(57)【要約】本発明は慢性痛を処置または改善するための新規な治療薬の開発のために好適な標的としてのＭＭＰ７を開示する。本発明は、慢性痛を処置および／または改善する方法、ならびにおよびＭＭＰ７の酵素活性および／またはＭＭＰ７の遺伝子発現に対して阻害作用を有するモジュレーターを含む、そのための医薬組成物に関する。本発明はまた、慢性痛の処置に治療上有用な化合物を同定する方法に関し、その方法はＭＭＰ７の活性および／または遺伝子発現を阻害することができ、また、インビボにおいて慢性痛の病理作用を逆転させることもできる組成物を同定することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＭＭＰ７モジュレーターを、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性痛を処置または改善する方法。
【請求項２】
有効量のＭＭＰ７モジュレーターを含む医薬組成物が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
慢性痛が慢性神経痛である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＭＰ７モジュレーターが対象におけるＭＭＰ７の酵素活性を阻害する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＭＰ７モジュレーターが対象におけるＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
ＭＭＰ７モジュレーターがヒドロキサム酸誘導体と呼ばれる化合物種に属する化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
モジュレーターが遊離形態または医薬上許容される塩の形態の（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
モジュレーターがアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質がＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
モジュレーターがＭＭＰ７に対する１以上の抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントがＭＭＰ７の酵素活性を阻害することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
慢性痛を処置または改善するのに有用なモジュレーターを同定する方法であって、ＭＭＰ７の酵素活性を阻害する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含む方法。
【請求項１１】
慢性痛を処置または改善するのに有用なモジュレーターを同定する方法であって、ＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含む方法。
【請求項１２】
慢性痛の動物モデルにおいて、および／または慢性痛を有する対象での臨床試験において観察される病理作用を逆転させるために、同定されたＭＭＰ７阻害モジュレーターの能力をアッセイすることをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
それを必要とする対象において慢性痛を処置または改善するのに有効な量のＭＭＰ７モジュレーター含む医薬組成物。
【請求項１４】
モジュレーターがＭＭＰ７の酵素活性を阻害する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
モジュレーターがＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
モジュレーターがヒドロキサム酸誘導体と呼ばれる化合物種に属する化合物である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
モジュレーターが遊離形態または医薬上許容される塩の形態の（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
モジュレーターがアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質がＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている、請求項１３または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
モジュレーターがＭＭＰ７に対する１以上の抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントがＭＭＰ７の酵素活性を阻害することができる、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
慢性痛の処置に用いる薬剤の製造のためのヒドロキサム酸誘導体の使用。
【請求項２１】
慢性痛の処置に用いる薬剤の製造のための（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドの使用。
【請求項２２】
ＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となり得る慢性痛に苦しむ対象を診断する方法であって、該対象由来の生体サンプル中のタンパク質レベルまたはこのタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含み、対照に比べてレベルが上昇している対象がＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となる、方法。
【請求項２３】
慢性痛を処置または改善する方法であって、
（ａ）対象のＭＭＰ７  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイすること、および
（ｂ）対照に比べてＭＭＰ７  ｍＲＮＡのレベルおよび／またはタンパク質レベルが上昇している対象にＭＭＰ７モジュレーターを慢性痛の病理作用を処置または改善するのに十分な量で投与すること
を含む方法。
【請求項２４】
生体サンプルにおいてＭＭＰ７のｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルを検出するための診断キットであって、
（ａ）  ＭＭＰ７のポリヌクレオチドまたはその断片；
（ｂ）  （ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）  ＭＭＰ７ポリペプチド、またはその断片；または
（ｄ）  ＭＭＰ７ポリペプチドに対する抗体
を含み、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を含み得る、キット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
痛みとは、一定の臨床状態を包含する用語である。通常の状態での急性の痛みは組織の損傷があるかもしれないという生理学的な警報として有用であり、また役立つ。さらに持続する痛みは、通常、炎症に関連するものであるが、軽度の組織損傷に対する正常な防御応答とも考えられ、その損傷が治癒すると消散する。しかし、慢性痛は、刺激と痛みが無関連な場合に起こり、もはや防御機構ではない。これらのタイプの痛みの症候群（たとえば、慢性関節リウマチ、癌の痛み、神経痛）は当然のことながら処置が異なる。成人人口の１０〜２０％が慢性痛に苦しんでいると見積もられている。これまでに用いられてきた主な無痛法はオピエートや、アスピリンなどの非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）に基づくものである。両薬物種とも重篤な副作用が起こる可能性があり、ＮＳＡＩＤＳは胃潰瘍の形成や腎傷害を引き起こすことがあり、オピエートでは悪心、便秘、および依存症の問題を引き起こすことがある。これらの不都合な点があるにもかかわらず、最近でも新たな種の無痛法は発見されてもいないし、開発されてもおらず、慢性痛のためのさらなる療法の必要性が明らかである。
【０００２】
慢性痛の状態はいくつかの臨床的特徴により特徴づけられる。一時的な痛みと同様に、患者は痛覚過敏症（有害な機械的刺激、熱刺激または低温刺激に対する過大な応答）、および異痛症（以前は無害であった刺激を痛いと感じる）を示し得る。これら特徴は全て、末梢の感覚神経の機能、および脊髄および脳の感覚情報処理における変化を伴う複雑な一連の事象によって起こるものである。これらの変化は直接的な神経損傷に応答して、または組織損傷もしくは炎症の際に放出されるメディエーターに応答して起こる。
【０００３】
広く言えば、慢性痛症候群は炎症性（侵害受容としても知られる）または神経性のものとして定義することができる。慢性炎症痛は、その名が示す通り、慢性関節リウマチ、火傷、筋肉損傷、または外科創傷などの炎症が基礎にある症状の際に起こる。炎症痛の基礎にある機構の知見は近年かなり進展してきており、種々のメディエーター、それらの活性化、感覚神経の末梢末端の増感、およびその結果としての脊髄神経の反応性の長期的変化を含むことが知られている。
【０００４】
慢性神経痛は神経系の一次病変部または不全が存在するところで起こり、たとえば三叉神経痛、糖尿病性神経障害、疱疹後神経痛、切断術または機械的な神経損傷などの症状の際に起こる。慢性神経痛は外傷による、糖尿病、帯状疱疹もしくは後期癌（下記参照）などの疾病による、あるいは化学傷害（たとえばいくつかの抗ＨＩＶ薬）による神経損傷によって起こる。また、切断術（乳房切除術を含む）後にも発症することがあり、何らかの腰痛に関連する。慢性神経痛の機構は十分に理解されていないが、ある種のイオンチャネルの新規な発現、感覚繊維の、脊髄の種々の層への出芽、および感覚神経および脊髄における種々の神経伝達物質および受容体の発現の変化による感覚神経の一時的な発火が関連すると考えられる。従来から、慢性神経痛は難治性であり、標準的な非ステロイド系およびオピエート系鎮痛薬に耐性があることが分かっている。したがって、この種の痛みを処置するための、未検討の新規な鎮痛薬の必要性が明らかにある。
【０００５】
癌の痛みは最も多い慢性痛症候群である（おそらくは炎症的要素と神経的要素を持つ）。特に乳癌、前立腺癌および肺癌においては、進行した癌を有する患者の３分の１が骨格への転移を発症するものと見積もられている。転移性の骨疾患では一般に骨の痛みを生じ、これは通常分散した領域に散らばり、刺すような不快感を伴う痛みと焼け付くような深く穿孔されるような感覚として表現される。骨の癌の痛みの原因となる機構は分かっていないが、おそらくは構造的損傷、骨膜の刺激および神経のエントラップメントを含んでいる。正常な骨の代謝が破壊され、炎症性プロスタグランジンおよびサイトカインが産生されるという証拠がある。骨の癌の痛みの現在の処置は依然としてオピエート類によるものであるが、必要な用量は許容できない副作用を招き、少なくとも２０％の患者ではなお痛みの制御ができない。これらの患者の生活の質を最適にするには、十分許容され、かつ、有効な新規な鎮痛薬が望まれている（Ｃｏｌｅｍａｎ  ＲＥ  （１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  ８０；  １５８８−１５９４）。
【０００６】
骨関節炎の痛みは慢性神経痛としては最も多い形態であり（おそらくは炎症的要素と神経的要素を持つ）、そのために患者は一般医を訪れる。骨関節炎は関節組織、主に軟骨、滑膜および肋軟骨下の骨における進行性の構造変化を含む慢性疾患である。典型的には関節炎の関節は軟骨の浮腫とびらん、肋軟骨下の骨および滑膜の肥厚、ならびに骨増殖体の形成を示し、全てが関節表面の変形に関わっている。骨関節炎の主な臨床症状は痛みであるが、この症状の慢性神経痛の基礎にある機構は分かっていない。
【０００７】
従来、慢性神経痛を改善するためには、痛みのシグナル伝達に関連する感覚繊維、たとえば「Ｃ繊維」に（Ｗｏｏｌｆ  Ｃ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３６０，  １２１−１２４）、または脊髄に沿って侵害刺激情報を伝達する感覚繊維に（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＡＨ．  ＆  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ａ．  （１９８７）    Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２６；  １２３５−１２３８．）治療化合物を向けることによる試みがなされてきた。また、化合物が、炎症の際に組織からのメディエーター（たとえば、サイトカインおよびブラジキニン）の放出を遮断することにより、かつ／またはこれらのメディエーターの受容体を遮断することによりこの痛みを改善し得るという仮説も立てられている（Ｄｒａｙ  Ａ．  ＆  Ｕｒｂａｎ  Ｌ．  （１９９６）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３６；  ２５３−２８０．）。
【０００８】
本発明者らは今般驚くことに、慢性痛の動物モデルでマトリリジン（ＭＭＰ７）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のｍＲＮＡがアップレギュレートされること、およびこれらの動物においてＭＭＰ７の小分子阻害剤の投与が機械的痛覚過敏症の逆転をもたらすことを見出した。よって、ＭＭＰ７は慢性痛の新規な薬物標的として使用できる。本発明はまた、ＭＭＰ７活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するモジュレーターを同定する方法、およびヒト患者および罹患動物における慢性痛の処置のためのこのようなモジュレーターの使用も提供する。本発明はまた、該モジュレーターを含む医薬組成物も提供する。
【０００９】
発明の概要
本願は、ＭＭＰ７が慢性痛を処置または改善するための新規な治療薬の開発のために好適な標的となるという発見に関する。よって、一態様では、本発明は慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置または改善するのに有用なモジュレーターを同定する方法に関し、該方法は（ａ）インビトロまたはインビボでＭＭＰ７の活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含み、さらにまた（ｂ）慢性痛の動物モデルで、および／または慢性痛を有する対象の臨床試験で見られる病理作用を逆転させる、同定された阻害モジュレーターの能力をアッセイすることを含み得る。
【００１０】
別の態様では、本発明は、有効量のＭＭＰ７モジュレーターを、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置または改善する方法に関し、該モジュレーターは、該対象においてたとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する。一実施形態では、モジュレーターはヒドロキサム酸誘導体と呼ばれる化合物種に属する化合物である。別の実施形態では、モジュレーターは、本明細書で化合物Ａと呼ばれる物質である、遊離形態または医薬上許容される塩の形態の化学化合物（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドである。別の実施形態では、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質はＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている。さらなる実施形態では、モジュレーターは、ＭＭＰ７に対する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体は、たとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害することができる。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、有効量のＭＭＰ７モジュレーターを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置または改善する方法に関する。種々の実施形態では、該医薬組成物は上記で論じたＭＭＰ７モジュレーターのいずれかを含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象において慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置または改善するのに有効量でＭＭＰ７モジュレーターを含む医薬組成物に関し、該モジュレーターは、たとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害することができる。一実施形態では、該医薬組成物はヒドロキサム酸誘導体と呼ばれる化合物種に属する化合物である。一実施形態では、該医薬組成物は、本明細書で化合物Ａと呼ばれる、遊離形態または医薬上許容される塩の形態の化学化合物である。別の実施形態では、該医薬組成物は、ＭＭＰ７の核酸配列に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質はＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている。さらなる実施形態では、該医薬組成物は、ＭＭＰ７に対する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体は、たとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害することができる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となり得る慢性痛に苦しむ対象を診断する方法を提供し、該方法は該対象由来の生体サンプル中のこのタンパク質のレベルを検出することを含み、対照に比べてレベルが上昇している対象はＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、ＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となり得る慢性痛に苦しむ対象を診断する方法を提供し、該方法は慢性痛に苦しむ対象由来の生体サンプル中のこのタンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含み、対照に比べてレベルが上昇している対象はＭＭＰ７モジュレーター処置の好適な候補となる。
【００１５】
さらの別の態様では、慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置または改善する方法であって、（ａ）対象のＭＭＰ７  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルをアッセイすること、および（ｂ）対照に比べてＭＭＰ７  ｍＲＮＡのレベルおよび／またはタンパク質レベルが上昇している対象にＭＭＰ７モジュレーターを慢性痛の病理作用を処置または改善するのに十分な量で投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様では、患者由来の身体組織サンプルにおいて、ＭＭＰ７をコードするポリヌクレオチドもしくは関連の調節ポリペプチドの発現、またはＭＭＰ７もしくは関連の調節ポリペプチド、またはその断片のレベルを検出するのに必要な成分を含むアッセイ方法およびキットが提供され、このようなキットは、たとえば、該ポリペプチドもしくはその結合する抗体、または該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む。好ましい一実施形態では、このようなキットは、それにしたがってキットの成分を使用すべき手順を詳説した使用説明書も含む。
【００１７】
本発明はまた、慢性神経痛をはじめとする慢性痛の処置または改善のための薬剤の製造における  ＭＭＰ７モジュレーターの使用にも関する。一実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはヒドロキサム酸誘導体である。別の実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターは遊離形態または医薬上許容される塩の形態の化合物  Ａである。さらなる実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質はＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている。なおさらなる実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはＭＭＰ７に対する１以上の抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、たとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害するよう設計されている。
【００１８】
本発明はまた、医薬として用いられるＭＭＰ７モジュレーターに関する。一実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはヒドロキサム酸誘導体である。別の実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターは遊離形態または医薬上許容される塩の形態の化合物Ａである。さらなる実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡからなる群から選択される任意の１以上の物質を含み、該物質はＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するよう設計されている。なおさらなる実施形態では、該ＭＭＰ７モジュレーターはＭＭＰ７に対する１以上の抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントは、たとえばＭＭＰ７の酵素活性を阻害するよう設計されている。
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法、プロトコール、および試薬に限定されるものではなく、これらは変更可能であると考えられる。また、本明細書で用いられる用語は単に特定の実施形態を表すためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと理解される。
【００２０】
特に断りのない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料を用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置および材料を記載する。本明細書に挙げられている刊行物は全て、本発明とともに用い得る、刊行物中に報告されている材料および方法を記載および開示する目的で、出典明示により本明細書の一部とする。
【００２１】
本発明を実施する上で、分子生物学の多くの常法が用いられる。これらの技術は周知であり、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  ｅｄｓ．，  １９８８，  ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，  ＩＩ，  ａｎｄ  ＩＩＩ，  １９９７  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｄ．）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，  １９８５  （Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  １９８４  （Ｍ．  Ｌ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  １９８５，  （Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，  １９８４  （Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．）；  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  １９８６  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  １９８６  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｐｅｒｂａｌ，  １９８４，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  １９８７  （Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １５４  ａｎｄ  Ｖｏｌ．  １５５  （それぞれＷｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  ａｎｄ  Ｗｕ，  ｅｄｓ．）に説明されている。
【００２２】
本明細書および添付のクレームにおいて単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないことが明示されていない限り、複数形も含む。したがって、たとえば、「抗体（ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という場合には、１以上の抗体および当業者に公知のその等価物を表す。
【００２３】
「慢性痛の病理作用」としては、限定されるものではないが、痛覚過敏症および異痛症が挙げられる。
【００２４】
物質の、ＭＭＰ７を調節する能力（たとえば、ＭＭＰ７モジュレーター）は、限定されるものではないが、物質の、ＭＭＰ７の酵素活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する能力を含む。このような調節は、その他のタンパク質、たとえば関連の調節タンパク質またはＭＭＰ７により修飾されたタンパク質の、ＭＭＰ７と相互作用する能力を果たすことも含み得る。
【００２５】
本明細書において「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびに一本鎖であっても二本鎖であっても、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよいが、ゲノムまたは合成起原のＤＮＡまたはＲＮＡをさす。
【００２６】
本明細書において「アンチセンス」とは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をさす。「アンチセンス鎖」とは、「センス鎖」に相補的な核酸鎖をさす場合に用いる。アンチセンス分子は、目的の遺伝子を逆向きに、相補鎖を合成し得るウイルスプロモーターに連結することによる合成を含む、いずれの方法で作製してもよい。これを細胞内に導入すれば、転写された鎖と細胞が生産した天然配列とが合わさって二重らせんが形成する。そして、これらの二重らせんはさらなる転写または翻訳のいずれかをブロックする。「ネガティブ」とは、アンチセンス鎖をさして用いられ、「ポジティブ」はセンス鎖をさして用いられる場合がある。
【００２７】
本明細書で意図されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは、選択されたＭＭＰ７のヌクレオチド配列がＭＭＰ７の遺伝子発現の遺伝子特異的阻害をもたらすように、「ＭＭＰ７の核酸配列に向けられる」。たとえば、ＭＭＰ７ヌクレオチド配列に関する知見を用いて、ｍＲＮＡに強い阻害を与えるアンチセンス分子を設計してもよい。同様に、ＭＭＰ７の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを切断するようなリボザイムを合成することもできる（Ｃｅｃｈ．  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｍｅｄ  Ａｓｓｎ．  ２６０：３０３０  （１９８８）。遺伝子発現の標的阻害に用いられるこのような分子の設計技術は当業者には周知のものである。
【００２８】
「ＭＭＰ７」とは、限定されるものではないが、ヒトまたは他のいずれかの種に由来するＭＭＰ７配列を含む変異体、部分形態、イソ型、前駆体、全長ポリペプチド、融合タンパク質、または上記のいずれかの断片をはじめとする、このポリペプチドのいずれか、また全ての形態をさす。ラットＭＭＰ７の配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２８６４で見出せる。当業者ならば明らかであろうが、ＭＭＰ７のホモログおよびオルトログもこの定義に含まれるものとする。また、この用語は、ゲノムＤＮＡライブラリーなどのいずれかの種の天然源、ならびに発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から単離された、あるいはたとえば自動ペプチド合成またはそのような方法の組み合わせを用いて化学合成により産生されたＭＭＰ７をさすと考えられる。このようなポリペプチドを単離および調製する手段は当技術分野で十分理解されている。
【００２９】
本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いる。対象からの生体サンプルは血液、尿、またはＭＭＰ７活性または遺伝子発現をアッセイし得るその他の生体材料を含み得る。生体サンプルとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップなどの通常のガラスチップマイクロアレイ技術、ＲＴ−ＰＣＲ、またはその他の常法を用いた遺伝子発現プロファイリング向けに全ＲＮＡを精製し得る背根神経節を含み得る。
【００３０】
本明細書において「抗体」とは、完全な分子、ならびにＦａ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど、エピトープ決定基と結合し得るそのフラグメントをさす。ＭＭＰ７ポリペプチドと結合する抗体は、完全ポリペプチド、または目的の小ペプチドを含む断片を感作抗原として用いて調製することができる。動物を免疫化するのに用いるポリペプチドまたはペプチドはＲＮＡの翻訳、または化学的に合成されたものに由来してもよく、所望により担体タンパク質とコンジュゲートさせることができる。通常ペプチドと化学的に結合させて用いる担体としては、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンが挙げられる。この結合ペプチドを用いて、次に、動物（たとえば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫化する。
【００３１】
本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合力を保持したまま、もっとヒト抗体に類似したものとするために、非抗原結合領域のアミノ酸を置換した抗体分子をさす。
【００３２】
「治療上有効な量」とは、限定されるものではないが痛覚過敏症をはじめとする慢性痛の病理作用を処置および／または改善するのに十分な薬物の量である。
【００３３】
本明細書において「関連の調節タンパク質」および「関連の調節ポリペプチド」とは、本明細書に記載されているものなどの常法を用いて当業者に同定され得るＭＭＰ７の調節に関連するタンパク質およびポリペプチドをさす。
【００３４】
本明細書で定義される痛みとしては、慢性痛を含む。「慢性痛」としては、上記のような炎症痛（侵害受容痛）および神経痛を含む。
【００３５】
「対象」とは、ヒトまたはヒトでない生物をさす。
【００３６】
本発明は、ＭＭＰ７メッセンジャーＲＮＡがラット慢性神経痛モデルにおいてアップレギュレートされるという驚くべき発見に基づく。この知見は、ＭＭＰ７阻害剤が慢性痛の実験モデル下にあるラットにおいて発症した機械的痛覚過敏症を逆転させるというさらなる発見をもたらした。よって、ＭＭＰ７は、これまでＭＭＰ７が関連するとは知られていなかった病態である慢性痛の処置のための治療薬の開発のために有用な薬物標的となる。
【００３７】
したがって、一態様では、本発明は、慢性神経痛をはじめとする慢性痛の処置または改善に有用なモジュレーターを同定する方法に関し、該方法はａ）インビトロまたはインビボでＭＭＰ７の活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害する候補モジュレーターの能力をアッセイすることを含み、さらにまたｂ）慢性痛の動物モデルで、および／または慢性痛を有する対象の臨床試験で見られる病理作用を逆転させる、同定された阻害モジュレーターの能力をアッセイすることを含み得る。
【００３８】
ＭＭＰ７の活性を阻害する、かつ／またはＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するモジュレーターを同定するためには通常のスクリーニングアッセイ（インビトロおよびインビボの双方）を用い得る。ＭＭＰ７の活性レベルは通常の酵素活性アッセイ法を用いて、対象からの生体サンプルを用いて被験者においてアッセイすることができる。ＭＭＰ７の遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡレベル）は、たとえば通常のノーザン解析または市販のマイクロアレイをはじめ、当業者に公知の方法を用いて調べることができる。さらに、試験化合物の、ＭＭＰ７および／または関連の調節タンパク質レベルの阻害作用はＥＬＩＳＡ抗体に基づくアッセイまたは蛍光標識反応アッセイを用いて検出することができる。これらの技術はハイスループットスクリーニングに容易に利用することができ、当業者によく知られている。
【００３９】
阻害物質は次に、インビボにおいて慢性痛の病理作用を改善する化合物の能力を評価する常法にしたがい、本明細書に記載の通常の動物生体慢性痛モデルで、および／または慢性痛を有するヒトの臨床試験でさらにアッセイすることができるので、これらの研究から採集したデータは慢性痛の処置に治療上有用なモジュレーターを同定するために使用される。
【００４０】
本明細書に開示される方法にしたがった分析のための候補モジュレーターとしては、ＭＭＰ阻害活性を有することが知られている化学化合物、ならびにこのタンパク質に対するその作用が何らかのレベルですでに特徴づけられている化合物を含む。ＭＭＰ阻害活性を有することが知られている化合物は本明細書に記載の動物の痛みのモデルまたは臨床試験直接アッセイすることができる。
【００４１】
特に有用なＭＭＰ阻害剤種の一つにヒドロキサム酸誘導体がある。この種の特に有用な化合物の一つが（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドおよびその医薬上許容される塩であり、本明細書では化合物Ａと呼ぶ（実施例２参照）。
【化１】
2005526820.tif 000002
化合物Ａ
化合物Ａはさらに英国特許出願第０２０８１７６．８号にも開示されており、本明細書に記載され、また、以下に示されるように合成することができる。
【００４２】
化合物Ａの合成
（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミド：
ステップＡ：２（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−３（Ｓ）−エチル−１−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−ペント−４−エン−１−オン
【化２】
2005526820.tif 000003
ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミドヒドロクロリド（０．１０７ｍｌ，  １．２３ｍｍｏｌ）および中間体２（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−３（Ｒ）−エチル−ペント−４−エン酸（２３９ｍｇ，  １．１２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＦに溶かし、氷浴中で冷却する。ＨＯＢＴ（１８８ｍｇ，  １．２３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．３０９ｍｌ，  ２．２４ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（２１４ｍｇ，  １．１２ｍｍｏｌ）を連続的に加える。氷浴を取り外し、一晩攪拌を続ける。この混合物を蒸発させ、ジエチルエーテルに再溶解し、２Ｎ−ＨＣｌ（２回）、５％重炭酸ナトリウムおよびブラインで抽出する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させ、オイルとして２（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−３（Ｓ）−エチル−１−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−ペント−４−エン−１−オンを得る。
【００４３】
ステップＢ：３（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−２（Ｓ）−エチル−４−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−４−オキソ−酪酸
【化３】
2005526820.tif 000004
この粗オレフィンとしての２（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−３（Ｓ）−エチル−１−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−ペント−４−エン−１−オン（３１５ｍｇ，  １．０２ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのメタノールに溶かし、−７５℃に冷却する。−７０℃前後の温度で一定流（５０ｌ／ｈ）のオゾンを導入する。約１０分後、全ての出発材料が消費され、青色になる。次にこの溶液を窒素でパージし、ジメチルスルフィド（０．３７５ｍｌ，  ５．１ｍｍｏｌ）を加える。冷却浴を取り外し、２時間攪拌を続ける。溶媒を蒸発させ、粗オイルを７ｍｌのｔ−ブタノールに再溶解する。水２ｍｌ中、リン酸二水素ナトリウム一水和物（４２３ｍｇ，  ３．０６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた後、水２ｍｌ中、２−メチル−２−ブテン（０．５４ｍｌ，  ５．１ｍｍｏｌ）および塩化ナトリウム（１８５ｍｇ，  ２．０４ｍｍｏｌ）を加える。混合物は黄色になり、発熱反応が見られる（大規模反応では氷浴での冷却が必要な場合がある）。１時間後、反応が終わり、無色の溶液を水２ｍｌ中、亜硫酸ナトリウム（１２９ｍｇ，  １．０２ｍｍｏｌ）で処理する。次に溶媒の大部分を蒸発させ、残渣をジエチルエーテルと１Ｎ−ＨＣｌで分液する。有機層を分離し、１Ｎ−ＮａＯＨで２回抽出する。水層を合し、冷濃ＨＣｌで酸性化し、ジエチルエーテルで３回抽出する。次に、合した有機層を水およびブラインで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。蒸発後、白色泡沫として３（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−２（Ｓ）−エチル−４−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−４−オキソ−酪酸が得られる。
【００４４】
ステップ  Ｃ：（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミド
【化４】
2005526820.tif 000005
粗酸３（Ｓ）−（４−クロロ−フェニル）−２（Ｓ）−エチル−４−（ピペリジン−２（Ｓ）−カルボン酸イソプロピルアミド）−４−オキソ−酪酸（３１０ｍｇ，  ０．９５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶かす。ＨＯＰＯ（１１１ｍｇ，  １ｍｍｏｌ）およびＭＥＩ（０．１５９ｍｌ，  １．１４ｍｍｏｌ）を連続的に加える。混合物を３０分間攪拌した後、ＴＭＳＯＮＨ２（０．２３３ｍｌ，  １．９ｍｍｏｌ）を加える。１時間後、さらにＴＭＳＯＮＨ２（０．２３３ｍｌ，  １．９ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌を続ける。反応混合物を濾過し（固体はほとんどＨＯＰＯ）、２０ｍｌのジクロロメタンで希釈し、２Ｎ−ＨＣｌおよびブラインで２回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミドを得る。粗固体（２３７ｍｇ，  ７３％）を分取ＨＰＬＣ（メタノール／水＝１／１）で精製する。
【化５】
2005526820.tif 000006
（Ｓ）−１−［（２Ｓ，３Ｓ）−２−（４−クロロ−フェニル）−３−ヒドロキシカルバモイル−ペンタノイル］−ピペリジン−２−カルボン酸イソプロピルアミド
ＭＳ  （ｎｅｇ．  ＥＳＩ）：  ４２２．０  ［Ｍ−Ｈ］−ＭＳ  （ｐｏｓ．  ＥＳＩ）：  ４４６．０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋１Ｈ−ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ２種類の回転異性体２０℃  （３：２）  δ  （ｐｐｍ）  １０．２８および１０．２５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５５および８．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８４および６．７７  （ｄ，  １Ｈ），  ７．２５−７．５  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．９５および４．６５  （ｂｒｏａｄ  ｄ，  １Ｈ），  ４．３および４．０８  （ｂｒｏａｄ  ｄ，  １Ｈ），  ４．１７および３．８９  （ｄ，  １Ｈ），  ３．９２および３．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０５および１．９３  （ｂｒｏａｄ  ｄ，  １Ｈ），  １．２−１．７  （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ７Ｈ），  ０．７−１．２  （ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ９Ｈ）．
【００４５】
別の態様では、本発明は、有効量のＭＭＰ７モジュレーターを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、慢性痛を処置または改善する方法に関する。このようなモジュレーターとしては、ＭＭＰ７ポリペプチドに対する抗体またはそのフラグメントが挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、医薬組成物はヒトＭＭＰ７ポリペプチドまたはヒトＭＭＰ７ポリペプチドの一部に対して選択性の高い抗体を含む。ＭＭＰ７に対する抗体は対象においてタンパク質の凝集を引き起こし、これにより酵素活性の阻害または低下をもたらし得る。このような抗体はまた、たとえば活性部位と直接相互作用することにより、あるいは活性部位への基質の接近を遮断することによってもＭＭＰ７活性を阻害または低下させ得る。また、ＭＭＰ７抗体は、ＭＭＰ７の調節に関与し得る、また、酵素活性に必要であり得るタンパク質−タンパク質相互作用を妨げることによってＭＭＰ７活性を阻害するためにも用い得る。本明細書に記載のものなど、阻害活性を有する抗体は当業者に公知の標準的なアッセイにしたがって生成および同定することができる。
【００４６】
ＭＭＰ７抗体はまた診断に用いてもよい。たとえば、対象におけるＭＭＰ７のレベルを定量する常法にしたがってこれらの抗体を使用することができ、レベルの上昇が慢性痛およびこの症状の重篤度を示す。したがって、種々のＭＭＰ７レベルが慢性痛の種々の臨床形態または重篤度の指標となる。このような情報はまた、ＭＭＰ７阻害剤での処置に応答し得る、あるいは応答しない、患者が感じている、ある一連の痛みを同定するのに有用であろう。同様に、本明細書では、対象におけるＭＭＰ７のメッセージレベルを定量することが、診断および適当な痛みの療法の決定に有用であるということも意図され、適当な対照個体と比べてこのタンパク質のｍＲＮＡレベルが上昇している対象はＭＭＰ７阻害剤処置の適切な候補と考えられる。
【００４７】
よって、別の態様では、本発明は、
（ａ）  ＭＭＰ７のポリヌクレオチドまたはその断片；
（ｂ）  （ａ）のものと相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）  ＭＭＰ７ポリペプチド、またはその断片；または
（ｄ）  ＭＭＰ７ポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関する。このようなキットはいずれも（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を含み得ると考えられる。また、該キットは本明細書で論じるように、ＭＭＰ７関連調節タンパク質またはＭＭＰ７によって改変されたタンパク質のレベルを検出するよう設計された成分（ａ）〜（ｄ）を含むことができると考えられる。
【００４８】
同様に、ＭＭＰ７のタンパク質レベルまたは酵素活性のモニタリングおよび／またはＭＭＰ７の遺伝子発現の検出（ｍＲＮＡレベル）が、たとえば所定の痛みの治療計画の効力を判定するための臨床試験手順の一部として使用できるとも考えられる。たとえば、痛みに対する薬物が投与された患者を評価し、臨床医がそのＭＭＰ７レベル、活性および／または遺伝子発現レベルが望ましいレベルよりも高い（すなわち、痛みを感じていない対照患者か、または臨床介入により痛みが十分改善された患者にレベルよりも高いレベル）患者を識別することができる。これらのデータに基づき、臨床医は次に痛みに対する処方薬の用量、投与計画または種類を調節することができる。臨床医は患者にどの程度の痛みを感じているか問診することで痛みに対する特定の投薬の有効性を判断することができるが、本明細書では、上記のように患者のＭＭＰ７レベルをモニタリングすることで患者の痛みのレベルの定量的評価が得られるということを意図する。さらに、このように対象のＭＭＰ７レベルのモニタリングを用いて、不応答患者（たとえば、幼児、昏睡状態の患者、火傷患者）が受けている痛みのレベルを評価することもできる。次に、このようなデータは、このような患者の痛みに対する投薬の適当な用量、投与計画または種類を決定するため臨床医が利用することができる。
【００４９】
患者のとっての療法の至適化を検討するための因子としては、治療する特定の症状、治療する特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、有効化合物の送達部位、有効化合物の特定の種類、投与方法、投与計画、および医師に高知のその他の因子が挙げられる。投与する治療上有効量の有効化合物はこのような検討項目により支配されているが、慢性痛、好ましくは慢性神経痛の処置に必要な最少量である。
【００５０】
ＭＭＰ７または関連の調節タンパク質に対する好適な抗体は商業ソースから得ることもできるし、あるいは常法にしたがって作製することもできる。たとえば、本明細書には、示唆的に発現される１以上の遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体の作製方法が記載されている。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化または決めた抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより作製されるフラグメント、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
【００５１】
本明細書で述べるＭＭＰ７ポリペプチドに対する抗体の作製のためには、種々の宿主動物を、ポリペプチドまたはその一部を注射することで免疫化すればよい。このような宿主動物としては、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられる。免疫応答を増強するために、宿主の種に応じ、限定されるものではないが、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用いてもよい。
【００５２】
ポリクローナル抗体とは、標的遺伝子産物のような抗原、またはその抗原的に機能性のある誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体遺伝子のヘテロな集団である。ポリクローナル抗体を作製するには、上記のような宿主動物を、上記のようなアジュバントを添加したポリペプチドまたはその一部を注射することで免疫化すればよい。
【００５３】
モノクローナル抗体とは、特定の抗原に対する抗体のホモな集団であり、連続的培養細胞系統による抗体分子の生産を提供するいずれの技術によって得てもよい。これらのものとしては、限定されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；  Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスをはじめ、いずれの免疫グロブリン種のものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで増殖させることができる。インビボにおいて高力価のｍＡｂが生産できれば、これはこれまでのところ好ましい生産方法となる。
【００５４】
さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともにスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：６８５１−６８５５；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２：６０４−６０８；  Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：４５２−４５４）も使用できる。キメラ抗体とは、ネズミｍＡｂに由来する可変領域または超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【００５５】
あるいは、単鎖抗体の生産のために記載された（米国特許第４，９４６，７７８号；  Ｂｉｒｄ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６））を示差発現される遺伝子単鎖抗体を生産するために採用することができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを、アミノ酸橋を介して結合させることにより形成し、単鎖ポリペプチドとする。
【００５６】
最も好ましくは、「ヒト化」抗体の生産に有用な技術を、本明細書に開示するポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的等価物に対する抗体を生産するために採用することができる。このような技術は、米国特許第５，９３２，４４８号；同第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，５３０，１０１号；同第５，９１０，７７１号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，５４５，５８０号；同第５，６６１，０１６号；および同第５，７７０，４２９号に開示されており、これらの全開示内容は出典明示により本明細書の一部とする。
【００５７】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術によって作製することができる。たとえば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより作製できるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの同定を迅速かつ容易にするためにＦａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５−１２８１）。
【００５８】
本明細書に記載の抗体の検出は、インビトロまたはインビボで用いられる標準的なＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および標準的なイメージング技術を用いて達成し得る。検出は抗体を検出可能な物質と結合（物理的に連結）させることで容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質に例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、クロロトリアジンイルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００５９】
検出を容易にするにはサンドイッチアッセイが特に好ましく、これにはいくつかのバリエーションが存在し、それらは全て本発明に含まれるものとする。たとえば、典型的な前者のアッセイでは、非標識抗体を固相支持体に固定化し、試験するサンプルを結合させた分子と接触させる。適切なインキュベーション期間、すなわち、抗体−抗原の二元複合体の形成を可能とするに十分な期間の後、検出可能なシグナルを誘導し得るリポーター分子で標識した第二の抗体を加え、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体の形成に十分な時間インキュベートする。次に、反応していない物質を洗い流し、シグナルの観察によって抗体の存在を判定するか、あるいは既知量の抗原を含む対照サンプルと比較することにより定量してもよい。前者のアッセイのバリエーションとしては、結合させた抗体にサンプルおよび抗体の双方を同時に加える同時アッセイ、または標識した抗体と試験するサンプルをまず合わせてインキュベートし、表面に結合させた非標識抗体に加える逆アッセイがある。これらの技術は当業者に周知であり、詳細なバリエーションの可能性は容易に明らかとなるであろう。本明細書において「サンドイッチアッセイ」とは、基本的な二元配置技術に対する全てのバリエーションを含むものとする。本発明の免疫アッセイにとって制限因子となるのは、標識される抗体がＭＭＰ７ポリペプチドもしくは関連の調節タンパク質に特異的な抗体、またはそのフラグメントであるということだけである。
【００６０】
最もよく用いられるリポーター分子は酵素、蛍光団または放射核含有分子のいずれかである。酵素免疫アッセイの場合、通常はグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩の手段により、酵素を第二の抗体とコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に分かるであろうが、種々の多様な連結技術が存在し、これらは当業者に周知のものである。一般に用いられる酵素としては、とりわけホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。特定の酵素とともに用いる基質は通常、対応する酵素によって加水分解された際に検出可能な変色を呈するように選択される。たとえば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートはアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとともに用いるのに好適であり、過ヨウ素酸塩コンジュゲートの場合には一般に１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが用いられる。また、上記に示した発色基質の代わりに蛍光産物を生じる蛍光性基質を用いることもできる。次に、適当な基質を含む溶液を三元複合体に加える。基質が第二の抗体に連結された酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生じ、これをさらに通常は分光光度法により定量することができ、血清サンプル中に存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチド断片の量を評価することができる。
【００６１】
あるいは、フルオレセインやローダミンのような蛍光化合物を、それらの結合能力を変化させることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光を照射することにより活性化させると、この蛍光団で標識された抗体は光エネルギーを吸収して分子を励起状態にし、その後、特徴的なより長い波長の光を放出する。この放出は光学顕微鏡で可視的に検出できる特徴的な色として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技術はいずれも当技術分野で十分確立されており、本方法にとって特に好ましい。しかし、放射性同位元素、化学発光または生物発光分子などの他のリポーター分子も使用し得る。必要とされる用途に合わせて手順をどのように変更すればよいかは、当業者であれば、容易に明らかとなる。
【００６２】
本発明の医薬組成物はまた、核酸レベルでＭＭＰ７の発現を阻害する物質を含んでもよい。このような分子としては、ＭＭＰ７核酸の適当なヌクレオチド配列に向けられたリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが挙げられる。これらの阻害分子は、当業者ならば過度な労力や実験なく、通常の技術を用いて作出することができる。たとえば、遺伝子発現の改変（たとえば、阻害）は、本明細書で論じるポリペプチドをコードする遺伝子の重要な領域に対するアンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより得ることができる。３０００ヌクレオチドのｍＲＡＮならば、約３００００通りの異なる１０〜２０マーの可能性がある。ｍＲＮＡについてのこの３００００通りの可能性のある１０〜２０マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドのどれだけのものが、また、どれが有用な活性を有するのかは先験的に推定することができないが、実験では小数が活性を有することが示されている。最適なオリゴヌクレオチドを同定する最も確実な方法は、３００００通り全ての配列を合成し、それらを個々に試験することであろう。これを実施するには膨大な労力がかかる。好適な化合物を提供する１０〜３０の間の異なるアンチセンス配列の小規模なセレクションが文献で数多く報告されている。これは標的ＲＮＡのどの領域がオリゴヌクレオチドの結合のために開放するのかを推定可能とする助けとなるが、ｍＲＮＡのある領域が接近可能かどうかを決定する方法には限りがある。ＲＮＡの二次的相互作用を推定するコンピュータープログラムが利用できるが、比較的原始的な方法であり、長いポリヌクレオチド（たとえば、数百を超えるヌクレオチド）について信頼性のある推定を得ることはできない。ＲＮＡの一本鎖および二本鎖領域を明らかにするために酵素マッピング実験（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：  １２０５５−１２０６１  （１９９２））  が用いられたが、単調で時間がかかり、種々の酵素で難解もインキュベーションを行い、いくつかのポリアクリルアミドゲルを用いる必要がある。短いＤＮＡオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを用いたＲＮＡが接近可能な領域のマッピングは最近導入された技術である（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：６２６−６３８  （１９９７））。ライブラリーのメンバーとこのＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ＲＮアーゼＨを導入して、形成した二重らせんを切断する。次に、これらの領域をポリアクリルアミドゲル上で同定する。この方法もまた、ゲルの分離能に限界があるため単調で時間がかかり、この情報を用いるということは、短いオリゴヌクレオチドにより局在化された一本鎖領域がまたより長いアンチセンス配列に対しても十分な結語部位となると仮定される誤差を伴う。アレイスキャン技術によれば、完全なセットのアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合能力を直接読みとることができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる高親和性二重らせん形成のためのＲＮＡ標的の接近可能な領域の同定に向けた大きなステップとなることが明らかである（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ��ｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  １３６８−１３７３  （１９９４））。この方法はそれ自体まったく直接的なものであり、同領域の専門家によるいくつかの刊行物に詳細に記載されている（たとえば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：  １３６８−１３７３  （１９９４）およびＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：５３７−５４１  （１９９７）；  Ｓｏｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３：  ６７−７２  （２０００）；  ＷＯ  ９５／１１７４８参照）。
【００６３】
１以上の標的部位が同定されれば、たとえば上記のいずれかの技術を用いて、所望の作用を得るための、その標的に十分相補的な、すなわち、十分よく、かつ、十分な特異性でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択される。
【００６４】
同様に、遺伝子発現の阻害は「三重らせん」塩基対合法を用いて達成し得る。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子が結合するに十分開放する二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法の進展は文献に記載されている（Ｇｅｅ，  Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｉｎ：  Ｈｕｂｅｒ，  Ｂ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｂ．  Ｉ．  Ｃａｒｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，  Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｍｔ．  Ｋｉｓｃｏ，  Ｎ．Ｙ．）。これらの分子はまた、転写物をリボゾームと結合しないようにすることにより、ｍＲＮＡの翻訳を遮断するよう設計することもできる。
【００６５】
リボザイム、すなわち酵素的ＲＮＡ分子はＲＮＡの特異的切断を触媒することで遺伝子発現を阻害するためにも用い得る。リボザイムの作用機構としては、リボザイム分子と相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションとその後のエンドヌクレアーゼによる分解性切断を含む。使用できる例としては、遺伝子配列、たとえばＭＭＰ７の遺伝子のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効率的に触媒するよう設計することができよう操作された「ハンマーヘッド」または「ヘアピン」モチーフリボザイム分子が挙げられる。
【００６６】
いずれかの可能性のあるＲＮＡ標的内にある特異的リボザイム切断部位はまず、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位に関して標的分子をスキャンすることにより同定される。これが同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子領域に相当する１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを作動不能にし得る二次的な構造特徴に関して評価することができる。また、候補標的が適切であるかどうかも、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用い、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために接近可能であるかどうかを試験することで評価することができる。
【００６７】
リボザイム法は細胞をリボザイムに曝すか、または細胞内でのこのような小ＲＮＡリボザイム分子の発現を誘導することを含む（Ｇｒａｓｓｉ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｉ，  １９９６，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２８：  ４９９−５１０；  Ｇｉｂｓｏｎ，  １９９６，  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５：  ２８７−２９９）。本明細書で論じられる少なくとも１つの遺伝子に相当するｍＲＮＡに向けられたハンマーヘッド型またはヘアピン型のリボザイムの細胞内発現を用いてその遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害することができる。
【００６８】
リボザイムはリボザイム配列を組み込んだＲＮＡオリゴヌクレオチドの形で細胞へ直接送達することもできるし、あるいは所望のリボゾームＲＮＡをコードする発現ベクターとして細胞へ導入することもできる。リボザイムはｍＲＮＡの切断において触媒的に有効な十分な数でインビボにて一定発現し、それにより細胞のｍＲＮＡの存在量を変更することができる（Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９    ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：３８６１−３８６６）。特に、従来の周知の法則にしたがって設計され、たとえばホスホルアミダイト化学により合成された、リボザイムをコードするＤＮＡ配列は、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドンステムとループの制限酵素部位へ連結することができ、次にこれを当技術分野の常法により目的の細胞へ形質転換し、発現させることができる。リボザイムの発現を選択的に制御できるようにこの構築物へ誘導プロモーター（たとえば、糖質コルチコイドまたはテトラサイクリン応答エレメント）も導入するのが好ましい。飽和状態での使用のためには、強力な構成的プロモーターを用いることができる。このような適用では、ｔＤＮＡ遺伝子（すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子）が、大きさが小さく、転写率が高く、また、種々の組織種で偏在発現するので有用である。
【００６９】
よって、通常、任意のｍＲＮＡ配列を実際に切断するようにリボザイムを設計することができ、通常、このようなリボザイム配列をコードするＤＮＡで、制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムが発現するように、細胞を形質転換することができる。よって、細胞内における任意のＲＮＡ種の実際の存在量は変更または摂動可能である。
【００７０】
リボザイム配列はアンチセンスヌクレオチドに関して記載したものと本質的に同様の方法で改変することができ、たとえばこのリボザイム配列は改変された塩基部分を含み得る。
【００７１】
また、ＲＮＡアプタマーも、ＲＮＡ存在量または活性を改変するために細胞へ導入し、発現させることができる。ＲＮＡアプタマーは、それらの翻訳を特異的に阻害することができるＴａｔおよびＲｅｖ  ＲＮＡ（Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：  ４５−５４）などのタンパク質に対する特異的ＲＮＡリガンドである。
【００７２】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、通常の二重らせんＲＮＡ技術を用いて達成することもできる。このような技術の記載はＷＯ  ９９／３２６１９ならびにＨａｒｂｏｒｔｈ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００１  Ｄｅｃ），  １１４（Ｐｔ  ２４），  ４５５７−６５に見出せる（両者とも出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする）。
【００７３】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡは核酸分子の合成に関して当技術分野で公知のいずれかの方法により作製することができる。これらには固相ホスホルアミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学合成するための技術が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は、本明細書で論じられるポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により作製することもできる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターとともに広範なベクターへ組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物を細胞系、細胞または組織へ導入することもできる。
【００７４】
ベクターは利用できる多くの手段により細胞または組織へ導入することができ、インビボ、インビトロまたはエキスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で用いることができる。エキスビボ療法では、患者から採取した幹細胞にベクターを導入し、クローン増殖させ、自己移植片として同じ患者へ戻せばよい。トランスフェクションによる送達およびリポソーム注入による送達は当業者で周知の方法を用いて達成できる。
【００７５】
ＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するための上記方法の他、本明細書では、限定されるものではないが、ＭＭＰ７をはじめとする、本明細書で論じられるポリペプチドのインビボ転写を阻害するため、小分子または他の天然産物を同定および使用できるということも意図される。たとえば、当業者ならば、常法を用いて細胞系の培地から得たサンプルに容易に適用できるＭＭＰ７に関するアッセイを確立することができるであろう。このアッセイを用いて細胞系をスクリーニングし、ＭＭＰ７を発現するものを見つけ出すことができる。これらの細胞系は神経起原のものであってもよく、たとえば９６ウェルプレートで培養する。細胞系におけるＭＭＰ７の調節が背根神経節（ＤＲＧ）における発現に密接に関わっているほど、その細胞系におけるＭＭＰ７発現の小分子改変因子がインビボにおけるＤＧＲ中のＭＭＰ７もまた改変するという可能性が高くなる。一次組織ＤＲＧ外植片および細胞系に対していくつか知られている遺伝子発現の改変因子、たとえばデキサメタゾン、ホルボールエステル、熱ショックの作用を比較すれば、使用に最も適した細胞系が選択できる。その後のスクリーニングとしては、単に、各ウェルに種々の化合物を加えて所定の時間細胞を培養した後、ＭＭＰ７の活性／ｍＲＮＡレベルをアッセイすることからなる。
【００７６】
上記のアッセイにおいてＭＭＰ７の検出を容易にするため、ルシフェラーゼまたは他の市販の蛍光タンパク質を適当なマーカータンパク質としてＭＭＰ７のプロモーターに遺伝子融合させることができる。ＭＭＰ７のＡＴＧの上流にある配列、すなわちＭＭＰ７のプロモーターは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２８６４からの配列を用い、ＮＣＢＩゲノム配列に対してＢＬＡＳＴを行うことで、ゲノム配列データから同定することができる。これにより、全プロモーターを含むと考えられるＭＭＰ７のＡＴＧの約１〜１０ｋｂ上流が示される。ヒトゲノムＤＮＡから１ｋｂ以上の断片を増幅するための２対のネスティッドＰＣＲプライマーは容易に設計および試験することができる。このプロモーター断片はヒト細胞での発現用に設計された、プロモーターを欠く任意のリポーター遺伝子ベクター（たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのプロモーターを欠く蛍光増強タンパク質ベクターｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−１、またはｐＥＹＦＰ）に容易に挿入することができる。その後のスクリーニングとしては、各ウェルに種々の化合物を加えて所定の時間細胞を培養した後、リポーター遺伝子活性のアッセイすることからなる。次に、有望な化合物を従前に記載されているインビボ慢性痛モデルを用いてインビボにおいてＭＭＰ７活性および／またはｍＲＮＡレベルに対する作用に関してアッセイする。適当な培養時間、培養条件、リポーターアッセイ、およびインビボにおいてＭＭＰ７の転写を阻害するのに有用な小分子またはその他の天然産物を同定するために使用できるその他の方法など、さらなる方法の詳細は当業者に公知である。
【００７７】
さらに、ＭＭＰ７のｃＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いて、ＤＲＧまたは神経系のその他の組織に由来するニューロンのＭＭＰ７により改変される他のタンパク質、たとえば受容体を同定することもできる。このようにして同定されたタンパク質は慢性痛を処置するための薬物スクリーニングに使用できる。ＭＭＰ７の下流にあるこれらの遺伝子を同定するため、たとえば慢性痛モデルの動物を特定のＭＭＰ阻害剤で処置し、動物を屠殺し、ＤＲＧを摘出し、これらの細胞から全ＲＮＡを単離し、標準的なマイクロアレイアッセイ技術を用いて対照動物（薬物を投与しなかった動物）に比べてメッセージレベルが変化したかどうかを同定するための常法を用いることができると考えられる。
【００７８】
慢性痛の状態においてＭＭＰ７がアップレギュレートされるという知見に基づき、インビトロまたはインビボアッセイの常法を用い、ＭＭＰ７の過剰発現をもたらす可能性のある遺伝子を同定することができる。このようにして同定された遺伝子によりコードされるこれら関連のある調節タンパク質用いて、慢性痛の処置のために可能性のある治療薬となり得る薬物をスクリーニングすることができる。たとえば、ＭＭＰ７のプロモーター領域をリポーター遺伝子の上流に置き、その構築物を好適なニューロン細胞（たとえば、神経芽細胞系）にトランスフェクトし、常法を用いてリポーター遺伝子の発現の検出により、ＭＭＰ７プロモーターを活性化させる上流遺伝子に関して細胞をアッセイするという通常のリポーター遺伝子アッセイを用いることができる。
【００７９】
本明細書では、関連の調節タンパク質またはＭＭＰ７により改変されたタンパク質の遺伝子の機能および／または発現を、たとえばこれらのタンパク質に対する抗体を設計し、かつ／または常法にしたがってこのようなタンパク質の遺伝子に対して向けられた阻害的アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーを設計することにより慢性痛を処置する方法として阻害することができるということを意図される。また、慢性痛の処置のための、このような阻害物質を含む医薬組成物も意図される。
【００８０】
慢性神経痛をはじめとする慢性痛を処置および／または改善するのに有用な、本明細書に開示される医薬組成物は、このような疾患の症状を処置または改善するために治療上有効な用量で患者に投与される。治療上有効な用量とは、たとえばＭｃＧｉｌｌの痛みのスコア（Ｍｅｌｚａｃｋ，  Ｒ．  Ｐａｉｎ  （１９７５）  Ｓｅｐｔ．  １（３）：２７７−２９９）に基づく慢性痛の痛みの症状の改善をもたらすに十分な化合物の量をさす。
【００８１】
本発明の阻害／刺激物質は医薬組成物として投与することができる。本発明にしたがって用いられるこのような医薬組成物、生理学上許容される１以上の担体または賦形剤を用いて常法にて製剤化することができる。
【００８２】
よって、これらの化合物およびそれらの生理学上許容される塩および溶媒和物は吸入または通気（口腔または鼻腔を経る）、または局所、経口、口内、非経腸もしくは経直腸投与による投与向けに製剤化してもよい。
【００８３】
経口投与としては、医薬組成物は、通常の手段により、たとえば、結合剤（たとえば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（たとえば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（たとえば、ポテトスターチ、またはグリコール酸ナトリウムデンプン）；湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬上許容される賦形剤を用いて製造される錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は当技術分野で周知の方法により被覆してもよい。経口投与用の液体製剤は、たとえば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとってもよく、あるいは使用前に水またはその他の好適なビヒクルで構成する乾燥製剤として提供してもよい。このような液体製剤は通常の手段により、沈殿防止剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアラビアガム）；非水性ビヒクル（たとえば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または清溜植物油）；および保存剤（たとえば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの医薬上許容される添加剤を用いて製造すればよい。また、これらの製剤は要すればバッファー塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含んでもよい。
【００８４】
経口投与用製剤は有効化合物の徐放性を得るために適宜製剤化してもよい。
【００８５】
口内投与としては、組成物は常法にて製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【００８６】
吸入による投与としては、本発明にしたがって用いられる組成物は、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適なガスなどの好適な噴射剤を用いて、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレー剤形で送達するのが便宜である。加圧エアゾールの場合、用量単位は計量された量を送達するためにバルブを設けることにより投与すればよい。たとえば吸入器または通気器で用いられるゼラチンのカプセルまたはカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するよう製剤化すればよい。
【００８７】
これらの化合物は注射、たとえばボーラス注射または点滴により非経腸投与用に製剤化してもよい。注射用製剤は、組成物を伴ってたとえばアンプルまたは複数用量容器中の単位投与形として提供してもよい。これらの組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤を含んでもよい。あるいは、有効成分は使用前に好適なビヒクル、たとえば滅菌パイロジェンフリー水で構成する粉末の形態であってもよい。
【００８８】
これらの組成物はまた、たとえばココアバターまたはその他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含めて、坐剤または滞留浣腸などの直腸組成物として製剤化してもよい。
【００８９】
これまでに記載した製剤の他、これらの化合物はデポー製剤として製剤化してもよい。このような持続型製剤は埋植により（たとえば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射により投与すればよい。よって、たとえば、これらの組成物は好適な高分子材料または疎水性材料（たとえば、許容されるオイル中のエマルション）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶誘導体、たとえば難溶塩として製剤化してもよい。
【００９０】
これらの組成物は、所望により、有効成分を含有する１以上の単位投与形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中に提供してもよい。パックは、たとえばブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルからなってよい。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与に関する使用説明書を添付してもよい。
【００９１】
本発明で用いるのに好適な医薬組成物としては、有効成分が意図した目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。有効な用量の決定は十分当業者の能力の範囲内である。
【００９２】
いずれの化合物についても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイ（たとえば腫瘍細胞の）かまたは動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタ）において評価することができる。また、動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を動物モデルで製剤化することができる。次に、このような情報を用いてヒトにおける有用な量および投与経路を決定することができる。
【００９３】
治療上有効な用量とは、慢性痛の病理作用を処置および／または改善するのに有用な有効成分、たとえば化合物Ａ、ＭＭＰ７の遺伝子発現を阻害するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーおよび二本鎖ＲＮＡ、ＭＭＰ７または関連の調節タンパク質に対する抗体もしくはそのフラグメントの量をさす。治療効果および毒性は細胞培養系または実験動物において標準的な薬学手順、たとえばＥＤ５０（その集団の５０％に治療上有効な用量）およびＬＤ５０（その集団の５０％に致死的な用量）によって求めることができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒト用の用量範囲の処方に用いられる。このような組成物中に含まれる用量は毒性がほとんど、またはまったくなく、ＥＤ５０値を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。用量は用いる投与形、患者の重篤度、および投与経路に応じてこの範囲内で可変である。
【００９４】
正確な用量は処置を要する対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与法は、十分なレベルの有効部分が提供されるよう、または望ましい作用を維持するように調節する。考慮すればよい因子としては、病態の重篤度、対象の全身の健康状態、対象の齢、体重および性、食事、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する許容度／応答が挙げられる。持続型医薬組成物は特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日おき、毎週、または２週間に１回に投与すればよい。
【００９５】
通常の用量は、投与経路にもよるが、０．１〜１００，０００μｇ、総用量約１ｇまでで可変である。特定の投与および送達方法に関する指針は文献に示されており、当業者であれば一般に利用できる。当業者ならば、ヌクレオチドについてはタンパク質またはそれらの阻害剤とは異なる処方を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、条件、場合などに特異的なものとなる。タンパク質の経口投与に好適な医薬製剤は、米国特許第５，００８，１１４号；同第５，５０５，９６２号；同第５，６４１，５１５号；同第５，６８１，８１１号；同第５，７００，４８６号；同第５，７６６，６３３号；同第５，７９２，４５１号；同第５，８５３，７４８号；同第５，９７２，３８７号；同第５，９７６，５６９号および同第６，０５１，５６１号に記載されている。
【００９６】
以下、実施例により本明細書をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１
慢性痛の動物モデルにおけるＭＭＰ７の発現プロフィール
慢性神経痛のインビボ動物モデルには以下の内容が含まれる。
末梢神経損傷のいくつかの形態を含む慢性神経痛の２つの動物モデルが使用できる。Ｓｅｌｔｚｅｒモデル（Ｓｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐａｉｎ  ４３：  ２０５−２１８）では、ラットを麻酔し、片方の大腿（通常は左）の正中を上に向かって小さく切開して座骨神経を露出させる。この神経を、二頭筋後方に半腱様筋神経が総座骨神経に分岐する点の少し遠位の転子付近の部位の周囲の結合組織を丁寧に除去する。７−０シルク縫合糸を３／８カーブのリバースカッティングミニニードルで神経の中へ通し、背側１／３〜神経の厚みの１／２が結紮内に保持されるようにしっかり結紮する。筋肉と皮膚を縫合糸とクリップで閉じ、傷口に抗生物質粉末を付けた。シャム動物では、座骨神経を露出させるが、結紮せずに、非シャム動物と同様に傷口を閉じる。
【００９８】
慢性痙攣傷害（ＣＣＩ）モデル（Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｘｉｅ，  Ｙ．Ｋ．  Ｐａｉｎ  （１９８８）  ３３：８７−１０７）では、ラットを麻酔し、片方の大腿（通常は左）の中央を上に向かって小さく切開して座骨神経を露出させる。神経は周囲の結合組織を除去し、４／０クロムガットを４箇所、各およそ１ｍｍ間隔で、結紮が神経の表面をわずかに締め付けるように神経をゆるく縛る結紮を作る。上記のように縫合糸とクリップで傷口を閉じる。シャム動物では、座骨神経を露出させるが、結紮せずに、非シャム動物と同様に傷口を閉じる。
【００９９】
ＳｅｌｔｚｅｒのモデルおよびＣＣＩモデルとは対照的に、Ｃｈｕｎｇのモデルは脊椎神経の結紮を含む（Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｏ．  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｊ．Ｍ．  Ｐａｉｎ  （１９９２）：  ５０：  ３５５−３６３）。このモデルでは、ラットを麻酔し、腹臥位に置き、脊椎の左をＬ４−Ｓ２レベルで切開する。座骨神経は分岐してＬ４、Ｌ５およびＬ６の脊椎神経を形成しているので、脊椎側部の筋肉を深く切開し、Ｌ４−Ｓ２レベルで脊椎突起から筋肉を分離すると、座骨神経の部分が現れる。Ｌ６横突起を骨鉗子で慎重に除去すると、これらの脊椎神経が見える。Ｌ５脊椎神経を単離し、７−０シルク縫合糸で強く結紮する。一重筋肉縫合糸（６−０シルク）と１個または２個の皮膚縫合クリップで傷口を閉じ、抗生物質粉末を付ける。シャム動物では、Ｌ５神経を上記のように露出させるが、結紮せずに、上記のように傷口を閉じる。
【０１００】
軸索切断術モデル：
軸索切断術モデルは、座骨神経を完全に切断して、結紮することを含む。神経の末端は神経腫を形成するが、このモデルでは神経は再生されず、脚は永久的に麻痺するので行動相関はない（Ｋｉｎｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｖａｌｌｉｎ，  Ｐａｉｎ  ３８，  ３２１−３２，  １９８９）。
【０１０１】
高度座骨神経損傷モデル：
このモデルでは、座骨神経を腸骨湾曲領域で穿刺する。神経の表だった損傷はないが、局部的な腫脹が腸骨湾曲物の下へ来るにつれ、神経の圧迫を増大させる。このモデルは臨床下でしばしば見られる症状に類似している。
【０１０２】
慢性炎症痛モデル：
フロイントの完全アジュバントによって誘導される機械的痛覚過敏症は慢性炎症痛のモデルとして用いることができる（Ｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．    Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｅｈａｖ．  （１９８８）  ３１  ：４４５−４５１）。このモデルでは、典型的には雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙまたはＷｉｓｔａｒラット（２００〜２５０ｇ）の片方の後足にフロイントの完全アジュバント２５μｌを足底内注射した。この後足に炎症が起こる。一般に、効力を評価するため、炎症誘発から２４時間後、機械的痛覚過敏症が十分確立されたと思われるときに薬物を投与する。
【０１０３】
挙動指数
全ての慢性痛モデルで、（炎症性および神経性）機械的痛覚過敏症を、Ａｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ  （Ｕｇｏ−Ｂａｉｌｅ，  Ｍｉｌａｎ）を用いて加圧刺激の上昇に対する両後足の払いのけ閾値を測定することで評価する。機械的異痛症は、両後足の足底表面にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒによって与えた無害な機械的刺激に対する払いのけ閾値を測定することで評価する。熱性痛覚過敏症は、各後足の下側に与えた無毒な熱刺激に対する払いのけ閾値を測定することで評価する。全てのモデルで機械的痛覚過敏症および異痛症および熱性痛覚過敏症が外科術後１〜３日以内に発症し、少なくとも５０日持続する。本明細書に記載のアッセイでは、痛覚過敏症の発症に対する作用を評価するため外科術前と外科術後、特に外科術の約１４日後に薬物を適用し、確立されている痛覚過敏症を逆転させるそれらの能力を調べればよい。
【０１０４】
痛覚過敏症の逆転％は以下にように算出される：
逆転％＝（投与後閾値−投与前閾値）／（ナイーブ閾値−投与前閾値）×１００
本明細書に開示される実施例では、上記の痛みのモデルにはＷｉｓｔｅｒラット（雄）を用いる。ラットの体重は外科術時およそ１２０〜１４０ｇであった。外科術は全て、エンフルラン／Ｏ２吸入麻酔下で行う。全ての場合、手術後傷を閉じ、動物を覚醒させた。用いた全ての痛みのモデルでは、擬似手術を行った動物以外は全て数日後に、顕著な機械的および熱性の痛覚過敏症および異痛症を発症し、痛み閾値の低下と接触、熱刺激の圧力に対する後足の反射応答の上昇が見られる。外科術後、動物はまた外科術を施された足に特徴的な変化を示す。大多数の動物では外科術を施された後足の指が一緒に曲がり、足が若干片側にねじれ、中には足指が下へ丸まってしまったラットもあった。結紮したラットの歩行は様々であるが、跛行は全般的なものではなかった。ケージの床面から外科術を受けた後足を浮かせているラット、また、捕まえた時に通常見られないような後脚の剛直な引き延ばしを示すラットもいた。これらのラットは接触に極めて敏感であり、鳴き声を上げる傾向がある。その他、ラットの全般の健康状態および症状は良好であった。
【０１０５】
慢性神経痛モデル動物モデル（Ｓｅｌｚｅｒ，  ＣＣＩおよびＣｈｕｎｇ）下にあるラットから採取したＤＲＧからのＲＮＡの抽出：
ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雄）は上記で論じた神経痛モデル下にある。神経損傷と同側のＬ４およびＬ５  ＤＲＧを、外科術後１４日、２１日、２８日および５０日目に標準的な方法にしたがってこれらのラットから取り出す。次に、酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  （１９８７）  １６２：１５６−１５９；  Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １５：  ５３２−５３７  （１９９３））にしたがい、分離したＤＲＧ組織から全ＲＮＡサンプルを調製する。収量はＤＲＧ当たり全ＲＮＡ約１μｇである。
【０１０６】
逆転写（プライマー：Ｔ７ｐｒＦＢ  ５’−ａａａｃｇａｃｇｇｃａｃｔｔｃｇａａａｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃｃ．ｔ３０−３’）（配列番号１）および全ＲＮＡサンプルからのビオチン標識プローブの調製を常法にしたがって行う（たとえば、Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：１６７５−８０  （１９９６）；  Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ  Ｍ，  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＪＡ．．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７：１１３４−６  （１９９９））参照）。標識ビオチンＲＮＡ  １５〜３５μｇからおよそ５μｇの全ＲＮＡが得られる。各標識ＲＮＡを標準的な方法を用い、２つのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｒａｔ  Ｕ３４Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）にハイブリダイズさせる。次に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウエアを用いて画像解析を行い、ＲＮＡ発現レベルの測定値としてノーマライズされた種々の平均値を得る（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）。テキストファイルとしてデータを転送した後、データを解析する。
【０１０７】
表１はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＲＮＡプロファイリング実験から任意の単位で測定したＭＭＰ７の相対的ｍＲＮＡレベルをまとめたものである（括弧内に標準偏差を示す。Ｎ．Ａ．：ＲＮＡサンプルが得られず）。データは、ＭＭＰ７メッセンジャーＲＮＡがＳｅｌｔｚｅｒのモデルでは２１日目と５０日目に、ＣＣＩモデルでは１４日目と２１日目に、ＣｈｕｎｇのモデルのＬ５  ＤＲＧでは２８日目と５０日目に、擬似手術の同等のものに比べてアップレギュレートされていることを示す。これらの時点は、神経性痛覚過敏症が十分確立され、長く持続している状態を示している。
【表１】
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【０１０８】
観察されたＭＭＰ７のアップレギュレーションを確認するため、Ｃｈｕｎｇのモデルの２８  日目と５０日目から選択したＲＮＡサンプルについて定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）実験を行った。ラットＭＭＰ７配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２８６４）から以下のオリゴヌクレオチドを誘導した後、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，  ＴＸ）により合成を行った。
【表２】
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ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）製のＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ｐａｒｔ  Ｎｏ．  Ｎ８０８−０２３４）を製造業者のプロトコールにしたがって用い、全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を行った。各１００μＬの反応液には、２μｇの全ＲＮＡ、１ＸＴａｑＭａｎＲＴバッファー、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各５００μＭのｄＮＴＰ、２．５μＭのランダムヘキサマー、０．４Ｕ／μＬのＲＮアーゼ阻害剤、および１．２５Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素を含んだ。反応液は２５℃で１０分、４８℃で４５分、次いで７５℃で５分インキュベートする。
【０１０９】
定量的ＰＣＲをＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）によって示唆されている標準的なプロトコールにしたがって行う。ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてインキュベーションおよび検出を行い、Ｃｈｕｎｇのモデルからの６サンプルのＭＭＰ７の相対的発現レベルを表２にまとめる。
【表３】
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【０１１０】
実施例２
Ｓｅｌｔｚｅｒの慢性痛モデルにおける化合物Ａの活性
上記のようなＳｅｌｔｚｅｒのラット神経痛モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９０）において機械的痛覚過敏症および胃痛症に対する化合物Ａの作用を検討する。このモデルでは痛覚過敏症および異痛症は術後約１日で同側（結紮）の後足に誘導され、数週間持続する。機械的痛覚過敏症はＡｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ  （Ｕｇｏ−Ｂａｉｌｅ，  Ｍｉｌａｎ）を用いて加圧刺激の上昇に対する両後足の払いのけ閾値を測定することで評価する。機械的異痛症は、両後足の足底表面にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒによって与えた無害な機械的刺激に対する払いのけ閾値を測定することで評価する。
【０１１１】
実験プロトコール：機械的痛覚過敏症の発症に対する化合物Ａの作用は、化合物またはビヒクル（２％クレモホール／水）を手術当日からはじめて７日間毎日２回経口投与することにより試験する。外科術の前の同側（結紮）と対側（非結紮）の足の払いのけ閾値は約１００ｇである。
【０１１２】
結果：
外科術後当日のビヒクル処置動物の同側払いのけ閾値は約６０ｇまで低下し、実験過程はこのレベルで維持され、機械的痛覚過敏症を示す（表３）。これに対し、化合物Ａで処置した動物の払いのけ閾値は外科術後さらに低い程度まで低下し、化合物を繰り返し投与した後は８０〜９０ｇまで増加した。化合物の投与の収量から３日後、薬物処置した動物の同側の払いのけ閾値はビヒクル処置した動物よりも高く維持されていた。全ての動物の対側の払いのけ閾値は外科術後も、あるいはビヒクルまたは化合物の投与後も実験過程を通じて有意な変化はない。よって、これらのデータはＭＭＰ７阻害剤が神経痛モデルにおいて機械的痛覚過敏症の発症を防ぎ、長期の作用期間を有することを示す。
【表４】
2005526820.tif 000010
【０１１３】
化合物Ａは外科術当日からはじめて７日間毎日２回経口投与する。データは各群６個体からの同側の足の払いのけ閾値を示している。＊はビヒクル群（ＡＮＯＶＡ＋Ｔｕｋｅｙｓ  ＨＳＤ試験）とは有意に異なっていることを示す。
【０１１４】
化合物Ａは、また、術中投与後の痛覚過敏症の発症にも影響を及ぼす。よって、手術の１時間前の化合物Ａの経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ）および術後５時間目での再度の経口投与は痛覚過敏症の程度の有意な低下をもたらし、これはビヒクル処置した動物に比べてより高い同側の足の払いのけ閾値により示される（表４）。手術の１時間前に化合物Ａを１回投与したところ、術後１日目だけに痛覚過敏症の有意な阻害がもたらされた。化合物Ａの２回の投与の作用は約７日間持続したが、この時までに痛覚過敏症の程度はビヒクル処置した動物で見られるものと同等になる。よって、これらのデータは、ＭＭＰ７阻害剤が術後の痛みの処置に有用であり得ることを示す。
【表５】
2005526820.tif 000011
【０１１５】
全ての動物に手術の１時間前（ｐｒｅ）と術後５時間後（ｐｏｓｔ）にビヒクルまたは化合物を投与した。データは各群６個体からの同側の足の払いのけ閾値を示している。＊はビヒクル群（ＡＮＯＶＡ＋Ｔｕｋｅｙｓ  ＨＳＤ試験）とは有意に異なっていることを示す。
【０１１６】
ＭＭＰ７の阻害はまた、確立された痛覚過敏症も軽減し得る。結紮後７日目、同側の足の払いのけ閾値は対側の読み取り値である約１００ｇに比べて約６５ｇまで低下し、機械的痛覚過敏症を示す。次に、化合物Ａ（３および３０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（２０％クレモホール／水）を１０日間毎日２回経口投与する。薬物処置４日後、ビヒクル処置した動物と比べ、同側の足の払いのけ閾値が有意に上昇する（表５）。この上昇は１０日の処置の残りの期間、より高用量での化合物投与を中止した後２週間まで続く。これらのデータは、ＭＭＰ７阻害剤が既存の神経痛の徴候の長期の逆転をもたらし得ることを示す。
【表６】
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【０１１７】
化合物Ａを毎日２回投与する。データは各群６個体からの同側の足の払いのけ閾値を示している。＊はビヒクル群（ＡＮＯＶＡ＋Ｔｕｋｅｙｓ  ＨＳＤ試験）とは有意に異なっていることを示す。
【０１１８】
実施例３
ＭＭＰ７阻害剤の同定のための９６ウェル蛍光アッセイ
ＭＭＰ７の阻害は蛍光基質（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｌｅｕ−［Ｎ３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノ−プロピオニル］−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｒｇ−ＮＨ２  （ＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ（Ｄｐａ）ＡＲ）（Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｇ．Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．  ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  ２９６，  ２６３−２６６  （１９９２））を用いて測定される。０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中の組換えヒトＭＭＰ７（２．３４ｎＭ）（最終量８０μｌ）を１０μｌの試験化合物（５μＭ）とともに２４℃で３０分間インキュベートする。プレインキュベーション期間の後、１０μｌのＭＯＣＡｃ−ＰＬＧＬ（Ｄｐａ）ＡＲ（２μＭ），  ｐＨ７．５を各ウェルに加える。触媒作用を２４℃で１０分間継続させる。このインキュベーション期間の後、１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム，  ｐＨ４．０の添加により反応を停止させる。各ウェルの蛍光を励起波長３２８ｎｍ、発光３２８ｎｍを用いて記録し、対照と比較して阻害％を求める。有効化合物を、酵素機能の＞５０％阻害を誘発するものとして同定する。
【０１１９】
実施例４
ＭＭＰ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成：
ＭＭＰ７の発現を含む遺伝子発現を阻害するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は常法にしたがって作製することができる。たとえば、インビトロにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯは両末端のヌクレオチドがＭＯＥ（メトキシエトキシ）基で修飾された、完全または部分的ホスホロチオエート化ホスホジエステル１８マーであり得る。たとえば、インビボにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯは両末端をＭＯＥ（メトキシエトキシ）基で修飾されたヌクレオチドを伴う、部分的ホスホロチオエート化または完全ホスホジエステル１８マーであり得る。これらはホスホルアミダイト化学法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、常法にしたがい、エレクトロスプレー質量分析法およびキャピラリー電気泳動法により同定することができる。各々３８〜７２％の間のＧＣ含量を有するＡＳＯを選択し、ＭＭＰ７のコード領域の一部に相補的なものを合成すればよい。誤対合を制御するオリゴヌクレオチドとしては、適合オリゴヌクレオチドに近い塩基組成を維持すればよい。さらに、たとえば一方はラットＧＡＰＤＨコード領域で、もう一方はランダム合成ＡＳＯといったように、２つの制御ＡＳＯを選択してもよい。抗ラットＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドの形式は抗ＭＭＰ７オリゴヌクレオチドの場合と同様であってよく、合成オリゴヌクレオチドは中央部にホスホロチオエートまたはホスホロジエステルＤＮＡ残基を含む配列の両末端にＭＯＥリボヌクレオチド修飾を持ち得る。
【０１２０】
ＭＭＰ７  ＡＳＯのインビトロセレクション：
その後の分析（たとえば、インビボ標的バリデーション）に最も有効なＡＳＯを同定するため、当業者に公知の方法を用い、インビトロのＡＳＯ候補コレクションから最適なＡＳＯを選択することができる。このようなＡＳＯ候補は誤対合したＡＳＯ（ＭＳＯ）（すなわち、保存的不活性化突然変異を有すること以外はＡＳＯと同じ）、ビヒクル、および／または非処置対照と比較試験を行うことができる。最適な候補ＡＳＯ配列がアンチセンスの標的として同定されれば、次に、インビボ適用により適し、同じ最適な標的配列に基づく化学誘導体および形式を合成し、続いてインビボ投与することができる。
【０１２１】
トランスフェクションプロトコール：
ＡＳＯのトランスフェクションは、ＭＭＰ７を内因的に過剰発現する細胞系、または常法にしたがいＭＭＰ７を過剰発現するよう操作された細胞を用い、当業者に公知の方法にしたがって（たとえば、リポフェクチン（商標）を使用）行えばよい。培養物をｍＲＮＡ採取またはタンパク質採取、および電気生理学のため、当業者に公知の方法にしたがってインキュベーションすればよい。
【０１２２】
リアルタイム定量的ＰＣＲ  ｍＲＮＡ分析：
リアルタイム定量的ＰＣＲ  ｍＲＮＡ分析は当技術分野で標準的な方法にしたがって行ってよい。たとえば、ＲＮイージー９６キット（Ｑｉａｇｅｎ，  ＧｍＢＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者のプロトコールにしたがって用いて全ＲＮＡを単離してもよい。このＲＮＡサンプルをそれぞれ１ｎｇ／Ｌに希釈する。次に、各サンプルのＲＮＡ  ５ｎｇを遺伝子特異的検出プライマー（当業者ならば容易に決定できる）、また、リアルタイム定量的ＰＣＲ反応キットＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ（商標）  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）の適当な試薬と混合し、製造業者のプロトコールにしたがって行う。適当な配列を有するＭＭＰ７プライマーはＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から購入すればよい。比較のための対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを選択できる。同じこれらのＲＮＡサンプルをＴａｑＭａｎ（登録商標）齧歯類ＧＡＰＤＨ対照試薬キット（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のラットＧＡＰＤＨプライマーとともに実施してもよい。配列特異的な蛍光発光シグナルは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  （ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて検出することができる。これらのサンプルとともに、純粋な鋳型ｍＲＮＡの希釈物の標品を試験して、全ＲＮＡの挿入量についての絶対濃度を得てもよい。
【０１２３】
インビトロ  ＭＭＰ７  ＲＮＡ分析：用量応答と誤対合：
ＭＭＰ７特異的ＡＳＯを、元の対合ＡＳＯと比較した場合にそれぞれ突然変異を有する誤対合対照とともに合成してもよい。要するに、たとえば、３’および５’末端において２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）基で修飾された５個のヌクレオチドを有するホスホロチオエート化１８マーをホスホルアミダイト化学法（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ  ａｎｄ  Ｎａｔｔ，  Ｆ．  ＥＰ  ０９９２５０６）を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、エレクトロスプレー質量分析法およびキャピラリーゲル電気泳動法により同定することができる。次に、インビトロセレクションを上記のようして行えばよい。
【０１２４】
ＭＭＰ７  ｍＲＮＡレベルを最もよく阻害するＡＳＯは、相対的に高いレベルの内在ＭＭＰ７  ｍＲＮＡを発現する細胞を用いるか、またはＭＭＰ７を過剰発現させる常法を用いて操作した細胞を用いて行われるインビトロアッセイにおけるリアルタイム定量的ＰＣＲにより判定することができ、次に再びこれらの細胞を用いた用量応答実験において誤対合対照に対して試験することができる。
【０１２５】
ＡＳＯまたはＭＳＯの作用をインビボで評価するためには、たとえば、ラット（たとえば、Ｗｉｓｔａｒ）の腰部または胸部脊髄領域に、常法にしたがってミニポンプ送達系に接続したカテーテルを髄腔内送管すればよい。次に、所望の濃度のアンチセンス、ミスセンスオリゴまたはビヒクルを最大７日間送達し、脊髄および背根神経節内の細胞体にオリゴまたはビヒクルを取り込ませることができる。本明細書に記載の痛みのモデルによれば、神経傷害は送管前か送管後のいずれかに起こり得る。機械的痛覚過敏症、異痛症などは、痛覚過敏症の逆転におけるＭＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を評価するための常法にしたがって測定すればよい。
【０１２６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび誤対合オリゴはラットに、座骨神経結紮の２４時間前または１４日後（または炎症痛モデルを用いる場合は、後足にフロイントの完全アジュバント２５μｌを注射する２４時間前）に挿入した留置カニューレから髄腔内投与すればよい。ラットを麻酔し、正中のすぐ側方で、腹側腸骨棘の約１０ｍｍ尾側の背の皮膚を切開する。滅菌カテーテル（ポリエチレンＰＥ１０管）を、ガイドカニューレ（２０ゲージニードル）を通じて挿入し、髄腔内空間内を頭蓋側へ３ｃｍほぼＬ１レベルまで進める。次にこのカテーテルを、ＭＭＰ７  ＡＳＯ、誤対合オリゴまたは生理食塩水（７日間）送達するＡｌｚｅｔミニオスモティックポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）と接続し、これを左または右側腹部に皮下挿入する。傷口は創傷クリップで閉じ、抗生物質粉末をつける。ＤＲＧ細胞体へのＡＳＯの送達はまず蛍光標識ＡＳＯを用いて確認し、その後の全ての実験では非標識型のものを用いればよい。
【０１２７】
実施例５
Ｓｅｌｔｚｅｒの慢性痛モデルにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯの活性
Ｓｅｌｔｚｅｒの慢性痛モデルにおけるＭＭＰ７に対するＡＳＯの作用は上記実施例２に開示した実験プロトコールにしたがって評価すればよい。ラットへのＡＳＯのインビボ投与は上記実施例４で示したように行えばよい。
【国際調査報告】
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