(57)【要約】本発明は、例えば、一般的血吸いコウモリＤｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓに由来する、非神経毒性プラスミノゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）を、ヒトにおける発作の治療処置のために使用することに関する。本発明はまた、この非神経毒性プラスミノゲン活性化因子の生成に関する。本発明は、ヒトにおける発作を処置するための新規な治療ベースを提供する。本願はまた、発作の処置のためのプラスミノゲン活性化因子の使用を開示し、このプラスミノゲン活性化因子のフィブリン特異性は、野生型ｔ−ＰＡと比較して増強されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発作の処置のためのプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子のフィブリン特異性は、野生型ｔ−ＰＡと比較して増強されている、使用。
【請求項２】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、アスパラギン酸残基と一緒になってチモーゲン三つ組残基の少なくとも一部を形成する、少なくともヒスチジン残基またはセリン残基を含む、使用。
【請求項３】
請求項２に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、前記セリン残基は、ｔ−ＰＡの２９２位と少なくとも部分的に一致する位置に位置し、前記ヒスチジン残基は、ｔ−ＰＡの３０５位と少なくとも部分的に一致する位置に位置し、そして前記アルパラギン酸残基は、ｔ−ＰＡの４４７位と少なくとも部分的に一致する位置に位置する、使用。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、以下のｔ−ＰＡ変異体：ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｆ３０５Ｈ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｆ３０５Ｈ，Ａ２９２Ｓからなる群より選択される、使用。
【請求項５】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、Ａｓｐ１９４または一致する位置にあるアスパラギン酸の点変異を保有し、これにより、フィブリンの非存在下における該プラスミノゲン活性化因子の触媒的に活性な立体構造の安定性が減少される、使用。
【請求項６】
請求項５に使用の使用であって、Ａｓｐ１９４が、グルタミン酸またはアスパラギンによって置換されている、使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用であって、ｔ−ＰＡが、Ａｓｐ１９４からＧｌｕ１９４またはＡｓｎ１９４への置換を保有する、使用。
【請求項８】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、該因子中の自己分解ループ中に少なくとも１つの変異を含み、該変異により、フィブリンの非存在下でのプラスミノゲンとプラスミノゲン活性化因子との間の機能的相互作用が減少される、使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記自己分解ループ中の少なくとも１つの変異が、野生型ｔ−ＰＡのアミノ酸４２０位〜４２３位または一致する位置に影響を与える、使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記変異が、以下の変異体：Ｌ４２０Ａ、Ｌ４２０Ｅ、Ｓ４２１Ｇ、Ｓ４２１Ｅ、Ｐ４２２Ａ、Ｐ４２２Ｇ、Ｐ４２２Ｅ、Ｆ４２３ＡおよびＦ４２３Ｅからなる群より選択される、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子が、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異を含むチモーゲンである、使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、前記点変異が、ｔ−ＰＡの１５位〜２７５位またはその位置に一致する位置に位置する、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、グルタミン酸が１５位または２７５位にある、使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子が、血吸いコウモリの唾液から単離された（ＤＳＰＡ）、使用。
【請求項１５】
発作発症の少なくとも３時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１４のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１６】
発作発症の少なくとも６時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１５のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１７】
発作発症の少なくとも９時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１６のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１８】
発作患者の治療的処置のための請求項１〜１７のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該発作の発症は、一時的であって正確には決定されていない、使用。
【請求項１９】
野生型ｔ−ＰＡの神経毒性を回避している発作の治療のための、請求項１〜１８のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項２０】
Ｈｉｓ４２０、Ａｓｎ４２、Ａｌａ４２２およびＣｙｓ４２３を含む、自己分解ループを含む組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組織プラスミノゲン活性化因子であって、１９４位における点変異により特徴付けられ、該点変異は、フィブリンの非存在下における該プラスミノゲン活性化因子の触媒的な活性な立体構造の安定性を減少させる、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２２】
Ｐｈｅ１９４を特徴とする、請求項２１に記載の組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のうちの少なくとも１項に記載の組織プラスミノゲン活性化因子であって、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異を特徴とする、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２４】
Ｇｌｕ２７５を特徴とする、請求項２３に記載の組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２５】
配列番号１に従うアミノ酸配列を有する、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２６】
Ｖａｌ４２０、Ｔｈｒ４２１、Ａｓｐ４２２、およびＳｅｒ４２３を含む、自己分解ループを含むウロキナーゼ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のウロキナーゼであって、１９４位における点変異によって特徴付けられ、該点変異は、フィブリンの非存在下での該ウロキナーゼの触媒活性な立体構造の安定性を減少させる、ウロキナーゼ。
【請求項２８】
Ｇｌｕ１９４により特徴付けられる、請求項２７に記載のウロキナーゼ。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のうちの少なくとも１項に記載のウロキナーゼであって、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異により特徴付けられる、ウロキナーゼ。
【請求項３０】
Ｉｌｅ２７５により特徴付けられる、請求項２９に記載のウロキナーゼ。
【請求項３１】
配列番号２に従うアミノ酸配列を有する、ウロキナーゼ。
【請求項３２】
請求項１〜３１のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子と、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な構成成分またはその薬学的に受容可能な塩とを含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
神経保護因子を特徴とする、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
グルタミン酸レセプターアンタゴニストを特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
競合性アンタゴニストまたは非競合性アンタゴニストを特徴とする、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１つのトロンビンインヒビターを特徴とし、該トロンビンインヒビターは、以下の物質：トロンボモジュリン、トロンボモジュリンアナログ、トリアビン、パリジピン、またはソルリンからなる群より優先的に選択される、薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１つの抗凝固剤を特徴とし、該抗凝固剤は、以下の抗凝固剤：ヒルジン、ヘパリン、アセチルサリチル酸またはアンクロドからなる群より優先的に選択される、薬学的組成物。
【請求項３８】
抗炎症物質を特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
抗生物質を特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
シチコリンを特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項１〜１９に記載の、請求項３６〜４５のうちの少なくとも１項に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４２】
１種の非神経毒性プラスミノゲン活性化因子を含む発作の処置のための薬物の製造のための方法であって、該プラスミノゲン活性化因子の改変のために、以下の工程：
チモーゲン三つ組残基の少なくとも一部を導入する工程；
フィブリンの非存在下での触媒活性な立体構造の安定性を減少させるために、Ａｓｐ１９４または一致するアスパラギン酸を置換する工程；
自己分解ループまたは該ループと一致するペプチド部分における、疎水性アミノ酸残基を置換する工程；
プラスミンによるチモーゲンの触媒を妨げるために該チモーゲン中に変異を導入する工程；
のうちの少なくとも１つを包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法により製造される、薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは発作の処置のための、Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓの唾液に特に由来する非神経毒性プラスミノゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）の治療的使用に関する。
【０００２】
異なる臨床像が、それらの臨床的症状に相関する用語「発作」の下でまとめられている。それぞれの病因に従って、いわゆる虚血性発作における臨床像と出血性発作における臨床像との間のこれらの第１の差異があり得る。
【０００３】
虚血性発作（虚血）は、動脈血液供給の欠如に起因して脳内の血液循環の減少または中断により特徴づけられる。しばしば、このことは、それぞれ動脈硬化により狭窄した血管の血栓症または動脈性心臓塞栓症によって引き起こされる。
【０００４】
出血性発作は、特に、動脈高血圧症によって損傷を受けた脳血液供給動脈（ｂｒａｉｎ  ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ  ａｒｔｅｒｉａ）の灌流に基づく。しかし、全ての大脳発作のうちのわずか約２０％が出血性発作によって引き起こされる。従って、血栓症に起因する発作は、遙かに関連性がある。
【０００５】
他の組織虚血に比較して、神経組織の虚血は、変化がもたらされた細胞の壊死を広く伴う。ニューロン組織における壊死のより高い発生率は、複数の反応工程を含む複雑なカスケードである現象「興奮特性」の新たな知識により説明されうる。そのカスケードは、酸素の欠如によって影響を受ける虚血ニューロンによって開始され、次いで、すぐにＡＴＰを失い、脱分極する。このことによって、神経伝達物質であるグルタミン酸の増大したシナプス後放出を生じ、このことにより、膜結合グルタミン酸レセプター（これは、カチオンチャネルを調節する）を活性化する。しかし、増大したグルタミン酸放出に起因して、グルタミン酸レセプターは、過剰に活性化される。
【０００６】
グルタミン酸レセプターは、グルタミン酸のそのレセプターへの結合によって開口する、電圧依存性カチオンチャネルを調節する。このことは、Ｎａ＋とＣａ２＋の細胞への流入を生じ、Ｃａ２＋依存性細胞代謝を広く妨害する。特に、Ｃａ２＋依存性異化酵素の活性化は、その後の細胞死の理由を与える（Ｌｅｅ，Ｊｉｎ−Ｍｏら「Ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｅｃｈａｍｉｓｍｓ」；Ｄｅｎｎｉｓ  Ｗ．Ｚｈｏｌ「Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」）。
【０００７】
グルタミン酸媒介性神経毒性の機構は、まだ完全には理解されていないものの、大脳虚血後のニューロン細胞死に大きく寄与していることに意見が一致している（Ｊｉｎ−Ｍｏ  Ｌｅｅら）。
【０００８】
生命機能を保護すること、および生理学的パラメーターを安定化させることの他に、閉塞した血管を再び開口することは、急性の大脳虚血の治療において優先される。再開口は、異なる手段によって行われ得る。今までは、例えば、心臓発作後のＰＴＣＡのような機械的再開口のみでは、まだ満足行く結果をもたらしていなかった。首尾よい線維素溶解によってのみ、患者の生理学的状態の許容可能な改善は、達成され得る。このことは、カテーテルを用いる局所的適用（ＰＲＯＣＡＴ、プロウロキナーゼを用いる研究）によって達成されうる。しかし、第１のポジティブな結果にかかわらず、この方法は未だ、薬学的処置として公的に認められていない。
【０００９】
天然に存在する繊維溶解は、セリンプロテアーゼであるプラスミン（触媒作用（活性化）によりその不活性前駆体から生じる）のタンパク質分解活性に基づく。プラスミノゲンの天然の活性化は、身体中に天然に存在するプラスミノゲン活性化因子ｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）およびｔ−ＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）によって触媒される。ｕ−ＰＡとは対照的に、ｔ−ＰＡは、フィブリンおよびプラスミノゲンとともに、いわゆる活性化因子複合体を形成する。従って、ｔ−ＰＡの触媒活性は、フィブリン依存性であり、その存在を約５５０倍に増強する。フィブリンの他に、フィブリノゲンもまた、より少ない程度ではあるが、プラスミノゲンからプラスミンへのｔ−ＰＡ媒介性触媒を刺激し得る。フィブリノゲンの存在下では、ｔ−ＰＡ活性は、２５倍増大するのみである。またフィブリンの切断産物（フィブリン分解産物（ＦＤＡ））は、ｔ−ＰＡを刺激する。
【００１０】
急性発作の血栓溶解処置の初期の試みは、１９５０年代に遡る。ストレプトキナーゼ、β溶血連鎖球菌由来のフィブリン溶解薬剤での最初の広範な臨床試験は、ようやく１９９５年に始まった。プラスミノゲンとともに、ストレプトキナーゼは、他のプラスミノゲン分子をプラスミンに触媒する複合体を形成する。
【００１１】
ストレプトキナーゼでの治療は、重大な欠点を有する。なぜなら、ストレプトキナーゼは、細菌性プロテアーゼであり、従って、身体においてアレルギー反応を誘起しうるからである。さらに、抗体の生成を含む前者の連鎖球菌感染に起因して、患者は、いわゆるストレプトキナーゼ耐性を示し得、このことは、治療をより困難にする。このほかに、欧州での臨床試験（欧州の多施設急性発作治験（ＭＡＳＴ−Ｅ）、イタリアの多施設急性発作治験（ＭＡＳＴ−Ｉ）およびオーストラリアでの臨床試験（オーストラリアのストレプトキナーゼ治験（ＡＳＴ））は、ストレプトキナーゼで患者を処置した後の増大した死亡率の危険性および脳内出血（脳内出血（ＩＣＨ））のより高い危険性を示した。これらの治験は、早期に終了されなければならなかった。
【００１２】
あるいは、ウロキナーゼ（これもまた、伝統的な線維素溶解性薬剤である）が適用されうる。ストレプトキナーゼとは対照的に、ウロキナーゼは、抗原性特徴を示さない。なぜなら、ウロキナーゼは、種々の身体組織に天然に存在する酵素であるからである。ウロキナーゼは、プラスミノゲンの活性化因子であり、補因子とは無関係である。ウロキナーゼは、腎臓細胞培養物中で生成される。
【００１３】
治療的血栓溶解に対する広範な経験が、組織型プラスミノゲン活性化因子（いわゆるｒｔ−ＰＡ）について利用可能であり（ＥＰ００９３６１９、米国特許第４，７６６，０７５号を参照のこと）、この組織型プラスミノゲン活性化因子は、組換えハムスター細胞において生成される。９０年代には、主な適応症として、急性心筋梗塞に対する、ｔ−ＰＡを使用するいくつかの臨床試験が、世界中で行われた。これは、部分的に理解できない矛盾する結果をもたらした。いわゆる欧州急性発作治験（ＥＣＡＳＳ）において、患者は、発作の症状の発生から６時間の時間枠内で、ｔ−ＰＡを静脈内に処置された。９０日後、死亡率ならびにＢａｒｔｈｅｌ指数を、患者の疾病または無関係の生存についての指標として調べた。生存の有意な改善は報告されなかったが、有意ではなかったものの、死亡率の増加が報告された。従って、発作の開始直後に、それぞれの病歴に従って個々に選択されたｒｔ−ＰＡでの患者の血栓溶解処置は、おそらく有利であり得た。しかし、発作の発生から６時間の時間枠内でのｒｔ−ＰＡの一般的な使用は、推奨されなかった。なぜなら、この時間の間の適用は、脳内出血（ＩＣＨ）の危険性を増大させるからである（Ｃ．Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  ＣおよびＷｉｌｉａｍ  Ｂａｒｓｏｎ、２００１；Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｔｒｏｋｅ；Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７：２；Ｓ．２０２  ｆｆ）。
【００１４】
発作の血栓溶解処置はまた、米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅによって行われた臨床試験（いわゆるＮＩＮＤＳ  ｒｔＰＡ発作治験）の主題であった。この治験は、症状の発生からわずか３時間後内の静脈内ｒｔ−ＰＡ処置の効果に対して集中していた。患者は、処置の３ヶ月後まで調べられた。この処置の患者の生存に対する観察されたポジティブな結果に起因して、３時間のこれらの限られた時間枠内でのｒｔ−ＰＡ処置が推奨されたが、筆者らは、ＩＣＨのより高い危険性が見いだした。
【００１５】
２つのさらなる研究（ＥＣＡＳＳ  ＩＩ治験：Ａｌｔｅｐｌａｓｅ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ａｃｕｔｅ  Ｎｏｎｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  Ｓｔｒｏｋｅ（ＡＴＬＡＮＴＩＳ））により、発作の発生から３時間後内のｒｔ−ＰＡ処置のポジティブな効果が、６時間内の処置を用いてなお繰り返されるか否かを調べた。しかし、この問題には、確かな答えが出なかった。なぜなら、臨床症状の改善も、死亡率の低下も全く観察されなかったからである。ＩＣＨのより高い危険性が残ったままであった。
【００１６】
それらの部分的に矛盾する結果は、ｒｔ−ＰＡの使用における高い警戒をもたらした。既に１９９６年には、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの刊行物により、発作の血栓溶解処置に関する医師の間で、強い懐疑が指摘されたのに対して；心筋梗塞の治療における線維素溶解に関するそのような懸念はない（ｖａｎ  Ｇｉｊｎ  Ｊ，ＭＤ，ＦＲＣＰ，１９９６−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６，９３：１６１６−１６１７）。
【００１７】
この懐疑の後ろにある道理は、まず、１９９７年に公表された（２００１年３月に更新された）全ての発作治験のまとめにおいて示された。この総説によれば、全ての血栓溶解処置（ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ｒｔ−ＰＡまたは組換えウロキナーゼ）は、発作から最初の１０日間後内に有意により高い死亡率を生じたが、死亡患者または疾病患者いずれの総数も、血栓溶解の場合、発作の発生から６時間後以内に適用した場合、減少した。この効果は、主にＩＣＨに起因した。発作の処置のための血栓溶解の広範な使用は、従って、推奨されなかった。
【００１８】
以前ですら、このような結果により、いくらかの他の著者らは、発作の患者は、死亡か、生存はするが障害が残るかのいずれかの選択を有するだけという辛辣な記事を示した（ＳＣＲＩＰ  １９９７：２２６５，２６）。
【００１９】
にもかかわらず、これまで、ｒｔ−ＰＡでの処置は、米国において、食品医薬局（ＦＤＡ）により認可された急性脳虚血の処置のみである。しかし、この処置は、発作の発生から３時間後以内のｒｔ−ＰＡの処置の適用に制限されていた。
【００２０】
ｒｔ−ＰＡの認可は、１９９６年に通達された。以前は、１９９５年に、ｔ−ＰＡのネガティブな副作用（これは、３時間の時間枠外で発作処置に適用した場合、その劇的な効果についての説明の根拠を提供する）についての最初の通知が知られた。従って、海馬の小膠細胞はおよび神経細胞は、グルタミン酸媒介性興奮毒性に寄与するｔ−ＰＡを生成する。これは、グルタミン酸アゴニストを、それぞれ、ｔ−ＰＡ欠損マウスおよび野生型マウスの海馬に注射した場合のｔ−ＰＡ欠損マウスおよび野生型マウスに対する比較研究から結論づけられる。ｔ−ＰＡ欠損マウスは、外因的に（クモ膜下腔内）適用されたグルタミン酸に対する有意に高い耐性を示した（Ｔｓｉｒｋａ  ＳＥら、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３７７，１９９５「Ｅｘｃｉｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ」）。これらの結果は、Ｗａｎｇらが、ｔ−ＰＡを静脈内注射した場合、ｔ−ＰＡ欠損マウスの壊死ニューロン組織のほぼ２倍の量を証明することができたときに、１９９８年に確認された。野生型マウスに対する外因的ｔ−ＰＡのこのネガティブな効果は、わずか約３３％であった（Ｗａｎｇら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ「Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔ−ＰＡ）  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｔ−ＰＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ」）。
【００２１】
ｔ−ＰＡによる興奮毒性の刺激に対するさらなる結果が、２００１年初めにＮｉｃｏｌｅら（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｏ．，Ｄｏｃａｇｎｅ  Ｆ  Ａｌｉ  Ｃ；Ｍａｒｇａｉｌｌ  Ｉ；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＥＴ、Ｖｉｖｉｅｎ  ＤおよびＢｕｉｓｓｏｎ  Ａ，２００１；Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，５９〜６４）により刊行された。彼等は、脱分極された皮質ニューロンにより放出されるｔ−ＰＡが、ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターのいわゆるＮＲ１サブユニットと相互作用してＮＲ１の切断をもたらし得ることを証明し得た。これは、このレセプターの活性を増加して、グルタミン酸アゴニストであるＮＭＤＡが適用された後により多くの組織損傷を生じる。このＮＭＤＡアゴニストは、興奮毒性を誘導した。従って、ｔ−ＰＡは、ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターを活性化することによって、神経毒性効果を示す。
【００２２】
さらなる説明的概念によると、ｔ−ＰＡの神経毒性は、プラスミンにおけるプラスミノゲンの転換から間接的に生じる。このモデルによると、プラスミンは、神経毒性のエフェクターである（Ｃｈｅｎ  ＺＬおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ  Ｓ，１９９７；Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｉｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｎ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｉｎ、Ｃｅｌｌ：９１，９１７〜９２５）。
【００２３】
ｔ−ＰＡの時間依存性神経毒性効果の概略が、図９に示される。この図９にはまた、内因性ｔ−ＰＡと比較した組換えｔ−ＰＡの毒性増加が明らかになることもまた、示される。これは、おそらく、ｒｔ−ＰＡが、より高濃度で組織に侵入可能であることに起因する。
【００２４】
その神経毒性副作用および死亡率に対する増加する影響にも関わらず、ｔ−ＰＡは、ＦＤＡによって認可された。これは、有害性および有効な選択肢がないことによってのみ説明され得る。従って、これは、非常に実用的な費用便益分析に起因する。従って、未だに安全な治療についての必要性が存在する。しかし、その治療が血栓崩壊剤に基づく場合、血栓崩壊に対する代替法を見出すことは可能ではない場合に備えて、神経毒性の問題が考慮されなければならない（例えば、Ｗａｎｇら、ａ．ａ．Ｏ．；ＬｅｗａｎｄｏｗｓｋｉおよびＢａｒｓｏｎ  ２００１  ａ．ａ．Ｏ．を参照のこと）。
【００２５】
従って、発作についての新規な薬物を開発するために、ＤＳＰＡ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ  プラスミノゲン活性化因子（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を含む公知の血栓崩壊剤のさらなる試験が終了したが、原則的にすべての血栓崩壊剤は、潜在的に適切である。特にＤＳＰＡの場合、この医療適用にとって可能な適切さが、以前に指摘された（Ｍｅｄａｎ  Ｐ；Ｔａｔｌｉｓｕｍａｋ  Ｔ；Ｔａｋａｎｏ  Ｋ；Ｃａｒａｎｏ  ＲＡＤ；Ｈａｄｌｅｙ  ＳＪ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍ：Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｓａｌｉｖａ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒＤＳＰＡ）  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｅｍｂｏｌｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ  ｍｏｄｅｌ；Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ  １９９６：６；１７５〜１９４（４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  Ｓｔｒｏｋｅ）。ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡと高い相同性（類似性）を有するプラスミノゲン活性化因子である。従って、ｔ−ＰＡの神経毒性副作用から生じる幻滅に加えて、ＤＳＰＡが発作処置のために適切な薬物であることについてさらなる期待は存在しなかった。
【００２６】
代わりに、公知の血栓崩壊処置を改善することを目的とする最近のストラテジーは、血栓崩壊物質をもはや静脈内適用を試みないが、脈管内血栓付近に直接カテーテルを介して動脈内適用を試みる。最初の経験は、組換え生成されたウロキナーゼを用いて利用可能である。従って、おそらく、血栓崩壊のために必要な用量およびそれに伴う負の副作用は、減少され得る。しかし、この適用には、高い技術的出費が必要であり、どこででも利用可能ではない。さらに、患者は、時間がかかる行為にて準備されなければならない。しかし、時間がしばしば制限されている。従って、この準備は、さらなる危険を提供する。
【００２７】
現在、新しい概念が、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、アスピリンまたはアンクロド）に対している。アンクロドは、マレーシア穴ヘビ（ｍａｌａｙｎａ  ｐｉｔ  ｖｉｐｅｒ）の毒中にある活性物質である。しかし、ヘパリンの効果を試験する２つのさらなる臨床試験（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｔｒｉａｌ（ＩＳＴ）およびＴｒｉａｌ  ｏｆ  ＯＲＧ  １０１７２  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＴＯＡＳＴ））は、発作の死亡率の有意な改善も発作の予防も示さない。
【００２８】
さらなる新規な処置は、血栓に対しても、血液低粘稠化に対しても、抗凝固に対しても焦点を合わせず、血液供給の妨害により損傷した細胞の生存性を高めることを試みる（ＷＯ  ０１／５１６１３  Ａ１およびＷＯ  ０１／５１６１４  Ａ１）。これを達成するために、キノン、アミノグリコシドまたはクロラムフェニコールの群からの抗生物質が、適用される。同様の理由で、発作の発症後にシチコリン（ｃｉｔｉｃｈｏｌｉｎ）の直接適用を始めることが、さらに示唆される。身体において、シチコリンは、シチジンとコリンとに切断される。これらの切断産物は、神経細胞膜の一部を形成し、従って、損傷組織の再生を支持する（米国特許第５，８２７，８３２号）。
【００２９】
安全な処置に関する最近の研究は、死に到る発作の結果の一部が、妨害された血液供給によって間接的にのみ生じるが、過剰活性化グルタミン酸レセプターを含む興奮毒性または神経毒性に直接的には引き起こされないという、新規な知見に基づく。この影響は、ｔ−ＰＡによって増加される（上記を参照のこと）。従って、興奮毒性を減少するための概念は、いわゆる神経保護剤（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）を適用することである。これらは、神経毒性効果を最小にするために、個別に使用され得るか、またはフィブリン溶解剤と組み合わせて使用され得る。これらは、直接的に（例えば、グルタミン酸レセプターアンタゴニストとして）かまたは電位依存性ナトリウムチャネルもしくはカルシウムチャネルを阻害することにより間接的に、興奮毒性の減少をもたらし得る（Ｊｉｎ−Ｍｏ  Ｌｅｅら、ａ．ａ．Ｏ．）。
【００３０】
ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターの競合阻害（アンタゴニスト作用）が、例えば、２−アミノ−５−ホスホノバレレート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｖａｌｅｒａｔｅ）（ＡＰＶ）または２−アミノ−５−ホスホノヘプタノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）（ＡＰＨ）と起こり得る。非競合阻害が、例えば、上記チャネルのフェンシクリジン側に結合する物質によって、達成され得る。このような物質は、フェンシクリジン、ＭＫ−８０１、デキストロファン（ｄｅｘｔｒｏｐｈａｎｅ）またはセタミン（ｃｅｔａｍｉｎｅ）であり得る。
【００３１】
従来、神経保護剤による処置は、予期された成功を示さなかった。これはおそらく、神経保護剤が、その保護効果を示すために血栓崩壊剤と合わせられなければならなかったからである。これは、他の物質に当てはまる（図１０も参照のこと）。
【００３２】
ｔ−ＰＡと神経保護剤との組み合わせでさえ、制限された損傷しか生じない。それにも関わらず、このようにフィブリン溶解剤の不利な神経毒性は回避される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
従って、ヒトにおける発作の処置のための新規な治療概念を提供することが、本発明の目的である。
【００３４】
本発明によると、発作の治療的処置のための非毒性プラスミノゲン活性化因子の使用が、請求項１に概略されるように示唆される。さらなる有利な使用は、それぞれ、独立請求項およびさらなる従属項の主題である。
【００３５】
本発明の中心的考えは、発作の処置におけるプラスミノゲン活性化因子の使用であり、成熟酵素が活性を示す、これは、フィブリンマニホールド（ｍａｎｉｆｏｌｄ）により選択的に（すなわち、６５０倍より多く）増加される。
【００３６】
本発明によるプラスミノゲン活性化因子の使用は、以下の知見に基づく。発作により引き起こされる脳内の組織損傷に起因して、血液脳関門が損傷または破壊される。従って、血液中を循環するフィブリノゲンが、脳のニューロン組織内に侵入し得る。ここで、フィブリノゲンがｔ−ＰＡを、グルタミン酸レセプターまたはプラスミノゲンを活性化することにより間接的に活性化する。これは、さらなる組織損傷を生じる。この影響を回避するために、本発明は、非常にフィブリン選択的であり、かつ議論の逆として、フィブリノゲンにより活性化される可能性が低い、プラスミノゲン活性化因子の使用を示唆する。従って、このプラスミノゲン活性化因子は、損傷した血液脳関門の結果として血液からニューロン組織へと侵入するフィブリノゲンにより活性化されないか、またはｔ−ＰＡと比較して少なくとも実質的に少なくしか活性化されない。なぜなら、ｔ−ＰＡの活性化因子であるフィブリンは、その大きさに起因して、ニューロン組織に侵入し得ないからである。従って、本発明によるプラスミノゲン活性化因子は、非神経毒性である。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態によると、非毒性プラスミノゲン活性化因子が使用され、これは、いわゆるチモーゲン三つ組残基（ｚｙｍｏｇｅｎｅ  ｔｒｉａｄｅ）の少なくとも１つのエレメントを含む。キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼの触媒中心からの匹敵する三つ組残基（ｔｒｉａｄｅ）が公知であり、この三つ組残基は、相互作用する３つのアミノ酸（アスパラギン酸１９４、ヒスチジン４０およびセリン３２）からなる。しかし、この三つ組残基は、キモトリプシン様セリンプロテアーゼのファミリーにこれもまた属するｔ−ＰＡ中には存在しない。それにも関わらず、適切な位置に上記のアミノ酸のうちの少なくとも１つを導入するためのネイティブｔ−ＰＡの特異的変異誘発は、フィブリン存在下でプロ酵素（単鎖ｔ−ＰＡ）の活性の減少を生じ、成熟酵素（二本鎖ｔ−ＰＡ）の活性の増加を生じることが、公知である。従って、この三つ組残基のうちの少なくとも１つのアミノ酸の（またはこの三つ組残基中の個々の機能を有するアミノ酸の）導入が、ｔ−ＰＡのチモーゲン性（ｚｙｍｏｇｅｎｉｔｙ）（すなわち、成熟酵素の活性とプロ酵素の活性との間の比）を増加し得る。結果として、フィブリンは、特に、顕著に増加される。これは、導入されたアミノ酸残基および／または野生型配列のアミノ酸残基間の立体構造相互作用に起因する。
【００３８】
Ｐｈｅ３０５をＨｉｓにより置換（Ｆ３０５Ｈ）し、Ａｌａ２９２をＳｅｒにより置換（Ａ２９２Ｓ）するネイティブｔ−ＰＡの変異誘発が、チモーゲン性を２０倍増加する一方、改変体Ｆ３０５Ｈ単独は、５倍高いチモーゲン性をすでにもたらすことが公知である（ＥＬ  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｋｏｂｅ  Ａ，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪＦ、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＥＪ  １９９３；Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｏ  ａ  Ｚｙｍｏｇｅｎ：Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，４１９〜４２１）。フィブリン存在下で、これらのｔ−ＰＡ変異体は、それぞれ、３０，０００倍（Ｆ３０５Ｈ）および１３０，０００倍（Ｆ３０５Ｈ、Ａ２９２Ｓ）の活性増加を示す。さらに、これらの変異体は、切断部位Ａｕｇ２７５−Ｉｌｅ２７６でのプラスミンによる切断を防ぐために、Ａｒｇ２７５からＲ２７５Ｒへの置換を含み、それにより、単鎖ｔ−ＰＡを二本鎖形態へと転換する。変異部位Ｒ２７５Ｅ単独は、ｔ−ＰＡのフィブリン特異性を６，９００倍増加する（Ｋ  Ｔａｃｈｉａｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＥＬ  １９９５：Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  Ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｗｈｉｃｈ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｉｂｒｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，３１：１８３１９〜１８３２２）。
【００３９】
ｔ−ＰＡの３０５位および２９２位は、キモトリプシンセリンプロテアーゼの公知の三つ組残基の位置Ｈｉｓ４０およびＳｅｒ３２と一致する。それぞれヒスチジンまたはセリンを導入する対応する置換によって、これらのアミノ酸は、ｔ−ＰＡのアスパラギン酸４７７と相互作用し得、ｔ−ＰＡ変異体において機能的三つ組残基を生じる（Ｍａｄｉｓｏｎら、１９９３）。
【００４０】
これらのｔ−ＰＡ変異体は、本発明による発作の処置のために使用され得る。なぜなら、これらは、そのフィブリン特異性の増加に起因して、神経毒性を示さないか、または野生型ｔ−ＰＡと比較して、有意に減少した神経毒性を示すからである。上記のｔ−ＰＡ変異体Ｆ３０５Ｈ；Ｆ３０５Ｈ；Ａ２９２Ｓの単独またはＲ２７５Ｅと組み合わせたＡ２９２Ｓの開示のために、本発明者らは、Ｍａｄｉｓｏｎら（１９９３）ならびにＴａｃｈｉａｓおよびＭａｄｉｓｏｎ（１９９５）の刊行物を本明細書により参考として完全に援用する。
【００４１】
プラスミノゲン活性化因子のフィブリン特異性の増加は、あるいは、Ａｓｐ１９４（または一致する位置のアスパラギン酸）の点変異によって達成され得る。プラスミノゲン活性化因子は、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼの群に属し、従って、保存されたアミノ酸Ａｓｐ１９４を含む。このＡｓｐ１９４は、成熟プロテアーゼの触媒活性立体構造の安定性を担う。Ａｓｐ１９４は、セリンプロテアーゼのチモーゲン形態にて、Ｈｉｓ４０と相互作用することが公知である。そのチモーゲンが切断により活性化された後で、この特異的相互作用は、妨害され、Ａｓｐ１９４の側鎖が約１７０°回転して、Ｉｌｅ１６と新規な塩架橋を形成する。この塩架橋は、成熟セリンプロテアーゼの触媒中心のオキシアニオンポケットの安定性に本質的に寄与する。これもまた、ｔ−ＰＡ中に存在する。
【００４２】
Ａｓｐ１９４を置換する点変異の導入は、明白に、セリンプロテアーゼの触媒立体構造の形成または安定性をそれぞれ妨害する。これにも関わらず、変異型プラスミノゲン活性化因子は、その補因子であるフィブリンの存在下で、特に、成熟野生型形態と比較して活性の有意な増加を示す。このことは、フィブリンとの相互作用が触媒活性を促進する立体構造変化を可能にする様式でのみ、説明され得る（Ｌ  Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＥＬ、１９９５；Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  Ｆｉｂｒｉｎ  ｃｏ−ｆａｃｔｏｒｓ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０、４０：２３４４〜２３４９）。
【００４３】
まとめると、プラスミノゲン活性化因子のＡｓｐ１９４変異体は、フィブリンの存在下で高い活性増加を示す。このことにより、本発明によるその使用が可能である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、変異体ｔ−ＰＡが使用され、この変異体において、Ａｓｐ１９４が、それぞれ、グルタミン酸（Ｄ１９３Ｅ）またはアスパラギン（Ｄ１９４Ｎ）によって置換されている。これらの変異体において、ｔ−ＰＡの活性は、フィブリン非存在下では２０００分の１に減少し、一方、フィブリン存在下では、４９８，０００〜１，０５０，０００倍の活性増加が達成され得る。これらの変異体は、Ａｒｇ１５からＲ１５Ｅへの置換をさらに含み得、この置換は、ペプチド結合Ａｒｇ１５−Ｉｌｅ１６でのプラスミンによる一本鎖ｔ−ＰＡの切断を防ぎ、ｔ−ＰＡの二本鎖形態をもたらす。この変異単独は、フィブリンによるｔ−ＰＡの化成かを１２，０００倍増加する。１９４位および１５位でのｔ−ＰＡ変異の開示のために、ＳｔｒａｎｄｂｅｒｇおよびＭａｄｉｓｏｎ（１９９５）の刊行物が、参考として完全に援用される。
【００４５】
プラスミノゲン活性化因子のフィブリン依存性の増加はまた、いわゆる「自己溶解ループ」中への点変異の導入によって、達成され得る。このエレメントは、トリプシンから公知である。これはまた、セリンプロテアーゼの相同的部分として見出され得、特に、３つの疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、およびＰｈｅ）により特徴付けられる。プラスミノゲン活性化因子中の自己溶解ループは、プラスミノゲン活性化因子との相互作用を担う。この領域における点変異は、プラスミノゲンとプラスミノゲンとの間のタンパク質−タンパク質相互作用がもはや有効には形成され得ないという、効果を有し得る。これらの変異は、フィブリンの非存在下では単に機能的に関連するだけである。対照的に、フィブリン存在下では、これらは、プラスミノゲン活性化因子の活性増加を担う（Ｋ  Ｓｏｎｇ−Ｈｕａ、Ｔａｃｈｉａｓ  Ｋ、Ｌａｍｂａ  Ｄ、Ｂｏｄｅ  Ｗ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＥＬ、１９９７：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｅｘｏｃｉｔｅ  ｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２：３，１８１１〜１８１６）。
【００４６】
好ましい実施形態において、４２０位〜４２３位での点変異を示すｔ−ＰＡが、使用される。これらの残基が特異的変異誘発により置換された場合、これは、ｔ−ＰＡのフィブリン依存性を増加し、６１，０００倍まで増加する（Ｋ  Ｓｏｎｇ−Ｈｕａら）。Ｓｏｎｇ−Ｈｕａらは、点変異Ｌ４２０Ａ、Ｌ４２０Ｅ、Ｓ４２１Ｇ、Ｓ４２１Ｅ、Ｐ４２２Ａ、Ｐ４２２Ｇ、Ｐ４２２Ｅ、Ｆ４２３ＡおよびＦ４２３Ｅを試験した。これらの刊行物は、本発明による使用の開示のために、参考として完全に援用される。
【００４７】
さらなる有利な実施形態によると、配列番号１（図１３）によるアミノ酸配列を有する改変型組織プラスミノゲン活性化因子が、使用される。この改変型ｔ−ＰＡは、自己溶解ループ中の４２０位〜４２３位における疎水性アミノ酸のＨｉｓ４２０、Ａｓｐ４２１、Ａｌａ４２２およびＣｙｓ４２３のような交換によって、野生型ｔ−ＰＡと異なる。このｔ−ＰＡは、１９４位にフェニルアラニンを優先的に含む。さらに、２７５位は、グルタミン酸により占められ得る。有利なことに、１９４位は、フェニルアラニンにより占められる。
【００４８】
さらに、改変型ウロキナーゼが、本発明により使用され得る。本発明によるウロキナーゼは、配列番号２（図１４）によるアミノ酸配列を含み得、その配列において、自己溶解ループ中の疎水性アミノ酸が、Ｖａｌ４２０、Ｔｈｒ４２１、Ａｓｐ４２２、およびＳｅｒ４２３により置換されている。有利なことに、このウロキナーゼは、Ｉｌｅ２７５およびＧｌｕ１９４を保有する。この変異体は、野生型ウロキナーゼと比較して、５００倍増加したフィブリン特異性を示す。
【００４９】
ウロキナーゼおよびｔ−ＰＡ両方の変異体が、半定量的試験において分析され、野生型ｔ−ＰＡと比較して増加したフィブリン特性を示した。
【００５０】
血吸いコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｔｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液由来のプラスミノゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）もまた、フィブリン存在下で、非常に増加した活性（詳細には、１００，０００倍の増加）を示す。従って、このプラスミノゲン活性化因子は、本発明により優先的に使用され得る。用語ＤＳＰＡは、この血吸いコウモリにとって必須の機能（すなわち、創傷の出血期間の増加）を満たす（Ｃａｒｗｒｉｇｈｔ、１９７４）、４つの異なるプロテアーゼを包含する。これらの４つのプロテアーゼ（ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβ、ＤＳＰＡγ）は、互いに対して、そしてヒトｔ−ＰＡに対して、高い類似性（相同性）を示す。これらはまた、類似する生理学的活性を示し、包括的用語ＤＳＰＡの下での共通した分類をもたらす。ＤＳＰＡは、特許ＥＰ  ０  ３５２  １１９  Ａ１およびＵＳ  ６，００８，０１９およびＵＳ  ５，８３０，８４９に開示される。これらの特許は、開示目的のために参考として完全に本明細書により援用される。
【００５１】
ＤＳＰＡαは、今までのところ、このグループからの最も良く分析されたプロテアーゼである。それは、既知のヒトｔ−ＰＡアミノ酸配列（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍｅｒら、１９９１）と比較して７２％より大きい相同性をもつアミノ酸配列をもつ。しかし、ｔ−ＰＡとＤＳＰＡとの間には２つの本質的な差異がある。第１は、すべてのＤＳＰＡが一本鎖分子として完全なプロテアーゼ活性をもつことである。なぜなら、それは、ｔ−ＰＡとは対照的に、二本鎖形態に変換されないからである（Ｇａｒｄｅｌｌら、１９８９：Ｋｒａｔｚｓｃｈｍｅｒら、１９９１）。第２に、ＤＳＰＡの触媒活性は、ほぼ完全にフィブリンに依存している（Ｇａｒｄｅｌら、１９８９；Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら、１９９５；Ｔｏｓｃｈｉｅら、１９９８）。例えば、ＤＳＰＡα１の活性は、フィブリンの存在下で１００，０００倍増加し、その一方、ｔ−ＰＡ活性は５５０倍増加するに過ぎない。対照的に、ＤＳＰＡ活性は、フィブリノゲンによってよりかなり弱く誘導される。なぜなら、それは７〜９倍の増加を示すのみであるからである（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら、１９９５）。結論として、ＤＳＰＡは、フィブリンにかなりより依存性であり、そしてフィブリンにより５５０倍だけ活性化される野生型ｔ−ＰＡよりはかなりフィブリン特異的である。
【００５２】
そのフィブリン溶解性性質とｔ−ＰＡに対する強い類似性のため、ＤＳＰＡは、血栓溶解剤の開発のための興味深い候補である。これにも関わらず、ＤＳＰＡの血栓溶解剤としての治療使用は、過去においては心筋梗塞の処置に限られていた。なぜなら、ｔ−ＰＡに関連するプラスミノゲン活性化因子が急性発作の処置に合理的に用いられ得るという正当化された希望が存在せず、グルタミン酸で誘導される神経毒性に対するｔ−ＰＡの寄与に起因するからである。
【００５３】
驚くべきことに、ＤＳＰＡは、たとえ、ｔ−ＰＡに対する高い類似性（相同性）を示すとしても、そしてたとえ、これら分子の生理学的効果が大きな程度まで匹敵するとしても、神経毒性効果をもたないことが示されている。上記の結論は、ＤＳＰＡは、結局、ニューロン組織損傷の重篤なリスクを引き起こすことなく、発作の治療のための血栓溶解剤として首尾良く用いられ得るというアイデアに至った。特に、興味深いのは、ＤＳＰＡがまた、発作の兆候の開始後３時間より後にも用いられ得るという事実である。
【００５４】
本発明のさらなる教示は、上記の知見から発展させたものであり、さらなるプラスミノゲン活性化因子を、それらがＤＳＰＡの本質的な特徴、特にｔ−ＰＡの神経毒性の欠如を示すように改変または生成するという選択肢である。この基礎は、神経毒性プラスミノゲン活性化因子を、非神経毒性プラスミノゲン活性化因子に変形し、そしてそれによって既知または新たに発見された神経毒性プラスミノゲン活性化因子を基に非神経毒性プラスミノゲン活性化因子を生成することを可能にする、調査された構造と生化学的効果との相関関係である。
【００５５】
この新たな教示は、いわゆるカイニン酸モデルおよび線条のＮＭＤＡ誘導損傷の調査のためのモデルを用いて実施される、１つの側面でｔ−ＰＡの、そして他の側面でＤＳＰＡの神経変性効果のインビボ比較実験に基づく。
【００５６】
カイニン酸モデル（カイニン酸損傷モデルともいう）は、カイニン酸型（ＫＡ型）のレセプターおよびＮＭＤＡおよびＡＭＰＡグルタミン酸レセプターのアゴニストとしての、カイニン酸（ＫＡ）の外部適用による神経毒性カスケードの刺激に基づく。実験モデルとしてｔ−ＰＡ欠損マウス幹を用い、実験室動物のカイニン酸に対する感受性が、外部ｔ−ＰＡの補助的付与の後のみ、野生型マウスのレベルに到達するであることを示すことが可能である。対照的に、同じ実験条件の下でＤＳＰＡの等モル濃度の注入は、カイニン酸（ＫＡ）に対する感受性を回復しない。ｔ−ＰＡの神経毒性影響は、ＤＳＰＡによって誘導されなかったと結論された。これらの結果の要約は、表２に示される。
【００５７】
【表２】
2005519025.tif 000002
このモデルに基づく定量的試験は、ＤＳＰＡ濃度の１０倍増加でさえ、ＫＡ処置に対するｔ−ＰＡ欠損マウスの感受性が回復され得なかったこと、その一方、既に１０分の１に低いｔ−ＰＡ濃度がＫＡ誘導組織損傷に至ったことを示した。これは、ＤＳＰＡが、ＫＡ処置後の神経変性の刺激に関して、ｔ−ＰＡと比較して少なくとも１００分の１に低い神経毒性能力を所有するという結論に至る（図１１および１２もまた参照のこと）。
【００５８】
神経変性の第２のモデルでは、ＮＭＤＡ依存性神経変性の刺激に対するｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの可能な影響が、野生型マウスと比較された。この目的には、ＮＭＤＡ（ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターのアゴニストとして）を、野生型マウスに単独またはｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡのいずれかとの組合せで注射した。このモデルは、常に、神経変性、および血液脳関門の破壊に起因する血漿タンパク質の流入（Ｃｈｅｎら、１９９９）に至る条件下で、これらプロテアーゼの影響の比較を可能にする。
【００５９】
このモデル上で作業する間、ＮＭＤＡの注射は、マウスの線条における再現性ある損傷に至った。これら損傷の容量は、ｔ−ＰＡおよびＮＭＤＡの組み合わせた注射で少なくとも５０％だけ増加した。対照的に、ＤＳＰＡα１との同時注射は、ＮＤＭＡによって引き起こされる損傷の増加または拡張に至らなかった。ＮＭＤＡによって誘導される損傷の領域中に自由に拡散し得る血漿タンパク質の存在下でさえ、ＤＳＰＡは、増加する神経変性を生じなかった（表３もまた参照のこと）。
【００６０】
【表３】
2005519025.tif 000003
これらの結果は、ｔ−ＰＡとは対照的に、フィブリンを含まないＤＳＰＡが、哺乳動物、そしてまたヒトの中枢神経系でほぼ不活性プロテアーゼのように挙動し、そしてそれ故、ＫＡまたはＮＭＤＡによって引き起こされる神経毒性影響に寄与しないことを示す。発作におけるｔ−ＰＡ様タンパク質の治療使用に対する偏見にも関わらず、この神経毒性の欠如は、ＤＳＰＡを、急性発作の処置のための適切な血栓溶解剤にする。
【００６１】
臨床試験の最初の結果は、これら結果をヒトにおける発作の処置に対しても移行可能であることを示す。成功した灌流の後の患者で有意な改善が達成され得ることが見出された（８ポイントＮＩＨＳＳまたはＮＩＨＳＳスコア０→１の改善）。表１はこのデータを示す。
【００６２】
【表１】
2005519025.tif 000004
ＤＳＰＡおよびその他の非神経毒性プラスミノゲン活性化因子の神経毒性の欠如（上記を参照のこと）は、野生型ｔ−ＰＡとは対照的に、これらプラスミノゲン活性化因子を用いる発作処置において特別の利点を提供し、発作の発生後３時間のみの短い最大時間に限定されない。反対に、この処置はより後期、例えば６時間後またはより後期に開始され得る。なぜなら、興奮毒性応答を刺激するリスクがほぼないからである。ＤＳＰＡを用いる最初の臨床試験は、発作の兆候の開始後６〜９時間に亘る範囲の時間でさえ、患者の安全処置を照明する。
【００６３】
非神経毒性活性化因子での時間的に制限されない処置というこの選択肢は、特に重要である。なぜなら、それは、診断が遅延するとき、または発作の開始が十分な安全性で決定できないときでさえ、急性発作の兆候をもつ患者を処置することを、初めて可能にするからである。先行技術では、このグループの患者は、所望されないリスク推定に起因してプラスミノゲン活性化因子での血栓溶解治療から排除されていた。結果として、発作に対する血栓溶解剤の認可された使用のための必須の反適応症が排除される。
【００６４】
ＤＳＰＡおよびさらなる非神経毒性プラスミノゲン活性化因子は、組織損傷副作用を示さない。しかし、ヒト身体中で自然に起こるグルタミン酸により誘導される組織損傷を制限するために、発作の処置に神経保護薬剤と組合せて、それらを付与することとが有利であり得る。グルタミン酸レセプターを競争的または非競争的に阻害する神経保護薬剤が用いられ得る。有用な組合せは、例えば、ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプター、カイニン酸型またはキスカル酸型（例えば、ＡＰＶ、ＡＰＨ、フェンシクリジン、ＭＫ−８０１、デキストロルファンまたはセタミン）である既知のインヒビターとともにである。
【００６５】
さらに、カチオンとの組合せが有利であり得る。なぜなら、カチオン、特にＺｎイオンは、グルタメータレセプターにより調節されるカチオンチャネルをブロックし、そしてそれ故、神経毒性影響を減少し得るからである。
【００６６】
さらに有利な実施形態では、非神経毒性プラスミノゲン活性因子は、少なくとも１つのさらなる治療剤と、または薬学的に許容可能なキャリヤーと組合せられ得る。細胞を生存させることにより組織損傷の減少を支持する治療剤との組合せは特に有利である。なぜなら、それは、既に損傷した組織の再生に寄与するか、またはさらなる発作発症の予防の役に立つからである。有利な例は、キノンのような抗生物質、ヘパリンまたはヒルジンのような抗凝固剤およびシチコリンまたはアセチルサリチル酸との組合せである。
【００６７】
少なくとも１のトロンビンインヒビターとの組合せもまた有利であり得る。好ましくは、トロンボモジュリンおよびトロンボモジュリンアナログ（例えば、ソルリン、トリアビンまたはパリジピン）が用いられ得る。抗炎症性物質とのさらなる組合せもまた有利である。なぜなら、それらは、白血球による浸潤に影響するからである。
【実施例】
【００６８】
（ｔ−ＰＡとＤＳＰＡとの比較実験は、以下の方法である：）
（１．動物）
野生型マウス（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６）およびｔ−ＰＡ欠損マウス（ｔ−ＰＡ−／−マウス）（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６）（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、１９９４）は、Ｐｅｔｅｒ  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ博士，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍによって提供された。
【００６９】
（２．脳組織からのタンパク質抽出）
ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１のいずれかの注入後の、脳組織におけるタンパク質分解活性の評価を、電気泳動分析によって実施した（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−ＰｉｐｅｒｎｏおよびＲｅｉｃｈ，１９７４）。７日間の期間にわたる海馬内への注入後に、マウスを麻酔し、次いで、心臓を通して（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）ＰＢＳで灌流し、そして脳を取り出した。海馬領域を取り出し、エッペンドルフ管に移し、そしてプロテアーゼインヒビターを含まない等体積（ｗ／ｖ）（約３０〜５０μｍ）の０．５％ＮＰ−４０溶解緩衝液（０．５％  ＮＰ−４０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＮａＣＬ、３ｍＭ  ｍｇＣｌ２、１ｍｍ  ＥＤＴＡ）中でインキュベートした。脳抽出物を、携帯型ガラスホモジナイザでホモジナイズし、そして氷上で３０分間維持した。次いで、サンプルを遠心分離し、そして上清を除去した。存在するタンパク質の量を決定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬）
（３．プロテアーゼのザイモグラフィ分析）
サンプルおよび脳組織抽出物におけるタンパク質分解活性を、Ｇｒａｎｅｌｌｉ，ＰｉｐｅｒｎｏおよびＲｅｉｃｈ（１９７４）の方法に従って、電気泳動分析によって決定した。組換えタンパク質（１００ｎＭまで）または脳組織抽出物（２０μｇ）を含むサンプルを、非還元条件下で（１０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルをプレートから取り出し、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００中で２時間洗浄し、次いで、重合したフィブリノゲンおよびプラスミノゲンを含有するアガロースゲル上に重ねた（Ｇｒａｎｅｌｌｉ，ＰｉｐｅｒｎｏおよびＲｅｉｃｈ，１９７４）。タンパク質分解されたゾーンが現れるまで、加湿チャンバ内でゲルを３７℃でインキュベートする。
【００７０】
（４．ｔ−ＰＡ、ＤＳＰＡの海馬内注入および引き続くカイニン酸の注入）
カイニン酸損傷モデルは、Ｔｓｉｒｋａら（１９９５）の研究に基づいた。動物に、アトロピン（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、次いで、ペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射で麻酔した。その後、マウスを、定位フレーム中に配置し、１００μｌのＰＢＳまたは組換えヒトｔ−ＰＡ（０．１２ｍｇ／ｍｌ，１．８５μＭ）またはＤＳＰＡα１（１．８５μＭ）のいずれかを含むミクロ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔモデル  １００７Ｄ、Ａｌｚｅｔ  ＣＡ、ＵＳＡ）を、肩甲骨間に皮下移植した。これらのポンプを、滅菌チューブを介して脳カニューレに連結し、そしてバー開口部を通って挿入し、正中栓付近に液体を導入するために、座標ブレグマ−２．５ｍｍ、座標中外側０．５ｍｍおよび座標背腹側１．６ｍｍで、頭蓋を通した。このカニューレを、所望の位置で固定し、そしてこれらのポンプを、それぞれの溶液を時速０．５μｌで合計７日間注入させた。
【００７１】
プロテアーゼ注入の２日後、マウスを再麻酔し、そして再度、定位フレーム中に配置した。その後、０．３μｌＰＢＳ中の１．５ｎｍｏｌのカイニン酸（ＫＡ）を、海馬中に片側性に注射した。これらの座標は、以下であった：ブレグマ−２．５ｍｍ、中外側１．７ｍｍおよび背腹側１．６ｍｍ。この興奮毒（ＫＡ）を、３０秒間送達した。このカイニン酸処置後、液体の逆流を防ぐために、この注射針を、さらに２分間これらの座標に留めた。
【００７２】
５．脳プロセシング手順
ＫＡ注射５日後、これらの動物を麻酔し、そして経噴門的に３０ｍｌのＰＢＳで還流し、続いて７０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で還流し、同じ固定液中で後固定し、続いて３０％ショ糖中でさらに２４時間インキュベーションした。脳の冠状切片（４０μｍ）を、次いで、凍結ミクロトーム上で切断し、そしてチオニン（ＢＤＨ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で対比染色するかまたは以下に記載されるように、免疫組織化学試験のために処理した。
【００７３】
（６．海馬内でのニューロン喪失の定量）
海馬のＣＡ１−ＣＡ３亜領域内でのニューロン喪失の定量を、以前（Ｔｓｉｒｋａら，１９９５；Ｔｓｉｒｋａら，１９９６）に記載されたとおりに行った。全ての処置群からの背側海馬の連続した５つの部分を、その部分が実際にＣＡ注射および損傷領域の場所を含むことに注意しながら調製した。これらの切片の海馬の亜領域（ＣＡ１〜ＣＡ３）を、海馬のカメラルシダーの図によってトレースした。亜領域全体の長さを、同じ倍率でトレースした１ｍｍ標準への比較によって測定した。生存可能な錐体ニューロンを有する（正常な形態を有する）組織の長さおよびニューロンのない（細胞が存在せず、チオニン染色もない）組織の長さを決定した。これらの長さは、各海馬亜領域についてのインタクトなニューロンおよびニューロン喪失を表す。これらの長さを切片毎に平均し、そして標準偏差を決定した。
【００７４】
（７．ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを有するかまたは有さない、線条体内ＮＭＤＡ興奮毒性損傷）
野生型マウス（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６）に麻酔し、そして定位フレーム内に配置した（上記を参照のこと）。次いで、マウスに、単独で、または４６μＭ  ｒｔ−ＰＡもしくは４６μＭ  ＤＳＰＡα１のいずれかと組み合わせて注射した、５０ｎｍｏｌ  ＮＭＤＡの片側注射を左側の層に受けさせた。コントロールとして、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡもまた（いずれも、４６μＭの濃度にて）単独で注射した。この注射の座標は以下の通りであった：ブレグマ−０．４ｍｍ、側方中間（ｍｉｄｉｏｌａｔｅｒａｌ）２．０ｍｍおよび背腹側２．５ｍｍ。溶液（全ての処置について１μｌ総体積）を、０．２μｌ／分の速度で５分間の期間にわたって移し、そして液体の逆流を最小にするために、注射後、針をさらに２分間適所に配置した。２４時間後、これらのマウスに麻酔をかけ、そして３０ｍｌ  ＰＢＳ、続いて７０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で、心臓を経て灌流し、同じ固定剤中で２４時間にわたって事後固定し、続いて３０％スクロース中でさらに２４時間にわたってインキュベートした。次いで、脳を、凍結ミクロトームで切断（４０μｍ）し、そしてゼラチンをコーティングしたスライドガラスに載せた。
【００７５】
（８．ＮＭＤＡ注射後の損傷体積の定量）
線条体損傷体積の定量を、Ｃａｌｌａｗａｙら（２０００）によって記載された方法を用いて行った。損傷を受けた領域にまたがる１０個の連続する冠状縫合切片を調製した。この損傷を受けた領域を、Ｃａｌｌａｗａｙ法を用いて可視化し、そして損傷体積を、マイクロコンピュータ画像化デバイス（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）の使用によって定量した。
【００７６】
（９．免疫組織化学）
免疫組織化学を、標準的な方法論を使用して行った。結腸切片を、３％  Ｈ２Ｏ２および１０％メタノールの溶液に５分間浸漬し、続いて５％正常ヤギ血清中で６０分間インキュベートした。この切片を、星状細胞検出のための抗ＧＦＡＰ抗体（１：１０００；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、小膠細胞の検出のための抗ＭＡＣ−１抗体（１：１０００，Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，ＵＳＡ）またはポリオクローナル抗ＤＳＰＡ抗体（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ）のいずれかとともに、一晩インキュベートした。すすいだ後、この切片を適切なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。これに続いて、アビジン／ビオチン−複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに６０分間最後にインキュベートした後、３，３’−ジアミンベブシジン（ｄｉａｍｉｎｅｂｅｂｃｉｄｉｎｅ）／０．０３％  Ｈ２Ｏ２で可視化した。次いで、切片を、ゼラチンコーティングしたスライドガラスに載せ、乾燥させ、脱水し、ｐｅｒｍｏｕｎｔとともにカバースリップを載せた。
【００７７】
（Ｂ．結果）
（１．ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの注入は、ｔ−ＰＡ−／−マウスの海馬に分散し、タンパク質分解活性を保持する）
最初の実験を、ＤＳＰＡおよびｔ−ＰＡの両方が、注入の７日間にわたって、それらのタンパク質分解活性を保持することを確認するように設計した。この目的のために、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡのアリコート（１００ｎｍｏｌ）を、水浴中で３７℃および３０℃にて７日間インキュベートした。タンパク質分解活性を決定するために、プローブの５倍連続希釈物を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質活性をザイモグラム分析により評価した。７日間凍結したままで維持したｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡのアリコートを、コントロールとして使用した。図１に認められ得るように、３０℃または３７℃いずれかでのインキュベーションのときに、この期間の間にＤＳＰＡ活性またはｔ−ＰＡ活性がごくわずかに喪失した。
【００７８】
（２．ｔ−ＰＡ活性およびＤＳＰＡ活性は、注入後にｔ−ＰＡ−／−マウスから調製された海馬抽出物中で回収される）
まず、注入したプロテアーゼが、注入した動物の脳に存在し、それらのタンパク質分解活性もまた保持すると同時に、この区画に存在することを確認しなければならなかった。この点に対処するために、ｔ−ＰＡ−／−に、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡのいずれかを７日間にわたり注入した（上記を参照のこと）。次いで。心臓を介してマウスをＰＢＳで灌流し、脳を取り出した。同側海馬領域および対側海馬領域を単離し、同様に、小脳領域もまた単離した（ネガティブコントロールとして）。組織サンプル（２０μｇ）を、方法の節における記載に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびザイモグラム分析に供した。図２に認められ得るように、ｔ−ＰＡ活性およびＤＳＰＡ活性の両方を、海馬の同側領域中で検出したのに対し、いくらかの活性が、対側でも検出された。このことは、注入したプロテアーゼが、脳においてそれらの活性を維持しているのみならず、海馬領域に拡散したこともまた示す。コントロールとして、小脳から調製した抽出物中では活性を検出することはできなかった。
【００７９】
（３．ＤＳＰＡの免疫組織化学的評価）
ＤＳＰＡが、海馬領域に実際に拡散したことをさらに確認するために、ｔ−ＰＡ−／−マウスの冠状脳切片を、ＤＳＰＡ注入後に、免疫組織化学的に分析した。ＤＳＰＡ抗原は、海馬領域において検出され、注入部位の領域において最も顕著に染色された。この結果により、注入されたＤＳＰＡが可溶性であり、かつ実際に海馬に存在することが確認される。
【００８０】
（４．ＤＳＰＡ注入は、インビボでカイニン酸媒介性ニューロン変性を修復しない）
ｔ−ＰＡ−／−マウスは、特徴として、カイニン酸（ＫＡ）媒介性ニューロン変性に耐性である。しかし、ｒｔ−ＰＡの海馬内注入は、ＫＡ媒介性障害に対する感受性を完全に回復する。ＤＳＰＡが、このモデルにおいてｔ−ＰＡと置換され得るか否かを決定するために、ｔ−ＰＡ−／−マウスの海馬内に、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡのいずれかを、ミニ浸透圧ポンプを使用して注入した。両方の群について、１２匹のマウスを試験した。２日後、動物にカイニン酸を注射し、回収するまで放置した。５日後、動物を屠殺し、その脳を取り出し、調製した（上記のように）。コントロールとして、ＫＡ処理前に、ｔ−ＰＡ−／−マウスに、ＰＢＳもまた注入した（Ｎ＝３）。
【００８１】
冠状脳切片を調製し、Ｎｉｓｓｌ染色により、ニューロンを検出した。図４に示されるように、ＰＢＳを注入したｔ−ＰＡ−／−マウスは、ＫＡでの引き続くチャレンジに耐性であった。しかし、組換えｔ−ＰＡの注入は、ＫＡ処理に対する感受性を回復させた。対照的に、同じ濃度のＤＳＰＡの海馬領域への注入は、動物のＫＡに対する感受性を変化させなかった。
【００８２】
これらの結果の定量は、各群において１２匹のマウスから得られたデータに基づいた。ＤＳＰＡを注入した１２匹のマウスのうちの２匹において、小さな程度のニューロン変性が観察された。その理由は未知であり、ＤＳＰＡの存在におそらく関連しない。データを合わせて、これらの２匹の動物の場合において観察された小さな効果を検討する。ｔ−ＰＡで処置した１２匹全てのマウスは、ＫＡ処置に対して感受性であった。これらの結果は、等モル濃度でのｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１の注入の場合に、ｔ−ＰＡの投与のみが、ＫＡ誘導性ニューロン変性に対する感受性の回復をもたらしたことを示す。
【００８３】
（５．ＤＳＰＡ注入は、小膠活性化を生じない）
ｔ−ＰＡ注入によって引き起こされるｔ−ＰＡ−／−マウスのＫＡ感受性の回復はまた、小膠活性化を生じる（Ｒｏｇｏｖｅら、１９９９）。ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡ注入および引き続くＫＡ処置後の小膠活性化の程度を評価するために、マウスの冠状切片を、Ｍａｃ−１抗体を使用する活性化小膠細胞についての免疫組織化学的染色に供した。ｔ−ＰＡ注入後のＫＡ感受性回復は、Ｍａｃ−１ポジティブ細胞の明らかな増加を生じた。このことは、ＤＳＰＡを注入したマウスにおいては観察されなかった。従って、ＤＳＰＡの存在は、ＫＡ処置後の小膠細胞の活性化を生じない。
【００８４】
（６．マウス海馬領域におけるＤＳＰＡおよびｔ−ＰＡの力価測定）
注入に使用したｔ−ＰＡの濃度は、Ｔｓｉｒｋａら（１９９５）によって記載される濃度（０．１２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ［１．８５μＭ］）に基づいた。ＫＡ傷害実験を、１０分の１のｔ−ＰＡ（０．１８５μＭ）および１０倍高いＤＳＰＡ（１８．５μＭ）を使用して反復した。より低いｔ−ＰＡ濃度は、なお、ＫＡ処置に対する感受性を回復させることができた（ｎ＝３）。特に興味深いのは、１０倍高いＤＳＰＡ濃度の注入が、ＫＡ処置後のニューロン喪失をほとんど引き起こさないという知見であった。これらのデータは、ＤＳＰＡが、ＫＡに対する感受性の増大をもたらさないことを強く指摘する。
【００８５】
（７．野生型マウスにおけるｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡのＮＭＤＡ依存性ニューロン変性に対する効果）
ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの効果もまた、野生型マウスにおけるニューロン変性のモデルにおいて試験した。これらのマウスの線条におけるｔ−ＰＡの注入は、グルタミン酸アナログＮＭＤＡによって引き起こされるニューロン変性効果の増大をもたらした（Ｎｉｃｏｌｅら、２００１）。
【００８６】
ＮＭＤＡを、総容積１μｌで、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡ（各４６μＭ）の存在下で、野生型マウスの線条領域に注射した。２４時間後に、脳を取り出し、病巣のサイズを、Ｃａｌｌａｗａｙ法（Ｃａｌｌａｗａｙら、２０００）に従って、定量した（上記を参照のこと）。図７において認められ得るように、ＮＭＤＡ単独の注射は、全ての処置マウスにおいて再現可能な病巣を引き起こした（Ｎ＝４）。ｔ−ＰＡおよびＮＭＤＡをともに適用した場合、病巣のサイズは、約５０％増大した（Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。明らかに対照的に、ＮＭＤＡおよび同じ濃度のＤＳＰＡの同時注射は、ＮＭＤＡ単独と比較して、病巣サイズの増大をもたらさなかった。
【００８７】
ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの単独での注射は、検出可能なニューロン変性をもたらさなかった。単独で投与される場合、ｔ−ＰＡの効果の欠如は、Ｎｉｃｏｌｅら（２００１）の結果と一致する。これらのデータは、ＤＳＰＡの存在が、ニューロン変性事象の間ですら、ニューロン変性を増大させないことを示す。
【００８８】
ＤＳＰＡの注射が、海馬領域に実際に拡がった否かを確かめるために、ＤＳＰＡ抗体の使用によって、冠状切片に対して免疫組織化学を行った。この試験により、ＤＳＰＡのアリコートは、線条領域内に実際に入ることが示された。
【００８９】
（間接的クロモゲン試験によるプラスミノゲン活性化の動力学的分析）
ｔ−ＰＡ活性の間接的クロモゲン試験を、基質Ｌｙｓ−プラスミノゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）およびｓｐｅｃｔｒｏｃｙｍｅ  ＰＬ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて、Ｍａｄｉｓａｎ  Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｒａｒｄ  Ｒ．Ｄ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：７２１−７２４；Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｅ．ＬＯ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．およびＢａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  Ｒ．Ｓ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３５３０−３５３３、ならびにＭａｄｉｓｏｎ  Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．およびＧｅｒａｒｄ  Ｒ．Ｄ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２１４２３−２１４２６に従って行った。補因子ＤＥＳＡＦＩＢ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在下および非存在下の両方で試験を行った。ＤＥＳＡＦＩＢは、プロテアーゼバトロキソビンでの非常に純粋なヒトフィブリノゲンの切断によって得られる可溶性フィブリンモノマーの調製物である。バトロキソビンは、フィブリノゲンのＡα鎖におけるＡｒｇ１６−Ｇｌｙ１７結合を切断し、それによってフィブリノペプチドＡを放出する。フィブリンＩモノマーを示す、得られたｄｅｓ−ＡＡ−フィブリノゲンは、ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの非存在下で可溶性である。Ｌｙｓ−プラスミノゲンの濃度を、ＤＥＳＡＦＩＢの存在下では０．０１２５μＭ〜０．２μＭまで、補因子の非存在下では、０．９μＭ〜１６μＭまで変化させた。
【００９０】
（異なる刺激の存在下での間接的クロモゲン試験）
間接的クロモゲン標準試験を、上記の刊行物に従って行った。０．２５〜１ｎｇ酵素、０．２μＭ  Ｌｙｓ−プラスミノゲン、および０．６２ｍＭ  ｓｐｅｃｔｒｏｃｙｍｅ  ＰＬを含む、総容積１００μｌのプローブを使用した。緩衝液、２５μｇ／ｍｌ  ＤＥＳＡＦＩＢ、１００μｇ／ｍｌ  フィブリノゲンの臭化シアンフラグメント（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）または１００μｇ／ｍｌの刺激性の１３アミノ酸のペプチドＰ３６８のいずれかの存在下で試験を行った。分析をマイクロタイタープレート中で行い、光学密度を、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ」において、１時間の間３０秒ごとに、４０５ｎｍ波長で決定した。反応温度は、３７℃であった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】 
【図２】 
【図４ａ】 
【図４ｂ】 
【図７】 
【図９】 
【図１０】 
【図１１】 
【図１２】 
【図１３】 
【図１４】 
【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１】
2005519025.tif 000010
【図２】
2005519025.tif 000011
【図４ａ】
2005519025.tif 000012
【図４ｂ】
2005519025.tif 000013
【図７】
2005519025.tif 000014
【図１０】
2005519025.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月13日(2004.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノゲン活性化因子のフィブリン特異性が野生型ｔ−ＰＡと比べて増強されている、発作の処置のためのプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項２】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、アスパラギン酸残基と一緒になってチモーゲン三つ組残基の少なくとも一部を形成する、少なくともヒスチジン残基またはセリン残基を含む、使用。
【請求項３】
請求項２に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、前記セリン残基は、ｔ−ＰＡの２９２位と少なくとも部分的に一致する位置に位置し、前記ヒスチジン残基は、ｔ−ＰＡの３０５位と少なくとも部分的に一致する位置に位置し、そして前記アルパラギン酸残基は、ｔ−ＰＡの４４７位と少なくとも部分的に一致する位置に位置する、使用。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、以下のｔ−ＰＡ変異体：ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｆ３０５Ｈ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｆ３０５Ｈ，Ａ２９２Ｓからなる群より選択される、使用。
【請求項５】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、Ａｓｐ１９４または一致する位置にあるアスパラギン酸の点変異を保有し、これにより、フィブリンの非存在下における該プラスミノゲン活性化因子の触媒的に活性な立体構造の安定性が減少される、使用。
【請求項６】
請求項５に使用の使用であって、Ａｓｐ１９４が、グルタミン酸またはアスパラギンによって置換されている、使用。
【請求項７】
請求項６に記載の使用であって、ｔ−ＰＡが、Ａｓｐ１９４からＧｌｕ１９４またはＡｓｎ１９４への置換を保有する、使用。
【請求項８】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子は、該因子中の自己分解ループ中に少なくとも１つの変異を含み、該変異により、フィブリンの非存在下でのプラスミノゲンとプラスミノゲン活性化因子との間の機能的相互作用が減少される、使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記自己分解ループ中の少なくとも１つの変異が、野生型ｔ−ＰＡのアミノ酸４２０位〜４２３位または一致する位置に影響を与える、使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記変異が、以下の変異体：Ｌ４２０Ａ、Ｌ４２０Ｅ、Ｓ４２１Ｇ、Ｓ４２１Ｅ、Ｐ４２２Ａ、Ｐ４２２Ｇ、Ｐ４２２Ｅ、Ｆ４２３ＡおよびＦ４２３Ｅからなる群より選択される、使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子が、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異を含むチモーゲンである、使用。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、前記点変異が、ｔ−ＰＡの１５位〜２７５位またはその位置に一致する位置に位置する、使用。
【請求項１３】
請求項１２に記載の使用であって、グルタミン酸が１５位または２７５位にある、使用。
【請求項１４】
請求項１に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該プラスミノゲン活性化因子が、血吸いコウモリの唾液から単離された（ＤＳＰＡ）、使用。
【請求項１５】
発作発症の少なくとも３時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１４のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１６】
発作発症の少なくとも６時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１５のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１７】
発作発症の少なくとも９時間後のヒトにおける発作の治療的処置のための、請求項１〜１６のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項１８】
発作患者の治療的処置のための請求項１〜１７のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該発作の発症は、一時的であって正確には決定されていない、使用。
【請求項１９】
野生型ｔ−ＰＡの神経毒性を回避している発作の治療のための、請求項１〜１８のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子の使用。
【請求項２０】
Ｈｉｓ４２０、Ａｓｎ４２、Ａｌａ４２２およびＣｙｓ４２３を含む、自己分解ループを含む組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組織プラスミノゲン活性化因子であって、１９４位における点変異により特徴付けられ、該点変異は、フィブリンの非存在下における該プラスミノゲン活性化因子の触媒的な活性な立体構造の安定性を減少させる、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２２】
Ｐｈｅ１９４を特徴とする、請求項２１に記載の組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のうちの少なくとも１項に記載の組織プラスミノゲン活性化因子であって、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異を特徴とする、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２４】
Ｇｌｕ２７５を特徴とする、請求項２３に記載の組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２５】
配列番号１に従うアミノ酸配列を有する、組織プラスミノゲン活性化因子。
【請求項２６】
Ｖａｌ４２０、Ｔｈｒ４２１、Ａｓｐ４２２、およびＳｅｒ４２３を含む、自己分解ループを含むウロキナーゼ。
【請求項２７】
請求項２６に記載のウロキナーゼであって、１９４位における点変異によって特徴付けられ、該点変異は、フィブリンの非存在下での該ウロキナーゼの触媒活性な立体構造の安定性を減少させる、ウロキナーゼ。
【請求項２８】
Ｇｌｕ１９４により特徴付けられる、請求項２７に記載のウロキナーゼ。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のうちの少なくとも１項に記載のウロキナーゼであって、プラスミンによる触媒を妨げる少なくとも１つの点変異により特徴付けられる、ウロキナーゼ。
【請求項３０】
Ｉｌｅ２７５により特徴付けられる、請求項２９に記載のウロキナーゼ。
【請求項３１】
配列番号２に従うアミノ酸配列を有する、ウロキナーゼ。
【請求項３２】
請求項１〜３１のうちの少なくとも１項に記載のプラスミノゲン活性化因子と、少なくとも１つのさらなる薬学的に活性な構成成分またはその薬学的に受容可能な塩とを含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
神経保護因子を特徴とする、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
グルタミン酸レセプターアンタゴニストを特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
競合性アンタゴニストまたは非競合性アンタゴニストを特徴とする、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１つのトロンビンインヒビターを特徴とし、該トロンビンインヒビターは、以下の物質：トロンボモジュリン、トロンボモジュリンアナログ、トリアビン、パリジピン、またはソルリンからなる群より優先的に選択される、薬学的組成物。
【請求項３７】
請求項３３に記載の薬学的組成物であって、少なくとも１つの抗凝固剤を特徴とし、該抗凝固剤は、以下の抗凝固剤：ヒルジン、ヘパリン、アセチルサリチル酸またはアンクロドからなる群より優先的に選択される、薬学的組成物。
【請求項３８】
抗炎症物質を特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
抗生物質を特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
シチコリンを特徴とする、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項１〜１９に記載の、請求項３６〜４５のうちの少なくとも１項に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４２】
１種の非神経毒性プラスミノゲン活性化因子を含む発作の処置のための薬物の製造のための方法であって、該プラスミノゲン活性化因子の改変のために、以下の工程：
チモーゲン三つ組残基の少なくとも一部を導入する工程；
フィブリンの非存在下での触媒活性な立体構造の安定性を減少させるために、Ａｓｐ１９４または一致するアスパラギン酸を置換する工程；
自己分解ループまたは該ループと一致するペプチド部分における、疎水性アミノ酸残基を置換する工程；
プラスミンによるチモーゲンの触媒を妨げるために該チモーゲン中に変異を導入する工程；
のうちの少なくとも１つを包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法により製造される、薬物。
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月6日(2005.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005519025000001.app
【国際調査報告】
2005519025.tif 000016
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