(57)【要約】本発明の局面は、一般に、光の励起波長および発光波長を選択するため、ならびに同じサンプル中の複数のフルオロフォアからの同時の蛍光発光（偏光蛍光発光を含む）を検出および定量するために、二重格子モノクロメータを使用するが光ファイバーを使用しない、波長走査蛍光分光計に関する。本発明の種々の実施形態に従って、波長および面積走査蛍光分光光度計は、励起二重モノクロメータ、同軸励起光／放射光伝達モジュール、放射二重モノクロメータ、高速タイマーカウンター回路基板、および励起光の焦点面に対してサンプルを位置付ける際に使用するための正確なｘ−ｙ−ｚ取り付けテーブルを備えて提供される。それぞれの操作は、タイマー−カウンター基板によって指示され、調整される。
2005500513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光分光光度計システムであって、以下：
光源；
第１の二重モノクロメータであって、２つ以上の格子を備え、そして該光源からの光を複数の波長に分離し、そして励起光として選択された波長を出力するように作動する、第１の二重モノクロメータ；
光伝達モジュールであって、以下：
該励起光の実質的全てを、直接的にサンプル上に配向するように作動する、第１反射表面；および
蛍光またはルミネセンス光として該サンプルから放射された光を配向するように作動する、第２反射表面、
を備える、光伝達モジュール；
第２の二重モノクロメータであって、２つ以上の格子を備え、そして該光伝達モジュールによって配向された蛍光またはルミネセンス光を複数の波長に分離し、そして放射光として選択された波長の蛍光またはルミネセンス光を出力するように作動する、第２の二重モノクロメータ；ならびに
光検出器および分析器であって、該第２二重モノクロメータによる該放射光出力を受信し、該選択された波長の放射光を配向し、そして該選択された波長の表示を出力するように作動する、光検出器および分析器、
を備える、蛍光分光光度計システム。
【請求項２】
請求項１に記載のシステムであって、前記第１二重モノクロメータまたは前記第２二重モノクロメータの少なくとも１方が、以下：
光を受信するための入口開口部；
該入口開口部を通して受信された光の少なくとも一部を分散するように位置決めされる、第１光学格子；
該第１光学格子によって分散された光の一部を遮断するように位置決めされ、そして該分散された光の選択された波長を通過するように作動する、第１選択開口部；
該第１の選択開口部を通過する光の少なくとも一部を分散するように位置決めされる、第２光学格子；ならびに
第２光学格子によって分散された光の一部を遮断するように位置決めされ、そして該分散された光の選択された波長を通過するように作動する、第２選択開口部、
を備える、システム。
【請求項３】
前記第１光学格子および前記第２光学格子が、凹面である、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１光学格子および前記第２光学格子が、ホログラフィー凹面格子である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
請求項２に記載のシステムであって、前記第１光学格子および前記第２光学格子の各々が、それぞれの回転軸の回りで旋回して、回転角の関数として、前記第１選択開口部および前記第２選択開口部をそれぞれ通過するような、光波長の範囲の選択を可能にするように作動する、システム。
【請求項６】
請求項５に記載のシステムであって、それぞれの回転軸の回りで前記第１光学格子を旋回させるための手段、およびそれと同調して、それぞれの回転軸の回りで前記第２光学格子を旋回させるための手段をさらに備える、システム。
【請求項７】
請求項６に記載のシステムであって、前記旋回させるための手段が、前記第１光学格子および前記第２光学格子の各々に作動可能に連結された帯域駆動機構を備える、システム。
【請求項８】
請求項１に記載のシステムであって、前記第１反射表面が、前記サンプルを含むウェルと実質的に同軸に位置決めされた励起ミラーであり、そして前記第２反射表面が、該サンプルを含むウェルと実質的に同軸に位置決めされた放射ミラーである、システム。
【請求項９】
請求項８に記載のシステムであって、前記第１反射表面が、前記励起光を直接的に前記サンプル上に焦点合わせするように作動する、放物型第１表面励起ミラーである、システム。
【請求項１０】
前記放射ミラーが、球形ミラーである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記励起ミラーおよび前記放射ミラーが、第１表面ミラーである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記励起ミラーが、５０００個程度の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルプレートの中の選択されたウェルの開口部中に前記励起光を配向するように位置決めされている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
請求項８に記載のシステムであって、前記ウェルが、透明な下部基板および頂部開口部を備え、そしてここで：
前記励起ミラーが、該透明な下部基板を通して、前記励起光を該ウェルに配向するように位置決めされ、そして
前記放射ミラーが、該放射光を該ウェルの頂部開口部から集めるように位置決めされる、
システム。
【請求項１４】
請求項１３に記載のシステムであって、前記光源または前記第１の二重モノクロメータのうちの少なくとも一方が、前記励起光を直接的に前記励起ミラーに配向するように作動する、システム。
【請求項１５】
請求項１３に記載のシステムであって、励起光を、前記第１の二重モノクロメータから前記励起ミラーに配向するように作動する配向される、光配向ミラーをさらに備える、システム。
【請求項１６】
前記光検出器および分析器が、前記選択された波長の放射光の光子の数を計数する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
請求項１に記載のシステムであって、以下：
前記励起光を偏波面励起光に制限するように作動する、光学フィルタ；および
該光学フィルタを該励起光の経路中に挿入するために、選択的に作動される光学フィルタホルダ、
をさらに備える、システム。
【請求項１８】
前記光学フィルタおよび前記光学フィルタホルダが、前記第１の二重モノクロメータ中に組み込まれる、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記光学フィルタおよび前記光学フィルタホルダが、前記光伝達モジュール中に組み込まれる、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
請求項１７に記載のシステムであって、以下：
前記偏波面励起光と平行な面で、放射光を伝達するように作動する、第１偏光フィルタ；
該偏波面励起光と平行ではない任意の面で、放射光を伝達するように作動する、第２偏光フィルタ；および
該第１偏光フィルタまたは該第２偏光フィルタの一方を前記放射光の経路に挿入するように選択的に作動される、偏光フィルタホルダ、
をさらに備える、システム。
【請求項２１】
請求項２０に記載のシステムであって、前記第１偏光フィルタ、前記第２偏光フィルタ、および前記偏光フィルタホルダが、前記第２の二重モノクロメータに組み込まれる、システム。
【請求項２２】
請求項２０に記載のシステムであって、前記第１偏光フィルタ、前記第２偏光フィルタ、および前記偏光フィルタホルダが、前記光伝達モジュールに組み込まれる、システム。
【請求項２３】
二重モノクロメータであって、以下：
入力光を受信するための入口開口部；
該入口開口部を通して受信された光の少なくとも一部を分散するように位置決めされる、第１光学格子；
該第１光学格子によって分散された光の一部を遮断するように位置決めされ、そして該分散された光の選択された領域の波長を通過するように作動する、第１選択開口部；
該第１の選択開口部を通過する光の少なくとも一部を分散するように位置決めされる、第２光学格子；ならびに
該第２光学格子によって分散された光の一部を遮断するように位置決めされ、そして該分散された光の選択された領域の波長を出力光として通過するように作動する、第２選択開口部、
を備える、システム。
【請求項２４】
前記第１光学格子および前記第２光学格子が、凹面である、請求項２３に記載の二重モノクロメータ。
【請求項２５】
前記第１光学格子および前記第２光学格子が、ホログラフィー凹面格子である、請求項２４に記載の二重モノクロメータ。
【請求項２６】
請求項２３に記載の二重モノクロメータであって、前記第１光学格子および前記第２光学格子の各々が、それぞれの回転軸の回りで旋回し、回転角の関数として、前記第１選択開口部および前記第２選択開口部をそれぞれ通過するような、波長範囲の光の選択を可能にするように作動する、二重モノクロメータ。
【請求項２７】
請求項２６に記載の二重モノクロメータであって、それぞれの回転軸の回りで前記第１光学格子を旋回させるための手段、およびそれと同調して、それぞれの回転軸の回りで前記第２光学格子を旋回させるための手段をさらに備える、二重モノクロメータ。
【請求項２８】
請求項２７に記載の二重モノクロメータであって、前記旋回させるための手段が、前記第１光学格子および前記第２光学格子の各々に作動可能に連結された帯域駆動機構を備える、二重モノクロメータ。
【請求項２９】
請求項２３に記載の二重モノクロメータであって、以下：
前記出力光を選択された偏光面に制限するように作動する、光学フィルタ；および
該光学フィルタを該出力光の経路に挿入するように選択的に作動する、光学フィルタホルダ、
を備える、二重モノクロメータ。
【請求項３０】
請求項２３に記載の二重モノクロメータであって、前記入力光が、偏光され、該二重モノクロメータは、以下：
前記偏波面入力光と平行な面で、光を伝達するように作動する、第１偏光フィルタ；
該偏波面入力光と平行ではない任意の面で、光を伝達するように作動する、第２偏光フィルタ；および
該第１偏光フィルタまたは該第２偏光フィルタの一方を該入力光の経路に挿入するように選択的に作動する、偏光フィルタホルダ、
をさらに備える、システム。
【請求項３１】
光伝達モジュールであって、以下：
励起ミラーであって、照射される領域と実質的に同軸に位置決めされ、そして入射光を配向して該領域を照射するように作動して、その結果該照射された領域が蛍光またはルミネセンス光を放射する、励起ミラー；および
放射ミラーであって、照射される領域と実質的に同軸に、かつ該励起ミラーと軸がずれたアライメントで位置決めされ、ここで、該放射ミラーが、放射光として照射された領域によって放射された光に焦点を合わせ、そして配向するように作動する、放射ミラー、
を備える、光伝達モジュール。
【請求項３２】
前記放射ミラーが、球形ミラーである、請求項３１に記載の光伝達モジュール。
【請求項３３】
前記励起ミラーおよび前記放射ミラーが、第１表面ミラーである、請求項３１に記載の光伝達モジュール。
【請求項３４】
請求項３１に記載の光伝達モジュールであって、以下：
前記入射光を、選択した偏光面に制限するように作動する、光学フィルタ；および
該光学フィルタを該入射光の経路に挿入するように選択的に作動する、光学フィルタホルダ、
をさらに備える、光伝達モジュール。
【請求項３５】
請求項３４に記載の光伝達モジュールであって、以下：
前記偏波面入力光と平行な面で、光を伝達するように作動する、第１偏光フィルタ；
該偏波面入力光と平行ではない任意の面で、光を伝達するように作動する、第２偏光フィルタ；および
該第１偏光フィルタまたは該第２偏光フィルタの一方を前記放射光の経路に挿入するように選択的に作動する、偏光フィルタホルダ、
をさらに備える、光伝達モジュール。
【請求項３６】
請求項３５に記載の光伝達モジュールであって、前記偏光フィルタホルダが、前記第１偏光フィルタまたは前記第２偏光フィルタの一方を、前記照射される領域と前記放射ミラーとの間に挿入するように選択的に作動する、光伝達モジュール。
【請求項３７】
分光光度計システムであって、以下：
球形凹面反射システムを備えた光源であって、該反射システムは、両端においてテレセントリックであり、そして３の収差次数について完全に修正されている、光源；
入口開口部を有する、第１の多重格子モノクロメータであって、該第１の多重格子モノクロメータは、該光源からの該入口開口部上に画像化された光を複数の波長に分離し、そして励起光として選択された波長を出力するように作動する、第１の多重格子モノクロメータ；
光伝達モジュールであって、以下：
該励起光の実質的に全てを、直接的にサンプル上に配向するように作動する、第１反射表面；および
第２反射表面であって、該第２反射表面が、複合放物型反射面であり、そして蛍光またはルミネセンス光として該サンプルから放射された光を集め、そして配向するように作動する、第２反射表面、
を備える、光伝達モジュール；
第２の多重格子モノクロメータであって、該蛍光またはルミネセンス光を複数の波長に分離し、そして放射光として選択された波長の蛍光またはルミネセンス光を出力するように作動する、第２の多重格子モノクロメータ；ならびに
光検出器および分析器であって、該第２多重格子モノクロメータによる放射光出力を受信し、該選択された波長の放射光を配向し、そして該選択された波長の表示を出力するように作動する、光検出器および分析器、
を備える、分光光度計システム。
【請求項３８】
請求項３７に記載のシステムであって、前記反射システムが、以下：
複数の開口部であって、複数の開口部の各々が、前記第１多重格子モノクロメータの入口開口部上に画像化された光の円錐角を変えるように作動する、複数の開口部；および
該複数の開口部の１つを該入口開口部上に画像化された光の経路に選択的に挿入するための手段、
を備える、システム。
【請求項３９】
前記反射システムは、オフナー１：１アフォーカルリレーを備える、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記第１の多重格子モノクロメータおよび前記第２の多重格子モノクロメータの各々は、第１凹面光学格子および第２凹面光学格子を備える、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４１】
前記第１凹面光学格子および前記第２凹面光学格子は、ホログラフィー凹面格子である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
請求項４０に記載のシステムであって、前記第１凹面光学格子および前記第２凹面光学格子の各々は、それぞれの回転軸の回りで旋回するように作動する、システム。
【請求項４３】
請求項３７に記載のシステムであって、前記光伝達モジュールの第１反射表面が、前記サンプルを含むウェルと実質的に同軸で位置決めされている励起ミラーであり、そして前記複合放物型反射面が、該ウェルと実質的に同軸で位置決めされ、そして該サンプルから前記第２の多重格子モノクロメータに放射された光を出力するように作動する放射ミラーと反射アライメントにある、システム。
【請求項４４】
前記光伝達モジュールの第１反射表面が、放物型第１表面励起ミラーである、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記放射ミラーが、第１表面ミラーである、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
請求項４３に記載のシステムであって、前記励起ミラーが、５０００個程度の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルプレートの中の選択されたウェルの開口部中に前記励起光を配向するように位置決めされている、システム。
【請求項４７】
請求項４３に記載のシステムであって、前記励起光が、偏波面であり、ここで、前記光伝達モジュールが、以下：
前記偏波面励起光と平行な面で、光を伝達するように作動する、第１偏光フィルタ；
該偏波面励起光と平行ではない任意の面で、光を伝達するように作動する、第２偏光フィルタ；および
該第１偏光フィルタまたは該第２偏光フィルタの一方を、前記複合放物型反射面と前記放射ミラーとの間に挿入するように選択的に作動する、偏光フィルタホルダ、
をさらに備える、システム。
【請求項４８】
前記光伝達モジュール、前記第２の多重格子モノクロメータ、ならびに前記光検出器および分析器が、前記サンプル中の１つ以上の蛍光化合物を分析するように作動する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４９】
請求項４６に記載のシステムであって、前記光伝達モジュールに対して前記マイクロウェルプレートを変換して、該マイクロプレート中の複数のウェル中の選択された１つからのサンプルの分析を可能にする手段をさらに備える、システム。
【請求項５０】
光伝達モジュールであって、以下：
励起光を許容するための入口開口部；
励起ミラーであって、照射される領域と実質的に同軸で位置決めされ、そして該入口開口部からの励起光を配向して、該領域を照射し、その結果照射された領域が、蛍光またはルミネセンス光を放射するように作動する、励起ミラー；および
複合放物型コンセントレータであって、複合放物型反射面を備え、そして該照射された領域から放射ミラーに放射された光を集め、そして配向するように作動する、複合放物型コンセントレータ、
を備える、光伝達モジュール。
【請求項５１】
前記放射ミラーが、前記複合放物型コンセントレータからモノクロメータに、放射光として光の焦点を合わせ、そして配向するように作動する、請求項５０に記載の光伝達モジュール。
【請求項５２】
前記放射ミラーが、球形ミラーである、請求項５０に記載の光伝達モジュール。
【請求項５３】
前記励起ミラーおよび前記放射ミラーが、第１表面ミラーである、請求項５０に記載の光伝達モジュール。
【請求項５４】
請求項５０に記載の光伝達モジュールであって、以下：
前記励起光を選択された偏光面に制限するように作動する、光学フィルタ；および
該光学フィルタを、該励起光の経路に挿入するように選択的に作動する、光学フィルタホルダ、
をさらに備える、光伝達モジュール。
【請求項５５】
請求項５４に記載の光伝達モジュールであって、以下：
前記偏波面励起光と平行な面で、光を伝達するように作動する、第１偏光フィルタ；
該偏波面励起光と平行ではない任意の面で、光を伝達するように作動する、第２偏光フィルタ；および
該第１偏光フィルタまたは該第２偏光フィルタの一方を、前記複合放物型コンセントレータと前記放射ミラーとの間に挿入するように選択的に作動する、偏光フィルタホルダ、
をさらに備える、光伝達モジュール。
【請求項５６】
サンプルを分析するための方法であって、該方法は、以下：
励起光を光源から提供する工程；
該励起光を第１の二重モノクロメータを通して配向する工程；
該励起光を光伝達モジュールを通して該サンプルに伝達する工程；
該光伝達モジュールを使用して、該サンプルによって放射された光を得る工程；
該サンプルによって放射された光を、第２の二重モノメーターに配向する工程；および
光出力を該第２の二重モノクロメータによって分析する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記励起光を提供する工程が、球形凹面反射システムを実行することを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記励起光を提供する工程が、オフナー１：１アフォーカルリレーを実施することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５６に記載の方法であって、前記励起光を前記サンプルに伝達する工程は、該サンプルを支持するサンプルホルダーと実質的に同軸で位置決めされる、第１表面励起ミラーを使用することを含む、方法。
【請求項６０】
請求項５６に記載の方法であって、前記サンプルによって放射された光を得るために、前記光伝達モジュールを使用する工程が、複合放物型コンセントレータを利用することを含む、方法。
【請求項６１】
前記サンプルによって放射される光を配向する工程は、前記複合放物型コンセントレータからの光の焦点を第１表面放射ミラーに合わせることを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記励起光を選択された偏光面に制限する工程をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
複数の偏光フィルタのうちの１つを、前記サンプルによって放射される光の光路に選択的に挿入されることをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、前記選択的に挿入する工程が、複数の偏光フィルタのうちの１つを、前記サンプルと放射ミラーとの間に挿入し、該放射ミラーが該サンプルによって放射された光を、前記第２の二重モノクロメータに配向するように作動することをさらに含む、方法。
【請求項６５】
前記第２の二重モノクロメータによって光の出力を分析する工程が、前記サンプル中の１つ以上の蛍光化合物を検出し、そして分析することを含む、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、発明の名称「ＳＣＡＮＮＩＮＧ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  ＦＯＲ  ＨＩＧＨ  ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＰＯＬＡＲＩＺＡＴＩＯＮ」の、２０００年１２月２９日に出願された、仮出願番号６０／２５９，３２６の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の局面は、一般に、光の励起波長および発光波長を選択するため、ならびに同じサンプル中の複数のフルオロフォアからの同時の蛍光発光（偏光蛍光発光を含む）を検出および定量するために、二重格子モノクロメータを使用するが光ファイバーを使用しない、波長走査蛍光分光計に関する。
【０００３】
（背景）
（定義）
１）蛍光：特定の天然に存在する鉱物、ポリ芳香族炭化水素および他の複素環の電子による、エネルギーの吸収および放出の多段階のプロセスの結果。
【０００４】
２）励起：エネルギーｅ＝ｈνｅｘｃの光子が光源によって供給され、そしてフルオロフォアの外側の電子によって吸収され、この電子が、基底状態Ｓ０から、励起した電子一重項状態Ｓ’１に上昇する。
【０００５】
３）励起状態寿命：励起された電子は、一定時間（代表的には１〜２０ナノ秒）一重項状態のままであり、この間に、フルオロフォアは、種々の変化（コンホメーション変化および溶媒との相互作用の変化を含む）を起こす。これらの変化の結果として、Ｓ１一重項電子のエネルギーは、部分的に散逸して、緩和一重項励起状態Ｓ１になり、この状態から、エネルギーの蛍光発光が起こり、電子を基底状態Ｓ０に戻す。
【０００６】
４）発光：エネルギーｅ＝ｈνｅｍの光子が励起状態電子から放出され、これによってフルオロフォアが基底状態に戻る。励起状態寿命の間のエネルギーの損失に起因して、これらの光子のエネルギーは、励起している光子のエネルギーより低く、そして発光される光は、波長がより長い。エネルギー（または波長）の差異は、ストークスシフトと呼ばれ、そして標識として、またはプローブにおいて使用するための色素の選択において、重要な特徴である。ストークスシフトが大きいほど、少ない数の光子が、バックグラウンド励起光からより容易に区別可能であり得る。
【０００７】
５）フルオロフォア：蛍光性分子は、一般に、フルオロフォアと称される。フルオロフォアが、いずれかの他の分子に色を加えるために利用される場合、このフルオロフォアは、蛍光性色素と呼ばれ、そしてこの組み合わせは、蛍光性プローブと称される。蛍光性プローブは、以下のように設計される：１）生物学的標本の特定の領域において、標的を局在化させ、そして可視化を補助する、または２）特定の刺激に応答する。
【０００８】
６）電磁スペクトル：γ線（０．００１Åの波長を有する）から長波（１，０００，０００キロメートルより大きな波長を有する）までの、全ての種類の電気放射線および磁気放射線の、連続するとみなされるスペクトル全体であり、そして紫外スペクトル、可視スペクトルおよび赤外スペクトルを含む。
【０００９】
７）蛍光スペクトル：フルオロフォアが不安定ではない（光漂白しない）限り、励起および発光は、サンプルが照射される時間の間の反復プロセスである。溶液中の多原子分子については、広いエネルギー帯によって不連続な電子遷移が反復される（それぞれ蛍光励起スペクトルおよび蛍光発光スペクトルと呼ばれる）。
【００１０】
８）モノクロメータ：電磁スペクトルからの広いスペクトル範囲の波長を入口開口部から入力し、そして空間において波長を分散させることによって、指定された波長の狭いスペクトル帯のみを、出口開口部において利用可能にする、デバイス。光学フィルタは、これらが空間分布ではなく選択された波長の透過率によって、波長の選択を提供する点で、モノクロメータとは異なる。モノクロメータの第２の明らかな特徴は、出力波長、および多くの場合において出力スペクトルの帯域幅が、連続的に選択可能であることである。代表的に、モノクロメータの最低の光学部品は、以下を備える：
（ａ）狭い光学画像を提供する、入口スリット；
（ｂ）このスリットによって入力される光線が平行であることを確実にする、コリメータ；
（ｃ）入力された光を空間的に分離された波長へと分散させるための、何らかの構成要素；
（ｄ）選択された波長からのスリットの画像を再構築するための、集束要素；および
（ｅ）所望の波長の光を単離するための、出口スリット。
【００１１】
モノクロメータにおいて、波長の選択は、分散要素をその中心を通る軸の周りで系統的に旋回させる、駆動システムを介して達成される。スリットとは、調節可能な寸法を有し得る、モノクロメータにおける狭い開口部である。スリットは、所望の波長の選択を行い、そしてこれらの寸法は、調節可能であり得る。
【００１２】
９）二重格子モノクロメータ：直列に接続された２つの格子を備える、モノクロメータ。第２の格子は、第１の格子によって選択された波長の光を受け入れ、そしてさらに、指定された波長を所望でない波長から分離する。
【００１３】
１０）波長走査：モノクロメータの出口スリットを離れる、指定された出力波長の連続的な変化。分光光度計において、電磁スペクトルの波長は、励起モノクロメータによって走査されて、フルオロフォアが励起する波長を同定または指定する；発光モノクロメータによって走査される波長は、フルオロフォアが蛍光を発光する波長を同定および検出するために使用される。自動蛍光分光光度計において、励起モノクロメータおよび発光モノクロメータによる波長の走査は、別個にまたは同時に（同調走査）のいずれかで、実施され得る。
【００１４】
１１）領域走査：領域操作は、波長走査とは異なり、規定された二次元空間における局所的な蛍光強度の集合的測定である。その結果は、二次元サンプルにおける実際の位置での蛍光強度をマッピングする、強度の画像、データベースまたは表である。その最も単純なものにおいて、領域走査は、全てのデータが同時に収集されるカメラを用いて撮影される、写真であり得る。あるいは、このサンプルは、サンプルの規定された副領域において蛍光を測定する検出器を通過して移動され得る。収集された情報は、蛍光強度に関連する行列を作成し、この行列から、もとのサンプルにおける蛍光の、画像、表、またはグラフによる表現が作成され得る。
【００１５】
１２）蛍光検出器
蛍光検出器の５つの要素が、過去２０年間の間に、実験室におけるフルオロフォアの使用を通して確立された：
（ａ）励起源、
（ｂ）フルオロフォア、
（ｃ）発光光子を励起光子から単離するための、何らかの型の波長識別、
（ｄ）発光光子を記録可能な形態（代表的には、電子信号または写真画像）に変換する、何らかの型の感光性応答要素、および
（ｅ）周囲の光を制限するための、耐光性エンクロージャー。
【００１６】
蛍光検出器は、主として４つの型であり、それぞれが、区別可能に異なる情報を提供する：
（ａ）カメラは、［ａ］高感度フィルム上の写真画像として、または［ｂ］電荷結合素子（ＣＣＤ）におけるピクセルのアレイに捕捉された、再構築された画像として、画像を捕捉することによって、二次元で空間座標として蛍光を分解する。
【００１７】
（ｂ）蛍光顕微鏡もまた、二次元または三次元で、空間座標として、蛍光を分解する。顕微鏡は、サンプルと観察対物レンズとのいずれをも全く動かさずに、指定された視野について同時に、画像に関する情報の全てを収集する。顕微鏡は、カメラの使用によって、フルオロフォアの濃度の定量的な推定を導入して、画像を捕捉し得、この場合、この測定は、露光時間の関数である。
【００１８】
（ｃ）フローサイトメータは、流動している液体中の生物学的細胞１個あたりの蛍光を測定し、細胞の混合物における部分集団が、同定され、定量され、そしていくつかの場合には、分離されることを可能にする。フローサイトメータは、規定された領域の画像を作成するため、または波長操作を実施するために、使用され得ない。励起光源は、常に、レーザであり、そして波長の識別は、チューナブル色素レーザとフィルタとの何らかの組み合わせによって、達成される。これらの機器は、光電子倍増管（ＰＭＴ）を使用して、測定可能な信号を検出し得るが、波長走査のためにモノクロメータを使用するフローサイトメータは、存在しない。
【００１９】
（ｄ）分光蛍光計（分光光度計）は、代表的に、ＰＭＴを使用して蛍光を検出するが、以下のいずれをも検出し得ない：［ａ］蛍光によって経時的に発生される平均電流（信号の平均化）または［ｂ］単位時間あたりにサンプルによって発光される光子の数（光子の計数）。
【００２０】
蛍光分光計は、蛍光色素またはプローブが特定の波長の光によって励起され、そして同時に、その発光される光が検出および分析されて、そのプローブを同定し、その濃度を測定および定量する、分析機器である。例えば、一片のＤＮＡに蛍光色素分子が化学的に付着（すなわち、標識）され得、この蛍光色素分子は、指定された波長の光に露出される場合、基底状態から励起状態への電子遷移を介して、エネルギーを吸収する。上に示したように、励起した分子は、様々な経路（蛍光の発光を含む）を介して過剰のエネルギーを放出する。発光された光は収集および分析され得る。あるいは、目的の分子は、特定の基質分子を非蛍光性物質から蛍光性生成物に変換し得る酵素と結合体化され得、その後、この生成物が、上記のように、励起および検出され得る。
【００２１】
蛍光分光計において使用される励起波長および発光波長の範囲は、代表的に、電磁スペクトルの紫外部分および可視部分に制限される。蛍光検出の目的で、有用な色素は、電磁スペクトルの近紫外および可視の部分での、少なく狭い波長帯域で励起され、そして蛍光を発光する色素である。特定の蛍光性分子を励起するために望ましい波長は、以下から発生され得る：
１）一連の帯域フィルタ（所望の波長の光を透過させ、そして他の光に対しては不透過性である物質）またはカットオンフィルタ（指定された値より長いかまたは短い全ての波長を透過させる物質）に光を通すことによる、広帯域の光源、
２）レーザのような狭帯域の光源、あるいは
３）適切なモノクロメータ。
【００２２】
広帯域の光源に対して、蛍光色素が曝露される光は、代表的に、帯域フィルタを通して単離されて、紫外スペクトルまたは可視スペクトルから、励起における使用のために望ましい波長を選択する。モノクロメータに基づく機器において、選択される波長は、光源からの光が、スペクトル（このスペクトルから、所望の波長が選択される）に分散された後に得られる。光源が何であっても、蛍光の発光は、代表的に、帯域フィルタ、カットオンフィルタ、または発光モノクロメータを通して単離されて、指定された波長以外のあらゆる波長の全ての光を除去することによって、検出のために望ましい波長を選択する。大部分の蛍光検出は、液相である標本の試験を包含する。液体は、例えば、以下の形態を採り得る、ガラス、プラスチックまたは石英の容器に含まれ得る：個々のキュベット；フロースルーセルまたはチューブ；顕微鏡スライド；マルチウェルプレートにおける円筒形または矩形のウェル；あるいは多くの核酸またはタンパク質が表面に付着し得る、シリコンマイクロアレイ。あるいは、液体は、二次元のポリアクリルアミドまたはアガロースのゲルにトラップされ得る。これらの場合の各々において、光学フィルタを既に通過して、励起のための正しい波長を選択された光は、この容器またはゲル内のサンプルを照射する；同時に、発光される光もまた収集され、第２のセットの光学フィルタを通されて、発光波長が単離され、次いで、カメラまたは光センサを使用して、検出される。
【００２３】
蛍光検出器において使用される光学フィルタは、蛍光検出の感度、ダイナミックレンジおよび融通性を制限する、以下が挙げられる特徴を提供する：システム全体の効率の損失を引き起こす、光の吸収；高いバックグラウンド信号を生じる、固有の自己蛍光；所望の帯域の波長外の他の波長の透過（これは次に、感度とダイナミックレンジとの両方を制限する）。光学フィルタは、これらのフィルタに適切な波長で励起および発光する化合物の使用に、蛍光検出を制限する波長の不連続な範囲（「中心幅帯域」）を選択するように、設計および製造されなければならない。異常なスペクトル特性を有する新たな蛍光性色素の開発は、新たな励起／発光フィルタ対の設計を必要とし得る。
【００２４】
蛍光キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）分光光度計における効率を増加させ、そして波長の連続的選択を提供するために、励起供給源からの入射光を分散させ、狭帯域の励起波長を選択し、そして別々に放射波長を選択するための、格子またはプリズムに基づくモノクロメータを使用することが公知である。格子は、多くの形態があるが、広帯域の光をその多くの波長に分散するラインでエッチングされる。モノクロメータは、代表的に、入口スリットおよび出口スリットを備える光を通さない（ｌｉｇｈｔ−ｔｉｇｈｔ）ハウジングを備える。供給源からの光は、入口スリット上に焦点を合わせる。ハウジング内のコリメートミラーは、受容されたビームを平坦な光学格子上に向け、この格子は、光の波長を第２のコリメートミラー上に分散し、この第２のコリメートミラーは、次いで、直線的に分散された光を出口スリット上で焦点を合わせる。所望の波長の光は、格子を旋回させて、出口スリットを通る波長の直線状アレイを移動させることによって選択され、比較的狭い帯域の光のみがモノクロメータから出ることができる。選択された光における波長の実際範囲は、スリットの寸法によって決定される。全ての波長の連続スペクトルからの狭い帯域の波長の連続的選択のプロセスは、波長走査（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）と呼ばれ、入口スリットおよび出口スリットに関する分散光学格子の回転の角度は、モノクロメータの出力波長と相関する。励起検出および蛍光検出の波長を選択するために、各モノクロメータにおいて２つの格子を使用して蛍光分光光度計における励起光および放射光の両方について波長選択を高めることが公知である。モノクロメータが波長選択のための光学フィルタを使用する必要性を潜在的に排除し、そしてフィルタの限界から科学者を解放するが、モノクロメータの使用は、機器の感度および設計において他の制限を課す。例えば、上記構成を有するモノクロメータは、関連する光ブロック入口スリットおよび出口スリットとともに、少なくとも４つのミラーおよび２つの分散要素を必要とするという不利な点を有する。結果として、このようなデバイスは、フィルタに基づく機器と比較して、比較的複雑であり、そして比較的に不十分であった。
【００２５】
複数のサンプルのマルチウェルプレートでの分析は、蛍光分光光度計の高度に専門化された用途である。代表的に、励起光は、ウェル内のサンプルからの蛍光放射光の大部分が、レンズまたはミラーによって収集され得るように、ウェルの少し上の角度からウェルに導入される。しかし、プレート当たりのウェルの数が増加する（例えば、プレート当たり９６ウェル〜プレート当たり９６００を越えるウェル）場合、この側面照射構成は、不利である。なぜなら、入射励起光の大部分が、サンプルよりもウェルの側面に当たるからである。このようなウェルが代表的に黒い壁を有するので、励起光の大部分は、失われる。
【００２６】
上記のように、側面照射構成の限界を克服するために使用される１つの方法は、ウェル上に直接配置された光ファイバーの照射末端に励起光を案内するための光ファイバーの使用であった。第２のバンドルのファイバーを使用して、ウェルから光を集め、そしてそれをＰＭＴに伝達する。この設計のバリエーションにおいて、マイクロウェル上に配置された二股光ファイバーを使用して、ウェルへそしてウェルからの両方の光を運ぶ。しかし、光ファイバーは、代表的に、吸収損失を導入し、また、特定の波長で自己蛍光し得る。従って、このような解決法は、特に効果的ではない。
【００２７】
別のアプローチは、透明の底を備えるマルチウェルプレートを使用し、開いた上部から放射光を収集しながら、底からの励起光にウェル内のサンプルを曝露することである。このアプローチがいくつかの場合において価値があるものの、ウェル底のプラスチックによる吸収および光散乱によって、光を失う。さらに、透明プレート材料自体が、自己蛍光し得る。さらに、ウェル底材料のウェル間の光学的再現性は達成されず、これは、ウェル間またはプレート間を基礎とする測定を補正する能力を制限している。従って、このような解決法は、サンプルの同じ側面から光を照射および収集するよりも効率がよくないことが証明されている。
【００２８】
光ファイバー光路を使用するこのような先行技術の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓによって１９９８年に導入された、シングルユニット蛍光マイクロタイタープレート検出器（「Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩ」）（これは、単一格子モノクロメータ、フィルタ、ミラーおよび光ファイバーのハイブリッド組み合わせを使用する）、ならびに「Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ−３」（モジュラー機器）および「Ｓｋｉｎ−Ｓｅｎｓｏｒ」（ユニット機器）（ともに、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＳＡによって製造される）（これらはともに、励起モノクロメータから光を伝導し、そしてサンプルから光を集め、その後、その光が励起モノクロメータに伝達されるための二股光ファイバーバンドルを使用する）が挙げられる。
【００２９】
蛍光モノクロメータのマイクロタイタープレート適用がまた、３８４ウェル、９６ウェル、またはより少ないウェルを有するマイクロウェルプレートに制限されることに注目するべきである；すなわち、１５３６ウェルマイクロプレート、ならびに２５００ウェル、３５００ウェル、さらに９６００ウェルを含む「ナノプレート」は、現在の光ファイバー／モノクロメーターベースの機器とともに使用され得ない。このようなプレートの検出器は、代表的に、共焦点顕微鏡と組み合わせて、レーザおよびフィルタを使用する。
【００３０】
ガラス顕微鏡スライド、ポリアクリルアミドゲルまたは標準９６ウェル、３８４ウェルおよび１５３６ウェルマイクロプレートに関係する多数の適用について、高い効率を提供し、高精度の連続的な励起波長および放射波長の選択を可能にし、有意なより高いダイナミックレンジを提供し、光フィルタおよび光ファイバーの使用を排除し（すなわち、光路は、空気以外のいかなる光学材料も通過しない）、そして励起光をサンプル上に案内しそしてマイクロタイターウェル中または２次元表面（例えば、ガラス顕微鏡スライド、ポリアクリルアミドゲル、シリコンマイクロアレイ、または他の固体表面）上のサンプルからの放射光を収集するための高い効率の構造を有する蛍光分光光度計を有することが望ましい。
【００３１】
一般的に、蛍光強度、ルミネセンスの測定は、単位時間当たりに放射される光子の数として規定される。原子または分子からの蛍光放射を使用して、サンプル中の放射する物質の量を定量化し得る。蛍光強度と分析物濃度との間の関係は：
Ｆ＝ｋＱｅＰｏ（１−１０（εｂｃ））
であり、ここで、Ｆは、測定された蛍光強度であり、ｋは、幾何学的な機器因子であり、Ｑｅは、量子効率（放射された光子／吸収された光子）であり、Ｐｏは、励起確率（これは、励起供給源の放射電力の関数である）であり、εは、波長依存性モル吸収係数であり、ｂは、経路長であり、そしてｃは、分析物濃度である。先の適用において、上記式は、連続して式を展開し、高次の項を落とすことにより単純化して、以下を得た：
Ｆ＝ｋＱｅＰｏ（２．３０３×ε×ｂ×ｃ）。
【００３２】
過去に、この関係は、蛍光強度が、分析物濃度に直線的に比例するようであるので、受け入れ可能であった。しかし、この式は、異なるフルオロフォアの蛍光強度の真の比較を提供しない。なぜなら、蛍光強度の測定は、幾何学的機器因子ｋに高く依存するからである。
【００３３】
異なる型の検出器は、測定がなされる期間とそれぞれが光子間で識別し得る速度の両方で変化し、この特徴は、２つのフルオロフォアの光度を比較する場合、非常に重要であり得る。１つの励起状態寿命が、第２のフルオロフォアの励起状態寿命よりも１０倍長い（例えば、それぞれ、１ナノ秒および１０ナノ秒）ことのみで異なる２つの蛍光色素を考える。規定された露出時間で曝露される写真用フィルムを使用する検出の場合、短い寿命を有する色素は、曝露されるフィルム上で明らかにより明るく見える。しかし、高い十分な周波数で光子間を区別できない連続励起を使用する検出器が使用される場合、より短い励起状態寿命を有するフルオロフォアは、実際にかなり多くの光子を放射し得るが、検出器は、２つの色素の蛍光強度が同じであることを間違って示し得る。
【００３４】
蛍光は、ＰＭＴまたは他の光感知デバイスのような適切な感光性デバイスにおける光電流の生成によって分光光度計において検出され、これらのデバイスはともに、低いレベルのバックグラウンドまたはランダムな電気的ノイズによって特徴付けられる。このため、蛍光放射プロセスは、ポアソン統計によって最も良く特徴付けられ、そして蛍光は、光子計数または信号平均化のいずれかによって測定され得る：
光子計数は、低レベルの電磁照射の測定のための高感度な技術である。光子計数検出において、電子のなだれ（ａｖａｌａｎｃｈｅ）を開始するのに十分なエネルギーを有してＰＭＴのアノードに衝突する光子によって生成される電流は、ランダムな電気ノイズと真の信号との間を区別するための選別器回路によって試験される。このような光のレベルにおいて、光子の分散性（ｄｉｓｃｒｅｔｅｎｅｓｓ）は、測定を支配し、そして他の原因に由来して検出器（例えば、ＰＭＴ）において発する暗電流インパルスから光子誘導される電気パルスを識別し得る技術を必要とする。
【００３５】
光子計数の先の適用において、検出のダイナミックレンジは、時間間隔が狭い光子間を区別する検出器の能力によって制限された。さらに、光子計数におけるＳＮ比はまた、光強度の関数である。１秒当たりｍ個の光電子を生じるフォトカソードに入射する定常状態の光束を想定する。任意の１秒の間、フォトカソードに入射する光は、平均して、ｍ１／２の標準偏差を有するｍ個の光電子である。このような測定におけるＳＮ比は、以下である：
Ｓ／Ｎ＝ｍ／ｍ１／２＝ｍ１／２                      （１）
それらの周波数およびエネルギーに依存して、個々の光電子は、十分なゲインの検出器を用いて計数され得るが、任意の測定の精度は、式（１）によって課せられる限界よりも決して良くはなり得ない。その最も単純な形式において、実際の光子計数機器は、高速増幅器および入力に対して低い閾値レベルに設定された選別器（代表的に、−２ｍＶ）からなり、これは、経験的に、電気的ピックアップに対する感受性と過剰なゲインにおいて光電子増倍器を操作することとの間の最適な妥協に対応することが見出されている。
【００３６】
理論的に、光子計数よりも感受性ではなく、そして電子ドリフトに対してより感受性の、信号平均化は、入射光信号の直接測定として光電流を使用する。光電流Ｉｋに関連するノイズは、システム帯域幅（応答の周波数）Ｂを考慮すると、以下のショットノイズ（ｓｈｏｔ  ｎｏｉｓｅ）式によって与えられる：
Ｓ／Ｎ＝（Ｉｋ／２ｅＩｋＢ）１／２                  （２）
ここで、ｅは、電荷である。式１および式２の形式は、類似するからであるからである。なぜなら、これらは、同じ現象を参照し、そして本質的に同じ結果を予想する。信号が固有にデジタル化され、そしてそのダイナミックレンジがタイマーカウンターの速度によって制限される光子計数とは対照的に、式２において、信号は、光電流の連続的な変数として考慮され、そしてずっと大きなダイナミックレンジを得ることが可能である。しかし、実際、アナログ−デジタル変換プロセスは、１６ビットよりも大きい分解能を有するＡＩＤコンバーターに関連する遅い応答時間に起因して、ダイナミックレンジを厳しく制限する。
【００３７】
汎用蛍光検出機器において、光源は、石英ハロゲンランプ、キセノンランプ、または類似の放電ランプ、光ダイオードまたは多くの型のうちの１つのレーザであり得る。代表的に、サンプルは、フルオロフォアの総数の比較的安定な割合を励起状態に維持する連続照射に曝露される。これらの機器において、照射されるサンプルの断面寸法は、主に、スリットによって決定される。より複雑な機器（画像化光、共焦点オプティクスまたは点照射源を使用する任意のものを含む）において、励起光ビームは、サンプル中の単一点および単一焦点面上にレンズおよびミラーによって形作られ、そして焦点を合わせられる。
【００３８】
（要旨）
本発明の種々の実施形態に従って、波長および面積走査蛍光分光光度計は、励起二重モノクロメータ、同軸励起光／放射光伝達モジュール、放射二重モノクロメータ、高速タイマーカウンター回路基板、および励起光の焦点面に対してサンプルを位置付ける際に使用するための正確なｘ−ｙ−ｚ取り付けテーブルを備えて提供される。それぞれの操作は、タイマー−カウンター基板によって指示され、調整される。
【００３９】
それぞれのモノクロメータは、入射する広帯域の光から所望の帯域の波長を正確に選択するために取り付けられる、一対のホログラフィック凹面格子を備え得る。選択された励起光は、光伝達モジュール（マルチウェルプレートのウェル中にまたはゲル、顕微鏡スライド、もしくはミクロアレイの特定の領域上に直接励起光を向けるために配置される同軸励起ミラーを備える）によって、サンプルウェル中にまたはポリアクリルアミドゲルもしくは顕微鏡スライドのような二次元表面上に向けられる。照射領域またはサンプルから出た放射された光は、比較的大きな前面のミラーによって収集される。収集される放射光は、放射二重モノクロメータによって選択された波長である。両方のモノクロメータが、光路の次の段階のための所望の波長の「近点（ｎｅａｒ  ｐｏｉｎｔ）」供給源を同時に作製しながら、望まない波長を制限するように位置付けられた、３つの精密調和開口部を備える。このように単離された放射光は、光検出器および分析器モジュール上に投射され、これは、受容されたエネルギーをサンプルの蛍光強度のデジタル表示に変換する。
【００４０】
１つの実施形態は、以下を有する蛍光分光光度計を含む：光源；第１の二重モノクロメータであって、光源からの光の励起光として選択された波長を分離しそして出力するために操作する、第１の二重モノクロメータ；光伝達モジュールであって、サンプル上に直接励起光の実質的に全てを向け、そして放射光としてのサンプルからの蛍光または発光を収集、焦点合わせ、および方向付けするための光伝達モジュール；第２の二重モノクロメータであって、選択された波長の放射光を分離しそして出力するために操作する、第２の二重モノクロメータ；ならびに光検出器および分析器であって、選択された波長の放射光を検出し、そしてこのような検出の表示を出力する、光検出器および分析器。
【００４１】
別の実施形態は、以下を有する二重モノクロメータを含む：光を受信するための入口開口部；この入口開口部を介して受信された光の少なくとも一部を遮断および分散するように位置決めされる、第１光学格子；第１光学格子によって分散された光の一部を遮断し、そしてこのような分散された光から狭められた範囲の波長を選択し通過させるように位置決めされた、第１選択開口部；第１の選択開口部を通過する光の少なくとも一部を遮断し分散するように位置決めされる、第２光学格子；ならびに第２光学格子によって分散された光の一部を遮断し、そしてこのように分散された光から狭められた範囲の波長を選択し通過させるように位置決めされた、第２選択開口部。
【００４２】
なお別の実施形態は、以下を有する光伝達モジュールを含む：励起ミラーであって、照射される領域と実質的に同軸に位置付けられ、この領域を照射するために入射光を方向付けるための、励起ミラー；および放射ミラーであって、照射された領域と実質的に同軸で、励起ミラーとオフ軸で整列して位置付けられ、照射の際にその領域によって放射された光を収集、焦点合わせ、および方向付けするための放射ミラー。
【００４３】
別の実施形態は、光子計数、光検出器および高速タイマーカウンター基板を含み、これは、機器ドリフトを大きく排除し、最大の分解能および定量のための光子の高周波数識別を可能にしながら、高い感受性を提供し、そして同時に、有意に高いダイナミックレンジを提供する。
【００４４】
別の実施形態に従って、蛍光分光光度計システムはさらに、励起光を平面偏光励起光に制限するように作動する光学偏光フィルタ、およびこの光学偏光フィルタを励起光の経路に挿入するために選択的に作動する光学フィルタホルダを備える。この光学フィルタおよび光学フィルタホルダは、上記の第１の二重モノクロメータに組み込まれ得るか、あるいは、この光学フィルタおよび光学フィルタホルダは、光伝達モジュールに組み込まれ得る。
【００４５】
さらに、前述のシステムはまた、第１の偏光フィルタ、第２の偏光フィルタ、および偏光フィルタホルダを備え得、この第１の偏光フィルタは、偏光された励起光の面と平行な面において放射光を伝達するように作動可能であり、この第２の偏光フィルタは、偏光された励起光の面に対して平行でない任意の面において放射光を伝達するように作動可能であり、そしてこの偏光フィルタホルダは、第１の偏光フィルタまたは第２の偏光フィルタのうちの１つを、放射光路に挿入するように選択的に作動可能である。光フィルタを用いる場合、第１の偏光フィルタ、第２の偏光フィルタ、および偏光フィルタホルダは、第２の二重モノクロメータまたは光伝達モジュールに代替的に組み込まれ得る。光伝達モジュールに組み込まれる場合、このような放射偏光フィルタは、照射された領域と放射ミラーとの間に（すなわち、放射ミラーの上側に）挿入され得る。
【００４６】
以下により詳細に記述される他の実施形態において、蛍光分光光度計システムは、光源、第１の多重格子モノクロメータ、および光伝達モジュールを組み込み得、この光源は、交換可能な開口を有する球凹面反射システムを備え、この反射システムは、両端においてテレセントリック（ｔｅｌｅｃｅｎｔｒｉｃ）であり、そして三次収差について完全に補正されており、この第１の多重格子モノクロメータは、入口開口部を有し、光源から入口開口上に結像された光を、複数の波長に分離し、そして選択された波長を励起光として出力するように作動可能であり、そして光伝達モジュールは、実質的に全ての励起光を直接的にサンプル上に向けるように作動可能な第１の反射表面および第２の反射表面を備え、この第２の反射表面は、複合放物反射（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｐａｒａｂｏｌｉｃ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ）表面であり、そして蛍光またはルミネセンス光としてサンプルから放射された光を集光、集束、および方向付けするように作動可能である。
【００４７】
なお他の実施形態において、光伝達モジュール、第２の多重格子モノクロメータ、ならびに光検出器および分析器を備えるシステムの構成要素は、サンプル中の１種より多くの蛍光化合物を分析するように作動可能である。さらに、またはあるいは、分光光度計システムは、例えば、光伝達モジュールに対してサンプルまたはサンプルホルダー（例えば、マイクロウェルプレート）を移動させるための手段を含み得、これによりマクロウェルプレート中の複数のウェルの選択された１つ由来のサンプルの分析が可能になる。
【００４８】
以下に詳細に記述される別の局面に従って、サンプルを分析する方法は、一般的に、光源から励起光を供給する工程、その励起光を第１の二重モノクロメータに通して方向付ける工程、その励起光を光伝達モジュールを通して伝達する工程、光伝達モジュールを使用してサンプルにより放射される光を得る工程、そのサンプルから放射された光を第２の二重モノクロメータへと方向付ける工程、およびこの第２の二重モノクロメータによる光の出力を分析する工程を包含する。この方法は、単一のサンプル中の１つより多い傾向化合物を検出および分析するために使用され得る。
【００４９】
本発明の種々の実施形態の前述の局面および他の局面は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を精査することにより明らかとなる。
【００５０】
（詳細な説明）
図１は、本発明により構築されそして作動可能な蛍光分光光度計システムの１つの例示的な実施形態の模式図である。広帯域光源１００は、ミラー１０２を照射し、このミラー１０２は、光を二重モノクロメータ１０４上に集束させるために適切に湾曲されている。代替の構成において、狭帯域光源（例えば、フォトダイオードまたはレーザー）は、図１に示される広帯域光源と置換され得る；このような狭帯域光源が、以下に詳細に記述される蛍光分光光度計システムおよびモノクロメータの構成のいずれかまたは全てと組み合わせて実施され得ることを当業者は理解する。
【００５１】
いくつかの代替の実施形態において、例えば、光源１００は、ハロゲンサイクル（ｈａｌｏｇｅｎ  ｃｙｃｌｅ）タングステンフィラメントランプ、または光を交換可能な開口を有する凹球面反射システムへと伝達するように作動可能な他の適切なランプを備え得る；以下に記載されるように、このような反射システムは、光の列（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｉｎ）の両端においてテレセントリックであり得、そして三次収差について完全に補正され得る。
【００５２】
所望の波長の光は、光伝達モジュール（ＬＴＭ）１０６へと励起二重モノクロメータ１０４によって通過される。このＬＴＭ１０６は、このモノクロメータ１０４からの励起光を、サンプル１０８上へ向ける。このサンプル１０８は、例えば、マイクロウェルプレートの１つのウェルまたは１−Ｄアクリルアミドゲルの１レーンであり得る。このサンプルから放射される結果としての任意の蛍光またはルミネセンス光は、以下に示されるように、ＬＴＭ１０６により集光され得る；ＬＴＭ１０６は、この光を放射二重モノクロメータ１１０の入口開口に向け得る。操作の際に、モノクロメータ１１０は、サンプル中の蛍光団の発光スペクトルからの波長を通過させるように選択的に調節され得、そしてこれらの波長を光検出器１１２（これは、放射光のエネルギーを測定する）に向けるように作動可能である。
【００５３】
光検出器１１２は、任意の適切な感光性デバイスであり得、これらとしては、光電子倍増管（ＰＭＴ）、フォトトランジスター、またはフォトダイオードが挙げられるがこれらに限定されない。光検出器１１２の電子的出力は、自動処理ユニット１１４に適用され得、この自動処理ユニット１１４は、選択された放射の検出を示す信号（さらなる分析に適切な数値形態で記憶され得る）を発生する。自動処理ユニット１１４は、例えば、分光光度計システムに対するデータ収集インターフェースを有するパーソナルコンピュータであり得る。一般的に、図１に示される機器（二重モノクロメータ１０４および１１０ならびにＬＴＭ１０６を備える）における光の経路の構成要素の全ては、反射および室内灯のような他の光源からの光を最小にするために、蛍光以外を吸収する材料で内部をコーティングされた光漏れのない（ｌｉｇｈｔ−ｔｉｇｈｔ）箱中で隔離され得る。
【００５４】
図２Ａは、蛍光分光光度計システムの実施形態における使用のために構成されて作動可能な二重モノクロメータの実施形態の模式図である。図示された構成は、励起二重モノクロメータ１０４または図１に図示される放射二重モノクロメータ１１０のいずれかに使用され得る。
【００５５】
広帯域光は、二重モノクロメータ中の入口開口２００を通って導入され、そして軸２０３の周りを旋回可能な第１のホログラフィック凹面格子２０２の前面から反射する。前面反射の使用は、光学的支持構造体（例えば、後面反射ガラスミラー）内の光吸収を避けることにより、二重モノクロメータの効率を増大させる。凹面格子の使用は、補助的なコリメートミラーを使用せずに、選択可能な波長に入射光を分散させることを可能にする。この設計は、従来の二重モノクロメータ機器において使用される１つの格子あたり２つのコリメートミラーを排除することが可能になる。ホログラフィック格子の使用はまた、非点収差を低減し、従って望ましくない波長の光（「迷光」）の量を減少する。
【００５６】
各二重モノクロメータは、３つの開口を有する：入口開口２００（これを通って光が最初にモノクロメータに入る）；内部（または「第１」）選択開口２０６；および出口（または「第２」）選択開口２１６（これを通って光がモノクロメータから出る）。第１の凹面格子２０２は、入射光の波長を第１の空間的に分散されたビーム２０４として反射する。この第１の空間的に分散されたビーム２０４の各波長は、他の波長に対して固有の角度で反射される。その軸２０３の周りに第１の凹面格子２０２を旋回させることにより、選択された帯域または範囲の波長２０８を、モノクロメーターハウジング内の内部選択開口２０６を通して方向付けることが可能になる。
【００５７】
次いで、選択された範囲の波長２０８は、軸２１１の周りに旋回可能な第２のホログラフィック凹面格子２１０から反射する。第２の凹面格子２１０は、第１の空間的に分散されたビーム２０４の選択された範囲の波長２０８を、第２の空間的に分散されたビーム２１２として反射する。第２の凹面格子２１０をその軸２１１の周りに旋回させることにより、選択された狭い帯域の波長２１４を出口選択開口２１６を通して方向付けることが可能になる。
【００５８】
選択開口２０６および２１６の寸法は、モノクロメータを出る光の選択された波長を決定する。開口が広いほどより多くの光エネルギーがモノクロメータを通過するが、この光は、広範囲の波長を含む；より狭い開口は、モノクロメータを通過する光の量を減少させるが、波長の選択された範囲を狭くする。より広い開口の使用は、検出感度を増加し、このことは、ある領域または容積における総蛍光の測定（例えば、マイクロウェルにおいて行われる測定）において有益であり得る。対照的に、狭い開口の使用は、モノクロメータの空間分解能を増加させ、このことは、特定の位置における異なる蛍光団間の識別（例えば、ポリアクリルアミドゲルで分離された帯域の測定）において有益であり得る。すなわち、開口寸法が小さいほど、サンプルにおける検出領域が小さくなる。レーザ光源およびピンホール開口の場合、例えば、任意の所定のモーメントにおける励起の領域は、蛍光強度および位置を表す特定のデータ対に対応する点である。
【００５９】
各光学的構成要素が、光のスループットの効率を減少させることは、光学系の当業者に一般的に知られている。図２Ａに示される構成の利点としては、伝統的なモノクロメータの場合のような、二重モノクロメータ内に光を再び向けるためのコリメートミラーの排除が挙げられるがこれに限定されない。例示的な実施形態では、光を方向付ける２つの構成要素（第１および第２のホログラフィック凹面格子２０２、２１０）しか必要ではなく、全体の光効率を改善する。
【００６０】
図２Ａに示される構成において、第１の凹面格子２０２および第２の凹面格子２１０は、適切な機構により反対方向に連繋して旋回され得る。１つの実施形態（図２Ｂに図示される）に従う機構は、格子２０２、２１０を旋回するための引張り帯域アクチュエータ機構を実施する。図２Ｂの構成において、格子２０２、２１０は、それぞれ旋回ホイール２５０、２５２と同軸に取付けられる。レバーアーム２５４の一端は、旋回ホイール２５０に接続される；レバーアーム２５４の他方の端は、ネジ駆動機構２５６に結合される。レバーアーム２５４は、ロッド２５８がモーター２６０により回転されるにつれてねじ山付きロッド２５８に沿って横移動する。
【００６１】
ロッド２５８に沿ったレバーアーム２５４の移動は、旋回ホイール２５０を回転させる。旋回ホイール２５０は、引張り帯域２６２により旋回ホイール２５２に接続される。図２Ｂの実施形態によれば、引張り帯域２６２は、０．００３インチのステンレス鋼帯域であり得る。引張り帯域２６２は、旋回ホイール２５２および格子２１０を旋回ホイール２５０および格子２０２と同時にそして連繋して逆に回転させる。ハウジング（示さず）と旋回ホイール２５２との間に接続されたばね２６４は、引張り帯域２６２の張力を維持する。格子２０２、２１０の位置（すなわち、角度方向）は、ホイールセンサー２６６およびネジ駆動センサ２６８に接続されたマイクロコントローラーにより決定され得、そして制御され得る。
【００６２】
図２Ｂの実施形態は、例としてのみ提供され、限定としてではない；同時にかまたはそれ以外で格子２０２、２１０を旋回させるための代替の機構が、存在する。例えば、各格子２０２、２１０は、個々の旋回機構を備え得、その結果互いに対する格子２０２、２１０の角度方向は、独立して選択可能であり得る。さらに、同時および相補的な回転のために格子２０２、２１０を結合するための代替の手段は、本開示の範囲内および意図に包含される。
【００６３】
図３は、図１に示されるＬＴＭ１０６の一実施形態の模式図である。励起光は、入口開口を通ってＬＴＭ１０６に入る。この入口開口上に、１つ以上のミラー３００を用いるかまたは用いずに、同軸励起ミラー３０２へと励起光が向けられる。この同軸励起ミラー３０２は、平坦でも、所望される場合に光を集束させるか分散させるように適切な曲率を含んでもよい。同軸励起ミラー３０２は、励起光を直接サンプル１０８上に向けるように位置付けられる。より詳細には、同軸励起ミラー３０２は、サンプル１０８に対していくらか軸から離れて位置付けられ得るが、実質的に全ての励起光が、サンプルに衝突して最大の発光を達成するように位置付けられるべきである。
【００６４】
１つの適用において、マルチウェルプレートの各ウェルは、ＬＴＭ１０６、マルチウェルプレート、またはそれらの両方のいずれかのＸ−Ｙ平行移動によって同軸励起ミラー３０２の真下に位置付けられ得る。任意の顕微鏡光学機器を備えるモノクロメータを含む別の適用において、ガラススライドまたは培養プレート上に据えられた、異なる領域のインタクトな生物学的細胞は、光路において光学素子を使用し、そしてＬＴＭ１０６、ガラススライドもしくは培養プレート、またはそれら両方のいずれかのＸ−Ｙ−Ｚ平行移動によって、このサンプルを同軸励起ミラー３０２の真下に位置付けることによって、個々に画像化され得る。サンプル中の１種以上の蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）からの蛍光放射は、同軸放射ミラー３０４によって収集され得る。同軸放射ミラー３０４は、ＬＴＭ１０６の出口ポートまたはＬＴＭの開口部から、直接的にかまたは１つ以上の光配向（ｌｉｇｈｔ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）ミラー３０６によって、放射光を集束しそして方向付けるように、凹面であり得る。図３に示される実施形態において、放射光は、励起光がＬＴＭ１０６に入る側と同じ側から出る。しかしながら、異なる位置の入口開口部と出口の開口部が、光配向ミラー３００、３０６の適切な配置によって使用され得る。
【００６５】
この文脈において、「同軸」とは、一般に、照射される領域（励起ミラー３０２の場合）および蛍光または放射光を発している領域（放射ミラー３０４の場合）に対するミラー３０２、３０４の位置および配向をいう。励起ミラー３０２の照射される領域との同軸配置、および放射ミラー３０４の光を発している領域との同軸配置は、例えば、高い割合の励起光がウェル１０８内のサンプルに向けられること、およびウェル１０８の開口部から発せられる高い割合の蛍光またはルミネセンス光が分析用に収集されることを確実にするように組み合わさる。いくつかの実施形態において、放射ミラー３０４は、励起ミラー３０２に対してわずかに軸から離れて位置付けられて、光学縦列における妨害を回避し得る。
【００６６】
特に有効な実施形態において、ＬＴＭ１０６内部の全てのミラーは、前面ミラー、すなわち「第一」表面ミラーを備える。第一表面ミラーは、例えば、基板（例えば、ガラスまたはセラミック）の表面上にコーティングされた反射材料（例えば、アルミニウムまたは他の反射金属）を有し；入射光が、この反射コーティング上に向けられる。このコーティングが反射面として働くので、入射光は、通常の第二表面ミラーにおけるように基板を透過しない。従って、このような第一表面ミラーは、実質的に、伝統的な第二表面ミラーよりも有効である。
【００６７】
多数の異なる反射ミラーが、所望ならば、ＬＴＭ１０６内の光を配向するために使用され得ることが、当業者によって理解される。しかしながら、上記のように、一般的には、ＬＴＭ１０６の効率を改善するために、このような反射面の数を最小にすることが望ましい。図３の実施形態において、励起ミラー３０２は、約６×９ミリメートルの寸法の楕円形のミラーであり得、一方、放射ミラー３０４は、約７５ミリメートルの直径であり得る。他の寸法が使用され得、そしてこの寸法は、一般に、機器全体の寸法にとともに変更される。
【００６８】
図４は、蛍光分光度計の単純化した実施形態の概略図である。図１を参照した上記実施形態におけるように、励起波長は、励起二重モノクロメータ１０４によって、広帯域光源１００から選択され得る。励起光は、同軸励起ミラー３０２によって、ウェル１０８内のサンプルに向けられる。蛍光およびルミネセンス放射光は、同軸放射ミラー３０４によって収集および集束され得、放射ミラーは、同軸励起ミラー３０２と一直線上にある。放射ミラー３０４は、この収集および集束された光を、放射二重モノクロメータ１１０に方向付ける。上記のように、モノクロメータ１１０は、カウントおよび分析のために、１つ以上の選択された波長の放射光を、光検出器および分析器モジュール１１２に方向付ける。この実施形態は、ＬＴＭ１０６内の反射面の数を最小にする。
【００６９】
図４に示される実施形態のコンパクトな構成により、二重経路分光光度計としての機器の使用が可能になる。すなわち、サンプルは、以下に記載されるように、ウェル１０８の開口側またはウェル１０８の底面側のいずれかからの励起光で照射され得る。
【００７０】
図５Ａは、蛍光分光光度計システムの第一の代替的な二重経路の実施形態を示す。光源１００および励起二重モノクロメータ１０４の一方または両方が、必要に応じて、第一の位置（図５Ａにおいて点線で示される）からマルチウェルプレートの下の位置まで平行移動され得、その結果、励起光は、底面照射同軸励起ミラー３０２’に突き当たり、このミラーは、励起光をウェル１０８の透明な底面基板を通して配向させる。あるいは、光源１００が平行移動されない場合、光配向ミラーが、励起二重モノクロメータ１０４を通して光を配向するために挿入され得る。ウェル１０８の開口部から発せられる蛍光放射は、放射ミラー３０４によって収集され得る。このシステムが底面照射のために構成される場合、上面照射励起ミラー３０２（図４において示されるが、図５Ａにおいては示されていない）は、放射ミラー３０４によって収集される蛍光およびルミネセンス光の量を最大にするために、光路から取り除かれ得る。あるいは、上面照射励起ミラー３０２は、適所に残され得る。いずれの場合においても、底面照射励起ミラー３０２’は、（反射直線に対向するように）放射ミラー３０４と一直線上にある。
【００７１】
図５Ｂは、蛍光分光光度計システムの第二の代替的な二重経路の実施形態を示す。底面照射のために与えられるこの構成において、１つ以上の再配向ミラー３０３Ａ、３０３Ｂのセットが、励起光を遮断して方向付けるために、励起二重モノクロメータ１０４からの光路に挿入され得る。この遮断された励起光は、底面照射同軸励起ミラー３０２’に突き当たるように再配向され、このミラー３０２’は、ウェル１０８の透明な底面基板を通してこの励起光を配向させる。上面照射同軸励起ミラー３０２は、示されるように、適所に残され得るか、または再配向ミラー３０３Ａ、３０３Ｂが位置を移動した場合、その位置から移動され得る。このような移動は、例えば、４つ全てのミラー（３０２、３０３Ａ、３０３Ｂ、３０２’）が取り付けられているキャリッジの平行移動（例えば、ページ内またはページ外の軸に沿って）によって、達成され得る。図５Ａの実施形態におけるように、底面照射励起ミラー３０２’は、放射ミラー３０４と（反射直線に対向するように）一直線上である。
【００７２】
図４、５Ａおよび５Ｂに示される全ての構成において、機器内部の選択された位置に光を誘導するために必要とされる場合に、さらなる再配向ミラーが使用され得る。
【００７３】
１つの実施形態に従って、１００ＭＨｚ超過の周波数で作動する時間計測器板が、使用され得る。光検出器および分析器モジュール（図４、５Ａおよび５Ｂにおいて参照番号１１２によって示される）は、３０ＭＨｚの高さの周波数で、光子に応答するように構成され得る。このシステムの動的範囲は、０〜３０×１０６光子を超える範囲であり、それによって、蛍光検出において光子計数の使用を以前は制限していた、動的範囲の制限が取り除かれる。ＰＭＴからの、観測される電流は、光検出器にて設定された規定閾値よりも大きく、約２ナノ秒の持続時間を有する５ボルトの電気パルスを生じ；時間計測回路は、これらのパルスを時間の関数として数え、すなわち、単位時間あたりの光子について直接定量化する。
【００７４】
１つの実施形態に従う分光光度計を使用して、蛍光により標識される核酸またはタンパク質を含有するプレキャストポリアクリルアミドゲルが、直接ＬＴＭの下に位置付け機構において平板プレート上に配置される。蛍光標識に適した波長で励起モノクロメータおよび放射モノクロメータを設定して、ゲルを、ＬＴＭの下で、全てのゲル領域を通過するまで（Ｘ方向およびＹ方向に）平行移動させた。この移動の各点において、蛍光読み取りを行い、ゲルの各点において蛍光放射を示す二次元アレイとして保存した。この点の間の距離を調節して、所定のデータ獲得時間に対する最良の応答を得た。実際の実験において、このゲルはまた、ゲルの上面のサンプルウェルからゲルの底面のサンプルウェルまでの、電気泳動通路を表わす、「レーン」としてスキャニングされた。なぜなら、電気泳動ゲル中の蛍光団は、点としてではなく線として整列するからである。このような各レーンは、サンプルウェルからゲルの底面までスキャニングされて、データ全部の収集時間の実質的な減少に到達した。バックグラウンドを参照すると、ブランクのレーンがスキャニングされ、このデータは、蛍光団を含むレーンについて、対応するデータに逐一基づいて減算された。次いで、補正したデータを、２つの様式で分析した。１つの分析において、標準的なゲルパラメータ（例えば、遊走距離、分子の分離、ならびにデジタル画像およびフィルムによって個々に決定されるような分子種の濃度）の評価に対して、同じゲルの標準的な研究用写真と比較される本来のゲルの画像を作成した。もう一方の分析において、フラットベッドスキャニング検出器を使用してオートラジオグラフィーフィルムからゲルレーンを作成したプロットと等しい「デンシトメトリー」プロットを作成した。レーンのデータベース関連蛍光強度から、各蛍光帯域の中心を同定し、そして遊走距離の関数として、蛍光強度の断面グラフを作成した。異なる量であるが既知の量の、同じ蛍光で標識された核酸を用いて調製されたゲルの使用から、感度、解像度、およびゲル検出の動的範囲全体の下限および上限を設定する標準曲線を、決定した。
【００７５】
１つおよび２つの光子吸収プロセスの、「平方強度点伝播機能（ｓｑｕａｒｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」特性および「長い侵入深さ（ｌｏｎｇ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｔｈ）」特性は、蛍光検出の将来の発展における重要な特徴として認識されている。これら両方は、蛍光について調査されるサンプル中の焦点面上に、フェムト秒の短いパルスレーザを集束させることによって達成される。別の実施形態に従う分光光度計において、適切なレーザからのレーザビームを、励起のために使用される、石英ハロゲン光源またはキセノン光源と置き換えた。このレーザビームを使用して、励起モノクロメータの入口開口部を照射した。いくつかの場合において必要とされる場合、さらなる変更としては、例えば、以下が挙げられる：標準的な長方形スリットではなく１つまたは２つのピンホール開口部を使用すること、およびモノクロメータを通過した後に光を集束させるために、対物レンズを挿入すること。蛍光放射は、以前のように光伝達モジュールを介して収集され、そして蛍光は、時間の関数としてか、または画像化形成スキャニングおよび領域スキャニングの場合においては、上記のゲル分析において記載したように、サンプルにわたる光伝達モジュールの時間および位置の関数として、測定される。この構成において、励起モノクロメータ上のピンホール出口開口部を使用して、サンプル上に光を画像化し、そしてこの画像の各点を、蛍光を誘発するために使用した。サンプル位置をｘ−ｙ−ｚの様式で移動させることによって、サンプル領域をスキャニングして、画像またはデータベースを作成するのを可能にした。共焦点顕微鏡のために、２つのピンホール開口部が、下記のように必要とされた。複数光子の適用のために、単一のピンホール開口部のみを、励起モノクロメータの出口開口部として使用した。２つの光子励起のために、高透過率のビームを集束させることが必要な場合、マイクロレンズアレイを使用し得る。一般的に、この構成は、エピ蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）であるが、特定の偏光適用において、励起は、底面からであり、放射光は、上面から収集された。
【００７６】
なお別の実施形態において、本発明に従って構成され、かつ作動可能である蛍光分光光度計システムを、スキャニング蛍光偏光検出器の作製に適用した。面偏光を用いて励起される場合、溶液中の蛍光分子は、分子が蛍光団の励起期間の間（すなわち、励起状態の存続期間）定常である場合、固定化面に戻る光を発する（すなわち、光は偏光したままである）。しかしながら、溶液中の分子は、無作為にタンブリングおよび回転し、そしてこの回転が励起状態の存続期間の間および放射が起こる前に生じる場合、光が放射される面は、本来の励起のために使用される光の面と、非常に異なり得る。
【００７７】
分子の偏光値は、その回転緩和時間に比例しており、この時間は、慣例により、分子が６８．５°の角度を回転するために必要とされる時間として定義される。回転緩和時間は、溶液粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子体積（Ｖ）、および気体定数（Ｒ）に関連する：
偏光値∝回転緩和時間＝３ηＶ／ＲＴ。
【００７８】
粘度および温度が一定である場合、偏光は、分子体積（分子サイズ）に直接関連し、一般的には、分子量とよく相関している。分子体積の変化は、分解、変性、コンホメーション変化、あるいは２つの分子の結合または解離を含む、いくつかの要因から生じる。これらいずれかの変化が、溶液の偏光値の変化の関数として検出され得る。詳細には、その励起状態の寿命の間に溶液中で自由に回転する蛍光低分子は、入射光の面と全く異なる面において光を発し得る。同じ小さい蛍光団が巨大分子に結合する場合、低分子の回転速度は、減少し、その効果は、偏光値の減少として検出される。この効果の測定は、レーザを用いてかまたは単一面において移動する光を伝達するだけの偏光フィルタを使用する光の選択を介して得られ得る、偏光された光による励起を必要とする。１つの実験において、本発明に従って作動可能な励起モノクロメータの１つの実施形態から得られる、規定された波長の光は、偏光フィルター（「偏光子」と表わされる）を通して光を通過させて、励起のための単色の面偏光光（本発明の目的のために、「垂直偏光光」と表わされる）を得ることによって、さらに精密化される。同時に、放射光を収集するための光路は、偏光フィルタ対（「分析器」と表わされる）のうちの１つを選択的に導入することによって同様に変更された。この偏光フィルタ対のうちの１つは、励起光の面に対して垂直な位置まで回転され得、それらのうちの他方は、励起光の面に対して水平な位置まで回転され得る。溶液中の蛍光サンプルは、偏光子と分析器との間の光路に導入され、垂直に偏光された面に適切に配向された分子のみが、その光を吸収し、励起され、続いて、光を発した。放射光路に挿入される適切な分析フィルタを選択することによって、垂直面および水平面における放射光の量が、測定され得、そして、より大きな分子への結合前後の、溶液中の蛍光低分子の回転の程度が評価され得る。以下に記載される図６は、前出の実験を容易にし得るシステムを示す。
【００７９】
なお別の適用において、蛍光分光光度計システムは、共焦点顕微鏡において利用された。この方法は、蛍光顕微鏡の基本的な困難（すなわち、焦点外の光に起因する、顕微鏡の焦点面での空間的分解の減少）の１つを排除するための方法である。別の実施形態に従う分光光度計を使用して、実質的に上記のように、全セルの台板に光画像の焦点を当て、そしてサンプル中の蛍光標識の多光子励起および単一光子励起の両方を達成するためのレーザ励起の下での実施形態から、共焦点顕微鏡を作製した。焦点外の面での蛍光団は照射されず、そして蛍光を発しなかった。
【００８０】
共焦点画像化において、試料を通る光の錐体に焦点を当てるために、励起光路および放射光路の両方で、そして散乱した平面外の蛍光を排除するために、放射光路で、アパーチャを使用した。モードロックされた色素レーザの発生は、実際の多光子励起と同時になされた。なぜなら、このようなレーザは、非常に短いパルスで、そして２光子励起を達成するのに十分なエネルギーで、焦点スポットに対して利用可能な励起エネルギーを送達し得るからである。多光子画像化において、上記の光伝達モジュールと組み合わせて使用される場合、レーザによって提供される焦点は、放射側の第二のピンホールアパーチャを用いずに、全てでの放射光を収集することを可能にする、十分小さい容積を励起する。放射アパーチャの変化は必要なかった。
【００８１】
図６は、簡潔に上記されたような、蛍光偏光を含む蛍光分光光度計システムの実施形態の模式図である。図６の実施形態において、励起モノクロメータ１０４を出る光は、直線偏光であり得る。これに関して、励起偏光フィルタ６０２は、選択された方向で励起光を偏光させるために作動し得る。偏光励起光は、ＬＴＭ１０６を介してサンプルウェル１０８へと伝達される。サンプルによって放射される、得られた蛍光およびルミネセンス光は、ＬＴＭ１０６によって収集され、このＬＴＭ１０６は、偏光分析器６０４へと放射光を向ける。作動中、偏光分析器６０４は、ウェル１０８から放射される光が、元の方向６０２から回転されたか否かを決定し得る。このような回転は、ウェル１０８中のサンプルについての情報（例えば、サンプル中の分子のスピンおよび／またはサイズ）を提供し得る。分析器６０４は、図１に示される実施形態を参照して上記のように、放射二重モノクロメータ１１０の進入アパーチャに、放射光を伝達する。
【００８２】
励起偏光フィルタ６０２は、一般に、当該分野で一般に公知のように、選択された平面において方向付けられた直線偏光励起光へと励起光を制限するための、光学フィルタ操作として与えられ得る。光学フィルタホルダ（示さず）を選択的に使用して、励起光の路へと光学偏光フィルタ６０２を挿入し得る。
【００８３】
図７は、本発明の１実施形態に従って構成され、そして作動する偏光分析器７００の１実施形態の単純化模式図である。分析器７００は、一般に、図６を参照して上記された分析器６０４に対応し、その機能性の全てを組み込む。分析器７００は、（図６に示されるＬＴＭ１０６から）放射光を受けるように作動するアパーチャ７０２、ならびに２つの放射偏光フィルタ７０４および７０６（これらは、例えば、プレート７０８のようなフィルタホルダ上に配置され得る）を備え得る。第一の放射偏光フィルタ７０４は、励起偏光フィルタ６０２の偏光に対して平行な偏光を有し、従って、励起偏光フィルタ６０２によって生じる元の方向を有する光を通過させる。一方、第二の放射偏光フィルタ７０６は、励起偏光フィルタ６０２の偏光と垂直の偏光を有し、従って、元の方向を有する光を遮断する。モーター付きスライダ７１０または他の適切な機構は、２つの位置の間でフィルタプレート７０８をスライドさせ得る：第一の位置は、第一の（平行）偏光フィルタ７０４が、光路上で（ｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｔｒａｉｎ）アパーチャ７０２と一直線上の位置にあり、第二の位置は、第二の（垂直）偏光フィルタ７０６が、光路上でアパーチャ７０２一直線上の位置にある。
【００８４】
各サンプルについて、２つの測定値を取り得る。第一の測定値について、モーター付きスライダ７１０は、第一の位置へとフィルタプレート７０８をスライドさせ、サンプルからの任意の放射蛍光は、平行フィルタ７０４を通過し得る。第二の測定値について、モーター付きスライダ７１０は、第二の位置へとフィルタプレートをスライドさせ、サンプルからの任意の放射蛍光は、垂直フィルタ７０６を通過し得る。存在する場合、回転の量は、２つの測定値を比較することによって決定され得る。例えば、励起光の偏光が、サンプルにおいて回転しなかった場合、第二の測定値において放射蛍光は検出されないはずである。なぜなら、元の方向の全ての光は、垂直フィルタ７０６によって遮断されるからである。
【００８５】
偏光分析器７００を、蛍光分光光度計システムの別個の成分（例えば、図６の参照番号６０４）として例示して記載してきたが、図７に詳述される構成要素またはそれらの等価物、ならびに偏光分析器の機能が、図６において例示されるＬＴＭ１０６の放射側またはモノクロメータ１１０へと、代替的に組み込まれ得ることが明らかである。以下に詳細に示すように、いくつかの実施形態は、光路上の放射ミラーの上流のＬＴＭにおける放射偏光分析器の機能を組み込む。同様に、励起偏光フィルタ（図６の参照番号６０２）は、モノクロメータ１０４またはＬＴＭ１０６の励起側へと組み込まれ得る。
【００８６】
図８は、照射システムの単純化断面図である。照射システム８００は、一般に、図４、５Ａおよび５Ｂに例示される光源１００に対応し得る。照射システム８００は、光源またはランプ８０１のフィラメントを、励起モノクロメータ（例えば、図１の参照番号１０４によって示される）の進入アパーチャ２００上に画像化するように作動し得る。図８の実施形態において、第一の球状反射表面８０２および第二の球状反射表面８０３は、球状凹型反射システム（この場合、オフナー１：１アフォーカルリレー）を形成するように協同する。球状表面８０２、８０３は、三次の異常全てについて較正するために使用され得る；球状凹型反射システムは、光学路（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｉｎ）の両端でテレセントリックである。
【００８７】
当該分野で一般に公知のように、ランプ８０１は、システム全体の前にあるフィラメントの後方からの流れを反射するように作動する、後方ミラー８０４を備え得る。さらに、またはあるいは、交換可能なアパーチャ（示さず）を有するアパーチャホイールは、光路へと挿入され得る。アパーチャホイールの回転により、例えば図８に例示される光路へと挿入される複数のアパーチャの１つを選択することが可能となる；従って、進入アパーチャ２００上に生じる流れの円錐角は、システム要件に従って選択的に調節され得る。
【００８８】
この点に関して、照射供給源８００の球状凹型反射システムを通って動く光路へと、複数のアパーチャの１つを選択的に挿入するための手段が、含まれ得る。線形アクチュエータ、アパーチャホイールを回転させるための歯車などのような機構が意図される。１以上のアパーチャを光学路へと挿入する種々の方法は、当該分野で公知である。
【００８９】
図９は、パラボラ型化合物コンセントレータを組み込む光伝達モジュールの１実施形態の単純化断面図である。図９において矢印で示されるように、励起光は、図の左側から、ＬＴＭ１０６（これは一般に、図９において点線で示される）へと受けられ得、そして励起ミラー３０２によって、アパーチャ９０２を通って方向付けられる（図４、５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。パラボラ型化合物コンセントレータ（ＣＰＣ）９０１は、アパーチャ９０２を通る放射光（すなわち、サンプル含有照射領域から放射される蛍光またはルミネセンス光）を受け得る。
【００９０】
この実施形態に従って、ＣＰＣ９０１は、研磨された反射表面を備え得、この反射表面は、照射されたサンプルから放射される流れを収集し、そして放射ミラー（図９には示されない）（例えば、上に詳述される）による反射のために放射光を集めるように作動する。
【００９１】
上記のように、放射偏光分析器（図６および７を参照のこと）の種々の構成要素は、ＣＰＣ９０１と放射ミラーとの間に組み込まれて、ＬＴＭ１０６へと偏光分析器の機能を取り込み得る。この配置は、放射光の偏光状態に対するＬＴＭ１０６自体の影響を、実質的に減少し得る。
【００９２】
図１０Ａは、パラボラ型化合物コンセントレータを組み込む光伝達モジュールの内側の単純化断面図であり、図１０Ｂは、放射ミラーの上流の放射偏光を組み込む光伝達モジュールの１実施形態の単純化断面図である。図１０Ａおよび１０Ｂに示される図は、光路に対して平行であり、それぞれ、図９に示される線１０Ａおよび１０Ｂで取られたものである；すなわち、図１０ＡのＣＰＣ９０１のアパーチャ９０２を通って方向付けられた放射光は、放射ミラーによって、上記の放射二重モノクロメータへと方向付けられる前に、図１０Ｂの偏光ユニット９１０を通過する。
【００９３】
図１０Ａの実施形態において、アパーチャ９０３は、図９を参照して上記されるように、励起二重モノクロメータからＬＴＭ１０６への放射光を受ける。上記のように、照射されたサンプルにより放出される放射光は、アパーチャ９０２を通り、そしてＣＰＣ９０１の研磨された内面によって、放射ミラーへと方向付けられる。
【００９４】
図１０Ｂに例示される偏光ユニット９１０は、ＣＰＣ９０１と放射ミラーとの間に組み込まれ得、その結果、放射光は、放射ミラーに衝突する前に、偏光され得るか、またはさもなければフィルタにかけられ得る。作動の際に、アクチュエータまたは駆動モーター９０７（例えば、フィルタホルダまたはホイール９０４に連結される）は、複数の偏光フィルタ（参照番号９０５Ａおよび９０５Ｂによって示される）または他のフィルタ（参照番号９０６によって示される）のうちの１つの選択を可能にする。ホイール９０４における１以上のスロット（参照番号９０８によって示される）は、フィルタを全く有さずに提供され得る。従って、ホイール９０４のようなフィルタホルダは、複数の偏光フィルタまたは他のフィルタのうちの１つを放射光路に挿入するように、選択的に作動し得る。ホイール９０４に組み込まれる種々のフィルタの品質、性質および偏光面は、システム全体の必要な機能として選択され得る。
【００９５】
代替の機構またはさらなる機構は、偏光ユニット９１０におけるフィルタの選択を可能にするように具体化され得ることが理解される。図７を参照する上記のフィルタプレートの線形平行移動は、例えば、全分光光度計システムに関して、ＬＴＭのサイズ要件および作動要件に依存して、適切かつ等しく有効であり得る。
【００９６】
下記の図面の説明は、例示に過ぎず、そして開示された実施形態が、全システム効率を改善し得る改変および変更を受け得ることもまた、理解される。例えば、アパーチャホイールの回転および適切な取り付けは、図９のＬＴＭ１０６においてさらに具体化され得る；アパーチャは、例えば、アパーチャ９０２を通過した励起光を調節し、その結果、漂遊光が最小化され得るように、サンプルウェルの寸法に従って選択され得る。
【００９７】
図２Ａに示されるような二重モノクロメータの１実施形態において、例えば、バッフルが、第一の選択アパーチャ２０６を通過しない回折された流れに起源する漂遊光を減少させるために組み込まれ得る。バッフルを有さないモノクロメータ設計の分光光度計測定値は、所望の半分の波長のかなりの流れが、第一の選択アパーチャを通って伝達され得ることを明らかにした；例えば、従来の励起モノクロメータが、６００ｎｍの波長を有する光を通過させるように設定される場合、３００ｎｍの波長を有する流れもまた、二次の異常として選択アパーチャを通って伝達され得る。従って、バッフルの実施を通じての、漂遊光の減少は、モノクロメータによる光出力の純度に関しての重要な決定因子を示し得る。
【００９８】
図１１は、サンプルを分析する方法の１実施形態を示す単純化流れ図である。システム実施形態を参照して上に詳細に示されるように、サンプルを分析する方法は、一般に、光源から励起光を提供する工程（ブロック１１０１）、第一の二重モノクロメータを通るように励起光を方向付ける工程（ブロック１１０２）、光伝達モジュールを通して、サンプルへと励起光を伝達する工程（ブロック１１０３）、光伝達モジュールを使用して、サンプルによって放射される光を得る工程（ブロック１１０４）、サンプルによって放射される光を、第二の二重モノクロメータへと方向付ける工程（ブロック１１０５）、および第二の二重モノクロメータによって、光出力を分析する工程（ブロック１１０６）を包含する。上記のように、図１１の実施形態は、単一サンプル中の１より多い蛍光化合物を検出および分析するために使用され得る。
【００９９】
本発明のいくつかの特徴および局面を、限定ではなく例示のみのために、特定の実施形態を参照して詳細に例示および説明してきた。当業者は、開示された実施形態に対する代替的な実施および種々の改変が、本発明の範囲内および実施内であることを理解する。例えば、開示された二重モノクロメータは、他の型の機器において具体化され得、そしてＬＴＭは、フィルタベースの分光光度計または他の光学機器において使用され得る。さらなる例として、ＬＴＭは、照射される領域に対して入力光を方向付けるため、そしてこの照射された領域から（例えば、反射または蛍光のいずれかによって）放出される光を、効率的に収集し、収束し、そして方向付けるために使用され得る。従って、本発明が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるとみなされることが意図される。
【０１００】
他に示さない限り、種々の図面における類似の参照番号および類似の表記は、類似の構成要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、蛍光分光光度計システムの実施形態の模式図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、二重モノクロメータの実施形態の模式図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、図２Ａに示される二重モノクロメータの格子を旋回させるための引張り帯域アクチュエータ機構の一実施形態を示す模式図である。
【図３】
図３は、図１に示される光伝達モジュールの一実施形態の簡略化模式図である。
【図４】
図４は、本発明により構築されて作動可能である蛍光分光光度計の簡略化したバージョンの模式図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、蛍光分光光度計システムの第１の代替の二重路実施形態を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、蛍光分光光度計システムの第２の代替の二重路実施形態を示す。
【図６】
図６は、蛍光偏光を含む蛍光分光光度計システムの実施形態の模式図である。
【図７】
図７は、本発明の一実施形態により構築されそして作動可能な偏光分析器の一実施形態の簡略化された模式図である。
【図８】
図８は、照射システムの簡略化された断面図である。
【図９】
図９は、複合放物集光器を組み込んだ光伝達モジュールの一実施形態の簡略化された断面図である。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、複合放物集光器を組み込んだ光伝達モジュールの内部の簡略化された断面図である。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、放射ミラーの上流に放射偏光を組み込んでいる光伝達モジュールの一実施形態の簡略化された断面図である。
【図１１】
図１１は、サンプルを分析する方法の一実施形態を図示する簡略化されたフローダイアグラムである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図９】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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