(57)【要約】本発明は、MUC-1を発現する腫瘍を治療および予防するための核酸ワクチン接種に有用である核酸構築物を提供する。
2005526511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全ての完全反復配列を欠くMUC-1誘導体をコードする核酸分子。
【請求項２】
さらに不完全反復配列を欠く、請求項１に記載のMUC-1誘導体をコードする核酸分子。
【請求項３】
さらにシグナル配列を欠く、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
さらに機能性膜貫通ドメインおよび／または細胞質内ドメインを欠く、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
FLSFHISNL；NSSLEDPSTDYYQELQRDISE；およびNLTISDVSVからなるグループから選択される１以上の配列をコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項６】
さらにＴヘルパーエピトープをコードする異種配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
DNA分子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載のDNA分子を含むプラスミド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子がコードするタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸または請求項８に記載のプラスミドまたは請求項９に記載のタンパク質ならびに製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
担体が微粒子である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
微粒子が金である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
アジュバントを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
医薬において使用する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸、請求項８に記載のプラスミド、請求項９に記載のタンパク質または請求項１０〜１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
MUC-1を発現する腫瘍を治療または予防するための医薬の調製における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項１６】
MUC-1を発現する腫瘍を治療または予防するための医薬の製造における、請求項８に記載のタンパク質の使用。
【請求項１７】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸、請求項８に記載のプラスミド、請求項９に記載のタンパク質の安全かつ有効な量を投与することを含む、腫瘍を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MUC-1を発現する腫瘍を治療および予防するための核酸ワクチン接種プロトコルに有用である新規の核酸構築物に関する。特に、核酸はDNAでありかつそのDNA構築物は完全な反復配列を欠くMUC-1誘導体をコードする遺伝子を含むものである。本発明はさらに、上記構築物を含む医薬組成物、特に粒子が媒介する送達に適合させた医薬組成物、それらを生産する方法、およびそれらの医薬における利用を提供する。核酸によりコードされた新規タンパク質およびそれらを含有する医薬組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮細胞ムチンMUC-1（エピシアリンまたは多形上皮細胞ムチンPEMとしても知られている）は、多数の上皮細胞上に発現される高分子量の糖タンパク質である。そのタンパク質は細胞質内尾部、膜貫通ドメインおよび20アミノ酸モチーフ（本明細書ではVNTRモノマーと名付けるが、これはVNTRエピトープ、またはVNTR反復配列としても知られている）の可変数タンデム反復から構成され、上記モチーフは高比率のプロリン、セリンおよびトレオニン残基を含有する。反復数はMUC-1遺伝子座における遺伝的多形によって可変であり、最も頻度の高いのは30〜100の範囲内である（Swallowら, 1987, Nature 328:82-84）。正常な導管上皮において、MUC-1タンパク質は導管内腔に露出した細胞の先端面上にのみ見出される（Grahamら, 1996, Cancer Immunol Immunother 42:71-80；Barratt-Boyesら, 1996, Cancer Immunol Immunother 43:142-151）。MUC-1分子の最も著しい特徴の１つは広範囲にわたるＯ-結合グリコシル化である。それぞれのMUC-1 VNTRモノマー中の利用しうるＯ-結合グリコシル化部位は５個所である。
【０００３】
VNTRは、ある配列を有する完全（典型）反復配列：およびその完全反復配列に対して20アミノ酸全体にわたり２または３アミノ酸の相違を含む少数の変化を有する不完全（非典型）反復配列により特徴付けることが出来る。野生型MUC-1の不完全反復配列は完全反復配列領域に隣接する。これらの上皮細胞の新生物形質転換により生じる悪性癌では、いくつかの変化がMUC-1の発現に影響を与える。タンパク質の極性のある発現が失われ、形質転換された細胞の全表面にわたって広がるのが見られる。MUC-1の全量もしばしば10倍以上増加する（Strous & Dekker, 1992, Crit Rev Biochem Mol Biol 27:57-92）。最も重要なこととして、Ｏ-結合炭水化物鎖の量と質が著しく変化する。グリコシル化されたセリンとトレオニン残基が減少する。見出されるこれらの炭水化物鎖は異常に短縮されて、腫瘍に随伴する炭水化物抗原STnを創り出す（Lloydら, 1996, J Biol Chem, 271:33325-33334）。これらのグリコシル化の変化の結果、従来は炭水化物鎖の篩に覆われていたMUC-1のペプチド鎖上の様々なエピトープがアクセス可能になる。この方法でアクセス可能になる１つのエピトープが、それぞれの20アミノ酸VNTR完全モノマー中に存在する配列APDTR（図２のAla8〜Arg12）により形成される（Burchellら, 1989, Int J Cancer 44:691-696）。
【０００４】
MUC-1におけるこれらの変化により、MUC-1の腫瘍上に発現される型に対する免疫系を活性化できるワクチンは、上皮細胞腫瘍に対して、そして実際には、MUC-1が見出される他の細胞型、例えばT細胞リンパ球に対しても有効となりうることは明白である。異常なタンパク質を発現する細胞を死滅させる免疫系により利用される主なエフェクター機構の１つは細胞傷害性Tリンパ球（CTL）免疫応答であり、この応答は腫瘍を治療するワクチン、ならびに抗体応答において所望されるものである。良いワクチンは免疫応答の全ての武器を活性化しうる。しかし、現行の炭水化物およびペプチドワクチン、例えばテラトープ（Theratope）またはBLP25（Biomira Inc, Edmonton, Canada）は免疫応答の１つの武器（それぞれ体液および細胞の応答）を優先的に活性化するものであり、従ってもっとバランスのとれた応答を産生するさらに優れたワクチン設計が所望される。
【０００５】
核酸ワクチンは、大量生産が容易である点において、通常のタンパク質ワクチン接種を超える数多くの利点を与える。核酸ワクチンは小用量でも強い免疫応答を誘導すること、および細胞傷害性Tリンパ球免疫応答ならびに抗体応答を誘導できることが報じられている。
【０００６】
しかし全長MUC-1は、高度な反復配列の故に、組換えを受けやすくそのような組換えイベントが著しい開発上の困難を生じるので、取扱いが非常に困難である。さらにVNTR領域のGCリッチの性質は配列決定を困難にする。さらに、規制上の理由で、DNA構築物を全て特徴付ける必要がある。このような高頻度の反復構造をもつ分子の配列決定は非常に問題が多い。野生型MUC-1中の反復回数が未知であることを考えると、全長MUC-1を正確に特徴づけることは不可能であって規制認可は得られない状況にある。
【０００７】
MUC-1 VNTR領域は免疫優性エピトープを含有すると考えられる。本発明者らは、意外にも、MUC-1発現腫瘍を認識しうる免疫応答を産生させることができる免疫原性MUC-1構築物であって、完全VNTRユニットを全く欠く上記構築物を作製することが可能であることを見出した。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、MUC-1発現腫瘍を認識できる免疫応答をin vivoで産生させることができるMUC-1誘導体をコードする核酸配列であって、コードされるMUC-1誘導体が完全VNTRユニットを全く欠くことを特徴とする上記核酸配列を提供する。
【０００９】
このような構築物は、意外にも、MUC-1発現腫瘍細胞を認識する細胞の応答およびまた抗体の応答も産生させることができる。
【００１０】
本発明の一実施形態においては、上記誘導体はまた、完全反復配列も欠く。
【００１１】
上記構築物はまた、外来エピトープおよび改変したVNTRユニット、例えばグリコシル化の減少した突然変異体を挿入するための中間物として利用することもできる。組込むことができる典型的な外来エピトープとしては、細菌タンパク質および毒素ならびにウイルス源由来のＴヘルパーエピトープ、例えばジフテリアもしくは破傷風由来のＴヘルパーエピトープ、例えばP2およびP30、またはHep B症例抗原由来のエピトープが挙げられる。
【００１２】
なおさらなる実施形態においては、本発明は、本発明のMUC-1構築物のＮまたはＣ末端に異種タンパク質を有する融合タンパク質をコードする核酸を意図する。このような融合パートナーはＴヘルパーエピトープを提供するかまたはリコール（re-call）応答を引き出すことができる。
【００１３】
これらの例としては、破傷風、ジフテリア、結核または肝炎タンパク質、例えば破傷風またはジフテリア毒素、特に破傷風毒素のP2および／またはP30エピトープを組込む断片が挙げられる。放線菌結核ペプチドの一例は、Mtb32aのアミノ酸192〜323に対応するRa12である（Skeikyら, Infection and Immunity (1999） 67:3998-4007)。Ｂ型肝炎コア抗原がさらに他の実施形態の例である。
【００１４】
他の好ましい免疫学的融合パートナーとしては、プロテインＤ、典型的にはＮ末端1/3（例えばＮ末端1-109）；肺炎連鎖球菌由来のLYTAまたはその部分（好ましくはＣ末端部分）（Biotechnology 10:795-798, 1992)が挙げられる。
【００１５】
このような構築物は、VNTR領域とは離れて、免疫応答を指令するワクチンに有用である。従って、これらはVNTRに基づくワクチン、例えば、Biomira社からのBLP-25（Mol. Ther 2001 3(1）P102-105に収載の「最近の見解（current opinion）」)とともに使用してVNTRおよび非VNTR領域の両方のバランスがとれた免疫応答を誘発することができる。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、核酸配列はプラスミドの形態のDNA配列である。プラスミドはスーパーコイルであることが好ましい。この様なヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は新規であり、本発明の一態様を形成するものである。
【００１７】
本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載の核酸配列またはタンパク質および製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
好ましい担体は金ビーズであり、医薬組成物は粒子が媒介する薬物送達による送達に馴染むものである。
【００１９】
なおさらなる実施形態においては、本発明は医学に使用する医薬組成物および核酸構築物を提供する。特に、本発明の核酸構築物は、MUC-1を発現する腫瘍を治療または予防するために使用する医薬品の製造において提供される。
【００２０】
本発明はさらに、MUC-1を発現する腫瘍、特に乳癌、肺癌（特に非小細胞肺癌）、胃癌および他のGI（胃腸）癌を患うかまたはそれらに感受性のある患者を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物または核酸の安全かつ有効な量の投与による上記方法を提供する。
【００２１】
なおさらなる実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を生産する方法であって、本発明の核酸構築物またはタンパク質に製薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体を加えて混合することによる上記方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
本明細書に記載したように、本発明の核酸構築物は完全反復配列を有しない。野生型MUC-1分子はシグナル配列、リーダー配列、不完全もしくは非典型VNTR、完全VNTR領域、さらなる非典型VNTR、非VNTR細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを含有する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態は、不完全反復配列を有しないかまたは１つの不完全反復配列、さらに好ましくは２つ、３つまたは４つの不完全反復配列を有するが、完全反復ユニットを有しない。
【００２４】
非VNTR細胞外ドメインは近似的にVNTRの5'側の80アミノ酸、およびVNTRの3'側の190〜200アミノ酸である。本発明の全ての構築物は、少なくとも１つのこの領域由来のエピトープを含む。あるエピトープは典型的には少なくとも７アミノ酸配列から形成される。従って、本発明の構築物は少なくとも１つの非VNTR細胞外ドメイン由来のエピトープを含む。好ましくは実質的に全ての、またはさらに好ましくは全ての非VNTRドメインを含む。特に好ましいのは、構築物が配列FLSFHISNL；NSSLEDPSTDYYQELQRDISE、またはNLTISDVSVを含むエピトープを含有することである。さらに好ましいのは、２つ、好ましくは３つの全てのエピトープ配列が構築物に組込まれることである。
【００２５】
好ましい実施形態においては、構築物はＮ末端リーダー配列を含む。シグナル配列、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインは、個々にまたは全て、任意に存在するかまたは欠失される。
【００２６】
本発明による好ましい構築物は：
１)末端切断MUC-1（すなわち、完全配列を持たない全MUC-1）
２)末端切断MUC-1Δss（１と同じであるが、シグナル配列を欠く）
３)末端切断MUC-1ΔTM ΔCYT（１と同じであるが、膜貫通および細胞質内ドメインを欠く）
４)末端切断MUC-1ΔssΔTMΔCYT（３と同じであるが、シグナル配列を欠く）
また、上記１〜４と等価であるが、不完全MUC-1反復配列を欠く構築物も好ましい。このような構築物をgutted MUC-1（「中身を抜いたMUC-1」の意味）と呼ぶ。一実施形態においては、１以上の不完全VNTRユニットを突然変異させてグリコシル化部位を改変することによりグリコシル化潜在能力を低減させる。突然変異は置換が好ましいが、挿入または欠失であってもよい。典型的には少なくとも１つのトレオニンまたはセリンをバリン、イソロイシン、アラニン、アスパラギン、フェニルアラニンまたはトリプトファンと置換する。従って、少なくとも１つ、好ましくは２つもしくは３つまたはより多数を上記アミノ酸を用いて置換することが好ましい。
【００２７】
さらなる実施形態においては、リーダー配列と細胞外ドメインの接合部に制限酵素切断部位をもつgutted MUC-1核酸が提供される。典型的にはこの制限酵素切断部位はNhel部位である。この部位をクローニング部位として利用し、例えば、グリコシル化突然変異体（すなわち、VNTR領域を突然変異させてO-グリコシル化部位を除去した）、P2またはP30などのＴヘルパーエピトープをコードする異種配列を含む他ペプチドをコードする配列を挿入することができる。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリヌクレオチド配列を含みかつその発現を指令することができる発現ベクターが提供される。ベクターは細菌、昆虫または哺乳類動物細胞、特にヒト細胞における異種DNAの発現を駆動するのに好適であってもよい。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、本発明によるポリヌクレオチド配列、または本発明による発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は細菌、例えば大腸菌（E. coli）、哺乳類動物、例えば、ヒトであってもよくまたは昆虫細胞であってもよい。本発明によるベクターを含有する哺乳類動物細胞はin vitroでトランスフェクトされた培養細胞であってもよいし、またはベクターの哺乳類動物への投与によりin vivoでトランスフェクトされてもよい。
【００３０】
本発明はさらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。好ましくは、その組成物はDNAベクターを含む。好ましい実施形態においては、その組成物は、複数の粒子、好ましくは金粒子であって、本明細書に記載のMUC-1アミノ酸配列をコードする本発明のポリヌクレオチド配列をコードするベクターを含むDNAを用いてコーティングした上記粒子を含む。代わりの実施形態においては、組成物は製薬上許容される賦形剤および本発明によるDNAベクターを含むものである。
【００３１】
組成物はまたアジュバントを含んでもよいし、またはアジュバントまたは免疫刺激薬を同時にまたは逐次的に投与してもよい。
【００３２】
従って本発明のベクターを免疫刺激薬とともに利用することが、本発明の一実施形態である。好ましくは、免疫刺激薬を本発明の核酸ベクターと同時に投与し、そして好ましい実施形態においては一緒に製剤する。そのような免疫刺激薬としては、（このリストは決して全てを網羅するものでなく、また他の薬剤を排除するものでもない）：合成イミダゾキノリン、例えばイミキモド［S-26308、R-837］、（Harrisonら, 「イミキモド単独でまたは糖タンパク質ワクチンと組合わせて使用する再発性HSVの低減（Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine）」, Vaccine 19:1820-1826,（2001)）；およびレシキモド［S-28463、R-848］（Vasilakosら, 「免疫応答修飾因子R-848のアジュバント活性：CpG ODNとの比較（Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN）」, Celllular Immunology 204:64-74（2000)）、抗原提示細胞およびＴ細胞表面上に構成的に発現されるカルボニルおよびアミンのシッフ塩基、例えばツカレゾール（tucaresol）（Rhodes, J.ら, 「同時刺激性シッフ塩基形成薬物による免疫系の治療効力の増強（Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs）」, Nature 377:71-75 (1995)）、サイトカイン、ケモカインおよびタンパク質またはペプチドのいずれかの同時刺激性分子、これは前刺激性サイトカインを含みうるのであって、例えばインターフェロン、特にインターフェロンα、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-αおよびTGF-β、TH1誘導物質、例えばIL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびIL-13ならびに他のケモカインおよび同時刺激性遺伝子、例えばMCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86およびCD40L、他の免疫刺激性ターゲティングリガンド、例えばCTLA-4およびL-セレクチン、アポトーシス刺激性タンパク質およびペプチド、例えばFas、(49)、合成脂質に基づくアジュバント、例えばヴァクスフェクチン（vaxfectin）、（Reyesら,「ヴァクスフェクチンは抗原特異的抗体力価を増強しかつプラスミドDNA免疫感作に対するTh1型免疫応答を維持する（Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization）」, Vaccine 19:3778-3786）、スクアレン、α-トコフェロール、ポリソルベート80、DOPCおよびコレステロール、内毒素、［LPS］（Beutler, B.,「内毒素、トル様受容体4、および先天免疫の求心性肢（Endotoxin, Toll−like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity）」, Current Opinion in Microbiology 3:23-30 (2000)）；CpGオリゴ-およびジ-ヌクレオチド（Sato, Y.ら,「有効な皮内遺伝子免疫感作に必要な免疫刺激性DNA配列（Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization）」, Science 273(5273):352-354 (1996)、Hemmi, H.ら,「トル様受容体は細菌DNAを認識する（A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA）」, Nature 408:740-745, (2000)）ならびにトル（Toll）受容体をトリガーしてTh1誘導サイトカインを産生する他の潜在的リガンド、例えば合成放線菌リポタンパク質、放線菌タンパク質p19、ペプチドグリカン、タイコ酸およびリピドAが挙げられる。他の細菌刺激性タンパク質、例えばコレラ毒素、大腸菌（E. coli）毒素およびそれらの突然変異トキソイドを利用してもよい。
【００３３】
優先的にTh1型応答を誘発するある特定の好ましいアジュバントは、モノホスホリルリピドAなどのリピドA誘導体、または好ましくは3-O-デアシル化モノホスホリル脂質Aを含む。MPL(登録商標)アジュバントはコリキサ社（Corixa Corporation、Seattle、WA；例えば、米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号および第4,912,094号を参照）から入手することができる。CpGを含有するオリゴヌクレオチド（ここでCpGジヌクレオチドはメチル化されていない）もTh1応答を優先的に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知でありかつ例えば、WO 96/02555、WO 99/33488および米国特許第6,008,200号および第5,856,462号に記載されている。免疫刺激性DNA配列はまた、例えば、Satoら, Science 273:352, 1996にも記載されている。他の好ましいアジュバントは、サポニン、例えばQuil A、またはQS21およびQS7を含むその誘導体（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）；エスシン（Escin）；ジギトニン；またはカスミソウ属（Gypsophila）もしくはアカザ科キノア（Chenopodium quinoa）サポニンを含む。
【００３４】
また、本発明によるポリヌクレオチドもしくはタンパク質または本発明によるベクターの、MUC-1を発現する腫瘍または転移の治療または予防における利用も提供される。
【００３５】
本発明はまた、MUC-1を発現する腫瘍、いずれかの症候群またはそれに関連する転移を含む疾患を治療または予防する方法であって、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたは医薬組成物の有効量を投与することを含む上記方法を提供する。医薬組成物の投与は、例えば「初回刺激-追加免疫（prime-boost）」ワクチン接種治療体制において１以上の個別用量の形をとってもよい。ある特定の事例において、「初回刺激（prime）」ワクチン接種は、好ましくはプラスミドから誘導されたベクター中に組込まれた本発明によるポリヌクレオチドの、粒子が媒介するDNA送達を経由してもよく、そして「追加免疫（boost）」は、上記ポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスベクターの投与、またはアジュバント中のタンパク質を用いる追加免疫であってもよい。逆に、初回刺激はウイルスベクターによるかまたはタンパク質製剤、典型的にはアジュバント中に製剤したタンパク質によるものであって、追加免疫は本発明のDNAワクチンによるものであってもよい。
【００３６】
以上考察したように、本発明は本発明のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む。このような発現ベクターは分子生物学の技術分野では日常的に構築されていて、例えばプラスミドDNAおよび適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび必要でありうる他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルの使用に関わるものであり、そしてこれらはタンパク質発現を可能にするために正しい方向に配置される。他の適当なベクターは当業者には明らかであろう。この点に関するさらなる例として、Sambrookら, 「分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」 第２版 CSH Laboratory Press. (1989)が挙げられる。
【００３７】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドまたは本発明に使用するポリヌクレオチドは宿主細胞によるコード配列の発現を可能にする制御配列と機能しうる形で連結されている、すなわち上記ベクターは発現ベクターである。用語「機能しうる形で連結された」は、記載された構成要素がそれらの意図する方法で機能することを可能にする関係にある近位を意味する。コード配列と機能しうる形で連結されたプロモーターなどの調節配列は、調節配列と適合しうる条件のもとでコード配列の発現が達成されるような方法で置かれる。
【００３８】
ベクターは、例えばプラスミド、人工染色体（例えば、BAC、PAC、YAC）、ウイルスまたはファージベクターであって、複製起点、場合によってはポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、および場合によってはプロモーターのレギュレーターを備えたものであってもよい。ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子または真菌ベクターに対する耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターはin vitroで、例えばDNAもしくはRNAの産生のために使用してもよく、または宿主細胞、例えば哺乳類動物宿主細胞を、例えばベクターがコードするタンパク質の産生のためにトランスフェクションまたは形質転換するために使用してもよい。ベクターはまた、例えばDNAワクチン接種または遺伝子治療の方法で、in vivoで使用するように適合させてもよい。
【００３９】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞に合わせて選択することができる。例えば哺乳類動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に応答して誘発させることができるメタロチオネインプロモーター、およびβ-アクチンプロモーターを含む。SV40ラージT抗原プロモーターなどのウイルスプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）最初期（IE）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域（URR）も利用することができる。全てのこれらのプロモーターはよく記載されかつ当技術分野では容易に利用しうる。
【００４０】
好ましいプロモーターエレメントは、イントロンAを欠くがエキソン1を含むCMV最初期プロモーターである。従って、HCMV IE初期プロモーターの制御下にある本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００４１】
適当なウイルスベクターの例は、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ワクシニアまたはアルファ-ウイルスベクターおよびレトロウイルスを含み、そしてレンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む。これらのウイルスを用いる遺伝子導入技術は当業者に知られている。例えば、レトロウイルスベクターを用いて安定して本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に組込むことはできるが、このような組換えは好ましいものではない。複製欠陥アデノウイルスベクターは対照的にエピソームに残り、従って一過性の発現が可能である。昆虫細胞（例えばバキュロウイルスベクター）、ヒト細胞または細菌細胞において発現を駆動することができるベクターを、例えばサブユニットワクチンとしてまたはイムノアッセイに使用するために、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるHIVタンパク質のまとまった量を生産するために採用してもよい。全長ワクシニア構築物を作製する先の試みは成功していないので、本発明のポリヌクレオチドは特にウイルスワクチンにおいて有用である。
【００４２】
本発明によるポリヌクレオチドは、コードされたタンパク質の発現による生産に有用であり、上記発現はin vitro、in vivoまたはex vivoで行うことができる。従って、本ヌクレオチドは、例えば収率を増加するための組換えタンパク質合成に関わってもよいし、または、それ自身の特性で、DNAワクチン接種技術に利用される治療薬としての用途を見出してもよい。本発明のポリヌクレオチドをin vitroまたはex vivoでコードされたタンパク質の生産に用いる場合、細胞を、例えば細胞培養において、発現すべきポリヌクレオチドを含むように改変しうる。そのような細胞は一過性の、または好ましくは安定した哺乳類動物細胞系統を含む。本発明によるポリペプチドをコードするベクターの挿入により改変しうる細胞の特定の例は、哺乳類動物HEK293T、CHO、HeLa、293およびCOS細胞を含む。好ましくは、選択される細胞系統は安定であるだけでなく、成熟したグリコシル化およびポリペプチドの細胞表面発現も可能にする細胞系統であろう。発現は形質転換された卵母細胞で達成することができる。ポリペプチドを、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において、本発明のポリヌクレオチドから発現させることができる。本発明のポリヌクレオチドからポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００４３】
本発明はさらに哺乳類動物被験体にワクチン接種する方法であって、上記被験体にこのようなワクチンまたはワクチン組成物の有効量を投与することを含む上記方法を提供する。最も好ましくは、DNAワクチン、ワクチン組成物および免疫治療薬に使用する発現ベクターはプラスミドベクターであろう。
【００４４】
DNAワクチンは、例えばシリンジまたは高圧ジェットを用いて投与する液製剤の「裸のDNA」の形態で、またはリポソームもしくは刺激性形質転換エンハンサーを用いて製剤したDNAの形態で、または粒子が媒介するDNA送達（PMDD）によって投与することができる。全てのこれらの送達系は当技術分野で周知である。ベクターを、例えばウイルスベクター送達系を用いて哺乳類動物に導入してもよい。
【００４５】
本発明の組成物は、いくつかの経路、例えば筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内によって送達することができる。
【００４６】
好ましい実施形態においては組成物を皮内に送達する。特に、組成物を遺伝子銃（特に粒子ボンバードメント）投与技術を用いて送達し、この投与技術はベクターをビーズ（例えば金）上にコーティングして次いでこれを高圧下で内皮中に投与することに関わる；例えば、Haynesら, J Biotechnology 44:37-42 (1996)に記載されている。
【００４７】
一説明例においては、ガス駆動による粒子加速を、Powderject Pharmaceuticals PLC社（Oxford、UK）およびPowderjet Vaccines Inc.社（Madison、WI）などが製造するデバイスを用いて達成することができ、その数例は米国特許第5,846,796号、第6,010,478号、第5,865,796号、第5,584,807号およびEP特許第0500 799号、に記載されている。この手法はニードルを使わない送達手法を提供し、顕微粒子の乾燥粉末製剤、例えばポリヌクレオチドを手で保持したデバイスにより発生させたヘリウムガスジェット内で高速に加速させ、粒子を目的の標的組織、典型的には皮膚中に推進させることを特徴とする。粒子は好ましくは0.4〜4.0μm、さらに好ましくは0.6〜2.0μm直径の金ビーズであり、DNA複合体がこれらの上にコーティングされ、そして「遺伝子銃」中に装填するカートリッジまたはカセット内に収納されている。
【００４８】
関係する実施形態において、本発明の組成物をガス駆動ニードルレス注入するために利用しうる他のデバイスと方法が、Bioject, Inc.（Portland、OR）により提供されており、それらの複数の例は、米国特許第4,790,824号、第5,064,413号、第5,312,335号、第5,383,851号、第5,399,163号、第5,520,639号および第5,993,412号に記載されている。
【００４９】
抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、予防または治療として有効でありうる量を投与する。投与する量は、１用量当たり、一般的に１ピコグラム〜１ミリグラム、粒子が媒介する送達では好ましくは１ピコグラム〜10マイクログラム、そして他のヌクレオチドの経路では10マイクログラム〜１ミリグラムの範囲内にある。正確な量は、免疫感作を受ける患者の体重および投与経路によりかなり変わりうる。
【００５０】
抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分は、１回切りの基準で投与するか、または反復して、例えば１〜７回、好ましくは１〜４回をほぼ１日〜ほぼ18ヶ月の間隔に投与することが可能である。しかし、ここでもまた、この治療体制は、患者のサイズ、治療／保護する対象の疾患、投与するヌクレオチド配列の量、投与経路および熟達した医療実施者には明らかである他の因子によって著しく変わりうる。患者はその全体的治療体制の一部として１種以上の抗癌薬を受けてもよい。
【００５１】
裸のポリヌクレオチドまたはベクターを患者中に導入するための好適な技術はまた、適当なビヒクルを用いる局所の適用も含む。核酸を、局所的に皮膚または粘膜表面、例えば鼻腔内、経口、膣内または直腸内に投与することができる。裸のポリヌクレオチドまたはベクターは製薬上許容される賦形剤、例えばリン酸バッファー生理食塩水（PBS）と一緒に存在してもよい。DNA取込みは、促進薬、例えば分離したまたはDNA製剤中に含まれたブピバカインの使用により、さらに促進させることができる。核酸を受給者に直接投与する他の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーションおよび米国特許第5,697,901号に記載のマイクロシーディング（microseeding）が挙げられる。
【００５２】
核酸構築物の取込みは、例えばトランスフェクション試薬の使用を含む複数の公知のトランスフェクション技術により促進することができる。これらの試薬の例は、カチオン試薬（例えばリン酸カルシウム）、DEAE-デキストランならびにリポフェクタント（lipofectant）（例えばリポフェクタム（lipofectam）およびトランスフェクタム（transfectam））を含む。投与する核酸の用量は変えることができる。
【００５３】
本発明の核酸配列はまた、形質転換した細胞を用いて投与してもよい。このような細胞は被験者から採取した細胞を含む。本発明の裸のポリヌクレオチドまたはベクターをこのような細胞中にin vitroで導入し、その後、形質転換した細胞を被験者に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドを細胞中に既に存在する核酸中に相同組み替えイベントにより組込んでもよい。もし所望であれば、形質転換した細胞をin vitroで増殖し、得られる１以上の細胞を本発明に利用してもよい。細胞を患者の適当な部位に公知の外科またはミクロ外科技術（例えば、移植術、ミクロ注入など）により提供することもできる。
【実施例】
【００５４】
実施例：
１．  gutted MUC-1およびOx VNTR MUC-1ベクターの構築
gutted（すなわち、不完全または完全反復配列のない）MUC-1およびOx（すなわち、完全反復配列のない）VNTR MUC-1ベクター構築の出発点は、プラスミドpcDNA3-FL-MUC1（ICRF、London）であった。MUC-1断片をBamHI断片として切除してpcDNA3.1(+)/Hygro中にクローニングし、ベクターJNW278を作製した。VNTRユニットをFseI消化により除去してベクターを再ライゲートしてJNW283を得た。このプラスミドは単一VNTRユニットをもつMUC-1を含有する。MUC-1の3'セクションをPCR増幅し、プライマーとして、gutted MUC-1に対しては2062MUC1とΔTR5'FORを、そしてOx VNTR MUC-1に対しては2062MUC1と非典型TRs FORをそれぞれ用いた（プライマー配列は図７に示す）。PCR産物を精製し、NheI-XhoIを用いて消化し、そしてNheI-XhoIにより制限したpVACのNheI-XhoI部位中にクローニングした。これにより次の中間物ベクター、すなわちJNW348およびJNW353を作製した。
【００５５】
MUC-1の5'セクションをPCR増幅し、プライマーとして、gutted MUC-1に対しては2060MUC1とΔTR3'REVを、そしてOx VNTR MUC-1に対しては2060MUC1と非典型TRs REVをそれぞれ用いた。得られる断片をベクターJNW348およびJNW353中にそれぞれクローニングし、NheIを用いて消化し、子ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸した。このクローニング手法によりベクターJNW389（gutted MUC-1）およびJNW399（Ox VNTR MUC-1）を作製した。JNW283、JNW389およびJNW399中のMUC-1カセットの配列は図１〜３に示した通りで、これらはプライマー2004MUC1-2014MUC1（図７を参照）を用いる配列決定により確証した。gutted MUC-1は完全または不完全反復配列を含有しない。Ox VNTR MUC-1は不完全反復配列だけを含有する（完全反復配列は存在しない）。
【００５６】
ノート：完全反復配列は、Engelmannら (2001) JBC 276(30)27764-27769に示された配列に基づいており、次に示す通りである。20アミノ酸VNTRユニットを示した。アミノ酸置換は下線を引いた残基でのみ許容される。
【００５７】
T                    
A                    
E S                       Q                    
A P D T R P A P G S  T  A  P  P  A  H  G  V  T  S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 
不完全反復配列はコンセンサス配列に対してアミノ酸レベルで55〜90％同一性を超える異なるアミノ酸置換を有する。下線を引いた置換をもつ、４つの不完全反復配列を以下に示す：
APDTRPAPGSTAPPAHGVTS-完全反復配列
APATEPASGSAATWGQDVTS-不完全反復配列１
VPVTRPALGSTTPPAHDVTS-不完全反復配列２
APDNKPAPGSTAPPAHGVTS-不完全反復配列３
APDNRPALGSTAPPVHNVTS-不完全反復配列４
２．抗体応答の比較
pVAC（空ベクター）、JNW358（FL-MUC1）、JNW389（gutted MUC-1）およびJNW399（Ox VNTR MUC-1）によるPMID免疫感作後の、免疫優性エピトープに対する抗MUC-1抗体応答を図４に示す。その結果は、予想通りgutted MUC-1は免疫優性MUC-1エピトープに対する抗体応答を誘発しないことを示す。対照的に、Ox VNTR MUC-1（JNW399）は弱い抗体応答を誘発し、不完全反復配列と完全反復配列の間の抗体レベルにおけるある程度の交差反応性を示唆する。
【００５８】
細胞外ドメインの残部に対する抗体応答を研究するために、免疫感作したマウスから得た血清をフローサイトメトリーにより試験した。標的細胞はB16F0MUC1、ヒトMUC-1を発現する腫瘍細胞系統であった。結果は、JNW389およびJNW399がMUC-1のヒト型を認識できる強い抗体応答を誘発することを示す。これらの血清の力価（1/100および1/2000）は、JNW389およびJNW399による免疫感作により誘発される抗体応答がFL-MUC1のそれと比較しうることを示す。このデータは、非VNTR細胞外ドメインに対する抗体応答がMUC-1免疫治療ワクチンの重要な特徴でありうることを示唆する。
【００５９】
３．FL-MUC1、Ox VNTR MUC-1およびgutted MUC-1に対する細胞応答
pVAC（空ベクター）、JNW358（FL-MUC1）、JNW399（Ox VNTR MUC-1）およびJNW389（gutted MUC-1）による免疫感作後の細胞応答を、第０日のPMIDによる一次免疫感作および第21日の追加免疫の後に、ELISPOTにより評価した。アッセイは追加免疫７日後に実施した。図６は、FL-MUC1、Ox VNTRまたはgutted MUC-1による免疫感作後のB16 MUC1腫瘍細胞に対する細胞応答がいずれも等価であることを示し、VNTR領域の不在はヒトMUC-1を発現する腫瘍細胞に対するロバストな細胞応答の誘導を害うものでないことを示唆する。抗体の結果と合わせて考えると、これらのデータは、MUC-1の非VNTR領域がMUC-1ワクチンの設計において不可欠な成分であるに違いないことを示唆する。
【００６０】
４．MUC-1のグリコシル化突然変異体を含有するguttedおよびOx VNTR構築物の構築
これらのベクターの構築のための出発点はプラスミドJNW389（gutted MUC-1）およびJNW399（Ox VNTR MUC-1）である。これらのプラスミドはNheIを用いて直線化し、子ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化することができる。
【００６１】
グリコシル化突然変異体VNTR断片（2TRs-２縦列反復配列）は次のプラスミド（WO/01/46228を参照）のNheI消化により単離することができる。
【００６２】
2TR-WT  pVAC1.ss2.WT.MUC1.HepB
MUT4    pVACl.ss2.MUT4.MUC1.HepB
MUT5N   pVACl.ss2.MUT5N.MUC1.HepB
これらの断片を上記の直線化したJNW389/JNW399中にライゲートすることができる。その断片を正しい方向に含有するクローンは、JNW389およびJNW399のNheIクローニング部位にフランキングする次の配列決定プライマー（2004MUC1、2005MUC1、2013MUC1、2012MUC1）を用いて配列決定することにより同定することができる。
【００６３】
MUC-1の他のグリコシル化突然変異体（MUT51、V、W、P、A）は、直線化JNW389およびJNW399ベクター中に突然変異したVNTR配列をコードするオリゴを用いて挿入することができる。オリゴをリン酸化し、次のようにアニーリングする：
10pmol    プライマーＡ、
l0pmol    プライマーＢ、
1x        T4 DNAリガーゼバッファー、および
10U       T4 ポリヌクレオチドキナーゼ
を含む20μl水中で；
２時間、37℃、
２分間、95℃、および
0.1℃/sで温度を低下させてオリゴのアニーリング；
４℃にて保持。必要時まで凍結保存。
【００６４】
アニーリングしたオリゴをNheIで直線化したJNW389およびJNW399とライゲートする。クローンは2004MUC1、2005MUC1、2012MUC1および2013MUC1を用いる配列決定により同定することができる。
【００６５】
混合と適合
全ての上記グリコシル化突然変異体VNTR配列はNheIカセット上にコードされ、かつベクターJNW389およびJNW399は適当に位置したNheI部位を有するので、様々な異なるグリコシル化突然変異体および異なる数のVNTRユニット（１〜10）を含有するMUC-1分子を積み上げて所望の抗体応答を達成することが可能である。
【００６６】
５．グルコシル化突然変異体を含有するgutted/Ox VNTR構築物の発現
構築物を一過的にCHO細胞中にトランスフェクトすることができる。gutted MUC-1構築物については、グリコシル化VNTR配列の存在を抗体ATR1（FACSまたはウェスタンブロットのいずれかによって）を用いて確認することができる。
【００６７】
グリコシル化突然変異体を含有するgutted/Ox VNTR構築物は腫瘍細胞構築物を認識できる抗体応答を誘発することの確証
構築物を用いて、マウスをPMIDにより第０日、第21日および第42日に免疫感作することができる。血清をほぼ第49日に採取して、ELISAに利用0しうる。同様に、FACSに基づくアッセイおよびヒトMUC-1を発現する腫瘍細胞（例えば、B16FOMUC1、T47D、RMA-MUC1、EL4-MUC1）を用いて、免疫化マウスから得た血清をそのヒトMUC-1の腫瘍型を認識する能力について試験しうる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１−１】プラスミドJNW283からのMUC-1配列である。BamHI部位に二重の下線を引いた。タンパク質は１文字表記で示した。開始および終止コドンは太字で示した。VNTR反復配列は下線を引き、FseI部位に太い下線を引いた。プラスミドpcDNA3-FL-MUC-1（ICRF）由来のFL-MUC-1配列は下線を引いたVNTR配列を除くと下記の配列と同一であり、pcDNA-FL-MUC-1プラスミドではこのVNTR配列がほぼ32回反復される。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−２の続きである。
【図２−１】プラスミドJNW389からのgutted MUC-1発現カセットである。タンパク質配列は１文字表記で示した。MUC-1の5'のNheI部位に二重の下線を引いた。MUC-1の中央のNheIクローニング部位に一本の下線を引いた。XhoI部位に点線の下線を引いた。Xbal部位はイタリック体で示した。開始および終止コドンは太字で示した。最適化コザック配列はシャープ記号（#）で記した。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３−１】プラスミドJnw399からのOx VNTR MUC-1発現カセットである。タンパク質配列は１文字表記で示した。MUC-1の5'のNheI部位に二重の下線を引いた。MUC-1の中央のNheIクローニング部位に一本の下線を引いた。XhoI部位に点線の下線を引いた。Xbal部位はイタリック体で示した。開始および終止コドンは太字で示した。最適化コザック配列はシャープ記号（#）で記した。不完全反復配列領域は太い下線で示した。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図４】pVAC（空ベクター）、JNW358（FL-MUC-1）、JNW389（gutted MUC-1）およびJNW399（Ox VNTR MUC-1）によるPMID免疫感作後の抗MUC-1抗体応答の動力学である。以下に示した抗MUC-1抗体応答はVNTR領域だけに対するものである。
【図５】MUC-1免疫感作したマウスから得た血清のヒトMUC-1を発現するB16F0腫瘍細胞との結合である。A)FL-MUC1（JNW358）、B)gutted MUC-1（JNW389）およびC)Ox VNTR MUC1（JNW399）を用いて免疫感作したマウスから得た血清を1/100および1/2000にて希釈した。
【図６】pVAC（空ベクター）、JNW358（FL-MUC-1）、JNW389（gutted MUC-1）およびJNW399（Ox VNTR MUC-1）によるPMID免疫感作後の抗MUC-1細胞応答である。C57BL/6マウスを第０日および第21日に免疫感作して、第28日にアッセイを実施した。グラフＡおよびＢは、IL-2およびIL-7の存在のもとでのB16MUC1腫瘍細胞に対するIFN-γ応答を示す。
【図７】プライマー配列を示す図である。
【図１−１】
2005526511.tif 000003
【図１−２】
2005526511.tif 000004
【図１−３】
2005526511.tif 000005
【図２−１】
2005526511.tif 000006
【図２−２】
2005526511.tif 000007
【図３−１】
2005526511.tif 000008
【図３−２】
2005526511.tif 000009
【図３−３】
2005526511.tif 000010
【図４】
2005526511.tif 000011
【図５】
2005526511.tif 000012
【図６】
2005526511.tif 000013
【図７】
2005526511.tif 000014
【国際調査報告】
2005526511.tif 000015
2005526511.tif 000016
2005526511.tif 000017
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