(57)【要約】そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、癌またはアンドロゲンレセプター機能の欠陥と関連する他の疾患の治療のための選択的アンドロゲンレセプターモデュレーター（ＳＡＲＭ）の同定および開発のためのインビボモデルに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
該レポーターがルシフェラーゼである、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
該アンドロゲン応答配列が２ＸＤＲ−１である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
請求項１に記載のトランスジェニックマウスから単離した細胞であって、そのゲノムが該核酸構築物を含むことを特徴とする、細胞。
【請求項５】
該レポーターがルシフェラーゼである、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
該アンドロゲン応答配列が２ＸＤＲ−１である、請求項４に記載の細胞。
【請求項７】
請求項４に記載の細胞を含むマウス細胞系統。
【請求項８】
アンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含む単離した核酸構築物であって、アンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする核酸構築物。
【請求項９】
該レポーターがルシフェラーゼである、請求項８に記載の構築物。
【請求項１０】
該アンドロゲン応答配列が２ＸＤＲ−１である、請求項８に記載の構築物。
【請求項１１】
そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されている標的マウスを得る方法であって、その際、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができ、下記工程：
（ａ）第一の雌マウスからの受精卵をゾル化し、
（ｂ）該核酸構築物を含むトランスジーンを受精卵に移し、
（ｃ）工程（ｂ）の受精卵を偽妊娠した第二の雌マウスの子宮に移し、ついで
（ｄ）該第二の雌マウスを、
（i）該第二の雌マウスが、工程（ｃ）の該受精卵からの胚で妊娠し、
（ii）該胚が該標的マウスに発育し、および
（iii）該標的マウスが該第二の雌マウスから生存して生まれる
ように保持する
ことを含み、その際、該標的マウスのゲノムは該核酸構築物を含み、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができる、ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
レポーター核酸を発現するトランスジェニックマウス細胞系統の製造方法であって、
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニックマウスから細胞を単離し、ついで
（ｂ）該トランスジェニックマウス細胞系統が該レポーター核酸を発現するように、単離した細胞を単離した細胞の増殖および生存を保持する条件下に置く
ことを含む方法。
【請求項１３】
アンドロゲンレセプターのモデュレーターをスクリーニングする方法であって、被験物質を請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、ついでアンドロゲンレセプターの活性に対する該被験物質の作用をアッセイすることを含む方法。
【請求項１４】
そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物は該アンドロゲンレセプター核酸が発現されたときだけ該レポーター核酸を器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲンレセプター機能のインビボ評価のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物を目的とするものである。さらに本発明は、アンドロゲンレセプター活性をモデュレートする化合物および治療法の開発におけるそのような哺乳動物の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡおよび遺伝子技術における近年の進歩は、所望の遺伝子配列をレシピエント動物に導入し発現させることを可能にした。このような方法を使用することで、天然には存在しない配列または遺伝子、すなわち、改変されていない動物には通常または天然には存在しない配列または遺伝子を持つような動物が作り出されてきた。この技術はまた、天然に存在する遺伝子または配列の、改変された発現を示す動物を作製するために利用できる。
【０００３】
これらの方法の使用によって作製される動物は、導入した配列または遺伝子を当該動物の幾らかの細胞のみが含み且つ発現する「キメラ」であるか、または、導入した配列または遺伝子を当該動物の全細胞が含んでいる「トランスジェニック」であるかのいずれかとなり得る。したがって、子孫への伝達が当該動物の生殖細胞にその導入された材料が存在するかどうかに依存するキメラ動物に比して、トランスジェニック動物の場合、全ての動物が導入された遺伝材料をその子孫に伝達することができる。
【０００４】
培養哺乳動物細胞の高効率形質転換は、特定のＤＮＡ配列を細胞核中に直接マイクロインジェクションすることによって達成されてきた（M. Capecchi, Cell 22: 479-488 (1980))。より詳細には、ＤＮＡをマウスの胚にマイクロインジェクションし、得られた子孫にそのＤＮＡが見出されることも証明されている（J. Gordonら、P.N.A.S. U.S.A. 77: 7380-7384 (1980))。このように、或る種のトランスジェニックマウスを作製できることは、記載されそして周知である。
【０００５】
トランスジェニックマウスを作製する基本的方法は、新たに交尾した雌マウスから受精卵を回収し、次いでマウスに移すべき配列または遺伝子を含むＤＮＡを該卵の雄マウスの前核にマイクロインジェクションすることを要する。このマイクロインジェクションした卵を偽妊娠１日の養母の卵管に移植し、分娩まで進行させる。次いでこのマウス新生児を、マイクロインジェクションされたＤＮＡの存在を検出するのに好適な、当該技術分野で知られた手段によって、そのマイクロインジェクションされたＤＮＡの存在について検査する。例えば、T. Wagnerら、P.N.A.S. U.S.A. 78: 6376-6380 (1981)、米国特許第4,873,191号を参照されたく、これは、ウサギβ−グロブリンを赤血球に発現できるマウスの作製を記載している。
【０００６】
アンドロゲンは、主として発育期および成人期の雄の性徴を担っている。正常な成人男性では、主たるアンドロゲンであるテストステロン（Ｔ）は約５〜７ｍｇ／日が精巣によて産生され、全身の循環系に放出されている。テストステロンまたは一層強力なその代謝産物であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）（K. Sundaram, Steroid Biochem. Mol. Biol. 53: 253-257 (1995)）は、ステロイド核内ホルモンレセプター（ＮＨＲ）スーパーファミリーの一員であるアンドロゲンレセプター（ＡＲ）に結合する。これら細胞内レセプターはリガンド依存性の転写因子であり、様々な遺伝子の転写を制御している。ＡＲは、前立腺および精嚢、男性および女性の性器、皮膚、精巣、卵巣、軟骨、皮脂腺、毛包、汗腺、心筋、骨格筋および平滑筋、胃腸の小嚢細胞、甲状腺の濾胞細胞、副腎皮質、肝臓、松果体、および多数の脳の皮質領域および皮質下領域（脊髄の運動ニューロンを含む）を含む生殖組織および非生殖組織に広く分布している（A. Negro-Vilar, J. Clin. Endocrinol. Metab., 54(10):3459-62 (1999)）。テストステロンはまた、分泌器官および標的器官でアロマターゼによってエストロゲン（エストラジオール−１７β）に代謝されることができ（M. Sawayaら、J. Invest. Dermatol. 109: 296-300 (1997), C. Roselliら、Biol. Reprod. 58: 79-87 (1998)）、エストロゲンレセプターを介して遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。
【０００７】
アンドロゲンの作用には複数ある。胚では、アンドロゲンは生殖器の男性の表現型への分化を担う。思春期にはアンドロゲン産生の増大は二次性徴を誘発する。さらに、アンドロゲンはまた、社会行動、性欲および身体的外観などのヒトの生活の他の側面にも影響を及ぼす。
【０００８】
たとえば、去勢（テストステロンの停止を引き起こす）は動物の攻撃性の低減に導くことが報告されている（J. Morley, Handbook of Clinical Psychoneuroendocrinology, Nemroff, C.B.およびLoosen, P.T. (編), Guilford, New York, pp. 3-41 (1987)）。低テストステロンレベルはまた疲労と関係しており、一方、テストステロン置換はしばしば幸福の一般的な気分を引き起こす（Nolten W.E., Curr Urol Rep. 4:313-9 (2000)）。テストステロンは雄マウスで記憶を改善することが示されており（J. Flood, P.N.A.S. U.S.A. 89:1567-1571 (1992)）、また、より老齢のマウスでの二重盲検試験によりテストステロンが空間視覚に関する知覚を改善することがわかった（J. Jankowsky, Behav. Neurosci. 108:325-332 (1994)）。さらに、研究により男性の遊離のテストステロン血漿レベルとこれら被験者の冠状心疾患の程度との逆の相関が示唆されているという点でアンドロゲンは脈管系に作用すると考えられている（G. Phillipsら、Arterioscler. Thromb. 14:701-706 (1994), K. English, Eur. Heart J. 21:890-894 (2000)）。冠状動脈疾患を有する男性の冠状動脈にテストステロンを注入すると、冠状血流の急性の有意の増大という結果となる（C. Webbら、Circulation 100:1690-1696 (1999)）。アンドロゲンはまた、内皮細胞の機能（Ongら、Ann. J. Cardiol. 85:14-17 (2000)）および心筋虚血（C. Webbら、Ann. J. Cardio. 83:437-439 (1999); K. English, Circulation 102:1906-1911 (2000)）に対して有利に作用する。性欲の点に関しては、テストステロンはクロスセクショナル研究（R. Schiaviら、Psychosom. Med. 53:363-374 (1991)）および介入（interventional）研究（Moralesら、J. Urol. 157(3):849-854 (1997); I. Klepschら、Endocrinologie 20(4):289-293 (1982)）の両者で明らかに性衝動を改善する。外観および体の作りに対するアンドロゲンの作用については、テストステロンはより老齢の男性で低レベルのテストステロンで筋力を向上させるとの観念を支持する男性における幾つかの研究が存在する（R. Baumgartnerら、Mech. Ageing Dev. 107(2):123-136 (1999); R. Sihら、J. Clin. Endocr. Metab. 82: 1661-167 (1997); R. Orrellら、J. R. Soc. Med. 88:454-46 (1995)）。骨に対するアンドロゲンの作用に関しては、骨の無機物密度が男性では年齢とともに低下し（H. Burgerら、Ann. J. Epidem. 147(9):871-879 (1998)）、テストステロン置換療法を受けた性機能低下症の老齢の男性で増加することが示されている（P. Snyderら、J. Clin. Endocr. Metab. 84:1966-1972 (1999); I. Reidら、Arch. Intern. Med. 156:1173-117 (1996)）。
【０００９】
アンドロゲンがこれほども多くの生理的な関連する系に作用するメカニズムについての正確な理解が欠如しているにもかかわらず、ＡＲが何故に医薬の発見および患者の治療の複数の領域で重要な標的であるかは容易に理解できる。腫瘍学の領域では、たとえば、アンドロゲンレセプター機能のインヒビター（アンタゴニストまたは部分的なアンタゴニスト）はアンドロゲン依存性の前立腺癌の治療に有用であり、一方、ＡＲのアゴニストまたは部分的なアゴニストは乳癌の治療に適用できる。代謝および内分泌疾患については、アンドロゲンレセプター機能のアゴニストまたは部分的なアゴニストは、加齢関連疾患および幾つかの疾患状態（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むが、これに限られるものではない）における悪液質の状態の治療に有用である。機能的なＡＲはまた種々の骨細胞でも同定されているため、アンドロゲンの投与は男性および女性で骨格の発育および維持に対して有利に作用する。
【００１０】
アンドロゲン療法の進歩は、所望とするアンドロゲン活性を所望としないまたは投与量の制限を受ける副作用から分離することができないことにより制限されている。選択的なエストロゲンレセプターモデュレーター（所望としない副作用を排除または最小にしながら、エストロゲンレセプターへのターゲティングにおいてある程度の組織選択性を有する）の開発における最近の進歩は、同様のアプローチが選択的なアンドロゲンレセプターモデュレーター（ＳＡＲＭ）などのような他のＮＨＲにも利用できることを示唆している（たとえば、A. Negro-Vilar, J. Clin. Endocr. Metab 54(10):3459-3462 (1999); P. Reidら、Investigational New Drugs 17:271-284 (1999)を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
今日、アンドロゲンレセプターの機能をインビボで明らかにするために幾つかのアプローチが採用されている。精巣性女性化した雄（ｔｆｍ；testicular feminized male）マウス（M. Lyonら、Nature 227: 1217-1219 (1970)）は機能の喪失の一例を表すが、ＡＲ遺伝子のＮ末端領域に単一の点変異を有していて早すぎる停止コドンという結果となる（M. Gasparら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:8606-8610 (1991)）。ｔｆｍマウスはヒトでの完全型男性ホルモン不応性症候群（ｃＡＩＳ）と等価であり、遺伝的には不妊の雄であると考えられる。それゆえ、ｔｆｍマウスはＡＲ遺伝子突然変異についてホモ接合性の遺伝的に雌と考えられるマウスの作製には用いることはできない。ｔｆｍキャリヤーの雌をＡＲ遺伝子突然変異についてキメラである雄とともに飼育することにより、ホモ接合性のｔｆｍ雌がごく少数だけ作製された。これら後者の動物について行った研究から、機能性のＡＲを有することはその生殖能にとって重要ではないことが明らかとなった（M. Lyonら、Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 208:1-12 (1980)）。しかしながら、成体マウスでのＡＲ機能の解明にこれら動物を使用することには限界がある。これら動物は生涯を通じて当該レセプターを欠くので、観察される表現型の幾つかは発育の際の機能性のＡＲの欠如の結果でありうる。逆に、プロバシン（probasin）、前立腺特異的プロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウス系統が作製されている（Y. Yanら、Prostate 32:129-139 (1997)）。この系統や関連する系統はＡＲの機能を評価するのに有用な手段であるが、前立腺でのＡＲの機能を定めることに限られている。
【００１２】
故に、アンドロゲンレセプターの組織特異的な活性の評価のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを開発することは興味深い。そのようなモデルを使用して、薬理学的剤の組織特異的活性並びに雄および雌の様々な器官でのアンドロゲンレセプターの活性を研究することができる。ここに記載する本発明は、アンドロゲン制御されたプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を用いたそのようなモデルを表すものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。一つの態様において、レポーターはルシフェラーゼである。他の側面において、アンドロゲン応答配列は２ＸＤＲ−１である。
【００１４】
本発明はまた、本発明のトランスジェニックマウスから単離した細胞であってそのゲノムが該核酸構築物を含むものをも提供する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のトランスジェニックマウスから単離した細胞を含むマウス細胞系統をも提供する。
【００１６】
本発明はまた、アンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含む単離した核酸構築物であって、アンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されていることを特徴とする核酸構築物をも提供する。一つの側面において、レポーターはルシフェラーゼである。他の側面において、アンドロゲン応答配列は２ＸＤＲ−１である。
【００１７】
本発明はまた、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含み、その際、該レポーター核酸の発現が該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御されている標的マウスを得る方法であって、その際、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができ、下記工程：
（ａ）第一の雌マウスからの受精卵をゾル化し、
（ｂ）該核酸構築物を含むトランスジーンを受精卵に移し、
（ｃ）工程（ｂ）の受精卵を偽妊娠した第二の雌マウスの子宮に移し、ついで
（ｄ）該第二の雌マウスを、
（i）該第二の雌マウスが、工程（ｃ）の該受精卵からの胚で妊娠し、
（ii）該胚が該標的マウスに発育し、および
（iii）該標的マウスが該第二の雌マウスから生存して生まれる
ように保持する
ことを含み、その際、該標的マウスのゲノムは該核酸構築物を含み、該マウスは生育させてゲノムが該核酸構築物を含む子孫マウスを生成することができる、ことを特徴とする方法をも包含する。
【００１８】
本発明はまた、レポーター核酸を発現するトランスジェニックマウス細胞系統の製造方法をも包含し、該方法は、（ａ）本発明のトランスジェニックマウスから細胞を単離し、ついで（ｂ）該トランスジェニックマウス細胞系統が該レポーター核酸を発現するように、単離した細胞を単離した細胞の増殖および生存を保持する条件下に置くことを含む。
【００１９】
本発明はまた、アンドロゲンレセプターのモデュレーターをスクリーニングする方法であって、被験物質を本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、ついでアンドロゲンレセプターの活性に対する該被験物質の作用をアッセイすることを含む方法をも提供する。アンドロゲンレセプターのモデュレーターは、癌などのＡＲ機能の欠陥と関連する疾患を治療するのに特に有用である。一つの側面において、本発明は、アンドロゲンレセプターのアンタゴニストまたはアゴニストである被験物質を同定する方法を提供し、該方法は、（ａ）本発明のトランスジェニックマウス中での該レポーターの発現を決定し、（ｂ）本発明のトランスジェニックマウスに該被験物質を投与して投与後の該レポーターの発現を決定し、（ｃ）該工程（ａ）および該工程（ｂ）での該レポーターの発現を比較する、その際、該工程（ｂ）での該レポーターの発現の増大は該被験物質を該アンドロゲンレセプターのアゴニストとして同定し、該工程（ｂ）での該レポーターの発現の低減は該被験物質を該アンドロゲンレセプターのアンタゴニストとして同定する、ことを含む。
【００２０】
本発明はさらに、そのゲノムが核酸構築物を含み、該構築物がアンドロゲン応答配列を含むプロモーターに作動可能に連結したレポーターをコードするレポーター核酸を含み、該構築物がアンドロゲンレセプターをコードするアンドロゲンレセプター核酸をさらに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物は該アンドロゲンレセプター核酸が発現されたときだけ該レポーター核酸を器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。それゆえ、該レポーター核酸の発現は該アンドロゲンレセプター核酸の発現によって制御される。
【００２１】
本発明は、その生殖細胞および体細胞がアンドロゲンレセプターを発現しうるプロモーターの制御下、すなわちアンドロゲン応答配列の制御下でレポーター遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該非ヒト哺乳動物がアンドロゲンレセプターが活性化された場合にルシフェラーゼを器官中で発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物を包含する。アンドロゲンレセプターが活性化されている細胞はレポーター遺伝子の発現によって容易に決定することができ、レポーター遺伝子の発現は当業者に知られた標準的なバイオルミネセンス画像化法により測定することができる。本発明の好ましい態様において、非ヒト哺乳動物はマウスであり、トランスジーン構築物はレポーター遺伝子を含み、２コピーのアンドロゲン応答配列ＤＲ−１（２ＸＤＲ−１）（配列番号３）を含むプロモーターによって制御されたルシフェラーゼｃＤＮＡ（配列番号２）およびＣＭＶプロモーター（配列番号５）によって制御されたラットアンドロゲンレセプターｃＤＮＡ（配列番号４）を含む。本発明はさらに、有性生殖で繁殖させた後にその子孫がアンドロゲン制御されたレポーター遺伝子を有する生存したトランスジェニック動物に発育することのできる、アンドロゲン制御されたレポーター遺伝子を有する非ヒト哺乳動物胚を包含する。本発明はさらに、哺乳動物のゲノム中への最終的な挿入のためにプラスミド中にクローニングした選択したプロモーターとレポーター遺伝子およびラットＡＲ ｃＤＮＡまたはＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物を包含する。
【００２２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、活性なアンドロゲンレセプターを含む組織での光の放射を特徴とする。本発明の好ましい態様において、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、アンドロゲンレセプター活性をモデュレートする分子および化合物の同定および最適化のためにヒトＡＲ機能のモデルまたは代理として利用される。そのようにして同定した分子および化合物は、ＡＲ機能の欠陥と関連する疾患（前立腺癌および男性更年期障害を含むがこれらに限られるものではない）の予防および治療に用いることができる。それゆえ、本発明は、アンドロゲンレセプターの活性を種々の器官および組織でモニターするためのインビボ系を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、アンドロゲンレセプターを含む種々の組織でアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することのできる選択的アンドロゲンレセプターモデュレーター（ＳＡＲＭ）を同定する方法を提供することである。一つの態様において、ホルモン依存性の腫瘍でのアンタゴニスト活性が、ホルモン依存性の腫瘍細胞株でインビトロかまたはインビボのいずれかにて成長の抑制についてスクリーニングすることにより確認される。他の態様では、潜在的なＳＡＲＭの活性はまた正常な非腫瘍細胞株で評価される。あるいは、ホルモン依存性のレポーター遺伝子を発現する動物モデルは、動物の種々の組織での潜在的なＳＡＲＭの活性を評価するのに用いることができる。それゆえ、本発明はまた、アンドロゲンレセプターの選択的モデュレーターの同定のための非ヒト哺乳動物および方法、およびそのようにして同定した選択的モデュレーターを含む医薬組成物をも提供する。
【００２４】
アンドロゲンレセプターは、正常な生理プロセス、すなわち男性の性徴、並びに前立腺癌などの病理状態に関与する多くの遺伝子プログラムの発現を制御するホルモン制御された転写因子である。アンドロゲンレセプターのこれら活性は細胞の種類に特異的であり、これら細胞の種類のそれぞれにおいて共存する多くの補因子に依存している。
【００２５】
本発明は、そのゲノムにルシフェラーゼレポーター遺伝子などのレポーター遺伝子（その発現は活性化されたアンドロゲンレセプターにより制御される）、並びに機能的なアンドロゲンレセプターを発現するようにデザインされた遺伝子操作したベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に関する。ホタルからのルシフェラーゼ基質であるルシフェリンを注射すると、動物は酵素ルシフェラーゼが産生されている組織から光を放射し、遺伝子操作したかまたは内生のいずれかのアンドロゲンレセプターの活性を示す。
【００２６】
本発明の好ましい態様においてはレポーター遺伝子はルシフェラーゼであるが、当業者であれば他のレポーター遺伝子の選択および使用の仕方がわかるであろう。そのような他のレポーター遺伝子としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ドーパミン２レセプター（Ｄ２Ｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＥＬＩＳＡによって検出できる一般的なタグが挙げられる。好ましい態様において、ルシフェラーゼはIvisTM Imaging System（Xeragon Corporation、アラメダ、カリフォルニア）で用いる。
【００２７】
本発明により提供されるのは、２つの直列反復１アンドロゲン応答配列（direct repeat-1 androgen response elements）（２ＸＤＲ−１ ＡＲＥ）（配列番号３）を含むプロモーターの制御下にルシフェラーゼｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（配列番号５）の制御下にラットアンドロゲンレセプターｃＤＮＡ（配列番号４）を発現するトランスジェニック系統の確立である。ＤＲ−１は１１塩基対の配列（５’ＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡ３’）（配列番号６）であり、重複する直列反復として配向した２つの潜在的なコア結合部位からなる。ＤＲ−１は、ランダム配列選択アッセイでのヒトＡＲ ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質のＤＮＡへの結合により、強力なアンドロゲン応答配列（ＡＲＥ）として同定された（Z. Zhouら、J. Biol. Chem., 272:8227-8235 (1997)）。２コピーのＤＲ−１の直列の配置は、糖質コルチコイドレセプターと比較してＡＲ結合に対する強力な嗜好およびトランス活性化を示した（上掲）。肺、心臓、肝臓、および精巣を含む複数の器官でトランスジーンを発現するマウスの系統を作製した；このトランスジーンを有するマウスはいかなる異常もきたさなかった。本明細書に記載するトランスジェニック動物は、アンドロゲンレセプターの活性をモデュレートする生物学的および化学的残基の同定、開発、および最適化に利用することができる。そのような残基は、今度は前立腺癌、男性更年期障害、およびホルモン補充など（これらに限られるものではない）の治療に用いることができる。
【００２８】
ｐＧＬ３ベクター（Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン）からのルシフェラーゼｃＤＮＡ（配列番号２）が２つのＤＲ−１ ＡＲＥ（配列番号３）（Z. Zhouら、J. Biol. Chem., 272:8227-8235 (1997)）を含むプロモーターの制御下に置かれ、効率的なメッセージプロセシングのためにニワトリベータ−グロビンイントロンおよびポリＡ配列によりフランキングされた構築物を作製した。当業者であれば制御ルシフェラーゼ発現のためにＤＲ−１に加えて他のＡＲＥを選択および使用できるであろう。停止転写カセットによって分離されて、同ベクターは反対方向にてラットアンドロゲンレセプターｃＤＮＡ（配列番号４）の発現を制御するＣＭＶプロモーター（配列番号５）並びに効率的なメッセージプロセシングのためにＳＶ４０ウイルスイントロンおよびポリＡ配列を含んでいる（図１）。ＣＭＶプロモーター（配列番号５）は、インビボで動物にて発現されたときに下流配列の転写を殆どあらゆる組織で遍在的に駆動させる。当業者であれば本発明のトランスジーンを他の組織特異的プロモーターの制御下にてベクター中にクローニングすることができるであろう。
【００２９】
以下の実施例に記載する好ましい態様では、構築物は遺伝子操作されたルシフェラーゼ遺伝子をアンドロゲンレセプターによって制御されるプロモーターの制御下に含む（図２Ａ〜２Ｄ、配列番号１）。当業者であれば、糖質コルチコイド、プロゲステロン、鉱質コルチコイド、およびエストロゲンレセプターなどのステロイド核内ホルモンレセプターファミリーの他の成員の特徴付けに有用な他の構築物を作製できることを認識するであろう。例として（これに限られることを意図するものではない）、本発明のトランスジーンは、ＤＲ−１アンドロゲン応答配列、あるいは他のＡＲＥ、たとえばＣ３、ＰＳＡ−ＡＲＥまたはプロバシン−ＡＲＥを含むプロモーター、または糖質コルチコイド応答配列、プロゲステロン応答配列、鉱質コルチコイド応答配列もしくはエストラジオール応答配列を含むプロモーターを含む。
【００３０】
本発明で使用するヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）は、パブリックドメインで利用可能な配列に基づき（たとえば、GenBank）、標準分子生物学技術を用いてクローニングした（Maniatusら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2 (1991)）。
【００３１】
構築物はまた、たとえば、標的ゲノム中への導入、トランスジェニック哺乳動物中でのその発現位置、トランスジーン発現のオン／オフ外部制御、および当該技術分野で一般的に知られている他の所望の特徴を媒体すべく、トランスジーンと結合して（トランスジーンと融合するなどして）選択した核酸領域をも含んでいてよい。
【００３２】
上記の同定したＤＮＡ構築物を受精した卵母細胞の前核にマイクロインジェクションすると、トランスジーン（ＡＲＬｕｃ）ＤＮＡを有する４匹のファウンダー（founder）マウスの生成という結果となった。これら４匹のマウスのうち３匹が、トランスジーンをメンデルの法則に従って子孫に受け継がせることがわかった。これら３つの系統からのマウスを、引き続きルシフェラーゼ遺伝子の発現について複数の組織で調べた。図７からわかるように、系統２６として同定された一つのトランスジェニックマウスは、肺、心臓、および精巣において特に高レベルのアンドロゲン応答性ルシフェラーゼトランスジーン発現を有していた。
【００３３】
系統２６からの３匹の雄トランスジェニックマウス（１匹の非トランスジェニックマウスおよび２匹のトランスジェニックマウス）に、３９日齢のときに１５０ｍｇ／ｋｇ体重のルシフェリンを麻酔の１５分前に注射し、IVISTM Imaging System（Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア）に置き、ルシフェラーゼを冷却した荷電結合素子（ＣＣＤ）IVISTMカメラ（Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア）で検出し、画像を製造業者によってデザインされたLiving ImageR Software（Xenogen Corporate、アラメダ、カリフォルニア）で捕捉した。図８Ａおよび図８Ｂに示すように、非トランスジェニックの対照とは対照的に、両トランスジェニックマウスはルミネセンスを呈示し、生殖器領域で優先的なルシフェラーゼ発現を示していた。この発現がアンドロゲン依存性であることを確認するため、これらトランスジェニックマウスの一方を去勢した１週間後に同じ動物で同じ研究を繰り返した。図８Ｂは去勢したマウスでのルミネセンスの消失を示しており、ルシフェラーゼのアンドロゲン依存性の発現が確認された。
【００３４】
いかなる理論によっても拘泥されることを意図するものではないが、生殖器領域で観察された高いルミネセンスは、精巣がアンドロゲンが合成される器官であり、それゆえアンドロゲンレセプターの活性が最大であるに違いないとの事実によるものと考えられた。この考えを検証するため、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のルシフェリンを注射した後に対照マウスおよびトランスジェニックマウスから精巣を単離し、カメラに暴露した。図９に示すように、非トランスジェニック動物からの精巣とは対照的に、トランスジェニック動物からの精巣は実質的な光を放射し、このことからもルシフェラーゼ発現のアンドロゲン依存性が確認された。
【００３５】
ルシフェラーゼの発現に対するアンドロゲンの作用をさらに確認するため、系統２６からの２対のマウスに２ｍｇ／ｋｇ体重のテストステロンを皮下注射した後の０日目および１日目に画像化した。図１０Ａ〜１０Ｄに示すように、テストステロン処理は全光子放射を１.５〜３.７倍増大させた（トランスジェニックマウスタグ＃４５４およびタグ＃４５３を処理前のそのベースラインと比較）。非トランスジェニック対照と比較した処理動物の比は、それぞれ１６.２倍および２９.０倍であった。
【００３６】
第一にルシフェラーゼ活性を単一の器官で測定する可能性、第二にこれら器官でのアンドロゲン機能の差異を検出する能力を試験するため、ルシフェラーゼ活性を脳、肺、肝臓、四頭筋、精嚢、および心臓から調製した全抽出物で測定した。図１１に示すように、トランスジェニックマウスのテストステロン処理は、対応する非トランスジェニック対照からの抽出物に対して、脳（３.４倍）、四頭筋（７.２倍）、精嚢（４.２倍）、および心臓（３.８倍）でのルシフェラーゼ活性の増大を促進した。
【００３７】
本発明のトランスジェニック動物はまた、アンドロゲンレセプター機能の欠陥と関連のある疾患、とりわけ癌の治療のための化合物または薬物療法の開発に有用である。「アンドロゲンレセプター機能の欠陥」とは、野生型のアンドロゲンレセプターに関して異常な発現、すなわちアップレギュレーションかまたはダウンレギュレーションされた仕方での異常な発現の結果としての機能を意味する。この有用性を示すため、３群のマウスをそれぞれテストステロン（２ｍｇ／ｋｇ、皮下）で処理、テストステロンおよびCasodexR（５０ｍｇ／ｋｇ、経口）で処理、または未処理とした。図１２に示すように、ビカルタミド（CasodexR）は、四頭筋、骨、前立腺−精嚢でのテストステロン誘発ルシフェラーゼ発現を許容しうる機能範囲で（四頭筋ではテストステロン作用の９２％抑制（未処理に対して５.８倍の誘発）、骨ではテストステロン作用の８６％抑制（未処理に対して３.３倍の誘発）、および前立腺−精嚢ではテストステロン作用の９０％抑制（未処理に対して５.６倍の誘発））抑制した。腎臓では応答は観察されなかった。
【００３８】
以上、本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することで、より容易に理解できる。これら実施例は例示のために提供するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【００３９】
実施例
実施例１．ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲトランスジーン構築物
Ａ．ｐＧＬ３／２ＸＤＲ−１ルシフェラーゼ
等価モル量の相補的オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｆ）（ＡＲＥ）（配列番号７）およびＤＲ−１（Ｒ）（ＡＲＥ）（配列番号８）をアニールし、ついでＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３−プロモータープラスミド（Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン）中にライゲートした。オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｆ）（ＡＲＥ）（配列番号７）は、配列：５’−ＴＣＧＡＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡ−３’を有する。オリゴヌクレオチドＤＲ−１（Ｒ）（ＡＲＥ）は、配列：５’−ＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号８）を有する。等価モル量の相補的オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｆ）（配列番号９）および１ＸＤＲ−１（Ｒ）（配列番号１０）をアニールし、ついで両者をＳａｃＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼプラスミド中にライゲートすることにより、第二のＤＲ−１応答配列をｐＧＬ３／１ＸＤＲ−１／ルシフェラーゼに存在するＤＲ−１配列の上流に挿入した。オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｆ）（配列番号９）は、配列：５’−ＣＧＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡ−３’を有する。オリゴヌクレオチド１ＸＤＲ−１（Ｒ）（配列番号１０）は、配列：５’−ＴＣＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴ−３’を有する。
【００４０】
Ｂ．ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ
標準分子生物学技術、たとえば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2 (1991)を用いて発現構築物の作製を行った。ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲトランスジーン構築物（配列番号１）の全配列を図２Ａ〜２Ｄに示す。
【００４１】
配列番号４のヌクレオチド配列を含みラットアンドロゲンレセプターの全アミノ酸配列をコードするＮｏｔＩ断片をｐｃＤＮＡ−ｒＡＲから単離し、クレノーを用いて平滑末端とした。ついで、この断片をＳｍａＩ／ＡｆｅＩ制限処理したｐＣＭＶ−ＴＳＩＲにクローニングして中間体のｐＣＭＶ−ｒＡＲｔｅｍｐを作製した。プラスミドｐＴｅｔＩｎｄをＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩで制限処理し、クレノーで平滑末端とし、自己に対してライゲートした。ついで、得られたプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩで消化し、ｐＧＬ３−ｐｒｏ／２ＸＤＲ−１の消化後に単離したＥｃｏＩＣＲＩ／ＸｂａＩ断片のサブクローニングのためのベクターとして用いた。この断片は、アンドロゲン応答性プロモーター（最小ＳＶ４０プロモーター（配列番号３）の５’プライミング末端に２つのアンドロゲン応答配列を融合することによって作製した）、並びに完全長ルシフェラーゼタンパク質をコードする配列（配列番号２）からなっていた。得られたプラスミドをｐ２ＸＤＲ−１−Ｌｕｃｔｅｍｐ−１と称した。５’末端にＸｈｏＩ部位および３’末端にＳａｌＩ部位でフランキングされた停止転写カセットを、ｐＢＳ３０２を鋳型として用いたＰＣＲにより作製した。ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ制限処理したＰＣＲ断片をＸｈｏＩ制限処理したｐ２ＸＤＲ−１−ＬｕｃＴｅｍｐ１中に、停止転写カセットの３’末端がアンドロゲン応答性プロモーターの５’末端のちょうど上流に挿入されるような方向でサブクローニングした。得られたプラスミドをｐ２ＸＤＲ−１−Ｌｕｃｔｅｍｐ−２と称した。ついで、このプラスミドをＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、停止転写カセット、アンドロゲン応答性プロモーター、およびルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を含む断片をＸｈｏＩ／ＸｂａＩ制限処理したｐＣＭＶ−ＡＲｔｅｍｐ中に挿入した。これによりＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲプラスミドが完成した。ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲのＰｍｅＩ／ＰａｃＩ消化により生成した８.６ｋｂ ＤＮＡ断片を、ＡＲＬｕｃトランスジェニック動物を作製すべくマウス胚にマイクロインジェクションするために単離した。
【００４２】
実施例２．トランスジェニックマウスの作製および飼育
上記構築物からのＰｍｅＩ／ＰａｃＩ断片をＣ５７Ｂｌ／６ＸＤＢＡ２Ｆ２（Ｂ６Ｄ２Ｆ２）胚の前核中にマイクロインジェクションすることにより、ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物を有するトランスジェニックマウスを作製した。胚の作製は、Hoganらにより記載された技術（Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual、第２版、Brigid Hogan, Rosa Beddington, Frank Constantini,およびElizabeth Lacey編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)）を用い、ハイブリッドスタッド（stud）Ｂ６Ｄ２雄を同じバックグラウンドの処女雌（Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ）に集団内（in-house）交配することにより行った。注射した胚を偽妊娠のＩＣＲ雌マウス（Harlan Sprague Dawley、インディアナポリス、インディアナ）に移し、分娩まで進行させた。５〜８日齢のときに足指および尾の試料をトランスジーンのＤＮＡ分析のために採取した。トランスジーンを有するマウスを、ＣＭＶプロモーターとベクター中のＤＲ−１配列、上流プライマー５’ＣＴＴＧＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡ３’（配列番号１１）および下流プライマー５’ＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡ３’（配列番号１２）との間を妨害するインシュレーター停止カセット配列を検出すべくデザインしたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）戦略により同定した。ついで、トランスジーンを有することが示されたファウンダーマウス（Ｆ０）をＩＣＲバックグラウンドに非近交系交配し、その子孫（Ｆ１）をメンデルの法則でのトランスジーンの移動について再び試験した。マウスはすべて靴箱施設（shoebox housing）に収容し、１２／１２明暗サイクルで食物および水を自由に取らせ、ＡＡＡＬＡＣ公認設備にて協会（institutional）ＡＣＵＣのガイドラインのもとに人道的に扱われた。
【００４３】
実施例３．遺伝子発現分析
ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲトランスジーン発現の検出はノーザンブロット分析により行った。トランスジーンの発現を有していたトランスジェニック系統を同定するため、ファウンダーからのＦ１子孫を安楽死させ、その肺、心臓、肝臓、および精巣を回収した。試料を液体窒素中でフラッシュ凍結し、ｍＲＮＡ単離のときまで貯蔵した。全ＲＮＡを、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液、たとえばTrizolR LS Reagentシステム（GIBCOTM Invitrogen Corporation、カールスバード、カリフォルニア）を製造業者の記載に従って使用して単離した。これらのＲＮＡ単離物からｍＲＮＡを、Oligotex Direct mRNAキットを製造業者（Operon/QIAGEN、バレンシア、カリフォルニア）の推奨に従って用いて抽出した。ｍＲＮＡを１７.６％ホルムアルデヒドを用いた変性条件下、１.０％アガロースゲル電気泳動で分離し、ハイブリダイゼーションする前に毛管ブロッティングによりナイロンメンブレン（Hybond-N、Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン）に移した。ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲメッセージの検出は、ルシフェラーゼｍＲＮＡを検出すべくデザインされた６０７ｂｐの放射性標識プローブ（Ready-to-Go kit, New England Nuclear/Perkin ElmerTM Life Sciences、ボストン、マサチューセッツ）にＲＮＡをハイブリダイズさせることにより行った。この６０７ｂｐの断片は、鋳型としてのｐＧＬ３ベクターおよびオリゴヌクレオチドＬＵＣ（Ｆ）：５’−ＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１３）およびＬＵＣ（Ｒ）：５’−ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１４）を用いたＰＣＲにより作製した。ハイブリダイゼーションはＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Amersham Biosciences、ウプサラ、スウェーデン）中で一夜行い、プローブの非特異的なアニーリングはストリンジェント条件下（０.１×ＳＳＣ、２％ＳＤＳ中、６５℃で２×２０分）で複数回洗浄することにより排除した。ルシフェラーゼメッセージへのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、phosphoimager（Model FLA-2000, Mfr. Fuji Film、スタンフォード、コネチカット）で検出した。
【００４４】
実施例４．インビボでのルシフェラーゼ画像化
インビボ画像化によるルシフェラーゼ発現の検出に割り当てたマウスに、画像化の１５分前にＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注射する。ついで、マウスにアベルチン（ＰＢＳ中の２.５％溶液を０.３ｍｌ）を注射することにより化学的拘束（chemical restraint）下に置く。麻酔したマウスを、冷却したCCD IVISTMカメラおよびステージを含む暗箱であるIVISTM Imaging System（Xenogen Corporation、アメラダ、カリフォルニア）中に置く。２分間の画像捕捉の後、画像をLiving ImageR Software（Xenogen、アラメダ、カリフォルニア）で処理する。組織の画像化のためには、二酸化炭素による安楽死の１５分前にマウスにルシフェリンを注射し、組織を切り出し、同様に画像化する。
【００４５】
実施例５．全器官抽出物でのルシフェラーゼ活性の測定
心臓、肺、肝臓、筋肉、脳、骨、精嚢（前立腺を含む）、および精巣を回収し、アッセイのときまでフラッシュ凍結した。抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイキット（ＬＵＣ１−１ＫＴ）（Sigma）を用いて評価した。液体窒素の存在下、乳鉢と乳棒により組織を細かい粉末に破砕し、ついで１ｍｌの溶解緩衝液中に入れた。不溶性物質は１４,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離（エッペンドルフマイクロ遠心管）することにより除いた。最上層の脂質層を廃棄し、上澄み液を回収した。Bradfordアッセイ（M. Bradford, Anal. Biochem. 1976, 72: 248-254）を３つずつ行ってタンパク質濃度を決定した。ルシフェラーゼ基質を含む１００μｌのアッセイ緩衝液に３つずつ、組織当たり１００μｇの全タンパク質を加えた。化学ルミネセンスをコスターブラック９６ウエルプレート中、Beckmanトップカウントによりカウント／秒にて測定した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】トランスジーンＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物（配列番号１）の模式図を示す。ルシフェラーゼｃＤＮＡ（配列番号２）は、２つのアンドロゲン制御された配列（ＡＲＥ−ＤＲ−１）およびＳＶ４０プロモーター（配列番号３）を含むプロモーターの下流にてベクター中にクローニングされ、効率的なメッセージプロセシングのためにイントロンおよびポリＡ配列によりフランキングされていた。ラットアンドロゲンレセプターｃＤＮＡ（配列番号４）は、同プラスミドのＣＭＶプロモーター（配列番号５）の下流にクローニングされた。
【００４７】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲトランスジェニック構築物（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。
【００４８】
【図３】ルシフェラーゼｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列を示す。番号付けはＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物（配列番号１）中の位置に対応する。
【００４９】
【図４】２ＸＤＲ−１ ＳＶ−４０プロモーター（配列番号３）のヌクレオチド配列を示す。番号付けはＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物（配列番号１）中の位置に対応する。
【００５０】
【図５】ラットアンドロゲンレセプターｃＤＮＡ（配列番号４）のヌクレオチド配列を示す。番号付けはＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物（配列番号１）中の位置に対応する。
【００５１】
【図６】ＣＭＶプロモーター（配列番号５）のヌクレオチド配列を示す。番号付けはＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ構築物（配列番号１）中の位置に対応する。
【００５２】
【図７】対照およびトランスジーン（ＡＲＥ−ＬＵＣ／ＣＭＶ−ｒＡＲ）を移行したことがわかった３匹の子孫マウスの肺、心臓、肝臓、および精巣組織の代表的ノーザンブロット分析を示す。各レーンは、各組織から単離した２０μｇの全ＲＮＡを含み、１７.５％ホルムアルデヒド中の１％アガロースゲルで分離した。
【００５３】
【図８】図８Ａは、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン皮下注射の１５分後に麻酔し、Xenogen画像システムに置いた、１匹の対照および２匹のトランスジェニックマウスの系統２６マウスの代表的なセットを示す。ルシフェラーゼの光放射は冷却したＣＣＤ ＩＶＩＳＴＭカメラで検出され、この酵素の発現を誘発した活性なアンドロゲンレセプターを含む器官を表している。図８Ｂは、対照およびトランスジェニックマウスの一方（それぞれ左および中央のマウス）を去勢した１週間後の同動物を示す。
【００５４】
【図９】図８Ａに記載したトランスジェニックマウスおよびそれぞれの対照から単離した精巣の電荷結合素子（ＣＤＤ）ＩＶＩＳＴＭカメラ（Xenogen Corporation、アラメダ、カリフォルニア）で捕捉した画像を示す。
【００５５】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、テストステロン（２ｍｇ／ｋｇ）で処理後２４時間での系統２６からの対照非トランスジェニックマウスとトランスジェニックマウスのペアの代表的な光放射画像を示す。
【００５６】
【図１１】テストステロンで処理したまたは処理していないトランスジェニックマウスまたは非トランスジェニックマウスからの種々の器官抽出物中で測定したルシフェラーゼ活性を示す。異なる群について等量のタンパク質をアッセイした。
【００５７】
【図１２】テストステロン誘発ルシフェラーゼ活性に対するアンドロゲンレセプターアンタゴニストであるビカルタミド（CasodexR、Astra Zeneca、ロンドン、英国）の四頭筋、骨、前立腺／精嚢および腎臓での作用を示す。ルシフェラーゼ活性（ｃｐｓ）の測定は、対応する器官抽出物の等価なタンパク質試料（１００μｇ）で２回ずつ行った。結果は、１群当たり３匹の平均値である。
【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月16日(2005.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532814000001.app
【国際調査報告】
2005532814.tif 000030