(57)【要約】本発明は、免疫抑制剤による治療を受けている患者の治療のための、保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの使用に向けられている。本発明は、更に、免疫抑制剤の及び保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの有効投与量を含む薬剤組成物に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制剤による治療を受けている患者の治療のための医薬の製造のための、保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの使用。
【請求項２】
免疫抑制剤の効果から上皮細胞及び／又は内皮細胞を保護するための医薬の製造のための、保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの使用。
【請求項３】
免疫抑制剤の投与によって誘導されるアポトーシス及び／又は活性化から上皮細胞及び／又は内皮細胞を保護するための医薬の製造のための、保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの使用。
【請求項４】
該免疫抑制剤がヌクレオシドである、請求項１ないし３の使用。
【請求項５】
該免疫抑制剤が、フルダラビン、シクロフォスファミド、ＢＣＮＵ、メルファランよりなる群より選ばれるものである、請求項１ないし３の使用。
【請求項６】
該免疫抑制剤がフルダラビンである、請求項１ないし３の使用。
【請求項７】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドがデフィブロチドである、請求項１ないし３の使用。
【請求項８】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップが、患者への該免疫抑制剤の投与に伴って、同時に、後に又は前に行われるものである、請求項１ないし７の使用。
【請求項９】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップが、患者への該免疫抑制剤の投与のステップの後に行われるものである、請求項８の使用。
【請求項１０】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップと患者への該免疫抑制剤の投与のステップとの間の時間的遅れが、約１時間ないし約２週間、好ましくは約２日ないし約７日である、請求項９の使用。
【請求項１１】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップが、患者への該免疫抑制剤の投与のステップの前に行われるものである、請求項８の使用。
【請求項１２】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップと患者への該免疫抑制剤の投与のステップとの間の時間差が、約１時間ないし約２週間、好ましくは約２時間ないし約２日である、請求項１１の使用。
【請求項１３】
投与されるデフィブロチドの投与量が、約１００μｇ／ｍＬないし約０．１μｇ／ｍＬの血中レベル、好ましくは約１０μｇ／ｍＬないし約１００μｇ／ｍＬに達するように選択されるものである、請求項１ないし１２の使用。
【請求項１４】
投与されるデフィブロチドの投与量が、約１０μｇ／ｍＬの血中レベルに達するように選択されるものである、請求項１３の使用。
【請求項１５】
投与されるデフィブロチドの投与量が、約１００ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし０．１ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１ないし１４の使用。
【請求項１６】
投与されるデフィブロチドの投与量が、約１５ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１２ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１５の使用。
【請求項１７】
該活性化がＩＣＡＭ−１の発現増強を含むものである、先行の請求項の何れかの使用。
【請求項１８】
免疫抑制剤による治療が、幹細胞移植中に行われるものである、先行の請求項の何れかの使用。
【請求項１９】
該幹細胞移植が同種幹細胞移植である、請求項１８の使用。
【請求項２０】
免疫抑制剤の及び保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの治療的有効量を含有する薬剤組成物。
【請求項２１】
一方は該免疫抑制剤を含有し、他方は該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するものである、２つの異なった別個に投与される処方より構成される、請求項２０の薬剤組成物。
【請求項２２】
同時に、別個に又は逐次に使用するための、組み合わせた調製物としての、請求項２０の薬剤組成物。
【請求項２３】
該免疫抑制剤がヌクレオシドである、請求項２０ないし２２の薬剤組成物。
【請求項２４】
該免疫抑制剤が、フルダラビン、シクロフォスファミド、ＢＣＮＵ、メルファランよりなる群より選ばれるものである、請求項２０ないし２２の薬剤組成物。
【請求項２５】
該免疫抑制剤がフルダラビンである、請求項２０ないし２２の薬剤組成物。
【請求項２６】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドがデフィブロチドである、請求項２０ないし２２の薬剤組成物。
【請求項２７】
慣用の賦形剤及び／又は補助薬を更に含有することを特徴とする、先行の請求項の何れかの薬剤組成物。
【請求項２８】
静脈内注射できるものであることを特徴とする、先行の請求項の何れかの薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線療法及び／又は化学療法の使用の分野に関する。より具体的には、本発明は、そのような治療に関連した副作用を緩和するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
同種幹細胞移植（ＳＣＴ）は、血液学的新生組織形成及び愈々様々な他の悪性疾患の治療のための、十分確立された方法である。ＳＣＴは、主として、２つの連続的なステップよりなっている、すなわち：第１のステップとしての、最小限の残存疾患と移植者の免疫抑制とをもたらすものである、古典的には全身放射線照射（ＴＢＩ）及び化学療法とからなる移植前コンディショニング、及び第２のステップとしての、最終的に治癒を提供する筈の同種幹細胞の移植である。しかしながら、主要（ＭＨＣ）及び副（ｍＨＡｇ）組織適合性抗原における不一致のため、急性移植片対宿主反応（ＧｖＨＤ）を含む重い炎症反応が、移植後に種々の相で起こり得る。本発明者1 による、及び他の数名の研究者等2,3 による研究に基づいて、コンディショニングは、非特異的炎症を介してこれらの移植関連合併症（ＴＲＣ）に寄与しているということが、広く受け入れられている。加えて、特にＴＢＩの直接的な毒性が、実証されている。4,5  このことは、現在研究されている様々な代替的コンディショニング療法をもたらしている。加えて、新しい移植前療法は、治療プロトコールの延長と患者による選択とを可能にしている。これらの新しいコンディショニングコンセプトのうちの一化合物は、もともと慢性のリンパ性白血病の治療に用いられてきた非骨髄変性性の免疫抑制剤であるフルダラビン（fludarabine）である。6  フルダラビンは、例えばＢＣＮＵ及びメルファラン、シクロフォルファミドその他の薬剤と組み合わせて、ＴＢＩに置き換わることができ、又は線量を減じたＴＢＩ療法とともに使用される。7,8  これまで得られた臨床データは、フルダラビンが比較し得る程に低副作用であること並びに造血及び免疫細胞特異性であることを、支持している。9  しかしながら、内皮及び上皮細胞のような非造血細胞に対するこの化合物の影響は、これまで研究対象とされていない。
【０００３】
実質上全てのＴＲＣは、内皮の機能不全及び損傷と関連している。10  本発明者その他は、内皮が移植前コンディショニングの一目標であることを、インビトロ及びインビボで示している。電離放射線は、内皮細胞にプログラムされた細胞死（アポトーシス）を誘発する。11-14  同時に内皮は、接着性分子の発現に関して活性化され、免疫過程に必須の条件である白血球−内皮相互作用の増大をもたらす。15,16  これらの効果は、消化管から損傷された粘膜障壁を通って転位し得る細菌のエンドトキシン（リポ多糖、ＬＰＳ）によって、有意に増強される。17  加えて、ＬＰＳは、同種のＣＤ８+ 細胞障害性Ｔリンパ球に対する内皮細胞の抗原性を増大させることが示されている。18
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フルダラビンを含んだ低減強度コンディショニング（ＲＩＣ）療法によりこれまでに得られた臨床結果は、免疫再構築に影響を及ぼすことなしに、コンディショニング関連毒性の明瞭な下方制御を示している。25  ＲＩＣを受けている患者における急性ＧｖＨＤの発生率は、古典的なコンディショニング療法を受けている患者のそれと同等又はそれ以下でさえある。26  しかしながら、骨壊死27 、肺合併症28 のような同等に重症のまたはより増強されてさえいる遅発効果や、慢性のＧｖＨＤ29 の症例がより多いことについての報告は、フルダラビンによる治療に関連した重大な副作用の潜在性を、明瞭に実証している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
本発明は、フルダラビンが内皮細胞及び上皮細胞を活性化させ損傷する、という発見に基づいている。それらの細胞の活性化は、フルダラビンが使用される治療状況において、例えば、ＳＣＴを用いた悪性腫瘍の治療に際して、損傷をもたらす。上皮細胞及び内皮細胞は、デフィブロチド（defibrotide）を用いた治療によって、この活性化及び損傷から保護できる。この治療は、同時に行え、又はデフィブロチドは、フルダラビンによる治療の前若しくは後に投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
略号及び定義
ＳＣＴ：  造血幹細胞移植
免疫抑制剤：  投与したとき被験者の免疫応答を下方制御する物質。免疫抑制剤は、幹細胞療法を受けている患者の免疫系の抑制に使用される。免疫抑制剤の例としては、フルダラビン、シクロフォスファミド、ＢＣＮＵ、シクロスポリン、シロリムス（sirolimus）、タクロリムス（tacrolimus）及びメルファランが挙げられる。本出願の文脈において好ましいのは、フルダラビン（２−フルオロ−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンとしても知られている）である。
保護的オリゴデオキシリボヌクレオチド：  本出願の文脈においては、米国特許5,646,268号に定義されたオリゴデオキシリボヌクレオチド及び米国特許5,223,609号に定義されたポリデオキシリボヌクレオチドを共に意味し、それらの全体が引用によりここに導入される。
米国特許5,646,268号は、次の物理・化学的及び化学的特徴を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを製造するための方法を開示している。
分子量：            ４０００〜１００００
ｈ：                ＜１０
Ａ＋Ｔ／Ｃ＋Ｇ*     １．１００〜１．４５５
Ａ＋Ｇ／Ｃ＋Ｔ*     ０．８００〜１．１６０
比旋光度：          ＋３０°〜＋４８°
―――――――――――――――――――――
*塩基モル比
ｈ＝濃色性パラメータ
【０００７】
そのようなオリゴデオキシリボヌクレオチドを製造するための方法は、次を含んでなる：  ポリデオキシリボヌクレオチドナトリウム塩の０．８Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を、２０℃にて、エチル、プロピル及びイソプロピルアルコールよりなる群より選ばれるアルキルアルコールの添加によって沈殿させること。
【０００８】
米国特許5,223,609号は、一定の薬理学的及び治療的性質を満たすデフィブロチドを開示しており、従って、それを構成しているヌクレオチド画分が次の任意の配列のポリデオキシリボヌクレオチド処方と化学量論的に一致するならば、特に適したものである：
Ｐ1〜5、（ｄＡＰ）12〜24、（ｄＧｐ）10〜20、（ｄＴｐ）13〜26、（ｄＣｐ）10〜20 
ここに、
Ｐ＝リン酸基
ｄＡｐ＝デオキシアデニル酸モノマー
ｄＧｐ＝デオキシグアニル酸モノマー
ｄＴｐ＝デオキシチミジル酸モノマー
ｄＣｐ＝デオキシシチジル酸モノマー
【０００９】
この式に対応するデフィブロチドは、更に、次の化学・物理的性質を示す：電気泳動＝均質なアノード移動性；吸収係数，Ｅ1cm1%  於２６０±１ｎｍ＝２２０±１０；吸収比，Ｅ230／Ｅ260＝０．４５±０．０４；モル吸収係数（リンについていう）、ε（Ｐ）＝７．７５０±５００；旋光性[α]D20°＝５３°±６；可逆性濃色性，天然ＤＮＡにおける％として表示，ｈ＝１５±５
【００１０】
好ましい保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、当業者に周知のポリヌクレオチドであるデフィブロチド（ＣＡＳ登録番号：83712-60-1）であり、それは通常、動物及び／又は植物組織から抽出（米国特許3,770,720号及び米国特許3,899,481号）によって得られるポリデオキシリボヌクレオチドに一致する；このポリデオキシリボヌクレオチドは、アルカリ金属、通常はナトリウムの塩の形で使用され、通常、約４５〜５０ｋＤａの分子量を有する。デフィブロチドは、例えば急性腎不全（米国特許4,697,134号）の治療及び急性心筋虚血（米国特許4,693,995号）の治療等のような種々の用途に用いることができるが、主としてその抗血栓活性（米国特許3,829,567号）のために使用されている。米国特許4,985,552号及び米国特許4,223,609号は、デフィブロチドの製造のための方法を記述しており、一定し十分規定された物理・化学的特徴を有し、そしてまた如何なる望ましからざる副作用をも有しない産物の取得を可能にしている。
【００１１】
本発明は、免疫抑制剤による治療を受けている患者の治療のための方法に関し、該患者に保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの有効投与量を投与するステップを含んでなる。免疫抑制剤による治療は、好ましくはＳＣＴ中に行われる。免疫抑制剤は、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、フルダラビン、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセルのような））、アルキル化剤（例えば、シクロフォスファミド、メルファラン、ビスクロロエチルニトロソウレア（ＢＣＮＵ））、プラチナ剤（例えば、シスプラチン（ｃＤＤＰとも名づけられている）、カルボプラチン、オキザリプラチン、ＪＭ−２１６、ＣＩ−９７３）、アントラサイクリン類（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン）、マイトマイシンＣを含む抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、カンプトテシン）、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスその他の、免疫系を抑制するように作用する細胞障害性剤よりなる群より、好ましくは選択される。悪性腫瘍の治療に頻繁に用いられるそのような薬剤の総説は、Gonzales et al., Alergol. Immunol. Clin. 15, 161-181, 2000に見出すことができ、これは参照によりここに導入される。好ましい免疫抑制剤は、例えばフルダラビン等のような、ヌクレオシド（すなわち、ヌクレオチドからリン酸基を除去して得られるグリコシド）であり、因みにフルダラビンは本発明の諸目的にとって好ましい免疫抑制剤である。
【００１２】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、免疫抑制剤と併せて、同時に又は一緒に投与することができる。好ましい組み合わせは、デフィブロチドとフルダラビンの同時的チューブ投与である。
【００１３】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップは、好ましくは、患者への免疫抑制剤のチューブ投与と併せて、伴って、同時に、後で又は前に、行われる。
【００１４】
本発明の好ましい一具体例においては、該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップは、患者への免疫抑制剤のチューブ投与の後に行われる。更に好ましい一具体例においては、患者への免疫抑制剤のチューブ投与と該保護剤の投与のステップとの間の時間的遅れは、約１時間〜約２週間である。患者への免疫抑制剤のチューブ投与と該保護剤の投与ステップとの間の時間的遅れは、好ましくは約２日ないし約７日である。
【００１５】
本発明の別の好ましい一具体例においては、該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与のステップは、患者への免疫抑制剤のチューブ投与の前に行われる。好ましくは、患者への該保護剤の投与のステップと免疫抑制剤のチューブ投与との間の時間差は、約１時間ないし約２週間である。より好ましくは、患者への該保護剤の投与のステップと免疫抑制剤のチューブ投与との間の時間差は、約２時間ないし約２日である。
【００１６】
該好ましい保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、デフィブロチドであるが、しかしながら、保護的オリゴヌクレオチドとして上述した他の物質を使用することもできる。次の具体例は、デフィブロチドのための好ましい投与量を規定している；しかしながら、デフィブロチド以外の保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いる場合にも、近似の投与量を使用することができる。如何なる保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの至適投与量も、担当医によって決定されるであろう。下記の実験は、デフィブロチドの保護効果を示している。そのような実験において決定された有効投与量は、治療のための有効投与量を決定するためのガイドとして使用することができる。デフィブロチドは、好ましくは、経口で又は静脈内注射で投与される。
【００１７】
デフィブロチドの好ましい投与量は、血中レベル約１００μｇ／ｍＬないし０．１μｇ／ｍＬに達するように選択される。より好ましくは、デフィブロチドの投与量は、血中レベル約１０μｇ／ｍＬないし約１００μｇ／ｍＬに達するように選択される。最も好ましくは、デフィブロチドの投与量は、血中レベル約１００μｇ／ｍＬに達するように選択される。本発明の好ましい一具体例においては、デフィブロチドの投与量は、約１００ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、デフィブロチドの投与量は、約２０ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし約０．１ｍｇ／ｋｇ体重である。より好ましくは、デフィブロチドの投与量は、約１５ｍｇ／ｋｇ患者体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。より好ましくは、１日の投与量として約１２ｍｇないし約１４ｍｇ／ｋｇ患者体重が投与される。最も好ましくは、デフィブロチドの投与量は、約１２ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【００１８】
好ましくは、本発明による保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与は、免疫抑制剤の効果から内皮細胞及び上皮細胞を保護することができる。免疫抑制剤は、好ましくは上皮細胞及び内皮細胞を活性化させ、それらにアポトーシスを誘導する。従って、好ましい一具体例においては、該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは上皮細胞及び／又は内皮細胞を、免疫抑制剤によるアポトーシス及び／又は活性化から保護する。免疫抑制剤は好ましくはフルダラビンである。該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、好ましくはデフィブロチドである。
【００１９】
活性化は、ＩＣＡＭ−１及びＭＨＣクラスＩ分子の増強された発現を含む。発現の増強は、好ましくは実質的である。更に好ましくは、免疫抑制剤は、患者の内皮細胞及び／又は上皮細胞の親炎症性活性化を誘導する。それらの細胞は、好ましくはヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）及び／又は皮膚及び／又は肺胞の上皮細胞である。損傷は、好ましくは、患者の内皮細胞及び／又は上皮細胞が、免疫抑制剤に約１時間ないし約１週間又はそれを越えて曝されるときに起こる。より好ましくは、該損傷は、該細胞が約５時間ないし約７２時間曝されるときに起こる。尚もより好ましくは、そのような曝露の長さは、２０時間ないし７２時間である。最も好ましくは、そのような曝露の長さは、４８時間を越える。
【００２０】
免疫抑制剤による処置は、好ましくは造血幹細胞の移植中に行われる。造血幹細胞の移植は、好ましくは同種造血幹細胞移植である。
【００２１】
本発明はまた、免疫抑制剤で処置されており、治療を必要とする患者を治療するための、少なくとも１の保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドを含んでなる薬剤組成物にも関する。該薬剤組成物の投与は、免疫抑制剤によって又は免疫抑制剤及び移植物によって引き起こされる副作用を緩和し又は副作用から保護する。移植物は、好ましくは骨髄又は造血幹細胞移植物である。より好ましくは、移植物は、同種の骨髄又は造血幹細胞移植物である。
【００２２】
副作用は、好ましくは患者の内皮及び／又は上皮の細胞及び／又は組織に関するものである。好ましくは、該副作用は該細胞のアポトーシス、及び／又は該細胞の活性化を伴う。活性化は、好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子及び／又は細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の発現の増強を含んでなる。該副作用は、薬理学的に関連ある濃度（範囲：１０μｇ／ｍＬないし１μｇ／ｍＬ）で使用したとき、ヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）、並びに好ましくは、皮膚及び肺胞の上皮細胞株を、４８時間の培養で損傷する。
【００２３】
副作用は、一般に、標的組織の損傷、移植関連合併症、及び刺激された同種免疫応答を含む。
【００２４】
副作用は、好ましくは、患者の内皮細胞及び／又は上皮細胞、特に、肺胞内皮細胞における、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）及びＭＨＣクラスＩ分子の有意な上方制御を含む。副作用は更に、微小血管細胞の親炎症性活性化を含む。副作用は更に好ましくは、移植物から誘導された同種ＭＨＣクラスＩ限定細胞障害性Ｔ細胞によるそのような細胞の溶解亢進をも含む。
【００２５】
該保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの投与は、好ましくは、アポトーシス及び同種活性化を含む、免疫抑制剤誘発性の副作用から保護する。
【００２６】
本発明の免疫抑制剤を含んでなる薬剤組成物は、経口及び注射の双方、特に静脈内注射で投与するための、慣用且つ周知のタイプの技術、賦形剤及び媒体により処方することができる。本発明による組成物中の活性成分の投与量は、単位投与量として５０ないし１５００ｍｇの範囲にわたるが、所望の結果を達成するためには、１０ないし４０ｍｇ／ｋｇの１日投与量が提案される。デフィブロチドの調製のための方法は、米国特許4,985,552号及び米国特許5,223,609号に見出すことができ、これらの特許はその全体が参照によりここに導入される。
【００２７】
本発明はまた、免疫抑制剤と保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドの治療的有効投与量を含んだ薬剤組成物にも関する。該免疫抑制剤は、好ましくはフルダラビンであり、保護的オリゴデオキシリボヌクレオチドは、好ましくはデフィブロチドである。
【実施例】
【００２８】
〔方法〕
〔細胞培養及び試薬〕
ヒトの皮膚微小血管内皮細胞株ＣＤＣ／ＥＵ−ＨＭＥＣ−１（以下、ＨＭＥＣという）は、疫病管理予防センター（the Centers for Disease Control and Prevention）（Atlanta, Georgia, USA）より供与され、先に記載したようにして19 樹立した。ＨＭＥＣは、１５％の胎仔牛血清（ＦＣＳ）、１μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン（Sigma, Deisenhofen, Germany）、１０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（Collaborative Biochemical Products, Bedford, MA, USA）及び抗生物質を添加したＭＣＤＢ１３１培地中で培養した。別に記載しない限り、細胞培養試薬は全て、Gibco BRL (Karlsruhe, Germany) より調達した。２−フルオロアデニン９−β−Ｄ−アラビノフラノシド（Ｆ−Ａｒａ）は、Sigma, Deisenhofen, Germanyから入手し、デフィブロチドのバイアルは、ProciclideTM, Crinos, Como, Italyより入手した。
【００２９】
アポトーシスアッセイ
ヒト内皮細胞におけるアポトーシスを検出するための確立された方法を、先に記載したようにして20 、フロー・サイトメトリー（FACScanTM及びCellQuestTMソフトウェア、Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）を用いて実施した。内皮細胞及び上皮細胞は、無処理のままにおくか、又はデフィブロチドの存在下若しくは不存在下に、漸減する各濃度のＦ−Ａｒａ（範囲：１０μｇ／ｍＬないし０．１μｇ／ｍＬ）と共に４８時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中で洗浄し、壊死検出染料であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ、０．２μｇ／ｍＬ、Sigma, Deisenhofen, Germany）で染色した。アポトーシスを起こしている細胞は、ＰＩに陰性の染色によって、及び非アポトーシス細胞から明確に識別できる特徴的な側方散乱画像によって、同定した。細胞タイプ当たり少なくとも３つの実験を実施した。
【００３０】
アポトーシスを検出するための代わりの一方法は、ＤＮＡ蛍光標識した細胞の顕微分析を用いた。１×１０5個／プレートの内皮細胞を、３５ｍｍのペトリ皿（Nunc, Wiesbaden, Germany）に播いた。これらの細胞は、上に示したようにして処理し、続いてメタノール／アセトン（１：１）で２分間固定し、ＰＢＳで１回洗い、２０％のグリセロール／ＰＢＳに溶解させた４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（０．５μｇ／ｍＬ、Sigma, Deisenhofen, Germany）で染色した。サンプルを載せ、顕微分析に付した。トリパンブルー取り込みの不存在下でのＤＡＰＩ染色によって判明するものである核濃縮は、壊死とは対照的にアポトーシスに特徴的であると考えられる。21  定量的分析は、視野当たり平均７０個の細胞を含む少なくとも１０箇所の顕微鏡視野からのすべての同定できる細胞に比して、アポトーシスを起こしている細胞数をカウントすることを含んだ。写しの明瞭さの関係上、ＤＡＰＩ染色の結果は、内皮細胞及びＨａＣａＴ並びにＡ５４９細胞での実験についてのみ示してある。
【００３１】
〔細胞表面分析〕
ＩＣＡＭ−１（Becton Dickinson/Pharmingen, Heidelberg, Germany）及びＭＨＣクラスＩ（w6/32, ハイブリドーマ上清、ATCC, Manassas, VA, USA）分子のＨＭＥＣ上における細胞表面発現は、間接免疫蛍光法並びにそれに続く、FACScanTMフロー・サイトメーター及びCellQuestTM分析プログラム（Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）を用いたフロー・サイトメトリーによって評価した。内皮細胞は、示したように処理し、インキュベーションの後トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco）で収穫し、冷ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで１回洗浄し、そして氷上にて５μｇ／ｍＬの抗接着分子ＭｏＡｂｓと共に１時間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合抗体Ｆ（ａｂ）2断片（Dako, Hamburg, Germany）と共に氷上で４５分間インキュベートした。次いで細胞を、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで洗浄し、分析に付した。細胞の生存は、同時のヨウ化プロピジウム染色（０．２μｇ／ｍＬ、Sigma, Deisenhofen, Germany）によって判定した。第１の抗体の省略は、非特異的蛍光を検出するための陰性対照として働いた。ラジオアイソトープ対照抗体を用いるものでないこのアプローチは、内皮細胞がＦｃレセプターを欠いているという先の観察22 によって正当化された。従って、それらのＦｃ部分を通じた抗体の非特異的結合は、排除できた。
【００３２】
〔ＨＭＥＣによる末梢血球の同種刺激〕
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常ヒトボランティアのヘパリン（Novo Nordisk, Mainz, Germany）処理した血液から、又はBavarian Red Crossからのバフィーコート（buffy coat）から、Ficoll hypaque （Pharmacia, Freiburg, Germany)密度勾配遠心を用いる標準的プロトコールに従って得た。次いで細胞を、インターロイキン２（５０Ｕ／ｍＬ）及び１０％のヒトＡＢ血清（Sigma, Deisenhofen, Germany）の存在下に、放射線照射（２０Ｇｙ）したＨＭＥＣで１：１及び２：１の比率で、７日間刺激した。代わりとして、ＰＢＭＣは、細胞単離キットを用いメーカーの指示書に従って（MACSTM, Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany）、それぞれ非ＣＤ８+及び非ＮＫ細胞の除去に基づいて、ＣＤ８+Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞について選択した。選択した細胞の刺激は、３日間しか刺激しないＮＫ細胞を除き、全ＰＢＭＣ培養物のそれと同一とした。
【００３３】
〔細胞毒性アッセイ〕
Ｔ細胞及びＮＫ細胞を介した細胞毒性は、４時間 51Ｃｒラジオアイソトープアッセイを用いた、十分確立されたプロトコール23 に従って評価した。無処理のままおいた、又はＦ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ）で終夜インキュベートしたＨＭＥＣを、０．４ｍＣｉ Ｎａ51ＣｒＯ4で２時間標識すべき標的細胞として用いた。３回の洗浄ステップの後、標的細胞を１０4個／ｍＬに調製し、ＰＢＭＣ、ＣＤ８+ 又はＮＫエフェクター細胞と共に、漸減するエフェクター／標的細胞比で４時間、同時インキュベートした。上清を乾燥したシンチレーションプレートに移し、γカウンター（全てCanberra Packard, Darmstadt, Germanyより）中でカウントした。ＮＫ感受性細胞として、自家（エフェクター）Ｂリンパ芽球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）及びＫ５６２を、追加の対照標的とした。特異的溶解のパーセントは、次のようにして算出された：［（実験的遊離−自発的遊離）／（最大遊離−自発的遊離）］×１００。全ての実験おいて自発的遊離は、常に２０％を下回った。
【００３４】
〔酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）〕
同種エフェクターＴ細胞（下記参照）の上清中のインターロイキン４（ＩＬ−４、Ｔc２応答）、及びインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、Ｔc１応答）、ＩＬ−１及びＩＬ−１０の検出のためのＥＬＩＳＡは、メーカー（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）のキットの指示書に正確に従って実施した。
【００３５】
〔統計解析〕
実験値間の統計的な差の有意性は、Student's-tテストによって評価した。
【００３６】
〔実施例１〕
Ｆ−Ａｒａは、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）におけるアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する。
培養ヒト内皮細胞に対するＦ−Ａｒａの影響を評価するために、フルダラビンの代謝された形である２−フルオロアデニン９−β−Ｄ−アラビノフラノシドの、漸減する、薬理学的に関連のある濃度（１０μｇ／ｍＬないし０．１μｇ／ｍＬ）と共に、ＨＭＥＣをインキュベートした。標的細胞における活性な（細胞障害性の）フルダラビン三リン酸の細胞内レベルの中央値は、２０μＭであり、５．８μｇ／ｍＬ（medac SCHERING, メーカーの指示書）の濃度に相当している。４８時間のインキュベーションの後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞（フロー・サイトメトリーにおける側方散乱（ＳＳＣ）画像）の細胞粒度の検出及びＤＡＰＩ染色細胞の顕微分析をそれぞれ用いて、ＨＭＥＣをアポトーシスアッセイに付した。アッセイシステムからは独立して、図１Ａ及びＢは、Ｆ−Ａｒａが、１０及び５μｇ／ｍＬの濃度でＨＭＥＣにアポトーシスを引き起こすのに対し、１μｇ／ｍＬではもはや効果が無いことを、明瞭に示している。Ｆ−Ａｒａの細胞障害性の閾値は２ないし３μｇ／ｍＬであった。Ｆ−Ａｒａによるアポトーシスは、既に２４時間後には、低い程度にではあるが検出できた（データ示さず）。
【００３７】
〔実施例２〕
デフィブロチドは、Ｆ−Ａｒａに誘導されるアポトーシスからＨＭＥＣを保護する
ＨＭＥＣを、無処理のままおくか、又は、種々の濃度のデフィブロチド（１００μｇ／ｍＬないし０．１μｇ／ｍＬ）の存在下若しくは不存在下にＦ−Ａｒａで処理し、プログラムされた細胞死について４８時間後に、図１Ａに記載したようにＳＳＣ画像のフロー・サイトメトリー分析を用いて評価した。図２Ａ（中央の輪郭プロット）は、デフィブロチドのみが、第２の対照として、内皮細胞の生存に影響を及ぼさなかったことを示している。Ｆ−Ａｒａのアポトーシス誘導効果は、図２Ａにおいて再現されている（右側の輪郭プロット）のに対し、図２Ｂは、Ｆ−Ａｒａ誘導細胞死からの、デフィブロチドによる用量依存性の保護を示している。Ｆ−Ａｒａとデフィブロチドの非特異的で人工的な細胞外での相互作用を除去するために、インビトロでのＨＭＥＣは、デフィブロチドで１時間前処理し、続いて、３回の洗浄ステップの後、Ｆ−Ａｒａと共に４８時間インキュベートし、また逆も同様に行った。図２Ｃ（右側の輪郭プロット）は、ＨＭＥＣの１時間の前処理が、細胞をＦ−Ａｒａ誘導アポトーシスから保護するのに十分であることを明らかにしている。同様に、ＨＭＥＣのＦ−Ａｒａによる１時間の前処理（図２Ｃ、左側の輪郭プロット）及びこれに続くデフィブロチドとのインキュベーションは、内皮細胞のプログラムされた細胞死をもたらさなかった。
【００３８】
〔実施例３〕
種々の上皮細胞株に対するＦ−Ａｒａの効果、デフィブロチドの保護効果
皮膚、消化管（ＧＩＴ）及びおそらくは肺が、ＧｖＨＤの主たる標的に含まれる。従って、これらの器官由来の細胞株に対するＦ−Ａｒａの影響を試験することは理に適っていた。ケラチン生成細胞（ＨａＣａＴ）、ＧＩＴ（ＳＷ４８０）、肺胞（Ａ５４９）及び気管支上皮（ＢＥＡＳ−２Ｂ）細胞株並びに一次気管支上皮細胞を、図１及び２に示したようにしてＦ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、そして処理の４８時間後にフロー・サイトメトリーによるアポトーシス分析で評価した。図３Ａは、消化管及び気管支の上皮細胞が、Ｆ−Ａｒａのアポトーシス刺激に抵抗性であるように見えるのに対し、ケラチン生成細胞（ＨａＣａＴ）及び肺胞上皮細胞（Ａ５４９）は、ＳＳＣ画像のフロー・サイトメトリーによる判定によると、アポトーシスの徴候を示した（それぞれ、ＨａＣａＴについては３４．０［±１．０］％のアポトーシス細胞、Ａ５４９細胞については４２．９［±２６．７］％）。再び、デフィブロチド（１００μｇ／ｍＬ）の保護能力が評価された。ＨａＣａＴ（４．３［±３．０］％）及びＡ５４９（５．４［±２．９］％）細胞は、Ｆ−Ａｒａとデフィブロチドによる同時処理により、プログラムされた細胞死から完全に保護された。図３Ａ、挿入されている棒グラフ）。これらの結果を確認するために、ＨａＣａＴ（図３Ｂ、左側カラム）及びＡ５４９細胞（図３Ｂ、右カラム）について、ＤＡＰＩ染色アポトーシスアッセイを実施した。内皮細胞について示したように、デフィブロチドのみでは何れの細胞株においてもアポトーシス細胞の数に影響を及ぼさなかった（データ示さず）。
【００３９】
〔実施例４〕
デフィブロチドは、Ｆ−Ａｒａの抗白血病及び抗ＰＢＭＣ効果を妨害しない
Ｆ−Ａｒａ誘導アポトーシスに対して内皮細胞及び上皮細胞へ向けられた望ましい保護能力の次に、デフィブロチドがＦ−Ａｒａの抗白血病特性を妨害しないか否かを検討することが重要であった。この問題に対処するために、一次抹消血からとった、芽球量７０％を有する急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を融解させ、２４時間培養し、続いて、デフィブロチドの存在下又は不存在下にＦ−Ａｒａで更に４８時間処理した。図４Ａは、既に殆ど５０％の細胞が、壊死性の細胞死で自然に死んだことを明らかにしている。しかしながら、Ｆ−Ａｒａは、８０％までの細胞において死を誘導した。内皮細胞及び上皮細胞に対するその効果とは対照的に、デフィブロチドは、ＡＭＬ細胞をＦ−Ａｒａ媒介性の毒性から保護することができなかった。Ｆ−Ａｒａは、ＡＭＬ細胞にアポトーシスではなく直接に壊死を引き起こすことから、図４Ａが、アポトーシス細胞％ではなくて細胞の生存％を記していることに注意すべきである。これは、２４時間だけのインキュベーションの後にも観察できた。やはり、図４Ａは、デフィブロチドが、白血病細胞に対するＦ−Ａｒａの望ましい毒性を妨害しないことを明瞭に示している。我々は、次に、デフィブロチドが正常の造血細胞に対するＦ−Ａｒａの効果を調節するか否かについて問い、健康なヒト供血者からのＰＢＭＣを用いてアポトーシスアッセイ（ＳＳＣ画像）を実施した。図４Ｂに描かれた代表的な実験から分かるように、Ｆ−Ａｒａは、無処理対照における５．１％のアポトーシス細胞と比較して、細胞の４０．１％にアポトーシスを誘導した。再び、デフィブロチドは、ＰＢＭＣに対するＦ−Ａｒａのアポトーシス活性を妨害せず（４３．１％のアポトーシス細胞）、このことは、Ｆ−Ａｒａの免疫抑制特性がデフィブロチドによる同時処理によって害されることのないことを示唆している。
【００４０】
〔実施例５〕
Ｆ−Ａｒａは、ＨＭＥＣ上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）を上方制御し、デフィブロチドの拮抗作用を受ける。
移植前のコンディショニングが内皮細胞株を損傷するだけでなく、接着性分子の誘導に関し親炎症性活性化をもたらすという先の観察結果15 に基づいて、我々は次に、Ｆ−Ａｒａの影響下におけるＩＣＡＭ−１の発現について検討した。図５Ａ及びＢに描かれているように、フロー・サイトメトリー分析は、Ｆ−Ａｒａが、２４時間のインキュベーションの後に、アポトーシスの誘導において見られたのと同様に、用量依存的にＨＭＥＣ上の発現を有意に増強することを明らかにしている。１μｇ／ｍＬまで下げた濃度のＦ−Ａｒａも、ＩＣＡＭ−１を誘導する効果があった。我々は次に、デフィブロチドがこの実験条件においてＦ−Ａｒａの拮抗剤として機能するか否かを問うた。示したようにＨＭＥＣをＦ−Ａｒａで処理し、漸減する各濃度のデフィブロチドの存在下又は不存在下にインキュベートした。図５は、デフィブロチドが、１００μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度で実際にＦ−Ａｒａ誘導性のＩＣＡＭ−１発現に対抗したことを示す、３つの独立した実験のまとめである。デフィブロチドのみでは内皮細胞を活性化せず、試験したどの濃度においてもＩＣＡＭ−１の発現は変化しないままであった（データ示さず）ことに注意すべきである。標的細胞の親炎症性の活性化がしばしば主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ及びIIの発現増大と関連していることから、我々は、更に、種々の濃度のＦ−Ａｒａと共に２４時間インキュベートした後に、これらの抗原につきフロー・サイトメトリー分析を行った。十分記述されたその免疫抑制特性にもかかわらず、Ｆ−Ａｒａは、驚くべきことに、ＨＭＥＣ上のＭＨＣクラスＩ分子を用量依存的に誘導（１０μｇ／ｍＬで平均蛍光強度を１．５倍誘導、５μｇ／ｍＬで１．３倍誘導）したのに対し、ＭＨＣクラスIIは変化しないままであった（データ示さず）。
【００４１】
〔実施例６〕
Ｆ−Ａｒａは、同種末梢血球に対する内皮細胞の抗原性を増強させる。デフィブロチドによる保護。
Ｆ−ＡｒａによるＨＭＥＣ上のＨＭＣクラスＩ分子の誘導は、同種細胞毒性を刺激するＨＭＥＣの能力も増強するか否かの検討に、我々を促した。エフェクターとしての抹消血単核球（ＰＢＭＣ）は、健康なヒトボランティアからのヘパリン処理血液から、又は、バフィーコート調製物からとり、放射線照射（２０Ｇｙ）したＨＭＥＣによって５０Ｕ／ｍＬのインターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下に７日間刺激し、続いて標準の 51Ｃｒ遊離アッセイ（詳細は「材料及び方法」を参照のこと）に付した。第１日に、標的としての新鮮なＨＭＥＣを、刺激しないままおくか又は、Ｆ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と共に、抗ＭＨＣクラスＩ中和抗体（ｗ６／３２）の存在下又は不存在下にインキュベートした。自家エフェクターＥＢウイルス形質転換Ｂリンパ芽球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）及び古典的なナチュラルキラー（ＮＫ）細胞標的としてのＫ５６２細胞を、対照とした。図６Ａは、Ｆ−Ａｒａが実際に、同種ＰＢＭＣに対するＨＭＥＣの抗原性を、試験した全てのＥ／Ｔ比率で増大させることを明らかにしている。Ｋ５６２及び自家エフェクターＢ−ＬＣＬの特異的溶解の欠如が、ＭＨＣ限定性の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の関与を検証した。加えて、無処理の又はＦ−Ａｒａ処理ＨＭＥＣの溶解は、これらの細胞を抗ＭＨＣクラスＩ交代ｗ６／３２と同時インキュベーションしたときほぼ完全に遮断できた（図６Ａ、* 。）ＣＤ８+ＣＴＬが抗内皮細胞障害活性を担っていることを更に確認するために、ＰＢＭＣを、MACSIMビーズキットによる磁性ビーズ分離を用いてＣＤ８+及びＣＤ４+Ｔ細胞について選択した（それぞれ、非ＣＤ８及び非ＣＤ４を枯渇させたＰＢＭＣ）。調製物の純度は、全ての場合において≧９３％であり、他方の細胞集団は全く含まれなかった（示さず）。分離したＴ細胞を、ＨＭＥＣ及びＩＬ−２で、無選択ＰＢＭＣについて記載したのと全く同じようにして（上記参照）刺激した。図６Ｂに示したように、Ｆ−Ａｒａ処理したＨＭＥＣのＣＤ８+ＣＴＬによるの溶解は、またも、対照ＨＭＥＣより有意に高かった。更には、Ｆ−Ａｒａ及びデフィブロチド（Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ）による標的ＨＭＥＣの前処理は、特異的溶解を、対照レベルよりなおも下へ下方制御し、このことはデフィブロチドはまた内皮細胞を同種エフェクターリンパ球による溶解から保護することを示唆している。ＨＭＥＣ刺激ＣＤ４+Ｔ細胞は、この実験条件では如何なる細胞障害性の徴候も示さなかった（データ示さず）。Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理ＨＭＥＣのフロー・サイトメトリー分析は、デフィブロチドによるＭＨＣクラスＩ分子の有意な下方制御という結果をもたらし、このことはＭＨＣクラスＩの発現はＦ−Ａｒａによる細胞障害性応答の誘導の制御における決定的な要素であることを示唆している（データ示さず）。
【００４２】
〔実施例７〕
抗内皮ＣＴＬは、Ｔc１様表現型を提示する。
抗内皮ＣＴＬの性質についての情報を得るために、ＰＢＭＣ及びＣＤ８+Ｔ細胞を上に示したようにして刺激し、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）についてＥＬＩＳＡ分析により評価するため、上清を集めた。表１に記載したように、ＨＭＥＣ及びＩＬ−２による刺激は、ＩＮＦ−γの特異な発現から言えるところによれば、明らかにＴc１様Ｔ細胞の発生をもたらしたのに対し、ＩＬ−４の産生はなかった。
【００４３】
〔実施例８〕
Ｆ−Ａｒａは同種ＮＫ細胞によるＨＭＥＣの溶解を下方制御する
別の興味深い問題の一つは、Ｆ−Ａｒａに誘導されるＭＨＣクラスＩ発現調節が、どのようにして、内皮細胞に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解応答に影響するのかということであった。健康な個人からのＰＢＭＣにつきＮＫ細胞について負の選択（非ＮＫ細胞の枯渇）をし、図６Ｂにおける実験について記載したようにして、放射線照射したＨＭＥＣでＩＬ−２の存在下に４日間刺激した。４日目に、標的細胞としてのＨＭＥＣを、無処理のままおくか、又はＦ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ）と共に２４時間インキュベートし、刺激したＮＫ細胞をエフェクターとして標準の 51Ｃｒ遊離アッセイに付した。図７は、Ｆ−Ａｒａが、ＮＫ細胞に対するＨＭＥＣの同種異系性を有意に下方制御することを明らかにしている。ＫＮ細胞活性についての陽性対照として、ＭＨＣクラスＩ陰性Ｋ５６２細胞の溶解を観察することができた（図７、* ）。Ｆ−Ａｒａ刺激ＨＭＥＣの抗ＭＨＣクラスＩ抗体ｗ６／３２による前処理は、Ｆ−Ａｒａの効果を完全に消失させ、ＨＭＥＣのほぼ１００％の特異的溶解をもたらしたが（図７）、このことは、ＨＭＥＣの表面上のＭＨＣクラスＩが、やはり、ＮＫ細胞の細胞障害性応答の制御にとって決定的なスイッチであることを示唆している。ＭＨＣクラスＩ分子の高い発現レベルによって負の制御をうけることが見出されたキラー細胞抑制レセプター（ＫＩＲ）24 の役割は、ＮＫ細胞の細胞障害性応答の低下を担っているのかもしれない。
【００４４】
考察
フルダラビンを含んだ強度低減コンディショニング（ＲＩＣ）療法によるこれまで得られた重要な離床結果は、免疫再構築に影響を及ぼすことなしに、25 コンディショニングに関連した毒性の明瞭な下方制御を示している。ＲＩＣを受けている患者における急性のＧｖＨＤの発生頻度は、古典的なコンディショニング療法を受けている患者のそれと同等又は更に低い。26  しかしながら、骨壊死、27 肺合併症、28 及びより高頻度の慢性ＧｖＨＤ等のような、同等に重い又はより増大さえしている遅発効果に関する報告がある。29 そのよく記述された免疫抑制特性にも拘わらず、フルダラビンは、我々の研究では、内皮細胞及び上皮細胞を活性化させ損傷することが明らかとなった。この観察は、骨壊死は、内皮細胞の機能不全の現われであり、またフルダラビンは肺胞上皮細胞に毒性を有することから、少なくとも部分的には、上記の好ましからざる臨床上の副作用を説明付け得る。気管支上皮細胞は、この免疫抑制剤に応答したアポトーシスを起こさないから、肺の細胞に対するフルダラビンの有害な効果が区画特異的であるということに注目するのは興味深いことである。ケラチン産生細胞株（ＨａＣａＴ）もまたフルダラビンに感受性であるという事実は、ＳＣＴ後の粘膜障害にもそれが関与している可能性を示唆している。遅発合併症の病因が多因子的であり、ＳＣＴ患者の年齢の上昇及び末梢幹細胞の使用によっても影響を受け得るため、肺及び皮膚科合併症の臨床解析における更なる評価が必要である。
【００４５】
多くの移植前プロトコールにおいてフルダラビンは電離放射線の照射と組み合わせて使用されていることから、これらの２つの組み合わせが、内皮細胞に影響を及ぼすに際し協力しているか否かを試験することは重要であった。興味深いことに、我々は、放射線照射で誘導される細胞死のフルダラビンによる増強も、その逆も、見出すことができなかった（データ示さず）。このことは、アポトーシスでの死のシグナルが内皮細胞に如何にして伝達されるかについての異なったメカニズムを示唆している。
【００４６】
如何にしてフルダラビンが内皮細胞及び上皮細胞にアポトーシスを誘導するかという正確なメカニズムは、解明されていない。フルダラビンは、プリン類縁体としてＤＮＡ中に組み込まれ、それにより、先に報告されたような遺伝子の除去をもたらす変異を引き起こす30 ことがありそうである。フルダラビンは、アポトーシスカスケード経路の始動においてチトクロームＣ及びアポトーシスタンパク質活性化因子−１（ＡＰＡＦ−１）と協同できることも示唆されている。31
【００４７】
フルダラビンは、ＣＤ８+Ｔ細胞に対する内皮細胞標的の同種異系性を増大させる。対照的に、フルダラビンは、同種ＮＫ細胞による内皮細胞溶解を有意に下方制御する。クラスＩの遮断がＣＴＬ溶解を完全になくし、ＮＫ細胞による溶解を甚だしく上方制御することから、ＭＨＣクラスＩの発現はこれらの免疫応答の何れの制御にとっても決定的であるように思われる。フルダラビンのこれら相反する効果は、古典的コンディショニング療法に比べてフルダラビンは、より少ない急性毒性及び同等かそれ以上の慢性毒性を示すという臨床観察と併せると、ＮＫ細胞及びＣＴＬがＧｖＨＤの病理学の異なった相において働く、すなわち、移植後において、ＮＫ細胞は、主として早い相で働き（フルダラビンにより抑制される）、ＣＴＬは遅い相で働く（フルダラビンにより増強される）という推測を生ずる。
【００４８】
抗内皮ＣＴＬの性質に関して、これらのＣＴＬが内皮特異的なのか又は単に同種特異的なのか、というのは興味深い問題である。内皮特異的なエフェクターリンパ球の存在が、先に記載されている。32 Ｔc１様表現型を示すとして我々が特徴付けたＣＬＴとは対照的に、報告されている多くのＣＴＬクローンは、あっても僅かしかＩＮＦ−γを示さず、細胞溶解活性を増強する可能性のあるＣＤ４０リガンドを静止状態で著しく発現する。33 しかしこれらのデータは、非造血性の標的に対する特異性を有する追加の同種異系ＣＴＬの存在を排除するものではない。
【００４９】
デフィブロチドは、ＳＣＴ後の主要な肝合併症の一つである肝静脈閉塞症の治療に成功裏に用いられている耐用性の高い薬物である。34 加えて、虚血／再灌流傷害、及びアテローム性動脈硬化症、並びに再発性の血栓性血小板減少性紫斑病の治療において有効性を示している前臨床及び臨床報告の数が増えつつある。35-37 デフィブロチドは、更なる代謝を必要とせずに内皮細胞に直接作用する38 ことが知られており、従って、我々のインビトロ研究に用いることができた。デフィブロチドは、フルダラビン媒介性のアポトーシスから内皮細胞及び上皮細胞を完全に保護した。デフィブロチドがフルダラビンと拮抗する正確な保護のメカニズムを評価するために、追加の実験が必要であるが、フルダラビンのＤＮＡ組み込みの阻害における、又は前述のカスパーゼの活性化における、デフィブロチドの役割を想像することができる。その抗アポトーシス効果とは別に、デフィブロチドは、ＭＨＣクラスＩの発現を制御することによって抗内皮ＣＴＬ応答を下方制御することができた。対照的に、デフィブロチドは、ＡＭＬ細胞を保護しないことによって示されるように、フルダラビンの望ましい抗白血病効果に影響を及ぼさない。別の重要な観察の一つは、デフィブロチドが、ＰＢＭＣのフルダラビン媒介性アポトーシスを遮断できなかったことである。このことは、コンディショニングに必須のフルダラビンの免疫抑制効果が、デフィブロチドによる同時治療によって影響をうけないことを示唆している。デフィブロチドが放射線照射により誘導される内皮細胞損傷に対し保護をしないことは、注目すべきであり、このことは、その効果がフルダラビン媒介性の細胞変化に特異的であることを示唆している（データ示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
これらの結果に基づいて、及び副作用が仮にあっても僅かであることに照らし、39 我々は、我々の研究から、デフィブロチドが、ＳＣＴ前のコンディショニングにおいて、特にＶＯＤの危険性のある患者において、フルダラビンと組み合わせて使用するのに優れた候補であると結論する。更なるコンディショニング剤に対する内皮保護を分析する研究は、デフィブロチドが広範な保護剤として使用できるか否かを明らかにする助けとなるはずである。
【００５１】
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【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】フルダラビンはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）にプログラムされた細胞死を誘導する。ＨＭＥＣは、無処置のままおくか、又は漸減する各濃度の２−フルオロ−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（以下、Ｆ−Ａｒａといい、フルダラビンの代謝形である）と共に４８時間インキュベートし、フロー・サイトメトリー分析（Ａ）又は顕微鏡によるＤＡＰＩ染色分析に付した。Ａ：細胞の粒度対細胞サイズについてのパラメータとしての、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性細胞の、前方散乱画像（ｙ軸）に対してプロットした側方散乱（ＳＳＣ）画像（ｘ軸）の輪郭プロット。Ｂ：ＤＡＰＩ染色内皮細胞の定量的蛍光顕微鏡分析。結果は、アポトーシスＨＭＥＣ％（アポトーシス細胞％）±標準偏差（視野当たり平均７０個の細胞を含む、ｎ＝１０箇所の顕微鏡視野からのもの）として与えられている。少なくとも５つの独立した実験の代表値が示されている。*：Ｆ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ９処理細胞に対する無処理対照についてのｐ＜０．００１
【図２】デフィブロチド（Ｄ）は、ＨＭＥＣにおけるＦ−Ａｒａ誘導性のアポトーシスを阻害する、細胞内拮抗の証拠。Ｆ−Ａｒａ：１０μｇ／ｍＬ。Ｄ：１００μｇ／ｍＬ。ＰＩ陰性細胞のＳＳＣ画像のフロー・サイトメトリー分析。Ａ：Ｆ−Ａｒａによる再現性あるアポトーシスの誘導。Ｂ：Ｆ−Ａｒａ誘導アポトーシスの、Ｄによる用量依存性の阻害。Ｃ：左側のプロット：ＨＭＥＣのＦ−Ａｒａによる１時間インキュベーション及びこれに続く洗浄後のＤによる４８時間のインキュベーション。右側のプロット：ＨＭＥＣのＤによる１時間のインキュベーション及びこれに続く洗浄後のＦ−Ａｒａによる４８時間のインキュベーション。実験の詳細については、図１の説明並びに「材料及び方法」を参照のこと。示されているのは、３つの独立した実験のうちの一代表例である。
【図３】Ｆ−Ａｒａは、ケラチン生成細胞及び肺胞上皮細胞のアポトーシスを誘導するが、消化管又は気管支上皮細胞においては誘導しない。デフィブロチドの保護効果。Ｆ−Ａｒａ：１０μｇ／ｍＬ。Ｄ：１００μｇ／ｍＬ。ＰＩ陰性細胞のＳＳＣ画像のフロー・サイトメトリー分析（図３Ａ）及びアポトーシス細胞のＤＡＰＩ染色分析（図３Ｂ）。結果は、３つの独立した実験の平均のアポトーシス細胞％±標準偏差として与えられている。ＨａＣａＴ：ヒトケラチン生成細胞株。ＳＷ４８０：消化管上皮細胞株。Ａ５４９：肺胞上皮からの肺癌細胞株。ＢＥＡＳ−２Ｂ：気管支上皮細胞株。一次気管支上皮細胞は、気管支鏡刷毛法から得られた。図３Ａ：*：Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理ＨａＣａＴ細胞についてのｐ＝０．００５。**：Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理Ａ５４９細胞についてのｐ＝０．１１６。−：アポトーシスの誘導なし。図３Ｂ：＋：Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理ＨａＣａｔ細胞についてのｐ＝０．０２６。＋＋：Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理Ａ５４９細胞についてのｐ＝０．００１。実験の詳細については、図１の説明及び「材料及び方法」を参照のこと。各細胞株につき、３つの代表的実験が要約されている。
【図４】デフィブロチド（Ｄ）は、Ｆ−Ａｒａの抗白血病及び抗ＰＢＭＣ効果を妨害しない。Ｆ−Ａｒａ：１０μｇ／ｍＬ。Ｄ：１００μｇ／ｍＬ。Ａ：急性転化（全ＢＰＭＣカウント中、芽球７０％）した患者からの原発急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞のヨウ化プロピジウム染色。結果は、３つの独立した実験の平均生存％として与えられている。*：対照対Ｆ−Ａｒａ処理ＡＭＬ細胞についてのｐ＝０．００８。Ｂ：ＰＩ陰性ＰＢＭＣ細胞のＳＳＣ画像のフロー・サイトメトリー分析。示されているのは、血液ドナーを異にする５つの独立した実験のうちの一代表例である。
【図５】Ｆ−Ａｒａは、ＨＭＥＣ上のＩＣＡＭ−１の発現を誘導する。デフィブロチド（Ｄ）の保護効果。ＩＣＡＭ−１陽性細胞のフロー・サイトメトリー分析。ＨＭＥＣは、無処理のままおかれたか又は、漸減する各濃度のＤの存在下若しくは不存在下にＦ−Ａｒａ（Ｂでは、１０μｇ／ｍＬ又は漸減する濃度）とインキュベートされた。Ａ：代表的実験からのＩＣＡＭ−１発現のヒストグラムプロット。点線：背景染色（ゼロ対照）；細線：無処理細胞のＩＣＡＭ−１発現；太線：Ｆ−Ａｒａ処理細胞のＩＣＡＭ−１発現。Ｂ：Ｆ−ＡｒａによるＩＣＡＭ−１発現の用量依存性の誘導。独立した３つの実験の要約。結果は、ＩＣＡＭ−１陽性細胞の平均％±標準偏差として与えられている。*：Ｆ−Ａｒａ対無処理対照細胞についてのｐ＝０．０７５。Ｃ：Ｆ−Ａｒａ誘導ＩＣＡＭ−１発現のデフィブロチド（Ｄ）による用量依存性の阻害。結果は、ＩＣＡＭ−１陽性細胞の平均％±標準偏差として与えられている。**：Ｆ−Ａｒａ対Ｆ−Ａｒａ＋Ｄ処理ＨＭＥＣについてのｐ＝０．００４。
【図６】Ｆ−Ａｒａは、ＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対するＨＭＥＣの同種異系性を増強する。デフィブロチドの保護効果。Ａ：インターロイキン２（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下、ＰＢＭＣを、放射線照射したＨＭＥＣで７日間刺激し、そして、標的細胞としての無処理（対照）及びＦ−Ａｒａ（１０μｇ／ｍＬ）処理したＨＭＥＣと共に、51Ｃｒ遊離アッセイ（２４時間インキュベーション）に付した。autolog.Ｂ−ＬＣＬ：自家（エフェクター）ＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ芽球。Ｋ５６２：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の標的細胞。結果は、「材料及び方法」に記述されているように、特異的溶解％として与えられている。* ：抗ＭＨＣクラスＩ抗体ｗ６／３２の存在下におけるＦ−Ａｒａ処理ＨＭＥＣの特異的溶解％。Ｅ／Ｔ比：エフェクター／標的比。Ｂ：ＣＤ８陽性ＣＴＬに対するＨＭＥＣのＦ−Ａｒａ誘導同種異系性の、デフィブロチド（Ｄ）による下方制御。ＣＤ８陽性ＰＢＭＣは、磁性ビーズ分離によって負の選択（非ＣＤ８+細胞を枯渇させる）をした。実験の詳細については、図６Ａの説明を参照のこと。
【図７】Ｆ−Ａｒａは、ＮＫ細胞に対するＨＭＥＣの同種異系性を低下させる。ＭＨＣクラスＩの遮断による溶解の増強。ＫＮ細胞を、磁性ビーズ分離によって負の選択（非ＮＫ細胞を枯渇させる）をし、放射線照射したＨＭＥＣによってＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下に４日間刺激し、次いで、図６について記述したようにして、51Ｃｒ遊離アッセイに付した。グラフの下の表：ＨＭＥＣによる刺激の前後でのエフェクター細胞集団のフロー・サイトメトリー分析。ＮＫ細胞は、ＣＤ３-／ＣＤ１６+ＣＤ５６+として特徴付けられた。* ：２０：１のＥ／Ｔ比におけるＫ５６２細胞の特異的溶解％。
【表１】
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刺激されたエフェクター細胞（７日、放射線照射したＨＭＥＣ、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２）の上清中のインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及びインターロイキン４（ＩＬ−４）の産生についてのＥＬＩＳＡ。ＰＢＭＣは、分離せずに、又は、図６の実験に示したようにＣＤ８+Ｔ細胞について負の選択をした。結果は、３つの独立した実験の平均サイトカインｐｇ／ｍＬ±標準偏差として与えられている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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