(57)【要約】本明細書は、セプシスを示す状態を検出する方法を記載する。本発明の或る態様では、体液又は組織サンプルにおける３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンの正常レベルからの増加が、早期セプシス又は感染を示す。本発明の別の態様では、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルを測定又は監視して、治療前に存在したレベルが減少することがイン・ビボにおいて治療が作用している徴候又は表示である感染症の治療的処置に対する応答を決定する。好ましい態様では、本発明の方法は、臨床的に関連するセプシスのモデルにおいて例証される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常レベルより上昇したレベルが初期感染又はセプシスを示す感染症に罹病していることが疑われる患者から採取された体液サンプル又は組織サンプル中の３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルを決定することを含む、
セプシスを示す状態の検出方法。
【請求項２】
感染の治療的処置による前記患者の処置の前又は後に、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルを決定又は監視する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３−クロロチロシンのレベルを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
３−クロロチロシンのレベルを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
３−ブロモチロシンのレベルを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
３−ブロモチロシンのレベルを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルをガスクロマトグラフィー及び質量分析法によって決定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立衛生研究所［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ］によって認められ、許諾番号ＡＧ１２２９３で、部分的に米国政府の支持を得てなされた。米国政府は、本発明の権利の一部を有する。
本出願は、２００１年９月１９日に出願された米国出願第６０／３２３５３２号の優先権を主張する。
【０００２】
《発明の分野》
本発明は、セプシスを示す状態を検出する分野に関する。
【０００３】
《発明の背景》
セプシスは、感染、特に敗血症の病巣からの細菌又はその生成物の拡散によって起こる毒性状態である。疾病管理センター（ＣＤＣ）によれば、敗血症は、米国内で、特に高齢者の間で、主要な死因である。敗血症に罹病している患者の４０％〜６０％において、死が発生することがある。米国では１年間に約５０万もの敗血症の症例が発生していると見積もられている。従って、セプシスを示す状態の検出方法は、医学的実務において重要な用途があるであろう。
【０００４】
現在、セプシスは、確認しにくい治療目標として残されている。製薬会社は、セプシスが発生させる細菌性成分に対する作用及び炎症経路及び凝固経路における化学的シグナリング分子に対する作用のための有効な治療法を開発してきた。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のアンタゴニスト及びモノクローナル抗体などの薬剤が、セプシス治療用に開発されてきたが、大きな成功は得られていない。また、ショックへと導く炎症カスケードにおけるメディエータとして一酸化窒素が関連づけられてきたので、一酸化窒素（ＮＯ）のスカベンジャーも提案されている。例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９３／２４１１４３（１９９３年１２月９日公開）及びＷＯ９３／２５２２３０（１９９３年１２月２３日公開）に記載のように、セプシス及び敗血症性ショックの治療用に、凝固経路分子、例えば、ＬＡＣＩ又はＴＦＰＩが開発されている。最近では、ビタミンＫ依存性血漿タンパク質であるヒト活性化プロテインＣが、組換えＤＮＡによって生成され、そしてセプシスに対して有効であるという結果を伴う臨床試験が行われたことが報告されている（Ｂｅｒｎａｒｄら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３４４，ｐｐ．６９９−７０９，２００１年３月）。後者の薬剤は、「ザイグリス」（Ｘｉｇｒｉｓ）と称されている。
セプシスの治療には、どの患者が治療法により利益を受けられるかを予測するため、及び感染の間における治療に対する応答を監視するための、良好な識別マーカー又は診断マーカーが、かなり必要とされている。
【０００５】
酸化剤は、好中球宿主防御系の鍵成分であると考えられている（参考文献１）。好中球は、病原体と接触することにより、酸素の激しい摂取により特徴付けられる呼吸バーストを生じる。生じたスーパーオキシドは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へとディスミューテートする（参考文献２）。Ｈ２Ｏ２の毒性は、Ｈ２Ｏ２を使用してクロライド（Ｃｌ−）を次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）に変換するヘム酵素ミエロペルオキシダーゼによって大きく増幅される（参考文献３〜８）。
Ｃｌ−＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ＋→ＨＯＣｌ＋Ｈ２Ｏ
注目すべきことに、ミエロペルオキシダーゼは、ハライドの血漿濃度においてＣｌ−をＨＯＣｌに酸化する唯一の公知の哺乳動物酵素である（参考文献３〜６）。
【０００６】
クロライドは、ミエロペルオキシダーゼによって使用される主要なハライドであると考えられる。ブロマイド（Ｂｒ−）は、Ｃｌ−の細胞外濃度よりも細胞外濃度が１０００倍以上低い（血漿［Ｃｌ−］＝１００ｍＭ，血漿［Ｂｒ−］＝２０−１００μＭ）ので、殆ど注目されてこなかった（参考文献９）。しかしながら、臭素化する中間体、例えば、ＨＯＢｒも、イン・ビトロにおいて、強力な抗微生物酸化剤である（参考文献１０，１１）。
【０００７】
ハライドの血漿レベルにおいて、ミエロペルオキシダーゼが核酸塩基を塩素化することも、そして臭素化することも、どちらも可能であることが、最近示された（参考文献１２）。その反応経路において、ミエロペルオキシダーゼは、最初にＨＯＣｌを生成し、これが、Ｂｒ−と反応して、臭素化する中間体を生成する（参考文献１２）。この臭素化経路が生理学的に関連があるか否かは、これまで確立されていなかった。
また、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスは、真菌感染に罹りやすいが（参考文献１３，１４）、ミエロペルオキシダーゼ系がイン・ビボで細菌に対して細胞毒性であるか否かも、これまで知られていない。
【０００８】
《発明の簡単な説明》
本発明により、セプシスを示す状態を検出する方法が提供される。
本発明の或る態様では、体液又は組織サンプル中における、正常レベルからの３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルの増加が、初期感染又はセプシスを示す。３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンの上昇したレベルは、初期感染又はセプシスに対する診断マーカーとして役立てることができる。
本発明の別の態様においては、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルを測定又は監視して、感染状態の治療、例えば、抗生物質又は別のそのような治療法に対する応答を決定する。治療前の前記レベルの減少は、初期徴候であるか、又はその治療がイン・ビボで作用していることの指標である。
【０００９】
本発明の有効性を説明するために、臨床的に関連するセプシスのマウスモデル（参考文献１５〜１８）及びガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）において、侵入細菌に対する宿主防御におけるミエロペルオキシダーゼ系の役割を試験した。この多菌性セプシスのマウスモデルは、ミエロペルオキシダーゼ系がイン・ビボで抗微生物性の臭素化する中間体及び塩素化する中間体を生成したことを示した。そのことは、腹膜液サンプル中の３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンのレベルを測定することにより決定することができた。
【００１０】
好中球のミエロペルオキシダーゼ系は、イン・ビトロで、過酸化水素及びクロライドを使用して、強力な殺細菌性酸化剤である次亜塩素酸を生成する。多菌性セプシスの前記マウスモデルにおいて、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスは、野生型マウスよりも感染によって死にやすいことが観察された。敗血症性野生型マウスからの腹膜炎症液の質量分析により、ミエロペルオキシダーゼ系の特徴的最終生成物である３−クロロチロシンの上昇した濃度が検出された。敗血症性のミエロペルオキシダーゼ欠損マウスにおいては、３−クロロチロシンのレベルは上昇しなかった。従って、ミエロペルオキシダーゼは、ハロゲン化種を生成することによって、イン・ビボにおいてセプシスから保護していると考えられる。
【００１１】
より驚くべきことに、３−ブロモチロシンのレベルが、敗血症性野生型マウスからの腹膜液中においても上昇したこと、及び敗血症性のミエロペルオキシダーゼ欠損マウスからの腹膜液中において著しく減少したことが発見された。更に、生理学的濃度のブロマイドは、イン・ビトロにおけるミエロペルオキシダーゼの殺細菌効果を変調した。従って、ブロマイドの細胞外濃度がクロライドの濃度よりも１０００倍以上低いとしても、ミエロペルオキシダーゼは、クロライドと同様にブロマイドを使用して、イン・ビボにおいて酸化剤を生成することができると考えられる。従って、ミエロペルオキシダーゼは、細菌病原体に対する宿主防御において重要な役割を果たし、また、ブロマイドは、この系のこれまで予測できなかった構成成分であると考えられる。
【００１２】
本発明者は、ＵＳＰ６２６８２２０において、体組織中の３−クロロチロシンの上昇したレベルの存在を、アテローム性動脈硬化症に対する診断マーカーとして既に記載しているが、本発明は、患者の分類及び群が完全に異なる。一方で、アテローム性動脈硬化症について評価される患者は、通常、狭心症の痛み、情動性ストレス、又はその他のこのような心臓血管性の状態及び症状を経験した患者であろう。他方で、本発明の方法が指示される患者は、感染する可能性のある患者又は既に感染しているかもしれないと考えられる患者である。
【００１３】
《発明の詳細な説明》
本発明を構成すると考える主題事項を特に指摘し及び明確に請求する特許請求の範囲によって本明細書は完結するが、添付の図面を参酌して、後出の本発明の好ましい態様から、本発明がより理解されるであろうと信じる。
【００１４】
《図面の簡単な説明》
図１は、セプシスの盲腸結紮及び穿刺（cecal ligation andpuncture：ＣＬＰ）モデルにおいて、ミエロペルオキシダーゼ欠損が生存率を悪化させることを示すグラフであり、生存率の％が時間（日）に対してプロットされている。ミエロペルオキシダーゼ欠損（ＭＰＯ−／−）マウス及び同腹の野生型（ＷＴ）対照における死亡率を監視した。
【００１５】
図２は、ＣＬＰ処理された野生型マウスの腹膜炎症液中の３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンのエチルヘプタフルオロブチレート（ＭｔＢＳＴＦＡ）誘導体のＥＣ−ＮＣＩ  ＧＣ／ＭＳ分析を示す。
Ａ：内因性（ｍ／ｚ４８９），
Ｂ：同位体標識（ｍ／ｚ４９５），及び
Ｃ：人工的（ｍ／ｚ４９９）３−クロロチロシン（３−Ｃｌ−Ｔｙｒ）及び３−ブロモチロシン（３−Ｂｒ−Ｔｒｙ）
の同時観察であることに注意されたい。
【００１６】
図３は、擬似手術を行ったマウス及びＣＬＰを行ったマウスの腹膜炎症液中の（Ａ）３−クロロチロシン（３−Ｃｌ−Ｔｙｒ）及び（Ｂ）３−ブロモチロシン（３−Ｂｒ−Ｔｒｙ）の同位体希釈ＧＣ／ＭＳ定量を示す。１２９／ＳｖＪ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドにおいて、ミエロペルオキシダーゼ欠損（ＭＰＯ−／−）マウス及び野生型（ＷＴ）マウス中で、酸化生成物を監視した。
【００１７】
図４は、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系に露出したＮ−アセチル−Ｌ−チロシン（Ｎ−Ａｃ−チロシン）の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。３ｎＭミエロペルオキシダーゼ、１ｍＭ・Ｎ−Ａｃ−チロシン、１０μＭ・ＮａＢｒ、及び５０μＭ・Ｈ２Ｏ２を補充したキーレックス［Ｃｈｅｌｅｘ］処理緩衝液Ａ（１００ｍＭ・ＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸ナトリウム，１００μＭ・ＤＴＰＡ，ｐＨ４．５）中で、３７℃で６０分間反応を続けた。前記反応は、Ｈ２Ｏ２で開始し、そして０．１ｍＭメチオニンで終了した。
【００１８】
図５は、中性ｐＨにおける食細胞ペルオキシダーゼ及び次亜ハロゲン酸によるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの生成に必要な反応を示すグラフである。１０μＭ・Ｂｒ−を補充した緩衝液Ａ中で反応を実施した。
Ａは、ミエロペルオキシダーゼによるＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるｐＨの影響を示す。
Ｂ〜Ｅは、それぞれ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ミエロペルオキシダーゼ、又は好酸球ペルオキシダーゼによるｐＨ７でのＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるタウリン（２００μＭ）の影響を示す。
逆相ＨＰＬＣによってアミノ酸を定量した。結果は、独立した３回の実験において実測した結果の代表である。ＭＰＯ＝ミエロペルオキシダーゼ；ＥＰＯ＝好酸球ペルオキシダーゼ；Ａｃ＝アセチル。
【００１９】
図６は、酸性条件下における食細胞ペルオキシダーゼ及び次亜ハロゲン酸によるＮ−アセチル−Ｌ−３−クロロチロシン及びＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの生成のための反応条件を示すグラフである。（Ａ）ＨＯＣｌ；又は（Ｂ）ミエロペルオキシダーゼによる、Ｎ−アセチル−クロロチロシン及びＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成における［Ｂｒ−］の影響。
（Ｃ）次亜ハロゲン酸（ＨＯＣｌ，ＨＯＢｒ）；又は（Ｄ）食細胞ペルオキシダーゼ（ＭＰＯ，ＥＰＯ）による、Ｎ−アセチルクロロチロシン及びＮ−アセチルブロモチロシンの生成におけるタウリンの影響。
Ａ及びＢに関する反応は、図４の説明に記載されているとおりに実施した。Ｃ及びＤに関する反応は、ｐＨが５．９であったこと以外は、図４の説明に記載されているとおりに実施した。逆相ＨＰＬＣによってアミノ酸を定量した。結果は、独立した３回の実験において実測した結果の代表である。ＭＰＯ＝ミエロペルオキシダーゼ；ＥＰＯ＝好酸球ペルオキシダーゼ；Ａｃ＝アセチル。
【００２０】
本発明をより詳細に説明するために、以下の特定の実験室実施例を実施した。こうして、特定の実施例が説明されているが、これらの特定の説明のための実施例又はその中の詳細事項に本発明が制限されないものと理解されたい。
【００２１】
《実施例》
〈材料〉特に断らない限り、全ての材料を、シグマ−アルドリッチ［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）又はフィッシャー［Ｆｉｓｈｅｒ］（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ペンシルバニア州）から購入した。同位体標識したアミノ酸は、ケンブリッジ同位体研究所［Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（Ａｎｄｏｖｅｒ，マサチューセッツ州）から購入した。マウスミエロペルオキシダーゼ中に存在するペプチド（ＮＴＬＰＫＬＮＬＴＳＷＫＥＴ）［配列番号１］（参考文献１４）に対して、ウサギポリクローナル抗体を作成した。
【００２２】
〈動物〉ワシントン医科大学［Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ］の動物研究委員会［Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ］が、全ての動物実験を承認した。ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスを、１２９／ＳｖＪバックグランド中で生成した。使用前に、それらをＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグランドに少なくとも４世代戻し交雑した（参考文献１４）。Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ及びＳｖ１２９／Ｊマウスを、ジャクソンラボラトリーズ［Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，マサチューセッツ州）から得た。マウスは、１２時間明期−暗期スケジュールにおいて病原体のない条件下に維持し、そして齧歯類用の飼料（ｒｏｄｅｎｔ  ｄｉｅｔ  ５００１：Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウイスコンシン州）に自由にアクセス可能にしておいた。
【００２３】
〈一般手順〉ミエロペルオキシダーゼを、ＨＬ６０細胞から精製した（参考文献１９）。吸光スペクトル（Ａ４３０／Ａ２８０比＞０．８）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びペルオキシダーゼ活性ゲル電気泳動（参考文献２０）によって評価したところ、酵素は見かけ上純粋であった。ブタ好酸球ペルオキシダーゼ（Ａ４１５／Ａ２８０＞０．９）を、ＥｘＯｘＥｍｉｓ（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｒｏｃｋ，アーカンソー州）から得た。前記のとおりに、クロライドを含まないＮａＯＣｌ及びＨＯＢｒを従来法によって調製した（参考文献２１，２２）。４％チオグリコレートの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって腹膜白血球を誘引し、そして注射の２４時間後に収集した（参考文献２３）。１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。分別したタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、リン酸干渉化食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭホスフェート，１３８ｍＭ・ＮａＣｌ、２．７ｍＭ・ＫＣｌ，ｐＨ７．４）中の５％ミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、４℃で一晩ブロッキングした。次に、そのブロットを、ウサギ抗マウスミエロペルオキシダーゼ抗体（１：１０００）、続いて西洋わさびペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギイムノグロブリン抗体（１：１００００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，カリフォルニア州）と一緒にインキュベーション（１時間）した。ウエスト・ピコ［Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ］化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，イリノイ州）を加え、そしてその膜をオートラジオグラフィーフィルムに露出し、そして現像した。
【００２４】
〈反応条件〉１ｍＭ・Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンと、５０μＭ次亜ハロゲン酸又は３ｎＭペルオキシダーゼ及び５０μＭ・Ｈ２Ｏ２とを補充した緩衝液Ａ（１００ｍＭ・ＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸ナトリウム，１００ｍＭジエチレントリアミンペンタ酢酸［ＤＴＰＡ］）中において、３７℃で６０分間反応を実施した。使用前に、キーレックス樹脂カラム上に緩衝液Ａを通過させて、レドックス活性遷移金属イオンを除去した。酸化剤の添加により反応を開始し、そして０．１ｍＭメチオニンによって終了した。
【００２５】
〈ハロゲン化アミノ酸の逆相ＨＰＬＣ分析〉
２７５ｎｍで監視しながらウォーターズ［Ｗａｔｅｒｓ］４８４波長可変吸光度検出器につないだウルトラスフェア［Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ］ＯＤＳ逆相カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ；５μｍ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，カリフォルニア州）を使用し、流速１ｍＬ／分で分析を実施した。溶媒Ａは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，ｐＨ２．５）であり、そして溶液Ｂは、メタノール中０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．５）であった。勾配の概要は以下のとおりであった、すなわち、Ａ：Ｂの６６：３４（ｖ／ｖ）で２．１分間かけて定組成溶離；３０分間かけてＢを３４％から４０％へ直線状増加；Ａ：Ｂの６０：４０で３分間定組成溶離；２分間かけてＢを４０％から１００％へ増加；及び１００％Ｂで３分間定組成溶離。集積したピーク領域を使用し、標準品Ｎ−Ａｃ−クロロチロシン及びＮ−Ａｃ−ブロモチロシンの標準曲線と比較することによって、生成物を定量した。
【００２６】
〈セプシスモデル〉前記のとおりの従来法によって、歳が適合し（８〜１６週齢）且つ性別が適合するマウスの盲腸結紮及び穿刺を実施した（参考文献１６）。手術から２４時間後に、ＰＢＳ、又は５０μＭブチル化ヒドロキシトルエン、１００μＭ・ＤＴＰＡ、１ｍＭアジ化ナトリウム、及び１０ｍＭアミノトリアゾールを補足したＰＢＳ５ｍＬで、腹膜を洗浄した。分析まで洗浄液を−８０℃で貯蔵した。対照実験は、抗酸化剤を含むことが、生成物の検出量に何ら影響しないことを示した。生存率実験のために、手術から約１時間後に、動物にメトリノジゾール［ｍｅｔｒｉｎｏｄｉｚｏｌｅ］（３５ｍｇ／ｋｇ）及びセフトリアゾン（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。手術後２４時間の時点で、抗細菌注射をもう一回繰り返した。マウスは、水及び飼料に自由にアクセス可能にしておいた。
【００２７】
〈細胞分析〉遠心分離によりスライド上に細胞をペレット化し、そして変形Ｗｒｉｇｈｔ染色法（Ｄｉｍｓｃｉｏ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ミズーリ州）で染色した。比較医薬学部［Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ］（ワシントン医科大学）によって細胞の計数を実施した。
【００２８】
〈ペルオキシダーゼ活性アッセイ〉腹膜洗浄液を遠心分離（４℃，１０分間，１６０００×ｇ）した。そのペレットに、２５％グリセロール及び３５ｍＭβ−アラニン（ｐＨ４．５）を含むセチルトリメチルアンモニウムブロマイド緩衝液（０．３％；５００μＬ）を加え、そしてその混合物を１０分間超音波破砕した。２回目の遠心分離（１０分間，１６０００×ｇ）をした後に、上清中の可溶性タンパク質を、在来の（ｎａｔｉｖｅ）ＰＡＧＥ、及びペルオキシダーゼ活性染色法で処理した（参考文献２０）。
【００２９】
〈ＧＣ／ＭＳ分析〉腹膜液５００μＬに、同位体標識した内部標準（１ｐｍｏｌ・Ｌ−３−クロロ［１３Ｃ６］チロシン，５００ｆｍｏｌ・Ｌ−３−ブロモ［１３Ｃ６］チロシン，１０ｎｍｏｌ・Ｌ−［１３Ｃ９，１５Ｎ］チロシン）を加え、そしてこれまでに記載されているとおりの従来法によって、ＧＣ／ＭＳ分析用に調製した（参考文献２４，２５）。要するに、Ｃ１８カラム、次いでスペルコ・クロム［Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃｈｒｏｍ］Ｐカラムによる固相抽出を用いて、アミノ酸を単離した（参考文献２４，２５）。サンプルを、無水Ｎ２下で乾燥し、そして分析まで−２０℃で貯蔵した。
【００３０】
エチルヘプタフルオロブチレート及びＮ−メチル−Ｎ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−トリフルオロアセトアミド＋１％トリメチルクロロシラン（ＭｔＢＳＴＦＡ）によって誘導体化した後に、そのサンプルを、無水Ｎ２下で乾燥し、そしてウンデカン／ＭｔＢＳＴＦＡ（３：１ｖ／ｖ）５０μＬ中に再び懸濁した。電子捕獲陰性化学イオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＣ−ＮＣＩ）モードのヒューレットパッカード（ＨＰ）５９７３質量検出器につないだＨＰ６８９０ガスクロマトグラフを用いて、選択したイオンを監視することによって、サンプル１μＬを分析した。注入器、トランスファーライン、及び材料の温度を、最初に、それぞれ１８３℃、３００℃、及び２５０℃に設定した。前記注入器及びトランスファーラインの温度は、４０℃／分で１８０℃から３００℃の温度勾配で徐々に増加するように設定した。３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンを、ｍ／ｚ４８９におけるそれぞれのイオン（［Ｍ−ハライド−ｔ−ブチル−ジメチルシリル］−）及び同位体により環を標識したそれらの［１３Ｃ６］−内部標準（ｍ／ｚ４９５）を用いて定量した。サンプルワークアップ間における強力な人工産物の形成を、Ｌ−［１３Ｃ９，１５Ｎ］チロシンから誘導されたイオンのｍ／ｚ４９９における出現として監視した（参考文献２４，２５）。
【００３１】
〈液体クロマトグラフィー−電気スプレー電離−ＭＳ〉逆相ＨＰＬＣによりＮ−アセチルアミノ酸を分離し、そしてフィニガン［Ｆｉｎｎｉｇａｎ］ＬＣＱによって分析した（参考文献２６）。その陰イオン化モードで完全質量スキャニング（ｍ／ｚ１００〜３５０）及びタンデムＭＳ分析を実施した。
【００３２】
〈殺細菌性〉これまでに記載されているとおりの従来法によって、ミエロペルオキシダーゼの殺菌活性を定量した（参考文献２７）。要するに、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を、ルリア−ベルタニ［Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ］ブロス中でミッド−ログ［ｍｉｄ−ｌｏｇ］生長フェーズまで培養し、ＰＢＳで洗浄し、そして細菌１０９／ｍＬで使用した。ＰＢＳ（ｐＨ５．５）中の５ｎＭ酵素、５ｎＭ・Ｈ２Ｏ２、及び１００ｍＭ・ＮａＣｌを用いて、３７℃で１５分間細菌をインキュベーションした。直ぐに、連続希釈物を寒天プレート上に播き、そして３７℃で一晩インキュベーションした後に、コロニー形成単位を決定した。
〈統計的分析〉フィッシャー［Ｆｉｓｈｅｒ］の正確Ｐ検定を用いて、前記生存率実験を評価した。他の全てのデータを、ステゥーデント［Ｓｔｕｄｅｎｔ］のｔ検定によって分析した。有意性は、Ｐ＜０．０５において許容した。
【００３３】
《結果》
〈ミエロペルオキシダーゼ欠損は、セプシスの盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）モデルにおいて死亡率を増加させた〉ミエロペルオキシダーゼ欠損マウス及び臨床的関連体、並びに腹腔内感染症及びセプシスの広く利用されているモデルを使用して、宿主防御におけるミエロペルオキシダーゼ系の潜在的役割を評価した。盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）モデルにおいて、終点が行き止まりの盲腸を結紮し、そして孔を開けて（参考文献１６）、腹腔内に腸管の微生物相を放出した。これまでの実験では、野生型マウスの３５〜４５％がこの手順で７日間以上も生存することが示されている（参考文献１６，１８）。ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスがＣＬＰされた場合には、手術から５日後に１匹も動物が生存していなかった（図１）。対照的に、野生型の同腹対照マウスの６３％が５日後に生存しており、そして３８％が１週間後に生存していた（図１；Ｐ＝０．０２）。
【００３４】
野生型マウス（ｎ＝７；好中球７７±３％，マクロファージ２３±３％，好酸球０．３±０．２％）及びミエロペルオキシダーゼ欠損マウス（ｎ＝１１；好中球７７±４％，マクロファージ２３±３％，好酸球０．９±０．５％）の双方から引き抜かれた細胞の集団において、好中球が優勢であった。前記マウスがＣＬＰされた後では、赤血球、細胞破片、及び微生物も腹膜液中に現れた。重要なことに、ミエロペルオキシダーゼ欠損動物のセプシスに対する細胞応答は、野生型動物のそれに匹敵していた。
【００３５】
〈セプシスの間、遊離３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンのレベルが非常に上昇する〉細胞毒性ＨＯＣｌの生成物である３−クロロチロシンに対して注意を向けて、セプシスの間にミエロペルオキシダーゼ系の生成物が蓄積するか否かを決定した（参考文献２８）。３−ブロモチロシンのレベルも定量して、ミエロペルオキシダーゼによる臭素化の生理学的有意性を調査した。野生型マウスをＣＬＰして、前記洗浄液の細胞成分及び細胞外成分中の遊離３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンを回収した。２４時間後に、洗浄により腹膜から炎症液を収集した。前記洗浄液は、白血球、細菌、及び炎症性滲出液を含んでおり、これを冷凍した。解凍した液体を、遠心分離してペレット状細胞破片にし、そして上清を収集して、遊離アミノ酸を回収した。
【００３６】
エチルヘプタフルオロブチレート及びＭｔＢＳＴＦＡを用いてアミノ酸を誘導体化し、そしてＥＣ−ＮＣＩモードでＧＣ／ＭＳによって分析した。サンプル調製（参考文献２４）の間にハロゲン化チロシンが生成されるのを防ぐために、酸性条件を回避する高感度（＜１００ａｍｏｌ）及び特異的ＧＣ／ＭＳ法を使用した（参考文献２４，２５）。
前記方法で、標準品３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンの主要イオン及び保持時間と、同じ主要イオン及び保持時間を示す化合物を検出した（図２ａ）。選択されたイオンの監視により、前記アミノ酸から誘導されたイオンが、１３Ｃで標識された内部標準から誘導されたイオンと一緒に共溶離したことが示された（図２ａ，ｂ）。各化合物の同一性は、酸化された各アミノ酸のＭｔＢＳＴＦＡ誘導体を用いて、信頼できる標準と比較することによって確認した。Ｌ−［１３Ｃ９，１５Ｎ］チロシンをサンプル中に含ませ、そしてＬ−３−クロロ［１３Ｃ９，１５Ｎ］チロシン又はＬ−３−ブロモ［１３Ｃ９，１５Ｎ］チロシンに対して監視を行って、ハロゲン化アミノ酸の全ての人工的な生成を監視した（図２ｃ）。この方法で生物材料を分析する場合又は純粋なチロシンを分析する場合には、人工物の生成は無視することができた。
【００３７】
擬似手術を行った動物からの腹膜液は、低レベルの３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンしか含んでいなかった（図３ａ，ｂ）。ＣＬＰ動物からの液は、１６倍高いレベルの３−クロロチロシン（Ｐ＝０．０３）、及び６倍高いレベルの３−ブロモチロシン（Ｐ＝０．０３）を含んでいた。これらの観察は、セプシスによって起こされた急性炎症の間、ハロゲン化中間体の生成が劇的に増加したことを示している。
【００３８】
〈セプシスの間、ミエロペルオキシダーゼは３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンを生成する〉敗血症のミエロペルオキシダーゼ欠損マウスにおけるアミノ酸レベルを定量して、ミエロペルオキシダーゼを含む経路が、炎症性滲出液中に見られるハロゲン化Ｌ−チロシンの上昇したレベルに対して応答可能か否かを決定した。野生型マウスが敗血症になった場合には、遊離３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンの洗浄液レベルが上昇したのに対して、ミエロペルオキシダーゼ欠損動物がＣＬＰをされた後では、３−クロロチロシンレベルは、僅かに増加しただけである（Ｐ＝０．０００４）。遺伝的に異なるマウスも、ＣＬＰ後に、野生型マウスよりも５９％少ない３−ブロモチロシンを生成した（Ｐ＝０．００９）。
【００３９】
これらの実験に使用したミエロペルオキシダーゼ欠損動物を、少なくとも４世代Ｃ５７Ｂ１／６Ｊバックグランドに戻し交雑した。ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスの２つのバックグランドを表す野生型マウスの２つの群においてＣＬＰを実施して、動物の遺伝的背景における違いが前記結果と関係ないことを保証した。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ（ｎ＝１１）及びＳｖ１２９／Ｊ（ｎ＝９）野生型動物は、同様のチロシン塩化及び臭化パターンを示した。
【００４０】
擬似手術された動物から単離された腹膜細胞（マクロファージ優勢）をイムノブロッティングした場合には、ミエロペルオキシダーゼが検出できなかった。ＣＬＰを行った野生型マウスからの腹膜細胞は、急性好中球炎症応答に対して予測されたように、免疫応答性ミエロペルオキシダーゼのレベルが非常に高かった。対照的に、敗血症のミエロペルオキシダーゼ欠損マウスから単離された腹膜細胞は、免疫応答性タンパク質を含んでいなかった。これらの結果は、セプシスの間に、正常マウスの腹膜内でミエロペルオキシダーゼ含有細胞の数が非常に増えたこと、及びミエロペルオキシダーゼ欠損マウスが、免疫応答性酵素を欠いていることを示している。
【００４１】
ミエロペルオキシダーゼ欠損動物の３−ブロモチロシンを生成する能力の低下は、ミエロペルオキシダーゼが、臭素化する中間体をイン・ビボで生成することを示している。あるいは、遺伝的処理で、ミエロペルオキシダーゼのように、好酸球ペルオキシダーゼを欠失させることができた。ヒトにおいては、この臭素化する酵素の遺伝子が、染色体１７上において、ミエロペルオキシダーゼ遺伝子の近くに位置する（参考文献２９）。二重欠失の可能性を除外するために、野生型から単離された炎症細胞中でペルオキシダーゼ活性を測定し、そしてミエロペルオキシダーゼ欠損マウスに対してＣＬＰを実施した。前記野生型細胞は、ヒトのミエロペルオキシダーゼと一緒に泳動し、ペルオキシダーゼ活性を有する材料の大きな単一のバンドを生じた。この材料は、ミエロペルオキシダーゼ欠損ＣＬＰ処理マウスから単離された細胞では検出できなかった。従って、ＣＬＰ後に腹膜中に出現した炎症細胞中の前記ペルオキシダーゼは、好酸球ペルオキシダーゼよりもむしろミエロペルオキシダーゼである。
【００４２】
対照的に、チオグリコレートを注射した野生型マウスの腹腔から単離された白血球の抽出物は、無変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、２つのペルオキシダーゼ活性バンドを生じた。その急速に泳動したバンド及びゆっくりと泳動したバンドは、それぞれ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼ及びヒトミエロペルオキシダーゼと一緒に泳動した。ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスからの細胞抽出物は、好酸球ペルオキシダーゼに相当する急速泳動バンドしか生じなかった。これらの結果は、前記野生型マウス及び遺伝的に異なる前記マウスのどちらも、好酸球ペルオキシダーゼを生成することができたことを示している。これらの観察は、まとまって、ミエロペルオキシダーゼが、ＣＬＰを実施された敗血症の野生型マウス中で、３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンを生成した酵素であったことをはっきりと示している。
【００４３】
〈Ｂｒ−の生理学的濃度は、イン・ビトロにおけるミエロペルオキシダーゼの殺細菌活性を変調する〉ミエロペルオキシダーゼを持たないマウスが、野生型マウスよりもセプシスに対してより脆弱であり、また、より低いレベルのハロゲン化チロシンしか生成しないことが示されてきて、細菌病原体であるクレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）におけるハライド及びミエロペルオキシダーゼの効果に直接注目が集まった。前記のとおり、完全なミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−系は、インキュベーション混合物中の前記細菌の４７％を殺した。低濃度（１μＭ）のＢｒ−の添加は、殺細菌性を非常に増加させ（７２％死亡）；高濃度（１０μＭ）のＢｒ−の添加は、完全に阻害的であった。従って、［Ｂｒ−］における生理学的にあり得る変形は、イン・ビトロにおいてＫ・ニューモニアエを殺すミエロペルオキシダーゼの能力に大きく影響する。
【００４４】
〈イン・ビトロにおけるミエロペルオキシダーゼによるチロシンの臭素化〉ヌクレオシド及び核酸塩基を臭素化するハロゲン転移経路（参考文献１２）が、前記ＣＬＰ実験で臭素化されたチロシンもハロゲン化することができるか否かを決定することにより、ブロマイドのこの細胞毒性効果の可能性のあるメカニズムに対する調査を実施した。これらの実験には、クロラミン形成を回避するため及びＬ−チロシンのｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドへの変換を避けるため、Ｌ−チロシン自体よりもむしろＮ−アセチル−Ｌ−チロシンを使用した（参考文献２２）。
【００４５】
Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンを、酵素、Ｈ２Ｏ２、及び血漿濃度のハライド（１００ｍＭ・Ｃｌ−及び１０μＭ・Ｂｒ−）にＮ−アセチル−Ｌ−チロシンを露出した後に、逆相ＨＰＬＣにより早期及び後期の溶出生成物を検出し、それを、それぞれ、標準品Ｎ−アセチル−Ｌ−３−クロロチロシン及びＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンと一緒に泳動させた（図４）。陰イオン電気スプレー電離タンデム型質量分析によって、そのハロゲン化アミノ酸の同一性を確認した。
【００４６】
Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンの塩素化及び臭素化のどちらも酸性条件下で最適であったが、中性ｐＨにおいても有意レベルのハロゲン化アミノ酸が生成した（図５ａ）。酸性条件下（ｐＨ５．９）においても中性条件下においても、ミエロペルオキシダーゼによる臭素化は、酵素及びＨ２Ｏ２の両方とも必要であり；カタラーゼ（ペルオキシドスカベンジャー）、アジ化ナトリウム（ヘム毒）、及びタウリン（次亜ハロゲン酸のスカベンジャー）によって阻害された。
【００４７】
〈ハロゲンイオンの生理学的にあり得る濃度においてミエロペルオキシダーゼがＮ−アセチル−Ｌ−チロシンを臭素化する〉次に、生理学的条件下でミエロペルオキシダーゼがチロシンを酸化する場合に、ミエロペルオキシダーゼがブロマイド又はクロライドを使用することが好ましいか否かを決定した。試薬ＨＯＣｌ又はミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２系が酸性条件下（図６ａ，ｂ）又は中性条件下でＮ−アセチル−Ｌ−チロシンを酸化させた場合には、１００ｍＭ・Ｃｌ−のみの存在下で、Ｎ−アセチル−Ｌ−３−クロロチロシンが主要な生成物であった。各酸化系への（１００ｍＭ・Ｃｌ−の存在下での）Ｂｒ−のμＭレベルでの添加は、Ｎ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンを生成し、そしてＮ−アセチル−Ｌ−３−クロロチロシン生成の相当する減少を起こした（図５ａ，図６ａ，ｂ）。Ｎ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシン及びＮ−アセチル−Ｌ−３−クロロチロシンの相対的な収量は、その反応混合物のｐＨ及び［Ｂｒ−］によって変化する（図５ａ，図６ａ，ｂ）。
【００４８】
タウリン（ＨＯＣｌのスカベンジャー）は、弱酸性（ｐＨ５．９）条件下において、ＨＯＣｌ−Ｃｌ−−Ｂｒ−系によるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの形成を阻害した（図６ｃ）。全く対照的に、タウリンは、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）によるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの形成を刺激した。このことは、ブロムアミン類が強力な臭素化剤であることを示している。また、タウリンは、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系によるＬ−チロシン臭素化も阻害した（図６ｄ）。しかしながら、好酸球ペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系によるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの生成には影響しなかった（図６ｄ）。これらの観察は、ミエロペルオキシダーゼは、最初に、Ｃｌ−をＨＯＣｌに酸化し、次いでそのＨＯＣｌをＢｒ−と反応させて、反応性のある臭素化する中間体を生成するということを強く暗示している。
【００４９】
タウリンは、中性条件下において、ＨＯＣｌ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系によるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの形成を完全に阻害したが、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系を部分的にしか阻害しなかった（図５ｃ，ｄ）。対照的に、タウリンは、ＨＯＢｒによるＮ−アセチル−Ｌ−３−ブロモチロシンの形成を刺激し、そして好酸球ペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系に若干影響があった（図５ｃ，ｄ）。これらの結果は、ミエロペルオキシダーゼが、異なる２経路によってＢｒ−を酸化することを示している。弱酸性条件及び中性条件下で作用する経路において、前記酵素は、最初に、ＨＯＣｌを生成し、次いでこれがＢｒ−を酸化する。中性ｐＨにおいてのみ作用する経路においては、ミエロペルオキシダーゼは、直接Ｂｒを酸化する。
【００５０】
本発明者は理論に拘束されているわけではないが、前記結果は、以下のように説明することができると考えられる：
３０年以上も前に、クレバノフ［Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ］は、ミエロペルオキシダーゼによって生成されるハロゲン化する中間体が、殺細菌において大きな重要性を有することを指摘した（参考文献３０）。しかしながら、侵入している病原体に対する宿主の防御における前記酵素の役割は、不明瞭なままであった。本明細書に記載の実験は、腹腔内に細菌を放出する敗血症の臨床的関連モデルであるＣＬＰ後に、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスの方が野生型マウスよりも死にやすいことを明らかにした。この観察は、イン・ビボにおいてミエロペルオキシダーゼが細菌の細胞毒を生成することの理解を支持する。更に、前記酵素は、イン・ビトロにおいて、ハライドを用いて、Ｋ．ニューモニアエを殺すことができた。また、腹腔内にＫ．ニューモニアエを注射した後に、ミエロペルオキシダーゼ欠損マウスの方が野生型マウスよりも死にやすいことも発見された。従って、ミエロペルオキシダーゼは、マウス内の抗細菌防御機構に対して重要な意味を有すると思われる。
【００５１】
ミエロペルオキシダーゼがイン・ビボにおいて抗細菌防御に貢献することに関する更なる証拠は、野生型マウスにＣＬＰを行った後の腹膜洗浄液において、その酵素の特徴的生成物の１つである３−クロロチロシンのレベルが、非常に上昇するという観察に基づいた。また、３−ブロモチロシンのレベルも増加した。ミエロペルオキシダーゼを欠損した敗血症マウスは、擬似手術した動物において観察されたレベルを上回るレベルで３−クロロチロシンを生成することができなかった。このことは、ミエロペルオキシダーゼが、このセプシスモデルにおける塩素化する酸化剤の主な供給源であることを示している。また、３−ブロモチロシンのレベルも、おそらく好酸球ペルオキシダーゼ活性が理由で、敗血症でない野生型マウスにおけるレベルよりも僅かに高いものの、敗血症のミエロペルオキシダーゼ欠損動物において非常に低下した。これらの観察は、ミエロペルオキシダーゼが、塩素化する酸化剤及び臭素化する酸化剤を生成し、この生成が、以前から、単に好酸球ペルオキシダーゼに基づいていた（参考文献１１，３１，３２）ことを示した。従って、ミエロペルオキシダーゼ依存塩素化及びミエロペルオキシダーゼ依存臭素化のどちらも、殺細菌に対して生理学的に関連する経路を意味することができる。また、ヒポチオシアナイト及びチオシアネートから誘導される他の酸化剤も、この擬ハライドは、細胞外液中に高濃度で存在し、且つペルオキシダーゼによって簡単に酸化されるので、有用であることができる（参考文献３３）。
【００５２】
ミエロペルオキシダーゼによって生成されるハロゲン化中間体としては、チロシンを３−クロロチロシンに変換する強力な細胞毒性酸化剤であるＨＯＣｌ（参考文献３，４）を挙げることができる。前記観察は、ハロゲンイオンが血漿濃度のイン・ビトロにおいても、ミエロペルオキシダーゼが、チロシンを臭素化するであろうということを示している。注目すべきことに、前記臭素化経路は、Ｃｌ−濃度がＢｒ−濃度よりも１０００倍から１００００倍高い場合にも作用する。従って、前記経路が生理学的に関連していると考えられる。
【００５３】
ミエロペルオキシダーゼによるＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成は、中性ｐＨにおいて起きたが、酸性条件の方が最適であった。従って、イン・ビボにおいて、ミエロペルオキシダーゼは、中性条件において細胞外で、及び酸性条件下でファゴリソソーム（又は低酸素性炎症組織）中でも、チロシンをハロゲン化することができよう。タウリンは、酸性ｐＨにおいて、殆ど完全に臭素化を阻害した。このことは、ＨＯＣｌが前記経路における中間体であることを示している。対照的に、タウリンは、中性ｐＨにおいて、ミエロペルオキシダーゼによるＮ−アセチル−Ｌ−ブロモチロシンの生成を部分的にしか阻害しなかった。このことは、ＨＯＣｌを含まない臭素化経路が存在することを示している。この第二の経路に関する１つの可能性は、好酸球ペルオキシダーゼがするように、ミエロペルオキシダーゼも直接Ｂｒ−をＨＯＢｒに酸化することができたということである（参考文献１１，２０）。中性ｐＨ及び１０μＭ・Ｂｒ−条件において、ミエロペルオキシダーゼは、同様の濃度のＮ−アセチル−Ｌ−ブロモチロシン及びＮ−アセチル−Ｌ−クロロチロシンを生成した。このことは、前記酵素が、細胞外環境においてハロゲン化する中間体を製造することができたことを示している。対照的に、ウー［Ｗｕ］らは、好中球が生成し、３−ブロモチロシンよりも更にずっと効果的な、タンパク質結合３−クロロチロシンを発見した（参考文献３４）。この矛盾に対する１つの説明として、本発明の実施例は、遊離アミノ酸のハロゲン化に焦点を当てているのに対して、ウーらは、タンパク質のハロゲン化を実験したことが考えられる。
【００５４】
これらの観察は、機能的なミエロペルオキシダーゼを欠くマウスが多菌性のセプシスによってより死にやすいこと、遊離３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンのイン・ビボレベルがセプシスの間に上昇すること、及びミエロペルオキシダーゼが不在の場合には、これらハロゲン化アミノ酸の生成が非常に減ること、を示した。従って、ミエロペルオキシダーゼは、ＣＬＰ誘発セプシスに対してマウスを防御することができると考えられる種々の塩素化する中間体及び臭素化する中間体を生成することができる。前記酵素が不在の場合には、これらの中間体の生成物は腹膜液中に蓄積することなく、そしてマウスは、感染に対してより脆弱になる。
【００５５】
本明細書の開示を読んだ後に、本発明の精神及び範囲から離れることのない種々の別の実施例が、当業者に明らかになろう。全てのそれらの別の実施例も、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。従って、体液又は組織のサンプル中の３−クロロチロシン及び３−ブロモチロシンの存在及びレベルは、本明細書に具体的に説明したように、ＧＣ／ＭＳ以外の方法によっても決定することができる。
【００５６】
例えば、これらのマーカーのレベルは、前記マーカーに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイにおいて、従来の免疫沈降法によって決定することができる。１−及び２−位置放射免疫測定法及び酵素免疫測定法、例えば、「Ｅｎｇｖａｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１０９，ｐｐ．１２９−１３５（１９７２）」に記載の酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を、前記マーカーのレベルの決定に用いることができる。免疫測定法にモノクローナル抗体は、「
【化１】
2005527785.tif 000002
ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７（１９７５）」及び「
【化２】
2005527785.tif 000003
ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．５１１−５１９（１９７６）、並びに「Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク州，１９８３」に記載されている従来のハイブリドーマ法によって調製することができる。
【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、セプシスの盲腸結紮及び穿刺（cecal ligation andpuncture：ＣＬＰ）モデルにおいて、ミエロペルオキシダーゼ欠損が生存率を悪化させることを示すグラフであり、生存率の％を時間（日）に対してプロットされている。ミエロペルオキシダーゼ欠損（ＭＰＯ−／−）マウス及び同腹の野生型（ＷＴ）対照における死亡率を観察した。
【図２】図２は、ＣＬＰ処理された野生型マウスの腹膜炎症液中の３−ブロモチロシン及び３−クロロチロシンのエチルヘプタフルオロブチレート（ＭｔＢＳＴＦＡ）誘導体のＥＣ−ＮＣＩ  ＧＣ／ＭＳ分析を示す。Ａ：内因性（ｍ／ｚ４８９），Ｂ：同位体標識（ｍ／ｚ４９５），Ｃ：人工的（ｍ／ｚ４９９）３−クロロチロシン（３−Ｃｌ−Ｔｙｒ）及び３−ブロモチロシン（３−Ｂｒ−Ｔｒｙ）の同時観察であることに注意されたい。
【図３】図３は、擬似手術を行ったマウス又はＣＬＰ処理したマウスの腹膜炎症液中の（Ａ）３−クロロチロシン（３−Ｃｌ−Ｔｙｒ）及び（Ｂ）３−ブロモチロシン（３−Ｂｒ−Ｔｒｙ）の同位体希釈ＧＣ／ＭＳ定量を示す。１２９／ＳｖＪ及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景において、ミエロペルオキシダーゼ欠損（ＭＰＯ−／−）マウス及び野生型（ＷＴ）マウス中で、酸化生成物を監視した。
【図４】図４は、ミエロペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２−Ｃｌ−−Ｂｒ−系に露出したＮ−アセチル−Ｌ−チロシン（Ｎ−Ａｃ−チロシン）の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。３ｎＭミエロペルオキシダーゼ、１ｍＭ・Ｎ−Ａｃ−チロシン、１０μＭ・ＮａＢｒ、及び５０μＭ・Ｈ２Ｏ２を補充したキーレックス［Ｃｈｅｌｅｘ］処理緩衝液Ａ（１００ｍＭ・ＮａＣｌ，５０ｍＭリン酸ナトリウム，１００μＭ・ＤＴＰＡ，ｐＨ４．５）中で、３７℃で６０分間反応を続けた。前記反応は、Ｈ２Ｏ２で開始し、そして０．１ｍＭメチオニンで終了した。
【図５Ａ】図５Ａは、ミエロペルオキシダーゼによるＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるｐＨの影響を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＯＣｌによるｐＨ７でのＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるタウリン（２００μＭ）の影響を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＨＯＢｒによるｐＨ７でのＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるタウリン（２００μＭ）の影響を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ミエロペルオキシダーゼによるｐＨ７でのＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるタウリン（２００μＭ）の影響を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、好酸球ペルオキシダーゼによるｐＨ７でのＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成におけるタウリン（２００μＭ）の影響を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＨＯＣｌによる、Ｎ−アセチル−クロロチロシン及びＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成における［Ｂｒ−］の影響を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ミエロペルオキシダーゼによる、Ｎ−アセチル−クロロチロシン及びＮ−アセチル−ブロモチロシンの生成における［Ｂｒ−］の影響を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、次亜ハロゲン酸（ＨＯＣｌ，ＨＯＢｒ）による、Ｎ−アセチルクロロチロシン及びＮ−アセチルブロモチロシンの生成におけるタウリンの影響を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、食細胞ペルオキシダーゼによる、Ｎ−アセチルクロロチロシン及びＮ−アセチルブロモチロシンの生成におけるタウリンの影響を示す。
【配列表】
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【図５Ｂ】
2005527785.tif 000005
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2005527785.tif 000007
【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【国際調査報告】
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