(57)【要約】本発明は、骨形成を増加させるためのグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βの阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における骨形成を増加させるための医薬を調製するための、ＧＳＫ−３β阻害剤の使用。
【請求項２】
医薬が哺乳動物の骨ミネラル密度を増大させる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬が哺乳動物における骨折の発生率を低下させる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
医薬が哺乳動物における骨折治癒を増強する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
哺乳動物における骨粗鬆症を予防及び治療するための医薬を調製するための、ＧＳＫ−３β阻害剤の使用。
【請求項６】
哺乳動物に有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を投与することによる、哺乳動物における骨粗鬆症を治療又は予防する方法。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項８】
哺乳動物が雌である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項９】
ＧＳＫ−３β阻害剤が、式（I）：
【化１】
2005519056.tif 000024
［式中、
Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ3は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、−ＣＯＲ7（ここで、Ｒ7は、水素又はアルキルである）を表すか、又は、水素、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択される１つ又は２つの置換基で場合により置換されているフェニルを表し；
Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ6は、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアルキル置換ヘテロシクリル、ヘテロアルキル置換シクロアルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、−ＯＲ8、−Ｓ（Ｏ）nＲ8（ここで、ｎは０〜２であり；Ｒ8は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、−ＮＲ9Ｒ10（ここで、Ｒ9は、水素又はアルキルであり、Ｒ10は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、又は、−Ｘ−（アルキレン）−Ｙ−Ｚ｛ここで、Ｘは、共有結合、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ（Ｏ）n1−（ここで、ｎ１は、０〜２である）であり、Ｙは、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ−であり、Ｚは、ヘテロアルキル又はＳｉＲ11Ｒ12Ｒ13（ここで、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、独立して、水素又はアルキルである）である｝であるか、あるいは、Ｒ6とＲ4は互いに隣接している場合には、一緒に、メチレンジオキシ基又はエチレンジオキシ基を形成している］
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１０】
ＧＳＫ−３β阻害剤が、
（a）  式：
【化２】
2005519056.tif 000025
［式中、Ｒ6は、２（Ｒ）３−ジヒドロキシプロポキシである］
で表される化合物；
（b）  式：
【化３】
2005519056.tif 000026
［式中、Ｒ6は、２，３−ジヒドロキシプロピルアミノである］
で表される化合物；
（c）  式：
【化４】
2005519056.tif 000027
［式中、Ｒ1はフルオロであり、Ｒ3はメチルであり、Ｒ6は３−アミノプロピルオキシである］
で表される化合物；
及び
（d）  Ｎ6−{２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル}−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン
から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１１】
ＧＳＫ−３β阻害剤が経口的に送達される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１２】
ＧＳＫ−３β阻害剤で処置した後、抗吸収剤で処置する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１３】
ＧＳＫ−３β阻害剤がＧＳＫ−３βに対して５０nM未満のＩＣ50を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１４】
ＧＳＫ−３β阻害剤がＧＳＫ−３βに対して１０nM未満のＩＣ50を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１５】
ＧＳＫ−３β阻害剤が１０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【請求項１６】
本明細書に記載されている発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成を促進して、骨粗鬆症のような骨代謝性疾患を処置するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤の使用に関する。
【０００２】
本発明は、特に、哺乳動物における骨形成を増加させるための医薬を調製するためのＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関する。
【０００３】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）は、セリン／トレオニンキナーゼであり、２種類のアイソフォーム、α及びβが同定されている。グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）は、最初は、インスリン刺激によるグリコーゲンの合成を調節する鍵酵素であるグリコーゲンシンターゼをリン酸化して不活性化するプロテインキナーゼとして同定された（Embiら，Eur. J. Biochem. 107，519−527，(1980)； Rylattら，Eur. J. Biochem. 107，529−537，(1980)；及び、Vandenheedeら，J. Biol. Chem. 255，11768−11774，(1980)を参照されたい。）。その後、ＧＳＫ−３βは、インスリン活性化により阻害され、それにより、グリコーゲンシンターゼが活性化されることが見いだされた。したがって、ＧＳＫ−３βの阻害は、インスリン依存性のプロセスを刺激し、インスリンに対する感受性の低下と血糖値の上昇を特徴とするII型糖尿病の処置において有用である。これまで、５−ヨードツベルシジン（5−iodotubercidin）、メトホルミン及びトログリタゾネム（troglitazonem）などの多くの薬物が糖尿病の処置に使用されている。しかしながら、メトホルミンは低血糖症を引き起こす可能性があり、トログリタゾネムは重篤な肝毒性を引き起こす可能性があり、公知ＧＳＫ−３β阻害剤である５−ヨードツベルシジンは別のセリン／トレオニン及びチロシンキナーゼを阻害するので、これらの薬物は、その適用が限られている。
【０００４】
最近、ＧＳＫ−３βが、アルツハイマー病の病因においてある役割を担っていることが見いだされ（Lovestoneら，Current Biology，4，1077−86(1994)，Brownleesら，Neuroreport，8，3251−3255(1997)，Takashimaら，PNAS 95，9637−9641(1998)，及び，Peiら，J Neuropathol. Exp.，56，70−78(1997)を参照されたい）、また、双極性障害の病因においてある役割を担っていることが見いだされた（Chenら，J. Neurochemistry，72，1327−1330(1999)を参照されたい）。さらにまた、ＧＳＫ−３βが、ＮＦ−ＡＴを介した初期の免疫応答遺伝子の活性化の遮断及びアポトーシスの調節に関与していることも見いだされた（Bealsら，Science，275，1930−33(1997)，及び，Pap，M.ら，J. Biochem. 273，19929−19932，(1998)を参照されたい）。さらに、ＧＳＫ−３βは、感染に対する炎症亢進性応答に関与するＴＮＦ−αシグナル伝達経路におけるＮＦ−ｋＢ介在生存応答に必要であることが報告されている（Hoeflichら，Nature，406，86−90(2000)）。
【０００５】
さらに、ＧＳＫ−３βは、転写因子のＴＣＦファミリーの活性を制御するタンパク質（β−カテニン）の分解を調節することも知られている（Dale，T.C.，Biochem. J. 329，209−223(1998)； Clevers，H. & van de Wetering，M.，Trends in Genetics 13，485−489(1997)； Staal，F.J.T.ら，International Immunology 11，317−323(1999)を参照されたい）。上記経路は、結腸上皮細胞の形質転換を調節することが示されている。
【０００６】
ＧＳＫ−３β阻害剤は、以下の参考文献に記載されている：WO 99/65897(Chiron)、WO 01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136493A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136489A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136486A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136483A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136099A1(Sanofi-Synthelabo)、)WO 2000/021927(SKB)、WO 2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO 2001/085685、WO 2001/009106(SKB)、WO 2001/52862(Isis)、WO 2001/37819、WO2001/60374、EP 1106180A1(CNRS)、WO 2000/38675(SKB)。
【０００７】
本発明は、骨形成を促進するための、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤の使用に関する。
【０００８】
一態様において、本発明は、患者の骨ミネラル密度（bone mineral density）を増大させるためのＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関する。別の態様において、本発明は、患者の骨折の割合を低減するための、及び／又は、患者の骨折治癒の速度を増大させるための、ＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関する。別の態様において、本発明は、患者の海綿骨の形成及び／又は新しい骨の形成を増大させるための、ＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関する。別の態様において、本発明は、骨粗鬆症を処置するためのＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関する。したがって、一態様において、本発明は、哺乳動物において骨形成を増加させるための、式（I）：
【０００９】
【化５】
2005519056.tif 000002
【００１０】
［式中、
Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ3は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、−ＣＯＲ7（ここで、Ｒ7は、水素又はアルキルである）を表すか、又は、水素、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択される１つ又は２つの置換基で場合により置換されているフェニルを表し；
Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ6は、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアルキル置換ヘテロシクリル、ヘテロアルキル置換シクロアルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、−ＯＲ8、−Ｓ（Ｏ）nＲ8（ここで、ｎは０〜２であり；Ｒ8は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、−ＮＲ9Ｒ10（ここで、Ｒ9は、水素又はアルキルであり、Ｒ10は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、又は、−Ｘ−（アルキレン）−Ｙ−Ｚ｛ここで、Ｘは、共有結合、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ（Ｏ）n1−（ここで、ｎ１は、０〜２である）であり、Ｙは、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ−であり、Ｚは、ヘテロアルキル又はＳｉＲ11Ｒ12Ｒ13（ここで、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、独立して、水素又はアルキルである）である｝であるか、あるいは、Ｒ6とＲ4は互いに隣接している場合には、一緒に、メチレンジオキシ基又はエチレンジオキシ基を形成している］
で表される３−インドリル−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、骨形成を増加させるためのＧＳＫ−３β阻害剤の使用に関し、その際、該阻害剤は、WO 99/65897(Chiron)、WO 01/20727A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136493A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136489A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136486A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136483A1(Sanofi-Synthelabo)、EP 1136099A1(Sanofi-Synthelabo)、WO 2000/021927(SKB)、WO 2001/049709、WO 2001/056567(Novo Nordisk)、WO 2001/081345、WO 2001/085685、WO 2001/009106(SKB)、WO 2001/52862(Isis)、WO 2001/37819、WO 2001/60374、EP 1106180A1(CNRS)、及び、WO 2000/38675(SKB)に開示されている化合物から選択される。
【００１２】
WO 01/20727A1（Sanofi−Synthelabo）、EP 1136493A1（Sanofi−Synthelabo）、EP 1136489A1（Sanofi−Synthelabo）、EP 1136486A1（Sanofi−Synthelabo）、EP 1136483A1（Sanofi−Synthelabo）、及び、EP 1136099A1（Sanofi−Synthelabo）は、様々なピリミジン−４（１Ｈ）−オン誘導体を開示している。WO 2001/37819は、インジルビン（indirubine）誘導体を開示している。WO 2001/60374は、パウロン（paullone）誘導体を開示している。EP 1106180A1は、ヒメニアルジシン（hymenialdisine）誘導体を開示している。
【００１３】
本明細書及び特許請求の範囲において式（I）の化合物の記載に関連して用いられている下記用語は、以下に与えられている意味を有する。
【００１４】
「アルキル」は、１〜６個の炭素原子からなる飽和一価直鎖炭化水素ラジカル、又は、３〜６個の炭素原子からなる飽和一価分枝鎖炭化水素ラジカル、例えば、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、tert−ブチル及びペンチルなどを意味する。
【００１５】
「アルキレン」は、１〜６個の炭素原子からなる飽和二価直鎖炭化水素ラジカル、又は、３〜６個の炭素原子からなる飽和二価分枝鎖炭化水素ラジカル、例えば、メチレン、エチレン、２，２−ジメチルエチレン、プロピレン、２−メチルプロピレン、ブチレン及びペンチレンなどを意味する。
【００１６】
「アルコキシ」は、ラジカル−ＯＲ（ここで、Ｒは、上記で定義されているとおりのアルキルである）、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びブトキシなどを意味する。
【００１７】
「アルキルチオ」は、ラジカル−ＳＲ（ここで、Ｒは、上記で定義されているとおりのアルキルである）、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ及びブチルチオなどを意味する。
【００１８】
「アシル」は、ラジカル−Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここで、Ｒは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニル又はフェニルアルキルであり、その際、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル及びフェニルアルキルは本明細書で定義されているとおりである。代表的な例としては、限定するものではないが、ホルミル、アセチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチルカルボニル、ベンゾイル及びベンジルカルボニルなどを挙げることができる。
【００１９】
「アシルアミノ」は、ラジカル−ＮＲ′Ｃ（Ｏ）Ｒを意味し、ここで、Ｒ′は、水素又はアルキルであり、Ｒは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニル又はフェニルアルキルであり、その際、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル及びフェニルアルキルは本明細書で定義されているとおりである。代表的な例としては、限定するものではないが、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、シクロヘキシルカルボニルアミノ、シクロヘキシルメチル−カルボニルアミノ、ベンゾイルアミノ及びベンジルカルボニルアミノなどを挙げることができる。
【００２０】
「シクロアルキル」は、３〜７個の環炭素からなる飽和一価環状炭化水素ラジカル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル及び４−メチルシクロヘキシルなどを意味する。
【００２１】
「シクロアルキルアルキル」は、ラジカル−ＲaＲb（ここで、Ｒaは本明細書で定義されているとおりのアルキレン基であり、Ｒbは、シクロアルキル基である）、例えば、シクロヘキシルメチルなどを意味する。
【００２２】
「ジアルキルアミノ」は、ラジカル−ＮＲＲ′を意味し、ここで、Ｒ及びＲ′は独立して、本明細書で定義されているとおりのアルキル基、シクロアルキル基又はシクロアルキルアルキル基を表す。代表的な例としては、限定するものではないが、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジ（１−メチルエチル）アミノ、（シクロヘキシル）（メチル）アミノ、（シクロヘキシル）（エチル）アミノ、（シクロヘキシル）（プロピル）アミノ、（シクロヘキシルメチル）（メチル）アミノ及び（シクロヘキシルメチル）（エチル）アミノなどを挙げることができる。
【００２３】
「ＧＳＫ−３β阻害剤」又は「ＧＳＫ−３βの阻害剤」は、本明細書の生物学的実施例１に記載されているインビトロＧＳＫ−３βアッセイにより測定した場合、ＧＳＫ−３βに対して、１００nM未満のＩＣ50、好ましくは、５０nM未満のＩＣ50、最も好ましくは、１０nM未満のＩＣ50を有する化合物を意味する。好ましくは、ＧＳＫ−３β阻害剤は、１０００ダルトン未満の分子量を有する有機分子である。別のキナーゼ類、例えば、ＰＫＣ、ｃｄｋｌ、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４及びｃ−ＳＲＣなどと比べて、ＧＳＫ−３βに対して選択性を示すＧＳＫ−３β阻害剤が特に有用である。
【００２４】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味し、好ましくは、フルオロ及びクロロを意味する。
【００２５】
「ハロアルキル」は、１個以上の同一であるか又は異なっているハロ原子で置換されているアルキル、例えば、−ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＦ3、−ＣＨ2ＣＦ3及び−ＣＨ2ＣＣｌ3などを意味する。
【００２６】
「ヘテロアルキル」は、１個、２個又は３個の水素原子が、−ＯＲa、−ＮＲbＲC及び−Ｓ（Ｏ）nＲd（ここで、ｎは０〜２の整数である）からなる群から独立して選択される置換基で置き換えられている、本明細書で定義されているアルキルラジカルを意味し、その際、該ヘテロアルキルラジカルの結合点は炭素原子を介しており、また、Ｒaは、水素、アシル、アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルであり；Ｒb及びＲcは互いに独立して、水素、アシル、アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルであり；ｎが０である場合、Ｒdは、水素、アルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキルであり、ｎが１又は２である場合、Ｒdは、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノであると理解される。代表的な例としては、限定するものではないが、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル、２，３−ジヒドロキシプロピル、１−ヒドロキシメチルエチル、３−ヒドロキシブチル、２，３−ジヒドロキシブチル、２−ヒドロキシ−１−メチルプロピル、２−アミノエチル、３−アミノプロピル、２−メチルスルホニルエチル、アミノスルホニルメチル、アミノスルホニルエチル、アミノスルホニルプロピル、メチルアミノスルホニルメチル、メチルアミノスルホニルエチル及びメチルアミノスルホニルプロピルなどを挙げることができる。
【００２７】
「ヒドロキシアルキル」は、１つ以上、好ましくは、１つ、２つ又は３つのヒドロキシ基で置換されている、本明細書で定義されているアルキルラジカルを意味するが、但し、同一の炭素原子は、２つ以上のヒドロキシ基を有することはできない。代表的な例としては、限定するものではないが、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル、１−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピル、２−ヒドロキシブチル、３−ヒドロキシブチル、４−ヒドロキシブチル、２，３−ジヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル、２，３−ジヒドロキシブチル、３，４−ジヒドロキシブチル及び２−（ヒドロキシメチル）−３−ヒドロキシプロピルなどを挙げることができ、好ましくは、２−ヒドロキシエチル、２，３−ジヒドロキシプロピル及び１−（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチルなどを挙げることができる。したがって、本明細書において使用される場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、ヘテロアルキル基の一サブセットを定義するために使用される。
【００２８】
「ヘテロ置換シクロアルキル」は、シクロアルキルラジカル内の１個、２個又は３個の水素原子が、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ又は−Ｓ（Ｏ）nＲ（ここで、ｎは０〜２の整数である）からなる群から独立して選択される置換基で置き換えられている、本明細書で定義されているシクロアルキルラジカルを意味し、ここで、ｎが０である場合、Ｒは、水素、アルキル、シクロアルキル、又はシクロアルキルアルキルであり、ｎが１又は２である場合、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノである。代表的な例としては、限定するものではないが、２−、３−若しくは４−ヒドロキシシクロヘキシル、２−、３−若しくは４−アミノシクロヘキシル、及び、２−、３−若しくは４−スルホンアミドシクロヘキシルなどを挙げることができ、好ましくは、４−ヒドロキシシクロヘキシル、３−アミノシクロヘキシル及び４−スルホンアミドシクロヘキシルなどを挙げることができる。
【００２９】
「ヘテロアルキル置換シクロアルキル」は、シクロアルキルラジカル内の１個、２個又は３個の水素原子がヘテロアルキル基で置き換えられている、本明細書で定義されているシクロアルキルラジカルを意味し、その際、該ヘテロアルキルラジカルは、炭素−炭素結合を介してシクロアルキルラジカルに結合していると理解される。代表的な例としては、限定するものではないが、１−ヒドロキシメチルシクロペンチル及び２−ヒドロキシメチルシクロヘキシルなどを挙げることができる。
【００３０】
「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ又はＳから選択される１個、２個又は３個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子はＣである少なくとも１つの芳香環を有する５〜１２の環原子からなる一価の単環式又は二環式ラジカルを意味し、その際、該ヘテロアリールラジカルの結合点は芳香環上に存在すると理解される。該ヘテロアリール環は、場合により、アルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロ、ニトロ及びシアノから選択される１つ以上の置換基、好ましくは、１つ又は２つの置換基で独立して置換されている。より特定的には、用語「ヘテロアリール」には、限定するものではないが、ピリジル、フラニル、チエニル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピロリル、ピラゾリル、ピリミジニル、ベンゾフラニル、テトラヒドロベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンズオキサゾリル、キノリル、テトラヒドロキノリニル、イソキノリル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル又はベンゾチエニル及びそれらの誘導体などが包含される。
【００３１】
「ヘテロアラルキル」は、ラジカル−ＲaＲb（ここで、Ｒaは本明細書で定義されているアルキレン基であり、Ｒbはヘテロアリール基である）、例えば、ピリジン−３−イルメチル、イミダゾリルエチル、ピリジニルエチル及び３−（ベンゾフラン−２−イル）プロピルなどを意味する。
【００３２】
「ヘテロシクリル」は、１個又は２個の環原子が、ＮＲ（ここで、Ｒは、独立して、水素、アルキル又はヘテロアルキルである）、Ｏ又はＳ（Ｏ）n（ここで、ｎは０〜２の整数である）から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子はＣ（ここで、１個又は２個のＣ原子は、場合により、カルボニル基で置き換えられていてもよい）である、５〜８個の環原子からなる飽和環状ラジカルを意味する。該ヘテロシクリル環は、場合により、アルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ及び−ＣＯＲ（ここで、Ｒはアルキルである）から選択される１つ、２つ又は３つの置換基で独立して置換されていてもよい。より特定的には、用語「ヘテロシクリル」には、限定するものではないが、テトラヒドロピラニル、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン、ピペリジノ、Ｎ−メチルピペリジン−３−イル、ピペラジノ、Ｎ−メチルピロリジン−３−イル、３−ピロリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオモルホリノ−１−オキシド、チオモルホリノ−１，１−ジオキシド、ピロリニル、イミダゾリニル及びそれらの誘導体などが包含される。
【００３３】
「ヘテロアルキル置換ヘテロシクリル」は、ヘテロシクリルラジカル内の１個、２個又は３個の水素原子がヘテロアルキル基で置き換えられている、本明細書で定義されているヘテロシクリルラジカルを意味し、その際、該ヘテロアルキルラジカルは、炭素−炭素結合を介してヘテロシクリルラジカルに結合していると理解される。代表的な例としては、限定するものではないが、４−ヒドロキシメチルピペリジン−１−イル、４−ヒドロキシメチルピペラジン−１−イル、４−ヒドロキシエチルピペリジン−１−イル及び４−ヒドロキシエチルピペラジン−１−イルなどを挙げることができる。
【００３４】
「ヘテロシクリルアルキル」、「シクロアルキルアルキル」又は「フェニルアルキル」は、ラジカル−ＲaＲb（ここで、Ｒaは本明細書で定義されているアルキレン基であり、Ｒbは、フェニル又はヘテロシクリル又はシクロアルキル基である）、例えば、テトラヒドロピラン−２−イルメチル、４−メチルピペラジン−１−イルエチル、３−ピペリジニルメチル、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イルメチル、ベンジル及びシクロヘキシルメチルなどを意味する。
【００３５】
「モノアルキルアミノ」は、ラジカル−ＮＨＲ（ここで、Ｒは、上記で定義されているアルキル、シクロアルキル又はシクロアルキルアルキル基である）、例えば、メチルアミノ、（１−メチルエチル）アミノ、シクロヘキシルアミノ、シクロヘキシルメチルアミノ及びシクロヘキシルエチルアミノなどを意味する。
【００３６】
「場合による（optional）」又は「場合により（optionally）」は、その後に続いて記載されている事象又は状況が、起こる必要はないが、起こってもよいことを意味し、そのような記載には該事象又は状況が起こる場合と起こらない場合が包含されることを意味する。例えば、「場合によりアルキル基で一置換又は二置換されているヘテロ環基」は、該アルキル基が存在する必要はないが、存在していてもよいことを意味し、そのような記載には、該ヘテロ環基がアルキル基で一置換又は二置換されている状況と該ヘテロ環基がアルキル基で置換されていない状況が包含される。
【００３７】
「フェニルアルキル」は、ラジカル−ＲaＲb（ここで、Ｒaは本明細書で定義されているアルキレン基であり、Ｒbはフェニル基である）、例えば、ベンジルなどを意味する。
【００３８】
「ヒドロキシ又はアミノ保護基」は、合成手法中に望ましくない反応に対して酸素原子及び窒素原子を保護することを目的とする有機基を意味する。適する酸素及び窒素保護基は当技術分野ではよく知られており、例えば、トリメチルシリル、ジメチル−tert−ブチルシリル、ベンジル、ベンジルオキシ−カルボニル（ＣＢＺ）、tert−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリフルオロアセチル及び２−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ）などである。他の保護基は、T.W. Greene and G.M. Wutsによる書籍 Protecting Groups in Organic Synthesis，Second Edition，Wiley，New York，1991 及びその中で引用されている参考文献中に見いだすことができる。
【００３９】
同一の分子式を有するが、それらの原子の結合の性質若しくは順序が異なるか、又は、それらの原子の空間における配置が異なっている化合物は、「異性体」と称される。それらの原子の空間における配置が異なっている異性体は、「立体異性体」と称される。互いに鏡像ではない立体異性体は「ジアステレオマー」と称され、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は「エナンチオマー」と称される。ある化合物が不斉中心（例えば、それは、４つの異なった基に結合している）を有する場合、１対のエナンチオマーが存在し得る。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置によって特徴付けることができ、カーンとプレローグのＲ−及びＳ−順位則によって記載するか、又は、該分子が偏光面を回転させる形式によって記載して、右旋性又は左旋性（即ち、それぞれ、（＋）−異性体、又は、（−）−異性体として）表す。キラル化合物は、個々のエナンチオマーとして存在し得るか又はそれらの混合物として存在し得る。エナンチオマーを等しい割合で含んでいる混合物を「ラセミ混合物」と称する。
【００４０】
式（I）の化合物は、１つ以上の不斉中心を有し得る。したがって、そのような化合物は、個々の（Ｒ）−又は（Ｓ）−立体異性体として生成されるか又はそれらの混合物として生成される。例えば、式（I）の化合物のＲ6置換基が２−ヒドロキシエチルである場合、該ヒドロキシ基が結合している炭素は不斉中心であり、したがって、式（I）の該化合物は、（Ｒ）−立体異性体又は（Ｓ）−立体異性体として存在し得る。特に示されていない限り、本明細書及び特許請求の範囲における特定の化合物の記載又は命名は、その個々のエナンチオマーとその混合物（ラセミ混合物又は別の混合物）の両方を包含することが意図されている。立体化学の確認方法及び立体異性体の分離方法は、当技術分野ではよく知られている（"Advanced Organic Chemistry"，4th edition J. March，John Wiley and Sons，New York，1992 の Chapter 4 における解説を参照されたい）。
【００４１】
「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全で非毒性であり、かつ、生物学的にもその他の点でも有害ではない医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、獣医学的な用途について許容される賦形剤とヒトの医薬的用途についての賦形剤を包含する。本明細書及び特許請求の範囲で用いられる「薬学的に許容される賦形剤」は、そのような賦形剤の１つ及び２つ以上の両方を包含する。
【００４２】
ある化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ、親化合物の望ましい薬理学的な活性を有している塩を意味する。そのような塩には、以下のものが包含される：
（1）  塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸及びリン酸などの無機酸を用いて形成される酸付加塩、又は、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、tert−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸及びムコン酸などの有機酸を用いて形成される酸付加塩；又は、
（2）  親化合物内に存在している酸性プロトンが金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属又はアルミニウムイオン）で置き換えられるときに形成される塩、又は、親化合物内に存在している酸性プロトンがエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン及びＮ−メチルグルカミンなどの有機塩基と配位するときに形成される塩。
【００４３】
式（I）の化合物はプロドラッグとして作用し得る。プロドラッグは、哺乳動物患者に投与されたときに、生体内で式（I）の活性親薬物を遊離する任意の化合物を意味する。式（I）の化合物のプロドラッグは、式（I）の化合物内に存在している官能基を化学修飾することによって調製するが、その際、該化学修飾は、生体内で切断されて親化合物を遊離し得るようなものである。プロドラッグには、化合物（I）内のヒドロキシ基、アミノ基又はスルフヒドリル基が、生体内で切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基又は遊離スルフヒドリル基を再生し得る任意の基に結合している式（I）の化合物が包含される。プロドラッグの例としては、限定するものではないが、式（I）の化合物内のヒドロキシ官能基のエステル類（例えば、酢酸エステル誘導体、ギ酸エステル誘導体及び安息香酸エステル誘導体）及びカルバメート類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニル）などを挙げることができる。
【００４４】
疾患の「処置する（treating）」又は「処置（treatment）」は、以下のものを包含する：
（1）  該疾患を予防すること、即ち、該疾患に晒され得るか又は該疾患にかかりやすいが、まだ、該疾患を経験していないか又は該疾患の症状が現れていない哺乳動物において、該疾患の臨床症状が発現しないようにすること；
（2）  該疾患を抑制すること、即ち、該疾患又はその臨床症状の発現を阻止するか又は発現の程度を弱めること；
又は、
（3）  該疾患を緩和すること、即ち、該疾患又はその臨床症状を軽減すること。
【００４５】
「治療有効量」は、疾患を処置する目的で哺乳動物に投与された場合、該疾患の処置を達成するのに充分な化合物の量を意味する。「治療有効量」は、該化合物、該疾患及びその重症度、並びに、処置される哺乳動物の年齢及び体重などに依存して変わる。
【００４６】
命名法
式（I）の化合物の命名及び番号付けについて、以下で説明する。
【００４７】
【化６】
2005519056.tif 000003
【００４８】
本出願で用いられている命名法は、概して、ＩＵＰＡＣ推奨に基づいている。ＩＵＰＡＣ推奨を厳守すると、単一の置換基のみが変更された場合に実質的に名称が変更されることとなるので、該分子の基本的な構造についての命名法の一貫性が維持されるように化合物を命名した。
【００４９】
例えば、式（I）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5が水素であり、Ｒ3がメチルであり、Ｒ6が該フェニル環とピロール−２，５−ジオン環を結合している炭素に対してメタ位にある２−ヒドロキシエチルアミノである］の化合物は、３−（１−メチルインドリル）−４−［３−（２−ヒドロキシエチルアミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンと命名される。
【００５０】
式（I）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5が水素であり、Ｒ3がメチルであり、Ｒ6が該フェニル環とピロール−２，５−ジオン環を結合している炭素に対してパラ位にある２−ヒドロキシエチルアミノである］の化合物は、３−（１−メチルインドリル）−４−［４−（２−ヒドロキシエチルアミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンと命名される。
【００５１】
式（I）の好ましい化合物は、以下のものから選択される。
I．式（I）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5＝水素、Ｒ3＝メチル、並びに、Ｒ6は下記で定義されているとおりである］の化合物：
【００５２】
【化７】
2005519056.tif 000004
【００５３】
II．本発明のさらに好ましい化合物は、式（I）［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5＝水素、Ｒ3＝メチル、並びに、Ｒ6は下記で定義されているとおりである］の化合物である：
【００５４】
【化８】
2005519056.tif 000005
2005519056.tif 000006
2005519056.tif 000007
【００５５】
III．式（I）のさらに好ましい化合物は、式中のＲ2、Ｒ4及びＲ5＝水素、Ｒ1、Ｒ3及びＲ6は下記で定義されているとおりである化合物である：
【００５６】
【化９】
2005519056.tif 000008
2005519056.tif 000009
【００５７】
IV．さらにまた、式（I）の好ましい化合物は、式中のＲ1、Ｒ2、Ｒ4及びＲ5＝水素、Ｒ3＝メチル、並びに、Ｒ6は下記で定義されているとおりである化合物である：
【００５８】
【化１０】
2005519056.tif 000010
【００５９】
V．式（I）のさらに好ましい化合物は、式中のＲ4〜Ｒ6の１つのみが水素である化合物であり、以下のものから選択される：
３−（１−メチル−インドール−３−イル）−４−{３−（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシル）−２−メチルフェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−インドール−３−イル）−４−{３−（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−プロポキシル）−２−ニトロフェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
及び、
３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−［５−（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ）−２−ニトロフェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン。
【００６０】
式（I）の化合物は、２００１年７月２７日に出願された同時継続している米国特許出願出願番号第09/916，706号に記載されている方法により調製する。前記特許は参照により本明細書に組み入れる。
【００６１】
本明細書に記載されている方法において有用な別の化合物には、Ｎ6−{２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル}−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン塩酸塩などがあり、これは、WO 99/65897 の記載に準じて調製される。
【００６２】
特に好ましいのは、前記で記載した使用又は処置方法であって、ＧＳＫ−３β阻害剤が以下のものから選択される該使用及び該治療方法である：
（a）  式
【００６３】
【化１１】
2005519056.tif 000011
【００６４】
［式中、Ｒ6は２（Ｒ）３−ジヒドロキシプロポキシである］で表される化合物；
（b）  式
【００６５】
【化１２】
2005519056.tif 000012
【００６６】
［式中、Ｒ6は２，３−ジヒドロキシ−プロピルアミノである］で表される化合物；
（c）  式
【００６７】
【化１３】
2005519056.tif 000013
【００６８】
［式中、Ｒ1はフルオロであり、Ｒ3はメチルであり、Ｒ6は３−アミノプロピルオキシである］で表される化合物；
及び、
（d）  Ｎ6−{２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル}−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン。
【００６９】
好ましいのは、哺乳動物における骨形成を増加させるための医薬を調製するためのＧＳＫ−３β阻害剤の使用である。
【００７０】
さらに好ましいのは、該医薬が哺乳動物における骨ミネラル密度を増大させる、前記使用である。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様は、該医薬が哺乳動物における骨折の発生率を低下させる、前記使用である。
【００７２】
さらにまた、好ましいのは、該医薬が哺乳動物における骨折治癒を増強する、前記使用である。
【００７３】
さらに好ましいのは、哺乳動物における骨粗鬆症を予防及び処置するための医薬を調製するための、ＧＳＫ−３β阻害剤の前記使用である。
【００７４】
さらにまた、好ましいのは、哺乳動物に有効量のＧＳＫ−３β阻害剤を投与することによる、該哺乳動物における骨粗鬆症を処置又は予防する方法である。
【００７５】
特に好ましいのは、該哺乳動物がヒトである、前記使用又は方法である。
【００７６】
極めて好ましいのは、該哺乳動物が雌である、前記使用又は方法である。
【００７７】
好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤が式（I）：
【００７８】
【化１４】
2005519056.tif 000014
【００７９】
［式中、
Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ3は、水素、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、−ＣＯＲ7（ここで、Ｒ7は、水素又はアルキルである）を表すか、又は、水素、アルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群から独立して選択される１つ又は２つの置換基で場合により置換されているフェニルを表し；
Ｒ4及びＲ5は、独立して、水素、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アルキルチオ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アシルアミノ、モノアルキルアミノ又はジアルキルアミノを表し；
Ｒ6は、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアルキル置換ヘテロシクリル、ヘテロアルキル置換シクロアルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、−ＯＲ8、−Ｓ（Ｏ）nＲ8（ここで、ｎは０〜２であり；Ｒ8は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、−ＮＲ9Ｒ10（ここで、Ｒ9は、水素又はアルキルであり、Ｒ10は、ヘテロアルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロ置換シクロアルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルである）、又は、−Ｘ−（アルキレン）−Ｙ−Ｚ｛ここで、Ｘは、共有結合、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ（Ｏ）n1−（ここで、ｎ１は、０〜２である）であり、Ｙは、−Ｏ−、−ＮＨ−又は−Ｓ−であり、Ｚは、ヘテロアルキル又はＳｉＲ11Ｒ12Ｒ13（ここで、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、独立して、水素又はアルキルである）である｝であるか、あるいは、Ｒ6とＲ4は互いに隣接している場合には、一緒に、メチレンジオキシ基又はエチレンジオキシ基を形成している］で表される化合物又はその薬学的に許容される塩である、前記使用又は方法である。
【００８０】
特に好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤が以下のものから選択される、前記使用又は方法である：
（a）  式
【００８１】
【化１５】
2005519056.tif 000015
【００８２】
［式中、Ｒ6は２（Ｒ）３−ジヒドロキシプロポキシである］で表される化合物；
（b）  式
【００８３】
【化１６】
2005519056.tif 000016
【００８４】
［式中、Ｒ6は２，３−ジヒドロキシ−プロピルアミノである］で表される化合物；
（c）  式
【００８５】
【化１７】
2005519056.tif 000017
【００８６】
［式中、Ｒ1はフルオロであり、Ｒ3はメチルであり、Ｒ6は３−アミノプロピルオキシである］で表される化合物；
及び、
（d）  Ｎ6−{２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル}−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン。
【００８７】
さらに好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤が経口的に配送される、前記使用又は方法である。
【００８８】
本発明の別の好ましい態様は、該ＧＳＫ−３β阻害剤で処置した後、抗吸収剤で処置する、前記使用又は方法である。
【００８９】
さらにまた、好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤がＧＳＫ−３βに対して５０nM未満のＩＣ50を有する、前記使用又は方法である。
【００９０】
特に好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤がＧＳＫ−３βに対して１０nM未満のＩＣ50を有する、前記使用又は方法である。
【００９１】
さらに好ましいのは、該ＧＳＫ−３β阻害剤が１０００ダルトン未満の分子量を有する、前記使用又は方法である。
【００９２】
有用性、試験及び投与
有用性
本出願人は、意外にも、ＧＳＫ−３β阻害剤であるという共通の特徴を共有する構造的に異なった様々な化合物が骨形成を増加させるのに有効であることを見いだした。したがって、本明細書に開示されている方法によって、骨ミネラル密度を増大させるための治療、新しい骨を形成させるための治療、骨折治癒の速度を増大させるための治療、骨の機械的特性を改善する（即ち、皮質骨及び骨梁骨を形成させる）ための治療、並びに、骨粗鬆症、医原性骨粗鬆症、高齢者の骨粗鬆症及び関連する骨代謝性疾患を処置するための処置が提供される。
【００９３】
ＧＳＫ−３β阻害剤を用いた処置は、コルチコステロイドでの処置（例えば、喘息の治療）に伴う骨粗鬆症や化学療法に伴う骨粗鬆症を包含するＩ型（閉経後）骨粗鬆症、II型（医原性）骨粗鬆症及びIII型（高齢者）骨粗鬆症の処置において有用であり、また、腎臓透析に起因する骨形成異常症及び副甲状腺機能亢進症の処置において有用である。本明細書に記載されているＧＳＫ−３β阻害剤を用いた処置により骨ミネラル密度が増大し、従来の治療とは異なって、骨の質が良くなる。したがって、本明細書に記載されている処置によって、骨折の発生率が低下し得、また、既に存在している骨折の治癒速度が速くなり得る。そのような処置は、該処置を受けなければ骨折する率が増大するリスクを有するであろうエストロゲンが分泌されなくなった患者（例えば、年配の女性）にとって特に有用である。処置可能な骨折のタイプには、外傷性骨折及び骨粗鬆症による骨折の両方が包含され、例えば、腰、大腿骨の頚部、手首、椎骨、背骨、肋骨、胸骨、喉頭及び気管、橈骨／尺骨、頸骨、膝蓋骨、鎖骨、骨盤、上腕骨、下肢、指及びつま先、顔並びに足首の骨折などがある。
【００９４】
試験
ＧＳＫ−３βを阻害する化合物は、下記生物学的実施例１及び２において詳述してあるリガンド結合アッセイ及びβ−カテニン分解阻害アッセイなどのインビトロアッセイにより同定することができる。
【００９５】
投与及び医薬組成物
一般に、該ＧＳＫ−３β阻害剤は、治療に有効な量で、骨形成を増加させるために使用される薬物を投与するのに許容されるいずれかの方法で投与する。該阻害剤の実際の量は、多くの要因、例えば、処置しようとする疾患の重症度、被験者の年齢及び相対的な健康状態、用いる化合物の効能、投与経路及び投与形態、並びに他の要因などに依存する。該阻害剤は、１日当たり１回以上投与することができ、好ましくは、１日当たり１回又は２回投与する。
【００９６】
ＧＳＫ−３β阻害剤の治療に有効な量は、１日当たり、レシピエントの体重１kg当たり、約１〜５０mgの範囲であることができ；好ましくは、約３mg／kg／日である。したがって、７０kgのヒトへの投与については、用量範囲は、約７０〜３５００mg／日、最も好ましくは、１日当たり約２００mgである。
【００９７】
一般に、該ＧＳＫ−３β阻害剤は、医薬組成物として、以下の経路のいずれか１つにより投与する：経口投与、全身投与（例えば、経皮投与、鼻腔内投与、又は、坐剤による投与）、又は、非経口投与（例えば、筋肉内投与、静脈内投与、又は、皮下投与）。好ましい投与方法は、苦痛の程度に応じて調節することが可能な都合の良い毎日の投与計画を用いる経口投与である。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体剤、散剤、徐放性製剤、溶液剤、懸濁液剤、エリキシル剤、エーロゾル剤、又は、別の任意の適切な組成物の形態であることができる。
【００９８】
本発明の関連する態様は、骨形成を増加させるための、ＧＳＫ−３β阻害剤と、ビスホスホネート類、エストロゲン、ＳＥＲＭＳ（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）、カルシトニン類又は同化療法（anabolic therapy）などの別の活性薬物との組合せ療法に関する。ビスホスホネート類の例としては、アレンドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、エチドロネート及びリセドロネートなどを挙げることができる。ＳＥＲＭＳの例としては、ラロキシフェン、ジヒドロラロキシフェン及びラソホキシフェンなどを挙げることができる。カルシトニン類としては、ヒトカルシトニン及びサケカルシトニンなどを挙げることができる。同化剤としては、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、例えば、ｈＰＴＨ（１−３４）、ＰＴＨ（１−８４）、及び、副甲状腺ホルモン−関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）とそれらの類似体などを挙げることが得きる。ＰＴＨｒＰの特定の類似体は、"Mono− and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein. 1. Synthesis and Biological Studies，" Michael Chorevら，Biochemistry，36： 3293−3299(1997) 及び "Cyclic analogs of PTH and PTHrP，" WO 96/40193、及び、米国特許第5，589，452号、及び、WO 97/07815 に記載されている。該別の活性薬物は、ＧＳＫ−３β阻害剤と同時に、ＧＳＫ−３β阻害剤に先だって、又は、ＧＳＫ−３β阻害剤の後で投与することができ、異なった送達方法で投与してもよい。好ましくは、該ＧＳＫ−３β阻害剤を最初に投与する。この投与の期間はどのような長さであっても良いが、典型的には、６ヶ月〜２４ヶ月の範囲である。この処置を行った後、抗吸収剤（antiresorptive agent）、例えば、ビスホスホネート、ＳＥＲＭ、カルシトニンを用いた治療又はホルモン補充療法を施す。
【００９９】
最近、生物学的利用能は、表面積を増大させることにより、即ち、粒径を小さくすることにより増大させることが可能であるという原理に基づいて、特に生物学的利用能に乏しい薬物について、医薬製剤が開発されてきた。例えば、米国特許第4,107,288号には、１０〜１０００nmの範囲の寸法を有し、活性物質が巨大分子の架橋マトリックス上に支持されている粒子を有する医薬製剤が記載されている。米国特許第5,145,684号には、医薬製剤の製造方法が記載されており、該製造では、表面調節剤（surface modifier）の存在下で薬物物質をナノ粒子（平均粒径４００nm）に粉砕し、次いで、液体媒体中に分散させて、極めて高い生物学的利用能を示す医薬製剤を得る。
【０１００】
ＧＳＫ−３β阻害剤の医薬組成物は、通常、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含有する。許容される賦形剤は非毒性であり、投与を助成し、該阻害剤の治療上の利益に悪影響を与えない。そのような賦形剤は、当業者が一般に利用可能な、任意の固体、液体、半固体であることができるか、又は、エーロゾル組成物の場合は、ガス状の賦形剤であることができる。
【０１０１】
固体の製薬用賦形剤としては、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム及び脱脂粉乳などを挙げることができる。液体賦形剤及び半固体賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、並びに、石油、動物油、植物油又は合成油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油及びゴマ油などを包含する様々な油から選択することができる。好ましい液体担体としては、特に、注射可能溶液剤用として、水、生理食塩水、水性デキストロース及びグリコール類などを挙げることができる。
【０１０２】
Pharmaceutical Sciences，edited by E.W. Martin （Mack Publishing Company，18th ed.，1990）。
【０１０３】
製剤中の該化合物の量は、当業者が採用する全範囲の範囲内で様々に変えることができる。典型的には、該製剤は、重量パーセント（重量％）基準で、製剤総量に基づいて約０．０１〜９９．９９重量％のＧＳＫ−３β阻害剤を含有し、残余は１つ以上の適する製薬用賦形剤である。好ましくは、該化合物は、約１〜８０重量％のレベルで存在する。
【実施例】
【０１０４】
以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解するのを容易にし且つ実施するのを可能とするために与えられている。それらは、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではなく、単に本発明を例証し代表するものであると見なされるべきである。
【０１０５】
該実施例で用いられている略語は以下のとおりに定義される：「ＨＣｌ」は塩酸であり、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドであり、「ＮａＯＨ」は水酸化ナトリウムであり、「ＫＯＨ」は水酸化カリウムであり、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドであり、「ＮａＨＣＯ3」は重炭酸ナトリウムであり、「ＮａＣｌ」は塩化ナトリウムであり、「Ｋ2ＣＯ3」は炭酸カリウムであり、「Ｎａ2ＣＯ3」は炭酸ナトリウムであり、「ＬｉＯＨ」は水酸化リチウムであり、「Ｅｔ3Ｎ」はトリエチルアミンであり、「ＮＨ3（aq）」は水酸化アンモニウムであり、「ＣＨ2Ｃｌ2」は塩化メチレンであり、「ＭｅＯＨ」はメタノールであり、「ＥｔＯＨ」はエタノールであり、「Ｐｈ3Ｐ」はトリフェニルホスフィンであり、「ＣｓＣＯ3」は炭酸セシウムであり、「ＢＩＮＡＰ」は２，２−ビス−（ジフェニルホスフィノ）−１，１′−ビナフチルであり、「Ｐｄ2（ｄｂａ）3」はトリス（ジベンジリデンアセトン）−ジパラジウムであり、「ＮａＣＮＢＨ3」はシアノホウ水素化ナトリウムであり、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランであり、「Ｎａ2ＳＯ4」は硫酸ナトリウムであり、「ＲＴ」は室温であり、「ＰＴＬＣ」は分取薄層クロマトグラフィーであり、「ＳｉＯ2」はシリカゲルであり、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルであり、「ＡＰＭＡ」はアミノフェニル−酢酸第二水銀であり、「ＩＬ−１」はインターロイキン−１であり、及び、「ＲＰＭＩ」はRoswell Park Memorial Instituteである。
【０１０６】
合成実施例
実施例１〜実施例３は式（I）で表される特定の化合物の調製方法を示している。
【０１０７】
実施例１
３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−［３−（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシプロピルアミノ）フェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンの合成
【０１０８】
【化１８】
2005519056.tif 000018
【０１０９】
ステップ１
３−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）プロパノール（２g，０．０１mmol）、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド（１．７６g）及び４Åモレキュラシーブを含有する塩化メチレン（２０mL）とアセトニトリル（２mL）の混合物に、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム（０．１８g，５，３mmol）を添加した。その反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、シリカゲルのパッドで濾過した。濾液を減圧下に濃縮して、３−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）プロピオンアルデヒド（１．３g，６６％）を得た。
【０１１０】
ステップ２
ＣＨ2Ｃｌ2（１０mL）とＭｅＯＨ（５mL）中の３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（０．２g，６mmol）と３−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）プロピオンアルデヒド（０．２５g，１３mmol）の混合物を室温で１５分間撹拌し、次いで、ＮａＣＮＢＨ3（５７mg，１．５当量）を添加した。得られた反応混合物を室温で一晩撹拌した後、減圧下に濃縮した。残渣を分取ＴＬＣで精製して、３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−［３−（３−tert−ブチルジメチルシリルオキシプロピルアミノ）フェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン９８mg（３２％）を得た。
ＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：（Ｍ＋Ｈ）+４９０，ＭＰ：５８〜６５℃。
【０１１１】
３−（tert−ブチルジメチル−シリルオキシ）プロパノールを２−（tert−ブチルジフェニルシリルオキシ）エタノールで置き換えた以外は、実施例１において記載した手法により、３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−［３−（３−tert−ブチルジフェニルシリルオキシ−エチルアミノ）フェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを得た。
【０１１２】
実施例２
３−（ｌ−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−{３−［（ＲＳ）−２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ］フェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンの合成
【０１１３】
【化１９】
2005519056.tif 000019
【０１１４】
ステップ１
乾燥ＤＭＦ（４０mL）中の５−クロロインドール（４．９７g）の室温の溶液に、水酸化カリウムペレット（２．７６g）を添加し、固体の大半が溶解するまで１時間撹拌した。得られた混合物を氷浴中で０℃に冷却し、ヨードメタン（２．４５mL）を滴下して加え、アルゴン下室温で一晩撹拌した。反応混合物を水に注ぎ入れ、ＥＴＯＡｃで２回抽出した。ＥＴＯＡｃ部分を一緒にして水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、１０％ＥＴＯＡｃ／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーに付して、１−メチル−５−クロロインドール（５．４３g）を桃色の液体として得た。
【０１１５】
ステップ２
１−メチルインドールを１−メチル−５−クロロインドールで置き換えた以外は、実施例１のステップ１において記載した手法により、１−メチル−５−クロロインドール−３−グリオキシリルクロリドを調製した。
【０１１６】
ステップ３
１−メチルインドール−３−グリオキシリルクロリドを１−メチル−５−クロロインドール−３−グリオキシリルクロリドで置き換えた以外は、実施例１のステップ２において記載した手法により、３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンを調製した。
【０１１７】
ステップ４
３−（１−メチルインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンを３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンで置き換えた以外は、実施例１のステップ３において記載した手法により、３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを調製した。
【０１１８】
ステップ５
３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（８６５mg）、炭素担持１０％パラジウム（９０mg）及び氷酢酸（３５mL）の混合物を、バルーン（balloon）を用いて大気圧下で撹拌し、水素化した（２時間）。反応混合物をセライトのパッドで濾過し、０℃に冷却し、ｐＨが８になるまでＫＯＨペレットを添加した。得られた溶液をＥＴＯＡｃで抽出し、乾燥し（硫酸マグネシウム）、及びストリッピングした。得られた粗物質を１０％〜２０％ＥＴＯＡｃ−ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーに付して、３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（４９５mg）を得た。
【０１１９】
ステップ６
メタノール（２５０mL）中の３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（４９２mg）の室温の溶液に、水（１５mL）に溶解させたＤＬ−グリセルアルデヒドダイマーを添加した後、シアノホウ水素化ナトリウム（１１０mg）を添加し、得られた反応混合物をアルゴン下で一晩撹拌した。ＴＬＣにより反応は３０％のみ完了したようであった。追加のダイマー（１５０mg）とシアノホウ水素化物（１００mg）を添加した。さらに６時間後、反応は５０％完了したようであった。溶媒を除去し、粗残渣を、５％〜７％〜１０％ＭｅＯＨ／ジクロロメタンを用いるフラッシュクロマトグラフィーに付した。３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−{３−［（ＲＳ）−２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ］フェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（２２０mg）を暗赤色の固体として得た。
ＭＳ（ＥＩ）：（Ｍ＋Ｈ）+４２６，Ｍ．ｐｔ．２２４．８〜２２６．１℃。
【０１２０】
実施例３
３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−{３−［（ＲＳ）−２，３−ジヒドロキシ−プロピルアミノ］フェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンの合成
【０１２１】
【化２０】
2005519056.tif 000020
【０１２２】
ステップ１
５−クロロインドールを５−フルオロインドールで置き換えた以外は、実施例２のステップ１において記載した手法により、１−メチル−５−フルオロインドールを調製した。
【０１２３】
ステップ２
１−メチル−クロロインドールを１−メチル−５−フルオロインドールで置き換えた以外は、実施例２のステップ２において記載した手法により、１−メチル−５−フルオロインドール−３−グリオキシリルクロリドを調製した。
【０１２４】
ステップ３
１−メチル−５−クロロインドール−３−グリオキシリルクロリドを１−メチル−５−フルオロインドール−３−グリオキシリルクロリドで置き換えた以外は、実施例２のステップ３において記載した手法により、３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンを調製した。
【０１２５】
ステップ４
３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンを３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）フラン−２，５−ジオンで置き換えた以外は、実施例２のステップ３において記載した手法により、３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを調製した。
【０１２６】
ステップ５
１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを３−（１−３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンで置き換えた以外は、実施例２のステップ５において記載した手法により、３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを調製した。
【０１２７】
ステップ６
３−（１−メチル−５−クロロインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−（３−アミノフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンで置き換えた以外は、実施例２のステップ５において記載した手法により、３−（１−メチル−５−フルオロインドール−３−イル）−４−{３−［（ＲＳ）−２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ］フェニル}−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを調製した。
ＭＳ（ＥＩ）（Ｍ＋Ｈ）+４１０，ＭＰ：２２３．２〜２２５℃。
【０１２８】
製剤実施例
以下は、式（I）の化合物を含有する代表的な医薬製剤である。
【０１２９】
実施例１
錠剤
下記成分を充分に混合し、圧縮成型して１本の刻み目が付いた分割錠剤とする。
【０１３０】
成分                                  １錠当たりの量、mg
本発明の化合物                        ４００
トウモロコシデンプン                    ５０
クロスカルメロースナトリウム            ２５
乳糖                                  １２０
ステアリン酸マグネシウム                  ５
【０１３１】
実施例２
カプセル剤
下記成分を充分に混合し、硬質シェルゼラチンカプセルに詰める。
【０１３２】
成分                                  １カプセル当たりの量、mg
本発明の化合物                        ２００
乳糖、噴霧乾燥                        １４８
ステアリン酸マグネシウム                  ２
【０１３３】
実施例３
懸濁製剤
下記成分を混合して経口投与用の懸濁液を形成させる。
【０１３４】
成分                                  量
本発明の化合物                        １．０ｇ
フマル酸                              ０．５ｇ
塩化ナトリウム                        ２．０ｇ
メチルパラベン                        ０．１５ｇ
プロピルパラベン                      ０．０５ｇ
グラニュー糖                        ２５．０ｇ
ソルビトール（７０％溶液）          １３．００ｇ
Veegum K (Vanderbilt Co.)             １．０ｇ
風味料                                ０．０３５mL
着色剤                                ０．５mg
蒸留水                                １００mLにする適量
【０１３５】
実施例４
注射可能製剤
下記成分を混合して注射可能製剤を形成させる。
【０１３６】
成分                                  量
本発明の化合物                        ０．２mg〜２０mg
酢酸ナトリウム緩衝液、０．４Ｍ        ２．０mL
ＨＣｌ（１Ｎ）又はＮａＯＨ（１Ｎ）    適切なｐＨにする適量
水（蒸留、滅菌）                      ２０mLにする適量
【０１３７】
実施例５
坐薬製剤
本発明化合物をＷｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）Ｈ−１５（飽和植物脂肪酸のトリグリセリド； Riches−Nelson，Inc.，New York）と混合することにより、総重量２．５gの坐剤を調製する。調製された坐剤は下記組成を有する。
【０１３８】
本発明の化合物                                ５００mg
Witepsol（登録商標）Ｈ−１５                  残り
【０１３９】
生物学的実施例
実施例１
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３βの阻害 −− インビトロアッセイ
本発明化合物のインビトロにおけるＧＳＫ−３β阻害活性を、端を切り取った（truncated）形態の組換えウサギＧＳＫ−３β酵素を用いて決定した。
【０１４０】
ＧＳＫ−３βの単離
Wang，Q.M.ら、J. Biol. Chem. 269，14566−14574(1994)に記載されている手法に従って、該構築物をｐＧＥＸ−３Ｘベクター中でクローン化した。Ｎ−末端の１０個のアミノ酸を除去して、本質的に活性なＧＳＫ−３βを得た（Murai H.ら，FEBS Lett. 392，153−60，(1996)を参照されたい）。ＧＳＫ−３βは、ＢＬ２１  ＤＥ３細胞で発現させた。該細胞を対数期の中頃に達するまで３７℃で増殖させ、次いで、３０℃で２時間イソプロピル−β−（Ｄ）−チオガラクトピラノシド（最終濃度０．４mM）で誘導した。該細胞をホモジェナイズし、細胞抽出物をグルタチオンセファロース４Ｂカラムに入れた。グルタチオンバッファー（５０mM トリス ｐＨ８ 及び １０mM 還元型グルタチオン）でＧＳＫ−３βを溶離させた。溶出液を３つの小さなフラクションに採集し、１０％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）でＧＳＫ−３β含有量についてアッセイした。２０％ピーク高さを超えるフラクションをプールし、等分し、使用するときまで−８０℃で貯蔵した。
【０１４１】
ＧＳＫ−３βの阻害
９６ウェルポリプロピレンプレート内の５０μL反応液中でＧＳＫ−３β結合アッセイを行ったが、その際、各反応液は、塩化マグネシウム２０mM、ＡＴＰ４０μM、ＤＴＴ２mM、ビオチニル化及びリン酸化ＣＲＥＢ−ペプチド基質（ビオチン−ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳ（ＰＯ4）ＹＲ−ＯＨ，Wang，Q.M.ら，J. Biol. Chem. 269，14566−14574(1994)を参照されたい）８８．５μM、［γ−33Ｐ］ＡＴＰ（１μCi）、及び、ＤＭＳＯ中の本発明化合物（様々な濃度）２μLを含んでいた。ＧＳＫ−３β（様々な濃度）１５μLを添加し、得られた反応混合物を３０℃で１時間インキュベーションした。該反応混合物２５μLを１．８５％リン酸１３０μLを含有するホスホセルロースプレートに移すことにより反応を停止させた。膜内の遊離放射性ヌクレオチドを減圧下に１．８５％リン酸で洗浄した（５回）。最後の洗浄が終了した後、該プレートをアドプタープレート（adoptor plate）に移し、各ウェルにシンチレーションカクテル（Microscint−20，Packard，cat. # 20−133）５０μLを添加した。放射能の量をトップカウンターで計数した。
【０１４２】
本発明の化合物は、このアッセイで活性であった。
【０１４３】
表（I）〜表（IV）に示してある本発明のいくつかの化合物の（対照の活性の５０％を阻害する阻害剤の濃度であるＩＣ50で表してある）ＧＳＫ−３β阻害活性は、２μm未満であった。特定の化合物の活性を以下に示す。
【０１４４】
【表１】
2005519056.tif 000021
【０１４５】
実施例２
β−カテニンの分解の阻害 −− インビトロアッセイ
以下に示すようにＥＬＩＳＡを用いて、本発明化合物で処理した後のジャーカット（Jurkat）Ｔ細胞内のβ−カテニンのレベルを測定することにより、細胞に基づく本発明化合物のＧＳＫ−３β活性を決定した。
【０１４６】
ジャーカット細胞（５×１０5細胞／mL）を６−ウェルプレートに播種（６mL／ウェル）した後、様々な濃度（好ましくは、１nM〜１０μM）の本発明化合物で、２４時間処理した。インキュベーションの終わりに、細胞を採集し、ＰＢＳで一度洗浄した。次いで、細胞を、放射線免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解バッファー（Boehringer Mannheim，cat.# 1 920 693）０．３mLに懸濁させた。３回の凍結−融解サイクルの後、細胞抽出物を１５，０００rpmで１０分間遠心分離した。上澄み液を採集し、以下に示してあるＥＬＩＳＡアッセイを用いて分析した。
【０１４７】
９６マイクロウェルプレートを、コーティングバッファー（０．１M ＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．５）で希釈した捕捉抗体（capture antibody）（マウスモノクローナル抗−β−カテニン，Zymed La.，cat.# 13−8400，ウェル当たり１００μL，抗体２５０ng含有）で一晩コーティングした。ウェルを吸引し、洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）３００μLで３回洗浄し、アッセイ希釈液（ＰＢＳ，１０％ＲＢＳ，ｐＨ７； PharMingen）２００μLでふさぎ、次いで、室温で７２時間以上インキュベーションした。ウェルを上記で記載したように再度洗浄した。ジャーカット細胞上澄み液１００μL及び様々な濃度のβ−カテニン標準（Behrensら，Nature，Vol. 382，p638（1996））をウェルに添加して、室温で２時間インキュベーションした。インキュベーションが終了した後、ウェルを洗浄し、アッセイ希釈液で希釈（１:１２５０）した抗−β−カテニン抗体（Santa Cruz，β−カテニン Ｈ−１０２，ｓｃ−７１９９，ウサギＩｇＧ）１００μLを各ウェルに添加し、細胞を室温で２時間インキュベーションした。洗浄後、アッセイ希釈液で希釈（１:２０００）した検出液（working detector）（Sigma B5283，マウスモノクローナル抗−ウサギＩｇＧ−ビオチン）１００μLを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベーションした。３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（PharMingen，Cat.# 2642KK）を用いて発色させた。各ウェルに停止液（２N Ｈ2ＳＯ4）５０μLを添加して、反応を停止させた。反応停止から３０分間内に、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０nmで読み取った。
【０１４８】
化合物の濃度をβ−カテニンのレベルに対してプロットすることにより、ＧＳＫ−３βの阻害レベルを計算した。結果を図１に示す。これは、本発明化合物のβ−カテニンレベルに対する効果を確認する。
【０１４９】
実施例３
研究ＧＳＫ８ − 化合物（II−３）で処理したラットにおける骨形成
オボアルブミンに感作したブラウン−ノルウェーラットを用いた。そのラットは、１週間に１度で３週間（第０日、第７日及び第１４日）、ミョウバン０．２mL中のＯＡ（オボアルブミン）１００μgで腹膜内に感作させた。最後の感作の７日後（第２１日）、ラットに対して１％ＯＡを用いて４５分間負荷試験を行い、７２時間後（第２４日）に安楽死させた。化合物（II−３）は、第６〜８日及び第１３〜２３日に経口経管栄養法により１日に２回投与した。化合物はリポソーム製剤（化合物１．４４グラム及びＬ−α−ホスファチジルコリン５４gからなるリポソーム組成物を注射用滅菌水１６０mLに溶解させた８mg／mLのリポソーム溶液）として調製した。
【０１５０】
大腿骨のサンプルを１０％ギ酸中で脱石灰化し、パラフィンに埋め込み、５ミクロンの厚さに切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。光学顕微鏡により評価して、該動物の大腿骨の成長板下の海綿骨が緩やかに増加した。
【０１５１】
実施例４
研究ＭＴ０２１ − 化合物（II−9）によるラットの骨形成
化合物を、１０％（w／v）Solutol中の溶液として製剤した。雄のウィスターラットに、２５、７５又は１５０mg／kg／日で、１日１回で１４日間、経口経管栄養法により投与して、ビヒクル対照（１０％Solutol，１０mL／kg／日）と比較した。完全な剖検を行い、組織を１０％ホルマリン中に保存した。大腿骨、胸骨及び椎骨を、実施例３において記載したように加工処理して分析した。全てのグループ（２５mg／kgのグループでは１匹の動物のみ）で、海綿骨の増加が観察された。１５０mg／kgのグループでは、６匹中５匹で、新しい骨の形成が増大した。これは、より強力な作用である。
【０１５２】
実施例５
ラットにおける骨同化作用
２種類の構造的に異なっているＧＳＫ−３β阻害剤である（III−２）とＮ6−{２−［４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ］−エチル}−３−ニトロ−ピリジン−２，６−ジアミン（化合物Ｘ）を、骨減少症のラットモデルにおける骨同化作用活性について試験した。３月齢のラットに卵巣摘除術を施し（Ｏｖｘ）、及び、ウシ副甲状腺ホルモン（アミノ酸1−34）（表中のｂＰＴＨ）又は本発明化合物の１つのいずれかを１日１回経口投与する。前記投与は、卵巣摘除術の少なくとも４週間後に開始して、毎日の処置の３週間後に最終的に動物を殺すまで続ける。対照のグループは、ｓｈａｍ（卵巣摘除術を受けていないラット）及びＯｖｘのいずれも、ビヒクルのみを投与された。ウシ副甲状腺ホルモン（ｂＰＴＨ）は、同化活性についての内用の陽性対照として４０μg／kg（最適用量）で試験した。（III−2）の効果についても、無傷で卵巣摘除術を受けていない動物で試験した。血液と尿のサンプルを、処置の開始２〜３週間後に採集し、血清及び尿中のカルシウムの量を測定した。
【０１５３】
ＱＤＲ−４５００Ｗ Bone DensitometerTM（Hologic，Waltham，MA）で、High Resolution Software を用いて、右大腿骨の骨ミネラル密度を測定した。右足が体の本体に垂直になりかつ頸骨が大腿骨に垂直になるように、該動物を背臥位でプレキシガラスブロック上に配置することにより、該動物をスキャンした。該化合物についての、骨ミネラル密度の増大と、尿及び血清中のカルシウム濃度の増加は、下記表に示してある。高カルシウム血症又は高カルシウム尿症を伴わない用量で、いずれの化合物についても効力が認められた。頸骨においても同様の結果が観察された。
【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
下記表には、実施例３〜実施例５で使用されたＧＳＫ−３β阻害剤及びそれらの生物学的実施例１のＧＳＫ−３βアッセイにおけるＩＣ50が示されている。
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
上記発明について、明瞭さと理解を深めることを目的として、例証及び例示によりある程度詳細に記載してきた。添付されている特許請求の範囲の範囲内で変更及び修正を行うことができるということは当業者には明らかであろう。したがって、上記記載は例証を意図したものであり、限定するものではないことは理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるべきではなく、その代わり、添付されている特許請求の範囲及び該特許請求の範囲により権利が与えられる同等物の範囲全体を参照して決定されるべきである。
【０１５８】
本出願で引用されている全ての特許、特許出願及び刊行物は、あたかも個々の特許、特許出願又は刊行物が各々個別的に示されているのと同じ範囲まで、意図されている全てに関して、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【国際調査報告】
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