(57)【要約】【課題】            植物成長調節物質を含む組成物の商業ベースで量産可能な生産方法及び当該組成物。【解決手段】        植物成長調節物質を含む組成物の調製方法は、長波長光の存在下かつ撹拌の実質的不存在下において少なくとも１０％の有効炭水化物を含む培地で菌類菌糸を培養すること、但し該培地は更にカリウムイオン及びカロテンを含むこと；培養濾液を回収すること；前記培養濾液中の可溶性タンパク質を変性し、当該変性タンパク質を除去すること；前記組成物を得るために残留する培養濾液を滅菌することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物成長調節物質を含む組成物であって、
長波長光の存在下かつ撹拌の実質的不存在下において少なくとも１０％の有効炭水化物を含む培地でインキュベートした菌類菌糸の培養物から回収した滅菌培養濾液であり、該培地は更にカリウムイオン及びカロテンを含む
組成物。
【請求項２】
植物の成長及び／又は発生の促進のために投与するための処方物であって、
植物成長調節物質を含む組成物の有効量を含み、
該組成物は、長波長光の存在下かつ撹拌の実質的不存在下において少なくとも１０％の有効炭水化物を含む培地でインキュベートした菌類の菌糸の培養物から回収し任意的に乾燥した滅菌培養濾液であり、該培地は更にカリウムイオン及びカロテンを含む
処方物。
【請求項３】
前記培地のＢＲＩＣ値が１２〜１５である請求項２の処方物。
【請求項４】
前記培地は、糖蜜及び／又はパイナップル又はパパイヤシロップ又はジュースを含む請求項２の処方物。
【請求項５】
前記培地は、黄色を付与するために十分なカロテン、及び０．０１％〜０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＫ＋を含む請求項２の処方物。
【請求項６】
前記菌類菌糸は、担子菌の菌糸である請求項２の処方物。
【請求項７】
前記担子菌は、ポリポラス菌である請求項６の処方物。
【請求項８】
前記ポリポラス菌は、褐色腐れ病ポリポラス菌である請求項７の処方物。
【請求項９】
前記褐色腐れ病ポリポラス菌は、ラエチポラス（Laetiporus）である請求項８の処方物。
【請求項１０】
植物成長調節物質を含む組成物の調製方法であって、
長波長光の存在下かつ撹拌の実質的不存在下において少なくとも１０％の有効炭水化物を含む培地で増殖された菌類菌糸培養物の濾液を滅菌することを含み、該培地は更にカリウムイオン及びカロテンを含む
方法。
【請求項１１】
植物成長調節物質を含む組成物の調製方法であって、
長波長光の存在下かつ撹拌の実質的不存在下において少なくとも１０％の有効炭水化物を含む培地で菌類菌糸を培養すること、但し該培地は更にカリウムイオン及びカロテンを含むこと；
培養濾液を回収すること；
前記培養濾液中の可溶性タンパク質を変性し、当該変性タンパク質を除去すること；
前記組成物を得るために残留する培養濾液を滅菌すること
を含む方法。
【請求項１２】
前記培地は、黄色を付与するために十分なカロテン、及び０．０１％〜０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＫ＋を含む請求１１の方法。
【請求項１３】
前記培養濾液は、培養物を濾過することにより回収される請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記変性タンパク質は、濾過によって除去される請求項１１の方法。
【請求項１５】
前記滅菌は、低温殺菌によって行われる請求項１０の方法。
【請求項１６】
前記滅菌は、低温殺菌によって行われる請求項１１の方法。
【請求項１７】
前記菌類菌糸は、担子菌の菌糸である請求項１０の方法。
【請求項１８】
前記担子菌は、ポリポラス菌である請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記ポリポラス菌は、褐色腐れ病ポリポラス菌である請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記褐色腐れ病ポリポラス菌は、ラエチポラスである請求項１９の方法。
【請求項２１】
植物の生長、発生又はバルク化を促進する方法であって、
前記植物の種子又は該植物の少なくとも一部を請求項２の処方物と接触させることを含む方法。
【請求項２２】
前記処方物は、更に、少なくとも１つの農薬及び／又は少なくとも１つの栄養素及び／又は少なくとも１つの除草剤を含む請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記処方物は、更に、フィトアレキシン産生のための少なくとも１つの誘導因子を含む請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記組成物で被覆された珪藻土又は肥料粒子を含む請求項２の処方物。
【請求項２５】
前記植物の種子又は該植物の少なくとも一部を、少なくとも１つの農薬及び／又は少なくとも１つの栄養素及び／又は少なくとも１つの除草剤と接触させることを含む請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００２年７月１６日付で出願された米国仮出願第６０／３９６，８３３号に基づく利益を主張する。なお、この仮出願の開示内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、食用及び観賞用植物の成長の促進及び品質の向上をする処方物に関する。とりわけ、本発明は、炭水化物（糖質）高含有培地、好ましくは農業廃棄物、のコンポスト（堆肥）化から得られる滅菌濾液に関する。
【背景技術】
【０００３】
食用植物の生産性を高めるために、栄養サプリメントとしての肥料の使用、害虫発生（infestation）の負の効果に対抗するための農薬の投与、及びオーキシンやジベレリン酸のような成長ホルモンの補充等を含む幾多もの方策が図られてきた。これらの方策は何れも、とりわけ合成物質を用いて実行される場合、環境の容認できない変化及びこれに付随する生態系の不均衡に関する問題を引き起こす。
【０００４】
植物成長制御因子はある種の菌類によって産生されると理解される。例えば、ジベレリン、インドール酢酸、サイトカイニン、及び植物の生長の調節に有用なその他の化合物は、ブリズエラ（Brizuela）,M.A., et al., Revista Ibero Americana de Mycologgia（1998）15:69-74において概説されたように、担子菌類（Basidiomycetes）に見出される。植物成長制御因子ジヒドロアンプリシン（dihydroampullicin）は、菌類アンプリフェリナ（Ampulliferina）（キムラ、Y., et al., Bioscience Biotech. & Biochem.（1993）57:687-688）によって産生される。アカパンカビ属及び種々の植物病原性菌類は植物成長制御因子を産生することが一般的に知られている。ポリポラス・バージカラー（Polyporus versicolor）即ち白腐れ多孔菌が植物成長制御因子を産生することも知られている。しかしながら、植物成長因子の産生を促進する培養条件は多様である。
【０００５】
担子菌類は、ジベレリン、オーキシン、インドール酢酸、アブシシン酸、サイトカイニン及びエチレン、並びにその他の植物刺激性代謝物を産生することが示されている。しかしながら、これらの因子の産生は、植物自体と関連した場合における生産又は小規模の実験室レベルでの生産という限りにおいて示されているに過ぎない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、商業ベースで、とりわけ担子菌類等の菌類から植物成長因子を生産する方法を提供する。この商業ベースでの生産は不可能であると一般的には考えられていた。例えば、「応用菌類学ハンドブック（Handbook of Applied Mycology）」、Vol.4, Fungal Biotechnology（1992）588頁には以下のような記載がある：
タフリナ（Taphrina）とエクソバシジウム（Exobasidium）の種が宿主植物の被寄生組織の表層に酵母様細胞と胞子を生成したということは非常に興味深いことである。合成培地における液内発酵（ＳＭＦ）プロセスで成長させる場合、これらの菌類によるサイトカイニン（ＣＫ）の産生は、酵母様細胞の形態でＳＭＦ培地において成長したにも関わらず、ごく僅かであるため、宿主植物内で自発的に生じる大きな形態変化を引き起こすことはできなかった。従って、宿主組織で成長するタフリナの病原性菌糸細胞によるＣＫの産生は量が全く異なったことが強調されている。宿主組織上での上記菌類の上述の種類の成長に対する固体発酵技術による上記菌類の成長の著しい類似性はよく知られている。
【０００７】
更に、上記の文献には、以下のような記載もある：
絶対寄生性、菌根性、子嚢菌性、及び担子菌性菌類は、培養上の問題及び遅い成長速度のため、ＣＫ（サイトカイニン）の発酵による産生は不可能であることは明らかである。
ダウンストリームプロセッシングは、極めて少量のＧＡ３（ジベレリン酸３）を分離するために大体積の液体の処理を伴い、従ってクエン酸やグルコン酸のような他の発酵産物と比較すると多大なコストを要する。
濾過又は遠心分離による菌糸体細胞の分離後、ＧＡ３は、適当な樹脂／吸着剤において吸着されるか、又は適当な溶媒において抽出される。更なる精製は、繰り返し液液分配、真空濃縮、及びＧＡ３の非晶質粉末又は結晶を得るための最終処理のような一連の処理を伴う。
【０００８】
従って、或る植物寄生菌類が植物成長調節因子を産生することが知られているとしても、その菌類は、培養、抽出及び濃縮ステップが取られない限り実用に供される発酵系では、当該植物成長調節因子（ＰＧＲ）を大量に産生することはできない。
【０００９】
環境に優しい成長刺激剤は、菌類菌糸の存在下農業廃棄物を堆肥化し、培養濾液を滅菌し、そして生成した「液状堆肥（コンポスト）因子（ＬＣＦ：liquid compost factor）」を、それも水で１：５００〜１：１０，０００に希釈したものでさえも、圃場作物（農作物）に直接投与することによって供給することができることが判明している。有用な溶液を得るための抽出や化学分離ステップは不要である。加熱及び濾過のみが必要とされる。抽出又は濃縮のための溶媒又は樹脂床は不要である。加熱液状培養溶液の濾過ステップからの固形物及びフィルタ材料自体は、乾燥して植物成長刺激剤として使用することもできる。乾燥した材料は、堆肥（コンポスト）に添加剤として添加することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、迅速な根成長及び植物バルク化並びに農作物、樹木及びその他の植物の生産性の向上を刺激する組成物であって、好ましくは農業廃棄物において、少なくとも高濃度の有効炭水化物を含む培地において成長した菌類菌糸の低温殺菌培養濾液を含む組成物を提供する。得られた「液状堆肥因子（ＬＣＦ）」は、多くの作物へ種々の方法で投与して、成長及び生産速度を向上することができる。
【００１１】
従って、１つの側面では、本発明は、植物サプリメントを調製する方法であって、光の存在下及び菌糸体のマットが乱されない条件での通気の存在下少なくとも１０％の有効炭水化物濃度を含む培地において菌類菌糸を培養すること、該培養物を採取すること、タンパク質を変性すること、固形物を除去すること、及び濾液に対し低温殺菌その他の滅菌処理をすることを含み、かくして本発明の組成物を得る方法を提供する。他の側面では、本発明は、この方法によって調製された組成物を提供する。従って、本発明の組成物は、好ましくは農業廃棄物を含む高炭水化物培地で成長された菌類菌糸培養物の滅菌培養濾液を含む。更なる他の側面では、本発明は、この組成物を単独で又は他の成長プロモータと組合せて用いて、植物の成長及び生産性を向上させる方法を提供する。従って、本発明は、また、本発明の組成物が単独で又は例えば除草剤、殺虫剤、殺線虫剤又はその他の成長刺激因子若しくは栄養素との組合せで使用されるか否かに関わらず、本発明の組成物を用いて植物を培養ないし栽培する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、「液状堆肥因子（ＬＣＦ）」と称される環境に優しい植物成長刺激組成物に関する。ＬＣＦは、特殊な条件下及び高炭水化物培地で成長させた菌類菌糸培養物の滅菌培養濾液である。本発明の組成物は、菌類菌糸からの滅菌濾液並びにその乾燥物及び濾過から回収された固形物の乾燥物を含む。典型的には、これら組成物の何れかは、水性溶液で希釈される。得られた希釈ＬＣＦは、トウモロコシ、サトイモ、レタス、ダイズ、キュウリ、パイナップル及びその他の食用作物のような農作物に投与されると、根成長を刺激し、果実生産性を向上し、及び作物収量を改善することができる。ＬＣＦは、確立された作物において線虫侵襲症候を緩和することが示されており、菌性斑点病、葉腐敗病（leaf rot）及び細菌性球根腐敗病（bacterial bulb rot）の緩和ような疾患緩和に役立つ。また、ＬＣＦは、観賞用植物に使用することも可能であり、開花を促進することができる。芝生に対しても効果があり、緑化を促進する。また、ＬＣＦは、切花及び葉の寿命を延ばすためにも使用可能である。また、ＬＣＦは、樹木の成長の促進、従って例えば森林再生活動の支援にも有用である。
【００１３】
本発明のＬＣＦは、菌性培養物の二次代謝産物である植物成長調節因子、並びに植物防御機構の誘発因子を含む。これら植物性調節因子の生産は、適切な培養条件、適切な培地組成、及び適切な培養後処理によって引き起こされる。培地は、ＰＧＲの代謝的産生のための適切な前駆体と共にこの生産を引き起こすために十分な有効炭水化物及び十分なカリウムイオンを含んでいなければならない。糖蜜は、凡そ２％〜６％のカリウムを含み、好ましい環境許容性原料であるが、バナナ、ジャガイモ、プルーン、オレンジ、トマト、アーティチョーク、カボチャ、ブドウ、ヒマワリ、ホウレンソウ、シード又はアーモンドのような他の原料も同様に使用することができる。Ｋ＋の終濃度は、０．００５％〜０．１％ｗｔ／ｖｏｌであるべきだが、０．０１％〜０．１％ｗｔ／ｖｏｌが好ましい。
【００１４】
一般に、有効炭水化物含量が大きいほど、植物成長調節因子の生産性も大きくなる。しかしながら、糖としての炭水化物の濃度が過大であれば、許容限度を越えて浸透圧が大きくなり、そのため菌類の成長が遅延ないし阻止され得る。最終産物における植物成長調節因子の生産を促進する他の要因としては、例えば、菌糸体マットが乱されずに維持される条件下での通気条件下及び主として可視スペクトルの長波長領域の光の存在下における成長がある。培養に適切な照明条件は、米国特許第5,123,203号に開示されたものが好ましい。この特許の開示内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとする。結果物質中のカロチノイド色素の添加及びＣａ２＋の減少により、赤色光源が好ましいことが分かった。従って、植物成長調節因子（ＰＧＲ）生産は、黄色を生成するために十分な培地へのカロテンの添加によっても促進される。パイナップルジュースを炭水化物源として使用する場合、十分なカロテンは本来的に存在する。
【００１５】
培養培地は、５〜１０％の糖蜜含量に相当する有効糖濃度を含み得る。農業廃棄物も培地を構成するものとして使用することができるが、適切な炭水化物及び他の必要な栄養素（カロテンを含む）の任意の原料も使用することができる。栄養素の或る部分は、穀物及びその他の栄養素の存在下で菌類を培養することにより調製される菌類菌糸自体によって供給され得る。従って、培地の必要な糖含量は、種々の果物、トウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、テンサイシロップ、糖蜜等を含む任意の原料から調製されたシロップによって供給可能である。パイナップル、オレンジ、プラム、ブドウ、パパイヤ等の他の果物からのシロップも使用することができる。培地中の栄養素源として植物抽出物を使用するのが好ましい。
【００１６】
培地は、菌類の培養に通常必要とされる量より大きい有効炭水化物含量を有していなければならない。「有効炭水化物」は、菌性培養物によって代謝可能な炭水化物エネルギー源を意味するものとする。このような有効炭水化物の典型的な成分としては、例えば、スクロース、グルコース、その他の単糖及び二糖が該当する。典型的には、培地は、有効炭水化物を少なくとも１０％ｗｔ／ｖｏｌ、好ましくは１２％ｗｔ／ｖｏｌ、より好ましくは１３％ｗｔ／ｖｏｌ、一層好ましくは１５％ｗｔ／ｖｏｌ含む。また、培地中の終濃度は、ＢＲＩＣ示数（BRIC reading）で少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１２、最も好ましくは少なくとも１５である。高濃度の有効炭水化物は非常に好ましく、上述したように、容認できない（許容限度を越えた）浸透圧状態の発生の回避の必要性のみによって制限を受ける。菌類はセルロースを消化できるので、セルロース又は浸透圧を上昇しない他の炭水化物による炭水化物レベルの上昇の利用は好ましいであろう。
【００１７】
培養培地に適切なＢＲＩＣ値は１２〜１５の範囲であるように思われる。或る典型的な培養物では、ＢＲＩＣ値が１９を越える場合、例えば２４又は３０では、成長は極めて遅いか、或いは全く起こらなかった。１９ ＢＲＩＣでは菌糸体は培地の表面を覆ったが、その層は薄いものに過ぎなかった。１１ ＢＲＩＣ及び８ ＢＲＩＣでは、非常に良好な成長が達成される。しかしながら、１１ ＢＲＩＣ未満では、ＰＧＲ含量はより少なかった。
【００１８】
炭素源としての有効炭水化物の他に、培地は、その他の栄養素、とりわけ窒素源及び種々の補因子を含まなければならない。典型的には、接種原として使用される菌類菌糸にはこれら栄養素の殆どの原料（ソース）が十分に存在する。しかしながら、視認可能な黄色を呈するのに十分なカロテンの濃度を培地が含むことが重要であるように思われる。
【００１９】
有効炭水化物のソースの少なくとも一部として糖蜜を使用する場合、糖蜜自体が、菌類によって必要とされる多くのビタミン及びその他の栄養素を供給する。サトウキビから調製されるシロップは、テンサイから調製されるシロップよりも好ましい。というのは、これらシロップは、より良好な栄養素源を供するからである。所望の栄養素の他のソースとしては、例えば、カリウムイオンの供給のためのバナナの使用があるが、パパイヤも培地に対する有用な添加物である。パパイヤは、カロチノイド、糖、及び糖化合物を含有する。とりわけフルクトースが多い。
【００２０】
まず、培地は、滅菌するが、あらゆる汚染生物を除去するのに十分な時間に亘り十分な温度で加熱することにより滅菌するのが好ましい。次に、除染された培地は、菌類培養物、例えば菌類菌糸を接種する。
【００２１】
本書に記載する培養技術に適合するものであれば、どのような菌類でも本発明において使用することができる。多くの菌類について植物成長調節因子を産生可能であるものとして（他の文献に）記載されてはいるが、典型的には、これは、当該化合物の商業レベルないし実用レベルでの生産のための手段としての事例ではなかった。
【００２２】
本発明のＬＣＦ組成物を得るために有用な菌類の培養は、容易に入手可能な装置を用い効率的な方法で実行することができる。ステンレス鋼製ドラムは有用であるが高価であり、ステンレス鋼が腐食に対して抵抗性となるように特別に処理されない限り、腐食は発酵中に起こり得る。従って、ガラス製又はプラスチック製容器が好ましい。差込口にコットン栓を挿入した５５ガロン半透明プラスチックドラムで菌類を培養するのが特に都合がよいことが判明している。ドラム又はその他の容器の内側は、使用する前に、予め、例えば希釈ヨード溶液で除染しておく。
【００２３】
本発明において有用な好ましい菌類は、担子菌類、即ち天然において植物と共存し、かつその成長を植物に依存する菌類の網である。担子菌類は、多孔性又はひだつきの形態をなすことが可能であり、本発明の方法で培養される菌糸のための好ましい菌源（ソース）は、多孔性菌類、とりわけポリポラケアエ（Polyporaceae；サルノコシカケ）科の菌類である。ポリポラケアエは、通常、褐色腐れ病菌又は白腐れ病菌である属を構成するものとして分類される。褐色腐れ病菌は、その内部で成長する木材中の白色のセルロースを分解し、褐色のリグニンをあとに残す。白色腐れ病菌は、その反対のことを行う。即ち、リグニンを分解して白色のセルロースをあとに残す。従って、本発明の方法での使用に好適な菌類は、褐色腐れ病菌ポリポラス、とりわけブリッジオポラス（Bridgeoporus）属、セリポリア（Ceriporia）属、ダエダレア（Daedalea）属、ラエチポラス（Laetiporus）属、オリゴポラス（Oligoporus）属、及びピクノポレラス（Pycnoporellus）属の褐色腐れ病菌ポリポラスである。
【００２４】
従って、本発明は、必要とされる特殊な培養条件において、担子菌類網の種々のメンバーを使用することができるが、ポリポラス科のもの、とりわけ褐色腐れ病型のものが好ましい。
【００２５】
本発明で使用されるとりわけ好ましい菌類は、ラエチポラス、特にラエチポラス・サルフレアス（Laetiporus sulphureus）である。ラエチポラス・サルファレアス「アイカワタケ（Sulphur shelf）」ないし「マスタケ（Chicken of the Woods）」は、広葉樹の傷寄生菌である。これは、通常、ハワイのユーカリプタス・ロブスタ（Eucalyptus robusta）に見出される。この菌は、樹木の心材に生息するので、樹木の外側では目立たない。子実体ないしマッシュルームは、硫黄ないしオレンジ色のブラケットマッシュルームのように見え、数年に１度現れる。この菌は、心材を摂食し、内部において嵩のある（cubical）褐色腐れ病を引き起こすが、これはセルロース及びヘミセルロースが酵素反応によって分解された後リグニンが残留するからである。樹木は、感染が起こってから多年を経た後枯死する。宿主樹木の成長を制御するこの菌の能力は、刊行されている文献では指摘されておらず、如何なる植物刺激物質もこの菌と関連付けられていない。本発明の制御された菌性液体培養成長では、これら植物成長因子は、大規模に生産されており、通常の宿主範囲外の植物における植物成長に影響を与えることが示されている。本書に記載するように、植物刺激物質を使用するために、組織分解酵素は、液体の加熱によって破壊される。植物刺激物質は、１００℃でも熱安定性である。
【００２６】
Ｌ．サルフレアスの菌性液状培養物は、トウモロコシ、ダイズ、レタス、マメ、穀類（grain）及び草（grass）の種子発芽を刺激することが示されている。スプレーによる葉面補給は、パイナップル、コーヒー、トマト、サトイモ、サトウキビ及びその他の農作物に影響を与えることが示されている。この菌は、通常、数トンのバイオマスに相当する１００フィートの高さのユーカリ属の木の成長に影響を与える。植物刺激効果は、適切に希釈することにより、より小さい植物に対しても同様に有効である。液状培養溶液は、例えば水で、１：３，０００に希釈することができ、この濃度でも依然として効力がある。天然においては、ラエチポラス菌は、大きな周囲寸法と根系とを有する大きな宿主樹木を刺激するために、種々の植物成長調節因子産生に平衡を保持させてきた。この平衡が、所望の効果と共に、より小さい植物及び樹木に適用される。
【００２７】
従って、菌類菌糸は、特定の菌を選択するための適切な条件下で生育された、好ましくは担子菌、より好ましくは褐色腐れ病担子菌、及びより好ましくはラエチポラス菌で構成される。これら菌のための栄養培地は、使用する菌に対し特別に調製された適切な成分を含むが、炭素源、窒素源、及び関連するビタミン及び補因子を必ず含有しなければならないことは勿論である。菌糸は、菌糸体マットが本発明の培養倍地中に形成されるよう、十分な菌接種源を生成するために十分な適切な時間に亘って培養することにより生産される。初期接種からの菌糸の生成のための典型的な時間は、５日〜１００日である。
【００２８】
本発明において有用な商業的に入手可能な液状菌類菌糸は、ククイ・スポーン・コー（Kukui Spawn Co.）、かつてのマウイ・シイタケ・トレーディング・カンパニー（Maui Shiitake Trading Company）、何れもマウイから入手できる。
【００２９】
次に、液状菌糸は、ＬＣＦを調製するための培養培地の接種に使用される。接種した培養培地は、主として可視スペクトルの長波長領域の光の存在下で、１５〜３７℃、好ましくは凡そ２０℃の温度で、必要なレベルのＰＧＲを生成するために十分な時間に亘って、撹拌を行うことなく培養される。典型的には、ＰＧＲは、培養から３０日後、好ましくは４５日後、より好ましくは６０日後には、有用な量で産生される。
【００３０】
菌糸体マットの撹乱を回避するためには接種された培養培地の撹拌は避けるべきだが、培地の通気は望ましい。通気は、例えば、培地に酸素の気泡を通過させることにより、又は菌糸体マットが撹乱されずに維持されるような他の方法によって供給される。空気の気泡を培地に通さずに単に菌糸体の表面との相互作用による通気をさせるだけでも十分な酸素は確保できることが判明している。
【００３１】
「可視スペクトルの長波長領域」は、凡そ５００〜８００ｎｍ、好ましくは６００〜７５０ｎｍの波長の光を意味する。その他の波長も含まれてもよいが、主要な波長は当該範囲にあるべきである。従って、フォトン全体に対する割合として、長波長領域は、当該フォトンの５０％より多く存在すべきである。
【００３２】
ＰＧＲレベルは、標準的なバイオアッセイによって評価することができる。鉢植え用土中の土壌灌注液（soil drench）として使用される既知の濃度のＬＣＦでのダイズ実生成長の比較は、成長標準として使用される。ＬＣＦ溶液の色は、ダイズ実生に対する経時的な効果に相関する。施肥速度は、処置及び制御に対して設定され、実生は適用後１４日目に評価される。総重量、根重量、根長、葉重量、及び高さに関する相違の影響は、標準ＬＣＦ溶液からの影響との比較のために測定される。また、培養溶液の色は、黄色から深ワインレッドへの色変化がＰＧＲの産生と関連することが判明しているので、指標として利用することができる。
【００３３】
ＬＣＦ溶液の濃度（strength）は、ダイズ実生に関し有用な１：５００の希釈度を有する基地のＬＣＦ溶液「標準」の色と整合させることにより制御することができる。通常、６０日間インキュベートした培養物は、標準に整合する色強度に到達するよう水で１：２に希釈される。インキュベートする時間がより長い場合、標準ＬＣＦレベルに達するためには、培養溶液の希釈の程度もより大きくなる。
【００３４】
培養物が成熟するにつれ、菌糸体マットも増殖し、培養物の液状部分は、十分なＰＧＲ生産が行われた後、無菌的に容易に除去可能となる。固形物は、好ましくは濾過又は遠心分離若しくは固形物を分離するためのその他の既知の方法によって、採取した培養培地から除去される。次に、液状部分を１００℃に加熱して１０分間維持する。このステップによって、セルラーゼ、リパーゼ及びヘミセルラーゼのような酵素が変性される。化学／熱タンパク質抽出又は膜濾過も使用することができる。次に、変性したタンパク質は、濾紙で濾過することもできるし、遠心分離で除去することもできる。次に、液状部分は、低温殺菌や限外濾過のような適切な滅菌処理を行うが、低温殺菌が好ましい。次に、得られた低温殺菌“ＬＣＦ”を無菌容器に収容する。次に、菌糸体マットを有する培養フラスコには、必要に応じ、追加のＬＣＦを調製するために、滅菌した冷栄養液を再充填する。最初のＬＣＦ生産には６０日かかるが、２回目は凡そ３０日しかかからない。というのは、最初のクールで既に菌糸体マットが出来上がっているからである。３回目及びそれ以降の生産クールは３０日間であり、培養容器が汚染されるまで続けることができる。
【００３５】
「培養濾液」は、上述の培養物の液状部分を意味する。「培養濾液」は、当該濾液の回収が必ずしも実際の濾過で行われるわけではないという事実があるのも関わらず、一般的に使用される用語である。実際、本発明の多くの培養物では、菌糸体マットが形成されるので、培養濾液は「デカンテーション」又はサイホン吸い上げによって取り出すことができる。従って、「培養濾液」は、単に培養物の液状部分を指す。
【００３６】
本発明のＬＣＦの「滅菌」は、種々の方法で行うことができる。低温殺菌は最も実用的なので、組成物はＬＣＦと称される。しかしながら、限外濾過又は抗生物質若しくはヨウ素担体のような消毒剤の封入のような他の滅菌方法を行うことも可能である。
【００３７】
滅菌培養濾液のほかにも、本発明のＬＣＦ組成物は、乾燥可能な培養物の濾過に際して保持される物質も含む。この物質は、ＰＧＲも含有し、滅菌濾液と同様の態様で使用することができる。
【００３８】
菌糸体マットは、ＬＣＦの採取のために培地から除去した後再利用することができる。典型的には、培地は、菌糸体マットの下方からチューブによって除去し、新鮮な滅菌培地で置き換えることができる。菌糸体マットは、通常、先の培地の除去中に壊れるので、新たな滅菌培地は、単に、容器内に注ぐだけでよく、菌糸体マットの破壊断片は再集合し、成長し続ける。
【００３９】
本発明の方法に応じた植物成長調節因子の生産に加えて、培地は、病原体に対する植物の防御を構成する物質の誘導因子も同様に含むことが判明している。このような防御機構は、寄生体ないし病原体が感染した植物に生産されるフィトアレキシンとして、一般的に知られている。この防御機構の一般的議論は、ウェブサイトwww.uidaho.edu/ag/plantdiseaseに見出されるアイダホ大学植物科学（U. of Idaho Plant Science）４０５／５０４コースのレクチャー８、「病原体に対する植物の防御機構（How Plants Defend Themselves Against Pathogens）」という表題のレクチャーの報告に見出される。概略を説明すれば、一般的に、構造的防御は、例えば、ワックス、コルク層、器官脱離層、その他植物代謝の妨害に対するバリアを構成するものの生成を伴う。代謝的防御は、既存の防御手段並びに病原体の感染によって誘発される防御手段を含む。これらの防御手段には、フィトアレキシンと称される毒性物質の産生が含まれる。本発明のＬＣＦは、この種の応答を誘発することができる。
【００４０】
従って、本発明の１つの側面は、ＬＣＦの植物成長調節効果とフィトアレキシン産生の誘発とを結びつける。本発明のこの側面は、エデン・バイオサイエンス社（Eden Bioscience）製の、ハーピンタンパク質を含むメッセンジャー（Messenger）と称される産物のような、既知のフィトアレキシン阻害剤を添加することにより、強化することができる。
【００４１】
ＬＣＦは、農作物又は樹木に投与するために、適切な濃度に希釈される。ＰＧＲの濃度及び所望の効果に応じて、１：１００〜１：２，０００ないし１：５，０００の希釈を行うことができる。希釈の程度は、ＰＧＲの初濃度、当該物質の投与方法、及び当業者に周知の決定されるべき他の要因の数に応じて決まるのは勿論である。ＬＣＦの希釈は、１：６，０００でも、更には１：１０，０００を越えるものであっても、多くの場合効果があることが判明している。また、ＬＣＦは、使用のために、滑石又は珪藻土のような不活性担体上で乾燥することもできるし、肥料のパフォーマンスを向上するために乾燥して粒状肥料とすることもできる。一般的に、希釈ＬＣＦは、栽植浸漬液（planting dip）又は葉面補給スプレー（foliar spray）への封入、細流灌漑システムを介した添加、鉢植え用土との混合、実生のための周囲の土への投与等の伝統的な方法で投与することができる。
【００４２】
１つの実施形態では、投与割合は、スプレー又は土サプリメントとして使用する場合は、１エーカー当り水３０ガロン当りＬＣＦ６〜８オンスである。しかしながら、より多量の液体を投与するのが好ましい。好ましくは、１エーカー当りに投与される総液量は、１００〜２００ガロンの水に希釈されたほぼ１パイント〜１．５クォートの希釈で１００〜５００ガロンである。従って、典型的な投与では、スプレーとして投与される場合１エーカー当り１２５〜２００ガロンの水に滅菌培地としてＬＣＦの１クォート、又は１エーカー当り３２５ガロンに希釈された滅菌培養濾液ＬＣＦの２クォートを使用するであろう。
【００４３】
しかしながら、上述のように、培養濾液ＬＣＦは、乾燥して粒状物質にして、乾燥物質として投与することもできる。
【００４４】
ＬＣＦ及びその希釈物又はその他の処方物は、農薬のような他の酸性物質、他の栄養素及び／又は組合せて使用するための肥料と混合することも可能である。とりわけ好ましい混合物は、ＰＣＴ刊行物WO 96/38590に記載されている界面活性剤混合農作物アジュバントとの混合物である。この国際特許出願の開示内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとする。また、ラウリル硫酸ナトリウム、糖蜜、ベニバナ油及びチーズの混合物のような、専ら免除成分（exempt ingredients）から構成される抗線虫剤混合物も使用することができるであろう。このような混合物は、２００２年６月２１日付で出願した同時係争出願60/390,289に記載されているが、この出願の開示内容は引用を以って本書に繰り込みここに記載されているものとする。上述したように、処方物に含まれたものも、フィトアレキシン防御タンパク質又は代謝産物の誘導因子であり得る。
【００４５】
単なる説明のために過ぎないが、ＬＣＦは、芝草のために又は野菜及び樹木のために設計された肥料ペレットに１％（ｗｔ/ｗｔ）のコーティングとして供給することができる。珪藻土に対する２％（ｗｔ/ｗｔ）コーティングは、レタス、トマト、キャベツ及びナスのような小種子のための好適な種子処理粉末である。珪藻土をコーティングするＬＣＦの割合の大きいものは、より大きな種子に対して有用である。例えば、６．５％コーティングは、トウモロコシ、マメ、ダイズ、エンドウ及びキュウリに対して適切である。裸苗（ベアルート）（Bare root seedlings）、球茎、パイナップルクラウン、及びその他の植物性栽植物質は、成長を促進するために、この粉末を撒布することができる。
【００４６】
都合のよい投与方法は、プラスチックの袋の内の１オンスの種子に上記粉末を茶さじ凡そ１／２を加えることである。袋を閉じて、振り動かし、種子に粉末をコーティングする。余った粉末は回収する。得られた種子は、粉末の薄いコーティングを有する。
【００４７】
一般的に、ＬＣＦは、直射日光を避け、室温で、乾燥条件下で保存されるべきである。ＬＣＦは環境安全性であるが、経口摂取されるべきではなく、長期間に亘って皮膚に残留させるべきでもない。
【００４８】
以下の実施例は、説明のためのものに過ぎず、本発明を（当該実施例に）限定することは意図されていない。
【実施例１】
【００４９】
低温殺菌ＬＣＦの調製
【００５０】
培地は、以下の成分で調製した：
限外濾過で得た繊維高含有パイナップルジュース濃縮液２０ガロン；
パイナップルシロップ１ガロン；
糖蜜水（糖蜜５ガロンと水４０ガロンの混合物）２０ガロン；及び
任意的に果皮、種子及び果肉を含んだ、軟熟期の（soft ripe-stage）パパイヤピューレ５ガロン。
次に、付加的な濃縮液及び／又は糖蜜水によって、全体積を５０ガロンに調節した。成分は、開放されたプラスチック製ドラム内で混合し、ステンレス鋼製ポットに移し、沸騰させ、少なくとも３０分間１００℃に維持した。この熱スラリーを消毒した白色半透明の５５ガロンプラスチックバイオプロセスドラムに移し、室温に冷却した。冷却には数日間かかる。
【００５１】
冷却した培地には、層流フードの下で（後掲）菌性開始培養物を接種し、１又は２個の綿栓を５５ガロンドラムに挿した。次に、このドラムを、空調され照明された部屋で６０日間撹乱しないでインキュベートした。照明は、アグロライト（Agrolights）又は強力な熱白色光によって供給した。冷白色光では不十分である。
【００５２】
６０日後、培養物の液状部分を移し、固形物を除去するために濾過した。濾液を１０分間１００℃に加熱し、可溶性タンパク質を変性させた。次に、加熱した媒体を濾過し、１００℃に再加熱して３０分間低温殺菌した。低音殺菌産物を無菌ボトルに移し、保存のために室温に維持した。この実施例で調製したＬＣＦのｐＨは２．５である。
【００５３】
この実施例で使用した菌性開始培養物は、ククイ・スポーン・コー社、かつてのマウイ・シイタケ・トレーディング・カンパニー社、ハワイから入手した。１リットル容器の液状菌糸を全て、冷却された栄養素溶液を含むバイオプロセスドラムに無菌的に加えた。通常、５０ガロンバイオプロセスドラム１つ当り、菌糸液状培養物をボトル２本加える。
【実施例２】
【００５４】
植物への投与
【００５５】
実施例１で調製したＬＣＦ１オンスを水５ガロンに加えて希釈した。この混合液をコーヒーノキ（コーヒーの木）の周囲の土壌に投与した。
【００５６】
ＬＣＦ１オンスを５ガロンの水に加えて希釈し、トウモロコシ植物を処置するために使用した。これにより、対照植物より６０％を越えてかさが増した。ＬＣＦ１オンスを水１０ガロンで希釈したものも結果の改善が見られた。
【００５７】
ＬＣＦ１オンスを水５ガロンで同様に希釈したものを用いてマノアレタス（Manoa lettuce）をスプレーした。これにより、対照よりも葉の重量が５０％を越えて増加した。
【００５８】
キュウリの種子を、播種する前に６．５％ＬＣＦ粉末で処置した。この植物は、対照よりも３９％を越えて質量が大きくなった。
【００５９】
水５ガロンに希釈したＬＣＦ１オンスをパイナップルクラウンに投与したところ、パイナップルの成長速度は比較的大きかった。成長の改善という結果は、より老齢の植物にこの希釈液をスプレーで経葉補給した場合又は３年齢のパイナップル植物をこの希釈液に浸した場合においても観察された。
【００６０】
ＬＣＦ１オンスの水１ガロン希釈液を乾地サトイモ、サツマイモ及びヤマノイモのための球茎／栽培浸漬液として使用した。
【００６１】
サトイモの実生は、６週間後対照植物より１６０％を越えて重量が増加した。
【００６２】
サトウキビに投与した場合、必要とした希釈度は、苗（Plant）の種類に応じて異なった。ある例では、ＬＣＦ１オンスと水２ １／２ガロンの希釈液により苗条径に５０％の増加という好結果が得られた。
【００６３】
芝草は、ＬＣＦ１オンスの水５ガロン希釈液をスプレーすることにより、成長速度が増加した。
【００６４】
また、ＬＣＦは、米松を処置するために、苗木鉢当り１：５００希釈液２９ｍｌの土壌潅注液として使用した。その結果、４週間以内に１０％〜２０％の成長が見られた。
【００６５】
ＬＣＦは、穀物、野菜及びその他の農作物の乾燥種子コーティング処理剤用のポリマーと混合することができる。ＬＣＦの割合は、農作物に応じて異なる。
【００６６】
ＬＣＦは、線虫発生（infestation）症候を緩和するために使用することができる。害虫が発生したコーヒーノキ当り１：５００希釈液５ガロン。５ヶ月間に３回投与することにより、根、葉枝は増加し、果実の均一性は増加し、及び生産性は増加する。
【００６７】
ＬＣＦは、菌性斑点病や細菌性植物腐敗病のような植物疾患の発生率を減少するために使用することができる。オニオン球茎腐れは、ＬＣＦの１：１６００希釈液を３週間毎に経葉投与することにより減じることができる。
【００６８】
ＬＣＦの希釈溶液、即ち０．１％溶液を用いて、切花、葉付き小枝及びクリスマスツリーの寿命を延ばすことができる。
【００６９】
ＬＣＦは、１：５００希釈液の葉面吸収又は土壌潅注液投与によって、霜、昆虫及び植物に対する化学的傷害の低減に使用することができる。
【００７０】
パイナップルの苗条を、粒状肥料を含む鉢植え用土に植付ける前に、ＬＣＦ滅菌培養溶液８００、１０００又は２０００ｐｐｍ含有溶液に１０分間苗条を浸漬することによって試験した。また、苗条は、同時に、マイクロエマルジョン界面活性剤混合抗線虫剤にも浸漬した。対照が平均根重６．９ｇ及び平均根長２９．４インチであったのに対し、８００ｐｐｍＬＣＦ処理植物は根重８．２ｇ及び根長３３．３５インチであった。１０００ｐｐｍＬＣＦ処理植物は根重７．４ｇ及び根長４１．４インチであり、対照に対して４１％の増加を示した。しかしながら、２０００ｐｐｍの場合は、毒性効果が現れ、根重及び根長共に対照より不良だった。
【００７１】
ヒヨコマメを、水１／２ガロン又は１ガロンに希釈した１オンス滅菌培養溶液ＬＣＦの希釈液に浸漬した。このヒヨコマメは、マメ１００ｇ当り希釈物１ｍｌの割合で処理した。次に、このヒヨコマメを乾燥して植え付けたところ、未処理の対照と比べて採取されたマメの収量は２２％増加した。
【００７２】
その他の投与では、本発明のＬＣＦ組成物処理は、開花刺激剤（Flower stimulator）、除草剤、及び芝草成長因子による処理と併せて行った。
【００７３】
ＬＣＦをトマトに投与したところ、果実の重量は５６％増加した。
【国際調査報告】
2005533118.tif 000002