(57)【要約】  本発明は、概して固相血小板依存性血管閉塞剤をターゲティングし、送達する方法及び組成物に関する。詳細には、血小板結合剤で被覆した粒子又はコイル又はステントを、充実性腫瘍の塊又は動静脈奇形又は動脈瘤又はエンドリーク（endoleak）の脈管構造などの標的脈管構造を対象にし；それから固相剤が血小板を結合し、活性化し、該血小板が他の血小板を結合し、活性化する。このような作用の結果、血小板によって媒介された血栓が固相剤周辺に迅速に形成され、血管の閉塞が引き起こされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管が新生した腫瘍又は増殖性組織を治療する方法であり、該方法は、血管が新生した腫瘍又は増殖性組織を有する哺乳類に、血小板を結合することが可能な結合剤を含む固相剤を投与し、続いて生体内で血栓を誘導することからなり：
前記固相剤上又は前記固相剤内に固定化した血小板結合剤に血小板を結合させることによって血小板を捕捉し、血小板の活性化を誘導し、血栓を形成させることからなることを特徴とする、該方法。
【請求項２】
前記固相剤は、粒子であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記固相剤は、コイルであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記固相剤は、ステントであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記血小板結合剤は、組換え型VWFであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記血小板結合剤は、哺乳類のVWFであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記VWFは、ヒト由来のものであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記VWFは、ブタ由来のものであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記固相剤は、ターゲティング部分を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分は、標的脈管構造上の抗原を対象にすることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記固相剤は、ビオチン又はアビジン又は模倣物質（mimetics）又はその誘導体を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記固相剤は、血小板を結合することが可能な血小板に特異的な成分を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記血小板に特異的な成分は、天然の又は合成の、フォン・ウィルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、ラミニン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、トロンビン、ガラス、シアリル−ルイスＸ、フィブリン−１、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ｐ−セレクチン・リガンドMAC-1、LFA-1、上記のいずれかの一部分、及び上記のいずれかと機能的に等価のものからなる群より選択される成分のうち少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記に列挙した成分は、単独のビオチン模倣物質（mimetics）、ペプチド、ヒトFc断片などの部分又はそれらを組み合わせたものに結合しているか、又は含むことを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
血小板に特異的な成分を含む固相剤を含む生体内で血栓の形成を誘導する組成物であり、該組成物は；標的脈管構造へ送達することにより、血小板結合成分が血小板を固相剤上に結合させ、血小板の活性化を誘導し、血栓を形成させることを特徴とする、該組成物。
【請求項１６】
前記固相剤は、粒子であることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記粒子は、マイクロスフェアであることを特徴とする、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記粒子は、大凝集アルブミンであることを特徴とする、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
前記粒子の大きさが、約5から約500ミクロンまでの範囲内であることを特徴とする、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記粒子の大きさが、約30から約150ミクロンまでの範囲内であることを特徴とする、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
前記固相剤は、コイルであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２２】
前記固相剤は、ステントであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２３】
前記血小板に特異的な成分は、天然の又は合成の、フォン・ウィルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、ラミニン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ホスホリパーゼA2、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、トロンビン、ガラス、シアリル−ルイスＸ、フィブリン−１、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ｐ−セレクチン・リガンドMAC-1、LFA-1、上記のいずれかの一部分、及び上記のいずれかと機能的に等価なものからなる群より選択される成分のうち少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２４】
前記血小板に特異的な成分は、組換え型VWFであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２５】
前記血小板に特異的な成分は、哺乳類のVWFであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２６】
前記血小板に特異的な成分は、ヒト由来のものであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２７】
前記血小板に特異的な成分は、ブタ由来のものであることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２８】
前記固相剤は、ターゲティング部分を含むことを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項２９】
前記ターゲティング部分は、標的脈管構造上の少なくとも１種の抗原を対象にすることを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項３０】
前記固相剤は、血小板を固相剤に結合させるためのリガンドをさらに含むことを特徴とする、請求項１５記載の組成物。
【請求項３１】
前記固相剤は、ナトリウム・パーテクネテイトTc 99mで放射標識されていることを特徴とする、請求項１５記載の組成物
【請求項３２】
第一の結合成分と第二の結合成分を有する固相血小板結合剤を含む血栓の形成を誘導する組成物であり、前記第一の結合成分は、固相剤をリガンド／受容体複合体に結合させるが、リガンドのみ又は受容体のみに結合させない結合領域を含み；前記第二の結合成分は、血小板に対する結合領域を含むことを特徴とする、該組成物。
【請求項３３】
第一の結合成分と第二の結合成分を有する固相剤を含む血栓の形成を誘導する組成物であり、前記第一の結合成分は、該結合成分を所定の部位上のエピトープに結合させる結合領域を含み；前記第二の結合成分は、血小板に対する結合領域を含むことを特徴とする、該組成物。
【請求項３４】
固相剤と、以下の物質のうち少なくとも１種を含む生体内で血栓の形成を誘導するキットであり、該物質は：血小板を結合する結合剤；血小板に特異的な成分を有する固相剤；前記結合剤を結合するリガンド；リガンド抱合体；前記リガンド又は前記リガンド抱合体を結合する抗リガンド；血小板結合エンハンサー；血栓形成モジュレーター；補体カスケード成分；補体カスケード成分インデューサー；及び抗リガンドを有する血小板を結合する結合剤；放射性核種；造影剤；及びそれらの組み合わせであることを特徴とする、該キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、開始事象として血小板を活性化させることで血管閉塞を生じさせることによって、治療上の利益をもたらすための組成物及び方法を対象にする。本発明の組成物及び方法は、固相血小板結合剤を標的部位に送達して、血小板を結合させ、かつ活性化し、それによって局在性の血栓を形成することを伴う。前記局在性の血栓によって標的組織の脈管構造が閉塞した結果、必須の酸素及び栄養素が奪われ、次に組織の退行と、最終的には組織の死をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
血小板は体内で機能して、血管の損傷が生じた場合に失血を抑える。通常、血小板は、血液の他の細胞性成分と共に体全体を循環し、種々の血漿タンパク質の混合物内で泳ぎ、その多くは凝固作用において鍵となる役割を果たしている。血管の内皮下層の露出により、一連の複雑な事象が生じて、損傷を受けた血管からの失血を抑える。循環している血小板は、露出した内皮下層の成分と接触すると：１）結合し、かつ付着し、２）露出した表面に広がり、３）顆粒の内容物を放出することからも明らかなように活性化し、４）血流から他の循環している血小板を集め、補充し、５）血管からの血液の流れを止めるのに有効な栓、血餅及び／又は血栓を形成する。
【０００３】
一つにはフィブリノーゲンがフィブリンへ変換することによって定義される作用である凝固カスケードとは対照的に、血小板は、損傷を受けた部分の辺に癒着し、血小板の表面上の特異的な受容体に結合する分子を架橋することによって結合される。血小板と内皮下層との間の初期の架橋は、血小板の表面上にある糖タンパク質Ib（glycoprotein Ib、GPIb）受容体と、内皮下層内のフォン・ウィルブランド因子（von Willebrand Factor、VWF）（すなわち、固定化されているVWF）との間の相互作用に依存している。この相互作用自体は、血液の中を循環している正常な血小板が、多くの場合可溶性VWFと接触するが、活性化せず、そしてまた可溶性VWFに結合することもないので、独特なものである。試験管内の実験によって、可溶性VWFを表面に固定化すると、血小板の結合と活性化が促進されることが確認された。血小板の活性化により、別の受容体である糖タンパク質IIb/IIIa（glycoprotein IIb/IIIa、GPIIb/IIIa）が変化して、いくつかの血漿タンパク質が結合できるようにし、それによって血小板と血小板の結合を促進する。フィブリノーゲンとは別に、可溶性VWFは、活性化したGPIIb/IIIa受容体に結合し、次に固定化されるようになり、GPIbとGPIIb/IIIaを介して他の血小板を結合することができるようになる。
【０００４】
極度に活発な血小板は、不適当な時に血栓の形成を誘導することができ、その結果、種々の器官及び組織への血液の供給が減少する。主な例として、狭窄（狭窄した）血管を通じて血流を心臓に供給することによって誘導される血栓の形成がある。心筋への血液の流れが減少すると梗塞が生じ、最終的には心臓発作（心臓細胞の死）が招かれる。塞栓又は血栓が脳に栄養を供給する血管を閉塞する場合には、脳虚血（一過性脳虚血発作（transient ischemic attack、TIA）；脳梗塞）が発生する。
【０００５】
抗体によって媒介される不適当な作用の結果、血小板が活性化することによって引き起こされる病理状態は他にもある。ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）は、血小板の数が劇的に減少し、既存の病態の部位に血栓を形成することを特徴とする。血流を促進する抗凝固物質として未分画のヘパリンを投与されている全ての患者の1％から5％が、ヘパリンと血小板顆粒タンパク質との複合体に結合する抗体を産生する。血小板の表面上のヘパリンとタンパク質との複合体に前記抗体が結合することによって、血小板の急速な活性化と局在性の血栓の形成が誘導される。このことによっても、患部の梗塞がもたらされる。
【０００６】
血栓症は、癌の結果であることがよく言われている。凝固亢進状態の存在が癌の前兆となるのかどうかについて議論がある。多くの研究が行われ、大部分の腫瘍形成又は腫瘍による血栓促進（prothrombotic）傾向が示されている。血栓症は、明らかな悪性疾患を有する患者では最も頻繁に起こる合併症であることが示唆されている。
【０００７】
抗癌剤の開発に成功するための鍵は、腫瘍細胞を選択的に殺し、もしあれば、正常な組織に対する有害作用が比較的少ない薬剤を設計する能力である。この目標は、腫瘍性組織と正常組織との間で質的な差異が少ないという点でつかみどころがないものである。このため、長年にわたる多くの研究では、化学療法と診断の両方を目的とした免疫学的なターゲットとなり得る腫瘍に特異的な“マーカー抗原”を同定することに着目していた。腫瘍特異的な、又は準腫瘍特異的な（腫瘍に関連した）多くのマーカーが、特異的な抗体によって認識することができる腫瘍細胞の抗原として同定されている。
【０００８】
残念なことに、腫瘍特異的な抗体は、癌治療に有用となるのに十分な抗腫瘍効果をそれ自体で独りでに発揮しないのが一般的なケースである。リンパ腫におけるその有効性とは対照的に、抗毒素は、悪性腫瘍などの充実性腫瘍の治療に比較的効果がないことが判明している。これは、主に充実性腫瘍は、一般的に抗体サイズの分子に浸透できない、すなわち特異的な取りこみの値が腫瘍のグラムあたりの注入量の0.001％より小さいことは、ヒトの研究において異常なことではないからである。さらに、腫瘍の塊に入る抗体は、いくつかの理由のために均等に分散しない。第一に、腫瘍細胞と繊維性腫瘍の間質の密な充填は、巨大分子の輸送への大変な物理的障壁となり、リンパの排液の欠如と相まって、血管外遊出と液体の対流を減少する腫瘍の核内における間質の圧力の上昇をもたらす。第二に、多くの腫瘍内における血管の分布の秩序が乱れ、不均一となっている。結果として、腫瘍細胞のいくつかは、毛細血管から大きな隙間で隔てられているので、血管外に遊出している抗体は、遠く離れた腫瘍細胞に到達し、結合するために、大容量で拡散しなければならない。第三に、腫瘍に入る抗体はすべて、最初に遭遇した腫瘍細胞によって血管周囲の部分に吸収され、より離れた部位の腫瘍細胞に到達するものは何も残らない。
【０００９】
抗体で腫瘍をターゲティングすることの欠陥を克服するアプローチの一つは、腫瘍よりも、むしろ腫瘍の脈間構造に対する血栓誘導剤をターゲティングすることである。
【００１０】
本発明者らは、このようなアプローチによって、腫瘍細胞を直接ターゲティングすることよりいくつかの利点が得られることを提案する。第一に、標的細胞は、血管に投与された治療薬剤に直接接近することが可能であって、注入量のうち多くの割合を急速に局在化することを可能にする。第二に、各毛細血管は、その周囲の腫瘍の帯内における何千もの細胞に酸素及び栄養素を供給するので、腫瘍の脈管構造にまさに限定して損傷を与えることによって、腫瘍細胞の大量死を引き起こすことができる。
【００１１】
本発明は、また異常な組織の成長、異常出血（外科手術、分娩の際又は後の）、子宮外妊娠、前置胎盤、癒着胎盤及び子宮筋腫を治療する組成物並びに方法も対象とする。
【００１２】
特定の臨床場面の下で、組織の関連した脈管構造の閉塞によって該組織への血流を阻害することが望ましい。例として、脳出血、伏在静脈バイパスグラフト手術における伏在静脈の側枝の存在、大動脈瘤の治療、血管奇形の是正及び充実性腫瘍の治療がある。
【００１３】
塞栓治療法（embolotherapy）を含む種々の手法及び材料を用いて血管閉塞を行う。塞栓治療法（embolotherapy）の例として、様々な物質からなる粒子を使用する方法があり、該物質には、ポリビニルアルコール（Boschetti、国際公開第00/23054号パンフレット）、アクリルアミド（Boschettiら、米国特許第5,635,215号；Boschettiら、米国特許第5,648,100号）、ポリメチルメタクリレート（Lemperle、米国特許第5,344,452号）、コラーゲンからなる物理的な栓（Constonら、米国特許第5,456,693号）及びコイル（Mariant、米国特許第5,639,277号）がある。塞栓治療法（embolotherapy）は、カテーテルを用いてこれらの物質を標的脈管構造へ送達するものである。いずれの所定の領域の脈管構造も、大きい動脈から細動脈、メタ細動脈、毛細血管へ及び、それぞれの血管の直径が徐々に小さくなっているので、送達した物質（塞栓）は、小さい血管内に留まるようになるまで流れている血液内を移動し続けて、依存している組織への血液の流れを妨げる。
【００１４】
本発明は新規なものであり、哺乳類由来のフォン・ウィルブランド因子（VWF）で被覆した微粒子又はコイル又はステントなどの固相剤を使用することによって、まだ対処されていない医療ニーズに対処するものである。このような方法で、固相血小板結合剤を標的部位へ送達し、有効な血栓の形成を開始して、関連した脈管構造の閉塞を招くことによって治療上の利益を得ることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、局所的な血小板の活性化によって血栓形成を誘導する固相剤を用いて、本質的に増殖性もしくは腫瘍性であるか、又は動静脈奇形を有するか、又は出血している組織及び／又は器官、及び関連した脈管構造をターゲティングするための治療方法及び治療組成物に関する。前記組成物は、コイル又はステント又は粒子などの固相剤上に血小板を捕捉する薬剤を含む。本発明の実施態様のいくつかにおいて、前記固相剤は、血小板を捕捉し、かつ血小板を活性化する。前記方法は、局在化する血小板の収集及び固相粒子上で活性化する血小板を利用して、続いて血栓を形成させ、それによって全般性又は全身性の血栓促進（pro-thrombotic）状態を誘導することなく、標的部分への血液の供給を制限する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
血栓が、患者の罹病率及び死亡率に著しく寄与することは既知であるので、患者において血栓を意図的に誘導することは、一見すると直観に反しているように見える。本発明である、固相の血小板によって媒介される閉塞は、体の本来の能力を利用して、固相化したフォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor、VWF）又は他の局所的に作用する血小板活性化剤に応じて血栓を形成する、血栓の部位特異的な誘導に基づくものである。VWFは、血流中を可溶型で循環するが、分子が内皮下層の一部として露出するか、又は内皮下層由来の露出したコラーゲンに結合して初めて血小板を捕捉し、血小板の活性化を誘導することができる。
【００１７】
固相血小板結合剤を、患者由来（生体外）の又は血流内（生体内）の血液と接触させると、血小板の結合と、局所的な活性化が誘導され、固相剤周辺に血小板を付着させ、血栓症と、閉塞した血管によって供給される組織への血流の停止を招く。局所の血流が減少した結果、細胞は腫瘍細胞又は増殖性組織を含めて減少するか、又は死ぬ。このようなアプローチは、全身性の血小板の活性化と血栓症を防ぎ、固定化したVWF（但し、可溶性VWFではない）が循環する血小板に結合し、その血小板を活性化させるという事実を基にしている。したがって、本発明の方法及び組成物は、癌、増殖性細胞、過剰出血又は動静脈奇形などの病態を治療する間接的な手段である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、充実性腫瘍、増殖性組織、過剰出血及び動静脈奇形、及び血小板（休止及び／又は活性化）が治療の役割を果たす他のいかなる疾病又は状態を治療する既存の方法を改良するものである。
【００１９】
既存の病的状態（すなわち、ヘパリン起因性血小板減少症［Heparin-Induced Thrombocytopenia、HIT］）と同様の様式で、固相剤上にヒトFc断片を加える、若しくは組み込むことによって、又は標的部分に対する精選した抗体を作成することによって、Fcによって媒介される作用を用いて局所的な血小板の活性化を増大させることができる。HIT症候群において血小板が活性化した結果、局所性の血栓症と患部への血流の停止がもたらされる。このことは、患部組織の死を招く。
【００２０】
部位特異的な血栓症の範囲又は程度を様々な方法で制御することができる。抗血小板剤（例えば、GPIIb/IIIaインヒビター、アスピリン、ジピリダモールなど）を使用することによって血小板の活性化を阻害することで、明確に滴定可能であるように（in a defined, titratable manner）血栓を誘導する傾向が減少する。局所の血流量、血圧及び組織の温度を変更することも、刺激に対する局所の血小板の活性化を制御する手段となることができる。
【００２１】
典型的な血管新生した腫瘍は、充実性腫瘍、特に悪性腫瘍であり、該腫瘍は、血管の血液の豊富な供給を必要とする。本発明が対象とする典型的な充実性腫瘍として、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、咽頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆道、結腸、直腸、子宮頚管、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、頭頚部、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍などの原発性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。本発明が対象とする他の状態として、上述した腫瘍の型の二次性（転移性）腫瘍、癌性疼痛、動静脈奇形、子宮筋腫、骨盤鬱血、月経過多、精索静脈瘤、喀血、動脈瘤、内蔵の動脈の動脈瘤、仮性動脈瘤及びエンドリーク（endoleak）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の好ましい方法には、組換え型又は哺乳類由来のVWFで被覆したコイル又はステントを製造し、VRFで被覆した薬剤をヒトの患者、動物の患者又は試験動物などの動物の血流内へ導入することが含まれ、その後、前記VWFを望ましい標的部位に送達するか、又は集める。コイル若しくはステント内に、又はコイル若しくはステントの表面上に、無期限に又は様々な期間VWFを保持できる任意の適切な材料からコイル又はステントを構築することができる。
【００２３】
充実性腫瘍の無制限の成長という問題を解決する方法は、腫瘍内の血管を攻撃することである。このアプローチは、腫瘍細胞を直接ターゲティングする方法を超えるいくつかの利点を提供する。第一に、腫瘍の血管が血管に投与された治療薬剤に直接接近可能であり、したがって、注入量のうち多くの割合が急速に局在化することを可能にする。第二に、各毛細血管は、その周辺の腫瘍の帯内にある何千もの細胞に酸素及び栄養素を供給しているので、腫瘍の脈管構造にまさに限定した損傷を与えることによって、大規模な腫瘍細胞の死が生じる。最後に、異なる腫瘍において血管が類似していて、非常に多くの種類の癌を治療する単独の薬剤を開発することが実現可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、所定の場所で血小板を捕捉し、血小板を活性化し、血小板本来の機能を利用して、有益な治療結果を達成する組成物及び方法を提供する。本発明において、血小板は、循環している血小板又は外部の供給源から得られた血小板であってもよい。本発明において、血小板を特異的な部位にターゲティングし、それから血栓形成を誘導する血小板本来の能力を用いて、前記部位における血流を妨害するか、中断させるか、又は減少させてもよい。血流が減少すると、腫瘍などの病因又は状態の原因への栄養素の供給が付随して減少するので病因の大きさが減少する。腫瘍の大きさが減少することが明白な治療上の利益であることは明らかである。いくつかの例では、標的部分への血液の供給が減少することによって、苦痛が軽減する。
【００２５】
本発明には、血小板を結合し、活性化することができる固相剤を用いて、選択的に標的にすることが可能な所定の組織、例えば増殖性組織に血小板をターゲティングすることも含まれる。本発明のこれらの実施態様において、ターゲティングは、所定の部位又は所定の組織を特異的に結合するターゲティング部分、例えばリガンド又はその種の他のものを含む固相を指す。本発明の他の実施態様において、ターゲティングには、本発明の組成物を、例えば、カテーテル、ステント、又はコイルを用いて、腫瘍部位に又は腫瘍近辺に送達することも含まれる。
【００２６】
本発明は、血小板を固相剤上に捕捉することによって血栓形成を誘導し、血小板の活性化を誘導し、血栓を形成させる組成物及び方法を提供する。標的の脈管構造内に血栓を形成することによって、下流の組織への血液の供給が減少する。VWFを含む固相（例えば被覆した粒子）上に血小板を捕捉することによって、本発明の組成物及び方法を用いて、癌、過形成、子宮筋腫、骨盤鬱血、月経過多、動静脈奇形、神経塞栓症（neuro-embolism）、精索静脈瘤、喀血、内蔵の動脈の動脈瘤、動脈瘤、エンドリーク（endoleak）などを治療することができる。さらに、本発明の組成物及び方法は、組成物のレシピエントに治療上の利益を提供する。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、VWFは哺乳類由来のものである。本発明の最も好ましい実施態様では、VWFはヒト由来のものである。本発明のさらなる最も好ましい実施態様では、VWFはブタ由来のものである。
【００２８】
VWFは、天然体、合成体、組換え体又はVWFの生物学的に活性のある部分に合致するペプチド配列であってもよい。本発明のさらなる最も好ましい実施態様では、VWFは組換え体由来のものである。
【００２９】
本発明は、血小板に結合する血小板結合剤の能力が低下しない限り、血小板結合剤（例えばVWF）を、直接的に又はスペーサを介して間接的に固相に結合させる組成物も提供する。本明細書で用いるスペーサは、物理的に血小板結合剤を固相剤の表面から引き離す不活性又は活性分子の一群を指す。典型的なスペーサを以下に記載する。共有又は非共有のいずれかにより直接結合が生じ得る。スペーサを介して間接結合が生じ得、該スペーサには、ペプチド・スペーサ・アーム、抗体スペーサ、抗体断片スペーサ、融合タンパク質スペーサ又は糖スペーサがあるが、これらに限定されない。これらのスペーサは、通常粒子とVWFとの間の架橋としてのみ作用するが、前記スペーサを用いて、血小板の活性化の程度を変更することもできる。例えば、Fc成分をスペーサとして用い、それによって固相剤上及びその周辺での血小板の活性化を増大させることができる。当業者に既知である方法によって、VWFの固相剤へのカップリングが生じることができる。カップリング剤の例として、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドが挙げられるが、これらに限られない。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、積極的なターゲティング剤を用いない哺乳動物の脈管系内での組成物の位置決めを、超選択的なマイクロカテーテルを用いて送達した後に血流の方向による位置決めによって選択する。
【００３１】
本発明による組成物は、血管内皮又は標的組織上の標的の抗原又は標的部位を結合することができ、それによって固相剤が選択部位に局在化することが可能なターゲティング剤又はターゲティング部分を含めてもよい。典型的なターゲティング剤又はターゲティング部分は当業者に既知であり、抗体、リガンド、受容体、ホルモン、レクチン、及びカドヘリン又はそれらの一部もしくは断片があるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様では、ターゲティング剤として、ビオチン、ビオチン模倣物質（mimetic）を有する抗体又は抗体様分子及び／又はペプチド成分が挙げられる。本発明のさらに好ましい実施態様では、前記抗体又は抗体様分子は、成長因子／受容体複合体を対象とする。
【００３３】
本発明による組成物には、以下に示すものを１種又はそれ以上含めてもよく、すなわち、１種又はそれ以上の血小板結合モジュレーター（例えばインヒビターもしくはエンハンサー）、１種又はそれ以上の血栓形成制御因子若しくは血栓形成モジュレーター、あるいは１種又はそれ以上の補体カスケード成分を含めてもよい。
【００３４】
本発明による方法には、所定の部位で血小板を結合することが可能な固相剤を投与することを含めてもよく、捕捉した血小板の活性化を誘導すること；抗原決定部位と血小板結合部位を有する２つの機能を有する結合剤を投与すること；１種又はそれ以上の本発明の組成物の温度を変更することによって、又は予め選択した部位の温度を変更することによって、血栓の産生を制御することも含めてもよい。
【００３５】
本発明による方法には、さらに以下に示すものを１種又はそれ以上含めてもよく、すなわち、１種又はそれ以上の血小板結合モジュレーターを投与すること、１種又はそれ以上の血栓形成モジュレーターを投与すること；１種又はそれ以上の補体カスケード成分を投与すること；固相を所定の部位に結合させるための、及び／又は血小板結合部分若しくは成分を固相に結合させるための１種又はそれ以上のリガンド及び／又は抗リガンドと投与することを含めてもよい。
【００３６】
本発明には、以下の成分のいずれか又はすべてを含むがこれらに限定されないキットも含まれ、該成分として、血小板を内皮の膜成分にターゲティングする固相剤、すなわち血小板を結合する結合剤；内皮の膜成分を結合するリガンド；リガンド抱合体；リガンド又は前記リガンド抱合体を結合する抗リガンド；血小板結合モジュレーター（エンハンサー及び／又はインヒビター）；血栓形成モジュレーター；補体カスケード成分；補体カスケード成分インデューサー；及び抗リガンドを有する血小板を結合する結合物質が挙げられる。前記キットは、２つの機能を有する結合物質、及び／又は結合物質−リガンド抱合体、及び／又は血小板結合剤−抗リガンド抱合体を含めてもよい。
【００３７】
本発明の組成物及び方法には、組成物を予め選択した部位へ送達するいずれの機構も含まれ、全身的に、局所的に、経口的に、又は局部的に送達することが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のいくつかの実施態様において、所定の部位で血小板を捕捉するために結合物質を使用する。
【００３９】
（定義）
本明細書で用いる固相剤は、血小板結合剤を結合するか、含有するか、又は保持するのに適した任意の固体物質を指す。前記血小板結合剤は、例えば標的部位で又は標的部位内で血小板結合活性を保持するような固相剤に付着してもよい。前期固相剤は、コイル、ステントまたは粒子、例えばビーズ又はその種の他のものであってもよく、これらのすべては当業者に既知である。
【００４０】
本明細書で用いる粒子は、血小板結合剤を含有するか、又は保持することが可能な固相物質の分離した一部又は部分を指す。本発明の好ましい方法には、組換え体又は哺乳類由来のVWFで被覆した粒子を製造すること、及びヒト患者、動物の患者、又は試験動物などの動物の血流内に前記VWFで被覆した粒子を導入することが含まれる。本明細書で用いる「粒子」という用語は、直接的あるいは間接的に（例えばリガンドを介して）血小板を結合することが可能な任意の固相物質を指す。前記粒子は、大きさに関して同種又は異種のものであってもよい。詳細には、前記粒子は、球状（卵形を含む）又は不揃いの形であってもよい。前記粒子は、粒子内又は粒子の表面上で無期限に又は様々な期間VWFを保持することが可能な任意の適した物質から構築してもよい。典型的な物質としては、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリラクチド、ポリグリコリド、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリカプロラクトン、ラクチド−カプロラクトン共重合体、ポリヒドロキシブチレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、多糖、デキストラン、デンプン、メチルメタクリレート、メタクリル酸、ヒドロキシルアルキル・アクリレート、ヒドロキシルアルキル・メタクリレート、メチレングリコール・ジメタクリレート、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、セルロース系重合体、エチレングリコール重合体及び共重合体、オキシエチレン及びオキシプロピレン重合体、ポリビニル酢酸、ポリビニルピロリドン及びポリビニルピリジン、磁性粒子、蛍光粒子、動物細胞、植物細胞、大凝集アルブミン、小凝集アルブミン、変性タンパク質凝集体並びにリポソームが挙げられ、単独で、又は組み合わせて使用する。本発明で使用するのに適した固相物質は当業者に既知であり、上記に列挙した典型的な物質に限定されるべきではない。
【００４１】
ステント又はコイルを形成する典型的な物質としては、ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol、PVA）、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリラクチド、ポリグリコリド、ラクチド−グリコリド共重合体、ポリカプロラクトン、ラクチド−カプロラクトン共重合体、ポリヒドロキシブチレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリ無水物、ポリオルトエステル、多糖、デキストラン、デンプン、メチルメタクリレート、メタクリル酸、ヒドロキシルアルキル・アクリレート、ヒドロキシルアルキル・メタクリレート、メチレングリコール・ジメタクリレート、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、セルロース系重合体、エチレングリコール重合体及び共重合体、オキシエチレン及びオキシプロピレン重合体、ポリビニル酢酸、ポリビニルピロリドン及びポリビニルピリジン；磁性物質、蛍光物質；金、プラチナ、パラジウム、レニウム、ロジウム、ルテニウム、ステンレススチール、タングステン、チタン、ニッケル及びそれらの合金が挙げられるが、これらに限定されず、単独で、又は組み合わせて使用する。
【００４２】
固相物質の好ましい大きさは、用いる物質の種類に依存する。例えば、固相がステントまたはコイルである場合、大きさは、動脈などの血管内に適合する直径のものが好ましく、このことは当業者であれば理解できる。典型的には、直径は約15mmまでであるか、又はそれよりも大きい。もし、固相がビーズなどの粒子である場合、直径は約7mmまででもよく、好ましくは約1μmから約5mmまで、さらに好ましくは約20μmから約300μmまででもよい。本発明で使用するのに適した固相物質の大きさは当業者に既知であり、上記に列挙した典型的な大きさに限定されるべきではない。
【００４３】
本明細書で使用する結合剤又はターゲティング部分は、ある物質を別の物質に結合させる１又はそれ以上の固相の化学的な又は生物学的な分子又は構造を指す。詳細には、結合剤、又は固相剤は、規定した細胞の集団上にある、典型的には増殖性組織及び／又は関連した脈管構造、あるいは癌細胞及び／又は関連した脈管構造上にあるリガンド、受容体又はリガンド／受容体複合体を結合する。結合剤としての分子の機能は、付着の構造的なメカニズムに限定されるべきではない。例えば、結合剤は、受容体、抗原決定基もしくはエピトープ、酵素基質、又は標的細胞若しくは標的細胞集団に結合剤を結合させる他の生物学的構造を結合してもよい。前記結合剤は抱合体であってもよく、免疫学的抱合体、化学的抱合体（共有結合又は非共有結合）、融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用するリガンド結合剤は、互いに対して特異的な結合を示す分子の相補的なセットを指す。リガンドと抗リガンドの対は、一般的に比較的高い親和性で結合し、従って、本発明で使用するのに大変望ましい。大変著名なリガンドと抗リガンドの対は、ビオチンとアビジンである。本明細書で使用するアビジンは、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（neutravidin）、それらの誘導体及び類似物質、並びにそれらと機能的に等価なものをいう。アビジンは、多価又は一価の様態でビオチンを結合する。他の典型的なリガンドと抗リガンドの対として、同種親和性のペプチド、異種親和性のペプチド、「ロイシン・ジッパー」、亜鉛フィンガータンパク質とdsDNA断片、酵素と酵素インヒビター、ハプテンと抗体、リガンドとリガンド受容体、及び成長因子と成長因子受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用する選択部位、予め選択した部位、ターゲティング及び事前のターゲティングはすべて、固相剤周辺に血小板が蓄積することによって治療上有益な結果が提供される部位を指す。典型的には、これには、ターゲティング部分の標的部位での局在化が含まれる。そのような部位としては、充実性腫瘍の脈管構造、良性腫瘍の脈管構造、増殖性組織の脈管構造、動静脈奇形、血管動脈瘤及びエンドリーク（endoleak）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する血小板結合剤を含む固体剤の送達は、カテーテル、マイクロカテーテルを用いて又は針及びシリンジによって起こすことができる。カテーテル又はマイクロカテーテルによる送達は、動脈回路を介してアクセスすることによってほとんどの場合達成されるが、静脈回路を介して固体物質を送達することも望ましい。例として、粒子、コイル又はステントの形態の固体剤を、動脈回路もしくは静脈回路を用いて、カテーテルで標的部位に送達することができる。動脈回路を用いる固体剤の送達は、標的組織内において投与した物質の下流にある毛細血管床が前記薬剤を捕捉する手段として作用し、それによって前記薬剤が全身の循環に入るのを防ぐので好都合である。前記固体剤は、該固体剤と関連するターゲティング剤を用いて動脈の循環内に局在化することもできる。静脈系を用いて固体剤を送達することも望ましい。静脈系内における固体剤の局所的な送達を、固体剤と関連するターゲティング剤を用いて、固体剤を標的部位に結合させることによって達成することができる。固体剤を、手術行為中に標的部位へ送達することもできる。例として、粒子状の固体剤を、シリンジと針によって標的部位へ送達することができる。さらなる例として、コイル又はステントの形態の固体剤を、手術行為中に標的部位に手動で置くことができる。
【００４７】
本明細書で使用する血栓は、フィブリン内の網の目に絡んだ血球及び固相剤に積極的に結合している血小板に由来する血小板の塊のいずれの半固体の凝集体を指す。本発明において、活性化した血小板が所定の部位に蓄積した直接の結果として、血栓が形成される。血栓症は、典型的には血管内に血栓が形成されることを指す。血栓形成性は、血栓症を引き起こす傾向がある物質又は血栓を形成することを指す。
【００４８】
本明細書で使用する塞栓は血管内の塊を指し、その血管内の塊は、血流に乗って移動し、サイズの制約によって、次第に該血管内の塊の発生部位から末端の血管又は毛細血管内に詰まるようになる。塞栓形成は、積極的な作用の意味を含まないが、代わりに消極的な作用を指し、それによって血流に乗って移動する血管内の塊によって血管の閉塞が生じ、その血管内の塊が小さい血管及び毛細血管に詰まるようになる。
【００４９】
その一方、本発明は、標的の脈管構造へ固相物質を送達することに関し、その後すぐに、血小板結合剤を使用することで固相の表面に血小板が積極的に集められる。本明細書に参考文献として挙げられている引用特許文献に記載されている塞栓を形成する物質と対照的に、固相物質の周辺に血小板が急速に蓄積するために、本発明の薬剤を、標的の脈管構造に近い近傍に送達しなければならない。
【００５０】
一例として、Draximage（Kirkland、Quebec、Canada）によって提供されている大凝集アルブミン（macro-aggregated albumin、MAA）を、例えば塞栓形成造影剤として用いる。MAAは、大きさが10μmから70μmの間であり、最大の大きさが150μmである粒子から構成され、ナトリウム・パーテクネテイトTc 99mで放射標識されて、シンチグラフィ・イメージングが可能である。MAA粒子は、静脈内に注入され、塞栓として血流に乗って移動し、肺の肺胞の毛細血管床内に捕捉される。本発明の方法を用いて、VWFをMAA上に固定化し、続いて粒子を脈管系内に注入することによって、血小板が直ちに粒子に結合し、注入部位に近い近傍における脈管構造を閉塞させる。
【００５１】
本発明は、血小板結合剤を使用することによって血小板を固相物質の表面に固定し、それによって前記固相物質の有効な大きさを増大させることで血管閉塞を引き起こす既存の方法を改良する。例えば、VWFで被覆した又はVWFを含む粒子は、血流内に注入され、血小板をその表面に急速に蓄積し、実際には層状の活性化した血小板の「タマネギ効果（onion-effect）」を注入部位に近い近傍で引き起こす。従って、本発明は、最小限の数の小さい粒子を血流内に送達することが可能であり、その後すぐに、前記粒子上又は前記粒子内の血小板結合剤に積極的に結合する血小板が付着することから前記粒子の大きさが急速に増大する。さらに、粒子に結合した血小板は相互に作用し、それによって大きさが増大する凝集体を形成し、密接なマトリックスを生じ、標的の脈管構造の閉塞をもたらす。
【００５２】
本発明は、さらに血小板結合剤を用いて固相物質の表面に血小板を固定することで血管の閉塞を引き起こす既存の方法を改善する。従って、本発明の薬剤は、生体内で以下の効果を有し、該効果は：ａ）それが存在する血管又は毛細血管の輪郭にぴたりと付き、ｂ）固体であって、不浸透性の三次元マトリックスを形成するものであり；これは、密接な不浸透性のシールを血管内に形成し、それによって下流の血管及び組織への血液の送達を最大限に阻害する。
【００５３】
例えば、以下の一連の事象によって血小板結合粒子の血流内への導入が進行し、その一連の事象は：ａ）血小板の単一の層を粒子の表面上に形成し、それによって（i）直径が増加した粒子と、（ii）本明細書で‘単層表面活性化血小板’粒子（‘single-layered surface activated platelets’particle、S-SAP粒子）と定義される、懸濁液内で近くの血小板を結合し、かつ活性化する傾向を有する活性化した血小板で被覆した粒子を形成し、ｂ）血流内を流れる血小板が、S-SAP粒子に結合した血小板と相互作用して、本明細書で‘多層表面活性化血小板’粒子（‘multi-layered surface activated platelets’particle、M-SAP粒子）と定義される‘タマネギ様’の層を形成し、ｃ）血小板と血小板の相互作用によってM-SAPが相互に作用して、本明細書で‘M-SAPマトリックス’と定義される、より大きい凝集体を形成することである。
【００５４】
さらなる例として、表面に結合した血小板結合剤（例えばVWF）を含むか、又は有する無定形の血小板を結合する粒子（例えばMAA）の血流内への導入は、以下の一連の事象によって進行し、その一連の事象は：ａ）単一の血小板が粒子のマトリックス上に又は該マトリックス内に結合し、それによって（i）直径と硬度が増大した粒子と、（ii）懸濁液内で近くの血小板を結合し、かつ活性化する傾向を有する活性化した血小板で被覆され、かつ該血小板を含む粒子を形成し；ｂ）血流内を流れる血小板が、粒子に結合した及び／又は粒子内に結合した血小板と相互作用し、それによって粒子内に及び／又は粒子上に凝集体を形成し、ｃ）表面に結合した血小板を含む及び／又は有する粒子が相互に作用して、大きい粒子の凝集体を形成することである。
【００５５】
本明細書で使用する、治療上有益であること、治療上の利益又はその種の他のものを提供することは、レシピエントの動物の生理機能における望ましい変化を指す。本発明の好ましい実施態様では、前記変化を検出することができる。本発明において、活性化した血小板又は血小板の調節に関連するいかなる生物機構も用いるか、又は活用して、有益な治療結果を得てもよい。本発明においてもたらされる典型的な治療上の利益としては、血栓を形成すること、血小板によって媒介される閉塞を成すこと、増殖性の組織又は細胞を除去すること、腫瘍及び／又は腫瘍細胞を除去すること、増殖性組織の大きさを縮小させること、腫瘍の大きさを縮小させること、増殖性組織又は腫瘍が、化学療法及び／又は放射線療法などの別の治療に敏感になるようにすること、増殖性組織又は癌への栄養素の供給を渇望させるか、又は減少させること、動静脈奇形を治すこと、エンドリーク（endoleak）からの血液の損失を減少させるか、又は防ぐこと、並びに血管の動脈瘤を治すことが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する“投与”は、典型的には哺乳類の、所定の細胞、細胞又は組織へ固相剤を含む組成物を送達する結果となる任意の行為を指す。投与は、生体内、試験管内又は生体外で行ってもよい。例えば，組成物を、注入によって、又は内視鏡もしくはカテーテルを通じて投与してもよい。投与には、本発明による組成物を細胞へ直接使用することも含まれる。例えば、手術の進行中に、腫瘍又は増殖性組織の脈管構造をさらしてもよい。本発明の実施態様において、露出した細胞又は脈管構造を、例えば手術部位、脈管構造及び／又は細胞を洗うか、又は洗浄することによって、本発明の組成物に直接さらしてもよい。
【００５７】
固相血小板結合剤を、結合剤又はターゲティング剤を用いて、特異的な標的部位に局在化させることができる。典型的な結合剤又はターゲティング剤としては、モノクロナール抗体；ポリクロナール抗体；キメラ・モノクロナール抗体；ヒト化抗体；遺伝子組換え抗体；F(ab)2、F(ab')2、Fab、F(ab')、Dab、Fv、sFv、scFv、Fc及び最小認識単位からなる群から選択された抗体の断片；モノクロナール抗体の反応部分に相当する単鎖（single chains representing the reactive portion of monoclonal antibodies、SC-Mab）；腫瘍結合ペプチド；受容体タンパク質を含むタンパク質；ペプチド；ポリペプチド；糖タンパク質；リポタンパク質又はその種の他のもの、例えば成長因子；リンホカインおよびサイトカイン；酵素、免疫モジュレーター；ホルモン、例えばソマトスタチン；リガンド（その相補的な抗リガンドと対となっている）；オリゴヌクレオチド；エフェクターの機能を仲介する分子に連結している上記のいずれか；並びに上記のいずれかの模倣物質（mimetics）又は断片が上げられるが、これらに限定されない。規定した標的細胞の集団に結合する能力を保持する上記に記載したターゲティング部分の類似物質を使用することも、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲内である。さらに、合成のターゲティング部分を設計してもよい。
【００５８】
本発明の実施において有用であるモノクロナール抗体として、全抗体及びその断片が挙げられる。そのようなモノクロナール抗体及び断片は、ハイブリドーマ合成、組換えDNA手法及びタンパク質合成などの従来の技術に従って生産可能である。有用なモノクロナール抗体及び断片を任意の種（ヒトを含む）から得るか、又は１以上の種由来の配列を使用するキメラタンパク質として作成してもよい。概して、Kohler及びMilsteinの Nature, 256:495-97, 1975; Eur.J.Immunol.,6:511-19, 1976を参照されたい。固相剤を標的部位に局在化させることが可能な好ましい結合剤及び／又はターゲティング剤は、抗体又は抗体様分子であり、好ましくはモノクロナール抗体である。より好ましい結合剤は、増殖性組織もしくは細胞（例えば腫瘍）又は増殖性組織もしくは細胞と関連する脈管構造上のリガンド／受容体複合体を結合する抗体である。最も好ましい結合剤は、腫瘍の脈管構造などの腫瘍の塊上にあるか、又は腫瘍の塊の近くにある成長因子／成長因子受容体複合体を結合する抗体又は抗体様分子である。本発明の好ましい実施態様では、結合剤（すなわち、抗体又は抗体様分子）は、VEGF/VEGF受容体複合体に結合する。本発明のさらに好ましい実施態様では、結合する抗体又は抗体様分子の結合によって、リガンドと受容体（すなわち、成長因子と成長因子受容体）の相互作用により形成されたネオ−エピトープ（neo-epitope）（隠れたエピトープ又はこれまでは利用できなかったエピトープ）が認識される。本発明のさらに好ましい実施態様では、抗体又は抗体様分子が成長因子/成長因子受容体複合体に結合することに、成長因子又は成長因子受容体のいずれかの機能は影響されない。
【００５９】
オリゴヌクレオチド、例えば、標的細胞の核酸（DNA又はRNA）の部分に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドも、本発明の実施におけるターゲティング部分として有用である。オリゴヌクレオチドの細胞表面への結合も有用である。
【００６０】
上述した分子と機能的に等価なものも、本発明のターゲティング部分として有用である。ターゲティング部分の機能的に等価なものの一つは、ターゲティング部分と標的細胞の結合に適した構造及び／又は配向性を模倣するように設計された有機化学構成物である、“模倣型”化合物である。別のターゲティング部分の機能的に等価なものは、“最小限の”ポリペプチドと呼ばれている短いポリペプチドであり、コンピューターを用いた分子モデリングと、結合親和性が変化した変異体を用いて構築され、そのような最小限のポリペプチドは、ターゲティング部分の結合親和性を示す。
【００６１】
イムノグロブリンのFv断片は、標的腫瘍治療における全イムノグロブリンを越える多くの有意な利益を有し、Fcによって媒介される免疫原性が潜在的に低いだけではなく、充実性腫瘍における障害の浸透が優れており、血液のクリアランスの速度がより速い。典型的な単鎖Fv（single-chain Fv、scFv）結合剤は、リガンド／受容体複合体を認識する抗体の可変領域から単離された遺伝子から設計してもよい。
【００６２】
本発明の実施態様は、標識に対する結合親和性を有するターゲティング剤に関し、該薬剤は、正常な腫瘍と関連していない脈管構造と比較すると、腫瘍と関連する血管内皮細胞の細胞表面上に見られ、発現し、結合しやすいか、又はそうでなければ局在化している。さらに、ターゲティング剤が結合親和性を有する特定のマーカーは、腫瘍と関連する内皮細胞自身よりも、むしろ腫瘍と関連する脈管構造の成分と関係があってもよい。例えば、そのようなマーカーは、基底膜又は腫瘍と関連する結合組織上に位置してもよい。
【００６３】
組織切断面の免疫染色によって評価される正常な内皮細胞の細胞表面との反応性がほとんどないか、又は全くなくて、抗体又は他の結合剤又は腫瘍の脈管構造に対する比較的高度な選択性を有する部分を製造し、使用するのが望ましい。また、すべての脈管構造に共通するエピトープを結合することが可能な抗体又は他の結合剤又は部分を製造し、使用するのも望ましい。
【００６４】
本発明による、ターゲティング剤を有するか、又は有さない固相血小板結合剤を含む任意の組成物を用いて、生体内での治療上の利益、血栓形成及び／又は細胞の死滅もしくは退行を起こしてもよい。前記組成物は、１種又はそれ以上のアジュバント、１種又はそれ以上の担体、１種またはそれ以上の賦形剤、１種又はそれ以上の安定剤、１種又はそれ以上の浸透剤（例えば、細胞膜を通した動きを調節する薬剤）、１種又はそれ以上の造影試薬、１種又はそれ以上のエフェクター；及び／又は生理学的に受容可能な生理食塩水及び緩衝液を含めてもよい。一般的に、アジュバントは、より著しい免疫反応を引き出すためにイムノゲンと混合した物質である。前記組成物は、薬剤的に受容可能な担体を含めてもよい。薬剤的に受容可能な担体として、生理食塩水、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられるが、これらに限定されない。患者へ送達するのに適した他の緩衝剤、分散剤及び不活性無毒性物質も、本発明の組成物の中に含まれる。前記組成物は、投与に適した溶液であり、典型的には無菌で、非発熱性であり、かつ望ましくない粒子状物質がないものである。前記組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌される。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様では、適した組成物は、リガンド／受容体複合体に結合する結合剤又はターゲティング剤を含む。本発明における標的として有用である典型的な抗原としては、肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭部、頚部、骨、免疫系、血液又は他のいずれの解剖学的な位置の癌と関連する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な抗原及び／又は所定の部位としては、VEGF/VEGF受容体複合体、FGF/FGF受容体複合体、又はTGF.ベータ/TGF.ベータ受容体複合体、ｐ−セレクチン、シアリル−ルイスＸ、エンドセリン、エンドセリン受容体、エンドセリン／エンドセリン受容体複合体、アルファ−フェトプロテイン、血小板内皮細胞接着分子（platelet-endothelial cell adhesion molecule、PECAM）、CD31、CD34、CD36、糖タンパク質Ib（glycoprotein Ib、GpIb）、エンドグリン、トロンボモジュリン、内皮白血球接着分子（endothelial leukocyte adhesion molecule、ELAM）、細胞間接着分子１（intercellular adhesion molecule 1、ICAM-1）、MHC-I及びMHCIIが挙げられるが、これらに限定されない。対象は、ヒト又は動物被検体であってもよい。
【００６６】
上述したように、本発明の組成物又は方法には、血小板結合剤又は組成物が含まれる。典型的な血小板結合剤又は組成物としては、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor、VWF）、オステオポンチン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、ラミニン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ホスホリパーゼA2（phospholipase A2、PLA2）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinases、MMPs）、トロンビン、ガラス、シアリル−ルイスＸ、フィブリン−１、血小板内被細胞接着分子（PECAM）、細胞間接着分子１（ICAM-1）、細胞間接着分子２（ICAM-2）、CD11b/CD18（MAC-1）、CD11a/CD18（LFA-1）、ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（p-selectin glycoprotein ligand 1、PSGL-1）の個々又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
上述したように、本発明の組成物又は方法には、血小板によって媒介される閉塞のエンハンサーが含まれる。前記血小板によって媒介される閉塞のエンハンサーは、上述したように２つの機能を有する分子の一部を形成する部分であってもよく、本発明による組成物中の成分であってもよく、かつ／又は本発明による組成物とは切り離して投与されてもよい。
【００６８】
典型的な血小板によって媒介される閉塞のエンハンサーとして、リストセチン、トロンビン、ヘパリン起因性血小板減少（heparin-induced thrombocytopenia、HIT）抗体もしくはその一部、抗リン脂質抗体（antiphospholipid antibody、APA）もしくはその断片、Fcによって媒介される機構を経る全抗体分子、抗LIBS抗体、抗CD9抗体、エピネフリン、トロンビン受容体活性化ペプチド（thrombin receptor activating peptide、TRAP）、プロテイナーゼ活性化受容体（別名プロテアーゼ活性化受容体、proteinase activated receptor、PAR）のアゴニスト、カテプシンG、エラスターゼ、アラキドン酸エステル、血小板活性化因子（platelet activating factor、PAF）、トロンボキサンA2（thromboxane A2、TxA2）、TxA2模倣物質（mimetics）、ホスホリパーゼA2（phospholipase A2、PLA2）、プロテインキナーゼC（protein kinase C、PKC）のアクチベータ、アデノシン二リン酸（adenosine diphosphate、ADP）、シクロオキシゲナーゼ１（cyclo-oxygenase 1、COX-1）のインデューサー、シクロオキシゲナーゼ２（cyclo-oxygenase 2、COX-2）のインデューサー、コラーゲン、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor、VWF）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinases、MMPs）、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、イオノフォア、補体カスケード成分（例えばC5b-9）、血小板微粒子、血小板膜画分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
上述したように、本発明の組成物又は方法には、血小板によって媒介される閉塞の凝固遅延剤又はその種の他のものが含まれてもよい。前記血小板によって媒介される閉塞の凝固遅延剤は、上述した２つの機能を有する分子の一部を形成する部分であってもよく、本発明による組成物中の成分であってもよく、かつ／又は本発明による組成物とは切り離して投与されてもよい。
【００７０】
典型的な血小板によって媒介される閉塞の凝固遅延剤として、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、チクロピジン、クロピドグレル、インドメタシン、ジピリダモール、オメガ−３脂肪酸、プロスタサイクリン、一酸化窒素、一酸化窒素のインデューサー、一酸化窒素シンターゼのインデューサー、マトリックス・メタロプロテイナーゼ・インヒビター（matrix metalloproteinase inhibitors、MMPIs、TIMPs）、抗GPIIb/IIIa剤、抗αvβ3剤、抗α2β1剤、抗CD36剤、抗GPVI剤、オーリントリカルボン酸、トロンビン受容体アンタゴニスト、トロンボキサン受容体アンタゴニスト、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベータ（tissue plasminogen activator、tPA）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
さらに、血小板の膜の相転移温度以下に（すなわち、15℃より下に）冷却した血小板は不可逆的に活性化した状態になることが知られている。前記血小板は、患者に輸血された場合、正常に機能するが、前記血小板は、急速に（すなわち、通常の循環している血小板の寿命が7から10日間であるのに対して、約24時間で）体から除去される。これらの血小板は急速に除去されるが、それらは、固定化したVWFに高い親和力で結合する。従って、冷却した血小板を輸血することによって、標的部位での血栓の形成を促進する別の手段が提供される。従って、本発明の一つの実施態様として、上述したように冷却した血小板を投与することによって血小板によって媒介される閉塞を制御することが挙げられる。
【００７２】
上述したように、ターゲティング部分は、結合する対の一つのメンバーであるか、又は結合する対の一つのメンバーに結合してもよい。本発明による方法は、ターゲティング部分が局在化部位に蓄積するために、標的でないものよりも最適な標的が蓄積するために、前記結合する対の第二のメンバーが蓄積し、かつ結合するために、及び／又は非結合物質を除去するために、十分な期間を必要とする。
【００７３】
本発明において、２、３又はそれ以上の段階のターゲティング又は局在化工程を使用してもよい。これらのプロトコールのうちの多くは、本技術分野で既知となっている（例えば、ビオチン／アビジン・プロトコールを用いる米国特許第5,578,287を参照されたい）。典型的な多段階プロトコールとしては、結合剤−リガンドを投与すること、抗リガンドを投与して、結合していない結合剤を除去し、かつ結合した結合剤−リガンドを局在化させること、及び活性剤−リガンドを投与することが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する活性剤は、活性状態であるか、又は活性状態になって、治療上の利益をもたらす任意の治療薬を指す。
【００７４】
本発明の方法において、結合剤は、リガンド／受容体複合体に結合する能力がなければならず、任意の免疫学的に適した経路によって患者に投与してもよい。例えば、静脈内経路、動脈内経路、皮下経路、腹腔内経路、髄腔内経路、膀胱内経路、皮内経路、筋肉内経路又はリンパ内経路によって、結合剤を患者内へ導入してもよい。組成物は、固体、溶液、錠剤、エアロゾル又は多層の剤型であってもよい。リポソーム、長期間循環するリポソーム、免疫リポソーム、生分解性マイクロスフェア、ミセル又はその種の他のものを担体、媒体又は送達システムとして用いてもよい。さらに、本技術分野で既知である生体外手法を用いて、血液、血漿又は血清を患者から採取し；任意であるが、患者の血液中の抗原を精製することが望ましく；その後、血液又は血清を、本発明による結合剤又は固相剤を含む組成物と混合し；処理した血液又は血清を患者に戻す。臨床医は、最も効果的な投与経路を決定するという点で、これらの異なる経路に伴う応答を比較することができる。本発明は、結合剤を患者に導入する特定の方法のいずれかに限定されるべきではない。
【００７５】
投与を、一度、一度以上、又は長期にわたって行ってもよい。本発明の組成物を、深刻な病的状態、すなわち、生死にかかわる又は生死にかかわる恐れのある患者に用いる場合、過剰量の固相剤を望ましいのであれば投与してもよい。医薬組成物を投与する実際の方法及びプロトコールは、本組成物を注入するために希釈する技術を含むものであり、当業者に既知であって、自明なものである。これらの方法及びプロトコールのうちのいくつかは、Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co. (1982)に記載されている。
【００７６】
固相剤を、他の結合剤と組み合わせて投与するか、あるいは他の治療のプロトコール又は薬剤、例えば化学療法薬、ゲルフォーム（Gelfoam）もしくはポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol、PVA）粒子などの塞栓形成剤と組み合わせて投与してもよい。
【００７７】
本技術分野でよく知られているように、治療薬剤又は治療薬剤抱合体を生体内に投与することに伴う不利益として、標的でないもの又は望ましくない標的の結合が挙げられる。従って、いずれの投与した組成物の特性が、標的でないものの結合を最小限にし、治療薬剤もしくは活性剤に標的でないものをさらすのを最小限にし、かつ／又は結合していない結合剤、リガンド又は活性剤の除去を最大にするものであることが望ましい。また、これらの特性を最適化することによって、典型的には活性剤、治療薬又は以前は活性化していない薬剤を活性化する作用の成分を高い用量で投与することが可能となる。当業者であれば、できるだけ最も高い容量を投与する一方で、毒性の閾値以下に安全に維持するために最適なパラメータを選択することに精通している。
【００７８】
従って、本発明の好ましい実施態様において、活性化していない血小板は、固相剤に結合することによって、所定の部位に蓄積するか、又は蓄積するように誘導され、それから適切に局在化した血小板が選択的に活性化される。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様において、活性化した血小板は、固相剤に結合することによって、又は固相剤に結合した血小板を介して、所定の部位に蓄積するか、又は蓄積するように誘導される。
【００８０】
本発明の有効性は、血栓形成を測定する従来の検定、血栓形成、腫瘍の壊死、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態学及び／又は腫瘍の壊死をもたらす血栓形成の形態計測試験、血流試験（例えば、血管造影法、ドップラー超音波法、Ｘ線撮影法、ＣＴスキャン、ＭＲＩ）、又は痛みの症状の軽減によって調べてもよい。他の試験を行って、治療上の利益を評価するか、又は調べることは、当業者に自明である。
【００８１】
特定の先天的かつ病的な状態に対して、本発明の組成物又は方法を変更して、過剰に出血するか、又は血栓症になる患者の疾病素質を補うことが望ましく、このことは当業者に自明なことである。前記特定の先天的かつ病的な状態のうちのいくつかは以下に記載されている。このような状況の下で、本発明の方法又は組成物を向上させるか、又は弱める変性剤を使用することを採用することができる。このような変性剤を使用することを予定して、出血又は凝固の症状発現を最小限にする。また、変性剤を使用することによって、正常な状況（すなわち、正常な恒常生）の下で、本発明による組成物を制御して投与することが可能になる。
【００８２】
本発明の方法又は組成物を弱める制御物質（controllers）、凝固遅延剤又は薬剤を使用することが当然である典型的な血栓形成促進性（pro-thrombotic）又は凝血促進性の状態として、中でもファクターＶLeiden欠乏症、抗リン脂質症候群（antiphospholipid syndrome、APS）プロテインＣ及び／又はプロテインＳ及び／又はアンチトロンビンIII欠乏症、深部静脈血栓症（deep vein thrombosis、DVT）擬フォン・ウィルブランド病、タイプIIbフォン・ウィルブランド病、末梢血管疾患（peripheral vascular disease、PVD）、並びに高血圧症が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法又は組成物を高めるエンハンサー又は薬剤を使用することが当然である出血の危険を有する典型的な状態としては、出血の危険を有する任意の状態が挙げられるが、これに限定されず、その状態として、中でも凝固因子欠乏症、血友病、血小板減少症及び抗凝固治療が挙げられるが、これらに限定されない。血栓の生成を制御することとして、所定の部位の温度を変更すること、所定の部位の血流速度を変更すること、所定の部位の血圧を変更することのうちの少なくとも一つが挙げられる。
【００８３】
前記のものの例として、血管閉塞作用の開始により、関連した血管形成促進性（prothrombotic）の状態が逆戻りすること又は減衰することが必然であることは、当業者に自明なことである。そのような場合に、血小板の反応性を減少させる薬剤を投与することによって、血管閉塞イニシエータに対する応答を減少させる。そのような薬剤は、当業者に容易に知られており、当該薬剤として、アスピリンもしくはアスピリン様化合物、イブプロフェン、アエトアミノフェン、ケトプロフェン、チクロピジン、クロピドグレル、インドメタシン、オメガ−３脂肪酸、プロスタサイクリン、一酸化窒素、一酸化窒素のインデューサー、一酸化窒素シンターゼのインデューサー、マトリックス・メタロプロテイナーゼ・インヒビター（matrix metalloproteinase inhibitors、MMPIs、TIMPs）、抗GPIb剤、抗GPIIb/IIIa剤、抗αvβ3剤、抗α2β1剤、抗CD36剤、オーリントリカルボン酸、トロンビン受容体アンタゴニスト、トロンボキサン受容体アンタゴニスト、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベータ（tissue plasminogen activator、tPA）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
血小板閉塞作用を向上させるか、又は増大させることが望ましい典型的な作用としては、血小板が減少している（血小板の数が少ない）患者が含まれる。このような人は、適切な供給源を提供して、血小板による閉塞を達成する血小板生成物を併用すること又は前投与（輸血）することにより利益を得る。正常な血小板の機能を模倣しているか、又はそれに似ている輸血可能なすべての生成物をそのような状況の下で使用できることは、当業者に自明である。そのような薬剤として、ランダムドナー血小板、アフェレーシス血小板、自家血小板、洗浄血小板、血小板膜画分、冷却した血小板、凍結した血小板、血小板膜成分を含むか、又は現す粒子、血小板の代替物及び全血が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
さらなる例として、特異的に血小板機能を増大させる薬剤を用いて、治療部位に一旦ターゲティングした初期の血小板の反応性を高めるか、又は向上させることができる。当業者に既知である薬剤は、既存の血小板反応性を向上させ、かつ／又は十分な血小板反応性を制限する閾値を低下させて、不可逆的な血小板の付着及び／又は血小板の脱顆粒及び／又は血小板と血小板の結合及び／又は既存の血栓周辺への血小板の癒着を促進するものであることが明示されている。このような薬剤として、リストセチン、トロンビン、ヘパリン起因性血小板減少（heparin-induced thrombocytopenia、HIT）抗体もしくはその一部、抗リン脂質抗体（antiphospholipid antibody、APA）もしくはその断片、Fcによって媒介される機構を経る全抗体分子、抗リガンド誘導結合部位（anti-ligand-induced binding site、抗LIBS）抗体もしくはその一部、抗CD9抗体もしくはその一部、エピネフリン、トロンビン受容体活性化ペプチド（thrombin receptor activating peptide、TRAP）、PARのアゴニスト、カテプシンG、エラスターゼ、アラキドン酸エステル、トロンボキサンA2（thromboxane A2、TxA2）模倣物質（mimetics）、TxA2、ホスホリパーゼA2（phospholipase A2、PLA2）、プロテインキナーゼC（protein kinase C、PKC）のアクチベータ、アデノシン二リン酸（adenosine diphosphate、ADP）、コラーゲン、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor、VWF）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinases、MMPs）、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、イオノフォア、血小板微粒子、血小板膜画分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
固相剤は、腫瘍、増殖性組織、動静脈奇形、動脈瘤又はエンドリーク（endoleak）を有する動物の血流内へ導入するとすぐに、標的の脈管構造に局在化し；血小板を結合するか、又は固定化することで、固定化によって血小板が活性化し；活性化した血小板は、閉塞が形成されるまで他の血小板を結合し、活性化させる。血小板の活性化と結合によって、活性化した血小板への白血球の結合が促進され、標的の脈管構造の閉塞がさらに増大する。
【実施例１】
【００８７】
抗原細胞表面のマーカーに対するモノクロナール抗体を製造する手法は非常に簡単であり、Kohler及びMilsteinの手法（1975）によって例示される当業者に既知である手法を用いて容易に行うことができる。概して、刺激を受けた内皮細胞を用いるモノクロナール抗体の製造は以下の手順を含むものである。ヒトの腫瘍由来の細胞又は細胞株を組織培養で４日間またはそれ以上の日数に渡って培養する。組織培養の上清（“腫瘍馴化培地”）を、腫瘍細胞の培養物から回収し、ヒト臍静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cells、HUVEC）の培養物に最終濃度で50％（容積／容積）となるように添加する。2日間培養した後、HUVECを非酵素的に回収し、1〜2x106個の細胞をマウスへ腹腔内注射する。この処理を、2週間間隔で3回繰り返し、最終免疫は静脈内経路を用いて行う。3日後、脾臓細胞を回収し、標準プロトコール（KohlerとMilstein、1975）によって、SP2/0ミエローマ細胞と融合させる。適切な反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈によってクローニングする。
【００８８】
その結果生じたハイブリドーマの回収物から、非活性の血管内皮細胞を認識するものよりも、活性化した血管内皮細胞を大いに認識する抗体を産生するハイブリドーマを１種又はそれ以上選択する。最終目標は、正常な内皮細胞に対する結合親和性を実質的にほとんど有さない抗体を同定することである。適した抗体産生ハイブリドーマを、1種又はそれ以上の腫瘍活性内皮細胞に対する、例えば、ELISA、RIA、IRMA、IEF又は同様の免疫学的検定を用いてスクリーニングすることによって同定する。一旦、候補を同定したら、非活性の又は“正常な”内皮細胞又はその他の正常な組織もしくは細胞種に対する反応性が欠如しているかどうか試験する。このようにして、想定される特定の用途にとって望ましくない高水準の通常の交差反応性を有する抗体を産生するハイブリドーマを除外することができる。
【実施例２】
【００８９】
リガンド／受容体複合体、詳細には成長因子／成長因子受容体複合体を特異的に認識する単鎖の抗体を製造する手法を使用し、それによって、生じた抗体分子は、成長因子／成長因子受容体複合体を認識するが、成長因子又は成長因子受容体のいずれかのみとは結合しない。これらの抗体を、マウスの免疫化によって、VEGF及びVEGF受容体などの精製したリガンド及び受容体の複合体、並びにその結果生じたV遺伝子を用いて線状ファージ内の抗体ライブラリーを構築することで作成することができる。抗体断片のファージ・ディスプレイによって、活性化した内皮細胞抗原、詳細にはリガンド／受容体複合体に対する組換え型抗体分子を産生することが可能になる。ファージ・システムは、脊椎動物の免疫システムを模倣する。
【００９０】
メスのBALB/cマウスを、HPLCで精製した組換えVEGFとVEGF受容体（例えば、可溶性VEGF/FLT-1受容体又はVEGF/KDR受容体）の複合体を用いてQuil Aなどのアジュバントの存在下で免疫する。適切な抗体価に到達した後（通常4番目の追加免疫後）、マウスを屠殺し、脾臓を摘出する。脾臓からメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）を単離し、cDNAに転写する。cDNAのV遺伝子を増幅し、“単鎖Fv”（single chain Fv、scFv）となるように構築する。適切な制限酵素で消化した後、scFvをファージミド・ベクター内へライゲーションする。次に、コンピテント大腸菌（E. coli）細胞を、これらのファージミド・ライブラリで形質転換し、ヘルパー・ファージ（例えば、M13K07、Pharmacia）により感染させた後、scFvを表すファージ粒子を製造する。リガンド／受容体複合体に結合するが、リガンド単独又は受容体単独のいずれかのみとは結合しない可溶性scFvを発現させるために、選択したクローンをスクリーニングする。固相抗原として用いられる、リガンド／受容体複合体、リガンド及び受容体をそれぞれ用いて、標準のELISA手法によってこのスクリーニングを行う。
【実施例３】
【００９１】
種々の内皮細胞マーカーは、本発明の態様を実施するために既存の又は誘導性の標的として用いることが可能であることが知られており、VEGF／VPF（血管内皮成長因子／血管透過性因子、vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor）、内皮白血球接着分子（endothelial-leukocyte adhesion molecule、ELAM-1；Bevilacquaら、1987）；血管細胞接着分子−１（vascular cell adhesion molecule-1、VCAM-1；Dustinら；1986）；細胞内接着分子−１（intercellular adhesion molecule-1、ICAM-1；Osbornら、1989）；白血球接着分子−１の薬剤（agent leukocyte adhesion molecule-1、LAM-1 agent）又はHLA-DR、HLA-DP又はHLA-DQなどの主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、MHC）クラスII抗原（Collinsら、1984）が挙げられる。これらのうち、VEGF/VEGF受容体複合体のターゲティングがおそらく好ましいであろう。上記の内皮細胞抗原を認識するモノクロナール抗体又は特異的なペプチドを、VWFで被覆した粒子などの固相剤に結合させ、カテーテル又は同様の送達装置を用いて標的の脈管構造へ送達する。それによって、粒子は、標的脈管構造内の内皮細胞に結合し、粒子上での血小板の結合及び血小板の活性化をもたらし、そのような血小板の活性化は、粒子周辺での血小板の凝集をもたらし、最終的には血栓形成をもたらす。形成した血栓は、標的脈管構造を閉塞し、それによって下流の組織への酸素及び栄養素の送達を防ぐ。
【実施例４】
【００９２】
血小板を特異的な部位にターゲティングすることは、固相剤上に固定化したVWFとの相互作用によって、血小板が固相剤に直接結合するという形で行われる。例えば、直径が約1μmから5mmである粒子上に固定化した組換え型VWF及び／又はヒトVWF及び／又はブタVWFをカテーテルなどの様々な手段によって標的部位に送達することができる。VWF粒子が標的の脈管構造に送達された後、血小板の結合が起こり、それによって血流内に流れる血小板が粒子と接触し、粒子に結合し、粒子全体に拡散し、活性化し、他の血小板を結合し、最終的には血管を閉塞する血栓を形成する。血小板がVWF粒子に結合することを、生体外で起こすことも可能であり、それによって血小板は、体外の血管内の粒子と接触し、続いてカテーテル又は同様の薬剤送達装置を用いて標的部位に送達される。粒子の大きさは、血小板の粒子との反応性（すなわち、血小板の粒子への結合）を起こすことにより、毛細血管床を超える粒子の発達が、大きさの制限のために、又は血管壁の受容体と相互作用する粒子と結合した血小板及び／又は結合凝固タンパク質のために生じることができないようなものが選択される。従って、VWF粒子の大きさは、直径が約1μmから約5mmまでの範囲内である。最も好ましくは、粒子は、直径が5μmから2mmまでの範囲内である。さらに好ましい粒子の直径は、20μmから300μmまでの範囲内である。
【実施例５】
【００９３】
（粒子）
種々の組成物の粒子を、本発明における固相剤として使用することができる。以下の粒子の、血小板を結合する薬剤を結合する能力を試験した。ポリスチレン・マイクロスフェアをPolysciences Inc.,（Warrington, PA）から購入し、受動的な接着処理（0.2M炭酸緩衝液、pH9.0-9.6内でインキュベーション）によって、又はカルボジイミド又はグルタルアルデヒドを用いて誘導体化したビーズへ共有結合させることによって、ヒトのフォン・ウィルブランド因子で被覆した。数種類のビーズを試験し、該ビーズの中には、単純な（plain）ポリスチレン・マイクロスフェア（カタログ＃07310、17134、17135、07312、07313、07314）、ポリビーズ（polybead）・アミノ・マイクロスフェア（カタログ＃19118）、ポリビーズ（polybead）・カルボキシレート・マイクロスフェア（カタログ＃17141）、フルオレスブライト（fluoresbrite）・マイクロスフェア（カタログ＃17155、17156）、ポリスチレン染色マイクロスフェア（カタログ＃15715、15714、15716）及び常磁性粒子（カタログ＃19829）があった。ビーズは、すべてフォン・ウィルブランド因子を結合し、後の試験で血小板を結合した。血小板がビーズに結合していることを、凝集測定法と位相差顕微鏡法によって確認した。
【００９４】
試験した他の粒子の中には、ポリビニルアルコール（polyvinyl alchol、PVA）粒子（Cook, Bloomington, Indiana）及び大凝集アルブミン（macro-aggregated albumin、MAA）粒子（Edmonton Radiopharmaceutical Centre、Edmonton, Alberta, Canada）がある。別の実験において、フォン・ウィルブランド因子を受動的に（上記のような炭酸緩衝液）及び共有結合により（上記のようなグルタルアルデヒドの結合）、粒子に結合させた。次に、血小板が粒子に結合していることを、凝集測定法、位相差顕微鏡法及び蛍光顕微鏡法（FITCで標識した抗CD61抗体）によって確認した。
【実施例６】
【００９５】
（哺乳類のVWFの比較。）
ブタVWF、ウシVWF及びヒトVWFを、２つのアプローチを用いてポリスチレン粒子に固定化した。第一のアプローチ（直接結合）では、0.2M炭酸塩の存在下（pH9.35）で、物質を固相粒子に受動的に吸収させる手段を用いた。第二のアプローチ（間接結合）は、固相粒子の表面上に固定化した抗VWF抗体を用いて、ブタ、ウシ、及びヒトの血漿からそれぞれVWFを単離することから構成されるものであった。後者のアプローチにおいて、使用した抗体（供給源はウサギ）は、Dako（Mississauga, Ontario;カタログ＃A0082）から購入し、製造業者によって提供されている情報に従って、ヒト、ウシ及びブタのフォン・ウィルブランド因子を結合していることを確認した。抗体を、炭酸緩衝液（0.2M、pH9.35）中で受動的に吸収させることによってポリスチレン・ビーズ（直径4.5μm）に固定し、それぞれの供給源からの血漿と室温で60分間インキュベートした。ビーズを、結合していないタンパク質がないように洗浄し、ヒト及びブタ由来の全血及び多血小板血漿を曝露するために使用した。同様にして、ヒト、ブタ及びウシのVWFを、上述したように受動的に吸収させることによって、別個にビーズに直接（すなわち、結合抗体を用いずに）結合させ、ヒト及びブタの血小板（全血及び多血小板血漿［platelet rich plasma、PRP］）を曝露するために使用した。いくつかの実験では、ブタ及びヒトのPRPを一緒に混合し、種々の薬剤（以下を参照）に曝露した。
【００９６】
【表１】
2005511502.tif 000002
【実施例７】
【００９７】
（白血球相互作用）
ブタ又はヒトのVWFと結合した粒子は、供給源の血液に依存して、ヒト又はブタの血小板を特徴的に結合した。さらに、単球、顆粒球及びリンパ球を含む白血球が、粒子に結合した血小板と相互作用したことを観察した（分染及び顕微鏡検査によって確認した）。
【００９８】
標的部位における血小板の活性化によって、標的組織の減少又は死滅を増大させる二次効果が誘導される。血小板因子４（platelet factor 4、PF4）などの物質の活性化した血小板による放出によって血管新生が阻害される。活性化した後の血小板によるRANTESなどの化学誘引物質の放出によって、標的組織に対する白血球（例えば好酸球、単球）の効果が増大する。CD62などの顆粒状成分の血小板による活性化後の発現によって、単球及び多形核白血球（polymorphonuclear leukocytes、PMNs）の結合が誘導され、組織の因子が発現（単球；凝血原）し、細胞が活性化し、攻撃する（PMNs）こととなるだろう。さらに、活性化した血小板によって、標的部位でCD40リガンド（CD40L）が放出されることによって、単球による組織の因子の発現が誘導され、局所の凝固亢進状態をもたらす。
【実施例８】
【００９９】
固相剤を、コイル又はステントの形にすることもできる。組換え型又は哺乳類由来のVWFをこのような固相剤に結合させ、手術を含めた様々な手段及び／又はカテーテルによって標的脈管構造に送達することができる。動脈瘤などの標的部位に、特別なカテーテル及び関連したガイドワイヤーを用いて血流を介して到達することができる。ガイドワイヤーを、大腿動脈などの進入部位を通じて血管システム内に導入し、主要な血管を通じて標的部位へ徐々に前進させる。カテーテルを、ガイドワイヤー越しに標的部位へ導入し、すぐにガイドワイヤーを取り除く。次に、固相血小板結合コイルを、カテーテルの内腔を通じてそれを配置する動脈瘤へ前進させる。コイルに結合したVWFは、血流内を流れる血小板を特異的に結合する。血小板は活性化し、コイルの周辺に急速に蓄積し、それによって局在化し、静止した血栓を形成し、次に動脈瘤の破裂の危険性を減少させる。
【実施例９】
【０１００】
（ブタモデルにおける粒子に固定化したVWFの急性効果）
ブタ腎臓の脈管構造内において血栓形成を誘導することにおけるヒトVWFで被覆した粒子の有効性を評価するために、研究を計画した。この手順において、20〜22ゲージの血管カテーテルを用いて腎動脈にカテーテルを入れた。腎動脈を手術によって露出させ、ドップラー・フロー・プローブ（Doppler flow probe）を腎動脈に取り付けて、標的器官内及び標的器官外の血流を観測した。腎動脈及び腎静脈から得られた流量の読取値の間に顕著な差異は全く見られず、そのため全ての読取値を、腎静脈から更に得て、標的の腎臓を通る血流を示した。ヒトVWFを、グルタルアルデヒドと一晩中インキュベートすることによって、ヒトMAAに共有結合させた。タンパク質の重量ごとにMAAに結合したVWFの量を変化させる事前の滴定による検討によって、1:5から1:80（MAA：VWF）の比率で、血小板の結合及び活性化を誘導するために十分に固定化したVWFが得られることを明らかにした。このことを踏まえて、生体内研究のために1:20（MAA:VWF）の比率を選択した。位相差顕微鏡法による粒子の分析によって、最終的な製造における粒子の大きさは、30μmから250μmまでの範囲内であることが示された（マイクロメータ／血球計を用いる光学顕微鏡法によって推定した）。
【０１０１】
MAAとVWF（500μl又は1ml）に続いて、ヒトPRP（500μl、約200x106から400x106の血小板を含む）をブタの腎動脈内へ注入することによって、血流が大幅に減少した。試験薬剤の後にヒト血小板を注入して、ヒト内の条件にできる限り近づけた。なお、ブタ血小板のヒトVWFへの結合が非常に弱いことが認められた（上記実施例６参照）。試験薬剤の注入から10分以内に、血流は、ベースラインの水準の半分以下に減少した。試験薬剤の注入から15分以内に、血流は、ベースラインの値の20％以下に減少した。90分間の観測期間の間に、器官への血流は増加しなかった。
【０１０２】
逆に、反対側の腎臓の腎動脈内に注入したコントロール薬剤（MAA単独；同じタンパク質濃度）は、血流の一時的な減少を示した。最初に血流は50％まで減少したが、急速にベースラインの水準付近まで、すなわち15分以内には本来の血流の80％より大きいところまで、30分以内には本来の血流の90％より大きいところまで戻った。
【０１０３】
標的の脈管構造の組織学実験によって、試験器官においては腎動脈の隣接した枝内にある大きな血栓が、コントロールの腎臓においては腎臓の脈管構造の小さい血栓が明らかにされた。コントロール又は試験動物の肝臓、肺、脾臓、脳、心臓及び眼では血栓は全く認められなかった。
【実施例１０】
【０１０４】
（ブタモデルにおける粒子に固定化したVWFの慢性効果）
実施例９で説明した手順と同様にして、2頭の試験ブタと2頭のコントロールブタの腎動脈に20〜22ゲージの血管カテーテルを用いてカテーテルを入れた。ドップラー・フロー・プローブ（Doppler flow probe）を、外科的に各々の動物の腎静脈に取り付け、最初の切開を閉じた後、動物の外皮上に鉛製のワイヤーを露出した。罹患した腎臓を通る血流のベースラインを定めた後、1mlのMAA：VWF粒子（総タンパク量11mg）に続いて、1mLのヒト多血小板血漿（約460x106の血小板（血小板の数458x109／リットル））を試験動物の腎動脈内に注入し、同量のMAAをコントロール動物内に注入した。動物を、代謝性クレート（metabolic crate）に移し、7日間に渡って、様々な時間間隔で観測した。以下の表は、これらの研究から得られた血流の結果を示す。
【０１０５】
【表２】
2005511502.tif 000003
【０１０６】
コントロール動物及び試験動物の主な器官及び組織を、血栓及び処理に関連した他の障害の証拠があるかどうか、組織学的に調べた。標的の腎臓の脈管構造以外に血栓は全く観察されなかった。
【実施例１１】
【０１０７】
（ナトリウム・パーテクネテイトTc 99mで標識したMAA/VWF）
MAA/VWF粒子を、ヒトVWF（供給元はAlphanate, Alpha Therapeutics Corp.）を、グルタルアルデヒド（0.0625％容積／容積、最終濃度）を用いて、MAA粒子（11mgタンパク質；供給元は、注入用MAA, Edmonton Radiopharmaceutical Centre）に結合させることによって製造した。タンパク質の比率は、40:1から20:1（MAA：VWF）までの範囲内であった。粒子の機能性を、健康な、投薬していない（2週間以上）ボランティア由来のクエン酸多血小板血漿及びクエン酸全血を、MAA/VWF粒子を用いて、500rpmで10分間攪拌して（10μlの粒子+100μlの血小板供給源）曝露することによって調査した。位相差顕微鏡法で反応を観察することによって、血小板を結合し、活性化して、血小板とMAA/VWF粒子の大きい塊を形成する粒子の能力を確認した。
【０１０８】
次に、MAA/VWF粒子を、88MBqから300MBqの範囲内の放射能量を用いて、ナトリウム・パーテクネテイトTc 99mで標識した。同容量の粒子の生理食塩水溶液とナトリウム・パーテクネテイトTc 99mを室温で10分間インキュベートした。標識効率を、薄層クロマトグラフィーを用いて決定し、標識効率は、95％を超えていることが分かった。
【０１０９】
次に、Tc 99mで標識したMAA/VWF粒子を、粒子の機能性への標識の影響を評価するために試験した。位相差顕微鏡法によって、Tc 99mで標識したMAA/VWF粒子が血小板を結合し、活性化することが可能であることが確認された。標識した粒子の機能的な活性の明白な減少は全くなかった。
【実施例１２】
【０１１０】
（ブタ腎臓脈管構造のMAA/VWF血栓の蛍光透視研究。）
MAA/VWFを、大腿動脈アプローチを用いてブタ腎臓脈管構造へ送達した。5Frシース・カテーテル（sheath catheter）を、全身麻酔（ハロタン）の後、18から20kgの子豚の大腿動脈内に挿入し、左の腎動脈へ蛍光透視によって誘導した。カテーテルを、造影色素（contrast dye）の送達により、腎臓の脈管構造の下端のみ可視化するように配置した。時間０の時に、MAA/VWF粒子（大きさの範囲30-250ミクロン）1mlを腎臓の脈管構造へゆっくりと（10秒以上に渡って）送達した。10秒後に、1mlのヒトPRP（420x109毎リットル）を送達し、カテーテルを1mlの生理食塩水で洗い流した。カテーテルを、置いたままにし、20分間待機した後、造影剤を再び標的の脈管構造へ送達した。造影剤が、カテーテルの末端に溜まり、それから腎臓の上端の脈管構造内へ急速に移動するのが観察された。腎臓の下端の脈管構造では、分散しなかった造影剤がゆっくり蓄積され（20分以上）、一方上端の脈管構造では、造影剤が急速に失われた（5秒以下）。麻酔下の動物とカテーテルをそのままにして、罹患した腎臓を外科的に露出させ、腎臓の脈管構造を、まさにカテーテルの近くに留め、罹患した腎臓を除去した。腎動脈を縦方向に切開することによって開き、腎臓に向かって解剖した。大きな血栓が、腎臓の下端の脈管構造内深部に達しているカテーテルの末端に認められた。腎臓の上端の脈管構造に凝固は認められなかった。さらに、罹患した腎臓の下端は著しく白くなっており、血流が欠乏していることを示したが、腎臓の上端は通常の赤色の呈色を示した。
【０１１１】
上述した手順に続く別個の実験では、カテーテルを、標的の腎臓の下端の脈管構造へ導き、該カテーテルを用いて、1mlのMAA/VWF粒子に続いて1mlのヒトPRPを送達した。20分後、蛍光透視で測定したところ、腎臓の下端への血流は著しく妨害された。既に述べたように、造影色素（contrast dye）は、カテーテルの先端に溜まった後、急速に上端の脈管構造へ移動した。次に、カテーテルの位置を変え、MAA/VWFに続いてヒトPRPを上端の脈管構造へ送達した。20分間待機した後、造影色素（contrast dye）を再び注入した。蛍光透視によって、上端の脈管構造への血流が妨害されたことが明らかとなった。造影色素（contrast dye）は、下端の脈管構造に流入しなかった。次に、動物を屠殺する前に、関連した腎臓血管を有する標的の腎臓を外科的に摘出した。腎臓を直ちに解剖すると、腎臓の上の極と下の極の両方における血管の過剰な血栓が明らかとなった。
【０１１２】
本発明を特定の好ましい実施態様によって説明したが、これらの実施態様は本発明を限定するものではない。当業者であれば、特に先の教示に照らして、別の実施態様、実施例及び変更を行うことができ、それらも本発明に包含される。
【国際調査報告】
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