(57)【要約】療法、診断および薬理遺伝学的用途に使用できる新規ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の少なくとも２４連続塩基を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードし；かつ
（ｂ）高ストリンジェントな条件下で配列番号：１のヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号：２の少なくとも約１２連続アミノ酸を有する、単離オリゴペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／２５７，９３２（それぞれ２０００年１２月２０日出願）の優先権を主張する。その仮出願の全体を本明細書に援用する。
１．発明の分野
本発明は、哺乳動物イオンチャンネルタンパクとの配列類似性をもつタンパク質をコードする新規ヒトポリヌクレオチドの知見、同定および解明に関する。本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオチド、宿主細胞発現系、コードされるタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、コードされるタンパク質およびペプチドに対する抗体、ならびに遺伝子工学的に処理された、開示遺伝子を欠如または過剰発現する動物、それらのタンパク質のアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに開示遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または活性を調節する他の化合物であって、診断、薬物スクリーニング、臨床試験モニタリング、疾患および障害の処置、および化粧品用途あるいは自然食品用途に使用できる化合物を包含する。
【０００２】
２．発明の背景
イオンチャンネルタンパクは、リン脂質二層を通過する物質輸送を仲介または容易にする膜内在タンパクである。
イオン輸送は哺乳動物生理の重要な調節要因として確認されているので、イオンチャンネルタンパクは証明された薬剤開発対象である。
【０００３】
３．発明の概要
本発明は、新規ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド、および対応するこのタンパク質のアミノ酸配列の知見、同定および解明に関する。本明細書に初めて記載した新規ヒトタンパク質（ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＮＨＰｓ）は、哺乳動物イオンチャンネルタンパク、特にカリウムチャンネル、およびより特にボルテージゲーテッド（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）カリウムチャンネルタンパクと構造類似性をもつ。このように前記ＮＨＰは、広範な門および種にわたる相同体およびオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）をもつ新規キナーゼをコードする。
【０００４】
本明細書に記載する新規ヒト核酸配列は、長さ４２５アミノ酸長のタンパク／オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコード化している（配列番号：２）。
本発明は下記のものをも包含する：前記ＮＨＰのアゴニストおよびアンタゴニスト（天然ＮＨＰと競合する、小型分子、大型分子、変異ＮＨＰ、またはその一部が含まれる）、ペプチド、および抗体、ならびに前記ＮＨＰポリヌクレオチドの発現を阻害するために使用できるヌクレオチド配列（たとえばアンチセンス分子およびリボザイム分子、ならびにオープンリーディングフレームまたは調節配列の置換構築体）、または前記ＮＨＰの発現を高めるために使用できるヌクレオチド配列（たとえば、前記ポリヌクレオチドを強力なプロモーター系の制御下におく発現構築体）、ＮＨＰトランスジーンを発現するトランスジェニック動物、または機能性ＮＨＰを発現しないＮＨＰ”ノックアウト体”（条件付きであってもよい）。ノックアウトマウスはいくつかの方法で調製することができ、その内のひとつには、記載したＮＨＰのマウス相同体中に遺伝子トラップ変異を含むマウス胚幹細胞（「ＥＳ細胞」）株の使用が含まれる。配列番号１〜３に記載の新規なＮＨＰ配列が“ノックアウト”であるときは、それらはその特別な遺伝子の形質発現を同定する方法並びにそれまで未知の遺伝子の機能を調べる方法を提供する。さらに配列番号１〜３に記載したユニークなＮＨＰ配列が“ノックアウト”された動物は、以前は免疫系により自己とみなされており顕著な抗体反応が顕在化しなかった相同および直系タンパクに対し、抗体を産生するユニークな供給源を提供する。それらの目的のために、前記ＮＨＰのマウス相同体中で遺伝子トラップノックアウトＥＳ細胞が調製された。
【０００５】
さらに、配列番号１−３に記載したユニークなＮＨＰ配列は、タンパクをコードしている配列の決定およびユニークな遺伝子を特定の染色体へマッピングするのに有用である（記載したＮＨＰをコード化する遺伝子は、明らかにヒト染色体２上にコード化されている。ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＣ００２５７５０参照）。それらの配列は、遺伝子配列のみからバイオインフォマチックスに基づいて推定されうるスプライス位置とは対照的に、生物的証明されたエキソンスプライス位置を確定する。本発明の配列は、制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＲＦＬＰ））解析における追加のＤＮＡマーカーとして、および法生物学において有用である。
【０００６】
更に本発明は、ＮＨＰ発現および／またはＮＨＰ活性を調節する化合物、すなわちそのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の同定方法であって、前記ＮＨＰおよび／またはＮＨＰ生成物の精製物、あるいはそれを発現する細胞を使用する方法にも関する。それらの化合物は、生物学的障害または平衡異常を伴う多様な症状の処置のための療法薬として使用できる。
【０００７】
４．配列表および図面の説明
配列表に、前記ＮＨＰアミノ酸配列をコード化するＮＨＰ  ＯＲＦの配列を示す。配列番号：３は、ＮＨＰ  ＯＲＦ並びに５’および３’フランキング配列を記載する。
【０００８】
５．発明の詳細な記述
本明細書に初めて記載するＮＨＰは、とりわけヒト細胞系、およびヒト胎児の脳、脳、小脳、脳下垂体、前立腺、胸腺、リンパ節、骨髄、気管、胎児の肝臓、肝臓、精巣、甲状腺、唾液腺、胃、骨格筋、心臓、子宮、脂肪、視床下部、卵巣、舌、大動脈、９〜１２週胚、腺癌、および骨肉腫細胞にて発現している新規タンパク質である。
【０００９】
本発明は下記のものを包含する：配列表に示すヌクレオチド配列、それらのヌクレオチドを発現する宿主細胞、それらのヌクレオチドの発現生成物、ならびに（ａ）前記遺伝子の哺乳動物相同体をコードするヌクレオチド（具体的に記載したＮＨＰおよびＮＨＰ生成物を含む）；（ｂ）機能性ドメイン（活性ドメインの新規領域が含まれるが、これらに限定されない）に対応する１以上のＮＨＰ部分をコードするヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物；（ｃ）前記ＮＨＰの少なくとも１つのドメインの全部または一部が欠失または変化した遺伝子工学的に形成した変異体または天然変異体をコードする単離ヌクレオチド、およびそれらのヌクレオチド配列により特定されるポリペプチド生成物；シグナル配列の全部または一部が欠失した可溶性タンパク質およびペプチドが含まれるが、これらに限定されない；（ｄ）ＮＨＰまたはそのドメインの１つ（たとえば受容体またはリガンドの結合ドメイン、アクセサリータンパク質／自己会合ドメインなど）が他のペプチドまたはポリペプチドに融合したキメラ融合タンパク質をコードする、ＮＨＰコード領域の全部または一部を含有するヌクレオチド；あるいは（ｅ）前記ポリヌクレオチドの療法用または診断用誘導体、たとえば本明細書の配列表に初めて開示した配列を含むオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｄｓＲＮＡまたは遺伝子療法構築体。
【００１０】
前記のように、本発明には下記のものが含まれる：配列表に示したヒトＤＮＡ配列（およびそれらを含むベクター）；さらに、配列表に示したＤＮＡ配列の相補配列に高ストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズする、連続ＮＨＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、機能的に均等な発現生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列も考慮される。さらに、配列表に示したアミノ酸配列をコードおよび発現するＤＮＡ配列の相補配列に中等度ストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前掲）］ハイブリダイズし、なおかつ機能的に均等なＮＨＰ生成物をコードする、いかなるヌクレオチド配列も考慮される。ＮＨＰの機能均等物には、他の種に存在する天然ＮＨＰ、および天然の、または工学的に作成した（たとえばＵＳＰ５，８３７，４５８に記載されているような部位特異的変異誘発、遺伝子シャッフリングまたは指向性進化）変異ＮＨＰが含まれる。本発明には、開示したＮＨＰポリヌクレオチド配列の縮重核酸バリアントも含まれる。
【００１１】
さらに、ＮＨＰ  ＯＲＦをコードするポリヌクレオチド、または配列表のヌクレオチド配列の対応する領域に約９９％、９５％、９０％もしくは約８５％類似する、または同一の（たとえば本明細書記載のように標準デフォルトセッティングを使用して、ＧＣＧ配列分析パッケージを用いるＢＬＡＳＴ配列比較分析により測定して）ポリヌクレオチド配列によってコードされるそれらの機能均等物が考慮される。
【００１２】
本発明には、前記ＮＨＰ遺伝子（またはコード領域）ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、したがってその相補配列である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子も含まれる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、本明細書記載のように高ストリンジェントであってもよく、またはストリンジェント度がより低くてもよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（”ＤＮＡオリゴ体”）である場合、それらの分子は本明細書の配列表に初めて開示した配列の連続領域を含む、一般に約１６〜約１００塩基、約２０〜約８０塩基、または約３４〜約４５塩基の長さのもの、またはそこに示すサイズの任意の変更または組合わせである。それらのオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせて用いて、ライブラリーのスクリーニング、クローンの単離、ならびにクローニング鋳型および配列決定用鋳型の調製などを行うことができる。
【００１３】
あるいは、そのようなＮＨＰオリゴヌクレオチドを、ライブラリーのスクリーニングおよび遺伝子発現パターンの評価のためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる（特にマイクロアレイまたはハイスループット”チップ”方式を用いて）。さらに、一連の前記ＮＨＰオリゴヌクレオチド配列またはその相補配列を用いて、前記ＮＨＰ配列の全部または一部を提示することができる。配列番号：１〜３の配列のうち１以上の少なくとも一部に初めて開示したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を、固体支持体マトリックス／基体（樹脂、ビーズ、膜、プラスチック、ポリマー、金属または金属化基体、結晶質または多結晶質の基体など）と組み合わせて、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。特に注目すべきものは、空間的にアドレス指定可能な、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのアレイ、または対応するオリゴペプチドおよびポリペプチドのアレイ（すなわち遺伝子チップ、マイクロタイタープレートなど）である。その際、空間的にアドレス指定可能なアレイ上に存在する少なくとも１つの生体ポリマーには、配列番号：１または３の配列のうち少なくとも１つに初めて開示したオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列、またはそれらがコードするアミノ酸配列が含まれる。生体ポリマーを固体支持体マトリックスに付着させる方法またはその上で合成する方法、およびその上で結合試験を実施する方法は、特にＵＳＰ５，７００，６３７、５，５５６，７５２、５，７４４，３０５、４，６３１，２１１、５，４４５，９３４、５，２５２，７４３、４，７１３，３２６、５，４２４，１８６および４，６８９，４０５に開示されており、それらの開示内容全体を本明細書に援用する。
【００１４】
配列番号：１〜３に初めて開示した配列を含むアドレス指定可能なアレイは、一時的および組織特異的な遺伝子発現を同定および解明するのに使用できる。これらのアドレス指定可能なアレイは、必要な特異性をもつのに十分であってなおかつ生産技術の限度内にある長さのオリゴヌクレオチド配列を含む。これらのプローブの長さは、約８〜約２０００ヌクレオチドの範囲内である。プローブは、好ましくは配列番号：１〜３に初めて開示した配列に由来する６０ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチドを含む。
【００１５】
たとえば一連の前記オリゴヌクレオチド配列またはその相補配列を、前記配列の全部または一部を提示するためにチップ方式で使用できる。一般に約１６〜約４０（またはこの範囲のうちの任意の整数）ヌクレオチド長さのオリゴヌクレオチドが互いに部分的にオーバーラップしてもよく、および／またはオーバーラップしないオリゴヌクレオチドを用いて配列を提示することもできる。したがって、前記ポリヌクレオチド配列は一般に、それぞれ前記配列表に初めて開示した少なくとも約８ヌクレオチドの長さの別個のオリゴヌクレオチド配列を少なくとも約２つまたは３つ含むはずである。そのようなオリゴヌクレオチド配列は、配列表中の配列内に存在するいずれかのヌクレオチドから始まり、前記配列に対してセンス（５’−から−３’へ）配向またはアンチセンス配向のいずれで進行してもよい。
【００１６】
マイクロアレイに基づく分析によって広範な遺伝子活性パターンを見出すことができ、遺伝子機能について新たな理解が得られ、転写プロセスおよび生物学的機序について新規な予想外の洞察が得られる。配列番号：１〜３に初めて開示した配列を含むアドレス指定可能なアレイの使用により、特定の経路に関与する転写の変化について詳細な情報が得られ、これによって新規な表現型として現われる新規な成分または遺伝子機能を同定できる。
【００１７】
配列番号：１〜３に初めて開示した配列を含むプローブは、薬物を見出すための新規分子ターゲットの同定、選択および立証にも使用できる。これらのユニーク配列を用いて薬物ターゲットを直接に確認し、その薬物の目的ターゲットとは異なる経路により調節される、薬物による遺伝子発現の変化を識別することができる。したがってこれらのユニーク配列は、薬物の作用および毒性の両方を判定およびモニターするのにも有用である。
【００１８】
有用性の例として、配列番号：１〜３に初めて開示した配列をマイクロアレイまたは他のアッセイ方式に利用して、特定の医学的状態にある患者から採集した遺伝子材料をスクリーニングできる。これらの検査は、配列番号：１〜３に初めて開示した配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで用い、当業者に既知のコンピューターソフトウェアを利用して、以前に収集した遺伝子データベースおよび開示配列を比較することによっても実施できる。
【００１９】
たとえば、配列番号：１〜３に初めて開示した配列を、特定の疾患に関連する変異の同定のために、また診断アッセイまたは予後アッセイにおいて利用できる。
現在記載されている配列はヌクレオチド配列を用いて具体的に記載されているが、各配列は多様な他の構造特性またはその組合わせのいずれかを用いて独自に記載できることを理解すべきである。たとえば、ある配列は、その配列の特定の領域内に存在するヌクレオチドの正味組成を、配列番号：１〜３に初めて開示した１以上の特異的オリゴヌクレオチド配列の存在と組み合わせることにより記載できる。あるいは、制限エンドヌクレアーゼ消化部位の相対位置または種々のパリンドロームその他の特異的オリゴヌクレオチド配列を特定する制限地図を用いて、ある配列の構造を記載することができる。このような制限地図は、広く利用できるコンピュータープログラム（たとえばウィスコンシン大学ＧＣＧ配列分析パッケージ、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ  ３．０、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ社、ミシガン州アン・アーバーなど）により一般に作製される。これらの制限地図は所望により、配列中にある１以上の別個のヌクレオチド配列を、１以上の追加配列または開示配列中にある１以上の制限部位に対するその配列の相対位置により表したものと組み合わせて使用できる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドプローブに関して、高ストリンジェントな条件とは、たとえば６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（１４塩基オリゴ体について）、４８℃（１７塩基オリゴ体について）、５５℃（２０塩基オリゴ体について）、および６０℃（２３塩基オリゴ体について）での洗浄を表す。これらの核酸分子は、たとえばＮＨＰ遺伝子調節に有用なＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子をコードし、またはＮＨＰ遺伝子アンチセンス分子として作用し、および／またはＮＨＰ遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして作用することができる。ＮＨＰ遺伝子調節に関しては、それらの方法を用いて生物学的機能を調節することができる。さらに、そのような配列を、同様にＮＨＰ遺伝子調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用できる。
【００２１】
さらに、阻害性のアンチセンスまたは二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記を含めた群（これらに限定されない）から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【００２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含めた（これらに限定されない）群から選択される少なくとも１個の修飾糖部分を含むこともできる。
【００２３】
さらに他の態様において、制限的でない例としてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタール、またはその類似体を含む群から選択される少なくとも１個の修飾リン酸主鎖を含む。
【００２４】
さらに他の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−単位と異なり、鎖が互いに平行に走行する特異的な二本鎖ハイブリッドを相補的ＲＮＡと形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。あるいは二本鎖ＲＮＡを用いてターゲットＮＨＰの発現および機能を撹乱することができる。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準法により、たとえば自動ＤＮＡ合成装置（たとえばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を用いて合成できる。一例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは（Ｓｔｅｉｎら，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９）合成でき、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体を用いて製造できる（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７４４８−７４５１）など。
【００２６】
低ストリンジェントな条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が由来する個々の生物に応じて異なるが、推定可能であろう。そのような条件に関する手引きについては、たとえば下記を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（およびその定期改訂版）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，上掲。
【００２７】
あるいは、適切なストリンジェントな条件を採用し、またはＰＣＲにより、適切に標識したＮＨＰヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ヒトゲノムクローンの同定および解明は、多型性（ヌクレオチド反復配列、マイクロサテライト対立遺伝子、一ヌクレオチド多型、またはコーディング一ヌクレオチド多型が含まれるが、これらに限定されない）の確認、特定の遺伝子座／対立遺伝子のゲノム構造の決定、および診断試験の設計に有用である。たとえばヒト遺伝子のイントロン／エキソン境界に隣接する領域に由来する配列を用いて、エキソン、イントロン、スプライス部位（たとえばスプライスアクセプターおよび／またはドナー部位）内などの変異を検出するための増幅アッセイに用いるプライマーを設計し、これらを診断および薬理遺伝学に使用できる。
【００２８】
例えば、本発明の配列は、制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＲＦＬＰ））解析において特定のものを同定するために使用することができる。この技術では、個々のゲノムＤＮＡが一つもしくはそれ以上の制限酵素で切断され、同定のために単一のバンドが得られるようにサザンプロットで精査される（米国特許番号５，２７２，０５７に一般的に記載されており、ここに参照として援用する）。さらに、本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬、たとえばヒトゲノムの特定位置にターゲットされたＰＣＲプライマーで、たとえば他の“同定マーカー”（すなわち、特定の個人に対してユニークな他のＤＮＡ配列）を提供することによってＤＮＡに基づいた法的同定の信頼性を高めることができるＰＣＲプライマー、を提供するために使用することができる。実際の塩基配列情報は、制限酵素によって生じた断片により形成された正確なパターンとして、同定のために使用することができる。
【００２９】
さらに、本明細書に開示するＮＨＰ生成物内のアミノ酸配列に基づいて設計した２つの縮重または”ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）”オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを行うことにより、目的生物の核酸からＮＨＰ遺伝子相同体を単離できる。反応の鋳型は、ＮＨＰ遺伝子の対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される、ヒトまたは非ヒト細胞系または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られる全ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡであってよい。
【００３０】
増幅配列が目的ＮＨＰ遺伝子の配列であることを確認するために、ＰＣＲ生成物をサブクローニングして配列決定することができる。次いでそのＰＣＲフラグメントを用いて多様な方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離できる。たとえば増幅フラグメントを標識し、ｃＤＮＡライブラリー、たとえばバクテリオファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。あるいは、標識フラグメントを用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することができる。
【００３１】
ＰＣＲ法を利用して、全長ｃＤＮＡ配列を単離することもできる。たとえば標準法により、適切な細胞源または組織源（すなわち、ＮＨＰ遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される源）からＲＮＡを単離できる。最も５’末端の増幅フラグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを第１鎖合成のプライミングに用いて、ＲＮＡについて逆転写（ＲＴ）反応を行うことができる。次いで得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応により”テイル形成”し、このハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、次いで相補プライマーにより第２鎖合成をプライミングすることができる。こうして、増幅フラグメントの上流のｃＤＮＡ配列を単離できる。使用できるクローニング方式の概説については、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（前掲）を参照されたい。
【００３２】
変異ＮＨＰ配列をコードするｃＤＮＡは、たとえばＰＣＲを用いて単離できる。この場合、第１ｃＤＮＡ鎖は、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有すると推定される個体においてＮＨＰ遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される組織から単離したｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、この新たな鎖を逆転写酵素で延長することにより合成できる。次いで正常配列の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、このｃＤＮＡの第２鎖を合成する。次いでこれら２プライマーを用いて、生成物をＰＣＲにより増幅させ、所望により適切なベクター中へクローニングし、当業者に周知の方法でＤＮＡ配列分析を行う。変異ＮＨＰ対立遺伝子のＤＮＡ配列を対応する正常なＮＨＰ対立遺伝子のものと比較することにより、変異ＮＨＰ遺伝子生成物の機能の喪失または変化に関与する変異（１以上）を確認できる。
【００３３】
あるいは、変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかもしくは分かっている個体（すなわちＮＨＰ関連表現型、たとえば肥満症、高血圧症、結合組織疾患、不妊、糖尿病、脱毛症、不整脈などを発現している者）から得たＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築することができ、または変異ＮＨＰ対立遺伝子を発現することが分かっているかもしくは推測される組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。次いで、正常なＮＨＰ遺伝子、またはそのいずれか適切なフラグメントを標識してプローブとして用い、そのようなライブラリー中の対応する変異ＮＨＰ対立遺伝子を同定することができる。次いで、当業者に周知の方法で変異ＮＨＰ配列を含むクローンを精製し、配列分析することができる。
【００３４】
さらに、たとえば変異ＮＨＰ対立遺伝子を保有することが推測されるかまたは分かっている個体の、そのような変異対立遺伝子を発現することが分かっているかまたは推測される組織より単離したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築できる。この方法で、後記のように、推定変異組織が形成した遺伝子生成物を発現させ、正常ＮＨＰ生成物に対して産生された抗体と組み合わせた標準抗体スクリーニング法を用いてスクリーニングすることができる（スクリーニング法については、たとえばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編，１９８８，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，コールド・スプリング・ハーバー、参照）。
【００３５】
さらに、標識ＮＨＰ融合タンパク質、たとえばアルカリ性ホスファターゼ−ＮＨＰまたはＮＨＰ−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質を用いてスクリーニングすることによりスクリーニングを行うことができる。ＮＨＰ変異により機能の変化した発現産物が生じる場合（たとえばミスセンス変異またはフレームシフト変異の結果）、ＮＨＰに対するポリクローナル抗体が対応する変異ＮＨＰ発現生成物と交差反応する可能性がある。それらとそのような標識抗体との反応により検出されるライブラリークローンを当技術分野で周知の方法で精製し、配列分析することができる。
【００３６】
本発明は下記のものをも包含する：（ａ）前記ＮＨＰコード配列および／またはそれらの相補配列（すなわちアンチセンス）のいずれかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前記ＮＨＰコード配列のいずれかを含むＤＮＡ発現ベクター（たとえばＵＳＰ５，８６９，３３６に記載のバキュロウイルス；本明細書に援用する）；（ｃ）宿主細胞におけるコード配列の発現を指令する調節要素と機能可能な状態で結合した前記ＮＨＰコード配列のいずれかを含む、遺伝子工学的に処理した宿主細胞；ならびに（ｄ）外から導入された調節要素の制御下に内因性ＮＨＰ配列を発現する（すなわち遺伝子の活性化）、遺伝子工学的に処理した宿主細胞。本明細書中で用いる調節要素には、誘導性および非誘導性のプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ならびに発現を誘発および調節することが当業者に知られている他の要素が含まれるが、これらに限定されない。それらの調節要素には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極初期遺伝子、調節可能なウイルス要素（特にレトロウイルスＬＴＲプロモーター）、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母α−接合因子のプロモーター。
【００３７】
本発明は下記のものをも包含する：抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントが含まれる）、ＮＨＰのアンタゴニストおよびアゴラスト、ならびにＮＨＰ配列の発現を阻害する化合物もしくはヌクレオチド構築体（転写因子阻害薬、アンチセンス分子およびリボザイム分子、またはオープンリーディングフレーム配列もしくは調節配列置換構築体）、またはＮＨＰの発現を促進する化合物もしくはヌクレオチド構築体（たとえばＮＨＰコード配列が機能可能な状態でプロモーター、プロモーター／エンハンサーなどの発現制御要素と結合した発現構築体）。
【００３８】
前記ＮＨＰまたはＮＨＰペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストは、疾病の診断のために変異ＮＨＰまたは不適正発現したＮＨＰを検出するのに使用できる。ＮＨＰタンパクまたはペプチド、ＮＨＰ融合タンパク質、ＮＨＰヌクレオチド配列、宿主細胞発現系、抗体、アンタゴニスト、アゴニスト、ならびに遺伝子工学的に処理した細胞および動物は、身体における正常なＮＨＰ機能の撹乱の症候性発現または表現型発現を処置するのに有効な薬物のスクリーニング（またはコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニング）にも使用できる。遺伝子工学的に処理した宿主細胞および／または動物の使用は、それらの系によりＮＨＰの内因性受容体に結合する化合物を同定できるだけでなく、ＮＨＰ仲介による活性または経路を誘発する化合物をも同定できるという点で、有利である。
【００３９】
最終的に、ＮＨＰ生成物を療法薬として使用できる。たとえばＮＨＰの可溶性誘導体、ＮＨＰに対応するペプチド／ドメイン、ＮＨＰ融合タンパク質生成物（特にＮＨＰ−Ｉｇ融合タンパク質、すなわちＩｇＦｃへのＮＨＰまたはＮＨＰドメインの融合体）、ＮＨＰ抗体および抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントが含まれる）、アンタゴニストまたはアゴニスト（ＮＨＰ仲介経路における下流ターゲットを調節し、またはそれに作用する化合物が含まれる）を用いて、そのような疾病または障害を直接に処置することができる。たとえば、有効量の可溶性ＮＨＰ、またはＮＨＰを模倣するＮＨＰ−ＩｇＦｃ融合タンパク質もしくは抗イディオタイプ抗体（またはそのＦａｂ）の投与により、内因性ＮＨＰ受容体を活性化するか、またはそれと効果的に拮抗させることができる。そのようなＮＨＰ生成物をコードするヌクレオチド構築体を用いて、そのような生成物をインビボで発現するように宿主細胞を遺伝子工学的に処理することができる；遺伝子工学的に処理したこれらの細胞は体内で”バイオリアクター”として作用し、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチドまたはＮＨＰ融合タンパク質を身体に連続的に供給する。機能性ＮＨＰ、変異ＮＨＰ、ならびにアンチセンス分子およびリボザイム分子をコードするヌクレオチド構築体は、ＮＨＰ発現を調節する”遺伝子療法”方式にも使用できる。したがって本発明は、生物学的障害を処置するための医薬配合物および方法をも包含する。
【００４０】
本発明の多様な態様について、以下の各サブセクションにさらに詳細に記載する。
５．１  ＮＨＰ配列
前記ＮＨＰのｃＤＮＡ配列および対応する推定アミノ酸配列を配列表に示す。
【００４１】
ＮＨＰヌクレオチドは、、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンからのクラスター配列（ｃｌｕｓｔｅｒｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から得られた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ガイザースバーグ，ＭＤ）。
【００４２】
発現解析により、上述のように前記ＮＨＰは、様々なヒト細胞において発現されうることが示された。
配列番号１のヌクレオチド位として４３２位でのＧ／Ｃ多型（それは配列番号２のアミノ酸１４４位が両方ともグリシンとなる結果となる）が確認された。
【００４３】
記載した新規ヒトポリヌクレオチド配列の更なる適用は、例えばポリヌクレオチドシャフリングまたは関連した方法論を用いて、少なくとも部分的に記載した新規配列によりコードされるタンパク質の分子突然変異生成／進化におけるそれらの使用である。そのようなアプローチは、米国特許第５，８３０，７２１および５，８３７，４５８に記載されており、それらの全体を参照として本明細書に援用する。
【００４４】
ＮＨＰ遺伝子生成物をトランスジェニック動物において発現させることもできる。蟯虫、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、鳥類、ヤギおよび非ヒト霊長類、たとえばヒヒ、サルおよびチンパンジーなどを含めた（これらに限定されない）任意の種の動物を用いて、ＮＨＰトランスジェニック動物を作成することができる。
【００４５】
ＮＨＰトランスジーンを動物に導入してトランスジェニック動物の創始系を作成するための、当技術分野で既知の任意の方法を使用できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：前核マイクロインジェクション（ＨｏｐｐｅおよびＷａｇｎｅｒ，１９８９，ＵＳＰ４，８７３，１９１）；レトロウイルス仲介による生殖系細胞への遺伝子伝達（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６１４８−６１５２）；胚性幹細胞における遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４）；精子仲介遺伝子伝達（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３）など。そのような方法の概説については、Ｇｏｒｄｏｎ，１９８９，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９参照；この全体を参考として本明細書に援用する。
【００４６】
本発明は、それらのすべての細胞にＮＨＰトランスジーンを保有するトランスジェニック動物、およびそれらのすべての細胞ではなく一部の細胞にこのトランスジーンを保有する動物、すなわちモザイク動物または体細胞トランスジェニック動物を提供する。トランスジーンは単一トランスジーンとして、またはコンカテマー中に、たとえば頭−頭縦列または頭−尾縦列で組み込まれてもよい。トランスジーンは、たとえばＬａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６２３２−６２３６の教示に従って、特定の細胞タイプに選択的に導入され、活性化されてもよい。そのような細胞タイプ特異的活性化に必要な調節配列は、目的とするその細胞タイプに依存し、当業者に自明であろう。
【００４７】
ＮＨＰトランスジーンを染色体の内因性ＮＨＰ遺伝子部位に組み込みたい場合、遺伝子ターゲティングが好ましい。要約すると、そのような方法を用いたい場合、内因性ＮＨＰ遺伝子のヌクレオチド配列に染色体配列との相同組換えにより組み込ませ、その機能を撹乱するために（すなわちノックアウト動物）、内因性ＮＨＰ遺伝子に相同な若干のヌクレオチド配列を含むベクターを設計する。
【００４８】
トランスジーンを特定の細胞タイプに選択的に導入し、これによりその細胞タイプにおいてのみ内因性ＮＨＰ遺伝子を不活性化することもできる：たとえばＧｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１０３−１０６の教示による。そのような細胞タイプ特異的不活性化に必要な調節配列は、目的とするその細胞タイプに依存し、当業者に自明であろう。
【００４９】
トランスジェニック動物が作成されると、標準法により組換えＮＨＰ遺伝子の発現を評価することができる。サザンブロット分析またはＰＣＲ法により初期スクリーニングを行って動物組織を分析し、トランスジーンの組込みが行われたかどうかをアッセイすることができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルも、その動物から得た組織試料のノーザンブロット分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、およびＲＴ−ＰＣＲを含めた方法（これらに限定されない）を用いて評価することができる。ＮＨＰ遺伝子発現組織の試料を、そのＮＨＰトランスジーン生成物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。
【００５０】
５．２  ＮＨＰおよびＮＨＰポリペプチド
前記ＮＨＰ、ＮＨＰポリペプチド、ペプチドフラグメント、変異形、トランケート形もしくは欠失形のＮＨＰ、および／またはＮＨＰ融合タンパク質を、多様な用途のために調製することができ、これらの用途には、抗体産生、ＮＨＰに関連した他の細胞遺伝子生成物の同定、精神的、生物学的または医学的な障害および疾病の療法処置において有用な医薬として使用できる化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬としての用途が含まれるが、これらに限定されない。得られた類似性の情報および発現データにより、前記ＮＨＰは疾患の治療のため、またはたとえば化学療法剤の効能を治療的に増強するためのターゲットとなり得る（薬剤、オリゴ、抗体等によって）。
【００５１】
配列表に、前記ＮＨＰ  ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を開示する。そのＮＨＰは、ＤＮＡ配列コンテクストに翻訳開始部位に当たるイニシエーターメチオニンを有する。
【００５２】
本発明のＮＨＰアミノ酸配列には、配列表に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の種に由来する対応するＮＨＰ相同配列も本発明に包含される。事実、配列表に示したアミノ酸配列の全部またはいずれかの新規部分をコードする新規ポリヌクレオチド配列のほか、前記ＮＨＰヌクレオチド配列がコードするいかなるＮＨＰタンパクも本発明の範囲に含まれる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって配列表に示した各アミノ酸はそのアミノ酸をコードしうる周知の核酸”トリプレット”コドン（または多くの場合、コドン類）の一般的代表例である。したがって、本明細書で意図するように、配列表に示したアミノ酸配列は、遺伝子コード（たとえば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９８６，Ｊ．Ｄａｒｎｅｌｌら編，ｐ．１０９，表４−１参照，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ニューヨーク州ニューヨーク；本明細書に参考として援用）を合わせて考慮すると、そのようなアミノ酸配列をコードしうる核酸配列の種々の変形および組合わせによるすべてのうちの一般的代表例である。
【００５３】
本発明は、多数の基準のいずれかにより判定して本明細書に記載したヌクレオチド配列がコードするＮＨＰに機能的に均等なタンパク質をも包含する。これらの基準には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＮＨＰの基質と結合しそして切断する能力；同一または補足的な下流経路に影響を及ぼす能力；細胞代謝（たとえばタンパク質分解活性、イオンフラックス、チロシンリン酸化、輸送など）を変化させる能力。そのような機能的に均等なＮＨＰタンパク質には、前記ＮＨＰヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加体または置換体であって、ただしサイレント変化を生じ、したがって機能的に均等な発現生成物を産生するものが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水度、親水度および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば非極性（疎水性）アミノ酸残基にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００５４】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本発明のＮＨＰヌクレオチド配列を発現させることができる。本発明のようにＮＨＰペプチドまたはポリペプチドが膜タンパクであると考えられる場合、そのタンパクの疎水性領域は切除されることができ、得られる可溶性ペプチドまたはポリペプチドを培地から回収できる。そのような発現系には、ＮＨＰまたはその機能均等物をｉｎ  ｓｉｔｕで発現する工学的に処理した宿主細胞も包含される。そのような発現系からのＮＨＰの精製または富化は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業者に周知の方法を用いて行うことができる。しかし、ＮＨＰの構造特性および機能特性を維持するだけでなく、たとえばある薬物スクリーニングアッセイにおいて生物学的活性を評価することが重要である場合、そのような工学的に処理した宿主細胞自体を使用できる。
【００５５】
本発明の目的に使用できる発現系には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、たとえば細菌（たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＮＨＰヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；またはＮＨＰヌクレオチド配列および哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）を含む組換え発現構築体を宿した哺乳動物細胞系（たとえばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２３９、３Ｔ３など）。
【００５６】
細菌系では、発現するＮＨＰ生成物について意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択できる。たとえばＮＨＰの医薬組成物またはＮＨＰ含有医薬組成物を調製するために、あるいはＮＨＰに対する抗体を産生させるために、そのようなタンパク質を大量に製造したい場合、容易に精製される融合タンパク質生成物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２：１７９１）、この場合、ＮＨＰコード配列を個々に、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域と読み枠を一致させて、ベクター中にライゲートさせる；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ、Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（ファルマシアまたはＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション））を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞からグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで遊離グルタチオンの存在下での溶離によって、容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターがトロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計し、これにより、クローン化したターゲット発現生成物をＧＳＴ部分から放出させることができる。
【００５７】
典型的昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドローシスウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）を外来ポリヌクレオチド配列発現のためのベクターとして用いる。このウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖させる。ＮＨＰコード配列を個々にウイルスの非必須領域（たとえばポリヘドリン遺伝子）内へクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえばポリヘドリンプロモーター）の制御下におく。ＮＨＰ遺伝子コード配列の挿入に成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、ノンオクルーデッド（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ）組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子がコードするタンパク質性コートをもたないウイルス）が産生されるであろう。次いでこれらの組換えウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の感染に用い、ここで挿入配列を発現させる（たとえばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ，ＵＳＰ４，２１５，０５１参照）。
【００５８】
哺乳動物宿主細胞の場合、多数のウイルス性発現系を利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的とするＮＨＰヌクレオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーターおよび三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲートさせることができる。次いでこのキメラ配列をインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すると、感染宿主においてＮＨＰ遺伝子生成物を発現しうる生存可能な組換えウイルスが得られる（たとえばＬｏｇａｎ、Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９参照）。挿入したＮＨＰヌクレオチド配列の効率的翻訳には、特異的開始シグナルが必要なこともある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全ＮＨＰ遺伝子またはｃＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ないかもしれない。しかしＮＨＰコード配列の一部のみを挿入する場合、外因性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）を供給することができる。さらに、挿入配列全体を確実に翻訳するためには、開始コドンが目的コード配列の読み枠と一致しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれでも、多様な由来のものであってよい。適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを取り込ませることにより、発現効率を高めることができる（Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４参照）。
【００５９】
さらに、挿入配列の発現を調節し、または発現生成物を目的とする特定の様式で修飾およびプロセシングする、宿主細胞系統を選ぶことができる。タンパク質生成物のそのような修飾（たとえばグリコシル化）およびプロセシング（たとえば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質および発現生成物の翻訳後プロセシングおよび修飾について特徴的かつ特異的な機序をもつ。発現した外来タンパク質の望ましい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選ぶことができる。このために、一次転写体の望ましいプロセシング、発現生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特にヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
組換えタンパク質の長期高収率産生のためには、安定な発現が好ましい。たとえば前記ＮＨＰ配列を安定に発現する細胞系を工学的に作成することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適切な発現制御要素（たとえばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択性マーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。この外来ＤＮＡの導入後、工学的に処理した細胞を富化培地で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド内の選択性マーカーが選択に対する耐性を与え、細胞はそのプラスミドを細胞の染色体に安定に組み込むことができ、増殖してフォーカスを形成する。次いでこれをクローン化し、細胞系に拡張することができる。この方法は、ＮＨＰ生成物を発現する細胞系を工学的に作成するのに有利に使用できる。このような工学的に作成した細胞系は、ＮＨＰ生成物の内因活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用である。
【００６１】
多数の選択系を使用でき、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）遺伝子を、それぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞に使用できる。代謝拮抗物質耐性を下記の遺伝子の選択の基礎として用いることもできる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。
【００６２】
あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、いかなる融合タンパク質も容易に精製できる。典型的系では、ヒト細胞系において発現した非変性融合タンパク質を容易に精製できる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的配列をその配列のオープンリーディングフレームが６ヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳時融合するように、ワクシニア組換えプラスミド内へサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮｉ2+・ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装填し、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶離する。
【００６３】
本発明には、ＮＨＰをターゲット臓器へ向かわせ、および／または膜を透過して細胞質ゾル内への輸送を促進する融合タンパク質が含まれる。抗体分子またはそのＦａｂフラグメントへのＮＨＰの結合は、特定のエピトープを保有する細胞をターゲティングするのに利用できる。適切なシグナル配列をＮＨＰに結合させると、ＮＨＰを細胞内の目的位置へ輸送することもできる。あるいは、ＮＨＰまたはその核酸配列のターゲティングは、リポソームまたは脂質複合体をベースとする送達系を用いて達成することもできる。そのような技術は、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｎｅｗ  Ｒ．Ｒ．Ｃ．編、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、およびＵＳＰ４，５９４，５９５、５，４５９，１２７、５，９４８，７６７および６，１１０，４９０に記載されており、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。更に本発明には、新規なタンパク質構築体であって、ＮＨＰがその機能活性を発揮することができる細胞膜および／または核を通過して、ターゲット部位あるいは目的臓器へのＮＨＰの輸送を容易にするように作成したものも包含される。この目標は、ＮＨＰのターゲティング特異性を与えるサイトカインあるいは他のリガンドとのカップリングによって、および／または必要であれば細胞膜透過容易にするためにタンパク形質導入ドメイン（そのような形質導入配列の例として米国仮特許出願６０／１１１，７０１および６０／０５６，７１３を参照。これらを参照として本明細書に援用する。）とＮＨＰをカップリングすることにより達成され、核局所化シグナルを含むように作成することができる。
【００６４】
さらに本発明の範囲に含まれるのは、配列表に初めて記載されたアミノ酸で示されるオリゴペプチドである。そのようなＮＨＰオリゴペプチドは、一般的に約１０〜約１００アミノ酸長の間、または約１６〜約８０アミノ酸長の間、あるいは約２０〜約３５アミノ酸長の間、あるいは配列表に初めて開示した配列の連続領域を含んだ前記サイズの変形物あるいは組合わせである。そのようなＮＨＰオリゴペプチドは、上述の長さ範囲のいずれであってもよく、配列表のいずれのアミノ酸位置からのものであってもよい。
【００６５】
５．３  ＮＨＰ生成物に対する抗体
ＮＨＰの１以上のエピトープ、またはＮＨＰの保存バリアントのエピトープ、またはＮＨＰのペプチドフラグメントを特異的に認識する抗体も、本発明に包含される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれるが、それらに限定されない。
【００６６】
本発明の抗体は、たとえば生物試料中のＮＨＰの検出に使用でき、したがって患者を異常な量のＮＨＰについて調べる診断法または予後判定法の一部として使用できる。そのような抗体を、たとえば化合物スクリーニング法と組み合わせて、後記のようにＮＨＰ発現生成物の発現および／または活性に対する被験化合物の作用を評価するのにも利用できる。さらに、そのような抗体を遺伝子療法と組み合わせて用い、たとえば正常および／または工学的に処理したＮＨＰ発現細胞を患者に導入する前に評価することができる。そのような抗体をさらに、異常なＮＨＰ活性の阻害手段として使用できる。したがって、そのような抗体を処置方法の一部として利用できる。
【００６７】
抗体産生のためには、ＮＨＰ、ＮＨＰペプチド（たとえばＮＨＰの機能性ドメインに対応するもの）、トランケート形ＮＨＰポリペプチド（１以上のドメインを欠失したＮＨＰ）、ＮＨＰの機能均等物、またはＮＨＰの変異バリアントを注射することにより、種々の宿主動物を免疫化することができる。数例を挙げると、そのような宿主動物にはブタ、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために種々のアジュバントを使用でき、これにはフロイントアジュバント（完全および不完全）、無機塩、たとえば水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、キトサン、界面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、破傷風毒素、ジフテリア毒素、卵アルブミン、コレラ毒素、またはそのフラグメントなどの分子との組合わせおよび／または結合により、免疫応答を高めることができる。ポリクローナル抗体は免疫化動物の血清から得られる不均一な抗体分子集団である。
【００６８】
特定の抗原に対する均一な抗体集団であるモノクローナル抗体は、連続した培養細胞系により抗体分子を産生するいかなる方法によっても得ることができる。これらには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：ハイブリドーマ法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７；およびＵＳＰ４，３７６，１１０）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ社，ｐｐ．７７−９６）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスを含めた、いかなる免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することができる。インビボで高力価のｍＡｂを産生できるので、これは現在好ましい産生方法である。
【００６９】
さらに、”キメラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）の産生のために開発された、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性をもつヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる方法を使用できる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、たとえばネズミｍＡｂ由来の可変部とヒト免疫グロブリン定常部をもつものである。そのような技術はＵＳＰ６，０７５，１８１および５，８７７，３９７に記載されており、それらの各開示内容全体を本明細書に援用する。同様に本発明に包含されるのは、ＵＳＰ６，１５０，５８４に記載されている完全人化モノクローナル抗体の使用であり、相当する開示の全体を参照として本明細書に援用する。
【００７０】
あるいは、一本鎖抗体の産生のために記載された方法（ＵＳＰ４，９４６，７７８；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６）を、ＮＨＰ発現生成物に対する一本鎖抗体の産生に適合させることができる。一本鎖抗体は、Ｆｖ部のＨ鎖およびＬ鎖フラグメントをアミノ酸橋により結合させて一本鎖ポリペプチドにすることにより形成される。
【００７１】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法で形成できる。たとえばそのようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により調製できるＦ（ａｂ’）2フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより調製できるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、目的とする特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定することができる。
【００７２】
次いでＮＨＰに対する抗体を使用し、当業者に周知の方法を用いて、そのＮＨＰを”模倣”する抗イディオタイプ抗体を産生させることができる（たとえばＧｒｅｅｎｓｐａｎ、Ｂｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２４２９−２４３８参照）。たとえば、ＮＨＰドメインに結合してＮＨＰがそのコグネイト受容体に結合するのを競合阻害する抗体を用いて、ＮＨＰを”模倣”する、したがって受容体に結合および活性化または中和する、抗イディオタイプ抗体を産生させることができる。そのような抗イディオタイプ抗体またはそのような抗イディオタイプ抗体のＦａｂフラグメントは、ＮＨＰ仲介経路（ＮＨＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙ）が関与する療法に使用できる。
【００７３】
さらに、哺乳動物ＮＨＰの高い類似性ゆえに、本願で述べているノックアウトマウス（ＮＨＰを有しておらず、従ってＮＨＰに寛容ではない）は、前記哺乳動物ＮＨＰに対しての抗体の産生に適用することができる（すなわち、ＮＨＰはＮＨＰノックアウト動物において免疫原性である）というユニークな有用性を有する。
【００７４】
本発明の範囲は本明細書に記載した具体的態様により限定されない。これらの態様は本発明の個々の態様を説明するために示したにすぎず、機能的に均等な方法および成分は本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に例示および記載したもののほか本発明の種々の変更が、以上の記載および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような変更も本発明の範囲に含まれる。引用した刊行物、特許および特許出願の全体を本明細書に援用する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005502307.tif 000040
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