(57)【要約】  複数の炭水化物ハプテンおよびキャリヤ部分のモノマー単位の凝集体（多量体）の共役体を提供する。共役体は免疫応答を顕在化させるために使用することができる。共役体は好ましくはＫＬＨモノマー、特に、凝集した二量体、三量体または四量体の炭水化物−置換凝集体である。凝集したＳＴｎ−ＫＬＨ共役体は特に興味を起こさせるものである。本発明は、同じかまたは異なる、複数の炭水化物ハプテン部分、およびリジン含有免疫原タンパク質キャリヤ部分の複数のモノマー単位からなる非天然発生免疫原共役体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じかまたは異なる、複数の炭水化物ハプテン部分、およびリジン含有免疫原タンパク質キャリヤ部分の複数のモノマー単位からなり、前記ハプテン部分が直接または間接的に、キャリヤ部分のモノマー単位のリジンに結合する、非天然発生免疫原共役体。
【請求項２】
前記キャリヤ部分が鍵穴リンペットヘモシアニンである請求項１記載の共役体。
【請求項３】
８００ｋD以上の見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項４】
１，２００kD以上の見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項５】
１，６００kD以上の見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項６】
少なくとも１，０００kDの見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項７】
少なくとも１，５００kDの見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項８】
少なくとも２，０００kDの見かけの分子量をもつ請求項１または２記載の共役体。
【請求項９】
５，０００kD以上の見かけの分子量をもたない請求項１−８のいずれか１項記載の共役体。
【請求項１０】
２，５００kD以上の見かけの分子量をもたない請求項１−８のいずれか１項記載の共役体。
【請求項１１】
免疫原力価が前記ハプテン部分からなる参照共役体のそれの少なくとも２００％であり、前記キャリヤ部分の単一モノマー単位がキャリヤのモノマー単位に対し同じ予想された数のハプテン部分をもつ請求項１−１０のいずれか１項記載の共役体。
【請求項１２】
キャリヤのモノマー単位に対し予想された数のハプテン部分が少なくとも１０である請求項１−１２のいずれか１項記載の共役体。
【請求項１３】
1またはそれ以上の前記炭水化物ハプテン部分がシアリルＴｎエピトープである請求項１−１２のいずれか１項記載の共役体。
【請求項１４】
共役体のタンパク質含量の割合としてシアル酸の量として測定するとＮＡＮＡ含量が３％（weight/weight）を超える請求項１３記載の共役体。
【請求項１５】
ＮＡＮＡ含量が少なくとも４％である請求項１３記載の共役体。
【請求項１６】
ＮＡＮＡ含量が少なくとも５％である請求項１３記載の共役体。
【請求項１７】
ＮＡＮＡ含量が少なくとも６％である請求項１３記載の共役体。
【請求項１８】
ＮＡＮＡ含量が少なくとも７％である請求項１３記載の共役体。
【請求項１９】
各炭水化物ハプテン部分がリンカーによってキャリヤ部分のモノマー単位に結合する請求項１−１８のいずれか１項記載の共役体。
【請求項２０】
リンカーが１２以下の水素とは異なる原子からなる脂肪族基である請求項１９記載の共役体。
【請求項２１】
リンカーがアルキル基である請求項２０記載の共役体。
【請求項２２】
リンカーがハプテン部分の酸素をアミノ窒素に結合する請求項１９−２１のいずれか１項記載の共役体。
【請求項２３】
リンカーが単一ハプテン部分を前記モノマー単位の単一アタッチメント部位に結合する請求項１９−２２のいずれか１項記載の共役体。
【請求項２４】
リンカーが複数のハプテン部分を前記モノマー単位の単一アタッチメント部位に結合する請求項１９−２２のいずれか１項記載の共役体。
【請求項２５】
前記炭水化物ハプテン部分の少なくとも１が天然にＫＬＨと結合していない請求項１−２４のいずれか１項記載の共役体。
【請求項２６】
共役体分子からなる組成物であって、前記共役体分子が前記炭水化物ハプテン部分からなる前記組成物において全共役体分子の少なくとも５０重量％である請求項１−２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２７】
共役体分子からなる組成物であって、前記共役体分子が前記炭水化物ハプテン部分からなる前記組成物において全共役体分子の少なくとも７５重量％である請求項１−２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２８】
共役体分子からなる組成物であって、前記共役体分子が前記炭水化物ハプテン部分からなる前記組成物において全共役体分子の少なくとも９０重量％である請求項１−２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２９】
共役体分子からなる組成物であって、前記共役体分子が前記炭水化物ハプテン部分からなる前記組成物において全共役体分子の少なくとも９５重量％である請求項１−２５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項３０】
１またはそれ以上の試薬を反応させる共役工程からなる請求項１−２５のいずれか1項記載の共役体を調製する方法であって、前記共役体を得るように、各試薬は前記炭水化物ハプテン部分の少なくとも１からなり、前記モノマー単位、または前記単位の複数からなる予め凝集したキャリヤ部分を有する方法。
【請求項３１】
前記試薬が前記炭水化物ハプテンのアルデヒド誘導体である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記アルデヒド誘導体がオゾナイドを得るためにクロチル誘導体をオゾン化し、アルデヒド誘導体を形成するようにオゾン化物を還元する請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
アセトアルデヒドをハプテンアルデヒドの製造の副産物として得る請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
共役工程において、反応温度が３９℃ないし４５℃であり、反応時間が１７時間ないし２５時間である請求項３０−３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
共役工程において、反応温度が２６℃以上である請求項３０−３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
共役工程において、反応温度が少なくとも３０℃である請求項３０−３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
共役工程において、反応温度が少なくとも３５℃である請求項３０−３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
共役工程において、反応温度が少なくとも３９℃である請求項３０−３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
共役工程において、反応温度が４５℃以下である請求項３０−３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
共役工程において、反応温度が４３℃以下である請求項３０−３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
共役工程において、反応時間が６時間以上である請求項３０−４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
共役工程において、反応時間が少なくとも１２時間である請求項３０−４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
共役工程において、反応時間が少なくとも１７時間である請求項３０−４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
共役工程において、反応時間が４０時間以下である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
共役工程において、反応時間が３０時間以下である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
共役工程において、反応時間が２５時間以下である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも０．６：１である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも１：１である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも１．５：１である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも１．７５：１である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも２：１である請求項３０−４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が４：１以上ではない請求項３０−５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも３．２５：１である請求項３０−５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が少なくとも２．７５：１である請求項３０−５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
ハプテン−アルデヒド対キャリヤモノマーの重量比が約２．２５：１である請求項３０−５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５６】
前記共役工程がシッフ塩基中間体の製造からなり、中間体は還元剤で還元する請求項３０−５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
還元剤が水素化シアノホウ素ナトリウムである請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
還元剤を最終濃度２５−１２５ｍＭで用いる請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
還元剤を最終濃度４５−７５ｍＭで用いる請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
対象に炭水化物ハプテン−特異的免疫応答を誘発させる方法が、請求項１ないし２５のいずれか１項記載の共役体または請求項２６−２９のいずれか１項記載の組成物の免疫学的に有効量を対象に投与することからなる方法。
【請求項６１】
体液性免疫応答を誘発する請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
細胞性免疫応答を誘発する請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
炭水化物ハプテンが腫瘍−結合である請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
前記共役体または組成物が病気に対し保護される請求項６０−６３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６５】
病気が癌である請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
病気に対して対象を保護するための組成物の製造において請求項１−２５のいずれか１項記載の共役体または請求項２６−２８のいずれか１項記載の組成物を使用する方法。
【請求項６７】
病気が癌である請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
共役体がキャリヤ部分の少なくとも３つのモノマー単位からなる請求項１または２記載の共役体。
【請求項６９】
共役体がキャリヤ部分の少なくとも４つのモノマー単位からなる請求項１または２記載の共役体。
【請求項７０】
請求項６８の少なくとも１の共役体からなる請求項２６記載の組成物。
【請求項７１】
請求項６９の少なくとも１の共役体からなる請求項２６記載の組成物。
【請求項７２】
キャリヤ部分のモノマー単位がヘモシアニンのモノマー単位である請求項１記載の共役体。
【請求項７３】
ヘモシアニンが節足動物のヘモシアニンである請求項７２記載の共役体。
【請求項７４】
ヘモシアニンが軟体動物のヘモシアニンである請求項７２記載の共役体。
【請求項７５】
ヘモシアニンが腹足類のヘモシアニンである請求項７２記載の共役体。
【請求項７６】
ヘモシアニンがFissurellidaeヘモシアニンである請求項７２記載の共役体。
【請求項７７】
共役体のキャリヤ部分がＫＬＨのモノマー単位のデカマー、ジデカマー、またはマルチデカマーではない請求項２記載の共役体。
【請求項７８】
共役体のキャリヤ部分がＫＬＨのモノマー単位のダイマーではない請求項２または７７記載の共役体。
【請求項７９】
共役体のキャリヤ部分がＫＬＨのモノマー単位のダイマー、トリマー、テトラマーまたはペンタマーである請求項２記載の共役体。
【請求項８０】
少なくとも１の炭水化物ハプテン部分がＴＦ二糖類からなる請求項１または２記載の共役体。
【請求項８１】
少なくとも１の炭水化物ハプテン部分がＴｎからなる請求項１または２記載の共役体。
【請求項８２】
少なくとも１の炭水化物ハプテン部分がシアリル化炭水化物である請求項１または２記載の共役体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願はその全体を参考文献に組み込む２００１年８月１４日出願の先行仮出願６０／３１１，８５０の非仮出願である。本発明は免疫応答が炭水化物エピトープに誘発される免疫治療に関する。これは炭水化物ハプテンの免疫原共役体、および凝集した（マルチマー）タンパク質キャリヤの用途である。鍵穴リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）マルチマーへのＳＴｎの共役体は特に興味深いものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫システム
感染性の微生物、毒素、ビールス、または他の外来マクロ分子に対し防護するための脊椎動物の能力は免疫として引用される。その技術は天然、および捕捉されたまたは特異的免疫の間で区別する（非特許文献１）。自然の免疫は防御機構からなり、微生物または外来マクロ分子に曝される前は活性であり、このような暴露によって高まることはなく、身体には外来の大抵の物質と区別がない。自然の免疫のエフェクターは皮膚または粘液性膜のような肉体バリヤー、マクロファージや好中球のような食細胞、自然のキラー細胞と名づけたリンパ球のクラス、および補体系である。補体は血清タンパク複合体であり、一定のバクテリアおよび特異的補体−固定抗体によって感作された他の細胞に破壊的であり；その活性はタンパク分解性の開裂で生じる一連の相互作用によって影響され、１または少なくとも２の他の経路に従うことができる（非特許文献２、３）。
【０００３】
取得しまたは特異的免疫は外来物質に暴露することによって誘発または刺激される防衛機構からなる。
脊椎動物では、自然または特異的免疫の機構は宿主防衛系内に協同し、免疫機構は外来の浸入者を排除する。微生物、癌細胞、寄生虫およびビールス−感染細胞のほかに、免疫系はまた遺伝的に異なるそれぞれの同じ種（同種移殖）からまたは異なる種（異種移殖）から対象に移殖された細胞または組織を認識し取り除く。
【０００４】
特異的免疫の機構が侵略する微生物、癌細胞に対して防御に従事する場合は免疫応答を終わらせる。脊椎動物は、体液性および細胞性の２つの基本的免疫応答をもつ。体液性免疫はＢリンパ球によって与えられ、増殖および分化後、血液およびリンパ液で循環する抗体を生む。細胞性免疫はリンパ系のＴ細胞によって与えられる。細胞免疫応答は特に菌類、寄生虫、細胞内ビールス感染症、癌細胞および外来物質に有効であるが、体液性応答は本来バクテリアとビールス性感染の細胞外相に対して防御する。
【０００５】
「抗原」は外来物質であり、抗体またはＴ−細胞受容体によって（特に結合）認識され、免疫応答を誘発することができるかどうかは問わない。特異的免疫を誘発する外来物質は「免疫抗原」、または「免疫原」と呼ばれる。「ハプテン」はそれ自体によって、（ハプテンの複数の分子の共役体、またはマクロ分子のキャリヤへのハプテンの共役体はそうするが）免疫応答を誘発することができない抗原である。本出願は免疫応答を誘発することに関するので、「抗原」の語は他に述べなければ抗原を免疫化することを指す。
【０００６】
腫瘍結合炭水化物抗原決定因子。
臨床で重要な多くの抗原は炭水化物決定因子を運ぶ。そのような抗原の１の群は腫瘍−結合ムチンからなる（非特許文献４）。
一般にムチンは唾液、胃液等に見られる糖タンパク質であり、粘性溶液を形成し身体の外表面および内面で滑剤または保護剤として作用する。ムチンは一般に高分子量（多くは＞１，０００，０００ダルトン）であり広範囲にグリコシル化されている。ムチンのグリカン鎖はＯ−結合であり（セリンまたはスレオニン残基に対して）糖タンパク質の分子量の８０％以上の量である。ムチンは管の上皮細胞によっておよび同じ起源の腫瘍によって生成し、完全な膜タンパク質として細胞−結合する（非特許文献５、６）．
【０００７】
癌性組織は正常のカウンター部分よりもグリコシル化が比較的少ないことが知られている異常なムチンを生成する（非特許文献７）。癌細胞でのタンパク質グリコシル化組織の機能的変更により、腫瘍−結合ムチンは一般に短い不完全グリカンを含む。したがって、人乳脂肪小球を結合した正常のムチンは、四糖グリカン、ガルβ１−４glcNAcp1-6(galβ１−3)gal NAc-αおよびそのシアリル化類似体（Hull,
et al.）から主としてなるが、腫瘍−結合Tnハプテンは単糖残基、α−２−アセトアミド−２−デオキシ−D−ガラクトピラノシル、および二糖β−D−ガラクトピラノシル−（１−３）α−アセトアミド−２−デオキシ−D-ガラクトピラノシルのＴ−ハプテンのみからなる。腫瘍−結合ムチンの他のハプテン、例えばシアリル−Ｔｎおよびシアリル−（２−６）Ｔハプテンは、短ＴｎおよびＴグリカンへの末端シアリル残基の結合から生じる（非特許文献８、９、１０、１１）。
【０００８】
ＴおよびＴｎ抗原（非特許文献１２）は大抵の一次癌細胞およびそれらの転移部（全ヒト癌の＞９０％）の外表面膜に免疫反応形に見出される。癌マーカーとしてＴおよびＴｎは早くに免疫組織化学的検出および若干の癌の侵襲性の予後判定（Springer）を可能にする。腫瘍細胞でのシアリル−Ｔｎハプテンの存在は不利な予後のパラメーターとして同定された（非特許文献１２、１３）。複数のタイプの腫瘍−結合炭水化物抗原は通常のヒト癌に大きく発現する。Ｔｎ、ＴおよびＳＴｎハプテンはムチン−タイプ（Ｏ−リンク）炭水化物として生じる。さらに、ＧＭ２およびＧＤ３のような癌−結合グリコスフィンゴリピドは種々の人癌に発現する。
【０００９】
癌結合ムチンによって示される変更されたグリカン決定因子は患者の免疫系によって非自己または外来として認識される（Springer）。実際に、大抵の患者では、Ｔハプテンに強い自己免疫性の応答が見られる。これらの応答は、先に可能であったよりも早くに、容易に測定でき、さらに大きい感受性と特異性をもつ癌の検出を可能にする。最後に、ＴおよびＴｎの発現の範囲は癌の分化の程度と相関している。（Springer）。
【００１０】
炭水化物−タンパク質共役体。
腫瘍−結合抗原は癌の多くのタイプの診断およびモニターに有用で、また治療にも有用であるから、多くの研究者は炭水化物ハプテンのグリコシドおよびそれらのシアリル化類似体を合成し、これらグリコシドをタンパク質または合成ペプチドキャリヤにハプテンを共役するために用いた。グリコシドは一般にグリコン部分を含み、そこから高い反応性の機能性を各ハプテングリコシドの糖タンパク質を変更することなく生成することができる。「活性化」ハプテングリコシドは次にタンパク質または合成ペプチドキャリヤのアミノ基と反応し、シッフ塩基結合のアミドを形成する。シッフ塩基群はホウ化水素で還元して二次アミン結合を形成して安定化できる；全体のカップリング工程を次に還元アミノ化と呼ぶ。（非特許文献１５）。
【００１１】
これら共役体の例（特許文献１−７参照）。
ヲングは炭水化物ハプテンのタンパク質キャリヤとの共役体の形成方法を開示している（特許文献８）。まず、アルファ−オレフィングリコシドをクロチルアルコールのようなオレフィンアルコールのフィッシャータイプグリコシル化によって調製する。アルファオレフィングリコシドをオゾン分解しハプテンアルデヒド（および副生成物として第二アルデヒド）を生成する。副生成物は好ましくはアセトアルデヒドまたは高級アルデヒドであり、ホルムアルデヒドではない。
ハプテンアルデヒドは次いでＫＬＨのようなキャリヤタンパク質に共役させる。
【００１２】
ＳＴＮ−ＫＬＨ共役体
ビオミラで開発されたTheratope（登録商標）ワクチンはＫＬＨに共役した合成ＳＴｎハプテンからなり、アジュバントとエマルジョンで与えられる。相Ｉおよび相ＩＩ臨床試験で用いられるワクチンはハプテン代用レベルであり、約2.5ないし３重量％のシアル酸（ＮＡＮＡ）を含む。相ＩＩ臨床試験は進行中であるが、共役方法論は約７％のＮＡＮＡ含量を達成できるように改良された。高い共役生成物はマウスで抗−ＳＴｎ抗体のかなり高い力価、そして小さい架橋研究ではヒトに非常に高い抗−ＳＴｎ
ＩｇＧ力価を誘発した。高い抗−ＳＴｎ ＩｇＧ力価は相ＩＩ臨床試験では生存の改良と相関関係あることが見受けられたので、大きい相ＩＩＩ臨床試験は約７％のＮＡＮＡ含量のＳＴｎ−ＫＬＨ共役体を用いて開始した。
【００１３】
エピトープクラスター
炭水化物エピトープクラスターは文献に報告されているが、これらの重要性はまだ明確に定義されていない（非特許文献１６、Clustred STn、非特許文献１７）。同様に、Ｏ−グリコシル化部位のクラスターが報告された（非特許文献１８）。
【００１４】
我々はモノマーまたはクラスターと反応させたクラスターその他に特異的であったＭａｂを用いて、種々のＳＴｎ−ＫＬＨ処方の「ＳＴｎクラスター」含量を調べた。全部のワクチン調製品はクラスター含量を検出できるが、多分ハプテンよりもはるかに大きいＭａｂｓの立体障害のためハプテン検出の上限は低い。改良された有効性はクラスター密度が測定には大きすぎるのでさらに高い置換レベルで空間的配列の生成に特異的に与えることができなかった。これら研究の過程で、我々は後述のようにプロセス変量で一定の変化をさせることによって有効性を少し改良してワクチンのＮＡＮＡ含量を７％まで増加させることができる。これは後記のシステムでの観察された有効性の改良が単にハプテン「クラスター」の形成にあるとすることはできない。
参照：Sloan-Kettering, WO98/46246；Sloan-Kettering，WO97/34921；
Sloan-Kettering,
WO99/15201 (フコシルGM1-KLH 共役体；ＫＬＨの分子量は５×10６)；
Kjeldsen, USP 5,660,834；Zhang, et al., Cancer Res. 55:3364-8（1995年8月1日）；
Swiss
Prot P04253；Swiss-Prot P80888；Swiss-Prot P02768；Kjeldsen，USP5,747,048。
次の米国特許は「クラスター形成したエピトープ」の語を用いる。
6,376,463、6,258,937、6,180,371、5,929,220、5,888,974、5,859,204、5,744,466．
次の米国特許は「クラスター形成した」および「炭水化物エピトープ」列挙した。
6,365,124、6,287,574、6,013,779、5,965,544、5,268,364、4,837,306．
【特許文献１】米国特許第4,866,045号明細書
【特許文献２】米国特許第4,935,503号明細書
【特許文献３】米国特許第4,42 ,284号明細書
【特許文献４】米国特許第4,563,445号明細書
【特許文献５】米国特許第5,055,562号明細書
【特許文献６】米国特許第4,356,170号明細書
【特許文献７】米国特許第5,034,516号明細書
【特許文献８】米国特許第6,013,779号明細書
【非特許文献１】Abbas, et al.，Cellular and Molecular Immunology, W. B.Saunders Company, 1991。
【非特許文献２】Hood et al., Immunology, 2nd Edition, TheBenjamin/Cummings Publishing Company Inc., 1984。
【非特許文献３】Illustrated Stedman's Medical Dictionary, 24th Edition,Williams and Wilkins, Baltimore/London, 1982。
【非特許文献４】Roussel, et al.,Biochimie 70, 1471, 1988。
【非特許文献５】Burchell, et al.,Cancer Res., 47, 5476, 1987。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は凝集した多量体タンパク質キャリヤへの複数の炭水化物ハプテンの免疫原共役に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
凝集は多量体物質を形成するためのタンパク質キャリヤの各モノマーの相後作用の結果である。相互作用は結合によって、および／または（炭水化物ハプテンの結合前、最中または後の）各タンパク質鎖のもつれによる。結合がオリゴマー形成に貢献するならば、それは共有結合または非共有結合である。
好ましくは、凝集は多少ともタンパク質への炭水化物の結合で生じる。
これら調製品の免疫原効力は高いハプテン置換比の組合せ、および多量体物質を形成するためのタンパク質キャリヤの凝集に貢献する。
好ましくは多量体物質は二量体、三量体、四量体、および／またはタンパク質キャリヤのモノマー単位の五量体である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、複数の炭水化物ハプテンおよびキャリヤ部分のモノマー単位の凝集体（多量体）の共役体を提供する。共役体は免疫応答を顕在化させるために使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
炭水化物ハプテン；エピトープ
本発明の炭水化物ハプテンは炭水化物エピトープからなり（好ましくはこれに等しい）炭水化物である。
「炭水化物」の語は単糖類、オリゴ糖および多糖類、ならびにカルボニル基の還元（アルジトール）によって、１またはそれ以上の末端基のカルボン酸への酸化によって、または水素原子、アミノ基、チオール基、または類似のヘテロ原子基による１またはそれ以上の水酸基の置換によって単糖類から誘導される物質を含む。また、前記の誘導体を含む。
通常、多糖類は一般にそれ自体の状態で免疫原であるために十分に大きいので、炭水化物ハプテンは多糖類ではない。オリゴ糖と多糖類との間の境界は固定していないが、我々は２ないし２０の単糖類（糖）単位からなるものとしてオリゴ糖を定義する。
ハプテンは（他のそのような単位へのグリコシド結合なしで）単糖類またはオリゴ糖である。オリゴ糖ならば、好ましくは１０以下の糖単位である。
単糖類は３またはそれ以上の炭素原子をもつポリヒドロキシアルデヒド（H[CHOH]n-CHO）またはポリヒドロキシケトン（H-[CHOH]n-CO-[CHOH]m-H）である。
各単糖類単位はアルドース（アルデヒドカルボニルまたは潜在的アルデヒドカルボニル基をもつ）またはケトース（ケトンカルボニルまたは潜在的ケトンカルボニル基をもつ）である。さらに単糖類は１以上のカルボニル基（または潜在的カルボニル基）をもち、したがってジアルドース、ジケトース、またはアルドケトースである。「潜在的アルデヒドカルボニル基」の語は環閉鎖によって生じるヘミアセタール基、およびケトン対応物（ヘミケタール構造）を指す。
単糖類単位は環状ヘミアセタールまたはヘミケタールである。３員環をもつ環状形態はオキシロース、４員環はオキセトース、５員環はフラノース、６員環はピラノース、７員環はセプタノース、８員環はオクタビールスである。環閉鎖の位置の位置づけは変わる。
単糖類単位はさらにデオキシ糖（水素によって置換されたアルコール性ヒドロキシ基、アミノ糖（アミノ基によって置換されたアルコール性ヒドロキシ基）、Ｃ＝Ｓによって置換されたチオ糖（チオールまたは、Ｃ＝によって置換されたアルコール性ヒドロキシ基）、または硫黄によって置換された環状形態の環酸素）、セレン糖、テルル糖、置換された単糖類、不飽和単糖類、アザ糖（窒素によって置換された環炭素）、アミノ糖（窒素によって置換された環酸素）、アルジトール（ＣＨＯＨ基によって置換されたカルボニル基）、アルドン酸（カルボニル基によって置換されたアルデヒド基）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等である。
またＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）として知られているシアル酸は、特に興味深い。それは幾つかの腫瘍結合炭水化物エピトープの末端糖である。
腫瘍結合炭水化物エピトープは特に興味深い。
種々の炭水化物は、特に腫瘍を検出し治療する際に用いるため本発明により共役できる。Ｔｎ、Ｔ、シアリルＴｎおよびシアリル（２−＞６）Ｔハプテンは特に好ましい。
特に、腫瘍を検出し治療するため、通常のヒト癌で高く発現される３種の腫瘍結合炭水化物エピトープはアミノ化した化合物に共役される。これらは特にラクトシリーズタイプ１と２の鎖、癌結合ガングリオ鎖、および中性スフインゴ糖脂質を含む。
ラクトシリーズタイプ１と２の鎖の例は次の通りである。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
【化２】
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【００２１】
【化３】
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本発明によるアミノ化した化合物に共役できる癌結合ガングリオ鎖の例は次の通りである。
【００２２】
【化４】
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上記の他に、中性スフィンゴ糖脂質はまた本発明によるアミノ化した化合物に共役できる。
【００２３】
【化５】
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【００２４】
タンパク質キャリヤ
タンパク質キャリヤはモノマー形態では、少なくとも１０ｋDの分子量の多量体であり、１またはそれ以上のリジン残基を含む。好ましくは、（モルで）少なくとも３％のリシンである。
好適なタンパク質キャリヤは節足動物または軟体動物ヘモシアニンのようなヘモシアニンである。特にFissurellidae（鍵穴カサガイ）の腹足類のヘモシアニン、および特に鍵穴カサガイ（Magathura crenulata）のヘモシアニンは最も好ましい。
ヘモシアニンは多くの節足動物および軟体動物の酸素輸送タンパク質である。鍵穴カサガイのヘモシアニンは、天然で、多量体であり、全MWが約8,000ｋDaである。モノマーは約400ｋDaである。２つの免疫学的に生理学的に明確なイソ型、KLH1とKLH2からなる。両者は円筒状20量体として血リンパに存在する。各イソ型モノマーは8官能基単位（Fus）を含み、Ｎ−ないしＣ−末端から「ａ」ないし「ｈ」と呼ぶ。ＫＬＨ１のFUs「ｂ」ないし「ｇ」は全部で２１４１a.a.であり、ＫＬＨ２のFUs「ｂ」ないし「ｈ」は全部で２４７３a.a.である（参照、Altenheim et al.，“Sequence
of Keyhole Limpet Hemocyanin”，Abstract, Swerdlow, Comp. Biochem．Biophys．113B：537-48 (1986)；Stoeva，Biochem．Biophys. Acta 1435：94-109 (1999)；Harris and Markl，Micron.，30：597-623（1999）．Swerdlow はＫＬＨ−Ａが449kDaでＫＬＨ−Ｂが392ｋDaであることを報告している。SohngenらはEur．J．Biochem.，248：602-14（1997）にＫＬＨ１が400kDaでありＫＬＨ２が345kDaであることを報告している。Ebertは米国特許5,855,919に400ｋDaの値を用いている。
好ましくは、本発明の共役体において、キャリヤ部分のモノマー単位がKLHモノマーであるならば、共役体はＫＬＨモノマーの置換した十量体、二十量体または多十量体ではない。
天然ＫＬＨは銅が豊富であるが、銅は還元アミノ化の間になくなる。約４％の分子量の炭水化物含量でＫＬＨはグリコシル化される。上記Harrisらを参照。
好ましくは、ＫＬＨモノマーを用いる場合、少なくとも１の炭水化物ハプテン部分はＫＬＨと自然結合したものではない。好ましくは、炭水化物ハプテン部分の少なくとも１の成分の糖はＫＬＨと自然結合したものではない。
【００２５】
凝集度 
本発明の好適な免疫原は凝集した炭水化物ハプテン置換したＫＬＨである。各モノマー単位はＫＬＨ１、ＫＬＨ２または幾つかの他のＫＬＨマノマーである。
ここに用いられるような「置換したＫＬＨモノマー」の語は自然に結合したものに加えて複数の炭水化物ハプテンと置換したＫＬＨを意味する。これらは存在する自然の炭水化物鎖の複製であるが、さらに通常はＫＬＨと自然に結合しないハプテンを含む。ＫＬＨは、必要ではないが、脱グリコシルして自然の炭水化物をハプテン置換の前に特異的にまたは非特異的に若干または全部除くことができる。
置換したＫＬＨモノマーの分子量は置換していないＫＬＨのそれよりも大きい。後者が400kDa（文献値は345ないし449ｋDaの範囲である）であるならば、置換したＫＬＨはさらに大きい分子量である。増加は各ハプテン部分の分子量に依存し（リンカーを含む）ハプテン部分対モノマーの数に依存する。
置換していないＫＬＨモノマーが400kDaであるならば、置換した二量体は必ず分子量が800ｋDaよりも大きい。したがって、置換した凝集体は好ましくは見かけの分子量が800ｋDa以上、さらに好ましくは1,200ｋDa以上、またさらに好ましくは1,600ｋDa以上である。
好適な炭水化物ハプテン置換モノマー形態のＫＬＨは分子量が約500ｋDaであり；追加の炭水化物（およびリンカー）なしで、約400ｋDaである。したがって、ハプテン置換は置換していないＫＬＨモノマーに対して、分子量を25重量％、またはそれ以上増加することができる。また好ましくは置換した凝集体は見かけ分子量が少なくとも1,000kDaであり、さらに好ましくは少なくとも1,500kDaであり、またさらに好ましくは少なくとも2,000ｋDaである。
調製品はｎ−量体、例えば、モノマー、二量体、三量体、四量体、等の不均一な混合物からなり、見かけの分子量は実際にｎ−量体の各サイズクラスの見かけの分子量の平均重量である。
調製品は理論的には分子量によって分けられｎ−量体の各サイズクラスに貢献できる画分を決定できる。好ましくは、モノマーは調製品の50重量％以下であり、さらに好ましくは25％以下であり、またさらに好ましくは10％以下、最も好ましくは５％以下である。調製品はまた優勢なモノマー画分を捨ててこれにより多量体を豊富にする目的で分画することもできる。
凝集度の最大リミットは溶液から沈殿するほど凝集が大きくはないことである。しかし、見かけ分子量は好ましくは5,000kDa以下（置換した十量体に等しい）、さらに好ましくは2,500ｋDa以下（置換した五量体に等しい）である。
見かけの分子量は好ましくはレーザー光散乱によって決定される。Wyatt, Anal. Chim. Acta，272：1-40（(1993)参照。サイズ排除（分子篩）クロマトグラフィによって、以下に示すように予測される。一般に、ＲＲＴ値は0.97以下が望ましい。
図１２はShodexのサイズ排除クロマトグラフィによって相対的保持時間（ＲＲＴ％）に対する分子量（ＫＤａ）の回帰プロットを示す。
回帰線は分子量とＲＲＴの間の予備的関係を与え、表１のデーターを説明するのに有用である。回帰線は
ＭＷ（Ｄ）＝30,455.378−（302.626＊ＲＲＴ％）であり
ＲＲＴ％はチログロブリンを100とした関係を表す。ＭＷはＲＲＴに逆比例する。ＲＲＴ％＝100＊ＲＲＴ。
回帰に対するＲ２は0.719であった。回帰は92−100の範囲のＲＲＴ％値を基礎とした。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
好ましくは、ＲＲＴ％は99以下、さらに好ましくは98以下、またさらに好ましくは97以下、さらに好ましくは96、95、94、93、92、91、90、89、88または87のように96以下（１に近づく）である。
上のＲＲＴ％範囲のロット、96以上（ＲＲＴ＝0.96）に対し、治療用途の前にロットの有効性を試験することが望ましい。
好ましくは、本発明の凝集した免疫原はキャリヤが凝集していない同じハプテンキャリヤモノマー置換比では、同じハプテンとキャリヤの共役体の有効性の少なくとも200％である有効性をもつ。このため、有効性は免疫化マウスの抗体応答によって有効性は測定される。
共役体
ハプテンの各分子はキャリヤに共役する。キャリヤの結合点は通常、キャリヤのアミノ末端、またはさらに通常リジンのイプシロンアミノ基のような、利用し易いアミノ基である。
ハプテンはこの接合点に直接またはリンカーを通して共役する。通常、リンカーは炭水化物またはペプチド自体ではない。リンカーは、たとえあるとしても、好ましくは水素とは別の12原子以下の炭素、水素、および任意に、酸素、窒素および／または硫黄からなる小さい脂肪基である。さらに好ましくはそれは線状または分枝の12以下の炭素原子のアルキル基である。さらに好ましくはそれはｎ＝１ないし12の−(ＣＨ２)ｎである。最も好ましくはそれは−ＣＨ２ＣＨ２−である。各リンカーは炭水化物ハプテンの酸素をアミノ窒素、すなわち、リジンのイプシロン窒素、またはタンパク質キャリヤのアミノ末端に結合する。
リンカーは（たった１つのハプテンをキャリヤモノマーに結合する）二機能性または（ケースワンリンカーは複数のハプテンをキャリヤモノマーに結合する）多機能性である。
「結合剤」はＡとＢに反応し構造Ａ−リンカー−Ｂを形成し、「リンカー」は元の結合剤の構造に関係する。反応は同時に起こり、または結合剤はまずＡと反応し構造Ａ−結合アームを形成し、次いで後者とＢからＡ−リンカー−Ｂを形成する。
ハプテン結合アームがハプテン−クロチル（例えばＳＴｎ−クロチル）であるならば、次にオゾン分解は反応性ハプテンアルデヒドを生成し、キャリヤの還元アミノ化に用いられハプテン−ＣＨ２ＣＨ２−キャリヤ、すなわち好適な2炭素リンカーを生成する。ハプテンは通常リンカーにＯ−結合するが、他の結合が可能である。
関心のある他の結合剤はＭＭＣＣＨ結合剤、４−（４−マレイミドメチル）シクロヘキサン−1−カルボキシルヒドラジドである。Ragaputhi, et al., Cancer
Immunol.Immunother.48:1-8(1999)。
クロチル結合化学に基づく若干の多官能リンカーはReddish, et al., Glycoconjugate
J.,14:549-60(1997)の図１に描かれている。
ハプテン置換比
本発明では、炭水化物ハプテンはキャリヤ、特に、ＫＬＨに共役する。キャリヤはまた凝集する。
好ましくは、ハプテン対キャリヤの比は共役したハプテン対各キャリヤモノマーの少なくとも10分子である。最大比は接近できる結合部位の数によって決定される。通常、その比は10−120の範囲である。
ＮＡＮＡ含量
シアリル化共役体、例えばＳＴｎ／ＫＬＨ共役体の場合、ＮＡＮＡ含量はハプテン置換比（シアリル化ハプテン対キャリヤモノマー）を示す。ＮＡＮＡ含量は以下に示すようにアッセイされる。
ＳＴｎ／ＫＬＨ共役体の場合には、ＮＡＮＡ含量は好ましくは３％を超え、さらに好ましくは少なくとも４％、さらに好ましくは少なくとも５％、更に好ましくは少なくとも６％、もっとも好ましくは少なくとも７％である。好適な値は表５と６に示される。
最大可能なＮＡＮＡ含量はＫＬＨの可能なＳＴｎ結合部位の全数の関数である。ＳＴｎがＫＬＨの各リジン部位鎖に結合すると仮定すると、ＮＡＮＡ含量は共役体の約12重量％である。これはリンカーまたはＴｎの分子量を含まない。置換していないＫＬＨの分子量に対して計算するならば、それは約13％である。全ハプテンーリンカーアーム含量は置換していないＫＬＨの分子量に対して約19％である。
さらに高いＮＡＮＡ含量は最初にグリコシル化反応でのハプテン対ＫＬＨの比を増加することによって達成される。
ハプテンの量がＮＡＮＡ含量を上げるが、これは免疫原性の増加とはならないように増加するならば、余分のハプテンは、実際に、むだになる。従って、経済的理由から、10重量％以下にＮＡＮＡ含量を制限することが望ましい。
従って、ＮＡＮＡ含量は６ないし10重量％が最適である。
共役反応
共役反応を実施するために、炭水化物ハプテン（例、ＳＴｎ）のアルデヒド誘導体を用意する。これはタンパク質（例、ＫＬＨ）キャリヤでインキュベートされる。縮合反応はハプテンアルデヒドとタンパク質のリジン側鎖のイプシロンアミノ基との間で起こる。反応生成物はシッフ塩基中間体である。これは適当な還元剤、例えば水素化シアノホウ素ナトリウムで還元し、ハプテンとキャリヤの間に安定な結合を与える。
ハプテンアルデヒドはハプテンのクロチル誘導体を与え、この誘導体をオゾン化してオゾン化物を形成することによって得られる。オゾン化物はたとえば、ジメチルスルフィドで還元し、アルデヒド誘導体を生成する。アセトアルデヒド副生成物はタンパク質と縮合しないように除去する。
凝縮度に影響する主なプロセスのパラメーターは反応温度と時間である。
ハプテン置換比に影響する主なプロセスのパラメーターはハプテン／キャリヤの比、残りのアセトアルデヒドの水準、そして水素化シアノホウ素濃度であった。
反応温度と時間
共役反応温度は好ましくは39℃ないし45℃であり、反応時間は好ましくは17ないし25時間である。
反応温度は十分長い時間、所望の凝集度になるため十分に高くなければならない。
好ましくは、温度は26℃よりも高く、さらに好ましくは少なくとも30℃、またさらに好ましくは少なくとも35℃、最も好ましくは少なくとも39℃である。
用いた温度は免疫原を変性するほどは高くない。好ましくは温度は45℃以下である。さらに好ましくは、43℃以下である。
反応時間は所望の凝集度を達成するために十分長くなければならず、必要な高い温度と短い反応時間を期待することは当然である。しかし、温度が低すぎると、温度にかかわらず凝集度は不充分である。また、反応温度と時間は所望のハプテン置換度を達成するように十分に長くなければならない。反応温度が低いほど、反応時間が長いほど、所定のハプテン置換水準を達成する。
反応時間は好ましくは６時間以上、さらに好ましくは少なくとも12時間、またさらに好ましくは少なくとも１７時間である。
反応時間には絶対的な制限はない。しかし、反応部位がハプテンによって占めることになるので、共役反応はゆっくりになる。凝集割合はまた時間進行とともに下がる。
従って、反応持続時間が40時間以下、さらに好ましくは30時間以下、またさらに好ましくは25時間以下であることが通常望ましい。
ハプテンアルデヒド対キャリヤモノマーの比
ハプテンアルデヒド対キャリヤモノマーの重量比は反応速度と達成されるハプテン置換比に影響を与える。
重量比は好ましくは少なくとも0.6：１、さらに好ましくは少なくとも１：１、またさらに好ましくは少なくとも1.5：１、さらに好ましくは少なくとも1.75：１、最も好ましくは少なくとも２：１である。
好ましくは、重量比は４：１以下、さらに好ましくは3.25：１以下、またさらに好ましくは2.75：１以下である。
最も好ましくは、重量比は約2.25：１である。最終のＫＬＨ濃度は好ましくは８mg／mLないし11.5mg／ｍLである。
水素化シアノホウ素濃度
最終の水素化シアノホウ素濃度は好ましくは25−125mM、さらに好ましくは45−75mMの範囲にある。代わりの還元剤は水素化ホウ素ナトリウムおよび水素化ホウ素−ピリジン複合体を含む。
【００２８】
免疫応答の性質決定
細胞性の免疫応答はインヴィトロとインヴィヴォでアッセイすることができる。伝統的なインヴィトロアッセイはＴ細胞増殖アッセイである。血液サンプルは病気に関連した利害のある病気に罹っている個人、またはワクチン注射をした個人から取る。この個人のＴ細胞はしたがって増殖によって抗原に新しく曝されて応答の用意をしなければならない。増殖はＤＮＡ複製での役割のためにチミジンを必要とする。
一般的に言えば、Ｔ細胞増殖はＢ細胞増殖よりもはるかに広範であり、分離していない細胞母集団でさえも強いＴ細胞応答を検出することができる。しかし、Ｔ細胞の精製はＴ細胞応答検出を容易にするために望ましい。抗原−特異的増殖に実質的に逆影響しないＴ細胞精製の任意の方法が用いられる。我々の好ましい方法では、全てのリンパ球母集団は比密度10.7にて等密度勾配、すなわちFicoll−HypaqueまたはPercoll勾配分離で（血液、脾臓、またはリンパ節から）先ず収集によって得られる。この混合した細胞母集団を次にさらにＴ細胞母集団に複数の手段によって精製することができる。最も簡単な分離はＢ細胞および単球／マクロファージ母集団のナイロンウールカラムへの結合による。Ｔ細胞母集団はナイロンウールを通過し＞90％純粋なＴ母集団が1回の通過で得られる。他の方法は非Ｔ細胞母集団（ネガチブ選択）を溶解するように補体タンパク質の存在でＢ細胞への特異的抗体およびまたは単球抗原を用いることを含む。さらに別の方法はポジチブ選択技法であり、抗−Ｔ細胞抗体（ＣＤ３）を（磁性ビーズのような）固相マトリックスに結合し、これによりＴ細胞を結合し非−Ｔ細胞母集団から（例えば磁気により）分離する。これらは機械的または化学的破壊によりマトリックスから回収される。
精製したＴ細胞母集団が得られると、照射抗原存在細胞（脾臓マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞がすべて存在する）の存在で培養される。（これらの細胞は照射してトリチウム化チミジンの応答および取り込みを避ける）。生存可能なＴ細胞（20単位でＩＬ２を用いて補充した100μlの培地にウェルにつき100,000−400,000個）を次に試験ペプチドまたは他の抗原を用いて試験抗原を濃度１ないし100μg／ｍLで３ないし７日間インキュベーションする。
抗原刺激期間の終りで、応答を複数の方法で測定する。先ず、細胞を含まない上澄み液を収集し、特異的なサイトカインの存在をテストする。α−インターフェロン、ＩＬ２またはＩＬ１２はＴｈヘルパータイプ１固体群応答を示す。ＩＬ４、ＩＬ６およびＩＬ１０の存在はともにＴヘルパータイプ２免疫応答を示す。したがってこの方法はヘルパーＴ細胞サブセットの同定を見込む。
胚発生で終わる第二の方法は抗原刺激期間の終りに培養基（例えば、ウェル当り１μキュリー）にトリチウム化チミジンを追加することを含み、細胞にシンチレーションカウンティング用フィルターで収集する前に４−１６時間放射標識代謝産物を混入する。混入した放射活性チミジンのレベルはＴ細胞複製活性の測定である。ネガチブ抗原または抗原コントロールのないウェルを用いて刺激インデックスによって胚発生の応答を計算する。これはＣＰＭテスト／ＣＰＭコントロールである。好ましくは、得られた刺激インデックスは少なくとも２であり、さらに好ましくは少なくとも３であり、またさらに好ましくは５であり、最も好ましくは少なくとも10である。
ＣＭＩはまたインヴィヴォで標準実験動物、例えばマウスでアッセイされる。マウスは準備刺激抗原で免疫化する。Ｔ細胞に対する応答を待った後、マウスをテスト抗原を足に注射して免疫性をテストする。（テストマウスを膨潤する）ＤＴＨ応答は例えば食塩水を注射したコントロールマウスのそれと比較する。
好ましくは、応答は少なくとも.10mm、さらに好ましくは少なくとも.15mm、またさらに好ましくは少なくとも.20mm、最も好ましくは少なくとも.30mmである。
インヴィヴォの体液性の免疫応答は免疫化したマウスから血液を抜き、関心のある抗原を結合する抗体の存在について血液をアッセイして測定される。例えば、テスト抗原を固定化しサンプルでインキュベーションして、これによって同族の抗体を捕捉し、次いで捕捉した抗体を標識を付けた抗−アイソタイプ抗体をもつ固相をインキュベーションして測定する。
好ましくは、体液性の免疫応答は、所望により、少なくとも１／100、さらに好ましくは少なくとも１／1000、またさらに好ましくは少なくとも１／10,000の抗体力価によって示されるほど少なくとも強い。
対象
本発明のワクチンのレシピエントは体液性または細胞性の免疫応答によって特異的免疫を取得できる任意の脊椎動物である。
哺乳動物の中で、好適なレシピエントは霊長類目（ヒト、サルおよびモンキイを含む）、Arteriodactyla（ウマ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ブタを含む）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む）、および食肉目（ネコ、イヌを含む）の哺乳動物である。鳥の中では、好適なレシピエントは七面鳥、ニワトリおよび他の同類のものである。最適なレシピエントはヒトである。
本発明の好ましい動物対象は霊長類哺乳類である。「哺乳類」の語は勿論ヒトを含む哺乳類にそれぞれ属することを意味する。そのうえ獣医用に向けようとしているが、本発明は特にヒト対象の治療に有用である。「非ヒト霊長類」の語はヒト科を除く節足動物亜目のメンバーである。そのような非ヒト霊長類はヒト上科、ヒト族（カツラザル属、ホウラーモンキー、クモザルおよびリスザルを含む新世界モンキー）およびCallithricidae族（マーモセットを含む）；オナガザル上科、オナガザル族（マカーク、マンドリル、ヒヒ、テングザル、モナザル、およびインドの神聖なフナマンモンキーを含む）；そしてヒト上科、ショウジョウ族（テナガザル、オランウータン、ゴリラ、およびチンパンジーを含む）を含む。アカゲザルはマカークザルの一員である。
製薬構成物
本発明の製薬調製品は保護免疫応答を顕在化するために有効な量で少なくとも１の免疫原を含む。応答は体液性、細胞性、またはそれらの組合せである。構成物は複数の免疫原を含むことができる。
さらに構成物はリポソームからなる。好適なリポソームは2000年11月25日出願の Jiang,
et al.，PCT/US00/31281（我々の書類記号JIANG3A−PCT）、および1994年4月12日出願の
Longenecker, et al., 08/229,606（我々の書類記号LONGENECKER5-USA）および1995年4月12日出願のPCT/US95/04540（我々の書類記号LONGENECKER5-PCT）で同定されたものを含む。
構成物は抗原−提示細胞を含み、さらに有効な提示のために、投与前に、この場合に免疫原は細胞にパルスできる。
構成物はこの分野で既知の補助剤または賦形剤を含むことができる。参照、例えばベルコウら著、ザ  メルク  マヌアル、１５版、メルク社、ラスウェイ、N.J．1987; グッドマンら著、メルク社、ラスウェイ  エヌ  ジジェイ、1987; グッドマンら著、グッドマン及びギルマンのThe Pharmacological Basis of Therapeutics, ８版、ペルガモンプレス社、エルムスフォード、N.Y.,（1990）；アベリーの薬品治療：Principles and Practice
of Clinical Pharmacology and Therapeutics,３版、ADISプレス社、ウイリアムス及びウイルキンス、バルチモア、M.D.(1987),カツング著、Basic and Clinical Pharmacology,５版、Appleton and Lange, Norwalk,  Coon.(1992)
らは参考文献として全体的にここに組み込まれる。
構成物はさらに免疫応答を非特異的に高めるアジュバントを含む。いくつかのアジュバントは体液性および細胞性の免疫応答の両方を増強し、他のものは１または他に対し特異的である。いくつかは１を増強し他を阻害する。したがってアジュバントの選択は所望の免疫応答による。
構成物は免疫調節物質、例えば細胞性または体液性免疫応答を与えるか阻害するサイトカイン、またはそのようなサイトカインに対し阻害性の抗体を含む。
本発明による製薬構成物はさらに抗−代謝物、ブレオマイシンペプチド抗生物質、ポドフィリンアルカロイド、Vincaアルカロイド、アルキル化剤、抗生物質、シスプラチン、またはニトロソウレアからなる群から選択されるような、少なくとも１の癌化学療法的化合物を含む。本発明による製薬構成物さらにまたは追加的にガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、チオセミカルバゾン、メチサゾン、リファンピン、リブビリン、ピリミジン類似物、プリン類似物、フォスカーネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、またはガンシクロビルから選択された少なくとも１のビールス化学療法化合物を含む。参照、例えばKatzung,上記、および７９８−８００および６８０−６８１頁に引用された文献、それぞれを、これら文献は参考文献として全体がここに組み込まれる。
抗−寄生虫剤は、類人猿、寄生虫（回虫、ギョウチュウ、線虫、十二指腸虫、サナダムシ、および住血吸虫を含む）および原生動物（アメーバ、およびマラリヤ、トキソプラズマ、およびトリコモナス生物体を含む）に用いるのに適した薬剤を含む。例としてチアベンゾール、種々のピレスリン、プラジカンテル、ニクロスアミド、メベンダゾル、クロロキンHCl、メトロニダゾール、ヨードキノール、ピリメタミン、メフロキンHCl、およびヒドロキシクロロキンHClを含む。
製薬目的
本発明の目的は病気に対し対象を保護することである。ここで用いられるように、「保護」の語は「感染または病気から保護」として、「予防」、「抑制」または「治療」を含む。「予防」は病気になる前に製薬構成物を投与することを含む。「抑制」は病気が臨床的に現れる前に構成物を投与することを含む。「治療」は病気が現れた後に保護構成物を投与することを含む。治療は改善または治癒である。
ヒトおよび獣医の医薬では、最終的誘導の事象が未知であり、潜在的であり、または患者が事象の発生後に良くなるまで確かめないから、「予防」と「制御」を区別することは常に可能ではないことは理解されるだろう。従って、「治療」とは別個のものとしてここに定義された「予防」および「制御」を含むように「防御」の語を用いることが一般的である。ここで使用されるような「保護」の語は「防御」を含む。参照、例えばベルカー、上記、グッドマン、上記、Avery,上記およびカツング、上記をここに引用した全参考文献を含み、参考文献として全体を組み込む。
規定された「保護」は絶対的である必要はなく、すなわち、コントロール集団に対して統計的にかなり改善（ｐ＝0.05）されているという条件で、病気は全体的に予防または根絶する必要はない。保護は病気の症状の開始の苦しさや速度を弱めるように制限される。拮抗剤よりも保護が小さい薬剤は他の薬剤が特定の個人に無効であるならば、保護のレベルを高める他の薬剤と組み合わせて用いられるならば、または拮抗剤よりも安全であるならば、まだ価値がある。
治療の有効性は、持続時間、つらさ等、好ましくは病気の段階の意味にマッチした未治療コントロール群のそれと治療後の病気の影響を比較して決定される。
予防の有効性は通常治療グループの病気の範囲をコントロールグループの病気の範囲と比較して確かめ、治療およびコントロールグループは等しいリスクがあると考えられ、または期待されるリスク差を補正した。
一般に、予防が、家族史、前の個人の医療史、または原因となる薬剤への高められた量によって病気のリスクが高いと考えられるものに行われる。
製薬投与
本発明の少なくとも１の保護剤は、前述の製薬構成物を用いて、意図する目的を達成する任意の手段によって投与できる。
投与は経口または非経口であり、そして、非経口ならば、局所的または全身的である。例えば、そのような構成物の投与は種々の非経口、例えば皮下、静脈、皮内、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、経皮、または頬面経路による。非経口投与は丸薬注入または時間をかけて徐々に潅流することによってできる。本発明の製薬構成物を用いる好適なかたちは皮下、筋肉内または静脈内投与である。参照、例えば上記ベルクナー、上記グッドマン、上記アベリー、上記カツング、これらは、ここに含まれる引用した参考文献を含み、参考文献として全体をここに組み込まれる。
進行中の特異的免疫治療による免疫応答によって緩和されることができる病気または状態を予防、抑制、または治療する代表的レジメは、１回の治療、またはエンハンサーまたはブースターの投薬として繰り返し、１週間と約２４ヶ月の間を含む期間にわたり、有効量の上記のような製薬構成物の投与を含む。
有効投与量は受容者の年齢、性別、健康状態、および体重、同時治療の種類、たとえあるとしても、治療頻度、および望ましい効果の性質による。以下の有効投与量の範囲は本発明を制限するものではなく好適な投与量の範囲を示すものである。しかし、最適な投与量は、過度の実験なしで、当業者によって理解され決定できるように、個々の対象に調整される。これは一般に、例えば、患者の体重が軽いと減らすといった標準投与量の調整を含む。参照、例えばベルコウら著、ザ  メルク  マニュアル、１５版、メルク社、ラーウェイ、ニュージャージー、１９８７；グッドマンら著、グッドマンとギルマンの治療学の薬理学基礎、８版、ペルガモンプレス社、エルムスフォード、ニューヨーク、（１９９０）；アベリーの薬物治療：臨床薬理学および治療学の基本と実際、３版、ＡＤＩＳプレス社、ウイリアムスおよびウイルキンス、バルチモア、ＭＤ．（１９８７）、エバジ、薬理学、リトルブラウンアンドカンパニイ、ボストン、（１９８５）；チャブナーら、上記；デビタら、上記；サーモン、上記；ショレダーら、上記；サルトレリら、上記；およびカツング、上記、参考文献およびここに引用された参考文献は、全体をここに参考文献として組み込まれる。
ヒトに用いる前に、まず薬剤は実験室動物で安全性と有効性を評価される。ヒトの臨床研究では、問題の薬剤の予備臨床データーに基づき、（たとえあるとしても）類似の薬剤の通常の投与量に基づき、ヒトに安全であると期待される投与量で開始される。この投与量が有効であるならば、投与量を減らし、所望により、最少の有効量を決定する。この投与量が無効であるならば、患者の副作用のサインをモニターし注意深く増量する。参照、例えば、ベルコウら著、ザ  メルク  マニュアル、１５版、メルク社、ラーウェイ、ニュージャージー、１９８７；グッドマンら著、グッドマンとギルマンの治療学の薬理学基礎、８版、ペルガモンプレス社、エルムスフォード、ニューヨーク、（１９９０）；アベリーの薬物治療：臨床薬理学および治療学の基本と実際、３版、ＡＤＩＳプレス社、ウイリアムスおよびウイルキンス、バルチモア、ＭＤ．（１９８７）、エバジ、薬理学、リトル、ブラウンアンドカンパニイ、ボストン、（１９８５）、参考文献およびここに引用された参考文献は、全体をここに参考文献として組み込まれる。
各治療に必要な全投与量は複数回の投与（同じかまたは異なる量で）または一回の投与で、予め決定されたかまたは特別に、免疫スケジュールによって投与できる。スケジュールは、抗原に有効な免疫応答を顕在化するために、これによって可能ならば他の薬剤と共に保護を与えるために十分であるように免疫学的に有効であるように選択される。これを達成するために十分な投薬量は「治療学的に有効な投薬量」と定義される。（注、スケジュールは個々の投与量が、それ自体で投与される場合、有効ではないとしても、免疫学的には有効であり、「治療学的に有効な投与量」は免疫スケジュールに関連して良く解釈される。）この使用に有効な分量は、例えば、ペプチド構成物、投与方法、治療する病気の段階と程度、患者の健康時の体重と一般的な状態、および処方医師の判断による。
代表的には、薬剤の活性成分の一日の投与量は、７０ｋｇの成人に対し、１０ナノグラムないし１０グラムの範囲である。免疫原には、このような患者に対するさらに一般的な投薬量は１０ナノグラムないし１０ミリグラムであり、さらに１ミクログラムないし１０ミリグラムである。しかし、本発明はこれら投与量の範囲を限定しない。
本発明の構成物は一般的に重大な病気の段階、すなわち、命を脅かすまたは潜在的に命を脅かす状態に用いられることを心にとめておかねばならない。そのような場合、外来物質の最少化とペプチドの相対的無毒性の観点で、これらペプチド構成物の本質的な過剰量を投与することは治療する医師には可能であり、望ましいと感じるかも知れない。
投与は有効な任意の間隔で行われる。間隔が短すぎると、免疫麻痺または他の逆効果が生じる。間隔が長すぎると、免疫が損なわれる。最適な間隔は各投与量が多いほど長くてよい。一般的な間隔は１週間、２週間、４週間（または１ヶ月）、６週間、８週間（または２ヶ月）および１年である。追加の投与量、および間隔の増減の適正値は、患者の免疫適確性（例えば、関連する抗原への抗体のレベル）を考慮して、継続的基準で再評価される。
種々の方法は例えば、ここに参考文献として組み込まれるスゾカら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号、４，８３７，０２８号、および５，０１９，３６９号に記載されているようなリポソームを調製するために得られる。
適当な投与形態は病気、免疫原、および投与形態により、可能なものは錠剤、カプセル、トローチ、歯磨き、座薬、吸入薬、溶液、軟膏および非経口デポを含む。参照、例えば上記ベルカー、上記グッドマン、上記アベリー、上記エバジ、ここに引用された全参考文献を含み、全体がここに参考文献として組み込まれる。
抗原は、例えば、抗原提示の「内発的経路」が起こるような抗原物質の細胞内成分への供給を高める方法で供給することができる。例えば、抗原を（細胞と融合する）リポソームで包括し、または（細胞を感染させる）ビールスベクターのコートタンパク質に組み込まれる。
抗原がペプチドであるとき応用できる他のアプローチは、筋肉内に、抗原を宿主に符号化する裸のＤＮＡを注入することである。ＤＮＡは内部移行し発現される。
また本発明の構成物を用い自己のＰＢＬｓを初回刺激し、ＰＢＬｓが所望の応答を表すことを確認し、次いでＰＢＬｓ、またはそのサブセットを対象に投与することができる。
【００２９】
方法
共役体の合成
ＳＴｎ−ＫＬＨの合成のための一般法の記述
ＳＴｎ−ＫＬＨの調製は２つの化学的プロセス、ＳＴＮアルデヒドを生成するためＳＴｎ−クロチルのオゾン分解、そしてＫＬＨへのＳＴｎ−アルデヒドの共役を要する。
これらのプロセスは生成物の形成と反応副生成物の十分な除去を確保するためにコントロールされなければならない。
オゾン分解
ＳＴｎ−クロチル（６−Ｏ−アルファシアリル、Ｎ−アセチルアルファＤ−ガラクトサミニル−１−Ｏ−２−ブテン）はカナダ、アルバーター、エドモントンのライロケミカル社から粉末で入手される。ＳＴｎ−クロチルは水溶性でオゾンにさらすと炭素−炭素二重結合を酸化し、オゾン化物構造を形成する。次に窒素ガスを溶液に通し過剰のオゾンを除く。ＳＴｎ−アルデヒド（ＳＴＮ−ＣＨＯ）を形成するように残留オゾン／酸素の除去とオゾン化物ボンドの還元はジメチルスルフィド（ＤＭＳ）の添加によって完了する。アセトアルデヒド、等モル量で生成した副生成物を先ずジエチルエーテル抽出によって除去した。まず酢酸エチルで抽出して除去し、残りのアセトアルデヒドと酢酸エチルのレベルをさらにローターリイエバポレーションによって減らす。最後のＳＴｎ−アルデヒド溶液を濾過し必要になるまで−２０℃で冷凍貯蔵する。
ＳＴｎアルデヒドとＫＬＨの共役
ＳＴｎ−アルデヒドとＫＬＨは共にリン酸緩衝液でインキュベーションする。ＳＴｎ−ＣＨＯのアルデヒド部分とＫＬＨのリジン部分残基の末端アミン基との間の縮合反応によってＳＴｎをＫＬＨに結合させる。形成するシッフ塩基中間体を水素化シアノホウ素ナトリウムによって還元しＳＴｎとＫＬＨの間に安定な結合を与える。ダイアフィルトレーションは残りの水素化シアノホウ素ナトリウム、反応副産物ＳＴｎ−アルコール、ならびにオゾン化の最後に存在したジメチルスルフォキシドと酢酸エチルを除く。生成物のタンパク質濃度は希釈により調整され、濾過により滅菌され、２ないし８℃で貯蔵される。
相Ｉ／ＩＩプロセスの例
水素化シアノホウ素ナトリウム２５０ｍｇを秤量し、７．８ｍｌのＰＢＳに溶解し滅菌濾過し貯蔵溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）を与えた。１２５ｍｇを含むＫＬＨ溶液のアリコットを秤量した（８．８５ｍｇ／ｍｌで１４．１ｍｌの溶液）。１５０ｍｇのハプテンを含むＳＴｎ−アルデヒド溶液のアリコットをＫＬＨ溶液に添加し、２．５＋／−０．５分間２１℃＋／−３℃にて（１．２：１比ＳＴｎ／ＫＬＨｗ／ｗ）混合した。水素化シアノホウ素ナトリウム１２５ｍｇを含む貯蔵溶液のアリコットを次にＫＬＨとＳＴｎ−アルデヒド混合物に添加し、反応混合物を１８＋／−０．５時間２１＋／−３℃にて静かに振とうしインキュベーションした。反応副産物をＹＭ３０膜をもつアミコン限外濾過ユニットを用いダイアフィルトレーションによって除去した。生成物をミリポアミレックス−ＧＶ０．２２ミクロンフィルターに通して濾過した。
生成物の％ＮＡＮＡを増加するために導入したプロセス変化
ＳＴｎ／ＫＬＨの比は３：１（ｗ／ｗ）に増加し、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５をＰＢＳの代わりに用いた。反応温度は３９＋／−２℃まであげて、水素化シアノホウ素ナトリウム溶液を１４のアリコットに、３．５時間１５分毎に１２５ｍＭ最終濃度まで添加した。インキュベーション時間は２１＋／−３時間、次いで反応副生物はダイアフィルトレーションによって除去した。
臨床生成物の調製のための最終プロセス変化
ＳＴｎ／ＫＬＨの比は２．２５：１（ｗ／ｗ）まで減少し、シアノホウ素水素化物濃度は６０ｍＭまで減少した。
カスタム共役体のためのプロセス変化
反応パラメーターを表２にまとめる。
【００３０】
動物効力アッセイ
免疫化
最初のセットの実験（表４および５の結果）のため、１グループにつき９または１０匹のマウス（８−１２週齢雌ＣａＦ１）に各ロットのテスト物質を用いＥＮＨＡＮＺＹＮ（登録商標）アジュバントインジェクタブルエマルジョン（Ｃｏｒｉｘａ）と合わせ、０．２５μｇの投与量で注入した。第二の注入は１４日目に行い、血清を２６日目に収集した。
第二の組の実験のために（表６の結果）、各ロットのテスト物質を３レベル投薬図で４５匹のマウス（８−１２週齢雌ＣａＦ１）に注入した。３種のテスト物質の投与量（０．２５μｇ、０．０５μｇ、０．０１μｇ）をＥＮＨＡＮＺＹＮ（登録商標）アジュバントインジェクタブルエマルジョン（Ｃｏｒｉｘａ）と合わせ、各投与量を１５匹のグループに注入し、同時に他の組のマウスに同じ３回分のＳＴｎ−ＫＬＨワクチンをインハウス参照（ロットＳＴＮＫ００５５）に注入した。第二の注入は１４日目に行い、血清を２６日目に収集した。
第三の組の実験のために（表７の結果）、少なくとも２つの投与量が力価において参照ロットによって画定された標準曲線の作動範囲内にあることになるように、テストロットの投与量が適当に選択された（０．０１２５μｇないし１．６μｇの範囲内）ことを除き注入図は第二の組と同じであった。
アッセイプロトコル
ＳＴｎへの特異的ＩｇＧ抗体応答はヒツジの顎下のムチン（ＯＳＭ）で被覆したプレート上の動力学的ＥＬＩＳＡによって決定した。免疫マウスからの血清を３倍シリーズに希釈し（１／３００−１／６５６，１００）室温で１時間ＯＳＭ被覆ウェルに添加した。洗浄工程で結合していない一次抗体を除去後、パーオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、次いで色素生産性基質ＡＢＴＳを添加した。各希釈でのＶｍａｘ値はＳＯＦＴｍａｘ（登録商標）プロソフトウェアを備えたモレキュラーデバイシーズＴＨＥＲＭＯｍａｘ（登録商標）マイクロプレートリーダーを用いる代表的な１０分動力学的読みで得られた。３倍希釈はこれらの研究で行われたが、２倍希釈を用いて生成した過去の動物力価とヒト免疫応答のデーターを直接比較するために、希釈値はｌｏｇ２力価としてとして表現された。
各マウスのためのエンドポイント力価は後のＶｍａｘ値（ΔＶｍａｘ）間の数の差に基づく数学的アルゴリズムによって得られた。過去のデーターと現在のデーターの分析によって、ノイズと統計的に区別できるΔＶｍａｘ値を同定し、エンドポイント決定のためのワーキングルールは次のように定義された：エンドポント力価はｌｏｇ２力価であり、前のＶｍａｘドロップ値が６ｍＯＤ／分以下にならない６ｍＯＤ／分を超えるＶｍａｘ値で最後のドロップに相当する。
データー分析
第一の組の実験では、マウス（表４）のグループからの抗体応答の平均力価として結果が表される。統計的優位性の分析は表５に示す。第二の組の実験では、相対的力価は表６に示すように計算された。第三の組の実験では、相対的力価は表７に示すように計算された。
【００３１】
分析方法
ＮＡＮＡ含量の決定
ＫＬＨに共役したシアリル−Ｔｎの量は酸加水分解後の共役体から放出されたＮＡＮＡの量として決定された。パルス電流測定検出（ＡＥ−ＨＰＬＣ−ＰＡＤ）を用いるDionex CarboPac PA1アニオン交換カラムで、ＮＡＮＡ含量を定量的にＨＰＬＣによって決定した。標準曲線はＮＡＮＡ標準の濃度対ピーク面積をプロットしてつくり、テストサンプルのＮＡＮＡ濃度は標準曲線から得た。
タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度は２８０ｎｍの吸光度で決定した。ＫＬＨとＳＴｎ−ＫＬＨの吸光係数（１ｍｇ／ｍＬ）を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液でＡ280＝１．３７であると決定した。
分子サイズの決定
移動相が５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、流速が０．５ｍＬ／分の１０００オングストロームＴＳＫＧ５０００ＰＷXLサイズ排除カラムを用いて分子の大きさを決定した。カラムをウォーターズ２６９０アリアンスＨＰＬＣシステムに結合し３つの検出器、ＵＶ吸光度、屈折率（ＲＩ）およびレーザー光散乱（ＬＩＳ）によりモニターした。精度検出器のレーザー光散乱プラットフォームをウォーターズ２４１０屈折率検出器の温度制御チャンバ内に取付けた。静的光散乱測定と組合せて示差屈折率測定を分子の大きさの決定に用いた。精度獲得３２および精度分析を用いてデーター獲得と分析を行った。
【００３２】
結果と論考
代替レベルに影響することがわかった反応因子はアセトアルデヒドの完全な除去、ハプテン／ＫＬＨ比、シアノホウ素水素化物濃度、反応時間および反応温度であった。反応温度が３９℃であるが、室温ではないとき、サブユニット会合が起きた。反応速度は室温では遅いが、反応時間を適当に調整することによりＮＡＮＡ含量を大きくできた。
３−レベル投与量によりテストしたサンプルに対する反応条件、分子サイズ、ＮＡＮＡ含量、そして相対的潜在力を表６に示す。結果はＮＡＮＡ含量が５％以上であり、三量体（たぶん二量体は十分）の凝集状態が高潜在力を達成するために望ましい。約２０量体までの高い凝集状態は何も利点をもたらさない。
ロットＰＤ０２０１０５−０８を先ずワクチンプラシーボとしてつくる、すなわち、何もハプテンは存在しないが、ワクチンと同じ共役プロセスによって凝集させた（２，０００ｋＤの範囲）。次いで再度２３℃にてハプテンを用いるプロセスで６．８％のＮＡＮＡを生成した。２３℃の反応条件は通常凝集しないが、この場合さらに凝集が起こり、複雑な分子サイズパターンがサイズ排除クロマトグラフィで得られた。このサンプルの有効性は他の「良好な」ロットと比較できた。
分子篩溶出プロフィルおよびピークを横切る水力学的半径の計算値を図１−９に示す。０４０４００−ＲＴおよび２６０１００ＲＴのロットのプロフィルは図５に重なって示され、詳細に比較される。これら２ロットは全分析テストでほぼ同じであるが、若干有効性で異なる。水動力学的半径（サイズの測定）はピークを横切って変化し、サイズは凝集したサンプルと凝集していないサンプルとは重ならないことに注意。平均ＭＷ量はサイズの範囲が何かは語らないが、ピークの「切片」を再計算して得られる。
初期の研究での１−レベル投与によってテストしたサンプルの分子サイズ、ＮＡＮＡ含量、および相対的有効性は表４に示す。若干のサンプルは両者の研究でテストした。表６と７は表４に報告されていない特性をもつサンプルを含む。
表２に報告したサンプルのデーター分析は表４，５，６および７に示す。サブユニットまたは約７％のＮＡＮＡを含む凝集したワクチンでマウスを免疫化後、ＯＳＭでの抗−ハプテン抗体力価の比較を表４に示す。各タイプの３ロットを用意した。データーは統計学的分析のために一緒にした。約３％のＮＡＮＡを含むワクチンロットの同じような比較を表４に示す。
抗−ＯＳＭ力価での差の統計学的有意性を表５に示す。３％ＮＡＮＡとのＳＴｎ−ＫＬＨの凝集は有意な効果がなかった。同様に、凝集なしの７％までのＮＡＮＡ含量の増加は有効性には意味がある効果を与えなかった。％ＮＡＮＡが増加し生成物が凝集したとき、有効性の改善は他のグループのものと比較してＰ−値＜．０００１で有意であった。
【００３３】
パラメーターの範囲と解説：
（ａ）アセトアルデヒドを＜１％（モル／モル；アセト−ＣＨＯ／ＳＴｎ−ＣＨＯ）のスペックまで除く。これはＲＰ−ＨＰＬＣリミットテストによって確かめられる。生の反応生成物は５０％モル／モルであった。残りのアセトアルデヒドの効果の大きさは各モルのアセト−ＣＨＯ／ＳＴｎＣＨＯに対しＮＡＮＡ含量が約０．３％の減少である。ここでテストした全サンプルはアセトアルデヒドの除去の内訳に合致した。
（ｂ）ハプテン／ＫＬＨ比は重量／重量である。
（ｃ）シアノホウ素水素化物濃度はミリモルである、テストした値の範囲は２０−ないし２００ｍＭであった。
（ｄ）温度は初めはサイズに、そして反応温度に影響を与える。最終％ＮＡＮＡは必ずしも温度の増加と共に増加しない。３９℃で３％ＮＡＮＡを超える最短反応時間は約６時間である。４８時間を超える反応時間は３９℃でさらに高い凝集物を生成する。
（ｅ）温度＞３０℃では２４時間で凝集が得られると我々は概算する。我々は４３℃まで問題がなかったが、それより高い温度では生成物が硬くなる（たぶん凝集物が容易に取り扱うには大きすぎるのだろう）。
表２は反応条件の要因分析である。
【００３４】
【表２】
2005526692.tif 000008
【００３５】
＊Ｒ．Ｒ．Ｔ＝Ｓｈｏｄｅｘでのサイズ排除クロマトグラフィによる相対保持時間。
数値はチログロブリン基準に関連し、分子サイズに反比例している。
レーザー光散乱による分子量との関係は表３に示す。
％ＮＡＮＡ含量は１００＊（シアル酸、遊離した糖として、２８０ｎｍでの吸光度で測定されるタンパク質含量によって分けられる）。重量／重量計算である。
表３は動物有効性実験に用いたＳＴｎ−ＫＬＨロットの反応条件と物理的性質である。
【００３６】
【表３】
2005526692.tif 000009
【００３７】
＊プラセボワクチンはハプテン不在で３９℃にてプロセスを通してＫＬＨを媒介し、次いでハプテンで２３℃にて再処理して製造した。
ＭＷおよびショデックスは共にいつでも入手できると報告されている。ショデックスの作業範囲は極めて短いが、そのポイントは「サブユニット」ＭＷが通常ショデックス値０．９８ないし１．００に相当することである。この意味で、表２に注目すると、０．９８のショデックス値は反応時間（２１時間）と温度（３９℃）がともに特定の条件から１７時間と３５℃にそれぞれ減ったときにのみ生じる。０．９７以下のショデックス値でのすべて他の反応条件は凝集生成物を代表するように思う。ラン＃８（表２での最初の項、ショデックス値０．９８）は（ＴＳＫクロマトグラフィ／レーザー光散乱によって）約２５％の凝集物質を含むと見積もられる。
表４は平均ｌｏｇ２抗体力価によるワクチン有効性の決定。高いＮＡＮＡを含む６ロットをテストし（３凝集および３サブユニット）、１組は２回テストし、全部で７９匹のマウスを用いた。低いＮＡＮＡを含む２ロットをテストし（１凝集および１サブユニット）、全部で１８匹のマウスを用いた。
【００３８】
【表４】
2005526692.tif 000010
【００３９】
表５はグループ間のｌｏｇ２抗体力価の統計的有意差を示す。
【００４０】
【表５】
2005526692.tif 000011
【００４１】
表６は３レベルでの投薬量によるワクチン有効性の決定および投与−応答曲線に合致した平行線の置換の評価を示す。３つの別々の実験からの３投与でのｌｏｇ２力価のランクに基づくランク関連有効性をロット１につき計算した。全ての点を通る最良の同時フィットを用いて参照投薬−応答曲線（相対的有効性１．００）を決定した。３投薬のランク相対的有効性をテストロットにつき計算し、平行フィット投薬−応答曲線を参照の曲線と置換して相対的有効性を計算した（テスト／参照）。
【００４２】
【表６】
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【００４３】
表７は中央値力価の５−ポイント参照投薬−応答曲線での内挿によるワクチン有効性の決定を示す。テストロットに複数投薬して、少なくとも２つの中央値ｌｏｇ２力価が標準曲線の作業範囲にあるようにした。相対的有効性はタンパク質含量によって決定されるワクチン濃度によって分けられる標準曲線から得た。
【００４４】
【表７】
2005526692.tif 000013
【００４５】
ここに引用した文書は直接関係のある従来技術であることを意図するものではなく、また本発明の請求の範囲の特許性を考慮するものでもない。これら文書の内容について日付や表示に関する全記述は本出願人が入手できた情報に基づくものでありこれら文書の日付や内容の正確性について何ら容認するものではない。
添付した請求の範囲は好適例を制限なく詳説するものとして取り扱われる。
ほかの場所で示されるものに加えて、次の参考文献はここに参照文献として組み込むが、これらは本出願時の最新の刊行物である。
【００４６】
ナビゲーター；細胞：実験マニュアル；酵母遺伝学での方法：実験コースマニュアル；ニューロンを発見：神経科学の実験基礎；ゲノム分析：実験マニュアルシリーズ；実験ＤＮＡ科学；タンパク質精製と特性化のための戦略：実験コースマニュアル；病原性バクテリアの遺伝子分析；ＰＣＲプライマー：実験マニュアル；植物分子生物学での方法：実験コースマニュアル；マウス胚を操作する：実験マニュアル；神経系の分子プローブ；分裂酵母を用いた実験：実験コースマニュアル；バクテリア遺伝学のショートコース：エシェリシアコリおよび関連するバクテリアのための実験マニュアルおよびハンドブック；ＤＮＡ科学：組み替えＤＮＡ技術の最初のコース；酵母遺伝学の方法：実験コースマニュアル；植物の分子生物学：実験コースマニュアル。
ここに引用した全参考文献は、関連する米国または外国特許出願の前に刊行された対応するジャーナルやアブストラクトを含め、或いは他の参考文献は、全てのデーター、表、数字、および引用文献に示されたテキストを含め、全体をここに参考文献として組み込む。さらに、ここに引用した参考文献内に引用された参考文献の全内容も全体を参考文献として組み込む。
工程の既知の方法、従来法の工程、既知の方法または従来法の参照は本発明の解釈、記述または実施例が開示され、教示され、または関連した分野で示唆されることを許すものではない。
特定の実施例の前記記述は本発明の一般的性質を完全に示し、他者は、（ここに引用した参考文献の内容を含め）当業者の範囲で知識を応用することにより、本発明の一般的概念から逸脱することなく、過度の実験をすることなく、前記特定例のような種々の応用を容易に変更しおよび／または種々採用することができる。従って、そのような応用や変更はここに示される教示やガイダンスに基づき、開示した好適例の意味および同等の範囲内である。ここにある術語または用語は記述のためのものであり制限するものではないということを理解すべきであり、本明細書の用語または術語はここに示される教示やガイダンスに照らして、当該分野の通常の知識と組み合わせて当業者によって解釈されるべきである。
本発明の実施で有用または好ましいクラスまたは範囲の記述はいずれもそこに含まれる任意のサブクラス（例えば、省略した１以上の開示された部分をもつ開示されたクラス）または下位の範囲、ならびに前記クラスまたは範囲での各部分または重要性の別々の記述であると考える。
好適例の記述は個々に、不可能である組み合わせ（例えば、本発明の要素を相互に排除選択）またはこの明細書で特に排除している組み合わせを除いて、そのような好適例の任意可能な組み合わせの記述であると考える。
この発明の具体例が従来技術に開示されるなら、本発明の記述はそのような摘出された具体例と共にここに開示されたような本発明を含むと考える。
出願人によって企図されたような本発明は、請求の範囲、および請求の範囲にはない組み合わせに示された主題を含むが制限されるものではない。さらに、従来技術に開示された１以上の欠点を解消することに限られた主題を含む。従来技術によって開示または示唆された主題へ請求の範囲が侵食する範囲まで、出願人は削り取られた侵食する主題をもつそのような請求の範囲に相当する発明を予期している。
この明細書で引用された特許、特許出願、書籍、刊行物、およびオンライン源を含む全参考文献は、これら参考文献によって引用された参考文献も同様に、ここに参考文献として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Lot PD020105−08（9,500ｋDa、6.8％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図２】Lot 211299−01（590ｋDa、3.2％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図３】Lot 040400−RT（460ｋDa、7.0％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図４】Lot 260100RT（500ｋDa、7.2％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図５】Lots 040400−RTおよび260100RTのサイズ除外クロマトグラフィプロフィルのオーバーレイを示す図である。
【図６】Lot 201299−01（4000ｋDa、3％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図７】Lot 011299−03（2600ｋDa、5.1％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図８】Lot STNK0055（1200ｋDa、7.8％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図９】Lot PD029910−03（1,500ｋDa、7.9％ NANA）のサイズ除外クロマトグラフィを示す図である。
【図１０】相対的保持時間％（チログロブリン＝100）に対する分子量（kDa）の回帰プロットである。
【図１０】
2005526692.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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