(57)【要約】全細胞パニングのための新たな方法および装置は、ファージ／ファージミド粒子に対して透過性の膜により分離された細胞の均一集団を採用する。この装置は、第１のタイプの細胞の第１の集団を含み得る第１のチャンバー；第２のタイプの細胞の第２の集団を含み得る第２のチャンバー；および該２つのチャンバーを分離する膜であって、細胞の該第１の集団と該第２の集団との混合を防ぎながら、ファージ粒子およびファージミド粒子に対して透過性である膜を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタイプの細胞の第１の集団を含み得る第１のチャンバー；
第２のタイプの細胞の第２の集団を含み得る第２のチャンバー；および
該２つのチャンバーを分離する膜であって、細胞の該第１の集団と該第２の集団との混合を防ぎながら、ファージ粒子およびファージミド粒子に対して透過性である膜、を備える、装置。
【請求項２】
前記膜に隣接する、少なくとも１つの除去可能な中実挿入物をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記膜を挟持する、第１の除去可能な中実挿入物および第２の中実挿入物をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
リッドをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
細胞の第１の集団の懸濁物を含み得、かつ開放端部を有する第１のコンテナ；
細胞の第２の集団を含み得、かつ開放端部を有する第２のコンテナ；および
該第１のコンテナおよび該第２のコンテナの両方の開放端部を受容するように適合されたカップリングであって、その中に配置された膜を有し、それを通るファージ粒子およびファージミド粒子の通過を可能にしながら、細胞の該第１の集団を細胞の該第２の集団から維持する、カップリング、を備える、装置。
【請求項６】
前記第１のコンテナおよび前記第２のコンテナの各々が、前記開放端部に隣接するねじ部分を有する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記カップリングが、前記第１のコンテナおよび前記第２のコンテナのねじ部分を受容する第１のねじ部分および第２のねじ部分を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記第１のコンテナの開放端部を水密様式でシールし得る第１のリッド、および前記第２のコンテナの開放端部を水密様式でシールし得る第２のリッドをさらに備える、請求項５に記載の装置。
【請求項９】
前記第１のリッドおよび前記第２のリッドがねじキャップである、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記カップリングが、前記第１のコンテナおよび前記第２のコンテナをスナップ適合関係で受容する、請求項６に記載の装置。
【請求項１１】
培地中の細胞の第１の集団の第１の懸濁物を含み得、かつ開放端部を有する第１のコンテナ；
該第１のコンテナの開放端部を覆う半透過性膜であって、細胞の通過に対して不透過性である半透過性膜；
培地中の細胞の第２の集団の第２の懸濁物を含み得、かつ開放端部を有する第２のコンテナ；
該第２のコンテナの開放端部を覆う半透過性膜であって、細胞の通過に対して不透過性である半透過性膜；ならびに
該第１のコンテナおよび該第２のコンテナの両方の開放端部を、該第１の懸濁物および該第２の懸濁物の培地の接触を許容するような様式で受容するように適合されたカップリング、を備える、装置。
【請求項１２】
前記第１のコンテナおよび第２のコンテナの各々が、前記開放端部に隣接するねじ部分を有する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記カップリングが、前記第１のコンテナおよび前記第２のコンテナのねじ部分を受容するための第１のねじ部分および第２のねじ部分を含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１のコンテナの開放端部を水密様式でシールし得る第１のリッド、および前記第２のコンテナの開放端部を水密様式でシールし得る第２のリッドをさらに備える、請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１のリッドおよび前記第２のリッドがねじキャップである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記カップリングが、前記第１のコンテナおよび前記第２のコンテナをスナップ適合関係で受容する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１７】
抗原に結合する抗体について抗体ライブラリーをスクリーニングする方法であって：
抗原陽性細胞の集団を含む第１の懸濁物を提供する工程；
抗原陰性細胞の集団を含む第２の懸濁物を提供する工程；
該第１の懸濁物または該第２の懸濁物の少なくとも１つに、複数のメンバーを含むディスプレイライブラリーを添加する工程；
該抗原陽性細胞の集団の、該抗原陰性細胞の集団からの分離を、該ディスプレイライブラリーのメンバーの該第１の懸濁物および該第２の懸濁物の両方中への通過を可能にしながら、半透過性膜によって維持する工程；および
該抗原陽性集団から細胞を回収し、それに結合した該ディスプレイライブラリーのメンバーを同定する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（技術分野）
本開示は、均一細胞培養に対するファージ／ファージミドライブラリーを用いる全細胞パニングのための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連する技術の背景）
ファージまたはファージミド粒子ディスプレイの技法では、予備構築された抗体または抗体フラグメントライブラリーが、ファージ／ファージミドのファージコートタンパク質遺伝子に付着される。次に、抗体フラグメントが発現され、そしてファージ／ファージミド粒子の表面上にディスプレイされる。標的抗原に対する親和性をもつ抗体が捕捉され、細菌中で増殖され、そして選択の連続的なラウンドを通じてさらに濃縮される。この技法は、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｉｅｇｅｌ、２００１）に総説があるように、パニングと呼ばれている。ほとんどの事例では、パニング法は、中実支持体に固定化された精製抗原を用いる。標的抗原の精製は、推定の幹細胞マーカーまたは腫瘍特異的抗原でのように抗原が未知であるか、または抗原が十分に大量に産生することができないためのいずれかでしばしば可能ではない。また、いくつかの膜の標的（すなわち、７つの膜貫通レセプター）の精製は、溶液中の不適正な折り畳みを引き起こす可能性がある。さらに、精製は、抗原のネイティブな結合性質に影響し得る。これらの理由のため、インタクトな細胞表面上のような、そのネイティブな状態にある抗原に結合する抗体−保持ファージ／ファージミド粒子についてパニングすることが所望される。
【０００３】
ファージ／ファージミドの非特異的結合は、すべてのタイプのパニングにおいて問題となる傾向にある。これは、「粘着表面」をもつ複合体抗原を用いることを含む種々の原因に起因する。全細胞を基礎にしたパニング技法では、この問題は、細胞表面上に存在する所望されない非特異的抗原またはリガンドの存在により増幅される。これらの抗原は、内因性のタンパク質、炭水化物、および脂質の形態をとり得る。細胞を基礎にするパニング技法における非特異的結合に関連する問題は、ネガティブ選択を採用することにより部分的に回避され得、そこでは、ファージ／ファージミドライブラリーが、目的の抗原を欠く細胞とプレインキュベートされる。次いで、非結合ファージ／ファージミドが、標的細胞をパニングするための出発ライブラリーとして用いられる。ネガティブ選択スキームは、非特異的結合相互作用の低親和性に起因してむしろ不十分である。さらに、ファージ／ファージミドと標的抗原との間の弱い特異的相互作用は、ファージ／ファージミドライブラリーが急速に枯渇し、そして新たな抗体−抗原相互作用を選択する機会を減少するネガティブ選択によりマスクされ得る。
【０００４】
最近、同時のポジティブ選択およびネガティブ選択を採用する方法が開発された。これらの方法は、抗原陽性細胞の不均一混合物、および過剰の抗原陰性吸着性細胞を採用する。この抗原陰性細胞は、非特異的ファージ／ファージミドのシンクとして供され、その一方、標的細胞は、特異的結合性質を示す任意のファージ／ファージミドを捕獲する。特異的結合相互作用のフィデリティーは、抗原陰性細胞に対する抗原陽性細胞の比を調節することにより制御され得る。これらの不均一混合物を採用する方法はまた、ファージ／ファージミドとのインキュベーションの後、２つの細胞型を分離するための特定のスキームを採用しなければならない。この分離を行うために多くの方法が存在する。例えば、ある方法は、フローサイトメトリー、および標的細胞上のオーソゴーナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）抗体を認識する蛍光色素標識抗体を採用する（米国特許第６，２６５，１５０ＢＩ号を参照のこと）。この方法は、吸着体細胞から標的細胞を区別する標的細胞上のマーカー抗原、およびそれに特異的な蛍光色素標識抗体の存在を予測し、特に腫瘍細胞標的中では、要求は常に容易に達成される訳ではない。
【０００５】
一般に用いられる別の方法は、標的細胞を磁性ビーズで標識し、次に吸着体細胞と混合する（米国特許第５，８７６，９２５号を参照のこと）。Ｉｇフラグメントをコードする細菌ファージは、ストレプトアビジン結合磁性マイクロビーズでプレコートされた抗原陽性ビオチン化細胞標的と過剰の非標識抗原陰性細胞との混合物に対してパニングされる。ファージインキュベーションの後、細胞を、磁性アフィニティーカラムの使用により分離する。この技法の１つの欠点は、Ｉｇフラグメントのパニングが、ビオチン／ストロレプトアビジン／磁性ビーズ複合体をディスプレイするネイティブでない細胞表面に対してなされることである。
【０００６】
なお別の方法では、結合ファージをもつ標的細胞は、免疫沈降を用いて不均一混合物から凝集され得る（米国特許第５，９８５，５４３号を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の方法を用いる全細胞パニングは、いくつかの欠点をもっている。ファージライブラリーでのパニングの後、標的細胞集団は、非特異的吸着体細胞から分離されなければならない。これは、不均一サンプル中の標的細胞が、それらを吸着体細胞から区別するマーカーを細胞表面上に有すること、およびこれらのマーカーを認識する二次抗体が利用可能であることを必要とする。第２に、標的細胞の細胞表面上のマーカーを検出するために成分を添加する作用が、細胞表面上の抗体のネイティブな環境を混乱し得、付着した磁性ビーズ複合体をもつ腫瘍細胞上でディスプレイされた抗原を結合する抗体の選択を生じることである。最後に、抗体−抗原相互作用は、分離のプロセスに起因して混乱され得る（例えば、せん断力）。
【０００８】
標的／吸着体細胞不均一混合物の利点を保持するが、目的のファージ／ファージミドを得るために細胞分離の必要性をなくす、全細胞パニングのためのより一般的な方法が有利であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要約）
全細胞パニングのための新たな方法および装置は、ファージ／ファージミド粒子に透過性の膜によって分離された細胞の均一集団を採用する。細胞の１つの集団（例えば、標的細胞）は、この膜の第１の側面上に維持され、そして目的の可能な抗原をディスプレイする標的細胞からなる。細胞の第２の集団は、膜の第２の側面上に維持され、そして非特異的吸着体細胞からなる。このプロトコールにおいては、２つの細胞集団を混合する点はない。
【００１０】
細胞培養装置は、２つ以上の異なるチャンバー中の２つ以上の細胞株の分離を、１つ以上の除去可能なバリアにより維持する。この単離されたチャンバーは、非特異的細胞と標的抗原陽性細胞との分離した増殖を可能にする。半透過性の膜が、２つの中実バリアに間に挟持され得る。異なる細胞株が、異なる増殖培地を必要とする場合、それらは、異なるチャンバー中に配置され得、そして中実片とともにその場で増殖し、チャンバー間で任意の材料の混合を防ぐ。増殖が終了した後、中実バリアは除去される。チャンバー間のバリアが除去されるとき、細胞集団は、両者とも、隣接チャンバーの間で受動的側方拡散を可能にする半透過性膜に接触する。この膜は、細胞がそれを通過することは防ぐが、より小さな粒子（例えば、ファージまたはファージミド）を通過させるポアサイズを有している。次いで、ファージ／ファージミド粒子の細胞型特異的ライブラリーが添加される。この膜は、細胞株の分離を維持しながら、装置のチャンバー間で、抗体フラグメントを保持するファージ／ファージミド粒子の側方拡散を可能にする。装置の全体は、空気循環を可能にするリッドで緩く覆われ得る。
【００１１】
別の実施形態では、個々の培養チャンバーは、上部と側部の両方に開口を有している。側面の開口部は、中実または半透過性挿入物を収容する。細胞増殖の間、個々のチャンバーは、隔離された細胞増殖を許容する中実の側面挿入物を備える。この中実の側面挿入物は除去され得、そして２つのチャンバーは、半透過性の膜挿入物のいずれかの側面上に取り付けられ得る。次いで、ファージ／ファージミドライブラリーが、細胞集団の１つまたは両方に添加され得る。この半透過性の膜は、吸着体細胞型および標的細胞型を分離したまま、チャンバー間のファージ／ファージミド粒子の受動的拡散を可能にする。装置の全体は、空気循環を可能にするためにリッドで緩くカバーされ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
図１に見られるように、全細胞パニングのための新たな装置１０は、第１のチャンバー１２および第２のチャンバー２２を規定するコンテナ１１を含む。このコンテナ１１は、細胞の溶液を支持し得る任意の不活性材料から作製され得る。構築の適切な材料は、ガラス、および、例えば、ポリカーボネートまたはポリスチレンのようなポリマーを含むが、これらに制限されるわけではない。好ましくは、構築の材料は透明である。チャンバー１２は、細胞（例えば、標的細胞）の集団を含む第１の懸濁物１３を保持する。チャンバー２２は、細胞（例えば、吸着体細胞）の集団を含む第２の懸濁物２３を保持する。緩く適合するカバー１６は、懸濁物１３、２３の汚染を防ぐ。チャンバー１２の１つの側面は、中実の除去可能な挿入物１４によって規定されている。チャンバー２２の１つの側面は、中実の除去可能な挿入物２４によって規定されている。中実の除去可能な挿入物１４、２４は、チャンバー１２、２２の内容物の混合が防がれるように水密シールを創製する。中実の除去可能な挿入物１４、２４の間に挟持されて半透過性の膜１５がある。この半透過性の膜は、細胞がこの膜を通って移動するには小さすぎる開口部を有するように設計されている。しかし、膜１５のポアは、この膜を通るディスプレイライブラリーの通過を可能にするに十分大きくなければならない。ファージまたはファージミドライブラリーの場合には、この膜のポアサイズは、０．２〜７ミクロンの範囲、好ましくは約５ミクロンである。この膜は、適切なサイズのポアが付与され得る任意の不活性材料から作製され得る。
【００１３】
中実の除去可能な挿入物１４、２４の除去に際し、第１の懸濁物および第２の懸濁物１３および２３は、それぞれ、膜１５と接触するようにされる。この膜のポアは、細胞の通過を許容するには小さ過ぎるので、細胞の２つの集団は別個のままである。ディスプレイライブラリーが、コンテナ１２、２２の１つまたは両方に添加される。ライブラリーの個々のメンバーは、この膜１５を自由に通過する。ディスプレイライブラリーの特定のメンバーは、第１の懸濁物１３中の標的細胞に優先的に結合する。所定の時間の後、生じ得る任意の結合は既に生じ、そして第１の懸濁物１３は除去され得、そしてライブラリーの結合メンバーは標的細胞から除去され得、かつ回収され得る。第２の懸濁物２３およびライブラリーの非結合メンバーは、廃棄され得る。
【００１４】
全細胞パニング装置の代替の実施形態を図３に示し、ここで、チャンバー１１２および１２２は、分離したコンテナ１１１、１２１によって規定され、その各々は、カバー１１６、１２６を有している。チャンバー１１２は、細胞（例えば、標的細胞）の集団を含む第１の懸濁物１１３を保持する。チャンバー１２２は、細胞（例えば、吸着体細胞）の集団を含む第２の懸濁物１２３を保持する。各コンテナ１１１、１２１の上部は、ねじ部分１１７、１２７をそれぞれ有している。カバー１１６、１２６は、きつくねじ込まれることができ、取扱いまたは輸送の間の漏れを避けるが、細胞培養の間は、空気循環を可能にするように緩くされたままであり得る。適切な細胞増殖が生じ、そして細胞懸濁物１１３、１２３がパニングのために用いられるべきとき、カバー１１６、１２６は除去され、ディスプレイライブラリーが、懸濁物１１３、１２３の１つまたは両方に添加され、そして共通のカバー１３０がコンテナ１１１、１２１に付与される。この共通のカバー１３０は、コンテナ１１１のねじ部分１１７にきつくねじ込まれ得る第１のねじ部分１３５、およびコンテナ１２１のねじ部分１２７にきつくねじ込まれ得る第２のねじ部分１３７を有する。膜１１５は、共通のカバー１３０の中心部分を規定する。図４に示されるように、一旦、アセンブルされた装置がその側面上に配置されると、懸濁物１１３および１２３の両方は、膜１１５と接触する。先の実施形態におけるように、この膜のポアは、細胞の通過を許容するには小さ過ぎるので、この２つの細胞の集団は別個のままである。しかし、ライブラリーの個々のメンバーは、この膜１１５を自由に通過する。このディスプレイライブラリーの特定のメンバーは、第１の懸濁物１１３中の標的細胞に優先的に結合する。所定の時間の後、生じ得る任意の結合は既に生じ、そして第１の懸濁物１１３は除去され得、そしてライブラリーの結合メンバーは標的細胞から除去され得、かつ回収され得る。第２の懸濁物１２３およびライブラリーの非結合メンバーは、廃棄され得る。
【００１５】
（図５に示される）なお別の実施形態では、チャンバー２１２および２２２は、矩形の試験管の形状の分離したコンテナ２１１、２２１によって規定されている。各コンテナ２１１、２２１は、上部カバー２１６、２２６、および膜２１５、２２５を覆うように側面フランジ２１９、２２９上にそれぞれスナップ適合する水密側面カバー２１８、２２８を有している。チャンバー２１２は、細胞（例えば、標的細胞）の集団を含む第１の懸濁物２１３を保持する。チャンバー２２２は、細胞（例えば、吸着体細胞）の集団を含む第２の懸濁物２２３を保持する。この実施形態では、懸濁物２１３は、膜２１５と直接接触し、そして懸濁物２２３は、膜２２５と直接接触している。適切な細胞増殖が生じ、そして細胞懸濁物２１３、２２３がパニングのために用いられるべきとき、ディスプレイライブラリーが、懸濁物２１３、２２３の１つまたは両方に添加される。側面カバー２１８、２２８が除去され、そして接続スリーブ２３０が、側面カバー２１８、２２８の代わりにコンテナ２１１、２２１に付与される。この接続スリーブ２３０は、２つのコンテナ２１１、２２１を、流体およびライブラリーメンバー（細胞ではない）が、一方のチャンバー２１２から他方のチャンバー２２２に通過し得るように連結する。先の実施形態におけるように、これらの膜２１５および２２５のポアは、細胞の通過を許容するには小さ過ぎるので、この２つの細胞の集団は別個のままである。しかし、ライブラリーの個々のメンバーは、これらの膜２１５、２２５を自由に通過する。このディスプレイライブラリーの特定のメンバーは、第１の懸濁物２１３中の標的細胞に優先的に結合する。所定の時間の後、生じ得る任意の結合は既に生じ、そして第１の懸濁物２１３は除去され得、そしてライブラリーの結合メンバーは標的細胞から除去され得、かつ回収され得る。第２の懸濁物２２３およびライブラリーの非結合メンバーは、廃棄され得る。
【００１６】
図５に示される実施形態の改変例では、各コンテナ上の膜の代わりに、接続スリーブ２３０上で単一の膜のみを採用することが可能である。また、上記の実施形態のいずれのチャンバーの１つまたは両方において攪拌（例えば、磁性スターラーにより）を採用することが有利であり得る。さらに、先に記載の実施形態のいずれにおいても、膜を通じるライブラリーのメンバーの移動を支援するためにポンプ輸送が有利に採用され得る。ポンプ輸送はまた、細胞懸濁物が装置のチャンバー内になお配置されている間に洗浄ステップが実施されるべき場合に役立ち得る。適切な型のポンプは、ペリスタポンプを含むが、これに限定されるわけではない。２つのシリンジ様コンテナが採用され得ることもまた企図され、そこでは、１つ以上のシリンジプランジャーを手動で用い、ポンプ輸送作用を提供する。
【００１７】
本明細書に記載の全細胞パニングの方法は、主要な欠点をなくしながら、現存する利点を保持している。標的細胞および吸着体細胞は、常時、装置の異なるチャンバー中で別個の均一な集団として維持されているので、細胞分離ステップは要求されず、それ故、細胞マーカーは不要である。さらに、細胞株は、中実のセパレーターを用いて異なる培地で増殖され得る。これらの中実のセパレーターは除去され得、半透過性の膜を剥き出す。次いで、ファージ／ファージミドライブラリーが添加される。このファージ／ファージミド粒子は、異なる細胞型が分離して維持されながら、この膜を通じて、両方のチャンバーに自由に移動し得る。
【００１８】
上記の記載は、本発明による方法の多くの特定の詳細を含んでいるが、これらの特定の詳細は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではなく、その好ましい実施形態の単なる例示である。当業者は、すべてが本明細書に添付された請求項により規定されるような本発明の範囲および思想内の多くの他の可能な改変例を想定する。例えば、ねじ付カバーの代わりに、上記コンテナは、当業者に一般に「スナップキャップ」として公知であるもので覆われ得る。これらの「スナップキャップ」は、コンテナ上で緩い第１の位置と、水密シールを形成する第２のスナップダウン位置を有する。別の例として、図５に示される実施形態における水密側面カバーは、細胞パニングのために１回使用デバイスを提供するはぎとり式カバーで置換され得る。従って、先行する記載は、例示として考慮されるべきであり、制限ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、中実バリアを所定位置に有する本開示による全細胞パニング装置の断面図である。
【図２】図２は、中実のバリアが除去された図１の全細胞パニング装置の断面図である。
【図３】図３は、本開示による全細胞パニング装置をアセンブルすることで有用な２つの個々のチャンバーの断面図である。
【図４】図４は、本開示による全細胞パニング装置を提供するためにアセンブルされたときの図３の２つの個々のチャンバーの断面図である。
【図５】図５は、中実バリアを所定位置に有する本開示による全細胞パニング装置をアセンブルすることで有用な２つの個々のチャンバーの代替の実施形態の断面図である。
【図１】
2005526498.tif 000002
【図２】
2005526498.tif 000003
【図３】
2005526498.tif 000004
【図４】
2005526498.tif 000005
【図５】
2005526498.tif 000006