(57)【要約】本発明は、(a) 生物試料を原形質膜抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に接触させ、抗体/原形質膜複合体を形成する段階、および(b) 抗体/原形質膜複合体を回収し、生物試料から原形質膜を精製する段階を含む、細胞表面原形質膜を精製する方法を特徴とする。本発明はさらに、質量分析法および精製原形質膜画分を用いて原形質膜ポリペプチドを同定する方法を特徴とする。
2005502727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 原形質膜抗原に特異的に結合する1つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片に生物試料を接触させ、抗体/原形質膜複合体を形成する段階；および
(b) 該抗体/原形質膜複合体を回収し、生物試料から該原形質膜を精製する段階を含む、原形質膜を精製する方法。
【請求項２】
段階(a)が、抗体/原形質膜複合体を、抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する不溶性アフィニティー支持体試薬とともにインキュベートする段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
原形質膜が細胞表面原形質膜である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
抗体が精製ポリクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
抗体がアフィニティー精製ポリクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
抗体が原形質膜のサブドメイン抗原に対するものである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
抗体が頂原形質膜または側底原形質膜ドメイン抗原に対するものである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
抗体が抗ESAまたは抗CEAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
抗体が少なくとも抗ESAおよび抗CEAを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
請求項1記載の回収段階より前に、生物試料に以下の1つまたは複数を利用した蛍光活性化セルソーティングを行う、請求項11記載の方法：抗CD-164、抗CD-138、または抗CD-104。
【請求項１３】
生物試料が培養細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
生物試料が初代培養組織である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
生物試料が腫瘍細胞集団である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞が癌細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
癌細胞が、乳房、卵巣、胃、腸、結腸、脳、または肺組織を原発部位とする癌腫由来である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
請求項1記載の接触段階より前に、生物試料が単一細胞懸濁液として調製される、請求項13、14、15、16、または17記載の方法。
【請求項１９】
不溶性アフィニティー支持体が常磁性ビーズである、請求項2記載の方法。
【請求項２０】
常磁性ビーズが約4.5μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
常磁性ビーズが約3.0μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
常磁性ビーズが約2.8μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
常磁性ビーズが約2.6μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
常磁性ビーズが約2μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
常磁性ビーズが約1μmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
常磁性ビーズが約500 nmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
常磁性ビーズが約100 nmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２８】
常磁性ビーズが約50 nmまたはそれ未満の直径である、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
不溶性アフィニティー支持体がセファロースビーズである、請求項2記載の方法。
【請求項３０】
(a) 請求項1記載の方法に従って原形質膜を精製する段階；および
(b) 質量分析法により精製原形質膜ポリペプチドを分析する段階
を含む、質量分析法により原形質膜ポリペプチドを分析する方法。
【請求項３１】
精製原形質膜画分。
【請求項３２】
画分が95%またはそれを上回って純粋である、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３３】
画分が90%またはそれを上回って純粋である、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３４】
画分が85%またはそれを上回って純粋である、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３５】
原形質膜画分が培養細胞の膜から得られる、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３６】
原形質膜画分が初代培養組織の原形質膜から得られる、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３７】
原形質膜画分が腫瘍細胞集団の原形質膜から得られる、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３８】
画分が微絨毛を有する原形質膜を含む、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項３９】
画分がクラスリン被覆形態を有する原形質膜を含む、請求項31記載の精製原形質膜画分。
【請求項４０】
精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４１】
免疫複合体が1つまたは複数の抗体をさらに含む、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４２】
原形質膜が培養細胞の膜から得られる、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４３】
原形質膜画分が初代培養組織の原形質膜から得られる、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４４】
原形質膜画分が腫瘍細胞集団の原形質膜から得られる、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４５】
原形質膜画分が微絨毛を有する原形質膜を含む、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４６】
原形質膜画分がクラスリン被覆形態を有する原形質膜を含む、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４７】
磁気ビーズが常磁性ビーズである、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【請求項４８】
磁気ビーズが常磁性マイクロビーズである、請求項40記載の精製原形質膜/磁気ビーズ免疫複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年9月21日に出願された米国仮特許出願第60/323,849号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、高度に精製された原形質膜の調製、および質量スペクトル分析および様々な条件下における原形質膜含有物の相違の検出を含むその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
原形質膜(PM)は、これまでに、ラット肝臓(Scottら(1993) Methods Mol. Biol. 19: 59-69；Hubbardら(1983) J. Cell. Biol. 96: 217-229 (PMID: 6298249)；Hubbardら(1983) J. Cell Biol. 96 230-239 (PMID: 6681819))、培養ヒト細胞(Bradleyら(1994) Methods Enzymol. 228: 432-48 (PMID: 8047013))、または培養動物細胞(Cezanneら(1992) Biochem. Biophys. Acta 1112: 205-214 (PMID: 1457453))を含む様々な供給源、および正常結腸細胞(Jacksonら(1977) Cancer 40: 2487-2496 (PMID: 144556)；GustinおよびGoodman (1981) J. Biol. Chem. 256:10651-10656 (PMID: 6116709；Brasitusら(1983) Biochem. Biophys. Acta 728: 11-19 (PMID: 6830771)；Abrahamseら(1996) Analytical Biochemistry 242: 112-122 (PMID: 8923973))および悪性結腸細胞(Jacksonら(1977) Cancer 40: 2487-2496 (PMID: 144556))由来の様々な供給源から精製されている。PMが濃縮された画分を作製するため、これらの単離手順は典型的に、等密度遠心法と合わせた分画遠心法を含む2段階分画を使用する。異なる細胞小器官の間で密度が重複しているため、これらの密度に基づいた方法はPM画分中の混入により制限される場合が多い。
【０００４】
PMを精製するこの方法の改良は、PM密度を改変し、混入する未改変の細胞小器官から改変したPMをより良く分離することを含む。分画遠心法および等密度遠心法を用いた1つの方法では、膜画分をジギトニンの存在下でインキュベートしてPMの密度を特異的に改変し、混入する細胞小器官からこれを分離した(Amar-Costesecら(1974) J. Cell Biol. 62: 717-745 (PMID: 4368410))。ジギトニンは、PMに極めて豊富であるが他の細胞小器官の膜には非常に少ないコレステロール分子に結合する穏和な界面活性剤として働く。ジギトニンでの処理により固有のPM密度が減少し、そのため2ラウンド目の等密度遠心分離において、PMは混入する構造体からよりきれいに分離される。しかし、この方法ははじめにPMの改変を必要としその後遠心分離を行うため、手順に時間を要する。さらに、遠心分離単独の場合と比較すると精製度は改良されるものの、この方法によって得られるPMの純度はまだ限られている。
【０００５】
この方法の別法では、金を結合したコムギ胚芽凝集素(WGA)の特性を利用する。この方法では、PMの密度は特異的に増加し(Pasqualiら(1999) J Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722: 89-102 (PMID: 10068135))、同様に、未改変のPMの遠心分離よりも、類似の密度を有する他の細胞小器官膜からPMをより良く分離することが可能となった。同様の方法において、陽イオン性シリカビーズを用いてPMの密度が改変された。正に荷電したシリカビーズ用いて、負に荷電した細胞表面を被覆する。ホモジナイズする前に、残りの荷電したビーズをポリアクリルポリマーで抑える。この方法を用いて、その後、低速遠心分離し次に核混入物から分離するためナイコデンツ(nycodenz)クッションを通した遠心分離を行い、PMを単離する(ChaneyおよびJacobson (1983) J. Biol. Chem. 258: 10062-10072 (PMID: 6309765))。これらの方法はすべて、最終的には、PMと様々な細胞小器官の内因性密度の相違または実験的に誘導した密度の相違に基づいており、遠心分離により様々な程度の混入物を伴う分離が行われる。これらの方法はどれも、いくつかの異なる細胞種からなる組織からのPMの単離を含む実験に必要となる、特定の細胞種のPMを区別し分離する能力を欠く。
【０００６】
免疫単離法は、様々な細胞内の膜区画を精製するために使用されてきた別の方法である(Luersら(1998) Electrophoresis 19: 1205-1210 (PMID: 9662184)；CalhounおよびGoldenring (1997) Biochem J. 325: 559-564 (PMID: 9230141)；Jinら(1996) J. Biol. Chem. 47: 30105-30113 (PMID: 8939959)；SaucanおよびPalade (1994) J. Cell Biol. 125: 733-741 (PMID: 8188743)；Henleyら(1996) J. Cell. Biol. 133: 761-775 (PMID: 8666662))。この方法は、単離すべき細胞小器官に固有の抗原を特異的に認識する高親和性抗体の使用に基づく。抗原との高親和性相互作用を介して抗体が分子フックとして働き、細胞小器官が別の細胞物質から特異的に単離される。粗製細胞抽出物からの抗体-抗原免疫複合体の回収および単離は、通常、固相支持体に結合した二次抗体(一次抗体に特異的に結合する抗体)を用いて行われる。その結果、いくつかの場合、固相支持体が遠心による分離の密度基盤を提供する。免疫単離法はPMを単離するために以前用いられたが、使用したこの方法では、PM画分に様々な他の細胞小器官が混入するという結果に終わった(DevaneyおよびHowell (1985) EMBO J 4: 3123-3130 (PMID: 4092679)；GruenbergおよびHowell (1985) Eur J. Cell Biol. 38: 313-321 (PMID: 2995034)；GruenbergおよびHowell (1986)EMBO J 5: 3901-3101 (PMID: 3028771))。
【０００７】
これらの免疫単離法により適度に濃縮されたPM画分は得られるものの、どれも、完全なPMを単離することも、あらかじめ細胞選別を行うことなく特定の種類の細胞または組織から完全なPMを単離することもできない。結果として、これらの方法は、培養細胞もしくは初代培養組織またはその両方からPMを迅速に分離し精製する効率および感度を欠き、一般に不十分である。さらに、上記の免疫単離法では、質量スペクトル分析およびその後のタンパク質同定に十分な程度に精製できない。
【０００８】
質量分析法等の新しいタンパク質同定技術が出現し、存在するすべてのタンパク質を包括的に同定するために、健康および疾患に重要な細胞から高度に精製された細胞小器官画分を得ることが望ましい。混入物を最小限に抑えた特定の細胞小器官の完全な単離は、タンパク質の有無および相対的レベルの評価に非常に重要となる。健康時、疾患時、および治療状態におけるタンパク質を比較するためにこれらの評価が用いられ、またこれらの評価が、重要な診断マーカー、疾患予測、または治療標的としての特異的なタンパク質の同定に役立つ可能性もある。
【０００９】
さらに、原形質膜は潜在的治療標的を同定するのに理想的な部位である。細胞表面上におけるそのような標的の同定は、薬剤の細胞移入技術の設計に伴って生じ得る遅延および問題の必要性を除去し得るため、重要である。例えば、Gタンパク質共役受容体または増殖因子受容体等の重要な薬剤標的は、PM内に埋め込まれて細胞表面に存在する。また、抗体に基づくほとんどの治療法では、最も効果的な抗原標的は細胞表面上、すなわちPM内および細胞外間隙に面して存在すると考えられている。
【００１０】
これらおよび他の理由から、健康時および疾患時における身体の重要な細胞および組織のPMを含むタンパク質成分の完全なセットの同定に一般的な関心が存在する。さらに、質量分析法による研究に応じやすくするため、精製PM調製物は十分な規模で単離され、特定の細胞種に特異的であり、できるだけ他の細胞小器官の混入がないことが好ましい。したがって、PM精製方法論を改良する技術の必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本出願者らは、培養細胞および結腸腫瘍等の初代培養組織を含む様々な生物試料からPMを精製する系統的な方法を開発した。1つの局面において、本発明は細胞表面PMを精製する方法を特徴とする。この方法は、一般に、(a) 生物試料をPM抗原に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に接触させ、抗体/PM複合体を形成する段階、および(b) 抗体/PM複合体を回収し、生物試料からPMを精製する段階を含む。好ましい態様においては、段階(a)はさらに、抗体/PM複合体または抗原結合断片/PM複合体を、抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する不溶性アフィニティー支持体試薬(常磁性ビーズ、常磁性マイクロビーズ、またはセファロースビーズ等)とともにインキュベートする段階を含む。好ましくは、本方法で使用する抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり、PMのサブドメイン抗原(例えば、頂サブドメインまたは基底面サブドメイン)に対するものである。本方法に有用である例示的な抗体には、モノクローナル抗ESA抗体および抗CEA抗体が含まれる(以下の略語リストを参照のこと)。他の好ましい態様において、生物試料は培養細胞(例えば、正常または疾患細胞由来)；初代培養組織；または腫瘍細胞集団(例えば、乳房、卵巣、胃、腸、結腸、膵臓、または肺組織を原発部位とする癌腫由来の細胞等の癌細胞)である。いかなる生物試料についても、試料は、抗体またはその抗原結合断片への接触段階以前に、単一細胞懸濁液として調製され得る。
【００１２】
好ましい態様において、不溶性アフィニティー支持体は常磁性ビーズであり、直径は約5μmまたはそれ未満から約50 nmまたはそれ未満の範囲であってよい。常磁性ビーズはまた、セファロースビーズであってよい。さらなる好ましい態様において、常磁性ビーズは、抗体/PM免疫複合体と複合体を形成させる前に、まず二次抗体に結合させておく。または、二次抗体に結合させた常磁性ビーズを、PM試料に添加する前に、まず一次抗体を結合させて置く
【００１３】
他の局面において、本発明は、質量分析法によりPMポリペプチドを分析する方法を特徴とする。この方法は、一般に、上記の方法に従ってPMを精製する段階、および質量分析法により精製されたPMポリペプチドを分析する段階を含む。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は精製PM画分を特徴とする。そのような精製PM画分は、本明細書に記載する方法に従った測定により、好ましくは少なくとも70%純粋である。より好ましくは、精製PM画分は、少なくとも75%、80%、または85%純粋である。さらにより好ましくは、この画分は、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%純粋である。最も好ましくは、この画分は、少なくとも96%、97%、98%、99%、またはそれを上回っての純度である。好ましい態様において、精製PM画分は、培養細胞、腫瘍細胞集団、または初代培養組織の細胞から得られる。他の好ましい態様において、精製PM画分は、微絨毛もしくはクラスリン被覆形態またはその両方を有するPMを含む。
【００１５】
本発明はまた、精製された磁気ビーズ/PM免疫複合体を特徴とする。そのような免疫複合体には、以下の任意のものまたはすべてを含んでよい：一次抗体、二次抗体、精製PM画分、および磁気ビーズ。好ましい態様において、PMは、培養細胞、腫瘍細胞集団、または初代培養組織の細胞から得られる。他の好ましい態様において、PM画分は微絨毛もしくはクラスリン被覆形態またはその両方を有するPMを含む。そのような精製磁気ビーズ/PM免疫複合体は、本明細書に記載する方法に従った測定により、少なくとも70%純粋である。より好ましくは、免疫複合体は、少なくとも75%、80%、または85%純粋である。さらにより好ましくは、免疫複合体は、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%純粋である。最も好ましくは、免疫複合体は、少なくとも96%、97%、98%、99%、またはそれを上回っての純度である。
【００１６】
本発明は、従来法を超える多数の利点および用途を提供する。例えば、本明細書で開示する方法は、高度に精製されたPMの調製物を提供する。さらに本発明は、完全な無傷のPMの単離、および不均一な細胞集団からの、質量スペクトル分析しその後タンパク質同定を行うために十分な量および精度での、特定の細胞種のPMの精製を提供する。さらに、本発明の方法は迅速であり、段階が比較的少ない。また、本明細書に記載する方法により、比較的少量の出発試料から生化学的に有用な量の無傷のPMを精製することが可能になる。例えば、本発明により、転移性腫瘍細胞からのPMの高感度な検出および精製が可能になる。選択した抗体は細胞表面においてその同属の抗原に十分に特異的に結合し、例えば間質細胞のPMを避けて腫瘍細胞のPMが単離し精製される。さらに、原形質膜は、混入する膜状の細胞内細胞小器官から容易に分離される。また、精製された膜により、PMの全体的なタンパク質補完同定が可能になる。そのような情報は、例えば、疾患の診断および治療、ならびに新規な治療標的の同定に有用である。
【００１７】
さらに、精製原形質膜調製物および質量分析法を使用して診断標的または治療標的となる重要なタンパク質を同定することは、多くの利点を有する。例えば、全細胞溶解液と比較し、精製細胞小器官の使用により存在量の少ないタンパク質が濃縮される。加えて、存在量の少ないタンパク質を増強して検出できることから、より多くの割合の全PMタンパク質が同定される可能性がある。また、既知機能を有する細胞小器官に未知タンパク質または予期しないタンパク質の存在部位を特定できることから、そのタンパク質機能への洞察がもたらされる。最終的に、細胞内でのタンパク質の特異的局在化および配向性は、貴重な薬剤標的としてのタンパク質を確認するための重要な検討材料である。
【００１８】
略語および定義
以下の略語および定義を用いる。
2D CE-IMLS：逆方向質量ラダー配列決定(Inverted Mass Ladder Sequencing)を伴う2次元キャピラリー電気泳動法
ATCC：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
CEA：癌胎児抗原
CE-MS：キャピラリー電気泳動質量分析法
DMEM：ダルベッコ改変イーグル培地
DTE：ジチオエリスリトール
EGTA：エチレングリコール-ビス[β-アミノエチルエーテル]N,N,N',N'-四酢酸
ESA：上皮特異的抗原であり、主要胃腸腫瘍関連タンパク質GA733-2前駆体、(上皮細胞表面抗原)、(上皮糖タンパク質)(EDP)、KSA、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー1前駆体、Ep-CAM/EGP40としても知られる
ESI：エレクトロスプレーイオン化質量分析法
ESI-MS/MS：エレクトロスプレータンデム質量分析法
ESI-TOF：エレクトロスプレーイオン化‐飛行時間型法
FAB/MS：高速原子衝撃質量分析法
FACS：蛍光活性化セルソーティング
FBS：ウシ胎仔血清
FCS：ウシ胎仔血清
FIA/MS：フローインジェクション分析質量分析法
FT/ICR：フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法
HCl：塩酸
HEPES：N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]
IgG：クラスG重鎖を有する免疫グロブリン
IgM：クラスM重鎖を有する免疫グロブリン
LC/MS：液体クロマトグラフィー/質量分析法
MALDI：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法
MALDI-TOF：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型法
MALDI-TOF/PMF：マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型
/ペプチド質量フィンガープリント法
MIMS：マルチアイソトープイメージング(Multi-Isotope Imaging)質量分析法
MS：質量分析法
MS/MS：タンデム質量分析法
MS/MS/MS：多重(Multiple)質量分析法
PBS：リン酸緩衝食塩水
PES：ポリエーテルスルホン
PIMS：光イオン化質量分析法
PM：原形質膜
PMID：PubMed識別番号
PNS：核除去後上清
PVP：ポリビニル-ピロリドン
PyMS：熱分解質量分析法
REMPI：共鳴多光子イオン化法
SIFT-MS：選択イオンフローチューブ(Selected Ion Flow Tube)質量分析法
SIMS：二次イオン質量分析法
ST：ショ糖‐トリス
TOF：飛行時間型
Tris：2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール
【００１９】
本明細書で用いる「親和性」とは、1つの化合物がもう1つの化合物に結合する強度を意味する。例えば、特定のタンパク質に対して高親和性を有する化合物を用いて、混合物中からそのタンパク質を容易に精製することができる。例えば、特定のタンパク質ファミリーの様々なメンバーが単離され得るなど、所望の広範な特異性を付与するのであれば、低い親和性の化合物を用いることも可能である。高い結合親和性は、一般に、抗体と抗原の間に望まれる。結合強度は実験条件によって影響を受ける可能性があり、そのため標準的な方法に従って測定される。
【００２０】
本明細書で用いる「アフィニティー試薬」とは、典型的に特定の標的に対する結合親和性の特徴を少なくともある程度介して機能する、化合物、基質、およびapparatiを意味する。例示的なアフィニティー試薬には抗体およびその抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で用いる「抗体」とは、天然に産生されたものか合成で産生されたものかにかかわらず、抗原を結合し得る免疫グロブリンタンパク質を意味する。そのような抗体は、完全な抗体でもよいし、抗原結合断片および改変抗体が鋳型抗体と十分に同程度の抗原結合特性を保持し、抗原の特異的結合を提供できるという条件において、その抗原結合断片(例えば、F(ab')2、Fab)およびそれから産生される改変抗体(例えば、化学的、生化学的、または組換えDNA方法論により改変された抗体)であってもよい。抗体は、ハイブリドーマ、マウス、ウサギ、ヒト、サル、ニワトリ、ヤギ、ラット等を含むがこれらに限定されない任意の供給源から得られ得る。抗体という用語はまた、抗体の抗原結合断片等の免疫グロブリン結合ドメインの配列に基づいたまたは由来する結合ドメインを有する任意の組換えタンパク質もカバーする。この用語には、環状ペプチド等の化学的に改変された抗体も含まれる。
【００２２】
本明細書で用いる「抗原結合断片」とは、抗原に結合可能な抗体の一部(例えばFv)を意味する。そのような断片は、抗体のタンパク質分解によって作製してもよいし、または抗体タンパク質に由来する配列またはこのタンパク質をコードする核酸を用いて組換えによって産生してもよい。
【００２３】
本明細書で用いる「抗原」とは、哺乳動物または家禽等の脊椎動物に導入もしくは注入することにより、または抗原提示機構による提示により、抗原を認識または結合し得る抗体の産生を動物に促す物質を意味する。そのような抗原は様々な供給源由来であり、例えばこれには、ウイルス、タンパク質、核酸、有機化合物等が含まれる。
【００２４】
本明細書で用いる「抗CD-104」とは、ヒトCD-104タンパク質(Genbankアクセッション番号P16144)、その前駆体、アイソフォーム、その断片、そのオーソログ、または遺伝子多型、突然変異、および配列修正を含むがこれらに限定されない任意の変異に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。
【００２５】
本明細書で用いる「抗CD-138」とは、ヒトCD-138タンパク質(Genbankアクセッション番号P18827)、その前駆体、アイソフォーム、その断片、そのオーソログ、または遺伝子多型、突然変異、および配列修正を含むがこれらに限定されない任意の変異に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。
【００２６】
本明細書で用いる「抗CD-164」とは、ヒトCD-164タンパク質(Genbankアクセッション番号NP_006007)、その前駆体、アイソフォーム、その断片、そのオーソログ、または遺伝子多型、突然変異、および配列修正を含むがこれらに限定されない任意の変異に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。
【００２７】
本明細書で用いる「抗CEA」とは、ヒトCEAタンパク質(例えば、Genbankアクセッション番号A36319およびAAA51965)、その前駆体、アイソフォーム、その断片、そのオーソログ、または遺伝子多型、突然変異、および配列修正を含むがこれらに限定されない任意の変異に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。例えば、CEA Ab-3モノクローナル抗体(NeoMarkers、カリフォルニア州フレモント)が抗CEA抗体である。
【００２８】
本明細書で用いる「抗ESA」とは、ヒトESAンパク質(Genbankアクセッション番号P16422)、その前駆体、アイソフォーム、その断片、そのオーソログ、または遺伝子多型、突然変異、および配列修正を含むがこれらに限定されない任意の変異に結合する抗体またはその抗原結合断片を意味する。例えば、ESA Ab-3モノクローナル抗体(NeoMarkers、カリフォルニア州フレモント)が抗CEA抗体である。
【００２９】
本明細書で用いる「結合」という用語は、2つまたはそれを上回っての分子を互いに結合する共有結合性または非共有結合性の相互作用を意味する。2つのそのような分子の例は、酵素とその酵素の阻害剤である。別の例は、酵素とその基質である。3番目の例は、抗体と抗原である。非共有結合性の相互作用には、水素結合、荷電した基または双極子間のイオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、および非極性基間の疎水性相互作用が含まれる。上記の相互作用の1つまたは複数が、2つまたはそれを上回っての分子の相互の結合を媒介し得る。結合はまた、実験条件によって影響を受け得る。
【００３０】
本明細書で用いる「生物試料」とは、全生物体、または、多量の体液、細胞、細胞溶解液、細胞外マトリックス、組織、器官、および/またはそれらの組み合わせ等の生物体の一部を意味する。培養細胞由来の細胞も意図している。試料は生きていても死んでいてもよいし、または生きている生物体または死亡した生物体から採取してもよい。試料は、正常、異常、または罹患組織であってよい。試料はまた、環境的治療、化学的治療、薬剤治療等に限定されない可能な数々の治療状況に由来してよい。
【００３１】
本明細書で用いる「細胞表面結合」とは、PMまたはその成分を結合する能力を意味する。
【００３２】
本明細書で用いる「クラスリン被覆形態」とは、特にクラスリンが局在化しているPMの陥入である「クラスリン被覆小孔」の形をした、クラスリンが細胞膜の内部表面上に局在化しているPMの特徴的な形態を意味する。細胞膜の内部表面上のポリペプチドは典型的に、細胞膜の限局性であり特徴的な肥厚または被覆を示し、これは電子顕微鏡によって可視化され得る。
【００３３】
本明細書で用いる「エピトープ」とは、免疫応答を誘発し、応答によって産生される特異的抗体と結合し得る抗原の分子領域を意味する。動物では、ほとんどの抗原が、抗原または抗原性分子の大きさおよび免疫原性に応じて、いくつものエピトープまたは抗原決定基を同時に提示することになる。タンパク質配列の領域は異なる高次構造をとり、特定の抗体に対する結合親和性を変化させ、免疫原性を変化させ得る可能性がある。ある状況下においては、高次構造的に特定のエピトープを強制し、特定の抗原高次構造に対して選択的な抗体を産生することが必要または有利である可能性がある。
【００３４】
本明細書で用いる「免疫応答」という用語は、免疫系により抗原に遭遇した際に誘発される一連の分子現象を意味する。そのような分子現象には、B細胞およびT細胞の増殖、および抗体の産生が含まれる。
【００３５】
本明細書で用いる「不溶性アフィニティー支持体試薬」とは、一般的な生物溶液または溶解液中での既知の遠心分離に勝り、溶媒作用によってより小さな断片に分解することのないアフィニティー試薬を意味する。例示的な不溶性アフィニティー支持体試薬には、常磁性ビーズまたは常磁性マイクロビーズが含まれるが、これらは平均的な実験を通じて溶液中で分解する可能性はない。
【００３６】
「無傷の原形質膜」とは、関連性のある成分(例えば、頂ドメインまたは側底ドメイン)が実質的に除去も破壊もされていないPMを意味する。「頂原形質膜ドメイン」とは、細胞内腔に面するPMのサブドメインを意味する。「側底原形質膜ドメイン」とは、結合組織の下層にあるPMのサブドメイン(底ドメイン)および隣接細胞に面したPMのサブドメイン(側ドメイン)を意味する。
【００３７】
本明細書で用いる「質量分析法」または「MS」とは、分子を測定し分析する技法を意味し、十分なエネルギー(例えばイオン化)を標的分子に導入し壊変を起こすことを伴う。次に生じた断片をその質量/電荷比に基づいて分析するが、これにより「分子フィンガープリント」が作製される。この分析を行うために用いられる機器は、最も多くは質量分析計である。一般に、質量分析計は3つの装置：イオン化装置、質量分析器、および検出器を連結している。使用される最も一般的なイオン化技法は、MALDIおよびESIである。試料がイオン化されたならば、次にその質量を分析する。タンパク質生化学への用途に最も一般的に用いられる質量分析器は、TOF、三連四重極、四重極-TOF、およびイオントラップ機器である。本明細書では、MSは、2D CE-IMLS、アフィニティー質量分析法、CE-MS、ESI、ESI-MS/MS、ESI-TOF、FAB/MS、FIA/MS、FT-ICR、ハイブリッド質量分析法、イオントラップ質量分析法、液体クロマトグラフィー/質量分析法(LC/MS)、MALDI、MALDI-TOF、MALDI-TOF/PMF、MIMS、MS/MS、MS/MS/MS、ナノエレクトロスプレー-MS/MS、PIMS、PyMS、四重極イオントラップ法、REMPI、SIFT-MS、SIMS、TOF、および三連四重極を含むがこれらに限定されない、当技術分野において一般に周知の基本的技法、ならびにそれに関する改良および変化形を意味する。
【００３８】
本明細書で用いる「微絨毛」とは、細胞の微細な突起、特にいくつかの上皮細胞表面の任意の指状外向き突起を意味する。微絨毛は細胞膜で覆われ、その細胞質は主要な細胞細胞質とつながっている。微絨毛の存在は最も一般的には電子顕微鏡等の細胞生物学的方法によって観察されるが、当技術分野で周知の任意の方法によって評価することも可能である。
【００３９】
本明細書で用いる「モノクローナル」とは、細胞クローンから産生される抗体を意味し、よって単一種類の免疫グロブリンを含む。一般にモノクローナル抗体は、マウス脾臓による抗体産生リンパ球をマウス骨髄腫細胞に融合して作製される。生じたハイブリッド細胞は迅速に増殖し、親リンパ球と同じ抗体を産生する。
【００４０】
本明細書で用いる「細胞小器官」とは、真核細胞の別々の機能を有する細胞内区画または構造を意味し、通常は膜が結合している。膜状の細胞小器官には、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、リソソーム、小胞体、ファゴソーム、エンドソーム、核、核小体、色素体、小胞、分泌小胞、液胞、およびゴルジ体が含まれるがこれらに限定されない。非膜状の細胞小器官には、細胞骨格、核膜孔、中心粒、リボソーム、デスモソーム、ギャップ結合、密着結合、繊毛、鞭毛、およびプロテアソームが含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
本明細書で用いる「常磁性ビーズ」とは、抗体もしくは抗体/抗原複合体またはそれらに結合させた別のアフィニティー試薬への結合を可能にする微細なアフィニティー試薬を意味し、これによって、ビーズの磁性により単離されやすくなるため生じた複合体の単離が可能になる。ビーズは例えば球状をしたビーズ様である必要はないが、多くはビーズ様である。球状またはほぼ球状であるならばビーズの直径は約5.0μmまたはそれ未満であってよく、非球状の形状であるならば最も長い軸が約5.0μmまたはそれ未満であってよい。抗体に結合させてある常磁性ビーズの例は、Pan抗マウスIgGダイナビーズ(Dynabeads)(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)である。
【００４２】
本明細書で用いる「常磁性マイクロビーズ」とは、抗体もしくは抗体/抗原複合体またはそれらに結合させた別のアフィニティー試薬への結合を可能にする微細なアフィニティー試薬を意味し、これによって、ビーズの磁性により単離されやすくなるため生じた複合体の単離が可能になる。マイクロビーズは例えば球状をしたビーズ様である必要はないが、多くはビーズ様である。球状またはほぼ球状であるならばマイクロビーズの直径は約100 nmまたはそれ未満であってよく、非球状の形状であるならば最も長い軸が約100 nmまたはそれ未満であってよい。抗体に結合させてある常磁性マイクロビーズの例は、MACSヤギ抗マウスIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec、ドイツ、グラッドバッハ)である。
【００４３】
本明細書で用いる「原形質膜」とは、「PM」、「細胞膜」、または「形質膜」とも呼ばれるが、細胞の半透性境界層を意味する。現在の原形質膜モデルは、様々なタンパク質を伴い、親水性頭部が膜の表面方向に、および疎水性尾部が膜の内側方向に配向した、(いくつかの種類ではコレステロールを伴う)リン脂質の二重層からなる流動モザイクである。いくつかの動物細胞では、糖衣と呼ばれる糖質のさらなる外膜を有する場合もある。原形質膜は細胞の外被としてだけでなく、細胞の内側および外側への物質の通過を制御する選択的障壁としても働く動的構造である。
【００４４】
本明細書で用いる「原形質膜抗原」とは、原形質膜のすべてまたは一部に存在する抗原、そこへの結合、または内在性膜タンパク質等のその成分を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる「原形質膜画分」とは、免疫単離された原形質膜を含む、細胞材料または細胞溶解液の画分を意味する。
【００４６】
本明細書で用いる「原形質膜ポリペプチド」とは、原形質膜画分内に存在するポリペプチドを意味する。
【００４７】
本明細書で用いる「ポリクローナル」とは一般に、1つまたはおそらくは複数の種類の免疫グロブリンからなる、誘発された免疫応答を介して産生される抗体を意味する。免疫応答は、ヤギ、ラット、ウサギ、マウス、およびニワトリを含むがこれらに限定されない任意の動物において誘発され得る。そのような抗体は通常血清中に存在するが、例えば免疫グロブリンを選択的に濃縮することにより(部分的にでも)精製してもよい。また、抗原への結合を選択的に濃縮することにより、(部分的にでも)アフィニティー精製してもよい。
【００４８】
「初代培養組織」とは、ヒト患者等の動物から直接得られる任意の組織を意味する。そのような組織には、被覆、裏打ち、および腺上皮組織；流動、支持、および脂肪組織を含む結合組織；骨格筋、心筋、および平滑筋を含む筋肉組織；ならびに神経組織が含まれる。
【００４９】
本明細書で用いる「タンパク質」または「ポリペプチド」もしくは「ペプチド」とは、ペプチド結合により結合した4つまたはそれを上回ってのアミノ酸残基の鎖からなる、自然に産生される多数の、(酵素または抗体等の)時に非常に複雑な物質を意味する。鎖は線状、枝状、環状、またはこれらの組み合わせであってよい。タンパク質内結合には、ジスルフィド結合も含まれる。タンパク質分子は、炭素分子、水素分子、窒素分子、酸素分子、通常は硫黄分子を含み、(リンまたは鉄等の)他の分子を含む場合もある。本明細書では、「タンパク質」はまた、アミノ酸類似体、および補因子またはガイド鋳型(例えば、適切なテロメラーゼ機能に関連する鋳型RNA)等の酵素機能に本質的な非タンパク性化合物の使用を含む、その断片、変異型、および(残基のグリコシル化、アシル化、ミリスチル化、および/またはリン酸化を含むかこれらに限定されない)修飾型を包含すると見なす。「ペプチド」は、より一般的には、少数アミノ酸のタンパク質、またはその配列がより大きなタンパク質の小さなサブセットであるタンパク質を意味する場合が多い。
【００５０】
「精製原形質膜」とは、核、ミトコンドリア、リソソーム、ペルオキシソーム、粗面および滑面小胞体、ならびにゴルジ体等の、細胞内の他の連続していない膜状細胞小器官が実質的に混入していないPM画分を意味する。そのような画分の純度は典型的に、標準的な定量的形態計測分析法および/または生化学的分析法により評価する。そのような精製PM画分は一般に、天然で会合している膜状細胞小器官の混入が少なくとも85%、より好ましくは90%、および最も好ましくは95%取り除かれている。
【００５１】
本明細書で用いる「二次抗体」とは、特定の種類の免疫グロブリンを認識し得る抗体を意味する。例えば、ヤギ抗マウスIgGは、マウスによって産生されるG型免疫グロブリンに特異的に結合する、ヤギによって産生される免疫グロブリンである。「二次」抗体は、その抗原が免疫グロブリンである必要のない「第二」抗体とは区別されるべきであることに留意されたい。
【００５２】
本明細書で用いる「特異的結合」とは、または何らかが「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、および/または「特異的に相互作用する」と称される場合には、たとえ短時間であっても、結合相互作用がアミノ酸一次配列によって決まるような分子の高次構造または構造に依存する、抗体等の化合物と1つまたは複数の他の物質、分子、および/または化合物との間の結合を意味する。特異性は、特定の種に存在する様々なIgG分子のすべてに結合し得る二次抗体の場合には一般的であるように、広範な種類の化合物に対するものであってよい。また、自身への結合、または二量体および他の多量体を形成する場合のような同じタンパク質の別の分子への結合を意味する可能性もある。同様に、選択的結合は親和性に基づくものであり、物質は一般に、適切な実験条件下で、通常存在する他の分子よりも特定の分子に対してより高い親和性を示す。
【００５３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００５４】
発明の詳細な説明
アフィニティー試薬(例えば、抗体またはその抗原結合断片)を用いて、例えば培養細胞のPMまたは初代培養組織を含む細胞のPM等の、関心対象の生物試料からPMを精製する方法を提供する。本方法は一般に、少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を原形質膜抗原に結合させる段階を含む。PM抗原結合抗体はIgGもしくはIgM型でよく、またはIgGもしくはIgG抗体の断片であってよい。抗体は、細胞表面PM上に存在し、小胞体、核、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、またはペルオキシソーム等の細胞内膜状細胞小器官の膜には存在しない1つまたは複数の抗原を特異的に認識することが好ましい。他の態様において、抗体は細胞内の膜状細胞小器官の膜上の1つまたは複数の抗原を認識する。
【００５５】
好ましい態様において、PMの免疫単離はPM抗原に対する高特異性抗体に基づく。「高特異性抗体」とは、同属抗原を優先的に認識し、他の無関係なタンパク質との交差反応性が限定されている抗体を意味する。最も好ましい抗体はモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体も使用でき、そのようなポリクローナル抗体は精製されている(例えば、アフィニティー精製されている)ことが好ましい。高特異性抗体は、PMの外膜に特異的に局在する抗原、重要なことには単離されるべき細胞種のPM中でのみ発現される抗原に結合することが好ましい。
【００５６】
後者のパラメータは、初代培養組織中に様々な比率で常に存在する間質細胞由来のPMを含まない画分を得るために重要である。例えば、正常結腸組織中の上皮細胞は、細胞の全集団の約10%を示す。細胞集団の残りは、筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞からなる。特定の細胞種のPMを単離するためには、関心対象の細胞のPM上に独占的に存在する特異的PM抗原に対するモノクローナル抗体を使用する。したがって、生物試料中に見出され得る任意の培養細胞および/または初代培養組織(正常または疾患)のPMを免疫単離するために、適切な一式の抗原を認識する選択された組み合わせの抗体を使用することができる。例えば、前立腺特異抗原(PSA)を認識するモノクローナル抗体3C6を用いて、前立腺初代培養組織または前立腺細胞(LNCap細胞等)からPMを精製することができる。モノクローナル抗体抗CD-138および抗CD-151を用いて、肺初代培養組織または肺細胞(A549細胞等)からPMを精製することができる。シンデカン-1を認識するモノクローナル抗体抗CD-138を用いて、膵臓初代培養組織または膵臓細胞(BxPC-3細胞等)から膜を精製することも可能である。別の例では、コンドロイチン硫酸様プロテオグリカンを認識するモノクローナル抗体9.2.27を用いて、黒色腫皮膚組織の膜を精製することができる。
【００５７】
選択された抗体はまた、頂および側底PMサブドメインを含むPMのサブドメイン内に位置するPM抗原に結合し得る。そのような抗体を用いて特定のサブドメインを選択すること、またはそのような抗体を混合してより典型的なPMを単離することが可能である。これは特に上皮組織の場合に重要であるが、それは細胞が極性化し、そのPMが均一ではなくむしろ頂ドメインと側底ドメインの2つの異なるドメインに分離されているためである。したがって、PMの一部だけでなく無傷のPMをうまく精製するためには、両サブドメインを精製するために選択された抗体を使用すべきである。本明細書に記載する態様において、抗CEAおよび抗ESA抗体を組み合わせて使用した場合に、高特異性抗体はこれらの基準を満たし、上皮PMの2つのサブドメインを精製することが可能となる。
【００５８】
別の態様において、ESA抗原の発現は結腸組織に限定されておらずむしろ全上皮組織で検出されることから、抗ESA抗体は任意の種類のヒト上皮細胞および/または組織のPMを精製するために有用である。さらに別の態様において、CEA抗原の発現も同様に結腸腫瘍組織に限定されておらず多くの初代ヒト腫瘍(膵臓腫瘍等)および細胞株(膵臓腺癌細胞株BxPC3等)で検出されるため、抗CEA抗体は任意の細胞種のPMおよび/またはCEA抗原が発現される腫瘍組織のPMを精製するために有用である。
【００５９】
本発明を実施する上で有用な抗体は、典型的には正常細胞もしくは異常細胞(例えば、悪性細胞または非悪性細胞)またはその両方に見出されるPM抗原決定基に対するものである。悪性細胞には、乳癌、卵巣癌、および肺癌、黒色腫、肉腫、グリア芽腫、ならびに胃腸管および細網内皮系の癌が含まれるが、これらに限定されない。非悪性疾患に関連する細胞には、心血管性、神経性、肺性、自己免疫性、胃腸管系、代謝性、および他の障害に関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。正常細胞には、異常細胞と比較するための対応する細胞種の集団が含まれるが、これらに限定されない。細胞は本質的にいかなる細胞種であってよく、また均一もしくは非均一な集団または調製物であってよい。悪性細胞等の細胞集団は、骨髄に見出される組織、末梢血から、胸水および腹水、ならびに尿、脳脊髄液、リンパ液等の他の体液区画から、または例えば肝臓、リンパ節、脾臓、肺、膵臓、骨組織、中枢神経系、消化器系の器官もしくは組織、前立腺、皮膚、および/または粘膜等の組織および/または器官中の固形腫瘍から得られ得る。
【００６０】
本発明の方法の生物試料として用いられる好ましい材料供給源には、任意の初代培養組織、細胞株、またはその成分である細胞が含まれる。本明細書の実施例において記載する1つの態様では、PMを、初代ヒト結腸腫瘍組織、および選択した対応する培養細胞モデルであるヒト腺癌結腸腫瘍由来のCaCo-2から精製した。初代培養組織からのPMの免疫精製は、培養細胞モデルのPMの免疫単離に対して確立した最適条件の知見によって容易になる。どちらの場合にも、実施例1および3のように、または適切な単一細胞懸濁液を産生する当技術分野で周知の他の任意の方法により、生物試料の細胞を単分散としてまたは単一細胞懸濁液として調製することが好ましい。
【００６１】
本方法はさらに、生物試料から回収される抗体/抗原複合体を提供するが、それにより抗体/抗原複合体に結合しているまたはこの複合体と相互作用しているPMが精製される。回収は当技術分野で周知の任意の方法によって達成され得るが、抗体/抗原複合体に対して選択的であるべきである。好ましい態様において、抗体はまた、二次抗体および/または磁気ビーズまたはセファロースビーズ等の不溶性アフィニティー支持体試薬に結合する。セルロースまたはアクリルアミド等の他の支持体が細胞小器官の免疫単離に用いられてきたが(DevaneyおよびHowell (1985) EMBO J. 4: 3123-3130 (PMID: 4092679))、そのような支持体は、非特異的なタンパク質結合の理由で質量スペクトル分析法等のタンパク質同定法には適合しないため、好ましくない。そのようなタンパク質の非特異的結合は、関心対象のタンパク質の同定を遮蔽し妨げる。実際に、磁気支持体およびセファロース支持体は非特異的なタンパク質結合が少ないため、開示する精製方法により、精製PM画分の直接的な質量スペクトル分析およびタンパク質同定が可能となる。
【００６２】
常磁性ビーズは、不溶性アフィニティー支持体試薬としての使用に好ましい態様である。常磁性ビーズはセファロースビーズよりも好ましいが、常磁性マイクロビーズが最も好ましい。ビーズおよびマイクロビーズは任意の形でよいが、ほぼ球状が好ましい。試薬のおよその直径または最も長い軸は、好ましくは約5μmもしくはそれ以下、または4.5μmもしくはそれ以下であり、より好ましくは約4.4μmもしくはそれ以下、4.3μmもしくはそれ以下、4.2μmもしくはそれ以下、4.1μmもしくはそれ以下、4.0μmもしくはそれ以下、3.9μmもしくはそれ以下、3.8μmもしくはそれ以下、3.7μmもしくはそれ以下、3.6μmもしくはそれ以下、3.5μmもしくはそれ以下、3.4μmもしくはそれ以下、3.3μmもしくはそれ以下、3.2μmもしくはそれ以下、3.1μmもしくはそれ以下、3.0μmもしくはそれ以下、2.9μmもしくはそれ以下、2.8μmもしくはそれ以下、2.7μmもしくはそれ以下、2.6μmもしくはそれ以下、2.5μmもしくはそれ以下、2.4μmもしくはそれ以下、2.3μmもしくはそれ以下、2.2μmもしくはそれ以下、2.1μmもしくはそれ以下、2.0μmもしくはそれ以下、1.9μmもしくはそれ以下、1.8μmもしくはそれ以下、1.7μmもしくはそれ以下、1.6μmもしくはそれ以下、1.5μmもしくはそれ以下、1.4μmもしくはそれ以下、1.3μmもしくはそれ以下、1.2μmもしくはそれ以下、1.1μmもしくはそれ以下、1.0μmもしくはそれ以下、900 nmもしくはそれ以下、800 nmもしくはそれ以下、700 nmもしくはそれ以下、600 nmもしくはそれ以下、500 nmもしくはそれ以下、400 nmもしくはそれ以下、300 nmもしくはそれ以下、または200 nmもしくはそれ以下である。最も好ましくは、100 nmもしくはそれ以下、90 nmもしくはそれ以下、80 nmもしくはそれ以下、70 nmもしくはそれ以下、60 nmもしくはそれ以下、50 nmもしくはそれ以下、40 nmもしくはそれ以下、30 nmもしくはそれ以下、20 nmもしくはそれ以下、10 nmもしくはそれ以下、または5 nmもしくはそれ以下である。
【００６３】
単離されたPM画分は、標準的な生化学的方法または細胞生物学的方法(電子顕微鏡観察等)による測定により、高度に純粋であるべきである。好ましい態様において、PM画分は少なくとも70%純粋である。より好ましくは、PM画分は、少なくとも75%、80%、または85%純粋である。さらにより好ましくは、PM画分は、少なくとも86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%純粋である。最も好ましくは、この画分は、少なくとも96%、97%、98%、99%、またはそれを上回っての純度である。
【００６４】
別の態様において、本方法は、少なくとも抗原/抗体複合体の回収段階以前の、またはそうでなければPM免疫単離に使用すべきPM抗原結合抗体もしくはその抗原結合断片に生物試料を接触させる段階以前の、PM抗原結合抗体またはその抗原結合断片を用いたFACSによる、生物試料の細胞選択を提供する。FACSに用いる例示的な抗体は、抗CD-104、抗CD-138、および抗CD-164である。
【００６５】
1つの実施例においては、PM細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体(またはその抗原結合断片)を、培養細胞または初代培養組織から得られた解離した細胞の懸濁液と共にインキュベートする。必要に応じて、第二の別の細胞表面抗原に対する第二モノクローナル抗体を使用することもできる。未結合の抗体を洗浄した後、穏和な条件下で細胞を溶解し、分画遠心分離して未溶解の細胞および大きな凝集塊を除去する。次に、結果として得られたPMを含む核除去後上清を、すでにPMに結合している抗体を認識する二次抗体をあらかじめ結合した磁気ビーズと共にインキュベートする。適切な磁気ビーズは、Dynal(ノルウェー、オスロ)から市販されている。次に、標準的な磁気分離方法により、他の細胞小器官から磁気ビーズ/PM免疫複合体を分離する。必要に応じて、単離されたPMを当技術分野で周知の標準的な方法により、磁気ビーズから分離することが可能である。続いて、標準的な生化学的方法および形態学的方法に従って、単離されたPMを特徴づけしアッセイする。そのような生化学的方法には、SDS-PAGE法およびウェスタンブロッティング法が含まれる(Lanoixら(1999) EMBO J 18:4935-4948 (PMID: 10487746))。精製PMを特徴づけする例示的な形態学的方法には、標準的な電子顕微鏡観察方法論の使用が含まれる(Lanoixら(1999)、上記；Lanoixら(2001) Journal of Cell Biology 155: 1199-1212 (PMID: 11748249))。例えば、形態学的定量化では、電子顕微鏡写真を格子で覆い、PMおよび混入する細胞小器官の相対的比率を、Weibel((1969) Intern. Rev.Cytol. 26: 235-302 (PMID: 4899604))により記載される標準的なポイントカウント法により測定する。
【００６６】
上記のように調製した精製PMは、直接質量スペクトル分析し、その後2次元ゲル電気泳動等の電気泳動を行うのに適しており(実施例6を参照のこと)、また続いてタンパク質同定に使用することができる。
【００６７】
実施例
これから、好ましい技法および実験結果を記載する以下の実施例において、本発明の特徴および他の詳細をより詳しく記載し説明する。これらの実施例は本発明を説明する目的で提供するものであり、限定するものとして解釈すべきではない。
【００６８】
実施例1
培養CaCo-2細胞からの単一細胞懸濁液の調製
細胞株HTB-37についてのATCC製品情報データシートに従って、CaCo-2細胞を培養した。コンフルエントになった細胞をD-PBS(Multicell)20 mlで洗浄した後、細胞解離溶液(Sigma C-5149)10 ml中で37℃で10分間インキュベートした。(16% FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した)イーグルMEM増殖培地20 mlを添加し、ピペッティングにより細胞を解離した。4℃、280 x gで5分間遠心分離した後、細胞を25 ml量のイーグルMEM増殖培地で2回洗浄した。トリパンブルー色素排除法により生細胞数を測定したところ、85%の細胞が生存していることが認められた。次に細胞を(FCSもペニシリン/ストレプトマイシンも含まない)氷冷イーグルMEM 1 ml中に再懸濁し、細胞懸濁液をプールして(9 ml、1億2千5百万個の細胞)その量を2等分に分割し(2 x 4.5 ml)、15 ml Falconチューブに等しく分割した。
【００６９】
実施例2
培養細胞からの原形質膜の免疫磁気精製
CaCo-2細胞の単一細胞懸濁液4.5 mlに(約6千2百5十万個の細胞)(実施例1を参照のこと)、120μg(600μl)のESA Ab-3モノクローナル抗体(抗ESA)(200μg/ml)(NeoMarkers)および120μg(600μl)抗CEA抗体(200μg/ml)を添加した。15 rpmに設定したDynalサンプルミキサー(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)中、細胞を4℃で30分間インキュベートし、次に4℃、280 x gで5分間遠心分離して細胞を回収した。各細胞ペレットを、PBSブロッキング緩衝液、PVP40T(2 mg/ml、Sigma、ミズーリ州セントルイス)、ノンファットドライミルク(0.5 mg/ml)、および抗プロテアーゼ(Boehringer Mannheimのプロテアーゼ阻害剤混合物1錠/50 ml)5 ml中に再懸濁し、細胞を4℃、280 x gで5分間遠心分離して再度回収した。細胞ペレットをPBSブロッキング緩衝液5 ml中に再懸濁し、26ゲージ針を取りつけた1 ccシリンジで勢いよく吸引することにより氷上で溶解した。トリパンブルー排除法により、細胞溶解をモニターした。次に溶解液をプールし、4℃、900 x gで20分間遠心分離した。核除去後上清(PNS)を回収し、トリパンブルー排除法により、PNS中の未溶解細胞および核の量を再度モニターした。核または未溶解細胞がPNS中に検出されなくなった時点で、ダイナビーズPanマウスIgG(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)400μlを添加した。15 rpmに設定したDynalサンプルミキサー(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)中、4℃で60分間インキュベートした後、ビーズをPBSブロッキング緩衝液7 mlで2回洗浄した。洗浄する毎に、ビーズをボルテックスにより再懸濁した。最後の洗浄では、ビーズをPBS 7 mlに再懸濁した。次に上清を等量に分割し、磁石を用いてビーズを回収した。標準的な生化学的分析および形態学的分析を行い、PM画分の純度を評価した。
【００７０】
図1に示すように、磁気ビーズに結合した物質の標準的なウェスタンブロッティングから、抗ESA/CEAビーズ画分(レーン2を参照のこと)が4つの既知PMマーカー：ESA、Na+/K+ ATPアーゼ、CEA、およびアネキシンIIの検出により判断されるPMを含むことが示された。PMの異なるサブドメインに局在する抗原の存在から(CEA(頂ドメイン)ならびにESAおよびNa+/K+ ATPアーゼ(側底ドメイン)タンパク質)、記載した免疫単離手順により完全なPMが完全に無傷の状態で精製され得ることが示唆された。さらに、混入する細胞小器官のマーカーはESA/CEA画分中に容易に検出されず、このことからPM画分が確かに極めて純粋であることが示唆された。電子顕微鏡観察によるESA/CEAビーズ画分の形態学的分析により(図2)、微絨毛およびクラスリン被覆構造がビーズに結合した物質中に同定され、上記の生化学的結果が十分に立証された。微絨毛およびクラスリン被覆構造はどちらも、PMの周知の形態学的特徴である。実際に、混入する細胞小器官を表す他の構造は、ビーズ画分中に認められなかった。
【００７１】
実施例3
初代結腸組織由来の細胞懸濁の方法
解離した細胞を得るため、コラゲナーゼおよびエラスターゼを含む酵素溶液中で初代結腸腫瘍塊を解離し(Worthington組織解離ガイド、Worthington Biochemical Corp.、ニュージャージー州フリーホールド、1990)、細胞懸濁液を調製した。凍結したヒト結腸癌組織生検試料(それぞれ約150 mgの固形物2つ、Ardais Corporation)を、室温で30分間解凍した。次に、この固形物を25 mM Hepes pH 7.4/D-MEM培地/10% FBS 10 mlで洗浄し、トリプシンインヒビターを含むコラゲナーゼ(300 U/ml)およびエラスターゼ(10 U/ml)溶液5 mlを、26ゲージ針を取り付けた1 mlシリンジを用いて固形物内に注入した。次にこの溶液5 mlを添加し、懸濁液を37℃で20分間、勢いよく撹拌した。インキュベーション培地を300 x gで5分間遠心分離し、解離した細胞を含む上清を回収した。次に、残った腫瘍塊を新しい解離溶液5 mlを用いて37℃で20分間インキュベートし、解離した細胞を含む上清を回収した。残った腫瘍塊を、新しい解離溶液5 mlを用いて37℃で20分間同様に処理した。位相差顕微鏡により、細胞の解離をモニターした。上清をプールし、次にE-MEM培地を用いて300 x gで5分間遠心分離することにより試料を2回洗浄し、ペレットをE-MEM培地1 ml中に再懸濁した。
【００７２】
実施例4
常磁性ビーズを用いた初代培養組織からの原形質膜の免疫磁気精製
解離した細胞9 ml(3億6千万個の細胞、実施例3)を含むチューブに、200μg(100μl)のESA-Ab-3モノクローナル抗体(抗ESA)(200μg/ml)(NeoMarkers)および200μg(100μl)の抗CEA抗体を添加した。次に、15 rpmに設定したDynalサンプルミキサー(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)中、試料を4℃で30分間インキュベートした。4℃、280 x gで5分間遠心分離した後、ペレットを10 ml量のPBSブロッキング緩衝液で2回洗浄した。細胞をPBSブロッキング緩衝液25 mlに再懸濁した後、Parr破砕機(Parr細胞破砕機：Parr Instrument Company、型番4639)に移した。Parr破砕機を用いて氷上で350 psiで15分間細胞を破壊し、100μl分割量をトリパンブルー染色して光学顕微鏡により観察し、均一化の効率を評価した。次に細胞溶解液を4℃、900 x gで5分間遠心分離し、PNSを回収した。トリパンブルー排除法により、PNS中の未溶解細胞および核の量をモニターした。PNSに、ダイナビーズPanマウスIgG(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)500μlを添加した。15 rpmに設定したDynalサンプルミキサー(Dynal Biotech、ニューヨーク州レークサクセス)中で、混合物を4℃で60分間インキュベートした。その後、磁石を使用し、ビーズをPBSブロッキング緩衝液10 mlで2回洗浄した。洗浄するごとに、毎回混合物を5秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁した。最後の洗浄では、ビーズをPBS 10 mlに再懸濁した。次に磁石を用いてビーズを回収し、液体窒素中で瞬時に凍結して-80℃で保存した。PM画分の純度は、上記のように評価した。
【００７３】
CaCo-2細胞株について先に決定した最適条件を使用したところ、得られたPM画分(図3、レーン2)は3つの既知PMマーカー、Na+/K+ ATPアーゼ、CEA、およびアネキシンIIを含み、他の細胞小器官の混入がごくわずかであることが示され、これにより純度が極めて高いことが示唆された。CEAおよびNa+/K+ ATPアーゼタンパク質がどちらもPM画分中に検出され、この結果から、培養CaCo-2細胞から精製されたPM画分と同様に、やはり完全なPMがうまく単離されたことが示された。
【００７４】
電子顕微鏡観察により、ビーズに結合した物質が微絨毛およびクラスリン被覆構造の存在を表すことが示され、ESA/CEAビーズ画分の形態学的特徴分析により(図4)生化学的分析が立証された。混入する他の細胞小器官構造は、このPM画分中に認められなかった。
【００７５】
実施例5
常磁性マイクロビーズを用いた培養細胞または新鮮組織からの原形質膜の免疫磁気単離
以下のようにして、溶液を調製した。PBS/PVP：2 mg/mL PVP-40T(Sigma、ミズーリ州セントルイス)をD-PBS 500 mLに添加し、減圧下でろ過した。PBS/PVP/ミルクの場合は、0.5 mg/mLノンファットドライミルク(インスタントのスキムミルク粉末：Nestle、製品番号6500011132.3)をPBS/PVPに添加し、減圧下でろ過した。ショ糖-トリス(ST)緩衝液：250 mMショ糖/10 mMトリス、pH 7.4を減圧下でろ過した。ST/抗プロテアーゼの場合は、抗プロテアーゼ1錠(完全プロテアーゼ阻害剤混合錠剤：Roche、カタログ番号1836145)をST緩衝液50 mLに添加した。PBS/PVP/抗プロテアーゼの場合は、抗プロテアーゼ1錠(完全プロテアーゼ阻害剤混合錠剤：Roche、カタログ番号1836145)をPBS/PVP 50 mLに添加し、使用直前に減圧下で15分間撹拌することにより脱気した。PBS/PVP/ミルク/抗プロテアーゼの場合は、抗プロテアーゼ1錠(完全プロテアーゼ阻害剤混合錠剤：Roche、カタログ番号1836145)をPBS/PVP/ミルク 50 mLに添加し、上記のように脱気した。さらに、33%(1.28 M)ショ糖溶液(Fisher、カタログ番号S5-500)を調製した。
【００７６】
免疫単離のため、細胞懸濁液を調製した。5千万個の細胞を50 mLチューブに入れた。PBS/PVP/ミルクで容量を40 mlに合わせてから、4℃、1200 rpm(300 g)で5分間遠心分離した。上清を除去した後、一次抗体750μL(抗ESA 1μg(ESA Ab-3、IgG1、200μg/mL；Neomarkers、カリフォルニア州フレモント、カタログ番号MS-181-P)/100万個細胞；および抗CEA 2μg(CEA Ab-3、IgG2a、200μg/mL；Neomarkers、カリフォルニア州フレモント、カタログ番号MS-613-P)/100万個細胞)を含むPBS/PVP/ミルク9.25 mL中で細胞を再懸濁し、全容量を10 mLに合わせた(5百万個細胞/mL)。
【００７７】
Dynalサンプルミキサー(Dynal Biotech、RKDYNAL 10111)中で、4℃、15 rpmで30分間細胞をインキュベートした。次に、PBS/PVP/ミルクを添加して容量を50 mLに合わせ、細胞を4℃、1200 rpm(300 g)で5分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをPBS/PVP/ミルク10 mL中で穏和に再懸濁した。インキュベートした後、PBS/PVP/ミルクを再度添加して容量を50 mLに合わせ、細胞を遠心分離し、PBS/PVP/ミルク9.375 mL中で穏和に二度目の再懸濁を行った。
【００７８】
マイクロビーズ50μL(MACSヤギ抗マウスIgGマクロビーズ(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州オーバーン、カタログ番号48-401))/100万個細胞＝ビーズ625μLを細胞懸濁液に添加し、全容量を10 mLに合わせ、Dynalサンプルミキサー中、4℃、15 rpmで30分間インキュベートした。D-PBSを添加して全容量を50 mLに合わせ、細胞を4℃、1200 rpm(300 g)で5分間遠心分離した。ペレットをD-PBS 10 mL中で穏和に再懸濁し、50μL分割量を採取した。この一定分量を用いて細胞数をカウントし、トリパンブルー排除法により生存度を調べた。再度D-PBSを添加して懸濁液の全容量を50 mLに合わせ、上記と同様に細胞をもう一度遠心分離し、ペレットをST/抗プロテアーゼ5 mL中で穏和に再懸濁した。
【００７９】
次に試料を液体窒素中で瞬時に凍結し、-80℃で一晩保存した。水の入ったビーカー中に試料を入れ、室温で撹拌しながら解凍した。解凍した試料をParr破砕機(Parr細胞破砕機：Parr Instrument Company、型番4639)に移した。試料を含んだチューブをST/抗プロテアーゼ2.5 mLで2回洗浄し、洗浄液もParr破砕機に移した(全容量＝10 mL)：5百万個細胞/mL。Parr破砕機を用いて氷上で350 psiで15分間細胞を破壊し、100μl分割量をトリパンブルー染色して光学顕微鏡により観察し、均一化の効率を評価した。
【００８０】
環境低温室(4℃)内で、LS分離カラム(Miltenyi Biotec、カタログ番号42-401)をMidiMACS分離ユニット(磁気)(Miltenyi Biotec、カタログ番号43-302)にセットし、カラムをPBS/PVP/ミルク/抗プロテアーゼ3 mLで平衡化した。このカラムは、緩衝液または試料をカラムに添加する間に流動が停止し得る(ストップフローカラムとして設計されており、完全に乾くことはない)。試料をカラムに供試し、流出液を陰性(非磁気)画分または「フロースルー」として回収した(フロースルー100μLを分析のために保存した)。次に、PBS/PVP/抗プロテアーゼ3 x 10 mLを用いて、側面から物質をすすぐためにカラム容器をできるだけいっぱいに満たしてカラムを洗浄し、流出液を洗浄液として回収した。カラムを磁気からはずし、PBS/PVP/抗プロテアーゼ3.5 mLで陽性(磁気)画分を5 mLチューブに溶出した。次に溶出液をSW 60 Ti超遠心チューブ(Optima超遠心：Beckman Coulter、モデルXL-100K；超遠心ローター型SW 60Ti：Beckman Coulter；ウルトラクリア遠心チューブ(4 ml)：Beckman、カタログ番号344062)に移し、33%(1.28 M)ショ糖50μLのクッションをチューブの底に添加した。試料を4℃、50,000 rpmで30分間遠心分離して膜をペレット化し、上清を除去した(膜はチューブの底でペレット化するため、ショ糖クッションを含む)。ペレットをST/抗プロテアーゼ100μ中でマイクロピペットを用いておよび穏和にボルテックスすることにより再懸濁し、SDS-PAGE用にまたは瞬時凍結して-80℃で保存するために調製した。精製PMの形態および生化学的特徴を、図5、6、および7に示す。
【００８１】
実施例6
質量分析法による原形質膜成分の分析
原形質膜タンパク質(例えば、実施例5による)をまず溶解/再水和緩衝液に溶解して遠心分し、次にIPGストリップ(IPGphor Amersham Pharmacia)に添加し、製造業者の説明に従って1次元目の分離を行う。ビーズは大きすぎてゲル内を移動できないため、PM抗原に結合した抗体をビーズから分離する。次にストリップをはずして平衡化し、SDS-PAGEで試料を2次元に泳動する。2次元目の分離後、ゲルを銀染色してスキャンする。続いて、スポットを切り出し、96ウェルプレートに入れる。次にゲル断片をMassprep(リキッドハンドラ；Micromass UK)に入れ、製造業者の説明に従って脱塩しトリプシン消化する。続いて過剰の液体をゲル断片から採取し、A) 96ウェルプレートのウェルおよびB) MALDI-TOF質量分析法による分析用の96ウェルターゲットプレート(Micromass UK)のウェル中に沈着させる。
【００８２】
本明細書で言及した出版物および特許はすべて、個々の出版物または特許が詳細にかつ個別に参照として組み入れられることが示されるがごとく、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８３】
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載した本発明を様々な使用および条件に適合化するために、本発明に変更および修正がなされ得ることは明らかであると考えられる。そのような態様もまた、特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】PM抗原マーカー(ESA、Na+/K+ ATPアーゼ、CEA、およびアネキシンII)および細胞内の混入細胞小器官のマーカー(BIP、TOM 20、p251、およびp62ヌクレオポリン)を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、CaCo-2細胞から免疫単離されたPM画分の生化学的特徴づけを示す。レーン1：全細胞溶解液；レーン2：ESA/CEAビーズ画分；レーン3：対照IgGビーズ画分。
【図２】CaCo-2細胞から精製されたPMの形態を示す。A) 形態学的特徴づけ：PMのマーカーである微絨毛を示す電子顕微鏡写真。B) 形態学的特徴づけ：モノクローナルESA抗体およびCEA抗体と共役した磁気ビーズに結合した免疫単離されたPMを示す、低倍率および高倍率の電子顕微鏡写真。PMのマーカーであるクラスリン被覆小孔を「Cp」で示す。
【図３】PMマーカー(Na+/K+ ATPアーゼ、CEA、およびアネキシンII)および細胞内の混入細胞小器官のマーカー(p62ヌクレオポリン、TOM 20、およびp251)を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、初代ヒト結腸腫瘍組織から免疫単離されたPM画分の生化学的特徴づけを示す。レーン1：全細胞溶解液、正常組織；レーン2：PM画分、正常組織；レーン3：対照IgG画分、正常組織；レーン4：全細胞溶解液、腫瘍組織；レーン5：PM画分、腫瘍組織；レーン6：対照IgG画分、腫瘍組織。
【図４】初代ヒト結腸腫瘍組織からの免疫単離精製手順後に磁気ビーズに結合した物質を表す一連の電子顕微鏡写真を示す(左、中央、および右のパネル)。また、クラスリン被覆構造(Ccs、左のパネル)および微絨毛(右のパネル)等の形態学的PMマーカーも示す。
【図５】PMマーカー(Na+/K+ ATPアーゼおよびCEA)および細胞内の混入細胞小器官のマーカー(p62ヌクレオポリンおよびBIP)を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、CaCo-2細胞からマイクロビーズ免疫単離されたPM画分の生化学的特徴づけを示す。レーン1：全細胞溶解液；レーン2：ESA/CEAビーズ画分。
【図６】実施例5の免疫単離精製手順後に磁気マイクロビーズに結合した、Caco-2細胞からのPM物質を表す一連の電子顕微鏡写真を示す。
【図７】PMマーカー(Na+/K+ ATPアーゼおよびCEA)および細胞内の混入細胞小器官のマーカー(p62ヌクレオポリンおよびBIP)を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングによる、初代ヒト結腸組織から免疫単離されたPM画分の生化学的特徴づけを示す。レーン1：正常細胞からの全細胞溶解液；レーン2：正常細胞から免疫単離されたPM画分；
レーン3：腫瘍細胞からの全細胞溶解液；レーン4：腫瘍細胞から免疫単離されたPM画分。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005502727.tif 000054
【国際調査報告】
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2005502727.tif 000056
2005502727.tif 000057
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