(57)【要約】ホルモン感受性リパーゼの発現を調節するための、アンチセンス化合物、組成物および方法が、提供される。これらの組成物は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に対して標的化されたアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ホルモン感受性リパーゼ発現の調節およびホルモン感受性リパーゼ発現に関連する疾患の処置のためにこれらの化合物を使用する方法が、提供される。ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に対して標的化された、８〜５０核酸塩基長の化合物であって、該化合物は、該ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、そして該ホルモン感受性リパーゼの発現を阻害する、化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に対して標的化された、８〜５０核酸塩基長の化合物であって、該化合物は、該ホルモン感受性リパーゼに特異的にハイブリダイズし、そして該ホルモン感受性リパーゼの発現を阻害する、化合物。
【請求項２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号６２、配列番号７０、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１５３または配列番号１７９を含む配列を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変されたヌクレオシド間連結を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記改変されたヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエート連結である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変された糖部分を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
前記改変された糖部分が、２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変された核酸塩基を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項９】
前記改変された核酸塩基が、５−メチルシトシンである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、キメラオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸分子上の活性部位の少なくとも８核酸塩基長と特異的にハイブリダイズする、８〜５０核酸塩基長の化合物。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、組成物。
【請求項１３】
コロイド分散系をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞または組織において、ホルモン感受性リパーゼの発現を阻害する方法であって、該方法は、ホルモン感受性リパーゼの発現が阻害されるように、該細胞または組織を、請求項１に記載の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
ホルモン感受性リパーゼに関連する疾患または状態を有する動物またはこのような疾患または状態を有すると疑われる動物を処置する方法であって、該方法は、ホルモン感受性リパーゼの発現が阻害されるように、治療的有効量または予防的有効量の請求項１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記状態が、異常な代謝状態である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記代謝状態が、高脂血症である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記状態が肥満である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記状態が、過剰増殖障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記過剰増殖障害が、癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、下垂体癌、結腸直腸癌、乳癌、精巣癌、肺癌または上皮癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
動物において血中グルコースレベルを調節する方法であって、該方法は、該動物に請求項１に記載の化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記動物がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記血中グルコースレベルが、血漿グルコースレベルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記血中グルコースレベルが、血清グルコースレベルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記動物が、糖尿病の動物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
動物においてホルモン感受性リパーゼに関連する疾患または状態の発生を予防または遅延する方法であって、該方法は、治療的有効量または予防的有効量の請求項１に記載の化合物を、該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
前記動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態が、異常な代謝状態である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記代謝状態が、高脂血症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が糖尿病である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記状態が肥満である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記状態が、過剰増殖障害である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記過剰増殖障害が癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、下垂体癌、結腸直腸癌、乳癌、精巣癌、肺癌または上皮癌である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
動物における血中グルコースレベルの増加の発生を予防または遅延する方法であって、該方法は、請求項１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
前記動物がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記状態が、異常な代謝状態である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記異常な代謝状態が、高脂血症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患が糖尿病である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記状態が肥満である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記状態が、過剰増殖障害である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記過剰増殖障害が癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌が、下垂体癌、結腸直腸癌、乳癌、精巣癌、肺癌または上皮癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
動物において血清コレステロールレベルを調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５２】
前記動物がヒトである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記状態が、異常な代謝状態である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記異常な代謝状態が、高脂血症である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患が糖尿病である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記状態が肥満である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
前記状態が、過剰増殖障害である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記過剰増殖障害が癌である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記癌が、下垂体癌、結腸直腸癌、乳癌、精巣癌、肺癌または上皮癌である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
動物において血清トリグセリドレベルを調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載の化合物を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記動物がヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記状態が、異常な代謝状態である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記異常な代謝状態が、高脂血症である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患が糖尿病である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記状態が肥満である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記状態が、過剰増殖障害である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６９】
前記過剰増殖障害が癌である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記癌が、下垂体癌、結腸直腸癌、乳癌、精巣癌、肺癌または上皮癌である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、ホルモン感受性リパーゼの選択的スプライシング形態をコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズし、そして該核酸分子の発現を阻害する、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ホルモン感受性リパーゼの発現を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に特異的にハイブリダイズする化合物（特にオリゴヌクレオチド）に関する。このような化合物は、ホルモン感受性リパーゼの発現を調節することが示されている。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
トリグリセリドおよびコレステロールエステルからの脂肪酸の動員は、哺乳動物において主なエネルギー供給源を提供する。ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ、ＬＩＰＥおよび中性コレステロールエステルヒドロラーゼ；ＮＣＥＨとしても公知）は、このプロセスにおいて重要な役割を果たす、多機能性組織リパーゼである。この酵素は、広い特異性を有し、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロールおよびモノアシルグリセロール、ならびにコレステロールエステルの加水分解を触媒する。ホルモン感受性リパーゼは、脂肪組織において最も広く研究されており、脂肪分解における主要な律速工程を触媒すると考えられている（Ｓａｌｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２０００、９７、５３５−５３７）。
【０００３】
ホルモン感受性リパーゼは、ｃＡＭＰ依存的リン酸化によって急速に活性化され、そして脂肪細胞におけるその調節は、脂肪分解因子（例えば、カテコールアミン）が遊離脂肪酸の循環レベルを制御する、主な手段である。
【０００４】
血漿中の遊離脂肪酸は、肝臓および筋肉の両方における、炭水化物および脂肪の利用、貯蔵および合成に大きく影響する。脂肪酸代謝産物はまた、核レセプターに直接結合し、こうして、脂肪の合成および分解に関与する遺伝子の転写を調節するすると考えられている。これらの観察は、ホルモン感受性リパーゼが、基質の利用と貯蔵とのバランスを制御することにおける重要なプレーヤーであることを示唆する（Ｓａｌｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２０００、９７、５３５−５３７）。
【０００５】
脂肪細胞に加えて、ホルモン感受性リパーゼは、骨格筋、心臓、脳、膵臓β細胞、副腎、卵巣、精巣およびマクロファージにおいて発現される。トリグリセリドの加水分解もまた、筋肉および膵臓において重要であるが、コレステロールエステルの加水分解は、これらの組織において別個の生物学的役割を果たすようである（Ｓａｌｔｉｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２０００、９７、５３５−５３７）。
【０００６】
ヒトホルモン感受性リパーゼ遺伝子は、１９８８年にクローニングされ（Ｈｏｌｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４１、１５０３−１５０６）、そして染色体１９ｑ１３．１−１３．２にマップされた（Ｌｅｖｉｔｔら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９５、６９、２１１−２１４）。
【０００７】
ホルモン感受性リパーゼ遺伝子産物のサイズは、多様である。ラットにおいて、心臓、骨格筋、胎盤および卵巣は、脂肪組織において発現されるｍＲＮＡ（３．３ｋｂ）よりも僅かに大きいｍＲＮＡ（３．５ｋｂ）を発現する。さらに、３．９ｋｂのｍＲＮＡが、別個のアイソフォームとして（Ｈｏｌｓｔら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９６、３５、４４１−４４７）、精巣において発現される（ＨＳＬｔｅｓ）（Ｈｏｌｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４１、１５０３−１５０６；Ｈｏｌｓｔら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９６、３５、４４１−４４７）。
【０００８】
トランスジェニックマウスにおける、ホルモン感受性リパーゼのマクロファージ特異的な過剰発現は、アテローム硬化症の発症についてのより高い感受性を示した（Ｅｓｃａｒｙら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、１９９９、４０、３９７−４０４）。
【０００９】
トランスジェニックマウスにおけるこの遺伝子の標的化された破壊は、ホルモン感受性リパーゼが、精子形成に必要であるが、脂肪細胞に貯蔵されたトリアシルグリセロールの加水分解の媒介に関与する唯一の酵素ではないことを、さらに示した（Ｏｓｕｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２０００、９７、７８７−７９２）。
【００１０】
糖尿病患者は、アテローム硬化性の脈管疾患を発症する危険性が増大していることが、実証されている。この結果の支持は、ラットおよびマウスのβ細胞の研究において見出され得、ここで、脂質由来のシグナルを介したホルモン感受性リパーゼの活性化が、インスリンの全体的放出に寄与する。この放出は、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）を導く事象において、β細胞に悪影響を与え得、ここで、高血糖症には、脂質代謝における異常が伴う（Ｍｕｌｄｅｒら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９９９、４８、２２８−２３２）。
【００１１】
卵巣癌患者の研究の結果は、正常な脂肪細胞におけるホルモン感受性リパーゼのレベルの増大を実証し、そして脂質代謝の癌媒介性欠損におけるホルモン感受性リパーゼの重要な役割を示唆している（Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９６、６０、３５−４１）。
【００１２】
ホルモン感受性リパーゼにおける欠損は、家族性肥満に関連する脂肪細胞異常を導くカテコールアミン誘導性の脂肪分解への耐性を付与することが実証されている（Ｈｅｌｌｓｔｏｒｍら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、１９９６、３９、９２１−９２８）。
【００１３】
ホルモン感受性リパーゼのいくつかのインヒビターが、当該分野で記載されてきた。これらとしては、抗体、低分子およびアンチセンス核酸が挙げられる。
【００１４】
ホルモン感受性リパーゼの低分子インヒビターは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／１７９８１（Ｐｅｔｒｙら、２００１）、ＷＯ  ００／６７０２５（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２０００）およびＷＯ  ００／２７３８８（Ｗａｇｌｅら、２０００）において開示され、そして特許請求されている。
【００１５】
トルブタミドは、インビトロでラット脂肪細胞におけるホルモン感受性リパーゼの活性を低減することが実証された。しかし、トルブタミドを用いる２型糖尿病患者の処置は、偽薬処置した患者と比較して恩恵を示さなかった（Ａｇａｒｄｈら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．、１９９９、４６、９９−１０８）。
【００１６】
ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ０１／２６６６４には、オスの動物における不妊を阻害するための、アンチセンスインヒビターの使用が、開示および特許請求されており、ここで、このアンチセンスインヒビターは、ホルモン感受性リパーゼをコードするｍＲＮＡの一部に対して実質的に相補的であり、そしてこのインヒビターは、少なくとも５個連続する塩基を含む（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＷａｎｇ、２００１）。
【００１７】
アンチセンス方向でラットホルモン感受性リパーゼの３８７ヌクレオチドのフラグメントを含むベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における中性コレステロールエステルヒドロラーゼの活性における、このホルモン感受性リパーゼ遺伝子の役割の調査において使用され、そして、実際、ホルモン感受性リパーゼおよび中性コレステロールエステルヒドロラーゼが、マクロファージにおいて同じ酵素であることを結論付けた（Ｏｓｕｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９７、２２３、６５５−６５７）。
【００１８】
異常な脂質代謝によって引き起こされる障害におけるホルモン感受性リパーゼの関与は、ホルモン感受性リパーゼを、肥満、糖尿病およびアテローム硬化性の脈管弛緩のような状態における調査のための潜在的に有用な治療標的にしている。
【００１９】
現在、ホルモン感受性リパーゼのインヒビターとしては、中性代謝産物（ＪｅｐｓｏｎおよびＹｅａｍａｎ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９２、３１０、１９７−２００；Ｐｌｅｅ−Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９９６、３１８、１０５７−１０６３）ならびに以前に引用した低分子、抗体およびアンチセンスインヒビターが挙げられる。しかし、ホルモン感受性リパーゼの機能を効果的かつ選択的に阻害し得るさらなる薬剤についての長きにわたる切実な必要性がいまなお存在する。
【００２０】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を低減するための有効な手段として出現しており、従って、ホルモン感受性リパーゼの発現の調節のための、多数の治療適用、診断適用および研究適用において独自に有用であることが証明され得る。
【００２１】
本発明は、ホルモン感受性リパーゼのアイソフォーム（精巣特異的ＨＳＬｔｅｓとして公知のを含むホルモン感受性リパーゼを含む）の調節を含む、ホルモン感受性リパーゼの発現を調節するための組成物および方法を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸に対して標的化され、そしてホルモン感受性リパーゼの発現を調節する、化合物（特にアンチセンスオリゴヌクレオチド）に関する。本発明の化合物を含む薬学的組成物または他の組成物もまた、提供される。細胞または組織においてホルモン感受性リパーゼの発現を調節する方法がさらに提供され、この方法は、この細胞または組織を、本発明のアンチセンス化合物またはアンチセンス組成物の１以上に接触させる工程を包含する。ホルモン感受性リパーゼの発現に関連する疾患もしくは状態を有することが疑われるか、またはこのような疾患もしくは状態に罹りやすい動物（特にヒト）を処置するための方法もまた提供され、この方法は、治療的有効量または予防的有効量の本発明のアンチセンス化合物またはアンチセンス組成物の１以上を投与する工程による。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸分子の機能を調節する際に、最終的には、産生されるホルモン感受性リパーゼの量を調節するために、オリゴマー化合物（特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を用いる。これは、ホルモン感受性リパーゼをコードする１以上の核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって達成される。本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸」および「ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸」は、ホルモン感受性リパーゼをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを包含する）、およびこのようなＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡもまた包含する。オリゴマー化合物の、その標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節は、一般に、「アンチセンス」といわれる。妨害されるべきＤＮＡの機能としては、複製および転写が挙げられる。妨害されるべきＲＮＡの機能としては、生命維持に必要な全ての機能（例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシング、およびＲＮＡに関与し得るかまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性など）が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨害の全体的効果は、ホルモン感受性リパーゼの発現調節である。本発明に関連しては、「調節」とは、遺伝子発現の増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関連しては、阻害は、遺伝子発現の好ましい調節形態であり、そしてｍＲＮＡが好ましい標的である。
【００２４】
アンチセンスに関して特定の核酸を標的とすることが好ましい。アンチセンス化合物を特定の核酸に対して「標的化」することは、本発明に関連しては、複数工程のプロセスである。このプロセスは通常、その機能が調節されるべき核酸配列の同定に始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害状態もしくは疾患状態と関連している細胞性遺伝子（またはこの遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）または感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明では、この標的は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸分子である。この標的化プロセスはまた、所望の効果（例えば、このタンパク質の検出またはこのタンパク質の発現の調節）をもたらすように、この遺伝子内での、アンチセンス相互作用が生じる部位の決定を包含する。本発明に関連しては、好ましい遺伝子内部位は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは翻訳終結コドンを包含する領域である。当該分野で公知であるように、翻訳開始コドンは代表的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５’−ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」ともいわれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧがインビボで機能することが示されている。従って、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、各例における開始アミノ酸は代表的には、メチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）とはいえ、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物遺伝子および原核生物遺伝子が、２以上の代替的開始コドンを有し得、これらのうちの任意のものが、特定の細胞型もしくは組織において、または特定のセットの条件下で、翻訳開始に関して優先的に利用され得ることもまた当該分野で公知である。本発明に関しては、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」とは、このようなコドンの配列にかかわらず、ホルモン感受性リパーゼをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するためにインビボで用いられるコドンをいう。
【００２５】
遺伝子の翻訳終結コドン（または「停止コドン」）が、３つの配列（すなわち、５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有し得ることもまた、当該分野で公知である。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」とは、このようなｍＲＮＡまたは遺伝子のうちの、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）にある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。同様に、用語「停止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」とは、このようなｍＲＮＡまたは遺伝子のうちの、翻訳終結コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）にある約２５〜約５０連続したヌクレオチドを含む部分をいう。
【００２６】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域をいうことが当該分野で公知であり、効果的に標的化され得る領域でもある。他の標的領域としては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（これは、ｍＲＮＡのうちの翻訳開始コドンから５’方向にある部分をいうことが当該分野で公知であり、従って、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（これは、ｍＲＮＡのうちの翻訳終結コドンから３’方向にある部分をいうことが当該分野で公知であり、従って、ｍＲＮＡの翻訳終結コドンと３’末端との間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを包含する）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に連結されたＮ７−メチル化グアノシン残基を包含する。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体ならびにキャップに隣接する最初の５０ヌクレオチドを包含すると考えられる。５’キャップ領域はまた、好ましい標的領域であり得る。
【００２７】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写産物は、直接的に翻訳されるが、多くのものは、転写産物から翻訳前に切り出される、「イントロン」として公知の１以上の領域を含む。残りの（それゆえ翻訳された）領域は、「エキソン」として公知であり、そして一緒にスプライシングされて、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわち、イントロン−エキソン連結部はまた、好ましい標的領域であり得、そして異常なスプライシングが疾患に関与する状況または特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰発現が疾患に関与する状況で特に有用である。再編成または欠失に起因した異常な融合連結部もまた、好ましい標的である。イントロンもまた、ＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡに対して標的化されるアンチセンス化合物についての効果な（それゆえ、好ましい）標的領域であり得ることが見出されている。
【００２８】
一旦、１以上の標的部位が同定されたら、その標的に対して充分に相補的である、すなわち、充分によく、そして充分な特異性を有してハイブリダイズし、所望の効果を与えるオリゴヌクレオチドが選択される。
【００２９】
本発明に関しては、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシド塩基間または相補的ヌクレオチド塩基間での水素結合（これは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る）を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する、相補的核酸塩基である。「相補的」とは、本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド間で正確に対合する能力をいう。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合し得る場合、このオリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとは、その位置で互いに相補的であると考えられる。このオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡまたはＲＮＡとは、各分子における充分な数の対応する位置が、互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズし得る」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合がこのオリゴヌクレオチドとこのＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的との間で生じるような充分な程度の相補性または正確な対合を示すために用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが当該分野で理解される。アンチセンス化合物は、この標的ＤＮＡ分子または標的ＲＮＡ分子に対するこの化合物の結合が、この標的ＤＮＡまたはこのＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の喪失を引き起こし、そして特異的結合が所望される条件下で（すなわち、インビボアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、そしてインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される条件下で）非標的配列に対するこのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するに充分な程度の相補性が存在する場合、特異的にハイブリダイズし得る。
【００３０】
標的にハイブリダイズしてその標的の発現を阻害する、本発明のアンチセンスおよび他の化合物は実験によって同定され、そしてこれらの化合物の配列は、本明細書中以下で、本発明の好ましい実施形態として同定される。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書中以下で、「活性部位」といわれ、それゆえ、標的化のために好ましい部位である。それゆえ、本発明の別の実施形態は、これらの活性部位にハイブリダイズする化合物を包含する。
【００３１】
アンチセンス化合物は通常、研究試薬および診断剤として用いられる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、遺伝子発現を鋭敏な特異性で阻害し得る）はしばしば、特定の遺伝子の機能を解明するために当業者によって用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の種々のメンバーの機能を識別するために用いられる。それゆえ、アンチセンス調節は、研究用途のために利用されている。
【００３２】
キットおよび診断における使用に関して、本発明のアンチセンス化合物は、単独で、または他のアンチセンス化合物もしくは治療剤との組合せで、細胞内および組織内で発現される遺伝子の構成要素の一部または全体の発現パターンを解明するために、示差的分析および／またはコンビナトリアル分析においてツールとして用いられ得る。
【００３３】
１以上のアンチセンス化合物で処理された細胞内または組織内での発現パターンは、アンチセンス化合物で処理されていない、コントロールの細胞または組織と比較され、そして生じたパターンは、例えば、調べられる遺伝子の、疾患との関連、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造または機能に関連するので、示差的レベルの遺伝子発現について分析される。これらの分析は、刺激された細胞または刺激されていない細胞において、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の存在下または非存在下で実施され得る。
【００３４】
当該分野で公知の遺伝子発現分析方法の例としては、以下が挙げられる：ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａおよびＶｉｌｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７−２４；Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化したｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列決定（Ｃｅｌｉｓら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７）、差引きＲＮＡフィンガープリント（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０８）、差引きクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃおよびＢｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇおよびＧｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０４）および質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５−４１において概説される）。
【００３５】
アンチセンスの特異性および感度はまた、治療的用途に関して、当業者によって利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾患状態の処置において治療部分として用いられている。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬物（リボザイムを含む）は、ヒトに対して安全かつ有効に投与されており、そして多数の臨床試験が現在行われている。従って、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物（特に、ヒト）の処置に関する処置レジメにおいて有用であるように構成され得る有用な治療様式であり得ることが確立されている。
【００３６】
本発明に関しては、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣物のオリゴマーまたはポリマーという。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（骨格）結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する、天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。このような改変または置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば、ネイティブな形態よりも好ましい。なぜなら、所望の特性（例えば、増強された細胞取り込み、増強された核酸標的親和性およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性など）があるからである。
【００３７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましい形態のアンチセンス化合物であるが、本発明は、以下で記載されるようなオリゴヌクレオチド模倣物を包含するがこれらに限定されない、他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含する。本発明によるアンチセンス化合物は好ましくは、約８〜約５０個の核酸塩基（すなわち、約８〜約５０個連結されたヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約３０個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物としては、標的核酸にハイブリダイズしてその発現を調節する、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム（ｏｌｉｇｏｚｙｍｅ）、および他の短い触媒性ＲＮＡまたは触媒性オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
当該分野で公知のように、ヌクレオシドは、塩基と糖との組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。２つの最も一般的なクラスのこのような複素環式塩基は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の２’ヒドロキシル部分、３’ヒドロキシル部分または５’ヒドロキシル部分のいずれかへと連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、隣のヌクレオシドを別のヌクレオシドへと共有結合的に連結して、直鎖状のポリマー化合物を形成する。次いで、この直鎖状ポリマー構造体のそれぞれの末端は、さらに連結されて、環状構造体を形成し得る。しかし、開いた直鎖状構造体が一般的に好ましい。このオリゴヌクレオチド構造においては、リン酸基は通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合または骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【００３９】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例としては、改変された骨格または天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書中で定義する場合、改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、リン原子をその骨格中に保持するオリゴヌクレオチドおよびリン原子をその骨格中に有さないオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書の目的に関して、そしてときどき当該分野で参照されるように、リン原子をそれらのヌクレオシド間骨格に有さない、改変されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
【００４０】
好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、正常な３’−５’結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’−アミノホスホロアミデートおよび３’−アミノアルキルホスホロアミデートを含む）、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートならびにボラノホスフェート；これらの２’−５’連結アナログ；ならびに１以上のヌクレオチド間結合が、３’−３’結合、５’−５’結合または２’−２’結合である、逆の極性を有するオリゴヌクレオチド骨格が挙げられる。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合での単一の３’−３’結合を含む、すなわち、無塩基性（核酸塩基が失われているかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）であり得る単一の逆ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態もまた含まれる。
【００４１】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，１９４，５９９号；同第５，５６５，５５５号；同第５，５２７，８９９号；同第５，７２１，２１８号；同第５，６７２，６９７号および同第５，６２５，０５０号。これらのうちの特定のものは、本出願とともに共有に係っており、そしてこれらのうちの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００４２】
リン原子を含まない、好ましい改変されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルヌクレオシド間結合もしくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子およびアルキルヌクレオシド間結合もしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖へテロ原子ヌクレオシド間結合もしくは短鎖複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらとしては、以下が挙げられる：モルホリノ結合を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合したＮ構成要素部分、Ｏ構成要素部分、Ｓ構成要素部分およびＣＨ２構成要素部分を有する他の骨格。
【００４３】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的米国特許としては、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号。これらのうちの特定のものは、本願とともに共有に係っており、そしてこれらの各々は、本明細書中に参考として援用される。
【００４４】
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方（すなわち、骨格）が、新規基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）といわれる。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置き換えられる。この核酸塩基は、維持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；および米国特許第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示が、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７〜１５００において見出され得る。
【００４５】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格（特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチリミノ）またはＭＭＩ骨格として公知］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ならびに−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここでネイティブホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と表される］、ならびに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格）を有するオリゴヌクレオシドである。上記で参照した米国特許第５，０３４，５６０号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
【００４６】
改変されたオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうち１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルもしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここでアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルで置換されても置換されなくてもよい。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ここでｎおよびｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換置。好ましい改変としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとして公知の２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）（すなわち、アルコキシアルコキシ基）が挙げられる。さらに好ましい改変としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であり、また本明細書後述でも記載したように、２’−ＤＭＡＯＥとしても公知である）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知でもある）（すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２であり、また、本明細書後述の実施例にも記載される）が挙げられる。
【００４７】
さらに好ましい改変としては、ロックされた核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）が挙げられ、ここで２’−ヒドロキシル基は、糖環の３’または４’の炭素原子と結合し、それにより二環式糖部分が形成される。この結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、ここでｎは、１または２である。ＬＮＡおよびその調製物は、ＷＯ９８／３９３５２およびＷＯ９９／１４２２６に記載される。
【００４８】
他の好ましい改変としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−改変は、アラビノ（上）位内またはリボ（下）位内であり得る。好ましい２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変がまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置（特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位）でなされうる。オリゴヌクレオチドはまた、糖模倣物（例えば、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分）を有し得る。このような改変糖構造物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，９８１，９５７号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，３１９，０８０号；米国特許第５，３５９，０４４号；米国特許第５，３９３，８７８号；米国特許第５，４４６，１３７号；米国特許第５，４６６，７８６号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５１９，１３４号；米国特許第５，５６７，８１１号；米国特許第５，５７６，４２７号；米国特許第５，５９１，７２２号；米国特許第５，５９７，９０９号；米国特許第５，６１０，３００号；米国特許第５，６２７，０５３号；米国特許第５，６３９，８７３号；米国特許第５，６４６，２６５号；米国特許第５，６５８，８７３号；米国特許第５，６７０，６３３号；米国特許第５，７９２，７４７号；および米国特許第５，７００，９２０号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちのあるものは、本出願と共有に係り、そしてこれらの各々は、その全文が、参考として本明細書中に援用される。
【００４９】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（しばしば、当該分野において「塩基」と簡単に称される）改変または置換を含み得る。本明細書中で用いられる場合、「非改変」または「天然」の核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。改変核酸としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基（例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンならびにグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンならびにグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンならびに２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよび５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３））シトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルならびに５−置換シトシン）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン）が挙げられる。さらなる改変核酸塩基としては、三環式ピリミジン（例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ（例えば、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン））、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。改変核酸塩基としてはまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環（例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン）に置き換えられている核酸塩基が挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示される核酸塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示される核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３により開示される核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａ���ｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２頁，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示される核酸塩基が挙げられる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増強について、とくに有用である。これらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン置換プリンおよびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリンが挙げられ、これには２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃で、核酸二重鎖の安定性を増強させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、そしてこれらは現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖改変と合わせた場合、なおさら特に、好ましい。
【００５０】
上記に記載される改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の特定のものの調製を教示する、代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに：米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第５，１３０，３０２号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号、米国特許第５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６４５，９８５号；米国特許第５，８３０，６５３号；米国特許第５，７６３，５８８号；米国特許第６，００５，０９６号；および米国特許第５，６８１，９４１号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちのあるものは、本出願と共有に係り、そしてこれらの各々は、参考として本明細書中に援用され、そして米国特許第５，７５０，６９２号は、本出願と共有に係り、そしてまた、本明細書中に参考として援用される。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の改変は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つ以上の部分または結合体をオリゴヌクレオチドに対して化学的に連結することを含む。本発明の化合物としては、官能基（例えば、一級ヒドロキシル基または二級ヒドロキシル基）と共有結合した結合基が挙げられ得る。本発明の結合基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基が挙げられる。代表的な結合基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。本発明に関連して、薬力学的性質を増強する基としては、オリゴマー取込みを改善する基、分解に対するオリゴマーの耐性を促進する基、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明に関連する、薬力学的性質を増強する基としては、オリゴマーの取込み、分布、代謝または排出を改善する基が挙げられる。代表的な結合基は、１９９２年１０月２３日に出願され、その開示の全体が参考として本明細書中に援用される、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６において開示される。結合部分としては、脂質部分（例えば、コレステロール部分）（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質（例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パル��チル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬物物質（例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗殺菌剤または抗生物質）に対して結合され得る。オリゴヌクレオチド−薬物結合体およびその調製は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許出願０９／３３４，１３０（１９９９年６月１５日に出願）に記載される。
【００５２】
そのようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては：米国特許第４，８２８，９７９号；米国特許第４，９４８，８８２号；米国特許第５，２１８，１０５号；米国特許第５，５２５，４６５号；米国特許第５，５４１，３１３号；米国特許第５，５４５，７３０号；米国特許第５，５５２，５３８号；米国特許第５，５７８，７１７号，米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５９１，５８４号；米国特許第５，１０９，１２４号；米国特許第５，１１８，８０２号；米国特許第５，１３８，０４５号；米国特許第５，４１４，０７７号；米国特許第５，４８６，６０３号；米国特許第５，５１２，４３９号；米国特許第５，５７８，７１８号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第４，５８７，０４４号；米国特許第４，６０５，７３５号；米国特許第４，６６７，０２５号；米国特許第４，７６２，７７９号；米国特許第４，７８９，７３７号；米国特許第４，８２４，９４１号；米国特許第４，８３５，２６３号；米国特許第４，８７６，３３５号；米国特許第４，９０４，５８２号；米国特許第４，９５８，０１３号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，２４５，０２２号；米国特許第５，２５４，４６９号；米国特許第５，２５８，５０６号；米国特許第５，２６２，５３６号；米国特許第５，２７２，２５０号；米国特許第５，２９２，８７３号；米国特許第５，３１７，０９８号；米国特許第５，３７１，２４１号，米国特許第５，３９１，７２３号；米国特許第５，４１６，２０３号，米国特許第５，４５１，４６３号；米国特許第５，５１０，４７５号；米国特許第５，５１２，６６７号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５６５，５５２号；米国特許第５，５６７，８１０号；米国特許第５，５７４，１４２号；米国特許第５，５８５，４８１号；米国特許第５，５８７，３７１号；米国特許第５，５９５，７２６号；米国特許第５，５９７，６９６号；米国特許第５，５９９，９２３号；米国特許第５，５９９，９２８号および米国特許第５，６８８，９４１号が挙げられるが、これらに限定されず、これらのうちのあるものは本出願と共有に係り、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００５３】
所定の化合物内の全ての位置に対して、一様に改変する必要はなく、実際、単一の化合物において、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドすら、１を超える上述の改変が組み込まれ得る。本発明はまた、キメラの化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明に関連して、「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は、２以上の化学的に異なる領域をふくむ、アンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）であり、これらの領域の各々は、少なくとも１つのモノマー単位（すならち、オリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド）で構成される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的に、ヌクレアーゼ分解に対する増強した耐性、増大した細胞の吸収、そして／または標的核酸に対する増大した結合親和性をオリゴヌクレオチドに対して与えるようにオリゴヌクレオチドが改変されている、少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域を、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断する能力がある酵素に対する基質として役立て得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断という結果を生じ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を、なお一層促進する。結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドを用いて、匹敵する結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および必要であれば、当該分野で公知である関連した核酸ハイブリダイゼーション技術により慣用的に検出され得る。
【００５４】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造体とし形成され得る。このような化合物はまた、当該分野において、ハイブリッドまたはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）といわれている。このようなハイブリッド構造体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第５，０１３，８３０号；米国特許第５，１４９，７９７号；米国特許第５，２２０，００７号；米国特許第５，２５６，７７５号；米国特許第５，３６６，８７８号；米国特許第５，４０３，７１１号；米国特許第５，４９１，１３３号；米国特許第５，５６５，３５０号；米国特許第５，６２３，０６５号；米国特許第５，６５２，３５５号；米国特許第５，６５２，３５６号；および米国特許第５，７００，９２２号が挙げらるが、これらに限定されず、これらのうちのあるものは本出願と共有に係り、これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００５５】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術を通して、都合よくかつ慣用的に作製され得る。そのような合成のための装置は、いくつかの販売者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が挙げられる）によって販売される。そのような、当該分野において公知の合成のための、他の任意の手段が、追加的にまたは代替的に用いられ得る。オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアルキル化誘導体）の調製のために同様の技術の使用が、周知である。
【００５６】
本発明のアンチセンス化合物は、インビトロで合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物もインビボでのアンチセンス分子の合成を指示するように設計した遺伝的ベクター構築物も含まない。
【００５７】
本発明の化合物はまた、取込み、分布および／または吸収の補助のために、他の分子、分子構造体、または化合物の混合物（例えば、リポソーム、レセプター標的化分子、経口処方物、直腸処方物、局所的処方物または他の処方物）と混合され得るか、カプセル化され得るか、結合され得るかさもなければ、会合され得る。そのような取込み、分布および／または吸収を補助する処方物の調製を教示する、代表的な米国特許としては、米国特許第５，１０８，９２１号；米国特許第５，３５４，８４４号；米国特許第５，４１６，０１６号；米国特許第５，４５９，１２７号；米国特許第５，５２１，２９１号；米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，５４７，９３２号；米国特許第５，５８３，０２０号；米国特許第５，５９１，７２１号；米国特許第４，４２６，３３０号；米国特許第４，５３４，８９９号；米国特許第５，０１３，５５６号；米国特許第５，１０８，９２１号；米国特許第５，２１３，８０４号；米国特許第５，２２７，１７０号；米国特許第５，２６４，２２１号；米国特許第５，３５６，６３３号；米国特許第５，３９５，６１９号；米国特許第５，４１６，０１６号；米国特許第５，４１７，９７８号；米国特許第５，４６２，８５４号；米国特許第５，４６９，８５４号；米国特許第５，５１２，２９５号；米国特許第５，５２７，５２８号；米国特許第５，５３４，２５９号；米国特許第５，５４３，１５２号；米国特許第５，５５６，９４８号；米国特許第５，５８０，５７５号；および米国特許第５，５９５，７５６号が挙げられるがこれらに限定されず、各々、参考として本明細書中に援用される。
【００５８】
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に受容可能な塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物へと投与された、生物学的に活性な代謝産物またはその残基を（直接的または間接的に）供給することが可能である、任意の他の化合物を含む。従って、例えば、この開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩、そのようなプロドラッグ、ならびに他の成体相当物を記載する。
【００５９】
用語「プロドラッグ」は、内生の酵素もしくは他の化学物質の作用および／または状態によって、体内もしくはその細胞内で活性形態（すなわち薬物）に転換される、不活性形態で調製される治療的な薬剤を示す。とくに、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドッグ版態は、ＷＯ  ９３／２４５１０（Ｇｏｓｓｅｌｉｎら，１９９３年１２月９日に公開）またはＷＯ  ９４／２６７６４および米国特許第５，７７０，７１３号（Ｉｍｂａｃｈら）に開示した方法に従って、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
【００６０】
用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の、生理学的および薬学的に受容可能な塩（すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を維持し、その上さらに所望しない毒物学的影響を与えない塩）をいう。
【００６１】
薬学的に受容可能な塩基付加塩は、金属またはアミン（例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミン）を用いて形成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照のこと）。上記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態と十分量の所望の塩とを接触させて従来の様式でその塩が生成させることにより、調製される。この遊離酸形態は、塩形態と酸とを接触させ、そして従来の方法で遊離酸を単離することによって、再生され得る。この遊離酸形態は、極性溶媒中での溶解度のような特定の物理的特性がいくらか各々の塩形態とは異なるが、他の点ではこの塩は、本発明の目的のためには各々の遊離酸と等価である。本明細書中に記載される場合、「薬学的な付加塩」は、本発明の組成物の成分の一つの酸形態の薬学的に受容可能な塩を含む。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に受容可能な塩は、当業者に周知であり、種々の無機酸および有機酸の塩基性塩（例えば、有機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）との塩基性塩；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸もしくはホスホ酸、またはＮ−置換スルファミン酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エムボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸）との塩基性塩；およびアミノ酸（例えば、天然におけるタンパク質合成に関与する２０種のαアミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸））との塩基性塩およびまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成を伴う）との塩基性塩、または他の酸有機化合物（例えば、アスコルビン酸）との塩基性塩）を含む。薬学的に化合物の受容可能な塩はまた、薬学的に受容可能なカチオンを用いて調製され得る。適切な薬学的に受容可能なカチオンは、当業者に周知であり、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、アンモニウムカチオンおよび四級アンモニウムカチオンを含む。炭素塩または炭酸水素塩もまた、可能である。
【００６２】
オリゴヌクレオチドに関して、薬学的に受容可能な塩の好ましい例としては、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムのようなカチオン、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミンなどで形成される塩；（ｂ）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などのような無機酸で形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸で形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素のような元素のアニオンから形成される塩が、挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防に、ならびに研究試薬およびキットとして利用され得る。治療について、ホルモン感受性リパーゼの発現を調節することによって処置され得る疾患または障害を有することが予測される動物（好ましくは、ヒト）が、本発明に従うアンチセンス化合物を投与することによって処置される。本発明の化合物は、適切な、薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアに有効量のアンチセンス化合物を添加することによって、薬学的組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防あるいは遅延させるために、予防的に有用であり得る。
【００６４】
本発明のアンチセンス化合物は、研究および診断に有用である。なぜなら、これらの化合物は、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸にハイブリダイズし、サンドウィッチアッセイおよびその他のアッセイが、この事実を開発するように容易に構築されることを可能にするからである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ホルモン感受性リパーゼをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当該分野で公知の手段によって検出され得る。このような手段としては、オリゴヌクレオチドへの酵素の結合体化、オリゴヌクレオチドの放射性標識化または任意の他の適切な検出手段が挙げられ得る。サンプル中のホルモン感受性リパーゼのレベルを検出するための、このような検出手段を使用するキットがまた、調製され得る。
【００６５】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含有する薬学的組成物および薬学的処方物を含む。本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが望まれているか、および処置される領域に依存して、多くの経路で投与され得る。投与は、局部（眼への投与、ならびに膣送達および直腸送達を含む粘膜への投与を含む）、肺（例えば、パウダーまたはエアロゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（噴霧器によるものを含む）；気管支内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射または注入；あるいは頭蓋内（例えば、くも膜下腔内投与または脳室内投与）が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル改変を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられている。
【００６６】
局所投与のための薬学的組成物および薬学的処方物としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体およびパウダーが挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水溶性のベース、パウダーベースまたは油ベース、増粘剤などもまた必要であるか、または望まれ得る。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。好ましい局所処方物としては、本発明のオリゴヌクレオチドが、局所送達剤（例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤）とともに混合物中にある局所処方物が挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、ネガティブ（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロリルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内にカプセル化され得るか、またはリポソーム（特に、カチオン性リポソーム）に複合体を形成し得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質（特に、カチオン性脂質）に複合体化され得る。好ましい脂肪酸および脂肪酸エステルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステート  ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそれらの塩。局所処方物は、米国特許出願０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日に出願され、全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。
【００６７】
経口投与のための組成物および処方物としては、パウダーまたは顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水溶性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）が挙げられる。増粘剤、香料添加剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は、望ましくあり得る。好ましい経口処方物は、本発明のオリゴヌクレオチドが、１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤およびキレート剤と併用して投与される経口処方物である。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、ジグリセリドあるいは薬学的に受容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。浸透増強剤の組合せ（例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩）もまた好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、スプレーされる乾燥粒子を含む顆粒形態またはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体化された顆粒形態で、経口で送達され得る。オリゴヌクレオチド複合体化剤としては、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅｓ）、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。特に好ましい複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレー��、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドのための経口処方物およびそれらの調製は、米国特許出願０８／８８６，８２９（１９９７年７月１１日出願）、０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、０９／２５６，５１５（１９９９年２月２３日出願）、０９／０８２，６２４（１９９８年５月２１日出願）および０９／３１５，２９８（１９９９年５月２０日出願）（各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載される。
【００６８】
非経口投与、くも膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物および処方物としては、滅菌水溶液（これはまた、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物（例えば、浸透増強剤、キャリア化合物および他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る）が挙げられ得る。
【００６９】
本発明の薬学的組成物としては、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有処方物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの組成物は、種々の成分（前もって成形された（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ）液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない）から作製され得る。
【００７０】
本発明の薬学的処方物（単位投薬形態で便利に存在し得る）は、製薬業界で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術としては、活性成分を薬学的キャリアまたは賦形剤と結合させる工程が挙げられる。一般的に、この処方物は、活性成分を液体キャリアまたは細かく分割された固体キャリアまたは両方と均一かつ密接に結合させることおよび次いで、必要に応じて、この製品を成形することによって調製される。
【００７１】
本発明の組成物は、多くの可能な投薬形態（例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟性ゲル、坐薬および浣腸が挙げられるがこれらに限定されない）のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水溶性媒体、非水溶性媒体または混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水溶性懸濁液は、懸濁液の粘性を増やす物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む）をさらに含み得る。この懸濁液はまた、安定剤を含み得る。
【００７２】
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、泡として処方され、そして使用され得る。薬学的泡としては、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームのような処方物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの処方物は、性質において基本的に類似しているが、最終産物の成分および濃度において異なる。このような組成物および処方物の調製は、薬学および処方の分野における、当業者に一般的に公知であり、そして本発明の組成物の処方に適用され得る。
【００７３】
（乳濁液（エマルジョン））
本発明の組成物は、乳濁液として調製および処方され得る。乳濁液は、代表的には、通常直径０．１μｍを越える液滴の形態で別の液体中に分散される、ある液体の異質系である。（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，，１巻、２４５頁；Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２巻、３３５頁；Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５，３０１頁）。乳濁液は、しばしば、互いで完全に混合および分散された２つの不混和性の液体相で構成される二相性の系である。一般的に、乳濁液は、油中水（ｗ／ｏ）または水中油（ｏ／ｗ）種のいずれかであり得る。水相が、大量の油相に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）乳濁液と呼ばれる。あるいは、油相が、大量の水相に細かく分割され、そして微細な液滴として分散される場合、生じた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）乳濁液と呼ばれる。乳濁液は、分散された相および活性薬物（これは、水相、油相中で、またはそれ自体が別の相としてのいずれかで、溶液として存在し得る）に加えて、さらなる成分を含み得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤のような薬学的賦形剤もまた、必要に応じて、乳濁液中に存在し得る。薬学的乳濁液はまた、（例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）乳濁液および例えば、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）乳濁液の場合のような）２つより多くの相で構成される複合乳濁液であり得る。このような複雑な処方物は、しばしば単純な２成分の乳濁液が成さない特定の利点を提供する。ｏ／ｗ乳濁液の個々の油滴が、小さい水滴を囲む複合乳濁液は、ｗ／ｏ／ｗ乳濁液を構成する。同様に、油の連続中に安定化された水の小球中に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ乳濁液を提供する。
【００７４】
乳濁液は、熱力学的安定性がほとんどないことによって特徴付けられる。
しばしば、乳濁液の分散された相または不連続の相は、外側の相または連続した相にうまく分散され、そして乳化剤の手段または処方物の粘性を介して、この形態で維持される。乳濁液型の軟膏ベースおよびクリームの場合、乳濁液の相のいずれかは、半固体または固体であり得る。乳濁液を安定化する他の手段は、乳濁液のいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、４つのカテゴリーに広く分類され得る：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸着ベース、および細かく分散された固体（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。
【００７５】
合成の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）としても知られる）は、乳濁液の処方物における広い適用性を有が見出されており、そして文献中で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，１巻、１９９頁）。界面活性剤は、代表的には両親媒性であり、親水性の部分および疎水性の部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の割合は、親水／疎水バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、処方物の調製において、界面活性剤を分類および選択する際の価値のある道具である。界面活性剤は、親水基の性質：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両親媒性に基づいて異なるクラスに分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、２８５頁）。
【００７６】
乳化処方物において使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンあよびアカシアが挙げられる。吸着ベースは、吸着ベースが水を吸い上げて、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのような、吸着ベースの半固体の粘度をなお維持するｗ／ｏ乳濁液を形成し得るように、親水性の性質を有する。細かく分割された固体はまた、特に界面活性剤との併用において、および粘稠性の調製物における良い乳化剤として使用されている。これらとしては、極性の無機固体（例えば、重金属水酸化物、非膨張性の粘土（例えば、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウムおよびコロイド状のケイ酸マグネシウムアルミニウム）、色素および非極性固体（例えば、炭素またはグリセリルトリステアレート）が挙げられる。
【００７７】
多種の非乳化物質もまた、乳濁液処方物中に含まれ、乳濁液の性質に寄与する。これらとしては、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、３３５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。
【００７８】
親水性コロイドまたはヒドロコロイドとしては、天然に存在するゴムおよび合成ポリマー（例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアールゴム、カラヤゴム、およびトラガカント））、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中で分散または膨張し、コロイド状溶液を形成し、これは分散相の液滴の周りに強い界面フィルムを形成することおよび外部の相の粘性を増すことによって乳濁液を安定化する。
【００７９】
乳濁液は、しばしば微生物の増殖を容易に支え得る多くの成分（例えば、炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチド）を含むので、これらの処方物は、しばしば保存剤を取り入れる。乳濁液処方物中に含まれる一般的に使用される保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤がまた、処方物の変質を抑制するために一般的に添加される。使用される抗酸化剤はフリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、アルキルギャレット、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、および抗酸化共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン））であり得る。
【００８０】
皮膚科学的経路、経口経路および非経口経路を介した乳濁液処方物の適用およびそれらの製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻、１９９頁）。経口送達のための乳濁液処方物は、処方の容易さ、吸収の有効性およびバイオアベイラビリティーの見地の理由で、非常に広く使用されている。（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，２４５頁；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１巻，１９９頁）。鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、ｏ／ｗ乳濁液として一般的に経口で投与されている物質中にある。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物は、ミクロエマルジョンとして処方される。ミクロエマルジョンは、単一で光学的に等方性であり、熱力学的に安定な液体溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義され得る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁）。代表的には、ミクロエマルジョンは、界面活性剤水溶液中の油をまず分散し、次いで十分量の第４の成分（一般的には中間の鎖長のアルコール）を透明な系を形成するように添加し透明にすることによって調製される系である。従って、ミクロエマルジョンは、熱力学的に安定で等方的に透明な、２つの混合できない液体の分散物としてもまた記載され、これらの液体は、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．編，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１８５頁−２１５頁）。ミクロエマルジョンは、３〜５の成分の組み合わせによって一般に調製され、これらの成分としては、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質が挙げられる。ミクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の特徴ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，２７１頁）。
【００８２】
状態図を使用した現象論的アプローチは、広範に研究されており、そして当業者に、どのようにミクロエマルジョンを処方するかという包括的な知見を与えてきた（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，３３５頁）。従来のエマルジョンと比較すると、ミクロエマルジョンは、自発的に形成される、熱力学的に安定な小滴の処方物中に、水不溶性薬物を溶解するという利点を提供する。
【００８３】
ミクロエマルジョンの調製物において使用される界面活性剤としては、単独でまたは補助界面活性剤との組み合わせての、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、脂肪酸ポリグリセロールエステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられるがこれらに限定されない。補助界面活性剤（通常、短鎖アルコール（例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール））は、界面活性剤分子間に生成された間隙空間に起因して、界面活性剤フィルムに貫通し、それ故に無秩序なフィルムを作製することによって界面の流動性の増加を提供する。しかし、ミクロエマルジョンは、補助界面活性剤を使用せずに調製され得、無アルコールの自己乳化ミクロエマルジョン系は、当該分野で公知である。水相は、代表的に、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相は、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中間鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪酸アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーンオイルのような材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８４】
ミクロエマルジョンは、薬物可溶化および促進された薬物の吸収の観点から特に目的のものである。脂質ベースのミクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティーを増強することが提唱されてきた（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。ミクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動性および膜透過性の界面活性剤誘導性の変化に起因する薬物吸収の可能な促進、調製の容易さ、固体投薬形態における経口投与の容易さ、改善された臨床的効能、および低減した毒性という利点を与える（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。しばしばミクロエマルジョンは、これらの成分が、周囲温度で一緒にされた場合、自発的に形成され得る。これらのことは、熱不安定性の、薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを処方する場合に、特に有用であり得る。ミクロエマルジョンはまた、化粧品適用および薬学的適用の両方での活性成分の経皮的送達において、効果的である。本発明のミクロエマルジョン組成物および処方物は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身的吸収の増大を容易にし、そして胃腸管、膣、口腔前庭および他の投与領域内での、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞内取り込みを改善する。
【００８５】
本発明のミクロエマルジョンはまた、さらなる成分および添加物（例えば、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、ならびに処方物の特徴の改善および本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収の促進のための浸透増強剤）を含み得る。本発明のミクロエマルジョンにおいて使用される浸透増強剤は、１〜５の広範な範疇（界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート性非界面活性剤）に属するとして分類され得る（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２頁）。これらの分類の各々は、上に議論される。
【００８６】
（リポソーム）
研究され、そして薬物の処方物のために使用されてきたミクロエマルジョンの他に、多くの組織化された界面活性剤構造が存在する。これらとしては、単分子層、ミセル、二分子層および小胞が挙げられる。小胞（例えば、リポソーム）は、薬物送達の観点から提供されるこれらの特異性および作用の持続時間に起因して、非常に興味を引いている。本発明において使用される場合、用語「リポソーム」は、球面状二分子層または二分子層に整列される、両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【００８７】
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層小胞または多層小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合され得るという利点を保有する。細胞壁と効率的に融合され得ないにも関わらず、非カチオン性リポソームは、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
【００８８】
インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々５０ｎｍ未満の直径を有する一連の細孔を通り抜けなければならない。従って、高度に変形可能であり、かつこのような細孔を通り抜け得るリポソームを使用することが所望される。
【００８９】
リポソームのさらなる利点としては以下が挙げられる；天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性および生体分解性である；リポソームは、広範囲の水溶性薬物および脂溶性薬物を組込み得る；リポソームは、代謝および分解からこれらの内部区画中でカプセル化された薬物を保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，２４５頁）。リポソーム処方物の調製物における重要な考察は、脂質表面電荷、小胞の大きさおよびリポソームの水体積である。
【００９０】
リポソームは、活性成分の作用部位への移入および送達のために有用である。リポソームの膜は、生体膜と構想的に類似しているので、リポソームが組織に適用される場合、リポソームは、細胞膜と融合し始める。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、リポソームの内容物は、活性薬剤が作用し得る細胞に移される。
【００９１】
リポソーム処方物は、多くの薬物の送達様式として大規模な調査の焦点であった。局所投与について、リポソームは、他の処方物に対していくつかの利点を示す証拠が増大している。このような利点としては、投与された薬物の高い全身性吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、および広範な種々の薬物（親水性および疎水性の両方）を皮膚に投与する能力、が挙げられる。
【００９２】
いくつかの報告は、リポソームの、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達する能力を詳述する。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量のＤＮＡを含む化合物は、皮膚に投与された。大多数の適用は、上側の表皮の標的化を生じる。
【００９３】
リポソームは、２つの広い分類に分けられる。カチオン性リポソームは、正に荷電されたリポソームであり、これは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用し、安定な化合物を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソームにおいて内在化する。エンドソームの中の酸性ｐＨに起因して、リポソームは、破裂し、その内容物を細胞質に放出する（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【００９４】
ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するよりむしろＤＮＡを閉じ込める。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様に荷電されているので、複合体形成よりむしろ反発が生じる。それにも関わらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水内部内に閉じ込められる。ｐＨ感受性リポソームは、培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するために使用されてきた。外因性遺伝子の発現が、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【００９５】
リポソーム組成物の主要な１つの型は、天然に誘導されたホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば、天然のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から合成される。別の型のリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣ、およびエッグＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００９６】
いくつかの研究は、リポソーム薬物処方物の、皮膚への局所的送達を評価した。モルモット皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用は、皮膚ヘルペスの疼痛の低減を生じたのに対して、他の手段（例えば、溶液としてまたはエマルジョンとして）でのインターフェロンの送達は、無効であった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、水系を使用するインターフェロンの投与に対する、リポソーム処方物の一部として投与されたインターフェロンの効力を試験し、リポソーム処方物が水投与に勝ることを結論付けた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【００９７】
非イオン性リポソーム系もまた、皮膚（特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系）への薬物の送達におけるこれらの有用性を決定するために試験した。非イオン性リポソーム処方物（ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ  Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ  ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む）は、マウス皮膚にシクロスポリンを送達するために使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系がシクロスポリンＡの、異なる皮膚の層への沈着を容易にすることにおいて効果的であることを示した（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【００９８】
リポソームはまた、「滅菌安定化」リポソームを含み、この用語は、本明細書中に使用される場合、リポソームに組込まれた場合、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の増加を生じる１つ以上の特殊化された脂質を含むリポソームをいう。滅菌安定化リポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）１つ以上の糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１））を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）で誘導体化される、リポソームである。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む滅菌安定化脂質について、これらの滅菌安定化リポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来することは、当該分野において考察された（Ａｌｌｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームは、当該分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）、によって示された。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４（両方はＡｌｌｅｎらに対する）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシド（ＧＭ１）または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）において開示される。
【００９９】
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化した脂質を含む多くのリポソームおよびその調製方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤（２Ｃ１２１５Ｇ）を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマー性グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングは、血液半減期の有意な増加を生じることに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって改変された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）によって記載される。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期を有意に上昇することを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせから形成された他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）に拡張した。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４に記載される。１〜２０モル％のＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号）に記載される。多くの他の脂質ポリマー結合体を含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方はＭａｒｔｉｎらに対する）ならびにＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示される。ＰＥＧ改変セラミド脂質を含有するリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面上の官能基部分がさらに誘導体化され得る、ＰＥＧ含有リポソームを記載する。
【０１００】
核酸を含む有限数のリポソームは、当該分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ９６／４００６２は、リポソーム中に高分子量の核酸をカプセル化する方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、そしてこのようなリポソームの内容物が、アンチセンスＲＮＡを含み得ることを主張する。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子に対して標的化されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【０１０１】
トランスファソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、さらに他の型のリポソームであり、そして薬物送達小胞としての魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファソームは、脂質小滴として記載され、この脂質小滴は、高度に変形されるので、小滴よりも小さな孔を通って容易に浸透し得る。トランスファソームは、それらが使用される環境に適合する（例えば、これらは自己最適化（皮膚の孔の形状に適合する）し、自己修復し、しばしば断片化せずにこれらの標的に達し、そしてしばしば自己増量する）。トランスファソームを作製するために、表面縁部活性化因子（通常、界面活性剤）を標準的なリポソーム組成物に添加することは可能である。トランスファソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用される。血清アルブミンのトランスファソーム媒介性送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注入と同程度に効果的であることが示された。
【０１０２】
界面活性剤は、エマルジョン（ミクロエマルジョンを含む）およびリポソームのような処方物における広い適用を見出す。多くの異なる型の界面活性剤（天然および合成の両方）の特徴を分類およびランク付けする最も共通する方法は、疎水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。親水性基（「頭部」としてもまた公知）の性質は、処方物中で使用される異なる界面活性剤の分類のための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，２８５頁）。
【０１０３】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品および化粧品における広い用途を見出し、そして広い範囲のｐＨ値にわたって有用である。一般的に、これらのＨＬＢ値は、これらの構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル（例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシレートエステル）が挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなど）はまた、この分類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤分類の最も普通のメンバーである。
【０１０４】
界面活性剤分子が、それが水中に溶解または分散される場合に、負電荷を保有する場合、この界面活性剤は、アニオン性界面活性剤として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート（例えば、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸エステル（例えば、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキル）、スルホナート（例えば、アルキルベンゼンスルホナート、アシルイソチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）アシルタウレートおよびスルホスクシナート）、およびホスフェート）が挙げられる。アニオン性界面活性剤分類の最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０１０５】
界面活性分子が水中に溶解または分散されるとき、界面活性分子が正電荷を有する場合、界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第４級アンモニウム塩は、この種類のうちで最も使用されるメンバーである。
【０１０６】
界面活性分子が、正電荷または負電荷のいずれかを有する能力を場合、この界面活性剤は、両性として分類される。両性の界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
【０１０７】
薬物製品、処方物およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、（Ｒｉｅｇｅｒ、ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、１９８８、２８５頁）に概説されている。
【０１０８】
浸透増強剤：１実施形態において、本発明は、動物の皮膚に、核酸、特にオリゴヌクレオチドの十分な送達をもたらす種々の浸透増強剤を使用する。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかし、通常、液体溶解性薬物または脂肪親和性薬物のみが、細胞膜を容易に通過する。非脂肪親和性薬物であっても、通過されるべき膜が浸透増強剤で処理された場合、細胞膜を通過し得ることが発見された。非脂肪親和性薬物が細胞膜を通過して拡散することを補助するのに加えて、浸透増強剤はまた、脂肪親和性薬物の浸透性を増強する。
【０１０９】
浸透増強剤は、５つの広範なカテゴリーのうちの１つ（すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート性非界面活性剤）に属するとして分類され得る（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）。上記の浸透増強剤の各分類は、以下により詳細に記載されている。
【０１１０】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）」は、水溶液に溶解される場合、この溶液の表面張力を減少させるか、またはこの水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るオリゴヌクオチドの吸収が促進されるという結果を生じる、化学実体である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透増強剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）；および水素をフッ素で置換した化合物のエマルジョン（例えば、ＦＣ−４３）（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２）が挙げられる。
【０１１１】
脂肪酸：浸透増強剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、以下が挙げられる：オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノ−グリセリドおよびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリスチテート、パルミテート、ステアレート、イノレートなど）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１−６５４）。
【０１１２】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、分散の促進ならびに脂質および脂溶性ビタミンの吸収が挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ、第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６、９３４−９３５頁）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成の誘導体は、浸透増強剤として作用する。従って、用語「胆汁酸塩」は、胆汁の任意の天然に存在する成分、およびそれらの任意の合成誘導体を含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、以下が挙げられる：コール酸（またはその薬学的に受容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロー２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｓｗｉｎｙａｒｄ、第３９章：  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．、１９９０、７８２−７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９−５８３）。
【０１１３】
キレート剤：  本発明に関して使用される場合、キレート剤は、金属イオンと錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が促進される化合物として定義され得る。本発明における浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮａｓｅインヒビターとしても作用するというさらなる利点を有する。なぜなら、最も特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒のために二価の金属イオンを必要とし、従って、キレート剤によって阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９）。本発明のキレート剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３−５１）。
【０１１４】
非キレート性非界面活性剤：本明細書中で使用される場合、非キレート性非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか実証しないにもかかわらず、消化粘膜を通るオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物として規定され得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１−３３）。この種類の浸透増強剤としては、例えば、不飽和環式尿素、１−アルキル−アルカノン誘導体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２頁）；ならびに非ステロイド抗炎症剤（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１−６２６）が挙げられる。
【０１１５】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する薬剤はまた、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／３０７３１））はまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することが知られている。
【０１１６】
他の薬剤が、投与された核酸の浸透を促進するために利用され得る。これらの薬剤としては、グリコール（例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール）、ピロール（例えば、２−ピロール）、アゾン（ａｚｏｎｅ）およびテルペン（例えば、リモネンおよびメントン）が挙げられる。
【０１１７】
（キャリア）
本発明の特定の組成物はまた、処方物中にキャリア化合物を含む。本明細書中で使用される場合、「キャリア化合物」または「キャリア」とは、核酸またはそれらのアナログをいい得、これは、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、または循環から生物学的に活性な核酸を除去することを促進することによって、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを減少させるインビボプロセスにより、核酸として認識される。核酸とキャリア化合物との同時投与（典型的に、後者の物質過剰である）は、おそらく、共通のレセプターについてのキャリア化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓または他の体外循環レザバにおいて回収される核酸の量の実質的な減少を生じ得る。例えば、肝臓組織における部分的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与される場合に減少され得る（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、１９９５、５、１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、１９９６、６、１７７−１８３）。
【０１１８】
（賦形剤）
キャリア化合物とは対照的に、「薬物学的キャリア」または「賦形剤」は、薬学的に受容可能な溶媒、懸濁剤または動物に１つ以上の核酸を送達するための他の任意の薬物学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でもよく、核酸と所定の薬学的組成物の他の成分とが組み合わされる場合、所望のバルク、粘稠度などが提供されるように考慮して計画された投与様式によって選択され得る。代表的な薬学的キャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息好酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）。
【０１１９】
核酸と有害に反応しない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な有機賦形剤または無機賦形剤もまた、本発明の組成物を処方するために使用され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど。
【０１２０】
核酸の局所投与のための処方物としては、以下が挙げられ得る：滅菌水溶液および非滅菌水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水溶液、または液体油ベースもしくは固体油ベース中の核酸溶液。これらの溶液はまた、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤を含み得る。核酸と有害な反応をしない、非腸管外投与に適切な薬学的に受容可能な有機賦形剤または無機賦形剤が、使用され得る。
【０１２１】
適切な薬学的に受容可能な賦形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど。
【０１２２】
（他の成分）
本発明の組成物は、薬学的組成物中に慣習的に見出される他のアジュバント成分を、当該分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合性の薬学的に活性な物質（例えば、かゆみ止め、収れん薬、局所麻酔剤または抗炎症剤）を含み得るか、あるいは本発明の組成物の、種々の投薬形態を生理学的に処方することにおいて有用なさらなる物質（例えば、色素、矯味剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤）を含み得る。しかし、このような材料は、添加される場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害するべきではない。これらの処方物は、安定化され得、そして所望される場合、処方物の核酸と有害に相互作用しない補助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色料、矯味物質および／または芳香物質など）と混合され得る。
【０１２３】
水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる）を含み得る。懸濁液はまた、安定剤を含み得る。
【０１２４】
本発明の特定の実施形態は、（ａ）１つ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）１つ以上の他の化学療法剤（これは、非アンチセンス機構によって機能する）を含む薬学的組成物を提供する。このような化学療法剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ダウノルビビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソウレア（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプレゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロへキシルニトロソウレア（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ（ＤＥＳ））。一般的に、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、１９８７、１２０６−１２２８頁、Ｂｅｒｋｏｗら編、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと。本発明の化合物と共に使用される場合、このような化学療法剤は、別個に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）か、連続して（例えば、一定時間の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、引き続いてＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）か、あるいは１つ以上の他のこのような化学療法剤と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線療法およびオリゴヌクレオチド）使用され得る。抗炎症薬物（非ステロイド抗炎症薬物およびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない）、ならびに抗ウイルス薬物（リビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない）もまた、本発明の組成物と組み合わされ得る。一般的に、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７、Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、それぞれ、２４９９−２５０６頁および４６−４９頁を参照のこと。他の非アンチセンス化学療法剤もまた、本発明の範囲内である。２つ以上組み合わせた化合物は、一緒にか、または連続して使用され得る。
【０１２５】
別の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１核酸に標的化された１つ以上のアンチセンス化合物（特にオリゴヌクレオチド）、および第２核酸標的に標的化された１つ以上のさらなるアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多数の例は、当該分野で公知である。２つ以上組み合わせた化合物は、一緒にか、または連続して使用され得る。
【０１２６】
治療組成物の処方およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内と考えられる。投与は、処置されるべき疾患状態の重篤度および応答性に依存して、数日から数ヶ月間まで続く処置過程で、あるいは治癒がもたらされるか、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投与量スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定から計算され得る。当業者は、最適な投薬量、投与方法および繰り返し率を容易に決定し得る。最適な投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に非常に依存し得、そして一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて確立され得る。一般的に、投薬量は、体重１ｋｇあたり０．０１  ｕｇ〜１００ｇであり、そして１日に１回以上、一週間に１回以上、一ヶ月に１回以上、もしくは１年に１回以上、または２年〜２０年ごとに１回、与えられ得る。当業者は、測定された、身体の流体または組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための繰り返し率を容易に決定し得る。首尾よい処置の後、患者は、疾患状態の再発を予防するために維持療法を受けることが所望され得、ここで、このオリゴヌクレオチドは、維持用量（体重１ｋｇあたり０．０１  ｕｇ〜１００ｇ、１日に１回以上〜２０年毎に１回の範囲）で投与される。
【０１２７】
本発明は、本発明のある好ましい実施形態に従って具体的に記載されているものの、以下の実施例は、本発明を説明するように作用するだけであり、同一なものに限定することを意図しない。
【実施例】
【０１２８】
（実施例１）
（オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホラミダイト）
（デオキシアミダイトおよび２’−アルコキシアミダイト）
２’−デオキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトおよび２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトを、業者（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ、またはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ．）から購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換されたヌクレオシドアミダイトを、米国特許第５，５０６，３５１号（本明細書中に参考として援用される）に記載されたように調製する。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成されたオリゴヌクレオチドについて、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を３６０秒まで長くしたことを除いて、非改変オリゴヌクレオチドについての標準的なサイクルを利用した。
【０１２９】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、公開された方法（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従って、市販のホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ，またはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を使用して、合成した。
【０１３０】
（２’−フルオロアミダイト）
（２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト）
２’−フルオロオリゴヌクレオチドを、以前に記載されるように［Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１および米国特許第５，６７０，６３３号（本明細書中に参考として援用される）］合成した。簡潔には、保護ヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを、文献の手順を改変し、それによりこの２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換により導入することによって、出発物質として市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを利用して合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを、３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として、中程度の収量において選択的に保護した。ＴＨＰ基およびＮ６−ベンゾイル基の脱保護を、標準的な方法論を使用して達成し、そして標準的な方法を使用して、５’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）中間体および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイト中間体を得た。
【０１３１】
（２’−フルオロデオキシグアノシン）
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成を、テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使用して、その中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護の次に、そのヒドロキシル基をＴＨＰで保護して、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的Ｏ−脱アシル化およびトリフレート化（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）の次に、フッ素で粗製生成物を処理し、次いで、ＴＨＰ基の脱保護を行った。標準的な方法論を使用して、その５’−ＤＭＴ−ホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’−ホスホルアミダイトを得た。
【０１３２】
（２’−フルオロウリジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成を、文献の手順の改変によって達成した。この手順において、２，２’−無水−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを、７０％  フッ化水素−ピリジンで処理した。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
【０１３３】
（２’−フルオロデオキシシチジン）
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成し、続いて、選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手順を使用して、その５’−ＤＭＴホスホルアミダイトおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホルアミダイトを得た。
【０１３４】
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト）
２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトを以下のように調製するか、または代わりに、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４の方法に従って調製する。
【０１３５】
（２，２’−無水［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］）
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ，Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎから市販されるリボシルチミン）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に添加した。この混合物を、攪拌しながら加熱して還流し、発生した二酸化炭素ガスを制御された様式にて放出させた。１時間後、わずかに色が濃くなった溶液を、減圧下で濃縮した。この得られたシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。この生成物はガム状物質を形成した。エーテルをデカントし、残渣を、最小量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を、新たなエーテル（２．５Ｌ）に注いで、硬いガム状物質を得た。このエーテルをデカントし、このガム状物質を、真空オーブンで乾燥して（６０℃、１ｍｍＨｇにて２４時間）、固体を得、これを、淡い黄褐色粉末（５７ｇ、８５％粗収率）に粉にした。そのＮＭＲスペクトルは、その構造と一致し、そのナトリウム塩としてフェノールが混入していた（約５％）。さらなる反応のために、この物質を使用した（または酢酸エチル中のメタノール勾配（１０〜２５％）を使用するカラムクロマトグラフィーによりさらに精製されて、白色固体を獲得し得る（ｍｐ  ２２２−４℃））。
【０１３６】
（２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン）
２，２’−無水−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を、２Ｌのステンレス鋼圧力容器に添加し、予め加熱した１６０℃の油浴に入れた。１５５〜１６０℃にて４８時間加熱した後、この容器を開け、その溶液を乾燥するまでエバポレートし、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、熱アセトン（１Ｌ）中に再懸濁した。不溶性の塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、濾液をエバポレートした。その残渣（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解し、エバポレートした。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中にパックした。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中に溶解し、このカラムに装填する前に、シリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を、パックした溶媒を用いて溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。さらなる物質を、不純物質画分を、再度作業することにより得た。
【０１３７】
（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）を、ピリジン（２５０ｍＬ）とともに同時にエバポレートし、その乾燥した残渣を、ピリジン（１．３Ｌ）中に溶解した。ジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第１のアリコートを添加し、その混合物を、室温にて１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの第２のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を添加し、その反応系を、さらに１時間攪拌した。次いで、メタノール（１７０ｍＬ）を添加して、その反応系を停止させた。ＨＰＬＣにより、約７０％の生成物の存在が示された。その溶媒をエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で摩砕した。その残渣を、ＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）中に溶解し、２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、エバポレートした。２７５ｇの残渣を得た。この残渣を、充填され、０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出される３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製した。この純粋画分をエバポレートして、１６４ｇの生成物を得た。さらに約２０ｇを、不純物質画分から得て、合計収量１８３ｇ（５７％）を得た。
【０１３８】
（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦと１８８ｍＬのピリジンから調製した、７５０ｍＬの３：１混合物）および、無水酢酸（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を合わせ、室温にて２４時間攪拌した。この反応系を、最初にＭｅＯＨの添加によりＴＬＣサンプルをクエンチすることによって、ＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断した場合に、反応が完了した際に、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を添加し、この混合物を、３５℃でエバポレートした。その残渣を、ＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）中に溶解し、２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。その水層を、２００ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出（ｂａｃｋ  ｅｘｔｒａｃｔ）した。合わせた有機物質を、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして、１２２ｇの残渣（約９０％生成物）を得た。その残渣を、３．５ｋｇのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分をエバポレートして、９６ｇ（８４％）を得た。さらに１．５ｇを残りの画分から回収した。
【０１３９】
（３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン）
第１の溶液を、ＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）中に３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）を溶解することによって調製し、とっておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）を、ＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に添加し、−５℃まで冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間攪拌した。０〜１０℃に維持した攪拌溶液に３０分かけてＰＯＣｌ３を滴下し、得られた混合物を、さらに２時間攪拌した。第１の溶液を、後者の溶液に４５分かけて滴下した。得られた反応混合物を低温室に一晩保存した。塩を反応混合物から濾過し、その溶液をエバポレートした。その残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体を、濾過により除去した。その濾液を、１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートした。その残渣を、ＥｔＯＡｃで磨砕して、標題化合物を得た。
【０１４０】
（２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン）
ジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を、室温にて２時間攪拌した。このジオキサン溶液をエバポレートし、その残渣を、ＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）で共沸した。その残渣をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解し、２ｌのステンレス鋼圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を添加し、この容器を、１００℃まで２時間加熱した（ＴＬＣにより、完全な変換が示された）。この容器の内容物を、乾燥するまでエバポレートし、その残渣を、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。この有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をエバポレートして、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。
【０１４１】
（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン）
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら添加した。３時間攪拌した後、ＴＬＣにより、反応が約９５％完了したことが示された。溶媒をエバポレートし、その残渣をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸した。残渣をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、エバポレートして、残渣（９６ｇ）を得た。その残渣を、溶出溶媒として０．５％  Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分をエバポレートして、９０ｇ（９０％）の標題化合物を得た。
【０１４２】
（Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト）
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および亜リン酸２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ）を、窒素雰囲気下で攪拌しながら添加した。得られた混合物を、室温にて２０時間攪拌した（ＴＬＣにより、反応が９５％完了したことが示された）。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。この水性洗浄液を、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、その抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用する１．５ｋｇのシリカカラムでクロマトグラフィーにかけた。純粋画分を合わせて、９０．６ｇ（８７％）の標題化合物を得た。
【０１４３】
（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト）
（２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（当該分野で２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても公知）を、以下の段落に記載されるように調製した。アデノシン、シチジンおよびグアノシンのヌクレオシドアミダイトを、アデノシンおよびシチジンの場合には環外アミンをベンゾイル部分で保護し、グアノシンの場合にはイソブチリルで保護したことを除いて、チミジン（５−メチルウリジン）と同様に調製する。
【０１４４】
（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン）
Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．，Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ，１００．０ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３当量、０．００５４ｍｍｏｌ）を、機械的に攪拌しながらアルゴン雰囲気下で周囲温度にて乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１当量、０．４５８ｍｍｏｌ）を一部添加した。その反応系を、周囲温度にて１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ  ０．２２、酢酸エチル）により、完全な反応が示された。この溶液を、減圧下で濃オイルになるまで濃縮した。これを、ジクロロメタン（１Ｌ）と、飽和重炭酸ナトリウム（２×１Ｌ）と、ブライン（１Ｌ）との間で分配した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃オイルになるまで濃縮した。このオイルを、酢酸エチルとエチルエーテルの１：１混合物（６００ｍＬ）中に溶解し、この溶液を−１０℃まで冷却した。得られた結晶生成物を、濾過により回収し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、１４９ｇ（７４．８％）の白色固体になるまで乾燥した（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４時間）。ＴＬＣおよびＮＭＲは、純粋生成物と一致した。
【０１４５】
（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン）
２Ｌのステンレス鋼の攪拌されない圧力反応器中に、テトラヒドロフラン（１．０Ｍ、２．０当量、６２２ｍＬ）中のボランを添加した。換気フードにおいて、手動で攪拌しながら、まず、水素ガスの蒸発が静まるまでエチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰）を慎重に添加した。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−無水−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１ｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３当量）を、手動で攪拌しながら添加した。反応器を封鎖し、内部温度が１６０℃に達するまで油浴中で加熱し、次いで、１６時間維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。この反応容器を周囲温度まで冷却し、開けた。ＴＬＣ（所望の生成物についてＲｆ  ０．６７およびａｒａ−Ｔ副生成物についてＲｆ  ０．８２、酢酸エチル）により、生成物の約７０％の変換が示された。さらなる副生成物形成を避けるために、反応を停止し、より極端な条件を、エチレングリコールを除去するために用いて、温水浴（４０〜１００℃）中、減圧下（１０〜１ｍｍＨｇ）で濃縮した（あるいは、一旦、低温での溶媒沸騰を行い、残りの溶液を、酢酸エチルと水との間で分配し得る。その生成物は、有機相中にある）。その残渣を、カラムクロマトグラフィー（２ｋｇのシリカゲル、１：１〜４：１の酢酸エチル−ヘキサン勾配）により精製した。適切な画分を合わせ、ストリッピングし（ｓｔｒｉｐ）、白色の砕けやすい泡沫（ｃｒｉｓｐ  ｆｏａｍ）（８４ｇ、５０％）、汚染出発物質（１７．４ｇ）および純粋な再利用可能な出発物質（２０ｇ）として生成物を乾燥した。出発物資、あまり純粋でない回収された出発物質に基づく収率は、５８%であった。ＴＬＣおよびＮＭＲは、純粋物質と９９％一致した。
【０１４６】
（２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いで、これを、４０℃にて２日間、高真空下で、Ｐ２Ｏ５で乾燥した。この反応混合物を、アルゴンでフラッシュし、乾燥ＴＨＦ（３６９．８ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、しっかりした封鎖瓶）を添加して、透明な溶液を得た。ジエチル−アゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を、反応混合物に滴下した。添加速度を、得られた濃赤色の着色が、次の滴下の前にちょうど脱色されるように維持した。添加を完了した後、この反応系を４時間攪拌した。そのときまでには、ＴＬＣにより、反応の完了が示される（６０：４０の酢酸エチル：ヘキサン）。溶媒を、真空中でエバポレートした。得られた残渣を、フラッシュカラムに配置し、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出して、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色泡沫（２１．８１９ｇ、８６％）として得た。
【０１４７】
（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）中に溶解し、メチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０℃〜０℃にて滴下した。１時間後、この混合物を濾過し、その濾液を、氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、合わせた有機相を、水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を濃縮して、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得た。次いで、これを、ＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）中に溶解した。これに、ホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１当量）を添加し、得られた混合物を、１時間攪拌した。溶媒を、真空下で除去し；残渣をクロマトグラフィーにかけて、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫（１．９５ｇ、７８％）として得た。
【０１４８】
（５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン）
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ  ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を、１０℃にて不活性雰囲気下でこの溶液に添加した。この反応混合物を、１０℃にて１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌し、この反応系を、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％  ＭｅＯＨ）によりニターした。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。残渣を、ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍ  ＰＰＴＳの溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％  ｗ／ｗ、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を、室温にて１０分間攪拌した。この反応混合物を、氷浴中で１０℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、１０℃にて１０分間攪拌した。１０分後、この反応混合物を、氷浴から取り出し、室温にて２時間攪拌した。この反応混合物に、５％  ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）溶液を添加し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。その得られた残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％  ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色泡沫（１４．６ｇ、８０％）として得た。
【０１４９】
（２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン）
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦおよびトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、乾燥、ＫＯＨで維持）中に溶解した。次いで、トリエチルアミン−２ＨＦのこの混合物を、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシラン−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に添加し、室温にて２４時間攪拌した。反応系を、ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％  ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を真空下で除去し、その残渣を、フラッシュカラムに配置し、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％  ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ、９２．５％）を得た。
【０１５０】
（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン）
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）を、Ｐ２Ｏ５で、高い真空下で４０℃にて一晩乾燥した。次いで、これを、無水ピリジン（２０ｍＬ）とともに同時エバポレートした。得られた残渣を、アルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）中に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を、この混合物に添加し、この反応混合物を、出発物質のすべてがなくなるまで、室温にて攪拌した。ピリジンを真空下で除去し、その残渣を、クロマトグラフィーにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％  ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含有する）で溶出して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ｇ、８０％）を得た。
【０１５１】
（５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］）
５’−Ｏ−ＥＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）と同時エバポレートした。この残渣に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加し、そして減圧下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５上で乾燥させた。次いで、この反応混合物を、無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）に溶解し、そして２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホルアミダイト（２．１２ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、周囲温度で、４時間、不活性雰囲気下で撹拌した。この反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル  １：１）でモニタリングした。溶媒をエバポレートし、次いで、残渣を、酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解し、そして５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。得られた残渣を、クロマトグラフィー（溶出液として酢酸エチル）にかけて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を泡状物として得た（１．０４ｇ、７４．９％）。
【０１５２】
（２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のパラグラフにおいて記載するようにして調製する。アデノシンヌクレオシドアミダイト、シチジンヌクレオシドアミダイトおよびチミジンヌクレオシドアミダイトを、同じようにして調製する。
【０１５３】
（Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］）
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシンアナログは、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化によって得られ得る。数グラム量のジアミノプリンリボシドを、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入して、少量の３’−Ｏ−異性体と共に、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを提供し得る。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを溶解し得、そしてアデノシンデアミナーゼを用いる処理によって、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換し得る（ＭｃＧｅｅ，Ｄ．Ｐ．Ｃ．，Ｃｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｕｉｎｏｓｓｏ，Ｃ．Ｊ．，ＷＯ  ９４／０２５０１  Ａ１  ９４０２０３）。標準的な保護手順により、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンおよび２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを得、これらを還元して、２−Ｎ−イソブチリル−６−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。上記のように、ヒドロキシル基を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドで置換し得、そしてこの保護されたヌクレオシドを、従来どおり、亜リン酸化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ］エチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］を得得る。
【０１５４】
（２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト）
２’−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２）または２’−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとしても当該分野で公知）を、以下のようにして調製する。他のヌクレオシドアミダイトも、同じようにして調製する。
【０１５５】
（２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン）
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，６．６６ｇ，５０ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの容器（ｂｏｍｂ）中で撹拌しながら、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）に添加する。この固体が溶解するにつれて、水素ガスが発生する。Ｏ２−，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）および炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を添加し、そしてこの容器を密閉し、油浴に入れ、そして１５５℃で２６時間加熱する。この容器を、室温まで冷却し、そして開ける。粗溶液を濃縮し、そして残渣を水（２００ｍＬ）とヘキサン（２００ｍＬ）との間で分配する。過剰のフェノールをヘキサン層に抽出する。水層を、酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機層を、水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮する。残渣を、１：２０のメタノール／塩化メチレン（これは２％のトリエチルアミンを含む）を溶出液として使用するシリカゲルカラムにかける。このカラムの画分を濃縮すると、無色の固体が形成され、これを回収して、表題化合物を白色固体として得る。
【０１５６】
（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン）
無水ピリジン（８ｍＬ）中の０．５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エトキシ）エチル）］−５−メチルウリジンに、トリエチルアミン（０．３６ｍＬ）およびジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ，０．８７ｇ、２当量）を添加し、１時間撹拌する。この反応混合物を、水（２００ｍＬ）に注ぎ入れ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出する。合わせたＣＨ２Ｃｌ２層を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、続いて、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をエバポレートし、続いて、ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％のトリエチルアミンを含む）を使用するシリカゲルクロマトグラフィーにかけて、表題化合物を得る。
【０１５７】
（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト）
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）および２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（１．１ｍＬ、２当量）を、アルゴン雰囲気下で、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）］−５−メチルウリジン（２．１７ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。この反応混合物を、一晩撹拌し、そして溶媒をエバポレートする。得られた残渣を、酢酸エチルを溶出液として使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得る。
【０１５８】
（実施例２）
（オリゴヌクレオチドの合成）
非置換および置換のホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）で合成する。
【０１５９】
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を、ホスフィネート結合の段階的チオ化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）のために、標準的な酸化ボトルをアセトニトリル中０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液で置き換えた以外は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成する。このチオ化中断工程を、６８秒まで上げ、続いてキャッピング工程を行う。ＣＰＧカラムからの切断および濃水酸化アンモニウム中での５５℃における脱ブロック化（１８時間）の後、このオリゴヌクレオチドを、２．５容量のエタノールを用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌ溶液から沈殿させることにより精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，５０８，２７０号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６０】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第４，４６９，８６３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６１】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，６１０，２８９号または同第５，６２５，０５０号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６２】
ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６３】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ  ９４／１７０９３およびＷＯ  ９４／０２４９９として公開されている）（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６４】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，４７６，９２５号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６５】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，０２３，２４３号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６６】
ボラノ（ｂｏｒａｎｏ）ホスフェートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号（この両方は本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６７】
（実施例３）
（オリゴヌクレオシドの合成）
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、ならびに例えば、ＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合を交互に有する混合骨格化合物を、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、同第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号（これら全ては本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６８】
ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）結合オリゴヌクレオシドおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１６９】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，２２３，６１８号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして調製する。
【０１７０】
（実施例４）
（ＰＮＡの合成）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）を、以下に言及される様々な手順のいずれかに従って調製する：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３。これらをまた、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７００，９２２号および同第５，７１９，２６２号（本明細書中で参考として援用される）に従って調製し得る。
【０１７１】
（実施例５）
（キメラオリゴヌクレオチドの合成）
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプであり得る。これらとしては、第１のタイプ（結合ヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合ヌクレオシドの５’「ウイング」セグメントと３’「ウイング」セグメントとの間に位置する）、および第２の「開放端」タイプ（ここで「ギャップ」セグメントは、オリゴマー化合物の３’末端または５’末端のいずれかに位置する）が挙げられる。第１のタイプのオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」またはギャップオリゴヌクレオチドとしても当該分野で公知である。第２のタイプのオリゴヌクレオチドは、「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」または「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒ）」としても当該分野で公知である。
【０１７２】
（［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートおよび２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを、上記のように、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂを使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ部分については２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを、５’および３’ウイングについては５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトを使用して、自動合成機を使用して合成する。標準的な合成サイクルを、テトラゾールおよび塩基の送達の後に停止工程を６００ｓまで増加することによって調節し、ＲＮＡについては４回、２’−Ｏ−メチルについては２回繰り返す。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そしてホスフェート基を、３：１のアンモニア／エタノール中、室温で一晩脱保護し、次いで乾固するまで凍結乾燥する。室温で２４時間、メタノール性アンモニアで処理して、全ての塩基を脱保護し、サンプルを再び、乾固するまで凍結乾燥する。このペレットを、ＴＨＦ中１ＭのＴＢＡＦに、室温で２４時間再懸濁して、２’位を脱保護する。次いで、この反応を、１Ｍ  ＴＥＡＡでクエンチし、次いで、このサンプルを、ロータリーエバポレーターによって２分の１の容量になるまで減らし、その後Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。次いで、回収したオリゴを、キャピラリー電気泳動および質量分光法によって、収率および純度について分光光度分析する。
【０１７３】
（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホルチオエートオリゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上で記載された手順によって、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを使用して、調製した。
【０１７４】
（［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−（２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド）
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドについて上で記載された手順によって、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを使用して調製する。ここでは、ヨウ素を用いる酸化により、ホスホジエステルヌクレオチド間結合がキメラ構造のウイング部分内に形成され、そして３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を使用する硫黄化により、中心ギャップについてホスホロチオエートヌクレオチド間結合が生成される。
【０１７５】
他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許第５，６２３，０６５号（本明細書中で参考として援用される）に従って合成する。
【０１７６】
（実施例６）
（オリゴヌクレオチドの単離）
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、制御型多孔質ガラスカラム（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ  ｃｏｌｕｍｎ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃で１８時間、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロック化した後、このオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、２．５容量のエタノールを用いて２回、０．５ＭのＮａＣｌから沈殿させることにより精製した。合成されたオリゴヌクレオチドを、変性ゲルを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、少なくとも８５％の全長物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエート結合およびホスホジエステル結合の相対量を、３１Ｐ核磁気共鳴分光法によって定期的にチェックし、そしていくつかの研究のために、オリゴヌクレオチドを、Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２−１８１７１に記載されるようにＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣで精製した物質について得られた結果は、ＨＰＬＣで精製していない物質について得られた結果と類似していた。
【０１７７】
（実施例７）
（オリゴヌクレオチドの合成−９６ウェルプレート様式）
オリゴヌクレオチドを、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホルアミダイト化学によって、標準的な９６ウェル様式で同時に９６の配列を構築し得る自動合成機で合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合を、水性ヨウ素を用いて酸化することによって得た。無水アセトニトリル中で、３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を使用して硫黄化することによって、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成した。標準的な塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトを、メーカー（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ、またはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。非標準的なヌクレオシドを、公知の文献または特許方法によって合成する。これらを、塩基保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトとして使用する。
【０１７８】
オリゴヌクレオチドを、支持体から切断し、そして高温（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃ＮＨ４ＯＨを使用して脱保護し、次いで遊離した生成物を減圧下で乾燥した。次いで、この乾燥した生成物を滅菌水に再懸濁して、マスタープレートを得、次いで、このプレートから、全ての分析プレートサンプルおよび試験プレートサンプルを、ロボット式ピペッターを使用して希釈する。
【０１７９】
（実施例８）
（オリゴヌクレオチドの分析−９６ウェルプレート様式）
各ウェル中のオリゴヌクレオチドの濃度を、サンプルの希釈およびＵＶ吸収分光法によって評価した。個々の生成物の全長完全性を、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって、９６ウェル様式（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ＭＤＱ）、または別々の調製されたサンプルについては、市販のＣＥ装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ５０００，ＡＢＩ  ２７０）のいずれかで評価した。塩基および骨格の組成を、エレクトロスプレー質量分光法を使用する化合物の質量分析により確認した。全てのアッセイ試験プレートを、シングルチャネルロボット式ピペッターおよびマルチチャネルロボット式ピペッターを使用して、マスタープレートから希釈した。このプレート上の化合物の少なくとも８５％が、少なくとも８５％の全長である場合、プレートを受容可能であると判断した。
【０１８０】
（実施例９）
（細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理）
標的核酸が、測定可能なレベルで存在している限り、標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果を、種々の細胞型の任意のものについて試験し得る。これは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して、慣用的に決定され得る。以下の５個の細胞型を、例示目的のために示すが、標的が選択された細胞型で発現される限り、他の細胞型が慣用的に使用され得る。これは、当該分野で慣用的な方法（例えば、ノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはＲＴ−ＰＣＲ）によって容易に決定され得る。
【０１８１】
（Ｔ−２４細胞）
ヒト移行細胞の膀胱癌細胞株Ｔ−２４を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｔ−２４細胞を、ＭｃＣｏｙの５Ａ基本完全培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で慣用的に培養した。細胞が９０％のコンフルーエンスに達すると、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析で使用するために、細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に、７０００細胞／ウェルの密度で播種した。
【０１８２】
ノーザンブロッティングまたは他の分析のために、細胞を１００ｍｍの組織培養プレートまたは他の標準的な組織培養プレートに播種し得、そして適切な容量の培養液およびオリゴヌクレオチドを使用して、同様に処理した。
【０１８３】
（Ａ５４９細胞）
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎ（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞を、ＤＭＥＭ基本培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補充）中で、慣用的に培養した。細胞が９０％のコンフルーエンスに達すると、トリプシン処理および希釈によって、慣用的に継代した。
【０１８４】
（ＮＨＤＦ細胞）：
ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＮＨＤＦを、供給業者によって推奨されるように、補充された線維芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中で慣用的に維持した。細胞を、供給業者によって推奨されるように、１０継代まで維持した。
【０１８５】
（ＨＥＫ細胞）：
ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。ＨＥＫを、供給業者によって推奨されるように処方した、ケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において慣用的に維持した。細胞を、供給業者によって推奨されるように、１０継代まで慣用的に維持した。
【０１８６】
（ＨｅｐＧ２細胞）：
ヒト肝芽細胞腫細胞株ＨｅｐＧ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＨｅｐＧ２細胞を、１０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で慣用的に培養した。細胞を、９０％コンフルエンスに達したとき、トリプシン処理および希釈して、慣用的に継代させた。細胞を、ＲＴ−ＰＣＲ分析における使用のために７０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に播種した。
【０１８７】
ノザンブロットまたは他の分析のために、細胞を、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して、１００ｍｍまたは他の標準的培養プレート上に播種し、そして同時に処理し得る。
【０１８８】
（アンチセンス化合物での処理）：
細胞が８０％コンフルエンスに達したときに、これらを、オリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートで増殖された細胞に対して、ウェルを一度２００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１低血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で洗浄し、次いで、３．７５μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１で処理した。処理の４〜７時間後、培地を、新鮮な培地と置き換えた。細胞をオリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に収穫した。
【０１８９】
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で異なる。特定の細胞株に対して最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、ある範囲の濃度でポジティブコントロールオリゴヌクレオチドを用いて処理する。ヒト細胞について、ポジティブコントロールオリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的化するホスホロチオエート骨格を有する、ＩＳＩＳ  １３９２０（
【０１９０】
【化１】
2005502331.tif 000002
配列番号１、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字で示される））である。マウスまたはラット細胞について、ポジティブコントロールオリゴヌクレオチドは、マウスｃ−ｒａｆおよびラットｃ−ｒａｆの両方を標的化するホスホロチオエート骨格を有する、ＩＳＩＳ  １５７７０（
【０１９１】
【化２】
2005502331.tif 000003
配列番号２、２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルが太字で示される）である。次いで、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ１  １３９２０に対して）またはｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡ（ＩＳＩＳ  １５７７０に対して）の８０％阻害を生じるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株についての、後の実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーング濃度として使用する。８０％阻害に達しない場合、Ｈ−ｒａｓ  ｍＲＮＡまたはｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡの６０％阻害を生じるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株についての後の実験におけるオリゴヌクレオチドスクリーニング濃度として使用する。６０％阻害が達成されない場合、その特定の細胞株を、オリゴヌクレオチドトランスフェクション実験に適さないとみなす。
【０１９２】
（実施例１０）
（ホルモン感受性リパーゼ発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析）
ホルモン感受性リパーゼ発現のアンチセンス調節は、当該分野で公知の種々の方法でアッセイされ得る。例えば、ホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルは、例えば、ノザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量化され得る。リアルタイム定量的ＰＣＲがここでは好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞性ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施され得る。ＲＮＡ単離の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．１．１−４．２．９頁および４．５．１−４．５．３頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。ノザンブロット分析は、当該分野において慣用的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．２．１−４．２．９頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能）を使用して簡便に達成され、そして製造業者の指示に従って使用され得る。
【０１９３】
ホルモン感受性リパーゼのタンパク質レベルは、当該分野で周知の種々の方法（例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡまたは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））で定量化され得る。ホルモン感受性リパーゼに対する抗体は、同定され得、そして種々の供給源（例えば、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ））から得られ得るか、または従来の抗体産生方法によって調製され得る。ポリクローナル抗血清の調製のための方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．１２．１−１１．１２．９頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．４．１−１１．１１．５頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示される。
【０１９４】
免疫沈降方法は、当該分野において標準的であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１０．１６．１−１０．１６．１１頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出され得る。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は、当該分野において標準的であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１０．８．１−１０．８．２１頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見出され得る。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、当該分野において標準的であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，１１．２．１−１１．２．２２頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見出され得る。
【０１９５】
（実施例１１）
（ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離）
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、Ｍｉｕｒａら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，，１９９６，４２，１７５８−１７６４に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，４．５．１−４．５．３頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示される。簡単に述べると、９６ウェルプレートで増殖される細胞について、増殖培地を、細胞から除去し、そして各ウェルを、２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬ溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次いで、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの溶解物を、Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）コーティング９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）に移した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、３回２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオル上にブロットして過剰な洗浄緩衝液を除去し、次いで、５分間風乾した。６０μＬの溶出緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）（７０℃まで予備加熱した）を、各ウェルに添加し、プレートを、５分間、９０℃のホットプレート上でインキュベートし、次いで、溶出物を新鮮な９６ウェルプレートに移した。
【０１９６】
１００ｍｍまたは他の標準的なプレート上で増殖した細胞を、適切な容量の全ての溶液を使用して、同様に処理し得る。
【０１９７】
（実施例１２）
（総ＲＮＡ単離）
総ＲＮＡを、製造業者の推奨する手順に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入した、ＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭキットおよび緩衝液を使用して単離した。簡単に述べると、９６ウェルプレートで増殖した細胞に対して、増殖培地を、細胞から除去し、そして各ウェルを２００μＬの冷ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ  緩衝液ＲＬＴを、各ウェルに添加し、そしてプレートを２０秒間激しく攪拌した。次いで、１００μＬの７０％エタノールを、各ウェルに添加し、そして内容物を、３回の上下のピペッティングによって混合した。次いで、サンプルを、廃液収集トレイを備え、減圧供給源に取り付けられたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドに取り付けられたＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭウェルプレートに移した。減圧を１５秒間適用した。１ｍＬの緩衝液ＲＷ１を、ＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして再び減圧を１５秒間適用した。次いで、１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして減圧を１５秒間適用した。次いで、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返し、そして減圧をさらに１０分間適用した。次いで、プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドから除去し、そしてペーパータオル上にブロットして乾かした。次いで、プレートを、１．２ｍＬコレクションチューブを備えるコレクションチューブラックを備え付けるＱＩＡＶＡＣＴＭマニホルドに再び取り付けた。次いで、ＲＮＡを、各ウェルに６０μＬの水をピペッティングすることによって溶出し、１分間インキュベートし、次いで、３０秒間減圧を適用した。溶出工程を、さらに６０μＬの水を用いて繰り返した。
【０１９８】
反復したピペッティングおよび溶出の工程を、ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して自動化し得る。基本的に、培養プレート上に細胞を溶解させた後、プレートをロボットデッキに移し、ここで、ピペッティング、ＤＮａｓｅ処理および溶出の工程を実施する。
【０１９９】
（実施例１３）
（ホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析）
ホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルの定量は、製造業者の指示に従って、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、リアルタイム定量的ＰＣＲによって決定した。これは、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物をハイスループットで定量化することを可能にする、閉鎖管、非ゲルベースの蛍光検出システムである。ＰＣＲが完了した後に、増幅生成物が定量される標準的なＰＣＲとは反対に、リアルタイム定量的ＰＣＲにおける生成物は、それらが蓄積するにつれて定量化される。これは、順方向ＰＣＲプライマーと逆方向ＰＣＲプライマーとの間で特異的にアニールし、かつ２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを、ＰＣＲ反応において含むことによって達成される。レポーター色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡのいずれかから入手される、ＪＯＥ，ＦＡＭ，またはＶＩＣ）を、プローブの５’末端に結合させ、そしてクエンチャー色素（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡのいずれかから入手される、ＴＡＭＲＡ）を、プローブの３’末端に結合させる。プローブおよび色素がインタクトである場合、レポーター色素発光は、３’クエンチャー色素が近いため、クエンチされる。増幅の間、プローブを標的配列にアニールすることによって、Ｔａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって切断され得る基質が作製される。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長期の間、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断は、プローブの残りから（それ故、クエンチャー部分から）レポーター色素を離し、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各サイクルに伴い、さらなるレポーター色素分子が、それらのそれぞれのプローブから切断され、そしてその蛍光強度が、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに組み立てられたレーザーオプティクスによって、規定の間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理のコントロールサンプルからｍＲＮＡの一連の希釈物を含む一連の並行反応は、試験サンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害％を定量するために使用される標準曲線を生じる。
【０２００】
定量的ＰＣＲ分析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを、ＧＡＰＤＨ増幅反応を「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）」する能力について評価される。多重化において、標的遺伝子と内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨとの両方が、単一のサンプル中で同時に増幅される。この分析において、未処理細胞から単離されたｍＲＮＡを、連続的に希釈する。各希釈物を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「一重化（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）、または両方（多重化）に特異的なプライマー−プローブセットの存在下で増幅される。ＰＣＲ増幅に続いて、希釈の関数としてＧＡＰＤＨおよび標的のｍＲＮＡシグナルの標準曲線を、一重化サンプルおよび多重化サンプルの両方から作製する。多重化サンプルから作成されるＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡシグナルｎ傾きおよび補正係数の両方が、一重化サンプルから作成されるそれらの対応する値の１０％以内に入る場合、その標的に特異的なプライマー−プローブセットは、多重化可能であるとみなされる。ＰＣＲの他の方法もまた、当該分野において公知である。
【０２０１】
ＰＣＲ試薬を、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから得た。２５μＬ  ＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮＴＭ緩衝液Ａ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、９００ｎＭの順方向プライマー、５０ｎＭの逆方向プライマー、および１００ｎＭのプローブ、２０単位ＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５単位ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＴＭ、および１２．５単位ＭｕＬＶ逆転写酵素）を、９６ウェルプレート（２５μＬの総ＲＮＡ溶液を含む）に添加することによって、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ反応を、３０分間、４８℃でインキュベーションすることによって、実行した。ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤＴＭを活性化するための９５℃で１０分のインキュベーションに続いて、２工程のＰＣＲプロトコルの４０サイクルを実行した：９５℃で、１５秒間（変性）、引き続く、６０℃で１．５分間（アニーリング／伸長）。
【０２０２】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られる遺伝子標的量は、ＧＡＰＤＨの発現レベル（この遺伝子の発現は一定である）を使用するか、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して総ＲＮＡを定量化することによってのいずれかで、規格化される。ＧＡＰＤＨ発現は、標的と同時に実施するか、多重化するか、または別々に実施することによって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化される。総ＲＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭＲＮＡ定量化試薬を使用して定量化される。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭによるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４に教示される。
【０２０３】
このアッセイにおいて、１７５μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ作業試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で、１：２８６５に希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、２５μＬの精製細胞性ＲＮＡを含む９６ウェルプレートにピペッティングする。このプレートを、４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光を用いてＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読んだ。
【０２０４】
ヒトホルモン感受性リパーゼに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００５３５７、本明細書中において、配列番号３として援用される）を使用して、ヒトホルモン感受性リパーゼ配列にハイブリダイズするように設計した。ヒトホルモン感受性リパーゼについて、ＰＣＲプライマーは、
【０２０５】
【化３】
2005502331.tif 000004
であり、そしてＰＣＲプローブは、
【０２０６】
【化４】
2005502331.tif 000005
であり、ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは、
【０２０７】
【化５】
2005502331.tif 000006
であり、そしてＰＣＲプローブは、
【０２０８】
【化６】
2005502331.tif 000007
であり、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。
【０２０９】
マウスホルモン感受性リパーゼに対するプローブおよびプライマーを、公開された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０８１８８、本明細書中において、配列番号１０として援用される）を使用して、マウスホルモン感受性リパーゼ配列にハイブリダイズするように設計した。マウスホルモン感受性リパーゼについて、ＰＣＲプライマーは、
【０２１０】
【化７】
2005502331.tif 000008
であり、そしてＰＣＲプローブは、
【０２１１】
【化８】
2005502331.tif 000009
であり、ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲプライマーは、
【０２１２】
【化９】
2005502331.tif 000010
であり、そしてＰＣＲプローブは、
【０２１３】
【化１０】
2005502331.tif 000011
であり、ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、蛍光レポーター色素であり、そしてＴＡＭＲＡ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、クエンチャー色素である。
【０２１４】
（実施例１４）
（ホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルのノザンブロット分析）
アンチセンス処理の１８時間後、細胞単層を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍＬ  ＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ”Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）中に溶解させる。総ＲＮＡを、以下の製造業者の推奨するプロトコルに従って、調製した。２０μｇの総ＲＮＡを、ＭＯＰＳ緩衝液系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を使用して、１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルを通して電気泳動によって分画した。ＲＮＡを、ノザン／サザン移動緩衝液系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ”Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して、一晩のキャピラリー移動によって、ゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移動させた。ＲＮＡ移動を、ＵＶ可視化によって確認した。膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭ  ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してＵＶ架橋して固定し、次いで、ストリンジェントな条件について、製造業者の推奨を使用して、ＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプローブ（ｒｏｂｅ）した。
【０２１５】
ヒトホルモン感受性リパーゼを検出するために、ヒト感受性リパーゼ特異的プローブを、
【０２１６】
【化１１】
2005502331.tif 000012
を使用して、ＰＣＲによって調製した。ローディングおよび移動効率における変動を規格化するために、膜をストリップし、そしてヒトグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）についてプローブした。
【０２１７】
マウスホルモン感受性リパーゼを検出するために、マウスホルモン感受性リパーゼ特異的プローブを、
【０２１８】
【化１２】
2005502331.tif 000013
を使用して、ＰＣＲによって調製した。ローディングおよび移動効率における変動を規格化するために、膜をストリップし、そしてマウスグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）についてプローブした。
【０２１９】
ハイブリダイズした膜を、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して可視化し、そして定量した。データを、未処理コントロールにおけるＧＡＰＤＨレベルに対して規格化した。
【０２２０】
（実施例１５）
（ヒトホルモン感受性リパーゼを標的化する、２’ＭＯＥウィングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの設計）
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ ００５３５７（配列番号３として本明細書中で援用される）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ１１７０６（配列番号１７として本明細書中で援用される）、およびＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＡ６３５８９１（配列番号１８として本明細書中で援用される））を使用して、ヒトホルモン感受性リパーゼＲＮＡの種々の領域を標的化するように設計した。これらのオリゴヌクレオチドを、表１に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の最初（最も５’側）のヌクレオチド数を示す。表１中の全ての化合物が、２０ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、これは、両側（５’方向および３’方向）に５−ヌクレオチド「ウィング」が隣接する、１０の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成される。これらのウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。インターヌクレオシド（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）（骨格）連結は、オリゴヌクレオチド全体を通じて、ホスホチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。
【０２２１】
（表１）
（２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するヒトホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの設計）
【０２２２】
【表１−１】
2005502331.tif 000014
【０２２３】
【表１−２】
2005502331.tif 000015
【０２２４】
【表１−３】
2005502331.tif 000016
【０２２５】
【表１−４】
2005502331.tif 000017
（実施例１６）
（２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有する、キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトホルモン感受性リパーゼ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５３５７（本明細書中で配列番号３として援用されている）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１１７０６（本明細書中で配列番号１７として援用されている）および；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ６３５８９１（本願明細書中で配列番号１８として援用されている））を使用して、ヒトホルモン−感受性リパーゼＲＮＡの異なる領域を標的化するために設計された一連のオリゴヌクレオチドのサブセットを、本明細書中の他の実施例において記載されているような定量的実時間ＰＣＲによって、ヒトホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について分析した。
【０２２６】
データは、２回の実験からの平均である。記載されている場合、「Ｎ．Ｄ．」は、「データ無し」を示す。このオリゴヌクレオチドを、表２に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の、最初（最も５’側）のヌクレオチド数を示す。表２における全化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成される、２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）」）であり、これは、５ヌクレオチド「ウイング」が、両方の部位（５’方向および３’方向）に隣接する。このウイングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。このヌクレオシド間（バックボーン）の結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０２２７】
（表２）
（２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡレベルの阻害）
【０２２８】
【表２】
2005502331.tif 000018
表２に示されるように、配列番号６２、７０、９９、１０７、１０８、１１１、１１２、１１５、１１７、１２１、１２３、１２４、１３２、１３３、１４２、１４６、および１５３は、このアッセイにおいて、ヒトホルモン感受性リパーゼ発現の少なくとも４０％の阻害を実証し、従って、好ましい。これらの好ましい配列が相補的である標的部位は、本明細書において、「活性部位」と呼ばれ、従って、本発明の化合物によって標的化するための好ましい部位である。
【０２２９】
（実施例１７）
（マウスホルモン感受性リパーゼを標的する２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有する、キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの設計）
本発明に従って、一連のオリゴヌクレオチドを、公開された配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０８１８８（本明細書中で配列番号１０として援用されている））を使用して、マウスホルモン−感受性リパーゼＲＮＡの異なる領域を標的するために設計した。このオリゴヌクレオチドを、表３に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の、最初（最も５’側）のヌクレオチド数を示す。表３における全化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心「ギャップ」領域から構成される、２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、これは、５ヌクレオチド「ウイング」によって両方の部位（５’方向および３’方向）に隣接される。このウイングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。このヌクレオシド間（バックボーン）の結合は、オリゴヌクレオチド全体にわたってホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。
【０２３０】
（表３）
（２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシギャップを有する、マウスホルモン−感受性リパーゼｍＲＮＡキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの設計）
【０２３１】
【表３−１】
2005502331.tif 000019
【０２３２】
【表３−２】
2005502331.tif 000020
【０２３３】
【表３−３】
2005502331.tif 000021
（実施例１８）
（ホルモン−感受性リパーゼタンパク質レベルのウエスタンブロット分析）
ウエスタンブロット分析（イムノブロット分析）を、標準方法を使用して実施する。細胞を、オリゴヌクレオチド処理後１６〜２０時間で回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）中に懸濁し、５分間煮沸し、そして１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填した。ゲルを、１５時間、１５０ｖで泳動させ、そしてウエスタンブロッティングのための膜に移動させた。ホルモン−感受性リパーゼに対して指向される適切な一次抗体を、一次抗体種に対して指向される放射標識または蛍光標識された二次抗体と共に使用する。ビーズを、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して視覚化する。
【０２３４】
（実施例１９）
（血糖値に対するホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
ｄｂ／ｄｂマウスを、２型糖尿病のモデルとして使用する。これらのマウスは、高血糖性耐性、肥満耐性、高脂血症耐性、およびインスリン耐性である。ｄｂ／ｄｂ表現型は、Ｃ５７ＢＬＫＳバックグラウンドにおけるレプチンレセプター中での突然変異に起因する。しかし、異なるマウスバックグラウンドにおけるレプチン遺伝子の突然変異は、糖尿病を伴わない肥満を生じさせ得る（ｏｂ／ｏｂマウス）。これらのマウスを、以下の研究に使用した。
【０２３５】
本発明に従って、ＩＳＩＳ  １２６９３０（ＧＴＣＴＣＧＴＴＧＣＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧ、配列番号１７９）を、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるグルコース代謝およびホメオスタシスでの、ホルモン感受性リパーゼの役割にアドレスするように設計された実験において研究した。
【０２３６】
ＩＳＩＳ  １２６９３０は、本明細書中で配列番号３（ヒトホルモン−感受性リパーゼのヌクレオチド１７６０において開始する；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５３５７）および配列番号１０（マウスホルモン−感受性リパーゼのヌクレオチド１１７２において開始する；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０８１８８）として援用された、ヒトおよびマウスホルモン−感受性リパーゼヌクレオチド配列のコード領域における配列に対して完全に相補的である。
【０２３７】
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。ｏｂ／ｏｂマウスを、２５ｍｇ／ｋｇの用量のＩＳＩＳ  １２６９３０で処置した。処置を５週間続け、血糖値を、０、７、１４、２１、２８、および３５日目に測定した。
【０２３８】
ＩＳＩＳ  １２６９３０で処置したｏｂ／ｏｂマウスにおいて２８日目までに、血糖値が、３００ｍｇ／ｄＬの開始レベルから１６０ｍｇ／ｄＬに減少し、そして５週間にわたってこのレベルを維持した。これらの最終レベルは、野生型マウスにとって正常な範囲内（１７０ｍｇ／ｄＬ）である。この生理食塩水処置レベルは、この研究全体にわたって、平均で２５０ｍｇ／ｄＬである。
【０２３９】
（実施例２０）
（肝臓におけるｍＲＮＡ発現に対するホルモン感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして実施例１９のように、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。処置を５週間続け、マウスを屠殺した後、ｍＲＮＡ分析用に組織を収集した。ＲＮＡ値を正規化し、そしてサリンで処置されたコントロールのパーセントとして表現する。
【０２４０】
ＩＳＩＳ  １２６９３０は、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓においてホルモン−感受性リパーゼｍＲＮＡレベルを首尾良く減少させた（ホルモン−感受性リパーゼｍＲＮＡの６０％の減少）。
【０２４１】
（実施例２１）
（肝臓および脂肪臓器の重量におけるホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして実施例１９のように、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。処置を５週間続けた。３５日目に、マウスを屠殺し、マウスの肝臓および脂肪の最終体重量を測定した。
【０２４２】
ＩＳＩＳ  １２６９３０を用いたｏｂ／ｏｂマウスの処置により、生理食塩水で処置したコントロールと比較して、肝臓重量の減少を生じ、そして脂肪含有量は変化しなかった。肝臓の重量は、平均４．７ｇ〜３．５ｇで減少したが、脂肪の重量は、同じままであった（平均１．８ｇ／マウス）。
【０２４３】
（実施例２２）
（血清インシュリンレベルに対するホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして実施例１９のように、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。処置を５週間続け、血清インシュリンレベルを、３５日目に測定した。
【０２４４】
ＩＳＩＳ  １２６９３０で処置したマウスが、コントロールと比較して、血清インシュリンレベルの減少を示した（オリゴヌクレオチドで処置した動物に対する８ｎｇ／ｍＬと比較して、コントロールに対して５７ｎｇ／ｍＬ）。
【０２４５】
（実施例２３）
（血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルに対するホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして実施例１９のように、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。処置を５週間続け、ＡＳＴおよびＡＬＴレベルを、３５日目に測定した。肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの増加したベルは、毒性および肝臓の損傷を示す。
【０２４６】
ＩＳＩＳ  １２６９３０で処置したマウスは、コントロールと比較して、ＡＳＴおよびＡＬＴレベルの減少を示した（オリゴヌクレオチドで処置した動物におけるＡＳＴレベルおよびＡＬＴレベルに対して２５０ＩＵ／Ｌであるのと比較して、コントロール動物においてＡＳＴレベルに対して３３０ＩＵ／ＬおよびＡＬＴレベルに対して５２０ＩＵ／Ｌ）。これらの結果は、オリゴヌクレオチド処置の進行中の毒性効果を示さなかった。
【０２４７】
（実施例２４）
（血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルに対するホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雄のｏｂ／ｏｂマウスを、同一の平均血糖値を有する群（ｎ＝８）に分けて、そして実施例１９のように、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０を用いた週に２回の腹腔内注射により処置した。処置を５週間続け、血清コレステロールおよびトリグリセリドのレベルを、３５日目に測定した。
【０２４８】
ＩＳＩＳ  １２６９３０で処置したマウスは、正常なレベルに対して血清コレステロール（コントロール動物に対して２５０ｍｇ／ｄＬおよびオリゴヌクレオチドで処置した動物に対して１５０ｍｇ／ｄＬ）およびトリグリセリド（コントロール動物に対して１４０ｍｇ／ｄＬおよびオリゴヌクレオチドで処置した動物に対して１００ｍｇ／ｄＬ）の両方の減少を示した。
【０２４９】
（実施例２５）
高脂血症のＰ−４０７マウスモデルにおけるホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
ポロキサマー４０７（Ｐ−４０７）、不活性ブロックコポリマー（親水性ポリオキシエチレン単位によって隣接された疎水性コアを含む）は、ゲッ歯類において高脂血症を誘導することが示された（Ｐａｌｍｅｒら，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１９９８，１３６，１１５〜１２３）。マウスにおいて、Ｐ−４０７（０．５ｇ／ｋｇ）の１回の腹腔内注射は、２４時間目にピークを有する高コレステロール血症を生じ、処置の９６時間後までに、コントロールレベルに戻った（Ｓａｌｔｉｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７，５３５−５３７）。
【０２５０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（高脂血症症誘導アテローム性動脈硬化プラーク形成に対して感受性であると報告されている株）を以下の研究において使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、強力な脂質低下化合物として評価した。
【０２５１】
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、３つの対応する群に分けた：（１）野生型コントロール動物；（２）Ｐ−４０７を注射（３日毎に０．５ｇ／ｋｇ）した動物、および（３）高コレステロール食餌を受けた動物。コントロール動物には、処置を施さず、通常のゲッ歯類食餌で維持した。各群からのマウスに、３日毎、一晩断食した後に、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １２６９３０を腹腔内投薬した。５匹のマウス／群を、０、０．１６、１、２、７、１４、２１、２８、４２、７０および１４０日目に屠殺し、そしてコレステロールおよびトリグリセリドレベル、肝臓酵素レベル、血清グルコースレベルについて評価した。１４０日目に、残りの動物を屠殺し、そして臓器重量およびホルモン−感受性リパーゼのｍＲＮＡ発現について評価した。
【０２５２】
（実施例２６）
（血清コレステロール、トリグリセリド、グルコース、肝臓酵素レベルの高脂血症−時間経過測定のＰ−４０７マウスモデルの評価）
高脂血症のＰ−４０７モデルを評価するために、（実施例２５に記載されたような）正常な食餌を受けたＰ−４０７処置群の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１４０日の時間経過にわたって、血清コレステロールおよびトリグリセリドのベースラインレベル、グルコースおよび肝臓酵素のレベルを評価した。測定を、０、０．１６、１、２、７、１４、２１、２８、４２、７０および１４０日目に行った。
【０２５３】
研究過程の間、全ての測定は、５００ｍｇ／ｄＬの残存平均血清コレステロールレベル；１５００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドレベル；２００ＩＵ／ＬのＡＳＴレベルおよび１００ＩＵ／ＬのＡＬＴレベルと相対的に一致した。グルコースレベルは、研究の時間過程にわたって平均で５００ｍｇ／ｄＬであった。
【０２５４】
（実施例２７）
（Ｐ−４０７マウスモデルの高脂血症の肝臓および脾臓の重量における、ホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、３つの対応する群に分けた：（１）野生型コントロール動物；（２）Ｐ−４０７を注射（３日毎に０．５ｇ／ｋｇ）した動物、および（３）高コレステロール食餌を受けた動物。コントロール動物には、処置を施さず、通常のゲッ歯類食餌で維持した。各群からのマウスに、３日毎、一晩断食した後に、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １２６９３０を腹腔内投薬した。５匹のマウス／群を、１４７日目に屠殺し、脾臓および肝臓の重量の変化を体重の割合として評価した。
【０２５５】
生理食塩水を注射した野生型群のマウスは、体重の４％の肝臓の重量を有したが、ＩＳＩＳ  １２６９３０を受けたこれらの動物は、体重の５．５％の肝臓の重量を有した。この処置群における脾臓の重量は、生理食塩水を注射した動物について体重の０．４％、およびＩＳＩＳ  １２６９３０を受けた動物について体重の０．５８％であった。従って、コントロール動物のアンチセンス処置は、生理食塩水を注射した動物と比較して、臓器重量の関数としての、肝臓または脾臓に対する有害な効果を有さなかった。
【０２５６】
生理食塩水を受けたＰ−４０７処置群におけるマウスは、体重の７％である肝臓重量を有したが、ＩＳＩＳ  １２６９３０を受けたこれらの動物は、体重の７．８％である肝臓体重を有さなかった。この処置群における脾臓体重は、生理食塩水を注射した動物について体重の０．５％であり、そしてＩＳＩＳ  １２６９３０を受けた動物について体重の０．５８％であった。従って、Ｐ−４０７で処置した動物のアンチセンス処置は、生理食塩水を注射した動物と比較して、臓器重量の関数としての、肝臓または脾臓に対する有害な影響を有さなかった。
【０２５７】
生理食塩水を受けた高コレステロール食餌処置群のマウスは、体重の１３％である肝臓重量を有したが、ＩＳＩＳ  １２６９３０を受けたこれらの動物は、体重の１２％に匹敵する肝臓重量を有した。この処置群における脾臓の重量は、生理食塩水を注射した動物について体重の０．５８％であり、そしてＩＳＩＳ  １２６９３０を受けた動物について体重の０．６％であった。
【０２５８】
肝臓重量は、他の処置群におけるよりも、高コレステロール食餌を供給した動物において、体重のより高い割合であったが、アンチセンス処置は、生理食塩水処置と比較して、肝臓受領に影響を与えることが見出されなかった。結果として、これらの動物は、生理食塩水を注射した動物と比較して、臓器重量の関数としての、肝臓または脾臓に対する有害な効果を有さなかった。
【０２５９】
（実施例２８）
（Ｐ−４０７マウスモデルの肝臓での高脂血症ｍＲＮＡ発現における、ホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、３つの対応する群に分けた：（１）野生型コントロール動物；（２）Ｐ−４０７を注射（３日毎に０．５ｇ／ｋｇ）した動物、および（３）実施例２５におけるような高コレステロール食餌を受けた動物。コントロール動物には、処置を施さず、通常のゲッ歯類食餌で維持した。各群からのマウスに、３日毎、一晩断食した後に、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １２６９３０を腹腔内投与した。５匹のマウス／群を、１４７日目に屠殺し、肝臓におけるホルモン感受性リパーゼ発現レベルについて評価した。
【０２６０】
全３つの処置群において、肝臓におけるホルモン感受性リパーゼｍＲＮＡの発現レベルは、コントロールの１０％未満まで減少した。
【０２６１】
（実施例２９）
（Ｐ−４０７マウスモデルの高脂血症−血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルにおける、ホルモン−感受性リパーゼ（ＩＳＩＳ  １２６９３０）のアンチセンス阻害の効果）
雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、３つの対応する群に分けた：（１）野生型コントロール動物；（２）Ｐ−４０７を注射（３日毎に０．５ｇ／ｋｇ）した動物、および（３）実施例２５におけるような高コレステロール食餌を受けた動物。コントロール動物には、処置を施さず、通常のゲッ歯類食餌で維持した。各群からのマウスに、３日毎、一晩断食した後に、生理食塩水または５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １２６９３０を腹腔内投薬した。５匹のマウス／群を、１４７日目に屠殺し、血清コレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルについて評価した。
【０２６２】
野生型コントロール群および高コレステロール食餌の両方において、生理食塩水またはＩＳＩＳ  １２６９３０のいずれかで処置した動物における、血清コレステロールまたはトリグリセリドのレベルの違いは、存在しなかった。野生型コントロール群の全ての動物は、８０ｍｇ／ｄＬの血清コレステロールレベルを有したが、高コレステロール群における全ての動物は、４００ｍｇ／ｄＬの血清コレステロールレベルを維持した。野生型および高コレステロール群の両方における動物の血清トリグリセリドレベルは、１００ｍｇ／ｄＬ未満であった。
【０２６３】
しかし、高脂血症のＰ−４０７モデルにおいて、アンチセンス処置動物における、血清コレステロールおよびトリグリセリドの両方の減少は、存在しなかった。この群の血清コレステロールのレベルは、８００ｍｇ／ｄＬ（生理食塩水で処置した動物）〜６００ｍｇ／ｄＬ（アンチセンス化合物で処置した動物）に降下した。トリグリセリドのレベルは、１８００ｍｇ／ｄＬ（生理食塩水で処置した動物）〜６００ｍｇ／ｄＬ（アンチセンスで処置した動物）によりさらに劇的に減少したことを示した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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