(57)【要約】本発明は、殺真菌剤を特定するための方法、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有する真菌のポリペプチドをコードする核酸、それらによってコードされるポリペプチド、並びに殺真菌剤の標的としての、および新規殺真菌活性化合物の特定への使用に関する。本発明は、前記ポリペプチドの修飾因子を検出するための方法、および前記ポリペプチドを含むトランスジェニック生物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物をグリオキサールオキシダーゼ阻害アッセイにおいて試験することを特徴とする、殺真菌剤を特定するための方法。
【請求項２】
グリオキサールオキシダーゼ阻害アッセイにおいて特定された化合物の殺真菌活性を真菌に対してアッセイすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリオキサールオキシダーゼを発現する細胞をグリオキサールオキシダーゼ阻害アッセイにおいて用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
受付番号Ｌ４７２８６およびＬ４７２８７のファネロカエテ・クリソスポリウムを除く、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有する真菌ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
植物病原性真菌に由来するポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
バシジオミセテスまたはアスコミセテスに由来するポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項４または５に記載の核酸。
【請求項７】
ウスチラゴおよびボトリチスに由来するポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項８】
一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとることを特徴とする、請求項４から７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
ゲノムＤＮＡの断片の形態またはｃＤＮＡの形態をとることを特徴とする、請求項４から８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
以下のものから選択される配列を含む、請求項４から９のうちの１項に記載の核酸：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１に示される配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）Ｃｕ２＋配位に適するアミノ酸チロシン１、チロシン２、ヒスチジン１、ヒスチジン２およびシステインを含むポリペプチドをコードする配列、
ｄ）長さが少なくとも１４塩基対である、ａ）からｃ）に定義される配列の部分配列、
ｅ）ａ）からｃ）に定義される配列との５０％同一性、特に好ましくは７０％同一性、とりわけ好ましくは９０％同一性を有する配列、
ｆ）ａ）からｃ）に定義される配列と相補的である配列、並びに
ｇ）遺伝子暗号の縮重のため、ａ）からｃ）に定義される配列と同じアミノ酸配列をコードする配列。
【請求項１１】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸および異種または同種プロモーターを含むＤＮＡ構築体。
【請求項１２】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸または請求項１１に記載のＤＮＡ構築体を含むベクター。
【請求項１３】
核酸が、原核または真核細胞における該核酸の発現を保証する調節配列に作動可能に連結する、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のＤＮＡ構築体または請求項１２または１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
原核細胞の形態をとることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
真核細胞の形態をとることを特徴とする、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
寄託番号ＤＳＭ１４５０９のウスチラゴ・メイジス株。
【請求項１８】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸によってコードされる、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２に示される配列と少なくとも２０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
以下の工程：
（ａ）それ自体公知の方法での完全化学合成、または
（ｂ）オリゴヌクレオチドの化学合成、オリゴヌクレオチドの標識、オリゴヌクレオチドと、真菌細胞に由来するゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡから出発して生成されるゲノムライブラリもしくはｃＤＮＡライブラリのＤＮＡとのハイブリダイズ、所望の核酸を含むクローンの選択およびこれらのクローンからのハイブリダイズするＤＮＡの単離、または
（ｃ）オリゴヌクレオチドの化学合成およびＰＣＲによる標的ＤＮＡの増幅
を含む、請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸を産生するための方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１４から１６のいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸の発現を保証する条件下で培養する工程、または
（ｂ）請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸をイン・ビトロ系において発現させる工程、および
（ｃ）細胞、培養培地またはイン・ビトロ系からポリペプチドを得る工程、
を含む、請求項１８または１９に記載のポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２３】
（ａ）請求項１４から１６のいずれか１項に記載の宿主細胞、請求項１７に記載の株の細胞または請求項１８もしくは１９に記載のポリペプチドを化合物または化合物の混合物と、化合物とポリペプチドとの相互作用を許容する条件下で接触させる工程、並びに
（ｂ）ポリペプチドに特異的に結合する化合物を決定する工程、並びに任意に、
（ｃ）ポリペプチドの活性に影響を及ぼす化合物を決定する工程、
を含む、請求項１８または１９に記載のポリペプチドに結合し、および／またはこのポリペプチドの活性を修飾する化合物を発見する方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項１４から１６のいずれか１項に記載の宿主細胞または請求項１７に記載の株の細胞を化合物または化合物の混合物と接触させる工程、
（ｂ）ポリペプチド濃度を決定する工程、および
（ｃ）ポリペプチドの発現に特異的に影響を及ぼす化合物を特定する工程、
を含む、請求項１８または１９に記載のポリペプチドの発現を修飾する化合物を発見する方法。
【請求項２５】
真菌グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチド、それをコードする核酸、またはこれらの核酸を含むＤＮＡ構築体もしくは宿主細胞の、新規殺真菌活性化合物の発見への使用。
【請求項２６】
真菌グリオキサールオキシダーゼ、それらをコードする核酸、またはこれらの核酸を含むＤＮＡ構築体もしくは宿主細胞の、請求項２３または２４に記載の方法における使用。
【請求項２７】
グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチドの修飾因子の殺真菌剤としての使用。
【請求項２８】
グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチドの修飾因子の、動物またはヒトに対して病原性である真菌によって生じる疾患を治療するための組成物の調製への使用。
【請求項２９】
請求項２３または２４に記載の方法によって見出される殺真菌活性物質。
【請求項３０】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項８に記載のＤＮＡ構築体、または請求項１２または１３に記載のベクターの、トランスジェニック植物または真菌の産生への使用。
【請求項３１】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のＤＮＡ構築体、または請求項１８または１９に記載のベクターの導入後に、対応する野生型細胞と比較して請求項１５または１６に記載のポリペプチドの細胞内濃度が増加することを特徴とする、トランスジェニック植物、植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物増殖物質。
【請求項３２】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のＤＮＡ構築体、または請求項１２もしくは１３に記載のベクターの導入後に、対応する野生型細胞と比較して請求項１８もしくは１９に記載のポリペプチドの細胞内濃度が増加することを特徴とする、トランスジェニック真菌、真菌細胞、真菌組織、プロトプラスト、または真菌増殖物質。
【請求項３３】
対応する内在性ポリペプチドと比較して生物学的活性または発現パターンが修飾されている請求項１８または１９に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、植物、植物部分、植物組織または植物増殖物質。
【請求項３４】
対応する内在性ポリペプチドと比較して生物学的活性または発現パターンが修飾されている請求項１８または１９に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、真菌、真菌細胞、真菌組織、または真菌増殖物質。
【請求項３５】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸が突然変異誘発によって修飾されていることを特徴とする、請求項３３に記載の植物、植物部分、プロトプラスト、植物組織または植物増殖物質の産生方法。
【請求項３６】
請求項４から１０のいずれか１項に記載の核酸が突然変異誘発によって修飾されていることを特徴とする、請求項３４に記載の真菌、真菌細胞、真菌組織、プロトプラストまたは真菌増殖物質の産生方法。
【請求項３７】
植物をもはやグリオキサールオキシダーゼを発現することができない真菌と接触させることを特徴とする、病原体の攻撃に対する該植物の耐性を誘導または増加させる方法。
【請求項３８】
もはやグリオキサールオキシダーゼを発現することができない植物病原性真菌の、植物の耐性の誘導または増加への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は殺真菌剤を特定するための方法並びにグリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有する真菌ポリペプチドをコードする核酸、それらによってコードされるポリペプチド、および殺真菌剤の標的としてのそれらの使用および新規殺真菌活性化合物の特定へのそれらの使用、並びにこれらのポリペプチドの修飾因子を発見する方法、並びに、最後に、グリオキサールオキシダーゼの機能を有する真菌ポリペプチドをコードする配列を含むトランスジェニック生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば農業において、毎年相当の損害につながる望ましくない真菌の成長は真菌剤の使用によって制御することができる。真菌剤に対する要求は、それらの活性、それらのコストおよび、特には、生態学的安定性に関して絶えず増加している。したがって、強力かつ生態学的に安定な新規殺真菌剤に発展可能な新規物質または物質クラスに対する需要が存在する。一般には、そのような新規先導化合物は温室試験において探索することが必要である。しかしながら、そのような試験は多大な労力の投入および多大な財政的投入を必要とする。したがって、温室において試験することができる物質の数が制限される。そのような試験の代替物は高スループットスクリーニング法（ＨＳＴ）として知られるものの使用である。これは、多数の個々の物質を、細胞に対するそれらの効果、個々の遺伝子産生物または遺伝子に関して自動化法において試験することを包含する。特定の物質が効果を有することが見出されたとき、それらを通常のスクリーニング法において研究し、かつ適切であるならば、さらに開発することができる。
【０００３】
殺真菌剤の有利な標的が必須生合成経路において頻繁に探索される。理想的な殺真菌剤は、さらに、真菌の病原性の発現において決定的な重要性を有する遺伝子産生物を阻害する物質である。そのような殺真菌剤の一例は、例えば、真菌のメラニン生合成を阻害し、したがって、無傷の付着器（付着器官）の形成を妨げる活性物質カルプロパミドである。しかしながら、真菌に対してそのような役割を果たす既知遺伝子産生物の数は非常に少数のみである。さらに、対応する生合成経路の阻害によって標的細胞の栄養要求を導き、結果として、病原性の損失を導く殺真菌剤が公知である。したがって、例えば、エチリモールの添加によるアデノシンデアミナーゼの阻害はブルメリア・グラミニス（Ｂｌｕｍｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）における病原性の有意の低下を導く（Ｈｏｌｌｏｍｏｎ，Ｄ．Ｗ．１９７９）。
【０００４】
バシジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する真菌ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）は欠乏条件下において木材リグニンを分解することが可能である。この分解はマンガン依存性リグニンペルオキシダーゼ（ＭｎＰｓ）およびリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰｓ）によって酵素的に生じる。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）がこれらの酵素の基質として作用する（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９９０）。過酸化水素は、以下の反応を触媒するグリオキサールオキシダーゼによって提供される：
ＲＣＨＯ＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ  →  ＲＣＯ２Ｈ＋Ｈ２Ｏ
この反応においては、アルデヒド官能基がカルボン酸に酸化され、それに対して元素状酸素が過酸化水素に還元される。この酵素の基質特異性は広範であるため、一連の単純アルデヒド、α−ジカルボニル化合物および様々なα−ヒドロキシカルボニル化合物、例えば、ＨＣＨＯ、ＣＨ３ＣＨＯ、ＣＨ２ＯＨＣＨＯ、ＣＨＯＣＨＯ、ＣＨＯＣＯＯＨ、ＣＨ２ＯＨＣＯＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯＣＨＯＨＣＨ２ＯＨまたは他のＣＨ３ＣＯＣＨＯが基質として受容される。加えて、リグニンペルオキシダーゼによるリグニンモデル基質の変換の他の産生物もグリオキサールオキシダーゼによって変換され（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９９５）、特には、リグノセルロースの主成分で成長する場合における中間代謝物としてのグリオキサールおよびメチルグリオキサールが変換される（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９９３）。グリオキサールオキシダーゼによってリグニンを分解する真菌ファネロカエテ・クリソスポリウムの能力を別にすると、この酵素が真菌に対して発揮する他の機能は知られていない。
【０００５】
ファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼは、リグニン生分解経路の必須成分を構成する銅金属酵素である（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら，１９９６）。この酵素は分泌される。グリオキサールオキシダーゼは、まずペルオキシダーゼに過酸化水素を提供し、次に、リグノ分解培養の培地中に二次代謝物として見出される、メチルグリオキサールおよびグリオキサールを主要基質として変換する（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９８７）。
【０００６】
立体視的研究は、真菌金属酵素ガラクトースオキシダーゼにおける場合と同様に、銅イオンに結合する異常フリーラジカルが活性中心に存在することを示している。ファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼと本発明によるＵ．メイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）グリオキサールオキシダーゼ１（Ｇｌｏ１）との相同性比較（図１を参照）およびＢ．シネレア（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）との相同性比較もＵ．メイジス酵素をラジカル銅オキシダーゼとして知られる酵素クラスに割り当てる。この酵素クラスにおいては、触媒モチーフは、それに結合するラジカルを有し、かつ銅イオンに結合するアミノ側鎖によって形成される（式Ｉ）。
【０００７】
【化１】
2005502358.tif 000002
【０００８】
最後に、ガラクトースオキシダーゼおよびファネロカエテ・グリオキサールオキシダーゼの配列整列化とそれに続く部位特異的突然変異誘発（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら，１９９９）が他の触媒的に重要なアミノ酸を割り当てることを可能にした。ＥＰＲ立体視研究により銅（ＩＩ）複合体中に２つの窒素リガンドが特定され、吸収およびラマン分光によって活性中心内にチロシンおよびチロシン−システイン二量体リガンドが特定された。これらのアミノ酸は以下のアミノ酸および位置であった：
チロシンリガンド１：Ｔｙｒ１７８（Ｕ．メイジス）およびＴｙｒ２７３（Ｂ．シネレア）、
チロシンリガンド２：Ｔｙｒ４５２（Ｕ．メイジス）およびＴｙｒ４９９（Ｂ．シネレア）、
ヒスチジンリガンド１：Ｈｉｓ４５３（Ｕ．メイジス）およびＨｉｓ５００（Ｂ．シネレア）、
ヒスチジンリガンド２：Ｈｉｓ５５５（Ｕ．メイジス）およびＨｉｓ５９７（Ｂ．シネレア）、
システイン残基：Ｃｙｓ１０５（Ｕ．メイジス）およびＣｙｓ２０９（Ｂ．シネレア）。
【０００９】
したがって、これらの保存されたアミノ酸（これらはＣｕ２＋イオン結合に特有であり、かつ本発明によるポリペプチドの全てに存在する）はこれらの酵素の構造的に特有の特徴である。電子１個を伝達しながらプロセスを触媒する他のラジカル酵素とは対照的に、２個の電子がこの触媒中心によって伝達される。最も完全に研究されている、このクラスのラジカル銅オキシダーゼからの酵素はガラクトースオキシダーゼであり、その結晶構造も解明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ファネロカエテ・クリソスポリウム以外の真菌生物に由来するグリオキサールオキシダーゼは未だに不明である。
【００１１】
今や完全なｃＤＮＡクローンおよびグリオキサールオキシダーゼをコードする対応遺伝子（ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列）が本発明内でウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）およびボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）から単離されている。
【００１２】
黒穂病真菌ウスチラゴ・メイジス、担子菌類はトウモロコシ植物を攻撃する。この疾病はトウモロコシが成長する全ての地域において生じるが、乾燥年の間のみに重要性を帯びる。典型的な症状はこぶ様のこぶし大腫脹（ブリスター）であり、これは全ての地上植物部分に形成される。これらのこぶは、まず、白っぽい灰色粗膜によって覆われる。この膜が破裂すると、ウスチロスポア（ｕｓｔｉｌｏｓｐｏｒｅ）の黒色塊（これは最初はグリース状であり、後に粉末状となる）が放出される。ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属のさらなる種は、例えば、Ｕ．ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）（オオムギおよびコムギの裸黒穂病を生じる）、Ｕ．ニグラ（Ｕ．ｎｉｇｒａ）（オオムギの墨黒穂病を生じる）、Ｕ．ホーデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）（オオムギの堅黒穂病を生じる）およびＵ．アベナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）（オート麦の裸黒穂病を生じる）である。
【００１３】
真菌ボトリチス・シネレア、子嚢菌類は「灰色カビ（ｇｒｅｙ  ｍｏｕｌｄ）」として知られるものを生じる。これは農業において深刻な損害を一貫して生じる疾病であり、したがって、積極的に制御される。これは植物の全ての部分に感染することができるが、特には、ベリー類の熟成に対して有害である。この普遍的な真菌は雑食性であり、かつ木材および植物残滓上で腐生菌として、さもなければ菌糸もしくは菌核として生存する。これは創傷を介して侵入するが、開花後に花の残滓を介して植物に感染することも可能である。これは未熟なベリー類においては顕在しない；その発症が劇症であるのは熟成が開始された後のみである。
【００１４】
今や、ノックアウト変異体が上記ゲノムＤＮＡまたはその断片の助けを借りてＵ．メイジスおよびＢ．シネレアの両者において産生されている；驚くべきことに、両者の場合、すなわち、担子菌類および子嚢菌類（これらの両者は植物病原性である）において、それらは真菌の無病原性を導いた。これらの異なる遺伝子、すなわち、ｇｌｏ１、ｇｌｏ２およびｇｌｏ３（これらは全てグリオキサールオキシダーゼをコードする）がウスチラゴ・メイジスにおいて特定できることに注意しなければならない。本発明の文脈においては、遺伝子ｇｌｏ１（配列番号１および３を参照）の場合において上述の効果が得られ、それに対して、対照的に、ｇｌｏ２のノックアウトには真菌の病原性に対する効果がないことが見出されている。ｇｌｏ３は、ｇｌｏ１と同様に、病原性決定基としての無病原性スクリーニングの間に変異体として特定された。これらの異なる表現型の理由は、異なる酵素の発現パターン、それらの細胞局在化、さもなければ酵素の特異的活性において特定することができる。しかしながら、明らかに、この真菌の病原性において決定的な役割を果たすのは間違いなくｇｌｏ１である。
【００１５】
ＣＬ１３株の形態学的に注目すべき変異体がＲＥＭＩ変異原性アプローチ（制限酵素介在統合、例えば、Ｋａｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂａｓｓｅ  １９９９を参照）において既に単離されている（Ｍ．Ｂｏｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｋａｈｍａｎｎ、未公開）。このＲＥＭＩ変異体＃５６６２は、鱗状、無光沢の表現型によって区別される。加えて、この変異体は注目すべきメラニン沈着を示す。
【００１６】
病原性試験においてはトウモロコシ植物の感染は検出されず、すなわち、この変異体は無病原性である。グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸を得るためプラスミド・レスキュー実験を行った。
【００１７】
今や、本発明の範囲内で、プラスミド・レスキュー実験（実施例１を参照）により、挿入部位に隣接する配列を再単離することが可能になっている。このようにして、グリオキサールオキシダーゼをコードする配列、この場合にはｇｌｏ１が単離される。この文脈において、挿入が推定ＯＲＦの開始コドンの７７０ｂｐ下流で生じていることが配列決定で明らかとなった。その推定アミノ酸配列はファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼとの類似性を示す。このウスチラゴ遺伝子はｇｌｏ１（グリオキサールオキシダーゼ１）と命名された。ＲＥＭＩ挿入と変異体の観察された表現型との相関が常に上手くいくわけではないので、本発明の目的に沿って表現型と遺伝子との明白な関係を確立するため、２つのハプロイド株Ｕｍ５１８およびＵｍ５２１におけるｇｌｏ１遺伝子をさらに削除した（実施例２を参照）。まず、推定ｇｌｏ１  ＯＲＦのそれぞれ５’および３’の１１５１ｂｐおよび１２４９ｂｐＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。次に、これらの断片を制限酵素ＳｆｉＩで開裂させ、１９３１ヌクレオチドがｇｌｏ１遺伝子のＯＲＦから除去されるようにＳｆｉＩ開裂ハイグロマイシンＢカセット（ｐＢＳ−ｈｈｎからの１８８４ｂｐ断片）でライゲートした（図２ＢおよびＫａｍｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，２００１を参照）。このノックアウトカセットを同様にＰＣＲによって増幅した（実施例２を参照）。相同組換えの場合においては、ｇｌｏ１のＮ末端部分をハイグロマイシンＢカセットで置換する。ｇｌｏ１特異的ＤＮＡプローブを用いるこれらの形質転換体のサザーン分析によりゼロ変異体を選択した（図２Ａを参照）。１０の形質転換体のうちの８つがサザーン分析において期待される制限パターンを示すことが明らかとなった。株５１８Δｇｌｏ１＃１、５１８Δｇｌｏ１＃４または５２１Δｇｌｏ１＃７および５２１Δｇｌｏ１＃９をさらなる分析のために選択した。
【００１８】
図４からわかるように、ｇｌｏ１ゼロ変異体は多面的な形態学的欠陥を示す。したがって、ｇｌｏ１ゼロ変異体の取り扱いも、プレート培地上で成長するとき、野生型株と比較して細胞が互いに接着することがかなり少ないことを示す。この表現型をより詳細に特徴付けるため、研究、例えば、顕微鏡研究を行うことができる。この目的のため、細胞をスライドに付着させ、微分干渉対照顕微鏡で観察する（図４）。野生型株と比較して細胞が伸長していることが明らかとなる。さらに、空胞形成の増加を観察することができる。さらに、変異体細胞の細胞質分裂が悪影響を受け、隔壁の発達の増加が観察される（図３も参照）。形状が球状であり、かつ非分離細胞凝集体の中央に位置する細胞も注目に値する。まとめると、多面的な形態学的欠陥の全ての徴候が本発明によるゼロ変異体において観察される。
【００１９】
さらに、適合性ｇｌｏ１ゼロ変異体の混合物が無病原性であることも注目すべきである。ｇｌｏ１ゼロ対立遺伝子の病原性に対する効果を研究するため、本発明の目的に沿って植物感染を行った。この目的のため、各々の場合において２つの独立した適合性ｇｌｏ１ゼロ変異体を成長させ、洗浄して混合した。次に、これらの混合物を若いトウモロコシ植物に注入した。比較のため、適合性野生型株（Ｕｍ５１８およびＵｍ５２１）でトウモロコシ植物を感染させた。対照実験においては１週間後に腫瘍形成が既に観察されたのに対して、適合性変異体の混合物においてはいかなる症状も見出されれなかった。注入後２週間で、対照感染における１０２の感染植物のうちの９７が腫瘍を形成していた。さらに３つの植物はアントシアニン色を示しており、これは真菌感染に典型的なものである。したがって、１０２の感染植物のうちの１００（９８％）が病原性の症状を示した（表Ｉを参照）。適合性変異体の混合物での感染の場合、腫瘍形成もアントシアニン色も観察されなかった（表Ｉを参照）。これは、ｇｌｏ１の適合性ゼロ変異体がトウモロコシ植物に感染することができず、すなわち、それらの病原性が不完全であることを意味する。
【００２０】
【表１】
2005502358.tif 000003
【００２１】
ｇｌｏ１ゼロ変異体の接合挙動が制限されることがさらに注目に値する。したがって、適合ｇｌｏ１変異体株の混合物における二核フィラメントの形成はもはや観察することができない。変異体を適合野生型と交配させるとき、二核菌糸（図４を参照）の形成に関して接合挙動に関する残留活性を観察することができ、これは細胞融合が不完全であると結論付けることを可能にする。
【００２２】
Ｂ．シネレアにおける対応ノックアウト変異体の研究は全く類似する結果をもたらす。ここでもやはり、グリオキサールオキシダーゼをコードする遺伝子の破壊がＢ．シネレアにおける不完全な病原性を導くことが明瞭に示された（実施例９および図９から１２を参照）。
【００２３】
したがって、これらの結果から、グリオキサールオキシダーゼが、１つの特定の真菌の場合だけではなく植物病原性真菌それ自体の場合においても、病原性の発生において特別な役割を果たすことが結論付けられた。このように、植物病原性真菌の病原性、宿主における生存可能性および生活環に対するグリオキサールオキシダーゼの重要性が最初に認識され、かつ新規特異的殺真菌剤を探索するための最適標的として初めて特定された。このように、この標的の助けを借りて完全に新規のリード構造を特定する可能性が初めて提供されている。グリオキサールオキシダーゼを阻害する化合物から開始して新規殺真菌剤を得ることができる。
【００２４】
ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列並びに、その上、それらを得るための方法の説明によって、植物病原性真菌の２つの異なる亜門から殺真菌剤を特定するための方法において用いるのに適するグリオキサールオキシダーゼがさらに得られ、対応する標的、すなわち、グリオキサールオキシダーゼの助けを借りて、特定されているこれらの殺真菌剤を特徴付け、かつさらに開発することが可能である。
【００２５】
したがって、本発明は、病原性真菌のグリオキサールオキシダーゼの完全なゲノム配列またはｃＤＮＡを初めて提供し、この酵素の阻害剤の特定へのそれらの使用またはそれらによってコードされるポリペプチドの使用、およびそれらの殺真菌剤としての使用を説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
したがって、本発明は、グリオキサールオキシダーゼをコードするファネロカエテ・クリソスポリウム核酸配列（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９９５）、５５９アミノ酸を有するＰＣＧＬＸ１Ｇ＿１ＰＲＴ（受付番号Ｌ４７２８６としてＥＭＢＬで、または受付番号Ｑ０１７７２としてＳＰＴＲＥＭＢＬで利用可能；（タンパク質ＩＤ＝ＡＡＡ８７５９４．１））、および５５９アミノ酸を有するＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１ＰＲＴ（受付番号Ｌ４７２８７としてＥＭＢＬで、または受付番号Ｑ０１７７３としてＳＰＴＲＥＭＢＬで利用可能（タンパク質ＩＤ＝ＡＡＡ８７５９５．１））を除く、完全な真菌グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸に関する。これらのタンパク質配列は、Ｔｈｒ３０８によるＬｙｓ３０８の一アミノ酸置換を除いて同一である。ヌクレオチド配列の同一性は９８％である。
【００２７】
本発明による核酸を用いて、グリオキサールオキシダーゼをコードし、かつ、ゲノムプロジェクトの脈絡における結果として公衆に利用可能でありながら、機能または生物学的重要性が割り当てられていないさらなる核酸配列を他の真菌から特定することが同様に可能であった。これらはクリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒトに対して病原性であり、クリプトコッカス髄膜炎および肺炎の原因である真菌（ＣＲＹＮＥ＿ｃｎｅｏ００１０２２．コンティグ６７８６（４０６４ｂｐ）、相同性領域２７０４−１３９３、ＣＲＹＮＥ＿ｃｎｅｏ００１０２２．コンティグ７８８３（１３４８７ｂｐ）；相同性領域：９１６−１６９５、４６８−２１８５、２１００−２３４５、ＣＲＹＮＥ  ｂ６ｆ１０ｃｎｆ１；相同性領域：１−５６４、ＣＲＹＮＥ＿４＿コンティグ４５６；相同性領域：９３０−１９およびＣＲＹＮＥ＿ｃｎｅｏ００１０２２．コンティグ６８２８（４５４６ｂｐ）；相同性領域：４３６４−３８４０を参照）、パンカビとして知られるアスコミセタ・ニューロスポラ・クラッサ（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔａ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（ＮＥＵＣＲ＿コンティグ１８８７（スーパーコンティグ１２７）；相同性領域：１４４１１−１５８８９を参照）および植物病原性コメイモチ病真菌マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）に由来する配列である。このように、グリオキサールオキシダーゼはヒトに対して病原性である真菌においても生じることが見出されている。ヒトに対して病原性であるこれらの真菌においても、この酵素が僅かとは言えない生理学的役割を果たし、したがって、酵素修飾因子の興味深い標的であるか、またはこれらの真菌においても抗真菌剤の作用部位としての役割を果たすものと推定することができる。
【００２８】
特には、本発明は、植物病原性真菌、好ましくは、アスコミセテスおよびバシジオミセテス亜門の真菌に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする核酸に関し、ボトリチスおよびウスチラゴ属が特に好ましい。
【００２９】
特に好ましくは、本発明は、ウスチラゴ・メイジスおよびボトリチス・シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸に関する。
【００３０】
本発明は、特に好ましくは、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７を有するウスチラゴ・メイジス・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸並びに配列番号９および配列番号１１を有するボトリチス・シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸並びに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に示されるポリペプチドをコードする核酸またはそれらの活性断片に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明による核酸は、特には、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の形態をとる。好ましい実施形態は、イントロンを含んでいてもよいゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの断片である。
【００３２】
本発明による核酸は、好ましくは、植物病原性真菌のｃＤＮＡに対応するＤＮＡ断片の形態をとる。
【００３３】
本発明による核酸は、特に好ましくは、以下のものから選択される配列を含む：
ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１に示される配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）Ｃｕ２＋配位に適する、式（Ｉ）によるアミノ酸チロシン１および２、ヒスチジン１および２並びにシステインを含むポリペプチドをコードする配列、
ｄ）長さが少なくとも１４塩基対である、ａ）からｃ）に定義される配列の部分配列、
ｅ）ａ）からｃ）に定義される配列との５０％同一性、特に好ましくは７０％同一性、とりわけ好ましくは９０％同一性を有する配列、
ｆ）ａ）からｃ）に定義される配列と相補的である配列、並びに
ｇ）遺伝子暗号の縮重のため、ａ）からｃ）に定義される配列と同じアミノ酸配列をコードする配列。
【００３４】
本発明による核酸のとりわけ好ましい実施形態は、ウスチラゴ・メイジス・グリオキサールオキシダーゼをコードする、配列番号１および３に示される配列または配列番号５もしくは配列番号７の配列を有するｃＤＮＡ分子である。
【００３５】
本発明による核酸のさらなるとりわけ好ましい実施形態は、ボトリチス・シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする、配列番号９もしくは１１に示される配列を有するｃＤＮＡ分子である。
【００３６】
「完全」グリオキサールオキシダーゼという用語は、本文脈において用いられる場合、その転写単位の完全コーディング領域がＡＴＧ開始コドンで始まり、出発生物内に存在する遺伝子の全ての情報担持エクソン領域を含み、かつグリオキサールオキシダーゼをコードし、並びに正確な転写終止に必要なシグナルが存在するグリオキサールオキシダーゼを記述する。
【００３７】
「活性断片」という用語は、本文脈において用いられる場合、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有し、すなわち、反応
ＲＣＨＯ＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ  →  ＲＣＯ２Ｈ＋Ｈ２Ｏ２
を触媒することが可能であるポリペプチドを依然としてコードする、グリオキサールオキシダーゼをコードするもはや完全ではない核酸を記述する。
【００３８】
この生物学的機能が実際に依然として存在するのかどうかを決定するのに活性アッセイを用いることができ、このアッセイは、例えば、Ｈ２Ｏ２を、例えば、Ｈ２ＳＯ４での酸性化およびＴｉＯＳＯ４溶液の添加によって検出することをベースとする（［ＴｉＯ２＊ａｑ］ＳＯ４の形成は黄色がかったオレンジ色の呈色を導く）。グリオキサールオキシダーゼ活性は既知グルコースオキシダーゼにおいて観察することもできる。しかしながら、その主活性が上記反応の触媒であるグリオキサールオキシダーゼとの比較において、この活性は顕著に低下する。したがって、「生物学的活性」という用語は、その主活性がこの反応の触媒ではないグルコースオキシダーゼのようなポリペプチドまで拡張しようとするものではない。「活性断片」は、グリオキサールオキシダーゼをコードする上記完全核酸より短い。本文脈において、核酸は配列の３’末端および／または５’末端の両者が除去されていてもよい；さもなければ、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性に対する決定的な悪影響を持たない配列の部分が欠失、すなわち、除去されていてもよい。依然として特徴付けまたは生じるグリオキサールオキシダーゼ断片の使用を可能にする、より低い、さもなければ、適切であるならば、高い活性がここで用いられるこの用語の目的に十分であるものと見なされる。「活性断片」という用語はグリオキサールオキシダーゼ・アミノ酸配列をも指すことができ、この場合、上述されているものに同様に適用され、上に定義される完全配列との比較でもはや特定の部分を含んではいないが酵素の生物学的活性に対する決定的な悪影響が発揮されていないポリペプチドに適用される。
【００３９】
これらの断片の好ましい長さは１２００ヌクレオチド、好ましくは９００ヌクレオチド、とりわけ好ましくは３００ヌクレオチド、または４００アミノ酸、好ましくは３００アミノ酸、とりわけ好ましくは１００アミノ酸である。
【００４０】
「遺伝子」という用語は、本文脈で用いられる場合、ポリペプチド鎖の合成の責を担う、細胞ゲノムからのセグメントの名称である。
【００４１】
「ハイブリダイズする」という用語は、本文脈において用いられる場合、一本鎖核酸分子が相補鎖との塩基対形成を受けるプロセスを記述する。これは、本発明による核酸のコンセンサス領域または他の既知領域にまたがる短い領域に特に関連し、それらの領域はグリオキサールオキシダーゼをコードするさらなる核酸を特定するためのＰＣＲ実験の実施に有利に用いられる。例えば、ここに開示される配列情報から出発して、さらなる相同遺伝子の、またはウスチラゴ・メイジスもしくはボトリチス・シネレア以外の真菌からのＤＮＡ断片をこのようにして単離することができ、これらのＤＮＡ断片は、それぞれ、配列番号１および配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するグリオキサールオキシダーゼと同じ特性または類似する特性を有するグリオキサールオキシダーゼをコードする。
【００４２】
「ｃＤＮＡ」という用語は、本文脈において用いられる場合、ＲＮＡ分子の一本鎖または二本鎖コピーの名称であり、したがって、生物学的に活性のｍＲＮＡのコピーであれば、イントロンがなく、すなわち、遺伝子のコーディング領域の全てが連続形態で存在する。
【００４３】
さらなる真菌グリオキサールオキシダーゼを特定するための上記ＰＣＲ法に主として用いることができるハイブリダイゼーション条件は、以下の式を用いておおよそ算出される。
【００４４】
融点Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ［ｃ（Ｎａ＋）］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ））−５００／ｎ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  ａｎｄ  Ｚｏｒｂａｓ，１９９８）。
【００４５】
この式において、ｃは濃度であり、かつｎはハイブリダイズする配列セグメントの塩基対での長さである。＞１００ｂｐの配列については、５００／ｎの項が低下する。洗浄は最高の厳密性をもって５℃から１５℃の温度、Ｔｍおよび１５ｍＭ  Ｎａ＋のイオン強度の下で行う（０．１×ＳＳＣに相当）。ＲＮＡ試料をハイブリダイゼーションに用いる場合、融点は１０℃から１５℃高い。
【００４６】
上述の核酸の同一性の程度は、好ましくは、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷまたはプログラムＢＬＡＳＴＸバージョン２．０．４の助けを借りて決定する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）。
【００４７】
本発明は、さらに、本発明による核酸および同種または異種プロモーターを含むＤＮＡ構築体に関する。
【００４８】
「同種プロモーター」という用語は、本文脈において用いられる場合、その源生物において問題の遺伝子の発現を制御するプロモーターを指す。
【００４９】
「異種プロモーター」という用語は、本文脈において用いられる場合、その源生物において問題の遺伝子の発現を制御するプロモーター以外の特性を有するプロモーターを指す。
【００５０】
異種プロモーターの選択は、実験に原核細胞もしくは真核細胞を用いるのか、または細胞非含有系を用いるのかに依存する。異種プロモーターの例は、植物細胞用のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、酵母細胞用のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、および原核細胞もしくは細胞非含有系用のＴ３、Ｔ７もしくはＳＰ６プロモーターである。
【００５１】
真菌発現系、例えば、ピチア・パウトリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）系を好ましく用いることができるはずであり、この場合の転写はメタノール誘導性ＡＯＸプロモーターによって駆動される。ファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの異種発現は既にこの系に対して示されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｍ．ら，１９９９）。
【００５２】
本発明は、さらに、本発明による核酸、本発明による調節領域または本発明によるＤＮＡ構築体を含むベクターに関する。用いることができるベクターは、分子生物学研究室において用いられる全てのファージ、プラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、人工染色体または微粒子銃粒子である。
【００５３】
好ましいベクターは、植物細胞に対してはｐＢＩＮ（Ｂｅｖａｎ，１９８４）およびその誘導体、酵母細胞に対してはｐＦＬ６１（Ｍｉｎｅｔら，１９９２）もしくは、例えば、ｐ４ＸＸｐｒｏｍ．ベクターシリーズ（Ｍｕｍｂｅｒｇら，１９９５）、細菌細胞に対してはｐＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または細菌細胞、植物、Ｐ．パストリス、Ｓ．セレビシアエもしくは昆虫細胞における様々な発現系に対してはＧａｔｅｗａｙベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００５４】
本発明は、本発明による核酸、本発明によるＤＮＡ構築体または本発明によるベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００５５】
「宿主細胞」という用語は、本文脈において用いられる場合、本発明による核酸を天然には含まない細胞を指す。
【００５６】
適切な宿主細胞は原核細胞、好ましくは、大腸（Ｅ．ｃｏｌｉ）だけではなく、真核細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス、昆虫、植物、カエル卵母細胞および哺乳動物細胞株の細胞である。
【００５７】
真菌細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびピチア・パストリスが発現に好ましく用いられる。ファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼは、例えば、Ａ．ニズランスおよびＰ．パストリスにおいて上手く発現した（Ｋｅｒｓｔｅｎら，１９９５；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら，１９９９）。
【００５８】
本発明によるポリペプチドの発現に用いることができる他のものは、特には、ウスチラゴ・メイジス細胞である。この目的に特に適する細胞は、ドイチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツァイルクルツレンＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｉｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）［ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セル・カルチャー（Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）］（ＤＳＭＺ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ  ｉｎ  ３８１２４  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋに２００１年９月１３日、ＤＳＭ  １４  ５０９として寄託されているＵ．メイジス株の細胞である。
【００５９】
これらの寄託細胞は実施例３において説明されるようにして得たものであり、例えば、実施例４に示される、元の株の野生型細胞のアッセイで区別することができる。寄託番号ＤＳＭ  １４  ５０９の株は、グリオキサールオキシダーゼ活性を検出し、かつその株を本発明による方法において用いることができるようにするのに十分な量および活性で本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼを発現することが可能である。
【００６０】
寄託番号ＤＳＭ  １４  ５０９の株は本発明の主題である。
【００６１】
本発明は、さらに、本発明の核酸によってコードされるグリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有するポリペプチドに関する。
【００６２】
本発明によるポリペプチドは、好ましくは、以下のうちから選択されるアミノ配列を含む：
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に示される配列、
ｂ）Ｃｕ２＋配位に適する、式（Ｉ）に示されるアミノ酸チロシン１、チロシン２、ヒスチジン１、ヒスチジン２およびシステインを含む配列、
ｃ）長さが少なくとも１５アミノ酸である、ａ）およびｂ）に定義される配列の部分配列、
ｄ）ａ）およびｂ）に定義される配列との少なくとも２０％、好ましくは２５％、特に好ましくは４０％、とりわけ好ましくは６０％、最も好ましくは７５％の同一性を有する配列、並びに
ｅ）ａ）からｄ）に定義される配列と同じ生物学的活性を有する配列。
【００６３】
「ポリペプチド」という用語は、ここで用いられる場合、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短いアミノ酸鎖および通常タンパク質と呼ばれるより長いアミノ酸鎖の両者を指す。これは、天然プロセス、例えば、翻訳後処理、または技術の現状である化学法のいずれかによって修飾されていてもよいアミノ酸鎖を包含する。そのような修飾は１つのポリペプチドにおいて様々な点で複数回、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端および／またはカルボニル末端で生じ得る。これらには、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体またはホスファチジルイノシトールとの共有結合、環化、ジスルフィド架橋の形成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解処理、リン酸化、セレニル化およびアミノ酸のｔＲＮＡ介在付加が含まれる。
【００６４】
本発明によるペプチドは「成熟」タンパク質の形態であってもよく、大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部の形態であってもよい。これらは、さらに、分泌またはリーダー配列、簡潔な生成を可能にする配列、例えば、ポリヒスチジン残基、またはさらなる安定化エピトープを有することができる。
【００６５】
本発明によるポリペプチド、特には、配列番号２、４、６、８、１０および１２に示されるポリペプチドは、完全な真菌グリオキサールオキシダーゼを構成する必要はなく、完全な真菌グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有する限りこれらの断片を構成するだけでもよい。配列番号２、４、６、８または配列番号１０および１２に示されるアミノ酸配列を有する、グリオキサールオキシダーゼと同じタイプの生物学的活性を発揮するポリペプチドは依然として本発明によるものと考えられる。この文脈において、本発明によるポリペプチドはウスチラゴ・メイジスもしくはボトリチス・シネレアまたは植物病原性真菌から推定可能である必要はなく、例えばグリオキサールオキシダーゼ間の関係により、様々な生物、例えば、ヒトに対して病原性である真菌、さもなければ植物から誘導することができる（図８も参照）。本発明によるものと考えられるポリペプチドは、とりわけ、例えば以下の真菌のグリオキサールオキシダーゼ、またはこれらの断片に相当するポリペプチド、およびそれらの生物学的活性を依然として有するポリペプチドでもある：
例えば、プラスモジオホロミセテス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、オオミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、キトリジオミセテス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ジゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、アスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、バシジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）およびジューテロミセテス（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）。
【００６６】
ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）種、例えば、ピチウム・ウルチマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種、例えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、シュードペロノスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えば、シュードペロノスポラ・フムリ（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ）もしくはシュードペロノスポラ・キュベンシス（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、プラスモパラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）種、例えば、プラスモパラ・ビチコラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）、ブレミア（Ｂｒｅｍｉａ）種、例えば、ブレミア・ラクツカエ（Ｂｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａｅ）、ペロノスポラ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えば、ペロノスポラ・ピシ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｉｓｉ）もしくはＰ．ブラシカエ（Ｐ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、エリシフェ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）種、例えば、エリシフェ・グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、スファエロテカ（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）種、例えば、スファエロテカ・フリギネア（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、ポドスファエラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）種、例えば、ポドスファエラ・ロイコトリカ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、ベンツリア（Ｖｅｎｔｕｒｉａ）種、例えば、ベンツリア・イナエカリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、ピレノホラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例えば、ピレノホラ・テレス（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ）もしくはＰ．グラミネア（Ｐ．ｇｒａｍｉｎｅａ）（分生子形態：ドレクスレラ（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ）、ｓｙｎ：ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コクリオボーラス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例えば、コクリオボーラス・サチブス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）（分生子形態：ドレクスレラ、ｓｙｎ：ヘルミントスポリウム）、ウロミセス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えば、ウロミセス・アッペンジクラツス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、プシニア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、例えば、プシニア・レコンジタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）種、例えば、スクレロチニア・スクレロチオラム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、チレチア（Ｔｉｌｌｅｔｉａ）種、例えば、チレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）；ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種、例えば、ウスチラゴ・ヌーダ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ）もしくはウスチラゴ・アベナエ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ａｖｅｎａｅ）、ペリクラリア（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ）種、例えば、ペリクラリア・ササキイ（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ  ｓａｓａｋｉｉ）、ピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）種、例えば、ピリクラリア・オリザエ（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えば、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、ボトリチス種、セプトリア（Ｓ���ｐｔｏｒｉａ）種、例えば、セプトリア・ノドラム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｎ）、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）種、例えば、レプトスファエリア・ノドラム（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）種、例えば、セルコスポラ・カネッセンス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、アルターナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）種、例えば、アルターナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）またはシュードセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）種、例えば、シュードセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス。
【００６７】
特に興味深い他のものは、例えば、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、コクリオブルス・ヘテロストロフス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｕｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、ネクトリア・ヘマトコッカス（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびフィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）種である。
【００６８】
既に上で考察されるように、本発明のポリペプチドは抗真菌剤の作用部位として、したがって、ヒトまたは動物に対して病原性である真菌の制御にも用いることができる。この文脈において特に興味深いものは、例えば、ヒトに対して病原性であり、かつ以下に述べられる症状を生じる以下の真菌である：
ダーマトフィテス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、例えば、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）種、ミクロスポラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）種、エピダーモフィトン・フロッコサム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）または、例えば水虫（足白癬）を生じる、ケラトミセス・アジェロイ（Ｋｅｒａｔｏｍｙｃｅｓ  ａｊｅｌｌｏｉ）。
【００６９】
酵母、例えば、ソア食道炎（ｓｏｏｒ  ｏｅｓｏｐｈａｇｉｔｉｓ）および皮膚炎を生じる、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）または、例えば肺クリプトコッカス症、さもなければトルロシス（ｔｏｒｕｌｏｓｉｓ）を生じ得る、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）。
【００７０】
カビ、例えば、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．フラブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、例えば気管支肺アスペルギルス症または真菌性敗血症を生じる、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）種、または、例えば接合菌症（管内真菌症）を生じる、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、例えば慢性肉芽腫性咽頭炎および気管炎を生じる、リノスポリジウム・シーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｑｒｉｄｉｕｍ  ｓｅｅｂｅｒｉ）、例えば皮下菌腫を生じる、マズレラ・ミセトマチス（Ｍａｄｕｒｅｌｌａ  ｍｙｃｅｔｏｍａｔｉｓ）、例えば細胞内皮性細胞真菌症およびダーリング病を生じる、ヒストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、肺性コクシジオイデス症および敗血症を生じる、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、例えば南アメリカ分芽菌症を生じる、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、例えばギルクリスト病および北アメリカ分芽菌症を生じる、ブラストミセス・ダーマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、例えばケロイド分芽菌症およびロボ病を生じる、ロボア・ロボイ（Ｌｏｂｏａ  ｌｏｂｏｉ）、並びに、例えばスポロトリクム症（肉芽腫性皮膚真菌症）を生じる、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）。
【００７１】
本発明によるポリペプチドは、天然グリオキサールオキシダーゼの対応領域との比較により、それらが完全グリオキサールオキシダーゼの少なくとも１つの生物学的活性を発揮する限り、欠失またはアミノ酸置換を有することができる。保存置換が好ましい。そのような保存置換には、１つのアミノ酸を以下の群からの他のアミノ酸で置換する変種が含まれる：
１．非極性であるか、または低極性である小脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；
２．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；
３．極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；
４．大脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；並びに
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
【００７２】
以下のリストは好ましい保存置換を示す：
【００７３】
【表２】
2005502358.tif 000004
【００７４】
したがって、本発明は、少なくともグリオキサールもしくはメチルグリオキサールまたはそれらの誘導体の変換における酸素の還元による過酸化水素形成の生化学的反応においてグリオキサールオキシダーゼと同様に作用し、かつ配列番号２および４または配列番号６もしくは８および配列番号１０もしくは１２に示される配列と１００アミノ酸、好ましくは２５０アミノ酸の長さにわたって、特に好ましくはその全長にわたって少なくとも２０％の同一性、好ましくは２５％の同一性、特に好ましくは４０％の同一性、とりわけ好ましくは６０％の同一性、最も好ましくは７５％の同一性、最終的に絶対的に好ましくは９０％の同一性を有するポリペプチドにも関する。
【００７５】
アミノ酸配列の同一性の程度は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰ＋ＢＥＡＵＴＹプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７）の助けを借りて決定する。
【００７６】
本発明によるポリペプチドの特に好ましい実施形態は、配列番号２、４、６および８並びに配列番号１０および１２に示されるアミノ酸配列を有するグリオキサールオキシダーゼである。
【００７７】
特に好ましくは、本発明は、Ｃｕ２＋配位部位の形成に適する上記アミノ酸を含む本発明によるポリペプチドに及ぶ：
チロシンリガンド１：（例えば、Ｔｙｒ１７８（Ｕ．メイジス）またはＴｙｒ２７３（Ｂ．シネレア））、
チロシンリガンド２：（例えば、Ｔｙｒ４５２（Ｕ．メイジス）またはＴｙｒ４９９（Ｂ．シネレア））、
ヒスチジンリガンド１：（例えば、Ｈｉｓ４５３（Ｕ．メイジス）またはＨｉｓ５００（Ｂ．シネレア））、
ヒスチジンリガンド２：（例えば、Ｈｉｓ５５５（Ｕ．メイジス）またはＨｉｓ５９７（Ｂ．シネレア））、および
システイン残基：（例えば、Ｃｙｓ１０５（Ｕ．メイジス）またはＣｙｓ２０９（Ｂ．シネレア））。
【００７８】
本発明による核酸は通常の方法で調製することができる。例えば、核酸分子は完全な化学合成によって調製することができる。本発明による核酸分子の短片を化学的に合成し、そのようなオリゴヌクレオチドを放射標識するか、さもなければ蛍光色素で標識することも可能である。標識されたオリゴヌクレオチドも、真菌ｍＲＮＡから出発して生成されたｃＤＮＡライブラリの探索に用いることができる。問題のＤＮＡ断片を単離するため、標識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるクローンを選択する。単離されたＤＮＡの特徴付けの後、本発明による核酸が簡潔な方法で得られる。
【００７９】
本発明による核酸は、ＰＣＲ法により、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いて生成することもできる。
【００８０】
「オリゴヌクレオチド（複数）」という用語は、本文脈において用いられる場合、１０個以上のヌクレオチド、好ましくは１５個から３０個のヌクレオチドからなるＤＮＡ分子を指す。これらは化学的に合成され、プローブとして用いることができる。
【００８１】
本発明によるポリペプチドが様々な方法、例えば、固相法のような化学的方法によって得ることができることは当業者には公知である。大タンパク質量の入手には組換え法の使用が推奨される。クローン化グリオキサールオキシダーゼ遺伝子またはそれらの断片の発現は、当業者に公知である一連の適切な宿主細胞において行うことができる。この目的のため、公知方法の助けを借りて、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子を宿主細胞に導入する。
【００８２】
宿主細胞の染色体へのクローン化グリオキサールオキシダーゼ遺伝子の組み込みは本発明の範囲内にある。好ましくは、遺伝子またはそれらの断片をプラスミドに導入し、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子のコーディング領域またはそれらの断片を構成性または誘導性プロモーターに作動可能に連結する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のピチア・パストリス発現系が特に適する発現系の例である。この目的に適するベクターは、例えば、ｐＰＩＣＺおよびその誘導体である。発現は、ここでは、ＡＯＸプロモーターの助けを借りて、メタノールを添加することによって誘導することができる。さらに、Ｕ．メイジス系における発現も適する。ここで、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子またはそれらの断片の発現は、例えば、誘導性ｃｒｇ１プロモーターまたは構成性ｏｔｅｆプロモーター（Ｂｏｔｔｔｉｎら，１９９６、Ｓｐｅｌｌｉｎｇら，１９９４）によって行う。
【００８３】
組換えグリオキサールオキシダーゼを産生するための基本的工程は以下のものである：
１．グリオキサールオキシダーゼをコードする天然、合成または半合成ＤＮＡの入手。
２．このＤＮＡの、グリオキサールオキシダーゼの単独での、または融合タンパク質としての発現に適する発現ベクターへの導入。
３．この発現ベクターを用いる、適切な、好ましくは真核生物の、宿主細胞の形質転換。
４．グリオキサールオキシダーゼの発現に適する方法での、この形質転換宿主細胞の成長。
５．細胞の収穫および、適切であるならば、適切な公知方法によるグリオキサールオキシダーゼの精製。
【００８４】
この文脈において、グリオキサールオキシダーゼのコーディング領域は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において慣例的な方法を用いて発現させることができる。大腸菌に適する発現系は商業的に入手可能であり、例えば、ｐＥＴシリーズの発現ベクター、例えば、簡潔な精製および発現した酵素の溶解度を高めるためのチオレドキシン融合のためのｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ２３ａ、Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ａもしくはＨｉｓタグを有するｐＥＴ３２ａ、およびグルタチオンシンセターゼ融合を伴うｐＧＥＸ、およびその上、ｐＳＰＯＲＴベクター。これらの発現ベクターでλＤＥ３溶原性大腸菌株、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）またはＡＤ４９４（ＤＥ３）を形質転換する。これらの細胞が当業者に馴染みのある標準条件下で成長をはじめた後、ＩＰＴＧを用いて発現を誘導する。細胞が誘導された後、それらを４℃から３７℃の温度で３時間から２４時間インキュベートする。
【００８５】
これらの細胞を超音波処理により破壊バッファ（１０ｍＭから２００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭから５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５から８）中で破壊する。発現したタンパク質はクロマトグラフィー法によって、Ｈｉｓタグで発現したタンパク質の場合にはＮｉ−ＮＴＡカラムでのクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００８６】
昆虫細胞培養物（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現が別の有利なアプローチである。
【００８７】
代替法として、タンパク質を植物において発現させることもできる。したがって、例えば、少なくとも３種類のグリオキサールオキシダーゼ相同体がアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に存在し（図８を参照）、これは植物における発現の可能性を強調する。
【００８８】
本発明は、本発明によるポリペプチドに結合し、かつそれらの特性を変化させる化合物を発見するための方法にも関する。したがって、この酵素の活性に影響を及ぼす修飾因子が真菌の病原性を制御することが可能である新規殺真菌性活性化合物を構成する。修飾因子はアゴニストであってもアンタゴニストであってもよく、または賦活剤であっても阻害剤であってもよい。特に興味深いものは、グリオキサールオキシダーゼの場合、この酵素を不活性化することによって真菌の病原性を妨げ得るこの酵素の阻害剤である。
【００８９】
したがって、本発明は、特には、殺真菌剤の標的としての真菌グリオキサールオキシダーゼの使用およびこれらのポリペプチドの修飾因子を発見する方法におけるそれらの使用にも関する。そのような方法において、グリオキサールオキシダーゼは宿主細胞中で、抽出物中で、もしくは精製形態で直接用いることができ、またはそれらのコードするＤＮＡの発現によって間接的に産生させることができる。上述されている本発明によるポリペプチド（配列番号６および配列番号８に示されるＧｌｏ２およびＧｌｏ３）は同様にこの用途に適する。真菌の病原性に対する直接的な重要性とは別に、それらは、後に殺真菌剤として活性になる酵素の修飾因子を特定する方法において同様に用いられるＧｌｏ１との十分な相同性を有する。
【００９０】
したがって、本発明は、グリオキサールオキシダーゼ修飾因子を発見する方法における、本発明によるグリオキサールオキシダーゼをコードする核酸、それらを含むＤＮＡ構築体、それらを含む宿主細胞、または本発明によるグリオキサールオキシダーゼに結合する抗体の使用にも関する。
【００９１】
「アゴニスト」という用語は、本文脈において用いられる場合、グリオキサールオキシダーゼの活性を促進または増強する分子を指す。
【００９２】
「アンタゴニスト」という用語は、本文脈において用いられる場合、グリオキサールオキシダーゼの活性を鈍化または妨げる分子を指す。
【００９３】
「修飾因子」という用語は、本文脈において用いられる場合、アゴニストまたはアンタゴニストの総称を構成する。修飾因子は本発明によるポリペプチドに結合する小有機化学分子、ペプチドまたは抗体であり得る。修飾因子は、さらに、ある分子に結合し、次にその分子が本発明によるポリペプチドに結合し、したがって、それらの生物学的活性に影響を及ぼす小有機化学分子、ペプチドまたは抗体であり得る。修飾因子は天然基質およびリガンドまたはそれらの構造的もしくは機能的模倣体であり得る。しかしながら、「修飾因子」という用語は、グリオキサールオキシダーゼの天然基質、例えば、酸素、グリオキサールおよびメチルグリオキサールを包含しない。
【００９４】
修飾因子は、好ましくは、小有機化学化合物である。
【００９５】
本発明によるグリオキサールオキシダーゼへの修飾因子の結合は、それらで処理した真菌の無病原性または死を導く方法で細胞プロセスを変化させ得る。
【００９６】
本発明による方法における本発明による核酸またはポリペプチドの使用は、本発明によるポリペプチドに結合する化合物の発見を可能にする。次いで、それらを、例えば植物において、殺真菌剤として、またはヒトおよび動物において抗真菌活性化合物として用いることができる。例えば、本発明による核酸を含み、かつ対応するポリペプチドを発現する宿主細胞、または遺伝子産生物それ自体を、少なくとも１つの化合物と宿主細胞、受容体または個々のポリペプチドとの相互作用を許容する条件下で化合物または化合物の混合物と接触させる。
【００９７】
特には、本発明は、グリオキサールオキシダーゼの生物学的活性を有する真菌ポリペプチド、好ましくは植物病原性真菌に由来するグリオキサールオキシダーゼ、特に好ましくはウスチラゴまたはボトリチス・グリオキサールオキシダーゼ、とりわけ好ましくはＵ．メイジスおよびＢ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼおよびそれらと同族であるポリペプチドに結合し、かつ上記コンセンサス配列を有する殺真菌性活性化合物を特定するのに適する方法に関する。しかしながら、これらの方法は、本発明によるグリオキサールオキシダーゼと同族であり、かつここで言及されるもの以外の種から誘導されるポリペプチドを用いて行うこともできる。本発明によるもの以外のグリオキサールオキシダーゼを用いる方法は本発明に包含される。
【００９８】
所定の期間で試験物質の数を最大化するため、多数の、化合物を試験するためのアッセイ系および天然抽出物が高スループット数のために設計されている。細胞非含有プロセスをベースとするアッセイ系は精製または半精製タンパク質を必要とする。それらは、主として標的タンパク質に対する物質の潜在効果の検出を目的とする「初期」アッセイに適する。しかしながら、十分な量の問題のポリペプチドを産生する無傷の細胞をベースとするアッセイ系を用いることもできる。本発明の場合、実施例４において説明される活性アッセイと同様に、グリオキサールオキシダーゼを過剰産生する無傷の細胞、例えば、ウスチラゴ・メイジス細胞を用いて、酵素活性を上手く測定することもできる。
【００９９】
細胞毒性のような効果は、一般には、これらのイン・ビトロ系においては無視される。これらのアッセイ系は物質の阻害または抑制効果および刺激効果の両者をチェックする。物質の効力は濃度依存性試験系列によってチェックすることができる。試験物質を含まない対照を効果の評価に用いることができる。
【０１００】
修飾因子を発見するため、合成反応混合物（例えば、イン・ビトロ翻訳の産生物）または細胞成分、例えば、抽出物もしくはポリペプチドを含むあらゆる他の調製品を、標識物質またはポリペプチドのリガンドと共に、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい候補分子の存在下および不在下でインキュベートすることができる。本発明によるポリペプチドの活性を増加または阻害する候補分子の能力は、標識リガンドの結合の増加もしくは減少から、または標識基質の変換の増加もしくは減少からわかる。十分に結合し、かつ本発明によるポリペプチドの活性の増加を導く分子はアゴニストである。十分に結合するが、本発明によるポリペプチドの生物学的活性を相殺する分子は、おそらくは、良好なアンタゴニストである。
【０１０１】
本発明によるポリペプチドの修飾因子は酵素試験によって発見することもできる。適切な修飾因子による酵素活性の変化を連結酵素アッセイにおいて直接または間接的に測定することができる。この測定は、例えば、光学的に活性の化合物の減少または増加によって生じる吸収の変化によって行うことができる。したがって、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼの存在下におけるフェノールレッド溶液の脱色によって過酸化水素の放出または消費を検出することができる（実施例４、１０および１１を参照）。
【０１０２】
本発明によるポリペプチドの活性を修飾する物質の特定のさらなる可能性は、「シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ）」（ＳＰＡ）（ＥＰ  ０１５  ４７３を参照）として知られるものである。このアッセイ系は、ポリペプチド（例えば、Ｕ．メイジスまたはＢ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ）と放射標識リガンド（例えば、小有機分子または第２放射標識タンパク質分子）との相互作用を利用する。ポリペプチドを、閃光性分子が付与された微小球またはビーズに結合させる。放射能が低下するとき、微小球中の閃光性物質が放射活性マーカーの亜原子粒子によって励起し、検出可能な光子が放出される。アッセイ条件は最適化され、それによりリガンドから放出される粒子のみが本発明によるポリペプチドに結合するリガンドによって放出されるシグナルを導く。
【０１０３】
可能性のある一実施形態においては、例えば、Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼを、相互作用性もしくは結合性試験物質と共に、またはそれら無しに、ビーズに結合させる。用いることができる試験物質は、とりわけ、本発明によるポリペプチドの断片である。結合性リガンドが固定化グリオキサールオキシダーゼに結合するとき、このリガンドは、接触領域区域においてそれ自体が結合するため、固定化グリオキサールオキシダーゼと標識リガンドとの既存の相互作用を阻害するか、または無効化する。ひとたび固定化グリオキサールオキシダーゼへの結合が生じると、閃光を参照してそれを検出することができる。したがって、固定化および遊離標識リガンドの間の既存の複合体は試験物質の結合によって破壊され、これは検出される閃光の強度の低下につながる。この場合、このアッセイ系は補完阻害系の形態をとる。
【０１０４】
その助けを借りて本発明によるポリペプチドの修飾因子を見出すことができる方法のさらなる例は置換アッセイであり、ここでは、本発明によるポリペプチドおよび潜在的修飾因子をこの目的に適する条件下で本発明によるポリペプチドに結合することが知られる分子、例えば、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガンド模倣体と組み合わせる。
【０１０５】
「競合体」という用語は、本文脈において用いられる場合、他の、おそらくは未だに特定されていない化合物と、グリオキサールオキシダーゼに結合して酵素から後者を置換するか、または後者によって置換されることについて競合する化合物の特性を指す。
【０１０６】
したがって、本発明は、本発明によるグリオキサールオキシダーゼの酵素活性の修飾因子、好ましくは、阻害剤にも関し、これは、グリオキサールオキシダーゼタンパク質またはそれらと同族であるポリペプチドの修飾因子を特定するための、ここで説明される方法のうちの１つの助けを借りて見出される。
【０１０７】
植物病原性真菌に由来するグリオキサールオキシダーゼが殺真菌剤の新規標的を構成し、およびこれらのグリオキサールオキシダーゼの助けを借りて殺真菌剤として用いることができる化合物を見出し、かつ開発できることは未だに開示されていない。この可能性は本発明において最初に説明され、かつ例示される。さらに提供されるものは、それらに必要なグリオキサールオキシダーゼ、およびそれらを入手し、かつ酵素の阻害剤を特定するための方法である。
【０１０８】
したがって、本発明は、グリオキサールオキシダーゼ修飾因子の殺真菌剤としての使用に関する。
【０１０９】
本発明によるポリペプチドの助けを借りて見出される殺真菌活性化合物はヒトに対して病原性である真菌種に由来するグリオキサールオキシダーゼとも相互作用することができる；等しく述べようとすることは、これらの真菌において生じる異なるグリオキサールオキシダーゼとの相互作用に常に必要とは限らない。
【０１１０】
したがって、本発明は、ヒトまたは動物に対して病原性である真菌によって生じる疾患を治療するための組成物の調製への、グリオキサールオキシダーゼの機能を有するポリペプチドの阻害剤の使用にも関する。
【０１１１】
「殺真菌剤」または「殺真菌性」という用語は、本文脈において用いられる場合、本発明の目的のため、「抗真菌剤（単数）」または「抗真菌剤」という用語をも包含する。
【０１１２】
本発明は、さらに、本発明によるポリペプチドの発現を改変する化合物を発見する方法を含む。そのような「発現修飾因子」も新規殺真菌活性化合物であり得る。発現修飾因子は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸の調節領域に結合する小有機化学分子、ペプチドまたは抗体であり得る。さらに、発現修飾因子は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸の調節領域に後に結合し、したがって、それらの発現に影響を及ぼす分子に結合する小有機化学分子、ペプチドまたは抗体であり得る。発現修飾因子はアンチセンス分子でもあり得る。
【０１１３】
本発明は、グリオキサールオキシダーゼタンパク質またはそれらと同族のポリペプチドの発現修飾因子を特定する上記方法の助けを借りて見出される、グリオキサールオキシダーゼの発現修飾因子にも関する。
【０１１４】
本発明は、本発明による核酸の発現修飾因子の殺真菌剤としての使用にも関する。
【０１１５】
本発明による方法は、高スループット・スクリーニング（ＨＴＳ）を含む。宿主細胞および本発明による核酸を含む細胞非含有調製品および／または本発明によるポリペプチドをこの目的に用いることができる。
【０１１６】
本発明は、さらに、本発明によるポリペプチドまたはこれらの断片に特異的に結合する抗体に関する。そのような抗体は慣例的な方法で生じる。例えば、それらの抗体は、抗体産生に有効である量の本発明によるポリペプチドまたはそれらの断片を有する免疫適格宿主を皮下注射し、次にこの抗体を得ることによって産生させることができる。さらに、モノクローナル抗体を産生する不死化細胞株をそれ自体公知の方法で得ることができる。これらの抗体は、適切であるならば、検出試薬で標識することができる。そのような検出試薬の好ましい例は、酵素、放射標識された元素、蛍光性化学薬品またはビオチンである。完全な抗体の代わりに、望ましい特異的結合特性を有する断片を用いることもできる。
【０１１７】
トランスジェニック生物、例えば、細菌、植物または真菌の産生、好ましくは、トランスジェニック植物および真菌の産生、特に好ましくは、トランスジェニック真菌の産生に本発明による核酸を同様に用いることができる。これらは、例えば、野生型から逸脱する本発明によるポリペプチドまたはそれらの変種の発現をベースとするアッセイ系において用いることができる。これらには、上述されるもの以外の遺伝子を修飾することによって、または遺伝子制御配列（例えば、プロモーター）を修飾することによって、本発明によるポリペプチドまたはこれらの変種の発現が変化させられている全てのトランスジェニック植物または真菌がさらに含まれる。
【０１１８】
トランスジェニック生物は、商業的または工業的な目的で本発明によるポリペプチドを（過剰）産生することで興味深いものでもある；ここで、例えば、それらの天然形態と比較して本発明によるポリペプチドの高程度の発現を示す真菌（例えば、酵母またはウスチラゴ・メイジス）がポリペプチドの修飾因子を特定するための方法（実際にはＨＴＳ法も）における使用に特に適する。
【０１１９】
本発明によるトランスジェニック真菌の製紙における使用もこの文脈において特に興味深いものであり、ここでは公知リグニンペルオキシダーゼとのカップリング、すなわち、増加することができるか、さもなければより多量の活性で両酵素を発現する真菌の活用がリグニンの分解について特に興味深いものである。
【０１２０】
逆に、本発明の方法によって特定されている、グリオキサールオキシダーゼの生物学的機能を有するポリペプチドの阻害剤の使用も物質の保護について興味深いものである。真菌は、特には、木材の保存における主要な問題である。グリオキサールオキシダーゼはリグニンペルオキシダーゼに過酸化水素を供給するため、最も不活性の木材成分でさえそれらの酸で分解する。しかしながら、結果として、本発明による阻害剤でのグリオキサールオキシダーゼの阻害はリグニンペルオキシダーゼをも阻害し、したがって、内部および外部領域における木材の分解を減少させることができる。
【０１２１】
さらに、本発明によるトランスジェニック生物、すなわち真菌ではあるが、例えば、藻類または他の微生物、例えば、細菌も、例えば廃水、汚染水路、水処理プラント等における媒体の解毒に用いることができる。この文脈においては、本発明によるポリペプチドおよび対応するトランスジェニック生物の能力を基質スペクトルの関数としてアルデヒドの酸化に、および反応性がより少なく、かつ環境有害性がより少ない酸へのそれらの変換に利用することができる。しかしながら、例えばトランスジェニック過剰産生から得ることができる、グリオキサールオキシダーゼそれ自体も、メチルグリオキサールの除去によるヒトまたは動物身体の解毒について興味深いものである（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，１９９６；Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙら，２００１）。様々な望ましくない物質を分解する、例えばＧｌｏ１で、形質転換された細胞の能力が実施例１１および図１３に示される。
【０１２２】
本発明による核酸は、病原体または環境ストレスに対する耐性の増加によって区別されるトランスジェニック植物の産生に用いることもできる。幾つかの作物、例えば、ヒマワリ、アブラナ、アルファルファ、ダイズ、ピーナッツ、トウモロコシ、サトウモロコシ、コムギもしくはコメ、および様々な花、樹木、野菜作物または果実作物、例えば、ブドウ、トマト、リンゴもしくはイチゴは、過酸化水素を発現する（これは、問題の植物に接近する真菌の方法を表す）ことによって区別される真菌、例えば、ボトリチス・シネレアまたは他の真菌種に対して感受性である。本発明によるグリオキサールオキシダーゼは過酸化水素を産生するような酵素である。病原体による植物の感染は、多くの植物において、過敏性応答（ＨＲ）として知られるものおよび／または病原体侵入部位での宿主組織の破壊を伴うことがある様々な防御機構の活性化を誘発する。これは病原体が宿主内に蔓延することを防ぐことができる。幾つかの場合、植物は、元の感染病原体から分類学的にかけ離れた病原体の感染に対する全身耐性（全身性獲得耐性、ＳＡＲ）をも発達させる。観察することができる病原体感染に対する第１応答のうちの１つはスーパーオキシドアニオン、すなわちＯ２−、および／または過酸化水素、すなわちＨ２Ｏ２、の蓄積の増加である。Ｈ２Ｏ２の蓄積は様々な方法での耐性応答の増加を誘発し得る；１．直接抗菌作用によるもの、２．Ｈ２Ｏ２をペルオキシダーゼの基質として提供すること（これは、リグニンの重合に寄与し、したがって、細胞壁の強化を助ける）によるもの、３．未だに解明されていない機構内で、感染に対する植物の防御において、例えば、サリチル酸蓄積の刺激において、役割を果たす遺伝子の発現を活性化するシグナルとして作用することによるもの。サリチル酸は、次に、幾つかの病原性関連タンパク質（ＰＲＰ）、例えば、グルカナーゼまたはキチナーゼをコードする遺伝子の発現の内在性トリガーと考えられる。さらに、サリチル酸は酸化バーストを増加させ、したがって、一種のフィードバックプロセスでそれ自体の合成を加速させることができる。さらに、サリチル酸は、Ｈ２Ｏ２を分解する酵素であるカタラーゼの阻害剤として作用することにより、過敏性の細胞死において役割を果たし得る。最後に、Ｈ２Ｏ２も防御に適するさらなる化合物、例えば、フィトアレキシンまたは低分子量抗菌性化合物の合成を誘発することができる。
【０１２３】
したがって、本願において説明されるグリオキサールオキシダーゼは、病原体による攻撃に対する有意の耐性を植物に付与するのに適する。グリオキサールオキシダーゼの活性のため、トランスジェニック植物はＰＲＰ遺伝子を発現し、かつサリチル酸を蓄積することが可能である。植物の形質転換に用いられるＤＮＡ構築体は、例えば、構成性プロモーターを含むことができ、かつそれらに作動可能に連結するコーディング領域に加えて形質転換体の選択を可能にするマーカー遺伝子をも含むことができる。用いることができるさらなる要素は、ターミネータ、ポリアデニル化配列および植物細胞内での局在化またはこの細胞からのタンパク質の分泌を支配するシグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１２４】
植物を形質転換するための様々な方法が既に公知である（例えば、Ｍｉｋｉら（１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｂｙ（１９９３）およびＢｅｖａｎら，１９８３も参照）。トランスジェニック植物を産生するための最も開発されているベクター系は、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するプラスミドである（Ｂｅｖａｎ，１９８４）。自然状態では、Ａ．ツメファシエンスは植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を産生する。これらの腫瘍はＡ．ツメファシエンスのＴｉプラスミド（腫瘍誘導性）によって生じる。Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれるそのＤＮＡの一部を宿主植物の染色体ＤＮＡに組み込む。このプラスミドのＤＮＡから腫瘍誘導性領域を除去し、しかしながら植物に遺伝物質を導入するその特性は保持する手段が開発されている。次に、外来遺伝子、例えば、本発明による核酸のうちの１つを、慣例的な組換えＤＮＡ技術の助けを借りて、Ｔｉプラスミドに組み込むことができる。続いて、この組換えプラスミドでＡ．ツメファシエンスを再度形質転換する。その後、この株を植物細胞培養物の感染に用いることができる。しかしながら、このプラスミドを植物に直接挿入することもできる。そのような細胞の無傷の生物への再生は、外来遺伝子を含み、かつその上、それを発現する、すなわち、所望の遺伝子産生物を産生する植物を生じる。
【０１２５】
Ａ．ツメファシエンスは双子葉類植物に容易に感染するが、多数の農業的に重要な作物植物、例えば、トウモロコシ、コムギまたはコメを含む単子葉植物の形質転換へのベクターとしての使用は、それがこれらの植物に容易には感染しないため、制限される。他の技術、例えば、粒子銃法として知られる「ＤＮＡ銃」がそのような植物の形質転換に利用可能である。この方法においては、気体発射または粉体爆発のいずれかにより、微小なチタンまたは金微小球をレシピエント細胞または組織に発射する。これらの微小球は関心遺伝子のＤＮＡでコートされており、それにより後者が細胞に到達し、球から徐々に脱着して宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１２６】
内在性遺伝物質にそれを安定に組み込むことができるのは外来性遺伝物質に晒されている細胞のうちの僅かのみである。遺伝子転移に用いられる組織においては、非トランスジェニック細胞が優性である。したがって、無傷の植物の再生の間、トランスジェニック細胞に利益をもたらす選択を適用することが必要である。実際には、植物細胞に転移されるマーカー遺伝子がこの目的に用いられる。これらの遺伝子の産生物は阻害剤、例えば、抗生物質または除草剤を不活性化し、したがって、その阻害剤を補足した栄養培地でのトランスジェニック細胞の成長を許容する。
【０１２７】
Ａ．ツメファシエンスでの形質転換の場合、葉断片の代わりにプロトプラスト（培養状態で、特定の化学薬品の存在下において、さもなければエレクトロポレーションを用いるときに外来性ＤＮＡを取り込む、細胞壁のない単離細胞）を用いることができる。それらを、新たな細胞壁が形成されるまで（例えば、タバコの場合には約２日）組織培養の状態で保持する。次に、アグロバクテリアを添加し、組織培養を継続する。ＤＮＡ構築体でのプロトプラストの一過性形質転換の簡潔な方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）の存在下におけるインキュベーションである。
【０１２８】
ＤＮＡはエレクトロポレーションによって細胞に導入することもできる。これは生活細胞へのＤＮＡの取り込みを増加させるための物理的方法である。電気パルスは生体膜の透過性を、その膜を破壊することなしに、一時的に増大させる。
【０１２９】
ＤＮＡは微量注入によって導入することもできる。ＤＮＡを、ガラスキャピラリの助けを借りて、細胞核の近傍に注入する。しかしながら、強固な細胞壁および大空胞を有する植物細胞の場合にはこれは困難である。
【０１３０】
さらなる可能性は超音波を利用することである；ヒトにおける聴覚の周波数範囲を上回る音波（２０ｋＨｚ超）で細胞を超音波処理するとき、やはり膜の一時的透過性が観察される。この方法を実施する場合、音波の振幅を非常に正確に調整しなければならず、これは、そうでなければ超音波処理された細胞が破裂して破壊されるためである。
【０１３１】
本発明によるトランスジェニック植物または、例えば発現を支配するための、シグナル配列もしくは適切なプロモーターを含む適切な構築体を産生する方法は、とりわけ、上記グルコースオキシダーゼ（例えば、Ａ．ニガーに由来する）を発現するトランスジェニック植物について既に説明されている（ＣＮ１２２９１３９、ＵＳ５，５１６，６７１、ＷＯ９５／２１９２４、ＷＯ９９／０４０１２、ＷＯ９５／１４７８４）。同様の方法を、本発明によるトランスジェニック植物を得るの用いることもできる。
【０１３２】
真菌の形質転換には広範囲の可能性が存在する。プロトプラスト形質転換（実施例２およびＳｃｈｕｌｚら，１９９０を参照）に加えて、さらなる慣用法をこの目的で利用可能である。酢酸リチウム法が酵母に対して頻繁に用いられる（Ｇｉｅｔｚら，１９９７）。ここでは、これらの酵母細胞は、化学的手段によりＤＮＡの取り込みについて適格にされる。エレクトロポレーションの場合、電流のパルスによってロードされているＤＮＡを細胞に導入する。別の方法はアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる形質転換である。プラスミドから出発して、この細菌は外来性生物にＤＮＡを導入することが可能である。異種配列をこのプラスミドに導入するとき、標的細胞が形質転換される。
【０１３３】
したがって、本発明は、本発明による核酸の少なくとも１つを含むトランスジェニック植物または真菌、好ましくは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種のようなトランスジェニック植物または酵母種もしくはウスチラゴ種のようなトランスジェニック真菌、およびそれらのトランスジェニック子孫にも関する。それらには、トランスジェニック植物の植物部分、プロトプラスト、植物組織もしくは植物増殖物質、または本発明による核酸を含むトランスジェニック真菌の個々の細胞、真菌組織、子実体、菌糸体および胞子も包含される。好ましくは、これらのトランスジェニック植物または真菌は本発明によるポリペプチドを野生型から逸脱する形態で含む。しかしながら、本発明によるポリペプチドの発現の程度が非常に低いか、またはそれが全くないことによってのみ生来特徴付けられるトランスジェニック植物または真菌も本発明によるものと考えられる。
【０１３４】
したがって、本発明は、同様に、トランスジェニック植物および真菌であって、グリオキサールオキシダーゼの活性を有するポリペプチドをコードする配列内に修飾が生成されており、かつ本発明によるポリペプチドの産生および／またはその植物または真菌内に存在する本発明によるポリペプチドの生物学的活性もしくは量の、突然変異誘発によって得られる、増加もしくは減少について選択されているトランスジェニック植物および真菌に関する。
【０１３５】
「突然変異誘発」という用語は、本文脈において用いられる場合、自発的な突然変異速度を高め、したがって、変異体を単離する方法を指す。この文脈において、変異体は、変異原の助けを借りて、例えば、突然変異の誘発に適する化合物または物理的因子（例えば、塩基類似体、ＵＶ線等）を用いてイン・ビボで産生させることができる。所望の変異体は特定の表現型に対する選択によって得ることができる。染色体上の突然変異の位置は、他の公知突然変異との関係で、組換え分析によって決定することができる。問題の遺伝子は遺伝子ライブラリを用いる相補性実験によって特定することができる。突然変異は、有方向的な方式（イン・ビトロ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、誤り易発性ＰＣＲ等）で、染色体または染色体外ＤＮＡに導入することもできる。
【０１３６】
「変異体」という用語は、本文脈において用いられる場合、修飾された（突然変異生成した）遺伝子を担持する生物を指す。変異体は非修飾遺伝子を担持する野生型との比較によって定義される。
【０１３７】
「耐性」という用語は、本文脈において用いられる場合、広範囲の機構をベースとする「抵抗能力」の形態を指す。「活動的耐性」の形態は「免疫」（＝非感受性植物の耐性）および「寛容」（＝その病原体に感受性である植物の耐性）である。中間形態が「転移耐性」であり、ここでは病原体が個々の細胞、細胞複合体または植物器官内に局所的に残存する。この３つのタイプの耐性の間に移行形態が存在する。
【０１３８】
「病原体」または「病原体による攻撃」という用語は、本文脈において用いられる場合、植物を攻撃し、かつ損害を与えるか、または破壊することができる生物、特には、真菌を指す。この損害は広範囲の症状、例えば、植物の部分の脱色、壊死、成長阻害または死滅をベースとし得る。特定の症状（例えば、脱色、壊死）を生じることによって植物の価値を低下させるが、植物または植物部分の死滅は導かない生物も病原体と呼ばれる。
【０１３９】
トランスジェニック植物の産生に加えて、病原体による攻撃に対する植物の耐性を高めるのに本発明に基づく別の経路をとることができる。
【０１４０】
したがって、例えば、グリオキサールオキシダーゼ・エンコーディング遺伝子（配列番号９および１１を参照）が不活性化または欠失されているボトリチス・シネレアの変異体（実施例９、Ｂ．シネレアＢｃＧｌｙｏｘ１ノックアウト変異体の産生を参照）は、もはや、植物においてこの真菌に典型的である損傷の障害を生じることはできない（実施例９および図９から１２を参照）。この変異体の分生子が接種されている植物において、これらの変異体はこの真菌の存在に対する上述の応答を誘発し、その応答が局所的および全身性耐性の確立を導いた。耐性の確立は、非処理植物およびもはやグリオキサールオキシダーゼを発現することができない真菌で処理されている植物を病原体と接触させ（実施例９を参照）、特定の期間にわたって植物の損傷を観察することによって容易に試験することができる。この植物の獲得された耐性はこの文脈においては非特異的であり、すなわち、耐性の誘導または増加に用いられた真菌に対して向けられるだけではなく、広範囲の病原体による攻撃に対して向けられる防御機構を誘導する。
【０１４１】
したがって、本発明は、病原体による攻撃に対する植物の耐性を誘導または増加させる方法であって、植物を、もはやグリオキサールオキシダーゼを発現することができず、かつその野生型が好ましくは植物病原性真菌の一因である真菌と接触させることによる方法にも関する。これらの真菌は、好ましくは、グリオキサールオキシダーゼをコードする遺伝子（１つもしくは複数）が不活性化または欠失されている真菌である。遺伝子を欠失または不活性化する方法は熟練研究者に公知である（これもやはり実施例９を参照）。問題の真菌のノックアウト変異体が好ましく用いられる。上記真菌ボトリチス・シネレアまたはその変異体に加えて、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子の適切な欠失または不活性化を伴う他の真菌、例えばＵ．メイジス変異体、も植物の処理に適する。
【０１４２】
したがって、本発明は、もはやグリオキサールオキシダーゼを発現することができない真菌、好ましくは植物病原性真菌の、病原体による攻撃に対して処理された植物の耐性を増加または誘導するための植物処理剤としての使用にも関する。本発明によるＢ．シネレアＢｃＧｌｙｏｘ１変異体がこの目的に特に好ましく用いられる。
【０１４３】
以下の例は、驚くべきことに、本発明によるポリペプチドが真菌における病原性に必須の酵素を構成することを示し、さらに、この酵素が殺真菌剤を特定するのに適する標的タンパク質であること、それを殺真菌活性化合物を特定するための方法において用いることができること、および対応する方法において特定されたグリオキサールオキシダーゼ修飾因子を殺真菌剤として用いることができることを示す。
【０１４４】
さらに、グリオキサールオキシダーゼの修飾因子を特定するための方法において用いることができるグリオキサールオキシダーゼの酵素活性を測定する方法の例が説明され（実施例１０および２２）、殺真菌剤を特定するための本発明による方法は明記される方法には限定されない。
【０１４５】
同様に、以下の例はウスチラゴ・メイジスおよびボトリチス・シネレアには限定されない。類似の方法および結果が他の真菌に関しても得られる。
（実施例）
【実施例１】
【０１４６】
Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸の単離（「プラスミド・レスキュー」）
プラスミド・レスキューをＢｏｌｋｅｒら，１９９５によって記載されるように行った。ゲノムＵ．メイジスＤＮＡをＭｌｕＩで切断して再ライゲートし、エレクトロポレーションによって大腸菌株ＤＨ５αをそれで形質転換した。
【０１４７】
Ｕ．メイジスの培養
これらの株を２８℃でＰＤ培地またはＹＥＰＳ培地において成長させた（Ｔｓｕｋａｄａら，１９８８）。株が液滴の形態で１％木炭を含有するＰＤプレート培地に適用された後、二核フィラメントの発生が観察された（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，１９７４）。病原性試験を記載される通りに行った（Ｇｉｌｌｅｓｓｅｎら，１９９２）。株の一晩培養物を４×１０７細胞の濃度で再懸濁させ、若年トウモロコシ植物（Ｇａｓｐａｒ  Ｆｌｉｎｔ）に注入した。少なくとも８０の植物が各々の株または各々の株の組合せに感染し、７日から２１日後にそれらをアントシアニン発生および腫瘍発生について検査した。
【０１４８】
画像処理
個々のウスチラゴ・メイジス細胞の形態を、Ｚｅｉｓｓアキシオスコープ（ａｘｉｏｓｃｏｐｅ）および示差干渉対照法として知られるものを用いて分析した。細胞の顕微鏡写真を撮影した（Ｋｏｄａｋ  Ｔ−６４、倍率１０００）。
【実施例２】
【０１４９】
Ｕ．メイジスにおけるｇｌｏ１およびｇｌｏ２ノックアウト変態の産生
ノックアウトカセットの産生
分子生物学的標準法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９によって記載される通りに行った。ｇｌｏ１ゼロ変異体を産生するため、ｇｌｏ１遺伝子の５’および３’フランクをＰＣＲによって増幅した。ＵＭ５１８株のゲノムＤＮＡをテンプレートして用いた。配列５’−ｃａｃｇｇｃｃｔｇａｇｔｇｇｃｃｇｇｔｇｔｇｔａａａｃｇａｔｃｃｔｔｔｃｔｇｇａａｇ−３’を有するプライマーＬＢ２および配列５’−ｃｃｔｃｃａａｇｔｔｔｃｇａｇａｔａｔｃｇａｃｃ−３’を有するＬＢ１を５’フランクに用いた（１１５１ｂｐ）。プライマーＲＢ１（５’−ｇｔｇｇｇｃｃａｔｃｔａｇｇｃｃｇｔｃａａｃａｇｃａｃｃａａａｔｔｃａｃａｇｃｃ−３’）およびＲＢ２（５’−ａｔｃｇｔａｇｃｔｃｇａｇｔｇｔａｔｇｃｔｔｃｃ−３’）を３’フランクに用いた（１２４９ｂｐ）。プライマーＬＢ２およびＲＢ１で開裂部位ＳｆｉＩ（ａ）およびＳｆｉＩ（ｂ）を導入した。これらのアンプリコンをＳｆｉＩで制限し、ベクターｐＢＳ（ハイグロマイシンＢカセット）から単離されている１８８４ｂｐ  ＳｆｉＩ断片とライゲートした。この４３００ｂｐ  ｇｌｏ１ノックアウトカセットを、プライマーＬＢ１およびＲＢ２を用いるＰＣＲによって増幅した（Ｋａｍｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，２００１）。
【０１５０】
Ｕ．メイジス・プロトプラストの調製
ＹＥＰＳ培地中の培養物５０ｍｌを２８℃で約５×１０７／ｍｌ（ＯＤ０．６から１．０）の細胞密度まで成長させた後、５０ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ管内で７分間、２５００ｇ（Ｈｅｒｅａｕｓ、３５００ｒｐｍ）で回転沈降させた。その細胞ペレットを２５ｍｌのＳＣＳバッファ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ５．８、１．０Ｍソルビトール、（２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１．０Ｍソルビトールおよび２０ｍＭクエン酸／１．０Ｍソルビトールを混合し、ｐＨメーターを用いてｐＨ５．８にする）に再懸濁させ、再度２５００ｇ（３５００ｒｐｍ）で７分間回転させ、そのペレットを２．５ｍｇ／ｍｌ  Ｎｏｖｏｚｙｍ２３４を補足した２ｍｌのＳＣＳバッファ、ｐＨ５．８に再懸濁させた。プロトプラストを室温で放出し、そのプロセスを顕微鏡下で５分毎に監視した。その後、プロトプラストを１０ｍｌのＳＣＳバッファと混合して１１００ｇ（２３００ｒｐｍ）で１０分間回転させ、上清を廃棄した。そのペレットを１０ｍｌのＳＣＳバッファに慎重に再懸濁させ、再度回転させた。ＳＣＳバッファでの洗浄プロセスを２回繰り返し、ペレットを１０ｍｌのＳＴＣバッファで洗浄した。最後に、ペレットを５００μｌの冷ＳＴＣバッファ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１．０Ｍソルビトール、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁させ、氷上で保持した。アリコートを−８０℃で数ヶ月間保存することができる。
【０１５１】
Ｕ．メイジスの形質転換
Ｕ．メイジスをＳｃｈｕｌｚら，１９９０の方法によって形質転換した。ゲノムＵ．メイジスＤＮＡをＨｏｆｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ  １９８７によって記述されるように単離した。
【０１５２】
この目的のため、最大で１０μｌのＤＮＡ（最適には、３μｇから５μｇ）を２ｍｌエッペンドルフ管に移し、１μｌのヘパリン（１５μｇ／μｌ）（ＳＩＧＭＡ  Ｈ３１２５）を添加した後、５０μｌのプロトプラストを添加し、氷上で１０分間インキュベートした。ＳＴＣ中の４０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ３３５０（ＳＩＧＭＡ  Ｐ３６４０）５００μｌ（フィルター滅菌）を添加してプロトプラスト懸濁液と慎重に混合し、その混合物を氷上で１５分間インキュベートした。その混合物を勾配プレートに塗布した（底部寒天：１０ｍｌ  ＹＥＰＳ−１．５％寒天−抗生物質を補足した１Ｍソルビトール；塗布の直前、この底部寒天層を１０ｍｌ  ＹＥＰＳ−１．５％寒天−１Ｍソルビトールで覆い、プロトプラストを塗布し、それらのプレートを２８℃で３日から４日間インキュベートした）。
【０１５３】
サザーン分析のため、ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで制限した。ジゴキシゲニン（Ｒｏｃｈｅ）で標識した１２４９ｂｐ  ＰＣＲ断片（ＲＢ１／ＲＢ２）をＤＮＡプローブとして用いて検出を行った。
【実施例３】
【０１５４】
Ｇｌｏ１の過剰産生
Ｇｌｏ１の過剰産生のため、ｇｌｏ１遺伝子を含む３４００ｂｐ断片を、プライマー５’ｇｌｏ１（５’−ｃｃｃｇｇｇａｔｇａｃｇａｇｇｃａｃｃｔｃｔｃｃｔｃａｔｃ−３’）および３’ｇｌｏ１Ｎｏｔ（５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｇａａｔｔｇｇｔｃａｇａｃｇａａｔｃｃｇ−３’）を用いて増幅した。そのアンプリコンをベクターｐＣＲ−Ｔｏｐｏ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。ｇｌｏ１断片をＳｍａＩおよびＮｏｔＩでの制限によって再単離し、ｐＣＡ１２３のそれぞれの開裂部位にクローン化した。ｐＣＡ１２３はプラスミドｐｏｔｅｆ−ＳＧ（Ｓｐｅｌｌｉｎｇら，１９９６）から得たプラスミドであり、ｏｔｅｆプロモーターをｐｏｔｅｆ−ＳＧから８９０ｂｐ  ＰｖｕＩＩ／ＮｃｏＩ断片として単離し、ＰｖｕＩＩ／ＮｃｏＩ−切断ベクターｐＴＥＦ−ＳＧにライゲートした（Ｓｐｅｌｌｉｎｇら，１９９６）。得られるプラスミドにおいて、ＳＧＦＰ遺伝子をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩでの制限によって切除し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来するＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ−切断ＥＧＦＰ対立遺伝子で置き換えた。生じるプラスミドをｐＣＡ１２３と命名する。ｐＣＡ１２３から最終的に得られるプラスミドｐＣＡ９２９をＳｓｐＩで直線化し、それでＵ．メイジスを形質転換する。用いられるＵ．メイジス株は、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋにおけるドイチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレン［ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セル・カルチャー］の公共コレクションにおいて株番号ＵＭ５２１として入手可能である。これらの形質転換体を構築体ｇｌｏ１−１で形質転換し、ｃｂｘ耐性について選択した（Ｋｅｏｎら，１９９１）。
【０１５５】
得られる株ウスチラゴ・メイジスＢＡＹ−ＣＡ９５は本発明によるポリペプチドＧｌｏ１の過剰産生に用いることができる。これはＢｒｕｎｓｗｉｃｋにおけるＤＳＭＺに番号ＤＳＭ１４５０９として寄託された。
【実施例４】
【０１５６】
細胞破壊、抽出物の分画、および酵素活性のアッセイ
グリオキサールオキシダーゼ活性を無傷の細胞、細胞抽出物および膜画分において決定した。
【０１５７】
グリオキサールオキシダーゼを発現する、寄託番号ＤＳＭ１４５０９として寄託されているウスチラゴ・メイジス株の細胞を最小培地またはＰＤ培地において０．６から３のＯＤ６００ｎｍまで成長させて回転沈降させ、再懸濁させることによって２０のＯＤ６００ｎｍとした。液体窒素中において乳棒および乳鉢で粉砕することによって細胞抽出物を得た。以下の工程の全ては４℃で行った。細胞残留物および細胞残骸を５０００ｒｐｍおよび８０００ｒｐｍでの分画遠心によって除去した。１３０００ｒｐｍで４５分間回転させることによって膜を単離した。膜沈殿を、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補足した５０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファ、ｐＨ８に再懸濁させた。
【０１５８】
Ｇｌｏ１活性は酵素反応をフェノールレッドおよびペルオキシダーゼと組み合わせることによって測定することができる。グリオキサールオキシダーゼ活性はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）反応を基質としてのフェノールレッドと組み合わせることによって検出した。ここで、５０μｌのアッセイ容積は１０μｌの試料、１５μｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファ、ｐＨ６、５μｌの１００ｍＭメチルグリオキサール溶液、５μｌのＨＲＰ（１９０Ｕ／ｍｌ）および５μｌの５６ｍＭフェノールレッド溶液からなる（Ｋｅｒｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｋｉｒｋ  １９８７）。２８℃で４時間インキュベートした後、ＮａＯＨを０．５Ｍの濃度まで添加した。吸収Ａ５５０ｎｍは「Ｔｅｃａｎ  ｐｌｕｓ」リーダーで決定した。活性酵素はフェノールレッドの脱色を参照して特定される。
【０１５９】
酵素の活性に影響を及ぼす基質または物質混合物は、実験において適切な対照を用いて、試験物質の存在および不在における酵素活性を比較することによって特定することができる。
【０１６０】
グリオキサールオキシダーゼの他の基質を、メチルグリオキサールが基質として用いられた上記プロセスにおいて用いることもできる。次に、無傷の細胞に加えて、膜画分を用いることができる。利用可能な基質には、例えば、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グリコールアルデヒド、グリオキサール、グリオキサレート、グリセロールアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、ヒドロキシアセトンおよびグルタルアルデヒドも含まれるが、形成されるＨ２Ｏ２の量は他の点で同一の条件下において同じでならなければならない必要はない。
【実施例５】
【０１６１】
Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸の単離
用いられる株
野生型Ｂ０５．１０株を分析、形質転換および野生型比較株として用いた。Ｂ０５．１０はＳＡＳ５６（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ−Ｂｅｒｇｍａｎｓら，１９９３）の派生体である。
【０１６２】
寒天プレート上での培養
Ｂ．シネレアを２０℃、暗所において、様々な炭素源が補足された、Ｏｘｏｉｄ麦芽寒天またはＯｘｏｉｄ  Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天を含有するプレート（スクロース３０．００ｇ、ＮａＮＯ３  ３．００ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．５０ｇ、ＫＣｌ  ０．５０ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  １．００ｇ、寒天１３．００ｇ、蒸留Ｈ２Ｏ  １０００．００ｍｌ；ｐＨを７．２とする）上で成長させた。
【０１６３】
分生子の単離
菌糸成長によって完全に覆われているプレートを用いて分生子（高級真菌の無性胞子）単離を行った。これらのプレート上で胞子形成を誘導するため、それらをＵＶ光（２７０ｎｍ−３７０ｎｍ）に１６時間露出した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有する無菌水５ｍｌを用いて誘導後７日から１４日真菌に胞子を形成させたプレートから分生子を洗い流した。その懸濁液をガラスウールを通して濾過し、１１４×ｇで遠心（５’）することによって１回洗浄し、無菌水に再懸濁させた。
【０１６４】
Ｂ．シネレア株およびノックアウト変異体の保存
Ｂ．シネレアの野生型および変異体の分生子を、１２ｍＭ  ＮａＣｌを含有する７５％（ｖ／ｖ）グリセロール中、−８０℃で凍結した。
【０１６５】
グリセロールオキシダーゼ遺伝子ｂｃｇｌｙｏｘｌの単離
ラムダＥＭＢＬ３中のＢ．シネレア、ＳＡＳ５６株のゲノムライブラリ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ−Ｂｅｒｇｍａｎｓら，１９９７）をグリオキサールオキシダーゼ遺伝子の存在についてスクリーニングした。用いられたプローブは、長さが３８５塩基対であり、かつおそらくはファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼと相同であるものと特定されているＴ４株のｃＤＮＡ断片であった。この断片はＥＭＢＬデータベースに受付番号ＡＬ１１３８１１として寄託されている。様々なハイブリダイズ相を精製し、ファージＤＮＡを単離した。これらのファージのうちの１つに由来する、ハイブリダイズする４．１ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ制限断片をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫＩＩ（−）ファージミドにクローン化した後、配列決定した。クローン化断片の特徴が図５に示される。
【実施例６】
【０１６６】
ゲノムＤＮＡのサザーンブロット分析
ゲノムＤＮＡの単離
液体培養の菌糸体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を通す濾過によって収穫し、凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を液体窒素中でホモジナイズした。３ｍｌ  ＴＥＳ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）および６０μｌプロテイナーゼＫ（２０μｇ／μｌ）を添加し、その懸濁液を６０℃で１時間インキュベートした。続いて、８４０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌおよび１３０μｌの１０％（ｗ／ｖ）臭化Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を添加し、インキュベーションを６５℃で２０分間継続した。次に、その懸濁液を、４．２ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加することによって処理した後、簡単に混合して氷上で３０分インキュベートし、続いて１８０００×ｇで５分間回転させた。水性上部相を除去して１３５０μｌの７．５Ｍ  酢酸ＮＨ４を添加し、その混合物を氷上で１時間インキュベートして１８０００×ｇで１５分間回転させた。０．７容量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。そのＤＮＡをガラス棒で除去し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄して乾燥させた。最後に、ゲノムＤＮＡを１ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５Ｕ  ＲＮａｓｅＡ）に溶解し、５０℃で３０分間インキュベートしてエタノールで沈殿させた。
【０１６７】
サザーンブロット分析
合計容積１００μｌ中１μｇのゲノムＤＮＡを望ましい制限酵素で完全に開裂した。ＤＮＡ断片を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで分離した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ製のＨｙｂｏｎｄ（商標）−Ｎ＋膜に、アルカリ性ブロットについてプロトコルに指定されるようにブロットした。この目的のため、まずＤＮＡ含有ゲルを、染料の色が変化するまで、０．２５Ｍ  ＨＣｌに入れた。そのゲルを蒸留水で洗浄した後、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）に記載されるように、０．４Ｍ  ＮａＯＨをブロット溶液として用いてキャピラリブロットを行った。ＤＮＡの転移の後、膜を２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）で簡単に洗浄し、乾燥させた。ＵＶ処理（３１２ｎｍ、０．６Ｊ／ｃｍ２）によってＤＮＡを膜に固定した。
【０１６８】
「Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の助けを借りて放射標識プローブを調製した。この目的のため、２０ｎｇのＤＮＡ断片（「プローブ」、図５を参照）を製造者のプロトコルに従って標識した。標識されたＤＮＡをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムで精製した。
【０１６９】
ハイブリダイゼーションはＣｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８４）によって記載されるように行った。この目的のため、ブロットをハイブリダイゼーションバッファ（０．２５Ｍリン酸バッファ、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）中、６５℃で３０分間予備ハイブリダイズさせた。その後、ブロットを、標識プローブを含有するハイブリダイゼーションバッファと６５℃で４０時間ハイブリダイズさせた。ブロットを３回洗浄した（３０分、６５℃、２×ＳＳＣおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中）。Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。
【０１７０】
これらのハイブリダイゼーションの結果が図６に示される。３つの制限（ＳａｌＩ、ＢａｍＨＬおよびＥｃｏＲＩ）の全てにおいてこのプローブで単一のバンドが特定された。ハイブリダイズしたＢａｍＨＩ断片はサイズが４ｋｂｐであった。
【実施例７】
【０１７１】
ｃＤＮＡのクローン化
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）一工程ＲＴ−ＰＣＲ系によって完全ｃＤＮＡ断片を得た。この目的のため、Ｂ．シネレア、Ｂ０５．１０株からＴＲＩｚｏｌプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を用いて単離されている全ＲＮＡ  ０．１μｇ（ＴＲＩｚｏｌ試薬はフェノールおよびチオシアン酸グアニジニウムの単相性溶液である；クロロホルムの添加およびそれに続く遠心の後、イソプロパノールを用いて水相からＲＮＡを沈殿させる）に逆転写を施し、遺伝子特異的プライマーの助けを借りて増幅した。そのｃＤＮＡをベクターｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローン化し、完全に配列決定した。
【０１７２】
このｃＤＮＡ配列により、キチン結合ドメインおよびグリオキサールオキシダーゼドメインをコードする配列間のイントロンの存在が確認された。
【実施例８】
【０１７３】
ＢｃＧｌｙｏｘ１の発現
ＢｃＧｌｙｏｘ１の発現を、トマトの葉の時間に基づく感染の経過を参照して研究した。Ｂ．シネレアＢ０５．１０株の分生子を、１０ｍＭグルコースおよび１０ｍＭ（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４を補足したＢ５培地において２時間予備インキュベートして発芽を刺激した。トマト（リコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）栽培変種マネーメーカー遺伝子型Ｃｆ４）の葉に、噴霧により、ｍｌ当たり１０６胞子を含む培地を接種した。これらの葉を２０℃および＞９５％の大気湿度でインキュベートした後、接種後定期的な間隔で収穫し、−８０℃で保存した。
【０１７４】
凍結乾燥され、かつ液体窒素中にホモジナイズされている菌糸体から、乳棒および乳鉢を用いて組織を粉末に粉砕することによりＲＮＡを抽出した。物質のグラム当たり２ｍｌのグアニジウムバッファ、ｐＨ７を添加した。このバッファは８．０Ｍ塩酸グアニジウム、２０ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．０で構成されていた。その懸濁液を２回、１回は等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＩＡＡ）（２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖ）で、１回はクロロホルム／ＩＡＡ（２４：１  ｖ／ｖ）で抽出した。１２０００×ｇ、４℃で４５分間遠心した後、８Ｍ  ＬｉＣｌの容積の１／３を水相に添加した。次に、その懸濁液を氷上で一晩インキュベートし、１２０００×ｇで１５分間回転させた。沈殿を２Ｍ  ＬｉＣｌで１回、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで２回洗浄し、風乾して１ｍｌのＴＥに溶解した。ＲＮＡ濃度は２６０ｎｍで分光光度的に決定した。代替法として、凍結乾燥物質からＲＮＡを得るのに、製造者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も用いた。
【０１７５】
ゲル電気泳動において全ＲＮＡを流すため、試料を以下のように変性した。３．６μｌの６Ｍ脱イオングリオキサール、１０．７μｌのジメチルスルホキシドおよび２．０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７を３．７μｌの溶液中１０μｇの全ＲＮＡに添加した。この試料を５０℃で６０分間インキュベートして簡単に回転させ、液体窒素中で凍結して氷上で再度解凍した。その試料を１．４％（ｗ／ｖ）アガロースゲルにおいて分離した、ゲルおよびランニング・バッファは０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．０を含有していた。ゲルを流した後、分離したＲＮＡ断片をキャピラリ・ブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）により、０．０２５Ｍリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７を含有するブロッティング溶液を用いて、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ＲＮＡが転移した後、その膜を乾燥させ、ＵＶ処理（３１２ｎｍ、０．６Ｊ／ｃｍ２）によってＲＮＡを膜上に固定した。ハイブリダイゼーション・プロトコルはＤＮＡハイブリダイゼーションについて述べられる通りである。
【実施例９】
【０１７６】
Ｂ．シネレアＢｃＧｌｙｏｘＩノックアウト変異体の産生
ベクター構築
ＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が除去され、かつハイグロマイシン耐性カセットで置換されているＢＣＧｌｙｏｘＩ遺伝子を含む相同組み換え用のベクター（ｐＨｙＧＬＹＯＸＩ、図８を参照）でＢ．シネレアを形質転換した。
【０１７７】
プロトプラストの調製
形質転換のためのプロトプラストを得るため、１リットルの１％（ｗ／ｖ）麦芽抽出物（Ｏｘｏｉｄ）を２×１０８Ｂ．シネレア分生子（Ｂ０５．１０株）に接種した。２時間後、発芽している分生子を、１８０ｒｐｍのロータリー・シェーカーにおいて、２０℃で２４時間インキュベートした。２２．４μｍふるいによって菌糸体を収穫し、５ｍｇ／ｍｌ  Ｇｌｕｃａｎｅｘ（ベータ−グルカン多糖を加水分解するための熱安定性ベータ−グルカナーゼ）を補足した、０．６Ｍ  ＫＣｌおよび５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するＫＣ溶液５０ｍｌ中でインキュベートした。このようにしてプロトプラストが調製された後、その懸濁液を２２．４μｍおよび１０μｍふるいを通して濾過した。プロトプラストを洗浄し、１００μｌ当たり１０７プロトプラストの濃度まで再懸濁させた。
【０１７８】
形質転換および形質転換体の選択
ＥｃｏＲＩで開裂してフェノールで抽出されている、２μｇの形質転換ベクターｐＨｙＧＬＹＯＸ１を９５μｌのＫＣで希釈し、２μｌの５ｍＭスペルミジンを添加した。氷上で５分間インキュベートした後、１００μｌのプロトプラスト懸濁液をＤＮＡに添加し、全てを氷上でさらに５分間インキュベートし、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の２５％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３３５０および５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液１００μｌを添加してその懸濁液を混合した。室温で２０分後、５００μｌのＰＥＧを添加し、容器を室温でさらに１０分間静置した。最後に、２００μｌのＫＣ溶液を添加した。
【０１７９】
形質転換されたプロトプラストを含む形質転換反応物を２００ｍｌのＳＨ寒天と混合し、直ちに２０のペトリ皿に分配した。ＳＨ寒天は、０．６Ｍスクロース、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．５、１．２％（ｗ／ｖ）精製寒天および１ｍＭ  ＮＨ４（Ｈ２ＰＯ４）を含有する。２０℃で２４時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する等量のＳＨ寒天を添加した。出現した個々のコロニーを、さらなる選択のため、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含有する麦芽寒天プレートに移した。次に、成長するコロニーをハイグロマイシンを含有しない麦芽寒天プレートに移し、ＵＶ光（近ＵＶ）で処理することによって胞子形成を誘発した。単胞子単離体を得るため、分生子を単離して希釈し、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを補足した麦芽寒天プレートに塗布した。これらのプレートから得られたコロニーを単離し、さらなる分析に用いた。
【０１８０】
形質転換体のサザーン分析
形質転換体をサザーン分析にかけた。ＤＮＡを単離してＥｃｏＲＶで切断し、電気泳動で分離し、ブロットしてプローブとハイブリダイズさせた（上記参照）。ノックアウト形質転換体の場合、そのようなハイブリダイゼーションは３００ｂｐの断片を生じるはずである。緩慢成長表現型を有する全ての形質転換体が３００ｂｐの断片を示した。
【０１８１】
形質転換体の成長分析
高ハイグロマイシン含量のプレート上で成長した形質転換体の全てはハイグロマイシンを含有しない麦芽寒天プレート上でも正常に成長した。これらの形質転換体を、単糖を炭素源として含有する合成寒天培地上で成長させたとき、形質転換体は緩慢に成長するか、または成長を停止した。試験した糖の例はヘキソース、ペントースおよびトリオースであった。発芽および菌糸発生の両者は悪影響を受けるか、または完全に妨げられた。この成長欠陥は、例えば、トリプトンまたはペプトンを添加することによって補うことができる。成長阻害はアルギニンを培地に添加することによって完全に修復することができる。１００μＭ以上の濃度のアルギニンが、単糖を含有する培地上での真菌の成長を完全に回復させることができる。
【０１８２】
バイオアッセイ
バイオアッセイを行い、ＢｃＧｌｙｏｘ１変異体の病原性を野生型Ｂ．シネレア（Ｂ０５．１０株）のものと比較した。
【０１８３】
トマト（リコペルシコン・エスクレンツム）およびリンゴ（Ａｌｋｍｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｏｘ  Ｏｒａｎｇｅ）の切除した葉および果実に分生子懸濁液を接種した（Ｂｅｎｉｔｏら，１９９８；ｔｅｎ  Ｈａｖｅら，１９９８）。バラおよびガーベラ雑種の切除した花に乾燥分生子をまぶした（ｖａｎ  Ｋａｎら，１９９７）。接種された宿主組織を暗所において１５℃で（トマトの葉および果実、バラおよびガーベラ）または明所において２０℃で（リンゴ）インキュベートした。
【０１８４】
試験したＢｃＧｌｙｏｘ１変異体は全ての実験構成において原発性の壊死病変を生じることができず、それに対して野生型は原発性の病変を生じ、これは幾つかの場合には隣接組織まで蔓延した（図９から１２を参照）。
【０１８５】
野生型とは異なり、ＢｃＧｌｙｏｘ１変異体はＢ５培地中で単糖の存在下（標準培地）においては発芽しないため、分生子を室温で２時間、１％強麦芽抽出物中で予備インキュベートすることによって発芽を刺激した。これは野生型および変異体の効率的な発芽を導いた。これらの予備インキュベートした懸濁液を同様に接種に用い、他の欠陥または欠損による変異体の病原性を排除した。しかしながら、これらの実験でさえ、変異体が試験組織に感染できないことを示した（図９から１２）。
【０１８６】
最後に、単糖の利用に関する変異体の問題を排除するため、接種懸濁液にアルギニンをさらに添加した。傷ついたリンゴへの変異体分生子および野生型のアルギニン含有懸濁液の接種は、両者の場合において壊死組織が発生することを明らかにした。野生型の病変は、最終的に全ての組織が腐敗するまで、数日間蔓延した。変異体によって生じた病変は２日から３日間蔓延し、そこで直ちに蔓延が完全に停止した。
【実施例１０】
【０１８７】
グリオキサールオキシダーゼの酵素活性の発現の検出
イン・ビトロおよびイン・ビボ、例えば、実施例３に説明されるように産生される本発明によるＵ．メイジス細胞（ＣＡ９５）におけるグリオキサールオキシダーゼの活性は、基質メチルグリオキサールの変換に基づき、以下の反応を利用して検出することができる：
工程１：
メチルグリオキサール＋Ｏ２→ピルベート＋Ｈ２Ｏ２
工程２：
Ｈ２Ｏ２＋１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標））→レゾルフィン＋Ｈ２Ｏ
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標）はＨ２Ｏ２と１：１の化学量論で反応し、レゾルフィン（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オンナトリウム塩）を生じる。蛍光を５５０ｎｍの励起波長および５９５ｎｍの放射で測定する。このアッセイにおいては１０ｍＭメチルグリオキサールの基質濃度を用いた。無傷の細胞を用いるとき、グリオキサールオキシダーゼ濃度が低く、したがって、反応をより長時間進行させなければならないことを考慮しなければならない。したがって、例えば、非常に良好な読み取り値は９時間のインキュベーション後に得られた。１ｍＭメチルグリオキサールの濃度では、所定の窓においては反応は観察されなかった。１００ｍＭメチルグリオキサールの添加は変換速度の僅かな増加を生じるだけであったが、２ｍＭから１０ｍＭメチルグリオキサールでの変換速度の増加は速度論の直線部分の範囲内である（図１３）。
【実施例１１】
【０１８８】
阻害剤を特定するための酵素アッセイ
酵素アッセイを５０μｌの総容積で行った。この目的のため、アッセイしようとする基質を１０μｌ基質溶液（５０ｍＭメチルグリオキサール、２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ）の状態で３８４マイクロタイタープレートに導入した。メチルグリオキサールに対するグリオキサールオキシダーゼのＫＭ値は前もって決定されていた（図１４を参照）。阻害効果について試験しようとする候補化合物の濃度は、実施されるアッセイにおける基質の最終濃度が１０μＭであるようなものであった。次の工程において、２０μｌの細胞溶液（過剰産生株Ｂａｙ−ＣＡ９５の細胞（ＯＤ６００＝５）；０．２Ｍ  ２，２−ジメチルスクシネートバッファ、ｐＨ５、４℃に冷却）を添加した。２０μｌの検出溶液（１２５μＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標）試薬（１００％ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ貯蔵溶液）、２．５Ｕ／ｍｌセイヨウワサビペルオキシダーゼ、６２．５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．４）を混合物に添加した。その混合物を３０℃で９時間インキュベートした。その後、蛍光の増加をλ＝５５０ｎｍ（吸収）およびλ＝５９５ｎｍ（放射）で測定し、Ｂａｙ−ＣＡ９５細胞の存在下における測定の結果を野生型Ｕ．メイジス５１８細胞の存在下における測定の結果と比較した（図１５も参照）。このアッセイにおいて用いられた物質は以下の最終濃度で存在していた：ｃ（２，２−ジメチルスクシネート／ＮａＯＨ）＝４０ｍＭ、ｃ（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標）（分子プローブ））＝５０μＭ、ｃ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）＝０．００１Ｕ／μｌ、ｃ（メチルグリオキサール）＝１０ｍＭ、ＯＤ（Ｂａｙ−ＣＡ９５）＝１、ｃ（リン酸ナトリウムバッファ）＝２５ｍＭ。候補化合物の阻害効果は相対蛍光度の減少からわかり、阻害剤を特定した。表ＩＩはグリオキサールオキシダーゼ阻害剤として作用する化合物の例を示す。表ＩＩは、個々の化合物について決定されているｐＩ５０値も示す。ｐ１５０値は、酵素の５０％阻害を導く物質のモル濃度を示すＩＣ５０値として知られるものの負の常用対数である。例えば、８のｐＩ５０値は１０ｎＭの濃度での酵素の最大阻害の半分に相当する。図１５は、グリオキサールオキシダーゼの活性に対する化合物（表ＩＩ、実施例３）の効果の例を示す。
【０１８９】
【表３】
2005502358.tif 000005
2005502358.tif 000006
【実施例１２】
【０１９０】
特定されているグリオキサールオキシダーゼ阻害剤の殺真菌効果の実証
例として、とりわけベンツリア・イナエクアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）に対する、化合物の抗真菌作用（防御作用）を試験した。この真菌はリンゴ黒星病として知られるものを生じ、これはリンゴ類果樹における葉の黒色および緑色斑点につながる。これらの病変は拡大し、かつ融合する。重度に感染した葉は死に、これは木がそれらの葉を夏に失うことにつながり得る。感染は果実に対する有害効果も有する。果実の黒星病は、コルク化および変形した果実を伴う、皮の灰色病変として現れる。
【０１９１】
活性化合物の適切な調製品を調製するため、１重量部の活性化合物を、例えば、２４．５重量部のアセトンおよび２４．５重量部のジメチルホルムアミドおよび乳化剤としての１．０重量部のアルキルアリールポリグリコールエーテルと混合し、その濃縮物を水で所望の濃度に希釈する。
【０１９２】
防御活性について試験するため、若年植物に活性化合物の調製品を述べられる適用率で噴霧する。噴霧コーティングが乾燥した後、それらの植物にリンゴ黒星病病原体ベンツリア・イナエクアリスの水性分生子懸濁液を接種し、インキュベーション・キャビネット内に１日間、約２０℃および１００％相対大気湿度で留める。
【０１９３】
次に、植物を約２１℃および約９０％の相対大気湿度の温室に入れる。
【０１９４】
接種後１日から１２日に、試験を評価する。０％は対照に相当する効力を意味し、それに対して１００％の効力は疾病が観察されないことを意味する。
【０１９５】
２５０ｐｐｍの濃度で、実施例４の化合物（表Ｉ）は４５％の効力を示した。
【０１９６】
図及び配列表
図１は、配列番号１および配列番号３に示される本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１、Ｇｌｏ２およびＧｌｏ３、Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ並びに既知のファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの間の相同性の決定（ＢＥＳＴＦＩＴ）。Ｕ．メイジスＧｌｏ１とＰ．クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼとの類似性は４４％であり、これに対して同一性は３８％である。銅イオンの配位に重要なものである保存位置は灰色の背景に対して示される。
【０１９７】
図２は、（Ａ）ｇｌｏ１ゼロ変異体を特定するためのサザーン分析。各々の場合において述べられるウスチラゴ株の各々のゲノムＤＮＡ  １μｇをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断し、１％アガロースゲルにおいて分離してブロットした。ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブ（１２００ｂｐ；図２Ｂに示されるような、プライマーＲＢ１／ＲＢ２でのＰＣＲ断片）を用いてハイブリダイゼーションを行った。個々のレーンにおいて適用されたＤＮＡは以下の株から単離した：
レーン２：野生型Ｕｍ５１８；レーン３：野生型Ｕｍ５２１；レーン４−８：Ｕｍ５１８の形質転換体（５１８＃０、５１８＃１、５１８＃４、５１８＃６、５１８＃８）；レーン９−１３：Ｕｍ５２１の形質転換体（５２１＃１、５２１＃５、５２１＃７、５２１＃８、５２１＃９）。レーン１における１ｋｂプラスＤＮＡマーカーはサイズマーカーとして作用した。
（Ｂ）ｇｌｏ１ゼロ変異体を産生するための相同組換えの模式的表示。プライマーＲＢ１およびＲＢ２はハイブリダイゼーションのためのＤＮＡプローブとして用いられるＰＣＲ産生物を定義する（Ｋａｍｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｒｅ（２００１）も参照）。
【０１９８】
図３は、ｇｌｏ１ゼロ変異体は多面的な形態学的欠陥を示す。問題の培養物をＰＤ培地において０．８のＯＤ６００まで成長させ、Ｈ２Ｏで洗浄した後、０．２％ケルツァン（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）溶液に再懸濁させた。大文字はゼロ変異体を示し、一方小文字は野生型を示す。Ａ、ｂ、ｃ、Ｆ、Ｇ、ＪおよびＫはＵｍ５１８株またはそれらの派生体であり、ｃ、ｄ、ｅ、Ｈ、Ｊ、ＬおよびＭはＵｍ５２１株およびそれらの派生体である。
【０１９９】
【化２】
2005502358.tif 000007
【０２００】
図４は、（デルタ）ｇｌｏ１株の表現型。（デルタ）ｇｌｏ１対立遺伝子をＵ．メイジス株Ｕｍ５２１（ａｌｂ１）およびＵｍ５１８（ａ２Ｂ２）に導入した。これらの株は全て、単独または述べられる組合せのいずれかで、ＰＣ木炭プレート培地に滴下により適用した。４８時間接種した後、白色空中菌糸の存在が接合の成功を示す。
【０２０１】
図５は、Ｂ．シネレアＢｃＧｌｙｏｘ１配列の主な特徴。ＢｃＧＬＹＯＸ１のタンパク質配列は、植物タンパク質（例えば、１型キチナーゼ、レクチン）において見出すことができる多糖結合ドメインとの相同性を有する短い配列が続く、推定シグナルペプチド開裂部位を含む。このドメインは、グリオキサールオキシダーゼをコードするＰ．クリソスポリウム遺伝子およびガラクトースオキシダーゼをコードする遺伝子（ダクチリウム・デンドロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ  ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ）に由来）との相同性を有する触媒ドメインに先行する。ＢｃＧｌｙｏｘ１遺伝子は、Ｐ．クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼに典型的である通常のＣｕ２＋結合部位をも含む。遺伝子を単離するのに用いられる開裂部位も示される。単離に用いられるＢ．シネレア断片の位置およびサザーン分析に用いられるＤＮＡプローブと同様に、見出されたイントロンがマークされた。
【０２０２】
図６は、図に示されるように３種類の異なる制限酵素で切断されたＢ．シネレア（Ｂ０５．１０株）のゲノムＤＮＡを用いるサザーンブロット。制限されたＤＮＡはＢ．シネレアに由来する放射標識３８５ｂｐ断片とハイブリダイズした。
【０２０３】
図７は、ノックアウト変異体の産生に用いられ、かつ元のベクターのＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を置換するハイグロマイシン耐性カセットを含むベクターｐＨｙＧＬＹＯＸ１の調製。
【０２０４】
図８は、ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。例として、関心保存アミノ酸が灰色の背景に対して示される。
【０２０５】
図９は、ノックアウト変異体の無病原性。
切除したリンゴ（Ａｌｋｍｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｏｘ  Ｏｒａｎｇｅ）にＢ．シネレア分生子の懸濁液（実施例９を参照）を接種した。接種した宿主組織に２０℃で明所において接種した。試験したＢｃＧｌｙｏｘ１変異体（ノックアウト変異体）は原発性壊死病変を生じることができず（図９、Ａ４ａおよびＲ３ａ）、それに対して野生型は原発性病変を生じ（図９、Ｂ０５．１０）、それはある程度隣接組織に蔓延した。麦芽抽出物と共に予備インキュベートした懸濁液の場合（実施例９を参照）、それらの変異体が試験組織に感染できないことも明らかとなった。
【０２０６】
図１０は、ノックアウト変異体の無病原性。
切除したトマト（リコペリコン・エスクレンツム）にＢ．シネレア分生子の懸濁液（実施例９を参照）を接種した。接種した宿主組織を１５℃で暗所においてインキュベートした。試験したＢｃＧｌｙｏｘ１変異体（ノックアウト変異体）は原発性壊死病変を生じることができず（図１０、左、Ａ４ａ、および中央、Ｒ３ａのトマト）、それに対して野生型Ｂ０５．１０は原発性病変を生じ（図１２、右のトマト）、それはある程度隣接組織に蔓延した。
【０２０７】
図１１は、ノックアウト変異体の無病原性。
切除したトマト（リコペリコン・エスクレンツム）の葉にＢ．シネレア分生子の懸濁液（実施例９を参照）を各々の場合において一方の側に接種した。接種した宿主組織を１５℃で暗所においてインキュベートした。試験されているＢｃＧｌｙｏｘ１変異体（ノックアウト変異体）は原発性壊死病変を生じることができず（図１１、葉の右半分）、それに対して野生型は原発性病変を生じ（図１１、葉の左半分）、それは隣接組織に蔓延した。
【０２０８】
図１２は、ノックアウト変異体の無病原性。
切除したガーベラ雑種の花に乾燥Ｂ．シネレア分生子（実施例９を参照）をまぶした。接種した宿主組織を１５℃で暗所においてインキュベートした。全ての実験構成において、試験したＢｃＧｌｙｏｘ１変異体は原発性壊死病変を生じることができず（図１２Ａ）、それに対して野生型は原発性病変を生じ、それはある程度隣接組織に蔓延した（図１２Ｂ）。
【０２０９】
図１３は、異なる基質濃度の関数としてのグリオキサールオキシダーゼによるメチルグリオキサールの変換の比較。
Ｇｌｏ１の発現を、Ｇｌｏ１が過剰産生されるＣＡ９５細胞（Ｕ．メイジス株ＢＡＹ−ＣＡ９５、実施例３を参照）におけるメチルグリオキサール（ＭＧ）の酵素変換を基準にして、無傷の細胞において検出した（実施例１０を参照）。この試験においては１０ｍＭメチルグリオキサールの基質濃度を用いる。１ｍＭメチルグリオキサールの濃度では、所定の範囲において反応は観察されなかった。１００ｍＭメチルグリオキサールの添加は変換速度の僅かな増加を生じるのみであり、それに対して２ｍＭから１０ｍＭメチルグリオキサールでの変換速度の増加は速度論の直線範囲内にある。この試験は無傷の細胞だけではなく、細胞断片（膜画分）でも行った。
【０２１０】
図１４は、メチルグリオキサールに対するグリオキサールオキシダーゼのＫＭを決定するためのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット。
反応をセイヨウワサビペルオキシダーゼと組み合わせることにより、アッセイを継続的に行った（実施例１０を参照）。Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標）（分子プローブ）の変換を蛍光定量的に監視した（λ（ｅｘｃ）＝５５０ｎｍ；λ（ｅｍ）＝５９５ｎｍ）。反応容積は５０μｌであった。約１８０分のインキュベーション期間（ラグ相）の後およびブランク値を差し引いた後に変換速度を決定した。
【０２１１】
図１５は、本発明による阻害剤の添加によるＧｌｏ１の阻害。
【０２１２】
実施例１０において説明されるように、検出試薬Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（登録商標）との組合せアッセイ系を用いてＧｌｏ１活性を行った。Ｂａｙ−ＣＡ９５細胞（ＣＡ９５）の代わりに、Ｕ．メイジス野生型５１８細胞を対照として用いた。本発明による方法において特定された化合物のうちの１つ（表ＩＩ、実施例３）（阻害剤）を１０μＭおよび１００μＭの２種類の異なる濃度で用いた。
【０２１３】
配列番号１
Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１をコードする核酸配列（ｃＤＮＡ）。
【０２１４】
配列番号２
配列番号１に示される配列によってコードされるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１のアミノ酸配列。
【０２１５】
配列番号３
Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１をコードする核酸配列（ゲノムＤＮＡ）。
【０２１６】
配列番号４
配列番号３に示される配列によってコードされるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１のアミノ酸配列。
【０２１７】
配列番号５
Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ２をコードする核酸配列（ｃＤＮＡ）。
【０２１８】
配列番号６
配列番号５に示される配列によってコードされるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ２のアミノ酸配列。
【０２１９】
配列番号７
Ｕ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ３をコードする核酸配列（ｃＤＮＡ）。
【０２２０】
配列番号８
配列番号７に示される配列によってコードされるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ３のアミノ酸配列。
【０２２１】
配列番号９
Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸配列（ｃＤＮＡ）
【０２２２】
配列番号１０
配列番号９に示される配列によってコードされるＢ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼのアミノ酸配列。
【０２２３】
配列番号１１
Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼをコードする核酸配列（２つのエクソン、エクソン１およびエクソン２、並びにイントロンを含むゲノムＤＮＡ）
【０２２４】
配列番号１２
配列番号１１に示される配列によってコードされるＢ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼのアミノ酸配列（この配列表においてはエクソン１および２は連結していた）。
【０２２５】
【表４】
2005502358.tif 000008
2005502358.tif 000009
2005502358.tif 000010
2005502358.tif 000011
2005502358.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１−１】配列番号１および配列番号３に示される本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１、Ｇｌｏ２およびＧｌｏ３、Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ並びに既知のファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの間の相同性の決定（ＢＥＳＴＦＩＴ）。
【図１−２】配列番号１および配列番号３に示される本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１、Ｇｌｏ２およびＧｌｏ３、Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ並びに既知のファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの間の相同性の決定（ＢＥＳＴＦＩＴ）。
【図１−３】配列番号１および配列番号３に示される本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１、Ｇｌｏ２およびＧｌｏ３、Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ並びに既知のファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの間の相同性の決定（ＢＥＳＴＦＩＴ）。
【図１−４】配列番号１および配列番号３に示される本発明によるＵ．メイジス・グリオキサールオキシダーゼＧｌｏ１、Ｇｌｏ２およびＧｌｏ３、Ｂ．シネレア・グリオキサールオキシダーゼ並びに既知のファネロカエテ・クリソスポリウム・グリオキサールオキシダーゼの間の相同性の決定（ＢＥＳＴＦＩＴ）。
【図２】（Ａ）ｇｌｏ１ゼロ変異体を特定するためのサザーン分析。（Ｂ）ｇｌｏ１ゼロ変異体を産生するための相同組換えの模式的表示。
【図３】ｇｌｏ１ゼロ変異体は多面的な形態学的欠陥を示す。
【図４】（デルタ）ｇｌｏ１株の表現型。
【図５】Ｂ．シネレアＢｃＧｌｙｏｘ１配列の主な特徴。
【図６】３種類の異なる制限酵素で切断されたＢ．シネレア（Ｂ０５．１０株）のゲノムＤＮＡを用いるサザーンブロット。
【図７】ノックアウト変異体の産生に用いられ、かつ元のベクターのＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を置換するハイグロマイシン耐性カセットを含むベクターｐＨｙＧＬＹＯＸ１の調製。
【図８−１】ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。
【図８−２】ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。
【図８−３】ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。
【図８−４】ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。
【図８−５】ウスチラゴ・メイジス（Ｕｓｔｍａｙ）、ボトリチス・シネレア（ｂｏｔｃｉｎｇｌｏｘ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（ＰＣＧＬＸ２Ｇ＿１）に由来するグリオキサールオキシダーゼをコードする配列または配列断片およびアラビドプシス・タリアナに由来する（グリオキサールオキシダーゼをコードする）様々な推定ＯＲＦ（ＡＴＦ５Ｋ２０．２５推定、ＡＴＦ１５Ｂ８＿１９推定、ＡＴＡＣ２１３０＿１１、ＡＣ０１２１８８＿２０）の間の配列整列化。
【図９】ノックアウト変異体の無病原性。
【図１０】ノックアウト変異体の無病原性。
【図１１】ノックアウト変異体の無病原性。
【図１２】ノックアウト変異体の無病原性。
【図１３】異なる基質濃度の関数としてのグリオキサールオキシダーゼによるメチルグリオキサールの変換の比較。
【図１４】メチルグリオキサールに対するグリオキサールオキシダーゼのＫＭを決定するためのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット。
【図１５】本発明による阻害剤の添加によるＧｌｏ１の阻害。
【図１−１】
2005502358.tif 000013
【図１−２】
2005502358.tif 000014
【図１−３】
2005502358.tif 000015
【図１−４】
2005502358.tif 000016
【図２】
2005502358.tif 000017
【図３】
2005502358.tif 000018
【図４】
2005502358.tif 000019
【図５】
2005502358.tif 000020
【図６】
2005502358.tif 000021
【図７】
2005502358.tif 000022
【図８−１】
2005502358.tif 000023
【図８−２】
2005502358.tif 000024
【図８−３】
2005502358.tif 000025
【図８−４】
2005502358.tif 000026
【図８−５】
2005502358.tif 000027
【図９】
2005502358.tif 000028
【図１０】
2005502358.tif 000029
【図１１】
2005502358.tif 000030
【図１２】
2005502358.tif 000031
【図１３】
2005502358.tif 000032
【図１４】
2005502358.tif 000033
【図１５】
2005502358.tif 000034
【国際公開パンフレット】
2005502358.tif 000035
2005502358.tif 000036
2005502358.tif 000037
2005502358.tif 000038
2005502358.tif 000039
2005502358.tif 000040
2005502358.tif 000041
2005502358.tif 000042
2005502358.tif 000043
2005502358.tif 000044
2005502358.tif 000045
2005502358.tif 000046
2005502358.tif 000047
2005502358.tif 000048
2005502358.tif 000049
2005502358.tif 000050
2005502358.tif 000051
2005502358.tif 000052
2005502358.tif 000053
2005502358.tif 000054
2005502358.tif 000055
2005502358.tif 000056
2005502358.tif 000057
2005502358.tif 000058
2005502358.tif 000059
2005502358.tif 000060
2005502358.tif 000061
2005502358.tif 000062
2005502358.tif 000063
2005502358.tif 000064
2005502358.tif 000065
2005502358.tif 000066
2005502358.tif 000067
2005502358.tif 000068
2005502358.tif 000069
2005502358.tif 000070
2005502358.tif 000071
2005502358.tif 000072
2005502358.tif 000073
2005502358.tif 000074
2005502358.tif 000075
2005502358.tif 000076
2005502358.tif 000077
2005502358.tif 000078
2005502358.tif 000079
2005502358.tif 000080
2005502358.tif 000081
2005502358.tif 000082
2005502358.tif 000083
2005502358.tif 000084
2005502358.tif 000085
2005502358.tif 000086
2005502358.tif 000087
2005502358.tif 000088
2005502358.tif 000089
2005502358.tif 000090
2005502358.tif 000091
2005502358.tif 000092
2005502358.tif 000093
2005502358.tif 000094
2005502358.tif 000095
2005502358.tif 000096
2005502358.tif 000097
2005502358.tif 000098
2005502358.tif 000099
2005502358.tif 000100
2005502358.tif 000101
2005502358.tif 000102
2005502358.tif 000103
2005502358.tif 000104
2005502358.tif 000105
2005502358.tif 000106
2005502358.tif 000107
2005502358.tif 000108
2005502358.tif 000109
2005502358.tif 000110
2005502358.tif 000111
2005502358.tif 000112
2005502358.tif 000113
2005502358.tif 000114
2005502358.tif 000115
2005502358.tif 000116
2005502358.tif 000117
2005502358.tif 000118
2005502358.tif 000119
2005502358.tif 000120
2005502358.tif 000121
2005502358.tif 000122
2005502358.tif 000123
2005502358.tif 000124
2005502358.tif 000125
2005502358.tif 000126
2005502358.tif 000127
2005502358.tif 000128
2005502358.tif 000129
2005502358.tif 000130
2005502358.tif 000131
2005502358.tif 000132
2005502358.tif 000133
2005502358.tif 000134
2005502358.tif 000135
2005502358.tif 000136
2005502358.tif 000137
2005502358.tif 000138
2005502358.tif 000139
2005502358.tif 000140
2005502358.tif 000141
2005502358.tif 000142
2005502358.tif 000143
2005502358.tif 000144
2005502358.tif 000145
2005502358.tif 000146
2005502358.tif 000147
2005502358.tif 000148
2005502358.tif 000149
2005502358.tif 000150
2005502358.tif 000151
2005502358.tif 000152
2005502358.tif 000153
2005502358.tif 000154
2005502358.tif 000155
2005502358.tif 000156
2005502358.tif 000157
2005502358.tif 000158
2005502358.tif 000159
2005502358.tif 000160
2005502358.tif 000161
2005502358.tif 000162
2005502358.tif 000163
2005502358.tif 000164
2005502358.tif 000165
2005502358.tif 000166
2005502358.tif 000167
2005502358.tif 000168
2005502358.tif 000169
2005502358.tif 000170
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502358.tif 000171
2005502358.tif 000172
2005502358.tif 000173
2005502358.tif 000174
2005502358.tif 000175
2005502358.tif 000176
2005502358.tif 000177
2005502358.tif 000178
2005502358.tif 000179
2005502358.tif 000180
2005502358.tif 000181
2005502358.tif 000182
2005502358.tif 000183
2005502358.tif 000184
2005502358.tif 000185
2005502358.tif 000186
2005502358.tif 000187
2005502358.tif 000188
2005502358.tif 000189
2005502358.tif 000190
2005502358.tif 000191
2005502358.tif 000192
2005502358.tif 000193
2005502358.tif 000194
2005502358.tif 000195
2005502358.tif 000196
2005502358.tif 000197
2005502358.tif 000198
2005502358.tif 000199
2005502358.tif 000200
2005502358.tif 000201
2005502358.tif 000202
2005502358.tif 000203
2005502358.tif 000204
2005502358.tif 000205
2005502358.tif 000206
2005502358.tif 000207
2005502358.tif 000208
2005502358.tif 000209
2005502358.tif 000210
2005502358.tif 000211
2005502358.tif 000212
2005502358.tif 000213
2005502358.tif 000214
2005502358.tif 000215
2005502358.tif 000216
2005502358.tif 000217
2005502358.tif 000218
2005502358.tif 000219
2005502358.tif 000220
2005502358.tif 000221
2005502358.tif 000222
2005502358.tif 000223
2005502358.tif 000224
2005502358.tif 000225
2005502358.tif 000226
2005502358.tif 000227
2005502358.tif 000228
2005502358.tif 000229
2005502358.tif 000230
2005502358.tif 000231
2005502358.tif 000232
2005502358.tif 000233
2005502358.tif 000234
2005502358.tif 000235
2005502358.tif 000236
2005502358.tif 000237
2005502358.tif 000238
2005502358.tif 000239
2005502358.tif 000240
2005502358.tif 000241
2005502358.tif 000242
2005502358.tif 000243
2005502358.tif 000244
2005502358.tif 000245
2005502358.tif 000246
2005502358.tif 000247
2005502358.tif 000248
2005502358.tif 000249
2005502358.tif 000250
2005502358.tif 000251
2005502358.tif 000252
2005502358.tif 000253
2005502358.tif 000254
2005502358.tif 000255
2005502358.tif 000256
2005502358.tif 000257
2005502358.tif 000258
2005502358.tif 000259
2005502358.tif 000260
2005502358.tif 000261
2005502358.tif 000262
2005502358.tif 000263
2005502358.tif 000264
2005502358.tif 000265
2005502358.tif 000266
2005502358.tif 000267
2005502358.tif 000268
2005502358.tif 000269
2005502358.tif 000270
2005502358.tif 000271
2005502358.tif 000272
2005502358.tif 000273
2005502358.tif 000274
2005502358.tif 000275
2005502358.tif 000276
2005502358.tif 000277
2005502358.tif 000278
2005502358.tif 000279
2005502358.tif 000280
2005502358.tif 000281
2005502358.tif 000282
2005502358.tif 000283
2005502358.tif 000284
2005502358.tif 000285
2005502358.tif 000286
2005502358.tif 000287
2005502358.tif 000288
2005502358.tif 000289
2005502358.tif 000290
2005502358.tif 000291
2005502358.tif 000292
2005502358.tif 000293
2005502358.tif 000294
2005502358.tif 000295
2005502358.tif 000296
2005502358.tif 000297
2005502358.tif 000298
2005502358.tif 000299
2005502358.tif 000300
2005502358.tif 000301
2005502358.tif 000302
2005502358.tif 000303
2005502358.tif 000304
2005502358.tif 000305
2005502358.tif 000306
2005502358.tif 000307
【国際調査報告】
2005502358.tif 000308
2005502358.tif 000309
2005502358.tif 000310
2005502358.tif 000311
2005502358.tif 000312
2005502358.tif 000313
2005502358.tif 000314
2005502358.tif 000315
2005502358.tif 000316
2005502358.tif 000317
2005502358.tif 000318
2005502358.tif 000319
2005502358.tif 000320
2005502358.tif 000321