(57)【要約】本発明は、ヒトグリコーゲンシンターゼ３（ＧＳＫ３）の構築物の三次元構造；タンパク質の触媒キナーゼドメインを含むヒトグリコーゲンシンターゼ３−β（ＧＳＫ３−β）の構築物の結晶；構造決定に十分なＧＳＫ３結晶を提供するためのタンパク質構築物を結晶化するための方法；およびＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患状態の処置における可能な治療化合物の同定のためにＧＳＫ構築物の三次元構造を使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化ＧＳＫ３−β複合体であって、該複合体は、
（ａ）ＧＳＫ３構築物；および
（ｂ）リン酸化ポリペプチド、
を含む、複合体。
【請求項２】
請求項１に記載の複合体であって、ここで、前記構築物が、配列番号１に示されるアミノ酸配列あるいはその活性突然変異体または改変体を有する、複合体。
【請求項３】
請求項１に記載の複合体であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、複合体。
【請求項４】
結晶化ＧＳＫ３−β複合体であって、該複合体は、
（ａ）表２において示される原子座標を有するＧＳＫ３−β構築物；および
（ｂ）リン酸化ポリペプチド、
を含む、複合体。
【請求項５】
請求項４に記載の複合体であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、複合体。
【請求項６】
結晶化形態中のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＧＳＫ３の活性形態およびそのインヒビター結合部位を含み、ここで、該ポリペプチドが表２において示される原子座標を含む、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリペプチドであって、さらに結合リガンドを含む、ポリペプチド。
【請求項８】
ＧＳＫ３タンパク質の原子モデルを提供するための方法であって、該方法は、
（ａ）結晶化形態におけるＧＳＫ３タンパク質の原子座標／Ｘ線回析データ、すなわちＧＳＫ３タンパク質の三次元構造のモデルを作るために十分なデータを保存した、コンピューターで読み取り可能な媒体を提供する工程であって、ここで、該結晶化形態におけるＧＳＫ３タンパク質が、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む、工程；
（ｂ）（ａ）からの該原子座標／Ｘ線回析データを分析し、該ＧＳＫ３タンパク質の原子モデルを規定するデータ出力を提供する工程；および
（ｃ）ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造を規定する原子モデル出力データを得る工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって生成されるＧＳＫ３タンパク質の原子モデルのデータを保存した、コンピューターで読み取り可能な媒体。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法によって生成されるリガンドモデルの原子モデルの物理的モデルに対応するＧＳＫ３−βリガンド。
【請求項１１】
ＧＳＫ３タンパク質に結合するリガンドを設計するための方法であって、表２において示されるＧＳＫ３複合体の原子座標のいくつかまたは全てを使用する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
ＧＳＫ３タンパク質に結合するリガンドを設計するための方法であって、該方法は、
（ａ）生物活性を有する結晶化ＧＳＫ３タンパク質を提供するために精製されたＧＳＫ３タンパク質を結晶化する工程であり、ここで、該結晶化ＧＳＫ３タンパク質がＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む工程；
（ｂ）ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造を決定するための適切なデータを得るために、Ｘ線結晶学を使用して結晶化ＧＳＫ３タンパク質の構造を解く工程；
（ｃ）結晶化ＧＳＫ３タンパク質の構造を解くことから生じたデータをコンピューターアルゴリズムに適用し、ＧＳＫ３タンパク質活性部位に結合するリガンドの設計において使用するために適切なＧＳＫ３タンパク質のモデルを生成する工程；および
（ｄ）反復プロセスを適用し、それによって、分子構造がコンピューターで生成されるモデルに適用され、ＧＳＫ３結合リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記結晶化ＧＳＫ３タンパク質が表２において示される原子座標を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記ＧＳＫ３タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の方法によって設計されるＧＳＫ結合リガンド。
【請求項１６】
潜在的なメディエーターとＧＳＫ３結合部位、すなわち表２において示される原子座標の少なくともいくつかによって規定される結合部位との間の結合相互作用を測定することにより、ＧＳＫ３メディエーターを同定するための方法であって、該方法が、
（ａ）コンピュータースクリーン上の該結合部位により規定される結合空洞を生成する工程；
（ｂ）その空間構造を有する化合物を生成する工程；および
（ｃ）該化合物が該ＧＳＫ３結合部位に結合するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
ＧＳＫ３活性を媒介する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）表２において示される原子構造座標の少なくともいくつかに基づいてＧＳＫ３結合部位におけるアミノ酸と、非共有結合を形成するＧＳＫ３に対する潜在的メディエーターを設計する工程；
（ｂ）該潜在的なメディエーターを得る工程；および
（ｃ）該潜在的なメディエーターがＧＳＫ３の活性を媒介するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
ＧＳＫ３活性を媒介する化合物を同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）表２において示される原子座標によって規定されるようなＧＳＫの三次元構造を使用し、潜在的なメディエーターを設計するかまたは選択する工程；
（ｂ）該潜在的なメディエーターを得る工程；および
（ｃ）該潜在的なメディエーターがＧＳＫ３の活性を媒介するか否かを決定するために、該潜在的なメディエーターをＧＳＫ３と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
分子もしくは分子複合体の三次元表示または該分子もしくは分子複合体のホモログの三次元表示を生じるためのコンピューターであって、ここで、該分子または分子複合体が表２において提供されるＧＳＫ３の原子座標の少なくともいくつかによって規定される結合ポケットを含み、ここで、該コンピューターが、
（ａ）機械で読み取り可能なデータでコードされるデータの貯蔵物質を備える機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、表２において示される原子座標を含む、貯蔵媒体；
（ｂ）該機械で読み取り可能なデータの処理についての指示書を保存するためのワーキングメモリ；
（ｃ）該機械で読み取り可能なデータを該三次元表示に処理するための中枢処理装置であって、該中枢処理装置は、該ワーキングメモリおよび該機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結される中枢処理装置；および
（ｄ）該三次元表示を表示するための、中枢処理装置に連結されるディスプレイ、
を備える、コンピューター。
【請求項２０】
分子または分子複合体のＸ線回析パターンに対応する原子座標の少なくとも一部を決定するためのコンピューターであって、ここで、該コンピューターが、
（ａ）機械で読み取り可能なデータでコードされるデータ貯蔵物質を備える、機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、表２において示される原子座標の少なくとも一部を含む、貯蔵媒体；
（ｂ）機械で読み取り可能なデータでコードされるデータ貯蔵物質を備える、機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体であって、ここで、該データが、該分子または分子複合体のＸ線回析パターンを含む、貯蔵媒体；
（ｃ）該（ａ）および（ｂ）の機械で読み取り可能なデータを処理するための指示書を保存するためのワーキングメモリ；
（ｄ）該（ａ）の機械で読み取り可能なデータのＦｏｕｒｉｅｒ転換を実行し、そして該（ｂ）の機械で読み取り可能なデータを構造座標に処理するための中枢処理装置であって、該中枢処理装置は、該ワーキングメモリならびに該（ａ）および（ｂ）の機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結される中枢処理装置；および
（ｅ）該分子または分子複合体の構造座標を表示するための該中枢処理装置に連結されるディスプレイ、
を備える、コンピューター。
【請求項２１】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質を結晶化するための方法であって、該方法は、
生物活性を有する結晶化ＧＳＫ３タンパク質を提供するために、精製されたＧＳＫ３タンパク質を結晶化する工程であって、ここで、該結晶化ＧＳＫ３タンパク質がＧＳＫ構築物およびリン酸化ポリペプチドを含み、そしてここで、該結晶化ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造の決定のために適切なＸ線パターンを得るために、該結晶化ＧＳＫ３タンパク質がＸ線結晶学を使用することで解くことが可能である、工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、ＧＳＫ３タンパク質の結晶化がハンギングドロップ蒸気拡散法による結晶化工程を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記結晶化ＧＳＫ３タンパク質が表２において示される原子座標を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記ＧＳＫ３タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはそれの活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法によって提供される結晶化ＧＳＫ３タンパク質。
【請求項２７】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質複合体を作るための方法であって、該方法は、
リン酸化され得るポリペプチド、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、およびＧＳＫ３タンパク質を組み合わせ、リン酸化ポリペプチド、アデノシン二リン酸、およびＧＳＫ３タンパク質を含むＧＳＫ３タンパク質複合体を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、該リン酸化され得るポリペプチドが一リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項３０】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質複合体を作るための方法であって、該方法は、
リン酸化ポリペプチド、およびＧＳＫ３タンパク質を組み合わせ、ＧＳＫ３タンパク質複合体を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化され得るポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項３３】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
沈殿剤をリン酸化され得るポリペプチド、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、およびＧＳＫ３タンパク質を含む溶液に添加する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤がポリエチレングリコールを含む、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤が２−メチル−２，４−ペンタンジオールを含む、方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質結晶が、表２において示される原子座標を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが一リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法によって提供される結晶化ＧＳＫ３タンパク質。
【請求項４０】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
沈殿剤をリン酸化ポリペプチドおよびＧＳＫ３タンパク質を含む溶液に添加する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤がポリエチレングリコールを含む、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記沈殿剤が２−メチル−２，４−ペンタンジオールを含む、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項４５】
ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）タンパク質結晶を作るための方法であって、該方法は、
結晶化ＧＳＫ３タンパク質と潜在的ＧＳＫ３メディエーターを接触させる工程であって、ここで、該結晶化ＧＳＫ３タンパク質が、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記ＧＳＫ３タンパク質が、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体もしくは改変体を含む、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、ここで、前記リン酸化ポリペプチドが二リン酸化ポリペプチドを含む、方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載の方法によって提供される結晶化ＧＳＫ３タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の三次元構造；ＧＳＫ３構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドの三元複合体の結晶；ＧＳＫ３三元複合体の結晶を形成するための方法；ＧＳＫ３三元複合体の結晶構造を決定するための方法；およびＧＳＫ３三元複合体の三次元構造を使用して、ＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患の状態を処置するための可能な治療化合物を同定するための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）は、２つのアイソフォーム、αおよびβが同定されたセリン／スレオニンキナーゼである（Ｗｏｏｄｇｅｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１６：１７７〜８１（１９９１））。両方のＧＳＫ３アイソフォームは、休止細胞において構成的に活性である。ＧＳＫ３は、本来直接リン酸化によってグリコーゲンシンターゼを阻害するキナーゼとして同定された。インスリン活性化の際に、ＧＳＫ３は不活化され、これによってグリコーゲンシンターゼおよびおそらく他のインスリン依存性の事象（例えば、グルコース輸送）の活性化を可能にする。引き続いて、ＧＳＫ３活性はまた、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によるシグナルに伝達されるインスリンのような他の成長因子によって不活化されることが示された。そのようなシグナル伝達分子の例としては、ＩＧＦ−１およびＥＧＦ（Ｓａｉｔｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：２７〜３１，１９９４；Ｗｅｌｓｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９４：６２５〜２９，１９９３；およびＣｒｏｓｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：２１〜２６，１９９４）が挙げられる。
【０００３】
ＧＳＫ３活性を阻害する薬剤は、ＧＳＫ３活性によって媒介される障害の処置において有用である。さらに、ＧＳＫ３の阻害は、成長因子シグナル伝達経路の活性化を模倣し、そして結果として、ＧＳＫ３インヒビターは、そのような経路が不十分に活性である疾患の処置において有用である。ＧＳＫ３インヒビターで処置され得る疾患の例としては、他の間での糖尿病、アルツハイマー病、双極性障害のようなＣＮＳ障害、および免疫増強関連状態が挙げられる。
【０００４】
ＧＳＫ３のインヒビターは、多くの疾患の処置において有用であるので、ＧＳＫ３の新規インヒビターの同定は、非常に望ましい。本発明は、ＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患状態の処置のための、可能な治療化合物を同定するための方法を提供する。本発明の方法は、可能な治療化合物を同定し、そしてリード（ｌｅａｄ）治療化合物の構造を最適化するために、タンパク質の触媒性ドメインを含むＧＳＫ三元複合体の三次元構造を使用する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明に従って、ヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドの構築物の三元複合体の三次元構造が提供される。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、タンパク質の触媒キナーゼドメイン、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含むヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３−β（ＧＳＫ３−β）の構築物を含む三元ＧＳＫ３複合体の結晶を提供する。１つの実施形態において、結晶は、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ペプチドを含む。このＧＳＫ３構築物は、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体または改変体を有し得る。このリン酸化ペプチドは二リン酸化ポリペプチドであり得る。この結晶は、表２において示される原子座標を有し得る。
【０００７】
本発明の別の局面において、構造決定のために十分なＧＳＫ３結晶を提供するための、ＧＳＫ３三元複合体の結晶化についての方法が提供される。１つの実施形態において、本方法は、生物活性を有する結晶化ＧＳＫ３タンパク質を提供するために、精製されたＧＳＫ３タンパク質の結晶化工程を包含し、この結晶化されたＧＳＫ３タンパク質は、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含み、そしてこの結晶化ＧＳＫ３タンパク質は、結晶化ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造決定のために適切なＸ線パターンを得るために、Ｘ線結晶学を使用して解くことが可能である。１つの実施形態において、ＧＳＫ３タンパク質の結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法による結晶化工程を包含する。このＧＳＫ３構築物は、配列番号１において示されるアミノ酸配列またはその活性突然変異体または改変体を有し得る。リン酸化ペプチドは、二リン酸化ポリペプチドであり得る。この結晶は、表２において示される原子座標を有し得る。この方法によって提供される結晶化ＧＳＫ３タンパク質もまた、提供される。
【０００８】
さらなる局面において、ＧＳＫ３タンパク質複合体を作るための方法が提供される。１つの実施形態において、本方法は、リン酸化され得るポリペプチド、アデノシン三リン酸、マグネシウム塩、およびＧＳＫ３タンパク質を組み合わせ、リン酸化ポリペプチド、アデノシン二リン酸、およびＧＳＫ３タンパク質を含むＧＳＫ３タンパク質複合体を提供する工程を包含する。この実施形態において、リン酸化され得るポリペプチドは、一リン酸化ポリペプチドであり得る。別の実施形態において、方法は、リン酸化ポリペプチド、アデノシン二リン酸、およびＧＳＫ３タンパク質を組み合わせ、リン酸化ポリペプチド、アデノシン二リン酸、およびＧＳＫ３タンパク質を含むＧＳＫ３タンパク質複合体を提供する工程を包含する。この実施形態において、リン酸化ポリペプチドは、二リン酸化ポリペプチドであり得る。
【０００９】
結晶は、沈殿剤をこれらの複合体を含む溶液に添加することによって、これらのＧＳＫ３タンパク質複合体から作られ得る。適切な沈殿剤としては、ポリエチレングリコールおよび２−メチル−２，４−ペンタンジオールが挙げられる。このＧＳＫ３タンパク質は、配列番号１において示されるアミノ酸配列あるいはその活性突然変異体または改変体を有し得る。この結晶は、表２において示される原子座標を有し得る。
【００１０】
本発明のさらに別の局面において、潜在的なＧＳＫ３メディエーターを含むＧＳＫ３タンパク質結晶を作るための方法が提供される。１つの実施形態において、方法は、結晶化ＧＳＫ３タンパク質と潜在的なＧＳＫ３メディエーターの接触工程を包含する。この結晶化ＧＳＫ３タンパク質は、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含み得る。本方法によって産生される結晶もまた、提供される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＧＳＫ３タンパク質の原子モデルを提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：（ａ）結晶化形態におけるＧＳＫ３タンパク質の原子座標／Ｘ線回析データ（ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造のモデルを作るために十分なデータ）を保存したコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、そして結晶性の形態のＧＳＫ３タンパク質が、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む工程；（ｂ）工程（ａ）からの原子座標／Ｘ線回析データを分析し、ＧＳＫ３タンパク質の原子モデルを規定するデータ出力を提供する工程；および（ｃ）ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造を規定する原子モデル出力データを得る工程を包含する。
【００１２】
この方法によって産生されるＧＳＫ３タンパク質の原子モデルのデータを保存した、コンピューターで読み取り可能な媒体およびこの方法によって産生されるリガンドモデルの原子モデルの物理的モデルに対応するＧＳＫ３−βリガンドもまた、提供される。
【００１３】
さらに別の局面において、ＧＳＫ３三元複合体の三次元構造を使用するための方法が、ＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患状態の処置における可能な治療化合物の同定のために提供される。１つの実施形態において、本発明は、ＧＳＫ３タンパク質に結合するリガンドを設計するための方法を提供し、この方法は、ＧＳＫ３複合体の原子座標のいくつかまたは全てを使用する工程を包含する。１つの実施形態において、方法は：（ａ）生物活性を有する結晶化ＧＳＫ３タンパク質を提供するように精製されたＧＳＫ３タンパク質を結晶化する工程（この結晶化ＧＳＫ３タンパク質は、ＧＳＫ３構築物およびリン酸化ポリペプチドを含む）；（ｂ）結晶化ＧＳＫ３タンパク質の構造をＸ線結晶学を使用して解き、ＧＳＫ３タンパク質の三次元構造決定のために適切なデータを得る工程；（ｃ）結晶化ＧＳＫ３タンパク質の構造を解く工程から生じたデータを、コンピューターアルゴリズムに適用し、ＧＳＫ３タンパク質活性部位に結合するリガンドを設計する際の使用に適切なＧＳＫ３タンパク質のモデルを生成する工程；および（ｄ）反復プロセスを適用し、それによって、分子構造がコンピューター生成モデルに適用され、ＧＳＫ３結合リガンドを同定する工程を包含する。この結晶化ＧＳＫ３タンパク質は、表２において示される原子座標を含み得る。ＧＳＫ３タンパク質は、配列番号１において示されるアミノ酸配列あるいはそれの活性突然変異体または改変体を含み得る。本方法によって設計されるＧＳＫ結合リガンドがまた提供される。
【００１４】
別の局面において、本発明は、潜在的なメディエーターとＧＳＫ３結合部位（少なくともいくつかのＧＳＫ３結晶の原子座標によって規定される結合部位）との間の結合相互作用を測定することによってＧＳＫ３メディエーターを同定するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：（ａ）コンピュータースクリーン上の結合部位により規定される結合空洞を生成する工程；（ｂ）間隙構造を有する化合物を生成する工程；および（ｃ）この化合物がＧＳＫ３結合部位で結合するか否かを決定する工程を包含する。本発明はまた、ＧＳＫ３活性を媒介する化合物を同定するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法は：（ａ）少なくともいくつかのＧＳＫ３結晶の原子座標に基づいたＧＳＫ３結合部位においてアミノ酸と非共有結合を形成するＧＳＫ３について、潜在的なメディエーターを設計する工程；（ｂ）潜在的なメディエーターを得る工程；および（ｃ）その潜在的なメディエーターが、ＧＳＫ３活性を媒介するか否かを決定する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は：（ａ）ＧＳＫ３結晶の原子座標により規定されるＧＳＫ３の三次元構造を使用して、潜在的メディエーターを設計するかまたは選択する工程；（ｂ）潜在的メディエーターを得る工程；および（ｃ）この潜在的メディエーターがＧＳＫ３の活性を媒介するか否かを決定するために、潜在的メディエーターとＧＳＫ３を接触させる工程を包含する。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、分子または分子複合体（少なくともいくつかのＧＳＫ３結晶の原子座標により規定される結合ポケットを含む分子または分子複合体）の二次元表示、またはこの分子または分子複合体のホモログの三次元表示を生じるためのコンピューターを提供する。１つの実施形態において、コンピューターは、（ａ）機械で読み取り可能なデータでコードされるデータの貯蔵物質を含む機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体（データは、ＧＳＫ３結晶の原子座標の少なくとも一部を含む）；（ｂ）機械で読み取り可能なデータのプロセスについての指示書を保存するためのワーキングメモリ；（ｃ）ワーキングメモリおよび機械で読み取り可能なデータを三次元表示に処理するための機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結する中枢処理装置；および（ｄ）三次元表示を表示するための中枢処理装置に連結されるディスプレイを備える。
【００１６】
本発明はまた、分子または分子複合体のＸ線回析パターンに対応する原子座標の少なくとも一部を決定するためのコンピューターを提供する。１つの実施形態において、コンピューターは、（ａ）機械で読み取り可能なデータをコードするデータ貯蔵物質を含む、機械で読み取り可能なデータ貯蔵媒体（データは、ＧＳＫ３結晶の原子座標の少なくとも一部を含む）；（ｂ）機械で読み取り可能なデータを保存するデータ貯蔵物質を含む機械で読み取り可能なデータ貯蔵媒体（データは、分子または分子複合体のＸ線回析パターンを含む）；（ｃ）（ａ）および（ｂ）の機械で読み取り可能なデータのプロセスについての指示書を保存するためのワーキングメモリ；（ｄ）ワーキングメモリおよび（ａ）の機械で読み取り可能なデータのＦｏｕｒｉｅｒ転換を実行し、そして（ｂ）の機械で読み取り可能なデータを構造座標に処理するための（ａ）および（ｂ）の機械で読み取り可能なデータの貯蔵媒体に連結される中枢処理装置；ならびに（ｅ）この分子または分子複合体の構造座標を表示するための中枢処理装置に連結されるディスプレイを備える。
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明に従って、タンパク質の触媒キナーゼドメイン、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含むヒトグリコーゲンシンターゼキナーゼ３−β（ＧＳＫ３−β）のタンパク質構築物を含む三元複合体の結晶が提供される。三元複合体を結晶化（三元複合体の三次元構造）するための方法およびＧＳＫ３−β活性によって媒介される種々の疾患状態の処置における可能な治療化合物の同定のために、三元複合体の三次元構造を使用する方法が提供される。
【００１８】
（三元複合体：ＧＳＫ−３β構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチド）
本発明の三元複合体は、ＧＳＫ−３β構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含む。この複合体は、ＧＳＫ３構築物とアデシン三リン酸（ＡＴＰ）およびＧＳＫ−３構築物によってリン酸化し得るペプチドを組み合わせることによって形成され得る。ペプチドのリン酸化は、リン酸化ペプチドおよびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む複合体を提供する。この複合体はまた、リン酸化ペプチドおよびアデノシン二リン酸とＧＳＫ３−β構築物を組み合わせることによって形成され得る。
【００１９】
以下に記載されるように、三元複合体構造の結晶構造は、リン酸化ペプチド（例えば、二リン酸化ペプチド）が、結晶中の２つの対称関連タンパク質の間の領域に広がり、そして別のセリン残基を受容するように位置決めされる。理論によって拘束されず、リン酸化ペプチドは、三元複合体の結晶形成を触媒し得ると考えられる。
【００２０】
他のＧＳＫ３結晶と比較した場合、本発明の三元複合体結晶は、安定性（候補ＧＳＫメディエーター中での浸漬しやすさ）、および高い分解能の利点を提供する。例えば、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＳＫ−３β  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ（２０００年９月１９日に出願された米国特許出願第６０／２３３，５３８号、および２００１年９月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５４９（それぞれ明白に、その全体が、本明細書中で参考として援用される））において記載される方法により成長した結晶は、分解能（最大２．２オングストローム）、データ収集の時間（代表的には３６時間）、およびＡＴＰ結合部位に浸漬され得るリガンドのサイズ（およそ約４００ダルトン未満）に関する限定を有する結晶を提供する。この三元複合体結晶は、全ての局面において上位である；達成された最大分解能は２．０オングストローム（おそらく、１．８オングストローム）であり；データ収集の時間は、劇的に減少され（代表的には、２４時間）；そしてＡＴＰ結合部位に浸漬され得るリガンドの質量について、同定された限定は存在しない。
【００２１】
種々の候補ＧＳＫ３メディエーター（すなわち、リード化合物）は、三元複合体の結晶および決定されたその結晶構造に浸漬され得る。得られた結晶において、リード化合物が浸漬され得、そしてＡＤＰおよびリン酸化ペプチドがしみ出され得る。三元複合体結晶の性質に起因して、相対的に大きいリード化合物がその結晶によって適合され得る。これは、結晶構造上のリン酸化ペプチドの結果であるようだ。三元複合体結晶における酵素の結合部位は、結晶パッキングによって占有されないようだ。これは、研究された他のＧＳＫ３結晶とは対照的であり、これは、その結晶によって適合され得るリード化合物のサイズおよび形の制限を受ける。三元複合体の結晶は、酵素の結合部位への相対的に遮断されない接近を提供する。上で記述されるように、ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５４９において記載されるように調製された結晶は、約４００ダルトンより大きい化合物を容易に浸漬し得ない一方で、本発明の結晶は、４５０ダルトンを超過する分子量を有する化合物を容易に浸漬し得る。
【００２２】
三元複合体結晶の結晶は、高分解能で解かれ得る（例えば、１．８オングストローム）。同様に、酵素および候補メディエーターを含む共結晶もまた、高分解能で解かれ得る（例えば、２．６オングストロームまたはそれより良好に）。
【００２３】
上で記述されるように、三元複合体は、ＡＴＰ、マグネシウム、およびＧＳＫ３構築物の作用によって産生され得るリン酸化ポリペプチドを含む。リン酸化ペプチドは、ＧＳＫ３構築物によってリン酸化し得るペプチドに由来し得る。リン酸化し得る適切なペプチドは、リン酸化され得るアミノ酸残基を含む。リン酸化され得る適切なアミノ酸残基としては、他の間で、セリンおよびスレオニンが挙げられる。リン酸化ペプチドはまた、リン酸化され得るアミノ酸残基を含むリン酸化ペプチドに由来し得る（例えば、一リン酸化ペプチドは、二リン酸化ペプチドを提供するためにリン酸化され得る）。他の適切なペプチドとしては、例えば、複合体を提供するためにＧＳＫ３構築物と組み合わせられ得る二リン酸化ペプチドが挙げられる。酵素の結合部位への相対的に遮断されない接近を提供するために、適切なリン酸化ポリペプチドは、結晶中の２つの対称的な関連タンパク質の間の領域に広がるポリペプチドを含む。適切なペプチドは、約６個〜約８個のアミノ酸残基を含み得る。１つの実施形態において、複合体を提供するためにＡＴＰおよびＧＳＫ３構築物と組み合わせる際に有用なリン酸化ペプチドは、ホスホセリン残基を含む７個（７）のアミノ酸残基を含む。別の実施形態において、複合体を提供するためにＡＴＰおよびＧＳＫ３構築物と組み合わせる際に有用なリン酸化ペプチドは、ホスホセリン残基を含む６個（６）のアミノ酸残基を含む。三元複合体を提供するためにＡＴＰおよびＧＳＫ３構築物と組み合わせられ得る代表的なリン酸化ペプチドは、配列：ＬＳＲＲＰＳ＊Ｙ（配列番号２）（Ｓ＊は、ホスホセリンを示す）を有する。二リン酸化ペプチドのような他のリン酸化ペプチドおよびリン酸化され得るペプチドのような他のペプチドは、本発明の三元複合体を提供するために使用され得ることが理解される。
【００２４】
図１は、酵素に架橋するポリペプチドを示すＧＳＫ３−β三元複合体の構造の例示である。図２Ａおよび図２Ｂは、結合ペプチドを有するＧＳＫ３−β三元複合体活性部位の表面表示である。図３Ａ〜図３Ｃは、ＧＳＫ３−β三元複合体の活性部位に浸漬された代表的な化合物の例示である。以下の化合物は、酵素活性部位と相互作用することが示され：
【００２５】
【化１】
2005532265.tif 000002
化合物のアミノ−ピリジン基は、リンカー領域と２つの水素結合を形成し、化合物のイミダゾールは、β鎖領域と水素結合を形成せず、そして化合物のジクロロフェニル基は、キナーゼの触媒領域の近傍にある疎水ポケットに適合する。浸漬された上記の化合物を有するＧＳＫ３−β構築物の三次元構造（原子座標の表として提供される）は、表３において供与される。
【００２６】
（ＧＳＫ３−βタンパク質構築物：発現、精製、および結晶化）
１つの局面において、本発明は、ＧＳＫ３−β構築物、アデノシン二リン酸、およびリン酸化ペプチドを含む三元複合体である組成物を提供する。ＧＳＫ３−β構築物は、タンパク質の触媒キナーゼドメインを含む。構築物は、ヒトＧＳＫ３−βの少なくとも残基３７〜３８４を含み、そしてタンパク質のＣ末端で３６個のアミノ酸を欠く。組成物は、Ｘ線による回析研究による構造決定のために十分な結晶性形態である。
【００２７】
本明細書中で記載される構築物以外のＧＳＫ３タンパク質構築物（例えば、その活性突然変異体または改変体）は、ＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患状態の処置において、可能な治療化合物を同定する際に有用である三次元構造情報を提供し得ることが理解される。
【００２８】
（構築物配列）
構築物配列（配列番号１）が、以下に提供される。星印は、結晶構造において見られる第１の残基を示す。以下の構築物およびさらに有用な構築物ならびにその調製物は、２０００年７月２７日に出願された同時係属中の米国特許出願第６０／２２１、２４２号（この開示が全体として本明細書中で参考として、および全ての目的のために援用される）において記載される。
【００２９】
【化２】
2005532265.tif 000003
（構築物の精製）
ＧＳＫ３−βタンパク質構築物は、ＧＳＫ３−β  ５８０ｃＤＮＡ構築物を有するバキュロウイルスで感染したＳＦ−９細胞から抽出された。ＧＳＫ３−βタンパク質構築物は、Ｓ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、およびＧｌｕ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを使用して明らかに均質になるように精製された。次いで、精製されたタンパク質は、結晶化のために濃縮された。構築物の精製は、実施例１において記載される。
【００３０】
（構築物の結晶化）
タンパク質結晶は、ＧＳＫ３構築物の溶液から、例えば、ハンギングドロップ技術によって形成され得る。構造決定のために適切なＧＳＫ３構築物の適切な結晶を形成するための代表的な方法は、実施例２において記載される。
【００３１】
種々の結晶化方法（例えば、微結晶化方法を包含する）は、ＧＳＫ３活性によって媒介される種々の疾患状態の処置において、可能な治療化合物を同定する際に有用な三次元構造情報を得るために利用され得る。
【００３２】
（ＧＳＫ３−βタンパク質構築物構造）
本発明の別の局面において、ＧＳＫ３  三元複合体の三次元構造が提供される。アミノ酸配列データおよびＸ線回析データに由来する原子座標が、構築物の三次元構造を決定するために使用された。構築物の原子座標は、Ｘ線回析データと位相データの組み合わせから生成される電子密度マップから計算された。
【００３３】
構造決定のために適切な結晶形成の際に利用されるＧＳＫ３  三元複合体とともに、結晶構造は、種々の技術によって得られ得る。代表的な方法において、回析パターンは、Ｘ線イメージングプレートデバイスを使用して得られた。次いで、位相データは、分子置換によって得られた。次いで、電子密度マップが構築され、そして構造が解かれ、そして分子が構築された。結果として生じた構造は精密化され、そしてこの構造は検証された。最終的な結果は、ＧＳＫ３構築物の原子モデルであった。ＧＳＫ３結晶構造を得るための代表的な方法は。実施例３において記載される。
【００３４】
ＧＳＫ３構造が、種々の方法によって解かれ得ることが理解される。
【００３５】
結晶学的データの収集に対する統計は、表１において要約される。
【００３６】
【表１】
2005532265.tif 000004
ＧＳＫ３−β三元複合体の三次元構造（原子座標の表として提供される）は、表２において供与される。表中で、「ＯＨ２」とは、構造的な水分子をいい、そして「ＴＥＲ」とは、ペプチド鎖の末端をいう。
【００３７】
誘導された構造結晶に基づくＧＳＫ３−β三元複合体の三次元構造は、図１において図で例示される。三元複合体は、２つのドメインの間で形成される活性部位を有するＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、βバレルを含む。活性部分領域は、ＡＴＰ結合部位、マグネシウム結合／触媒塩基部位、および基質結合部位を含む。
【００３８】
誘導された構造結晶に基づくＧＳＫ３−β三元複合体の活性部位（触媒部位および基質結合部位を含む）の三次元構造は、図２Ａおよび図２Ｂにおいて図で例示される。活性部位は、他のアミノ酸残基の間で、Ｐｒｏ１３６およびＰｈｅ６７を含む。
【００３９】
リン酸化ペプチドの相互作用の領域は、酵素の領域に結合する基質中にあるが、ＡＴＰ結合部位（ほとんどのリード薬剤化合物の作用部位）中にはない。ペプチドと酵素との間および結晶マトリクス中のペプチドと酵素の対称対との間に形成される相互作用は、結晶の優れた形態が形成されるのを可能にするものであると考えられる。ペプチドと酵素の相互作用は、変化される。重要な相互作用の第１セットは、リン酸化ペプチドのＮ末端ホスホセリンがＡｒｇ−９６および水素結合を介してＶａｌ−２１４の主鎖アミドと相互作用する（静電相互作用のことである）。重要な相互作用の第２セットは、ペプチドの第２アルギニン（Ｃ末端の方に前進する）が、主鎖カルボニルのＰｒｏ−２５８’および側鎖のＡｓｐ−２６０’（プライムは、対称対を意味する）との相互作用によって、隣接する酵素の対称対との重要な静電相互作用を形成することである。ペプチドは、いくつかの他の副次的な疎水的相互作用を酵素および隣接する酵素の対称対の両方と作る。
【００４０】
アポタンパク質活性部位の構造情報は、ＧＳＫ３−β活性によって媒介される種々の疾患状態の処置において有効な治療化合物を誘導するリガンドの合理的設計のための基礎を提供し得る。従って、結晶学データから得られた構造情報は、リガンドプロフィールを発達させるために、および以下に記載されるようにＧＳＫ３−β活性を媒介するための薬物の合理的設計のために使用され得る。
【００４１】
（ＧＳＫ３の構造表示）
上で記述されるように、１つの局面において、本発明は、ＧＳＫ３−β活性によって媒介される種々の疾患状態の処置において、可能な治療化合物を同定するための方法を提供する。この方法は、ＧＳＫ三元複合体の三次元構造表示の使用を包含する。三次元構造表示は、（ａ）完全なＧＳＫ構築物、（ｂ）ＧＳＫ構築物を含むＧＳＫ３のフラグメント、または（ｃ）ＧＳＫ３活性を媒介し得るリガンドと相互作用するアミノ酸を含むＧＳＫ構築物のフラグメントを含む表示であり得る。
【００４２】
構造表示は、好ましくは、表２において示されるような原子座標に基づかれるか、またはそれらに由来され、これは、完全なＧＳＫ構築物の構造を示す。適切な構造表示は、三次元モデルおよびこれらの原子座標に由来する分子表面を含む。表２における座標は、構造的な水分子を含む。これらは、構造的に誘導される他のモデルにおいて変化し、そして非存在でさえあり得る（それらは、分解能依存性および空間群依存性である）。これらの溶媒分子は、結晶から結晶へ変化する。
【００４３】
表２において記述される原子座標の改変体（例えば、表２において記述される原子座標と比較して、全ての重原子（すなわち、水素ではない）についてのｘ、ｙ、およびｚ座標のＲＭＳ偏差が、約２．５Å未満（例えば、約２Å未満、好ましくは約１Å未満、より好ましくは約０．５Å未満、または最も好ましくは約０．１Å未満）である改変体）がまた、本発明のために使用され得る。原子の三次元空間関係が保持される座標変換がまた、適切な改変体を供与するために使用され得る。
【００４４】
本明細書中で提供される原子座標はまた、さらなるタンパク質構造のモデルの基礎として使用され得る。例えば、相同性モデルは、ＧＳＫ構築物構造に基づかれ得た。座標はまた、ＧＳＫ３のさらなる結晶構造（例えば、新規のリガンドを有する共結晶構造）の解において使用され得るか、または精密化の際に使用され得る。
【００４５】
（ＧＳＫ３の構造表示記憶媒体）
ＧＳＫ三元複合体の原子座標は、コンピューターのようなコンピューターデバイス（例えば、スーパーコンピューター、大型コンピューター、小型コンピューター、またはマイクロプロセッサー）を用いる後の使用のために媒体上で記憶され得る。代表的には、座標は、磁気媒体または光学媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、コンパクトディスク）、磁気光学媒体（「フロッピー（登録商標）の」ディスクもしくは磁気テープ）または電子媒体（例えば、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）もしくは読み取り専用メモリー（ＲＯＭ）のような多量のデータを保持するために有用な媒体上で記憶される。記憶媒体は、コンピューターに対して局所であり得るか、または遠隔であり得る（例えば、ネットワーク化された記憶媒体（インターネットを含む））。コンピューター、記憶媒体、ネットワーキング、および他のデバイスまたは技術の選択は、構造／コンピューター化学分野の当業者に公知である。
【００４６】
本発明はまた、コンピューターのためのコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、これは、ＧＳＫ三元複合体の原子座標および／または三次元構造表示を含む。原子座標は、好ましくは表２において記述されるものか、またはそれらの改変体である。任意の適切なコンピューターが、本発明において使用され得る。
【００４７】
（ＧＳＫ３−βリガンドプロフィールの発達）
上で記述されるように、結晶学データから得られた構造情報は、ＧＳＫ３−β活性を媒介するための化合物を合理的に設計するために有用なリガンドプロフィールを発展させるために使用され得る。リガンドプロフィールは、アポタンパク質について上述されたように得られた構造情報を考慮することによって、発展され得る。リガンドプロフィールは、さらに発展され得、そして結合リガンドを有するタンパク質のさらなる構造決定で精密化され得る。最終的に発展されたリガンドプロフィールは、ＧＳＫ３−β活性を媒介するための可能な治療化合物を同定する。
【００４８】
リガンドプロフィールは、主として、リガンドとタンパク質リガンド結合部位との間の形状相互作用に基づかれ得る。形状相互作用の評価は、リガンド立体配座特性の考慮を含み得、これは、リガンド結合部位と比較して低エネルギー立体配座を達成する能力をベースにしたリガンドを評価する。形状相互作用はまた、リガンドと結合部位との間のエンタルピー相互作用を最大にするように努め得る。
【００４９】
リガンドプロフィールを発展させるプロセスは、幅広く変更し得る。例えば、プロフィールは、専門家による活性部位構造の視覚検査によって発達され得る。そのような検査は、結合部位およびリガンド構造ならびに化合物データベース検索の考慮を含み得る。プロフィールの発展はまた、他の類似のタンパク質との公知のリガンド結合相互作用の考慮とともに、生物データおよび構造活性相関（ＳＡＲ）を考慮し得る。
【００５０】
任意の事象において、リガンドプロフィールは、リガンド結合相互作用（第１相互作用および第２相互作用を含む）を考慮することによって発展され、そして薬剤運搬体の定義を得る。用語「薬剤運搬体（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）」とは、リガンド活性を担う特定の特徴を示す化学的特徴および三次元の束縛の集団をいう。薬剤運搬体は、他の特徴のうち、表面で接近可能な特徴、水素結合のドナーおよびアクセプター、荷電／イオン化可能な基、ならびに／または疎水性パッチを含む。
【００５１】
上で記述されるリガンドプロフィール発展のためのプロセスに加えて、ＧＳＫ３活性を媒介するようにＧＳＫ３と相互作用する化合物を同定するために、他の構造ベースの薬物設計技術は、ＧＳＫ３構造物の構造表示に適用され得る。種々の適切な技術が、当業者にとって利用可能である。
【００５２】
構造ベースの薬物設計の際に使用するための分子モデリング技術を実行するためのソフトウェアパッケージとしては、他のうち、ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ）から利用可能）；ＡＭＢＥＲ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｏｘｍｏｌ．ｃｏ．ｕｋ／）から利用可能）；ＣＥＲＩＵＳ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）；ＩＮＳＩＧＨＴＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）；ＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）；ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）；ＨＹＰＥＲＣＨＥＭ（Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｈｙｐｅｒ．ｃｏｍ／）から利用可能）；ＦＩＲＳＴ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ）から利用可能），ＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｃｈｅｍｃｏｍｐ．ｃｏｍ）から利用可能），およびＣＨＥＭＳＩＴＥ（Ｐｙｒａｍｉｄ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｃｈｅｍｓｉｔｅ．ｏｒｇ／）から利用可能）が挙げられる。
【００５３】
モデリングソフトウェアは、ＧＳＫ３結合表面を測定し、そしてファン・デル・ワールス接触、静電相互作用、および／または水素結合機会（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）のような特徴を示すために使用され得る。これらの結合表面は、リガンドとＧＳＫ３のドッキングモデルを作り、薬物運搬体仮説に到達するように、そしてデノボで可能な治療化合物を設計するために使用され得る。
【００５４】
（ＧＳＫ３−βリガンドの仮想スクリーニング）
アポタンパク質の三次元構造、および特にこのタンパク質の活性部位の構造は、活性部位への化合物の適合の決定を可能にする。迅速なドッキングプログラムを利用することで、例えば、化合物データベースに由来する個々の化合物は、活性部位結合について評価され得る。特定の化合物の適合が評価され得、そしてスコアリングされ得る。次いで、スコア閾値の設定は、仮想スクリーニングに対する解として化合物のファミリーを提供し得る。
【００５５】
第１レベルで、仮想スクリーニングは、アポタンパク質の活性部位の三次元構造を考慮する。第２レベルで、仮想スクリーニングは、リガンドプロフィールを考慮し、そして結合リガンドを有するタンパク質の構造決定から得られた情報を利用し得る。結合リガンドに関する構造情報が存在しない場合であっても、仮想スクリーニングは可能である。
【００５６】
仮想スクリーニングから得られた情報は、リガンドプロフィールをさらに発展させるために考慮され得る。あるいは、仮想スクリーニングの結果が有望な化合物を示す場合、この化合物は得られ得、そして関連した生物活性についてスクリーニングされ得る。
【００５７】
（ドッキング）
ドッキングとは、２つ以上の分子がエネルギー考察に基づいて配列されるプロセスをいう。ドッキングは、分子から形成される複合体の立体配座を予測するような２つ以上の分子の三次元構造を配列する（例えば、ＢｌａｎｅｙおよびＤｉｘｏｎ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：３０１，１９９３を参照のこと）。本発明の実施において、ＧＳＫ３との相互作用する能力を評価するために、分子は、ＧＳＫ３構築物構造とドッキングされる。
【００５８】
ドッキングは、リガンドおよびそのレセプターのゲノムマッチングまたは相互作用のエネルギーの最小化のいずれかによって達成され得る。その相対的な速さに起因して、ゲノムマッチングアルゴリズムが好ましい。
【００５９】
適切なドッキングアルゴリズムとしては、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９〜２８８，１９８２，ＵＣＳＦから利用可能）（構造ベースの薬物設計のための基本型プログラム）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（ＧｏｏｄｓｅｌおよびＯｌｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：１９５〜２０２，１９９０およびＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ／ｏｘｍｏｌ．ｃｏ．ｕｋ／から利用可能）（グリッドベースのＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏシミュレーションアニーリングを使用して、リガンドを順応的な様式でレセプターとドッキングする）が挙げられる。剛体ドッキングにおける開始立体配座は、通常リガンドの最小エネルギーの立体配座方向へ偏向している一方で、結合立体配座が、相対的に高い立体配座エネルギーであり得るので（Ｎｉｃｋｌａｕｓら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：４１１，１９９５）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ手順の順応的な特性は、利用者（検索者）によって導入される偏向（例えば、活性部位中のリガンドの配向および立体配座における）の回避を助ける（Ｍｅｙｅｒら，Ｐｅｒｓｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．３：１６８〜９５，１９９５）。
【００６０】
他の適切なドッキングアルゴリズムとしては、ＭＯＥ−ＤＯＣＫ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｃｈｅｍｃｏｍｐ．ｃｏｍ）から利用可能）（シミュレートされたアニーリング検索アルゴリズムが使用され、リガンドを順応的にドッキングさせ、そしてグリッドベースのエネルギー評価がドッキングされた立体配座をスコアリングするために使用され得る）；ＦＬＥｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ）から利用可能）（リガンドを部位内で組み立て、そしてリガンド−レセプター相互作用の強度に基づいたドッキングされた立体配座をスコアリングする漸増構築アルゴリズムを使用して、立体配座的に柔軟なリガンドを結合部位内にドッキングさせる）；ＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：７２７〜７４８，１９９７）（リガンド全体の柔軟性および部分タンパク質の柔軟性を有し、そしてエネルギー関数が立体配座および非結合性の接触情報に一部基づく順応的なリガンドドッキングについての遺伝的アルゴリズム）；ＡＦＦＩＮＩＴＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）（リガンドをドッキングするために、２工程プロセスを使用する：第１に、立体配座空間およびＣａｒｔｅｓｉａｎ空間の両方を検索するために、レセプター内へのリガンドの初期置換が、Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ型の手順を使用して行われる；そして第２に、シミュレートされたアニーリング相が、各リガンド置換の位置を最適化し、この相の間に、ＡＦＦＩＮＩＴＹは、「巨大な」レセプターリジッド（結合部位内に原子は存在しない）を保持する一方で、結合部位原子およびリガンド原子は移動可能である）；Ｃ２ＬｉｇａｎｄＦｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能）（リガンド−レセプター複合体のエネルギーを使用し、保持された構造的サンプリングからの最良の結果を有する最良の結合モードおよび確率論的立体配座検索技術を自動的に見つける）が挙げられる。グリッド方法は、リジッドレセプターと順応的なリガンドドッキングとの間の非結合性の相互作用を評価するために使用される。ＤＯＣＫＩＴ（Ｍｅｔａｐｈｏｒｉｃｓ  ＬＩＣから利用可能）は、迅速な順応的リガンドドッキングのためにディスタンスジオメトリーを使用する。ＧＬＩＤＥ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｉｎｃ．から利用可能）は、順応的なドッキングのために、プレコンピュータ化エネルギーグリッドおよび効率的で簡潔な系統的検索を使用する。
【００６１】
好ましくは、ドッキングアルゴリズムは、ハイスループットモード（潜在的なリガンドの巨大な構造ライブラリーのメンバーが、レセプター構造に対してスクリーニングされる）において使用される（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５-〜５４，１９９２）。
【００６２】
適切な構造ライブラリーとしては、ＡＣＤ（Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，ｆｏｒｍ  ＭＤＬ  Ｉｎｃ．，）、ＡｓＩｎＥｘ、Ｂｉｏｎｅｔ、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、ｔｈｅ  Ｄｅｒｗｅｎｔ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｄｅｘ（ＷＤＩ）、ｔｈｅ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙデータベース、ＬａｂｏＴｅｓｔ、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｉｃｋ、ＣｈｅｍＳｔａｒ、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅ、Ｏｒｉｏｎ、ＳＡＬＯＲ、ＴＲＩＡＤ、ＩＬＩＡＤ、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅデータベース（ＮＣＩ）、およびｔｈｅ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、ならびにＭａｙｂｒｉｄｇｅ  ｃａｔａｌｏｇｓが挙げられる。これらは市販される（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒからのｔｈｅ  ＨＴＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、またはＴｒｉｐｏｓからのｔｈｅ  ＬｅａｄＱｕｅｓｔＴＭｆｉｌｅ）。
【００６３】
（薬物運搬体の定義）
上で記述されるように、薬物運搬体は、他の特徴のうちで、表面で接近可能な特徴、水素結合ドナーおよびアクセプター、荷電／イオン化可能な群、ならびに／または疎水性パッチを含むＧＳＫ３  三元複合体について定義され得る。これらの特徴は、付与される活性における相対的な重要性に依存して重みづけられ得る（例えば、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌｅａｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ＴｅｓｔｒａおよびＦｏｌｋｅｒｓ，１９９７を参照のこと）。
【００６４】
薬物運搬体は、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（ＨｙｐｏＧｅｎまたはＨｉｐＨｏｐ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ／）から利用可能である）を含む）、ＣＥＲＩＵＳ２のようなソフトウェアを使用して決定され得るか、またはリード化合物の公知の立体配座から手動で構築され得る。薬物運搬体は、ＣＡＴＡＬＹＳＴのようなプログラムを使用して構造ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。ＣＬＩＸプログラム（ＤａｖｉｄおよびＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １２：３１〜４１，１９９２）もまた使用され得、このプログラムは、レセプターと相互作用する化学群との最大空間一致を生じる構造データベースにおける候補分子の配向を検索する。ＤＩＳＣＯプログラム（Ｔｒｉｐｏｓから利用可能）は、各構造中の共通の薬物運搬体特徴を同定し、必要に応じて整列された構造を生じ、そして薬物運搬体の重要な特徴を引き出すためのクリーク検出の方法を使用する。ＧＡＳＰプログラム（Ｔｒｉｐｏｓから利用可能）は、自動的に構造的な柔軟性を有する薬物運搬体を見出すための遺伝的アルゴリズムを使用する。
【００６５】
（デノボでの化合物設計）
ＧＳＫ３  三元複合体の結合表面および薬物運搬体は、官能基（例えば、陽子、ヒドロキシル基、アミン基、酸性基、疎水基および／または二価陽イオン）または低分子フラグメントのための有利な相互作用位置をマップするために使用され得る。次いで、関連官能基がＧＳＫ３と相互作用するように正確な空間的な関係で位置付けられる化合物が、デノボで設計され得る。
【００６６】
一旦、ＧＳＫ３の結合性表面における特異的な部位と相互作用し得る官能基または低分子フラグメントが同定されたならば、それらは、正確なサイズおよび形態を有する架橋フラグメントまたは有利な配向で官能基を支持し得るフレームワークのいずれかを使用して単一化合物と連結され得、これにより、本発明に従う化合物を提供する。本方法で官能基との連結が手動で行われ得る一方で、おそらくＱＵＡＮＴＡまたはＳＹＢＹＬのようなソフトウェアの助力をもって、自動化または半自動化デノボ設計アプローチがまた、使用され得る。
【００６７】
適切なデノボ設計ソフトウェアとしては、ＭＣＤＬＮＧ（Ｇｅｈｌｈａａｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４６６−７２，１９９５）（レセプター結合部位を一般的な原子の密接に充填されたアレイで満たし、そしてＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ手順を使用して、原子型、位置、結合整列および他の特性をランダムに変更させる）；ＭＣＳＳ／ＨＯＯＫ（Ｃａｆｌｉｓｈら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２１４２〜６７，１９９３；Ｅｉｓｅｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１９９〜２２１，１９９４；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ）から利用可能）（複数の官能基とデータベースから得られた分子テンプレートを連結させる）；ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ６：６１〜７８，１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｍｓｎ．ｃｏｍ）から利用可能）（リガンドによって理想どおりに遂げられた相互作用の点を計算し、レセプターと相互作用する能力に基づいた結合部位にフラグメントを置く、そしてリガンドを生成するためにそれらを連結させる）；ＧＲＯＷ（ＭｏｏｎおよびＨｏｗｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：３１４〜３２８，１９９１）（初期の「種子」フラグメント（手動または自動で置かれた）で開始し、そしてリガンドを外部方向へ伸長させる）；ＳＰＲＯＵＴ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍ．ｌｅｅｄｓ．ａｕ．ｕｋ／ＩＣＡＭＳ／ＳＰＲＯＵＴ．ｈｔｍｌから利用可能）（結合ポケット内の有利な水素結合および疎水性領域を同定するための分子を含み（ＨＩＰＰＯモジュール）、構造生成のための開始フラグメントを形成するために官能基を選択し、そしてそれらを標的部位で位置決めし（ＥｌｅＦａｎＴ）、開始フラグメント上のスペーサーフラグメントを伸長することによって結合ポケットの立体化学的束縛を満足する骨格を生成し、そして得られた部分骨格を結合させ（ＳＰＩＤｅＲ）、レセプター部位の静電特性と相補的な静電特性を有する分子を生成するために、ヘテロアトムで骨格を置換し（ＭＡＲＡＢＯＵ）、そして解がクラスター化され得、そしてＡＬＬｉｇａＴＯＲモジュールを使用してスコアリングされ得る）；ＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ）から利用可能）（徐々に構造変化を小さくし、そして迅速に新規化合物の結合エネルギーを評価することによってリガンドを評価し、変更された結合エネルギーに基づいて変化を保つかまたは放棄し、そしてレセプターとの相互作用エネルギーを増大するように構造を発展させる）；ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（Ｒｏｒｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００，１９９３）（共通の有機テンプレートのライブラリーならびにレセプター結合部位と相補的な、化学的に無理のない構造ならびに立体化学的特性および静電的特性を有するリガンドとレセプターとの間の非結合性相互作用の完全な経験的な力場の記載を使用する）；ＣＡＶＥＡＴ（ＬａｕｒｉおよびＢａｒｔｌｅｔｔ，Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ  ８：５１〜６６，１９９４）（非環式分子を束縛するための連結装置を設計する）；およびＲＡＳＳＥ（Ｌａｉ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．３６：１１８７〜１１９４，１９９６）が挙げられる。
【００６８】
（ＧＳＫ３−βリガンド）
構造ベースの設計サイクルを開始するほとんどのリード化合物は、ハイスループットスクリーニングによって同定される。上述されるハイスループットスクリーニングとリガンドプロフィールと仮想スクリーニングの結果として、適切な形状を採り、かつタンパク質の活性部位に結合するための必須の立体配座エネルギーを有するリガンドが、同定される。低い立体配座エネルギーを有し、そしてアポタンパク質の活性部位との空間的な適合性を有することに加えて、同定されたリガンドは、好ましくは、合成的に接近可能である。次いで、同定されたリガンドが得られ（例えば、市販で得られるか、または合成される）そして生物活性についてスクリーニングされ得る。同定されたリガンドはまた、タンパク質構築物とともに共結晶化され得、そしてその三次元構造が、結合したリガンドを有するタンパク質について決定され得る。次いで、結合したリガンドを有するタンパク質の構造から得られた情報が、さらに上述されたようなリガンドプロフィールを発展させるために使用され得る。
【００６９】
リガンド生物学的活性を評価するための適切なＧＳＫ３−β生物学的スクリーニング方法が公知であり、そして、例えば、２０００年３月２９日に出願された米国特許出願第６０／１９３，０４３号（本明細書中で全体が参考として明白に援用される）において記述される方法が挙げられる。
【００７０】
（ＧＳＫ３結晶構造を使用する合理的な薬物送達のための方法）
別の局面において、本発明は、ＧＳＫ３−βに結合し、そしてその活性を媒介するためのリガンドを設計するために、ＧＳＫ３結晶構造（特に、ＧＳＫ３構築物の活性部位の三次元構造）を使用するための方法を提供する。
【００７１】
１つの実施形態において、方法は、治療化合物の設計のための反復的な構造ベースの方法である。代表的な方法は、図４において示されたフローダイアグラムによって表示される。図４で言及されるように、アポタンパク質および結合したリガンドを有するタンパク質の結晶構造は、それぞれ、工程１０２および工程１０４において決定される。工程１０２および工程１０４から得られた構造情報から、リガンドプロフィールは、工程１０６において発展される。リガンドプロフィールはまた、アポタンパク質の結晶構造から直接発展され得る。得られたタンパク質を使用して、新規のリガンドが設計され得そして／または得られ得、生物活性についてスクリーニングされ得、そして／または工程１０８においてタンパク質と共結晶化され得、あるいは、リガンドプロフィールは、工程１１０における仮想スクリーニングにおいて使用され得る。発展したプロフィールから得られたリガンドが共結晶化された場合、共結晶構造は、工程１０４において決定され、そして得られた構造情報は、工程１０６においてリガンドプロフィールをさらに発展させるために使用される。リガンドプロフィールが工程１１０における仮想スクリーニングで使用される場合、仮想スクリーニングは、成功しそして得られ得た１つ以上のリガンドを同定され、スクリーニングされるか、そして／または工程１０８において共結晶化されるかのいずれかである。仮想スクリーニングが適切なリガンドを同定することに不適切である場合、リガンドプロフィールは、さらに工程１０６において発展される。
【００７２】
リード化合物は、リガンドプロフィールによって発展されたリガンドの生物学的スクリーニングから同定され得る。リード化合物を同定するための代表的な方法は、図５で示されたフローダイアグラムによって表示される。図５で言及されるように、アポタンパク質および結合リガンドを有するタンパク質の結晶構造は、それぞれ、工程２０２および２０４において決定される。工程２０２および２０４から得られた構造情報から、リガンドプロフィールは、工程２０６において発展される。リガンドプロフィールはまた、アポタンパク質の結晶構造から直接発展され得る。得られたプロフィールから、新規リガンドが設計され得、そして／または工程２０８において得られ得、そして工程２１０で生物活性についてスクリーニングされ得、そして／または工程２１２においてタンパク質と共結晶化され得るかのいずれかである。生物スクリーニングが成功する場合、リード化合物は、工程２１４において同定される。引き続く反復において、リード化合物は、工程２１２において共結晶化され得、そして反復は、新規薬物候補が同定されるまで続けられ得る。生物学的スクリーニングが成功しない場合、その情報は、工程２０６においてリガンドプロフィールをさらに発展させるために使用され得る。リガンドが共結晶化される場合、共結晶構造は、工程２０４において決定され得、そして構造情報が、工程２０６においてリガンドプロフィールをさらに発展させる際に使用され得る。
【００７３】
あるいは、リガンドプロフィールの結果は、工程２１６における仮想スクリーニングで使用され得る。仮想スクリーニングが成功しそして１つ以上のリガンドを同定する場合、リガンドは工程２０８において得られ得、そしてその生物活性およびリード化合物が同定されているか否かを決定するために工程２１０においてスクリーニングされ得る。工程２０８において得られたリガンドはまた、工程２１２において共結晶化され得、そしてその構造が決定され得、そして得られた情報は、リガンドプロフィールをさらに発展させるために使用され得る。仮想スクリーニングが適切なリガンドを同定する際に不成功である場合、リガンドプロフィールは、さらに工程２０６において発展される。
【００７４】
（ＧＳＫ３リガンドおよびその使用）
本発明の方法は、ＧＳＫ３と相互作用し得るリガンドを同定する。これらの化合物は、デノボで設計され得、公知の化合物であり得るか、または公知の化合物に基づかれ得る。化合物は、有用な薬物自体であり得るか、あるいは結合親和性または他の薬物学的に重要な特徴（例えば、バイオアベイラビリティ、毒物学、代謝、薬物動態学）を改善するための、さらなる薬物精密化のために使用され得る原型（すなわち、リード化合物）であり得る。
【００７５】
従って、別の局面において、本発明は、（１）本発明の方法を使用して同定される化合物；（２）薬物として使用するために、本発明の方法を使用して同定される化合物；（３）ＧＳＫ３活性を媒介するために、医薬の製造において本発明の方法を使用して同定される化合物の使用；および（４）ＧＳＫ３活性によって媒介される状態に苦しむ患者を処置するための方法（本発明の方法を使用して同定される化合物の量を投与することを含み、これは、ＧＳＫ３活性を媒介するために有効である。
【００７６】
これらの化合物は、好ましくは、マイクロモーラーまたは、より好ましくは、ナノモーラー範囲あるいはより強い範囲での結合拘束を有するＧＳＫ３と相互作用する。
【００７７】
構造ベースの設計技術によって同定されたリガンドは、個々に有用な化合物であり、そしてまた、慣用的なインビトロまたはインビボでのスクリーニング方法のための化合物のライブラリーを示唆するために使用され得る。ＧＳＫ３結合活性のスクリーニングのために、リガンド中の重要な薬学的モチーフが同定され得、そして化合物ライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）において模倣され得る。
【００７８】
本発明の前述の局面および他の局面は、以下の代表的な例と関連してより理解され得る。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
（ＧＳＫ３−β構築物精製）
この実施例において、ＧＳＫ３−βタンパク質構築物の精製を記載する。ＧＳＫ３−β５８０ｃＤＮＡ構築物を有するバキュロウイルスで感染した構築物を、ＳＦ９細胞から抽出し、そして以下で記載するように、Ｓ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、およびＧｌｕ−ｔａｇアフィニティークロマトグラフィーを使用して明らかに均質になるように精製した。
【００８０】
（抽出）
感染ＳＦ−９細胞の２０Ｌの発酵物からの細胞ペーストを、１００ｍＬのＰＢＳ（１０ｍＭ  ＮａＰｉ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄し、次いで３００ｍＬの緩衝液Ｈ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭタングステン酸塩、１ｍＭヒ酸塩、５０ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１μｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ、１０％グリセロール、０．３５％オクチルグリコシド、１ｍＭ  Ｍｇ２＋）で再懸濁した。細胞を１００−ｍＬ  Ｄｏｕｎｃｅｒ（ペステル（ｐｅｓｔｅｌ）Ｂを有する２０ストローク）中にホモジネートした。細胞破片および核を除去するために、組み合わせたホモジネートを、Ｔｉ４５ローター中で４０，０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した。遠心分離からの上清を、注意深くデカントし、そして０．４５μフィルターを通して濾過した。
【００８１】
（Ｓ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌクロマトグラフィー）
１７５ｍＬのＳ−ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８８８２）を５ｃｍ×８．９ｃｍカラム中にパックし、そして５倍カラム容量の緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）で平衡化した。濾過された上清を充填する前に、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む１倍カラム容量の緩衝液Ａを平衡化したカラムに通した。次いで、前の工程からの濾液を、２０ｍＬ／分でカラム上に充填した。カラムを５０ｍＭを含むＤＴＴ３倍カラム容量の緩衝液Ａおよび２倍カラム容量の緩衝液Ａで洗浄し、次いで２０倍カラム容量にわたって緩衝液Ａ中に、０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。溶離物を２０ｍＬ画分に分画した。ＧＳＫ３を含む画分は、抗ＧＳＫ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＣ−７２９１）を使用するウェスタンブロッティングによって検出した。ウェスタンブロッティング陽性画分をプールし、そして等量の緩衝液Ｍ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、３．１Ｍ  ＮａＣｌ）と混合し、そして０．４５μのフィルターを通して濾過した。濾液を、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍクロマトグラフィーに対して使用した。
【００８２】
（Ｐｈｅｎｙｌ−６５０  Ｍクロマトグラフィー）
３７．５ｍＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０  Ｍ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ、カタログ番号０１４９４３）を、２．２×１０ｃｍカラム中に充填し、そして５倍カラム容量の緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１．６Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化した。Ｓ−ｆｒａｃｔｏｇｅｌ工程からの濾液を、７．５ｍＬ／分でカラム上に充填した。充填が完了した後、カラムを５倍カラム容量の緩衝液Ｃで洗浄し、そして２０倍カラム容量にわたって、０％〜１００％の緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール）の直線勾配で溶離した。画分を１５ｍＬずつ集め、そしてＧＳＫを含む画分を、抗ＧＳＫ抗体を使用するウェスタンブロッティングによって検出した。ウェスタン陽性画分をプールし、そしてＧｌｕ−タグ抗体アフィニティーカラム上で充填した。
【００８３】
（Ｇｌｕ−タグアフィニティークロマトグラフィー）
５０ｍｇのＧｌｕ−タグ抗体を２８ｍＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０（ＢｉｏＲＡＤ、カタログ番号１５３−６０４６）上に固定し、そして２．２×６．５ｃｍカラム中にパックした。カラムを５倍カラム容量の緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２％オクチルグルコシド）で平衡化し、そしてＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ工程からの画分プールを、２．８ｍＬ／分で充填した。充填が完了した後、カラムを５倍カラム容量の緩衝液Ｄで洗浄し、次いでＧｌｕ−タグペプチド（１００μｇ／ｍＬ）を含む１００ｍＬの緩衝液Ｄで溶離し、そして４ｍＬ画分に分画した。ＧＳＫを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色で検出した。これらの画分をプールして、濃縮し、そして１０ｋ  ＭＷＣＯ  ＹＭ１０膜を使用してＡｍｉｃｏｎ濃縮器に、約４．８ｍｇ／ｍＬまで緩衝液Ｄへとダイアフィルトレートした。次いで、濃縮された物質を、結晶化のために提供した。
【００８４】
（実施例２）
（ＧＳＫ３−β構築物の結晶化）
この実施例において、ＧＳＫ３−β三元複合体の結晶化を記載した。
【００８５】
１００ｍＭの７個の残基ペプチド（Ｎ−ＬＳＲＲＰＳ＊Ｙ−Ｃ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから購入した）を含む溶液（２０ｍＭ  ＡＴＰ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を、１：１０の比（ｖ：ｖ）で標準的な貯蔵緩衝液中のＧＳＫ３−βタンパク質溶液と混合した。使用したＧＳＫ３−βタンパク質溶液は、ＧＳＫ３−βタンパク質を貯蔵緩衝液（１×ＴＢＳ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、０．２％（ｖ：ｖ）オクチルグルコピラノシド、および５ｍＭ  ＤＴＴ）中に４．８ｍｇ／ｍｌで含んだ。得られた溶液を、氷を入れたバケツ中で４°Ｃで２時間インキュベートした。このインキュベーション期間の次に、結晶ドロップを、ハンギングドロップ方法を使用して仕込んだ。７〜１２％（ｗ：ｖ）ＰＥＧ６０００および５〜８％ＭＰＤ（ｖ：ｖ）を含み、緩衝剤として１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を有する沈殿剤溶液の２次元グリッドを、リンブロ（ｌｉｎｂｒｏ）培養プレートのレサバにおいて確立した。タンパク質溶液（２μＬ）を、ガラスカバーガラス上で、レサバからの２μＬの沈殿剤溶液と混合した。次いで、このカバーガラスをウェルのレサバの上に置いた。三元結晶を一晩増大させ、そして４日目に最大サイズに達した。この結晶を標準的なＧＳＫ３−β凍結溶液中で、凍結保存した。得られた結晶は、非対称性単位でモノマーを有するＰ２１空間群で成長し、そしておおよそ以下の単位胞を有する：ａ＝５７．０Å、ｂ＝６４．８Å、ｃ＝５７．２Å、α＝γ＝９０°、β＝１００．９°。これらの結晶は、インハウスＸ線供給源上では２．２Åおよびシンクロトンビームライン線上で２．０Åより良好に回析する。実際に三元複合体を形成するようなペプチドは、二リン酸化ペプチドであることが留意されるべきであり、このペプチドは、インキュベーション期間に酵素反応において形成されなければならない。
【００８６】
薬物送達のための化合物の浸漬は、結晶を５μＬのウェル溶液（上記を参照のこと）および１ｍＭ（または他の適切な濃度）のリード化合物からなるドロップに、１２〜２４時間移植することによって容易に行われる。この時間の間に、ＡＤＰおよびペプチドは、結晶から「しみ出る」一方で、リード化合物は浸漬する。これは、結晶が（およそ２．５オングストローム）回析し得る分解能を幾分低下させるが、迅速な複合体の構造決定を可能にする。これらの結晶は、浸漬された化合物によって引き起こされる変化に対して不浸透性であるようだ。
【００８７】
この結晶を、１２％ＰＥＧ６０００、１１％ＭＰＤ、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールからなる凍結溶液中でデータ収集のために凍結防止し得る。この凍結溶液は、約１０〜約１４重量パーセントのポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、約９〜約１３重量パーセントの２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、および約１８〜約２２重量パーセントのグリセロールを含み得る。この凍結溶液は、約７．３〜約７．７のｐＨを有し得る。
【００８８】
（実施例３）
（ＧＳＫ３−β三元複合体結晶構造分解能）
この実施例において、ＧＳＫ３−β三元複合体の結晶構造を解くための代表的な方法を記載する。
【００８９】
ＧＳＫ３−β三元複合体結晶構造の結晶構造を、Ｃ２２２（１）結晶構造（ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５４９を参照のこと）およびプログラムＥＰＭＲ（Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒら，「Ｒａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｂｙ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｅａｒｃｈ」Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５５（Ｐｔ  ２）：４８４〜９１、１９９９年２月）を使用して得た。次いで、数回の精密化マクロサイクルによって解を処理した。代表的な精密化マクロサイクルは、１００〜２００回の共同勾配最小化、ねじれ力学またはＣａｒｔｅｓｉａｎ力学のいずれかによるシミュレーションアニーリング、およびグループ化または個々の温度因子計測からなる。全ての精密化手順を、プログラムＣＮＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して実行した。この後は、プログラムＯ（ＤＡＴＡＯＮＯ  ＡＢ）を使用して、新規の電子密度マップの計算およびこれらのマップ内の特徴に基づいたモデルの手動でのリモデリングを実施した。データセット中の５０Å〜２．０Åからの全データを使用した。大部分の構造が、ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９５４９において記載されるＧＳＫ３−βの結晶形態と非常に類似していることが記述されるべきである。ＡＤＰおよびペプチドを、１回目の精密化後、電子密度マップに構築した。このプロセスが５０．０〜２．０オングストロームからの全データに関して、２５．１のＲ因子および３１．９のＲフリーで収束する前に、構造は、数回の精密化（２３５構造水の添加を含む）で経た。
【００９０】
単一／複数回の同形置換または分子自身によるＭＡＤ位置決定あるいは分子置換と組み合わせたこれらの方法のようなより慣用的な方法をも、同等に使用し得た。これらの方法および他の結晶学の原理の記載は、Ｓｃｏｉｃｈｅｔ、Ｂ．Ｋ．およびＤ．Ｅ．Ｂｕｓｓｉｅｒｅ、「Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｖｅａｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３（４）：４０８〜４２２、２０００において見出され得る。
【００９１】
ＧＳＫ３−β三元複合体および浸漬された代表的な化合物を有するＧＳＫ３−β構築物についての原子座標は、それぞれ、表２および表３において示される。水の位置が結晶から結晶で変化することが理解される。
【００９２】
【数１】
2005532265.tif 000005
【００９３】
【数２】
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【００９４】
【数３】
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【００９５】
【数４】
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【００９６】
【数５】
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【００９７】
【数６】
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【００９８】
【数７】
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【００９９】
【数８】
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【０１００】
【数９】
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【０１０１】
【数１０】
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【０１０２】
【数１１】
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【０１０３】
【数１２】
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【０１０４】
【数１３】
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【０１０５】
【数１４】
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【０１０６】
【数１５】
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【０１０７】
【数１６】
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【０１０８】
【数１７】
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【０１０９】
【数１８】
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【０１１０】
【数１９】
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【０１１１】
【数２０】
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【０１１２】
【数２１】
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【０１１３】
【数２２】
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【０１１４】
【数２３】
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【０３３３】
【数２４２】
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【０３３４】
【数２４３】
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【０３３５】
【数２４４】
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【０３３６】
【数２４５】
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【０３３７】
【数２４６】
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【０３３８】
【数２４７】
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【０３３９】
【数２４８】
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【０３４０】
【数２４９】
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【０３４１】
【数２５０】
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【０３４２】
【数２５１】
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【０３４３】
【数２５２】
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【０３４４】
【数２５３】
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【０３４５】
【数２５４】
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【０３４６】
【数２５５】
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【０３４７】
【数２５６】
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【０３４８】
【数２５７】
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【０３４９】
【数２５８】
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【０３５０】
【数２５９】
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【０３５１】
【数２６０】
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【０３５２】
【数２６１】
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【０３５３】
【数２６２】
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【０３５４】
【数２６３】
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【０３５５】
【数２６４】
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【０３５６】
【数２６５】
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【０３５７】
【数２６６】
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【０３５８】
【数２６７】
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【０３５９】
【数２６８】
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【０３６０】
【数２６９】
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【０３６１】
【数２７０】
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【０３６２】
【数２７１】
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【０３６３】
【数２７２】
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【０３６４】
【数２７３】
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【０３６５】
【数２７４】
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【０３６６】
【数２７５】
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【０３６７】
【数２７６】
2005532265.tif 000280
【０３６８】
【数２７７】
2005532265.tif 000281
【０３６９】
【数２７８】
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【０３７０】
【数２７９】
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【０３７１】
【数２８０】
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【０３７２】
【数２８１】
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【０３７３】
【数２８２】
2005532265.tif 000286
【０３７４】
【数２８３】
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【０３７５】
【数２８４】
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【０３７６】
【数２８５】
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【０３７７】
【数２８６】
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【０３７８】
【数２８７】
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【０３７９】
【数２８８】
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【０３８０】
【数２８９】
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【０３８１】
【数２９０】
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【０３８２】
【数２９１】
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【０３８３】
【数２９２】
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【０３８４】
【数２９３】
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【０３８５】
【数２９４】
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【０３８６】
【数２９５】
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【０３８７】
【数２９６】
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本発明の好ましい実施形態が例示されそして記載される一方で、種々の変化が、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、その中でなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３８８】
添付される図面とともに考慮される場合、本発明の前述の局面および多くの付随の利点は、以下の詳細な説明に関する参考によってよりよく理解されるように、より容易に理解される：
【図１】図１は、ＧＳＫ３−β三元複合体の構造の例示である；
【図２Ａ】図２Ａは、結合したペプチドを有するＧＳＫ３−β三元複合体活性部位の表面表示である；
【図２Ｂ】図２Ｂは、結合したペプチドを有するＧＳＫ３−β三元複合体活性部位の表面表示である；
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＳＫ３−βの活性部位に浸漬された化合物の表示の例示である；
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＧＳＫ３−βの活性部位に浸漬された化合物の表示の例示である；
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＧＳＫ３−βの活性部位に浸漬された化合物の表示の例示である；
【図４】図４は、ＧＳＫ３−β活性を媒介するための可能な治療化合物を同定するために、ＧＳＫ３−β三元複合体の三次元構造を使用する代表的な本発明の方法のフローダイアグラムである；そして
【図５】図５は、ＧＳＫ３−β活性を媒介するための可能な治療化合物を同定するために、ＧＳＫ３−β三元複合体の三次元構造を使用する代表的な本発明の方法のフローダイアグラムである。
【配列表】
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2005532265.tif 000302
【図１】
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【図２Ａ】
2005532265.tif 000304
【図２Ｂ】
2005532265.tif 000305
【図３Ａ】
2005532265.tif 000306
【図３Ｂ】
2005532265.tif 000307
【図３Ｃ】
2005532265.tif 000308
【図４】
2005532265.tif 000309
【図５】
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【国際調査報告】
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