(57)【要約】本発明の方法は数千本の光ファイバからなるイメージガイドを使用するもので、励起信号は光源から発射され、偏向され、イメージガイドのいづれかの光ファイバに交わる交わる導入され、ファイバの出口における組織の夫々の励起点は戻りに蛍光信号を発射し、この蛍光信号は前記ファイバによって回収され、次いで検出され、画素を形成するべく数値化される。本発明の第１の観点によれば、この方法は表面下の平面を励起して共焦点画像を形成するべくファイバの出口のところにビームを集束させる。第２の観点によれば、この方法は表面から組織のマイクロボリュームを励起することの可能な収斂するビームをファイバの出口のところに形成する。本発明によれば、この方法は、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で励起信号を偏向させ、ファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することを特徴とする。本発明によれば、生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）かつリアルタイムで画像を形成することができる。
2005532883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光の共焦点画像を生体内でその場式に形成するための方法であって、該方法は数千本の光ファイバからなるイメージガイドを使用して表面下の平面内で組織を点から点へと走査することからなり、各点は、連続光源から発射され、偏向され、前記ガイドのいづれかの光ファイバに導入され、次いで前記平面内において前記ファイバの出口に集束される、励起信号に対応し、各点は戻りに蛍光信号を発射し、この蛍光信号は、前記光ファイバによって回収され、次いで画素を形成するべく検出されかつディジタル化され、この方法の特徴は、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で励起信号を偏向させること、および、ファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することからなる方法。
【請求項２】
集束レンズの開口係数はほぼ０.５〜１であることを特徴とする請求項１に基づく方法。
【請求項３】
数千本の光ファイバからなるイメージガイドを用いて高解像度の蛍光画像を形成するための方法であって、励起信号は連続光源から発射され、偏向され、前記イメージガイドのいづれかの光ファイバに交わる交わる導入され、励起信号に応答して発射された蛍光信号は、励起に用いたのと同じ光ファイバによって回収され、次いで画素を形成するべく検出されかつディジタル化され、この方法の特徴は、ファイバの端部はイメージングすべき組織の表面と裸で直接に接触せられるようになっており、各ファイバは表面から光ファイバのコアの直径に特に依存する最大深度までの間に位置する組織のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成するようになっていること、および、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で励起信号を偏向させること、および、ファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することからなる方法。
【請求項４】
共鳴式ラインミラーの迅速な共鳴周波数と検流式枠ミラーの緩慢な共鳴周波数とを決定することにより励起ビームの偏向速度を制御することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項５】
励起された蛍光体の発光帯域の全幅にわたって光子を回収することの可能な程度の無色性を呈する偏向用光学手段、導入手段、集束手段、および検出手段を使用することを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項６】
検出すべき蛍光波長に対する量的検出効率は少なくとも５０％であることを特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項７】
使用すべきイメージガイドのファイバの位置を予め検出する工程を特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項８】
各ファイバに固有の真の導入率を予め決定する工程を特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項９】
バックグラウンド画像に対応する回収されたビームを予め決定する工程を特徴とする前記請求項のいづれかに基づく方法。
【請求項１０】
バックグラウンド画像に対応するビームを控除し、当該ファイバに固有の真の導入率に適合させることにより、ファイバから来るディジタル信号を補正する工程を特徴とする請求項８および９に基づく方法。
【請求項１１】
補正された信号に基づいて画像を再構成することを特徴とする請求項１０に基づく方法。
【請求項１２】
画像を再構成する工程はゴーシアン・ローパス濾過からなることを特徴とする請求項１１に基づく方法。
【請求項１３】
請求項１、２、４〜１１のいづれかに基づく方法を実施するための、ファイバ利用の生体内式その場式共焦点式蛍光イメージング装置であって：
−イメージガイド（6）と；
−標的とされた少なくとも１つの蛍光体の励起波長で連続的に発光する光源（1）と；
−光源（1）によって生成された励起ビームをイメージガイド（6）の入口断面に対応するＸＹ面内で横列と縦列に沿ってファイバからファイバへと時間にわたり迅速に走査する手段（4）および導入する手段（5）と；
−励起波長と蛍光波長を分離する手段（3）と；
−蛍光信号を検出する手段（11）と；
−検出された信号を処理して画像形成を可能にする手段（12）；
とを備え、遠位端には観察される組織（13）に接触せられる励起ビーム集束用光学ヘッド（7）が設けてあり、
その特徴は：
−前記走査手段はリアルタイムで画像を得るのに対応する速度で励起信号を変位させるようになっていること；および、
−前記検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に応じて定まる周波数を有するパスバンドを有することからなる装置。
【請求項１４】
請求項３〜１２のいづれかに基づく方法を実施するための、ファイバ利用の生体内式その場式の高解像度の蛍光イメージング装置であって：
−イメージガイド（6）と；
−標的とされた少なくとも１つの蛍光体の励起波長で連続的に発光する光源（1）と；
−光源（1）によって生成された励起ビームをイメージガイド（6）の入口断面に対応するＸＹ面内でファイバからファイバへと走査する手段（4）および導入する手段（5）と；
−励起波長と蛍光波長を分離する手段（3）と；
−蛍光信号を検出する手段（11）と；
−検出された信号を処理して画像形成を可能にする手段（12）；
とを備え、
その特徴は、各ファイバの端部は、拡散するビームを生成するようになっていると共に、観察すべき組織の表面に裸で直接に接触せられることを目的としていること；および、
前記走査手段はリアルタイムで画像を得るのに対応する速度で励起信号を変位させるようになっていると共に、前記検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に応じて定まる周波数を有するパスバンドを有することからなる装置。
【請求項１５】
光源（1）によって生成された励起ビームは長手方向モノモードであり、僅かにマルチモードの光ファイバへの導入のための最良の波面品質を有することを特徴とする請求項１３又は１４に基づく装置。
【請求項１６】
ファイバの断面は円形であり、光源によって生成された励起ビームはファイバへの導入を最適化するべく円形であることを特徴とする請求項１３から１５のいづれかに基づく装置。
【請求項１７】
イメージガイド（6）への導入手段（5）に適合するべく励起ビームを成形するために光源の出口でビーム成形手段（2）を用いることを特徴とする請求項１３から１６のいづれかに基づく装置。
【請求項１８】
励起波長と蛍光波長を分離する手段（3）は励起波長に対する最大効率を有する二色性フィルター（3）を備えていることを特徴とする請求項１３から１７のいづれかに基づく装置。
【請求項１９】
励起波長を除去するための拒絶手段（8）を検出手段（11）の上流に配置したことを特徴とする請求項１３から１８のいづれかに基づく装置。
【請求項２０】
走査手段（4）は、共鳴式ラインミラー（M1）と、検流式枠ミラー（M2）と、２つのミラーを共役させるための統一倍率の無焦点の第１の光学系（AF1）と、２つのミラーの回転面をいづれかのファイバへの導入面に共役させるための統一倍率の第２の光学系（AF2）を備えていることを特徴とする請求項１３から１９のいづれかに基づく装置。
【請求項２１】
光学ヘッド（7）の光学手段と、走査手段（4）と、導入手段（5）と、検出手段は、蛍光信号のスペクトル帯域の全幅にわたって光子を回収することの可能な程度の無色性を呈することを特徴とする請求項１３から２０のいづれかに基づく装置。
【請求項２２】
導入手段（5）は２つの光学アッセンブリ（E1、E2）を備え、第１のアッセンブリ（E1）は走査手段（4）の視野の縁における光学収差を補正するようになっており、第２のアッセンブリ（E2）はイメージガイド（6）のいづれかのファイバへの実際の導入を行うようになっていることを特徴とする請求項１３から２２のいづれかに基づく装置。
【請求項２３】
第１の光学アッセンブリ（E1）は１つの二枚玉レンズからなり、第２の光学アッセンブリ（E2）は１つのレンズを従えた２つの二枚玉レンズからなることを特徴とする請求項２２に基づく装置。
【請求項２４】
検出手段（11）の前に配置された濾過用穴（10）を備え、その直径は１本のファイバの画像がそこに内接するように設定されていることを特徴とする請求項１３から２３のいづれかに基づく装置。
【請求項２５】
蛍光信号を濾過用穴（10）に集束する手段（9）を特徴とする請求項２４に基づく装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファイバ利用の高解像度の、特に共焦点式の、蛍光イメージング方法および装置に関する。目的とする応用分野はより詳しくは生体内式（in-vivo）かつその場式（in-situ）イメージングの分野である。
【背景技術】
【０００２】
観察される蛍光作用は生物組織の外来的な化合物（典型的には注入したマーカー）又は内生的な化合物（細胞内にあるもの）に由来することができる。
【０００３】
より詳しくは、本発明の共焦点式イメージング方法は、表面下の平面内で組織を点から点へと走査することからなるタイプのもので、各点は連続光源から発射された１つの励起信号に対応しており、この励起信号は、偏向されて光ファイバの束のうちのいづれかのファイバに交わる交わる導入され、次いで前記平面内において当該ファイバの出口に集束され、各点は帰りに蛍光信号を発射し、この蛍光信号は前記光ファイバによって回収され、次いで検出され、画素を形成するべく数値化される。
【０００４】
共焦点特性は、励起信号とそれに応答して発射された蛍光信号とを伝送するために同じ光路（特に空間的濾過に使用するのと同じ光ファイバ）を使用すること、並びに、組織内の焦点を当該光ファイバに共役させるのを可能にする光学系を使用することにより得られる。
【０００５】
これに対応する共焦点式イメージング装置は可撓性の光ファイバの束（今日ではイメージガイドと呼ばれている）を備え、その近位端には：
−標的とされた１若しくは複数の蛍光体の励起波長で連続的に又はパルスモードで発光する光源（典型的にはレーザ光源）と；
−光源が生成した励起ビームをイメージガイドの入口断面に対応するＸＹ面内で横列と縦列に沿って時間にわたり迅速に走査する手段と；
−励起ビームをいづれかの光ファイバに導入する手段と；
−蛍光信号を検出する手段と；
−制御手段（特に走査手段の制御手段）；
とを備えている。
【０００６】
各ファイバ上で順次に検出された信号に基づいて画像を形成し表示するための手段が更に設けてある。
【０００７】
イメージガイドの遠位端には、観察すべき組織に接触させるようになった光学ヘッドが設けてあり、これは励起ビームを所与の深さ（数拾μｍ）に集束させて表面下画像を形成するのを可能にする。
【０００８】
実際には、この種の装置は以下のような利点を呈する：
−イメージガイドの遠位端側には走査手段が組み込まれた光学ヘッドよりも堅牢で安価な集束用光学系だけが存在するのであり、光学ヘッドの交換は走査手段とは独立にすることができる；更に、このヘッドはミニチュア化可能であるから、内視鏡術に有利であると共に、一般に、位置決め精度を上げるためにも有利である；
−可撓性の光ファイバで形成されたイメージガイドは観察すべき部位へのアクセス・アームとして作用するのであり、これはその場（in-situ）型の用途に重要である。
【０００９】
従来技術には、次のような蛍光方法および装置が記載されている。
【００１０】
“Applied Optics”、38巻、34号、1999年12月、7133〜7144頁、に掲載された記事には、可撓性光ファイバの束の遠位端に集束用のミニチュア型の光学ヘッドを設けた共焦点式のマイクロ内視鏡が提案されている；これは光ファイバの束をライン状に走査するようになっており、この装置は検出スリットおよび電荷トランスファー型のCCDリニアーセンサーを備えている。この種の装置は毎秒４画像を得るのを可能にするもので、これは主体とオペレータの動きに従属するその場式（in-situ）イメージングのためには遅すぎる。更に、点毎にではなくてライン状に走査することは共焦点特性を悪化させると共に、画像の解像度の低下を招く。
【００１１】
“Optics Communications”、188（2001）、267〜273頁、に掲載された記事には、レーザ走査式の共焦点式卓上型顕微鏡と、遠位端にミニチュア型の光学ヘッドを備えた可撓性光ファイバの束とを結合することが提案されている。その目的は顕微鏡と内視鏡とを相容的にすることである。走査はファイバ毎に行われるが、使用する卓上型顕微鏡は、画像を得るための時間を配慮することなく固定サンプルを表示するように設計された従来思想のものである。この記事には２秒の露出時間が提案してあり、その場式（in-situ）のリアルタイムのイメージングのためには余りにも長すぎる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の目的は、連続的に発射される励起ビームによって１本づつ走査される光ファイバで形成されたイメージガイドを用いるタイプの、高解像度で、特に共焦点式の、ファイバ式の蛍光イメージング方法および装置であって、部位をリアルタイムで生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）に表示することを可能にする（即ち、主体と施術者の動きに従属されることなく、点毎に毎秒当たり充分な数の画像を提供することが可能で、特に充分に迅速な検査を可能にする）方法および装置を提供することにある。
【００１３】
本発明の目的は、また、一般的に、夫々の画像の品質を最適化して、特に、優れた横方向および軸方向解像度を得ることの可能な方法および装置を提供することにある。
【００１４】
本発明の第１の観点によれば、本発明は蛍光の共焦点画像を生体内でその場式に形成するための方法を提供するもので、該方法は数千本の光ファイバからなるイメージガイドを使用して表面下の平面内で組織を点から点へと走査することからなり、各点は、連続光源から発射され、偏向され、前記ガイドのいづれかの光ファイバに導入され、次いで前記平面内において前記ファイバの出口に集束される、励起信号に対応し、各点は戻りに蛍光信号を発射し、この蛍光信号は、前記光ファイバによって回収され、次いで画素を形成するべく検出されかつディジタル化され、この方法の特徴は、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で励起信号を偏向させること、および、ファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することからなる。
【００１５】
本発明の第２の観点によれば、本発明は数千本の光ファイバからなるイメージガイドを用いて高解像度の蛍光画像を形成するための方法を提供するもので、励起信号は連続光源から発射され、偏向され、前記イメージガイドのいづれかの光ファイバに交わる交わる導入され、励起信号に応答して発射された蛍光信号は、励起に用いたのと同じ光ファイバによって回収され、次いで画素を形成するべく検出されかつディジタル化され、この方法の特徴は、ファイバの端部はイメージングすべき組織の表面と裸で直接に接触せられるようになっており、各ファイバは表面から光ファイバのコアの直径に特に依存する最大深度までの間に位置する組織のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成するようになっていること、および、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の取得に対応する速度で励起信号を偏向させること、および、ファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することからなる。
【００１６】
この方法は、各ファイバの出口で集束される信号を走査するのではなくて、各ファイバの出口で拡散する信号を走査する点で、第１の観点に基づく方法と相違する。ファイバの出口で信号を集束させないことは、組織の表面の直下に位置するボリュームの画像を得るのを可能にするもので、これらの画像は開発可能で特に医学的な見地から興味深いものである。これらの画像は点から点へと走査される表面下の切断面に由来するものではないので“共焦点的”ではないが、表面の直下に位置するマイクロボリュームを交わる交わる走査すること、および、励起に用いたのと同じファイバによって各マイクロボリュームによって発射された蛍光信号を空間的濾過することに由来するので、“解像度が高い”と評価できる画像である。斯る装置の主たる利点は、内視鏡の用途のためには、内視鏡プローブの直径をイメージガイドの直径（従って、光ファイバの数）のみに応じて非常に小さくすることができるということにある。これは、例えば神経学の分野のような、内視鏡プローブのサイズが集束用光学ヘッドのミニチュア化に固有の問題を解消するための決定的なファクターであるような応用分野への適用を可能にする。
【００１７】
本発明は、ファイバの出口に集束させる方法であるかさせない方法であるかを問わず、生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）リアルタイムで画像を形成するための解決を提案する。本発明は、夫々のファイバに良く対応する画像を点から点へと得て再構成することを可能にするファイバ・サンプリング（シャノンの基準による）を尊重することに立脚するものである。これは毎秒当たりの最小平均画像数（即ち、最大640×640ピクセルのモードの場合に実際には最小でも毎秒１２画像）を尊重しながらすべてのファイバを１本づつサンプリングする際に情報を失わないことを可能にする。この最小サンプリングに応じて検出周波数（検出センサーのパスバンド）を選定すれば各ファイバについて可能な最大数の蛍光光子を検出するのが可能になる。
【００１８】
従って、約30,000の可撓性光ファイバからなるイメージガイドを用いた可能な実施例では、サンプリング周波数と検出系（アバランシュ型フォトダイオード又は同等物）のパスバンドはほぼ１.５MHzに設定され（ファイバ当たり約12ピクセルに対応）、最大640×640ピクセルのモードで最小１２画像／秒を得るのを可能にする。
【００１９】
実用上は、リアルタイムの画像を得るべくファイバを適切に迅速走査するのを可能にする好ましい実施態様によれば、ビームの偏向は共鳴式“ライン”ミラーの迅速な共鳴周波数と検流式“枠”ミラーの緩慢な共鳴周波数を決定しながら制御される。
【００２０】
本発明によれば、１本のファイバから来る光線の検出時間は時間制限され、かつ、リアルタイムの画像の取得を尊重するべく非常に短い。従って、本発明によれば、この限られた検出時間内に検体から来る最大限の光線を回収し検出するための最適化手段が更に設けられ、特に：
−励起波長と最大蛍光波長との間の波長のずれ、並びに発射された蛍光信号のスペクトル幅、に応じた無色性を呈する偏向光学手段、導入手段、場合により集束手段および検出手段を使用し（これは有利なことに発射された蛍光のスペクトル帯域の全幅にわたって回収された蛍光光線を最適化するのを可能にする）；
−場合により、組織に対する集束レンズの開口係数をほぼ０.５〜１に選定し（視野サイズと回収される光子の量との間の良好な妥協を得るのが可能になる）；
−検出すべき蛍光波長に対する少なくとも５０％の量的効率を有する検出センサーを選定する。
【００２１】
本発明によれば、検出した光線に対して次に行われる画像処理は、また、検出した光子のこの限られた光線から非常に良好な品質の画像を得るべく最適化される。この最適化は次のように行われる。
【００２２】
リアルタイムの画像を取得する前に次の一連の工程が行われる：
−使用すべき選ばれたファイバ組立体（イメージガイド全体か、選ばれたサブアッセンブリ）の各ファイバの位置を検出する工程（この工程は少なくともイメージガイドを交換する度に行うべきである）；
−各ファイバへの導入率を較正する工程（即ち、各ファイバ固有の導入率を確定する工程）；
−（検体なしに）バックグラウンド画像を検出する工程。
【００２３】
作動時には、画像処理の最適化は、特に、検出した信号をディジタル化した後に：
−補正された信号を得るべく、ファイバ固有の導入率に基づいて補正し、かつ、バックグラウンド画像を控除した後に、各ファイバによって回収した真の光線（即ち、検体からしか来ない光線）を確定すること；
−次いで、特にファイバのモザイクを呈する画像を見かけのファイバのない画像に変換することを目的として、この補正された信号に基づいて画像の再構成を行うこと；
からなる工程を包含する。
【００２４】
本発明によれば、これら２つの工程はリアルタイムに行わなければならない。信号の補正に関しては、これは観察された信号の構造に適合した処理および最適化されたアルゴリズムによってリアルタイムに行うことができる。画像の再構成に関しては、これは画像の品質の点で要求通りの結果を得ることを可能にしながらリアルタイムで実行可能なピクセル当たりの操作数を選択することにより行うことができる。ゴーシアン（Gaussien）ローパスフィルターは処理の複雑さと結果の品質と計算時間との間の良好な妥協を提供する。
【００２５】
時間を稼ぎ、かつ、画像の再構成に対応する処理の複雑さを増加させるには、例えば特殊な処理カード及び／又はマルチプロセッサのようなパラレル・アーキテクチャーを使用することにより、素材の処理能力を増加させることもできる。
【００２６】
本発明は、また、前述した第１の観点に基づく方法を実施するための装置を提供するもので、この装置は：
−イメージガイドと；
−標的とされた少なくとも１つの蛍光体の励起波長で連続的に発光する光源と；
−光源によって生成された励起ビームをイメージガイドの入口断面に対応するＸＹ面内で横列（ライン）と縦列（コラム）に沿ってファイバからファイバへと時間にわたり迅速に走査する手段および導入する手段と；
−励起波長と蛍光波長を分離する手段と；
−蛍光信号を検出する手段と；
−検出された信号を処理して画像形成を可能にする手段；
とを備え、遠位端には観察される組織に接触せられる励起ビーム集束用光学ヘッドが設けてある。
【００２７】
この装置の特徴は：
−前記走査手段はリアルタイムで画像を得るのに対応する速度で励起信号を変位させるようになっていること；および、
−前記検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に応じて定まる周波数を有するパスバンドを有することからなる。
【００２８】
本発明は、また、上記第２の観点に基づく方法を実施するための装置を提供するもので、この装置は：
−イメージガイドと；
−標的とされた少なくとも１つの蛍光体の励起波長で連続的に発光する光源と；
−光源によって生成された励起ビームをイメージガイドの入口断面に対応するＸＹ面内でファイバからファイバへと走査する手段および導入する手段と；
−励起波長と蛍光波長を分離する手段と；
−蛍光信号を検出する手段と；
−検出された信号を処理して画像形成を可能にする手段；
とを備え、
その特徴は、各ファイバの端部は、拡散するビームを生成するようになっていると共に、観察すべき組織の表面に裸で直接に接触せられることを目的としており；
前記走査手段はリアルタイムで画像を得るのに対応する速度で励起信号を変位させるようになっていると共に、前記検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小サンプリング周波数に応じて定まる周波数を有するパスバンドを有することからなる。
【００２９】
本発明および他の利点は添付図面を参照にした以下の実施例の記載に従い明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図１および図２に示した特定の実施例においては、この装置は：
−光源１；
−励起ビームを成形する手段２；
−波長を分離する手段３；
−走査手段４；
−ビームを導入（インジェクト）する手段５；
−可撓性光ファイバで構成されたイメージガイド６；
−集束用光学ヘッド７；
−励起ビームを拒絶する手段８；
−蛍光信号を集束する手段９；
−蛍光信号を空間的に濾過する手段１０；
−蛍光信号を検出する手段１１；および、
−検出された蛍光信号を電子的に演算処理して表示する手段１２；
を備えている。
これらの要素について以下に詳細に説明する。
【００３１】
光源１は広範囲な蛍光体を励起することの可能な励起波長（例えば、488ｎｍ）を発射するレーザである。イメージガイド６のいづれか１本のファイバへの導入を最適化するため、励起ビームはやはり円形の断面のファイバに導入できるように円形であり、導入率を最適化するため、レーザは僅かにマルチモードの光ファイバへ導入するための可能な最良の波面を提供するべく好ましくは長手方向モノモードである。レーザは連続的に又はパルス状にかつ安定的に（可能な限り最小のノイズ、＜１％）発光する。出口での利用可能な出力は約２０ｍＷである。例示として、量子ウェル型レーザ（VCSEL）、ダイオードでポンピングされた固体レーザ、ダイオードレーザ、或いはアルゴンのようなガスレーザを使用することができる。
【００３２】
光源１の出口のところには励起用レーザビームを成形する手段２が配置されている。この手段は、レーザビームの直径を修正することを可能にする２つのレンズL1およびL2からなる、１以外の倍率の無焦点の光学系で構成されている。倍率はビームの直径がファイバへの導入手段５に適合するように計算される。
【００３３】
成形された励起用レーザビームは次いで励起波長と蛍光波長とを分離するための手段３の方へ向けられる。それは例えば励起波長の98〜99％の透過効率を有する（従って、他の波長を実質的に反射する）二色性フィルターである。従って蛍光信号は、戻りに励起信号と同じ光路を通りながら（共焦点特性）、ほぼ全部が検出路（８〜１１）の方へ送られるであろう。検出路上に配置された拒絶手段８は、励起波長488ｎｍにおけるノイズ反射（これは検出路（例えば、488ｎｍにおける拒絶フィルタ、例えば500〜600ｎｍの透過しか許容しないバンドパスフィルタ、又は500ｎｍ以上の透過を許容するハイパスフィルタ）の方へ通過する）の１〜２％を完全に除去する役割を果たす。
【００３４】
走査手段４は次いで励起ビームをピックアップする。図１に示した実施例では、この走査手段は、ビームを水平に偏向し、従って画像の横列を形成するための、４kHzで共鳴するミラーM1と、ビームを垂直に偏向し、従って画像の枠を形成するための15Hz型の検流式ミラーM2と；統一された倍率の２つの無焦点系（２つのミラーの間に位置するAF1と、ミラーM2の後に位置するAF2）とを備え、これらの無焦点系は２つのミラーM1およびM2の回転面をファイバへの導入面に共役させるために使用される。本発明によれば、走査速度は組織の生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）リアルタイムの観察を可能にするべく決定される。このため、走査は、最も遅いモードに対応する640×640ピクセルの表示モード用のスクリーン上に少なくとも１２画像／秒が表示されるように、充分速くなければならない。より少ないピクセルを有する表示モードのためには、毎秒当たりの取得画像数は従って常に１２画像／秒以上である。変化形では、走査手段は特に回転ミラー、MEMs型（XY走査ミラー）の一体化構成、又は音響光学系を有することができる。
【００３５】
走査手段の出口で偏向された励起ビームは、イメージガイド６のいづれか１本のファイバへ導入するべく光学手段５の方へ向けられる。これらの手段５はこの実施例では２つの光学アッセンブリE1およびE2で構成されている。第１の光学アッセンブリE1は走査手段４の視野の縁における光学収差を部分的に補正するのを可能にするもので、従って、導入は光学視野の全体（中央においても縁においても）について最適化される。第２の光学アッセンブリE2は実際の導入を行うことを目的としている。その焦点距離と開口係数はガイド６の光ファイバへの導入率を最適化するように選ばれる。色消し性の基準を得るのを可能にする実施例によれば、第１のアッセンブリE1は１つの無色の二枚玉レンズからなり、第２のアッセンブリE2は２つの無色の二枚玉レンズからなり、後者の後にはイメージガイドの近くに位置するレンズがある。変化形として、この導入用光学系は、例えば２つの三枚玉レンズのような他の任意のタイプの標準的光学系や、屈折率分布レンズや、或いは顕微鏡の対物レンズ（しかし、より高価）で構成することができる。
【００３６】
イメージガイド６は非常に多数（数万）の可撓性光ファイバ、例えば直径２μｍの30,000本のファイバ、で構成されている。実際には、イメージガイドのファイバの組立体を使用するか、或いは、これらのファイバの特定のサブアッセンブリ（例えばセンタリングされたもの）を使用することができる。
【００３７】
光ファイバを出ると、励起用レーザビームは光学ヘッド７によって検体１３内において検体の表面１５（光学ヘッドはこの表面に当接せられるようになっている）に対して数拾μｍから百μｍまでの所与の深さに位置する点１４に集束される。この深さは例えば４０μｍにすることができる。従って、光学ヘッドはイメージガイドを出るビームを検体内に集束させることを可能にするし、また、検体から戻って来る蛍光ビームを回収することも可能にする。光学ヘッドは２.４の倍率と、検体に対する０.５の開口係数を有する。これら２種のパラメータは、戻り信号が励起信号を発射した光ファイバのみに入り、隣接するファイバには入らないように（従って、１本のファイバを用いて共焦点フィルトレーションが確保されるように）選ばれる。倍率と開口係数をこのような数値にすれば、軸方向解像度は約１０μｍとなり、横方向解像度は約１.４μｍとなる。開口係数は、また、回収される光子の数を最適化する（出来るだけ大きくなければならない）ように選ばれる。光学ヘッドは従来型の光学系（二枚玉レンズ、三枚玉レンズ、非球面レンズ）及び／又は屈折率分布レンズ（GRIN）、及び／又は、共焦点性に適合した光学的品質と色収差を有する屈折レンズ（即ち、光学的収差を最小限にするもの。さもないと、特に視野の深さの低下を惹起し、その結果、装置の軸方向解像度を悪化させる）で構成することができる。作動時には、光学ヘッドは検体１３に当接せられる。検体は生物組織或いは細胞培養物である。蛍光の発現は注射した蛍光体によって行われる（システミック蛍光作用）か、遺伝子の変更により細胞自身によって作られた蛍光体によって行われる（トランスジーニック蛍光作用）。これら２つの場合において、蛍光体は拾ナノメーターから百ナノメーター以上にも達するかなり広いスペクトル帯にわたって光子を再発射する。
【００３８】
検出路上では、蛍光信号は、拒絶フィルター８を出ると、次いで手段９（例えば、検出レンズで構成されている）によって空間的濾過手段１０の濾過用穴のなかに集束される。検出レンズの焦点距離は、１本のファイバから来る蛍光信号が濾過用穴のサイズになるか或いは僅かに小さくなるように計算される。この濾過用穴は、入射ビームによって照射されたファイバから来る蛍光光線だけを保存することを許容する。それは照射されたファイバに隣接するファイバに連結されたおそれのある光線を拒絶するのを可能にする。穴のサイズは１本のファイバの画像が完全に内接するように計算される。この実施例では２０μｍである。更に、やはり濾過用穴を通過する光子の量（従って、検出されるビーム）を最適化するため、走査手段４、導入手段５、光学ヘッドの集束手段７、および検出手段８、９、１０は検出された蛍光体に適合される：これらの手段は蛍光体の最大発光帯域にわたって光子を回収するに充分に無色性になるように選ばれる。
【００３９】
検出手段は検討中の蛍光作用の波長に対して最大の感度を有する。例えばアバランシュ型フォトダイオード（APD）やフォトマルチプリケータを使用することができる。更に、本発明によれば、パスバンドは蛍光信号の統合時間を最適化するように選ばれる。パスバンドは１.５MHzであり、これは各ピクセルに対する最適化された統合時間を有するイメージガイドの最小サンプリング周波数に対応する。
【００４０】
検出された信号を制御し、分析し、ディジタル処理し、表示するための電子情報処理手段１２は以下のカードを有する：
−次の機能を有する同期カード２０：
−走査（即ち、ラインミラー M1と枠ミラーM2の動き）を同期的に制御する機能；
−このように走査されるレーザスポットの位置をあらゆる瞬間において知る機能；および、
−マイクロコンピュータ（それ自身も制御され得る）を介して他のすべてのカードを管理する機能；
−特にインピーダンスの適合を行うアナログ回路と、アナログ・ディジタル変換器と、次いでプログラム可能な論理回路（例えば、信号を成形するFPGA回路）とを備えた検出カード２１；
−可変周波数のディジタルデータの流れを処理して表示スクリーン２３にするためのディジタル取得カード２２；
−グラフィックカード２４。
変化形として、これらの異なるカードの機能を集積した単一のカードを使用することができる。
【００４１】
画像処理は次のように行われる。
この装置内にイメージガイドが配置されると、イメージガイド内のファイバのデザインを認識すると共に、従って、使用したい各ファイバの現実の位置を知るための、最初の操作が行われる。
【００４２】
装置の使用に先立って以下の操作も行われる：
−均質な検体を用いて、各ファイバに固有の導入率（この導入率はファイバ毎に異なり得る）を決定すること；および、
−バックグラウンド画像の測定（検体を用いることなく行われる）。
【００４３】
これら２つの操作は装置の使用頻度に応じて規則的に行うことができる。得られた結果は検出カードの出口におけるディジタル信号を作動時に修正するために使用されるであろう。
【００４４】
作動時には、本発明によれば、検出カードの出口においてディジタル信号に対して２グループの処理が行われる：
最初のグループは、特に前記信号が出力されるところの当該ファイバ固有の実際の導入率を考慮するべく、かつ、ビームのうちバックグラウンド画像に対応する部分を当該ファイバのために控除するべく、先ずディジタル信号を補正することからなる。これは、観察中の検体に真に対応する信号しか処理しないことを可能にする。この処理グループのために、従来の計算アルゴリズム（これはリアルタイムの制約を尊重するべく最適化される）を使用する。
【００４５】
第２のグループは、次に、補正された信号に基づいて、施術者によって表示可能なディジタル画像を再構築することからなる。この処理の目的は、単に、並置された１本のファイバの１つの補正されたディジタル信号に夫々対応する１つの画素モザイクではない、再構築されたディジタル画像を表示のために提供することであるが、ファイバを最早現れさせることのない再構築されたディジタル画像を提供することである。このため、各ピクセル毎に所定数の処理を行うようになったアルゴリズムが使用され、このアルゴリズムはリアルタイムの制約を尊重するべく（即ち、要求される操作の複雑性と、得ることができる結果の品質と、計算時間との間の良好な妥協を提供するように）選ばれる。例示として、ゴーシアン・ローパス濾過用アルゴリズムを使用することができる。
【００４６】
この装置の作動は以下の通りである。光源１は488ｎｍの波長の励起用の円形平行ビームを生成し、このビームは次いでファイバのコア内への可能な最良の導入をするに充分なサイズを与えるべく無焦点系２内で成形される。このビームは次いで励起波長を反射する二色性分離装置３の方へ送られる。入射ビームは次いで光学機械式ミラー走査装置４によって時間にわたり空間の２方向へ角度偏向され、光学的導入手段５によってイメージガイド６のいづれかのファイバに導入される。電子手段１２は、所与のラインにつき点から点へと、かつ、ラインからラインへと、画像を構成するべくミラーを用いてビームを角度方向に偏向しながら、所与の瞬間にイメージガイドのいづれか一本の光ファイバへの導入を制御する役割を果たす。ガイドの出口では、導入されたファイバから現れた光線は光学ヘッド７によって検体内においてほぼ数拾μｍから百μｍの所与の深さに位置する点に集束される。走査により、検体は点から点へと照射される。各瞬間に、組織を照射するスポットは蛍光信号を発光し、この蛍光信号はより大きな波長の方へシフトされようとする特性を有する。この蛍光信号は光学ヘッド７によって捕捉され、次いで二色フィルター３まで励起信号とは逆の光路を辿り、同フィルターは蛍光信号を検出路の方へ伝達する。励起波長で起こるノイズ反射は次いで拒絶フィルター８によって拒絶されるであろう。最後に、蛍光信号は、励起されたファイバから来る光線しか選択しないように、かつ、光子がアバランシュ型フォトダイオード１１によって検出されるように、濾過用穴１０内に集束される。検出された信号は次に数値化され補正される。検出された信号は、リアルタイムで画像を再構築しスクリーンに表示するべく、前述した画像処理によって次から次へとリアルタイムで処理される。
【００４７】
図３および図４に示した特定の実施例によれば、この装置は、集束用光学ヘッド７を除いて図１および図２の装置と同じ構成要素を有する。図においてはこれら同じ構成要素については同じ参照番号を使用し、ここでは詳細な再説明はしない。
【００４８】
この装置に使用するイメージガイド６は、目的とする用途（内視鏡、求める視野サイズ、など）に応じた所望のガイド外径に応じて、ほぼ5,000から100,000の可撓性の光ファイバからなる。それは例えば株式会社藤倉によって市販されているイメージガイドである。ファイバのコアの直径は好ましくは１〜４μｍである。これはファイバの出口において空気中で開口係数0.42について約１８°の角度を呈するビームの拡散を生じさせる。１μｍのコア直径はイメージガイド組立体の端部を延伸する方法により得ることができる。イメージガイドの端部は研磨してあり、光学手段を備えていない。研磨の目的は、一方において得られた画像のバックグラウンドできるだけ均質にするために、かつ、他方において起こり得る組織へのファイバの接着の問題（これは組織を傷めるおそれがある）を解消するために、ガイドの面に（従って組織と接触する裸のファイバに）同じ表面状態を与えることにある。研磨は組織の形に合うように平面でも丸くてもよい。夫々の光ファイバの開口係数は、好ましくは、最大限の蛍光光子を回収するべくできるだけ大きく（即ち、例えば0.42）設定される。コア間距離は得られた画像の側方解像度（画像の２点間の距離）を与える。この距離が小さいほど、解像度が良くなるであろうが、これは逆に画像の視野サイズを犠牲にするであろう。従って、所望の組織要素を観察するための適当な視野サイズをもった良好な側方解像度（２〜８μｍ）を得るためには、ガイドのファイバ数とファイバ相互のコア間距離との間の良好な妥協を見出すのがよい。
【００４９】
本発明に適したガイドの二例を以下に記す：
例１            例２
ファイバ数                    6,000          30,000
画像視野の直径                300μｍ        650μｍ
ガイドの外径                  330μｍ        750μｍ
ファイバのコア直径              3μｍ          1.9μｍ
コア間距離                      4μｍ          3.3μｍ
表面（図１に平面Ｐで示す）
からの最大信号統合深度
又は軸方向解像度              15〜20μｍ    15〜20μｍ  
側方解像度                      4μｍ          3.3μｍ
【００５０】
使用時には、イメージガイドの遠位端を検体１３に接触させる。その結果、ファイバの端面は組織の表面に直接に接触する。検体は生物組織又は細胞培養物である。蛍光の発現は注射した蛍光体によって行われる（システミック蛍光作用）か、遺伝子の変更により細胞自身によって作られた蛍光体によって行われる（トランスジーニック蛍光作用）。これら２つの場合において、本発明により励起されたマイクロボリューム内に存在する蛍光体は拾ナノメーターから百ナノメーター以上にも達するかなり広いスペクトル帯にわたって光子を再発射する。
【００５１】
この装置の作動は、以下の点を除けば、前述したものと同じである：ガイドを出たところでは、導入されたファイバから現れた拡散性光線は検体内で散乱され、蛍光信号は表面と25μｍの最大深度（ファイバのコアの直径とその開口係数による）との間に位置するマイクロボリューム内で回収される。走査により検体はマイクロボリュームからマイクロボリュームへと照射される。各瞬間に、組織内の励起されたマイクロボリュームは、より大きな波長の方へシフトされようとする特性を有する蛍光信号を発光する。この蛍光信号は励起に使用したのと同じ光ファイバによって捕捉され、次いで二色フィルター３まで励起信号とは逆の光路を辿り、同フィルターは蛍光信号を検出路の方へ送る。検出された信号は図１および図２を参照しながら前述したのと同じ画像処理によって次から次へとリアルタイムで処理され、リアルタイムで画像を再構築しスクリーンに表示するのを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】集束ヘッドを備えた本発明の共焦点式蛍光イメージング装置の実施例の模式図である。
【図２】図１の装置の機能図である。
【図３】高解像度の共焦点式蛍光イメージング装置の実施例の模式図である。
【図４】図３の装置の機能図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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