(57)【要約】ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼドメインを含んでいるが、ＰＩＮ１ ＷＷドメインを含んでいないポリペプチドを記載している。また、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ：リガンド複合体の結晶構造を含むこれらポリペプチドの結晶構造を記載している。これらの結晶から誘導される構造座標データは、ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性の調節因子の同定及びデザインに関する薬物の発見及びデザインに有用なＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼ基質結合部位の三次元的概要を提供するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードし、そしてＷＷドメインをコードしない単離したポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＷＷドメインをコードしない、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含んでいる単離したポリヌクレオチド。
【請求項３】
(ａ) 配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードし；そして、
(ｂ) ＷＷドメインをコードしない、
単離したポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＷＷドメインをコードしない、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含んでいる単離したポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされる単離したポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３のポリヌクレオチド配列によりコードされる単離したポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４のポリヌクレオチド配列によりコードされる単離したポリペプチド。
【請求項８】
(ａ) ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるが、ＷＷドメインを含んでいないポリペプチドに、試験化合物を添加し；
(ｂ)該ポリペプチドのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を測定し；そして、
(ｃ)該ポリペプチドの活性が、該試験化合物によって調節されているかを決定することからなる、ＰＩＮ１調節能力について化合物を検定する方法。
【請求項９】
ポリペプチドが、配列番号２又は配列番号４のポリヌクレオチド配列を含んでいるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８に記載の方法
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントによりコードされたポリペプチドを含んでいる結晶構造。
【請求項１１】
請求項３に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントによりコードされたポリペプチドを含んでいる結晶構造。
【請求項１２】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体を含み、ここで該ポリペプチドがＷＷドメインを含んでいない、結晶構造。
【請求項１３】
ポリペプチドが請求項１又は３に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１２に記載の結晶構造。
【請求項１４】
表IIの構造座標により特徴付けられる三次元構造を有しているＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼポリペプチドの結晶構造。
【請求項１５】
表IIIの構造座標により特徴付けられる三次元構造を有しているＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体を含む結晶構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＩＮ１ ＷＷドメイン及びそれをコードするポリヌクレオチドを欠損している突然変異ＰＩＮ１ポリペプチドに関するものである。本発明はまた、これらのポリペプチドのＸ−線結晶構造に関するものである。更に、本発明は、突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド、及びＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインに結合する小物質に関するものである。本発明はまた、ドラッグデザイン及び開発における使用のために、かかる結晶構造から決定される原子座標（atomic coordinate）の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞周期は、究極的に細胞の複製をもたらす秩序正しい一連の工程である。体細胞分裂は二つの連続的な過程からなるが、主要部はＤＮＡ複製であり、染色体分裂がそれに続く。成長周期（間期）において、細胞はこれら事象の準備のために多くの時間を費やすが、それは三つのサブフェース：初期ギャップ期（Ｇ1）、合成期（Ｓ）及び第二ギャップ期（Ｇ2）からなる。Ｇ1期において、細胞は高い率で生合成を行なう。Ｓ期は、ＤＮＡ合成の開始の時に始まり、そして核のＤＮＡ含量が二倍になった時に終了する。細胞はその後、Ｇ2期に入り、それは分裂の最終である有糸分裂（Ｍ）期に入るまで続く。このM期は、核膜が壊れ、染色体が凝縮し、そして同一の２セットの染色体を形成してこれが二つの新しい核に分離することにより始まる。この後、細胞分裂（細胞質分裂）が起こり、二つの娘細胞が生ずる。この分離でＭ期が終了し、そして二つの新しい細胞の間期の始まりとなる。
【０００３】
有糸分裂期の開始は、正常な細胞においては高度に制御されている事象である。今日まで研究されてきた真核細胞では、Ser／ThrキナーゼであるCdc２／サイクリンＢにより、有糸分裂期の開始は制御されている（Nurse, Nature 344:503-508(1990)）。不適切な有糸分裂の活性を防止するために、Cdc２／サイクリンＢの活性は厳密に制御されている。Cdc／サイクリン複合体は、リン酸化により、ポジテイブにもネガテイブにも制御される。Cdc2／サイクリンＢは、Cdc25による脱リン酸化により活性化された時、細胞を有糸分裂へと誘導する。
【０００４】
Cdc25の制御因子の一つは、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）の一種である、ＰＩＮ１である。ＰＩＮ１は、ＰＰＩアーゼのパルブリン(parvulin)ファミリーの一員であり、プロリン残基の前方のペプチド結合回転を触媒する。この反応は、或る種の蛋白質の折りたたみ及び輸送において重要であることが示唆される(Schmid, Curr, Biol. 5:993-994(1995))。他のよく特性決定がされているＰＰＩアーゼファミリーには、シクロフィリン、ＦＫ５０６−結合蛋白質（ＦＫＢＰｓ）があり、それぞれ、免疫抑制薬品である、シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６がある。ＰＩＮ１、シクロフィリン及びＦＫＢＰｓのようなパルブリンは、一次配列には関係しない。
【０００５】
ＰＩＮ１は、植物、酵母、昆虫及び哺乳類を含む実験した全ての真核細胞生物において同定されている(Hanes他, Yeast 5:55-72(1989); Lu他, Nature 380:544-547(1996); Maleszka他, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:447-451(1996))。酵母（Ess1）及びショウジョウバエ (dodo) ＰＩＮ１オルソログは、ヒト発現配列タグと高度な類似性を有していて、それは、終局的には、ＰＩＮ１と呼ばれるヒトのdodo遺伝子のクローン化をもたらす(Maleszka他, Gene 203:89-93(1997))。ハエのdodo遺伝子は、酵母の遺伝子Ess1に対して４５％同一であると報告されている。
【０００６】
ヒトcＤＮＡライブラリーの酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を用いて、ヒトＰＩＮ１は、真菌アスペルギルス ニデユレンス(Aspergillus nidulens)の蛋白質NIMAの結合蛋白質であるとして初めて同定された(Lu他, 1996, 同上)。NIMAは、細胞を有糸分裂に誘導するキナーゼであり、そして、ＰＩＮ１によりネガテイブに制御されていると報告されている。A. ニデユレンス(A. nidulens)の細胞におけるNIMAの減少は、細胞周期をＧ2の休止期に導くと報告されているが、また一方では、過剰発現は未成熟な有糸分裂を促進すると報告されている。ヒト細胞中において他のNIMA様経路が存在するという仮説があるが(Lu他, Cell 81:413-424(1995))、Ser／ThrキナーゼCdc２／サイクリンＢは、ヒト細胞中における類似のNIMAキナーゼであるのかも知れない。
【０００７】
ＰＩＮ１活性の調節は、劇的な形態的細胞表現型をもたらすと報告されている。例えば、HeLa細胞におけるＰＩＮ１の減少は有糸分裂の休止期の原因となる一方、ＰＩＮ１の過剰発現は、Ｇ2休止期の原因となることが報告されているが、これは、NIMA調節において観察された反対の表現型である(Lu et l., 1996, 同上; Crenshaw他, EMBO J. 17:1315-1327(1998))。更に、 完全長のアンチセンス発現によってＰＩＮ１蛋白質の発現が減少すると、細胞の未成熟な有糸分裂を生じ、未成熟な染色体凝縮による異常な核を含み、及びアポトーシスを誘導することが報告されている(Lu et l., 1996, 同上)。これらのデータから、ＰＩＮ１は、哺乳類におけるNIMAの機能的相同体との相互作用を介する有糸分裂のネガテイブ制御因子であり、及び有糸分裂の進行にとって必要とされるものであることが示唆される。更に、ＰＩＮ１の減少が、アルツハイマー病において何らかの役割を果たすものと推測される(Lu他, Nature 399:784-788(1999)。
【０００８】
インビトロにおいてＰＩＮ１は、ＭＰＭ-２抗体よっても認識される有糸分裂蛋白質と相互作用することが報告されている(Crenshaw他, 同上;Lu他, Science 283:1325-1328(1999);Ranganathan他, Cell 89:875-886 (1997): Yaffe他, Science 278:1957-1960(1997))。ＭＰＭ-２モノクローナル抗体は、Cdc25, Wee 1, Cdc 27, Map 4, 及び NIMAのような重要な有糸分裂制御因子を含む有糸分裂に関連するおよそ５０個の蛋白質上のホスホ-Ser／Thr-Pro エピトープを認識する(Davis他, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2926-2930(1983); Kuang他, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:4982-4986(1989); Westendorf他, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:714-718(1994);Stuckenberg et al., Curr Biol. 7:338-348(1997))。ＰＩＮ１は、Cdc２５及びその既知の調節因子であるPlx 1 を含んでいるCdc２／サイクリンBの重要な上流制御因子と相互作用することが報告されている(Shen他, Genes Dev. 12:706(1998); Crenshaw他, EMBO J. 17:1315-1327(1998))。ＰＩＮ１は、その酵素作用により、細胞内におけるCdc25及びPlx1の分解を引き起こすことによって、それらの役割を除去することができる。
【０００９】
研究の結果、ＰＩＮ１の生物学的機能は、機能的ＰＰＩアーゼ活性部位に依存していることが分かっている(Lu et l., 1999, 同上)。更に研究の結果、ＰＩＮ１は、そのＷＷドメインを通して基質（有糸分裂に特異的なりん蛋白質）を認識することが示唆されている。ＷＷドメインは、生物全般について一般的な蛋白質認識モチーフである。しかしながら、ＰＩＮ１ＷＷドメインは、その中でも独特なものであり、リン酸化されたセリンを含んでいるリガンド蛋白質を必要とする。ＰＰＩアーゼドメインについて、機能的ＷＷドメインはＰＩＮ１の生物学的機能にとって必須であることが報告されている。このことは、ＰＩＮ１はＷＷドメインを通して基質を認識し、その後に、その本質的な触媒という役割を完成させるというモデルとよく一致する。
【００１０】
完全長のＰＩＮ１蛋白質及び完全長のＰＩＮ１をコードするヌクレオチド配列は、米国特許5,952,467号及び5,972,697号に開示されている。ＰＩＮ１アミノ酸配列及びｍＲＮＡ配列についての配列情報は、登録番号ＮＭ００６２２１（ｍＲＮＡ）及びＳ６８５２０（
蛋白質）としてＧｅｎＢａｎｋに寄託している。dodoのｍＲＮＡ配列については、登録番号Ｕ３５１４０としてＧｅｎＢａｎｋに寄託している。マウスＰＩＮ１のｍＲＮＡ配列については、登録番号ＮＭ０２３３７１としてＧｅｎＢａｎｋに寄託している。
【００１１】
Ranganathan他(Cell, 89:875-886(1997); 国際公開 ＷＯ99／63931; 米国特許出願公開ＵＳ2001／0016346 A1) は、ＡlaＰro ジペプチドと複合するとして報告された完全長ＰＩＮ１の結晶構造を提示している。Ranganathan他により報告された結晶構造の原子座標は、Ｐrotein Ｄata Ｂank (ＰＤＢ)から入手可能である。ＰＤＢインターネットサイト(http:／／www. rcsb. org／pdp／)からの情報によれば、このデータは１９９８年６月２１日に寄託され、そして１９９８年１０月１４日に公表されている。
【００１２】
先天的な遺伝子の不安定性に基づく悪性細胞は、細胞分裂を制御する調節機構の多くを欠損している。そのような悪性細胞は、細胞周期の変調又はアポトーシスによる細胞死をもたらす手段の介在に対してより感受性である。更に、細胞周期の調節における変異は、正常細胞と癌細胞間の相異の一つであるから、細胞周期の調節に関与する蛋白質は、細胞増殖に関する病気に対する使用として効果的な細胞傷害物質の開発にとっては興味有る標的である。そのような標的の一つがＰＩＮ１である。
【００１３】
ＰＩＮ１阻害物質は、細胞にとって細胞傷害性であり、そして細胞周期のＧ2期において細胞に影響を与える。形質転換した細胞は、遺伝子の不安定性に基づき、ＰＩＮ１阻害物質に対しては高感受性であり、そして細胞周期の制御が低下し、かつ不十分となる。
【００１４】
ＰＩＮ１阻害物質については、先行文献に記載されている。例えば、ジュグロン(juglone:5-ヒドロキシ-1,4-ナフトキノン)がヒトＰＩＮ１を含むいくつかのパルブリン(parvulin)を選択的に阻害することが報告されている（Henning他, Biochemistry 37:5953-5960(1998)）。完全長ヒトＰＩＮ１から誘導された結晶構造に基づくデータを用いて、ＰＩＮ１阻害物質として或る種の化合物が記載されている(Noel他, 国際公開 ＷＯ 99／63931; 米国特許出願公開 US201／0016346 A1)。Lu他は、ホスホセリン又はホスホトレオニン−プロリンペプチジル−プロリルイソメラーゼ基質のホスホ−Ser／Thr残基に類似する阻害物質について報告している(Lu他, 国際公開 PCT ＷＯ 99／12962)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞周期の制御においてＰＩＮ１が果たす重要な役割から、生化学的検定及び結晶解析研究の操作を可能とするＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ結合ドメインを含んでいる安定な組換えポリペプチドは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性の調節因子となる化合物の開発に必要とされるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ポリヌクレオチド及びそれらがコードしているポリペプチドに関するものである。これらのポリヌクレオチドは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインをコードするが、ＰＩＮ１ ＷＷドメインはコードしない。ここに記載したポリヌクレオチドによりコードされ、遺伝子工学的に操作されたポリペプチドはまた、野生型ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインと比較して区別されるアミノ酸置換を含んでもよい。ここに記載したポリペプチドは、ＰＰＩアーゼ基質−結合ドメインと相互作用するリガンドと結晶化したときに、より良い結晶化特性を有しているが故に、完全長の野生型ＰＩＮ１よりも有利である。
【００１７】
本発明の実施態様の一つには、ＷＷドメインを欠く、ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。
【００１８】
好ましい実施態様は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードし、そしてＷＷドメインをコードする配列を含まない単離されたポリヌクレオチドである。
【００１９】
好ましい実施態様は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含んでいる単離されたポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、ＷＷドメインをコードする配列を含んでいない。
【００２０】
他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドをコードし、そしてＷＷドメインをコードする配列を含まない単離されたポリヌクレオチドである。
【００２１】
更に、他の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号３のポリヌクレオチド配列を含んでいる単離されたポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、ＷＷドメインをコードする配列を含んでいない。
【００２２】
好ましい実施態様においては、ここに記載したポリヌクレオチドは、少なくとも一つの蛋白質分解の切断部位をコードする。好ましい切断部位は、トロンビン切断部位である。
【００２３】
更に、好ましい実施態様においては、ここに記載したポリヌクレオチドは、ヒスチジン−タグをコードする少なくとも一つの配列を含んでいる。
【００２４】
本発明はまた、ここに記載したポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドに関するものである。これらのポリペプチドは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインを含んでいるが、ＷＷドメインは含んでいない。好ましいポリペプチドとしては、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドが含まれる。
【００２５】
本発明の他の実施態様は、ここに記載している単離したポリヌクレオチドを少なくとも一つ含んでいるベクターに関するものである。好ましいベクターとしては、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいるが、しかしＷＷドメインをコードする配列を含んでいないものである。
【００２６】
好ましい実施態様においては、ベクターは、プロモーターに作動可能に連結している、ここに記載しているポリヌクレオチドの一つを含んでいる発現ベクターである。発現のための好ましいポリヌクレオチドとしては、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいるが、しかしＷＷドメインをコードする配列を含んでいないものである。
【００２７】
本発明はまた、ここに記載しているポリヌクレオチドの一つを含んでいるベクターにより形質転換されるか又は形質移入された真核細胞の細胞系又は原核細胞に関するものである。好ましくは、真核細胞の細胞系又は原核細胞は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼをコードするポリヌクレオチドを含んでいるが、しかしＷＷドメインをコードする配列を含んでいないポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されるか又は形質移入される。
【００２８】
本発明の他の実施態様は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドを生成する方法であり、当該方法は以下の工程を含んでいる：(ａ) ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼをコードし、そしてＷＷドメインをコードする配列を含んでいないポリヌクレオチドにより形質転換され又は形質移入された真核細胞の細胞系又は原核細胞を、ポリペプチドが発現するような条件下で培養し、そして、(ｂ) ポリペプチドを回収する。
【００２９】
本発明はまた、ＰＩＮ１調節能力について化合物を検定する方法に関するものである。
当該方法は次の工程を含んでいる：ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるポリペプチドで、ＷＷドメインを含んでいないポリペプチドに試験化合物を添加し；ポリペプチドのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を測定し；そして、ポリペプチドの活性が試験化合物により調節されたか否かを決定する。
【００３０】
ＰＩＮ１調節能力について化合物を検定する好ましい方法は、以下の工程を含んでいる高速スループット検定である：マイクロウエルプレートのような複連式容器フォーマットにおいて、試験化合物を、ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるポリペプチドでＷＷドメインを含んでいないポリペプチドに添加し；ポリペプチドのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を測定し；そして、ポリペプチドの活性がスクリーニングされた試験化合物により調節されたか否かを決定する。
【００３１】
尚、本発明の他の実施態様は、ＷＷドメインを欠いているＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドの結晶構造である。好ましくは、配列番号２、配列番号４のアミノ酸配列又はそれらのフラグメントを有するポリペプチドの結晶構造である。
【００３２】
好ましい実施態様において、結晶構造は、３オングストロームに等しいか又はそれ以上の解像度でＸ−線を回析する。更に好ましい実施態様においては、結晶構造は、２オングストロームに等しいか又はそれ以上の解像度でＸ−線を回析する。
【００３３】
他の好ましい実施態様において、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの結晶構造は、表IIの構造座標により特徴付けられる三次元構造を有している。
【００３４】
本発明の他の実施態様は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体の結晶構造であり、そこでは、当該ポリペプチドはＷＷドメインを含んでいない。好ましくは、当該複合体中のポリペプチドは配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含んでいる。
【００３５】
好ましい実施態様において、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体の結晶構造は、３.０オングストロームに等しいか又はそれ以上の解像度でＸ−線を回析する。更に好ましい実施態様においては、結晶構造は、２オングストロームに等しいか又はそれ以上の解像度でＸ−線を回析する。
【００３６】
他の好ましい実施態様において、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体におけるリガンドは、ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性の調節因子である。
【００３７】
好ましい調節因子は、次の化学式を有する。
【化１】
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【００３８】
本発明の他の実施態様は、表IIIの構造座標により特徴付けられる三次元構造を有しているＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：リガンド複合体の結晶構造である。
【００３９】
本発明はまた、表IIIの構造座標により定義されたＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：化合物Ｉ複合体又はその部分の三次元構造を、以下の工程を含んでいる創薬ストラテジーに使用する方法に関するものである：
(ａ) 表IIIの原子座標の一つ又はそれ以上のセットから決定された三次元構造によるコンピューターを用いたドラッグデザインを使用して、薬品候補物質を選択するが、その選択はコンピューターモデルと連係して行ない；
(ｂ) 得られた薬品候補物質を、機能性ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるポリペプチドに接触させ；そして、
(ｃ) 薬品候補物質と当該ポリペプチドとの結合を測定し、そして薬品候補物質が当該
ポリペプチドと結合する場合は、更なる分析のために、当該薬品候補物質を選択する。
【００４０】
ここに記載した他の好ましい方法は、表IIIの構造座標により定義されたＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：化合物I複合体又はその部分の三次元構造を、以下の工程を含んでいる創薬ストラテジーに使用する方法に関するものである：
(ａ) 表IIIの構造座標の一つ又はそれ以上のセットから決定された三次元構造によるコンピュータを用いたドラッグデザインを使用して、薬品候補物質を選択するが、その選択はコンピュータモデルと連係して行ない；
(ｂ) 得られた薬品候補物質を、機能性ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるポリペプチドに接触させ；そして、
(ｃ) ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼを含んでいるポリペプチドのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を当該薬品候補物質が調節するか否かを決定する。
【００４１】
また、表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130, Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154,及び His157の構造座標により定義される結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体と結合する化学物質の存在の可能性を評価する方法を記載するが、それは以下の工程を含んでいる：
(ａ) 化学物質と表IIIに記載したＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130, Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154及び His157の構造座標により定義される結合ポケット間のフィット操作を行なうためのコンピューターを用いた方法を採用し、そして、
(ｂ) 化学物質と結合ポケット間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を分析すること。
【００４２】
表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 Arg54, Arg56, His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73, Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120, Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130, Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154及びHis157の構造座標により定義される結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体と結合する化学物質の存在の可能性を評価する方法を記載するが、それは以下の工程を含んでいる：
(ａ) 化学物質と表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 Arg54, Arg56, His59,
Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73, Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120, Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130, Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154, 及び His157の構造座標により定義される結合ポケット間のフィット操作を行なうためのコンピュータを用いた方法を採用し；そして、
(ｂ) 化学物質と結合ポケット間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を分析すること。
【００４３】
更に、ここに、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインを含んでいる分子調節因子を同定する方法を記載するが、それは以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130, Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154及びHis157の構造座標を、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様の基質−結合ポケットを含んでいる分子の三次元構造を作成するために使用し；
(ｂ) その三次元構造を調節因子のデザイン又は選択に使用し；
(ｃ) その調節因子を合成し又は取得し；そして、
(ｄ) 分子と相互作用する調節因子の能力を決定するために、その調節因子を分子に接触させること。
【００４４】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインを含んでいる分子の調節因子を同定する他の方法を記載するが、それは以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 Arg54, Arg56, His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73, Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120, Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130, Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154及びHis157の構造座標を、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質−結合ポケットを含んでいる分子の三次元構造を作成するために使用し；
(ｂ) その三次元構造を調節因子のデザイン又は選択に使用し；
(ｃ) その調節因子を合成し又は取得し；そして、
(ｄ) 分子と相互作用する調節因子の能力を決定するために、その調節因子を分子に接触させること。
【００４５】
更に、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインを含んでいる分子の調節因子を同定する他の方法は、以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づくＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの全てのアミノ酸の構造座標を、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様の基質−結合ポケットを含んでいる分子の三次元構造を作成するために使用し；
(ｂ) その三次元構造を調節因子のデザイン又は選択に使用し；
(ｃ) その調節因子を合成し又は取得し；そして、
(ｄ) 分子と相互作用する調節因子の能力を決定するために、その調節因子を分子に接触させること。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様は、表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの基質−結合部位のアミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130,
Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154及びHis157の構造座標を含んでいるデータを記録保存した機器読取り可能な媒体である。
【００４７】
他の好ましい実施態様は、表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの基質−結合部位のアミノ酸 Arg54, Arg56, His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73,
Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120,
Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130,
Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154, 及び His157の構造座標を含んでいるデータを記録保存した機器読取り可能な媒体である。
【００４８】
更に、他の好ましい実施態様は、表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ：化合物I複合体の全ての構造座標を含んでいるデータを記録保存した機器読取り可能な媒体である。
【００４９】
本発明はまた、表IIIに記載した構造座標を用いて、未知の構造である分子又は分子複合体についての構造に関する情報を入手する方法を記載するが、それは以下の工程を含ん
でいる：
(ａ)結晶化した分子又は分子複合体からのＸ−線回析データの作成；及び
(ｂ) 分子又は分子複合体の少なくとも一部分についての三次元電子密度マップを作成するために、表IIIに記載した構造座標の少なくとも一つをＸ−線回析パターンに適用すること。
【００５０】
本発明の他の実施態様として、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体と結合する化合物の能力を評価する方法を記載する。その方法は以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130, Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154及びHis157の構造座標により定義される結合ポケットのコンピューターモデルを構築し；
(ｂ) (ｉ) 分子フラグメントを一個の化合物に組み立てること、(ii) 小分子データベースからの化合物の選択、(iii) 化合物の新たな（de novo）リガンドデザイン、及び(iv) ペプチジル−プロリルイソメラーゼの既知の調節因子又はその部分の修飾、からなる群より選択される方法によって評価すべき化合物を選択し；
(ｃ) 結合ポケットにおける化合物のエネルギーを最小とする立体配置を提供するために、評価すべき化合物のコンピューターモデルと結合ポケット間のフィットプログラム操作を行なうためのコンピュータを用いた方法を採用し；そして、
(ｄ) 化合物と結合ポケットモデル間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を評価し、それにより、結合ポケットに結合する化合物の能力を評価すること。
【００５１】
更に、本発明の他の実施態様として、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体と結合する化合物の能力を検定する方法を記載する。その方法は以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 Arg54, Arg56, His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73, Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120, Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130, Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154及びHis157の構造座標により定義される結合ポケットのコンピューターモデルを構築し；
(ｂ) (ｉ) 分子フラグメントを一個の化合物に組み立てること、(ii) 小分子データベースからの化合物の選択、(iii) 化合物の新たな（de novo）リガンドデザイン、及び(iv) ペプチジル−プロリルイソメラーゼの既知の調節因子又はその部分の修飾、からなる群より選択される方法によって評価すべき化合物を選択し；
(ｃ) 結合ポケットにおける化合物のエネルギーを最小とする立体配置を提供するために、評価すべき化合物のコンピュータモデルと結合ポケット間のフィットプログラム操作を行なうためのコンピュータを用いた方法を採用し；そして、
(ｄ) 化合物と結合ポケットモデル間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を評価し、それにより、結合ポケットに結合する化合物の能力を検定すること。
【００５２】
更に、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合部位を含んでいる分子の調節因子を同定する方法を開示しているが、その方法は以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合部位アミノ酸 His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Cys113, Leu122, Met130, Gln131, Phe134, Glu135, Thr152, Ser154及びHis157の構造座標により定義される結合ポケットのコンピュータモデルを構築し；
(ｂ) (ｉ)分子フラグメントを一個の化合物に組み立てること、(ii) 小分子データベースからの化合物の選択、(iii) 化合物の新たな（de novo）リガンドデザイン、(iv) ペプチジル−プロリルイソメラーゼの既知の阻害物質又はその部分の修飾、からなる群より選
択される方法によって評価すべき化合物を選択し；
(ｃ) 結合ポケットにおける化合物のエネルギーを最小とする立体配置を提供するために、評価すべき化合物のコンピュータモデルと結合ポケット間のフィットプログラム操作を行なうためのコンピュータを用いた方法を採用し；
(ｄ) 化合物と結合ポケットモデル間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を評価し、それにより、結合ポケットに結合する化合物の能力を評価し；
(ｅ) 当該化合物を合成し；そして、
(ｆ) 当該分子のＰＰＩアーゼ活性を調節する当該化合物の能力を測定するために、当該分子に当該化合物を接触させること。
【００５３】
好ましい実施態様は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合部位を含んでいる分子の調節因子を同定する方法であり、それは以下の工程を含んでいる：
(ａ) 表IIIに基づいて、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼアミノ酸 Arg54, Arg56, His59, Leu61, Lys63, Ser67, Arg68, Arg69, Ser72, Trp73, Ser111, Asp112, Cys113, Ser114, Ser115, Ala116, Lys117, Ala118, Arg119, Gly120, Asp121, Leu122, Gly123, Ala124, Phe125, Ser126, Arg127, Gly128, Gln129, Met130, Gln131, Lys132, Pro133, Phe134, Glu135, Thr152, Asp153, Ser154及びHis157の構造座標により定義される結合ポケットのコンピュータモデルを構築し；
(ｂ) (ｉ) 分子フラグメントを一個の化合物に組み立てること、(ii) 小分子データベースからの化合物の選択、(iii) 化合物の新たな（de novo）リガンドデザイン、(iv) ペプチジル−プロリルイソメラーゼの既知の阻害物質又はその部分の修飾、からなる群より選択される方法によって潜在的な活性因子又は阻害物質として評価すべき化合物を選択し；
(ｃ) 結合ポケットにおける化合物のエネルギーを最小とする立体配置を提供するために、評価すべき化合物のコンピュータモデルと結合ポケット間のフィットプログラム操作を行なうためのコンピュータを用いた方法を採用し；
(ｄ) 化合物と結合ポケットモデル間の結合を定量化するために、フィット操作の結果を評価し、それにより、結合ポケットに結合する化合物の能力を評価し；
(ｅ) 当該化合物を合成し；そして、
(ｆ) 当該分子のＰＰＩアーゼ活性を調節する当該化合物の能力を測定するために、当該分子に当該化合物を接触させること。
【００５４】
ここに記載した他の方法は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの調節活性を有する化合物をスクリーニングする方法であり、以下の工程を含んでいる：
(ａ) ピンチド(Pintide)−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド複合体を含んでいる検定緩衝液を提供し；
(ｂ) 試験化合物を添加し；そして、
(ｃ) ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ複合体の崩壊を測定する。
【００５５】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの調節活性を有する化合物をスクリーニングする好ましい実施態様は、高速スループットスクリーニング方法であり、以下の工程を含んでいる：
(ａ) マイクロウエルプレートのような複連式容器フォーマット中に、ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド複合体を含んでいる検定緩衝液を提供し；
(ｂ) 試験化合物を添加し；そして、
(ｃ) 複連式容器中におけるピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ複合体の崩壊を測定する。
【００５６】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの調節活性を有する化合物をスクリーニングする他の好ましい実施態様は、高速スループットスクリーニング方法であり、以下の工程を含んでいる：
(ａ)複連式容器フォーマット中に、蛍光−ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプ
チド複合体を含んでいる検定緩衝液を提供し；
(ｂ) 試験化合物を添加し；そして、
(ｃ) 複連式容器中における蛍光−ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ複合体の崩壊を測定する。
【００５７】
更に、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの調節活性を有する化合物をスクリーニングする他の好ましい実施態様は、高速スループットスクリーニング方法であり、以下の工程を含んでいる：
(ａ) 複連式容器フォーマット中に、蛍光−ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド複合体を含んでいる検定緩衝液を提供し；
(ｂ) 試験化合物を添加し；そして、
(ｃ) 複連式容器中における蛍光−ピンチド−ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ複合体の崩壊を、蛍光偏光を用いて測定する。
【００５８】
本特許出願書類は、色彩を施した少なくとも一つの図面を含んでいる。有色彩の図面を含む本特許出願公開の写しは、請求及び必要な料金支払いにより、米国特許商標庁から提供される。
【００５９】
図１は、化合物Ｉに結合したＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）ドメイン構造のリボン−及び−ステイック図である。αへリックスは赤、βストランドは黄色、ターンは青、そして結合セグメントは緑で表示している。右手のパネルは完全長ＰＩＮ１の構造を示している。
図２Ａは、ステイック結合を用いて描写した、化合物Ｉと結合したＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）活性部位の拡大図を示している。化合物Ｉに近接したアミノ酸側鎖はステイック結合及び緑色で表示している。
図２Ｂは、ＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）の活性部位の拡大図及び化合物Ｉの電子密度を示している。
図３は、ＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）溶媒−接近可能な表面を示している。赤色は疎水性領域を、そして青緑色（シアン色）は親水性領域を示している。
図４Ａ：ヒトＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列のリスト
図４Ｂ：トロンビンによる切断後のｐET−２８aから発現したヒトＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸配列。
図５Ａ：突然変異 ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑをコードするヌクレオチド配列のリスト。
図５Ｂ：トロンビンによる切断後のｐET−２８aから発現したＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑのアミノ酸配列のリスト。
図６：His−タグＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼよる化合物Ｉの熱量測定滴定の図解。
【００６０】
本発明の詳細な説明及び好適な実施態様
ここで使用されている用語「構成する、含んでいる(comprising)」及び「含んでいる(including)」は、広義の意味で非制限的に使用される。
【００６１】
本発明は、当業者に既知の従来の微生物学及び組換えＤＮＡ技術を使用している。例えば、Sambrook他, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,”3rd ed.(2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Glover, ed., “DNA Cloning: A Pracical Approach,” 第I及びII巻, 2nd (1995), IRL Press, Oxford; Ausbel他, eds.“Current Protocols in Molecular Biology”(1994) Green Publishers Inc.及びWiley and Sons, New York; Innes他, eds. “PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications”(1990) Academic Press, San Diego; Freshney “Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,” 4th ed.(2000) Wiley & Sons;及びPerbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning,”2nd ed.(1988) Wiley & Sonsを参照。
【００６２】
Ａ．核酸及びポリヌクレオチド
本発明は、改善された結晶学的特性を有する突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインをコードする、単離した核酸分子を提供するものである。そのような改善された特性には、結晶形において野生型ＰＩＮ１よりもリガンドにより良く結合する能力、及びホスフェート又はサルフェートなしで結晶化する能力を含んでいる。ホスフェート又はサルフェートの非存在下においては、基質結合ポケットは化合物の結合に関して影響を受け易い。
【００６３】
用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本出願においては相互交換可能に使用される。これらの用語は、如何なるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドにも当てはまり、それは非修飾のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡであってもよい。これらの用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体をも含んでいる。典型的なポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域、又は一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含んでいるハイブリッド分子で、それは一本鎖、二本鎖及び三本鎖領域であってもよく、また、一本鎖及び二本鎖領域の混合であってもよい。更に、ここで使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡ双方からなる三本鎖領域にも当てはまる。そのような領域における鎖は、同一分子又は異なる分子由来であってもよい。この領域は、一つ又はそれ以上の分子の全部を含んでいてもよく、更に好ましくは、いくつかの分子のある領域のみを含む。トリプルヘリカル領域の分子の一つは、オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
典型的なポリヌクレオチド及び核酸分子は、上述したように、一つ又はそれ以上の修飾した塩基を含んでいるＤＮＡ又はＲＮＡもまた含んでいる。更に、イノシンのような通常でない塩基、又はトリチル化された塩基のような修飾された塩基を含んでいるＤＮＡ若しくはＲＮＡは、典型的なポリヌクレオチドである。典型的なポリヌクレオチド及び核酸分子はまた、ポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に、又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス、及び例えば、単一又は複合細胞のような細胞のＤＮＡ及びＲＮＡ特性を有する化学的形態を含んでいる。典型的なポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドといわれる短いポリヌクレオチドをも含んでいる。
【００６５】
ここで使用されている用語「単離した」核酸分子とは、当該物質が通常見られるような自然環境下で存在する蛋白質及び他の核酸を含んでいない核酸分子を意味する。特に、核酸分子は細胞成分を含んでいないことを意味する。典型的な単離した核酸分子は、ＰＣＲ産物、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は制限フラグメントを含んでいる。他の実施態様においては、単離した核酸分子は、好ましくは、それが存在している染色体から取り出されたものであり、更に好ましくは、自然環境下で染色体中に存在する遺伝子の上流又は下流領域に位置している非制御領域、非コード領域又はその他の遺伝子に結合しないことである。更に、他の実施態様においては、単離した核酸分子は一つ又はそれ以上のイントロンを欠損している。単離した核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体及びその他のものに挿入することができる。このように、特定の実施態様においては、組換え核酸はまた単離した核酸である。更に、ｃＤＮＡ分子のような「単離した」核酸分子は、実質的に、組換え技術により生成した場合は他の細胞物質又は培地を、そして化学的に合成した場合は化学的前駆体又は他の化学物質を含んでいないものである。しかしながら、核酸分子は、他のコード配列又は制御配列と融合することができるが、尚、これらも単離したものとして考慮すべきである。
【００６６】
例えば、ベクターに含まれている組換えＤＮＡ分子は、単離したものである。更に、単離したＤＮＡ分子の他の例には、異種の宿主細胞中に保持されている組換えＤＮＡ分子、又は溶液中の精製した（部分的に又はかなりの部分）ＤＮＡ分子も含まれる。典型的な単離したＲＮＡ分子には、ここに記載した単離したＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロのＲＮＡ転写物も含まれる。更に、典型的な単離した核酸分子には、合成的に作成
されたこれらの分子も含まれる。
【００６７】
完全長遺伝子又はそれらの部分は、当業者に既知の種々の適当な方法の如何なる一つを用いてクローニングすることができる。例えば、長鎖ＤＮＡを増幅するために、ＸＬ−ＰＣＲ(Perkin-Elmer, Foster City, Calif.) を用いた方法を使用することができる。
【００６８】
単離した核酸分子には、例えば、蛋白質輸送を容易化し、蛋白質の半減期を延長若しくは短縮し、又は検定若しくは作成のための蛋白質の操作を容易化するような、機能的ポリペプチド及び付加的アミノ酸又はカルボキシ末端のアミノ酸をコードすることができる。完全長遺伝子が一旦クローニングされれば、ＰＰＩアーゼドメインのような遺伝子の部分を既知の方法により入手することができる。本発明の単離した核酸分子は、活性なＰＰＩアーゼのみをコードするか又はリーダー配列若しくはセクレタリー配列（例えば、プレ−プロ若しくはプロ蛋白質配列）のような、他のコード配列と組み合わせた配列、付加的コード配列と共に又は単独で、ＰＰＩアーゼドメインをコードする配列、並びに、付加的な非コード配列、例えば、イントロン及び転写されるが翻訳されない配列で、それらは転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライス及びポリアデニル化シグナルを含む。）、リボソ−ム結合、及びｍＲＮＡ安定化の役割を果たす非コード５'及び３'配列を含んでいる。更に、当該核酸分子は、例えば、精製を容易化するペプチドをコードするマーカー配列に融合することができる。
【００６９】
単離した核酸分子は、クローニングにより得られるか、又は既知の化学的合成技術若しくはそれらの組合せにより生成された、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、又はｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含んでいるＤＮＡの形態である。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖である。一本鎖核酸は、コード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【００７０】
更に、本発明は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの機能的フラグメント又は変異体をコードする核酸分子を提供するものである。そのような核酸分子は、既知の組換えＤＮＡ方法又は化学的合成により構築される。そのような非天然型の変異体は、核酸分子、細胞又は生物に適用する技術を含んで、突然変異誘発技術により作成することができる。それ故、変異体はヌクレオチド置換、欠損、変換、及び挿入を含んでいる。変異はコード及び非コード領域で生じ得る。当該変異体は、保存的及び非保存的アミノ酸置換のいずれをも生成することができる。
【００７１】
本発明に係る核酸分子は、結晶化研究、創薬、及びドラッグデザインにおいて使用するペプチド生成に有用である。核酸分子は、核酸分子の如何なる領域をも増幅するため、ＰＣＲのプライマーとしても使用することができ、また所望の長さ及び配列のアンチセンス分子を合成するためにも有用である。
【００７２】
核酸分子はまた、組換えベクターの構築にも有用である。そのようなベクターは、ペプチド配列の全部又は部分を発現する発現ベクターを含んでいる。ベクターはまた、遺伝子及び／又は遺伝子産物のインサイチュ発現を変異させるために、細胞ゲノムのような、他の核酸分子配列中に組み込むために使用する挿入ベクターを含んでいる。例えば、外因性コード配列を、相同的組換えを経由して、一つ又はそれ以上の特異的に導入した変異を含んでいるコード領域の全部又は一部分と置換することができる。
【００７３】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの部分又は全部を発現する宿主細胞の構築にも有用である。
【００７４】
ベクター及び宿主細胞
本発明はまた、ここに記載した核酸分子を含んでいるベクターを提供するものである。ベクターが核酸分子であるときは、ここに記載した核酸分子は、ベクター核酸に共有結合で結合している。本発明に係るこの実施態様の典型的なベクターは、プラスミド、一本鎖若しくは二本鎖ファージ、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、若しくはＭＡＣのような人工染色体を含んでいる。種々の発現ベクターは、ｐＥＴ及びｐＰｒｏＥＸのような本発明のポリヌクレオチドを発現するのに使用することができる。
【００７５】
ベクターは、外来の染色体要素として宿主細胞中に維持され、そこで複製し、そして核酸分子の付加的コピーを産生する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして宿主細胞が複製するときに核酸分子の付加的コピーを作成する。
【００７６】
ベクターは、核酸分子の維持（クローニングベクター）又は発現（発現ベクター）として用いることができる。ベクターは、真核細胞若しくは原核細胞、又は双方（シャトルベクター）において作用することができる。
【００７７】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合し、その結果、核酸分子の転写が宿主細胞中で許容されるシス−作動制御領域を含んでいる。核酸分子は、転写に影響を与えることができる別個の核酸分子と共に宿主細胞中に導入することができる。このように、ベクター由来の核酸分子の転写が許容されるように、第二の核酸分子はシス−作動調節制御領域と相互作用するトランス−作動因子を提供することができる。あるいは、宿主細胞が、トランス−作動因子を提供することができる。最終的に、トランス−作動因子は、ベクター自身から産生することもできる。しかしながら、或る実施態様においては、核酸分子の転写及び／又は翻訳は、無細胞系においても行なうことができる。
【００７８】
ここに記載した核酸分子が、作動可能に結合することができる典型的な制御配列は、ｍＲＮＡ転写を導くプロモーターを含んでいる。これらは、バクテリオファージλ由来の left プロモーター、大腸菌（E.coli)由来のlac プロモーター、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期又は後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター、アデノウイルス初期又は後期プロモーター、及びレトロウイルスの長末端反復を含んでいる。
【００７９】
ここで使用した用語「作動可能に結合」とは、遺伝子及びプロモーターのような制御配列が、適当な分子（例えば、転写活性化因子蛋白質又は転写活性化ドメインを含んでいる蛋白質）が制御配列に結合したときに、遺伝子発現を許容するように結合していることを意味する。
【００８０】
転写を促進する調節領域に加えて、典型的な発現ベクターは、リプレッサー結合部位及びエンハンサーのような転写を調節する領域を含んでいる。説明的に記載した実施態様には、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、及びレトロウイルスＬＴＲエンハンサーを含んでいる。
【００８１】
転写の開始及び調節部位を含んでいることに加えて、典型的な発現ベクターは、転写終止に必要な配列を含むことができる。これらのベクターはまた、リボソーム結合部位のような翻訳に必要なシグナルをも含むことができる。他の例示的な発現制御の調節因子は、
開始及び終止コドン並びにポリアデニル化シグナルを含んでいる。他の制御配列の例は、例えば、上記のSambrook他, 2001 に記載されている。
【００８２】
種々の発現ベクターは、核酸分子の発現に使用することができる。そのようなベクターの例には、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクターが含まれ、例えば、細菌性プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母人工染色体を含む酵母の染色体要素由来、及びバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターが含まれる。ベクターはまた例えば、コスミド及びファージミドのようなプラスミド及びバクテリオファージの遺伝子要素由来のように、異なる起源の組合せに由来することも可能である。原核生物及び真核生物の宿主の適当なクローニング並びに発現ベクターについては、上記のSambrook他, 2001 に記載されている。
【００８３】
制御配列は、一つ又はそれ以上の宿主細胞の構成性発現（即ち、組織特異的）を提供することができ、又は、一つ又はそれ以上の細胞型において、例えば、温度、栄養添加物、又はホルモン若しくは他のリガンドのような外来因子によって誘導的発現を提供することができる。原核生物及び真核生物の宿主における構成性発現及び誘導的発現を提供する適当なベクターは、当業者にとって既知のものである。
【００８４】
核酸分子は、既知の方法論により、ベクター核酸中に挿入することができる。例えば、興味あるＤＮＡを、ＤＮＡ配列及びベクターを一つ又はそれ以上の制限酵素を用いて切断し、その後にフラグメントを共に連結することによってベクターに結合することができる。
【００８５】
適当な核酸分子を含んでいるベクターは、既知の技術を用いて増殖又は発現させるために、適当な宿主細胞に導入することができる。適当な細菌の宿主細胞には、大腸菌（E.coli)、ストレプトミセス、ネズミチフス菌が含まれる。適当な真核生物宿主細胞には、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯのような動物細胞、並びに植物細胞が含まれる。
【００８６】
好ましい実施態様において、ここに記載したペプチドは、融合蛋白質として発現される。その結果、本発明はまたそのようなペプチドを生成することができる融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは、組換え蛋白質の発現を増加させ、組換え蛋白質の溶解度を増大させ、及び／又は当該蛋白質の精製を、例えば、アフィニテイ精製のリガンドとして作用させることにより補助する。蛋白質切断部位は、融合残基の結合部に導入することができ、その結果、所望のペプチドが融合部分から最終的に分離することができる。典型的な蛋白質切断酵素には、ファクターＸａ、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。例示的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ(Smith他, Gene 67:31-40(1988))、ｐＥＴ２８ａ (Novegen, Madison, WI)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs,Beverly, MA)及びｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ) が含まれるが、それらは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ−結合蛋白質、又はプロテインＡを標的組換え蛋白質に融合させる。適当な誘導性非−融合の大腸菌（E.coli)の発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amann et a., Gene 69:301-315(1988))及びｐＥＴ１１ｄ (Studier他, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology, 185:60-89(1990))が含まれる。
【００８７】
組換え蛋白質の発現は、組換え蛋白質の蛋白質分解を減少させる能力を宿主細胞が有するような遺伝的背景を与えることによって、宿主細菌において最大にすることができる(Gottesman, Gene Expression Technology：Methods in Enzymology, 185:119-128(1990))。あるいは、興味ある核酸分子の配列は、特定の宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli)に使用される好適なコドンを与えるために、変更することができる(Wada他, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118(1992))。
【００８８】
核酸分子はまた、酵母で作動可能な発現ベクターにより発現させることができる。酵母、例えばS.cerevisiaeでの発現のためのベクターの例としては、例えば、pYepSec 1(Baldari他, EMBO J. 6:229-234(1987)), pMFa (Kurjan他, Cell 30:933-943(1982)), pJRY88(Schulz他, Gene 54:113-123(1987)),及び pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)を挙げることができる。
【００８９】
核酸分子はまた、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させることができる。典型的には、培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中で蛋白質を発現させることができるバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系(Smith他, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165(1983))及びｐＶＬ系(Lucklow他, Virology 170:31-39(1989))が含まれる。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様において、ここに記載した核酸分子は、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳類の細胞中でも発現される。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, Nature 329:840(1987))及びｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman他, EMBO J. 6:187-195(1987))が含まれる。
【００９１】
好ましい発現ベクターには、pET28a(Novagen, Madison, WI)、pAcSG2(Pharmingen, San
Diego, CA)、pProEx( Life Technologies, Gaithersburg, MD) 及びpFastBac(Life Technologies) が含まれる。ここに記載した核酸分子の増殖又は発現を維持するために適当なその他のベクターは、当業者にとって既知のものである。例えば、適当なベクター及びそれを使用して増幅する方法については、上記のSambrook他, 2001 に記載されている。
【００９２】
本発明はまた、ここに記載したベクターを含んでいる組換え宿主細胞にも関するものである。典型的な宿主細胞には、原核細胞、酵母のような下等な真核細胞、昆虫細胞のような他の真核細胞、及び哺乳類細胞のような高等な真核細胞が含まれる。
【００９３】
組換え宿主細胞は、ここに記載したベクター構築物を、当業者にとって利用可能な技術によって細胞中に導入することによって調製することができる。これらは、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン−仲介形質移入、陽イオン脂質−仲介形質移入、電気穿孔、形質導入、感染、リポフェクションを含んでいる。更に、上記のSambrook他, 2001 を参照することができる。
【００９４】
ここに記載したペプチドを発現する組換え宿主細胞には、種々の使用がある。例えば、当該細胞は、本発明に係るポリペプチドの作成に有用であり、そしてそれは、結晶学的研究、生化学的研究、及び創薬に用いることができる。
【００９５】
宿主細胞は、一つより多くのベクターを含むことができる。このように、異なるヌクレオチド配列は、同一細胞の異なるベクターに導入することができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターにトランス−作動因子を提供するような、上記核酸分子に関するものではない他の核酸分子と共に導入することができる。細胞に一つより多くのベクターが導入された場合は、当該ベクターは、独立に若しくは同時に導入されるか、又はＰＰＩアーゼポリヌクレオチドベクターに結合されことができる。
【００９６】
バクテリオファージ及びウイルスベクターの場合は、これらは、感染及び形質導入の標準的な工程により、パッケージ又はカプセル化ウイルスとして細胞の中に導入することができる。ウイルスベクターは、複製可能又は複製不全であってもよい。ウイルス複製が不
全の場合は、その不全を補完する作用因子を与えることによって宿主細胞中で複製を行なわせることができる。
【００９７】
典型的なベクターは、組換えベクター構築物を含んでいる細胞のサブ集団の選択を可能とする選択的マーカーを含んでいる。当該マーカーは、ここに記載した核酸分子を含んでいる同一ベクターに含ませることができるが、又は別個のベクターに含ませることもできる。典型的なマーカーには、原核生物の宿主細胞の場合は、テトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、そして真核生物の宿主細胞の場合は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性を含ませることができる。しかしながら、表現型形質を選択する如何なるマーカーをも使用することができる。
【００９８】
Ｂ．ペプチド、蛋白質及び抗体
ここでは、以下のアミノ酸の略語を使用している：Ａ＝Ａla＝アラニン；Ｖ＝Ｖal＝バリン；Ｌ＝Ｌeu＝ロイシン；Ｉ＝Ｉle＝イソロイシン；Ｐ＝Ｐro＝プロリン；Ｆ＝Ｐhe＝フェニルアラニン；Ｗ＝Ｔrp＝トリプトファン；Ｍ＝Ｍet＝メチオニン；Ｇ＝Ｇly＝グリシン；Ｓ＝Ｓer＝セリン；Ｔ＝Ｔhr＝トレオニン：Ｃ＝Ｃys＝システイン；Ｙ＝Ｔyr＝チロシン：Ｎ＝Ａsn＝アスパラギン；Ｑ＝Ｇln＝グルタミン；Ｄ＝Ａsp＝アスパラギン酸；Ｅ＝Ｇlu＝グルタミン酸；Ｋ＝Ｌys＝リシン；Ｒ＝Ａrg＝アルギニン；Ｈ＝Ｈis＝ヒスチジン。
【００９９】
ここで使用されているように、用語「ペプチジル−プロリルイソメラーゼ」及び「ＰＰＩアーゼ」は、プロリル残基前のペプチド結合のシス／トランス異性化反応を促進する酵素を意味する。
【０１００】
用語「突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ」は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインを含んでいるが、ＰＩＮ１ ＷＷドメインは欠損しているポリペプチドを意味する。これらの突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドはまた、それらのＰＰＩアーゼドメイン中に、別個のアミノ酸置換を含むことができる。
【０１０１】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は変更されたペプチド結合によって互いに結合した、二つ又はそれ以上のアミノ酸を含んでいる如何なるペプチド又は蛋白質、即ち、ペプチド等配電子対(アイソスター)(isostere)を意味する。「ポリペプチド」は、短鎖（通常はペプチドという。）、オリゴペプチド又はオリゴマー、及び長鎖（通常は蛋白質という。）の双方を意味する。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「蛋白質」は、ここでは、相互交換可能なものとして用いている。
【０１０２】
ここで使用されているように、ペプチドが、相同な細胞物質又は化学的前駆体若しくは他の化学物質を本質的に含んでいないときは、「単離した」又は「精製した」と呼ぶこととする。本発明に係るペプチドは、均一になるまで又は他の純度の程度までに精製することができる。精製の程度は使用目的に応じて選択することができ、たとえ他の成分のかなりの量が存在していても、当該ペプチドの所望する機能が得られる限りその標品は許容される。
【０１０３】
或る実施態様においては、「細胞物質を本質的に含んでいない」とは、ペプチド標品が含む他の蛋白質（例えば、混入蛋白質）が約３０％（乾燥重量）未満であることを意味する。好ましい実施態様においては、ペプチド標品は、他の蛋白質を約２０％未満、更に好ましい実施態様においては、他の蛋白質を約１０％未満、特に好ましい実施態様においては、他の蛋白質を約５％未満しか含まない。ペプチドが組換え技術で作成されたときは、培地を本質的に含んでいないことを意味し、すなわち、培地が蛋白質標品容量の約２０％
未満であることを意味する。
【０１０４】
用語「化学的前駆体若しくは他の化学物質を本質的に含んでいない」とは、ペプチド標品が、合成に関与した化学的前駆体若しくは他の化学物質から分離されていることを意味する。当該用語「化学的前駆体若しくは他の化学物質を本質的に含んでいない」とは、突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼのポリペプチド標品が、化学的前駆体若しくは他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満しか含んでいないことを意味する。好ましい実施態様においては、ペプチド標品は、化学的前駆体若しくは他の化学物質を約２０％未満、更に好ましい実施態様においては、化学的前駆体若しくは他の化学物質を約１０％未満、特に好ましい実施態様においては、化学的前駆体若しくは他の化学物質を約５％未満しか含まない。
【０１０５】
ここに記載した単離した変異ＰＰＩアーゼポリペプチドは、その発現が変異した（組換え）又は既知の蛋白質合成技術を用いて合成した細胞から精製することができる。例えば、ＰＰＩアーゼポリペプチドをコードする核酸分子を、発現ベクターにクローニングし、その発現ベクターを宿主細胞中に導入し、そして蛋白質を宿主細胞中で発現させる。発現した蛋白質は、標準的蛋白質精製技術を用いた適当な精製系によって細胞から単離することができる。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、細菌、酵母、哺乳類細胞及び他の細胞中で、適当な制御配列の調節下において作成することができるが、無細胞系の転写及び翻訳システムもまた、ここに記載したＤＮＡ構築物から誘導したＲＮＡを用いて、これらの蛋白質を作成するために使用することができる。
【０１０７】
ペプチドの分泌を所望するときは、適当な分泌シグナルをベクター中に組み込めばよい。シグナル配列は、ペプチドに対し内因性であっても又はこれらのペプチドにとって異種性であってもよい。
【０１０８】
ここに記載したペプチドの組換え技術による生成において、ペプチドは、宿主細胞に依存して種々の糖鎖形成型をとることができ、細菌中での生成においては、非糖鎖形成型をとる。或る実施態様において、ペプチドは宿主仲介工程の結果として、初期修飾のメチオニンを含むことができる。
【０１０９】
本発明はまた、ペプチドの対立遺伝子／配列の変異、ペプチドの非天然的に発生する組換え技術で誘導した変異のような、上述したペプチドの変異を提供するものである。そのような変異は、組換え核酸技術及び蛋白質生化学の分野における当業者にとって既知である技術を用いて作成させることができる。
【０１１０】
そのような変異は、ここに記載した分子技術及び配列情報を用いて容易に作成し、また同定することができる。更に、そのような変異は、本発明に係るペプチドとの配列及び／又は構造相同性に基づいて、他のペプチドから容易に区別することができる。
【０１１１】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、当該配列を最適な比較の目的に適するように整列させた（例えば、最適な整列を得るために、ギャップを第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一つ若しくは両方に導入し、及び比較の目的のためには、非相同性配列は無視することができる。）。好ましい実施態様においては、比較の目的のために整列させた対照配列の長さは、対照配列の全長に対して少なくとも３０％、好ましくは４０％、更に好ましくは５０％、特に好ましくは６０％又はそれ以上である。好ましい実施態様においては、比較の目的のために整列させた対照配列の長さは、対照配列の全長に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、更に好ましくは９０％又はそれ以上である。その後に、アミノ酸配置又は核酸配置に対応するアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較した。第二配列の配置に対応して、第一配列の配置が同一アミノ酸残基又はヌクレオチドで占められたとき、分子はその配置において同一であるといえる（ここで使用するアミノ酸又は核酸の「同一」とは、アミノ酸又は核酸の「相同」と均等である。）。二つの配列間の同一性パーセントは、二つの配列の最適な整列を得るために導入したギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、その配列により占められた同一配置の数の関数である。
【０１１２】
配列の比較並びに二つの配列間の同一性パーセント及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて求めることができる(Lesk, ed., “Computational Molecular Biology”(1988) Oxford University Press, New York; Smith, ed.,“Biocomputing: Informatics and Genome Project”(1993) Academic Press, New York; Griffin他, eds., “Computer
Analysis of Sequence Data, Part 1”(1994) Humana Press, New Jersey; von Heinje,“Sequence Analysis in Molecular Biology” (1987) Academic Press: 及び Gribskov他 eds.,“Sequence Analysis Primer”(1991) Stockton Press, Hew York)。例えば、二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Needleman他のアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970))を用いて決定することができるが、このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰのような、市場で入手可能なコンピュータプログラムに組み込まれていて、Blossom 62マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイト（gap weight）、及び１、２、３、４、５又は６の長さウェイト（length weight）を用いる。二つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントも、市場で入手可能なコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧソフトウエアパッケージ中のＧＡＰプログラム(Devereux他, Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984))で、ＮＷＳギャップＤＮＡ ＣＭＰマトリックス並びに４０、５０、６０、７０又は８０のギャップウェイト及び１、２、３、４、５又は６の長さウェイトを用いて、計算することができる。二つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントも、Meyers他のアルゴリズム(CABIOS,4:11-17(1989))を用いて決定することができるが、このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮ(バージョン2.0)のような、市場で入手可能なコンピュータプログラムに組み込まれていて、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表(weight residue table)、１２のギャップ長さに対するペナルテイ(gap length penalty)及び４のギャップペナルテイ(gap penalty)を用いて計算することができる。
【０１１３】
更に、本発明に係る核酸及び蛋白質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連する配列との同一性を探すために配列データベースを検索するため、「問合せ配列」として用いることができる。そのような検索は、Altschul他のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）(Altschul他, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)) のような、市場で入手可能な検索エンジンを用いて行なうことができる。ヌクレオチド検索は、本発明に係る核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、上記のプログラムを用いて行なうことができる。蛋白質検索は、本発明に係る蛋白質に相同なアミノ酸配列を得るために、上記のプログラムを用いて行なうことができる。比較の目的のためのギャップアラインメント（gapped alignment）を得るためには、Altschul他によって記載されているように、ギャップド（gapped）ＢＡＬＳＴを使用することができる(Altschul他,Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402(1997))。
【０１１４】
本発明に係るペプチドとの配列相同性／同一性を高い程度（有意義）に有するペプチドを、常用的(routinely)に同定することができる。ここで使用する場合、二つの蛋白質（又は蛋白質の領域）は、アミノ酸配列が典型的に、少なくとも約７０−７５％の相同性を有する場合は、「有意義な相同性」を有しているといえる。好ましい実施態様においては、相同性は８０−８５％、更に好ましくは、少なくとも約９０−９５％である。有意義に相同であるアミノ酸配列は、緊縮(stringent)条件下で、核酸分子をコードするペプチドにハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。
【０１１５】
本発明に係るポリペプチドの非天然型変異は、組換え技術を用いて発生させることができる。そのような変異体は、ＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸配列における欠損、付加及び置換を含んでいる。例えば、置換の一つの型は、保存的アミノ酸置換である。そのような置換は、ペプチドの或るアミノ酸が同じ特性の他のアミノ酸によって置換される。典型的な保存的置換は、脂肪族アミノ酸（Ａla、Ｖal、Ｌeu及びＩle）中での互いの置換、水酸基を含んでいるアミノ酸（Ｓer及びＴhr）の入れ替え、酸性残基を含んでいるアミノ酸（Ａsp及びＧlu）の交換、アミド残基を含んでいるアミノ酸（Ａsn及びＧln）間の置換、塩基残基を含んでいるアミノ酸（Ｌys及びＡrg）の交換、及び芳香族残基を含んでいるアミノ酸（Ｐhe及びＴyr）中の置換である。表現型には現われないアミノ酸変換についての手引書は、Bowie他, Science 247:1306-1310(1990) 中に見出すことができる。
【０１１６】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ変異体は、野生型蛋白質と比較した場合、完全に機能するか、又は縮小した若しくは減少した活性を有している。完全に機能する変異体は、保存的な変異又は重要でない残基若しくは重要でない領域における変異を含むことができる。また機能的変異体は、類似するアミノ酸の置換であって機能的に変化しないか、又は重要ではない変化でしかなく機能的に影響を与えることはない置換をも含むことができる。一方では、そのような置換は、或る程度において、機能的にポジテイブに又はネガテイブに影響を与えることがある。
【０１１７】
典型的な非機能的変異体は、一つ又はそれ以上の非保存的アミノ酸の置換、欠損、挿入、変換、若しくは特定のポリペプチドの切断、又はポリペプチドの重要な残基若しくは重要な領域における置換、挿入、変換、若しくは欠損を有している。
【０１１８】
機能に影響を与えるアミノ酸は、部位特異的突然変異又はアラニン走査(alanine-scanning)突然変異(Cunningham他, 1989, Science 244:1081-1085)のような当業者にとって既知の方法によって同定することができる。後者の工程により、分子中の全ての残基において単一のアラニン突然変異を生じさせることができる。その結果得られた突然変異分子は、生物活性を、例えば、酵素活性を測定することにより検定することができる。結合にとって重要な部位は、Ｘ−線結晶解析、核磁気共鳴、又は光親和性(photoaffinity)標識(Smith他, J. Mol. Biol. 224:899-904(1992);de Vos他, Science 255:306-312(1992)) のような構造分析により決定することができる。その結果、本発明に係るペプチドは、誘導体又は類似体をも含んでいるが、そこにおける置換したアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされたものではないか；その中には置換基も含まれているか；ポリペプチドは、ポリペプチドの半減期を増大する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合されているか；又は、その中には、付加的なアミノ酸がリーダー若しくはセクレタリー配列、又はポリペプチドの精製のための配列のようなポリペプチドに融合されている。
【０１１９】
更に、本発明は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインの機能的な活性フラグメントをも提供するものである。「フラグメント」は、アミノ酸配列を有している変異ポリペプチドであり、それは本発明に係る如何なるポリペプチドの如何なるアミノ酸配列と、全体ではなく部分的にではあるが、完全に同一なものである。本発明に係る突然変異ＰＩＮ１ポリペプチドと共に、フラグメントはより大きなポリペプチドの中に、その一部として又は領域を形成して構成されているか、或いは独立に存在している（freestanding）が、最も好ましくは、それらは単一のより大きなポリペプチドの中に、単一の連続領域として存在している。ここで使用したように、「フラグメント」とは、ＰＰＩアーゼドメイン蛋白質由来の少なくとも８個の又はそれ以上の連続アミノ酸残基から構成されている。そのようなフラグメントは、ＰＰＩアーゼドメインの生物学的活性を維持するための能力に基づき、又
は機能を作動するための能力、例えば免疫原として作用するための能力に基づいて選択することができる。好ましくは、フラグメントは、触媒的に活性であり、かつ完全長の野生型ＰＩＮ１と比較して改善された結晶学的特性を有している。そのようなフラグメントは、好ましくは、ＰＰＩアーゼのドメイン又はモチーフ、例えば、活性部位又は結合部位を含んでいる。
【０１２０】
ポリペプチドは、２０個の天然アミノ酸に通常言及される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいる。更に、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、副経路、及び他の翻訳後の修飾のような天然に起こる工程により、又は当業者に既知である化学的修飾技術により修飾され得る。既知の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム残基の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチン形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、フェニル化、ラセミル化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニル化のような転移−ＲＮＡ仲介による蛋白質へのアミノ酸添加、及びユビキチン化が含まれる。グルコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水酸化、及びＡＤＰ−リボシル化のような修飾については、例えば、最も基礎的な教科書であるCreighton“Protein-Structure and Molecular Properties,” 2nd ed. (1993) W.H. Freeman and Company, New York に記載されている。この表題の概説書には、Wold, “Posttranslational Covalent Modification of Proteins,”Johnson, ed., Academic Press, New York 1-12(1983); Seifter他, (Meth. Enzymol. 182:626-646(1990)): 及び Ratten他, (Ann. N.Y. Acad. Sci.663:48-62(1992)) が含まれる。
【０１２１】
或る実施態様においては、ペプチドは、異種の配列に結合し、キメラ又は融合蛋白質を形成することができる。そのようなキメラ及び融合蛋白質は、ＰＰＩアーゼペプチドに実質的に相同でないアミノ酸配列を有している異種の蛋白質に作動可能に結合したペプチドを含んでいる。「作動可能に結合」とは、ペプチド及び異種蛋白質がインフレームで融合していることを意味する。異種蛋白質は、ＰＰＩアーゼペプチドのＮ−末端又はＣ−末端に融合することができる。融合ペプチドに結合している二つのペプチドは、好ましくは、二つの独立した起源から誘導したものであり、そしてそれ故、そのような融合ペプチドは、天然には通常見られない二つの結合したペプチドを含んでいる。
【０１２２】
或る実施態様においては、融合蛋白質は、ペプチド自身の活性には影響しない。例えば、融合蛋白質は、酵素の融合蛋白質、又は、アフィニテイタグ、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ融合、酵母ツー−ハイブリッドＧＡＬ融合、Ｈｉｓ−タグ、ＭＹＣ−タグ、緑色融合蛋白質、及びＩｇ融合を含むことができる。そのような融合蛋白質は、ここに記載したポリペプチドの精製を容易化することができる。或る宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）、蛋白質の発現及び／又は分泌を、異種シグナル配列を用いることによって増大させることができる。
【０１２３】
キメラ又は融合蛋白質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により作成することができる。例えば、異なる蛋白質配列をコードするＤＮＡフラグメントコーディングは、従来の技術に従って互いにインフレームで連結される。他の実施態様において、融合遺伝子は自動化されたＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することができる。一方、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、二つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的な突出を生じさせるアンカープライマーを用いて行われ、続いてアニール化し、そして再増幅してキメラ遺伝子配列を生じさせることができる（上記のAusubel他, 1992 参照）。更に、多くの発現ベクター、融合部分を既にコードしているもの（例えば、ＧＳＴ蛋白質、Ｈｉｓ−タグ、緑色
蛍光蛋白質）が市販されている。ＰＰＩアーゼポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクター中にクローン化され、その結果融合部分を、ＰＰＩアーゼポリペプチドにインフレームで連結することができる。
【０１２４】
ポリペプチドは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性を阻害又は調節する化合物を同定するために、迅速スクリーニング法（高速スループットスクリーニング法）に使用することができる。高速スループットスクリーニング検定は、ロボットワークステーションによる完全自動化によって行なうことができる。検定には、放射能標識、蛍光、又は他の検出に有用な物質を用いることができる。
【０１２５】
ここで使用する「高速スループットスクリーニング法」とは、複数の候補物質又は標品を同時にスクリーニングすることができる検定法をいう。好ましくは、検定する候補物質又は標品の数が、一つ以上であり、更に、好ましくは、１００以上であり、特に好ましくは、３００以上である。そのような検定には、マイクロタイター プレート、又は多くの検定を同時に行なうことができる機器を含む他の容器の使用を含むことができる。
【０１２６】
Ｃ．結晶化及びドラッグデザイン
本発明に係るポリペプチド又はそのようなポリペプチドのリガンド複合体の結晶は、バッチ結晶化、蒸気拡散（静滴(sitting drop)又は懸滴）、及びマイクロダイアリシスのような種々の既知の技術により作成することができる。或る場合には、結晶のシーディングが、Ｘ−線回析用の品質の結晶を得るために必要とされる。それ故、結晶の標準的なミクロ及び／又はマクロシーディングが使用される。下記に例示したように、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ化合物Ｉ複合体は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼを１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、そしてそれを最終濃度が１ｍＭとなるように１００％ＤＭＳＯに溶解された化合物Ｉに暴露して調製することができる。得られた蛋白質／化合物Ｉの溶液を、４℃で２４時間インキュベートした後、結晶化実験を開始する前に、０.４５μＭ酢酸セルロース膜で濾過した。これらの条件下では、結晶は３日以内に成長した。
【０１２７】
本発明に係る結晶が一旦成長すると、Ｘ−線回析データを採集することができる。Ｘ−線回析データの採集は、例えば、ＭＡＲイメージプレート検出器を用いて得ることができる。結晶は、従来の発生源（密閉管若しくは回転アノード等）又はシンクロトロン発生源（例えば、Stanford University Synchrotron Radiation Laboratory により提供）を用いて発生したＸ−線を使用して、特性決定をすることができる。
【０１２８】
データ処理及び整理は、DENZO／SCALEPACK(HKL Research, Inc., Charlottesvilee, VA; Otwinowski他, Meth. Enzymol. 276:307-326(1997)) のようなプログラムを用いて行なうことができる。更に、X-PLOR(Brunger,“X-PLOR: A System for X-ray Chrystallography and NMR”Yale University Press, New Haven, Conn (1992)) 又は Heavy (Terwilliger, Los Alamos National Laboratory) は、バルク溶媒補正及びＢ−ファクタースケーリングに使用することができる。電子密度マップは、SHARP(La Fortelle他, Meth. Enzymol. 276:472-494(1997)) 及び SOLOMON(Abrahams他, Acta Cryst. D52:30-42(1996))を用いて計算することができる。分子モデルは、Ｏ(Jones他, ACTA Crystallogr. A47:110-119(1991))、XTALVIEW(Scripps Research, La Jolla, CA) 又は QUANTA98(Accelrys, Inc. San Diego, CA) を用いて、このマップに構築することができる。リファインメントは、X-PLOR(上記の Brunger, 1992) を用いて行なうことができ、またフリーＲ値を用いてリファインメントの過程をモニターすることができる。
【０１２９】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ複合体を含んでいる結晶の三次元構造が一旦決定されれば、潜在的なリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）は、FelxiDock(Tripos, St. Louis, ＭＯ)、ＧＲＡＭ(Medical Univ. of South Carolina), DOCK(Univ. of California at San Francisco),Glide(Schroedinger, Portland, OR), Gold (Cambridge Crystallographic Data Centre, UK), FlexX(BioSolvel T GmbH, Germany); AGDOCK(Gehlhaar他, Cheistry & Biol. 2:317-324(1995);Bouzida他, Pacific Symp. on Biocomputing '99, 426-437(1999) ;Bouzida他, Internat. J. of Quantum Chem. 72:73-84(1999) ;Gehlhaar他, Proceedings of the Seventh Ann. Conf. on Evolutionary Programming, The MIT Press, Cambridge, MA(1988); Hex(Ritchie他, Proteins:Struct. Funct. & Genet. 39:178-194(2000);全てがここに参照により加入される)、又は AUTODOCK(Scripps Research Institute, La Jolla, CA) のようなドッキング プログラムを用いたコンピュータモデリングの使用により検定することができる。このモデリング工程は、潜在的なリガンドの形及び化学構造が、ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインといかにうまく補足又は干渉するかを確認するために、潜在的なリガンドのＰＰＩアーゼ基質結合ドメインに対するコンピュータフィッテング(computer fitting)を含むことができる(Bugg他, Scientific American Dec. :92-98(1993); West他, TIPS, 16:67-74(1995))。
【０１３０】
コンピュータプログラムは、ＰＰＩアーゼ結合ドメインに対するリガンドの誘引、反発、及び立体障害を評価するのに用いることもできる。例えば、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼに、全体に又は部分的に結合できる化学物質又は化合物の小分子データベースを、コンピュータを用いてスクリーニングすることができる。このスクリーニングにおいて、そのような物質又は化合物が結合部位にフィットする特性は、形状の相補性又は相互作用エネルギーの推定により判断することができる(Meng他, J. Comp. Chem. 13:505-524(1992))。一般に、フィトが密接であればあるほど（例えば、立体障害が低ければ低いほど及び／又は誘引力が強ければ強いほど）、その薬剤が強力であることが予測されるが、それは、これらの特性がより堅い結合定数と一致しているからである。
【０１３１】
「結合部位」、「結合ポケット」、「基質結合部位」、「触媒ドメイン」又は「基質結合ドメイン」とも呼ばれる「結合ドメイン」は、分子若しくは分子複合体の一つ若しくは複数の領域のことをいい、その形状により、他の化学物質若しくは化合物と結合することができる。そのような領域は、創薬のような分野において有用である。天然のリガンド若しくは基質とそれらに対応する受容体又は酵素の結合ポケットとの結合は、多くの生物学的作用機構の基礎である。同様に、多くの薬品は、酵素又は受容体の結合ポケットとの相互作用を経由して生物学的効果を発揮する。そのような相互作用は、結合ポケットの全部又は部分において起こり得る。このような相互作用の理解は、標的受容体又は酵素との好適な及び特異的な相互作用を有し、それ故に改善された生物学的効果を発揮するドラッグデザインを容易にする。それ故、ＰＩＮ１基質結合部位とリガンド結合に関する情報は、ＰＩＮ１の調節因子のデザイン及び発見を容易にする点で有用である。更に、薬品候補物質のデザインが特異的であればあるほど、薬品は他の類似する蛋白質と相互作用することなく、それ故、望ましくない交差相互作用による潜在的な副作用を最小にすることができる。
【０１３２】
初めに、潜在的リガンドは、ランダム化学ライブラリーのスクリーニングにより入手することができる。このようにして得られたリガンドは、次に、コンピュータモデリングプログラムを用いて、一つ又はそれ以上の潜在的リガンドが同定されるまで、系統的に修飾され得る。そのような分析は、例えば、ＨＩＶプロテアーゼ阻害物質のデザインにおいて有用であることが知られている(Lam他, Science 263:380-384(1994); Wlodawer他, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585(1993); Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48(1993); Erickson, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128(1993)。更に、ランダム化学ライブラリーを用いたスクリーニングからリガンドとして事前に同定した化合物を修飾する手段として、指向的又は集中的な(directed or focused)ライブラリーを構築することができる。この方法を用いて、リガンド結合部位の特定部分を系統的に調べ、次に、興味ある蛋白質に対する活性を検定する多くの異なる化合物を合成することができる。例えば、化合物Ｉにおいては、フェニル基を当該フェニル基とは異なる物理的及び化学的特性を有している置換基で置換することができる。
【０１３３】
実施できてそのいずれかが薬品をもたらし得る、潜在的に無限の数の本質的にランダムな化学修飾に対し、このようなコンピュータモデリングを用いることにより、有限の数の合理的な化学修飾を選択することができる。各化学修飾は、付加的な化学的工程を必要とするが、それは有限数の化合物の合成にとって合理的な範囲であり、もしも全ての可能性のある修飾を合成しなければならないとすれば、たちどころに圧倒されてしまうであろう。このように、ここに開示した構造座標の使用とコンピュータモデリングにより、これら多くの化合物は、コンピュータにより迅速にモデル化され、その結果、数多くの化合物の労多い合成をすることなく、数個の有望な候補化合物を決定することができる。
【０１３４】
可能性のあるリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）が一旦同定されれば、化合物の市販ライブラリーから選択することができるし、又は潜在的リガンドを新たに合成することもできる。有望な薬品は、下記に例示する結合検定法で検定することができ、ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインに対する結合能力を検定するか、或いはＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性の調節能力を検定することができる。
【０１３５】
用語「調節する」とは、ＰＩＮ１のようなペプチジル−プロリルイソメラーゼの機能を変更する化合物の能力を意味する。例えば、或る化合物が、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ蛋白質のペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性を増大又は減少させるとき、その化合物は、ペプチジル−プロリルイソメラーゼの活性を調節するという。
【０１３６】
適当な化合物が同定されたとき、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインと化合物間に形成される蛋白質リガンド複合体を含むように、追加結晶(supplemental crystal)を成長させることができる。好ましくは、結晶がＸ−線を効果的に回析し、蛋白質リガンド複合体の原子座標の測定ができるように、解像度は、３.０オングストロームと同等か又はそれ以上であり、更に好ましくは、２.０オングストロームと同等か又はそれ以上である。分子置換分析(Molecular Replacement Analysis)は、追加結晶の三次元構造の決定に使用することができる。
【０１３７】
分子置換は、探索モデルとして既知の三次元構造を用いて、新たな結晶型における同一若しくは密接に関連する分子又は蛋白質リガンド複合体の構造を決定することに関与する。測定した新たな結晶のＸ−線回析特性は、新たな結晶蛋白質の配置及び配向(position and orientation)を計算するために、探索モデル構造から計算したものと比較する。この目的に使用することができるコンピュータプログラムには、X-PLOR(Brunger, 1992、上記、EPMR(Kissinger他, Acta Cryst. D55:484-491(1999)；参照によりここに加入される), ProLSQ(Konnert他, Acta Cryst. A36:344-350(1980))、及びAMORE(J. Navaza, Acta Crystallographics, ASO, 157-163(1994))が含まれる。
【０１３８】
配置及び配向が一旦わかれば、電子密度マップは、Ｘ−線相を与える探索モデルを用いて計算することができる。それ故、電子密度を構造差について検査し、そして探索モデルを新たな構造に整合するように修飾する。このアプローチにより、当該構造は、いかなるこのようなＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドリガンド複合体の三次元構造を解析するために使用することができる。そのようなＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ結晶構造を解析するために使用することができる他のコンピュータプログラムには、QUANTA(Accelrys, Inc., San Diego, CA). INSIGHT(Accelrys, Inc., San Diego, CA), ARP／wARP(European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany; Perrakis他, Nature Struc. Biol. 6:458-463(1999); Lamzin他, Acta Cryst. D49:129-147(1993))及び ICM(MolSoft, La Jolla, CA) が含まれる。
【０１３９】
ここに記載したドラッグデザイン戦略の全てにとって、上記の方法により提供される工程のいかなる及び／又は全ての継続的反復は、改善された特性（例えば、活性）を有している一つ又はそれ以上のリガンドを得るために、典型的に行なわれる。
【０１４０】
本発明に係る他の局面は、ＰＰＩアーゼリガンド複合体から生じた構造座標の使用により三次元形状を生じさせることに関するものである。これは、構造座標のセットから、分子又はその部分の三次元グラフ表示することを可能とする市販されているソフトウエアを用いて行なうことができる。
【０１４１】
下記に記載するように、突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドの結晶構造の解析において、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインの形状を定義するＰＩＮ１アミノ酸が決定された。例えば、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインの一つの構成要素は、アミノ酸Ｌeu61，Ｃys113，Ｓer114，Ｓer115，Ａla116，Ｌys117，Ａla118, Ａrg119，Ｇly120，Ａsp121，Ｌeu122，Ｇly123，Ａla124，Ｐhe125，Ｓer126，Ａrg127，Ｇly128，Ｇln129，及びＭet130により形成される表面である。これらの残基は、結合の一部を果たしている（疎水的な相互作用）。Ａrg54、Ｌys117，及びＧln129はまた、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合部位において結合する物質と静電気的相互作用を形成することができる。Ａrg54，Ａrg56，Ser111，Ｌys132及びＡsp153は、直接のリガンド相互作用からは少し離れてはいるが、修飾した又はより大きいリガンドと相互作用することができる。
【０１４２】
更に、プロリルポケットは、Ｈis59，Ｌeu122，Ｐhe134，Ｍet130，Ｈis157，Ｔhr152，Ｓer154，Ｇln131，及びＣys113を含んでいる。Ｌys63，Ｓer67，Ａrg68，及びＡrg69は、静電気的相互作用に関連している。Ｌys63及びＳer67の相互作用は、直接であったり水分の仲介により間接であったりする。更に、Ｇln131，Ｔhr152，Ｇlu135及びＰro133と相互作用する可能性のある結晶構造は、Ｇln131ポケットを示唆する。更にまた、Ｔrp73ポケットは、アミノ酸Ａrg69，Ｓer114，Ｓer72，Ｔrp73，Ａsp112及びＡla116により形成されている。Ｃys113に対する潜在的共有結合付加物が存在する。このように、表IIIにおいて説明されているように、これらのアミノ酸の構造座標により定義される結合ポケット、又はこれらアミノ酸の骨格原子の構造座標からの平均二乗偏差の平方根が約０.５オングストローム以上ではない結合ポケットは、本発明に係るＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインである。ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合部位の描写は、図１−３に表示してある。
【０１４３】
ＰＩＮ１の他のイソ型におけるアミノ酸の番号付けは、ここに表示したものとは異なり得ることは、当業者にとって自明のものである。ＰＩＮ１の他のイソ型における対応するアミノ酸は、アミノ酸配列を調べることにより、例えば、市販されている相同性ソフトウエアプログラムの使用により容易に同定することができる。
【０１４４】
本発明に係るポリペプチドのＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸は、表II及び表IIIに表示してある構造座標のセットに関連してここに記載してある。用語「構造座標」及び「原子座標」は、結晶型における蛋白質又は蛋白質リガンド複合体の原子（散乱中心）によるＸ−線の単色ビームの回析について得られたパターンに関する数学方程式から誘導したデカルト座標を意味する。回析データは、結晶の反復単位の電子密度マップの計算に使用される。そして電子密度マップは、酵素又は酵素複合体の個々の原子の配置を確立するために使用される。
【０１４５】
上記に論じた座標における変動は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ−化合物Ｉ複合体の構造座標の数学的操作の故に生じたものであるかもしれない。例えば、表IIIに表示した構造座標は、構造座標の結晶学的順列(permutations)、構造座標の細分(fractionalization)、
構造座標のセットに対する整数加算（integer additions）、引算(subtractions)、座標変換(transformations)、例えば、並進(translation)若しくは回転(rotation)又はそれらの組合せによって操作され得る。
【０１４６】
一方では、アミノ酸の突然変異、付加、置換、及び／若しくは欠損又は結晶を形成するいかなる要素におけるその他の変化に基づく結晶構造の修飾もまた、構造座標における変動の原因となる。もしも、そのような変動が元の座標に比較して許容し得る標準誤差の範囲内であれば、得られた三次元形状は、同一とみなすことができる。このように、例えば、変異体ＰＰＩアーゼドメインの結合ポケットに結合したリガンドは、構造座標が、記載されるものと比較した場合、骨格原子から約０.５オングストロームに等しいか又はそれ未満である平均二乗偏差の平方根を有する他の結合ポケットにも結合すると予想することができる。
【０１４７】
種々のコンピュータ分析の実施により、ポリペプチド又はその結合ポケット部分が、ここに記載しているＰＰＩアーゼ結合ポケットに十分に類似するか否かを決定することができる。そのような分析は、INSIGHT IIの MODELLER モジュール(Accelrys, Inc., San Diego, CA), ProMod(University of Geneva, Switzerland), SWISS-MODEL(Swiss Institute of Bioinformatics)及び QUANTA の分子類似アプリケーション (Molecular Similarity application of QUANTA：Accelrys, Inc., San Diego, CA)のような既知のソフトウエアアプリケーションを用いて行なうことができる。
【０１４８】
QUANTA (Accelrys, Inc., San Diego, CA)、INSIGHT II (Accelrys, Inc., San Diego,
CA), Maestro(Schroedinger, Portland, OR), SYBYL(Tripos. Inc., St. Louis, MO)及びMacroModel(Schroedinger, Portland, OR)のようなプログラムは、異なる構造、同一構造の異なる立体配座、及び同一構造の異なる部分間の比較を可能とする。そのようなコンピュータソフトウエアを用いた構造比較は、次の工程が関与している：１）比較すべき構造のロード；２）当該構造における原子同等性の定義；３）フィット操作の実行；４）結果の分析。
【０１４９】
構造の比較において、各構造は名前によって同定した。或る構造は標的（例えば、固定構造（fixed structure））として同定し、残りの他の全ての構造は、作動構造(working structure)（すなわち、移動構造（moving structure））として同定した。QUANTAを用いた原子同等性は、使用者のインプットにより定義されるため、ここに定義したように「同等原子」は、比較する二つの構造間の全保存残基にとっての蛋白質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、及びＯ）を意味する。
【０１５０】
厳密フィット法(rigid−fitting methods)を用いた場合は、作動構造は、標的構造と最適フィットを得るために並進及び回転される。フィット操作では、等価原子の特定した対に対するフィットの平均二乗偏差の平方根が絶対最小値となるように、移動構造に適用する最適な並進及び回転を計算するアルゴリズムを使用した。この数値は、オングストローム単位（Å）で与えられるが、QUANTA (Accelrys, Inc., San Diego, CA)又は他の同様なプログラムのようなソフトウエアアプリケーションによる報告がある。表IIIに表示されている構造座標により記載された関連する骨格原子と重ね合わせたときに、約０.５オングストロームより小さい保存残基の骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）の平均二乗偏差の平方根を有している、いかなる分子若しくは分子複合体又はその結合ポケットは、同一であるとみなされる。
【０１５１】
用語「平均二乗偏差の平方根」とは、平均からの偏差値の二乗の算術平均の平方根を意味する。それは、トレンド又は対象からの偏差又は変動を表示するための方法である。ここで使用した「平均二乗偏差の平方根」は、ここに記載した構造座標によって定義された
ように、蛋白質の骨格における、本発明に係るＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド、又はそのＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメイン部分の骨格からの変動を定義する。
【０１５２】
Ｄ．コンピュータ、コンピュータソフトウエア、コンピュータモデル化
上記に論じたように、コンピュータはＰＰＩアーゼ基質結合ドメインの三次元表示の作成に使用することができる。適当なコンピュータは当業者にとって既知のものであり、典型的には中央処理装置（ＣＰＵ）及びランダムアクセスメモリー、コアメモリー、大容量記憶メモリー又はそれらの組合せである作業メモリーを含んでいる。ＣＰＵは一つ又はそれ以上のプログラムをコードすることができる。コンピュータはまた一つ又はそれ以上のブラウン管デイスプレー端末、キーボード、モデム、入力ライン及び出力ラインのような、デイスプレー、入力及び出力装置を典型的に含んでいる。更に、コンピュータはコンピュータサーバー（大規模計算をバッチ式で行うことができる機械）及びファイルサーバー（全集中データーベースに対する主要機器）にネットワークで連結している。
【０１５３】
ポリペプチドの結晶構造座標のようなデータを含んでいる機械読取り可能な媒体は、モデム、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、デイスクドライブ、又はキーボードを含む種々のハードウエアーを用いてインプットされ得る。
【０１５４】
機械読取り可能なデータ媒体は、例えばフロッピーデイスク、ハードデイスク、又は光学的に読取り可能なデータ記憶媒体であり、それらはメモリー読取り専用又は光磁気デイスクのように書き換え可能のいずれであってもよい。
【０１５５】
ＣＲＴデイスプレー端末のようなアウトプットハードウエアーは、ここに記載したような、ＰＰＩアーゼポリペプチドの基質結合部位のグラフィック表現を表示するために使用することができる。アウトプットハードウエアーはまた、プリンター及びデイスクドライブを含むことができる。
【０１５６】
ＣＰＵは、種々の入力及び出力装置の使用を調整し、記憶装置からのデータアクセス、及び作業メモリーへの及びそれからのアクセスを調整し、並びにデータ処理の工程の順序を決定する。多くのプログラムが、機械読取り可能なデータを処理するために使用することができる。そのようなプログラムは、創薬のコンピュータによる方法に関連してここで論じている。
【０１５７】
本発明に係る好ましい実施態様において、ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体の三次元グラフィック表示に処理可能なＸ−線座標データは、機械読取り可能な記録媒体に記憶することができる。ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ポケットを含んでいる分子又は分子複合体の三次元構造は、創薬及びドラッグデザインにおける種々の目的に有用である。
【０１５８】
例えば、構造座標データから誘導した三次元構造は、化学物質と結合する能力についてコンピュータを用いて評価する（コンピュータ支援ドラッグデザイン）ことができる(Butt他, Scientific American Dec.:92-98(1993):West他, TIPS 16:67-74(1995); Dunbrack他, Folding & Designl 2:27-42(1997))。ここで用いている用語「化学物質(chemical entity)」は、化合物、少なくとも二つの化合物の複合体、又はそのような化合物若しくは複合体のフラグメントを意味する。そのような物質は、潜在的な薬品候補物質であり、そしてＰＩＮ１ ＰＩＮ１活性を阻害又は調節する能力を評価することができる。ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインと結合又は会合する物質の能力は、物質自身の特質に依存する。化合物がＰＩＮ１に結合するかどうか測定する検定法は、ここに例示しているように、当業者にとって既知のものである。
【０１５９】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインと結合する化合物のデザインは、二つの要素を考慮することができる。第一は、当該物質は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインの部分又は全体と物理的に及び構造的に会合することができなければならない。用語「会合する」とは、化学物質と蛋白質の結合ポケット又は結合部位との間が接近する状態を意味する。会合は、例えば、並列状態がファンデルワールス(van der Waals)又は静電気的相互作用による水素結合によりエネルギー的に好適である非共有結合であってもよく、或いは、それが共有結合であってもよい。この会合に寄与する非共有結合による分子相互作用には、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用及び静電気的相互作用が含まれる。
【０１６０】
第二に、当該物質は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインと、直接的に会合することを許容する立体配座を取ることができなければならない。勿論、当該物質の或る部分はこの会合に直接的に関与しないが、これらの部分もまた、分子の全体的な立体配座に対して影響を与えることができる。そして今度はこれが、可能性にとって重要なインパクトを与え得る。そのような立体配座の必要条件には、結合ポケットの全部又は部分において、化学物質の全体的な三次元構造及び配向、並びにＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様結合ポケットと直接的に相互作用する数個の化学物質を含んでいる一個の物質が有する複数の作用基の間の空間も含まれる。
【０１６１】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインに対する化学物質の潜在的な阻害又は結合の影響は、コンピュータモデル化技術を使用した実際の合成及び検定の前に分析することができる。もしも、与えられた物質の理論的構造から、その物質とＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様結合ポケット間の相互作用及び会合が不十分であると推測される場合は、当該物質についてそれ以上の試験を考慮することはないであろう。しかしながら、もしもコンピュータモデル化が強力な相互作用を示唆するならば、当該分子を合成し、そしてＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様結合ポケットに対する結合能力を試験することができよう。これは、ここに記載した検定法を用いて当該分子のＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性を調節する能力を試験することにより行なうことができる。
【０１６２】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインの潜在的な阻害物質は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様結合ポケットと会合する能力をスクリーニング及び選択する一連の工程により、コンピュータを用いて評価することができる（コンピュータ支援ドラッグデザイン）。当業者は、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ドメインと会合する能力を有している化学物質又はフラグメントをスクリーニングするための種々の方法の一つを使用することができる。例えば、当業者は、表IIIに報告されているＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ構造座標、又は機械読取り可能な記録媒体から生じる類似形状を定義する他の座標に基づいたコンピュータ画面上のＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様結合ポケットを視覚的に評価することができる。その後、選択した化学物質は、種々の配向に配置し、又はここに記載した結合ポケットにドッキングされる。ドッキングは、Quanta (Accelrys, Inc., San Diego, CA) 及び SYBYL(Tripos, Inc., St. Louis, MO)のようなソフトウエアを用い、続いて、CHARMM(Department of Chemistry & Chemical Biology, Harvard Univ., Cambridge, MA)及びAMBER(School of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California at San Francisco, CA)のような、標準的な分子力学の力の場(standard molecular mechanics force fields)によるエネルギー最小化及び分子動力学によって遂行される。
【０１６３】
化学物質の選択工程において補助する特殊なコンピュータプログラムには、以下の参考文献が含まれるが、これらはここに参照により加入される。
１．GRID(Goodford, “A Computational Procedure for Determing Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules,”J. Med. Chem. 28:849-857(1985)). GRIDは、the Oxford University, Oxford, UK から入手可能である。
２．MCSS(Miranker他,“Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method,”Proteins: Struct. Funct. and Genet. 11:29-34(1991). MCSSは、Accelrys, Inc., San Diego, CAから入手可能である。
３．AUTODOCK(Goodsell他,“Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing” Proteins: Struct. Funct. and Genet. 8:195-20(1990)). AUTODOCKは、the Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.から入手可能である。
４．DOCK(Kuntz他,“A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions,” J. Mol. Biol., 161:269-288(1982)). DOCKは、the University of California,San Francisco, CA から入手可能である。
５．GOLD(Jones他,“Development and Validation of a Genetic Algorithm for Flexible Docking”, J. Mol. Biol. 267:727-748(1997)). GOLDは、the Cambridge Crystallographic Data Centre UKから入手可能である。
６．GLIDE(Eldridge他,“Empirical Scoring Functions :I. The Development of a Fast Empirical Scoring Function to Estimate the Binding Affinity of Ligands in Receptor Complexes,”J. Comput. Aided Mol Des. 11:425-445(1997)). Glideは、Schroedinger, Portland ORから入手可能である。
【０１６４】
適当な化学物質が一旦選択されれば、それらは単一化合物又は複合体に組み合わせることができる。組合せは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼリガンド複合体の構造座標に関するコンピュータ画面上に表示された三次元画像により、フラグメントの互いの関連性を視覚的に評価する以前に行なうことができる。そしてこの後に、Quanta又はSYBYLのようなソフトウエアを用いた手動モデル構築を行なうことができる。個々の化学物質を結び付けることにおいて、当業者に役立つ有用なプログラムには、以下の参考文献に記載されるものが含まれるが、これらはここに参照により加入される。
１．CAVEAT(Bartlett他,“CAVEAT:A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules", Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems”, Special Pub., Royal Chem. Sco., 78, pp.182-196(1989);
Lauri他,“CAVEAT: a Program to Faciliate the Design of Organic Molecules”, J. Comput. Aided Mol. Des. 8:51-66(1994)). CAVEATは、the University of California, Berkeley, CAから入手可能である。
２．ISIS: Martin,“3D Database Searching in Drug Design”, J. Med. Chem. 35:2145-2154(1992))を参照。ISISは、MDL Information Systems, San Leandro, CAから入手可能である。
３．HOOK(Eisen他,“HOOK: A Program for Finding Novel Molecular Architectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a Macromolecule Binding
Site,” Proteins: Struct. Funct. Genet.,19:199-221(1994)). HOOKは、Accelrys, Inc., San Diego, CAから入手可能である。
【０１６５】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ポケットの阻害物質を段階的に作成する態様で遂行するのではなく、空の結合部位を用いて、又は、場合によっては既知阻害物質の或る部分を含んで、上記のように一度に一つの化学物質、阻害的又は他のＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ結合化合物を、全体として又は新たに(de novo)デザインすることができる。LeapFrog(Tripos Associates、St. Louis, MO から入手可能である。)及び以下の参考文献に論じられているように、多くの既知の新たなリガンドデザイン法があるが、これらはここに参照により加入される。
１．LUDI(Bohm,“The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design
of Enzyme Inhibitors” J. Comp. Aid. Molec. Design. 6:61-78(1992)). LUDIは、Accelrys, Inc., San Diego, CAから入手可能である。
２．SPROUT(Gillet他, “SPROUT: A Program for Structure Generation,” J. Comput
. Aided Mol Design. 7:127-153(1993)). SPROUTは、the University of Leeds, UK
から入手可能である。
【０１６６】
他の分子モデル化技術も採用することができる(例えば、Cohen他, J. Med. Chem. 33:883-894(1990); Navia他, Curr. Opin. Struct. Biol.2:202-210(1992); Balbes他, Review in Computational Chemistry, Vol. 5, K. Lipkowitz他, eds. VCH, New York, pp. 337-380(1994); Guida, Curr. Opin. Struct. Biol. 4:777-781(1994)を参照)。
【０１６７】
上記の方法を用いて化学物質が一旦デザイン又は選択された後、その物質がＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ポケットに結合する効率が試験され、そしてコンピュータを用いた評価により最適化することができる。例えば、効率的なＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ポケットの阻害物質は、その結合状態と遊離状態間で相対的な小さいエネルギー相異（すなわち、結合の小さい変形エネルギー）を好ましくは実証する。ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ポケットの阻害物質は、全体的結合エネルギーとしては類似している２つ以上の立体配座における基質結合ドメインと相互作用することができる。これらの場合は、結合の変形エネルギーは、遊離状態のエネルギーと阻害物質が蛋白質に結合したときに観察される立体配座の平均的エネルギーとの間の相異として考えられる。
【０１６８】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ基質結合ドメインに結合するようにデザイン又は選択した物質は、更に、コンピュータを用いて最適化することができ、その結果その結合状態において、好ましくは、標的酵素及び周囲の水分子と反発する静電気的相互作用を欠く。そのような非補完的な静電気的相互作用には、反発的な荷電−荷電、双極子−双極子及び荷電−双極子相互作用がある。
【０１６９】
適当なコンピュータソフトウエアは、化合物変形エネルギー(compound deformation energy)及び静電気的相互作用を評価することができる。そのような使用のためにデザインされたプログラムの例としては、Gaussian(Frisch, Gaussian, Inc., Carnegie, PA); AMBER(Kollman, University of California at San Francisco); Jaguar(Schroedinger, Portland, OR); SPARTAN(Wavefunction, Inc., Irvine, CA); QUANTA／CHARMM (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ; Impact (Schroedinger, Portland OR); InsightII／Discover(Accelrys, Inc., San Diego, CA) : MacroModel(Schroedinger, Portland OR); Maestro(Schroedinger, Portland OR); DelPhi (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ; 及びAMSOL (Quantum Chemistry Program Exchange, Indiana University)が含まれる。これらのプログラムは、例えば、Silicone Graphics, Hewlet Packard, Sun Microsystems, 及び International Business Machinesのような会社によって作成されたワークステーションを用いて実行することができる。
【０１７０】
他のアプローチにおいて、小分子データベースは、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ様基質結合ポケットの全体又は部分に結合する可能性を検定するために、コンピュータを用いてスクリーニングされる。このスクリーニングにおいて、結合部位にフィットする当該物質の特性は、形状相補性又は概算した相互作用エネルギーによって判断することができる(Meng他, J. Comp. Chem. 13:505-524(1992))。潜在的調節因子の結合は、生化学的に、例えばここに記載したような等温滴定熱量計を用いて評価することができる。
【０１７１】
表IIIに表示した構造座標は、他の結晶化分子又は分子複合体の構造に関する情報を得るために使用することができる。これは、分子置換のような適当な既知の技術により遂行することができる。分子置換を用いて、突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチド：化合物Ｉ複合体の構造座標の全部又は部分を、構造未知の結晶化分子又は分子複合体の構造を決定するのに使用することができる。この工程は、そのような情報を初めから決定する試みよりはより効率的である。
【０１７２】
分子置換は、未知の構造のための位相(phases)の正確な見積もりを提供するものである。位相は直接的には決定することができない結晶構造を解明するために使用される方程式における係数を構成する。分子置換による方法以外の方法で、位相のための正確な値を得ることは、近似(approximations)及びリファインメントの反復サイクルが関与する時間を要する方法であり、そして結晶構造の解明を非常に遅らせるものである。しかしながら、少なくとも１つ相同な部分を含んでいる蛋白質の結晶構造が解明されれば、既知の構造からの位相は、未知の構造のための位相の見積もりを提供することができる。
【０１７３】
当該方法は、未知分子又は分子複合体結晶の単位格子の範囲内で、表IIIに基づく突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ：化合物Ｉ複合体の関連部分の配向付け(orienting)及び位置付け(positioning)により、構造座標が不明の分子又は分子複合体の予備的なモデルを作成することに関与し、その結果、構造未知の分子又は分子複合体の結晶の観測したＸ−線回析データについて極めて理論的に説明できる。その後、位相はこのモデルから計算し、そして観測したＸ−線回析データ幅(amplitudes)と組み合わせ、座標が未知の構造の電子密度マップを作成することができる。次に、これを、未知の結晶化した分子又は分子複合体についての正確な構造を最終的に提供するため、任意の既知のモデル構築及び構造リファインメント技術に供する (Lattman, Meth. Enzymol. 115:55-77(1985): Rossmann, ed., “The Molecular Replacement Method” Int. Sci. Rev, Ser, No. 13, Gordon & Breach, New York (1972))。このようにして、突然変異ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ：化合物Ｉ複合体のいずれかの部分に対して十分に相同である任意の結晶化した分子又は分子複合体の任意の部分の構造も、当該方法により解明することができる。
【０１７４】
他の好ましい実施態様において、分子置換法が、他のＰＰＩアーゼについての構造情報を得るために使用することができる。ここに記載したように、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼの構造座標は、他のＰＩＮ１イソ型又は他のＰＩＮ１を含んでいる複合体の構造解明にも有用である。
【０１７５】
更に、ここに記載したＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドの構造座標は、アミノ酸置換体、付加、及び／又は欠損を有する他のＰＩＮ１蛋白質の構造解明にも有用である。これらのＰＩＮ１変異体は、場合によっては、化合物Ｉのような化学物質との複合体として結晶化することができる。このとき、そのような複合体の結晶構造は、分子置換により解明され、そして、ここに記載したＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドの構造と比較することができる。酵素の種々の結合部位の中で、修飾のための可能性のある部位は、このようにして同定され得る。この情報は、効率的な結合相互作用、例えば、ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼと化学物質間の増大した疎水性相互作用を決定するための付加的な道具を提供するものである。
【０１７６】
構造座標はまた、ＰＩＮ１又は化学物質とのＰＩＮ１相同複合体の結晶の構造を解明するために有用である。このアプローチは、ＰＩＮ１基質結合部位を有する潜在的なＰＩＮ１調節因子を含む化学物質間の相互作用にとって重要な部位を決定することを可能とする。例えば、異なるタイプの溶媒にさらされた結晶から得られた高分解Ｘ−線回析データにより、各タイプの溶媒分子がどこに属するかを決定することができる。これらの部位に堅く結合した小分子をデザインし、合成し、そしてＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性を調節する能力を検定することができる。
【０１７７】
上述した全複合体は、既知のＸ−線回析技術を用いて研究することができ、そしてＸ−ＰＬＯＲ(上記のBrunger, 1992：Accelrys, Inc., San Diego, CAから入手可能)のようなコンピュータソフトウエアを用いて、１.５−３.０オングストローム解像度のＸ−線回析データに対して、約０.２０又はそれ以下のＲ値となるように精密化される。この情報は
、既知のＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ調節因子を最適なものとし、そして新たなＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ調節因子をデザインするのに使用することができる。
【０１７８】
Ｅ．ペプチジル−プロリルイソメラーゼ検定法
ＰＩＮ１は、リン酸化依存型ペプチジル−プロリルイソメラーゼである。本発明に係るペプチドのペプチジル−プロリルイソメラーゼ活性は、パラ−ニトロアニリン−含有ペプチド基質の、キモトリリプシン触媒と共役したcis−trans立体配座に依存する切断に基づく、分光光度検定法により測定することができる。このロータマーゼ(rotamase)検定法は、Kofron他(Biochemistry 30:6217-6134(1991))により記載されており、またそのＰＩＮ１イソメラーゼ活性に対する応用は、Yaffe他(Science 278, 1957-1960(1997))により記載されている。異性化したペプチドの切断は、パラ−ニトロアナリンを放出するが、それは３９０ｎｍにおける吸光度の増大によってモニターすることができる。ＰＩＮ１ペプチド基質、スクシニル−アラニン−ロイシン−プロリン−フェニルアラニン−パラニトロアニリン(Suc−AEPF−pNA) (Bachem California, Inc., Torrence, CA) は、無水ＴＦＥ(トリフルオロエタノール)／ＬｉＣｌ(塩化リチウム)の溶媒混合物においては、シス−立体配座が優勢である。ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ活性を有するペプチドを含んでいる水溶性検定混合液中に希釈すると、ペプチド基質は、ＰＩＮ１触媒異性化を受け、トランス−立体配座に移行する。キモトリプシン又はスブチリシンカールスベルク(Subtilisin Carlsberg) のような他の適当なプロテアーゼは、トランス−生成物を切断し、遊離のパラ−ニトロアナリンを生成する。ペプチド基質の自発的な異性化を最小限とするために、反応は１５℃で行なわれる。この方法を用いて、野生型ＰＩＮ１及び変異体ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ(Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ)（配列番号４）の双方は、Ｓｕｃ−ＡＥＰＦ−ｐＮＡの１００μＭを含んでいる０.０３３ｎＭの濃度において、比率０.２を示した。化合物Ｉ（実施例１）及びＫ７７Ｑ／Ｋ８２ＱのＫiは、０.０６μＭであった。
【０１７９】
以下の実施例は、本発明に係る種々の実施態様及び特徴を説明するためのものである。
【０１８０】
実施例
実施例１    ＰＩＮ１阻害物質−化合物Ｉの合成
化合物Ｉは、スキーム１に基づいて合成した。スキーム１で使用した略語は、他に指摘がない限り、以下の意味である：ＣＢｚＣｌ＝ベンジルクロロホルメート；ＭＣＰＢＡ＝安息香酸３−クロロペロキシ：Ｐｄ＝パラジウム；ＥＴＯＨ＝エチルアルコール；ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル；Ｐｈ＝フェニル；及びＢｎ＝ベンジル。
【化２】
2005532061.tif 000004
【０１８１】
実施例１Ａ
【化３】
2005532061.tif 000005
アルコール１：Ｄ−フェニルアラニノール（１.１５ｇ、７.６１mmol）の塩化メチレン溶液（８０ｍＬ）に、トリエチルアミン（１.５９ｍＬ，１１.４mmol）及びベンジルクロロホルメート（１.１９ｍＬ，８.３７mmol）を添加した。混合液を３時間（ｈ）撹拌し、その後濃縮した。残留物を塩化メチレン（５０ｍＬ）に溶解し、塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。溶液を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）そして濃縮した。カラムクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０から３０％ＥｔＯＡｃ）の後、標記の化合物を収率７３％で得た（１.５９ｇ）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣＬ3）：δ ７.４６−７.１５（１０Ｈ，ｍ），５.１１（２Ｈ，ｓ），４.９６（１Ｈ，ｍ），３.９８（１Ｈ，ｍ），３.７２（１Ｈ，ｍ），３.６３（１Ｈ，ｍ），２.８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.２Ｈｚ）。
ＭＳ（ＥＳＰ）：２８６（Ｍ+Ｈ+）；２８４（Ｍ−Ｈ）-。
【０１８２】
実施例１Ｂ
【化４】
2005532061.tif 000006
リン酸ベンジルエステル２：アルコール1（１.５８ｇ；５.５４mmol）及び１Ｈ−テトラゾール（１.０５ｇ、１５mmol）のアセトニトリル溶液（４０ｍＬ）に、ジベンジルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（３.７２ｍＬ，１１.１mmol）を、２５℃で添加した。３時間後、ＭＣＰＢＡ（４.１９ｇ、純度７０％、１３.８５mmol）を懸濁液に添加した。溶液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＳＯ3濃縮溶液（２×８０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、そして真空下で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー精製（ヘキサン中１０〜３０％ＥｔＯＡｃ）し、標記の化合物２.８８ｇを収率９５％で得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ７.４７−７.０５（２０Ｈ，ｍ），５.１９−４.９６（７Ｈ，ｍ），４.０９−３.８３（３Ｈ，ｍ），２.９３−２.６７（２Ｈ，ｍ）。
ＭＳ（陽性ＥＳＰ）：５６８（Ｍ+Ｎａ+）；ＭＳ（陰性ＥＳＰ）：５８０（Ｍ+Ｃｌ）-。
【０１８３】
実施例１Ｃ
【化５】
2005532061.tif 000007
塩酸（２Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロピル−ジヒドロゲン−ホスフェート（３）：リン酸ベンジルエステル（２）（２.８８ｇ、５.２８mmol）のエタノール溶液に、パラジウム−炭（１０％、３００ｍｇ）を添加した。この懸濁液を水素雰囲気下（１気圧）で４時間静置した後、セライトパッド(Celite pad)で濾過した。採集した固体を塩化メチレンで洗浄した。当該固体及びセライトの混合物を５％ＨＣｌ溶液に懸濁し、そして２０分間撹拌した。濾過後、濾液を濃縮乾燥し、標記の化合物１.２ｇを収率８６％で得た。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ ７.４９−７.２５（５Ｈ，ｍ），４.２２−４.０８（１Ｈ，ｍ），４.０（１Ｈ，ｍ），３.７２（１Ｈ，ｍ），３.０３（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝７.５Ｈｚ）。
ＬＣＭＳ：２３２（Ｍ+Ｈ+）；２３０（Ｍ−Ｈ）-。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）Ｃ9Ｈ15ＮＯ4Ｐ（Ｍ+Ｈ+）の計算値：２３２.０７３３；測定値：２３２.０７３６。
【０１８４】
実施例１Ｄ
【化６】
2005532061.tif 000008
化合物１−リン酸モノ｛（Ｒ）−２−［（１−ベンゾ[b]チオフェン−２−イル−メタノイル）−アミノ］−３−フェニル−プロピル｝エステル（４）：炭酸ナトリウム溶液（１Ｍ，１ｍＬ）に、当該アミノホスフェート３（４８ｍｇ、０.１７９mmol）と塩化ベンゾチオフェン−２−カルボニル（３５ｍｇ、０.１７９mmol）を添加した。１５時間後に、濃塩酸を０℃で添加して、約ｐＨ１までに酸性化した。調製ＨＰＬＣで精製し、標記化合物３４ｍｇを得た（収率４８％）。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：δ ７.９６（１Ｈ，ｓ），７.９０（２Ｈ，ｍ），７.４３（２Ｈ，ｍ），７.３７−７.１７（５Ｈ，ｍ），４.５０（１Ｈ，ｍ），４.１０（２Ｈ，ｍ）、３.０９（１Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝１３.９，６.６Ｈｚ）、３.００（１Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝１３.９、７.８Ｈｚ）。
ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）Ｃ18Ｈ18ＮＯ5ＰＳＮａ（Ｍ+Ｎａ+）の計算値：４１４.０５４０；測定値：４１４.０５３６。
【０１８５】
実施例２    ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドのクローン化及び生化学的分析
野生型ＰＩＮ１由来のＰＰＩアーゼドメインを、完全長ＰＩＮ１のコード配列を含んでいるＰＣＲ(Mullis他, CSH Symp. Quantum Biol. 51:263-273(1986):Saiki他,Science 239:487-491(1988))により増幅した。使用したプライマーは、以下のものである。
正プライマー−５'−ＡＧＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴ−３'（配列番号５）
逆プライマー−５'−ＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴ−３'（配列番号６）
【０１８６】
増幅したＤＮＡは、細菌発現ベクターｐＥＴ３ａ及びｐＥＴ２８ａ（Novagen）のNdel 及びBamHI部位にクローン化し、そして配列を確認した。ｐＥＴ２８ａは、トロンビン切断部位が続く６ヒスチジンタグを含んでいた。
【０１８７】
ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸配列は、完全長ＰＩＮ１のアミノ酸４５−１６３(GenBank受託番号XM-009024)に対応するが、それは以下の通りである。
４５ ＧＫＮＧＱＧ ＥＰＡＲＶＲＣＳＨＬ ＬＶＫＨＳＱＳＲＲＰ ＳＳＷＲＱＥＫＩＴＲ ＴＫＥＥＡＬＥＬＩＮ ＧＹＩＱＫＩＫＳＧＥ ＥＤＦＥＳＬＡＳＱＦ ＳＤＣＳＳＡＫＡＲＧ ＤＬＧＡＦＳＲＧＱＭ ＱＫＰＦＥＤＡＳＦＡ ＬＲＴＧＥＭＳＧＰＶ ＦＴＤＳＧＩＨＩＩＬ ＲＴＥ １６３（配列番号７）
【０１８８】
当該ｐＥＴ３ａベクターは、Ｎ末端に付加的なＭ残基を含んでいる組換えＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドをコードした。ｐＥＴ２８ａベクターは、トロンビン切断部位において、アミノ酸配列：５'−ＧＳＨＭ−３'に対応するＮ末端に４個の付加的なアミノ酸を有しているポリペプチドを生ずる組換えＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドを発現した。
【０１８９】
実施例３    ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ
二重突然変異Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑは、７７及び８８位のアミノ酸がグルタミンではなくリシンを含んでいるが、部位指向性突然変異誘発方法QuickChange TM（Stratagene, La Jolla, CA）により、製造会社のプロトコールに基づき、そして以下に記載した通り（カタログ♯２００５１８；改定♯１０８００５ｈ）、ｐＥＴ２８ａＰＰＩアーゼベクター及び次のＰＣＲプライマーを用いて、生じさせた。
ＰＩＮ１Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ  フォワード
５'−ＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣ−３'（配列番号８）
ＰＩＮ１Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ  リバース
５'−ＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣ−３'（配列番号９）
【０１９０】
突然変異誘発プロトコール
標品反応混合液は、１０×反応用緩衝液５μｌ（１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ （ＮＨ4）2ＳＯ4２００ｍＭ Tris／HCl（ｐＨ8.8）、２０ｍＭ ＭｇＳＯ4、１％ Triton(R) X-100 及びヌクレアーゼを含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍｌ）；ｄｓＤＮＡテンプレートを５−５０ng；各プライマーを１２５ｎｇ；ｄＮＴＰ混合物を１μｌ；最終容量を５０μｌとするためのｄｄＨ2Ｏの組合せにより調製した。
【０１９１】
上記の標品反応混合液に、PfuTurbo(R) ＤＮＡポリメラーゼ(２.５Ｕ／μｌ)の１μｌを添加した。反応液は鉱油３０μｌで被覆した。各反応は、次のサイクルパラメターを用いて連続して行なった。第一区域：９５℃で３０秒の１サイクル；第二区域：９５℃で３０秒の１２から１８サイクル、５５℃で１分、及び６８℃で２分（プラスミドの長さ、１ｋｂ当たり）。サイクル後に、Ｄpn １制限酵素(１０Ｕ／μｌ)の１μｌを鉱油被覆の下に添加した。反応混合液を穏やかにそして完全に混合し、その後、１分間マイクロ遠心分離にかけて沈殿させた。遠心分離後、反応を３７℃で１時間インキュベートして、親スーパーコイルｄｓＤＮＡを消化させた。各反応標品及び対照からＤpn １処理したＤＮＡの１μｌを採取し、大腸菌（E.coli)ＤＨ５α菌株を形質転換するために使用した。
【０１９２】
Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ変異体の配列が確認された。
【０１９３】
Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ変異体のアミノ酸配列は、図５に表示してある。Ｋ７７Ｑ、Ｋ８２Ｑ ＰＩＮ１変異体のＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである。
４５ ＧＫＮＧＱＧ ＥＰＡＲＶＲＣＳＨＬ ＬＶＫＨＳＱＳＲＲＰ ＳＳＷＲＱＥＱＩＴＲ ＴＱＥＥＡＬＥＬＩＮ ＧＹＩＱＫＩＫＳＧＥ ＥＤＦＥＳＬＡＳＱＦ ＳＤＣＳＳＡＫＡＲＧ ＤＬＧＡＦＳＲＧＱＭ ＱＫＰＦＥＤＡＳＦＡ ＬＲＴＧＥＭＳＧＰＶ ＦＴＤＳＧＩＨＩＩＬ ＲＴＥ（配列番号１０）
【０１９４】
実施例４    ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼポリペプチドの精製及び生化学的分析
Ａ．発酵
野生型ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ又はＰＰＩアーゼ変異体Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２ＱをコードするｐＥＴ２８ａベクターを含んでいる大腸菌（E.coli)ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ファルコン（Falcon）2059 管中にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含んでいる２×ＹＴ培地（リットル当たり：トリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ）の５ｍｌ中に接種した。この培養物を３７℃、２５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。一晩培養した後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含んでいる２ｘＹＴ培地で１００倍に希釈した。希釈された培養物を、３７℃、２５０ｒｐｍで振とうし、ＯＤ595を０.６から０.８にした。０.３ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、そしてこの培養物を２５℃、２５０ｒｐｍで一晩振とうした。一晩培養した細胞培養物を５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１０×緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4、ｐＨ７.５，０.５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。懸濁液を高圧マイクロフリューダイザーに通した。ホモジネートをベックマン（Beckman）超遠心分離機中で、４０,０００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。透明な上清を後続する精製のために保存した。
【０１９５】
Ｂ．精製
浄化された上清を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（２０ｍｌ）上に、４ｍｌ／分の速度で充填した。このカラムを緩衝液Ａの２００ｍｌで洗浄した。１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｎａ3ＰＯ4、ｐＨ７.５，０.５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭ イミダゾール、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）の直線勾配（４００ｍｌ）で、４ｍｌ／分の速度で溶出した。画分（６ｍｌ）を採集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）を用いて分離した。６×ＨｉｓＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼを含んでいる画分を採集し、そして貯留した。貯留した画分を緩衝液Ｃ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）の4リットルを用いて、４℃で一晩透析した。
【０１９６】
Ｃ．トロンビン切断
６×ＨｉｓＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼを含んでいる貯留画分にビオチニル化トロンビン（１０ｍｇ蛋白質当たり１単位）を添加した。この溶液を４℃で一晩緩やかに回転した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（５ｍｌ）に通し、次いで、ストレプトアビジン(Streptavidin)−アガロースカラム（１ｍｌ）に通した。流出液を採集し、後の研究のために、約１０ｍｇ／ｍｌまでに濃縮した。
【０１９７】
Ｄ．ＰＩＮ１ペプチジル−プロリルイソメラーゼ検定
ペプチジル−プロリルイソメラーゼ反応を、２５ｍＭ ＭＯＰＳ[３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸]、ｐＨ７.５、０.５ｍＭ ＴＣＥＰ[塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン]、２％ＤＭＳＯ、スブチリシンカールスベルクプロテアーゼ（Sigma）の２５ｍｇ／ｍｌ溶液５μｌ、５０ｎＭ ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ、１００μＭ Ｓｕｃ−ＡＥＰＦ−ｐＮＡペプチド基質中で行なった。反応を１５℃に冷やし、Ｓｕｃ−ＡＥＰＦ−ｐＮＡで開始した。３９０ｎｍにおける吸光度を、全基質が切断された産物に変換されるまで連続的にモニターした。このデータ、即ち、プログレス曲線を当該反応の速度定数ｋを求めるために、指数方程式にフィトさせた。自発的異性化の速度定数を一旦差し引くと、速度定数ｋは、検定混合液に存在している活性酵素の濃度に直線的に比例する。この基質に対するＫmは、１００μＭ（[Ｓ]＜＜Ｋｍ）よりかなり高いものであった。それ故、阻害実験において、この強固でない結合の阻害物質に対するＩＣ50は、本質的にＫiであった。阻害物質の存在なしでは、野生型ヒトＰＩＮ１及び変異体ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼ双方共に、１００μＭ Ｓｕｃ−ＡＥＰＦ−ｐＮＡを含む０.０３３ｎＭにおいて、０.２の比率であった。化合物Ｉ及び変異体ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２ＱのＫiは、０.０６μＭであった。
【０１９８】
Ｅ．等温滴定熱量測定
Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインのＨis−タグ構築物に対する化合物Ｉの結合（図４）を、下記の等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）で調べた。滴定は二連で行い、定まった不確定性は、得られた結果の平均値の標準偏差値で表示した。
【０１９９】
予備的な２μＬ注入に続いて、ＰＰＩアーゼポリペプチドの２００μＭ溶液の１０μＬ注入を、化合物Ｉの１０μＭ溶液中に、２０から２５回滴下した。滴定は、ＶＰ−ＩＴＣ（MicroCal, Northampton, MA）を用いて、１５℃、２７０ｒｐｍの撹拌設定、４分間の注入間隔、及び１０μＬ注入の注入時間は２０秒で行なった。ＩＴＣセルの稼働容量は、１.４１４ｍＬであった。両溶液は、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、０.５ｍＭ ＴＣＥＰ及び２.０％ ＤＭＳＯ（容量％）を含んでいた。ＰＰＩアーゼポリペプチド溶液は、４.０℃で、透析緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、０.５ｍＭ ＴＣＥＰ）の数回の交換により、貯蔵蛋白質溶液を完全に透析して製造した。
【０２００】
透析後、蛋白質は遠心分離して、いかなる粒状物質をも除去した。蛋白質濃度は、蛋白質のトリプトファン及びチロシン含量に基づいて計算した吸光係数を用いて、吸光度から決定した。その後、透析した蛋白質は、透析液で希釈し、そして２.０％（容量％）ＤＭＳＯを添加し、最終濃度２００μＭ蛋白質を得た。２０ｍＭの化合物Ｉ貯蔵溶液は、少量の化合物ＩをＤＭＳＯに溶解して調製した。当該貯蔵溶液の一部をＤＭＳＯで希釈し、そして透析液の適当量を添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は、２.０％（容量％）であり、化合物の最終濃度は、１０μＭであった。
【０２０１】
適切な調節滴定（緩衝液中への緩衝液、化合物への緩衝液、緩衝液への蛋白質）は、希釈熱を測定することにより行なった。結合パラメターにフィットする前に、観測した結合熱を、蛋白質の希釈熱について補正した。機械的なブランク補正（緩衝液中への緩衝液）及び化合物の希釈熱は、似たようなものであり、そしてそのようなものは、希釈熱の補正においては無視できるものであった。データは、ＩＴＣで提供されたＯＲＩＧＩＮ(R)ソフトウエアパッケージ(MicroCal)を用いてフィットさせた。図６において、実線は、ＯＲＩＧＩＮ(R)ソフトウエアパッケージ（ｋa＝１.４２×１０7Ｍ-1，Ｃ値＝１４２）を用いて補正した結合データの最良フィットを表示している。セル中におけるリガンドとの「ワンセットオブサイト」（One Set of Sites）モデルを選択した。観測した一対一化学量論よりも小さいものは、貯蔵蛋白質標品中に存在していた少量の不活性酵素に由来するものと思われる。
【０２０２】
化学量論、解離定数及び結合エンタルピーは、それぞれ、０.８５４（±０.００３）、６７（±５）ｎＭ、及び−７.３（±０.１）kcal／mol であった。
【０２０３】
実施例５    ＰＰＩアーゼポリペプチド及びＰＰＩアーゼ  ＰＰＩアーゼ／化合物Ｉの結晶化
アポ酵素（トロンビン切除ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）の結晶は、懸滴(hanging-drop)蒸気拡散法により、１３℃で成長させた。等量の蛋白質溶液（蛋白質：１０−１５ｍｇ／ｍｌ）及び１.２−１.４Ｍ クエン酸ナトリウムを、０.１Ｍ ヘペス(Hepes）（又は、ｐＨ＞８.５の場合はボレート）、ｐＨ範囲は７.５−１０.０（最適ｐＨ＝８.８）、及び５ｍＭ ＤＴＴと混合することにより、結晶を得た。結晶は、典型的に、３日以内で成長した。Ｘ−線データ採集のため、結晶は貯蔵溶液に加えて２０％グリセロールを含んでいる凍結保護物質中に移し、そして液体窒素中で瞬間凍結した。a＝１１６.８４、b＝３５.８２、c＝５１.４０オングストローム、アルファ＝９０.０、ベータ＝１００.３３、及びガンマ＝９０.０度の単斜空間群(monoclinic space group)Ｃ２に属すると決定された結晶は、非対称単位当たり２分子を含んだ。
【０２０４】
トロンビン切除ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ及び化合物Ｉの結晶は、上記のアポ酵素の場合に類似する条件下における結晶化により得た。蛋白質を１０ｍｇ／ｍｌに希釈した後、最終濃度が１ｍＭとなるように添加して、１００％ＤＭＳＯに溶解された化合物Ｉに暴露した。ＰＰＩアーゼポリペプチドと化合物Ｉとの比率は、１：５であった。貯蔵溶液は、１.４Ｍ クエン酸ナトリウムを、０.１Ｍ ヘペス(Hepes）、ｐＨ７.５（ＨＣｌで滴定）及び１０ｍＭ ＤＴＴと共に含んでいた。得られた蛋白質／化合物Ｉ溶液を、４℃で２４時間インキュベートした後、結晶化実験の開始前に、０.４５μＭの酢酸セルロース膜を通して濾過した。結晶は、３日以内で成長した。結晶：リガンド複合体は、上記のアポ酵素について記載したように、同一の空間群（Ｃ２）及び同様の格子サイズ(cell dimensions)を有していた。
【０２０５】
実施例６    ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑの構造解析
ＰＰＩアーゼ変異体Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑの構造は、ＭＲプローブとしてネイティブなＰＩＮ１構造の残基５５−１６３を用いて、ＥＰＭＲソフトウエア(Kissinger他, Acta Cryst. D55:484-491 (1999)) を用いた分子置換（ＭＲ）により解析した。正しく配置しかつ配向したダイマーのＲファクターは、１０−４.０オングストロームの範囲のデータでは、３９.７％であった。このＭＲ解析は、フィット用ＳＩＧＭＡＡ加重２Ｆｏ−Ｆｃマップを作成するために、１７.６％のＲファクターまで、ＡＲＰ／ｗＡＲＰ（ＥＭＢＬ）によって精密なものとした。このリファインメントは、プログラムＸ−ＰＬＯＲにおいてシミュレートしたアニーリングおよび結合勾配の最小化プロトコール（上記Brunger 1992）を用いて行なった（リファインメントの統計データは表１を参照）。最終モデルは、分子Ａの残基５１−１６３（残基６９及び８７の側鎖原子を除いて）の全ての原子を含み、分子Ｂの残基５４−１６３（残基６９、９４及び９５の側鎖原子を除いて）の全ての原子、加えて２４２の水を含んでいた。アポ酵素の構造座標は、表IIに表示してある。
【０２０６】
実施例７    化合物Ｉと複合体を形成しているＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑの構造解析
ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑの結晶構造からの蛋白質原子座標を、Ｘ−ＰＬＯＲにおける剛体のリファインメントの開始に使用し、それに続いて、シミュレートしたアニーリング及び結合勾配の最小化プロトコールを使用した。阻害物質の置換及び異なる電子密度マップ中への整然とした溶媒の付加に続いて、Ｘ−ＰＬＯＲ（リファインメントについての統計は表１を参照）を用いたリファインメントの実質的な循環を行なった。最終モデルは、分子Ａの残基５１−１６３（残基８７の側鎖原子を除いて）の全ての原子を含み、分子Ｂの残基５４−１６３（残基９４及び９５の側鎖原子を除いて）の全ての原子を含み
、加えて化合物及び１８１の水を含んでいた。分子Ｂにおける阻害物質の占有率は、分子Ａについて測定されたものより小さかった。
【０２０７】
結晶学的分析から得られた結果は、以下の表１に表示している。結晶構造座標は表IIIに規定している。
【表１】
2005532061.tif 000009
【０２０８】
実施例８    ＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインを含んでいるペプチドを使用した高速スループット検定法
この検定法は、蛍光偏光に基づいている。蛍光偏光の検出においては、単色光は偏光フィルターを通って標品穴における分子を励起させる。
偏光板に正しく配向した分子のみが光を吸収して励起し、そして発光する。
発光は、励起板に平行にかつ垂直に配向した偏光フィルターを通った後に検出される。小分子は、大きい分子よりも急速に回転するため（例えば、結合型（bound）複合体の場合）、平行（Ｓ）及び垂直（Ｐ）の測定値は近似し、そして相異は小さくなる。蛍光偏光はｍＰ(ミリＰ)で測定し、次の式を用いて定義される。
ｍＰ＝１０００*（Ｓ−Ｐ）／（Ｓ+Ｐ）
【０２０９】
ＰＩＮ１検定のため、ライブラリー化合物は、ＰＩＮ１のＰＰＩアーゼドメインに結合するために、フルオレセインタグされたピンチドと競合する。短時間インキュベートした後、標品を蛍光偏光により検定した。フルオレセインの励起及び発光は、それぞれ、４８５ｎｍ及び５３０ｎｍにおいて起こった。検定は、均一であり、そしてライブラリー化合物の存在下及び非存在下で行なった。フルオレセインタグされたピンチドとＰＩＮ１のＰＰＩアーゼドメイン間の複合体の形成は、Ｓ及びＰ測定間の大きな相異を導くものであり、高いｍＰ値をもたらした。ＰＩＮ１のＰＰＩアーゼドメインに結合してこの複合体形成を妨げる化合物は、ｍＰ値を減少させた。
【０２１０】
材料及び試薬
実験は、９６穴プレート又は３８４穴黒色平底のポリスチレン非結合表面（ＮＢＳ）プ
レート（Costar）中で行なった。ＰＰＩアーゼ基質は、フルオレセインタグされたピンチド、ＦＬ−ＷＦＹｐＳ ＰＦＬＥ（配列番号１１）であり、ここにおいてｐＳは、リン酸化されたセリンを意味する。阻害物質の対照としては、フルオレセインタグをしていないピンチドを用いた。蛍光標識したピンチドは、市販品（AnaSpec, Inc., San Jose, CA）を購入するか、又はここに記載したようにして合成した。緩衝液の条件は、２５ｍＭ ＭＯＰＳ[３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸]、 及び０.５ｍＭ ＴＣＥＰ[塩酸トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン]、ｐＨ７.５である。阻害物質の対照としては、フリーのピンチドを、５０、１０及び２μＭ（フリーのピンチドのＩＣ50は、約７−１０μＭ）を用いた。励起は４８５ｎｍ及び発光は５３０ｎｍにおいて測定した。読み取りは、蛍光偏光リーダー(Molecular Devices Analyst）で行った。
【０２１１】
ピンチドの合成
ピンチド(ＷＦＹｐＳＰＦＬＥ)は、標準的Ｆmoc 化学及び充填済みＨＭＰ樹脂を用いて、０.１mmol規模で、Applied Biosystem４３３Ａペプチド合成機により合成した。ジクロロメタン(ＤＣＭ)（Fisher)で洗浄した後、ペプチドを樹脂から切断し、そして捕捉剤としてエタンジチオール及びチオアニソールを含んでいるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Aldrich）中で、保護基を脱離した。溶液を冷却したｍ−tertブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（Aldrich）中に注いでペプチドを沈殿させ、そして６Ｋｒｐｍで３分間遠心分離した。得られたペレットを洗浄し、そして冷却したＭＴＢＥ中で、４回遠心分離した後、真空下で乾燥させた。乾燥させた沈殿物を再懸濁し、一晩凍結乾燥した。
【０２１２】
精製は、直線スキャニングデイテクターＬＳ５００及び FoxyII フラクションコレクター付のＩＳＣＯ２３５０ＨＰＬＣを用いて行なった。精製の条件は次のようである。移動相は、０.１％ＴＦＡ：Ｈ2Ｏ，溶離剤は、０.１％ＴＦＡ：ＣＨ3ＣＮ（アセトニトリル（Omnisolve, VWR））；勾配は、５％から９５％、３０分間、２５×１ｃｍ Hypersil ＯＤＳ（５μｍ、３００Ａ，Phenomenex）；流速は２.５ｍｌ／分；そして画分は３０秒ごとに採集した。
【０２１３】
画分は、同一緩衝系及び勾配を用いて、１００×４.６ｍｍ Hypersil ＯＤＳカラム(Hewlett-Packard) 付のＨＰ１０５０を用いて分析した。純粋な生成物（ピンチド；溶離時間＝１２.２２分）を一晩凍結乾燥した。化合物の同定は、ＭＡＬＤＬ−ＴＯＦ質量分析機で確認した。
【０２１４】
フルオレセイン修飾は、下記に記載したように、Molecular Probes (ＭＰ−００１４３；８／１９／９８)により公開された基礎的プロトコールに基づいて行なった。
【０２１５】
精製しかつ凍結乾燥したピンチド２０ｍｇ（ペプチド含量約６０％、実質的ペプチド１２ｍｇ）を、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3（炭酸水素ナトリウム）（Sigma）ｐＨ８.３の１.７５ｍｌに再懸濁した。フルオレセイン−５−ＥＸ スクシニミジルエステル(Molecular Probes ♯Ｆ−６１３０)の３.３ｍｇを、１０ｍｇ／ｍｌ（３３０μｌ）となるようにＤＭＳＯに再懸濁した。この溶液の１６５μｌを、ペプチド溶液に室温で継続的に撹拌しつつ滴下した。３０分後に、残りの１６５μｌを、継続的に撹拌しつつ滴下した。６０分後に反応を終止しかつ精製を容易にするために、溶液をＨＰＬＣ（上記の条件下で）に充填した。画分を上述したように分析し、そして生成物（フルオレセインタグされたピンチド；溶離時間＝１４.５８分）を一晩凍結乾燥した。化合物の同定はＭＡＬＤＬ−ＴＯＦ質量分析機で確認した。
【０２１６】
９６穴−プレートを用いた検定プレートフォーマット及びスクリーニング条件
フルオレセイン−ピンチド２０μＭを含んでいる検定緩衝液の４５μＬを、各穴に分注した。試験化合物（ＤＭＳＯ中０.５ｍＭ保存濃度の１μＬ）をカラム１−２２に添加し
た。ＰＩＮ１の６Ｈis−ＰＰＩアーゼドメイン（検定緩衝液中の４μＭ溶液の５μＬ）をカラム１−２２の全穴、及びカラム２３−２４の大部分の穴に添加した。カラム２３−２４に対しては、次の対照を用いた：Ａ２３−Ｆ２４穴は、ＤＭＳＯ対照で最大値の計算に用い、Ｇ２３−Ｈ２４穴、Ｉ２３−Ｊ２４穴、及びＫ２３−Ｌ２４穴は、それぞれ、５０μＭ、１０μＭ及び２μＭのフリーのピンチドの阻害物質対照であり；そしてＭ２３−Ｐ２４穴は、ＰＰＩアーゼを含まず、そして最小値の計算に用いた。検定物を室温で１０分間インキュベートし、その後直ちに４８５ｎｍにおける励起及び５３０ｎｍにおける発光において蛍光偏光モードで読み取った。各穴の阻害パーセントを次の式を用いて計算した。
％阻害＝１００*（１−(ｍＰ穴−最小値平均)／(最大値平均−最小値平均)）
【０２１７】
添加の順番は変更可能である。例えば、当該検定の変法として、化合物を最初にプレートに添加し、次に検定緩衝液にフルオレセイン−ピンチドを加え、そして最後に６Ｈis−ＰＰＩアーゼを加えることもできる。目下のところデザインされている検定は競合検定である。
【０２１８】
検定の前提は、フルオレセイン−ピンチド及び６Ｈis−ＰＰＩアーゼを最初に添加し、次に化合物を加えたときには相異する。フルオレセイン−ピンチド及び６Ｈis−ＰＰＩアーゼは複合体を前もって形成する。化合物を加えると、これは結合部位からフルオレセイン−ピンチドを移動させる。これは、化合物のＫDに依存して起こり得るが；しかしながら、長いインキュベーションが必要とされる。
【０２１９】
前述の記載は、本発明及びその好ましい実施態様の説明のために供されるものである。本発明は、前述の記載により限定されるものではないが、しかし、添付した請求の範囲によって定義付けられる。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】化合物Ｉに結合したＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）ドメイン構造のリボン−及び−ステイック図である。αへリックスは赤、βストランドは黄色、ターンは青、そして結合セグメントは緑で表示している。右手のパネルは完全長ＰＩＮ１の構造を示している。
【図２Ａ】ステイック結合を用いて描写した、化合物Ｉと結合したＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）活性部位の拡大図を示している。化合物Ｉに近接したアミノ酸側鎖はステイック結合及び緑色で表示している。
【図２Ｂ】ＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）の活性部位の拡大図及び化合物Ｉの電子密度を示している。
【図３】ＰＰＩアーゼ（Ｋ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑ）溶媒−接近可能な表面を示している。赤色は疎水性領域を、そして青緑色（シアン色）は親水性領域を示している。
【図４Ａ】ヒトＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列のリストである。
【図４Ｂ】トロンビンによる切断後のｐET−２８aから発現したヒトＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼドメインのアミノ酸配列である。
【図５Ａ】突然変異 ＰＰＩアーゼＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑをコードするヌクレオチド配列のリストである。
【図５Ｂ】トロンビンによる切断後のｐET−２８aから発現したＫ７７Ｑ／Ｋ８２Ｑのアミノ酸配列のリストである。
【図６】His−タグＰＩＮ１ ＰＰＩアーゼよる化合物Ｉの熱量測定滴定の図解である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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