(57)【要約】本発明は、（i）試料ゲノムを断片化すること、（ii）プライマーが断片上の相補領域と二重鎖を形成することを許容する条件の下で、断片を過剰の多数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること（ここで、各プライマーは、推定ＳＮＰ部位に近位のゲノム上の配列との予定された配列相補性を有しており、得られた二重鎖は、固体支持体上に固定化される）、（iii）少なくともＳＮＰ部位にまでプライマーを伸長させるため、（一つ又は複数の）配列決定反応を実施し、オリゴヌクレオチドプライマーへの塩基の取り込みを検出すること、並びに（iv）得られた配列を、１個又は複数個の参照ＳＮＰのものと比較すること、を含む、ゲノム内の１個又は複数個の一塩基対多型（ＳＮＰ）の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム内の１個又は複数個の一塩基多型（ＳＮＰ）の同一性を決定する方法であって、
（i）試料ゲノムを断片化すること、
（ii）プライマーが断片上の相補領域と二重鎖を形成することを許容する条件の下で、断片を過剰の多数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、
（iii）少なくともＳＮＰ部位にまでプライマーを伸長させるため、一つ又は複数の配列決定反応を実施し、オリゴヌクレオチドプライマーへの塩基の取り込みを検出すること、及び、
（iv）得られた塩基を、１個又は複数個の参照ＳＮＰのものと比較すること、
を含み、
前記プライマーが、ＳＮＰ部位に近位のゲノム上の配列との予定された配列相補性を有しており、得られた二重鎖は、固体支持体上に固定化されるようになっている、方法。
【請求項２】
二重鎖が、断片との共有結合を介して固体支持体に固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ii）の前に、固体支持体による断片の固定化のためのリンカー分子を含むヌクレオチドが、断片の一端に組み込まれる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
固定化が、固定化された各二重鎖が光学顕微鏡検査により個々に解像されることを可能にする密度でなされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ii）が、３００〜１０６個の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ii）が、１０３〜１０５個の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ii）が、１０３〜１０４個の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプライマーが１０〜７０塩基を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプライマーが３０〜５０塩基を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーが約４０塩基を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
プライマーが、ＳＮＰ部位由来の２０塩基未満の配列に相補的である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
プライマーが、ＳＮＰ部位由来の１０塩基未満の配列に相補的である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
プライマーが、ＳＮＰ部位由来の１〜６塩基の配列に相補的である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
プライマーがＳＮＰ部位に隣接する配列に相補的である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（iii）が、蛍光標識された塩基の逐次付加を含む、請求項１〜１４のいずれか１４項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、核酸断片の配列のバリエーション、特に患者から入手された試料中の遺伝子のＤＮＡ配列のバリエーションを検出する方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００２】
最近、ヒトゲノムプロジェクトによって、ヒトゲノム、全部で３×１０９塩基の全配列が決定された。その配列情報は、平均的なヒトの情報を表す。しかしながら、異なる個体間の遺伝子配列の差を同定することも非常に重要である。遺伝子バリエーションの最も一般的な型は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。平均すると、１０００分の１の塩基がＳＮＰであり、これは、いかなる個体にも３００万個のＳＮＰが存在することを意味する。ＳＮＰのうちのいくつかはコーディング領域に存在し、異なる結合親和性又は特性を有するタンパク質を生成させる。制御領域に存在し、代謝産物又はメッセンジャーのレベルの変化に対する異なる応答をもたらすものもある。ＳＮＰは非コーディング領域にも見出され、これらも、コーディング領域又は制御領域のＳＮＰと相関している場合があるため、重要である。鍵となる課題は、個体のＳＮＰのうちの１個以上を決定する低コストの手段を開発することである。
【０００３】
ＳＮＰを決定するためには、通常、ハイブリダイゼーションイベントのモニタリングと関連して、核酸アレイ（ａｒｒａｙ）が使用されている（Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：２７−３２）。これらのハイブリダイゼーションイベントの多くは、高感度の蛍光検出器、例えば電荷結合型（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｌｅｄ）検出器（ＣＣＤ）を使用して検出される、ヌクレオチドに付着した蛍光標識を使用して検出される。これらの方法の主要な短所は、反復配列が結果の曖昧さをもたらす場合があるという点である。この問題は、Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）、Ｔ．Ｊ．Ｂｅｕｇｅｌｓｄｉｊｋ編、チャプター１０：２０５〜２２５において認識されている。
【０００４】
他の分析法は、高密度ポリヌクレオチドアレイを使用したゲノム断片の配列決定を必要とする。多工程分析手法における高密度アレイの使用は、位相決定（ｐｈａｓｉｎｇ）に関する問題をもたらす場合がある。位相決定問題は、アレイの異なる分子上で起こる反応工程の同期化の喪失に起因する。アレイ化された分子のうちのいくつかが手法中のある工程を経ることに失敗した場合、これらの分子に関して入手されるその後の結果は、もはや、その他のアレイ化された分子に関して入手される結果と同調していない。位相から外れた分子の割合は、連続工程を通して増加し、結果的に、検出される結果は曖昧なものとなるであろう。この問題は、米国特許第５３０２５０９号明細書に記載された配列決定手法において認識されている。
【０００５】
蛍光標識されたＤＮＡ鎖を、流動している試料流中に懸濁した標的ＤＮＡ試料にハイブリダイズさせ、次いでエキソヌクレアーゼを使用して、ハイブリダイズしたＤＮＡから末端塩基を繰り返し切断することを含む、別の配列決定アプローチが、欧州公開第０３８１６９３号に開示されている。切断された塩基は、検出器を逐次通過しながら検出され、ＤＮＡの塩基配列の再構築を可能にする。異なるヌクレオチドには、各々、レーザー誘起蛍光により検出される別個の蛍光標識が付着している。主に、ＤＮＡ鎖の全てのヌクレオチドが標識されること、そしてこれが最初の配列に対して高度に忠実に達成されることを保証するのは困難であることから、これは、複雑な方法である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトのような配列決定プロジェクトにより提供された情報が、限定された配列決定を行うための出発点を提供するため、試料ゲノム（又はゲノム断片）上のＳＮＰ部位の近傍の領域にハイブリダイズさせるために使用され得る特異的なプライマー配列を設計するために使用され得るということの知見に基づく。次いで、ＳＮＰ部位に取り込まれた塩基が、参照配列と同じであるか否かを決定するため参照配列と比較され得る。一つの実験において複数のプライマーが使用され得る。これは、複数のＳＮＰ部位を同定するために全ゲノムを配列決定する必要を排除し、コスト及び処理時間の減少をもたらす。
【０００７】
従って、本発明によると、
（i）試料ゲノムを断片化すること、
（ii）プライマーが断片上の相補領域と二重鎖を形成することを許容する条件の下で、断片を過剰の多数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること（ここで、各プライマーは、推定ＳＮＰ部位に近位のゲノム上の配列との予定された配列相補性を有しており、得られた二重鎖は、固体支持体上に固定化される）、
（iii）少なくともＳＮＰ部位にまでプライマーを伸長させるため、（一つ又は複数の）配列決定反応を実施し、オリゴヌクレオチドプライマーへの塩基の取り込みを検出すること、並びに
（iv）得られた配列を参照ＳＮＰのものと比較すること、
を含む、ゲノム内の１個又は複数個の一塩基対多型（ＳＮＰ）の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定する方法が提供される。
【発明の説明】
【０００８】
本発明は、複数のＳＮＰの配列を同定するため、試料ゲノムの短い断片を配列決定するために使用され得る方法に関する。従って、本発明は、対象が特定のＳＮＰを有するか否か、従って疾患のリスクを有するか否かを決定するのに有用である。多くの癌が、特定の遺伝子上の遺伝子突然変異により引き起こされ、例えば、乳癌には単一の突然変異が関与している。本発明の方法は、疾患に関与していることが示されている多様な突然変異をスクリーニングするために使用され得る。従って、単一の実験において複数の（例えば、数千個の）可能性のあるＳＮＰをスクリーニングする能力は、極めて有益である。
【０００９】
本法は、任意の異常を同定するために、試料中の短い配列を参照配列又は野生型配列と比較するために、ヒトゲノムプロジェクトのようなゲノム配列決定事業により提供された情報を利用する能力に頼っている。ＳＮＰ部位は既知であり、ＳＮＰ部位の近傍の（例えば、隣接している）ゲノム上の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにこの情報を使用することが可能である。ＳＮＰ部位の近傍の試料ゲノムの断片に多数のプライマーをハイブリダイズさせることにより、各ＳＮＰ部位に関する情報を獲得するために、限定された配列決定のみが必要とされるようになる。生成した限定された配列情報、及び参照配列又は野生型配列に関する知識を使用して、ゲノム上の配列決定された各断片の位置を同定し、存在するＳＮＰの配列を同定することが可能である。
【００１０】
本法は、塩基取り込みが個々の二重鎖に関して決定され得るよう実施される。好ましい方法において、単一分子レベルで各プライマーへの塩基の取り込みをモニタリングするために、一分子イメージング（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）が使用される。一分子イメージングのさらなる詳細は、後に与えられ、国際特許公開第００／０６７７０号（これの内容は参照によりここに組み込まれる）にも開示されている。
【００１１】
オリゴヌクレオチドプライマーは、１０〜７０塩基、好ましくは１５〜６０塩基、より好ましくは３０〜５０塩基、最も好ましくは約４０塩基を含み得る。プライマーの混合物が使用されるため、一つの反応において異なる長さのプライマーを使用することが可能である。異なる長さのプライマーの混合物が使用される場合、プライマーの長さの平均は、上記のようなものである。融解温度を標準化し、従って普遍的なハイブリダイゼーション条件下での各プライマーの効率的なハイブリダイゼーションを保証するため、各プライマー上の塩基の数を調整することが好ましい。ＳＮＰ部位由来の２０塩基未満、より好ましくは１０塩基未満、最も好ましくは１〜６塩基の配列に相補的であるよう、各プライマーを設計することが好ましい。プライマーはＳＮＰ部位に隣接していてもよい。
【００１２】
配列決定する必要がある塩基の数は、ＳＮＰ部位の位置、及び使用される異なるプライマーの数によって決定されるであろう。添加されるプライマーが多いほど、どのプライマーがゲノム断片に関連しているか、及びどのＳＮＰが決定されているかを同定するため、配列決定する必要があるかもしれない塩基は多くなる。
【００１３】
例えば、１０００個の異なるプライマーが使用される場合、通常、使用されたプライマーを正確に同定するためには、少なくとも５個の塩基の取り込みを決定することが必要であろう。ＳＮＰ部位は、配列決定される塩基内の既知の位置に位置しているであろう。１０，０００個の異なるプライマーが使用される場合には、通常、各プライマーを正確に決定するため７個の塩基を配列決定することが必要であろう。異なるプライマーが区別されるような方式で塩基取り込みの検出が実施されるのであれば、任意の数の異なるプライマーが使用され得る。一分子イメージングに関しては、３００〜１０６個の異なるプライマー、より好ましくは１０３〜１０４個の異なるプライマーを有することが好ましい。少数の定義されたＳＮＰ部位に分析を制限することが望まれる場合には、より少数の異なるプライマー、例えば３００〜１０００個、好ましくは４００〜６００個の異なるプライマーが使用され得る。プライマーは、ゲノム断片の濃度と比較して過剰に存在する。
【００１４】
試料ゲノムＤＮＡは、当技術分野において既知の方法により入手され得る。断片化は、制限酵素消化及び剪断力の使用を含む任意の適切な方法により実施され得る。
【００１５】
プライマーは、好ましくは、相補プライマー配列とゲノム断片との間に二重鎖形成が起こるようなハイブリダイジング条件下で溶液中の断片と接触させられる。ハイブリダイジング条件は、当技術分野において既知であり、適切な緩衝液、塩濃度、温度等は全て当業者には明らかであろう。ハイブリダイゼーション工程の後、得られた二重鎖は、固体支持体へ固定化される。
【００１６】
二重鎖の固体支持体の表面への固定化は、一つの実施形態において、より詳細に後述されるように、二重鎖の個々の解像のための適度の分離を提供し得るアレイを形成させるための、当技術分野において既知の技術により実施され得る。本発明に関して、アレイとは、固体支持体上に分布したポリヌクレオチド分子の集団をさす。一般に、アレイは、ランダム一分子アレイを生成させるために小量の試料を分配することにより作製される。このように、異なる分子の混合物は、一分子アレイを作製する単純な手段によりアレイ化され得る。この実施形態においては、二重鎖化された断片及び二重鎖化されていない断片の両方が、固体支持体へ固定化されるであろう。しかしながら、二重鎖化されていない断片は、配列決定反応を経ず、従って検出可能なシグナルを生成させないであろう。別の実施形態において、ハイブリダイゼーションの前に、固体表面への付着を許容する化学基を取り込むようプライマーを設計することも可能である。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、二重鎖化された分子は、好ましくはハイブリダイゼーション前に実施されるゲノム断片との共有結合を介して、固体支持体に付着させられる。これは、好ましくは、適切に調製された固体支持体と反応するリンカー分子により修飾されたヌクレオチドの、断片の一端への取り込みを含む、様々な技術により達成され得る。修飾されたヌクレオチドは、ターミナルトランスフェラーゼ又はポリメラーゼを使用した従来の方式でゲノム断片へ取り込まれ得る。この取り込み工程は、オリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーション工程の前に実施され得る。プライマーの添加の前に、ゲノム断片を固体支持体へ固定化することも可能である。しかしながら、ハイブリダイゼーション工程において使用され得る断片及びプライマーの濃度に関してより柔軟であるため、溶液中でハイブリダイゼーション工程を実施し、次いで固定化することが、より好ましい。
【００１８】
ゲノム断片とのハイブリダイゼーションの前に、プライマーを固体支持体に固定化することも可能である。プライマーは、固体支持体上にランダム又は非ランダムに固定化され得る。プライマーが非ランダムに固定化される場合には、全てのプライマーをＳＮＰ部位がプライマーに隣接するよう設計し、それによりＳＮＰ部位を特徴決定するために１塩基の取り込みのみが必要であるようにすることが可能である。
【００１９】
二重鎖の形成の際、化学結合によってプライマーをゲノム断片に付着させることが好ましいかもしれない。これは、スルプヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基の使用を含む既知の架橋試薬を使用して行われ得る。
【００２０】
本発明における使用に適している固体支持体は、商業的に入手可能であり、当業者には明らかであろう。支持体は、ガラス、セラミックス、シリカ及びシリコンのような材料から製造され得る。支持体は、通常、平らな（平面状の）表面を含む。任意の適切なサイズが使用され得る。例えば、支持体は各方向およそ１〜１０ｃｍであり得る。
【００２１】
固定化は、特異的な共有結合性又は非共有結合性の相互作用によるものであり得る。共有結合性付着が好ましい。しかしながら、ポリヌクレオチドは、その主鎖上の任意の位置において固体支持体に付着させられ得る（この付着は、ポリヌクレオチドを固体支持体に繋ぎ止めるよう機能する）。次いで、固定化されたポリヌクレオチドは、固体支持体から遠位の位置における相互作用を経ることができる。典型的には、その相互作用は、例えば洗浄により、非特異的相互作用によって固体支持体に結合した任意の分子を除去することが可能であるようなものであろう。この様式の固定化は、よく分離された単一ポリヌクレオチドをもたらす。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態においては、固体表面がエポキシドでコーティングされ、二重鎖化された分子が、アミン結合を介して支持体にカップリングされる。アレイ化すべき分子を含有している溶液中に存在する塩を回避するか又は低下させることも好ましい。塩濃度の低下は、アレイ上の位置付けに影響を与える可能性がある、溶液中での分子の凝集の確率を最小限に抑える。
【００２３】
固定化の後、プライマー（即ち、ゲノム断片に相補的なプライマー）への塩基の取り込みが決定され得、この情報が、存在するＳＮＰを同定するために使用される。塩基に付着した蛍光標識の検出に頼る従来のアッセイが、ＳＮＰに関する情報を入手するために使用され得る。これらのアッセイは、米国特許第５６３４４１３号において「一塩基（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ）」配列決定法と呼ばれている、適切に標識された塩基の段階的な同定に頼る。塩基は、ポリメラーゼ反応を使用してプライマー配列へ取り込まれる。
【００２４】
本発明の一実施形態において、塩基の取り込みは、蛍光標識されたヌクレオチドを使用して、米国特許第５６３４４１３号に記載されたのと類似の様式で決定される。（プライマー上の）新生鎖は、ポリメラーゼ反応により段階的に伸長させられる。異なるヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）は、各々、調節されない重合を防止するための保護基として機能する特有のフルオロフォアを３’位に取り込んでいる。本明細書において使用されるように、「保護基」という用語は、鋳型依存的な酵素的なポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの取り込みを本質的に妨害することなく、組み込まれたヌクレオチドの、さらなるヌクレオチド付加のための基質として作用する能力を消滅させる、ヌクレオチドに付着した基をさす。「除去可能保護基」とは、ヌクレオチドと保護基との間の共有結合の切断をもたらす特異的処理により除去され得る保護基である。特異的処理は、例えば、ヌクレオチドと蛍光標識との間の共有結合の切断をもたらす、光化学的、化学的又は酵素的な処理であり得る。保護基の除去は、取り込まれた、それまで保護されていたヌクレオチドの、さらなる酵素的ヌクレオチド付加のための基質として作用する能力を回復させるであろう。ポリメラーゼ酵素は、ゲノム断片上の配列に相補的な新生鎖へヌクレオチドを取り込み、保護基は、さらなるヌクレオチドの取り込みを防止する。取り込まれなかったヌクレオチドは除去され、取り込まれた各ヌクレオチドが、レーザー励起及びフィルターを使用して電荷結合型検出器により光学的に「読み取まれる」。次いで、さらなるヌクレオチド取り込みのための新生鎖を露出させるため、３’保護基が除去（脱保護）される。
【００２５】
アレイは別個の光学的に解像可能なポリヌクレオチドからなるため、蛍光イベントが検出されるにつれ、各標的ポリヌクレオチドが一連の別個のシグナルを生成させるであろう。次いで、配列の詳細が決定され、ＳＮＰを同定するために既知の配列情報と比較され得る。
【００２６】
達成され得るサイクルの数は、主として脱保護サイクルの収率により支配される。あるサイクルにおいて脱保護が失敗した場合には、その後のヌクレオチドの脱保護及びそれに続く取り込みが、次のサイクルにおいて検出され得る可能性がある。配列決定は一分子レベルで実施されるため、配列決定は、配列決定前に異なる試料断片の分離を必要とすることなく、一度に異なるポリヌクレオチド配列に対して実施され得る。この配列決定は、先行技術の方法に関連した位相決定問題も回避する。
【００２７】
当業者には理解されるであろうが、標識されたヌクレオチドは、別々の標識及び除去可能保護基を含み得る。これに関して、さらなる取り込みの前に、保護基及び標識の両方を除去することが通常必要であろう。
【００２８】
脱保護は、化学的、光化学的又は酵素的な反応により実施され得る。類似の同等に適用可能な配列決定法は、欧州公開第０６４０１４６号に開示されている。その他の適切な配列決定手法は、当業者には明らかであろう。
【００２９】
画像及びその他のアレイに関する情報、例えば位置情報等は、当技術分野において既知のような、ノイズを低下させシグナル又はコントラストを増加させる画像処理を実施することができるコンピュータプログラムにより処理され得る。コンピュータプログラムは、画像及び／又はサイクル間のオプショナルアラインメント（ｏｐｔｉｏｎａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を実施し、画像から一分子データを抽出し、画像及びサイクル間のデータを相関させ、個々の分子から生成したシグナルのパターンからＤＮＡ配列を特定することができる。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態において、二重鎖は、各二重鎖が光学的手段、即ち一分子イメージングにより個々に解像されることを可能にする密度で、固体支持体表面上に固定化される。これは、使用される特定のイメージング装置の解像可能範囲内に、各々１個の二重鎖を表す別個の画像が１個又は複数個、存在しなければならないことを意味する。典型的には、取り込まれた塩基の検出は、高感度検出器、例えば電荷結合型検出器（ＣＣＤ）を装備した一分子蛍光顕微鏡を使用して実施され得る。アレイの各二重鎖が同時に分析されてもよいし、又はアレイをスキャンすることにより高速逐次分析が実施されてもよい。一分子アレイの調製、及び一分子イメージングのための方法は、国際公開第００／０６７７０号に記載されている。
【００３１】
「個々に解像される」という用語は、本明細書において使用されるように、可視化された場合に、アレイ上のある二重鎖を近隣の二重鎖と区別することが可能であることを示す。可視化は、前述のような検出可能に標識されたヌクレオチドの使用によって達成され得る。
【００３２】
アレイの密度は重大ではない。しかしながら、本発明は、高密度の固定化された分子を利用することができ、そしてこれらは好ましい。例えば、１ｃｍ２当たり１０６〜１０９個、好ましくは１０８個という密度で二重鎖化された分子を含むアレイが使用され得る。好ましくは、その密度は少なくとも１０７個／ｃｍ２であり、典型的には最大１０８個／ｃｍ２である。これらの高密度アレイは、当技術分野において「高密度」と記載され得るが、必ずしも高くなく、かつ／又は一分子解像を可能にしない他のアレイとは対照的である。所定のアレイにおいて、重要であるのは、特色の数ではなく、単一ポリヌクレオチドの数である。支持体へ適用される核酸分子の濃度は、アドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）な単一ポリヌクレオチド分子の最も高い密度を達成するために調整され得る。比較的低い適用濃度で得られるアレイは、比較的低い単位面積当たり密度で、高い割合のアドレス可能単一ポリヌクレオチド分子を有するであろう。核酸分子の濃度が増加するにつれ、アドレス可能単一ポリヌクレオチド分子の密度は増加するであろうが、アドレスされ得る単一ポリヌクレオチド分子の割合は事実上減少するであろう。従って、当業者は、アドレス可能単一ポリヌクレオチド分子の最も高い密度は、単一ポリヌクレオチド分子の割合は高いがそれらの分子の物理的密度はより低いアレイと比べて、単一ポリヌクレオチド分子の割合又はパーセンテージがより低いアレイにおいて、達成され得ることを認識するであろう。
【００３３】
本発明の方法及び装置を使用すれば、少なくとも１０７個又は１０８個の分子を同時に画像化することが可能であり得る。高速逐次イメージングは、走査型装置を使用して達成され得る、画像間のシフティング（ｓｈｉｆｔｉｎｇ）及びトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、より多数の二重鎖化された分子が画像化されることを可能にし得る。
【００３４】
アレイ上の個々の二重鎖化された分子間の分離の程度は、一部は、解像のために使用された特定の技術により決定されるであろう。分子アレイを画像化するために使用される装置は、当業者に既知である。例えば、共焦点走査型顕微鏡は、蛍光により個々の分子上に取り込まれたフルオロフォアを直接画像化するため、レーザーによりアレイの表面をスキャンするために使用され得る。あるいは、電荷結合型検出器のような高感度２Ｄ検出器が、アレイ上の個々の二重鎖化された分子を表す２Ｄ画像を提供するために使用され得る。
【００３５】
拡大率１００倍で、隣接した二重鎖化された分子が、少なくとも２５０ｎｍ、好ましくは少なくとも３００ｎｍ、より好ましくは少なくとも３５０ｎｍの距離だけ分離されている場合、２Ｄ検出器によるアレイ上の一分子の解像が実施され得る。これらの距離が拡大率に依存し、その他の値が相応じて決定され得ることは、当業者には理解されよう。
【００３６】
光学解像能がより高く、従ってより高密度のアレイが使用されることを許容する、走査型近接場光学顕微鏡検査（ＳＮＯＭ）のようなその他の技術も利用可能である。例えば、ＳＮＯＭを使用する場合、隣接した二重鎖化された分子は、１００ｎｍ未満、例えば１０ｎｍの距離だけ分離されていればよい。走査型近接場光学顕微鏡検査の説明に関しては、Ｍｏｙｅｒら、Ｌａｓｅｒ  Ｆｏｃｕｓ  Ｗｏｒｌｄ（１９９３）２９（１０）を参照のこと。
【００３７】
使用され得る付加的な技術は、表面特異的な全反射蛍光顕微鏡検査（ＴＩＲＦＭ）である（例えば、Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９９６）３８０：４５１−４５３参照）。この技術を使用した場合、一分子感度による広視野イメージング（最大１００μｍ×１００μｍ）を達成することが可能である。これは、１ｃｍ２当たりの解像可能分子数が１０７個を越えるアレイが使用されることを可能にする。
【００３８】
さらに、走査型トンネル顕微鏡検査（Ｂｉｎｎｉｇら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９８２）５５：７２６−７３５）、及び原子間力顕微鏡検査（Ｈａｎｓｍａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（１９９４）２３：１１５−１３９）の技術が、本発明のアレイのイメージングに適している。固体支持体上の不連続エリアにおいて画像化し得るものであれば、顕微鏡検査に頼らないその他の装置も使用され得る。
【００３９】
ポリメラーゼ反応から入手された配列情報は、ＳＮＰを同定するため、参照配列と比較され得る。参照配列は、正常な／一般的なゲノムを表す任意の適切な配列である。適切な参照ゲノムは、様々なゲノム配列決定事業、例えばヒトゲノムプロジェクトの一部として同定されたものである。参照配列上の対応する塩基と比較されるのは、厳密には、ＳＮＰ部位の塩基のみである。残りの配列（プライマー及び付加的な配列決定された塩基）は、研究下の参照配列の関連部分を同定するために使用される。
【国際公開パンフレット】
2005500067.tif 000002
2005500067.tif 000003
2005500067.tif 000004
2005500067.tif 000005
2005500067.tif 000006
2005500067.tif 000007
2005500067.tif 000008
2005500067.tif 000009
2005500067.tif 000010
2005500067.tif 000011
2005500067.tif 000012
2005500067.tif 000013
2005500067.tif 000014
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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