アミノ−３，６−ジオキサクタン酸（８−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｏｘａｃｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）リンカー、スクシンイミジルマレイミジルメチルシクロヘキサンカルボキシレート、リンカー、スクシニルリンカー、など、である。適切なリンカーの別の例は、１９９６年６月１１日に発行された、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら、米国特許第５，５２５，４６５号に記載されるリンカーである。
【０１０１】
スペーサーの長さは、核酸結合因子およびタグ分子の用途および性質に依存して変化し得る。いくつかの重要な実施形態において、これは１００ｎｍ以下の長さを有し、いくつかの好ましい実施形態において、これは１〜１０ｎｍの長さを有する。
【０１０２】
本明細書中に記載される結合もしくは修飾は、慣用化学を用い、それは化学の当業者に既知である。保護基ならびにモノおよびヘテロの二官能性リンカーのような既知のリンカーの使用は文献で実証されており（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６）、ここでは繰り返さない。
共有結合の具体例としては、二官能性の架橋剤分子が使用される共有結合が挙げられる。架橋剤分子は、結合されるべき分子の性質に従い、ホモ二官能性もしくはヘテロ二官能性であり得る。ホモ二官能性架橋剤は、二つの同一の反応性基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤は、連続結合反応を可能にする二つの異なる反応基を有すると定義される。市販される様々なタイプの架橋剤は、以下の基の内の一つ以上と反応する：一級アミン基、二級アミン基、スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）、カルボキシル、カルボニル、糖質。アミン特異的架橋剤の例は以下である：ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、ジスクシンイミジルスベレート、ジスクシンイミジルタータレート、ジメチルアジピメート・２ＨＣｌ、ジメチルピメリミデート・２ＨＣｌ、ジメチルスベリミデート・２ＨＣｌ、およびエチレングリコールビス−［スクシンイミジル−［スクシネート］］。スルフヒドリル基と反応する架橋剤としては、以下が挙げられる：ビスマレイミドヘキサン、１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）］ブタン、１−［ｐ−アジドサリチルアミド］−４−［ヨードアセトアミド］ブタン、およびＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド。炭水化物と優先的に反応する架橋剤としては、アジドベンゾイルヒドラジンが挙げられる。カルボキシル基と優先的に反応する架橋剤としては、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミンが挙げられる。アミンおよびスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、以下が挙げられる：Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］プロピオンアミド］ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート。カルボキシル基およびアミン基と反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、１−エチル−３−［［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミドヒドロクロリドが挙げられる。糖質およびスルフヒドリルと反応するヘテロ二官能性架橋剤としては、以下が挙げられる：４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド・２ＨＣｌ、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド・２ＨＣｌ、および３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド。この架橋剤は、ビス−［β−４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドおよびグルタルアルデヒドである。
【０１０３】
アミン基またはチオール基は、二官能性架橋剤分子の結合点を与えるため、合成核酸分子の任意のヌクレオチドに加えられ得る。核酸は、結合能のある試薬、例えば、Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ  ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、３’−ＤＭＴ−Ｃ６−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ  ＣＰＧ、ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ  ＩＩ、Ｎ−ＴＦＡ−Ｃ６−ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−ＴｈｉｏｌＭｏｄｉｆｉｅｒ、Ｃ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅおよびＣ６−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ＣＰＧ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を組み込んで合成され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ある条件下で切断できる結合により、タグ分子を、核酸結合因子と結合することが所望され得る。例えば、この結合は、正常な生理学的な条件下で切断する結合、または光のような刺激の適用によって特異的な切断が引き起こされ得、それにより因子が放出され得、標識されるもしくは分析される核酸分子に対して結合したタグ分子だけが残される結合であり得る。容易に切断可能な結合としては、容易に加水分解可能な結合、例えば、エステル結合、アミド結合、およびシッフ塩基型結合が挙げられる。光により切断可能な結合は、当該分野で公知である。そのような結合を使用することで、核酸分子に対する配列特異的結合後に結合体から核酸結合因子を取除くことが可能である。これら後者の実施形態において、この核酸タグ分子は、検出可能な部分により標識されることが望ましい。
【０１０５】
非共有結合による結合方法もまた、使用され得る。非共有結合による結合としては、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ファンデルワールス（もしくは分散）相互作用、水素結合などが挙げられる。ビオチン−アビジン複合体形成およびビオチン−ストレプトアビジン複合体形成、ならびに抗原／ハプテン−免疫グロブリン相互作用、ならびにレセプター―リガンド相互作用のような高親和性相互作用もまた、想定される。ある実施形態において、アビジンのような分子は、核酸結合因子に対して結合させられ、そしてこの結合パートナーであるビオチンは、核酸タグ分子と結合する。
【０１０６】
本発明の結合体は、検出可能な部分によって標識される。この部分は、特定の波長の光を放出および／または吸収する能力により直接的に検出され得る。この部分は、それ自体特定の波長の光を放出および／または吸収し得る別の部分を、結合するか、補充するか、ある場合においては、切断する能力により間接的に検出され得る。間接的検出の例は、基質を切断し可視産物とする第一酵素標識の使用である。この標識は、化学的、ペプチドまたは核酸の性質のものであり得るが、それに限定はされない。検出可能な部分は、チオール基、アミノ基またはカルボキシル基を使用して、結合体に対して結合され得る。できる限り多くの検出可能な標識を、結合体または可能な結合体のいずれかの構成要素に対し結合させることが所望され得るため、そのような標識は、タンパク質に一般によくあるアミノ基またはカルボキシル基に結合され得る。
【０１０７】
好ましい実施形態において、この結合体自体は、検出可能な部分ではない（つまり、結合体のいずれかの構成要素の固有の性質であるため、それらの存在は検出できない）。例えば、核酸結合因子は、それ自体検出可能な部分ではないことが好ましい、つまりその存在を検出するために使用できる固有の酵素活性を有さないということである。
【０１０８】
本明細書中に記載される検出可能な部分は、それらを検出するためのシステムに従い言及される。例えば、発蛍光団分子は、蛍光に依存する検出システムを使用することにより検出できる分子である。
【０１０９】
一般に、検出可能部分は、電子スピン共鳴分子（例えば、ニトロキシルラジカル）、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、ペプチド、電荷移動分子、半導体ナノ結晶体、半導体ナノ粒子、コロイド状金ナノ結晶体、リガンド、マイクロビーズ、磁性体ビーズ、常磁性粒子、量子ドット、色素原基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体フラグメント、および脂質からなる群より選択され得る。
【０１１０】
本明細書中に用いられる場合、用語「電荷変換（ｃｈａｒｇｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）」および「電荷移動（ｃｈａｒｇｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）」は、相互に交換可能に使用される。
【０１１１】
検出可能部分を用いた標識は、結合体の形成の前または後のいずれかに行うことができ、または標的核酸に対する結合体の結合の前または後に行うことができる。好ましい実施形態において、一つの標的核酸分子は、与えられた時間内にいくつかの異なる結合体により結合され、そしてそれ故に、そのような結合体の標識は核酸分子の結合前に行うことが賢明である。しかしながら、検出可能部分が、抗体もしくは抗体フラグメントである場合、特に核酸結合因子およびそれぞれの結合体に特異的な抗体もしくは抗体フラグメントが、免疫学的に明確に異なる結合因子を含む（その結果、結合体間に交差反応が存在しない）場合には、核酸に結合した後であっても、結合体の検出は可能である。
【０１１２】
他の検出可能な標識としては、Ｐ３２またはＨ３のような放射性同位体、光学的マーカーまたは電子密度マーカーなど、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープのようなエピトープタグ、ビオチン、アビジン、およびアルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような酵素タグが挙げられる。他の標識としては、化学発光基質、色素原基質、フルオレセイン（例えば、フルオレセインスクシンイミジルエステル）、ＴＲＩＴＣ、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フェコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、Ｐｈａｒ−レッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）などのような発蛍光団が挙げられる。本発明によりまた想定されるものは、量子ドットのような半導体ナノ結晶体の使用であり、米国特許第６，２０７，３９２号に標識として記載される。量子ドットは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより市販されている。この標識（つまりタグ）は、直接的にＤＮＡ塩基に結合し得るか、または、改変されたＤＮＡ塩基に結合し得る、第二もしくは第三の単位であり得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、本発明の結合体は、検出可能な部分により標識され、その検出可能な部分は、識別可能なシグナルを発する部分であり、そのシグナルは、ある種の検出システムにより全て検出できるものである。例えば、検出可能な部分は、全て蛍光色素標識もしくは放射性物質であり得る。他の実施形態において、結合体は、異なる検出システムを使用して検出される部分により標識される。例えば、一つの結合体は、発蛍光団で標識され得、別の結合体は、放射能で標識され得る。
【０１１４】
この核酸の分析は、この標識（潜在的に、二次標識の使用を通して）からのシグナルの検出、および互いに関してこれら標識の相対的位置の決定を含む。いくつかの例においては、分析された他の核酸から得られた情報と、このようにして得られた情報との比較を容易にする標準的なマーカーで核酸分子をさらに標識するのが好ましくあり得る。例えば、標準的なマーカーは、骨格標識、もしくはヌクレオチドの特定配列（特有配列であれ非特有配列であれ）、またはその核酸分子における特定の位置（例えば、複製開起点、転写プロモーター、セントロメアなど）に結合する標識であり得る。
【０１１５】
骨格標識の一つのサブセットは、核酸染色剤であり、その染色剤は配列非依存的な様式で核酸に結合する。例としては、インターカレイト色素、例えば、フェナントリジン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）およびアクリジン（例えばエチジウムブロミド、プロピジウムヨージド、ヘキシジウムヨージド、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１およびエチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、およびＡＣＭＡ）、副溝結合剤、例えばインドール類およびイミダゾール類（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０およびＤＡＰＩ）；および種々の核酸染色剤、例えば、アクリジンオレンジ（これはまた、インターカレイトする能力を有する）、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバミジンが挙げられる。前述の全ての核酸着色剤は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃのような供給者より、市販されている。なお他の核酸染色剤の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからの以下染色剤：シアニン色素、例えばＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５（ブルー）、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−２５（グリーン）、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５（オレンジ）、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６３（レッド）を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、特にそのタグ分子の標識がそのタグ分子の結合にマイナスの影響を与える場合には、タグ分子よりも核酸結合因子を標識するほうがより好ましい。
【０１１７】
核酸タグ分子および／または核酸結合因子は、抗体または抗体フラグメントおよびそれらに対応する結合パートナーの抗原またはハプテンを使用して、標識され得る。このように結合した抗体およびタンパク質もしくはペプチドの検出は、当業者に周知な手段により行われる。例えば、ジゴキシゲニンまたはニトロフェニルのようなハプテン結合体の使用もまた、本明細書中において十分に適切である。ハプテン結合体に応答して形成する抗体／抗原複合体は、そのハプテンまたは、そのハプテンを認識する抗体の標識に結合することにより、次いでその標識の部位を観察することにより、容易に検出される。あるいは、その抗体は、使用される一次抗体に特異的である二次抗体またはそのフラグメントの使用により、可視化され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が使用され得る。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ＦｄおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントが挙げられる。この結合体は、また、二重特異的抗体を用いてまた標識され得る。
【０１１８】
いくつかの例において、本発明の結合体は、細胞傷害性因子（例えば抗生物質）または核酸切断酵素を用いて、さらに標識され得る。このようにして、この結合体は、治療的目的のため、ならびに核酸の検出および分析のために使用され得る。これは、タグ分子が、障害または障害の素因に関連する公知の遺伝子変異または転位配列特異性を有する場合、特に有効であり得る。
【０１１９】
核酸分子は、線状ポリマー分析システムを用いて分析される。線状ポリマー分析システムは、線状様式でポリマーを分析する（すなわち、ポリマー上の位置地点より開始し、次いでそこからいずれかの方向に線状に進行する）システムである。ポリマーが分析されるとき、そのポリマーに結合した検出可能な標識は、連続的様式もしくは同時様式のいずれかで検出される。同時的に検出される場合、シグナルは、通常ポリマーのイメージを形成し、そのイメージにより標識間の距離が決定され得る。連続的に検出される場合、シグナルは、その核酸分子の速度の知見を用いて、マップへと翻訳され得るヒストグラム（シグナル強度対時間）として表示される。いくつかの実施形態においては、この核酸分子は、固体支持体に結合され、他方、他の実施形態においては、この核酸分子は、自由に漂っていることが、理解されるべきである。いずれの場合においても、例えば相互作用ステーションまたは検出器を通過する際のその核酸分子の速度は、相互に対しておよびその核酸分子上に存在し得る他の検出可能なマーカーに対して、その標識の位置を決定することを助成する。
【０１２０】
それゆえに、線状ポリマー分析システムは、核酸分子上の標識の全量を推論し得るだけではなく、おそらくさらに重要なことであるが、そのような標識の位置についても推論し得る。分析されるゲノムの領域と方向付けおよび／または同定するために、この標識を位置付けおよび配置する能力は、これらのパターンをほかの遺伝子マップ上に重ねることを可能にする。好ましい実施形態において、線状ポリマー分析システムは個々に核酸分子の分析を行う能力を有する（すなわち、このシステムは単一分子検出システムである）。
【０１２１】
そのようなシステムの例は、参照ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／３５０１２およびＷＯ００／０９７５７（それぞれ１９９８年８月１３日および２０００年２月２４日に公開）および米国特許６，３５５，４２０Ｂ１号（２００２年３月１２日発行）に記載される、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステムである。これらの出願および特許の内容ならびに、本明細書中で引用される他の出願および特許ならびに参考文献の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。このシステムは、単一の核酸分子が線状様式で相互作用ステーションを通過させることを可能にし、それによって核酸分子におけるヌクレオチドは、その核酸分子における結合体化される検出可能な標識が存在するかどうかを決定するため個々に調査されることが可能である。その調査は、設定された波長の光学的照射のようなエネルギー源にその核酸分子を曝す工程を包含する。エネルギー源への曝露に応答して、そのヌクレオチド上のその検出可能な標識は、（存在する場合に）検出可能なシグナルを放出する。シグナルの放出および検出のメカニズムは、検出されることが求められる標識の種類に依存する。
【０１２２】
ＤＮＡ分子の伸長を含む他の単一分子核酸分析方法も、またＤＮＡ分子の伸長を含む本発明の方法に使用され得る。これらは、光学的マッピング（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２（５１３０）：１１０−１１４（１９９３）；Ｍｅｎｇ，Ｘ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．９（４）：４３２−４３８（１９９５）；Ｊｉｎｇ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１４）：８０４６−８０５１（１９９８）；およびＡｓｔｏｎ，Ｃ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（７）：２９７−３０２（１９９９））ならびにファイバー蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ）（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５（５１８１）：２０９６−２０９８（１９９７））を含む。光学的マッピングにおいて、核酸分子は、流体サンプルにおいて、伸長させられ、そしてゲル内もしくは表面において、伸長した構造で固定化される。次いで制限分解は、この伸長および固定化された核酸分子に対して行われる。次いで、順序化された制限酵素地図は、制限フラグメントサイズの決定によりつくられる。ファイバー−ＦＩＳＨにおいて、核酸分子は、分子コーミングにより表面に伸長および固定される。蛍光的に標識されたプローブ配列とのハイブリダイゼーションは、核酸分子の配列目印の決定を可能にする。両方法は伸長された分子の固定を要し、その結果、分子の長さおよび／もしくはマーカー間の距離が測定され得る。パルスフィールドゲル電気泳動もまた、標識された核酸分子を分析するため使用され得る。パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ  ３７（１）：６７−７５（１９８４）に記載される。他の核酸分析システムは以下；Ｏｔｏｂｅ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（２２）：Ｅ１０９（２００ｌ）、Ｂｅｎｓｉｍｏｎ，Ａ．ら．米国特許第６，２４８，５３７号、２００１年６月１９日発行、Ｈｅｒｒｉｃｋ，Ｊ．ら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．７（６）：４０９：４２３（１９９９）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ米国特許第６，１５０，０８９号、２０００年１１月２１日発行および米国特許第６，２９４，１３６号、２００１年９月２５日発行に記載される。他の線状ポリマー分析システムもまた使用され得、そして本発明は、本明細書中に挙げたものだけに限定することを意図しない。
【０１２３】
そのような検出システムの性質は、結合体、結合体成分、および核酸を標識するために使用される検出可能な部分の性質に依存する。この検出システムは、当該分野において公知である多数の検出システムから選択され得る。これらは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）検出システム、電子結合素子（ＣＣＤ）検出システム、蛍光検出システム、電気検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近距離場検出システム、全反射（ＴＩＲ）検出システムを含み、これらの内多くのものは、電磁的検出システムである。
【０１２４】
本発明の結合体の標的核酸に対する結合パターンは、ＤＮＡ物理的マップのような標的に関する配列情報を引き出すために使用され得る。上記のように、タグ分子の長さ（およびそれ故その相補的配列）は、そのような情報の解像度を、ある程度支配する。例えば、タグ分子が長ければ、解像度は低くなる。タグ分子を短くすると、連続して配置される結合体が互いにそれぞれ識別され得る限り、可能な解像度は高くる。つまり、連続して配置される結合体は、用いられる検出システムの解像度よりも大きな距離をあけるべきである
（等価物）
先述のものは単に、特定の実施形態の詳細な説明であると理解されるべきである。それゆえに、当業者には、本発明の趣旨および範囲から離れることなく、かつ、慣用的な試験のみで、様々な改変および等価物が形成され得ることは明らかであるべきである。そのような改変および等価物はすべて、添付の特許請求の範囲の目的内に含まれることが意図される。
【０１２５】
この出願内で引用される、全ての参考文献、特許および特許出願は、本明細書中においてこの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、核酸結合因子（「Ｅ」と表記）および核酸タグ分子（「ＰＮＡ」と表記）を含む結合体の略図を示し、ならびにその後の標的核酸分子（「ＤＮＡ」と表記）の走査を示す。
【図２】図２は、蛍光基（Ｒ１およびＲ２）と、タンパク質表面のアミノ基（ａ），カルボシル基（ｂ）、およびチオール基（ｃ）との間で、それぞれイソチオシアン酸塩、カルボジイミド、臭化アルキルを用いて、可能な結合体化の例を示す。
【図３】図３は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の化学構造式を表示する。ＰＮＡ合成の間に形成されたペプチド結合が囲まれている。
【図４】図４は、ｂｉｓＰＮＡの侵襲の後、ｄｓＤＮＡに形成されたループ構造の略図を示す。Ｐループ（一番上の図）、合流若しくは伸張したＰループ（二番目の図）、ライナーオリゴヌクレオチドが付いたＰＤループ（三番目の図）、および、「イアリング」複合体（一番下の図）を示す。
【図５】図５は、二本のｐｃＰＮＡがさらにハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの複合体を示す。また、アデニン、チミン、２，６−ジアミノプリン、および５Ｕ−２−チオウラシルの構造を示す。
【図６】図６は、ロック核酸（ＬＮＡ）の化学構造式を表示する。
【図１】
2005533256.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2005533256.tif 000009