(57)【要約】【課題】美白、にきび予防、抗炎症、しわの発生予防、肌の保湿などのスキンケアの分野において用いることができる自然界起源の安全な化合物を提供する。【解決手段】抗菌剤に、びわの葉から抽出されるトリテルペノイド、特に、ウルソル酸、オレアノール酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸からなる群から選択される化合物を含有させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
びわの葉から抽出されるトリテルペノイドを有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項２】
前記びわの葉から抽出されるトリテルペノイドは、ウルソル酸、オレアノール酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
びわは、バラ科に属する亜熱帯常緑樹である。びわの葉は、伝統的な中国医学で用いられてきた。日本では、ビワの葉は、単体で、あるいは茶葉と混ぜて、びわ茶として用いられている。特許文献１では、びわの葉の抽出物が骨減少性疾患の治療および予防のために用いることができることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１５−１７８４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
美白、にきび予防、抗炎症、しわの発生予防、肌の保湿などのスキンケアの分野では、様々な化粧料が開発されている。
【０００５】
そこで、本発明は、美白、にきび予防、抗アレルギー、しわの発生予防、肌の保湿などのスキンケアの分野において用いることができる自然界起源の安全な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の目的を達成するため、本発明は、抗菌剤において、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドを有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、美白、にきび予防、抗アレルギー、しわの発生予防、肌の保湿などのスキンケアの分野において用いることができる自然界起源の安全な化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】コラーゲン生成刺激活性値（ＣＰ／ＣＶ比）の試験結果である。
【図２】ＨＡ／ＣＶ値の試験結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係るメラニン抑制剤、抗菌剤、抗アレルギー剤、コラーゲン生成促成剤、保湿剤の一実施の形態を、説明する。なお、この実施の形態は単なる例示であり、本発明はこれに限定されない。
【００１０】
びわは、loquat, Eriobotrya
japonicaとして知られるバラ科の顕花植物である。びわの葉は、伝統的漢方薬として知られている。また、日本国内でも、びわの葉は、びわ茶として飲用されている。びわは、数多くの化学薬理学研究によって、肥満抑制、腫瘍抑制などが確かめられている。そこで、びわの葉のスキンケアに対する効用を調べた。
【００１１】
［評価対象］
びわの葉の抽出物である１８種類のトリテルペノイドについてスキンケアに対する効用に関する評価を行った。この１８種類のトリテルペノイドとは、（１）ウルソル酸（ursolic acid）、（２）オレアノール酸（oleanolic acid）、（３）ウバオール（uvaol）、（４）ベツリン酸（betulinic acid）、（５）マスリン酸メチル（methyl maslinate）、（６）コロソリン酸メチル（methyl corosolate）、（７）マスリン酸（maslinc acid）、（８）コロソリン酸（corosolic acid）、（９）3-エピコロソリン酸（3-epicorosolic acid）、（１０）ポモル酸（pomolic acid）、（１１）トルメン酸（tormentic acid）、（１２）オイスカフ酸（euscaphic acid）、（１３）3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸（3-oxours-12-en-28-oic
acid）、（１４）6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸（6β,19-dihydroxyurs-12-en-3-oxo-28-oic acid）、（１５）2α,19α-ジヒドロキシ-3-オキソ-12-ウルセン-28-オイック酸（2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic
acid）、（１６）ヒプタジエニック酸（hyptadienic acid）、（１７）3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸（3-O-trans-p-coumaroyltormentic acid）、（１８）3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸（3-O-cis-p-coumaroyltormentic
acid）、である。
【００１２】
ここで、括弧で閉じた数字は、参照用の化合物（トリテルペノイド）の番号である。たとえば、以下で化合物７と表現した場合、マスリン酸を示す。
【００１３】
それぞれの化合物の構造は以下の通りである。
【００１４】
（１）ウルソル酸（ursolic acid）
【化１】
2018058801.tif 000002
【００１５】
（２）オレアノール酸（oleanolic acid）
【化２】
2018058801.tif 000003
【００１６】
（３）ウバオール（uvaol）
【化３】
2018058801.tif 000004
【００１７】
（４）ベツリン酸（betulinic acid）
【化４】
2018058801.tif 000005
【００１８】
（５）マスリン酸メチル（methyl maslinate）
【化５】
2018058801.tif 000006
【００１９】
（６）コロソリン酸メチル（methyl corosolate）
【化６】
2018058801.tif 000007
【００２０】
（７）マスリン酸（maslinc acid）
【化７】
2018058801.tif 000008
【００２１】
（８）コロソリン酸（corosolic acid）
【化８】
2018058801.tif 000009
【００２２】
（９）3-エピコロソリン酸（3-epicorosolic acid）
【化９】
2018058801.tif 000010
【００２３】
（１０）ポモル酸（pomolic acid）
【化１０】
2018058801.tif 000011
【００２４】
（１１）トルメン酸（tormentic acid）
【化１１】
2018058801.tif 000012
【００２５】
（１２）オイスカフ酸（euscaphic acid）
【化１２】
2018058801.tif 000013
【００２６】
（１３）3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸（3-oxours-12-en-28-oic
acid）
【化１３】
2018058801.tif 000014
【００２７】
（１４）6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸（6β,19-dihydroxyurs-12-en-3-oxo-28-oic
acid）
【化１４】
2018058801.tif 000015
【００２８】
（１５）2α,19α-ジヒドロキシ-3-オキソ-12-ウルセン-28-オイック酸（2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic
acid）
【化１５】
2018058801.tif 000016
【００２９】
（１６）ヒプタジエニック酸（hyptadienic acid）
【化１６】
2018058801.tif 000017
【００３０】
（１７）3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸（3-O-trans-p-coumaroyltormentic acid）
【化１７】
2018058801.tif 000018
【００３１】
（１８）3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸（3-O-cis-p-coumaroyltormentic acid）
【化１８】
2018058801.tif 000019
【００３２】
［メラミン生成抑制］
びわの葉から抽出された１８種類のトリテルペノイドのメラニン抑制効果を評価するため、マウスのＢ１６メラノーマ細胞を用いた試験を行った。マウスのＢ１６メラノーマ細胞は、理研バイオリソースセンター細胞バンクから入手した。濃度０．０９ｍｇ／ｍｌのテオフィリンおよび１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地で細胞生存を維持した。サンプルの処理に先立ち、細胞濃度１×１０５（細胞／ウェル）の培地中で２４時間、Ｂ１６メラノーマ細胞をインキュベートした。
【００３３】
２４時間のインキュベートの後、ウェル当たりの濃度を０．２％未満としたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に試験サンプルを溶解させ、各ウェルに添加した。サンプル数は３（ｎ＝３）である。アルブチンを対照サンプルとして使用した。
【００３４】
Ｂ１６メラノーマ細胞をさらに４８時間インキュベートし、その後、培地を再度各試料を含む新鮮な培地と交換した。さらに２４時間後、メラニン含有量と細胞生存率をそれぞれ４０５ｎｍおよび５７０ｎｍでマイクロプレートリーダーを用いて測定した。細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルブロマイド）法を用いて測定した。
【００３５】
このようにして様々な濃度について、びわの葉から抽出された１６種類の化合物のメラニン合成に対する阻害効果および細胞生存性の細胞傷害性効果を試験した。生存細胞の５０％に死を引き起こす細胞毒性濃度ＣＣ５０の値、および、Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン合成の５０％阻害を引き起こす濃度ＩＣ５０の値を、対応する照射量反応曲線から計算した。ＣＣ５０およびＩＣ５０の値を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2018058801.tif 000020
【００３７】
細胞死の誘導に対するメラニン生成の阻害に関する化合物の相対的有効性、すなわち、ＣＣ５０の値／ＩＣ５０の値を選択指数（Ｓ．Ｉ．：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）として定義し、表１に併せて示した。メラニン合成が阻害される状況としては、メラニン生成が単に阻害される状況の他、Ｂ１６メラノーマ細胞が死に至る状況がある。ＣＣ５０は、Ｂ１６メラノーマ細胞が死に至る、すなわち、細胞傷害性効果の大きさを示したものである。ＩＣ５０は、細胞傷害性効果を含むメラニン合成に対する阻害効果の大きさを示したものである。メラニン抑制効果の観点から、選択的にメラニン生成を阻害する、すなわち、より高い濃度でなければ細胞傷害性が生じず、より低い濃度であってもメラニン生成を阻害する、高い選択指数（Ｓ．Ｉ．＞１）を有することが好ましい。
【００３８】
表１に示す評価結果によれば、８種類のトリテルペノイド、すなわち、化合物１、２、４、５、６、７、８、１１は、低い細胞毒性を持ちつつ、高いメラニン生成阻害特性を有する（Ｓ．Ｉ．＞１）ことがわかった。特に、化合物７のマスリン酸は、Ｓ．Ｉ．の値が１．９と最高であった。この値は、美白成分として知られるアルブチンと同程度である。
【００３９】
活性な化合物の化学構造の不活性な化合物との比較により、以下のことがわかる。ベータ型水酸基をアルファ型水酸基と置き換えた化合物９、１２、ケトンと置き換えた化合物１３、１４、１５、および、他の置換基で置き換えた化合物１７、１８の活性が減少していることが認められることから、Ｃ−３位のベータ型水酸基は、メラニン生成阻害活性に重要な役割を果たしている。また、ベータ型の水酸基が存在する場合、化合物（３）は、Ｃ−１７位のＣＯＯＨがＣＨ２ＯＨに還元されることのみにより活性を失うことから、カルボキシル基は、部分的に活性に寄与している可能性がある。化合物５、６に見られるように、カルボキシル基のメチルエステル化は、活性をわずかに低下させる。
【００４０】
このように、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部、すなわち、化合物１、２、４、５、６、７、８、１１は、メラニン生成を阻害することがわかる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、オレアノール酸、ベツリン酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、トルメン酸からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物は、自然界起源の安全なメラニン抑制剤として用いることができる。
【００４１】
人の肌が紫外線に過度に晒されるとメラニンおよび異常な色素沈着が過剰に生成される。びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部は、メラニン生成抑制効果を有するため、肌の美白に対して効果がある。また、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部によって、反応性炎症、シミ、肝斑、そばかすなどの様々な皮膚の損傷につながる反応種の過剰生成を抑制することができる。したがって、びわの葉から抽出されるトリテルペノイド、特に、ウルソル酸、オレアノール酸、ベツリン酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、トルメン酸はメラニン生成抑制すなわち美白の機能を有するスキンケア用剤として用いることができる。
【００４２】
［抗菌］
びわの葉から抽出された１８種類のトリテルペノイドの抗菌特性評価用の試験菌としては、プロピオニバクテリウム・アクネスを用いた。試験菌の単一コロニーを採取し、培地に加え、３７℃で３０時間培養した。次いで、これを細菌懸濁液に加え、１０５ＣＦＵ／ｍｌの細菌濃度に調製した。
【００４３】
各化合物は、ＤＭＳＯに溶解した。ソルビン酸を対照サンプルとして使用した。さらに、ＤＭＳＯに溶解した各化合物を３７℃で３０時間インキュベートした。
【００４４】
その後、細菌増殖を波長６３０ｎｍでマイクロプレートリーダーで測定した。最小阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は標準的なブロス微量希釈法により評価した。
【００４５】
表２は、化合物濃度が５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌにおけるプロピオニバクテリウム属アクネ菌に対する１８種類のトリテルペノイドの抗菌活性を示す。いずれのデータも平均値と標準偏差（ｎ＝３）を示した。表２には、活性な化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を併せて示した。対照サンプルであるソルビン酸の抗菌活性は、濃度が４００μｇ／ｍｌのときに、１０４．４±２．５（％）であった。
【００４６】
【表２】
2018058801.tif 000021
【００４７】
１２種類の化合物、すなわち、化合物１、２、６、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１７、および、１８は、それらの最大溶解度でプロピオニバクテリウム属アクネ菌に対して活性を有する。化合物１、７、８および１２については、ＭＩＣが５０μｇ／ｍｌ、ＭＢＣがそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および、５０μｇ／ｍｌにおいて、プロピオニバクテリウム属アクネ菌に対する高い活性を示した。なお、トリテルペノイドは、５から８までの範囲のｌｏｇＰ値を有する低い親水性を示す。一般的に、親水性が低い場合には抗菌活性も低い傾向があるが、化合物１、２、６、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１７、および、１８は、高い抗菌活性を示している。
【００４８】
このように、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部、すなわち、化合物１、２、６、７、８、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８は、プロピオニバクテリウム属アクネ菌に対する抗菌活性を持つことがわかる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、
オレアノール酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物は、自然界起源の安全な抗菌剤として用いることができる。
【００４９】
プロピオニバクテリウム属アクネ菌（Ｐ．アクネ）は、毛包脂腺ユニットに主に位置する嫌気性グラム陽性細菌であり、にきびの発症に重要な役割を果たしている。したがって、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部は、にきびの発症の抑制に効果がある。よって、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、
オレアノール酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、ヒプタジエニック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸は、にきびの発症を抑制する抗菌剤としての機能を有するスキンケア用剤として用いることができる。
【００５０】
［抗アレルギー］
びわの葉から抽出された１８種類のトリテルペノイドの抗アレルギー効果を評価するため、ＩｇＥ刺激されたラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞からのβヘキソサミニダーゼの放出をチェックした。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は理研バイオリソースセンター細胞バンクから入手した。
【００５１】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をＣＯ２濃度が５％の加湿空気インキュベーター中、３７℃で、１０％のＦＢＳおよび１％の抗生物質−抗真菌剤を含むＥＭＥＭ培地中で維持した。細胞濃度は、２×１０５細胞／ウェルとした。２４時間のインキュベーションの後、培地に１ｍｌの０．５μｇ／抗ＤＮＰ（ジニトロフェノール）のマウス免疫グロブリンＥ（ＩｇＥを補充した。さらにこの培養菌を２４時間インキュベートした後、培地を、１００μｌの甲状腺緩衝液で置き換えた。
【００５２】
０．５％未満の濃度の１μｌのＤＭＳＯにサンプルを溶解させ、さらに細胞プレートを３０分間再度インキュベートした。次いで、甲状腺緩衝液を含むサンプルを、５０μｇ／ｍｌのＤＮＰ−ＢＳＡを含有する甲状腺緩衝液の１００μｌで置換した。１時間のインキュベーションの後に、上清の５０μｌを各ウェルから回収し、それぞれを２Ｍの基質溶液（p-nitrophenyl-N-acetyl-β-glucosaminide）５０μｌと混合した。
【００５３】
室温において、混合物をシェーカー上で３時間インキュベートした。最後に、１００ｍＭの炭酸水素ナトリウムを停止液として１００μｌを添加した。その後、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。前述と同様のＭＴＴ試験により、細胞生存率を測定した。化合物濃度は２５μｇ／ｍｌとした。クェルセチンを対照サンプルとして使用した。
【００５４】
細胞生存率および抗アレルギー活性の試験結果を表３に示す。いずれのデータも平均値と標準偏差（ｎ＝３）を示した。対照サンプルであるクェルセチンの抗アレルギー活性は、７２．５±３．０（％）であった。表３における「＊」はスチューデントｔ検定により危険率０．０５で対照サンプルとの有意差が見られた化合物、「＊＊」はスチューデントｔ検定により危険率０．０１で対照サンプルとの有意差が見られた化合物を示している。
【００５５】
【表３】
2018058801.tif 000022
【００５６】
表３に示すように、３種類のトリテルペノイド、すなわち、化合物１、９、および、１２は、非細胞毒性濃度においてβ−ヘキソサミニダーゼの放出を大幅に抑制した。化合物７は、わずかな細胞傷害性を持つものの６６％の抑制率を示した。
【００５７】
さらに、化合物１、７、９、および、１２について、ヘキソサミニダーゼ放出阻害を引き起こす濃度ＩＣ５０値を測定し、それぞれ３９．５μＭ、２２．８６μＭ、２５．６μＭ、および、１５．８μＭであることを見出した。
【００５８】
化合物１、７、９、および、１２は、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ：12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）がマウスに引き起こす炎症、および、ＴＰＡ誘導性のエプスタイン−バーウイルス早期抗原（ＥＢＶ−ＥＡ）活性化に対して大幅な阻害活性を有することがわかる。
【００５９】
このように、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部、すなわち、化合物１、７、９、１２は、抗アレルギー性を持つことがわかる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、マスリン酸、3-エピコロソリン酸、オイスカフ酸、からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物は、自然界起源の安全な抗アレルギー剤として用いることができる。
【００６０】
アレルギーや炎症は、体（皮膚、鼻、肺、消化管等）の様々な標的臓器での環境物質に対する過剰反応として現れる。皮膚は、環境との間の主要なインタフェースであるため、不適切な免疫活性は、炎症、皮膚発疹、かゆみや湿疹などとして発症する。したがって、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部は、抗アレルギー、抗炎症に効果がある。って、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、マスリン酸、3-エピコロソリン酸、オイスカフ酸は、抗アレルギーや抗炎症の機能を有するスキンケア用剤として用いることができる。
【００６１】
［コラーゲン生成促成］
びわの葉から抽出された１８種類のトリテルペノイドのコラーゲン生成促成効果を評価するため、成人正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた試験を行った。成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＡＤ）は、Ｌｏｎｚａ社から入手した。
【００６２】
成人正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％のＦＢＳおよび１％の抗生物質−抗真菌剤を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。培養細胞が接着面いっぱいに広がった状態（コンフルエンス）に成長した後、細胞密度は、５×１０３／ウェルとした。
【００６３】
２４時間のインキュベーションの後、培地を、サンプル溶液１μｌおよび０．５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭの９９マイクロリットルの混合物で置換した。ＤＭＳＯ濃度は、培地中０．５％とした。培養の７２時間後、培地中のＩ型コラーゲン生成量をＡＣＥＬ社のＥＬＩＳＡキット用いて測定した。コラーゲン産生量は、同じＥＬＩＳＡキットで測定することにより作成した標準曲線を用いて計算した。残りの細胞はＭＴＴ評価に用いた。１００μＭのアスコルビン酸を対照サンプルとして使用した。
【００６４】
それぞれの化合物について、１、５、および、１０μｇ／ｍｌという３種類の化合物濃度におけるコラーゲン生成活性（ＣＰ）および細胞生存率（ＣＶ）をそれぞれ求めた。コラーゲン生成活性（ＣＰ）および細胞生存率（ＣＶ）の値は、対照サンプルの場合に対する割合（％）として求めた。次に、細胞生存率（％）あたりの平均のコラーゲン生成活性（％）の平均を表すＣＰ／ＣＶ比（＞１）を、細胞当たりのコラーゲン生成の刺激活性の指標として求めた。
【００６５】
試験結果のコラーゲン生成刺激活性値（ＣＰ／ＣＶ比）を表４および図１に示す。
【００６６】
【表４】
2018058801.tif 000023
【００６７】
表４および図１に示すように、いくつかのトリテルペノイドは、細胞あたりの皮膚線維芽細胞のコラーゲン生成を著しく増大させる。びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物１、２、３、４、６、７、８、１０、１３、１４の１０種類は１０μｇ／ｍｌの濃度でＩ型コラーゲンを生成した。化合物６、８は、対照サンプルよりも高い、３．４および３．６という特に強力な刺激活性を示している。他の化合物は、中等度の促進効果を示している。
【００６８】
びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８の１６種類の化合物は、５μｇ／ｍｌの濃度で、コラーゲン生成の増大を引き起こしている。化合物１、４については、対照サンプルよりも高い、３．８および３．０という値を示している。
【００６９】
びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物４、８、９、１０、１３、１４の６種類の化合物については、１μｇ／ｍｌという低い濃度においてもコラーゲン生成活性を有している。
【００７０】
このように、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部、すなわち、化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８は、コラーゲン生成促成特性を持つことがわかる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、オレアノール酸、ウバオール、ベツリン酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、3-エピコロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、2α,19α-ジヒドロキシ-3-オキソ-12-ウルセン-28-オイック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物は、自然界起源の安全なコラーゲン生成促成剤として用いることができる。
【００７１】
高齢ヒトの皮膚は、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などの皮膚細胞外マトリックスの著しい減少により、真皮−表皮接合部が平坦化し、機械的張力および弾性が減少する。びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部は、コラーゲン生成に効果があり、その結果、皮膚のしわの発生を抑制することができる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、オレアノール酸、ウバオール、ベツリン酸、マスリン酸メチル、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、3-エピコロソリン酸、ポモル酸、トルメン酸、オイスカフ酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、6β,19-ジヒドロキシウルス-12-エン-3-オキソ-28-オイック酸、2α,19α-ジヒドロキシ-3-オキソ-12-ウルセン-28-オイック酸、3-O-トランス-p-クマロイルトルメンチック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、はコラーゲン生成を促成し肌の老化を抑制するコラーゲン生成促成剤の機能を有するスキンケア用剤として用いることができる。
【００７２】
［ヒアルロン酸生成］
びわの葉から抽出された１８種類のトリテルペノイドのヒアルロン酸生成促進効果を評価するため、成人正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた試験を行った。成人正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−ＡＤ）は、Ｌｏｎｚａ社から入手した。
【００７３】
成人正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％のＦＢＳおよび１％の抗生物質−抗真菌剤を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。培養細胞が接着面いっぱいに広がった状態（コンフルエンス）に成長した後、細胞密度は、５×１０３／ウェルとした。
【００７４】
７２時間の培養後、培地中のヒアルロン酸の量は、バイオトレーディングパートナーズ社のＱｎＥヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ヒアルロン酸産生量は、定量標準曲線から計算した。細胞生存率は、ＭＴＴ法により測定された。アスコルビン酸を対照サンプルとして使用した。
それぞれの化合物について、１、５、および、１０μｇ／ｍｌという３種類の化合物濃度におけるＨＡ／ＣＶ値をそれぞれ求めた。
【００７５】
試験結果のＨＡ／ＣＶ値を表５および図２に示す。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
ここで、ＨＡ／ＣＶ値とは、ヒアルロン酸生成促進率であり、ヒアルロン酸濃度の平均値（％）／細胞生存率の平均値（％）である。ヒアルロン酸濃度（ＨＡ）および細胞生存率（ＣＶ）の値は、対照サンプルの場合に対する割合（％）として求めた。
【００７８】
表５および図２に示すように、いくつかのトリテルペノイドは、細胞あたりの皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸生成を著しく増大させる。びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物１、２、３、４、６、７、８、１０、１３、１６の１０種類の化合物は、１０μｇ／ｍｌの濃度で、ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸生成の強力な刺激効果を発揮していた。化合物８、１０は、対照サンプルを超える５．９および５．８という刺激活性値を示した。化合物６も高い刺激活性値を示している。
【００７９】
５μｇ／ｍｌの濃度では、びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物１、３、４、６、７、８の６種類の化合物は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸生成の刺激効果を発揮していた。化合物１は、比較例を超える４．７という刺激活性値を有している。
【００８０】
低濃度（１μｇ／ｍｌで）では、びわの葉から抽出される１８種類のトリテルペノイドのうち、化合物４の１種類の化合物がヒアルロン酸生成促進効果を示した。
【００８１】
このように、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部、すなわち、化合物１、２、３、４、６、７、８、１０、１３、１８は、ヒアルロン酸生成促進特性を持つことがわかる。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、オレアノール酸、ウバオール、ベツリン酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、からなる群から選択される化合物、またはその塩、溶媒和物または水和物は、自然界起源の安全なヒアルロン酸生成促進剤として用いることができる。
【００８２】
若々しい肌は、水分を多く含んでおり、膨圧、弾力性と柔軟性を維持している。ヒアルロン酸は、水分を保持する高い能力を持ち、皮膚の水分量に大きな影響を与える。びわの葉から抽出されるトリテルペノイドの一部は、コラーゲン生成に効果があり、その結果、若々しい皮膚の維持に効果がある。つまり、びわの葉から抽出されるトリテルペノイドのうち、ウルソル酸、オレアノール酸、ウバオール、ベツリン酸、コロソリン酸メチル、マスリン酸、コロソリン酸、ポモル酸、3-オキソウルス-12-エン-28-オイック酸、3-O-シス-p-クマロイルトルメンチック酸、は肌の水分量を高める保湿剤としての機能を有するスキンケア用剤として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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