(57)【要約】本発明は、スラミンまたはその誘導体を実際の感染部位または潜在的な感染部位に局所投与することによってSTDを阻害する方法、およびスラミンまたはその誘導体を腟内に局所適用することによって妊娠を阻止する方法に関する。抗菌剤および/または精子機能阻害剤を含むスラミン組成物も提供され、本発明の方法において有利に使用することができる。STDの阻害および妊娠の阻止を同時に行う方法も提供される。さらに、局所用スラミン組成物を注入またはコーティングした装置が開示され、本明細書に記載の組成物を適用するのに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラミンまたはその誘導体を膣に適用する段階を含む、性感染症の伝播を阻害する方法。
【請求項２】
界面活性剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および陰イオン界面活性剤からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p-ジイソブチフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、オニクスオール、アルキルスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルケトン、塩化セチルピリミジニウム、および塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤がソルビタンモノラウレートである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
性感染症が細菌により引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
細菌が、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、肉芽腫カリマトバクテリウム、性器マイコプラスマ、およびウレアプラズマ-ウレアリチカムからなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
性感染症がウイルスにより引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項９】
界面活性剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
スラミンが粘膜部位に局所適用される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
粘膜部位が、膣腔、直腸腔、および口腔からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
粘膜部位または皮膚表面が、外陰、肛門周囲、肛門の内層、および陰茎の粘膜部位または皮膚表面である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスが、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、およびB型肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが、HTLV-1、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、およびB型肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
性感染症が、カンジダアルビカンスおよび膣トリコモナスからなる群より選択される微生物により引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
性感染症が、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、淋菌、およびトラコーマ病原体からなる群より選択される微生物により引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
抗菌剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
抗菌剤が、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、および抗原生動物剤からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
抗菌剤が抗ウイルス剤である、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
抗ウイルス剤が抗HIV-1活性を有する、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
スラミンまたはその誘導体を局所適用する段階を含む、細菌により引き起こされる性感染症の伝播を阻害する方法。
【請求項２２】
細菌が、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、肉芽腫カリマトバクテリウム、性器マイコプラスマ、およびウレアプラズマ-ウレアリチカムからなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
界面活性剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
スラミンが粘膜部位に局所適用される、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
粘膜部位が、膣腔、直腸腔、および口腔からなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
粘膜部位または皮膚表面が、外陰、肛門周囲、肛門の内層、および陰茎の粘膜部位または皮膚表面である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
抗細菌剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
精子-卵の受精を阻害するのに有効な量のスラミンまたはその誘導体を膣に投与する段階を含む、避妊方法。
【請求項２９】
界面活性剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
精子機能阻害剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および陰イオン界面活性剤からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p-ジイソブチフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、オニクスオール、アルキルスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルケトン、塩化セチルピリミジニウム、および塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
界面活性剤がソルビタンモノラウレートである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
殺精子剤または精子機能阻害剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
スラミンが、液体、ローション、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、リポソーム、ゲル、泡、フィルム、スプレー、軟膏、ペッサリー、坐剤、カプセル、錠剤、ゼリー、クリームの形で適用される、請求項28記載の方法。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体、ならびに性感染症の伝播の阻害および精子-卵の受精の阻害に有効な量の界面活性剤およびスラミンまたはその誘導体のいずれかを含む、局所用組成物。
【請求項３７】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および陰イオン界面活性剤からなる群より選択される、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p-ジイソブチフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、オニクスオール、アルキルスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルケトン、塩化セチルピリミジニウム、および塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
膣に挿入するように適合させられ、界面活性剤およびスラミンまたはその誘導体のいずれかを含む組成物が注入またはコーティングされた固体支持体を含む、スラミンを膣または子宮に投与する装置。
【請求項４０】
固体支持体が、スポンジ、子宮頸キャップ、ペッサリー、および子宮内器具からなる群より選択される、請求項39記載の装置。
【請求項４１】
性感染症の阻害および精子-卵の受精の阻害を同時に行う方法であって、性感染症および精子-卵の受精の阻害に有効な量のスラミンを含む組成物を、雌の腟内、子宮頸、または子宮に投与する段階であって、該性感染症は、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、肉芽腫カリマトバクテリウム、性器マイコプラスマ、ウレアプラズマ-ウレアリチカム、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、膣トリコモナス、およびカンジダアルビカンスからなる群より選択される微生物により引き起こされる、段階を含む、方法。
【請求項４２】
微生物が、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、淋菌、およびトラコーマ病原体からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
界面活性剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
界面活性剤が、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、または陰イオン界面活性剤である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p-ジイソブチフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、オニクスオール、アルキルスルホン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキルケトン、塩化セチルピリミジニウム、および塩化ベンザルコニウムからなる群より選択される、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
界面活性剤がソルビタンモノラウレートである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
精子機能阻害剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
抗菌剤を同時投与する段階をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４９】
抗菌剤が抗ウイルス剤である、請求項49記載の方法。
【請求項５０】
抗ウイルス剤が抗HIV-1活性を有する、請求項49記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2002年3月26日に出願された米国特許仮出願第60/367,273号の利益を主張する。米国特許仮出願第60/367,273号はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究または開発に関する記載
本発明は、米国国際開発庁(USAID)とイースタンバージニア医科大学(EVMS)との協力協定として設立された避妊薬研究開発(Contraceptive Research and Development:CONRAD)プログラム(助成金番号HRN-A-00-98-00020-00)によって一部資金提供を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本発明は、一般的に、局所用製剤におけるスラミンおよびその誘導体、ならびに性感染症(STD)および受胎を阻止するための殺菌避妊薬としてのそれらの使用に関する。本発明によれば、スラミンおよびその誘導体は強力な抗STD病原体活性を示し、抗精子活性を示し、単独でまたは他の精子機能阻害剤(殺精子剤を含む)および/または他の抗菌剤(抗ウイルス剤を含む)と併用して有効な膣用避妊殺菌剤を構成することが本明細書において発見された。
【０００４】
STD有病率の増加は、先進国および発展途上国に影響を及ぼす重大な公衆衛生問題である。発展途上国では、後天性免疫不全症候群(AIDS)の流行がヒトの生命に甚大な被害をもたらしている。資金不足、人口過剰、およびコンドームの普及を妨げる文化習慣の制約により、これらの国々ではヒト免疫不全症ウイルス(HIV)感染者の数が著しく増加し、場合によっては生殖可能な年齢の人口の1/3に達する。性感染病原体(特に、HIV)および受胎に対して有効な、安全で予防可能な女性で管理できる薬剤の開発が緊急に必要とされている。
【０００５】
非イオン界面活性剤であるノノキシノール(Nonoxynol)-9(N-9)は、現在、米国市場においてFDAにより認可されている唯一の殺精子剤である。カナダおよび欧州では、塩化ベンザルコニウムなどの他の界面活性剤が殺精子製剤の一部として利用されている。これらの界面活性剤は脂質に影響を及ぼすことによって抗HIV活性をインビトロで示し、ウイルスエンベロープを破壊し、ウイルスを不活化する。残念なことに、これらの界面活性剤は単独では、インビボで、N-9ではっきりと証明されたような有意な保護をもたらすように見えない。いくつかのN-9臨床試験からHIV感染の発生率は低下しないことが分かっている(Rowe,Lancet.,349:1074 1997;Hiraら,Int J.STD AIDS.,8(4)243-50 1997;Martinら,Sex.Transm.Dis.,24(5):279-283,1997;Roddyら,N.Engl.J.Med.,339(8):504-10 1998;Van Dammeら,Lancet.,360(9338):971-7 2002)。それどころか、N-9は、生殖器炎症(Staffordら,J.Acquir Immune Defic Syndr.Hum.Retrovirol.17(4):327-31 1998)、尿路感染(Fihnら,Am.J.Epidemiol.,144(5):512-20 1996)、陰門膣カンジダ症(GeigerおよびFoxman,Epidemiology.,7(2):182-7 1996)、ならびに生殖器潰瘍(Feldblum,Genitourin Med.,72(6):451-2 1996)のリスクを実際に高めることが証明されている。最近の研究(Fichorovaら,J.Infect.Dis.,184(4):418-28 2001)から、N-9は膣上皮に対して細胞傷害性であり、炎症誘発性サイトカインの放出を誘導し、その結果としてHIVの標的である免疫細胞を動員し、従って、HIVの組織侵入を促進することが明らかになっている。
【０００６】
これらの理由から、粘膜および粘膜のミクロフローラに無害で、HIVおよび他のSTD病原体(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、淋菌(NG)、およびトラコーマ病原体(CT))に有効であり、同時に避妊を行う局所用製剤の開発が引き続き必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
スラミンまたはその誘導体を含む組成物は避妊薬として有効であり、性感染症の伝播の阻害に有効であることが発見された。従って、性感染症の伝播を阻害する方法および避妊方法が提供される。スラミンまたはその誘導体を含む組成物、およびこのような組成物がコーティングまたは注入された装置も本明細書で提供される。
【０００８】
本発明の第1の局面において、性感染症の伝播を阻害する方法が提供される。1つの形では、方法は、スラミンまたはその誘導体を局所に、好ましくは膣に適用する段階を含む。本発明のある形では、組成物においてスラミンと1種類またはそれ以上の種類の抗菌剤が同時投与されてもよい。
【０００９】
本発明の第2の局面において、避妊方法が提供される。1つの態様では、方法は、精子-卵の受精を阻害し、従って、妊娠を阻止するのに有効な量のスラミンまたはその誘導体を膣に投与する段階を含む。ある態様では、スラミンは、1種類またはそれ以上の種類の抗菌剤および/または精子機能阻害剤と共に同時投与されてもよい。
【００１０】
本発明の第3の局面において、性感染症の伝播および精子-卵の受精を阻害するのに有利に使用することができる局所用組成物が提供される。1つの態様では、組成物は、薬学的に許容される担体、ならびに性感染症の伝播の阻害および精子-卵の受精の阻害に有効な量の界面活性剤およびスラミンまたはその誘導体のいずれかを含む。
【００１１】
本発明の第4の局面において、スラミンを膣または子宮に投与する装置が提供される。1つの態様では、装置は、膣に挿入するように合わせられた固体支持体を含む。有利なことに、支持体には、界面活性剤およびスラミンまたはその誘導体のいずれかを含む組成物が注入またはコーティングされている。
【００１２】
本発明の第5の局面において、性感染症の阻害および精子-卵の受精の阻害を同時に行う方法が提供される。1つの形では、方法は、性感染症および精子-卵の受精を阻害するのに有効な量のスラミンを含む組成物を、雌哺乳動物の腟内、子宮頸、または子宮に投与する段階を含む。性感染症は、微生物(例えば、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、肉芽腫カリマトバクテリウム、性器マイコプラスマ、およびウレアプラズマ-ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、膣トリコモナス、およびカンジダアルビカンス)により引き起こされうる。
【００１３】
好ましい態様の説明
局所用製剤におけるスラミンおよびその誘導体には、STD感染の伝播を阻害し、精子-卵の受精(すなわち、精子による卵の受精)の可能性を低くする複合的な効果があることが発見された。出願人らは、スラミンおよびその誘導体の局所投与がSTDの伝播の阻害および妊娠の阻止に有効であることを発見した。
【００１４】
本発明の第一の局面において、性感染症の伝播を阻害する方法が提供される。1つの形では、方法は、スラミンまたはその誘導体を局所適用するか、または一般的には感染部位に投与する段階を含む。
【００１５】
スラミンは、8,8'-(カルボニルbis(イミノ-3,1-フェニレンカルボニルイミノ(4-メチル-3,1-フェニレン)カルボニルイミノ))bis-1,3,5-ナフタレントリスルホン酸)の化学名を有するポリスルホン化ナフチル尿素である。スラミンの6ナトリウム塩の構造を図1に示す。スラミンは市販されており、以下の化学名および商品名:アントリポール、バイエル205、フォルノー309、ゲルマニン、モラニル(Moranyl)、ナガノール(Naganol)、ナガニン(Naganin)、スラミン、ナフリドナトリウム(Naphuride Sodium)でも知られている。スラミンは、様々な成長因子のインビボ活性ならびに自己免疫疾患およびアレルゲン疾患を阻害し(米国特許第5,158,940号)、強力な逆転写酵素(RT)阻害活性を有し(Jentschら,J.Gen.Virol.,68:2183-2192 1987)、抗増殖活性を有する(Nakajimaら,J.Biol.Chem.,266(15):9661-6 1991)ことが以前に示されている。
【００１６】
本明細書で使用する「スラミン」は、スラミンならびにSTD感染の阻害および精子-卵の受精の阻害に有効なその薬学的に許容される塩の両方を含むものとする。薬学的に許容される塩として、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、他の無毒な金属、アンモニウムおよび置換アンモニウム塩(例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、アンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、ピリジニウムおよび置換ピリジニウム塩)が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、スラミンの6ナトリウム塩が用いられる。
【００１７】
スラミンの「誘導体」(類似体)が当技術分野において周知であり、例えば、Jentschら,J.Gen.Virol.,68:2183-2192(1987)ならびに米国特許第5,173,509号および同第6,121,320号(両方とも全体が参照として本明細書に組み入れられる)に記載のものを含む。他の既知のスラミン誘導体が、例えば、米国特許第6,121,320号(スラミンのNF110、NF032、NF201、NF023、およびNF103誘導体について述べている)ならびにFirsching-Hauckら,Anticancer Drugs 11(2):69-77(2000)およびGagliardiら,Cancer Chemother.Pharmacol.41(2):117-24(1998)に記載されている。誘導体は当業者に周知の方法(例えば、Nickel Pら,Arzneim.-Forsch.36,1153-1157(1986)に記載の方法を含む)によって合成することができる。
【００１８】
スラミンまたはその誘導体と本明細書に記載の他の活性な薬剤との併用によって、相乗作用的な相互作用が得られることが予期せずに発見された。従って、本発明のさらに別の態様では、本明細書に記載の性感染症の伝播を阻害する方法は、スラミンおよび1種類またはそれ以上の種類の活性な薬剤を含む組成物を局所適用する段階を含む。本明細書で定義される活性な薬剤は、抗菌剤、または抗STD病原体活性を示す他の薬剤を含む。活性な薬剤はまた、例えば、精子を殺傷することによって、および/もしくは精子の機能を不活化することによって、または精子の活性に及ぼす他の作用によって、精子の機能を阻害することができる、精子による卵の受精を阻害することができる、および/または妊娠を阻止することができる精子機能阻害剤でもよい。活性な薬剤は少なくとも2つの機能を有してもよい(例えば、精子機能阻害剤および抗菌剤として作用してもよい)。
【００１９】
抗菌剤は、藻類、細菌、菌類、寄生生物(蠕虫、原生動物)、ウイルス、およびサブウイルス病原体に対して活性があるものでもよい。従って、抗菌剤は、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生生物剤、および抗原生動物剤でもよい。抗菌剤は、好ましくは、性感染症などの感染症に対して活性がある。このような疾患を引き起こす微生物(およびこのような微生物によって引き起こされる疾患)の例として、淋菌(淋病);トラコーマ病原体(クラミジア感染症、性病性リンパ肉芽腫);梅毒トレポネーマ(梅毒);軟性下疳菌(軟性下疳);肉芽腫カリマトバクテリウム(ドノヴァン症(donovanosis))、性器マイコプラスマ、ならびにウレアプラズマ-ウレアリチカム(マイコプラズマ症);ヒト免疫不全症ウイルスHIV-1およびHIV-2(HIV、AIDS);HTLV-1(Tリンパ球向性ウイルス1型);単純ヘルペスウイルス1型および2型(HSV-1およびHSV-2);エプスタイン-バーウイルス;サイトメガロウイルス;ヒトヘルペスウイルス6;水痘帯状疱疹ウイルス;ヒトパピローマウイルス(性器いぼ);A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス(ウイルス性肝炎);膣トリコモナス(トリコモナス症);ならびに酵母(例えば、カンジダアルビカンス(外陰膣カンジダ症)が挙げられる。抗菌剤はまた、体液が接触することにより伝播する(性的接触によっても伝播する可能性のある)、本発明の組成物の投与によって阻止可能な他の疾患に対して活性があるものでもよい。従って、句「性感染症(STD)」は、生殖器官が、結果として生じる病変部位であろうとなかろうと、性的接触の過程で伝播可能な任意の疾患を含むと本明細書で解釈される。
【００２０】
適切な抗ウイルス剤として、例えば、本明細書に記載の非イオンイオン界面活性剤、陰イオンイオン界面活性剤、および陽イオン界面活性剤、ならびにC31G(アミンオキシドおよびアルキルベタイン)、ポリビグアニド、ドコサノール、アシルカルニチン類似体、オクチルグリセロール、ならびに抗菌性ペプチド(例えば、マガイニン、グラミシジン、プロテグリン、およびレトロサイクリン)などのウイルス不活化剤が挙げられる。本明細書に記載の組成物に含まれる抗ウイルス剤として、穏やかな界面活性剤を有利に使用することができる。1つの態様では、STD感染を阻害するためのスラミン組成物は、STD原因微生物を、スラミンと同じ機構によって阻害しない抗ウイルス性界面活性剤を含む。より好ましくは、抗ウイルス性界面活性剤はソルビタンモノラウレートである。本明細書に記載の組成物に有利に使用することができる他の抗ウイルス剤として、ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体(例えば、テノフォビル、アシクロビル、アマンタジン、ジダノシン、フォスカーネット、ガンシクロビル、リバビリン、ビダラビン、ザルシタビン、およびジドブジン)が挙げられる。使用することができるさらなる抗ウイルス剤として、UC-781(チオカルボキサニリド)、ピリジノン、TIBO、ネバリピン、デラビルジン、カラノリドA、カプラビリン、およびエファビレンツなどの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が挙げられる。HIVの性的伝播を阻止するために、これらの逆転写酵素阻害剤に由来する十分な経口バイオアベイラビリティを示さない薬剤およびその類似体がスラミンと併用した膣投与に特に適している。スラミンと併用することができる他の抗ウイルス剤は、HIV侵入ブロッカー(HIV entry blocker)(例えば、シアノビリン-N、クリクロデキストリン(clyclodextrin)、カレギーナン(carregeenan)、硫酸化またはスルホン化ポリマー、マンデル酸縮合ポリマー、モノクローナル抗体、ケモカイン受容体アンタゴニスト(例えば、TAK-779、SCH-C/D、およびAMD-3100))、ならびに融合阻害剤(例えば、T-20および1249)の部類に入るものである。
【００２１】
適切な抗細菌剤として、アミノグリコシド、セファロスポリン(第一世代、第二世代、および第三世代セファロスポリンを含む);マクロライド(エリスロマイシンを含む)、ペニシリン(天然ペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、アミノペニシリン、広域ペニシリンを含む);スルホンアミド、テトラサイクリン、フルオロキノロン、メトロニダゾール、および尿路防腐薬などの抗生物質が挙げられる。
【００２２】
適切な抗真菌剤として、アンフォテリシンB、ナイスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン、フルコナゾール、ヨウ化カリウム、イントラコナゾール、クロルチマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、およびトルナフテートが挙げられる。
【００２３】
適切な抗原生動物剤として、抗マラリア剤(例えば、クロロキン、プリマキン、ピリメタミン、キニーネ、ファンシダール、およびメフロキン);殺アメーバ薬(例えば、ジオロキサニド、エメチン、ヨードキノール、メトロニダゾール、パロモマイシン、およびキナクリン);イセチオン酸ペンタミジン、アトバコン(atovaquone)、およびエフロルニチン(eflornithine)が挙げられる。
【００２４】
本明細書に記載の方法によれば、本発明のスラミン組成物は、組成物を局所に(一般的に、感染部位に)送達することによって投与または適用される。感染部位は、既に感染している部位(実際の感染部位)でもよく、感染している可能性が高い部位(非感染個体の内部または表面の潜在的な感染部位)でもよい。従って、組成物は、目的の部位の皮膚もしくは粘膜または目的の部位を取り囲む皮膚もしくは粘膜に接触させることによって、外陰(膣腔を含む)、陰茎、ならびに肛門直腸腔および口腔に局所送達することができる。粘膜表面または皮膚表面は、肛門周囲および肛門の内層をさらに含んでもよい。例えば、STD感染を阻害する場合、本発明のスラミン組成物は、性的行為間のSTD感染を阻止するために、膣腔、肛門直腸腔、または口腔を含む任意の潜在的な感染部位または実際の感染部位に接触させることによって投与することができる。膣腔に投与する場合、組成物は、子宮(子宮内部を含む)ならびに子宮頸(子宮頸内膜および子宮膣部の粘膜および/または内層を含む)の任意の部分にも適用することができる。さらに、潤滑剤として処方された場合、組成物は、不適切な潤滑から生じる微小外傷を減らすために外性器および内部粘膜表面に適用することができ、外傷のある、罹患した、または健康な皮膚または粘膜を介した、生きたSTD病原体の伝播も阻止する。
【００２５】
薬学的組成物の用量は、好ましくは、1回またはそれ以上の薬学的投与単位で構成される。選択された用量は、本明細書に記載の方法を含む任意の既知の用量投与法によって(例えば、膣、直腸、または子宮に適用する場合、坐剤またはゲルとして)、哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。例えば、スラミン組成物は、潤滑剤(例えば、スポンジ、子宮頸キャップ、タンポン、ペッサリー、もしくは子宮内器具を含む装置に付着した潤滑剤)として適用することによって、または坐剤、潅注液、腔坐剤(ovule)、ゲル、または他の制御送達装置として組成物を適用することによって腟内に送達することができる。組成物をコンドームの表面に配置すると、組成物の一部が粘膜表面に移動し、粘膜表面をある程度保護することができるが、このような用途の主な利点はコンドーム使用者の保護を含む。スラミン組成物は、当業者に周知の子宮内器具(IUD)を含む子宮内送達装置によって子宮の任意の部分に適用することができる。当業者に周知の塗布器(例えば、殺精子ゲルまたは抗酵母化合物を送達するために現在、商業的に用いられている塗布器)も、組成物を腟内に送達するのに使用することができる。
【００２６】
一般的に、STD感染の阻害または阻止に有効な量のスラミン組成物が投与される。この量は、スラミンを必要とする哺乳動物に投与する場合、STD感染の伝播を阻害するのに十分なスラミンの量を意味すると意図される。言い換えると、この用量は、侵入部位でSTD感染を阻止するのに、またはSTD原因微生物の複製を阻止するのに有効な量である。STD感染の伝播を阻害する場合、スラミンの有効量は、侵入のブロックまたは感染部位での複製の停止によって阻害しようとするSTD原因微生物などの要因によって変化してもよい。例えば、本発明のスラミン組成物は、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)(HIV-1およびHIV-2を含むが、これに限定されない)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、淋菌(NG)、およびトラコーマ病原体(CT)を阻害するように適切に処方される。好ましくは、スラミンの有効量は、当業者に周知であり、本明細書に記載の潜在的なSTD原因微生物全ての伝播を阻害するのに有効な量である。これらの量は異なってもよいが、スラミンは、一般的に、約0.1％(製剤1グラムにつきスラミン1mg)〜約30％(300mg/g)、好ましくは約1％(10mg/g)〜約5％(50mg/g)の量で適用されるか、または送達システムがこれらのパーセント濃度(w/v)を維持するのに十分なスラミンを放出する方法で適用される。抗菌剤と共に組成物に存在する場合、適用される組成物に含まれるスラミンの量はまた、使用される特定の抗菌剤を基準にして変化し、当業者により容易に決定することができる。組成物に含まれる抗菌剤の量は、例えば、関与する疾患の種類および組成物に含まれるスラミンの量によって変化し、これも当業者により容易に決定することができる。これらの量は、STD個体またはSTD個体と性的接触しようと考えている個体に投与することができる。
【００２７】
本発明の方法において参照される「阻害」または「阻害する」は、少なくとも、未処置個体と比較した、特定の活動の発生または流行の減少を意味すると意図される。これらの用語は、哺乳動物における予防的もしくは防止的な処置、または未処置哺乳動物と比較した症状の発生の減少を含んでもよい。STD感染の伝播の「阻害」は、性的接触前または性的接触直後に個体を処置した結果としての、未処置個体と比較したSTD感染の伝播の減少を意味する。このような場合、特定の作用機構に限定されないが、STD伝播は、STD感染を引き起こす微生物を感染部位で中和することによって阻害してもよく、または感染部位で微生物の複製を阻止することによって阻害してもよい。STD感染は、STD感染するほど十分に接触した少なくとも2人の間で阻害される。例えば、性的接触に関与した2人の間のSTD感染または母子間のSTD感染(垂直伝播)を阻害することができる。
【００２８】
本発明の方法によって多種多様なSTD感染を阻害することができる。例えば、スラミンおよび本明細書に記載の組成物は、藻類、細菌、菌類、寄生生物(蠕虫、原生動物)、ウイルス、およびサブウイルス病原体の部類に入る微生物に対して使用することができる。例えば、スラミン組成物は、様々な微生物により引き起こされる疾患の伝播を阻害するために本発明の方法に従って適用することができる。微生物として、淋菌(淋病);トラコーマ病原体(クラミジア感染症、性病性リンパ肉芽腫);梅毒トレポネーマ(梅毒);軟性下疳菌(軟性下疳);肉芽腫カリマトバクテリウム(ドノヴァン症)、性器マイコプラスマ、ウレアプラズマ-ウレアリチカム(マイコプラズマ症);ヒト免疫不全症ウイルスHIV-1およびHIV-2(HIV、AIDS);HTLV-1(Tリンパ球向性ウイルス1型);単純ヘルペスウイルス1型および2型(HSV-1およびHSV-2);エプスタイン-バーウイルス;サイトメガロウイルス;ヒトヘルペスウイルス6;水痘帯状疱疹ウイルス;ヒトパピローマウイルス(性器いぼ);A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス(ウイルス性肝炎);膣トリコモナス(トリコモナス症);ならびに酵母(例えば、カンジダアルビカンス(外陰部膣カンジダ症))が挙げられる。このような微生物により引き起こされる疾患を上記の括弧内に示す。
【００２９】
本発明のさらに別の形では、STD感染は細菌により引き起こされてもよい。このような細菌の例として、淋菌、トラコーマ病原体、梅毒トレポネーマ、軟性下疳菌、肉芽腫カリマトバクテリウム、性器マイコプラスマ、およびウレアプラズマ-ウレアリチカムが挙げられる。さらに他の態様では、STD感染は、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス6、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、およびB型肝炎ウイルスを含むウイルスにより引き起こされてもよい。本発明の他の態様では、STD感染は、HTLV-1、エプスタイン-バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、A型肝炎ウイルス、およびB型肝炎ウイルスなどのウイルスにより引き起こされてもよい。さらなる態様では、STD感染は、カンジタアルビカンスおよび膣トリコモナスにより引き起こされてもよい。
【００３０】
本発明のさらに別の局面では、避妊方法または妊娠を阻止する方法が提供される。1つの形では、方法は、精子-卵の受精を阻害するのに、および妊娠を阻止するのに有効な量のスラミンまたはその誘導体を膣に投与する段階を含む。本発明の他の態様では、スラミンまたはその誘導体と精子機能阻害剤の併用が、避妊に関して相乗作用を示すことが本明細書で見出されているので、スラミンまたはその誘導体は異なる精子機能阻害剤と併用されてもよい。スラミンおよびその誘導体を含む組成物(選択的に、スラミンおよびその誘導体と本明細書に記載の活性な薬剤を含む組成物)もまた、本明細書に記載の方法において用いられることが想定される。
【００３１】
スラミンの避妊性を高める精子機能阻害剤は、例えば、界面活性剤(非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および陰イオン界面活性剤を含む);殺精子剤(例えば、ノノキシノール-9(α-(4-ノニルフェニル)-ω-ヒドロキシノナ(オキシエチレン);他の精子不活化剤(例えば、硫酸化またはスルホン化ポリマー(例えば、ポリスチレンスルホン酸)、マンデル酸縮合ポリマー、シクロデキストリン));抗菌性ペプチド(例えば、グラミシジン、マガイニン、インドリシジン、およびメリチン);ならびに酸緩衝組成物(例えば、バッファーゲル(BufferGel)およびアシドフォーム(AcidForm))から選択することができる。非イオン界面活性剤として、例えば、ソルビタンモノラウレート、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、p-ジイソブチフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル、およびオニクスオール(onyx-ol)が挙げられる。適切な陰イオン界面活性剤として、アルキルスルホン酸ナトリウムおよびアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。陽イオン界面活性剤として、例えば、第四級アンモニウム界面活性剤(例えば、塩化セチルピリミジニウムおよび塩化ベンザルコニウム)が挙げられる。穏やかな皮膚刺激性および粘膜刺激性には、アシルカルニチン類似体およびC31Gなどの両性イオン界面活性剤が特に適している。
【００３２】
精子-卵母細胞の受精を阻害する場合または妊娠を阻止する場合、本発明のスラミン組成物は直接または間接的に腟内に適用される。例えば、スラミン組成物は、潤滑剤(例えば、コンドームまたは他の装置(スポンジ、子宮頸キャップ、タンポン、ペッサリー、もしくは子宮内器具を含む)に付着した潤滑剤)として適用することによって、あるいは坐剤、潅注液、腔坐剤、ゲル、または他の制御送達装置として組成物を適用することによって腟内に送達することができる。スラミン組成物は、当業者に周知の子宮内器具(IUD)などの子宮内送達装置によって子宮の任意の部分に適用することができる。当業者に周知の塗布器(例えば、殺精子ゲルまたは抗酵母化合物を送達するために現在、商業的に用いられている塗布器)も、組成物を送達するのに使用することができる。
【００３３】
一般的に、有効量のスラミン組成物が投与される。この有効量は、本明細書に記載の避妊方法の状況で、スラミンを必要とする哺乳動物に投与する場合、精子-卵の受精および胚形成を阻害するのに十分なスラミン量を意味すると意図される。避妊性の場合、スラミンの有効量は、精子の卵への進入のブロック、精子受精能の阻害、または他の方法によって、精子-卵の受精の可能性を少なくするのに有効な量である。このスラミン量は当業者によって容易に決定することができる。例えば、スラミンは、有効量で、好ましくは組成物1グラムにつき約1〜約300mg、好ましくは約5〜約100mg/g、または組成物の0.0001〜90重量％、好ましくは約0.01〜約30重量％または約0.5重量％〜約10重量％の量で存在してもよい。これより多い量および少ない量も本発明の実施において効果的に使用することができる。
【００３４】
さらに、精子-卵の受精の「阻害」は、未処置個体と比較して、妊娠をもたらす受胎(すなわち、精子-卵の受精)の発生が低下することを意味する。このような場合、スラミンは多くの異なるやり方で作用してもよい。例えば、スラミンは精子受容体と透明帯をブロックすることによって受精を阻害してもよい。または、スラミンは、ヒアルロニダーゼまたは受精に必要な他の精子酵素の相互作用を阻害してもよい。スラミンはまた、精子を凝集して、雌生殖路を通る正常な上昇または移動を妨げてもよい。どのような機構でも、および本明細書に記載の組成物の作用機構のどの特定の理論にも限定されず、精子-卵受精の阻害によって、本発明の局所用スラミン薬学的組成物の有効な避妊性が得られる。
【００３５】
本明細書に記載の方法において用いられる組成物は、組成物の成分(抗菌剤、精子機能阻害剤、スラミンまたはスラミン誘導体を含む)の殺菌有効性および/または避妊有効性に悪影響を及ぼさないまたは影響を及ぼさない他の薬剤を含んでもよい。例えば、固体、液体、または固体および液体の混合物の薬学的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル、または賦形剤を薬学的組成物において使用することができる。適切な生理学的に許容される実質的に不活性の担体として、水、ポリエチレングリコール、ミネラルオイルまたはペトロラタム、プロピレングリコール、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロース誘導体、ポリカルボン酸、結合ポリアクリル酸 (例えば、カルボポール);および他のポリマー(例えば、ポリ(リジン)、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(乳酸)、熱ポリアスパラギン酸(thermal polyaspartate)、および脂肪族芳香族樹脂);グリセリン、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、生理食塩水などが挙げられる。
【００３６】
本発明の方法に有用な本明細書に記載の薬学的組成物は、希釈剤、増量剤、結合剤、加湿剤、結合剤、防腐剤、および当業者に周知の他の成分をさらに含んでもよい。例えば、適切な防腐剤は当技術分野において周知であり、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、およびベンジルアルコールを含む。
【００３７】
本発明の方法において用いられる組成物は、局所適用に適した任意の形で使用することができる。例えば、本発明の組成物は当業者に周知の様々な形態をとることができる。形態として、液体またはローション(水中油型エマルジョンもしくは油中水型エマルジョン)、水性ゲル組成物、泡、フィルム、スプレー、軟膏、ペッサリー、坐剤、カプセル、錠剤、ゼリー、クリーム、リポソーム、あるいは生物学的に活性な物質を、適用または接触された皮膚または表面にゆっくりと放出または制御放出するためのマトリックスに埋め込まれた他の形態が挙げられる。好ましくは、本発明の組成物は水性組成物である。最も好ましくは、組成物は水性ゲル組成物である。
【００３８】
本発明のさらに別の局面では、性感染症または感染症の阻害および精子-卵の受精の阻害を同時に行う方法が提供される。本発明のスラミン組成物は、STD原因微生物(HIV、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、トラコーマ病原体、および淋菌を含む)の粘膜侵入の阻害、ならびに雌哺乳動物における精子-卵の受精の阻害を同時に行うのに有効である。このような場合、スラミン組成物は、雌哺乳動物における精子-卵の受精の阻害およびSTDまたは感染症の阻害に十分な殺菌避妊量で雌哺乳動物の腟内に送達される。STDは、例えば、STD原因微生物が頸膣粘膜に侵入しないように、ならびに/またはこのような微生物が雌哺乳動物において複製および増殖しないようにすることによって阻害されてもよい。
【００３９】
今から、前記の方法、組成物、および装置を例示する特定の実施例について言及する。実施例は好ましい態様を例示するために示され、本発明の範囲の限定を目的としないことを理解しなければならない。
【００４０】
実施例1
抗精子活性
精子不動化
Sander FVおよびCramer SD.,Hum.Fertil.6:134-153(1941)に記載のように、精子不動化に及ぼす影響を確かめるためにサンダークラマー(Sander Cramer)試験を用いた。この試験は、避妊用組成物の精子不動化効果を評価するのに使用することができる。それぞれの試験組成物の連続希釈液を、指定した数(例えば、6000万個/ml)の運動性精子に調整した精液に室温(すなわち、25℃)で添加した。エンドポイントは、全ての精子が20秒以内に不動化された最大希釈液である。結果を最小有効濃度(mg/mL)として表す。
【００４１】
スラミンは20mg/mLで有意な精子不動化活性を示さなかった。さらに、10mg/mLおよび5mg/mLのスラミンナトリウムを用いて実験を行った時には、試料の精子は全て運動性であった。1対数倍濃度(1〜10,000μg/mL)または2倍連続希釈(5〜0.07mM)を使用し、精子前進運動性および膜完全性をエンドポイントとした、さらに詳細な用量反応試験では、スラミンナトリウムは、その溶媒対照との有意な違いを示さなかった。すなわち、スラミンは精子前進運動および生存の変化を誘導しなかった(図2)。逆に、同時に試験した市販の殺精子剤ノノキシノール-9(N-9)は既知の精子不動化作用を示した。最適以下の用量での時間依存性試験では、スラミンナトリウムはN-9とは異なり長期インキュベーション(例えば、30分)後でさえ精子運動性の変化を示さなかった。精子運動パラメータの有意な変化は、例えば、WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction,第4版.,WHO Organization,Cambridge University Press,30-33頁,1999に記載のCASA(コンピュータ援用精液分析)によって1mMで検出されなかった。さらに高い濃度(例えば、7.5mg/mL)でさえ、精子運動性は対照(溶媒処理)精子と有意に異なるように見られなかった。
【００４２】
頸管粘液貫通作用
ウシ頸管粘液は、予め梱包されたフラットキャピラリーチューブ(ペネトラック(Penetrak)(登録商標))の形でヒューマゲン(Humagen)(Charlottesville,VA)から入手し、凍結した状態で保存し、実験の直前に融解した。頸管粘液の精子貫通に及ぼす化合物(例えば、本明細書に記載のスラミンナトリウム)の影響を確かめるために、Modified One End Test(MOET)(Doncel G.F.,「Barrier Contraceptives」,Wiley-Liss,Mauck C.K.ら編,147-162頁(1994)に記載)を使用した。試験しようとする化合物を含む各試験組成物を生理食塩水(すなわち、水1リットルにつき9グラムのNaCl)で希釈した。頸管粘液チューブをこじあけた。生理食塩水に溶解した試験化合物を含む容器の中に開口端を入れた。チューブの中を通るように試験化合物を30分間拡散させた。次いで、正常な健常ドナーから得られた精液試料を緩衝液で6000万運動性精子/mLまで希釈し、試験化合物試料(すなわち、スラミンナトリウム)と混合した。次いで、この混合溶液を含む容器に試験化合物試料を含むチューブを再度挿入し、空気中5％二酸化炭素の雰囲気の37℃インキュベーターに入れて60分間保管した。次いで、容器およびチューブをインキュベーターから取り出し、先頭運動性精子がチューブの中を通って移動しているかどうか、チューブを顕微鏡で視覚的に分析した。結果を対照試料と比較した移動パーセントとして表す。対照試料では、チューブを、化合物を含まない生理食塩水とインキュベートした。
【００４３】
特に、精子運動性の変化によって及ぼされる試験化合物の急速ブロック作用を検出するために、Simultaneous One End Test(SOET)を使用した。この試験は、Doncel G.F.,「Barrier Contraceptives」,Wiley-Liss,Mauck C.K.ら編,147-162頁(1994)に記載されている。SOETは、試験化合物を含む溶液と精液試料を混合し、次いで、ウシ頸管粘液を含むキャピラリーチューブの一端を試験化合物および精液試料の混合物に挿入し、空気中5％二酸化炭素の雰囲気の37℃インキュベーターに入れて60分間保管した以外はMOETと同様である。先頭運動性精子が貫通した長さを記録し、結果を対照試料(すなわち、化合物を含まない生理食塩水)と比較した移動パーセントとして表す。SOETでは、精子は試験化合物によって妨げられなければ、チューブに接触した直後に移動することができる。
【００４４】
MOET試験の用量依存性試験において、スラミンナトリウムが50mg/mL(5％)で試験された時、わずかな精子貫通阻害しか認められなかった。25mg/mL以下では有意な精子妨害は見出されなかった。5％ではデキストラン硫酸がスラミンナトリウムより強い阻害を示した。比較のために、N-9は300μg/mL(0.03％)で精子貫通を完全にブロックした。市販の膣潤滑剤であるKYゼリー(登録商標)(KY)およびスラミンナトリウムを含むKYは同程度の阻害(約40％)を示し、これは同濃度のスラミンナトリウム単独(約4％)とは有意に異なった。どの濃度でも、大きな精子凝集は観察されなかった(表1)。
【００４５】
（表１）スラミンの頸管粘液ブロック活性
2005527546.tif 000002
【００４６】
精子の生存
精子の生存を、Jeyendran R.S.ら,J.Reprod.Fertil.,70:219-28(1984)に記載の精子膜完全性評価によって評価した。精子試料のアリコートをスラミンまたはN-9試験化合物とインキュベートした。Ham'sF10を1.5mL添加することで反応を終結させた。精子を遠心分離し、ペレットを培地200μLに再懸濁した。精子生存は、精子懸濁液100μLを低浸透圧膨化試験(hypo-osmotic swelling test:HOST)培地900μLに30分間入れることによって評価した。コイル状の精子尾部は精子膜の透過性が損なわれていないことを反映し、精子が生きていることを示している。各試料から、最低200個の細胞を顕微鏡で評価した。
【００４７】
精子膜完全性評価の結果を図2に示す。スラミン処理試料(10〜0.001mg/mL)と溶媒処理対照を比較した場合、精子生存に有意な違いは観察されなかった。同時インキュベーションの15分後、運動性および生存は、用量依存性試験および時間依存性試験の両方で非常に似た反応パターンを示した。このことからスラミンは殺精子化合物でないことが分かる。
【００４８】
ヒト精子-透明帯結合
精子が受精能を獲得し、卵母細胞の透明帯に結合する能力を測定するために、Burkman L.J.,ら,Fertil.Steril.,49:688-697(1988)に記載の半透明帯検査を使用した。簡単に述べると、この検査において、正常な運動性精子を、受精能獲得を誘発するウシ血清アルブミンを含む培地内で分離した。ヒト運動性精子をスイムアップ(swim-up)法を用いて分離し、ミネラルオイルで覆った培地の小滴100μL中で1mMスラミンまたは溶媒対照培地と、5％CO2、37℃で15分間インキュベートした。次いで、精子を、透明帯(卵母細胞の無細胞被覆)に取り囲まれた死んだ卵母細胞とインキュベートする。1個の卵母細胞に相当する二等分した半透明帯をそれぞれ試験(スラミン)小滴および対照(溶媒)小滴に入れ、さらに4時間インキュベートした。精子-半透明帯複合体を十分に洗浄し、半透明帯の外面に結合した受精能獲得精子を倒立顕微鏡で計数した。一方の半透明帯に結合したスラミン処理精子の数を、他方の半透明帯に結合した未処理(対照)精子の数で割ることによって、半透明帯指数(HZI)を計算した。
【００４９】
半透明帯検査の結果を図3に示す。スラミンは、1mMでヒト精子結合を92％阻害する強力な精子-透明帯結合阻害剤であることが分かった(HZI=0.08±0.01,n=9)(図3)。阻害は、精子表面レベルでの透明帯受容体のブロックおよび/またはシグナル伝達の妨害を介して生じるのかもしれない。
【００５０】
精子の透明帯結合および貫通
精子の卵母細胞貫通能力を評価することによってヒト精子の受精能を予測するために、Yanagimachi R.ら,Biol.Reprod.,15:471-6(1976)に記載のハムスター卵貫通試験(HEPT)を使用した。ハムスター卵の透明帯をプロテアーゼ処理によって分解し、その後に、ヒト精子を、透明帯の無い卵に添加した。精子-卵複合体をポリリジンでコーティングしたガラススライドに置き、22×22mmカバーガラスで覆った後に、精子の結合および貫通を標準的な顕微鏡(倍率60倍)で評価した。精子が卵に結合し、進入する能力は、卵細胞質の中にある精子核を計数することによってスコア付けした。試験化合物の影響は、卵表面に結合した精子の数および貫通された卵の割合を比較することによって確かめた。
【００５１】
試験化合物としてスラミンナトリウムを用いたHEPTアッセイの結果を図3に示す。スラミンナトリウムは、透明帯の無いハムスター卵母細胞への精子の結合を減少させ(約75％阻害)、インビトロで、このような卵の精子貫通/受精を完全に無効にした(N=28卵母細胞)。
【００５２】
精子ヒアルロニダーゼ活性
スラミンナトリウムのヒアルロニダーゼ阻害性を評価するために、ヒアルロン酸加水分解アッセイを使用した。ヒアルロニダーゼは、卵丘貫通に関与する重要な精子酵素である。この酵素を阻害すると精子は卵外被を横断できなくなり、従って、精子-卵母細胞の相互作用が妨げられ、最終的に受精が妨げられる。
【００５３】
ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロン酸加水分解の程度(すなわち、酵素活性により形成されるN-アセチルグルコサミン反応性物質の濃度)を測定することによって定量した。以下を含む反応混合物:試験化合物(様々な濃度のスラミンナトリウム);0.1M酢酸ナトリウム;0.15M塩化ナトリウム;pHを5.5に調節;7.2単位ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ(シグマ(Sigma),Type III;H-2251)を含む酢酸緩衝液;0.3mg/mlヒアルロン酸(シグマ,ウシ硝子体液由来;H-7630)を調製した。ヒアルロン酸添加によって反応を開始する前に、酵素を試験薬剤(スクリーニングの目的で1mg/ml)と10分間予めインキュベートした。酵素反応は、AronsonおよびDavidson(J.Biol.Chem.241 437-40,1967)の方法を用いて測定した。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。反応産物を、β-ジメチルアミノベンズアルデヒド(Reissigら,J.Biol.Chem.217 959-966,1965)を用いて545nmでの吸光度を測定することによって熱量（calorimetrically）測定した。1mg/mlのスクリーニング濃度で阻害を示さない化合物は活性が無いとみなす。試験薬剤がスクリーニング濃度で阻害を示せば、用量反応曲線を作成し、曲線フィッティングソフトウェアを用いて、用量反応曲線からIC50値を求めることができる。
【００５４】
スラミンナトリウムを用いて試験したヒアルロニダーゼ活性アッセイの結果を図4に示す。スラミンナトリウムは、IC50=22μg/mLを示す強力かつ不可逆的なヒアルロニダーゼ阻害剤であることが判明した。1mg/mLで100％の阻害を誘導した(図4)。
【００５５】
先体反応
先体反応を起こすカルシウムイオノフォア(一般的に、A23187)に反応する精子の割合を測定するために、Cummins J.M.ら,J.Androl.,12:98-103(1991)に記載の先体反応イオノフォア攻撃(acrosome reaction ionophore challenge:ARIC)試験を使用した。さらに詳細に述べると、この試験は、スラミンナトリウムがイオノフォアにより誘導される精子先体反応に影響を及ぼすかどうか、従って、精子が卵を貫通する能力を変えるかどうかを確かめるために用いられた。結果を、対照(未処理精子)先体反応と比較した阻害パーセントで表す。スラミンナトリウムを用いたARICの結果を表2に示す。
【００５６】
（表２）ヒト精子先体反応に及ぼすスラミンの影響
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【００５７】
表2を見ると、スラミンナトリウムは、他の硫酸化およびスルホン化した化合物(特に、ポリマー)について述べられたように、自発的な先体反応(先体消失)を刺激せず、Ca2＋イオノフォア誘導性反応もブロックしないように見えた。
【００５８】
ウサギ避妊効率試験
精液を人工的な膣を用いて雄のニュージーランドホワイト(NZW)ウサギから集め、プールし、改変タイロードアルブミン乳酸ピルビン酸(TALP)培地で5000万運動性精子/mLに調節した。200IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の静脈内注射によって、雌において排卵を誘導した。Anderson R.A.らJ.Androl.,21:862-875(2000)に記載のように、媒精(0.5mL)の前に、エクスビボ(インビトロ)混合プロトコールによって、精子を、示されたスラミン試験化合物とチューブ内で37℃で15分間インキュベートした。スラミン組成物がこのプロトコールの後に避妊活性を示したら、媒精の15〜30分前に腟内に(1mL)適用する処方で試験した。この場合、精子と化合物の接触はインビボで(腟内で)生じた。媒精および化合物投与は、可撓性のある12cm長のポリウレタンカテーテルを用いて行った。両プロトコールの主なエンドポイントは、媒精の11日後に計数した着床部位の数および妊娠率であった。このような部位は管の目視検査によって計数した。
【００５９】
エクスビボ試験
表3を見ると、精子がスラミンナトリウム含有培地またはスラミンナトリウム非含有培地とインビトロでインキュベートされる「エクスビボ混合」形式では、1mM(1.4mg/mL)の濃度で、妊娠率(PR)は86％(1/7)阻害され、着床部位(IS)の数も対照の6.4±0.9から試験群の1まで低下した。0.1mg/mLの濃度では、PRは有意に低下しなかったが、ISは7.7±1.2から4.4±0.8とわずかに減少した。5パーセント(5％)の濃度で妊娠は完全に阻止された(0/7)。結果を表3に示す。
【００６０】
（表３）エクスビボ精子混合後のスラミンナトリウムの避妊効率
2005527546.tif 000004
媒精前に15分間、インビトロで、プールしたウサギ精子を様々な濃度のスラミンと混合した。hCGを用いて雌が排卵するように誘導し、次いで、5000万個の処理または未処理運動性精子/mL(0.5mL)を用いて腟内に人工授精した。媒精の11日後に妊娠および着床部位を評価した。
【００６１】
インビボ試験
5％スラミンナトリウムを含むKYゼリー(登録商標)(KY)またはカルボキシメチルセルロース(CMC)を腟内投与して、人工媒精した後、PRは75％低下した(2/8)。スラミン効力を高める可能性のある潜在的な相加作用を確かめるために、穏やかな非イオン界面活性剤であるソルビタンモノラウレートをスラミンナトリウム/KY製剤に添加する予備実験を行った。対照、2％ソルビタン、2％スラミンナトリウム、および2％ソルビタン＋2％スラミンナトリウムのPRは、それぞれ、100％、100％、44％、および0％であった(表4)。5％スラミンと0.1％N-9を含むKYを組み合わせた別の実験でも相乗作用が示された。
【００６２】
（表４）腟内適用後のスラミンナトリウムの避妊効力および界面活性剤の相乗作用
2005527546.tif 000005
hcGによる排卵誘導前に、対照および試験製剤を雌に腟内投与した(1mL)。
15分〜30分後、プールされた正常な未処理ウサギ精子(5000万運動性精子/mL,0.5mL)を用いて、雌に媒精した。
【００６３】
表5を見ると、様々な濃度(5％〜1.25％)のスラミンを含むカルボポールベースの膣潤滑剤ゲル、レプレンス(Replens)(登録商標)が処方された時、相乗作用は明らかであった。試験した最低濃度(1.25％)でさえ100％避妊した(PR=0％)。対照群(レプレンス(登録商標)のみ)のPRは100％であった。
【００６４】
（表５）スラミン製剤の避妊効力-用量反応
2005527546.tif 000006
雌ウサギに化合物0.75mLを腟内投与し、15分〜30分後、プールされたウサギ精子を媒精した。媒精の11日後に着床部位を視覚化した。
【００６５】
本発明の化合物の抗精子活性および避妊活性の概要を表6に示す。
【００６６】
（表６）スラミン組成物の抗精子活性および避妊活性の概要
2005527546.tif 000007
【００６７】
実施例2
抗微生物活性
抗HIV活性
HIV感染の阻害:ウイルス結合阻害アッセイ
VBIAIIIB:MT-2細胞、化合物、およびウイルス(HIV-1 IIIB)を96ウェルプレート内で一緒に混合し、37℃で2時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終わりに、96ウェルプレートを10分間遠心分離し、マルチチャンネルピペッターを用いて約175μLの培地を取り出し、新鮮な培地175μLと交換した。次いで、培養物を37℃で6日間インキュベートした。ウイルスによる細胞変性効果の変化は、XTT(2,3-bis(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[フェニルアミノ)カルボニル]-2H-テトラゾリウムヒドロキシド)色素還元アッセイを用いて光学密度(O.D.)低下のパーセントを求めることによって測定した。ウイルスによる細胞変性効果および培地除去による機械的な人為構造を顕微鏡観察によって確かめた(Anderson R.A.ら,J.Androl.,21:862-875(2000))。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００６８】
C-MAGI/Ba-Lアッセイ
MAGI-CCR-5細胞を用いてC-MAGI/Ba-Lアッセイを行った。前記で示したように、細胞株を、10％FBS、100U/mLペニシリン、300μg/mLグルタミン酸、および選択用抗生物質を含むDMEM培地中で維持した。アッセイの前に、細胞を、平らな96ウェル組織培養プレートに1×104細胞/ウェルでプレートし、抗生物質の非存在下で一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、ウイルスおよび化合物(100μLウイルス(HIVBa-L)＋100μL化合物)を添加した。ウイルスが付着するように培養物を2時間インキュベートした。このインキュベーションの後、培地をウェルから除去し、化合物を含まない新鮮な培地と交換し、2回洗浄し、最後に、新鮮な培地中で37℃で2日間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、β-ガラクトシダーゼ酵素活性の誘導を化学ルミネセンスによって検出した。β-ガラクトシダーゼ活性は、製造業者の説明書(トロピックス(Tropix))に従って化学ルミネセンス基質を用いて検出した。TC50およびIC50を線形回帰を用いて求め、治療指数または抗ウイルス指数を計算した。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００６９】
ME-180に基づく局所殺菌アッセイ
ME-180子宮頸上皮細胞を、96-ウェル平底マイクロタイタープレートの内部ウェルに5×103細胞/ウェルの密度でプレートし、一晩インキュベートした。慢性感染H9細胞(H9-SK1)を、200μg/mLマイトマイシンC(シグマ)を含む完全培地で1時間処理し、十分に洗浄し、4×105/mlで再懸濁した。使用したマイトマイシンCの濃度によって、慢性感染細胞が48時間の処理内で殺傷された。この処理によって、ME-180細胞へのウイルスの細胞間伝播に十分な時間があけられ、その一方で、ウイルス終点定量が慢性感染細胞からの寄与を受けないことが保証される。ME-180細胞を含む各ウェルに、抗ウイルス化合物および慢性感染細胞(2×104細胞)を添加し、6時間インキュベートした。共培養の後、単層を十分に洗浄し、新鮮な培地を添加した。死んだリンパ球を除去するために感染の24時間後および48時間後に、培地を除去し、新鮮な培地を添加した。感染後6日目に、上清試料を取り出し、p24 ELISA(Phillips DMら,1995,J Virol Methods,Mar,52(1-2):1-13)によってウイルス含有量について分析した。このアッセイの結果を以下に示す。
【００７０】
細胞間伝播(CTC)アッセイ
37℃で1時間のマイトマイシンC(200μg/mL)前暴露によって殺傷されたHIV-1感染SupT1細胞(IIIB株)を、それぞれの薬剤およびP4-R5(MAGI)細胞と37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、細胞を洗浄し、新たな培地を加えた。伝播の成功およびその後の複製事象を、感染の48時間後にガラクト-スター(Galacto-Star)アッセイを用いて定量した。感染細胞を、偽暴露(mock exposure)後に感染した細胞のパーセントとして表した。各アッセイにおいて、各濃度について3つのウェルを試験した。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７１】
末梢血単核球(PBMC)における臨床分離株:PBMCの分離および芽球化(blasting)
末梢血単核球(PBMC)を、フィコールハイパーク勾配分離によって肝炎陰性HIV-1陰性正常ドナーから入手した。簡単に述べると、凝血防止処理をした血液を、Ca＋＋およびMg＋＋を含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水(PBS)で1:1に希釈し、50ml遠心管に入れたリンパ球分離培地14mLの上で層にした。次いで、遠心管を600×gで30分間遠心分離した。結果として生じた境界面からPBMCのバンドを穏やかに吸引し、その後に、低速遠心分離によってPBSで2回洗浄した。単核球を計数し、生死をトリパンブルー色素排除によって判定し、細胞を、15％FBS(熱不活化)、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および10μg/mLゲンタマイシンと20U/mL組換えIL-2(R＆Dシステムズ(R＆D Systems),Minneapolis,MN)を添加したRPMI1640培地に再懸濁した。IL-2は、PHA分裂促進刺激により始まる細胞分裂を維持するために培地に含めた。次いで、3日毎に培養物の体積の半分を新鮮なIL-2含有培地で交換することによって、培養物を使用するまで維持した。ほとんどのアッセイは3日齢芽球化PBMCを用いて始めた。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７２】
PBMCアッセイ
最低2人のドナーに由来する、PHSおよびIL-2で刺激されたヒト末梢血単核球を計数し、その生死をトリパンブルー色素排除によって判定し、同じ比率で混合した。個々のドナー間で観察されるばらつきを最小限にするために、プールしたドナーを使用した。このばらつきは、HIV感染ならびにPHAおよびIL-2に対する一次リンパ球集団の反応全体の定量的および定性的な違いに起因する。15％胎仔ウシ血清(熱不活化)、2mM L-グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、10μg/mLゲンタマイシン、およびIL-2(20U/mL,R＆Dシステムズ,Minneapolis,MN)を添加したRPMI 1640(フェノールレッドを含まない)に細胞を1×106細胞/mLで再懸濁した。次いで、細胞50μlを、標準的な方法で96ウェル丸底マイクロタイター培養プレートの60ウェル内部に分配した。各プレートは、細胞対照ウェル(細胞のみ)、ウイルス対照ウェル(細胞＋ウイルス)、および実験ウェル(薬物＋細胞＋ウイルス)を含んだ。連続希釈した化合物をマイクロタイタープレートに添加した後、予め力価測定された適切なHIV-1を添加した。次いで、プレートを、37℃で6時間、5％CO2でインキュベートし、約300×gで10分間遠心分離し、マルチチャンネルピペッターを用いて175μLの上清を取り出し、化合物を含まない新鮮な培地と交換した。ウェル1個あたりの最終体積は200μLであった。化合物の毒性を確かめるために、ウイルスを含まない複製プレートを用いて、全試料を3回繰り返してアッセイした。このアッセイを、37℃、5％CO2の加湿雰囲気内で6日間インキュベートし、その後に、RT活性の分析のために上清を集め、同一のプレートを、XTT色素還元によって細胞生存について分析した。また、ウェルを顕微鏡で調べ、全ての異常を記録した。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７３】
細胞生存および化合物細胞傷害性のためのXTT染色
試験材料のTC50値は、細胞および化合物を含み、ウイルスを含まない複製マイクロタイタープレート中でのテトラゾリウム色素XTT(2,3-bis(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-[(フェニルアミノ)カルボニル]-2H-テトラゾリウムヒドロキシド)の還元を測定することによって得た。XTTは、代謝活性のある細胞において、ミトコンドリア酵素NADPHオキシダーゼによって可溶性ホルマザン生成物へと代謝された。XTT溶液を、PBSに溶解した1mg/mL保存液として毎日調製した。15mg/mLのフェナジンメトサルフェート(phenzaine methosulfate:PMS)溶液をPBSに溶解して調製し、-20℃暗所で保存した。使用直前に、XTT/PMS保存液を、PMSをPBSで1:100に希釈し、XTT溶液1mLにつき40μLを添加して調製した。XTT/PMS 50μLをプレートの各ウェルに添加し、プレートを37℃で4時間インキュベートした。この4時間インキュベーションは、各アッセイについて、示された数の細胞を用いたMTS色素還元の直線反応の範囲内であることが実験から確かめられた。蓋の代わりに粘着プレートシーラーを使用し、可溶性ホルマザン生成物を混合するために、密封したプレートを数回ひっくり返し、モレキュラーデバイシーズスペクトラマックスプラス(Molecular Devices SpectraMax Plus)96ウェルプレートフォーマット分光光度計を用いて450nmで測定した。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７４】
逆転写酵素アッセイ
ウイルス複製の尺度である逆転写酵素活性を無細胞上清中で測定した。トリチウム化チミジン三リン酸(NEN)(TTP)を5Ci/mLで蒸留水に再懸濁した。ポリrAおよびオリゴdTを保存溶液として調製し、-20℃で保存した。RT反応緩衝液は毎日、新しいものを調製し、1.0M EGTA 125μL、dH2O 125μL、10％SDS 110μL、1.0M Tris(pH7.4) 50μL、1.0M DTT 50μL、および1.0M MgCl2 40μLからなった。これら3種類の溶液を、TTP 2部、ポリrA:オリゴdT 1部、および反応緩衝液1部の比で一緒に混合した。この反応混合物10マイクロリットル(10μL)を丸底マイクロタイタープレートに入れ、ウイルスを含む上清15μLを添加し、混合した。プレートを37℃で60分間インキュベートした。反応後、反応体積を数枚のDE81紙にスポットし、5％リン酸ナトリウム緩衝液で5回(各5分)、蒸留水で2回(各1分)、70％エタノールで2回(各1分)洗浄し、次いで乾燥させた。オプチフルオロ(Opti-Fluor)Oを各試料に添加し、取り込まれた放射能を、ワラック1450マイクロベータプラス(Wallac 1450 Microbetaplus)液体シンチレーションカウンターを用いて定量した。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７５】
樹状細胞関連HIVによるT細胞の感染(DC/Tアッセイ)
単球由来樹状細胞(MO-DC)を10-3感染多重度でNSI/R5 Ba-L株に感染させ、単独で、または自己由来CD4(＋)T細胞と共に1:1もしくは1:10の比で培養した。感染の1時間前にスラミンの希釈シリーズをMO-DCに添加し、感染の間、一緒にした。感染後、細胞を十分に洗浄し、化合物を、プレインキュベーションと同じ濃度で添加した。1週間に2回、培地および化合物を交換した。2週間後、ELISAを用いて上清中のHIV Agを測定し、線形回帰を用いてEC50値(有効濃度50％)を計算した(Vanham Gら,AIDS 2000,14:2299-2311)。このアッセイの結果を本明細書に示す。
【００７６】
結果
スラミンは、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV-III)により引き起こされる感染、複製、および細胞壊死からT細胞をインビトロで保護することが以前に報告されている(Mitsuya Hら Science,Oct;226(4671):172-4,1984;Balzarini J.ら Int.J.Cancer.,37:451-7,1986)。さらに、スラミンは、カポジ肉腫患者またはAIDS関連複合体患者において試験され、部分的な成功を収めた(Broder S.ら,Lancet.,2(5456):627-30,1985)。しかしながら、HIVの性的伝播を阻止する腟内法または直腸内法としてスラミンを使用することは一度も評価も計画もされたことがなかった。臨床試験を続行しなかった主な理由は全身毒性および治療指数の悪さであった。これらの理由ならびにスラミンの長い半減期および高いタンパク質結合のために、性的伝播を阻止するためのスラミン局所適用がつきとめられなかった。
【００７７】
スラミンナトリウムは、リンパ球向性および一細胞向性HIV-1株に対して高い活性があることが本明細書で発見された(ウイルス侵入アッセイではIIIBに対してIC50=7.3μg/mL[72時間インキュベーション]および18.5μg/mL[2時間インキュベーション]、ならびにBalに対して0.34および5.5μg/mL[2時間インキュベーション])(図5)。CD4非依存性上皮細胞伝播アッセイ(ME-180アッセイ; IC50=24.5μg/mL)(図6)、CD4依存性細胞間伝播アッセイ(CTCアッセイ; IC50=93.5μg/mL)(図5)、および樹状細胞(DC)/Tリンパ球モデル(IC50=17μg/mL)でも有効であった(結果を表7に示す)。
【００７８】
（表７）樹状細胞からT細胞へのHIV伝播の阻害
2005527546.tif 000008
BaL(R5 HIV-1)に感染したDCを単独で、または自己由来Tリンパ球と2種類の比で組み合わせて、何種類もの濃度のスラミンの存在下で培養した。
【００７９】
ME-180アッセイでは頸膣分泌液に似せるためにムチンを添加したが、スラミン活性は有意に低下しなかった(図6)。2％スラミンをKYゼリー(登録商標)に入れて処方しても、スラミンの抗ウイルス活性は損なわれなかった。興味分解ことに、スラミンをカルボポールベースの膣潤滑剤であるレプレンス(登録商標)に入れて処方すると、特に、無細胞および細胞関連HIV-1 IIIBに対するスラミンの抗ウイルス活性において、有意な相乗作用が得られた(表8)。
【００８０】
（表８）スラミン製剤の抗HIV活性
2005527546.tif 000009
データは50％阻害濃度(IC50)を示す。
標的細胞はCD4/補助受容体発現HeLa細胞である。インキュベーション時間:2時間。
【００８１】
本発明の組成物および方法の防止的局面は本発明の前には完全に認識されていなかった。例えば、本発明の前には、HIVは接触後2時間未満で膣粘膜に感染し(Hu Jら,J Virol 2000 Ju1;74(13):6087-95)、直腸粘膜にはさらに短時間で感染する可能性が高いことが知られていた。しかしながら、スラミンの抗HIV活性について説明することを意図した報告されたアッセイでは全て長時間のインキュベーション(日)が用いられ、インキュベーションの全期間にわたって化合物が存在していた。この評価方法は治療用途には適しているが、膣または直腸を介したHIV伝播を阻止する方法には適していない。この膣または直腸を介したHIV伝播を阻止する方法では、薬剤は感染期間(window of infectivity)にわたって作用すべきである。この期間は、性的接触した時点で開始し、化合物が(例えば、漏出および希釈によって)有効濃度未満になった時点で、または回復した膣酸性pHによってウイルスが不活化された時点で終了する。
【００８２】
さらに、膣粘膜および直腸粘膜に存在する上皮細胞および樹状細胞は、初回感染の数日後でさえ、生きたウイルスに感染することができるか、または生きたウイルスを伝播することができる。今や、スラミンはCD4非依存性の上皮感染感染および樹状細胞感染をブロックできることが発見されている。この2つの事象が無ければ、性的伝播の阻止は不可能であろう。
【００８３】
本明細書に記載の頸膣HIV感染を含むHIV粘膜伝播を阻止するために、組成物の機能および有効性に関する様々な重要な実験データを入手しなければならない。例えば、化合物または組成物は、a)ウイルスに接触して2時間未満に(ウイルスが膣粘膜に感染する許容時間枠)、ウイルスを不活化するか、HIV侵入を阻害しなければならない;b)精液中のHIV量の重要な成分である細胞関連ウイルスに対して有効でなければならない(すなわち、細胞間伝播をブロックしなければならない);c)上皮細胞感染ならびにCD-4保持細胞感染をブロックしなければならない;d)(粘膜伝播における主な標的の一つである)樹状細胞のHIV感染および樹状細胞による伝播をブロックしなければならない;ならびにe)(性的伝播において最も優勢な)一細胞向性HIV-1株を阻害しなければならない。
【００８４】
スラミンは前記の特徴を全て有することが本明細書で証明されている。さらに、スラミンは膣上皮に対しても、病原性微生物の増殖を制御する過酸化水素産生菌である乳酸杆菌に対しても無毒であり、膣細胞に対して抗炎症活性を示す(すなわち、炎症誘発性サイトカインの膣分泌を阻害する)ことも本明細書で示されている。この後者の発見によって、理想的な薬剤であるスラミンと、その特性によってHIV粘膜伝播に有利な特徴である炎症誘発活性を示す界面活性剤、ウイルス不活化剤、抗菌剤、および殺菌剤が組み合わされる。さらに、スラミンが膣投与された時にバイオアベイラビリティをほとんど示さないことは証明されていなかった。
【００８５】
化合物に前記の特徴が無ければ、その化合物または組成物がHIV性的伝播の予防薬として推奨できないことは当業者に理解されるだろう。
【００８６】
抗HSV活性
スラミンの抗HSV活性の評価は、Heroldら,J.Virol.,70:3461-3469(1996)に記載の方法に基にした。化合物をリン酸緩衝食塩水(PBS)で連続希釈し(1000μg/ml〜1.0μg/ml)、各希釈液を、2種類の連続希釈(10-5および10-6)HSV(2型333株)のそれぞれと混合した。作用ウイルス力価は、それぞれ、約103および104プラーク形成単位(pfu)/mlであった。2回繰り返して、各混合物の試料(1ml)を、25cm2フラスコの底にある、洗浄および水切りしたCaSki細胞(ヒト子宮頸上皮細胞株,アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection),Rockville,MDから入手)コンフルエント単層にプレートした。(試験薬剤を添加していない対照培養物において示された)各培養物における初期力価をpfu/mlとして示した。フラスコを2時間インキュベーションし、その後、(ウイルスおよび試験化合物を含む)培地を除去し、細胞をPBSで洗浄した。細胞を、1％血清および0.5％メチルセルロースを添加し、二次プラークが形成しないように抗HSV抗体を含む培地199中で3日間培養した。位相差顕微鏡によるウイルスプラークの計数のために、細胞をギムザ染色した。希釈を補正した後、ウイルス力価をプラーク数から推論した。値を対照力価5×108pfu/mlと比較して補正した。データを、ウイルス力価および(試験薬剤に暴露されていない)対照細胞培養物において計数されたプラークに対するパーセントとして表した。100μg/mlで活性を示さなかった試験化合物は、抗HSV薬剤として不活性であるとみなした。ウイルス力価を50％低下させるのに必要な化合物の濃度(IC50)を、曲線フィッティングソフトウェア(テーブルカーブ(TableCurve)2D,バージョン3.02)を用いて化合物濃度の関数としたプラーク形成単位(pfu)/mlのプロットから評価した。
【００８７】
スラミンナトリウムはHSV-2に対しても非常に有効であり、プラークアッセイにおいて100μg/mlでウイルス感染を100％阻害した。結果を図7に示す。試験した最高濃度(1000μg/mL)では有意な細胞傷害性を示さなかったが、HSV-2およびHSV-1に対するスラミンのIC50は、それぞれ、1μg/mLおよび30μg/mLであった。
【００８８】
抗サイトメガロウイルス活性
サイトメガロウイルス結合アッセイでは、トリチウム化マウスサイトメガロウイルス(MCMV)を、24ウェルプレート内で固定(0.4％パラホルムアルデヒド)されたNIH3T3線維芽細胞と、培地のみまたは1〜1000μg/mLスラミン含有培地の存在下で前後に揺らしながら37℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞を十分に洗浄し、1％SDSおよびトライトン(triton)X-100で溶解した。シンチレーションカウンターで溶解産物の放射能(cpm)を定量した。
【００８９】
スラミンナトリウムはCMVに対しても有効であり、図8に示すように結合アッセイにおいてIC50=50μg/mLを示した。
【００９０】
抗トラコーマ病原体(CT)活性
クラミジア増殖阻害を、Cooper M.D.ら,J.Gen.Microbiol.,136:1109-1115(1990)に従って行った。実験の前に、凍結保存したトラコーマ病原体(血清型E/UW-5/CX)を急速融解し(37℃)、穏やかな超音波処理によって懸濁した。細菌懸濁液の連続1:10希釈液(10-1〜10-7)を作成した。
【００９１】
HeLa単層(カバーガラスに付着)に、試験薬剤の存在下または非存在下で様々なクラミジア(基本小体)希釈液100μlを接種した。0.1、1.0、10、100、および1000μg/mlのスラミン化合物を試験した。1時間後、遊離クラミジアおよび試験薬剤を除去するために単層を洗浄し、48時間インキュベートした。
【００９２】
培地を除去し、HeLa単層をメタノールで固定し、洗浄し、カールステッド(Kallsted)クラミジア培養確認用フルオレセイン結合モノクローナル抗体で処理した。標識抗体と細胞との反応を、加湿チャンバー内で室温(すなわち、25℃)(暗所)で30分間行った。細胞を水で洗浄した。一滴の封入剤をガラススライド上に置き、カバーガラスを貼り付けた。クラミジア感染による封入体を、蛍光顕微鏡を用いて緑色蛍光として視覚化した。データは、非希釈クラミジア力価の封入体形成単位(inclusion forming unit)/mlの数値として報告し、各実験において対照培養物(試験薬剤なし)の対照値2.6×107IFU/mlと比較して調整した。1000μg/mlで活性を示さなかった化合物は抗クラミジア薬剤として不活性であるとみなした。全データの対数変換の後、用量反応曲線を、曲線フィッティングソフトウェア(テーブルカーブ2D,バージョン3.02;ジャンデルサイエンティフィク(Jandel Scientific))を用いて作成した。
【００９３】
スラミンナトリウムは100μg/mlでCT増殖を75％阻害した(IC50=28μg/mL)(図9)。2mg/mLで、阻害は本質的に完全であった(対照力価:1×10-5、スラミンナトリウム力価:0.08×10-5)。
【００９４】
淋菌(GC)
淋菌増殖阻害
淋菌増殖阻害アッセイを、Anderson R.A.,ら,J.Androl.,21:862-875;2000の方法によって行った。簡単に述べると、淋病の局所無併発性症例から淋菌を単離した(グラム染色、オキシダーゼ反応性、および糖発酵によって確認した)。対数増殖期培養物の力価を、GCブロスでの希釈によって0.5マックファーランド(McFarland)標準(約108コロニー形成単位/ml)に調整した。これを、添加物を含まないブロス(対照)および試験薬剤の連続1:10希釈液(1mg/ml〜1.0μg/ml)のそれぞれを含むブロスで1:10に希釈した。培養物を37℃で4時間インキュベートした。4つの連続1:10希釈液をGCブロスで作成し、各希釈液の一部をGC寒天プレートに接種した。プレートを一晩インキュベートし、結果として得られた淋菌コロニーを明視野顕微鏡で計数した。各濃度のスラミンのデータを、最初の対数増殖期細菌懸濁液のコロニー形成単位(CFU)/mlの数値として表した。
【００９５】
図10(1〜1000μg/mLで試験したスラミンの試験)をみると、明らかな用量反応性は無かった。しかしながら、スラミンナトリウムは1mg/mLでGC増殖(増殖アッセイ)を完全に阻害した。
【００９６】
本発明のスラミン組成物の抗菌活性の概要を表9に示す。
【００９７】
（表９）スラミン組成物の抗菌活性の概要
2005527546.tif 000010
【００９８】
これは、スラミンが抗細菌活性を示す最初の報告であると考えられる。スラミンは、最も流行している性伝播病原体の2つであるトラコーマ病原体および淋菌に対して阻害活性を示した。このスラミンの抗細菌活性は、スラミンの既知の抗ウイルス活性または抗トリパノソーマ活性に基づいて予測できなかった。
【００９９】
実施例3
局所毒性
膣細胞傷害性
膣細胞傷害性を、臭化3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイおよびサイトカインアッセイによって測定した。2つのアッセイは、Fichorova R.N.ら,J.Infect.Dis.184(4):418-28,2001)に記載されている。MTTアッセイは、化合物への暴露前に所望の細胞をプレートすることによって細胞株に対する様々な化合物の細胞傷害性を評価する。処理日に、培地をウェルから注意深く吸引し、様々な濃度の試験化合物を含む新鮮な培地と交換した。細胞を様々な化合物と6時間インキュベートし、新鮮な培地で洗浄し、次いで、MTTを添加し、プレートを、MTTが代謝活性のある細胞と反応することによってホルマザン結晶が生成されるのに十分な時間、37℃でインキュベートした。ホルマザン結晶を、10％SDSを含む0.01M HCl溶液に37℃で一晩溶解した。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダー(ダイネクス(Dynex))において540nmおよび参照波長690nmで測定した。
【０１００】
化合物と細胞を6時間インキュベートした後に集めた上清中のインターロイキン濃度を、市販ELISAキット(R＆Dダイアグノスティクス(R＆D Diagnostics),Minneapolis,MN)を用いて製造業者の説明書に従って測定した(Fichorova R.N.ら,J.Infect.Dis.184(4):418-28,2001も参照のこと)。
【０１０１】
スラミンナトリウムは、前記のようにMTTアッセイにおいてヒト膣細胞株(VK2)と10mg/mL〜10μg/mLの濃度で30分、6時間、および24時間インキュベートされた時、細胞傷害性の形跡を示さなかった(図11)。この発見は、異なる細胞株(例えば、MT-2、HeLa、CaSKiなど)を用いた抗菌アッセイで説明される細胞傷害作用の欠如によって強固なものとなった。デキストラン硫酸、硫酸セルロース、およびN-9を用いた比較試験において、スラミンナトリウムは、これらの全ての中で最も少ない細胞傷害性を示した。
【０１０２】
HIVの性的伝播を阻止する膣方法としてスラミン製剤の使用を可能にする別の要因は、膣環境に対して悪影響を及ぼさないことが証明されることである。スラミンは、膣上皮内層および乳酸杆菌(病原性細菌の増殖を抑える有益な細菌)に対して安全であることが判明した。さらに、スラミンは炎症誘発性反応を誘導せず、界面活性剤により引き起こされる炎症を低下させた。ノノキシノール-9のような界面活性剤の臨床試験が殺ウイルス活性の悪さではなく炎症を引き起こしたという理由で失敗していれば(Van Damme L.ら,Lancet.,360(9338):971-7,2002;Fichorova R.N.ら,J.Infect.Dis.184(4):418-28,2001)、抗炎症活性を示したスラミンとの併用が理想的であるように思われる。
【０１０３】
炎症誘発性サイトカイン
スラミンナトリウムは、ELISAアッセイにおいて培養膣細胞によるIL-1β放出を誘導しなかった。これは、N-9および他の界面活性剤の作用とはかなり対照的であった。図12に一部を示したように、同様の結果がIL-1α、IL-6、IL-8、およびIL-18を用いて得られた(データは示さず)。炎症誘発性サイトカインの刺激は無かった。さらに、スラミンナトリウムは膣細胞によるN-9誘導性のIL-1およびIL-8の放出を減少させ、従って、抗炎症活性を示した(図12)。この活性は、HIV感染の標的として働く白血球の数の減少と関連しているはずである。
【０１０４】
乳酸杆菌増殖
5mg/mL(試験した最高濃度)で評価されたスラミンナトリウムには、ラクトバチルス-ガセリ(Lactobacillus gasseri)の増殖に対して阻害作用が無かった(増殖は対照の107％であった)(図13)。
【０１０５】
局所毒性活性の概要を以下の表10に示す。
【０１０６】
（表１０）スラミン組成物の局所毒性活性
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【０１０７】
実施例4
薬物動態学
スラミンが主に全身副作用のために治療剤として断念されていれば、膣での抗STD病原体阻止方法(本願)としてスラミンを使用する実現可能性にとって、膣区画からのバイオアベイラビリティが低いことを証明することが重要であった。
【０１０８】
雌ラット(N=6)に30mg/kgの化合物を、生理食塩水に溶解して単回量で静脈内に投与するか、またはKYゼリー製剤で腟内に5日間(1日2回)投与した。選択した単回量は推定ヒト用量(250mg)の10倍に相当した。この試験の実施中には臨床徴候は観察されなかった。静脈内投与後、投与開始後1時間(第1の時点)で、血漿中に比較的高い濃度のスラミンナトリウム(平均値=563μg/mL)が測定された。スラミンナトリウムは、この投与経路の後、長い平均半減期の値(68.5時間)および低い平均クリアランス値(1.75mL/時間)により示唆されるように、ゆっくり排泄されるように見えた。平均分布容積は147mL/kgと計算された。
【０１０９】
膣内投与後、最後の投与後3.5時間で、血漿中に比較的低い濃度の化合物(平均値=17.7μg/mL)が測定された。スラミンナトリウムは、腟内投与後、長い平均半減期の値(132時間,約5.5日)および低い平均クリアランス値(0.006mL/時間)により示唆されるように、ゆっくり排泄されるように見えた。
【０１１０】
腟内に投与された総用量(90mg)から計算したバイオアベイラビリティは0.8％とごくわずかであった。組織学的病変は、化合物溶液を静脈内に投与した雌ラットの選択された組織(膣、肺、肝臓、および腎臓)において観察されなかった。
【０１１１】
スラミンは経口投与後の全身吸収が非常に悪いために、過去、静脈内投与されてきた。さらに、スラミンはタンパク質結合親和性が高いために大量(グラム)に投与された。大量のスラミン静脈内投与によって副作用が示され、このために全身抗HIV薬物としての治療指数が低かった。従って、臨床試験は展開されず、化合物はさらに追跡されなかった。しかしながら、粘膜(膣)用殺菌剤および避妊薬として提案された使用では、全身吸収が悪いことは、投与部位への作用を限定し、全身副作用の発症を阻止するので有利である。前記のように、実施された薬物動態試験から、膣投与後のバイオアベイラビリティはごくわずか(＜1％)であることが証明された。
【０１１２】
薬物動態分析の概要を表11に示す。
【０１１３】
（表１１）30mg/kg用量で静脈内注入および腟内投与した後の雌ラット血漿中のスラミンの平均した個々の薬物動態パラメータを示す、薬物動態分析の概要
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IV:30mg/kgの静脈内単回投与
IVag:30mg/kg、5日間(一日2回)の腟内投与
AUC(I):時間0から無限大までの血漿中濃度対時間曲線下の面積
AUC(tf):時間0から投与後144時間までの血漿中濃度対時間曲線下の面積
CL:血漿クリアランス
Cmax:観察可能な最高濃度
Kel:排泄定数
Tmax:Cmaxまでの時間
t1/2:末期半減期
Vdss:定常状態での見かけの分布容積
【０１１４】
本明細書で述べられた全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１５】
本発明は本発明の特定の態様と共に説明されたが、さらなる変更が可能であると理解される。本願は、一般的に本発明の原理に従い、本発明が属する当該技術内の既知または従来の実施の範囲内にあり、かつ以下の添付の特許請求の範囲に示される前記の本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本発明の全ての変化、使用、または適応を含むことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】スラミン(8,8'-(カルボニルbis(イミノ-3,1-フェニレンカルボニルイミノ(4-メチル-3,1-フェニレン)カルボニルイミノ))bis-1,3,5-ナフタレントリスルホン酸)の6ナトリウム塩を示す。
【図２】示された濃度のスラミンおよびノノキシノール-9の関数とした精子の運動性および生存を示すグラフである(実施例1に詳細に説明)。
【図３】ヒト精子透明帯結合およびハムスター卵貫通に及ぼすスラミンの影響を示す棒グラフである(実施例1に詳細に説明)。HZA,半透明帯検査;HEPT,ハムスター卵貫通試験。
【図４】スラミン濃度の関数とした精子ヒアルロニダーゼ活性を示すグラフを示す(実施例1に詳細に説明)。
【図５】所定のスラミン濃度の関数とした、示された細胞に残存する感染力を示す(実施例2に詳細に説明)。VBI-BaL,一細胞向性HIV-1 BaL株を用いたウイルス侵入阻害アッセイ;CTC,細胞間伝播アッセイ;VBI-IIIB,リンパ球向性HIV-1 IIIB株を用いたウイルス侵入阻害アッセイ;API,活性薬学的成分(スラミン薬物物質)。
【図６】ムチンの存在下および非存在下でのスラミンによるHIV-1上皮細胞伝播の阻害を示すグラフである(実施例2に詳細に説明)。
【図７】スラミンの抗ヘルペス活性および細胞傷害性を示すグラフである(実施例2に詳細に説明)。
【図８】スラミン濃度の関数とした線維芽細胞へのサイトメガロウイルス結合の阻害を示す棒グラフを示す(実施例2に詳細に説明)。
【図９】様々な濃度のスラミンで処理した後のトラコーマ病原体の力価を示すグラフを示す(実施例2に詳細に説明)。
【図１０】淋菌(MSIIA)増加(増殖)アッセイにより測定された、示されたスラミン濃度の関数とした淋菌の増殖を示す棒グラフである(実施例2に詳細に説明)。
【図１１】示されたスラミン濃度の関数とした膣細胞生存を示す棒グラフである(実施例3に詳細に説明)。
【図１２】スラミンおよびノノキシノール9(N-9)の濃度の関数としての、ヒト膣細胞上清から得られた示されたインターロイキンの濃度を示す棒グラフである。ヒト膣(VK-2)細胞を、示された組成物の存在下または非存在下で6時間培養した(実施例3に詳細に説明)。細胞上清中のインターロイキン(IL)濃度を測定した。結果を、細胞生存パーセントで標準化したIL濃度(pg/mL)で示す。
【図１３】乳酸杆菌属の増殖に及ぼすスラミンの影響を示すグラフである(実施例3に詳細に説明)。r2(相関係数)=0.996。TD,倍加時間。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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