(57)【要約】本発明は、野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼに関し、改変された配列は、野生型ポリメラーゼにおけるウラシル結合ポケットを含むアミノ末端アミノ酸中にあり、それによって変異体ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼよりも、ウラシルについて減少された親和性を有する。このような変異体ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応のような生物学的アッセイ系において有用に用いられ得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変されたアミノ酸配列は、野生型ポリメラーゼにおけるウラシル結合ポケットを含むアミノ末端のアミノ酸中にあり、それによって変異ポリメラーゼは、ウラシルについて、野生型ポリメラーゼよりも減少された親和性を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、サーモコッカス  ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)(Tgo-Pol)、サーモコッカス  リトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli-Pol)、サーモコッカス  エスピー９°エヌ−７ (Thermococcus sp.9°N-7)(9°N-7-Pol)、デルスルフロコッカス株(Desulfurococcus Tok)(DTok-Pol)、ピロバクラム  アイランジカム(Pyrobaculum islandicum)(Pis-Pol)、アーキオグロブス  フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)(Afu-Pol)、スルフォロブス  アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac-Pol)、スルフリスファエラ  オーワクエンシス(Sulfurisphaera ohwakuensis)(Soh-Pol)、スルフォロブス  ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(Sso-Pol)、ピロジクティム  オカルタム(Pyrodictim occultum)(Poc-Pol)、またはエアロピラム  ペルニックス(Aeropyrum pernix)(Ape-Pol)から選択される野生型ポリメラーゼの改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
請求項１に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、野生型ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)ＤＮＡポリメラーゼ(Pfu-Pol)の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
請求項３に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸１〜４０またはアミノ酸７８〜１３０における改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
配列番号２の請求項４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸７、３６、３７、９０〜９７、または１１２〜１１９に対する改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸Ｙ７、Ｙ３７、Ｖ９３、Ｉ１１４、またはＰ１１５に対する改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＹ７Ａである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＹ３７Ａである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＶ９３Ｑである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＶ９３Ｒである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＩ１１４Ｒである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＩ１１４Ｑである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
請求項５に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＰ１１５Δである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
配列番号１の請求項４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸、８、３７、３８、９１〜９８、または１１３〜１２０に対する改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸Ｙ８、Ｙ３８、Ｖ９４、Ｉ１１５、またはＰ１１６に対する改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＹ８Ａである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＹ３８Ａである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＶ９４Ｑである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１９】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＶ９４Ｒである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２０】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＩ１１５Ｒである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２１】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＩ１１５Ｑである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２２】
請求項１４に記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変がＰ１１６Δである変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、アミノ酸モチーフ：Ｅ−−Ｉ−Ｆ／Ｙ−−−Ｙ−−Ｄにおける改変を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の古細菌ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸ヌクレオチド。
【請求項２５】
ＤＮＡを増幅する方法であって、（ｉ）ＤＮＡ、遊離オリゴヌクレオチド、プライマー、および請求項１〜２３のいずれかにおいて定義される変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液を加熱することによって、ＤＮＡの２重鎖を変性する工程；（ｉｉ）溶液の温度を低減してプライマーおよびＤＮＡのアニーリングを達成する工程、ならびに（ｉｉｉ）溶液を加熱して、変異体ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長を達成する工程、を包含するＤＮＡを増幅する方法。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれかにおいて定義される変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに必要に応じて増幅されるＤＮＡ、遊離塩基、およびプライマーを含む、ポリメラーゼ連鎖反応のために有用なキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体およびＤＮＡの増幅におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それによって、ＤＮＡが選択的に増幅され得、容易に分析され得る多くのサンプルを生成する方法である。増幅されるＤＮＡと、遊離塩基、ポリメラーゼ酵素、および複製されるＤＮＡセグメントの２つの鎖の反対の末端に結合するプライマーを含む溶液は、ＤＮＡの鎖間の結合を破壊するために加熱される。溶液が冷却される場合、プライマーは別々の鎖に結合し、そしてポリメラーゼはプライマーに遊離の塩基を結合することによって新規な鎖を構築し、それによって所望されるセグメントにもっぱら限定される新規な鎖を生成する。ＰＣＲを用いれば、数時間で、ＤＮＡの小片の数十億個のコピーを生成することが可能である。
【０００３】
このプロセスにおいては、熱安定性のポリメラーゼが必要であり、最も一般的に使用されるものの１つとして、サーマス  アクアティカス(Thermus aquaticus)から得られるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。しかし、この酵素は、一般に「プルーフリーディング活性」と呼ばれる３′−５′エクソヌクレアーゼＩＩＩ機能を保有しない。この機能は、プライマー−鋳型２重鎖の３′末端にてミスマッチする塩基を除去する。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはこの機能を保有しないため、塩基の取り込みエラーを生じやすい傾向にある。
【０００４】
古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性であり、プルーフリーディング活性を実証する。しかし、ネイティブな古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシウラシルによって阻害される。古細菌ＤＮＡポリメラーゼはウラシルについて特異的な「前方確認」機能(read-ahead function)を有する。この鋳型を確認する活性は、複製フォークの前方の鋳型を、ウラシルの存在についてスキャンし、ウラシルの存在を確認すると重合化を失速させる。従って、ＤＮＡ中のデオキシウラシルの存在は、ネイティブな古細菌ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、増幅の失速を引き起こす。これは深刻な問題である。なぜならば、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡサンプルの反復的な加熱および冷却サイクルにより、部分的に、熱的に誘発されるｄＣＴＰ（新規に増幅されるＤＮＡに取り込まれる成分）の、ｄＵＴＰ（これはＤＮＡに取り込まれ得る）への脱アミノ化、およびＤＮＡ中のデオキシシチジンの、デオキシウラシルへの脱アミノ化が生じるからである。このことは、ＰＣＲに不適切であるネイティブな古細菌ＤＮＡポリメラーゼを生じる可能性があり、特に、ＰＣＲがｄＴＴＰよりもむしろｄＵＴＰを用いて行われる場合に問題となる「持ち越し汚染」(carry-over contamination)の防止と関係する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、デオキシウラシルによって阻害される不利益を有さず、特にポリメラーゼ連鎖反応において有用である、改変された古細菌ＤＮＡポリメラーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、本発明の第１の様態は、野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼであって、改変された配列は、野生型ポリメラーゼにおけるウラシル結合ポケットを含むアミノ末端アミノ酸中にあり、それによって変異体ポリメラーゼは野生型古細菌ＤＮＡポリメラーゼに比較して、ウラシルについて減少された親和性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ中にウラシル結合ポケットを同定した、本発明者らによって行われた研究（実施例を参照のこと）に基づくものである。彼らは、このポケットを変化させることによって、本明細書中に記載されるように有利に使用され得る本発明に係る変異体ポリメラーゼを提供することが可能であることを見出した。
【０００８】
変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼの改変物であり得る。例えば、変異体は、図１において示される１４個の古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼのいずれかに由来し得る。例えば、変異体は、ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu-Pol)、サーモコッカス  ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)(Tgo-Pol)、サーモコッカス  リトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli-Pol)、サーモコッカス  エスピ−９°  エヌ−７(Thermococcus sp.9°N-7)(9°N-7-Pol)、デスルフロコッカス株(Desulfurococcus Tok)(DTok-Pol)、ピロバクラム  アイランジカム(Pyrobaculum islandicum)(Pis-Pol)、アーキオグロブス  フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)(Afu-Pol)、スルフォロボス  アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac-Pol)、スルフリスファエラ  オーワクエンシス(Sulfurisphaera ohwakuensis)(Soh-Pol)、スルフォロブス  ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(Sso-Pol)、ピロジクティム  オカルタム(Pyrodictim occultum)(Poc-Pol)、またはエアロピラム  ペルニックス(Aeropyrum pernix)(Ape-Pol)において見出されるポリメラーゼに由来し得る。変異体はまた、任意の他の古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼに由来し得ることが理解される。
【０００９】
変異体は、ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu-Pol)に由来することが好ましい。本発明者らによって使用されたＰｆｕ−Ｐｏｌは、以下のアミノ酸配列を有する：
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【００１０】
本発明者らによって使用されたＰｆｕ  Ｐｏｌは、第２位にて余分なＡを含む。この余分なアミノ酸は、酵素の特性に影響を与えることなくタンパク質発現を改善するので、取り込まれた。真正の野生型Ｐｆｕ  Ｐｏｌは、ＭＩＬＤＶＤＹで始まる。真正の野生型の配列は以下である：
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【００１１】
従って、本発明に係る好ましい変異体は、ＭＡＩＬＤＶＤＹまたはＭＬＤＶＤＹで始まる。
【００１２】
本発明者らは、野生型ポリメラーゼのウラシル結合ポケットが、ｓｓＤＮＡ鋳型の、ポリメラーゼの間隙（いわゆる間隙Ｔ）を結合する部分を形成することを見出した（実施例１を参照のこと）。さらに、ウラシル結合ポケットは、ポリメラーゼの２つの保存された領域からのアミノ酸を含む：領域Ａおよび領域Ｂは、保存されない領域によって分離される。ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu-Pol)からの古細菌ポリメラーゼにおいて、領域Ａはアミノ酸１〜４０によって形成され、そして領域Ｂはアミノ酸７８〜１３０によって形成される。これらの２つの領域における高度に保存された残基は、高度に序列されたウラシル結合ポケットを形成する。他の古細菌は、それぞれのポリメラーゼにおいて、図１において説明されるような、類似の領域Ａ＆Ｂを有する。好ましくは、領域Ａおよび／またはＢにおけるアミノ酸の１つ以上が、変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼを形成するように変化される。
【００１３】
図１は、種々の古細菌ポリメラーゼのＮ末端ドメインの配列アラインメントを図示する。図１において、（１）と示されるアミノ酸は９０％以上の同一性を有し、（２）は８０〜９０％の同一性を示し、そして（３）は６０〜８０％の同一性を示す。ウラシル結合ポケットを形成する、しっかりと保存された２つの領域は：
領域Ａ、Ｐｆｕ−Ｐｏｌにおけるアミノ酸１〜４０（および他のポリメラーゼにおける対応する領域）；ならびに
領域Ｂ、Ｐｆｕ−Ｐｏｌにおけるアミノ酸７８〜１３１（および他のポリメラーゼにおける対応する領域）、である。
【００１４】
変異体は、図１において影がつけられるアミノ酸ブロック（１、２、または３）のうちの１つの変化によって形成されることが好ましい。例えば、モチーフ：Ｅ−−Ｉ−Ｆ／Ｙ−−−Ｙ−−Ｄにおける変化であってもよい。
【００１５】
改変は、置換、欠失、または付加からなり得る。不変残基の１つを変化させてもよいし、またはウラシル結合ポケットの立体配座に影響を与える領域Ａおよび／またはＢにおける他の残基を変化させてもよい。
【００１６】
本発明者らは、Ｐｆｕ−Ｐｏｌにおける残基７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９は特に、ウラシル結合について重要であると考える。好ましくは、これらの残基の少なくとも１つを改変し、ポケットの立体配座に影響を与え、それによってそのウラシル結合能力を減少させる。より好ましくは、Ｐｆｕ−Ｐｏｌにおける変異は、アミノ酸Ｙ７、Ｙ３７、Ｖ９３、Ｉ１１４、またはＰ１１５における変化からなる。より好ましくは、変化はＹ７Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｒ、Ｉ１１４Ｒ、Ｉ１１４Ｑ、またはＰ１１５Δからなる。最も好ましくは、Ｐｆｕ−Ｐｏｌの変異はＶ９３Ｑである。
【００１７】
好ましいＰｆｕ−Ｐｏｌ変異体の例は、以下のアミノ酸配列を有する：
【００１８】
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【００１９】
2005526510.tif 000006
【００２０】
2005526510.tif 000007
【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
上述に列挙される好ましい変異体は、野生型において見出されない、第２位でのアラニン（Ａ）の挿入を含むことが理解される。従って、このような変異体は、Ｐｆｕ  ＰｏｌのＭＡＩＬＤＶＤＹのＹ８Ａ、Ｙ３８Ａ、Ｖ９４Ｑ、Ｖ９４Ｒ、Ｉ１１５Ｒ、およびＩ１１５Ｑ変異体と表され得、ならびに真正の野生型（ＭＩＬＤＶＤＹ）のＹ７Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｒ、Ｉ１１４Ｒ、およびＩ１１４Ｑ変異体に対応する。真正の野生型（ＭＩＬＤＶＤＹ）のＹ７Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｒ、Ｉ１１４Ｒ、およびＩ１１４Ｑ変異体はまた、本発明に係る好ましい変異体である。
【００２５】
他の古細菌ポリメラーゼの等価な残基が変異され得ることが理解される（図１を参照のこと）。例えば、Ｙ７Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｒ、Ｉ１１４Ｒ、およびＩ１１４Ｑ、およびＰ１１５Δは、Ｔｇｏ−ｐｏｌ、ＤＴｏｋ−ｐｏｌ、および９°Ｎ７−ｐｏｌにおいて好ましい変異体のままである。
【００２６】
本発明はまた、上述で規定されるような古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸を提供する。
【００２７】
好ましい変異体遺伝子の例は、以下のＤＮＡ配列を有する：
【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
上述に列挙されるＤＮＡ配列によってコードされる好ましい変異体が、野生型において見出されない、第２位で挿入されるアラニン（Ａ）についてのコドンを含むことが理解される。従って、このような変異体は、Ｐｆｕ  ＰｏｌのＭＡＩＬＤＶＤＹのＹ８Ａ、Ｙ３８Ａ、およびＰ１１６Δ変異体と表され得、ならびに野生型（ＭＩＬＤＶＤＹ）のＹ７Ａ、Ｙ３７Ａ、およびＰ１１５Δ変異体に対応する。
【００３２】
また、他の好ましい変異体についてのＤＮＡ配列が、上記のアミノ酸配列を考慮して容易に明白であることが理解される。従って、真正の野生型（ＭＩＬＤＶＤＹ）のＹ７Ａ、Ｙ３７Ａ、Ｖ９３Ａ、Ｉ１１４Ｒ、Ｉ１１４Ｑ、およびＰ１１５Δ変異体をコードするＤＮＡ分子もまた、本発明に係る好ましい核酸である。
【００３３】
上述で規定されるような変異体ポリメラーゼは、それらが熱安定性であり、プルーフリーディング能力を有するが、ｄＵＴＰの存在によって失速されないので、ＰＣＲに特に有用である。
【００３４】
従って、本発明のさらなる様態は、増幅されるＤＮＡ、遊離塩基、プライマー、および野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応に有用なキットを提供し、改変された配列は、野生型ポリメラーゼにおけるウラシル結合ポケットを含むアミノ末端のアミノ酸中にあり、それによって変異体ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼに比較して、ウラシルについて減少された親和性を有する。
【００３５】
本発明はさらに、ＤＮＡを増幅する方法を提供し、（ｉ）ＤＮＡ、遊離オリゴヌクレオチド、プライマー、および野生型アミノ酸配列の改変されたアミノ酸配列を有する変異体古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液を加熱することによって、ＤＮＡの２重鎖を変性する工程であって、改変された配列は、野生型ポリメラーゼにおけるウラシル結合ポケットを含むアミノ末端のアミノ酸中にあり、それによって変異体ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼに比較して、ウラシルについて減少された親和性を有する、工程；（ｉｉ）溶液の温度を低減してプライマーおよびＤＮＡのアニーリングを達成する工程、ならびに（ｉｉｉ）溶液を加熱して、変異体ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの伸長を達成する工程、を包含する。
【００３６】
変異体ＤＮＡポリメラーゼはｄＵＴＰの存在下でＤＮＡを増幅する能力を有する。従って、変異体ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＴＴＰよりもむしろｄＵＴＰを使用するＰＣＲにおいて特に適切であり、例えば、サンプルの汚染の防止に適切である。
【００３７】
本発明の方法に係る変異体ポリメラーゼを利用するＰＣＲを行うための好ましいプロトコルは以下のようである：ＰＣＲは、以下の条件下で行われ得る：１００μｌ容量、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および２５０μＭ  ｄＴＴＰまたは２５０μＭ  ｄＵＴＰのいずれか、２．５単位のＤＮＡポリメラーゼ（１単位のポリメラーゼは、３０分間７２℃での、活性化ウシ胸腺ＤＮＡベースのアッセイ（４）を使用して、酸沈殿性物質に１０ｎｍｏｌのｄＡＴＰを取り込む酵素の量として規定される）、４０μｌの鉱油で重層される。増幅される５ｎｇの鋳型ＤＮＡが使用され、そして正方向および逆方向プライマー（それぞれ１８塩基長）の濃度は、０．３μＭである。各ＰＣＲは、９５℃で１分間、５２℃で２分間、７２℃で４．５分間の３０サイクルからなった。
【００３８】
本発明は、以下の実施例によって、および添付の図面を参照してさらに説明され、その中で実施例１は、古細菌ポリメラーゼ、特に超好熱性古細菌、ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu-Pol)のウラシル結合を研究し、そして実施例２は、古細菌ＤＮＡポリメラーゼのウラシル結合ポケット中の、およびその周囲の残基の変異誘発の効果を調査する。
【実施例１】
【００３９】
結晶構造は、５つのＢ属ＤＮＡポリメラーゼについて：１つはウイルス、残りは古細菌について公知である。解明された第１の構造は、バクテリオファージＲＢ６９ポリメラーゼ(PB69-Pol)についてであった(J.Wangら、Cell 89、1087(1997))；プライマー−鋳型を伴なう構造がまた決定された（M.C.Franklin,J.J.Wang、T.A.Steitz,Cell 105、657(2001))。より近年になって、超好熱古細菌サーモコッカス  ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)(Tgo-Pol)からの古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼの構造が報告された(K.P.Hopfnerら、Structure 7、1189(1999))。３つの他の古細菌ポリメラーゼ構造、デルフロコッカス株(Deulfurococcus Tok)(DTok-Pol) (Y.Zhaoら、Structure 7、1189(1999))、サーモコッカス  エスピー9°  エヌ-７(Thermococcus sp.9°N-7)(9°N-7-Pol) (A.C.Rodgriguez、H-W.Park、C.Mao、L.S.Beese,J.Mol.Biol.299、447(200))、およびピロコッカス  コダカラエンシス  ケーオーディー１(Pyrococcus kodakaraensis KOD1)(KOD1-Pol)(H.Hashimotoら、J.Mol.Biol.306、469(2001))が、その後に解明された。アポ酵素構造のみが古細菌について公知である。全ての５つのＢ属ポリメラーゼは５つの異なるドメイン、Ｎ末端ドメイン、エキソヌクレアーゼまたは「編集」ドメイン、および３つのポリメラーゼ活性部位ドメインを含む。５つのドメインの折り畳みは、中央の穴から伸張される３つの異なる間隙を形成する。２つの（ＤおよびＴと名付けられる間隙）は、互いに関して、中央穴の両側に対して約１８０°に配向される。プライマー−鋳型を含有するＲＢ６９−ｐｏｌの構造は、間隙Ｄが２本鎖プライマー−鋳型を結合すること、および間隙Ｔが、１本鎖鋳型を結合することを実証した（M.C.Franklinら、前出）。３つのポリメラーゼドメインは間隙Ｄを形成し、一方間隙Ｔは、エキソヌクレアーゼドメインおよびＮ末端ドメインによって形成される。第３の間隙は、他の２つに対して垂直であり、および３′−５′エキソヌクレアーゼ／編集間隙を表す。
【００４０】
Ｔｇｏ−Ｐｏｌの場合における間隙Ｔの試験は（他の古細菌ポリメラーゼは類似の結果を与える）、ポリメラーゼの外縁に面して曝露される表面上に位置されるポケットの存在を示した（図２Ａ）。このポケットの位置は、鋳型鎖結合領域において、プライマー−鋳型結合からの約４つの塩基は、これをウラシル認識部位についての明らかな候補にした。ポケットは、Ｎ末端ドメインに単独で存在するアミノ酸から構成される。この領域の４つの領域からのアミノ酸は、空間において共に密接であり、推定のウラシル結合ポケットをアセンブリするために使用される。これらのアミノ酸は図２Ｂ（Ｎ末端の構造提示）において図示され、そして図２Ｃ（Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列）において下線が付される。ポケットの入口にあるＹ７の機能は不明である。これは、ふたを形成し得、結合後に閉じ、ウラシルの捕獲（すなわち高い親和性）を確実にする。ポケットの塩基（明らかに、図２ＢにおいてＰ３６／Ｙ３７として可視的である）は、Ｙ３７によって形成され、βシートの始めにＰ３６により配向され、そしてＹ３７の「下部」のＫ８４によって支持される。ポケットの一方の面は、αヘリックスに存在するアミノ酸９０〜９７によって形成される。プロリン（Ｐ９４）は、αへリックスを曲げ、湾曲された壁を形成する（図２Ｂ）。他方の面は、残基１１０〜１１６を含み；アミノ酸はループ領域（１１０〜１１４）に存在するか、または第２のαへリックスの開始にある（１１５〜１１６）。このαへリックスは、アミノ酸Ｐ１１５およびＦ１１６で開始する。プロリンは重要な役割を有するようであり、Ｐ１１５およびＦ１１６がポケットの湾曲された壁を形成し得ることを確実にする（図２Ｂ）。
【００４１】
ＲＢ−６９からのウイルスポリメラーゼは、バクテリオファージＴ４−Ｐｏｌに対して、６１％アミノ酸同一性を示す。さらに、ＲＢ６９−ＰｏｌのＮ末端は、Ｔ４−ＰｏｌのＮ末端フラグメントについての構造に同一である(J.Wang,P.Yu、T.C.Lin、W.H.Konigsberg、T.A.Steitz、Biochemistry 35、8110(1996))。以前に、Ｔ４−Ｐｏｌは鋳型−鎖ウラシルに応答して重合化を失速しなかったことが実証され(M.A.Greaggら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、96(1999))、ウラシルを認識し得ないことはまた、ＲＢ６９−Ｐｏｌについて予測される。このことは、鋳型鎖ウラシルが遭遇される場合、重合化を失速するＴｇｏ−Ｐｏｌとは対照的である（M.A.Greaggら、前出）。Ｔｇｏ−Ｐｏｌまたは、ウラシルを含有するＤＮＡによって阻害され(R.S.Lasken、D.M.Schuster,A.Rashtchian、J.Biol.Chem.271、17692(1996))；ウイルス酵素ではみられない特徴である。それゆえ、Ｔｇｏ−Ｐｏｌで見られるポケットが、ウラシル検出のために使用される場合、これはウイルス酵素について不在であるべきである。Ｔｇｏ−ＰｏｌおよびＲＢ６９−ＰｏｌのＮ末端ドメインは、かなりの構造相同性を示す（図２Ｄ）；アミノ酸配列相同性をほとんど完全に欠くにも関わらず（図２Ｃ）、２次構造エレメントのほぼ完全なアラインメントが観察される。古細菌酵素において唯一の有意な差異は、アミノ酸挿入（図２Ｄにおいて示される）の存在である。しかし、詳細な比較は、２つのポリメラーゼにおける差異を実証する（図２Ｅ）。Ｔｇｏ−Ｐｏｌでは、Ｙ７はふたとして作用してもよく、そしてＹ３６はポケットの底を形成する；ＲＢ−６９において、これらの残基は、それぞれ、バリン／グルタミン（ＲＢ６９−Ｐｏｌにおけるこれらのアミノ酸の両方は、Ｔｇｏ−ＰｏｌのＹ７に近く、そして正確な置き換えであることは明らかでない）、およびセリンで置き換えられる。同様に、Ｔｇｏ−Ｐｏｌは、ポケットの１つの壁を形成するために、プロリンを含有する屈曲されるα−へリックス（残基９０〜９７）を使用する。ＲＢ６９−Ｐｏｌにおいて、対応するα−へリックス（残基６５〜７４）はプロリンを欠き；それゆえ、へリックスは真っ直ぐであり、良好な壁を形成しない。しかし、重要な特徴は、Ｐ１１５およびＦ１１６を含み、これらはＴｇｏ−Ｐｏｌでポケットの壁の１つの部分を形成する。ＲＢ６９の場合において、プロリンは見当たらず、そしてこのことは対応するフェニルアラニン（Ｆ８８）が落下し、そして完全にポケットを充填することを生じる。図１Ｅにおいて示されるように、このことはウイルス酵素がウラシル結合ポケットを欠くことを意味する（Ｐ３５／Ｓ３６は実質的に覆い隠される）。ウイルス酵素と古細菌酵素との間の差異は、幾つかのアミノ酸への僅かな変化に基づいて、Ｎ末端ポケットがウラシル検出を担うという説得力のある証拠を提供する。
【００４２】
Ｔｇｏ−Ｐｏｌのポケットにウラシルをモデリングすることが可能であった（図３Ａ）。もっとも好ましい配向においては、タンパク質とウラシルとの間に４つの水素結合が生成される。全ての場合において、タンパク質は水素結合形成のためにペプチド骨格を使用する。相互作用は以下を含む：Ｉ１１４（ペプチド−ＮＨ）対ウラシルＣ２＝Ｏ基；Ｅ１１１（ペプチド＝Ｏ）対ウラシルＮ３Ｈ；Ｙ３７（ペプチド＝Ｏ）対ウラシルＮ３Ｈ、および（ペプチド−ＮＨ）対ウラシルＣ４＝Ｏ（図３Ａ）。ウラシルと同じ位置にて重ね合わされるシトシンは、１つの水素結合のみを形成する（Ｉ１１４（ペプチド−ＮＨ）対ウラシルＣ２＝Ｏ）および４−ＮＨ２基は、Ｙ３７（ペプチド＝Ｏおよび−ＮＨ）の主要な鎖原子と衝突する）（図３Ｂ）。この衝突は、シトシンを再配置することによって救済され得るが、１つのＨ結合を犠牲にしなくてはならず、塩基とタンパク質との間の相互作用がなくなる。ウラシルの位置にて重ね合わされるチミンは、ほとんどのタンパク質−塩基の水素結合を形成し得た（Ｙ３７（ペプチド−ＮＨ）対ウラシル／チミンＮ３Ｈの水素結合が形成されなかったことを除いて、相互作用はウラシルに同一であった）。決定的に、Ｃ５−ＣＨ３基は、環状Ｐ３６側鎖およびＦ１１６の環の端と激しい立体的な衝突を示し、それによってポケット内の塩基の結合を妨げた（図３Ｃ）。従って、ポケットは、ウラシルを結合することに非常に特異的であり、そして「通常の」ＤＮＡピリミジンと区別することができる。
【００４３】
アミノ酸配列アラインメントが、１４個の古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼのＮ末端ドメインについて行われ（図１）；８個は、クレン古細菌(crenachaea)からであり、および６個はユーリ古細菌(euryarchaea)からであった。１２個のポリメラーゼは、好熱性または超好熱性のいずれかであり、１つは中等温度好性メタノコッカス  ボルタエ(Methanococcus voltae(Mvo))であり、および１つは好冷性セナキアム  シンビオサム(Cenarchaeaum symbiosum(Csy))であった。ウラシル結合ポケットから派生するアミノ酸の大部分を含む２つのしっかりと保存された領域（ＡおよびＢ）が見られた。ウラシル結合ポケットを含むアミノ酸の多く（図２Ｂおよび２Ｃ）、特にウラシルに接触する残基（図３Ａ）は、しっかりと保存された。従ってＰ３６、Ｙ３７、Ｅ１１１、およびＩ１１４は１００％の同一性を示す。潜在的なポケットのふたであるＹ７もまた１００％保存を示す。幾つかの他の重要なアミノ酸、例えば、Ｖ９３（これはポケットの一方の側に並ぶ）、Ｐ１１５およびＦ１１６（これはポケットの他方の側に並ぶ）は、高い保存性を示す。
【実施例２】
【００４４】
ウラシルを認識する、変異体ポリメラーゼの能力を試験するために３つのアッセイが使用された。プライマー伸張反応（M.A.Greaggら、前出）は、鋳型鎖中のウラシル塩基を介してプライマーを伸張する、ポリメラーゼの能力を測定した。予測されるように、野生型酵素および変異体酵素の両方は、ウラシルを欠くコントロール鋳型を完全にコピーし得た（図４Ａ）。以前に観察されるように（M.A.Greaggら、前出）、野生型酵素は、鋳型−鎖ウラシルの上流の４つの塩基の重合化を失速し、短縮された生成物を生じた（図４Ｂ）。Ｙ３７Ａ、Ｙ３７Ｆ、およびＰ１１５Ｆは、野生型に類似の挙動を示した。しかし、変異体酵素の３つ、Ｖ９３Ｑ、Ｐ１１５Δ、およびＹ７Ａは、ウラシルが存在した場合、完全長の生成物を生成した（図４Ｂ）。Ｖ９３Ｑでは、完全長の生成物が優勢であり、Ｐ１１５ΔおよびＹ７Ａの場合において、完全長および短縮された生成物の両方が見られた。
【００４５】
次に、ウラシルを含有する１本鎖ＤＮＡを結合するポリメラーゼの能力が、蛍光異方性に基づく結合アッセイ(S.L.Reid、D.Parry、H-H.Liu、B.A.Connolly、Biochemistry 40、2484(2001)）を使用して研究された。ＫＤは蛍光異方性によって決定され、単一のウラシルおよびその５′末端にてヘキサクロロフルオレセイン標識を含有するオリゴデオキシヌクレオチドが使用された。使用されたオリゴデオキシヌクレオチドは：５′−ｈｅｘ−ＧＣＣＣＧＣＧＧＧＡＵＡＴＣＧＧＣＣＣＴＴＡ−３′（配列番号１６）（またはウラシルがチミンで置き換えられたコントロール）であった。オリゴデオキシヌクレオチドの濃度は、１ｍｌの１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の５ｎＭであった。酵素のアリコートが添加され、そして異方性が測定され、力価は異方性が増加することを停止するまで計測された。ＫＤ値を得るために調整されるデータは、Ｒｅｉｄら（前出）によって記載されているものと同一である。ＫＤ値は、表１に要約されている。野生型酵素はウラシルを含有するオリゴデオキシヌクレオチドを、この塩基を欠くコントロール鎖よりも１７倍の優先性の、８．３ｎＭのＫＤで結合した。変異体のうちの３つの、Ｙ７Ａ、Ｖ９３Ｑ、およびＰ１１５Δは、野生型よりも良好でない、ウラシルを含有するオリゴでオキシヌクレオチドに結合する（それぞれ、２５．７、１４４．５、および８４ｎＭのＫＤ値）。これらの変異体は、ウラシルを含有する鋳型を介して読み取り得る変異体に正確に対応し；さらにウラシル結合における減少は、能力を介する読み取りと対応した。両方のアッセイにおいて、ウラシル認識の喪失は：Ｖ９３Ｑ＞Ｐ１１５Δ＞Ｙ７Ａである。これらの３つの変異体はまた、コントロール配列よりもウラシルを含有するＤＮＡについて減少された優先性を示し；Ｐ１１５ΔおよびＶ９３Ｑでは優先性は実質的に廃止される。変異体Ｙ７Ａ、Ｙ３７Ａ、およびＰ１１５Ｆは、野生型と本質的に同じ親和性でウラシルを含有するＤＮＡを結合する（表１）。幾つかの、Ｙ３７ＡおよびＹ３７Ｆの場合において、ウラシルを含有するオリゴデオキシヌクレオチドについての優先性は減少されるが、このことはコントロールのより強化された結合からもっぱら生じる。表１はまた、野生型に対して、変異体Ｐｆｕ−Ｐｏｌの特異的な活性を与える。一般に、野生型活性の３８％を保持する最も低い活性を伴なう変異体（Ｙ３７Ａ）であっても、活性が僅かに減少するのみである。
【００４６】
ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ(Richardson、C.C.(1966)、Procedures in Nucleic Acids Research、G.L. Cantoni、D.R.Davis編（Harper and Row、New York、1966、第263−27頁）は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ウシ胸腺ＤＮＡ(AP Biotech)、１μＣｉ  ３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ。Ｐｆｕ−Ｐｏｌ（量は酵素の活性に依存して変化した）が添加され、そして７２℃で１０分間培養された（反応はこの時間にわたって線形であった）。この期間の後、酸沈殿性の材料中に取り込まれた放射活性の量は、シンチレーション計測によって決定された。１単位の酵素は、３０分間７２℃にて、酸沈殿性の材料に１０ｎｍｏｌのｄＡＴＰを取り込む酵素の量として規定される。
【００４７】
【表１】
2005526510.tif 000014
【００４８】
Ｐｆｕ−Ｐｏｌ変異体の特異的な活性は、記載されるように酸沈殿性ウシ胸腺ＤＮＡへの、［α−３２Ｐ］−ｄＡＴＰの取り込みを使用して決定された（上述を参照のこと）。値は、正確に±１５％である。結合定数は、ｈｅｘ−ＧＣＣＣＧＣＧＧＧＡＵＡＴＣＧＧＣＣＣＴＴＡ（配列番号１６）（ウラシル）またはウラシルがチミンで置き換えらえた類似のオリゴデオキシヌクレオチド（コントロール）を使用する蛍光異方性によって決定された（S.L.Reidら；前出およびJ.Wangら（前出））。各値は、３回測定され、そして平均±１標準偏差が与えられた。ウラシルについての優先性は、ＫＤ（ウラシル）／ＫＤ（コントロール）の比率である。
【００４９】
最後に、ＰＣＲが＋／−ｄＵＴＰで行われ、ＰＣＲを行うＰｆｕ−Ｐｏｌの能力が、ｐＥＴ１７−ｂ（Ｐｆｕ−Ｐｏｌ）の約２キロベースのフラグメント（Ｔ７プロモーターとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間）（S.J.Evansら、Nucl.Acids.Res.28、1059(2000)）を増幅することによって評価された。条件：１００μｌ容量、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐｈ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５０μＭの各ｄＮＴＰ（一方のセットの反応は、ｄＴＴＰを含み、他方はｄＵＴＰを含んだ）、２．５単位ＤＮＡポリメラーゼ、４０μｌの鉱油で重層される。５ｎｇのｐＥＴ１７−ｂ（Ｐｆｕ−Ｐｏｌ）が使用され、そして正方向および逆方向プライマーの濃度は両方ともに０．３μＭであった。各反応は、９５℃で１分間、５２℃で２分間、および７２℃で４．５分間の３０サイクルであった。Ｔａｑ−ＰｏｌでのＰＣＲは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８，５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．０８％  ＮＰ−４０、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が使用された他は、Ｐｆｕ−Ｐｏｌに同一であった。分析は、エチジュームブロミド染色されたアガロースゲルが使用された。
【００５０】
Ｐｆｕ−Ｐｏｌ（野生型および変異体）およびＴａｑ−Ｐｏｌが、４つの通常のｄＮＴＰを用いるＰＣＲを行うことが可能であった（図４Ｃ）。ｄＵＴＰがｄＴＴＰの代わりに使用された場合、Ｔａｑ−ＰｏｌでのＰＣＲが影響されなかった。しかし、野生型Ｐｆｕ−Ｐｏｌは生成物を生じなかった（図４Ｄ）。読み通しおよび結合アッセイにおいて減少されたウラシル認識を示した３つの変異体の、Ｙ７Ａ、Ｐ１１５Δ、およびＶ９３Ｑは、ＰＣＲ産物を生じた（図４Ｄ）。生成されたＰＣＲ産物の量は、Ｖ９３Ｑ＞Ｐ１１５Δ＞Ｙ７Ａであり、ウラシル認識の喪失について見出された順番に再度一致した。ｄＵＴＰ（濃度２５０μＭ）は完全に、それらの反応においてｄＴＴＰを置き換える。４つの通常のｄＮＴＰを含有するＰＣＲ反応を急増するために０．０２μＭ  ｄＵＴＰが使用される場合、野生型酵素は完全に阻害され（H.H.Hogrefeら（前出））、このことは、明らかに、これらの３つの変異体が非常にウラシル認識において無効であることを示す。Ｐｆｕ−Ｐｏｌ変異体の、Ｙ３７Ａ、Ｙ３７Ｆ、およびＰ１１５Ｆは、ｄＵＴＰでＰＣＲ生成物を生じなかった。
【００５１】
図５は、熱性古細菌ポリメラーゼ(Taq-Pol)、ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)ポリメラーゼ(Pfu-Pol)の野生型および２つの変異体（Ｖ９３ＱおよびＶ９３Ｒ）を用いたＰＣＲの結果を示す。ＰＣＲ増幅は、２つの異なる条件下、すなわちＴＴＰの存在下およびｄＵＴＰの存在下で行われた。
【００５２】
予測されたように、全ての４つのポリメラーゼ、Ｔａｑ−Ｐｏｌ、Ｐｆｕ−ｐｏｌの野生型、およびＰｆｕ−ｐｏｌの２つの変異体は、ＴＴＰの存在下でＤＮＡサンプルの増幅を首尾よく媒介し得た。レーン１〜４における１０６４ｂｐのフラグメントの明らかに可視的なバンドが、この首尾よい増幅を説明する。ｄＵＴＰの使用は、レーン５において説明されるように、Ｔａｑ−Ｐｏｌが共に使用された場合、予測される量の増幅を生じた。さらに、レーン６は、増幅されたＤＮＡサンプルを何も示さず、それによって、ｄＵＴＰがＰｆｕ−Ｐｏｌ媒介性の増幅の閉塞を誘発することを確認した。しかし、最も重要なことに、レーン７および８は、１０６４ｂｐフラグメントに対応するバンドを示し、従ってＰｆｕポリメラーゼ変異体の両方が増幅を行い得ることを確認する。このことは、野生型Ｐｆｕ−Ｐｏｌとは異なり、Ｐｆｕ−ＰｏｌのＶ９３ＱおよびＶ９３Ｒ変異体がｄＵＴＰ誘発性の骨格によって影響されないことを証明する。
【００５３】
総合的に、ｄＵＴＰを利用するＰＣＲにおける、本発明に従う変異体の有用性が図５により確認される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１−１】古細菌Ｂ属のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アラインメントを説明し、ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)ポリメラーゼの１〜１３０残基に対応する。候補は、Ｐｆｕ−Ｐｏｌの相同体についてＷＵＢＬＡＳＴ(European Bioinformatics Institute、http://www.ebi.ac.uk/ebi_home.html）を使用して同定された。Ｂ属ＤＮＡポリメラーゼについてのＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースのさらなるＥＮＴＲＥＺサーチが行われた［ＧｅｎＢａｎｋ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)］。配列アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＸ（１．８１版）［J.D.Thompsonら、Nucl.Acids.Res24、4876(1997)］を使用して作成された。微生物およびＤＮＡポリメラーゼ配列のアクセス番号は：ピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus fuiosus)(Pfu)(P80061)、サーモコッカス  ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)(pdb1D5A)、ピロコッカス  コダカラエンシス(Pyrococcus kodakaraensis)(PKOD)(gi/13399597)、デスルフロコッカス株(Desulfurococcus Tok)(DTok)、サーモコッカス  エスピ−９°  エヌ−７(Thermococcus sp.9°N-7)(9°N-7)(Q56366)、サーモコッカスリトラリス(Thermococcus litoralis)(Tli)(AAA72101.1)、メタノコッカス  ボルタエ(Methanococcus voltae)(Mvo)(P52025)、ピロバクラム  アイランジカム(Pyrobaculum islandicum)(Pis)(AAF27815.1)、アーキオグロブス  フルジダス(Archaeoglobus fulgidus)(Agu)(O29753)、セナキアム  シンビオサム(Cenarchaeaum symbiosum)(Csy)(AAC62712.1)、スルフォロブス  アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)(Sac)(P95690)、スルフリスファエラ  オーワクエンシス(Sulfurisphaera ohwakuensis)(Soh)(BAA23994.1)、スルフォロブス  ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)(Sso)(P26811)、ピロディクティム  オカルタム(Pyrodictium occultum)(Poc)(BAA07579.1)、およびエアロピラム  ペルニックス(Aeropyrum pernix)(Ape)(NP_148473.1)である。
【図１−２】図１−１の続き
【図１−３】図１−２の続き
【図２】図２Ａ：ポケットの存在を示すＴｇｏ−Ｐｏｌの鋳型を結合する間隙Ｔ（２１）。図２Ｂ：空間充填において示されるポケットを形成するアミノ酸を伴なう、Ｔｇｏ−ＰｏｌのＮ末端ドメイン：Ｙ７；Ｐ３６／Ｙ３７；アミノ酸９０〜９７（２２）；アミノ酸１１２〜１１６（２３）。α−へリックス（２４）およびβシート（２５）が示される。Ｃ：Ｔｇｏ−Ｐｏｌ（上部配列（配列番号１２））、およびＲＢ６９−Ｐｏｌ（下部配列（配列番号１３））のＮ末端ドメインのアミノ酸配列。Ｔｇｏ−Ｐｏｌにおいてポケットを形成するアミノ酸（およびＲＢ６９−Ｐｏｌにおける対応する残基）は下線を付され、そしてパネルＢおよびＥにおいて同定されるアミノ酸に対応する。円柱は、αへリックスを示し、および矢印はβ−シートを示す。アミノ酸配列は最小の相同性を有し、そして構造相同性を使用してアラインメントされた。図２Ｄ：Ｔｇｏ−ＰｏｌおよびＲＢ６９−ＰｏｌのＮ末端ドメインの構造アラインメント。Ｔｇｏ−Ｐｏｌにおける挿入が示される（２６）。この構造の重ね合わせは、Ｃにおいて示されるアミノ酸アラインメントを作成するために使用された。図２Ｅ：ＲＢ６９−ＰｏｌのＮ末端ドメイン。空間充填されるアミノ酸（Ｖ８  Ｑ１０；残基６５〜７２（２７）；残基８４〜８９（２８）；Ｐ３５／Ｓ３６は、実質的に残基８４〜８９の背後にある）は、ポケットを形成するＴｇｏ−Ｐｏｌにおけるアミノ酸（パネルＢにおいて示される）に対応する。Ｖ８およびＱ１０の両方は、Ｔｇｏ−Ｐｏｌ  Ｙ７の位置の近くにある。αへリックス（２４）およびβシート（２５）が示される。画像および構造相同性モデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ［N.Guex,M.C.Peitsch、Electrophoresis 18、2714(1997)](http://www.expasy.ch/spdbv/)、POV-Ray[C.Cason、POV-Ray、ウインドウズ用、第３．１ｇ版(1999)］(http://www.povray.org)およびRasmol[R.Sayle、J.F.Milner-White、Trends Biochem.Sci.20、374(1995)］を使用して生成された。
【図３】Ｗｅｂ  Ｌａｂ  Ｖｉｅｗｅｒ  Ｐｒｏ［Molecular Simulations Inc.、Web Lab Viewer Pro（４.０版）(2000)](http://www.msi.com)を使用するＴｇｏ−ＰｏｌのＮ末端ドメインポケットへのピリミジンのモデリング。斜めの線は、水素結合を表す；但し立体衝突が同定される（３１）。ウラシルは４つの酵素−塩基の水素結合を形成し、衝突は形成しない。シトシンおよびチミンは、数個の水素結合および／または衝突を生じる。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ：２４ｍｅｒの鋳型（５′−ＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧ（Ｕ／Ｔ）ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＣＧＧＣＴＡＡＡＡ−３′（配列番号１５））（５ｎＭ）にアニールされる、５′−３２Ｐ標識化２４ｍｅｒプライマー（５′−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣ−３′（配列番号１４）（２．５ｎＭ）を使用するプライマー伸張反応。プライマーは、鋳型の下線を付される部分とハイブリダイズし、プライマー−鋳型接合部からウラシル（コントロールにおいてチミン）の７塩基を配置する(H.H.Hogrefe,C.J.Hansen、B.R.Scott,K.B.Nielson、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、99、596(2002))。４つのｄＮＴＰの存在下、全てのＰｆｕ−Ｐｏｌは、ウラシルを欠くコントロール鋳型を完全にコピーし得、標識化された２４ｍｅｒのプライマーを４４塩基長の生成物に変換した（Ａ）。鋳型においてウラシルを伴なうと、野生型酵素（ＷＴ）は重合化を失速し(H.H.Hogrefe,C.J.Hansen、B.R.Scott,K.B.Nielson、Proc.Natl.Acad.U.S.A.、99、596(2002))、短縮された生成物を生じた（Ｂ）。矢印（４１）は、主要な中断止部位を示し、ウラシルの前に４つの塩基を生じたことが示される（標準を使用、説明されず）。Ｙ７Ａ、Ｖ９３Ｑ、およびＰ１１５Δでは、幾つかの完全長の生成物が観察され（量：Ｖ９３Ｑ＞Ｐ１１５Δ＞Ｙ７Ａ）、鋳型−鎖のウラシルの読み通しを示す（パネルＢ）。完全長の生成物は、Ｙ３７Ａ、Ｙ３７Ｆ、およびＰ１１５Ｆでは、観察されなかった（「ウラシルに誘発される中断」を過ぎて部分的に伸張される幾つかの材料が、Ｙ７Ａ、Ｙ３７Ａ、およびＹ３７Ｆで観察された。第１および第２のレーンは、標準２４ｍｅｒおよび４４ｍｅｒを含む。図４Ｃおよび４Ｄ：ＰＣＲ反応。通常の４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）を用いるコントロールＰＣＲにおいて、全てのＰｆｕ−Ｐｏｌ変異体（およびＴａｑ−Ｐｏｌ）は予期されるＰＣＲ産物、約２キロベース長を生じた（Ｃ）。ｄＵＴＰがｄＴＴＰに置き換えられる場合、Ｔａｑ−Ｐｏｌは２キロベースフラグメントを生成した（Ｄ）。ほとんどのＰｆｕ−Ｐｏｌ変異体（ＷＴ、Ｙ３７Ａ、Ｙ３７Ｆ、およびＰ１１５Ｆ）では、ＰＣＲ産物は見られなかった（Ｄ）。３つのＰｆｕ−Ｐｏｌ変異体はＰＣＲ産物を生成した（量：Ｖ９３Ｑ＞Ｐ１１５Δ＞Ｙ７Ａ）（２×および４×負荷が、それぞれ、Ｐ１１５ΔおよびＹ７Ａでの可視化のために使用された）。全てのＰＣＲ反応は、最適化を伴なわずに同一の条件下で行われた；このことはおそらく、幾つかのレーンにおいて見られる低重量の汚染を説明する。マーカー（重要な大きさが示される）は、プロメガ株式会社製であった。
【図５】サーマス  アクアティカス(Thermus aquaticus)ポリメラーゼ(Taq-Pol)およびピロコッカス  フリオサス(Pyrococcus furiosus)ポリメラーゼ(Pfu-Pol)（野生型および２つの変異体、Ｖ９３ＱおよびＶ９３Ｒ）を用いる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)。プラスミドｐＥＴ−１７ｂ(Pfu-Pol)からのＤＮＡフラグメント（約１キロベース長）が増幅された。条件、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン。各反応は、２５０μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを含んだ。反応１〜４は、２５０μＭ  ＴＴＰを含み；反応５〜８は２５０μＭ  ｄＵＴＰを含んだ。２．５単位のＤＮＡポリメラーゼが使用された。サイクル１×１０分間  ９４℃；３０×１分間  ９４℃／２分間  ４２℃／１分間  ７２℃；１×１０分間  ７２℃。Ｐｆｕ−Ｐｏｌ変異体のＶ９３ＱおよびＶ９３Ｒは、ＴＴＰが使用される場合、野生型Ｐｆｕ−Ｐｏｌ（レーン２）よりも高いＰＣＲ産物の収量を与えた（レーン３、４）。野生型Ｐｆｕ−Ｐｏｌは、ｄＵＴＰではＰＣＲ産物を与えない（レーン６）が、Ｐｆｕ−Ｐｏｌ変異体のＶ９３ＱおよびＶ９３Ｒは生成物を与えた（レーン７、８）［レーン１＝ＴＴＰを用いるＴａｑ−Ｐｏｌ；レーン２＝ＴＴＰを用いる野生型Ｐｆｕ−Ｐｏｌ；レーン３＝ＴＴＰを用いるＰｆｕ−Ｐｏｌ  Ｖ９３Ｑ；レーン４＝ＴＴＰを用いるＰｆｕ−Ｐｏｌ  Ｖ９３Ｒ；レーン５＝ｄＵＴＰを用いるＴａｑ−Ｐｏｌ；レーン６＝ｄＵＴＰを用いる野生型Ｐｆｕ−ｐｏｌ；レーン７＝ｄＵＴＰを用いるＰｆｕ−Ｐｏｌ  Ｖ９３Ｑ；レーン８＝ｄＵＴＰを用いるＰｆｕ−Ｐｏｌ  Ｖ９３Ｒ］［Ｍ＝１００ｂｐラダー；Ｍｂ＝１Ｋｂラダー］。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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