(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現、代謝産物又はタンパク質のレベルを解析する方法、細胞の示差的プロファイルを作製するためのその方法の使用、並びに疾患の診断及び細胞の処理に用いる新規化合物の作用様式の診断におけるそのプロファイルの使用に関する。細胞の分子プロファイルを得るためのこれらの簡略化した方法は、当業者が細胞内の選択されたクラスの分子レベルについてプロファイルを作製することを可能にする利点を有する。これらは、異なる処理間又は異なる細胞状態間で区別するために用いることができ、一方、現存するプロファイルの作製に典型的に用いられるものよりもより少ないデータで作製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は細胞に対する処理の効果を特徴づける方法であって、以下のステップ：
ａ）多数の総合シグナルを得ること、ここで、各総合シグナルは少なくとも２つの表示シグナルの組合せを表すものであり、各表示シグナルは細胞内の分子レベルを示す；
ｂ）多数の総合シグナルから、細胞又は細胞に対する処理に特有のプロファイルを作製すること、
を含み、
各総合シグナルが、いずれか１つの表示シグナルによりなされるその総合シグナルへの寄与を解析することなく得られることを特徴とする方法。
【請求項２】
各表示シグナルが細胞内のｍＲＮＡ分子レベルを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各表示シグナルが細胞内の代謝産物レベルを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
各表示シグナルが細胞内のタンパク質レベルを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞又は細胞に対する処理の効果を特徴づける方法であって、以下のステップ：
ａ）細胞由来のｍＲＮＡ又は細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ポリヌクレオチドの集団にハイブリダイズさせること、ここで、各ポリヌクレオチドは、細胞内で発現可能な少なくとも１つの遺伝子に対応し、各ハイブリダイゼーション事象は、遺伝子又はハイブリダイズされたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーションシグナルを生ずる；
ｂ）多数の総合発現シグナルを得ること、ここで、各総合発現シグナルは、ポリヌクレオチド集団のサブセットから生ずるハイブリダイゼーションシグナルの組合せを表すものであり、各サブセットは、細胞内で発現可能な少なくとも２つの遺伝子に対応するものである、そして、各総合発現シグナルは、いずれか１つのハイブリダイゼーションシグナルによりなされるその総合発現シグナルへの寄与を解析することなく得られる；
ｃ）多数の総合発現シグナルから、細胞又は細胞の処理に特有の発現プロファイルを作製すること、
を含む方法。
【請求項６】
サブセットが、ランダムに選択される、２〜５００（５００を含む）の細胞内で発現可能な遺伝子に対応する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
サブセットが、ランダムに選択される、４１、１６６、６６４又は２６５６の細胞内で発現可能な遺伝子に対応する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第１サブセットが対応する遺伝子数が、第２サブセットが対応する遺伝子数と異なる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サブセットを含むポリヌクレオチド数が、サブセットが対応する遺伝子数と同一である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
サブセットを含むポリヌクレオチド数が、サブセットが対応する遺伝子数より少ない、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの集団が固体支持体に結合している、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体が平面状の表面をしており、ポリヌクレオチドの集団が平面状の表面に分離したスポットの配列を形成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
分離したスポットそれぞれが、総合発現シグナルが得られるサブセットを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固体支持体が多数のビーズの形態をしており、各ビーズが独自に同定可能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
各ビーズが、総合発現シグナルが得られるポリヌクレオチドの集団のサブセットに結合している、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
多数の総合シグナルを含む、細胞内の遺伝子発現レベルのプロファイルであって、各総合シグナルは少なくとも２つの表示シグナルの組合せを表すものであり、各表示シグナルは細胞内の遺伝子発現レベルを示し、そして、総合シグナルは、いずれか１つの表示シグナルによりなされるその総合シグナルへの寄与を解析することなく得られる、プロファイル。
【請求項１７】
それぞれ請求項１６に記載の第１プロファイルと第２プロファイルとを比較することにより得られる遺伝子発現プロファイルであって、第１プロファイルは第１状態の細胞から得られ、第２プロファイルは第２状態の細胞から得られ、各プロファイルに用いるサブセットの遺伝子の組成は同一である、プロファイル。
【請求項１８】
第１状態が第１処理の結果であり、第２状態が第２処理の結果である、請求項１７に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項１９】
第１状態が試験状態であり、第２状態が対照状態である、請求項１７又は１８に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項２０】
試験状態が潜在的に疾患状態である、請求項１９に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項２１】
疾患状態を診断するための請求項２０に記載の遺伝子発現プロファイルの使用。
【請求項２２】
第１状態の細胞が、作用様式が公知の化合物で処理されている、請求項１９に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項２３】
第１状態の細胞が、作用様式が未知の化合物で処理されている、請求項１９に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項２４】
試験化合物の作用様式を同定又は証明するための、請求項２２又は２３に記載の遺伝子発現プロファイルの使用。
【請求項２５】
その作用様式が、請求項２２又は２３に記載の遺伝子発現プロファイルの使用により同定又は証明されている、新規化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現、代謝産物又はタンパク質のレベルを解析する方法、細胞の示差的プロファイルを作製するためのその方法の使用、並びに疾患及び細胞の処理に用いる新規化合物の作用様式の診断におけるそのプロファイルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の技術的進歩は、細胞内の非常に多くの分子を同時期に測定することを容易にしている。これは、細胞内に存在する、タンパク質、代謝産物及びｍＲＮＡのような特定のクラスの分子の複雑なプロファイルの作製へと導いている。典型的には、細胞内に存在する選択されたクラスの分子中の各分子についてシグナルが作製され、これは細胞内に存在するその分子の数と相関する。したがって、細胞内の遺伝子発現プロファイルは、通常、単一遺伝子のｍＲＮＡレベルの非常に多くの個々の測定から構築される。換言すれば、発現プロファイルは多くのシグナルから構築されており、各シグナルは１遺伝子の発現レベルを表している。同様に、代謝産物プロファイルは、細胞内の単一代謝産物のレベルを表す各シグナルを用いて構築され、タンパク質プロファイルは、細胞内の単一タンパク質レベルを表す各シグナルを用いて構築される。
【０００３】
このようなプロファイルの構築は、例えば異なる細胞状態間（例えば、健康な状態と疾患状態）の差、又は細胞に対する異なる処理による効果の差を検出すること可能にする点で非常に価値がある。しかしながら、このようなプロファイリング実験は、非常に多くのデータを作製し、その完全なボリュームは、データ保存、操作及び解釈を非常に問題の多いものにする。典型的には、プロファイルの解釈を容易にするために、個々のデータポイントを解析し、その後、例えば同様の発現レベル又は同様の機能的若しくは構造的特徴を示す分子群をクラスター化することができる。しかしながら、この解析段階は、ユーザーフレンドリーで容易に解釈できるプロファイルを作製する前に、ある程度の知識（例えば他の分子と比較した１個の分子レベルに関するもの、あるいは個々の分子自体の構造的及び／又は機能的知識）を必要とすることを意味する。
【発明の詳細な説明】
【０００４】
本発明は、こうした困難に取り組み、細胞の分子プロファイルを得るための非常に簡略化した方法を提供するものであって、当業者が細胞内の選択されたクラスの分子レベルのプロファイルを作製することを可能にするという利点を有し、異なる処理間又は異なる細胞状態間で区別するために用いることができ、一方、現存するプロファイルの作製に典型的に用いられるものよりも少ないデータで作製することができる。更に、本発明は、プロファイルに寄与する個々の分子に関する知識を必要とすることなく、細胞の有用な分子プロファイルを得るための方法を提供する。
【０００５】
本発明の方法は、それらが細胞内の異なるクラスの分子に応用できるものに対し、包括的に応用可能である。例えば、細胞内の代謝産物又はタンパク質又は発現遺伝子のレベルのプロファイルを得るために用いることができ、そして、いかなる生物源からの細胞にも応用できる。
【０００６】
本発明によれば、細胞又は細胞に対する処理の効果を特徴づける方法が提供され、この方法は、以下のステップ：ａ）多数の総合シグナルを得ること、ここで、各総合シグナルは少なくとも２つの表示シグナルの組合せを表すものであり、各表示シグナルは、細胞内の分子レベルを示す；及びｂ）多数の総合シグナルから、細胞又は細胞に対する処理に特有のプロファイルを作製すること、を含み、各総合シグナルが、いずれか１つの表示シグナルによりなされるその総合シグナルへの寄与を解析することなく得られることを特徴とする。
【０００７】
本発明の方法は、データ解析段階の前の総合シグナルの作製が、プロファイルの作製に用いるデータポイント数を減少させ、その後のデータの取り扱い及び解析を簡略化させる点で特に有益である。本発明の方法により作製されるプロファイルは、個々の細胞、１群の細胞、組織又は生物全体から得ることができ、それらに特有のものである。また、本発明のプロファイルは、特定の細胞内画分内の選択されたクラスの分子レベルに関するものであり、且つそれに特有のものであることができる。
【０００８】
本発明の方法は、細胞内に存在する好適なクラスの分子から特有のプロファイルを作製するために用いることができる。例えば、本発明の方法は、遺伝子発現レベル、代謝産物レベル又はタンパク質レベルにより細胞を特徴づけるために用いることができる。
【０００９】
プロファイルが得られる総合シグナルは、少なくとも２つの表示シグナルを表すものであり、各表示シグナルは細胞内の個々の分子レベルを示している。したがって、１つの総合シグナルは細胞内の１群の分子レベルを表している。分子群の組成は、好ましくは、個々の分子の構造又は機能に関しランダムに選択される。代謝産物、タンパク質又は遺伝子の表示シグナルを、それらが関連する生物学的又は生理学的経路に関しグループ分けする必要はなく、また実際にグループ分けしないほうが好ましい。同様に、このような表示シグナルは、構造クラスにより又は完全長遺伝子／タンパク質の相同性に基づき定義されるファミリーのメンバーによりグループ分けされる必要がない。したがって、表示シグナルをあまりグループ分けしないことが更に好ましい。
【００１０】
本発明の更なる態様において、分子群の組成は、プロファイルを作製すべき細胞内、細胞群、組織又は生物の個々の分子レベルに関しランダムに選択される。即ち、分子群を含む個々の分子が同一又は類似の発現レベルを有したり、同一又は類似の量で存在する必要はない。したがって、好ましい態様において、総合シグナルは少なくとも２つの表示シグナルの組合せを表すものである。ここで、第１表示シグナルは第１分子のレベル又は量を表し、第２表示シグナルは第２分子のレベル又は量を示す。そして、第１分子のレベル又は量は第２分子のレベル又は量とは著しく異なるものである。「著しく異なる」とは、第１分子及び第２分子のレベルが、総合シグナルの作製前に適当な統計解析又はクラスター解析手法を用いて解析される場合は、その２つのレベルは異なっているとみなされることを意味する。上記のように、各表示シグナルは細胞内の個々の分子レベルを表している。個々の分子レベルは０でも０より大きくてもよいことが当業者に理解されるであろう。
【００１１】
表示シグナルは、適当な手段により作製され、検出される：放射リガンド検出、蛍光検出、イムノアッセイ、及び酵素に基づくアッセイ。これらは全て、本発明の方法に用いることができるシグナル検出システムの例を含む。表示シグナルを電子シグナルに変換して、総合シグナル及びその後のプロファイルの作製を容易にすることができる。しかしながら、このような変換は、個々の分子による総合シグナルへの比較寄与に関し知識を必要としないことは当業者に容易に理解されるであろう。
【００１２】
総合シグナルを含む表示シグナルは、互いに物理的に非常に近接して生じてもよく、これにより、総合シグナルの作製を容易にする。あるいは、総合シグナルは、ランダムにクラスター化した表示シグナルより得ることができる。
【００１３】
本発明の方法が遺伝子発現プロファイルを作製する場合、総合シグナルを生ずるものからの表示シグナルは、細胞内で発現する遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。ｍＲＮＡレベルは、例えば核酸ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ及び当業者が熟知する他の手段を含む好適な手段により測定することができる。
【００１４】
１つの態様において、細胞由来のｍＲＮＡ（又は細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ）をポリヌクレオチドの集団とハイブリダイズさせる。各ポリヌクレオチドは、細胞内で発現可能な少なくとも１つの遺伝子に対応する。そして、各ハイブリダイゼーション事象は、遺伝子又はハイブリダイズされたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現レベルを示すハイブリダイゼーションシグナル（即ち、表示シグナル）を生ずる。総合発現シグナルは、ポリヌクレオチドの集団のサブセットから生ずるハイブリダイゼーションシグナルの組合せを表すものであるが、いずれか１つのハイブリダイゼーションシグナルによりなされるその総合発現シグナルへの寄与を解析することなく得られ、発現プロファイルの作製に用いられる。
【００１５】
当業者に周知の常用方法を用いてｍＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡを調製し、本発明に使用することができる。本発明に用いる細胞のｍＲＮＡは、細胞内総ＲＮＡの混合物の形でもよく、又は精製した形、例えばポリＡで精製した形で用いてもよいことは当業者に容易に理解されるであろう。
【００１６】
これまでのところ、特定の時間又は特定の条件セット下で、どのくらいの遺伝子が又はどの遺伝子が細胞内で発現するかを予測することは可能ではないため、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡがハイブリダイズするポリヌクレオチドの集団は、細胞内で発現可能な遺伝子に対応する。ポリヌクレオチドの全集団は、細胞内で発現可能な全ての遺伝子（推定遺伝子配列、機能が未知の遺伝子及び機能が特定されている遺伝子を含む）に対応していてもよい。あるいは、ポリヌクレオチドの集団は、細胞内で発現可能な遺伝子のサブセット（例えば、それらの機能が規定され、及び／又は特定の条件セット下で発現可能であることが知られている遺伝子、又はそれらの集団のみ）に対応してもよい。
【００１７】
ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡがハイブリダイズできるポリヌクレオチドの集団の各個々のメンバーは、細胞内で発現可能な少なくとも１つの遺伝子に対応する。「対応する」とは、ポリヌクレオチドが、その遺伝子が細胞内で発現している場合、細胞内で発現可能な遺伝子のｍＲＮＡ転写物（又はそれに由来するｃＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズできることを意味する。したがって、本発明に用いるポリヌクレオチドの集団は、全長若しくは部分長のゲノム又はｃＤＮＡクローン、又は合成核酸配列を含むそれ由来のポリヌクレオチドを含むことができる。
【００１８】
ポリヌクレオチドの集団のメンバーは、単一遺伝子に対応しても、１よりも多い遺伝子に対応してもよい。ポリヌクレオチドが単一遺伝子に対応する場合、ポリヌクレオチドの配列は、通常、単一遺伝子の核酸（ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）に相補的なものである。ポリヌクレオチドが１よりも多い遺伝子に対応する場合、ポリヌクレオチドの配列は、いくつか（即ち２以上）の遺伝子の核酸に相補的なものである。
【００１９】
総合発現シグナルが得られるポリヌクレオチドの各サブセットは、細胞内で発現可能な少なくとも２つの遺伝子に対応する。好ましくは、サブセットは、２〜５００（５００を含む）のあいだのいずれかの遺伝子数に対応する。特定の態様において、サブセットは、４１、１６６、６６４又は２６５６遺伝子に対応する。
【００２０】
ポリヌクレオチドの集団の単一メンバーが１以上の遺伝子に対応する場合、サブセットがその単一メンバーを含んでいてもよいことは当業者に明らかであろう。あるいは、サブセットは１以上のポリヌクレオチドを含むことができる。そして、このようなサブセット内の各ポリヌクレオチドは、細胞内で発現可能な１以上の遺伝子に対応することができる。したがって、サブセット内のポリヌクレオチド数が、そのサブセットが対応する遺伝子数と同一であっても異なっていてもサブセットを有することが可能である。
【００２１】
本発明に用いるポリヌクレオチドの集団は、溶液でも、あるいは固体支持体に結合していてもよい。好適な固体支持体は、平面状の表面の形態、例えばナイロン及びＰＶＤＦを含む膜、またはガラススライドである。平面状の表面を固体支持体として用いる場合、ポリヌクレオチドの集団は、平面状の表面に分離したスポットの配列を形成することができる。各分離したスポットは、ポリヌクレオチドの集団の少なくとも１つのメンバーを含み、したがって、細胞内で発現可能な少なくとも１つの遺伝子に対応するであろう。好ましい側面において、各分離したスポットは、総合発現シグナルが得られるポリヌクレオチドの集団のサブセットを含むであろう。
【００２２】
代案として、ポリヌクレオチドの集団を、多数のビーズに直接的又は間接的に結合させることができる。ビーズを固体支持体として用いる場合、各ビーズを総合発現シグナルが得られるポリヌクレオチドの集団のサブセットに結合させることが好ましい。例えば各ビーズに蛍光ラベルを結合させることにより、各ビーズが独自に同定可能であることも好ましい。
【００２３】
特に好ましい態様において、集団の全てのポリヌクレオチドメンバーは、ポリＴ領域及びヌクレオチドのランダム配列を含むであろう。ｍＲＮＡをそのような集団にハイブリダイズさせることにより、集団の異なるメンバーに対し、異なるｍＲＮＡ分子数の結合を生ずる。この特定の態様は、いかにして表示シグナルがランダムにグループ分けされるかという例を提供する。この場合、グループ分けは遺伝子の５’末端配列に基づいており、遺伝子の機能又は遺伝子の全長に対する相同性に基づくものではない。この態様の他の重要な特徴は、ポリヌクレオチドの集団の個々のメンバーから総合発現シグナルを得ることができることである。即ち、単一ポリヌクレオチドは、総合発現シグナルが得られるポリヌクレオチドのサブセットとして作用する。
【００２４】
そのような個々のポリヌクレオチドメンバーが、互いに容易に区別できることが更に好ましい。これは、例えば、個々のポリヌクレオチドメンバーを、別個のビーズに結合させること、又は分散した各スポットが個々のポリヌクレオチドメンバーを含むように平面状の膜にスポットで配列させることにより達成できる。
【００２５】
個々のポリヌクレオチドにハイブリダイズしている非常に多くのｍＲＮＡ分子の確率が、ポリヌクレオチド中のランダム配列の長さが減少するにつれて増加するため、ヌクレオチドのランダム配列の長さを変化させることにより、個々のポリヌクレオチドメンバーに結合しているｍＲＮＡ分子の数を変化させることができる。
【００２６】
更なる態様において、本発明の方法は、細胞の代謝産物プロファイル、又は細胞のタンパク質プロファイルを作製するために用いることができる。
本明細書に記載されるような総合シグナルは、本発明の更なる態様を形成する。例えば、１つの態様において、細胞又は細胞に対する処理の効果に特有のプロファイルの作製に用いられる総合シグナルが提供される。ここで、総合シグナルは少なくとも２つの表示シグナルの組合せを表すものであり、各表示シグナルは細胞内の分子レベルを示してる。また、総合シグナルは、いずれか１つの表示シグナルによりなされるその総合シグナルへの寄与を解析することなく得られる。第２の態様において、少なくとも２つの表示シグナルのランダムな組合せを表す総合シグナルが提供される。第３の態様において、少なくとも２つの表示シグナルのランダムな組合せを表す総合シグナルが提供され、その総合シグナルは、いずれか１つの表示シグナルによりなされるその総合シグナルへの寄与を解析することなく得られる。
【００２７】
また、本発明は、細胞内の選択されたクラスの分子レベルのプロファイルにも及ぶものであり、このプロファイルは、本発明の多数の総合シグナルを含む。
プロファイルが遺伝子発現プロファイルである場合、各総合シグナルは遺伝子のサブセットの総合発現レベルを示し、各サブセットは少なくとも２つの遺伝子を含む。同様に、タンパク質プロファイルは、各総合シグナルが細胞内に存在する少なくとも２つのタンパク質の総合レベルを示す、多数の総合シグナルを含むであろう。そして、代謝産物プロファイルは、各総合シグナルが細胞内に存在する少なくとも２つの代謝産物の総合レベルを示す、多数の総合シグナルを含むであろう。
【００２８】
本発明のプロファイルを用いて、特定の細胞状態にある選択された分子（ｍＲＮＡ、タンパク質又は代謝産物）レベルを相関させることができる。本明細書で細胞に用いる「状態」という用語は、環境ストレス、疾患又は外因性薬剤による処理を原因とする細胞の生理学的状態を表すことができる。あるいは、細胞の発達状態を意味することもできる。２つの異なる状態にある細胞から得られるプロファイルの比較により、いずれかの状態を特徴づけるために用いられ且つ両状態に特有のプロファイルの作製が可能になる。これらプロファイルの直接的な比較に関し、総合シグナルが作製されるサブセット中の分子の組成が、比較される各プロファイルにおいて同一であることは容易に理解されるであろう。一般に、試験状態にある細胞（例えば疾患状態にある細胞又は外因性薬剤で処理された細胞）から得られるプロファイルと、対照状態にある細胞（例えば健康な状態にある細胞又は外因性薬剤で処理されていない細胞）から得られるプロファイルとの間で比較がなされるであろう。
【００２９】
遺伝子発現プロファイルは、特定の細胞状態を診断すること、例えば、その疾患が発現遺伝子の数及び／又はレベルを変化させる場合、疾患の診断に特に有用である。疾患細胞に対する遺伝子発現プロファイルと、健康な細胞又は対照細胞のそれとの比較により、その疾患に特有のプロファイルの作製が可能になるであろう。したがって、一画のプロファイルを構築することができ、各プロファイルは特定の疾患状態に特有である。細胞が疾患状態にあると疑われる場合、それらのプロファイルは、健康な細胞のものと比較して得られ、特定の疾患に特有のものであることが知られているプロファイルと共に再検討されるかもしれない。このようにして、疾患を診断することができる。
【００３０】
遺伝子発現プロファイルを同様に用いて、特定の処理（例えば化合物を用いた処理）が細胞に影響する方法を証明又は同定することができる。その化合物で処理した細胞から得たプロファイルを、未処理細胞又は適当な対照細胞から得たプロファイルと比較することにより、化合物の作用様式を証明又は同定することができる。その後、このプロファイルを、公知の作用様式を有する化合物に対して得られているプロファイルと共に再検討することができる。そして、試験化合物の作用様式が証明又は同定される。
【００３１】
また、本発明は、本明細書に記載されるプロファイルを用いて、その作用様式が証明又は同定されている新規化学薬品に及ぶものである。
本発明の種々の側面及び態様は、実施例により、更に詳細に記載されるであろう。細部の改変が本発明の範囲を逸脱することなく行われ得ることは容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００３２】
総合発現シグナルを用いた植物細胞の遺伝子発現プロファイルの作製
植物を、ＡＬＳ（０．５ｐｐｍ）、ＰＤＳ（５０ｐｐｍ）、ステロール（１５０ｐｐｍ）及びＡＯＺ（０．５ｐｐｍ）で処理し、処理後３日で回収した。標準の手順を用いて処理植物及び無処理の対照植物よりＲＮＡを単離した。
【００３３】
シロイヌナズナ遺伝子発現マイクロアレイ又はＧＥＭ（Incyte）を用いて、全部で１８のハイブリダイゼーション実験を行った。それぞれ７９６８の異なる遺伝子（即ち、シロイヌナズナ遺伝子の総数のサブセット）に対応するポリヌクレオチドを含んでいた。各ＧＥＭを、２つのＲＮＡサンプル：「処理」サンプル及び「対照」サンプル、又は２つの異なる対照ＲＮＡサンプルのいずれかを用いてハイブリダイズさせた。実施したハイブリダイゼーション実験の概要を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2005511006.tif 000002
【００３５】
個々のハイブリダイゼーションシグナルから得た発現プロファイル
各ＧＥＭ由来のシグナルを全シグナルにより正規化した。各遺伝子について、処理と対照との比のｌｏｇを計算した。次に距離アルゴリズムを用いて、遺伝子発現比の類似性により実験をクラスター化した。得られた系統樹（図１）は、７９６８遺伝子に基づき、個々の遺伝子（それぞれ１遺伝子からなる７９６８群）から作製された遺伝子発現プロファイルを表している。
【００３６】
この解析は全処理と全対照を明確に分離した。しかしながら、ある程度の対照の偏りが観察され、実験は、処理よりも対照によりクラスター化するように見えた。
総合発現シグナルから得た発現プロファイル
次に、処理のクラスター化に対する、種々のサイズの遺伝子群の総合発現レベルを考慮することの効果を調べた。オリゴｄＴＮ(n)プライマーを用いて実際に総合発現レベルの評価がなされるであろうという前提に基づき、グループのサイズを選択した。ｎ＝１の場合は、３つの異なる可能なプライマー（オリゴｄＴ（Ｇ／Ａ／Ｃ））があり、ｎ＝２の場合は１２の異なるプライマーがある（オリゴｄＴ（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ））、など。遺伝子を以下のようにランダムにグループ分けした；各遺伝子に、ランダムに数を規定し、次にこの遺伝子を、この番号によりリストにし、そして、そのリストの位置によりグループを特定した。このin silico解析のために、グループサイズを一定に保った。しかしながら、実際はグループサイズは異なるプライマーに対し変化するようである。その結果、遺伝子のいくつか（リストの最後のもの）は、解析から除外した。表２は、解析した異なるグループサイズを示す。遺伝子の番号は各場合において省略した。
【００３７】
【表２】
2005511006.tif 000003
【００３８】
各遺伝子群について、成分遺伝子のシグナルを合計した。次にこのシグナルを正規化し、ｌｏｇ比を計算し、そして処理を上記のようにクラスター化した。得られた系統樹を図２〜図７に示す。
【００３９】
結果
個々の遺伝子の解析では（図１）、ＡＬＳで処理したサンプルは、他の処理とは異なり、うまくクラスターを形成した。ＰＤＳ処理及びステロール処理は、あまり明確に分解されない。対照は、クラスターパターンに対し、処理よりも影響を発揮することを表している。しかしながら、ＰＤＳ処理及びステロール処理は、同様の発現プロファイルを与えることが期待されるであろう。
【００４０】
特に、それぞれ２遺伝子からなる３０７２群（図２）又はそれぞれ１０遺伝子からなる７６８群（図３）としてサンプルを解析したとき、同一クラスターパターンが作製された。それぞれ４２遺伝子からなる１９２群（図４）としてデータを解析したとき、ＡＬＳ処理は依然としてステロール処理及びＰＤＳ処理からよく分離した。しかしながら、ＰＤＳ処理とステロール処理との分解はわずかに低下していた。データを１６６遺伝子からなる４８群に総合したとき（図５）、異なる対照によるシグナルは、各処理からのシグナルに対し支配的であった。しかしながら、Ｃｂ１対照（即ち処理と同時に実施された対照）に対してプロファイルされたサンプルのみを考慮する場合、ＡＬＳインヒビターは、他の処理と離れて依然としてクラスターとなり、全ての処理は全ての対照から明確に分離される。それぞれ６６４遺伝子からなる１２群（図６）としてデータを解析したときにのみ、いくつかの対照が処理とともにグループとなり始める。２５６５遺伝子からなる３群（図７）としてデータを解析したときは、分解度が低い。
【００４１】
結論
遺伝子群の総合発現解析は、処理をその処理の作用様式によりクラスター化することを可能にする。個々の遺伝子の同一性に関する知識は必要とされない。
【００４２】
特に、１０遺伝子からなる７６８群を有するクラスターパターンに変化は見られなかった。したがって、クラスター化に影響を与えることなく、解析されるデータポイント数を１０倍に減少させることが可能であった。典型的によくクラスター化する処理は、１６６遺伝子からなる４８群でも依然として分解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】個々の遺伝子を発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図２】２遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図３】１０遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図４】４１遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図５】１６６遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図６】６６４遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図７】２６５６遺伝子群について発現解析するときの処理の関連度を示す系統樹である。
【図１】
2005511006.tif 000004
【図２】
2005511006.tif 000005
【図３】
2005511006.tif 000006
【図４】
2005511006.tif 000007
【図５】
2005511006.tif 000008
【図６】
2005511006.tif 000009
【図７】
2005511006.tif 000010
【国際調査報告】
2005511006.tif 000011
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