(57)【要約】Ｎ−アセチル置換基及びＯ−スクシニル置換基でいろいろに置換されたポリ−１，６，β−２−アミドグルコピラノシドの一般構造を有する高分子量ポリサッカライド細胞内接着（ＳＡＥ）抗原を開示する。また、前記抗原のスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からの単離方法も開示する。前記ＳＡＥはワクチン中に単独でまたは免疫原性タンパク質にコンジュゲートして使用され得、及び／または免疫原性アジュバントと一緒に使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2005532415.tif 000005
（式中、Ｒ１の４０〜６０％はＨで、残りのＲ１はＣＯＣＨ３であり、Ｒ２の７５〜９５％はＨで、残りのＲ２はＣ４Ｈ６Ｏ４であり、ｎは分子量が少なくとも約３００，０００Ｄａになるような値である。）
を有する単離スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）エキソポリサッカライド（ＳＡＥ）。
【請求項２】
Ｒ１の４５〜５５％がＨであり、Ｒ２の８５〜９５％がＨである請求項１に記載のＳＡＥ。
【請求項３】
Ｒ１の５０％がＨであり、Ｒ２の８５〜９５％がＨである請求項２に記載のＳＡＥ。
【請求項４】
請求項１に記載のＳＡＥを含む免疫原性組成物。
【請求項５】
生理学的に許容され得る塩溶液中の請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
免疫原性タンパク質担体に共有結合している請求項１に記載のＳＡＥを含む免疫原性組成物。
【請求項７】
更に免疫賦活性アジュバントを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項４に記載の免疫原性組成物を投与することを含む動物における免疫応答の誘導方法。
【請求項９】
請求項６に記載の免疫原性組成物を投与することを含む動物における免疫応答の誘導方法。
【請求項１０】
ａ）スタフィロコッカス・アウレウス培養物から得た培地を濃縮して、濃縮培地を得るステップ、
ｂ）前記濃縮培地を濾過して、保持物質を得るステップ、及び
ｃ）前記保持物質をプロテアーゼで消化して、ＳＡＥ化合物を得るステップ
を含む、請求項１に記載のＳＡＥ化合物の生産方法。
【請求項１１】
更に、
ｄ）ＳＡＥをダイアフィルトレーションを用いて濃縮するステップ
を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）がスタフィロコッカス・アウレウスから得た培地を接線流濾過を用いて濃縮することを含む請求項１０に記載のＳＡＥ化合物の生産方法。
【請求項１３】
ステップｂ）がダイアフィルトレーションステップを含む請求項１０に記載のＳＡＥ化合物の生産方法。
【請求項１４】
ａ）スタフィロコッカス・アウレウス培養物から得た培地を濃縮して、濃縮培地を得るステップ、
ｂ）前記濃縮培地を濾過して、保持物質を得るステップ、及び
ｃ）前記保持物質をプロテアーゼで消化して、高分子量ポリサッカライド抗原を得るステップ
を含む方法により生産される高分子量ポリサッカライド抗原。
【請求項１５】
請求項１４に記載の高分子量組成物を含む免疫原性組成物。
【請求項１６】
高分子量組成物が免疫原性タンパク質担体に共有結合されている請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物を動物に投与することを含む免疫応答の誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチル置換基及びＯ−スクシニル置換基でいろいろに置換されたポリ−１，６−β−２−アミドグルコピラノシドの一般構造を有する新規な高分子量スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）エキソポリサッカライド（ＳＡＥ）抗原及びその作成方法に関する。本発明はまた、前記ＳＡＥ抗原を用いて生産したワクチンにも関する。
【背景技術】
【０００２】
スタフィロコッカス・アウレウス及びスタフィロコッカス・エピデルミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、毎年報告されている院内敗血症例の大部分を占める重要なヒト病原菌である。両方とも、病原球菌も埋込んだ医療用具からの定着を伴い、それにより全身性菌血、場合により心内膜炎や人工呼吸器の使用に伴う肺炎のような致命的状態をもたらす。抗生物質耐性を示す微生物、特にメチシリン及びバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス株の数が増えているために、新しい防御方法が求められている。付着及び蓄積の初期ステップの媒介において重要であることが知られている表面分子を標的とする細菌性ワクチンが特に魅力的である。
【０００３】
付着及び蓄積の主要段階はスタフィロコッカス・エピデルミジスのようなコアグラーゼ陰性スタフィロコッシイ（ＣｏＢＳ）において広く研究されている。初期付着は主に細菌表面タンパク質との非特異的相互作用により生じるが、蓄積は主として細菌性エキソポリサッカライドにより媒介される。この表面発現炭水化物はワクチンベース戦略の魅力的な標的であり得る。
【０００４】
着目のスタフィロコッシイ炭水化物の一つはポリサッカライド細胞内アドヘシン（ＰＩＡ）である。ＰＩＡは、増殖の蓄積フェーズ中に生ずる非晶質エキソポリサッカライドであるバイオフィルムの主成分であることが分かっている。ＰＩＡは細胞−細胞間付着の媒介に関与し、宿主の免疫防御から増殖コロニーを遮断するように機能し得る。
【０００５】
スタフィロコッカス・エピデルミジスから単離されたＰＩＡはＭａｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１７８（１）：１７５−１８３（１９９６）により特性付けられた。分子量が３０，０００Ｄａ未満でβ−１，６−結合グルコサミンから構成されるポリマーである。アミノ基の約８５％がＮ−アセテートで置換され、糖ヒドロキシ基の少量がホスフェート及びスクシネートでエステル化されている。
【０００６】
ＰＩＡ産生は、ｉｃａ遺伝子座に関連し、インビトロで数種のＣｏＮＳ株について特定の規定増殖条件下で示された。最近、スタフィロコッカス・アウレウスを含めた他のブドウ球菌株はｉｃａ座を含むことが報告された。スタフィロコッカス種の幾つかは培養中にバイオフィルムを誘発し得たが、他のものはそうしなかった。ｉｃａの調節に影響を及ぼす環境因子のすべてが知られてはいなく、ポリサッカライドベースのワクチンの開発にはその発現の増殖条件に対する感受性が主な障害であった。よって、インビトロで増殖させた微生物がインビボ感染中に存在するものと同じ表面ポリサッカライドを生成することを確実に示すことは困難であった。最後に、ポリサッカライド調製物の正確な構造特性づけはしばしば残留している培地汚染物質により妨害され、このために新規抗原と確信されるものはまれにしか同定されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ワクチン作成を容易とすべくＳＡＥを高量で産生するための単純でロバストな方法が所望されている。また、スタフィロコッカス・エピデルミジス以外のソース、すなわちスタフィロコッカス・アウレウスからの単離ＳＡＥを化学的に特性づけることが所望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、式：
【０００９】
【化２】
2005532415.tif 000002
（式中、Ｒ１の４０〜６０％はＨで、残りのＲ１はＣＯＣＨ３であり、Ｒ２の７５〜９５％はＨで、残りのＲ２はＣ４Ｈ６Ｏ４であり、ｎは分子量が少なくとも約１００，０００Ｄａ、好ましくは少なくとも約２００，０００Ｄａ、最も好ましくは少なくとも約３００，０００Ｄａになるような値である。）
を有する単離スタフィロコッカス・アウレウス高分子量エキソポリサロッカライド（ＳＡＥ）抗原を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様では、Ｒ１の約４５〜５５％がＨであり、Ｒ２の約８５〜９５％がＨである。本発明の特に好ましい実施態様では、Ｒ１の約５０％がＨであり、Ｒ２の約８５〜９５％がＨである。
【００１１】
本発明の別の態様は、式：
【００１２】
【化３】
2005532415.tif 000003
（式中、Ｒ１の４０〜６０％はＨで、残りのＲ１はＣＯＣＨ３であり、Ｒ２の７５〜９５％はＨで、残りのＲ２はＣ４Ｈ６Ｏ４であり、ｎは分子量が少なくとも約１００，０００Ｄａ、好ましくは少なくとも約２００，０００Ｄａ、最も好ましくは少なくとも約３００，０００Ｄａになるような値である。）
を有する精製スタフィロコッカス・アウレウス高分子量エキソポリサロッカライド（ＳＡＥ）である。好ましくは、調製物中にＳＡＥは少なくとも約７５％の純度、好ましくは少なくとも約８０％の純度、より好ましくは約８０％以上の純度で存在する。
【００１３】
好ましい実施態様では、精製ＳＡＥ中のＲ１の約４５〜５５％がＨであり、Ｒ２の約８５〜９５％がＨである。本発明の特に好ましい実施態様では、Ｒ１の約５０％がＨであり、Ｒ２の約８５〜９５％がＨである。
【００１４】
本発明の単離または精製ＳＡＥは免疫原性組成物、すなわちワクチンを作成するために使用され得る。前記ワクチンは免疫原性応答を生じさせ得る動物において使用され得る。本発明は特にヒトワクチン及び獣医用に適したワクチンを含む。
【００１５】
免疫原性組成物は生理学的に許容され得る塩溶液中に単離及び／または精製ＳＡＥを含み得る。更に、別の実施態様ではＳＡＥは免疫原性タンパク質担体に共有結合され得る。場合により、ＳＡＥ免疫原性組成物は更に免疫賦活性アジュバントを含み得る。
【００１６】
本発明の更なる態様は、ＳＡＥ免疫原性組成物の１つ（ＳＡＥ単独、免疫原性タンパク質担体にコンジュゲートしたＳＡＥ及び／またはアジュバントの存在下で）を投与することを含む動物における免疫応答の誘導方法である。
【００１７】
本発明はまた、式：
【００１８】
【化４】
2005532415.tif 000004
（式中、Ｒ１の４０〜６０％はＨで、残りのＲ１はＣＯＣＨ３であり、Ｒ２の７５〜９５％はＨで、残りのＲ２はＣ４Ｈ６Ｏ４であり、ｎは分子量が少なくとも約１００，０００Ｄａ、好ましくは少なくとも約２００，０００Ｄａ、最も好ましくは少なくとも約３００，０００Ｄａになるような値である。）
を有するＳＡＥ化合物の生産方法も提供し、その方法は、
ａ）スタフィロコッカス・アウレウス培養物から得た培地を濃縮して、濃縮培地を得るステップ、
ｂ）前記濃縮培地を濾過して、保持物質を得るステップ、及び
ｃ）前記保持物質をプロテアーゼで消化して、ＳＡＥ化合物を得るステップ
を含む。
【００１９】
本発明の別の方法では、更に、
ｄ）ＳＡＥをダイアフィルトレーションを用いて濃縮するステップ
を含む。
【００２０】
場合により、ＳＡＥ化合物はより均一サイズの生成物を得るためにサイジングクロマトグラフィーにかけてもよい。
【００２１】
好ましい実施態様では、ステップａ）はスタフィロコッカス・アウレウスから得た培地を接線流濾過を用いて濃縮することを含む。別の好ましい実施態様では、ステップｂ）はダイアフィルトレーションステップを含む。
【００２２】
本発明の更に別の態様は、ａ）スタフィロコッカス・アウレウス培養物から得た培地を濃縮して、濃縮培地を得るステップ、ｂ）前記濃縮培地を濾過して、保持物質を得るステップ、及びｃ）前記保持物質をプロテアーゼで消化して、ＳＡＥ化合物を得るステップを含む方法により生産される高分子量ＳＡＥ抗原に関する。場合により、ＳＡＥ化合物はより均一サイズの生成物を得るためにサイジングクロマトグラフィーにかけてもよい。
【００２３】
更に、本発明はこの方法により作成したＳＡＥを含む免疫原性組成物にも関する。この方法により作成したＳＡＥは適当なワクチン処方物中に使用され得る。或いは、前記ＳＡＥは免疫原性タンパク質担体に共有結合されていてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
請求の範囲及び明細書に使用される用語には以下の定義が適用される。
【００２５】
「高分子量」は、少なくとも約１００，０００Ｄａ、好ましくは少なくとも約２００，０００Ｄａ、より好ましくは少なくとも約３００，０００Ｄａの分子量を有するポリマー分子を指す。
【００２６】
「単離」は、ＳＡＥが天然生物から分離されていることを意味する。
【００２７】
「精製」または「実質的に純粋」は、アッセイされるＳＡＥ調製物が少なくとも約７５％の純度、好ましくは少なくとも約８０％の純度、より好ましくは約８０％以上の純度を有することを意味する。
【００２８】
「天然ＳＡＥ」は、サイジングステップを受けていない本発明のＳＡＥを意味する。その分子量は“サイジングした”ＳＡＥよりも非常に高い。天然ＳＡＥは約３００，０００〜７００，０００の分子量を有する。
【００２９】
「サイジングしたＳＡＥ」は、分子量を５０，０００〜１００，０００に低減させるサイジング工程を受けた本発明のＳＡＥを意味する。
【００３０】
最近の報告（参照により本明細書に含まれるとするＭｃＫｅｅｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１５２３−１５２７（１９９０））には、スタフィロコッカス・アウレウス及びスタフィロコッカス・エピデルミジスにより産生されるＳＡＥに類似の抗原の同定が記載されている。ポリ−Ｎ−スクシニル−β−１，６−グルコサミン（ＰＮＳＧ）またはカプセル状ポリサッカライドアドヘシン（ＰＳ／Ａ）と称される前記抗原はＳＡＥと同じ化学的骨格を有しているが、主にＮ−結合アセテートではなくＮ−結合スクシネートを含んでおり、高い（２５０，０００Ｄａ以上）分子量を有すると報告されている。構成的に過剰産生するスタフィロコッカス・アウレウス変異体（ＭＮ８ｍ株、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎｓ病院から入手）が同定されると、マウスにおける生理化学的特性付け及びその後の免疫原性研究のために十分量の抗原が精製され得た。ＭｃＫｅｅｎｅｙらの研究は、ＰＮＳＧに対する免疫予防法は同種及び異種スタフィロコッカス・アウレウス攻撃株に対して広範囲に防御的であること及びこの防御はＮ−スクシニル化の存在に依存していたことを示唆していた。これらの研究に基づいて、別の動物モデルにおいて免疫予防値を評価するためにＰＮＳＧの産生を増大させようとした。しかしながら、報告されているＰＮＳＧの構造を有する抗原は発見されなかった。
【００３１】
本発明によれば、ＭＮ８ｍ株が、化学モノサッカライド分析及びＮＭＲにより、約５０％のＮ−結合アセテート及び１０％のＯ−結合スクシネートで置換されたβ−１，６−グルコサミンから構成されることが判明した高分子量ポリマーを産生することが知見された。更に、本発明者らは、グリカンのＮ−結合スクシネート成分の従来の同定がＮＭＲ特性付けの前にポリマーを加水分解するために使用した条件の人為産物であったことを知見することができた。ポリマーの化学的及び物理的サイズを縮小させると約５０，０００Ｄａ以下の分子量を有する分子を生じさせ得る。従って、本発明者らはスタフィロコッカス・アウレウス株ＭＮ８ｍ株中のｉｃａ座の産物はＳＡＥであると結論づける。
【００３２】
スタフィロコッカス・アウレウスＳＡＥの精製及び特徴づけ
本発明の１態様は、スタフィロコッカス・アウレウス及び関連種（スタフィロコッカス・エピデルミジス、スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）及びその属の他のポリサッカライド産生菌を含む）からＳＡＥポリサッカライドを大量に産生する方法である。スタフィロコッカス・アウレウス株を選択する場合、ＭＮ８のような過剰産生株を使用することが望ましいが、他の株を使用してもよい。高い生産性を達成するためには発酵条件がしばしばより重要であり、場合によっては株の選択よりも重要なことさえある。例えば、ＭＮ／８ｍを参照により本明細書に含まれるとするＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６６（１０）：４７１１−４７２０（１９９８）に記載されている化学的に規定した培地及び条件を用いて増殖させたとき、最終ＯＤ６００ｎｍは複合接種培地を用いたときの値の約１／８であった。「複合」培地は１つ以上の不確定成分、例えば植物ペプトン、微生物抽出物または動物ソース成分を含む任意の培地である。
【００３３】
化学的に規定した培地を用いると、プロセス収率は約１ｍｇ／Ｌまで大きく低下した。更に、複合培地を用いても、必要な発酵時間を７２時間から２４時間未満に短縮できた。図１は各種形態のポリサッカライドの組成分析の結果を示す。
【００３４】
従って、本発明の１態様は、スタフィロコッカス菌を複合培地において最長２４時間培養するステップ及び生じたＳＡＥを収集するステップを含むスタフィロコッカス菌においてＳＡＥを産生させる方法である。よって、培地は好ましくは大豆ペプトン及び／または酵母抽出物を含まなければならない。これらの成分の量は培養する各生物の要件に依存して異なるが、通常大豆ペプトンは約５〜３５ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜３０ｇ／Ｌ、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ存在させ得る。酵母抽出物の場合、その量は約２０〜６０ｇ／Ｌ、好ましくは約３０〜５０ｇ／Ｌ、より好ましくは約４５〜５０ｇ／Ｌである。
【００３５】
培地中に存在させるのが好ましい他の成分には、
塩：例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ（０．５〜１５ｇ／Ｌ、好ましくは約５ｇ／Ｌ）；
約６．５〜７．５のｐＨ範囲を与える緩衝剤：例えば二塩基性リン酸カリウム、または培地中に使用されることが当業界で公知の他の緩衝剤（１〜５ｇ／Ｌ、好ましくは約２．５ｇ／Ｌ）；
消泡剤：例えばＵ  ＣＯＮ  ＬＢ６２５（０．０１〜５ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｌ）またはケイ素を主成分とする消泡剤；
他の添加剤：例えばコハク酸（約１ｇ／Ｌ）及びコハク酸ナトリウム（約１ｇ／Ｌ）；
細菌が炭素源及び／または緩衝剤として使用し得る培地作成の際に慣用されている他の添加剤
が含まれる。任意のタイプのヘキソース及び多くのジサッカライドを含めた炭素源、好ましくはデキストロースは約１％の濃度で存在させなければならない。
【００３６】
培養時間は変更可能であり、通常約１８〜２４時間であるが、もっと長い時間としてもよい。培養は撹拌培養条件で実施しなければならず、通気の程度は振とう機のスピード、フラスコ形状及び培地容量で調節され得る。前記培養パラメーターは当業界で公知である。
【００３７】
スタフィロコッカス・エピデルミジス及びスタフィロコッカス・アウレウスからのＰＮＳＧ抗原の単離を記載している従来の報告は、可溶性生成物を得るために強酸（５Ｎ  ＨＣｌ）及びその後の低ｐＨ（ｐＨ２．５）プロセスステップを用いる過酷な抽出条件が必要であることを示していた。本発明の１態様は、上記した過酷な抽出条件が不必要であり、膜限外濾過（またはサイズ排除クロマトグラフィー）ステップ、選択的汚染物質除去のための酵素処理（またはクロマトグラフィー後溶媒沈殿）ステップ及び任意のクロマトグラフ仕上げステップまたはアニオン交換クロマトグラフィーステップを含む方法を用いることにより多量のポリサッカライドが培養上清物から精製され得るという知見である。この仕上げステップにより、例えばアニオン交換クロマトグラフィーまたはＨＦ処理により低量存在の酸性汚染物質が除去される。
【００３８】
本発明によると、高い塩及び低いｐＨ抽出は単離ＳＡＥの完全性を維持しながら汚染物質を除去し得ることも知見された。本発明において“高い塩”は１．５〜３Ｍの塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、好ましくは約２Ｍの塩化ナトリウムを意味し、別の塩を使用する場合のその塩の濃度は１．５〜３Ｍの塩化ナトリウムに同等である。また、本発明において“低いｐＨ”はｐＨ２．０〜３．０、好ましくは約２．５を意味する。
【００３９】
例えば、本発明のプロトコルにより、培養流体１Ｌあたり約４００ｍｇという全プロセス収率が得られ、これは上掲のＭｃＫｅｎｎｙがスタフィロコッカス・アウレウス株ｐＣＮ２７について報告した０．５〜２ｍｇ／Ｌよりも有意に高かった。
【００４０】
パルス電流検出を伴う高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）による化学組成分析は精製プロセス中抗原を追跡するために有用であった。なぜならば、非炭水化物汚染物質及びマトリックス成分から干渉をかなり受けやすい一般的な比色アッセイとは反対に、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤはグルコサミンを特異的に同定、定量できたからである。しかしながら、酸加水分解が必要であったために、この方法によりグルコサミン置換基が失われ、よってＮＭＲが精製生成物の構造解明のために使用された。
【００４１】
天然ＳＡＥは、約５７％がアセテートで置換されてなるグルコサミン残基のβ−１，６−結合ホモポリマーから構成されている。アミノ基のスクシニル化は観察されなかった。置換位置でのプロトンの強い低ダウンフィールドシフト及びＯ−置換エステルが穏和な塩基処理を受けやすいことに基づいて、両方法で観察された低量（１０％）のスクシネートが糖ヒドロキシ基に結合していることが判明した。
【００４２】
得られたＳＡＥは十分に精製されており、グリセロホスフェートの検出により同定されるように主要汚染物質はタイコ酸（２〜５％）であった。タイコ酸に加えて、紫外（ＵＶ）吸収スペクトルは核酸を示唆する２６０ｎｍ吸収不純物の存在を示した。ＳＡＥをストリッピング条件（５Ｍ  ＮａＯＨ，３７℃，１８時間；中和及びダイアフィルトレーション）で処理すると、２６０ｎｍのピークが除去され、これは公知の核酸の塩基処理の受けやすさに一致した。アガロース電気泳動及び特定の株検出の結果は汚染物質をＤＮＡと同定した。粉末中の推定ＤＮＡレベルは２６０ｎｍ吸光度測定に基づいて３〜５％（ｗ／ｗ）であった。タイコ酸不純物はポリホスホグリセロール含量に基づいてＮＭＲにより検出され、生成物の約５質量％を占めた。
【００４３】
参照により本明細書に含まれるとするＭｃＫｅｎｎｅｙら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６６：４７１１−４７２０（１９９８）で既に報告されているように、生成物のＨＦ処理はグリセロホスフェート汚染物質の除去に有効であったが、こうするとＯ−スクシニル化が損失した。ＮＭＲデーターがＨＦ処理前後の遊離グルコサミンアミノ基の量は殆ど変化しないことを示したので、これからＨＦ−ＳＡＥはより正に耐電した物質であることが暗示される。アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）はＨＦに対する化学的に穏和な代替処理を提供し、８０〜９０％の高い生成物回収率を得ながらタイコ酸及びＤＮＡを非検出レベルに低下させるのに非常な有効であった。ＡＥＣ−ＳＡＥはＯ−スクシニル化の維持を含めて元の化学的組成を維持した。ＮＭＲで観察された高い値は、凍結乾燥後Ｄ２Ｏ中の不完全可溶化ＡＥＣ−ＳＡＥの上清に由来した。スクシネートは塩基処理により完全に遊離し、幾つかのポリサッカライドは乏しい可溶性のためにＮＭＲに反映されなかったので、明らかに高いスクシネート比が生じた。
【００４４】
サンプルのＯ−置換コハク酸の％をＯ−スクシネートを遊離スクシネートに加水分解するアルカリ溶液中で測定した。約２．３９ｐｐｍの遊離スクシネートの十分に分解されたピークを積分し、アノマーピーク（４．３〜４．６ｐｐｍ）で表されるポリサッカライド繰り返し単位に対するその比をＯ−スクシネート％として計算した。
【００４５】
天然ＳＡＥ及びＡＥＣ−ＳＡＥは本発明の別の態様を構成する。
【００４６】
ＳＡＥのサイジング分析
ポリマーサイズに対する各種処理の影響を判断するために、ポルーラン(pollulan)標準物質を用いる較正及び多重角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を用いて相対比較を実施した。図２には、各方法で測定した各種形態の推定分子量を示す。いずれの場合も、ＭＡＬＬＳ値は標準物質に対して溶離時間で測定した値ぐらい高く、大体２倍高かった。光散乱測定は低量汚染物質に対して感受性であり、高いＭｒ物質が非常に低濃度でも結果を分子量の上限に向かってかなり曲げる恐れがある。上記影響果を最小限とするために、屈折率ピークの頂点でシャープカットを取ったが、高いＭｒ物質からのブリード−インは依然として生じ得た。この説明は、ＡＥＣ分粒ＳＡＥ中に存在する小さなリーディングエッジピークの分子量はＭＡＬＬＳで定量したときの分子量のほぼ１０倍以上であるという観察から裏付けられる。矛盾に関与する別の要因は分散データーからＭｒを計算するために使用されるｄｎ／ｄｚ値であった。デテクタはｄｎ／ｄｃに対して０．１３３の値を用いて低分子量ポルーランに対して較正した（参照により本明細書に含まれるとするＢｅｄｎａｒら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４３：１１５−１３０（１９９３））。この用語は一部はクロマトグラフィーアナライトの分子形状を反映し、ＳＡＥ及びポルーランの形状が明らかに異なることが認められる。
【００４７】
天然ＳＡＥは３００，０００Ｄａ以上の高いＭｒポリマーとして単離された。ＡＥＣは非共有静電的に会合した酸性汚染物質を除去するために使用した。天然ＳＡＥをＨＦで処理すると、かなりの加水分解が生じ、汚染物質の大きさが１／５〜１／１０に縮小した。得られる全減少をコントロールし且つ抗原の化学的改変を避けるために音波処理によるＡＥＣ−ＳＡＥの物理的サイジングを使用した。使用した条件により、ＨＦ処理した物質に匹敵するＭｒを有する調製物が生じた。中間体音波処理タイムポイントの分析ＨＰＳＥＣに基づいて、減少プロセスはかなり直線的であった。ＡＥＣ分粒した物質が非常に高いＭｒのピークを少ししか含んでいない理由はわからない。入力したエネルギー条件で少量のラジカル誘導ポリマー化が小さな副反応として進行し得ると考えられる。
【００４８】
赤血球凝集分析
他の研究者により、スタフィロコッカス・エピデルミジス株が発現するＰＩＡは赤血球の凝集能力の原因となることが判明している。よって、赤血球凝集アッセイは各種ポリサッカライド調製物に対するインビトロ機能アッセイとして使用され得る。図３は赤血球を凝集するのに必要な各ＳＡＥ形態の最小濃度を要約している。ＨＦ処理ＳＡＥは最低の赤血球凝集能力を示し、他の調製物に比して赤血球凝集のために４〜８倍高い濃度が必要であった。ＨＦ処理ＳＡＥは他の形態に比してより正に帯電し、低分子量を有していた。残りの調製物間の赤血球凝集に差は殆どないようであり、サイズは多くとも５倍ほどしか違わなかった。Ｍａｃｋらに記載されている精製ＰＩＡの大きさは約２８，０００Ｄａであった。他のデーターから、分子の電荷はサイズよりもこの機能に対してより重要であり得ると示唆される。分子量が低ければポリサッカライドが凝集させる可能性は低いという可能性は残っている。
【００４９】
Ｎ−結合置換基のＮＭＲ分析
従来の報告において、ＰＮＳＧの防御効果はＮ−スクシニル化に依存していると推定したという事実があるので、本発明者らは置換されたＧｌｃＮＨ２残基の種類を綿密に研究した。ＮＭＲ分析に対する真性標準物質を調製するために、天然ＳＡＥを塩基で処理することによりＮ−及びＯ−結合置換基を除去した。利用可能なグルコサミンアミノ基の完全スクシニル化及び部分的Ｏ−スクシニル化は無水コハク酸との反応により得られた。中程度の塩基条件下で２時間インキュベートすることによりＮ＋ＯスクシニルＳＡＥからＯ−スクシネートを選択的に除去し得た。これらの条件下で、アミノ基置換はニンヒドリン活性の欠乏により測定されるように保存された。
【００５０】
ＳＡＥのＯＭＰＣに対するコンジュゲーション
ＳＡＥのＡＥＣプロセシングされた完全形態及びサイジングした形態を活性化してスルフヒドリル反応性マレイミド基を導入し、その後チオール化ＯＭＰＣタンパク質にコンジュゲートさせた。図４にコンジュゲート及び活性化中間体の分析特性づけを要約する。ＯＭＰＣの大きな粒状特性により、過剰の試薬及び非コンジュゲートポリサッカライドを除去するために限外濾過を使用することができる。使用したチオール化条件で、４３％の理論誘導体化された表面接近可能なリシンを有する活性化ＯＭＰＣが生じた。この生成物は安定であり、４℃で７０時間でもスルホヒドリル反応性の損失率は１０％未満であった。ポリサッカライド活性化により、完全及びサイジングした形態のそれぞれで４．８％及び９．９％の側鎖充填が生じた。活性化ポリサッカライド及びタンパク質を、予備実験で１０〜２０重量％のＳＡＥを生ずることが判明している０．５〜１の規定マレイミド／チオール比で混合した。
【００５１】
組成分析により、これらの標的は完全な（１１％）及びサイジングした（１３％）調製物に対して達成されたことを示した。高い塩及び洗剤を用いるストリンジェントな洗浄条件が９５％以上の非コンジュゲートポリサッカライドを除去するのに必要であることが分かった。前記コンジュゲートを０．５ｍｇ／ｍｌで明ばんアジュバンドに吸着させ、その濃度で９９％以上が吸着された。バルク明ばん生成物の安定性のルーチンなモニタリングを、アリコートをペレット化し、上清フラクション中のタンパク質を測定することにより実施した。４℃で４５日保存後検出可能なタンパク質は観察されない。
【００５２】
また、本発明はブドウ球菌感染に対する予防用ワクチンの作成に関する。本発明のＳＡＥを含む医薬的に有用な組成物は、医薬的に許容され得る担体を混合すること等の公知方法に従って処方され得る。この担体の例は公知であり、例えばＯＭＰＣまたは明ばん（水酸化アルミニウムに吸着させた）である。他の担体はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見つけることができる。有効投与に適した医薬的に許容され得る組成物を形成するためには、前記組成物は有効量のＳＡＥを含む。
【００５３】
本発明のワクチン組成物はブドウ球菌感染を予防するのに十分な量で患者に投与される。有効量は患者の状態、体重、性別及び年齢のような各種要因に従って変更され得る。他の要因には投与モードも含まれる。通常、組成物は約０．５μｇから約２５０μｇの用量で投与される。ワクチンは各種ルートで、例えば経口、非経口、皮下、粘膜または筋肉内に投与される。ワクチンはカプセル、懸濁液、エリキシル剤または液剤のような剤形で使用され得る。ワクチンは免疫学的に許容され得る担体と一緒に処方され得る。
【００５４】
ワクチンは治療有効量で、すなわち免疫学的防御応答を生じさせるのに十分な量で投与される。ワクチンは１回または複数回投与され得る。
【００５５】
以下、本発明を更に例示するために非限定的実施例を提示する。
【実施例１】
【００５６】
スタフィロコッカス・アウレウス株ＭＮ８ｍの発酵及び培養物不活性化
発熱物質非含有水（ＰＦＷ）（４Ｌ）中に大豆ペプトン（３００ｇ）、ＮａＣｌ（７５ｇ）及び二塩基性リン酸カリウム（３７．５ｇ）を溶解させることにより培養ブロスを調製した。限外濾過物グレードの溶解酵母抽出物（ＹＥＵ）（１．５Ｌ）を混合物に添加し、ＰＦＷで容量を１４．４Ｌに調節した（ＹＥＵ最終濃度＝３１．５ｇ／ｍｌ）。ＵＣＯＮ  ＬＢ６２５消泡剤（７．５ｍｌ）を添加し、培地に１ｇ／Ｌ  コハク酸及び１ｇ／Ｌ  コハク酸ナトリウムを補充した。ブロスを１２３℃において３０分間滅菌した後、滅菌デキストロースを１％の最終濃度まで添加した。（Ｂｒｉｇｈａｍ  ＆  Ｗｏｍｅｎｓ病院から入手した）スタフィロコッカス・アウレウスＭＮ８ｍストック（０．１ｍｌ）で画線したトリプシン大豆寒天プレートを３７℃において一晩インキュベートした。３００ｍｌ容量のＴｕｎａｉｒフラスコにおいて接種培地（２０ｇ／ｍｌ  大豆ペプトン、５．８ｇ／ｍｌ  ＮａＣｌ、２．９ｇ／ｍｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．４６ｇ／ｍｌ  ＮａＨＣＯ３、及び１％  滅菌デキストロース及び３１．５ｇ／ｍｌ  濾過滅菌ＹＥＵを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（５５．５ｇ／ｍｌ，ｐＨ７．０））（４５ｍｌ）にプレート由来の単一コロニーを接種し、３７℃において撹拌しながら一晩インキュベートした。一晩増殖後、接種物調製のためにフラスコを収集した。大豆ペプトン／ＹＥＵ培地にＭＮ８ｍ接種物（４０ｍｌ）を接種した。培養物を撹拌し、溶存酸素を３０％に維持するために空気を吹き込んだ。温度を３７℃に維持し、ｐＨを滅菌３０％  ＮａＯＨを添加することにより７に維持した。ｐＨ７を維持するためにＮａＯＨが必要でなくなったきに増殖は停止した。収集のために、ｐＨを５０％  酢酸で５に調節し、ＭｇＣｌ２を０．１Ｍまで添加した。培養物を６０℃に加熱し、９０分間保持した。不活性培養物を１３，６００×ｇで１０分間遠心し、上清を更なるプロセシングのために残した。
【実施例２】
【００５７】
ＳＡＥ抗原の精製
培養上清（１１．２Ｌ）をＳｕｐｒｏｃａｐ−１００  ０．８／０．２ミクロンカートリッジ（ミシガン州アナーバーに所在のＰａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ）を用いて濾過することにより清澄化し、５００Ｋ分子量カットオフ（ＮＷＣＯ）中空ファイバー膜カートリッジ（マサチューセッツ州ニーダムに所在のＡ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる接線流濾過（ＴＦＦ）により容量７００ｍｌまで濃縮した。濃縮後、保持物質フラクションを８容量の蒸留脱イオン（ＤＩ）水に対してダイアフィルトレートした。保持物質を５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ２で調節した。プロテイナーゼＫ（１４ｍｇ）を添加し、混合物を２０℃において１６時間インキュベートした。消化反応物を２Ｍ  ＮａＣｌで調節し、上記したＴＦＦにより７００ｍｌに濃縮した。保持物質を８容量の２Ｍ  ＮａＣｌ、８容量の低ｐＨ緩衝液（２５ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ２．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）及び１０容量のＤＩ水に対してダイアフィルトレートし、その後３４０ｍｌの最終容量まで濃縮した。濃縮物を予め秤量したボトル中でシェル凍結し、凍結乾燥して、天然ＳＡＥ抗原を得た。
【実施例３】
【００５８】
天然ＳＡＥの仕上げ精製及びサイジング
天然ＳＡＥ（１ｇ）を周囲温度で一晩撹拌することにより１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．７緩衝液中に２ｍｇ／ｍｌで溶解させた。残留不溶物を２０℃において１３，０００×ｇで３０分間遠心することにより除去した。上清フラクションを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．４Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．７緩衝液で平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＤＭ  ＴＭＡＥ（Ｍ）樹脂（ニュージャージー州ギブスタウンに所在のＥ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の０．９Ｌカラム（内径１１．３ｃｍ×９ｃｍ）に４０ｍｌ／分で適用した。前記カラムを３容量の平衡緩衝液で洗浄し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．８緩衝液を用いて溶離させた。１００ｍｌフラクションを集め、３４０〜２４０ｎｍの波長範囲で走査した。２６０ｎｍで吸収極大を示さなかった貫流フラクションをプールし、室温においてＢＩＯＭＡＸ  ５０Ｋ  ＭＷＣＯ膜（マサチューセッツ州ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１８容量のＤＩ水に対してダイアフィルトレートした。カップ及びホルン音波装置（ニューヨーク州Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅに所在のＭｉｓｏｎｉｘ）を６．５のパワー出力、２秒のサイクル速度及び５０％の動作周期で用いて粉砕した。サンプルを装置中に水を一定に流して低温に保った。時間依存性分子量低下をＨＰＳＥＣにより３０、４５、６０、７５、９０及び１１０分でモニターし、その時点で音波処理を停止した。
【実施例４】
【００５９】
天然ＳＡＥのＨＦ処理
天然ＳＡＥ（１０１ｍｇ）をＤＩ水に５ｍｇ／ｍｌで溶解した。等量の４８％  ＨＦを添加した後、サンプルを倒置することにより混合し、４℃において２５時間インキュベートした。反応物を等量のＤＩ水で希釈し、ｐＨを５０％  ＮａＯＨを添加することにより中性に調整した。サンプルを８Ｋ  ＭＷＣＯチューブを用いて高温（６５℃）ＤＩ水に対して２２時間透析した。その後更に周囲温度においてＤＩ水を２回交換して２４時間透析した。反応混合物を予め秤量したボトルにおいてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【実施例５】
【００６０】
Ｎ−スクシニル化ＳＡＥの作成
Ｎ−及びＯ−結合置換基を除去するために、天然ＳＡＥをアルゴンを吹き込んだ５Ｎ  ＮａＯＨに４ｍｇ／ｍｌで溶解し、アルゴン下３７℃において１８時間かけてインキュベートした。反応混合物を氷水スラリーで≦１０℃に冷却し、氷冷５Ｎ  ＨＣｌをゆっくり添加して中和した。反応物をＢＩＯＭＡＸ  ５０Ｋ  ＭＷＣＯ膜を用いて３倍濃縮し、５容量の２．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１０容量のＤＩ水に対して順次ダイアフィルトレートした。生成物を０．４５μｍ濾過し、遊離グルコサミン含量を一般的方法を用いて手動ニンヒドリンアッセイにより測定した。
【００６１】
裸にしたポリサッカライドのスクシニル化を、５Ｎ  ＮａＯＨを用いる滴定によりｐＨ８．５に維持するためにｐＨ−スタットセットで実施した。無水コハク酸（無水１，４−ジオキサン中３０ｍｇ／ｍｌ）を全グルコサミンに比して１０倍モル過剰でｐＨ−スタットでｐＨを８．２〜８．５に維持し得る速度で添加した。反応物を周囲温度で４時間インキュベートした。全Ｎ−スクシニル化及び一部のＯ−スクシニル化生成物に関して、反応物をＮａＣｌで２．５Ｍとし、６容量の２．５Ｍ  ＮａＣｌ及び１０容量のＤＩ水に対して順次ダイアフィルトレートした。Ｎ−スクシニル化生成物に関して、反応物をｐＨ１２に調節し、周囲温度で２時間インキュベートした。その後、Ｎ＋Ｏ生成物の場合のようにダイアフィルトレートした。
【実施例６】
【００６２】
ポリサッカライド分析
ポリサッカライド分析を高磁場ＮＭＲ機器を用いて実施した。Ｏ−置換スクシネートによるスペクトルを単純化するために、サンプルをＤ２ＯにｐＨ〜１２で溶解した。化学シフト（０ｐｐｍ）の基準としてＤＳＳ−ｄ６をサンプルにスパイクした。スペクトルは２０℃で獲得した。スペクトル幅は興味あるプロトンピークを全てカバーするために少なくとも６ｐｐｍであった。
【００６３】
ＧｌｃＮＨ２及びＧｌｃＮＡｃの％を上記残基に対するアノマープロトンのピーク積分から測定した。Ｏ−置換率は遊離したスクシネート及びアロマープロトンのピーク積分の比に基づいていた。
【００６４】
ポリサッカライドの結合は、長距離異核相関スペクトルＨＭＢＣ（援用により本明細書に含まれるとするＡｂｅｙｇｕｎａｗａｒｄａｎａら，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３：１９９−２４９（１９９３））を用いて測定した。グリコシド結合を横切る交差ピークは１→６結合を示した。
【００６５】
糖残基のアノマー配置を３ＪＨ１Ｈ２結合定数を測定することにより調べた。大きな結合定数（８〜９Ｈｚ）はβアノマー配置を示した。従って、ポリサッカライド化学構造はβ（１→６）ＧｌｃＮＸ（ここで、ＸはＨ２またはＡｃ（アセテート）であり得る）と決定された。
【００６６】
側鎖充填をプロトン１Ｄ  ＮＭＲスペクトルで測定した。６．８６ｐｐｍでのマレイミドのプロトンピークを積分した。アノマープロトンのピーク積分により表されるポリサッカライド反復単位に対するその比は側鎖充填を決定した。
【実施例７】
【００６７】
組成分析
化学組成分析を、アルカリ溶離プロトコルを用いる高速アニオン交換クロマトグラフィーとパルス電流検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により実施した。ＳＡＥサンプルを６Ｎ  ＨＣｌ中９５℃において７２時間加水分解した後、加水分解物を蒸発乾固し、ＤＩ水（２００μｌ）中で再構成した。モノサッカライド組成分析はＥＤ４０電気化学デテクタ（カリフォルニア州サニーベールに所在のＤｉｏｎｅｘ）を備えたＢｉｏＬＣ  ＧＰ５０システムを用いて実施した。クロマトグラフィーは室温においてＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡＩカラム（内径４ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いて１ｍｌ／分の流速で以下の溶離スキームで実施した：（ａ）１８ｍＭ  ＮａＯＨで１９分間イソクラティック、（ｂ）１００ｍＭ  ＮａＯＨで１１分間洗浄、（ｃ）１８ｍＭ  ＮａＯＨでイソクラティック条件を１５分間回復。
【００６８】
グリセロホスフェート及びスクシネート分析は、室温においてＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１１カラム（内径４ｍｍ×２５０ｍｍ）を用いて１ｍｌ／分の流速で以下の溶離スキームで実施した：（ａ）４ｍＭ  ＮａＯＨで５分間イソクラティック、（ｂ）１０分間で４ｍＭから１０ｍＭ  ＮａＯＨに勾配、（ｃ）０．１分間で１０ｍＭから２０ｍＭ  ＮａＯＨに段階的勾配、（ｄ）５０ｍＭ  ＮａＯＨで１４分間洗浄、（ｅ）４ｍＭ  ＮａＯＨでイソクラティック条件を１０分間回復。
【実施例８】
【００６９】
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）
ポリサッカライド調製物の相対分子量を、ガードカラムの後に直列に連結した２つのＷａｔｅｒｓ  ＵＬＴＲＡＨＹＤＲＯＧＥＬ直線カラム（内径７．８ｍｍ×３００ｍｍ）及び２５０Ｐｓｉフロー制限器を用いてＡｌｌｉａｎｃｅ  ２９０ＨＰＬＣシステム（マサチューセッツ州ミルフォードに所在のＷａｔｅｒｓ）で実施した。クロマトグラフィーを０．０５％  アジ化ナトリウムを含有する０．１Ｍ  リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２緩衝液を用いて０．５ｍｌ／分の流速で実施した。Ｗａｔｅｒｓ  ４１０示差屈折計を用いて屈折率により検出した。ポルーラン分子量マーカー（マサチューセッツ州アマーストに所在のＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をシステム多重角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）を校正するために用い、データを４７，３００Ｄａポルーラン標準物質で較正した双角度Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ  ＰＤ２０００ＤＬＳシステムを用いて作成した。
【実施例９】
【００７０】
赤血球凝集アッセイ
全細菌をアッセイするために、スタフィロコッカス・エピデルミジス株ＲＰ６２ａ細胞をＴＳＡプレートで一晩増殖させ、前記プレートからの懸濁液を３７℃、振とうフラスコを用いてＴＳブロスにおいて３〜５時間経代培養した。細胞を収集し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ中にＯＤ６５０ｎｍが１まで懸濁した。１％  ヒツジ赤血球（ＳＲＢ）懸濁液を凍結乾燥したＳＲＢ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）をＰＢＳ，１％ＢＳＡ中で再構成することにより作成した。細菌懸濁液（５０μｌ）を９６ウェル微量測定プレートに添加した後細菌をＰＢＳで２倍希釈した。その後、各ウェルに１％  ＳＲＢ（５０μｌ）を添加し、プレートを混合せずに室温において２時間インキュベートした後、肉眼で調べた。
【００７１】
ＳＡＥ調製物を用いるアッセイのために、１０μｇ／ｍｌの濃度のポリサッカライド（５０μｌ）を９６ウェル微量測定プレートに添加し、続いてＰＢＳで２倍希釈した。１％  ＳＲＢ（５０μｌ）を各ウエルに添加し、プレートを混合せずに室温において２時間インキュベートした後、肉眼で調べた。生じた細菌またはポリサッカライドの希釈物が赤血球を拡散するがウェルの底部にペレット化した赤血球が存在していない場合にはポジティブ結果とした。
【実施例１０】
【００７２】
ＳＡＥ−ＯＭＰＣコンジュゲートの作成
入手可能なリシン残基を一般的な方法に若干変更を加えて用いてチオール化することによりＯＭＰＣ担体タンパク質を活性化した。簡単に説明すると、ＯＭＰＣ（７０ｍｇ）を２８９，０００×ｇで９０分間遠心することによりペレット化し、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーを用いて０．１Ｍホウ酸ナトリウム，ｐＨ１１．３緩衝液中に１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。チオール化のために、ＥＤＴＡ（４０ｍｇ）及びＤＴＴ（８ｍｇ）をｐＨ１１緩衝液（１．４ｍｌ）に溶解し、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン（６３ｍｇ）をＨ２Ｏ（０．７ｍｌ）に溶解した。前記溶液をＯＭＰＣに添加し、反応混合物をＮ２下室温において２時間インキュベートした。チオール化ＯＭＰＣを上記したようにペレット化し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．３（ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ）で洗浄し、再ペレット化した。ペレットを１０ｍｇ／ｍｌでＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ中に再懸濁し、チオール化ＯＭＰＣを４℃において１，０００×ｇで５分間遠心して、凝集物質をペレット化した。
【００７３】
コンジュゲーションのために、ヘテロ二官性試薬のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートｓＳＭＣＣ（イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅ）を用いてマレイミド基を導入することにより仕上げ精製したまたは仕上げ精製／サイジングしたＳＡＥを活性化した。固体ｓＳＭＣＣを水に溶解したポリサッカライドにＳＡＥ遊離グルコサミンよりも５倍モル過剰で添加した（ＮＭＲで測定）。ＨＥＰＰＳを３５ｍＭの最終濃度まで添加することにより反応物のｐＨを７．８に調節した。反応物を暗所室温において３時間インキュベートした。反応混合物を濃縮し、１０Ｋ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎフラットシート膜を用いてＨＢＳに対してダイアフィルトレートした。マレイミド取り込み量をチオール消費を定量することにより調べた。活性化ポリサッカライドをスナップ凍結し、コンジュゲーションまで−７０℃で保存した。
【００７４】
コンジュゲーションのために、ポリサッカライドを融解し、チオール化ＯＭＰＣと０．５〜１のマレイミド／スルフヒドニルのモル比で混合した。ＨＢＳを添加してｐＨを７に調節し、反応物を暗所室温において１５〜２０時間インキュベートした。残留チオールをクエンチするために、ヨードアセタミドを全スルフヒドリルに対して１０倍モル過剰で添加し、反応物を暗所室温において１５〜２０時間インキュベートした。残留マレイミドをクエンチするために、Ｎ−アセチルシステアミンをヨードアセトアミドに対して５倍モル過剰で添加し、上記したようにインキュベートした。過剰の試薬及び残留遊離ポリサッカライドを除去するために、コンジュゲートを２８９，０００×ｇで６０分間遠心することによりペレット化し、ＴＥＤ緩衝液（０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ．ｐＨ８．５緩衝液中０．５％ｗ／ｖ  デオキシコレート）にｄｏｕｎｃｅ型ホネジナイザーを用いて再懸濁し、室温において１５〜２０時間インキュベートした。コンジュゲートをペレット化し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３緩衝液中に２回再懸濁した。最終再ペレット化後、ペレットをＨＢＳ中に再懸濁し、１，０００×ｇで１０分間遠心して、凝集物質を除去した。タンパク質を改変Ｌｏｗｒｙアッセイにより測定し、ポリサッカライド含量をＤｉｏｎｅｘ分析により測定した。
【００７５】
コンジュゲートを、室温において２×ストック及び２×明ばんを４５分間混合することにより０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で明ばんアジュバント上に吸着させた。明ばん吸着させたバルクを、８０、８、０．８及び０．０８μｇ／ｍｌポリサッカライドでワクチンストックを調製することにより動物研究のために処方した。バルク明ばん生成物を１×明ばん希釈剤で所望最終濃度となるまで希釈した。
【実施例１１】
【００７６】
４〜５週令のＢａｌｂ／ｃマウスを１週間安静させた後両方の大腿筋の裏側に１×Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバント中で処方した天然ＳＡＥ−ＯＭＰＣ及びサイジングしたＳＡＥ−ＯＭＰＣを０．０５μｌ注射して免疫化した。動物を２５匹マウス／群として８群に分け、各群に１×Ｍｅｒｃｋアルミニウム明ばんに吸着させたＳＡＥ−ＯＭＰＣコンジュゲート抗原の天然またはサイジングバージョンを８、０．８、０．０８または０．００８μｇ／マウスの量投与した。別の群の２５匹マウスは１×Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバントのみで免疫化した。動物は０日目及び１４日目に抗原を用いて免疫化した。−２日目、２１日目及び２８日目に動物から採血した。９．８８×１０８ＣＦＵのスタフィロコッカス・エピデルミジス株ＲＰ６２Ａを腹腔内注射することにより動物を免疫攻撃した。免疫攻撃から生き延びた動物の数を７日間追跡し、図６Ａ及び６Ｂに示す。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の精製ＳＡＥ調製物の組成分析を示す。図中、ａ：１Ｄ１ＨＮＭＲにより測定。ｂ：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより測定後ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１１カラムでの伝導率検出。サンプルを６Ｎ  ＨＣｌ中９５℃において７２時間加水分解した。酸遊離したグリセロホスフェート及びスクシネートを、グリセロホスフェートピークの面積を４ｎｍｏｌの加水分解グリセロホスフェート及び０．５ｎｍｏｌの加水分解スクシネート標準物質の面積と比較することにより定量した。直線検出範囲は１回の注射あたりグリセロホスフェートでは０．０１６〜１６ｎｍｏｌ、スクシネートでは０．０１６〜１ｎｍｏｌであった。ｃ：２６０ｎｍの吸光度により測定。ｄ：検出せず。ｅ：アッセイせず。
【図２】精製ＳＡＥ調製物のＨＰＳＥＣ分析を示す。ａ：クロマトグラフィーは実施例に記載したように実施した。カラム較正のために、４７，３００〜７８８，０００のＭｒ範囲をカバーするポルーラン標準物質（４〜７ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ注射し、平均保持時間（ＲＴ）を計算した。ｌｏｇ１０Ｍｒ対ｌｏｇ１０ＲＴの直線プロットを作成し、適合度線を最小自乗回帰により計算した。ＳＡＥサンプルの場合、サンプル（１〜３ｍｇ／ｍｌ）を７５μｌ注射し、ｌｏｇ１０ＲＴを標準曲線式にインプットすることにより推定Ｍｒを求めた。ｂ：ａと同様に標準物質及びサンプルを注射した。推定Ｍｒは屈折率ピークの中心から狭いデーターセットを選択し、０．１３３のｄｎ／ｄｃ値を仮定することにより求めた。ｃ：括弧内の数字は微量成分ピークを表す。
【図３】ＳＡＥポリサッカライド形態による赤血球凝集の結果を示す。ａ：分子量はポルーラン標準に相対させて測定。図２参照。ｂ：赤血球凝集は周囲温度で２時間後ヒツジ赤血球の１％懸濁液を凝集させるのに必要なポリサッカライドの最低希釈度として定義。
【図４】活性化ＯＭＰＣ及びＳＡＥ調製物の特性付けを示す。ａ：５，５’−ジチオニトロ安息香酸との反応により測定したチオール含量。タンパク質濃度は改変Ｌｏｗｒｙアッセイにより測定。リシン含量はタンパク質１ｍｇあたり０．４μｍｏｌ  ｌｙｓであった。ｂ：実施例に記載されている当量アッセイにより測定したマレイミド含量。グルコサミンはＨＡＰＥＣ−ＰＡＤにより測定。ｃ：記載のパルス場の勾配拡散濾過を用いる１Ｄ  １Ｈ  ＮＭＲにより測定。ｄ：ＨＡＰＥＣ−ＰＡＤにより測定したグルコサミン。コンジュゲートの値は、活性化ＳＡＥ及び非活性化ＯＭＰＣ（データー示さず）を用いる物理的混合コントロールにより測定した残留遊離ポリサッカライドに対して補正した。ｅ：アッセイせず。
【図５】マウスにおける異なる時間後の天然ＳＡＥのＥＬＩＳＡ力価を示す。
【図６Ａ】ワクチン接種後感染で免疫攻撃したマウスの生存率を示す。図６Ａは天然ＳＡＥ−ＯＭＰＣであり、図６ＢはサイジングＳＡＥ−ＯＭＰＣである。
【図６Ｂ】ワクチン接種後感染で免疫攻撃したマウスの生存率を示す。図６Ａは天然ＳＡＥ−ＯＭＰＣであり、図６ＢはサイジングＳＡＥ−ＯＭＰＣである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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