(57)【要約】本発明は、組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ＡＤＳＣ-ＥＦ）並びに本発明のＡＤＳＣを含まない単独の組織脂肪由来格子状物質および本発明のＡＤＳＣと組み合わされた組織脂肪由来格子状物質を提供する。ある態様では、本発明は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まないＡＤＳＣ、並びに結合組織幹細胞のクローン性集団を提供する。本ＡＤＳＣは単独または生物学的に適合可能な組成物中で用いて、分化した組織および構造物をin vivoおよびin vitroの両方で作製することができる。さらにまた、本ＡＤＳＣを増大させ、さらに培養して例えばホルモンのような分子を製造することができ、さらに、他の細胞集団の成長および増大を支援する条件付け培地を提供することができる。別の態様では本発明は、実質的に細胞を欠く組織脂肪由来格子状物質を提供し、前記格子状物質は脂肪組織に由来する細胞外マトリックス物質を含む。本格子状物質は、原基、場合によっては成熟組織または構造物へと細胞の成長または分化を促進する土台としてin vivoであれin vitroであれ用いることができる。
2005502352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された組織脂肪由来幹細胞（ADSC）。
【請求項２】
分化することなく少なくとも15代培養することができる請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
多分化能を有する請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
中胚葉、外胚葉または内胚葉に分化する請求項３に記載の幹細胞。
【請求項５】
一の対象に由来する脂肪組織サンプルの組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ADSC-EF）であって、前記分画が実質的に脂肪細胞を含まない前記組織脂肪由来幹細胞濃縮分画。
【請求項６】
ヒト由来である請求項１に記載の幹細胞。
【請求項７】
遺伝的に改変される請求項１に記載の幹細胞。
【請求項８】
複数の請求項１に記載の細胞を含む限定細胞集団。
【請求項９】
均質である請求項８に記載の限定細胞集団。
【請求項１０】
不均質である請求項８に記載の限定細胞集団。
【請求項１１】
クローンに由来する請求項８に記載の限定細胞集団。
【請求項１２】
中胚葉細胞への分化に拘束された請求項４に記載の幹細胞の子孫細胞。
【請求項１３】
外胚葉細胞への分化に拘束された請求項４に記載の幹細胞の子孫細胞。
【請求項１４】
内胚葉細胞への分化に拘束された請求項４に記載の幹細胞の子孫細胞。
【請求項１５】
請求項４に記載の幹細胞および分化した中胚葉細胞で構成された組織。
【請求項１６】
請求項４に記載の幹細胞および分化した外胚葉細胞で構成された組織。
【請求項１７】
請求項４に記載の幹細胞および分化した内胚葉細胞で構成された組織。
【請求項１８】
請求項４に記載の幹細胞を中胚葉誘導培地で培養することを含む、中胚葉組織を誘導する方法。
【請求項１９】
請求項４に記載の幹細胞を外胚葉誘導培地で培養することを含む、外胚葉組織を誘導する方法。
【請求項２０】
請求項４に記載の幹細胞を内胚葉誘導培地で培養することを含む、内胚葉組織を誘導する方法。
【請求項２１】
請求項１２、１３または１４に記載の子孫細胞を、中胚葉、外胚葉または内胚葉組織を対象で形成するために十分な量で前記対象に導入することを含む、対象で組織を形成する方法。
【請求項２２】
請求項１、１２、１３または１４に記載の幹細胞を組織の再生または修復に十分な量で対象に導入することを含む、対象で組織を再生または修復する方法。
【請求項２３】
脂肪細胞を除去するために対象の脂肪組織サンプルを処理し、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ADSC-EF）を形成することを含む、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ADSC-EF）を得る方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法によって得られた組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ADSC-EF）。
【請求項２５】
請求項２４に記載のADSC-EFから前記細胞を分離することによって得られた組織脂肪由来幹細胞（ADSC）。
【請求項２６】
前記幹細胞が多分化能を有する請求項２５に記載の幹細胞。
【請求項２７】
前記幹細胞が中胚葉、外胚葉または内胚葉に分化する請求項２６に記載の幹細胞。
【請求項２８】
実質的に細胞を欠く脂肪組織細胞外マトリックスを含む組織脂肪由来格子状物質。
【請求項２９】
実質的に無水物である請求項２８に記載の格子状物質。
【請求項３０】
水和物である請求項２８に記載の格子状物質。
【請求項３１】
請求項１に記載の細胞および生物学的に適合する格子状物質を含む組成物。
【請求項３２】
請求項１に記載の細胞と、請求項２９または３０に記載の格子状物質と、を含む組成物。
【請求項３３】
請求項３に記載の幹細胞の子孫細胞。
【請求項３４】
選択したトランスジーンが対象で発現されるように前記トランスジーンを含む請求項１に記載の幹細胞を前記対象に導入することを含む、動物にトランスジーンをデリバリーする方法。
【請求項３５】
適切な分化条件下で分化を誘導するために有効な適切な培地で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の細胞の分化を誘導する方法。
【請求項３６】
前記培地が特定の細胞タイプの条件付け培地である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
所望の系列の細胞とともに前記細胞を同時培養することを含む、請求項１に記載の細胞の分化を誘導する方法。
【請求項３８】
請求項１に記載の細胞と培地を接触させることを含む、培地を条件付けする方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法によって得られる培養済み培地。
【請求項４０】
ADSCを脂肪組織から分離する手段を含む、対象の脂肪組織から組織脂肪由来幹細胞（ADSC）を得ることを目的とするキット。
【請求項４１】
対象から脂肪組織を単離するための装置をさらに含む請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
組織脂肪由来幹細胞の分化を誘導するための培地をさらに含む請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
ADSCの培養のための培地をさらに含む請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本特許出願は、ＰＣＴ出願PCT/US00/06232号（2000年3月10日出願）に対応する米国特許出願（2001年9月10日出願、出願番号未定）の一部継続出願である（前記ＰＣＴ出願は、米国特許出願60/123,711号（1999年3月10日出願）および米国特許出願60/162,462号（1999年10月29日出願）の出願日の利益を請求する）。前述の全出願の内容は、その全体を援用して本特許明細書の一部となる。
本出願を通して多様な文献が引用される。それら文献の内容は、その全体を援用して本明細書の一部となる。
【０００２】
発明の背景
近年、間葉系幹細胞（主に骨髄から得られる）が同定されたことによって組織の再生および分化に進歩がもたらされた。前記のような細胞は、骨髄および骨膜で見出される多能性（pluripotent）細胞であり、それら細胞は多様な間葉系組織または結合組織に分化することができる。例えばそのような骨髄由来幹細胞を導入し、例えば５−アザシチジンのような薬剤に接触させて筋細胞に発達させることができる（Wakitani et al., Muscle Nerve, 18(12):1417-26(1995)）。そのような細胞は、組織（例えば軟骨、脂肪および骨）の修復に有用であり（例えば以下を参照されたい：米国特許5,908,784号、5,906,934号、5,827,740号、5,827,735号）、さらに前記のような細胞はまた遺伝子改変によりいくつかの用途を有することが提唱された（例えば米国特許5,591,625号を参照されたい）。前記のような細胞の特定が組織の再生および分化で進歩をもたらしたが、一方、そのような細胞の使用はいくつかの技術的な障害のために妨げられている。そのような細胞を使用する場合の欠点の１つは、それらが非常に希少（わずかに１／2,000,000細胞を占める）であり、それら細胞の入手および単離のための方法をいずれも困難で費用を要するものにしているということである。もちろんのこと、骨髄の採集はドナーには例外なく苦痛である。さらにまた、前記の細胞は、特別に選別した血清ロットを使用しないかぎり分化を誘導することなく培養することは困難であり、そのような幹細胞の使用に更なる経費と労力を付加している。米国特許6,200,606号（Peterson et al.）は、組織（組織脂肪を含む）から（中胚葉起源の）CD34+骨前駆細胞または軟骨前駆細胞の単離を記載した。
【０００３】
極めて多数の幹細胞、特に多系列の胚葉に分化することが可能で、また培養材料の高コストな予備スクリーニングを必要としないで培養することができる細胞をより容易に入手できる供給源がなお必要とされている。
組織工学における他の進歩によって、空間的に制限された培養物中で細胞を成長させて三次元構造物を生成できることが示された。空間的制限は典型的には、種々の無細胞格子状物質またはマトリックスを用い細胞の成長および分化を支持し誘導することによって達成される。この技術はなお揺籃期にあるが、動物モデルによる実験で、種々の無細胞格子状材料を利用して完全な組織を再生することが可能であることが示された（例えば以下を参照されたい：Probst et al., BJU Int., 85(3):362-7(2000)）。適切な格子状材料は腫瘍細胞株から単離された細胞外マトリックスから分泌される（例えばエンゲルブレス−ホーム−スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）腫瘍分泌マトリックス：“マトリゲル（matrigel）”）。前記の材料はIV型コラーゲンおよび成長因子を含み、細胞の成長のための優れた土台を提供する（Vukicevic et al., Exp. Cell Res., 202(1):1-8(1992)）。しかしながら、前記材料はまたいくつかの細胞の悪性形質への転換を促進する（Fridman et al., Int. J. Cancer, 51(5):740-744(1992)）ので、臨床的用途には適さない。一方で他の人工格子状物質が開発されたが、これらはin vivoで用いたとき細胞または患者に対して毒性を示す。したがって、細胞集団の培養および成長で土台として使用するために適した格子状材料がなお必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
本発明は、組織脂肪由来幹細胞（adipose-derived stem cells）、組織脂肪由来幹細胞分画、格子状物質並びに前記細胞、分画および格子状物質を得る方法を提供する。ある態様では、本発明は、実質的に脂肪細胞および赤血球および結合織細胞集団を含まない組織脂肪由来幹細胞分画を提供する。本発明はまた、前記分画から単離された多能性幹細胞を提供する。前記多能性幹細胞は、中胚葉、外胚葉または内胚葉に分化する能力を有する。前記細胞は、単独または生物学的に適合する組成物中で用いて、分化した組織および構造物をin vivoまたはin vitroで生成することができる。さらにまた、前記細胞を増大させ培養して成長因子を生産し、さらに他の細胞集団の成長および増大を促進させるために条件付け培地を提供することができる。また別の態様では、本発明は、実質的に細胞を含まない組織脂肪由来格子状物質を提供する。前記格子状物質は脂肪組織由来の細胞外マトリックス物質を含む。In vivoであれin vitroであれ前記格子状物質を土台として用いて、細胞の原基または成熟組織もしくは構造物にさえも成長および分化を促進することができる。
【０００５】
脂肪組織は豊富に存在し、前記幹細胞、幹細胞分画および格子状物質の即時使用可能な供給源の典型である。さらにまた、前記幹細胞は、予めスクリーニングした血清ロットを必要としない培養条件下で、未分化状態で継代培養することができる。本発明の細胞は他のタイプの幹細胞よりも極めて安価に維持することができる。本発明の上記の利点および他の利点は、本発明のさらに別の特徴とともに以下の詳細な説明および添付の図面から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いられるように、“幹細胞”とは、そのもの自体およびさらに分化した子孫細胞を生成することができる成体の未分化細胞と定義される。
本明細書で用いられるように、細胞の“系列”とは、細胞の遺伝形質（すなわち細胞がどの細胞に由来し、どんな細胞を生じることができるか）と定義される。細胞系列によって細胞の発育と分化の遺伝体系が示される。
本明細書で用いられるように、“分化するまたは分化している”とは、ある細胞の系列内でより拘束された（committed）（“分化した（differentiated）”）位置にある細胞と定義される。“脱分化”とは、ある細胞の系列内でより拘束されていない位置に復帰した細胞と定義される。
【０００７】
本明細書で用いられるように、“中胚葉（または外胚葉または内胚葉）系列に分化する細胞”とは、それぞれ特定の中胚葉、外胚葉または内胚葉系列に拘束されることとなった細胞と定義される。中胚葉系列に分化する細胞、または特定の中胚葉系細胞を生じる細胞の例には、脂肪生成細胞、軟骨形成細胞、心形成細胞、皮膚形成細胞、造血細胞、血管形成細胞、筋形成細胞、腎形成細胞、泌尿生殖器形成細胞、骨形成細胞、心膜形成細胞または間質形成細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
外胚葉系列に分化する細胞の例には、上皮細胞、神経形成細胞、神経膠形成細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
内胚葉系列に分化する細胞の例には、胸膜形成細胞および肝形成細胞、腸管基底層を生じる細胞並びに膵形成細胞および内臓形成細胞を生じる細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０００８】
本明細書で用いられるように、“多能性（pluripotent）細胞”とは、（遺伝型としておよび／または表現型として）少なくとも２つの異なるさらに分化した子孫細胞を生じることができる分化度の低い細胞と定義される。
“多系列（multi-lineage）幹細胞”または“多分化能を有する（multipotent）幹細胞”は、それ自体および別個の発生系列に由来する少なくとも２つのさらに分化した子孫細胞を再生する幹細胞を指す。前記系列は、同じ胚葉（すなわち中胚葉、外胚葉または内胚葉）に由来するものでも、異なる胚葉に由来するものでもよい。多系列幹細胞の分化から生じる異なる発生系列の２つの子孫細胞の例は、筋原細胞および脂肪生成細胞である（両者は中胚葉起源であるが、異なる組織を生じる）。また別の例は、神経形成細胞（外胚葉起源）および脂肪生成細胞（中胚葉起源）である。
【０００９】
本明細書で用いられるように、“脂肪組織”とは、白色脂肪、黄色脂肪または褐色脂肪で構成された一次代謝で重要な分散性器官と定義される。脂肪組織は、脂肪細胞と間質を有する。脂肪組織は動物の身体全体で見出される。例えば哺乳類では、脂肪組織は網、骨髄、皮下間隙および大半の器官の周辺に存在する。
本明細書で用いられるように、“条件付け培地”とは、特定の細胞または細胞集団がその中で培養され、続いて除去された培地と定義される。細胞が前記培地で培養されていた間に、前記細胞は細胞性因子を分泌する。前記因子にはホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体および顆粒が含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記細胞性因子を含む培地が条件付け培地である。
本明細書で用いられるように、“単離された”とは、夾雑物から分離された物質、例えば組織脂肪由来幹細胞と定義される（この場合、夾雑物はすなわち幹細胞とは異なる物質である）。
【００１０】
本発明は、組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と、中胚葉起源（例えば脂肪組織）から前記細胞を得る方法およびそれらを用いる方法を提供する。驚くべきことに、本発明のＡＤＳＣは、２つ以上の胚葉タイプ（例えば中胚葉、外胚葉または内胚葉およびその組合せ）を生じる細胞に分化することができ、したがって“多系列”または“多分化能を有する”細胞である。
別の実施形態では、ＡＤＳＣは、異なる胚葉（例えば内胚葉および外胚葉）由来の２つ以上の別個の系列、例えば肝細胞および脂肪細胞に分化することができる。
本発明のＡＤＳＣは、２つ以上の系列の細胞に分化することができる。前記細胞は例えば、脂肪生成、軟骨形成、心形成、皮膚形成、造血、血管形成、筋形成、腎形成、神経形成、神経膠形成、泌尿生殖器形成、骨形成、心膜形成、腹膜形成、胸膜形成、内臓形成、および間質発生表現型である。前記のような細胞は２つ以上のこれら異なる系列（または発生表現型）を保持することができるが、一方、好ましくはそのようなＡＤＳＣは３つ以上の異なる系列に分化することができる。もっとも好ましいＡＤＳＣは４つ以上の系列に分化することができる。
【００１１】
本発明のＡＤＳＣは、中胚葉組織、例えば成熟脂肪組織、骨、心臓の種々の組織（例えば心膜、心外膜、心筋層、心膜、弁組織など）、皮膚結合織、血管組織（例えば血球、心内膜、血管上皮など）、造血組織、筋組織（骨格筋、心筋、平滑筋など）、泌尿生殖組織（例えば腎、前腎、後および中腎管、後腎憩室、尿管、腎盂、集合管、雌生殖器構造物の上皮（特に卵管、子宮および膣）、中胚葉腺組織（例えば副腎皮質組織）および間質組織（例えば骨髄）に分化する能力を有する。もちろんのこと、ＡＤＳＣは、成熟細胞に発育する潜在的能力を保持することができるので、前記はまたその発生表現型に関する潜在能力を、適切な前駆細胞（例えば前脂肪細胞、筋原細胞、前骨細胞など）に分化することによって認識される。
【００１２】
また別の実施形態では、本ＡＤＳＣは、外胚葉組織、例えば神経形成組織および神経膠形成組織に分化する能力を有する。
さらに別の実施形態では、本ＡＤＳＣは、内胚葉組織、例えば胸膜組織、内臓形成組織、肝形成組織および膵形成組織に分化する能力を有する。
さらにまた別の実施形態では、ＡＤＳＣは、未成熟な発生段階の細胞タイプに脱分化する能力を有する。ＡＤＳＣの未成熟な細胞タイプへの脱分化の例には胚性細胞および胎児細胞が含まれる。
さらに別の実施形態では、本発明のＡＤＳＣは、１つ以上の胚葉由来の１つ以上の細胞系列、例えば神経形成細胞（外胚葉起源）および筋形成細胞（中胚葉起源）を生じることができる。
【００１３】
本発明のＡＤＳＣは、生物組織工学、創傷修復、in vivoおよびex vivoでの組織再生、組織移植、並びに種々の表現型および遺伝型に分化することができる細胞またはin vivoもしくはin vitroで他の細胞タイプを支援することができる細胞が必要とされる他の方法で有用である。
本発明の態様の１つは、本発明の組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）を含む、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ＡＤＳＣ-ＥＦ）に関する。好ましくは、本ＡＤＳＣ−ＥＦは他の細胞タイプ（例えば脂肪細胞、赤血球および他の間質細胞など）および細胞外マトリックス物質を実質的に含まない。より好ましくは、本ＡＤＳＣ−ＥＦは前記のような細胞タイプおよびマトリックス物質を完全に含まない。本ＡＤＳＣ−ＥＦは哺乳類の脂肪組織から得られる。好ましい実施形態は、高等霊長類（例えばヒヒまたは尾なしザル）の脂肪組織から得られたＡＤＳＣ−ＥＦを含む。もっとも好ましいＡＤＳＣ濃縮分画は本明細書に開示した方法を用いてヒトの脂肪組織から得られる。
【００１４】
本発明のＡＤＳＣ−ＥＦおよびＡＤＳＣを得る方法
本発明のＡＤＳＣは脂肪組織から単離される。前記脂肪組織は任意の適切な方法によって動物から入手することができる。そのような任意の方法の第一の工程では、供給源の動物から脂肪組織を単離することが必要である。前記動物は、その動物の体内の脂肪間質細胞が生命活性を有するかぎり生きていても死んでいてもよい。典型的には、ヒトの脂肪組織をドナーの生体から周知のプロトコル（例えば外科的または吸引脂肪除去）を用いて入手する。ヒトの脂肪組織を入手する好ましい方法は、当分野で周知の摘出または脂肪吸引法による。好ましくは、本発明のＡＤＳＣは脂肪吸引物から単離される。本発明のＡＤＳＣは、脂肪組織を入手した方法に関係なく、最初に摘出または吸引された脂肪組織に存在する。
各々異なる患者から入手した脂肪吸引物の３つの寄託物（１’、２’、３’と特定される）を、ブダペスト条約の規定にしたがいアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-2209）に2001年9月7日に寄託した（以下のATCC寄託番号を付与された： 、 および ）。
【００１５】
しかしながら、入手した脂肪組織は、脂肪組織の残余のものから本発明のＡＤＳＣを分離するために処理される。ＡＤＳＣを含むＡＤＳＣ−ＥＦは、前記入手した脂肪組織を生理学的に適合する溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））で洗浄することによって得られる。前記洗浄工程は、前記脂肪組織をＰＢＳですすぎ、組織をかき混ぜ、さらに沈澱させることから成る。洗浄に加えて脂肪組織を分解する。前記分解は酵素分解および中和によって実施することができる。また別には（或いは酵素処理と併用して）、他の分解方法（例えば機械的攪拌、超音波エネルギーまたは熱エネルギー）を用いてもよい。洗浄、分解および沈澱工程の後で３層が形成される。上層は遊離脂肪層である。中央層は格子状物質および脂肪細胞凝集物を含む。前記中央層は“組織脂肪由来格子状物質濃縮分画”と称される。前記中央層または格子状物質濃縮分画をろ過して本発明の格子状物質を濃縮する。ろ過方法は、大きな孔を有するフィルターに中央層を通過させることを含む。フィルターを通過しなかった物質は本発明の格子状物質および脂肪細胞凝集物を含む。前記組織脂肪由来格子状物質は、フィルターを通過しなかった他の細胞から手で分離することができる。
【００１６】
下層はＡＤＳＣ−ＥＦおよび本発明のＡＤＳＣを含む。前記下層をさらに処理して本発明のＡＤＳＣを単離する。前記下層の細胞分画をペレットにして濃縮する。前記細胞を濃縮する方法の１つは遠心沈澱を含む。下層を遠心し、ペレットを保持する。前記ペレットは組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ＡＤＳＣ-ＥＦ）と称され、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ＡＤＳＣ-ＥＦ）を含む。前記ＡＤＳＣ−ＥＦは赤血球（ＲＢＣ）を含むかもしれない。好ましい方法では、前記ＲＢＣは溶解されて除去される。ＲＢＣを溶解し除去する方法は当分野で周知である（例えば低張液中でのインキュベーション）。ＲＢＣを除去した場合、前記ＲＢＣ非含有分画はＡＤＳＣ−ＥＦ分画およびＡＤＳＣを含む。しかしながら前記ＲＢＣはＡＤＳＣ−ＥＦから除去することは要求されない。
【００１７】
前記ペレットを再懸濁し、さらに１回または２回以上連続してＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離および再懸濁してさらに高純度のＡＤＳＣを達成することができる。本発明のＡＤＳＣ−ＥＦは不均質の細胞集団で、本発明のＡＤＳＣおよび脂肪細胞を含むかもしれない。前記洗浄および再懸濁したペレットの細胞は直ちに平板培養に用いることができる。
前記再懸濁ペレット中のＡＤＳＣは、前記再懸濁ペレットの他の細胞から、細胞選別、サイズ分画、顆粒度、密度、分子、形態および免疫組織学による方法を含む方法（ただしこれらに限定されない）によって分離することができる。
ある実施形態では、本ＡＤＳＣは、それらが小型であり顆粒状である場合は、細胞サイズおよび顆粒度を基準に他の細胞から分離される。また別には、ペレット中の他の細胞からＡＤＳＣを分離する分子的方法はテロメアの長さを分析することによる。幹細胞は分化細胞よりも長いテロメアを有する傾向がある。
【００１８】
別の実施形態では、テロメラーゼ活性を分析することにより、ペレット中の他の細胞からＡＤＳＣを分離する生化学的方法が用いられる。テロメラーゼ活性は幹細胞特異的マーカーとして用いられる。
さらに別の実施形態では、ＡＤＳＣはペレットの他の細胞から免疫組織化学的に、例えば磁気ビーズまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いたパニングによって分離される。
また別には、ＡＤＳＣを含むＡＤＳＣ濃縮分画を単離する方法は適切な装置を用いるものであり、前記装置の多くは当分野では公知である（例えば米国特許5,786,207号を参照されたい）。そのような装置は、洗浄および分解工程を機械的に実施することができる。
【００１９】
ＡＤＳＣの培養
ＡＤＳＣ−ＥＦ中のＡＤＳＣは所望の場合には培養し、収量を調べるために数および生存度について分析することができる。
ある実施形態では、前記幹細胞は、標準的な細胞培地（例えばＤＭＥＭ、典型的には５−15％（例えば10％）の血清（例えばウシ胎児血清またはウマ血清）を補充されている）を用いて、分化させることなく培養される。好ましくは、幹細胞はそれらの発生表現型を維持しながら少なくとも５回前記のような培地で分化させることなく継代され、より好ましくは、幹細胞は多分化能（multipotency）を維持しながら少なくとも10回（例えば少なくとも15回または少なくとも20回すら）前記のような培地で継代される。したがって、分化を誘導することなくＡＤＳＣの培養は特別にスクリーニングした血清ロットを用いないで達成できる。対照的に、間葉性幹細胞（例えば骨髄に由来）は、上記に記載した同じ培養条件下で分化するであろう。生存度および収量を測定する方法は当分野で公知であり、それらを利用することができる（例えばトリパンブルー排除）。
ＡＤＳＣを表現型の特定によって分離し、上述の２つ以上の発生系列を有する前記細胞を特定することができる。ＡＤＳＣ−ＥＦからＡＤＳＣを表現型により分離するために、細胞を所望の密度で、例えば約100細胞／ｃｍ2から約100,000細胞／ｃｍ2（例えば約500細胞／ｃｍ2から約50,000細胞／ｃｍ2、より好ましくは約1,000細胞／ｃｍ2から約20,000細胞／ｃｍ2）で平板培養する。
【００２０】
好ましい実施形態では、ＡＤＳＣ−ＥＦはより低密度（例えば約300細胞／ｃｍ2）で平板培養してＡＤＳＣのクローン単離を容易にする。例えば数日後に、前記のような密度で平板培養したＡＤＳＣは増殖（増大）してＡＤＳＣのクローン性集団を形成するであろう。細胞集団のクローニングに適した方法により、前記ＡＤＳＣを用いてクローンを作製し、増大させて、多分化能を有するＡＤＳＣのクローン集団を作製する。クローニングおよび増大方法は、細胞（または小さな細胞凝集物）の培養、物理的選別および別のプレート（例えばマルチウェルプレートのウェル）への播種を含む。また別には、単一細胞が各ウェルに配置されるように統計学に基づく割合で（例えば約0.1から約１細胞／ウェルまたは約0.25から約0.5細胞／ウェル、例えば0.5細胞／ウェル）、前記幹細胞をマルチウェルプレートでサブクローニングしてもよい。ＡＤＳＣはそれらを低密度で（例えばペトリ皿または他の適切な土台で）平板培養し、さらにクローニングリングのような装置を用いて他の細胞からそれらを単離することによってクローニングしてもよい。また別には、放射線源が利用可能な場合には、細胞を成長させて単層を形成し、続いて前記を遮蔽し、単層内の残りの細胞に放射線を照射することによってクローンを得ることができる。続いて生存細胞は成長してクローン集団を形成するであろう。クローン集団は任意の適切な培地で増大させることができるが、幹細胞（例えば本発明の幹細胞または他の幹細胞）のクローニングに好ましい培養条件は、約２／３のＦ１２培地＋20％血清（好ましくはウシ胎児血清）と約１／３の間質細胞（例えば脂肪吸引物の間質血管分画に由来する細胞）条件付け標準培地である（相対的な割合は体積によって決定される）。
【００２１】
いずれの場合にも、クローンであってもなくても、ＡＤＳＣは特別な誘導培地で培養して、ＡＤＳＣの分化を誘導しその多分化能を発現させることができる。ＡＤＳＣは中胚葉、外胚葉および内胚葉系列の細胞並びにその混合細胞を生じる。したがって、多分化能を有するＡＤＳＣに由来する１つ以上のＡＤＳＣを処理して多様な細胞タイプに分化させることができる。
別の実施形態では、ＡＤＳＣは脂肪生成分化を誘導するために限定培地で培養される。脂肪生成表現型に進むように本発明のＡＤＳＣを誘導する特別な培地の例には、グルココルチコイド（例えばデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾンなど）、インスリン、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる化合物（例えばジブチル‐cAMP、8-CPT-cAMP（8-(4)クロロフェニルチオ）‐アデノシン3',5'サイクリックモノホスフェート；8-ブロモ‐cAMP；ジオクタノイル‐cAMP、フォルスコリンなど）、および／またはｃＡＭＰの分解を阻害する化合物（例えばホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、メチルイソブチルキサンチン、テオフィリン、カフェイン、インドメタシンなど）および血清を含有する培地が含まれるが、ただしこれに限定されない。したがって、約１μＭから約10μＭのインスリンおよび約10-9Ｍから約10-6Ｍ（例えば約１μＭ）のデキサメタゾンの組合せにＡＤＳＣを暴露して脂肪生成分化を誘導することができる。前記のような培地はまた他の薬剤（例えばインドメタシン（例えば約100μＭから約200μＭ））を所望の場合には含むことができ、さらに好ましくは前記培地は血清を含まない。
別の実施形態では、ＤＭＥＭ、10％ＦＢＳ、１μMデキサメタゾン、10μMインスリン、200μMインドメタシン、１％抗生物質／抗真菌剤（ＡＢＡＭ）、0.5ｍMのＩＢＭＸ中で培養したＡＤＳＣは脂肪生成表現型を示す。
【００２２】
ＡＤＳＣの骨形成分化を誘導することができる培地は、約10-7Ｍから10-9Ｍのデキサメタゾン（例えば約１μＭ）を、約10μＭから約50μＭのアスコルベート−２−ホスフェートおよび10ｎＭから約50ｎＭのβ‐グリセロホスフェートと一緒に含むが、ただしこれに限定されない。前記培地はまた血清（例えばウシ血清、ウマ血清など）を含むことができる。
別の実施形態では、ＤＭＥＭ、10％ＦＢＳ、５％ウマ血清、50μＭヒドロコルチゾン、10−７デキサメタゾン、50μＭアスコルベート−２−ホスフェート、１％ＡＢＡＭ中で培養したＡＤＳＣは骨形成表現型を示す。
本発明のＡＤＳＣの筋形成分化を誘導することができる培地は、約10μＭから100μＭのヒドロコルチゾンを好ましくは血清富裕培地（例えば約10％から約20％の血清（ウシ、ウマまたはその混合物）を含む）中に含み（ただしこれらに限定されない）、細胞を前記に暴露する。使用することができる他のグルココルチコイドにはデキサメタゾンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。また別には５’−アザシチジンをグルココルチコイドの代わりに用いることができる。
別の実施形態では、ＤＭＥＭ、10％ＦＢＳ、10-7Ｍデキサメタゾン、50μＭアスコルベート−２−ホスフェート、10ｍＭβ−グリセロホスフェート、１％ＡＢＡＭ中で培養したＡＤＳＣは筋形成表現型を示す。
【００２３】
本発明のＡＤＳＣの軟骨形成分化を誘導することができる培地は、約１μＭから10μＭのインスリンおよび約１μＭから約10μＭのトランスフェリン、約１ng/mLから10ng/mLのトランスフォーミング成長因子（TGF）β１および10ｎＭから約50ｎＭのアスコルベート−２−ホスフェート（50ｎＭ）を含み（ただしこれらに限定されない）、細胞を前記に暴露する。軟骨形成分化のために、好ましくは細胞を高密度で（例えば約数百万細胞／mLで、またはミクロマス培養技術を用いて）、さらにまた少量の血清（例えば約１％から約５％）の存在下で培養する。
別の実施形態では、ＤＭＥＭ、50μＭアスコルベート−２−ホスフェート、6.25μg/ｍLのトランスフェリン、100ng/mLのインスリン成長因子（IGF-1）、５ng/mLのＴＧＦ−β−１、５ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；１週間だけ使用）中で培養したＡＤＳＣは軟骨形成表現型を示す。
【００２４】
さらにまた別の実施形態では、ＡＤＳＣは神経形成培地、例えばＤＭＥＭ、無血清、および５から10ｍＭのβ−メルカプトエタノールで培養され、外胚葉系列の様相を示す。
ＡＤＳＣはまたより未熟な発生表現型（例えば胎児性または胚性表現型）に脱分化するように誘導することができる。そのような誘導は、胎児および胚における状態を摸倣する状態にＡＤＳＣを暴露したときに達成される。例えば、本発明のＡＤＳＣ、またはＡＤＳＣ集団は胎児または胚から単離した細胞とともに培養するか、または胎児血清の存在下で培養することができる。
本発明のＡＤＳＣは、中胚葉、外胚葉または内胚葉系列への分化を、前記ＡＤＳＣを対応する胚葉から単離した成熟細胞またはその前駆細胞とともに同時培養することによって誘導することができる。
【００２５】
ある実施形態では、分化した成熟細胞と同時培養することによる特定の細胞タイプへのＡＤＳＣの誘導には、ＡＤＳＣと筋細胞または筋細胞前駆体との同時培養によって誘導される筋形成分化が含まれるが、ただしこれに限定されない。ＡＤＳＣとニューロンまたはニューロン前駆細胞との同時培養によってＡＤＳＣの神経細胞系列への分化が誘導され、ＡＤＳＣ内胚葉系列への誘導は、成熟もしくは前駆体膵細胞または成熟肝細胞もしくは対応する前駆細胞との同時培養によって生じるであろう。
また別には、ＡＤＳＣを条件付け培地中で培養し、特定の表現型への分化を誘導する。条件付け培地は、細胞性因子（例えばサイトカイン、成長因子、ホルモンおよび細胞外マトリックス）を培地に提供する成熟細胞を用いて培養した培地である。例えば、成熟筋細胞に暴露した培地をＡＤＳＣの培養に用いて、ＡＤＳＣの筋形成細胞系列への分化を誘導する。特定の分化を誘導する他の条件付け培地の例には、心臓弁細胞に暴露することによって条件付けした培地中で培養して心臓の弁組織への分化を誘導するものが含まれるが、ただしこれに限定されない。さらに、ニューロンによって条件付けした培地、または肝細胞によって条件付けした培地中でＡＤＳＣを培養して内胚葉系列が誘導される。
【００２６】
同時培養の場合は、ＡＤＳＣおよび他の所望される細胞を前記２つの細胞タイプが接触する条件下で同時培養することが所望される。これは、例えば適切な培養土台上に不均質細胞集団として前記細胞を播種することによって達成することができる。また別には、ＡＤＳＣを最初にコンフルエンスに達するまで成長させる（前記は条件付け培地で培養されるべき第二の所望される細胞のための土台として機能するであろう）。
分化を誘導する他の方法は当分野では公知であり、前記をＡＤＳＣの誘導に用いて、中胚葉、外胚葉または内胚葉系列の細胞を生じることができる。
分化誘導培地で適切な期間（例えば数日、一週間またはそれ以上）幹細胞を培養した後、ＡＤＳＣをアッセイして、実際にそれらが所望の系列を獲得したか否かを決定することができる。
【００２７】
本発明のＡＤＳＣから発生した分化細胞の性状を決定する方法には、組織学的、形態学的、生化学的および免疫組織化学的方法、または細胞表面マーカーを用いる方法、または遺伝子もしくは分子的方法、または分化細胞によって分泌された因子を特定する方法、および分化したＡＤＳＣの誘導性能による方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のＡＤＳＣから分化した中胚葉細胞の性状を決定する分子マーカーにはMyoD、ミオシン、α−アクチン、ブラキウリ（brachyury）、xFOG、Xtbx5、FoxF1、XNkx-2.5が含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記のマーカーの哺乳類同族体が好ましい。
本発明のＡＤＳＣから分化した外胚葉細胞の性状を決定する分子マーカーにはN-CAM、GABAおよび表皮特異的ケラチンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記のマーカーの哺乳類同族体が好ましい。
本発明のＡＤＳＣから分化した内胚葉細胞の性状を決定する分子マーカーにはXhbox8、Endo1、Xhex、Xcad2、Edd、ＥＦ1-α、HNF3‐β、LFABP、アルブミン、インスリンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。上記のマーカーの哺乳類同族体が好ましい。
【００２８】
ある実施形態では、分化したＡＤＳＣの分子的性状決定はテロメアの長さを測定することによる。未分化幹細胞は分化した細胞より長いテロメアを有する。したがって細胞をテロメラーゼ活性レベルについてアッセイすることができる。また別には、ＲＮＡまたはタンパク質をＡＤＳＣから抽出して、（ノーザン・ハイブリダイゼーション、ＲＴＰＣＲ、ウェスタンブロット分析などにより）固有表現型の指標マーカーの存在について分析することができる。
また別の実施形態では、免疫組織化学的にまたは組織学的にそれぞれ組織特異的抗体または組織特異的染色を用いて細胞をアッセイすることによって細胞の分化が調べられる。例えば、脂肪生成分化を調べるために、脂肪特異的染色を用いて（例えばオイルレッドＯ、サファリンレッド、ズダンブラックなど）、または脂肪関連因子（例えばPPAR-γ、アジプシン、脂質タンパク質リパーゼなど）を特定する標識抗体または分子マーカーを用いて分化ＡＤＳＣを染色する。
別の実施形態では、骨形成は、骨特異的染色（例えばアルカリ性ホスファターゼ、フォンコッサ（von Kossa）など）を用いるか、または骨特異的マーカー（例えばオステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、骨形態形成タンパク質、cbfaなど）を特定する標識抗体もしくは分子マーカーを用いて分化したＡＤＳＣを染色することによって調べることができる。
【００２９】
筋形成は、古典的な形態学的変化（例えば多核細胞、合胞体形成など）の確認によって調べるか、または筋特異的因子（例えばmyoD、ミオシン重鎖など）の存在について生化学的に調べることができる。
軟骨形成は、軟骨特異的染色（例えばアルシアンブルー）を用いるか、または培地中の軟骨特異的分子（例えば硫酸化グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカン、ケラチン、コンドロイチン、II型コラーゲンなど）を特定する標識抗体もしくは分子マーカーを用いて決定することができる。
また別の実施形態では、当分野で公知の発生表現型を調べる方法を用いることができる。例えば、前記細胞はサイズおよび顆粒性によって分類することができる。前記細胞を免疫原として用いて、モノクローナル抗体を作製することができる（Kohler and Milstein）。続いて前記抗体を用いて、与えられた細胞タイプと結合させることができる。抗原性の相関性によって、与えられた発生経路にしたがってＡＤＳＣが分化したことを確認できる。
ＡＤＳＣは単離することができるが、好ましくは前記は細胞集団内に存在する。本発明はＡＤＳＣの限定集団を提供する。ある実施形態では前記集団は不均質（heterogeneous）である。別の実施形態では前記集団は均質（homogeneous）である。
また別の実施形態では、ＡＤＳＣの集団は他の細胞を培養するために細胞を支援することができる。例えばＡＤＳＣが支援することができる細胞には他のタイプの幹細胞、例えば神経幹細胞（ＮＳＣ）、造血幹細胞（ＨＰＣ、特にCD34+幹細胞）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）およびその混合物が含まれる。他の実施形態では、前記集団は実質的に均質で、本質的に本発明の組織脂肪由来幹細胞から成る。
【００３０】
ＡＤＳＣ−ＥＦおよびＡＤＳＣの使用並びに本発明の方法
前記ＡＤＳＣ−ＥＦは本発明のＡＤＳＣの供給源として用いることができる。前記ＡＤＳＣ−ＥＦを組織再生、創傷修復、または幹細胞供給源を必要とする他の用途のために対象に導入することができる。さらに、ＡＤＳＣ−ＥＦを処理して、その中のＡＤＳＣを、対象に導入することを所望された細胞タイプに分化させることができる。ＡＤＳＣ−ＥＦはまた、ＡＤＳＣの供給源を維持するためにin vitroで培養するか、または所望の組織に発達させることができるさらに分化したＡＤＳＣを産生させるために誘導することができる。
ＡＤＳＣ（およびＡＤＳＣ集団）を多様な目的に用いることができる。ＡＤＳＣは他の細胞タイプの成長および増大を支援することができる。本発明は、適切な培地中のＡＤＳＣを用いて培地を条件付けする方法および、そのような方法によって製造されたＡＤＳＣ条件付け培地を含む。典型的には、前記培地はＡＤＳＣのin vitro成長を支援するために用いられる。前記ＡＤＳＣは、ホルモン、細胞マトリックス物質および他の因子を培地中に分泌する。適切な期間（例えば１日または数日）の後で、分泌された因子を含む培地を細胞から分離し、更なる使用のために保存することができる。所望にしたがって、前記ＡＤＳＣは連続して再使用して培地を条件付けすることができる。他の用途（例えばＡＤＳＣと他の細胞との同時培養）では、前記ＡＤＳＣは条件付け培地中に保持することができる。したがって、本発明は本方法を用いて得られたＡＤＳＣ条件付け培地を提供し、前記培地は、所望に応じてＡＤＳＣを含んでいるか、または実質的にＡＤＳＣを含まない。
【００３１】
ＡＤＳＣ条件付け培地を用いて、所望の細胞タイプの成長および増大を支援することができ、本発明は前記条件付け培地を用いて細胞（特に幹細胞）を培養する方法を提供する。前記方法は、所望の細胞が生命活性を保持する条件下で前記所望の細胞を前記条件付け培地中で維持することを含む。前記細胞は、それら細胞を培養するために適した任意の条件（例えば当分野で公知の条件）下で維持することができる。望ましくは、本方法は細胞有糸分裂の連続繰返しを可能にして増大した細胞集団を形成する。正確な条件（例えば温度、CO2レベル、攪拌、抗生物質の有無など）は培地の他の成分および細胞タイプに左右されるであろう。しかし、これらのパラメータの最適化は、当分野の通常の技術である。
別の実施形態では、前記ＡＤＳＣを遺伝的に改変して、例えば外因性遺伝子（“トランスジーン”）を発現させるか、または内因性遺伝子を抑制することができ、本発明は前記のような細胞および集団を遺伝的に改変する方法を提供する。本方法にしたがえば、ＡＤＳＣは、トランスジーンを含む核酸を含む遺伝子移転ベクターに暴露され、それによって前記核酸は前記細胞内でトランスジーンが発現される適切な条件下で細胞に導入される。前記トランスジーンは一般的に発現カセットであり、前記カセットは適切なプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドはタンパク質をコードすることができる。または前記ポリヌクレオチドは生物学的に活性なＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）をコードすることができる。したがって、例えば前記ポリヌクレオチドは、毒素への遺伝子性の抵抗、ホルモン（例えばペプチド成長ホルモン、ホルモン遊離因子、性ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、サイトカイン（例えばインターフェリン、インターロイキン、リンホカイン）など）、細胞表面結合細胞内シグナリング成分（例えば細胞粘着分子、ホルモンレセプターなど）、与えられた細胞系列の分化を促進する因子（例えば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ））などコードすることができる。もちろんのこと、あるトランスジーンのデリバリーのために遺伝子移転技術を用いることを所望する場合は、その配列は公知であろう。
【００３２】
前記発現カセット内では、コードするポリヌクレオチドは適切なプロモーターに機能的に連結される。適切なプロモーターの例には、原核細胞プロモーターおよびウイルスプロモーター（例えばレトロウイルスのITR、LTR、極初期ウイルスプロモーター（IEp）、例えばヘルペスウイルスIEｐ（例えばICP4-IEpおよびICP0-IEp）サイトメガロウイルス（CMV）IEp、および他のウイルスのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターおよびネズミ白血病ウイルス（MLV）プロモーター）が含まれる。他の適切なプロモーターは真核細胞プロモーター、例えばエンハンサー（例えばウサギβ−グロビン調節エレメント）、構成的に活性なプロモーター（例えばβ−アクチンプロモーターなど）、シグナル特異的プロモーター（例えば誘導性プロモーター、例えばRU486に反応するプロモーターなど）、および組織特異的プロモーターである。予め限定した細胞条件下で遺伝子の発現を駆動させるために適したプロモーターの選択は、当業者には明白であろう。前記発現カセットは２つ以上のコードポリヌクレオチドを含むことができ、さらに前記は他の成分（例えばポリアデニル化配列、膜挿入シグナルまたは分泌リーダー配列をコードする配列、リボソームエントリー配列、転写調節エレメント（例えばエンハンサー、サイレンサーなど）など）を所望に応じて含むことができる。
【００３３】
トランスジーンを含む発現カセットは、細胞に前記トランスジーンをデリバーするために適した遺伝子ベクターに取り込ませるべきである。所望の最終用途に応じて、前記細胞を遺伝的に改変できるように前記のようないずれのベクターも用いることができる（例えばプラスミド、裸出（naked）ＤＮＡ、ウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ附随ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルス、レトロウイルスなど））。そのようなベクター内に所望の発現カセットを構築する任意の方法を用いることができる。前記方法の多くは当分野で周知である（例えば直接クローニング、相同組換えなど）。もちろんのこと、細胞にベクターを導入するために用いられる方法は主としてベクターの選択によって決定されるであろう（例えばプロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈澱、遺伝子銃、電気穿孔、ウイルスベクターによる感染など）（前記は当分野で一般的に知られている）。
遺伝的に変更されたＡＤＳＣをバイオリアクターとして用いてトランスジーンの産物を生成することができる。他の実施形態では、遺伝的に改変したＡＤＳＣを用いて前記トランスジーンおよびその産物を動物にデリバーする。例えば、いったん遺伝的に改変したら、前記トランスジーンをin vivoで発現させるために十分な条件下で前記ＡＤＳＣを動物に導入することができる。
【００３４】
遺伝的改変の有用な標的として役立つことの他に、多くのＡＤＳＣおよびＡＤＳＣ集団はホルモンを分泌する（例えばサイトカイン、ペプチドまたは他の（例えばモノブチリン）成長因子など）。細胞のいくつかは前記のようなホルモンを最初の単離時に自然に分泌し、他の細胞は本明細書で考察するように遺伝的に改変してホルモンを分泌させることができる。ホルモンを分泌するＡＤＳＣをin vivoおよびin vitroの多様な環境で用いることができる。例えば、そのような細胞をバイオリアクターとして用いて、あるホルモンの直ちに使用できる供給源を提供することができる。したがって本発明は前記の細胞からホルモンを得る方法に関する。本方法にしたがえば、培地中にホルモンを分泌させるために適した条件下でＡＤＳＣが培養される。適切な時間の後で（好ましくは周期的に）、培地を採集し、培地からホルモンを単離するために処理する。任意の標準的な方法（例えばゲルクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィー、透析、凍結乾燥など）を用いて、培地からホルモンを精製することができる（前記の多くは当分野で公知である）。
【００３５】
他の実施形態では、ホルモンを分泌するＡＤＳＣ（およびＡＤＳＣ集団）を治療薬剤として用いることができる。一般的には、そのような方法は、前記細胞をin vitroで所望の組織に移すか（例えば移植または埋め込み前の移植片として）、またはin vivoで動物組織に直接移すことを含む。前記細胞は所望の組織に適切な任意の方法で移すことができるが、前記任意の方法は組織のタイプに応じて変動するであろう。例えば、ＡＤＳＣは、前記細胞を含む培地に移植片を浸すことによって、または移植片に前記培地を注入することによって移植片に移される。また別には、ＡＤＳＣを前記組織内の所望の部位に播種してＡＤＳＣ集団を樹立することができる。細胞は、例えばカテーテル、トロカール、カニューレ、ステント（これらは細胞とともに配置することができる）などの器具を用いてin vivoで所望部位に移すことができる。これらの用途の場合、好ましくはＡＤＳＣは以下を分泌する：サイトカインまたは成長ホルモン、例えばヒト成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、インスリン様成長因子、造血幹細胞成長因子、線維芽細胞成長因子類のメンバー、血小板由来成長因子類のメンバー、血管細胞および内皮細胞成長因子、ＴＧＦｂ類のメンバー（骨形態形成因子を含む）、または先天性疾患（例えばジストロフィー）に特異的な酵素。
【００３６】
ある用途では、本発明はＡＤＳＣにより患者の体内で創傷閉鎖を促進する方法を提供する。本方法にしたがえば、ＡＤＳＣがホルモンを産生するために十分な条件下で前記ホルモン分泌ＡＤＳＣが創傷近傍に移される。創傷近傍におけるホルモンの存在は創傷の閉鎖を促進する。前記方法は外部創傷（例えば表面）および内部創傷の両創傷の閉鎖を促進する。閉鎖を促進するために本発明の方法が用いられる創傷には擦過傷、剥離創、開放性気胸、火傷、挫傷、銃創、切開創、開放創、穿通創、穿孔創、刺創、串線創、刺し傷、手術創、皮下創傷または接線創が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本方法は創傷の完全な治癒または閉鎖の達成を必要とせず、本方法は任意の程度に創傷閉鎖を促進すれば十分である。この点から、本方法は単独で用いるか、または創傷組織の治癒を目的とする他の方法の補助として用いることができる。
ＡＤＳＣが血管形成ホルモン（血管成長因子、血管細胞および内皮細胞成長因子など）を分泌する場合は、ＡＤＳＣを（ＡＤＳＣを含む集団も同様に）用いて組織内の血管形成を誘導することができる。したがって、本発明はそのようなＡＤＳＣを用いて組織内の新生血管形成を促進または抑制する方法を提供する。前記ホルモンの組織内の存在は新生血管形成を促進または抑制する。本方法にしたがえば、ＡＤＳＣは、前記細胞が血管形成ホルモンを産生するために十分な条件下で所望の組織に導入される。前記ホルモンの組織内の存在は組織内の新生血管形成を促進する。
【００３７】
ＡＤＳＣは発生表現型を有するので、それらは生物組織工学で用いることができる。これに関して、本発明は、ＡＤＳＣが増大し所望の物質を形成するために十分な条件下でＡＤＳＣを維持することを含む、動物性成分を製造する方法を提供する。前記成分は成熟組織、または完全な器官すら含むことができる。前記器官には（本明細書で説明するように）本発明の細胞が分化することができる組織タイプが含まれる。典型的には、前記成分には組織脂肪、軟骨、心臓、皮膚結合織、血液組織、筋、腎、骨、肋膜組織、内臓組織、血管組織などが含まれるであろう。より典型的には、前記成分はこれら組織タイプの組合せ（すなわち２つ以上の組織タイプ）を含むであろう。例えば、前記成分は動物器官（例えば心臓、腎臓）、または四肢（脚、翼、腕、手、足など）の全てまたは一部を含むことができる。もちろんのこと、前記細胞が分裂し分化してそのような構造を生成することができるかぎり、前記細胞はまたそのような構造物の原基を形成することができる。初期段階ではそのような原基は凍結保存し、所望の成熟構造物または器官を将来生成することができる。
【００３８】
そのような構造物を製造するために、ＡＤＳＣおよびＡＤＳＣ集団が増大して所望の構造物を形成するために適した条件下でそれらを維持する。いくつかの用例では、前記はＡＤＳＣを動物に（すなわちin vivo）、典型的には新規物質が所望される部位に移すことによって達成される。したがって例えば、本発明は動物体内で組織（例えば骨、筋、軟骨、腱、組織脂肪など）の再生を促進することができる（この場合ＡＤＳＣは前記のような組織に移植される）。他の実施形態では（特に原基を形成するためには）、ＡＤＳＣは組織への分化および成長をin vitroで誘導される。そのような用例では、ＡＤＳＣは、組織の発達を誘導する三次元的構造物の形成を促進する土台上で培養される。したがって例えば、ＡＤＳＣは生体適合性格子状物質（例えば細胞外マトリックス物質、合成ポリマー、サイトカイン、成長因子などが含まれる）上で培養または播種される。そのような格子状物質は、組織タイプへの発育を促進する所望の形状に鋳型成形することができる。さらにまた、そのような培養の少なくとも初期段階では、培地および／または土台には、適切な組織タイプおよび構造の発育を促進するいくつかの因子（例えば成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス物質など）が補充される。実際、いくつかの実施形態では本明細書で考察するように、ＡＤＳＣを対応する組織タイプの成熟細胞またはその前駆細胞と一緒に同時培養するか、または対応する条件付け培地に細胞を暴露することが望ましい。
【００３９】
前記のような動物性成分および組織の形成のためにＡＤＳＣおよびその集団の使用を容易にするために、本発明はＡＤＳＣ（およびＡＤＳＣ集団）および生物学的に適合する格子状物質を含む組成物を提供する。典型的には、前記格子状物質はポリマー物質から形成される。前記ポリマー物質はメッシュまたはスポンジのような繊維を有し、典型的には約100μＭから約300μＭの規模の間隙を含む。そのような構造物は、細胞が成長し増殖することができる十分な領域を提供する。望ましくは、前記格子状物質は時間の経過にしたがって生体内で分解され、その結果、前記動物性成分が発達するにつれ、前記格子状物質は前記動物性成分に吸収されるであろう。したがって、適切なポリマー性格子状物質は、例えばグリコール酸、乳酸、フマール酸プロピル、カプロラクトン、ヒアルロナン、ヒアルロン酸などのモノマーから生成することができる。他の格子状物質にはタンパク質、多糖類、ポリヒドロキシ酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼンまたは合成ポリマー（特に生体分解性ポリマー）が含まれる。もちろんのこと、そのような格子状物質の形成に適したポリマーは２つ以上のモノマー（例えば表示のモノマーの組合せ）を含むことができる。さらにまた、前記格子状物質はまた、所望に応じてホルモン、例えば成長因子、サイトカインおよびモルフォゲン（例えばレチン酸、アラキドン酸など）、所望の細胞外マトリックス分子（例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなど）、または他の物質（例えばＤＮＡ、ウイルス、他の細胞タイプ）を含むことができる。
【００４０】
前記組成物を形成するために、ＡＤＳＣが格子状物質内の間隙に侵入することができるようにＡＤＳＣが導入される。例えば、前記マトリックスは前記細胞を含む溶液または懸濁液に浸すか、または前記細胞をマトリックスに注入することができる。特に好ましい組成物は、ポリマーを含む懸濁物を架橋し、さらに本発明の細胞をその中に分散させることによって形成されたヒドロゲルである。この製造方法によって細胞を格子状物質全体に分散させることができ、細胞が格子状物質内により侵入しやすくする。もちろんのこと、前記組成物はまた所望の表現型の成熟細胞またはその前駆細胞を含み、（例えば格子状物質内での前記のような細胞の同時培養効果として）ＡＤＳＣを格子状物質内で適切に分化させる潜在能力をもたせることもできる。
【００４１】
前記組成物は、所望の組織タイプ、構造物または原基の成長および発生を促進するために、任意の適切な態様で用いることができる。例えば、前記組成物は三次元的または定位的モデリング技術を用いて構築することができる。したがって、例えば組成物内の１つの層またはドメインには骨形成分化のためにプライミングされた細胞が存在し、組成物内の別の層またはドメインには筋形成および／または軟骨形成発育のためにプライミングされた細胞が存在するであろう。前記のようなドメインを互いに並置させることによって、多数の組織タイプを含む複雑な構造物（例えば筋肉に取囲まれた骨、例えば四肢で見出されるもの）の成形および分化が促進される。所望の構造物の成長および分化を誘導するために、適切な場合には前記組成物をバイオリアクターまたはインキュベーターでex vivoで培養することができる。他の実施形態では、前記構造物または組織を成長させることを所望するホスト動物内の部位に直接前記構造物が移植される。また別の実施形態では、前記構造物はホスト（典型的には動物、例えばブタ、ヒヒなど）に移植され、使用できるようになるまで前記ホストで成長または成熟させられる。その後、前記成熟構造物（または原基）を前記のホストから摘出し、適切なホストに移植する。
【００４２】
組成物に包含させるために適した格子状物質は任意の適切な供給源（例えばマトリゲル）に由来するが、格子状物質に適したいくつかの市販供給源が存在する（例えば適切なポリグリコール酸が例えばEthicon（N.J.）のような供給源から入手できる）。また別の適切な格子状物質は脂肪組織の無細胞部分（すなわち実質的に細胞を欠く脂肪組織の細胞外マトリックス成分）に由来し、本発明はそのような組織脂肪由来格子状物質を提供する。典型的には、そのような組織脂肪由来格子状物質は、タンパク質（例えばプロテオグリカン、糖タンパク質、ヒアルロニン、フィブロネクチン、コラーゲン（Ｉ型、II型、III型、IV型、Ｖ型、VI型など）などを含む。前記タンパク質は細胞の成長のために優れた土台として機能する。さらにまた、そのような組織脂肪由来格子状物質はホルモン、好ましくはサイトカインおよび成長因子を含み、マトリックスに播種された細胞の成長を促進することができる。
【００４３】
組織脂肪由来マトリックスは、前記が無細胞分画に存在するという点を除いて上記に述べたように同様に脂肪組織から単離することができる。例えば、脂肪組織またはその誘導体（例えば上記に記載した方法による格子状物質濃縮上清分画）に超音波または熱エネルギーを与えるか、および／または酵素処理を施してマトリックス物質を回収することができる。さらにまた、所望の場合には脂肪組織の細胞性分画を、例えばリパーゼ、洗剤、プロテアーゼで処理することによって、および／または機械的もしくは超音波破壊（例えばホモジナイザーまたはソニケーター）によって破壊する。しかしながら単離された前記物質は最初粘稠な物質として確認されるが、最終的な所望の使用に応じてさらに処理することができる。例えば、未加工マトリックス物質を処理して（例えば透析またはプロテアーゼもしくは酸による処理など）、所望の格子状物質を生成できる。したがって、格子状物質は水和形として調製してもよく、または乾燥もしくは凍結乾燥させて実質的に無水形または粉末にしてもよい。その後で、前記粉末を細胞培養土台として、例えばそれを適切な細胞培地に懸濁して使用のために再水和させることができる。これに関しては、組織脂肪由来格子状物質は他の適切な格子状物質（例えば上記で述べたようなもの）と混合してもよい。もちろんのこと、本発明は、組織脂肪由来格子状物質および細胞または細胞集団、例えば本発明のＡＤＳＣおよび同様に他の細胞（特に他の幹細胞タイプ）を含む組成物に関する。
【００４４】
上記で考察したように、ＡＤＳＣ、ＡＤＳＣ集団、格子状物質および本発明の組成物は生物組織工学および組織の再生で用いることができる。したがって、本発明は前記の本発明の特徴のいずれかを有する移植可能構造物（すなわち移植物）に関する。前記移植物の正確な性質はその最終用途に応じて変動するであろう。前記移植物は記載したように成熟組織を含んでいても、また未成熟組織または格子状物質を含んでいてもよい。したがって、例えば、１つのタイプの移植物は、骨形成分化が進行している（又は活性化された）本発明の細胞集団（場合によって適切なサイズおよび寸法を有する格子状物質内に播種されている）を含む骨移植物でもよい。そのような移植物はホストの体内に注入または移植され、前記患者の体内の成熟骨組織の発生または再生を促進させることができる。同様な移植物を用いて、患者の体内で筋肉、軟骨、腱などの成長または再生を促進することができる。他のタイプの移植物は原基（例えば本明細書で述べるように）、例えば肢芽、指芽、発生腎などであり、前記はいったん患者に移植されるや適切な構造物に成熟するであろう。
【００４５】
組織脂肪由来格子状物質は細胞培養キットのパーツとして都合よく用いることができる。したがって本発明は、組織脂肪由来格子状物質および１つまたは２つ以上の他の成分、例えば水和剤（例えば水、生理的に許容できる食塩溶液、調製済み細胞培地、血清またはその誘導体など）、細胞培養土台（例えば培養皿、プレート、バイアルなど）、細胞培地（液体形であれ粉末形であれ）、抗生物質、ホルモンなどを含むキットを提供する。前記キットは任意の前記のような成分を含むことができるが、好ましくは前記キットは、所望の細胞タイプの培養および成長を支援するために必要な全ての成分を適切な組合せで含有する。もちろんのこと、所望される場合には、前記キットはまた細胞（典型的には凍結されている）を含み、前記細胞は本明細書に記載されているように格子状物質に播種することができる。
【００４６】
本発明の多くの態様が組織の成長および分化に関するが、本発明は他の用途にも同様に関係する。例えば、組織脂肪由来格子状物質を実験試薬として、例えば組織の成長および分化のために改善された格子状物質および土台の改善において用いることができる。組織脂肪由来格子状物質はまた、例えば皺、瘢痕、皮膚の機能低下を隠蔽するために、または組織増量物のために化粧分野で用いることができる。前記のような用途の場合、好ましくは、格子状物質は、一定の型にはめられユニット剤形（unit dosage form）として包装される。所望の場合は、格子状物質は、担体（溶媒、例えばグリセリンまたはアルコール）、香料、抗生物質、着色剤および化粧品で一般的に用いられる他の成分と混合されてもよい。前記土台はまた同一個体内で用いてもまたは同種異系移植として用いてもよい。さらに前記土台は、創傷治癒促進のために軟膏または包帯剤として、またはそれらに含有させて用いてもよい。ＡＤＳＣはまた、実験用試薬として用いることができる。例えばＡＤＳＣを用いて、分化の初期事象に反応することができる薬剤の発見を促進することができる。例えば、本発明の細胞を特定の分化系統を誘導する培地に暴露し、続いて遺伝子の弁別的発現についてアッセイすることができる（例えばランダムプライムＰＣＲまたはタンパク質もしくはＲＮＡの電気泳動など）。
【００４７】
本発明のＡＤＳＣまたは組織脂肪由来格子状物質を単離する工程のために、本発明は脂肪組織から前記のような試薬を単離するキットを提供する。前記キットは患者から脂肪組織を単離する手段（例えばカニューレ、注射針、アスピレーターなど）を、間質細胞分離のための手段（例えば本明細書に記載した方法による）と同様に含むことができる。前記キットを例えば、適切な場合に同じ個体から再導入できるＡＤＳＣの即時供給源として用いることができる。したがって本キットは、所望の組織タイプの再成長を（場合によって同じ方法で）必要とする患者で移植のための組織脂肪由来幹細胞の単離を促進することができる。これに関して、前記キットはまた前記細胞を分化させる培地（例えば本明細書で説明される培地）を含むことができる。適切な場合は、前記細胞を前記培地に暴露し、必要に応じて患者の体内で前記細胞の分化を開始させることができる。さらにまた、in vitro操作（例えば本明細書に記載されるようにクローニングまたは分化誘導）のために前記キットをＡＤＳＣの便利な供給源として用いることができる。別の実施形態では、本明細書に記載されるように前記キットを組織脂肪由来格子状物質の単離に用いることができる。
【００４８】
前述の詳細な記載により当業者は本発明を完全に実施することができるが、以下の実施例は本発明の特徴のいくつかの解説に役立つであろう。特にそれら実施例は、成熟脂肪細胞を実質的に含まないヒトの組織脂肪由来幹細胞の単離、そのような細胞のクローン集団の単離、in vivoおよびin vitroで中胚葉表現型、内胚葉表現型および外胚葉表現型をもつ全ての細胞へ分化するそのような細胞の能力、並びに他のタイプの幹細胞の成長を支援するそのような細胞の能力を示す。前記実施例はまた、細胞培養のための適切な土台として機能することができ、且つ、実質的に細胞を含まない組織脂肪由来格子状物質の単離を示す。もちろんのこと、これらの実施例は完全に例示を目的として提示されるので、それらは本発明の範囲を拘束するために用いられるべきではなく、本発明の前述の記載を全体として補足するものとして考えられるべきである。
これらの実施例で用いられる方法、例えば外科手術、細胞培養、酵素消化、タンパク質およびポリヌクレオチドの組織学並びに分子的分析は当業者には周知であろう。前記の理由により、さらには簡潔にするために、実験の詳細は詳しくは記載されない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
本実施例は実質的に成熟脂肪細胞を含まないヒト組織脂肪由来幹細胞の単離を実演する。
脂肪吸引による未処理脂肪吸引物は任意手術を受けている患者から入手した。脂肪吸引術の前に、患者にはエピネフリンを投与して吸引物の血液による夾雑を最小限にした。吸引物をろ過して附随する脂肪組織片を附随する廃液から分離した。単離した組織を中性のリン酸緩衝食塩水で十分にすすぎ、続いて0.075％（w/v）のコラゲナーゼで37℃で約20分、間欠的に攪拌しながら酵素で分解した。消化の後、前記コラゲナーゼを中和し、スラリーを約260ｇで約10分遠心分離し、それによって多層の上清および細胞ペレットが得られる。前記上清を取り出して更なる使用のために保持し、前記ペレットを赤血球溶解溶液に再懸濁して攪拌せずに約25℃で約10分インキュベートした。インキュベーションに続いて、前記媒体を中和し、細胞を再度約250ｇで約10分遠心分離した。二回目の遠心分離の後、細胞を懸濁させて生存度（トリパンブルー排除を用いる）および細胞数について調べた。
【００５０】
その後、細胞を約１ｘ106細胞／100mm皿の密度で平板培養した。前記細胞をＤＭＥＭ＋ウシ胎児血清（約10％）中で約５％ＣＯ2下37℃で培養した。
細胞の大半は付着性、小型で比較的顆粒をもたない線維芽細胞に類似する細胞であり、目に見える脂肪滴を含まず、CD34は陰性であった。細胞の大半はオイルレッドOおよびフォンコッサで陰性に染色された。前記細胞をまたテロメラーゼ発現について調べた（市販のTRAPアッセイキットを使用）。HeLa細胞およびHN-12細胞を陽性コントロールとして用いた。ヒト包皮線維芽細胞およびHN-12加熱細胞抽出物を陰性コントロールとして用いた。テロメラーゼ生成物は12.5％のポリアクリルアミドセルで分離し、シグナルはリン画像化（phosphorimaging）によって決定した。テロメラーゼ活性の指標となるテロメラーゼラダーが組織脂肪由来幹細胞で陽性コントロールと同様に観察された。ラダーは陰性コントロールでは観察されなかった。
したがって、これら細胞を筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞または血液細胞と同定することはできなかった。これらの結果は、ヒト幹細胞について以前に報告された結果と同様に、組織脂肪由来細胞はテロメラーゼ活性を発現することを示している。
これらの細胞の亜集団を続いて以下の培地に暴露してそれらの発生表現型を調べた：
【００５１】
【表１】
2005502352.tif 000003
【００５２】
一集団を軟骨形成培地中で数週間高密度で培養した。前記組織培養およびパラフィン切片の組織学的分析を２、７および14日でＨ＆Ｅ、アルシアンブルー、トルデンブルーおよびゴルドナーのトリクロム染色により実施した。
免疫組織化学検査をコンドロイチン−４−硫酸およびケラチン硫酸およびII型コラーゲンに対する抗体を用いて実施した。マトリックス染色の定性的評価もまた実施した。前記の結果は、軟骨膜細胞の明瞭な境界をもつ軟骨性球状結節が最初の処理後早くも48時間で形成されることを示した。未処理コントロール細胞は軟骨形成分化の証拠を示さなかった。これらの結果によって前記幹細胞は軟骨形成性発生表現型を有することが確認された。
【００５３】
一集団をほぼコンフルエンスになるまで培養し、続いて脂肪生成培地に数週間暴露した。前記集団を培養後２および４週間でオイルレッドO染色後の相対的濁度について比色判定によって調べた。脂肪生成は２週間で進行中であり４週間では極めて進行していることが判明した（それぞれ相対的濁度１および5.3）。骨髄由来幹細胞を陽性コントロールとして用い、これらの細胞はわずかに低い脂肪生成能を示した（相対的濁度はそれぞれ0.7および2.8）。
一集団をほぼコンフルエンスになるまで培養し続いて骨形成培地に数週間暴露した。前記集団を培養後２および４週間でフォンコッサ染色後の相対的濁度について比色判定によって調べた。骨形成は２週間で進行中であり４週間では極めて進行していることが判明した（それぞれ相対的濁度1.1および7.3）。骨髄由来幹細胞を陽性コントロールとして用い、これらの細胞はわずかに低い骨形成能を示した（相対的濁度はそれぞれ0.2および6.6）。
一集団をほぼコンフルエンスになるまで培養し続いて筋形成培地に数週間暴露した。前記集団を培養後１、３および６週間で多核細胞および筋特異的タンパク質（MyoDおよびミオシン重鎖）の発現を判定することによって調べた。ヒト包皮線維芽細胞および骨格筋芽細胞をコントロールとして用いた。MyoDおよびミオシン発現細胞は、筋形成培地に前記幹細胞集団を暴露した後全ての時点で観察され、そのような細胞の割合は３および6週間で増加した。多核細胞は６週間で観察された。対照的に、線維芽細胞は前記の特徴をいずれの時点でも全く示さなかった。
これらの結果は、成熟脂肪細胞を含まないヒト組織脂肪由来多能幹細胞が単離されたことを明瞭に示している。
【００５４】
実施例２
本実施例は組織脂肪由来幹細胞は５−アザシチジンに反応して分化しないことを示す。
実施例１にしたがって得られた組織脂肪由来幹細胞を５−アザシチジンの存在下で培養した。骨髄由来幹細胞と比較して、前記薬剤への暴露は筋形成分化をもたらさなかった（例えば上掲書（Wakitani et al.）を参照されたい）。
【００５５】
実施例３
本実施例は、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画からヒト組織脂肪由来幹細胞のクローン集団が形成されることを示す。
実施例１で説明した方法にしたがって単離した細胞を約5000細胞／100mm皿で播種し、実施例１に示したように数日培養した。数回の細胞分裂の後で、いくつかのクローンをクローニングリングで選択し、48ウェルプレートのウェルに移した。これらの細胞を数週間培養し、約80％から90％コンフルエントになるまで培地を１週間に２回交換した（37℃、約５％CO2下、２／３のF12培地＋20％ウシ胎児血清および１／３の標準培地（前記は最初は実施例１で単離した細胞によって条件付けした）、“クローニング培地”）。その後、各培養を35mmの培養皿に移して成長させ、続いて100mmの皿に移しコンフルエント近くまでさらに成長させた。その後、１つの細胞集団を凍結し、残りの集団を12ウェルプレートに1000細胞／ウェルで播種した。
【００５６】
前記細胞をクローニング培地で15代よりも多く培養し、実施例１に示したように分化についてモニターした。各クローンの未分化状態は連続継代培養後にも終始一貫していた。
続いてクローン集団を樹立し、実施例１に述べたように脂肪生成、軟骨形成、筋形成、および骨形成培地に暴露した。それぞれ対応する培地に暴露されたとき、少なくとも前記クローンの１つが骨、脂肪、軟骨および筋に分化することができ、さらにクローンの大半が少なくとも３つのタイプの組織に分化できることが観察された。前記細胞が筋および軟骨に生育できる能力は、これら組織脂肪由来幹細胞の多能性をさらに示した。
これらの結果は、組織脂肪由来幹細胞は、予め特別に選別された血清ロットを要求しないで何代もの継代で未分化状態を維持することができることを示している。前記結果はまた前記細胞はそのような多くの継代の後も多能性を維持することを示し、前記細胞が実際に幹細胞であり、単なる拘束された前駆細胞ではないことを証明した。
【００５７】
実施例４
本実施例は、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画から得られた組織脂肪由来幹細胞は他のタイプの幹細胞培養を支援することができることを示す。
ヒト組織脂肪由来幹細胞を約30,000／ウェルの密度で96ウェルプレートで継代して１週間培養し、続いて放射線を照射した。臍帯血から単離したヒトCD34+造血幹細胞を続いて前記ウェルに播種した。同時培養をMyeloCulH5100培地で維持し、細胞生存度および増殖を顕微鏡観察によって主観的にモニターした。２週間同時培養した後、前記造血幹細胞をCD34の発現についてフローサイトメトリーで調べた。
間質細胞との２週間以上の同時培養で、造血幹細胞は球形細胞の大きなコロニーを形成した。フロー分析によって、前記細胞の62％がCD34+を維持することが示された。顕微鏡観察によれば、ヒト組織脂肪由来間質細胞は、臍帯血由来ヒト造血幹細胞の生存を維持し、さらに前記細胞の成長を支援した。
これらの結果は、ヒト皮下脂肪組織由来の間質細胞は他の幹細胞のex vivoでの維持、成長および分化を支援することができることを示している。
【００５８】
実施例５
本実施例は、組織脂肪由来幹細胞濃縮分画に由来する組織脂肪由来幹細胞はin vivoで分化することができることを示す。
各々が12匹の無胸腺マウスを含む４つの群に、以下を含むヒドロキシアパタイト／リン酸三石灰キューブを皮下に移植した：Ａ群は、実施例１で説明した骨形成培地で前処理した組織脂肪由来幹細胞を含んでいた。Ｂ群は未処理の組織脂肪由来幹細胞を含んでいた。Ｃ群は骨形成培地を含むが細胞は含まれてなかった。Ｄ群は骨形成培地も細胞も含んでなかった。各群の中で６匹のマウスを移植後３週間で殺し、残りのマウスを８週間で殺した。前記キューブを抽出して固定し、脱石灰し切片を作製した。各切片をヘマトキシリンとエオシン（例えばＨ＆Ｅ）、マローリー骨染色およびオストカルシンのための免疫染色で染色して分析した。
オステオカルシンおよびマローリー骨染色に対して類骨様組織の明瞭な領域がＡ群およびＢ群の切片で観察された。Ａ群およびＢ群で、他の群より実質的に多くの類骨組織が観察されたが（ｐ＜0.05、ANOVA）、Ａ群とＢ群の間では骨形成において有意差は観察されなかった。さらにまた、骨成長の定性的増加が、３週間と８週間の間でＡ群およびＢ群の両群で観察された。これらの結果は、組織脂肪由来幹細胞はin vivoで分化することができることを示している。
【００５９】
実施例６
本実施例は、実質的に細胞を含まない組織脂肪由来格子状物質の単離を示す。
あるプロトコルでは、実施例１の格子状物質濃縮分画を３日間、0.05％トリプシンEDTA／100U/mLデオキシリボヌクレアーゼ中で酵素消化に付して細胞が破壊された。毎日残屑を食塩水中ですすぎ、新しい酵素を添加した。その後、前記物質を食塩水ですすぎ、0.05％のコラゲナーゼおよび約0.1％リパーゼに再懸濁し、存在するタンパク質および脂肪を部分的に消化した。このインキュベーションを２日間続けた。
別のプロトコルでは、実施例１で残しておいた上清をEDTA中でインキュベートし、一切の上皮細胞を除去した。以下を含む緩衝液で残存する細胞を溶解させた：１％NP40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、５mMのEDTA、0.4MのNaCl、50ｍMトリス−HCl（pH８）およびプロテアーゼ阻害剤並びに各々10μg/ｍLのロイペプチン、キモスタチン、アンチパインおよびペプスタチンA。最後に、二価陽イオンを含まないＰＢＳで前記組織を十分に洗浄した。
両方の調製プロトコルを実施した後、残存する物質を洗浄し、ゼラチン性集積物として確認された。この物質の顕微鏡分析によって、前記は細胞を含まず、さらに大量のコラーゲン（おそらくIV型）および多様な成長因子で構成されることが明らかにされた。この物質で構成された調製物は細胞の成長を支援し、前記物質が組織培養のために優れた土台となることが示された。
【００６０】
実施例７
以下の記載は、中胚葉性多組織潜在能力を示す組織脂肪由来幹細胞濃縮分画および前記幹細胞を単離する方法を提供する。
材料と方法
全ての材料は別に記載がないかぎりシグマ（Sigma; St. Louis, MO）から購入した。全ての組織培養試薬はライフテクノロジーズ（Life Technologies; New York, NY）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびウマ血清（ＨＳ）はハイクローン（Hyclone; Logan, UT）およびライフテクノロジーズからそれぞれ購入した。
細胞株：
正常ヒト骨芽細胞（NHOst）、ヒト骨格筋（SkM）細胞および骨髄に由来する間葉系幹細胞（MSC）はクロネチクス（Clonetics; Walkersville, MD）から購入した。ネズミ３T3-L1前脂肪細胞株（H. Green and M. Meuth, Cell 3:127-133(1974)）はＡＴＣＣ（Rockville, MD）から入手した。ヒト包皮線維芽細胞（HFF）はカスケードバイオロジクス（Cascade Biologics; Portland, OR）から得た。
【００６１】
幹細胞の単離および培養：
ヒトの脂肪組織は、患者同意プロトコル（HSPC #98-08 011-02; University of California Los Angeles）にしたがい局所麻酔下で随意脂肪吸引術により入手した。この方法では、中空の鈍端チップ付きカニューレを小切開（〜約１cm）から皮下間隙に導入した。前記カニューレを弱い吸引装置に連結し組織脂肪区画内を移動させ、機械的に脂肪組織を破壊した。食塩および血管収縮剤エピネフリンの溶液を前記脂肪区画内に注入し、血液の損失および末梢血液細胞による組織の夾雑を最小限にした。間質性血管分画（ＳＶＦ）を得るために、未処理脂肪吸引物（約300cc）を確立された方法で処理した（H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64:832-835(1987); A.J. Katz et al., Clin. Plast. Surg. 26:587-603, viii (1999)）。ＳＶＦを単離するために、脂肪吸引物を等容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、さらに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を0.075％のコラゲナーゼで37℃30分消化した。酵素活性をダルベッコーの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（10％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有）で中和し、1200ｇで10分遠心分離して高密度のＳＶＦペレットを得た。前記ペレットを160mLのＮＨ4Ｃｌに再懸濁し、室温で10分インキュベートして夾雑する赤血球を溶解させた。上記に記載したように前記ＳＶＦを遠心分離で採集し、100μｍのナイロンメッシュを通過させて細胞屑を除去し、コントロール培地（ＤＭＥＭ、10％ＦＢＳ、１％抗生物質／抗真菌剤溶液）中で37℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。インキュベーションの後で、前記プレートをＰＢＳで十分に洗浄して残留する非付着性赤血球を除去した。得られた細胞集団を組織脂肪由来幹細胞濃縮分画（ＡＤＳＣ濃縮分画）と称し、切り出した脂肪組織から得られたＳＶＦとは区別した。組織脂肪由来幹細胞は、非誘導性コントロール培地中で37℃／５％ＣＯ2で維持した。細胞は特別なＦＢＳ血清を増大および分化のために要求しなかった。免疫蛍光試験の場合、文献のプロトコル（D.J. Rickard et al., J. Bone Min. Res. 11:312-324(1996)）にしたがってＭＳＣ集団をヒト骨髄吸引物から得て、コントロール培地で維持した。偶発的な分化を防ぐために、細胞はサブコンフルエンスレベルで維持した。
【００６２】
幹細胞の間接免疫蛍光：
ヒト骨髄吸引物から得られた幹細胞およびＭＳＣをガラスチャンバースライドで培養し、100mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中の４％パラホルムアルデヒドで15分固定した。前記細胞をＰＢＳ中の100mMグリシン（ＰＢＳ／グリシン）で10分洗浄し、免疫蛍光ブロッキング緩衝液（IBB;５％ＢＳＡ、10％ＦＢＳ、1ｘＰＢＳ、0.1％トリトンX-100）で１時間封鎖した。続いて細胞を以下の細胞特異的モノクローナル抗体を含むＩＢＢで１時間インキュベートした：１）抗平滑筋アクチン（抗SMA；Cedarlane Inc, Hornby Ont）、平滑筋細胞および血管周囲細胞の特定用（O. Skalli et al., J. Cell Biol. 103:2787-2796(1986); W. Schurch et al., Am. J. Pathol. 128:91-103(1987); A. Nehls and D. Drenckhahn, J. Cell Biol. 113:147-154(1991); A. Barghorn et al., Pediatr. Pathol. Lab. Med. 18:5-22(1998)）；２）抗第VIII因子（抗ＦVIII; Calbiochem, San Diego, CA）、内皮細胞特定用（E.A. Jaffe et al., J. Clin. Envest. 52:2757-2764(1973); R.B. Nagle et al., Lymphology 20:20-24(1987)）；および３）ＡＳＯ２（dianova, Hamburg, Germany）、線維芽細胞および間葉起源の細胞の特定用（A. Saalbach et al., J. Invest. Dermatol. 106:1314-1319(1996); A. Saalbach et al., Cell and Tiss. Res. 290:595-599(1997)）。細胞をＰＢＳ／グリシンで十分に洗浄し、ＦＩＴＣ結合二次抗体を含むＩＢＢで１時間インキュベートした。前記細胞をＰＢＳ／グリシンで洗浄し、ＤＡＰＩ含有溶液でマウントして核を可視化した（VectaShield, Vector Labs, Burlingame, CA）。
【００６３】
フローサイトメトリー：
５人のドナーに由来する組織脂肪由来幹細胞サンプルを分析前にコントロール培地で72時間培養した。フローサイトメトリーはFACScanアルゴンレーザーサイトメーター（Becton Dickston, San Jose, CA）で実施した。細胞は0.25％トリプシン／ＥＤＴＡで採集し、氷冷した２％のホルムアルデヒドで30分固定した。固定後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液（FCB；1ｘＰＢＳ、２％ＦＢＳ、0.2％トウィーン20）で洗浄した。細胞の部分標本（1ｘ106細胞）を第VIII因子、平滑筋アクチンまたはASO2に対するモノクローナル抗体を含むＦＣＢでインキュベートした。さらにまた、細胞をヴィメンチンに対する抗体（抗VIM；Biogenesis, Brentwood, NH）を含むＦＣＢでインキュベートし、間葉細胞を特定した（E. Lazarides, Annu. Rev. Biochem. 51:219-250(1982); S. Suza et al., Eur. J. Cell Biol. 70:84-91(1996)）。生存度を調べるために、二連でサンプルを採集し、氷冷した１％パラホルムアルデヒドで30分固定し、0.05％のノニデット40で透過性にし、さらに25μg/mLの濃度のヨウ化プロピジウム（PI）でインキュベートした。ＰＩ陽性物を除外することによって残屑および死細胞を排除した。全てのこの後の組織脂肪由来幹細胞サンプルはこれにしたがって修正された。
【００６４】
累積集団ダブリング：
組織脂肪由来幹細胞を80％コンフルエンスまでコントロール培地で維持した。コンフルエンス細胞を採集し、式、logＮ1／logＮ2を用いて集団ダブリングを算出した（式中、Ｎ1は継代前のコンフルエンスの細胞数であり、Ｎ2は継代後に播種された細胞数である）。累積集団ダブリングは13代（約165日）まで維持された培養で決定された。３人のドナーから得た平均累積集団ダブリングは継代数の関数として表した。
細胞老化アッセイ：
老化はβ-gal染色アッセイを用いて調べた。前記アッセイでは、β−ガラクトシダーゼ活性は老化細胞ではpH6.0で検出されるが、増殖している細胞では存在しない（G.P. Dimri et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 92:9363-9367(1995)）。各継代培養（継代１回から継代15回）から得た細胞を２％ホルムアルデヒド／グルタルアルデヒド中で５分固定し、さらにβ-Gal反応緩衝液（１mg/mLのX-Gal、40mMクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）、それぞれ５mMのフェロシアン化カリウムおよびフェリシアン化カリウム、150ｍMのNaClおよび２mMのMgCl2）中でインキュベートした。老化細胞（青色）を光学顕微鏡で確認した。
【００６５】
組織脂肪由来幹細胞の多系列分化の確認：
脂肪生成、骨形成、軟骨形成および筋形成系列へ分化する組織脂肪由来幹細胞の能力について継代１回の前記幹細胞を分析した。分化を誘導するために、前記幹細胞を表１に示した特別の誘導培地で培養した。各培地は以前に記載されたもので、ＭＳＣの多系列分化を誘導することが示されている（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); A. Grigoradis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); S-L. Cheng et al., Endo. 134:277-286(1994); G. Loffler et al., Klin. Wochenschr. 65:812-817(1987); H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinl. Metabol. 64:832-835(1987)）。分化は、表２に概略した組織学的および免疫組織学的アッセイを用いて確認された。市販の骨髄由来ＭＳＣおよび系列特異的前記細胞を陽性コントロールとして調べた。組織脂肪由来幹細胞はコントロール培地で維持し、ＨＦＦを陰性コントロールとして分析した。
【００６６】
１．脂肪生成：脂肪生成分化は脂肪生成培地（AM）で２週間幹細胞を培養することによって誘導し、細胞内脂質蓄積のインジケーターとしてオイルレッドＯ染色を用いて調べた（A. Preece, 1972, A Manual for Histologic Technicians, Boston, MA: Little, Brown, and Co.）。染色の前に、細胞を４％ホルムアルデヒド／１％カルシウムで60分室温で固定し、70％エタノールで洗浄した。細胞を２％（w/v）オイルレッドＯ試薬で５分室温でインキュベートした。過剰染色液は70％エタノール、続いて数回蒸留水に変えて洗浄することによって除去した。細胞を２分間ヘマトキシリンで後染色した。
２．骨形成：骨形成分化は骨形成培地（OM）で最小限２週間幹細胞を培養することによって誘導し、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性およびフォンコッサ染色によるＥＣＭ石灰化について調べた。ＡＰ活性の検出のために細胞をＯＭ中で２週間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して１％のＡＰ溶液（１％ナフトールABSIホスフェート、１mg/mLファストレッドTR）で37℃30分染色した。フォンコッサ染色の場合、細胞をＯＭで４週間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで60分室温で固定した。細胞を蒸留水ですすぎ、続いて暗所で30分１％（w/v）硝酸銀を重層した。細胞を数回蒸留水で洗浄し、ＵＶ光の下で60分感光させた。最後に細胞をエタノール中の0.1％エオシンで後染色した。
【００６７】
３．軟骨形成：軟骨形成分化はミクロマス培養技術によって誘導した（P.B. Ahrens et al., Develop. Biol. 60:69-82(1977); A.H. Reddi, Prog. Clin. Biol. Res. 110(Part B):261-268(1982); A.E. Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995)）。簡単に記せば、10μLの濃縮組織脂肪由来幹細胞懸濁液（８ｘ106細胞／ｍL）を各ウェルの中心に播種し、37℃で２時間付着させた。細胞小塊が剥離しないように軟骨形成培地（CM）を穏やかに重層し、培養を分析まで２週間ＣＭ中で維持した。軟骨形成は酸性ｐＨでアルシアンブルーの組織学的染色を用いて確認した。幹細胞小塊を４％パラホルムアルデヒドで15分室温で固定し、ＰＢＳで数回洗浄した。検査によってｐＨレベル１以下で硫酸化プロテオグリカン（軟骨マトリックスに存在する）の固有の染色が示された（R. Lev and S. Spicer, J. Histochem. Cytochem. 12:309-312(1964)）。これを考慮して、0.1ＮのHCl（pH1.0）中の１％（w/v）アルシアンブルー（Sigma A-3157）と細胞を30分インキュベートし、さらに0.1NのHCｌで５分洗浄して過剰染色液を除去した。アルシアンブルー染色の他に、軟骨特異的II型アイソフォームの発現もまた調べた。幹細胞を４％パラホルムアルデヒドで15分室温で固定した。細胞を0.2Ｕ／mLのコンドロイチナーゼＡＢＣ中で40分37℃でインキュベートし、II型コラーゲンに抗体がアクセスし易くした。細胞をＰＢＳ中ですすぎ、さらにメタノール中の３％過酸化水素中で10分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。ＰＢＳで洗浄した後、非特異的部位はブロッキング緩衝液（10％ウマ血清含有ＰＢＳ）で１時間インキュベートすることによって封鎖した。続いてヒトII型コラーゲンに特異的なモノクローナル抗体（ICN Biomedical, Costa Mesa, CA）を含むブロッキング緩衝液で１時間細胞をインキュベートした。前記細胞をブロッキング緩衝液で十分に洗浄し、市販のモノクローナル抗体検出用キットを用い製造元（VectaStain ABC kit, Vector Labs Inc., Burlingame, CA）の指示にしたがってII型コラーゲンを可視化した。
【００６８】
４．筋形成：筋形成分化は筋形成培地（MM）で６週間組織脂肪由来幹細胞を培養することによって誘導し、筋特異的転写因子、MyoD1およびミオシン重鎖について免疫組織化学的染色によって確認した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで20分固定し、ＰＢＳで数回洗浄した。前記細胞をＰＢＳ中の３％過酸化水素と10分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ酵素活性を停止させ、非特異的部位をブロッキング緩衝液（10％ウマ血清および0.1％トリトンX-100含有ＰＢＳ）でさらに60分インキュベートすることによって封鎖した。細胞を各々５分間３回ブロッキング緩衝液で洗浄し、さらに骨格筋ミオシン重鎖（Biomeda, Foster City, CA）またはMyoD1（Dako Corp, Carpenteria, CA）に特異的なモノクローナル抗体のどちらかを含むブロッキング緩衝液で１時間細胞をインキュベートした。前記細胞をブロッキング緩衝液で十分に洗浄し、前記モノクローナル抗体を製造元の指示にしたがってVectaStain ABCキットを用いて可視化した。前記細胞を３分間ヘマトキシリンで後染色した。
【００６９】
結果：
ヒト脂肪組織を吸引補助脂肪除去（すなわち脂肪吸引）によって入手し、処理脂肪吸引物（Processed Lipoaspirate）またはＰＬＡ細胞（組織脂肪由来幹細胞）集団（仮説的幹細胞分画を含む）を得るため、適合させた方法（A.J. Katz et al.,1999, Clin. Plast. Surg.26:587-603, viii）により前記脂肪吸引物を処理した。脂肪吸引組織300ccの処理によって日常的に２−６ｘ108細胞の幹細胞サンプルが得られた。培養は10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭで維持した。ＦＢＳによる補充はヒトおよび動物のＭＳＣのin vitroでの付着および増殖に重要であることが示されている（S.E. Haynesworth et al., Bone 13:81-88(1992); D.P. Lennon et al., Exp. Cell Res. 219:211-222(1995); D.P. Lennon et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 32:602-611(1996)）。しかしながら、実験によってヒトのＭＳＣの増殖および分化はＦＢＳ供給源および質に左右されることが示唆され、血清のスクリーニングが極めて重要になった（D.P. Lennon et al., Exp. Cell Res. 219:211-222(1995); D.P. Lennon et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 32:602-611(1996)）。本発明の幹細胞はin vitroで容易に増大して線維芽細胞様形態を示し、骨髄および市販供給源から得られたＭＳＣの形態と一致した（図１Ａ）。本幹細胞は、増大および多系列分化のために特別な血清ロットを必要とするようには思われなかった。３製造業者の10のＦＢＳロットを調べたところ、前記幹細胞のin vitroでの形態、増殖速度またはそれらの分化能を変化させるようには思われなかった。
【００７０】
成長カイネティクスおよびＰＬＡの組成
20人のドナーから入手し、標準条件下（すなわち10％ＦＢＳ）で培養した組織脂肪由来幹細胞は、いくつかの血清供給源およびロットを使用して平均集団ダブリングタイムが60時間であることを示した。単離後、最初のラグタイムは５から７日であることが幹細胞培養で観察された。続いて細胞は増殖期に入り48時間でコンフルエンスに達した。幹細胞の長期成長カイネティクスを調べるために、多数のドナーで累積集団ダブリングを継代数に対応して測定した。最初の培養時に観察されたラグタイムと一致して、幹細胞は初回継代前には平均して３の集団ダブリングを示した（図１Ｂ）。その後の継代時には平均して1.5の集団ダブリングが観察された。累積集団ダブリングと継代数との間には直線的関係が観察され、調べた範囲にわたって比較的一定の集団ダブリング速度が示唆された。さらにまた、より後の継代（Ｐ13＝培養165日）で累積集団ダブリングに顕著な遅れは認められず、長期に及ぶ培養期間中、幹細胞培養はその増殖能を維持することを示唆した。
【００７１】
累積集団ダブリングの他に、我々はまた幹細胞長期培養における細胞老化をβ-gal染色プロトコルを用いて調べた。前記プロトコルでは、β−ガラクトシダーゼ発現は増殖している細胞では存在しないが、老化細胞ではpH6.0で検出される（G.P. Dimri et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 92:9363-9367(1995)）。このアッセイを用いて、幹細胞培養の老化を各継代について調べた。初回継代の幹細胞培養は評価可能なβ-gal染色を示さなかった（図１Ｃ、P1）。β-gal染色の増加はより後の継代で観察されたが、老化細胞のパーセンテージは10回継代まで５％より低く維持され、さらに15回継代で15％に増加した。総合すれば、前記データは、組織脂肪由来幹細胞サンプルは長期培養で比較的安定で、一定の集団ダブリング速度を維持し、低レベルの老化を示すことを示している。
【００７２】
切り出した脂肪組織から処理されたＳＶＦは不均質な集団で、マスト細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、線維芽細胞および系列拘束前駆細胞（lineage-committed progenitor cell）または前脂肪細胞を含む（P. Pettersson et al., Acta Med. Scand. 215:447-453(1984); H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64:832-835(1987)）。これらの成分はまた、脂肪吸引術による脂肪組織から得られる仮説的幹細胞分画にも一緒に存在するかもしれない。しかしながらこれに関する報告は公表されていない。幹細胞の表現型の特徴を調べるために、幾人かのドナーから得られたサンプルを確定された表面マーカーに特異的な抗体を用いて間接免疫蛍光によって調べた。ヒト骨髄吸引物から得られた骨髄間質分画もまたコントロールとして調べた。内皮細胞を特定するために、第VIII因子に対するモノクローナル抗体とともに幹細胞をインキュベートした（E.A. Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52:2757-2764(1973); R.B. Nagle et al., Lymphology 20:20-24(1987)）。平滑筋細胞は、平滑筋アクチンに対するモノクローナル抗体を用いて特定した（E. Lazarides, Annu. Rev. Biochem. 51:219-250; S. Suza et al., Eur. J. Cell Biol. 70:84-91(1996)）。この抗体はまた移行性血管周囲細胞（すなわち前および後毛細管の血管周囲細胞）および平滑筋系列に拘束された血管周囲細胞の収縮装置と反応することが示された（A. Nehls and D. Drenckhaln, J. Cell Biol. 113:147-154(1991); I.M. Herman and P.A. D'Amore, J. Cell Biol. 101:43-52(1985)）。低レベルの内皮細胞、平滑筋細胞および血管周囲細胞が幹細胞分画で観察された（図２）。対照的に、これらのマーカーに対する染色は処理された骨髄間質サンプルでは観察されなかった。第VIII因子および平滑筋アクチンの他に、線維芽細胞および間葉細胞に特異的なモノクローナル抗体（ASO2）とともにまた細胞をインキュベートした（A. Saalbach et al., Invest. Dermatol. 106:1314-1319(1996); A. Saalbach et. Al., Cell and Tiss. Res. 290:595-599(1997)）。幹細胞および骨髄間質細胞の大半がＡＳＯ２で陽性に染色され、間葉起源であることを示唆した（図２、ASO2パネル）。
【００７３】
幹細胞の組成を定量的に決定するために、上記に述べた細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーによりサンプルを分析した。サンプルを入手しコントロール培地で72時間培養した。細胞サイズおよび顆粒性をフォワードスキャターおよびサイドスキャター設定を用いて測定した（図３Ａ）。幹細胞サンプルの大半は小型で非顆粒性細胞で構成されていた。さらに前記幹細胞を第VIII因子、平滑筋アクチンおよびＡＳＯ２に対するモノクローナル抗体並びにヴィメンチン［主に間葉系起源の細胞で見出される中間体フィラメント（E. Lazarides, Annu. Rev. Biochem. 51:219-250(1982); S. Suza et al., Eur. J. Cell Biol. 70:84-91(1996)）］に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートした。生存度をヨウ化プロピジウムを用いて調べ、サンプルの生存度、非特異的蛍光および自家蛍光を修正した。代表的な患者から得られたデータが示されている（図３Ｂ）。サイトメトリーのデータは５人のドナーから収集し、各細胞特異的マーカーの陽性件数を全幹細胞数の百分率として表した。免疫蛍光データと一致して、幹細胞の一部分は、第VIII因子（FVIII陽性細胞＝全幹細胞数の24.9％±8.2）および平滑筋アクチン（SMA陽性細胞＝全PLA細胞数の29.2％±2.1）を発現し（図３C）、前記幹細胞分画は内皮細胞、平滑筋細胞、およびおそらく血管周囲細胞を含むことを示した。さらにまた、幹細胞の大半はＡＳＯ２（ASO2陽性細胞＝全PLA細胞数の85.0％±12.8）およびヴィメンチン（VIM陽性細胞＝全細胞数の63.2％±5.6）に対して陽性に染色され、間葉系起源の細胞であることを示唆した。総合すれば、これらの結果は、前記幹細胞分画は比較的均質な中胚葉または間葉系細胞集団であり内皮細胞、血管周囲細胞および平滑筋細胞が低度に夾雑していることを示唆している。
【００７４】
組織脂肪由来幹細胞は多系列潜在能を示す：
組織脂肪由来幹細胞の多系列能を調べるために、細胞系列特異的誘導因子（表１）を用いて細胞を脂肪生成、骨形成、軟骨形成および筋形成細胞系列に分化させた。ヒトおよび動物の骨髄由来ＭＳＣは、適切な培養補充物により脂肪生成、骨形成および軟骨形成系列に分化することが示されている（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); A. Grigoradis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); S-L. Cheng et al., Endo. 134:277-286(1994); G. Loffler et al.,  Klin. Wochenschr. 65:812-817(1987); H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64:832-835(1987)）。誘導の後で、組織学的および免疫組織化学的に分化を調べた（表２）。幹細胞はコントロール培地で維持しながら、市販のＭＳＣおよび系列拘束幹細胞を陽性コントロールとして用い、ＨＦＦ細胞は陰性コントロールとして調べた。
【００７５】
脂肪生成誘導培地（cAMP作動薬および誘導剤（例えばイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、インドメタシン、インスリンおよびデキサメタゾン）を含む）で処理された前脂肪細胞およびＭＳＣは、脂質染料オイルレッドＯを蓄積させる脂肪含有液滴を生じる（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); C.S. Rubin et al., J. Biol. Chem. 253:7570-7578(1978); S. Deslex et al., Int. J. Obesity 11:19-27(1987)）。ＰＬＡ細胞が脂肪生成に進むか否か決定するために、細胞をこれら薬剤を含む培地（脂肪生成培地、AM）で培養し、オイルレッドＯで染色した。ＡＭで培養された幹細胞は誘導後２週間で再現性をもって脂肪生成系列に誘導された（図４）。前記細胞の相当な分画が、オイルレッドＯを蓄積させる多数の細胞内の脂肪充満液滴を含んでいた。オイルレッドＯ含有幹細胞は、細胞内容積の大半（90−98％）が脂肪滴で占拠された膨張した形態を示し、成熟脂肪細胞の表現型と一致した。35歳以下の６人のドナーで測定した脂肪生成分化の平均レベルは、42.4％±10.6％（％オイルレッドＯ陽性細胞／全PLA細胞数）であった。培養時間の延長（すなわち４週間）によって、分化細胞は培養プレートから剥がれ表面に浮き上がった。分化した幹細胞の前記観察された形態および脂肪の蓄積は、骨髄由来ＭＳＣおよび前脂肪細胞株（3T3-L1）のＡＭ中の処理で観察されたものと類似していた。脂肪滴は、未分化幹細胞またはＨＦＦ陰性コントロールでは観察されなかった。ＭＳＣ（前記では脂肪生成分化は３回目の継代以降劇的に低下した（P.A. Conget and J.J. Minguell, J. Cell. Physiol. 181:67-73(1999)）と対照的に、幹細胞の脂肪生成の潜在能力は長期の培養にわたって維持された（すなわち15回継代＝175日培養）。総合すれば、前記結果は幹細胞が脂肪生成分化を経ることを示している。
【００７６】
骨幹細胞および骨髄由来ＭＳＣの骨芽細胞への分化は、低濃度のアスコルビン酸、β−グリセロホスフェートおよびデキサメタゾンで細胞を処理することによってin vitroで誘導される（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); S-L. Cheng et al., Endo. 134:277-286(1994); P.A. Conget and J.J. Minguell, J. Cell. Physiol. 181:67-73(1999)）。これら細胞の未熟な骨芽細胞への初期分化は、ヒトＭＳＣ発現アルカリホスファターゼ（ＡＰ）によるＡＰ酵素活性を特徴とし、前記は誘導後４日で発現し12日に最大レベルが観察される（N. Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997)）。前記細胞の骨形成能を確認するために、前記幹細胞を骨形成培地（ＯＭ）で14日間処理し、ＡＰの発現を調べた。ＯＭで培養した幹細胞は、ＡＰが陽性染色される密集した多層結節の広範囲のネットワークを形成した（図５）。６人のドナーで測定したＡＰ陽性染色細胞の平均数は全幹細胞数の50.2％±10.8％であった。ＡＰの発現はまたＯＭ中で維持したＭＳＣおよびNHOst陽性細胞の両細胞で観察された。対照的に、未分化幹細胞およびＨＦＦ陰性細胞コントロールはＡＰ発現の証拠を示さなかった。ＡＰ発現は骨形成組織で劇的にアップレギュレートされるが、その発現はいくつかの非骨形成細胞タイプおよび組織（例えば軟骨、肝および腎）で観察された（P.S. Henthorn et al., J. Biol. Chem., 263:12011(1988); M.J. Weiss et al., J. Biol. Chem. 263:12002(1988); P.S. Leboy et al., J. Biol. Chem. 264:17281(1989)）。したがって、ＡＰ発現は、骨形成指標としてしばしば他の骨形成特異的マーカーと組み合わせて用いられる。前記のような指標の１つは石灰化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成である。成熟骨芽細胞はＩ型コラーゲン富裕ＥＣＭを分泌し、前記は分化の後期に石灰化される（D.M. Scott, Arch. Biochem. Biophys. 201:384-391(1980)）。したがって、骨形成分化を確認するために、ＥＣＭマトリックスの石灰化をフォンコッサ染色を用いて前記幹細胞で調べた。石灰化は単層細胞内の黒色領域として出現する。骨形成と一致して、いくつかの黒色領域（石灰化ＥＣＭを示す）がＯＭで４週間処理した幹細胞で観察された。石灰化はまたＭＳＣおよびNHOst陽性コントロールで確認されたが、石灰化は未分化幹細胞またはＨＦＦ細胞では観察されなかった。前記幹細胞の骨形成能は長期にわたる培養で維持され、細胞は培養175日でもＡＰを発現した。総合すれば、組織脂肪由来幹細胞によるＡＰの発現および石灰化ＥＣＭの生成は、前記組織脂肪由来細胞が骨形成系列に誘導されることを強く主張している。
【００７７】
軟骨形成分化はミクロマス培養技術を用いてin vitroで誘導することができる。前記技術では、細胞凝縮（非常に重要な最初の軟骨形成事象）が再現される（P.B. Ahrens et al., Develop. Biol. 60:69-82(1977); A.H. Reddi, Prog. Clin. Biol. Res. 110 Pt B:261-268(1982); A.E. Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995); C. Tacchetti et al., Exp. Cell Res. 200:26-33(1992)）。分化の強化はデキサメタゾンおよびＴＧＦβ１で細胞を処理することによって達成できる（M. Iwasaki et al., Endocrinology 132:1603-1608(1993)）。骨髄由来ＭＳＣは前記薬剤とともにミクロマス条件下で培養したとき、II型コラーゲンおよび硫酸化プロテオグリカンに富む良好な統合を示すＥＣＭを伴なう細胞結節を形成する（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); A.M. Mackay et al., Tissue Eng. 4:415-428(1998)）。これらの硫酸化プロテオグリカンは酸性条件下でアルシアンブルー染色を用いて特異的に検出することができる（R. Lev. And S. Spicer, J. Histochem. Cytochem. 12:309-312(1964)）。前記幹細胞の軟骨形成能を調べるために、前記細胞をデキサメタゾンおよびＴＧＦβ１を含む軟骨形成培地（CM）でミクロマスにより培養した。前記幹細胞のミクロマス培養によって、軟骨形成分化と一致する密集した結節が形成された。前記幹細胞結節はアルシアンブルー陽性ＥＣＭを伴ない、マトリックス内に硫酸化プロテオグリカンが存在することを示した（図６）。軟骨性結節はまたＭＳＣコントロールのミクロマス培養でも観察された。軟骨性マトリックスのアルシアンブルーの特異性を確認するために、ヒトの軟骨および骨切片を酸性条件下でアルシアンブルーで染色した。予想したように、ヒト軟骨切片はアルシアンブルーで陽性に染色され、一方骨切片では染色は観察されなかった。ＥＣＭ内の硫酸化プロテオグリカンの存在の他に、幹細胞およびヒト軟骨切片は軟骨特異的II型コラーゲンを発現したが、一方、未分化幹細胞では染色は観察されなかった。脂肪生成および骨形成分化とも一貫して、前記幹細胞は長期の培養期間（すなわち175日まで）その軟骨形成潜在的分化能を保持した。上記の結果は、組織脂肪由来幹細胞は軟骨系列への分化能を有することを示唆している。
【００７８】
筋形成は、筋特異的タンパク質の発現に続き一定期間筋芽細胞が増殖および融合して多核筋管を形成することを特徴とする。初期筋形成分化は、いくつかの筋形成調節因子（筋形成決定因子（MyoD1: R.L. Davis et al., Cell 51:987-1000(1987); H. Weintraub et al., Science 251:761-763(1991); P. Dias et al., Semin. Diagn. Pathol. 11:3-14(1994)）を含む）の発現を特徴とする。最終的に分化した筋芽細胞は、ミオシンの発現および多核の存在を特徴とする（L. Silberstein et al., Cell 46:1075-1081(1986)）。筋肉前駆細胞および骨髄由来幹細胞の増殖および筋形成分化をデキサメタゾンによって誘導し、筋特異的タンパク質の発現をもたらすことができる（A. Grigoradis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); E.H. Ball and B.D. Samwal, Cell. Physiol. 102:27-36(1980); V. Guerriero and J.R. Florini, Endocrinology 106:1198-1202(1980)）。さらにまた、ヒドロコルチゾンの添加はヒトの筋芽細胞が分化した筋管に移行する前に前記筋芽細胞の増殖を刺激することが知られている（R.J. Zalin, Exp. Cell Res. 172:265-281(1987)）。前記幹細胞が筋形成を惹起するか否かを調べるために、前記細胞を６週間デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンの存在下で培養し、さらにMyoD1およびミオシン（重鎖）に特異的な抗体とインキュベートした。初期筋形成分化に一致して、幹細胞を１週間ＭＭで処理することによってMyoD1の発現が誘導された（図７）。より長期にわたって（６週間）処理された幹細胞はミオシン染色が陽性であった。ミオシン発現の他に、多数の核を有する大型で細長い細胞が別々につぎはぎとして存在しているのもまた観察され、幹細胞による筋芽細胞融合の進行が示唆された（PLAパネル挿込み図）。MyoD1およびミオシン重鎖の発現もまたヒト骨格筋陽性コントロール細胞で検出された。筋形成培地を用いたとき、ＭＳＣコントロールでは誘導６週間でも筋形成分化は観察されなかった。これらの細胞はヒドロコルチゾンによって逆の影響を受けたかもしれない。これらの細胞は分化の誘導にまた別の条件を要求するかもしれない。前記幹細胞の筋形成分化のレベルは平均して12％であった。多核化、ミオシン重鎖およびMyoD1発現は未分化幹細胞でもＨＦＦ陰性コントロールでも観察されなかった。多核細胞並びにMyoD1およびミオシン重鎖の両発現の存在は、組織脂肪由来幹細胞が筋形成分化に進む能力を有することを示唆している。
【００７９】
【表２】
2005502352.tif 000004
【００８０】
【表３】
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【００８１】
考察
概念的には２つの一般的な幹細胞タイプ、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および自家幹細胞（autologous stem cell）が存在する。その多能性のために理論的には好ましいが、細胞調節および倫理上の潜在的な問題のためにＥＳＣの実際的な使用には限界がある。対照的に、自家幹細胞はそれらの性質により免疫的に適合性があり、その使用に関して倫理上の問題が生じない。間葉由来組織の操作の場合、骨髄から得られる自家幹細胞は実験的には有望性が証明された。ヒト骨髄は胚の中胚葉に由来し、造血性幹細胞（Hematopoietic Stem Cell; ＨＳＣ）の集団で構成され、前記は間葉系間質によってサポートされる（A.J. Friedenstein et al., Transplantation 6:230-47(1968); A.J. Friedenstein et al., Transplantation 17:331-40(1974); E.D. Werts et al., Exp. Hematol. 8:423(1980); T.M. Dexter, J. Cell Physiol. 1:87-94(1982); S.R. Paul et al., Blood 77:1723-33(1991)）。ＨＳＣの増殖および分化が詳細に報告されている一方、間質成分についてはあまり知られていない。骨髄間質は（動物でもヒトでも）不均質な組成であり、間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell; MSC）またはＭＳＣと称される幹細胞集団を含むいくつかの細胞集団を含有する（A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991)）。ＭＳＣに関する研究によって、それらの脂肪細胞への分化（J.N. Beresford et al., J. Cell Sci. 102:341-351(1992); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）、軟骨細胞への分化（A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); L. Berry et al., J. Cell Sci. 101:333-342(1992); B. Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998); J.U. Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998)）筋芽細胞への分化（S. Wakitani et al., Muscle Nerve 18:1417-1426(1995); G. Ferrari et al., Science 279:1528-1530(1998)）および骨芽細胞への分化（A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); A. Grigoradis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); S-L. Cheng et al., Endo 134:277-286(1994); S.E. Haynesworth et al., Bone 13:81-8(1992); D.J. Rickard et al., J. Bone Min. Res. 11:312-324(1996); D.J. Prockop, Science 276:71-74(1997); J.E. Dennis et al., J. Bone Miner. Res. 14:700-709(1999)）が示された。これらの細胞は将来の生物組織工学的戦略のための有望な選択肢である。しかしながら、伝統的な骨髄調達方法は痛みを伴い、しばしば全身麻酔または脊椎麻酔を必要とし、処理に際して少数のＭＳＣしか得ることができないであろう（約１個のＭＳＣに対し105個の付着性間質細胞（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); D.J. Rickard et al., J. Bone Min. Res. 11:312-324(1996); S.P. Bruder et al., J. Cell. Biochem. 64:278-294(1997)）。実際的な観点から、幹細胞数の希少さは、臨床的に意義のある細胞数を得るためにex vivoでの増大工程を必要とする。そのような工程は時間を要し高価でもあり、さらに細胞の汚染および損失をもたらすおそれがある。理想的な供給源である自家幹細胞は、したがって入手が容易で患者の苦痛が最小限あり、しかも高度な培養増大を避けるために実質的に十分な細胞数を入手できるものであろう。
【００８２】
我々は、多くの中胚葉系列能をもつ細胞分画をヒトの脂肪吸引物から処理することができることを報告した。この細胞分画は組織脂肪由来幹細胞であり、処理脂肪吸引物（Processed Lipoaspirate; PLA）と称され、特別な血清ロットまたは培地補充物を要求することなくin vitroで容易に増大させることができる線維芽様細胞を含む。前記幹細胞サンプルは、長期にわたる培養期間中に容易に認識される老化を示さずに直線的成長速度を維持した。前記幹細胞集団は性質として不均質であり、細胞の大半は間葉系起源である。しかしながら、夾雑する内皮細胞、平滑筋細胞および血管周囲細胞集団が確認された。前記幹細胞はまた、in vitroで多系列潜在能を示し、すでに確立されている系列特異的分化因子の存在下で培養したとき脂肪生成、骨形成、軟骨形成および筋形成系列に分化した。前記分化の結果は、骨髄由来ＭＳＣおよび系列拘束前駆細胞の系列特異的分化に際して観察される結果と一致した。
前記幹細胞の明瞭なマルチ分化能はヒトの脂肪吸引による脂肪組織内に幹細胞集団が存在することを示唆しているが決定的ではない。多系列分化はまた以下が存在するためであるかもしれない：（１）多系列拘束前駆細胞；（２）他の供給源（例えば血管周囲細胞、末梢血管に由来する骨髄由来ＭＳＣからの多分化能を有する細胞（multi-potent cells）；または（３）上記の組合せ。
【００８３】
前記の観察された分化は、幹細胞内の系列拘束前駆細胞（例えば前骨芽細胞、前筋芽細胞または前脂肪細胞）の存在によるかもしれない。切り出した脂肪組織から得た細胞分画は、成熟脂肪細胞に分化する前脂肪細胞を含むことが判明している（P. Pettersson et al., Acta Med. Scand. 215:447-453(1984); P. Pettersson et al., Metabolism 34:808-812(1985)）。前記幹細胞による観察された脂肪生成分化は単に現存する前脂肪細胞の拘束（commitment）の結果であり、多分化能を有する細胞の分化ではない可能性がある。しかしながら、前記はこの場合に当てはまらないと我々は考える。切り出した脂肪組織から得られたＳＶＦのわずか0.02％が脂肪生成分化が可能な前脂肪細胞であることが確認されている（P. Pettersson et al., Acta Med. Scand. 215:447-453(1984)）。前記幹細胞分画内の前脂肪細胞の数が切り出した組織に由来するＳＶＦで測定された数のレベルに匹敵するものであるならば、脂肪形成レベルは比較的低いと予想されるであろう。しかしながら、前記幹細胞で観察された脂肪生成の程度は顕著なものであり（全ＰＬＡ細胞数の約40％）、また別の細胞タイプの分化の結果であるかもしれない。
【００８４】
脂肪吸引時の基底筋に対する損傷が筋形成前駆細胞または衛星細胞を前記幹細胞分画に誘導し、これらの細胞によって観察された筋形成分化が生じたのかもしれない。筋細胞膜と筋繊維の外板との間に位置し、未分化状態の筋形成前駆細胞は休止状態であり、識別できる特徴を示さず、それら細胞の特定を困難にしている。いくつかのグループがこれら前駆細胞のための固有のマーカーの特定を試みたがほとんど成功していない。現在のところ、筋形成調節因子、MyoD1およびミオゲニンの発現が胚形成時およびげっ歯類の成獣の筋肉再生時の衛星細胞の特定に用いられた（M.C. Cusella-DeAngelis et al., Cell Biol. 116:1243-1255(1992); M.D. Grounds et al., Cell Tiss. Res. 267:99-104(1992); D.A. Sassoon, Develop. Biol. 156:11(1993); M.A.L. Maley et al., Exp. Cell Res. 211:99-107(1994); M.J. Lawson-Smith and J.K. McGeachie, J. Anat. 192:161-171(1998)）。さらに、MyoD1発現は、分化開始前の増殖している筋芽細胞で確認された（H. Weintraub et al., Science 251:761-763）。これらのマーカーはヒトで筋形成前駆細胞の特定に用いられなかったが、一方、MyoD1は正常な骨格筋の初期筋形成分化中に発現され、ヒトの横紋筋肉腫77-79の骨格筋起源の確認に用いられた（P. Dias et al., Am. J. Pathol. 137:1283-1291(1990); J. Rosai et al., Am. J. Surg. Pathol. 15:974(1991); H. Nakano et al., Oncology 58:319-323(2000)）。非誘導性コントロール培地で維持された幹細胞ではMyoD1が発現されないということは（図28参照）、我々が観察した分化は幹細胞分画内に存在する筋形成前駆細胞または筋芽細胞の増殖のためではないことを提唱している。前記と一致して、脂肪吸引カニューレの鈍端では筋肉を取り巻く線維性筋膜腔を突き抜けこれら前駆細胞を脂肪区画内に誘導することは極めて難しいであろう。
【００８５】
ヒトの脂肪組織には血管が形成されてあり、したがって、多分化能を有する細胞（例えば血管周囲細胞および骨髄由来MSC）による夾雑をもたらす潜在的な体系的血管としての“導管”を含んでいる。脂肪吸引時に血液供給を破壊することによって、in vivoおよびin vitroの両方で多系列潜在能を示す血管周囲細胞の遊離をもたらすかもしれない（A.M. Schor et al., J. Cell Sci. 97:449-461(1990); M.J. Doherty, J. Bone Miner. Res. 13:828-838(1998); D.L. Diefenderfer and C.T. Brighton, Biochem. Biophys. Res. Commun. 269:172-178(2000)）。前記に一致して、我々の免疫蛍光データおよびフローサイトメトリーデータは幹細胞のわずかが平滑筋アクチンを発現する細胞を含むことを示した（前記アクチンは移行時の血管周囲細胞および平滑筋系列に拘束された血管周囲細胞の成分である（A. Nehls and D. Drenckhahn, J. Cell Biol. 113:147-154(1991)）。前記幹細胞で観察された多系列分化は、部分的には血管周囲細胞の存在によるものかもしれない。血液供給の破壊もまたＭＳＣを前記幹細胞分画に導入するかもしれない。しかしながら、前記の文献は末梢血中にこれら幹細胞が存在することについて矛盾する（R. Huss, Stem Cells 18:1-9(2000); H.M. Lazaras et al., J. Hematother. 6:447-455(1997)）。もしも末梢血がＭＳＣの供給源であるならば、我々が観察した多系列分化はこれら幹細胞（MSC）による脂肪組織への夾雑によるものであろう。しかしながら、ＭＳＣはヒトでは骨髄間質のわずかな構成成分である（105個の付着性間質細胞に対して約１個のMSC（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); D.J. Rickard, Bone Min. Res. 11:312-324(1996); S.P. Bruder et al., J. Cell. Biochem. 64:278-294(1997)）。これらの細胞が実際に末梢血に存在するとしても、それらは骨髄よりもはるかに少ない量で存在し、これらの細胞による組織脂肪由来幹細胞分画への夾雑レベルは無視できるであろう。
【００８６】
上記の考察は多分化能を有する幹細胞集団が脂肪吸引による脂肪組織中に存在することを支持するであろうが、最終的な確認のためには単一細胞に由来する多数のクローンの単離および性状決定が必要である。予備実験データによって、クローン由来の幹細胞集団は多系列潜在能を有し、脂肪生成、骨形成、および軟骨形成分化の能力をもつことが確認された。
これまでの研究は骨髄由来ＭＳＣを用いてポジティブな結果を示した。ＭＳＣは骨形成および軟骨形成組織にin vivoで分化することができ（D. Benayahu et al., J. Cell Physiol. 140:1-7(1989); H.M. Ohgushi, Acta Orthop. Scand. 61:431-434(1990); P.H. Krebsbach et al., Transplantation 63:1059-1069(1997); S.P. Bruder et al., J. Orthop. Res. 16:155-162(1998)）、予備実験データはこれらの細胞を用いて骨および軟骨欠損を修復できることを示唆した（S. Wakitani et al., Muscle Nerve 18:1417-1426(1995); P.H. Krebsbach et al., Transplantation 63:1059-1069(1997); S.P. Bruder et al., J. Orthop. Res. 16:155-162(1998); Bruder et al., Clin. Orthop. S247-56(1998); P.H. Krebsbach, Transplantation 66:1272-1278(1998); Johnstone and Yoo, Clin. Orthop. S156-162(1999)）。脂肪吸引による脂肪組織から得た幹細胞はまた別の多系列中胚葉細胞の供給源であるかもしれない。骨髄間質のように、上記のデータは脂肪組織は多系列能をもつ相当な割合の細胞を含む可能性を示唆している。これら組織脂肪由来幹細胞は、それらを採集するときに罹患率および苦痛が最も少なく、大量に容易に入手することができるであろう。
【００８７】
実施例８
以下の記述は、骨形成組織に分化する組織脂肪由来幹細胞および前記幹細胞を単離する方法を提供する。前記幹細胞の骨形成潜在能力はドナーの年齢により低下する。しかしながら脂肪生成はドナーの年齢によって影響を受けない。
材料と方法
脂肪吸引物の採集と処理：
患者同意プロトコルHSPC#98-08 011-02（University of California Los Angeles）にしたがって、ヒト脂肪組織を随意脂肪吸引方法により局所麻酔下で入手した。未処理脂肪吸引物を処理して組織脂肪由来幹細胞集団を得た（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）。簡単に記せば、未処理脂肪吸引物を等容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を0.075％のコラゲナーゼで37℃30分消化した。10％ウシ胎児血清（ＦＢＳ; HyClone）を含むダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ; Life Technologies）で酵素活性を中和し、1200ｇで10分遠心した。幹細胞ペレットをＤＭＥＭ／10%ＦＢＳに再懸濁し、細胞ろ過装置に通して一切の残存する組織を除去した。細胞を37℃／５％ＣＯ2で非誘導コントロール培地（ＤＭＥＭ、10％ＦＢＳ、１％抗生物質／抗真菌溶液）で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、前記プレートをＰＢＳで十分に洗浄して残留する非付着性赤血球を除去した。前記幹細胞を37℃／５％ＣＯ2でコントロール培地で維持した（表３）。偶発的分化を防止するために、培養をサブコンフルエントレベルで維持した。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
誘導および分化の分析：
１．脂肪生成分化：ＰＬＡ細胞（１回継代）を６ウェルのプレート（Costar, Cambridge, MA）に４ｘ104細胞／ウェルの密度で播種し、72時間コントロール培地で培養した。脂肪生成分化を誘導するために、ＰＬＡ細胞を脂肪生成培地（表３）で２週間培養した。陰性コントロールとして同じ密度のＰＬＡ細胞をコントロール培地で維持した。
オイルレッドＯ染色：脂肪生成は誘導後2週間で、細胞内脂質小胞を特定するためのオイルレッドＯ染色により確認された。された。細胞を４％ホルムアルデヒド／１％カルシウムで室温で60分固定し、70％エタノールで洗浄した。細胞を２％（w/v）オイルレッドＯ試薬（Sigma, St Louis, MO）中で５分室温でインキュベートした。過剰染色は70％のエタノールで洗浄し、続いて蒸留水を数回交換して除去した。細胞をヘマトキシリンで１分後染色した。
【００９０】
２．骨形成分化：ＰＬＡ細胞（１回継代）を６ウェルのプレートに１ｘ104細胞／ウェルの密度で播種し、72時間コントロール培地で培養した。骨髄由来間葉系幹細胞に関する以前の実験（M.F. Pittenger, Science 284:143-147(1999)）に基づき、骨形成を誘導するため、ＰＬＡ細胞を骨形成培地（表３）中で最低限２週間維持した。陰性コントロールとしてＰＬＡ細胞をコントロール培地で維持した。
アルカリ性ホスファターゼ染色：アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性は誘導後14日で調べた。ＰＬＡ細胞をＰＢＳですすぎ、以下を含む0.05Ｍトリス−塩酸（pH９）中で37℃30分インキュベートした：ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解したナフトールＡＳ−ビホスフェート（Sigma）の50mg/mLの溶液を１％（v/v）および１mg/mLのファストレッドＴＲ塩（sigma）。インキュベーションの後、細胞を等容積の８％パラホルムアルデヒドで10分固定し、続いて蒸留水ですすいだ。
フォンコッサ染色：細胞外マトリックスの石灰化は誘導後４週間でフォンコッサ染色によって検出した。ＰＬＡ細胞を４％パラホルムアルデヒドで１時間室温で固定し、続いて５％（w/v）の硝酸銀溶液（Sigma）とともに光の非存在下でインキュベートした。細胞を数回蒸留水で洗浄し、ＵＶ光下で60分感光させ、さらにエタノール中の0.1％エオシンで後染色した。マトリックスの石灰化は黒色の細胞外沈着物の存在によって確認された。
【００９１】
分化の定量：
各ドナーにおける脂肪生成分化および骨形成分化レベルは、スポット２デジタルカメラおよび20倍の対物レンズを取り付けたツァイスアキシオスコープ２顕微鏡（倍率200Ｘ）を用いて定量した。各ドナーに由来する２対のサンプルにおけるオイルレッドＯ陽性およびＡＰ陽性細胞の総数（それぞれ脂肪生成および骨形成）を、各ウェルの３つの一定の領域（例えば３、６および９時の位置で）内で数えた。陽性染色細胞の総数を各領域内の全ＰＬＡ細胞数のパーセンテージとして表した。３つの領域から得た数値を平均して各ドナーについての平均分化レベルを得た。平均分化レベルは患者の年齢に対して表した。フォンコッサ染色では個々の分化細胞ではなくマトリックスの産生領域が特定される。したがってこの染色方法を用いて骨形成分化を確認した。
ＰＬＡサンプル内の骨形成前駆細胞の定量：
ＰＬＡ集団内の骨形成前駆細胞の数を概算するために、骨形成活性を有する細胞を数え患者の年齢との関係を調べた。特に以下の２つの年齢群を調べた：Ａ群＝20から39歳およびＢ群＝40から60歳。1回継代ＰＬＡ細胞（P1）を100mmの培養皿に播種し、上記に記載したように骨形成系列へ誘導し、ＡＰ活性について染色し分化を確認した。各ＰＬＡサンプル内の前駆細胞数はＡＰ陽性コロニー形成単位（CFU/AP+）の数を数えることによって決定した。以前の実験から、最低で10個のＡＰ陽性細胞をＣＦＵ／ＡＰ+の確定に用いた（M. Long et al., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Soc. 54:B54-62(1999)）。ＣＦＵ／ＡＰ+の平均数を決定し年齢群に対して表した。骨形成分化に要求されるＰＬＡ細胞の最適数は経験的に決定した（培養皿当たり１ｘ104、５ｘ104、１ｘ105および５ｘ105細胞を播種した）。骨形成分化レベルは培養皿当たり５ｘ105細胞で最大であったが、コンフルエンシーレベルでは正確なコロニーの計測が妨げられた。したがってデータは１ｘ105細胞／培養皿の密度を用いて得た。
【００９２】
成長カイネティクス：
ドナーの年齢との関係でＰＬＡ細胞の成長カイネティクス（集団ダブリング）を測定するために、各ドナーから得たＰＬＡ細胞（P１）を多数の培養皿に１ｘ104細胞の密度で播種した。細胞数は播種後24時間から11日目まで48時間毎に３つのサンプルから決定した。成長曲線（培養時間に対する細胞数）を作製し集団ダブリングをログ期から計算した。
統計的分析：
ドナーの年齢に対するＰＬＡ細胞の骨形成および脂肪生成における有意差を直線回帰分析（ｒ値）によって決定した。さらにまた、ドナーの全年齢に対する分化の平均レベルを不対合（unpaired）スチューデントｔ検定（不均等分散（unequal variance）と仮定）および一方向分散分析（one way analysis of variance; ANOVA）を用いて比較した。
【００９３】
結果
ＰＬＡ細胞成長カイネティクスはドナーの年齢に対応して変動する
最初のＰＬＡ培養は外観が比較的均質であり、細胞の大半（85から90％）は線維芽細胞様の形態を示した。わずかの割合の内皮細胞、マクロファージおよび前脂肪細胞が確認された（全集団の10％未満）。ＰＬＡ細胞はコントロール培地中で14日以内に80から90％コンフルエントに達した。１回継代ＰＬＡ細胞（P1）から得られた成長曲線は、各ドナーについて最初のラグ期（典型的には48時間）、続いてログ期（平均＝７日）およびプラトー期で特徴を示した。代表的な成長カイネティクス曲線は図８Ａに示されている。ラグ期およびログ期の長さについて有意差はいずれのドナーにおいても認められなかった。同様に若い患者（20歳対39歳）ではＰＬＡ成長カイネティクスで有意差は観察されなかった。しかしながら、ＰＬＡ細胞のログ期での減少が高齢患者で観察された（例えば13日目では58歳で12.6ｘ104細胞、20歳で26.9ｘ104細胞）。成長カイネティクスのデータから、15人のドナーから算出した平均ＰＬＡ細胞集団ダブリングタイムは52.67±8.67時間であった。ＰＬＡ細胞集団ダブリングタイムは38時間から77時間の範囲であった（図８Ｂ；20歳対53歳）。集団ダブリングとドナーの年齢との回帰分析によってｒ＝0.62の正の相関性（ｎ＝15）が得られ、年齢とともに集団ダブリングが増加する傾向（すなわち（増殖能の低下）を示した。しかしながら、10年づつでまとめたドナーの統計分析（すなわち20から30歳、30から40歳、40から50歳、50から60歳）は、不対合ｔ検定を用いたとき集団ダブリングで有意差を示さず（ｐ＞0.05）、ＰＬＡの増殖はドナーの年齢の増加とともに有意に低下することはないことを示唆した。
【００９４】
脂肪生成分化能はＰＬＡの年齢で変化しない
ＰＬＡ細胞における脂肪生成および脂質小胞形成は、細胞を脂質染料オイルレッドＯによって染色して確認された。全てのドナーで、ＰＬＡ細胞の低レベルの脂肪生成分化が脂肪生成培地での誘導で早くも５日で明瞭であった。分化細胞は、脂肪細胞と一致する拡張した形態を帯び、オイルレッドＯで染色される脂質に富む細胞内小胞を蓄積した（図９Ａ、パネル１および２）。誘導後14日までに、分化細胞は大きなオイルレッドＯ陽性脂質滴を細胞質内に含んでいた。分化レベルはドナーによって変動し、幾人かのドナーは低レベルの脂肪生成を示した。そのような場合は、中等度の量の染色を含む個々のオイルレッドＯ陽性細胞が容易に特定された（図９Ａ、パネル１）。さらに、幾人かのドナーは脂肪生成レベルの増強を示し、そのような場合はオイルレッドＯ陽性細胞の数および染色の蓄積の両方が劇的に増加した（図９Ａ、パネル２）。非誘導コントロール培地で培養された細胞は形態学的に変化を示さずオイルレッドＯも蓄積せず、誘導培地の特異性が確認された（図９Ａ、パネル３）。ドナーの年齢に対する脂肪生成分化の潜在能力における変化を測定するために、オイルレッドＯ陽性細胞の数を限定領域内で直接数え、計測した全ＰＬＡ細胞数のパーセンテージとして表した。各領域から得た数値を平均して脂肪生成分化の平均レベルを算出し、ドナーの年齢に対して表した（図９Ｂ）。脂肪生成分化レベルは、全ＰＬＡ細胞の4.51％から57.78％の範囲であった（ｎ＝20）。26.55％±18.14％の平均分化潜在能力が算出された。しかしながら、無視できる回帰値が解析で得られ（ｒ＝0.016）、脂肪生成分化ではドナーの年齢の増加により有意な変化は生じないことが示唆された。
【００９５】
骨形成分化はドナーの年齢とともに低下する
骨形成を確認するために、細胞をアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）活性について染色し、細胞外マトリックスの石灰化は硝酸銀／フォンコッサ染色を用いて染色した。骨形成培地で培養したＰＬＡ細胞は誘導後早くも４日で細胞形態に劇的な変化を受け、紡錘形から立方形（骨芽細胞の特徴）に変化した。幾人かのドナーでは低レベルの骨形成は単層のＡＰ陽性細胞の形成を特徴とした（図10Ａ、パネル１）。幾人かの患者では、高レベルの骨形成は多層のＡＰ陽性結節構造物の存在を特徴とし、前記構造物は明瞭に限局された細胞を含まない結節間領域を有していた（図10Ａ、パネル２）。ＡＰ活性の他に、フォンコッサ染色によって検出される石化領域が培養３週間後で明白であり、骨形成分化をさらに立証した（図10Ａ、パネル４および５）。コントロールＰＬＡはＡＰ活性もマトリックスの石化も示さなかった（図10Ａ、パネル３および６）。ドナーの年齢による骨分化における潜在的変化を測定するために、骨形成（すなわちＡＰ陽性細胞）の平均レベルを脂肪生成レベルの計算と同じ方法を用いて決定した。脂肪生成とは対照的に、高齢のドナーでは骨形成の顕著な低下が観察された。骨形成分化は全ＰＬＡ細胞の11.64％から64.69％の範囲であった（図１0Ｂ）。ドナーの年齢と骨形成の回帰分析によって顕著な負の相関性（ｒ＝−0.70、ｎ＝19）が得られ、骨形成分化は年齢に対応して低下することを示唆した。同様な傾向がフォンコッサ染色を用いて観察された。興味深いことには、骨形成分化における異常な低下は36歳以上のドナーで観察された（図１0Ｂ、点線）。これと一致して、骨形成の有意差（ｐ＜0.001）が、対象者を２つの年齢群に分けたときに観察された。若年群（20から36歳；ｎ＝７）のドナーは平均骨形成潜在能50.7±10％（全PLA細胞に対して）を示し、一方、高齢群（37から58歳；ｎ＝11）では顕著に低レベルの骨形成が測定された（全PLA細胞の20.7±7.9％）（図10C）。このデータにより、若年群の細胞は骨形成潜在能で2.4倍の増加を示し、59％多いＡＰ陽性細胞を形成した。
【００９６】
ＰＬＡ内の骨形成前駆細胞の相対的割合：
ＰＬＡの骨形成の低下が骨形成潜在能をもつＰＬＡ細胞数の低下のためであるか否かを決定するために、ＰＬＡ内の骨形成前駆細胞の相対的割合をドナーの年齢に対して計算した。ＰＬＡ細胞を２週間骨形成培地で誘導し、ＰＬＡ内の前駆細胞数をＡＰ陽性コロニー形成単位（CFU/AP+）の数を計算することによって決定した（A. Grigoradis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); N. Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997)）。前駆細胞の数は２つの年齢群で計算した（Ａ群＝20から39歳、ｎ＝５；Ｂ群＝40から58歳、ｎ＝６）。高齢者のＰＬＡサンプルで観察された骨形成潜在能の低下と一致して、ＣＦＵ／ＡＰ+数のわずかな低下が年齢の増加で観察された。Ａ群のＣＦＵ／ＡＰ+の平均数は105のＰＬＡ細胞当たり194±61であったが、Ｂ群のＣＦＵ／ＡＰ+の数は105のＰＬＡ細胞当たり136±32に低下した（図11）。骨幹細胞の減少傾向が観察されたが、この減少は統計的には有意ではなく（ｐ＝0.11）、ＰＬＡ細胞による骨形成潜在能の低下は直接的には骨形成前駆細胞数の低下によるものではないであろうと示唆された。
【００９７】
考察
間葉系幹細胞は骨髄から単離することができる。間葉系幹細胞は骨髄間質の成分であり、種々の中胚葉組織（脂肪、骨および軟骨を含む）に分化する能力を有する（A. Grigordis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1988); A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991); J.N. Beresford et al., J. Cell Sci. 102:341-351(1992); L. Berry et al., J. Cell Sci. 101:333-342(1992); G. Ferrari et al., Science 279:1528-1530(1998); B. Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。この多系列潜在能は、複雑な外傷後欠損および先天的欠損の修復に臨床的に有用であろう。実際、いくつかのin vitroおよびin vivo実験によってこれら幹細胞の臨床的潜在能力が提唱された（D. Benayahu et al., J. Cell Physiol. 140:1-7(1989); S. Wakitani et al., Muscle Nerve 18:1417-1426(1995); P.H. Krebsbach et al., Transplantion 63:1059-1069(1997); S.P. Bruder et al., Clin. Orthop. (355 Suppl):S247-56(1998); B. Johnstone and J.U. Yoo, Clin. Orthop. (367 Suppl):S156-62(1999)。しかしながら、骨髄の調達は痛みを伴い、全身麻酔を必要とし、さらに処理に際して少数の間葉系幹細胞しか得ることができず（M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); D.J. Rickard et al., J. Bone Miner. Res. 11:312-324(1996); S.P. Bruder et al., J. Cell. Biochem. 64:278-294(1997)）、したがって臨床で使用する前にex vivoでの増大工程を必要とする。これらの要件を考慮すると、さらに別の多系列幹細胞供給源が所望されるであろう。我々は脂肪吸引によるヒトの脂肪組織の間質性−血管性分画で幹細胞集団を特定した（実施例７、上記）。この細胞集団は処理脂質吸引物（Processed Lipoaspirate（PLA））と称され、骨髄由来間葉系幹細胞と多くの点で類似しているように思われる。間葉系幹細胞のように、ＰＬＡ細胞は長期の培養で安定であり、容易にin vitroで増大し、多系列潜在能を有し、脂肪生成、骨形成、筋形成および軟骨形成細胞に分化する。
【００９８】
ＰＬＡは線維芽細胞様形態を有しin vitroで安定的に増大し、53時間の平均集団ダブリングタイムで増殖する。以前の実験では脂肪組織内の脂肪細胞のサイズおよび数は年齢とともに増加することが示され（H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64:832-835(1987)）、年齢の進行とともに脂肪貯蔵器官で脂肪生成が全体的に増加することが示唆された。これらの研究と対照的に、ＰＬＡ細胞による脂肪生成における顕著な年齢相関変化は観察されず、高齢者のＰＬＡ細胞の脂肪生成の潜在能力は加齢によって影響されないことが示唆された。脂肪組織の発達にはいくつかの成長因子およびステロイドホルモンの活性が要求される（H. Hauner et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 64:832-835(1987)）。したがって、ＰＬＡ細胞の脂肪生成潜在能力は、各ドナーの遺伝的背景および／またはホルモンレベルによって影響を受けるであろう。Proenzaらは、脂肪生成はいくつかの遺伝子（脂質タンパク質リパーゼ、アドレノレセプターおよび非共役タンパク質を含む）の発現の変化によって影響されることを報告した（D.J. Rickard et al., J. Bone Miner. Res. 11:312-324(1996); J. Glowacki, Calcif. Tiss. Int. 56(Suppl 1):S50-51(1995)）。さらにまたChenらは、前脂肪細胞における特定の肥満関連遺伝子の発現はこれら細胞の成熟脂肪細胞への分化に関係があることを示した（X. Chen et al., Biochem. Biophys. 1359:136-142(1997)）。したがってホルモン活性とともに遺伝子発現レベルはドナー間で相違し、ＰＬＡ細胞の脂肪生成潜在能力に影響を及ぼし、ドナーの年齢とは無関係に脂肪生成レベルの変動をもたらしたのかもしれない。
【００９９】
脂肪生成とは対照的に、ＰＬＡの骨形成潜在能力の低下（ＡＰ活性によって測定したとき）がドナーの年齢が増加するにしたがい観察された。骨形成とドナーの年齢との間に顕著な負の相関性が回帰分析で見出された（ｒ＝−0.70）。さらにまた、ドナーを２つの年齢群（20から36歳および37から58歳）に分けたとき骨形成における有意差が観察され、若年群の細胞は２倍を超える骨形成潜在能力を有する。
骨形成は３期に分けられる：骨形成前駆細胞の増殖期、これら前駆細胞の骨芽細胞への成熟期（マトリックス沈積を伴う）および石化期。各期は必須であり、成熟した骨の生育に劇的な影響を与える。高齢のドナーで観察される骨形成の低下は３つの可能性によるものであろう：１）ＰＬＡ細胞の増殖の低下、２）ＰＬＡ由来骨形成前駆細胞そのものの数の減少、または３）骨形成分化能の低下。図８に示すように、集団ダブリングタイムは高齢ドナーでわずかに増加し、高齢者のＰＬＡ細胞の増殖能は年齢とともに低下することを示唆している。しかしながら、集団ダブリングタイムにおけるこの増加は統計的に有意ではなく、骨形成潜在能力の年齢依存低下の一因とは考えにくい。
【０１００】
ＰＬＡ内の骨形成前駆細胞数の減少が我々の結果の一因となったのか否かを決定するために、ＣＦＵ／ＡＰ+コロニーの平均数を求めた。ＡＰ活性を有するコロニーは骨幹細胞であると考えられ、以前には骨髄中の骨前駆細胞および／または幹細胞の数を求めるために用いられた（T.A. Owen et al., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990)）。動物実験で骨髄中の骨幹細胞数は加齢とともに減少することが示されたが（R.J. Bergman et al., J. Bone Miner. Res. 11:568-577(1996); B.A. Huibregtse et al., J. Orthop. Res. 18:18-24(2000)）、矛盾する結果がヒトのサンプルについて報告された。Glowacki and Rickardらの研究は骨髄の骨幹細胞には年齢と相関する変化がないことを示した（D.J. Rickard et al., J. Bone Miner. Res. 11:312-324(1996); J. Glowacki, Calcif. Tiss. Int. 56(Suppl 1):S50-51(1995)）。これらの研究と一致して、我々は、小さな変化ではあるが統計的に有意な、年齢に相関するＣＦＵ／ＡＰ+コロニー数における変化を見出した。このことは、観察された骨形成潜在能力における年齢依存低下はＰＬＡ内の骨形成前駆細胞および／または幹細胞の数の低下によるものではないであろうということを示唆している。
【０１０１】
ＰＬＡの骨形成の低下は骨形成能力の消失によるものであろう。１）細胞対細胞および細胞対マトリックス相互作用および２）成長因子およびホルモン、を含むいくつかの因子が幹細胞の骨形成能に影響を与えるであろう。Becerraらによる最近の研究によって、高齢ラットの間葉系幹細胞における脱石灰化骨マトリックスに対する骨形成反応の顕著な低下が示され（J. Becerra et al., J. Bone Miner. Res. 11:1703-1714(1996)）、ＭＳＣ−マトリックス相互作用における年齢関連変化が示唆された。同様に、高齢ドナーの骨形成潜在能力の低下は細胞外マトリックスの分解と相関性を示した（A.J. Bailey et al., Calcif. Tiss. Int. 65:203-210(1999)）。ＰＬＡを取り巻くミクロの環境は加齢とともに変化し、ＰＬＡの骨形成分化を阻害したりまたは別の系列（例えば脂肪生成系列）への分化を促進したりする細胞対細胞および細胞対細胞外マトリックス相互作用を変化させる可能性がある。さらにまた、ＰＬＡ細胞の骨形成潜在能力の低下は性別のためであるかもしれない。この実験のドナーは全て女性である。女性の加齢はエストロゲンの低下を伴い骨質量の減少と一体であることはよく説明されている（A.M. Parfitt (1990), "Bone", ed B.K. Hall, Vol. 1, 351-431, New Jersey: Caldwell; T.J. Hahn (1993), "Textbook of Rheumatology", ed W.N. Kelly, 1593-1627, New York: Saunders）。骨細胞は複製されないので、骨の再形成および修復は持続的な骨芽細胞の供給を必要とし、その主要な供給源は骨髄間質である。エストロゲンは骨髄由来幹細胞の分化を調節することが判明しており、循環エストロゲンの減少は幹細胞の骨形成潜在能力の低下と連結している（J.A. Robinson et al., Endocrinology 138:2919-2927(1997); M.A. Ankrom et al., Biochem. J. 333:787-794(1998)）。骨髄幹細胞のように、高齢女性ドナーのＰＬＡ細胞の骨形成能の低下は、単にエストロゲン低下に附随する変化を反映しているのかもしれない。ＰＬＡ骨形成潜在能の低下は上記で考察した３つの全ての因子における比較的小さな変化によるものであり、加齢女性で観察される一般的な現象を反映しているのかもしれない。
【０１０２】
髄腔の脂肪生成の増加と一体化した骨芽細胞数および骨形成活性の低下は、II型または年齢関連骨粗しょう症の一因である（A.M. Parfitt (1990), "Bone", ed B.K. Hall, Vol. 1, 351-431, New Jersey: Caldwell; T.J. Hahn (1993), "Textbook of Rheumatology", ed W.N. Kelly, 1593-1627, New York: Saunders）。従来の研究は骨髄由来間葉系幹細胞の骨粗しょう症における役割に集中しているが、組織脂肪由来ＰＬＡ細胞による骨形成能の年齢関連低下は、研究者らにこの疾患の研究のためのまた別のモデル系を提供するであろう。さらにまた、ＰＬＡ細胞は、骨粗しょう症および他の代謝性骨疾患の治療を目的とするまた別の生細胞による治療例となるかもしれない。
生物組織工学的用途での幹細胞の使用は、幹細胞の数、成長カイネティクスおよび分化潜在能力によって劇的な影響を受けるであろう。前記の因子の各々は順次ドナーの年齢によって影響されるであろう。骨髄由来間葉系幹細胞に関するいくつかの研究によって、動物およびヒトモデルの両方でドナーの年齢に対応するＭＳＣ数、集団ダブリングおよび分化潜在能力における変化が報告された（P.M. Lansdorp et al., Blood Cells 20:376-380(1994); J. Becerra et al., J. Bone Miner. Res. 11:1703-1714(1996); R.J. Bergmann et al., J. Bone Miner. Res. 11:568-77(1996); D. Gazit et al., J. Cell Biochem. 70:478-88(1998); R.O. Oreffo et al., Clin. Sci. (Colch.) 94:549-555(1998); G. D-Ippoliot et al., J. Bone Miner. Res. 14:1115-1122(1999); M.W. Long et al., J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Soc. 54:B54-62; B.A. Huibregtse et al., J. Orthop. Res. 18:18-24(2000)）。我々は、ドナーの年齢に関連して集団ダブリング、分化潜在能力および平均コロニー形成単位数を調べることによって、いくつかのＰＬＡ集団の特徴を調べた。
【０１０３】
実施例９
以下の記述は、軟骨組織に分化する組織脂肪由来幹細胞および前記幹細胞の単離方法を提供する。
材料と方法
試薬および抗体：
酢酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｎ‐エチルマレイミド（NEM）、６‐アミノカプロン酸、フッ化フェニルメチル−スルホニル（PMSF）およびベンズアミジン塩酸塩は全てシグマ（Sigma; St. Louis, MO）から購入した。II型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（クローンII-4C11）、コンドロイチン‐4‐硫酸に対するモノクローナル抗体およびケラタン硫酸に対するモノクローナル抗体（クローン5-D-4）はＩＣＮバイオメディカル（ICN Biomedical; Aurora, Ohio）から購入した。
脂肪吸引方法：
ヒト脂肪吸引物は、20から55歳の10人の健常な随意美容外科患者から入手し、処理脂肪吸引物（processed lipoaspirate, PLA）細胞集団を得るために処理した。全ての手順は、プロトコル番号HSPC＃98-08-011-02により被験者保護委員会（Human Subject Protection Committee (HSPC)）の承認を受けた。未処理脂肪吸引物を実施例７（上記）に記載した方法にしたがって処理した。簡単に記せば、脂肪吸引物をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、続いて穏やかに攪拌しながら0.075％のコラゲナーゼ（Sigma, St. Louis, MO）とともに37℃で30分インキュベートした。前記コラゲナーゼを等容積のダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ, Cellgro, Herndon, VA）およびＦＢＳを添加して中和し、細胞懸濁液を260ｇで５分遠心分離した。得られた細胞ペレットを１％の赤血球溶解緩衝液（0.16ＭのNH4Cl）に再懸濁して夾雑赤血球を溶解した。細胞懸濁液を260ｇで５分遠心分離し、ＰＬＡ分画を単離した。ＰＬＡペレットをコントロール培地（ＤＭＥＭ、10%ＦＢＳ、および1%抗生物質／抗真菌剤）に再懸濁し、サブコンフルエントの密度で37℃／５％ＣＯ2で維持した。ヒト包皮線維芽細胞（HFF）をコラゲナーゼによる酵素消化によって同様に採集し、サブコンフルエントレベルでコントロール培地で維持した。
【０１０４】
軟骨形成分化：
３継代（P3）まで培養を拡張した後、前記ＰＬＡ細胞をトリプシン消化し、107細胞／mLの濃度でコントロール培地に再懸濁した。軟骨形成分化は、いくつかの改変を加えながら以前に記載（P.B. Ahrens et al., Dev. Biol. 60:69-82(1977); A.E. Denker Differentiation 59:25-34(1995)）されたようにミクロマス培養プロトコルを用いて誘導した。10μLのＰＬＡ細胞懸濁液を24ウェルの組織培養プレートおよびチャンバースライドの各ウェルの中心に静置した。前記細胞を37℃／５％ＣＯ2のインキュベーターに２時間静置して細胞を付着させた。前記細胞沈積物にコントロール培地を静かに重層し一晩インキュベートした。培地を軟骨形成培地［10ng/mLのTGF-β1（R&D Systems, Minneapolis, MN）、6.25μg/mLのインスリン（Sigma）および6.25μg/mLのトランスフェリン（Sigma）を補充した1%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ］と交換した。前記細胞沈積物を軟骨形成培地で６日間誘導した。６日目およびそれ以降、50μg/mLのアスコルビン酸-2-フォスフェートを軟骨形成培地混合物に添加した。ＰＬＡ沈積物を最初の誘導から２日目、７日目および14日目に分析のために採集した。軟骨形成分化の誘導に最適な培養条件を特定するために、ＰＬＡ細胞をまた0.1μMの濃度でデキサメタゾン単独およびＴＧＦ-β１と一緒に誘導した。陰性コントロールとして、ＨＦＦ細胞をミクロマスおよび単層培養条件下で上記のように培養した。単層培養としてインキュベートしたＰＬＡ細胞は三次元結節を形成せず、パラフィン包埋並びに組織学的および免疫組織学的分析には用いることができなかった。
【０１０５】
弁別的細胞密度播種：
ＰＬＡ細胞と軟骨形成誘導の関係を調べるために、１ｘ105、１ｘ106、2.5ｘ106、５ｘ106、１ｘ107、２ｘ107および５ｘ107細胞／mLの細胞濃度でミクロマス培養を軟骨形成培地に静置した。続いて前記ミクロマス培養を軟骨形成培養条件に付し結節形成の開始を観察した。
アルシアンブルー染色：
軟骨性マトリックスの特徴である高度硫酸化プロテオグリカンの存在を検出するために、誘導処理を施したＰＬＡペレットを酸性pHでアルシアンブルーを用いて染色した（R. Lev and S. Spicer, J. Histochem. Cytochem. 12:309(1964)）。ミクロマス培養をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、続いて0.1ＮのHClで５分間インキュベートしてpHを１に低下させた。前記培養を0.1ＮのHCl（pH１）中の１％のアルシアンブルー８GX（Sigma）で一晩染色した。前記細胞を２回0.1ＮのHClで洗浄して非特異的染色を除去し、その後風乾した。パラフィン切片の場合、細胞結節を採集し、ＰＢＳで２回洗浄して４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した。結節をパラフィンに包埋して５μｍの切片に切り出した。結節の三次元構造内の硫酸化プロテオグリカンの空間的分布を求めるため、ＰＬＡ結節のパラフィン切片を記載のように調製し標準的なアルシアンブルー染色によりpH１で染色した。デジタル画像をツァイスアキシオスコープ（Zeiss Axioscope）II顕微鏡（Carl Zeiss, Munich, Germany）およびスポットソフト（Spot software）を用いて入手した。
【０１０６】
組織学および免疫組織化学：
細胞形態の決定のために標準的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）を用い、さらに細胞外マトリックス中のコラーゲンの存在を検出するためにゴルドナーの三色染色を用いてＰＬＡパラフィン切片の組織学的検査を実施した。免疫組織化学的分析のためには、先ずパラフィン切片をキシレン中でパラフィン除去を実施し、続いて下降エタノール溶液（100％から70％）で水和させた。抗体のエピトープへのアクセスを促進するために、切片を0.5mLのコンドロイチナーゼABC（Sigma）［50ｍMトリス（Gibco BRL）（pH8.0）、30ｍM酢酸ナトリウム（0.5mg/mLのＢＳＡを含む）］で１時間37℃で前消化した。切片を３％のＨ2Ｏ2中で15分インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させ、続いて10％のウマ血清中でインキュベートして非特異的結合を阻止した。続いて前記切片を以下（ヒトII型コラーゲン、コンドロイチン‐４‐硫酸およびケラタン硫酸）に対する一次抗体（それぞれ1:10、1:50および1:250の希釈）で1時間37℃でインキュベートした。モノクローナル抗体の代わりに正常なウマ血清中でのインキュベーションを実施して陰性コントロールとして用いた。反応性はヴェクタステイン（Vectastain）ABCキット（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用い製造元の指示にしたがって検出した。
【０１０７】
ｃＤＮＡ合成およびＲＴ−ＰＣＲ：
未処理ＰＬＡ細胞、ＰＬＡ結節およびＨＦＦから全ＲＮＡを単離した。簡単に記せば、以下の方法（RNA-Easy, Qiagen）を用いてＲＮＡを単離した。前記ＲＮＡをMMLV-RT酵素（Promega）を用いるオリゴｄＴプライミングｃＤＮＡ合成に用いた。等量のｃＤＮＡを以下のためにデザインしたプライマー対を用いてＰＣＲ増幅に付した：ヒトＩ型コラーゲンα１鎖（CNI）、ヒトII型コラーゲンα１鎖（CNII）、ヒトＸ型コラーゲンα１鎖（CNX）、ヒト大凝集プロテオグリカンまたはアグリカン（AG）およびヒトオステオカルシン（OC）。使用したプライマー対は公開されたジーンバンク（GeneBank）配列から入手し以下のとおりであった（表４）。
【０１０８】
【表５】
2005502352.tif 000007
【０１０９】
II型コラーゲン、X型コラーゲンおよびアグレカンのためのプライマー対は関節軟骨サンプルに対して陽性であることが確認された。各プライマー対について計算による最適アニーリング温度（OLIGOプライマー分析ソフト、National Biosciences Inc., Plymouth, MN）を用いた。鋳型を35サイクル増幅し、ＰＣＲ生成物は通常のアガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０１１０】
ＰＬＡ細胞の軟骨形成潜在能力に対する継代の影響：
ヒトＰＬＡ細胞の軟骨形成潜在能力に対する細胞継代数の影響を調べるために、15回単層培養を継代し、１回目、３回目および15回目で細胞分画を採集した。前記細胞分画をミクロマス培養下で軟骨形成培地で成長させ、軟骨形成分化をアルシアンブルー染色で調べた。
ＰＬＡクローンの単離：
新たに単離したＰＬＡ細胞を100mm2の組織培養皿につき100細胞の密度で播種し、単一細胞由来のコロニーの形成を促進させた。明瞭なコロニーが出現するまでコントロール培地で培養を増大させた。単一のＰＬＡ細胞に由来するコロニーを滅菌クローニングリングにより単離し、続いて0.25％のトリプシンで消化して採集した。分離させた細胞を24ウェルプレートに播種し増大させた。上記に記載したようにＰＬＡクローンを軟骨系列に誘導し、軟骨分化はアルシアンブルー染色およびII型コラーゲンの免疫組織化学的分析によって確認した。
【０１１１】
結果
ヒト脂肪吸引物を処理してＰＬＡ細胞集団を得た。ＰＬＡを高密度のミクロマス培養に付し、ＴＧＦ-β１、インスリン、トランスフェリンおよびアスコルビン酸を補充して軟骨形成分化を誘導した。軟骨形成は、標準的な組織学アッセイを用いて２日、７日および14日で組織学的に判定した。さらにまた、II型コラーゲン、コンドロイチン-４-硫酸およびケラタン硫酸に対する抗体を用いて免疫組織化学的アッセイを実施した。最後にRT-PCR分析を実施し、軟骨特異的プロテオグリカンおよびアグリカンとともに、I型、II型およびＸ型コラーゲンの発現を確認した。
全てのＴＧＦ-β1処理ミクロマス培養は三次元球状物を誘導後48時間以内に形成した。前記球状物はアルシアンブルーで陽性に染色され、軟骨性結節の形成が示唆された。細胞外マトリックス全体にII型コラーゲン、コンドロイチン-４-硫酸およびケラタン硫酸が存在することが免疫組織化学的に確認された。最後に、RT-PCR分析によって、軟骨特異的II型コラーゲン、アグリカンおよび軟骨特異的プロテオグリカンの発現が確認された。
【０１１２】
ＰＬＡ細胞は軟骨形成結節を形成する：
前軟骨間葉系細胞および多系列幹細胞を高密度ミクロマス培養技術を用い、続いて前軟骨形成因子を誘導することによって軟骨形成系列に誘導することができる（P.B. Ahrens et al., Dev. Biol. 60:69-82(1977); A.E. Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995); B. Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998)）。これらの実験と一致して、ヒト処理脂肪吸引物（PLA）細胞を高密度ミクロマス条件下で培養し、トランスフォーミング成長因子β１（TGF-β1）、インスリンおよびトランスフェリンを含む軟骨形成培地で誘導したとき、凝縮して誘導後24時間で三次元の球状体を形成した。この時点でＰＬＡ結節は肉眼で直径が約１−２mmの白色球形構造物として識別できた。結節は500個の処理ミクロマス培養で100％の割合で形成された。未処理のミクロマス培養では小さな球状体が時おり（10％）形成され、培養条件自体の影響かもしれない。ＰＬＡ結節はＴＧＦ-β1処理または未処理の単層培養では観察されなかった。ＰＬＡ結節のサイズは培養時間とともに大きくなり、隣接する小結節は培養７日後に顕微鏡下で見ることができた。いくつかの事例では、培養時間の増加とともに隣接するＰＬＡ結節が合体してより大きな細胞凝集物を形成し、軟骨形成で必須である細胞相互作用および細胞補充について提唱されたことと一致する（P.B. Ahrens et al., Dev. Biol. 60:69-82(1977)）。
ＰＬＡ結節形成に対する細胞数の影響を調べるために弁別的播種実験を実施した。５ｘ106細胞／mL未満の密度で播種した培養では球状体形成の証拠は観察されなかった。高い密度（すなわち１ｘ107細胞／mL以上）で播種したＰＬＡ細胞はより迅速に結節を形成し、いくつかの事例ではＴＧＦ-β1の非存在下で球状体を形成した。ＴＧＦ-β1を含む軟骨形成培地へのデキサメタゾンの添加はより大きな軟骨性凝集物の形成をもたらした（B. Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998)）。前記報告と一致して、デキサメタゾンの添加は、ＴＧＦ-β１刺激による結節形成と比較したときより大きな球状体を生じた。デキサメタゾン単独で処理した培養は結節を形成せず、ＴＧＦ-β１がＰＬＡ細胞による結節形成に必須であることを示唆した。軟骨形成培地で処理したＨＦＦのミクロマス培養および単層培養では結節形成の証拠は認められず、我々の軟骨形成条件の特異性が確認された。
【０１１３】
ＰＬＡ結節は硫酸化プロテオグリカンに富む細胞外マトリックスを含む：
軟骨性マトリックスは非常に大量の多価陰イオン性硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）、例えばコンドロイチン4-および6-硫酸を含み、低pHでアルシアンブルーにより陽性に染色されることを特徴とする（R. Lev. And S. Spicer, J. Histochem. Cytochem. 12:309-312(1964)）。ＰＬＡ結節の軟骨としての性質を確認するために、組織学的分析をチャンバースライドに静置した完全なＰＬＡ結節の封入物およびパラフィン切片で実施した。軟骨形成培地によるＰＬＡ培養の最初の処理で24時間以内に細胞凝縮物が得られた（図12、パネルＡ）。凝縮ＰＬＡ細胞は低レベルのアルシアンブルー染色を示し、硫酸化細胞外マトリックスの初期形成を示唆した。ＰＬＡ凝縮に続いて稜線が形成され、アルシアンブルーによる染色が増強され、マトリックス分泌の増加が示された（パネルＢ）。強いアルシアンブルー染色および球状態の形成が誘導後48時間で観察された（パネルＣ）。対照的に、未処理ＰＬＡのミクロマス培養ではアルシアンブルー陽性染色領域は全く示されなかった（パネルＤ）。
完全ＰＬＡ封入サンプルの他に、結節の三次元構造を調べるためにＰＬＡ結節のパラフィン切片を調製した。パラフィン包埋切片の形態は、ヘマトキシリン−エオシン染色で調べたとき、誘導後２日で丸型細胞の内部コアを取り囲む軟骨膜細胞に類似する線維芽細胞様細胞の扁平な辺縁層を示した（図13、パネルＡ）。14日間の処理の後、結節は細胞が減少しコアへの細胞外マトリックスの沈積が増加した（パネルＢ）。ゴルドナーの三色染色（コラーゲン性マトリックス（緑色）の存在を示す）によってＨ＆Ｅパターンが確認された（パネルＣおよびＤ）。誘導後14日で結節コアで観察された高レベルのコラーゲン（パネルＤ）と比較したとき、わずかなバックグラウンドレベルのコラーゲン性マトリックスが２日で結節切片で観察された（パネルＣ）。パラフィン切片のアルシアンブルー染色は完全封入調製物と同様であり、誘導後２日で硫酸化プロテオグリカンに富む軟骨性マトリックスが形成されることが確認された（パネルＥ）。中心コア領域の染色濃度の増加が誘導後14日で観察され（パネルＦ）、細胞が軟骨細胞経路を通って成熟していくにしたがい、硫酸化プロテオグリカンの分泌が増加することを示唆している。要約すれば、我々の組織学的染色の結果によって、コラーゲンおよび硫酸化プロテオグリカンに富む細胞外マトリックスを伴う軟骨様ＰＬＡ結節の形成が確認された。
【０１１４】
ＰＬＡ結節は軟骨特異的タンパク質を発現する：
免疫組織化学分析を用いて、II型コラーゲン（軟骨組織に高度に特異的な細胞外マトリックス成分）並びにコンドロイチン-4-硫酸およびケラタン硫酸（２つは軟骨プロテオグリカンの主要なモノマー成分）を検出した。誘導後２日で、コンドロイチン-4-硫酸およびケラタン硫酸に対する強い免疫反応性領域が球状態の外側周辺およびコア全体に観察され、我々のアルシアンブルー染色の結果と一致した（図14、パネルＡおよびＣ）。コンドロイチン-4-硫酸およびケラタン硫酸発現の顕著な増加が、結節コア内に２週間の期間にわたって観察された（パネルＢおよびＤ）。対照的に、II型コラーゲンの陽性免疫反応は２日目ではＰＬＡ結節で明瞭ではなかった（パネルＥ）。II型コラーゲンの発現はむしろ誘導後７日目で出現し、強い発現は14日目で出現した（パネルＦ）。ＴＧＦ-β１処理ＰＬＡミクロマス培養の完全封入培養でも強いII型コラーゲンの反応性が示されたが、未処理のミクロマスＰＬＡ培養では染色は認められなかった。さらにまた、一次モノクローナル抗体の代わりに正常ウマ血清中でインキュベートしたパラフィン切片では染色は観察されず、II型コラーゲン、コンドロイチン-4-硫酸およびケラタン硫酸抗体の特異性が確認された。総合すれば、前記の免疫組織化学的な結果は前記組織学的染色のデータを支持し、軟骨性マトリックスがＰＬＡ結節内に存在することを示唆している。
【０１１５】
単一細胞由来クローン集団の軟骨形成分化：
ＰＬＡ細胞による外見的軟骨形成分化は、多分化能を有する細胞の存在によるものではなく脂肪吸引物の前軟骨形成細胞の夾雑に起因するかもしれない。したがって、我々の結果が多分化能を有するＰＬＡ細胞の分化によるものであるか否かを決定するために、我々は単一細胞由来ＰＬＡクローンを単離し、その多系列潜在能力を確認した。ＰＬＡのクローン性集団（すなわち組織脂肪由来中胚葉性幹細胞またはＡＤＳＣ）は、骨形成分化および脂肪生成分化の他に軟骨形成分化に進む能力を示した。骨形成および脂肪生成系列に誘導したＰＬＡクローン性集団は古典的な系列特異的組織学的マーカー（骨形成：アルカリ性ホスファターゼ活性、脂肪生成：オイルレッドＯ蓄積）を提示した（未発表データ）。不均質なＰＬＡ培養と同様に、ＰＬＡクローン性集団はまた軟骨形成培地での誘導後48時間以内に球状体形成を示した。さらにまた、前記ＰＬＡ結節はII型コラーゲンおよび高度に硫酸化されたプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスを分泌した。
ＰＬＡ細胞は長期培養後軟骨形成潜在能力を保持する：
培養時間および継代数は多くの細胞タイプの分化能力に影響を与えることができる。ＰＬＡ細胞の軟骨形成潜在能力に対する継代の影響を調べるために、ＰＬＡ細胞を15回（175日）単層培養として継代し、さらに高密度条件下で培養して軟骨形成を誘導した。ＰＬＡ細胞は、軟骨形成培地による誘導後三次元球状体を形成するその能力によって証明されたように、この長期培養期間を通してその軟骨形成分化能を維持した。最後に初期継代および後期継代ＰＬＡ結節はともに、アルシアンブルーによる陽性染色で立証されたように、高度に硫酸化されたプロテオグリカンに富む細胞外マトリックスを分泌した（図22）。全ての培養継代（すなわちP1からP15）から得られた細胞結節が非常に類似した外観を有していた。すなわち、丸型細胞の内部コアを取り囲む軟骨膜細胞に類似する線維芽細胞様細胞の扁平な辺縁層である。
【０１１６】
RT-PCR分析によって軟骨特異的コラーゲンの発現が確認される：
ヒトI型コラーゲン、II型コラーゲンおよびＸ型コラーゲン並びにアグリカンおよびオステオカルシンに対する遺伝子に特異的なプライマーを用いて、ＰＬＡ結節のRT-PCR分析を実施した。ミクロマス条件下で培養した未処理ＨＦＦおよびヒトＰＬＡ細胞を陰性コントロールとして分析した。ＰＬＡ結節のRT-PCR分析によって、II型コラーゲンα１（CNII）の発現が７日目および14日目のみ確認された（図15）。さらにまた、CNII発現の低下が７日から14日誘導の間で観察された。CNIIのスプライス変種（IIAおよびIIB、IIB型変種が示されている）が両時点で観察された。
７日目と14日目の結節とは対照的に、CNIIの発現は２日目の結節では観察されず、我々の免疫組織化学的データが確認された。予想されたように、CNIIはHFFミクロマス培養では観察されなかった。しかしながら、少量のCNIIのｍＲＮＡが未処理のＰＬＡ細胞に存在していた。軟骨形成分化はさらに、大凝集プロテオグリカン（またはアグレカン）の発現について結節を調べることによって確認された。アグレカンは軟骨に特異的であることが示され、開始から軟骨形成中に蓄積される（R.A. Kosher er al., J. Cell Biol. 102:1151-1156(1986)）。アグレカンの発現は２日および７日の誘導で観察され、14日目のＰＬＡ結節では存在しなかった。アグレカン発現は処理ＰＬＡ結節に特異的であり、コントロールのＰＬＡ細胞またはＨＦＦ培養では観察されなかった。
【０１１７】
Ｉ型およびＸ型コラーゲンのα１鎖の発現を調べることによってさらにＰＬＡ結節の性状を決定した。Ｉ型コラーゲンの発現は骨性組織でアップレギュレートされ、軟骨形成分化時にはダウンレギュレートされることが判明している（R.A. Kosher er al., J. Cell Biol. 102:1151-1156(1986); C. Shukunami et al., Exp. Cell Res. 241:1-11(1998)）。前記文献と一致して、ＣＮＩ発現が２日処理ＰＬＡ結節でのみ観察された。CNIIと同様に、低レベルのＣＮＩが未処理のＰＬＡ細胞で観察され、未分化ＰＬＡ細胞には、分化が進行するときに劇的に改造されるコラーゲン性マトリックスが附随していることを示唆した。ＣＮＸの発現は誘導後２日および７日ではＰＬＡ結節で観察されなかったが、14日の時点で出現した。ＣＮＸは未処理のＰＬＡ細胞またはＨＦＦコントロールでは観察されなかった。Ｘ型コラーゲンは肥厚性軟骨細胞に特異的で、軟骨内骨化および骨形成進行のシグナルであるかもしれない（T.F. Linsenmayer et al., Pathol. Immunopathol. Res. 7:14(1988)）。
ＰＬＡ結節内で骨化および骨形成が存在しないことを確認するために、オステオカルシン［骨特異的遺伝子（P.A. Price, Connect. Tissue Res. 21:51-57(1989)）］に対するプライマーを用いてRT-PCR分析を実施した。予想したように、オステオカルシン発現は全ての処理および未処理ＰＬＡサンプルで存在しなかった。総合すれば、軟骨特異的アグレカン（II型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンの両者）の発現は、Ｉ型コラーゲンの発現低下とともにＰＬＡ細胞による軟骨形成分化を支持する。
【０１１８】
考察
軟骨欠損の修復は重要な臨床課題である。損傷した関節軟骨は修復能力に限界があり、大きな欠損は偶発的には治癒しない。損傷が軟骨下の骨に及ぶとき、修復プロセスは散発的で、本来の関節軟骨は線維性軟骨および瘢痕組織に置き換えられ、これらは構造的に正常な関節軟骨の硝子質構造より劣っている。軟骨欠損に対する通常の治療様式には髄質刺激技術（marrow stimulation technique）（例えば軟骨下ドリリング）および関節形成術（joint arthroplasty）が含まれる（I.H. Beiser and O.I. Knat, J. Foot Surg. 29:595-601(1990); J.E. Gilbert, Am. J. Knee Surg. 11:42-46(1998); T. Minas and S. Nehrer Orthopedics 20:525-538(1997); S.W. O'Driscoll, J. Bone Joint Surg. Am. 80:1795-1812(1998)）。さらに最近では、新規な治療法、例えば骨軟骨、軟骨膜および骨膜の同種異系移植が開発された（S.J. Bouwmeester et al., Int. Orthop. 21:313-317(1997); A. Carranza-Bencano et al., Calcif. Tissue Int. 65:402-407(1999); M.T. Ghazavi et al., J. Bone Joint Surg. Br. 79:1008-1013(1997); G.N. Homminga et al., J. Bone Joint Surg. Br. 72:1003-1007(1990)）。残念ながら、上記の選択肢は本来の硝子質構造の完全な再生には至らない。さらに重要なことには、前記の関節は正常な重量を支える能力をもたず長期にわたる物理的活動に耐えることができない。
細胞を使用する組織工学による治療は通常の技術に対する有望な選択肢を提供する。第一世代の組織工学治療は自家軟骨細胞移植を用いて従来臨床的に利用されている（M. Brittberg et al., New Engl. J. Med. 331:889-95(1994); F.S. Chen et al., Am. J. Orthop. 26:396-406(1997); J.E. Gilbert, Am. J. Knee Surg. 11:42-46(1998); J.B. Richardson et al., J. Bone Joint Surg. Br. 81:1064-1068(1999)）。しかしながら、軟骨細胞採集についてドナー側の入手可能性の限界、in vitro培養による非常に長期間の増大が要求されること、およびドナー側の罹患率がこの技術の実際的応用性を制限している。軟骨前駆細胞の他の供給源を特定することが重要である。
【０１１９】
いくつかの細胞タイプがin vitroおよびin vivo軟骨形成を経ることが示された。前記細胞タイプには、ラットの頭蓋冠クローン細胞株および初代培養細胞、ネズミの胚性C3H10T1/2細胞、並びにいくつかの動物の（ウサギ、ラット、ウマおよびヤギを含む）骨膜由来および骨髄由来前駆細胞が含まれる（A.E. Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995); L.A. Fortier et al., Am. J. Vet. Res. 59:1182-1187(1998); Grigoriadis et al., Differentiation 60:299-307(1996); Grigoriadis et al., J. Cell. Biol. 106:2139-2151(1988); Iwasaki et al., J. Bone Joint Surg. Am. 77:543-554(1995); Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998); Nakahara et al., Bone 11:181-188(1990); Shukunami et al., J, Cell. Biol. 133:457-468(1996)）。しかしながら、これから調査されねばならない他の組織に由来する骨軟骨形成前駆細胞の潜在的な巨大貯蔵庫がまだ残されている。種々の中胚葉系細胞タイプの相互変換能力が多くの研究で報告されている。特に、成熟ヒト脂肪細胞および骨髄から単離された脂肪細胞はともに骨に分化する潜在能力を示す（J.H. Bennett et al., J. Cell Sci. 99(Pt1):131-139(1991); Park et al., Bone 24:549-554(1999)）。さらにまた、骨芽細胞は軟骨細胞に分化転換し、さらに筋細胞を軟骨系列に拘束することができる（Manduca et al., Eur. J. Cell Biol. 57:193-201(1992); M.A. Nathanson, Clin. Orthop. 200:142-158(1985); Sampath et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 81:3419-3423(1984)）。
【０１２０】
骨軟骨形成分化能を有する間葉系幹細胞がヒトの骨髄に存在することが多数報告されている（Mackay et al., Tissue Eng. 4:414-428(1998); Pittinger et al., Science 284:143-147(1999); Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998)）。間葉系幹細胞を用いる利点のいくつかには以下が含まれる：培養で迅速に増殖する能力、多数の継代後でさえも軟骨形成細胞へ分化する能力、その再生能力、および広範囲の軟骨形成細胞タイプ（すなわち前軟骨細胞、成熟軟骨細胞および肥厚性軟骨細胞）を生じる能力。研究者らは幹細胞に由来する分化した軟骨形成組織は、発育中の胎児の肢芽で認められるものに非常に類似すると期待した。さらにまた、軟骨細胞は培養では増殖が悪く維持が困難であり、単層培養で増大したとき脱分化を生じる（von der Mark et al., Nature 267:531-532(1977)）。組織工学により得た軟骨細胞の代わりに自家幹細胞を使用することは、将来において軟骨欠損治療のより効果的な選択肢となるかもしれない。残念なことに、ドナー側における入手の限界並びに骨髄調達に附随する不快および痛みが問題として残っている。
いくつかの間葉系組織に分化することができる、脂肪組織内の多分化能を有する細胞集団の存在は重要な発見であろう。脂肪組織は大量に入手可能で、さらに比較的容易に入手できる。さらにまた、脂肪吸引術はドナー側の罹患率および患者の苦痛を最少限にする。細胞供給源としてのこれらの利点にために、我々は、骨髄由来および骨膜由来間葉系幹細胞のようにＰＬＡ細胞が軟骨形成分化を生じる能力をもつ細胞集団であるか否かを決定することを試みた。
【０１２１】
我々は、ヒトの多系列（multilineage）処理脂肪吸引物（PLA）細胞の軟骨形成潜在能力を確認した。ＴＧＦ-β1で処理した高密度ミクロマス培養中のヒトＰＬＡ細胞は、軟骨の特徴を有する三次元細胞結節を生じた。前記分化細胞の軟骨を形成する性質は以下のいくつかの発見によって支持された：１）アルシアンブルーで陽性に染色されるＰＬＡ結節の完全封入スライドおよび組織学的切片、２）細胞が極めて少ない軟骨形成コアを取り巻く細胞の軟骨膜縁を示すＨ＆Ｅ形態学、３）ゴルドナーの三色染色によって示されるコラーゲンに富む細胞外マトリックス、４）免疫組織化学的分析によって確認されるII型コラーゲン、コンドロイチン-4-硫酸およびケラタン硫酸の発現、および５）RT-PCRによって示される、II型コラーゲンおよび軟骨特異的アグリカンの発現。
in vivoにおける軟骨発生のもっとも初期の特性の１つは、骨格の原基に相当する細胞凝縮の形成である。軟骨は先ず初めにこれらの凝縮の中心で分化し、続いて一定期間細胞が特徴的な細胞外マトリックスを分泌し、このマトリックスによって前記細胞が取囲まれる。この状況に類似して、in vitroでの軟骨形成分化は、スフェロイド又は結節と呼ばれる多層の細胞凝集物の形成を特徴とする。初期結節の形成の後、稜線形成、マトリックスの蓄積および隣接細胞の補充が続き、最初の結節が拡張される（Ahrens et al., Dev. Biol. 60:69-82(1977); Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995); Stott et al., J. Cell Physiol. 180:314-324(1999); Tacchetti et al., Exp. Cell Res. 200:26-33(1992); Tavella et al., Exp. Cell Res. 215:354-362(1994)）。前記文献の実験と一致して、ＰＬＡ細胞は、ＴＧＦ-β1含有軟骨形成培地による誘導から24時間以内に凝縮を開始し、さらに誘導後48時間までに境界が明瞭な三次元球状体を形成した。培養をさらに長期にわたって軟骨形成培地で処理した後で最初の軟骨結節の他に小さな隣接する結節の出現が認められ、成熟過程の軟骨結節由来のシグナルによって可能なパラクリン成長因子を介して更なる軟骨形成誘導が生じることが示唆された。ＰＬＡ結節形成は、５ｘ106細胞／mLより高い細胞密度で播種されたミクロマス培養でのみ明瞭であり、軟骨形成には高い細胞密度が要求されることを報告した以前の研究（Rodgers et al., Cell Differ. Dev. 28:179-187(1989); Tsonis and Goetinck, Exp. Cell Res. 190:247-253(1990)）と一致する。
【０１２２】
軟骨は、組織に高い引張り強度と内部膨潤圧を与えるコラーゲン原線維およびプロテオグリカンの混合物で構成されている。軟骨の主要なコラーゲンはII型コラーゲンである。このコラーゲンは軟骨に特異的ではないが、II型コラーゲンは限られた数の非軟骨性細胞タイプでしか産生されないので軟骨組織に極めて特徴的である。ゴルドナーの三色染色（一般的にコラーゲン特異的）による陽性染色によって、軟骨形成培地による誘導から２日および14日後のＰＬＡ結節内でこれらのタンパク質が確認された。特に、ＴＧＦ-β1で48時間処理されたＰＬＡ結節は低レベルのII型コラーゲンを含む細胞外マトリックスを伴い、ＰＬＡ細胞で予備段階の軟骨形成分化が進行していることが示唆された。II型コラーゲンレベルは誘導中に増加するように思われた。II型コラーゲンの他に、軟骨性マトリックスはまた高レベルの硫酸化ＧＡＧ、例えばコンドロイチン-4-および-6-硫酸を含み、前記は典型的にはプロテオグリカン（例えばアグレカン）と結合している。これと一致して、アルシアンブルーによる組織学的染色で早くも誘導24時間で硫酸化プロテオグリカンの存在が確認され、ＰＬＡ結節がより明瞭になるにつれ（すなわち２日）増加していった。アルシアンブルー染色の増強はまた14日誘導でも確認され、前記では結節コアおよび周囲の個々の細胞が局在化された。結節をケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸に特異的な抗体で結節を染色したときもまた同様な結果が観察され、さらに免疫組織化学的実験でもこれらの成分の存在が確認され、ＰＬＡ結節内の軟骨形成細胞の存在が支持された。
【０１２３】
我々の免疫組織化学的な結果と一致して、RT‐PCR分析によって７日および14日誘導ＰＬＡ結節ではCNIIの発現が確認され、14日目には低レベルの前記遺伝子が観察された。CNIIの発現は軟骨形成培地による誘導から48時間後には観察されなかった。ＰＬＡ結節内のCNIIの発現は軟骨性表現型を支持する。我々の免疫組織化学的な結果は、誘導ＰＬＡ結節に特異的にコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の両者で顕著なレベルを示した。コンドロイチン-4-および-6-硫酸は軟骨特異的タンパク質、アグレカンの主要なモノマー成分であることが知られている（B.K. Hall, Histochem. J. 13:599-614(1981)）。アグレカンは軟骨特異的であることが示されており、細胞凝縮と同時に発生する明白な軟骨形成の開始で蓄積する（Kosher et al., J. Cell Biol. 102:1151-1156(1986)）。
我々は、アグレカンの発現を評価することによってＰＬＡ結節の軟骨形成の性質を確認した。図22に示されているように、アグレカンの発現パターンは７日目のCNIIのそれと重なり合った。さらにまた、アグレカンの発現はCNIIの発現に先行した。しかしながら、CNIIとは対照的に、アグレカンは14日間誘導されたＰＬＡ結節では観察されなかった。アグレカンは、硫酸化プロテオグリカンとの結合部位を含むマルチドメインタンパク質コアから成る軟骨特異的タンパク質である（Hardinghamn et al., Prog. Clin. Biol. Res. 151:17-29(1984)）。本実験でアグレカンを検出するために用いたプライマーは、Ｇ３球状ドメインを含むＣ末端に対してデザインした［前記ドメインは選択的スプライシングを受け、成熟軟骨ではタンパク分解により除去される部位である（Fulop et al., J. Biol. Chem. 268:17377-17387(1993)）］。14日目のＰＬＡ結節にアグレカンが存在しないことは、したがってＣ末端を欠くアグレカンの選択的スプライシング形を表しているのかもしれない。しかしながら、Ｎ末端に対してデザインしたプライマーを用いてRT‐PCRを実施したとき、14日目にアグレカンは観察されず、アグレカンは軟骨形成培地で２週間誘導した後はもはや発現されないことが示唆された。
【０１２４】
アグレカンおよびCNIIの他に、ＰＬＡ結節はＩ型およびＸ型コラーゲンの両コラーゲンを別個の時点で発現した。２日目のＰＬＡ結節はCNIおよびCNIIの両者の発現を特徴とした。しかしながらアグレカンおよびCNIIとは対照的に、CNIの発現パターンは極めて限定され、２日を越える出現は観察されなかった。興味深いことに、CNIおよびCNIIの両者で低レベルが未処理のＰＬＡコントロール細胞で観察された。これと一致して、Ｉ型およびII型コラーゲンのｍＲＮＡが多くの発育中の胚組織で観察され、基礎レベルのこれらコラーゲンサブタイプを前軟骨間葉系前駆細胞で軟骨分化前に検出することができる（Lisenmeyer et al., Dev. Biol. 35:232-239(1973); Dessau et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 57:51-60(1980); Cheah et al., Development 111:945-953(1991); Kosher and Solursh, Dev. Biol. 131:558-566(1989); Poliard et al., J. Cell Biol. 130:1461-1472(1995)）。最後に、14日目の結節におけるCNIIの発現低下は、CNX（肥厚性軟骨細胞の指標コラーゲン）の出現と同時に発生する（Kirsch et al., Bone Miner. 18:107-117(1992); Linsenmayer et al., Pathol. Immunopathol. Res. 7:14-19(1988)）。
Ｘ型コラーゲンおよび肥厚性表現型の出現は可能な結節の骨化および骨形成に先行するかもしれない。しかしながら、ＰＬＡ結節はオステオカルシン［骨形成系列へ分化する細胞で発現される骨特異的遺伝子（Price et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 117:765-771(1983)）］を発現しなかった。Ｘ型コラーゲンの発現にもかかわらず、その特徴である小腔をもつ成熟軟骨細胞はＰＬＡ結節では観察されなかった。しかしながら、C3H10T1/2ネズミ多能細胞をミクロマス培養しTGF‐β1で処理したときに同様な結果が報告された（Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995)）。肥厚性軟骨細胞は、培養をBMP-2（139）で処理したときに結節の代わりに観察されただけである。したがって、完全な肥厚を誘導するためにＰＬＡミクロマス培養をBMP-2で誘導し、成熟軟骨細胞の形成を誘導する必要があるかもしれない。
【０１２５】
総合すれば、我々の組織学的、免疫組織化学的およびRT-PCRのデータは、ＰＬＡ細胞の軟骨形成系列への分化を支持している。しかしながら、処理脂肪吸引物は不均質な細胞集団であり、種々の中胚葉系列のいくつかの細胞タイプを含んでいる可能性がある。特に、偶発的に分化することができる軟骨形成前駆細胞が、多分化能を有する細胞（すなわちPLA幹細胞）のサブ集団と同様に前記脂肪吸引物中に存在するかもしれない。単一ＰＬＡ細胞に由来するＰＬＡクローンの単離およびその多系列分化（軟骨形成、骨形成および脂肪生成）は多分化能を有する幹細胞（組織脂肪由来中胚葉幹細胞）がこの不均質な細胞集団に存在することを支持する。
【０１２６】
細胞を用いた組織工学を臨床的セッティングで用いるためには多数の基準に適合する必要がある。細胞性担体として用いられる細胞集団は豊富に存在し、入手が容易であり、組織培養で増大可能であり、多数の継代中にもその分可能を維持することが可能で、さらに天然の標的組織と同等の特性を示す必要がある。骨髄から採集した幹細胞を用いる関節軟骨欠損の治癒は種々の動物モデルで成功したことが報告された（Angele et al., Tissue Eng. 5:545-554(1999); M. Butnariu-Ephrat et al., Clin. Orthop.330:234-243(1996); Wakitani et al., J. Bone Joint Surg. Am. 76:579-592(1994)。しかしながら、骨髄採集は痛みを伴い、臨床的使用には少数の幹細胞しか得ることができず、通常はin vitroでの増大を必要とする。脂肪組織は大量に存在し、入手が容易で比較的不快感がわずかである。ＰＬＡ細胞は比較的少量の脂肪組織から大量に採集でき（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）、したがって長期間の培養増大の必要性がない。随意の美容外科手術はもっとも一般的な脂肪吸引物の供給源であるが、十分な脂肪組織はまた、再建を必要とする非美容外科患者で小さな穿刺用カニューレから入手することができ、本技術を多様な患者で利用可能にする。本実施例では、多分化能を有するの組織脂肪由来幹細胞の軟骨形成能を提示し、幹細胞が長期培養後でさえも分化能を保持していることを示した。最後に、組織脂肪由来幹細胞結節は天然の軟骨組織に一致する多くの特性を示す。
これらの特性を完全に満たすこと、およびＰＬＡ細胞の潜在的な豊富さは、これら多分化能を有する細胞を組織工学による治療方法のための理想的な系にする。さらにまた、これら細胞はin vitro培養実験およびin vivo動物モデルの両方で軟骨形成研究に適しているであろう。軟骨形成前駆細胞の特定は関節軟骨欠損の修復に重要な関わりを有する。脂肪組織の豊富さおよびアクセスの容易さは、前記脂肪組織を軟骨再建のための実現性のある選択肢にする（Asahina et al., Exp. Cell Res. 222:38-47(1996); Atkinson et al., J. Cell Biochem. 65:325-339(1997); Chimal-Monroy and Diaz de Leon, Int. J. Dev. Biol. 43:59-67(1999); Denker et al., Differentiation 64:67-76(1999); Klein-Nulend et al., Tissue Eng. 4:305-313(1998); Martin et al., Exp. Cell Res. 253:681-688(1999); Quarto et al., Endocrinology 138:4966-4976(1997); Shukunami et al., Exp. Cell Res. 241:1-11(1998)）。
【０１２７】
実施例10
以下の記載は脂肪組織から幹細胞を単離する方法を提供し、この場合幹細胞は筋形成組織に分化する。
方法
分化試薬および組織培養試薬：
ヒドロコーチゾン、コラゲナーゼおよびパラホルムアルデヒドはシグマ（Sigma, St. Louis, MO）から購入した。ウマ血清（ＨＳ）はライフテクノロジーズ（Life Technologies, Grand Island, NY）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、0.25％トリプシン／1mMＥＤＴＡ（トリプシン／EDTA）、ダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および抗生物質／抗真菌剤溶液はセルグロ（CellGro, Herndon, VA）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はハイクローン（Hyclone, Logan, UT）から購入した。
ＰＬＡの調製および培養
８人の随意吸引補助脂肪除去術（SAL）を受ける患者（平均年齢＝39.3、25歳から58歳）から、患者の同意のためのプロトコルHSPC＃98-08-011-02（University of California Los Angeles）にしたがって入手したヒト脂肪組織を、実施例７（上記）に記載した方法によって処理し処理脂肪吸引物（PLA）細胞集団を得た。簡単に記せば、未処理脂肪吸引物を滅菌ＰＢＳで十分に洗浄して血球、食塩水および局所麻酔剤を除いた。細胞外マトリックスを0.075％のコラゲナーゼで37℃、30分消化して細胞分画を遊離させた。コラゲナーゼを等容積の10％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで不活化した。遊泳液を250ｘｇで10分遠心分離して高濃度のＰＬＡ細胞ペレットを得た。前記ペレットをＤＭＥＭ／10％ＦＢＳに再懸濁し、赤血球溶解緩衝液（0.16ＭのNH4Cl）を10分間添加して夾雑赤血球を溶解した。更なる遠心分離工程に続いて、ＰＬＡ細胞ペレットをＤＭＥＭ／10％ＦＢＳに再懸濁し、100mmの培養皿に１ｘ106細胞／プレートの密度で播種した。ＰＬＡ細胞をコントロール培地（CM：ＤＭＥＭ，10％ＦＢＳ，１％抗生物質／抗真菌剤）で37℃／５％ＣＯ2で維持した。コンフルエントのＰＬＡ培養（約80％コンフルエンシー）をトリプシン／ＥＤＴＡで１：３の割合で継代した。コントロール実験のために、ヒト包皮線維芽細胞、ＨＦＦ（American Type Culture Collection, Manasass, VA）およびヒト骨格筋細胞株、ＳＫＭ（Clonetics, Walkersville, MD）を37℃／５％ＣＯ2でＣＭおよび筋形成維持培地（SKM−Clonetics）でそれぞれ維持した。
【０１２８】
筋形成分化：
最適な筋形成を誘導するために、ＰＬＡ細胞を１ｘ104細胞の密度で35mmの組織培養皿に播種し、一晩ＣＭ中でインキュベートして付着させた。最適な筋形成は、ＰＬＡ細胞を筋形成培地（MM＝５％ウマ血清および50μMヒドロコーチゾンをCMに補充し、筋形成分化に決定的事象である増殖を促進した）（196）でインキュベートすることによって得られた。PLA細胞をＭＭ中で１、３および６週間誘導した。培地は実験が終了するまで毎週２回交換した。ＳＫＭおよびＨＦＦは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールとしてＭＭ中で１、３および６週間誘導した。
免疫組織化学：
筋形成分化を検定するために、ＰＬＡ細胞を８ウェルのチャンバースライドに５ｘ103細胞／ウェルの密度で播種しＣＭ中で一晩付着させた。細胞をＭＭ中で１、３および６週間誘導した。誘導後、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、４％パラホルムアルデヒドで４℃20分固定した。前記細胞を３％の過酸化水素でインキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を停止させた。非特異的エピトープはブロッキング緩衝液（BB：ＰＢＳ，１％ＨＳ，0．1％トリトンX-100）で30分インキュベートして封鎖した。ヒトMyoD1に対するモノクローナル抗体（Dako; Carpenteria, CA）またはヒト急速単収縮骨格筋（fast twitch skeletal muscle）のミオシン重鎖に対するモノクローナル抗体（Biomeda Corp., Foster City, CA）のいずれかとともに細胞を４℃で一晩インキュベートした。前記インキュベーションに続いて、細胞をＢＢで洗浄し、ビオチン結合ウマ抗マウスＩｇＧ二次抗体を含むＢＢ中でさらに２時間室温でインキュベートした。ヴェクタステイン（VectaStain）ABCキット（Vector Labs; Burlingame, CA）を製造元の説明書にしたがって用いて前記二次抗体を可視化した。細胞を３分間ヘマトキシリンで後染色した。ＭＭで誘導したＳＫＭ細胞は陽性コントロールとして上記のように処理した。ＣＭで培養したＰＬＡ細胞およびＭＭで誘導したＨＦＦ細胞は陰性コントロールとして分析した。
【０１２９】
RT‐PCR分析：
全ＲＮＡを１、３および６週間ＭＭで処理したＰＬＡ細胞から単離した。ＲＮＡは上記の実施例９に記載した方法にしたがって単離した。５マイクログラム（５μg）の全ＲＮＡをネズミモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV‐RT, Promega, Madison, WI）によるオリゴｄT‐プライミングｃＤＮＡ合成に使用した。得られたｃＤＮＡをヒトMyoD1（Accession; NM#002478）およびヒト骨格筋ミオシン重鎖（Accession; X03740）に対してデザインしたプライマー対を用いるＰＣＲ分析の鋳型として使用した。使用したプライマー対および予想されるＰＣＲ生成物サイズは以下のとおりであった：MyoD1：５’−ＡＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＡ−３’（前進方向プライマー）および５’−ＧＣＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＧＡＴＣＡＣＣ−３’（逆方向プライマー）；500bp；ミオシン重鎖：５’−ＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＴＧＣＴＴ−３’（前進方向プライマー）および５’−ＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＴＧＡ−３’（逆方向プライマー）；750bp。MyoD1およびミオシンはTaqポリメラーゼ（Promega）を用い、総反応容積100μLで35サイクル増幅させた。内部コントロールとしてハウスキーピング遺伝子、β-アクチンに対してデザインしたプライマーを用い２組ずつの反応を実施した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分離させた。ＣＭで培養したＰＬＡ細胞およびＭＭで誘導したＨＦＦ細胞から得られたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を陰性コントロールとして実施した。
免疫組織化学的定量およびデータの分析：
筋形成を定量するために、それぞれの誘導時間で得られた合計500個のＰＬＡ細胞を、倒立顕微鏡“アキシオスコープ２”（Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY）を用いて200倍の倍率で手動で数え、MyoD１およびミオシン陽性細胞数を求めた。MyoD1およびミオシン陽性細胞数を合計500個の細胞のパーセンテージとして表し（総PLA細胞に対する％）、筋形成分化の程度の指標として用いた。全ての実験を８人の患者で実施し、MyoD1およびミオシン陽性細胞の平均数を標準誤差（±SEM）とともに算出した。上記で説明した実験群およびコントロール群の筋形成分化を、一方向分散分析（ANOVA）を用いて統計的有意について分析した。0.05未満のｐ値を有意と考えた。
【０１３０】
結果
誘導幹細胞はMyoD1およびミオシン重鎖を発現する：
以前の実験と一致して、本実験の８人の患者間でＰＬＡ成長カイネティクスおよび継代に定量的な変化はなく、単離ＰＬＡ集団は全ての患者で比較的一定であることが示唆された。ＰＬＡ細胞は未処理脂肪吸引物から単離し、ヒドロコーチゾンを含むＭＭを用いて誘導した。非誘導コントロール培地または別の中胚葉系列（すなわち骨形成および脂肪生成系列）を誘導する培地では分化は観察されなかったので、ＰＬＡ細胞による筋形成は本実験で用いた筋形成条件に特異的であった。さらにまた、骨形成または脂肪生成分化はＭＭ中で６週間まで誘導したＰＬＡ細胞では観察されなかった。
ＰＬＡの筋形成潜在能力を確認するために、確立された筋特異的マーカーの発現を免疫組織化学的に測定した。筋形成前駆細胞の分化および幹細胞の筋前駆細胞への分化はいくつかの転写因子（MyoD1、Myf-5、ミオゲニンを含む）および構造たんぱく質（例えばミオシン重鎖）の発現によって確認できる（Batler-Browne et al, Anat. Enbryol. (Berl) 181:513-522(1990); Thornell et al., J. Neurol. Sci. 66:107-115(1984); Megeney et al., Genes Dev. 10:1173-1183(1996); Seale and Rudnicki, Dev. Biol. 218:115-124(2000); Tapscott et al., Scince 242:405-411(1988); Weintraub et al., Science 251:761-766(1991); Molkentin and Olson Curr. Opin. Genet. Dev. 6:445-453(1996)）。筋形成系列への拘束は、MyoD1に特異的なモノクローナル抗体で細胞を染色することによって特定した。ＰＬＡ細胞のMyoD1の核内発現はＭＭによる誘導１、３および６週間で観察され、この細胞での筋形成分化経路の開始を示唆した（図16、パネルＡからＣ）。ＰＬＡの結果と同様に、MyoD1の核内発現は陽性コントロールのＳＫＭ細胞でもＭＭによる誘導後１週間で観察され、MyoD1の発現の増加が誘導６週間までにＳＫＭ細胞で観察された。誘導ＰＬＡ細胞とは対照的に、MyoD1発現は、ＣＭで１、３および６週間処理されたＰＬＡ細胞では観察されなかった（図16、パネルＤからＦ）。同様に、ＭＭで処理されたＨＦＦ細胞ではMyoD1の発現は観察されなかった。誘導ＰＬＡ細胞でのMyoD1の発現は、これらの細胞が筋形成プログラムを開始させたことを示唆している。
【０１３１】
さらに筋形成を確認するために、骨格筋ミオシン重鎖（ミオシン）に特異的なモノクローナル抗体で細胞を染色し、最終的な筋芽細胞の分化を確認した(Batler-Browne et al, Anat. Enbryol. (Berl) 181:513-522(1990); Thornell et al., J. Neurol. Sci. 66:107-115(1984))。
MyoD1の核内発現と一致して、ＭＭで誘導したＰＬＡ細胞はまたミオシンを発現した（図17、パネルＡからＣ）。しかしながら、MyoD1とは対照的に、ミオシン発現は後期誘導時点（３および６週間のみ）に限定され、完全に分化した成熟筋芽細胞でこのマーカーは発現することと一致した（Batler-Browne et al, Anat. Enbryol. (Berl) 181:513-522(1990); Thornell et al., J. Neurol. Sci. 66:107-115(1984)）。我々のMyoD1の結果と同様に、ミオシンの発現はＣＭで培養されたＰＬＡ細胞（図17、パネルＤからＦ）またはＭＭで誘導したＨＦＦ細胞では観察されなかった。広範なミオシン発現はまたＭＭで３および６週間誘導したＳＫＭ陽性コントロールで観察された。総合すれば、誘導したＰＬＡ細胞のMyoD1およびミオシンの両者の発現は、これら細胞は筋形成潜在能力を有することを示唆している。
筋形成前駆細胞の最終分化は分化した筋芽細胞の細長い多核の筋管への融合を伴う。したがって、我々は誘導ＰＬＡ培養を仮定的筋管の形成について調べた。最低限３週間でＭＭで処理したＰＬＡ細胞は細長い多核の細胞を生じた（図18Ａ）。これらの多核細胞の数およびサイズは誘導時間とともに徐々に増加し、多核細胞は６週間誘導した全てのＰＬＡ培養で観察された。融合はＭＭによる誘導１週間後では観察されなかった。さらにまた、多核化はＣＭで同じ時間培養されたＰＬＡ細胞、またはＭＭで処理したＨＦＦ細胞では観察されなかった。これら仮定的筋管の筋形成起源を確認するために、ミオシンの発現を誘導後６週間のＰＬＡ培養で調べた。図18Ｂで示されるように、６週間の多核ＰＬＡ細胞はまたミオシン重鎖も発現した。ＭＭ誘導時にミオシンを発現する多核細胞の形成は、ＰＬＡ細胞が融合を受けて筋管を形成することを示唆し、さらにＰＬＡ細胞のin vitroにおける筋形成潜在能力を確認する。
【０１３２】
RT-PCR分析：
最後に、筋形成分化をRT-PCRを用いて確認した（図19）。我々の免疫組織化学的データと一致して、ＭＭで１、３および６週間誘導したＰＬＡ細胞でのMyoD1の発現がRT-PCR分析によって確認された。対照的に、MyoD1発現はＣＭ培養ＰＬＡ細胞でもＭＭ誘導ＨＦＦ細胞でも観察されなかった。低レベルのミオシン発現が３週間誘導ＬＡ細胞で観察され、一方、このマーカーの発現増加はＭＭで６週間誘導後に観察された。ミオシンはこれらの細胞では誘導1週間では検出されず、免疫組織化学的結果と一致した。コントロールＰＬＡ細胞またはＭＭ誘導ＨＦＦ細胞ではミオシンの発現は検出されなかったので、ミオシンの発現は誘導ＰＬＡ細胞に特異的であった。RT-PCRの結果によって我々の免疫化学的結果が確認され、ＰＬＡ細胞の筋形成潜在能力がさらに支持された。
【０１３３】
ＰＬＡ細胞による筋形成分化の定量：
誘導ＰＬＡ細胞による筋形成分化の程度を測定するために、免疫組織化学的データを定量した。そのために、MyoD1陽性細胞またはミオシン陽性細胞の数を筋形成マーカー発現レベルの指標として数え、数えたＰＬＡ総数に対する百分率±平均標準誤差（総ＰＬＡに対する％±SEM）として表した。ＭＭ誘導時のMyoD1陽性ＰＬＡ細胞の数は図20に示されている。低レベルMyoD1陽性を示すＰＬＡ細胞がＭＭ中で１週間誘導後に観察された（総ＰＬＡ細胞に対して4.11±0.51％）。誘導後３週間までに、総ＰＬＡ細胞に対して10.11±3.85％がMyoD1陽性であったが、誘導後６週間では総ＰＬＡ細胞に対して15.37±4.33％がMyoD1陽性であった。細胞計測によれば、MyoD1陽性細胞数では2.4倍の増加が最初の３週間以内の誘導で観察された。最初の３週間とは対照的に、MyoD1の発現レベルは最後の３週間の筋形成誘導では1.5倍しか増加しなかった。最後の３週間の誘導に対して最初の３週間の誘導でより多くの数のMyoD1陽性細胞が存在することは、MyoD1調節因子の筋形成分化で果す初期の役割を反映しているのかもしれない（Megeney et al., Genes Dev. 10:1173-1183(1996); Seale and Rudnicki Dev. Biol. 218:115-124(2000); Tapscott et al., Science 242:405-411(1988); Weintraub et al., Science 251:761-766(1991)）。
ＭＭ誘導ＰＬＡ細胞とは対照的に、ＣＭによるＰＬＡ処理またはＭＭ処理ＨＦＦはいずれの時点でも評価しえる筋形成分化は観察されず、本誘導条件の特異性が確認された。ＰＬＡ細胞における経過時間に対するMyoD1発現の増加が有意であるか否かを確認するために、一方向ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を実施した。１週間から６週間のMyoD1の実験値のみの比較によって統計的有意が得られた（P＜0.001；F＝18.9）。さらにまた、不対合ｔ検定を用いた１週間および３週間のMyoD1レベルの分析によって有意差が確認された（ｐ＝0.0021）。３週間と６週間の間では有意性レベルが低下し（ｐ＝0.0335）、おそらく筋芽細胞の成熟におけるMyoD1の役割の低下を反映しているのであろう。最後にコントロール群に対して実験群におけるMyoD1の発現増加は、一方向ＡＮＯＶＡを用いて各分化時点内で統計的に有意であることが見出された（ｐ＜0.0001）。
【０１３４】
ミオシン陽性ＰＬＡ細胞数における時間依存増加がまたＭＭによる誘導に際して観察された（図21）。極めてわずかなレベルのミオシン発現が誘導後１週間で観察され、このタンパク質の成熟筋芽細胞での発現と一致した。誘導３週間後に、数えた総ＰＬＡ細胞の3.88±0.46％がミオシン発現陽性であったが、６週間では8.42±0.71％がミオシン陽性で、最後の３週間の誘導でミオシン陽性細胞の数は2.2倍増加した。誘導後３週間から６週間におけるでミオシン発現細胞数の増加はMyoD1について測定したものより大きく、分化中の筋形成細胞から成熟筋形成細胞へのシフトと一致した（Batler-Browne et al, Anat. Enbryol. (Berl) 181:513-522(1990); Thornell et al., J. Neurol. Sci. 66:107-115(1984)）。ＣＭで培養したＰＬＡ細胞またはＭＭで誘導したＨＦＦ細胞ではミオシン発現は観察されず、本誘導条件の特異性が確認された。１週間から６週間のミオシン発現レベルの増加を分析することによって統計的有意が確認された（一方向ANOVA：P＜0.0001，F＝75.5）。統計的有意はまた不対合ｔ検定を用いて３週間および６週間のミオシン発現レベルを比較したときにのみ観察された（ｐ＜0.0001）。MyoD1実験の場合のように、ＰＬＡおよびコントロール培養の統計分析によって統計的有意が確認された（一方向ANOVA：P＜0.0001）。最後に、MyoD1およびミオシン発現レベルを用いて測定したとき、筋形成分化レベルは患者間で一定であることが見出された。さらにまた、回帰分析では筋形成分化と患者の年齢との間に有意の相関性は示されなかった（MyoD1、相関性＝0.27；ミオシン、相関性＝0.30）。
【０１３５】
考察
外傷、血管損傷、腫瘍切除または変性筋疾患（例えば筋ジストロフィー）による筋肉の喪失は、解決方法がほとんどない重大な臨床的問題の代表である。巣状性筋減少の場合には血管形成筋肉の移植が実施されたが、ドナー側の美容上および機能上の負担のために制限が生じる。全身的筋疾患（例えば変性筋減少）は一般的に致死的疾患と考えられ、進行性の筋減少、横隔膜麻痺または機能不全および最終的には窒息をまねく。従来の治療方法（例えば遺伝治療）はこれまでのところ効果がないことが判明した。しかしながら、組織工学分野における最近の進歩は、巣状性および広汎性筋組織消失の究極の置換または修復を可能にするかもしれない。
一般的には２つの細胞タイプ、胚性幹細胞および出生後に得られる前駆細胞または幹細胞が筋肉の組織工学のための候補細胞と考えられる。残念なことに、倫理的な問題および細胞制御に関する潜在的な問題が胚性幹細胞の使用を制限してきた（Baker et al., Curr. Top. Dev. Biol. 33:263-279(1996); Dinsmore et al., Cell Transplant 5:131-143(1996); N. Lenoir, Science 287:1425-1427(2000); Rohwedel et al., Dev. Biol. 164:87-101(1994); F.E. Young, Science 287:1424(2000)）。出生後骨格筋前駆細胞または衛星細胞が、筋芽細胞移植療法（MTT）によってデュシェーヌ型筋ジストロフィーの治療のために導入された（Karpati et al., Am. J. Pathol. 135:27-32(1989); Law et al., Muscle Nerve 11:525-533(1988); Rando et al., Exp. Cell Res. 220:383-389(1995); Partridge et al., Nature 273:306-308）。潜在的な利点は存在するが、衛星細胞を実際に使用することには主として細胞の入手可能性のため（そのような細胞は生きているドナーの筋肉組織から採集されねばならない）だけでなく、寿命による自己再性能の低下のために限界がある（Rando et al., J. Cell Biol. 125:1275-1287(1994); Satoh et al., J. Histochem. Cytochem. 41:1579-1582(1993); Schultz and Lipton, Mech.Ageing Dev. 20:377-383(1982)）。衛星細胞の他に、骨髄に由来する間葉系幹細胞（MSC）もまた特別な培養条件下で筋形成能をもつことが報告された（Ferrari et al., Science 279:1528-1530(1998); Wakitani et al., Muscle Nerve 18:1417-1426(1995)）。
【０１３６】
本実験では、我々は、吸引補助脂肪除去（ＳＡＬ）により得られたヒトの処理脂肪吸引物（ＰＬＡ）細胞はin vitroで筋形成潜在能をもつことを示した。免疫組織化学分析およびRT-PCR分析によって、ＭＭで誘導したＰＬＡ細胞はMyoD1およびミオシン重鎖の両者（分化および成熟が進行している骨格筋前駆体で発現されるマーカー）を発現することが示された。ＰＬＡ細胞でのMyoD1の発現は誘導の最初の３週間でもっとも高く、筋形成におけるその初期の役割と一致した。ミオシンの時間依存増加もまた観察され、分化の後半段階でミオシン陽性細胞数はもっとも多かった（すなわち誘導後３から６週間）。そのような増加はＰＬＡ細胞の筋芽細胞への成熟を反映しているのかもしれない。最終的分化および筋芽細胞融合と一致して、ミオシンを発現する細長い多核の筋管は誘導後３週間で先ず観察され、これら多核細胞の数およびサイズは時間とともに増加していった。最後に、免疫組織化学的定量によって、約15％のＰＬＡ細胞が筋形成を経ることが判明した。
出生後には、成熟骨格筋線維は損傷した場合は再生されない。筋肉の損傷に対する反応では、または慢性変性筋障害をもつ個体では、筋細胞膜と筋線維の基底膜の間に位置する衛星細胞が活性化され筋形成前駆細胞となる。これらの前駆細胞は分裂し融合して損傷した筋肉を修復する（D.R. Campion, Int. Rev. Cytol. 87:225-251(1984)）。しかしながら、成熟筋肉内の衛星細胞数は全細胞数のわずかに１−５％であり、さらにそれらの自己再生能力は年齢とともに低下する（Schultz and Lipton, Mech. Ageing Dev. 20:377-383(1982); Alameddine et al., Muscle Nerve 12:544-555(1998)）。巣状性筋肉損失の場合、血管形成筋肉の移植が実施されたが、ドナー側の美容上および機能上の負担によって制限がある。さらにまた、全身性筋疾患の場合、自家骨格筋移植は当該疾患プロセスにおける広汎性特質のために利用できない。したがって他の細胞による治療方法が要求される。
【０１３７】
そのような状況で出現した方法の１つは筋芽細胞移植療法またはＭＴＴである。筋芽細胞移植療法は大量の健常な筋芽細胞の移植を必要とする。この方法は1978年に初めて実施され、デュシェーヌ型筋ジストロフィー患者の有望な治療法であることが示された（Karpati et al., Am. J. Pathol. 135:27-32(1989); Law et al., Muscle Nerve 11:525-533(1988); Rando et al., Exp. Cell Res. 220:383-389(1995); Partridge et al., Nature 273:306-308）。筋肉組織の置換または増大のために理論的には便利ではあるが、前記の成功には限界があった（Rando et al., J. Cell Biol. 125:1275-1287(1994); Satoh et al., J. Histochem. Cytochem. 41:1579-1582(1993)）。別の選択肢として、多分化能を有する幹細胞が将来の細胞による治療方法の有望な候補となった。なぜならば、多分化能を有する幹細胞は培養で迅速に増殖し、いくつかの中胚葉系細胞タイプへの分化能を維持するからである（Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991); Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。
【０１３８】
以前の報告によって、中胚葉幹細胞は出生前および出生後の器官から単離できることが示された（Ferrari et al., Science 279:1528-1530(1998); Caplan, J. Orthop. Res. 9:641-650(1991); Elmer et al., Teratology 24:215-223(1981); Swalla et al., Dev. Biol. 116:31-38(1986); Hauschka et al., Dev. Biol. 37:345-68(1974); Solursh et al., Dev. Biol. 83:9-19(1981); Nakahara et al., Exp. Cell Res. 195:492-503(1991); Goshima et al., Clin. Orthop.274-283(1991);  Goshima et al., Clin. Orthop. 298-311(1991);Benayahu et al., J. Cell Physiol. 140:1-7(1989); Bennett et al., J. Cell Sci. 99:131-139(1991); Calcutt et al., Clin. Res. 41:536A(1993); Lucas et al., In vitro Cell Dev. Biol. 28:154A(1992); Lucas et al., J. Cell Biochem. 17E:122(1993)）。Williamsらは、骨格筋組織から得た出生後の細胞は脂肪生成、骨形成、軟骨形成および筋形成潜在能力を有することを示した（Williams et al., Am. Surg. 65:22-26(1999)）。さらにまた、いくつかのグループは、ヒトおよび動物の骨髄から得られた間葉系幹細胞（MSC）は脂肪生成、骨形成および軟骨形成系列細胞に分化することを示した（Pittenger et al., Science 284:143-147(1999); Grigoriadis et al., J. Cell Biol. 106:2139-2151(1998); Beresford et al., J. Cell Sci. 102:341-351(1992); Cheng et al., Endocrinology 134:277-286(1994); Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998); Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998)）。これらの発見は、骨髄および骨格筋は幹細胞の有望な供給源であることを示唆している 。しかしながら、筋形成細胞の供給源として骨髄および骨格筋を使用することには欠点がある。骨髄の調達は痛みを伴い、さらに少数のＭＳＣしか得ることができず、臨床的に使用する前にしばしばex vivoでの増大を必要とする。さらにまた、患者に機能低下をもたらすことなく骨格筋から得ることができる幹細胞はほんのわずかであろう。
本実施例では、我々は、確立された筋形成マーカー（MyoD1、ミオシン、多核形成）の組織脂肪由来幹細胞による発現を示し、それら細胞の筋形成潜在能力を確認および定量した。脂肪組織は大量に存在し、さらに脂肪吸引術は患者の苦痛が最小限で比較的安全であるので、ヒト組織脂肪由来幹細胞は、筋疾患の治療のために骨髄および骨格筋から得られる細胞とともにさらに別の多系列細胞の供給源を提供する。
【０１３９】
幹細胞での筋形成マーカーの発現が示されたが、これら細胞の正確な起源を確認することはできない。ほとんどありそうにもないことであるが、我々の結果は、脂肪区画内への衛星細胞または非脂肪組織由来の筋形成前駆細胞の夾雑によるためとすることは可能である。可能性の１つは、骨格筋からの筋形成前駆細胞の脂肪区画内への混入である。しかしながら、鈍端をもつ脂肪吸引カニューレで骨格筋の被覆筋膜を突き破ることは技術的な観点からは可能性は少ない。別の可能性は末梢血からのＭＳＣによる脂肪区画の汚染である。抹消血にＭＳＣが存在することに関して反対の報告が提示されたが（lazarus et al., J. Haematother. 6:447-455(1997); Huss, Stem Cell 18:1-9(2000)）、我々の実験で観察された筋形成レベルは、末梢血が一因となる可能性があるＭＳＣのパーセンテージの低さと矛盾すると我々は考えている。最後に、衛生細胞および筋形成前駆細胞の特定に明瞭なマーカーは存在しないが、MyoD1は分化中に発現されるもっとも初期のマーカーの１つであり、筋形成前駆細胞の特定に用いられてきた（Weintraub et al., Science 251:761-766(1991); Grounds et al., Cell Tiss. Res. 267:99-104(1992); D.A. Sassoon, Develop. Biol. 156:11(1993)）。図16に示されるように、MyoD1発現は非誘導ＰＬＡ培養では観察されず、我々の結果はＰＬＡ中に筋形成前駆細胞が存在するためではなく、多系列幹細胞の筋形成分化のためであることが示唆される。
【０１４０】
骨格筋の組織工学の目標は特定の内因性骨格筋疾患および外傷または虚血による骨格筋消失の治療である。これらの疾患に対する現在の内科的治療および外科的治療は効果が少ないかまたは実際的ではない。これらの領域でのヒトＰＬＡ細胞の使用は有望である。ヒトＰＬＡ細胞は大量に存在し、最小限の臨床的負担で容易に入手することができ、さらに筋形成潜在能力を示す。したがって、これらの細胞は筋形成のための組織工学および修復に重要な用途を有するであろう。
ＰＬＡ細胞の筋形成分化の程度は脂肪生成および骨形成分化で観察されたレベルと比較して低いが（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）、外因性因子（例えば受動的および能動的作用因子）の適用（Periasamy et al., Biochem. J. 257:691-698(1989); Vandenburgh and Kaufman, J. Cell Physiol. 109:205-214(1981); Vandenburgh, J. Cell Physiol. 116:363-371(1983); Vandenburgh et al., In vitro Cell Dev. Biol. 24:166-174(1988); Vandenburgh, In vitro Cell Dev. Biol. 25:607-616(1989)）および培養条件の洗練によって筋形成分化を高め、これらの細胞を臨床的に有用にすることができるであろう。
【０１４１】
実施例11
以下の記述は、骨形成、軟骨形成、脂肪生成、筋形成および神経形成組織に分化することができる組織脂肪由来幹細胞を提供する。本記述はまた、前記幹細胞を単離する方法および前記幹細胞の分化を誘導する方法を提供する。
材料と方法
全ての材料は、別に記載がなければシグマ（Sigma, St. Louis, MO）、ＶＷＲ（San Dimas, CA）およびフィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific, Pittsburg, PA）から購入した。全ての組織培養試薬はライフテクノロジーズ（Life Technologies, New York, NY）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびウマ血清（ＨＳ）はハイクローン（Hyclone, Logan, UT）およびライフテクノロジーズ（New York, NY）からそれぞれ購入した。1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3はバイオモル（BioMol, Plymouth Meeting, PA）から購入した。
細胞株：
正常ヒト骨芽細胞（NHOst）、膝から得られた正常ヒト軟骨細胞（NHCK）およびヒト骨髄由来ＭＳＣ集団はクローンティクス（Clonetics, Walkersville, MD）から購入した。ネズミ3T3-L1前脂肪細胞株（Green and Meuth, Cell 3:127-133(1974)）はATCC（Rockville, MD）から入手した。ヒト神経内分泌細胞株ＰＣ12は、Dr. Harvey Herschman（UCLA, Los Angeles, CA）から寄贈された。
【０１４２】
抗体：
ヒトオステオカルシンに対するモノクローナル抗体はタカラ酒造（日本）から購入した。以下に対するポリクローナル抗体はDr. Larry Fisher（NIH）から入手した：ヒトオステポンチン（αOP-LF123）、オステオネクチン（αON-LE37）、バイグリカン（αBG-LF51）、デコリン（αDEC-LF136）およびアルカリ性ホスファターゼ（αＡＰ）。以下に対するモノクローナル抗体はレインコテクノロジーズ（Leinco Technologies, St. Louis, MO）から購入した：ＭＡＰ２（αMAP）、神経フィラメント70（αNF70）およびτ-tau（αtau）。Trk-aに対するモノクローナル抗体（αTRK）およびNeuNに対するモノクローナル抗体（αNeu）はサンタクルツバイオテック（Santa Cruz Biotech; Santa Cruz, CA）およびケミコン（Chemicon; Temecula, CA）からそれぞれ購入した。グリア筋原線維酸性タンパク質に対するポリクローナル抗体（αGFAP）および、に対するポリクローナル抗体はダコ（Dako ）およびストレスゲン（Stressgen; Victoria, BC）からそれぞれ購入した。アルカリホスファターゼを結合させた二次抗体はザイメド（Zymed）から購入したが、FITCを結合させた二次抗体はバイオソース（BioSource; Camaririllo, CA）から購入した。
【０１４３】
細胞採集、培養および分化の条件：
組織脂肪由来幹細胞（PLA）細胞は未加工脂肪吸引物から入手し、以前の実験で述べたように培養した（Zuk, Tissue Engineering 7(2):209-226(2001)）。組織脂肪由来幹細胞および3T3-L1細胞は非誘導コントロール培地（表５）で維持した。NHOst、MSCおよびNHCK細胞は特殊化された市販のコントロール培地（Clonetics）で維持した。組織脂肪由来幹細胞は表５に概略したように所望の間葉系系列に誘導した。MSCは表５に概略したように成長因子を補充した市販のコントロール培地を用いて誘導した。3T3-L1細胞は脂肪生成培地（AM）を用いて誘導した。NHOstおよびNHCK細胞は市販の誘導培地（Clonetics）を用いて誘導した。
組織学、免疫組織化学および間接免疫蛍光法：
間接免疫蛍光法（IF）：特異的なＣＤマーカーに対するモノクローナル抗体（表６）を用いて、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣを記載（Zuk, Tissue Engineering 7(2):209-226(2001)）のようにＩＦのために処理した。
組織学および免疫組織化学（IH）：系列特異的分化を確認するために、以下の組織学的アッセイを用いて分化させた細胞を記載（Zuk, Tissue Engineering 7(2):209-226(2001)）のように処理した：アルカリホスファターゼ（骨形成）、オイルレッドO（脂肪生成）およびアルシアンブルー（軟骨形成）。さらに、軟骨形成系列に誘導したＰＬＡ結節は、２型コラーゲン、ケラタン硫酸（KS）およびコンドロイチン-4-硫酸（CS）の発現についてＩＨのために記載（Zuk, Tissue Engineering 7(2):209-226(2001)）のように処理した。
【０１４４】
分光分析：
アルカリホスファターゼ：３組ずつのＰＬのサンプルを骨形成培地（ＯＭ）中で６週間まで分化させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／0.1％トリトンX-100（ＰＢＳ/TX100）中に採集した。ＡＰ酵素活性は市販のＡＰ酵素キット（Sigma）を用いてアッセイし、405nmの吸収を測定した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）を用いて、各サンプルの総タンパク質をブラッドフォード法により測定した（Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254(1976)）。ＡＰ活性は、産生されたp-ニトロフェノール（nmol）／分／μgタンパク質として表した。p-ニトロフェノール標準溶液を用いてアッセイの目盛りを修正した。分化ＭＳＣおよびNHOst細胞は陽性コントロールとしてアッセイし、一方、非誘導ＰＬＡ細胞は陰性コントロールとしてアッセイした。数値は平均±ＳＤとして表した。
全カルシウム（Ca2+）：３組ずつのＰＬＡ細胞を上記に記載したようにＯＭ中で分化させた。細胞をＰＢＳ（Ca2+およびMg2+を含まない）で洗浄し、0.1ＮのHCl中に採集した。細胞を最低限４時間４℃で抽出し1000ｘｇで５分遠心した。上清中の総カルシウムをシグマキット#587を用いてＡ575nmで測定して決定した。アッセイはカルシウム標準溶液を用いて目盛り修正を実施した。総タンパク質を求め、サンプルをCa（mM）／μgタンパク質として表した。
分化ＭＳＣおよびNHOst細胞は陽性コントロールとしてアッセイし、一方、非誘導ＰＬＡ細胞は陰性コントロールとしてアッセイした。数値は平均±ＳＤとして表した。
【０１４５】
グリセロール-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GPDH）：３組のＰＬＡ細胞サンプルをＡＭ中で５週間分化させた。前記細胞を25mLのトリス-Cl、１ｍMのＥＤＴＡ（pH7.5）、0.1ｍMのβ-メルカプトエタノールに採集し、40Wで５秒間超音波処理して溶解させた。懸濁液を10000ｘｇで遠心し、Wise and Greenの方法（Wise, 1979）にしたがって上清中のＧＰＤＨをＮＡＤＨの酸化をＡ340nmで測定することによってアッセイした。ＧＰＤＨ１単位は１分当たり１nmolのＮＡＤＨの酸化と定義される。サンプルをタンパク質について標準化し、ＧＰＤＨ（単位）／μｇとして表した。分化させたＭＳＣおよび3T3-L1細胞は陽性コントロールとしてアッセイし、一方、非誘導ＰＬＡ細胞は陰性コントロールとしてアッセイした。数値は平均±ＳＤとして表した。
ジメチルジメチレンブルー（DMMB）：確立されたミクロマスプロトコル（Ahrens et al., Develop. Biol. 60:69-82(1977); Denker et al., Differentiation 59:25-34(1995); Reddi et al., Prog. Clin. Biol. Res. 110(Part B):261-268(1982)）を用い、３組ずつのＰＬＡ細胞サンプルを軟骨形成培地（CM）中で３週間まで分化させた。ＰＬＡ結節を採集し、硫酸化グリコサミノグリカンケラタン硫酸（KS）およびコンドロイチン硫酸（CS）についてFarndale et al.の方法（Farndale et al., Biochimica1 et Biophysica Acta 883:173-177(1986)）にしたがってアッセイした。アッセイは標準ＫＳおよびＣＳ溶液の使用によって目盛り修正を実施した。サンプルをタンパク質に対して標準化し、ＫＳまたはＣＳ（μg）／μｇとして表した。非誘導ＰＬＡ細胞は陰性コントロールとしてアッセイした。数値は平均±ＳＤとして表した。
【０１４６】
RT-PCR分析：
ＰＬＡ細胞を表５に示した５系列にそれぞれ規定時間で誘導した。全細胞ＲＮＡを市販のキット（QiaEasy, Qiagen）を用いて分化細胞から単離した。オリゴｄＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega, Madison, WI）を60分42℃で用いてＲＮＡを逆転写した。ＰＣＲ増幅は以下を添加して実施した：Taq緩衝液（Promega）、2.5ｍMのMgCl2、１mMのｄNTPおよび50pmolの適切なプライマーセット（表７）。前記混合物を１分間94℃でインキュベートし、2.5単位のTaqポリメラーゼ（Promega）を添加した。ＰＣＲは40サイクル実施した（１分、94℃；１分、57℃；１分、72℃；最終伸長は５分、72℃）。全てのプライマー配列は確立されたジーンバンク（GenBank）の配列およびプライマー３プログラムを用いて決定した。ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対してデザインしたプライマーを用いたＰＣＲは、内部コントロールとして35サイクル増幅させた。各ＰＣＲ生成物の配列は自動配列決定を用いて確認した。非誘導ＰＬＡ細胞を陰性コントロールとして調べた。系列固有細胞株を骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列のための陽性コントロールとして分析した。ヒト骨格筋および脳の全ＲＮＡを逆転写し、それぞれ筋形成および神経形成系列の陽性コントロールとして増幅させた。
【０１４７】
ウェスタンブロット：
ＰＬＡ細胞を分化させ１％のＳＤＳに採集した。溶解物を均質化し、全タンパク質をアッセイした。各系列から等量のタンパク質をＳＤＳロード緩衝液（0.5Ｍトリス-HCl（pH6.8）、１％SDS、１ｍMのDTT、50％グリセロール、１％ブロモフェノールブルー）中で100℃、５分変性させた。標準的なプロトコルにしたがって、溶解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（10％分離ゲル、５％スタッキングゲル）によって分離させた。タンパク質をニトロセルロースメンブレンに一晩移動させ、前記メンブレンを最低限60分ウェスタンブロッキング緩衝液（WBB:５％脱脂粉乳、１倍のＰＢＳ、0.1％トウィーン-20）中で封鎖した。メンブレンを以下の抗体を補充したＷＢＢで最低限60分インキュベートした：骨形成についてはαＯＰ、αＯＮ、αＣＮＩ、αＤＥＣおよびαＢＧ；脂肪生成についてはαＧ４およびαＬＥＰ。さらにまた内部コントロールとしてトランスフェリンレセプターおよび可溶性熱ショックタンパク質HSC70に対する抗体とメンブレンをインキュベートした。メンブレンをＰＢＳ／0.1％トウィーン-20で最低限３回洗浄し、続いてアルカリホスファターゼに結合させた適切な二次抗体を補充したＷＢＢと60分インキュベートした。メンブレンを上記のように洗浄し、市販のキット（CSPD Ready-To-Use, Trppix, Bedford, MA）を製造元の支持にしたがって用いて前記二次抗体を可視化した。非誘導ＰＬＡ細胞もまた陰性コントロールとして分析した。
【０１４８】
神経形成分化：
免疫組織化学：サブコンフルエントのＰＬＡ細胞を予備誘導培地（ＤＭＥＭ、20％ＦＢＳ、1mMβ-メルカプトエタノール）で24時間培養した。予備誘導に続いて、細胞を神経形成培地（NM）で８時間まで誘導し、固有の神経形成系列（表８）を確認するためにＩＨで調べた。
RT-PCR：ＰＬＡ細胞を予備誘導培地で24時間前誘導し、続いてＮＭで９時間まで誘導した。ＰＬＡサンプルを採集してＲＮＡを単離し（QiaEasy, Qiagen）、さらに固有の神経形成遺伝子（表７）の発現について上記のようにRT-PCRで分析した。
ＰＬＡクローンの単離と分析：
クローンの単離：単離された単一細胞を得るために、ＰＬＡ細胞を極めて低コンフルエンシーで播種した。単一細胞の増殖によって明瞭なコロニーが形成されるまで、培養をコントロール培地で維持した。単一ＰＬＡ細胞に由来するコロニーを滅菌クローニングリングおよび0.25％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて採集した。採集したクローンをクローニング培地（15％ＦＢＳ、F12／ＤＭＥＭ（1:1）中の抗生物質／抗真菌剤１％）で拡大させた。
多系列能の確認：以前に記載したように（組織学および免疫蛍光法の項を参照されたい）増大させたクローンを多系列能について分析した。
分子的性状の決定：いくつかの系列特異的遺伝子の発現について上記のようにクローンを分析した。
【０１４９】
結果
幹細胞はＭＳＣと多くの類似性を共有する：
さらにＰＬＡ集団の性状を調べるために、細胞を間接ＩＦを用いて調べ、市販のヒトＭＳＣ集団と比較した。ＭＳＣは、この幹細胞集団を特定するために用いることができる固有の細胞表面マーカーセットを発現することが示されている（表６）（Bruder et al., J. Orthop. Res. 16:155-162(1998); Cheng et al., Endo. 134:277-286(1994); Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997); Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。ＭＳＣのように、ＰＬＡ細胞は前記タンパク質のいくつかを発現し（図23）、これら細胞の特徴が幹細胞であることを支持した。ＰＬＡおよびＭＳＣ培養のほぼ100％がCD29、CD44、CD90およびCD105/SH2の発現について陽性であり、これらマーカーの各々について高い発現レベルが両細胞集団で観察された。両細胞集団はまたＳＨ３抗原を発現し、前記抗原はＳＨ２とともにＭＳＣの特異的マーカーと考えられている（Haynesworth et al., Bone 13:69-80(1992)）。さらにまた、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの大半が、トランスフェリンレセプター、CD71について陽性であり、これら細胞集団の一部分が複製されていることを示している。ＰＬＡおよびＭＳＣは造血系列のマーカー、CD31およびCD34を発現しなかった。少数のＰＬＡサンプルがCD45について極めてわずかの染色を示したが、CD45陽性細胞数は全ＰＬＡ細胞数の５％を越えなかった。ＭＳＣとは異なり、粘着分子CD58に対する染色はＰＬＡ細胞では観察されなかった。CDマーカー発現についてのフローサイトメトリー分析はＩＦの結果を確認した（図24）。総合すれば、免疫蛍光分析およびフローサイトメトリーの結果は、ＰＬＡ集団と骨髄由来ＭＳＣとの間のＣＤ発現プロフィールにおけるいくつかの類似性を明示している。
【０１５０】
ＰＬＡ細胞は骨形成誘導に際して明瞭な変化を示す：
本実施例では、我々は、骨形成誘導に際してＰＬＡ細胞は明瞭な増殖、合成および骨化期を経ることを示す。ＰＬＡ細胞の骨形成能の特徴をさらに調べるために、骨誘導ＰＬＡ細胞の増殖を測定し、ＡＰ活性およびリン酸カルシウム生成に対する相関性を調べた（図25、パネル）。ＰＬＡ細胞数は骨形成分化の開始に際して（１日目から３日目）増加したが、極めてわずかなＡＰおよびフォンコッサ染色が観察された（図25、パネルＢ）。ＰＬＡ細胞数の直線的増加は３日目から９日目まで観察され、ごくわずかのＡＰ染色は13日目まで観察された。ＰＬＡ増殖速度は13日目と15日目の間で短時間平坦になった。これはいくつかのＰＬＡ集団で観察される現象であった。ＡＰ活性の劇的な増加が15日目と19日目との間で観察され、リン酸カルシウム沈着の最初の出現は３週間の誘導によって観察された。ＰＬＡ増殖速度の強化は15日目から25日目で測定され、ＡＰおよびＶＫ両染色の時間依存増強と同時に発生した。さらに、多層の結節構造物の形成およびマトリックス合成の増加もまたこの時期に観察された。ＰＬＡ細胞数は25日目以降減少し、付着性細胞を欠く結節間領域の発達を伴い、それといっしょにマトリックスの石化が増加した。総合すれば、これらの結果は、ＰＬＡ細胞は骨形成分化が進行するにつれ明瞭な増殖期および代謝期を経るらしいということを示している。
【０１５１】
アルカリホスファターゼ活性とマトリックス石化の時間依存増強：
in vivoでの骨形成は、モルフォゲン、ホルモンおよび成長因子を必要とする複雑なプロセスである。最近の研究は合成グルココーチコイド（例えばデキサメタゾン（Dex））の骨形成仲介における有効性に疑問を投げかけた。グルココーチコイドは、Cooperらの概論（Cooper et al., J. Endocrinol. 163:159-164(1999)）で示されるように、いくつかの骨形成遺伝子（オステオカルシン、CBFA-1およびCNIを含む）の作用を阻害するらしい。骨組織および骨前駆細胞はビタミンD作用の標的であることは確立されているが（Chen et al., J. Biol. Chem. 258:4350(1983); Chen et al., J. Biol. Chem. 254:7491(1979); Narbaitz et al., Calcif. Tiss. Int. 35:177(1983)）、この代謝物は、ヒト骨細胞集団によるＡＰ活性およびCNI合成の両者を刺激する（Beresford et al., Endo. 119:1776-1785(1986)）。したがって、ＰＬＡ細胞は、デキサメタゾン（Dex、10-7M）または1,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD、10-8M）のどちらかを含む２種の骨形成培地組成を用いて誘導した。ＡＰ活性およびCa2+の蓄積は市販のキットを用いて経時的に測定し、タンパク質および／または時間に対して標準化した。
【０１５２】
誘導ＰＬＡ、ＭＳＣおよびNHOst細胞をＡＰ活性について測定し、ステージ特異的誘導レベルを表９に示した。DexまたはＶＤ誘導のどちらかから得たＰＬＡ細胞のＡＰ活性は最初３週間で出現し、未分化ＰＬＡ細胞は全ての時点で無視できるレベルのＡＰ活性を示した（図26、パネルＡ）。３から６週間のＡＰ活性は、ＰＬＡ細胞のDexおよびＶＤ両刺激について二相性で、21日目および42日目にピーク活性があり、35日目にレベル低下があった。ＰＬＡ細胞のＶＤ誘導は３、４および５週でより高い酵素活性をもたらし、一方、６週間では２つの誘導条件間で顕著な差は測定されなかった。最大ＡＰレベルはＶＤ誘導ＰＬＡ細胞で３週間で検出され、一方、Dex処理では顕著な活性は検出されなかった。さらにまた、ＰＬＡ細胞はＶＤ刺激に対して３週間でより反応性が高く、これらの細胞でDex処理に対して酵素活性の誘導（enzyme induction）レベルの強化が測定された（Dexでは17.2倍誘導に対してVDでは71.3倍誘導）。ＰＬＡ細胞と同様に、Dex処理ＭＳＣでは無視できる程度のＡＰ活性が21日まで測定された。ＰＬＡ細胞とは対照的に、ＭＳＣのDex刺激は３、４および５週間でより高い酵素活性をもたらした。DexおよびＶＤ誘導で観察されたＭＳＣのＡＰ活性の全体的なパターンはＶＤ誘導ＰＬＡ細胞と類似していた（すなわち二相性）。しかしながら、減少レベルはＭＳＣで35日目ではなく28日目に測定された。さらにまた、ＭＳＣにおける最大の酵素活性は後期の分化ステージ（すなわち５／６週間）に検出された。最後に、ＰＬＡで観察されたように、２から３週間のＭＳＣの誘導は最大のＡＰ活性の誘導をもたらした。しかしながら、デキサメタゾンはＶＤ処理とは異なり、これらの細胞で酵素レベルにより強く影響を与えた（Dexでは54.2倍の誘導に対してＶＤでは1.1倍の誘導）。ＡＰ酵素活性のパターンはNHOst細胞では極めて相違した。最大ＡＰレベルはこれらの細胞では７日で観察され、この時点後酵素レベルは減少し、６週間で最低レベルに達した。無視できる程度の酵素活性をＶＤ処理骨芽細胞で35日目および42日目に検出することができた。さらにまた、いずれの誘導条件下でもＡＰ活性の顕著な相違は７日目から28日目までは測定されなかった。
【０１５３】
DexまたはＶＤによるＰＬＡおよびＭＳＣの誘導はマトリックスの石化の時間依存増加をもたらした（図26および表10）。ＡＰ活性と同様に、ＰＬＡ細胞はＶＤ誘導に対しより反応性が高く、マトリックスの石化では全体的により高い増加を示し（ＶＤで122倍に対してDexで56倍）、最大レベルは６週間で検出された。同様な作用がＶＤ処理ＭＳＣでも観察されたが、ただし最大レベルには１週間早く到達した。ＡＰ活性の場合のように、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの両者で無視できる程度の石化が３週間まで観察された。誘導条件の本来の作用はＰＬＡ細胞では６週間で観察され、ＶＤ処理細胞では顕著に高いリン酸カルシウムを伴った。ＰＬＡ細胞とは対照的に、誘導条件はＭＳＣサンプルの石化に顕著な影響を与え、Dex処理は分化の初期（３および４週間）にはるかに高レベルのカルシウムを生じ、この誘導条件下でのＡＰレベルと一致した。この傾向は５および６週間で入れ替わり、ＶＤは石化レベルを強化した。興味深いことには、Ca2+の減少が、DexおよびＶＤ処理ＭＳＣの両者で28日で観察され、この時点のＡＰ活性の低下と相関するように思われた。ＰＬＡ細胞およびＭＳＣとは対照的に、最大のCa2+の蓄積が誘導NHOst細胞で生じ、これ以降減少してNHOstで観察されたＡＰ活性と一致した。ＭＳＣのように、Dex誘導は、５週間以外の全ての誘導時点ではるかに多くのCa2+レベルをもたらした。コントロール骨芽細胞は最少レベルのCa2+レベルを有し、これら細胞は適切な誘導無しには自発的に石化しないことを示している。総合すれば、ＡＰおよびCa2+の分光分析データはＰＬＡ細胞の骨形成現象をさらに支持する。
【０１５４】
骨誘導ＰＬＡ細胞はオステオカルシンおよびＣＢＦＡ−１を発現する：
分子レベルでＰＬＡ細胞の骨形成表現型を確認するために、骨誘導ＰＬＡ細胞をRT-PCRおよびウェスタンブロッティングを用いて分析した。RT-PCR分析の場合、DexまたはＶＤを含むＯＭで時間を増加させながらＰＬＡ細胞を誘導した。NHOst細胞の他にDexまたはＶＤ誘導ＭＳＣもまた分析した。β-アクチンレベルはコントロール細胞と顕著には変化しなかったので、骨形成分化はＰＬＡ細胞に影響を与えるようには思われなかった（図27）。DexまたはＶＤによる誘導は調べた遺伝子の大半の発現に影響を与えなかった。しかしながら、劇的な影響は骨特異的遺伝子、ＯＣの発現で観察された。ＯＣ発現はDex処理およびコントロールＰＬＡ細胞では検出されず、またコントロールおよびDex誘導NHOst骨芽細胞でも検出されなかった。ＶＤによるＰＬＡ細胞の処理は二相性ＯＣ発現パターンを生じた。無視できるレベルのＯＣが誘導４日および14日で検出され、一方、顕著な増加が７日目に観察された。最後に、比較的一定レベルのＯＣ発現が21日目から42日目で観察された。ＰＬＡ誘導の最後の48時間の間にDexを除去しＶＤで置換することによってDexの作用が十分に克服され、顕著なレベルのＯＣ発現が誘導された。RT-PCRの結果とは対照的に、遺伝子マイクロアレイを用いた分析では非誘導コントロールに対してDex処理PLA細胞でわずかなＯＣ発現増加が検出された（図27、パネルＢ）。コントロールＭＳＣでも検出可能レベルのＯＣが観察されたので、ＯＣは骨誘導ＭＳＣに特異的ではなかった。ＭＳＣのDex処理は4日および７日でＯＣレベルを増加させるようにみえ、コントロール細胞のようにその後２週間および４週間で減少した。ＰＬＡ細胞と異なり、ＭＳＣのＶＤ誘導は二相性のＯＣ発現パターンを生じなかった。むしろ、この遺伝子の発現レベルは４週間の誘導期間の間一定を維持するように思われ、Dex処理と比較したとき上昇した。
【０１５５】
ＯＣの他に、骨特異的転写因子、CBFA1の発現をRT-PCRを用いて骨誘導ＰＬＡ細胞で観察した。CBFA1は全ての誘導時点で発現し、発現に対する識別可能な影響はDexまたはVD誘導に際して観察されなかった。さらに、コントロールで低いレベルのこの遺伝子が観察されたので、CBFA1発現は骨誘導ＰＬＡ細胞に特異的ではなかった。しかしながら、増加レベル（約２倍）のCBFA1発現が遺伝子アレイを用いて骨誘導ＰＬＡ細胞で測定された（図27、パネルＢ）。ＰＬＡ細胞のように、CBFA1は、未分化ＭＳＣコントロールでも低レベルで発現されただけでなくDexおよびVD誘導ＭＳＣで各誘導時点で発現された。CBFA1発現は骨芽細胞ではさらに制限的で、4週間の骨誘導NHOst細胞でのみ検出された。ＡＰ発現は分化およびコントロールＰＬＡ細胞、ＭＳＣおよびNHOst細胞において全ての時点で観察された。CBFA1およびＡＰの他に、高レベルのCNIがこれらの細胞で観察された。一方、CNI発現レベルにおける評価可能な差はＰＬＡ細胞のDexまたはVD誘導に際してRT-PCRでは観察されなかったが、遺伝子アレイ分析によって骨誘導に際してCNIレベルの低下が確認された（図27、パネルＢ）。ＯＣ、CBFA1、ＡＰおよびCNIの他に、分化ＰＬＡ細胞、ＭＳＣおよびNHOstは骨分化に一致する他のマーカー（OPおよびONを含む）を発現した。CNIで観察されたように、低下したレベルのＯＮおよびＯＰがまたDex処理ＰＬＡ細胞でアレイを用いて測定された（図27、パネルＢ）。転写因子、PPARγ1の発現増加がまた、非誘導コントロールと比較したときDex処理ＰＬＡおよびＭＳＣで観察された。さらにまた、低レベルのPPARγ1がＰＬＡ細胞でのVD誘導初期ステージ（4日目から14日目）で観察され、その後、4週間を越える誘導で発現が増加した。骨形成誘導は脂肪および軟骨分化と一致する遺伝子（それぞれPPARγ2およびCNII）の発現をもたらさなかった。総合すれば、骨誘導ＰＬＡ細胞における骨特異的OCおよび骨形成分化に特徴的な他の遺伝子の発現はさらにこれら細胞の骨形成能を支持する。
【０１５６】
最後に、ＰＬＡ細胞による骨形成分化は免疫蛍光分析およびウェスタンブロッティングによってタンパク質レベルで確認された。骨誘導ＰＬＡ細胞（ＯＭ／Dex）をＯＰ、ＯＮおよびＯＣの発現についてＩＦによって分析した。同一の条件下で誘導したＭＳＣもまたコントロールとして調べた。図28で示したように、非誘導および骨誘導ＰＬＡ細胞は特にＯＰおよびＯＮの両者を発現した（図28、パネルＡ）。ＯＰは、明瞭な核周囲の濃縮の他にコントロールおよび誘導細胞全体に均一に分布した。細胞外ＯＰ染色は観察できなかった。両細胞タイプで細胞内の斑点模様がまたＯＮについて観察された。さらに、このタンパク質に対する核内染色の増加がコントロールでも観察された。骨誘導に際して、ＯＮ染色は細胞が集中した領域で増強されるようにであり、細胞内および細胞外の両方で発現された。ＯＣの発現は非誘導細胞では観察できず、RT-PCRの結果と一致した。わずかなパーセンテージの骨形成ＰＬＡ細胞が低レベルのＯＣを細胞内で発現するようであった。これらのタンパク質について同様な発現パターンがＭＳＣで観察された。コントロールおよび誘導ＭＳＣは高レベルのＯＰおよびＯＮを発現した。ＰＬＡ細胞と同様に、斑点状の細胞内および核内染色パターンがＯＮについて観察され、誘導に際して核内染色は減少した（図28、パネルＢ）。コントロールおよび誘導ＭＳＣは細胞内でＯＰを発現した。しかしながらＰＬＡ細胞とは異なり、このタンパク質の核周囲の濃縮は観察されなかった。最後にRT-PCRのデータと一致してコントロールおよび誘導ＭＳＣは両者ともＯＣを発現した。
【０１５７】
骨形成タンパク質の発現をウェスタンブロット分析によって確認するために、ＰＬＡ細胞をＯＭ中で７、14および21日維持して溶解した。細胞溶解物をCNI、ＯＰ、ＯＮ、デコリンおよびバイグリカン発現について分析した。さらにまた、溶解物を内部コントロールとしてトランスフェリンレセプター（TfR）についても分析した。ＯＣはタンパク質のサイズが小さいという理由から（６kDa）調べなかった。同等レベルのTfR発現が骨誘導細胞およびコントロール培地で３週間維持したコントロールで観察されたので、骨形成分化はTfRの発現に変化を与えないらしい。相当レベルのCNI、デコリンおよびバイグリカンが骨誘導ＰＬＡ細胞で３種の誘導時間の全てで観察された。さらにまた、これらのタンパク質はまたコントロールでも観察され、分化および未分化ＰＬＡ細胞の両者がタンパク様ＥＣＭを伴うことを示唆している。これらマトリックスタンパク質と同様に、ＯＮおよびＯＰの両者が分化細胞および未分化コントロールで認められた。しかしながら、ＯＮレベルはＰＬＡの最初の誘導に際して減少するようにみえ、３週間までにコントロールレベルに復帰した。さらにまた、骨形成誘導は21日目にＯＰのかすかな増加を伴った。総合すれば、免疫蛍光データおよびウェスタンブロットデータによって、ＰＬＡ細胞の骨形成分化に合致するタンパク質発現が確認された。
【０１５８】
ＰＬＡ細胞は脂肪生成分化を示す：
脂肪生成分化は分化プログラムに拘束される前に前脂肪細胞の成長停止を伴う（以下で概論されている：Ailhaud et al., Annu. Rev. Nutr. 12:207-233(1992); MacDougald and Lane, Annu. Rev. Biochem. 64:345-373(1995); Smyth et al., J. Cell. Sci. 106:1-9(1993)）。ＰＬＡ増殖と脂肪生成分化との間の相関性を決定するために、ＡＭ中で３週間ＰＬＡ細胞を脂肪生成系列に誘導し、オイルレッドＯ染色を用いた分化度と併せて細胞数も決定した。分化（すなわち細胞内脂肪小胞の出現）は先ず初め４日誘導で出現した。オイルレッドＯ染色／脂質蓄積レベルの時間依存増加にもかかわらず、前脂肪細胞の拘束に合致してＰＬＡ細胞数の評価可能な増加は脂肪生成誘導中には検出できなかった（図29、パネルＡ）。分化レベルは、ＰＬＡ細胞がコンフルエントで互いに接触する状態にある培養領域で最大であった。これらの結果は、ＰＬＡ細胞の脂肪生成系列への拘束は細胞対細胞接触によって影響を受け、成長停止と同時に発生することを示唆している。
前脂肪細胞株（例えば3T3-L1）の脂肪転換（adipose conversion）はまた脂肪生成酵素（グリセロ-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GPDH））の活性増加を特徴とする（Wise et al., J. Biol. Chem. 254:273-275(1979)）。したがって、ＰＬＡ細胞をＡＭで誘導し、ＧＰＤＨ活性レベルを測定した。3T3-L1細胞を陽性コントロールとして同様に誘導した。ＰＬＡおよび3T3-L1細胞の初期の誘導（4日目および7日目）は比較可能なＧＰＤＨ活性をもたらし、コントロールＰＬＡレベルと同様であった（図30）。２週間のＰＬＡ細胞の誘導は酵素活性の減少をもたらし、コントロール、誘導ＰＬＡおよび3T3-L1細胞間に顕著な相違は観察されなかった。この減少はまた脂肪生成誘導ＭＳＣでも観察された。２週間を越える脂肪生成分化は、誘導ＰＬＡおよび3T3-L1細胞で特異的にＧＰＤＨ活性の増加をもたらした。酵素活性は４週と５週の間で平坦になり、コントロールＰＬＡ細胞より顕著に高かった。ＧＰＤＨ活性の時間依存増加は、脂肪誘導培養中の脂肪充満ＰＬＡ細胞のパーセンテージと相関性を示し（図29）、これら細胞の脂肪生成分化と一致した。
【０１５９】
ＰＬＡの脂肪生成を確認するために、脂肪誘導細胞をRT-PCRで分析した。図31に示すように、ＰＬＡ誘導は組織脂肪特異的（adipose-specific）転写因子PPARγ2の発現をもたらした。PPARγ2の発現は７日目に観察され、そのレベルは残りの５週間の誘導期間中一定を維持したようであった。この遺伝子の発現は非誘導ＰＬＡ細胞では検出されなかった。PPARγ2の他に、低レベルの脂肪生成遺伝子ＬＰＬおよびａＰ２が誘導ＰＬＡ細胞で発現された。低レベルのこれら遺伝子は脂肪誘導初期（４日）に観察され、続いて１週間で顕著に増加した。増加レベルは５週間にわたる誘導で維持された。ＬＰＬおよびａＰ２の基礎発現はコントロールＰＬＡでも観察されたが、誘導サンプルよりも顕著に低いレベルであった。骨誘導ＰＬＡ細胞のように、PPARγ1が脂肪誘導細胞で発現された。しかしながら、この遺伝子の発現パターンは骨誘導細胞とは異なるようで、初期の時点（4日目から14日目）で低レベルの発現が観察され、続いて３週間から６週間まで発現が増加した。ＭＳＣの脂肪生成誘導は同様な遺伝子発現パターンをもたらした。ＰＬＡ細胞のように、PPARγ2の発現は脂肪誘導ＭＳＣに特異的で、誘導の初期段階では出現しなかった。極めて低レベルのａＰ２およびＬＰＬもまたコントロール細胞で観察され、脂肪生成誘導はこれら遺伝子の7日を越える顕著な増加をもたらした。しかしながら、ＰＬＡ細胞とは対照的に、PPARγ1はコントロールＭＳＣでは観察されなかった。むしろ、この転写因子の発現は脂肪ＭＳＣに限定された。さらにまた、この遺伝子の発現パターンはPPARγ2のそれと類似し、誘導1週間までその発現は観察されなかった。最後に、これら遺伝子の発現を脂肪生成系列に誘導するか、またはコンフルエンスに成長させることによって誘導した3T3-L1細胞で調べた。ａＰ２およびＬＰＬの発現は脂肪誘導3T3-L1細胞で観察され、一方、PPARγ2発現の明白な抑制が観察された。ＰＬＡ細胞、ＭＳＣおよび3T3-L1細胞の脂肪生成分化は骨特異的遺伝子ＯＣおよび軟骨マーカーCNIIの発現をもたらさず、本脂肪生成誘導条件の特異性が確認された。要約すれば、脂肪誘導ＰＬＡ細胞によるPPARγ2の限定発現は、誘導によるａＰ２およびＬＰＬの発現増加とともにこの細胞のin vitroでの脂肪生成能を支持する。
【０１６０】
軟骨生成分化：
ミクロマス条件下でのＣＭによるＰＬＡ細胞の誘導は、ＭＳＣの軟骨生成誘導に際して認められるものと一致する、境界が明瞭なコンパクトな結節を生じた（Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998);Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998)）。ＰＬＡ細胞の軟骨形成分化は細胞密度および誘導条件に左右された。特にＰＬＡ結節はTGFβ1のみを含む誘導培地で形成されたが、デキサメタゾンの添加によってTGFβ1誘導ＰＬＡ結節のサイズが増した。結節形成はデキサメタゾンしか存在しない場合には観察されなかった。単層培養でＰＬＡの軟骨形成を開始させる試みは成功しなかった。軟骨形成ＰＬＡ細胞によって生成されるＥＣＭを調べるために、CNIIおよび硫酸化プロテオグリカンの発現について結節をＩＨによって調べた。ＣＭで14日間誘導したＰＬＡ結節は、硫酸化プロテオグリカンを特異的に確認するアルシアンブルーで陽性に染色された（図32、パネルＡ、ＡＢ）。前記と合致して、14日のＰＬＡ結節はまたケラタンおよびコンドロイチン-4-硫酸に特異的なモノクローナル抗体を用いて陽性に染色された（パネルＡ、それぞれKSおよびCS）。CNIIの発現はまたこれら結節でも観察された。アルシアンブルーおよびCNII染色はまたヒト軟骨切片でも観察され、さらにコントロール培地で維持された高密度ＰＬＡ培養では認められず、我々の組織学的およびＩＨプロトコルの特異性が確認された。
ＫＳおよびＣＳに対するＩＨ染色に加えて、これら硫酸化プロテオグリカンレベルを定量的ジメチルジメチレンブルーアッセイを用いて測定した（図32、パネルＢ）。ＰＬＡ結節およびＮＨＣＫコントロールをアッセイ前にパパインで予備消化して、タンパク質と糖タンパク質による可能な干渉を排除した。ＫＳおよびＣＳの時間依存増加が軟骨形成誘導の２週間までＰＬＡ結節で観察された。わずかな減少が両ＰＧについて３週間で観察された。高密度条件下で維持した非誘導ＰＬＡ細胞にもこれらのプロテオグリカンを含むＥＣＭが附随していた。さらにまた、誘導4日および７日のコントロールＰＬＡ細胞は誘導サンプルと比較してより多くのＫＳおよびＣＳを含んでいた。しかしながら顕著に多いプロテオグリカンは14日および21日の誘導ＰＬＡ細胞で観察された。
【０１６１】
ＰＬＡ細胞をＣＭ中で２週間処理することによって、RT-PCRで示されるように軟骨形成に合致するいくつかの遺伝子の発現がもたらされた（図33）。CNII発現は誘導ＰＬＡ細胞で特に観察され、７日目および10日目に限定された。RT-PCR分析によってCNIIのIIAおよびIIBの両スプライス変種の存在が確認されたが、ただしは図33ではIIB変種のみ示されている。低レベルのCNII発現はまたNHCKコントロールの軟骨形成誘導に際しても観察された。CNIIに対する類似の発現パターンが、大型プロテオグリカン（アグレカン）のアミノ末端に対してデザインしたプライマーを用いて誘導ＰＬＡ結節で観察された（AG）。このプロテオグリカンの発現はまた前記のカルボキシ末端に対するプライマーを用いて観察された（PG）。しかしながら、ＰＬＡ結節によるアグレカンの発現は、カルボキシプライマーを用いて７日目から14日目まで観察された。前記ＰＬＡの結果と合致して、NHCKコントロールの軟骨生成誘導はまた両プライマーセットを用いてアグレカンの発現を示した。最後にCNIIのように、アグレカンの発現は誘導ＰＬＡ結節およびNHCK細胞に特異的であった。CNIIに加えて、ＰＬＡ結節の軟骨形成誘導は14日目でのみCNX（肥厚性軟骨細胞のマーカー）の特異的発現をもたらした。これとは対照的に、CNXの発現はNHCKコントロールでは観察されず、その理由はそれが関節軟骨に由来するためであろう。ＰＬＡ細胞にはさらに別のコラーゲンタイプが附随する。誘導およびコントロールＰＬＡ細胞の両細胞でCNIおよびCNIIIが発現した。調べた大半のＰＬＡサンプルが限定された（4日目のみ）コラーゲン発現パターンを示し、いくつかのＰＬＡサンプルが14日目までCNIおよびCNIIIの発現を示した。誘導ＰＬＡ細胞はまたプロテオグリカン、デコリンおよびバイグリカン並びに遺伝子Cbfa-1を発現した。これらの遺伝子の発現は全誘導期間を通して観察され、コントロールＰＬＡ細胞でも観察された。デコリンおよびバイグリカンのレベルは一定に維持されたが、CBFA-1レベルのわずかな低下が誘導の後期段階（すなわち10日目および14日目）で出現した。いずれの時点でもＯＣの発現は観察されず、骨形成分化は存在しないことが確認された。総合すれば、誘導ＰＬＡ結節におけるCNII、アグレカンおよびCNXの特異的発現は、ＥＣＭ内のケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸の存在とともにこの細胞の軟骨形成表現型を支持する。
【０１６２】
ＰＬＡ細胞はMyod1、Myf5、ミオゲニンおよびミオシン転写物を発現する：
ラットのＭＳＣは筋形成潜在能力を有することが示された（Saito, 1995; Wakitani, 1995）。ＰＬＡ細胞が前記能力を有するか否かを調べるために、初期筋形成調節因子、myoD1およびmyf5の発現とともに、筋形成分化の後期マーカーであるミオゲニンおよびミオシン重鎖の発現について細胞を調べた。myod1、ミオゲニンおよびミオシンの発現は全ての誘導時点で観察され、一方、myf5の発現は1週間および３週間のみに限定されるようであった（図34）。myod1の筋形成決定における役割と合致して、この遺伝子のレベル増加は1週間で観察された。さらにまた、ミオゲニンレベルは一定に維持されるが、ミオシンについては時間依存発現増加が検出され、このタンパク質の成熟筋芽細胞での発現と一致した。ＰＬＡの結果と合致して、これら４つの筋形成遺伝子の発現はまたヒト骨格筋から調製した全ＲＮＡのサンプルでも観察された。したがって、これら筋形成調節タンパク質はＰＬＡ細胞の筋形成分化の可能性を示している。
【０１６３】
単一ＰＬＡ細胞に由来するクローンは多系列能を有する：組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）
ＰＬＡ細胞に多数の中胚葉性潜在能力が存在することはこの細胞の幹細胞としての特徴を強く支持する。しかしながら、この現象は単に系列特異的前駆細胞の夾雑によるものかもしれない。これが正しいか否かを決定するために、単一のＰＬＡ細胞に由来するコロニーの形成を促進するために十分に低いコンフルエンシーでＰＬＡ細胞を培養した。いくつかの多系列クローンを単離し、三系列潜在能をもつクローンを組織脂肪由来幹細胞またはＡＤＳＣと称した。ＰＬＡ細胞と同様に、ＡＤＳＣは形態的に線維芽細胞であった。増大させた後、他の細胞を示す形態的な証拠は観察されず、ＡＤＳＣ培養の均質性が確認された。500個のＰＬＡクローン単離株の分析によって、調べたクローン総数の約６％に分化潜在能力が確認された。７つのＡＤＳＣ単離株が三系列潜在能力を示し、骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列に分化した（表11）。三系列ＡＤＳＣの他に、いくつかの二系列クローン（Ｏ／Ａ、Ｏ／ＣおよびＡ／Ｏ）および単一脂肪生成系列クローンもまた単離された（図35）。組織学的染色によって測定したとき、分化レベルの定性的増加がＰＬＡクローン集団で観察された。最後に、ＩＦによって示されるように三系列ＡＤＳＣの単離および増大によってＣＤ発現プロフィールに変化は生じず、二系列クローンでも相違は検出されなかった（図36）。三系列ＡＤＳＣのRT-PCR分析によってその多系列潜在能力が確認された（図36）。
【０１６４】
ＯＭ／ＶＤ中で２から４週間ＡＤＳＣを誘導することによって、３および４週間でのみＯＣの発現がもたらされ、ＯＣ発現が２週間では検出できなかった骨誘導ＰＬＡ細胞と一致した。ＯＣの他に、ＯＮ、ＯＰ、CNIおよびＡＰの発現が全ての誘導時点で認められた。ＰＬＡ細胞のように、ＯＣの発現は誘導ＡＤＳＣに特異的であり、そしてまた脂肪マーカーPPARγ2は誘導およびコントロールクローンの両方で検出できた。２および４週間ＡＤＳＣの脂肪生成を誘導することによって、ａＰ２およびＬＰＬが特異的に発現した。興味深いことには、PPARγ2の劇的な減少が脂肪誘導ＡＤＳＣで観察され、４週間でのみわずかに発現した。不均質なＰＬＡ集団で観察されるように、骨形成分化は脂肪生成ＡＤＳＣでは検出されなかった。最後に、アグレカン、CNX、デコリンおよびバイグリカンの発現は軟骨誘導２週間で検出された。CNIIの発現はこの誘導時点ではこれらの細胞では観察できなかった。ＰＬＡ細胞のように、アグレカンおよびCNXの発現は軟骨形成ＡＤＳＣに限定され、ＯＣ発現は検出されなかった。ＩＨデータと併せて、RT-PCRの結果はＡＤＳＣ単離株の多系列能を確認し、ＰＬＡ集団の多系列能は仮定的幹細胞集団の存在によること示唆している。
【０１６５】
ＰＬＡ細胞は神経形成能を有するかもしれない：
胚中胚葉層はいくつかの結合組織を生じ、一方、その上に重なる外胚葉は多数の神経系組織および細胞タイプの先駆細胞である。最近の証拠によって、ＭＳＣを非中胚葉性系列に誘導し、仮定的神経形成潜在能力をもつ細胞に分化させることができることが示唆された（Deng et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:148-152(2001); Sanches-Ramos et al., Exp. Neurol. 164:247-256(2000); Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）。ＰＬＡとＭＳＣとの類似性は中胚葉の潜在能力を超えるものであるかもしれない。したがって、Woodburyらのプロトコル（ Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）にしたがってＰＬＡ細胞を神経外胚葉系列に誘導し、神経マーカー（NSE、trk-aおよびMAP-2を含む）の発現またはGFAPおよびGalC（それぞれ星状細胞および稀突起神経膠細胞のマーカー）の発現について調べた。ＰＬＡ細胞の誘導のために、サブコンフルエント培養を１mMのβ-メルカプトエタノール（βME）および20％のＦＢＳで最大24時間予備処理し（予備誘導）、続いて５から10ｍMのβMEを含む血清非含有培地（神経形成培地／NM）で８時間まで誘導した。予備誘導はＰＬＡ細胞の線維芽細胞形態を変化させなかった（図38、パネルＡ：PLA／0時間）。形態的変化はＮＭ誘導で早くも30分で観察され、培養の10％がニューロン様表現型を呈した。ＦＢＳがＮＭに添加された場合は形態的変化は観察されなかった。60分の誘導でニューロン様細胞の割合は培養の20％に増加した。３時間の誘導でこの表現型は最大70％まで増加し、この誘導時間を超えても顕著な増加は観察されなかった。ＮＭ誘導ＰＬＡ細胞は収縮を受け、多数の伸長部を有するコンパクトな細胞体を形成する。誘導時間の増加により細胞体はより球状になり、細胞突起は二次分枝を示した（パネルＡ：PLA／2時間およびPLA／8時間）。ＮＭでの誘導によって、顕著なＮＳＥ、trk-aおよびNeuNの発現がもたらされ、神経系列と合致した（パネルＢ）。ＰＬＡ培養の実質的に100％がＮＳＥおよびtrk-aの両者について陽性に染色された。ＮＳＥの結果とは対照的に、すべてのＰＬＡ細胞がNeuN陽性を示すようにはみえず、ＰＬＡ培養内のより限定されたニューロン様細胞サブセットが対応するようである。成熟ニューロンマーカーMAP-2およびNF-70の発現は観察されず、誘導ＰＬＡ細胞は初期発生段階を示していることが示唆された。さらにまた、誘導されたＰＬＡ細胞はGalCおよびGFAPを発現せず、ＰＬＡ細胞はそれぞれ稀突起神経膠細胞および星状細胞には分化しないことを示した。最後にコントロールＰＬＡ細胞はニューロン、稀突起神経膠細胞または星状細胞のいずれのマーカーも発現せず、我々の誘導条件および染色プロトコルの特異性が確認された。
【０１６６】
ＮＭ誘導で得られた系列をさらに調べるために、ＰＬＡ細胞をRT-PCRで分析した（図38、パネルＣ）。4.5時間ＮＭで誘導したＰＬＡ細胞は顕著な量のネスチンを発現した（ネスチンは神経幹細胞および前駆細胞で顕著な量で発現される中間体フィラメントタンパク質である（Lendahl, 1990））。ネスチン発現は非誘導ＰＬＡ細胞およびヒト脳調製全ＲＮＡでも検出された。末梢神経マーカーであるChaTの発現はＮＭ誘導細胞または脳では観察されなかった。さらにまた、ＮＭ誘導ＰＬＡ細胞はGAD65（成熟ニューロンのマーカー）を発現せず、この段階（例えばMAP-2、NF-70）のニューロンに対する抗体を用いた場合にＩＨ染色が認められないことと一致した。ＩＨの結果で認められるように、ＰＬＡ細胞はまたGFAPを発現しなかった。同様な発現パターンが９時間誘導されたＰＬＡ細胞で観察された。ネスチン、ＮＳＥ、NeuNおよびtrk-aの発現は、ChaTまたはGFAP発現が観察されないことと併せて、ＰＬＡ細胞はＣＮＳに特徴的な初期ニューロン表現型に分化する能力を有する可能性を示唆している。したがって、ＮＭで培養されたＰＬＡは外胚葉系列に分化することができる。さらにまた、Lumelskyらの最近のデータ（N. Lumelsky et al., Science 292:1389(2001)）は、胚性幹細胞を誘導してネスチンを発現する細胞に分化させることができることを示している。ネスチン陽性細胞の性状は膵前駆細胞であることが判明した。したがって、Lumelskyのデータは、ネスチン陽性細胞は中胚葉系列および外胚葉系列の両系列に分化することができることを示唆している。内胚葉表現型はさらにまた以下の1つまたは２つ以上の発現によって確認することができる：インスリン、グルコーストランスポーター２、膵島アミロイドポリペプチド、GATA4、GATA6、アルブミン、チロシンアミノトランスフェラーゼ。
【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
【表８】
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【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
【表１０】
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【０１７２】
【表１１】
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【０１７３】
【表１２】
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【０１７４】
【表１３】
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【０１７５】
考察
ＰＬＡ細胞が間葉系幹細胞集団を表しているのか否かをさらに確認するために、我々はこの細胞集団およびいくつかのＰＬＡクローン（組織脂肪由来幹細胞またはＡＤＳＣと称する）の分子的並びに生化学的性状検査を実施した。ＰＬＡ集団を多数の中胚葉系列（骨および脂肪を含む）に誘導し、系列特異的遺伝子およびタンパク質の発現をRT-PCR、間接免疫蛍光（IF）およびウェスタンブロッティングによって確認した。さらにまた、確立された生化学的アッセイを用いて、アルカリホスファターゼ（骨代謝のマーカー）、脂肪生成酵素グリセロ-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GPDH）の活性を、軟骨生成誘導時の硫酸化プロテオグリカンの蓄積と合わせて測定した。組織学的分析およびRT-PCRも用いてＡＤＳＣの多系列分化を確認した。最後に、ＰＬＡ細胞の神経形成系列細胞への分化の潜在能力についても調べた。
我々は、不均質ＰＬＡ細胞集団およびヒト脂肪吸引物から得たその派生クローン、ＡＤＳＣの多系列分化能を示した。この実験と合致して、我々は、いくつかの系列特異的遺伝子およびタンパク質の発現によって示されるように、ＰＬＡ細胞およびＡＤＳＣクローンは骨形成、脂肪生成、軟骨形成および筋形成分化を達成することができることを確認した。中胚葉系列の他に、ＰＬＡ細胞はまた、神経形成表現型と一致する系列に分化することができるようであった。総合すれば、前記分子的および生化学的データは、ＰＬＡ細胞はヒト脂肪組織から単離することができる仮定的幹細胞集団である可能性を示唆している。
【０１７６】
ＰＬＡ細胞はＭＳＣで観察されるものと類似するＣＤマーカー補完を発現する：
細胞集団の性状決定は、細胞表面で発現される固有のタンパク質の特定によって実施することができる。続いて、いくつかのグループが、ＭＳＣの性状をその細胞特異的タンパク質（例えばSTRO-1、SH2、SH3、SH4）および“群別指定”（Cluster designation）（CD）マーカー（Bruder et al., J. Orthop. Res. 16:155-162(1998); Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); Pitteger et al., Science 284:143-147(1999)）の発現を基準にして調べた。本実験では、細胞表面タンパク質の固有の組合せがＰＬＡ細胞で発現されることが確認された。さらにまた、ＰＬＡおよびＭＳＣ集団は両者ともに類似の発現パターンを示す。ＭＳＣのように、ＰＬＡ細胞は、ＩＦによって示されるとおりCD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH2、SH3およびSTRO-1を、ＦＣによって確認されるとおりCD13とともに発現した（図24）。ＭＳＣと同様に、ＰＬＡ細胞はCD4、８、11、14、16、19、31、33、34、45、56および62Eを細胞表面に発現しなかった（図24）。類似のこのCDプロフィールは、ＰＬＡ細胞がＭＳＣのような幹細胞集団である可能性を示唆している。しかしながら、前記類似性の存在は、ＰＬＡ細胞が、単に組織脂肪区画内に存在するＭＳＣ集団または組織脂肪区画に混入したＭＳＣ集団であるということを示しているのかもしれない。脂肪修復術（lipoplasty）は多数の血管の破壊をもたらし、血液損失を最小限にするために血管収縮剤が用いられるが、処理されたＰＬＡペレットは周辺の血液供給から得られるＭＳＣである可能性が存在する（Zvaifler et al., Atthritis Res. 2:477-488(2000)）。しかしながら、ＰＬＡとＭＳＣの間にはいくつかの微妙な相違が存在するように思われる。ＭＳＣとは対照的に、ＰＬＡ細胞ではＩＦを用いたときCD58は検出できないが、ＭＳＣではその発現が観察された（図23）。さらにまた、ＭＳＣはまたCD104、CD106およびCD140ａを発現することが報告されている（Bruder et al., J. Orthop. Res. 16:155-162(1998); Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); Pitteger et al., Science 284:143-147(1999)）。これらCD抗原の発現は、ＩＦまたはＦＣを用いた場合ＰＬＡ細胞では検出されなかった（表12）。これらの相違は、ＰＬＡ集団は別個の幹細胞集団であることを示しているのかもしれない。しかしながら、ＰＬＡ細胞がＭＳＣのクローン変種であるという可能性を排除することはできない。
【０１７７】
ＰＬＡ細胞は骨形成を示す：
間葉形成過程（mesengenic process）は以下を含む：１）先駆細胞の増殖、２）特定の成長因子およびサイトカインの作用による前記細胞の拘束、３）特定の遺伝子を発現する遷移性細胞タイプへの系列化の進行、および４）増殖停止および組織特異的生成物の生合成を特徴とする終末分化（Bruder et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997)）。骨形成は前記のパターンに綿密にしたがう。骨形成前駆細胞は分裂性前骨芽細胞および分泌性骨芽細胞に分化し、前記分泌性骨芽細胞はその分裂潜在能力を失い成熟骨細胞を形成する（Owen et al., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990); Stein et al., Connect. Tissue. Res. 20:3-13(1989)）。したがって、骨形成分化は増殖、マトリックス合成／成熟および石化の別個の相を特徴とする（Owen et al., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990)）。これと一致して、ＰＬＡ細胞の骨形成分化に際して別個の相が観察された。比較的直線状の成長速度が誘導の最初の週内で測定され、この時期は無視できる程度のＡＰ活性およびCa2+の沈積を特徴とする。増殖速度は９日目から13日目で増加し、13日目までにＡＰの出現が附随した。13日目と15日目の間で増殖は一時的に停止し、この時期にはＡＰ染色の顕著な増加は観察されなかった。細胞数の増加およびＡＰ染色の強化は２週間の誘導を越えて観察された。これらの発見は、頭蓋冠培養で報告された一連の事象と類似している。前記培養では、細胞は先ず増殖し、続いてＡＰのレベル上昇が示された（Aronow et al., J. Cell. Physiol. 143:213-221; Owen et al., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990)）。さらにまた、グルココーチコイドが骨形成前駆細胞の増殖を刺激することが主張されている（Shalhoub et al., Biochem. 28:5318-5322(1989); Tenenbaum et al., Endo 117:2211-2217(1985)）。ＡＰ活性の他に、顕著なレベルのカルシウムが３週までに観察され、ＰＬＡ細胞の石化相の開始を示した。マトリックスの石化の増加はＡＰ染色の劇的な増加を伴い、ラットの頭蓋冠培養で見出された結果と一致した（Collin et al., Calcif. Tiss. Int. 50:175-183(1992); Shalhoub et al., Biochem. 28:5318-5322(1989)）。石化の増加はまた増殖の停止を伴い（25日目）、ＰＬＡ細胞数の減少がこれに続いた。この減少はおそらく無機物の沈積増加のためであり、ＥＣＭの出現増加および細胞非含有結節間ゾーンの形成と同時に発生した。これと合致してＥＣＭの形成は、ラットの骨芽細胞（Owen et al., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990)）およびラットの骨髄間質細胞（Malaval et al., J. Cell. Physol. 158:555-572(1994)）による増殖停止の一因であると提唱されている。総合すれば、これらの結果は、ＰＬＡ細胞は骨形成分化中に別個の増殖、合成および石化相を有することを示唆している。
【０１７８】
グルココーチコイド過剰および／または長期にわたるin vivoでの処置は骨形成の低下を伴い（Baylink N. Engl. J. Med. 309:306-308(1983)）、これはおそらく前駆細胞から骨芽細胞への変換の低下によるのであろう（Chyun et al., Endo. 114:477-480(1984)）。デキサメタゾンとは対照的に、ビタミンＤ代謝物による処理は、骨由来細胞によるin vitroでの骨石化および骨形成を回復させる（Beresford et al., Endo. 119:1776-1785(1986); Kanis et al., 1982 in Endocrinology of Calcium Metabolism, ed. J.A. Parsons, New York: Raven Press, pp321）。したがって、ＰＬＡの骨形成に対するデキサメタゾンおよび1,25-ジヒドロキシビタミンＤ３（VD）の作用を調べた。ＡＰの骨／腎／肝アイソフォームはアルカリ性pHで無機および有機ホスフェートの切断を触媒する。in vivoでの骨形成時のＡＰの正確な機能は不明であるが、前骨芽細胞およびＭＳＣのＡＰ発現レベルは骨形成分化開始に際してアップレギュレートされ、この酵素はそのピロホスファターゼ活性を通してマトリックスの石化に主要な役割を果すと考えられた（McComb et al., 1979 Alkaline Phosphatase, New York: Plenum Press; Robison Biochem. J. 17:286-293(1923); Siffert, J. Exp. Med. 93:415-426(1951)）。したがって、ＡＰレベルおよびマトリックス石化の分析は骨形成の重要な指標である。このことから、前記のパラメーターを誘導ＰＬＡサンプルで測定し、同様に処理したＭＳＣおよびコントロールとしてヒト骨芽細胞と比較した。
【０１７９】
ＡＰ活性およびマトリックス石化に対する骨形成分化の全体的な影響は、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣで類似しているように思われるが、酵素活性のカイネティクスおよび誘導条件に対する反応は分化のステージに左右され、これら２つの集団は別個の表現型を有する可能性を示唆する。ＡＰ活性は２から３週間の誘導でＰＬＡおよびＭＳＣ両集団で出現した。ＰＬＡ細胞のＶＤ処理はDex誘導よりも３週間ではるかに高いレベルのＡＰ活性をもたらし、さらに２から３週間の誘導でより高レベルの酵素誘導をもたらした（17.2倍／Dexに対して71.3倍／VD）。このＶＤの作用は各分化ステージで観察された。対照的に、誘導条件の影響はＭＳＣでは逆で、Dexは各分化ステージではるかに強いＡＰ活性を生じた。測定された酵素活性および誘導レベルの相違の他に、ＡＰ活性のカイネティクスはＰＬＡ細胞およびＭＳＣで相違した。DexおよびＶＤ誘導ＰＬＡ細胞の両者のＡＰ活性は二相性であった。特に、ピークのＡＰレベルは３および６週間の両誘導条件下で測定され、レベル減少は５週間で検出された。ＰＬＡ細胞のように、二相性反応はまたDex処理ＭＳＣで観察された。しかしながら、ＡＰ活性のカイネティクスはDex処理ＭＳＣで加速されるように思われ、ピークは３および５週間で検出され、酵素の減少は４週間で検出された。さらにまた、明瞭な二相性パターンがＭＳＣのＶＤ刺激では観察されず、これら２つの細胞集団間の仮説的差異に更なる支持を提供する。
【０１８０】
ＰＬＡおよびＭＳＣ集団における二相性反応の理由は明らかではない。ラットの頭蓋冠モデルを用いた経時的実験では骨ＥＣＭの沈積中にＡＰ活性は初期にピークに達し、続いてダウンレギュレートされることが示された（Owen et a., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990); Rodan and Rodan 1984 in Bone and Mineral Research, ed. W.A., Amsterdam: Elsvier Science Publishers, pp. 244-285; Stein et al., FASEB J. 4:3111-3123(1990)）。類似のパターンが骨髄間質細胞培養で観察され、マトリックスの石化の進行および骨細胞への最終的骨形成分化に対する相関性が示された（Bruder and Caplan Bone 11:189-198(1990); Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997); Malaval et al., J. Cell. Physiol. 158:555-572(1994)）。４週間から５週間で観察されるＰＬＡのＡＰ活性の降下は、マトリックス中のリン酸カルシウムレベルの増加と相関性を有する。しかしながら、このマトリックス合成期以降のＡＰレベルを定量した実験は知られていない。したがって、本実験は長期にわたって幹細胞のＡＰ活性を調べた最初のものであろう。ＰＬＡおよびＭＳＣのＡＰ活性パターンが骨形成誘導に対するステージ特異的反応を表している可能性がある。これに合致して、ＡＰの増加がＶＤで処理された未熟骨肉腫培養で観察され（Majeska et al., J. Biol. Chem. 257:3362(1982)、一方、用量依存抑制がより成熟した細胞で検出され、その作用は、細胞の一部の骨前駆細胞への復帰または骨細胞（低いＡＰ活性をもつ細胞集団）への分化を表すと考えられた。したがって、ＰＬＡおよびＭＳＣサンプルにおけるＡＰレベルの減少は一部の細胞の最終分化による可能性があり、一方、二次的なＡＰピークは一部の骨形成前駆細胞の分化の遅れによるものかもしれない。
【０１８１】
ＡＰの結果と一致して、ＶＤによるＰＬＡ細胞の誘導は、デキサメタゾンと比較してカルシウムレベルのはるかに高い全体的増加をもたらした。ＡＰ活性と同様に、カルシウム蓄積における微妙な相違がＰＬＡ細胞およびＭＳＣの間で観察できた。ＡＰのデータと一致して、ＰＬＡ細胞によるマトリックスの石化は３週間の誘導まで観察されなかった。この時点以降、Dex刺激はマトリックスの石化速度に顕著な影響を与えるようにはみえなかった。しかしながら、劇的な増加がＶＤ処理ＰＬＡサンプルで検出された（６週間のサンプルは極めて多くのリン酸カルシウムを含む）。この石化速度の増加は、ＡＰは３週間と６週間のＶＤサンプル間では劇的には相違しないという事実にかかわらず発生した。さらにまた、ＰＬＡ細胞で４週間と５週間の間で観察されたＡＰ活性の減少はカルシウムレベルの低下に変換されなかった。むしろ、これらの細胞で無機物の蓄積は増加しつづけた。このようなパターンはヒトＭＳＣで以前に観察された（Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64:295-312(1997)）。ＰＬＡ細胞のように、石化の時間依存増加がＭＳＣで観察され、ＶＤ処理サンプルで観察されたはるかに高い増加を示した。これらの細胞のマトリックス石化パターンは最初の４週間の誘導以内ではＡＰ活性と良好な相関性を示した。特に、Dex処理ＭＳＣのより高いＡＰレベルはより高いカルシウム蓄積をもたらした。しかしながら、４週間から５週間誘導の間で劇的なシフトが生じ、カルシウムレベルに劇的な増加を生じるＶＤ処理ＭＳＣのＡＰ活性には小さな増加が生じる。さらにまた、ＶＤ誘導ＭＳＣのＡＰ活性はDex処理細胞よりも極めて低く、しかもＶＤ処理は極めて多くのカルシウムをもたらし、ＭＳＣは時間の経過にしたがってＶＤ誘導により鋭敏になることを示唆した。総合すれば、骨形成誘導時のＡＰの出現および石化ＥＣＭの蓄積はＰＬＡ細胞の骨形成表現型を支持する。さらにまた、これら２つのマーカーのカイネティクスおよびパターンで観察される相違は、ＰＬＡ集団はＭＳＣとは別個のものである可能性を示している。
【０１８２】
骨形成時に、骨芽細胞は周囲のＥＣＭの足場に取り込まれる多様なタンパク質を合成しない。前記マトリックスの組成は（分泌カイネティクスと併せて）、骨組織の固有の特性を明らかにするために役立ち、骨形成分化の確認に用いることができる。しかしながら、極わずかの例外を除き、実際のマトリックスのタンパク質は骨に固有ではない。これらの例外の１つはタンパク質オステオカルシン（OC）である。３つのγ-カルボキシグルタミン酸残基を含む高度に保存されたタンパク質、ＯＣはin vitroでのヒドロキシアパタイト生成の阻害剤であり、このタンパク質が石化に関与することを示唆している（Boskey et al., Calc. Tiss. Int. 37:75(1985); Price et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 73:1447-1451(1976)）。これと合致して、ＯＣは成熟骨芽細胞で発現され、その発現レベルは石化期に劇的に上昇する（Collin et al., Calcif. Tiss. Int. 50:175-183(1992); Malaval et al., J. Cell. Physiol. 158:555-572(1994); Owen et a., J. Cell Physiol. 143:420-430(1990);Shalhoub et al., J.Cell. Biochem. 50:425-440(1992); Stein et al., FASEB J. 4:3111-3123(1990)）。ＯＣは骨芽細胞分化の比較的後期のマーカーであると考えられるが、前記は大量のマトリックスが合成される前に骨髄間質細胞培養で骨形成の初期に発現される（ Malaval et al., J. Cell. Physiol. 158:555-572(1994)）。骨形成分化と一致して、骨誘導ＰＬＡ細胞はＯＣを発現した。しかしながら、その発現は骨誘導培地の組成によって左右された。特に、オステオカルシンの発現は非誘導ＰＬＡ細胞でもデキサメタゾン含有ＯＭで誘導したＰＬＡ細胞でも観察されなかった。Dex処理ＰＬＡ細胞でＯＣが発現されないのは、グルココーチコイドに附随する阻害作用のためかもしれない（Cooper et al., J. Endocrinol. 163:159-164(1999)）。これと一致して、無視できる程度のＯＣレベルがラットのＭＳＣおよびデキサメタゾン誘導ヒト骨細胞培養で観察された（Beresford et al., Endo. 119:1776-1785(1986); Leboy et al., J. Cell Physiol. 146:370-378(1991)）。さらにまた、この実験ではOCはヒト骨芽細胞細胞株、NHOstの誘導に際して観察されなかった（図27）。
【０１８３】
デキサメタゾン誘導とは対照的に、ＯＣ発現はＶＤ刺激でのみ観察され、骨肉腫細胞によるＯＣ発現のＶＤ依存増加（Price et al., J. Biol. Chem. 225:11660-11663(1980)、およびＯＣプロモーターのその刺激（Lian et al., Clin. Orthop. Rel. Res. 226:276-291(1988); Yoon et al., Biochem. 27:8521-8526(1988)）を確認する実験と一致する。ＶＤ誘導に際してのその出現に加えて、明瞭に区別されるＯＣの二相性発現パターンが観察された。骨髄ＭＳＣと合致して、ＯＣの出現は分化の最初のステージに附随していた（誘導から早くも４日で出現する）。ＯＣレベルの劇的な増加が１週間誘導後に検出された。２週間の誘導によってＯＣ発現の明白な抑制がもたらされ、続いて３週間後に発現が増加した。３週間でのＯＣの再出現は周囲のＥＣＭの合成および石化と同時に発生し、マトリックス石灰化に対するＯＣの提唱されている役割を支持することができよう。ＯＣの二相性パターンに関しては、ＡＰ発現で観察された作用と類似する作用、すなわちＶＤに対する発生ステージ特異的反応が生じているかもしれない。ＶＤに加えて、いくつかの他の誘導物質（TGFβを含む）もまた骨形成に対してステージ特異的作用を示す（Breen et al., J. Cell. Biochem. 160:323-335(1994)）。ＶＤ誘導ＰＬＡ細胞と同様にＯＣはまたＭＳＣで検出されるが、これらの細胞で観察されるＯＣ発現パターンにはいくつかの相違が観察された。第一に、ＰＬＡ培養とは対照的に、低レベルのＯＣ発現が非誘導ＭＳＣで観察された。コントロールＭＳＣの基礎レベルのＯＣ発現は極めて低く、ラットＭＳＣ培養の構成的ＯＣ発現の報告と一致した（Malaval et al., J. Cell. Physiol. 158:555-572(1994)）。第二にＯＣ発現はDex処理ＭＳＣで観察された。最後に、ＶＤ誘導はＭＳＣでＯＣの発現を増加させたが、明白な二相性パターンは観察されなかった。総合すれば、骨誘導ＰＬＡ細胞による骨特異的ＯＣの発現はＰＬＡ細胞の骨形成能を支持する。さらにまた、ＭＳＣおよびＰＬＡ細胞間で観察された異なるＯＣ発現パターンおよび誘導因子に対する異なる反応は、これら２つの集団は固有の表現型を有することをさらに示唆する。
【０１８４】
ＯＣの他に、骨誘導ＰＬＡ細胞はまた、ＯＰ、ＯＮ、CBFA1、ＡＰおよびCNIを含む骨形成系列に特徴的ないくつかの他の遺伝子を発現する。Cbfa-1（コア結合因子-1またはOsf-2）は、遺伝子CBFA1（runtドメイン遺伝子ファミリーのメンバー（Kania et al., Genes Dev. 4:1701-1713(1990)）によってコードされる転写調節因子である。初代骨芽細胞の核抽出物から単離されたCbfa1因子は、いくつかの骨形成遺伝子のプロモーター（OC、OP、BSPおよびI型CNを含む）と結合することが示され、したがって骨芽細胞分化の主調節因子として作用する（Ducy et al., Cell 89:747-754(1997)）。さらにまた、ヒトCBFA1のＣ末端領域の変異は、鎖骨頭蓋形成異常（CCD；骨格形成異常を特徴とする常染色体優性症状）を伴う（Jones et al., 1997 Smith's Recognizable Patterns of human Malformation, 5th ed., Philadelphia: WB Saunders Company; Mondlos et al., Cell 89:773-779(1997); Otto et al., Cell 89:765-771(1997)）。提唱されたその役割に合致して、DexおよびＶＤ誘導ＰＬＡ細胞は両細胞ともCBFA1を全ての誘導時点で発現し、２つの誘導条件間で発現レベルの顕著な相違は観察されなかった。ＰＬＡの結果と合致して、CBFA1はまた骨誘導ＭＳＣでも発現され、NHOst細胞では後期分化ステージに限定された。最後に、未分化ＰＬＡ細胞およびＭＳＣは両者ともこの成長因子を低レベルで発現した。しかしながら、ＰＬＡ細胞の骨形成誘導は、遺伝子アレイを用いて確認したとき約２倍のCBFA１発現の増加をもたらした。さらにまた、マウスの発生における最近の実験で、Cbfa1は骨形成系列および軟骨形成系列の両系列の前記細胞で発現されることが示唆された（Ducy et al., Cell 89:747-754(1997)）。したがって、コントロールＰＬＡ細胞のCBFA１の発現は前駆細胞表現型を有する細胞の基礎遺伝子発現を示しているのかもしれない。
【０１８５】
CBFA１と同様に、ＯＰ、ＯＮ、ＡＰおよびＣＮＩはコントロールおよび骨誘導ＰＬＡ細胞、ＭＳＣ並びにNHOstで分化の間中観察された。これらの細胞タイプにおけるＣＮＩの発現は、RT-PCRを用いたとき各誘導条件下で同等のようであった。しかしながら、この遺伝子の発現低下が遺伝子アレイを用いたとき骨誘導ＰＬＡ細胞で検出され、コラーゲン発現に対するグルココーチコイドの提唱された阻害作用と一致する（以下で概論されている：Cooper et al., J. Endocrinol. 163:159-164(1999)）。他の遺伝子に関しては、ＯＮおよびＯＰ発現は誘導条件によって影響を受けるようには思われなかった。さらにまた、骨形成誘導はマイクロアレイで測定したときＯＰレベルの顕著な低下をもたらし、ラットの骨髄間質細胞の誘導に際して観察された低下と一致した（Malaval et al., J. Cell. Physol. 158:555-572(1994)）。骨形成細胞に限定されないが、ＯＰおよびＯＮの両方が骨組織で大量に見出される。したがって、前記の発現は、ＯＣのような骨芽細胞特異的遺伝子とともにＰＬＡ細胞の骨形成能を支持する。これらの骨形成遺伝子の他に、骨誘導ＰＬＡ細胞は、プロテオグリカン（デコリンおよびバイグリカン）および転写因子（PPARγ1およびPPARδ）を含むいくつかの他の遺伝子を発現した。
【０１８６】
RT-PCRの結果の他に、骨形成分化に特徴的ないくつかのタンパク質の発現がまたＩＦおよびウェスタンブロッティングを用いて観察された。RT-PCRのデータと合致して、コントロールおよび骨誘導ＰＬＡ細胞は、骨形成表現型と合致するいくつかのタンパク質（CNI、デコリン、バイグリカン、OPおよびONを含む）を発現した。ＣＮＩ、デコリン、バイグリカンおよびＯＮ発現には顕著な相違は骨形成誘導で観察されず、ＯＰ発現の増加は誘導３週間後に観察された。ＯＮおよびＯＰの発現もまたコントロールおよび骨誘導ＰＬＡ細胞でＩＦを用いて観察され、２つの細胞集団間で細胞内発現パターンにおける相違が検出された。特に、コントロールおよび誘導ＰＬＡ細胞の両細胞におけるＯＰ発現は核周囲に集中したが、その分布はＭＳＣサンプルでより均一のように見えた。この核周囲濃縮は骨形成中のＭＳＣで観察され、分泌タンパク質の特徴である（Zohar et al., Eur. J. Oral. Sci. 106:401-407(1998)）。しかしながら、この実験とは対照的に、ＯＰの明瞭な核周囲濃縮は我々のＭＳＣ集団では観察されず、クローン変種または特定の培養条件を示しているのかもしれない。むしろ、ＭＳＣのＯＰは細胞表面および細胞突起に集中した。この巣状分布はまたＭＳＣで観察され、分化中のこれらの細胞による細胞移動を示しているのかもしれない（Zohar et al., Eur. J. Oral. Sci. 106:401-407(1998)）。類似の細胞内パターンはコントロールＰＬＡおよびＭＳＣサンプルでＯＮについて観察された。これらの細胞ではＯＮは微細な点状パターンとして細胞全体に分布し、核内にも低レベルで見出された。骨形成誘導はＭＳＣでこのパターンに変化を与えなかった。しかしながら、核内発現はＰＬＡ細胞の分化に際して失われた。さらにまた、ＯＮは実質的に全てのコントロールＰＬＡ細胞で見出されたが、全ての骨誘導ＰＬＡ細胞がＯＮ陽性であったわけではない。むしろ、このタンパク質の発現は高い細胞密度領域で見出された。最後にＯＣの発現はコントロールＰＬＡ細胞では観察されなかったが、非常に低レベルが未分化ＭＳＣで検出され、RT-PCRによる発見と一致した。骨形成誘導はわずかなパーセンテージの骨形成ＰＬＡ細胞でのＯＣ発現をもたらしたが、一方、高いパーセンテージの骨形成ＭＳＣがこのタンパク質を発現した。ＯＣの発現パターンは骨形成ＰＬＡおよびＭＳＣの両者で類似していた。すなわち細胞全体に分布するが、細胞表面に沿って境界の明瞭な領域に集中した。ＣＮＩ、ＯＰおよびＯＮと併せて、ＯＣの発現はRT-PCRのデータと一致し、ＰＬＡ細胞のin vitroでの骨形成能をさらに確認した。
【０１８７】
ＰＬＡ細胞は脂肪生成分化を示す：
培養脂肪細胞の分化は多くの因子（血清、ホルモン補充物質（インスリン）および薬剤（インドメタシン、ＩＢＭＸ）を含む）に左右される（Green et al., Cell 3:127-133(1974); T.R. Russell Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 73:4516-4520(1976); Williams and Polakis, Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:175-186(1977)）。しかしながら、脂肪生成プログラムの開始は、最終分化と対照的に、そのような脂肪生成剤を要求しないが、培養コンフルエンスの増加に左右されるであろう。さらにまた、ほとんどの前脂肪細胞が脂肪生成系列に拘束される前に、コンフルエンスでの可逆的な成長停止が発生する必要があることが知られている（Scott et al., J. Cell Biol. 94:400-405(1982); Speigelman and Farmer, Cell 29:53-60(1982); Trayhurn and Ashwell, Proc. Nutr. Soc. 46:135-142(1987)）。脂肪生成分化が進行しているとき、増殖能力の低下が観察され、複製能の不可逆的低下は脂肪細胞最終分化の特徴である。ＰＬＡ細胞が同じ特徴を示すか否かを解明するために、オイルレッドＯ蓄積によって測定されるＰＬＡ増殖と脂肪生成との相関性を調べた。前脂肪細胞の細胞株による研究と合致して、コンフルエントなＰＬＡ培養で高レベルの分化が発生した。分化ＰＬＡ細胞はより拡張した形態を示し、早くも誘導２週間で細胞内に脂肪滴を蓄積し始めた。ＰＬＡ細胞数の顕著な増加を示すことなく分化は進行し、細胞数と成長カイネティクスはＰＬＡの脂肪生成と連係していることを示唆した（図29）。
【０１８８】
ＰＬＡ−ＣｄマーカーおよびＥＣＭ−補充
脂肪生成分化は、グルコースの脂肪酸およびトリグリセリドへの変換を触媒する脂肪生成酵素の増加を含むいくつかの分子的および生化学的事象を伴う。グリセロール-3-ホスフェート（G３P）は脂肪組織におけるトリグリセリド合成のための主要基質であり、３Ｔ３細胞による脂肪変換はＧ３Ｐの酵素供給源、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（GPDH）の劇的な増加を特徴とする（Kuri-Harcuch et al., J. Biol. Chem. 252:2158-2160(1978); Pairault Greem, J. Biol. Chem. 76(1979)）。これを根拠にして、GPDH活性を脂肪誘導ＰＬＡおよび3T3-L1細胞で測定した。３週間の誘導までは分化細胞および非誘導コントロール間で、GPDHレベルに顕著な相違は検出されなかった。さらにまた、初期分化期間にはより高いGPDH基礎レベルが示された。脂肪誘導ＰＬＡ細胞におけるGPDHレベルの増加はオイルレッドO染色の出現を伴った（図29）。３から４週間の誘導によって、分化ＰＬＡ細胞および3T3-L1コントロールの両方でGPDHの顕著な増加がもたらされ、同時に脂質の蓄積が生じた。さらに1週間の分化の継続によってこれらの細胞集団で酵素レベルは顕著には変化しなかった。GPDH活性の類似のパターンがまた脂肪誘導ＭＳＣで観察された。したがって、脂肪生成系列に誘導されたＰＬＡ細胞におけるGPDH酵素活性の増加は、これら細胞が脂肪生成分化を経ている可能性を示す。
【０１８９】
骨形成のように、脂肪生成は、脂質合成および貯蔵に必要な明瞭な遺伝子セットの発現を特徴とする。前記遺伝子の１つ、PPARγ2は、PPARγ1およびPPARδとともにPPAR核内ホルモンレセプタースーパーファミリーのメンバーである（以下で概略されている：Fajas et al., Curr. Biol. 10:165-173(1998)）。PPARγ2は、組織特異的aP2遺伝子の主要な転写調節因子として機能するヘテロダイマー複合体（ARF6およびレチノイドXレセプターを含む）の部分として特定された（Totonoz et al., Nucl. Acid Res. 1995）。さらにまた、PPARγ2は特に脂肪内で高レベルで発現され、培養脂肪細胞株の分化の初期に誘導される（Totonoz et al., Genes Dev. 8:1224-1234(1994); Totonoz et al., Cell 79:1147-1156(1994)）。これと一致して、PPARγ2は脂肪誘導ＰＬＡおよびＭＳＣサンプルで特異的に検出された。これら細胞集団の初期分化（すなわち4日）はこの転写因子が存在しないことが特徴で、分化３Ｔ３脂肪細胞から得られた以前の結果と一致する（Totonoz et al., Genes Dev. 8:1224-1234(1994); Totonoz et al., Cell 79:1147-1156(1994)）。検出可能なPPARγ2レベルは誘導1週間後に観察された。しかしながら、この時点で脂肪誘導ＰＬＡ細胞での発現レベルは極めて高く、PPARγ2の発現カイネティクスはＭＳＣおよびＰＬＡ集団間でわずかに異なる可能性が示唆された。PPARγ1発現における相違はまたＰＬＡ細胞およびＭＳＣ間で観察された。PPARγ1発現における同様な時間依存増加がＰＬＡ細胞およびＭＳＣで観察された。しかしながら、ＭＳＣの初期分化（すなわち4日）はこの転写因子の欠落を伴い、一方、誘導ＰＬＡ細胞では低レベルが検出された。さらにまた、PPARγ1はコントロールＭＳＣでは検出されなかった。最後に、検出可能レベルのPPARγ1が非誘導ＰＬＡ細胞で観察され、脂肪生成誘導は顕著な発現増加を伴い脂肪生成分化と合致した。
【０１９０】
PPARγ2は、成長停止および前脂肪細胞の脂肪生成系列への初期拘束を伴う。この分化期間はまた、遺伝子ＬＰＬが発現する時点を示す（Ailhaud et al., Annu. Rev. Nutr. 12:207:233(1992); Fajas et al., Curr. Biol. 10:165-173(1998)）。ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）は普遍的に発現されるが、脂肪組織では顕著にアップレギュレートされる。そのトリグリセリドの加水分解をとおしてＬＰＬは脂質の交換を促進し、いくつかのトリグリセリド富裕リポタンパク質（HDLおよびLDLを含む）の代謝に影響を与える（Eisenberg et al., J. Lipid Res. 25:1017-1058(1984)）。その普遍的な発現と一致して、非誘導ＰＬＡおよびＭＳＣコントロールは低レベルのＬＰＬを発現した。しかしながら、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの脂肪生成誘導はこの遺伝子の顕著な増加を伴った。この増加は誘導後１週間で観察され、残りの分化期間をとおしてそのレベルは同じように持続した。最後に、長期の前脂肪細胞の分化は後期脂肪生成マーカーの発現をもたらし、成熟脂肪細胞内の脂質の蓄積を伴う（Ailhaud et al., Annu. Rev. Nutr. 12:207:233(1992); Fajas et al., Curr. Biol. 10:165-173(1998)）。そのような後期マーカーの１つは脂肪酸結合タンパク質aP2である（Bernlohr et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 81:468-472(1984); Bernlohr et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 132:850-855(1985)）。以前の結果（Bernlohr et al., Biochem. Biophys. Res. Comun. 132:850-855(1985)）と合致して、aP2は3T3-L1コントロールで、ＬＰＬおよびPPARγ2とともに検出された。しかしながら、脂肪細胞における後期マーカーとしてのその分類にもかかわらず、aP2発現はＰＬＡ細胞およびＭＳＣの両者で脂肪生成誘導期間を通して観察され、出現レベルは各誘導時点で同じようであった。さらにまた、aP2発現は、前脂肪細胞で観察された発現パターンとは全く反対にPPARγ2の発現に先行した（Totonoz et al., Genes Dev. 8:1224-1234(1994); Totonoz et al., Cell 79:1147-1156(1994)）。脂肪生成におけるその機能と合致して、極めて低レベルのaP2が非誘導コントロールで見出された。この構成的発現は脂肪以外の組織におけるaP2の発現と一致（Zezulak and Green, Mol. Cell Biol. 5:419-421(1985)）し、LPLの結果と類似する。総合すれば、脂肪誘導ＰＬＡ細胞におけるPPARγ2の脂肪生成特異的発現は、LPLおよびaP2のアップレギュレート発現とともに、これら細胞の脂肪生成能力を支持する。さらにまた、これら細胞の骨形成能と組み合わされた脂肪生成能は、ＰＬＡ細胞は多系列潜在能をもつ可能性を示唆する。
【０１９１】
ＰＬＡ細胞は軟骨形成を示す：
細胞株の軟骨形成分化は、特定の成長因子［例えばTGFβ1、TGFβ3またはBMP2（Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998); Mackay et al., Tissue Eng. 4:415-428(1998)）］による補充の他に、高密度培養（Johnstone et al., Exp. Cell Res. 238:265-272(1998)1）、細胞凝縮プロセスの再現（Fell, J. Morphol. Physiol. 40(1925)）を必要とする。これと一致して、TGFβ1を含むＣＭ中でのＰＬＡ細胞の凝集培養は小さくコンパクトな結節を誘導24時間で形成した。誘導されたＰＬＡ結節はアルシアンブルー染色で陽性に染色され、結節ＥＣＭ内の硫酸化プロテオグリカンの存在と合致し、上記実施例７で述べた結果と一致した。アルシアンブルー染色は結節の内部にさらに強く集中するように見え、誘導３日で明白であった。アルシアンブルー染色と一致して、ＰＬＡ結節はまたケラタン‐およびコンドロイチン-4-硫酸（軟骨で大量に発現される２つのプロテオグリカン）を含んでいた。これらの結果と一致して、ＫＳおよびＣＳの発現はまた、軟骨系列に誘導されたヒト骨髄ＭＳＣでも観察された（Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998); Yoo et al., Clin. Orthop. S73-81(1998)）。硫酸化プロテオグリカンの他に、ＰＬＡ結節はまたII型コラーゲン（軟骨組織に特徴的なコラーゲンアイソフォーム）を発現した。最後に、高密度条件下で培養し、非誘導コントロール培養で維持したＰＬＡは結節を形成せず、さらにいずれの軟骨特異的組織学的マーカーに対しても染色されず、我々の誘導条件の特異性が確認された。
【０１９２】
硫酸化プロテオグリカンの定量は、異染性ジメチルジメチレンブルーアッセイを用いて実施できる（Farndale et al., Biochimica et Biophysica Acta 883:173-177(1986)）。我々の免疫組織化学検査の結果と一致して、DMMBアッセイによって弁別的ＰＬＡサンプルで硫酸化プロテオグリカンの存在が確認された。さらにまた、軟骨形成ＰＬＡ結節内のＫＳおよびＣＳの時間依存増加は誘導２週間まで観察された。同様な増加はまた誘導ＭＳＣ培養でも観察され（Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998); Yoo et al., Clin. Orthop. S73-81(1998)）、ＰＬＡ細胞は軟骨組織に特徴的なＥＣＭを蓄積することを示唆した。ＰＧレベルは２週間の誘導を過ぎてわずかに減少し、軟骨性ＥＣＭの改造を示しているのかもしれない。高密度条件下で維持された非誘導ＰＬＡ細胞はまたこれらのプロテオグリカンを含むＥＣＭを伴っていた。さらにまた、ＰＧの基礎レベルは誘導ＰＬＡサンプルよりも４日および７日で高かった。しかしながら顕著に多くのプロテオグリカンの蓄積が14日および21日の誘導ＰＬＡ結節で観察された。誘導ＰＬＡ結節のＥＣＭ内のＫＳおよびＣＳの顕著な蓄積は、組織学的検査とあいまって、ＰＬＡ細胞はまた高密度条件下で培養されたときin vitroで軟骨形成能を有することを示唆している。
【０１９３】
ＣＭ中でのＰＬＡ細胞の誘導は軟骨形成に合致するいくつかの遺伝子の発現をもたらした。CNII発現は誘導ＰＬＡ細胞で特異的に観察され、７日目および10日目に限られ、我々の免疫組織化学の結果を支持した。CNIIと類似する限定的発現パターンが、アグレカン（AG）（軟骨で大量に発現される大型のプロテオグリカン）のアミノ末端に対してデザインしたプライマーを用いてＰＬＡ結節で観察された。アグレカンの発現はまたカルボキシ末端（PG）に対するプライマーを用いてＰＬＡサンプルで観察された。しかしながら、７日目および10日目の発現に加えて、ＰＧはまたこれらの結節で14日目にも検出された。ＰＬＡの結果と合致して、誘導NHCK結節でのアグレカンの発現はアミノおよびカルボキシプライマーの両プライマーセットを用いて検出された。CNIIのように、アグレカンの発現は誘導ＰＬＡおよびNHCK結節に特異的であった。CNIIの他に、ＰＬＡ細胞の軟骨形成誘導によってＣＮＸ（肥厚性軟骨細胞マーカー）の限定的発現がもたらされた。ＣＮＸの発現は14日目に検出され、ＰＬＡ結節は時間をかけて肥厚することを示唆している。誘導NHCKサンプルはまたＣＮＸを発現するが、ただしそのレベルは低い。ＰＬＡ結節はさらに別のコラーゲンタイプ（CNIおよびCNIIIを含む）も伴っていた。調べたＰＬＡサンプルの大半は限定されたコラーゲンパターン（４日目のみ）を示すが、ＣＮＩおよび、は14日目までいくつかのＰＬＡサンプルで検出された。ＣＮＩの発現はまた、外側結節に存在する線維芽細胞によってヒトＭＳＣ結節でも観察され、このために研究者らは前記の領域が分化プロセスに巻き込まれる軟骨膜様細胞を含むと考えた（Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80:1745-1757(1998); Yoo et al., Clin. Orthop. S73-81(1998)）。これと合致して、軟骨膜様細胞はまたニワトリ胚肢芽細胞の高密度培養および細胞凝集物でも観察された（Osdoby and Caplan Devel. Biol. 73:84-102(1979); Tachetti et al., J. Cell Biol. 106:999-1006(1987)）。したがって、選択したＰＬＡサンプルでＣＮＩが持続的に発現するのは同様な細胞集団が存在するためであろう。
【０１９４】
誘導ＰＬＡ細胞およびコントロールＰＬＡ細胞もまたプロテオグリカン（デコリンおよびバイグリカン）および遺伝子CBFA1を発現した。デコリンおよびバイグリカンは軟骨性ＥＣＭ内の小型のロイシンに富むプロテオグリカンの大半を構成し、ＰＬＡ結節内のそれらの発現はさらにその軟骨形成表現型を支持する。骨形成時のその発現に加えて、軟骨細胞の肥厚および最終分化におけるCBFA1の役割が最近確認された（Enomoto et al., J. Biol. Chem. 275:8695-8702(2000)）。したがって、CBFA1の発現はCNXとあいまって、結節内でのＰＬＡ細胞の最終分化を示しているのかもしれない。軟骨細胞の肥厚はまた軟骨組織の石灰化に先行する。しかしながら、骨特異的ＯＣの軟骨形成ＰＬＡまたはNHCK細胞による発現はいずれの時点でも観察されず、ＰＬＡ結節内に骨形成分化は存在しないことが確認された。興味深いことには、ＣＭ中でのＭＳＣのミクロマス培養は結節を形成せず、したがって検査しなかった。総合すれば、誘導ＰＬＡ結節におけるCNII、アグレカンおよびCNXの特異的発現は、ＥＣＮ内にケラタン-およびコンドロイチン-4-硫酸が存在することと併せてこれら細胞の軟骨形成表現型をさらに支持する。さらにまた、ＰＬＡ細胞の軟骨形成能は、その骨形成能および脂肪生成能とともにこれら仮説的幹細胞の多系列能を支持する。
【０１９５】
ＰＬＡ細胞は筋形成分化を示す：
筋形成系列に誘導したＰＬＡ細胞のRT-PCR分析によって、筋特異的タンパク質（ミオシン重鎖）の他にいくつかの筋形成遺伝子（転写因子MyoD1、ミオゲニンおよびmyf5を含む）の発現が確認された。筋形成系列の決定は、MyoD1およびmyf5（これらは増殖している筋芽細胞で発現される）によって転写レベルで制御されると考えられる（Atchey et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. 91:11522-11526; Lassar et al., Curr. Opin. Cell Biol. 6:432-442(1994); Weintraub et al., Genes Dev. 15:2203-2211(1994)）。一方、筋形成分化プログラムの実行はミオゲニンおよびMRF4発現によって制御される（Emerson et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 3:265-274(1993); Olson et al., Cell 5:1-4(1996)）。最後に、筋芽細胞の最終分化はミオシン重鎖の発現によって確認することができる。これらの発見と合致して、myf5の発現は筋形成ＰＬＡ誘導の最初の３週間に限定され、MyoD1発現の増加は分化期間の残りの部分と比較して第１週に検出された。筋誘導ＰＬＡ細胞はまた、６週間の誘導期間を通して比較的同等レベルでミオゲニンを発現した。最後に、ミオシン重鎖の発現増加は誘導６週間で検出され、ＰＬＡ細胞は最終分化を示すことが示唆される。myf5の発現および筋形成はさらに、ＰＬＡ細胞のこの筋形成能力は、その骨形成、脂肪生成および軟骨形成能力と併せて、多数の中胚葉系列へのそれらの分化能を示している。
【０１９６】
ＰＬＡ細胞は神経形成潜在能力を有するかもしれない：
幹細胞の真の多能性は別個の胚性系列に由来する細胞への分化で達成される。最近の報告では、ＭＳＣの神経細胞への分化（Deng et al., Genes Devel. 8:3045-3057(1994); Kopen et al., Proc. Natl. AcＡＤＳＣi. USA 95:3908-3913(1999); Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurol. 164:247-256; Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）および神経幹細胞（ＮＳＣ）の造血細胞への分化（Bjornson et al., Science 283:534-537(1999)）が記載され、幹細胞集団は以前に考えられたように制限されない可能性が示唆された。これらの発見から、我々はＰＬＡ細胞がその仮説的多系列中胚葉系能力を超えて誘導できるか否かを調べた。この目的のために、神経形成分化を誘導することが判明している培地（Vescovi et al., Exp. Neurol. 156:71-83(1999); Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）中でＰＬＡ細胞を培養し、分化について、神経マーカー（NSE、trk-aおよびMAP-2を含む）について、またはGFAPおよびGalC（それぞれ星状細胞および稀突起神経膠細胞のマーカー）について染色することによりアッセイした。この形態学的および組織学的データによって、ＰＬＡ細胞がＭＳＣと同様にin vitroで神経形成潜在能力を有することが示唆された。PLA細胞をＮＭ中で最低限30分誘導することによって劇的な形態変化が生じ、細胞はニューロン様表現型を示した。ＮＭ誘導ＰＬＡ細胞は収縮を示し、多数の突起を有するコンパクトな細胞体を形成した。誘導時間が増すにつれ細胞体はより球状になり、細胞突起は二次分枝を示した。全ての誘導ＰＬＡ培養で、この表現型を有するＰＬＡ細胞の割合に時間依存増加が観察された。類似の形態学的な変化がげっ歯類およびヒトに由来するＭＳＣの神経形成誘導に際して観察された（Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）。さらにまた、このＰＬＡの形態は、PC12細胞（一次交感神経ニューロンに類似する神経内分泌細胞株）のＮＧＦ刺激で観察される形態に類似していた。
【０１９７】
神経誘導ＰＬＡ細胞で観察された形態学的変化は神経特異的マーカー（例えばNSE、trk-aおよびNeuN）の発現増加を伴ったが、星状細胞および稀突起神経膠細胞のマーカーの発現はもたらさなかった。さらにまた、これらマーカーの発現はPC12培養でまた観察され、ＰＬＡ細胞はニューロン様表現型を有する可能性を示唆している。このＰＬＡの結果と一致して、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）およびtrk-aの発現増加がβ-ＭＥによるＭＳＣの誘導に際して観察され、ニューロン様ＭＳＣのほぼ100％がこれらマーカーについて陽性であった（Woodbury et al., J. Neurosci. Res. 61:364-370(2000)）。ＭＳＣでの実験のように、ニューロン表現型を示す全てのＰＬＡ細胞が顕著なレベルのＮＳＥおよびtrk-aを発現した。ＮＳＥの他に、NeuNの発現もまた神経形成前駆細胞およびＭＳＣのニューロンの発生の特定に用いられた（Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurol. 164:247-256(2000)）。特に、NeuNは有糸分裂後のニューロンで発現され（Sarnat et al., Brain Res. 20:88-94(1998)）、その出現は細胞周期から発生中のニューロンの脱落および／または最終分化の開始と同時に発生すると考えられる（Mullen et al., Development 116:210-211(1992)）。ニューロン様ＰＬＡ細胞内でのNeuNの発現は、ＮＳＥおよびtrk-aの存在とともにＰＬＡ細胞におけるニューロン表現型の 発生をさらに支持する。さらにまた、NeuNの発現は有糸分裂後のニューロン表現型の発生を示しているのかもしれない。ＮＳＥ、trk-aおよびNeuNとは対照的に、成熟ニューロンのマーカー（tau，MAP-2およびNF-70）は観察されず、誘導ＰＬＡ細胞は初期発生ステージであることを示唆している。これと合致して、誘導ＭＳＣ培養のMAP-2発現はいくつかのグループでは観察されず、使用された誘導条件を反映しているのかもしれないし、また長期にわたる誘導時間の必要性を示しているのかもしれない。（Deng et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:148-152(2001); Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurol. 164:247-256(2000)）。
【０１９８】
最後に、ＰＬＡ細胞の仮説的ニューロン潜在能力がRT-PCRを用いて確認された。免疫組織化学検査の結果と一致して、GFAPの発現は検出されず、誘導ＰＬＡ細胞がニューロン系列に限定されることが支持された。さらにまた、ＰＬＡ細胞を遺伝子ネスチンの発現について調べた。ネスチン（中間フィラメントタンパク質）は、ＣＮＳ幹細胞で（Lendahl et al., Cell 60:585-595(1990)）、マウスの発生中の神経管内で（Frederikson and McKay, J. Neurosci. 8:1144-1151(1988)）、および神経形成系列に誘導されたＭＳＣで（Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurol. 164:247-256(2000)）で大量に検出された。神経前駆細胞の分化はネスチン発現レベルの低下をもたらし、このタンパク質は前駆細胞表現型のマーカーとして用いることができることを示した（Johe et al., Genes Dev. 10:3129-3140(1996); Lendahl et al., Cell 60:585-595(1990)）。コントロールＰＬＡ培養におけるネスチンの発現はＰＬＡ内に神経形成前駆細胞が存在することを支持する。しかしながら、ＰＬＡ細胞の分化はネスチン発現の評価可能な低下をもたらさなかった。これには２つの可能性があるであろう：１）ＰＬＡ細胞は神経形成前駆細胞集団にのみ分化する；または２）ＰＬＡ細胞はネスチン発現を保持する初期ニューロン様細胞に分化する。後者と合致して、ネスチン発現はまたＮＧＦ処理PC12コントロールで検出された。誘導ＰＬＡ細胞でのNeuN、NSEおよびtrk-aの発現と併せて、このことは後者の可能性を我々に支持させ、更なる実験を担保した。我々のＩＨの結果と同様に、RT-PCR分析は成熟ニューロンマーカー（GAD65）（PC12コントロールおよび脳で検出されるマーカー）の発現を検出することができなかった。ＰＬＡ細胞をさらに成熟ステージに誘導するためにまた別の成長因子またはさらに長期の誘導期間が要求されるという可能性はあるであろう。最後に、ＰＬＡ細胞のＮＭによる誘導は、それらの細胞はChaT（末梢神経の特異的マーカー）を発現しなかったので、その発生をＣＮＳに特徴的な細胞に限定するように思われた。ネスチン発現はまた、筋形成細胞、新しく形成された内皮細胞、発生中のレンズの上皮細胞および肝の星状細胞の他に非誘導ＭＳＣでも観察された。この広範囲の分布は、ネスチンは、それ自体、神経形成前駆細胞マーカーとして用いることはできないことを示している。しかしながら、また別のニューロンマーカー（例えばNeuN）と併用することによって、ＰＬＡ細胞は神経外胚葉系列の前駆細胞を形成するという可能性が強化される。
【０１９９】
ＡＤＳＣクローン単離株は多系列能を示す：
ＰＬＡ細胞による多系列分化は、脂肪組織内に多能性幹細胞集団が存在するためではなく、むしろ多系列特異的前駆細胞の拘束により生じるのかもしれない。したがって、単一ＰＬＡ細胞に由来するクローン単離株による多系列分化は幹細胞の供給源としてのＰＬＡ細胞の分類に極めて重要である。これと合致して、培養で増大させた単一ＰＬＡ細胞単離株はin vitroで多系列能を示し、アルカリフォスファターゼに対し（骨形成）、オイルレッドＯに対し（脂肪生成）およびアルシアンブルーに対し（軟骨形成）陽性に染色された。クローン分析によって以下を含むいくつかの系列の組み合わせをもつ単離株が示された：三系列（骨形成、脂肪生成および軟骨形成）、二系列（骨形成／脂肪生成、骨形成／軟骨形成）および一系列（脂肪生成のみ）。三系列クローンは以降で組織脂肪由来幹細胞（Adipose Derived Stem cell, ＡＤＳＣ）と称され、RT-PCRを用いて多系列潜在能について分析された。多系列能に合致して、ＡＤＳＣは、骨形成に特徴的ないくつかの遺伝子（OC、ON、OP、CNI、AP）、脂肪生成に特徴的ないくつかの遺伝子（PPARγ2、aP2およびLPL）および軟骨形成に特徴的ないくつかの遺伝子（AGG、CNX、デコリンおよびバイグリカン）を発現した。さらにまた、いくつかの三系列ＡＤＳＣはＩＨを用いたときニューロンマーカーtrk-aを発現した（図39）。これらの結果から、ＡＤＳＣによる多系列特異的中胚葉遺伝子の発現は、これら単離されたクローンが多分化能（multipotentiality）を有し、幹細胞と考えることができることを示唆している。
【０２００】
実施例12
以下は組織脂肪由来幹細胞の分子的および生化学的性状決定についての記載である。
材料と方法
全ての材料は、別に記載がないかぎりシグマ（Sigma; St. Louis, MO）、ＶＷＲ（San Dimas, CA）およびフィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific; Pittsburgh, PA）から購入した。全ての組織培養試薬はライフテクノロジーズ（Life Technologies; New York, NY）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびウマ血清（ＨＳ）はハイクローン（Hyclone; Logan, UT）およびライフテクノロジーズからそれぞれ購入した。
抗体：
CD29、CD34、CD44、CD45、CD58、CD90、CD104、CD105およびCD140aに対するモノクローナル抗体はファーミンゲン（Pharmingen; Bedford, MA）から購入した。CD31およびCD71に対するモノクローナル抗体はR&Dシステム（Minneapolis, MA）およびザイムド（Zymed; San Francisco, CA）からそれぞれ購入した。フローサイトメトリー（FC）で使用したFITC-およびPE-結合抗CD抗体はファーミンゲンから購入した。SH3抗原に対するモノクローナル抗体はSH3ハイブリドーマ（ATCC）から作製した。Stro-1ハイブリドーマの上清はDr. John Fraser（UCLA）から寄贈された。ヒト１型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（αCNI）および同４型に対するモノクローナル抗体（αCNIV）はシグマから購入した。ヒト３型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（αCNIII）および同５型に対するモノクローナル抗体（αCNV）はバイオジェネシス（Biogenesis; Kingston, NH）から購入した。
【０２０１】
細胞の採集、培養および分化の条件：
以前に報告（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）されているように、未処理脂肪吸引物から処理脂肪吸引物（PLA）細胞を入手し培養した。ＰＬＡ細胞は非誘導コントロール培地（表13）で維持し、一方、ＭＳＣは特殊化コントロール培地（Clonetics）で維持した。ＰＬＡ細胞は、表13に概略した誘導培地を用いて所望の間葉系系列に誘導した。ＭＳＣは、表13に概略したものと同じ成長因子を補充した市販のコントロール培地を用いて誘導した。
ＰＬＡクローンの単離と分析：組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）：
ＡＤＳＣの単離：単離された単一細胞を得るために、ＰＬＡ細胞を極めて低いコンフルエンシーで播種した。単ＰＬＡ細胞が限界明瞭なコロニーを形成するまで培養をコントロール培地で維持した。単一ＰＬＡ細胞に由来するコロニーを組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と称した。ＡＤＳＣを滅菌クローニングリングおよび0.25％トリプシン／EDTAを用いて採集した。採集したＡＤＳＣをクローニング培地（15％ＦＢＳ、F12/ＤＭＥＭ（１:１）中の抗生物質／抗真菌剤１％）で増幅させた。
間接免疫蛍光法：
間接免疫蛍光（IF）：以前に記載（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）されているように、表14に概略した抗ＣＤマーカー抗体を用いてＰＬＡ細胞、ＡＤＳＣおよびＭＳＣをＩＦのために処理した。さらにまた、ＰＬＡ細胞はSTRO-1およびSH3ハイブリドーマ細胞株から得られた上清とともにインキュベートされた。分化したＰＬＡ細胞およびＭＳＣの細胞の特徴を決定するために、細胞を骨形成系列に向けて３週間または脂肪生成系列に向けて２週間誘導し、さらに抗ＣＤ抗体とともにインキュベートした。分化細胞はまたヒトコラーゲン１型、４型および５型に対する抗体を用いて分析した。
フローサイトメトリー：
ＭＳＣに加え、多数のドナーから得たＰＬＡ細胞をコントロール培地で３週間培養し、以前に記載（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）されているようにＣＤ抗原の発現についてフローサイトメトリー（FC）で分析した。ＰＬＡ細胞はまた分析の前に２週間ＯＭまたはＡＭで誘導した。簡単に記せば、細胞を80％コンフルエントな状態でトリプシン／EDTAで採集し、洗浄してフローサイトメトリー緩衝液（FCB）に１ｘ106細胞／ｍLの濃度で再懸濁させた。100μLの細胞調製物（１ｘ105細胞）を、飽和濃度のFITC-結合（抗CD14、44、45、61、71、90および105）抗体または飽和濃度のPE-結合（抗CD13、16、31、34、44、49d、56、62Eおよび106）抗体で1時間４℃で染色した。自家抗体を判定するためにコントロールとしてアイソタイプ適合ＩｇＧとともにまた細胞をインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を３回ＦＣＢで洗浄し、分析のために再懸濁した。フローサイトメトリーはファックスター（FACStar）フローサイトメトリー（Becton Dickson）で実施した。10000例当たりの細胞の絶対数から計算した相乗平均は表12に示されている。
【０２０２】
結果
ＰＬＡ細胞はＭＳＣと多くの類似点を共有する：
本実施例に記載した結果は、組織脂肪由来幹細胞の多系列潜在能およびそれらのクローン単離株について明らかにする。ＰＬＡ集団の特徴をさらに調べるために、細胞を間接ＩＦおよびＦＣを用いて調べ、市販のヒトＭＳＣ集団と比較した。ＭＳＣは、この幹細胞集団の特定に用いることができる一組の固有細胞表面マーカーを発現することが示されている（表14）（S.P. Bruder et al., Clin. Orthop. S247-256(1998); P.A. Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。ＭＳＣと同様に、ＰＬＡ細胞はこれらタンパク質のいくつかを発現し（図23および24）、幹細胞としてのこれら細胞の特徴を支持した。ほぼ100％のＰＬＡおよびＭＳＣ培養が、CD29、CD44、CD90およびCD105／SH2の発現について陽性で、両細胞集団で前記マーカーの各々について高い発現レベルが観察された。両細胞集団はまたSH3抗原を発現し、SH3はSH2とともにＭＳＣの特異的マーカーと考えられている（S.E. Haynesworth et al., Bone 13:69-80(1992)）。さらにまた、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの大半がまたトランスフェリンレセプター（CD71）について陽性で、これら細胞集団の一部分が複製していることを示した。ＰＬＡおよびＭＳＣは造血細胞系列マーカー、CD31およびCD34を発現しなかった。少数のＰＬＡサンプルがCD45について無視できる程度の染色を示したが、ただしCD45陽性細胞数は全ＰＬＡ細胞数の５％を越えなかった。ＭＳＣとは異なり、粘着分子CD58に対する染色はＰＬＡ細胞では観察されなかった。続いてＩＦの結果をＦＣで確認した（図24、パネルＢ）。ＭＳＣおよびＰＬＡ細胞は両者とも同様なプロフィールを示し、主として比較的小さな顆粒をもたない細胞の集団で構成されていた（図24、パネルＡ）。しかしながら、ＰＬＡ集団のより大きな部分は大型で顆粒をもつ細胞を含み（上右隅）、一方、ＭＳＣ集団のより大きな部分は小型の非顆粒性細胞を含んでいた。ＦＣはＰＬＡおよびＭＳＣの両者でCD44、CD71、CD90およびCD105の発現を確認したが、CD31、CD34、CD45およびCD104については顕著なレベルは検出されなかった。前記のマーカーの他に、ＰＬＡ細胞上でCD13、CD49ｄ、SH3およびSTRO-1の発現がＦＣで検出されたが、CD４、８、11、16、19、33、56、62Eおよび106の発現は検出されなかった（表12）。総合すれば、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーの結果は、ＰＬＡ集団と骨髄由来ＭＳＣとの間でＣＤ発現プロフィールにいくつかの類似性が存在することを示している。
【０２０３】
分化ＰＬＡ細胞の表現型の特徴：
幹細胞の分化はいくつかの細胞表面タンパク質および細胞内タンパク質の発現に変化を与えるかもしれない。分化ＰＬＡ細胞の特徴を調べるために、同じ患者に由来する細胞を非誘導コントロール培地で維持し、骨形成および脂肪生成系列に誘導した。コントロールおよび分化ＰＬＡ細胞を続いてＩＦで分析し、コントロールとしてのＭＳＣと比較した。結果は表15に示されている。ＯＭ中で３週間誘導したＰＬＡ細胞は、未分化ＰＬＡ細胞と比較したとき増殖増加を示したが、ＣＤマーカープロフィールには顕著な相違は全く示さなかった。コントロールＰＬＡ細胞のように、CD45の発現は骨形成ＰＬＡ細胞では観察されなかったが、CD44およびCD90の顕著な発現が検出された（図40、パネルＡ：PLA−骨）。しかしながら、コントロール細胞とは対照的に、骨形成分化は限局領域にCD34の発現をもたらした。ＰＬＡ細胞のように、コントロールＭＳＣおよび骨誘導ＭＳＣのCDマーカープロフィールは類似していたが、ただしCD34およびCD45は例外であった。図40（パネルＢ）に示されるように、CD34およびCD45の発現はコントロールＭＳＣでは観察されなかった。しかしながら、CD34発現レベルのかすかな増加がＯＭでの誘導に際して観察され、一方、CD45陽性細胞数の増加が検出された。
【０２０４】
脂肪生成分化を誘導するために、ＰＬＡ細胞をＡＭで最低限２週間維持した。ＣＤマーカー発現と細胞形態との相関性を知るために、蛍光顕微鏡写真を光学顕微鏡写真と重ね合わせた（差込み写真）。ＰＬＡ細胞のＡＭによる誘導によって、細胞形態が拡大して多数の細胞内脂質小胞が蓄積し、脂肪生成と一致した。これらの脂質含有ＰＬＡ細胞は成熟脂肪細胞と考えられた（白矢印）（図41、パネルＡ：PLA−脂肪）。骨形成と同様に、線維芽細胞状ＰＬＡ細胞と脂質含有ＰＬＡ細胞の両細胞で脂肪生成分化によってわずかにCD34が増加するようであった（図41、パネルＡ）。さらにまた、脂肪生成ＰＬＡ培養の無視できる程度の部分がCD45陽性細胞を含んでいた。しかしながら、これらの細胞は成熟脂肪細胞に特徴的な脂質小胞を含まなかった（CD45−差込み図）。顕著なレベルのCD44がまた脂肪生成ＰＬＡ培養で検出された。しかしながら、脂質充満ＰＬＡ細胞は、それらの線維芽細胞状の対応細胞と比較してより低いレベルのCD44を発現しているようであった。（白矢印：CD44−ve脂肪細胞、黒矢印：CD44＋ve細胞）。さらにまた、CD44の染色レベルは、強い発現からほとんどまたはまったくCD44の発現がないものまで線維芽細胞間で変動した。同様な制限がまた、CD90を比較可能なレベルで発現する全ての線維芽細胞でこのタンパク質について観察された。ＰＬＡ細胞のように、脂肪誘導ＭＳＣはCD44およびCD90を発現し、CD34およびCD45について染色増加を示した（図41、パネルＢおよび表16）。しかしながら、脂肪誘導ＰＬＡ細胞とは異なり、線維芽細胞状ＭＳＣおよび脂質充満ＭＳＣ（それぞれ黒矢印対白矢印）もともに同レベルでCD44およびCD90を発現しているようであった。
【０２０５】
免疫蛍光検査の結果を確認するために、非誘導ＰＬＡ細胞および分化ＰＬＡ細胞でＦＣを実施し、各ＣＤマーカータンパク質について相乗平均を算出した（図42）（表16）。骨形成分化はＰＬＡ集団のサイズおよび顆粒性に評価可能な変化をもたらさなかった（図42、パネルＡ）。しかしながら、脂肪生成は、おそらくは拡張した細胞形態および細胞内脂質小胞の形成の反映であるＰＬＡ集団のサイズおよび顆粒性に顕著な増加をもたらした。免疫蛍光検査の結果と一致して、コントロールＰＬＡ細胞はCD34およびCD45発現について陰性で（パネルＢ）、さらにこれらの細胞ではCD14、CD16、CD31、CD34、CD45、CD56、CD61、CD62、CD105またはCD106もまた測定できなかった（パネルＢ）。分化はCD34およびCD61の発現を増加させるようで、骨形成分化ではより高い増加が観察された。CD34の発現増加はＩＦ処理で観察された染色増加と一致した（図40）。CD56およびCD49dのかすかな増加は特に骨誘導ＰＬＡ細胞で検出された。脂肪誘導ＰＬＡ細胞のCD56発現はコントロールと顕著には異ならなかったが、CD49d発現の低下が脂肪生成で検出された。ＦＣによってまた、CD13、CD44およびCD90のコントロール細胞での発現が確認された（図42、パネルＣ）。骨形成はこれらマーカーの発現を顕著に増加させ、CD90の更なる増加が脂肪誘導ＰＬＡ細胞で検出された。最後に、脂肪生成分化は、CD13およびCD44の発現を未分化ＰＬＡ細胞のそれ以下に低下させた。CD44の減少はＩＦの結果と一致し、ＩＦでは脂質含有ＰＬＡ細胞で発現レベルの低下が観察された。
【０２０６】
中胚葉由来細胞、例えば脂肪細胞および骨芽細胞は大量の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を伴う。分化ＰＬＡ細胞でのＥＣＭタンパク質の発現を調べるために、脂肪生成および骨形成ＰＬＡ細胞をＥＣＭコラーゲンの発現についてＩＦによって分析した。結果は表17に要約されている。未分化ＰＬＡ細胞の大半が１型および３型コラーゲン（CNI、CNIII）を発現した（図43、パネルＡ：PLA−コントロール）。線維芽細胞状ＰＬＡ細胞のCNIおよびCNIIIは限局された核周囲濃縮物に限定され、拡張した形態をもつ細胞全てに平等に分布していた。CNIVおよびCNVの発現パターンは筋原繊維状であり、これら細胞周囲の細胞外間隙へのこのタンパク質の分泌と合致していた。
ＰＬＡ細胞の脂肪生成分化はCNIおよびCNV発現の両発現を抑制した（図43、パネルＡ：PLA−脂肪）。分化はまた、CNIIIの細胞内発現パターンにも変化をもたらしたようで、CNIIIは成熟ＰＬＡ脂肪細胞全体に平等に再分布された。さらにまた、より低いレベルのCNIVの発現が脂肪生成ＰＬＡサンプルで観察され、CNIV蛍光の大半は脂質充満ＰＬＡ細胞で観察された（矢印参照；差込み図）。CNV発現の抑制はまた骨誘導で観察されたが、CNI発現パターンには顕著な相違はこの系列では検出できなかった（図43、パネルＡ：PLA−骨）。最後に、骨形成はCNIV発現レベルを増加させるようで、このコラーゲンのＰＬＡ培養内でのより広範な分布をもたらした。コントロールMSCにおけるCNI、CNIII、CNIVおよびCNVの発現パターンはコントロールＰＬＡ細胞と類似していることが判明した（図43、パネルＢ：MSC−コントロール）。ＰＬＡ培養のように、CNIIIおよびCNIVは脂肪誘導ＭＳＣサンプルで検出された。しかしながら、CNIVは細胞内分布ではなくむしろ細胞外筋原線維に限定されるようであった（図43、パネルＢ：MSC−脂肪、矢印参照）。脂肪生成ＰＬＡ培養とは対照的に、この系列への誘導はCNIおよびCNVのＭＳＣによる合成を抑制しなかった。むしろ、前記コラーゲンは細胞外筋原繊維内で検出され、弱いCNI発現はまた脂質充満ＭＳＣ内で観察できた。最後に、骨誘導ＰＬＡ細胞とは対照的に、ＭＳＣの骨形成誘導は、CNIの細胞内発現パターンまたはCNIVおよびCNVの合成もしくは細胞外沈積に変化をもたらさなかった（図43、パネルＢ；MSC−骨）。総合すれば、免疫蛍光データは、脂肪生成ＰＬＡ細胞および骨形成分化ＰＬＡ細胞の両者は附随するＥＣＭの改造をもたらし、ＭＳＣのマトリックスとは異なるように思われるマトリックスを生成することを示唆している。
【０２０７】
ＰＬＡクローン単離株（ＡＤＳＣ）は類似するＣＤマーカータンパク質補完を発現する：
ＰＬＡ細胞による多系列分化は、脂肪組織内に多能幹細胞集団が存在するためではなく、むしろ多系列特異的前駆細胞の拘束により生じるのかもしれない。したがって、単一ＰＬＡ細胞に由来するクローン単離株による多系列分化は幹細胞の供給源としてのＰＬＡ細胞の分類に極めて重要である。これと合致して、組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と称される単一ＰＬＡ細胞コロニーがin vitroで多系列能を示した（図35）。500個のＡＤＳＣ単離株の分析によって、調べたコロニー総数のほぼ６％で分化潜在能が確認された。７つのＡＤＳＣ単離株が三系列分化能を示し、骨形成、脂肪生成および軟骨形成系列の細胞に分化し、分化潜在能陽性ＡＤＳＣの総数のほぼ24％に該当した（表11）。さらにまた、組織学的染色によって測定したとき、分化レベルにおける定性的な増加がまたこれら三系列ＡＤＳＣ集団で観察された。三系列ＡＤＳＣの他に、いくつかの二系列クローン（Ｏ／Ａ、Ｏ／ＣおよびＡ／Ｏ）および単一脂肪生成系列クローンもまた単離された。ＡＤＳＣの単離および増大は、ＩＦによってＣＤ発現の変化が検出されなかったのでクローンのＣＤ発現プロフィールに変化を与えなかった。さらにまた、三系列および二系列ＡＤＳＣ単離株間にも相違は観察されなかった（図36）。不均質なＰＬＡ集団のように、ＡＤＳＣはCD29、CD44、CD71およびCD90発現について陽性であったが、CD31、34、45および104の発現は観察されなかった。したがって不均質なＰＬＡ細胞集団内の多系列ＡＤＳＣ単離株の存在およびそれらの同じＣＤマーカープロフィールは、組織脂肪区画は多分化能を有する幹細胞の供給源であるという説をさらに支持する。
【０２０８】
【表１４】
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【０２０９】
【表１５】
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【０２１０】
【表１６】
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【０２１１】
【表１７】
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【０２１２】
【表１８】
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【０２１３】
考察
本実験では、免疫蛍光およびフローサイトメトリーを用いてＰＬＡおよびＡＤＳＣ集団のより包括的な性状決定を実施した。ＰＬＡ細胞はＭＳＣと同様なＣＤ抗原補完を発現し（陽性：CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、SH3；陰性：CD31、CD34、CD45）、CD58、CD104およびCD140aは、免疫蛍光で調べたときＰＬＡ細胞上では異なっていた。フローサイトメトリーによってまたCD13の発現、並びにCD14、CD16、CD56およびCD62Ｅが存在しないことが確認された。非誘導および分化ＰＬＡ細胞間の微妙な相違がフローサイトメトリーを用いて検出された。特に、CD13、CD44およびCD90の増加が骨誘導に際して観察され、一方、脂肪生成培養でCD13およびCD44レベルは低下することが見出された。これと一致して、ＩＦ分析は脂質充満ＰＬＡ細胞（すなわち成熟脂肪細胞）でより低レベルのCD44発現を示した。骨形成分化はまたCD34、CD49ｄ、CD56およびCD61のかすかな増加をもたらした。CD34発現は免疫蛍光を用いて確認され、CD34陽性領域は骨形成ＰＬＡ培養で観察された。ＡＤＳＣクローン集団はまた、不均質なＰＬＡ集団で観察されたものと類似するＣＤ抗原補完を発現し、クローン単離およびこれらクローン細胞の増大は細胞表面タンパク質の発現に影響を与えないことを示唆した。最後に、ＰＬＡ細胞の分化はまた附随するＥＣＭに変化を生じ、コラーゲン１、４および５型の発現パターン並びにレベルにおける相違が分化ＰＬＡおよびＭＳＣの間で見出された。総合すれば、このデータは、ＰＬＡ細胞は脂肪組織内で幹細胞集団を表す可能性があるが、ＭＳＣとは微妙な相違を有する集団であることを示唆している。
【０２１４】
ＰＬＡ細胞はＭＳＣ（樹立間葉系幹細胞集団）と類似するＣＤ抗原補完を発現したが、ただしＰＬＡ細胞はCD58、CD104およびCD140aの発現で微妙な相違を示した。ＰＬＡ細胞上でのＣＤマーカープロフィールはフローサイトメトリーを用いてさらに確認された。骨形成および脂肪生成分化はＣＤプロフィールに顕著な変化を与えなかったが、コントロール細胞に関しては、フローサイトメトリーを用いて微妙な相違を検出することができた。分化はまた附随するＥＣＭに変化をもたらした。最後に、ＡＤＳＣの両クローン集団は不均質なＰＬＡ集団で観察されるＣＤ抗原と類似のＣＤ抗原補完を発現し、ＰＬＡに由来する多系列集団のクローン単離は細胞表面タンパク質の発現に影響を与えないことが示唆された。
細胞集団の性状決定を細胞表面に発現された固有のタンパク質の特定をとおして実施することができる。続いていくつかのグループが、それらの細胞特異的タンパク質（例えばSTRO-1、SH2、SH3、SH4）の発現および“群別指定”（CD）マーカープロフィールを基にしてＭＳＣの性状を決定した（S.P. Bruder et al., Clin. Orthop. S247-256(1998); P.A. Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); M.F. Pittenger et al., Science 284:143-147(1999)）。この実験は、ＭＳＣと同様に細胞表面タンパク質の固有の組合せがＰＬＡ細胞上で発現され、２つの集団が同様な発現プロフィールを示すことを確認した。ＭＳＣのように、ＰＬＡ細胞は、ＩＦおよびＦＣを組合せて示したようにCD13、CD29、CD44、ＣＤ71、CD90、CD105／SH2およびSH3を発現した。さらにまた、ＰＬＡ細胞はCD14、CD16、CD31、CD34、CD45、CD56およびCD62Ｅをその細胞表面に発現しなかった。ＣＤプロフィールにおけるＭＳＣとの類似性はＰＬＡ細胞が幹細胞集団であるという説を支持させる。しかしながら、この類似性は、ＰＬＡ細胞は単に脂肪区画内に存在するかまたは脂肪区画に夾雑するＭＳＣ集団であることを示しているのかもしれない。脂肪修復術は多数の血管の破壊をもたらし、さらに血液損失を最小限にするために血管収縮剤が用いられるが、処理したＰＬＡペレットは末梢血液供給に由来するＭＳＣであるかもしれない（N.J. Zvaifler et al., Arthritis Res. 2:477-488(2000)）。しかしながら、いくつかの微妙な相違がＰＬＡとＭＳＣ集団との間に存在するように思われる。ＭＳＣとは対照的に、CD58の発現はＩＦを用いたときＰＬＡ細胞では検出できなかったが、ＭＳＣではその発現が観察された（図23）。さらにまた、ＭＳＣはまたCD104、CD106およびCD140aも発現することが報告された（S.P. Bruder et al., Clin. Orthop. S247-256(1998); P.A. Conget et al., J. Cell Physiol. 181:67-73(1999); M.F. Pitttenger et al., Science 284:143-147(1999)）。これらＣＤ抗原はＩＦまたはＦＣを用いたときＰＬＡ細胞では検出されなかった（図23および24）。これらの相違は、ＰＬＡ集団は別個の幹細胞集団であることを示している可能性がある。しかしながら、ＰＬＡ細胞はＭＳＣの変種クローンであるという可能性も完全には除外することはできない。
【０２１５】
ＰＬＡ細胞による多系列分化は、脂肪組織内の多能性幹細胞集団の存在によるのではなく、多系列特異的前駆細胞の拘束により生じるのかもしれない。したがって、単一ＰＬＡ細胞に由来するクローン単離株による多系列分化は、幹細胞の供給源としてのＰＬＡ細胞の分類に極めて重要である。これを支持するものとして、単離ＡＤＳＣは、組織学的アッセイ、アルカリホスファターゼ（骨形成）、オイルレッドＯ（脂肪生成）およびアルシアンブルー（軟骨形成）を用いて陽性に染色され、in vitroで多系列分化能を示した。いくつかの系列の組合せが観察され、三系列（骨形成、脂肪生成および軟骨形成）、二系列（骨形成／脂肪生成、骨形成／軟骨形成）および一系列（脂肪生成のみ）が含まれていた。ＡＤＳＣの単離および増大はＣＤ発現プロフィールに変化を与えず、いずれの三系列および二系列ＡＤＳＣ集団間にもＣＤ発現の相違を検出することはできなかった。したがって、多系列ＡＤＳＣ単離株の存在およびそれらが不均質なＰＬＡ細胞と同一のＣＤマーカープロフィールをもつことによって、脂肪区画は多能性幹細胞の供給源であるという説がさらに支持される。
【０２１６】
間葉系前駆細胞および幹細胞の分化は、これらの細胞は新規な運命および機能を獲得するので、いくつかの細胞表面および細胞内タンパク質の発現に変化をもたらすかもしれない。これについて調べるために、ＣＤマーカープロフィルにおけるなんらかの変化について未分化ＰＬＡ細胞並びに骨形成脂肪生成系列に誘導した細胞をＩＦおよびＦＣによって調べた。骨形成分化はＰＬＡ細胞のＣＤプロフィールを顕著には変化させなかった（図２および表16および17）。間接ＩＦによってCD44およびCD90の発現が確認され、CD34およびCD45は骨形成ＰＬＡおよびＭＳＣ培養の両方で発現を検出されなかった。さらにまた、骨形成ＰＬＡおよびＭＳＣ培養の両方でCD29、CD71、CD105およびSH3発現が陽性であったが、CD31は検出できなかった。しかしながら、ＦＣによる骨形成ＰＬＡ培養の更なる分析によってＣＤプロフィールに対する微妙な変化が明らかにされた。特に、骨誘導は、CD90およびCD44発現レベルにおいてそれぞれ1.8倍および3.8倍の増加をもたらした。CD44（ヒアルロナンレセプター）の発現増加はおそらく、骨形成時のＰＬＡ細胞によるマトリックス合成の増加および細胞対マトリックス相互作用の増加の結果であろう。最近の研究によってまた、マウス、ラットおよびヒト由来の骨芽細胞および骨芽細胞様細胞におけるThy／CD90の発現が確認された。このタンパク質の発現はもっとも初期の成熟ステージ（増殖相）で顕著に増加し、骨芽細胞が成熟するにつれて減少した。ＰＬＡ細胞の骨形成誘導時におけるCD90の発現増加は、したがって分化の最も初期相で骨形成ＰＬＡ細胞が分裂しているときにこのタンパク質の発現が増加することを反映しているのかもしれない。CD44およびCD90に加えて、メタロプロテアーゼ、CD13／アミノペプチダーゼＮの劇的な増加がまた骨形成ＰＬＡ細胞で観察された。顆粒球および単球の拘束前駆細胞における前記の発現（Kishimoto, 1997 #1082）の他に、CD13はまた線維芽細胞、骨髄間質細胞および破骨細胞でも特定された（M. Syrjala et al., Br. J. Haematol. 88:679-684(1994)）。最近の研究によって細胞対細胞接触時にCD13のｍRNAレベルが増加することが確認された（A. Kehlen et al., J. Cell Biochem. 80:115-123; D. Reimann et al., J. Immunol. 158:3425-3432(1997)）。ＰＬＡ細胞におけるCD13の劇的な増加はしたがって骨形成ＰＬＡ培養内の細胞対細胞接触の増加によるためかもしれない。さらにまた、幹細胞でのプロテアーゼ（例えばCD13）の発現増加はまた、これら細胞の発生に影響を与えることができる調節性ペプチドおよび増殖物質を分解することによって分化に関与するのかもしれない（H.E. Young et al., Wound Repair Regen. 6:66-75(1998); H.E. Young et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 221:63-71(1999)）。
【０２１７】
興味深いことに、ＦＣによって、CD34、CD56、CD49D、CD61およびCD105発現のわずかな増加が骨形成の誘導時に測定された。ＣＤ105は例外として、前記マーカーは未分化ＰＬＡ細胞およびＭＳＣでは発現されず、それらの増加はおそらく分化の結果である。CD34発現では2.6倍の増加が骨誘導ＰＬＡ培養で検出された。ＩＦによって示されるように、この増加は骨形成ＰＬＡ培養内でのCD34陽性領域の出現と一致した（図23）。CD34のわずかな増加がまた骨形成ＭＳＣのＩＦ分析で観察された（図40）。しかしながら、この増加は全てのＭＳＣによる全体的な発現レベルの強化の結果であるように思われた。骨形成誘導はまたCD56の発現で1.8倍の増加をもたらした。神経細胞粘着分子（NCAM）として特定されたが、CD56は造血幹細胞で発現され[T. Kishimoto et al., 1997 Leucocyte Typing VI. White Cell Differentiation Antigens.(C.T. Hamden: Garland Publishing)]、隣接細胞と周囲のマトリックスとの粘着を仲介する（L.L. Lanier et al., J. Immunol. 146:4421-4426(1991); L.L. Lanier et al., J. Exp. Med. 183:681-689(1989)）。その機能は未だ確認されていないが、CD56は同様な態様で非造血細胞で機能するかもしれない。これと合致して、骨芽細胞はNCAMを発現し、この粘着分子を用いて細胞とマトリックスの相互作用を仲介しそれらの分化をもたらす（Y.A. Lee et al., J. Bone Miner. Res. 7:1435-1466(1992)）。したがって、ＰＬＡ細胞の骨形成分化はこのCDタンパク質のレベル上昇を誘導し、分化の最中に細胞対細胞および細胞対マトリックスの相互作用を調節するかもしれない。同じ解釈が、α4インテグリン、CD49dで観察された３倍増加にもおそらく適用できるであろう。最後に、CD105発現の小さな増加が骨形成ＰＬＡ細胞で測定された。III型TGFβ3レセプターとして分類されるが（S. Cheifetz et al., J. Biol. Chem. 267:19027-19030(1992)）、CD105は以下を含む多様な細胞で発現される：内皮細胞、Ｂ系列前駆細胞、ＭＳＣおよび末梢血から単離されたCD34+細胞サブセット（O.W. Rokhlin et al., J. Immunol. 154:4456-4465(1995); M.K. Majumdar et al., J. Cell Physiol. 176:57-66(1998); F.P. Barry et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 265:134-139(1999); L. Pierelli et al., Br. J. Hematol. 108:610-620(2000)）。骨発生時におけるこのタンパク質についてはほとんど何も判明していないが、CD105の発現は、骨形成前駆細胞が最終分化へと進むとき成熟骨芽細胞から消失して減少すると考えられる（S.E. Haynesworth et al., Bone 13:69-80(1992)）。したがって、ＩＦで示される骨形成ＰＬＡおよびＭＳＣでのCD105の発現は、これら細胞は分化の初期ステージを表し、最終分化ステージに達していないことを示しているのかもしれない。さらにまた、ＦＣで測定されるＰＬＡ細胞でのCD105のわずかな増加はCD34の増加と相関性を有し、骨形成培養中のCD34+サブセットの増加を反映しているのかもしれない。
【０２１８】
ＰＬＡ細胞の脂肪生成分化は、多数の脂肪充満細胞内小胞の蓄積とともに形態の拡張をもたらすことが示された（P. Zuk et al., Tissue Engineering 7:209-226(2001)）。結果として、脂肪誘導ＰＬＡ培養は、脂質充満細胞（すなわち成熟脂肪細胞）およびより未成熟な線維芽細胞の不均質な混合物である。これと合致して、ＦＣによる脂肪生成ＰＬＡ培養の性状検査ではより大型でより顆粒の多い細胞へのシフトが示された。ＩＦ分析によって、脂肪生成ＰＬＡおよびＭＳＣでCD29、CD44、CD71、CD90およびCD105の発現が確認された（図41）。同等レベルのCD29、CD71およびCD105が線維芽細胞状細胞および脂質充満細胞の両細胞で見出されたが、CD44およびCD90のレベルは成熟ＰＬＡ脂肪細胞で低かった。ＰＬＡ培養とは対照的に、脂肪誘導ＭＳＣではそのような制限はＩＦによって検出されなかった。CD90の発現は脂質充満ＰＬＡ細胞では低下するようであったが、ＰＬＡ線維芽細胞では実質的に100％がCD90について明るく染色され、ＦＣを用いたときこのタンパク質で1.8倍の増加（骨形成培養で測定される量に匹敵するレベル（1.75倍））が測定された。CD90とは対照的に、CD44陽性ＰＬＡ線維芽細胞の発現レベルは変動するようにみえ、その範囲は濃染からほとんどまたは全くCD44染色が認められないものまであった。これと合致して、ＦＣでは、脂肪生成ＰＬＡサンプルで、CD44発現の48％低下が確認された。CD13／アミノペプチダーゼNについてもまた低下が測定され、これら２つのタンパク質の減少はおそらく、ＥＣＭが脂肪組織により一致するものに改造されたことを反映しているのであろう。
【０２１９】
骨形成ＰＬＡ細胞のように、ＦＣによってCD14、CD16、CD31、CD45、CD62EおよびCD106がＰＬＡ培養には存在しないことが確認され、一方、CD34、CD49およびCD61の発現はこれらの細胞でわずかに上昇した。ＦＣでは脂肪誘導に際してCD45の顕著な増加は検出されなかったが、このタンパク質について陽性を示す、低いパーセンテージのＰＬＡ細胞がＩＦ分析で観察された。脂肪生成ＰＬＡ細胞でのCD34の発現増加は骨形成で測定されたもののように多くはなく、さらにＩＦ分析によってＰＬＡの全形態によるCD34の発現が確認された。しかしながら、発現は線維芽細胞状形態を有する細胞に限定された。CD34およびCD45の両CDの弱い発現がまた脂肪生成ＭＳＣのＩＦ分析で検出され、発現は線維芽細胞および脂質充満細胞の両細胞で観察された。
間葉系前駆細胞のそれらの系列拘束細胞タイプ（すなわち骨芽細胞、脂肪細胞）への分化はＥＣＭの合成および改造を伴う。ＥＣＭの組成および機構の変動は各組織にその特異的な性状を付与し、構成細胞タイプの分化および成長に関与する。例えば、骨マトリックスは、プロテオグリカンおよびコラーゲン（１型コラーゲンがその大半を構成する（有機分画の約90％））を含む有機分画とともに、無機ヒドロキシアパタイトから成る。軟骨マトリックスは、主として２および10型コラーゲン並びに多数の硫酸化プロテオグリカンから成る。脂肪生成ＥＣＭは多数のコラーゲンサブタイプ（１型から６型）、ラミニンおよびフィブロネクチンを含む。いずれの場合も、これらコラーゲンは各組織の固有の細胞外環境の一部分であり、成分細胞の生存および機能に不可欠である。このことを基にして、ＥＣＭコラーゲンの発現をコントロールおよび誘導ＰＬＡ細胞およびＭＳＣで調べた。
【０２２０】
非誘導ＰＬＡ細胞およびＭＳＣはCNIIIの他にCNI、CNIVおよびCNVを発現した（図43）。CNIおよびCNIIIの両者は両細胞集団で類似の染色パターンを示し、骨形成誘導はこれらコラーゲンの細胞内分布に変化を与えなかった。さらにまた、CNIの定量的増加がいくつかのＰＬＡおよびＭＳＣサンプルで観察された。多くの研究によって骨形成分化における１型コラーゲンの役割が確認された。例えば、CNIレベルはラットの頭蓋冠骨芽細胞分化の初期ステージで増加し、このコラーゲンの阻害は全体的に骨形成分化を阻止する（G.S. Stein et al., Faseb J. 4:3111-3123(1990); Lynch et al., Exp. Cell Res. 216:35-45(1995)）。骨形成に影響を与えることが知られている因子（例えばデキサメタゾン、ビタミンＤおよび上皮小体ホルモン）はCNIのレベルに直接影響をあたえることができる。さらにまた、CNIマトリックスで維持された骨髄間質細胞はin vitroで骨芽細胞に分化し、in vivoで骨形成を誘導する（この作用はCNII、CNIIIまたはCNVマトリックスでは観察されない）。したがって、前誘導および骨誘導されたＰＬＡ培養におけるCNIの合成は、骨形成におけるこのコラーゲンの役割と一致する。さらにまた、骨誘導ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの両者で観察されたCNIの発現における類似性は、これら細胞タイプの骨分化で類似の機構が機能している可能性を示唆する。
CNIの他に、CNIVおよびCNVの発現もまたＰＬＡおよびＭＳＣ両コントロール培養で観察され、それらの細胞外環境への分泌と一致して筋原線維状パターンで分布した。これらのコラーゲンの存在は骨形成ＥＣＭの必須の成分である。なぜならば、これらコラーゲンの発現は、全骨髄間質、新規に生成される骨の骨芽細胞およびSTRO-1陽性コロニー由来間質細胞株で観察されるからである。誘導ＭＳＣ培養とは対照的に、ＰＬＡ細胞の骨形成誘導はCNIV合成を顕著に低下させるようであり、さらにCNV発現を完全に阻害した。
【０２２１】
脂肪生成分化はＰＬＡおよびＭＳＣ集団間にさらに別の区別をもたらした。骨形成培養と同様に、ＰＬＡ細胞の脂肪生成誘導はCNV発現の阻害をもたらした。さらにまた、脂肪生成はまたCNIの阻害ももたらした。そのような阻害は脂肪誘導ＭＳＣでは観察されなかった。むしろ、CNIV合成レベルの低下が脂肪生成ＭＳＣ集団で観察され、３つのコラーゲンタイプの全て（Ｉ、IVおよびV）が筋原線維状の細胞外発現パターンを示した。CNIの弱い細胞内発現がまた脂質充満ＭＳＣで観察されたが、CNIVおよびCNVの発現は細胞外に存在したままのようであった。ＭＳＣサンプルのように、脂肪誘導ＰＬＡ細胞はまたCNIVも発現した。しかしながら、これらの細胞におけるCNIVの発現は細胞内にとどまり、もっぱら脂質充満ＰＬＡで発現されるようにみえた。
骨形成のように、いくつかの明白な事実によって、ＥＣＭ成分（例えばコラーゲン）は脂肪生成に関与することが示唆された。第一に、ＥＣＭの変化は脂肪生成酵素の発現に要求される形態変化および細胞骨格変化をもたらす（W. Kuri-Haruchi et al., Differentiation 28:(1984); B.M. Spiegelman et al., Cell 357-666(1983)）。第二に、CNI、CNIIIおよびCNIVの発現は３T3-L1細胞の分化で劇的に変動する（F.R. Weiner et al., Biochem. 28:4094-4099(1989)）。最後に、発生中の脂肪組織のＥＣＭは分化中に編成され、この現象は脂肪細胞自体によって仲介されると考えられる（I. Nakajima et al., Differentiation 63:193-200(1998)）。線維芽細胞および線維芽細胞状形態を有する脂肪細胞の前駆細胞は、少量の基底膜コラーゲン（IV型）の他にI型およびIII型コラーゲンを合成および分泌する（B. Goldberg, PNAS 74:3322-3325(1977); K. Alitano et al., J. Cell Biol. 94:497-505(1982); A. Cryer et al., Eur. J. Clin. Invest. 12:235-238(1982); W. Kuri-Harcuch et al., 1984, Differentiation, 28; G. Liau et al., J. Biol. Chem. 260:531-536(1985)）。これらの細胞が分化を開始するとき、細胞形態、細胞骨格並びに分泌ＥＣＭのレベルおよびタイプにおける変化が生じる（L. Napolitano, J. Cell Biol. 18:663-679(1963); Y. Aratani et al., J. Biol. Chem. 263:16163-16169(1988); F.R. Weiner et al., Biochem. 28:4094-4099(1989)）。これらの変化は順次脂肪細胞への最終分化のための要件となるであろう。
【０２２２】
脂肪生成でのＥＣＭ成分の合成および分布を調べるために、いくつかの前脂肪細胞株が開発されている。これらの細胞株にはいくつかの３Ｔ３変種（H. Green et al., Cell 3:127-133(1974)）および日本産牛に由来する前脂肪細胞クローン株（BIP細胞）（H. Aso et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 213:369-374(1995)）が含まれる。ＢＩＰ細胞の脂肪細胞への変換は、脂肪組織と類似するＥＣＭの生成をもたらした。その場合、脂肪細胞は、CNIIIの細胞内発現と合わせてＩ、II、IV、ＶおよびVI型コラーゲンの筋原線維ネットワークによって互いに連結されている（I. Nakajima et al., Differenriation 63:193-200(1998)）。ＢＩＰ細胞のように、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣの両細胞の脂肪誘導はCNIIIの同様な細胞内分布をもたらした。さらにまた、CNI、CNIVおよびCNVの筋原線維もまた脂肪生成ＭＳＣに附随し、ランダムに編成されるようであった。脂肪生成ＭＳＣにおける類似のコラーゲンの発現およびそれらのランダムな編成は前脂肪細胞の分化に際して観察されたものと一致し、類似するＥＣＭ合成および改造がこれら幹細胞の分化に際して生じる可能性を示唆した。
【０２２３】
しかしながら、ＰＬＡ細胞の脂肪生成分化は、いくつかの前脂肪細胞株およびＭＳＣに対しいくつかの相違を示している。前脂肪細胞（ウシ由来のBIP細胞およびマウス由来の3T3細胞を含む）のように、前分化ＰＬＡ細胞はCNIおよびCNVを合成する。しかしながら、これらのコラーゲンは分化時にはもはや観察されない。脂肪生成ＰＬＡ培養のCNIおよびCNVの消失はこれら細胞の固有の改造経路を示しているのかもしれない。これと合致して、分化中に生じる細胞周囲環境の変化は、細胞内環境および周囲のＥＣＭを分解するＭＭＰ分泌を変化させることができる。低レベルのCNIVがまた前脂肪細胞により生成され、さらに劇的な増加が脂肪生成に際して観察される（Y. Aratani et al., J. Biol. Chem. 263:16163-16169(1998); I. Nakajima et al., Differentiation 63:193-200(1998)）。CNIVの定性的増加が脂肪生成ＰＬＡ培養で観察されたが、その筋原線維状分布は失われ、コラーゲンは脂質充満細胞に限定される。前脂肪細胞およびＭＳＣと比較してCNIVの発現パターンの変化は明らかではない。
【０２２４】
成熟脂肪細胞をＥＭで観察したとき他のいくつかの筋原線維コラーゲンと結合したCNIVに富む基底膜が確認されたが（W.H. Chase, J. Ultrastruc. Res. 2:283-287(1959); R.J. Barnett, 1962, L.W. Kinsell, ed., (I.L. Springfield, Charles C. Thomas); A. Angel et al., 1970, B. Jeanrenaud and D. Hepp, et ed.(Thiene, Stuttgard: Academic Press)）、成熟脂肪細胞はコラーゲンを合成しない。さらにまた、in vitroで脂肪生成前駆細胞は、コンフルエントになった後の分化ステージでコラーゲン合成能を失う。しかしながら、コラーゲン合成は最終脂肪細胞分化に必須であり、トリアシルグリセロールの蓄積は、ＥＣＭの前分化発現がそれら細胞の究極の表現型を決定することを示している。したがって、ＰＬＡ細胞およびＭＳＣによるCNI、CNIII、CNIVおよびCNVの前分化発現はそれらの分化プログラム開始のために機能するのかもしれない。分化が進行するにつれ、さらに脂質充満細胞（すなわち成熟脂肪細胞）の出現が増加するにつれ、これらコラーゲンの合成は停止し、脂肪組織に固有のコラーゲン性ＥＣＭが生じる。これがおそらくＭＳＣ集団の場合であろう。しかしながら、ＰＬＡ培養でCNIおよびCNVが存在しないのは、ＥＣＭ合成の直接阻害またはＥＣＭの劇的な改造の結果かもしれない。ＰＬＡの脂肪生成時におけるコラーゲン阻害の正確な時期および／またはコラーゲン分解に必要とされる可能な物質の存在については未だ明らかでない。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】長期培養の組織脂肪由来幹細胞の形態、成長カイネティクスおよび老化を示す。パネルＡ：脂肪吸引による脂肪組織から得た組織脂肪由来幹細胞（例えば処理された脂肪吸引物またはPLA）。パネルＢ：３人のドナーから得た組織脂肪由来幹細胞（PLA）をさらに長期間培養し、累積集団ダブリングを測定し、継代数の関数として表した。パネルＣ：β−ガラクトシダーゼ発現についてpH6.0で染色することにより検出した組織脂肪由来幹細胞（PLA）培養の老化。代表的な老化細胞が示されている（矢印）。
【図２】間接免疫蛍光（IF）によって決定した組織脂肪由来幹細胞（PLA）の組成を示す。組織脂肪由来幹細胞（PLA）および骨髄間質細胞（BMS）を以下の抗体で染色した：１）抗第VIII因子（FVIII）；２）抗平滑筋アクチン（SMA）；および３）ＡＳＯ２（ASO2）。第VIII因子および平滑筋アクチンを発現している細胞が示されている（矢印）。
【図３】フローサイトメトリーによって決定した組織脂肪由来幹細胞（PLA）の組成を示す。パネルＡ：フォワードスキャターおよびサイドスキャター（それぞれFSおよびSS）を用いた組織脂肪由来幹細胞（PLA）のフローサイトメトリー。代表的な組織脂肪由来幹細胞サンプルが示されている。パネルＢ：１人のドナーから得た代表的な組織脂肪由来幹細胞（PLA）サンプルの細胞組成を以下のモノクローナル抗体により染色して決定した：抗第VIII因子（FVIII）、抗平滑筋アクチン（SMA）、ＡＳＯ２およびヴィメンチン（間葉系起源の細胞に対するまた別のマーカー）に対するモノクローナル抗体（VIM）。パネルＣ：５人のドナーから得たフローサイトメトリーデータを採集し、各細胞特異的マーカーに対する陽性事例の平均数が全組織脂肪由来幹細胞（PLA）数のパーセンテージとして表されている。
【図４】組織脂肪由来幹細胞（PLA）は脂肪生成培地（AM）で処理したとき脂質で満たされた液滴を蓄積する。組織脂肪由来幹細胞（PLA）、骨髄由来ＭＳＣ（MSC）および３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（3T3-L1）をＡＭ中で２週間培養し、オイルレッドＯで染色して脂質充満細胞内小胞を特定した。コントロール培地で維持した未分化ＰＬＡ細胞（-veコントロール）は陰性コントロールとして染色した。
【図５】骨形成培地（ＯＭ）で誘導した組織脂肪由来幹細胞（PLA）はアルカリ性ホスファターゼを発現し、さらに石灰化細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を伴う。組織脂肪由来幹細胞（PLA）、骨髄由来ＭＳＣ（MSC）およびヒト骨芽細胞株（NHOst）をＯＭ中で培養して骨形成を誘導した。２週間で細胞をアルカリ性ホスファターゼ活性（AP；赤色）について染色した。石灰化細胞外マトリックス（黒色領域）の存在を４週間で調べた（フォンコッサ）。コントロール培地中で維持した未分化組織脂肪由来幹細胞は陰性コントロール（-veコントロール）としてＡＰ発現およびマトリックス石灰化について調べた。
【図６】軟骨形成培地（CM）で処理した組織脂肪由来幹細胞（PLA）はプロテオグリカン富裕マトリックスを伴い、さらにII型コラーゲンを発現する。組織脂肪由来幹細胞（PLA）およびＭＳＣ（MSC）をミクロマス技術を用いてＣＭ中で２週間培養し、軟骨形成を誘導した。細胞を固定し、硫酸化プロテオグリカンの存在についてアルシアンブルーを用い酸性条件下で処理した（アルシアンブルー）。ヒト軟骨のパラフィン切片（軟骨）を陽性コントロールとして用い、一方、コントロール培地で維持した未分化ＰＬＡを陰性コントロール（-veコントロール）として処理した。さらに、軟骨特異的II型コラーゲン（II型コラーゲン）の発現をＰＬＡ細胞およびヒト軟骨切片で調べた。コントロール培地で培養した組織脂肪由来幹細胞（-veコントロール）を陰性コントロールとしてアルシアンブルーで染色し、さらにII型コラーゲン発現について染色した。
【図７】筋形成培地（MM）で培養した組織脂肪由来幹細胞（PLA）はミオシン重鎖およびMyoD1を発現する。組織脂肪由来幹細胞（PLA）をＭＭで処理し、骨格筋ミオシン重鎖（ミオシン）またはMyoD1に特異的な抗体で染色した。ヒト骨格筋細胞株（SKM）を陽性コントロールとして調べた。さらに、組織脂肪由来幹細胞培養中の多核細胞の存在が示されている（PLA、差込み図）。ミオシンおよびMyoD1の発現は陰性コントロールとして未分化組織脂肪由来幹細胞（-veコントロール）でも調べた。
【図８】組織脂肪由来幹細胞（PLA）の成長カイネティクスを示す。パネルＡ：各ドナーから単離した組織脂肪由来幹細胞を１ｘ104細胞／ウェルの密度で３ウェルずつ播種した。細胞数を、24時間後（１日目）および１日目以降48時間毎に（３日目から11目まで）算出した。各ドナーの平均細胞数を培養時間に対して表した。４人の代表的なドナーから得た成長曲線が示されている（20歳、白四角；39歳、白丸；50歳、白三角；58歳、バツ印）。結果は平均±ＳＥＭとして表されている。パネルＢ：集団ダブリングを各成長曲線のログ期（すなわち３日目から９日目まで）で全ドナーから算出し、年齢に対して表した。回帰直線を算出した（ｎ＝20；ｒ＝0.62）。
【図９】組織脂肪由来幹細胞（PLA）による脂肪生成および骨形成分化の組織学的確認を示す。Ａ：脂肪生成を確認するために、誘導後２週間で細胞をオイルレッドＯで染色した。低レベルおよび強レベルの脂肪生成が示されている（パネル１、低レベル；パネル２、強レベル）。非誘導性コントロール培地で培養した組織脂肪由来幹細胞を陰性コントロールとして分析した（パネル３）。Ｂ：脂肪生成を定量するために、オイルレッドＯ陽性染色細胞の数を３つの限定領域内で数えた。各ドナーから２つのサンプルを分析した。オイルレッドＯ陽性細胞の平均数を求め、脂肪生成分化の指標として全組織脂肪由来幹細胞数のパーセンテージとして表した。分化は年齢に対して表し、回帰直線を算出した（ｎ＝20；ｒ＝0.016）。
【図１０】骨形成分化はドナーの年齢増加とともに低下する。パネルＡ：骨形成を確認するために、組織脂肪由来幹細胞（PLA）を誘導後２週間でアルカリ性ホスファターゼ（AP）活性について染色し（パネル１から３）、誘導後４週間でフォンコッサ染色を用いてマトリックスの石灰化について染色した（パネル４から６）。骨形成分化レベルが示されている（パネル１／２、低レベル；パネル４／５、高レベル）。非誘導性コントロール培地で培養した組織脂肪由来幹細胞を陰性コントロールとして分析した（パネル３および６）。パネルＢ：骨形成分化を定量するために、ＡＰ陽性染色細胞の数を３つの限定領域内で数えた。各ドナーから２つのサンプルを分析した。ＡＰ陽性細胞の平均数を求め、骨形成分化の指標として全組織脂肪由来幹細胞数のパーセンテージとして表した。分化は年齢に対して表し、回帰直線を算出した（ｎ＝18；ｒ＝−0.70）。パネルＣ：パネルＢの結果から、ドナープールを２つの年齢群に分けた［（20から36歳（ｎ＝７）および37から58歳（ｎ＝11））。骨形成分化の平均レベルを各群について算出し、全組織脂肪由来幹細胞数のパーセンテージとして表した。統計的有意は不対合（unpaired）スチューデントｔ検定を用い不均等分散と仮定して求めた（ｐ＜0.001）。分化は平均±ＳＥＭとして表した。
【図１１】組織脂肪由来幹細胞分画（PLA分画）内の骨幹細胞数は年齢とともに顕著には変化しない。前記分画内の骨幹細胞数は骨形成潜在能力をもつ細胞を特定することによって求めた。２つの群のドナーを調べた［Ａ群＝20から39歳（ｎ＝５）、Ｂ群＝40から58歳（ｎ＝６）］。骨形成はＡＰ活性について染色することによって確認した。10個を越えるＡＰ陽性細胞を含むコロニー（ＣＦＵ／ＡＰ+）を数え、各年齢群内の骨形成前駆細胞数の指標として平均した。統計的有意は、不均等分散と仮定した不対合スチューデントｔ検定を用いて決定した（ｐ＝0.11）。数値は平均ＣＦＵ／ＡＰ+±ＳＥＭとして表した。
【図１２】ミクロマス培養下で培養し軟骨形成培地により誘導したヒト組織脂肪由来幹細胞（PLA）は、細胞凝縮および結節形成を示す。ミクロマス下で誘導された組織脂肪由来幹細胞をpH１でアルシアンブルー染色により染色して硫酸化プロテオグリカンの存在を検出した。（パネルＡ）細胞凝縮；（パネルＢ）稜線形成；（パネルＣ）三次元球状体の形成が示されている（倍率100倍）。パネルＤ：陰性コントロール（コントロール培地）。
【図１３】組織脂肪由来幹細胞（PLA）から得た結節パラフィン切片のヘマトキシリン−エオシン染色、ゴルドナーの三色染色およびアルシアンブルー染色を示す。組織脂肪由来幹細胞のミクロマス培養を軟骨形成培地で処理して結節を形成した。前記結節をパラフィンに包埋して切片を作製した。結節切片を通常のヘマトキシリン−エオシン（パネルＡおよびＢ）で染色し、さらにゴルドナーの三色染色を用いて染色してコラーゲン（緑色）を検出した（パネルＣおよびＤ）。２日間誘導した組織脂肪由来幹細胞が200倍の倍率で（パネルＡおよびＣ）、さらに14日誘導が100倍の倍率（パネルＢおよびＤ）で示されている。さらにまた、切片をアルシアンブルー染色によりpH１で染色して高度に硫酸化されたプロテオグリカンを検出した。２日目の結節（パネルE）は200倍、14日目の結節（パネルＦ）は100倍の倍率で示されている。
【図１４】組織脂肪由来幹細胞（PLA）から分化した結節は、軟骨特異的II型コラーゲンとともにコンドロイチン−４−硫酸およびケラチン硫酸を発現する。組織脂肪由来幹細胞から２日間（パネルＡおよびＣ）および14日間（パネルＢおよびＤ）誘導した結節をパラフィンに包埋して切片を作製した。硫酸化プロテオグリカンコンドロイチン−４−硫酸およびケラチン硫酸に対するモノクローナル抗体で切片を染色した。切片をまたII型コラーゲンに対するモノクローナル抗体で染色した（パネルＥおよびＦ）（倍率200倍）。
【図１５】組織脂肪由来幹細胞から誘導した結節のRT-PCR分析によって、軟骨特異的プロテオグリカンおよびアグレカンの発現とともにII型およびX型コラーゲンの発現が確認された。軟骨形成培地および非誘導性コントロール培地で２、７および14日間誘導した組織脂肪由来幹細胞を、軟骨特異的プロテオグリカン（PG）、アグレカン（AG）およびオステオカルシン（OC）とともにＩ型（CN I）、II型（CN II）およびX型（CN X）コラーゲンの発現についてRT-PCRで分析した。
【図１６】筋形成培地で誘導した組織脂肪由来幹細胞はMyoD1を発現する。パネルＡからＣ：組織脂肪由来幹細胞（PLA）を、ＭＭでの誘導後１週間（パネルＡ）、３週間（パネルＢ）および６週間（パネルＣ）でMyoD1に対する抗体で染色した。陽性染色ＰＬＡ細胞の核内でのMyoD1の発現が示されている（矢印、倍率200倍）。パネルDからＦ：非誘導コントロール培地で１週間（パネルD）、３週間（パネルＥ）および６週間（パネルＦ）誘導したＰＬＡ細胞を陰性コントロールとして上記のよう処理した（倍率200倍）。
【図１７】筋形成培地で誘導した組織脂肪由来幹細胞は骨格筋ミオシン重鎖を発現する。パネルＡからＣ：組織脂肪由来幹細胞（PLA）を、ＭＭでの誘導後１週間（パネルＡ）、３週間（パネルＢ）および６週間（パネルＣ）でミオシン重鎖に対する抗体で染色した。ミオシン陽性染色ＰＬＡ細胞が示されている（矢印、倍率200倍）。パネルDからＦ：非誘導コントロール培地で１週間（パネルD）、３週間（パネルＥ）および６週間（パネルＦ）誘導した組織脂肪由来幹細胞（PLA）を陰性コントロールとして上記のよう処理した（倍率200倍）。
【図１８】筋形成培地で培養した組織脂肪由来幹細胞は多核細胞を形成する。パネルＡ：ＭＭで誘導後３週間（１）および６週間（２）の組織脂肪由来幹細胞（PLA）の位相差像（倍率400倍）。多核細胞が示されている（矢印）。パネルＢ：誘導後６週間の組織脂肪由来幹細胞（PLA）のミオシン重鎖に対する抗体による免疫染色。ミオシン発現多核細胞が示されている（矢印）。
【図１９】ＭＭで誘導した組織脂肪由来幹細胞のRT-PCR分析を示す。RT-PCRは、ＭＭ（PLA-MM）またはＣＭ（PLA-CM）で１、３および６週間誘導した組織脂肪由来幹細胞でヒトMyoD1およびミオシンに対するプライマーを用いて実施した。ヒトの包皮線維芽細胞（HFF）をＭＭで誘導したもの（HFF-MM）のRT-PCR分析もまた陰性コントロールとして実施した。内部コントロールとしてβ−アクチンに対するプライマーセットを用い二組ずつ反応を実施した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し、β−アクチンレベルを用いて均等化した。
【図２０】MyoD1陽性の組織脂肪由来幹細胞の割合は誘導時間とともに増加する。ＭＭでの誘導後１、３および６週間のMyoD1陽性組織脂肪由来幹細胞（PLA）の平均数を示す柱状図が示されている（全PLA細胞に対する％±SEM、斜線入り棒線）。ＣＭによる組織脂肪由来幹細胞の誘導後に観察されたMyoD1陽性細胞の平均数（黒棒線）およびＭＭ中におけるＨＦＦの場合の平均数（白棒線）もまた測定された。各実験の数値は下に表形式で示されている。一方向ＡＮＯＶＡを用いて１から６週間のMyoD1値の統計的比較を実施した（星印；P＜0.001、F=18.9）。さらにまた、ＡＮＯＶＡを実施して各時点の実験値およびコントロール値を比較した。ｐ値が示されている（ｐ＜0.0001）。
【図２１】ミオシン発現の時間依存増加が、誘導された組織脂肪由来幹細胞で観察される。ミオシン培地（MM）での誘導後１、３および６週間のミオシン陽性組織脂肪由来幹細胞（PLA）の平均数を示す柱状図が示されている（全PLA細胞に対する％±SEM、斜線入り棒線）。コントロール培地（CM）（黒棒線）による組織脂肪由来幹細胞の誘導後に観察されたミオシン陽性細胞の平均数（黒棒線）およびミオシン培地（MM）におけるヒト包皮線維芽細胞（HFF）の場合の平均数（白棒線）もまた測定された。各実験の数値は下に表形式で示されている。一方向ＡＮＯＶＡを用いて１から６週間のミオシン値の統計的比較を実施した（星印；P＜0.0001、F=75.5）。さらにまた、ＡＮＯＶＡを実施して各時点の実験値およびコントロール値を比較した。ｐ値が示されている（ｐ＜0.0001）。
【図２２】組織脂肪由来幹細胞の長期にわたる軟骨形成潜在能を示す。継代1回（パネルＡ）、３回（パネルＢ）および15回（パネルＣ）の組織脂肪由来幹細胞をミクロマス条件下で誘導し、pH１でアルシアンブルー染色を実施して硫酸化プロテオグリカンの存在を検出した。
【図２３】組織脂肪由来幹細胞（PLA）は固有のＣＤマーカーセットを発現する。ＰＬＡ細胞およびヒト骨髄由来ＭＳＣを表示のＣＤ抗原についてＩＦによる分析のために処理した。細胞をＤＡＰＩで同時染色し、核（青色）を可視化し蛍光画像と合体させた。
【図２４】組織脂肪由来幹細胞（PLA）および骨髄ＭＳＣのフローサイトメトリーによるＣＤマーカープロフィールを示す。パネルＡ：組織脂肪由来幹細胞をフォーワードスキャターおよびサイドスキャターを用いてＦＣで分析し、細胞サイズおよび顆粒度を判定した（それぞれFSC-HおよびSSC-H）。ＭＳＣはコントロールとして分析した。パネルＢ：ＰＬＡ細胞を固定し、蛍光色素結合一次抗体を用いて表示のＣＤマーカーとインキュベートした。続いて、染色したＰＬＡ細胞をＦＣで分析した。蛍光色素結合非特異的ＩｇＧで染色されたＭＳＣおよびＰＬＡ細胞をそれぞれ陽性および陰性コントロールとして調べた。全ての結果を老化について修正し、合計105事例を示す。
【図２５】骨形成組織脂肪由来幹細胞（PLA）は明瞭な増殖期、合成期および石化期の特徴を示す。組織脂肪由来幹細胞を採集し、各分化期間につき４プレートずつ２組として35ｍｍの培養皿に播種した。全ての培養皿を約50％コンフルエンシーまでコントロール培地で維持した。細胞を骨形成培地（ＯＭ）で誘導し、表示の日数で細胞数を計測した。細胞数は組織脂肪由来幹細胞数（細胞数（105））として表し、分化時間に対して作図した（パネルＡ）。各時点について、１枚の培養皿をアルカリ性ホスファターゼ（AP）活性について染色し、１枚の培養皿をフォンコッサ染色（VK）を用いて染色してリン酸カルシウムを検出した（パネルＢ）。
【図２６】デキサメタゾンおよび1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3はＰＬＡの骨形成に弁別的に影響を与える：ＡＰ酵素およびリン酸カルシウムの定量。ＰＬＡ細胞、ＭＳＣおよびNHOstのそれぞれ３サンプルをＯＭ中で６週間までインキュベートした。前記は10-7Ｍのデキサメタゾン（ＯＭ/Dex）または10-8Ｍの1,25-ジヒドロキシビタミンＤ3（ＯＭ/VD）のいずれかを含んでいた。細胞をＡＰ活性、カルシウム総含有量および総タンパク量についてアッセイした。ＡＰレベルは、タンパク質１μMにつき1分当たり生成されるｐ−ニトロフェノール（nmol）として表した（nmol p-ニトロフェノール／分／μg）。カルシウムレベルはタンパク質１μg当たりのｍMカルシウムとして表した（ｍMＣａ2+／μｇ）。非誘導ＰＬＡ細胞（コントロール）は陰性コントロールとして分析した。数値は平均±ＳＤとして表した。
【図２７】骨誘導したＰＬＡ細胞は骨形成分化に一致するいくつかの遺伝子を発現する：RT-PCRおよびマイクロアレイ分析。パネルＡ：ＰＬＡ細胞をＯＭ／Ｄｅｘ、ＯＭ／ＶＤまたは非誘導性コントロール培地（コントロール）で表示した日数培養した。全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成し、表示の遺伝子についてＰＣＲ増幅を実施した。ＭＳＣをＯＭ／ＤｅｘまたはＯＭ／ＶＤで誘導し、NHOstはコントロールとしてＯＭ／Ｄｅｘ中で２および３週間誘導した。内部コントロールとしてベータ−アクチンに対するプライマーを用いて２反応ずつ増幅させた。パネルＢ：ＰＬＡ細胞をＯＭ／Ｄｅｘで３週間誘導するか、または非誘導性コントロール培地で維持した。全ＲＮＡを単離し、注文誂えの遺伝子（OC、OP、ON、CBFA1、CNIおよびBSP）含有アレイを用いてマイクロアレイ分析を実施した。
【図２８】骨誘導したＰＬＡ細胞は骨形成分化に一致するいくつかの遺伝子を発現する：免疫蛍光分析およびウェスタン分析。パネルＡ：ＰＬＡ細胞およびＭＳＣをＯＭ／Ｄｅｘで誘導するか、または非誘導性コントロール培地（コントロール）で21日間維持した。細胞を、ＯＣ、ＯＰおよびＯＮの発現についてＩＦで分析するために処理した。細胞をＤＡＰＩで同時染色し、核（青色）を可視化し、蛍光画像と合体させた。パネルＢ：ＰＬＡ細胞をＯＭ／Ｄｅｘまたは非誘導性コントロール培地（コントロール）で７日および21日間培養した。細胞溶解物を電気泳動で分離し、ＯＰに対する抗体（αOP）、ＯＮに対する抗体（αON）、デコリンに対する抗体（αDEC）、バイグリカンに対する抗体（αBG）およびＣＮＩに対する抗体（αCNI）を用いてウェスタンブロッティングで分析した。トランスフェリンレセプターの発現（αTfR）は内部コントロールとして用いた。
【図２９】組織脂肪由来幹細胞（PLA）による脂肪生成分化は成長の停止を伴う。組織脂肪由来幹細胞を採集し、各分化時間につき４枚ずつを１組として35mmの組織培養皿に播種した。全ての培養皿を約80％コンフルエンスに達するまでコントロール培地で維持した。前記細胞を脂肪生成培地（AM）で誘導し、表示した日数で細胞数を数えた。細胞数をＰＬＡ細胞数（細胞数（105））として表し、分化時間に対して作図した（パネルＡ）。各時間について１枚の培養皿をオイルレッドＯで染色し、脂質の蓄積を検出した（パネルＢ）。
【図３０】脂肪生成ＰＬＡ細胞はＧＰＤＨ活性を発現する。３サンプルずつのＰＬＡ細胞および3T3-L1細胞をＡＭ中で５週間まで誘導した（それぞれPLA-AM、3T3-AM）。細胞をＧＰＤＨ活性および総タンパク質についてアッセイした。ＧＰＤＨレベルはタンパク質１μｇ当たりのＧＰＤＨ単位として表した（GPDH／μg）。非誘導ＰＬＡ細胞を陰性コントロールとして分析した（PLA−コントロール）。数値は平均±ＳＤとして表した。
【図３１】組織脂肪由来幹細胞は脂肪生成分化と一致するいくつかの遺伝子を発現する：RT-PCR。組織脂肪由来幹細胞をＡＭで誘導するか（AM）または非誘導性コントロール培地で表示の日数維持した（コントロール）。細胞を表示の遺伝子についてRT-PCRによって分析した。ＭＳＣおよび3T3-L1細胞をコントロールとしてＡＭ中で誘導した。２組ずつの反応を内部コントロールとしてβ−アクチンに対するプライマーを用いて増幅した。
【図３２】軟骨形成系列へと誘導された組織脂肪由来幹細胞はプロテオグリカンケラタンおよびコンドロイチン硫酸を伴う：免疫組織化学アッセイおよびジメチルジメチレンブルーアッセイ。パネルＡ：ミクロマス条件下の組織脂肪由来幹細胞（PLA）を軟骨形成培地で誘導するか（CM）、または非誘導性コントロール培地で７日間維持した（コントロール）。結節を固定してパラフィンに包埋し、切片を作製してアルシアンブルーで染色して硫酸化プロテオグリカンを特定した。切片はまたＣＮＩＩ、ケラタン硫酸（KS）およびコンドロイチン−４−硫酸（CS）の発現について染色し、その後Ｈ＆Ｅを用いて後染色を実施した。パネルＢ：ＰＬＡ細胞およびＮＨＣＫ細胞のそれぞれ３サンプルをＣＭ中で３週間まで誘導した（それぞれPLA-CM、NHCK-CM）。プロテオグリカンレベル（ケラタン硫酸およびコンドロイチン硫酸）を求め、総タンパク質１μｇ当たりのμｇプロテオグリカン（μｇＰＧ／μｇ）として表した。誘導されていない組織脂肪由来幹細胞（PLA-コントロール）は陰性コントロールとして分析した。数値は平均±ＳＤとして表した。
【図３３】軟骨形成ＰＬＡ細胞は軟骨分化に一致するいくつかの遺伝子を発現する：RT-PCR。ミクロマス培養条件下のＰＬＡ細胞をＣＭ中で４、７、10および14日誘導するか、または非誘導性コントロール培地（コントロール）で10日間維持した細胞を表示した遺伝子についてRT-PCRで分析した。ＮＨＣＫ細胞を市販のプロ−軟骨形成培地で陽性コントロールとして誘導した。内部コントロールとしてβ−アクチンに対するプライマーを用いて２組ずつの反応を実施した。
【図３４】筋形成系列へ誘導されたＰＬＡ細胞は筋形成分化に一致するいくつかの遺伝子を発現する：RT-PCR分析。ＰＬＡ細胞をＭＭ中で１、３および６週間誘導した（PLA-MM）。MyoD1（MD1）、ミオシン（MYS）、ミオゲニン（MG）およびmyf５（MYF5）の発現について細胞をRT-PCRで分析した。ヒト骨格筋（SKM）から調製した全ＲＮＡを陽性コントロールとして分析した。内部コントロールとしてβ−アクチンに対するプライマーを用いて２組ずつの反応を実施した。
【図３５】ＡＤＳＣは多系列能と一致する多数のマーカーを発現する。ＡＤＳＣの単離：単一細胞の単離が得られるようにＰＬＡ細胞を極めて低いコンフルエンシーで平板培養した。単一のＰＬＡ細胞の増殖によって境界が明瞭なコロニーの生成が生じるまでコントロール培地中で前記培養を維持した。単一のＰＬＡ細胞に由来するコロニーを組織脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）と称した。滅菌コロニーリングおよび0.25％トリプシン／ＥＤＴＡを用いてＡＤＳＣを採集した。前記採集ＡＤＳＣをクローニング培地（15％ＦＢＳ、F12／ＤＭＥＭ（1:1）中の１％抗生物質／抗真菌剤）で増加させた。三系列ＡＤＳＣクローンをＯＭ、ＡＭおよびＣＭで分化させ、多系列能を以下の組織学的アッセイおよびＩＨアッセイによって調べた：アルカリ性ホスファターゼ（骨形成）、オイルレッドＯ（脂肪生成）およびアルシアンブルー（軟骨形成）。
【図３６】ＰＬＡから多系列クローンを単離することによってＣＤマーカーの発現プロフィールに変化は生じない。二系列および三系列クローンを単離し、単一ＰＬＡから増大させた。前記クローン集団を表示のマーカーの発現についてＩＦを用いて調べた。ＡＤＳＣをＤＡＰＩで同時染色して核（青色）を可視化し蛍光画像と合体させた。
【図３７】ＡＤＳＣは多系列能と一致して多数の遺伝子を発現させる。三系列ＡＤＳＣクローンをＯＭ／ＶＤ（ＡＤＳＣ-骨）、ＡＭ（ＡＤＳＣ-脂肪）およびＣＭ（ＡＤＳＣ-軟骨）で、コントロール培地（ＡＤＳＣ-コントロール）でも同様に培養し、続いて表示の系列特異的遺伝子についてRT-PCR分析を実施した。β−アクチンレベルは内部コントロールとして分析した。
【図３８】ＰＬＡ細胞はin vitroで神経形成能を示すらしい。パネルＡ：非誘導ＰＬＡ細胞（PLA-0時間）並びに２および８時間ＮＭで誘導したＰＬＡ細胞（それぞれPLA-2時間、PLA-8時間）の光学顕微鏡写真。パネルＢ：ＰＬＡ細胞をＮＭまたはコントロール培地で５時間維持し（それぞれPLA-NM、PLA-コントロール）、以下の系列特異的マーカーの発現についてＩＨにより分析した：ＮＳＥ、ｔｒｋ−Ａ、ＮｅｕＮおよびＭＡＰ−２（神経細胞）、ＧＦＡＰ（星状細胞）。ＮＧＦで処理したＰＣ１２細胞も陽性コントロールとして調べた。パネルＣ：ＰＬＡ細胞をＮＭで4.5時間および９時間誘導し、RT-PCRによって表示の遺伝子について分析した。さらに、ＰＬＡ細胞をＮＭで９時間誘導し、さらにＮＰＭＭで１週間維持した（NPMM）。非誘導ＰＬＡ細胞（コントロール）を陰性コントロールとして分析した。ＰＣ１２細胞は陽性コントロールとして、ヒト脳（脳）から調製した全ＲＮＡと一緒に調べた。
【図３９】組織脂肪由来幹細胞分画から単離したクローンは神経形成潜在能力を示す。脂肪生成（オイルレッドＯ染色）、骨形成（アルカリ性ホスファターゼ）、軟骨形成（アルシアンブルー染色）および神経形成（抗trka発現）分化について、クローンを免疫組織化学的に調べた。
【図４０】組織脂肪由来幹細胞（PLA）の骨形成分化はＣＤマーカーの発現を顕著には変化させない。ＰＬＡ細胞（パネルＡ）およびＭＳＣ（パネルＢ）を３週間ＯＭで誘導するか（それぞれPLA-骨、MSC-骨）、または非誘導性コントロール培地で維持した（PLA-コントロール、MSC-コントロール）。細胞をCD34、CD44、CD45およびCD90の発現についてＩＦで分析するために処理し、ＤＡＰＩで同時染色して核（青色）を可視化し、蛍光画像と合体させた。
【図４１】脂肪生成分化は組織脂肪由来幹細胞（PLA）のＣＤマーカープロフィールに繊細な変化をもたらす。ＰＬＡ細胞（パネルＡ）およびＭＳＣ（パネルＢ）をＡＭ中で２週間誘導するか（それぞれPLA-脂肪、MSC-脂肪）、または非誘導コントロール培地で維持した（PLA-コントロール、MSC-コントロール）。細胞をCD34、CD44、CD45およびCD90の発現についてＩＦで分析するために処理し、ＤＡＰＩで同時染色して核（青色）を可視化し、蛍光画像と合体させた。脂肪細胞およびその染色パターンを可視化するために、蛍光画像を光学顕微鏡写真（差込み図）と合体させた。脂質充満細胞（白矢印−蛍光画像；黒矢印−差込み図）および線維芽細胞（白塗り矢印−蛍光画像；黒塗り矢印−差込み図）が表示されている。
【図４２】分化は組織脂肪由来幹細胞（PLA）の特定のＣＤマーカーの発現を変化させる：フローサイトメトリー。パネルＡ：ＰＬＡ細胞をコントロール培地（コントロール）、またはＯＭ（骨形成）またはＡＭ（脂肪生成）で２週間維持した。細胞をフォワードスキャターおよびサイドスキャターを用いてＦＣで分析し、細胞サイズおよび顆粒性を調べた（それぞれFSC-HおよびSSC-H）。パネルＢおよびＣ：ＰＬＡ細胞をコントロール培地（PLA-CM）、またはＯＭ（PLA-OM）またはＡＭ（PLA-AM）で２週間維持した。蛍光色素結合一次抗体を用いて表示のＣＤマーカーについて直接染色してＦＣで分析した。蛍光色素結合非特異的ＩｇＧで染色した細胞を陰性コントロールとして調べた。全ての結果を老化について修正し、合計105事例を示した。
【図４３】組織脂肪由来幹細胞（PLA）の分化はＥＣＭ組成に変化をもたらす。ＰＬＡ細胞をＯＭで３週間（PLA-骨）、ＡＭで２週間（PLA-脂肪）、またはコントロール培地で維持した（PLA-コントロール）。1型コラーゲン（CNI）４型コラーゲン（CNIV）および５型コラーゲン（CNV）に対する抗体を用いて細胞をＩＦ分析のために処理した。細胞をＤＡＰＩで同時染色して核（青色）を可視化し、蛍光画像と合体させた。蛍光画像は光学顕微鏡写真（差込み図）と合体させた。脂質充満ＰＬＡ細胞（白矢印−蛍光画像；黒矢印−差込み図）が表示されている。骨誘導ＭＳＣ（MSC-骨）、脂肪誘導ＭＳＣ（MSC-脂肪）および非誘導ＭＳＣ（MSC-コントロール）もまた分析した。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際公開パンフレット】
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2005502352.tif 000299
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502352.tif 000300
2005502352.tif 000301
【国際調査報告】
2005502352.tif 000302
2005502352.tif 000303
2005502352.tif 000304
2005502352.tif 000305