(57)【要約】  被験体の腎臓疾患の治療方法が開示されている。予め決定された発達期に腎臓組織の移植片を被験体に移植し、それにより被験体の腎臓疾患を治療することによって前記の方法は行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠４週から１０週に対応する分化期のヒト腎臓組織の移植片を被験体に移植し、それにより被験体の腎臓疾患を治療する工程を含む、被験体の腎臓疾患の治療方法。
【請求項２】
ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方の発現を実質的に示さない移植片を選択する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して前記選択を行う請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりも少なくとも１つの分子の発現が低い移植片を選択する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して前記選択を行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記の少なくとも１つの分子がリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記の少なくとも１つの分子がＢ７−１、ＣＤ４０、またはＣＤ４０Ｌである請求項４に記載の方法。
【請求項９】
被験体がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト腎臓組織の移植片を、被験体の腎被膜、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、または腹腔内に移植する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療し、それにより被験体におけるヒト腎臓組織の移植片の生着を促進する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
被験体へのヒト腎臓組織の移植片の前記移植の前、前記移植と同時、または前記移植の後に免疫抑制処方計画を使用して被験体の前記治療を行う請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫抑制薬の投与および／または免疫寛容誘導細胞集団の投与によって免疫抑制処方計画を使用した被験体の前記治療を行う請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化期が妊娠５週から９週に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化期が妊娠６週から９週に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分化期が妊娠７週から８週に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化期が妊娠７週に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記分化期が妊娠８週に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
妊娠３週から６週に対応する分化期のブタ腎臓組織の移植片を被験体に移植し、それにより被験体の腎臓疾患を治療する工程を含む、被験体の腎臓疾患の治療方法。
【請求項２０】
ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方の発現を実質的に示さない移植片を選択する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して前記選択を行う請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト１４週齢の胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりも少なくとも１分子の発現が低い移植片を選択する請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して前記選択を行う請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記の少なくとも１つの分子がリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記の少なくとも１つの分子がＢ７−１、ＣＤ４０、またはＣＤ４０Ｌである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
被験体がヒトである請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ブタ腎臓組織の移植片を、被験体の腎被膜、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、または腹腔内に移植する請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療し、それにより被験体におけるブタ腎臓組織の移植片の生着を促進する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
被験体へのブタ腎臓組織の移植片の前記移植の前、前記移植と同時、または前記移植の後に免疫抑制処方計画を使用して被験体の前記治療を行う請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫抑制薬の投与および／または免疫寛容誘導細胞集団の投与によって免疫抑制処方計画を使用した被験体の前記治療を行う請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記分化期が妊娠４週から５週に対応する請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記分化期が妊娠４週に対応する請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記分化期が妊娠５週に対応する請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの分子の発現について組織外植片の細胞または細胞培養物の細胞を試験し、それにより組織外植片または細胞培養物の移植適合性を評価する工程を含む、組織外植片または細胞培養物の移植適合性を評価する方法。
【請求項３６】
ＲＴ−ＰＣＲを介して前記試験を行う請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記の少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記の少なくとも１つの分子がリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記の少なくとも１つの分子がＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＢ７−１である請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、腎臓疾患の治療方法に関する。より詳細には、本発明は、発達中のヒトまたはブタ腎臓組織の移植を介した腎臓疾患の治療方法に関する。
【０００２】
ＭＨＣハプロタイプ適合同種腎臓移植を介した腎臓疾患の治療は広範に実施されており、しばしば救命されているが、その治療モダリティは非常に制限される。
【０００３】
利用可能なドナー器官の希少さおよび多くの場合ドナープール中にほとんど示されていない組織および形態適合ドナーから器官を得る必要性により、毎年多数の腎不全関連死が認められる。
【０００４】
さらに、組織適合腎臓が移植に利用可能な場合でさえも、同種器官を生着および寛容させるために大規模な免疫抑制処方計画を実施する必要がある。これらの処方計画には、発癌性、腎毒性、および身体の感染と戦う能力が非常に弱くなるなどの重篤な副作用を引き起こす強力な免疫抑制薬（シクロスポリンＡなど）の強制的投与が含まれる。
【０００５】
さらに、腎臓移植は、このような手順を首尾よく受けた患者がいつかは急性移植片拒絶反応を起こし、それにより移植片を除去するための緊急の外科的介入を余儀なくされ、その後に別の利用可能な移植適合器官を待つ間に腎臓透析を行う必要があるという点で制限される。
【０００６】
最後に、死体の腎臓を使用することができるにもかかわらず、ドナー腎臓はしばしば移植片レシピエントファミリーメンバーから提供され、メンバーは器官の取り出しのために大規模な手術を経てその腎臓の１つを犠牲にしなければならない。
【０００７】
これらの制限を克服するために種々のアプローチが試みられているかまたは着想されている。
【０００８】
１つのこのようなアプローチは、胚または胎児の腎細胞または組織の移植を使用した完全に分化した腎臓の置換移植を想定する。このような細胞または組織は、非同系移植環境で長期生存可能な固有の免疫学的特徴を有することが見出されている（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ  ＭＲ、２０００、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１４、５１３）。
【０００９】
例えば、１２〜２２週齢のヒト胎児由来の後腎組織は、免疫不全マウス宿主に移植した場合、血管が発達し、急速に成長して機能的腎単位に分化することが証明されている（Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６４、１５５０、Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、印刷中）。このような実験を移植片同種ヒトＰＭＢＣでの宿主免疫再構築によって改変した場合、胎児腎臓移植片の拒絶が誘導されるが、重要なことに、成体腎臓組織同種移植片の拒絶と比較して遅延されることが示された（Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６４、１５５０；Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６４、１５４１；Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１、１６７３）。このような後腎移植片は、組織のアポトーシスおよび破壊の減少ならびに成長期の維持を示すことが見出された（Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６４、５５０；Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、２０００、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６９、１４７０）。
【００１０】
したがって、胎児の同種胚由来の腎臓組織移植片の使用は同種ドナー由来の成体腎臓のそれと比較して移植について免疫学的に有利であることが示されているが、移植片拒絶が遅延されるだけに過ぎず、予防されるわけではない。このようなアプローチの別の欠点は、その臨床適用には法外に大量のヒト後腎細胞または組織が必要であり得ることである。
【００１１】
ブタ異種移植片の移植を介した非腎臓疾患の治療のためのアプローチにおいてこの欠点が取り組まれている。例えば、パーキンソン病治療のための胎児の中脳腹側組織の移植を介した胚または胎児の発達中の組織の移植（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｔ．、２００１、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２１（１）、１０３；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＪＭ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２０００、５４（５）、１０４２）および胎児島細胞の移植を介した膵臓病の治療（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ  Ｔ．ら、１９９９、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６８（１１）、１６７４；Ｇｒｏｔｈ  ＣＧ．ら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７７（１）、１５３）が試みられている。しかし、このような研究には、移植組織の生着を促進するために免疫抑制薬を投与する必要があるか（Ｓｕｂｒａｍａｎｉｎａｎ，Ｔ．、２００１、Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２１（１）、１０３；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＪＭ．ら、２０００、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、５４（５）、１０４２；Ｏｔｏｎｓｋｉら、１９９９、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６８（１１）、１６７４）、または経験的に定義した組織至適条件下での経験的に定義した組織特異的発達期の膵臓組織の移植前ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が必要である。機能的且つ解剖学的に膵臓組織に特異的であり、腎臓組織に対して完全に無関係の組織型であるこれらの経験的に定義した条件を、過度の実験を行うことなく発達中の腎臓組織の至適な移植には容易に適用できない。後者の研究は、さらに、ヒト免疫細胞による移植された移植片の寛容が証明されていない。
【００１２】
したがって、上記制限を欠く腎臓移植片移植を使用した腎臓疾患の治療方法の必要性が広く認識されており、この方法を得ることは非常に有利である。
【００１３】
発明の要約
本発明の１つの態様によれば、妊娠４週から１０週に対応する分化期のヒト腎臓組織の移植片を被験体に移植し、それにより被験体の腎臓疾患を治療する工程を含む、被験体の腎臓疾患の治療方法を提供する。
【００１４】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方を実質的に発現しない移植片を選択する。
【００１５】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して選択を行う。
【００１６】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方の発現を実質的に示さない移植片を選択する。
【００１７】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して選択を行う。
【００１８】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりも少なくとも１つの分子の発現が低い移植片を選択する。
【００１９】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる。
【００２０】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである。
【００２１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はＢ７−１、ＣＤ４０、またはＣＤ４０Ｌである。
【００２２】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、被験体はヒトである。
【００２３】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒト腎臓組織の移植片を、被験体の腎被膜、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、または腹腔内に移植する。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、被験体の腎臓疾患の治療方法は、さらに、免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療し、それにより被験体におけるヒト腎臓組織の移植片の生着を促進する工程を含む。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、被験体へのヒト腎臓組織の移植片の移植の前、移植と同時、または移植の後に免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療する。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、免疫抑制薬の投与および／または免疫寛容誘導細胞集団の投与によって免疫抑制処方計画を使用した被験体の治療を行う。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠５週から９週に対応する。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠６週から９週に対応する。
【００２９】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠７週から８週に対応する。
【００３０】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠７週に対応する。
【００３１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠８週に対応する。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、妊娠３週から６週に対応する分化期のブタ腎臓組織の移植片を被験体に移植し、それにより被験体の腎臓疾患を治療する工程を含む、被験体の腎臓疾患の治療方法を提供する。
【００３３】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの両方の発現を実質的に示さない移植片を選択する。
【００３４】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して選択を行う。
【００３５】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ヒト１４週齢の胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりも少なくとも１分子の発現が低い移植片を選択する。
【００３６】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して選択を行う。
【００３７】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる。
【００３８】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである。
【００３９】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はＢ７−１、ＣＤ４０、またはＣＤ４０Ｌである。
【００４０】
下記の本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、ブタ腎臓組織の移植片を、被験体の腎被膜、腎臓、精巣脂肪、皮下組織、網、または腹腔内に移植する。
【００４１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、被験体の腎臓疾患の治療方法は、さらに、免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療し、それにより被験体におけるブタ腎臓組織の移植片の生着を促進する工程を含む。
【００４２】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、被験体へのブタ腎臓組織の移植片の移植の前、移植と同時、または移植の後に免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療する。
【００４３】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠４週から５週に対応する。
【００４４】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠４週に対応する。
【００４５】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化期は、妊娠５週に対応する。
【００４６】
本発明は、付加的に免疫抑制治療を行うことなく腎臓組織を首尾よく移植する方法を提供することによる、現在公知の構成の欠点に首尾よく取り組む。
【００４７】
本発明のさらに別の態様によれば、少なくとも１つの分子の発現について組織外植片の細胞または細胞培養物の細胞を試験し、それにより組織外植片または細胞培養物の移植適合性を評価する工程を含む、組織外植片または細胞培養物の移植適合性を評価する方法を提供する。
【００４８】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を介して試験を行う。
【００４９】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子は免疫応答を刺激または増強することができる。
【００５０】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はリンパ球コレセプターまたはリンパ球コレセプターリガンドである。
【００５１】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの分子はＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、またはＢ７−１である。
【００５２】
図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図１ａ〜ｄは７、８、１０、および１４週のヒト胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対する同種反応性ヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットを示す図である（それぞれ、図１ａ〜ｄ）。再構成した動物の免疫細胞および再構成した動物の非免疫細胞の移植から４、６、および８週間後に成長を測定した（それぞれ、三角および四角）。
図２ａ〜ｈはヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ａ〜ｄは、１４週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図２ａは、移植から８週間後の移植片（矢印）の拡大図である。図２ｂは、移植腎臓組織中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。図２ｃ〜ｄは、移植腎臓組織の糸球体および尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。図２ｅ〜ｇは、８週の胚由来の完全な寛容移植片を示す。図２ｅは、移植から８週間後の移植後腎（矢印）の拡大図である。図２ｆは、移植腎臓組織のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。図２ｇ〜ｈは、移植腎臓組織の糸球体および尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
図３は移植片同種ヒトＰＢＭＣで再構成されたマウスに移植されたヒト腎臓組織の腹腔内移植片によって形成された尿様流動物で満たされた巨大嚢胞を示す立体顕微鏡写真である。
図４ａ〜ｃは通常のヒトの発達中腎臓、移植直後であるが同種ヒトＰＢＭＣの投与前、ならびに移植片同種ヒトＰＭＢＣでの移植片レシピエントの再構成から２、４、および６週間後の発達中のヒト腎臓における同時刺激分子のｍＲＮＡ発現分析を示す図である。図４ａ〜ｃは、８、１４、および２２週の胎児由来の腎臓組織移植片をそれぞれ示す。
図５ａ〜ｄは３、４、６、および８週齢（それぞれ、図５ａ〜ｄ）のブタ胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対するヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットである。ＰＢＭＣおよび非ＰＢＭＣ再構成動物の移植から４、６、および８週間後に測定した（それぞれ、三角および四角）。
図６ａ〜ｃはヒトＰＢＭＣによる移植成体ブタ腎臓組織の拒絶を示す顕微鏡写真である。図６ａ〜ｂは、ヒトＰＢＭＣの腹膜内注入から４週間後の被膜下成体ブタ腎臓移植片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）組織染色を示すそれぞれ４倍および２０倍の図である。図６ｃは、移植組織中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す。
図７ａ〜ｈはブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ａ〜ｄは、８週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図７ａは、移植から８週間後の移植片（矢印）の拡大図である。図７ｂは、移植腎臓組織のＨ＋Ｅ組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。図７ｃ〜ｄは、損傷した血管および移植組織の細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。図７ｅ〜ｇは、４週の胚由来の完全に寛容された移植片を示す。図７ｅは、移植から８週間後の移植腎臓組織（矢印）の拡大図である。図７ｆは、移植腎臓組織のＨ＋Ｅ組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。図７ｇ〜ｈは、移植腎臓組織の糸球体および尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色をそれぞれ示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。これらの構造はインタクトであり、ヒトＣＤ細胞の浸潤は認められない。
図８ａ〜ｃはヒトＰＢＭＣの移植と組み合わせた被膜下移植から８週間後の３週齢の胚由来のブタ腎臓組織の多能性を示す顕微鏡写真である。図８ａは、血管（右上の矢印）、軟骨（左上の矢印）、および骨（下の矢印）を示す、低倍率（元の４倍）での組織のＨ＋Ｅ組織学的分析を示す。図８ｂ〜ｃは、それぞれ骨および軟骨を示す、高倍率（元の４０倍）のＨ＋Ｅ染色組織を示す。
図９は異種反応性ヒトＰＢＭＣで再構成されたレシピエントに移植されたブタ腎臓組織の腹腔内移植片によって形成された尿様流動物で満たされた巨大嚢胞を示す立体顕微鏡写真である。
【００５３】
好ましい実施形態の説明
本発明は、腎臓疾患の治療方法および移植片の移植適合性の評価方法に関する。詳細には、本発明は、低免疫コレセプター発現レベルを示す移植片を選択し、この移植片がヒト同種反応性または異種反応性エフェクターによって完全に寛容される機能的腎臓器官に成長および分化する、移植用の同種ヒトまたはブタの発達中の腎臓組織移植片に関する。そのようなものとして、レシピエントに移植された場合、このような同種反応性または異種反応性ヒトエフェクター（このような発達中の腎臓組織移植片）を含む免疫器官は、機能的腎臓器官を形成する。
【００５４】
本発明の原理および操作は、図面および添付の明細書を参照してより深く理解することができる。
【００５５】
少なくとも１つの本発明の実施形態を詳細に説明する前に、以下の説明に記載の構成の詳細および要素の配置への適用において本発明が制限されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用した表現および専門用語は説明を目的とし、制限と見なされないと理解すべきである。
【００５６】
発達中の同種ヒトまたはブタ腎臓組織移植片は、レシピエント中で成長および発達することができ、同種または異種ヒトエフェクターをそれぞれ含む免疫系が先行技術に記載されている。
【００５７】
例えば、移植片同種反応性ヒトエフェクターを保有する免疫不全マウス宿主に移植された１２から２２週齢のヒト胎児由来の腎臓組織移植片は、脈管化して機能的腎臓器官への成長および分化が認められ、成体期の腎臓移植片と比較して移植片拒絶が遅延されるが、予防されるわけではない。
【００５８】
別のアプローチでは、免疫不全マウスに移植されたブタ胎児島細胞移植片は、移植後に分化および成熟が認められるが、これらの研究において、移植片がヒト移植片免疫反応性エフェクターによって寛容されることは証明されなかった。さらに、このような移植片の最適なｉｎ  ｖｉｖｏ分化には、大規模な実験後の経験的に定義された膵臓組織特異的条件下での移植前ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が必要である。移植片が最適な生着および分化を誘導すべきである胎児の最適な膵臓組織特異的発達期を決定するためになおさらに大規模な実験が必要であった。
【００５９】
ヒト移植片免疫反応性エフェクターの存在下でブタ胎児組織を使用する他の全てのアプローチは、移植片拒絶を予防するための非常に有毒な細胞免疫障害免疫抑制薬の投与による付加的免疫抑制が必要であった。
【００６０】
したがって、発達中の腎臓組織移植片の移植を使用した全ての先行技術のアプローチは、非移植片同系ヒト移植片反応性免疫エフェクターを含む免疫系を有するレシピエントへの移植後に完全に寛容された機能的腎臓器官への発達のための適切な解決法を得ることができなかった。
【００６１】
本発明の実施において、本発明者らは、被験体への移植後に完全に寛容された機能的腎臓器官に成長および分化することができる腎臓組織移植片を誘導することができる、胚または胎児の固有の発達期を同定した。
【００６２】
このような腎臓組織を使用し、本発明の方法を使用して、免疫抑制治療を使用することなく被験体の腎臓疾患を治療することができる。
【００６３】
非同系移植片はレシピエントと同一である同種起源およびレシピエントと異なる種である異種起源の両方に由来し得ることが当業者に理解される。
【００６４】
本発明の方法によれば、完全に寛容された移植片は、好中球またはＴリンパ球などの宿主免疫系細胞によって拒絶も不能にもされない移植片である。
【００６５】
以下の実施例に記載のように、腎臓移植片を、血漿濃度を超えた尿特異的副産物（例えば、尿素窒素およびクレアチニンなど）を含む流動物の生成によって機能的に特徴付ける。
【００６６】
したがって、本発明の１つの態様によれば、哺乳動物（好ましくは、ヒト）の腎臓疾患の治療方法を提供する。
【００６７】
本発明によって治療することができる腎臓疾患の例には、急性腎不全、急性腎炎症候群、鎮痛薬性腎症、アテローム性腎臓疾患、慢性腎不全、慢性腎炎、先天性ネフローゼ症候群、末期腎臓疾患、グッドパスチャー症候群、ＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎、間質性腎炎、腎臓癌、腎臓損傷、腎臓感染、腎臓傷害、腎臓結石、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎Ｉ型、膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型、膜性腎症、壊死性糸球体腎炎、腎芽細胞腫、腎石灰症、腎性尿崩症、ＩｇＡ媒介腎症、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、多発性嚢胞腎、溶連菌後糸球体腎炎、逆流性腎症、腎動脈塞栓症、腎動脈狭窄症、腎乳頭壊死、尿細管性アシドーシスＩ型、尿細管性アシドーシスＩＩ型、腎臓灌流不足、および腎静脈血栓症が含まれる。
【００６８】
本発明の腎臓疾患の治療方法は、被験体へのヒトまたはブタの発達中の腎臓組織の移植片の移植によって行う。
【００６９】
このような移植片の解剖学的位置は、治療する疾患の性質および重症度によって変化する。腎臓組織を、被験体の腎臓被膜、腎臓、または腹腔内に移植することができる。
【００７０】
例えば、被膜下移植片に、皮膚にあまり延長せずに尿を採取することができるカテーテルを挿入することができ、腹腔内移植片を使用して、腎臓組織移植片の発達中の尿管または腎盂を宿主の排泄系に吻合することができる。あるいは、必要に応じて、移植片を、精巣の脂肪、皮下組織、または網に移植することができる。
【００７１】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、以下の実施例に記載のように、移植片を被験体の腎臓被膜に移植する。
【００７２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、以下の実施例に記載のように、移植片を被験体の腹腔内に移植する。
【００７３】
本発明によって使用される腎臓組織は、好ましくは、胚または胎児由来であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された前駆細胞（胚幹細胞または胚腎臓前駆細胞などが含まれるが、これらに限定されない）由来の腎臓組織の使用もまた、本発明の範囲内である。
【００７４】
ヒト腎臓組織を使用する場合、このような細胞は、好ましくは妊娠４から１０週、より好ましくは妊娠５から９週、最も好ましくは妊娠７から８週に対応する分化期である。
【００７５】
以下の実施例に示す結果によって証明されるように、妊娠８週に対応する分化期の発達中のヒト腎臓組織を使用して首尾よい移植が達成された。
【００７６】
あるいは、本発明の他の態様にしたがって、被験体への妊娠３から６週、好ましくは４から５週に対応する分化期の発達中のブタ腎臓組織の移植片の移植によって腎臓疾患の治療を行う。
【００７７】
最も好ましくは、以下の実施例に示すように、妊娠４週に対応する分化期の発達中のブタ腎臓組織を移植する。
【００７８】
妊娠期間は、発達中の胚または胎児の受精からの経過時間に対応することが当業者に理解される。したがって、発達中の腎臓組織の移植片の分化期は、由来する胚または胎児の発達期に対応する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来の発達中の腎臓組織の場合、その分化期は、類似の発達期の腎臓組織が由来し得る胚または胎児の分化期に対応する。
【００７９】
発達中の腎臓組織には、発達中の腎臓全体またはその一部（各々の細胞を含む）、原腎、中腎、または後腎組織ならびに腎臓組織系統に発達する運命にある任意の組織型を含み得ることも当業者に理解される。
【００８０】
ヒト移植片の拒絶を最小にするために、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりも免疫応答を刺激または増強することができる少なくとも１つの分子の発現が低い移植片を使用して移植を行うことが好ましい。
【００８１】
ブタ移植片の場合、移植片拒絶を最小にするために、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりも免疫応答を刺激または増強することができる少なくとも１つの分子の発現が低い移植片を選択し、それを使用して移植を行うことが好ましい。
【００８２】
本明細書中で使用される、分子の「発現」は、細胞および／または細胞外の生体材料（移植片など）中の分子のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在と定義する。
【００８３】
好ましい実施形態では、移植片中のｍＲＮＡ種発現の分析によって移植片の選択を行う。
【００８４】
好ましくは、移植片などの生体材料中のｍＲＮＡの分析を、以下の実施例の実施例１の「材料と方法」に記載のＲＴ−ＰＣＲ分析によって行う。
【００８５】
あるいは、上記のＲＴ−ＰＣＲ法と等価の検出感度を有する任意のｍＲＮＡ分析方法（例えば、以下の実施例の実施例１に記載のものと異なるプロトコール（ノーザンブロッティングまたはマイクロアレイチップハイブリッド形成）を使用したＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ｍＲＮＡ発現を分析することができる。
【００８６】
移植片などの材料中のタンパク質の存在を検出する方法は、当業者に周知であり、例えば、ウェスタン免疫ブロッティング分析、蛍光フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、ＥＬＩＳＡ、およびマイクロアレイチップハイブリッド形成などが含まれる。
【００８７】
免疫応答を刺激または増強することができる分子の例には、サイトカイン、ケモカイン、炎症媒介物質、および免疫細胞受容体または免疫細胞受容体の可溶性もしくは膜リガンドが含まれる。
【００８８】
免疫細胞の例には、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、マクロファージ、単球、顆粒球、肥満細胞、および好中球などが含まれる。
【００８９】
好ましい実施形態によれば、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりも少なくとも１つのリンパ球コレセプターまたはそのリガンドの発現が低いヒト移植片を選択し、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりも少なくとも１つのリンパ球コレセプターまたはそのリガンドの発現が低いブタ移植片を選択する。
【００９０】
リンパ球コレセプターおよびそのリガンドの例には、ＣＤ２８およびＢ７−１（ＣＤ８０）またはＢ７−２（ＣＤ８６）、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１５４）、ＣＤ２およびＣＤ５８（リンパ球機能関連抗原３、ＬＦＡ−３）ならびにＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）およびＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原１）が含まれる。
【００９１】
１つの好ましい実施形態によれば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、好ましくはＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの発現を実質的に示さない移植片を選択する。
【００９２】
別の好ましい実施形態によれば、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりもＢ７−１の発現が低い移植片を選択し、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりもＢ７−１の発現が低いブタ移植片を選択する。
【００９３】
最も好ましい実施形態によれば、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの発現を実質的に示さず、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりＢ７−１の発現が低いヒト移植片を選択し、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの発現を実質的に示さず、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織の発達期と等価な発達期のブタ胎児の腎臓組織よりもＢ７−１の発現が低いブタ移植片を選択する。
【００９４】
以下の実施例の実施例１は、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの発現を実質的に示さず、ヒト１４週齢胎児の腎臓組織よりＢ７−１の発現が低いヒト移植片は宿主に拒絶されないことを示す。そういうものとして、これらの移植片は、移植片組織としての使用に最も適切である。
【００９５】
実施例（以下）で示した結果は、本発明の方法を使用していかなる免疫抑制形態を使用することなく首尾よく移植することができることを示すにもかかわらず、付加的な免疫抑制を医学的に示す例を挙げることができる。このような場合、移植片拒絶の回避に関して先行技術の方法よりも優れていることが示された本発明の方法は、非常に有毒な免疫抑制薬の投与などの最小の付加的免疫抑制を使用する余裕がある。したがって、本発明の方法は、先行技術の移植方法に関連する付加的免疫抑制治療と比較して副作用が存在する場合でも少ない付加的免疫抑制治療を使用する余裕がある。
【００９６】
したがって、本発明の腎臓疾患患者の治療方法は、移植前、移植中、または移植後に免疫抑制薬および／または移植片ドナー由来寛容誘導細胞集団の投与などの免疫抑制処方計画を使用して被験体を治療するさらなる工程を含み得る。
【００９７】
免疫抑制薬の例には、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０リガンド抗体、抗Ｂ７抗体、ラパマイシン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、シクロホスファミド、およびフルダラビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
寛容誘導細胞集団の例には、脊髄表現型を示す細胞、表面マーカーＣＤ３３を示す細胞、ベト（ｖｅｔｏ）細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
この特許の係属期間中、多数の関連する医学的診断技術が開発され、用語「分析機構」の範囲はこのような新規の全てのテクノロジーを推測的に含むことを意図されることが予想される。
【０１００】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実施例の実験により支持される。
【０１０１】
実施例
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
【０１０２】
一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｎｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１２９６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ、１９９４；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ編、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８４；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１〜１３７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用される）を参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。
【０１０３】
実施例１
７〜８週のヒト胎児から得た発達中の腎臓組織の移植片は、同種反応性ヒトＰＢＭＣによって完全に寛容される機能的腎臓器官に発達する
ヒト腎臓同種移植片拒絶の最小化、好ましくは完全な回避は、腎臓障害治療の非常に望ましい治療目的である。先行技術のアプローチは、発達中の腎臓組織の同種移植片は成体期の腎臓同種移植片と比較して弱い同種免疫応答を誘導することが示されている。本発明の着想時に、発達中の腎臓組織が移植後に機能的腎臓器官に発達するのに十分に分化した最も初期の発達期は、このような移植片の同種免疫拒絶が最適に最小化されるか、おそらく完全に排除される発達期に対応するという仮説を立てた。したがって、本発明の実施において、下記の同種ヒトＰＢＭＣで再構成した免疫不全マウスへの移植後に種々の妊娠期由来の発達中の腎臓組織の運命の試験によって、発達中のヒト腎臓組織の最適な発達期などを確認する実験を行った。
【０１０４】
材料と方法：
マウス移植片宿主の調製：
３月齢のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｏｌａｃ，Ｓｈａｗ’ｓ  Ｆａｒｍ、Ｂｌａｃｋｔｈｏｒｎ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、Ｏｘｏｎ、ＵＫ）を、移植研究の宿主として使用した。全てのマウスを小さなケージに保持し（ケージあたり５〜１０匹）、滅菌した食餌およびシプロフロキサシン（２０ｍｇ／ｍｌ）を含む酸性水を与えた。以前に記載のように（Ｉ．Ｌｕｂｉｎら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ、８３、２３６８）、７５ｃｍの皮膚焦点距離および０．７Ｇｙ／分の線量率を使用した１５０−Ａ６０Ｃｏγ線源（Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ、Ｋａｎａｔａ、Ｏｎｔａｒｉｏによって得る）による分割線量全身照射（ＴＢＩ；３．５Ｇｙおよび３日後の９．５Ｇｙ）にマウスを曝露した。以前に記載のように（Ｍ．Ｌｅｖｉｔｅら、１９９５、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２、１３８）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウス由来の骨髄細胞（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）を、４〜８週齢のマウスの大腿骨および脛骨体から洗い出した。レシピエントＢａｌｂ／ｃマウスを、１ｍｌのＰＢＳ中で静脈内投与した３×１０６ＳＣＩＤ骨髄細胞およびその１日後のＴＢＩの第２フラクションで再構成した。得られたＳＣＩＤ様動物は、機能的ヒト造血細胞または固形組織を見事に生着させた（Ｈ．Ｍａｒｃｕｓら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ、８６、３９８；Ｈ．Ｓｅｇａｌｌら、１９９６、Ｂｌｏｏｄ、８８，８８；Ｙ．Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ｓ．Ｄａｇａｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、２４２；Ｗ．Ｏ．Ｂｏｃｈｅｒら、２００１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１、２０７１）。
【０１０５】
発達中の腎臓組織の採取：
発達中のヒト腎臓組織を、ヘルシンキ委員会の同意を得た掻爬によって獲得し、以前に記載のように（Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ．ら、１９９８、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５４、２７）、後腎を解剖顕微鏡下で胚から外科的に切り出した。
【０１０６】
発達中の腎臓組織の移植：
以下のように、発達中のヒト腎臓組織を、照射宿主のＳＣＩＤ骨髄での再構成から７〜１０日後に移植した。腎臓組織を、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を補足したＲＰＭＩ１６４０またはダルベッコ改変イーグル培地中、滅菌条件下にて４℃で約２時間維持した。２．５％アベルチンのＰＢＳ溶液の腹膜内注射（１０ｍｌ／ｋｇ体重）によって誘導される一般的麻酔条件下で、腎臓移植を行った。宿主の両腎臓を両側切開によって露呈し、腎臓被膜の尾部末端を１．５ｍｍ切開し、腎臓組織の１ｍｍ３断片を各腎臓被膜下に移植した。免疫特権が腎臓被膜下空間特異的である可能性を制御するために、腎臓組織を腹腔内にも移植した。いくつかの実験では、腎臓組織を移植し、精巣脂肪塊上に縫合した（５−０縫合）。移植マウスを、手術後にシプロフロキサシンを含む飲料水で７日間処置した。
【０１０７】
ヒトＰＢＭＣでのマウスの生着：
腎臓組織の移植から１から３日後、上記のように、１０８ヒトＰＢＭＣを宿主マウスに腹膜内注射した。ヒトＰＢＭＣを、以下のように正常なボランティアから得た軟膜から作製した。血液サンプルをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ液（Ｎｙｃｏｍｅｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）のクッション上に被覆して２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、境界層を回収し、２回洗浄し、細胞を計数し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で所望の濃度に再懸濁した。コントロールマウスには、ヒトＰＢＭＣを投与しなかった。ヒトリンパ球生着の分析のために、ＰＢＭＣ注入から１０〜１４日後に腹膜から細胞を採取した。１細胞懸濁液を、標識抗ヒトＣＤ３−ＰＥおよびＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（全人類的白血球抗原）抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ分析器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、ヒト抗原の２色または３色蛍光分析を行った。標準的な前方および側方散乱特性を介して選択的にゲーティングしたリンパ球由来のデータを収集した。
【０１０８】
移植片の浸潤、成長、および分化の分析：
以下のように、ヒト免疫細胞の浸潤ならびに発達中の腎臓組織の成熟した糸球体および尿細管への成長および発達を、移植後にモニターした。
【０１０９】
移植片レシピエントを、ヒトＰＢＭＣ投与から４、６、８、および１０週間後に屠殺した。腎臓組織の移植片を、最初に、被膜下または腹腔内部位での移植片の巨視的実験（色、直径）によって生着および成長について評価した。次いで、腎臓およびその被膜を取り出し、１０％パラフィン中で固定した。
【０１１０】
腎臓構造の視覚化のために、移植片を切片にし、ポリ−Ｌ−リジンでコートしたスライド上にのせ、移植片の分化、細胞浸潤、および組織損傷の評価のために切片をＨ＋Ｅ染色した。次いで、群あたり３個の移植片における移植片あたり１０個の連続する強拡大視野（ＨＰＦ；４０倍）での成熟糸球体および尿細管の計数によって移植片発達の評価を行った。各測定時点での群あたり少なくとも３個の移植片についての移植後サイズ：移植前サイズの比の決定によって移植片成長を評価した。
【０１１１】
移植片のヒトＴ細胞浸潤を、以前に記載のように（Ｍ．Ｔ．Ｎａｖｅｈら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０、２４３４）、切片中のＣＤ３＋細胞の染色および群あたり３個の移植片における移植片あたり１０個の連続する顕微鏡視野（１００倍）中のＣＤ３＋細胞の計数によって定量した。この場合、移植片のパラフィン組織ブロックを４〜６μｍ厚さに切断し、キシレンで脱パラフィン処理し、再水和し、３％Ｈ２Ｏ２を含むエタノール中に１５分間置いて、内因性ペルオキシダーゼを遮断した。スライドを水道水で完全に洗浄し、ＰＢＳに移した。次いで、切片を、１％ウシ血清アルブミンで処理してバックグラウンド染色を防止し、ウサギ抗ヒトＣＤ３抗体（ｐａｎＴ細胞；Ｄａｋｏ）と共に室温の湿室中で１時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで３分間リンスし、ビオチン化抗ウサギ抗体と３０分間インキュベートし、次いで、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＳｔｒＡｖｉｇｅｎ；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）と３０分間インキュベートした。リンス後、ペルオキシダーゼ標識を、１５分間のインキュベーションおよび製造者（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）の説明書にしたがって免疫組織染色キットを使用してメイヤーヘマトキシリンで対比染色した。試薬３−アミノ−９−エチルカルバゾールにより、アルコールに可溶で、水性封入剤（カイザーグリセロールゼラチン）と共に使用することができる赤色生成物が生成された。上記全工程に従うが、一次抗体の添加を省略した工程によって、Ｔリンパ球染色についての負のコントロールを作製した。染色は、ヒトＰＢＭＣを注入していないコントロールマウス由来の移植片では一様に負であることが見出された。
【０１１２】
移植片における同時刺激分子発現の分析：同定された複数の同時刺激経路の内、証拠の増加により、Ｔ細胞同時刺激受容体ＣＤ２８およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現したその各リガンドＢ７−１／Ｂ７−２およびＣＤ４０との相互作用が同種抗原に対するＴ細胞応答に重要であることが示唆される（Ｍ．Ｈ．Ｓａｙｅｇｈ，Ｌ．Ａ．Ｔｕｒｋａ、１９９８、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３８、１８１３）。
【０１１３】
したがって、同時刺激分子の発現を下方制御するこのような腎臓組織の結果として、ヒト免疫細胞が８週齢の胎児由来の同種ヒト腎臓組織の移植片を拒絶しないかどうかを試験するための実験を以下のように行った。
【０１１４】
８、１４、および２２週齢の胎児由来の移植腎臓組織におけるＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０、およびＣＤ４０ＬのｍＲＮＡ発現を、移植前、移植直後であるが同種ヒトＰＢＭＣ注入前、およびヒトＰＢＭＣでのマウス再構成から２、４、および６週間後にＲＴ−ＰＣＲを介して分析した。
【０１１５】
全ＲＮＡの単離のために、製造者の説明書にしたがって、ガラス−テフロン組織ホモジナイザーを使用して、Ｔｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＩＮＣ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）中で腎臓組織をホモジナイズした。単離全ＲＮＡを風乾し、無ヌクレアーゼ水で再懸濁し、分光側光法によって定量した。１μｇの全ＲＮＡアリコートを、標準的手順に従ってＡＭＶ逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写した。逆転写反応によるｃＤＮＡ産物を、滅菌水で５０倍、１００倍、および５００倍に希釈し、熱安定性Ｔｆ１ＤＮＡポリメラーゼを含み、４０μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０μｌ反応混合物を使用して同時刺激受容体配列のＰＣＲ増幅を行った。全ての実験では、逆転写酵素を逆転写反応混合物から取り除くか、これに緩衝液のみを添加する制御反応により汚染ＤＮＡ由来の増幅の可能性を排除した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）  ＧｅｎＢａｎｋ  ライブラリーを用いて全プライマー配列の相同性検索を行って、ヒトに関連するが対応するマウス遺伝子ではない遺伝子についてのプライマー特異性を確認した。さらに、非標的配列の非特異的増幅を最小にするために、ＰＣＲアニーリング温度を高温（６４℃）に設定した。順番に示した以下のセンスおよびアンチセンスプライマーをＰＣＲ増幅に使用した：Ｂ７−１、５’−ＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１）および５’−ＡＧＧＡＧＡＧＧＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣ３’（配列番号２）；Ｂ７−２、５’−ＣＡＣＴＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴＴＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号４）；ＣＤ４０、５’−ＣＴＣＴＧＣＡＧＴＧＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号５）および５’−ＧＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号６）；ＣＤ４０Ｌ、５’−ＴＡＴＣＡＣＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号７）および５’−ＣＣＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＴＣＡ−３’（配列番号８）；ＨＬＡ−ＤＲ、５’−ＡＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣ−３’（配列番号９）および５’−ＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１０）；β−アクチン、５’−ＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１２）。産物増幅の直線増幅期のＰＣＲシグナルを検出するために、１ＰＣＲ反応あたり２０〜３５の熱サイクルを行った。以前に記載のように（Ｖ．Ｋ．Ｓｈａｒｍａら、１９９６、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６２、１８６０）、ＰＣＲ反応産物を、１．５％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ照射下で撮影した。比較すべき組織サンプル中の同時刺激分子の転写物を、単一のマスター試薬混合物を使用して並行して増幅させた。各サンプルについて、少なくとも３���試験した。
【０１１６】
実験結果：
基礎実験条件を確立するための予備実験時に、レシピエントマウスに移植したヒト成体腎臓組織移植片の完全な拒絶を誘導することができる１０８ヒトＰＢＭＣの注入の最小数を同定した（データ示さず）。このような注入の４週間後、移植片の大規模な浸潤が認められ、移植片組織の破壊および拒絶が明らかであった（表１）。
【０１１７】
対照的には、同一の条件下で、１４週の胎児由来の腎臓組織の移植片は、移植後４週間で拒絶されず、むしろ顕微鏡ＨＰＦ（表１）あたり平均３９．８±７．８個のヒトＴリンパ球が浸潤されること以外は全ての移植片の有意な成長が認められた（図１ｄ）。それにもかかわらず、このような移植片の移植後６週間および８週間の分析では、移植片の変質が明らかであった（表１、図２ａ〜ｄ）。細胞浸潤および組織変質全体を図２ｂに示し、図２ｃ〜ｄはそれぞれ尿細管および糸球体の代表的破壊を示す。ＰＢＭＣ注入および非ＰＢＭＣ注入宿主由来の移植片について平均移植片サイズが１２．３±１．８に対して６．２±０．９（ｐ＜０．０１）で証明されるように、移植片成長は移植後８週間で停止することも認められた（表１、図１ｄ）。これらおよび１０週の胎児由来の腎臓組織移植片分析から得た類似の所見（表３、図４ｃ）は、同種ヒトＰＢＭＣが成体期の腎臓組織の移植片と比較してこれらの腎臓形成期では移植片拒絶が遅延されることを示した。
【表１】
2005511501.tif 000002
１移植後４週間後の抗ヒトＣＤ３の免疫染色および群あたり３つの移植片における移植片あたり１０個の連続ＨＰＦ（１００倍）におけるＣＤ３＋細胞の計数によってデータを得た。
２３移植片／群における移植片あたり１０個の連続ＨＰＦ（４０倍）中の成熟糸球体および尿細管の計数によって移植後６〜８週で分化を評価した。妊娠８週未満の胚の移植前組織では、糸球体および尿細管は存在しない。
３組織（Ｈ＋Ｅ）および移植片の成長を評価した。移植片の成長（移植後：移植前直径比で公式化）を、ＰＢＭＣ注入に供していないコントロール移植片の成長と比較した。各群において少なくとも３つの移植片を評価した。移植後８週で、各コントロールと比較して１０週および１４週の胎児由来の移植片が有意に減少した（図１および本文を参照のこと）。
４移植後４週間で全成体腎臓移植片は大規模に浸潤され、激しく損傷し、以前に証明された（Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９７、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６４、１５４１；Ｄｅｋｅｌ  Ｂ．ら、１９９９、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１、１６７３）急性細胞拒絶を示す。データを、平均±ＳＥＭで示す。
【０１１８】
それに対して、７週の胚または８週の胎児由来の腎臓組織移植は、非ＰＢＭＣ注入マウス由来の移植片と同一の持続成長速度プロフィールを示した（それぞれ表１、図１ａ、および図１ｂ）。養子導入ヒト免疫効果細胞によるいかなる拒絶徴候も示さない機能的成熟腎臓器官への８週胎児由来の腎臓組織の分化もまた明確に認められた（表１、図２ｅ〜ｈ）。図２ｅは、このような移植片の典型的な腎臓形態を示す腎臓器官への大規模な成長を示す。移植片の顕微鏡分析により、リンパ球の浸潤が存在しないで十分に形成された糸球体および尿細管への分化が明確に証明された（図２ｆ〜ｈ）。
【０１１９】
８週胎児由来の腎臓組織の移植片により、移植後移植片が移植マウスの血清よりも有意に高レベルの腎臓代謝副産物である尿素窒素およびクレアチニンを含む流動物で満たされた巨大嚢胞（図３）を形成することが見出された（表２）。
【表２】
2005511501.tif 000003
【０１２０】
尿様流動物のこのような生成は、移植片が腎臓機能を有する腎臓器官に発達したことを明確に示した。膀胱尿と比較して嚢胞流動体中で測定された尿マーカー濃度が低いことは、腎臓機能のみが部分的に発達する未成熟発達期で腎臓組織によって嚢胞流動物が生成されるという事実に起因する。一方、膀胱尿は完全に機能的な成体期の腎臓の生成物である。
【０１２１】
図４に示すように、ＰＣＲ分析では、移植後６週間までの間に８週のヒト胎児由来の腎臓組織の移植片中にＣＤ４０またはＣＤ４０ＬのｍＲＮＡ発現は検出されなかった（図４ａ）。対照的に、移植後４週間までの１４週および２２週胎児由来の腎臓組織の移植片中でこのような発現が検出された（それぞれ、図４Ｂおよび４ｃ）。さらに、移植およびＰＢＭＣ注入後のＢ７−１発現は、１４週および２２週の胎児由来の腎臓組織の移植片（それぞれ、図４ｂおよび４ｃ）と比較して、８週の胎児由来の腎臓組織の移植片（図４ａ）で有意な下方制御が見出された。
【０１２２】
したがって、同時刺激分子の遺伝子発現パターンは、７週または８週のヒト胎児由来のヒト腎臓組織の移植片に対するヒト同種エフェクターによる免疫応答が完全にないｉｎ  ｖｉｖｏデータと一致し、それにより本発明の機能性の基礎をなす機構が得られる。
【０１２３】
まとめると、これらの結果は、７週から８週のヒトの胚または胎児由来の腎臓組織の移植した移植片は、その成長および発達が同種ヒトＰＢＭＣによって完全に寛容された、完全に形成され、脈管化し、機能的な腎臓器官に分化する能力を有することを明確に証明している。このような妊娠初期の腎臓組織が移植の最適な時期を示すという所見は、先行技術の実験由来の結果を腎臓組織移植に適用することはできないという事実を浮き彫りにする。際立って対照的に、発達中の膵臓組織の移植を含むこれらの先行技術の研究により、妊娠終期の発達中の組織が移植に最適であることが見出されることが示唆された（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ  Ｔ．ら、１９９９、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６８（１１）、１６７４）。
【０１２４】
したがって、先行技術の動物研究はヒト免疫効果の存在下での移植片寛容を証明していないか、先行技術で適用されたアプローチは同種拒絶の予防のために毒性の高い免疫抑制薬の一生涯の投与を必要とするので、本発明の方法のこの態様は、先行技術のヒト腎臓疾患の治療のためのヒト腎臓同種移植の利用方法よりも劇的に改良されている。
【０１２５】
実施例２
４週齢のブタ胎児由来の腎臓組織移植片は、異腫ヒトＰＢＭＣによって完全に寛容される形態学的に分化した機能的腎臓器官に発達する
ヒト腎臓移植を介した腎臓疾患の治療は、ドナー器官の適合可能性に制限される。この障害に対する１つの有望な解決法は、固形器官移植片の移植時の場合のように、ドナー血管の代わりに宿主血管によって脈管化される長所として超急性拒絶の回避のために移植用のヒト移植片の代わりに最適に適用可能であると考えられるブタ後腎移植片などの異種腎臓移植片を使用することである（Ｄ．Ｐ．Ｈｙｉｎｋら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７０、Ｆ８８６；Ｂ．Ｒｏｂｅｒｔら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７１、Ｆ７４４）。したがって、ヒト免疫細胞によるブタ腎臓移植片拒絶の最小化または好ましくは完全な回避は、腎臓障害治療の非常に望ましい治療目的である。先行技術のアプローチは、発達中の腎臓組織の移植片は成体期の腎臓同種移植片と比較して同種免疫応答が弱められることを示した。本発明の着想時に、本発明者らは、発達中の腎臓組織が移植後に機能的腎臓器官に発達するのに十分に分化する最も早い発達期はこのような移植片の拒絶が最適に最小化するか、理想的には完全に回避することができる発達期に対応するという仮説を立てた。
【０１２６】
したがって、ブタ腎臓組織のこのような最適な発達期を、下記のように異種反応性ヒトＰＢＭＣで再構成した免疫不全マウスへの種々の発達期での移植によって同定した。
【０１２７】
材料と方法：
マウス移植片宿主の調製：
実施例１のように行った。
【０１２８】
腎臓組織の採取：
３から８週齢のブタ胎児由来の腎臓組織および成体ブタ腎臓組織を、Ｌａｈａｖ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｌａｈａｖ、Ｉｓｒａｅｌの支援によって入手した。以前に記載の技術（Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ．ら、１９９８、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５４、２７）を使用して、ブタ後腎を、胎児から外科的に切り出した。
【０１２９】
腎臓組織の移植：
実施例１のように行った。
【０１３０】
生着マウスのヒトＰＢＭＣでの注入：
実施例１のように行った。
【０１３１】
移植片の浸潤、成長、および分化の分析：
実施例１のように行った。
【０１３２】
移植片腎臓機能の分析：
異種反応性ヒトＰＢＭＣの注入と組み合わせて移植した４週の胚由来の腎臓組織の腹腔内移植片によって形成された巨大嚢胞から採取した流動物中の腎機能マーカーである尿素窒素およびクレアチニンの検出および定量を介して移植片腎臓機能の分析を行った。移植後８週間の嚢胞流動物中の腎機能マーカーレベルを測定し、移植マウスの血清および膀胱尿中で測定されたレベルと比較した。
【０１３３】
実験結果：
基礎実験条件を確立するための予備実験時に、１０８個のヒト単核細胞の注入が、レシピエントマウスに移植されたブタ成体腎臓組織移植片の完全な拒絶を誘導することができる最小数であることが同定された（データ示さず）。このような注入の４週間後、移植片は大規模に浸潤され、移植片組織の破壊および拒絶が明らかであった（表３）。
【０１３４】
対照的に、同一の条件下で、８週の胎児由来の腎臓組織の移植片は、非ＰＢＭＣ注入マウス（図５）と同一の持続成長プロフィールを示し、拒絶される代わりに、平均４０．５±６．７のヒトＴリンパ球／顕微鏡ＨＰＦで浸潤され（表３）、ヒトＴ細胞による腎臓柔組織の破壊が示される（図６ｃ）。
【表３】
2005511501.tif 000004
１移植後４週間後の抗ヒトＣＤ３の免疫染色および群あたり３つの移植片における移植片あたり１０個の連続ＨＰＦ（１００倍）におけるＣＤ３＋細胞の計数によってデータを得た。
２３移植片／群における移植片あたり１０個の連続ＨＰＦ（４０倍）中の成熟糸球体および尿細管の計数によって移植後６〜８週で分化を評価した。
３組織（Ｈ＋Ｅ）および移植片の成長を評価した。移植片の成長（移植後：移植前直径比で公式化）を、非ＰＢＭＣ注入コントロール移植片の成長と比較した。各群において少なくとも３つの移植片を評価した。移植後８週で、各非ＰＢＭＣ注入コントロールと比較して６週の胚および８週の胎児由来の腎臓組織の移植片が有意に減少した（図５および本文を参照のこと）。
４移植後４週間で全成体腎臓移植片は大規模に浸潤され、激しく損傷した。データを、平均±ＳＥＭで示す。
【０１３５】
しかし、移植後６週間よおび８週間での分析は、６つの移植片のうちの５つで拒絶の徴候を示すことが示された（表３および図７ａ〜ｄ）。図７ｂは、糸球体および尿細管の破壊および全体的な移植片の変質を示す。図７ｃおよび７ｄは、それぞれヒトＴ細胞による血管および細管の破壊を示す。それぞれＰＢＭＣ注入宿主または非ＰＢＭＣ注入宿主由来の移植片について４．３±０．６：７．３±１．１（ｐ＜０．０２）の平均移植片サイズ比によって証明されるように、移植片の成長は移植後８週間で停止されることも示された。６週の胚由来の腎臓組織移植片の分析から得たこれらおよび類似の所見（表３、図５ｃ）は、これらの腎臓生成期での移植片の異種ヒトＰＢＭＣ誘導拒絶は成体腎臓組織移植片と比較して明らかに遅延することを示した。
【０１３６】
他方では、３週および４週のブタ胚由来の腎臓組織の移植片は、非ＰＢＭＣ再構成マウス由来の移植片と同一の持続成長速度プロフィールを示した（それぞれ表３、図５ａ、および図５ｂ）。異種ヒト免疫エフェクターによるいかなる拒絶徴候も示さない４週の胚由来の腎臓組織の成熟腎臓器官への分化もまた明らかであった（表３、図７ｅ〜ｈ）。図７ｅは、このような移植片の典型的な腎臓形態を示す腎臓器官および外部血管床への大規模な成長を示す。移植片の顕微鏡分析により、いかなるリンパ球の浸潤または組織拒絶の徴候が存在しないで十分に形成された糸球体および尿細管の分化が明らかに証明された（ＨＰＦあたり、糸球体で７．０±１．０および尿細管で３５．５±５．１）（図７ｆ〜ｈ）。
【０１３７】
３週の胚由来の腎臓組織移植の分析は、９つの移植片のうち５つの移植片が、糸球体および尿細管をほとんど含まないが、軟骨および骨などの分化した誘導体を含む巨大な奇形腫に発達することを示した（図８）。対照的に、４週の胚の腎臓組織移植片は奇形腫に発達しなかった。
【０１３８】
４週胚の腎臓組織移植片は、移植マウスの血清よりも有意に高レベルの腎臓代謝副産物である尿素窒素およびクレアチニンを含む流動物で満たされた巨大嚢胞（図９）を形成することが見出された（表４）。このような尿様流動物の生成は、移植片が腎臓機能を有する腎臓器官に発達したことを明らかに示した。膀胱尿と比較して嚢胞流動物中で測定された尿マーカー濃度が低いことは、腎臓機能のみが部分的に発達する未成熟発達期で腎臓組織によって嚢胞流動物が生成されるという事実による。一方、膀胱尿は完全に機能的な成体期の腎臓の生成物である。
【表４】
2005511501.tif 000005
【０１３９】
したがって、これらの実験により、成長および発達が完全に寛容され、異種反応性ヒトＰＢＭＣに影響を受けない完全に形成されて脈管化された機能的腎臓器官に発達することができる移植片の最適な発達期を示す４週齢のブタ胚由来の腎臓組織が首尾よく同定された。したがって、本発明のブタ腎臓組織移植片を使用して、いかなる免疫抑制の形態を使用することなく腎臓疾患を有効に治療することができる。このようなものとして、本発明の方法により、望ましくない副作用を起こす非常に有毒な薬剤を使用した免疫抑制治療を強制的に必要とするレシピエント非同系ブタ腎臓組織移植片を使用した先行技術の腎臓疾患の治療方法を超えた劇的な改良がもたらされる。
【０１４０】
実施例３
最小の免疫抑制で７から８週のヒト胎児または４週のブタ胚由来の腎臓組織片を移植してヒト腎臓疾患を治療することができる
それぞれ実施例１および２に示す本発明の実施において、７から８週のヒト胎児または４週のブタ胚由来の腎臓組織の移植片は、いかなる付加的免疫抑制治療形態を使用することなくそれぞれ同種または異種反応性ヒト免疫エフェクターによって完全に寛容される形態学的に分化した機能的腎臓器官に発達する。
【０１４１】
したがって、それぞれ同種または異種反応性ヒト免疫エフェクターによる寛容が最大である発達期の上記のヒトおよびブタ腎臓組織の移植片を使用して、好ましい場合に最小の付加的免疫抑制治療を使用してヒト腎臓疾患を治療する。
【０１４２】
このようなものとして、非常に望ましくない副作用を起こす最小レベルの強力な免疫抑制薬の投与により首尾よく移植を達成することができるので、本発明の方法のこの態様は、ヒト腎臓疾患を治療するために同種ヒトまたは異種ブタ腎臓組織移植片を使用する先行技術の方法よりも非常に改良されている。
【０１４３】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、特許、特許出願、および本明細書中に記載したアクセッション番号によって識別される配列は、その全体が、それぞれの刊行物、特許、特許出願、および本明細書中に記載したアクセッション番号によって識別される配列があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１ａ】７週のヒト胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対する同種反応性ヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットを示す図である。
【図１ｂ】８週のヒト胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対する同種反応性ヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットを示す図である。
【図１ｃ】１０週のヒト胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対する同種反応性ヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットを示す図である。
【図１ｄ】１４週のヒト胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対する同種反応性ヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットを示す図である。
【図２ａ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ａは、１４週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図２ａは、移植から８週間後の移植片（矢印）の拡大図である。
【図２ｂ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｂは、１４週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図２ｂは、移植腎臓組織中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。
【図２ｃ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｃは、１４週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図２ｃは、移植腎臓組織の糸球体中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図２ｄ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｄは、１４週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図２ｄは、移植腎臓組織の尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図２ｅ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｅは、８週の胚由来の完全な寛容移植片を示す。図２ｅは、移植から８週間後の移植後腎（矢印）の拡大図である。
【図２ｆ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｆは、８週の胚由来の完全な寛容移植片を示す。図２ｆは、移植腎臓組織のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。
【図２ｇ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｇは、８週の胚由来の完全な寛容移植片を示す。図２ｇは、移植腎臓組織の糸球体中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図２ｈ】ヒト腎臓組織移植片に対する同種反応性ＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図２ｈは、移植腎臓組織の尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図３】移植片同種ヒトＰＢＭＣで再構成されたマウスに移植されたヒト腎臓組織の腹腔内移植片によって形成された尿様流動物で満たされた巨大嚢胞を示す立体顕微鏡写真である。
【図４ａ】通常のヒトの発達中腎臓、移植直後であるが同種ヒトＰＢＭＣの投与前、ならびに移植片同種ヒトＰＭＢＣでの移植片レシピエントの再構成から２、４、および６週間後の発達中のヒト腎臓における同時刺激分子のｍＲＮＡ発現分析を示す図である。図４ａは、８週の胎児由来の腎臓組織移植片をそれぞれ示す。
【図４ｂ】通常のヒトの発達中腎臓、移植直後であるが同種ヒトＰＢＭＣの投与前、ならびに移植片同種ヒトＰＭＢＣでの移植片レシピエントの再構成から２、４、および６週間後の発達中のヒト腎臓における同時刺激分子のｍＲＮＡ発現分析を示す図である。図４ｂは、１４週の胎児由来の腎臓組織移植片をそれぞれ示す。
【図４ｃ】通常のヒトの発達中腎臓、移植直後であるが同種ヒトＰＢＭＣの投与前、ならびに移植片同種ヒトＰＭＢＣでの移植片レシピエントの再構成から２、４、および６週間後の発達中のヒト腎臓における同時刺激分子のｍＲＮＡ発現分析を示す図である。図４ｃは、２２週の胎児由来の腎臓組織移植片をそれぞれ示す。
【図５ａ】３週齢のブタ胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対するヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットである。
【図５ｂ】４週齢のブタ胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対するヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットである。
【図５ｃ】６週齢のブタ胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対するヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットである。
【図５ｄ】８週齢のブタ胚または胎児由来の移植腎臓組織の成長に対するヒトＰＢＭＣの効果を示すデータプロットである。
【図６ａ】ヒトＰＢＭＣによる移植成体ブタ腎臓組織の拒絶を示す顕微鏡写真である。図６ａは、ヒトＰＢＭＣの腹膜内注入から４週間後の被膜下成体ブタ腎臓移植片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）組織染色を示す４倍の図である。
【図６ｂ】ヒトＰＢＭＣによる移植成体ブタ腎臓組織の拒絶を示す顕微鏡写真である。図６ｂは、ヒトＰＢＭＣの腹膜内注入から４週間後の被膜下成体ブタ腎臓移植片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）組織染色を示す２０倍の図である。
【図６ｃ】ヒトＰＢＭＣによる移植成体ブタ腎臓組織の拒絶を示す顕微鏡写真である。図６ｃは、移植組織中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す。
【図７ａ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ａは、８週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図７ａは、移植から８週間後の移植片（矢印）の拡大図である。
【図７ｂ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｂは、８週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図７ｂは、移植腎臓組織のＨ＋Ｅ組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。
【図７ｃ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｃは、８週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図７ｃは、損傷した血管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図７ｄ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｄは、８週の胎児由来の移植片に対するＰＢＭＣの悪影響を示す。図７ｄは、損傷した移植組織の細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図７ｅ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｅは、４週の胚由来の完全に寛容された移植片を示す。図７ｅは、移植から８週間後の移植腎臓組織（矢印）の拡大図である。
【図７ｆ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である図７ｆは、４週の胚由来の完全に寛容された移植片を示す。図７ｆは、移植腎臓組織のＨ＋Ｅ組織染色を示す顕微鏡写真である（元の１０倍）。
【図７ｇ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｇは、４週の胚由来の完全に寛容された移植片を示す。図７ｇは、移植腎臓組織の糸球体中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図７ｈ】ブタ腎臓組織移植片に対する異種反応性ヒトＰＢＭＣの異なる効果を示す写真である。図７ｈは、移植腎臓組織の尿細管中のヒトＣＤ３の免疫染色を示す顕微鏡写真である（元の４０倍）。
【図８ａ】ヒトＰＢＭＣの移植と組み合わせた被膜下移植から８週間後の３週齢の胚由来のブタ腎臓組織の多能性を示す顕微鏡写真である。図８ａは、血管（右上の矢印）、軟骨（左上の矢印）、および骨（下の矢印）を示す、低倍率（元の４倍）での組織のＨ＋Ｅ組織学的分析を示す。
【図８ｂ】ヒトＰＢＭＣの移植と組み合わせた被膜下移植から８週間後の３週齢の胚由来のブタ腎臓組織の多能性を示す顕微鏡写真である。図８ｂは、骨を示す、高倍率（元の４０倍）のＨ＋Ｅ染色組織を示す。
【図８ｃ】ヒトＰＢＭＣの移植と組み合わせた被膜下移植から８週間後の３週齢の胚由来のブタ腎臓組織の多能性を示す顕微鏡写真である。図８ｃは、軟骨を示す、高倍率（元の４０倍）のＨ＋Ｅ染色組織を示す。
【図９】異種反応性ヒトＰＢＭＣで再構成されたレシピエントに移植されたブタ腎臓組織の腹腔内移植片によって形成された尿様流動物で満たされた巨大嚢胞を示す立体顕微鏡写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号１〜１２は一本鎖ＤＮＡプライマーの配列である。
【配列表】
2005511501.tif 000006
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2005511501.tif 000008
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【図１ａ】
2005511501.tif 000010
【図１ｂ】
2005511501.tif 000011
【図１ｃ】
2005511501.tif 000012
【図１ｄ】
2005511501.tif 000013
【図２ａ】
2005511501.tif 000014
【図２ｂ】
2005511501.tif 000015
【図２ｃ】
2005511501.tif 000016
【図２ｄ】
2005511501.tif 000017
【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
2005511501.tif 000026
【図５ｂ】
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【図５ｃ】
2005511501.tif 000028
【図５ｄ】
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【図６ａ】
2005511501.tif 000030
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
2005511501.tif 000032
【図７ａ】
2005511501.tif 000033
【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図７ｇ】
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【図７ｈ】
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【図８ａ】
2005511501.tif 000041
【図８ｂ】
2005511501.tif 000042
【図８ｃ】
2005511501.tif 000043
【図９】
2005511501.tif 000044
【国際調査報告】
2005511501.tif 000045