(57)【要約】本発明は、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）などのキサンテノン酢酸クラスの化合物などの式（Ｉ）の化合物とＮＳＡＩＤｓ、特に抗腫瘍作用を有するジクロフェナクの相乗的な組み合わせに関する。さらに特に、本発明は、癌を治療する際のこのような組み合わせの用途と、組み合わせを含有する製薬学的組成物とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2005526786.tif 000008
（式中、
（ａ）Ｒ4およびＲ5は、それらが結合する炭素原子と一体として、置換基−Ｒ3および基−（Ｂ）−ＣＯＯＨ（式中、Ｂは、飽和またはエチレン系不飽和である、直鎖状または分岐鎖状の置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル基である）を有する６員環の芳香環を形成し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、各々、独立に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲからなる群から選択され、各Ｒは、独立に、必要に応じて、ヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つ以上の置換基で置換されているＣ1〜Ｃ6アルキルであるか、または
（ｂ）Ｒ4およびＲ5の一方はＨまたはフェニル基であり、Ｒ4およびＲ5の他方は、Ｈまたは必要に応じて、置換されていてもよいフェニル基、テニル、フリル、ナフチル、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、シクロアルキルまたはアラルキル基であり、Ｒ1はＨまたはＣ1〜Ｃ6アルキルまたはＣ1〜Ｃ6アルコキシ基であり、Ｒ2は、−（Ｂ）−ＣＯＯＨ基（式中、飽和またはエチレン系不飽和である、直鎖状または分岐鎖状の置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル基である））
の化合物または製薬学的に許容されうるその塩またはエステルの有効量を、治療を必要としているヒトを含む哺乳類に投与するステップと、ＮＳＡＩＤの有効量を同時投与または逐次投与するステップとを含み、前記ＮＳＡＩＤの有効量が、前記哺乳類において上記に規定する式（Ｉ）を有する化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない、腫瘍増殖を調節する方法。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、式（ＩＩ）：
【化２】
2005526786.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5およびＢは、請求項１のパート（ｂ）において式（Ｉ）について規定されているとおりである）の化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩＩ）：
【化３】
2005526786.tif 000010
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、各々、独立に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲからなる群から選択され、各Ｒは、独立に、必要に応じて、ヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つ以上の置換基で置換されているＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｂは、請求項１において式（Ｉ）について規定されているとおりであり、
式（Ｉ）の炭素環式の芳香環の各々において、メチン（−ＣＨ＝）基の２つ以下がアザ（−Ｎ＝）基で置換されていてもよく、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の任意の２つが、さらに一体として、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−基を提供して、この基が、結合している炭素または窒素原子と一体として、融合６員環の芳香環を形成してもよい）の化合物である請求項１記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が式（ＩＶ）：
【化４】
2005526786.tif 000011
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、請求項３において式（ＩＩＩ）について規定されているとおりである）
の化合物である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
式（ＩＶ）の化合物が式（Ｖ）：
【化５】
2005526786.tif 000012
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、請求項４において式（ＩＶ）について規定されているとおりである）の化合物である請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｒ4はＨまたはフェニル基であり、Ｒ5は、Ｈまたは必要に応じて、置換されていてもよいフェニル基、テニル、フリル、ナフチル、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、シクロアルキルまたはアラルキル基であり、Ｒ1はＨまたはＣ1〜Ｃ6アルキルまたはＣ1〜Ｃ6アルコキシ基であり、Ｒ2は、−（Ｂ）−ＣＯＯＨ基（式中、飽和またはエチレン系不飽和である、直鎖状または分岐鎖状の置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル基である請求項１記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである、請求項１、３、４または５のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤが、相乗作用を示す比で投与される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤが、同時に投与される請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤが、逐次的に投与される請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ＮＳＡＩＤがＣＯＸ阻害剤である請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＮＳＡＩＤが、ジクロフェナク、サリチル酸塩、イブプロフェン、セレコキシブおよびロフェコキシブからなる群から選択される請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＮＳＡＩＤがジクロフェナクである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
結腸癌における腫瘍増殖を調節するためである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法
【請求項１５】
腫瘍増殖を調節するために、単位用量のＮＳＡＩＤ化合物と同時投与、別個の投与または逐次投与するための医薬品を製造するための請求項１〜６のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルの用途であって、前記単位用量が、哺乳類において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む用途。
【請求項１６】
腫瘍増殖を調節するために、請求項１〜６のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルを同時投与、別個の投与または逐次投与するための単位用量の医薬品を製造するためのＮＳＡＩＤ化合物の用途であって、前記単位用量が、治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む用途。
【請求項１７】
ＮＳＡＩＤが、ジクロフェナク、サリチル酸塩、イブプロフェン、セレコキシブおよびロフェコキシブからなる群から選択される請求項１５または請求項１６記載の用途。
【請求項１８】
ＮＳＡＩＤ化合物がジクロフェナクである請求項１７記載の用途。
【請求項１９】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物が相乗作用を示す比で存在する請求項１５〜１８のいずれか１項記載の用途。
【請求項２０】
式（Ｉ）の化合物：ＮＳＡＩＤの比が１０：１〜１：１の範囲内である請求項１９記載の用途。
【請求項２１】
式（Ｉ）の化合物：ＮＳＡＩＤの比が約５：１である請求項２０記載の用途。
【請求項２２】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物が同時投与される請求項１５〜２１のいずれかに記載の用途。
【請求項２３】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物が逐次投与される請求項１５〜２１のいずれかに記載の用途。
【請求項２４】
式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである請求項１５〜２３のいずれか１項記載の用途。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせを含む製薬学的製剤であって、前記製薬学的製剤の単位用量が、治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む製薬学的製剤。
【請求項２６】
製剤が静脈内投与用に適合されている請求項２５記載の製薬学的製剤。
【請求項２７】
ＮＳＡＩＤ化合物がジクロフェナクである請求項２５または請求項２６記載の製薬学的製剤。
【請求項２８】
式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである請求項２５〜２７のいずれか１項記載の製薬学的製剤。
【請求項２９】
請求項１〜６のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物を、前記ＮＳＡＩＤ化合物が治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量である単位用量において、１種以上の製薬学的に許容されうる担体と会合させるステップを含む製薬学的製剤を調製する方法。
【請求項３０】
ＮＳＡＩＤ化合物がジクロフェナクである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである請求項２９または請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍増殖を調節する際に同時使用、別個の使用または逐次的な使用のための組み合わせにおいて、請求項１〜６のいずれか１項記載の式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物を含むキットであって、前記ＮＳＡＩＤが、治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量のＮＳＡＩＤを含む単位用量で提供されるキット。
【請求項３３】
ＮＳＡＩＤ化合物がジクロフェナクである請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである請求項３３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下に規定する式（Ｉ）を有するクラスの化合物、例えば、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）などの、以下に規定する式（ＩＩ）を有するキサンテノン酢酸クラスの化合物と抗腫瘍作用を有するシクロオキシゲナーゼ阻害剤などの非ステロイド性抗炎症薬、特にジクロフェナクの相乗作用のある組み合わせに関する。さらに特に、本発明は、癌を治療する際のこのような組み合わせの用途とこのような組み合わせを含有する製薬学的組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）は以下の式：
【化１】
2005526786.tif 000002
によって表される。
【０００３】
ＤＭＸＡＡの第Ｉ相臨床試験は最近終了しており、ダイナミックＭＲＩは、ＤＭＸＡＡは耐用性が良好な容量において腫瘍の血流の有意な低下を誘導することを示している。ＤＭＸＡＡは、作用（腫瘍血流の非可逆的な阻害）がヒト腫瘍において証明されている最初の抗血管剤の１つである。これらの所見は、腫瘍またはヒト腫瘍異種移植片を使用し、抗血管作用が長期間の腫瘍血流の阻害を生じ、広範な出血性壊死領域を生じることを示した前臨床試験に一致している。
【０００４】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）は炎症の徴候および症状を抑制する能力を有する。多くは解熱鎮痛作用も発揮する。サリチル酸塩は、最初のＮＳＡＩＤであるアスピリンの主要な抗炎症性代謝物である。アスピリンは、血小板シクロオキシゲナーゼを非可逆的にアセチル化し、遮断する。他のＮＳＡＩＤｓは可逆的な阻害剤である。従来のＮＳＡＩＤｓの多くに対するＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の選択性は異なる。イブプロフェンは、ほぼ同じ程度でＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１を阻害する。しかし、選択性が高いＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブおよびロフェコキシブ）が現在利用可能である。
【０００５】
ジクロフェナクは、化学名２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸を有する非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。ジクロフェナクカリウムはカタフラム（登録商標）として利用可能であり、ジクロフェナクナトリウムはボルタレン（登録商標）として利用可能である。ジクロフェナクは、骨関節炎および関節リウマチの徴候および症状の急性および慢性治療並びに強直性脊椎炎、無痛症および原発性月経困難症の治療に適応される。
【０００６】
薬物動態学的薬物相互作用は、薬物Ａが薬物Ｂの吸収、分布、排泄または代謝を変更することによって薬物Ｂの血漿（または組織）濃度に影響を与えるものと規定される（ＤｏｒｒおよびＦｒｉｔｚ、癌化学療法ハンドブック（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、Ｈｅｎｒｙ  Ｋｉｍｐｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ロンドン、１９８０年、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ，Ｌ．、癌化学療法−参照ガイド（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、ニューヨーク、１９８９年）。５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）とサリドマイドの併用療法は、薬物代謝の変更に関係する薬物動態学的相互作用の例の１つである。
【０００７】
ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ２Ｂ７およびＣＹＰ１Ａ２は、ＤＭＸＡＡの代謝に関与することが示されている（Ｍｉｎｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７：２８４−２８９，１９９７、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ、７５７：３４３−３４８，２００１）。グルクロン酸抱合はＤＭＸＡＡの主要な代謝的排泄経路である（Ｍｉｎｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７：２８４−２８９，１９９７、Ｋｅｓｔｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４６：１３５−１４１，２０００）。ＤＭＸＡＡは６−メチル水酸化によっても代謝されうるが、程度はわずかである（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ，７５７：３４３−３４８，２００１）。グルクロン酸抱合の産物、ＤＭＸＡＡアシルグルクロニド（ＤＭＸＡＡ−Ｇ）および６−メチル水酸化の産物、６−メチルヒドロキシル−５−メチルキサンテノン−４−酢酸（６−ＯＨ−ＭＸＡＡ）は、次いで、胆汁および尿中に排泄される（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ，７５７：３４３−３４８，２００１）。
【０００８】
ジクロフェナクはＤＭＸＡＡの代謝に影響を与えることが示されている。ジクロフェナクは、１００μＭの濃度で、マウスおよびヒトミクロソームにおいてＤＭＸＡＡのグルクロン酸抱合（＞７０％）および６−メチル水酸化（＞５４％）を有意に阻害することが示されている。ジクロフェナク（１００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は、インビボにおいて、雄および雌マウスにおいて血漿ＤＭＸＡＡ  ＡＵＣ（血漿濃度−時間曲線下面積）のそれぞれ２４％および３１％の増加並びにＴ1/2の３倍増（Ｐ＜０．０５）を生じることが示されている（Ｚｈｏｕら、（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７  ３１９−３２６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以下に規定する式（Ｉ）を有する化合物と式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態に影響を与えないＮＳＡＩＤ濃度のＮＳＡＩＤジクロフェナクなどのＮＳＡＩＤを同時投与または逐次投与することによって、上記に規定する式（Ｉ）の化合物の抗腫瘍作用の相乗作用が達成されることが驚くべきことに現在見出されている。
【００１０】
特に、ＤＭＸＡＡなどの以下に規定する式（Ｉ）の化合物とジクロフェナクなどのＮＳＡＩＤの同時投与は、以下に規定する式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態に有意に影響を与えないＮＳＡＩＤ濃度において、皮下に定着した（３〜５ｍｍ、約２０ｍｇ）の結腸３８腫瘍断片に治療的利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、第一の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化２】
2005526786.tif 000003
（式中、
（ａ）Ｒ4およびＲ5は、それらが結合する炭素原子と一体として、置換基−Ｒ3および−（Ｂ）−ＣＯＯＨ基（式中、Ｂは、飽和またはエチレン系不飽和である、直鎖状または分岐鎖状の置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル基である）を有する６員環の芳香環を形成し、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、各々、独立に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲからなる群から選択され、各Ｒは、独立に、必要に応じて、ヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つ以上の置換基で置換されているＣ1〜Ｃ6アルキルであるか、または
（ｂ）Ｒ4およびＲ5の一方はＨまたはフェニル基であり、Ｒ4およびＲ5の他方は、Ｈまたは必要に応じて、置換されていてもよいフェニル基、テニル、フリル、ナフチル、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、シクロアルキルまたはアラルキル基であり、Ｒ1はＨまたはＣ1〜Ｃ6アルキルまたはＣ1〜Ｃ6アルコキシ基であり、Ｒ2は、−（Ｂ）−ＣＯＯＨ基（式中、飽和またはエチレン系不飽和である、直鎖状または分岐鎖状の置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル基である））
の化合物または製薬学的に許容されうるその塩またはエステルの有効量を、治療を必要としているヒトを含む哺乳類に投与するステップと、ＮＳＡＩＤの有効量を同時投与または逐次投与するステップとを含み、ＮＳＡＩＤの有効量が、哺乳類において上記に規定する式（Ｉ）を有するキサンテノン酢酸クラスの化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない、腫瘍増殖を調節する方法を提供する。
【００１２】
−（Ｂ）−ＣＯＯＨ基が置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル基である場合には、置換基はアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピルもしくはイソプロピルまたはフルオロ、クロロもしくはブロモ基などのハライドであってもよい。特に好ましい置換基はメチルである。
【００１３】
本発明の第一の態様の一実施態様において、上記に規定する式（Ｉ）の化合物は式（ＩＩ）、
【化３】
2005526786.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ4、Ｒ5およびＢは、パート（ｂ）において式（Ｉ）について規定されているとおりである）の化合物である。
【００１４】
本発明の第一の態様の好ましい実施態様において、上記に規定する式（Ｉ）の化合物は式（ＩＩＩ）、
【化４】
2005526786.tif 000005
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、各々、独立に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲからなる群から選択され、各Ｒは、独立に、必要に応じて、ヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つ以上の置換基で置換されているＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｂは、上記に式（Ｉ）について規定されているとおりであり、
式（Ｉ）の炭素環式の芳香環の各々において、メチン（−ＣＨ＝）基の２つ以下がアザ（−Ｎ＝）基で置換されていてもよく、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3の任意の２つが、さらに一体として、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−基を提供して、この基が、結合している炭素または窒素原子と一体として、融合６員環の芳香環を形成してもよい）の化合物である。
【００１５】
好ましくは、式（ＩＩＩ）の化合物は式（ＩＶ）、
【化５】
2005526786.tif 000006
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、式（ＩＩＩ）について規定されているとおりである）の化合物である。
【００１６】
式（ＩＶ）の化合物の好ましい実施態様において、Ｒ2はＨであり、Ｒ1およびＲ3の一方は、Ｃ1−Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、  ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲ（式中、各Ｒは、独立に、必要に応じてヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つ以上の置換基で置換されているＣ1−Ｃ6アルキルである）からなる群から選択され、Ｒ1およびＲ3の他方はＨである。
【００１７】
好ましくは、式（ＩＶ）の化合物は式（Ｖ）、
【化６】
2005526786.tif 000007
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、式（ＩＶ）について規定されているとおりである）のものである。
【００１８】
最も好ましくは、式（ＩＶ）の化合物は５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）である。
【００１９】
本発明に関連して、ＮＳＡＩＤの濃度は、式（Ｉ）の化合物のＡＵＣ（血漿濃度−時間曲線下面積）および／または血漿中の式（Ｉ）の化合物のＴ1/2で判断するとき、哺乳類における式（Ｉ）の化合物の血漿濃度が有意に増加されない場合には（Ｐ＜０．０５）、哺乳類において上記に規定する式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更しないと考えられる。好ましくは、ＡＵＣおよびＴ1/2値は共に、式（Ｉ）の化合物の単独療法で治療した哺乳類と式（Ｉ）の化合物とＮＳＡＩＤで治療した哺乳類の間で有意に異ならない。別の方法としてまたは好ましくは、ある濃度のＮＳＡＩＤが、本発明に関連して、哺乳類において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するかどうかを評価するための追加の試験は代謝物の測定であってもよい。例えば、式（Ｉ）の化合物がＤＭＸＡＡである場合には、ＤＭＸＡＡアシルグルクロニド（ＤＭＸＡＡ−Ｇ）および６−メチルヒドロキシル−５−メチルキサンテノン−４−酢酸（６−ＯＨ−ＭＸＡＡ）などの代謝物濃度を測定してもよい。ＮＳＡＩＤの存在下および非存在下においてＤＭＸＡＡの代謝アッセイにおいてＤＭＸＡＡ−Ｇまたは６−ＯＨ−ＭＸＡＡ濃度を測定することによって評価するとき、ＮＳＡＩＤがグルクロン酸抱合または６−メチル水酸化の有意な阻害を生じない場合には、ある濃度のＮＳＡＩＤは哺乳類においてＤＭＸＡＡの血漿薬物動態を実質的に変更しないと考えることができる。インビトロおよびインビボにおける好適なアッセイは当業者に既知である。例えば、ＤＭＸＡＡ代謝を評価するために使用することができる肝ミクロソーム調製物に基づいたインビトロアッセイは、Ｚｈｏｕら、（２００１）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７  ３１９−３２６に記載されている。さらに好適には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に基づいた方法を使用して測定することができる。好適なＨＰＬＣに基づいたアッセイを使用して、被験者の血漿または尿中のＮＳＡＩＤ代謝物の濃度を測定することができる。このようなアッセイは、内容が参照として本明細書に組み入れられている、Ｋｅｓｔｅｌｌ，Ｐら、（１９９９）：Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３，３２３−３３０に記載されている。
【００２０】
別の態様において、本発明は、腫瘍増殖を調節するために、単位用量のシクロオキシゲナーゼ阻害剤化合物と同時投与または逐次投与するための医薬品を製造するための上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルの用途であって、前記単位用量が、哺乳類において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む用途を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍増殖を調節するために、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルを同時投与、別個の投与または逐次投与するための単位用量の医薬品を製造するためのＮＳＡＩＤ化合物の用途であって、前記単位用量が、治療対象の被験者においてＤＭＸＡＡの血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む用途を提供する。
【００２２】
よりさらに別の態様において、本発明は、腫瘍増殖を調節するために同時使用、別個の使用または逐次的な使用のための上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩またはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせ製剤であって、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩またはエステルとＮＳＡＩＤ化合物が相乗作用を示す比で存在し、前記ＮＳＡＩＤ化合物が、組み合わせを投与する被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量で存在する組み合わせ製剤を提供する。
【００２３】
さらに別の態様において、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせを含む製薬学的製剤であって、前記製薬学的製剤の単位用量が、治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量の前記ＮＳＡＩＤ化合物を含む製薬学的製剤が提供される。
【００２４】
本発明は、さらに、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物を、前記ＮＳＡＩＤ化合物が治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量である単位用量において、１種以上の製薬学的に許容されうる担体と会合させるステップを含む製薬学的製剤を調製する方法を提供する。
【００２５】
さらに本発明はまた、腫瘍増殖を調節する際に同時使用、別個の使用または逐次的な使用のための組み合わせにおいて、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物を含むキットであって、前記ＮＳＡＩＤが、治療対象の被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変更するのに必要な量より少ない量のＮＳＡＩＤを含む単位用量で提供されるキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
一実施態様において、ＮＳＡＩＤ化合物はシクロオキシゲナーゼ阻害剤である。好ましくは、ＮＳＡＩＤはＣＯＸ−２阻害剤である。本発明の好ましい実施態様において、ＮＳＡＩＤは、ジクロフェナク、サリチル酸塩、イブプロフェン、スリンダック、セレコキシブおよびロフェコキシブからなる群から選択される。特に好ましい実施態様において、ＮＳＡＩＤはジクロフェナクである。
【００２７】
「相乗作用を示す比」という用語は、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物が、その組み合わせの抗腫瘍作用が式（Ｉ）の化合物もしくはＮＳＡＩＤ化合物単独の抗腫瘍作用または個々の成分の作用に基づいてその組み合わせについて予測される相加作用の抗腫瘍作用より大きい比で存在することを示すために本明細書において使用される。従って、個々の成分は、相乗作用を示す比で存在する場合には、組み合わせにおいて相乗的に作用する。
【００２８】
上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物は同時投与、別個の投与または逐次投与されてもよい。好ましくは、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物は互いに６時間以内に投与され、さらに好ましくは、４時間以内に投与され、さらに好ましくは２時間以内に投与される。最も好ましくは、上記に規定する式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物は同時投与される。例えば、２つの薬物は０．２〜６時間、例えば０．３３〜３時間かけて注入により同時投与することができる。
【００２９】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物は相乗作用を示す比で投与される。好ましくは、製薬学的に許容されうる塩はナトリウム塩である。
【００３０】
癌を治療するために成功裏に使用することができる上記に規定する式（Ｉ）の化合物とＮＳＡＩＤの相乗作用を示す比は、好ましくは、１５０：１〜１：１５の範囲内であり、さらに好ましくは７５：１〜１：１０の範囲内であり、よりさらに好ましくは５０：１〜１：５であり、例えば、２５：１〜１：１、１５：１〜１：１である。好適には、相乗作用を示す比は１０：１〜１：１の範囲内である。約５：１の相乗作用を示す比が最も好ましい。
【００３１】
抗癌剤として有効となるのに必要な上記に規定する式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物、例えばＤＭＸＡＡまたは製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせの量は、当然のことながら異なり、最終的には担当医の判断による。考慮すべき因子には、投与経路および製剤の性質、哺乳類の体重、年齢および全身状態ならびに治療対象の疾患の性質および重症度が挙げられる。
【００３２】
一般に、癌を治療するためにヒトに投与するためにＤＭＸＡＡと併用使用する予定のＮＳＡＩＤの好適な有効用量は、ヒトに実質的に無毒性で、ＤＭＸＡＡの薬物動態に実質的に影響を与えない量であってもよい。例えば、ＮＳＡＩＤが化合物のグルクロン酸抱合または６−メチル水酸化を実質的に阻害しない、例えば、ＮＳＡＩＤがその化合物のグルクロン酸抱合または６−メチル水酸化を４０％未満、好ましくは３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、最も好ましくは１％未満または０．１％未満しか阻害しない場合には、ある用量のＮＳＡＩＤは化合物、例えば、ＤＭＸＡＡの薬物動態に実質的に影響を与えないと考えてもよい。
【００３３】
一般に、癌を治療するためにヒトに投与するためのＤＭＸＡＡとＮＳＡＩＤの組み合わせの好適な有効用量は、ＤＭＸＡＡが６００〜４９００ｍｇ／ｍ2の範囲内であり、ジクロフェナクなどのＮＳＡＩＤは０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。例えば、６００〜４９００ｍｇ／ｍ2のＤＭＸＡＡと０．０２５〜４ｍｇ／ｋｇのジクロフェナクなどのＮＳＡＩＤ、好適には１２００〜３５００ｍｇ／ｍ2のＤＭＸＡＡと０．０５〜４ｍｇ／ｋｇのＮＳＡＩＤ、特に２０００〜３０００ｍｇ／ｍ2のＤＭＸＡＡと０．１〜３ｍｇ／ｋｇのＮＳＡＩＤ、さらに特に２２５０〜２７５０ｍｇ／ｍ2のＤＭＸＡＡと０．２〜２．５ｍｇ／ｋｇのＮＳＡＩＤ、さらに特に２２５０〜２７５０ｍｇ／ｍ2のＤＭＸＡＡと０．０５〜２ｍｇ／ｋｇのＮＳＡＩＤ。特に好ましい用量は２２５０〜２７５０ｍｇ／ｍ2の範囲内のＤＭＸＡＡと０．７５〜１．２５ｍｇ／ｋｇｍｇ／ｍ2の範囲内のＮＳＡＩＤである。さらに特に好ましい用量は２２５０〜２７５０ｍｇ／ｍ2の範囲内のＤＭＸＡＡと０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲内のＮＳＡＩＤ、例えば、０．１〜０．２５ｍｇ／ｋｇである。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物は任意の好適な剤形で投与することができる。しかし、本発明による用途のためには、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせは、好ましくは、製薬学的製剤として提供される。
【００３５】
製薬学的製剤は、有効成分（すなわち、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせ）を製薬学的に許容されうる１種以上の担体および必要に応じて他の治療用および／または予防用成分と共に含む。担体は、製剤の他の成分と適合性があり、レシピエントに有害でないという意味において許容可能でなければならない。
【００３６】
従って、本発明は、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせを、製薬学的に許容されうる１種以上の担体と会合させて含み、前記ＮＳＡＩＤ化合物が、その組み合わせを投与する被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態に実質的に影響を与えるのに必要な量より少ない量で存在する製薬学的製剤を提供する。
【００３７】
本発明は、さらに、式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせを製薬学的に許容されうる１種以上の担体と会合させるステップを含む製薬学的製剤を調製する方法であって、前記ＮＳＡＩＤ化合物が、前記製薬学的製剤において、その組み合わせを投与する被験者において式（Ｉ）の化合物の血漿薬物動態を実質的に変えるのに必要な量より少ない量で存在する方法を提供する。
【００３８】
製薬学的製剤は、経口、局所（皮膚、口腔および舌下を含む）、直腸および非経口（皮下、皮内、筋肉内および静脈内を含む）投与並びに経鼻胃管による投与に好適なものを含む。製剤は、適宜、別個の投与単位で便利に提供することができ、薬学分野において既知の方法のいずれかによって調製することができる。全ての方法は、作用成分を液体担体もしくは細分割した固形担体または両者と会合させるステップおよび適宜、生成物を望ましい製剤に形作るステップとを含む。
【００３９】
好ましくは、製薬学的製剤は非経口投与用に適合され、最も好ましくは静脈内投与用に適合される。例えば、化合物は、当技術分野において既知の各化合物の製剤を使用して静脈内に投与することができる。
【００４０】
担体が固形である経口投与に好適な製薬学的製剤は、最も好ましくは、各々が所定の量の作用成分を含有するボーラス、カプセルまたは錠剤などの単位用量製剤として提供される。錠剤は、必要に応じて１種以上の補助成分と共に圧縮成形または湿製成形によって製造することができる。圧縮錠剤は、必要に応じて結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒などの自由流動形態の作用化合物を好適な機械で圧縮成形することによって製造することができる。湿製錠剤は、不活性な液体希釈剤を湿製成形することによって製造することができる。
【００４１】
錠剤は、必要に応じてコーティングされてもよく、コーティングされない場合には、必要に応じて刻み線をつけてもよい。カプセルは、有効成分を単独でまたは１種以上の補助成分と共にカプセルシェルに充填し、次いで通常の方法でそれらを密封することによって製造することができる。カシェ剤はカプセルに類似しており、有効成分が任意の補助成分と共にライスペーパーの外皮で密封されている。式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせは、例えば、投与前に水で懸濁化することができるまたは食物に振り掛けることができる分散性の顆粒として製剤化されてもよい。顆粒は、例えば、小袋に包装されてもよい。担体が液体である経口投与に好適な製剤は、水性液体もしくは非水性液体の溶液もしくは懸濁液または水中油型の液体エマルジョンとして提供されてもよい。
【００４２】
経口投与用の製剤は、徐放性製剤、例えば、有効成分が適当な徐放性基質で製剤化されているまたは好適な徐放性フィルムでコーティングされている錠剤を含む。このような製剤は、予防的用途に特に便利となりうる。
【００４３】
有効成分はまた、経鼻胃管を介する投与に好適な溶液または懸濁液として製剤化することができる。
【００４４】
担体が固形である直腸投与に好適な製薬学的製剤は、最も好ましくは、単位用量の座剤として提供される。好適な担体には、カカオ脂および当技術分野において通常に使用される他の材料が挙げられる。座剤は、作用のある組み合わせと軟化または融解した担体を混合し、次に冷却して成形することによって便利に製造することができる。
【００４５】
非経口投与に好適な製薬学的製剤には、作用のある組み合わせの水性または油性賦形剤の滅菌溶液または懸濁液が挙げられる。注射用製剤は、１回大量投与注射または持続注入用に適合することができる。このような製剤は、製剤の導入後使用時まで密封される単回投与容器または頻回投与容器で提供される。または、有効成分は、使用時に発熱物質を含有しない滅菌水などの好適な賦形剤で構成される粉末形態であってもよい。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物または製薬学的に許容されうるその塩もしくはエステルとＮＳＡＩＤ化合物の組み合わせはまた、筋肉内注射または例えば皮下もしくは筋肉内への植え込みによって投与することができる長時間作用型デポ製剤として製剤化されてもよい。デポ製剤は、例えば、好適なポリマーもしくは疎水性材料またはイオン交換樹脂を含んでもよい。このような長時間作用型製剤は特に予防的用途に便利である。
【００４７】
上記の担体成分以外に、上記の種々の投与経路用の製薬学的製剤は、希釈剤、緩衝剤、矯味矯臭剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）等などの１種以上の追加の担体成分並びに製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする目的のために含まれる物質を含むことが理解されるべきである。
【００４８】
式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は当技術分野において既知の方法によって製造することができる。例えば、式（Ｉ）（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は上記に引用した式（Ｉ）の定義のパート（ｂ）に規定されているとおりである）の化合物は、内容が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第４，６０２，０３４号（Ｂｒｉｅｔら）に開示されている方法を使用して製造することができる。
【００４９】
式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物は既知であり、当技術分野において既知の方法を使用して製造することができる。例えば、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物並びにそれらの製造は、内容が参照として本明細書に組み入れられている、以下の参照文献に記載されている：
Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４（１）：２１７−２２、１月号１９９１、
Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４（２）：４９１−６、２月号１９９１、
Ａｔｗｅｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３（５）：１３７５−９、５月号１９９０、
Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４（９）：２８６４−７０、９月号１９９１、
Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２（４）：７９３−９、４月号１９８９
【００５０】
ＤＭＸＡＡは、内容が参照として本明細書に組み入れられている、Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（１）：２１７−２２、１月Ｊａｎｕａｒｙ  １９９１に記載されている方法により製造することができる。
【００５１】
ＮＳＡＩＤｓは当業者に既知の任意の好適な方法によって製造することができる。例えば、ジクロフェナクは既知の化合物であり、当業者に既知の方法によって製造することができる。
【００５２】
本発明は、上記に記載する好適で、好ましい群の全ての組み合わせを含むことが理解されるべきである。
【００５３】
本発明は、以下の実施例によってここで例示されるが、それらに限定する意図ではない。
【００５４】
［実施例］
材料と方法
オークランド大学動物資源施設（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｕｎｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ）のＣ５７Ｂ１／６マウスを、施設の倫理指針に準拠して、温度および湿度が一定の条件下において、滅菌ベッドおよび食料で飼育した。マウスは全て８〜１２週齢であった。
【００５５】
薬物と薬物投与
ＤＭＸＡＡはナトリウム塩として合成した（Ｒｅｗｃａｓｔｌｅら、（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８２：５２８−５２９）。ＤＭＸＡＡナトリウム塩を滅菌水に溶解し、体重１０ｇあたり２５ｍｇ／ｋｇの０．１ｍｌ量をマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００５６】
ジクロフェナク（Ｓｉｇｍａ社）はジメチルスルホキシドに溶解し、体重１０ｇあたり２５μｌ量をマウスにｉ．ｐ．注射した。必要量のジクロフェナクをＤＭＸＡＡと同時注射した。
【００５７】
腫瘍増殖遅延アッセイ
結腸３８腫瘍断片（〜１ｍｍ3）を麻酔した（ペントバルビタールナトリウム、８１ｍｇ／ｋｇ）マウスの左側の横腹の皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。腫瘍が径約３〜５ｍｍになったら実験を開始した。上記の投与計画により腫瘍を保有するマウスを薬物で治療し、その後毎週３回カリパスを使用して腫瘍を計測した。腫瘍の容積は０．５２ａ2ｂ（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の短軸および長軸である）として算出した。各経過時点において算術平均を算出し、治癒した腫瘍は容積ゼロと計測した。増殖遅延は、対照腫瘍および治療腫瘍の容積が４倍増加するのに必要な日数の差として判定した。
【００５８】
薬物動態学的検討
ＤＭＸＡＡ試料調製
マウスをＤＭＸＡＡまたはＤＭＸＡＡとジクロフェナクの組み合わせでｉ．ｐ．治療した。治療後０．２５、１．５、３、４．５および６時間経過時に、マウスをハロタン麻酔し、眼窩よりヘパリン処理したプラスチックマイクロ遠心管に採血した。次いで、動物は頚椎脱臼により速やかに命を絶った。マウスの命を絶ったら即座に腫瘍組織を取り出し、後のＤＭＸＡＡアッセイのために−７０℃で保存した。
【００５９】
データ分析およびアッセイバリデーション
ＤＭＸＡＡの薬物動態学的検討では、対数−台形法を使用してＡＵＣを時間の関数として算出した。Ｃｍａｘは測定された最高血中濃度であった。半減期（Ｔ1/2）は０．６９３／Ｌｚ（式中、Ｌｚは対数−濃度−時間曲線の末端の直線部分の傾斜である）として算出した。相対回収率およびアッセイ内正確度および精度の変動計数（ＣＶ）は、０．２〜１００μＭ（ＤＭＸＡＡアッセイ）の濃度範囲において、それぞれ、８５〜１１５％および６〜１０％（血漿アッセイはｎ＝８で、腫瘍／肝臓アッセイではｎ＝１０である）であった。アッセイ間正確度も許容可能であり、相対回収率（８５〜１１５％）およびＣＶｓ（６〜１０％、血漿アッセイはｎ＝８で、腫瘍／肝臓アッセイではｎ＝１０である）はほぼ同じであった。
【００６０】
ＤＭＸＡＡアッセイ
特異的な逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを使用して血漿中および腫瘍ホモジェネート中のＤＭＸＡＡ濃度を測定した。自動固相抽出および２，５−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（内部標準として）をこのアッセイに使用した。マウス血漿試料を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分）（Ｂｉｏｆｕｇｅ  Ａ、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｃｈｒｉｓｔ  ＧｍｂＨ、ドイツ）し、次いで１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１０倍希釈した。腫瘍試料を１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）の１ｍｌ中でホモジェナイズした。その後、希釈した血漿または腫瘍ホモジェネートの２００μｌを内部標準溶液（５０μｌ、２０μＭ）と混合し、氷冷したアセトニトリル／メタノール（３：１ｖ／ｖ）を使用してタンパク質を沈降させた。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、上清を酢酸アンモニウム緩衝液（９ｍｌ）に添加し、１ｍｌ／１００ｍｇの事前調製した（１ｍｌアセトニトリル／メタノール３：１ｖ／ｖおよび１ｍｌ  Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水）Ｃ１８  Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔカートリッジ（Ｖａｒｉａｎ、カリフォルニア州ハーバーシティ）に自動的に移した。これは、抽出カラムシステムを用いた自動試料調製を使用して実施した（ＡＳＰＥＣ、Ｇｉｌｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ウィスコンシン州ミドレトン）。カートリッジをＭｉｌｌｉ  Ｑ水（１ｍｌ）で洗浄し、関心対象の化合物を、３０％メタノールを含有するアセトニトリル１ｍｌで溶出した。
【００６１】
溶出液を濃縮遠心機（Ｊｏｕａｎ、サンナザーレ、フランス）を使用して蒸発させて乾燥し、残渣を２００μｌの移動相に溶解した。励起波長および放射波長をそれぞれ３４５ｎｍおよび４０９ｎｍに設定した蛍光検出装置（ＳｈｉｍａｄｚｕモデルＲＦ５３０、島津製作所、京都、日本）とＬＵＮＡ  ５μＣ１８（２）１００×４．６ｍｍステンレス鋼カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ  ＷＩＳＰ  ７１２Ｂ試料シンジェクターおよびモデル５１０ポンプ、Ｗａｔｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）に少量（１８μｌ）を自動で注入した。積分およびデータ獲得は、Ｕｎｉｃａｍ４８８０クロマトグラフィーデータシステム（Ｕｎｉｃａｍ、ケンブリッジ、英国）を使用して実施した。化合物は、１０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）およびアセトニトリル（３：１、ｖ／ｖ）からなる移動相を流速１．５ｍｌ／分で使用してカラムから溶出した（ＤＭＸＡＡおよび内部標準の保持時間は、それぞれ、８分および６分であった）。ヒト血漿検量線試料は、濃度範囲０．２〜１００μＭにわたって血漿にＤＭＸＡＡを添加することによって調製した。ヒト血漿検量線試料を使用した。内部標準に対するＤＭＸＡＡのピーク−高さ比を検量線標準のＤＭＸＡＡ濃度に対してプロットし、直線回帰分析によって最もよく適合する直線を得た。マウス血漿試料におけるＤＭＸＡＡの定量は、マウス血漿試料においてピーク−高さ比を求め、検量線から得られた式を使用して実施した。
【００６２】
統計学
腫瘍増殖阻止の統計学的有意性はスチューデントのｔ−検定によって試験した。腫瘍の容積は、式０．５２×短軸の二乗×長軸を使用して算出した。
【実施例１】
【００６３】
実施例１−腫瘍増殖遅延
結腸３８腫瘍を保有するマウスにおける毒性実験において無毒性であることが示されている組み合わせ（結果は示していない）、ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ）を、マウスの皮下に移植した結腸３８腫瘍に対するＤＭＸＡＡ単独療法と比較した。腫瘍増殖遅延実験は４つの投薬計画を使用して実施した：未治療の対照、ＤＭＸＡＡ単独（２５ｍｇ／ｋｇ）ジクロフェナク単独（５ｍｇ／ｋｇ）およびＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ）の併用群。結果を図１に示す。
【００６４】
ジクロフェナク単独は結腸３８腫瘍の増殖に有意な影響を与えないことが見出された。ＤＭＸＡＡは〜６日の増殖遅延を生じたが、治癒したマウスはいなかった。併用群では、マウス全てが治癒した（１００％）という点において、抗腫瘍応答に顕著な改善を示した。ジクロフェナクとＤＭＸＡＡの併用は抗腫瘍作用の有意な増加を生ずることができることを結果は示した。
【実施例２】
【００６５】
実施例２  ジクロフェナクの存在下における抗腫瘍作用の増強は、ＤＭＸＡＡの代謝に対する薬物動態学的影響に寄与しない
次に、ＤＭＸＡＡの血漿濃度に対するジクロフェナクの影響を検討した。変動が少ないので、３時間という時点を、使用する最良の時点と判定した（Ｄｒ  Ｋｅｓｔｅｌｌ、私信）。ＤＭＸＡＡ血漿濃度の有意な増加（５６％）を生じる唯一の組み合わせはＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ジクロフェナク（１００ｍｇ／ｋｇ）であった（表１）。１００ｍｇ／ｋｇ以下の全ての用量のジクロフェナクは、投与後３時間経過時においてＤＭＸＡＡ血漿濃度に有意な影響を与えなかった。
【００６６】
５ｍｇ／ｋｇのジクロフェナクが最初の６時間のＤＭＸＡＡの血漿薬物動態に任意に影響を与えるかどうかを判定するために実験を実施した。ＤＭＸＡＡ血漿濃度の統計学的な差は、ジクロフェナクを同時投与した場合またはジクロフェナクを同時投与しない場合にも観察されなかった（図２）。ＤＭＸＡＡ単独およびジクロフェナクとの併用におけるＡＵＣ値、それぞれ、１３３３μＭ．ｈｒおよび１５１４μＭ．ｈｒは統計学的に差がなかった。同様に、血漿におけるＤＭＸＡＡの半減期（２．７時間）は、同時投与したジクロフェナクで得られた半減期（３．６時間）と統計学的に差がなかった。同時投与されたジクロフェナクの抗腫瘍作用の改善が観察される理由はＤＭＸＡＡの血漿濃度の変更の結果ではないことをこれらの結果は示唆した。
【実施例３】
【００６７】
実施例３  腫瘍内ＤＭＸＡＡに対するジクロフェナクの影響
ＤＭＸＡＡ単独またはジクロフェナクとの併用での５時間の時間経過にわたる治療後の結腸３８腫瘍におけるＤＭＸＡＡ濃度の有意な差はなかった（図３）。しかし、６時間経過時では、ＤＭＸＡＡ濃度の有意な低下が観察された。ＤＭＸＡＡ単独療法および併用療法のＡＵＣ値、それぞれ５０７μＭ．ｈｒおよび３８８μＭ．ｈｒは有意な差を示さなかった。ＤＭＸＡＡ単独療法および併用療法のＣｍａｘ値、それぞれ１１１μＭおよび１１０μＭは同様に有意な差を示さなかった。ジクロフェナクの存在下における抗腫瘍作用の改善はＤＭＸＡＡの薬物動態の変更に起因していないことをこれらの結果はさらに示している。
【００６８】
考察
高濃度のジクロフェナクは、インビトロにおいてＤＭＸＡＡのグルクロン酸抱合（＞７０％）および６−メチル水酸化（＞５４％）を阻害することが示されている（Ｚｈｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ４７：３１９−３２６）。インビボにおけるジクロフェナク（１００ｍｇ／ｋｇ）は、マウスにおいてＤＭＸＡＡの血漿濃度およびＡＵＣを２４％から３１％まで増加することができる（Ｚｈｏｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７：３１９−３２６）。ジクロフェナク（１００ｍｇ／ｋｇ）はＤＭＸＡＡの血漿濃度を５６％増加したが（表５）、低用量は有意な影響を与えなかった。
【００６９】
本発明の検討において、ＮＳＡＩＤｓ、特に５ｍｇ／ｋｇのジクロフェナクはＤＭＸＡＡの抗腫瘍作用を増強することができたことが示された（図１）。ＤＭＸＡＡ単独療法の増殖遅延は約６日で、治癒は見られなかったが、ＤＭＸＡＡ併用療法では、治癒数の有意な増加が見られた。ジクロフェナクの同時投与によって、ＤＭＸＡＡの抗腫瘍作用が増加されうることをこれらの結果は示唆している。
【００７０】
ＤＭＸＡＡ単独療法および併用療法における血漿および腫瘍内濃度の時間経過実験（０〜６時間）を実施した（図２および図３）。療法の治療によって誘導されるＣｍａｘおよびＡＵＣ値はほぼ同じであった。本発明の実験では、ジクロフェナクは、ＤＭＸＡＡのグルクロン酸抱合を阻害することができる有効濃度よりかなり低い濃度である５ｍｇ／ｋｇを使用した。従って、ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ）の併用投与によって増強される抗腫瘍作用はＤＭＸＡＡの薬物動態の直接的な変更によらないことをこれらの結果は示唆している。
【００７１】
腫瘍内ＡＵＣ値は２つの療法間に有意な差はなかったが、６時間の時点では有意な低下を生じ（図３）、併用群のＤＭＸＡＡの腫瘍内濃度は単独療法におけるものよりはるかに低かった。任意の１つの理論に結びつけるわけではないが、これは、ジクロフェナクが腫瘍への腫瘍血流の低下率を増加することによってＤＭＸＡＡの抗腫瘍作用を増強し、腫瘍組織内部のＤＭＸＡＡ濃度を低下する可能性があることが考えられる。
【００７２】
本発明の明細書において記載されている全ての文献は参照として本明細書に組み入れられている。本発明の記載されている方法および材料の種々の改良および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施態様に関連して記載されているが、特許請求されている本発明はこのような実施態様を不当に限定すべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかな本発明を実施するための記載されている様式の種々の実施態様は以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】未治療（丸）またはＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ、三角形）、ジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ、ひし形）もしくは組み合わせ（ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）とジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ、四角形）による治療後の結腸３８腫瘍の増殖を示す。１群あたり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）。
【図２】ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ、丸）または組み合わせ（ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）とジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ、三角形）による治療後のＤＭＸＡＡ血漿濃度の時間経過を示す。時間経過あたり３匹のマウスの平均±ＳＥＭ。
【図３】ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ、丸）または組み合わせ（ＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）とジクロフェナク（５ｍｇ／ｋｇ、三角形）による治療後のＤＭＸＡＡの腫瘍内濃度の時間経過を示す。時間経過あたり３匹のマウスの平均±ＳＥＭ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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