(57)【要約】本発明は、オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの量を低減するための方法を提供し、この方法は、この細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸を、この細胞に導入する工程を包含する。本発明はまた、オステオポンチン関連障害の発症を阻害するための方法およびオステオポンチン関連障害を処置するための方法、ならびにこの方法を実施するための組成物を提供する。本発明は、サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための方法、およびこの方法を実施するためのキットをさらに提供する。本発明はまた、因子がオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの量を低減するか否かを決定するための方法を提供する。最後に、本発明は、内因性タンパク質によって媒介される障害に苦しむ被験体を処置するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンの発現が病因に寄与する障害を罹患するかまたは該障害の危険性がある患者を予防または処置するための方法であって、該方法は、オステオポンチンをコードするセグメントを含む有効量の核酸を被験体に投与し、これにより、該核酸は該患者において発現されてオステオポンチンを産生し、そして、該オステオポンチンは、該患者におけるオステオポンチンのレベルを低下させる免疫応答を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記免疫応答がオステオポンチンに対する抗体の形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が対宿主性移植片病を罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者がてんかんを罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が肉芽腫障害を罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が単純ヘルペス角膜塩を罹患する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が細菌性関節炎を罹患するかまたは細菌性関節炎の危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が自己免疫疾患を罹患するかまたは自己免疫疾患の危険性が有る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が慢性関節リウマチである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患がＩ型糖尿病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、前記障害の危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が前記障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸がＤＮＡでありかつ前記オステオポンチンをコードするセグメントに作動可能に連結されたプロモーターおよび必要に応じてエンハンサーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロモーターが構成的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロモーターが細胞型特異的である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が筋肉内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与する工程に応答したオステオポンチンのレベルにおける低下をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
オステオポンチンのレベルが前記患者の細胞にてモニタリングされ、該細胞は、ニューロン、マクロファージ、脈管内皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者が前記障害を有し、そして、前記方法が前記投与する工程に応答した該患者の症状における減少をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
オステオポンチンをコードする核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【請求項２５】
オステオポンチンの発現が病因に寄与する障害を罹患するかまたは該障害の危険性がある患者を予防または処置するための方法であって、該方法は、有効量のオステオポンチンを該患者に投与し、これにより該オステオポンチンは、該患者におけるオステオポンチンのレベルを低下させる免疫応答を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記オステオポンチンがアジュバントとともに投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫応答が、オステオポンチンに対する抗体の形成を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が対宿主性移植片病を罹患するかまたは対宿主性移植片病の危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者がてんかんを罹患するかまたはてんかんの危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記患者が肉芽腫障害を罹患するかまたは肉芽腫障害の危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が単純ヘルペス角膜炎を罹患する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者が細菌性関節炎を罹患するかまたは細菌性関節炎の危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者が自己免疫疾患を罹患するかまたは自己免疫疾患の危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が慢性関節リウマチである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患がＩ型糖尿病である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記患者が、前記障害の危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記患者が前記障害を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与する工程に応答したオステオポンチンのレベルにおける低下をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
オステオポンチンのレベルが前記患者の細胞にてモニタリングされ、該細胞は、ニューロン、マクロファージ、脈管内皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者が前記障害を有し、そして、前記方法が前記投与する工程に応答した該患者の症状における減少をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項４３】
オステオポンチンおよびアジュバントを含有する、組成物。
【請求項４４】
サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための方法であって、該方法は、以下；
（ａ）適切な条件下で、該サンプルを抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分に接触させる工程、
（ｂ）該サンプルに結合した抗体またはその抗原結合部分の量を決定する工程、および
（ｃ）こうして決定した量を既知の標準と比較し、それによって該サンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記標準が、オステオポンチン関連障害を有さずかつ該障害の危険性がない個体由来のサンプル中のオステオポンチンのレベルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体またはその抗原結合部分が、検出可能なマーカーで標識される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）適切な条件下で、該サンプルをオステオポンチンをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸に接触させる工程、
（ｂ）こうしてハイブリダイズした核酸の量を決定する工程、
（ｃ）こうして決定した核酸の量を既知の標準と比較し、それによって該サンプル中のオステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を決定する工程、および
（ｄ）こうして決定したｍＲＮＡの量を公知の標準と比較し、それによって該サンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項４８】
前記核酸が検出可能なマーカーで標識される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが、組織サンプルである、請求項４４または４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織サンプルが、ニューロン、マクロファージ、脈管内皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組織サンプルがオステオポンチン関連障害に苦しむかまたは該障害に苦しんでいる疑いがある被験体由来である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記組織サンプルが多発性硬化症に苦しむかまたは該障害に苦しんでいる疑いがある被験体由来である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組織サンプル内のオステオポンチンの位置を決定する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）および（ｂ）がインビボで実施される、請求項４４または４７に記載の方法。
【請求項５５】
工程（ａ）および（ｂ）がエキソビボで実施される、請求項４４または４７に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４４または４７に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットは、以下：
（ａ）因子であって、（ｉ）抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、（ｉｉ）オステオポンチンをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸、および（ｉｉｉ）オステオポンチン、からなる群から選択される因子、ならびに
（ｂ）使用説明書
を含む、キット。
【請求項５７】
因子がオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの量を低減するか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）適切な条件下で該細胞を該因子に接触させる工程、
（ｂ）該細胞におけるオステオポンチンの量を決定する工程、および
（ｃ）こうして決定した量を、該因子の不在下での匹敵する細胞におけるオステオポンチンの量と比較し、それによって該因子が該細胞におけるオステオポンチンの量を低減するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記オステオポンチン発現細胞が、ニューロン、マクロファージ、脈管内皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
工程（ｂ）において、前記細胞におけるオステオポンチンの量が、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を用いて決定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
工程（ｂ）において、前記細胞におけるオステオポンチンの量が、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸を用いて決定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
因子が、オステオポンチンの活性を低減するか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）適切な条件下で該因子をオステオポンチンに接触させる工程、
（ｂ）該因子の存在下で、オステオポンチンの活性を決定する工程、および
（ｃ）こうして決定した活性を、該因子の不在下でのオステオポンチンの活性と比較し、それによって該因子がオステオポンチンの活性を低減するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項６３】
前記オステオポンチンが細胞中にある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
内因性タンパク質が関与する障害に苦しむ被験体を処置するための方法であって、該方法は、（ａ）オステオポンチンおよび（ｂ）該内因性タンパク質またはその抗原部分を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分が、該被験体を処置するために有効な量で投与される、方法。
【請求項６７】
前記オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分が、同時に投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記オステオポンチンおよび内因性タンパク質または素の抗原部分が、別々に投与される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
内因性タンパク質が関与する障害に苦しむ被験体を処置するための方法であって、該方法は、（ａ）オステオポンチンをコードする発現可能な核酸および（ｂ）該内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする発現可能な核酸を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該核酸が、該被験体を処置するために有効な量で投与される、方法。
【請求項７０】
前記オステオポンチンをコードする核酸および前記内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする核酸が、同時に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記オステオポンチンをコードする核酸および前記内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする核酸が、別々に投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記障害が自己免疫障害である、請求項４７または５０に記載の方法。
【請求項７３】
前記障害が、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、自己免疫ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、てんかんおよびアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項６６または６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記障害が多発性硬化症である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
多発性硬化症に苦しむ被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体にオステオポンチンをコードする発現可能な核酸を治療有効量投与する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
被験体における多発性硬化症の発症を阻害する方法であって、該方法は、該被験体にオステオポンチンをコードする発現可能な核酸を予防有効量投与する工程を包含する、方法。
【請求項７７】
オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸、およびオステオポンチン関連障害の処置または予防において該核酸を使用するための説明書を含む、キット。
【請求項７８】
抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、およびオステオポンチン関連障害の処置または予防において該抗体またはその抗原結合部分を使用するための説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、＿＿＿＿に提出された＿＿＿＿の通常出願であり、この通常出願は、あらゆる目的でその全体が参考として援用される。
【０００２】
本明細書中で開示される本発明は、厚生省の米国国立衛生研究所からの助成金第Ｒ０１１８２３５号の下での政府の支援によりなされた。従って、米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本出願の全体を通じ、種々の刊行物が括弧内に参照される。これらの刊行物の完全な引用は、明細書の最後に列挙されて見出され得る。これらの刊行物の開示は、当業者に公知の技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願において本明細書中に参考として援用される。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、多発性硬化症のようなオステオポンチン関連障害の処置および予防すること、ならびに、サンプル中のオステオポンチンを定量的に測定することに関する。本発明はまた、内因性タンパク質によって媒介される自己免疫障害のような障害の処置においてオステオポンチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
（多発性硬化症）
多発性硬化症（「ＭＳ」）は、脳および脊髄における炎症により特徴付けられる脱髄疾患である。ＭＳは、神経系に関する最も一般的なヒト自己免疫疾患である。米国において、約２５０，０００の個人がＭＳを罹患する。ＭＳでは、免疫系の細胞が、脳および脊髄の神経を絶縁する脂肪性物質であるミエリンに浸入してこれを破壊する。他のＣＮＳ細胞は、複数の脱髄部位の周辺に硬化した硬化性病変（斑）を生じる。神経学的な所見は、異なる時間に生じる、ＣＮＳの別々の領域における病変を示唆する。
【０００６】
ＭＳの代表的な症状は、数年から１０年以上にわたる初発性の過程、再発の発症、その後の寛解による徴候を含む。再発はしばしば、上部呼吸器系または胃腸管のウイルス感染の発症後に生じる。約３分の１のＭＳ患者において、この疾患は、「続発性進行性ＭＳ」と名付けられる進行性の過程に発展する。少数の患者において、寛解を伴わない進行性の神経学的な悪化は、疾患の発症時から生じ、そして、これは、「原発性進行性ＭＳ」と呼ばれる。原発性進行性ＭＳと続発性進行性ＭＳの根底にある病理学的原因および遺伝的原因は不明なままである。
【０００７】
ＭＳ患者において観察される臨床的問題は、視力障害を含み得、これらはときどき、結果として以下になり得る：盲目；二重視；歩行および手の使用に影響する運動障害；協調不全（ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）；腸および膀胱の失禁；痙縮；ならびに触覚、痛覚、温覚および固有感覚の喪失を含む感覚障害。ＭＳの病状は、全体が中枢神経系にあり、そして、細静脈を取り囲み、髄鞘に伸びる炎症の典型的な像により特徴付けられる。
【０００８】
髄鞘の種々の成分に対する免疫応答がＭＳ患者において検出されている。これらの構成要素としては、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）、プロテオリピド（「ＰＬＰ」）、トランスアルドラーゼおよび２’３’環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（「ＣＮＰ」）ならびに髄鞘において見出される免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーの２つのメンバー（すなわち、ミエリンオリゴデンドログリアの糖タンパク質（「ＭＯＧ」）およびミエリン関連糖タンパク質（「ＭＡＧ」））が挙げられ得る（１１）。さらに、クリスタリン−Ｂを含むいくつかの誘導性熱ショックタンパク質がＭＳ病変のグリア細胞において検出され得、ＭＳ患者の免疫応答を刺激し得る。ＨＬＡ  ＤＲ２である約３分の２のＭＳ患者の中枢神経系の主要なＴ細胞応答およびＢ細胞応答が、ＭＢＰの残基８４と残基１０３との間の領域に方向付けられる（１４、１８）。
【０００９】
（オステオポンチン）
オステオポンチン（「ＯＰＮ」）（初期Ｔ細胞活性化遺伝子−１とも呼ばれる）は、一次構造が特徴付けられているヒトタンパク質である（２５）。ＯＰＮは、保存ＲＧＤ結合モチーフを有し、骨芽細胞によって産生される場合、骨マトリクスのミネラルに破骨細胞を係留することに関与する、多面的なタンパク質である。骨組織におけるオステオポンチンの発現は、１−α−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３によって刺激される。オステオポンチンはまた、尿結石についてのタンパク質マトリクスを提供する。
【００１０】
オステオポンチンはまた、炎症および感染性疾患に対する免疫において役割を果たす（２９）。オステオポンチンは、Ｔ細胞増殖を同時刺激し（８）、そして、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生を増強する能力ならびにＩＬ−１０を減少させる能力に起因して、Ｔｈ１サイトカインとして分類される（３２）。ラット大動脈平滑筋細胞におけるオステオポンチン発現が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼインヒビターの一種であるＮＫ−１０４によって阻害されることが示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、オステオポンチンの発現が病因に寄与する障害を罹患するかまたはその障害の危険性がある患者を予防または処置するための方法を提供する。これらの方法は、オステオポンチンをコードするセグメントを含む有効量の核酸を被験体に投与し、それにより、この核酸が患者内で発現されてオステオポンチンを産生し、そしてこのオステオポンチンが、患者中のオステオポンチンレベルを低下させる免疫応答を誘導する工程を含む。いくつかの方法において、免疫応答は抗体の形成を含む。いくつかの方法において、患者は、対宿主性移植片病（ｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、てんかん、肉芽腫障害、単純ヘルペス角膜炎、細菌性関節炎もしくは自己免疫疾患を罹患するかまたはこれらの危険性がある。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病が挙げられる。
【００１２】
核酸はＤＮＡであり得、この場合、核酸は、オステオポンチンをコードするセグメントに作動可能に連結されたプロモーターおよび必要に応じてエンハンサーをさらに含む。プロモーターは構成的であり得るかまたは細胞型特異的であり得る。あるいは、核酸はＲＮＡであり得る。いくつかの方法において、核酸は筋肉内に投与される。いくつかの方法において、被験体はヒトである。
【００１３】
いくつかの方法は、投与工程に応答性のオステオポンチンのレベルの低下をモニタリングする工程をさらに含む。いくつかの方法において、オステオポンチンのレベルは、患者の細胞においてモニタリングされ、この細胞はニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞，  星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される。いくつかの方法において、患者は障害を有し、そして、この方法は、投与に応答した患者の症状の減少をモニタリングする工程をさらに含む。
【００１４】
本発明は、オステオポンチンをコードする核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、オステオポンチンの発現が病因に寄与する障害を罹患するかまたはその障害の危険性がある患者を予防または処置するための方法をさらに提供する。これらの方法は、有効量のオステオポンチンを患者に投与し、それにより、オステオポンチンが患者中のオステオポンチンのレベルを低下させる免疫応答を誘導する工程を含む。いくつかのこのような方法において、オステオポンチンはアジュバントとともに投与される。いくつかの方法において、免疫応答はオステオポンチンに対する抗体の形成を含む。
【００１６】
いくつかの方法において、患者は、対宿主性移植片病、てんかん、肉芽腫障害、単純ヘルペス角膜炎、細菌性関節炎または上述のような自己免疫疾患を罹患するかまたはこれらの危険性がある。いくつかの方法において、患者はヒトである。
【００１７】
いくつかの方法は、投与工程に応答性のオステオポンチンのレベルの低下をモニタリングする工程をさらに含む。いくつかの方法において、オステオポンチンのレベルは、患者の細胞においてモニタリングされ、この細胞は、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞、星状細胞および小グリア細胞からなる群から選択される。いくつかの方法において、患者は、疾患を有し、そしてこの方法は投与に応答した患者の症状の減少をモニタリングする工程をさらに含む。
【００１８】
本発明は、オステオポンチンおよびアジュバントを含有する組成物をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、オステオポンチンが産生される障害においてオステオポンチンの量を低減するための方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、被験体におけるオステオポンチン関連障害の発症を阻害するための第１の方法を提供し、この方法は、オステオポンチンのレベルを特異的に低下させる、予防的有効量の核酸を被験体に投与する工程を含む。
【００２１】
さらに、本発明は、被験体においてオステオポンチン関連障害に苦しむ被験体を処置するための第１の方法を提供し、この方法は、被験体のオステオポンチンを発現する細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する治療有効量の核酸を被験体に投与する工程を含む。
【００２２】
本発明は、被験体におけるオステオポンチン関連障害の発症を阻害するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、予防的有効量の抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与する工程を含む。
【００２３】
本発明は、オステオポンチン媒介性障害に苦しむ被験体を処置するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与する工程を含む。
【００２４】
本発明は、さらに２つの組成物を提供する。第１の組成物は、オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。第２の組成物は、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【００２５】
本発明は、サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための第１の方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）適切な条件下でサンプルを抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部位に接触させる工程、（ｂ）サンプルに結合した、抗体またはその抗原結合部分の量を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した量を既知の標準と比較し、それによってサンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程、を含む。
【００２６】
本発明は、サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）適切な条件下でサンプルを、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸に接触させる工程、（ｂ）こうしてハイブリダイズした核酸の量を決定する工程、（ｃ）こうして決定した核酸の量を既知の標準と比較し、サンプル中のオステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を決定する工程、および（ｄ）こうして決定したｍＲＮＡの量を既知の標準と比較し、それによってサンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程、を含む。
【００２７】
本発明は、第１および第２の定量的方法を実施するためのキットを提供し、このキットは、（ａ）（ｉ）抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、および（ｉｉ）オステオポンチンをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸、からなる群から選択される因子、ならびに（ｂ）使用説明書を含む。
【００２８】
本発明はまた、因子がオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの量を低減するか否かを決定するための２つの方法（「アッセイ」）を提供する。第１のアッセイは、（ａ）適切な条件下で細胞を因子に接触させる工程、（ｂ）細胞中のオステオポンチンの量を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した量を、因子の不在下の匹敵する細胞におけるオステオポンチンの量と比較し、それによってこの因子が細胞中のオステオポンチンの量を低減するか否かを決定する工程、を含む。
【００２９】
第２のアッセイは、（ａ）適切な条件下で因子をオステオポンチンに接触させる工程、（ｂ）因子の存在下でオステオポンチンの活性を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した活性を因子の不在下のオステオポンチンの活性と比較し、それによってこの因子がオステオポンチンの活性を低減するか否かを決定する工程、を含む。
【００３０】
本発明は、多発性硬化症に苦しむ被験体を処置する方法をさらに提供し、この方法は、オステオポンチンをコードする発現可能な核酸を被験体に治療有効量投与する工程を含む。被験体における多発性硬化症の発症を阻害する方法もまた提供され、この方法は、オステオポンチンをコードする発現可能な核酸を被験体に予防的有効量投与する工程を含む。
【００３１】
本発明は、オステオポンチン関連障害を処置または予防するためのキットをさらに提供する。第１のキットは、オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸、およびオステオポンチン関連障害の処置または予防において核酸を使用するための説明書を含む。第２のキットは、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、および、オステオポンチン関連障害の処置または予防において抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を使用するための説明書を含む。
【００３２】
最後に、本発明は、内因性タンパク質によって媒介される障害に苦しむ被験体を処置するための２つの方法を提供する。第１の方法は、（ａ）オステオポンチンおよび（ｂ）内因性タンパク質またはその抗原部分を被験体に投与する工程を含み、ここで、オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分は、被験体を処置するのに有効な量で投与される。内因性タンパク質によって媒介される障害に苦しむ被験体を処置するための第２の方法は、被験体に、（ａ）オステオポンチンをコードする発現可能な核酸および（ｂ）内因性タンパク質またはその抗原部分コードする発現可能な核酸を投与する工程を含み、ここで、この核酸は、被験体を処置するのに有効な量で投与される。
【００３３】
（詳細な説明）
（定義）
オステオポンチンの「活性」は、そのタンパク質によってなされる任意の酵素的機能または結合機能を意味するものとする。オステオポンチン活性としては、例えばＣＤ４４への結合が挙げられる。
【００３４】
「抗体」は、例として、自然に生じる抗体および自然には生じない抗体の両方を含むものとする。特に、この用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントを含む。さらに、この用語は、キメラ抗体および完全合成抗体ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００３５】
「アンチセンス核酸」は、細胞に導入された場合、細胞において発現が阻害されるべきタンパク質（「標的タンパク質」）をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズし、それによって標的タンパク質の発現を阻害する任意の核酸を意味するものとする。
【００３６】
「触媒核酸」は、独特の基質を特異的に認識し、この基質の化学修飾を触媒する核酸を意味するものとする。
【００３７】
「匹敵する細胞」は、比較される別の細胞のものと細胞型が同一である細胞を意味するものとする。匹敵する細胞の例は、同じ細胞株由来の細胞である。
【００３８】
「ＤＮＡｚｙｍｅ」は、ＤＮＡであるかまたはその触媒成分がＤＮＡであって、独特の標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る）を特異的に認識して切断する触媒核酸を意味するものとする。各ＤＮＡｚｙｍｅは、触媒成分（「触媒ドメイン」としても呼ばれる）および２つの結合ドメインからなる標的配列結合成分を有し、このうちの１つは触媒ドメインのいずれかの側にある。
【００３９】
「内因性タンパク質」は、特定の被験体に関して、被験体自身のゲノムによって本来コードされるタンパク質を意味するものとする。
【００４０】
「発現可能な核酸」は、目的の核酸をコードする核酸および／または目的のタンパク質をコードする核酸であって、この核酸は、細胞に配置される場合に目的の核酸もしくはタンパク質の発現を可能にする、発現ベクター、プラスミドまたは、他の構築物である核酸を意味するものとする。発現ベクターおよびプラスミドは当該分野で周知である。
【００４１】
障害の発症の「阻害」は、障害の発症の可能性を減らすかまたは障害の発症を完全に妨げるかのいずれかを意味するものとする。好ましい実施形態において、障害の発症を阻害するとは、障害の発症を完全に妨げることを意味するものとする。
【００４２】
細胞における遺伝子の発現の「阻害」は、遺伝子が発現される程度を減らすかまたはこのような発現を完全に妨げるかのいずれかを意味するものとする。
【００４３】
「核酸」は、任意の核酸分子を意味するものとし、核酸としては、限定することなく、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドが挙げられる。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵならびにその誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は当該分野で周知であり、ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １９９６−１９９７，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）において例示される。
【００４４】
「オステオポンチン」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０４７６５に示されるｍＲＮＡ配列によってコードされるヒトタンパク質、全ての天然に生じるその誘導体およびホモログ、ならびに本明細書中で適用可能な場合、その全ての抗原フラグメントを意味するものとする。
【００４５】
オステオポンチンの活性フラグメントは、全長オステオポンチンと機能的特性または結合特性を共有する。
【００４６】
オステオポンチンのエピトープフラグメントは、全長オステオポンチンに結合するモノクローナル抗体に結合する。
【００４７】
「オステオポンチン関連障害」は、（ａ）苦しむ被験体におけるオステオポンチンの過剰発現によって特徴付けられる任意の障害、（ｂ）苦しむ被験体にけるオステオポンチン発現を阻害することによって寛解される任意の障害、および／または（ｃ）苦しむ被験体におけるオステオポンチン活性を阻害することによって寛解される任意の障害、（ｄ）オステオポンチンの発現が病因に寄与する任意の障害を意味するものとする。
【００４８】
いくつかの個体において正常であるオステオポンチンの発現は、それにもかかわらず、他の個体のオステオポンチンが別の細胞成分（例えば、タンパク質）とともに病因に作用する場合、このような他の個体におけるオステオポンチン関連障害に対して寄与し得る。いくつかのオステオポンチン関連障害は、正常な（すなわち、オステオポンチン関連疾患を有さず、かつこのような疾患の危険性がない）個体の集団におけるＴｈ１免疫応答およびＴｈ２免疫応答の平均と比較して上昇したＴｈ１免疫応答および抑制されたＴｈ２免疫応答によって特徴付けられる。
【００４９】
オステオポンチンの過剰発現とは、正常な個体の集団における発現レベルの平均＋１標準偏差よりも高い発現レベルを意味する。好ましくは、この発現レベルは、正常な個体の集団における発現レベルの平均の少なくとも１０倍である。
【００５０】
「リボザイム」は、ＲＮＡであるか、またはその触媒成分がＲＮＡであって、独特の標的核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る）を特異的に認識して切断する触媒核酸分子を意味するものとする。各リボザイムは、触媒成分（「触媒ドメイン」としても呼ばれる）および２つの結合ドメインからなる標的配列結合成分を有し、このうちの１つは触媒ドメインのいずれかの側にある。
【００５１】
核酸に「特異的にハイブリダイズする」とは、第１の核酸に関して、第１の核酸が第２の核酸に、任意の他の核酸よりも高い親和性でハイブリダイズすることを意味するものとする。
【００５２】
タンパク質の発現を「特異的に阻害する」とは、そのタンパク質の発現を、（ａ）任意の他のタンパク質の発現よりもまたは（ｂ）１０以下の他のタンパク質以外の他の全てのタンパク質の発現よりも阻害することを意味するものとする。
【００５３】
「被験体」または「患者」は、任意の動物（例えば、ヒト、非ヒトの霊長類、マウス、ラット、モルモットまたはウサギ）を意味するものとする。
【００５４】
「適切な条件」とは、この用語が使用される状況に依存する意味を有するものとする。すなわち、抗体と関連して使用される場合、この用語は、抗体をその対応する抗原に結合させる条件を意味するものとする。この用語が核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、この用語は、少なくとも１５ヌクレオチド長の核酸をそれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズさせる条件を意味するものとする。因子を細胞に接触させることに関連して使用される場合、この用語は、そうすることが可能な因子が細胞に入り、その意図される機能を実行させる条件を意味するものとする。１つの実施形態において、用語「適切な条件」は、本明細書中で使用される場合、生理学的条件を意味する。
【００５５】
障害を「処置する」とは、障害の進行を遅延するか、停止するかまたは逆戻りさせることを意味するものとする。好ましい実施形態において、障害を処置することは、理想的には、障害自体を除去する点まで、障害の進行を逆戻りさせることを意味する。本明細書中で使用される場合、障害を寛解することと障害を処置することとは等価である。
【００５６】
用語「免疫」応答とは、レシピエント患者におけるオステオポンチン（アミロイドペプチド）に対する有益な体液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはその分泌産物によって媒介される）応答の発達である。このような応答は、免疫原によって誘導される活性応答であり得る。「免疫原」は、必要に応じてアジュバントと組み合わされての、哺乳動物への投与の際に、それ自身に対する免疫応答を誘導し得る。
【００５７】
用語「裸のポリヌクレオチド」は、コロイド物質と複合体化されていないポリヌクレオチドをいう。裸のポリヌクレオチドは、ときどき、プラスミドベクター中にクローニングされる。
【００５８】
用語「アジュバント」は、抗原とともに投与される場合、抗原に対する免疫応答を増強するが、単独で投与される場合は抗原に対する免疫応答を生じない化合物をいう。アジュバントは、リンパ球の補充、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構によって免疫応答を増強し得る。
【００５９】
状況から明らかでない限り、本発明の全ての要素、工程または特徴は、他の要素、工程または特徴と任意に組み合わせて使用され得る。
【００６０】
（一般）
本発明は、オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの量を低減するための方法を提供し、この方法は、細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸を細胞内に導入する工程を含む。１つの実施形態において、この方法は、オステオポンチン分泌細胞によって分泌されるオステオポンチンの量をさらに低減する。
【００６１】
この方法において、核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましい実施形態において、核酸はＤＮＡである。
【００６２】
さらに、核酸は、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸、またはオステオポンチンをコードするｍＲＮＡを切断する触媒核酸であり得る。好ましい実施形態において、核酸は、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸をコードする発現可能な核酸、および／またはオステオポンチンをコードするｍＲＮＡを切断する触媒核酸をコードする発現可能な核酸であり得る。
【００６３】
オステオポンチンの発現はまた、ＷＯ  ００／００４０９に記載されるジンクフィンガータンパク質のようなジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を使用して阻害され得る。あるいは、発現の阻害は、ＷＯ  ９９／３２６１９，Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．２０，６８７７−６８８８（２００１）およびＮｙｋａｎｅｎら、Ｃｅｌｌ  １０７，３０９−３２１（２００１）；ＷＯ  ０１／２９０５８によって記載されるようなｓｉＲＮＡを使用して達成され得る。
【００６４】
これらの方法において、オステオポンチンを発現する細胞は、例えば、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞，  星状細胞および小グリア細胞であり得る。好ましい実施形態において、細胞はニューロンである。
【００６５】
本発明はまた、被験体におけるオステオポンチン関連障害の発症を抑制するための第１の方法を提供し、この方法は、被験体のオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する予防的有効量の核酸を被験体に投与する工程を含む。
【００６６】
さらに、本発明は、被験体におけるオステオポンチン関連障害に苦しむ被験体を処置するための第１の方法を提供し、この方法は、被験体のオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する治療有効量の核酸を被験体に投与する工程を含む。
【００６７】
これらの予防および処置の第１の方法において、核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましい実施形態において、核酸はＤＮＡである。
【００６８】
さらに、核酸は、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸、またはオステオポンチンをコードするｍＲＮＡを切断する触媒核酸であり得る。好ましい実施形態において、核酸は、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸をコードする発現可能な核酸、および／またはオステオポンチンをコードするｍＲＮＡを切断する触媒核酸をコードする発現可能な核酸であり得る。
【００６９】
これらの予防および処置の第１の方法においてまた、オステオポンチンの量が低減される被験体の細胞は、例えば、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞，  星状細胞および小グリア細胞であり得る。
【００７０】
本発明は、被験体におけるオステオポンチン関連障害の発症を阻害するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、予防的有効量の抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与する工程を含む。
【００７１】
本発明は、オステオポンチン媒介性障害に苦しむ被験体を処置するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を被験体に投与する工程を含む。
【００７２】
予防および処置の第１および第２の方法の好ましい実施形態において、オステオポンチン関連障害は多発性硬化症である。好ましくは、被験体はヒトである。
【００７３】
本発明は、２つの組成物をさらに提供する。第１の組成物は、オステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。第２の組成物は、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。
【００７４】
本発明の組成物の治療有効量または予防的有効量の決定は、慣習的なコンピュータ方法を使用する動物データに基づいてなされ得る。１つの実施形態において、治療有効量または予防的有効量は、適切な場合、約０．１ｍｇと約１ｇとの間の核酸またはタンパク質を含む。別の実施形態において、有効量は、適切な場合、約１ｍｇと約１００ｍｇとの間の核酸またはタンパク質を含む。さらなる実施形態において、有効量は、適切な場合、約１０ｍｇと約５０ｍｇとの間の核酸またはタンパク質を含む。
【００７５】
本発明において、本発明の組成物の投与は、当業者に公知の任意の種々の方法および送達系を使用してもたらされ得るかまたは実施され得る。投与は、例えば、静脈内、経口、移植物を介して、経粘膜、経皮、筋肉内、くも膜下腔内および皮下で実施され得る。多くの慣習的に用いられる薬学的キャリアを使用する以下の送達系は、本発明の組成物の投与のために想定された多くの実施形態の代表にすぎない。
【００７６】
注射可能な薬物送達系としては、液剤、懸濁剤、ゲル剤、ミクロスフェアおよびポリマー注射物が挙げられ、そして、溶解度変更剤（例えば、エタノール、プロピレングリコールおよびスクロース）およびポリマー（例えば、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｙｌａｃｔｏｎｅ）およびＰＬＧＡ）のような賦形剤を含み得る。移植可能な系としては、ロッドおよびディスクが挙げられ、そして、ＰＬＧＡおよびポリカプロラクトンのような賦形剤を含み得る。本発明のオステオポンチンまたは核酸はまた、粒子に接着し、遺伝子銃を使用して投与され得る。
【００７７】
経口送達系としては、錠剤およびカプセル剤が挙げられる。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ｐｙｒｉｌｏｄｏｎｅ）、他のセルロース物質およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム、ならびにセルロース物質）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース物質）および滑沢剤（例えば、ステアリン酸および滑石）のような賦形剤を含み得る。
【００７８】
経粘膜送達系としては、パッチ剤、錠剤、坐剤、ペッサリー剤、ゲル剤およびクリーム剤が挙げられ、可溶化剤およびエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）、ならびに他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、ならびに親水性ポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸））のような賦形剤を含み得る。
【００７９】
皮膚送達系としては、例えば、水性および非水性ゲル剤、クリーム剤、多乳剤（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、マイクロエマルジョン（ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、リポソーム、軟膏、水性液剤および非水性液剤、ローション剤、エアロゾル剤、炭化水素基剤および散剤が挙げられ、溶解剤、浸透エンハンサー（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）のような賦形剤を含み得る。１つの実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームまたは経皮エンハンサーである。
【００８０】
再構築可能な送達系のための液剤、懸濁剤および散剤としては、懸濁剤（例えば、ガム、キサンタン（ｚａｎｔｈａｎ）、セルロースおよび糖）、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧおよびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎ、Ｔｗｅｅｎおよびセチルピリジン）、保存剤および抗酸化剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、ならびにアスコルビン酸）、抗凝固剤、コーティング剤、ならびにキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が挙げられる。
【００８１】
本発明は、サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための第１の方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）適切な条件下でサンプルを抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部位に接触させる工程、（ｂ）サンプルに結合した、抗体またはその抗原結合部分の量を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した量を既知の標準と比較し、それによってサンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程、を含む。
【００８２】
この第１の定量方法の１つの実施形態において、因子は抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部位である、好ましくは、抗体またはその抗原結合部分は、検出可能なマーカーで標識される。
【００８３】
本発明は、サンプル中のオステオポンチンの量を決定するための第２の方法をさらに提供し、この方法は、（ａ）適切な条件下でサンプルを、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸に接触させる工程、（ｂ）こうしてハイブリダイズした核酸の量を決定する工程、（ｃ）こうして決定した核酸の量を既知の標準と比較し、サンプル中のオステオポンチンをコードするｍＲＮＡの量を決定する工程、および（ｄ）こうして決定したｍＲＮＡの量を既知の標準と比較し、それによってサンプル中のオステオポンチンの量を決定する工程、を含む。
【００８４】
この第２の定量方法の１つの実施形態において、核酸は、検出可能なマーカーで標識される。
【００８５】
第１および第２の定量方法において、サンプルは、オステオポンチンを単体でもしくはオステオポンチン産生細胞の存在下で含むか、またはオステオポンチンを単体でもしくはオステオポンチン産生細胞の存在下で含む疑いのある任意のサンプルであり得る。１つの実施形態において、サンプルは、組織サンプルである。組織サンプルとしては、限定することなく、体液サンプル（例えば、脳脊髄液および血液ならびにその成分部分）および固形組織の切片（例えば、脳および脊髄）が挙げられる。組織サンプルは、例えば、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞、星状細胞および小グリア細胞を含み得る。１つの実施形態において、組織サンプルは、オステオポンチン関連障害（好ましくは多発性硬化症）に苦しんでいるかまたは苦しんでいる疑いのある被験体由来である。
【００８６】
さらなる実施形態において、第１および第２の定量方法は、組織サンプル内のオステオポンチンの位置を決定する工程を含む。これらの方法の工程（ａ）および（ｂ）は、例えば、インビボまたはエキソビボのいずれかで実施され得る。
【００８７】
本発明は、第１および第２の定量的方法を実施するためのキットを提供し、このキットは、（ａ）（ｉ）抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、および（ｉｉ）オステオポンチンをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする核酸、からなる群から選択される因子、ならびに（ｂ）使用説明書を含む。
【００８８】
本発明はまた、因子がオステオポンチン発現細胞におけるオステオポンチンの活性または量を低減するか否かを決定するための２つの方法（「アッセイ」）を提供する。第１のアッセイは、（ａ）適切な条件下で細胞を因子に接触させる工程、（ｂ）細胞中のオステオポンチンの量を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した量を、因子の不在下の匹敵する細胞におけるオステオポンチンの量と比較し、それによってこの因子が細胞中のオステオポンチンの量を低減するか否かを決定する工程、を含む。
【００８９】
第１のアッセイにおいて、オステオポンチン発現細胞は、例えば、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞，  星状細胞および小グリア細胞であり得る。好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。第１のアッセイの工程（ｂ）において、細胞内のオステオポンチンの量は、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分を使用して決定される。あるいは、工程（ｂ）において、細胞内のオステオポンチンの量は、オステオポンチンをコードするｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸を使用して決定される。
【００９０】
第２のアッセイは、（ａ）適切な条件下で因子をオステオポンチンに接触させる工程、（ｂ）因子の存在下でオステオポンチンの活性を決定する工程、および（ｃ）こうして決定した活性をこの因子の不在下のオステオポンチンの活性と比較し、それによってこの因子がオステオポンチンの活性を低減するか否かを決定する工程、を含む。
【００９１】
第２のアッセイの１つの実施形態において、オステオポンチンは細胞中にある。この細胞は、例えば、ニューロン、マクロファージ、脈管上皮細胞，  星状細胞および小グリア細胞であり得る。好ましくは、細胞は、ヒト細胞である。
【００９２】
本発明は、内因性タンパク質によって媒介される障害に苦しむ被験体を処置するための２つの方法をさらに提供する。１つの方法は、被験体に（ａ）オステオポンチンおよび（ｂ）内因性タンパク質またはその抗原部分を被験体に投与する工程を含み、ここで、オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分は、被験体を処置するのに有効な量で投与される。
【００９３】
この方法において、オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分は、同時に投与され得る。あるいは、オステオポンチンおよび内因性タンパク質またはその抗原部分は、別々に投与される。
【００９４】
内因性タンパク質によって媒介される障害に苦しむ被験体を処置するための第２の方法は、被験体に（ａ）オステオポンチンをコードする発現可能な核酸および（ｂ）内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする発現可能な核酸を投与する工程を含み、ここで、この核酸は、被験体を処置するのに有効な量で投与される。
【００９５】
この第２の方法において、オステオポンチンをコードする核酸および内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする核酸は、同じベクター上かまたは別々のベクター上のいずれかで、同時に投与され得る。あるいは、オステオポンチンをコードする核酸および内因性タンパク質またはその抗原部分をコードする核酸は、別々に投与される。
【００９６】
内因性タンパク質に媒介される障害に苦しむ被験者を処置するための第１および第２の方法の１つの実施形態において、障害は、自己免疫障害である。別の実施形態において、障害は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、自己免疫ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変またはアルツハイマー病である。好ましくは、障害は、多発性硬化症である。
【００９７】
処置される障害が多発性硬化症である場合の第１および第２の方法において、内因性タンパク質は、例えば、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質またはα−Ｂ−クリスタリンであり得る。
【００９８】
表１は、本発明の方法によって治療可能な障害およびその対応する内因性タンパク質の例を示す。
【００９９】
【表１】
2005519033.tif 000002
最後に、本発明は、オステオポンチン関連障害を処置または予防するためのキットを含む。第１のキットは、オステオポンチンを発現する細胞におけるオステオポンチンの発現を特異的に阻害する核酸、およびオステオポンチン関連障害の処置または予防におけるこの核酸の使用のための説明書を含む。第２のキットは、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合部分、およびオステオポンチン関連障害の処置または予防におけるこの抗体またはその抗原結合部分の使用のための説明書を含む。
【０１００】
（オステオポンチンまたはオステオポンチンをコードする核酸を用いる処置方法）
本発明は、オステオポンチン、そのエピトープフラグメント、またはこれらのいずれかをコードする核酸を使用するオステオポンチン関連障害の処置方法を提供する。対宿主性移植片病。これらの方法は、１型免疫応答のダウンレギュレーションおよび／または２型免疫応答のアップレギュレーションが必要とされる種々の疾患を処置するのに有用である。このような疾患としては、自己免疫疾患、対移植片性宿主病（ｈｏｓｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｇｒａｆｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、および対宿主性移植片病、肉芽腫障害、単純ヘルペス角膜炎、細菌性関節炎ならびにてんかんが挙げられる。自己免疫疾患としては、多発性硬化症、慢性関節リウマチおよびＩ型糖尿病が挙げられる。この方法を使用して、このような障害を有するかまたはこのような障害の危険性がある患者において、このような障害を処置または予防し得る。障害を有する患者としては、現在臨床症状を経験している患者、および、任意の特定の時点で症候性または無症候性であり得る、断続的に症状を経験する患者が挙げられる。これらの方法は、多発性硬化症に苦しむ被験体を処置するのに特に効果的であり、これらの方法は、被験体にオステオポンチンをコードする治療有効量の発現可能な核酸を投与する工程を包含する。被験体において多発性硬化症の発症を阻害する方法もまた提供され、この方法は、被験体にオステオポンチンをコードする、予防有効量の発現可能な核酸を投与する工程を包含する。
【０１０１】
（１．オステオポンチンをコードする核酸）
これらの方法において使用される核酸は、オステオポンチンまたはそのエピトープフラグメントをコードする。核酸は、インサイチュで転写および翻訳（ＤＮＡ）または転写（ｍＲＮＡ）され、そして、この翻訳産物は、免疫応答を惹起する。ＤＮＡ免疫は、ＷＯ  ９９／２８４７１，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、ＰＮＡＳ  ９５，６６９−６７４（１９９８）およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，８３−９１（１９９９））によって記載される。
【０１０２】
ＤＮＡ免疫はアジュバントを伴ってかまたは伴わないで実施され得る。存在する場合、アジュバントは、代表的にはタンパク質抗原とともに用いられるアジュバント（以下を参照のこと）であり得るか、または、正に荷電した洗浄剤ＣＴＡＢのようなＤＮＡに会合するように特に選択されるアジュバントであり得る。ＤＮＡは、裸でかまたはコロイド物質と複合体化されて投与され得る。リポフェクションは、例えば、ＵＳ  ５，０４９，３８６、ＵＳ  ４，９４６，７８７；およびＵＳ  ４，８９７，３５５）に記載され、そして、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的なリポフェクションに適するカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ  ９１／１７４２４、ＷＯ  ９１／１６０２４のものが挙げられる。
【０１０３】
必要な場合、ＤＮＡは、無菌かつ実質的に等張である溶液中の薬学的キャリアに溶解される。
【０１０４】
免疫原として使用される核酸は、オステオポンチンをコードするセグメント、ならびに免疫原の翻訳および転写（ＤＮＡの場合）を確実にする１つ以上の調節配列をコードする他のセグメントを含む。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写終結部位、リボソーム結合部位、およびイントロン部位が挙げられる。プロモーターは構成的もしくは誘導的であり得るかまたは組織特異的であり得、この場合、このプロモーターは好ましくは抗原提示細胞に特異的である。血球における発現について、免疫応答の誘導が望ましいので、軽鎖もしくは重鎖の免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメント、またはＣＭＶ主要前初期プロモーターおよびエンハンサーが発現を導くのに適する。必要な場合、ＤＮＡ免疫原はベクターの成分として存在する。いくつかの例において、ベクターは、炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインをコードし、注入部位に免疫細胞を引きつける。いくつかの例において、ＤＮＡは、抗体が所望される抗原成分およびＴ細胞抗原（例えば、破傷風トキソイド）または他のアジュバント（例えば、Ｃ３ｄ（Ｄｅｍｐｓｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１，３４８−５０（１９９６）を参照のこと））を含む融合タンパク質をコードする。ＤＮＡは全長タンパク質またはその所望のエピトープフラグメントをコードし得る。
【０１０５】
さらなるバリエーションにおいて、核酸は、ウイルスまたは細菌のゲノムに組み込まれ得る。必要な場合、核酸は、免疫原性ペプチドが分泌タンパク質としてかまたはウイルスの外部表面タンパク質もしくは細菌の膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現されるように組み込まれ、その結果、ペプチドが提示される。このような方法において使用されるウイルスまたは細菌は、非病原性であるかまたは弱毒化されているべきである。適切なウイルスとしては、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよび他のαウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ならびに他のラブドウイルス、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスが挙げられる。適切な細菌としては、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｈｉｇｅｌｌａが挙げられる。ＨＢＶのＨＢｓＡｇへの免疫原性ペプチドの融合体は特に適する。
【０１０６】
（２．オステオポンチンの投与）
本発明はまた、オステオポンチンまたはそのエピトープフラグメントが患者に投与される方法を提供する。オステオポンチンは免疫応答を惹起し、オステオポンチンをコードする核酸の投与について記載されるのと同じ様式で、患者におけるオステオポンチンのレベルを低減させる。オステオポンチンは、単独でかまたはより長いタンパク質の成分として融合されて投与され得る。必要な場合、このような融合タンパク質は、異種アミノ酸に対するヘルパーＴ細胞応答を誘導し、それによってオステオポンチンに対するＢ細胞応答を誘導する、異種アミノ酸配列を含み得る。
【０１０７】
本方法の使用に適するオステオポンチンのエピトープフラグメントは、可能な免疫原性領域を同定する標準のコンピュータプログラムによって最初にスクリーニングされ得る。次いで、フラグメントは、実施例に記載されるように、動物モデルにおいて活性について試験される。
【０１０８】
（３．アジュバント）
種々のアジュバントを、オステオポンチンもしくはそのエピトープフラグメント、またはこれらをコードする核酸と組み合わせて使用し、免疫応答を誘発し得る。好ましいアジュバントとしては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３  Ｄｅ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＴＭ）（ＧＢ  ２２２０２１１（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ，現在はＣｏｒｉｘａの一部）を参照のこと）が挙げられる。ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ  ＱＳ−２１は、南アメリカで見出されるＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離したトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）、（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）。他のアジュバントは、水中油乳剤（例えば、スクアレンまたはピーナッツ油）であり、必要に応じて、モノホスホリルリピドＡ（（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照のこと）のような免疫刺激剤と組み合わせられる。別のアジュバントはＣｐＧである（ＷＯ  ９８／４０１００）。
【０１０９】
（４．免疫応答を惹起するための治療レジメおよび予防レジメ）
予防的適用において、オステオポンチン関連障害に感受性であるか、さもなくばオステオポンチン関連障害の危険性がある患者に、薬学的組成物または医薬が、危険性を排除するかもしくは低減するか、重篤度を緩和するかまたは疾患の発症を遅延するのに十分な量で投与され、これらの症状には、疾患の生化学的、組織学的および／または挙動的症状、疾患の進行中に現れるその合併症および中間病理表現型を含む。治療適用において、組成物または医薬がこのような疾患に感受性であるかまたはすでに罹患する患者に、疾患の症状（生化学的、組織学的および／または挙動的）を治癒するかまたは少なくとも部分的に静止するのに十分な量で投与され、これらの症状には、疾患の進行におけるその合併症および中間病理表現型を含む。治療的処置または予防的処置を達成するのに適切な量は、治療有効用量または予防有効用量として規定される。予防レジメおよび治療レジメの両方において、薬剤は通常、十分な免疫応答が達成されるまで、複数の投薬量で投与される。効果的なレジメは、有効投薬量および投与頻度の組み合わせを含む。代表的には、免疫応答がモニタリングされ、免疫応答が減衰し始める場合は、繰り返し投薬がなされる。
【０１１０】
本発明の組成物の有効用量は、多くの異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与される他の医薬、および処置が予防的であるかまたは治療的であるか、を含む）に依存して変化する。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために力価測定される必要がある。免疫原の量は、アジュバントもまた投与されるかどうかに依存し、アジュバントなしではより高い投薬量が必要とされる。投与のための免疫原の量は、ときどき、患者あたり１〜５００μｇで変化し、より通常は、ヒト投与のための１注入あたり５〜５００μｇで変化する。時折、１注入あたり１〜２ｍｇという、より高い用量が使用される。代表的には、約１０、２０、５０または１００μｇが各ヒト注入に使用される。注入のタイミングは、１日に１回から１年に１回、１０年に１回まで有意に変化し得る。代表的なレジメンは、免疫、それに続く６週間間隔のような間隔での追加免疫注入からなる。別のレジメンは、免疫それに続く１、２および１２ヵ月後の追加免疫注入からなる。別のレジメンは、一生、２ヶ月ごとの注入を必要とする。あるいは、追加免疫注入は、免疫応答のモニタリングによって示されるような不規則な基準に従い得る。
【０１１１】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇまたは３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１１２】
以下の実験の詳細の節の理解を促進するために、特定のよく用いられる方法および／または用語は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（４０）に最もよく記載される。
【０１１３】
本発明は、以下の実施例を参照してより良く理解されるが、詳細な情報は、添付の特許請求の範囲により完全に記載される本発明を単に例示するのみであることを当業者は容易に理解する。
【実施例】
【０１１４】
（概要）
多発性硬化症は、脱髄疾患であり、脳および脊髄における炎症により特徴づけられ、自己免疫に起因する可能性がある。ＭＳを有する患者の脳から取り出した斑由来のｃＤＮＡライブラリーの大規模配列決定は、大量のオステオポンチンの転写物を示した。ＭＳのモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）で麻痺させたラット由来の脊髄のマイクロアレイ分析はまた、ＯＰＮ転写物の増加を明らかにした。オステオポンチン欠損マウスは、進行性ＥＡＥに耐性であり、頻繁に寛解したが、ＯＰＮ−／−マウスのミエリン反応性Ｔ細胞は、ＯＰＮ＋／＋マウスよりも多いＩＬ−１０およびより少ないγ−インターフェロンを産生した。従って、オステオポンチンは、Ｔｈ１媒介性脱髄疾患を調節し、進行性ＭＳおよび他のオステオポンチン媒介疾患の進行を止める標的を提供することが明らかである。
【０１１５】
（考察）
本発明者らは、ＭＳおよびＭＳの実験モデルであるマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（「ＥＡＥ」）におけるＯＰＮの役割を調べた。最初に、本発明者らは、活性型ＥＡＥの間に中枢神経系（「ＣＮＳ」）で増加し得、かつＥＡＥが麻痺の発症後に好首尾に処置された場合に正常に戻り得る、炎症性応答に関与する遺伝子転写物を同定するために設定した。カスタマイズしたオリゴヌクレオチドマイクロアレイを作製し、炎症性応答に関連する遺伝子の転写をモニタリングした（１２および１３）。これらのカスタムマイクロアレイに関する詳細を、以下の方法の節に示す。これらの最初のマイクロアレイ実験は、オステオポンチン転写物がＥＡＥのラットの脳で上昇し、ＥＡＥから防御されたラットの脳では上昇しなかったことを示した。本発明に関連するこれらの実験および他のものの詳細は、以下の方法の節に示す。
【０１１６】
並行して、本発明者らは、ＭＳ脳病変およびコントロールの脳から作製された非規格化ｃＤＮＡ脳ライブラリー（１５、１６、１７）を利用して、発現配列タグ［ＥＳＴ］のハイスループットスクリーニングを行った。このプロトコールを使用して、脳標本に存在するｍＲＮＡ集団を正確に示し、転写物の定量的評価および標本間の比較を可能にする（表２および３）。２つの配列決定ライブラリーの分子マイニング、ならびに、サイズおよび組織型が一致しており、理想的なプロトコールで構築されたそれらの正常脳ライブラリーとの比較は、ＯＰＮ転写物が頻繁に検出され、ＭＳのｍＲＮＡ集団に限定されたが、コントロール脳ｍＲＮＡにおいて見出されないことを明らかにした（表２）。
【０１１７】
【表２】
2005519033.tif 000003
平均の倍数の変化が＞２．５である遺伝子のみを列挙する。「Ｎ／Ａ」は、マッピング位置が未知であることを示す。「＊」は、ゲノム全体でのスクリーニングにおいて連鎖の名目上の基準に達するゲノム領域を示す。
【０１１８】
本発明者らは、ＭＲライブラリー１および２ならびにコントロールライブラリーからの１１，０００を越えるクローンを配列決定し（図１Ａ〜１Ｃ）、両方のＭＳライブラリーには存在するが、コントロールライブラリーには存在しない遺伝子に本発明者らの分析の焦点を当てた。これより４２３遺伝子（２６の新規遺伝子を含む）を得た。これらから、５４遺伝子がＭＳライブラリー１および２において２．５以上の平均の倍数変化を示した（表２）。α  Ｂ−クリスタリン（誘導性熱ショックタンパク質、髄鞘に局在化し、ＭＳ中のＴ細胞によって標的化されることが知られる）の転写物は、ＭＳ斑に独特の最も多い転写物であった（１９）（表２）。次の最も多い方から５つの転写物は、プロスタグランジンＤシンターゼに対する転写物、前立腺結合タンパク質に対する転写物、リボソームタンパク質Ｌ１７に対する転写物およびＯＰＮに対する転写物を含んだ。
【０１１９】
次に、本発明者らは、３つのｃＤＮＡライブラリーの各々に存在する全ての遺伝子を分析し、３３０個の遺伝子（７つが新規）を見出した。各配列決定した遺伝子のクローン数に基づき、ＭＳとコントロールとの間で平均の倍数の差異が２．００以上を示す転写物について表を構築した。ライブラリー間の異なる発現の一貫性に基づいて、これらの転写物のうちの４０個を３つのレベルに分けた（表３）。これらの遺伝子のいくつか（表３）は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびシナプトブレビンであった。ＭＢＰ転写物は、３つのライブラリーで一貫して高いレベルの発現を示し、このタンパク質の非常に高い代謝回転を示した。ミエリンの折りたたみに関与する（２０）ＨＳＰ７０−１の発現が有意に上昇した。差次的には発現されないが、ＧＦＡＰは、全てのライブラリーにおいて、３つの中で最も豊富な種であり、ＭＳ脳における顕著なグリア（または星状細胞）応答と一貫している。大きなサイズのクローン化されたｍＲＮＡのＫＩＡＡ群に属する６つの遺伝子は、差次的な発現を示した。シナプトブレビンの減少した転写は、ニューロンのシナプス小胞に特異的な低分子膜内在性タンパク質ファミリーに属することを考慮すると重要である。最近の証拠は、軸索の欠損がＭＳの病理の１つの主要な構成要素であることを示す（２１、２２）。
【０１２０】
【表３】
2005519033.tif 000004
≧２の平均の倍数差異を有する転写物に対応する遺伝子のみを列挙する。この表の最初のセクションは、発現が、ＣＴＲＬライブラリーと比較した場合に両方のＭＳライブラリーにおいて統計的に有意であった遺伝子を列挙する（フィッシャーの正確検定、ｐ＜０．０５）。第２セクションは、ＭＳライブラリーの１つのみとＣＴＲＬとで発現の有意な差を有する遺伝子を含む。最後のセクションは、有意な差を有さないがＡＦＤ≧±３．００である遺伝子を含む。Ｎ／Ａ、マッピング位置が未知である。「＊」、ゲノム全体のスクリーニングにおいて連鎖の名目上の基準に達するゲノム領域。
【０１２１】
ＯＰＮについての既知の炎症性役割を考慮して、本発明者らは、ヒトＭＳ斑およびコントロール組織におけるこのタンパク質の細胞内発現パターンを、免疫組織化学によって試験した。インサイチュでＯＰＮを発現する細胞を同定するために、本発明者らは、マウス中で組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＯＰＮに対して生成したポリクローナル抗体を使用し、死後のＭＳおよびコントロール組織サンプルを染色した（２３）（図２Ａおよび２Ｂ）。活性なＭＳ斑内で、ＯＰＮは、微小脈管内皮細胞上およびマクロファージ上（図２Ａ）、ならびに斑に隣接する白質に見出された。反応性星状細胞および小グリアもまた、ＯＰＮを発現した（図２Ｂ）。
【０１２２】
炎症性脱髄疾患におけるＯＰＮの役割を、次に、２つのＥＡＥモデル（１）を使用して試験した。まずＥＡＥの再発−寛解モデルを使用して、異なる疾患段階でのＯＰＮの細胞内発現を比較した。完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）中のプロテオリピドタンパク質ペプチド１３９−１５１（ＰＬＰ１３９−１５１）を用いる免疫化によってＳＪＬマウスに疾患を誘導し、動物を疾患の徴候について毎日スコア化した（２４）。急性期、寛解期、および最初の再発期に脳および脊髄を取り出した。次いで、ＥＡＥにおけるＯＰＮの組織病理学的同定を実施した（図２Ｃ〜２Ｆ）。ＯＰＮは、疾患からの再発期および寛解期の両方の間に小グリアにおいて広範に発現し、この発現は、脈管周辺の炎症性病変の近くに集中した。グリア上のＯＰＮの発現に加え、ニューロンにおける発現が急性疾患および再発期では検出し得たが、寛解期には検出し得なかった。ＥＡＥの急性形態におけるＯＰＮの発現を確認するために、急速単相性脱髄疾患をＬｅｗｉｓラット（１２）において誘導し、次いで、それらの脳についてＯＰＮ免疫染色を行った（図２Ｇ）。小グリアおよびニューロンにおけるＯＰＮ発現は、疾患ラットにおいて優勢であり、そして、ＥＡＥの再発寛解マウスモデルにおいて観察されたように、急性病変に隣接して集中した。同じ抗体ＭＰＩＩＩＢ１０ｌを用いる骨のＯＰＮ染色は、ポジティブコントロールとして役立てた（図２Ｈ）。これらの結果は、ＥＡＥの急性形態および再発性形態におけるＯＰＮの役割を示し、病変におけるＯＰＮ発現の程度は、疾患の重篤度に相関したことを示す。
【０１２３】
次に、脱髄疾患におけるＯＰＮの役割を、ＯＰＮ欠損マウスを用いて試験した（図３Ａ〜３Ｃ）（３０）。ＥＡＥを、ＣＦＡ中のミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５〜５５（ＭＯＧ３５〜５５）を用いて、ＯＰＮ−／−マウスおよびＯＰＮ＋／＋コントロール（３１）において誘導した。ＥＡＥは、ＭＯＧ３５〜５５を用いて、ＯＰＮ＋／＋マウスおよびＯＰＮ−／−マウスの両方の１００％で観察された。これにも関わらず、疾患の重篤度は、ＯＰＮ−／−群の全ての動物において有意に減少し（図３Ａ）、これらのマウスは、全体的にＥＡＥ関連の死から防御された（図３Ｂ）。従って、ＯＰＮは、ＭＯＧ３５〜５５によって誘導された進行性ＥＡＥの経過に、有意に影響を与えた。
【０１２４】
次に、再発および寛解の割合を試験した。最初の２６日間、ＯＰＮ−／−マウスはコントロールと比較してより高い割合のマウスが寛解を有し、ＥＡＥの明確な進展を示した（図３Ｃ）。ＯＰＮ＋／＋マウスおよびＯＰＮ−／−マウスを、免疫の２８、４８および７２日後に組織病理学のために屠殺した。この２群の臨床経過はかなり異なるが、ＣＮＳ内の炎症性病巣の数および外観が類似した。
【０１２５】
異なる免疫応答がＯＰＮ−／−動物およびＯＰＮ＋／＋動物に関与するか否かを調べるために、本発明者らは、これらのマウスにおけるサイトカイン発現プロファイルを試験した。ＥＡＥは、Ｔ細胞媒介疾患なので、本発明者らはまず、ＯＰＮ−／−マウスにおいて自己抗原ＭＯＧ３５〜５５に対するＴ細胞増殖応答を分析した。ＯＰＮ−／−マウスのＴ細胞は、ＯＰＮ＋／＋Ｔ細胞と比べて、ＭＯＧ３５−５５への減少した増殖応答を示した（図４Ａ）。さらに、ＩＬ−１０の産生は、ＯＰＮ＋／＋マウスのＴ細胞と比べて、ＥＡＥを発症したＯＰＮ−／−マウスにおいてＭＯＧ３５−５５に反応性のＴ細胞において増加した（図４Ｂ）。同時に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生は、ＭＯＧで刺激された脾細胞の培養物において減少した（図４Ｃ〜４Ｄ）。
【０１２６】
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、ＭＳにおいて重要な炎症促進性サイトカインであるため（１、３３）、ＯＰＮ−／−マウスにおいて、これらのサイトカインの産生が減少しているという所見は、ＯＰＮがＭＳおよびＥＡＥにおいてＴｈ１免疫応答の調節に重要な役割を果たすという概念に一致する。さらに、ＩＬ−１０は、ＥＡＥからの寛解と関連付けられる（３４）。この状況において、ＯＰＮ−／−マウスにおけるミエリン特異的ＩＬ−１０産生の増強が、これらのマウスが寛解に至る傾向にあることの説明となり得る。従って、ＩＬ−１０の持続性の発現は、ＭＳの再発の逆転における重要な因子であり得、ＩＬ−１０が存在しないと、二次的な進行性ＭＳの発症を許容し得る。
【０１２７】
結論として、本発明者らのデータは、脱髄疾患の病因においてＯＰＮが多面的な機能を有し得ることを示す。グリア細胞によるＯＰＮの産生は、Ｔｈ１細胞の誘引をもたらし得、そして、オステオポンチンがグリア細胞および脳室上衣細胞に存在することにより、炎症性のＴ細胞を脳に侵入させ得る。最終的に、本発明者らのデータは、ニューロンがまた、この炎症促進性分子を分泌し得、そして、自己免疫プロセスに参加し得ることを示唆する。潜在的に、ニューロンのＯＰＮ分泌は、炎症および脱髄を調節し得、そして、この疾患の臨床的重篤度に影響し得る。この考えに一致して、ＭＳおよびＥＡＥの病態生理学におけるニューロンの役割が、最近記載されており（２１、２２）、そして、ニューロンは、サイトカインを産生し得ることが公知である（３５、３６）。ＯＰＮは細胞溶解を阻害し（６）、従って、ニューロンのＯＰＮは、自己免疫脱髄の間、変性から軸索を保護さえし得る。
【０１２８】
ＣＤ４４は、ＯＰＮの公知のリガンドであり、ＩＬ−１０産生の減少を媒介する（１０）。本明細書中に示すように、ＯＰＮ−／−マウスは、ＥＡＥの経過の間、上昇したＩＬ−１０を産生した。本発明者らは最近、抗ＣＤ４４抗体がＥＡＥを妨げることを示し（３７）、これは、ＭＳおよびＥＡＥにおけるＯＰＮの炎症促進性作用がＣＤ４４によって媒介され得ることを示唆した。ＯＰＮのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチドモチーフを介するインテグリンフィブロネクチンレセプターａｖｂ３への結合はまた、Ｔｈ１炎症を永続化し得る（１０）。活性ＭＳ病変において、このレセプターのａｖサブユニットは、マクロファージおよび内皮細胞で過剰発現し、そして、ｂ３サブユニットは、内皮細胞管腔表面で発現される（２３）。トリペプチド結合モチーフによって、ＯＰＮは誘導性の酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯｓ）を阻害し（３８）、これは、自己免疫脱髄に関与することが知られる（１）。従って、結論として、ＯＰＮは、自己免疫媒介性の脱髄の経過における多様な活動を可能にする多くのチェックポイントに位置する。
【０１２９】
（方法）
（カスタムマイクロアレイ）
カスタムマイクロアレイを設計し、炎症応答の５１７成分（サイトカイン、ケモカイン、種々の接着分子およびマトリックスメタロプロテアーゼを含む）に対するｍＲＡＮの大規模プロファイリングを可能にするように設計した。ＥＡＥを有する６匹のＬｅｗｉｓラット由来の脊髄からのｍＲＮＡ転写物のプロファイリングを分析した。ラットを４００ｍｇのモルモット脊髄ホモジネート［ＧＰＳＣＨ］で免疫し、以前（１２）に記載されるようにＥＡＥをモニタリングした。ＧＰＳＣＨでの免疫の１５日後、後肢麻痺を有する３匹のラットの脳および脊髄から（平均ＥＡＥスコア２．７、これは重篤な麻痺を示す）、そしてＥＡＥの開始後にメタロプロテアーゼインヒビターで処置した３匹のラットから、ｍＲＮＡを単離した。マトリックスメタロプロテアーゼインヒビターはＥＡＥを逆転させ得（１３）、メタロプロテアーゼインヒビター［ＲＳ１１０３７９］で処置したラットは、臨床的疾患を示さなかった（平均ＥＡＥスコア０．２）ことが確立される。２匹の他の正常なラット由来の脊髄をコントロールとした。
【０１３０】
ＯＰＮ転写物は、ＥＡＥおよび麻痺を有するラットの脊髄で、ＥＡＥを有さないコントロールと比べて３．４倍増加した（ＯＰＮ転写物の強度に対する平均差変化は、ＥＡＥを有さないラットのＯＰＮ転写物の４８４６という強度に対する平均差変化であったのに対し、ＥＡＥを有する未処置のラットの１６６０９蛍光単位であった）。ＲＳ１１０３７９で処置した後、ＯＰＮ  ｍＲＮＡのレベルはＥＡＥを有さないコントロールラットと変わらなかった。従って、ＥＡＥを有さないラットに対し、ＭＭＰインヒビターで処置したＥＡＥラットにおいて、ＯＰＮ転写物の強度の間で、１．１倍の変化があった（カスタムマイクロアレイでのＯＰＮ転写物の強度の変化の平均差は、ＥＡＥを有さないラットで４８４６単位の平均差強度であったのに対し、ＲＳ１１０３７９で処置したラットで５１７６単位であった）。
【０１３１】
（非規格化ｃＤＮＡ脳ライブラリー）
高頻度の転写物がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのヌクレアーゼ処理によって優先的に排除されて希少なＲＮＡ種の検出を促進する、規格化したライブラリーとは対照的に、本発明者らは、非規格化ライブラリーを作製した（ここでは、クローンの操作が回避される）。３人のＭＳ患者の斑由来の白質脳組織を回収し、死後２時間以内に凍結した。第１のライブラリー（本明細書中、ＭＳ１）に使用した標本の患者暦は、臨床的に明らかなＭＳおよび急性炎症性病変の存在を含んだ。第２のＭＳライブラリー（本明細書中、ＭＳ２）の材料は、２人の患者からの組織プール由来であり、そのうち１人は、急性活性病変および白質に広範に広がる炎症性介入を有し、もう１人は、グリオーシスを伴うが、リンパ球浸潤の証拠はない慢性「無症状」病変を有した。コントロールライブラリー（ＣＴＲＬ）を、心不全で亡くなった神経病理変化を有さない３５歳の白人男性から取り出した中脳白質、下部側頭皮質、髄質および後部頭頂皮質組織から単離しプールしたｍＲＮＡを使用して構築した。ライブラリーを、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓと共同で作製した。各サンプル由来の１．５ｍｇのポリＡ  ＲＮＡを使用してライブラリーを構築した。ｃＤＮＡ合成を、ＮｏｔＩアンカー化オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて開始した。二本鎖ｃＤＮＡを平滑末端化し、ＥｃｏＲＩアダプターに連結し、ＮｏｔＩで消化し、サイズを選択し、そして、ｐＩＮＣＹベクター（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。各ライブラリーからの約４，０００クローンをＡＢＩ自動ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定した。注釈したデータを、ＩｎｃｙｔｅデータベースＬｉｆｅＳｅｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）から抽出し、さらなる分析のためにＭＳ  Ａｃｃｅｓｓ２０００（登録商標）およびＭＳ  Ｅｘｃｅｌ  ２０００（登録商標）に組み込んだ。全てのクエリーをＭＳ  Ａｃｃｅｓｓで設計および実行し、一方で、チャートおよび表をＭＳ  Ｅｘｃｅｌで作製した。Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＥＧＡＤ，Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｅｇａｄ）を考慮した後、細胞内役割を割り当てた。ゲノム位置は、ＮＣＢＩのＭａｐＶｉｅｗおよびＧｅｎｅｍａｐ’９８（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に従って含めた。各ＭＳライブラリーおよびＣＴＲＬ間の遺伝子頻度の比較を行い、平均の倍数の変化を算出した。遺伝子発現の差を、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定にかけ、０．０５以下のＰ値を各比較における包含のための判断基準として選択した。これらの実験の結果を図１Ａ〜１Ｃに示す。
【０１３２】
本発明者らは、それぞれＭＳ１、ＭＳ２およびコントロールライブラリー由来の３６７８個、４１７４個および３７４０個のクローンを配列決定した。各々のライブラリーは、Ｇｅｎｂａｎｋのデータベースにマッチせず、従って新規であるとみなされる相当量のクローンを有した。ＭＳ１ライブラリーのクローンは、２３８７の異なるｃＤＮＡ種に割り当てられ得る（このうち３３１個が新規遺伝子に対応する）。ＭＳ２およびＣＴＲＬは、それぞれ２７２７（５４６が新規）および２３５２（５１１が新規）の種を得た。頻度分布の分析は、全ての３つのライブラリーで同様のパターンを示し、最も多い転写物は、２つのミエリン遺伝子、ミエリン塩基性タンパク質［ＭＢＰ］およびプロテオリピドタンパク質［ＰＬＰ］、ならびに星状細胞特異的転写物であるグリア線維酸性タンパク質［ＧＦＡＰ］を含むわずかな種によって示された。同様に、３つ全てのライブラリーにおいてより頻度の低いｃＤＮＡ種について指数関数的に減少する頻度が観察された。このデータを考慮すると、これらの３つのライブラリーの組成および複雑さは同様であり、明らかな偏りは存在せず、それゆえ比較分析が可能になることが明らかである。
【０１３３】
（免疫染色）
再発および寛解の間にマウスを屠殺し、６０ｍｌの１０％ホルマリンで灌流した。脳および脊髄を取り出し、同じ溶液中で固定した。パラフィン切片（６〜１０μｍ）を調製した。ＯＰＮを、製造業者の説明書に従って、ベクターＭｏｕｓｅ  Ｏｎ  Ｍｏｕｓｅ（Ｍ．Ｏ．Ｍ．）免疫検出キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＰＫ  ２２００）、Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ番号ＰＫ  ６１００）を用いて、１／５０希釈のモノクローナル抗ＯＰＮ抗体ＭＰＩＩＩＢ１０ｌ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）および基質３，３’−ジアミノベンジジン（０．５ｍｇ／ｍｌ、４分間）を用いて検出した。細胞染色の強度を半定量的なスケール（３つのグレード）に従って、実験設計に盲目的な観察者によって評価した。ＭＰＩＩＩＢ１０ｌは、マウスからの免疫組織化学切片のＯＰＮを染色するが、ウェスタンブロットのＯＰＮは認識しない（２６）。マウスの切片におけるＭＰＩＩＩＢ１０ｌの首尾よい使用が報告されている（２７、２８）。
【０１３４】
（ＥＡＥの誘導）
本発明者らは、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５−５５を用いて１２９／Ｃ５７Ｂｌ／６  ＯＰＮ−／−マウスにＥＡＥを誘導し、そして１２９／Ｃ５７Ｂｌ／６  ＯＰＮ＋／＋マウスがコントロールであった。ここで、本発明者らは、プロトコールをわずかに改変した：本発明者らは、０日目の各メスの側腹部皮下に１００ｍｇのＭＯＧ３５−５５乳剤、ならびに４００ｎｇの百日咳毒素を０日目および２日目に注入した。７匹のＯＰＮ＋／＋および６匹のＯＰＮ−／−マウスを、免疫後２８日、４８日および７２日に組織病理について試験した。データは、未刊行であるが、２群の中枢神経系内の炎症性病巣について同じ数および外観を示した。
【０１３５】
（カスタムマイクロアレイを用いた転写プロファイリング）
Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で脊髄をホモジナイズし、総ＲＮＡを推奨されるプロトコールに従って調製した。オリゴ（ｄＴ）樹脂（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ，Ｑｉａｇｅｎ）を使用するｍＲＮＡを２ラウンドの選択により精製した。２ｍｇのｍＲＮＡを使用して、二本鎖ｃＤＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を調製した。ｃＤＮＡ合成のためのプライマーは、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼプロモーター部位を含んだ。１ｍｇのｃＤＮＡを、ビオチン化ＣＴＰおよびＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を用いるインビトロ転写反応（Ａｍｂｉｏｎ  Ｔ７  Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ）に使用した。標識化手順は、ｍＲＮＡ集団を約６０倍増幅する。マイクロアレイチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を４５℃のインキュベーター中で１６時間、６０ｒｐｍで一定に回転させながらハイブリダイズさせた。チップを洗浄し、フルイディクスステーションで染色し、そして、レーザー共焦点顕微鏡を用いてスキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは、サンプル調製のための手順、フルイディクスステーション、スキャナおよびコンピュータワークステーションを備えた。チップをＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｖ３．１ソフトウェアで解析し、１５０の値までスケールした。このソフトウェアは、特定のＲＮＡ転写物が存在するかまたは存在しないかを、シグナルの強度に基づいて決定する。倍数の変化を、実験サンプル中の平均差変化の強度をコントロールの平均差変化の強度で割って算出した。
【０１３６】
（実施例２）
（オステオポンチンをコードするＤＮＡを用いて、多発性硬化症および他の自己免疫疾患を処置するための方法）
マウス（すなわち「自己タンパク質」）オステオポンチンをコードするＤＮＡでのマウスの処置は、宿主内で抗オステオポンチン免疫グロブリン応答を誘導し、このことは、疾患の永続化におけるオステオポンチンの有害な影響を阻害する。
【０１３７】
マウスオステオポンチンをコードするＤＮＡを、オステオポンチンをコードするＤＮＡをｐＣＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターにクローニングすることによって調製した。ｐＣＤＮＡ３は、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ−４０ラージＴ抗原ポリアデニル化シグナルを含む。このオステオポンチンコードベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生し、内毒素を含まないＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｇａ−ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０１３８】
マウスの四頭筋に０．１ｍｌのＰＢＳ中の０．２５％ブピビカイン−ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を注入する（四頭筋あたり０．０５ｍｌ）。２日後、マウスに０．９ｍＭのカルシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中１．０ｍｇ／ｍｌの各「自己−プラスミド」ＤＮＡを０．０５ｍｌ、各四頭筋に注入する。このプラスミドＤＮＡを、２〜４週間間隔でさらに２回注入する。オステオポンチンコード自己ベクターの抗オステオポンチン抗体誘導効力は、ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドの共送達および／または１つ以上のＣ３ｄ成分と融合されるオステオポンチンをコードするＤＮＡを用いる処置によって増強され得る。酵素連結免疫吸着アッセイを使用して、抗オステオポンチン抗体のレベルをモニタリングした。抗オステオポンチン抗体の誘導は、治療の効力を示す。引き続いて、マウスを、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のミエリンペプチド（代表的にはＰＬＰｐ１３９−１５１）でチャレンジすることによりＥＡＥを発症させ、オステオポンチンをコードする自己ベクターで前処置したマウスは、図５に示すように、ＥＡＥの発症率および重篤度が低減した。
【０１３９】
あるいは、慢性再発性ＥＡＥ感受性のマウス株（例えば、ＳＪＬマウス）が、（例えば、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中のＰＬＰｐ１３９−１５１で）ＥＡＥを発症するように誘導され得、オステオポンチン−自己ベクター治療が、隔週間隔で、確立されたＥＡＥを有するマウスにおいて開始されて、この疾患を処置するためのオステオポンチンに対する抗体が誘導され得る。全疾患重篤度および臨床麻痺の新規発症数の減少に基づいて、標準的なスコアシステムを用いて効力を測定する。
【０１４０】
多発性硬化症を有するヒトにおいて、オステオポンチン−自己ベクター治療が診断に引き続いて開始される。効力は、多発性硬化症を有する患者内の抗オステオポンチン抗体の誘導（ＥＬＩＳＡ分析により測定される）に基づいてモニタリングされる。効力は、さらに、脳の病変（ＭＲＩスキャンにより測定される）の数およびサイズの減少、疾患の再発（臨床麻痺の発症）数の減少、ならびに能力障害の進行の遅延に基づいて示される。
【０１４１】
（実施例３）
マウスに１０マイクロモルの心臓毒（Ｓｉｇｍａ）を前脛骨筋に注入した。５日後、マウスに０．９ｍＭカルシウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中の全長ＯＰＮを含むプラスミド１００μｇを前頚骨筋に与えた。ＯＰＮを含むプラスミドを、６〜７日間隔でさらに３回注入した。最後の注入の７日後に、ミエリンオリゴデンドログリア糖タンパク質３５−５５でＥＡＥを誘導した。コントロールは、処置を行わないか、ＰＢＳで処置するか、またはインサートを有さないプラスミドで処置して行った。処置を、マウスの能力障害に関して、標準的な臨床スケールで評価した。抗体力価もまた、以下のようにマウスにおいて測定した。ＥＬＩＳＡプレートを１ウェルあたり５０ｎｇのマウス組換えＯＰＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号：４４１−ＯＰ）で４℃で一晩コーティングした。２日目にプレートをＰＢＳおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ（すなわち、ＰＢＳＴ緩衝液）で３〜４回洗浄し、次いで、ＰＢＳおよび０．２５％ゼラチンで、３７℃で３時間ブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで、血清を限界希釈で添加し、一晩に渡って４℃でインキュベートした（血清をＰＢＳＴ０．２５％ゼラチンで希釈する）。次の日、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、ヤギ抗マウスオステオポンチン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号：ＡＦ８０８）を、ＰＢＳＴ０．２５％ゼラチン中に希釈した１μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１：３００００希釈のアルカリホスファターゼに結合体化した抗ヤギＡｂとともに１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、ＰＢＳ中の基質ｐ−ＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を添加した。発色後、プレートを４０５ｎｍ波長で読み取った。
【０１４２】
図６は、ＯＰＮをコードするプラスミドでの処置が、ＥＡＥの慢性期に、２４日目〜４８日目にＥＡＥの臨床症状を減少させた結果を示す（ｐ＜０．０３）。図７は、オステオポンチンをコードするＤＮＡでの免疫が約２０日後にプラトーになる抗体力価を生成したことを示す。
【０１４３】
（参考文献）
【０１４４】
【表４】
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2005519033.tif 000007
本願に引用される全ての刊行物および特許出願は、各々が個々にそのように示される場合と同程度に、あらゆる目的のために、その全体が、参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】（図１Ａ）  頻度分布。６よりも多い数を有するクローンを、その頻度に従って降順に組織化した。矢印は、各ライブラリーにおいて最も一般的な３つのＥＳＴを示す。ＭＢＰは、３つの全てのライブラリーにて最も高く発現する遺伝子であった。ＧＦＡＰおよびＰＬＰは、ＭＳライブラリーにおいては次に最も量の多い種であるが、コントロールライブラリーではその頻度順序が逆であった。未同定ＥＳＴを、既知の注釈つきのクローンよりも明るい色で示す。
【０１４６】
（図１Ｂ）
カテゴリー分布。クローンを以下のカテゴリーの１つに分布させた：ＲＮ、重複性で新規；ＲＫ、重複性で既知；ＨＡ、多い量；ＳＮ、単一で新規；およびＳＫ、単一で既知。各カテゴリーに対する相対寄与度を全てのライブラリーについて円グラフに示す。
【０１４７】
（図１Ｃ）
交差区クエリー。３つのライブラリー間で、全ての可能な比較を行った。クローンを計数し、ベン図の対応する交差区に分布させた。配列決定したクローンの総数を各ライブラリーについて示す。各ライブラリーに対する異なるｍＲＮＡ種の数もまた、括弧内に未知の遺伝子の数とともに示す。各ライブラリーまたはライブラリーの交差区に特異的であったＲＮＡ種の数を、括弧内に未知の遺伝子の数とともに下線で示す。
【図２】（図２Ａおよび２Ｂ）  マクロファージ内のＯＰＮを活性な脱髄ＭＳ斑の中央（１Ａ）、および活性ＭＳ斑に隣接する白質星状細胞（１Ｂ）に示す。ポリクローナル抗ＯＰＮ抗体を用いて、パラフィン包埋切片でＯＰＮ染色を行った。図２Ａ〜２Ｈの全ての写真は、ジアミノベンジン色素原およびヘマトキシリン対比染料を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色されている。拡大率：Ａ〜Ｄ、Ｆ、Ｈ＝３７０倍；Ｅ、Ｇ＝４９４倍。
【０１４８】
（図２Ｃ〜２Ｆ）
これらの図は、マウスの再発−寛解ＥＡＥを示す。以前に記載したように（２４）、ＰＬＰ  １３９−１５１を用いてＥＡＥを９匹のＳＪＬマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に誘導した。ＰＢＳを注入した４匹のマウスをコントロールとした。抗ＯＰＮ抗体ＭＰＩＩＩＢ１０ｌ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）（２５）を用いて免疫染色を行い、スライドを盲目的な観察者により試験した。図２Ｃにおいて、ＯＰＮはＣＮＳミクログリア、特に炎症性病変に近い部分で広範に発現したが、末梢神経に近接する部分では発現しなかった（矢印）。図２Ｄにおいて、ニューロンにおける発現（矢印）が、急性期（Ｎ＝４）および再発（Ｎ＝２）の間は検出可能だったが、寛解（Ｎ＝１）の間、または、決して麻痺を発症しない炎症性病変を有するマウス（Ｎ＝２）においては検出できなかった。星状細胞（矢印）（図２Ｅ）および脈絡叢細胞（図２Ｆ）におけるＯＰＮ発現はまた、コントロール（２５％）においてよりも免疫したマウス（１００％）においてより頻繁かつより明白であった。
【０１４９】
（図２Ｇ）
この図は、ラットの急性ＥＡＥに関する。４００μｇのＧＰＳＣＨを用いること以外は（１３）に記載のように、ＥＡＥを１９匹のＬｅｗｉｓラット（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に誘導した。ＣＦＡ単独を注入した４匹のラットをコントロールとした。脳を処理し、ＭＰＩＩＩＢ１０ｌで染色した。炎症性病変の周囲でのＯＰＮの小グリア細胞発現（Ｇ）は、臨床疾患の重篤度と相関した。ＯＰＮはまた、重篤な臨床徴候を有する動物の大半においてニューロン（矢印）で発現した。
【０１５０】
（図２Ｈ）
この図は、ポジティブコントロール（すなわち、マウス大腿骨の骨端軟骨板の、ＭＰＩＩＩＢ１０ｌでのＯＰＮ染色）を示す。
【図３】（図３Ａ〜３Ｃ）  これらの図は、ＯＰＮ−／−マウスにおけるＥＡＥの臨床減少に関する。ＯＰＮ＋／＋マウスおよびＯＰＮ−／−マウスは、１２９／Ｃ５７ＢＬ／６交雑バックグラウンドであり、部分的に異種交配系統として維持された（３０）。ＥＡＥをＯＰＮ＋／＋マウス（Ｎ＝１８）（黒丸）およびＯＰＮ−／−マウス（Ｎ＝１７）（白丸）（３０）に、ＭＯＧ３５−５５を用いて記載（３１）のように誘導した。ＥＡＥを以下のようにスコア化した：０＝正常；１＝単麻痺；２＝不全対麻痺；３＝対麻痺；４＝四対麻痺；および５＝瀕死または死亡。各動物について、寛解を、少なくとも連続２日で少なくとも１点のスコアの減少によって規定した。最初の２６日間以内に少なくとも１つの寛解が生じる場合、ＥＡＥは寛解しているとみなし、寛解が生じない場合、進行性であるとみなした。
【０１５１】
図３Ａにおいて、ＯＰＮ−／−マウス（白丸）は、ＯＰＮ＋／＋コントロール（黒丸）よりも穏やかな疾患を有する。エラーバーは、各点について標準誤差を示す。ＥＡＥは、ＯＰＮ＋／＋およびＯＰＮ−／−の両方のマウスにおいてＭＯＧ３５−５５を用いて１００％観察された［ＯＰＮ＋／＋についてＮ＝１８、そしてＯＰＮ−／−についてＮ＝１７］。ＥＡＥはＯＰＮ−／−マウスにおいて１００％の発症率を誘導され得るが、ＯＰＮ−／−群で発症した疾患の重篤度を有意に減少させ得、平均ＥＡＥスコアの減少（３０日目に、ＯＰＮ＋／＋における平均ＥＡＥスコア２．５、これに対し、ＯＰＮ−／−における平均ＥＡＥスコア１．２、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ試験  ｐ＝０．０３７３）および、平均最大重篤度スコアの減少（ＯＰＮ＋／＋における平均重篤度３．７、これに対し、ＯＰＮ−／−における平均重篤度２．８、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定  ｐ＝０．０４２２）を伴った。疾患発症の日数の有意な遅延はなかった（ＯＰＮ＋／＋において平均１１．７日、これに対し、ＯＰＮ−／−において１２．５日、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定  ｐ＝０．３２２）。
【０１５２】
図３Ｂにおいて、ＯＰＮ−／−マウス（白丸）は、ＥＡＥ関連死から防御され、１７匹中死んだマウスはいなかったが、これに比べ、ＯＰＮ＋／＋マウスは、７０日目で１８匹中７匹が死んだ（ｐ＝０．００７６（Ｆｉｓｈｃｅｒの正確検定による））。
【０１５３】
図３Ｃは、ＯＰＮが進行性のＥＡＥを促進することを示す。棒は、各群において寛解（黒）または進行性（白）の疾患を有するマウスの百分率を示す。ＯＰＮ−／−マウスは、ＥＡＥの明白な進行を示し、コントロールと比較してより高い百分率のマウスが寛解を有した（ＯＰＮ＋／＋群において、１８匹中１０匹（５５．５％）が寛解を有したのに対し、ＯＰＮ−／−群において、１７匹中１６匹（９４．１％）が寛解を有した、ｐ＝０．０１７８（Ｆｉｓｈｅｒの正確検定による））。
【図４】（図４Ａ）  この図は、ＯＰＮ−／−マウスにおけるＴ細胞増殖の阻害を示す。ＥＡＥの誘導から１４日後に、ＯＰＮ＋／＋マウス（黒丸）およびＯＰＮ−／−マウス（白丸）（３０）由来のドレーンを施したリンパ節（ＬＮ）について増殖アッセイを行った。ＭＯＧ３５−５５を用いて記載（３１）のようにＥＡＥを誘導した。ドレーンを施したＬＮを免疫の１４日後に取り出し、ＬＮ細胞を９６ウェル平底プレート（２．５×１０６／ｍｌ、１ウェルあたり２００ｍｌ）にて、記載（３９）のように、ＨＰＬＣ精製ＭＯＧ３５−５５の限界希釈物（０〜５０ｍＭ）を用いて刺激した。培地は、ＯＰＮ−／−細胞のインビトロアッセイにＯＰＮが導入されることを防ぐために、試験されるマウスの型からの２％の血清を含んだ。ＯＰＮ＋／＋正常マウス血清をＯＰＮ＋／＋細胞のアッセイに使用し、その一方で、ＯＰＮ−／−正常マウス血清をＯＰＮ−／−細胞のアッセイに使用した。Ｔ細胞についての非特異的マイトジェンであるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎｃａｎｖａｌｉｎ  Ａ）（２ｍｇ／ｍｌ）を、非特異的なポジティブコントロールとして使用した。抗原刺激の７２時間後に［３Ｈ］チミジンを三連で添加し［平均±標準偏差をグラフにした］、増殖した細胞によるその取り込み（ｃｐｍで）を２４時間後に測定した。
【０１５４】
（図４Ｂ）
この図は、ＯＰＮ−／−細胞がＯＰＮ＋／＋細胞よりも多くのＩＬ−１０を産生することを示す。ＯＰＮ＋／＋（黒棒）およびＯＰＮ−／−（白棒）のＬＮ細胞を、２４ウェル平底プレート（１ウェルあたり２ｍｌ）中という以外は増殖アッセイの方法（図４Ａ）と同じ方法で刺激した。ＭＯＧ３５−５５を１２．５ｍＭの濃度で使用した。ＩＬ−１０を４８時間の上清（１／２希釈）について、製造業者の説明書（ＯＰＴＥＩＡキット，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従ってＥＬＩＳＡにより二連で測定した［平均±標準偏差をグラフにした］。
【０１５５】
（図４Ｃ）
この図は、ＯＰＮ−／−細胞がＯＰＮ＋／＋よりも少ないＩＦＮ−γを産生することを示す。ＯＰＮ＋／＋（黒棒）およびＯＰＮ−／−（白棒）の脾臓細胞を、ＭＯＧ３５−５５でのＥＡＥの誘導後１４日目に取り出し、１ウェルあたり４．５×１０６細胞という以外は図４Ｂに記載のように刺激した。ＩＦＮ−γを４８時間の上清（１／５希釈）について、製造業者の説明書（ＯＰＴＥＩＡキット，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従ってＥＬＩＳＡにより三連で測定した。
【０１５６】
（図４Ｄ）
この図は、ＯＰＮ−／−細胞がＯＰＮ＋／＋よりも少ないＩＬ−１２を産生することを示す。ＯＰＮ＋／＋（黒棒）およびＯＰＮ−／−（白棒）の脾臓細胞を、図４Ｃに記載のように取り出した。ＩＬ−１２  ｐ７０を２４時間の上清（１／１希釈）について、製造業者の説明書（ＯＰＴＥＩＡキット，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従ってＥＬＩＳＡにより二連で測定した［平均±標準偏差をグラフにした］。
【図５】（図５）  この図は、オステオポンチンをコードするＤＮＡを用いる処置がＥＡＥの発症率および重篤度を減少させることを示す。Ｃ５７Ｂ６マウスを、オステオポンチンをコードするＤＮＡで処置した。
【図６】（図６）  この図は、オステオポンチンをコードするＤＮＡを用いる処置がＥＡＥの発症率および重篤度を減少させることを示す。Ｃ５７Ｂ６マウスを、オステオポンチンをコードするＤＮＡで処置した。
【図７】（図７）  この写真は、図６に示すマウスの抗体力価を示す。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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