(57)【要約】  本発明は、ビトロネクチンレセプターファミリー、αｖβ３インテグリンと相互作用する剤のスクリーニング方法および該方法により入手可能な剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲンＥフラグメント、またはそのペプチド誘導体と、ビトロネクチンレセプターとの相互作用を調節する剤の同定のためのスクリーニング法であって、
i)図２において示されたアミノ酸配列、またはその活性結合フラグメントを含んでなるポリペプチドを提供する工程；
ii)図１において示された配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのペプチドを提供する工程；
iii)試験される少なくとも１つの剤を提供する工程；
iv)(i)、(ii)および(iii)の調製物を形成する工程；および
v)(i)および(ii)におけるペプチドおよびポリペプチドの相互作用に対する(iii)における剤の効果を検出または測定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
剤が、(ii)におけるペプチドの添加の前に、(i)におけるポリペプチドでプレインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
剤が、当該剤の添加の前に、(ii)におけるペプチドでプレインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
(ii)におけるペプチドが配列：
ＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
からなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
(ii)におけるペプチドが配列：
ＳＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
からなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
(ii)におけるペプチドが配列：
ＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＶＸＲ
からなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
(ii)におけるペプチドが配列：
ＧＥＧＸＦＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＶＸＲ
からなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
(ii)におけるペプチドが：
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＶＥＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＸＲＧＰＲＶＶＥＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＸＧＰＲＶＶＥＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＸＰＲＶＶＥＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＸＥＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＶＸＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＸＸＸＰＲＶＶＸＲ
ＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
〔ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である。〕
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
(ii)におけるペプチドが：
【表１】
2005511008.tif 000005
〔ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である。〕
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｘが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ｘがアラニンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
(ii)におけるペプチドが配列：
ＸＦＬＡＥＧＧＧＶＸＧ
〔ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である。〕
からなるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ末端のＸが酸性アミノ酸であり、かつ、Ｃ末端のＸが塩基性アミノ酸であるか、またはＮ末端のＸが塩基性アミノ酸であり、かつ、Ｃ末端のＸが酸性アミノ酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ末端のＸがＤであり、かつ、Ｃ末端のＸがＲである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビトロネクチンレセプターが可溶性である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ビトロネクチンレセプターが細胞により提示される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞がビトロネクチンレセプターを自然に発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞が内皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞がビトロネクチンレセプターを自然に発現しない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
細胞が、ビトロネクチンレセプターを発現するように遺伝子操作されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載のスクリーニング方法により入手可能な剤(複数も可)。
【請求項２３】
剤がフォルダマー、低分子量化合物、ペプチド、ペプチド誘導体またはポリペプチドである、請求項２２に記載の剤。
【請求項２４】
剤が抗体である、請求項２３に記載の剤。
【請求項２５】
剤がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の剤。
【請求項２６】
剤がキメラ抗体である、請求項２５に記載の剤。
【請求項２７】
剤がヒト化抗体である、請求項２５または２６に記載の剤。
【請求項２８】
ビトロネクチン結合活性を有し、血管形成を調節する能力を有する剤を同定するためのスクリーニング方法であって、
i)ペプチドα１−２４、またはそのバリアントと結合するインテグリンファミリーのメンバーを提供する工程；
ii)少なくとも１つの候補結合剤を提供する工程；
iii)(i)および(ii)の組合せを含んでなる調製物を形成する工程；
iv)(i)におけるポリペプチドで(ii)における剤の結合を検出または測定する工程；および所望により
v)血管形成を調節する剤の能力を試験する工程
を含んでなる方法。
【請求項２９】
ビトロネクチンレセプター結合活性を有する剤が抗血管形成活性を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ビトロネクチンレセプター結合活性を有する剤がプロ血管形成活性を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ビトロネクチンレセプターがαｖβ３インテグリンであり、そして図２において示されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
ビトロネクチンレセプターが可溶性である、請求項２８〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ビトロネクチンレセプターが細胞により提示される、請求項２８〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
細胞がビトロネクチンレセプターを自然に発現する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が次の細胞タイプ：内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が内皮細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞がビトロネクチンレセプターを自然に発現しない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、ビトロネクチンレセプターを発現するように遺伝子操作されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２８〜３８のいずれかに記載の方法により入手可能な剤。
【請求項４０】
剤が抗血管形成活性を有する、請求項３９に記載の剤。
【請求項４１】
剤がプロ血管形成活性を有する、請求項３９に記載の剤。
【請求項４２】
剤がポリペプチドである、請求項３９〜４１のいずれかに記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ビトロネクチンレセプターファミリーのメンバー、αｖβ３インテグリンと相互作用する剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
血管形成、すなわち存在する血管床からの新たな血管の発達は、細胞外マトリックスの構成成分の分解、次いで、小管および最終的には新規血管を形成するための、内皮細胞の移動、増殖および分化を含む複雑な多段階プロセスである。血管形成は、例としてであって、限定されるわけではないが、胚移植；胚形成および発達；および創傷治癒を含む、通常の生理学的プロセスにおいて重要である。過剰の血管新生は、また、腫瘍細胞増殖のような病理学的状態、ならびに血管新生緑内障、リウマチ様関節炎、乾癬および糖尿病性網膜症のような非癌性状態にも関与する。
【０００３】
血管内皮は、通常、静止性である。しかしながら、活性化すると、内皮細胞は、増殖および移動して、発達している組織および、もちろん、増殖している腫瘍に血液を供給するための毛細血管床を最終的に形成する微小管を形成する。血管形成を受けるように内皮細胞を促進／活性化する数多くの成長因子が同定されている。これらには、例としてであって、限定されるわけではないが；血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)；トランスフォーミング成長因子(ＴＧＦｂ)；酸性および塩基性線維芽細胞成長因子(ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ)；および血小板由来性成長因子(ＰＤＧＦ)(１、２)を含む。
【０００４】
ＶＥＧＦは、作用、すなわち内皮細胞の増殖、移動および分化の促進、の極めて特異的な部位を有する内皮細胞特異的成長因子である。ＶＥＧＦは、２つの同一の２３ｋＤａのポリペプチドを含んでなるダイマー性複合体である。モノマー形態のＶＥＧＦは、異なる分子量の４つの別個のポリペプチドとして存在し得、これらはそれぞれ、オルタナティブスプライシングを受けたｍＲＮＡに由来する。４つのモノマー形態のうち、２つは膜結合ＶＥＧＦとして存在し、そして２つは可溶性である。ＶＥＧＦは、胚組織；増殖性ケラチノサイト；マクロファージ；腫瘍細胞を含む、広範な細胞／組織タイプにより発現される。試験(２)により、ＶＥＧＦが神経膠腫およびＡＩＤＳ関連カポジ肉腫を含む多くの腫瘍細胞系において高度に発現されることが示された。ＶＥＧＦ活性は、内皮細胞および腫瘍細胞により発現されるＶＥＧＦ特異的レセプターを通して仲介される。実際、ＶＥＧＦレセプターは腫瘍に浸透する内皮細胞において上方調節され、それによって腫瘍細胞の増殖が促進される。
【０００５】
ｂＦＧＦは、線維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する成長因子である。ｂＦＧＦは、１６.５ｋＤａの分子量を有する単ポリペプチド鎖である。それらのアミノ末端領域の長さが異なるいくつかの分子形態のｂＦＧＦが発見されている。しかしながら、さまざまな分子形態の生物学的機能は、同一であるように見える。ｂＦＧＦは下垂体により産生され、そしてヒト第四染色体に位置する単一の遺伝子によりコードされている。
【０００６】
血管形成の数多くの内因性インヒビターが発見されており、これらの例はアンギオスタチンおよびエンドスタチンである。これらは、それぞれ、プラスミノーゲンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩのタンパク質分解により形成される。これらの因子の両方は、血管性ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦのようなプロ血管形成成長因子の活性を抑制することが示されている。両者は、また、インビトロでのＶＥＧＦおよびｂＦＧＦへの内皮細胞の応答を抑制し、そして動物モデルにおける血管形成および実験的腫瘍の増殖を減少させる。
【０００７】
フィブリノーゲンの５０ｋＤａのタンパク質分解フラグメントであり、強力かつ新規の血管形成インヒビターである、フィブリノーゲンＥは、我々の同時係属出願ＷＯ０１／８８１２９において開示されており、これを、引用により本明細書の一部とする。さらに、我々は、フィブリノーゲンＥフラグメント内のドメインであって、さらに大きいフィブリノーゲンＥフラグメントと同じ抗血管形成活性を有するドメインを同定した。該ドメインは、同時係属特許出願ＷＯ０２／１８４４０において開示されており、これを、引用により本明細書の一部とする。該ドメインは、α鎖のアミノ末端に位置し、そしてα１−２４と呼ばれる。
【０００８】
我々は、今回、これらのポリペプチドが結合して、抗血管形成作用を仲介するレセプターを開示する。該ペプチドは、ビトロネクチンレセプター、αｖβ３インテグリンに結合し、そしてその活性を阻害する。ビトロネクチンレセプターは、一般にインテグリンと呼ばれるレセプターの、大きなファミリーのメンバーである。
【０００９】
ビトロネクチンレセプターが多くの細胞プロセスの仲介に関与していることは既知である。基底膜は、上皮および内皮細胞のための支持体を提供する薄層の専門の細胞外マトリックスとして組織化される。基底膜は、機械的支持体を提供し、そして内皮細胞のような細胞の分化、増殖および移動といった細胞の挙動を調節する。
【００１０】
αｖβ３インテグリンは、主にマトリックスタンパク質において見出されるトリペプチド配列、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(‘ＲＧＤ’)との相互作用を介して、数多くの細胞外マトリックスタンパク質；例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、ビトロネクチンおよびフォンウィルブランド因子に結合する。タムスタチン、すなわちＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン由来のコラーゲンフラグメントのような少数の他の細胞外マトリックスタンパク質は、ＲＧＤ非依存性メカニズムを介して、αｖβ３に結合する。Ｍａｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ (２０００)およびＭａｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ (２００１)には、アミノ酸５４〜１３２の間に見出されるαｖβ３に結合するタムスタチンの領域が記載されている。この領域は、ＲＧＤモチーフを有していない。さらに、タムスタチンの結合は、活性化された内皮細胞により仲介される血管形成を妨げる。
【００１１】
我々の同時係属出願(ＷＯ０２／１８４４０)において、我々は、規範的なＲＧＤモチーフが欠如しており、したがってＲＧＤ非依存的様式でαｖβ３に結合する、α１−２４と呼ばれる抗血管形成ペプチドを記載した。αｖβ３に結合するこのペプチドの同定により、α１−２４の結合を阻害する剤の同定が可能となり、したがって、細胞外マトリックス：この新規の、非ＲＧＤ相互作用経路を介するαｖβ３相互作用、を妨げる可能性を有する剤が同定される。同定された剤は、血管形成を妨げること、それにより、血管形成に依存する疾患状態、例えば創傷治癒、癌を寛解させることに関して、有用性を有する。
【００１２】
本発明の１つの目的は、フィブリノーゲンＥフラグメント、またはそのペプチド誘導体、およびビトロネクチンレセプターの相互作用を干渉する剤の同定方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、ビトロネクチンレセプターに結合する剤(ここで、当該剤は血管形成調節活性を有する。)の同定方法を提供することである。
【００１４】
本発明の１つの観点にしたがって、ビトロネクチンレセプターと、フィブリノーゲンＥフラグメント、またはそのペプチド誘導体の相互作用を調節する剤の同定のためのスクリーニング方法が提供される。
【００１５】
本発明の好適な方法において、該方法には：
i)図２において示されたアミノ酸配列、またはその活性結合フラグメントを含んでなるポリペプチドを提供する工程；
ii)図１において示された配列から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのペプチドを提供する工程；
iii)試験される少なくとも１つの剤を提供する工程；
iv)(i)、(ii)および(iii)の調製物を形成する工程；および
v)(i)および(ii)におけるポリペプチドおよびペプチドの相互作用に対する(iii)における剤の効果を検出または測定する工程
が含まれる。
【００１６】
本発明のさらに好適な方法において、該剤は、(ii)におけるペプチドの添加の前に、(i)におけるポリペプチドでプレインキュベートされる。
【００１７】
本発明の別の好適な方法において、該剤は、(i)におけるポリペプチドの添加の前に、(ii)におけるペプチドでプレインキュベートされる。
【００１８】
本発明の好適な方法において、(ii)におけるペプチドは配列：
ＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
からなるアミノ酸配列、またはその部分を含んでなる。
【００１９】
本発明のいっそうさらに好適な方法において、(ii)におけるペプチドは配列：
ＳＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
からなるアミノ酸配列、またはその部分を含んでなる。
【００２０】
本発明のいっそうさらに好適な方法において、該ペプチドは配列：
ＧＥＧＸＦＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＶＸＲ
により示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２１】
本発明のいっそうさらに好適な方法において、該ペプチドは配列：
ＧＥＧ ＸＦＬ ＸＸＸ ＸＸＸＸＸ ＸＸＸＸ ＸＸ
により示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２２】
Ｘは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンからなる群から選択される、任意のアミノ酸残基である。好ましくは、Ｘはアラニンである。
【００２３】
本発明の好適な実施態様において、該ペプチドは、ｔａｂｌｅ １において示される配列により表されるアミノ酸配列を含んでなる。好ましくは、該配列を含んでなるペプチドは、抗血管形成活性を有する。
【００２４】
本発明のいっそうさらに好適な実施態様において、該ペプチドは、ｔａｂｌｅ １において示される２つのフラグメントの重複する部分により表されるアミノ酸配列を含んでなる。さらに好適な実施態様において、該ペプチドは、ｔａｂｌｅ １におけるペプチドＡＨＩ−４０１およびＡＨＩ−３７８の重複する部分に由来する。好ましくは、ペプチドＡＨＩ−４０１およびＡＨＩ−３７８の重複する部分に由来する該ペプチドは、Ｎ末端にさらに１つのアミノ酸残基を含んでなる。
【００２５】
かくして、本発明の好適な方法において、該ペプチドは配列：
ＸＦＬＡＥＧＧＧＶＸＧ
により表されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２６】
Ｘは、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖからなる群から選択される任意のアミノ酸残基である。好ましくは、Ｘは、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＰからなる群から選択され、さらに好ましくは、Ｘは、Ｈ、ＲおよびＫからなる群から選択される塩基性アミノ酸、またはＤおよびＥからなる群から選択される酸性アミノ酸である。
【００２７】
別の好適な実施態様において、Ｎ末端のＸは、ＤおよびＥからなる群から選択されるが、Ｃ末端のＸは、Ｈ、ＲおよびＫからなる群から選択される。または、代わって、Ｎ末端のアミノ酸は、Ｈ、ＲおよびＫからなる群から選択されるが、Ｃ末端のＸは、ＤおよびＥからなる群から選択される。特に好適な実施態様において、Ｎ末端のＸはＤであり、そしてＣ末端のＸはＲである。
【００２８】
本発明のいっそうさらに好適な方法において、該ペプチドは：
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＶ ＲＧＰ ＲＶＶＥ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＸ ＲＧＰ ＲＶＶＥ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＶ ＸＧＰ ＲＶＶＥ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＶ ＲＸＰ ＲＶＶＥ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＶ ＲＧＰ ＲＶＸＥ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＶ ＲＧＰ ＲＶＶＸＲ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＸＸＸＰ ＲＶＶＸ Ｒ
ＧＥＧ ＤＦＬ ＡＥＧ ＧＧＸＸＸＰ ＲＶＸＸＲ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２９】
Ｘは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンからなる群から選択される、任意のアミノ酸残基である。好ましくは、Ｘはアラニンである。
【００３０】
本発明のさらに好適な方法において、その部分は、アミノ酸配列：
ＳＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
の＋１〜＋１５のアミノ酸配列により表される。
【００３１】
本発明のさらに好適な方法において、その部分は、アミノ酸配列：
ＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
の＋６〜＋２１のアミノ酸配列により表される。
【００３２】
本発明のいっそうさらに好適な方法において、その部分は、アミノ酸配列：
ＸＸＸＸＸＬＸＥＸＸＧＸＸＸＰＲＶＸＸＲ
の＋６〜＋１５のアミノ酸配列により表される。
【００３３】
本発明のさらに好適な方法において、該ペプチドは、本明細書において開示されたペプチドアミノ酸配列からなる。
【００３４】
本発明のさらに好適な実施態様において、該ペプチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸長であり、そして本発明にしたがうアミノ酸配列を含んでなる。
【００３５】
本発明の好適な方法において、(ii)におけるペプチドは、
【表１】
2005511008.tif 000002
〔ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。〕
からなる群から選択される。
【００３６】
好ましくは、Ｘは疎水性アミノ酸残基であり、そしてさらに好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはプロリンからなる群から選択される。さらに好ましくは、該アミノ酸残基はアラニンである。
【００３７】
本発明のさらに好適な方法において、ビトロネクチンレセプターは、可溶形態でまたは細胞により提示される。好ましくは、該細胞は、ビトロネクチンレセプターを自然に発現する。ビトロネクチンレセプターを自然に発現する細胞の例は、内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞および腫瘍細胞である。代わって、該細胞はビトロネクチンレセプターを自然に発現せず、この場合において、該細胞は、好ましくはビトロネクチンレセプターを発現するように遺伝子操作される。
【００３８】
本発明のさらなる観点にしたがって、本発明のスクリーニング方法により同定される剤(複数も可)が提供される。好ましくは、該剤(複数も可)は、ビトロネクチンレセプター結合活性を有するペプチドまたはポリペプチドの相互作用を干渉する。代わって、該剤は、ビトロネクチンレセプター結合活性を有するポリペプチドの相互作用を促進する。
【００３９】
本発明の好適な実施態様において、該剤は、αｖβ３インテグリンとのα１−２４の結合を調節する、フォルダマー、すなわち特定の、コンパクトなコンホメーションをとる強い傾向を有するポリマー(１５)である。
【００４０】
本発明のさらに好適な実施態様において、該剤は、ペプチド、ペプチド誘導体またはαｖβ３インテグリンとα１−２４との結合を調節する低分子量の剤である。
【００４１】
本発明のさらに好適な実施態様において、該剤はポリペプチドである。好ましくは、該剤は抗体である。
【００４２】
本発明のさらに好適な実施態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。好ましくは、該モノクローナル抗体は、キメラ抗体である。代わって、該抗体なヒト化抗体である。
【００４３】
免疫グロブリンとしても知られている、抗体は、外来の分子(抗原)に対する特異性を有するタンパク質分子である。免疫グロブリン(Ｉｇ)は、２組のポリペプチド鎖、すなわち１組の軽(Ｌ)(低分子量)鎖(κまたはλ)、および１組の重(Ｈ)鎖(γ、α、μ、δおよびε)からなる構造的に関連したタンパク質のクラスであり、これら４つすべては、ジスルフィド結合により一体となって、結合している。Ｈ鎖およびＬ鎖の両方は、抗原の結合に寄与し、そして１つのＩｇ分子と別のもので高度に可変性である、領域を有する。さらに、Ｈ鎖およびＬ鎖は、非可変性または定常である領域を含有する。
【００４４】
Ｌ鎖は、２つのドメインからなる。カルボキシ末端ドメインは、本質的に所定のタイプのＬ鎖と同一であり、そして「定常」(Ｃ)領域と呼ばれる。アミノ末端ドメインはＬ鎖ごとに異なり、そして抗体の結合部位を与える。その可変性のため、それは「可変」(Ｖ)領域と呼ばれる。
【００４５】
Ｉｇ分子のＨ鎖には、いくつかのクラス、すなわちα、μ、σ、αおよびγ(これらには、いくつかのサブクラスが存在する。)がある。２つの同一のＨおよびＬ鎖の１もしくはそれ以上のユニットからなる集合Ｉｇ分子の名前は、それが有しているＨ鎖の名前に由来する。したがって、５つのＩｇイソタイプ：ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧ(Ｈ鎖における相違に基づいて４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を有する)が存在する。抗体の構造およびそれらのさまざまな機能に関するさらなる詳細は、Using Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Pressにおいて見出され得る。
【００４６】
キメラ抗体は、マウスまたはラット抗体のＶ領域のすべてを、ヒト抗体のＣ領域と組み合わせた、組換え抗体である。ヒト化抗体は、げっ歯類抗体のＶ領域からの相補性決定領域をヒト抗体のＶ領域からのフレームワーク領域と融合させた、組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体からのＣ領域も使用される。相補性決定領域(ＣＤＲ)は、Ｖ領域の大部分の変異が制限されている抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域である。これらの領域は、抗体分子の表面にてループを形成する。これらのループは、抗体と抗原の間の結合表面を提供する。
【００４７】
非ヒト動物からの抗体は、外来抗体に対する免疫応答および循環からの除去を誘発する。組換えハイブリッド抗体内には低減化された量のげっ歯類(すなわち外来)の抗体が存在するが、ヒト抗体の領域は免疫応答を誘発しないので、キメラ抗体およびヒト化抗体の両方は、ヒト対象に注射された場合に低減化された抗原性を有する。このことは、より弱い免疫応答、および抗体のクリアランスにおける減少をもたらす。
【００４８】
本発明の別の観点にしたがって、ビトロネクチン結合活性を有する剤を同定するためのスクリーニング方法であって、
i)ペプチドα１−２４、またはそのバリアントと結合するインテグリンファミリーのメンバーを提供する工程；
ii)少なくとも１つの候補結合剤を提供する工程；
iii)(i)および(ii)の組合せを含んでなる調製物を形成する工程；
iv)(i)におけるポリペプチドで(ii)における剤の結合を検出または測定する工程；および所望により
v)血管形成を調節する剤の能力を試験する工程
を含んでなる方法が提供される。
【００４９】
本発明の好適な方法において、ビトロネクチンレセプター結合活性を有する剤は、抗血管形成活性を有する。代わって、ビトロネクチンレセプター結合活性を有する剤は、プロ血管形成活性を有する。
【００５０】
本発明の好適な方法において、インテグリンはビトロネクチンレセプターであり、そしてαｖβ３インテグリンである。好ましくは、インテグリンは、図２において示されるアミノ酸配列、またはそのフラグメントにより表される。
【００５１】
本発明のさらに好適な方法において、該ビトロネクチンレセプターは可溶形態であるか、または細胞により提示される。
【００５２】
本発明のさらに好適な方法において、該細胞は、ビトロネクチンレセプターを自然に発現する。
【００５３】
ビトロネクチンレセプターαｖβ３インテグリンは、さまざまな細胞タイプ、例えば内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞および腫瘍細胞により発現される。
【００５４】
好ましくは、該細胞は、内皮細胞である。
【００５５】
本発明の別の実施態様において、該細胞はビトロネクチンレセプターを自然に発現しない。好ましくは、該細胞はビトロネクチンレセプターを発現するように遺伝子操作される。
【００５６】
本発明のさらなる観点にしたがって、本発明の方法により入手可能な剤が提供される。好ましくは、該剤は抗血管形成活性を有する。代わって、該剤はプロ血管形成活性を有する。
【００５７】
本発明の好適な実施態様において、剤はフォルダマー、すなわち特定の、コンパクトなコンホメーションをとる強い傾向を有するポリマー(１５)である。本発明のさらに好適な実施態様において、剤は低分子量化合物、ペプチド、ペプチド誘導体またはバリアント、またはポリペプチドである。
【００５８】
ここで、本発明の実施態様を、例示のみのため、および下記の図を参照して、記載する：
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、フィブリノーゲンＥのα１−２４ポリペプチドおよびα１−２４のバリアントのアミノ酸配列を表す；
【図２】図２は、ビトロネクチンレセプターファミリーのメンバー、αｖβ３インテグリン(α鎖およびβ鎖)のアミノ酸配列である；
【図３】図３は、α１−２４の抗血管形成活性に対する抗−ビトロネクチンレセプターポリクローナル抗体の阻害効果を表す；そして
【図４】図４は、α１−２４ペプチドまたはビトロネクチンでインキュベートした固定化αｖβ３インテグリンを用いる結合アッセイを表す。
【００６０】
【図５】図５(Ｔａｂｌｅ １)は、本明細書に記載されたポリペプチドの抗血管形成活性の概要を表す。
【００６１】
材料および方法
ヒトインテグリンαｖβ３を、Chemicon International Inc (28835 Single Oak Drive Temecula, CA92590, USA, catalogue code CC1018)から入手した。
【００６２】
αｖβ３インテグリンの直接結合アッセイ
１.  プレートを、密閉プレートにおいて室温にて、ＰＢＳ中の試験タンパク質(α１−２４、修飾α１−２４、またはビトロネクチン)で一夜コーティングせよ。
２.  洗浄バッファー(ＰＢＳ中０.１％ＢＳＡ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０)で３回洗浄せよ。
３.  (ＰＢＳ中)１％ＢＳＡを用いて、３７℃にて３０分間ブロックせよ。
４.  洗浄バッファーで３回洗浄せよ。
【００６３】
５.  ３７℃にて等モル量のαｖβ３インテグリン(Chemicon)を１時間添加せよ。
６.  洗浄バッファーで３回洗浄せよ。
７.  ３７℃にて１０μｇ／ｍｌのαｖβ３インテグリン(Chemicon)に対するモノクローナル抗体を１時間添加せよ。
８.  洗浄バッファーで３回洗浄せよ。
９.  ３７℃にてＰＢＳ中で１：１０００に希釈されたＨＲＰ(Dako)に結合した二次抗体を１時間添加せよ。
１０.  洗浄バッファーで３回洗浄せよ。
１１.  基質−テトラメチルベンジジン(１００μｇ／ｍｌ)(Sigma)を添加せよ。
１２.  発色現像(１５〜３０分)後、６３０ｎｍでのＥＬＩＳＡプレートリーダーで読取りをせよ。
【００６４】
細胞培養
成人のヒト皮膚微小血管内皮細胞(HuDMEC)を商品として(TCS Biologicals, Buckinghamshire, United Kingdom)入手し、そして微小血管内皮細胞増殖培地(EGM)中で培養した。この培地は、ヘパリン(１０ｎｇ／ｍｌ)、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮成長因子(１０ｎｇ／ｍｌ)、ヒト線維芽細胞成長因子(１０ｎｇ／ｍｌ)(かかる内皮細胞増殖因子は、培養におけるＨｕＤＭＥＣのルーチン的な継代に必要である。)およびジブチリルサイクリックＡＭＰを含有する。これに、５％熱不活性化ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび５０ｎｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ(TCS Biologicals, United Kingdom)を補った。ネズミの内皮細胞(SVEC 4-10)をＡＴＣＣから入手し、そしてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２の気相を有する１００％加湿インキュベーター中で３７℃にて成長させ、マイコプラズマに関してルーチン的にスクリーニングした。下記のアッセイにおいてそれらを使用する前に、ＨｕＤＭＥＣを８０％コンフルエンシーまで成長させ、ＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ中で２時間インキュベートし、次いで、０.０５％トリプシン溶液で回収し、２回洗浄し、そして再懸濁させ、個々のアッセイに必要とされる細胞密度にした(下記参照)。
【００６５】
α１−２４修飾ペプチド
α１−２４ペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸および合成装置を用いる標準的ペプチド合成法により製造された。ペプチドの純度は、質量分析により確認された。
【００６６】
小管形成アッセイ
２４ウェルプレートを、３０μｌ／ウェルの成長因子低減化(ＧＦ低減化)Ｍａｔｒｉｇｅｌ(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)でコーティングした。このマトリックス上にプレーティングされた内皮細胞は移動し、そして以前に記載(１４)されたようにプレーティング６時間以内に小管へと分化する。ＨｕＤＭＥＣまたはＳＶＥＣ ４−１０細胞を、４×１０４細胞／ｍｌの密度で播種し、そして５００μｌのＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ単独(対照)、またはα１−２４ペプチドの存在下もしくは不存在下での当該培地±１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ中で、６時間インキュベートした。小管形成の評価は、４℃にて７０％エタノール中で細胞調製物を１５分間固定すること、ＰＢＳ中ですすぐこと、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンで染色することを含んでいた。それぞれの試験条件に関して、３つの複製ウェルにおける視野の３つの無作為の領域を、低倍率(４０倍)で可視化し、そしてカラー画像を、(フレーム取込みボードを含む)Ｐｅｎｔｉｕｍ ＩＩＩコンピューターに接続したＦｕｊｉデジタルカメラを用いて取込んだ。小管形成は、小管分岐の数およびＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅにより供給された画像解析ソフトウェアを用いて、視野のそれぞれの領域における小管が受け持つ総面積を計測することにより評価された。
【００６７】
移動アッセイ
Ｂｏｙｄｅｎチャンバー技術を(１３)から適応させ、そしてＶＥＧＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)またはｂＦＧＦ(１０ｎｇ／ｍｌ)の濃度勾配への、多孔性膜を通過するＨｕＤＭＥＣ移動を評価するために使用された。Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ ４８ウェルマイクロケモタキシスチャンバー(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)を、１００μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンで被覆された８μｍの孔サイズのポリカーボネート膜(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)と共に使用した。単独またはさまざまな濃度のα１−２４ペプチドと組み合せた、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦをＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ中に溶かし、そして下側のウェルに置いた。次いで、コラーゲン被覆膜をこれの上に置き、そして５０μｌの(１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中の)２５×１０４ＨｕＤＭＥＣ／ｍｌを上側のチャンバーに添加した。次いで、チャンバーを３７℃にて４.５時間インキュベートした。次いで、チャンバーを取り外し、膜を除去し、そして移動していない細胞を上側の表面からこすりとった。下側の表面にある移動細胞をメタノールで固定し、Ｈｅｍａ‘Ｇｕｒｒ’急速染色キット(Merck, Leics, United Kingdom)で染色し、そして光学顕微鏡(１６０倍)を用いて、ウェル当たり３つの無作為領域において計数する。それぞれの試験条件は、３〜６の複製ウェルにおいて行われ、そしてそれぞれの実験を３回繰り返した。
【００６８】
増殖アッセイ
ＭＴＴ(３−[４,５−ジメチルチアゾール−２−イル]−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを、以前に記載(１２)されたように使用し、α１−２４ペプチドの不存在下または存在下で、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦにより誘導されるＨｕＤＭＥＣ増殖を評価した。ＨｕＤＭＥＣを、３×１０３細胞／１００μｌにて、試験溶液中のＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ±１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレートへと４.５および６時間播種した。これらの時点において、４分の１の容量のＭＴＴ溶液(２ｍｇ ＭＴＴ／ｍｌ ＰＢＳ)をそれぞれのウェルに添加し、そしてそれぞれのプレートを３７℃にて４時間インキュベートすると、不溶性の紫色のホルマザン生成物を得た。培地を吸引し、そして沈澱をｐＨ１０.５に緩衝化した１００μｌのＤＭＳＯ中に溶かした。次いで、Ｄｙｎｅｘ ＥＬＩＳＡプレートリーダーで５４０ｎｍにおける吸光値を読み取った。
【００６９】
細胞毒性アッセイ
ＨｕＤＭＥＣを、α１−２４ペプチドの不存在下または存在下で２４ウェルプレート中に、ウェル当たり１〜２×１０５細胞の密度で播種した。６時間後、生存細胞(トリプシン処理による除去後)および死亡細胞(浮遊している)を回収し、そして存在するすべての細胞の細胞生存度を、４８８ｎｍにて１５ｍＷの青色レーザー励起を備えたＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson)を用いる処理当たりそれぞれトリプリケートの試料中の５０００細胞のヨウ化プロピジウム染色を用いて評価した。データを回収し、そしてＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析した。
【００７０】
腫瘍細胞培養
ＣＴ２６細胞系を、１０％ウシ胎児血清、ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するダルベッコ最小イーグル培地におけるインビトロ継代により維持し、そして空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃にて維持した。マイコプラズマを含まないことを保証する(マイコプラズマ急速検出システム、Gena-Probe Incorporated, USA)ために、細胞系をルーチン的に調べた。
【００７１】
【表２】
2005511008.tif 000003
【００７２】
【表３】
2005511008.tif 000004
【図１】
2005511008.tif 000006
【図２】
2005511008.tif 000007
【図３】
2005511008.tif 000008
【図４】
2005511008.tif 000009
【図５】
2005511008.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月25日(2004.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005511008000001.app
【国際調査報告】
2005511008.tif 000011
2005511008.tif 000012
2005511008.tif 000013
2005511008.tif 000014
2005511008.tif 000015
2005511008.tif 000016