(57)【要約】本発明は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ）ファミリーのタンパク質をコードし、したがってＮｇＲホモログ１（ＮｇＲＨ１）と呼ばれる遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、神経系の再生および保護に有用である可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物を同定する上での、またＮｇＲＨ１ポリペプチド、誘導体および抗体を生産するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号２または配列番号２５の配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド；
（b）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（c）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列、および
（d）（a）〜（c）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチド配列が配列番号２または配列番号２５である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
（a）配列番号１または配列番号２４のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（b）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（d）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは配列番号２４、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらの断片の配列を有する標識プローブでライブラリーをスクリーニングすることにより得られた少なくとも１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（e）（a）〜（d）のポリヌクレオチドのＲＮＡ同等物であるポリヌクレオチド；または上記ポリヌクレオチドの変異体および断片であるか、もしくは上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的である、上記の単離ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列
からなる群から選択される、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
（a）配列番号１または配列番号２４のポリヌクレオチドを含んでなる単離ポリヌクレオチド；
（b）配列番号１または配列番号２４の単離ポリヌクレオチド；
（c）配列番号２または配列番号２５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチド；および
（d）配列番号２または配列番号２５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
発現ベクターが適合宿主細胞に存在する場合に請求項１に記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含んでなる発現系。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターまたは請求項１のポリペプチドを発現する膜を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、上記ポリペプチドの産生に十分な条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養し、そして培養培地からポリペプチドを回収するステップを含んでなる方法。
【請求項８】
免疫グロブリンＦｃ領域および請求項１に記載のいずれか１種のポリペプチドからなる融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜２のいずれか一項に記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１０】
ＮｇＲＨ１レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（a）化合物を請求項１に記載のポリペプチドを合し；
（b）レセプターに対する化合物の効果を測定する
ことを含んでなる方法。
【請求項１１】
ＮｇＲＨ１レセプターが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んでなるヒトＮｇＲＨ１レセプターである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２もしくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または配列番号２もしくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの断片と特異的に結合する精製抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントである、請求項１２に記載の抗体フラグメント。
【請求項１４】
ポリクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ）ファミリーのタンパク質をコードし、したがってＮｇＲホモログ１（ＮｇＲＨ１）と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、さらに、神経系の再生および保護に有用である可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の同定における、ならびにＮｇＲＨ１ポリペプチド、誘導体および抗体を生産するための、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等脊椎動物の成体ＣＮＳにおいて傷害を受けたニューロンの再生は、ミエリンに阻害分子が存在すること、あるいは瘢痕組織が形成されることで制限されている。これまでに、ミエリン由来タンパク質であるＮｏｇｏＡおよびミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）は、神経突起の成長（neurite outgrowth）を阻害することが分かっている（Huber and Schwab （2000） Biol. Chem. 381, 407-419）。ＮｏｇｏＡは、傷害後のインビボにおける軸索の再生能を制限する強力な神経突起成長阻害剤であるが（Bregman et al. （1995） Nature 378, 498-501, Schnell and Schwab （1990） Nature 343, 269-72）、ＭＡＧはインビトロでニューロンの齢に依存して神経突起の成長を阻害することが分かっている（Mukhopadhyay et al. （1994） Neuron 13, 757-767, DeBellard et al.（1996） Mol. Cell Neurosci. 7, 89-101）。
【０００３】
ＮｏｇｏＡは、３つの異なる変異体（ＮｏｇｏＡ、ＢおよびＣ）のうちＮｏｇｏ遺伝子の最長のスプライス産物であり（Chen et al. （2000） Nature 403, 434-439, GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444, Prinjha et al. （2000） Nature 403, 383-384）、レチキュロン（ＲＴＮ）タンパク質ファミリーに属す。抗体を中和し、ＮｏｇｏＡの異なるドメインを用いたところ、この分子中の２つの阻害ドメインが示され（Chen et al. （2000） Nature 403, 434-439, GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444, Prinjha et al. （2000） Nature 403, 383-384）、１つは分子のアミノ酸末端に相当し（アミノ−ＮｏｇｏＡ）、もう１つはＣ末端の細胞外ループ領域であり、Ｎｏｇｏ−６６と呼ばれている（GrandPre et al. （2000） Nature 403, 439-444）。
【０００４】
ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）ファミリーのメンバーであり（Lai et al. （1987） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4337-4341, Salzer et al. （1987） J. Cell. Biol. 104, 957-965）、そしてニューロンの齢に依存して神経突起の成長を促進または阻害することができる（DeBellard et al.（1996） Mol. Cell Neurosci. 7, 89-101）。ＭＡＧはＰＮＳのシュワン細胞にも存在するが、末梢神経の損傷後のダウンレギュレートにより末梢神経に限定されなくなる（Martini and Schachner （1988） J. Cell Biol. 106, 1735-1746, Fawcett and Keynes （1990） Annu. Rev. Neurosci. 13, 43-60, Brown et al. （1991） Neuron 6, 359-370）。
【０００５】
Ｎｏｇｏ−６６レセプター（ＮｇＲ）と呼ばれるレセプターは、今では、ミエリン結合タンパク質からＣＮＳのニューロンへの阻害シグナルの伝達に中心的役割を果たすことが分かっている。これは最初に発見されたリガンドＮｏｇｏ−６６と同等の親和性でＭＡＧおよび乏突起神経膠細胞タンパク質ＯＭｇｐと結合し、また、インビトロおよびインビボで軸索の伸張の阻害も媒介する（Fournier et al. （2001） Nature 409, 341-346, GrandPre and Strittmatter （2002） Nature 417, 547-51, Wang et al.（2002） Nature 417, 941-914, Domeniconi et al. （2002） Neuron 35, 283-290 （published online Jun 28）, Liu et al. （2002） Science Jun 27 （epub ahead of print））。これは脳で特異的に発現し、発達中に調節される（Wang et al. （2002） J. Neurosci. 22, 5505-5515）。ＮｇＲはプロテオグリカン／ロイシンリッチリピートタンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｃ末端グリオシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞表面に結合している。ＮｇＲのタンパク質配列は、８つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）とその後にロイシンリッチリピートＣ末端（ＬＲＲＣＴ）を含む。これらのモチーフは、接着分子やシグナル伝達レセプターをはじめ、機能的および進化的に多様なタンパク質セットにおいて見られる（Kobe and Deisenhofer （1994） TIBS 19, 415-421）。
【０００６】
最近では、Ｎｏｇｏ−６６のＮ末端の４０アミノ酸を含んでなるＮｇＲアンタゴニストペプチドが脊髄傷害時に再生を誘導し、また機能回復も向上させ留ことが示され、これによって、ＣＮＳ傷害の可能性のある治療薬が提供された（GrandPre and Strittmatter （2002） Nature 417, 547-51）。
【０００７】
発明の概要
第一の態様では、本発明は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含み、ヒトＮｇＲＨ１ ｃＤＮＡと呼ばれるヒト起源の単離ＤＮＡを提供する。さらなる態様では、本発明は、配列番号２４で示されるラットＮｇＲＨ１ ｃＤＮＡに関する。さらなる態様では、本発明はラットおよび／またはヒト型ＮｇＲＨ１ポリペプチドに関する。
【０００８】
このようなポリペプチドとしては、
（a）配列番号１または配列番号２４の配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド；
（b）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（c）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列を含んでなる単離ポリペプチド；
（d）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離ポリペプチド；
（e）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列；
（f）配列番号２または配列番号２５のポリペプチド配列と比較して０.８０、０.８５、０.９０、０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９の同一率を有するポリペプチド配列を有する、または含んでなる単離ポリペプチド；および
（g）（a）〜（f）のポリペプチドの断片および変異体
が挙げられる。
【０００９】
また、配列番号１または配列番号２４の少なくとも約１５塩基、好ましくは少なくとも約２０塩基、より好ましくは約３０の連続する塩基を含んでなる核酸配列も提供される。また、配列番号１または配列番号２４で示されるヌクレオチド配列を有する核酸と実質的に同じ核酸も本発明の範囲内にある。好ましい実施態様では、単離ＤＮＡは配列番号１または配列番号２４で示されるＤＮＡを含んでなるベクター分子の形態をとる。
【００１０】
第二の態様では、本発明は配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを提供する。配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドの断片には、約５〜４１０のアミノ酸、好ましくは約１０〜約４００のアミノ酸、より好ましくは約２０〜１００のアミノ酸、最も好ましくは約２０〜約５０のアミノ酸を含んでなるポリペプチドが含まれる。本発明のこの態様によれば、ヒト起源の新規なポリペプチド、ならびにその生物学上、診断上または治療上有用な断片、変異体および誘導体、断片の変異体および誘導体、および上記のものの類似体が提供される。
【００１１】
第三の態様では、本発明は治療薬としてのＮｇＲＨ１のモジュレーターの使用を提供する。本明細書に記載されているモジュレーターとしては、ＮｇＲＨ１のアゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサーおよびインデューサーが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、ＮｇＲＨ１のｍＲＮＡの検出に有用なヌクレオチドプローブおよびＮｇＲＨ遺伝子の翻訳を調節するアンチセンスポリヌクレオチドが提供され；もう１つの実施態様では、ＮｇＲＨ１遺伝子の転写を調節し得る二本鎖ＲＮＡが提供される。これには常法にしたがう小さな干渉ＲＮＡ（small interfering RNA; siRNA）が含まれる（Zamore et al. （2000） Cell 101, 25-33; Elbashir et al. （2001） Nature 411, 494-498）。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、上記のポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体および誘導体、変異体および誘導体の断片、ならびに上記のものの類似体を生産する方法を提供する。本発明の本態様の好ましい実施態様では、外因性のＮｇＲＨ１コードポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを組み込んだ宿主細胞を、その宿主内でのＮｇＲＨ１ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養した後、発現したポリペプチドを回収することを含んでなる、上記ヒトＮｇＲＨ１ポリペプチドの生産方法が提供される。
【００１４】
本発明のもう１つの態様によれば、とりわけ研究、生物学的、臨床的および治療的目的で上記のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、組成物および方法が提供される。
【００１５】
本発明の本態様の特定のさらなる好ましい実施態様では、配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、すなわちヒトまたはラットＮｇＲＨ１と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。これに関するある特に好ましい実施態様では、抗体はヒトＮｇＲＨ１ポリペプチドまたはヒトＮｇＲＨ１ポリペプチドの一部に選択性が高い。
【００１６】
さらなる態様では、配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列の断片または一部と結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。
【００１７】
もう１つの態様では、最終的に対象の神経系の損傷をもたらす疾患、障害または損傷の処置方法が提供され、この疾患はあらゆる主要な脳領域（脳橋を除く）、骨格筋および肝臓におけるＮｇＲＨ１遺伝子発現の増強または低下、あるいはＮｇＲＨ１ポリペプチドの存在の増加または低下に媒介されるか、または関連する。このような疾患、障害または損傷としては、限定されるものではないが、中枢神経系（ＣＮＳ）外傷（例えば、脊髄または脳の傷害）、梗塞、感染、悪性障害、毒物暴露、栄養欠乏、傍腫瘍症候群、および神経変性障害（限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、および進行性核上麻痺を含む）が挙げられる。この処置はＮｇＲＨ１活性を妨げる化合物（例えば、ＮｇＲＨ１に対する抗体、ＮｇＲＨ１のアンチセンス核酸（Zamore et al. （2000） Cell 101, 25-33 or Elbashir et al. （2001） Nature 411, 494-498に記載のsiRNA）、ＮｇＲＨ１リボザイム、またはＮｇＲＨ１の活性部位に結合する化学基）を投与することにより達成され得る。
【００１８】
もう１つの態様は、急性および慢性神経変性障害（例えば上記のようなもの）、外傷および変性性眼障害、脳脊髄外傷、卒中、脊髄損傷の処置を目的とする、ＮｇＲＨ１ポリペプチドまたはその断片と結合する抗体を含んでなる医薬組成物を対象とする。
【００１９】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ＮｇＲＨ１ポリペプチドと結合し、かつ／またはＮｇＲＨ１ポリペプチドの活性を調節し得る分子、またはＮｇＲＨ１ポリペプチドの転写または翻訳を調節する核酸配列と結合し得る分子の同定のための方法を対象とする。このような方法は、例えば出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第６,０４３,０２４号に開示されている。このような方法によって同定された分子も本発明の範囲内である。
【００２０】
さらにもう１つの態様では、本発明は、培養増殖させた際に配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその断片を産生し得る、インビトロで増殖できる細胞、特に脊椎動物を提供し、これらの細胞はヒトＮｇＲＨ１転写制御配列以外の転写制御ＤＮＡ配列を含み、この転写制御配列は配列番号２または配列番号２５のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡの転写を制御する。
【００２１】
もう１つの態様では、本発明は、外因性のＮｇＲＨ１コードポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを組み込んだ宿主細胞を、その宿主内でのＮｇＲＨ１ポリペプチドの発現に十分な条件下で培養し、それにより、発現ポリペプチドを生産し、発現したポリペプチドを回収することを含んでなる、ＮｇＲＨ１ポリペプチドの生産方法を提供する。
【００２２】
本発明のその他の目的、特徴、利点および態様は、当業者には以下の説明から明らかになろう。しかし、以下の説明および具体例は本発明の好ましい実施態様を示し、単に例示として示されるものと理解すべきである。当業者ならば、以下の説明を読めば、また本開示の他の部分を読めば開示される発明の精神および範囲内にある様々な変更および改良が容易に明らかになる。
【００２３】
発明の詳細な記載
本明細書に挙げられている全ての特許出願、特許および参照文献は出典明示によりそれらの全開示内容を本明細書の一部とする。
【００２４】
本発明を実施するにあたっては分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡの多くの常法が用いられる。これらの技術は周知のものであり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 （F. M. Ausubel ed.）; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 （D. N. Glover ed.）; Oligonucleotide Synthesis, 1984 （M. L. Gait ed.）; Nucleic Acid Hybridization, 1985, （Hames and Higgins）; Transcription and Translation, 1984 （Hames and Higgins eds.）; Animal Cell Culture, 1986 （R. I. Freshney ed.）; Immobilized Cells and Enzymes, 1986 （IRL Press）; Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology （Academic Press, Inc.）; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 （J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory）; and Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 （それぞれWu and Grossman, and Wu, eds.）に説明されている。
【００２５】
本明細書において「示差的発現遺伝子」とは、本明細書で開示される（例えば、配列番号１または配列番号２４で示される）ＤＮＡ配列の少なくとも１つを含む遺伝子；（b）本明細書で開示される（例えば、配列番号２または配列番号２５で示される）ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列をコードするいずれかのＤＮＡ配列；または（c）本明細書で開示されるコード配列と実質的に同じいずれかのＤＮＡ配列をさす。例えば、本発明は、多くの異なる種のＮｇＲＨ１遺伝子およびそれらのコードされるタンパク質を提供する。特定の実施態様では、これらＮｇＲＨ１遺伝子およびタンパク質は脊椎動物、より詳しくは哺乳類由来のものである。本発明の好ましい実施態様では、ＮｇＲＨ１遺伝子およびタンパク質はヒト由来ものである。その最も広い意味において「実質的に同じ」とは、本明細書でヌクレオチド配列に関しては、参照ヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を意味し、相当する配列とは参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードし、例えばそれらは全長（野生型）ＮｇＲＨ１タンパク質に関連する１またはそれ以上の既知の機能的活性（例えば、脊髄または脳におけるニューロンの再生の阻害、基質に対する増殖制限特性の付与、神経細胞および腫瘍細胞の拡散および移動、背根神経節神経突起の成長の阻害、背根神経節成長円錐崩壊の誘導、インビトロにおけるＮＩＨ ３Ｔ３細胞の拡散遮断、ＰＣ１２神経突起成長の遮断、柔軟性の制限）を示し得る。
【００２６】
望ましくはこの実質的に同じヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的に同じヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の同一性％は望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８％、いっそう好ましくは少なくとも９９％である。配列比較はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アライメントアルゴリズムを用いて行う（例えば、Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London: 1995. ISBN 0-412-99391-0参照）。参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じ」ヌクレオチド配列は、５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で（５０℃、２×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗浄）、より望ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で（５０℃、１×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗浄）、いっそう望ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で（５０℃、０.５×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗浄）、好ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で（５０℃、０.１×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗浄）、より好ましくは５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で（６５℃、０.１×ＳＳＣ、０.１％ ＳＤＳで洗浄）参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、やはり機能的に同等な遺伝子産物をコードする。
【００２７】
ＮｇＲＨ１タンパク質によって媒介される活性を阻害すると、脊髄または脳におけるニューロンの再生；基質に対する増殖許容性の付与；神経細胞および腫瘍細胞の拡散および移動；背根神経節神経突起の成長；背根神経節成長円錐成長の誘導；インビトロにおけるＮＩＨ ３Ｔ３細胞の拡散；ＰＣ１２神経突起成長、および柔軟性が可能となる。
【００２８】
本明細書において「宿主細胞」とは、何らかの手段、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などにより細胞へ導入された異種ＤＮＡを含む原核または真核細胞をさす。
【００２９】
本明細書において「異種」とは、「異なる天然起源のもの」を意味するか、あるいは非天然状態を表す。例えば宿主細胞が別の生物に由来する、特に別の種に由来するＤＮＡまたは遺伝子で形質転換されている場合、この遺伝子はその宿主細胞に対しても、また、その遺伝子を持っている宿主細胞の子孫に対しても異種である。同様に異種とは、同じ天然型の原細胞種に由来し、それに挿入されているが、例えばコピー数が異なったり、異なる調節エレメントの制御下にあるなど、非天然状態で存在するヌクレオチド配列もさす。
【００３０】
「同一性」は配列を比較することで決定される、２もしくはそれ以上のポリペプチド配列または２もしくは以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を反映している。一般に同一性とは、比較する配列の長さにわたってそれぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸の一致をさす。
【００３１】
正確に一致しない配列については「同一性％」を求める。一般に、比較する２つの配列は配列間の最大の相関が得られるようにアラインする。これはアライメントの程度を高めるために一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含み得る。同一性％は比較する各配列の全長にわたって求めてもよく（いわゆるグローバルアライメント）、これは長さが同じか、極めて類似している配列に特に適しており、あるいはより短い所定の長さにわたって求めてもよく（いわゆるローカルアライメント）、これは長さの異なる配列に適している。
【００３２】
「類似性」はさらに、２つの配列間の関係のより精密な尺度となる。一般に「類似性」とは、（同一性に関して）比較する各配列から１つずつ、残基対間の正確な一致を考慮するだけでなく、正確に一致しない場合に進化に基づいてある残基が別の残基に置き換わっている可能性があるかどうかも考慮して、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間を残基ごとに比較することを意味する。この見込みには「スコア」が付帯し、次にこれから２つの配列の「類似性％」が求められる。
【００３３】
２以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は、当技術分野で周知のものである。よって例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列解析パッケージ、バージョン９.１（Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USAから入手可能）で利用できるプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰプログラムを用いて２つのポリヌクレオチド間の同一性％、ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性％および類似性％を求めることができる。ＢＥＳＴＦＩＴではＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを用い、２つの配列間で最も類似性の高い１つの領域を見つけ出す。ＢＥＳＴＦＩＴは長さの異なる２つポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の比較に適しており、このプログラムでは短い方の配列が長い方の配列の一部に相当すると仮定する。
【００３４】
これに対して、ＧＡＰは２つの配列をアラインし、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（J Mol Biol, 48, 443-453, 1970）のアルゴリズムにしたがって「最大類似性」を探す。ＧＡＰはほぼ同じ長さの配列の比較を適しており、アライメントは全長にわたって予測する。好ましくは、各プログラムで用いるパラメーター「ギャップ・ウエイト（Gap Weight）」および「レンクス・ウエイト（Length Weight）」は、それぞれポリヌクレオチド配列については５０および３であり、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、同一性％および類似性は、比較する２つの配列が最適にアラインされたときに求められる。配列間の同一性および／または類似性を決定する他のプログラムも当技術分野で公知であり、例えばＢＬＡＳＴ系のプログラム（Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997, National Center for Biotechnology Information （NCBI）, Bethesda, Maryland, USAから入手可能であり、ＮＣＢＩホームページ www.ncbi.nlm.nih.govにアクセスできる）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988, Wisconsin配列解析パッケージの一部として入手可能）がある。
【００３５】
好ましくは、ヌクレオチド配列が比較の前にまずアミノ酸配列へと翻訳される場合などのポリペプチド配列の比較にはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992）が用いられる。
【００３６】
好ましくは、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して検索ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性％を求めるために、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを用い、検索配列と参照配列を最適にアラインし、プログラムのパラメーターは以上に記載したようにデフォルト値に設定する。
【００３７】
ベクター分子は、異種の核酸を挿入し、次にそれを適当な宿主細胞へ導入することができる核酸分子である。ベクターは好ましくは１またはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡが挿入できる１またはそれ以上の部位を有する。ベクターは多くの場合、例えば薬剤耐性遺伝子をコードするなど、ベクターを有する細胞がベクターを含まない細胞から選択できるような便宜な手段を持っている。通常のベクターとしてはプラスミド、ウイルスゲノム、および（主として酵母および細菌では）「人工染色体」が挙げられる。
【００３８】
「プラスミド」は、通常、本明細書では当業者に知られている標準的な命名慣例にしたがい、小文字のｐではじめ、かつ／または次に大文字および／または数字を続け表記する。本明細書で開示する出発プラスミドは商業的に入手できるか、公的に自由に入手できるか、あるいは周知の公開されている手法の通常の適用により入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明にしたがって使用できる多くのプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターが周知のものであり、当業者ならば容易に利用できる。さらに当業者ならば本発明での使用に好適な他のプラスミド容易にいくつも構築することができる。本発明におけるこのようなプラスミドならびにその他のベクターの特性、構築および使用は当業者にならば本開示から容易に明らかになろう。
【００３９】
「単離（された）」とは、その材料がその本来の環境（天然に存在するものであれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、動物生体に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものではないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドであっても天然系で一緒に存在している材料のいくつかまたは全てから分離されていれば、たとえ次に天然系に再導入するとしても単離されたものである。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよいし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点でやはり単離されたものである。
【００４０】
本明細書において「転写制御配列」とは、それらが作動可能なように連結されており、タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導、抑制、あるいはまた制御するイニシエーター配列、エンハンサー配列、およびプロモーター配列などのＤＮＡ配列をさす。
【００４１】
「ポリペプチド（polypeptide）」なる語は、本明細書において「ポリペプチド（polypeptides）」および「タンパク質（複数を含む）」なる用語と互換的に使用される。
【００４２】
本明細書において本発明のポリペプチド「化学誘導体」とは、通常はその分子の一部ではない付加的化学部分を含む本発明のポリペプチドである。このような部分は分子の溶解度、吸光度、生体半減期などを改良し得る。あるいはこれらの部分は分子の毒性を軽減したり、分子の望ましくない副作用を除去または緩和などしたりできる。このような効果の媒介となり得る部分は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. （1980）に開示されている。
【００４３】
本発明は核酸分子、好ましくは（１）配列番号１または配列番号２４で示されるヌクレオチド配列を含んでなる単離ＤＮＡ、（２）配列番号１または配列番号２４で示される単離されたＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる単離ＤＮＡ；および（３）上記の（１）または（２）とハイブリダイズする核酸配列などのＤＮＡ分子を含んでなる。このようなハイブリダイゼーション条件は上記のように高ストリンジェントであってもそれほど高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合には、高ストリンジェント条件とは、３７℃（１４塩基のオリゴ）、４８℃（１７塩基のオリゴ）、５５℃（２０塩基のオリゴ）、および６０℃（２３塩基のオリゴ）で例えば６×ＳＳＣ／０.０５％ピロリン酸ナトリウムでの洗浄をさす。種々の組成の核酸に関するこのようなストリンジェント条件の適切な範囲は、例えばKrause and Aaronson （1991） Methods in Enzymology, 200:546-556に記載されている。
【００４４】
これらの核酸分子は、例えば標的遺伝子の調節において有用な標的遺伝子アンチセンス分子として、かつ／または標的遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして働き得る。
【００４５】
本発明はまた（a）上述のコード配列および／またはそれらの相補物（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むベクター；（b）コード配列の発現を命令する調節エレメントと作動可能なように連結された上述のコード配列のいずれかを含む発現ベクター；および（c）宿主細胞でコード配列の発現を命令する調節エレメントと作動可能なように連結された上述のコード配列のいずれかを含む遺伝子操作宿主細胞も包含する。本明細書において調節エレメントとしては、限定されるものではないが、誘導および非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および調節することが当業者に公知のその他のエレメントが挙げられる。
【００４６】
本発明は、本明細書で開示される核酸配列のいずれかの断片を含む。全長ＮｇＲＨ１遺伝子の断片は、全長遺伝子を単離するため、また、ＮｇＲＨ１遺伝子と高い配列類似性または類似の生物活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。この種のプローブは、好ましくは少なくとも約３０塩基を有し、例えば約３０〜約５０塩基、約５０〜約１００塩基、約１００〜約２００塩基、または２００を超える塩基を含み得る。このプローブはまた、全長転写物に相当するｃＤＮＡクローン、および調節およびプロモーター領域、エキソン、およびイントロンを含む完全なＮｇＲＨ１遺伝子を含むゲノムクローンを同定するためにも使用され得る。スクリーニングの一例としては、既知のＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、ＮｇＲＨ１遺伝子のコード領域を単離することを含んでなる。ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングしてプローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするのかを調べるには、本発明の遺伝子の配列を相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用いる。
【００４７】
上記の遺伝子配列のほか、例えば他の種に存在し得るもののような配列のホモログも、当技術分野で周知の分子生物学的技術により、過度な実験を行うことなく同定し、容易に単離できる。さらにこのような遺伝子産物の１またはそれ以上のドメインと詳細なホモロジーを有するタンパク質をコードするゲノム内のその他の遺伝子座に遺伝子が存在する可能性もある。これらの遺伝子もまた同様の技術によって同定し得る。
【００４８】
例えば、単離された示差的発現遺伝子配列を標識し、対象生物から得られたｍＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。ｃＤＮＡライブラリーが、標識された配列が由来する生物種とは異なる生物に由来している場合は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは低くなる。あるいは、標識断片を用い、ここでもまた適当なストリンジェント条件を用い、対象生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。このような低ストリンジェント条件は当業者に周知であり、そのライブラリーおよび標的配列が由来する特定の生物によって異なるものと思われる。
【００４９】
さらに、従来知られていない示差発現遺伝子種の配列は、対象遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計される２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いるＰＣＲを行うことで単離され得る。反応の鋳型は示差的発現遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られている、または発現する疑いのあるヒトまたは非ヒト細胞系または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡであってもよい。
【００５０】
ＰＣＲ産物は、増幅された配列が示差的発現遺伝子様の核酸配列の配列に相当することを確認するためにサブクローニングし、配列決定すればよい。次にこのＰＣＲ断片を用いて種々の方法により全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる。例えば増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは、標識断片をゲノムライブラリーのスクリーニングに用いてもよい。
【００５１】
また、全長ｃＤＮＡ配列を単離するためにＰＣＲ技術を用いてよい。例えばＲＮＡは標準的な手順にしたがい、適当な細胞または組織源から単離できる。このＲＮＡに対して、第一鎖合成をプライミングするため、増幅した断片の５'最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写反応を行ってもよい。次に、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンの「テール」を付ければよく、このハイブリッドをＲＮＡアーゼＨで消化し、その後、ポリ−Ｃプライマーを用いて第二鎖の合成をプライミングすればよい。このようにして増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は容易に単離することができる。
【００５２】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけそれらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同等の生物機能／特性を有すると予測される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドはヒトまたはラットＮｇＲＨ１の少なくとも１つの活性を有する。
【００５３】
本発明の示差的発現遺伝子コード配列を発現させるためには、種々の宿主−発現ベクター系が利用できる。このような宿主−発現系は対象となるコード配列が産生され、次に精製されるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした際にインサイツ（in situ）で本発明の示差的発現遺伝子タンパク質を発現し得る細胞も当てはまる。これらには限定されるものではないが、示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis））；示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピチア（Pichia））；示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に感染させた、または示差的発現遺伝子タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド形質転換ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を担持する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられる。
【００５４】
細菌系では、発現される示差的発現遺伝子タンパク質に対して意図した使用に応じていくつかの発現ベクターが有利に選択できる。例えば抗体の作製のため、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするためにこのようなタンパク質を大量に生産しようとする場合には、例えば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を命令するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、示差的発現遺伝子タンパク質コード配列が個々にｌａｃ Ｚコード領域とともにベクターのフレーム内に連結して融合タンパク質を産生する大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791）；ｐＩＮベクター（例えば、Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109）などが挙げられる。また、ＰＧＥＸベクターを用いてグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。このＰＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計し、そうすればクローニングされた目的遺伝子タンパク質はＧＳＴ部分から遊離することができる。
【００５５】
プロモーター領域は、制限部位、すなわち候補プロモーター断片、すなわちプロモーターを含み得る断片を導入するための部位の下流に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「ｃａｔ」）転写ユニットなど、プロモーター領域を欠いたリポーター転写ユニットを含むベクターを用いて、任意の目的遺伝子から選択することができる。周知のように、ベクターの、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位にプロモーター含有断片を導入するとＣＡＴ活性が生じ、これは標準的なＣＡＴアッセイによって検出することができる。この目的に好適なベクターは周知であり、容易に入手できる。このようなベクターのうちの２つがｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。このように、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは周知で容易に入手できるだけでなく、リポーター遺伝子を用い、前述の技術により容易に得られるプロモーターでもある。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に好適な公知の細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、Ｔ５ タックプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターがある。これに関して好適な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のものなどのレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターがある。
【００５７】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためにベクターとして使用できるいくつかの昆虫系のうちの１つである。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞で増殖する。示差的発現遺伝子コード配列は、このウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置けばよい。示差的発現遺伝子コード配列がうまく挿入できれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞型の組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子にコードされているタンパク質外被を欠いたウイルス）が産生される。次にこれらの組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染させると、挿入された遺伝子が発現される（例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith、米国特許第４,２１５,０５１号参照）。
【００５８】
哺乳類宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系を利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、目的の示差的発現遺伝子コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部分リーダー配列に連結すればよい。このキメラ遺伝子を次にインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入すればよい。非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）にウイルスゲノムを挿入すると、生存力があり、かつ、感染した宿主で示差的発現遺伝子を発現し得る組換えウイルスが生じる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照）。また、挿入された示差的発現遺伝子コード配列を効率的に発現させるためには特定の開始シグナルも必要となり得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。その固有の開始コドンおよび隣接配列を含め全体としての示差的発現遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合、付加的な転写制御シグナルは必要ない。
【００５９】
しかし、示差的発現遺伝子コード配列の部分だけを挿入する場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、全インサートの翻訳を確保するには、この開始コドンは目的のコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドン天然であれ合成であれ、様々な起源のものであってよい。発現効率は適当な翻訳エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることで増強させることができる（Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照）。
【００６０】
宿主細胞での発現のために適当なベクターおよびプロモーターの選択は周知であり、発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入、および宿主での発現のために必要な技術はそれ自体当技術分野にとっては慣例のものである。
【００６１】
一般に、組換え発現ベクターは複製起点、下流の構造配列の翻訳を命令するための発現の高い遺伝子に由来するプロモーター、およびベクターに曝された後にベクター含有細胞の単離を可能とする選択マーカーを含む。
【００６２】
さらにまた、所望の特定の様式で、挿入された配列の発現を調節する、あるいは遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要なものであり得る。種々の宿主細胞がタンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的な機構を持っている。発現した外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングを確保するために適当な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用できる。このような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられる。
【００６３】
長期間、高収量の組換えタンパク質生産の安定発現が好ましい。例えば示差的発現遺伝子タンパク質を安定発現する細胞株を操作し得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後、操作した細胞を富化培地（enriched media）で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えればよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞にプラスミドを自分の染色体に安定して組み込ませ、細胞叢（foci）を形成するまで増殖させ、次に細胞株中でクローニングおよび拡張する。この方法は示差的発現遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に用いられる。このような操作細胞株は示唆発現遺伝子タンパク質の内在活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【００６４】
以下に記載のもののようなアッセイ系において成分として用いる場合、示差的発現遺伝子タンパク質を直接または間接的に標識し、示差的発現遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成された複合体の検出を助長し得る。限定されるものではないが、１２５Ｉなどの放射性同位元素；基質に曝された際に検出可能な比色シグナルまたは光を生じる酵素標識系；および蛍光標識をはじめとする種々の好適な標識系のいずれかを用いることができる。
【００６５】
組換えＤＮＡ技術を用いてこのようなアッセイ系のための示差的発現遺伝子タンパク質を生産する場合、標識、固定化および／または検出を容易にし得る融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【００６６】
間接的標識には、標識抗体など、いずれかの示差的発現遺伝子産物と特異的に結合するタンパク質の使用が含まれる。
【００６７】
１またはそれ以上の示差的発現遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の生産方法が本明細書に記載されている。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生産されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。このような抗体は、例えば、フィンガープリント、生体サンプル中の標的遺伝子の検出に、あるいはまた異常な標的遺伝子活性を阻害する方法として用い得る。かくして、このような抗体は神経系の再生および発芽および機能回復のために利用できる。
【００６８】
示差的発現遺伝子に対する抗体の生産のため、種々の宿主動物を、示差的発現遺伝子タンパク質またはその一部を注射することにより免疫化し得る。このような宿主動物としては、限定されるものではないがいくつかを挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられる。限定されるものではないが、フロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リソレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメットゲランウシ結核菌（bacille Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの有用な可能性のあるヒトアジュバントをはじめ、宿主種に応じて種々のアジュバントを用いて免疫応答を増強してもよい。
【００６９】
ポリクローナル抗体とは、標的遺伝子産物などの抗原またはその抗原機能誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体分子の異質な集団である。ポリクローナル抗体の生産のためには、上記のもののような宿主動物を、これもまた上記のようなアジュバントを添加した示差的発現遺伝子産物を注射することで免疫化すればよい。特定抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は継代培養細胞系による抗体分子の生産を提供するいずれの技術によって得てもよい。これには、限定されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（例えば米国特許第４,３７６,１１０号）のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030参照）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤをはじめとするいずれの免疫グロブリンクラスおよびそのいずれのサブクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロでもインビボでも培養し得る。インビボでの高力価のｍＡｂの生産がこれまでのところ好ましい生産方法となっている。
【００７０】
さらに、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（例えば、Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855）を使用することもできる。キメラ抗体とは、ネズミｍＡｂに由来する可変または超可変領域とヒト免疫グロブリン不変領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。
【００７１】
あるいは、示差的発現遺伝子一本鎖抗体を生産するよう一本鎖抗体の生産のための技術（例えば、米国特許第４,９４６,７７８号）を適用することができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを、アミノ酸結合を介して連結して一本鎖ポリペプチドとすることで形成される。最も好ましくは、本明細書で開示されるポリペプチド、断片、誘導体および機能的同等物に対する抗体を生産するために「ヒト化抗体」の生産に有用な技術を適用することができる。このような技術は、例えば出典明示によりその全開示内容が本明細書の一部とされる米国特許第５,７７０,４２９号に開示されている。特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術によって作製され得る。
【００７２】
本発明の好ましい抗体は、とりわけＮｇＲＨ１のリガンドとしてこれまでに開示されている抗体（＝ＩＮ−１）と同等の生物機能／特性を有するものと期待される（例えば、Schnell and Schwab, 1990, Nature 343, 269-272参照）。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドはＩＮ−１の少なくとも１つの活性を有する。例えば遺伝子の突然変異の効率的なスクリーニングを行うため、ＧＢＲＳポリヌクレオチド配列またはその断片を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。このようなアレイは好ましくは高密度アレイまたはグリッドである。アレイ技術は周知のものであり、全般的な応用性を持ち、遺伝子発現、遺伝子連鎖、および遺伝子多様性をはじめ、分子遺伝学における様々な疑問に取り組むために用いることができる（例えば、M. Chee et al., Science, 274, 610-613 （1996）およびそこに挙げられているその他の参照文献参照）。
【００７３】
また、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現レベルの異常な低下または上昇の検出は、本発明の疾患に対する対象の感受性を診断または判定するためにも使用できる。発現の低下または上昇は、例えば核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロット法およびその他のハイブリダイゼーション法など、ポリヌクレオチドの定量のために当技術分野で周知の方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。宿主由来のサンプルにおいて本発明のポリペプチドなどのタンパク質のレベルを求めるために使用できるアッセイ技術は当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【００７４】
よって、もう１つの態様では本発明は、
（a）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１または配列番号２４のヌクレオチド配列、またはその断片もしくはＲＮＡ転写物；
（b）（a）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（c）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号２５のポリペプチド、またはその断片；あるいは
（d）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体
を含んでなる診断キットに関する。
【００７５】
このようないずれのキットにおいても、（a）、（b）、（c）または（d）は実質的成分を含み得ると考えられる。このようなキットは疾患、中でも特に本発明の疾患の診断、または疾患に対する感受性の診断に用いられる。
【００７６】
本発明のさらなる実施態様は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定する方法に関する。よって、さらなる態様では、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する（例えば、インビトロにおいてＮＩＨ ３Ｔ３細胞の拡散を遮断または刺激する、インビボモデルにおいてＰＣ１２神経突起の成長を遮断または刺激する、背根神経節成長円錐崩壊を誘導または遮断する、神経細胞を拡散または遮断する、傷害神経繊維の再生）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。このような方法は、上述されたような本発明の疾患の治療および予防目的で用い得るアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は種々のソース、例えば細胞、細胞フリー調製物、化学ライブラリー、化学化合物のコレクションおよび天然産物混合物から同定され得る。このようにして同定されるアゴニストまたはアンタゴニストは、考えられるケースとしてポリペプチドの天然基質または改変基質、新規なリガンドなど；その構造的または機能的ミメティクス（Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1（2）: Chapter 5 （1991）参照）または小分子であり得る。
【００７７】
この方法は単に、ＮｇＲＨ１レセプター活性を調節する化合物を同定する方法であってよく、
（a）化合物とＮｇＲＨ１レセプター、好ましくはヒトＮｇＲＨ１、最も好ましくは配列番号２または配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含んでなるレセプターを合し；
（b）そのレセプターに対する化合物の効果を測定する
ことを含んでなる。
【００７８】
このスクリーニング法では単に、候補化合物とポリペプチドとの、またはそのポリペプチドもしくはその融合タンパク質を含む細胞もしくは膜との結合を、候補化合物と直接または間接的に会合した標識の手段によって測定すればよい。あるいは、このスクリーニング法は標識競合物（例えばアゴニストまたはアンタゴニスト）に対する候補化合物とポリペプチドの競合的結合を測定または検出（定性的または定量的）ことを含み得る。さらにこれらのスクリーニング法では、ポリペプチドを含む細胞に適当な検出系を用い、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害によって生成するシグナルを生じるかどうかを試験してもよい。活性化の阻害剤は、一般には、既知のアゴニストの存在下でアッセイし、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化における効果を観測する。さらに、これらのスクリーニング法は単に、候補化合物と、本発明のポリペプチドを含有する溶液とを混合して混合物とし、その混合物におけるＮｇＲＨ１結合または活性を測定し、その混合物のＮｇＲＨ１結合または活性を、候補化合物を含まない対照混合物と比較するステップを含んでもよい。
【００７９】
本発明のポリペプチドは、従来の能力の低いスクリーニング法において用いてもよいし、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式で用いてもよい。このようなＨＴＳ形式は十分確立されている９６ウェル、さらに最近の３８４ウェルマイクロタイタープレートを含むだけでなく、Schullek et al, Anal Biochem., 246, 20-29, （1997）により記載されているナノウェル法などの新しい方法も含む。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体はまた、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの生産に対する添加した化合物の効果を検出するスクリーニング法を構築するためにも用い得る。例えば、当技術分野で公知の標準的な方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用い、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞会合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを構築してもよい。これを用いて、適宜操作した細胞または組織からポリペプチドの生産を阻害または促進し得る薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見することができる。
【００８１】
本発明のさらなる実施態様は、上述の治療効果のいずれかを目的にした、医薬上許容される担体をともなう医薬組成物の投与に関する。このような医薬組成物はＮｇＲＨ１、ＮｇＲＨ１のミメティクス、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤からなり得る。これらの組成物は、単独で投与してもよいし、あるいは限定されるものではないが緩衝生理食塩水、デキストロース、および水をはじめとする任意の滅菌生体適合性医薬担体にて投与し得る安定化化合物など、少なくとも１種のその他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。これらの組成物は、患者に単独で投与してもよいし、あるいは他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて投与してもよい。
【００８２】
本発明に包含される医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸手段をはじめとするかなり多数の経路によって投与してもよい。
【００８３】
これらの医薬組成物は活性成分の他、医薬上使用できる、有効化合物を製剤へと加工する補助となる賦形剤および補助剤を含んでなる適切な医薬上許容される担体を含んでもよい。調製および投与に関する技術のさらなる詳細は、最新刊のRemington's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton, Pa.）に見出せる。
【００８４】
この医薬組成物は、塩として提供されてもよく、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする多くの酸で形成され得る。塩は水性その他のプロトン性溶媒中で、それに対応する遊離塩基形態よりも溶解度が高い傾向にある。他の場合では、好ましい製剤は以下のもの：１〜５０ｍＭのヒスチジン、０.１％〜２％のスクロース、および２〜７％のマンニトール、ｐＨ範囲は４.５〜５.５のいずれかまたは全てを含み得る凍結乾燥粉末であってもよく、これを使用前にバッファーと合わせる。
【００８５】
いずれの化合物でも、治療上有効な量はまず、細胞培養アッセイ（例えば新生物細胞）か動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかで評価することができる。動物モデルは、また、適当な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用できる。このような情報は次にヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定するために使用できる。治療上有効な用量とは、徴候または症状を緩和する有効成分、例えばＮｇＲＨ１の抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の量をさす。治療効果および毒性は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学手法、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％において致死的な用量）によって決定され得る。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数（therapeutic index）であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒト用として一定範囲の用量を製剤化する上で用いられる。このような組成物に含まれる用量は、毒性がほとんど、または全くなく、ＥＤ５０を含む一定範囲の循環濃度内であることが好ましい。用量は用いる剤形、患者の重篤度、および投与経路によってこの範囲内で変動する。
【００８６】
正確な用量は、処置を必要とする対象に関連する因子に照らして担当医により決定される。用量および投与は、十分なレベルの有効部分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう調節する。考慮する因子としては、病状の重篤度、対象の健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答が挙げられる。持続的医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス速度によって３〜４週間ごと、毎週、または二週に一度投与すればよい。
【００８７】
通常用量は投与回数に応じて０.１から１００,０００μg、総用量約１ｇまで様々であり得る。特定の用量および送達方法についての指針は文献に示されており、当業者ならば通常容易に入手できる。当業者ならば、タンパク質またはそれらの阻害剤よりもヌクレオチドに関する種々の製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も特定の細胞、症状、状況など特異的である。タンパク質の経口投与に好適な医薬製剤については例えば米国特許第５,００８,１１４号；同第５,５０５,９６２号；同第５,６４１,５１５号；同第５,６８１,８１１号；同第５,７００,４８６号；同第５,７６６,６３３号；同第５,７９２,４５１号；同第５,８５３,７４８号；同第５,９７２,３８７号；同第５,９７６,５６９号；および同第６,０５１,５６１号に記載されている。
【００８８】
以下、実施例を示して本明細書を説明する。なお、これらはその範囲を何ら限定するものではない。
【００８９】
実施例
実施例１  ヒトＮｇＲＨ１ ｃＤＮＡの単離
ヒトＮｇＲＨ１の同定および配列解析−クエリーとして公開されているＮｇＲアミノ酸配列（受託番号：ＡＦ２８３４６３）を用いて、ｔｂｌａｓｔｎ検索により、Ｃｅｌｅｒａデータベースから２つの配列、ｈＣＴ３１０２０およびＧＡ＿５３２５６８６８が提示され、それらの転写産物は、公開されているＮｇＲ配列とおおよそ５０％の類似性（ｂｌａｓｔの結果）を示した。Wisconsin Package Version 10.1, Genetics Computer Group （GCG）, Madison, Wisc.からのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ解析のいずれかを用いてアラインメントを行った。多重配列解析をＣｌｕｓｔａｌＷにより行った。ＮｇＲおよびそのホモログのシグナルペプチド予測を、Ｓｐｓｃａｎを用いて行った。ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を、プロテインファミリーデータベースＰｆａｍに存在する種々のコンセンサスセグメントと配列を比較することにより同定した。ＬＲＲのさらなる同定および確認は、ＩＭＰＡＬＡソフトウエアを用いるＢＬＯＣＫＳ＋アラインメントにより行われた。可能性のあるＧＰＩ切断部位の予測は、スイス・インスティチュート・オブ・バイオインフォマティクス（ＳＩＢ）のサーバーに存在するＥｘＰａＳｙプログラムパッケージからの、ＤＧＰＩを用いて行われた。
【００９０】
ヒトＮｇＲＨ１をコードする完全長ｃＤＮＡの単離：
ＮｇＲホモログ−１のｃＤＮＡを、ヒト脳ｃＤＮＡ（Marathon-ReadyTM cDNA, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7400-1）からＰＣＲにより取得した。該遺伝子の５'および３'末端を、別々に増幅した（下記参照）。配列特異的プライマーを、Ｃｅｌｅｒａデータベース（受託番号：ｈＣＴ３１０２０）由来の予測転写配列および公開ＤＮＡデータベース由来の２つのＥＳＴ配列（受託番号：ＡＩ９２９０１９およびＢＥ４１０１３９）から集めた連続配列に基づいてデザインした。４％ＤＭＳＯおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅＴＭ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands）を用いて、ＰＣＲをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ９６００サイクラーで行った。５'末端（７９８ｂｐ）を、５'−ＲＡＣＥにより全脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7400-1）から増幅した。
【００９１】
最初の増幅を、該キットからのＡＰ１プライマーおよび配列特異的プライマーＧＳＰ１（５'−ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＴ−３'（配列番号３））を用いて行った。該キットからのＡＰ２プライマーおよび配列特異的プライマーｎＧＳＰ１（５'−ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  Ｇ−３'（配列番号４））を用いるネステッドＰＣＲにより、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクター（Invitrogen, Basel, Switzerland）へと連結された７９８ｂｐフラグメントが得られた。正確な配列を、自動配列解析により確認した。該遺伝子の３'末端（８０４ｂｐ）を、ヒト胎児脳ｃＤＮＡ（Marathon Ready, Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, cat. Nr. 7402-1）から、遺伝子特異的プライマーＧＳＰ２（５'−ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣ−３'（配列番号５））およびＮｇＲＨ１−３'（５'−ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＡＧ−３'（配列番号６））を用いるＰＣＲにより増幅した。該ＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ  ＴＯＰＯ  ＴＡ−ベクター（Invitrogen, Basel, Switzerland）へと連結し、そして配列決定した。次いで、完全長ｃＤＮＡを、ＮｇＲＨ１−５'（５'−ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  Ｇ−３'（配列番号７））およびＮｇＲＨ１−３'（上記参照）のプライマーを用いるオーバーラップＰＣＲにより組み立てた。該ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯクローニングベクターへと連結した。この最終プラスミドを、以後、ｈＮｇＲＨ１−ｆｌと称する。配列解析は、予測配列の６４２位（Ｇ→Ａ）の点変異（サイレント）および９２６位に挿入された追加的な５１塩基以外はＣｅｌｅｒａデータベースからの予測された配列を確認した。該５１塩基の挿入は、Ｇｅｎｂａｎｋの別のＥＳＴの存在により確認された（受託番号：ＢＥ２２２７３７）。近年、我々のＮｇＲＨ１配列にマッチする配列がＧｅｎｂａｎｋデータベースに寄託された（受託番号：ＡＸ４１１５２９）。ヒトＮｇＲＨ１は、ヒトＮｇＲに対して、アミノ酸レベルで４５％の類似性を有する。
【００９２】
ヒトＮｇＲＨ１の完全なＤＮＡ配列（配列番号１）（４２ｋＤａの分子量を有する４２０アミノ酸をコードしている１２６３ｂｐ）のみならず、本発明の開示された他のバリアントおよびフラグメントも、このアプローチで入手できる。別法として、ＮｇＲＨ１を得る第一のステップをヒトＮｇＲＨ１のアミノ酸配列を用いて始めてもよい。
【００９３】
ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）は、タンパク質ファミリーデータベースＰｆａｍに存在する種々のコンセンサスセグメントと配列を比較することにより同定される。ＬＲＲのさらなる同定および確認は、ＩＭＰＡＬＡソフトウエアを用いてＢＬＯＣＫＳ＋アライメントにより行われる。可能性のあるＧＰＩ切断部位の推定は、スイス・インスティチュート・オブ・バイオインフォマティクス（ＳＩＢ）のサーバーにあるＥｘＰａＳｙプログラムパッケージから、ＤＧＰＩを用いて行われる。
【００９４】
このようにして、ヒトＮｇＲＨ１はＮｇＲと同じファミリーのロイシンリッチ／プロテオグリカンタンパク質に属すことが明らかになる。ヒトＮｇＲと同様、ヒトＮｇＲＨ１はロイシンリッチリピートＮ末端とロイシンリッチリピートＣ末端によってフランキングされた８つのＬＲＲもコードする。ヒトＮｇＲＨ１は、Ｎ末端にシグナル配列が存在する他、そのＣ末端に、ＧＰＩ結合タンパク質に典型的な短い疎水性アミノ酸ストレッチを含む（実施例３も参照）。
【００９５】
ラット遺伝子も同様の方法により得ることができる。ラットＮｇＲＨ１をコードするｃＤＮＡはラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Marathon-Ready cDNA, BD Clontech, Palo Alto）からＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲはＨｅｒｃｕｌａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands）を用いて標準的なプロトコールにしたがって行う。プライマーはヒトＮｇＲＨ１（配列番号１）の５'−ＵＴＲの配列（５'−ＴＧＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧ−３'（配列番号８））およびラットＥＳＴ配列（受託番号ＢＥ０９７３３２）（５'−ＴＣＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡ−３'（配列番号９））に基づき選択する。完全長ｃＤＮＡをｐＣＲ−ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen）へクローニングする。ラットＮｇＲＨ１の全長ｃＤＮＡは、ヒト配列とＤＮＡレベルでは８７％同一であり、アミノ酸レベルでは８８％同一である。
【００９６】
実施例２
ヒトＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の発現およびそれらの生化学的特性決定
材料−培地：ＭＥＭ-α-プラス培地およびＧｌｕｔａｍａｘを含むＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Invitrogen, Basel, Switzerland）。一次抗体：モノクローナル抗Ｖ５抗体（Invitrogen, Basel, Switzerland）；モノクローナル抗ＨＡ抗体クローンＨＡ−７（SIGMA, Buchs, Switzerland）。二次抗体：ＰＯＤ結合抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体（SIGMA, Buchs, Switzerland）；抗マウスＩｇＧ、ＦＩＴＣ結合抗体（SIGMA, Buchs, Switzerland）。ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Roche Applied Science （Rotkreuz, Switzerland）。
【００９７】
方法：
a）ノーザンブロット：ｈＮｇＲおよびｈＮｇＲＨ１の発現の組織分布を調べるため、マルチプル・ティッシュ・ノーザンブロット（MTN, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）およびマルチプル・ティッシュ・エクスプレション・アレイ（MTEアレイ, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）をα−３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ−放射性標識ヒトＮｇＲおよびＮｇＲＨプローブとハイブリダイズさせた。それぞれのｃＤＮＡに対するプローブを以下のように作製した。ＮｇＲプローブはＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏ−Ｉ切断によりｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲの切り出しによって作製した。このクローンはヒト背根神経節（ＤＲＧ）ｃＤＮＡライブラリー（Life Technologies Inc., Rockville, Maryland）から得たものである。これはクエリーとしてヒトＮｇＲ ｃＤＮＡを用い、ライブラリーのクローン配列に対してｂｌａｓｔ検索を行って同定した。ｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲのｃＤＮＡインサートは公開されているＮｇＲの配列（受託番号：ＡＦ２８３４６３）と比べて５'末端および３'末端でそれぞれ２４および２９２ｂｐ長い。ＮｇＲＨ１プローブは、ＥｃｏＲＩ切断によるｈＮｇＲＨ２−ｆｌの切り出しにより作製した。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１に対してそれぞれ得られた１．８ｋｂおよび１．４３ｋｂ ｃＤＮＡインサートをゲル精製し（QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAGEN AG, Basel, Switzerland）、各１００ｎｇを、Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡラベリングキット（Roche Biochemicals, Rothkreuz, Switzerland）を用いて３種の異なる標識反応で放射性標識した。組み込まれなかったヌクレオチドはＮｕｃＴｒａｐプローブ精製カラム（Stratagene Europe, Amsterdam, Netherlands）を用いて除去した。ＭＴＮまたはＭＴＥ膜をＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）中で、製造業者の説明書にしたがい（ただし、Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは除外した）、ＮｇＲまたはＮｇＲＨ１プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。ヒトＮｇＲおよびヒトＮｇＲＨ１に関して、２．４ｋｂに一本のバンドが検出された。
【００９８】
ヒトＮｇＲおよびヒトＮｇＲＨ１ｍＲＮＡ発現は、ヒトの脳において最も高い。しかしながら、ヒトＨｇＲＨ１の豊富な発現は、ヒトの肝臓においても見られる。これらの遺伝子は、ともに、他の周辺組織、例えば骨格筋、脾臓、腎臓、肺および胎盤において低いレベルで発現する。脳での発現における可能性のある空間的相違をさらに詳細に考察するために、我々は、また、さまざまな脳の領域からの目印付きＲＮＡを担持しているＭＴＥをプローブ化した。この解析から、両方の遺伝子が異なる脳の領域において示唆的に発現されるように思われた。それらは大脳皮質、扁桃体、海馬および中隔側座核において高度に発現しているが、ＮｇＲのみが大脳皮質における発現に比べて小脳において極めて豊富である。両方の遺伝子の共通点は、脳橋、脳梁、尾状核、延髄、被核、黒質および脊髄においてそれらの発現が弱いことである。
【００９９】
b）細胞培養物およびトランスフェクション：ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＭＥＭ−α−プラス培地中で成長させる。この培地に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（最終濃度１０％）およびペニシリン、ストレプトマイシンを補い、２００Ｕ／ｍｌの最終濃度とする。一時的および安定的細胞トランスフェクションのために、ＦＵＧＥＮＥ６（Roche Applied Science, Rotkreuz, Switzerland）を、製造者の指示にしたがって使用する。ヒトＮｇＲおよびヒトＮｇＲＨ１（ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター）を発現している細胞を、ゼオシン（最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）で選別した。
【０１００】
c）エピトープタグ化ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の構築
1.）ＮｇＲ−Ｖ５タグクローニング手順：
Ｖ５−タグをコードする２つの相補的、合成オリゴヌクレオチド（Microsynth, Balgach, Switzerland）、５'−ＣＣＧ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ−３'（配列番号１０）および５'−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＧＡ−３'（配列番号１１）と制限切断部位ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩをアニーリングし、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（INVITROGEN, Basel, Switzerland）のＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ部位に連結してｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５を得た。その後、シグナルペプチドを含まないヒトＮｇＲをコードするｃＤＮＡ配列を、フォワードプライマー５'−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＣＣＣ−３'（配列番号１２）およびリバースプライマー５'−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＡＣ−３'（配列番号１３）を用いてｐｃＤＮＡ−Ｓｐｏｒｔ６−ＮｇＲ（上記参照）からＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＳｅｃＴａｇ２−Ｖ５のそれぞれの切断部位に連結した。
【０１０１】
2.）ＮｇＲＨ１−ＨＡタグクローニング手順：ＦＬＡＧ−タグをコードする２つの相補的、合成オリゴヌクレオチド（Microsynth, Balgach, Switzerland）、５'−ＣＣＧ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣ−３'（配列番号１４）および５'−ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＣＧＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡ−３'（配列番号１５）と制限切断部位ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩをアニーリングし、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（INVITROGEN, Basel, Switzerland）のＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ部位に連結し、ｐＳｅｃＴａｇ２−ＦＬＡＧを得た。その後、シグナルペプチドを有さないヒトＮｇＲＨ１をコードするｃＤＮＡ配列を、ｈＮｇＲＨ１−ｆｌから、フォワードプライマー５'−ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ−３'（配列番号１６）およびリバースプライマー５'−ＡＡＴ  ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ−３'（配列番号１７）を用いてＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、そしてｐＳｅｃＴａｇ２−ＦＬＡＧにおいてそれぞれの切断部位へと連結した。
【０１０２】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞への安定的細胞トランスフェクションの後、Ｖ５−またはＨＡ−タグでそれぞれタグ化したヒトＮｇＲおよびＮｇＲＨ１をウエスタンブロットで解析した。それぞれのセルラインは、ＮｇＲ（４７ｋＤａ）およびＮｇＲＨ１（４２ｋＤａ）に関して予想される分子量よりも大きいタンパク質（約６４ｋＤａ）を発現した。後記のように、この異常な分子量は、翻訳後修飾により説明され得る。ＮｇＲについて少なくとも２つの主要形態（major form）がＣＨＯ細胞により産生される。６４ｋＤａに見られるタンパク質のバンドは、完全長ＮｇＲとほとんど一致する。もう一方の約４８ｋＤａのバンドは、トランケートされたＮｇＲ分子のようである。しかしながら、４８ｋＤａのバンドは、ポリクローナルα−ＮｇＲ抗血清で検出できなかった。これは、近くにある非特異的バンド（これにより同定が不可能になる）のためであるか、またはこの形態のＮｇＲが、生じた抗血清に対するエピトープを欠如しているためである。対照的に、ＮｇＲＨ１についての個々のタンパク質のバンドは、特異的なポリクローナル抗血清を用いて確認され得る。α−ＮｇＲを除いて、抗血清は非トランスフェクト対照細胞においてタンパク質を捕捉せず、また、それらは異なるＮｇＲ種と交差反応しなかった。
【０１０３】
d）ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の細胞表面発現
1.）抗体および免疫学的検出
ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１タンパク質の検出のため、市販のモノクローナル抗タグ抗体またはウサギで作製したポリクローナル抗血清のいずれかを用いた。ポリクローナル抗血清の作製：ウサギ抗ＮｇＲ抗血清は、ヒトＮｇＲ（ＥＱＬＤＬＳＤＮＡＱＬＲＳＶＤＰＡ（配列番号１８）、ＥＶＰＣＳＬＰＱＲＬＡＧＲＤＬＫＲ（配列番号１９）およびＧＰＲＲＲＰＧＣＳＲＫＮＲＴＲＳ（配列番号２０））からの３つの合成ペプチドに対して作製したものをM.Schwab, University of Zurichから入手し、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Invitrogen, Corporation）によりアフィニティー精製した。ウサギＮｇＲＨ１抗血清は、ヒトＮｇＲＨ１配列由来の合成ペプチド（ＣＰＰＡＡＰＴＲＰＧＳＲＡＲＧＮ（配列番号２１）、ＤＬＰＡＥＤＳＲＧＲＱＧＧＤＡＰ（配列番号２２）およびＴＥＤＤＹＷＧＧＹＧＧＥＤＱＲ（配列番号２３））に対して作製し、ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣＳ（Seraing, Belgium）によりアフィニティー精製した。
【０１０４】
2.）ウエスタンブロット：
ＮｕＰＡＧＥプレキャスト４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（INVITROGEN, Basel, Switzerland）を用いてＳＤＳゲル電気泳動を行った。通常、分離にはＭＯＰＳランニングを用いた。ゲルの電気ブロットはＳｅｍｉｐｈｏｒ Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ Ｕｎｉｔ（Amersham Biosciences D bendorff, Switzerland）を用い、２４Ｖで１時間行った。免疫検出のため、このＰＶＤＦメンブランをＴＢＳＴ中５％のスキムミルクで４５分間ブロッキングした後、それぞれブロッキング液で希釈した一次抗体および二次抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ抗体とともに１時間インキュベートした。各抗体インキュベーション後に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳＴで３回メンブランを洗浄し、その後ＴＢＳで１回洗浄した。シグナルはＥＣＬＴＭ ウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland）およびＨｙｐｅｒｆｉｌｍＴＭ ＥＣＬＴＭ（Amersham Biosciences, Dubendorf, Switzerland）を用い、製造業者の説明書にしたがって現像した。
【０１０５】
3.）細胞表面のビオチニル化：
コンフルエント状態の細胞を４℃で３０分間、１ｍｇ／ｍｌのビオチン３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（スルホ−ＮＨＳ−ビオチン）を含むＰＢＳでインキュベートし、５０ｍＭのグリシンを含むＰＢＳで３回すすぎ、Ｍ−ＰＥＲ中で溶解させた。清澄化した溶解液を室温で２時間、アガロースビーズに結合させた２０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンとともにインキュベートし、その後ビーズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．８、１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、１００ｍＭ ＮａＣｌで連続的に洗浄した。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１は安定的ＣＨＯ−Ｋ１トランスフェクト体の細胞表面上で容易にビオチニル化されるが、対照タンパク質（ＧＡＰＤＨ）はビオチニル化されない。
【０１０６】
4.）免疫蛍光：表面および細胞質の対比染色のため、細胞を一次抗体とともに直接インキュベートした後に固定するか、あるいは細胞を、一次抗体を加える前に、４％パラホルムアルデヒドで固定して１０％ ＦＣＳ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２０分間ブロッキングした。ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。免疫前血清を対照として用いたところ、インタクト細胞の非特異的バックグラウンド染色は見られなかった。
【０１０７】
ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の亜細胞性分配を特徴付けるために、そして３つすべてのタンパク質が細胞表面に発現していることを示すために、我々は、細胞表面ビオチニル化を行った。細胞質性対照タンパク質ＧＡＰＤＨの標識は観察されなかったが、ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１分子は、該細胞に加えられた非浸透性試薬スルホ−ＮＨＳ−ビオチンで容易にビオチニル化された。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の細胞表面発現を、非浸透性、安定型ＣＨＯ細胞の免疫蛍光により、抗タグ抗体または個々のＮｇＲタンパク質に対するポリクローナル抗血清のいずれかを用いて、確認した。
【０１０８】
ｅ）ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１のＧＰＩ結合とグリコシル化：
次の実験対で、我々はインビトロ翻訳後修飾に関して確認を行った。ＮｇＲＨ１のＧＰＩ結合はそれらの一次構造から推定されたので、我々は、まず、このことをＰＩ−ＰＬＣを用いて実験的に確認した。まず、全細胞抽出液を細菌のホスファチジル−イノシトール−ホスホリパーゼ−Ｃ（ＰＩ−ＰＬＣ）の存在下または不存在下でインキュベートした。ＧＰＩリンカーを除去すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてタンパク質の移動度が変化する（Cardoso de Almeida et al., （1983） Nature 302, 349-52; Stahl, N. et al, （1987） Cell 51, 229-40; Littlewood, G.M. et al., （1989） Biochem. J. 257, 361-7）。ＧＰＩリンカーを有するタンパク質は、一般に、ＧＰＩリンカーの脂質鎖との疎水性相互作用のために、ＳＤＳ分子があると負荷が大きくなる。したがって、正味の電荷は、ＧＰＩリンカーが酵素的に除去されたタンパク質に比べると若干負の方向へ傾く。このようにＧＰＩを除去すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて平行レーンに流した非処理対照タンパク質に比べ、個々のタンパク質の特徴的な上方シフトが見られることになる。
【０１０９】
説明を簡単にするため、細胞をツニカマイシンで前処理し、グリコシル化により生じるタンパク質の複雑性を小さくした。このプロトコールに従えば、ＮｇＲならびにＮｇＲＨ１は、実際に、ＰＩ−ＰＬＣ処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴的な上方シフトを示し、それらがＧＰＩ結合していることが証明された。分泌型のＮｇＲは、ＰＩ−ＰＬＣ処理から完全に影響を受けずに残る。これらの知見をさらに確認するため、ＮｇＲまたはＮｇＲＨ１を発現している培養ＣＨＯ細胞をＰＩ−ＰＬＣとともにインキュベートした。その後、コンディショニング培地から回収したタンパク質を、細胞上に残っているタンパク質との比較においてウエスタンブロット法で解析した。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１は、３時間のＰＩ−ＰＬＣ処理の後、コンディショニング培地に放出され、それらがすべてＧＰＩアンカーを持っていることが確認された。
【０１１０】
興味深いことに、ＰＩ−ＰＬＣの不存在下でさえ、異なる３種すべてのタンパク質はかなり構成的に分泌されている。これは、ＮｇＲ発現細胞系の場合に最も顕著であり、従前に見られたトランケート型ＮｇＲ（４８ｋＤａ）は実質的に培地に放出される。それより小さいが、ＮｇＲＨ１の全長種の可能性もあるタンパク質も、対照コンディショニング培地で検出可能である。これらの所見がＣＨＯ細胞について特異的なものであるということを除外するため、我々は一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞においてＮｇＲの２つの主要な形態の存在を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＮｇＲおよびＮｇＲＨ１  ＣＨＯ細胞の細胞ペレットで現れるバンドがあったが、その同定は容易には行えなかった。
【０１１１】
１つの単純な説明は、それらがグリコシル化の不完全なＮｇＲ分子に由来するというものである。すべてのＮｇＲタンパク質は、それらのアミノ酸配列中に推定Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含む。細胞をツニカマイシンとともにインキュベートすると、ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１に特異的なバンドの分子量が著しく低下するが、このことは全てのＮｇＲタンパク質のグリコシル化が高くなることを示している。ここで、これらの分子量はＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の推定サイズによく一致しており、それらが非修飾タンパク質であることを反映している。ＮｇＲでは、そのより小さな分泌型がなお検出可能であるが、これは、この分子がグリコシル化とは独立に産生されることを示している。
【０１１２】
興味深いことに、ツニカマイシンは、培地へのＮｇＲの放出を容易に妨げたが、ＮｇＲＨ１の場合には効果が小さかった。比較的大量のＮｇＲＨ１がＰＩ−ＰＬＣ処理後でも培地に放出されるが、このことはＮｇＲと比較して、このタンパク質の半減期がより長いことを示している。このツニカマイシン実験でＮｇＲおよびＮｇＲＨ１がグリコシル化されていることが明らかに示されたことから、我々は、細胞ペレット画分における分泌型または成熟分子に明確に割り付けることができない付加的なバンドが、十分な翻訳後修飾を受けていない未熟な前駆体に由来するものであると考えている。興味深いことに、これらの未熟な形態は、細胞をＰＩ−ＰＬＣ処理した場合にのみ見られる。これは定常状態に比べ、原形質膜からＮｇＲタンパク質を除去した後の、新たな（de novo）タンパク質合成の増加を反映していると言えるかもしれない。
【０１１３】
f）ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１の脂質ラフト会合
1.）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）処理：
i）インタクト細胞の処理：コンフルエント状態の細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中で２回洗浄した後、３７℃で４時間、０．２Ｕ／ｍｌ  ＰＩ−ＰＬＣ（GLYKO Inc., Novato, CA）を含む４ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中でインキュベートした。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（Millipore, Volketswil, Switzerland）で細胞培地を６倍濃縮した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞スクレーパーで回収し、５０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。細胞の溶解：細胞ペレットを室温で２０分間、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（ROCHE Applied Science, Rothkreuz, Switzerland）を補ったＭ−ＰＥＲ中に溶解させた（１００μ／２５ｍｇ細胞ペレット）。その後、溶解物を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清に４℃で同バッファーを加えた。同量の溶解液と濃縮培地に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Invitrogen 4-12% Bistris Gels, MOPSバッファー）を行い、ＰＶＤＦメンブランにブロットした。ＰＩ−ＰＬＣ処理の後、ＰＩ−ＰＬＣは、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１および２９３Ｔ細胞から濃縮培地中へＮｇＲおよびＮｇＲＨ１を容易に放出するが、このことはそれらがＧＰＩ−アンカーを持っていることを示す。
【０１１４】
ii）細胞溶解液の処理：細胞を５０％〜８０％コンフルエントまで増殖させた。培地を廃棄し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で一晩、培地１ｍｌ当たり５μｇのツニカマイシン（GLYKO Inc., Novato, CA）を含む３ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（INVITROGEN, Basel, Switzerland）中でインキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き取って回収した。回収した細胞を４℃で１分間、２００００×ｇで遠心分離し、室温で２０分間、細胞ペレット１００ｍｇ当たり２００μｌのＭ−ＰＥＲ／ＥＤＴＡ含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ中で溶解させた。このサンプルを４℃で１０分間、２００００×ｇで再び遠心分離し、上清を回収した。この材料を等量のアリコートに２分し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．６バッファーで１：２希釈した。一方のアリコートに１Ｕ／ｍｌ  ＰＩ−ＰＬＣを加え、両アリコートを３７℃で少なくとも３時間インキュベートした。細胞溶解液をＰＩ−ＰＬＣ処理の後、ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１は、ＧＰＩアンカーの除去の指標となるＳＤＳ−ＰＡＧＥの特徴的な上方シフトを示す（Cardoso et al. （1983） Nature 302, 349-52; Stahl et al. （1987） Cell 51, 229-40; Littlewood et al. （1989） Biochem. J. 257, 361-7）。
【０１１５】
脂質ラフトの単離：脂質ラフトの調製は、ブラウン（Brown）およびローズ（Rose）１９９２（Brown et al. （1983） Nature 302, 349-52）にしたがって行った。要するに、１０ｃｍディッシュからのコンフルエント状態の細胞をＭＢＳ（２５ｍＭ  ＭＥＳ−バッファー／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で洗浄し、同バッファー中に掻き取った。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、細胞を氷上で０．３ｍｌ  ＭＢＳに再懸濁させた。以下のステップは全て４℃で行った。サンプルをＭＢＳで約０．５ｍｌに調整し、最終濃度１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とし、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズサンプルを同量の８０％（ｗ／ｖ）スクロース／ＭＢＳ（０．５ｍｌ）と混合して最終濃度４０％（ｗ／ｖ）スクロースとした。次に、このサンプルを５％／３０％スクロース密度勾配層の下方に入れた。この勾配の遠心分離は、ＳＷ５０．１ローターにて４℃で１６〜１８時間、３７２００ｒｐｍで行った。脂質ラフト／ＤＲＭは５％／３０％境界に不透明なバンドとして現れる。下方から上方へ９×０．５ｍｌ画分を、１ｍｌシリンジ／２１Ｇニードルを用いて回収した。
【０１１６】
ＧＰＩ結合タンパク質は脂質ラフトの特徴的な構成成分である。原形質膜のこれらの微小ドメインは、リン脂質生体層として知られているように、原形質膜構造の通常の組織とは機能的にも生物物理学的にも異なっている。コレステロールやスフィンゴ脂質などの特定の脂質の非対称パッキングが、脂質が整列した状態のラフトを決め、その結果、低温下でＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で不溶となる。この挙動は、ラフトまたは小胞と同義で、技術用語として用いられるいわゆる界面活性剤耐性膜（detergent−resistant−membranes （ＤＲＭ））をもたらす。ＤＲＭは、脂質含量が高いためにスクロース密度勾配で低密度上に浮く。これにより、会合型のタンパク質を細胞のその他の可溶性成分から同定および識別することができる。したがって、我々は、ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１を発現するＣＨＯ細胞を４℃の１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で抽出し、得られた抽出液をスクロース密度勾配遠心分離に適用した。
【０１１７】
我々の実験設定下では、ＤＲＭの沈降は通常、ラフトと会合することが知られているフローチリンなどのタンパク質とともに５％／３０％スクロース境界（画分５と６）で起こる。ＮｇＲおよびＮｇＲＨ１タンパク質は、実際に、マーカータンパク質とともに予測される画分５と６に沈降し、それらの脂質ラフト会合が示される。これに対して、分泌型のＮｇＲはラフトとともに沈降せず、スクロース密度勾配の下方から上方までいくつかの画分に混入し、主としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００可溶物を含有する４０％スクロースの高密度画分に存在する。これはＮｇＲＨ１由来の分泌型についてもそうであり、主として画分１と２に見られる。フローチリンの２つのタンパク質バンドは、このスクロース密度勾配において一本は４８ｋＤａに、小さい方は約４５ｋＤａに検出できる。いずれも原法としてはBickel et al. （1997） J. Biol. Chem. 272, 13793-802に記載されている。下方の４５ｋＤａのバンドは抗体と交差反応することが分かっており、我々の実験によればスクロース密度勾配のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００可溶性画分にのみ見られる。
【０１１８】
このように、我々は、このタンパク質の特性決定に関して、最近記載されたＮｏｇｏ−６６のレセプターのホモログであると同定したことを記載する。ＮｇＲＨ１は一次構造、生化学的特性および発現パターンの点でＮｇＲとの関連が強い。上記に示した複数の系統の証拠は、ＮｇＲおよび新たに同定されたホモログＮｇＲＨ１が新規なタンパク質ファミリーのメンバーであるという結論を支持するものである。
【０１１９】
実施例３：リガンド結合分析
リガンド結合アッセイは受容体の薬理学を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット形式の適用ができる。レセプターｈＮｇＲＨ１の対する精製リガンド（推定されるものとしてはＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧまたはＯＭｇｐ）は結合実験のために高い比活性（５０〜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）まで放射性標識することができる（あるいは、アルカリホスファターゼ、ＧＳＴ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ、Ｖ５など）のような、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）に対する好適な検出タグを用いる）。次に、放射性標識（またはその他のシグナル）のプロセスがそのレセプターに対するリガンドの活性を消失させないかどうかの判定を行ない得る。バッファー、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドなどのその他のモジュレーターのアッセイ条件は、膜のソースおよび全細胞レセプターのソース双方に対して働き得るシグナル／ノイズ比を確立し得る。これらのアッセイでは、特異的なレセプター結合は、（全会合放射活性）−（過剰量の非標識競合リガンドの存在下、またはＧＰＩアンカーを欠く過剰量の可溶性ＮｇＲＨ１エクトドメインの存在下で測定した放射活性）で定義できる（Domeniconi et al. （2002） Neuron 35, 283-290 （published online Jun 28）, Liu et al. （2002） Science Jun 27 （epub ahead of print）。可能であれば、１またはそれ以上の競合リガンドを用いて残りの非特異的結合を定義してもよい。
【０１２０】
実施例４：機能アッセイ
ヒトＮｇＲＨ１を、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞などの組換え発現系で発現させ、細胞表面での発現を証明することができる（例えば実施例２d参照）。あるいは、ｈＮｇＲＨ１を、上記のような組換え発現系で推定相互効果タンパク質（例えば、Ｎｏｇｏ−６６またはＮｏｇｏＡ、ＮｏｇｏＢ、ＮｏｇｏＣ、ＭＡＧまたはＯＭｇｐ）とともに発現させる。ｃＤＮＡ発現構築物の同時トランスフェクションは、例えばＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション剤（Qiagen）を用いて行う。機能の読み取りには細胞接着、細胞萌芽、細胞内ｃＡＭＰレベルおよび細胞内Ｃａ２＋レベルに変化をもたらすアゴニストの分析を含み得る（例えば、ＮｇＲＨ１を安定発現するＣＨＯ細胞へのＮｏｇｏ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭＡＧまたはＯＭｇｐの添加、または同時発現による）。
【０１２１】
あるいは、レセプターを遮断またはダウンレギュレートする化合物、抗体および分子の効果を評価し、以下の論文に記載されているように（Chen et al., 2001, Nature 403, 434-439; Fournier et al., 2001, Nature 409, 341-346）、Ｎｏｇｏリガンド（例えばＮｏｇｏ ＡまたはＣ）の存在下で成長円錐の崩壊、神経突起の成長および３Ｔ３細胞の拡散に関して標準的な機能アッセイで確認する。これらの治療薬の再生効果は、また、例えば以下の文献に記載されているように（例えば、Schnell et al., 1990, Nature 343, 269-272）脳および脊椎損傷、および機能欠損に対する効果（例えば、Thallmair et al., 1998, Nature Neurosci. 1, 124-131; Z'Graggen et al., 1998, J. Neurosci. 18, 4744-4754）のインビボモデルでも評価される。
【配列表】
2005519584.tif 000002
2005519584.tif 000003
2005519584.tif 000004
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2005519584.tif 000029
2005519584.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月3日(2004.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005519584000001.app
【国際調査報告】
2005519584.tif 000031
2005519584.tif 000032