(57)【要約】  本発明は、感染細胞培養物の上清からのＡ型肝炎ウイルスの精製方法、および精製ＨＡＶ抗原の調製物の生成方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物における保護免疫を誘導するのに有効な量で、精製された成熟ＨＡＶ粒子からなる調製物を含む、ＨＡＶワクチン組成物に関する。本発明において、無血清条件下でのＨＡＶ抗原の作製および感染細胞の細胞培養上清からのＨＡＶ抗原の簡単な精製を可能にするプロセスが、確立される。これらの細胞または細胞培養培地に由来し得る汚染不純物は、本発明の方法によって効果的に除去される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全なＡ型肝炎ウイルス粒子を生成する方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の細胞培養物上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、および
該完全ＨＡＶ粒子の精製された調製物を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記核酸分解剤およびプロテアーゼで処理する工程の前に、前記細胞物上清を濃縮する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、濾過によって、前記細胞培養物上清を濃縮する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記核酸分解剤が、酵素である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、ＤＮａｓｅである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、微生物プロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、プロナーゼまたはその酵素的に活性な画分である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのトリプシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞培養物が、ＶＥＲＯ細胞培養物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、無血清培地中、または無血清かつ無タンパク質培地中で増殖される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記精製された完全ＨＡＶ粒子の調製物が、濾過によって単離される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記完全ＨＡＶ粒子の調製物が、１ＩＵ  ＨＡＶ抗原当たり、約３０ｐｇ未満の混入核酸を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記完全ＨＡＶ粒子の調製物が、タンパク質１ｍｇ当たり、少なくとも約５０００ＩＵ未満のＨＡＶ抗原を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、ウイルス不活化剤で、前記完全ＨＡＶ粒子の調製物を処理する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、前記完全ＨＡＶ粒子の調製物から、精製された成熟ＨＡＶビリオンを単離する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
前記調製物が、細胞または細胞培養培地からの混入タンパク質を実質的に含まない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記調製物が、ＨＡＶ抗原１ＩＵ当たり、約０．５ｐｇ未満の混入核酸を有する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、ウイルス不活化剤で、前記精製されたＨＡＶ粒子を処理する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
完全ＨＡＶ粒子の調製物であって、該調製物は、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドおよび混入細胞または混入細胞培養物タンパク質を含まない、調製物。
【請求項２０】
前記調製物が、ＨＡＶ抗原１ＩＵ当たり、約３０ｐｇ未満の混入核酸を有する、請求項１９に記載の調製物。
【請求項２１】
前記調製物が、タンパク質１ｍｇ当たり、少なくとも約５０００ＩＵ未満のＨＡＶ抗原を有する、請求項１９または２０に記載の調製物。
【請求項２２】
不活化された、精製された完全ＨＡＶ粒子からなる、請求項１９に記載の調製物。
【請求項２３】
精製された成熟ＨＡＶ粒子の調製物であって、該調製物は、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドおよび混入細胞または混入細胞培養物タンパク質を含まない、調製物。
【請求項２４】
ＨＡＶプロビリオンを含まない、請求項２３に記載の調製物。
【請求項２５】
前記調製物が、ＨＡＶ抗原１ＩＵ当たり、約０．５ｐｇ未満の、細胞または細胞培養物からの混入核酸を有する、請求項２３または２４に記載の調製物。
【請求項２６】
不活化された精製成熟ＨＡＶ粒子からなる、請求項２３または２４に記載の調製物。
【請求項２７】
精製された完全ＨＡＶ粒子調製物の生成方法であって、該方法は、濾過によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から、完全ＨＡＶ粒子を精製する工程からなる、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ウイルス不活化剤で前記調製物を処理する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
精製された成熟ＨＡＶ粒子調製物の生成方法であって、該方法は、濾過および遠心分離によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から、成熟ＨＡＶ粒子を精製する工程からなる、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、ウイルス不活化剤で処理する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
ＨＡＶ感染細胞の無細胞細胞培養物上清から、完全ＨＡＶ粒子を単離する方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、ならびに
該完全ＨＡＶ粒子の精製された調製物を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記調製物が、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドを含まない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＨＡＶ感染細胞の、細胞培養物上清ＨＡＶ回収物から、成熟ＨＡＶ粒子を単離する方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、
該完全ＨＡＶの精製された調製物を単離する工程、ならびに
該完全ＨＡＶ粒子の調製物から、成熟ＨＡＶ粒子からなる調製物を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
ＨＡＶワクチンの生成方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の細胞培養物上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、
該完全ＨＡＶ粒子の精製された調製物を単離する工程、ならびに
精製された完全ＨＡＶビリオンからなる調製物を含む免疫原性組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
ＨＡＶワクチンの生成方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、
該完全ＨＡＶ粒子の精製された調製物を単離し、そして該完全ＨＡＶ粒子の調製物から、精製された成熟ＨＡＶビリオンを単離する工程、ならびに
精製された成熟ＨＡＶビリオンからなる調製物を含む免疫原性組成物を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ワクチンが、前記細胞培養物由来の混入タンパク質を実質的に含まない、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
不活化ＨＡＶワクチンの生成方法であって、該方法は、
核酸分解剤およびプロテアーゼで、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清由来のＨＡＶ調製物を処理する工程、
該完全ＨＡＶ粒子の精製された調製物を単離し、そして該完全ＨＡＶ粒子の調製物から、精製された成熟ＨＡＶビリオンを単離する工程、ならびに
調製物を含む免疫原性組成物を調製する工程、
を包含し、ここで、該ＨＡＶ調製物は、成熟ＨＡＶビリオン粒子を単離する工程の前または後に、不活化剤で処理される、
方法。
【請求項３８】
ＨＡＶワクチンであって、宿主保護量の、請求項２３〜２６のいずれかに記載の成熟ＨＡＶ粒子調製物を含む、ＨＡＶワクチン。
【請求項３９】
前記調製物が、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドおよびＨＡＶビリオンを含まない、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４０】
前記宿主保護用量が、１用量当たり、約２５ＩＵ未満のＨＡＶ抗原である、請求項３８または３９に記載のワクチン。
【請求項４１】
前記宿主保護用量が、１用量当たり、約１０ＩＵと約２５ＩＵとの間のＨＡＶ抗原である、請求項３８または３９に記載のワクチン。
【請求項４２】
免疫刺激剤を含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項４３】
Ｂ型肝炎ウイルス抗原をさらに含む、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項４４】
ウイルス病原体または細菌病原体由来の抗原をさらに含む、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染細胞培養物の上清からのＡ型肝炎ウイルスの精製方法、および精製ＨＡＶ抗原調製物の生成方法に関する。本発明はまた、哺乳動物において防御免疫応答を誘導するに十分な量の精製成熟ＨＡＶ粒子からなる調製物を含む、ＨＡＶワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ａ型肝炎は、散在性症例、風土病および時折死へと続き、世界中すべてにわたる公共の健康問題である。その感染は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（小さな非エンベロープＲＮＡウイルスの群であるピコルナウイルスファミリーのメンバーである）によって引き起こされる。このウイルス粒子は、直径２７ｎｍ〜３２ｎｍであり、１つのポリペプチド前駆分子から切断される３つのポリペプチドＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成される。
【０００３】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、細胞培養物から単離され得る唯一の肝臓指向性ウイルスであるが、このウイルスは、通常は、長期インキュベート期間により、細胞変性効果なしで増殖することは困難である。いくつかの霊長類細胞型（例えば、胎仔アカゲザル腎臓細胞株（ＦＲｈｋ−４）、初代アフリカ緑色サル腎臓細胞（ＡＧＫＭ）、持続性アフリカ緑色サル腎臓細胞（ＢＣＳ−１））がＨＡＶの複製を支持することが報告されているが、これらは、一般的には、ヒトワクチンのために使用され得ない。なぜなら、サルの腎臓は、しばしば、高含有量の潜伏性シミアンウイルスを有し、この潜伏性シミアンウイルスは、ワクチンのためのウイルス生成過程において明らかになり得るからである。他の細胞株は、これらの細胞のうちのいくつかの腫瘍原性の性質に起因して使用され得ず、ワクチン生成のためのその使用に対して束縛を行使する。ＨＡＶを生成するために、初代ヒト上皮細胞もしくは初代ヒト上皮細胞株、初代ヒト線維芽細胞もしくは初代ヒト線維芽細胞株、初代ヒト腎臓細胞もしくは初代ヒト腎臓細胞株を大量生成することは、これらの細胞が培養中で低い継代数であることによって制限される。実際、世界保健機構（ＷＨＯ）の適用可能なガイドラインは、ほんの少数の細胞株のみが、ウイルスワクチン生成のために許容されることを示す。
【０００４】
ヒトに適用可能なワクチン生成のために現在承認されかつ有効とされている細胞株のうちの１つは、ＶＥＲＯ細胞である。ＶＥＲＯ細胞は、ヒトワクチンの製造プロセスにおいて使用することについて承認されている継続性サル腎臓細胞であり、ポリオおよび狂犬病ワクチンの生成のために現在使用されている。
【０００５】
ＨＡＶ生成のためにＶＥＲＯ細胞を使用する試みもまたなされたが、ＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶ複製は制限される。なぜなら、ＶＥＲＯ細胞は、ウイルス増殖の温度制限を有し、そしてウイルスは、感染細胞の上清液中に決して見出されないからである（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉら、１９８１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３７：２１６〜２２５）。米国特許第４，７８３，４０７号は、温度制限を克服するために、３３℃以下の温度でのローラーボトル中でのＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶの生成を開示する。この系において、約５０μｇのＨＡＶ抗原が、１つのローラーボトル当たり得られ得、その後、培養細胞が凍結融解される。ＶＥＲＯ細胞におけるＨＡＶの増殖に基づく商業的ワクチンは、未だ記載されていない。
【０００６】
現在までに、ホルマリン不活化したＨＡＶワクチンが、臨床試験のために生成され（Ａｎｄｒｅら、１９９０、Ｍｅｌｎｉｃｋ編：Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ  ３７：７２〜９５、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １８：２０〜２６）、４つが認証された。これらは、長期持続性免疫を誘導し、一次感染からの防御を誘導する。現在利用可能な不活化ＨＡＶ全ウイルスワクチンの製造プロセスは、ヒト胚性肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５を宿主細胞として使用し、この細胞は、組織培養中およびウシ胎仔血清の添加によってのみ、ゆっくり増殖する。
【０００７】
この細胞培養物中の血清の使用および／または培養培地に添加する動物供給源もしくはヒト供給源由来のタンパク質添加物の使用から生じる問題（すなわち、異なるバッチの種々の品質および組成、ならびにマイコプラズマ、ウイルスまたはＢＳＥ因子による汚染の危険）が、周知である。従って、血清も他の血清由来化合物も必要としない多くの試みが、効率的な宿主系および培養条件を提供するためになされている。加えて、無血清培地の使用による汚染を回避することにより、ウイルス抗原を含む出発物質における少ない汚染に起因して、より効率的精製が可能になる。
【０００８】
Ｂｉｎｎら（１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎｃａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：２８〜３３）は、ＨＡＶの複製のためのいくつかの霊長類細胞型を試験し、多量のウイルスの単離および生成のための最適条件を試験した。ＢＳＣ−１細胞（現在までヒトにおける使用のためのワクチン調製のためには使用されていない、ヘテロ二倍体）におけるローラーフラスコ中でのＨＡＶの無血清生成は、培養プロセス２１日後に、ウイルス抗原が上清および細胞画分において見出され得ることを明らかにした。無血清培地において維持された細胞は、血清中で維持された細胞と等しいウイルス増殖を支持した。凍結融解した細胞の上清と無血清培地中で維持した感染ＢＳＣ−１細胞の上清液との低速度遠心分離により得られた候補ＨＡＶワクチンが、Ｂｉｎｎら、１９８６（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １５３：７４９〜７５６）により記載された。
【０００９】
Ｆｌｅｈｍｉｇら（１９８７．Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌ．２２：７〜１６）は、血清含有培地において増殖した持続性感染した正常ヒト胚性線維芽細胞の細胞培養上清（これは、細胞変性効果を示さなかった）から単離したＨＡＶを用いて候補ＨＡＶワクチンを調製した。これにより、ＮＵＮＣ細胞工場において製造された大量の上清から連続工程で単離および精製されたＨＡＶ抗原が、ワクチン接種試験のために使用された。
【００１０】
しかし、細胞培養物中で増殖されたすべてのＨＡＶ株が、培養上清中へのウイルスの非効率的放出によって特徴付けられる。５０％程度の多くの感染ウイルスが放出され得るが、代表的には感染性ウイルスの３０％未満が細胞外にある（Ｎａｓｓｅｒら、１９８７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２９６７〜２９７１）。従って、抗原は、しばしば、非濃縮培養上清においては検出可能でなく、大容量の濃縮が、このプロセスを用いるＨＡＶ精製における困難性に寄与する。ＨＡＶ抗原は培養上清中に効率的には放出されず、大容量を濃縮するための方法はコストがかかる（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．４７：２０３〜２１６）ので、記載されたほとんどの精製プロセスは、細胞内生成されたウイルスの細胞溶解物由来のＨＡＶ抗原を、ＨＡＶワクチンの生成のための供給源として使用する（ＥＰ  ０  ３３９  ６６７；ＥＰ  ０  ５８３  １４２、Ａｎｄｒｅら、１９９０、Ｍｅｌｎｉｃｋ編：Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．Ｂａｓｅｌ．Ｋａｒｇｅｒ  ３７：７２〜９５；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １８：２０〜２６）；Ｈａｇｅｎら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３：２０９〜２１５；Ｂａｄｅｒら、１９９６、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９１：２１７〜２２２、Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙら、１９９９、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２８３０〜２８８５、ＷＯ  ００／２３５７４）。しかし、これらのプロセスは、時間がかかり、細胞から細胞内生成された抗原を放出するために必要な界面活性剤を使用し、そして界面活性剤とその細胞由来の混入物とを除去するための激しい連続的精製工程を必要とする。
【００１１】
防御免疫応答の誘導のために、キャプシドタンパク質が、正しい立体構造でフォールディングされそしてアセンブルされなければならず、そして前駆タンパク質は、防御免疫応答を惹起可能ではないことが、示唆される。成熟ＨＡＶ粒子は、３つのウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）からなる。これらのタンパク質は、いくつかの連続切断によって、単一前駆分子（Ｐ１）から誘導される。ウイルスの成熟およびアセンブリの間に、異なる中間体が形成される。予め切断されたタンパク質は、まず、ペンタマー構造へとアセンブルし、その後、６０個のペンタマーが、プロビリオンを形成する。このプロビリオンは、ＶＰ１、ＶＰ０、およびＶＰ３からなる。成熟ウイルス粒子は、ＶＰ２およびＶＰ４におけるＶＰ０の最終的成熟切断の後に、３つのプロビリオンから誘導される。ＶＰ４は、成熟ウイルス粒子中に存在しない。
【００１２】
細胞溶解物および／または細胞培養上清からの、ＨＡＶの大規模精製物は、成熟ビリオン、プロビリオンおよびプロキャプシドの混合集団を含む（Ｂｉｓｈｏｐら、１９９７．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：２１４７−２１６０；ＥＰ  ３３９  ６６７、ＥＰ  ３３９  ６６８）。この成熟ウイルスは、ポリペプチドＶＰ１、ポリペプチドＶＰ２およびポリペプチドＶＰ３から構成されており、ここで、そのキャプシドタンパク質ＶＰ１およびキャプシドタンパク質ＶＰ３は、主要な抗原性部位を含み、かつ中和抗体を誘導する能力を有する（Ｌｅｍｏｎら、１９８９：Ｓｅｍｌｅｒら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＡＳＭ  ｐ１９３−２０８）。ＨＡＶを精製しそして種々の形態のＨＡＶ粒子を分離するための試みが、なされている。Ｂｉｓｈｏｐら、前出（１９９７）は、線形勾配の遠心分離を使用して、種々のＨＡＶ粒子形態を分離し、１．３２〜１．３３ｇ／ｃｍ３の密度のＨＡＶ粒子が、ＶＰ０含有粒子およびＶＰ２含有粒子の混合物であることを見出した。このことは、プロビリオンと成熟ビリオンとの不完全な分離を示す。成熟ＨＡＶビリオンを優性に含む画分において、それぞれ５５％：４５％の割合で、ＶＰＯよりもＨＡＶビリオンの割合が高いことが見出されている。ビリオンとプロビリオンとの両方が、細胞溶解物および培養上清中で検出される。ＶＰ０に加えて、約６７ＫＤの分子量を有する、種々のレベルのＶＰ１前駆体タンパク質ＰＸを含む放出粒子が、検出された。Ｄｕｂｏｉｓら（１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．３２：３２７−３３４）は、１．３３ｇ／ｃｍ３の密度での主要なピーク画分（これは、等密度遠心分離によって精製される完全な粒子を含む）からワクチンを調製した。ＵＳ  ５，２６８，２９２は、持続的に感染させた細胞からの、ＨＡＶの単離および精製を記載し、かつほとんどの銀染色タンパク質が、ウイルスポリペプチドＶＰ１、ウイルスポリペプチドＶＰ２およびウイルスポリペプチドＶＰ３によって占められるが、約６７ｋＤのポリペプチドもまた検出可能であることを見出した。
【００１３】
ＨＡＶワクチンに対する世界的な市場の需要は、１年間あたり１００，０００，０００用量のオーダーである。有効なワクチン生成物は、宿主系から高収率で生成される大規模量のウイルスの増殖を必要としている。さらに、すでに利用可能である材料を使用しかつ最低回数の時間消費操作を必要とする、ウイルス増殖に対するアプローチについての必要性が存在する。ここで、宿主細胞、培養培地、増殖条件および生成系の組み合わせの選択が、有効な生成工程を達成するために必須である。ほとんどのワクチンは、そのワクチンの有効性に不可欠である、感受性の生物学的活性を保存するように精製されていない。純粋な生成物は、より高い免役原性を有するより一貫性のワクチンを生じ、かつ臨床学的観点からほとんど副作用を生じないことが予測される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の簡単な要旨）
本発明の目的は、感染細胞培養物の細胞培養上清からＨＡＶを精製する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、感染細胞培養物の上清から完全なＨＡＶ粒子を単離する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、感染細胞培養物の上清から成熟ＨＡＶ粒子を単離する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＨＡＶ粒子の精製調製物を作製する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の目的はまた、完全なＨＡＶ粒子からなる精製調製物を作製する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の目的はまた、成熟ＨＡＶ粒子からなる精製調製物を作製する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、不活性化された精製成熟ＨＡＶ粒子からなる調製物を作製する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的はまた、精製ＨＡＶ粒子からなる調製物を提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、ワクチン精製した完全なＨＡＶ抗原を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、ワクチン精製した成熟ＨＡＶ抗原を提供することである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明において、無血清条件下でのＨＡＶ抗原の作製および感染細胞の細胞培養上清からのＨＡＶ抗原の簡単な精製を可能にするプロセスが、確立される。これらの細胞または細胞培養培地に由来し得る汚染不純物は、本発明の方法によって効果的に除去される。
【００２５】
本発明の１つの目的に従って、単一の精製工程内で高度の純度を生じるＨＡＶ抗原の精製のための単純な方法が提供される。この方法によって、ＨＡＶ抗原は、ＨＡＶ感染細胞培養物の細胞培養上清から、その培養培地へと生成されかつ放出される細胞培養上清を濾過することにより濃縮し、核酸変性剤およびプロテアーゼで濃縮ＨＡＶ調製物を処理し、この薬剤およびプロテアーゼで処理した調製物を濾過し、完全生成ＨＡＶ粒子の調製物を単離することにより、精製される。
【００２６】
次いで、完全ＨＡＶ粒子の精製ＨＡＶ調製物は、精製成熟ＨＡＶ粒子を、完全ＨＡＶ粒子の精製ＨＡＶ調製物から単離するさらなる工程に供される。精製工程および単離工程を包含する本発明の方法は、ヒトの臨床的使用に適切な精製ＨＡＶ調製物を生じ、この調製物は、細胞または細胞培養物に由来する混入物を実質的に含まない。
【００２７】
用語「完全ＨＡＶ粒子」は、成熟した感染性ＨＡＶビリオン粒子のＲＮＡ含有ＨＡＶ粒子を意味し、このビリオン粒子は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、ならびにＶＰ１、ＶＰ３およびＶＰ０前駆ポリペプチドを含む未成熟前プロビリオンからなる。
【００２８】
用語「成熟ＨＡＶ粒子」は、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のみからなるＲＮＡ含有ＨＡＶビリオン粒子を意味する。
【００２９】
用語「ヒトの臨床的使用に適した」とは、色素生成性ＬＡＬ試験によって決定されるように、１０μｇの抗原のエンドトキシン含有量が、約２Ｕ未満であることを意味する。さらに、混入ＤＮＡのレベル、特にＶＥＲＯ細胞のＤＮＡのレベルは、内部標準を用いる定量的ＰＣＲによって決定されるように、本発明に従って、１００ＩＵのＨＡＶ抗原あたり、約１００ｐｇ未満、好ましくは、約５０ｐｇ未満、より好ましくは、約４０ｐｇ未満である。従って、約２０ｌＵ  ＨＡＶ抗原を有するワクチン用量は、約２０ｐｇ未満、好ましくは、約１０ｐｇ未満、最も好ましくは、約８ｐｇ未満の混入ＤＮＡを有する。さらに、細胞混入物のレベルは、ウイルス抗原の用量あたりのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により決定されるように、総タンパク質含有量の約０．１％未満、好ましくは約０．０５％未満である。
【００３０】
用語「実質的に含まない」とは、混入不純物（例えば、細胞または細胞培養物由来のタンパク質）または混入細胞核酸の量が、当該分野の検出法法の最も高感度の状態の検出限界未満であることを意味する。ウェスタンブロット分析およびデンシトメトリー法は、サンプル中の混入タンパク質の量を試験するために使用される。核酸定量、特に、ＶＥＲＯ細胞のゲノムＤＮＡについて米国特許第５，８５８，６５８号に記載される高感度のＰＣＲ法は、サンプル中の核酸の残存量を提供するために使用され得る。
【００３１】
用語「細胞および細胞培養物由来の混入物」とは、細胞フラグメント、細胞ポリペプチドおよびタンパク質、細胞核酸および他の細胞由来高分子、ならびに培地由来のポリペプチドおよびタンパク質を意味する。
【００３２】
用語「細胞核酸」とは、ウイルスを増殖するために使用される、ウイルスを感染させた細胞に由来する異種ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００３３】
本発明の精製ＨＡＶ抗原は、混入タンパク質および混入核酸を実質的に含まず、ヒトの臨床的使用に適しており、かつ安定である。「精製Ａ型肝炎ウイルス抗原」によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色またはクーマシー染色される）およびウェスタンブロットによって確認されるような純度および総タンパク質量に対するＨＡＶ抗原の比率を意味し、この純度は、好ましくは、約９８％より大きい。
【００３４】
本発明の目的に従って、感染細胞培養物の細胞培養上清に由来するＨＡＶ調製物を、核酸変性剤およびプロテアーゼで処理する工程、ならびに完全ＨＡＶ粒子の調製物を単離する工程を包含する、完全ＨＡＶ粒子の精製調製物の生成方法が提供される。ＨＡＶ含有上清が採取され得、核酸変性剤およびプロテアーゼで処理する前に濃縮される。このＨＡＶ含有細胞培養上清は、ＨＡＶを生成し、これを上清に放出する任意の細胞培養物に由来し得る。細胞培養物は、好ましくは無血清培地である。
【００３５】
この方法の１つの実施形態に従って、提供される細胞培養上清は、ＨＡＶ感染ＶＥＲＯ細胞由来である。このＶＥＲＯ細胞は、懸濁物、ローラーボトルまたはフラスコ中に存在し得る。好ましい実施形態に従って、このＶＥＲＯ細胞は、好ましくは、マイクロキャリア培養であり、ここで細胞は、マイクロキャリアに結合される。このマイクロキャリアは、Ｂｕｔｌｅｒ（１９８８：Ｓｐｉｅｒ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２８３−３０３）において記載されるように、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロースなどに基づくマイクロキャリアの群から選択されるマイクロキャリアであり得る。細胞は、好ましくは、無血清培地または無血清かつタンパク質非含有の培地で増殖する。この無血清培地または無血清かつタンパク質非含有の培地は、例えば、Ｋｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：９６０−９６８）、Ｍｅｒｔｅｎら（１９９４．Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．１４：４７−５９）、Ｃｉｎａｔｌ．ら（１９９３．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．１７：８８５−８９５）、Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９９．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９８：１３−２１）、ＷＯ９６／１５２３１、米国特許第６，１００，０６１号によって記載される培地または当該分野で公知の任意の他の無血清培地もしくは無血清かつタンパク質非含有の培地であり得る。細胞は、好ましくは、アンプルからバイオマスになるまで、無血清培地または無血清かつタンパク質非含有の培地中で増殖され、細胞培養増殖、ウイルス増殖およびウイルス生成プロセスの間のそれぞれの培養培地条件下で維持される。
【００３６】
しかし、本発明の方法は、例えば、Ｂｉｎｎｓら（１９８４．前出）またはＦｌｅｈｍｉｇら（１９８７．前出）によって記載されるように、細胞培養上清へＨＡＶ粒子を放出することが公知のＨＡＶ感染細胞の任意の細胞培養上清に適用され得、それによって、ＨＡＶに感受性であり、かつＨＡＶを培地に放出する任意の宿主細胞が使用され得る。
【００３７】
ＨＡＶ感染細胞の細胞培養培地中のＨＡＶ粒子の希釈に起因して、培地中のＨＡＶ抗原は、培地容積を減少させることによって濃縮される。このことは、液体の容積を減少させ、ウイルス含有液体を濃縮することが公知の任意の方法（例えば、遠心分離、濾過、沈澱、2相分画）によって行われ得る。本発明の好ましい局面に従って、ＨＡＶ含有培地の採取は、濾過によって濃縮される。本発明の方法に従うと、限外濾過が好ましい。これは、ＨＡＶ粒子より小さなサイズを有する混入物が、同じ工程において除去され得るというさらなる利点を有する。次いで、ＨＡＶを含む得られた濃縮物は、核酸変性剤およびプロテアーゼで処理される。この薬剤およびプロテアーゼは、それらの活性のために特定の条件を必要とし得る（例えば、イオン強度、ｐＨおよび緩衝液）。活性について効率的な緩衝液条件を提供するために、細胞培地が除去され得、ＨＡＶ含有調製物中での核酸変性剤およびプロテアーゼの効率的な活性を可能にする緩衝液に交換され得る。これは、当該分野で公知の方法（例えば、透析および限外濾過もしくはクロマトグラフィーによる緩衝液交換）によって行われ得る。本発明の方法の好ましい局面に従って、これは、濾過により行われる。この濾過は、好ましくは、ダイアフィルトレーションによって行われる。
【００３８】
本発明に従う核酸変性剤は、核酸を変性させる酵素、好ましくは、核酸変性酵素（例えば、ヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡまたはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｂｅｎｚｏｎ  ＰｈａｒｍａＡ／Ｓ）として市販されるＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ製））であり得る。
【００３９】
高分子量のタンパク質およびポリペプチドの変性に使用されるプロテアーゼは、当該分野で公知の任意のプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン）であり得る。しかし、動物供給源由来のプロテアーゼ（例えば、ウシまたはブタのトリプシン）は、感染因子（例えば、ＢＳＥなど）が混入している危険性を有する。
【００４０】
従って、本発明の方法の好ましい局面によると、ＨＡＶ含有調製物は、微生物由来のプロテアーゼで処理される。この微生物プロテアーゼは、プロナーゼであり得る。プロナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（Ｓ．ｇ．）由来の異なる酵素の混合物であり、市販されている。このカクテルは、多くの異なるタンパク質（プロテアーゼ、ホスファターゼ、コラゲナーゼおよびトリプシン様プロテアーゼ（一般的には、Ｓ．ｇ．トリプシン（ＳＧＴ）と呼ばれる）を含む）を含む。この酵素は、その選択性および活性について、動物由来のトリプシンに対する高程度の類似性を示す。プロナーゼは、異なる酵素の組成物であるので、酵素活性の１つは、調製物中のＨＡＶに対して悪影響を有し得る。
【００４１】
好ましい実施形態によると、微生物プロテアーゼの精製トリプシン様酵素が使用される。特に、トリプシン様酵素のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（ＳＧＴ）である、プロナーゼの精製画分が使用される。この精製ＳＧＴは、好ましくは、ベンズアミジンでのアフィニティークロマトグラフィーおよび０．５〜１．２Ｍのアルギニンを含有する溶離剤を用いる精製ＳＧＴの溶離の方法によって得られる。この方法によって精製されたＳＧＴは、非常に有効であり、そしてその高い特異的活性に起因して、培地への負荷が少ないタンパク質と共に使用され得ることが見出されている。当該分野で公知の他の方法によってプロナーゼから精製されたＳＧＴも同様に、本発明の方法で使用され得る。このような方法としては、Ｙｏｋｏｓａｗａら（１９７６．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：７５７−７６３）により記載されるような方法または他のクロマトグラフィー法が挙げられる。
【００４２】
ＨＡＶ調製物の核酸分解剤およびプロテアーゼでの処理の後、これらの薬剤およびプロテアーゼならびにそれらの活性から生じる分解産物（例えば、高分子量高分子（例えば、核酸またはタンパク質）の低分子量フラグメント）および他の不純物が、この調製物から除去される。本発明の方法によると、不純物の除去は、濾過によって行われる。それにより、３０ｐｇ未満の混入核酸／ＩＵ  ＨＡＶ抗原を有する精製調製物が、得られる。この調製物は、少なくとも５０００ＩＵのＨＡＶ抗原／ｍｇタンパク質を有する。
【００４３】
濾過によって、不純物は、効果的に除去され、そして完全ＨＡＶ粒子は、１回の単一工程内で単離されることが見出されている。従って、上記のようにして得られた完全ＨＡＶ粒子の精製調製物は、本質的に、完全ＨＡＶ粒子からなり、ここで、完全ＨＡＶ粒子は、濾過によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から精製される。
【００４４】
上記の方法によって得られるような完全ＨＡＶ粒子の精製調製物は、成熟ＨＡＶ粒子の単離のため、および成熟ＨＡＶ粒子の精製ＨＡＶ調製物の生成のための供給源として使用され得る。この調製物中の異なるＨＡＶ粒子形態（ビリオンおよびプロビリオン）は、従来の遠心分離（例えば、スクロース勾配、ＣｓＣｌ勾配での等密度遠心分離またはゲルクロマトグラフィー、あるいは分取用Ｆｉｅｌｄ  Ｆｌｏｗ画分化）によって分離され得る。
【００４５】
本発明の別の目的によると、成熟ＨＡＶ粒子の精製調製物の生成方法が提供される。この方法は、ＨＡＶ感染細胞培養物の細胞培養物上清を提供する工程、このＨＡＶ調製物を、核酸分解剤およびプロテアーゼで処理する工程、完全ＨＡＶ粒子の調製物を単離する工程、およびこの完全ＨＡＶ粒子の調製物から、精製成熟ＨＡＶビリオンを単離する工程、を包含する。この成熟ＨＡＶビリオンは、遠心分離（例えば、等密度遠心分離）によって単離され得る。この遠心分離は、好ましくは、スクロース勾配を用いる等密度遠心分離、ペレッティングまたはスクロースクッションを用いる遠心分離である。従って、この方法は、成熟ＨＡＶ粒子の生成ＨＡＶ調製物の生成を提供し、ここでこの成熟ＨＡＶ粒子は、完全ＨＡＶ粒子の調製物から単離される。成熟ＨＡＶ粒子の調製物は、濾過および等密度遠心分離によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から得られる。記載される方法は、簡単であり、効率的であり、かつ費用削減的であり、そして従来技術には記載されていない純粋な生成物を提供する。
【００４６】
ＨＡＶ感染血清を含まないかまたは血清とタンパク質を含まない細胞培養物の、細胞を含まない上清を、精製ＨＡＶの精製のための供給源として使用して、血清を含まないかまたは血清とタンパク質を含まない培地で増殖させた細胞培養物から出発する特定の条件を合わせることによって、細胞および細胞培養培地由来の可能性のある混入の主な供給源が避けられる。しかし、マイクロキャリアに結合した細胞が、ＨＡＶ粒子が本発明の方法によって効率的に精製され得る細胞培養培地に生成されるウイルスを放出することは、予測されていなかった。濾過による精製によって、この方法は、大規模精製スキームに適合するのが簡単になる。核酸分解剤およびプロテアーゼでのさらなる処理は、高分子量高分子の全てを破壊し、これもまた、次いで、濾過によって除去され得る。
【００４７】
本発明の精製ＨＡＶ調製物は、細胞または細胞培養培地由来の混入タンパク質を含まない。このことは、宿主細胞タンパク質に対する特異的抗体を用いるウエスタンブロット分析、および調製物中の全タンパク質量に対するＨＡＶ抗原の比の決定によって決定される。細胞由来の混入核酸の除去の効率は、米国特許第５，８５８，６５８号に記載されるような残留核酸の高感度定量方法によって決定される。当該分野で公知の他の定量的核酸分析法もまた、使用され得る。本発明の方法による精製ＨＡＶ調製物は、約０．５ｐｇ未満の混入核酸／ＩＵ  ＨＡＶ抗原を有する。
【００４８】
弱毒化ＨＡＶは、当該分野で公知であり、そして感染粒子の伝播の危険性を軽減する。しかし、ワクチンウイルスの不活性化は、弱毒化されている場合でさえ、ヒトワクチンにおける使用について、ワクチンの安全性を増大する。方法の一実施形態によると、この方法は、精製ＨＡＶ粒子を、ウイルス不活性化因子で処理する工程を包含する。この不活性化因子は、不活性化活性を有する当該分野で公知の任意の因子（例えば、ホルマリン、ＢＥＩ、レーザー光、ＵＶ光、化学的処理（例えば、メチレンブルー）、ソラレンまたは任意のこれらの組合せ）であり得る。好ましくは、ウイルスは、ホルマリンで不活性化される。このウイルスの不活性化は、精製プロセスの間の任意の段階で実施され得るが、最も通常は、ウイルス不活性化剤を用いる処理は、最終精製工程の前であり、それによって成熟ＨＡＶ粒子は、完全ＨＡＶ粒子形態の調製物から単離される。
【００４９】
本発明のこの局面によると、この方法は、完全ＨＡＶ粒子の精製され、不活性化されたＨＡＶ調製物の生成を提供し、ここで完全ＨＡＶ粒子は、濾過およびウイルス不活性化処理によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から精製される。
【００５０】
本発明の別の局面によると、この方法は、成熟ＨＡＶ粒子の精製され、不活性化されたＨＡＶ調製物の生成を提供し、ここで成熟ＨＡＶ粒子は、濾過および遠心分離によって、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から精製される。このＨＡＶ粒子は、遠心分離および成熟ＨＡＶ粒子の単離の前または後に不活性化され得、それにより、遠心分離遠心分離前の不活性化処理が好ましい。これは、最終の精製および単離工程による不活性化剤の混入残留物の除去を可能にする。
【００５１】
別の局面によると、本発明は、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養物上清から完全ＨＡＶ粒子ビリオンを単離する方法を提供する。この方法は、細胞を含まない細胞培養物上清のＨＡＶ収集物を濾過する工程、この濾過したＨＡＶ調製物を、核酸分解剤およびプロテアーゼで処理する工程、および完全ＨＡＶ粒子を単離する工程、を包含する。この単離された完全ＨＡＶ粒子は、いずれのＨＡＶ前駆体ポリペプチド（例えば、Ｐ１またはＰＸ）も含まない。この方法は、濾過以外のいずれの精製および単離工程も包含しない。
【００５２】
上記の方法によって、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドＰ１および細胞または細胞培養物由来の混入タンパク質を実質的に含まない精製完全ＨＡＶ粒子から構成されるＨＡＶの精製調製物が提供される。この調製物は、ＨＡＶ抗原１ＩＵ当たり３０ｐｇ未満の混入核酸を有し、少なくとも５０００ＩＵ  のＨＡＶ抗原／ｍｇタンパク質を有する。
【００５３】
別の局面に従って、本発明は、ＨＡＶ感染細胞の細胞培養上清からの成熟ＨＡＶ粒子を単離する方法を提供する。この方法は、核酸分解剤およびプロテアーゼを用いてＨＡＶ感染細胞培養物の細胞培養上清から誘導される濾過されたＨＡＶ調製物を処理する工程、完全ＨＡＶ粒子を単離する工程、およびさらに、成熟ＨＡＶビリオン粒子を単離する工程を包含する。無細胞培養上清ＨＡＶを、核酸分解剤およびプロテアーゼを用いる処理の前に濾過する。成熟ＨＡＶ粒子の単離は、好ましくは、遠心分離によって実施される。この方法は、任意の他の精製方法または単離方法（例えば、クロマトグラフィー工程）を含まない。
【００５４】
上記方法によって、細胞または細胞培養物由来の混入タンパク質を含まない成熟ＨＡＶ粒子の精製調製物が提供される。精製成熟ＨＡＶビリオン粒子は、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドＰ１を含まず、ＨＡＶプロビリオンを含まない。調製物は、１ＩＵのＨＡＶ抗原当たり、０．５ｐｇ未満の細胞または細胞培養物由来の混入核酸を有し、そして少なくとも５０００ＩＵのＨＡＶ抗原／ｍｇタンパク質を有する。
【００５５】
調製物は、さらに、生理学的に受容可能なキャリアおよび／または安定化剤を含み得る。
【００５６】
調製物は、免疫原性組成物として処方され得る。本発明の１つの実施形態に従って、免疫原性組成物は、ＨＡＶ粒子の水溶液であり、直接的に使用され得る。
【００５７】
精製ＨＡＶ粒子は、任意の種々の公知のアジュバントと混合され得るかまたは吸着され得る。このようなアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）、またはＱＳ２１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明の１つの局面に従って、ＨＡＶワクチンの産生のための方法が提供され、この方法は、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清のＨＡＶ調製物を、核酸分解剤およびプロテアーゼを用いて処理する工程、完全ＨＡＶ粒子調製物を単離し、そして免疫原性組成物の精製完全ＨＡＶ粒子を処方する工程を包含する。
【００５９】
本発明の別の局面に従って、ＨＡＶワクチンの産生のための方法が提供され、この方法は、ＨＡＶ感染細胞培養物の上清のＨＡＶ調製物を、核酸分解剤およびプロテアーゼを用いて処理する工程、完全ＨＡＶ粒子の調製物を単離する工程、この完全ＨＡＶ粒子の調製物から精製成熟ＨＡＶビリオンを単離する工程、および精製成熟ＨＡＶビリオンの調製物を含む免疫原性組成物を調製する工程を包含する。
【００６０】
ワクチンは、ウイルス不活化剤で処理された精製ＨＡＶ粒子を含み得る。本発明のさらなる局面に従って、不活化ＨＡＶ粒子（精製完全ＨＡＶ粒子または成熟ＨＡＶビリオン粒子のいずれか）を含むＨＡＶワクチンの産生のための方法を提供する。従って、この方法は、完全ＨＡＶの精製調製物を不活化剤で処理する工程を包含する。次いで、この不活化剤を、従来の方法によって、ＨＡＶ調製物から除去する。この薬剤はまた、上記のように、不活化成熟ＨＡＶ粒子の濾過および単離によって除去され得る。最終工程において、精製不活化された完全または成熟ＨＡＶビリオンの調製物を含む免疫原性組成物が調製される。
【００６１】
本発明の別の局面によると、細胞または細胞培養物由来の混入物を含まない精製成熟ＨＡＶ粒子の宿主保護量の調製物を含有するＨＡＶワクチンが提供される。ワクチンを処方するために使用される調製物は、ＨＡＶ前駆体ポリペプチドＰ１およびＨＡＶプロビリオンを含まない。
【００６２】
用語「宿主保護量」とは、ワクチン中のウイルス抗原の臨界保護用量を意味し、ここで、この量は、Ａ型肝炎ウイルス感染に対して感受性の哺乳動物を免疫し、この宿主における保護免疫応答を誘導するのに有効である。
【００６３】
本発明の成熟ＨＡＶ粒子の調製物は、公知の市販のＨＡＶ調製物よりも、試験された動物モデルにおいて高度に免疫原性である。有効な免疫応答を得るために必要な、本発明のワクチン調製物中の抗原用量（ＩＵ）は、他のワクチン調製物よりも低い。これは、少なくとも部分的に、本発明の調製物の高い純度によって説明され得る。さらに、この調製物は、ＨＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のみからなる成熟ＨＡＶ粒子（これは中和抗体の誘導のための主要抗原性部位を含む）から構成される。この調製物は、未成熟粒子、プロビリオンまたＨＡＶ前駆体ポリペプチド（これらは、ＨＡＶ調製物中の免疫原性部位の割合を減少させる）を含まない。
【００６４】
従って、本発明のワクチン組成物は、好ましくは、約２５ＩＵ未満のＨＡＶ抗原／用量、好ましくは約２０ＩＵ未満のＨＡＶ抗原／用量の宿主保護量のＨＡＶ抗原を含む。本発明の好ましい実施形態によると、ワクチンにおける宿主保護量は、約５ＩＵと約２５ＩＵとの間のＨＡＶ抗原／用量である。しかし、より高い濃度が、使用され得る。ワクチン組成物中の細胞由来の混入核酸の量は、約０．５ｐｇ／ＩＵ抗原未満である。ワクチン組成物は、安定であり、このことは、組成物中の成熟ＨＡＶ粒子が、明らかには分解性ではないことを意味する。すなわち、２〜８℃での１年間の保存の後、ＨＡＶ抗原の９５％より多くが、標準参照物と比較して、動物における抗原ＥＬＩＳＡおよび効力研究により決定されるように、粒子構造として残る。
【００６５】
精製成熟ＨＡＶ粒子から構成される免疫原性組成物は、緩衝液および／または生理学的に受容可能なキャリアをさらに含み得る。この組成物は、アジュバントを含み得る。低濃度のアジュバントを含む組成物が、より高いアジュバント濃度を含む組成物よりも、高い抗体力価および中和抗体力価を誘導することもまた示されている（実施例５を参照のこと）。従って、ワクチン組成物は、少量のアジュバントを含み得る。ワクチン中のアジュバントの最終濃度は、約０．００１％（ｗ／ｖ）と約０．５％（ｗ／ｖ）との間であり得、好ましくは約０．０５％（ｗ／ｖ）と約０．１％（ｗ／ｖ）との間であり得る。このアジュバントは、標準的なアジュバント、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムであり得る。免疫原性ＨＡＶ調製物は、他の成分（例えば、免疫刺激剤）を含み得る。
【００６６】
別の局面によると、ワクチンは、病原体由来の少なくとも二次抗原をさらに含む。この抗原は、ウイルスまたは細菌病原体からヒトであり得る。
【００６７】
一実施形態によると、ワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス抗原をさらに含む。好ましくは、ＨＢＶ抗原は、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であり、ここでこのＨＢＶ表面抗原は、ＨＢＶ  ｐｒｅＳ１−ｐｒｅＳ２−Ｓ（大抗原）、ｐｒｅＳ２−Ｓ抗原（中抗原）またはｓ−抗原（小抗原）あるいはそれらの混合物の群から選択される。ＨＢｓＡｇは、精製ＨＡＶ粒子と混合され得、ＨＡＶ／ＨＢＶワクチン組成物が得られる。ＨＢＶ抗原は、免疫刺激剤、またはアジュバント（例えば、アルミニウム塩もしくは上記のような任意の他のアジュバント）と組み合わされ得る。
【００６８】
別の局面によれば、ワクチンは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  ＷまたはＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ｙ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される病原体由来の抗原を、さらに含有し得る。
【００６９】
本発明の利点は、以下の実施例に説明される。これらの実施例は、本発明の説明であり、その範囲を限定しない。
【実施例】
【００７０】
（実施例１：）
（ＶＥＲＯ細胞上でのＨＡＶ抗原の産生）
細菌プラスミドｐＨＡＶ／７（Ｃｏｈｅｎら、１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０３５−３０３９）にクローニングした弱毒化株ＨＭ１７５／７のゲノム由来の全長ｃＤＮＡを使用して、インビトロ転写により、全長ゲノムＲＮＡを調製する。無血清ＶＥＲＯ細胞を、３４℃で、インビトロ転写したＨＡＶ  ＲＮＡでトランスフェクトして、外来因子のないＨＡＶ  ＨＭ１７５／７のウイルスストックを作製する。
【００７１】
ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル、Ｃｅｒｃｏｐｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、腎臓）を、産生細胞株として使用する。これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから、継代番号１２４で、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１の指定で入手した。これらの細胞を、Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９８（前出）またはＷＯ９６／１５２３１に記載されるように、無血清培地または無血清無タンパク質培地中での増殖に適合させる。無血清培地中での増殖のために、無機塩、アミノ酸、重炭酸ナトリウムおよび酵母またはダイズ抽出物を補充した、基本的なＤＭＥＭ  ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地を使用する。作業細胞バンクを、いずれの動物由来の培地成分も使用せずに調製する。
【００７２】
Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物と１：１の比で混合したＤＭＥＭ培地中で培養した、１アンプルのＶＥＲＯ細胞の作業細胞バンク（ＷＣＢ）を、ダイズ抽出物または酵母抽出物のいずれかを補充した血清含有培地および無血清培地中に再懸濁させる。精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を使用することによって、継代培養を実施し、任意の病因因子を含有し得る動物供給源由来の任意の因子を回避する。Ｒｏｕｘおよびローラー瓶中での継代培養後、６〜８×１０７細胞／グラムのマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｄｅｘ  ＩＩＩ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、１２ｌの撹拌タンク醗酵槽中で接種する。細胞を、３７℃で６〜８時間増殖させる。２０％±１０％の酸素飽和度およびｐＨ７．１±０．２の培養条件、ならびに３０〜６０ｒｐｍの撹拌速度を制御する。接種後２日目に、６×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、０．１と１．０との間の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）のＨＡＶ  ＨＭ１７５／７のウイルス懸濁物を、３４℃の温度の醗酵槽にポンピングする。２時間後、ウイルス吸着を可能にするために、培地の灌流を開始する。醗酵槽の体積の半分を、毎日新鮮な培地と交換する。マイクロキャリアおよび付着した細胞を、篩によって醗酵槽中に保持する。醗酵の間、ｐＨ７．１、Ｏ２（３０％）、３０〜６０ｒｐｍの撹拌速度、および３４℃の温度を制御する。
【００７３】
ＨＡＶ  ＨＭ１７５／７ウイルスの大規模産生のために、１×１０１１のバイオマスのＶＥＲＯ細胞培養物を、マイクロキャリアに播種し、そして３７℃で無血清培地条件下で、１００ｌの醗酵槽において増殖させる。この温度を３４℃に低下させ、そして引き続く醗酵サイクルの間、細胞の数は８〜１０倍増加する。最後の醗酵槽において、細胞を、０．０１〜１．０のｍ．ｏ．ｉ．のＨＡＶで感染させる。感染細胞中での、３４℃で３５０日までの増殖を、細胞培養培地の永続的な灌流によって実施し得る。ウイルス抗原が培地中に検出される場合、ウイルス含有上清を収集し、そして４℃で貯蔵する。細胞培養上清の採取を、感染の３５〜４５日目に開始する。
【００７４】
（実施例２：）
（ウイルス採取物の精製）
実施例１の細胞培養上清のウイルス採取物を、Ｐｒｏｓｔａｋ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ  ２００Ｋでの限外濾過によって１００倍に濃縮し、次いで、緩衝液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０１％Ｔｗｅｅｎと交換して、ダイアフィルトレーション工程（Ｐｒｏｓｔａｋ  ２００Ｋ、Ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）を行う。調製物中に存在し得る残余の宿主細胞核酸を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）１０００Ｕ／ｌ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中）と共に、Ｄｉａｒｅｔｅｎａｔｅを室温で３時間インキュベーションすることによって除去する。引き続いて、０．５〜５Ｕ／ｍｌの濃度のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（ＳＧＴ）の精製したトリプシン様微生物プロテアーゼを添加し、そしてその保持物を、室温で２４時間さらにインキュベートする。宿主細胞混入物（すなわち、核酸および／またはタンパク質）を、１００Ｋ膜で、２０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を緩衝液として用いるダイアフィルトレーションによって、除去する。
【００７５】
（実施例３：）
（ＨＡＶの初期精製の効力）
最初の精製工程の効力を、連続的な醗酵プロセスの間の異なる時間間隔での２つの細胞培養採取物を用いて調査する。精製を、実施例２に記載されるように実施し、そしてサンプルを、限外濾過／ダイアフィルトレーションによる濃縮後に、出発物質から取り出し、そして酵素処理後、最終ダイアフィルトレーション工程を行う。
【００７６】
（Ａ．ウェスタンブロット分析）
少なくとも１０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌのＨＡＶ抗原を含有するサンプルを、各濾過工程の間に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして銀染色して、全タンパク質を可視化するか、またはウェスタンブロット分析によって分析して、ＨＡＶ特異的抗原を決定する。
【００７７】
図１Ａは、銀染色後の種々の中間体のタンパク質パターンを示す。広範なポリペプチドが、出発物質および精製手順の最初の中間体において検出され得（図１Ａ、レーン１〜１１）、一方でほんの１つのわずかなタンパク質バンドが、プロテアーゼ処理およびダイアフィルトレーション後に残った（図１Ａ、レーン１４および１６）。ＨＡＶ特異的キャプシドタンパク質は、出発物質においても精製したダイア保持物（ｄｉａｒｅｔｅｎｔａｔｅ）においても、銀染色によって検出可能ではない。
【００７８】
ＨＡＶ特異的抗原を、ウェスタンブロット分析によって、ＨＡＶキャプシドタンパク質に特異的な抗血清を使用して同定する（図１Ｂ）。ＨＡＶ前駆体タンパク質（Ｐ１）は、精製プロセスの間に除去されることが見られ得る（図１Ｂ、レーン１〜１１）。細胞培養上清の出発物質において、プロテアーゼ処理後のダイア保持物中には存在しないＨＡＶ特異的ポリペプチドが検出されるが、ＨＡＶ特異的キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、プロテアーゼ処理によって影響を受けない（図１Ｂ、レーン１４および１６）。銀染色およびウェスタンブロットによる、異なる中間体の分析は、精製手順の効力を明らかに実証した。
【００７９】
ＶＥＲＯ細胞タンパク質に対して惹起された抗血清を使用する、ウェスタンブロット分析（図１Ｃ）は、出発物質および精製中間体において、広範な優先的に高分子量のＶＥＲＯタンパク質が検出可能であることを明らかにする。最終保持物中では、少量のＶＥＲＯ細胞混入物のみが、検出可能である（図１Ｃ、レーン１５〜１６）。
【００８０】
単に連続濾過工程を使用する主な精製手順は、宿主細胞混入物ならびにウイルス性前駆体タンパク質を除去する際に、より効果的であることが見出される。高分子量のＶＥＲＯ細胞のタンパク質を、プロテアーゼ処理によってフラグメント化し、そしてダイアフィルトレーション工程によって後に効率的に除去する。さらに、精製手順は、感染ＨＡＶ粒子の純粋な調製物をもたらす。感染ＨＡＶ粒子は、３つのウイルス性カプサイドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）からなる。これらのタンパク質を、ウイルス成熟およびアセンブリプロセスの間に、いくつかの連続的な切断によって単一ポリペプチド前駆体分子（Ｐ１）から誘導する。保護性の免疫応答の誘導について、カプサイドタンパク質が折り畳まれるべきであり、そして現在のコンフォメーションにおいてアセンブリされるべきであること、および前駆体タンパク質が、保護性の免疫応答を誘発し得ないことを示唆する。前駆体タンパク質がプロテアーゼ処理に敏感であり、そして除去され得るが、ウイルス性カプサイドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３がプロテアーゼによって影響を受けないことが証明される。
【００８１】
従って、ＨＡＶワクチンの製造者のプロセスにおける第１の精製工程は、ＶＥＲＯ細胞タンパク質および未熟な前駆体タンパク質の除去に関してより効率的である。
【００８２】
（Ｂ．ＨＡＶ抗原含量）
競合的ＥＩＡを、製造者の指示書に従って、試験キットＥ１２（Ｍｅｄｉａｇｎｏｓｔ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行う。
【００８３】
各サンプルを、希釈緩衝液に連続的に希釈し、１００μｌの各サンプルを試験する。抗原濃度を、統計学的な計算プログラム（Ｓｏｆｔｍａｘ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４つのパラメーター分析によって測定する。
【００８４】
（Ｃ．全タンパク質濃度の測定）
全タンパク質含量の測定を、市販のビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって、標準タンパク質調製物と比較して行う。２ｍＬのＢＣＡ溶液を、１００μｌの各サンプルに添加し、そして３０分間、６０℃にてインキュベートする。引く続き、サンプルの光学密度を５６２ｎｍの波長で光度計を用いて測定する。タンパク質濃度を、標準曲線を用いて計算する。
【００８５】
（Ｄ．精製したＨＡＶの培養細胞感染量（ＴＣＩＤ５０）の測定）
ＴＣＩＤ５０の測定を、細胞培養培地中で調製された連続１対数希釈のサンプルによってＦＲｈＫ−４細胞に対して行う。１００μｌの各連続希釈を８回添加し、並行してＦＲｈＫ−４細胞をマイクロタイタープレートで増殖させる。
【００８６】
カットオフ値を、ネガティブコントロールウェルの平均光学密度として計算する。カットオフ値より２倍高い光学密度を有する全ての位置を、ポジティブと考える。ＴＣＩＤ５０の測定を、ポアソン分布に従って最大見込み方法（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍｅｔｈｏｄ）によって行い、ｌｏｇ  １０  ＴＣＩＤ５０として表す。
（Ｅ．ＰＣＲを使用するＶＥＲＯ細胞濃度の決定）
ＶＥＲＯ細胞ＤＮＡの量は、米国特許第５，８５８，６５８号に記載されるように、定量的ＰＣＲによって決定される。
【００８７】
表１に示すように、ウイルスの感染性（ＴＣＩＤ５０によって測定された）は、精製手順によって影響されず、他方では、ＨＡＶ抗原の量が実行１において４８５，０００ＩＵから２６３，９４０ＩＵまで約５０％低下し、そして実行２において４９０，００ＩＵから２１６，５５８ＩＵまで約５０％低下する。総タンパク質量は、実行１において２６，６７０ｍｇから３７ｍｇまで低下し、そして実行２において２６１，００ｍｇから４２ｍｇまで低下する。ＶＥＲＯ細胞ＤＮＡの量は、単純フィルタリング方法によって約９，０００の因子によって低下される。酵素処理およびダイアフィルトレーションの後、２．９７μｇおよび６．３６μｇのＶＥＲＯ細胞ＤＮＡがダイアリテンテート（ｄｉａｒｅｔｅｎｔａｔｅ）において検出される。２０ＩＵが１ワクチン抗原用量に相当すると仮定すると、濾過による初期精製後の、ワクチン用量当たりのＶＥＲＯ細胞ＤＮＡの量は、それぞれ５９０ｐｇおよび２３０ｐｇと算出される。
【００８８】
【表１】
2005511077.tif 000002
さらに、精製プロセスの異なる中間体の純度の程度は、総タンパク質に対するＨＡＶ抗原の量で算出される。表２に示すように、純度の程度は、１８．２ＩＵ／ｍｇから７，１３４ＩＵ／ｍｇまでであったのが、それぞれ１８．８ＩＵ／ｍｇから５，１５６ＩＵ／ｍｇまで増大した。
【００８９】
【表２】
2005511077.tif 000003
感染性ＨＡＶ粒子の不活性化前のフィルタリングプロセスは、安定であり、宿主細胞混入の減少に極めて有効であることが見出されている。純度の程度は、約３００の因子によって増大し、他方では、ＶＥＲＯ細胞ＤＮＡは、約９０００の因子によって減少する。精製プロセス中の感染性ではなく、ＨＡＶ抗原の損失が、プロトマーおよびペンタマーのようなウイルス特異的前駆体タンパク質の除去におそらく最も起因する。
【００９０】
従って、不活性化ＨＡＶワクチンの製造において使用される第一精製工程は、ＶＥＲＯ細胞タンパク質およびＤＮＡのような宿主細胞混入物の除去、ならびに未成熟のＨＡＶ前駆体ポリペプチドの除去に関して、極めて有効である。
（実施例４）
精製ＨＡＶの不活性化および不活性化ＨＡＶ粒子の単離
実施例３の精製した感染性Ａ型肝炎ウイルス調製物は、０．１％ホルマリンと共に３７℃で１２０時間インキュベーションすることによって、不活性化を受ける。
【００９１】
不活性化されたＨＡＶ調製物を、次いで、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．３中で０〜６５％ショ糖勾配の勾配遠心分離に供す。ゾーン遠心分離後、０〜６５％ショ糖勾配の異なる画分（画分１１〜１６）およびプールしたピーク画分（画分１２〜１４）をウエスタンブロット分析によって検討する。
【００９２】
（Ａ．抗ＨＡＶ抗体による精製ＨＡＶの特徴づけ）
各画分を、特異的なモルモット抗ＨＡＶカプシドポリクローナル抗体（図２Ａ）またはモルモット抗ＶＰＯポリクローナル抗体（図２Ｂ）とのインキュベートによるウェスタンブロット分析により、ＨＡＶ抗原について分析する。
【００９３】
単一画分１１〜１６の精製ＨＡＶ粒子のタンパク質パターン（図２ＡおよびＢ、レーン２〜７）およびプール化画分１２〜１４（図２ＡおよびＢ、レーン８）を示す。ウイルスのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、画分１２〜１４において検出される（図２Ａ、レーン３〜５および８）。ＶＰ０に特異的な抗血清を用いる各画分のウェスタンブロット分析により、ＶＰ０前駆体タンパク質が存在せず、カプシドタンパク質ＶＰ２のみが精製調製物中に存在することが明らかになった（図２Ｂ、レーン３〜５および８）。従って、精製画分は、細胞培養上清から得られた成熟ＨＡＶビリオンのみを含んだ。
【００９４】
（Ｂ．抗ＶＥＲＯ抗体による精製ＨＡＶの特徴づけ）
収集したウイルスサンプルおよび各精製工程の後のサンプルを、特異的なヤギ抗ＶＥＲＯ細胞のタンパク質ポリクローナル抗体とのインキュベートによるウェスタンブロット分析により、ＨＡＶ抗原について分析する（図３）。
【００９５】
最初の濾過プロセスの中間体のウェスタンブロット分析による分析は、精製手順の有効性を示す。図３は、ＶＥＲＯ細胞タンパク質に対して生じる抗血清を用いるウェスタンブロット分析後の中間体サンプルのタンパク質パターンを示す。広い範囲のポリペプチドが、開始物質および精製手順の第１の中間生成物において検出され得る（図３、レーン１〜３）が、プロテアーゼ処理およびダイアフィルトレーション後には、ほんのかすかなタンパク質のバンドが残される（図３、レーン４）。（例えば、０〜６５％のショ糖勾配による）最終精製の後、ＶＥＲＯ細胞特異的なタンパク質は検出されない（図３、レーン５）。
【００９６】
精製手順は、ＶＥＲＯ細胞の混入を除去するのに非常に有効であること示される。高分子量タンパク質をプロテアーゼ処理によって断片化し、その後、濾過による最初の精製における、ダイアフィルトレーション工程によって除去する。核酸分解剤およびプロテアーゼ処理由来ならびに不活性化プロセスの残留混入物は、最終精製工程によって効率的に除去される。
【００９７】
（Ｃ．ＶＥＲＯ細胞ＤＮＡのＰＣＲによる精製ＨＡＶの特徴づけ）
精製した、プール画分１２〜１４の成熟ＨＡＶ粒子調製物を、ＵＳ５，８６８，６５８に記載されるように、ＶＥＲＯ細胞培養物由来の核酸の混入について分析する。ＶＥＲＯ核酸の計算値は、１００ＩＵのＨＡＶ抗原あたり４０ｐｇ未満のＶＥＲＯ核酸を明らかにした。従って、１用量当たり２０ＩＵのＨＡＶ抗原を有する抗原用量は、８ｐｇ未満のＶＥＲＯ細胞核酸を有する。
【００９８】
（実施例５：）
（精製した成熟ＨＡＶ粒子のＨＡＶワクチン）
精製された、不活化成熟ＨＡＶビリオンの調製物を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ  ｐＨ７．３）とともに処方し、異なる濃度のアドジュバントで補助する。例示的なアドジュバントとして水酸化アルミニウムを使用する。水酸化アルミニウムを終濃度が０．０５％、０．１％および０．２％（ｗ／ｖ）となるように精製調製物に添加する。アドジュバントに対する抗体の吸着について、これらの調製物を試験する。アドジュバントの濃度を変更することなく、試験物質を連続希釈する。１０匹のマウスの試験群の各々に対し、０．５ｍｌの調製物を皮下投与し、そして免疫の４週間後にこれらの動物をセロコンバージョン（ＥＤ５０：有効用量）、抗体の力価および中和活性について分析する。結果を表３および４に示す。
【００９９】
表３は、異なるアドジュバント濃度での抗原調製物のセロコンバージョン率およびＥＤ５０値を示す。驚くべきことに、組成物中のより低いアドジュバント濃度（０．０５％）は、より高いアドジュバント濃度（０．２％）よりも高いセロコンバージョンを誘導するのに有利であることが見出される。従って、精製された低ウイルス抗原性成熟ＨＡＶ粒子の本発明の調製物は、低濃度のアドジュバントの存在下で、動物の５０％セロコンバートに必要とされる。
【０１００】
（表３：異なる濃度のＨＡＶ抗原およびアドジュバント濃度で免疫されたマウスのセロコンバージョン率およびＥＤ５０値）
【０１０１】
【表３】
2005511077.tif 000004
【０１０２】
（表４：異なる濃度のＨＡＶ抗原およびアドジュバント濃度で免疫されたマウスの抗体力価および中和化抗体力価）
【０１０３】
【表４】
2005511077.tif 000005
【０１０４】
表４に示される結果は、免疫原性調製物における同じ抗原濃度は、アドジュバント濃度に依存して異なる抗体力価を誘導することを示す。より低いアドジュバント濃度では、より高いアドジュバント濃度のときよりも抗体の力価が高い。誘導された中和化抗体の力価は、同じＨＡＶ抗原濃度およびアドジュバントの異なる濃度で類似する。従って、成熟ＨＡＶ粒子の精製された調製物を含む本発明の免疫原性組成物は、アドジュバントの低い濃度で、高い免疫原性を示した。低いアドジュバント（０．０５％）を有するか、いかなるアドジュバントも含まないＨＡＶワクチンの比較免疫化研究を、モルモットで行った（表５）。
【０１０５】
（表５：アジュバントを用いたＨＡＶワクチンでの動物の免疫およびアジュバントを用いないＨＡＶワクチンでの動物の免疫）
【０１０６】
【表５】
2005511077.tif 000006
表３〜５に示される実験の結果は、有効ワクチン用量中の抗原濃度およびアジュバント濃度が、ＨＡＶ感染に対する保護免疫応答を誘導するために劇的に減少され得ることを示す。さらに、アジュバントをいずれも有さないワクチンの免疫原性および効力は、低アジュバント濃度を含むワクチンと同程度である。
【０１０７】
（実施例６：２つの認可されたワクチンと本発明のＨＡＶワクチンの比較）
（Ａ．免疫原性の比較）
１５〜２０ＩＵのＨＡＶ抗原含量および０．０５％の最終濃度のＡｌ（ＯＨ）３を有する成熟ＨＡＶビリオン粒子の精製調製物を含む本発明のワクチンは、その免疫原性に関して、２つの認可され市販されるワクチン（ＶＡＱＴＡ（登録商標）５０Ｕ（ＭＥＲＣＫ）およびＨＡＶＲＩＸ（登録商標）１４４０（Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ））と比較される。ワクチンを、アルミニウム濃度を変化させずに連続的に希釈する。マウスの試験群を、０．５ｍｌの種々のワクチン調製物でｓ．ｃ．免疫する。各群の血清をプールし、抗体力価および中和抗体を、実施例５に記載されるように決定する。
【０１０８】
表６は、種々のワクチンを用いた抗体力価および中和抗体力価の誘導を示す。より高い抗体力価は、本発明の希釈されないワクチンを使用する場合に誘発される。プールされた血清の抗体力価は、３５４１ｍＩＵ／ｍｌであり、本発明のワクチンは、１５〜２０ＩＵ／ｍｌを有する。希釈されない認可されたワクチンＶＡＱＴＡ（登録商標）およびＨＡＶＲＩＸ（登録商標）は、それぞれ、２５４１ｍＩＵ／ｍｌおよび６９１ｍＩＵ／ｍｌを誘導し得る。プールされた血清の中和活性の分析は、本発明のワクチンを用いて誘導される、より高い中和抗体力価を示す。
【０１０９】
（表６：種々のワクチンの抗体力価および中和抗体力価の比較データ）
【０１１０】
【表６】
2005511077.tif 000007
種々の市販のワクチンの抗原含量が標準化されておらず、各製造業者が独自の試験系を有するが、候補ワクチンおよび市販のワクチンの免疫原性は、免疫実験ならびにセロコンバージョンによる有効な免疫応答の誘導および抗体力価によって比較され得る。比較データの分析は、精製された１５〜２０ＩＵの濃度の本発明の成熟ＨＡＶ粒子の調製物および低濃度のアジュバント（または、アジュバントなし）が、ＨＡＶに対する有効な免疫応答を誘導し得ることを示す。
【０１１１】
（Ｂ．ワクチン中のＨＡＶ粒子の比較）
本発明のＨＡＶ調製物を、モノクローナル抗体の抗−ＶＰＯ抗体、抗−ＶＰ１抗体および抗−ＶＰ３抗体の混合物を用いるウェスタンブロット分析によって、２つの認可されたワクチンＶＡＱＴＡ（登録商標）およびＨＡＶＲＩＸ（登録商標）に対して比較する。
【０１１２】
図４に示されるように、本発明の調製物は、ＶＰ２の検出に起因して成熟ＨＡＶ粒子のみから構成され、このＶＰ２は、前駆体ポリペプチドＶＰＯのタンパク質分解切断に由来し、成熟ウイルス粒子の部分である一方、ＶＰＯは、プロビリオン中に存在し、単なる欠損ウイルス粒子である。市販されるワクチンはまた、プロビリオンおよび前プロビリオンを含むが、これらを成熟粒子より多量含む。この観察を、ＶＡＱＴＡ（登録商標）ＨＡＶワクチンが、空のプロビリオンおよび完全成熟粒子の両方を３：１の比で含むというＡｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９９３．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．８：２０−２６）の発見によって確認する。
【０１１３】
（実施例７：プロナーゼからのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓトリプシンの精製）
（Ａ．イオン交換クロマトグラフィー）
３０ｇのプロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を、緩衝液Ａ（０．０２ピリジン、ｐＨ５．０）中に、最終濃度４０ｍｇ／ｍｌのプロナーゼになるまで溶解する。２５ｍｌの溶液を、緩衝液Ａで平衡化されたＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｌ  ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのカチオン交換クロマトグラフィーに供する。溶出を、カラム容量の５倍を用いる、緩衝液Ａ（０．０２Ｍ  ピリジン）と緩衝液Ｂ（０．７５Ｍ  ピリジン  ｐＨ５．０）を用いた直線勾配を使用して、室温で実施する。
【０１１４】
回収された画分を、この画分のサンプルをダイズインヒビターと１：１０の比（例えば、１ｍｇダイズインヒビター／１００μｇタンパク質）で混合し、Ｓ２２２２を使用するクロマトグラフィー基質アッセイすることによって、阻害特性について試験する。結果を、１分当たりのΔ吸収単位（ΔＡ／分）として示す。ダイズインヒビターに対して最も高い阻害活性を有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅで染色する。
【０１１５】
このトリプシン活性は、基質としてＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５℃）を使用するクロモジェニックアッセイによって測定され、１分あたりのΔ吸光度単位が決定される。コントロール参照物として、１３×１０３Ｕ／ｍｇの比活性を有するブタトリプシン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）が使用される。この比活性は、１ｍｇのタンパク質あたりのトリプシン酵素活性の単位として規定される。この結果を、表７に要約する。
【０１１６】
キモトリプシン活性は、３−カルボキシメトキシプロピニル−Ｌ−アルギニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−チロシン−ｐ−ノトロアニリン（ｎｏｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ）ヒドロクロリド（Ｓ−２５８６、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を使用するクロモジェニックアッセイによって測定される。この結果は、１分あたりのΔ吸光度単位（ΔＡ／分）で表す。
【０１１７】
【表７】
2005511077.tif 000008
表７は、トリプシン様活性を有するタンパク質を含む画分が、ダイズインヒビターでの阻害試験によって測定される場合、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）の活性よりも１０倍高い比活性、および約７０％の回収率で、イオン交換クロマトグラフィーによって精製され得ることを示す。しかし、このタンパク質は不安定であり、そして単一のバンドではなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の種々のバンドを示す。これは、タンパク質の断片化および自己開裂を示す。
【０１１８】
（Ｂ．固定化されたベンズアミジンでのアフィニティークロマトグラフィー）
緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）で平衡化したベンズアミジンセファロース６Ｂファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを、４０ｍｌのプロナーゼ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ、緩衝液Ａ）で充填する。溶出を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ベンズアミジンヒドロクロリド  ｐＨ７．０）、緩衝液Ｃ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．６Ｍ  アルギニン、ｐＨ５．５）または緩衝液Ｄ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍ  アルギニン、ｐＨ５．５）で実施する。
【０１１９】
回収される画分を、ダイズインヒビターを使用して阻害特性について、ならびに実施例７Ａに記載されるようなトリプシン活性およびキモトリプシン活性について試験する。この比活性は、タンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性の単位として決定される。
【０１２０】
【表８】
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表８に要約される結果は、ベンズアミジンでの競合溶出によって、プロナーゼの精製トリプシン様活性の６０％が、約１４０Ｕ／μｇタンパク質の比活性で回収されることを示す。しかし、この精製トリプシン様プロテアーゼ含有画分は、好ましくは、さらに精製され、そして細胞培養増殖またはヒトにおける適用のための生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の製造に関与するプロセスにおける、使用の前に、ベンズアミドが回収される。
【０１２１】
【表９】
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表９における結果から見られ得るように、プロナーゼの開始トリプシン様活性の約６３％が、０．６Ｍのアルギニンを含有する緩衝液を使用する場合に回収され、一方、約７１％が、１Ｍのアルギニンを含有する緩衝液で回収される。ベンズアミジン親和性キャリアからアルギニンで溶出される精製ＳＧＴもまた、イオン交換クロマトグラフィーまたはベンズアミジンキャリアからのベンズアミジンでの溶出によって得られるＳＧＴと比較してより高い比活性を有した。
【０１２２】
さらに、モル濃度の増加するアルギニンを含む緩衝液が使用される場合、より高い純度および比活性の産物が得られる。
【０１２３】
上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明を限定しない。本発明の他の改変は、当業者に容易に理解され、そして添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために、本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１Ａ】図１Ａは、ＨＡＶ精製プロセスの種々の中間体の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質パターンおよび銀染色を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＡＶ特異的モルモット血清を使用した、ＨＡＶ精製プロセスの種々の中間体のウェスタンブロット分析を示す。これは、以下のレーンにおいて示される：レーン１：ＨＡＶ濃縮物（出発物質）、レーン２：空、レーン３：限外濾過工程（１０倍濃縮）の濾過物、レーン４：限外濾過工程（１０倍濃縮）の保持物(ｒｅｔｅｎｔａｔｅ)、レーン５：空、レーン６：ダイアフィルトレーション工程１のダイアフィルトレーション物（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）１、レーン７：ダイアフィルトレーション工程１のダイア保持物（ｄｉａｒｅｔｅｎｔａｔｅ）１；レーン８：０．２２μフィルターを用いた濾過後のダイア保持物１、レーン９：空、レーン１０：ダイア保持物＋Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（処理の３時間後）、レーン１１：ダイア保持物＋プロテアーゼ（処理の２４時間後）、レーン１２：空、レーン１３：緩衝液を用いたダイアフィルトレーションのダイアフィルトレーション物２、レーン１４：ダイア保持物２、レーン１５：空、レーン１６：ダイア保持物２（０．２２μフィルターを使用する）、レーン１７：空、およびレーン１８：分子量標準物質。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＶＥＲＯ細胞特異的抗血清を使用した、ＨＡＶ精製プロセスの種々の中間体のウェスタンブロット分析を示す。レーン１：分子量標準物質、レーン２：空、レーン３：ＨＡＶ濃縮物（出発物質）、レーン４：空、レーン５：限外濾過工程（１０倍濃縮）の濾過物、レーン６：限外濾過工程（１０倍濃縮）の保持物、レーン７：ダイアフィルトレーション工程１のダイアフィルトレーション物１、レーン８；ダイアフィルトレーション工程１のダイア保持物１、レーン９：０．２２μフィルターを用いた濾過後のダイア保持物１、レーン１０：空、レーン１１：ダイア保持物＋Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（処理の３時間後）、レーン１２：ダイア保持物＋プロテアーゼ（処理の２４時間後）、レーン１３：空、レーン１４：緩衝液を用いたダイアフィルトレーションのダイアフィルトレーション物２；レーン１５：ダイア保持物２、レーン１６：ダイア保持物２（０．２２μフィルターを使用する）。
【図２Ａ】図２Ａは、キャプシドタンパク質に対して惹起されるモルモット血清を使用した、ＨＡＶ調製物のスクロース勾配精製の種々の画分のウェスタンブロット分析を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、抗ＶＰＯ特異的モルモット血清を使用した、ＨＡＶ調製物のスクロース勾配精製の種々の画分のウェスタンブロット分析を示す。レーン１：分子量標準物質、レーン２：画分１１、レーン３：画分１２、レーン４：画分１３、レーン５：画分１４、レーン６：画分１５、レーン７；画分1６、レーン８：プール画分１２〜１４。
【図３】図３は、ＶＥＲＯ細胞特異的抗血清を使用した、精製プロセスの種々の中間体のウェスタンブロット分析を示す。レーン１：細胞培養上清収集物、レーン２：ダイア保持物（限外濾過／ダイアフィルトレーション後）；レーン３：ダイア保持物１＋プロテアーゼ（処理の２４時間後）、レーン４：ダイア保持物２（緩衝液を用いたダイアフィルトレーション後）、レーン５：スクロース勾配の画分１２〜１４。
【図４】図４は、抗ＶＰＯ抗体、抗ＶＰ１抗体および抗ＶＰ３の混合物を使用した、本発明の成熟ＨＡＶ粒子および２つの許可されたワクチンからなるＨＡＶ調製物のウェスタンブロット分析を示す。レーン１：分子量標準物質、レーン２：１０倍の上清収集濃縮物（限外濾過前）、レーン３：スクロース勾配のピーク画分１、レーン４；スクロース勾配のピーク画分２、レーン５：ＶＥＲＯ細胞溶解物、レーン６：１０倍のＶＡＱＴＡ、レーン７：１０倍のＨＡＶＲＩＸ、レーン８：分子量標準物質。
【図１】
2005511077.tif 000011
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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