(57)【要約】【課題】【解決手段】少なくとも１つの金属イオンに配位する環状リガンド基を有する官能基により官能化されたポリマー基材であって、前記環状リガンド基がＮ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備える、ポリマー基材。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの金属イオンに配位する環状リガンド基を有する官能基により官能化されたポリマー基材であって、前記環状リガンド基がＮ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備える、ポリマー基材。
【請求項２】
前記環状リガンド基中の少なくとも１つの金属イオン配位ドナー原子が環原子である、請求項１に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項３】
前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項１又は２に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項４】
前記ポリマーが、多糖及びその誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド、表面修飾されたシリカ、並びに表面修飾された金属酸化物からなる群から選択される、請求項１乃至３の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項５】
前記ポリマーが、アガロース及びその誘導体、デキストラン及びその誘導体、並びにセルロース及びその誘導体からなる群から選択される、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項６】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有する環中に少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた複素環基である、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項７】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６個の環原子を有するトリアザシクロアルカン由来の基である、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項８】
先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材であって、
前記官能基が一般式（Ｉ）を有する、官能化ポリマー基材。
【化１】
2005526487.tif 000036
ここで、
ｎは０又は１乃至３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中の各ａ、ｂ、ｃは、相互に独立し且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、１乃至３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ２−基の一方又は両方の水素原子は、相互に独立し且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に且つ独立に置換基で置換することができ、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に置換基で置換することができ、
ｎが０の場合には、ＲはＨ又は置換基であり、
ｎが１の場合には、Ｒは任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備えた二官能性基であり、
ｎが２又は３の場合には、Ｒは任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備えた（ｎ＋１）−官能基であり、
Ｘは、リンカー／スペーサー基である。
【請求項９】
環の−ＣＨ２基中の水素原子を任意に置換する前記置換基が、任意に置換された低級アルキル基および任意に置換されたアリール基からなる群から選択され、前記低級アルキル基又はアリール基上に任意に導入される前記置換基が任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える、請求項８に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１０】
環の−ＮＨ基中の水素原子を任意に置換する前記置換基が、任意に置換された低級アルキル基および任意に置換されたアリール基からなる群から選択され、前記低級アルキル基又はアリール基上に任意に導入される前記置換基が任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える、請求項８又は９に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１１】
請求項８乃至１０の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材であって、
前記ポリマー基材がアガロースであり、
ｎが０、１、２又は３であり、
各トリアザシクロアルカン環中のａ、ｂ、及びｃが２であり、
ｎが０の場合には、ＲがＨであり、
ｎが１の場合には、Ｒは、
−〔ＣＨ２〕ｍ（ｍは、２、３、又は４である）、
【化２】
2005526487.tif 000037
並びにそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
ｎが２の場合には、Ｒは、
【化３】
2005526487.tif 000038
及びそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
ｎが３の場合には、Ｒは、
【化４】
2005526487.tif 000039
及びそれらの置換された誘導体からなる群から選択され、
Ｘは、アガロースとエピクロロヒドリンとの反応、及び該反応によって生じた生成物とＸに結合した状態になるトリアザシクロアルカン環の環−ＮＨ−基との反応によって誘導可能な基である、
官能化ポリマー基材。
【請求項１２】
前記官能基中の少なくとも１つの前記環状リガンド基に配位した金属イオンをさらに備えた、先行する請求項の何れか１項に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１３】
前記配位した金属イオンが２価又は３価の金属イオンである、請求項１２に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１４】
前記金属イオンが、Ｃａ２＋、Ｍｇ2＋、Ｃｕ2＋、Ｚｎ2＋、Ｎｉ2＋、Ｍｎ2＋、Ｃｏ2＋、Ｆｅ3＋、及びＣｒ3＋からなる群から選択される、請求項１３に記載の官能化ポリマー基材。
【請求項１５】
第一の官能基と第二の官能基を有する二官能性試薬の前記第一の官能基と第一の反応を行うことができる反応性官能基を有するポリマー基材を選択する工程であって、
前記第一の反応によって前記ポリマー基材と前記二官能性試薬との間に共有結合が形成され、
前記共有結合された試薬の前記第二の官能基が、続いて、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた金属イオンに配位する環状リガンド基を有する種の中に存在する反応性官能基と第二の反応を行うことができ、
前記第二の反応によって前記種と前記共有結合された試薬との間に共有結合が生じる、工程と
前記ポリマー基材を前記二官能性試薬と反応させる工程と、
生じた前記共有結合された試薬を前記種と反応させる工程と、
を備えた、請求項１に記載の官能化ポリマー基材を調製する方法。
【請求項１６】
前記環状リガンド基中の少なくとも１つの金属イオン配位ドナー原子が環原子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーが実質的に水に不溶性である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーが、多糖及びその誘導体、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド、表面修飾されたシリカ、並びに表面修飾された金属酸化物からなる群から選択される、請求項１５乃至１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーが、アガロースとその誘導体、デキストランとその誘導体、及びセルロースとその誘導体からなる群から選択される、請求項１５乃至１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有する環中に少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を備えた複素環基である、請求項１５乃至１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基が、少なくとも６つの環原子を有するトリアザシクロアルカン由来の基である、請求項１５乃至２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記金属イオンに配位する環状リガンド基を含む前記種が、一般式（ＩＩ）を有する種である、請求項１５乃至２１の何れか１項に記載の方法：
【化５】
2005526487.tif 000040
ここで、
ｎ、ａ、ｂ、ｃ、及びＲは、請求項８に記載のとおりであり、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ２−基の一方又は両方の水素原子は、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意にかつ独立に置換基で置換することができ、任意に導入される該置換基は任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備え、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、Ｈ＊を除き、相互に独立して且つ他の何れのトリアザシクロアルカン環とも独立して、任意に置換基で置換することができ、任意に導入される該置換基は任意に１以上の金属イオン配位ドナー原子を備える。
【請求項２３】
環−ＣＨ２−基中の水素原子を置換する前記任意に導入される置換基が、任意に置換された低級アルキル基及び任意に置換されたアリール基からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
環−ＮＨ−基中の水素原子を置換する前記任意に導入される置換基が、任意に置換された低級アルキル基及び任意に置換されたアリール基からなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマー基材がアガロースであり、
ｎ、ａ、ｂ、ｃ及びＲが、請求項１１に記載のとおりであり、
前記二官能性試薬がエピクロロヒドリンである、請求項２２乃至２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリマー基材を前記二官能性試薬と反応させる際に、反応混合物に還元剤を加える、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記還元剤が水素化ホウ素ナトリウムである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５乃至２７の何れか１項に記載の方法により取得可能な官能化ポリマー基材。
【請求項２９】
請求項１乃至１１の何れか１項又は請求項２８に記載された官能化ポリマー基材に、前記環状基のうち少なくとも１つに配位された金属イオンをさらに備えた官能化ポリマー基材を調製する方法であって、請求項１乃至１１の何れか１項又は請求項２８に記載の官能化ポリマー基材を前記金属イオンの無機又は有機塩の水溶液に接触させることを備えた、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法によって取得可能な金属イオン含有官能化ポリマー基材。
【請求項３１】
下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を備えたヒスチジン含有オリゴペプチド：
ＨＨＨＮＳＷＤＨＤＩＮＲ（配列番号１）
ＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲ（配列番号２）
ＨＡＭＬＤＲＡＨＤＨＧＴＲ（配列番号３）
ＳＬＨＥＨＨＳＧＤＮＬＲ（配列番号４）
ＴＨＹＮＡＶＨＳＨＮＴＬＱ（配列番号５）
ＤＩＨＨＷＴＤＨＬＱＳＳＴＨ（配列番号６）
ＬＹＮＨＹＳＨＴＡＨＶＮＨＬ（配列番号７）。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列がアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｘａａを含むＮ末端伸長部を有し、前記Ｘａａがプロリン残基以外のアミノ酸残基である、請求項３１に記載のヒスチジン含有オリゴペプチド。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列が、多くとも１０アミノ酸残基のアミノ酸配列を備えたＮ末端伸長部を有する、請求項３１に記載のヒスチジン含有オリゴペプチド。
【請求項３４】
請求項３１乃至３３の何れか１項に記載された少なくとも１つのオリゴペプチドに目的のタンパク質分子のアミノ末端又はカルボキシ末端が融合したタンパク質を備えた融合タンパク質であるポリペプチド。
【請求項３５】
前記オリゴペプチドのアミノ酸配列の前記アミノ末端及びカルボキシ末端が、目的のタンパク分子にそれぞれ融合する、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
酵素及び化学的切断部位からなる群から選択される切断部位に前記オリゴペプチドのアミノ酸配列が隣接して存在する、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記２つの対象タンパク質分子が同一タンパク質の分子である、請求項３５又は３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記２つの対象タンパク質分子が異なる分子である、請求項３５又は３６に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドを発現させる条件下で、適切な増殖培地中において、請求項３４乃至３８の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を備える宿主細胞を培養すること、及び前記培地から当該ポリペプチドを回収することにより取得可能なポリペプチド。
【請求項４０】
前記宿主細胞がＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの菌株である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
請求項３４乃至３８の何れか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物。
【請求項４２】
ベクターである、請求項４１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載のポリヌクレオチド構築物を含む宿主細胞。
【請求項４４】
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの菌株である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項３４乃至４０の何れか１項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドを発現させる条件下で、適切な増殖培地中において、請求項４３又は４４に記載されている宿主細胞を培養することと、前記培地から前記ポリペプチドを回収することを備えた方法。
【請求項４６】
目的のタンパク質を精製する方法であって、
請求項３４乃至４０の何れか１項に記載のポリペプチドを含有し、他のタンパク質とともに前記目的のタンパク質を有するタンパク質試料を、前記ポリペプチドが前記金属イオン含有官能化ポリマー基材を結合して該基材と複合体を形成する条件下で、請求項１２乃至１４の何れか１項又は請求項３０に記載の金属イオン含有官能化ポリマー基材と接触させる工程と、
前記複合体を緩衝溶液で洗浄して、前記他のタンパク質を除去する工程と、
前記結合したポリペプチドを前記洗浄された複合体から溶出する工程と、
を備えた方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドが切断される工程をさらに備えた、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
酵素的手段により前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドが切断される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリペプチドから前記オリゴペプチドを切断するために、ジペプチジルアミノペプチダーゼ等のアミノペプチダーゼを使用する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４７乃至４９の何れか１項に記載の方法により取得可能な精製タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、とりわけ、固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いたペプチド、特に、組換えタンパク質などのポリペプチドの単離および精製の分野に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ヒト又は動物の治療に使用するためのオリゴペプチドやポリペプチドなどの組換え（遺伝子操作が施された）ペプチド（特にタンパク質）の製造において重要なことは、特に（ａ）製造過程（典型的には、適切な微生物の選択株又は遺伝子修飾株を用いた発酵過程など）に存在することがある外来タンパク質や（ｂ）製造過程中に導入されることがある望ましくない金属イオン（特に、重金属イオン）が、ほぼ完全に所望のタンパク質に混入しないように、十分に高い純度まで当該ペプチドを精製することである。
【０００３】
固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、多数の生体ポリマーの金属イオンに対する親和性の差を利用した用途の広い分離手法である。この技術では、予め多座配位のリガンドを用いて化学的に改変を施した表面を有する固相支持体マトリックス上に、適切な金属イオンをキレート化する。その結果生じる固定化された金属イオンキレート錯体は、相互作用するタンパク質の表面上に存在する１以上の電子供与基との配位能を有することになる(Sulkowski, E., Trends in Biotechnology, 3 (1985) 1-6; Porath, J., Carlsson, I., Olsson, I. and Belfrage, G., Nature, 258 (1975) 598-599; Kagedal, L., in “Protein Purification” (Ed., J.C. Janson, and L. Ryden), VCH Publishers (1989) pp.227-251; Zachariou, M. and Hearn, M.T.W., Biochemistry, 35(1996)202-211)。次いで、吸着したタンパク質／固定化された金属イオン錯体の熱力学的な安定性の差に基づいて、分離の選択性が得られる。その吸着錯体の安定性が最も低いタンパク質が最初に溶出され、これより安定な錯体を形成するタンパク質が後に溶出される。平衡結合定数の差が大きいほど（すなわち、各タンパク質／固定化金属イオン配位錯体の解離定数（ＫＤ）の差が大きいほど）、分離の程度は高くなる。このため、アミノ酸組成、特定のアミノ酸残基の表面分布、及びタンパク質のコンフォメーションは、ＩＭＡＣ系に対するタンパク質の親和性を決定する上で、何れも重要な役割を果たしている。その結果、電荷、分子サイズ、アミノ酸組成に関して性質が非常に似通っているが、三次構造が異なるタンパク質を分離することが可能となる。
【０００４】
過去２０年にわたるＩＭＡＣの使用に関する研究の関心は、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋などの境界域にある硬さ（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ｈａｒｄｎｅｓｓ）（下記参照）の第一周期遷移金属イオンの利用に中心が向けられてきた。これらの金属イオンは、芳香族及び脂肪族の両アミン並びにカルボキシレート官能基に対して中程度の金属イオン安定度定数を示す（例えば、ｌｏｇβ値が５乃至１０）(Wong, J.W., Albright, R.L. and Wang, N.H.L., Separation and Purification Methods, 20(1991) 49-57; Zachariou, M., Traverso,I., Spiccia,L. and Hearn,M.T.W., Journal of Physical Chemistry, 100(1996) 12680-12690)。Ｍ２＋イオンとこのような結合特性を示す多数の非拘束三座配位キレートを、支持体材料上に化学的に固定化することができる。対応するｌｏｇβ値の大きさやこのため選択能が比較的低くなるという制約にもかかわらず、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）などの非拘束タイプのキレート化合物が、このようなＩＭＡＣ研究において、これまで利用されてきたキレートリガンドの主流を成している［例えば、Kagedal, L., “Protein Purification”(Eds. J.C. Janson and L. Ryden), VCH Publishers (1989) pp227-251を参照］。固定化Ｍ２＋−ＩＤＡを基礎とするＩＭＡＣ系の使用例としては、固定化されたＣｕ２＋−ＩＤＡを用いた発芽麦からのα−アミラーゼの精製［Zawistowska, U., Sangster, K., Zawistowski, J., Langstaff, J. and Friessen, A.D., Cereal Chemistry, 65(1988) 5413-5418］、及び固定化されたＺｎ２＋−ＩＤＡを用いたヒト血漿からのヒト凝固因子ＶＩＩ［Weeransinghe, K.M., Scully, M.F. and Kadder, V.V., Biochimica Biophysica Acta, 839(1985) 57-65］及びα１−チオールプロテイナーゼの精製がある［Otsuka, S. and Yamanaka, T. (Eds),“Metalloproteins-Chemical Properties and Biological Effects” in“Bioactive Molecules”, Kodansha Ltd, Tokyo (1988), pp18-45］。ＩＤＡを基礎としたＩＭＡＣ手法の応用（すなわち、固定化Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸（Ｎｉ２＋−ＮＴＡ）を用いた組換えタンパク質の精製［Hochuli, E., Bannwarth, W., Dobeli, H. and Stuber, D., Bio/Technology, 6 (1988) 1321-1324］（ＮＴＡは、ＩＤＡの構造的相同物である））は、固定化Ｎｉ２＋−ＮＴＡキレート錯体へのさらに高い結合親和性をタンパク質に付与することによって、このＩＭＡＣ吸着剤上にタンパク質を選択的に保持できるようにするポリヒスチジンペプチド（典型的には、ヘキサ−Ｈｉｓ）に対応するポリヌクレオチド配列を遺伝子レベルで取り込むことに依拠している。本出願では、「吸着剤（ｓｏｒｂｅｎｔ）」および「吸着体（ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）」という用語は、主として、金属イオンが配位結合した官能化ポリマー基材（リガンドが固定化されたポリマー基材）を表すために用いられるが、これらの用語は、金属イオンが結合していない官能化ポリマー基材（ｆｕｎｃｔｉｏｎｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を表すために用いられる場合もある。
【０００５】
ＩＤＡ及びＮＴＡを基礎としたＩＭＡＣ系の使用に関する上述の記載から明らかなように、ＩＭＡＣ系とのタンパク質結合選択性を変化させる別の手段は、キレートライゲート（ｌｉｇａｔｅ）の構造を変更することである。しかし、ここ数年は、少数の新規ＩＭＡＣキレートライゲートが導入されているにすぎない。これらには、二座配位キレーターであるアミノヒドロキサム酸（ＡＨＭ）と８−ヒドロキシキノリン（８−ＨＱ）［Zachariou, M., raverso, I., Spiccia, L. and Hearn, M.T.W., Journal of Physical Chemistry, 100(1996) 12680-12690］；Ｃａ２＋への親和性がＩＤＡより高いカルボキシメチルアスパラギン酸（ＣＭ−ＡＳＰ）［Porath,J., Trends in Analytical Chemistry, 7(1988), 254-256; Mantovaara,T.,Pertofz.,H. and Porath, J., Biotechnology Applied Biochemistry, 11(1989), 564-569］；リン酸基の関与によってＦｅ３＋、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋、Ｙｂ３＋などの「硬い（ｈａｒｄ）」金属イオンをキレートすることができるオルト−ホスホセリン（ＯＰＳ）［Zachariou, M., Traverso, I. and Heam, M.T.W., Journal of Chromatography, 646(1993), 107-115］；（２−ピリジルメチル）アミノ酢酸（ＣＰＭＡ）、ジピコリルアミン（ＤＰＡ）、シス又はトランス−カルボキシメチル−プロリンなどの他の三座配位ライゲート［Chaouk, H., Middleton S., Jackson W.R. and Heam, M.T.W., International Journal of BioChromatography, 2(1997)153-190; Chaouk,H. and Heam, M.T.W., Jornal of Biochemical and Biophysical Research Methods,39(1999) 161-177］、四座配位のためにＭ２＋イオンに対する親和性がＩＤＡより大きく、配位部位が１つ失われているために、ＩＤＡ型の三座配位ライゲートに比べてタンパク質結合定数が低いニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの四座配位リガンド［Hochuli,E., Bannwarth, W., Dobell H., Gentz, R. and Stuber, D. Bio/Technology, 6(1988) 1321-1325］、５つのドナー原子（すなわち、ＴＥＰＡの場合には、第一級アミン基の２つの窒素原子と第二級アミン基の３つの窒素原子、ＴＥＤの場合には、第二級アミン基の２つの窒素原子と３つのカルボキシル基由来の３つの酸素原子）を介して金属イオンを配位するテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）［Hidaka Y., Park,H. and Inouye,M., FEBS Letters, 400(1997) 238-242］又はＮ，Ｎ，Ｎ’−トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）［Porath,J., Protein Expression & Purification, 3(1992) 263-281］などの五座配位リガンドに基づいた系が含まれる。
【０００６】
クロマトグラフィー工程において、比較的穏やかな溶出条件を用いたときにも、固定化金属イオンイミノ二酢酸キレート（ｉｍ−Ｍｎ＋−ＩＤＡ）系では、金属イオンが相当漏出することが観察されている［Oswald, T., Hornbostel, G., Rinas, U. and Anspach, F.B., Biotechnology Applied Biochemistry, 25(1997) 109-115; Kagedal, L. in Protein Purification (eds. J.C. Janson and L Ryden) VCH Publishers, New York(1989), pp227-251］。このため、選択性の調節という問題に加え、従来利用されてきたＩＤＡ又はＮＴＡを基礎とした系に比べて金属イオンの安定度定数を著しく増加させることが必要とされていたために、新しいクラスのキレートライゲートを開発することが望まれていた［Zachariou, M., Traverso,I.,Spiccia, L. and Heam, M.T.W., Analytical Chemistry, 69(1996) 813-822］。
【発明の簡単な説明】
【０００７】
目的タンパク質のポリペプチド鎖に加えて、金属イオンと配位結合を形成し得る１つ以上の適切な位置にアミノ酸残基を組み込んだ共有結合オリゴペプチド鎖（「タグ」と称することもある）が（所望のタンパク質自体のアミノ酸配列の伸長部分として）含まれる「融合タンパク質」の形態にすることにより、所望のタンパク質の金属イオン配位結合の強度及び／又は選択性が、融合タンパク質が結合する金属イオン用マトリックスとして少なくとも１つの金属イオン配位環式リガンド基を含む官能基で官能化したポリマー基材を使用することによって、著しく増加し得るという驚くべき発見がなされた。このようなマトリックスに対する融合タンパク質の結合の強度及び／又は選択性は、外来性タンパク質の結合の強度及び／又は選択性よりも一般にかなり大きいので、融合タンパク質を１つ以上の外来性タンパク質と共に含有する混合物から融合タンパク質を分離及び単離することが容易となる。
【０００８】
したがって、本発明の第１の側面は、Ｎ、Ｏ及びＳから独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を含む少なくとも１つの金属イオン配位環式リガンド基を含む官能基で官能化したポリマー基材を提供する。本発明の第２の側面は、官能基中に環式リガンド基の少なくとも１つに配位する金属イオンをさらに含む、後者のタイプの官能化ポリマー基材に関する。本発明の別の側面は、このような官能化ポリマー基材を調製する方法である。
【０００９】
本発明のさらに重要な側面は、
本発明に関連する融合タンパク質中に「タグ」として組み込むのに適したオリゴペプチド、
そのアミノ末端又はカルボキシ末端又は両方において、あるいは目的タンパク質の内部アミノ酸配列位置において、少なくとも１つのこのようなオリゴペプチドに融合している目的タンパク質を含む当該タイプの融合タンパク質、
このような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体、例えばベクター、
このようなポリヌクレオチド構築体を含む宿主細胞、
当該タイプの融合タンパク質を産生する方法であって、融合タンパク質が発現され、その融合タンパク質が培地から回収される条件下にある増殖培地中で後者のタイプの宿主細胞を培養する方法、及び
目的タンパク質を精製する方法であって、（目的タンパク質を含む）このような融合タンパク質及び他のタンパク質（外来性タンパク質）を含有するタンパク質試料を、本発明による金属イオン含有官能化ポリマー基材と接触させる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
上述したように、本発明の第１の側面は、少なくとも１つの金属イオン配位環式リガンド基を含む官能基で官能化したポリマー基材に関し、この環式リガンド基は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を含む。一般に、環式リガンド基中の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全部のこれらの金属イオン配位ドナー原子は、環原子（ｒｉｎｇ  ａｔｏｍ）であり、すなわち金属イオン配位環式リガンド基の環の一部を形成する。
【００１１】
本発明に関連する有用なポリマー基材としては、水溶性ポリマー、実質的な水不溶性ポリマーなどがあり、極めて広範なポリマー材料から選択することができる。その例は以下の通りである。
【００１２】
多糖及びその誘導体（アガロース、デキストラン、セルロース、ヘミセルロース、デンプン、キシランなど、及びこれらの多糖の誘導体を含む）。適切な多糖誘導体としては、一般に、当該多糖のヒドロキシ基の一部が誘導体化されてエーテル（例えば、メチルエーテルなどの低級アルキルエーテル）又はエステル（例えば、アセテート、プロピオネートなどの低級カルボン酸エステル）を形成する誘導体、並びに出発多糖又はその誘導体を適切な架橋試薬で処理することによって架橋した材料などがある。
【００１３】
一般に、実質的な水不溶性ポリマーに基づく本発明の官能化ポリマー基材は、例えば、クロマトグラフィカラムへの充填、培地への直接導入（バッチ式使用）などに適しており、本発明に関連するタイプの用途に特に適した多糖としては、アガロース、デキストラン、それらの誘導体などがあり、それら様々な適切なタイプが市場で容易に入手可能である。すなわち、例えば、様々なアガロース製品は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎによって生産され、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）の名称で市販されており、入手可能なグレードはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）２Ｂ、４Ｂ、６Ｂなどである。（２，３−ジブロモプロパノールによるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）の架橋によって調製される）これらの様々なグレードのアガロース架橋誘導体が、やはり同じ会社から入手可能であり、それぞれＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ−２Ｂ、ＣＬ−４Ｂ及びＣＬ−６Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４及び６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＭＢ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６及び１２として市販されている。
【００１４】
本発明に関連して使用するのに適切ないくつかのデキストランベースの材料又はデキストラン−アガロース複合材料は、やはりＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈからＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０、７５及び２００）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）の名称で入手可能である。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）シリーズの製品は、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋して調製され、以下のグレードが入手可能である：Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−１０、Ｇ−１５、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−７５、Ｇ−１００、Ｇ−１５０及びＧ−２００。Ｇナンバーが増加すると架橋度は減少する。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）シリーズは、アリル−デキストランをＮ，Ｎ’−メチレン−ビスアクリルアミドで架橋して調製され、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−１００、Ｓ−２００、Ｓ−３００、Ｓ−４００、Ｓ−５００、Ｓ−１０００などがある；後者の６つの製品は、細孔サイズ及び粒子径分布の範囲が異なる。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）シリーズの製品は、アリルデキストランを様々な組成のアガロース誘導体で架橋して調製される。
【００１５】
ポリアルキレングリコール及びその誘導体（特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち一般式がＨＯＣＨ２（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨ又はＨ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨであり、一般に平均分子量が２００−６０００であるエチレングリコールの縮合ポリマーを含む）。いくつかのＰＥＧ（それぞれ平均分子量４００、６００、１５００、４０００及び６０００のＰＥＧを含む）が、様々な名称（例えば、Ｍａｃｒｏｇｏｌ（商標）、ＰＥＧ（商標）、Ｃａｒｂｏｗａｘ（商標）、Ｎｙｃｏｌｉｎｅ（商標）、Ｐｌｕｒａｃｏｌ  Ｅ（商標）、Ｐｏｌｙ−Ｇ（商標）、Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌ  Ｅ（商標）、Ｓｏｌｂａｓｅ（商標））で様々な市販供給源から入手可能である。ＰＥＧは、一般に、水に可溶又は相溶し、エタノール及び芳香族炭化水素を含めたいくつかの他の有機溶媒に可溶である。水に可溶な低分子量成分を含む類似の（一般式Ｈ（ＯＣ３Ｈ６）ｎＯＨを有する）ポリプロピレングリコールも本発明に用いるのに適している。このような適切なポリアルキレングリコールの誘導体としては、部分エーテル化誘導体、例えば、末端ヒドロキシ基の１つがメチルエーテル基などの低級アルキルエーテル基に転化された誘導体などがある。
【００１６】
このようなポリマーは、担体材料に容易に固定化することができ、本発明の手順によってその後活性化され、次いで金属イオン結合大環状キレートリガンドで官能化又は誘導体化され得る基材が生成する。
【００１７】
ポリビニルポリマー（ポリビニルアルコール、すなわちポリ酢酸ビニルの様々な分子量画分を一般に塩基又は酸加水分解で加水分解（「アルコール分解」）して通常生成されるヒドロキシルポリマー、及びその誘導体を含む）。「アルコール分解」の程度は、ポリ酢酸ビニルの酢酸エステル基の加水分解を実質的に完結するまで進行させることによって、又はそれを所望のアルコール分解度で停止することによって変わり得る。ポリビニルアルコールは、通常、４つの分子量範囲、すなわち約２５０，０００−３００，０００（超高粘度と称する）、約１７０，０００−約２２０，０００（高粘度と称する）、約１２０，０００−１５０，０００（中粘度と称する）及び約２５，０００−約３５，０００（低粘度と称する）の範囲で市販されている。一般に、ポリビニルアルコールの分子量が低いほど、水感受性、すなわち水への溶解し易さが高くなる。しかし、アルコール分解の程度も、ポリビニルアルコールの水溶解性及び他の諸特性に関して重要な役割を果たす。上述した全分類内のポリビニルアルコール、例えば、メチルエーテル誘導体などのそのエーテル誘導体が本発明に関連する。
【００１８】
他の対象とするポリビニルポリマー材料としては、中圧及び低圧液体クロマトグラフィ用に設計された半硬質球状ゲル粒子である多孔質のＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷシリーズなどの材料がある。このような材料によって、活性化及び官能化／誘導体化の後、本発明に関連するＩＭＡＣ吸収剤を調製するための別の選択肢が提供される。（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｊａｐａｎ及び他の供給源から入手可能な）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷゲルは、もっぱらＣ、Ｈ及びＯ原子のみを含有する親水性ビニルポリマーから合成される。入手可能なグレード（粒子及び細孔サイズによって異なる）は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＨＷ−４０、ＨＷ−４０Ｃ、ＨＷ−４０Ｆ、ＨＷ−４０Ｓ、ＨＷ−５０、ＨＷ−５０Ｆ、ＨＷ−５０Ｓ、ＨＷ−５５、ＨＷ−５５Ｆ、ＨＷ−５５Ｓ、ＨＷ−６５Ｆ、ＨＷ−６５Ｓ及びＨＷ−７５Ｆなどである。
【００１９】
ポリアクリルアミド及びその誘導体（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（商標）ＡｃＡゲル（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なビーズ状の複合ポリアクリルアミド−アガロースゲル）などのポリアクリルアミドとアガロースベースの複合材料を含む）。Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（商標）ＡｃＡゲルシリーズには、ＡｃＡ  ２２、ＡｃＡ  ３４、ＡｃＡ  ４４及びＡｃＡ  ５４などがある。数字はアクリルアミドとアガロースの割合を示し、すなわち、ＡｃＡ  ２２は２％のアクリルアミドと２％のアガロースを含有する。これらの担体材料のヒドロキシル基を活性化することによって、ＩＭＡＣ吸収剤の調製方法が提供される。
【００２０】
表面改質シリカ（ＬｉＣｈｒｏＳｐｈｅｒ（商標）Ｄｉｏｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔｏｙｏｓｏｄａ（商標）ＴＳＫＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）などのグリシジルプロポキシ変性多孔質シリカ、アミノプロピルジエトキシシランと適切な細孔サイズ及び適切な平均直径のシリカとの（適切な触媒の存在下での）反応によって調製されるアミノプロピル変性シリカ、及びメルカプトプロピルジエトキシシランと適切な細孔サイズ及び適切な平均直径のシリカとの（適切な触媒の存在下での）反応によって調製されるメルカプトプロピルシリカを含む）。あるいは、適切な細孔サイズ及び適切な平均直径のデキストラン変性又はブタジエン−ビニルコポリマー変性シリカを、クロマトグラフィの担体材料として使用することができる。このように誘導体化し、その後変性してそれぞれ新規なＩＭＡＣ吸収剤を生成させるのに適切な「裸の」多孔質シリカは、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）、Ｅｋａ−Ｎｏｂｅｌ  ＡＢ（Ｇoｔｅｂｏｒｇ、Ｓｗｅｄｅｎ）及びＧｒａｃｅ  Ｄａｖｉｓｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｗｏｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含めて様々な供給源から容易に入手可能である。
【００２１】
表面改質金属酸化物（第２の金属酸化物を「ドープ」したそれぞれの金属酸化物に基づくグリシジルプロポキシ変性多孔質ジルコニア、チタニア又はアルミナ、並びにそれらの変性体／変異体；アミノプロピルジエトキシシランと適切な細孔サイズ及び適切な平均直径のジルコニア、チタニア又はアルミナとの（適切な触媒の存在下での）反応によって調製されるアミノ−プロピル変性ジルコニア、チタニア又はアルミナ；及びメルカプトプロピルジエトキシシランと適切な細孔サイズ及び適切な平均直径のジルコニア、チタニア又はアルミナとの（適切な触媒の存在下での）反応によって調製されるメルカプトプロピル変性ジルコニア、チタニア又はアルミナを含む）。あるいは、適切な細孔サイズ及び平均直径のデキストラン変性又はブタジエン−ビニルコポリマー変性ジルコニア、チタニア又はアルミナを、クロマトグラフィの担体材料として使用することができる。このように誘導体化し、その後変性してそれぞれ新規なＩＭＡＣ吸収剤を生成させるのに適切な「裸の」多孔質ジルコニア、チタニア又はアルミナは、ＹＭＣ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（ＫＹＯＴＯ、Ｊａｐａｎ）、Ｇｒａｃｅ  ＧｍｂＨ（Ｗｏｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＢｉｏＳｅｐｒａ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を含めて様々な供給源から容易に入手可能である。
【００２２】
本発明に適したポリマー基材としては、アガロース、デキストラン及びそれらの誘導体、例えば、上述したものの中から選択される材料などがある。
【００２３】
本発明の一側面においては、本発明による官能化ポリマー基材中の金属イオン配位環式リガンド基は、少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子が少なくとも６つの環原子を含む環中に存在する複素環式基である。そのような官能化ポリマー基材の中でも、特に適切なタイプの複素環式基は、少なくとも６つの環原子を有するトリアザシクロアルカンから誘導される基と考えられ、このクラス内の官能化ポリマー基材における（上で定義した）官能基の好ましいタイプは、一般式（Ｉ）を有する官能基である。
【化６】
2005526487.tif 000002
【００２４】
式中、ｎは０又は１−３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中のａ、ｂ及びｃの各々は、互いに独立して、かつ他のあらゆるトリアザシクロアルカン環から独立した１−３の整数であり、
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ２−基の１つ又は両方の水素原子は、互いに独立して、かつ他のあらゆるトリアザシクロアルカン環から独立して、ある置換基で任意に独立に置換することができ；
各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、互いに独立して、かつ他のあらゆるトリアザシクロアルカン環から独立して、ある置換基で任意に置換することができ；
ｎが０であるときは、ＲはＨ又はある置換基であり；
ｎが１であるとき、すなわち、官能基が２つのトリアザシクロアルカン環を含むときは、Ｒは、２つのトリアザシクロアルカン環を連結する（すなわち、各々に共有結合する）二官能基であり、この二官能基は任意に１つ以上の金属イオン配位ドナー原子を含み；
ｎが２又は３のとき、すなわち、官能基がそれぞれ３つ又は４つのトリアザシクロアルカン環を含むときは、Ｒは、それぞれ３つ又は４つのトリアザシクロアルカン環を連結する（すなわち、各々に共有結合する）（ｎ＋１）官能基であり、この（ｎ＋１）官能基は任意に１つ以上の金属イオン配位ドナー原子を含み；
Ｘはリンカー／スペーサー基である。
【００２５】
本発明のこの後者の側面に関連して、上で定義した式（Ｉ）の官能基中の環−ＣＨ２−基及び／又は環−ＮＨ−基中の水素原子を置換する上述の任意選択の置換基は、任意に置換される低級アルキル基及び任意に置換されるアリール基の中から適切に選択され、特に、上で定義した式（Ｉ）の官能基中の環−ＣＨ２−基中の水素原子を置換するのに適切な任意選択の置換基の別の例は、任意に置換される低級アルコキシ基である。当該低級アルキル基、低級アルコキシ基又はアリール基上の任意選択の置換基は、必要に応じて、１つ以上の金属イオン配位ドナー原子、特に１つ以上のＮ、Ｏ又はＳドナー原子を含むことができる。
【００２６】
１つ以上の環−ＮＨ−基の水素原子を置換する任意選択の置換基としての低級アルキル基（メチル、エチル、プロピルなど）の場合、ある種の金属イオン［特に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋又はＺｎ２＋などの「硬い」金属イオン又は「境界にある硬さの（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ｈａｒｄｎｅｓｓ）」金属イオン（下記参照）］に対する官能基の金属イオン配位特性に関連し得るこの低級アルキル基上のＯ含有置換基としてはカルボキシ／カルボキシレート（ｐＨに応じて−ＣＯＯＨ／−ＣＯＯ−）などがあり、したがって、環Ｎ原子上のこのような置換基の例は、カルボキシ置換低級アルキル基、特にカルボキシメチル（−ＣＨ２ＣＯＯＨ）（特に、対応する脱プロトン化体、すなわち−ＣＨ２ＣＯＯ−）である。同様に、１つ以上の環Ｎ原子に結合した低級アルキル基上の置換基として存在し得る関連Ｎ含有基は、アミノ置換低級アルキル基、特に２−アミノエチル（−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）又は３−アミノプロピル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）などである。
【００２７】
１以上の環Ｎ原子上の水素原子を置換する置換基として存在し、それ自体ある種の金属イオン［特に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋又はＺｎ２＋などの「硬い」金属イオン又は「境界域にある硬さの」金属イオン（下記参照）］に対する官能基の金属イオン配位特性に関連し得る他の関連するタイプの任意選択の置換基としては、−ＰＯ３Ｈ２（又はその脱プロトン化体、すなわち、−ＰＯ３Ｈ−）などがある。
【００２８】
本発明に関連して使用する「低級アルキル基」という用語は、１−６個の炭素原子を有するあらゆる線状（直鎖）、分枝又は環式アルキル基を指す。線状アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルであり、分枝アルキル基の例は、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル及びイソヘキシルであり、環式アルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルである。一般に、１−３個の炭素原子を有する低級アルキル基が、本発明に適している。
【００２９】
本発明に関連して使用する「低級アルコキシ基」という用語は、１−６個の炭素原子を有するあらゆる線状、分枝又は環式アルコキシ基を指す。線状アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ及びヘキソキシであり、分枝アルコキシ基の例は、イソプロポキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、イソペントキシ及びイソヘキソキシであり、環式アルコキシ基の例は、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシである。一般に、１−３個の炭素原子を有する低級アルコキシ基が本発明に適している。
【００３０】
本明細書に関連する「アリール」という用語は、あらゆる芳香族基を指し、炭素環式芳香族基と複素環式芳香族基の両方を含む。その例は、フェニル、ナフチル、ピリジル、テトラゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、インドリル、キノリニル、ピリミジニル、チアジアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チエニル、フラニル又はオキサジアゾリルである。本発明に関連するアリール基上の適切な任意選択の置換基としては、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルコキシなどがある。
【００３１】
「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを指す。
【００３２】
したがって、上で定義した式（Ｉ）の官能基中の環−ＣＨ２−基及び／又は環ＮＨ−基上の任意選択の置換基として関連する置換基としては、複素環式環中に１つ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含む複素環式芳香族基などがある。また、上で定義した式（Ｉ）の官能基中の環−ＣＨ２−基及び／又は環−ＮＨ−基上の任意選択の置換基として関連する別の置換基としては、複素環式環中に１つ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含む飽和複素環式基などがあり、Ｎ−複素環式基が適している場合が多い。この状況において関連する飽和複素環式基の例は、２−アジリジル、２−及び３−アゼチジル（ａｚｅｔｉｄｙｌ）、２−及び３−ピロリジル、２−、３−及び４−ピペリジルなどである。上で定義した１つ以上の置換基、例えば低級アルキル、低級アルコキシ又はハロゲンは、必要に応じてこのような飽和複素環式基中に存在することができる。
【００３３】
この状況において使用される「金属イオン配位ドナー原子」という用語は、（それが発生した基／置換基中に存在し）本発明に関連する金属イオンと配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｖｅ  ｂｏｎｄ）（錯体結合（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｏｎｄ）、ドナー結合（ｄｏｎｏｒ  ｂｏｎｄ））を形成可能な原子、特にＮ、Ｏ又はＳ原子を表す。この状況において特に目的とする金属イオンは、本明細書で定義する「硬い」、「軟らかい」及び「境界にある」金属イオン（いくつかの遷移金属イオン及びある種の非遷移金属イオン）である（下記参照）。
【００３４】
上で定義した式（Ｉ）の官能基中のリンカー又はスペーサー基（ｓｐａｃｅｒ  ｇｒｏｕｐ）Ｘは、リンカー又はスペーサーのあらゆる適切なタイプとすることができるが、一般に、二官能有機化合物（例えば、カルボキシル、チオール、アミノプロピル、ハロゲン及びエポキシなどの基から選択される少なくとも２つの反応性官能基を有する有機化合物）から、一方で、ポリマー基材上の適切な反応性官能基と反応し、もう一方で、金属イオン配位環式リガンド基上の適切な反応性官能基（一般にアミノ基又は置換アミノ基）と反応することによって誘導され得るリンカー又はスペーサーである。本発明に関連して一般に極めて有用なタイプのリンカー又はスペーサー基Ｘは、エピクロロヒドリンから、そのハロゲン末端が、例えば、当該ポリマー基材表面のヒドロキシ基と反応し、次いでそのエポキシ基が環式リガンド基中のアミノ基又は置換アミノ基と反応して誘導し得るものである。本明細書の実施例１２２のスキーム８にその概略を示す（下記参照）。
【００３５】
本発明の極めて汎用的な側面においては、本発明の官能化ポリマー基材中のポリマー基材は、アガロース又はアガロース誘導体（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ゲル）であり、金属イオン配位官能基は、１、２又は３トリアザシクロアルカン環を含む官能基などの１−４個のトリアザシクロアルカン環を含む（すなわち、ｎが０、１、２又は３である）上記式（Ｉ）で示されるタイプである。このような各トリアザシクロアルカン環は、１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル基［すなわち、１，４，７−トリアザシクロノナン（ｔａｃｎ）から誘導される］、すなわちパラメータａ、ｂ及びｃ［式（Ｉ）参照］が各々２であるものが極めて適切であり得る。
【００３６】
官能基がそのような環をただ１つしか含まない（すなわちｎ＝０）ときには、基Ｒは、水素であることが適切であり、官能基がそのような環を２つ含む（すなわちｎ＝１）ときには、Ｒは、以下の
［ＣＨ２］ｍ−  （式中、ｍは２、３又は４である）、
【化７】
2005526487.tif 000003
【００３７】
及びその置換誘導体から選択することが極めて適切であり、関連する任意選択の置換基としては上述したものなどがある。
【００３８】
当該官能基がそのような環を３つ含む（すなわちｎ＝２）ときには、Ｒは、
【化８】
2005526487.tif 000004
【００３９】
又はその置換誘導体のタイプの基であることが適切であり、関連する任意選択の置換基としてはやはり上述したものなどがある。
【００４０】
当該官能基がそのような環を４つ含む（すなわちｎ＝３）ときには、Ｒは、
【化９】
2005526487.tif 000005
【００４１】
又はその置換誘導体タイプの基であることが適切であり、関連する任意選択の置換基としてはやはり上述したものなどがある。
【００４２】
リンカー又はスペーサー基Ｘは、エピクロロヒドリンとアガロース又はアガロース誘導体の形のポリマー基材との反応、及び得られた生成物とＸと結合するトリアザシクロアルカン環の環−ＮＨ−基との後続反応によって、エピクロロヒドリンから誘導され得る基であることが極めて適切である。
【００４３】
本明細書の開示から明らかなように、所望のタンパク質（目的タンパク質）を単離し精製する本発明によって使用される材料（官能化ポリマー基材）の重要な特徴は、官能基中の環式リガンド基（例えば、１，４，７−トリアザシクロノン−１−イル基などのトリアザシクロアルキル基）にそれ自体が配位結合し、オリゴペプチド「タグ」が目的タンパク質のアミノ酸配列に結合している融合タンパク質のオリゴペプチド「タグ」部分のアミノ酸残基中のドナー原子に適切に選択的に配位結合できる金属イオンが材料中に存在することである。したがって、上述したように本発明の別の側面は、官能基中の環式リガンド基の少なくとも１つがそれに配位する金属イオンを有する官能化ポリマー基材に関係する。一般に、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋及びＣｒ３＋から選択される金属イオンなどの二価（２＋帯電）及び三価（３＋帯電）の（非遷移金属イオンと遷移金属イオンの両方を含めた）金属イオンは、この状況に適している。本明細書の実施例に示すように（下記参照）、Ｃｕ２＋は、この点で特に汎用の金属イオンであることが判明した。
【００４４】
すでに簡単に示したように、本発明の別の側面は、本発明による官能化ポリマー基材を調製するためのプロセスに関し、このプロセスは、
第１及び第２の官能基を有する二官能試薬の第１の官能基と第１の反応を起こすことが可能な反応性官能基を有するポリマー基材を選択するステップであって、当該第１の反応の結果、ポリマー基材と二官能試薬の共有結合が形成され、得られた共有結合試薬の第２の官能基が、続いて、Ｎ、Ｏ及びＳから独立に選択される少なくとも３つの金属イオン配位ドナー原子を含む金属イオン配位環式リガンド基を含む化学種中に存在する反応性官能基と第２の反応を起こすことができ、第２の反応の結果、当該化学種と共有結合試薬の共有結合が形成されるステップと、
このポリマー基材を二官能試薬と反応させるステップと、
得られた共有結合試薬を当該化学種と反応させるステップとを含む。
【００４５】
本発明による後者のプロセスに関連して、このプロセスで使用するポリマー基材、及び反応種中の金属イオン配位環式リガンド基は、本発明による官能化ポリマー基材に関連して上述したものの中から選択することができる。使用する二官能試薬は、一般に、二官能有機化合物、例えば、カルボキシル、チオール、アミノプロピル、ハロゲン、エポキシなどの基から選択される少なくとも２つの反応性官能基を有する有機化合物である。エピクロロヒドリンは、表面ヒドロキシル基を有する多糖及びその誘導体を含めて、いくつかのタイプのポリマー基材に対する二官能試薬として特に有用である。
【００４６】
本発明による官能化ポリマー基材に関連した上記考察から明らかなように、金属イオン配位環式リガンド基を含有する反応種は、（得られた官能化ポリマー基材生成物中の）上記式（Ｉ）に示すタイプの官能基を生じるものが適切である。本発明のプロセスで使用するのに適切な反応種は、下記一般式（ＩＩ）の化学種などである。
【化１０】
2005526487.tif 000006
【００４７】
パラメータｎ、ａ、ｂ及びｃの大きさ、並びに基Ｒの性質は、本発明による官能化ポリマー基材に関連して上述したものに対応する。また、各トリアザシクロアルカン環中の各−ＣＨ２−基の一方又は両方の水素原子は、互いに独立して、かつ他のあらゆるトリアザシクロアルカン環から独立して、ある置換基によって任意に且つ独立に置換することができる。この任意選択の置換基は、任意に、１つ以上の金属イオン配位ドナー原子（一般にＮ、Ｏ又はＳ）を含む。また、各トリアザシクロアルカン環中の各−ＮＨ−基の水素原子は、Ｈ＊以外、互いに独立して、かつ他のあらゆるトリアザシクロアルカン環から独立して、ある置換基で任意に置換することができる。この任意選択の置換基は、任意に、１つ以上の金属イオン配位ドナー原子を含む。この状況における任意選択の置換基は、式（Ｉ）の官能基に関連して上述したものの中から同様に選択することが適切であり得る。
【００４８】
上述の考察から明らかなように、アガロース及びアガロース誘導体（上述したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）製品など）は、本発明による上述のプロセスに関連するポリマー基材として、特に式（ＩＩ）の化学種と組み合わせて適している。適切な二官能試薬はエピクロロヒドリンであり、これに関連してポリマー基材をエピクロロヒドリンと反応させるときに、ホウ化水素ナトリウムなどの還元剤を反応混合物中にさらに混合することが有利であり得る。
【００４９】
本発明の範囲は、官能化ポリマー基材を調製するための上述したプロセスによって得られる又は得ることができる官能化ポリマー基材をさらに包含する。
【００５０】
また、本発明の範囲は、その中の少なくとも１つの金属イオン配位環式基に配位する金属イオンをさらに含む本発明による官能化ポリマー基材を調製するためのプロセスも包含する。このプロセスは、本発明による官能化ポリマー基材を、当該金属イオン（例えば、上述した金属イオンの１つ）の無機塩［例えば、硝酸塩、ハロゲン化物（フッ化物、塩化物、臭化物又はヨウ化物）、硫酸塩、過塩素酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩又はリン酸塩］又は有機塩［例えば、カルボン酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、プロパン酸塩又は安息香酸塩）、テトラフェニルホウ酸塩又はスルホン酸塩］の水溶液と接触させることを含む。このようなプロセスによって得られる又は得ることができる金属イオン含有官能化ポリマー基材も本発明の範囲に属する。
【００５１】
本発明による官能化ポリマー基材中の金属イオン配位大環状リガンドの選択基準、及び好ましいペプチドタグの位置、構造及び諸特性に関する基準
Ａ：金属イオン配位大環状リガンドの選択基準：上述したように、本発明に関連して定義される官能化ポリマー基材の極めて重要で貴重な適用例は、タンパク質の精製におけるその金属イオンを含有する態様の使用である。当該タンパク質は、融合タンパク質の形をしており、目的タンパク質がそのアミノ又はカルボキシ末端においてオリゴペプチド「タグ」、特に本発明によるヒスチジン含有オリゴペプチドに融合している。また、目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子、あるいはそのアミノ又はカルボキシ末端がそれぞれオリゴペプチド「タグ」、特に本発明によるヒスチジン含有オリゴペプチドに結合している２つの異なる目的タンパク質又はポリペプチドの同時融合によって、新しい融合タンパク質構造が生成され、それによってオリゴペプチド「タグ」がエンドの位置（すなわち、内部の位置）に置かれて、目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子を連結する。特定の理論に拘泥するものではないが、本発明に関連して本発明者らが実施した研究において得られた結果に基づいて、本発明者らは、本発明のこの側面の根底にある現象は、金属イオン／リガンド錯体とＮ末端、Ｃ末端又はエンド位置のオリゴペプチド「タグ」として融合タンパク質内に存在する相補オリゴペプチド配列との分子相互作用を可能にし、金属イオン／リガンド錯体及び「タグ」のペプチド配列内のその同族の結合相手の分子サイズ及び表面配向によって決まる「分子カセット」とみなすことが適切であると考える。したがって、既述されたすべてのキレート系と比較して、導入したペプチド「タグ」によって組換えタンパク質を捕捉する本発明の官能化ポリマー基材における金属イオン結合キレートリガンド系の主要な特性及び利点は、少なくとも以下の特徴の非排他的なリストに関係付けることができると考えられる。
【００５２】
（ａ）本発明のキレートリガンド系は、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）及び同様のリガンドに基づく系によって得られるよりもはるかに高い安定度定数（すなわち、金属イオン結合定数）を有し、その結果、緩衝液によって誘導される又はタンパク質除去用金属イオンの漏洩による有害な望ましくない効果が大いに抑制される。
【００５３】
（ｂ）本発明の金属イオン含有官能化ポリマー基材における金属イオン含有錯体の配位構造は、例えば、ＩＤＡ又はＮＴＡキレートリガンドを用いて観測される配位構造とは異なる。すなわち、電荷ｎ＋の金属イオン（Ｍ）では、ｎ＝２の場合のＭｎ＋−ＩＤＡ又はＭｎ＋−ＮＴＡの配位構造は八面体（下記スキーム１参照）であることが多い。
【化１１】
2005526487.tif 000007
【００５４】
スキーム１．リガンドが配位八面体の１面を占有している従来のＩＤＡ又はＮＴＡ型キレートリガンドとのＭｎ＋錯体の配位構造の八面体配置の説明図。カルボキシル基由来の２つの酸素ドナー原子が互いに反対の位置（すなわち、トランス配置）にある別のリガンド配置も可能である。
【００５５】
しかし、歪んだ三角錐体又は四角錐体に対応する配位構造も発生し得る。これは、ＩＤＡ又はＮＴＡ型キレートリガンド系が、得られる選択性が限られ予測不可能な結果になる非拘束キレート系として挙動し得ることを意味する。このようなキレートリガンド系では、Ｃｕ２＋は５又は６配位構造をとり易く、Ｎｉ２＋はもっぱら６配位構造をとることも言える。これに対して、例えば、Ｍｎ＋−ｔａｃｎ、Ｍｎ＋−ｄｔｎｅ／−ｄｔｎｐリガンド系、並びに例えば、ビス−、トリス−及びテトラキス（ｔａｃｎ）リガンド系［その調製及び使用は実験の項（下記参照）に記載されており、本発明に関連する極めて有用なリガンド系である］が、例えば、Ｃｕ２＋と共にとる配位構造は、主に、リガンド上のすべての金属イオン配位ドナー原子が同一面にあり配位ポリ多面体の三角形の面を占めている四角錐体である。他の大環状リガンド、例えば、２つの窒素ドナー原子と１つの酸素ドナー原子を含むリガンド（Ｎ２Ｏ）、２つの窒素ドナー原子と１つの硫黄ドナー原子を含むリガンド（Ｎ２Ｓ）、及び１つの窒素ドナー原子と２つの硫黄ドナー原子を含むリガンド（ＮＳ２）の場合、類似の「三角形」構造が得られる。また、同様の構造が、ビス（ｔａｃｎ）（Ｎ６）、トリス（ｔａｃｎ）（Ｎ９）及びテトラキス（ｔａｃｎ）（Ｎ１２）リガンド系によってとられる。その結果、本発明において使用する環式又は大環状リガンド系は、新規な固定化金属イオン親和性クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）システムに使用するのに極めて適した予測可能な拘束型配位構造となり、金属イオン、金属イオンと相互作用し得る溶媒和／緩衝液成分の性質に応じて、さらにはペプチド配列内のアミノ酸残基の性質及び配向に応じて、好ましいペプチド（オリゴペプチド）「タグ」構造の選択に対する基本原理が与えられ得る。
【００５６】
したがって、本発明に関連して使用したオリゴペプチド「タグ」配列の設計及び選択の指針の１つは、これらのｔａｃｎ、ビス（ｔａｃｎ）、トリス（ｔａｃｎ）及びテトラキス（ｔａｃｎ）由来の金属イオン／大環状リガンド錯体及びそれらの構造的に関係する類縁体及び誘導体の実質的にすべてが配位部位に対して三角形構造を有し、すなわち金属イオンに配位するときに、実質的にすべてのこれらの大環状リガンドが金属イオンの配位多面体の三角面を占有するということであった。この注目すべき特性は、本発明に織り込まれ、オリゴペプチド「タグ」への結合に対して（又は、さらに言えば、目的タンパク質のペプチド配列中のアミノ酸残基に対して）これまで可能であったよりも高い特異性／選択性を得るために利用された。したがって、この構造原理は、本発明者らが認識した後は、本明細書に開示する本発明の形成に重要な原理となった。本発明の環式又は大環状リガンド系と従来用いられたリガンド系との配位結合の配置に関するこの基本的な相違は、環式／大環状リガンド錯体の場合、金属イオンが大環状リガンドの「ひだ状の」面に位置し、「タグ付き」タンパク質（融合タンパク質）の入りの（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）オリゴペプチド「タグ」の接近及び配向が一方向になることを意味している。構造組織におけるこのような重要な相違の例は、（固定化Ｍｎ＋含有Ｎ−カルボキシメチル化ｔａｃｎリガンドに対する入りのヒスチジン残基のイミダゾイル基の配向配置を示した）下記スキーム２に示す配置を従来用いられたＩＤＡ又はＮＴＡ系と比較することによって示すことができる。
【化１２】
2005526487.tif 000008
【００５７】
スキーム２．（この場合Ｎ−ドナーとして働く）入りのＨｉｓ残基のイミダゾイル基の接近方向を示す、Ｎ−カルボキシメチル化ｔａｃｎキレートリガンドと八面体配位したＭｎ＋イオンの「ひだ状の（ｐｕｃｋｅｒｅｄ）」配向配置。
【００５８】
このＮ−カルボキシメチル化ｔａｃｎの例は、さらに、入りのオリゴペプチド「タグ」に利用可能な部位の数を制御し、固定金属錯体の全電荷を調整し得ることを明示するものであり、それによってさらに結合相互作用を制御することが可能になる。本発明の一部を形成する他の三座配位単環大環状分子に対して類似の構造体を作製することができる。このことは、リガンド設計と金属イオンの適切な組み合せによって、入りのオリゴペプチド「タグ」との結合相互作用を制御することが可能になるということをさらに明示するものである。また、類似のｔａｃｎ、ビス（ｔａｃｎ）、トリス（ｔａｃｎ）及びテトラキス（ｔａｃｎ）由来の金属イオン／大環状リガンド錯体、並びにカルボキシメチル、アミノエチル、アミノプロピルなどの懸垂結合成分（ｐｅｎｄａｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有するそれらの構造的に関係する類縁体及び誘導体は、２つの金属配位部位が利用されて水和（ａｑｕｏ−ｈｙｄｒａｔｅｄ）錯体又は加水分解錯体（ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）を形成する単核大環状リガンドの場合にも使用することができる。例えば、スキーム３は、（ｏ−キシレニル架橋中の）フェニル環のπ電子系とオリゴペプチド「タグ」又は融合タンパク質の（ヒスチジン残基中に存在する）イミダゾリル環との結合相互作用のさらなる可能性を示すｏ−キシレニル架橋ビス（ｔａｃｎ）型リガンドの（固定化）Ｃｕ２（ｄｉ−ｃｏｐｐｅｒ）（ＩＩ）錯体に対する配向アレイ（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ａｒｒａｙ）を示している。Ｎ−カルボキシメチル、Ｎ−アミノエチル、Ｎ−アミノプロピル成分などの（１つ以上の第二級アミノ基に化学結合した）懸垂構造をさらに導入することによって、懸垂アームの電荷状態に応じて、金属イオンキレート化を進めることができる別の構造類縁体が提供される。
【化１３】
2005526487.tif 000009
【００５９】
スキーム３．キレートリガンド中のイミダゾイル基とオルトジ置換フェニル環とのπ→π相互作用の例における注目すべき特徴を示す、Ｃｕ２＋含有α，α’−ビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）−オルト−キシレンキレートリガンドの配向アレイ。注：これらのビス系（ｂｉｓ−ｓｙｓｔｅｍｓ）では、示差的に示した表面に接触可能な標的目的タンパク質内のアミノ酸残基由来の２つのドナー基が、リガンドと同時に相互作用する可能性がある。あるいは、これらの残基は、タグのアミノ酸配列構造の一部として存在し得る。これは、本発明の側面を構成する特異的オリゴペプチドタグに対する好ましいアミノ酸配列の設計及び選択の根底にある考慮事項の１つであった。
【００６０】
ビス系の場合、錯体が（スキーム３に示すように）「開いた」形又はいくつかのＮｉ２＋系で見られるような「サンドイッチ」の形（スキーム６参照）のどちらであるかも考慮に入れる必要がある。当該タイプの大環状リガンド、特に、ビス、トリス及びテトラキス型リガンドの特徴がこのように極めて特殊なので、（ａ）入りのオリゴペプチド「タグ」（又は、さらに言えば、目的タンパク質自体の表面接触可能なアミノ酸残基）に対する接近構造、（ｂ）ｐＨの影響、（ｃ）Ｏ−及び／又はＮ−ドナー効果の相互作用の点で異なる好ましいアミノ酸配列を有するオリゴペプチド「タグ」に対する結合の選択性、（ｄ）極めて特異的な緩衝液イオン相互作用の結果、及び関与する大環状環単位数の点で、かなりの自由度がもたらされる。後者の諸特性はすべて、本新規発明の進歩性と重要性に寄与し、本発明者らの知る限りでは、オリゴペプチド「タグ」融合タンパク質の使用は、従来のＩＭＡＣシステムでは実証されていなかった。
【００６１】
（Ｃ）これまで検討された２＋及び３＋に帯電した金属イオンのすべて、すなわち、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｒ３＋及びＦｅ３＋では、溶出条件（実験の項参照）の選択に関する本発明者らの研究は、金属イオン／大環状リガンド錯体は（錯体は全体として電気的中性ではあるが）実際には僅かの正電荷を有するという事実にもかかわらず、固定化金属イオン／大環状リガンド錯体における入りのタンパク質上（すなわち、オリゴペプチド「タグ」上及び／又はタンパク質自体の上）の金属イオン結合ドナー基と金属イオン上の配位可能な部位（例えば、容易に置換可能な水分子、ハロゲン化物イオンなどによって当初占有されている配位部位）との配位結合（電子供与）は、利用可能なときには、優勢な結合機序であることを明確に示している。これは、結合タンパク質の脱離が極めて選択的な溶出緩衝液条件を必要とすることから明らかである。例えば、従来使用されたＩＤＡ又はＮＴＡを用いたＩＭＡＣシステムに比べると、オリゴペプチド「タグ」構造内の複数のアミノ酸残基が関与する協同的結合効果によって媒介される相互作用と共に、異なる（より高い）結合親和性を示すはるかに選択的な溶出条件を使用することができる。したがって、イオン強度依存性及びｐＨ依存性の面で、従来用いられた非拘束型ＩＤＡ又はＮＴＡ型キレートリガンドよりもはるかに有利な溶出挙動が認められたことは極めて驚くべきことであった。
【００６２】
スキーム３の説明文で述べたように、ビス系では（並びにトリス及びテトラキス系でも）、タンパク質内の２つ（又はそれ以上）の示差的に示した表面に接触可能なアミノ酸残基由来の２つ（又はそれ以上）のドナー基と本発明のクラスのＩＭＡＣリガンドとが同時に相互作用する可能性がある。しかし、この場合、所望の範囲の親和性をもたらすアミノ酸配列は、キレート金属イオンと当該特異的オリゴペプチド「タグ」とのそれぞれの相互作用に対して微調整することができるので、最適な相互作用を得るために、オリゴペプチド「タグ」配列内に適正に配置された適切なアミノ酸残基を提供することは、好ましい選択肢である。オリゴペプチド「タグ」のアミノ酸残基の側鎖内にドナー基を配向させて配置するこの考え方を利用することは、本発明の側面を構成する特異的オリゴペプチド「タグ」に対する好ましいアミノ酸配列パターンを設計し選択する際の基本的考慮事項の１つであった（下記セクションＢ及びＤも参照されたい）。
【００６３】
便宜上、説明を簡単にするために、この手法は、分子カセットシステムを形成すると考えることができる。固定化金属イオン／リガンド系、及びオリゴペプチド「タグ」の調整済みアミノ酸配列特性の両方によって、オリゴペプチド「タグ」内の同種配列を正確に認識することが可能な正しい原子距離で配置された固定化金属イオン／リガンド系内の結合部位を有する「分子ピンセット（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｗｅｅｚｅｒｓ）」システムが形成される。
【００６４】
（ｄ）本タイプのキレート大環状リガンドに結合したときにＭｎ＋イオンの特徴を有することが証明された表面配向「ひだ状」三角配位構造を使用した結果、本タイプの大環状錯体は、境界にある「硬さ」の金属イオン、例えばＣｕ２＋、又は「硬い」金属イオン、例えばＣｏ３＋を含むＩＤＡ又はＮＴＡ型キレートリガンドで見られるものとは異なる加水分解挙動を示す。金属イオンに関連して本明細書において使用する「硬い」、「硬さ」及び「軟らかい」という用語の意味は、Ｒ．Ｇ．Ｐｅａｒｓｏｎ（例えば、Ｓ．Ｆ．Ａ．Ｋｅｔｔｌｅ、Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．、１９６９、ｐｐ．４８−４９参照）によるものであることに留意されたい。尺度の一端にある「硬い」金属イオンは、リガンドへの結合に関してプロトンに匹敵するものであり、小さく、高い電荷を有することが多く、容易に変形し又は除去される原子価殻電子を欠いたものであり、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｒ３＋及びＦｅ３＋である。尺度のもう一端にある「軟らかい」金属イオンは、大きく、低電荷であり、容易に変形し又は除去される原子価殻電子を有し、例えば、Ｃｕ＋、Ａｇ＋及びＣｄ２＋である。その特性が硬い金属イオンと軟らかい金属イオンの境界にある、すなわち、境界にある硬さの金属イオンは、例えば、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋及びＣｕ２＋である。
【００６５】
これは、本ＩＭＡＣシステムのｐＨ依存性及び塩依存性が、従来用いられたシステムのそれとは異なり、添加又は溶出緩衝液における任意の有機溶媒、例えば、エタノール又はアセトニトリルの有無の影響も異なることを意味する。また、本ＩＭＡＣシステムが使用可能な配位構造のタイプは、より拘束の少ないＩＤＡ又はＮＴＡ型ＩＭＡＣシステムのそれとは異なる。これらの特徴は、スキーム４におけるＣｕ２＋及びＮｉ２＋の開いた構造の二核ビス（ｔａｃｎ）リガンド錯体、スキーム５におけるＣｕ２＋及びＮｉ２＋の単核非サンドイッチ構造、及びスキーム６におけるｔａｃｎ及びビス（ｔａｃｎ）リガンドの単核Ｃｕ２＋及びＮｉ２＋サンドイッチ錯体の例で示されている。
【化１４】
2005526487.tif 000010
【００６６】
スキーム４．非サンドイッチ型の二核銅（ＩＩ）及びニッケル（ＩＩ）ビス（ｔａｃｎ）錯体
【化１５】
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【００６７】
スキーム５．ｔａｃｎ及びビス（ｔａｃｎ）リガンドの単核銅（ＩＩ）及びニッケル（ＩＩ）非サンドイッチ錯体
【化１６】
2005526487.tif 000012
【００６８】
スキーム６．単核銅（ＩＩ）及びニッケル（ＬＬ）ｔａｃｎ及びビス（ｔａｃｎ）サンドイッチ錯体
本発明に関連するいくつかの特徴を挙げることができる。第１に、本固定化キレート大環状リガンドの配位構造は、異なる立体電子効果（ｓｔｅｒｉ−ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）パターンを生じ、金属イオン結合定数に関して異なる親和性をもたらす。第２に、スキーム４−６から明らかなように、単核及び二核の開いた構造、非サンドイッチ及びサンドイッチ構造に対して金属イオンキレート錯体を固定化することによって、特に金属イオンの性質、キレートリガンドの化学構造、ビス（並びにトリス及びテトラキス）構造における架橋基Ｒの立体特性及びンホメーション特性、及び溶媒組成に応じて、分子認識の平衡が純粋な配位型相互作用から純粋なアニオン交換型相互作用に移行した、基本的に諸特性が異なる吸着剤が得られる。サンドイッチ及び非サンドイッチ構造の形成は、大環状分子の第二級アミン基を非配位基で官能化することによって制御できることに留意されたい。これらの特徴はすべて、これらのＩＭＡＣシステムがオリゴペプチド「タグ」の配列特性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ）を高い親和性で認識できるかどうかに影響する。実際、金属イオン結合中心間の分子距離、金属イオン結合中心間の相互作用配位部位表面への接近、オリゴペプチド「タグ」配列中の特異的アミノ酸残基との相互作用配位部位の表面接触性（ｆａｃｉａｌ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）、分極率、これらの中心の溶媒和力、それぞれの結合エネルギー、したがってこれらの相互作用に対する親和性を含めて、架橋基Ｒの諸特性は、これらの新しいＩＭＡＣシステムのいくつかの主要な側面を規定している。
【００６９】
（ｅ）固定化金属イオン／大環状分子錯体の多くは着色しており、それらの紫外−可視吸収スペクトルの特質は、個々の配位金属イオンに特徴的であり、したがって、固定化吸着剤を含有する充填カラムのタンパク質結合現象並びに一般的状態／条件をいっそう良好に視覚化することができる。
【００７０】
（ｆ）本発明の大環状リガンドのファミリーセットの魅力的特徴は、それらの合成経路の面での「コンビナトリアル」な関連性、並びに結合（官能基）特性である。これらの諸特性によって、本質的に同じタイプのシステム及びケミストリに基づいて生成され得る多種多様な選択性が利用できるようになる。このタイプの合成条件は、既知のＩＤＡ及びＮＴＡ型システムなどでは利用できない。
【００７１】
（ｇ）様々な固定化金属イオン／キレート大環状リガンド錯体によって明らかにされた異なるｐＨ依存性の結果、様々な金属イオンと所与の大環状リガンドを使用することによって、電気陰性度、金属イオンの空のｄ軌道構造及び充填効果に関係する新規な選択性を得ることができ、したがって、（本明細書の多数の実施例によって実証されるように（下記参照））Ｃｕ２＋の挙動は、意外なことに、Ｎｉ２＋のそれとは異なり、Ｎｉ２＋の挙動はやはりＺｎ２＋のそれとは異なる。
【００７２】
（ｈ）上述したように、本発明のビス（大環状分子）リガンドの位相幾何学的特徴（並びに、トリス及びテトラキス系の位相幾何学的特徴）は、既知のＩＤＡ又はＮＴＡ型系、Ｎ，Ｎ，Ｎ’−トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）に基づく系、又は関係するタイプの非拘束型キレート系では得ることができないように、例えば、それらの疎水性、立体電子的特徴、金属イオン結合中心間の距離、固有の電荷、超分子集合体への傾向、金属イオン結合定数、あるいは様々な緩衝液イオン又は様々な溶媒和化学種に対する優先度を「微調整」することができる。これに関し、本明細書の実施例（下記参照）に示すように、これらの特性を利用して、適切な選択金属イオン、大環状リガンド系（例えば、本明細書に開示するビス−トリス−又はテトラキス−系）及び諸条件（溶出培地、ｐＨなど）によって、多くの場合、「タグ無し」（未変性）タンパク質／ポリペプチドを極めて良好に精製することができると考えられる。また、本発明による金属イオン／リガンド吸収剤系の当該選択性及び結合特性によって、（溶出／精製後の溶液中ではなく）それが結合している吸収剤系上で、「タグ」を融合タンパク質からインサイチュで切断することが可能になり有利になる。
【００７３】
（ｉ）本発明のモノ、ビス、トリス及びテトラキス型リガンドの合成経路は、従来の非拘束型ＩＤＡ、ＮＴＡなどの系に対して使用される合成経路とは異なる。ドナー原子、例えば、Ｎ−カルボキシメチル置換変異体をさらに含む懸垂アームを有する本発明のタイプのリガンドの変異体は、コンビナトリアル合成によって容易に調製することができる。したがって、異なるタイプのスペーサー（すなわち、大環状キレートリガンドを担体材料に連結する側鎖基、あるいはビス（ｔａｃｎ）、トリス（ｔａｃｎ）及びテトラキス（ｔａｃｎ）系の場合、キレート錯体中の金属イオン間の距離を制御する構造的成分を介在させる側鎖基）、異なるリガンド構造、並びに異なるリガンド密度を、原則的には得ることができる。したがって、異なるタイプのスペーサーをリガンドの大環状区分に導入できることに加えて、大環状分子上の第二級アミン基を配位基又は非配位基のどちらかで官能化することによってリガンド配位特性を制御することができる。
【００７４】
（ｊ）同じ「コア」構造を、３つの窒素ドナー原子を用いて、すなわちＮ３リガンド（ビスリガンドの場合Ｎ６、トリスリガンドの場合Ｎ９、テトラキスリガンドの場合Ｎ１２）として、又は類似のＮ２Ｏ、Ｎ２Ｓ、Ｏ２Ｎ又はＳ２Ｎリガンドとして（対応するビス、トリス及びテトラキスリガンドに対してはそれらの適切な倍数で）作製することができる。本発明に関連して使用されるタイプのリガンドのより高次の同族体（ペンタキス、ヘキサキス、ヘプタキスなど）も可能であり、本発明に関連していることに留意されたい。
【００７５】
（ｋ）（ｉ）において示したように、固定化大環状「コア」リガンドを化学的に容易に誘導体化して、ドナー原子を含有する１つ以上の懸垂置換基を導入することができる。したがって、選択性に関する特性がやはり異なる別のクラスのＭＡＣ吸着剤を生成させることができる。例えば、懸垂カルボキシメチル基を含有するこのタイプの系も本発明の範囲内にあり、例えば、Ｃａ２＋特異的ＩＭＡＣシステムとして価値があるものと考えられる。このような懸垂置換基を有する対応するタイプのリガンド系は、ＩＤＡ、ＮＴＡ及び他の非拘束型クラスのキレート系から同様な方法で生成させることはできない。
【００７６】
Ｂ：本発明に関連して使用される金属イオン大環状キレートリガンドに関連するペプチドタグの好ましい配列及び構造配置：セクションＡで概説したように、適切なオリゴペプチド「タグ」を構築するために、いくつかの客観的基準を用いて、コンピューターデータベースから適切なアミノ酸配列を選択した。これらのオリゴペプチド「タグ」のいくつかの共通又は一般的諸特性によって、オリゴペプチド「タグ」が、組成又は構造に関して他のクラスの既知のオリゴペプチド「タグ」から区別される。これらの共通又は一般的諸特性は、以下のように要約することができる。
【００７７】
（ａ）（アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基などの）酸性アミノ酸残基が、オリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列中のその配列番号がｉであるヒスチジン残基（又は他の適切なＮ−ドナー残基）に対してｉ→ｉ＋１、ｉ→ｉ＋２、ｉ→ｉ＋３又はｉ→ｉ＋４位に位置し、当該酸性アミノ酸残基の側鎖成分とヒスチジン残基の原子距離（すなわち、酸性アミノ酸残基とヒスチジン残基の平均距離）が本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致しているアミノ酸配列。
【００７８】
（ｂ）ヒスチジン残基が、別のヒスチジン残基（又は他の適切なＮ−ドナー残基）に対してｉ→ｉ＋１、ｉ→ｉ＋２、ｉ→ｉ＋３又はｉ→ｉ＋４配列位置にあり、２つのヒスチジン残基の側鎖成分の原子距離が、本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致しているアミノ酸配列。
【００７９】
（ｃ）（アラニン、ロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン又はグルタミン残基などの）非極性又は中性アミノ酸残基が、ヒスチジン残基に対してｉ→ｉ＋１、ｉ→ｉ＋２、ｉ→ｉ＋３又はｉ→ｉ＋４配列位置にあり、当該非極性又は中性アミノ酸残基の側鎖成分とヒスチジン残基の原子距離が本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致しているアミノ酸配列。
【００８０】
（ｄ）アミノ酸残基の配置によって、本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している第１と第３、及び／又は第３と第５、及び／又は第５と第７、及び／又は第７と第９．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、第１、第３、第５、第７、第９．．．（等）アミノ酸残基が好ましくはヒスチジン残基又は（セリン、トレオニン又はチロシン残基などの）極性アミノ酸残基であるアミノ酸配列。
【００８１】
（ｅ）アミノ酸残基の配置によって、本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している第２と第４、及び／又は第４と第６、及び／又は第６と第８、及び／又は第８と第１０．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、第２、第４、第６、第８．．．（等）アミノ酸残基が好ましくは（アルギニン、リジン、ヒスチジン又はチロシン残基などの）イオン性又は極性アミノ酸残基又は（ロイシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン又はグルタミン残基などの）非極性アミノ酸残基であるアミノ酸配列。
【００８２】
（ｆ）アミノ酸残基の配置によって、本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している少なくとも２つのアミノ酸残基、好ましくは第１と第３、及び／又は第３と第５、及び／又は第５と第７、及び／又は第７と第９．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、Ｃ末端アミノ酸残基が好ましくはヒスチジン又はアルギニン残基又は（ロイシン、アスパラギン又はグルタミン残基などの）非極性アミノ酸残基であるアミノ酸配列。
【００８３】
（ｇ）オリゴペプチドのＮ末端位が生合成によってアセチル化又はアシル化されていないオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８４】
（ｈ）オリゴペプチド「タグ」の［Ｎｏｚａｋｉ及びＴａｎｆｏｒｄ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８（１９６３）４０７４−４０８１；同上２４５（１９７０）１６４８−１６５２）及びＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．、Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｍ．及びＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１（１９８４）１４０−１４４）によって計算及び定義された］疎水性モーメント（Τ）が１≦＜Ｔ≦２５であり、組換え融合タンパク質（オリゴペプチド「タグ」を含む宿主タンパク質）の[Richards,F.M.(Annual Reviews of Biophysics and Bioengineering 6(1977)151-176)及びWilce,M.C.J.、Aguilar,M.I. and Hearn,M.T.W.(Anal.Chem.67(1995)1210-1219)]に従って計算される疎水性の全体的変化が０．３以下であるオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８５】
（ｉ）組換え融合タンパク質の等電点（ｐＩ）値に対するオリゴペプチド「タグ」配列の全体の寄与が、対応する野生型（タグ無し）宿主タンパク質（目的タンパク質）の値と比較して０．５以下であるオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８６】
（ｊ）ｐＨ７．０で１．５≦ｑ≦１．０の実効電荷（ｑ）を有するオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８７】
（ｋ）オリゴペプチドの等電点（ｐＩ）が５．８≦ｐＩ≦８．５であるオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８８】
（ｌ）フリー溶液（ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中又はキャピラリーゾーンの電気泳動条件下で、オリゴペプチドが、７．０近いｐＨ及び≦５０ｍＭのイオン強度（Ｉ）で１００ｎＭ≦Ｋａｓｓｏｃ≦１００ｍＭの親和性定数（Ｋａｓｓｏｃ）を有する軟らかい、境界にある又は硬い金属イオンに対して親和性を示すオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００８９】
（ｍ）ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝食塩水中≦３００μＭのモル濃度で、オリゴペプチドがコイルドコイル構造を形成しないオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列。
【００９０】
より特異的なレベルで、極めて有用な本発明の側面におけるように、当該オリゴペプチド「タグ」を（エンテロキナーゼ、第ＩＸａ因子などのエンドペプチダーゼ又はプロテアーゼを使用するのではなく、あるいは、例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン、Ｎ−ブロモスクシンイミド、ヨードソ安息香酸、３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−インドレニン−スカトール又は他の適切な化学試薬の使用に基づく化学手順を使用するのではなく）アミノペプチダーゼの使用によって融合タンパク質から切断できることが必要又は重要である場合、適切なアミノペプチダーゼとしては（カテプシンＣ又はＤＰＰ  Ｉ；Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１としても知られ、例えば、Aldrich-Sigma、St Louis、MO、U.S.A又はUnizyme Laboratories、Horsholm、Denmarkから得られる）ＤＡＰ−１などのジペプチジルアミノペプチダーゼなどがあり、大腸菌及び他の適切な原核生物発現システム／宿主細胞における組換えタンパク質の発現に対するこのような「タグ」の所望の特性は、以下の基準を満たすと考えられる。
【００９１】
（ｎ）アミノ酸残基の配置によって本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している第１と第３、及び／又は第３と第５、及び／又は第５と第７、及び／又は第７と第９．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、第１、第３、第５、第７、第９．．．（等）アミノ酸残基がプロリン、アルギニン又はリジン残基ではないアミノ酸配列。
【００９２】
（ｏ）アミノ酸残基の配置によって本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している第２と第４、及び／又は第４と第６、及び／又は第６と第８、及び／又は第８と第１０．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、第２、第４、第６、第８．．．（等）アミノ酸残基がプロリン残基ではないアミノ酸配列。
【００９３】
また、本発明の別の側面におけるように、エンドペプチダーゼを使用することによって当該オリゴペプチド「タグ」を融合タンパク質から切断することが可能である場合、このような「タグ」の適切な基準としては以下が含まれる。
【００９４】
（ｐ）エンドペプチダーゼ、例えば、第ＩＩａ因子、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、トロンビン、フューリン又は（Ｋｅｘ１又はＫｅｘ２などの）Ｋｅｘなどのエンドペプチダーゼに対する切断モチーフを含有する短いアミノ酸配列による、目的タンパク質のアミノ酸配列へのオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列の結合。
【００９５】
また、本発明の別の側面におけるように、当該オリゴペプチド「タグ」を融合タンパク質から化学反応によって切断することが可能である場合、このような「タグ」の適切な基準としては以下が含まれる。
【００９６】
（ｑ）化学試薬、例えば、ヒドロキシルアミン、臭化シアン、Ｎ−ブロモスクシンイミド、ヨードソ安息香酸、３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルサルフェニル）−インドレニン−スカトール又は他の適切な化学試薬などの試薬に対する切断モチーフを含有する短いアミノ酸配列による、目的タンパク質のアミノ酸配列へのオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列の結合。
【００９７】
また、本発明のさらに別の側面におけるように、アシルチオール自己連結再配列を使用するなどの自己切断／自己スプライシング偽酵素（ｐｓｅｕｄｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ）反応によって、当該オリゴペプチド「タグ」を融合タンパク質から切断することが可能である場合、このような「タグ」の適切な基準としては以下が含まれる。
【００９８】
（ｒ）親和性分離のための自己切断インテインドメインを含有するアミノ酸配列による、目的タンパク質のアミノ酸配列へのオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列の結合（例えば、Wood, D. W.、Derbyshire, V.、Wu. W、Chartrain, M、Belfort, M.及びBelfort, G. Biotechnology Progress、16(2000) 1055-1063; Wood, D. W.、Wu, W、Belfort, G.、Derbyshire, V.及びBelfort, M., Nature Biotechnology、17(1999)889-892参照）。
【００９９】
真核生物発現システム、例えば、哺乳動物細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、組換えタンパク質の製造に使用されるSpodoptera furgiperda又は(Saccharomyces cerevisiae及びPichia pastorisを含めて)様々な商業的に重要な酵母細胞由来のバキュロウイルス形質移入昆虫Ｓｆ  ９細胞の場合、これらのシステムを用いて以下を含むオリゴペプチド「タグ」配列を使用することが可能である。
【０１００】
（ｓ）オリゴペプチド「タグ」中の他のアミノ酸残基の配置によって、本発明のタイプの金属イオン／大環状リガンド錯体内の利用可能な各結合部位を隔てる原子距離に一致又はほぼ一致している第１と第３、及び／又は第３と第５、及び／又は第５と第７、及び／又は第７と第９．．．（等）アミノ酸残基、又は第２と第４、及び／又は第４と第６、及び／又は第６と第８．．．（等）アミノ酸残基の各側鎖成分間の原子距離がもたらされるという条件で、第１のアミノ酸残基がプロリン残基であるアミノ酸配列。
【０１０１】
（ｔ）（ＤＡＰ−１などのアミノペプチダーゼが関与する酵素切断がオリゴペプチド「タグ」を除去する好ましい方法である場合）第２のアミノ酸残基とそれ以降のアミノ酸残基がプロリン残基ではないアミノ酸配列。
【０１０２】
上記特性（Ａ）−（ｔ）の１つ以上を示すオリゴペプチド「タグ」は本発明の範囲内にある。
【０１０３】
Ｃ：ペプチドタグの位置：周知の分子生物学的手法及び技術を用いて、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作に基づいて、本発明によるオリゴペプチド「タグ」を目的タンパク質のアミノ末端、カルボキシル末端又は内部（エンド）位置に導入することができる。その結果、オリゴペプチド「タグ」をＣ末端に置いても、上述したＩＭＡＣ手順を本発明の大環状キレートリガンド系を用いて実施することができる。また、オリゴペプチド「タグ」、特に本発明によるヒスチジン含有オリゴペプチドを、目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子、あるいは２つの異なる目的タンパク質又はポリペプチドのそれぞれアミノ又はカルボキシ末端に同時に融合させることができ、それによって新しい融合タンパク質構造が形成され、オリゴペプチド「タグ」がエンド位置（すなわち、内部位置）に置かれて目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子が連結される。本明細書の実施例に示すように（実験の項参照）、Ｃ末端のオリゴペプチド「タグ付き」組換えタンパク質は、新しいＩＭＡＣシステムによって極めて効率的に捕捉され、選択的に精製されることが判明した。続いて、組換えタンパク質のＣ末端位置にあるオリゴペプチド「タグ」を除去するために、特異的カルボキシペプチダーゼを使用することができ、又は宿主タンパク質のＣ末端残基と「タグ」ペプチドのＮ末端残基の結合部に一義的な化学切断部位を導入しなければならない。これらの切断部位の化学的諸特性を選択する基準は、科学文献から得られることが期待され、一方、カルボキシペプチダーゼ切断の動力学の最適化は、文献の例を基にすることができる。オリゴペプチド「タグ」配列及び宿主タンパク質のＣ末端アミノ酸配列の性質に応じて、適切なカルボキシペプチダーゼを、例えば、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣｐＹ）又は亜鉛依存性カルボキシペプチダーゼとすることができる。適切なカルボキシペプチダーゼは、Worthington Biochemicals Corporation、Lakewood、New Jersey、U.S.A.を含むいくつかの供給源から入手可能である。
【０１０４】
Ｄ：好ましいオリゴペプチドタグの置換要件：上記セクションＢ、特にそのサブセクション（Ａ）−（Ｃ）から明らかなように、許容されるアミノ酸置換反応を利用して、コンビナトリアル合成戦略によって最も容易に生成されるいくつかの変異体を生成させることができる。好ましいアミノ酸の選択に関しては、特に、コンビナトリアルによって誘導された変異体のアミノ酸配列を、セクションＣで考察した標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端のオリゴペプチド「タグ」を用いて、エキソペプチダーゼによって、又はジアミノペプチダーゼ、例えば、ＤＡＰ−１（上記参照）などのジペプチジルアミノペプチダーゼによって切断するし易さに関して、セクションＢで述べた基準に指針を見出すことができる。その結果、「好ましいオリゴペプチド「タグ」」の一般的定義に基づいて利用可能な合成候補の全数制限としてかなりの分子制約（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）を導入することができる。例えば、大腸菌などの原核生物発現系の場合、プロリン含有変異体は一般に除外される。第１、第３、第５、第７．．．（等）アミノ酸残基が、（ＤＡＰ−１などの）ジアミノペプチダーゼによる切断に対して配列停止として働く結果「許されない」残基である、すなわちＮ−１切断反応後のこの部位における切断が動力学的に不適当である配列変異体の場合（Ｐｒｏ、Ａｒｇ及びＬｙｓは、このような「許されない」アミノ酸残基の例である）、又はこの部位における切断が動力学的に不適当であるので第２、第４、第６、第８．．．（等）アミノ酸残基が好ましくない配列変異体（Ｍｅｔは、このようなアミノ酸残基の例である）の場合、オリゴペプチド「タグ」ライブラリのこのような変異体はコンピュータによって排除される。これらを考慮に入れると、例えば、対応するｃＤＮＡの複数の並行したＰＣＲ反応によってＤＮＡレベルで生成されるオリゴペプチド「タグ」配列ＨＨＨＮＳＷＤＨＤＩＮＲ（以後ＮＴ１と称する）又はＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲ（以後ＮＴ２と称する）の完全なコンビナトリアルライブラリ変異体は、期待される実用要件を示さない、又は期待される実用要件には不要であると考えられる。そうではなく、サブライブラリは、新しい固定化金属イオン／大環状リガンド錯体との結合相互作用の一部として特異的タンパク質成分（又は、関係するタンパク質ファミリー）を含む、親和性成熟可能なオリゴペプチド「タグ」配列の生成に適切な構造変異体グループ、すなわち特異的大環状リガンドに対する所望の特徴の親和性を有し、ＤＡＰ−１などの選択されたペプチダーゼによって除去可能である構造変異体グループである。この状況における「親和性成熟」という用語は、一次構造が親オリゴペプチド「タグ」（ＮＴ１又はＮＴ２など；上記参照）（すなわち、変異体）に関係するオリゴペプチド「タグ」配列（すなわち、親オリゴペプチド「タグ」の変異体）の選択的使用を指し、これらのオリゴペプチド「タグ」変異体は、分子認識カセットとして、選択された固定化金属イオン親和性錯体とのより高い又はより低い結合親和性を生じるアミノ酸置換体であり、本発明の側面として上で開示した選択オリゴペプチド「タグ」配列変異体及び固定化金属イオン親和性錯体の���和性特性は、目的とする標的タンパク質の特異的特性に従って選択される。
【０１０５】
Ｅ：好ましいペプチドタグの切断要件：上記セクションＢ、Ｃ及びＤに記載した基準が満たされる場合、本発明による好ましいオリゴペプチド「タグ」、例えば、ＮＴ１又はＮＴ２のアミノ酸配列をＮ末端及び／又はＣ末端から切断することは、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（例えば、ＤＡＰ−１；上記参照）又は他のアミノペプチダーゼ、ジアミノペプチダーゼ若しくはトリアミノペプチダーゼを利用してオリゴペプチド「タグ」を除去することに等しい。この場合、切断によって（ｄｅｓ  ｕｎｏ−オリゴペプチド「タグ」構造：
５’  １−２−３−４−５−６−７−．．．−［標的タンパク質］  →  ５’  ２−３−４−５−６−７−．．．−［標的タンパク質］で示される）の例がもたらされる。ここでの重要な側面は、切断によってアミノ酸配列の「違相（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｈａｓｅ）」シフトが起こらないことを確実にすることである。これは、精製操作中のオリゴペプチド「タグ」と固定化金属イオン／リガンド錯体の相互作用に対して効果がない場合もあり得るが、融合タンパク質からのオリゴペプチド「タグ」のタンパク質分解切断を不十分にするアミノ酸残基の好ましくない配置をもたらす恐れがある。したがって、「同相の（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）」切断変異体は、親オリゴペプチド「タグ」配列「ライブラリ」の特別なサブセット（Ｔ−サブセット）であり、組成又は配列上の特徴の類似性、及びＩＭＡＣ結合能力又は酵素による切断特性によって、それぞれの親オリゴペプチド「タグ」に関係付けられる。
【０１０６】
Ｆ：好ましいペプチドタグの欠失要件：内部アミノ酸残基を除去することによって、アミノ酸残基の規定の順序が混乱し、２つの結果がもたらされる。第１の結果は、痕跡オリゴペプチド「タグ」の分子認識用の好ましい結合モチーフに対する固定化金属イオン／大環状キレートリガンドの効果に関する。この効果は、アミノ酸配列における位相のずれとして表れ、アミノ酸残基「ｍ」が欠失変異体において「ｍ−ｘ」残基になる。ここで、「ｘ」は欠失アミノ酸又は配列である。このような変化は第２の効果を有し、すなわち、ＤＡＰ−１切断性が大きく損なわれ得る。この場合、欠失によって、（ｄｅｓ  ｄｉ−ペプチド「タグ」構造：
５’  １−２−３−４−５−６−７−．．．−［標的タンパク質］  →  ５’  １−２−３−６−７−．．．−［標的タンパク質］で示される）の例がもたらされる。
【０１０７】
しかし、セクションＢ、Ｃ及びＤで概説した基準を依然として満たす場合、欠失変異体を使用できることを、好ましいオリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列に対する選択要件の一部として加えることもできる。したがって、「同相の」欠失変異体は、親オリゴペプチド「タグ」配列「ライブラリ」の特別のサブセット（Ｄ−サブセット）であり、親オリゴペプチド「タグ」配列のＩＭＡＣ結合能力又は酵素切断特性に対するそれらの組成又は配列の類似性によっても関係付けられる。
【０１０８】
Ｇ：好ましいオリゴペプチドタグのモジュール化要件：上記セクションＣ、Ｄ、Ｅ及びＦに概説した考慮事項に従って、オリゴペプチド「タグ」配列のモジュール化の基準を定めることができる。この場合、モジュールの再配置によって、（再配列テトラペプチド「タグ」構造：
５’  １−２−３−４−５−６−７−．．．−１４−１５−１６−１７−［標的タンパク質］  →  ５’  １，２−３−１４−１５−１６−１７−−４−５−６−７−．．．−［標的タンパク質］で示される）の例がもたらされる。
【０１０９】
この考察から、１つ以上の好ましい「完全」長「タグ」の断片的な部分配列も、新しいペプチド「タグ」設計の基礎として含まれ得ることになる。このようにして、配列の一部のみが変えられ、その結果は、親配列のさらなるサブセット（Ｍ−サブセット）である。この場合、親ペプチド「タグ」から新しいペプチド「タグ」モジュールを作製する置換ブロックサイズは、ＩＭＡＣ相互作用及び酵素切断に対して記載した基準に従わなければならない。
【０１１０】
Ｈ：好ましいオリゴペプチドタグ配列の方向性：生合成によって調製したオリゴペプチド「タグ」融合タンパク質を用いると、好ましい配列においてアミノ酸残基の順が逆転し得るかどうかについての疑問が生じる。例えば、オリゴペプチド「タグ」配列ＮＴ２（上記参照）の場合、逆転によって配列−−Ｒ−Ｈ−Ｆ−Ｈ−Ｎ−Ｈ−Ｑ−Ｄ−Ｑ−Ｈ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｈ−−が生成する。ただし、このような配列順の逆転が、多くの場合、１位（及びおそらく他の位置）で好ましくない残基をもたらすことに留意されたい。
【０１１１】
Ｉ：好ましいペプチドタグのカセット配列の可能性  相補的な相互作用挙動の問題を、好ましいオリゴペプチド「タグ」配列及び使用した特異的ＩＭＡＣリガンドの性質に関して上で考察した。（唯一ではないが）主要なアミノ酸配列の選択基準は、バルクではなく、分子レベルでの対応する固定化金属イオン／リガンド錯体システムの余角（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｇｕｌａｒ）及び結合エネルギー性能面でのアミノ酸残基側鎖間の距離及び角度方向に関する。このため、好ましいオリゴペプチド「タグ」の選択は、ＩＭＡＣリガンドの選択にも依存し、そのため、２つの同族相手が関与するカセット相互作用の考え方が上で始めに想起された。この一般的な考え方は、本明細書に記載する新規なオリゴペプチド「タグ」システムの特殊な結合特性の多くを特徴付けるのに役立った。
【０１１２】
上記考察に関係して、ただしより具体的なレベルで、融合タンパク質（それ自体はポリペプチドである）からのオリゴペプチド「タグ」の切断が、アミノペプチダーゼ、例えば、ＤＡＰ−１などのジペプチジル−アミノペプチダーゼの作用で起こる、タンパク質精製戦略に使用するのに極めて適していると考えられるオリゴペプチド「タグ」としては、以下から選択されるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドなどがある。
【０１１３】
HHHNSWDHDINR      （本明細書ではＮＴ１と略記する）  （配列番号１）
HTNIHQDQHNHFHR  （本明細書ではＮＴ２と略記する）  （配列番号２）
HAMLDRAHDHGTR                                      （配列番号３）
SLHEHHSGDNLR                                        （配列番号４）
THYNAVHSHNTLQ                                      （配列番号５）
DIHHWTDHLQSSTH                                      （配列番号６）
LYNHYSHTAHVNHL                                      （配列番号７）
このようなペプチド（オリゴペプチド）「タグ」は、示したアミノ酸配列の１つに加えて、オリゴペプチド「タグ」のＣ末端又はＮ末端に結合した２−６又はそれ以上の追加のアミノ酸残基などの１つ以上の追加のアミノ酸残基を含むことができることを理解されたい。このような配列伸長は、伸長がオリゴペプチド「タグ」のＮ末端においてであり「タグ」システムを大腸菌などの原核生物発現系を用いて組換えタンパク質の産生に利用しようとするときには、例えば、２位と１位（１位のＬｙｓは、オリゴペプチド「タグ」のＮ末端から数えて最初のアミノ残基である）にあるＭｅｔ−Ｌｙｓなどのジペプチド単位であることが適切である。周辺質の分泌のない原核生物発現系の場合、オリゴペプチド「タグ」のＮ末端伸長の好ましい第１のアミノ酸残基は、配列Ｍｅｔ−Ｘａａを含む。ここで、Ｘａａは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸残基である。これらのアミノ酸配列伸長を含めることによって、原核生物宿主細胞における標的タンパク質の発現が増加する別の利点がもたらされる可能性がある。
【０１１４】
真核生物発現システムの場合、オリゴペプチド「タグ」のＮ末端伸長は、通常、伸長の第２のアミノ酸残基がプロリン残基ではないという条件で１０以下、しばしば１０未満のアミノ酸残基を含有することが適切である。
【０１１５】
同様に、配列伸長は、伸長がオリゴペプチド「タグ」のＣ末端においてであり「タグ」システムを大腸菌などの原核生物発現系を用いて組換えタンパク質の産生に利用しようとするときには、例えば、＋１と＋２位（＋１位のＶａｌは、オリゴペプチド「タグ」のＣ末端から数えて最初のアミノ残基である）にあるＶａｌ−Ａｓｐなどのジペプチド単位であることが適切である。
【０１１６】
本発明のさらに別の側面は、以下のものを含む。
【０１１７】
上述の配列番号１−７中のオリゴペプチドなど１つ以上の上記基準に従う少なくとも１つのオリゴペプチドに、そのアミノ末端又はカルボキシ末端において融合した目的タンパク質を含む融合タンパク質であるポリペプチドであって、既述したように（上記参照）、目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子、あるいは２つの異なる目的タンパク質又はポリペプチドが、それぞれそれらのアミノ末端又はカルボキシ末端において、同一オリゴペプチド（すなわち、オリゴペプチド「タグ」）、適切には本発明によるヒスチジン含有オリゴペプチドに同時に結合し、オリゴペプチド（すなわち、「タグ」）がエンド位置（すなわち、内部位置）に置かれて目的タンパク質又はポリペプチドの２つの分子が連結された融合タンパク質構造を形成する融合タンパク質を、当該タイプの融合タンパク質が含み、このタイプの融合タンパク質構造において、オリゴペプチド「タグ」のアミノ酸配列に１つ以上の酵素又は化学切断部位が適切に隣接しているポリペプチド；
このようなポリペプチドをコードするベクターなどのポリヌクレオチド構築体；
このようなポリヌクレオチド構築体を含む宿主細胞（例えば、大腸菌などの原核生物）を、ポリペプチドの発現及び培養培地からのそのポリペプチドの回収が可能な条件下、適切な増殖培地中で培養することによって得られるポリペプチド；
このようなポリヌクレオチド構築体を含む宿主細胞、より具体的には原核生物細胞（例えば、大腸菌株）又は真核生物細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はＢＨＫ、ＨＥＫ若しくはＣＯＳなどの他の哺乳動物細胞系）；及び
ポリペプチドの発現及びそのポリペプチドの培養培地からの回収が可能な条件下、適切な増殖培地中で当該タイプの宿主細胞を培養することを含む、当該タイプのポリペプチドを産生するための方法；
さらに別の本発明の側面は、目的タンパク質を精製するための方法に関し、この方法は、
本発明による少なくとも１つのオリゴペプチド（すなわち、オリゴペプチド「タグ」）にそのアミノ末端又はカルボキシ末端において融合している目的タンパク質を含む融合タンパク質（すなわち、オリゴペプチド（すなわち、「タグ」）が既述したエンド位置にある融合タンパク質を含めて、既述したタイプの１つの融合タンパク質）であるポリペプチドと、他の（外来性）タンパク質とを含有するタンパク質試料を、ポリペプチド（融合タンパク質）が金属イオン含有官能化ポリマー基材に結合してそれと錯体を形成する条件下で、本発明による金属イオン含有官能化ポリマー基材と接触させるステップと、
その錯体を緩衝溶液で洗浄して他の（外来性）タンパク質を除去するステップと、
結合ポリペプチドを洗浄した錯体から溶出させるステップとを含む。
【０１１８】
後者の方法は、さらに、例えば、化学的手段又は酵素手段（例えば、配列番号１−７として記載されたアミノ酸配列の１つを含む「タグ」の場合はジペプチジル−アミノペプチダーゼなど）によって、ポリペプチド又は目的タンパク質からオリゴペプチド（「タグ」）を切断するステップを含むことができる。
【０１１９】
本発明は、後者の方法によって得られる又は得ることができる精製タンパク質も包含する。
【０１２０】
本発明において教示する精製方法に関連するポリペプチド又はタンパク質（目的ポリペプチド又はタンパク質）としては、哺乳動物タンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インシュリンＡ鎖；インシュリンＢ鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；（第ＶＩＩａを含めた）第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；ウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノゲンアクチベータ；ボンバジーン（ｂｏｍｂａｚｉｎｅ）；トロンビン；腫瘍壊死因子α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン（ｐｒｏｒｅｌａｘｉｎ）；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；ＤＮアーゼ；アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＤ又はアクチビンＥ）；インヒビン（例えば、インヒビンＡ又はインヒビンＢ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子の受容体；インテグリン；タンパク質Ａ又はＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）、又はＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなどの繊維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α並びにＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４及び又はＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−β；インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０などのＣＤタンパク質；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒｓ）；免疫毒素；骨形成タンパク質１−７（ＢＭＰ  １−７）；インターフェロンα、β、γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１２；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面メンブレンタンパク質；崩壊促進因子（ＤＡＦ）；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；及びあらゆる上記ポリペプチド又はタンパク質の生物学的に活性な断片又は変異体などがある。
【０１２１】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、５’から３’末端へ読んだデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡなどがあり、天然源から単離し、インビトロで合成し、又は天然と合成分子の組み合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（「ｎｔ」と略記）又は塩基対（「ｂｐ」と略記）に換算して与えられる。「ヌクレオチド」という用語は、状況が許せば、一本鎖及び二本鎖分子の両方に使用される。この用語を二本鎖分子に適用するときは、全長を表すために使用され、「塩基対」という用語と等価であることを理解されたい。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は、長さがわずかに異なり、それらの末端は酵素切断の結果としてねじれている場合があることを当業者は認識すべきである。したがって、二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドが対を形成している必要はない。このような不対末端は、一般に２０ｎｔ長を超えない。
【０１２２】
本明細書で使用する「宿主細胞」という用語は、ハイブリッド細胞を含む、異種ＤＮＡが発現され得るあらゆる細胞を表す。典型的な宿主細胞としては、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及びＢＨＫ、ＣＨＯ、ＨＥＫ、ＣＯＳ細胞などのヒト細胞を含めた哺乳動物細胞などがあるが、これらのみに限定されない。
【０１２３】
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、宿主細胞において増幅可能なあらゆる核酸成分を指し、したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体複製とは無関係な染色体外成分として存在するベクターとすることができ、例えばプラスミドである。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入すると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものとすることができる。ベクターの選択は、それを導入すべき宿主細胞によって決定されることが多い。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルス、コスミドベクターなどがあるが、これらだけに限定されない。ベクターは、通常、複製開始点及び少なくとも１つの選択可能な遺伝子、すなわち容易に検出可能な産物、又はその存在が細胞成長にとって必須である産物をコードする遺伝子を含む。
【０１２４】
本明細書において、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物学命名法委員会（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（ＣＢＮ）によって承認された略語を用いて表される。アミノ酸に関して、以下の略語で表されるアミノ酸は、天然のＬ型である。また、アミノ酸ペプチド配列の左末端及び右末端は、特段の指定がない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。
【表Ａ】
2005526487.tif 000013
本明細書及び特許請求の範囲で使用する酵素分類は、Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biologyの推奨（１９９２）に従い、その（追加を含めた）最新版は、ワールドワイドウェブ上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／で入手可能である。
【０１２５】
以下、添付の図面を参照しながら、本発明をさらに説明する。
【実験の部】
【０１２６】
特に指定しない限り、用いた試薬は全て、標準的な実験用試薬グレ−ドの精製度又はさらに高い精製度のものであり、既存の製造者より入手した。ＣＨ３ＣＮを４Åのモレキュラ−シ−ブで乾燥させた。セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ及び他のタイプのセファロースＴＭ、ＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ及び関連するアガロ−スを基礎とした製品は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）より購入した。全体に渡って、蒸留水又はＭｉｌｌｉ−ＱＴＭ水を用いた。
【０１２７】
金属イオンを配位するリガンド
Richman-Atkins反応[J.E. Richman及びT.J. Atkins, Journal of the American Chemical Society, 96(1974) 2268; J.E. Richman, W.F. Oettle及びT.J. Atkins, Organic Synthesis 58(1978)86]を用いて、金属イオンに配位してするリガンド、1，４，７−トリアザシクロノナン（略称、ｔａｃｎ又はＴＡＣＮ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡより購入可能）を調製しうる。後述のｔａｃｎのトリヒドロブロミド塩は、５Ｍ  臭化水素酸からの遊離リガンドの結晶化により得た。
【０１２８】
Ｗｉｅｇｈａｒｄｔら［Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４（１９８５）１２３０］により記述されているようにして、1，２−ビス（1，４，７−トリアザシクロノナニル）エタン（略称、ｄｔｎｅ、ＤＴＮＥ又はＬｅｔｈ）及び１，３−ビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）プロパン（略称、ｄｔｎｐ、ＤＴＮＰ又はＬｐｒｏｐ）を調製しうる。Sesslerら[Inorganic Chemistry, 29(1990) 4143]又はZhangら[Inorganic Chemistry, 34(1995) 2883]により記述されているようにして、１，４−ビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）ブタン（略称、ｄｔｎｂ、ＤＴＮＢ又はＬｂｕｔ）を調製しうる。後者３種類の化合物を、ヘキサキス−臭化水素塩として分離した。
【０１２９】
Grahamら[Inorganic Chemistry, 36(1997) 6366]、又はFarrugia, L.J., Lovatt, P.A.及びPeacock, R.D.[Journal of the Chemical Society,Dalton Transactions (1997) 911-912]によって記述されているようにして、２個の１，４，７−トリアザシクロノナニル基の間に、−（ＣＨ２）ｎ−架橋（ｎ＝２、３又は４）に代えて、ｏ−、ｍ−又はｐ−キシレン、すなわち、
【化１７】
2005526487.tif 000014
【０１３０】
から誘導された架橋基を有する後者のビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）リガンドの類似体を、ヘキサキス−臭化水素塩として調製しうる。本明細書中においてこれらのリガンドは、それぞれＬｏｘ、Ｌｍｘ及びＬｐｘと略す。
【０１３１】
中心に存在するメシチレン、すなわち、
【化１８】
2005526487.tif 000015
【０１３２】
から誘導された基に３つの１，４，７−トリアザシクロノナニル基が結合した対応するトリス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）リガンド、並びに、中心に存在するズレーン、すなわち
【化１９】
2005526487.tif 000016
【０１３３】
から誘導された基に４つの１，４，７−トリアザシクロノナニル基が結合したテトラキス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）リガンドも、ノナキス−及びドデカキス−臭化水素塩として、それぞれ、Ｓｐｉｃｃｉａら[Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions(1997) 1092]及びGrahamら[Inorganic Chemistry, 39(2000) 1092]により記述されているように調製することができる。
【０１３４】
分析的定量及び物理的測定
窒素分析は、Dairy Technical Services Ltd., Melbourne, Australiaにより行われた。銅及びニッケル分析は、Varian AA-1475原始吸光分析装置を用いて行った。拡散反射電子スペクトルは、Ｃａｒｙ  ５Ｇ  分光光度計により記録した。ＥＳＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｅ−１２分光計を用い、約９．６ＧＨｚ（Ｘ−バンド）において操作して、７７Ｋにて記録し、ｇ値が２．００３６であるα，α‘−ジフェニル−β−ジピークリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）を基準とした。試料は、標準的な内径３ｍｍの試験管に入れ測定し、液体窒素フロ−式クリオスタット中で凍結させた。
【０１３５】
［実施例１］  固定化１，４，７−トリアザシクロノナン（ｉｍ−ｔａｃｎ）を含む吸着剤（官能化基材）の調製
キレート試薬（ｔａｃｎ）をマトリックス（基材）上に固定化する第一段階では、エピクロロヒドリン（又はカルボニルジイミダゾールなど他の適切な活性化化合物）を用いてマトリックスを共有結合により活性化した。このため、セファロースＴＭＣＬ−６Ｂゲル（１９ｇ、湿重量）に１０ｍＬの２Ｍ  ＮＡＯＨと３７．５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（９８％）を混合した。この混合物を２５℃で２時間インキュベートした後、１２ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、混合物を２５℃で一晩ゆっくりと攪拌した。こうして得たエポキシで活性化されたセファロースＴＭゲルを吸引ろ過により回収し、Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ水で完全に洗浄して残った未反応のエピクロロヒドリンを除去した。次に、水（３０ｍＬ）にｔａｃｎの三臭化水素酸塩５ｍｍｏｌを溶解し、固体ＮＡＯＨを加えてｐＨを１１に調整し、最終容量を水で５０ｍＬにして、０．１Ｍ  ｔａｃｎのリガンド溶液を調製した。本溶液の一部（２０ｍＬ）を、上記のように調製したエポキシで活性化した１０ｇ（吸引乾燥した重量）のセファロースＴＭＣＬ−６Ｂに添加した。振蘯ウォーターバスを用いて、２５℃でこの懸濁液を一晩混合した。得られた官能化ゲルの一部を吸引ろ過（ウォーターポンプ使用）により回収し、Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ水（５ｘ２００ｍＬ）、０．１Ｍ  ＫＮＯ３（ｐＨ４．０）を含有する５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍＬ、最後にＭｉｌｌｉ−ＱＴＭ水（５ｘ２００ｍＬ）でよく洗浄した。ｉｍ−ｔａｃｎ吸着剤の一部を次に２０ｍＬの２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール／水溶液に懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【０１３６】
［実施例２］  固定化ビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）エタン（ｉｍ−ｄｎｔｅ）を含む吸着剤（官能化基材）の調製
使用した０．１Ｍ  ｄｔｎｅリガンド溶液の最終的な容量が２５ｍＬである点を除き、使用した操作は実施例１に述べたものと本質的に同様である。
【０１３７】
［実施例３］  固定化ビス（１，４，７−トリアザシクロノナニル）プロパン（ｉｍ−ｄｔｎｐ）吸着剤を含む吸着剤（官能化基材）の調製
０．１Ｍ  ｄｔｎｐリガンド溶液の最終的な容量が２５ｍＬである点を除き、操作は実施例１に述べたものと本質的に同様である。
【０１３８】
［実施例４］  固定化金属イオン−ｔａｃｎ吸着剤の調製
典型的には、約５ｇ（湿重量）のｉｍ−ｔａｃｎ吸着剤を、Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ水中に調製した５０ｍＭ  境界域硬度の金属イオンの硝酸塩溶液５０ｍＬ、すなわちＣｕ（ＮＯ３）２、Ｎｉ（Ｎ０３）２、Ｚｎ（Ｎ０３）２、Ｃｏ（Ｎ０３）２、Ｍｎ（Ｎ０３）２又はＣｒ（ＮＯ３）３の５０ｍＭ溶液と、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、前記様々な固定化金属イオン吸着剤（ゲル）を、Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ水（５ｘ２００ｍＬ）で完全に洗浄した。ゆるく結合した金属イオンを吸着剤から除去するために、０．１ＭのＫＮＯ３を含有する５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を、５０ｍＬの緩衝液に対して５ｇ（湿重量）の吸着剤という比率で、固定化金属吸着剤ゲルとともに１０分間インキュベートした。次いで、Ｍｉｌｌｉ−ＱＴＭ水を用いてゲルをよく洗浄した。続いて、様々な固定化金属イオン吸着剤（ゲル）の一部を、２０ｍＬの２０％（Ｖ／Ｖ）エタノール水溶液に懸濁して、使用するまで４℃で保存した。
【０１３９】
［実施例５］  固定化金属イオン−ｄｔｎｅ吸着剤の調製
約５ｇ（湿重量）のｉｍ−ｄｔｎｅ吸着剤を使用した以外、用いた操作は実施例４とまったく同様である。
【０１４０】
［実施例６］  固定化金属イオン−ｄｔｎｐ吸着剤の調製
約５ｇ（湿重量）のｉｍ−ｄｔｎｐ吸着剤を使用した以外、用いた操作は実施例４とまったく同様である。
【０１４１】
［実施例７］    ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
ヒト血清の調製
血液細胞とフィブリノゲンを取り除くため、新鮮なヒト血液サンプル（２０ｍＬ）を４℃で２４時間沈殿させた。血清上清をＳｏｒｖａｌｌＴＭ  ＲＴ６０００冷却遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ  ＣＯ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用い、５０００ｘｇと４℃で２０分間遠心分離した。上清を除去し、５０００ｘｇと４℃でさらに２０分間遠心分離した。上清を分取（０．２ｍＬ）し、１．５ｍＬのチューブに入れて、−２０℃で保存した。
【０１４２】
バッチ式クロマトグラフィー操作を用いたヒト血清タンパク質の単離
ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤（１ｍＬ）を、４．０ｃｍ（長さ）ｘ０．８ｃｍ（内径）のカラムなどのＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に充填して、２０ｍＭ  炭酸ナトリウム及び０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ９．５の平衡緩衝液で平衡化させた（表１参照）。平衡緩衝液で５倍に希釈したヒト血清の分取試料（２００μＬ）を平衡化カラムにロードした。ヒト血清サンプルを５分間にわたって載せた後、カラム壁からサンプルをゲル中に洗い流すために平衡緩衝液（３００μＬ）を加えた。さらに５分間おいた後、未結合のタンパク質を溶出させるために平衡緩衝液（５ｍＬ）をカラム・リザーバーに導入した。
【０１４３】
回収した画分（約５．５ｍＬ）を未結合画分と呼んだ。
【０１４４】
結合したヒト血清タンパク質は、表１に示した一連の溶出緩衝液（５ｍＬ）を用いて吸着剤から溶出した。回収した画分を溶出画分と呼んだ。
【０１４５】
未結合画分と溶出画分のタンパク質含量は、Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｄｙｅとビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて分析した（図１）。これらの画分のタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した（図２）。吸着及び脱離操作はすべて室温で行った。
【０１４６】
［実施例８］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
使用した平衡緩衝液が０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０（表２参照）である点と結合ヒト血清タンパク質を表２に示した一連の溶出緩衝液（５ｍＬ）を用いて吸着剤から溶出した点を除き、用いた操作は実施例７と実質的に同様である。結果を図３及び図４に示す。
【０１４７】
［実施例９］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
使用した緩衝液が０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０（表３参照）である点と結合したヒト血清タンパク質を表３に示した一連の溶出緩衝液（５ｍＬ）を用いて吸着剤から溶出した点を除き、用いた操作は実施例７と実質的に同様である。結果を図５及び図２に示す。
【０１４８】
［実施例１０］    ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実施例７と実質的に同様である。結果を図１及び図２に示す。
【０１４９】
［実施例１１］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３及び図４に示す。
【０１５０】
［実施例１２］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５及び図２に示す。
【０１５１】
［実施例１３］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１及び図６に示す。
【０１５２】
［実施例１４］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３及び図４に示す。
【０１５３】
［実施例１５］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５及び図６に示す。
【０１５４】
［実施例１６］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１及び図６に示す。
【０１５５】
［実施例１７］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３及び図４に示す。
【０１５６】
［実施例１８］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５及び図６に示す。
【０１５７】
［実施例１９］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２＋−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１に示す。
【０１５８】
［実施例２０］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２＋−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３に示す。
【０１５９】
［実施例２１］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２＋−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５に示す。
【０１６０】
［実施例２２］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２＋−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２＋−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１に示す。
【０１６１】
［実施例２３］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２+−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２+−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３に示す。
【０１６２】
［実施例２４］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｃｏ２+−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２+−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５に示す。
【０１６３】
［実施例２５］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１及び図７に示す。
【０１６４】
［実施例２６］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３及び図７に示す。
【０１６５】
［実施例２７］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｅ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｅである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５及び図７に示す。
【０１６６】
［実施例２８］  ｐＨ９．５の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例７と同様である。結果を図１及び図７に示す。
【０１６７】
［実施例２９］  ｐＨ７．０の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例８と同様である。結果を図３及び図７に示す。
【０１６８】
［実施例３０］  ｐＨ４．０の結合緩衝液と固定化Ｚｎ２+−ｄｔｎｐ吸着剤を用いたヒト血清タンパク質の分離と精製
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｐである点を除き、用いた操作は実質的に実施例９と同様である。結果を図５及び図７に示す。
【０１６９】
［実施例３１］  固定化Ｃｕ２+−ｄｔｎｅ吸着剤をＦＰＬＣＴＭシステムとともに用いたヒト血清タンパク質の分離
これらの分離操作を通じて、プログラム化されたＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、  Ｕｐｐｓａｌａ、  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｅ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤（１ｍＬ）をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ  ＨＲ５／１０カラム（充填容積 ５ｃｍ×内径０．５ｃｍ）に充填した。クロマトグラフィー操作を通じて、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速を用いた。カラムは平衡緩衝液（下記参照）を用いて平衡化させた。平衡緩衝液で５倍に希釈したヒト血清溶液（２００μＬ）を、前記充填したカラムに２００μＬのインジェクションループを通じてロードした。洗浄及び濃度勾配溶出操作については全て下記に述べる。ヒト血清タンパク質のクロマトグラフィー操作経過をモニターし記録するために、ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ  ＵＶ−１  単一光路モニター（２８０ｎｍ）、ＲＥＣ−４８２  ツーチャンネルレコーダー、及びコンピューター化されたデータ自動記録装置を使用した。全ての画分はＦＲＡＣ−１００  画分コレクターで１ｍＬ画分として採集し、Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｄｙｅとビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて分析した。ピーク画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果を図８及び図９に示す。
【０１７０】
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｅカラムの溶出プロトコル
平衡緩衝液：２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５
洗浄緩衝液：１５ｍＬの平衡緩衝液
溶出操作：１）ｐＨ線形勾配法で１０ｍＬ、２０分間（２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５から２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）
２）塩濃度線形勾配法で１０ｍＬ、２０分間（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０中の０．１Ｍから１．０Ｍ  ＮａＣｌ）
３）イミダゾール濃度線形勾配法で１０ｍＬ、２０分間（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０中の０から２５０ｍＭイミダゾール）
［実施例３２］  固定化Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ吸着剤をＦＰＬＣＴＭシステムとともに用いたヒト血清タンパク質の分離
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用い、以下の溶出プロトコルを使用した点を除き、用いた操作は実質的に実施例３１と同様である。結果を図１０及び図１１に示す。
【０１７１】
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐカラムの溶出プロトコル
平衡緩衝液：２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５
洗浄緩衝液：５ｍＬの平衡緩衝液
溶出操作：１）ｐＨ線形勾配法で５ｍＬ、１０分間（２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５から２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）
２）２ｍＬの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
３）塩濃度線形勾配法で７ｍＬ、１４分間（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０中の０．１Ｍから１．０Ｍ  ＮａＣｌ）
４）１ｍＬの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
５）イミダゾール線形勾配法で５ｍＬ、１０分間（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０中で０から２５０ｍＭ  イミダゾール）
６）１ｍＬの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ及び２５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ４．０
［実施例３３］  固定化Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ吸着剤をＦＰＬＣＴＭシステムとともに用いたヒト血清タンパク質の分離
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として使用し、以下の溶出プロトコルを使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３１と同様である。結果を図１２及び図１３に示す。
【０１７２】
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐカラムの溶出プロトコル
平衡緩衝液：２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５
洗浄緩衝液：１０ｍＬの平衡緩衝液
溶出緩衝液：緩衝液Ａ：２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５；
緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
溶出操作：１）塩濃度線形勾配法で１０ｍＬ、２０分間（２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５中で０．１Ｍから１．０Ｍ  ＮａＣｌ）
２）１ｍＬの緩衝液Ａ
３）直線濃度勾配法で５ｍＬ、１０分間（緩衝液Ａから緩衝液Ｂ；最終緩衝液組成：緩衝液Ａ５０％及び緩衝液Ｂ５０％）
４）緩衝液Ａと緩衝液Ｂの５０：５０（Ｖ／Ｖ）混合物を８ｍＬ
５）直線濃度勾配法で５ｍＬ、１０分間（５０／５０Ｖ／Ｖの緩衝液Ａ＋緩衝液Ｂから緩衝液Ｂ１００％に）
６）１０ｍＬの２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
［実施例３４］  組換えタンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
０．５ｍＬから２０ｍＬまでのｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂゲルを含有するＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ［典型的なカラムサイズは４．０ｃｍ（長さ）×０．８ｃｍ（内径）から１２ｃｍ（長さ）×１．５ｃｍ（内径）］（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、３００ｍＭ  塩化ナトリウム及び１０％グリセロールを含む平衡緩衝液ｐＨ８．０によって平衡化させた。部分的に精製された融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６（Ｅ．Ｃｏｌｉ株Ｋ１２  ＤＨ５ａｌｐｈａＦ’において産生される）の分取。ＤＨ５ａｌｐｈａＦ’株の起源と遺伝子型は次の通りである：Ｆ’、８０ｄｌａｃＺΔＭ１５、ｅｎｄＡ１、ｒｅｃＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−，  ｍｋ＋）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｉＡ１、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、λ−。[http://wheat.dw.usda.gov/qqpaqes/probes/strains.htmlを参照]。細胞発現システムから回収したＥ．Ｃｏｌｉの細胞ペレットを細胞破砕して得た目的の組換えタンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６を含有する粗Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液（４．０ｃｍ×０．８ｃｍのカラムには０．３ｍＬで、これより大きなカラムには比例して容量を増やした）をカラムにロードした。未結合のタンパク質と弱く結合したタンパク質を溶出するためには、平衡緩衝液（４．０ｃｍ×０．８ｃｍのカラムには５ｍＬ、これより大きなカラムには比例して容量を増やした）を使用した。タンパク質がそれ以上溶出されなくなったら、それぞれ、２０ｍＭ  イミダゾール、４０ｍＭ  イミダゾール、２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する大量の平衡緩衝液（４．０ｃｍ×０．８ｃｍのカラムには２ｍＬ；これより大きなカラムには比例して容量を増やした）を順次流して結合したタンパク質を溶出させ、１ｍＬずつ画分を回収した。未結合画分と溶出画分のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｄｙｅ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）法により測定し、酵素活性はＧＳＴ基質１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて測定した。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７３】
［実施例３５］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７４】
［実施例３６］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｚｎ２+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ｔａｃｎである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７５】
［実施例３７］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｏ２+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２+−ｔａｃｎである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７６】
［実施例３８］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｍｎ２+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｍｎ２+−ｔａｃｎである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７７】
［実施例３９］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｒ３+−ｔａｃｎ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｒ３+−ｔａｃｎである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７８】
［実施例４０］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｅ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｕ２+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１７９】
［実施例４１］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｎｉ２+−ＤＴＮＥ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８０】
［実施例４２］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｚｎ２+−ＤＴＮＥ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８１】
［実施例４３］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｏ２+−ＤＴＮＥ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８２】
［実施例４４］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｍｎ２+−ＤＴＮＥ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｍｎ２+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８３】
［実施例４５］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｒ３+−ＤＴＮＥ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｒ３+−ＤＴＮＥである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８４】
［実施例４６］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｕ２+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｕ２+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８５】
［実施例４７］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｎｉ２+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｎｉ２+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８６】
［実施例４８］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｚｎ２+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｚｎ２+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８７】
［実施例４９］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｏ２+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｏ２+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８８】
［実施例５０］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｍｎ２+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｍｎ２+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１８９】
［実施例５１］  組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の結合についてのｉｍ−Ｃｒ３+−ＤＴＮＰ吸着剤のスクリーニング
用いた吸着剤がセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ上のｉｍ−Ｃｒ３+−ＤＴＮＰである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例３４と同様である。吸着剤に結合した融合タンパク質ＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６のパーセンテージを表４に示す。
【０１９０】
［実施例５２］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
実施例３４のように得た粗Ｅ．Ｃｏｌｉ抽出液（３ｍＬ）を、３００ｍＭの塩化ナトリウムと１０％グリセロールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０（平衡緩衝液）の存在下で平衡化させた１ｍＬのｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂゲルと混合した。４℃で３０分間インキュベートした後、４℃で５分間、３，０００×ｇで混合物を遠心分離にかけ、上清を取り除いた。未結合のタンパク質又は弱く結合したタンパク質を除去するため、ゲルのペレットを５ｍＬの平衡緩衝液で２度洗浄した。次いで、洗浄したゲルをＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（１０ｍＬ）（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に充填した。さらに平衡緩衝液（２０ｍＬ）を使用して、未結合のタンパク質又は弱く結合したタンパク質を溶出させた。
【０１９１】
１２５ｍＭのイミダゾールを含有する平衡緩衝液、ｐＨ７．０（溶出緩衝液Ａ）１０ｍＬと、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する平衡緩衝液、ｐＨ７．０（溶出緩衝液Ｂ）５ｍＬを使用することによって、保持されたタンパク質を溶出させることができた。全ての画分（１ｍＬ）を回収してタンパク質含量と酵素活性を分析した。未結合画分と溶出画分のタンパク質濃度はビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）とＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｄｙｅ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）法により測定し、酵素活性はＧＳＴ基質１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて測定した。結果を図１４−１６に示す。
【０１９２】
［実施例５３］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９３】
［実施例５４］  ｉｍ−Ｚｎ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｚｎ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９４】
［実施例５５］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９５】
［実施例５６］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９６】
［実施例５７］  ｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９７】
［実施例５８］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９８】
［実施例５９］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０１９９】
［実施例６０］  ｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｚｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例５２と同様である。結果を図１４−１６に示す。
【０２００】
［実施例６１］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするクロマトグラフィー操作を用いたＥ．Ｃｏｌｉ細胞破砕液からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質の分離
ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ吸着剤（１ｍＬ）を、５ｃｍの高さになるようにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＨＲ５／１０カラム（充填容積  ５ｃｍ×内径０．５ｃｍ）に充填した。クロマトグラフィー操作を通じて、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速を用いた。Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（１０ｍＬ）の中で、平衡緩衝液（３００ｍＭ  塩化ナトリウムと１０％  グリセロールを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）を用いてゲルを平衡化させた後、２ｍＬのインジェクションループを通じて、実施例５２に記載されているように取得した２ｍＬのＥ．Ｃｏｌｉ抽出液を充填したカラムにロードした。次にゲルを１５ｍＬの平衡緩衝液で溶出させた。この溶出操作では、平衡緩衝液（１０ｍＬ）中のイミダゾールを２０分間にわたって０ｍＭから２５０ｍＭまで増加させる線形グラジエントを用いた後、２５０ｍＭイミダゾールを含有する平衡緩衝液５ｍＬで均一濃度溶出を行った。溶出タンパク質のクロマトグラフィー曲線をモニターし記録するために、ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ  ＵＶ−１単一光路モニター（２８０ｎｍ）、ＲＥＣ−４８２  ツーチャンネルレコーダーとコンピューター化した自動記録装置を使用した。全ての画分（１ｍＬ）はＦＲＡＣＴＭ−１００  画分コレクターで回収した。未結合画分と溶出画分のタンパク質濃度はビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｄｙｅ（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）法により測定し、酵素活性はＧＳＴ基質１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いて測定した。ピーク画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより性質決定した。結果を図１７−１８に示す。
【０２０１】
［実施例６２］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いた酵母培養液からのｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５の分離
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤（１ｍＬ）をＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（１０ｍＬ）に充填し、平衡緩衝液（１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）で平衡化させた。特定の組換えＣ末端ヘキサヒスチジンタグ付きＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  カテプシン  Ｌ５（ｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５）発現システムを含有し、培地で成長させた被トランスフェクトＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞から得た粗酵母抽出上清液（３０ｍＬ）をｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭにロードした。ブレークスルー画分（未結合画分）は、後にタンパク質含量と酵素活性を決定するために回収した。次いで、１０ｍＬの平衡緩衝液でカラムを洗浄して、未結合のタンパク質又は弱く結合したタンパク質を取り除いた。次に、タンパク質不純物を溶出させるために、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ６．０を１０ｍＬ使用して洗浄操作を行った。その後、この洗浄緩衝液にさらにそれぞれ１２５ｍＭ  イミダゾール（溶出緩衝液Ａ）、２５０ｍＭ  イミダゾール（溶出緩衝液Ｂ）、及び５００ｍＭ  イミダゾール（溶出緩衝液Ｃ）を含有する３種類の溶液各５ｍＬを用いて結合タンパク質を溶出させた。ブレークスルー、洗浄及び溶出操作における全ての画分を回収して、ＢＣＡ及びＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  ＤｙｅアッセイならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質含量を分析した。酵素活性は、Barrett, A.J.[Biochemical Journal、187(1980) 909-912]ならびにByanastati, A.、Brown, M.A.、Kembhavi, A.A.、Nicklin, M.J.H.、Sayers, C.A.、Sunter, D.C.及びBarrett, A.J.[Biochemical Journal, 211(1983) 129-138]に記載されている蛍光アッセイにより測定した。結果を図１９に示す。
【０２０２】
［実施例６３］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするバッチ吸着操作を用いた酵母培養液からのｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除いて、用いた操作は実質的に実施例６２と同様である。結果を図１９に示す。
【０２０３】
［実施例６４］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤とするクロマトグラフィー操作を用いた酵母培養液からのｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５の分離
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤（０．５ｍＬ）を、２．５ｃｍの高さまでＰｈａｒｍａｃｉａ  ＨＲ５／５カラム（充填容積  ２．５ｃｍ×内径０．５ｃｍ）に充填した。組換えＣ末端ヘキサヒスチジンタグ付きＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  カテプシン  Ｌ５（ｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５）を含む酵母上清（２４６ｍＬ）を、前記充填したカラムに０．２ｍＬ／分の流速でロードした。洗浄操作は、３０ｍＬの平衡緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）及び２１ｍＬの溶出緩衝液Ａ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）を使用して行った。次いで、緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの直線濃度勾配法（１５ｍＬ、３０分）でカラムからの溶出を行った後、５ｍＬの緩衝液Ｂで均一濃度溶出を行った。溶出緩衝液Ｂは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと５００ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０である。全ての画分（１ｍＬ）をＦＲＡＣ−１００  画分コレクターで回収した。タンパク質含量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイにより分析した。酵素活性は実施例６２のような蛍光アッセイで測定した。ピーク画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより性質決定した。結果を図２０及び図２１に示す。
【０２０４】
［実施例６５］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた酵母培養液からのヘキサヒスチジンタグ化組換えマラリア抗原頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−１）の分離
ＡＭＡ−１を含む被トランスフェクトＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母細胞の粗上清を透析緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロールを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を使用し４℃で一晩透析した後、新しい透析緩衝液を使用して4℃で４時間にわたる透析を２度行った。
【０２０５】
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤（１ｍＬ）をＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎ（１０ｍＬ）に充填した。カラムは平衡緩衝液（１５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０）で平衡化させた。透析した酵母上清（４５ｍＬ）を本カラムにロードした。ブレークスルー（未結合）画分はタンパク質アッセイのために回収した。次いで、２５ｍＬの平衡緩衝液でカラムを洗浄し、未結合のタンパク質と弱く結合したタンパク質を取り除いた。次に、タンパク質不純物を溶出させるために計２０ｍＬの洗浄緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０）を２度カラムに通した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１２５ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（溶出緩衝液Ａ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（溶出緩衝液Ｂ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと５００ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０（溶出緩衝液Ｃ）という３つの緩衝液をそれぞれ順次５ｍＬずつ使用して結合タンパク質を溶出させた。ブレークスルー画分ならびに洗浄及び溶出操作から得られた画分をウェスタンブロット分析のために回収した。結果を図２２に示す。
【０２０６】
［実施例６６］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた酵母培養液からのヘキサヒスチジンタグ化組換えマラリア抗原頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−１）の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｃｕ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除き、用いた操作は実質的に実施例６５と同様である。結果を図２２に示す。
【０２０７】
［実施例６７］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた酵母培養液からのヘキサヒスチジンタグ化組換えマラリア抗原頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−１）の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除き、用いた操作は実質的に実施例６５と同様である。結果を図２２に示す。
【０２０８】
［実施例６８］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた酵母培養液からのヘキサヒスチジンタグ化組換えマラリア抗原頂端膜抗原−１（ＡＭＡ−１）の分離
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除き、用いた操作は実質的に実施例６５と同様である。結果を図２２に示す。
【０２０９】
［実施例６９］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株から単離したヘキサヒスチジンタグ化組換えタンパク質グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）の精製
本研究で使用した緩衝液：
平衡緩衝液：３００ｍＭ  塩化カリウム、２０ｍＭ  イミダゾール及び０．１２％  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０
洗浄緩衝液：１Ｍ  塩化カリウム、４０ｍＭ  イミダゾール及び０．１２％  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０
溶出緩衝液：Ａ．５００ｍＭ  塩化カリウム、１２５ｍＭ  イミダゾール及び０．１２％  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、
Ｂ．５００ｍＭ  塩化カリウム、２５０ｍＭ  イミダゾール及び０．１２％  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、
Ｃ．５００ｍＭ  塩化カリウム、５００ｍＭ  イミダゾール及び０．１２％  ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を平衡緩衝液で平衡化させた後、その０．２ｍＬを１．８ｍＬのエッペンドルフ・チューブに分け入れた。ｉｍ−Ｎｉ２+−ＮＴＡカラム(Chelating SepharoseTM Fast Flow、Amersham Pharmacia、Uppsala、Sweden)を用いて予め分離された、部分精製タンパク質溶液（５００μＬ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株で発現させて得られた粗タンパク質混合物をエッペンドルフチューブに加え、４℃で９０分間インキュベートした。混合物を１０００×ｇで1分間遠心分離にかけた後、上清を取り除いた。前記吸着剤を１ｍＬの平衡緩衝液で洗浄した後、続いてタンパク質不純物を取り除くために１ｍＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。それぞれ、０．５ｍＬの溶出緩衝液Ａ、溶出緩衝液Ｂ、溶出緩衝液Ｃを順次４回使用して、結合タンパク質の溶出を行った。未結合画分、洗浄画分及び溶出画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために回収した。結果を図２３に示す。
【０２１０】
［実施例７０］  ｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株から単離したヘキサヒスチジンタグ化組換えタンパク質グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）の精製
用いた吸着剤がｉｍ−Ｎｉ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂである点を除き、用いた操作は実質的に実施例６９と同様である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果を図２３に示す。
【０２１１】
［実施例７１］  ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂを吸着剤として用いた、組換えＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株から単離したヘキサヒスチジンタグ化組換えタンパク質グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）の精製
ｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂゲル（１ｍＬ）をＢｉｏ−ＲａｄＴＭ  Ｅｃｏｎｏ−ｃｏｌｕｍｎに充填し、平衡緩衝液（３００ｍＭ  塩化カリウム、０．１ｍＭ  ２−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド、１ｍＭ  グルタミン、０．２ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、２０μＭ  ピリドキサール-Ｌ-リン酸、及び２ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有する５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、Ｎｉ緩衝液と表記）で平衡化させた。
【０２１２】
Ｃ末端ヘキサヒスチジン「タグ」を含む組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株中で産生するための発現ベクターは、確立した方法[Law, R.H.P.、Rowley, M.J.、MacKay, I.R.及びCorner, B.、Journal of Biotechnology 61(1998) 57-68; Papakonstantinou, T.、Law, R.H.P.、Gardiner, P.、Rowley, M. J.及びMackay, I.、Enzyme and Microbial Technology 26(2000) 645-652]を用いて作成した。
【０２１３】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの細胞破砕液から得た粗融合タンパク質ＧＡＤ６７／６５は、ｉｍ−Ｎｉ２+−ＮＴＡ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて部分精製した。最適化を徹底的に試みたにも関わらず、融合タンパク質ＧＡＤ６７／６５は、ｉｍ−Ｎｉ２+−ＮＴＡ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ吸着剤を用いて、均一な形態で得ることができなかった。ｉｍ−Ｎｉ２+−ＮＴＡカラムを用いた分離操作では、Ｎｉ緩衝液中にさらに２５０ｍＭ  イミダゾールを加えることによって、結合したＧＡＤ６７／６５を溶出することができた。部分精製された融合タンパク質ＧＡＤ６７／６５の溶液中のイミダゾール濃度は、Ｎｉ緩衝液で希釈して２０ｍＭに調整した。次いで、０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で、本溶液をｉｍ−Ｃｕ２+−ｔａｃｎカラムにロードした。ブレークスルー（未結合）画分をタンパク質含量測定のために回収した。未結合の不純タンパク質又は弱く結合した不純タンパク質を取り除くために、２０ｍＬの洗浄緩衝液（４０ｍＭ  イミダゾールを含むＮｉ緩衝液、ｐＨ８．０）でカラムを洗浄した。結合したタンパク質は、Ｎｉ緩衝液、ｐＨ８．０中の２５０ｍＭ  イミダゾールによって溶出し、画分（０．５ｍＬ）を回収した。ブレークスルー画分、洗浄画分、及び溶出画分は、Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いたタンパク質含量の測定のために回収し、酵素活性は、「Papakonstantinou, T.、Law, R.H.P.、Gardiner, P.、Rowley, M.J.及びMackay, I、Enzyme and Microbial Technology 26(2000) 645-652」の方法に従って測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２４に示す。
【０２１４】
［実施例７２］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのミオグロビンの結合
Ｍｅｔｔｌｅ  ＡＥ５０  ５桁天秤上でＨＭＹＯタンパク質を正確に秤量し、以下の平衡緩衝液中に希釈することによって、１．０ｍｇ／ｍＬのウマ骨格筋ミオグロビン（ｈｏｒｓｅ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、ＨＭＹＯ）を含有する試料を調製した：
緩衝液Ａ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ４．０
緩衝液Ｂ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ６．０
緩衝液Ｃ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ７．０
緩衝液Ｄ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
緩衝液Ｅ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ９．５
吸引乾燥したｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂゲル（約０．０５ｇ）（ここで、Ｍ２+はＣｕ２+、Ｎｉ２+、Ｚｎ２+又はＣｏ２+を表す）を０．５ｍＬのタンパク質溶液を含むＤｕｒａｐｏｒｅＴＭメンブレンチューブ（ＵｌｔｒａｆｒｅｅＴＭ−ＣＬ、０．１μｍ、  Ｎｉｈｏｎ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｋｏｇｙｏ  Ｋ．Ｋ、Ｊａｐａｎ）の中で、時計回りのローテーター（ＲＡＴＥＫＴＭ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｔｃｈａｍ、ＶＩＣ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてゆっくり回転させながら、２５℃で９０分間インキュベートした。上清を回収した後、ＳｏｒｖａｌｌＴＭ  ＲＴ６０００冷却遠心分離機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）を用いて３０００×ｇで混合物を遠心分離し、分析用逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ法を用いて、直ちにサンプルの遊離タンパク質濃度を分析した。結果を図２５及び図２６に示す。
【０２１５】
［実施例７３］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ／セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのミオグロビンの結合
ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除き、用いた操作は実質的に実施例７２と同様である。結果を図２５及び図２６に示す。
【０２１６】
［実施例７４］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのリゾチームの結合
タンパク質がニワトリ卵白ゾチーム（ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＨＥＷＬ）である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７２と同様である。結果を図２７及び図２８に示す。
【０２１７】
［実施例７５］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのリゾチームの結合
ｉｍ−Ｍｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７４と同様である。結果を図２７及び図２８に示す。
【０２１８】
［実施例７６］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのチトクロムＣの結合
タンパク質がウマ心臓チトクロムＣ（ｈｏｒｓｅ  ｈｅａｒｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ  、ＨＨＣＣ）である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７２と同様である。結果を図２９及び図３０に示す。
【０２１９】
［実施例７７］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのチトクロムＣの結合
ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７６と同様である。結果を図２９及び図３０に示す。
【０２２０】
［実施例７８］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのα−ラクトアルブミンの結合
タンパク質が牛乳α−ラクトアルブミン（ｃｏｗ  ｍｉｌｋ  α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ、αＬＡＣ）である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７２と同様である。結果を図３１及び図３２に示す。
【０２２１】
［実施例７９］  様々なｐＨ条件下におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのα−ラクトアルブミンの結合
ｉｍ−Ｍｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７８と同様である。結果を図３１及び図３２に示す。
【０２２２】
［実施例８０］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのミオグロビンの結合
以下の平衡緩衝液を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例７２と同様である。
【０２２３】
緩衝液Ｆ：０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
緩衝液Ｇ：０．５Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
緩衝液Ｈ：１．０Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
緩衝液Ｉ：２．０Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
緩衝液Ｊ：３．０Ｍ  塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝
液、ｐＨ８．０
結果を図３３に示す。
【０２２４】
［実施例８１］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのミオグロビンの結合
ｉｍ−Ｍｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８０と同様である。結果を図３３に示す。
【０２２５】
［実施例８２］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのリゾチームの結合
タンパク質がニワトリ卵白ゾチーム（ＨＥＷＬ）である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８０と同様である。結果を図３４に示す。
【０２２６】
［実施例８３］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのリゾチームの結合
ｉｍ−Ｍｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８２と同様である。結果を図３４に示す。
【０２２７】
［実施例８４］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのチトクロムＣの結合
タンパク質がウマ心臓チトクロムＣ（ＨＨＣＣ）である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８０と同様である。結果を図３５に示す。
【０２２８】
［実施例８５］  様々な塩濃度におけるｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤へのチトクロムＣの結合
ｉｍ−Ｍｎ２+−ｄｔｎｐ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着剤を使用した点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８４と同様である。結果を図３５に示す。
【表１】
2005526487.tif 000017
【表２】
2005526487.tif 000018
【表３】
2005526487.tif 000019
【表４】
2005526487.tif 000020
【０２２９】
［実施例８６］  ＮＴ１と称するオリゴペプチド「タグ」がＮ末端に融合されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現させるために使用できる発現プラスミドの構築
ＰＣＲテンプレートの消化：
ＧＳＴのソースはｐＧＥＸ３ＸＧＳＴである。これを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで消化した。条件：約３．４５μｇのプラスミド、２０ユニットのＢａｍＨＩ、２０ユニットのＥｃｏＲＶ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、総容量５０μＬ。この混合物を３７℃で２時間インキュベートした。２つのＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、所望のフラグメントを単離した。
【０２３０】
ＰＣＲ操作：
６０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、６０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌを含む混合物に、ＧＳＴをコードする５０ｎｇと２５ｎｇのＤＮＡフラグメントを加えた。反応混合物の容量は５０μＬである。ＧＳＴ  ｃＤＮＡはＰＣＲによって増幅した。概略を述べると、前記反応混合物をサーモサイクラーに入れ、最初の変性ステップを９５℃で５分間行い、９４℃、５０℃及び７２℃でそれぞれ１、２及び３分間を２サイクル行った後、９４℃、５５℃、７２℃で１、２、及び３分間を４０サイクル、次いで、最後の伸長ステップを７２℃で５分間実施するという条件を使用した。反応混合物を１％アガロースゲルに流し、ＰＣＲ産物を単離した。
【０２３１】
フォワードプライマーの配列：  ５’−ＴＴＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴ−３’
リバースプライマーの配列：  ５’−ＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＧＧ−３’
ＰＣＲ産物末端の修飾：
約３００ｎｇの上記単離されたＰＣＲ産物サンプルを、３ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、１ｍＭ  ｒＡＴＰ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び５μｇのＢＳＡを含有する１００μＬの反応混合物に加えた。反応は３７℃で１時間にわたり行った。次に、０．５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを前記混合物に加え、７５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で冷却した。ＤＮＡはフェノール／クロロフォルム抽出を行った後、エタノール沈殿により回収した。
【０２３２】
シャトルベクターへのライゲーション：
様々な量の修飾ＰＣＲ産物（約３６ｎｇ、１２ｎｇ及び４ｎｇ）を含む１０μＬの反応溶液を、５０ｎｇのシャトルベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳｍａＩで切断、脱リン酸化）、２．５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び０．５ｍＭ  ＡＴＰと混合した。ライゲーション反応溶液は室温で一晩インキュベートした。
【０２３３】
ＤＨ５αの形質転換：
標準的な技法を用いて、塩化ルビジウムで処理したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を５μＬの上記ライゲーション反応混合溶液で形質転換した。８００μｇのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）とＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を塗布したＬＢ  Ａｍｐプレート（トリプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、寒天  １５ｇ／Ｌを添加しオートクレーブした後、アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌを追加）上に、様々に希釈した形質転換混合物を播種した。プレートは３７℃で一晩インキュベートした。
【０２３４】
陽性クローンの同定：
修飾されたプラスミドＤＮＡは、標準的な技術を用いて、上記のＤＨ５α形質転換体から単離した。所望の挿入物を有するプラスミドを含むと考えられるクローンを同定するために、異なるクローンから得たプラスミドＤＮＡを様々な制限エンドヌクレアーゼで消化した。多くのクローンから得たプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化した。条件は、約３００μｇのＤＮＡ、１０ユニットのＰｖｕＩＩ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＥ、容量２０μＬ。温度は３７℃で、反応時間は３時間であった。１％アガロースゲル上でＤＮＡフラグメントを分離することにより、正しいサイズのフラグメントを含むプラスミドの同定が可能となった。ＰｖｕＩＩ酵素によるスクリーニングで選択したプラスミドに対して、制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩを用いた２回目のスクリーニングを行った。条件は、約３００μｇのＤＮＡ、１０ユニットのＢｓｐＨＩ、５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．９、容量２０μＬ。温度は３７℃で、反応時間は２時間であった。消化されたＤＮＡを１％アガロースゲル上に流し、正しいサイズのフラグメントを含むプラスミドを同定した。
【０２３５】
両酵素によるスクリーニングで選択したクローンのプラスミド挿入物のＤＮＡ配列は、以下のように決定した。選択したクローンのＰｖｕＩＩ消化物から単離された所望のプラスミドフラグメント約１００ｎｇを、ＤＮＡ配列決定反応のテンプレートとして使用した。配列決定反応溶液は、１００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、５ｐｍｏｌのプライマー、８μＬのターミネーター前混合液、容量２０μＬであった。
【０２３６】
上記反応混合溶液を２つ調製し、一方を配列５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｔ３プライマー、他方を配列３’−ＣＧＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＴＡＡＴＧ−５’を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７プライマーとした。以下の条件に従って、反応混合液をサーモサイクラーに加えた。最初の変性ステップを９６℃で１分間、次に９６℃、５０℃及び６０℃でそれぞれ３０秒、１５秒及び４分間を２５サイクル。伸長産物は、標準技術を用いてエタノール／酢酸ナトリウム沈殿を実施することによって回収し、ペレットを乾燥し、ＤＮＡ配列決定に供した。
【０２３７】
ＧＳＴ−ＮＴ１をコードする所望のプラスミド挿入物を含むクローンを同定した。ＤＮＡ配列決定により、その配列が正しいことが証明された。
【０２３８】
挿入物の調製：
陽性クローン（所望の挿入物を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）から得たプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩとともにインキュベートした。条件は、約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、２０ユニットのＢｓｐＨＩ、４０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．９、容量７０μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は２．５時間であった。ＤＮＡフラグメントを２％アガロースゲル上で分離し、所望のフラグメントを単離した。
【０２３９】
発現ベクターの調製：
発現プラスミドｐＴｒｃ  ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩとともにインキュベートした。条件は、約４．２５μｇのプラスミド、２０ユニットのＮｃｏＩ、２０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、容量２００μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は２時間であった。２つのＤＮＡフラグメントを１％アガロースゲル上で分離し、所望のフラグメントを単離した。
【０２４０】
プラスミドが両酵素によって完全に消化されたことを確認するために、単離したフラグメントをライゲートし、次にＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換させるために使用した。概略に述べると、これは以下のように行った。約５０ｎｇの単離されたフラグメント、２．５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰを含む１０μＬの反応溶液を調製した。ライゲーション反応溶液を１６℃で一晩インキュベートした。標準的な技法を用いて、塩化ルビジウム処理したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を５μＬのライゲーション反応液で形質転換させた。異なる希釈度の形質転換物をＬＢ  Ａｍｐプレート上に播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。形質転換コロニーが存在しないことによって、発現プラスミドが両酵素によって完全に消化されたことが確認された。
【０２４１】
ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたベクターｐＴｒｃ ９９Ａへのライゲーション：
様々な量の挿入プレップＤＮＡ（約２５ｎｇ、８．３ｎｇ及び２．７５ｎｇ）を含有し、約５０ｎｇの発現プラスミドｐＴｒｃ  ９９Ａ（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断）、２．５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び０．５ｍＭ  ＡＴＰと混合した１０μＬの反応液を調製した。温度は１６℃であり、反応時間は少なくとも１日であった。５μＬの該反応混合溶液をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換するために使用した。修飾された発現プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用した酵素スクリーニングを行うことよって、単離し同定した。
【０２４２】
発現細胞の形質転換：
標準的な技術を用いて、塩化ルビジウム処理したＥ．ｃｏｌｉ細胞株ＪＭ１０５を約１００ｎｇの修飾された発現プラスミドで形質転換した。プラスミド含有細胞を選択するために、異なる希釈度の形質転換細胞をＬＢ  Ａｍｐプレート上に播種した。
【０２４３】
［実施例８７］  ＣＴ１と称するコントロールオリゴペプチド「タグ」（アミノ酸配列：ＭＫＨＨＨＨＨＨ）にＮ末端を融合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現させるために使用できる発現プラスミドの構築
フォワードプライマーの配列が５’−ＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴ−３’である点を除いて、操作は実質的に実施例８６と同様である。
【０２４４】
陽性クローンの同定：
多くのクローンから得たプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩとともにインキュベートした。条件は、約１５０μｇのプラスミド、１０ユニットのＰｖｕＩＩ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＥ、容量２０μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は１時間であった。１％アガロースゲル上で２つのＤＮＡフラグメントを分離して、正しいサイズのフラグメントを含むプラスミドの同定を可能とした。これらの選択したプラスミドに対して、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩを用いた２回目の酵素スクリーニングを行った。二重消化の条件は、約１５０μｇのプラスミド、２０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、２０ユニットのＳａｌＩ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＥ、容量４０μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は４時間であった。消化されたＤＮＡを１％アガロースゲル上に流し、正しいサイズのフラグメントを含むプラスミドを同定した。選択したプラスミドから得た約３００ｎｇの未切断ＤＮＡを、ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートとして使用した。他の配列決定条件は実施例８６と同様である。
【０２４５】
ＧＳＴ−ＣＴ１をコードする所望のプラスミド挿入物を含むクローンを同定した。配列は、ＧＳＴの２８番塩基がＡからＧに点突然変異されて、ＧＳＴの１０番アミノ酸のイソロイシンがバリンに保存的に置換されている（ＡＡＴからＧＴＴ）点を除き、正しいことが証明された。ＧＳＴの３４２番塩基がＣからＴに点突然変異されて、アスパラギン酸のサイレント突然変異が生じた（ＧＡＣからＧＡＵ）。ＧＳＴの６４５番塩基がＴからＣに点突然変異されて、ヒスチジンのサイレント突然変異が生じた可能性がある（ＣＡＴからＣＡＣ）。
【０２４６】
挿入物の調製：
陽性クローンから得たプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩとともにインキュベートした。条件は、約１５０ｎｇのプラスミド、３０ユニットのＢｓｐＨＩ、６０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸  ｐＨ７．９、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、容量１００μＬ。温度は３７℃であり、反応時間は２２時間であった。
【０２４７】
［実施例８８］  ＣＴ２と称するコントロールオリゴペプチド「タグ」（アミノ酸配列：ＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱを有する）にＮ末端が融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現させるために使用できる発現プラスミドの構築
ＣＴ２をコードするフォワードプライマーの配列が５’−ＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴ−３’である点を除いて、操作は実質的に実施例８６と同様である。
【０２４８】
陽性クローンの同定：
異なるクローンから得た被修飾プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩのみで消化した。
【０２４９】
条件は、約３００μｇのプラスミド、２０ユニットのＰｖｕＩＩ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＥ、容量３０μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は３時間であった。１％アガロースゲルで２つのＤＮＡフラグメントを分離して、正しいサイズのフラグメントを含むプラスミドを同定可能とした。所望のフラグメントを単離し、約１００ｎｇをＤＮＡ配列決定のためのテンプレートとして使用した。
【０２５０】
ＧＳＴ−ＣＴ２をコードする所望のプラスミド挿入物を含むクローンを同定した。ＤＮＡ配列決定によって、その配列が正しいことが証明された。
【０２５１】
挿入物の調製：
陽性クローンから得たプラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩとともにインキュベートした。条件は、約１５０ｎｇのプラスミド、３０ユニットのＢｓｐＨＩ、６０ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ、５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸  ｐＨ７．９、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、容量１００μＬであった。温度は３７℃であり、反応時間は約２２時間であった。
【０２５２】
［実施例８９］  ＮＴ２と称するオリゴペプチド「タグ」がＮ末端に融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を発現させるために使用できる発現プラスミドの構築
ＮＴ２をコードするフォワードプライマーの配列が５’−ＴＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴ−３’である点を除いて、用いた操作は実質的に実施例８６と同様である。
【０２５３】
陽性クローンの同定：
ＧＳＴ−ＮＴ２をコードする所望のプラスミド挿入物を含むクローンを同定した。ＤＮＡ配列決定によりその配列が正しいことが証明された。
【０２５４】
［実施例９０］  Ｎ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の小規模発現
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株ＪＭ１０５を実施例８６−８９に記載されているように形質転換するとともに、未修飾発現ベクターｐＴｒｃ  ９９Ａ及びＧＳＴの親ベクターｐＧＥＸ３ＸＧＳＴにより形質転換した。ＬＢ  Ａｍｐ培地を含むペトリ皿上で、形質転換細胞を３７℃で一晩増殖させた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充したＬＢ培地（トリプトン  １０ｇ／Ｌ、酵母抽出物  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、オートクレーブ処理した）に前記ペトリ皿から得たシングルコロニーを接種し、３７℃で振蘯しながら一晩インキュベートした。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した５ｍＬの２×ＹＴ培地（トリプトン  １６ｇ／Ｌ、酵母抽出物  １０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、オートクレーブ処理）（２×ＹＴＡ）に、一晩培養した培養物の１／１０希釈物を接種し、６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００）がｐＴｒｃ形質転換体の場合には０．６−１．０、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体の場合には０．６−０．８になるまで、３７℃で振蘯しながらインキュベートした。最終濃度が１ｍＭ（ｐＴｒｃ形質転換体）又は０．１ｍ（ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体）になるようにＩＰＴＧを加えることによって、遺伝子発現を誘導した。誘導から５時間後（ｐＴｒｃ形質転換体）又は１時間後（ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体）に、１．５ｍＬの培養液から細胞を採取した。３００μＬの氷冷した１×ＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ７．３）に細胞を再懸濁し、超音波で破砕した。ペレット化した後、細胞破砕液を回収し冷凍した。
【０２５５】
［実施例９１］  Ｎ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の大規模発現
大規模タンパク質発現に用いるために、各タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の各クローンを選択した。１００ｍＬの培地（２×ＹＴＡ）に一晩培養した培養物の１／１００希釈物を接種した点を除き、実質的に実施例９０に記載されているようにこれを行った。誘導後、細胞を採取するまでに、培養物をさらに６時間インキュベートした。次に、５ｍＬの１×ＰＢＳ中に細胞を再懸濁（ＧＳＴ−ＣＴ２を含む細胞の場合に限り、１０ｍＬ中に再懸濁）し、超音波で破砕した。最終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加した後、融合タンパク質を可溶化しやすくするために３０分間インキュベートした。ペレット化して後、細胞破砕液を回収し、冷凍した。
【０２５６】
［実施例９２］  活性の測定
信頼性の高い機能的ＧＳＴ活性のアッセイは、ＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）アッセイであり、該アッセイでは、ＧＳＴはグルタチオンによるＣＤＮＢの誘導化を触媒する。この複合体は波長３４０ｎｍの光学密度を測定することによりモニターできる。本アッセイは、情報冊子（ＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、３ｒｄｅｄｎ．、Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  １、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に概説されているとおりに行った。簡潔に述べると、各組換えＧＳＴ融合タンパク質から得た１０μＬの細胞破砕液のサンプルを、実施例９０及び９１に記載されているように、９６−ウェルのプレート中で、ｐＨ６．５の１００ｍＭ  ＫＨ２Ｐ０４、１ｍＭ  １−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）及び１ｍＭ  還元グルタチオンを含有する１９０μＬの反応混合溶液に添加し、５分間にわたって、１分置きにプレートリーダー中で３４０ｎｍの吸光度を測定した。本アッセイで測定したところによれば、４つの組換え融合タンパク質は何れも機能的なＧＳＴ活性を示した。
【０２５７】
［実施例９３］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１のバッチ方式による精製
Ｎｉ２＋−ｔａｃｎ及びＮｉ２＋−ＮＴＡカラムを用いて、粗細胞破砕液（実施例９１参照）を精製した。各カラムは充填容量が０．５ｍＬで、緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ＝１０ｍＭイミダゾールを追加した緩衝液Ａ、ｐＨ８．４；緩衝液Ａ＝４４５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４及び２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０、ｐＨ７．２）で平衡化させた。カラムに１２５μＬの粗細胞破砕液（総容量０．５ｍＬとなるように緩衝液Ｂで１／４に希釈）をロードした。次いで、溶出前に緩衝液Ｂでカラムを２度洗浄した。緩衝液１による溶出（緩衝液１＝５００ｍＭ  イミダゾールを追加した緩衝液Ａ、ｐＨ９．７１）（１ｍＬ）に続いて、１０Ｍ  水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整された２００ｍＭのマロン酸ナトリウム溶液（１ｍＬ）による２度目の溶出を行う、２つの溶出操作を用いた。
【０２５８】
［実施例９４］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２のバッチ方式による精製
操作は実施例９３に記載のものと同じである。
【０２５９】
［実施例９５］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１のバッチ方式による精製
操作は実施例９３に記載のものと同じである。
【０２６０】
［実施例９６］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＴ２）のバッチ方式による精製
操作は実施例９３に記載のものと同じである。
【０２６１】
［実施例９７］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１の段階的（均一濃度）溶出
粗細胞破砕液（実施例９１参照）をＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムにロードした。カラムは充填容量が０．５ｍＬで、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃ＝緩衝液Ｂ＋５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ９．０）で平衡化させた。緩衝液Ｃで１／４に希釈した１２５μＬの粗細胞破砕液を含む０．５ｍＬのサンプルをカラムにロードした。サンプルをカラムに通した後、カラムを緩衝液Ｃ（５ｍＬ）で洗浄した。一連の段階的（均一濃度）溶出を行った。各溶出では、様々な濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを１ｍＬずつ３回使用した。最初の溶出は、１００ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ９．３を追加した緩衝液Ａを用いて行った。イミダゾールの濃度は、次の溶出に進むごとに５０ｍＭずつ増加させた。初回の様々な溶出条件から得られたサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにかけた。
【０２６２】
［実施例９８］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２の段階的（均一濃度）溶出
操作は実施例９７に記載のものと同じである。
【０２６３】
［実施例９９］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１の段階的（均一濃度）溶出
操作は実施例９７に記載のものと同じである。
【０２６４】
［実施例１００］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の段階的（均一濃度）溶出
操作は実施例９７に記載のものと同じである。
【０２６５】
［実施例１０１］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１の２度目の段階的（均一濃度）溶出
２度目の段階的（均一濃度）溶出を行った。充填容量が０．５ｍＬのＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムを緩衝液Ｂで平衡化させた。実施例９０及び９１に記載されているように、緩衝液Ｄ（緩衝液Ｄ＝緩衝液Ａ+１２．５ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．５）で１／５に希釈した５００μＬの粗細胞破砕液を含む２．５ｍＬのサンプルをカラムにロードした。フロースルー画分を２度カラムに再度ロードした。次いで、緩衝液Ｂ（５ｍＬ）をカラムに流した。一連の段階的（均一濃度）溶出を次に行った。各溶出では、様々な濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを１ｍＬずつ３回使用した。最初の溶出は、緩衝液Ａ＋２５ｍＭ  イミダゾールを用いて行った。１００ｍＭの濃度になるまで、次の溶出に進むごとに２５ｍＭずつイミダゾール濃度を増加させ、その後は５０ｍＭずつ増加させた。初回の様々な溶出条件から得られたサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析にかけた。
【０２６６】
［実施例１０２］  Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２の２度目の段階的（均一濃度）溶出
緩衝液Ｄで１／５に希釈した１ｍＬの粗細胞破砕液を含む５ｍＬのサンプルをカラムにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１０１に記載のものと同様である。
【０２６７】
［実施例１０３］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１の２度目の段階的（均一濃度）溶出
緩衝液Ｄで１／５に希釈した３００μＬの粗細胞破砕液を含む１．５ｍＬのサンプルをカラムにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１０１に記載のものと同様である。
【０２６８】
［実施例１０４］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の２度目の段階的（均一濃度）溶出
緩衝液Ｄで１／５に希釈した１００μＬの粗細胞破砕液を含む０．５ｍＬのサンプルをカラムにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１０１に記載のものと同様である。
【０２６９】
［実施例１０５］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１の小規模発現後に得られた様々なクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
細胞破砕液（実施例９０参照）を分取して、ＳＤＳ  ローディング緩衝液（還元状態）と混合し、１００℃で１分間加熱した。次に、サンプルを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、適切な時間にわたって泳動させた。６０μＬの細胞破砕液と３０μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）及び１０ＫＤａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］をゲルにロードした。ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体を陽性対照として用いた。Ｎ末端タグ化組換えＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴ成分は、Ｃ末端のアミノ酸が１つ切断されている。親ＧＳＴはＣ末端にアミノ酸が１４個追加された完全長タンパク質として発現される。したがって、親ＧＳＴのＣ末端にはアミノ酸が１５個追加されており、Ｎ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴ成分より約１．６５ＫＤａ大きい泳動を示す。ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５を陰性対照として用いた。バンドを可視化するため、ゲルはクーマシーブルーで染色した。
【０２７０】
図３６に示されたゲル１のポイント：
レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．１；レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ２；レーン５、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．３；レーン６、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．４；レーン７、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．５；レーン１１、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．６；レーン１２、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．７；レーン１３、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．８；  レーン１４、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ９；レーン１５、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．１０；レーン８、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーがレーン３、４及び１０に示されている。
【０２７１】
［実施例１０６］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２を小規模発現した後に得られた様々なクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
用いた操作は実質的に実施例１０５に記載のものと同様である。
【０２７２】
図３７に示されたゲル２のポイント：
レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．１；  レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．２；レーン３、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．３；レーン６、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．４；レーン７、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．５；レーン１１、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．６；レーン  １２、ＧＳＴ−  ＣＴ２  クローンＮｏ．７；レーン１３、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．８；レーン１４、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．９；レーン１５、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．１０；レーン８、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーが、レーン４、５及び１０に示されている。
【０２７３】
［実施例１０７］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１を小規模発現した後に得られた様々なクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
用いた操作は実質的に実施例１０５に記載のものと同様である。
【０２７４】
図３８に示されたゲル３のポイント：
レーン１、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．１；  レーン２、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．２；レーン３、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．３；レーン４、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．４；レーン７、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．５；レーン１１、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．６；レーン  １２、ＧＳＴ−  Ｔ１  クローンＮｏ．７；レーン１３、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．８；レーン１４、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．９；レーン１５、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．１０；レーン８、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーが、レーン５、６及び１０に示されている
［実施例１０８］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２を小規模発現した後に得られた様々なクローンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
用いた操作は実質的に実施例１０５に記載のものと同様である。
【０２７５】
図３９に示されたゲル４のポイント：
レーン１、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．１；レーン２、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．２；レーン３、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．３；レーン４、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．４；レーン５、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．５；レーン１１、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．６；レーン１２、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．７；レーン１３、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．８；レーン１４、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．９；レーン８、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーが、レーン６、７及び１０に示されている。
【０２７６】
［実施例１０９］  高発現レベルを基準に選択したＧＳＴ融合タンパク質クローンの小規模タンパク質発現を行った後に得られた粗細胞破砕液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
５μＬの細胞破砕液と１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１０５に記載のものと同様である。バンドを可視化するためにゲルは銀染色を行った。
【０２７７】
図４０に示されたゲル５のポイント：
レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ１  クローンＮｏ．７；  レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ２  クローンＮｏ．６；レーン６、ＧＳＴ−ＮＴ１  クローンＮｏ．１；レーン７、ＧＳＴ−ＮＴ２  クローンＮｏ．７；レーン４、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン５、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーがレーン３に示されている
［実施例１１０］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１のバッチ方式精製から回収された様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
バッチ方式の精製（実施例９３参照）から回収した細胞破砕液及び画分をＳＤＳ  ローディング緩衝液（還元状態）と混合し、１００℃で９０秒加熱した。１０μＬの精製画分サンプル、５μＬの陽性及び陰性対照細胞破砕液、組換え融合タンパク質を含む１．２５μＬの細胞破砕液及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、適切な時間にわたり泳動させた。バンドを可視化するために、ゲルに銀染色を行った。
【０２７８】
図４１に示されたゲル６のポイント：
レーン３−５はＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムから回収したサンプルを含み、レーン６−８はＮｉ２＋−ＮＴＡカラムから回収したサンプルを含む；レーン３及び６、洗浄２；レーン４及び７、溶出１；レーン５及び８、溶出２；レーン１、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン２、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照；レーン１０、粗細胞破砕液。分子量マーカーがレーン９に示されている。
【０２７９】
［実施例１１１］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２のバッチ方式精製から回収された様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９４で述べたようなバッチ精製から回収した細胞破砕液と画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１０に記載のものと同様である。
【０２８０】
図４２に示されたゲル７のポイント：
レーン３−５はＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムから回収したサンプルを含み、レーン６−８はＮｉ２＋−ＮＴＡカラムから回収したサンプルを含む。レーン３及び６、洗浄２；レーン４及び７、溶出１；レーン５及び８、溶出２；レーン１、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン２、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照；レーン９、粗細胞破砕液。分子量マーカーがレーン１０に示されている。
【０２８１】
［実施例１１２］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１のバッチ方式精製から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９５で述べたようなバッチ精製から回収した細胞破砕液と画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１０に記載した操作と同様である。
【０２８２】
図４３に示されたゲル８のポイント：
レーン５−７はＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムから回収したサンプルを含み、レーン８−１０はＮｉ２＋−ＮＴＡカラムから回収したサンプルを含む；レーン５及び８、洗浄２；レーン６及び９、溶出１；レーン７及び１０、溶出２。レーン１、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン２、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照；レーン３、粗細胞破砕液。分子量マーカーがレーン４に示されている
［実施例１１３］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２のバッチ方式精製から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９６で述べたようなバッチ精製から回収した細胞破砕液と画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１０に記載のものと同様である。
【０２８３】
図４４に示されたゲル９のポイント：
レーン５−７はＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムから回収したサンプルを含み、レーン８−１０はＮｉ２＋−ＮＴＡカラムから回収したサンプルを含む。レーン５及び８、洗浄２；レーン６及び９、溶出１；レーン７及び１０、溶出２；レーン１、ｐＴｒｃで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン２、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照；レーン４、粗細胞破砕液。分子量マーカーがレーン３に示されている。
【０２８４】
［実施例１１４］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９７で述べたように、ＧＳＴ−ＣＴ１を含む細胞破砕液を段階的に均一濃度で溶出した初回のサンプルを、ＳＤＳ  ローディング緩衝液（非還元状態）と混合し、１００℃で９０秒加熱した。溶出画分の最初の１ｍＬから得た１０μＬの分取試料と２．５μＬの細胞破砕液を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲルは適切な時間にわたり泳動させ、バンドを可視化するために銀染色を行った。
【０２８５】
図４５に示されたゲル１０のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａにより溶出を行った：レーン１、１００  ｍＭ；レーン３、１５０  ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ；レーン１０、５００ｍＭ。細胞破砕液がレーン２に示されている。
【０２８６】
［実施例１１５］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９８で述べたように、段階的（均一濃度）溶出から回収した細胞破砕液の分取試料と画分をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１４に記載のものと同様である。
【０２８７】
図４６に示されたゲル１１のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａにより溶出を行った：レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン３、２００ｍＭ；レーン４、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；  レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ；レーン１０、５００ｍＭ。細胞破砕液がレーン５に示されている。
【０２８８】
［実施例１１６］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例９９で述べたように、段階的（均一濃度）溶出から回収した細胞破砕液と画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１４に記載のものと同様である。
【０２８９】
図４７に示されたゲル１２のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａにより溶出を行った：レーン２、１００ｍＭ；レーン３、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；  レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ；レーン１０、５００ｍＭ；細胞破砕液がレーン１に示されている。
【０２９０】
［実施例１１７］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１００で述べたように、段階的（均一濃度）溶出から回収した細胞破砕液と画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１４に記載のものと同様である。
【０２９１】
図４８に示されたゲル１３のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａにより溶出を行った：レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；  レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ；レーン１０、５００  ｍＭ。細胞破砕液がレーン３に示されている。
【０２９２】
［実施例１１８］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１を２度目の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１０１で述べたように、ＧＳＴ−ＣＴ１を含む細胞破砕液の２度目の段階的均一濃度溶出によって得られたサンプルを、ＳＤＳ  ローディング緩衝液（非還元状態）と混合し、１００℃で９０秒加熱した。溶出画分の最初の１ｍＬから得た１６μＬの分取試料と０．５μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした。ゲルは適切な時間にわたり泳動させ、バンドを可視化するために銀染色を行った。
【０２９３】
図４９に示されたゲル１４のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを用いて溶出を行った：レーン２、２５ｍＭ；レーン３、５０ｍＭ；レーン４、７５ｍＭ；レーン５、１００ｍＭ；レーン６、１５０ｍＭ；レーン７、２００ｍＭ；レーン８、２５０ｍＭ；レーン９、３００ｍＭ；レーン１０、３５０  ｍＭ。分子量マーカーがレーン１に示されている。
【０２９４】
［実施例１１９］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２の２度目の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１０２で述べたように、段階的（均一濃度）精製から回収した画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１８に記載のものと同様である。
【０２９５】
図５０に示されたゲル１５のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを用いて溶出を行った：レーン１、２５ｍＭ；レーン３、５０ｍＭ；レーン４、７５ｍＭ；  レーン５、１００ｍＭ；レーン６、１５０ｍＭ；レーン７、２００ｍＭ；レーン  ８、２５０ｍＭ；レーン９、３００ｍＭ；レーン１０、３５０  ｍＭ。分子量マーカーがレーン２に示されている。
【０２９６】
［実施例１２０］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１の２度目の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１０３で述べたように、段階的（均一濃度）精製から回収した画分の分取試料をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１８に記載したものと同様である。
【０２９７】
図５１に示されたゲル１６のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを用いて溶出を行った：レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ、レーン１０、５００ｍＭ。分子量マーカーがレーン３に示されている。
【０２９８】
［実施例１２１］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の段階的（均一濃度）溶出から回収した様々な画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１０４で述べたように、段階的（均一濃度）精製から回収した画分をゲルにロードした点を除き、用いた操作は実質的に実施例１１８に記載のものと同様である。
【０２９９】
図５２に示されたゲル１７のポイント：
以下の濃度のイミダゾールを追加した緩衝液Ａを用いて溶出を行った。レーン１、５０ｍＭ；レーン２、７５ｍＭ；レーン３、１００ｍＭ；レーン５、１５０ｍＭ；レーン６、２００ｍＭ；レーン７、２５０ｍＭ；レーン８、３００ｍＭ；レーン９、３５０ｍＭ；レーン１０、４００ｍＭ。分子量マーカーがレーン４に示されている。
【０３００】
［実施例１２２］  セファロースＴＭＣＬ−４Ｂへのビス（１，４，７−トリアザシクロノナン）リガンドの固定化
本実施例では、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂの表面上に事前に作製したリガンドを固定化する方法を示す。固定化した各種ビス（ｔａｃｎ）リガンド（Ｌｅｔｈ、Ｌｐｒｏｐ、Ｌｂｕｔ、ＬＯＸ、Ｌｍｘ及びＬｐｘと表記）とともに、前記リガンドｔａｃｎ（＝１，４，７−トリアザシクロノナン）を下記のスキーム７に示す。これらの大環状高分子（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ）およびビス（大環状高分子）のセファロースＴＭＣＬ−４Ｂへの結合（共有結合）には、多糖類基材等のヒドロキシポリマー基材（ここでは、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂを例示した）の表面に１以上のアミノ基を含む分子を結合させるのに一般的な応用性がある技術を採用した。当該プロセスの第１段階では、エポキシ活性化ポリマー基材（本件の場合、エポキシ活性化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル）を作製するために、塩基性条件下でエピクロロヒドリンによる前記基材（本件の場合、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル）の処理を行う。次いで、前記リガンドの共有結合は、求電子性のエポキシド表面基を有するその構造中に存在する求核性第二級アミン基の反応を介して達成することができる。スキーム８（下記）には、当該ポリマー基材（例えば、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ）の表面の模式図が示されており、リガンドは各ケースで単一のスペーサー基を介して付着している。前記リガンド内に２個以上の第二級アミン基が存在していると仮定すると、複数の固定化結合がある程度生じることがある。すなわち、少量のリガンドが、２個以上のエポキシド基と反応することによって、前記ポリマー基材表面に結合することがある。
【化２０】
2005526487.tif 000021
【０３０１】
スキーム７  セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ上に固定化したリガンド
【化２１】
2005526487.tif 000022
【０３０２】
スキーム８  単一のスペーサー基を介したリガンドの共有結合
前記リガンドは吸着剤の唯一の窒素含有成分であるので、窒素分析によってリガンドの固定化の程度を測定することができた（表５、下記）。ビス（ｔａｃｎ）リガンドと比較した場合、固定化ｔａｃｎ吸着剤に高い表面吸着率（リガンド表面密度）が観察された。ビス（ｔａｃｎ）リガンド内の第二級アミン基はより多く用いることができるため、求電子性の表面のエポキシド基と統計的に反応し易いと予想されるにもかかわらず、このようなことが生じる。ビス（ｔａｃｎ）リガンドの方が表面吸着率が低かったのは、ビス（ｔａｃｎ）リガンドの方がスパンが大きいために、複数のエポキシド基と反応するリガンド数を増加させ、ゲル構造内の架橋レベルを高めたためであるかもしれない。さらに、ビス（ｔａｃｎ）リガンドのかさが大きいために、立体的に緻密度が高いｔａｃｎリガンドと同数のエポキシド基にはアクセスできないという可能性もある。
【表５】
2005526487.tif 000023
【０３０３】
［実施例１２３］  セファロースＴＭＣＬ−４Ｂの表面上へのビス（ｔａｃｎ）リガンドの構築
本実施例では、ビス（ｔａｃｎ）リガンドを多糖類基材（本実施例では、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ）等のヒドロキシポリマー基材の表面上に構築するための（幅広い一般性があると考えられている）方法を示す。ポリマー支持体の表面上の適切なポリ（求電子体）に結合することにより、ビス（ｔａｃｎ）、トリス（ｔａｃｎ）、テトラキス（ｔａｃｎ）．．．等のその他の誘導体やこれらの構造的類縁体を構築することができるため、前記方法は幅広い一般性を有していると考えられる。ビス（ｔａｃｎ）リガンドの場合、前記合成方法では、トリス（求電子体）の求電子基のうち１つを用いてアミノ化したポリマー基材表面を処理し、次に、残り２個の求電子基をｔａｃｎマクロサイクルと反応させる（スキーム９参照、下記）。前述のように、当該ポリマー基材（本件ではセファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル）をまずエポキシ活性化させ（例えば、実施例１２２を参照、上記）、表面をアミノ化するために過剰のメチルアミンと反応させる。次に、該分子の求電子基のうちの１つとアミノ化したゲル表面との間に反応を生じさせる目的で、大過剰（ＸＳと省略）の１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンで前記活性化したポリマー基材を処理して、２個の求電子基を続くｔａｃｎとの反応に利用できる状態にし、固定化したビス（ｔａｃｎ）リガンドを構築する。反応性の高いベンジル誘導体の結合は、塩基を添加せずに行ってもよい（これは、ブロモメチル基と固定化した第二級アミン基との縮合時に遊離されるプロトンが、生成された第三級アミンにプロトンを付加し、さらなる反応からある程度の保護を与えて、第四級窒素中心を生じるという予測と一致している）。
【０３０４】
このように、まずアミノ化してから完全に官能化したセファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル上で行った窒素分析により、前記ゲル表面へのｔａｃｎの連結が成功したことが明らかになり、本材料の窒素含有量が３倍増加したことからも確認される（表６）。
【化２２】
2005526487.tif 000024
【０３０５】
スキーム９  Ｃ結合型Ｌｍｘ官能化ヒドロキシルポリマー基材の合成（例えば、セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル）
【表６】
2005526487.tif 000025
【０３０６】
スキーム９（上記を参照）に記載した固定化のスキームによると、最終ゲルの窒素含量は、単にアミノ化したゲルの約７倍の量となることが予想される。窒素含量が低かったことに関して考えられる説明は２つある。第一に、メチルアミンによるゲル表面のアミノ化に続いて、２つの合成段階のうち一方又は両方で不完全な反応が生じた可能性がある。結果として、最終ゲルの表面上には、未反応のメチルアミン及び／又はブロモメチル基が数多く存在している可能性がある。第二に、スキーム９に示した３つの合成段階のうち何れか１つで、架橋が生じて、下記スキーム１０に示されているような架橋分子種が発生した可能性がある。興味深いことに、固定化したリガンドの表面密度は、予め構築したビス（ｔａｃｎ）リガンドから調製した全てのゲルについて測定した表面密度とよく一致していた。
【化２３】
2005526487.tif 000026
【０３０７】
スキーム１０  Ｃ結合型ＬｍｘセファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲルの合成中に形成される可能性がある架橋された２つの分子種の例
［実施例１２４］  金属イオン結合に関する考証
本実施例では、新しい官能化ゲル上へのＣｕ２＋とＮｉ２＋イオンの固定化、及びその生成物の性質決定について記述する。当該ゲルを適切な金属硝酸塩の溶液と混合した後に、弱く結合したイオンを除去するために、酢酸塩緩衝液（ｐＨ５）で洗浄することによって、固定化を達成した。ゲルによるＣｕ２＋イオンの急激な取り込みは、前記ゲルの色が青に変色することで直ちに識別できるが、Ｎｉ２＋の結合に関しては、適当な時間内に明るい紫−青にゲルを着色するためには、温度を上昇させながらインキュベーションすることが不可欠であることがわかった。このため、Ｎｉ２＋イオンと当該固定化したリガンド間の反応は、極めて緩慢なようである。６０℃で１時間のインキュベートした後における、ゲルによるＣｕ２＋及びＮｉ２＋の取り込みレベルは、対応するリガンド表面密度（表７、下記参照）に基づいて予測した最大取り込みレベルのそれぞれ約７０％と４０％であることが明らかとなった。Ｎｉ２＋処理したゲルの場合、Ｃｕ２＋イオンの溶液と混合すると前記ゲルの試料が青くなった事実によって、配位していないリガンドドナー原子が存在することが確認された。ニッケル（ＩＩ）ｔａｃｎ錯体は速度論的に不活性であることが知られているので、Ｃｕ２＋イオンによるＮｉ２＋イオンの置換が原因である可能性はない（例えば、Yang, RとZompa, L.J., Inorganic Chemistry, 15(1976) 1499;and Murphy, L.J. and Zompa, L.J., Inorganic Chemistry,18(1979) 3278を参照）。このような低い負荷の下では、固定化二核ニッケル（ＩＩ）錯体種が低いレベルで形成されるにすぎないと予測されること、及び（本発明に記載された態様で）ビス（ｔａｃｎ）リガンドのＩＭＡＣへの付与を研究する重要な理由の一つがタンパク質の二核錯体への結合を探索することであったことに鑑みれば、Ｎｉ２＋添加した支持体は、対応するＣｕ２＋添加した吸着剤よりも有利ではないように思われる。さらに、実際的な面から見ると、使用する吸着剤の調製に過大な時間が費やされないように、ＩＭＡＣ吸着剤による金属イオンの最大取り込みは相当な速さで達成しなければならない。このため、かかる観察と考察に基づいて、容量が大きいＣｕ２＋添加吸着剤の実験に比重を置いた。
【表７】
2005526487.tif 000027
【０３０８】
官能化ゲルによるＣｕ２＋イオンの明白な急激な取り込みを確認するために、一連の小規模な実験を行って、平衡状態の達成に必要なインキュベーション時間を確定した。室温で３０分間混合した後に生じる取り込みの増加をほとんど又は全く検出せずに、迅速に平衡状態に達することが本結果によって示された。代表的な取り込み曲線をスキーム１１に示す。本研究の結果に基づいて、その後のＣｕ２＋添加支持体の調製には、３０分の標準吸着時間を選択した。
【化２４】
2005526487.tif 000028
【０３０９】
スキーム１１  ｔａｃｎ−（●）とＬＰＸ（■）−官能化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲルの経時的なＣｕ２＋の取り込み
Ｎｉ２＋の取り込みとは異なり、Ｃｕ２＋の結合が最大に達しなかったのは、平衡の達成が遅いせいであるとは思われないので、その理由を考察することは興味深い。ＩＤＡ−アガロース支持体へのＣｕ２＋結合に関しては、金属イオン対リガンドの割合がおよそ１対１であると報告されているが（例えば、Porath, J. and Belew, M. Journal of Chromatography,516(1990) 333; and Jiang, W. and Hearn, M.T.W. Analytical Biochemistry, 242(1996) 45を参照）、観察された約７０％という結合の程度は、Ｎ−ドナーのみを用いて又はエーテル型のＯ−ドナーとともにＮ−ドナーを用いて固定化リガンドを取り込んだ様々な支持体について観察された程度と合致している（例えば、Gros, C.、Rabiet, F.、Denat, F.、Brandes, S.、Collet, H.、Guilard, R.、Journal of the Chemical Society, Dalton Transaction,(1996)1209; van Berkel, P.M.、Driessen,W.L.,Kodhaas,G.J.A.A.、Reedijk,J.、Sherrington,D.C. Journal of the Chemical Society,Chemical Communication(1995)147;Dudler,V.、Lindoy,L.F.、Sallin, D.、Schlaepfer, C.W., Australian Journal of Chemistry, 40(1987) 1557を例として参照）。これらの固定化された系のいくつかについて、結合が金属イオンに依存することは、３次元ポリマーネットワークに付随する立体効果の差を反映しているものと解釈されている（上記引用文中のｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ，Ｐ．Ｍ．らとＤｕｄｌｅｒ，Ｖ．らを参照）。好ましくないコンフォメーション変化が誘発されると、このような立体障害により、幾つかの部位で、ある腫の金属イオンを結合する能力が減少するか、又は特定部位への金属イオンのアクセスが制限される可能性がある。ここで報告した吸着剤に関しては、Ｃｕ２＋：リガンド比の減少は、ＣｕＬ２２＋種の形成も原因の１つである可能性があり、ゲル表面上の隣接するリガンド（Ｌ）由来のｔａｃｎ環の対の間に、Ｃｕ２＋イオンが挟まれている（スキーム１２）。しかし、比較的高い結合度が得られたということは、ｔａｃｎ−及びビス（ｔａｃｎ）−官能化吸着剤については、それぞれ、ＣｕＬ２＋とＣｕ２Ｌ２＋が主要種であると思われることを示唆している。リガンド表面密度から予測した最大限結合度に対するパーセントとして表したＣｕ２＋イオンの取り込みは、何れのケースでも実質的に同一であることに注目することが重要である。
【化２５】
2005526487.tif 000029
【０３１０】
スキーム１２．  隣接する固定化リガンドを含んだ生じ得るサンドイッチ構造。本構造は、Ｃｕ２＋添加ｔａｃｎ−及びビス（ｔａｃｎ）−官能化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲルの表面上に形成される可能性がある。
【０３１１】
IＭＡＣに使用するための本発明の新規Ｃｕ２+添加吸着剤の適合性を更に評価するために、後のタンパク質／ペプチド結合研究で使用する様々な異なる平衡化条件下で、金属イオン浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）に対する本システムの抵抗性を調べた。弱く結合した金属イオンを除去するために、金属イオン添加支持体を水と２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５）で洗浄した後に、以下の培養液のうち１つ（２０ｍＭ  酢酸緩衝液、２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）、２０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）、２００ｍＭ  イミダゾール、又は２００ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液）を用いて更に吸着剤を洗浄した。結果をスキーム１３に示す。Ｎａ２ＥＤＴＡ培地を除き、これらの培地では、金属イオンの浸出は無視できることが明らかとなり、固定化錯体の安定性が高いことが確認された。しかし、Ｎａ２ＥＤＴＡで長時間処理すると、固定化Ｃｕ２＋イオンの８０％以上が溶出した。
【化２６】
2005526487.tif 000030
【０３１２】
スキーム１３．  各種溶液で洗浄した後のＣｕ２＋−ｔａｃｎ−（●）及び−Ｌｐｘ−官能化（■）セファロースＴＭＣＬ−４Ｂゲル中のＣｕ２＋含量。洗浄液１＝２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ５；洗浄液２＝２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ５；洗浄液３＝２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ７；洗浄液４＝２０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ９；洗浄液５＝２００ｍＭ  イミダゾール；洗浄液６＝２００ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ。
【０３１３】
本発明の側面に関する本明細書の開示に関連する重要な平衡データを、下表８及び表９に示す。
【表８−１】
2005526487.tif 000031
【表８−２】
2005526487.tif 000032
【表９】
2005526487.tif 000033
【０３１４】
［実施例１２５］  Ｃｕ２＋添加ゲルのスペクトル特性に関する考証
吸着剤表面上に固定化したＣｕ２＋イオンの配位環境に関する情報を得るために、Ｃｕ２＋添加支持体の拡散反射率とＥＳＲスペクトルを記録した。拡散反射率のスペクトルはそれぞれ、可視領域の約６４０ｎｍに中心が存在する極めて広いバンドを示したが、溶液中の非固定化ビス（ｔａｃｎ）リガンドの銅（ＩＩ）錯体について観察されたものと類似しており、四角錐又は正方体が歪曲した八面体配位環境に銅（ＩＩ）が存在していることを示唆している。「遊離」錯体に対して１１００ｎｍ付近に観察された低強度のバンドは、ゲルの拡散反射率のスペクトル中では分離されなかった。
【０３１５】
７７Ｋで測定したＣｕ２＋添加ゲルのＸバンドＥＳＲスペクトルは、各ケースで約３２００Ｇに強いシグナルを示し、核スピン３／２を有する単核の銅（ＩＩ）錯体に対して認められる代表的なシグナルであった。予想される４つの超微細シグナルのうち３つは明白に認識できたが、４つ目のシグナルはｇ（垂直）ラインの下に隠れていた（Ｈａｔｈａｗａｙ，ｂ．Ｊ．  Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｇ．、Ｇｉｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｄ．、ＭｃＣｌｅｖｅｒｔｙ，Ｊ．Ａ．（Ｅｄｓ．）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７，Ｖｏｌ．５，ｐ５３３を参照）。ｔａｃｎゲルのシグナルの分離は良好であった。ビス（ｔａｃｎ）ゲルのものは幾分広めで、ゲル表面に固定化した際に前記リガンドの２つの半分部分が等しくならないことを示している。従って、各リガンドによって結合された２つの銅（ＩＩ）中心の配位環境は、わずかに異なると考えられる。吸着剤のＥＳＲスペクトルは、ＳＰ又は正方体が歪曲した八面体配位環境にあるＣｕ２＋イオン特有のパラメータ（ｇ（平行）＝２．２４、ｇ（垂直）＝２．０５−２．０７、Ａ（平行）＝１７０ｘ１０−４ｃｍ−１）を有する「遊離」銅（ＩＩ）錯体のスペクトルと極めて類似している（上記引用文中、Ｈａｔｈａｗａｙ，Ｂ．Ｊ．参照）。それ故、ゲル表面上に存在する前記錯体種は、溶液中のリガンドによって形成される銅（ＩＩ）錯体と実際には類似している。
【０３１６】
［実施例１２６］    実験の部の序言(上記参照)に記載した情報に加えて、本発明に関して特別に使用した様々な材料、試薬、及び操作について、以下でさらに詳述する。
【０３１７】
セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ上へのｔａｃｎ及びビス（ｔａｃｎ）リガンドの大規模な固定化
真空乾燥したセファロースＴＭＣＬ−４Ｂ（３００ｇ）を水（５×３００ｍＬ）で徹底的に洗浄して、丸底フラスコに入れ、オーバーヘッド機械式スターラーを用いて１Ｍ  ＮａＯＨ（３００ｍＬ）及びＮａＢＨ４（１．２ｇ）と室温で１時間混合した。次に、エピクロロヒドリン（１００ｍＬ）を加えて、更に６時間、前記懸濁液を攪拌した。生成されたエポキシ活性化ゲルを減圧濾過によって収集して、水（５×３００ｍＬ）、２０％ＥｔＯＨ／水（５×３００ｍＬ）で徹底的に洗浄し、さらにもう一度水（５×３００ｍＬ）で洗浄した。各リガンドの３．７５ｍｍｏｌ量の臭化水素酸塩を水（４０ｍＬ）に溶解することにより、リガンドｔａｃｎ及びビス（ｔａｃｎ）リガンドＬｅｔｈ、Ｌｐｒｏｐ、Ｌｂｕｔ、Ｌｏｘ、Ｌｍｘ及びＬｐｘの７５ｍＭ  溶液を調製して、６Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１１に調節し、その後、水を加えて５０ｍＬにした。真空乾燥したエポキシ活性化ゲル６０ｇ分に前記溶液を加えて、振盪式ウォーターバスを用いて６０℃で１５時間、前記懸濁液を混合した。生成された官能化ゲルを減圧濾過で収集し、水（５×２００ｍＬ）、５０ｍＭ  酢酸／０．１Ｍ  ＫＮＯ３（ｐＨ４）（２×２００ｍＬ）で洗浄後、もう一度水（５×２００ｍＬ）で洗浄した。ゲルは、必要なときまで、２０％ＥｔＯＨ／水に４℃で保管した。
【０３１８】
セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ上へのビス（ｔａｃｎ）リガンドの構築
真空乾燥したエポキシ活性化セファロースＣＬ−４Ｂゲル（８０ｇ）（前述のように調製）を２４％メチルアミン水溶液中に懸濁し、この混合物を６０℃で１５時間、攪拌した。次に、生成されたアミノ化ゲルを減圧濾過により濾過して、水（１０×２００ｍＬ）、５０ｍＭ  酢酸／０．１Ｍ  ＫＮＯ３／ｐＨ４緩衝液（４×１００ｍＬ）で洗浄し、もう一度水（１０×２００ｍＬ）で洗浄した。アミノ化したゲルの一部（１５ｇ）を窒素分析のために取り分けた。残りを、１００ｍＬの５％トリエチルアミン／水、２０％アセトニトリル／５％トリエチルアミン／水、４０％アセトニトリル／５％トリエチルアミン／水、６０％アセトニトリル／５％トリエチルアミン／水、８０％アセトニトリル／５％トリエチルアミン／水、９５％アセトニトリル／５％トリエチルアミンで３回ずつ連続して洗浄し、最後にアセトニトリル（６×１００ｍＬ）で洗浄した。その後、ゲルにアセトニトリルを加えて、総量１７０ｍＬの懸濁液とした。アセトニトリル（３０ｍＬ）中の１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（１０ｇ、２８ｍｍｏｌ）の溶液を加えて、その混合物を室温で１８時間、速い速度で攪拌した。次に、前記ゲルを濾過して、アセトニトリル（５×１００ｍＬ）を用いて洗浄した。前記ゲルにアセトニトリルを添加して、総量１３０ｍＬの懸濁液にした。次に、アセトニトリル（４０ｍＬ）中の遊離塩基型ｔａｃｎ（６．５ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を加えて、その混合物を室温で２２時間、勢いよく攪拌した。前記ゲルを濾過して、５０ｍＬアセトニトリル、７５％アセトニトリル／水、５０％アセトニトリル／水、２５％アセトニトリル／水、水、５０ｍＭ  酢酸／０．１Ｍ  ＫＮＯ３／ｐＨ４緩衝液で連続して２回ずつ洗浄し、その後、再度、水で洗浄した。ゲルは２０％ＥｔＯＨ／水に４℃で保管した。
【０３１９】
リガンド−官能化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ吸着剤の窒素分析
リガンドの固定化の程度を測定するために、官能化ゲルの窒素含有量を分析した。各ゲルにつき、２０%アセトン／水（５０ｍＬ）中に、約２０ｇの真空乾燥した材料を２分間懸濁した。次に、ゲルが乾燥しきらないように注意しながら、静かに減圧濾過して溶媒の大部分を除去した（この段階でゲルが乾燥すると、吸着剤が凝集する原因になることがわかっている）。このゲルを、全く同様の方法で更に２０％アセトン／水で洗浄した。前記ゲルが純アセトン中に移行するまでアセトンの量を増加した（２０％ずつ増加）溶液を用いて、この二重洗浄操作を繰り返した。次に、徹底的に真空乾燥する前に、このゲルを再度アセトン（５０ｍＬ）で洗浄した後、２４時間、高真空の下で乾燥させた。Ｋｊｅｌｄａｈｌ法を用いて、乾燥した吸着剤の総窒素含量を分析した。
【０３２０】
官能化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ吸着剤上へのＣｕ２＋及びＮｉ２＋イオンの添加
該当する金属硝酸塩（５ｍＬ）の５０ｍＭ水溶液を含む１０ｍＬシンチレーションバイアルに真空乾燥した吸着剤のうち０．５ｇを加え、６０℃で１時間、倒置して混合した。Ｃｕ２＋添加に関しては、Ｃｕ２＋の取り込みにおける経時的な変化を確立するために、０．５時間から２０時間までの期間にわたって、一連の行程として室温でこの操作を実行した。次に、減圧濾過によりゲルを収集し、水（３×５０ｍＬ）、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ５緩衝液（２×２５ｍＬ）、及び水（３×５０ｍＬ）で連続して洗浄し、前記溶液の添加と減圧濾過によるその除去の間に３分間の平衡時間を与えた。
【０３２１】
官能化セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ吸着剤上にＣｕ２＋及びＮｉ２＋イオンを添加するための標準条件
室温で３０分間、５０ｍＬのシンチレーションバイアル中で、５０ｍＭのＣｕ（Ｎｏ３）２・３Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を用いて前記真空乾燥したゲルのうち４ｇをインキュベートすることにより、官能化吸着剤上にＣｕ２＋イオンを大量に添加（結合）させたが、取り込みの予備実験（実施例１２４；上記参照）により、この時間で十分なことが示されていた。次に、金属イオン添加吸着剤を減圧濾過で収集して、水（５×１００ｍＬ）で洗浄し、２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ５緩衝液（５０ｍＬ）中に１５分間懸濁した。前記ゲルを濾過し、更に一定分量（５０ｍＬ）のｐＨ５緩衝液で洗浄後、水（３×１００ｍＬ）で洗浄して、３分間の洗浄平衡化の時間を維持した。
【０３２２】
緩衝液平衡化実験の選択に関する詳細
真空乾燥したＣｕ２＋添加吸着剤０．５ｇを２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れて、下記の溶液（１０ｍＬ）とともに、室温で所定の時間、インキュベートした。次に、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ７緩衝液（１０ｍＬ）、続いて水（３×５０ｍＬ）で洗浄する前に前記ゲルを減圧濾過によって単離し、洗浄の間には３分間平衡化させた。
【０３２３】
溶液：１）２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ７緩衝液、１０分
２）２０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ９緩衝液、１０分
３）２００ｍＭ  イミダゾール、１０分
４）２００ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、３０分
Ｃｕ２＋−及びＮｉ２＋−添加セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ吸着剤の金属分析
金属イオン添加吸着剤の試料ごとに、約０．５ｇの真空乾燥した材料を純アセトン中に移行させ、無金属イオンゲルに対して上述の方法を用いて高真空下で乾燥させた。次に、約２０ｇの乾燥させた吸着剤を正確に秤量して２０ｍＬの密封シンチレーションバイアルに入れ、頻繁に倒置させながら、５０℃で４時間にわたり４Ｍ  ＨＣｌ（４ｍＬ）中で消化した。生成した明黄褐色の溶液を８ｍＬの容量になるように水で希釈した後、原子吸光分光法により銅の含有量を分析した。膨潤したゲル容積について吸着剤の金属含量を測定するために、５０％（ｖ／ｖ）ゲル／水懸濁液の分取試料（１ｍＬ）を用いて分析を繰り返し、ゲルを水中に沈降させ、ゲル上の液体量がベッド容量と等しくなるように調整することによって調製した。
【０３２４】
Ｃｕ２＋添加セファロースＴＭＣＬ−４Ｂ吸着剤の拡散反射率及びＥＳＲ分光法
上記の操作に従って、高真空下で乾燥させたゲル試料を用いて、拡散反射率のスペクトルを記録した。２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ／１Ｍ  ＮａＣｌ／ｐＨ５緩衝液で洗浄したゲルの真空乾燥試料を用いて、ＥＳＲスペクトルを記録した。
【０３２５】
［実施例１２７］    ＮＴ１（配列番号１）と称されるオリゴペプチド「タグ」にＮ末端が融合された完全長の組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ〔ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）〕を発現するために使用可能な発現プラスミドの構築（ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１と称される融合タンパク質）
実施例８６に記述したように、ＧＳＴをコードする配列のＣ末端を修飾して完全長の構築物を得るために、ＧＳＴ−ＮＴ１を発現するように構築されたプラスミドの部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を行った。リジン残基（コドンＡＡＡ）をコードするようにＧＳＴのＳＤＭを行うことによって、単一塩基の変化が導入された（停止コドン（ＴＡＡ）を変化させた）。Ｎ末端がタグ化された組換えＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＴ１）発現プラスミド中に存在するこの終止コドンを除去すると、Ｎ末端がタグ化された組換えＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＴ１）を発現するために使用できるプラスミドが得られ、該融合タンパク質においては、４アミノ酸Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−ＬｅｕだけＧＳＴのＣ末端がそれぞれ伸長する。Ｃ末端のリジン残基の復活により、完全長のＧＳＴ配列に加えて、例えば、元の構築物を作製するために使用されたｐＧＥＸ３ＸＧＳＴベクターに由来する更に３つのＣ末端残基がコードされるので、これにより得られた発現プラスミドは、完全長グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ〔ＧＳＴ（ＦＬ）〕と命名された。
【０３２６】
ストラタジーン社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的突然変異誘発キット取扱説明書カタログ#200518改訂版#1000007に概略されている通りに、ＳＤＭ操作を実行した。
【０３２７】
部位特異的突然変異誘発反応：
実施例８６に記載されているように、Ｎ末端がタグ化されたＧＳＴ融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１を発現するために構築された発現プラスミドを、鋳型ＤＮＡとして使用した。望ましい塩基の変更を導入するために使用したオリゴヌクレオチドは下記のとおりであり、下線が付されている。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドＮｏ．１：５‘ＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣ３’
オリゴヌクレオチドＮｏ．２：５‘ＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＣＧＣＣ３’
１２５ｎｇのオリゴヌクレオチドＮｏ．１、１２５ｎｇのオリゴヌクレオチドＮｏ．２、５μＬの１０Ｘ反応緩衝液、及び１μＬのｄＮＴＰを含む混合物に約２５ｎｇのｄｓＤＮＡテンプレートを加えた。前記反応混合物の量を二重蒸留水で５０μＬになるように調節した。この混合物に２．５ＵのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、反応混合物を鉱油で覆った。
【０３２９】
次に、前記反応混合物を下記の条件を使用してサーモサイクラーに入れた。（ａ）最初の変性段階は９５℃で３０秒間、（ｂ）その後、９５℃、３０秒間で１２サイクル、（Ｃ）５５℃で１分間、（ｄ）続いて６８℃で１０分間。サーモサイクラーの休止時に、反応物を取り出して、２分間、氷冷した。次に、増幅反応に１０Ｕの制限酵素Ｄｐｎｌを加え、混合物を静かに且つ徹底的に攪拌した。続いて、前記混合物をマイクロ遠心分離機で１分間沈降させ、直ちに３７℃で１時間インキュベートした。
【０３３０】
ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞への形質転換：
上記の反応から得た５μＬのＤｐｎｌ処理ＤＮＡを５０μＬのＸＬ−１−Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ細胞に添加し、氷上でその混合物を３０分間インキュベートした。次に、この混合物に対して、４２℃で４５秒間、ヒートパルスを行った後、２分間、氷冷した。０．５ｍＬのＳＯＣ培地〔５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び、５ｍＭ  ＭｇＳ０４、２０ｍＭグルコースを追加して濾過殺菌した５ｍＬのＳＯＢ（トリプトン２０ｇ／Ｌ及び酵母エキス５ｇ／Ｌ、２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、６２５μＭ  ＫＣｌ、加圧滅菌処理）を添加した後に、形質転換反応を３７℃１時間でインキュベートした。異なる希釈度の形質転換混合物をＬＢ  Ａｍｐプレート（寒天１５ｇ／Ｌにトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌを添加して加圧滅菌した後、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを補充した）上に播種した。前記プレートを、３７℃で一晩、インキュベートした。
【０３３１】
陽性クローンの同定：
標準的な技術を用いて、上記ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ形質転換体から修飾されたプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡのＤＮＡ塩基配列決定は下記のように実行した。約２００ｎｇの修飾されたプラスミドＤＮＡ、５ｐｍｏｌのプライマー、６μＬのターミネーターを１５μＬの容積に事前に混合する。前記反応による混合物を２つ準備し、一方には、
（ａ）ｐＴｒｃ  フォワードプライマー：  ５‘ＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣ３’を入れ、
他方には、
（ｂ）ｐＴｒｃ  リバースプライマー：５‘ ＣＣＡＧＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧ３’を入れた。
【０３３２】
前記反応混合物を下記の条件を使用したサーモサイクラーに供した。（ａ）最初の変性段階は９６℃で１分間、その後、（ｂ）９６℃で３０秒間、（ｃ）４５℃で１５秒間及び（ｄ）６０℃で４分間からなる２５サイクル。標準的な技術を用いてエタノール／酢酸ナトリウム沈殿を行って、伸長生成物を回収し、ペレットを乾燥させて、ＤＮＡ塩基配列の決定に供した。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１をコードする所望のプラスミドを含有するクローンを同定し、正しいことを確認した。
【０３３３】
発現細胞の形質転換：
標準技術を用いて、塩化ルビジウム処理した大腸菌細胞の菌株ＪＭ１０５、ＢＬ２１、ＴＯＰ１０を、約１００ｎｇの修飾発現プラスミドでそれぞれ形質転換した。プラスミド含有細胞を選択するため、様々な希釈度の形質転換細胞をＬＢ  Ａｍｐプレート上に播種した。
【０３３４】
［実施例１２８］    ＣＴ２と称されるオリゴペプチド「タグ」Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６がＮ末端に融合された完全長組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ〔ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）〕を発現するために使用可能な発現プラスミドの構築〔ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２と称される融合タンパク質〕
ＧＳＴをコードする配列のＣ末端を修飾するために、実施例８８に記載のＧＳＴ−ＣＴ２を発現するために構築されたプラスミドの部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を行った点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１２７に記述した操作と同一であった。
【０３３５】
［実施例１２９］    ＮＴ２（配列番号２）と称されるオリゴペプチド「タグ」にＮ末端が融合された完全長組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ〔ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）〕を発現するために使用可能な発現プラスミドの構築〔ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２と称される融合タンパク質〕
ＧＳＴをコードする配列のＣ末端を修飾するために、実施例８９に記載のＧＳＴ−ＮＴ２を発現するために構築されたプラスミドの部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を行った点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１２７に記述した操作と同一であった。
【０３３６】
［実施例１３０］    大腸菌細胞株ＪＭ１０５中でのＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の大規模発現
実施例１２８に記述の通りに、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２発現プラスミドを用いて、大腸菌細胞株ＪＭ１０５を形質転換した。ＬＢ  Ａｍｐ培地を含むぺトリ皿上で、形質転換した細胞を３７℃で一晩繁殖させた。１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、加圧滅菌処理）に、前記ぺトリ皿の単一コロニーを播種し、一晩中振盪させながら３７℃でインキュベートした。１００μｇ／ｍＬアンピシリン（２×ＹＴＡ）を補充した５００ｍＬの２×ＹＴ培地（トリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、加圧滅菌処理）に、一晩培養物の１／１００希釈液を播種した後、６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．６−１．０になるまで、３７℃で振盪させながらインキュベートした。最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えることにより、遺伝子発現を誘導した。誘導から６−７時間後に、前記培地の細胞を採集した。２５ｍＬの氷冷１×ＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中に細胞を再懸濁し、超音波処理することによって溶解した。ペレット化した後に、前記細胞破砕液を収集した。
【０３３７】
［実施例１３１］  大腸菌細胞株ＪＭ１０５中でのＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長〔ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）〕（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の大規模発現
実施例１２７に記載したようにＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１発現プラスミドで大腸菌細胞株ＪＭ１０５を形質転換した点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１３０に記述した操作と同一であった。
【０３３８】
［実施例１３２］  大腸菌細胞株ＪＭ１０５中のＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の大規模発現
実施例１２９に記載したようにＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２発現プラスミドで大腸菌細胞株ＪＭ１０５を形質転換した点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１３０に記述した操作と同一であった。
【０３３９】
［実施例１３３］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中でのＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２発現プラスミドで大腸菌細胞株ＢＬ２１を形質転換した点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１３０に記述した操作と同一であった。
【０３４０】
［実施例１３４］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中のＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１発現プラスミドで大腸菌細胞株ＢＬ２１を形質転換した点を除いて、使用した操作は、基本的に実施例１３１に記述した操作と同一であった。
【０３４１】
［実施例１３５］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中でのＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２発現プラスミドで大腸菌細胞株ＢＬ２１を形質転換した点を除いて、使用した操作は実質的に実施例１３２に記述した操作と同一であった。
【０３４２】
［実施例１３６］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中でのＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２発現プラスミドで大腸菌細胞株ＴＯＰ１０を形質転換した点を除いて、使用した操作は実質的に実施例１３０に記述した操作と同一であった。
【０３４３】
［実施例１３７］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中でのＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１発現プラスミドで大腸菌細胞株ＴＯＰ１０を形質転換した点を除いて、使用した操作は実質的に実施例１３１に記述した操作と同一であった。
【０３４４】
［実施例１３８］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中でのＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の大規模発現
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２発現プラスミドで大腸菌細胞株ＴＯＰ１０を形質転換した点を除いて、使用した操作は実質的に実施例１３２に記述した操作と同一であった。
【０３４５】
［実施例１３９］  大腸菌細胞株ＪＭ１０５で発現させたＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の精製
適切なクロマトグラフィーの吸着剤として、固定化したＮｉ２＋−ｔａｃｎ、Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ、Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ、Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ、Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ、Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ又はその他の金属イオンをキレートした大環状トリス−又はテトラキス−ｔａｃｎ系を用いて、基本的に実施例９３に記述したバッチ法又はカラムクロマトグラフィ法によって、実施例１２８（上記）に記述したとおりに発現したＮ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２を精製することができる。緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ＝１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．４を追加した緩衝液Ａ；緩衝液Ａ＝４４５ｍＭ  ＮａＣｌ、７．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４.２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．２）を用いて各カラムをインキュベートした。ゲル１ｍＬにつき２５０μＬの粗細胞破砕液（緩衝液Ｂで４分の１に希釈）をカラムに添加した。次に、溶出前に、緩衝液Ｂでカラムを２回洗浄した。以下の２つの溶出操作を使用した。緩衝液１（緩衝液１＝５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ９．７を追加した緩衝液Ａ）で溶出後に、２度目の溶出を２００ｍＭ  マロン酸ナトリウムで行った（これは、１０Ｍ  水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調節した）。あるいは、これらのＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースＴＭ４Ｂ（ＧＳ４Ｂ）を用いて精製することもできる。本ケースでは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ出版の情報冊子ＧＳＴ  Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ第３版改訂１に従ってバッチ精製を行った。簡潔に記述すると、実施例１３０に記載したように、１ＸＰＢＳ（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）で洗浄及び平衡化したベッド容積が０．７５ｍＬのＧＳ４Ｂに、２４ｍＬの細胞破砕液を加えた。生じた混合物を室温で約１時間、繰り返し回転させながらインキュベートした。前記混合物を５００Ｘｇで５分間、遠心分離した。上清を収集して、ゲルを１ＸＰＢＳで徹底的に洗浄した。融合タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  還元型グルタチオン）で溶出した。
【０３４６】
溶出液を収集後、残留している緩衝塩又はＧＳ４Ｂを全て除去するために１０ｍＬのエコノカラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ）にかけた。溶出液を室温で２０分間、４．７ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）とともにインキュベートした後、４℃で緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．９）で徹底的に透析した。透析後、タンパク質を０．４５μｍ無菌フィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ）に通した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．,  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、濾過前及び濾過後のタンパク質濃度を測定した。その後、精製された融合タンパク質を４℃で保管した。
【０３４７】
［実施例１４０］  大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のバッチ精製
実施例１３１に記述した通りに粗細胞破砕液を精製した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３４８】
［実施例１４１］  大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のバッチ精製
実施例１３２に記述した通りに粗細胞破砕液を精製した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３４９】
［実施例１４２］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６をタグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のバッチ精製
実施例１３３に記述した通りに粗細胞破砕液を精製した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５０】
［実施例１４３］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のバッチ精製
実施例１３４に記述した通りに粗細胞破砕液を、ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかった精製タンパク質を用いて分画した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５１】
［実施例１４４］  大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のバッチ精製
実施例１３５に記述した通りに粗細胞破砕液を、ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかった精製タンパク質を用いて分画した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５２】
［実施例１４５］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現させたＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のバッチ精製
実施例１３６に記述した通りに粗細胞破砕液を、ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかった精製タンパク質を用いて分画した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５３】
［実施例１４６］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のバッチ精製
実施例１３７に記述した通りに粗細胞破砕液を、ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかった精製タンパク質を用いて分画した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５４】
［実施例１４７］  大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現されたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のバッチ精製
実施例１３８に記述した通りに粗細胞破砕液を、ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかった精製タンパク質を用いて分画した点を除いて、使用した操作は、実質的に実施例１３９に記述した操作と同様であった。
【０３５５】
［実施例１４８］  様々な大腸菌細胞株中で発現させたＮ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量測定
実施例１３９、１４２、１４５に記載したように、様々な大腸菌株で発現精製された精製透析Ｎ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２融合タンパク質の分子量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって測定した。非還元タンパク質試料がグルタチオンセファロースＴＭ４Ｂ（ＧＳ４Ｂ）精製手順から発生したため、予想した理論上の分子量より［Ｍ＋Ｈ］＋の実験値の方が高くなり、実施例１３６及び１４２、１４５に記載したように、グルタチオン精製時に還元グルタチオン（ＧＳＨ）によってＧＳＴタンパク質がＳ−チオレートされるという事実と合致していた。しかし、βメルカプトエタノールを添加して前記タンパク質試料を還元後に脱塩すると、［Ｍ＋Ｈ］＋の実験値は予想理論分子量と一致した。従って、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析したタンパク質試料は全て、このようにして調製した。
【０３５６】
予め４．７ｍＭ  ＥＤＴＡとともにインキュベートされなかったタンパク質試料を、室温で２０分間、このようにして処理した。次に、β−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｍＭ）とともに前記タンパク質をインキュベートした後に、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐＴＭ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ）を用いて脱塩し、分析を行うまで−２０℃で保管した。破砕結晶（ｃｒｕｓｈｅｄ−ｃｒｙｓｔａｌ）法を用いて、この試料をシナピン酸マトリックスに使用した。Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ生体分光光度法ワークステーションを用いてスペクトルを記録した。加速度ポテンシャル２５ｋＶ、パルス遅延時間２５０ｎｓ、低マスゲート５ＫＤａ、グリッド電圧８５％の陽イオンリニアモードで試料を分析した。１スペクトルにつき１００ショットを撮り、５スペクトルを蓄積させた。
【０３５７】
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の理論上の分子量は２８，００７．３ダルトンである。
【０３５８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の分子量測定
実施例１３９に記載したように、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値の２８，００６±５．５７ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３５９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の分子量測定
実施例１４２に記載したように、大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２８，００８．１０±５．２９ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の分子量測定
実施例１４５に記載したように、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０に発現したＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２８，００３．００±３．４６ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６１】
［実施例１４９］  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる、様々な大腸菌細胞株中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の分子量測定
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の理論上の分子量が２７，９６５．３ダルトンであるという点を除けば、使用した操作は実質的に例１４８に記述したものと同じであるが、
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の分子量測定
実施例１４０に記載したように、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２７，９５３．００±２．６５ダルトンのシングルピークを示した。実験データは無傷のタンパク質と一致した。
【０３６２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の分子量測定
実施例１４３に記載したように、大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２７，９５１．００±４．３６ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現したＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の分子量測定
実施例１４６に記載されているとおりに、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現したＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２７，９５４．６７±６．６６ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６４】
［実施例１５０］  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる、様々な大腸菌細胞株中で発現させたＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の分子量測定
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の理論上の分子量が、２８，２１８．６ダルトンである点を除いて、使用した操作は実質的に実施例１４８に記述したものと同じである。
【０３６５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の分子量測定
実施例１４１に記載したように、大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２８，２０８．００±８．４４ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＢＬ２１中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の分子量測定
実施例１４４に記載したように、大腸菌細胞株ＢＬ２１で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のスペクトルは、平均［Ｍ＋Ｈ］＋値２８，２１４．３３±５．８６ダルトンのシングルピークを示した。実験データは、変化を受けていないタンパク質のデータと合致していた。
【０３６７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の分子量測定
実施例１４７に記載したように、大腸菌細胞株ＴＯＰ１０中で発現させたＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルは下記の通り。
【０３６８】
（ａ）主ピーク（１００％強度）の平均［Ｍ＋Ｈ］＋値は２８，２１３．８３±６．０５ダルトン、
（ｂ）マイナーピークは（約２５％相対強度）の平均［Ｍ＋Ｈ］＋値は２７，８１５．８３±８．０４ダルトン、
（ｃ）マイナーピーク（約１３％相対強度）の平均［Ｍ＋Ｈ］＋値は２６，３０１．０±６．９０ダルトンであった。
【０３６９】
無傷のタンパク質並びに最初の３基及び最初の１５残基がそれぞれＮ末端で切断された少量のタンパク質を主に含有する精製試料と、実験データは一致していた。これらの種は、イタリック体で表記した以下のＮ末端アミノ酸を欠く末端切断型ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２に対応する。
【０３７０】
マイナーピーク  ＭＫＨ    １ＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲ------［ＧＳＴ］
この種の理論上の分子量は２７，８２２．１１ダルトンである。
【０３７１】
マイナーピーク    ＭＫＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨ    １Ｒ------［ＧＳＴ］
この種の理論上の分子量は２６，３１２．５５ダルトンである。
【０３７２】
［実施例１５１］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のジペプチジルアミノペプチターゼ１（ＤＡＰ−１）消化
等量のＤＴＴ（２０ｍＭ）を添加して室温で４−６分間、混合物をインキュベートすることによって、Ｎ末端切断酵素ジペプチジルアミノペプチターゼ１［例えば  Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）又はＵｎｉｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能なＤＡＰ−１（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）］（１０Ｕ／ｍＬ）を活性化した。消化反応混合物には、実施例１３９に記述の大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させたＮ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２タンパク質５０μｇ及び１２．５ｍＵの活性化したＤＡＰ−１が含まれた。タンパク質が懸濁された緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．９）を加えることによって、前記反応混合物の量を７０μＬに調節した。次に、前記消化反応混合物をウォーターバスに入れて３７℃で５分ないし約２３時間にわたって、インキュベートした。
【０３７３】
インキュベーション時間の最後に、一定分量のＤＡＰ−１消化反応混合物を取り出し、ＳＤＳ添加緩衝液（還元性）を加えて反応を止めた。前記試料を１００℃で９０秒加熱した後に、引き続きＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を行うために−２０℃で保管した。
【０３７４】
さらに、インキュベーション期間の終了時に、ＤＡＰ−１消化反応混合物をさらに分取して、消化反応を止めるために室温で５分間、グアニジン−ＨＣｌ（最終濃度１Ｍになるように加えた）とともにインキュベートした。次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析を引き続き行うために、この混合物を実施例１４８に記載したように更に調製した。簡潔に記述すると、停止した消化反応混合物にβ−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｍＭになるように）を加え、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐＴＭを用いた脱塩に先立って室温で１５分間インキュベートした後に、−２０℃で保管した。
【０３７５】
ＤＡＰ−１消化の時点でタンパク質試料を評価し、それに対する陰性対照とするために、実施例１３９に記載したように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子量の連続測定のために未消化（すなわち、非ＤＡＰ−１処理）タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の試料も調製した。Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐＴＭを用いた脱塩の前に、前記タンパク質試料に（最終濃度５０ｍＭになるように）β−メルカプトエタノールを追加した後、引き続きＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行うまで−２０℃で前記試料を保管した。
【０３７６】
実施例１３９に記載したように、未消化（すなわち、非ＤＡＰ−１処理）タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の試料にもＳＤＳ添加緩衝液（還元性）を追加し、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析を行うために−２０℃で保管する前に、１００℃で９０秒加熱した。
【０３７７】
［実施例１５２］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のＤＡＰ−１消化
以下の点を除き、操作は実質的に実施例１５１に記述したものと同じであった。実施例１４０に記述したように、精製Ｎ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１を大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させ、緩衝液（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）に対して更に透析を行った。透析後、標準物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質の濃度を測定した。前記ＤＡＰ−１消化反応混合物を、５分乃至約２４時間にわたってインキュベートした。
【０３７８】
［実施例１５３］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のＤＡＰ−１消化
以下の点を除いて、Ｎ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のＤＡＰ−１消化の操作は、実質的に実施例１５１に記述した操作と同様であった。
【０３７９】
実施例１４１に記述したように、精製したＮ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２を大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現させ、緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３）に対して透析を行った。透析後、標準物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質の濃度を測定した。前記消化反応混合物を、５分乃至約２４時間にわたってインキュベートした。
【０３８０】
［実施例１５４］  Ｎ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２のＤＡＰ−１消化の前後における分子量測定
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２をＤＡＰ−１で処理した。消化反応の条件は実施例１５１に記載されているとおりである。５分から約２３時間のインキュベーション時間の最後に、一定分量の消化反応物を取り出し、消化反応を停止させるために、室温で５分間、グアニジンＨＣｌ（最終濃度１Ｍになるように加えた）とともにインキュベートした。次に、この混合物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる後の分析のために、実施例１４８に記載したように、更に調製した。簡潔に記述すると、反応を停止した消化反応混合物にβ−メルカプトエタノール(最終濃度５０ｍＭになるように)を加え、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐＴＭを用いて脱塩する前に、−２０℃で保管した。次に室温で１５分間インキュベートした。
【０３８１】
消化の時点でタンパク質試料を測定し、その陰性対照とするために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで引き続き分子量を測定するためのＤＡＰ−１消化の時点で、実施例１３９に記載したように、未消化（すなわち、非ＤＡＰ−１処理）タンパク質の試料ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２も調製した。実施例１５１に前述したように、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐＴＭを用いて脱塩する前にβ−メルカプトエタノール（最終濃度５０ｍＭになるように）を前記タンパク質試料に追加した。次いで、後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を行うまで、前記試料を−２０℃で保管した。
【０３８２】
上記の試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。各試料を破砕結晶法を用いてシナピン酸マトリックスに適用した。Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いてスペクトルを記録した。加速度ポテンシャル２５ｋＶ、パルス遅延時間２５０ｎｓ、低マスゲート５ＫＤａ及びグリッド電圧８５％の陽イオンリニアモードで試料を分析した。１スペクトルにつき１００ショットを撮り、５スペクトルを集積した。
【０３８３】
スペクトルを図５３に示す。非ＤＡＰ−１処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２融合タンパク質、すなわち、陰性対照のスペクトルは、２８，０１３±３．２１ダルトンの［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するシングルピーク（標識１）を示した。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２（２８，００７．３ダルトン）の理論的な同位体の分子量と比較すると、観察された質量は、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２タンパク質が変化を受けていないことを示している。ＤＡＰ−１消化ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２（標識２）のスペクトルは、融合タンパク質をＤＡＰ−１で２時間処理すると分子量が減少することを示している。
【０３８４】
スペクトル２は、２６，１５４±６ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するメジャーピーク（２ａ）、２５，９３１±７．５１ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するマイナーピーク（２ｂ）を表している。これらの種は、イタリック体で表されているＮ末端アミノ酸を喪失した末端切断型のＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２に対応する。
【０３８５】
ピーク（２ａ）    ＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨ   １ＶＤＱＭＳＰ――――［ＧＳＴ］
（この種の理論的分子量は、２６，１５６．３ダルトンである）
ピーク（２ｂ）  ＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＶＤ  １ＱＭＳＰ―――――［ＧＳＴ］
（この種の理論的分子量は２５，９４２．１ダルトンである）
ここで、１Ｖと１Ｑは、ＤＡＰ−１消化後に得られる末端切断されたＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２バリアントのＮ末端アミノ酸残基に対応する。ＤＡＰ−１の特異性が顕著であることを前提にすれば、ＤＡＰ−１の停止位置１ＳＰ―――――ＧＳＴまでさらに切断が起こる（ここで、１ＳはＮ末端アミノ酸残基である）。
【０３８６】
［実施例１５５］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１のＤＡＰ−１消化の前後における分子量測定
以下の点を除き、操作は実質的に実施例１５４に記述したものと同様であった。
【０３８７】
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１をＤＡＰ−１で処理した。消化反応の条件は、実施例１５２に記載されているとおりである。消化反応混合物を５分から約２４時間にわたってインキュベートした。
【０３８８】
実施例１４０に記載したように、未消化の（すなわち、非ＤＡＰ−１処理）タンパク質の試料ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１も、ＤＡＰ−１消化の時点で調製した。
【０３８９】
スペクトルを図５４に示す。非ＤＡＰ−１処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１（すなわち、陰性対照）のスペクトルは、２７，９７２±３．５１ダルトンの［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するシングルピーク（標識１）を示している。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の予想される理論上の分子量２７，９６５．３ダルトンと比較すると、観察された質量はタンパク質が変化を受けていないことを示している。ＤＡＰ−１消化（２時間）ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１（標識２）のスペクトルは、ＤＡＰ−１で処理した後に分子量が減少することを示している。
【０３９０】
スペクトル２は、２６，６５９±６．８１ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するメジャーピーク（２ａ）を表している。また、２５，９３４±３．２１ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するマイナーピーク（２ｂ）、さらに、２５，６８０±６．０３ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するマイナーピーク（２ｃ）も表している。これらの種は、イタリック体で示された以下のＮ末端アミノ酸を喪失した末端切断型のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１に対応する。
【０３９１】
ピーク（２ａ）  ＭＫＨＨＨＮＳＷＤＨ    １ＤＩＮＲＶＤＱＭＳＰ――――［ＧＳＴ］
（この種の理論上の分子量は２６，６５４．９ダルトンである）
ピーク（２ｂ）  ＭＫＨＨＨＮＳＷＤＨＤＩＮＲＶＤ    １ＱＭＳＰ――――［ＧＳＴ］
（この種の理論上の分子量は２５，９４２．１ダルトンである）
ピーク（２ｃ）  ＭＫＨＨＨＮＳＷＤＨＤＩＮＲＶＤＱＭ  １ＳＰ―――― ［ＧＳＴ］
（この種の理論上の分子量は２５，６８２．８０ダルトンである）
ここで、１Ｄ・・・、１Ｑ・・・及び１Ｓ・・・は、ＤＡＰ−１消化後に得られる、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の末端切断バリアントのＮ末端アミノ酸残基に対応する。ＤＡＰ−１の顕著な特異性を前提とすれば、ＤＡＰ−１の停止位置１ＳＰ―――――［ＧＳＴ］まで切断が起こる。シナピン酸（分子量が２２４．２Ｄａ増加）及びβ−メルカプトエタノール（ＭＷ７８．１３）の付加物に対応する副次的ピークもスペクトル中に明瞭に観察される。
【０３９２】
［実施例１５６］  Ｎ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号２）融合タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２のＤＡＰ−１消化の前後における分子量測定
以下の点を除いて、操作は実質的に実施例１５４に記述したものと同様であった。
【０３９３】
ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２をＤＡＰ−１で処理した。消化反応の条件は、実施例１５３に記載されているとおりである。消化反応混合物を５分乃至約２４時間にわたってインキュベートした。
【０３９４】
実施例１４１に記載したように未消化の（すなわち、非ＤＡＰ−１処理した）タンパク質ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の試料も、ＤＡＰ−１消化時に調製した。
【０３９５】
スペクトルを図５５に示す。非ＤＡＰ−１処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２（すなわち、陰性対照）のスペクトルは、２８，２２３±２．８９ダルトンの［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するシングルピーク（標識１）を示している。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の予想される理論分子量２８，２１８．６ダルトンと比較すると、観察された質量は、タンパク質が変化を受けていないことを示している。ＤＡＰ−１消化した（２時間）ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２（標識２）のスペクトルは、ＤＡＰ−１による処理後に分子量が減少することを示している。
【０３９６】
スペクトル２は、２５，９１０±９．１６ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するメジャーピーク（２ａ）、２５，６４８±１２．８６ダルトンの平均［Ｍ＋Ｈ］＋値を有するマイナーピーク（２ｂ）を表している。これらの種は、イタリック体で示されたＮ末端アミノ酸を喪失した末端切断型のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２に対応する。
【０３９７】
ピーク（２ａ）    ＭＫＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲＶＤ  １ＱＭＳＰ――［ＧＳＴ］
（この種の理論上の分子量は２５，９４２．１ダルトンである）
ピーク（２ｂ）    ＭＫＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲＶＤＱＭ  １ＳＰ――［ＧＳＴ］
この種の理論上の分子量は２５，６８２．８Ｄａである。
【０３９８】
ここで、１Ｑ・・・及び１Ｓ・・・は、ＤＡＰ−１消化後に得られるＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の末端切断バリアントのＮ末端アミノ酸残基に対応する。ＤＡＰ−１の顕著な特異性を前提とすれば、ＤＡＰの停止位置１ＳＰ―――――［ＧＳＴ］まで切断が起こる。
【０３９９】
［実施例１５７］  様々なオリゴペプチド構築物［例えば、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１及びＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２］でＮ末端にタグを施した様々な組換え完全長グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質のＤＡＰ−１消化の前後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ＤＡＰ−１消化前及び消化後に、実施例１５１、１５２、及び１５３に記載したように、様々なＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ完全長融合タンパク質の一定分量を、ＳＤＳ添加緩衝液（還元性）と混合し、１００℃で９０秒間加熱した。次に、試料を１８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に添加して、適宜の時間展開させた。前記ゲル上に、０．４μＬの未消化（すなわち、非ＤＡＰ−１処理）タンパク質、０．６μＬのＤＡＰ消化反応混合物、及び８μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］をゲルに添加した。バンドを可視化するために、前記ゲルを銀染色した。染色したゲルを図５６に示す。
【０４００】
［実施例１５８］  ＮＴ１と称されるオリゴペプチド構築物でＮ末端にタグを施した組換え完全長グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質（すなわち、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１）のＤＡＰ−１消化前後における活性の測定
基本的に実施例９２及び１５２に記述した操作で、ＤＡＰ−１消化反応混合物を調製した。簡潔に記述すると、等量のＤＴＴ（２０ｍＭ）を加え、室温で４−６分間前記混合物をインキュベートすることによって、ＤＡＰ−１［ＥＣ３．４．１４．１］（１０Ｕ／ｍＬ）を活性化した。前記消化反応混合物には、実施例１４０及び１５２に記載したように大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現された５０μｇのＮ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１タンパク質及び１２．５ｍＵの活性化ＤＡＰ−１が含有されていた。タンパク質を懸濁した緩衝液（２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を加えることによって、前記反応混合物の量を７０μＬに調整した。次に、消化反応混合物をウォーターバスの中に入れ、３７℃で約２４時間インキュベートした。
【０４０１】
非ＤＡＰ−１処理陰性対照反応混合物も調製した。操作は、ＤＡＰ−１を省略したことを除いて、基本的に上述のとおりであった。
【０４０２】
インキュベーションの休止時に、両反応の活性を測定した。機能的なＧＳＴ活性の信頼できるアッセイは、ＧＳＴがグルタチオンによるＣＤＮＢの誘導体化を触媒するＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）アッセイである。３４０ｎｍの波長で光学密度を測定することによって、この錯体をモニターすることができる。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ出版の情報冊子Ｇｓｔ  Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ第３版改訂１の概説通りにこのアッセイを行った。簡潔に記述すると、ＤＡＰ−１消化前及び後の各反応混合物の１００倍希釈物１０μＬを、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、１ｍＭ  １−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）、１ｍＭ  還元グルタチオンをキュベット中に含有する１００μＬのアッセイ反応混合物に加えて、３４０ｎｍの吸光度を１分間隔で５分間測定した。本アッセイで測定したところ、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１を含有するＤＡＰ−１消化前及び消化後の反応混合物は何れも、機能的なＧＳＴ活性を示した。
【０４０３】
［実施例１５９］  ＮＴ２と称されるオリゴペプチド構築物でＮ末端にタグを施した組換え完全長グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ［ｒ−ＧＳＴ（ＦＬ）］（配列番号１）融合タンパク質（すなわち、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２）のＤＡＰ−１消化前後における活性の測定
下記の点を除いて、操作は、基本的に実施例１５８に記述したものと同様であった。
【０４０４】
前記消化反応混合物には、実施例１４１及び１５３に記載したように大腸菌細胞株ＪＭ１０５中で発現された５０μｇのＮ末端タグ化ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２タンパク質及び１２．５ｍＵの活性化ＤＡＰ−１が含有されていた。タンパク質を懸濁した緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３）を加えることによって、前記反応混合物の量を７０μＬに調整した。次に、消化反応混合物をウォーターバスの中に入れ、３７℃で約１２時間インキュベートした。
【０４０５】
非ＤＡＰ−１処理陰性対照反応混合物も調製した。操作は、ＤＡＰ−１を省略したことを除いて、基本的に上述のとおりであった。
【０４０６】
本アッセイで測定したところ、ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２を含有するＤＡＰ−１消化前及び消化後の反応混合物は何れも、機能的なＧＳＴ活性を示した。
【０４０７】
［実施例１６０］  様々なＮ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の単一段階均一濃度溶出
以下の様々なアフィニテイータグ（すなわち、ヘキサヒスチジン（ＧＳＴ−ＣＴ１）、Ｈｉｓ−Ｇｌｎの交互リピート（ＧＳＴ−ＣＴ２）、新しいタグ１（ＧＳＴ−ＮＴ１）とＮＴ２（ＧＳＴ−ＮＴ２））を、実施例９１に記載されているようにＮ末端に融合させたグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の大規模な発現から得られた粗細胞破砕液（ＣＣＬ）を、単一段階の均一濃度溶出操作によって精製した。粗細胞破砕液をＮｉ２＋−ｔａｃｎ及びＣｕ２＋−ｔａｃｎの両カラムにかけた。各カラム（１０ｍＬ  エコノカラム、Ｂｉｏ−ＲａｄＴＭ）のベッド容積は０．５ｍＬで、緩衝液Ａ１［緩衝液Ａ１＝緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸緩衝液、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）＋１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８］により平衡化した。前記カラムに０．５ｍＬ（ＣＣＬ）＋４．５ｍＬの緩衝液Ａ１を含有する５ｍＬの試料を添加した。試料がカラムを通過した後に、カラムを緩衝液Ａ１（５ｍＬ）で洗浄した。緩衝液Ａ２（緩衝液Ａ２＝緩衝液Ａ＋２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８）を用いて，２度目の洗浄（５ｍＬ）を行った。３×１ｍＬの溶出緩衝液（ＢＡ＋５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）をカラムにロードすることによって溶出を行った。
【０４０８】
［実施例１６１］  単一段階均一濃度溶出を用いた様々なＮ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の精製で得られた前記第一の溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
実施例１６０に記載したように、それぞれをＮｉ２＋−ｔａｃｎ及びＣｕ２＋−ｔａｃｎカラムにかけた様々なＮ末端タグ化ＧＳＴ融合タンパク質の単一段階均一濃度溶出から収集した第一の溶出分画を一定分量採って、ＳＤＳ添加緩衝液（還元性）と混合し、１００℃で９０秒間加熱した。次に、試料を１５％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上に添加し、適切な時間にわたって展開した。１６μＬの溶出分画と２μＬの分子量マーカー［Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）］を前記ゲル上に添加した。バンドを可視化するために、前記ゲルを銀染色した。染色したゲルを図５７に示す。
【０４０９】
［実施例１６２］  Ｎ末端にＮＴ２−ＶＤタグを施したヒト成長ホルモン（ＮＴ２−ＶＤ−ｈＧＨ；ＭＫＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲＶＤ−ｈＧＨ）の精製。ＤＡＰ−１によるタグの切断と成熟ｈＧＨの単離
基本的に実施例１２７に記載したように生成されたプラスミド構築物を用いて、１リットルの振盪容器中でＮ末端タグ化融合タンパク質ＮＴ２−ＶＤ−ｈＧＨ、すなわちＭＫＨＴＮＩＨＱＤＱＨＮＨＦＨＲＶＤ−ｈＧＨを発現した。ペレットを収集して水で洗浄した。次に、２５０μＬのリゾチーム（３０ｍｇ／ｍＬ）と１．２５μＬのベンゾナーゼを加えることによって、溶解緩衝液（２０ｍＬ  ２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中で２５０ｍＬの前記ペレットを溶解した。懸濁液を５℃で１時間放置した後に、遠心分離を行った。上清を収集して８０ｍＬの溶解緩衝液で希釈した後、３ｍＬ／分の速度で１５ｍＬの固定化Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムに導入し、続けて１５０ｍＬ緩衝液を加えた。次いで、２％溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＬ  イミダゾール、ｐＨ８）を含む１５０ｍＬの溶解緩衝液でカラムを洗浄した後、４％溶出緩衝液を含む１５０ｍＬ溶解緩衝液で洗浄した。その後、７５ｍＬの総量について、４％から１００％の溶出緩衝液を用いて勾配溶出を行い、続いて１００％溶出緩衝液７５ｍＬを用いて溶出した。
【０４１０】
電気泳動法により所望の生成物を含有する溶出分画を同定して、プールし、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．３に対して脱塩した後、３７℃に加熱した。活性化ＤＡＰ−１（１２５μＬ  ＤＡＰ−１＋２５μＬ  １００ｍＭ  ＤＴＴ、室温で５分間インキュベートした）を脱塩画分に添加した後、２７０分の間に培地のｐＨを約６．３から５．１の間で何度も変化させた。次に、培地を週末まで５℃及びｐＨ５で放置した。その後、切断したプールを遠心分離して、上清を収集し、ｐＨ８になるように調整して、１ｍＬの固定化Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラム上に導入した。次に、カラムを基本的に上述のように０．１８ｍＬ／分の流速で溶出し、ｈＧＨを含有するピークを収集した。下記のスキーム１４に示されているように、ＳＤＳ−Ｐａｇｅとウェスタンブロットによって分析した。
【化２７】
2005526487.tif 000034
【０４１１】
スキーム１４．（Ａ）コロイダルブルー染色を用いたＳＤＳ−Ｐａｇｅ（±還元）及び（Ｂ）選択した試料のウェスタンブロット分析。レーン１−６：還元試料；レーン７−１０非還元試料（レーン１：分子量マーカー；レーン２：ｈＧＨ標準；レーン３：溶解した生成物；レーン４：単離したタグ化ｈＧＨ；レーン５：切断された生成物；レーン６：２度目のＮｉ２＋−ｔａｃｎカラム溶出操作後に得られた切断生成物；レーン７：ｈＧＨ標準；レーン８：溶解した生成物；レーン９：切断生成物；レーン１０：２度目のＮｉ２＋−ｔａｃｎカラム溶出操作後に得られた切断生成物
さらに、推定精度５０ダルトンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって多数の試料を分析し、単離したタグ化生成物の分子量が２４，４４４ダルトンであることを明らかにした（理論値は２４，４０２ダルトン）。切断と２度目のＮｉ２＋−ｔａｃｎカラム溶出の後には、２２，１５６ダルトンの分子量が測定された（理論値は２４，１２５ダルトン）。ｈＧＨ標準試料の分子量は２２，１４７ダルトンであった。
【０４１２】
［実施例１６３］  Ｎｉ２＋-ｔａｃｎカラム溶出後のＣｕ２＋−ｔａｃｎカラム溶出によるＣＴ２−ＶＤ−ｈＧＨ（ＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＶＤ−ｈＧＨ）の精製
基本的に実施例１２７に記載したように生成されたプラスミド構築物を用いて、１リットルの振盪容器中でＮ末端タグ化融合タンパク質ＣＴ２−ＶＤ−ｈＧＨ、すなわちＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＶＤ−ｈＧＨを発現した。ペレットを収集して水で洗浄した。次に、実施例１６２に記載したように、２５０ｍＬから得られたペレットを溶解緩衝液中で溶解した。懸濁液を５℃で１時間放置した後に、懸濁液の遠心分離を行った。上清を収集して、その半分の量を４０ｍＬの溶解緩衝液で希釈後、１ｍＬ／分の速度で５ｍＬの固定化Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムに導入した後、２０ｍＬ緩衝液を流した。次に、前記カラムを２％溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ０４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＬ  イミダゾール、ｐＨ８）を含む５０ｍＬの溶解緩衝液で洗浄後、４％の溶出緩衝液を含む５０ｍＬの溶解緩衝液で洗浄した。その後、総量２５ｍＬに対して４％から１００％の溶出緩衝液を用いて勾配溶出を行った後、１００％の溶出緩衝液２５ｍＬを用いて溶出した。
【０４１３】
電気泳動により所望のタグ化生成物を含有する溶出画分を同定し、これをプールして、溶解緩衝液に対して脱塩した。脱塩したプールを溶解緩衝液で５倍に希釈し、５ｍＬのＣｕ２＋−ｔａｃｎカラム上に導入した。Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムの溶出緩衝液と速度は上述のとおりであった。同様に、タグ化ｈＧＨ生成物を含有するそれぞれの分画をプールし、脱塩した。
【０４１４】
下記のスキーム１５に示されているように、選択した試料をＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分析した。
【化２８】
2005526487.tif 000035
【０４１５】
スキーム１５．非還元ＳＤＳ−Ｐａｇｅ。レーン１：ＭＷマーカー；レーン２：ｈＧＨ標準；レーン３：Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラム精製から得た透析プール；レーン４：Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムにＮｉ２＋−ｔａｃｎカラムから得たプールを導入した後のスループット；レーン５：洗浄１；レーン６：洗浄２；レーン７：標識ｈＧＨ分画のプール；レーン８：レーン７と同様であるが透析を行った；レーン９：ｈＧＨ標準；レーン１０：ＭＷマーカー
本結果から、２つの異なるＭ２＋−ｔａｃｎカラムを連続して用いることによって、非ｈＧＨ関連物質の含量が著しく減少することが実証された。
【図面の簡単な説明】
【０４１６】
【図１】２０ｍＭ  炭酸ナトリウム／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５の結合緩衝液と様々な金属イオンを用いたｉｍ−Ｍｎ＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍｎ＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムに対するヒト血清タンパク質の結合様式（ここで、それぞれ、Ｍｎ＋＝Ｃｕ２＋，Ｃｏ２＋，Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋）。溶出は本明細書中の実施例（下記参照）の表１に要約されている操作を用いて行った。溶出されたタンパク質の割合＝（溶出された全タンパク質量／添加された全タンパク質量）×１００％である。
【図２】様々な試料添加条件下において、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ及び ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂバッチカラムより回収した分画から選択した分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１＝ヒト血清試料；レーン２及びレーン３＝試料添加ｐＨが４．０である場合の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの漏出／洗浄及び溶出分画；レーン４及びレーン５＝試料添加ｐＨが９．５である場合の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの漏出／洗浄及び溶出分画；レーン６及びレーン７＝添加ｐＨが４．０である場合の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの漏出／洗浄及び溶出分画；レーン８−１１＝試料添加ｐＨが９．５である場合の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの漏出／洗浄及び溶出分画。ＮａＣｌ濃度を上昇させること、及びｐＨを低下させることにより、溶出を行った。；レーン９＝１Ｍ  ＮａＣｌ、及びｐＨ＝９．５、レーン１０＝ｐＨ４．０、レーン１１＝ｐＨ４．０及び２５０ｍＭ  イミダゾール；レーン１２は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図３】２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の結合緩衝液と様々な金属イオンを用いたｉｍ−Ｍｎ＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍｎ＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムに対するヒト血清結合様式（ここで、それぞれ、Ｍｎ＋＝Ｃｕ２＋，Ｃｏ２＋，Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋）。溶出は、本明細書中の実施例（下記参照）に記載されている表２の操作を用いて行った。溶出されたタンパク質の割合＝（溶出された全タンパク質量／添加された全タンパク質量）×１００％である。
【図４】結合緩衝液のｐＨを７．０とした場合のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂバッチカラムより回収した分画から選択した分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。ＮａＣｌ濃度を１．０Ｍまで上昇させ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２を添加することによって溶出を行った。レーン１＝ヒト血清試料；レーン２及び３＝ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン４＝ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン５及び６＝１Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．０の緩衝液又は０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２を用いて、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから溶出した分画；レーン７＝ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅカラムから得た漏出／洗浄分画；レーン８及び９＝ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから１Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ７．０の緩衝液又は０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２を用いて溶出した分画；レーン１０＝ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン１１及び１２＝ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから、１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の緩衝液あるいは０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．２を用いて溶出した分画；レーン１３は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａ。
【図５】結合緩衝液が、様々な金属イオン、Ｍｎ＋＝Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋及びＮｉ２＋をそれぞれ含有する２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０である際の、ｉｍ−Ｍｎ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムに対するヒト血清の結合様式。表３の方法を用いて溶出を行った。溶出されたタンパク質の割合＝（溶出された全タンパク質量／添加された全タンパク質量）×１００％である。
【図６】様々な試料添加条件下において、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂバッチカラムより回収した分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１＝ヒト血清試料；レーン２及び３＝試料添加のｐＨが４．０である場合の、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン４及び５＝試料添加のｐＨが９．５である場合の、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画;レーン６及び７＝試料添加のｐＨが４．０である場合の、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン８−１３＝試料添加のｐＨが９．５である場合の、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画。ＮａＣｌ濃度を上昇させることにより又はｐＨを低下させることにより、溶出を行った。；レーン９＝１Ｍ  ＮａＣｌ及びｐＨ９．５、レーン１０＝ｐＨ８．０、レーン１１＝ｐＨ７．０、レーン１２＝ｐＨ６．０、レーン１３＝ｐＨ４．０及び２５０ｍＭ  イミダゾール；レーン１４は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図７】様々な添加条件下において、ｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂバッチカラムより回収した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１＝ヒト血清試料；レーン２及び３＝試料添加のｐＨが４．０である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｅカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン４及び５＝試料添加のｐＨが９．５である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン６及び７＝試料添加のｐＨが４．０である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン８及び９＝試料添加のｐＨが９．５である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの漏出／洗浄及び溶出分画；レーン１０及び１１＝試料添加のｐＨが７．０である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン１２及び１３＝試料添加のｐＨが４．０である場合のｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得た漏出／洗浄及び溶出分画；レーン１４は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図８】ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラム（５０ｍｍ×内径５ｍｍ）を用いて以下の溶出方法によって分画されたヒト血清タンパク質の溶出プロファイル：（Ｉ）ｐＨ９．５からｐＨ４．０までのｐＨ勾配、（ＩＩ）１００−１０００ｍＭまでのＮａＣｌ濃度勾配、及び（ＩＩＩ）０−２５０ｍＭまでのイミダゾール濃度勾配。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ。平衡緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５であった。
【図９】図８から選択した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１はヒト血清試料を示す；レーン２は漏出／洗浄分画を示す；レーン３及び４はｐＨ９．５からｐＨ４．０のｐＨ勾配下での溶出ピーク示す；レーン５はＮａＣｌ濃度勾配下の溶出における溶出ピークを示す；レーン６はイミダゾール濃度勾配溶出での溶出ピークを示す；レーン７は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図１０】ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラム（５０ｍｍｘ内径５ｍｍ）を用いて以下の溶出方法によって分画されたヒト血清タンパク質の溶出プロファイル：（Ｉ）ｐＨ９．５−ｐＨ４．０までのｐＨ勾配、（ＩＩ）１００−１０００ｍＭまでのＮａＣｌ濃度勾配、及び（ＩＩＩ）０−２５０ｍＭまでのイミダゾール濃度勾配。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ。平衡緩衝液は、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５であった。
【図１１】図１０から選択した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１はヒト血清試料を示す；レーン２及びレーン３は漏出／洗浄分画を示す；レーン４及びレーン５はｐＨ９．５−ｐＨ４．０のｐＨ勾配による溶出の溶出ピーク示す；レーン６−８はＮａＣｌ濃度勾配下での溶出ピークを示す；レーン９−１１はイミダゾール濃度勾配下での溶出における溶出ピークを示す；レーン１２は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図１２】ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラム（５０ｍｍｘ内径５ｍｍ）でＮａＣｌ濃度勾配とｐＨ勾配の組み合わせによって溶出されたヒト血清タンパク質の溶出プロファイル。実線（―）は波長２８０ｎｍにおける各分画の紫外線吸収を示す。破線（―  ―  ―）はＮａＣｌの濃度を示す。破線−点−点−破線（―・・―・・―）はｐＨを示す。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。平衡緩衝液は１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５であった。
【図１３】図１２から選択した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１はヒト血清試料を示す；レーン２は漏出／洗浄分画を示す；レーン３はＮａＣｌ濃度勾配溶出時の溶出ピークを示す；レーン４は１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ９．５の緩衝液による溶出時の溶出ピークを示す；レーン５は１Ｍ  ＮａＣｌ存在下でｐＨ９．５−ｐＨ６．７５のｐＨ勾配によって溶出した際の溶出ピーク示す；レーン６は１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ６．７５の緩衝液によって溶出した際の溶出ピークを示す；レーン７はｐＨ６．７５−ｐＨ４．０のｐＨ勾配による溶出及び１Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ４．０の緩衝液によるイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶出による溶出ピークを示す；レーン８は分子量スタンダードを示す。ミオシンは２１２ｋＤａ、還元型α２−マクログロブリンは１７０ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１１６ｋＤａ、トランスフェリンは７６ｋＤａ、グルタミンデヒドロゲナーゼは５３ｋＤａである。
【図１４】ｉｍ−Ｃｕ２＋−、ｉｍ−Ｎｉ２＋−及びｉｍ−Ｚｎ２＋−ｔａｃｎ，−ｄｔｎｅ及びｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体を用いて調製した種々のカラムに結合する、組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）発現物質から、バッチ吸収法によって回収したＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出液分画に存在する全タンパク質量及び酵素活性の割合。この結合実験では５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液／３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％  グリセロールを含有するｐＨ８．０の平衡緩衝液を用いた。
【図１５】この図が示しているのは、ｉｍ−Ｃｕ２＋、ｉｍ−Ｎｉ２＋及びｉｍ−Ｚｎ２＋−ｔａｃｎ、−ｄｔｎｅ及びｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラム及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから、１２５ｍＭ及び２５０ｍＭ  イミダゾールを含む溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％  グリセロール、ｐＨ７．０）によって溶出されうる結合タンパク質の量（カラムに添加した全タンパク質量に対する割合）及び、それに対応する、組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）発現物質からのＥ．ｃｏｌｉ細胞抽出液の分画化により回収された分画のＧＳＴ特異的活性である。
【図１６】組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉの粗抽出液、その粗抽出液のクロマトグラフィー分離によるカラム漏出分画及び溶出分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。分子量スタンダードは以下の通りである：オボアルブミン、４６ｋＤａ；カルボニックアンヒドラーゼ、３０ｋＤａ；トリプシンインヒビター、２１．５ｋＤａ；リゾチーム、１４．３ｋＤａ、アプロチニン、６．５ｋＤａ及びインスリンＢ鎖、３．４ｋＤａ。パネル（ａ）中のレーンはそれぞれ：レーン１、Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出液；レーン２−４、それぞれ、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ、−ｄｔｎｅ及びｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムの漏出分画；レーン５、タンパク質の分子量スタンダード；レーン６−９、それぞれ、ｉｍ−Ｚｎ２＋−ｔａｃｎ、ｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｅ、ｉｍ−Ｚｎ２＋−ｄｔｎｐ、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｅセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムの漏出分画に相当する。同様に、パネル（ｂ）のレーンは：レーン１−３が、それぞれｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ、−ｄｔｎｅ及びｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムの溶出分画；レーン４はタンパク質の分子量スタンダード；レーン５−７は、それぞれｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎ、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムからの溶出分画；レーン８及び９は、それぞれ、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐカラムから得られた漏出分画に相当している。組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６の移動位置を矢印で示す。
【図１７】５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロール、ｐＨ８．０、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化したｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体を用いた、Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出液中の他のタンパク質からの組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質のクロマトグラフィ−分離。組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６を含有するＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液を、充填カラムに添加した（１ｍＬの吸着体あたり２ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液）。（カラム体積の）１５倍量の平衡化緩衝液によって、結合しない、あるいは結合が弱いタンパク質を洗い流した。結合したタンパク質は、平衡化緩衝液中のイミダゾール濃度を０−２５０ｍＭまで２０分間に渡って直線的な勾配で上昇させることにより溶出させた。勾配溶出の完了後、２００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶出緩衝液で洗い流した。回収した分画中のＧＳＴ活性を定量し、破線（―  ―  ―）で示した。破線−点−点−破線（―・・―・・―）と実線（―）は、それぞれイミダゾールの勾配及び、それぞれの分画の波長２８０ｎｍにおける紫外線吸収を示している。
【図１８】Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出液（レーン２）及び、ｉｍ−Ｎｉ２＋ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いたＥ．ｃｏｌｉ粗抽出液のクロマトグラフィー分離によって回収された組換えＧＳＴ−δＡＴＰａｓｅ−Ｈｉｓ６タンパク質（図１７で示した）を含む溶出分画（レーン３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。タンパク質の分子量スタンダード（レーン１）は以下の通り：オボアルブミン、４６ｋＤａ；カルボニックアンヒドラーゼ、３０ｋＤａ；トリプシンインヒビター、２１．５ｋＤａ、リゾチーム、１４．３ｋＤａ。
【図１９】ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いて精製組換えＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  カテプシンＬ５（ｒＦ．ｈ  カテプシン  Ｌ５）をクロマトグラフィー分離し回収した分画、並びにｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ及びｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いて未精製酵母上清をクロマトグラフィー分離し回収した分画中で、蛍光基質Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−７−アミノ−４−メチルクマリンを用いた蛍光検出によって示されたＣ末端ヘキサヒスチジンタグ化組換えＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａカテプシンＬ５（ｒＦ．ｈカテプシンＬ５）の酵素活性。洗浄は、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の平衡化緩衝液を用いて行われた。溶出の手順１−４は、０ｍＭ、１２５ｍＭ、２５０ｍＭ又は５００ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の溶出緩衝液で行われた。
【図２０】ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの未精製上清中の他のタンパク質から、組換えＣ末端ヘキサヒスチジンタグ化組換えＦａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  カテプシンＬ５（ｒＦ．ｈカテプシンＬ５）を分離した際の溶出プロファイル。未精製の酵母上清を５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０の緩衝液を用いて０．２ｍＬ／ｍｉｎで一晩平衡化した充填カラムに添加した。結合しない、又は結合が弱いタンパク質は、それぞれカラム体積の５０倍量の平衡化緩衝液及び洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で洗い流した。次に、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の０−５００ｍＭ  イミダゾールの直線的濃度勾配によって、結合したタンパク質を溶出した。濃度勾配による溶出が完了した後、カラムを２００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶出緩衝液で洗浄した。回収された分画中のｒＦ．ｈカテプシンＬ５の活性は、蛍光分析によって定量し、破線−点−破線（―・・―・・―）によって示した。破線（―  ―  ―）、及び実線（―）はそれぞれイミダゾール濃度の勾配及び分画中のタンパク質量を示している。
【図２１】図２０で示したようなｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いて、組換えＣ末端ヘキサヒスチジンタグ付加Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ  カテプシンＬ５（ｒＦ．ｈカテプシンＬ５）を精製した際の各分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。レーン１＝未精製試料、酵母上清；レーン２＝漏出分画；レーン３＝平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた際の洗浄分画；レーン４＝洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を用いた際の洗浄分画；レーン５＝洗浄緩衝液中で０−５００ｍＭ  イミダゾールの濃度勾配を用いて溶出した分画。およそ２８．５−３４．１ｋＤａの範囲に見られるマイナーなバンドは、ｒＦ．ｈカテプシンＬ５の自己分解によってもたらされた断片のバンドである。タンパク質濃度が低い場合には、これらのバンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で認識し得ない；レーン６＝分子量スタンダード。ホスホリラーゼＢは１０３ｋＤａ、ウシ血清アルブミンは８１ｋＤａ、オボアルブミンは４６．９ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーゼ  は３４．１ｋＤａ、ダイズトリプシンインヒビターは２８．５ｋＤａ及びリゾチームは２０．２ｋＤａ；レーン７＝ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから得られた、ｒＦ．ｈカテプシンＬ５分画。
【図２２】ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎ（ａ）、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ（ｂ）、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｄｔｎｐ（ｃ）、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｄｔｎｐ（ｄ）セファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収されたヘキサヒスチジンタグ付加  ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＡＭＡ−１）を含む分画のウェスタンブロットプロファイル。レーン１＝分子量、ミオシンは２０９ｋＤａ、β−ガラクトシダーゼは１２４ｋＤａ、ウシ血清アルブミンは８０ｋＤａ、及びオボアルブミンは４９ｋＤａ；レーン２＝平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いた洗浄分画；レーン３＝５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むｐＨ６．０の緩衝液による溶出分画；レーン４＝５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１２５ｍＭ  イミダゾールを含有するｐＨ６．０の緩衝液による溶出分画；レーン５＝５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５０ｍＭ  イミダゾールを含有するｐＨ６．０の緩衝液による溶出分画；レーン６＝５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５００ｍＭ  イミダゾールを含有するｐＨ６．０の緩衝液による溶出分画；レーン７＝添加試料、酵母上清；レーン８＝コントロール試料、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｃｈａｂａｕｄｉ  ａｄａｍｉ溶解液。組換えＡＭＡ−１タンパク質は酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現した。
【図２３】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株より単離された組換えヘキサヒスチジンタグ付加グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）を、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎ、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いて回収した分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイル。ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルは、以下の分画の解析を含むものである：グループ１＝１２５ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ２＝１２５ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ３＝２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ４＝２５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ５＝５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ６＝５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液でｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムから溶出された分画；グループ７＝ｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎに結合しないタンパク質分画；グループ８＝ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎに結合しないタンパク質分画；グループ９＝添加試料、ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを用いて単離した組換えＧＡＤ６７／６５タンパク質；グループ１０＝４０ｍＭイミダゾールを含有する洗浄緩衝液を用いてｉｍ−Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムから得られた洗浄分画；グループ１１＝４０ｍＭイミダゾールを含む洗浄緩衝液を用いてｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムから得られた洗浄分画
【図２４】ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムを用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ３５０５株から単離し、回収したヘキサヒスチジンタグ化組換えタンパク質、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６７／６５）を含有する分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットのプロファイル。ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いて、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓから、添加試料を分離した。（Ａ）実験１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１：分子量スタンダード；レーン２：ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂを用いて精製した添加試料；レーン３：ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂからの漏出分画；レーン４：平衡化緩衝液を用いて得られた、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂからの洗浄分画；レーン５：２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する緩衝液を用いて得られた、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎ  セファロースＴＭＣＬ−６Ｂからの溶出分画；（Ｂ）：実験２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１：分子量スタンダード；レーン２：ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂを用いて精製した添加試料；レーン３：ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの漏出分画；レーン４：平衡化緩衝液を用いた際の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂからの洗浄分画；レーン５及び６：２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する緩衝液を用いた際の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画；レーン７：０．１Ｍ  ヒスチジンを含有する緩衝液を用いた際の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＣＬ−６Ｂの溶出分画；レーン８：１％  ＳＤＳを含有する緩衝液を用いて得られた、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画。（Ｃ）：実験３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ：レーン１：分子量スタンダード；レーン２：ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂを用いて精製した添加試料；レーン３：ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの漏出分画；レーン４：平衡化緩衝液を用いた際の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの洗浄分画；レーン５：２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する緩衝液を用いた際の、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画；レーン６：０．２Ｍ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いて得られた、ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画。（Ｄ）実験３のウエスタンブロット：レーン１：ｉｍ−Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂを用いて精製した添加試料；レーン２：ｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの漏出分画；レーン３：平衡化緩衝液を用いた際のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂからの洗浄分画；レーン４：２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する緩衝液を用いた際のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画；レーン５：０．２Ｍ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液を用いた際のｉｍ−Ｃｕ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂの溶出分画。
【図２５】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ウマ筋肉ミオグロビン（ＨＭＹＯ）の結合。本研究において、使用した緩衝液条件は、白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５であった。容量因子として、Ｙ軸（ｑ＊／ｃ＊）は、平衡状態における、ＩＭＡＣ吸着体に結合したタンパク質の量と溶液中のタンパク質の量との比に基づいた、タンパク質に対するＩＭＡＣ吸着体の見かけの親和性を示す。
【図２６】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ウマ筋肉ミオグロビン（ＨＭＹＯ）の結合  本研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５、であった。Ｙ軸、相対的結合定数、Ｋｒｅｌ（１／μｍｏｌ）は、平衡状態において吸着体に固定化された金属イオン１モルあたりの結合を基にした相対的結合能を示す。
【図２７】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ウマ心臓チトクロムＣ（ＨＣＣ）の結合。この研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５、であった。容量因子として、Ｙ軸、ｑ＊／ｃ＊は、平衡状態における溶液中のタンパク質量とＩＭＡＣ吸着体に結合したタンパク質の割合に基づいた、ＩＭＡＣ吸着体のタンパク質への見かけの親和性を示す。
【図２８】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ウマ心臓チトクロムＣ（ＨＣＣ）の結合。
【０４１７】
本研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ  ２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ ２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；斜め格子柱――緩衝液Ｄ  ２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ  ２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５。Ｙ軸、相対的結合定数、Ｋｒｅｌ（１／μｍｏｌ）は、平衡状態において吸着体に固定化された金属イオン１モルあたりの結合を基にした相対的結合能を示す。
【図２９】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）の結合。この研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０ ；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５、であった。容量因子として、Ｙ軸、ｑ＊／ｃ＊は、平衡状態における溶液中のタンパク質量とＩＭＡＣ吸着体に結合したタンパク質の割合に基づいた、ＩＭＡＣ吸着体のタンパク質への見かけの親和性を示す。
【図３０】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＷＬ）の結合。この研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ ２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５。Ｙ軸、相対的結合定数、Ｋｒｅｌ（１／μｍｏｌ）は、平衡状態において吸着体に固定化された金属イオン１モルあたりの結合に基づく相対的結合能を示す。
【図３１】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、 ウシα−ラクトアルブミン（αＬＡＣ）の結合。この研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０ ；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５、であった。容量因子として、Ｙ軸ｑ＊／ｃ＊.は、平衡状態における溶液中のタンパク質の量とＩＭＡＣ吸着体に結合したタンパク質との割合に基づいた、ＩＭＡＣ吸着体のタンパク質への見かけの親和性を示す。
【図３２】様々なｐＨ条件下における、ｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２+−ｄｔｎｐセファロースＣＬ−６Ｂ吸着体に対する、ウシα−ラクトアルブミン（αＬＡＣ）の結合。この研究における緩衝液条件は：白抜き柱――緩衝液Ａ、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；右上斜線柱――緩衝液Ｂ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；左上斜線柱――緩衝液Ｃ、２０ｍＭ  リン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、 ｐＨ７．０ ；斜め格子柱――緩衝液Ｄ、２０ｍＭリン酸カリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ, ｐＨ８．０；水平線柱――緩衝液Ｅ、２０ｍＭ  重炭酸ナトリウム／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５、であった。Ｙ軸、Ｋｒｅｌ（１／μｍｏｌ）は、平衡状態において吸着体に固定化された金属イオン１モルあたりの結合を基にした相対的結合能を示す。
【図３３】ｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体へのモデルタンパク質ＨＭＹＯの結合に対する、イオン強度の影響。固定化させた金属イオンは次のとおり、Ｃｕ２＋（黒塗り柱）、Ｎｉ２＋（白抜き柱）、Ｚｎ２＋（格子柱）、及びＣｏ２＋（付点柱）であった。緩衝液の条件は、緩衝液Ａが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ 、緩衝液Ｂが２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０、緩衝液Ｃが２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／１Ｍ  ＮａＣｌ、  ｐＨ８．０、緩衝液Ｄが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／２Ｍ  ＮａＣｌ、  ｐＨ８．０、緩衝液Ｅが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。
【図３４】ｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体へのモデルタンパク質ＨＣＣ の結合に対する、イオン強度の影響。固定化させた金属イオンは次のとおり、Ｃｕ２＋（黒塗り柱）、Ｎｉ２＋（白抜き柱）、Ｚｎ２＋（格子柱）、及びＣｏ２＋（付点柱）であった。緩衝液の条件は、緩衝液Ａが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ 、緩衝液Ｂが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０、緩衝液Ｃが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、緩衝液Ｄが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、緩衝液Ｅが２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。
【図３５】ｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｅ及びｉｍ−Ｍ２＋−ｄｔｎｐセファロースＴＭＣＬ−６Ｂ吸着体へのモデルタンパク質ＨＥＷＬの結合に対する、イオン強度の影響。固定化させた金属イオンは次のとおり、Ｃｕ２＋（黒塗り柱）、Ｎｉ２＋（白抜き柱）、Ｚｎ２＋（格子柱）、及びＣｏ２＋（付点柱）であった。緩衝液の条件は、緩衝液Ａが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ 、緩衝液Ｂが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０、緩衝液Ｃが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、緩衝液Ｄが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、緩衝液Ｅが２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液／３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。
【図３６】Ｎ−末端（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ１の小スケ−ル発現後の、複数のクローンに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。分注した細胞溶解液（実施例９０及び１０５参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で１分間加熱した。次に、これらの試料を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。およそ６０μＬの細胞溶解液と３０μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）及び１０ｋＤａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］を同じゲルに添加した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動距離に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルをクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色した。
【０４１８】
図３６で示すゲル１のポイント：  レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号１；レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号２；レーン５、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号３；レーン６、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号４；レーン７、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号５；レーン１１、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号６；レーン１２、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号７；レーン１３、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号８；レーン１４、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号９；レーン１５、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号１０；レーン８、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーは、レーン３、４及び１０に示す。
【図３７】Ｎ−末端（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ２の小スケ−ル発現後の、複数のクローンに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。分注した細胞溶解液（実施例９０及び１０５参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で１分間加熱した。次に、これらの試料を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。およそ６０μＬの細胞溶解液と３０μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）及び１０ｋＤａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］を同じゲルに添加した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的な１５アミノ酸が含有されることとなり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルをクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色した。
【０４１９】
図３７で示すゲル２のポイント：  レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号１；レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号２；レーン３、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号３；レーン６、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号４；レーン７、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号５；レーン１１、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号６；レーン１２、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号７；レーン１３、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号８；レーン１４、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号９；レーン１５、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号１０；レーン８、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーは、レーン４、５及び１０に示す。
【図３８】Ｎ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＮＴ１の小スケ−ル発現後の、複数のクローンに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。分注した細胞溶解液（実施例９０及び１０７参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で１分間加熱した。次に、これらの試料を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。およそ６０μＬの細胞溶解液と３０μＬの分子量マーカー[BenchMark Protein Ladder(Gibco BRL、Bethesda、MD、U.S.A)及び10kDa Protein Ladder(Gibco BRL)]を同じゲルに添加した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的な１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルをクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色した。
【０４２０】
図３８で示すゲル３のポイント：  レーン１、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号１；レーン２、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号２；レーン３、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号３；レーン４、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号４；レーン７、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号５；レーン１１、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号６；レーン１２、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号７；レーン１３、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号８；レーン１４、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号９、レーン１５、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号１０；レーン８、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照である。分子量マーカーは、レーン５、６及び１０に示す。
【図３９】Ｎ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＮＴ２の小スケ−ル発現後の、複数のクローンに対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。分注した細胞溶解液（実施例９０及び１０８参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で１分間加熱した。次に、これらの試料を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。およそ６０μＬの細胞溶解液と３０μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）及び１０ｋＤａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）］を同じゲルに添加した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端に１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに１５アミノ酸が付加されることになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルをクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色した。
【０４２１】
図３９で示すゲル１のポイント：  レーン１、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号１；レーン２、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号２；レーン３、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号３；レーン４、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号４；レーン５、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号５；レーン１１、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号６；レーン１２、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号７；レーン１３、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号８；レーン１４、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号９；レーン８、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン９、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーは、レーン６、７及び１０に示す。
【図４０】高レベルの発現を示すことにより選択したクローン由来のＮ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質の小スケ−ル発現後の、未精製細胞溶解液に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。分注した細胞溶解液（実施例９０及び１０８参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で１分間加熱した。次に、これらの試料を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。およそ２μＬの細胞溶解液及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）を同じゲルに添加した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルを銀染色した。
【０４２２】
図４０で示すゲル５のポイント：レーン１、ＧＳＴ−ＣＴ１クローン番号７；レーン２、ＧＳＴ−ＣＴ２クローン番号６；レーン６、ＧＳＴ−ＮＴ１クローン番号１；レーン７、ＧＳＴ−ＮＴ２クローン番号７；レーン４、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照；レーン５、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照。分子量マーカーは、レーン３に示す。
【図４１】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ１のバッチ精製により回収した複数の分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。細胞溶解液及びバッチ精製から回収した分画を分注した試料（実施例９３参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。およそ１０μＬの精製分画試料と、５μＬのポジティブ及び陰性対照細胞溶解液、及び組換え融合タンパク質を含有する１．２５μＬの細胞溶解液、及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルを銀染色した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現させる。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに追加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。
【０４２３】
図４１で示すゲル６のポイント：  レーン３−５には、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収したＧＳＴ−ＣＴ１試料が添加され、レーン６−８には、Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収した試料が添加されている。レーン３及び６は、洗浄２のステップに対応し、レーン４及び７は溶出１のステップに対応し、レーン５及び８は、溶出２のステップに対応する。レーン１は、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン２は、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照、レーン１０は、未精製細胞溶解液である。分子量マーカーは、レーン９に示す。
【図４２】高発現レベルを示すことにより選択したクローンから得たＮ−末端（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ２のバッチ精製から回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。細胞溶解液及び、バッチ精製から回収した分画を分注した試料（実施例１１１参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。およそ１０μＬの精製分画試料と、５μＬのポジティブ及び陰性対照細胞溶解液、及び組換え融合タンパク質を含有する１．２５μＬの細胞溶解液、及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。バンドを可視化するために、泳動を行ったゲルを銀染色した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。
【０４２４】
図４２で示すゲル７のポイント：  レーン３−５には、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収したＧＳＴ−ＣＴ２試料が添加され、レーン６−８には、Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収した試料が添加されている。レーン３及び６は、洗浄２のステップに対応し、レーン４及び７は溶出１のステップに対応し、レーン５及び８は、溶出２のステップに対応する。レーン１は、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン２は、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照、レーン９は未精製細胞溶解液である。分子量マーカーはレーン１０に示す。
【図４３】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＮＴ１のバッチ精製から回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。細胞溶解液及びバッチ精製より回収した分画を分注した試料（実施例１１２参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。およそ１０μＬの精製分画試料と、５μＬのポジティブ及び陰性対照細胞溶解液、及び組換え融合タンパク質を含有する１．２５μＬの細胞溶解液、及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。バンドを可視化するために、泳動に用いたゲルを銀染色した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに結合させた形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに追加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。
【０４２５】
図４３で示すゲル８のポイント：レーン５−７には、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収したＧＳＴ−ＮＴ１試料が添加され、レーン８−１０には、Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収した試料が添加されている。レーン５及び８は、洗浄２のステップに対応し、レーン６及び９は溶出１のステップに対応し、レーン７及び１０は、溶出２のステップに対応する。レーン１は、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン２は、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照、レーン３は、未精製細胞溶解液である。分子量マーカーは、レーン４に示す。
【図４４】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＮＴ２のバッチ精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。細胞溶解液及びバッチ精製より回収した分画を分注した試料（実施例１１３参照）をＳＤＳローディング緩衝液（還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。およそ１０μＬの精製分画試料と、５μＬのポジティブ及び陰性対照細胞溶解液、及び組換え融合タンパク質を含有する１．２５μＬの細胞溶解液、及び１μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加し、適当な時間、泳動を行った。バンドを可視化するために、泳動したゲルを銀染色した。陽性対照としてｐＧＥＸ３ＸＧＳＴ形質転換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。Ｎ−末端にタグを付加させたｒ−ＧＳＴ融合タンパク質の、ｒ−ＧＳＴコンポーネントのＣ−末端において１アミノ酸が切断されている。元のＧＳＴは、Ｃ−末端に１４個のアミノ酸をさらに付加した形で全長タンパク質として発現される。その結果として、元のＧＳＴは、Ｃ−末端にさらに付加的に１５アミノ酸を含有することになり、従って、Ｎ−末端タグ付加ｒ−ＧＳＴ融合タンパク質のＧＳＴコンポーネントよりも分子量として約１．６５ｋＤａ大きい分子の移動度に相当する位置に移動する。陰性対照として、ｐＴｒｃで形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０５細胞を用いた。
【０４２６】
図４４で示すゲル８のポイント：レーン５−７には、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収したＧＳＴ−ＮＴ２試料が添加され、レーン８−１０には、Ｎｉ２＋−ＮＴＡセファロースＴＭＣＬ−６Ｂカラムから回収した試料が添加されている。レーン５及び８は、洗浄２のステップに対応し、レーン６及び９は溶出１のステップに対応し、レーン７及び１０は、溶出２のステップに対応する。レーン１は、ｐＴｒｃを用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陰性対照、レーン２は、ｐＧＥＸ３ＸＧＳＴを用いて形質転換したＥ−ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５から成る陽性対照、レーン４は、未精製細胞溶解液である。分子量マーカーは、レーン３に示す。
【図４５】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端（Ｈｉｓ）６−タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ１の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例９７で記述されているように、ＧＳＴ−ＣＴ１を含有する細胞溶解液の段階溶出により得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した分画の最初の１ｍＬから１０μＬを分注したもの及び２．５μＬの細胞溶解液を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４４に対する説明で記述しているように、このゲルに対して適当な時間泳動し、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４２７】
図４５で示すゲル１０のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、１００ｍＭ；レーン３、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ及びレーン１０、５００ｍＭ。細胞溶解液は、レーン２に示す。
【図４６】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６−タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＣＴ２の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例９８で記述されているように、ＧＳＴ−ＣＴ２を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し、１００℃で９０秒間加熱した。溶出した分画の最初の１ｍＬから１０μＬを分注したもの及び２．５μＬの細胞溶解液を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４４に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４２８】
図４６で示すゲル１１のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン３、２００ｍＭ；レーン４、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ及びレーン１０、５００ｍＭ。細胞溶解液は、レーン５に示す。
【図４７】高発現レベルを示すことにより選択したクローンから得たＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質、ＧＳＴ−ＮＴ１の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例９９で記述されているように、ＧＳＴ−ＮＴ１を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した分画の最初の１ｍＬから１０μＬを分注したもの及び２．５μＬの細胞溶解液を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４４に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４２９】
図４７で示すゲル１２のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン２、１００ｍＭ；レーン３、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ及びレーン１０、５００ｍＭ。細胞溶解液は、レーン１に示す。
【図４８】発現レベルに基づいて選択したクローンから得たＮ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の段階的精製から回収した複数の分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例１００に記載されているように、ＧＳＴ−ＮＴ２を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した分画の最初の１ｍＬから１０μＬを分注したもの及び２．５μＬの細胞溶解液を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４４に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４３０】
図４８で示すゲル１３のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ及びレーン１０、５００ｍＭ。細胞溶解液は、レーン３に示す。
【図４９】発現レベルに基づいて選択したクローンから得たＮ末端（Ｈｉｓ）６タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ１の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例１０１で記述されているように、ＧＳＴ−ＣＴ１を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した各分画の最初の１ｍＬからおよそ１６μＬを分注したもの及び０．５μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４４に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４３１】
図４９で示すゲル１４のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン２、２５ｍＭ；レーン３、５０ｍＭ；レーン４、７５ｍＭ；レーン５、１００ｍＭ；レーン６、１５０ｍＭ；レーン７、２００ｍＭ；レーン８、２５０ｍＭ；レーン９、３００ｍＭ及びレーン１０、３５０ｍＭ。分子量マーカーは、レーン１に示す。
【図５０】高発現レベルを示すことにより選択したクローンから得たＮ−末端（Ｈｉｓ−Ｇｌｎ）６−タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＣＴ２の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例１０２で記述されているように、ＧＳＴ−ＣＴ２を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した各分画の最初の１ｍＬからおよそ１６μＬを分注したもの及び０．５μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４５に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４３２】
図５０で示すゲル１５のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、２５ｍＭ；レーン３、５０ｍＭ；レーン４、７５ｍＭ；レーン５、１００ｍＭ；レーン６、１５０ｍＭ；レーン７、２００ｍＭ；レーン８、２５０ｍＭ；レーン９、３００ｍＭ及びレーン１０、３５０ｍＭ。分子量マーカーは、レーン２に示す。
【図５１】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ−末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ１の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例１０３で記述されているようにＧＳＴ−ＮＴ１を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した各分画の最初の１ｍＬからおよそ１６μＬを分注したもの及び０．５μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］とを１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４５に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４３３】
図５１で示すゲル１６のポイント：  次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、１００ｍＭ；レーン２、１５０ｍＭ；レーン４、２００ｍＭ；レーン５、２５０ｍＭ；レーン６、３００ｍＭ；レーン７、３５０ｍＭ；レーン８、４００ｍＭ；レーン９、４５０ｍＭ及びレーン１０、５００ｍＭ。分子量マーカーは、レーン３に示す。
【図５２】発現レベルにより選択したクローンから得たＮ末端タグ化組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｒ−ＧＳＴ）融合タンパク質ＧＳＴ−ＮＴ２の段階的精製より回収した複数の分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。実施例１０４で記述されているように、ＧＳＴ−ＮＴ２を含有する細胞溶解液の段階溶出より得た試料をＳＤＳローディング緩衝液（非還元）と混合し１００℃で９０秒間加熱した。溶出した各分画の最初の１ｍＬから１６μＬを分注したもの及び０．５μＬの分子量マーカー［ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｕ．Ｓ．Ａ）］を１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに添加した。図３５−４５に対する説明で記述しているように、このゲルを適当な時間泳動し、次に、バンドを可視化するためにゲルを銀染色した。
【０４３４】
図５２で示すゲル１７のポイント：次に挙げる濃度のイミダゾールを添加した緩衝液Ａ系（表１）を用いて分画を回収した。レーン１、５０ｍＭ；レーン２、７５ｍＭ；レーン３、１００ｍＭ；レーン５、１５０ｍＭ；レーン６、２００ｍＭ；レーン７、２５０ｍＭ；レーン８、３００ｍＭ；レーン９、３５０ｍＭ及びレーン１０、４００ｍＭ。分子量マーカーは、レーン４に示す。
【図５３】スペクトル１：  非−ＤＡＰ−１−処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２融合タンパク質に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル、即ち、陰性対照。これは、単一のピーク（１と表示されているもの）を示し、［Ｍ＋Ｈ］＋値は２８，０１３±３．２１Ｄａｌｔｏｎである。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２の予想される理論上の同位体分子質量は２８，００７．３Ｄａｌｔｏｎである。このように、これらを比較すると、実測分子質量は、インタクトなＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２タンパク質の予想値と一致する。スペクトル２：ＤＡＰ−１−消化したＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２に対して得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、ＤＡＰ−１で２時間処理を行った後、分子質量が低下したことを表す。スペクトル２は、［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２６，１５４±６Ｄａｌｔｏｎであるメジャーピーク（２ａ）及び、［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２５，９３１±７．５１Ｄａｌｔｏｎであるマイナーピーク（２ｂ）を示す。
【図５４】スペクトル１：  ＤＡＰ−１−非処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１融合タンパク質（即ち、陰性対照）に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル。これは、単一のピーク（１と表示されているもの）を示し、［Ｍ＋Ｈ］＋値は２７，９７２±３．５１Ｄａｌｔｏｎである。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１の予想される理論上の分子質量が２７，９６５．３Ｄａｌｔｏｎであることと比較すると、実測質量が、インタクトなＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１タンパク質の予想値と一致する。スペクトル２：ＤＡＰ−１−消化（２時間）したＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１に対して得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルである。このスペクトルは、ＤＡＰ−１を用いて２時間処理を行った後に分子質量が低下していることを表す。スペクトル２は、［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２６，６５９±６．８１Ｄａｌｔｏｎであるメジャーピーク（２ａ）を示す。また、［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２５，９３４±３．２１Ｄａｌｔｏｎであるマイナーピーク（２ｂ）及び［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２５，６８０±６．０３Ｄａｌｔｏｎであるさらにマイナーピーク（２ｃ）をも示す。
【図５５】スペクトル１： ＤＡＰ−１−非処理ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２融合タンパク質に対するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトル、即ち、陰性対照。これは、単一のピーク（１と表示されているもの）を示し、［Ｍ＋Ｈ］＋値は２８，２２３±２．８９Ｄａｌｔｏｎである。ＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２の予想される理論的分子質量が２８，２１８．６Ｄａｌｔｏｎであることと比較して、実測された理論上の分子質量はこのように、インタクトなＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２タンパク質の値と一致する。スペクトル２：ＤＡＰ−１−消化（２時間）したＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２に対して得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ スペクトルである。このスペクトルは、ＤＡＰ−１で２時間処理を行った後に分子質量が低下していることを表す。スペクトル２は、［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２５，９１０±９．１６Ｄａｌｔｏｎであるメジャーピーク（２ａ）及び［Ｍ＋Ｈ］＋値の平均値が２５，６４８±１２．８６Ｄａｌｔｏｎであるマイナーピーク（２ｂ）を示す。
【図５６】ゲルのポイント：  レーン４、ＤＡＰ−１処理前のＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２；レーン５、ＤＡＰ−１処理後のＧＳＴ（ＦＬ）−ＣＴ２ ；レーン６、ＤＡＰ−１処理前のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１；レーン７、ＤＡＰ−１処理後のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ１；レーン８、ＤＡＰ−１処理前のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２；レーン９、ＤＡＰ−１処理後のＧＳＴ（ＦＬ）−ＮＴ２。レーン１、３及び１０は、試料を添加しなかった。分子量マーカーはレーン２に示す。
【図５７】ゲルのポイント：  レーン２、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＣＴ１；レーン３、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＣＴ２；レーン４、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＮＴ１；レーン５、Ｎｉ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＮＴ２；レーン６、Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＣＴ１；レーン７、Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＣＴ２、レーン８、Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＮＴ１；レーン９、Ｃｕ２＋−ｔａｃｎカラムで精製したＧＳＴ−ＮＴ２。分子量マーカーはレーン１に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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