(57)【要約】本発明は、新規なイオンチャンネルポリペプチドおよびそれらを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、それらを製造するための発現ベクター、宿主細胞および方法を提供する。本発明は、ヒトの疾患および症状を処置するのに有用なイオンチャンネルアゴニスト／アンタゴニストの同定方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的なエピトープを含むそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的なエピトープを含むそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５、１３６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープをコードするそのフラグメントを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５、１３６よりなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するヌクレオチド配列、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープをコードするそのフラグメントを含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
精製されたポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５および１３６よりなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補体に下記のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション、そして
（ｂ）０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃で３０分の洗浄２回；
その際、該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５および１３６よりなる群から選択される配列と少なくとも１残基異なる。
【請求項６】
核酸分子がＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
核酸分子がＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
核酸分子がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５、１３６よりなる群から選択される配列、または前記ポリペプチドに特異的なエピトープをコードするそのフラグメントを含む、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ベクターがプラスミドである、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
ベクターがウイルス粒子である、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
ベクターが、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ならびにそのコンビネーションおよびサブコンビネーションよりなる群から選択される、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
核酸分子が、サルウイルス４０（simian virus 40）、マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの末端反復配列、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトメタロチオネイン、ならびにそのコンビネーションおよびサブコンビネーションよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能な状態で連結している、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
細胞が細菌細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１５に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
細胞が酵母である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
細胞が昆虫細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
昆虫細胞がＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである、請求項１９に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞よりなる群から選択される、請求項２１に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２３】
少なくとも１０個のヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５、１３６よりなる群から選択される配列またはポリペプチド特異的エピトープをコードするそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２４】
分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５および１３６よりなる群から選択される配列のある領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５および１３６よりなる群から選択される配列の調節領域に対するものである、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項１〜５または２５のいずれか１項に記載の核酸分子および許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項２７】
請求項８に記載の組換え発現ベクターおよび許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的なエピトープを含むそのフラグメントを製造するための、下記の工程を含む方法：
ａ）請求項８に記載の組換え発現ベクターを適合する宿主細胞に導入し；
ｂ）該ポリペプチドの発現のための条件下で宿主細胞を増殖させ；そして
ｃ）該ポリペプチドを回収する。
【請求項２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的なエピトープを含むそのフラグメントを製造するための、下記の工程を含む方法：
ａ）請求項８に記載の組換え発現ベクターを適合する宿主細胞に導入し；
ｂ）該ポリペプチドの発現のための条件下で宿主細胞を増殖させ；そして
ｃ）該ポリペプチドを回収する。
【請求項３０】
宿主細胞を溶解し、そして宿主細胞の溶解物からポリペプチドを回収する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞を溶解せずに培地を精製することによりポリペプチドを回収する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたはポリペプチド特異的エピトープを含むそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択される配列に対して少なくとも約９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはポリペプチド特異的エピトープを含むそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
請求項３２または３３に記載のポリペプチドおよび許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項３５】
請求項３２または３３に記載のポリペプチド上のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項３６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項３５に記載の抗体および許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項３８】
哺乳動物において請求項３２または３３に記載のポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法であって、免疫応答を誘発するのに十分な量の該ポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３９】
請求項３２または３３に記載のポリペプチドを結合する化合物を同定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該ポリペプチドを化合物と接触させ；そして
ｂ）該化合物が該ポリペプチドを結合するかを判定する。
【請求項４０】
ポリペプチドへの化合物の結合をタンパク質結合アッセイにより判定する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質結合アッセイが、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージをベースとする発現クローニング、クロマトグラフィーによる共分画、共沈、架橋、相互作用トラップ／２ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ、ならびにそのコンビネーションおよびサブコンビネーションよりなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を結合する化合物を同定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該核酸分子を化合物と接触させ；そして
ｂ）該化合物が該核酸分子を結合するかを判定する。
【請求項４３】
核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、１３１、１３５および１３６よりなる群から選択される配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
結合をゲルシフトアッセイにより判定する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３２または３３に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該ポリペプチドを化合物と接触させ；そして
ｂ）該ポリペプチドの活性が調節されたかを判定する。
【請求項４６】
ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、１３２よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはポリペプチド特異的エピトープを含むそのフラグメントを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
活性がリガンド結合性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
リガンドがモノアミンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
モノアミンがセロトニンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
リガンドがアセチルコリンである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
活性が神経ペプチドシグナル伝達である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１および１３２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと該ポリペプチドの結合パートナーとの結合のモジュレーターとして有用な化合物を同定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該結合パートナーと該ポリペプチドを含む組成物とを推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ；そして
ｂ）該結合パートナーと該ポリペプチドの結合を検出し、
その際、推定モジュレーター化合物の不存在下での結合と比較して、推定モジュレーター化合物の存在下での該結合パートナーと該ポリペプチドの結合の低下および増強は、障害の処置に有用なモジュレーター化合物であることの指標となる。
【請求項５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１および１３２から選択される配列に対して少なくとも約９０％相同であるアミノ酸配列を有するポリペプチドと該ポリペプチドの結合パートナーとの結合のモジュレーターとして有用な化合物を同定するための、下記の工程を含む方法：
ａ）該結合パートナーと該ポリペプチドを含む組成物とを推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ；そして
ｂ）該結合パートナーと該ポリペプチドの結合を検出し、
その際、推定モジュレーター化合物の不存在下での結合と比較して、推定モジュレーター化合物の存在下での該結合パートナーと該ポリペプチドの結合の低下および増強は、障害の処置に有用なモジュレーター化合物の指標となる。
【請求項５４】
組成物が、表面に前記ポリペプチドを発現する細胞を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
組成物が、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションした細胞を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで米国仮特許出願Ｎｏ．６０／４０３，２５４（２００２年８月１３日出願）および米国仮特許出願Ｎｏ．６０／３１８，７３３（２００１年９月１２日出願）に基づく優先権を主張する。これらの各書類を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一部は、イオンチャンネルをコードする核酸分子、ヒトのこれらのイオンチャンネルの新規ポリペプチド、およびこれらのポリペプチドに結合し、および／またはそれらの活性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
イオンチャンネルは、細胞へのイオンの流入流出を調節する”分子ゲート”である。イオンの流れは、学習や記憶に必要なすべての脳細胞連絡において重要な役割を果たす。さらにイオンの流れは、心拍および身体運動を含めた（これらに限定されない）多くの生理的プロセスにおいて重要である。特にてんかん、統合失調症（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、アルツハイマー病、片頭痛、不整脈、糖尿病、および発作損傷などの障害においてイオンチャンネルの異常が指摘されている。イオンは、それらの電気化学的勾配に従ってイオンチャンネルを通って流れる（受動輸送）。チャンネルのコアは親水性であり、そのタンパク質の一部である選択的フィルターを含み、これが特定のイオンのみを認識してそれらを通過させる。チャンネルは、それらが通過させるイオンにより命名されている。イオンチャンネルの例にはカルシウムチャンネル、カリウムチャンネル、ナトリウムチャンネル、塩素イオンチャンネルなどが含まれるが、これらに限定されない。チャンネルの他の構成要素はゲートである。ゲートが開いているときだけ、選択的フィルターが認識したイオンがチャンネルを通過できる。ゲートは多様な刺激に応答して開く。これには膜電位の変化または細胞内外における特定の化学物質の存在が含まれるが、これらに限定されない。チャンネル名にはゲートを制御するものの指示も含まれることが多い：たとえば”電位依存性カルシウムチャンネル”。現在、５０以上の異なるタイプのイオンチャンネルが同定されている。
【０００４】
ニューロン間の連絡は、シナプス内への神経伝達物質の放出により達成される。次いでこれらの神経伝達物質がシナプス後ニューロン上の受容体を活性化する。これらの受容体の多くは、ナトリウム、カルシウム、カリウムおよび塩素などのイオンを速やかにニューロン内へ伝達するためのポアを含む。これらのポア、すなわちチャンネルは、一般に神経伝達物質依存性イオンチャンネルタンパク質と呼ばれるタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質サブユニットから形成されている。このファミリーには下記のものが含まれる：セロトニン５−ＨＴ３受容体；γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）受容体サブユニット：γ−１、ρ−３およびβなどを含む；ならびにアセチルコリン受容体タンパク質サブユニット：α−９鎖、ε鎖、およびβ−２鎖を含む。
【０００５】
神経伝達物質依存性イオンチャンネルスーパーファミリーには、５−ＨＴ３、ＧＡＢＡＡ、グルタミン酸、グリシンおよびニコチン性アセチルコリン受容体ファミリーが含まれる。このスーパーファミリーでは、４つの膜貫通ドメインおよび１つの細胞外リガンド結合ドメインをもつサブユニットのホモ−またはヘテロ五量体により機能性受容体が形成される。これらの受容体の膜貫通ドメインは、イオンポアの形成に寄与する。
【０００６】
セロトニンは５−ヒドロキシトリプタミンまたは５−ＨＴとしても知られ、神経伝達物質、マイトジェンおよびホルモンとして機能する生物源アミンである（Ｃｏｎｌｅｙ，Ｅ．Ｃ．（１９９５）ＴＨＥ  ＩＯＮ  ＣＨＡＮＮＥＬＳ  ＦＡＣＴＳ  ＢＯＯＫ，ＶＯＬ．Ｉ．ＥＸＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＬＩＧＡＮＤ−ＧＡＴＥＤ  ＣＨＡＮＮＥＬＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドンおよびサンディエゴ，ｐｐ．４２６）。セロトニンは多数の受容体を活性化し、その大部分はＧタンパク質の活性化に関係する。ただし５−ＨＴ３受容体は構造的に異なり、神経伝達物質依存性イオンチャンネルスーパーファミリーに属する。５−ＨＴ３受容体は、中枢および末梢ニューロンにおいてシナプス前およびシナプス後の両方に発現する。シナプス後５−ＨＴ３受容体はシナプス後ニューロンに興奮性電位を誘発することによりそれらの作用を及ぼし、これに対しシナプス前５−ＨＴ３受容体はシナプス前ニューロンからの他の神経伝達物質の放出を調節する（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）。５−ＨＴ３受容体は、痛覚、認知、脳運動ニューロン活性、感覚処理および情動調節において重要な役割をもつ（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）。したがって、５−ＨＴ３受容体を調節するリガンドまたは薬物は、疼痛、ニューロパシー、片頭痛、認知障害、学習および記憶の欠陥、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、嘔吐、脳ニューロパシー、感覚欠陥、不安、うつ病、統合失調症、および他の情動障害の処置に有用となりうる。
【０００７】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）は、ニコチンに対するそれらの親和性、および神経伝達物質依存性イオンチャンネルスーパーファミリーのすべてのメンバーと同様なそれらの構造、すなわちホモ−またはヘテロ五量体により、他のアセチルコリン受容体と区別される。ニコチン性ＡＣｈＲは、骨格筋の神経筋接合部ならびに末梢および中枢ニューロンにみられる。これらの受容体は非選択的カチオンチャンネルを形成し、したがって活性化されると興奮性電流を誘発する。ニコチン性ＡＣｈＲは麻酔薬、鎮静薬および幻覚薬に対する受容体であり（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）、特定のリガンドが動物において学習および記憶の改善を示した（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９９，１０：６７５−７８０）。したがって、ニコチン性ＡＣｈＲを調節するリガンドまたは薬物は、麻酔、鎮静、学習および記憶の改善、認知改善、統合失調症、不安、うつ病、注意欠陥多動性障害、ならびに嗜癖停止または禁煙に有用となりうる。特定の発生段階または疾患を特異的にターゲティングするリガンドまたは薬物の設計を可能にする開発に際しては、ＡＣｈＲサブユニットの発現を調節する。
【０００８】
神経伝達物質γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、神経伝達物質依存性イオンチャンネルファミリー（ＧＡＢＡＡ）およびＧタンパク質結合受容体ファミリー（ＧＡＢＡＢ）を活性化する（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）。ＧＡＢＡＡ受容体は、ＧＡＢＡまたはＧＡＢＡＡ受容体アゴニストにより刺激されると抑制性または過分極性電流を誘発する塩素イオンチャンネルを形成する。（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）。ＧＡＢＡＡ受容体は、ベンビジアゼピン類、バルビツレート、ピクロトキシンおよびビククリンにより調節される（Ｃｏｎｌｅｙ，１９９５）。したがって、ＧＡＢＡＡ受容体を調節するリガンドまたは薬物は、鎮静、不安、てんかん、発作、アルコール嗜癖または離脱、パニック障害、月経前症候群、片頭痛、および中枢または末梢ニューロンの過剰興奮を特色とする他の疾患に有用となりうる。ＧＡＢＡＡ受容体の薬理作用は、この受容体のサブユニット組成を変化させることにより影響を受ける。ＧＡＢＡ受容体ρサブユニットは網膜にかなり特異的に発現し（Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２６７３−７）、ρ受容体ホモ多量体の薬理作用はいわゆるＧＡＢＡＣ受容体のものに類似する（Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：６８３−７）。したがって、ρサブユニットを含むＧＡＢＡ受容体は視覚異常、黄斑変性症、緑内障その他の網膜障害を処置するためのリガンドまたは薬物を見いだすのに有用なターゲットとなりうる。
【０００９】
これらのチャンネルの活性を修飾する化合物は、てんかんならびにパーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性性疾患を含めた神経運動疾患の制御にも有用となりうる。これらのチャンネルの活性を調節する化合物は、心血管性不整脈、発作、ならびに内分泌障害および筋障害を含めた（これらに限定されない）疾患も処置できる。
【００１０】
したがってイオンチャンネルは、統合失調症、うつ病、不安、注意欠陥多動性障害、片頭痛、発作、虚血、ならびに神経変性性疾患、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、緑内障、ならびに黄斑変性症を含めた多様な障害および欠陥を処置するためのリガンドまたは薬物を見いだすのに有用なターゲットとなりうる。さらに、イオンチャンネルを調節する化合物は、虚血、うっ血性心不全、不整脈、高血圧および再狭窄を含めた心血管疾患の処置にも使用できる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子に関する。この核酸分子はｉｏｎ−ｘの少なくとも一部をコードする
【００１２】
【化１】
2005532029.tif 000002
【００１３】
ある態様において核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする配列を含む。ある態様において核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列に相同な配列、またはそのフラグメントを含む。ある態様において核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列、またはそのフラグメントを含む。
【００１４】
配列群を示す場合、そのコンビネーションおよびサブコンビネーションも具体的に含まれることを理解すべきである。たとえば”ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４”という開示については、本発明はそのコンビネーションおよびサブコンビネーションも含むと理解すべきである。これにはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２および５３；５２および５５；５２、５３および５５；などが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
ある態様によれば、本発明は本発明の核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様においては、ベクターは発現ベクターである。
ある態様によれば、本発明は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。ある態様においては、宿主細胞は発現ベクターを含む。
【００１６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、この一部は少なくとも１０個のヌクレオチドを含むものである、単離された核酸分子を提供する。
【００１７】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたはその相同体もしくはフラグメントを製造する方法を提供する。この方法は、それらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを適合する宿主細胞に導入し、該ポリペプチドの発現のための条件下で宿主細胞を増殖させ、そして該ポリペプチドを回収する工程を含む。
【００１８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたはその相同体もしくはフラグメント上のエピトープに結合する、単離された抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列を含むポリペプチドまたはその相同体もしくはフラグメントに対する哺乳動物の免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、免疫応答を誘発するのに十分な量の上記ポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む。
【００２０】
本発明は、ｉｏｎ−ｘを結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｉｏｎ−ｘを化合物と接触させ、そして該化合物がｉｏｎ−ｘを結合するかを判定する工程を含む。ｉｏｎ−ｘを結合すると同定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明は、ｉｏｎ−ｘをコードする核酸分子を結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｉｏｎ−ｘをコードする核酸分子を化合物と接触させ、そして該化合物が核酸分子を結合するかを判定する工程を含む。
【００２２】
本発明は、ｉｏｎ−ｘの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｉｏｎ−ｘを化合物と接触させ、そしてｉｏｎ−ｘの活性が調節されたかを判定する工程を含む。ｉｏｎ−ｘ活性を調節すると同定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明は、ｉｏｎ−ｘの動物相同体を同定する方法を提供する。この方法は、動物の核酸データベースを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列またはその一部によりスクリーニングし、そしてそのライブラリーまたはデータベースの一部がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列またはその一部と相同であるかを判定する工程を含む。
【００２４】
本発明は、ｉｏｎ−ｘの動物相同体を同定する方法を提供する。この方法は、動物の核酸ライブラリーを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列を有する核酸分子またはその一部によりスクリーニングし；そしてそのライブラリーまたはデータベースの一部がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列またはその一部と相同であるかを判定する工程を含む。
【００２５】
本発明の他の態様は、脳に影響を及ぼす障害またはそれに対する遺伝的素因についてヒト対象を診断するためのスクリーニング方法に関する。この方法は、ヒト対象の核酸をアッセイして、脳に発現する少なくとも１種類のイオンチャンネルのアミノ酸配列、発現または生物活性を変化させる変異の存在または不存在を判定する工程を含む。イオンチャンネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはその対立遺伝子バリアントを含む。障害または素因の診断は、その変異の存在または不存在から行われる。核酸中にイオンチャンネルのアミノ酸配列、発現または生物活性を変化させる変異が存在することは、その障害を発症するリスクが高いことと相関する。
【００２６】
本発明はさらに、ヒト患者におけるｉｏｎ−ｘ性精神障害遺伝子型をスクリーニングする方法に関する。この方法は、ｉｏｎ−ｘの対立遺伝子に対応する配列を含む核酸を含有する生物試料を患者から得る工程を含む。そのｉｏｎ−ｘ対立遺伝子中に１以上の変異が存在すると、精神障害遺伝子型の指標が検出されたことになる。ある態様において、精神障害には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：統合失調症、情動障害、ＡＤＨＤ／ＡＤＤ（すなわち注意欠陥多動性障害／注意欠陥障害）、ならびに神経障害、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、片頭痛、および老年性痴呆、ならびにうつ病、不安、双極性疾患、てんかん、神経炎、神経衰弱症、ニューロパシー、ノイローゼなど。
【００２７】
本発明は、精神障害またはそれに対する遺伝的素因を診断するためにヒト対象をスクリーニングするキットを提供する。このキットには、ヒトｉｏｎ−ｘ遺伝子における多型を同定するためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド置換よりなる群から選択される１つの配列相異以外は野生型ヒトｉｏｎ−ｘ遺伝子配列またはコード配列と同一または相補的である配列中の６〜５０個のヌクレオチドを含む。このキットには、オリゴヌクレオチドと共に包装された媒体も含まれる。この媒体には、精神障害またはそれに対する遺伝的素因と相関する多型を同定するための情報が含まれ、その多型は上記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて同定できる。
【００２８】
本発明はさらに、精神障害と相関するイオンチャンネル対立遺伝子バリアントを同定する方法に関する。この方法は、精神障害を伴うと診断された患者からの、またはその患者の遺伝的祖先もしくは子孫からの核酸を含有する生物試料を用意し、その核酸中において脳に発現するイオンチャンネルにおける１以上の変異の存在を検出する工程を含む。イオンチャンネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体を含む。核酸は、ｉｏｎ−ｘをコードする遺伝子または複数の遺伝子に対応する配列を含む。１以上の変異が検出されると、精神障害と相関する対立遺伝子バリアントの指標となる。
【００２９】
本発明はさらに、精神障害を伴うヒトからのｉｏｎ−ｘの対立遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、精製されたポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の相補体に下記のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする：（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション、そして（ｂ）０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃で３０分の洗浄２回。そのヒトのｉｏｎ−ｘアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２または１３４と少なくとも１残基異なる。
【００３０】
本発明は、ｉｏｎ−ｘの生物活性のモジュレーターを同定するための方法であって、ｉｏｎ−ｘを発現する細胞を推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ、そして細胞におけるｉｏｎ−ｘの生物活性を測定する工程を含む方法をも提供する。推定モジュレーター化合物の不存在下と対比して存在下でのｉｏｎ−ｘの生物活性の低下および増強は、生物活性のモジュレーターの指標となる。ｉｏｎ−ｘ活性を調節すると同定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で用いるイオンチャンネルの”生物活性”という用語は、そのイオンチャンネルの天然活性を表わす。イオンチャンネルの活性には、特定の化合物を結合する能力またはそれにより影響される能力、およびイオンを膜の一方側から他方側へ輸送する能力が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明はさらに、精神障害の処置に有用な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ｉｏｎ−ｘを含む組成物とｉｏｎ−ｘを結合すると推定される化合物とを接触させる工程を含む。ｉｏｎ−ｘとｉｏｎ−ｘを結合すると推定される化合物との結合を検出する。ｉｏｎ−ｘを結合すると同定された化合物は、精神障害の処置に有用な候補化合物である。
【００３３】
本発明はさらに、ｉｏｎ−ｘとｉｏｎ−ｘの結合パートナーとの結合のモジュレーターとして有用な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、結合パートナーとｉｏｎ−ｘを含む組成物とを推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ、そして結合パートナーとｉｏｎ−ｘの結合を検出する工程を含む。推定モジュレーターの不存在下での結合と比較して、推定モジュレーターの存在下での該結合パートナーとｉｏｎ−ｘの結合の低下および増強は、精神障害の処置に有用なモジュレーター化合物の指標となる。
【００３４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列の少なくとも一部を含み、この一部は少なくとも１０個のヌクレオチドを含むものである、キメラ受容体を提供する。
【００３５】
これらおよび他の本発明の態様を以下にさらに詳細に記載する。
好ましい態様の詳細な説明
本発明は特に、ヒトのイオンチャンネルまたはその一部をコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含有するベクター、これらのベクターで形質転換した宿主細胞、イオンチャンネルおよびサブユニットの調製方法、前記ポリヌクレオチドおよびベクターの使用方法、単離および精製されたイオンチャンネルおよびサブユニット、イオンチャンネル活性を調節する化合物のスクリーニング方法、ならびにイオンチャンネル活性を調節する化合物を提供する。
【００３６】
定義
本明細書全体において種々の定義を行う。大部分の語は、当業者がそれらの語に適用している意味をもつ。以下においてまたは本明細書の他の箇所において特別に定義する語は、本発明に関して提示した場合、全体として当業者が一般に理解している意味をもつ。
【００３７】
本明細書中で用いる句”イオンチャンネル”は、膜を通してイオンを移動させうるチャンネル全体、およびそのチャンネルを構成するサブユニットポリペプチド鎖を表わす。本発明のイオンチャンネルはリガンド依存性であるので、これらのイオンチャンネルは”受容体”とも呼ばれる。当業者はイオンチャンネルがサブユニットからなることを認識しているであろう。本明細書中で用いる用語”サブユニット”はイオンチャンネルのいずれかの構成部分を表わし、これにはβサブユニットその他の関連サブユニットが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本明細書中で用いられ、当技術分野で理解されている”合成された”は、酵素によるものではなく純粋に化学的な方法で製造されたポリヌクレオチドを表わす。したがって”全”合成ＤＮＡ配列は全体が化学的方法で製造されたものであり、”部分”合成ＤＮＡは得られたＤＮＡの一部のみが化学的手段で製造されたものを含む。
【００３９】
用語”領域”は、生体分子の一次構造の物理的に連続した部分を意味する。タンパク質の場合、領域はそのタンパク質のアミノ酸配列の連続部分により規定される。
本明細書において用語”ドメイン”は、生体分子の構造部分であって、その生体分子の既知の機能または推定機能に関与する部分を表わすものと定義される。ドメインは領域またはその一部と同一の広がりをもって（ｃｏ−ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）いてもよい；ドメインは、生体分子の特定領域の全部または一部のほかに、その特定領域と区別される部分を含むこともできる。イオンチャンネルドメインの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：細胞外（すなわちＮ末端）ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（すなわちＣ末端）：これらは同様な名称をもつイオンチャンネル領域と同一の広がりを有している；ならびに隣接する膜貫通セグメントを連結する各ループセグメント（細胞外ループおよび細胞内ループの両方）。
【００４０】
本明細書中で用いる用語”活性”は、測定可能である多様な指標であって、直接または間接結合を示唆または表示するもの；応答に影響を及ぼすもの、すなわちある暴露または刺激に応答する測定可能な作用をもつものを表わす。これには、たとえば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを直接結合することについての化合物の親和性が含まれる。活性は、ある刺激または事象の後の下流の酵素活性、ならびに下流のメッセンジャー、たとえばＫ＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｎａ＋イオン、Ｃｌ−イオン、サイクリックＡＭＰおよびリン脂質を測定することによっても判定できる。たとえば、活性はイオンフラックスを測定することによっても判定できる。本明細書中で用いる用語”イオンフラックス”には、イオン電流が含まれる。活性は、電極もしくは電圧感受性色素を用いて膜電位の変化を測定し、または神経もしくは細胞の活性、たとえば活動電位の持続時間もしくは周波数、刺激作用電位の閾値、長期増強もしくは長期阻害を測定することによっても判定できる。
【００４１】
本明細書中で用いる用語”タンパク質”は、タンパク質の全長および部分フラグメントを含むものとする。本明細書において用語”タンパク質”は、”ポリペプチド”と互換性をもって使用できる。したがって、本明細書中で用いる用語”タンパク質”には、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチドまたはアミノ酸配列が含まれる。
【００４２】
本明細書中で用いる用語”キメラ受容体”は、１種類より多いタイプの受容体の一部を含む受容体を表わすものとする。限定ではない例としてキメラ受容体は、α９ニコチン性アセチルコリン受容体のポア形成性膜貫通ドメインおよびα１０ニコチン性アセチルコリン受容体の細胞外ドメインを含むものであってもよい。本発明のキメラ受容体は関連受容体のハイブリッドに限定されない；キメラ受容体はたとえばα７ニコチン性アセチルコリン受容体のポア形成性膜貫通ドメインおよびＧＡＢＡ受容体の細胞外ドメインを含むこともできる。キメラ受容体は、既知の野生型受容体の一部および人工受容体の一部を含むこともできる。
【００４３】
本明細書中で用いる用語”抗体”は、完全な無傷の抗体、そのＦａｂフラグメント、およびＦ（ａｂ）２フラグメントを表わすものとする。完全な無傷の抗体には、モノクローナル抗体、たとえばネズミモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびファージディスプレーにより同定した組換え抗体が含まれる。
【００４４】
本明細書中で用いる用語”結合”は、２つのタンパク質、化合物もしくは分子（核酸分子、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡを含む）またはその組合わせ間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用である結合は、直接的または間接的であってよく、間接的なものは他のタンパク質、化合物または分子を介し、またはその作用によるものである。直接結合は、他のタンパク質、化合物または分子を介して、またはその作用により行われるのではなく、他の実質的な介在物質のない相互作用を表わす。結合は多様な方法で検出できる。限定ではない例として、本発明のイオンチャンネルと化合物の物理的結合相互作用は標識化合物を用いて検出できる。あるいは、たとえば本発明のイオンチャンネルでトランスフェクションされてそれを発現する細胞を用いて、結合の機能的証拠を検出できる。細胞中へトランスフェクションしたイオンチャンネルのリガンドへのトランスフェクション細胞の結合は、結合の機能的証拠を提供する。結合を検出するための他の方法は当業者に周知である。
【００４５】
本明細書中で用いる用語”化合物”は、同定可能な化学物質または分子を意味し、これには低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物は天然または合成のいずれであってもよい。
【００４６】
本明細書中で用いる用語”相補的”は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン・クリック塩基対合を表わす。
本明細書中で用いる用語”接触”は、ある化合物を直接的または間接的に本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドはかなり多数の緩衝液、塩類、溶液などの中に存在してもよい。接触には、たとえばイオンチャンネルポリペプチドもしくはそのフラグメントを、またはイオンチャンネルポリペプチドもしくはそのフラグメントをコードする核酸分子を収容したビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ、たとえば遺伝子チップなどの中へ化合物を入れることが含まれる。
【００４７】
本明細書中で用いる用語”相同ヌクレオチド配列”または”相同アミノ酸配列”またはその変形は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の全体に対して、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の少なくとも一部（この一部は、コードしているポリペプチドの機能性ドメインをコードする）に対して、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２もしくは１３４に対して、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を特色とする配列を表わす。本明細書中で用いる用語”約”は、参照数値の±１０％の範囲を示す。たとえば”約８０％相同”という句は、７２〜８８％の相同範囲を表わし、”少なくとも約８０％の相同性”という句は、少なくとも７２％の相同性を表わす。本明細書中で用いる用語”少なくとも”は、そこに挙げた数値およびその特定範囲に含まれる整数値を含む。相同ヌクレオチド配列には、イオンチャンネルタンパク質のイソ型をコードする配列が含まれる。そのようなイソ型は、たとえばＲＮＡのオルタナティブスプライシングの結果として、同一生物の異なる組織に発現する可能性がある。あるいは、イソ型は異なる遺伝子によりコードされる可能性がある。相同ヌクレオチド配列には、ヒト以外の種（哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない）のイオンチャンネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。相同ヌクレオチド配列には、本明細書中で前記に述べたヌクレオチド配列の天然の対立遺伝子バリアントおよび変異体も含まれるが、これらに限定されない。本発明は特定の配列を提示するが、本発明の範囲には本明細書に記載するイオンチャンネルの他のヒト対立遺伝子バリアントおよびヒト以外の形態も含まれるものと理解すべきである。
【００４８】
相同アミノ酸配列には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２もしくは１３４およびイオンチャンネル活性をもつポリペプチドにおける、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列が含まれる。ただし相同アミノ酸配列は、イオンチャンネル活性をもつ既知ポリペプチドの配列を含まない。本明細書中で用いる用語”相同性％”は、２配列をアラインした際のそれらの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数と対比した同一ヌクレオチドまたは同一アミノ酸の比率を表わす。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴユーティリティープログラムによりデフォルト設定を用いて、ＤＮＡおよびタンパク質の両方に関する配列アラインメントを行った。より具体的には、２配列の相同性％を判定するために、最適比較が得られるようにそれらの配列をアラインする（たとえば、第１配列に第２配列との最適アラインメントのためにギャップを導入できる）。次いで対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１配列中のある位置が第２配列の対応する位置と同一のヌクレオチドまたはアミノ酸で占められている場合、それらの分子はその位置において相同である（すなわち本明細書中で用いる”相同性”は”同一性”と等しい）。さらに具体的には、配列相同性は、当技術分野で既知のコンピュータープログラム、たとえばＧＣＧプログラムパッケージ中に提供されるＧＡＰソフトフェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、ワイオミング州マディソン）を用いて判定できる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  １９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−４５３参照。たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９；その全体を本明細書に援用する）を用いた配列比較のためのデフォルト設定付きＧＣＧ  Ｇａｐソフトフェアを使用できる。本明細書中で用いる用語”相同性％”およびその変形は、”同一性％”および”類似性％”と互換性をもって用いられる。
【００４９】
本明細書中で用いる用語”単離された”核酸分子は、それの天然環境から取り出された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を表わす。単離された核酸分子の例には、ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ分子、ヘテロロガス宿主細胞中に保持された組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で用いる用語”調節（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）”または”修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｓ）”は、特定の活性またはタンパク質の量、質または作用の低下または増大を意味する。
【００５１】
用語”予防”は、生物が異常な状態を罹患または発現する確率を低下させることを表わす。
用語”治療”は、生物において療法効果をもつこと、および異常な状態を少なくとも部分的に軽減するかまたは排除することを表わす。
【００５２】
用語”療法効果”は、異常な状態の原因となり、または関与している要因を、阻害または活性化することを表わす。療法効果は、異常な状態の１以上の症状をある程度軽減する。異常な状態の処置に関して、療法効果は下記のうち１以上を表わすことができる：（ａ）細胞の増殖、成長および／または分化の増大；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち遅延または停止）；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関連する１以上の症状のある程度の軽減；ならびに（ｅ）影響を受けた細胞集団の機能の増強。異常な状態に対する効果を示す化合物は、本明細書の記載に従って同定できる。
【００５３】
用語”異常な状態”は、生物における正常な機能から逸脱した、その生物の細胞または組織の機能を表わす。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達または細胞生存に関係する可能性がある。異常な状態には、肥満症、糖尿病合併症、たとえば網膜変性、ならびにグルコースの取込みおよび代謝の不全、ならびに脂肪酸の取込みおよび代謝の不全も含めることができる。
【００５４】
異常な細胞増殖状態には、癌、たとえば線維性障害およびメサンギウム障害、異常な血管形成および脈管形成、創傷癒合、乾癬、糖尿病および炎症が含まれる。
異常な分化状態には、神経変性性障害、創傷治癒速度の低下、および移植組織治癒速度の低下が含まれるが、これらに限定されない。異常な細胞シグナル伝達状態には、過度の神経伝達物質活性を伴う精神障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
異常な細胞生存状態は、プログラミングされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化または妨害された状態にも関する。アポトーシス経路には多数のプロテインキナーゼが関係する。これらのプロテインキナーゼのうちのいずれかの機能が異常であると、細胞不死または早期細胞死を生じる。
【００５６】
用語”投与”は、化合物を生物の細胞または組織に取り込ませる方法に関する。生物の細胞または組織が生物内または生物外にある状態で、異常な状態を予防または治療できる。生物外にある細胞は、細胞培養皿内で維持または増殖できる。生物内にある細胞についは、当技術分野に多数の化合物投与方法があり、これには経口、非経口、皮膚、注射およびエアゾル剤投与が含まれる（これらに限定されない）。生物外にある細胞についは、当技術分野に多数の化合物投与方法があり、これには細胞マイクロインジェクション法、形質転換法およびキャリヤー法が含まれる（これらに限定されない）。
【００５７】
異常な状態は、生物のイオンチャンネルに異常をもつ細胞群に化合物を投与することによっても予防または治療できる。その際、化合物投与が生物の機能に及ぼす影響をモニターすることができる。生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはヤギ、より好ましくはサルまたは類人猿、最も好ましくはヒトである。
【００５８】
”増幅”とは、正常な細胞と比較して細胞のＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加することを意味する。ある正常細胞にはＲＮＡの基礎発現がないので、ＲＮＡに関する”増幅”は、細胞中に検出可能なＲＮＡが存在することであってもよい。他の正常細胞においては基礎レベルの発現があるので、これらの場合は増幅は基礎レベルと比較して少なくとも１〜２倍、好ましくはそれ以上検出されることである。
【００５９】
本明細書中で用いる用語”オリゴヌクレオチド”は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いるのに十分な数の塩基をもつ一連の連結したヌクレオチド残基を表わす。この短い配列はゲノム配列またはｃＤＮＡ配列を基礎とし（またはそれから設計され）、特定の細胞または組織における同一、類似または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅、確認または解明するために用いられる。オリゴヌクレオチドは少なくとも約１０ヌクレオチドないし約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチドをもつ核酸配列部分を含む。それらは化学的に合成でき、プローブとして使用できる。
【００６０】
本明細書中で用いる用語”プローブ”は、用途に応じて多様な長さ、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドないし約６，０００ヌクレオチドをもつ核酸配列を表わす。それらは、同一、類似または相補的核酸配列の検出に用いられる。より長いプローブは、通常は天然源または組換え源から得られ、特異性が高く、オリゴマーよりハイブリダイズする速度がはるかに遅い。それらは一本鎖または二本鎖であってよく、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション膜ベース法またはＥＬＩＳＡ様の方法において特異性をもつように慎重に設計される。
【００６１】
本明細書中で用いる句”ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”または”ストリンジェントな条件”は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがそれのターゲット配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイゼーションは最小数である条件を表わす。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、かつ異なる環境では異なるであろう。配列が長いほど、より高い温度でそれらの適正な相補体に特異的にハイブリダイズする。一般にストリンジェントな条件は、特定のイオン濃度およびｐＨで特異的配列の融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選定される。Ｔｍは、ターゲット配列に相補的なプローブの５０％がターゲット配列に平衡状態でハイブリダイズする温度（一定のイオン濃度、ｐＨおよび核酸濃度で）である。ターゲット配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは５０％のプローブがそれらの相補体に平衡状態でハイブリダイズする。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他のイオン）となり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃となる条件である。ストリンジェントな条件は、脱安定化剤、たとえばホルムアミドを添加しても達成できる。
【００６２】
アミノ酸配列は、左から右にアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）方向へ示される。Ｎ末端α−アミノ基およびＣ末端β−カルボキシ基は配列中に示されない。ヌクレオチド配列は一本鎖のみで、左から右に５’から３’方向へ示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する様式で示される。あるいは、アミノ酸はそれらの３文字コード表示法により示される。
【００６３】
本発明は下記の出願に関連する：出願番号（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．）６０／１８８，５１７；出願番号６０／１８８，５１９；出願番号６０／１８８，４８４；出願番号６０／１８８，５１８；出願番号６０／１８８，４００；出願番号６０／２１５，８１５；出願番号６０／２１６，４８１；出願番号０９／８０２，６６８；および出願番号０９／８０２，６６８；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００６４】
ポリヌクレオチド
本発明は、未知のイオンチャンネルをコードする精製および単離されたポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写体、センス鎖および相補的アンチセンス鎖の両方、一本鎖および二本鎖の両方、そのスプライスバリアントを含む）を提供する。これらの遺伝子を本明細書にｉｏｎ−ｘと記載し、本明細書中でそのように総称する
【００６５】
【化２】
2005532029.tif 000003
【００６６】
すなわち、これらの遺伝子および遺伝子産物を下記のように本明細書に記載し、本明細書中でそのように表示する：
【００６７】
【化３】
2005532029.tif 000004
【００６８】
下記の表１に、新規遺伝子配列ｉｏｎ−ｘの表示、遺伝子配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：、およびそれがコードするポリペプチドのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：を示す。
【００６９】
【表１】
2005532029.tif 000005
【００７０】
特定のｉｏｎ−ｘ（たとえばｉｏｎ−５−ＨＴ３Ｃ）を指定すると、その特定のイオンチャンネルサブユニットのみを表わすことが理解される。
本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含む精製および単離されたポリヌクレオチド（たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組合わせ；一本鎖または二本鎖のいずれも）を提供する。そのようなポリヌクレオチドは、受容体の組換え発現および細胞における受容体発現の検出（たとえばノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用）に有用である。そのようなポリヌクレオチドは、培養細胞、組織または動物においてｉｏｎ−ｘの発現を抑制するためのアンチセンスその他の分子の設計に；療法用として；または異常なｉｏｎ−ｘ発現を特色とする疾患もしくは症状のモデルの提供にも有用である。本発明のポリヌクレオチドの定義から特に除外されるのは、宿主細胞の単離された非組換え天然染色体全体である。好ましいポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列をもつ。これらは天然のｉｏｎ−ｘ配列に対応する。普遍遺伝子コードがもつ周知の縮重のため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列をもつｉｏｎ−ｘを同様にコードする他の多数のポリヌクレオチド配列があることは認識されるであろう。
【００７１】
本発明は、哺乳動物ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列をもつポリヌクレオチドまたはそれに相補的な非コード鎖に、下記のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをも提供する：
（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション；そして
（ｂ）０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃でそれぞれ３０分の洗浄２回。ヒト対立遺伝子バリアントをコードするポリヌクレオチドがきわめて好ましい。
【００７２】
本発明はまた、前記イオンチャンネルをコードする遺伝子配列を含む分子；それらの遺伝子配列を組み込んだ構築体および組換え宿主細胞；それらの遺伝子配列がコードする新規なｉｏｎ−ｘポリペプチド；それらのポリペプチドおよび相同体に対する抗体；それらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いたキット；ならびに以上のすべてを製造および使用する方法に関する。さらに本発明は、前記遺伝子配列およびポリペプチドの相同体、ならびにそれらを製造および使用する方法に関する。
【００７３】
本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドに対するタンパク質コード領域を含み、その対立遺伝子バリアントをも含むものとする。多くの遺伝子に関して、ゲノムＤＮＡがＲＮＡ転写体に転写され、これが１またはそれより多くのスプライシング事象を受け、その際、転写体のイントロン（すなわち非コード領域）が除去される、すなわち”スプライスアウト”されることは広く理解されている。オルタナティブ機序によりスプライスされ、したがって異なるＲＮＡ配列が除去されるが、なおｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードするＲＮＡ転写体を、当技術分野でスプライスバリアントと呼ぶ。これらも本発明に含まれる。したがって本発明に含まれるスプライスバリアントは、同じ起源ゲノムＤＮＡ配列によりコードされるが、異なるｍＲＮＡ転写体に由来する。対立遺伝子バリアントは野生型遺伝子配列の修飾型であり、その修飾は染色体分離に際して、または遺伝子変異を生じる条件への暴露に際して、組換えにより起きる。対立遺伝子バリアントは、野生型遺伝子と同様に天然配列である（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの操作により生じる非天然バリアントとは異なる）。
【００７４】
本発明には、ｉｏｎ−ｘをコードするＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写により得られるｃＤＮＡも含まれる（慣習的に、続いて相補鎖の第２鎖合成により二本鎖ＤＮＡを得る）。
【００７５】
ヒトｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードする好ましいＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列に示される。本発明の好ましいＤＮＡは、二本鎖分子に加えて、ＤＮＡに関するワトソン・クリック塩基対合規則に従ってコード鎖から明確に演繹できる相補分子（”非コード鎖”または”相補体”）を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列のｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドであって、普遍核遺伝子コードがもつ周知の縮重のためＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列のポリヌクレオチドと配列が異なるものも好ましい。
【００７６】
ある好ましい態様において、単離された核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、または１１９の配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、または１１９の配列を含むポリペプチドは、下記の配列のうち１以上のものからのアミノ酸残基を少なくとも１個またはそれ以上含む：ｉｏｎ３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、ｉｏｎ５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）、ｉｏｎ１１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、ｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）。
【００７７】
ある好ましい態様において、単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、または１１９の配列をもつポリペプチドをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、または１１８のヌクレオチド配列を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、または１１９の配列をもつポリペプチドをコードする単離された核酸は、下記の配列のうち１以上のものからのヌクレオチドを少なくとも１個またはそれ以上含む：ｉｏｎ３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ｉｏｎ５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）、ｉｏｎ１１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）、ｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）。
【００７８】
ある好ましい態様において、単離された核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８、１２０、１３１または１３３のヌクレオチド配列を含む。この単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０（ＡＴＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣ）のうち少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２２、より好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも２６、より好ましくは少なくとも２８、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも３１個の連続ヌクレオチドを含む。
【００７９】
ある好ましい態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、または１１９の配列をもつポリペプチドをコードする単離された核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０（ＡＴＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣ）のうち少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２２、より好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも２６、より好ましくは少なくとも２８、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも３１個の連続ヌクレオチドを含む。
【００８０】
ある好ましい態様において、単離された核酸はキメラ受容体をコードする。このキメラ受容体コード核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０（ＡＴＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＡＣＣＣ）のうち少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１４、より好ましくは少なくとも１６、より好ましくは少なくとも１８、より好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２２、より好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも２６、より好ましくは少なくとも２８、より好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも３１個の連続ヌクレオチドを含む。
【００８１】
本発明はさらに、ヒトｉｏｎ−ｘ  ＤＮＡの、他の種、好ましくは哺乳動物の相同体を含む。種相同体（時には”オルソログ”と呼ばれる）は一般に、本発明のヒトＤＮＡと少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性をもつ。一般に、本発明のポリヌクレオチドに関して配列”相同性”％は、配列をアラインし、最大％の配列同一性を達成するために必要ならばギャップを導入た後、候補配列中において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択されるｉｏｎ−ｘ配列中のヌクレオチドと同一であるヌクレオチド塩基の％として計算できる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、サザンおよび／またはノーザンハイブリダイゼーション、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた周知の方法により、関連のｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、たとえばヒト対立遺伝子バリアントおよび種相同体を同定および単離するのを可能にする。関連ポリヌクレオチドの例には、ｉｏｎ−ｘに相同なポリペプチドならびにｉｏｎ−ｘの１以上の生物学的、免疫学的および／または物理的特性をもつ構造関連ポリペプチドをコードする、ヒトおよびヒト以外のゲノム配列（対立遺伝子バリアントを含む）ならびにポリヌクレオチドが含まれる。ｉｏｎ−ｘに相同なタンパク質をコードするヒト以外の種の遺伝子も、サザンおよび／またはＰＣＲ分析により同定でき、ｉｏｎ−ｘ障害の動物モデルに有用である。ヒトｉｏｎ−ｘ  ＤＮＡ配列の知見は、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の採用により、ｉｏｎ−ｘ発現を制御する調節配列、たとえばプロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサーなどをコードするゲノムＤＮＡ配列の同定も可能にする。本発明のポリヌクレオチドは、細胞のｉｏｎ−ｘ発現能を検出するハイブリダイゼーションアッセイにも有用である。本発明のポリヌクレオチドは、１以上の疾病状態の原因であるｉｏｎ−ｘ遺伝子座の遺伝子変化を同定するのに有用な診断方法の基礎も提供できる。この情報は診断および療法戦略選定の両方に有用である。
【００８３】
本発明によれば、本明細書に開示するｉｏｎ−ｘヌクレオチド配列を用いて他の動物におけるｉｏｎ−ｘ相同体を同定できる。動物にはヒトおよび他の哺乳動物ならびに無脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に開示するいずれかのヌクレオチド配列またはその一部をたとえばプローブとして用いて、当業者に周知のスクリーニング法によりデータベースまたは核酸ライブラリー、たとえばゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、相同体を同定できる。したがって、ｉｏｎ−ｘ配列と少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも１００％の相同性をもつ相同体を同定できる。
【００８４】
本明細書に開示するｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、当業者はイオンチャンネルポリヌクレオチドの多数の可能なフラグメントを容易に得ることができる。本明細書に示すポリヌクレオチド配列は、たとえば（限定ではない）天然チャンネル、構成性活性チャンネル、または優性ネガティブチャンネルをコードすることができる。
【００８５】
本発明の好ましい態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３ならびにそのフラグメントよりなる群から選択される配列に相同な配列を含む、単離された核酸分子を提供する。他の好ましい態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３ならびにそのフラグメントよりなる群から選択される配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００８６】
本発明において用いるｉｏｎ−ｘコードポリヌクレオチドのフラグメントは、ｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語”少なくとも”は、そこに挙げられた数値およびその特定範囲に含まれる整数値を含む。好ましくは、本発明のフラグメントポリヌクレオチドはｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチド配列にユニークな配列を含み、したがってｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）に高度ストリンジェントまたは中等度ストリンジェント条件下でのみ（すなわち”特異的に”）ハイブリダイズする。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチドフラグメントは、コード領域にユニークな配列を含むだけでなく、全長配列のイントロン、調節領域および／または他の非翻訳配列に由来するフラグメントも含む。本発明のポリヌクレオチドにユニークな配列は、他の既知ポリヌクレオチドとの配列比較により識別でき、当技術分野でルーティンに採用されるアラインメントプログラム、たとえば公開配列データベースで得られるものを用いて同定できる。そのような配列は、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡフラグメント数を調べるサザンハイブリダイゼーション分析からも識別できる。本発明のポリヌクレオチドは、それらの検出を可能にするように標識することができ、これには放射性標識、蛍光標識および酵素標識が含まれる。
【００８７】
フラグメントポリヌクレオチドは、全長ｉｏｎ−ｘポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを検出するためのプローブとして特に有用である。ｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに用いるための、またはｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチド配列における変異を検出するのに用いるための１以上のポリヌクレオチドを、キットに収容することができる。
【００８８】
本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドをコードするＤＮＡであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列に示したポリヌクレオチドの非コード鎖または相補体に、中等度ストリンジェントまたは高度ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡをも含む。
【００８９】
高度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は下記のものである：５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃で３０分の洗浄２回。温度および緩衝液または塩濃度の変更により同等なストリンジェンシー条件を達成できることは、当技術分野で理解されている；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４），ｐｐ．６．０．３−６．４．１０に記載。ハイブリダイゼーション条件の変更は経験的に判定するか、あるいはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合％に基づいて厳密に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９），ｐｐ．９．４７−９．５１の記載に従って計算できる。
【００９０】
本発明に開示するヌクレオチド配列情報の知見により、当業者は多様な手段で多様な供給源（すなわち種々の組織または種々の生物）からｉｏｎ−ｘをコードするヌクレオチド配列を同定および入手できる；それらの手段は当業者に周知であり、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９）に記載されている；その全体を本明細書に援用する。
【００９１】
ｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡは、たとえば本明細書に示すｉｏｎ−ｘ遺伝子配列情報から作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いてｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをスクリーニングすることにより得ることができる。当業者に既知であって一般的なハイブリダイゼーションアッセイに用いられている方法、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋらが記載したものに従って、プローブを検出可能な基、たとえば蛍光性基、放射性原子または化学発光性基で標識できる。
【００９２】
あるいは、前記のいずれかのｉｏｎ−ｘヌクレオチド配列を含む核酸分子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により合成でき、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは本明細書に示すヌクレオチド配列から作製される。ＵＳＰ４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓら）および４，６８３，２０２（Ｍｕｌｌｉｓら）参照。ＰＣＲ反応は、特定の核酸配列が予め精製されていなくても、またその試料中に１コピーしか存在しなくても、その配列の濃度を選択的に高める方法を提供する。この方法を用いて一本鎖または二本鎖ＤＮＡを増幅できる。この方法の本質は、目的核酸分子の鋳型依存性ポリメラーゼ仲介複製のためのプライマーとして作用する２種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いることである。
【００９３】
他の多様なクローニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法が当業者に周知である。これらの方法の例は、たとえばＢｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，分子クローニング法の指針，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）にみられる；その全体を本明細書に援用する。
【００９４】
ｉｏｎ−ｘのヌクレオチド配列の入手または確認のために、自動化された配列決定法を使用できる。本発明のｉｏｎ−ｘヌクレオチド配列は１００％正確であると考えられる。しかし当技術分野で知られているように、自動化法で得られるヌクレオチド配列は若干の誤りを含む可能性がある。自動化法で決定されたヌクレオチド配列は、その核酸分子の配列の実際のヌクレオチド配列と一般に少なくとも約９０％、より一般的には少なくとも約９５％ないし少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当技術分野で周知の手動による配列決定法を用いると、より正確に決定できる。１個以上のヌクレオチドの挿入または欠失を生じるような配列における誤りは、翻訳におけるフレームシフトを生じる可能性があり、したがって推定アミノ酸配列は、変異点から出発して核酸分子の実際のヌクレオチド配列から推定するものと異なるであろう。
【００９５】
本発明の核酸分子およびそれに由来するフラグメントは、特定の障害に関連する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）のスクリーニング、および遺伝子地図作製に有用である。
本発明により提供されるポリヌクレオチド配列情報は、それがコードするポリペプチドを当技術分野で周知のルーティンに実施されている方法で大規模発現させるのを可能にする。
【００９６】
ベクター
本発明の他の態様は、前記のいずれかの核酸分子を含むベクターまたは組換え発現ベクターに関する。本発明においては、ｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの増幅のために、および／またはｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡの発現のためにベクターを用いる。好ましいベクターにはプラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルス、および組込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち相同的組換えにより宿主ゲノムに組み込むことができるフラグメント）が含まれるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子にはアデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好ましい発現ベクターにはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれるが、これらに限定されない。他の発現ベクターにはｐＳＰＯＲＴ（商標）ベクター、ｐＧＥＭ（商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（商標）（ＬＴＩ、メリーランド州ベテスダ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥ（商標）ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＹＥＳ２（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
発現構築体は、好ましくは内因性または外因性の発現制御ＤＮＡ配列および転写ターミネーターに作動可能な状態で結合したｉｏｎ−ｘコードポリヌクレオチドを含む。発現制御ＤＮＡ配列はプロモーター、エンハンサー、オペレーター、および調節要素結合部位を一般的に含み、そして典型的にはその発現構築体が利用する発現系に基づいて選択される。好ましいプロモーターおよびエンハンサー配列は一般に遺伝子発現を増大させる能力で選択され、一方、オペレーター配列は一般に遺伝子発現を調節する能力で選択される。本発明の発現構築体は、その構築体を保有する宿主細胞を同定できる１以上の選択マーカーをコードする配列を含むこともできる。発現構築体は、宿主細胞における相同的組換えを容易にし、好ましくは促進する配列を含むこともできる。本発明の好ましい構築体は、宿主細胞における複製に必要な配列をも含む。
【００９８】
発現構築体は、好ましくはコードされるタンパク質の産生に利用されるが、単にｉｏｎ−ｘコードポリヌクレオチド配列を増幅するのにも利用できる。好ましい態様においてベクターは、発現制御配列を含むポリヌクレオチドに本発明のポリヌクレオチドが作動可能な状態で結合した発現ベクターである。本発明のポリヌクレオチドを組み込んだ自律複製型の組換え発現構築体、たとえばプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターも提供される。好ましい発現ベクターは、適切な宿主におけるｉｏｎ−ｘ発現に影響を及ぼしうる適切な制御配列にｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡ配列が作動可能な状態で連携または結合した、複製可能なＤＮＡ構築体である。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能可能な関係にある場合、作動可能な状態で連携または結合している。たとえばプロモーターは、それがコード配列の転写を制御する場合、その配列に作動可能な状態で連携または結合している。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要とせず、宿主において複製する能力（通常は複製起点により与えられる）および形質転換体の識別を容易にする選択遺伝子のみを必要とする。発現ベクターにおける制御配列の必要性は、選択された宿主および選ばれた形質転換方法に応じて異なるであろう。一般に制御配列には、転写プロモーター、転写を制御するための所望による（optional）オペレーター配列、ｍＲＮＡの適切なリボソーム結合をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。
【００９９】
好ましいベクターは、好ましくは宿主生物が認識するプロモーターを含む。本発明のプロモーター配列は、原核細胞、真核細胞またはウイルス性のものであってよい。適切な原核細胞配列には下記のものが含まれる：バクテリオファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター（ＴＨＥ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＰＨＡＧＥ  ＬＡＭＢＤＡ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９７３）；その全体を本明細書に援用する；ＬＡＭＢＤＡ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８０）；その全体を本明細書に援用する）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、およびｌａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９０，３０４−３１０；その全体を本明細書に援用する）。他のプロモーターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス極初期プロモーター、エプスタイン・バー  ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ヒトメタロチオネイン。
【０１００】
好ましいベクターは追加の調節配列も含むことができる。適切な調節配列の好ましい例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子およびバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン・ダルガーノにより示される。シャイン・ダルガーノ配列のすぐ後にｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡがあってもよく、これにより成熟ｉｏｎ−ｘタンパク質が生成する。
【０１０１】
さらに、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする適切なマーカーを含むことができる。選択した宿主の形質転換は、当業者に周知であってＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）が記載した種々の方法のいずれかを用いて実施される。
【０１０２】
複製起点も、外因性起点を含むようにベクターを構築することにより得られ、あるいは宿主細胞の染色体複製機序により得られる。ベクターを宿主細胞染色体に組み込む場合、後者で十分であろう。あるいは、ウイルスの複製起点を含むベクターを用いずに、当業者は選択マーカーとｉｏｎ−ｘ  ＤＮＡの同時形質転換方法により哺乳動物細胞を形質転換することができる。適切なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（ＵＳＰ４，３９９，２１６参照）。
【０１０３】
ｉｏｎ−ｘをコードするヌクレオチド配列を、常法によりベクターＤＮＡで組み換えることができる。これには、ライゲーションのための平滑末端または付着末端形成、適切な末端を得るための制限酵素消化、突出末端の適宜なフィリングイン、不都合な接合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによるライゲーションが含まれる。そのような操作のための方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に示されており、当技術分野で周知である。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、たとえばＯｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３，３，２８０；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６，２３，９３５；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２，７６８；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、およびＷＯ９１／１８９８２に示されている；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【０１０４】
宿主細胞
本発明の他の態様によれば、コードされるｉｏｎ−ｘポリペプチドの発現が可能な様式で本発明のポリヌクレオチド（または本発明のベクター）を含む宿主細胞（原核細胞および真核細胞を含む）が提供される。本発明のポリヌクレオチドを、環状プラスミドの一部として、または単離されたタンパク質コード領域を含む線状ＤＮＡもしくはウイルスベクターとして、宿主細胞に導入することができる。ＤＮＡを宿主細胞に導入するために当技術分野でルーティンに実施されている周知の方法には、リポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラストなどのキャリヤーと合わせた形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核内注入、または融合が含まれる。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、脊椎動物および哺乳動物の細胞系が含まれる。
【０１０５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで形質転換またはトランスフェクションした（安定または一過性）宿主細胞を提供する。前記のように、そのような宿主細胞は前記ポリヌクレオチドの増幅、およびそのポリヌクレオチドがコードするｉｏｎ−ｘポリペプチドまたはそのフラグメントの発現に有用である。
【０１０６】
さらに他の関連態様において本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチド（またはそのフラグメント）を製造する方法であって、本発明の宿主細胞を栄養培地で増殖させ、そして細胞または培地からポリペプチドまたはそのバリアントを単離する工程を含む方法を提供する。ｉｏｎ−ｘは膜貫通チャンネルであるので、特定の活性のアッセイなどある種の用途については、好ましい単離は埋め込まれた状態のポリペプチドを含む細胞膜の単離を伴う場合があることは理解されるであろう。一方、他の用途についてはより完全な単離が好ましいであろう。
【０１０７】
本発明のある態様によれば、前記のいずれかの核酸分子を含む発現ベクターをもつ形質転換された宿主細胞が提供される。ヌクレオチド配列の発現は、ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に起きる。本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞には原核細胞、酵母および真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。原核細胞発現ベクターを用いる場合、適切な宿主細胞はそのクローン化配列を発現しうるいずれかの原核細胞である。適切な原核細胞には、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
真核細胞発現ベクターを用いる場合、適切な宿主細胞はそのクローン化配列を発現しうるいずれかの真核細胞である。好ましくは、真核細胞は高等真核生物の細胞である。適切な真核細胞にはヒト以外の哺乳動物の組織培養細胞およびヒトの組織培養細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましい宿主細胞には昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養におけるそのような細胞の増殖はルーティンな方法になっている（ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）参照；その全体を本明細書に援用する）。
【０１０９】
さらに、酵母宿主を宿主細胞として使用できる。好ましい酵母細胞にはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）およびクルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属が含まれるが、これらに限定されない。好ましい酵母宿主はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。好ましい酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含むことができる。これには酵母と大腸菌の両方における複製のためのシャトルベクターも含まれる。
【０１１０】
あるいは、昆虫細胞を宿主細胞として使用できる。ある好ましい態様においては、バキュロウイルス発現系を用いて本発明のポリペプチドを発現させる（参照：Ｌｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７；ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク，１９９２；およびＵＳＰ４，８７９，２３６；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する）。さらに、たとえばＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を昆虫細胞における産生のために使用できる。
【０１１１】
本発明の宿主細胞は、ｉｏｎ−ｘと特異的に免疫反応する抗体の発現に有用な免疫源である。本発明の宿主細胞は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドの大規模製造方法にも有用であり、その際、細胞を適切な培養培地で増殖させ、目的ポリペプチド生成物を細胞から、または細胞を増殖させた培地から、当技術分野で既知の精製法、たとえば下記を含めた一般的なクロマトグラフィー法により単離する：免疫アフィニティークロマトグラフィー、受容体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除濾過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなど。さらに他の精製法には、特異的結合パートナーもしくは試薬が認識する特異的なタグ、標識、またはキレート形成部分をもつ融合タンパク質として目的タンパク質を発現させ、そして精製する方法が含まれる。精製されたタンパク質を開裂させて目的タンパク質を得るか、あるいは融合タンパク質のままにしておくことができる。融合タンパク質の開裂により、開裂処理の結果として付加アミノ酸残基をもつ形の目的タンパク質が得られる場合がある。
【０１１２】
ｉｏｎ−ｘ  ＤＮＡ配列の知見から、内因性ｉｏｎ−ｘの発現を可能にし、または増大するように、細胞を修飾できる。細胞がｉｏｎ−ｘをより高いレベルで発現するように天然ｉｏｎ−ｘプロモーター全体または一部をヘテロロガスプロモーター全体または一部と交換することにより細胞を修飾して（たとえば相同的組換えにより）、発現を増大させることができる。ヘテロロガスプロモーターを、内因性ｉｏｎ−ｘコード配列と作動可能な状態で結合するように挿入する（たとえばＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９２／２０８０８、およびＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９１／０９９５５参照）。ヘテロロガスプロモーターＤＮＡのほかに、増幅可能なマーカーＤＮＡ（たとえばａｄａ、ｄｈｆｒ、ならびにカルバモイルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコードする多機能ＣＡＤ遺伝子）および／またはイントロンＤＮＡをヘテロロガスプロモーターＤＮＡと一緒に挿入することも考慮される。ｉｏｎ−ｘコード配列に結合させると、標準的選択法によりマーカーＤＮＡが増幅され、ｉｏｎ−ｘコード配列が細胞において同時増幅される。
【０１１３】
ノックアウト
本発明により提供されるＤＮＡ配列情報は、機能性ｉｏｎ−ｘを発現できないかまたはｉｏｎ−ｘのバリアントを発現する動物の開発（たとえば相同的組換えまたは”ノックアウト”法による；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−１２９２（１９８９）参照；これを本明細書に援用する）も可能にする。そのような動物（特に小型の実験動物、たとえばラット、ウサギおよびマウス）は、ｉｏｎ−ｘおよびｉｏｎ−ｘモジュレーターのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を研究するためのモデルとして有用である。
【０１１４】
アンチセンス
同様に本発明により得られるのは、ｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチドを認識してそれにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。全長およびフラグメントアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のフラグメントアンチセンス分子には、（ｉ）ｉｏｎ−ｘ  ＲＮＡを特異的に認識してそれにハイブリダイズするもの（ｉｏｎ−ｘをコードするＤＮＡと他の既知分子をコードするＤＮＡとの配列比較により判定）が含まれる。ｉｏｎ−ｘをコードするポリヌクレオチドにユニークな配列の同定は、公開された配列データベースを用いて、および／または市販の配列比較プログラムを用いて実施できる。目的配列を同定した後、当技術分野で周知の制限消化または既知のポリメラーゼ連鎖反応法を用いた増幅により単離を行うことができる。アンチセンスポリヌクレオチドは特に、ｉｏｎ−ｘ  ｍＲＮＡを発現する細胞によるｉｏｎ−ｘ発現の調節に関係する。
【０１１５】
ｉｏｎ−ｘ発現制御配列またはｉｏｎ−ｘ  ＲＮＡに特異的に結合しうるアンチセンス核酸（好ましくは１０〜３０塩基対のオリゴヌクレオチド）を細胞に導入する（たとえばウイルスベクター、またはコロイド分散系、たとえばリポソームによる）。アンチセンス核酸は細胞中のｉｏｎ−ｘターゲットヌクレオチド配列に結合して、ターゲット配列の転写および／または翻訳を妨げる。ホスホロチオエートおよびメチルホスホナートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明による療法用途のために特に考慮される。ロックされた核酸も本発明による療法用途のために特に考慮される（たとえばＷａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１０），５６３３−５６３８（２０００）参照；その全体を本明細書に援用する）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらの５’末端へのポリ−Ｌ−リシン、トランスフェリンポリリシン、またはコレステロール部分の付加によりさらに修飾することができる。転写または翻訳レベルでのｉｏｎ−ｘ発現の抑制は、異常なｉｏｎ−ｘ発現を特色とする疾患／症状の細胞モデルまたは動物モデルの作製に有用である。
【０１１６】
本発明のｉｏｎ−ｘをコードするヌクレオチド配列に由来するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれに相補的もしくは相同な配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはフラグメントは、種々の組織における遺伝子発現を検査する診断ツールとして有用である。たとえば、検出可能な基をもつオリゴヌクレオチドプローブを用いて一般的なオートラジオグラフィー法により組織をｉｎ  ｓｉｔｕ検査して、この酵素の自然発現またはそれに関連する病的状態を調べることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列またはそれに対応するｍＲＮＡの調節領域に対するものである。これには開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
転写因子
本発明において教示されるｉｏｎ−ｘ配列は、天然の細胞または動物、およびｉｏｎ−ｘポリヌクレオチドにより形質転換またはトランスフェクションした細胞における、ｉｏｎ−ｘ発現を調節するための新規な転写因子の設計を容易にする。たとえば、それらのジンクフィンガードメインによりＤＮＡを結合するＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質は、異なるターゲット配列を認識するような構造変化を受けやすいことが示されている。これらの人工的ジンクフィンガータンパク質は特異的ターゲット部位を高い親和性および低い解離定数で認識するので、遺伝子発現を調節する遺伝子スイッチとして作用できる。本発明の特定のｉｏｎ−ｘターゲット配列の知見から、構造に基づくモデリングとファージディスプレイライブラリーのスクリーニングとの組合わせなど既知方法を用いた、ターゲット配列特異的なジンクフィンガータンパク質の工学的作製が容易になる（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：２７５８−２７６３（１９９９）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：５５２５−５５３０（１９９７）；Ｇｒｅｉｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７−６６１（１９９７）；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：５２５−５３２（１９９７））。各ジンクフィンガードメインは通常は３またはそれより多くの塩基対を認識する。いずれの既知ゲノムにおいてもユニークなものであるためには一般に１８塩基対の認識配列で十分な長さであるので、当該配列について６タンデム・リピートのジンクフィンガーよりなるジンクフィンガータンパク質が確実に特異的であると予想される（Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．）。ｉｏｎ−ｘ配列に基づいて設計した人工的ジンクフィンガーリピートを活性化ドメインまたは抑制ドメインに融合させて、ｉｏｎ−ｘ発現を促進または抑制する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．）。あるいは、ジンクフィンガーペプチドとＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）の間に多様な長さのリンカー領域をおいてジンクフィンガードメインをＴＢＰに融合させ、転写アクチベーターまたはリプレッサーを作製することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：３６１６−３６２０（１９９７））。このようなタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、天然細胞、動物およびヒト；ならびに／あるいはｉｏｎ−ｘコード配列でトランスフェクションした細胞のいずれにおいても、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｉｏｎ−ｘ発現を調節するのに有用である。新規な転写因子を発現する構築体のトランスフェクションにより（遺伝子療法）、またはそのタンパク質の導入により、新規な転写因子をターゲット細胞へ送達できる。アンチセンスまたは触媒ＲＮＡ法に対する代替として療法に使用するために、ＲＮＡ配列を結合するように工学的に作製したジンクフィンガータンパク質を設計することもできる（ＭｃＣｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：９５２１−９５２６（１９９７）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３４４−��４８（１９９５））。本発明は、本発明の遺伝子配列に基づいたそのような転写因子、およびカスタマイズドジンクフィンガータンパク質を、設計する方法を含む；これらは、これらの配列を遺伝子相補体中に含む細胞（天然または形質転換したもの）におけるｉｏｎ−ｘ発現の調節に有用である。
【０１１８】
ポリペプチド
本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる精製および単離された哺乳動物ｉｏｎ−ｘポリペプチドをも提供する。現在好ましいある態様には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列に示すアミノ酸配列を含むヒトｉｏｎ−ｘポリペプチド、またはポリペプチド特異的エピトープを含むそのフラグメントが含まれる。”に特異的なエピトープ”もしくは”ポリペプチド特異的エピトープ”またはその変形は、のちに詳述するようにｉｏｎ−ｘまたはアミノ酸配列に特異的な抗体により認識可能な、ｉｏｎ−ｘペプチド受容体またはアミノ酸配列の一部を意味する。
【０１１９】
提示する配列は特定のヒト配列であるが、本発明の範囲には、他のヒト対立遺伝子バリアント；ヒト以外の哺乳動物形のｉｏｎ−ｘ、および他の脊椎動物形のｉｏｎ−ｘが含まれるものとする。
【０１２０】
ｉｏｎ−ｘなどの受容体に結合する抗体その他の結合化合物の産生およびスクリーニングのために細胞外エピトープが特に有用であることは理解されるであろう。したがって他の好ましい態様において本発明は、ｉｏｎ−ｘの少なくとも１つの細胞外ドメインを含む、精製および単離されたポリペプチドを提供する。ｉｏｎ−ｘの細胞外ドメインを含む、精製および単離されたポリペプチドはきわめて好ましい。ｉｏｎ−ｘの細胞外ドメイン、ｉｏｎ−ｘの膜貫通ドメイン、ｉｏｎ−ｘの細胞質領域、およびその融合体よりなる群から選択されるｉｏｎ−ｘフラグメントを含む、精製および単離されたポリペプチドも好ましい。そのようなフラグメントは天然受容体の連続部分であってもよい。しかし、本明細書に提示するｉｏｎ−ｘ遺伝子およびタンパク質配列の知見から、天然タンパク質において連続していない種々のドメインの組換えが可能となることも理解されるであろう。
【０１２１】
”ｔｍｔｒｅｓｔ．ａｌｌ”と呼ばれるＦＲＯＴＲＡＮコンピュータープログラム［Ｐａｒｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：５２７−５３５（１９９４）］を用いて、ｉｏｎ−ｘは膜貫通ドメインを含むことが示された。
【０１２２】
本発明は、本発明の好ましいポリペプチドに対して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性および／または相同性をもつポリペプチドをも含む。本明細書において、本発明の好ましいポリペプチドに関するアミノ酸配列”同一性”％は、両配列をアラインし、最大の配列同一性％を達成するために必要ならばギャップを導入した後、ｉｏｎ−ｘ配列中の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される；保存置換は配列同一性の一部として考慮されない。本明細書において、本発明の好ましいポリペプチドに関する配列”相同性”％は、配列をアラインし、最大の配列同一性％を達成するために必要ならばギャップを導入した後、ｉｏｎ−ｘ配列中の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される；保存置換も配列同一性の一部として考慮される。
【０１２３】
１態様において相同性％は、アラインメントを最大にするために長さ１００アミノ酸に４つのギャップを導入した場合、２配列のうち短い方において、比較される配列中の同一アミノ酸残基とアラインするアミノ酸残基の％として計算される［Ｄａｙｈｏｆｆ，ＡＴＬＡＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ，Ｖｏｌ．５，ｐ．１２４，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ワシントンＤ．Ｃ．（１９７２）；本明細書に援用する］。
【０１２４】
本発明のポリペプチドは、天然細胞源から単離するか、あるいは化学合成することができるが、好ましくは本発明の宿主細胞を用いる組換え法により製造される。哺乳動物細胞の使用は、本発明の組換え発現生成物に最適な生物活性を付与するのに必要な翻訳後修飾（たとえばグリコシル化、トランケーション、脂質化およびリン酸化）を提供すると期待される。グリコシル化および非グリコシル化形のｉｏｎ−ｘポリペプチドが本発明に含まれる。
【０１２５】
本発明は、バリアント（または類似体）ｉｏｎ−ｘポリペプチドをも含む。一例においては、１個以上のアミノ酸残基がｉｏｎ−ｘ配列に補充された挿入バリアントが提供される。挿入はタンパク質の一方または両方の末端に位置してもよく、あるいはｉｏｎ−ｘアミノ酸配列の内部領域に配置されてもよい。一方または両方の末端に付加残基をもつ挿入バリアントには、たとえば融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質を含めることができる。
【０１２６】
挿入バリアントには、ｉｏｎ−ｘ配列またはその生物活性フラグメントに１個以上のアミノ酸残基が付加されたｉｏｎ−ｘポリペプチドが含まれる。
本発明のバリアント生成物には、成熟ｉｏｎ−ｘ生成物、すなわちリーダー配列またはシグナル配列が除去されたｉｏｎ−ｘ生成物であって、付加アミノ末端残基をもつものも含まれる。付加アミノ末端残基は他のタンパク質に由来するものであってもよく、あるいは特定のタンパク質に由来するものと同定できない１個以上の残基を含有してもよい。位置−１に付加メチオニン残基をもつｉｏｎ−ｘ生成物（Ｍｅｔ−１−ｉｏｎ−ｘ）、および位置−２および−１に付加メチオニンおよびリシン残基をもつｉｏｎ−ｘバリアント（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−ｉｏｎ−ｘ）が考慮される。付加Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（または一般に１個以上の塩基性残基）をもつｉｏｎ−ｘバリアントは、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生の増大に特に有用である。
【０１２７】
本発明は、特定の発現系の使用により得られる付加アミノ酸残基をもつｉｏｎ−ｘバリアントをも含む。たとえば、目的ポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として発現する市販ベクターを使用すると、目的ポリペプチドからＧＳＴ成分を開裂させた後、位置−１に付加グリシン残基をもつ目的ポリペプチドが得られる。他のベクター系における発現により生じるバリアントも考慮される。
【０１２８】
挿入バリアントには、ｉｏｎ−ｘのアミノ末端および／またはカルボキシ末端が他のポリペプチドに融合した融合タンパク質も含まれる。
他の態様において本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチド中の１個以上のアミノ酸残基が除去された欠失バリアントを提供する。欠失はｉｏｎ−ｘポリペプチドの一方または両方の末端で行われてもよく、あるいはｉｏｎ−ｘの末端以外の１個以上のアミノ酸残基が除去されてもよい。したがって、欠失バリアントにはすべてのｉｏｎ−ｘポリペプチドフラグメントが含まれる。
【０１２９】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列のポリペプチドフラグメントであって、ｉｏｎ−ｘポリペプチドの生物学的特性（たとえばリガンド結合性および／またはイオン転送性）および／または免疫学的特性を保持したフラグメントをも含む。
【０１３０】
本発明のある好ましい態様において、単離された核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含み、その核酸分子はｉｏｎ−ｘの少なくとも一部をコードする。より好ましいある態様において、単離された核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列ならびにそのフラグメントを含む。
【０１３１】
本発明において用いるポリペプチドフラグメントは、ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０個の連続アミノ酸を含む。好ましいポリペプチドフラグメントは、ヒトｉｏｎ−ｘならびにその対立遺伝子相同体および種相同体にユニークまたは特異的な抗原特性を示す。目的とする生物学的特性および免疫学的特性をもつ本発明のフラグメントは、当技術分野で周知のルーティンに実施されているいずれかの方法で作製できる。
【０１３２】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１３３】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＮＭＤＡグルタミン酸受容体に関連する配列を含む。
【０１３４】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＮＭＤＡグルタミン酸受容体に関連する配列を含む。
【０１３５】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＮＭＤＡグルタミン酸受容体に関連する配列を含む。
【０１３６】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、ρ−２サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１３７】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体に関連する配列を含む。
【０１３８】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１３９】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体に関連する配列を含む。
【０１４０】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体に関連する配列を含む。
【０１４１】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、α−１サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１４２】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグルタミン酸受容体、イオンチャンネル共役型カイニン酸４前駆体に関連する配列を含む。
【０１４３】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−１ａ鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４４】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−３鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４５】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−４鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４６】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−７鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４７】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４８】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１４９】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５０】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５１】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α−９鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５２】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５３】
本発明の１他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５４】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５５】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、α鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５６】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５７】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５８】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、γ鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１５９】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−３鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１６０】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−４鎖前駆体（非α−２）に関連する配列を含む。
【０１６１】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−４鎖前駆体（非α−２）に関連する配列を含む。
【０１６２】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−４鎖前駆体（非α−２）に関連する配列を含む。
【０１６３】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−４鎖前駆体（非α−２）に関連する配列を含む。
【０１６４】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、β−４鎖前駆体（非α−２）に関連する配列を含む。
【０１６５】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はアセチルコリン受容体、非α鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１６６】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、ｐｉサブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１６７】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、β−１サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１６８】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、β−３サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１６９】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、γ−１サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１７０】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、δサブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１７１】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、ρ−２サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１７２】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧＡＢＡ受容体、ρ−２サブユニット前駆体に関連する配列を含む。
【０１７３】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグルタミン酸受容体、イオンチャンネル共役型カイニン酸５前駆体（グルタミン酸受容体ｋａ−２）に関連する配列を含む。
【０１７４】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグルタミン酸受容体、イオンチャンネル共役型カイニン酸５前駆体（グルタミン酸受容体ｋａ−２）に関連する配列を含む。
【０１７５】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグルタミン酸受容体前駆体（カイニン酸結合タンパク質）に関連する配列を含む。
【０１７６】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグルタミン酸受容体前駆体に関連する配列を含む。
【０１７７】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧタンパク質経路サプレッサー２（ｇｐｓ２）タンパク質に関連する配列を含む。
【０１７８】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はＧタンパク質経路サプレッサー２（ｇｐｓ２）タンパク質に関連する配列を含む。
【０１７９】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグリシン受容体、α−１鎖前駆体（ストリキニーネ結合サブユニット）に関連する配列を含む。
【０１８０】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグリシン受容体、α−２鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１８１】
本発明の１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグリシン受容体、α−２鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１８２】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はグリシン受容体、β鎖前駆体に関連する配列を含む。
【０１８３】
本発明の他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１８４】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１８５】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１８６】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１８７】
本発明のさらに他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１を含む。あるいは、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１のフラグメントを含む。好ましくは本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１のフラグメントであって、少なくとも１４、好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５個の連続ヌクレオチドを含むものを提供する。このフラグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１のいかなる部分に位置してもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１の部分の１より多くを含んでもよく、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１の部分の反復を含んでもよい。ある好ましい態様において、核酸分子はセロトニン受容体に関連する配列を含む。
【０１８８】
さらに他の態様において本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドの置換バリアントを提供する。置換バリアントには、ｉｏｎ−ｘポリペプチドの１個以上のアミノ酸残基が除去されて他の残基と置き換えられたポリペプチドが含まれる。１態様において、置換は保存的性質のものである；しかし本発明は、保存的でない置換をも含む。この目的のための保存的置換は下記の表２、３または４に示すように定義できる。
【０１８９】
バリアントポリペプチドには、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により保存的置換が導入されたものが含まれる。アミノ酸は、物理的特性ならびにタンパク質の二次および三次構造への関与に従って分類できる。当技術分野において保存的置換は、あるアミノ酸が類似の特性をもつ他のアミノ酸により置換されたものと認識されている。保存的置換の例を下記の表２に示す（ＷＯ９７／０９４３３、１０頁から、１９９７年３月１３日公開（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７、９／６／９６出願））。
【０１９０】
【表２】
2005532029.tif 000006
【０１９１】
あるいは、保存的アミノ酸は表３に示すようにＬｅｈｎｉｎｇｅｒ［ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５），ｐｐ．７１−７７］の記載に従って分類できる。
【０１９２】
【表３】
2005532029.tif 000007
【０１９３】
さらに他の別法として、保存的置換の例を下記の表４に示す。
【０１９４】
【表４】
2005532029.tif 000008
【０１９５】
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾をもつポリペプチドを含むと理解すべきである。たとえば、修飾は共有結合性のものであってもよく、たとえばポリマー、脂質、他の有機部分および無機部分との化学結合を含む。そのような誘導体は、ポリペプチドの循環半減期を延長するために作製でき、あるいは目的とする細胞、組織または臓器に対するポリペプチドのターゲティング能を改善するために設計できる。同様に本発明はさらに、１以上の水溶性ポリマー付加物、たとえばポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むように共有結合により修飾されたｉｏｎ−ｘポリペプチドをも含む。天然ｉｏｎ−ｘがもつリガンド結合特性を示しかつより高レベルで発現するすバリアント、および構成性活性受容体を提供するバリアントは、本発明のアッセイ法に特に有用である；これらのバリアントは、疾患／症状の異常なｉｏｎ−ｘ活性を特色とする細胞、組織および動物モデルの作製にも有用である。
【０１９６】
関連態様において、本発明は精製された本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドのほかに、医薬ビヒクル、賦形剤または媒質として用いられる医薬的に許容できる（すなわち無菌かつ無毒性）液体、半固体または固体希釈剤を含む。当技術分野で既知のいかなる希釈剤も使用できる。希釈剤の例には水、塩類溶液、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピル、タルク、アルギナート、デンプン、乳糖、ショ糖、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱油ならびにカカオ脂が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９７】
天然ｉｏｎ−ｘがもつリガンド結合特性を示しかつより高レベルで発現するすバリアント、および構成性活性受容体を提供するバリアントは、本発明のアッセイ法に特に有用である；これらのバリアントは、異常なｉｏｎ−ｘ活性を特色とする疾患／症状の細胞、組織および動物モデルの作製にも有用である。
【０１９８】
抗体
本発明には、ｉｏｎ−ｘまたはそのフラグメントに特異的な抗体（たとえばモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）−グラフト抗体；本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物が含まれる）も含まれる。本発明の好ましい抗体は、ＷＯ９３／１１２３６（１９９３年６月２０日公開；その全体を本明細書に援用する）に記載の方法に従って調製され、同定されるヒト抗体である。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含めた抗体フラグメントも本発明により提供される。本発明の抗体について述べる際に”に特異的”という用語は、本発明の抗体の可変部がｉｏｎ−ｘポリペプチドのみを認識して結合する（すなわち、ｉｏｎ−ｘと他の既知イオンチャンネルポリペプチドの間に局部的な配列同一性、相同性または類似性があったとしても、測定可能な結合親和性の差により、ｉｏｎ−ｘポリペプチドをその既知イオンチャンネルポリペプチドと識別できる）ことを示す。特異的抗体が、それらの抗体の可変部以外の配列、特にその分子の定常部、を介した相互作用により他のタンパク質（たとえば緑膿菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、またはＥＬＩＳＡ法における他の抗体）と相互作用してもよいことも理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を測定するスクリーニングアッセイ法は当技術分野で周知であり、ルーティンに実施されている。そのようなアッセイ法の包括的考察については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８８），６章参照。本発明のｉｏｎ−ｘポリペプチドのフラグメントを認識して結合する抗体も、この抗体がｉｏｎ−ｘポリペプチドに特異的であれば考慮される。本発明の抗体は、当技術分野で周知のルーティンに実施されているいかなる方法によっても調製できる。
【０１９９】
本発明は、本発明のｉｏｎ−ｘに特異的な抗体を提供する。抗体特異性について以下にさらに詳細に記載する。ただし、文献にこれまでに記載されているポリペプチドから産生できる抗体であって偶然にｉｏｎ−ｘと交差反応しうる抗体（たとえば、両ポリペプチド中に偶然に類似エピトープが存在するため）は、”交差反応性抗体”であることを強調すべきである。そのような交差反応性抗体は、ｉｏｎ−ｘに”特異的な”抗体ではない。抗体がｉｏｎ−ｘに特異的であるか、または他の既知受容体と交差反応性であるかの判定は、当技術分野で周知の幾つかのアッセイ法のいずれか、たとえばウェスタン・ブロッティングアッセイ法を用いて行われる。ｉｏｎ−ｘを発現する細胞の同定、およびｉｏｎ−ｘ−リガンド結合活性の調節のためには、ｉｏｎ−ｘの細胞外エピトープに特異的に結合する抗体が好ましい。
【０２００】
ある好ましい別態様において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。そのような抗体を産生するハイブリドーマも本発明の態様として考慮される。さらに他の別態様において、本発明はヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体はｉｎ  ｖｉｖｏ療法適用に有用である。
【０２０１】
他の別態様において本発明は、少なくとも１種類の抗体がｉｏｎ−ｘに特異的な本発明の抗体であるポリクローナル抗体を含む無細胞組成物を提供する。動物から単離した抗血清が組成物の一例であり、抗血清の抗体画分を水または他の希釈剤、賦形剤もしくはキャリヤーに再懸濁したものを含む組成物もそうである。
【０２０２】
さらに他の関連態様において、本発明はｉｏｎ−ｘに特異的な抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。
抗体が比較的小さな抗原結合ドメインを含み、これらを化学的に、または組換え法により単離できることは周知である。そのようなドメインは有用なｉｏｎ−ｘ結合分子そのものであり、ヒト抗体に再導入するか、または毒素もしくは他のポリペプチドに融合させることもできる。したがって、さらに他の態様において本発明は、ｉｏｎ−ｘ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する；この場合、このフラグメントおよびポリペプチドがｉｏｎ−ｘに結合する。限定ではない一例として、本発明は、一本鎖抗体およびＣＤＲ−グラフト抗体であるポリペプチドを提供する。
【０２０３】
ヒト以外の抗体を当技術分野で既知のいずれかの方法でヒト化することができる。１方法においては、ヒト以外のＣＤＲをヒト抗体またはコンセンサス抗体の枠組み配列に挿入する。次いで抗体枠組みにさらに変更を導入して、親和性または免疫原性を調節することができる。
【０２０４】
本発明の抗体は、たとえば療法用（ｉｏｎ−ｘの活性を調節することによる）として、ｉｏｎ−ｘを検出または定量する診断用として、またｉｏｎ−ｘの精製に有用である。本明細書に記載するいずれかの目的に用いるための本発明の抗体を含むキットも含まれる。一般に本発明のキットは、それに対して抗体が免疫特異的である対照抗原も含む。
【０２０５】
組成物
ｉｏｎ−ｘ遺伝子生成物の正常な機能を失うようなｉｏｎ−ｘ遺伝子の変異がｉｏｎ−ｘ関連のヒト疾病状態態の原因である。本発明は、ｉｏｎ−ｘ活性を回復させてこれらの疾病状態を処置する遺伝子療法を含む。適切な細胞への機能性ｉｏｎ−ｘ遺伝子の送達は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、ベクター、より具体的にはウイルスベクター（たとえばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）を用いて、あるいはｅｘ  ｖｉｖｏで物理的ＤＮＡ伝達方法（たとえばリポソームまたは化学的処理）を用いて行われる。たとえばＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９２，Ｎｏ．６６７９への補稿，ｐｐ．２５−２０（１９９８）参照。遺伝子療法の概説についてはさらにＦｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４（１９９０）；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：４５５−４６０（１９９２）を参照されたい。あるいは他のヒト疾病状態においては、ｉｏｎ−ｘ発現の阻止またはｉｏｎ−ｘ活性の阻害が疾病状態の処置に有用であると考えられる。ｉｏｎ−ｘの発現を負に調節するためにはアンチセンス療法または遺伝子療法を適用できると考えられる。
【０２０６】
本発明の他の態様は、前記のいずれかの核酸分子または組換え発現ベクターおよび医薬的に許容できるキャリヤーまたは希釈剤を含む組成物（医薬組成物を含む）に関する。好ましくは、キャリヤーまたは希釈剤は医薬的に許容できるものである。適切なキャリヤーは、この分野の標準的参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に記載されている；その全体を本明細書に援用する。そのようなキャリヤーまたは希釈剤の例には水、塩類溶液、リンゲル液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、および非水性ビヒクル、たとえば固定油も使用できる。配合物を常法により殺菌する。
【０２０７】
本発明の範囲には、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体に、たとえば医薬的に許容できるキャリヤーを配合したものを含む組成物も含まれる。
本発明は、本発明の抗体の使用方法をも提供する。たとえば本発明は、ｉｏｎ−ｘのリガンド結合性を調節する方法であって、ｉｏｎ−ｘとそのｉｏｎ−ｘに特異的な抗体を、抗体がこの受容体を結合する条件下で接触させる工程を含む方法を提供する。
【０２０８】
脳に発現する可能性のあるイオンチャンネル、たとえばｉｏｎ−ｘは、異常なｉｏｎ−ｘシグナル伝達活性が１以上の神経障害または精神障害に相関することを示す。本発明は、神経障害または精神障害を処置する方法であって、その処置を必要とする哺乳動物に、その哺乳動物のニューロンにおいてｉｏｎ−ｘへのリガンド結合を調節するのに十分な量の本発明の抗体様ポリペプチドを投与する工程を含む方法をも提供する。ｉｏｎ−ｘは多数の組織においても発現する可能性がある。これには腎臓、結腸、小腸、胃、精巣、胎盤、副腎、末梢血白血球、骨髄、網膜、卵巣、胎児脳、胎児肝臓、心臓、脾臓、肝臓、肺、筋肉、甲状腺、子宮、前立腺、皮膚、唾液腺、および膵臓が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定のｉｏｎ−ｘが発現する組織を後記の実施例１２において同定する。
【０２０９】
キット
本発明はまた、医薬キットを含めたキットに関する。このキットは、前記のいずれかの核酸分子、前記のいずれかのポリペプチド、または前記の本発明ポリペプチドに結合するいずれかの抗体、および陰性対照を含むことができる。キットは、好ましくは他の要素、たとえば指示書、固体支持体、定量に有用な試薬などを含む。
【０２１０】
他の態様において本発明は、疾患または障害の診断ツールとして試料中のポリペプチドを検出するための下記の工程を含む方法である：（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列をもつポリペプチドの核酸ターゲット領域にハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズする核酸プローブと試料を接触させ、このプローブはこれらのポリペプチドをコードする核酸配列、そのフラグメント、ならびにこれらの配列およびフラグメントの相補体を含み；そして（ｂ）疾患の指標としてプローブ：ターゲット領域のハイブリッドの存在または量を検出する。
【０２１１】
本発明のある好ましい態様において、疾患は特に下記よりなる群から選択される：消化管障害；甲状腺障害（たとえば甲状腺中毒症、粘液水腫）；腎不全；炎症症状（たとえばクローン病）；細胞の分化および恒常性に関連する疾患；慢性関節リウマチ；自己免疫障害；運動障害；ＣＮＳ障害（たとえば疼痛：ニューロパシー性疼痛、片頭痛、および他の頭痛を含む；発作；精神障害および神経障害：不安、統合失調症、躁うつ病、不安、全般性不安障害、外傷後ストレス障害、うつ病、双極性障害、譫妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む；ジスキネジア、たとえばハンチントン病またはトゥレット症状群；注意欠陥障害：ＡＤＤおよびＡＤＨＤを含む；ならびに変性性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病；運動障害：運動失調症、核上麻痺などを含む）；感染症、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症；代謝および心血管疾患および障害（たとえば２型糖尿病、肥満症、食欲不振症、低血圧症、高血圧症、血栓症、心筋梗塞、心筋障害、アテローム性硬化症など）；増殖性疾患および癌（たとえば胸部癌、結腸癌、肺癌など種々の癌、および乾癬、前立腺肥大などの過増殖性障害）；ホルモン障害（たとえば雄性／雌性ホルモン置換、多嚢胞卵巣症候群、脱毛症など）；ならびに性的機能障害。
【０２１２】
組織が神経性であることを同定するために、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現またはタンパク質そのものを検出するように、キットを設計できる。たとえば、ｉｏｎ−ｘ特異的ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを入れた容器、ならびに所望により陽性対照および陰性対照を入れた各容器、ならびに／あるいは指示書を含む、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションキットを提供できる。同様に、ｉｏｎ−ｘ特異的配列のＤＮＡに特異的なプライマーを入れた容器、ならびに所望によりサイズマーカー、陽性対照および陰性対照を入れた各容器、ならびに／あるいは指示書を含む、ＰＣＲキットを提供できる。
【０２１３】
ハイブリダイゼーション条件は、他の核酸分子の存在下で前記遺伝子とだけハイブリダイゼーションが起きるものでなければならない。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下では、相補性の高い核酸配列のみがハイブリダイズする。好ましくは、そのような条件は２０個の連続ヌクレオチドにつき１つまたは２つの不適正塩基対をもつ核酸のハイブリダイゼーションを妨げる。そのような条件を前記に定義した。
【０２１４】
試料中の遺伝子の検出が診断となりうる疾患には、正常細胞と比較して核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が増幅した疾患が含まれる。”増幅”とは、ある細胞において正常細胞と比較してＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加することを意味する。
【０２１５】
試料中の核酸の検出により診断できる疾患には、好ましくは中枢神経系疾患および代謝疾患が含まれる。本発明の核酸検査法に適した被験試料には、たとえば細胞もしくは細胞の核酸抽出物、または生物学的流体が含まれる。前記方法に用いる試料は、アッセイ形式、検出方法、およびアッセイされる組織、細胞または抽出物の性質に応じて異なるであろう。細胞の核酸抽出物の調製方法は当技術分野で周知であり、採用する方法に適した試料を得るために容易に適合させることができる。
【０２１６】
あるいは、ｉｏｎ−ｘタンパク質に特異的な抗体を入れた容器、ならびに所望により陽性対照および陰性対照を入れた各容器、ならびに／あるいは指示書を含む、免疫アッセイキットを提供できる。
【０２１７】
ｉｏｎ−ｘ結合パートナー、たとえば天然のリガンド、神経伝達物質、またはモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト）の同定に有用なキットも提供できる。障害または疾患の処置に有用な物質は、問題の疾患または障害の処置に対応する活性についての１以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて陽性結果を示すことが好ましい。前記ポリペプチドの活性を調節する物質には、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、アゴニストおよびアンタゴニスト、ならびにプロテインキナーゼ阻害薬が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
免疫応答を誘発する方法
本発明の他の態様は、哺乳動物に免疫応答を誘発するのに十分な量の本発明ポリペプチドを投与することにより、その哺乳動物において本発明ポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法に関する。その量は、動物の種、動物の体格などに依存するが、当業者が決定できる。
【０２１９】
リガンドを同定する方法
本発明は、ｉｏｎ−ｘを結合する化合物を同定するためのアッセイ法をも提供する。そのようなアッセイ法の一つは、下記の工程を含む：（ａ）ｉｏｎ−ｘを含む組成物を、ｉｏｎ−ｘを結合すると思われる化合物と接触させ；そして（ｂ）その化合物とｉｏｎ−ｘの結合を判定する。１変法において、組成物は表面にｉｏｎ−ｘを発現する細胞を含む。他の変法では、単離されたｉｏｎ−ｘ、またはｉｏｎ−ｘを含む細胞膜を用いる。結合は、たとえば標識化合物を用いて直接判定でき、あるいはその化合物により誘発されたｉｏｎ−ｘのイオン転送の測定を含めた幾つかの方法により間接的に判定できる。ｉｏｎ−ｘを結合すると判定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２０】
単離または組換えｉｏｎ−ｘ生成物、ｉｏｎ−ｘバリアント、または好ましくはそのような生成物を発現する細胞を用いて、天然リガンドおよび合成化合物を含めた特異的結合分子を同定または開発できる。結合パートナーは、既知の免疫学的方法を用いて流体および組織試料中のｉｏｎ−ｘ生成物を精製し、そしてｉｏｎ−ｘ生成物を検出または定量するのに有用である。結合分子は、ｉｏｎ−ｘの生物活性、特にシグナル伝達に関与する活性の調節（たとえば遮断、阻害または刺激）にも有用なことは明らかである。
【０２２１】
本発明により提供されるＤＮＡおよびアミノ酸の配列情報は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドまたはポリヌクレオチドが相互作用する結合パートナー化合物の同定も可能にする。結合パートナー化合物の同定方法には、溶液アッセイ法、ｉｏｎ−ｘポリペプチドを固定化したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法、および細胞ベースのアッセイ法が含まれる。ｉｏｎ−ｘポリペプチドの結合パートナー化合物の同定により、ｉｏｎ−ｘの正常および異常な生物活性に関連する病的状態に治療介入または予防介入するための候補が得られる。
【０２２２】
本発明には、ｉｏｎ−ｘ結合パートナーを同定するための幾つかのアッセイ系が含まれる。溶液アッセイにおいて、本発明方法は（ａ）ｉｏｎ−ｘポリペプチドを１種類以上の結合パートナー候補化合物と接触させ、そして（ｂ）ｉｏｎ−ｘポリペプチドに結合する化合物を同定する工程を含む。ｉｏｎ−ｘポリペプチドを結合する化合物の同定は、ｉｏｎ−ｘポリペプチド／結合パートナー複合体を単離し、結合パートナー化合物をｉｏｎ−ｘポリペプチドから分離することにより達成できる。結合パートナー化合物の物理的、生物学的および／または生化学的特性を解明する追加工程も、本発明の他の態様に含まれる。１態様においては、ｉｏｎ−ｘポリペプチドまたは結合パートナー候補化合物のいずれかに対して免疫特異的な抗体を用いて、ｉｏｎ−ｘポリペプチド／結合パートナー複合体を単離する。
【０２２３】
さらに他の態様においては、ｉｏｎ−ｘポリペプチドまたは結合パートナー候補化合物のいずれかが、その単離を容易にする標識またはタグを含み、結合パートナー化合物を同定するための本発明方法は、この標識またはタグとの相互作用によりｉｏｎ−ｘポリペプチド／結合パートナー複合体を単離する工程を含む。このタイプのタグの一例は、一般に約６個のヒスチジン残基のポリ−ヒスチジン配列であり、こうして標識された化合物をニッケルキレーションにより単離できる。他の標識およびタグ、たとえば当技術分野で周知のルーティンに用いられるＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，ニューヨーク州ロチェスター）が本発明に含まれる。
【０２２４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法の１変法において、本発明は（ａ）固定化したｉｏｎ−ｘポリペプチドと結合パートナー候補化合物を接触させ、そして（ｂ）ｉｏｎ−ｘポリペプチドへの候補化合物の結合を検出する工程を含む方法を提供する。他の態様においては、結合パートナー候補化合物を固定化し、ｉｏｎ−ｘの結合を検出する。固定化は当技術分野で周知のいずれかの方法を用いて達成できる。これには下記の方法が含まれる：支持体、ビーズもしくはクロマトグラフィー樹脂への共有結合、および共有結合以外の高親和性相互作用、たとえば抗体結合、または固定化される化合物がビオチン部分を含むストレプトアビジン／ビオチン結合の使用。結合の検出は下記により達成できる：（ｉ）固定化しない化合物に放射性標識を使用、（ｉｉ）固定化しない化合物に蛍光を使用、（ｉｉｉ）固定化しない化合物に対して免疫特異的な抗体を使用、（ｉｖ）固定化した化合物が結合している蛍光性支持体を励起する標識を、固定化しない化合物に使用；および当技術分野で周知のルーティンに実施されている他の方法。
【０２２５】
本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドの結合パートナー化合物を同定するための細胞ベースのアッセイ法をも提供する。１態様において本発明は、細胞表面に発現したｉｏｎ−ｘポリペプチドを結合パートナー候補化合物と接触させ、そしてｉｏｎ−ｘポリペプチドへの結合パートナー候補化合物の結合を検出する工程を含む方法を提供する。ある好ましい態様において検出は、前記分子への結合により細胞に生じたカルシウムフラックスまたは他の生理学的事象の検出を含む。
【０２２６】
本発明の他の態様は、ｉｏｎ−ｘまたはｉｏｎ−ｘをコードする核酸分子のいずれかに結合する化合物を同定する方法であって、ｉｏｎ−ｘまたはそれをコードする核酸分子と化合物を接触させ、そしてその化合物がｉｏｎ−ｘまたはそれをコードする核酸分子を結合するかを判定することを含む方法に関する。結合は当業者に周知の結合アッセイ法により判定でき、これには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージベースの発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分画、共沈、架橋、相互作用トラップ／２ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡなど；これらはたとえばＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ニューヨーク）に記載されており、その全体を本明細書に援用する。スクリーニングされる化合物には、細胞外、細胞内、生物または化学物質に由来するものが含まれる（ｉｏｎ−ｘまたはそれをコードする核酸分子を結合すると推測される化合物も含まれる）が、これらに限定されない。本発明方法は、標識、たとえば放射性標識（たとえば、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識および免疫学的標識に結合したリガンド、特に神経ペプチドをも含む。本発明の範囲に含まれるモジュレーターには非ペプチド分子、たとえば非ペプチド模倣体、非ペプチドアロステリックエフェクター、およびペプチドが含まれるが、これらに限定されない。そのような試験に用いられるｉｏｎ−ｘポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、溶液中で自由であるか、固体支持体に結合しているか、細胞表面に保有されているか、あるいは細胞内に位置し、または細胞の一部と結合している。当業者は、たとえばｉｏｎ−ｘと被験化合物の複合体形成を測定できる。あるいは当業者は、被験化合物により生じたｉｏｎ−ｘとそれの基質の複合体の形成の減少を調べることができる。
【０２２７】
本発明の他の態様においては、ｉｏｎ−ｘに対する適切な結合親和性をもつ化合物のハイスループットスクリーニングを採用する。要約すると、多数の異なる小ペプチド被験化合物を固体支持体上で合成する。これらのペプチド被験化合物をｉｏｎ−ｘと接触させ、そして洗浄する。次いで、結合したｉｏｎ−ｘを当技術分野で周知の方法により検出する。精製された本発明のポリペプチドを、前記の薬物スクリーニング法に用いるプレート上に直接コーティングすることもできる。さらに、非中和抗体を用いてタンパク質を捕獲し、それを固体支持体上に固定化することもできる。
【０２２８】
一般に、発現したｉｏｎ−ｘをその特定リガンド（この場合はｉｏｎ−ｘを活性化する対応する神経ペプチド）と共にＨＴＳ結合アッセイに使用できる。同定したペプチドを、当業者に周知の方法により、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓまたは３２Ｐを含めた（これらに限定されない）適切な放射性同位体で標識する。あるいは、周知の方法によりペプチドを適切な蛍光性誘導体で標識してもよい（Ｂａｉｎｄｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ．，１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換えタンパク質を発現する細胞系から調製した膜調製物中の受容体に特異的に結合した放射性リガンドは、幾つかの標準法のいずれかのＨＴＳアッセイ法において検出できる；これには、結合したリガンドを結合していないリガンドから分離するための受容体−リガンド複合体の濾過が含まれる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。別法には、そのような分離を必要としないシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはＦｌａｓｈＰｌａｔｅ形式が含まれる（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１；Ｂｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−２９２）。蛍光性リガンドの結合は多様な方法で検出でき、これには蛍光エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、結合したリガンドの直接分光蛍光測光分析、または蛍光偏光が含まれる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【０２２９】
他のアッセイ法を用いてｉｏｎ−ｘ受容体の特異的リガンドを同定できる。これには、ターゲットタンパク質への被験リガンドの直接結合を測定することによりターゲットタンパク質のリガンドを同定するアッセイ法、およびイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法をによるアフィニティー限外濾過によりターゲットタンパク質のリガンドを同定するアッセイ法、または他の物理的方法および分析法が含まれる。あるいは、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４６（１９８９）およびＦｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：２８６−２９２（１９９４）（両者を本明細書に援用する）に記載される酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、そのような結合相互作用を間接的に評価する。ツーハイブリッドシステムは２種類のタンパク質またはポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝学的アッセイ法である。それは、問題となっている既知タンパク質に結合するタンパク質の同定、または相互作用に重要なドメインもしくは残基の解明に使用できる。ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子のクローニング、あるタンパク質に結合するペプチドの同定、および薬物スクリーニングのために、この方法の変法が開発された。ツーハイブリッドシステムは、相互作用するタンパク質対が、レポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインに転写活性化ドメインを近接させうる能力を利用し、一般に酵母において行われる。このアッセイ法には下記をコードする２種類のハイブリッド遺伝子の構築が必要である：（１）第１タンパク質に融合したＤＮＡ結合ドメイン、および（２）第２タンパク質に融合した活性化ドメイン。ＤＮＡ結合ドメインは、第１ハイブリッドタンパク質をレポーター遺伝子のＵＡＳにターゲティングする；しかし、大部分のタンパク質は活性化ドメインをもたないので、このＤＮＡ結合ハイブリッドタンパク質はレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第２ハイブリッドタンパク質自体は、ＵＡＳに結合しないのでレポーター遺伝子の発現を活性化できない。しかし、両方のハイブリッドタンパク質が存在すると、第１タンパク質と第２タンパク質の非共有相互作用により活性化ドメインがＵＡＳに繋ぎ留められ、レポーター遺伝子の転写が活性化される。たとえば、第１タンパク質がイオンチャンネル遺伝子生成物またはそのフラグメント（他のタンパク質もしくは核酸と相互作用することが分かっている）である場合、このアッセイ法を利用して、結合相互作用を妨害する薬剤を検出できる。種々の被験薬剤をこの系に添加してレポーター遺伝子の発現をモニターする。阻害薬が存在すると、レポーターシグナルが失われる。
【０２３０】
酵母ツーハイブリッドアッセイ法を利用して、遺伝子生成物に結合するタンパク質を同定することもできる。ｉｏｎ−ｘ受容体またはそのフラグメントに結合するタンパク質を同定するアッセイにおいては、ｉｏｎ−ｘ受容体（またはフラグメント）およびＵＡＳ結合ドメイン（すなわち第１タンパク質）の両方をコードする融合ポリヌクレオチドを使用できる。さらに、活性化ドメインに融合した異なる第２タンパク質をそれぞれコードする多数のハイブリッド遺伝子を調製し、このアッセイ法でスクリーニングすることができる。一般に第２タンパク質は全ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ融合ライブラリーの１以上のメンバーによりコードされ、第２タンパク質コード領域はそれぞれ活性化ドメインに結合している。この系は多様なタンパク質に適用でき、第２結合タンパク質の正体または機能が分かっている必要すらない。この系は高感度であり、他の方法で解明されない相互作用を検出できる；一過性の相互作用ですら、安定なｍＲＮＡを産生する転写の引き金を引く可能性があり、これにより反復翻訳されてレポータータンパク質を得ることができる。
【０２３１】
他のアッセイ法を用いて、ターゲットタンパク質に結合する薬剤を探索できる。ターゲットタンパク質への被験リガンドの直接結合を同定するそのようなスクリーニング法の一つがＵＳＰ５，５８５，２７７に記載されており、これを本明細書に援用する。この方法は、タンパク質は一般に折りたたまれた状態と折りたたまれていない状態の混合物として存在し、これら２つの状態間で絶えず変動しているという原理に依存する。被験リガンドが折たたまれた形のターゲットタンパク質に結合すると（すなわち被験リガンドがターゲットタンパク質のリガンドであると）、リガンドが結合したターゲットタンパク質分子はその折りたたまれた状態を維持する。したがって、折りたたまれたターゲットタンパク質が存在する度合いは、ターゲットタンパク質を結合する被験リガンドの存在下の方がリガンドの不存在下より大きい。ターゲットタンパク質へのリガンドの結合は、ターゲットタンパク質の折りたたまれた状態と折りたたまれていない状態を識別するいずれかの方法で判定できる。このアッセイを実施するためにターゲットタンパク質の機能が分かっている必要はない。この方法で実質的にいかなる物質も被験リガンドとして評価でき、これには金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、ポリヌクレオチド、および有機低分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３２】
ターゲットタンパク質のリガンドを同定するための他の方法は、Ｗｉｅｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９：１６８３−１６９１（１９９７）に記載されており、これを本明細書に援用する。この方法は、一度に２０〜３０種類の物質のコンビナトリアルライブラリーを溶液相でターゲットタンパク質への結合についてスクリーニングする。ターゲットタンパク質に結合する物質を、簡単な膜洗浄により他のライブラリー成分から分離する。フィルターに保持されている特異的に選択された分子を、次いでターゲットタンパク質から遊離させ、ＨＰＬＣおよび空気介助エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析法により分析する。この方法で、ターゲットタンパク質に対する親和性が最大のライブラリー成分が選択され、特に低分子ライブラリーに有用である。
【０２３３】
本発明の他の態様は、競合スクリーニングアッセイ法の使用を含む。この方法では、本発明のポリペプチドを結合しうる中和抗体が、そのポリペプチドへの結合に対して被験化合物と特異的に競合する。こうして、抗体を用いてｉｏｎ−ｘと共通の１以上の抗原決定基をもつペプチドの存在を検出できる。放射性標識競合結合試験はＡ．Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，４１（１０）：２１２７−２１３１に記載されており、その内容全体を本明細書に援用する。
【０２３４】
調節薬の同定
本発明は、ｉｏｎ−ｘとｉｏｎ−ｘ結合パートナーの結合のモジュレーターを同定するための、下記の工程を含む方法をも提供する：（ａ）ｉｏｎ−ｘ結合パートナーとｉｏｎ−ｘを含む組成物とを推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ；（ｂ）結合パートナーとｉｏｎ−ｘの結合を検出し；そして（ｃ）推定モジュレーターの不存在下での結合と比較した、推定モジュレーターの存在下での結合パートナーとｉｏｎ−ｘの結合の低下および増強からみて、推定モジュレーター化合物またはモジュレーター化合物を同定する。ｉｏｎ−ｘとｉｏｎ−ｘ結合パートナーの結合を調節すると同定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
ｉｏｎ−ｘ活性を刺激するｉｏｎ−ｘ結合パートナーは、不十分なｉｏｎ−ｘシグナル伝達（たとえばｉｏｎ−ｘリガンド活性が不十分な結果として）を特色とする疾病状態または症状においてアゴニストとして有用である。リガンド仲介ｉｏｎ−ｘシグナル伝達を遮断するｉｏｎ−ｘ結合パートナーは、過剰なｉｏｎ−ｘシグナル伝達を特色とする疾病状態または症状を処置するためのｉｏｎ−ｘアンタゴニストとして有用である。さらに、ｉｏｎ−ｘモジュレーター全般ならびにｉｏｎ−ｘポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、そのような疾病または症状の診断アッセイに有用である。
【０２３６】
他の態様において本発明は、その処置を必要とする患者に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択される配列をもつポリペプチドの活性または発現を調節する物質を投与することにより、疾患または異常な状態を処置する方法を提供する。
【０２３７】
ｉｏｎ−ｘの活性または発現を調節（すなわち増強、低下、または遮断）する薬剤は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する細胞と共に推定モジュレーターをインキュベートし、そしてｉｏｎ−ｘの活性または発現に対する推定モジュレーターの影響を判定することにより同定できる。ｉｏｎ−ｘの活性を調節する化合物の選択性は、ｉｏｎ−ｘに対するそれの作用と他のイオンチャンネル化合物に対するそれの作用を比較することにより評価できる。選択的モジュレーターには、たとえばｉｏｎ−ｘポリペプチドまたはｉｏｎ−ｘコード核酸に特異的に結合する抗体および他のタンパク質、ペプチド、または有機分子を含めることができる。ｉｏｎ−ｘ活性のモジュレーターは、正常または異常なｉｏｎ−ｘ活性が関与する疾患および生理学的状態を処置する療法に有用であろう。ｉｏｎ−ｘ活性を調節すると同定された化合物は、それらの活性を確認または定量するためにさらに他のアッセイ法で試験することができる。これにはｉｎ  ｖｉｖｏモデルが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３８】
ｉｏｎ−ｘポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびモジュレーターは、特に下記の疾患および症状の処置に使用できる：感染症、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症；消化管障害；甲状腺障害（たとえば甲状腺中毒症、粘液水腫）；腎不全；炎症症状（たとえばクローン病）；細胞の分化および恒常性に関連する疾患；慢性関節リウマチ；自己免疫障害；運動障害；ＣＮＳ障害（たとえば疼痛：ニューロパシー性疼痛、片頭痛、および他の頭痛を含む；発作；精神障害および神経障害：不安、統合失調症、躁うつ病、不安、全般性不安障害、外傷後ストレス障害、うつ病、双極性障害、譫妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む；ジスキネジア、たとえばハンチントン病またはトゥレット症状群；注意欠陥障害：ＡＤＤおよびＡＤＨＤを含む；ならびに変性性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病；運動障害：運動失調症、核上麻痺などを含む）；感染症、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症；代謝および心血管疾患および障害（たとえば２型糖尿病、肥満症、食欲不振症、低血圧症、高血圧症、血栓症、心筋梗塞、心筋障害、アテローム性硬化症など）；増殖性疾患および癌（たとえば胸部癌、結腸癌、肺癌など種々の癌、および乾癬、前立腺肥大などの過増殖性障害）；ホルモン障害（たとえば雄性／雌性ホルモン置換、多嚢胞卵巣症候群、脱毛症など）；ならびに性的機能障害。ｉｏｎ−ｘポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびにｉｏｎ−ｘモジュレーターは、そのような疾患または症状の診断アッセイにも使用できる。
【０２３９】
モジュレーターを同定するための本発明方法には、結合パートナー化合物を同定するための前記のいずれかの方法の変法が含まれる。これらの変法には、結合パートナー化合物を同定し、そして候補モジュレーターの存在下または不存在下で結合アッセイを実施する方法が含まれる。候補モジュレーター化合物の不存在での結合と比較して候補モジュレーターの存在下でｉｏｎ−ｘポリペプチドと結合パートナー化合物の結合が変化した場合に、モジュレーターと同定される。ｉｏｎ−ｘポリペプチドと結合パートナー化合物の結合を増強するモジュレーターは増強薬または活性化剤と表現され、ｉｏｎ−ｘポリペプチドと結合パートナー化合物の結合を低下させるモジュレーターは阻害薬と表現される。
【０２４０】
本発明は、ｉｏｎ−ｘポリペプチドと相互作用し、またはその生物活性を阻害する（すなわち酵素活性、結合活性などに影響を及ぼす）化合物を同定するための、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ法をも含む。ＨＴＳアッセイは、多数の化合物の効果的なスクリーニングを可能にする。ｉｏｎ−ｘ受容体−リガンド相互作用を調べるための細胞ベースのＨＴＳ系が考慮される。ＨＴＳアッセイは目的特性をもつ”ヒット”または”リード化合物”を同定するように設計され、これらからその目的特性を改良するための修飾を設計できる。”ヒット”または”リード化合物”の化学的修飾は、”ヒット”とｉｏｎ−ｘポリペプチドの同定可能な構造／活性関係に基づく場合が多い。
【０２４１】
本発明の他の態様は、ｉｏｎ−ｘの活性を調節（すなわち増強または低下）する化合物を同定する方法であって、ｉｏｎ−ｘをある化合物と接触させ、そしてその化合物がｉｏｎ−ｘの活性を修飾するかを判定することを含む方法に関する。被験化合物の不存在下での活性と対比した被験化合物の存在下での活性を測定する。当業者は、たとえば前記の電気生理学的方法を用いてイオンチャンネルポリペプチドの活性を測定できる。被験化合物を含有する試料の活性が被験化合物を含有しない試料の活性より高い場合、その化合物が活性を増大させたのであろう。同様に、被験化合物を含有する試料の活性が被験化合物を含有しない試料の活性より低い場合、その化合物が活性を阻害したのであろう。
【０２４２】
本発明ポリペプチドの活性は、限定ではないが、たとえば下記のものを結合または活性化される能力によっても測定できる：特定のリガンド：既知の神経伝達物質を含むが、これらに限定されない；アゴニストおよびアンタゴニスト：セロトニン、アセチルコリン、ニコチン、およびＧＡＢＡを含むが、これらに限定されない。あるいはイオンチャンネルの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質および光子を結合する能力、またはそれらにより影響される可能性などの活性を調べることによりアッセイできる。この方法の多様な態様において、アッセイは下記の形をとることができる：イオンフラックスアッセイ、膜電位アッセイ、酵母増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、イノシトールトリスリン酸アッセイ、ジアシルグリセロールアッセイ、エクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、細胞内Ｃａ２＋濃度に関するＦＬＩＰＲアッセイ、マイトジェネシスアッセイ、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ（たとえば［３Ｈ］−アラキドン酸を使用）、および細胞外酸性化速度に関するアッセイ、ならびに当技術分野で一般に知られている他の結合または機能をベースとするアッセイ法。
【０２４３】
イオンチャンネルの活性を調べるのに有用な可能性のある他のアッセイ法は、電気生理学的方法、すなわち細胞膜のイオン透過性の測定である。この方法は、たとえば下記に記載されている：ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，編者Ｄ．Ｉ．Ｗａｌｌｉｓ，オックスフォード大学出版社ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、およびＶＯＬＴＡＧＥ  ＡＮＤ  ＰＡＴＣＨ  ＣＬＡＭＰＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＭＩＣＲＯＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ，編者Ｓｍｉｔｈら，米国生理学会Ｗａｖｅｒｌｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【０２４４】
イオンチャンネル活性を調べるための他のアッセイ法は、たとえば膜電位を測定する細胞ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを実施するためにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤｒ．Ｖｉｎｃｅ  Ｇｒｏｐｐｉが開発したＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、蛍光イメージングプレートリーダー）システムを用いるものである。細胞膜電位の変化は、細胞内または外へのイオンの移動に伴うイオンチャンネルの調節と相関する。ＦＬＩＰＲシステムは膜電位のそのような変化を測定する。これは、イオンチャンネル遺伝子を発現する細胞に、膜電位の変化を測定するのに適した細胞膜透過性蛍光指示薬色素、たとえばｄｉＢＡＣ（ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加することにより達成される。したがって、イオンチャンネル活性の調節は、ｄｉＢＡＣ色素の発光スペクトルの変化としてＦＬＩＰＲにより評価および検出できる。
【０２４５】
本発明は、多様な薬物スクリーニング法のいずれかにおいて、ｉｏｎ−ｘを用いて化合物をスクリーニングするのに特に有用である。スクリーニングされる化合物（ｉｏｎ−ｘ活性を調節すると推測される化合物を含む）には、細胞外、細胞内、生物または化学物質起源のものが含まれるが、これらに限定されない。そのような試験に用いるｉｏｎ−ｘポリペプチドはいかなる形態であってもよく、好ましくは溶液中で自由であるか、固体支持体に結合しているか、細胞表面に保有されているか、あるいは細胞内に位置する。当業者は、たとえばｉｏｎ−ｘと被験化合物の複合体形成を測定できる。あるいは当業者は、被験化合物により生じたｉｏｎ−ｘとその基質の複合体の形成の減少を調べることができる。
【０２４６】
本発明のｉｏｎ−ｘポリペプチドの活性は、たとえば化学合成されたペプチドリガンドを結合する能力またはそれらにより活性化される可能性を調べることにより測定できる。あるいはｉｏｎ−ｘポリペプチドの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、臭気物質および光子を結合する能力を調べることによりアッセイできる。あるいはｉｏｎ−ｘポリペプチドの活性は、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼおよびイオンチャンネルを含めた（これらに限定されない）エフェクター分子の活性を調べることにより判定できる。よって、ｉｏｎ−ｘポリペプチド活性のモジュレーターはイオンチャンネル機能、たとえばチャンネルの結合特性またはイオン選択性などの活性を変化させる可能性がある。この方法の多様な態様において、アッセイは下記の形をとることができる：イオンフラックスアッセイ、酵母増殖アッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、イノシトールトリスリン酸アッセイ、ジアシルグリセロールアッセイ、エクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、細胞内Ｃａ２＋濃度に関するＦＬＩＰＲアッセイ、マイトジェネシスアッセイ、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ（たとえば［３Ｈ］−アラキドン酸を使用）、および細胞外酸性化速度に関するアッセイ、ならびに当技術分野で一般に知られている他の結合または機能をベースとするｉｏｎ−ｘ活性のアッセイ法。ｉｏｎ−ｘ活性は、当業者に周知のＦａＲＰ活性アッセイに用いられる方法により測定できる。本発明によるｉｏｎ−ｘ受容体の生物活性には、天然または天然以外のリガンドの結合、および当技術分野で既知のイオンチャンネル機能活性のいずれか１以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４７】
本発明のモジュレーターは多様な化学構造を示し、一般に天然イオンチャンネルリガンドの非ペプチド模倣体、イオンチャンネルのペプチドおよび非ペプチドアロステリックエフェクター、ならびにイオンチャンネルの活性化薬または阻害薬（競合的、不競合的および非競合的）として機能しうるペプチド（たとえば抗体生成物）に分類できる。本発明は適切なモジュレーターの供給源を限定せず、それらは天然の供給源、たとえば植物、動物もしくは鉱物の抽出物、または天然以外の供給源、たとえばライブラリー構築のためのコンビナトリアルケミストリー法の生成物を含めた低分子ライブラリー、ならびにペプチドライブラリーから得ることができる。
【０２４８】
イオンチャンネルの有機モジュレーターの例はＧＡＢＡ、セロトニン、アセチルコリン、ニコチン、グルタメート、グリシン、ＮＭＤＡ、およびカイニン酸である。
他のアッセイ法を用いて酵素活性を調べることができ、これには測光法、放射能測定法、ＨＰＬＣ、電気化学的方法などが含まれるが、これらに限定されない；これらはたとえばＥＮＺＹＭＥ  ＡＳＳＡＹＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，編者Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ，１９９２（オックスフォード大学出版社）に記載に記載されており、その全体を本明細書に援用する。
【０２４９】
イオンチャンネルをコードするｃＤＮＡを薬物探索計画に用いることは周知である；１日数千種類の未知化合物をハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）で試験できるアッセイ法については十分に文献記載されている。文献には放射性標識リガンドを薬物探索のためのＨＴＳ結合アッセイに使用する例が多数示されている（概説に関しては：Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５参照）。結合アッセイＨＴＳには組換え受容体が好ましい。それらは、より良好な特異性（より高い相対純度）を示し、多量の受容体材料を産生することができ、かつ多様な形式に使用できるからである（参照：Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，９７３−９８０；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する）。
【０２５０】
組換え受容体の機能発現には、当業者に周知の多様なヘテロロガス系を利用できる。そのような系には下記のものが含まれる：細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８）、酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）、数種類の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８）、両生類細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）および数種類の哺乳動物細胞系（ＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳなど；参照：Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３）。これらの例は、ネマトーダから得られる細胞系（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７）を含めた他の可能な細胞発現系の使用を除外しない。
【０２５１】
本発明の好ましい態様において、ｉｏｎ−ｘ活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、被験化合物をｉｏｎ−ｘと接触させ、そしてその化合物とｉｏｎ−ｘの複合体の存在をアッセイすることを含む。そのようなアッセイにおいて、リガンドは一般に標識される。適切なインキュベーションの後、遊離リガンドを結合形で存在するものから分離し、遊離または非複合化標識の量はその化合物がｉｏｎ−ｘを結合する能力の尺度である。
【０２５２】
そのような生物学的応答の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：特異的に遺伝子工学処理した酵母細胞が制限栄養素の不存在下で生存する能力（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定した細胞内Ｃａ２＋濃度の変化（Ｍｕｒｐｈｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光変化を利用して、リガンド誘発性の膜電位または細胞内ｐＨの変化をモニターすることもできる；これらの目的に対するＨＴＳに適した自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１，７５−８０）。アフリカツメガエル種（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）から調製した黒色素胞は、ヘテロロガスイオンチャンネル活性化に応答して、リガンド依存性の色素オーガニゼーション変化を示す；この変化をＨＴＳ形式に適用できる（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，８，６２９−６３４）。ｃＡＭＰ、ホスホイノシチドおよびアラキドン酸を含めた一般的なセカンドメッセンジャーを測定するためのアッセイ法もあるが、これらは一般にＨＴＳには好ましくない。
【０２５３】
本発明の他の態様においては、永久トランスフェクションＣＨＯ細胞を、有意量の組換え受容体タンパク質を含有する膜の調製に使用できる；次いでこれらの膜調製物を受容体結合アッセイに用い、その際その受容体に特異的な放射性標識リガンドを使用する。あるいは、機能アッセイ、たとえばこれらの各受容体を個別にまたは組み合わせて含有する永久トランスフェクションＣＨＯ細胞におけるリガンド誘発による細胞内Ｃａ２＋濃度または膜電位の変化の蛍光モニタリングが、ＨＴＳに好ましいであろう。同様に好ましいのは、同様な形式における別タイプの哺乳動物細胞、たとえばＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ細胞である。より好ましいのは、永久トランスフェクション昆虫細胞系、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞であろう。さらに好ましいのは、当業者に周知のＨＴＳ形式におけるキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）受容体を発現する組換え酵母細胞であろう（たとえばＰａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）。
【０２５４】
本発明は、ｉｏｎ−ｘに結合するリガンドの阻害薬をスクリーニングおよび同定するための多数のアッセイ法を考慮する。一例においては、ｉｏｎ−ｘを固定化し、候補モジュレーター、たとえば阻害化合物の存在下および不存在下で結合パートナーとの相互作用を評価する。他の例では、溶液アッセイ法において、候補阻害化合物の存在下と不存在下の両方でｉｏｎ−ｘとそれの結合パートナーとの相互作用を評価する。いずれのアッセイ法においても、ｉｏｎ−ｘとそれの結合パートナーの結合を低下させる化合物として阻害薬を同定する。考慮される他のアッセイ法は、形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞における正のシグナルの検出によりタンパク質／タンパク質相互作用の阻害薬を同定するジハイブリッドアッセイの変法を伴う；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２０６５２に記載：１９９５年８月３日公開。
【０２５５】
本発明により考慮される候補モジュレーターには、潜在活性化薬または潜在阻害薬のライブラリーから選択される化合物が含まれる。低分子モジュレーターの同定に用いられる多種多様なライブラリーがあり、これには（１）化学物質ライブラリー、（２）天然物ライブラリー、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子からなるコンビナトリアルライブラリーが含まれる。化学物質ライブラリーはランダムな化学構造体からなり、それらのうちあるものは既知化合物の類似体または他の薬物探索スクリーニングにおいて”ヒット”もしくは”リード”と同定されている化合物の類似体であり、それらのうちあるものは天然物に由来し、それらのうちあるものは無制御の合成有機化学から得られたものである。天然物ライブラリーは、下記によりスクリーニング用混合物を調製するために用いた微生物、動物、植物または海洋生物の回収物である：（１）土壌、植物もしくは海洋微生物からの発酵およびブロスの抽出、または（２）植物もしくは海洋生物の抽出。天然物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびそのバリアント（天然に存在しないもの）が含まれる。概説についてはＳｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３−６８（１９９８）参照。コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物を混合物として含む。これらのライブラリーは伝統的な自動合成法、ＰＣＲ、クローニング、または特許合成法で比較的容易に調製される。特に重要なものは、ペプチド以外のコンビナトリアルライブラリーである。さらに他の対象のライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、多重平行合成の回収物、組換えおよびポリペプチドのライブラリーが含まれる。コンビナトリアルケミストリーおよびそれにより作製されたライブラリーの概説についてはＭｙｅｒｓ，，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）参照。本明細書に記載する種々のライブラリーを用いてモジュレーターを同定することにより、候補”ヒット”（または”リード”）を修飾して”ヒット”の効力を最適化できる。
【０２５６】
本発明により考慮されるさらに他の候補阻害薬を設計でき、これには可溶形の結合パートナー、およびキメラタンパク質または融合タンパク質のような結合パートナーが含まれる。本明細書中で用いる”結合パートナー”には、広く非ペプチドモジュレーター、ならびにペプチドモジュレーター、たとえば神経ペプチド（天然リガンド以外のもの）、抗体、抗体フラグメント、および、同定されたｉｏｎ−ｘ遺伝子の発現生成物に免疫特異的な抗体ドメインを含む修飾化合物が含まれる。
【０２５７】
本発明のポリペプチドは、相互作用性調節タンパク質の同定、特性解明および精製のための研究ツールとして用いられる。当技術分野で既知の多様な方法で適切な標識を本発明のポリペプチドに取り込ませ、それらのポリペプチドを相互作用分子の捕獲に用いる。たとえば分子を標識ポリペプチドと共にインキュベートし、結合していないポリペプチドを洗浄除去し、そしてポリペプチド複合体を定量する。種々の濃度のポリペプチドを用いて得たデータを利用して、ポリペプチドとタンパク質の複合体の数、親和性および結合に関する数値を計算する。
【０２５８】
標識ポリペプチドは、ポリペプチドが相互作用する分子を精製するための試薬としても有用である。これには阻害薬が含まれるが、これらに限定されない。アフィニティー精製の１態様においては、ポリペプチドをクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。細胞およびそれらの膜を抽出し、種々の細胞サブコンポーネントをカラムに通す。分子はポリペプチドに対するそれらの親和性によりカラムに結合する。ポリペプチド−複合体をカラムから回収し、解離し、回収された分子をタンパク質配列決定する。次いでこのアミノ酸配列を利用して捕獲分子を同定し、または適宜なｃＤＮＡライブラリーから対応する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドを設計する。
【０２５９】
あるいは、本発明のｉｏｎ−ｘに対するリガンドと類似の特性を示すが人体または動物体の内因性リガンドより低分子でありより長い半減期を示す化合物を同定できる。有機化合物を設計する場合、本発明による分子を”リード”化合物として用いる。既知の医薬有効化合物に対する模倣体の設計は、そのような”リード”化合物に基づく医薬開発において周知の方法である。模倣体の設計、合成および試験は、標的特性に対する多数の分子のランダムなスクリーニングを避けるために一般に採用される。さらに、本発明のＤＮＡがコードする演繹アミノ酸配列の分析から得られる構造データは、より特異的な、したがって薬理効果がより高い新規薬物の設計に有用である。
【０２６０】
本発明のタンパク質配列と利用できるすべてのデータベースにある配列との比較により、イオンチャンネルタンパク質の膜貫通ドメイン（ポアドメインを含む）について有意の相同性が示された。したがって、コンピューターモデリングを用いて、入手できる他のタンパク質の膜貫通ドメインの情報に基づいて本発明のタンパク質の推定三次構造を開発できる。こうして、ｉｏｎ−ｘの推定構造に基づく新規リガンドを設計できる。
【０２６１】
具体的態様において、本発明のスクリーニング法により同定した新規分子は低分子量有機分子であり、この場合、それの経口摂取用の組成物または医薬組成物、たとえば錠剤を調製できる。本明細書に記載するスクリーニング法により同定した核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体および化合物を含む組成物または医薬組成物は、いかなる投与経路用にも調製でき、これには経口、静脈内、皮膚、皮下、鼻腔、筋肉内または腹腔内が含まれるが、これらに限定されない。キャリヤーまたは他の成分の性質は個々の投与経路および投与される本発明の個々の態様に依存するであろう。これに関して有用な方法およびプロトコルの例は、特にＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ（編），１９８０中にみられ、その全体を本明細書に援用する。
【０２６２】
この低分子量化合物の投与量は、処置すべき疾病状態または症状、および他の臨床的要因、たとえばそのヒトまたは動物の体重および状態、ならびに化合物の投与経路に依存するであろう。ヒトまたは動物を処置するためには、約０．５〜５００ｍｇ／体重ｋｇの化合物を投与できる。療法には一般に低い方の用量で投与し、目的とする療法結果がみられるまで継続する。
【０２６３】
本明細書に記載するスクリーニング法により同定した核酸分子、ポリペプチド、抗体、化合物を含めた本発明の化合物および方法は、多様な医薬用途をもち、たとえば癌および腫瘍の増殖など、無調節な細胞増殖を治療または予防するために使用できる。具体的態様において、本発明の分子は遺伝子療法に用いられる。遺伝子療法の概説については、たとえばＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５６，８０８−８１３を参照；その全体を本明細書に援用する。
【０２６４】
本発明には、哺乳動物において天然ｉｏｎ−ｘ結合パートナー関連活性に作動（刺激）または拮抗する方法であって、前記に開示するポリペプチドのいずれか一つに対するアゴニストまたはアンタゴニストを、その作動または拮抗を生じるのに十分な量で哺乳動物に投与することを含む方法も含まれる。したがって本発明の１態様は、哺乳動物において本発明のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストにより疾患を処置する方法であって、ｉｏｎ−ｘ関連機能に作動または拮抗するのに十分な量のアゴニストまたはアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含む方法である。
【０２６５】
本発明に基づいて処置できる疾患および症状の例には特に下記のものが含まれるが、これらに限定されない：消化管障害；甲状腺障害（たとえば甲状腺中毒症、粘液水腫）；腎不全；炎症症状（たとえばクローン病）；細胞の分化および恒常性に関連する疾患；慢性関節リウマチ；自己免疫障害；運動障害；ＣＮＳ障害（たとえば疼痛：ニューロパシー性疼痛、片頭痛、および他の頭痛を含む；発作；精神障害および神経障害：不安、統合失調症、躁うつ病、不安、全般性不安障害、外傷後ストレス障害、うつ病、双極性障害、譫妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む；ジスキネジア、たとえばハンチントン病またはトゥレット症状群；注意欠陥障害：ＡＤＤおよびＡＤＨＤを含む；ならびに変性性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病；運動障害：運動失調症、核上麻痺などを含む）；感染症、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症；代謝および心血管疾患および障害（たとえば２型糖尿病、肥満症、食欲不振症、低血圧症、高血圧症、血栓症、心筋梗塞、心筋障害、アテローム性硬化症など）；増殖性疾患および癌（たとえば胸部癌、結腸癌、肺癌など種々の癌、および乾癬、前立腺肥大などの過増殖性障害）；ホルモン障害（たとえば雄性／雌性ホルモン置換、多嚢胞卵巣症候群、脱毛症など）；ならびに性的機能障害。
【０２６６】
細胞膜を通過でき、かつ酸加水分解抵抗性である化合物は、患者に経口投与した後の生物学的利用能が高くなるので、療法薬として有利な可能性がある。しかし、これらのタンパク質阻害薬の多くは機能を軽度に阻害するにすぎない。さらに、多くは多様なプロテインキナーゼを阻害するので、疾患の療法薬として多数の副作用を引き起こすであろう。
【０２６７】
患者に投与する化合物量を決定する方法および化合物を生物に投与する様式は、米国特許出願番号０８／７０２，２８２（１９９６年８月２３日出願）および国際特許出願公開番号ＷＯ９６／２２９７６（１９９６年８月１日公開）に開示されており、図面、式または表を含めて両者の全体を本明細書に援用する。そのような記載を本発明に利用でき、容易に適合させうることは、当業者に理解されるであろう。
【０２６８】
適正な投与量は、処置すべき疾患のタイプ、使用する個々の組成物、ならびに患者の体格および生理学的状態など、種々の要因に依存する。本明細書に記載する化合物の療法有効量は、まず細胞培養および動物モデルから推定できる。たとえば、まず細胞培養アッセイにおいて判定したＩＣ５０を考慮した循環濃度範囲を達成する用量を、動物モデルに処方することができる。この動物モデルデータを利用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定できる。
【０２６９】
障害を抑制するのに最適な薬物の選択を容易にするために、血漿、腫瘍および主要臓器における薬物および代謝産物の血漿内半減期および生体内分布を判定することもできる。そのような測定を実施できる。たとえば、薬物で処理した動物の血漿についてＨＰＬＣ分析を実施し、放射性標識化合物の位置をＸ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩなどの検出方法により判定できる。スクリーニングアッセイにおいては有効な阻害活性を示すけれども薬物動態特性が低い化合物は、化学構造を変化させて再試験することにより最適化できる。これに関して、良好な薬物動態を示す化合物をモデルとして使用できる。
【０２７０】
血球組成を調べることにより毒性試験を実施することもできる。たとえば、適切な動物モデルにおいて下記の毒性試験を実施できる：１）化合物をマウスに投与し（非処理対照マウスも使用すべきである）；２）各処理群中１匹のマウスから尾静脈より血液試料を定期的に採取し；そして３）赤血球数および白血球数、血球組成、ならびに多形核血球に対するリンパ球の％について試料を分析する。毒性があれば、各投与方式についての結果と対照の比較により示される。
【０２７１】
各毒性試験が終了すると、動物を殺すことによりさらに試験を実施できる（好ましくは、米国獣医学会指針、安楽死に関する米国獣医学会パネルの報告書に従う，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．，２０２：２２９−２４９，１９９３）。次いで各処理群からの代表的動物を、転移の直接的証拠、異例の疾患または毒性について、肉眼検死により検査する。組織の肉眼的異常を記録し、組織を組織学的に検査する。体重または血液成分の減少を生じる化合物は主要臓器に有害作用を及ぼす化合物であるので、好ましくはない。一般に有害作用が大きいほど、その化合物はより好ましくない。
【０２７２】
癌の処置のためには、疎水性医薬の予想１日量は１〜５００ｍｇ／日、好ましくは１〜２５０ｍｇ／日、最も好ましくは１〜５０ｍｇ／日である。有効部分の血漿中濃度が療法効果の維持に十分であれば、薬物の投与頻度はより少なくてよい。血漿中濃度に薬物の力価を反映させるべきである。一般に、化合物の力価が高いほど、有効性を達成するのに必要な血漿中濃度はより低い。
【０２７３】
ｉｏｎ−ｘ  ｍＲＮＡ転写体は多くの組織中にみられ、これには脳、腎臓、結腸、小腸、胃、精巣、胎盤、副腎、末梢血白血球、骨髄、網膜、卵巣、胎児脳、胎児肝臓、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、肺、筋肉、甲状腺、子宮、前立腺、皮膚、唾液腺、および膵臓が含まれるが、これらに限定されない。特定のｉｏｎ−ｘ  ｍＲＮＡを発現する組織を、後記の実施例において同定する。
【０２７４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列ならびにそのフラグメントは、前記に詳述したように、ｉｏｎ−ｘを活性化、作動し、またはそれに拮抗する内因性神経伝達物質／ホルモン／リガンド、および特に下記を含めた（これらに限定されない）障害の処置における潜在的有用性をもつ化合物のスクリーニングを可能にする：消化管障害；甲状腺障害（たとえば甲状腺中毒症、粘液水腫）；腎不全；炎症症状（たとえばクローン病）；細胞の分化および恒常性に関連する疾患；慢性関節リウマチ；自己免疫障害；運動障害；ＣＮＳ障害（たとえば疼痛：ニューロパシー性疼痛、片頭痛、および他の頭痛を含む；発作；精神障害および神経障害：不安、統合失調症、躁うつ病、不安、全般性不安障害、外傷後ストレス障害、うつ病、双極性障害、譫妄、痴呆、重篤な精神遅滞を含む；ジスキネジア、たとえばハンチントン病またはトゥレット症状群；注意欠陥障害：ＡＤＤおよびＡＤＨＤを含む；ならびに変性性障害、たとえばパーキンソン病およびアルツハイマー病；運動障害：運動失調症、核上麻痺などを含む）；感染症、たとえばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によるウイルス感染症；代謝および心血管疾患および障害（たとえば２型糖尿病、肥満症、食欲不振症、低血圧症、高血圧症、血栓症、心筋梗塞、心筋障害、アテローム性硬化症など）；増殖性疾患および癌（たとえば胸部癌、結腸癌、肺癌など種々の癌、および乾癬、前立腺肥大などの過増殖性障害）；ホルモン障害（たとえば雄性／雌性ホルモン置換、多嚢胞卵巣症候群、脱毛症など）；ならびに性的機能障害。
【０２７５】
たとえばｉｏｎ−ｘは、呼吸器疾患、たとえばＴ細胞が疾病に関与している喘息の処置に有用であろう。気道平滑筋の収縮はトロンビンにより刺激される。Ｃｉｃａｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２６：４７８−４８４。さらに、閉塞性細気管支炎においてはトロンビン受容体の活性化が有害な可能性があると指摘されている。Ｈａｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７：Ｌ２２−Ｌ２９。さらに、マスト細胞がトロンビン受容体をもつことも示されている。Ｃｉｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８２１−８２７。ｉｏｎ−ｘは、線維芽細胞プロコラーゲン合成の刺激による慢性肺炎状態の気道構造の再現にも有用であろう。たとえばＣｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３３：１２１−１２７；Ｔｒｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２１５３６−２１５４１参照。
【０２７６】
他の例で、トロンビン受容体の活性化後にＴ細胞によるｓＣＤ４０Ｌ放出およびＣＤ４０Ｌ発現が増大したことは、Ｔ細胞および炎症の作用による不安定狭心症の処置にｉｏｎ−ｘが有用である可能性を示唆する。Ａｕｋｒｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：６１４−６２０参照。
【０２７７】
他の例は、炎症性疾患、たとえば乾癬、炎症性腸疾患、多発硬化症、慢性関節リウマチ、および甲状腺炎の処置である。組織のｉｏｎ−ｘ発現プロフィルからみて、トロンビン受容体の阻害がこれらの疾患に有益であろう。たとえばＭｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：８４１−８４３参照。Ｔ細胞のほか、ＮＫ細胞および単球もこれらの疾患の発病に関与する重要な細胞タイプである。たとえばＮａｌｄｉｎｉ  ＆  Ｃａｒｎｅｙ（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：３５−４２；Ｈｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｃｏｏｐｅｒ（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２１：１５６−１６７；Ｃｏｌｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４：９７５−９８５参照。
【０２７８】
脾臓にｉｏｎ−ｘが発現することは、それが造血系前駆細胞の増殖において役割を果たしている可能性を示唆する。ＤｉＣｕｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：９１４−９１８参照。
【０２７９】
他の例として、ｉｏｎ−ｘは急性および／または外傷性脳傷害の処置に有用であろう。星状神経膠細胞はトロンビン受容体を発現することが証明された。脳傷害後の星状神経膠症にトロンビン受容体の活性化が関与している可能性がある。したがって、受容体活性の阻害は神経炎症の抑制に有益であろう。星状神経膠細胞により仲介される瘢痕形成も、トロンビン受容体の阻害により抑制されるであろう。たとえばＰｉｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：７６６−７７４；Ｕｂｌ  ＆  Ｒｅｉｓｅｒ（１９９７）Ｇｌｉａ  ２１：３６１−３６９；Ｇｒａｂｈａｍ  ＆  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６４：５８３−５９１参照。
【０２８０】
ｉｏｎ−ｘ受容体の活性化は、神経細胞および星状神経膠細胞のアポトーシスならびに神経突起伸展の阻止を仲介すると思われる。阻害は慢性および急性脳傷害のいずれにも有益であろう。たとえばＤｏｎｏｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：５３１６−５３２６；Ｔｕｒｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：６８８２−６８９１；Ｓｍｉｔｈ−Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９：１８９０−１８９６；Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７９７：３２１−３２７；Ｓｕｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２２：１２５−１３３参照。
【０２８１】
添付の配列表には本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、その全体を本明細書に援用する。
したがって、アゴニストおよびアンタゴニストのようなモジュレーターの同定は、神経性の疾患および障害を処置するのに有用な化合物の同定に有用である。そのような神経性の疾患および障害には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：統合失調症、情動障害、ＡＤＨＤ／ＡＤＤ（すなわち注意欠陥多動性障害／注意欠陥障害）、ならびに神経障害、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、片頭痛、および老年性痴呆、ならびにうつ病、不安、双極性障害、てんかん、神経炎、神経衰弱症、ニューロパシー、ノイローゼなど。
【０２８２】
ヒト対象のスクリーニング法
したがってさらに他の態様において本発明は、ヒトゲノム−−特に本発明のイオンチャンネルに対するそれらの対立遺伝子−−を分析して、遺伝的要素をもつと思われる精神障害または脳疾患に罹患しているかまたはそれを発症するリスクをもつと考えられる他の個体にみられる遺伝的特徴をその個体がもつかを判定することを伴う遺伝子スクリーニング法を提供する。たとえば１態様において本発明は、ヒト対象において脳に影響を与える障害を発症する可能性を判定する方法であって、そのヒト対象に由来する１またはそれより多くのイオンチャンネル遺伝子のコード配列を分析し、そしてこの分析工程からそのヒト対象におけるその障害の発症の可能性を判定する工程を含む方法を提供する。
【０２８３】
より具体的には本発明は、脳に影響を与える障害またはそれに対する遺伝的素因を診断するためにヒト対象をスクリーニングする方法であって、下記の工程を含む方法を提供する：（ａ）ヒト対象の核酸をアッセイして、脳に発現する可能性のある少なくとも１種類のイオンチャンネルのアミノ酸の配列、発現または生物活性を変化させる変異の存在または不存在を判定する；その際イオンチャンネルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、１０６、１０９、１１０、１１９、１２１、１２２、１３２および１３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはその対立遺伝子バリアントを含み、核酸はイオンチャンネルをコードする遺伝子に対応する；そして（ｂ）その変異の存在または不存在から障害または素因を診断する；その際、アミノ酸の配列、発現または生物活性を変化させる変異が核酸の対立遺伝子中に存在することは、その障害を発症するリスクが高いことと相関する。
【０２８４】
”ヒト対象”とは、ヒト、ヒトの胚、またはヒト胎児のいずれかを意味する。本発明方法が、脳に影響を与える障害をもつと診断された個体自身または脳に影響を与える障害をもつと診断された血縁者をもつ個体に特に重要であることは自明であろう。
【０２８５】
”高いリスクについてのスクリーニング”とは、ヒト対象において、脳に影響を与える障害を発症する可能性がヒト集団全体またはその個体が属する関連民族もしくは人種亜集団にみられるより高いことと相関する遺伝子変異があるかを判定することを意味する。陽性および陰性両方の判定（すなわち遺伝的素因マーカーが存在するか不存在であるかの判定）が本発明のスクリーニング法の範囲に含まれるものとする。ある好ましい態様において、核酸中における少なくとも１つのｉｏｎ−ｘイオンチャンネル対立遺伝子の配列または発現を変化させる変異の存在はその障害を発症するリスクが高いことと相関し、一方、そのような変異の不存在は陰性の判定として報告される。
【０２８６】
本発明の”アッセイ”工程は、核酸の特性を判定するための分析に利用できるいかなる技術も伴うことができ、これにはたとえば下記の周知の技術が含まれるが、これらに限定されない：一本鎖コンホメーション多型分析（ＳＳＣＰ）［Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２７６６−２７７０（１９８９）］；ヘテロデュプレックス分析［Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：３０１−３０６（１９９２）］；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動分析［Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：１５７９−１５８３（１９８３）；およびＲｉｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１０：３７７−３８９（１９８９）］；ＤＮＡ配列決定法；ＲＮａｓｅ開裂［Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１２４２−１２４６（１９８５）］；不適正塩基対の化学的開裂法［Ｒｏｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３０：５７４−５８２（１９９５）；およびＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３７７−３３７８（１９９７）］；制限断片長多型分析；シングルヌクレオチドプライマー伸長分析［Ｓｈｕｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，７：３４６−３５４（１９９６）；およびＰａｓｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７：６０６−６１４（１９９７）］；５’ヌクレアーゼアッセイ［Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５０２２−５０２６（１９９４）］；ＤＮＡマイクロチップ分析［Ｒａｍｓｅｙ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：４０−４８（１９９９）；およびＣｈｅｅら，ＵＳＰ５，８３７，８３２］；およびリガーゼ連鎖反応［Ｗｈｉｔｅｌｅｙら，ＵＳＰ５，５２１，０６５］。［全般的にＳｃｈａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：３３−３９（１９９８）参照］。以上の文献すべての全体を本明細書に援用する。
【０２８７】
したがって、たとえばｉｏｎ−ｘ配列のスクリーニングを伴うある好ましい態様において、アッセイ工程は下記よりなる群から選択される少なくとも１つの操作を含む：（ａ）ヒト対象の少なくとも１つのｉｏｎ−ｘ対立遺伝子の少なくとも１つのコドンのヌクレオチド配列を決定する；（ｂ）ハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ヒト対象からの核酸が１以上の標準配列と同一または異なるヌクレオチド配列をもつかを判定する；（ｃ）ポリヌクレオチド移動アッセイを実施して、ヒト対象からの核酸が１以上の標準配列と同一または異なるヌクレオチド配列をもつかを判定する；および（ｄ）制限ヌクレアーゼ消化を実施して、ヒト対象からの核酸が１以上の標準配列と同一または異なるヌクレオチド配列をもつかを判定する。
【０２８８】
きわめて好ましいある態様においてアッセイは、利用できるいずれかの配列決定法により核酸配列を決定してそのヌクレオチド配列を決定することを伴う［たとえばＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７４：５４６３−５４６７（１９７７）（ジデオキシチェインターミネーション法，ｄｉｄｅｏｘｙ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）；Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，ＴＩＢＴＥＣＨ，１２：２７−３２（１９９４）（ハイブリダイゼーションによる配列決定）；Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５４−５８（１９９８）；米国特許第５，２０２，２３１号；およびＳｃｉｅｎｃｅ，２６０：１６４９−１６５２（１９９３）（ハイブリダイゼーションによる配列決定）；Ｋｉｅｌｅｃｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１７８７−１７９１（１９９２）（プライマー・ウォーキング法による配列決定）；（Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８２４−８２８（１９９３）（ＰＣＲ生成物の直接配列決定）；およびＡｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６：２３８−２４１（１９９４）；Ｍａｘａｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：４９９−５６０（１９７７）（化学的終結による配列決定）参照；すべてを本明細書に援用する］。分析は、ｉｏｎ−ｘ遺伝子ゲノムＤＮＡ配列全体もしくはその一部の配列決定；または受容体コード配列全体もしくはその一部の配列決定を伴うことができる。場合により、分析は個体が特定の対立遺伝子バリアントをもつかの判定を伴ってもよく、この場合、核酸の小部分のみ−−その対立遺伝子バリアントを特徴づける特定のコドンの配列を決定するのに十分な−−の配列決定で十分である。この方法は、たとえば家族の他のメンバーについて以前に解明されたものと同一の対立遺伝子バリアントを家族の１メンバーが遺伝しているか、あるいはより全般的に、以前に解明された、遺伝的要素をもつ精神障害と相関するバリアントをある者のゲノムが含むかを判定するためにアッセイする場合に適切である。
【０２８９】
きわめて好ましい他のある態様において、アッセイ工程は、ハイブリダイゼーションアッセイを実施してヒト対象からの核酸が１以上の標準配列と同一または異なるヌクレオチド配列をもつかを判定することを含む。ある好ましい態様において、ハイブリダイゼーションはヒト対象からの核酸が１以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするかを判定することを含み、その際オリゴヌクレオチドは本明細書に教示するｉｏｎ−ｘ遺伝子の一部と同一であるかまたは１つの不適正塩基対以外は同一であるヌクレオチド配列をもつ。ハイブリダイゼーション条件は、完全な配列相補性と１個以上の塩基が異なる不完全な塩基対合とを識別するように選択される。これにより、そのようなハイブリダイゼーション実験で、実験に用いるオリゴヌクレオチド配列の知見によりヒト対象からの核酸について一塩基多型配列情報を得ることができる。
【０２９０】
以上に概説した幾つかの方法は、変性または非変性条件下に、たとえばポリアクリルアミド電気泳動ゲル（またはキャピラリー電気泳動システム）上で、ポリヌクレオチド移動アッセイを実施する分析を伴う。ヒト対象に由来する核酸を、通常は１以上の標準核酸、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列（または１つの既知の多型以外は同一のもの）の全体または一部と同一のコード配列をもつ標準イオンチャンネルコード配列に隣接して（または共装填して）ゲル電気泳動処理する。ヒト対象からの核酸と標準配列に同様な化学的処理または酵素処理を施し、次いでこれらのポリヌクレオチドが同一配列を含まない限り異なる移動パターンを示す条件下で電気泳動する。［一般にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ニューヨーク，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８７−１９９９）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）参照；両者の全体を本明細書に援用する。］
アッセイに関して用語”ヒト対象の核酸”は、ヒト対象から直接得た核酸（たとえば、血液、組織、または他の細胞もしくは流体試料から得たＤＮＡまたはＲＮＡ）；およびヒト対象から直接得た核酸に由来する核酸を含むものとする。限定ではない例として、ヒト対象からの生物試料に由来するＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを作製するために、およびヒト対象から得た生物試料に由来するＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するために、周知の方法がある。ヒト対象自身のＤＮＡ／ＲＮＡの関連ヌクレオチド配列情報を保持するそのような由来のポリヌクレオチドはいずれも、本発明の目的に関して本発明の”ヒト対象の核酸”の定義に含まれるものとする。
【０２９１】
アッセイに関して用語”変異”には、ｉｏｎ−ｘ遺伝子配列の１個以上のヌクレオチドの付加、欠失および／または置換（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すイオンチャンネルコード配列と比較して）、ならびにイントロン（イントロンがある場合）に起きる他の多型であって、配列決定、制限断片長多型その他の方法で同定できるものが含まれる。本明細書に示す多様な活性の例により、ある変異が種々の被験物質の存在下または不存在下で関連受容体の活性を調節するかを判定できる。
【０２９２】
関連する態様において本発明は、ある者の遺伝子型を本発明のイオンチャンネルに関してスクリーニングし、そしてそのような遺伝子型を疾患の診断または疾患の素因（遺伝子カウンセリングのために）と相関させる方法を提供する。たとえば、本発明はヒト患者においてｉｏｎ−ｘ精神障害遺伝子型についてスクリーニングするための、下記の工程を含む方法を提供する：（ａ）患者からの核酸であって患者のｉｏｎ−ｘ対立遺伝子に対応する配列を含む核酸を含有する生物試料を用意し；（ｂ）その核酸を１以上の変異の存在について分析し；（ｃ）分析工程からｉｏｎ−ｘ遺伝子型を判定し；そして（ｄ）ｉｏｎ−ｘ対立遺伝子における変異の存在を精神障害遺伝子型と相関させる。ある好ましい態様において生物試料は、ヒト対象のゲノムＤＮＡを含むヒト細胞を含有する細胞試料である。分析は、前記の各節に記載したアッセイと同様に実施できる。たとえば、分析は核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部の配列決定を含み、この一部はｉｏｎ−ｘ対立遺伝子の少なくとも１つのコドンを含む。
【０２９３】
核酸分析を伴う方法より時間および経費がかかるが、本発明はヒト対象のタンパク質をアッセイして、ヒト対象からのイオンチャンネルタンパク質におけるアミノ酸配列変異の存在または不存在を判定することによっても実施できる。そのようなタンパク質分析は、たとえばイオンチャンネルタンパク質を化学的方法または酵素法により切断し、得られたペプチドを配列決定することにより；あるいはイオンチャンネルの特定の対立遺伝子バリアントに対する特異性をもつ抗体を用いるウェスタン分析により実施できる。
【０２９４】
本発明は、本発明方法の実施に有用な材料をも提供する。たとえば本発明は、前記の多くの分析法においてプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に教示するヒトのイオンチャンネル遺伝子配列（またはその対立遺伝子バリアント）の一部と同一もしくは厳密に相補的であるか、または１個のヌクレオチド置換以外は同一もしくは厳密に相補的である配列をもつ、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドを含む。ある好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは本明細書に教示するヒトのイオンチャンネルコード配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すコード配列に上記と同様に対応する配列をもつ。１変法においては、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを精製および単離する。他の変法においては、オリゴヌクレオチドプローブをたとえば放射性同位体、発色団または発蛍光団で標識する。さらに他の変法においては、プローブを固体支持体に結合させる。［全般的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）参照。］
関連態様において、本発明は本発明方法の実施に有用な試薬を含むキットを提供する。たとえば本発明は、下記のものを一緒に含む、ヒト対象を精神障害または遺伝的素因の診断のためにスクリーニングするキットを提供する：（ａ）ヒトｉｏｎ−ｘイオンチャンネル遺伝子における多型を同定するためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチド；このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド付加、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド置換よりなる群から選択される１つの配列相異以外はヒトｉｏｎ−ｘ遺伝子配列またはｉｏｎ−ｘコード配列の一部と同一もしくは厳密に相補的である配列をもつ６〜５０個のヌクレオチドを含む；および（ｂ）オリゴヌクレオチドと共にパッケージした、精神障害またはその遺伝的素因と相関する、前記プローブにより同定できる多型を同定する情報を含む媒体。情報を含む媒体の例には、印刷した紙パッケージ同封物または包装ラベル；ならびに遺伝子スクリーニングおよびカウンセリングサービスを行う専門家がコンピューターまたは機器により読み出し可能な磁気および光学記憶媒体が含まれる。専門家はこの媒体中に提供された情報を用いて、オリゴヌクレオチドによる分析結果を診断と相関させる。ある好ましい変法においては、オリゴヌクレオチドを標識する。
【０２９５】
さらに他の態様において本発明は、精神障害と相関する、本発明のイオンチャンネルの対立遺伝子バリアントを同定する方法を提供する。ｉｏｎ−ｘを含めたイオンチャンネルが脳を含む多くの異なる組織に発現することは周知である。したがって、本発明のｉｏｎ−ｘは特に精神障害の処置および／または診断に有用である。たとえば本発明は、精神障害と相関するイオンチャンネル対立遺伝子バリアントを同定するための、下記の工程を含む方法を提供する：（ａ）精神障害をもつと診断されたヒト患者またはその患者の遺伝的祖先もしくは子孫からの核酸を含む生物試料を用意し；（ｂ）脳に発現する少なくとも１種類のイオンチャンネルにおける１以上の変異の存在について核酸を分析し、その際イオンチャンネルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択されるアミノ酸配列またはその対立遺伝子バリアントを含み、核酸はイオンチャンネルをコードする１以上の遺伝子に対応する配列を含み；（ｃ）分析工程からイオンチャンネルについて患者の遺伝子型を判定し；そして（ｄ）判定工程から精神障害と相関する対立遺伝子バリアントを同定する。この方法を促進するために、患者（および可能ならばその家族）において連鎖調査を実施して、染色体マーカーと疾病状態を相関させることが望ましいであろう。本明細書に提示する染色体位置データは、染色体マーカーによる関連イオンチャンネルの同定を容易にする。
【０２９６】
前記方法を実施して、本発明のイオンチャンネルを、障害の原因であるかまたはヒトをその障害に罹患しやすくする遺伝的要素をもつ多数の障害と相関させることができる。たとえばある好ましい変法において、イオンチャンネルはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２に示すアミノ酸配列ｉｏｎ−７５またはその対立遺伝子バリアントを含む。
【０２９７】
同様に本発明の一部として考慮されるのは、そのような方法で同定した対立遺伝子バリアント配列を含むポリヌクレオチド、およびその対立遺伝子バリアント配列によりコードされるポリペプチド、ならびに同定した変異を含むそのオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドのフラグメントである。そのような材料は、リード化合物および障害を処置するための療法薬を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞および細胞ベースアッセイに有用である。たとえば、前記バリアントを本明細書に記載する活性アッセイ、結合アッセイ、および活性モジュレーターをスクリーニングするアッセイに使用できる。ある好ましい態様において本発明は、前記方法に従って同定したイオンチャンネル対立遺伝子バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む精製および単離されたポリヌクレオチド；ならびにｉｏｎ−ｘ対立遺伝子バリアントをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示す配列から識別する配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むベクター（好ましくは発現ベクター）；および前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換またはトランスフェクションした宿主細胞をも提供する。本発明は、前記の対立遺伝子バリアントイオンチャンネルポリペプチドを発現する単離された細胞系；そのような細胞から精製された細胞膜；精製されたポリペプチド；および前記対立遺伝子バリアントアミノ酸配列を含む合成ペプチドをも提供する。具体的な１態様において本発明は、精神障害に罹患しているヒトのｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む精製されたポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の相補体に下記のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する：（ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション、そして（ｂ）０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液中、６０℃で３０分の洗浄２回；このポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９と少なくとも１残基異なるｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃアミノ酸配列をコードする。
【０２９８】
対立遺伝子バリアントを用いたアッセイ法の一例は、ｉｏｎ−ｘ生物活性のモジュレーターを同定するための、下記の工程を含む方法である：（ａ）対立遺伝子バリアントを発現する細胞を推定モジュレーター化合物の存在下および不存在下で接触させ；（ｂ）細胞におけるｉｏｎ−ｘ生物活性を測定し；そして（ｃ）推定モジュレーターの不存在下に対比して存在下で低下または増強したｉｏｎ−ｘ生物活性からみて推定モジュレーター化合物を同定する。
【０２９９】
本発明の他の特色は下記の実施例から明らかであろう。実施例１、２、１２、および実施例３の一部は実際のものであり、残りの実施例は予測である。本発明の他の特色および変法は、詳細な説明を含めた本明細書全体から当業者に明らかであろう。それらの特色すべてを本発明の態様とする。同様に本明細書に記載する本発明の特色の組合わせを変更して他の態様にすることもでき、その特色の組合わせが本発明の観点または態様として前記に具体的に述べたものであるかどうかにかかわらず、これらも本発明の態様とする。また、本発明に必須なものとして本明細書に記載した限定のみを限定とみなすべきである；必須なものとして本明細書に記載していない限定を含まない本発明の変更は本発明の態様とする。
【０３００】
表５は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列、ならびにこれらの配列のクローニングに有用なプライマー例を含む。”Ｘ”は未知のアミノ酸またはギャップ（アミノ酸が存在しない）を示す。
【０３０１】
【表５−１】
2005532029.tif 000009
【０３０２】
【表５−２】
2005532029.tif 000010
【０３０３】
【表５−３】
2005532029.tif 000011
【０３０４】
【表５−４】
2005532029.tif 000012
【０３０５】
【表５−５】
2005532029.tif 000013
【０３０６】
【表５−６】
2005532029.tif 000014
【０３０７】
【表５−７】
2005532029.tif 000015
【０３０８】
【表５−８】
2005532029.tif 000016
【０３０９】
【表５−９】
2005532029.tif 000017
【０３１０】
【表５−１０】
2005532029.tif 000018
【０３１１】
【表５−１１】
2005532029.tif 000019
【０３１２】
【表５−１２】
2005532029.tif 000020
【０３１３】
【表５−１３】
2005532029.tif 000021
【０３１４】
【表５−１４】
2005532029.tif 000022
【０３１５】
【表５−１５】
2005532029.tif 000023
【０３１６】
【表５−１６】
2005532029.tif 000024
【０３１７】
【表５−１７】
2005532029.tif 000025
【０３１８】
【表５−１８】
2005532029.tif 000026
【０３１９】
【表５−１９】
2005532029.tif 000027
【０３２０】
【表５−２０】
2005532029.tif 000028
【０３２１】
【表５−２１】
2005532029.tif 000029
【０３２２】
【表５−２２】
2005532029.tif 000030
【０３２３】
【表５−２３】
2005532029.tif 000031
【０３２４】
【表５−２４】
2005532029.tif 000032
【０３２５】
【表５−２５】
2005532029.tif 000033
【０３２６】
【表５−２６】
2005532029.tif 000034
【０３２７】
【表５−２７】
2005532029.tif 000035
【実施例】
【０３２８】
実施例
実施例１：ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにおけるイオンチャンネルの同定
検索メカニズムの簡単な説明を以下に示す。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、配列類似性の判定に適する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；その全体を本明細書に援用する）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公開されている。このアルゴリズムは、下記によりまず高評点配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う：データベース配列中の同一長さのワードとアラインした場合、質問配列中において、ある正の数値をもつ閾値評点”Ｔ”と調和するかまたはそれを満たす長さ”Ｗ”の短いワードを同定する。Ｔを近傍ワード評点閾値と呼ぶ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見いだす検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として用いられる。累積アラインメント評点を増加させうる限り、これらのワードヒットを各配列に沿って両方向へ伸長する。下記の場合、各方向へのワードヒットの伸長を中止する：１）累積アラインメント評点がその最大達成値から量Ｘだけはずれた場合；２）１以上のマイナス評点残基アラインメントの蓄積により累積評点がゼロ以下になった場合；または３）いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして、ワード長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１９参照；その全体を本明細書に援用する）アラインメント（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。
【０３２９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７；その全体を本明細書に援用する）およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９−３４０２；その全体を本明細書に援用する）は、２配列間の類似性の統計分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより得られる類似性の１尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起きることを示す確率指標を与える。たとえばイオンチャンネル核酸と比較した被験核酸の最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸はイオンチャンネル遺伝子またはｃＤＮＡに類似するとみなされる。
【０３３０】
Ｃｅｌｅｒａデータベースを、ＮＣＢＩプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９；その全体を本明細書に援用する）により、新規イオンチャンネルを示唆するパターンを見いだすための質問配列としてＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースから得た既知のイオンチャンネルタンパク質配列を用いて検索した。具体的には、ＢＬＡＳＴプログラムの一つであるＴＢＬＡＳＴＮを用いて、タンパク質配列を、６つのリーディングフレームにおいて動的翻訳したＤＮＡデータベースと比較した。あるいは、６つのリーディングフレームにおいて翻訳したそのヌクレオチドデータベースに質問する第２の検索方式を、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，２３５：１５０１−１５３１）を用いて開発した。本明細書中で用いるＨＭＭは、関連タンパク質ファミリーと比較した場合の保存配列の確率分布を表わす。この異なる検索アルゴリズムのため、ＨＭＭを用いると、ＢＬＡＳＴ検索により得られるものと異なる、より関連性があると思われる結果が得られる可能性がある。正のヒットをプログラムＢＬＡＳＴＸによりＮＣＢＩが保持する非重複タンパク質およびヌクレオチドデータベースに対比してさらに分析し、どのヒットが新規イオンチャンネルをコードする可能性が最も高いかを標準（デフォルト）パラメーターを用いて判定した。この検索方式と本発明者らの洞察により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３を候補配列として同定した。
【０３３１】
実施例２：イオンチャンネルのオープンリーディングフレームの検出および一次転写体の推定
一次転写体および成熟ｍＲＮＡの推定を手動で行った。参考文献（すなわちＬｏｄｉｓｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，ＩＳＢＮ：０−７１６７−２３８０−８）にみられるコンセンサス配列、および既知のイオンチャンネルに類似する領域を用いて、イオンチャンネルポリペプチドの一次転写体を見いだした。
【０３３２】
実施例３：イオンチャンネルｃＤＮＡのクローニング
全長イオンチャンネルタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３またはその相補的ヌクレオチド配列の一部に対応するＤＮＡフラグメントを、ファージ、ファージミド、またはプラスミドｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションスクリーニングするためのプローブとして使用できる。これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ反応混合物５０μｌは、ポリメラーゼ混合物（０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液、および０．７５μｌのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、１００ｎｇ〜１μｇのヒトｃＤＮＡ、ならびに５０ｐｍｏｌのフォワードプライマーおよび５０ｐｍｏｌのリバースプライマーを含有する。プライマーは本明細書に提示するヌクレオチド配列に基づいて当業者が容易に設計できる。増幅はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＥ２４００サーモサイクラーにより、たとえば下記のプログラムを用いて実施される：９５℃で１５秒、５２℃で３０秒、および７２℃で９０秒；２５サイクル反復。実際のＰＣＲ条件は、たとえばオリゴヌクレオチドプライマーの物理的特性およびＰＣＲ生成物の長さに依存するであろう。増幅生成物をプラスミドからアガロースゲル電気泳動により分離し、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）により精製することができる。
【０３３３】
ライブラリーＺＡＰＩＩファージベクター中へクローニングしたｃＤＮＡを含むラムダファージライブラリーを大腸菌ＸＬ−１  ｂｌｕｅ宿主と共に、１５ｃｍのＬＢ−寒天プレートにプレート当たり５０，０００ｐｆｕの密度で接種し、３７℃で一夜増殖させる；（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（前掲）に従って接種）。ファージプラークをナイロン膜に移し（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｂｏｎｄ  ＮＪ）、変性溶液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で２分間変性させ、再生溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で５分間再生し、２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ  ＮａＣｌ，０．３Ｍクエン酸ナトリウム）中で短時間洗浄する。フィルターメンブランを乾燥させ、８０℃で１２０分間インキュベートして、ファージＤＮＡをメンブランに架橋させる。
【０３３４】
メンブランを前記に従って調製したＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ランダムプライミング（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、製造業者の指示に従って、ＤＮＡフラグメント（２５ｎｇ）をα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ）で標識する。取り込まなかったヌクレオチドからＳ２００スピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により標識ＤＮＡを分離し、９５℃で５分間変性させ、氷上に保存する。ＤＮＡを含むメンブラン（前記）を５０ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）溶液中、６８℃で９０分間、プレハイブリダイズさせる。次いで標識ＤＮＡプローブをハイブリダイゼーション溶液に添加し、プローブを６８℃で７０分間、メンブランにハイブリダイズさせる。メンブランを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、４２℃でそれぞれ５分間、５回洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで３０分間洗浄する。増感スクリーンを用いてフィルターをＫｏｄａｋ  ＸＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，米国ニューヨーク州ロチェスター）に−８０℃で１６時間露光する。１つの陽性コロニーをプレートから単離し、１５ｃｍのＬＢプレートに約１０００ｐｆｕで再接種する。接種、フィルターへのプラークのリフト、およびハイブリダイゼーションを前記に従って実施する。この二次スクリーニングで約４つの陽性ファージプラークを単離できる。
【０３３５】
単離ファージおよびＥｘｃｉｓｉｏｎヘルパーファージを同時感染させたＸＬ−１  ｂｌｕｅ細胞の培養により、ｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−）を単離ファージからｉｎ  ｖｉｖｏ切除により開放する；製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の記載に従う。プラスミドを含むＸＬ−１細胞をＬＢプレートに接種し、３７℃で１６時間増殖させる。各プレートからのコロニー（１８）をＬＢプレートに再接種し、増殖させる。各プレートから１つのコロニーをナイロンフィルターに秩序アレイ状に植え付け、フィルターをＬＢプレートに乗せてコロニーを増殖させる。フィルターを前記に従って標識プローブとハイブリダイズさせる。約３つの陽性コロニーを選択し、ＬＢ培地で増殖させる。これらの３コロニーからＱｕｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）により、製造業者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを単離する。挿入サイズを確定する制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩでプラスミドを消化することにより、挿入配列のサイズを決定する。
【０３３６】
ＡＢＩ３７７蛍光ベースシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＰＥ／ＡＢＤ，カリフォルニア州フォスターシティー）、およびＴａｇ  ＦＳＴＭポリメラーゼ付きのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）Ｒｅａｄｙ  Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキットを用いて、これらのクローンを直接配列決定する。各ＡＢＩサイクルの配列分析反応は、約０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含む。下記によりサイクル配列分析を実施する：９８℃で１分の初期変性、続いて下記のパラメーターで５０サイクル：９８℃で３０秒、５０℃で３０秒のアニーリング、そして６０℃で４分の伸長。温度サイクルおよび時間をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラーにより制御する。Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘ（商標）ゲル濾過カートリッジ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，メリーランド州ガイザースバーグ）を用いて伸長生成物を精製する。各反応生成物をピペットでカラムに装填し、スインギングバケット遠心機（ＳｏｒｖａｌｌモデルＲＴ６０００Ｂ卓上型遠心機）により１５００×ｇで４分間、室温において遠心分離する。カラム精製試料を約４０分間真空乾燥し、５μｌのＤＮＡ装填溶液（８３％の脱イオンホルムアミド、８．３ｍＭのＥＤＴＡ、および１．６ｍｇ／ｍｌのＢｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ）に溶解する。試料を９０℃に３分間加熱し、ＡＢＩ３７７シークエンサーによる配列分析のためにゲル試料ウェルに装填する。ＡＢＩ３７７ファイルをシークエンサープログラム（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，ミシガン州アンアーバー）にインポートすることにより配列分析を実施する。一般に、約７００ｂｐまでの配列の読出しが得られる。両方のＤＮＡ鎖から情報を得ることにより、また困難な領域は異なる位置でアニーリングするプライマーを用いてすべての配列決定のあいまいさが除かれるまで反復配列決定することにより、配列分析潜在誤差を最小限に抑える。
【０３３７】
ｉｏｎ３１
ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲＲ（特許出願中）ｃＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにより、本明細書にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として示したｉｏｎ３１の配列を用いて、全長と思われるクローンを単離した。ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲＲ  Ｓｙｓｔｅｍは、ｃＤＮＡライブラリー（１０１２のＤＮＡ分子を含む）より調製したＤＮＡからｃＤＮＡクローンを単離する。このシステムでは、ターゲットｃＤＮＡのセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドの３’末端をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によりビオチン−１４−ｄＣＴＰでビオチニル化する。同時に、ｃＤＮＡ挿入配列を含む複雑な二本鎖ファージミドＤＮＡ集団（それぞれ１０６〜１０７のメンバー）を、Ｇｅｎｅ  ＩＩ（ファージＦ１エンドヌクレアーゼ）および（大腸菌）エキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ  ＩＩＩ）により一本鎖ＤＮＡに変換する。ビオチニル化オリゴヌクレオチドと一本鎖ＤＮＡのハイブリッドを溶液中で形成し、次いでストレプトアビジンコーティングした常磁性ビーズに捕獲させる。磁石を用いて溶液から常磁性ビーズを回収すると、ハイブリダイズしていない一本鎖ＤＮＡが残る。次いで、捕獲された一本鎖ＤＮＡターゲットを、常磁性ビーズに結合したままのビオチニル化オリゴヌクレオチドから離脱させる。離脱後、回収された一本鎖ＤＮＡターゲットから二本鎖ＤＮＡへの変換を特異的に開始する非ビオチニル化ターゲットオリゴヌクレオチドを用いて、目的とするｃＤＮＡクローンをさらに富化する。形質転換および平板培養の後、一般に２０〜１００％のコロニーが目的とするｃＤＮＡクローンである。
【０３３８】
ｉｏｎ３１について、ビオチニル化オリゴヌクレオチドは下記の配列をもつ：
ＴＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）。
下記の配列をもつＰＣＲプライマー：
５’ＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）および
３’ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）
を、製造業者の指示に従ってライブラリースクリーニングおよびコロニースクリーニングに用いた。
【０３３９】
全長と思われる２つのクローン、ｉｏｎ３１ｄ６およびｉｏｎ３１ｃ４をこの方法で単離した。これら２クローンを配列決定して、表５および添付の配列表に示すヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）および推定アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）を得た。
【０３４０】
これらのクローンの分析により、特許出願中の出願Ｎｏ．６０／２５５，６９２（２０００年１２月１５日出願；その全体を本明細書に援用する）に出願したｉｏｎ１、ならびに本明細書に記載するｉｏｎ３１、ｉｏｎ５１、ｉｏｎ５２、ｉｏｎ１１０、およびｉｏｎ１１１に対する高い相同性が明らかになる。
【０３４１】
ゲノム構造
５ＨＴ−３ａ遺伝子の既知の構造（Ｂｒｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０００  Ｊａｎ  ４；３９（２）：３０８−１５）を用いて５ＨＴ−３受容体相同体のゲノム構造を決定した。この構造を利用し、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）の一部である”ｅｓｔ２ｇｅｎｏｍｅ”プログラムを用いて、ｃＤＮＡクローンのエキソンを推定した。デフォルトパラメーターを用いてこのプログラムを実行した。
【０３４２】
ｉｏｎ３１ｃ４クローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）の配列を個別のエキソンに分割し、利用できるすべてのゲノムおよびＥＳＴデータベースの検索にこれらを用いた（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９）。デフォルトパラメーター付きｂｌａｓｔｎアルゴリズムを用いて検索を行った。高評点ゲノムフラグメントをＣｅｌｅｒａおよび公開ゲノムデータベースにおいて同定した。これらのフラグメントの配列をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒプログラム（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）により再生およびアセンブルした。得られたコンティグをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４と比較した。２つのコンティグが大部分の５ＨＴ−３受容体遺伝子配列を含んでいた。これらのコンティグをそれぞれ５’および３’と命名した。５’および３’コンティグは新規かつユニークであり、いずれのデータベース中にも存在しなかった。エキソン２に対応するゲノム配列は、いずれのゲノムデータベース中にも存在しなかった。２つのコンティグの配列を１つに結合し、ギャップの位置を示す”Ｎ”を挿入した。結合したコンティグの中間に推定エキソン２の配列を挿入し、ギャップ（Ｎのストリングとして示す）を隣接させて、ゲノム配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）を得た。この配列を、ｅｓｔ２ｇｅｎｏｍｅプログラムによりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４と比較した。出力ファイルをフォーマティングし、ゲノムブラウザープログラム”Ａｒｔｅｍｉｓ”（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）に挿入し、イントロン／エキソン境界を手動で調節した。この分析の最終結果を前記の表５および添付の配列表に示す。
【０３４３】
別形態の推定ゲノム配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１として前記に示す。推定タンパク質配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２として示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５の推定ｃＤＮＡによりコードされる：これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８および１２９で構成される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２のアミノ酸配列酸配列は、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６の推定ｃＤＮＡによりコードされる：これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３の一部、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、１２５、１２６、１２７、１２８および１２９で構成される。既知の５−ＨＴ受容体との相同性に基づいて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２の最初の３３個のアミノ酸（ＭＬＡＦＩＬＳＲＡＴＰＲＰＡＬＧＰＬＳＹＲＥＨＲＶＡＬＬＨＬＴＨＳ）はタンパク質を適切な細胞コンパートメント中へターゲティングするシグナルペプチドであると推定された。
【０３４４】
実施例４：ノーザンブロット分析
イオンチャンネル発現パターンは、種々のタイプの細胞および組織からのｍＲＮＡのノーザンブロット分析により判定できる。一般に、そのような細胞または組織から単離されたｍＲＮＡの”ブロット”を標準法により調製し、あるいは業者から購入し、次いでイオンチャンネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのフラグメントであるヌクレオチドプローブを用いて検査する。
【０３４５】
当業者には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に由来するセンスおよびアンチセンス配向のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて適切なプローブを作製するための標準ＰＣＲプロトコルは周知である。ＰＣＲ処理においては、分析に際して検出できるように、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ（商標）ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてα−３２Ｐ−ｄＣＴＰによりプローブを放射性標識する。プローブをＮｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりさらに精製する。
【０３４６】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得られる多重ヒト組織ノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ  ＩＩ＃７７６７−１）をプローブとのハイブリダイゼーション反応に用いて、どの組織がイオンチャンネルを発現するかを判定する。４２℃で４時間、５×ＳＳＣ、１×デンハート試薬、０．１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２５０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中においてプレハイブリダイゼーションを実施する。約１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを添加した同混合物中において、４２℃で一夜、ハイブリダイゼーションを実施する。４２℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において、フィルターを数回洗浄する。増感スクリーンを用いてフィルターをＫｏｄａｋ  ＸＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，米国ニューヨーク州ロチェスター）に−８０℃で１６時間露光すると、ｍＲＮＡ発現を分析できる。
【０３４７】
実施例５：哺乳動物細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現
１．ＨＥＫ−２９３細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現
哺乳動物細胞ＨＥＫ−２９３細胞（トランスフォームしたヒト一次胚性腎細胞）におけるイオンチャンネルポリペプチド発現のために、ベクターｐＣＤＮＡ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて関連イオンチャンネルコード配列を保有するプラスミドを調製する。ベクターｐＣＤＮＡ６は、ＣＭＶプロモーター、および安定形質転換細胞を選択するためのブラスチサイジン耐性遺伝子を含む。たとえば異なるプロモーター、タンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグ、ならびに耐性遺伝子を含む、他の多数のベクターを使用できる。このイオンチャンネルポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーは当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、イオンチャンネルｃＤＮＡ配列中に存在しない制限クローニング部位、たとえばＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、およびそのイオンチャンネルヌクレオチド配列に一致するヌクレオチドを導入するための５’側伸長ヌクレオチドを含む。リバースプライマーも当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、イオンチャンネルｃＤＮＡ配列中に存在しない制限クローニング部位、たとえばＸｈｏＩ制限部位、およびそのイオンチャンネルヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを導入するための５’側伸長ヌクレオチドを含む。ＰＣＲ条件は、オリゴヌクレオチドプライマーの物理的特性およびイオンチャンネル遺伝子の長さにより決まる。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングする。
【０３４８】
プラスミドＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎプラスミドｍｉｎｉ−ｐｒｅｐキットにより精製し、たとえばＨＥＫ−２９３細胞中へＤＯＴＡＰトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナ州インディアナポリス）を用いてトランスフェクションする。２４〜４８時間後、一過性トランスフェクションした細胞のイオンチャンネルの活性および発現を、確立された電気生理学的方法により検査する；ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，編者Ｄ．Ｉ．Ｗａｌｌｉｓ，オックスフォード大学出版社ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、およびＶＯＬＴＡＧＥ  ＡＮＤ  ＰＡＴＣＨ  ＣＬＡＭＰＩＮＧ  ＷＩＴＨ  ＭＩＣＲＯＥＬＥＣＴＲＯＤＥＳ，ＴＧ  Ｓｍｉｔｈ，Ｈ  Ｌｅｃａｒ，ＳＪ  Ｒｅｄｍａｎ  ａｎｄ  ＰＷ  Ｇａｇｅ，編，米国生理学会Ｗａｖｅｒｌｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）。これはイオンチャンネル活性を解明できる１手段を提供する。
【０３４９】
ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムにより精製し、ＨＥＫ−２９３細胞中へＤＯＴＡＰトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナ州インディアナポリス）を用いてトランスフェクションする。トランスフェクションの２４時間後、一過性トランスフェクションした細胞の発現を、抗−Ｈｉｓ抗体および抗イオンチャンネルペプチド抗体により検査するウェスタンブロットにより調べる。永久トランスフェクションした細胞をＺｅｏｃｉｎで選択し、増殖させる。組換えタンパク質の産生を細胞と培地の両方から、抗−Ｈｉｓ、抗−Ｍｙｃまたは抗−イオンチャンネルペプチド抗体で検査するウェスタンブロットにより検出する。
【０３５０】
２．ＣＯＳ細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現
ＣＯＳ細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド分子またはその相補的ヌクレオチド配列を、ベクターｐ３−ＣＩ中へクローニングできる。このベクターはｐＵＣ１８由来のプラスミドであり、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列の上流に位置するＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）イントロン、および多重クローニング部位を含む。さらに、このプラスミドは、薬物メトトレキサン（ＭＴＸ）の存在下で安定形質転換細胞の選択のための選択を可能にするｄｈｒｆ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子を含む。たとえば異なるプロモーター、タンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグ、ならびに耐性遺伝子を含む、他の多数のベクターを使用できる。
【０３５１】
フォワードプライマーは当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、クローニングのためのＸｂａＩ制限部位を導入する５’側伸長配列、続いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドまたはその一部を含む。リバースプライマーも当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、ＳａｌＩクローニング部位を導入する５’側伸長ヌクレオチド、続いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドまたはその一部を含む。
【０３５２】
ＰＣＲは、９５℃で５分の初期変性；９５℃で３０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリング、そして７２℃で３０秒の伸長を３０サイクル；続いて７２℃で５分の伸長からなる。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ベクターｐ３−ＣＩのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位にライゲートする。この構築体を増幅およびＤＮＡ精製のために大腸菌細胞に形質転換する。ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムで精製し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）により製造業者のプロトコルに従ってＣＯＳ  ７細胞中へトランスフェクションする。トランスフェクションの４８および７２時間後、培地および細胞を組換えタンパク質発現について検査する。
【０３５３】
培養ＣＯＳ細胞において発現したイオンチャンネルポリペプチドは、細胞をホモジナイゼーションにより破壊し、遠心分離により膜を精製し、適切な界面活性剤によりタンパク質を可溶化し、そしてタンパク質をたとえばクロマトグラフィーにより精製することによって精製できる。精製したイオンチャンネルを、ＹＭ−１０メンブラン付きＡｍｉｃｏｎ濃縮装置で０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃に保存する。
【０３５４】
実施例６：昆虫細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現
バキュロウイルス系におけるイオンチャンネルポリペプチド発現のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３よりなる群から選択される配列をもつポリヌクレオチド分子またはその一部もしくは相補体をＰＣＲにより増幅する。フォワードプライマーは当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、ＮｄｅＩクローニング部位を付加する５’側伸長配列、続いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドまたはその一部を含む。リバースプライマーも当技術分野で周知の方法により決定され、好ましくは、ＫｐｎＩクローニング部位を導入する５’側伸長配列、続いてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３に示すヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドまたはその一部を含む。
【０３５５】
ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてベクターｐＡＣＨＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）の対応する部位にクローニングする。ｐＡｃＨＴＬ発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、および多重クローニング部位上流の１０ＸＨｉｓタグを含む。リン酸化のためのプロテインキナーゼ部位および組換えタンパク質切除のためのトロンビン部位も多重クローニング部位の前に存在する。もちろんｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに、他の多数のバキュロウイルスベクター、たとえばｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１も使用できる。イオンチャンネルポリペプチドの発現のための他の適切なベクターも、それらのベクター構築体が必要に応じて適切な位置に転写、翻訳および転送のためのシグナル配列、たとえば読み枠の一致したＡＵＧおよびシグナルペプチドを含む限り使用できる。そのようなベクターは、特にＬｕｃｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８９，１７０，３１−３９に記載されている。
【０３５６】
標準的なバキュロウイルス発現法、たとえばＳｕｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，バキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養操作のための方法の手引き書，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載の方法により、ウイルスを増殖および単離する。
【０３５７】
ある好ましい態様においては、イオンチャンネルポリペプチドをコードする遺伝子を含むｐＡｃＨＬＴ−Ａを、”ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ”トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）により、製造業者が提示する方法でバキュロウイルスに導入する。感染の２４時間後に感染細胞を３５Ｓ−メチオニンで放射性標識することにより、個々のウイルス単離体をタンパク質産生について分析する。感染の４８時間後に感染細胞を収穫し、標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーにより視覚化する。高い発現レベルを示すウイルスを単離し、規模を拡大した発現に使用することができる。
【０３５８】
Ｓｆ９昆虫細胞におけるイオンチャンネルポリペプチド発現のために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、１０４、１０７、１０８、１１８、１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３〜１２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３の配列をもつポリヌクレオチド分子またはその一部を、バキュロウイルス発現に関する前記のプライマーおよび方法を用いてＰＣＲにより増幅する。イオンチャンネルポリペプチドをコードするｃＤＮＡ挿入配列を、ベクターｐＡｃＨＬＴ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のＮｄｅＩ部位とＫｐｎＩ部位の間にクローニングする（内部ＮｄｅＩ部位を除去した後）。ＤＮＡをＱｕｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムにより精製する。精製していないプラークを、予備ウェスタンブロット実験により、ポリ−Ｈｉｓタグ抗体と反応する予想サイズの組換えタンパク質の存在について検査する。イオンチャンネルポリペプチドは膜統合タンパク質であるので、界面活性剤抽出によりタンパク質試料の調製を容易にする。さらにＨｉＧ５昆虫細胞において精製および発現最適化した後、結果を確認する。
【０３５９】
実施例７：相互作用トラップ／ツーハイブリッドシステム
イオンチャンネルポリペプチド相互作用タンパク質をアッセイするために、相互作用トラップ／ツーハイブリッドライブラリースクリーニング法を採用できる。このアッセイ法は最初にＦｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，２４５に記載された；その全体を本明細書に援用する。プロトコルは下記に公表されている：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９２，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク；両者の全体を本明細書に援用する。キットはＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）から入手できる（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３）。
【０３６０】
イオンチャンネルポリペプチドの全部または一部をコードするヌクレオチド配列と酵母転写因子ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）の融合体を、適切なプラスミド（すなわちｐＧＢＫＴ７）中に標準的サブクローニング法により構築する。同様にＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーを、第２プラスミド（すなわちｐＧＡＤＴ７）中に潜在イオンチャンネルポリペプチド結合タンパク質のｃＤＮＡから構築する（ｃＤＮＡライブラリー作製に関するプロトコルについてはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲、参照）。ＤＮＡ−ＢＤ／イオンチャンネル融合構築体を配列決定により確認し、自律レポーター遺伝子活性化および細胞毒性について検査する；これらは両者ともツーハイブリッド分析の達成を妨害する。ＡＤ／ライブラリー融合構築体について同様な対照試験を実施して、宿主細胞における発現を確認し、転写活性がないことを確認する。酵母細胞を、標準プロトコル（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，前掲）に従ってイオンチャンネルおよびライブラリー両方の融合プラスミドで形質転換する（約１０５の形質転換体／ｍｇ  ＤＮＡ）。ＤＮＡ−ＢＤ／イオンチャンネルとＡＤ／ライブラリータンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ結合により、特異的な酵母プラスミドレポーター遺伝子（すなわちｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）が転写される。酵母細胞を栄養欠乏培地に接種して、レポーター遺伝子の発現をスクリーニングする。コロニーを、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）補充培地中で増殖させた際のβ−ガラクトシダーゼ活性について二重アッセイする（β−ガラクトシダーゼ活性のフィルターアッセイはＢｒｅｅｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１９８５，５０，６４３に記載されており、その全体を本明細書に援用する）。陽性ＡＤ−ライブラリープラスミドを形質転換体から開放し、元の酵母株、および無関係なＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を含む他の株に再導入して、特異的なイオンチャンネルポリペプチド／ライブラリータンパク質相互作用を確認する。挿入ＤＮＡを配列決定して、ＧＡＬ４  ＡＤに融合したオープンリーディングフレームの存在を確認し、イオンチャンネルポリペプチド結合タンパク質の同一性を判定する。
【０３６１】
実施例８：イオンチャンネルポリペプチドに関するタンパク質−タンパク質相互作用のＦＲＥＴ分析
イオンチャンネルポリペプチド相互作用タンパク質をアッセイするためには、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法を採用できる。このタイプのアッセイ法の例はＭａｈａｊａｎ  ＮＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５４７に記載されており、その全体を本明細書に援用する。このアッセイ法は、適切な励起／発光特性をもつ２種類の蛍光性部分を接近させると、励起されたドナー発蛍光団がそのエネルギーをアクセプター発蛍光団に転移することができるという事実に基づき、その発光を測定する。ドナーの発光スペクトルはアクセプターの吸光スペクトルと重ならなければならないが、それぞれ２つの吸光スペクトル間の重なりおよび２つの発光スペクトル間の重なりは最小限に抑えるべきである。有用なドナー／アクセプター対の例は、Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＰ）／Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＹＦＰ）である（Ｔｓｉｅｎ，ＲＹ（１９９８），Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７，５０９−５４４；その全体を本明細書に援用する）。
【０３６２】
イオンチャンネルポリペプチド全部または一部をコードするヌクレオチド配列とＣＦＰの融合体を、適切なプラスミド中に、標準的なサブクローニング法により構築する。同様に、可能性のある相互作用ターゲットタンパク質のＹＦＰ融合体をコードするヌクレオチドを、第２プラスミド中に構築する。ＣＦＰ／イオンチャンネルポリペプチド融合構築体を配列決定により証明する。ＹＦＰ／ターゲットタンパク質構築体について同様なコントロールを実施する。各タンパク質の発現を蛍光法（たとえば蛍光顕微鏡検査または蛍光分光法）によりモニターできる。標準法に従って、宿主細胞をＣＦＰ／イオンチャンネルポリペプチドとＹＦＰ／ターゲットタンパク質の両方の融合プラスミドで形質転換する。ＣＦＰ発蛍光団の励起後にＹＦＰ発蛍光団をモニターすることにより、ＣＦＰ／イオンチャンネルポリペプチドとＹＦＰ／ターゲットタンパク質のｉｎ  ｓｉｔｕ相互作用を検出する。蛍光は蛍光顕微鏡検査または蛍光分光法によりをモニターされる。さらに、たとえば外部刺激による相互作用の変化を時間分解蛍光法により判定する。
【０３６３】
あるいは、潜在イオンチャンネルポリペプチド結合タンパク質のｃＤＮＡからＹＦＰ融合ライブラリーを構築できる（ｃＤＮＡライブラリー作製に関するプロトコルについてはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲、参照）。宿主細胞をＣＦＰ／イオンチャンネルポリペプチドとＹＦＰ融合ライブラリーの両方のプラスミドで形質転換する。次いでＦＲＥＴを示すクローンを単離し、ＹＦＰ／ターゲット融合タンパク質をコードするＤＮＡの開放および配列決定により、イオンチャンネルポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定する。
【０３６４】
実施例９：イオンチャンネル活性のモデュレーターを同定するためのアッセイ法
イオンチャンネル活性のモデュレーター（アゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するための、限定ではない幾つかのアッセイ法を以下に示す。以下のアッセイ法は一般にカルシウムフラックスを測定するが、他のイオンの測定も実施できると考えられる。これらのアッセイ法により同定できるモデュレーターには、イオンチャンネルの天然リガンド化合物；天然リガンドの合成類似体および誘導体；抗体、抗体フラグメント、および／または天然抗体もしくは抗体様コンビナトリアルライブラリーに由来する抗体様化合物；ならびに／あるいはライブラリーのハイスループットスクリーニングにより同定した合成化合物；などである。イオンチャンネルを結合するすべてのモデュレーターが、組織試料中のそのようなイオンチャンネルの同定に有用である（たとえば診断用、病態生理学用など）。アゴニストおよびアンタゴニストモデュレーターは、異常なイオンチャンネルレベルを特色とする疾病状態を処置するために、イオンチャンネル活性のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションにそれぞれ有用である。アッセイは、単一の推定モデュレーターを用いて実施し、および／または既知のアゴニストを候補アンタゴニストと組み合わせて用いて（またはその逆）実施することができる。
【０３６５】
Ａ．エクオリンアッセイ法
１アッセイ法においては、細胞（たとえばＣＨＯ細胞）をイオンチャンネル発現構築体および発光タンパク質アポエクオリンをコードする構築体の両方で一過性共トランスフェクションする。補因子コエレンテラジンの存在下で、アポエクオリンは細胞内（細胞質）遊離カルシウムの量に比例した測定可能なルミネセンスを発する。（全般的に下記を参照：Ｃｏｂｂｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，”細胞質遊離カルシウムのエクオリン測定”：ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  Ｊ．Ｇ．ａｎｄ  Ｃｏｂｂｏｌｄ，Ｐ．Ｈ．，編，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＣＡＬＣＩＵＭ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，オックスフォード：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｓｔａｂｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５２：１１５−２６（１９９７）；およびＨａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，第６版；Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９６））；それぞれの全体を本明細書に援用する。
【０３６６】
１アッセイ例においては、イオンチャンネル核酸を市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へサブクローニングし、発光タンパク質アポエクオリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）をコードする構築体と一緒に、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品同封物として提供されるトランスフェクションプロトコルにより、ＣＨＯ細胞中へ一過性共トランスフェクションする。
【０３６７】
細胞を３７℃で２４時間、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，メリーランド州ガイザースバーグ）培養し、その時点で５μＭのコエレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含有する無血清ＭＥＭに培地を交換する。次いで３７℃でさらに２時間、培養を続ける。その後、ＶＥＲＳＥＮＥ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）により細胞をプレートから脱着し、洗浄し、無血清ＭＥＭに２００，０００個／ｍｌで再懸濁する。
【０３６８】
無血清ＭＥＭ中に候補イオンチャンネルモデュレーター化合物の希釈液を調製し、不透明な９６ウェルアッセイプレートのウェルに５０μｌ／ウェルで分注する。次いでプレートをＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，バージニア州シャンティリー）に載せる。５０μｌの細胞懸濁液を各ウェルに１回で１ウェルずつ分注するように計測器をプログラミングし、直ちに１５秒間、ルミネセンスを読みとる。それぞれの光信号ピークの曲線下面積を用いて、候補モデュレーターの用量−応答曲線を作成する。データをＳｌｅｄｅＷｒｉｔｅにより１部位リガンドに関する方程式を用いて分析し、ＥＣ５０値を求める。ルミネセンスの変化を生じた化合物をモデュレーター活性の候補とみなす。
【０３６９】
Ｂ．ＦＬＩＰＲを用いた細胞内カルシウム測定
細胞内カルシウム濃度の変化はイオンチャンネル活性について認識されている他の指標であり、そのようなアッセイ法を用いてイオンチャンネル活性のモデュレーターをスクリーニングできる。たとえば、イオンチャンネル発現ベクターで安定トランスフェクションしたＣＨＯ細胞を、プレートの種々のウェルから発せられる蛍光信号を識別するために特別に設計されたＰａｃｋａｒｄ黒壁９６ウェルプレートに４×１０４個／ウェルの密度で接種する。３６ｍｇ／Ｌのピルビン酸および１ｇ／Ｌのグルコースを含有し、さらに１％のウシ胎仔血清および４種類のカルシウム指示薬色素（Ｆｌｕｏ−３（商標）ＡＭ、Ｆｌｕｏ−４（商標）ＡＭ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）−１  ＡＭ、またはＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８  ＢＡＰＴＡ−１  ＡＭ）のうち１種類（それぞれ４μＭの濃度）を添加した改変ダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中、３７℃で６０分間、細胞をインキュベートする。１％のウシ胎仔血清を含有しない改変Ｄ−ＰＢＳでプレートを１回洗浄し、３７℃で１０分間インキュベートして、残留色素を細胞膜から除去する。さらに、カルシウム応答を活性化する直前に、１％のウシ胎仔血清を含有しない改変Ｄ−ＰＢＳで一連の洗浄を行う。
【０３７０】
１種類以上の候補受容体アゴニスト化合物、カルシウムイオノホアＡ２３１８７（１０μＭ；陽性対照）、またはＡＴＰ（４μＭ；陽性対照）の添加により、カルシウム応答を開始する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅのアルゴンレーザー付きＦＬＩＰＲ（４８８ｎｍで励起）により蛍光を測定する（たとえばＫｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４（１）：１４−２０（１９９８）参照）。検出器カメラのＦ−ｓｔｏｐを２．５に設定し、露光時間を０．４ミリ秒とした。候補アゴニスト、ＡＴＰまたはＡ２３１８７の添加前に細胞の基礎蛍光を２０秒間測定し、応答信号からこの基礎蛍光レベルを差し引いた。カルシウム信号を約２００秒間測定し、２秒毎に読みとる。カルシウムイオノホアＡ２３１８７およびＡＴＰは、カルシウム信号をベースラインより２００％増強する。
【０３７１】
Ｃ．細胞外酸性化速度
さらに他のアッセイにおいて、被験化合物により誘発される細胞外ｐＨの変化をモニターすることによって、イオンチャンネル活性の候補モデュレーターの作用をアッセイする（たとえばＤｕｎｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０（１）：４７−５５（１９９８）参照）。１態様においては、イオンチャンネル発現ベクターでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を、１２ｍｍのカプセルカップ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中、４×１０５個／カップで接種する。細胞を、この培地中、３７℃で５％ＣＯ２中において２４時間インキュベートする。
【０３７２】
Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒマイクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）により細胞外酸性化速度を測定する。カプセルカップをマイクロフィジオメーターのセンサーチャンバーに装入し、チャンバーにランニング緩衝液（バイカーボネートを含有しないＭＥＭ：４ｍＭのＬ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２６ｍＭのＮａＣｌを補充）を１００μｌ／分の流速で潅流する。候補アゴニストまたは他の薬剤をランニング緩衝液中に希釈し、第２流路を通して潅流する。各６０秒のポンプサイクル中、ポンプを３８秒間運転し、残りの２２秒間は停止する。センサーチャンバー内のランニング緩衝液のｐＨを、サイクル中４３秒から５８秒まで記録し、６０秒目にポンプを再始動して次のサイクルを開始する。記録時間内のランニング緩衝液の酸性化速度をＣｙｔｏｓｏｆｔプログラムにより計算する。モデュレーター候補添加後の最高速度測定値からベースライン値（モデュレーター候補添加直前の４回の速度測定値の平均）を差し引くことにより、酸性化速度の変化を計算する。選択した計測器は、６１ｍＶ／ｐＨ単位を検出する。イオンチャンネルのアゴニストとして作用するモデュレーターは、アゴニスト不存在下での速度と比較して細胞外酸性化速度を高める。この応答は、イオンチャンネルのアンタゴニストとして作用するモデュレーターにより遮断される。
【０３７３】
実施例１０：ＦＬＩＰＲを用いたイオンチャンネルモデュレーターのハイスループットスクリーニング
イオンチャンネルポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための１方法は、ＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、蛍光イメージングプレートリーダー）システムを用いるものである。このシステムは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤｒ．Ｖｉｎｃｅ  Ｇｒｏｐｐｉが、たとえば膜電位を測定する細胞ベースのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを実施するために開発した。細胞膜電位の変化は、細胞内または外へのイオンの移動に伴うイオンチャンネルの調節と相関する。ＦＬＩＰＲシステムは膜電位のそのような変化を測定する。これは、イオンチャンネル遺伝子を発現する細胞に、膜電位の変化を測定するのに適した細胞膜透過性蛍光指示薬色素、たとえばｄｉＢＡＣ（ビス−（１，３−ジブチルバルビツール酸）ペンタメチンオキソノール、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を添加することにより達成される。したがって、イオンチャンネル活性の調節は、ｄｉＢＡＣ色素の発光スペクトルの変化としてＦＬＩＰＲにより評価および検出できる。
【０３７４】
一例として、目的のイオンチャンネル遺伝子でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞をｄｉＢＡＣに浸漬する。細胞内に内因性カリウムチャンネルとトランスフェクションチャンネルの両方が存在するため、３０ｍＭの細胞外カリウムの添加により膜の脱分極が起き、その結果、細胞によるｄｉＢＡＣ取込みが増加し、したがって蛍光が全般的に増強する。細胞をカリウムチャンネル開放物質、たとえばクロマカリム（ｃｈｒｏｍａｋａｌｉｍ）で処理すると、膜は過分極し、ｄｉＢＡＣの正味流出が起き、したがって蛍光が減少する。こうして、このアッセイ法により未知の被験化合物が膜電位に及ぼす影響を評価できる。
【０３７５】
実施例１１：キメラ受容体
リガンドの天然受容体活性を容易に測定できない場合、キメラ受容体を用いてリガンド結合の活性を測定できる。そのようなキメラは、１つの受容体のリガンド結合ドメインが他の受容体のポア形成ドメインに融合したものからなっていてもよい。そのようなキメラの有用な例はＷＯ００／７３４３１  Ａ２にみることができる。
【０３７６】
ｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）のポア形成膜貫通ドメインを、たとえばα７ニコチン性アセチルコリン受容体の細胞外ドメインと融合させて、α７受容体リガンドに結合するがｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃのように電流を通すキメラ受容体を形成することができる。このキメラを作製するために、α７受容体（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６２４３６）の５’側領域を３’末端プライマー上のｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃとオーバーラップして増幅するＰＣＲプライマーを設計する。
【０３７７】
適切なｃＤＮＡクローンを鋳型として用い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，メリーランド州ガイザースバーグ）を使用して、製造業者の指示に従ってＰＣＲを実施する。次いでこれら２つの反応からのＰＣＲ生成物を１：１０００希釈し、スプライス−オーバーラップＰＣＲにより最終キメラｃＤＮＡを作製するために適切に設計されたプライマーを含む第２ＰＣＲ混合物中にプールする。これらのプライマーはまた、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へのサブクローニングを容易にするために、ＥｃｏＲＩ制限部位を５’末端に、ＮｏｔＩ部位を３’末端に付加される。ＰＣＲ生成物をｐｃＤＮＡ３．１中へライゲートし、コンピテント大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，メリーランド州ガイザースバーグ）中へ形質転換する。アンピシリン含有培地で選択した孤立大腸菌コロニーを単離して増殖させる。大腸菌中のプラスミド由来ＤＮＡを単離し、配列決定して予想配列が得られたことを確認する。次いでこのＤＮＡをカチオン性脂質トランスフェクション試薬によりＳＨ−ＥＰ１細胞などの哺乳動物細胞中へ形質転換する。安定形質転換された細胞を８００μｇ／ｍｌのジェネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）の存在下で選択する。次いでこれらの細胞を前記に従って、リガンド、たとえばニコチンに応答した細胞内カルシウムの変化または膜電位の変化についてアッセイする。
【０３７８】
実施例１２：組織発現プロファイリング
ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、下記のものを含有する１００μＬの反応混合物中でのＰＣＲにより、ｉｏｎ３１およびｉｏｎ５２の組織発現プロファイリングを調べた：各０．５ｍＭのフォワードおよびリバースプライマー、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、０．５ｍｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ならびに５単位のＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００サーモサイクラーにおいて下記のサーモサイクリング条件を採用：９５℃で１０分を１サイクル；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を３５サイクル；７２℃で１０分を１サイクル；続いて４℃でソーキング。
【０３７９】
０．５ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上、Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ＥＤＴＡランニング緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で移動させて、生成物を分析する。ヒト組織ｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡは、ＯｒｉＧｅｎｅ（メリーランド州ロックビル）から入手したパネルであった。
【０３８０】
ｉｏｎ３１
ｉｏｎ３１の発現を検出するために用いたフォワードプライマーは下記のものであり：
５’ＧＣＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）
リバースプライマーは下記のものであった：
５’ＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）。
【０３８１】
ｉｏｎ３１  ｍＲＮＡは、精巣、網膜、肺、脳、胎児脳、筋肉、腎臓および小腸を含めた組織中に検出された。これは、ｉｏｎ３１の活性を調節する化合物が下記を含めた疾患（これらに限定されない）の処置に有用である可能性を示す：アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、不安、片頭痛、てんかん、肥満症、双極性障害その他の情動障害、炎症性腸疾患、下痢または便秘、喘息、関節炎、白血病およびリンパ腫、神経変性、網膜変性、再狭窄、心不整脈、糖尿病、毛髪生育、高血圧、疼痛、ならびに化学療法または制吐による悪心。
【０３８２】
ｉｏｎ５２
ｉｏｎ５２の発現を検出するために用いたフォワードプライマーは下記のものであり：
ＴＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）
リバースプライマーは下記のものであった：
ＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）。
【０３８３】
ｉｏｎ５２  ｍＲＮＡは、脳、胎児脳、心臓、腎臓、肺、小腸、筋肉、脾臓、末梢血白血球、精巣および網膜を含めた組織中に検出された。これは、ｉｏｎ５２の活性を調節する化合物が下記を含めた疾患（これらに限定されない）の処置に有用な可能性を示す：アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、不安、片頭痛、てんかん、肥満症、双極性障害その他の情動障害、炎症性腸疾患、下痢または便秘、喘息、関節炎、白血病およびリンパ腫、神経変性、網膜変性、再狭窄、心不整脈、糖尿病、毛髪生育、高血圧、疼痛、ならびに化学療法または制吐による悪心。
【０３８４】
他のｉｏｎ−ｘをコードするｃＤＮＡの組織特異的発現を同様な方法で達成できる。
実施例１３：セロトニン受容体３様遺伝子５ＨＴ−３Ｃおよび５ＨＴ−３−ｌｏｎｇの組織および細胞系発現に関するＴａｑｍａｎ（登録商標）分析
組織および細胞系のＲＮＡのＴａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ分析により、推定遺伝子の発現を調べた。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ分析は、二重標識蛍光原プローブの使用により各ＰＣＲサイクルの試料増幅を測定できる。プローブを消光色素とレポーター色素の両方に結合させる。各ＰＣＲサイクルの伸長に際して、アニールしたプローブはＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりレポーター色素から開裂する。これによりレポーター色素は消光色素から離脱し、検出可能な蛍光増強が生じる。したがって蛍光の増強はターゲットの増幅と相関する。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイはＰＣＲアッセイであるので、低濃度のターゲットＤＮＡに対してもきわめて高感度である。さらに、このアッセイの条件を高特異性に設計するのは容易であり、一塩基置換でＰＣＲ増幅は阻止される。Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲアッセイにより、ｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃおよびｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃ  ｌｏｎｇを高感度で特異的にスクリーニングできる。本発明者らが設計したプライマーおよびプローブは、両方の形の遺伝子を検出できる。
【０３８５】
材料および試薬
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイに下記の材料および試薬を用いた：０．２ｍｌのＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学試験管（Ｃａ＃Ｎ８０１−０９３３，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；光学キャップ（Ｃａ＃Ｎ８０１−０９３５，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマー（Ｃａ＃４３０４９７１，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ（Ｃａ＃４５００２５，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｔａｑｍａｎ（登録商標）万能ＰＣＲマスターミックス（Ｃａ＃４３０４４３７，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ  ＲＴ（Ｃａ＃１８０６４−０１４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｄＮＴＰミックスＰＣＲグレード（Ｃａ＃１８４２７−０１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ランダムプライマー（Ｃａ＃４８１９０−０１１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；改変イーグル培地（Ｃａ＃１１０９０−０８１，Ｇｉｂｃｏ）；ダルベッコ改変イーグル培地（Ｃａ＃１２３７５−０４８，Ｇｉｂｃｏ）；ウシ胎仔血清、検定済み（Ｃａ＃１６０００−０４４，Ｇｉｂｃｏ）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）試薬（Ｃａ＃１０９６４−０１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）試薬（Ｃａ＃１８３２４−０１２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；およびＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｃａ＃１５１４２，ＱＵＩＡＧＥＮ）。
【０３８６】
細胞
Ｃａｃｏ−２細胞（腸細胞系）は、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持された。未分化Ｃａｃｏ−２細胞を周密状態に達したとき継代した。未分化細胞を周密後、継代せずに２〜３週間増殖させると（培地を２〜３日毎に交換）、分化したＣａｃｏ−２細胞が得られた。ＨＥＫ  ２９３細胞は、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および１０Ｕ／ｍｌ−１０μｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に維持された。すべての細胞を３７℃、５．０％ＣＯ２、９５％湿度で増殖させた。
【０３８７】
細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ  ２９３細胞を、５μｇの推定５ＨＴ−３Ｃ鋳型ＤＮＡで、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸を含有する無血清ＭＥＭ中において、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（商標）プロトコルに従って一過性トランスフェクションした。トランスフェクション体を３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を前記に従って維持した。４８時間後、細胞からＲＮＡを単離した。
【０３８８】
ＲＮＡおよびｃＤＮＡ
組織由来の全ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡは、下記のもの以外はＣｌｏｎｔｅｃｈから購入された：小腸ＲＮＡの１試料はＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入され、色素上皮および網膜全ＲＮＡはＰｈａｒｍａｃｉａで調製され、ここから入手された。全ＳＷ４８０  ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈから得られた。
【０３８９】
分化および未分化Ｃａｃｏ−２細胞ならびに一過性トランスフェクションしたＨＥＫ  ２９３細胞からの全ＲＮＡを、ＱＵＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミディキットにより、製造業者のプロトコルに従って調製した。
【０３９０】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ分析
プローブおよびプライマーの設計
５ＨＴ−３Ｃおよび５ＨＴ−３Ｄ  Ｃｅｌｅｒａ推定配列に対するＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーの初期セットを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １．０プライマー設計ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により作製した。プローブおよびプライマーの最終セットを、Ｌｉｖａｋ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：１４３−１４９，１９９９）の指針に基づいて選択した。ＦＡＭレポーター色素およびＴａｍｒａ消光色素で二重標識したプローブとして、オリゴ体をＡｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに注文した。
【０３９１】
ｃＤＮＡ合成
２μｇの全ＲＮＡまたは０．２μｇのポリＡ  ＲＮＡならびに１μｇのランダムプライマーを６５℃で１０分間変性した（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）。プライマーの伸長を、３７℃で１時間、１×１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、６．７ｍＭのＤＴＴ、３３３μＭのｄＮＴＰ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下に、全容量３０μｌで実施した。６５℃で１０分間の加熱により反応を停止した。陰性対照をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素の不存在下で（−ＲＴ）実施した。ｃＤＮＡを直ちにＴａｑｍａｎ（登録商標）分析に用いた、または−２０℃で保存した。
【０３９２】
ＰＣＲ反応条件
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ分析を、２μｌのｃＤＮＡ反応、陰性対照反応（−ＲＴ）、またはＨ２Ｏで、全容量２５μｌの１×Ｔａｑｍａｎ（登録商標）緩衝液（Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中において、５０〜４００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを用いて実施した。リアルタイムＰＣＲを実施し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。下記の温度プログラムを用いた：５０℃で２分、９５℃で１０分、そして９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル。
【０３９３】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイの開発
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを５ＨＴ−３Ｃおよび５ＨＴ−３Ｃ−ｌｏｎｇ配列の検出に用いた。前記に従って近位および遠位５ＨＴ−３Ｃプローブ（それぞれ５ＨＴ−３Ｃプローブ１および２）を設計した。このプライマー／プローブを下記に示す。フランキング配列から区別するために、プローブおよびプライマーの配列に下線を施した。セット１プライマー  プローブ中の星印はスプライス部位を示す。プローブ配列は太字のものである。
【０３９４】
プライマー  プローブ  セット１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）
【０３９５】
【化４】
2005532029.tif 000036
【０３９６】
プライマー  プローブ  セット２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）
【０３９７】
【化５】
2005532029.tif 000037
【０３９８】
両プライマー／プローブセットを、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ反応における機能について、５ＨＴ−３ＣベクターＤＮＡおよび５ＨＴ−３Ｃ発現ＲＮＡを用いて試験した。推定５ＨＴ−３Ｃ配列を含むｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ６発現ベクターで一過性トランスフェクションしたＨＥＫ  ２９３細胞から、ＲＮＡを単離した。この単離されたＲＮＡ上で一本鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。試料の潜在汚染またはＰＣＲ反応中の異常増幅に対する対照とするために、逆転写酵素を用いない反応（−ＲＴ）を並行して実施した。いずれの５ＨＴ−３ＣプローブについてのＴａｑｍａｎ（登録商標）分析も、ベクターＤＮＡおよび生成ｃＤＮＡの顕著な増幅を示したが、陰性対照は鋳型を用いないＰＣＲ反応と同等レベルで増幅した。したがって、プローブの機能およびＲＮＡの統合性が共に確認された。鋳型を用いない対照および逆転写酵素を用いない対照における低い増幅は、ＰＣＲ試薬の低濃度の汚染またはプライマー／プローブセット固有の特性によるものと思われる。
【０３９９】
５ＨＴ−３ＣベクターＤＮＡのＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ分析にはシグナル飽和があったので、飽和せずに最高シグナルが得られるようにアッセイ条件を最適化した。５０〜４００ｎＭのプローブ濃度および２００〜４００ｎＭのプライマー濃度を試験した。より高いプローブ濃度はより高い最終シグナル強度と相関し、わずかに低いサイクルで閾値に達した。しかし２００ｎＭ以上のプローブ濃度はプラトーに達しない傾向があった。これらの結果は、両５ＨＴ−３Ｃプローブについて類似していた。したがって、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲによる組織および細胞系ｃＤＮＡのスクリーニングは、１４０ｎＭのプローブ濃度および３００ｎＭのプライマー濃度を用いて行われた。
【０４００】
５−ＨＴ３Ｃおよび５−ＨＴ３−ｌｏｎｇの組織発現
プライマー／プローブセットが最適化されると、入手できる組織ｃＤＮＡをｉｏｎ５ＨＴ−３Ｃおよびｉｏｎ５ＨＴ−３Ｃ−ｌｏｎｇの発現についてプローブ１によりスクリーニングした。組織ｃＤＮＡの５ＨＴ−３Ｃ分析から、脳における存在が低く、小腸における存在が高いことが示唆された（表６）。ｉｏｎ５ＨＴ−３Ｃおよびｉｏｎ５ＨＴ−３Ｃ−ｌｏｎｇの発現が検出されたことは、それらが偽遺伝子またはクローニングの人工産物ではなく機能性遺伝子として存在することを支持する。リアルタイムＰＣＲを用いた場合、プライマー／プローブセットが相同遺伝子配列を検出するわずかな可能性がしばしばある。この問題に対処するために、発現を確認するプローブ２で小腸試料をアッセイした。
【０４０１】
【表６】
2005532029.tif 000038
【０４０２】
５ＨＴ−３Ｃおよび５ＨＴ−３−ｌｏｎｇの細胞系発現
５ＨＴ−３Ｃおよび／または５ＨＴ−３−ｌｏｎｇを内因性発現する細胞を同定するために、細胞系ＲＮＡ（ｃＤＮＡによる）をセロトニン受容体様遺伝子の発現についてＴａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイによりスクリーニングした。小腸で有意の５ＨＴ−３Ｃ発現があるのは明らかなので、ヒト結腸直腸腺癌細胞系ＳＷ４８０およびＣａｃｏ−２を発現についてＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ分析によりまず試験した。単離した分化および未分化Ｃａｃｏ−２全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、ＳＷ４８０全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をこの目的のために購入した。５ＨＴ−３Ｃおよび／または５ＨＴ−３−ｌｏｎｇ発現を、ＳＷ４８０細胞および分化したＣａｃｏ−２細胞の両方において、プローブ１により検出した。未分化Ｃａｃｏ−２細胞の５ＨＴ−３Ｃおよび／または５ＨＴ−３−ｌｏｎｇ発現レベルははるかに低く、反復実験において必ずしも常には検出できなかった。
【０４０３】
結論
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを、既知の５ＨＴ−３受容体サブユニットに相同なｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃおよびｉｏｎ−５ＨＴ−３Ｃ  ｌｏｎｇ遺伝子発現の検出に合わせて、両配列を認識するプライマー  プローブセットを用いて調整した。
【０４０４】
このアッセイは、これらの配列が腸の機能に関与することを示唆する。小腸では一方または両方の形が発現する。将来の特性解明を補助するために、５ＨＴ−３Ｃを内因性発現する細胞系を同定した。分化したＣａｃｏ−２細胞およびＳＷ４８０細胞は５ＨＴ−３Ｃを発現する。したがってこのアッセイ法は、薬物開発のための受容体機能評価に際して５ＨＴ−３Ｃ発現が有用な工程であることを証明できた。
【０４０５】
小腸における５ＨＴ−３Ｃ発現は、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、下痢、便秘、悪心、嘔吐を含めた症状にこれが関与することを示す。５ＨＴ−３アンタゴニストである薬物オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ，Ｚｏｆｒａｎ）は過敏性腸症候群に用いられている。本発明の５ＨＴ−３Ｃおよび５ＨＴ−３Ｃ  ｌｏｎｇ遺伝子、ならびにそれらをアゴニストおよびアンタゴニストの同定に利用するアッセイ法は、潜在的に副作用の少ないより具体的な化合物を同定するためのきわめて有用なツールである。
【０４０６】
本発明の精神から逸脱することなく本発明の好ましい態様を多様に変更および改変できることは、当業者に理解されるであろう。そのようなすべての変更が本発明の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用した各刊行物の内容全体を本明細書に援用する。