(57)【要約】1つの態様において、本発明は、細胞におけるEdg-1受容体介在生物活性をモジュレーションする方法を提供する。Edg-1受容体を発現する細胞を、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションするのに十分なEdg-1受容体モジュレーターと接触させる。もう1つの態様において、本発明は、被験者におけるEdg-1受容体介在生物活性をモジュレーションする方法を提供する。治療に有効な量のEdg-1受容体モジュレーターを被験者に投与する。
2005533852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Edg-1受容体を発現する細胞を、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションするのに十分な量のEdg-1受容体モジュレーターと接触させることを含んでなり、該モジュレーターがリン脂質ではないことを特徴とする、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションする方法。
【請求項２】
治療に有効な量のEdg-1受容体モジュレーターを被験者に投与することを含んでなり、該モジュレーターがリン脂質ではないことを特徴とする、該被験者におけるEdg-1受容体介在生物活性をモジュレーションする方法。
【請求項３】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記モジュレーターがアンタゴニストである、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
前記モジュレーターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
前記モジュレーターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
前記モジュレーターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
前記インヒビターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
前記インヒビターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項１０】
前記インヒビターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項１１】
前記インヒビターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項１２】
前記インヒビターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す、請求項1または2記載の方法。
【請求項１３】
前記生物活性が細胞増殖である、請求項1または2記載の方法。
【請求項１４】
前記インヒビターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記モジュレーターが、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
前記モジュレーターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
前記モジュレーターが、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞増殖が卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、大腸癌または前立腺癌をもたらす、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞増殖がS1Pにより刺激される、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
前記生物活性が、カルシウム動員、VEGF合成、IL-8合成、血小板の活性化、細胞遊走、ホスホイノシチドの加水分解、cAMP形成の阻害、脂肪酸のレベルの増加、アクチン重合、アポトーシス、血管新生、創傷治癒の阻害、炎症、内因性タンパク質増殖因子の発現、癌の侵襲、血管収縮またはアテローム発生である、請求項1または2記載の方法。
【請求項２１】
前記モジュレーターが約10μM〜約1fMの結合定数でEdg-1受容体に結合する、請求項1または2記載の方法。
【請求項２２】
前記モジュレーターが少なくとも約1μMの結合定数でEdg-1受容体に結合する、請求項1または2記載の方法。
【請求項２３】
前記モジュレーターが少なくとも約10nMの結合定数でEdg-1受容体に結合する、請求項1または2記載の方法。
【請求項２４】
前記モジュレーターが核酸、ペプチドまたは炭水化物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項２５】
前記モジュレーターが750ダルトン未満の分子量の有機分子である、請求項1または2記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、HTC肝癌細胞、卵巣細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン性細胞、癌細胞、クロム親和性細胞腫細胞、筋芽細胞、血小板細胞または繊維肉腫細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、OV202ヒト卵巣細胞、HTCラット肝癌細胞、CAOV-3ヒト卵巣癌細胞、MDA-MB-453乳癌細胞、MDA-MB-231乳癌細胞、HUVEC細胞、A431ヒト類上皮癌細胞またはHT-1080ヒト繊維肉腫細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
前記モジュレーターが、構造式（I）：
【化１】
2005533852.tif 000027
（式中、
n = 0、1、2、3、4または5；
XはCR5またはNである；
YはCR5R5またはNR1である；
R1は、存在しないか、または水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたは置換ヘテロアルキルである；
R2、R3および各R5は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである；
各R4は、独立して、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項２９】
前記モジュレーターが、構造式（II）：
【化２】
2005533852.tif 000028
（式中、
XはOまたはSである；
R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである；
R6、R7、R8、R9およびR10はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項３０】
前記モジュレーターが、構造式（III）：
【化３】
2005533852.tif 000029
（式中、
nは1、2、3、4または5である；
mは1、2、3、4または5である；
XおよびYはそれぞれ、独立して、CまたはNである；
R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である、請求項1または2記載の方法。
【請求項３１】
被験者における癌、急性肺疾患、慢性肺疾患の急性炎症性悪化、表面上皮細胞損傷または心血管疾患の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３２】
被験者における卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、喘息、経角膜冷凍、皮膚熱傷、虚血またはアテローム性動脈硬化症の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３３】
被験者における血管収縮、自己免疫障害または血管閉塞性障害の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３４】
被験者における脳動脈内の血管収縮、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体性ネフローゼ、乾癬、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎、慢性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、片頭痛、卒中、くも膜下出血または血管痙攣の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３５】
被験者における癌、急性肺疾患、慢性肺疾患の急性炎症性悪化、表面上皮細胞損傷、心血管疾患、血管収縮、自己免疫障害または血管閉塞性障害の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３６】
被験者における癌、急性肺疾患、慢性肺疾患の急性炎症性悪化、表面上皮細胞損傷、心血管疾患、血管収縮、自己免疫障害または血管閉塞性障害の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）、または（III）の化合物と、癌、慢性肺疾患の急性炎症性悪化、表面上皮細胞損傷、心血管疾患、血管収縮、自己免疫障害または血管閉塞性障害の治療または予防に有用な1以上の薬物とを投与することを含んでなる方法。
【請求項３７】
前記モジュレーターが、
【化４】
2005533852.tif 000030
2005533852.tif 000031
よりなる群から選ばれる式の化合物である、請求項28記載の方法。
【請求項３８】
前記モジュレーターが、式
【化５】
2005533852.tif 000032
の化合物である、請求項29記載の方法。
【請求項３９】
前記モジュレーターが、式
【化６】
2005533852.tif 000033
の化合物である、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
前記生物活性が免疫応答である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫応答がS1Pにより刺激される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
被験者における障害の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）または（III）の化合物を投与することを含んでなり、構造式（I）、（II）または（III）の化合物が免疫系を刺激することを特徴とする方法。
【請求項４３】
前記被験者が遺伝性免疫不全に罹患している、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
構造式（I）、（II）または（III）の化合物をワクチンに対するアジュバントとして投与する、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
前記被験者がウイルスに感染している、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスよりなる群から選ばれる、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
被験者における免疫障害の治療または予防方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、治療に有効な量の構造式（I）、（II）または（III）の化合物を投与することを含んでなり、該免疫障害が免疫系の不適切な活性化により特徴づけられることを特徴とする方法。
【請求項４８】
構造式（I）、（II）または（III）の化合物が前記被験者の免疫系を抑制する、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
前記被験者が、全身性エリテマトーデス、リウマチ性心臓炎、多発性筋炎、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、スチーブンス・ジョンソン症候群、菌状息肉腫、皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、難治性スプルー、特発性紫斑病、溶血性貧血、赤芽球減少症、先天性低形成性貧血、骨関節症、慢性関節リウマチ、滑液嚢炎、急性痛風性関節炎、上顆炎、急性非特異性腱滑膜炎、多発性硬化症、角膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、視神経炎、サルコイドーシス、レフレル症候群、ベリリウム中毒、結核、脊椎炎、腱滑膜炎、乾癬性関節炎およびI型糖尿病よりなる群から選ばれる障害に罹患している、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
前記被験者が、移植される細胞、組織または臓器のレシピエントである、請求項48記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．発明の分野
本発明は、全般的には、Edg-1受容体が介在する生物活性をモジュレーションする方法に関する。より詳しくは、本発明は、Edg-1受容体を選択的にモジュレーション（例えば、作動または拮抗）するために使用しうる化合物および組成物を提供する。本発明は、これらの化合物の製造方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
2．発明の背景
最近の研究は、構造的機能を有するに過ぎないとこれまで考えられていた細胞膜リン脂質の複雑な生物学的役割を明らかにしている。細胞の活性化後、膜リン脂質はエイコサノイドおよびリゾリン脂質に代謝されることが可能であり、これらは細胞の機能および挙動の重要な調節因子である。リゾリン脂質は、リゾホスファチジン酸（「LPA」）、スフィンゴシン-1-リン酸（「S1P」）、リゾホスファチジルコリンおよびスフィンゴシルホスホリルコリンのような成分を含み、内皮遺伝子分化（endothelial gene differentiation）（「Edg」）受容体として公知の特定の細胞表面膜貫通Gタンパク質共役受容体を活性化しうる重要なセカンドメッセンジャーである。
【０００３】
Gタンパク質共役受容体の異なる2つのサブファミリーがLPAまたはS1Pに特異的に結合し、1以上のGタンパク質との会合により多様な細胞シグナルを伝達する。アミノ酸配列同一性に基づけば、S1P1（Edg-1）、S1P3（Edg3）、S1P2（Edg5）およびS1P5（Edg8）は1つの構造クラスターに属し、LPA1（Edg2）、LPA2（Edg4）およびLPA3（Edg7）は、もう1つの構造クラスターのメンバーである（Goetzl, E. J.およびLynch, K. R. 2000, Ann. N Y. Acad. Sci. 905:1-357）。どちらのサブファミリーのメンバーも、約351〜約400アミノ酸の範囲のサイズを有し、第1、第9または第19染色体によりコードされる。アミノ酸配列同一性によれば、S1P4（Edg6）のアミノ酸配列は、それらの2つの主要クラスターのアミノ酸配列の間に位置する（Gralerら, 1998, Genomics 53:164-169）。現在のところ、LPAにより特異的に活性化される3つのEdg受容体（LPA1またはEdg2、LPA2またはEdg4およびLPA3またはEdg 7）、およびS1Pにより特異的に活性化される5つのS1P受容体（S1P1またはEdg-1、S1P2またはEdg5、S1P3またはEdg3、S1P4またはEdg6、およびS1P5またはEdg8）が公知である。
【０００４】
Edg-1（ヒトEdg-1, GenBank登録番号AF233365）、Edg-3（ヒトEdg-3, GenBank登録番号X83864）、Edg-5（ヒトEdg-5, GenBank登録番号AF034780）、Edg-6（ヒトEdg-6, GenBank登録番号AJ000479）およびEdg-8（ヒトEdg-8, GenBank登録番号AF317676）受容体はS1Pにより活性化され、一方、LPAはEdg-2（ヒトEdg-2, GenBank登録番号U78192)、Edg-4（ヒトEdg-4, GenBank登録番号AF233092またはAF011466）およびEdg-7（ヒトEdg-7, GenBank登録番号AFI27138）受容体を活性化する。
【０００５】
Edg受容体は、細胞増殖および細胞遊走のような極めて重要な細胞イベントに介在すると考えられており、したがって、これらの受容体は魅力的な治療標的である。しかし、Edg受容体に結合する現在公知の化合物は、ほとんどすべてがリン脂質（例えば、S1PおよびLPA、S1PおよびLPAの類似体、ジオクチルグリセロールなど）である。これらのリン脂質化合物のほとんどはEdg受容体間の相違を有効に識別できず、それらの物理化学的特性は劣っており、したがって、薬剤としてのそれらの潜在的用途は限定される。したがって、Edg受容体に結合し又はそれを調節し、また、特定のEdg受容体に選択的に結合しうる、リン脂質以外の化合物が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
3．発明の概要
本発明は、S1P1またはEdg-1受容体（例えば、ヒトEdg-1, GenBank登録番号AF233365）をモジュレーションする化合物を提供する。そのような化合物は、好ましくは、Edg-1受容体に選択的に結合し又はそれをモジュレーションする。
【０００７】
1つの態様においては、本発明は、Edg-1受容体介在生物活性（Edg-1受容体が介在する生物活性）のモジュレーション方法を提供する。本発明はまた、卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌および前立腺癌；急性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群（「ARDS」）、喘息のような慢性肺疾患の急性炎症性悪化、表面上皮細胞損傷（例えば、経角膜冷凍（transcomeal freezing）または皮膚熱傷）および心血管疾患（例えば、虚血）のような疾患の治療または予防において、そのような治療または予防が必要な被験者にEdg-1モジュレーター（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を使用する方法を提供する。
【０００８】
もう1つの態様においては、本発明は、脳動脈内の血管収縮、自己免疫および関連免疫障害、例えば（以下のものに限定されるものではない）、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体性ネフローゼ、乾癬、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎、慢性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血のような障害（これらに限定されるものではない）の治療または予防において、Edg-1モジュレーター（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を使用する方法を提供する。また、Edg-1アンタゴニストは臓器移植においても使用することができる。さらにもう1つの実施形態においては、Edg-1のアゴニストおよびアンタゴニストは、血管閉塞性障害を治療するために使用することができる。例えば、Edg-1アゴニストを使用することによるEdg-1受容体の活性化は、片頭痛のような症状において有益である血管収縮の増加を招きうる。Edg-1アンタゴニストによるEdg-1の阻害は、卒中、くも膜下出血または血管痙攣（例えば、脳血管痙攣）のような症状において有益でありうる。
【０００９】
さらにもう1つの態様においては、本発明は、被験者における疾患または障害を治療または予防するためにEdg-1モジュレーター（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を使用する方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者に、免疫系を刺激するEdg-1モジュレーター（例えば、Edg-1アゴニスト）の治療に有効な量を投与することを含んでなる方法を提供する。ある実施形態においては、該被験者は感染因子に侵されている。他の実施形態においては、該被験者は免疫無防備状態である。
【００１０】
さらにもう1つの態様においては、本発明は、被験者における免疫障害を治療または予防するためにEdg-1モジュレーター（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を使用する方法であって、そのような治療または予防が必要な被験者にEdg-1モジュレーター（例えば、Edg-1アンタゴニスト）の治療に有効な量を投与することを含んでなり、該免疫障害が免疫系の不適切な活性化により特徴づけられることを特徴とする方法を提供する。該免疫障害は、限定的なものではなく、当業者に公知の免疫系の不適切な活性化により特徴づけられる任意の免疫障害でありうる。ある実施形態においては、該被験者は、移植される細胞、組織または臓器のレシピエントである。
【００１１】
さらにもう1つの態様においては、本発明は、細胞におけるEdg-1受容体介在生物活性のモジュレーション方法を提供する。Edg-1受容体を発現する細胞を、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションするのに十分な量のEdg-1受容体モジュレーターと接触させる。
【００１２】
さらにもう1つの態様においては、本発明は、被験者におけるEdg-1受容体介在生物活性のモジュレーション方法を提供する。そのような方法においては、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションするのに有効な量のEdg-1受容体モジュレーターを該被験者に投与する。
4．図面の簡単な記載
【００１３】
図1は、Edg-1受容体に対する101の選択性を示す。
【００１４】
図2は、Edg-1受容体に対する102の選択性を示す。
【００１５】
図3は、Edg-1受容体に対する103の選択性を示す。
【００１６】
図4は、ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるカルシウム応答に対するEdg-1アンタゴニスト101の効果を示す。
【００１７】
図5は、ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるカルシウム応答に対するEdg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【００１８】
図6は、ヒト臍帯静脈内皮細胞のS1P刺激マトリゲル（matrigel）侵入に対する10μM Edg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【００１９】
図7は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の侵入に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【００２０】
図8は、ヒト臍帯静脈内皮細胞によるEdg-1アゴニスト104刺激侵入に対するEdg-1アンタゴニスト101の効果を示す。
【００２１】
図9は、ヒト末梢血単核細胞（「PMBC」）の遊走に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【００２２】
図10は、ヒト臍帯静脈内皮細胞によるS1P刺激侵入に対するEdg-1アンタゴニスト101、Edg-3アンタゴニスト301および101と301との組合せの効果を示す。
【００２３】
図11は、exodus-2へのマウスCD4 T細胞走化性応答に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【００２４】
図12は、exodus-2へのマウスCD4 T細胞走化性応答のS1P調節に対するFTY720およびEdg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【００２５】
図13は、S1PへのPBMCの遊走を例示する。
【００２６】
図14は、in vitroでのリンパ球の遊走の、Edg-1による調節を例示する。
【００２７】
図15は、マウス背側エアーポーチ（air-pouches）におけるリンパ球の遊走の、Edg-1による調節を例示する。
5．表の簡単な説明
【００２８】
表1は化合物105〜113を示す。
【００２９】
表2は、Edg-1に対する化合物101、102および103の選択性を示す。
【００３０】
表3は結合アッセイを示す。
【００３１】
表4は、Edg-1に対する化合物104の選択性を示す。
6．発明の詳細な説明
6.1．定義
【００３２】
「本発明の化合物」は、一般には、S1P1またはEdg-1受容体（例えば、ヒトEdg-1, GenBank登録番号AF233365）の任意のモジュレーターを意味し、本明細書に開示する一般式に含まれる任意のEdg-1受容体モジュレーターを含み、さらに、本明細書に構造が開示されている式に含まれる任意の種を含む。本発明の化合物は、それらの化学構造および／または化学名により特定されうる。化学構造と化学名とが矛盾する場合には、化学構造が該化合物の実体を決定する。本発明の化合物は、1以上のキラル中心および／または二重結合を含有することがあり、したがって、二重結合異性体（すなわち、幾何異性体）、エナンチオマーまたはジアステレオマーのような立体異性体として存在しうる。したがって、本明細書に記載の化学構造は、例示されている化合物の可能なすべてのエナンチオマーおよび立体異性体、例えば、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何異性体として純粋な、エナンチオマーとして純粋な、またはジアステレオマーとして純粋な形態）ならびにエナンチオマー混合物および立体異性体混合物を包含する。エナンチオマー混合物および立体異性体混合物は、当業者によく知られた分離技術またはキラル合成技術を用いて、それらの成分エナンチオマーまたは立体異性体に分離することができる。本発明の化合物は、エノール形態、ケト形態およびそれらの混合物を含む（これらに限定されるものではない）いくつかの互変異性体としても存在しうる。したがって、本明細書に記載の本発明の化合物は、例示されている化学構造の可能なすべての互変異性体を包含する。本発明の化合物は、天然で通常見出される原子質量とは異なる原子質量を1以上の原子が有する同位体標識化合物をも含む。本発明の化合物中に取り込まれうる同位体の具体例には、2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18Fおよび36Clが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明の化合物の部分構造が示されている場合、括弧は該化合物の残部への該部分構造の結合点を示すと理解されるべきである。
【００３３】
「本発明の組成物」は、本発明の少なくとも1つの化合物と、該化合物と共に被験者に投与される製薬上許容されるビヒクルとを意味する。被験者に投与する場合、本発明の化合物は、単離された形態（これは、該化合物が合成有機反応混合物から分離されていることを意味する）で投与する。
【００３４】
「アルキル」は、親アルカン、アルケンまたはアルキンの単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、飽和または不飽和の、分枝状、直鎖状または環状の一価炭化水素基を意味する。典型的なアルキル基には、メチル；エチル、例えばエタニル、エテニル、エチニル；プロピル、例えばプロパン-1-イル、プロパン-2-イル、シクロプロパン-1-イル、プロパ-1-エン-1-イル、プロパ-1-エン-2-イル、プロパ-2-エン-1-イル（アリル）、シクロプロパ-1-エン-1-イル；シクロプロパ-2-エン-1-イル、プロパ-1-イン-1-イル、プロパ-2-イン-1-イルなど；ブチル、例えばブタン-1-イル、ブタン-2-イル、2-メチル-プロパン-1-イル、2-メチル-プロパン-2-イル、シクロブタン-1-イル、ブタ-1-エン-1-イル、ブタ-1-エン-2-イル、2-メチル-プロパ-1-エン-1-イル、ブタ-2-エン-1-イル、ブタ-2-エン-2-イル、ブタ-1,3-ジエン-1-イル、ブタ-1,3-ジエン-2-イル、シクロブタ-1-エン-1-イル、シクロブタ-1-エン-3-イル、シクロブタ-1,3-ジエン-1-イル、ブタ-1-イン-1-イル、ブタ-1-イン-3-イル、ブタ-3-イン-1-イルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
「アルキル」なる語は、任意の飽和度または飽和レベルを有する基、すなわち、炭素-炭素単結合のみを有する基、1以上の炭素-炭素二重結合を有する基、1以上の炭素-炭素三重結合を有する基、および炭素-炭素単結合、二重結合および三重結合の混合を有する基を含むと特に意図される。特定の飽和レベルを意図する場合には、「アルカニル」、「アルケニル」および「アルキニル」なる表現を用いる。好ましくは、アルキル基は1〜20個の炭素原子を含む。
【００３６】
「アルカニル」は、親アルカンの単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、飽和の分枝状、直鎖状または環状アルキル基を意味する。典型的なアルカニル基には、メタニル；エタニル；プロパニル、例えばプロパン-1-イル、プロパン-2-イル（イソプロピル）、シクロプロパン-1-イルなど；ブタニル、例えばブタン-1-イル、ブタン-2-イル（sec-ブチル）、2-メチル-プロパン-1-イル（イソブチル）、2-メチル-プロパン-2-イル（t-ブチル）、シクロブタン-1-イルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
「アルケニル」は、親アルケンの単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有する不飽和の分枝状、直鎖状または環状アルキル基を意味する。該基は、該二重結合に関してシスまたはトランスのコンホメーションでありうる。典型的なアルケニル基には、エテニル；プロペニル、例えばプロパ-1-エン-1-イル、プロパ-1-エン-2-イル、プロパ-2-エン-1-イル（アリル）、プロパ-2-エン-2-イル、シクロプロパ-1-エン-1-イル；シクロプロパ-2-エン-1-イル；ブテニル、例えばブタ-1-エン-1-イル、ブタ-1-エン-2-イル、2-メチル-プロパ-1-エン-1-イル、ブタ-2-エン-1-イル、ブタ-2-エン-1-イル、ブタ-2-エン-2-イル、ブタ-1,3-ジエン-1-イル、ブタ-1,3-ジエン-2-イル、シクロブタ-1-エン-1-イル、シクロブタ-1-エン-3-イル、シクロブタ-1,3-ジエン-1-イルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
「アルキニル」は、親アルキンの単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を有する不飽和の分枝状、直鎖状または環状アルキル基を意味する。典型的なアルキニル基には、エチニル；プロピニル、例えばプロパ-1-イン-1-イル、プロパ-2-イン-1-イルなど；ブチニル、例えばブタ-1-イン-1-イル、ブタ-1-イン-3-イル、ブタ-3-イン-1-イルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
「アシル」は-C(O)R基を意味し、ここで、Rは、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル（これらは本明細書中に定義されている）である。代表例には、ホルミル、アセチル、シクロヘキシルカルボニル、シクロヘキシルメチルカルボニル、ベンゾイル、ベンジルカルボニルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
「アシルアミノ」は-NR'C(O)R基を意味し、ここで、R'は、水素、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルであり、Rは、水素、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル（これらは本明細書中に定義されている）である。代表例には、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、シクロヘキシルカルボニルアミノ、シクロヘキシルメチルカルボニルアミノ、ベンゾイルアミノ、ベンジルカルボニルアミノなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
「アルキルアミノ」は-NHR基を意味し、ここで、Rはアルキルまたはシクロアルキル基（これらは本明細書中に定義されている）を表す。代表例には、メチルアミノ、エチルアミノ、1-メチルエチルアミノ、シクロヘキシルアミノなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
「アルコキシ」は-OR基を意味し、ここで、Rはアルキルまたはシクロアルキル基（これらは本明細書中に定義されている）を表す。代表例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、シクロヘキシルオキシなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
「アルコキシアミノ」は-N(H)OR基を意味し、ここで、Rはアルキルまたはシクロアルキル基（これらは本明細書中に定義されている）を表す。
【００４４】
「アルコキシカルボニル」は-C(O)-アルコキシ基を意味し、ここで、アルコキシは本明細書中に定義されているとおりである。
【００４５】
「アルキルアリールアミノ」は-NRR'基を意味し、ここで、Rはアルキルまたはシクロアルキル基を表し、R'は、本明細書中に定義されているとおりのアリールである。
【００４６】
「アルキルスルホニル」は-S(O)2R基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりのアルキルまたはシクロアルキル基である。代表例には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、ブチルスルホニルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
「アルキルスルフィニル」は-S(O)R基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりのアルキルまたはシクロアルキル基である。代表例には、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、プロピルスルフィニル、ブチルスルフィニルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
「アルキルチオ」は-SR基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりに置換されていてもよい、本明細書中に定義されているとおりのアルキルまたはシクロアルキル基である。代表例には、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
「アミノ」は-NH2基を意味する。
【００５０】
「アリール」は、親芳香環系の単一の炭素原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、一価の芳香族炭化水素基を意味する。典型的なアリール基には、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、as-インダセン、s-インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ-2,4-ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから誘導される基が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、アリール基は6〜20個の炭素原子を含む。
【００５１】
「アリールアルキル」は、炭素原子（典型的には末端またはsp3炭素原子）に結合した水素原子のうちの1つがアリール基で置換された非環状アルキル基を意味する。典型的なアリールアルキル基には、ベンジル、2-フェニルエタン-1-イル、2-フェニルエテン-1-イル、ナフチルメチル、2-ナフチルエタン-1-イル、2-ナフチルエテン-1-イル、ナフトベンジル、2-ナフトフェニルエタン-1-イルなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定のアルキル部分を意図する場合には、アリールアルカニル、アリールアルケニルおよび／またはアリールアルキニルの名称を用いる。好ましくは、アリールアルキル基は(C6-C30)アリールアルキルであり、例えば、該アリールアルキル基のアルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分は(C1-C10)であり、該アリール部分は(C6-C20)である。
【００５２】
「アリールアルキルオキシ」は-O-アリールアルキル基を意味し、ここで、アリールアルキルは本明細書中に定義されているとおりである。
【００５３】
「アリールアミノ」は-NHR基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりのアリール基を表す。
【００５４】
「アリールオキシカルボニル」は-C(O)-O-アリール基を意味し、ここで、アリールは本明細書中に定義されているとおりである。
【００５５】
「アリールスルホニル」は-S(O)2R基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりのアリールまたはヘテロアリール基である。
【００５６】
「アジド」は-N3基を意味する。
【００５７】
「カルバモイル」は-C(O)N(R)2基を意味し、ここで、各R基は、独立して、水素、アルキル、シクロアルキルまたはアリールであり、これらは本明細書中に定義されているとおりであり、本明細書中に定義されているとおりに置換されていてもよい。
【００５８】
「カルボキシ」は-C(O)OH基を意味する。
【００５９】
「カルボキシアミノ」は-N(H)C(O)OH基を意味する。
【００６０】
「シアナト」は-OCN基を意味する。
【００６１】
「シアノ」は-CN基を意味する。
【００６２】
「シクロアルキル」は飽和または不飽和の環状アルキル基を意味する。特定の飽和度を意図する場合には、「シクロアルカニル」または「シクロアルケニル」の名称を用いる。典型的なシクロアルキル基には、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどから誘導される基が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態においては、シクロアルキル基は（C3-C10）シクロアルキル、好ましくは（C3-C6）シクロアルキルである。
【００６３】
「シクロヘテロアルキル」は、1以上の炭素原子（および任意の結合水素原子）が、独立して、同じ又は異なるヘテロ原子で置換されている飽和または不飽和の環状アルキル基を意味する。炭素原子を置換する典型的なヘテロ原子には、N、P、O、S、Siなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の飽和度を意図する場合には、「シクロヘテロアルカニル」または「シクロヘテロアルケニル」を用いる。典型的なシクロヘテロアルキル基には、ジオキサン、ジオキソラン、エポキシド、イミダゾリジン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、キヌクリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピランなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
「シクロヘテロアルキルオキシカルボニル」は-C(O)-OR基を意味し、ここで、Rは、本明細書中に定義されているとおりのシクロヘテロアルキルである。
【００６５】
「ジアルキルアミノ」は-NRR'基を意味し、ここで、RおよびR'は、独立して、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリール基（これらは本明細書中に定義されているとおりである）を表す。
【００６６】
「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００６７】
「ハロアルキル」は、1以上のハロ原子により置換されたアルキル基を意味し、ここで、アルキルおよびハロは本明細書中に定義されているとおりである。
【００６８】
「ヘテロアルキルオキシ」はO-ヘテロアルキル基を意味し、ここで、ヘテロアルキルは本明細書中に定義されているとおりである。
【００６９】
「ヘテロアルキル、ヘテロアルカニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル」は、炭素原子（および任意の結合水素原子）の1以上が、それぞれ独立して、同じ又は異なるヘテロ原子基で置換されたアルキル、アルカニル、アルケニルおよびアルキニル基を意味する。典型的なヘテロ原子基には、-0-、-S-、-0-0-、-S-S-、-O-S-、-NR'-、=N-N=、-N=N-、-N=N-NR'-、-PH-、-P(O)2、-O-P(O) 2-、-S(O)-、-S(O) 2-、-SnH2-（ここで、R'は、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリールまたは置換アリールである）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
「ヘテロアリール」は、親へテロ芳香環系の単一の原子から1個の水素原子を除去することにより誘導される、一価のヘテロ芳香族基を意味する。典型的なヘテロアリール基には、アクリジン、アルスインドール、カルバゾール、∃-カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサントレンなどから誘導される基が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、該ヘテロアリール基は5〜20員ヘテロアリールであり、5〜10員ヘテロアリールが特に好ましい。好ましいヘテロアリール基としては、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、キノリン、イミダゾール、オキサゾールおよびピラジンから誘導されるものが挙げられる。
【００７１】
「ヘテロアリールオキシ」は-O-ヘテロアリールアルキル基を意味し、ここで、ヘテロアリールアルキルは本明細書中に定義されているとおりである。
【００７２】
「ヘテロアリールオキシカルボニル」は-C(O)-ORを意味し、ここで、Rは本明細書中に定義されているとおりのヘテロアリールである。
【００７３】
「ヘテロアリールアルキル」は、炭素原子（典型的には末端またはsp3炭素原子）に結合した水素原子の1つがヘテロアリール基で置換されている非環状アルキル基を意味する。特定のアルキル部分を意図する場合には、ヘテロアリールアルカニル、ヘテロアリールアルケニルおよび／またはヘテロアリールアルキニルの名称を用いる。好ましい実施形態においては、ヘテロアリールアルキル基は6〜30員ヘテロアリールアルキルであり、例えば、ヘテロアリールアルキルのアルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分は1〜10員であり、ヘテロアリール部分は5〜20員ヘテロアリールである。
【００７４】
「ヒドロキシ」は-OH基を意味する。
【００７５】
「脱離基」は、有機合成化学におけるそれに通常関連した意義を有し（すなわち、求核剤により置換されうる原子または基を意味し）、ハロ（例えば、クロロ、ブロモおよびヨード）、アルコキシカルボニル（例えば、アセトキシ）、アリールオキシカルボニル、メシルオキシ、トシルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、アリールオキシ（例えば、2,4-ジニトロフェノキシ）、メトキシ、N,O-ジメチルヒドロキシルアミノなどを含む。
【００７６】
「ニトロ」は-NO2基を意味する。
【００７７】
「オキソ」は二価基 =Oを意味する。
【００７８】
「製薬上許容される」は、動物、特にヒトでの使用に関して連邦政府または州政府の規制機関により承認されている又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。
【００７９】
「製薬上許容される塩」は、親化合物の所望の薬理学的活性を有し製薬上許容される、本発明の化合物の塩を意味する。そのような塩には、（1）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような無機酸により形成される、または酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタン-ジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4-メチルビシクロ[2.2.2]-オクト-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、tert-ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などのような有機酸により形成される酸付加塩、あるいは（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオン）により置換される又はエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N-メチルグルカミンなどのような有機塩基に配位する場合に形成される塩が含まれる。
【００８０】
「製薬上許容されるビヒクル」は、本発明の化合物と共に投与される希釈剤、添加剤、賦形剤または担体を意味する。
【００８１】
「予防する」又は「予防」は、疾患または障害を被るリスクの軽減、すなわち、疾患にさらされうる又はその素因を有しうるが該疾患の症状を未だ経験または示していない被験者において、該疾患の臨床症状の少なくとも1つを発現させないこと、を意味する。
【００８２】
「プロドラッグ」は、活性な薬物を放出するよう体内での変換を必要とする、薬物分子の薬理学的に不活性な誘導体を意味する。典型的には、プロドラッグは、さもなければ薬物の臨床的有用性を制限しうる、親薬物分子に関連した薬学および／または薬物動力学に基づく問題を克服するように設計される。
【００８３】
「プロ部分（promoiety）」は、薬物分子中の官能基をマスクするために使用された場合に該薬物をプロドラッグに変換する保護基の一形態を意味する。典型的には、プロ部分は、酵素的または非酵素的手段によりin vivoで切断される結合を介して薬物に結合している。理想的には、プロ部分は、プロドラッグから切断されると体内から速やかに消失する。
【００８４】
「保護基」は、分子中の反応性基に結合している場合にその反応性をマスクし減少させ又は妨げる原子群を意味する。保護基の具体例は、Greenら, “Protective Groups in Organic Chemistry”, (Wiley, 2nd ed. 1991) およびHarrisonら, “Compendium of Synthetic Organic Methods”, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996)に記載されている。代表的なアミノ保護基には、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「CBZ」）、tert-ブトキシカルボニル（「Boc」）、トリメチルシリル（「TMS」）、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル（「SES」）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（「FMOC」）、ニトロベラトリルオキシカルボニル（「NVOC」）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。代表的なヒドロキシ保護基には、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されているもの、例えば、ベンジルおよびトリチルエーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
「被験者」はヒトを含む。「ヒト」、「患者」および「被験者」なる語は本明細書中では互換的に用いられる。
【００８６】
「置換」は、1以上の水素原子が、それぞれ独立して、同じ又は異なる置換基で置換されている基を指している。典型的な置換基には、-X、-R14、-0-、=0、-OR14、-SR14、-S-、=S、-NR14R15、=NR14、-CX3、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、S(O)2O-、-S(O)2OH、-S(0)2R14、-OS(O2)O-、-OS(0)2R14、-P(O)(O-)2、-P(0)(OR14)(0-)、-OP(0)(OR14)(OR15)、-C(O)R14、-C(S)R14、-C(0)OR14、-C(0)NR14R15、-C(O)O-、-C(S)OR14、-NR16C(0)NR14R15、-NR16C(S)NR14R15、-NR17C(NR16)NR14R15および-C(NR16)NR14R15（ここで、それぞれのXは、独立して、ハロゲンである；それぞれのR14、R15、R16およびR17は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アルキル、アリールアルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換アルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、-NR18R19、-C(O)R18または-S(O)2R18であるか、あるいは場合によっては、R18およびR19が、それらが共に結合している原子と一緒になって、シクロヘテロアルキルまたは置換シクロヘテロアルキル環を形成している；R18およびR19は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アルキル、アリールアルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換アルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルまたは置換ヘテロアリールアルキルである）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
「スルホニル」は二価基 -S(O)2-を意味する。
【００８８】
「治療に有効な量」は、疾患を治療するために被験者に投与された場合に、該疾患に対するそのような治療をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。「治療に有効な量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびにその被験者の年齢、体重などに応じて様々となりうる。
【００８９】
「チオ」は-SH基を意味する。
【００９０】
「チオシアナト」は-SCN基を意味する。
【００９１】
「チオノ」は二価基 =Sを意味する。
【００９２】
疾患または障害のいずれかの「治療」は、1つの実施形態においては、該疾患または障害を改善すること（すなわち、該疾患またはその臨床症状の少なくとも1つの発現を阻止または軽減すること）を意味する。もう1つの実施形態においては、「治療」は、被験者が認識できないかもしれない少なくとも1つの物理的パラメーターの改善を意味する。さらにもう1つの実施形態においては、「治療」は、物理的に（例えば、認識できない症状の安定化）、生理的に（例えば、物理的パラメーターの安定化）またはそれらの両方で疾患または障害をモジュレーションすることを意味する。さらにもう1つの実施形態においては、「治療」は疾患または障害の開始を遅らせることを意味する。
【００９３】
以下、本発明の好ましい実施形態を詳しく説明することとする。本発明は好ましい実施形態に関して説明されているが、本発明はそれらの好ましい実施形態に限定されるものではないと理解される。それだけではなく、本発明は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の精神および範囲に含まれうる代替物、修飾および均等物を包含すると意図される。
6.2．本発明の化合物の用途
【００９４】
本発明は、S1P1またはEdg-1受容体（例えば、ヒトEdg-1, GenBank登録番号AF233365）が介在する生物活性をモジュレーションする方法を提供する。Edg-1受容体を発現する細胞を、Edg-1受容体介在生物活性をモジュレーションするのに十分な量のEdg-1受容体のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させる。
【００９５】
Edg-1はGタンパク質共役受容体（「GPCR」）であると当業者は理解するであろう。Edg-1（S1P1）受容体は内皮分化遺伝子によりコードされ、関連受容体Edg-3（S1P3）、Edg-5（S1P2）、Edg-6（S1P4）およびEdg-8（S1P5）と共に、スフィンゴシン-1-リン酸（「S1P」）に結合する。好ましくは、Edg-1受容体はヒト受容体である。
【００９６】
Edg-1受容体は、当業者によく知られた組換えDNA法により発現させることができる。Edg-1を発現させアッセイするための特に有用な細胞型には、HTC4（ラット肝癌細胞）、RH7777（ラット肝癌細胞）、HepG2（ヒト肝癌細胞）、CHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞）およびHEK-293（ヒト胚性腎細胞）が含まれるが、これらに限定されるものではない。Gタンパク質受容体を発現させるための特に有用なベクターには、pLXSNおよびpCMV（Clontech Labs, Palo Alto, CA; Invitrogen Corporation, Carlsbard, CA）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
Edg-1をコードするDNAはよく知られており（例えば、ヒトEdg-1, GenBank登録番号AF233365）、当業者に公知の方法に従いヒトまたは哺乳類細胞内にトランスフェクトすることができる。例えば、ヒトEdg-1をコードするDNAを、ウイルス複製のための同種指向性エンベロープを与える標準的なパッケージングベクター（例えば、前記のもの）と共に、GP-293（Clontech Labs, Palo Alto, CA）のようなパッケージング細胞系内にコトランスフェクトすることができる。
【００９８】
あるいは、gagおよびpolのほかに同種指向性エンベロープを産生するenv遺伝子を有するEcoPack-293細胞系内に、Edg-1をコードするDNAをトランスフェクトすることができる。どちらの方法も（すなわち、パッケージングベクターとのコトランスフェクションまたはEcoPack-293の使用）、ウイルスのパッケージングのための同種指向性エンベロープの産生を可能にし、したがって、ラットおよびマウス細胞をトランスフェクトするために有利に用いられうる。ヒトおよび他の哺乳類系における使用には、AmphoPack-293細胞系を使用することができる（Clontech, Palo Alto, CA）。
【００９９】
多数の天然細胞系がEdg-1受容体を天然で発現する。これらには、CaOV-3ヒト卵巣癌細胞、MDA-MB-453およびMDA-MB-231乳癌細胞、HT-1080ヒト線維肉腫、HUVEC細胞、SKOV3ヒト卵巣癌細胞、A2780ヒト卵巣細胞、Helaヒト子宮頸腺癌細胞、HEK293ヒト胚性腎細胞、NIH 3T3マウス繊維芽細胞（ATCC, Manassas, VA; Vec Technologies Inc., Rensselaer, NY; Dr. Edward Goetzl, University of California, San Francisco, San Francisco, CA）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
Edg-1受容体を発現する細胞はin vitroで増殖させることが可能であり、あるいは例えば哺乳動物のような複雑な生物の一部でありうる、と当業者は理解するであろう。本発明の方法は、局所的な環境に関係なく、Edg-1受容体の活性の阻害に適用可能であると予想される。1つの好ましい実施形態においては、Edg-1受容体を発現する細胞をin vitroで増殖させる（すなわち、培養する）。もう1つの好ましい実施形態においては、Edg-1受容体を発現する細胞がin vivoで存在する（すなわち、複雑な生物の一部である）。
【０１０１】
本発明の方法を実施しうる細胞には、肝癌細胞、卵巣細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、ニューロン性細胞、癌細胞、クロム親和性細胞腫細胞、筋芽細胞、血小板細胞、ケラチノサイトおよび繊維肉腫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。より詳しくは、本発明を実施しうる細胞には、SKOV3ヒト卵巣細胞、HTCラット肝癌細胞、CAOV-3ヒト卵巣癌細胞、A2780ヒト卵巣細胞、MDA-MB-453乳癌細胞、MDA-MB-231乳癌細胞、HUVEC、Helaヒト子宮頸腺癌細胞、HEK293ヒト胚性腎細胞、NIH 3T3マウス繊維芽細胞およびHT-1080ヒト繊維肉腫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法の実施のための更なる細胞には、2001年7月11日付け出願の同時係属米国特許出願第09/904,099号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているものが含まれる。
【０１０２】
本発明のもう1つの態様においては、Edg-1受容体介在生物活性を、被験者において又は動物モデルにおいてモジュレーションする。Edg-1受容体のモジュレーターの治療に有効な量を該被験者または動物に投与する。好ましくは、該被験者または動物はそのような治療を必要とするものである。
【０１０３】
Edg-1受容体が介在する生物活性には、例えば、カルシウム動員、VEGF合成、IL-8合成、血小板の活性化、細胞遊走、ホスホイノシチドの加水分解、cAMP形成阻害またはアクチン重合が含まれうる。好ましくは、Edg-1受容体が介在する生物活性には、アポトーシス、血管新生、創傷治癒、炎症、内因性タンパク質増殖因子の発現、癌の侵襲またはアテローム発生が含まれるが、これらに限定されるものではない。最も好ましくは、Edg-1受容体が介在する生物活性は、創傷治癒の増進につながりうる細胞増殖（あるいは、それは卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌または前立腺癌を招きうる）である。1つの実施形態においては、細胞増殖がS1Pにより刺激される。
【０１０４】
もう1つの実施形態においては、Edg-1受容体が介在する生物活性には、急性肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（「ARDS」）、および喘息のような慢性肺疾患の急性炎症性悪化を招きうる脂肪酸レベル（例えば、遊離脂肪酸およびリゾホスファチジルコリン）の増加が含まれうる。
【０１０５】
さらに他の実施形態においては、Edg-1受容体が介在する生物活性は免疫応答でありうる。ある実施形態においては、該免疫応答はEdg-1受容体モジュレーターにより刺激されうる。免疫応答を刺激しうるEdg-1受容体モジュレーターは一般にはEdg-1受容体アゴニストであるが、あるEdg-1受容体アンタゴニストも免疫応答を刺激する能力を有することがある。
【０１０６】
当業者は、免疫応答の刺激から利益を受ける被験者を容易に認識することが可能である。例えば、遺伝性免疫不全を有する被験者は免疫応答の刺激から利益を受けるであろう。他のそのような被験者には、ウイルスに感染した被験者が含まれる。例えば、該被験者は、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスに感染したものでありうる。さらに他の実施形態においては、免疫応答の刺激から利益を受ける被験者には、ワクチンが投与される被験者が含まれる。そのような実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターをワクチンに対するアジュバントとして投与することが可能である。他の実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターをワクチンと同時に投与することができる。
【０１０７】
他の実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターにより免疫応答を抑制することができる。そのような実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターはEdg-1受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。いずれの特定の理論や作用メカニズムにも拘束されるものではないが、十分に強力なEdg-1アゴニストまたは十分に高い用量のEdg-1アゴニストは、S1Pによるシグナル伝達に対して、Edg-1受容体を発現する細胞を脱感作することにより、免疫応答を抑制しうる。Edg-1アンタゴニストは、Edg-1受容体へのS1P結合を阻害することにより又はEdg-1受容体がシグナルを伝達するのを妨げることにより、免疫応答を抑制すると考えられている。
【０１０８】
当業者は、免疫応答の抑制から利益を受ける被験者を容易に認識することが可能である。例えば、そのような被験者には、免疫系の不適切な活性化により特徴づけられる免疫障害に罹患した被験者が含まれる。そのような障害には、全身性エリテマトーデス、リウマチ性心臓炎、多発性筋炎、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、スチーブンス・ジョンソン症候群、菌状息肉腫、皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、難治性スプルー、特発性紫斑病、溶血性貧血、赤芽球減少症、先天性低形成性貧血、骨関節症、慢性関節リウマチ、滑液嚢炎、急性痛風性関節炎、上顆炎、急性非特異性腱滑膜炎、多発性硬化症、角膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、視神経炎、サルコイドーシス、レフレル症候群、ベリリウム中毒、結核、脊椎炎、腱滑膜炎、乾癬性関節炎およびI型糖尿病が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫応答の抑制から利益を受ける被験者のもう1つの例としては、移植される細胞、組織または臓器のレシピエントである被験者が挙げられる。
【０１０９】
さらにもう1つの実施形態においては、本発明は、脳動脈内の血管収縮、自己免疫および関連免疫障害、例えば（以下のものに限定されるものではない）、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体性ネフローゼ、乾癬、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎、慢性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血のような障害（それらに限定されるものではない）の治療または予防において、Edg-1モジュレーターを使用する方法を提供する。また、Edg-1モジュレーターは臓器移植においても使用することができる。さらにもう1つの実施形態においては、Edg-1のアゴニストおよびアンタゴニストは、血管閉塞性障害を治療するために使用することができる。例えば、Edg-1アゴニストを使用することによるEdg-1受容体の活性化は、片頭痛のような症状において有益である、血管収縮の増加を招きうる。Edg-1アンタゴニストによるEdg-1の阻害は、卒中、くも膜下出血または血管痙攣（例えば、脳血管痙攣）のような状態において有益である。
【０１１０】
1つの実施形態においては、該モジュレーターはEdg-1受容体に対して阻害選択性を示す。例えば、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す。阻害選択性は、カルシウム動員アッセイあるいは遊走および／または侵入アッセイあるいは増殖アッセイ（例えば、それぞれ、7.10、7.12および7.13節に記載されているもの）のようなアッセイにより測定することができる。阻害選択性の測定に適した他のアッセイは当業者に公知である。好ましいアッセイには、7.10節のカルシウム動員アッセイが含まれる。
【０１１１】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す。
【０１１２】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の阻害選択性を示す。
【０１１３】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す。
【０１１４】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の阻害選択性を示す。
【０１１５】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す。
【０１１６】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す。
【０１１７】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の阻害選択性を示す。
【０１１８】
好ましい実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す。
【０１１９】
もう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す。
【０１２０】
さらにもう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の阻害選択性を示す。
【０１２１】
さらにもう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の阻害選択性を示す。
【０１２２】
他の実施形態においては、該モジュレーターはEdg-1受容体に対して刺激選択性を示す。例えば、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の刺激選択性を示す。刺激選択性は、カルシウム動員アッセイあるいは遊走および／または侵入アッセイあるいは増殖アッセイ（例えば、それぞれ、7.10、7.12および7.13節に記載されているもの）のようなアッセイにより測定することができる。刺激選択性の測定に適した他のアッセイは当業者に公知である。好ましいアッセイには、7.10節のカルシウム動員アッセイが含まれる。
【０１２３】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の刺激選択性を示す。
【０１２４】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の刺激選択性を示す。
【０１２５】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の刺激選択性を示す。
【０１２６】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約200倍の刺激選択性を示す。
【０１２７】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の刺激選択性を示す。
【０１２８】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の刺激選択性を示す。
【０１２９】
さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約100倍の刺激選択性を示す。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の刺激選択性を示す。
【０１３１】
もう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、他のEdg受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の刺激選択性を示す。
【０１３２】
さらにもう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約5倍の刺激選択性を示す。
【０１３３】
さらにもう1つの実施形態においては、細胞増殖のモジュレーターは、Edg-3、Edg-5、Edg-6およびEdg-8受容体と比べて、Edg-1に対して少なくとも約20倍の刺激選択性を示す。
【０１３４】
1つの実施形態においては、Edg-1モジュレーターは脂質ではない。好ましくは、Edg-1受容体介在生物活性のモジュレーターはリン酸、環状リン酸エステルまたは直鎖状リン酸エステルのようなリン酸基を含有しない。より好ましくは、Edg-1受容体のモジュレーターはリン脂質ではない。「リン脂質」なる語は、炭素数10以上のアルキル鎖を有するグリセロール誘導体を含有するすべてのリン酸（リン酸エステルおよびリン酸の両方）、任意のN-アシルエタノールアミドリン酸誘導体（リン酸エステルおよびリン酸の両方）、LPA、S1Pまたはそれらの任意の類似体（リン酸エステルおよびリン酸の両方）（例えば、Bandohら, 2000, FEBS Lett. 428, 759; Bittmanら, 1996, J. Lipid Research 391; Lilliomら, 1996, Molecular Pharmacology 616, Hooksら, 1998, Molecular Pharmacology 188; Fischerら, 1998, Molecular Pharmacology 979; Heiseら, 2001, Molecular Pharmacology 1173; Hopperら, 1999, J. Med. Chem. 42 (6):963-970; Tigyiら, 2001, Molecular Pharmacology 1161を参照されたい）を含む。ある実施形態においては、Edg-1受容体のモジュレーターは、スフィンゴシン-1-リン酸、スフィンゴシン-1-リン酸の誘導体もしくは類似体またはEdg-1活性の任意のモジュレーター［WO 01/69252またはWO 02/17899（それらのそれぞれの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているもの］ではない。他の実施形態においては、Edg-1受容体のモジュレーターはFTY720またはEdg-1活性の任意のモジュレーター（Brinkmannら, 2002, J. Biol. Chem. 277: 21453-21457に記載されているもの）ではない。
【０１３５】
また、もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、構造式（IV）：
【化１】
2005533852.tif 000003
（式中、
XはOまたはSである；
R20はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリールまたはハロである；
R21はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである；
R23は水素、アルキルまたは置換アルキルである；
R24はアリール、置換アリール、ヘテロアリールまたは置換ヘテロアリールである；
あるいは、R23とR24とがシクロアルキル環を形成している）の化合物または製薬上入手可能なその塩（国際出願WO 01/60819）ではない。
【０１３６】
もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、式：
【化２】
2005533852.tif 000004
（式中、R20、R21およびR24は前記と同意義を有する）のいずれの化合物でもない。さらにもう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、国際出願WO 01/60819（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているいずれの化合物でもない。
【０１３７】
1つの好ましい実施形態においては、該モジュレーターはEdg-1受容体のアゴニストである。該モジュレーターは天然のアゴニストより弱いアゴニストであってよく、結合部位に関して天然アゴニストと競合しうる。もう1つの好ましい実施形態においては、該モジュレーターはEdg-1受容体のアンタゴニストである。Edg-1モジュレーターは生体分子、例えば核酸、タンパク質（すなわち、酵素または抗体）もしくはオリゴ糖またはそれらの任意の組合せでありうる。あるいは、該Edg-1モジュレーターは、前記生体分子のオリゴマーまたは単量体、例えばアミノ酸、ペプチド、単糖、二糖、核酸単量体、二量体など、あるいはそれらの任意の組合せでありうる。また、Edg-1モジュレーターは合成ポリマー、または生体分子の単量体もしくはオリゴマーを含む生体分子と合成ポリマーとの任意の組合せでありうる。
【０１３８】
また、Edg-1モジュレーターは、1000ダルトン未満の分子量の有機分子でありうる。1つの実施形態においては、該分子量は約200〜約1000ダルトンである。もう1つの実施形態においては、該分子量は約200〜約750ダルトンである。さらにもう1つの実施形態においては、該分子量は約200〜約600ダルトンである。好ましくは、該分子量は約300〜約500ダルトンである。
【０１３９】
いずれの特定の理論や理解にも束縛されるものではないが、該モジュレーターは、例えば、Edg-1受容体のS1P結合部位への直接的な結合、Edg-1受容体の他のいずれかの部位における結合、Edg-1またはS1Pの生合成の阻害、S1PまたはEdg-1受容体の共有結合性修飾を介してEdg-1受容体の阻害を促進したり、あるいはEdg-1介在シグナル伝達を阻害しうる。
【０１４０】
1つの実施形態においては、該モジュレーターは、約10μM〜約1fMの結合定数でEdg-1受容体に結合する。もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、約10μM〜約1nMの結合定数でEdg-1受容体に結合する。もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、約1μM〜約1nMの結合定数でEdg-1受容体に結合する。もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、約100nM〜約1nMの結合定数でEdg-1受容体に結合する。もう1つの実施形態においては、該モジュレーターは、約10nM〜約1nMの結合定数でEdg-1受容体に結合する。好ましくは、該モジュレーターは、約10nMより良好な（すなわち、低い）結合定数でEdg-1受容体に結合する。
【０１４１】
1つの態様においては、該モジュレーターは、構造式（I）：
【化３】
2005533852.tif 000005
（式中、
各点線は、場合によっては二重結合でありうることを示す；
n = 0、1、2、3、4または5；
XはCR5またはNである；
YはCR5R5またはNR1である；
R1は、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキルまたは置換ヘテロアルキルである；
R2、R3および各R5は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである；
各R4は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである；
R6は存在しないか、または水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である。
【０１４２】
ある実施形態においては、該モジュレーターは構造式（Ia）：
【化４】
2005533852.tif 000006
（式中、n、X、Y、R1、R2、R3、R4およびR5は、前記構造（I）に関して記載したとおりである）の化合物である。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態においては、該モジュレーターは、nが1であり、XがNであり、YがNR1であり、R1がアシルまたは置換アシルであり、R2がアルキルまたは置換アルキルであり、R3が水素、アルコキシ、置換アルコキシまたはヒドロキシルであり、各R5がHであり、R6が存在しない構造式（I）の化合物である。
【０１４４】
好ましいモジュレーターには、以下の101および102、ならびに105〜113（表1）が含まれる。化合物105〜113は、20μMではEdg-1以外のEdg受容体に対して活性を示さない。
【化５】
2005533852.tif 000007
【０１４５】
ある実施形態においては、本発明のこの態様は、化合物が101、102または105〜113ではない構造式（I）または（Ia）の化合物を提供する。
【０１４６】
本発明の第2の態様においては、該モジュレーターは、構造式（II）：
【化６】
2005533852.tif 000008
（式中、
XはOまたはSである；
R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである；
R6、R7、R8、R9およびR10はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である。
【０１４７】
本発明の好ましい実施形態においては、該アゴニストは、XがOであり、R1、R2、R3、R4およびR5がそれぞれ、独立して、水素、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アミノ、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノまたはハロであり、R6、R7、R8、R9およびR10がそれぞれ、独立して、水素、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アリールアルキルオキシまたは置換アリールアルキルオキシである構造式（II）の化合物である。さらなる好ましい実施形態においては、該アゴニストは、XがOであり、R1、R2、R3、R4およびR5がそれぞれ、独立して、水素、アミノまたはハロであり、R6、R7、R8、R9およびR10がそれぞれ、独立して、水素、アルコキシまたは置換アルコキシである構造式（II）の化合物である。さらなる好ましい実施形態においては、該アゴニストは、XがOであり、R2、R3およびR5がそれぞれ水素であり、R1およびR4がそれぞれ、独立して、アミノまたはハロであり、R6およびR10がそれぞれ、水素であり、R7、R8およびR9がそれぞれ、独立して、アルコキシである構造式（II）の化合物である。
【０１４８】
好ましいモジュレーターには、104：
【化７】
2005533852.tif 000009
も含まれる。
【０１４９】
ある実施形態においては、本発明のこの態様は、化合物が104ではない構造（II）の化合物を提供する。
【０１５０】
本発明の第3の態様においては、該モジュレーターは、構造式（III）：
【化８】
2005533852.tif 000010
（式中、
nは1、2、3、4または5である；
mは1、2、3、4または5である；
XおよびYはそれぞれ、独立して、CまたはNである；
R1、R2、R3、R4およびR5はそれぞれ、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アシル、置換アシル、アシルアミノ、置換アシルアミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アルキルチオ、置換アルキルチオ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシカルボニル、置換アルコキシカルボニル、アルキルアリールアミノ、置換アルキルアリールアミノ、アリールアルキルオキシ、置換アリールアルキルオキシ、アミノ、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、アジド、カルボキシ、カルバモイル、置換カルバモイル、カルボキシル、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、置換シクロヘテロアルキル、ジアルキルアミノ、置換ジアルキルアミノ、ハロ、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヒドロキシル、ニトロまたはチオである）の化合物または製薬上入手可能なその溶媒和物もしくは水和物である。
【０１５１】
本発明の好ましい態様においては、該モジュレーターは、構造式（IIIa）：
【化９】
2005533852.tif 000011
（式中、n、m、X、Y、R1、R2、R3、R4およびR5は、前記構造（III）に関して定義されているとおりである）の化合物または製薬上許容しうるその塩もしくは水和物である。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態においては、該モジュレーターは、nが2であり、mが2であり、XがNであり、YがNであり、R3、R4およびR5がそれぞれ水素である構造式（III）または（IIIa）の化合物である。さらなる好ましい実施形態においては、該モジュレーターは、nが2であり、mが2であり、XがNであり、YがNであり、R3、R4およびR5がそれぞれ、水素であり、R1およびR2がそれぞれ、独立して、アルコキシまたは置換アルコキシである構造式（III）または（IIIa）の化合物である。さらなる好ましい実施形態においては、該モジュレーターは、nが2であり、mが2であり、XがNであり、YがNであり、R3、R4およびR5がそれぞれ、水素であり、R1およびR2がそれぞれ、メトキシである構造式（III）または（IIIa）の化合物である。
【０１５３】
好ましいモジュレーターには、103：
【化１０】
2005533852.tif 000012
が含まれる。
【０１５４】
ある実施形態においては、本発明のこの態様は、化合物が103ではない構造（III）または（IIIa）の化合物を提供する。
【０１５５】
最後に、ある実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターは、他のEdg受容体のモジュレーターの1以上と組合せて使用することができる。ある実施形態においては、他のEdg受容体のモジュレーターはEdg-2受容体をモジュレーションしうる。他の実施形態においては、他のEdg受容体のモジュレーターはEdg-3受容体をモジュレーションしうる。さらに他の実施形態においては、他のEdg受容体のモジュレーターはEdg-4受容体をモジュレーションしうる。さらに他の実施形態においては、他のEdg受容体のモジュレーターはEdg-7受容体をモジュレーションしうる。これらの他のEdg受容体のモジュレーターは、同時係属米国特許出願第10/390,427号、第10/390,426号、第10/390,429号および第10/390,428号（それらの各々の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。
6.3．本発明の化合物の合成
【０１５６】
本発明の化合物は、スキーム1に例示する合成方法により得ることができる。本発明の化合物およびその中間体の製造に有用な出発物質は商業的に入手可能であるか、またはよく知られた合成方法により製造することができる。本明細書に記載の化合物の他の合成方法は当技術分野において記載されているか、または当技術分野でよく知られた一般的な刊行物を参照すれば当業者に明らかであり（例えば、Greenら, “Protective Groups in Organic Chemistry", (Wiley, 2nd ed. 1991); Harrisonら, “Compendium of Synthetic Organic Methods", Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996); “Bei1stein Handbook of Organic Chemistry," Beilstein Institute of Organic Chemistry, Frankfurt, Germany; Feiserら, “Reagents for Organic Synthesis," Volumes 1-17, Wiley Interscience; Trostら, “Comprehensive Organic Synthesis," Pergamon Press, 1991; “Theilheimer's Synthetic Methods of Organic Chemistry," Volumes 1-45, Karger, 1991; March, “Advanced Organic Chemistry," Wiley Interscience, 1991; Larock “Comprehensive Organic Transformations," VCH Publishers, 1989; Paquette, “Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis," John Wiley & Sons, 1995を参照されたい）、本発明の化合物を合成するために用いることが可能である。したがって、本明細書のスキーム1に記載の方法は網羅的なものではなく、例示にすぎない。
【０１５７】
式（I）の化合物を合成するためには、スキーム1に記載の経路を用いることが可能である。
【化１１】
2005533852.tif 000013
6.3.1．化合物101
【０１５８】
エタノール（約2 mL）およびトルエン（50 mL）中に溶解した1-(4-クロロフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（0.883 g, 3.17 mmol）とニコチン酸ヒドラジド（0.448 g, 3.17 mmol）の溶液を還流温度で加熱した。2日後、該反応混合物を真空中で濃縮し、粗残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（98:2 CH2Cl2/MeOH）にかけた。不純な生成物をエタノールから再結晶して、5-(4-クロロフェニル)-2-ピリジン-3-イルメチル-3-トリフルオロメチル-3,4-ジヒドロ-2H-ピラゾール-3-オール（0.134 g, 収率11％）を淡黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.24 (m, 1H), 8.79 (m, 1H), 8.27 (m, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.47 (s, 1H), 3.74 (d, 1H), 3.75 (d, 1H)。ESI-MS m/z: 370 [C16H11ClF3N3O2 + H]+。m.p.（融点） 158〜160℃。
6.3.2．化合物102
【０１５９】
化合物102は以下の合成スキームに従い製造することができる。
（a）1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオンの合成
【化１２】
2005533852.tif 000014
【０１６０】
トリフルオロ酢酸エチル（81.0 mL, 0.452 mol）のメトキシ tert-ブチルエーテル（0.5 L）溶液に、ナトリウムメトキシド（メタノール中の30重量％, 102 mL, 0.542 mol）を室温でゆっくり加えた。該反応は発熱し、氷浴で室温まで冷却した。4'-ブロモアセトフェノン（90.0 g, 0.452 mol）を該反応混合物に、10分間かけて、分割して加え、該反応混合物を室温で一晩撹拌した。有機層を塩酸（3N, 300 mL）、ブライン（l00 mL）で洗浄し、乾燥（硫酸マグネシウム）し、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をヘキサンから5回再結晶して、1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（96.5 g, 72％）を淡黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDC13) δ 11.9 (s, 1H), 7.83-7.75 (m, 2H), 7.68-7.60 (m, 2H), 6.54 (s, 1H)。
（b）[3-(4-ブロモフェニル)-5-トリフルオロメチルピラゾール-1-イル]ピリジン-3-イル-メタノンの製造
【化１３】
2005533852.tif 000015
【０１６１】
無水エタノール（0.7 L）中の1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（55.2 g, 0.187 mol）とニコチン酸ヒドラジド（25.6 g, 0.187 mol）との混合物を還流温度で一晩撹拌した。該反応混合物を室温まで冷却し、ついで真空中で濃縮した。粗残留物をトルエン（0.7 L）中に取り、還流温度で2日間撹拌した。該混合物を冷却し、ついで真空中で濃縮した。残留物をメトキシ tert-ブチルエーテル（0.4 L）で処理し、55℃で30分間撹拌した。固体を濾去し、母液を真空中で濃縮した。粗残留物をクロマトグラフィー（シリカゲル, 0.5％メタノール／塩化メチレン）により精製して、[3-(4-ブロモフェニル)-5-トリフルオロメチルピラゾール-1-イル]ピリジン-3-イル-メタノン（13.0 g, 17％）を白色固体として得た: mp 150〜152℃; 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 9.11-8.92 (m, 1H), 8.69-8.58 (m, 1H), 8.38-8.20 (m, 1H), 7.74-7.42 (m, 5H), 3.95 (d, 1H), 3.60 (d, 1H); ESI MS m/z 414 [C16HllBrF3N3O2 + H]+。
【０１６２】
また、化合物102はChembridge (San Diego, CA) #5795726から商業的に入手可能な化合物である。
6.3.3．化合物103
【０１６３】
化合物103はSpecs/BioSpecs(The Netherlands) #AH-262/34399012から商業的に入手可能な化合物である。
6.3.4．化合物104
【化１４】
2005533852.tif 000016
【０１６４】
水酸化カリウムペレット（85％, 5.76g, 87.3 mmol, 17.5当量）をメタノール（12 mL）に溶解した。該混合物を氷浴で冷却し、p-クロロニトロベンゼン（788 mg, 5 mmol）と3,4,5-トリメトキシフェニルアセトニトリル（Acros, 1.140 g, 5.5 mmol）とのメタノール（15 mL）溶液を滴下した（Davis, R.B.; Pizzini, L.C. J. Org. Chem. 1960,25, 1884-1888参照）。その暗紫色の反応混合物をゆっくりと一晩かけて室温まで加温し、ついで水（250 mL）中に注いだ。沈殿物を吸引濾過により集め、水で数回洗浄し、風乾し、酢酸エチル／ヘキサン（1:10、1:6、および1:4）を使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにかけた。5-クロロ-3-(3,4,5-トリメトキシ-フェニル)ベンゾ[c]イソキサゾールを淡黄色固体（405 mg, 収率25％）として単離した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.27 (m, 1H), 7.16 (s, 2H), 4.01 (s, 6H), 3.96 (s, 3H)。APCI-MS: m/z 320 [C16H14ClN04 + H]+。m.p. 119〜120℃。
【０１６５】
鉄粉末（183 mg, 3.28 mmol, 3等量）、エタノール（4 mL）、水（2 mL）および酢酸（6 mL）の混合物を60℃（油浴）に予熱した。ついでメタノール（10 mL）中の5-クロロ-3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-ベンゾ[c]イソキサゾール（350 mg, 1.10 mmol）を加え、該反応混合物をその温度で30分間、ついで95〜98℃で一晩撹拌した。溶媒のほとんどをロータリーエバポレーションにより除去し、残留物をジクロロメタン（100 mL）で希釈した。不溶性無機物を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。得られた固体を、酢酸エチル／ヘキサン（1:10、1:6、1:4、および1:2）を使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた。(2-アミノ-5-クロロフェニル)-(3,4,5-トリメトキシフェニル)メタノンを黄色固体（315 mg, 収率89％）として単離した。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.35 (m, 1H), 7.24 (m, 1H), 6.91 (s, 2H), 6.83 (m, 1H), 3.86 (s, 6H), 3.85 (s, 3H)。APCI-MS: m/z 322 [C16H16ClN04 + H]+。m.p. 141〜142℃。
6.4．本発明の化合物の治療用途
【０１６６】
本発明の化合物および／または組成物は、卵巣癌（Xuら, 1995, Biochem. J. 309 (Pt 3):933-940; Xuら, 1998, JAMA 280 (8):719-723; Goetzlら, 1999, Cancer Res. 59 (20):5370-5375）、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌および前立腺癌；急性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群（「ARDS」）、喘息のような慢性肺疾患の急性炎症性悪化（Chiltonら, 1996, J Exp Med 183:2235-45; Arbibeら, 1998, J Clin Invest 102:1152-60）、表面上皮細胞損傷（例えば、経角膜冷凍（transcorneal freezing）（Liliomら, 1998, Am. J. Physiol 274 (4 Pt 1): C1065-C1074））、心血管疾患（例えば、虚血（Karlinerら, 2001, J. Mol. Cell Cardiol. 33 (9):1713-1717）およびアテローム性動脈硬化症（Siessら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (12):6931-6936; Siessら, 2000, IUBMB Life 49 (3):167-171））を含む（これらに限定されるものではない）疾患を治療するために使用することができる。
【０１６７】
本発明においては、本発明の化合物および／または組成物を、前記疾患を含む（それらに限定されるものではない）疾患の治療が必要な被験者、好ましくはヒトに投与する。さらに、ある実施形態においては、本発明の化合物および／または組成物を、例えば前記のような疾患または障害に対する予防手段として、被験者、好ましくはヒトに投与することができる。こうして、本発明の化合物および／または組成物を、前記疾患など（それらに限定されるものではない）の素因を有する被験者に予防手段として投与することができる。したがって、本発明の化合物および／または組成物は、1つの疾患または障害の予防のためと、それと同時にもう1つの疾患の治療（例えば、癌の予防と心血管疾患の治療）のために使用することができる。
【０１６８】
もう1つの態様においては、本発明の化合物および／組成物は、免疫応答が関わる障害の治療または予防に使用することができる。免疫応答を刺激または増強することによりどのような障害が治療または予防されうるのか、また、免疫応答を阻害することによりどのような障害が治療または予防されうるのかを、当業者は容易に認識するであろう。
【０１６９】
免疫応答を刺激したい場合には、Edg-1受容体モジュレーターは、好ましくは、Edg-1受容体アゴニストであるが、これに限定されるものではない。当業者は、例えば7.12節に記載の遊走および侵入アッセイまたは7.9節に記載のマウス背側エアーポーチ（air-pouch）モデルにおける遊走アッセイを行うことにより、個々のEdg-1アゴニストまたはアンタゴニストが免疫応答を刺激しうるのかどうかを容易に判定することが可能である。さらに、当業者は、免疫応答の刺激から被験者が利益を受けるかどうかを容易に確認することが可能である。例えば、遺伝性免疫不全に罹患した被験者は免疫応答の刺激から利益を受けるであろう。他のそのような被験者には、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスを含む（これらに限定されるものではない）ウイルスに感染した被験者が含まれる。さらに他の実施形態においては、免疫応答の刺激から利益を受ける被験者には、ワクチンが投与される被験者が含まれる。そのような実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターをワクチンに対するアジュバントとして投与することが可能である。
【０１７０】
他の実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターにより免疫応答を阻害することができる。そのような実施形態においては、Edg-1受容体モジュレーターは、前記のとおり、Edg-1受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。当業者は、例えば7.12節に記載の遊走および侵入アッセイまたは7.9節に記載のマウス背側エアーポーチモデルにおける遊走アッセイを行うことにより、個々のEdg-1アゴニストまたはアンタゴニストが免疫応答を阻害しうるのかどうかを容易に判定することが可能である。さらに、当業者は、免疫応答の抑制から利益を受ける被験者を容易に認識することが可能である。例えば、そのような被験者には、免疫系の不適切な活性化により特徴づけられる免疫障害に罹患した被験者が含まれる。
【０１７１】
そのような障害には、全身性エリテマトーデス、リウマチ性心臓炎、多発性筋炎、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、スチーブンス・ジョンソン症候群、菌状息肉腫、皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、難治性スプルー、特発性紫斑病、溶血性貧血、赤芽球減少症、先天性低形成性貧血、骨関節症、慢性関節リウマチ、滑液嚢炎、急性痛風性関節炎、上顆炎、急性非特異性腱滑膜炎、多発性硬化症、角膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、視神経炎、サルコイドーシス、レフレル症候群、ベリリウム中毒、結核、脊椎炎、腱滑膜炎、乾癬性関節炎およびI型糖尿病が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫応答の抑制から利益を受ける被験者のもう1つの例としては、移植される細胞、組織または臓器のレシピエントである被験者が挙げられる。
【０１７２】
当業者は、個々のEdg-1アゴニストまたはアンタゴニストが、被験者に投与された場合に、免疫応答を成功裏に刺激または阻害しているかどうかを容易に判定することが可能である。例えば、被験者の細胞性免疫を試験するために、被験者に対して遅延型過敏症アッセイを行うことができる。そのようなアッセイにおいては、被験者が既に曝露されている抗原を皮下注射する。被験者の免疫応答が阻害されている場合には、遅延型過敏症は全く観察されないか又は軽度の遅延型過敏症が観察される。被験者の免疫応答が阻害されていない場合には、より強力な遅延型過敏症反応が観察される。被験者の免疫応答が刺激されている場合には、遅延型過敏症は全く観察されないか又は軽度の遅延型過敏症が観察される。遅延型過敏症アッセイは当技術分野においてよく知られており、当業者により容易に実施されうる。
【０１７３】
好ましい実施形態においては、脳動脈内の血管収縮、自己免疫および関連免疫障害、例えば（以下のものに限定されるものではない）、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体性ネフローゼ、乾癬、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎、慢性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血（これらに限定されるものではない）のような障害を治療または予防するために、Edg-1アンタゴニストを使用することができる。また、Edg-1のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、臓器移植における免疫阻害剤および種々の癌の治療のための血管新生インヒビターとしても使用することができる。さらにもう1つの実施形態においては、Edg-1のアゴニストおよびアンタゴニストは、血管閉塞性障害を治療するために使用することができる。例えば、Edg-1アゴニストを使用することによるEdg-1受容体の活性化は、片頭痛のような症状に有益である血管収縮の増加をもたらす。Edg-1アンタゴニストによるEdg-1の阻害は、卒中、くも膜下出血または血管痙攣（例えば、脳血管痙攣）のような状態に有益である。前記疾患のような疾患を治療するために本発明の化合物および／または組成物をアッセイし使用することは、当業者の能力の範囲内に十分に含まれる。
6.5．治療的／予防的投与
【０１７４】
本発明の化合物および／または組成物は、ヒトの医学を含む医学において有利に使用されうる。前記6.4節で既に説明したとおり、本発明の化合物および組成物は、癌、例えば卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌（これらに限定されるものではない）；急性肺疾患、例えば成人呼吸窮迫症候群（「ARDS」）（これに限定されるものではない）、および喘息のような慢性肺疾患の急性炎症性悪化；表面上皮細胞損傷、例えば経角膜冷凍または皮膚熱傷（これらに限定されるものではない）；心血管疾患、例えば虚血およびアテローム性動脈硬化症（これらに限定されるものではない）；ウイルス感染症、例えばサイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス感染症（これらに限定されるものではない）；ならびに免疫障害、例えば全身性エリテマトーデス、リウマチ性心臓炎、多発性筋炎、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、スチーブンス・ジョンソン症候群、菌状息肉腫、皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、難治性スプルー、特発性紫斑病、溶血性貧血、赤芽球減少症、先天性低形成性貧血、骨関節症、慢性関節リウマチ、滑液嚢炎、急性痛風性関節炎、上顆炎、急性非特異性腱滑膜炎、多発性硬化症、角膜炎、虹彩炎、虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、視神経炎、サルコイドーシス、レフレル症候群、ベリリウム中毒、結核、脊椎炎、腱滑膜炎、乾癬性関節炎およびI型糖尿病（これらに限定されるものではない）を含む疾患の治療または予防に有用である。
【０１７５】
好ましい実施形態においては、Edg-1アンタゴニストは、脳動脈内の血管収縮、自己免疫および関連免疫障害、例えば（以下のものに限定されるものではない）、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、非糸球体性ネフローゼ、乾癬、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病、慢性糸球体腎炎、慢性血小板減少性紫斑病および自己免疫性溶血性貧血（これらに限定されるものではない）のような障害を治療または予防するために使用することができる。また、Edg-1のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、臓器移植における免疫阻害剤および種々の癌の治療のための血管新生インヒビターとしても使用することができる。さらにもう1つの実施形態においては、Edg-1のアゴニストおよびアンタゴニストは、血管閉塞性障害を治療するために使用することができる。例えば、Edg-1アゴニストを使用することによるEdg-1受容体の活性化は、片頭痛のような症状に有益である血管収縮の増加をもたらす。Edg-1アンタゴニストによるEdg-1の阻害は、卒中、くも膜下出血または血管痙攣（例えば、脳血管痙攣）のような状態に有益である。
【０１７６】
本発明の化合物および／または組成物は、疾患または障害を治療または予防するために使用する場合には、単独で又は他の物質と組合せて投与または適用することが可能である。また、本発明の化合物および／または組成物は、単独で又は他の薬学的に活性な物質（本発明の他の化合物および／または組成物を含む）と組合せて投与または適用することも可能である。
【０１７７】
本発明は、治療に有効な量の本発明の組成物または化合物を被験者に投与することによる治療および予防方法を提供する。被験者は動物であり、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１７８】
本発明の化合物および／または組成物（これは1以上の本発明の化合物を含む）は、好ましくは経口投与する。本発明の化合物および／または組成物は、他の任意の簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射、上皮または粘膜・皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によっても投与することが可能である。投与は全身的または局所的でありうる。本発明の化合物および／または組成物を投与するために使用しうる種々の送達系が公知である（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入）。投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸内投与方法、吸入、または特に耳、鼻、眼または皮膚への局所的投与方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい投与様式は実施者の判断に委ねられるが、1つには医学的症状の部位に左右されるであろう。ほとんどの場合には、投与は血流内への本発明の化合物および／または組成物の放出をもたらすであろう。
【０１７９】
特定の実施形態においては、本発明の1以上の化合物および／または組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましいかもしれない。これは、例えば、手術中の局所的注入、局所的適用（例えば、手術後の傷の手当てと共に行うもの）、注射、カテーテル、坐剤またはインプラント（該インプラントは、多孔性、無孔性、ゼラチン状物質、例えば膜、例えばシアラスチック（sialastic）膜または繊維）により達成されうるが、これらに限定されるものではない。1つの実施形態においては、投与は前記疾患の部位（または前の部位）における直接的な注射でありうる。
【０１８０】
ある実施形態においては、本発明の1以上の化合物および／または組成物を、脳室内、髄腔内および硬膜外注射を含む任意の適当な経路により中枢神経系内に導入することが望ましいかもしれない。脳室内注射は、例えばレザバー（例えばオマヤレザバー(Ommaya reservoir)）に取り付けられた脳室内カテーテルにより容易に行うことが可能である。
【０１８１】
本発明の化合物および／または組成物は、吸入により肺に直接的に投与することができる。吸入による投与の場合、本発明の化合物および／または組成物を多種多様な装置により肺に簡便に送達することができる。例えば、適当な低沸点プロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の任意の適当なガス）を含有するキャニスターを利用する加圧式定量噴霧式吸入器（「MDI」）を使用して、本発明の化合物を肺に直接的に送達することが可能である。
【０１８２】
あるいは、本発明の化合物および／または組成物を肺に投与するために、乾燥粉末吸入（Dry Powder Inhaler：DPI）装置を使用することが可能である。DPI装置は、典型的には、後に被験者により吸入されうる乾燥粉末の霧を容器の内部で生成させるためにガスの噴出のようなメカニズムを用いている。DPI装置も当技術分野でよく知られている。有名な修飾形態として、複数回投与用（multiple dose）DPI（「MDDPI」）システムが挙げられ、これは2回以上の治療量の送達を可能にする。例えば、本発明の化合物とこれらのシステムに適する粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含有する、吸入器または通気器において使用するゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することが可能である。
【０１８３】
本発明の化合物および／または組成物を肺に送達するために使用しうるもう1つのタイプの装置として、液体噴霧装置が挙げられる。液体噴霧系は、後に肺に直接的に吸入されうる液体薬剤をエアゾール化するために非常に小さなノズル孔を使用する。
【０１８４】
1つの実施形態においては、本発明の化合物および／または組成物を肺に送達するために、噴霧器を使用する。噴霧器は、例えば、容易に吸入されうる微細粒子を形成させるために超音波エネルギーを使用することにより、液体薬剤からエアゾールを生成する（例えば、参照により本明細書に組み入れるVerschoyleら, British J. Cancer 1999,80, Suppl. 2, 96を参照されたい）。噴霧器の具体例には、Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd.（Armerら, 米国特許第5,954,047号; van der Lindenら, 米国特許第5,950,619号; van der Lindenら, 米国特許第5,970,974号を参照されたい）、AventisおよびBatelle Pulmonary Therapeuticsにより供給されている装置が含まれる。
【０１８５】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物および／または組成物を肺に送達するために、エレクトロハイドロダイナミック（「EHD」）エアゾール装置を使用する。EHDエアゾール装置は、液体薬物溶液または懸濁液をエアゾール化するために電気エネルギーを利用する（例えば、Noakesら, 米国特許第4,765,539号を参照されたい）。EHDエアゾール装置は、他の肺送達技術より効率的に薬物を肺に送達することが可能である。
【０１８６】
もう1つの実施形態においては、本発明の化合物は、小胞、特にリポソームに含有させて送達することが可能である（Langer, Science 1990, 249:1527-1533; Treatら, in "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer," Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)を参照されたい; 全般的には、"Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer," Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)を参照されたい）。
【０１８７】
さらにもう1つの実施形態においては、本発明の化合物を徐放系、好ましくは経口徐放系により送達することができる。1つの実施形態においては、ポンプを使用することができる（Langer, 前掲; Sefton, 1987, CRC Crit RefBiomed. Eng. 14:201; Saudekら, N. Engl. J Med. 1989,321:574）。
【０１８８】
もう1つの実施形態においては、高分子物質を使用することができる（"Medical Applications of Controlled Release," LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); "Controlled Drug Bioavailability," Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, J. Macromoi. Sci. Rev. Macromoi Chem. 1983,23:61を参照されたい; また、Levyら, Science 1985, 228: 190; Duringら, Ann. Neurol. 1989,25:351; Howardら, J. Neurosurg. 1989, 71: 105も参照されたい）。好ましい実施形態においては、経口徐放送達のために高分子物質を使用する。もう1つの実施形態においては、経口徐放投与のために腸溶製剤を使用することができる。さらにもう1つの実施形態においては、経口徐放投与のために浸透送達系を使用する（Vermaら, Drug Dev. Ind. Pharm. 2000,26:695-708）。
【０１８９】
さらにもう1つの実施形態においては、本発明の化合物および／組成物の標的の近傍に制御放出系を配置することができ、したがって、全身用量の一部のみで十分である（Goodson, in "Medical Applications of Controlled Release," 前掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)）。Langer, 1990, Science 249:1527-1533において考察されている他の制御放出系も使用することが可能である。
6.6．本発明の組成物
【０１９０】
本組成物は、被験者への適切な投与のための形態が得られるよう、本発明の1以上の化合物（好ましくは、精製された形態のもの）の治療有効量を、適当な量の製薬上許容されるビヒクルと共に含有する。被験者に投与する場合、本発明の化合物および製薬上許容されるビヒクルは、好ましくは無菌性である。本発明の化合物を静脈内に投与する場合には、水が好ましいビヒクルである。食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射溶液用の液体ビヒクルとして使用することができる。適当な医薬ビヒクルには、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどのような賦形剤も含まれる。本組成物は、所望により、少量の湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝化剤を含有することも可能である。また、補助剤、安定剤、粘稠化剤、滑沢剤および着色剤を使用することが可能である。
【０１９１】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥法により製造することができる。医薬組成物は、薬学的に使用されうる製剤への本発明の化合物の加工を促進する1以上の製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して常法により製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路に左右される。
【０１９２】
本組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放剤、坐剤、エアゾール剤、噴霧剤の形態または使用に適した他の任意の形態をとることが可能である。1つの実施形態においては、製薬上許容されるビヒクルはカプセルである（例えば、Grosswaldら, 米国特許第5,698,155号を参照されたい）。適当な医薬ビヒクルの他の具体例は当技術分野において既に記載されている（Remington's Pharmaceutical Sciences, Philadelphia College of Pharmacy and Science, 17th Edition, 1985を参照されたい）。
【０１９３】
当技術分野においてよく知られているとおり、局所投与には、本発明の化合物を溶液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
【０１９４】
全身用製剤には、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与用に設計された製剤、および経皮、経粘膜、経口または肺投与用に設計された製剤が含まれる。全身用製剤は、気道粘膜の粘膜線毛クリアランスを改善し又は粘液粘度を減少させるもう1つの活性剤と組み合わせて製造することが可能である。これらの活性剤には、ナトリウムチャンネルブロッカー、抗生物質、N-アセチルシステイン、ホモシステインおよびリン脂質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１９５】
好ましい実施形態においては、本発明の化合物を、ヒトへの静脈内投与に適した組成物として、常法に従い製剤化する。典型的には、静脈内投与用の本発明の化合物は、無菌等張水性バッファー中の溶液である。注射には、本発明の化合物を水溶液、好ましくは、生理的に許容されるバッファー、例えばハンクス液、リンガー液または生理食塩水中で製剤化することができる。該溶液は、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化用物質を含有しうる。必要に応じて、該組成物は可溶化剤をも含みうる。静脈内投与用の組成物は、所望により、注射部位の痛みを緩和するためにリグノカインのような局所麻酔剤を含みうる。一般には、成分は別々に又は単位投与剤形［例えば、活性剤の量を表示したアンプルまたは薬袋（sachette）のような密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物］として一緒に混合されて供給される。本発明の化合物を輸液により投与する場合には、それを、例えば、無菌医薬等級の水または食塩水を含有する輸液ボトルに分注することが可能である。本発明の化合物を注射により投与する場合には、投与前に成分を混合することができるよう無菌の注射用水または食塩水のアンプルが提供されうる。
【０１９６】
経粘膜投与には、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野で公知である。
【０１９７】
経口送達用の組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤、顆粒剤、散剤、乳濁剤、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤の剤形でありうる。経口投与される組成物は、所望により、製薬上風味のある製剤を与える1以上の物質、例えば、甘味剤、例えば、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリン；香味剤、例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、またはサクランボ着色剤および保存剤を含有しうる。さらに、錠剤または丸剤の場合には、胃腸管内での崩壊および吸収を遅らせて長期間にわたる持続作用を得るために、該組成物をコーティングすることが可能である。浸透的に活性な駆動性（driving）化合物を包囲する選択透過性膜も、経口投与される本発明の化合物に適している。これらの後者の形態においては、該駆動性化合物が、カプセルを包囲する環境から流体を吸収し、膨潤して、開口から該物質または組成物を放出する。これらの送達形態は実質的にゼロ次の送達プロファイルを与えることが可能であり、これは、即時放出製剤の急上昇プロファイルとは対照的である。グリセロールモノステアラートまたはグリセロールステアラートのような時間遅延物質を使用することも可能である。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なビヒクルを含みうる。そのようなビヒクルは、好ましくは、医薬等級のものである。
【０１９８】
経口液体製剤（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および溶液剤）用の適当な担体、賦形剤または希釈剤には、水、食塩水、アルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）油、アルコール、pH 4〜pH 6の弱酸性バッファー（例えば、約5.0mM〜約50.0mMの酢酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩など）が含まれる。また、香味剤、保存剤、着色剤、胆汁酸塩、アシルカルニチンなどを加えることが可能である。
【０１９９】
バッカル（頬腔）投与には、該組成物は、常法により製剤化された錠剤、ロゼンジ剤などの剤形をとりうる。
【０２００】
ネブライザーおよび液体スプレー装置およびEHDエアゾール装置での使用に適した液体薬剤は、典型的には、製薬上許容されるビヒクルと共に本発明の化合物を含む。好ましくは、製薬上許容されるビヒクルは、アルコール、水、ポリエチレングリコールまたはパーフルオロカーボンのような液体である。所望により、本発明の化合物の溶液または懸濁液のエアゾール特性を改変するために、別の物質を加えることができる。好ましくは、この物質は、アルコール、グリコール、ポリグリコールまたは脂肪酸のような液体である。エアゾール装置での使用に適した液体薬物溶液または懸濁液の他の製剤化方法は当業者に公知である（例えば、Biesalski, 米国特許第5,112,598号; Biesalski, 米国特許第5,556,611号を参照されたい）。
【０２０１】
また、本発明の化合物は、直腸または膣用組成物、例えば坐剤または停留性浣腸剤（例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような通常の坐薬用基剤を含有するもの）として製剤化することも可能である。
【０２０２】
既に記載されている製剤に加えて、本発明の化合物はデポー製剤としても製剤化することが可能である。そのような長時間作用性製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、本発明の化合物は適当な高分子もしくは疎水性物質（例えば、許容しうる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体（例えば、難溶性の塩）として製剤化することが可能である。
【０２０３】
本発明の化合物が酸性である場合には、それは遊離酸、製薬上許容される塩、溶媒和物または水和物として前記製剤のいずれかに含めることができる。製薬上許容される塩は遊離酸の活性を実質的に保有し、塩基との反応により製造することが可能であり、対応する遊離酸形態と比べて水性および他のプロトン性溶媒に可溶性となる傾向にある。
6.7．用法および用量
【０２０４】
本発明の化合物またはその組成物は、一般には、意図される目的を達成するのに有効な量で使用される。本発明の化合物またはその組成物は、卵巣癌、腹膜癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、胃癌、小腸癌、甲状腺癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、急性肺疾患（例えば、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）および喘息）、表面上皮細胞損傷（例えば、経角膜冷凍および皮膚熱傷）および心血管疾患（例えば、虚血およびアテローム性硬化症）（これらに限定されるものではない）を含む疾患または障害を治療または予防するのに使用するために、治療に有効な量で投与または適用される。
【０２０５】
本明細書に開示されている個々の障害または症状の治療に有効な本発明の化合物の量は該障害または症状の性質に左右され、既に記載されているとおりの当技術分野で公知の標準的な臨床技術により決定されうる。また、最適な投与量範囲を決定するのを助けるために、in vitroまたはin vivoアッセイを用いることが可能である。もちろん、本発明の化合物の投与量は、種々の要因のなかでもとりわけ、治療する被験者（患者）、被験者の体重、疾患の重症度、投与方法および医師の判断に応じたものとなろう。
【０２０６】
例えば、１回の投与、複数回の適用または制御放出により、投与量を医薬組成物として送達することが可能である。好ましい実施形態においては、本発明の化合物を経口持続放出投与により送達する。好ましくは、この実施形態においては、本発明の化合物を1日2回（より好ましくは、1日1回）投与する。投与を断続的に反復したり、単独で又は他の薬物と組合せて提供したり、病態または障害の有効な治療に必要な限り継続することが可能である。
【０２０７】
経口投与に適当な投与量範囲は効力に左右されるが、一般には体重1kg当たり本発明の化合物約0.001mg〜約200mgである。投与量範囲は、当業者に公知の方法により容易に決定することができる。
【０２０８】
静脈内（i.v.）投与に適当な投与量範囲は体重1kg当たり約0.01mg〜約100mgである。鼻腔内投与に適する投与量範囲は一般には約0.01mg/kg体重〜約1mg/kg体重である。坐剤は一般には体重1kg当たり本発明の化合物約0.01mg〜約50mgを含有し、約0.5〜約10重量％の範囲の有効成分を含む。皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下または脳内投与のための推奨される投与量は約0.001mg〜約200mg/kg体重の範囲である。有効量は、in vitroまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿されうる。そのような動物モデルおよび系は当技術分野でよく知られている。
【０２０９】
好ましくは、ヒトでの使用の前に、所望の治療活性または予防活性に関して、本発明の化合物をin vitroおよびin vivoでアッセイする。例えば、本発明の特定の化合物または本発明の化合物の組合せが痙攣の軽減に好ましいかどうかを判定するために、in vitroアッセイを用いることができる。また、動物モデル系を使用して、本発明の化合物が有効かつ安全であることを実証することが可能である。
【０２１０】
好ましくは、本明細書に記載の本発明の化合物の治療に有効な量は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果をもたらす。本発明の化合物の毒性は、標準的な薬学的手法を用いて判定することが可能であり、当業者が容易に判定しうる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数である。本発明の化合物は、好ましくは、疾患および障害の治療において特に高い治療指数を示す。本明細書に記載の本発明の化合物の投与量は、毒性をほとんど又は全く示さない有効量を含む循環濃度の範囲内とするのが好ましい。
6.8．組合せ療法
【０２１１】
ある実施形態においては、本発明の化合物を少なくとも1つの他の治療剤との組合せ療法において使用することができる。本発明の化合物とその他の治療剤とは、相加的に、またはより好ましくは相乗的に作用しうる。好ましい実施形態においては、本発明の化合物を別の治療剤の投与と同時に投与する。もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の化合物を含む組成物を、本発明の化合物と同じ組成物または異なる組成物の一部でありうる別の治療剤の投与と同時に投与する。もう1つの実施形態においては、本発明の化合物を含む組成物を別の治療剤の投与の前または後に投与する。本発明の化合物および／または組成物と共に使用しうる他の治療剤には、Edg-1のアゴニストおよびアンタゴニスト、心血管疾患および／または癌を治療するために使用する薬物、例えば、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、慢性経口エトポシド、トポテカン、ゲムシタビン、ヘキサメチルアミン、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
6.9．アッセイ
【０２１２】
当業者は、Edg-1のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、以下のアッセイを用いることが可能である。
6.9.1．細胞内カルシウム測定アッセイ
【０２１３】
Edg-1受容体活性に関する具体的なアッセイは当業者に公知である。例えば、Edg-1受容体を発現する細胞を、膜透過性カルシウム感受性色素（例えば、Fluo-4 AM）または専売品のカルシウム色素ローディングキット（例えば、FLIPR Calcium Assayキット, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）と接触させることが可能である。細胞内カルシウムは該色素に結合し、適当な波長で照射されると蛍光放射を発することができる。したがって、該細胞に、該染料に適した波長を照射することが可能であり、発光を冷却CCDカメラにより捕捉することが可能である。蛍光の変化は、Edg-1受容体の活性化から生じた細胞内カルシウムの変化を示す。そのような変化は「リアルタイム」で細胞全体において有利に測定されうる（Berridgeら, Nature Reviews 2000, 1: 11-21）。典型的な方法は、2001年7月11日出願の同時係属米国特許出願第09/904,099号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０２１４】
細胞内カルシウムを測定するための他の方法は当業者に公知である。例えば、一般に用いられる技術は、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞内での、関心のある受容体の発現、およびそれに続く、カルシウム活性化塩素イオン流の測定である（Weber, 1999, Biochim Biophys Acta 1421:213-233を参照されたい）。また、いくつかのカルシウム感受性色素が、細胞内カルシウムの測定に利用可能である。そのような色素は膜透過性または膜非透過性でありうる。有用な膜透過性色素の具体例には、細胞内エステラーゼにより切断されて遊離酸（これは、もはや膜透過性ではなく、細胞内に捕捉されたままである）を生成しうるアセトキシメチルエステル形態の色素が含まれる。膜非透過性色素は、マイクロインジェクション、化学的透過化、スクレープローディング（scrape loading）および同様の技術により細胞内に導入することが可能である（Haughland, 1993, in "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity" Mason, W.T.編, pp 34-43; Academic Press, London; Haughland, 1996, in "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", sixth edition, Molecular Probes, Eugene, OR）。
6.9.2．IL-8およびVEGFアッセイ
【０２１５】
インターロイキン8（「IL-8」）および血管内皮増殖因子（「VEGF」）のレベルは、腫瘍細胞系の増殖能、血管新生能および転移能に関する重要なマーカーである。IL-8およびVEGFに関する具体的なアッセイは当業者に公知である。例えば、IL-8およびVEGFアッセイは、標準的な酵素結合イムノソルベントアッセイ（「ELISA」）（これに限定されるものではない）を含む技術により行うことができる。標準的なELISAにおいては、細胞を、例えば96ウェルフォーマット中で培養し、一晩にわたり血清飢餓に付し、LPAまたはS1Pで処理することができる。用量範囲は当業者に公知であろう。例えば、用量は無血清培地中0.1〜10μMの範囲としうる。ついで細胞上清を集めて、分泌されたIL-8またはVEGFの量を測定することが可能である。
【０２１６】
分泌されたIL-8またはVEGFの量を測定するための方法は当業者に公知である。1つの方法においては、抗IL-8または抗VEGF捕捉抗体を表面（例えば、プラスチック皿）上に吸着させる。ついで、IL-8またはVEGFを含有する細胞上清を該皿に加え、当技術分野で公知の抗体検出法を用いて抗IL-8または抗VEGF抗体を検出することが可能である。1つの実施形態においては、抗IL-8または抗VEGFビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン-HRPを使用して、基質溶液の添加およびマイクロタイタープレートリーダーを使用する比色測定により検出を行うことが可能である。IL-8またはVEGFのレベルは、標準曲線から非線形回帰解析により内挿することが可能である。
6.9.3．遊走および侵入アッセイ
【０２１７】
遊走および侵入アッセイは当業者に公知である。例えば、遊走アッセイは、化学誘引物質（例えば、LPAまたはS1Pが挙げられるが、これらに限定されるものではない）の濃度勾配に向かう、細胞系の走化能またはその遊走を測定するよう設計することができる。侵入アッセイは、例えば、基底膜を通過する細胞系の能力（転移形成の重要な特徴）を評価するよう設計することができる。
【０２１８】
当業者に公知の具体的なアッセイには、修飾されたボイデン・チャンバー（Boyden Chamber）アッセイが含まれ、このアッセイにおいては、細胞懸濁液を無血清培地中に調製し、トップチャンバーに加える。加える細胞の濃度（例えば、約105細胞/ml）は当業者に公知である。ついで適当な用量の化学誘引物質をボトムチャンバーに加える。インキュベーション時間の後、下方チャンバーに侵入した細胞の数を当技術分野で公知の方法により定量する。1つの実施形態においては、Fluoroblokフィルターインサートを使用し、該フィルターインサートを染色し、当技術分野で公知の手段により蛍光を検出することにより、下方チャンバーに遊走した細胞の数を定量することができる。蛍光レベルは遊走細胞の数に相関しうる。
6.9.4．増殖アッセイ
【０２１９】
増殖アッセイは、刺激物質（これは、Edg-1受容体の場合には、S1Pでありうる）に応答した細胞増殖の度合を定量する。細胞をプレーティングし、血清飢餓を伴って又は伴わずに刺激物質（例えば、S1P）で処理する。刺激物質の用量は0.1〜10μMの範囲とすることが可能であり、いずれの場合にも当業者により容易に決定されうる。典型的には、細胞増殖を測定する前に、細胞を数時間から数日間にわたり処理する。
【０２２０】
細胞増殖の度合を測定するための具体的な方法は当業者に公知である。例えば、1つの方法は、代謝的に活性なすべての細胞に存在するATPの生物発光測定である。ATPはヌクレオチド放出試薬（Nucleotide Releasing Reagent）の添加により抽出することが可能であり、その放出はATPモニター試薬（ATP Monitoring Reagent）の添加によりモニターすることが可能である。ATPとルシフェリンとからの発光を触媒するルシフェラーゼのような酵素を使用して、存在するATPの量を定量することができる。
6.9.5．サイクリックAMPアッセイ
【０２２１】
cAMPは細胞シグナル伝達において第2メッセンジャーとして作用し、プロテインキナーゼを活性化し、続いてプロテインキナーゼが酵素および転写因子をリン酸化するため、cAMP濃度はしばしば下流シグナル伝達経路の活性化状態の指標となる。Edg受容体のようなGPCRの場合、Gαi経路を介した共役は、ATPの分解およびcAMPの生成に関与する重要な酵素であるアデニリルシクラーゼ活性の阻害を引き起こす。したがって、まず、cAMPの生成を刺激することによりアデニリルシクラーゼ活性の阻害を測定するよう、アッセイを設計することが可能である。cAMP生成を刺激する化合物の一例として、フォルスコリンが挙げられる。フォルスコリンは該受容体を迂回し、アデニリルシクラーゼを直接的に活性化する。これらの条件下、Gαi共役受容体の活性化はフォルスコリンにより刺激されたcAMPを阻害し、そのような受容体におけるアンタゴニストは該阻害を逆転させるだろう。
【０２２２】
このアッセイは、当業者に公知の手段により行うことができる。例えば、細胞をプレーティングし、血清飢餓を伴って又は伴わずに処理することが可能である。cAMP産生を誘導するために、まず、細胞をフォルスコリンのような化合物で処理する。この後、Edg-1刺激物質（例えば、S1P）を加える。刺激物質の必要量は当技術分野でよく知られており、無血清培地中0.1〜10μMの範囲でありうる。インキュベーション時間の後、該細胞を溶解し、cAMPのレベルを測定する。
【０２２３】
cAMPアッセイは、当業者に公知の手段（例えば、競合イムノアッセイの実施）により行うことができる。細胞ライセートを、抗cAMP抗体で予めコートされたプレートに、cAMP-APコンジュゲートおよび二次抗cAMP抗体と共に加える。検出は、基質溶液の使用および化学発光の測定（これらに限定されるものではない）を含む任意の適当な手段により行うことができる。
7．実施例
【０２２４】
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に詳しく特定される。これらの実施例は、本発明の化合物および組成物の製造、ならびに本発明の化合物および組成物を使用するためのアッセイを詳しく説明している。本発明の範囲から逸脱することなく物質および方法の両方に対する多数の変更を実施しうることが当業者には明らかであろう。
7.1．実施例1：  101の合成
【化１５】
2005533852.tif 000017
【０２２５】
エタノール（約2 mL）およびトルエン（50 mL）中に溶解した1-(4-クロロフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（0.883 g, 3.17 mmol）とニコチン酸ヒドラジド（0.448 g, 3.17 mmol）の溶液を還流温度で加熱した。2日後、該反応混合物を真空中で濃縮し、粗残留物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィー（98:2 CH2Cl2/MeOH）に付した。不純生成物をエタノールから再結晶して、5-(4-クロロフェニル)-2-ピリジン-3-イルメチル-3-トリフルオロメチル-3,4-ジヒドロ-2H-ピラゾール-3-オール（0.134 g, 収率11％）を淡黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.24 (m, 1H), 8.79 (m, 1H), 8.27 (m, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.42 (m, 3H), 6.47 (s, 1H), 3.74 (d, 1H), 3.75 (d, 1H)。ESI-MS m/z: 370 [C16H11ClF3N3O2 + H]+。m.p.（融点） 158〜160℃。
7.2．実施例2：  102の合成
7.2.1．1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオンの製造
【化１６】
2005533852.tif 000018
【０２２６】
メトキシ tert-ブチルエーテル（0.5 L）中に溶解したトリフルオロ酢酸エチル（81.0 mL, 0.452 mol）の溶液に、ナトリウムメトキシド（メタノール中の30重量％, 102 mL, 0.542 mol）を室温でゆっくり加えた。該反応は発熱し、氷浴で室温まで冷却した。4'-ブロモアセトフェノン（90.0 g, 0.452 mol）を該反応混合物に、10分間かけて、分割して加え、該反応混合物を室温で一晩撹拌した。有機層を塩酸（3N, 300 mL）、ブライン（l00 mL）で洗浄し、乾燥（硫酸マグネシウム）し、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をヘキサンから5回再結晶して、1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（96.5 g, 72％）を淡黄色固体として得た。1H NMR (300 MHz, CDC13) δ 11.9 (s, 1H), 7.83-7.75 (m, 2H), 7.68-7.60 (m, 2H), 6.54 (s, 1H)。
7.2.2．[3-(4-ブロモフェニル)-5-トリフルオロメチルピラゾール-1-イル]ピリジン-3-イル-メタノンの製造
【化１７】
2005533852.tif 000019
【０２２７】
無水エタノール（0.7 L）中の1-(4-ブロモフェニル)-4,4,4-トリフルオロ-1,3-ブタンジオン（55.2 g, 0.187 mol）とニコチン酸ヒドラジド（25.6 g, 0.187 mol）との混合物を還流温度で一晩撹拌した。該反応混合物を室温まで冷却し、ついで真空中で濃縮した。粗残留物をトルエン（0.7 L）中に取り、還流温度で2日間撹拌した。該混合物を冷却し、ついで真空中で濃縮した。残留物をメトキシ tert-ブチルエーテル（0.4 L）で処理し、55℃で30分間撹拌した。固体を濾去し、母液を真空中で濃縮した。粗残留物をクロマトグラフィー（シリカゲル, 0.5％ メタノール／塩化メチレン）により精製して、[3-(4-ブロモフェニル)-5-トリフルオロメチルピラゾール-1-イル]ピリジン-3-イル-メタノン（13.0 g, 17％）を白色固体として得た: mp 150〜152℃; 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 9.11-8.92 (m, 1H), 8.69-8.58 (m, 1H), 8.38-8.20 (m, 1H), 7.74-7.42 (m, 5H), 3.95 (d, 1H), 3.60 (d, 1H); ESI MS m/z 414 [C16HllBrF3N3O2 + H]+。
7.3．実施例3：  104の合成
【化１８】
2005533852.tif 000020
【０２２８】
水酸化カリウムペレット（85％, 5.76g, 87.3 mmol, 17.5当量）をメタノール（12 mL）に溶解した。該混合物を氷浴で冷却し、メタノール（15 mL）中に溶解したp-クロロニトロベンゼン（788 mg, 5 mmol）と3,4,5-トリメトキシフェニルアセトニトリル（Acros, 1.140 g, 5.5 mmol）の溶液を滴下した（Davis, R.B.; Pizzini, L.C. J. Org. Chem. 1960,25, 1884-1888参照）。その暗紫色の反応混合物をゆっくりと一晩かけて室温まで加温し、ついで水（250 mL）中に注いだ。沈殿物を吸引濾過により集め、水で数回洗浄し、風乾し、酢酸エチル／ヘキサン（1:10、1:6、および1:4）を使用するシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーに付した。5-クロロ-3-(3,4,5-トリメトキシ-フェニル)ベンゾ[c]イソキサゾールを淡黄色固体（405 mg, 収率25％）として単離した。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.75 (m, 1H), 7.59 (m, 1H), 7.27 (m, 1H), 7.16 (s, 2H), 4.01 (s, 6H), 3.96 (s, 3H)。APCI-MS: m/z 320 [C16H14ClN04 + H]+。m.p. 119〜120℃。
【０２２９】
鉄粉末（183 mg, 3.28 mmol, 3当量）、エタノール（4 mL）、水（2 mL）および酢酸（6 mL）の混合物を60℃（油浴）に予め加熱した。ついでメタノール（10 mL）中の5-クロロ-3-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-ベンゾ[c]イソキサゾール（350 mg, 1.10 mmol）を加え、該反応混合物をその温度で30分間、ついで95〜98℃で一晩撹拌した。溶媒のほとんどをロータリーエバポレーターにより除去し、残留物をジクロロメタン（100 mL）で希釈した。不溶性無機物を濾過により除去し、濾液をロータリーエバポレーターにより濃縮した。得られた固体を、酢酸エチル／ヘキサン（1: 10、1:6、1:4、および1:2）を使用するシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーに付した。(2-アミノ-5-クロロフェニル)-(3,4,5-トリメトキシフェニル)メタノンを黄色固体（315 mg, 収率89％）として単離した。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.35 (m, 1H), 7.24 (m, 1H), 6.91 (s, 2H), 6.83 (m, 1H), 3.86 (s, 6H), 3.85 (s, 3H)。APCI-MS: m/z 322 [C16H16ClN04 + H]+。m.p. 141〜142℃。
7.4．実施例4：  化合物101、102および103によるEdg-1受容体の選択的阻害
【０２３０】
101、102および103は、Edg-1刺激S1P応答の阻害を実証する一連の化合物の代表例である。ヒトEdg-1受容体を発現するHTC細胞において、該化合物を試験した。ラット肝癌細胞系HTCは、検出可能なレベルのいずれの公知Edg受容体をも発現しない。したがって、この細胞内に組換え的に導入すると、Edg-1を分離して試験できるため、HTCは有用な系であることが判明した。最初に該化合物をこの組換え系において試験し、ついでEdg-1（および他のEdg受容体）を発現する細胞において試験した。
【０２３１】
図1は、101がEdg-1受容体を特異的に阻害したことを示している。101は、20μMもの高濃度において、Edg-2、Edg-4またはEdg-7受容体を発現するHTC細胞においてはLPA刺激カルシウム増加を阻害せず、また、Edg-3、Edg-5、Edg-6またはEdg-8を発現するHTC細胞においてもS1P刺激カルシウム増加を阻害しなかった。
【０２３２】
図2は、もう1つのEdg-1アンタゴニストである102がEdg-1受容体を特異的に阻害したことを示している。102は、20μMもの高濃度において、Edg-2、Edg-4またはEdg-7受容体を発現するHTC細胞においてはLPA刺激カルシウム増加を阻害せず、また、Edg-3、Edg-5、Edg-6またはEdg-8を発現するHTC細胞においてもS1P刺激カルシウム増加を阻害しなかった。
【０２３３】
図3は、もう1つのEdg-1アンタゴニストである103がEdg-1受容体を特異的に阻害したことを示している。103は、20μMもの高濃度において、Edg-2、Edg-4またはEdg-7受容体を発現するHTC細胞においてはLPA刺激カルシウム増加を阻害せず、また、Edg-3、Edg-5、Edg-6またはEdg-8を発現するHTC細胞においてもS1P刺激カルシウム増加を阻害しなかった。
【０２３４】
図4は、Edg-1アンタゴニスト101がヒト臍帯静脈内皮細胞においてS1P誘導カルシウム応答を用量依存的に阻害することを示している。カルシウム動員アッセイは後記7.10節に従って実施した。
【０２３５】
図5は、Edg-1アンタゴニスト102がヒト臍帯静脈内皮細胞においてS1P誘導カルシウム応答を用量依存的に阻害することを示している。カルシウム動員アッセイは後記7.10節に従って実施した。
【０２３６】
表2には、Edg-1に対する101、102および103の選択性も示されている。表2は、Edg-1に対する、他のEdg受容体と比較した場合の101、102および103の選択性を示している。表3は、GPCRおよびイオンチャンネルを含む標的の一覧であり、これらに対して101（10μM）は標準的な結合アッセイで活性をまったく示さなかった。放射性リガンド結合アッセイは7.15節に記載のとおりに行った。
7.5．実施例5：  101および301はHUVECによるS1P刺激走化性を阻害する
【０２３７】
前記のとおり、101はEdg-1介在S1P応答を選択的に阻害する。Edg-1に加えて、Edg-3およびEdg-6を含む他のEdg受容体もS1P刺激走化性に関与している。S1P刺激走化性におけるEdg-1受容体およびEdg-3受容体の相対的役割を評価するために、S1Pがトランス-マトリゲル（trans-matrigel）走化性を誘発する能力を、Edg-1アンタゴニスト101、Edg-3アンタゴニスト301および101と301との組合せの存在下で試験した。これらの実験は、後記7.12節に記載の遊走および侵入アッセイプロトコールに従って行った。Edg-3アンタゴニスト301（3-メチル-2-フェニル-キノリン-4-カルボン酸 4-フルオロ-ベンジルアミド）は同時係属米国特許出願第10/390,426号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。301は、米国特許出願第10/390,426号においては化合物101として記載されている。さらに、301は化合物番号AK-968/12971392としてSpecs（オランダ）から商業的に入手可能である。
【０２３８】
図10はこれらの実験の結果を示し、化合物101および化合物301が共に、S1P刺激走化性を阻害することを示している。また、101は、301より強力な、S1P刺激走化性のインヒビターである。さらに、その結果は、101および301の阻害効果が相加的であることを示しており、このことは、Edg-1のアゴニストおよび／またはアンタゴニストとEdg-3もしくは他のEdg受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストとの組合せが本発明の方法において有用でありうることを示唆している。
7.6．実施例6：  104はEdg-1受容体の選択的アゴニストである
【０２３９】
Edg-1アゴニスト104の選択性を表4に示す。表4は、他のEdg受容体と比較した、Edg-1に対する104の選択性を示している。104は、25μMもの高濃度においても、Edg-2、Edg-3、Edg-4、Edg-5、Edg-6、Edg-7またはEdg-8受容体を発現するHTC細胞においてはカルシウム応答を惹起しなかった。カルシウム動員アッセイは後記7.10に従って行った。
7.7．実施例7：  S1PおよびEdg-1アゴニストはexodus-2に対する走化性応答を調節する
【０２４０】
Edg-1受容体およびEdg-6受容体はナイーブCD4およびCD8細胞においては強く発現されるが、抗原にさらされたCD4およびCD8細胞においては、それほど強くは発現されない。いずれの理論または作用メカニズムにも束縛されるものではないが、Edg-1およびEdg-6受容体は、CD4およびCD8リンパ球が抗原にさらされるコンパートメントへそれらのリンパ球を導くCD4およびCD8リンパ球サイトカインの感受性を調節すると考えられる。このメカニズムの一部として、Edg-1は、例えばexodus-2を含むサイトカインに対するリンパ球の走化性応答をモジュレーションする。
【０２４１】
このモジュレーションを評価し、この効果に対するEdg-1アゴニストおよびアンタゴニストの効果を試験するために、exodus-2に対するマウスCD4 T細胞の走化性応答をS1PおよびEdg-1アゴニスト104の存在下で試験した。これらの実験は、後記7.12節に記載の遊走および侵入アッセイプロトコールに従って行った。
【０２４２】
図11はこれらの実験の結果を示す。これは、S1Pおよび104が共に、exodus-2に対するマウスCD4 T細胞の走化性に対して釣り鐘状の用量依存的応答曲線を示すことを表している。S1Pおよび104の低濃度および高濃度では、exodus-2に対する走化性応答は脱感作されるが、中等度の濃度のS1Pおよび104はexodus-2に対する走化性応答を刺激する。さらに、S1Pおよび104は、exodus-2に対する走化性応答に対して同様のプロファイルを示すが、走化性応答に対して同じ効果を奏するためには、104がS1Pより高い濃度を必要とする。
【０２４３】
exodus-2に対する走化性応答のS1P調節に対するEdg-1アンタゴニストの効果も評価した。この実験は、後記7.12節に記載の遊走および侵入アッセイプロトコールに従って行った。図12は、exodus-2に対する走化性応答のS1P介在刺激および脱感作を逆転させるEdg-1アンタゴニストFTY720および102の能力を試験する実験の結果を示す。中等度のS1P濃度においては、FTY720および102はexodus-2に対する走化性応答のS1P介在刺激を阻害する。高いS1P濃度においては、FTY720および102はexodus-2に対する走化性応答のS1P介在脱感作を逆転させる。このように、これらのEdg-1アンタゴニストはexodus-2介在走化性のS1Pによる調節の両面に拮抗しうる。
7.8．実施例8：  101、102および104によるS1P介在遊走の阻害または刺激
【０２４４】
S1Pは、ヒトPBMCに対する強力な化学誘引物質である。この効果にはS1P受容体（注目すべきはEdg-1）が介在すると考えられている（Mandalaら, Science 2002; Lynchら, JBC 2002; Goetzl, 私信）。この仮説を試験するために、また、S1P介在走化性に対するEdg-1アゴニストおよびアンタゴニストの効果を判定するために、いくつかの遊走アッセイを行った。遊走アッセイは、後記7.12節に記載のプロトコールに従って行った。これらのアッセイの結果を図6、図7、図8、図9および図13に示す。
【０２４５】
図13は、S1PがヒトPMBCを用量依存的に誘引することを示している。図7は、Edg-1アゴニスト104が、S1Pよりは相当に弱いものの、0.5〜100μMの濃度でヒト臍帯静脈内皮細胞の侵入を刺激することを示している。さらに、図9は、104がマイクロモル濃度でヒト末梢血単核細胞の遊走をも刺激することを示している。このように、104は、S1Pと同様に、Edg-1受容体を発現する細胞を誘引しうる。
【０２４６】
さらに、図6および8は、Edg-1アンタゴニストがS1Pおよび104介在走化性を阻害しうることを示しており、このことは、S1P化学誘引物質の効果がEdg-1受容体により媒介されるらしいことを示している。図6は、Edg-1アンタゴニスト102がS1P誘発性マトリゲル侵入を阻害することを示しており、一方、図8は、Edg-1アンタゴニスト101が104誘発性マトリゲル侵入を阻害することを示している。
7.9．実施例9：  Edg-1受容体はリンパ球の移動(trafficking)をin vitroおよびin vivoで調節する
【０２４７】
リンパ球の移動におけるEdg-1受容体の役割をさらに詳しく解明するために、マウスT細胞の遊走をin vitroおよびin vivoの両モデルにおいて分析した。まず、マトリゲルの層で隔てられた、8μmの孔幅を有するポリカーボネート繊維を有するトランスウェル（Transwell）チャンバー（Costar, Cambridge, MA）において、マウスT細胞の遊走を試験した。刺激物質S1Pまたはexodus-2を別々にボトムチャンバーに加えた。exodus-2の効果を、単独で、またはS1Pの存在下、またはS1PとEdg-1アンタゴニスト101および102の存在下で試験した。
【０２４８】
図14はこの実験の結果を示す。高濃度のS1Pは単独ではT細胞の遊走を刺激せず、exodus-2はT細胞の遊走を刺激することを、データは示している。一方、101および102はS1Pの存在下においてもexodus-2刺激遊走を増強する。このように、Edg-1アンタゴニストは、in vitroにおいて、exodus-2へのT細胞の遊走のS1P介在阻害を逆転しうる。
【０２４９】
マウスT細胞の遊走をin vivoで試験するために、マウスリンパ球を誘引するexodus-2の能力をマウス背側エアーポーチモデルにおいて評価した。これらの実験では、5mlの濾過空気を皮下注射することにより形成させた背側エアーポーチ内に、0.5mlの1μM exodus-2を導入した。マウス脾CD4 T細胞をFM-DiI（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で蛍光標識し、ついでS1P（1μM）、102または104で処理した。処理されたCD4 T細胞を腹腔内に導入した。24時間後、背側エアーポーチからの洗浄液（1ml）を蛍光に関してアッセイした。
【０２５０】
図15はこの実験の結果を示す。データは、Edg-1受容体と、Edg-1受容体をモジュレーションする化合物とが、マウス背側エアーポーチモデルにおいてリンパ球の移動を調節しうることを示している。特に、PBSで処理されたリンパ球は化学誘引物質exodus-2に遊走するが、S1PまたはEdg-1アゴニスト104で処理されたリンパ球は遊走しない。このように、in vivoマウス背側エアーポーチ動物モデルから、Edg-1受容体のS1Pまたは104刺激はexodus-2による誘引に対してリンパ球を脱感作することが確認される。さらに、このS1P介在脱感作は選択的Edg-1アンタゴニスト102との共処理により逆転されうる。
【０２５１】
これらの実験は、S1Pが、exodus-2により例証されるように、種々の走化性因子に対して応答するリンパ球の能力を調節することを証明している。これらの実験はさらに、そのような走化性因子に応答する能力のS1P依存的調節には、少なくとも部分的に、Edg-1受容体が介在することを示している。最後に、これらの実験は、選択的Edg-1アゴニストおよびアンタゴニストの使用によりこの調節を成功裏に操作することができ、望みどおりに増大したまたは減少したリンパ球のホーミングおよび移動を可能にしうることを示している。
7.10．実施例10：  細胞内カルシウム測定アッセイ
【０２５２】
Edg-1のようなLPA受容体はカルシウムエフェクター経路に共役し、受容体の活性化後に細胞内カルシウムの増加を引き起こす（An, 1998, J. Cell Biochem. Supp 30-31:147-157）。この生物学的応答は、蛍光イメージングプレートリーダー（Fluorescence Imaging Plate Reader: FLIPR; Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用する非常に効率のよいハイスループットスクリーニングに役に立つ。FLIPRシステムは、冷却CCDカメラを使用する連続的な蛍光検出を伴う、リアルタイムの、細胞に基づいたアッセイシステムである。Edg-1受容体のスクリーニングを開発するために、FLIPRシステムを使用した。Edg-1/3i3キメラまたはEdg-1とGqiとを安定に発現するラット肝癌細胞を384ウェルプレート上にプレーティングし、カルシウム色素ローディングキット（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で室温にて1時間ローディングした。ついで細胞をFLIPR384（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）に配置し、アルゴンレーザーにより488nmで励起した。全384ウェルプレートに関するデータを毎秒、アップデートした。内臓自動ピペッターは、該プレートの各ウェル内への化合物の同時添加を可能にした。
7.11．実施例11：  IL-8およびVEGFアッセイ
【０２５３】
IL-8およびVEGFアッセイは、標準的な酵素結合イムノソルベントアッセイ（「ELISA」）技法により行った。細胞を96ウェルフォーマットで培養し、一晩にわたり血清飢餓に付し、LPAまたはS1P（用量は無血清培地中0.1〜10μMの範囲とする）で24時間処理した。ついで、細胞上清を集め、分泌されたIL-8の量を測定する。
【０２５４】
このアッセイは標準的なサンドイッチELISAであり、この場合、抗IL-8またはVEGF捕捉抗体をプラスチック皿上に吸着させた。IL-8またはVEGFを含有する細胞上清を該皿に加え、ついで抗IL-8／VEGFビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン-HRPを加えた。
【０２５５】
検出は、基質溶液の添加およびマイクロタイタープレートリーダーを使用する比色測定によるものであった。IL-8またはVEGFのレベルを、標準曲線から非線形回帰分析により内挿した。
【０２５６】
すべての試薬はR＆D Systems (Minneapolis, MN)から入手した：MAB208およびAF-293-NA（それぞれIL-8およびVEGFに対する捕捉抗体）、BAF208およびBAF-293（それぞれIL-8およびVEGFに対する検出抗体）、208-IL-O10および293-VE-010（それぞれ組換えヒトIL-8タンパク質標品および組換えヒトVEGFタンパク質標品）、DY998（ストレプトアビジン-HRP）、DY999（基質溶液）。
7.12．実施例12：  遊走および侵入アッセイ
【０２５７】
Fluoroblokフィルターインサートプレート（8μM孔径）またはFluoroblokマトリゲルコーティングフィルターインサートプレート（Becton Dickinson, San Diego, CA）を使用して、細胞を24ウェルフォーマットにプレーティングした。このアッセイは、改変されたボイデン・チャンバーアッセイであり、この場合、細胞懸濁液（1×105細胞/ml）を無血清培地中に調製し、トップチャンバーに加えた。LPAまたはS1P（用量は無血清培地中0.1〜10μMの範囲とする）をボトムチャンバーに加えた。20〜24時間のインキュベーション後、ハンクス平衡塩類溶液中の4μg/ml カルセインAM（Molecular Probes, Sunnyvale, CA）を含有する新鮮な24ウェルプレートに該フィルターインサートを移し、1時間染色することにより、ボトムチャンバーに遊走または侵入した細胞の数を定量した。
【０２５８】
検出は、蛍光光度計を使用する蛍光測定（450nmの励起／530nmの発光）により行った。蛍光のレベルは細胞数と相関した。
【０２５９】
ほとんどの細胞型の場合、さらなる操作は不要であった。しかし、CaOV3ヒト卵巣癌細胞の場合、細胞懸濁液を調製する前に、該細胞を一晩にわたり血清飢餓に付すことが必要であった。さらに、該フィルターインサートに、ラット尾コラーゲンIの1mg/ml溶液（BD, San Diego, CA）をコーティングした。
【０２６０】
ヒトPBMCをスタンフォード血液センターからの健常ドナーのバッフィーコートから単離する。血液をPBSで1回洗浄し、ついでフィコール勾配上に重層し、400gで45分間遠心分離する。白色の単核細胞層を取り出し、PBSで3回洗浄する。ついで該細胞を、5μg/ml PHAと100ng/ml 組換えヒトIL-2とを含有する完全RPMIに再懸濁させ、T175フラスコ中、1×106 細胞/mlの細胞密度で培養する。培養下での維持のために、細胞を3〜5日ごとに洗浄し、新鮮なRPMI＋IL-2中に再懸濁させた。
7.13．実施例13：  増殖アッセイ
【０２６１】
細胞を96ウェルフォーマットにプレーティングした。処理は、血清飢餓を行うことなく直接実施し、典型的には、無血清培地中0.1〜10μMの範囲のLPAまたはS1P用量を含むものであった。細胞を24〜48時間処理した後、細胞増殖の度合を測定した。
【０２６２】
このアッセイは、Bio Whittaker (Rockland, ME)からのViaLight HSキットを使用して行った。このキットは、代謝的に活性なすべての細胞に存在するATPの生物発光測定に基づくものである。反応は、ATPとルシフェリンからの光の発生を触媒する酵素ルシフェラーゼを利用するものであった。発生した光強度は、細胞数と相関するATP濃度と線形に関係していた。
【０２６３】
細胞増殖の測定には、ヌクレオチド放出試薬（Nucleotide Releasing Reagent）の添加およびそれに続くATPモニター試薬（ATP Monitoring Reagent）（いずれもキットとして提供される）の添加によるATPの抽出が必要であった。検出は、EG＆G Berthold Luminometer (Gaithersburg, MD)を使用して化学発光により行った。
7.14．実施例14：  cAMPアッセイ
【０２６４】
細胞を96ウェルフォーマットにプレーティングした。処理は、血清飢餓を行うことなく直接実施した。該細胞をフォルスコリンで処理してcAMP産生を誘導し、ついで無血清培地中0.1〜10μMの範囲のLPAまたはS1P用量で処理した。30分間のインキュベーション後、該細胞を溶解し、cAMPのレベルを測定した。
【０２６５】
cAMPアッセイは、Tropix cAMP-Screen（Applied BioSystems, Foster City, CA）を使用して行った。スクリーニングは、抗cAMP抗体をプレコーティングした96ウェルアッセイプレートを使用する競合イムノアッセイである。細胞ライセートを、cAMP-APコンジュゲートおよび二次抗cAMP抗体と共に、プレコーティングしたプレートに加えた。
【０２６６】
検出は、基質溶液および化学発光の測定を用いて行った。化学発光のレベルはcAMPのレベルに反比例し、標準曲線から算出された。
7.15．実施例15：  薬理学プロファイリング（選択性アッセイ）
【０２６７】
化合物の選択性を試験するために、以下に挙げた多数の非Edg受容体標的を使用して、種々の酵素アッセイおよび放射性リガンド結合アッセイを行った。
【０２６８】
GreengrassおよびBremner, 1979, Eur. J Pharmacol. 55:323-326の方法に従い、アドレナリン作動性α1を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。BoyajianおよびLeslie, 1987, J Pharmacol. Exp. Ther. 241:1092-1098の方法に従い、アドレナリン作動性α2を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Feveら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5677-5681の方法に従い、アドレナリン作動性βを使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Whitebreadら, 1991, Biachem. Biaphys. Res. Camm. 181:1365-1371の方法に従い、アンギオテンシンAT2を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Ehlertら, 1982, Life Sci. 30:2191-2202の方法に従い、カルシウムチャンネルL型、ジヒドロピリジンを使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Bunzoら, 1988, Nature 336:783-787の方法に従い、ドーパミンD2Lを使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Miharaら, 1994, J Pharmacol. Exp Ther. 268:1122-1127の方法に従い、エンドセリンETAを使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Hillら, 1978, J Neurachem. 31:997-1004の方法に従い、ヒスタミンH1、中枢(Central)を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。LuthinおよびWolfe, 1984, J Pharmacol. Exp. Ther. 228:648-655の方法に従い、ムスカリン性、非選択的、中枢を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。Middlemiss, 1984, Eur. J Pharmacol. 101:289-293の方法に従い、セロトニン5-HT1、非選択的を使用して放射性リガンド結合アッセイを行った。
7.15.1．放射性リガンド結合アッセイ
1．アドレナリン作動性α1、非選択的（Broadhurstら, 1988, Life Sci. 43:83-92）
起源：Wistarラットの脳
リガンド：0.25nM 3H プラゾシン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で30分間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, 0.1％ アスコルビン酸, 10μM 
非特異的リガンド：0.1μM フェントラミン
Kd：0.29nM *
Bmax：0.095pmol/mg タンパク質*
特異的結合：90％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
2．アドレナリン作動性α2（BoyajianおよびLeslie, 1987, J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:1092-1098）
起源：Wistarラットの大脳皮質
リガンド：0.7nM 3H ラウオルシン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で30分間
インキュベーションバッファー：20mM HEPES, 2.5mM Tris-HCl, pH7.4（25℃）
非特異的リガンド：0.1μM ヨヒンビン
Kd：7.8nM *
Bmax：0.36pmol/mg タンパク質*
特異的結合：80％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
3．アドレナリン作動性β（Feveら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5677-5681）
起源：Wistarラットの脳
リガンド：0.25nM 3H ジヒドロアプレノロール
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で20分間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, pH7.4
非特異的リガンド：1μM S(-)-プロプラノロール
Kd：0.5nM *
Bmax：0.083pmol/mg タンパク質*
特異的結合：85％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
4．アンギオテンシンAT2（Whitebreadら, 1991, Biochem. Biophys. Res. Comm.181:1365-1371）
起源：ヒト組換えHela細胞
リガンド：0.025nM 125I CGP-42112A
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：37℃で3時間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, 5mM MgCl2, 0.1％ BSA, 1mM EDTA, pH7.4
非特異的リガンド：10μM [Sar1, Ile8]-Ang II
Kd：0.012nM *
Bmax：2.9pmol/mg タンパク質*
特異的結合：90％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
5．カルシウムチャンネルL型, ジヒドロピリジン（Ehlertら, 1982, Life Sci. 30:2191-2202）
起源：Wistarラットの大脳皮質
リガンド：0.1nM 3H ニトレンジピン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で90分間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, pH7.7
非特異的リガンド：1 μM ニトレンジピン
Kd：0.18nM *
Bmax：0.23pmol/mg タンパク質*
特異的結合：91％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
6．ドーパミンD2L（Bunzoら, 1988, Nature 336:783-787）.
起源：ヒト組換えCHO細胞
リガンド：0.16nM 3H スピペロン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で2時間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 1.4mM アスコルビン酸, 0.001％ BSA
非特異的リガンド：10μM ハロペリドール
Kd：0.08nM *
Bmax：0.48pmol/mg タンパク質*
特異的結合：85％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
7．エンドセリンETA（Miharaら, 1994, J Pharmacol. Exp Ther. 268:1122-1127）
起源：ヒト組換えCHO細胞
リガンド：0.03nM 125I エンドセリン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：37℃で2時間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, pH7.4, 0.5mM CaCl2, 0.1％ バシトラシン, 0.05％ Tween-20, 1mg/ml BSA
非特異的リガンド：0.1μM エンドセリン-1
Kd：0.048nM *
Bmax：0.35pmol/mg タンパク質*
特異的結合：90％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
8．ヒスタミンH1, 中枢（Central）（Hillら, 1978, J Neurochem. 31:997-1004）
起源：モルモット小脳
リガンド：1.75nM 3H ピリラミン
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で60分間
インキュベーションバッファー：50mM リン酸 K-Naバッファー pH7.4（25℃）
非特異的リガンド：1μM ピリラミン
Kd：0.23nM *
Bmax：0.198pmol/mg タンパク質*
特異的結合：90％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
9．ムスカリン性非選択的, 中枢（Central）（LuthinおよびWolfe, 1984, J. Pharmacol. Exp. Ther. 228:648-655）
起源：Wistarラット大脳皮質
リガンド：0.29nM 3H キヌクリジニル ベンジラート
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で60分間
インキュベーションバッファー：50mM リン酸Na-K, pH7.4
非特異的リガンド：0.1μM アトロピン
Kd：0.068nM *
Bmax：1.4pmol/mg タンパク質*
特異的結合：97％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
10．セロトニン5-HT1、非選択的（Middlemiss, 1984, Eur. J. Pharmacol. 101:289-293）
起源：Wistarラット大脳皮質
リガンド：2nM 3H セロトニン(5-HT)トリフルオロアセタート
ビヒクル：0.4％ DMSO
インキュベーション時間／温度：25℃で10分間
インキュベーションバッファー：50mM Tris-HCl, 0.1％ アスコルビン酸, 10μM パルギリン, 4mM CaCl2, pH7.6
非特異的リガンド：10μM 5-HT(セロトニン)
Kd：0.61nM *
Bmax：0.58pmol/mg タンパク質*
特異的結合：80％ *
定量方法：放射性リガンド結合
有意性基準：最大刺激または阻害の50％以上
* 履歴的数値
【０２６９】
最後に、本発明を実施するための代替的方法が存在することに留意すべきである。したがって、本実施形態は例示に過ぎず、限定的なものではないとみなされるべきであり、本発明は、本明細書に記載の細部に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で修飾されうる。
【０２７０】
本明細書中に引用されている全ての刊行物および特許の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【表１】
2005533852.tif 000021
2005533852.tif 000022
2005533852.tif 000023
【表２】
2005533852.tif 000024
【表３】
2005533852.tif 000025
【表４】
2005533852.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１】Edg-1受容体に対する101の選択性を示す。
【図２】Edg-1受容体に対する102の選択性を示す。
【図３】Edg-1受容体に対する103の選択性を示す。
【図４】ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるカルシウム応答に対するEdg-1アンタゴニスト101の効果を示す。
【図５】ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるカルシウム応答に対するEdg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【図６】ヒト臍帯静脈内皮細胞のS1P刺激マトリゲル（matrigel）侵入に対する10μM Edg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【図７】ヒト臍帯静脈内皮細胞の侵入に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【図８】ヒト臍帯静脈内皮細胞によるEdg-1アゴニスト104刺激侵入に対するEdg-1アンタゴニスト101の効果を示す。
【図９】ヒト末梢血単核細胞（「PMBC」）の遊走に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【図１０】ヒト臍帯静脈内皮細胞によるS1P刺激侵入に対するEdg-1アンタゴニスト101、Edg-3アンタゴニスト301、および101と301との組合せの効果を示す。
【図１１】exodus-2へのマウスCD4 T細胞走化性応答に対するEdg-1アゴニスト104の効果を示す。
【図１２】exodus-2へのマウスCD4 T細胞走化性応答のS1P調節に対するFTY720およびEdg-1アンタゴニスト102の効果を示す。
【図１３】S1PへのPBMCの遊走を示す。
【図１４】in vitroでのリンパ球の遊走の、Edg-1による調節を示す。
【図１５】マウス背側エアーポーチ（air-pouch）におけるリンパ球の遊走の、Edg-1による調節を示す。
【図１】
2005533852.tif 000034
【図２】
2005533852.tif 000035
【図３】
2005533852.tif 000036
【図４】
2005533852.tif 000037
【図５】
2005533852.tif 000038
【図６】
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【図７】
2005533852.tif 000040
【図８】
2005533852.tif 000041
【図９】
2005533852.tif 000042
【図１０】
2005533852.tif 000043
【図１１】
2005533852.tif 000044
【図１２】
2005533852.tif 000045
【図１３】
2005533852.tif 000046
【図１４】
2005533852.tif 000047
【図１５】
2005533852.tif 000048
【国際調査報告】
2005533852.tif 000049
2005533852.tif 000050
2005533852.tif 000051