(57)【要約】修飾されたオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの溶融温度（Ｔｍ）および他の特性を予測するためのソフトウエアーシステムおよび方法。修飾オリゴヌクレオチドは、非置換および３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンならびに５−置換ピリミジンから選択される塩基を含有し、マイナー・グルーブ・バインダーーおよびレポーター基を任意に結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド配列の融点（Ｔｍ）を予測するコンピューター実行方法であって、下記：
Ｎ塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドを同定すること；および
同定されたオリゴヌクレオチド配列の融点（Ｔｍ）を、同定された配列中の各Ｎ−１近傍の塩基対についての最近傍の熱力学的パラメータを用いて、計算すること、各最近傍の熱力学的パラメータは二つの対応する近傍の塩基の熱力学的寄与を定義するものである；
を含む方法。
【請求項２】
同定がジーンバンクからポリヌクレオチド配列を受け取ることを含む、請求項１のコンピューター実行方法。
【請求項３】
同定がユザーインプットのポリヌクレオチド配列を受け取ることを含む、請求項１のコンピューター実行方法。
【請求項４】
同定が、ポリヌクレオチド配列を受け取ること、ならびに受け取られた配列の一部分のひとつおよび受け取られた配列の一部分に相補的な配列を同定することを含む、請求項１のコンピューター実行方法。
【請求項５】
該同定された配列が少なくともひとつの修飾された塩基を含む、請求項１のコンピューター実行方法。
【請求項６】
該少なくともひとつの修飾された塩基が、アミノ酸に結合する塩基、ロック核酸糖および普遍塩基よりなる群から選ばれるメンバーを含む、請求項５のコンピューター実行方法。
【請求項７】
該少なくともひとつの修飾された塩基が、ＰＰＡ、ＰＰＧ、ＰＰＰＡ、ＰＰＰＧ、ＰＵ、ＰＣ、ＨＯＰＵ、ＨＯＢｕＵ、ＨＯＢｕＣ、ＨＯＢｕＰＰＡ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＢｕＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＢｒ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＣｌ、ＰＰＡＩ、ＰＰＡＢｒ、ＰＰＡＣｌおよびＨＯＢｕＰＰＧよりなる群から選ばれるメンバーを含む、請求項５のコンピューター実行方法。
【請求項８】
該同定されたオリゴヌクレオチド配列が、それに付着するマイナー・グルーブ・バインダー（ＭＧＢ）を有する、請求項５のコンピューター実行方法。
【請求項９】
該ＭＧＢが、下記：
【化１】
2005532618.tif 000053
式中、
下付ｍは、２から５の整数；
下付ｒは、２から１０の整数；
各ＲａおよびＲｂは、独立的に、該修飾されたオリゴヌクレオチドに連結する基、Ｈ、−ＯＲｃ、−ＮＲｃＲｄ、−ＣＯＯＲｃ、および−ＣＯＮＲｃＲｄであり、うち、ＲｃおよびＲｄはＨ、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキルおよびアリールよりなる群から選ばれる；
よりなる群から選ばれる式を有する、請求項８のコンピューター実行方法。
【請求項１０】
同定された配列中の各Ｎ−１近傍の塩基対についての該最近傍の熱力学的パラメータをメモリーからさらに検索することを含む、請求項１のコンピューター実行方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）を計算するためにプロセッサーを制御するコンピューターコードを含むコンピューター読み取り可能な媒体であって、コンピューターコードが下記：
ユーザーインプットに応答するオリゴヌクレオチド配列を同定すること、該配列はＮ塩基を有するものである；
同定された配列中の各Ｎ−１近傍の塩基対についての最近傍の熱力学的パラメータをメモリーから検索すること、最近傍の熱力学的パラメータは二つの対応する近傍の塩基の熱力学的寄与を定義するものである；および
同定されたオリゴヌクレオチド配列の融点（Ｔｍ）を、検索された最近傍の熱力学的パラメータを用いて、計算すること；
に対する指示を含む、媒体。
【請求項１２】
該ユーザーインプットがジーンバンクコードを含み、該同定のための指示が、該インプットのジーンバンクコードを用いて、ネットワーク上ジーンバンクからポリヌクレオチド配列を自動的に検索する指示を含む、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１３】
該ユーザーインプットがポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
該指示が、受け取られた配列の一部分のひとつおよび受け取られた配列の一部分に相補的な配列を同定する指示を含む、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１５】
該同定された配列が少なくともひとつの修飾された塩基を含む、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１６】
該少なくともひとつの修飾された塩基が、アミノ酸に結合する塩基、ロック核酸糖および普遍塩基よりなる群から選ばれるメンバーを含む、請求項１１のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１７】
該少なくともひとつの修飾された塩基が、ＰＰＡ、ＰＰＧ、ＰＰＰＡ、ＰＰＰＧ、ＰＵ、ＰＣ、ＨＯＰＵ、ＨＯＢｕＵ、ＨＯＢｕＣ、ＨＯＢｕＰＰＡ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＢｕＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＢｒ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＣｌ、ＰＰＡＩ、ＰＰＡＢｒ、ＰＰＡＣｌおよびＨＯＢｕＰＰＧよりなる群から選ばれるメンバーを含む、請求項１５のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１８】
該同定されたオリゴヌクレオチド配列が、それに付着するマイナー・グルーブ・バインダー（ＭＧＢ）を有する、請求項１５のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１９】
該ＭＧＢが、下記：
【化２】
2005532618.tif 000054
式中、
下付ｍは、２から５の整数；
下付ｒは、２から１０の整数；
各ＲａおよびＲｂは、独立的に、該修飾されたオリゴヌクレオチドに連結する基、Ｈ、−ＯＲｃ、−ＮＲｃＲｄ、−ＣＯＯＲｃ、および−ＣＯＮＲｃＲｄであり、うち、ＲｃおよびＲｄはＨ、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキルおよびアリールよりなる群から選ばれる；
よりなる群から選ばれる式を有する、請求項１８のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチド配列の融点（Ｔｍ）を予測するためのコンピューターシステムであって、下記：
最近傍の熱力学的パラメータを保存するためのメモリーユニット；
Ｎ塩基を有するヌクレオチド配列を同定するための手段、少なくともひとつの該Ｎ塩基は修飾された塩基を含むものである；および
同定された配列中の各Ｎ−１近傍の塩基対についての最近傍の熱力学的パラメータをメモリーから検索するための、および最近傍の熱力学的パラメータを用いて、同定されたオリゴヌクレオチド配列の融点（Ｔｍ）を計算するためのメモリーユニットに連結しているプロセッシング手段、なお、各最近傍の熱力学的パラメータは二つの対応する近傍の塩基の熱力学的寄与を定義するものである、
を含むコンピューターシステム。
【請求項２１】
同定のための手段が、ユーザー入力のヌクレオチド配列を受け取るための手段を含む、請求項２０のシステム。
【請求項２２】
同定のための手段が、ジーンバンク・サーバーに保存されたヌクレオチド配列を同定するジーンバンクＧＩ番号を受け取るための手段を含む、請求項２０のシステム。
【請求項２３】
同定のための手段が、Ｎまたはより大きい塩基を有するポリヌクレオチド配列を受けとるための、ならびに受け取られた配列の一部分のひとつおよび受け取られた配列の一部分に相補的な配列を同定するための手段を含む、請求項２０のシステム。
【請求項２４】
該同定されたオリゴヌクレオチド配列が、１以上のマイナー・グルーブ・バインダー（ＭＧＢ）、フルオロフォア（ＦＩ）およびクエンチャー（Ｑ）をそれに接着している、請求項５のコンピューター実行方法。
【請求項２５】
マイナー・グルーブ・バインダーがオリゴヌクレオチドにクエンチャー分子を介して接着している、請求項９のコンピューター実行方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願 09/796,988（2001年2月28日出願）の一部継続出願であり、これは米国特許出願 09/724,959（2000年11月28日出願）の一部継続出願であり；また米国特許出願 09/640,953（2000年8月16日出願）の一部継続出願であり；米国特許出願 09/054,832（1998年4月3日出願）の一部継続出願であり；米国特許出願 09/431,385（1999年11月1日出願）の一部継続出願であり；米国特許出願 09/054,830（1998年4月3日出願）で現在米国特許 6,127,121 の一部継続出願である（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０００２】
連邦政府の委託研究または開発下になされた発明権に関する説明
該当せず
【０００３】
発明の背景
本発明は液体、固体および混合相アッセイの際、プローブおよびプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使うことに関係する、分子生物学分野において有用なコンピュータ・ソフトウェア・システムおよび方法に関する。特に本発明はオリゴヌクレオチド、ことに修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）および他の性質を予測するのに有用なコンピュータ・ソフトウェア・システムおよび方法に関し、アレイにおいて、またプローブおよびプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの性質および識別力を改良することを目的とする。
【０００４】
分子生物学において最近使用されている多くの技術は、プローブおよび／またはプライマーとしてオリゴヌクレオチドを利用する。これら技術の実際面でしばしば有利なことは、ひとつ以上のヌクレオチドが異なるものの、関連している二つ以上の配列を区別できることである。例えば、臨床上意味のある多くの突然変異は、野生型配列とはわずか１個のヌクレオチドが異なるだけである。哺乳類ゲノムの遺伝子多型は１個または数個のヌクレオチドが異なる配列である点で、しばしば特徴づけらる。このような区別をする能力はミスマッチ識別として知られている。実際上の用語でミスマッチ識別を表わす特性というのは、明確な配列のオリゴヌクレオチドが全長にわたって相補的（完全ハイブリッドまたは完全マッチ）な標的配列に、ある厳しさで強くハイブリッドする（そのひとつの表れはハイブリッド体が高い融点をもつことである）が、一方で１個または数個のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの配列に非相補的（ミスマッチ）な標的配列に、検出ができる程度で弱くハイブリッドすることである。ハイブリダイゼーションの強さの違いとは、完全マッチはハイブリッドとして検出可能であるが、ミスマッチはハイブリッドを形成できないという点で、特定の厳しさが選べるほどのものである。
【０００５】
核酸の二本鎖において各塩基対は安定性に寄与している。それゆえ、二本鎖が短ければ短いほど、二本鎖の安定性に対する個々の塩基対の相対的寄与はますます大きくなる。その結果、完全マッチとミスマッチの安定性の差は、より短いオリゴヌクレオチドにとって、より大きなものとなる。しかし短いオリゴヌクレオチドは完全相補的配列とでさえハイブリッドは弱く、従って厳しさの弱い条件でハイブリッドしなければならない。このように短いオリゴヌクレオチドの潜在的な識別力は、厳しさの低い条件を除外するにしても、実現は容易ではない。
【０００６】
技術的に必要なのは、例えばたいていの核酸増幅に見られる典型的な高い温度のような厳しさの強い条件での、ミスマッチ識別、とりわけ単一鎖ヌクレオチドのミスマッチ識別の新しい方法である。技術的に必要なことはまた、Ｔｍのような性質およびヌクレオチド配列の他の特徴を分析し予測する新しいシステムおよび方法である。意外にも、本発明は、このようなシステムおよび方法を、その方法に利用できる新しい試薬および組成物と共に提供する。
【０００７】
本発明の概要
本発明は種々のアッセイにおいて異例の性質および有用性をもつことが分かった多くの修飾オリゴヌクレオチドを提供する。従って、また本発明は、ここに述べる修飾オリゴヌクレオチドを用いるシステムおよびその方法――コンピュータ・ソフトウェア・システムおよびその方法を含む――を提供する。
【０００８】
ひとつの実施態様において、本発明は非置換および３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基から選ばれる少なくとも二つの塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。好ましい実施態様において、修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドは検出可能な標識、蛍光および化学発光クエンチャー、および／またはマイナー・グルーブ・バインダーのような別の部分、および／または他のタイプの修飾塩基あるいは塩基類似体をさらに包含する。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は少なくともひとつの５−置換ピリミジン塩基および少なくともひとつの３‐置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。好ましい実施態様では、これら修飾オリゴヌクレオチドは検出可能な標識、蛍光および化学発光クエンチャー、および／またはマイナー・グルーブ・バインダーのような他の部分（上述）をさらに包含する。
【００１０】
また別の実施態様では、本発明は関連配列を有するポリヌクレオチドの区別方法を提供する。
さらに別の実施態様では、本発明はポリヌクレオチドの標的配列の存在を検出する方法を提供する。
さらに別の実施態様では、プライマー伸長の方法、およびポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の測定方法を提供する。
【００１１】
関連する実施態様では、本発明は細胞内の遺伝子発現を調べる方法および興味ある遺伝子の標的配列での突然変異または遺伝子多型を同定する方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、ここに記載する方法、および他の一般的アッセイならびにその方法に必要な修飾オリゴヌクレオチドの調製に有用である、多くの修飾塩基を提供する。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は修飾オリゴヌクレオチド・アレイを提供する。ここでアレイ・メンバーはおよそ１−２℃のＴｍおよび１−２塩基の長さをもつものである。またアレイ・メンバーの配列を測定する方法も提供する。
【００１３】
さらなる実施態様では本発明は、ここに記載するような最近傍の熱力学的パラメータを使って、ヌクレチド配列および特に修飾塩基を有するオリゴヌクレオチドのＴｍを測定するソフトウェアおよびコンピュータ・システムならびにその方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点については、図および請求範囲を含め明細書の残り部分の参照して明確にする。本発明のさらなる特徴および利点はもとより、本発明のさまざまな実施態様の構造および運用について、以下に添付図で詳細に説明する。図において、数字は、参照と同じかまたは機能的に類似の要素を示す。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、いくつかの修飾塩基の化学構造およびそれらの略語を示す。波線は連結した糖部分（非保護、保護、活性化および類似の状態のもの）の位置を示すのに使っている。
図２は、ＭＧＢ、ＰＰＰＡおよびＰＵの異なる組み合わせをもった八量体ＧＣ−リッチおよびＡＴ−リッチのプローブの均衡度を説明するグラフである。
【００１６】
図３は、ＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド・プローブでＰＰＰＡおよびＰＰＧを使用することによって得られる、ひとつの利点を説明する図である。図から分かるように、修飾塩基は、リアルタイムＰＣＲで高いミスマッチ識別を示すプローブを短くさせる。
【数１】
2005532618.tif 000002
はＰＰＰＡであり
【数２】
2005532618.tif 000003
はＰＰＧである。
図４は、Invader（商標）アッセイを説明する。これに本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使うことができる。
【００１７】
図５は、さまざまな数のＰＰＧを用いたInvader（商標）プローブ実績の比較を示す。
図６は、本発明の実施態様に従ったウェブ基盤のオリゴヌクレオチド・プローブ設計システムの一般的な概観を示す。
図７は、本発明のひとつの実施態様に従った標本プローブ設計プロセスの流れを示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
略語と定義
本明細書で述べる多くの修飾塩基（これら塩基の構造式は図１Ａおよび１Ｂにあげる）の略語を以下に示す。
６−アミノ−３−プロプ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン、ＰＰＰＧ；
６−アミノ−３−(３−ヒドロキシプロプ−１−イニル)−５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン、ＨＯＰＰＰＧ；
６−アミノ−３−(３−アミノプロプ−１−イニル)−５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン、ＮＨ２ＰＰＰＧ；
４−アミノ−３−(プロプ−１−イニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、ＰＰＰＡ；
４−アミノ−３−(３−ヒドロキシプロプ−１−イニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、ＨＯＰＰＰＡ；
【００１９】
４−アミノ−３−(３−アミノプロプ−１−イニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、ＮＨ２ＰＰＰＡ；
３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡ；
２−(４,６−ジアミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル)エチン−１−オール、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＯＨ；
３−(２−アミノエチニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＮＨ２；
５−プロプ−１−イニル−１,３−ジヒドロピリミジン−２,４−ジオン、ＰＵ；
【００２０】
５−(３−ヒドロキシプロプ−１−イニル)−１,３−ジヒドロピリミジン−２,４−ジオン、ＨＯＰＵ；
６−アミノ−５−プロプ−１−イニル−１,３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＰＣ；
６−アミノ−５−(３−ヒドロキシプロプ−１−イニル)−１,３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＰＣ；
６−アミノ−５−(３−アミノプロプ−１−イニル)−１,３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＮＨ２ＰＣ；
５−[４−アミノ−３−(３−メトキシプロプ−１−イニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル]−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール、ＣＨ３ＯＰＰＰＡ；
【００２１】
６−アミノ−１−[４−ヒドロキシ−５−(ヒドロキシメチル)オキソラン−２−イル]−３−(３−メトキシプロプ−１−イニル)−５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン、ＣＨ３ＯＰＰＰＧ；
５−(４−ヒドロキシブト−１−イニル)−１,３−ジヒドロピリミジン−２,４−ジオン、ＨＯＢｕＵ；
６−アミノ−５−(４−ヒドロキシブト−１−イニル)−３−ヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＢｕＣ；
４−(４−アミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル)ブト−３−イン−１−オール、ＨＯＢｕＰＰＡ；
６−アミノ−３−(４−ヒドロキシブト−１−イニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オール、ＨＯＢｕＰＰＧ；
【００２２】
４−(４,６−ジアミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル)ブト−３−イン−１−オール、(ＮＨ２)２ＢｕＰＰＡＯＨ；
３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン、(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ；
３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン、(ＮＨ２)２ＰＰＡＢｒ；
３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン、(ＮＨ２)２ＰＰＡＣｌ；
３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−イルアミン、ＰＰＡＩ；
３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−イルアミン、ＰＰＡＢｒ；
３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−イルアミン、ＰＰＡＣｌ。
【００２３】
特記しない限り、明細書および請求の範囲において用いる以下の用語は下にあげる意味をもつ。
「アルキル」なる用語は、接頭辞が示す数の炭素原子からなる、直鎖、分枝または環状で飽和の一価炭化水素基、または環状および直鎖または分枝した一価飽和炭化水素基の組み合わせを表わす。例えば、(Ｃ１−Ｃ８)アルキルはメチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチルおよび同様の基を含んでいることを表わす。ここで各定義(例えば、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アラルキルオキシ)について、接頭辞がアルキル部分の主鎖の炭素数を示していない場合は、その基または部分は８以下の主鎖炭素原子である。
【００２４】
「アルキレン」なる用語は、接頭辞が示す数の炭素原子からなる、直鎖で飽和の二価炭化水素基または分枝した飽和の二価炭化水素基を意味する。例えば、(Ｃ１−Ｃ６)アルキレンはメチレン、エチレン、プロピレン、２−メチルプロピレン、ペンチレンおよび同様の基を含んでいることを表わす。
【００２５】
「アルケニル」なる用語は、接頭辞が示す数の炭素原子からなり、少なくとも１個の二重結合を含む、直鎖の一価炭化水素基または分枝した一価炭化水素基を表わす。例えば、(Ｃ２−Ｃ６)アルケニルはエテニル、プロペニルおよび同様の基を含んでいることを表わす。
【００２６】
「アルキニル」なる用語は、少なくとも１個の三重結合を含み、接頭辞が示す数の炭素原子からなる、直鎖の一価炭化水素基または分枝した一価炭化水素基を表わす。例えば、(Ｃ２−Ｃ６)アルキニルはエチニル、プロピニルおよび同様の基を含んでいることを表わす。
【００２７】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）なる用語は一般的な意味で使われ、各々酸素原子、アミノ基または硫黄原子を経て分子の残り部分に結合するアルキル基を表わす。同様に、ジアルキルアミノは、同一かまたは異なってもよい２個のアルキル基を結合したアミノ基を表わす。
【００２８】
「アリール」なる用語は、６ないし１０個の環原子からなる一価の単環または二環式芳香族炭化水素基を意味し、このものは置換していないか、またはアルキル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、ＣＯＲ（Ｒは水素原子、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）、−(ＣＲ'Ｒ'')ｎ−ＣＯＯＲ（ｎは０から５の整数、Ｒ'およびＲ''は独立して水素原子またはアルキル、およびＲは水素原子、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）または−(ＣＲ'Ｒ'')ｎ−ＣＯＮＲａｂ（ｎは０から５の整数、Ｒ'およびＲ''は独立して水素原子またはアルキル、ならびにＲａおよびＲｂは独立して水素原子、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）から選ばれる１ないし４個の置換基、好ましくは１、２または３個の置換基が独立して置換している。より具体的に「アリール」なる用語は、これらに限定しないが、フェニル、ビフェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル、およびその置換したものを含む。同様に、「ヘテロアリール」なる用語は、芳香族性を維持したまま、１個以上のへテロ原子またはヘテロ原子を含む官能基が環状炭素に置き換わった、先述のアリール基を表わし、例えばピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニルおよび同様の基である。簡略のため、アリールなる用語は、他の基と組み合わせて使う場合(例としてアリールオキシ、アリールアルキルなど)、上述のようなアリール基およびヘテロアリール基の両方を含んでいることを意味する。
【００２９】
「アリールアルキル」なる用語は−ＲａＲｂの基を表わし、ここでＲａはアルキレン基（指示した炭素原子数をもつか、または特記しなければ、６個以下の主鎖炭素原子をもつ）であり、Ｒｂはここに定義するようなアリール基である。アリールアルキル基の例をあげれば、ベンジル、フェニルエチル、３−(３−クロロフェニル)−２−メチルペンチル、および同様の基である。
【００３０】
同様に、「アリールアルケニル」なる用語は−ＲａＲｂの基を意味し、ここでＲａはアルケニレン基であり、Ｒｂはここに定義するようなアリール基である。例をあげれば、３−フェニル−２−プロペニルおよび同様の基である。
【００３１】
「アリールへテロアルキル」なる用語は−ＲａＲｂの基を意味し、ここでＲａはヘテロアルキレン基（指示した炭素原子数をもつ）であり、Ｒｂはここに定義するようなアリール基である。例をあげれば、２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル、２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−２−フェニルエチルおよび同様の基である。
【００３２】
「アリールオキシ」なる用語は−ＯＲの基を表わし、ここでＲはアリール基で、例えばフェノキシ、ナフチルオキシおよび同様の基である。
【００３３】
置換基を表わすときに使う接頭辞「ハロ」および用語「ハロゲン」は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉなる置換基を表わす。
【００３４】
「ヘテロアルキル」なる用語は、シアノ、−ＯＲａ、−ＮＲｂＲｃおよび−Ｓ(Ｏ)ｎＲｄ（ｎは０から２の整数である）から独立して選ばれる１、２、または３個の置換基をもつアルキル基（但しヘテロアルキル基はヘテロアルキル基の炭素原子に結合している）を表わす。Ｒａは水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミドまたはモノ−もしくはジ−アルキルカルバモイルである。Ｒｂは水素原子、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである。Ｒｃは水素原子、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、カルボキサミド、モノ−またはジ−アルキルカルバモイル、またはアルキルスルホニルである。Ｒｄは水素原子（ｎが０であれば）、アルキル、アリール、アリールアルキル、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノまたはヒドロキシアルキルである。代表的な例をあげれば、２−ヒドロキシエチル、２,３−ジヒドロキシプロピル、２−メトキシエチル、ベンジルオキシメチル、２−シアノエチルおよび２−メチルスルホニルエチルである。上述の各々について、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄはＮＨ２、フッ素、アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、ＯＨまたはアルコキシでさらに置換されてもよい。加えて、炭素原子の数を示す接頭辞（例えばＣ１−Ｃ１０）は、シアノ、−ＯＲａ、−ＮＲｂＲｃまたは−Ｓ(Ｏ)ｎＲｄを除いて、ヘテロアルキル部分の炭素原子の総数を表わす。
【００３５】
「ヘテロシクリル」なる用語は、３ないし８個の環原子からなる飽和または不飽和の非芳香族の環状基を表わし、そのうち１個または２個の環原子はＯ、ＮＲ（Ｒは独立して水素原子またはアルキルである）またはＳ(Ｏ)ｎ（ｎは０から２の整数である）から選ばれるヘテロ原子であり、残りの環原子はＣ（１または２個の炭素原子はカルボニル基で任意に置換されていてもよい）である。ヘテロシクリル環は、アルキル、ハロ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、−ＣＯＲ（Ｒは水素原子、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）、−(ＣＲ'Ｒ'')ｎ−ＣＯＯＲ（ｎは０から５の整数、Ｒ'およびＲ''は独立して水素原子またはアルキルであり、Ｒは水素原子、アルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）、または−(ＣＲ'Ｒ'')ｎ−ＣＯＮＲａＲｂ（ｎは０から５の整数、Ｒ'およびＲ''は独立して水素原子またはアルキルであり、ＲａおよびＲｂは独立して水素原子、アルキル、フェニルまたはフェニルアルキルである）から選ばれる１、２または３個の置換基で独立して任意に置換されていてもよい。より具体的にヘテロシクリルの用語は、これらに限定しないが、テトラヒドロピラニル、ピペリジノ、Ｎ−メチルピペリジン−３−イル、ピペラジノ、Ｎ−メチルピロリジン−３−イル、３−ピロリジノ、２−ピロリドン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリノ、チオモルホリノ−１−オキシド、チオモルホリノ−１,１−ジオキシド、ピロリジニル、およびそれらの誘導体を含んでいる。炭素原子の数を示す接頭辞（例えばＣ３−Ｃ１０）は、ヘテロ原子の数を除いてヘテロシクリル基部分の炭素原子の総数を表わす。
【００３６】
「ヘテロシクリルアルキル」、「ヘテロシクリルアルケニル」および「ヘテロシクリルアルキニル」なる用語は−ＲａＲｂを表わし、ここでＲａはそれぞれアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン基であり、Ｒｂはここで定義するようなヘテロシクリル基、例えばテトラヒドロピラン−２−イルメチル、４−メチルピペラジン−１−イルエチル、３−ピペリジニルメチルおよび同様の基である。
【００３７】
「ヘテロアルキレン」なる用語は、１ないし６個の炭素からなる直鎖の飽和二価炭化水素基または３ないし６個の炭素原子からなる分枝の飽和炭化水素基を意味し、該炭化水素基は−ＯＲａ、−ＮＲｂＲｃおよび−Ｓ(Ｏ)ｎＲｄ（ｎは０から２の整数である）から独立して選ばれる１、２、または３個の置換基を結合している。ここでＲａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄはヘテロアルキル基について定義したものと同じである。例をあげれば、２−ヒドロキシエタン−１,２−ジイル、２−ヒドロキシプロパン−１,３−ジイルおよび同様の基である。
【００３８】
上述の各用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」および「アリール」）は同一の基の置換型および非置換型を共に含んでいることを意味する。各タイプの基にとっての好ましい置換基を以下に述べる。
【００３９】
アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、へテロアルケニル、アルキニル、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアルケニルとしてしばしば言及するこれらの基を含む）に対する置換基は、以下の中から、０から４個、好ましくは０、１、２、または３個の範囲で選ばれる多様な基である：すなわち、−ＯＲ'、＝Ｏ、＝ＮＲ'、＝Ｎ−ＯＲ'、−ＮＲ'Ｒ''、−ＳＲ'、−ハロゲン、ＳｉＲ'Ｒ''Ｒ'''、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ'，−Ｃ(Ｏ)Ｒ'、−ＣＯ２Ｒ'、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ''、−ＮＲ''Ｃ(Ｏ)Ｒ'、−ＮＲ'−Ｃ(Ｏ)ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＲ''Ｃ(Ｏ)２Ｒ'、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＨ、−ＮＲ'Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＲ'、−Ｓ(Ｏ)Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)２ＮＲ'Ｒ''、−ＣＮ、および−ＮＯ２である。ここでＲ'、Ｒ''およびＲ'''は各々独立して水素原子、非置換(Ｃ１−Ｃ８)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリール、１−３個のハロゲンが置換したアリール、非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ、またはアリール−(Ｃ１−Ｃ４)アルキル基を表わす。Ｒ'およびＲ'' が同じ窒素原子に結合している場合は、その窒素原子と合わせて５−、６−または７−員環を形成してよい。例えば、−ＮＲ'Ｒ''は１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意味する。置換基についての上述の説明から、当業者は「アルキル」なる用語は広い意味でハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３、−Ｃ(Ｏ)ＣＦ３、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＯＣＨ３および同様の基）のような基を含む意味であることを理解する。好ましくは、特に断らない限り、アルキル基は０ないし３個の置換基、より好ましくは０、１または２個の置換基をもつ。
【００４０】
同様に、アリール基の置換基は、以下の中から個数として０から芳香環システム上の空いている総価数の範囲で、各々独立して選ばれる：すなわちハロゲン、−ＯＲ'、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ'、−ＮＲ'Ｒ''、−ＳＲ'、−Ｒ'、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＯ２Ｒ'、−ＣＯＮＲ'Ｒ''、−Ｃ(Ｏ)Ｒ'、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ''、−ＮＲ''Ｃ(Ｏ)Ｒ'、−ＮＲ''Ｃ(Ｏ)２Ｒ'、−ＮＲ'−Ｃ(Ｏ)ＮＲ''Ｒ'''、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＨ、−ＮＲ'Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ２)＝ＮＲ'、−Ｓ(Ｏ)Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ'、−Ｓ(Ｏ)２ＮＲ'Ｒ''、−Ｎ３、−ＣＨ(Ｐｈ)２、パーフルオロ(Ｃ１−Ｃ４)アルコキシ、およびパーフルオロ(Ｃ１−Ｃ４)アルキルである。ここでＲ'、Ｒ''およびＲ'''は水素原子、(Ｃ１−Ｃ８)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびへテロアリール、(非置換アリール)−(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、および(非置換アリール)オキシ−(Ｃ１−Ｃ４)アルキルから各々独立して選ばれる。
【００４１】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上にある２個の置換基は、式−Ｔ−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｑ−Ｕ−なる置換基で任意に置き換わってもよく、ここでＴおよびＵは独立して−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−または単結合であり、ｑは０から２の整数である。それとは別に、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上にある２個の置換基は、式−Ａ−(ＣＨ２)ｒ−Ｂ−なる置換基で任意に置き換わってもよく、ここでＡおよびＢは独立して−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｓ(Ｏ)２ＮＲ'−または単結合であり、ｒは０から３の整数である。そのようにしてできた新しい環の単結合のひとつは、任意に二重結合と置き換わってもよい。あるいはまた、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上にある２個の置換基は、式−(ＣＨ２)ｓ−Ｘ−(ＣＨ２)ｔ−なる置換基で任意に置き換わってもよく、ここでｓおよびｔは独立して０から３の整数、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ'−、−Ｓ−、−Ｓ(Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−または−Ｓ(Ｏ)２ＮＲ'−である。−ＮＲ'−および−Ｓ(Ｏ)２ＮＲ'−の置換基Ｒ'は水素原子または非置換(Ｃ１−Ｃ６)アルキルから選ばれる。
【００４２】
本発明のある種の化合物またはオリゴヌクレオチドは塩の形であってもよい。このような塩はナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミンまたはマグネシウムのような塩基付加塩、または類似の塩を含む。本発明の化合物または修飾オリゴヌクレオチドが相対的に塩基性の官能基を含んでいる場合には、無溶媒または適切な溶媒中で、このような化合物の中性型と十分量の望む酸とを接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。許容される酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸水素酸、リン酸、第一リン酸、第二リン酸、硫酸、重硫酸、ヨウ化水素酸または亜リン酸等のような無機酸から誘導される無機酸の付加塩の他、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマール酸、マンデリン酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような有機酸から誘導される有機酸の付加塩も含む。また、アルギン酸塩等のアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸等の有機酸の塩も含む（例えば Berg, S. M. et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-9 を参照）。本発明の特定の化合物は、塩基付加塩または酸付加塩のどちらかに変換可能な、塩基性および酸性の両機能をもっている。
【００４３】
化合物の中性型は、その塩を塩基または酸と接触させ、通常の方法により原化合物を単離することにより再生成できる。化合物の原型は、極性溶媒中の溶解性の如きある種の物性が種々の塩の形と異なってはいるが、それ以外、塩は本発明の目的化合物の原型と均等である。
【００４４】
本発明のある種の化合物は非溶媒和形の他、水和物を含む溶媒和形でも存在しうる。一般的に溶媒和形は非溶媒和形と均等であって、本発明の範囲に含まれることを意味する。本発明のある種の化合物は複数の結晶形または無晶形で存在しうる。一般的に、すべての物理形は本発明が意図する用途に関して均等であり、本発明の範囲に含まれることを意味する。
【００４５】
本発明のある種の化合物は不斉炭素原子(光学活性中心)または二重結合をもっている。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体もすべて本発明の範囲に含まれる。立体化学の判定方法および異性体の分離方法については技術的によく知られている（"Advanced Organic Chemistry",４版、J. March, John Wiley and Sons, New York, 1922 の第４章の説明を参照）。
【００４６】
本発明化合物は化合物を構成する１個以上の原子の同位体を天然にない割合で含んでいてもよい。例えば、化合物はトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）のような放射性同位体で標識されていてもよい。本発明化合物すべての同位体の変形体は、放射性であろうとなかろう(例、２Ｈ)と、本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
「保護基」または「その保護形」は、分子マスクの状態で反応活性基に結合して、その反応性を弱めたり妨げたりする原子の集団を意味する。保護基の例は T. W. Greene & P. G. Futs, Protective Groups in Organic Chemistry, (Wiley, ２版、1991)、Beaucage & Iyer, Tetrahedron 48:2223-2311 (1992) および Harrison & Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, 1-8 巻（John Wiley & Sons. 1971-1976）を参照。代表的なアミノの保護基は、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、tert-ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル、アリールオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）等である。代表的な水酸基の保護基は、水酸基がアシル化されている場合の保護基、またはベンジルおよびトリチルエーテルの他、アルキルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルならびにアリールエーテルの如くアルキル化されている場合の保護基を含む。
【００４８】
上述の定義での「任意の」または「任意に」の用語は、その後に述べる事柄または状況が必ずしも必要ではないこと、およびその事象または状況が起きる場合も起きない場合も含んでいることを意味する。例えば、「アルキル基が任意にモノ−またはジ−置換したヘテロシクロ基」は、アルキル基があってもなくても構わないこと、およびヘテロシクロ基がアルキル基でモノ−またはジ−置換されている状態およびヘテロシクロ基がアルキル基で置換されていない状態を含んでいることを意味する。
【００４９】
本発明の実施には、特に断らない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチドの合成と修飾、バイオ抱合化学、核酸のハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組み換えＤＮＡおよび当該技術の関連分野を用いる。これらの技術は文献にて余すところなく説明されている。例えば以下の文献を参照：Maniatis, Fritsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982); Sambrook, Fritsch & Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, ２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); Gait (編), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH,IRL Press (1984); Eckstein (編), OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)。
【００５０】
一般
オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの短いポリマーであり、一般的に長さ２００ヌクレオチド未満、好ましくは１５０ヌクレオチド未満、より好ましくは１００ヌクレオチド未満、より好ましくは５０ヌクレオチド未満、最も好ましくは２１ヌクレオチド未満である。ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド長の上限とポリヌクレオチド長の下限との間に技術的に認められる重複はあるものの、技術的にはオリゴヌクレオチドよりも長いヌクレオチドのポリマーを含有すると一般的に考えられる。本発明に関して、「オリゴヌクレオチド」は、通常検出可能な標識を含み、プローブまたはプライマーとして用いられる核酸を表わすが、一方ポリヌクレオチドは、標的配列を含む核酸を表わす。従って、本発明の目的には、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」の用語はポリマー長に対する制限を考慮しない。
【００５１】
本発明は、修飾していないオリゴヌクレオチドに比べ、優れたミスマッチ識別の新規で驚くべき性質をもった修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の修飾オリゴヌクレオチドはプローブとして用いられ、ここでは標的配列へのハイブリダイゼーションが検出される。あるいはまた本発明の修飾オリゴヌクレオチドはプライマーとして用いられ、ここでは標的配列へのハイブリダイゼーションに続き、修飾オリゴヌクレオチドの３'末端から始まるポリヌクレオチド合成が進行し最後に合成物（すなわち伸長生成物）が検出される。
【００５２】
標的配列とはプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション位置を含むヌクレオチド配列を表わす。標的配列は、これに限定しないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその増幅生成物を含む核酸中に見出せるし、また野生型遺伝子配列、突然変異の遺伝子配列、非コード配列、調節性配列等を構成する。標的配列は一般に長さが１００ヌクレオチド未満、好ましくは５０ヌクレオチド未満、最も好ましくは２１ヌクレオチド未満である。
【００５３】
実施態様の説明
本発明は、一般に３グループに分類できる多くの修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５４】
第１グループの修飾オリゴヌクレオチドは、天然由来の塩基に代わる、少なくとも２個の修飾塩基をもつものである。ここで修飾塩基は、非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンである。しかしある実施態様において、修飾塩基は塩基の少なくともひとつが５−置換ピリミジンであり、塩基の少なくともひとつは非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンであるように選択される。好ましくは、このグループの修飾オリゴヌクレオチドは、アッセイにおいて標的配列の検出を支援する付加的な連結基（例えば、マイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基、クエンチャー等）をもっている。
【００５５】
第２グループの修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾塩基をもつものであるが、連結したマイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基またはクエンチャー等も有する。
【００５６】
第３グループの修飾オリゴヌクレオチドは、下に述べる新規な修飾塩基の１個以上を含むものである。第１グループのように、第３グループの修飾オリゴヌクレオチドは例えばマイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基またはクエンチャーの中から選ばれる基を好ましくは連結する。
【００５７】
修飾オリゴヌクレオチド
ひとつの実施態様において、本発明は、非置換および３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基からなる群より選ばれる、少なくとも２個の塩基を含む修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【００５８】
ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基とは、ピラゾール環が次に示す特定の配置でピリミジン環に融合している塩基である：
【化１】
2005532618.tif 000004
式中、波線は塩基と、連結オリゴマーの生成に関わる糖またはペプチド核酸の生成に関わるアミノ酸のどちらかが結合している位置を示す。加えてＸ１およびＸ２は、ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基を天然のプリン塩基、グアノシン、アデニンおよびイノシンの他、これら塩基の関連誘導体の構成に近づけるような、独立してＨ、ＯＨまたはＮＨ２である。このグループの実施態様において、「非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基」は一般式Ｉａの塩基を表わし、一方「３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基」は式Ｉｂをもつ塩基を表わすが、ここでＲ１は下記のように定義する。
【００５９】
【化２】
2005532618.tif 000005
式Ｉｂにおいて、Ｘ１およびＸ２は独立してＨ、ＯＨ、ＮＨ２またはその保護形を表わす。Ｒ１は(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、−Ｓ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２およびその保護形から選ばれる置換基を表わす。好ましいヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基は、ヘテロ原子の基（例えばＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ等）で終る（ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン環システムより遠位側で）基である。例えば、好ましいヘテロアルキル、ヘテロアルケニルおよびヘテロアルキニル基は、３−アミノ−１−プロピル、４−ヒドロキシ−１−ブチル、３−アミノ−１−プロピン−１−イル、３−ヒドロキシ−１−プロピン−１−イル、４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル−１−ブチン−１−イル、４−ヒドロキシ−１−ブチン−１−イルおよびその高次同族体を含む。別の好ましいＲ１基はアリールまたはヘテロシクリル基で終る基（例えば、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニルおよびアリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル）を含む。好ましいアリールおよびヘテロシクリル基は置換または非置換のフェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンツイミダゾリル、ベンツチアゾリルおよびベンゾオキサゾリルである。
【００６０】
特に好ましい実施態様において、ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基は以下から選ばれる：
【化３】
2005532618.tif 000006
【００６１】
より好ましくは、修飾塩基はＩｃ、ＩｄまたはＩｅから選ばれ、ここでＲ１は、プロピニル、ヒドロキシプロピニル、アミノプロピニル、アミノブチニル、ヒドロキシブチニル、または置換もしくは非置換のフェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンツイミダゾリル、ベンツチアゾリルまたはベンゾオキサゾリル基であり、これらはピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン環システムに直接結合しているか、または１ないし４個の炭素連結基を経て環システムに結合しており、炭素連結基は飽和していてよく（例えばエチレン、プロピレン、ブチレン）または不飽和（例えばアセチレニル、プロピニレン、ブチニレン、プロペニレン、ブテニレン）であってもよい。
【００６２】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、例えば天然由来のオリゴヌクレオチドまたはペプチド−核酸（例として、オリゴマー生成に関わる糖またはペプチド−核酸生成に関わるアミノ酸に連結したヘテロシクリル塩基）に見られるような骨格をもっている。あるいは別のオリゴメリック骨格は当業者によく知られている（「修飾された」骨格または骨格修飾を含むの如く以下で表わす）。本発明の目的には、修飾オリゴヌクレオチドは天然のリン酸骨格および非天然の骨格を含むオリゴメリック・ポリマーであって、これは天然または／および修飾塩基をもち、また相補核酸に特異的にハイブリッドし得る能力を保持していて安定な二本鎖を形成する。
【００６３】
好ましい実施態様において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは糖またはグリコシド部分の骨格、好ましくはヌクレチド間結合が天然由来のホスホジエステル結合である２−デオキシリボフラノシドの骨格をもっている。しかし別の実施態様においては、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノーズ基は他の糖、例えばβ−Ｄ−リボフラノーズで置き換わっている。加えて、β−Ｄ−リボフラノーズが存在していてもよく、そのリボーズ部の２−ＯＨはＣ１−６アルキル基（２−(Ｏ−Ｃ１−６アルキル)リボーズ）で、またはＣ２−６アルケニル基（２−(Ｏ−Ｃ２−６アルケニル)リボーズ）でアルキル化されているか、またはフルオロ基（２−フルオロリボーズ）で置き換わっている。本発明に有用な関連のオリゴマー生成の糖は「鍵をかけた」状態、すなわちＣ−４' 炭素原子とＣ−２' 酸素原子との間にメチレン・ブリッジをもっている糖である。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションと相性のよい他の糖部分も用いることが可能であり、それらは当業者にはよく知られている。例としてあげれば、これに限定しないが、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２'−デオキシリボフラノシドまたは２',３'−ジデオキシ−３'−アミノリボフラノシドである。α−Ｄ−アラビノフラノシドを含むオリゴヌクレオチドは米国特許 5,177,196 に記載のようにして調製できる。２',３'−ジデオキシ−３'−アミノリボフラノシドを有するオリゴヌクレオチドは Chen et al. ((1995) Nucleic Acids Res. 23:2661-2668) に記載されている。鍵かけした核酸 (Singh et al., Chem. Comm., 455-456 (1998); Wengel J., Acc. Chem. Res., 32:301-310 (1998)) および２'−ハロゲノ−２'−デオキシリボフラノシドを含むオリゴヌクレオチド (Palissa et al., Z. Chem., 27:216 (1987)) の合成方法はそれぞれ引用の文献に記載されている。ここで述べた修飾オリゴヌクレオチドのホスフェート骨格は、オリゴヌクレオチドがホスホロチオアート結合および／またはメチルホスホナートおよび／またはホスホロアミダートを含むように修飾できる(Chen et al., Nucl. Acids Res., 23:2662-2668 (1995))。オリゴヌクレオチド結合の組み合わせも本発明の範囲内である。なお他の骨格修飾は当業者によく知られている。
【００６４】
他の実施態様において、ここで述べる修飾塩基は、ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラに組み込まれてＴｍの均衡を保ち、改善されたミスマッチ識別をもつ修飾オリゴヌクレオチドを与える。プローブおよびプライマーとしてＤＮＡ分子を使用することの短所を克服しようとして、ＤＮＡおよびＤＮＡ類似体の種々の修飾形が用いられてきた。これらのうちにペプチド核酸がある（ポリアミド核酸としても知られるＰＮＡ）。Nielsen et al. (1991), Science 254:1497-1500。ＰＮＡは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるように、ヘテロシクリル塩基ユニットをもち、ＤＮＡおよびＲＮＡに特有の糖−ホスフェート骨格に代わって、ポリアミド骨格によって連結している。ＰＮＡは相補ＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列にハイブリダイゼーションが可能であって、事実対応する核酸プローブよりも強くハイブリッドする。ＰＮＡオリゴマーの合成に用いるＰＮＡオリゴマーおよび活性モノマーの合成は米国特許 5,539,082、5,714,331、5,773,571、5,736,336 および 5,766,855 に記載されている。ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ合成、およびＰＮＡのモノマー合成への別のアプローチが、次に要約されている。Uhlmann et al. (1998), Angew. Chem. Int. Ed., 37:2796-2823。従って、通常の塩基、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基（例えばＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的塩基またはＰＮＡあるいはＤＮＡ／ＰＮＡキメラのＴｍの均衡を保つマイナー・グルーブ・バインダーとのどの組み合わせも、本発明の範囲内である。種々の普遍的な塩基が技術的に知られている。その他の普遍的な塩基は最近記載されているが、これらも本発明に有用である（Seela et al., XIV International Round Table: Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, September 10-14, 2000, San Francisco California, pp. 40を参照）。ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ合成に必要な修飾塩基のモノマー・ユニットの合成方法は技術的に入手可能である。本出願に記載の方法およびUhlmann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 37:2796-2823 (1998) を参照。
【００６５】
同様に、通常の塩基、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基（例えばＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５−置換ピリミジン、普遍的塩基またはマイナー・グルーブ・バインダーの組み合わせがオリゴヌクレオチド・ポリマーまたはオリゴポリマー／ＤＮＡキメラのＴｍの均衡を保つために使用できることを本発明は示している。
【００６６】
ここに述べた用途のために、修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは４から７０の塩基、より好ましくは４から２５の塩基を有する。ある実施態様では、修飾オリゴヌクレオチドは１５以下、より好ましくは１０以下の塩基を有する。加えて修飾オリゴヌクレオチドは、ある実施態様において、３、４、５、６、７、８または９、またはそれ以上の修飾塩基（非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのどちらか）をもつ。複数の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基が存在する実施態様の各々に対しては、修飾塩基は同じであるか、または互いに異なっていてもよい。
【００６７】
修飾塩基の構成要素に加え、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、ある実施態様において、３'末端、５'末端またはその両端で、内部に位置するヌクレオチド塩基の１個またはそれ以上に連結したインターカレーター、親油性基、マイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基、キレート剤、クエンチャーおよび架橋結合剤のような付加的ペンダント基を含んでいる。インターカレーター、親油性基、マイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基、キレート剤、クエンチャーおよび架橋結合剤をオリゴヌクレオチドに連結させる適切な方法は、例えば 米国特許 5,512,667 および 5,419,966、ＰＣＴ公表 WO 96/32496 および 米国特許出願 No. 09/457,616 に記載されている。本発明のオリゴヌクレオチドは３'または５'末端、または両端に連結する比較的低分子量の「尻尾部」を有していてよい。例をあげると、尻尾分子はホスフェート、ホスフェート・エステル、アルキル基、アミノアルキル基またはリン酸基である。尻尾部はインターカレーター、親油性基、マイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基、キレート剤、クエンチャーおよび架橋結合機能部を本発明のオリゴヌクレオチドに連結することも可能である。尻尾部の性質および種々の尻尾部をもつオリゴヌクレオチドを得る方法は上記引用の米国特許 5,512,667および5,419,966 に記載されている。
【００６８】
マイナー・グルーブ・バインダー
実施態様のひとつにおいて、修飾オリゴヌクレオチドは共有結合したマイナー・グルーブ・バインダー（ＢＧＢ）をもつ。種々の適切なマイナー・グルーブ・バインダーが文献に記載されている。例えば、Kutyavin et al., 米国特許5,801,155; Wemmer, D. E. & Dervan, P. B., Current Opinon in Structural Biology, 7:355-361 (1997); Walker, W. L., Kopka, J. L. & Goodsell, D. S., Biopolymers, 44:323-334 (1997); Zimmer, C & Wahnert, U., Prog. Biophys. Molec. Bio., 47:31-112 (1986); Reddy, B. S. P., Dondhi, S. M. & Lown, J. W., Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999) を参照。
【００６９】
ＭＧＢ（および下記のフルオロフォアおよびクエンチャーのようなリポーター基も）を、リンカーを経てオリゴヌクレオチドに連結する適切な方法は、例えば、米国特許 5,512,677; 5,419,966; 5,696,251; 5,585,481; 5,942,610；5,736,626 に記載されている。
【００７０】
ＭＧＢはオリゴヌクレオチドの末端のどちらかまたは両端に連結できる。これに加えてまたはそれとは別に、１個以上のＭＧＢはオリゴヌクレオチドの長さに依存してオリゴヌクレオチドの内部に連結できる。一般的に、ＭＧＢのオリゴヌクレオチド末端のどちらかへの抱合は最大のハイブリッド安定性を与えるであろう。何故ならオリゴヌクレオチド二本鎖の融点が限界に達するからである。そうはいうものの、オリゴヌクレチドによってできた二本鎖の両末端が、例えば高いＧ＋Ｃ含有量のために相対的に安定であるならば、オリゴヌクレオチドの内部（例えばＡ＋Ｔ−リッチ配列の近く）でのＭＧＢの連結は、安定性を高めるであろう。ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド抱合体の意図的な使用は、抱合したＭＧＢの位置に制限を加えるかもしれない。例えば、もしオリゴヌクレオチドがプライマーとして使われるよう設計されるなら、３'−ヒドロキシ基は遊離であり重合酵素によって伸長されねばならない。それとは別に、標識された５'−末端を有するオリゴヌクレオチドを必要とするアッセイは、ＭＧＢの内部的または３'−末端連結を必要とするであろう。
【００７１】
ＭＧＢ−修飾オリゴヌクレオチド抱合体内でのＭＧＢの位置は、このような抱合体の識別の性質に影響を及ぼしうる。二本鎖内の不対領域はミスペアー塩基の近傍でマイナー・グルーブの形に変化をもたらす。ＭＧＢは完全マッチのＤＮＡ二本鎖のマイナー・グルーブ内で最もよく適合するので、マイナー・グルーブでの形の変化となって現れるミスマッチは、ミスマッチを含む領域へのＭＧＢの結合力を弱めるであろう。それゆえ、ハイブリッドを安定化させるＭＧＢの能力は弱まり、そのためにＭＧＢ−オリゴヌクレオチド抱合体のミスマッチと完全マッチの二本鎖を識別する能力は増加する。一方、ミスマッチがＭＧＢ−オリゴヌクレオチド抱合体の相補領域の外部にあるなら、等しい長さの非抱合体とＭＧＢ−抱合体のオリゴヌクレオチドとを識別する能力は、ほぼ同じであると思われる。オリゴヌクレチド・プローブが単塩基対ミスマッチを識別する能力は長さに依存するので、オリゴヌクレオチドが短ければ短いほど、ミスマッチ識別はますます効果的となる。こういった状況でＭＧＢ−オリゴヌクレオチド抱合体を使用する第一の利点は、先行技術で用いられるものに比べ、とても短いオリゴヌクレオチド（すなわち二十量体またはより短い）がより大きい識別力を有しており、ＭＧＢ抱合体の顕著な安定化効果の故に使用できる、という事実にある。
【００７２】
好ましいマイナー・グルーブ・バインダーは下記式から選択されるものである:
【化４】
2005532618.tif 000007
下付き文字ｍは２から５の整数、下付き文字ｒは２から１０の整数、および各ＲａおよびＲｂは独立して修飾オリゴヌクレオチドへの連結基であるＨ、−ＯＲｃ、−ＮＲｃＲｄ、−ＣＯＯＲｃまたはＣＯＮＲｃＲｄであり、ここで各ＲｃおよびＲｄはＨ、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキルおよびアリールから選択される。
【００７３】
特に好ましいマイナー・グルーブ・バインダーは３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−(３Ｈ)−ピロロ[３,２−ｅ]インドール−７−カルボキシラートの三量体（ＣＤＰＩ３）、Ｎ−メチルピロール−４−カルボキシ−２−アミドの五量体（ＭＰＣ５）および高いミスマッチ識別を示す他のマイナー・グルーブ・バインダーを包含する。本発明の実践にて有用と分かる付加的なＭＧＢ部分は共同所有の米国特許 5,801,155 に開示されている。ある実施態様においては、ＭＧＢは水溶性増加基（例えば糖またはアミノ酸）を連結している。
【００７４】
レポーター基
実施態様の別のグループにおいて、修飾オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１個の共有結合したレポーター基を含む。リポーター基はＭＧＢについて上述した方法および連結基を用いて連結できる。本発明の修飾オリゴヌクレオチドに適切なリポーター基は、ビーズ、ナノ粒子（Taton, T. A. et al., Science 289:1757-1760 (2000)）、化学発光体、アイソトープ、酵素およびフルオロフォアを含む。好ましくは、レポーター基はフルオロフォアである（Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, ６版, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996 を参照）。適切なフルオロフォアはリゾルフィン色素、クマリン色素、ローダミン色素、シアニン色素、BODIPY(商標)色素およびピレンを包含する。
【００７５】
クエンチャー
最近開発された検出法は、蛍光強度を直接検出するよりも、プローブ・ハイブリダイゼーションを検出する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを用いる。このタイプのアッセイでは、クエンチャー分子の吸収スペクトルがドナーのフルオロフォアの発光と重なり、そして二つの分子が接近しているとき、ドナーのフルオロフォア（レポーター）とアクセプター分子（クエンチャー）間にＦＲＥＴが起こる。ドナーのフルオロフォアの励起エネルギーは共鳴双極子誘導の双極子相互作用により近接するアクセプター分子に移動し、その結果ドナーの蛍光が消える。もしもアクセプター分子がフルオロフォアであれば、蛍光はときに増加する。ドナーとアクセプター分子間のエネルギー移動の効率性はその分子間の距離に大きく依存する。この関係を示す方程式が知られている。フォースター距離（Ｒ０）は、エネルギー移動の効率が５０％である場合のドナーとアクセプター間の距離として表わされる。蛍光を消去する別のメカニズムとして衝突と電荷移動抑制なども知られている。クエンチャーと蛍光対の選択およびオリゴヌクレオチドへの連結に関する技術には豊富なガイダンスがある（Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, ６版, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996；米国特許 3,996,345 および 4,351,760 等）。 
好ましいクエンチャーは共有の米国特許出願 09/457,616（１９９９年１１月８日出願）に記載されている。
【００７６】
フルオロフォアおよびクエンチャー
本発明のある実施態様では、蛍光標識（フルオロフォア）および／または蛍光消去剤（クエンチャー）を含むオリゴヌクレオチドを用いる。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドはフルオロフォアおよびクエンチャーの両方を含んでいる。蛍光標識は、これに限定しないが、蛍光色素、ローダミン、シアニン、フィコエリトリンおよびここに述べるような他のフルオロフォアを含む。さらに別の適切なフルオロフォアが当業者には知られている。上述のように、消光剤すなわちクエンチャーはフルオロフォアが放出したエネルギーを吸収し、放出する蛍光の量を減少させる（すなわち、蛍光標識の放出を抑える）。別のフルオロフォアは別のクエンチャーで抑えられる。一般的に、特定のフルオロフォア／クエンチャー・ペアのスペクトル的性質は、クエンチャーのひとつ以上の吸収波長がフルオロフォアのひとつ以上の発光波長と重なったようなものである。好ましいフルオロフォア／クエンチャー・ペアを、当業者者は上述の性質に従い、放出波長と励起波長との比較によって選択できる。
【００７７】
ポリマー鎖反応のような高温で行う増幅アッセイで、または熱安定性酵素を用いる別の方法で使用するために、標識は、好ましくは高温で安定なものである。重合化を含むアッセイにとって、標識は重合化酵素の活性に干渉しないものである。加えて標識は、オリゴヌクレオチドの５'および／または３'末端に存在し、および／または非干渉部位に内在的に存在してもよい。従って標識はオリゴヌクレオチドの塩基、糖またはホスフェート部のどれかに、またはこれらのひとつにそれ自体が結合した連結基のどれかに連結していてよい。
【００７８】
本発明を種々の塩基、および他の任意の組成物について述べてきたが、修飾オリゴヌクレオチドの全体構造は望む構造物を示す化学式でも説明しうる。
すなわち、実施態様のひとつのグループにおいて、修飾オリゴヌクレオチドは次の化学式をもっている。
【００７９】
【化５】
2005532618.tif 000008
式中、Ｒ２およびＲ３は修飾オリゴヌクレオチドの末端を示し、下付き文字ｎは４から７０、より好ましくは４から２５、さらにより好ましくは４から１０の整数であり、Ｂはアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから独立して選ばれる基であり、Ｍはオリゴマー生成の糖およびペプチド−核酸生成のアミノ酸から選ばれる。但し各Ｂの少なくとも二つは非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選ばれる。ある特定の実施態様において、Ｒ２およびＲ３は修飾オリゴヌクレオチドの５'−および３'−末端を表わし、ここでＭはオリゴマー生成の糖（例えば、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノーズ、β−Ｄ−リボフラノーズ、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２'−デオキシリボフラノシド、２',３'−ジデオキシ−３'−アミノリボフラノシドおよび鍵かけした糖）である。修飾オリゴヌクレオチドがマイナー・グルーブ・バインダー、レポーター基等を連結している実施態様については、各Ｒ２およびＲ３基は、連結基および付加的な官能性組成（ＭＧＢ、フルオロフォア、クエンチャー等）の連結に適した官能基を含んでいることを意味する。このような官能基は、例えば水酸基、アミノ基、カルボン酸またはそのエステル基、燐酸、ホスホン酸またはホスフィン酸あるいはそれらのエステル基、スルホン酸およびそのエステル基などを含んでいる。他の実施態様において、ＭＧＢ、レポーター基および類似のものは内部の塩基／骨格基のどれかに通常の方法で連結させる。
【００８０】
関連する実施態様において、本発明は、少なくともひとつの５−置換ピリミジン塩基、および少なくともひとつの非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基を含む修飾オリゴペプチドを提供する。本発明のこの実施態様に有用な非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基は本質的に、上述（式ＩａおよびＩｂを参照）の塩基である。種々の５−置換ピリミジン塩基は 米国特許 5,645,985 および 5,484,908  に記載のものを含む。
【００８１】
好ましい実施態様において、５−置換ピリミジン塩基は次の式をもつ：
【化６】
2005532618.tif 000009
また非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基は次の式をもつ：
【化７】
2005532618.tif 000010
式中、各Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はＨ、ＯＨ、ＮＨ２および保護されたアミノ基の中から独立して選ばれ、各Ｒ１およびＲ４は(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、−Ｓ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２およびその保護形の中から独立して選択され、また付加的な特性としてＲ１はＨでもありうる。
【００８２】
特に好ましい実施態様において、５−置換ピリミジン塩基は次から選ばれる：
【化８】
2005532618.tif 000011
式中、Ｒ４はプロピニル、ヒドロキシプロピニル、アミノプロピニル、ヒドロキシブチニル、またはピリミジン環に直接結合しているかまたは飽和（例えばエチレン、プロピレン、ブチレン）もしくは不飽和（例えばアセチレン、プロピニレン、ブテニレン）の１から４個の炭素連結基を経てピリミジン環に結合している、置換または非置換のフェニル、チエニル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、ピリジニル、ピロリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリルまたはベンゾオキサゾリル基の中から好ましく選ばれる。
【００８３】
他の好ましい実施態様において、ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基は上に示した好ましい塩基（Ｉｃ、ＩｄおよびＩｅ）から選ばれる。加えて適切な塩基は図１に示す。
【００８４】
修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも二つの非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを含む本発明の初めの方で示した実施態様のように、本発明のこの実施態様は、ＭＧＢおよびレポーター基（例えばフルオロフォア、クエンチャー等）および付加的組成物の連結に適切な連結基の如き付加的基を含む。
【００８５】
修飾オリゴヌクレオチドが次の式で表わされる実施態様もまた好ましい：
【化９】
2005532618.tif 000012
式中、Ｒ２は修飾オリゴヌクレオチドの１番目の末端を表わし；Ｒ３は修飾オリゴヌクレオチドの２番目の末端を表わし、下付き文字ｎは４から７０の整数を表わし、Ｂはアデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、５−置換ピリミジン、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン（但し少なくともひとつの塩基は５−置換ピリミジンであり、少なくともひとつの塩基はピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンである）であり、そしてＭはオリゴマー生成の糖またはペプチド−核酸生成のアミノ酸である。
【００８６】
本発明の別の実施態様において、連結したマイナー・グルーブ・バインダーを含む修飾オリゴヌクレオチドおよびわずか１塩基が修飾塩基に置き換わった修飾オリゴヌクレオチドを提供する。意外にも、ＭＧＢと単一修飾塩基（または任意に複合的に修飾した塩基）の組み合わせは、プライマー伸長法および下に示す他の有用性のみならず、ミスマッチ識別に特に有用な性質をもつ修飾オリゴヌクレオチドにつながる。このグループの修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは４から７０塩基および連結したマイナー・グルーブ・バインダーを含むが、ここで少なくとも塩基のひとつは５−置換ピリミジンおよび非置換または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンからなる群より選ばれる修飾塩基で置き換わっている。
【００８７】
本発明のこの実施態様において、マイナー・グルーブ・バインダー、５−置換ピリミジンおよび非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンまたは３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンは本質的に上述の構成要素のどれかである。
【００８８】
実施態様のひとつのグループにおいて、修飾オリゴヌクレオチドは少なくともひとつの、好ましくは式ＩＩａで表わされる５−置換ピリミジンをもつ：
【化１０】
2005532618.tif 000013
式中、Ｘ３はＨ、ＮＨ２、ＯＨおよびＳＨから選ばれ、Ｒ４は(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、−Ｓ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２およびその保護形から選ばれる。このグループの実施態様では、好ましいアリールおよびヘテロシクリル基（アリールアルキルのような他のグループの組成を含む）はフェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンツイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンツチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニルおよびナフチルの置換ならびに非置換誘導体から選ばれる。これらアリールおよびヘテロシクリル基に対する適切な置換基は上述の一般的定義にあげたものである。
【００８９】
より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは式ＩＩｄおよびＩＩｅで表わす、少なくともひとつの５−置換ピリミジン塩基を含み、ここでＲ４置換基は、置換または非置換アルキル基もしくはアルケニル基から選ばれる。好ましくは、Ｒ４はヒドロキシプロピニル、ヒドロキシブチニル、アミノプロピニル、アミノブチニルまたはプロピニル基の他、これらアルキニル基の高級同族体（例、Ｃ５−Ｃ８）である。それとは別にＲ４基は３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル基であってもよい（さらに詳しくは下に述べる）。
【化１１】
2005532618.tif 000014
【００９０】
好ましい実施態様の別のグループにおいて、修飾オリゴヌクレオチドは、式Ｉｂで表わす少なくともひとつの修飾塩基をもつ：
【化１２】
2005532618.tif 000015
ここでＸ１およびＸ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ２および保護されたアミノ基から独立して選択され、Ｒ１はＨ、(Ｃ１−Ｃ１２)ヘテロアルキル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルケニル、(Ｃ２−Ｃ１２)ヘテロアルキニル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｏ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、−Ｓ−(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、−Ｓ−(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、アリール(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２およびその保護形から選ばれる。このグループの実施態様において、好ましいアリールおよびヘテロシクリル基（アリールアルキル、ヘテロシクリルアルキルのような他のグループの組成を含む）はフェニル、トリル、ピリジル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニル、オキサゾリル、チエニル、ピロリル、ベンツイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンツチアゾリル、インドリル、トリアジニル、ピリミジニルおよびナフチルの置換ならびに非置換誘導体から選ばれる。これらアリールおよびヘテロシクリル基に対する適切な置換基は上述の一般的定義にあげたものである。
【００９１】
特に好ましい実施態様において、修飾オリゴヌクレオチドは式Ｉｆで表わす少なくともひとつのモノマーを含む：
【化１３】
2005532618.tif 000016
式中、Ｘ１およびＸ２はＨ、ＯＨまたはＮＨ２であり、Ｒ１は、最も好ましくは３−ヒドロキシプロピン−１−イル、プロピニル、３−アミノ−プロピン−１−イル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、ハロゲンまたは３,３,３−トリフルオロプロピン−１−イルである。これらいくつかのモノマーの合成が報告されている（Balow et al., Nuc. Acid Res., 26:3350-3357 (1998); Seela et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., I, 479-488 (1999); Ramzaeva et al., Helv. Chim. Acta, 80:1809-1822 (1997)）。
【００９２】
修飾塩基およびオリゴヌクレオチドの調製
反応式１〜１０は、本発明で有用な多くの修飾塩基（非置換および３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、および５−置換ピリミジン）の調製方法を図示する。反応式は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドを調製する自動合成に有用な、修飾塩基のホスフォルアミジト誘導体の調製を説明する。
【００９３】
反応式１は、５−ヨード−２'−デオキシウリジンから出発して、５−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート)−５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリフェニルメチル)−２'−デオキシウリジン  ３'−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミジト]（３）の調製を説明する。出発物質をＰｄ(ＰＰｈ３)４−ＣｕＩの存在下にプロプ−２−イニル  ４−メチルベンゾアートと処理してメチルベンゾアート誘導体（１）となし、これを５'−ブロックのＤＭＴｒ誘導体（２）に、次いでホスフォルアミジト（３）に変換した。
【００９４】
【化１４】
2005532618.tif 000017
【００９５】
反応式２および３はピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンホスフォルアミジトの調製方法のひとつを示す。特にこれら反応式は、３−[４−((１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−２−イル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロプ−２−イニル  ４−メチルベンゾアート（１３；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）の調製を示すが、これは二つに分けて合成する。
【００９６】
【化１５】
2005532618.tif 000018
【００９７】
第一の部分（反応式２）では、(２Ｒ,５Ｒ)−５−(４−アミノ−３−ヨードピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（９）を１,５−ジヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン（４）から出発して合成した。まず出発物質をモノ塩化ヨウ素および続いてＰ２Ｓ５と処理して、それぞれヨード体（４）およびチオン体（５）を得た。チオン体（５）をエチルチオ誘導体（６）に変換し、これを１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノーズ誘導体と結合させてブロックしたヌクレオシド（７）を得た。化合物（７）とナトリウムメチラート、次いで水酸化アンモニウムとの反応でそれぞれヒドロキシメチル誘導体（８）および化合物（９）を得た。
【００９８】
第二の部分（反応式３）では、２,３−[４−((１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−２−イル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロプ−２−イニル  ４−メチルベンゾアート（１３；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）を化合物（９）から出発して合成した。化合物（９）をＰｄ(ＰＰｈ３)４−ＣｕＩの存在下にプロプ−２−イニル  ４−メチルベンゾアートと反応させ、プロプ−２−イニル誘導体（１０；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）を得た。この化合物のアミノ基を、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド  ジメチル  アセタールとの反応で保護し化合物（１１；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）とした。化合物（１１；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）をＤＭＴｒ誘導体（１２；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）、次いでホスフォルアミジト（１３；Ｒ１＝−ＯＣＯＰｈＣＨ３）に変換した。
【００９９】
【化１６】
2005532618.tif 000019
【０１００】
反応式４はＮ−{３−[１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ] (２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)−６−アミノ−４−オキソ−(５−ヒドロキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル)]プロピル}−２,２,２−トリフルオロアセトアミド（２２）の調製を示す。
【０１０１】
【化１７】
2005532618.tif 000020
【０１０２】
反応式４において、６−アミノ−４−メトキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンはヨード誘導体（１４）に変換し、これを１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノーズと処理してヌクレオシド（１５）を得た。化合物（１５）をＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨで処理してトルオイル基を加水分解し保護基のないヌクレオシド(１６)を得た。（１６）を水酸化ナトリウム水溶液で処理し（１７）となし、これをトリフルオロ−Ｎ−プロプ−２−イニルアセトアミド誘導体（１８）に変換した。化合物（１８）を水素およびＰｄ触媒にて還元してトリフルオロ−Ｎ−プロピルアセトアミド誘導体（１９）を得た。化合物（１９）の４−アミノ基をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールと処理して保護し、化合物（２０）に導き、さらにＤＭＴｒ誘導体（２１）、次いでホスフォルアミジト誘導体（２２）に変換した。
【０１０３】
式４の化合物（３−[((２Ｒ,５Ｒ)−５−(６−アミノ−４−オキソ−３−プロプ−１−イニル(５−ヒドロキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル))−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル）（ＰＰＰＧホスフォルアミジト）は反応式４に示す反応のいくつかを利用して合成できる。
【０１０４】
【化１８】
2005532618.tif 000021
【０１０５】
化合物（１７）から（１８）への変換において、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロプ−２−イニルアゼトアミドに代えてプロプ−１−インを用いる。６−アミノ基は化合物（２０）について述べたように保護できる。また５−ヒドロキシ基は化合物（２１）について述べたようにＤＭＴｒ基で保護できる。最後に、化合物（２２）について述べたように、式４の化合物（ホスフォルアミジト）を合成できる。同様にして、Ｒ６が−ＯＣＯＰｈＣＨ３または−ＮＨＣＯＣＦ３である式５の化合物は、技術的に知られた関連の反応を利用して合成することができる。
【０１０６】
反応式５は３−{[５−(４,６−ビス{(１Ｅ)−１−アザ−２−[ビス(２−メチルプロピル)アミノ]ビニル}−３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンニル)−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ] [エチル(メチルエチル)アミノ]ホスフィノプロパンニトリル（２６）の調製を図示する。
【０１０７】
【化１９】
2005532618.tif 000022
【０１０８】
化合物（２６）は(ＮＨ２)２ＰＰＰＡ（２３）から出発して合成できる（Seela & Driller, Herv. Chem. Acta, 71:757-761 (1988)を参照）。化合物(２３)はビス(メチルエチル)アミノ誘導体（２４）（Vincent et al., J. Org. Chem., 64:991-997 (1999)）に変換し、ＤＭＴｒＣｌと反応させて化合物（２５）とし、これをホスフォルアミジト（２６）に変換することができる。
【０１０９】
反応式６は、ヘテロアルキル基を置換基としてもつ、保護された３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンの合成を示す。
【化２０】
2005532618.tif 000023
【０１１０】
反応式７はメトキシプロピニル基を置換基としてもつ、保護された３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンの合成を示す。３−ヨードジアミノ誘導体（２３）を無水ＤＭＦ中Ｐｄ(ＰＰｈ３)４−ＣｕＩおよびトリエチルアミンと、次いでメチル  プロパルギル  エーテルと反応させ、３−メトキシプロピニル−２,４−ジアミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン誘導体（２７）を得た。本化合物のアミノ基をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールと反応させてブロックし、化合物(２８)を得た。ブロックしたヌクレオシド（２８）を初めにジメトキシトリチル  クロリドと、次いで２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスフォルアミジトと反応させ、目的のブロックしたホスフォルアミジト（２９）を得た。
【０１１１】
【化２１】
2005532618.tif 000024
【０１１２】
次の反応式は３−ヘテロ環状置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンの調製方法を示す。ここにあげる一般的な方法は他のヘテロ環状置換基の調製にも適応できる。
【化２２】
2005532618.tif 000025
【０１１３】
反応式８はフラニル基を置換基としてもつ、保護された３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンの合成を示す。マロニトリルを塩基の存在下にフルフリルクロリドと、次いでジメチルスルフィドと反応させてメトキシジニトリル誘導体（３０）とした。化合物(３０)とヒドラジンとの反応で置換ピラゾール(３１)を得て、これをホルムアミドと反応させて３−(２−フリール)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−イルアミン（３２）を得た。塩基(３２)を１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノーズと処理してブロックされたヌクレオシド（３３）を得た。化合物(３３)を初めにＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨで処理してトルオイル基を加水分解しブロックされていないヌクレオシドを得、次いでＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールと反応させて保護されたヌクレオシド誘導体（３４）とした。誘導体(３４)をジメトキシトリチルクロリドと、次いで２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスフォルアミジトと反応させ目的のブロックされたホスフォルアミジト（３５）を得た。
【０１１４】
【化２３】
2005532618.tif 000026
【０１１５】
反応式９はフラニル基を置換基としてもつ、保護された３−置換２,４−ジアミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンの合成を示す。カルボニトリル（３１）をグアニジニウム  カルボナートと反応させ、３−(２−フリール)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン（３６）を得た。この塩基(３６)を１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノーズと処理してブロックされたヌクレオシドを得、次いでＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨで処理してトルオイル基を加水分解しブロックされていないヌクレオシド(３７)を得た。次いで化合物（３７）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド  ジメチルアセタールと反応させて、保護されたヌクレオシド誘導体（３８）とした。この誘導体(３４)を初めにジメトキシトリチルクロリドと、次いで２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスフォルアミジトと反応させ目的のブロックされたホスフォルアミジト（３９）を得た。
【０１１６】
【化２４】
2005532618.tif 000027
【０１１７】
反応式１０は水酸基で保護されたＨＯＢＵ−ホスフォルアミジトへのひとつの合成ルートを示す。この反応式で、３−ブチン−１−オールをピリジンの存在下にｐ−トルオイルクロリドで処理しｐ−トルイルエステル（４０）に変換する。保護されたブチノールはテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)およびヨウ化銅の存在下に５−ヨード−２'−デオキシウリジンと結合させ、次いで（ＤＭＴエーテルとして）保護して化合物(４１)に導き、これを対応するホスフォルアミジト誘導体（４２）に変換する。化合物(４２)は修飾オリゴヌクレチドの合成に直接使用できる。ｐ−トルオイル保護基の脱離は標準的な方法によって達成できる。
【０１１８】
各上記反応式において、当業者は、他の保護基および／または活性化基を使えることが分かっている。加えて、異なる非天然塩基含有のモノマーは、異なる官能基と共に、修飾オリゴヌクレオチドの首尾よい合成には異なるブロック基を必要とする。種々の有用な保護基、その合成法および脱保護の方法は、例えば、Beaucage & Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311 (1992)に記載されている。
【０１１９】
オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの合成は、最初の塩基が連結した切断可能なリンカーを含む固相担体から開始される。最初のヌクレオチドとして３'−末端に置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを有する、本発明のオリゴヌクレオチドは適当な３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを用いて合成できる。それとは別に、５−置換ピリミジンが固相担体に初めから結合していてもよい。反応式１１は保護された３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンｄＡ ＣＰＧ誘導体（Ｃ）の一般的合成アプローチを示す。中間体（Ａ）は反応式３で述べた方法を用い合成できるし、一方（Ｂ）および（Ｃ）は審理中の米国特許出願 09/457,616に記載のようにして合成できる。
【０１２０】
【化２５】
2005532618.tif 000028
【０１２１】
本発明のこの実施態様において、もし担体がオリゴヌクレオチドの自動化技術と相性がよく、またガラス、ポリスチレン、ナイロン、プラスチック等を含んでいるなら、種々の固相担体が有用である。加えて、関連の実施態様において本発明は、連結した修飾塩基、好ましくは式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、Ｉｆ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、ＩＩｄ、ＩＩｅの塩基をもつ固相担体（例えば孔径制御した多孔性ガラス（ＣＧＰ））を提供する。より好ましくは、連結した修飾塩基は３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンまたは５−置換ピリミジン部であり（ここでの置換基は上述の好ましい基の中から選ばれる）、さらに下に詳しく述べる新規な塩基を含む。
【０１２２】
本発明はこれら組成物および方法をさらに包含するが、ここで非置換および／または３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、および／または５−置換ピリミジンのどれかを組み合わせるか、または技術的に知られた他の修飾塩基と組み合わせて使用する。他の修飾モノマー・ユニットが開示されている； Scheit, NUCLEOTIDE ANALOGS, John Wiley, New York, 1980; Uhlman & Meyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990); Seela & Debelak, Nucl. Acids Res., 28:3224-3232 (2000); Balow et al., Nucl. Acids Res., 26:3350-3357 (1998); Bolli et al., Nucl. Acids Res., 24:4660-4667 (1996)。
【０１２３】
修飾オリゴヌクレオチド・アレイ
本発明の他の実施態様において、ハイブリダイゼーションおよび遺伝子発現のアレイに基礎を置く分析によるシーケンシングのように、オリゴヌクレオチドのアレイを利用する方法において修飾オリゴヌクレオチドを用いる。本発明は、例えばチップまたはプラットホーム・アレイ、ビーズ・アレイ、液相アレイ、「ジップコード」アレイ等を含む種々のアレイを意図している。ハイブリダイゼーションによるシーケンシングにおいて、異なる既知配列のヌクレオチドの整理アレイは、１個以上の試験ポリヌクレオチド、核酸または核酸集団へのハイブリダイゼーションのプラットホームとして用いる。ハイブリッドするオリゴヌクレオチドの決定および既知配列の整列は試験ヌクレオチドの配列の再構築を可能にする。それとは別に、野生型配列および関心ある遺伝子の特定領域への可能なすべての突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドはアレイに配置される。ハイブリダイゼーションの条件下、対象または生物試料由来のＤＮＡまたはＲＮＡにアレイを曝すと、関心ある遺伝子の、野生型または突然変異の状態の決定が可能となる。例えば、米国特許 5,492,806; 5,525,464; 5,556,752; PCT 公表 WO 92/10588、WO 96/17957を参照。これら両技術には、特に単一ヌクレオチドのレベルで関連配列間の識別が必要である。従って本発明の修飾オリゴヌクレオチドの高い識別特性はこれら技術に改良をもたらすのである。アレイの構築原料は、これに限定しないが、ニトロセルローズ、ガラス、シリコン・ウエハー、光ファイバーおよび当業者に知られているようなアレイの構築に適した他の原料を含む。オリゴヌクレオチド・アレイの合成は審理中の米国特許出願 09/364,320 に記載されており、また本発明のアレイの調製法に適切な改良を加えてよい。
【０１２４】
本発明のアレイ技術へのさらなる適応は、特定の細胞または組織における遺伝子発現パターンの試験にある。この場合、異なる遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを表面に配置し、特定の細胞または組織タイプ由来の核酸試料をハイブリダイゼーションの条件下でアレイと共に培養する。ハイブリダイゼーションが起こったアレイ上の位置を検出すると、どのヌクレオチドがハイブリッドしたのか、従って試料元の特定の細胞または組織で、どの遺伝子が活性であるかを決定することができる。
【０１２５】
アレイ法は、野生型および突然変異配列が表面の整理アレイに置かれた、突然変異または遺伝子多型の同定に使うこともできる。厳格な条件下でポリヌクレオチド試料のアレイへのハイブリダイゼーションおよびそのアレイ内のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリッドしているかの決定は、ポリヌクレオチドが野生型または突然変異配列をもっているかどうかの決定を可能とする。臨床的に関係する遺伝子の多くの突然変異配列は野生型のそれとは、ひとつまたは２、３の核酸の位置が異なるだけなので、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの高い識別力は突然変異の検出に改善をもたらす。
【０１２６】
アレイ技術の上記適応のすべてにおいて、修飾オリゴヌクレオチドの高い識別力は感度と解像力において意義深い改善をもたらす。
例えば、アレイでの効率的なハイブリダイゼーションには、捕捉プローブが狭い温度範囲のＴｍをもっている必要がある。本発明のひとつの実施態様において、アレイで使用の補足オリゴヌクレオチドは均衡が取れているので、ＧＣおよびＡＴ−リッチ配列に関わる問題を、３'−ＭＧＢと修飾塩基（例えばＰＰＰＡおよびＰＰＰＵ）の組み合わせを用いて排除する。表１および図１は異なるＧ／ＣおよびＡ／Ｔ塩基対をもつピリミジン・リッチ・プローブのＴｍの均衡を説明する。異なるプローブのＴｍの均衡を保つため、ＰＰＰＡ、ＰＵおよびＭＧＢを組み合わせて使用した。プリンおよびピリミジン・リッチ・プローブ、および相補的な標的を表１に示し、これらプローブのＴｍを図２に示す。図２に見られるように、ＧＣ−リッチ・プローブとＡＴ−リッチ・プローブとのＴｍ差は５０℃よりも高い。
【０１２７】
【表１】
2005532618.tif 000029
【０１２８】
図２から分かるように、ＰＰＰＡ、ＰＵおよびＭＧＢでの修飾は均衡を保ったＴｍプローブ・セットを与える。
例えば、アレイでの効率的なハイブリダイゼーションには、プローブが狭い温度範囲のＴｍもっていることが必要である。すなわち関連の実施態様において、ここで述べる修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのＴｍの均衡を保つために、通常の塩基、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基（例えばＰＰＧおよびＰＰＡ）、３-置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５-置換ピリミジン、普遍的塩基およびマイナー・グルーブ・バインダーの、どの組み合わせも包含し得る。ある種の実施態様では、修飾オリゴヌクレオチドは１個以上の修飾塩基を有し、その最近傍パラメータおよびＴｍは少なくとも１個の塩基を含有していることに基づいて好ましく測定される。修飾塩基の例としては、アミノ酸に連結した塩基、通常の塩基をもつロックされた核酸糖、通常の塩基をもつＰＮＡ骨格、およびここで述べるような他の修飾塩基または当業者にとっては自明の他の修飾塩基である。いくつかの実施態様において、修飾塩基はそれに連結したクエンチャー、フルオロフォアおよびマイナー・グルーブ・バインダーを有する。
【０１２９】
複合的修飾オリゴヌクレオチドのＴｍを予測および「平準化」する能力はオリゴヌクレオチド・アレイの開発に、または複数個のオリゴヌクレオチドをもつ組成に特に有用である。さらに修飾オリゴヌクレオチドのＴｍを予測する能力は、ハイブリダイゼーション、再生、配列の塩基組成変化のマッピング、配列の複雑性および逸脱に対する適切な条件の設定に有用である。Ｔｍの予測アルゴリズムは、すべての可能な個々の塩基対の最近傍について、二本鎖生成への熱力学的寄与を決めるモデルを用いて開発できる。塩基対のうち１０個の独立した最近傍に対する熱力学的パラメータは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド（Sugimoto et al., Biochem., 34:11211-11216(1995)）およびｄｓＤＮＡ（SantaLucia et al., Biochem., 36:10581-10595 (1997)）についての公開文献から入手可能である。Ｔｍによってオリゴヌクレオチド二本鎖の安定性を計算する、プログラム開発用の最近傍パラメータの使用については、以下に記載されているので参照されたい；Schutz & von Ahsen, Biotechniques, 27:1218-1222 (1999)； Owczarzy et al., Biopolymers, 44:217-239 (1997); ＰＮＡ／ＤＮＡに関し、Geisen et al., Nucl. Acids Res., 26:5004-5006 (1998); Blake et al., Bioinformatics, 15:370-375 (1999) & 米国特許5,556,749。
【０１３０】
ミスマッチ識別の熱力学的および動力学的説明の基本原理はよく知られており、以下に要約する。
プローブ−標的の相互作用は、
Ａ＋Ｂ⇔ＡＢ    但しＡ＝プローブ、Ｂ＝ＤＮＡ標的
として表わすことのできる平衡反応である。
【０１３１】
温度Ｔにおける順方向（会合）および逆方向（離合）反応の平衡は平衡定数Ｋによって表わしうる；
【数２】
2005532618.tif 000030
平衡熱力学に関しては
Ｋ＝exp(−ΔＨ０ＡＢ/ＲＴ＋ΔＳ０ＡＢ/Ｒ)；
ΔＧ０ＡＢ＝ΔＨ０ＡＢ−ＴΔＳ０ＡＢ；
ΔＧ０ＡＢ＝−ＲＴＬｎ(Ｋ)
但し、ΔＨ０ＡＢ、ΔＳ０ＡＢおよびΔＧ０ＡＢは、二本鎖ＡＢ生成のエンタルピー、エントロピーおよび自由エネルギーの変化をそれぞれ表わす。
【０１３２】
二本鎖ＡＢはＮ塩基対（Ｎ−１最近傍）をもち、最近傍の近似は以下のようにみなす；
ΔＨ０ＡＢ＝ΔＨ０１＋ΔＨ０２＋・・・ΔＨ０ｎ−１＋ΔＨ０init＝Σ(ΔＨ０i＋ΔＨ０init）
ΔＳ０ＡＢ＝ΔＳ０１＋ΔＳ０２＋・・・ΔＳ０ｎ−１＋ΔＳ０init＝Σ(ΔＳ０i＋ΔＳ０init）
ΔＧ０ＡＢ＝ΔＧ０１＋ΔＧ０２＋・・・ΔＧ０ｎ−１＋ΔＧ０init＝Σ(ΔＧ０i＋ΔＧ０init）
但し、ΔＨ０ｉ、ΔＳ０ｉおよびΔＧ０ｉは、二本鎖ＡＢ生成の各最近傍塩基対の増分に関するエンタルピー、エントロピーおよび自由エネルギーの変化をそれぞれ表わし、ΔＨ０init、ΔＳ０init、およびΔＧ０initは二本鎖ＡＢ生成開始の熱力学的パラメータを表わす。
【０１３３】
総濃度が等しい場合、すなわちＣプローブ＝Ｃ標的 である場合、自由エネルギー、エンタルピーおよびエントロピーに関するＴｍの方程式は下に示す式となる：
【数３】
2005532618.tif 000031
【０１３４】
プローブがミスマッチを含む標的とハイブリッドする際には、上述と同様に相関関係を展開することができ、下に示すようになる：
Ａ＋Ｂ＊⇔ＡＢ  但しＡ＝プローブ、Ｂ＊＝ミスマッチＤＮＡ標的
【０１３５】
ミスマッチ二本鎖ＡＢ＊の熱力学的パラメータはＫ＊、ΔＨ０ＡＢ＊、ΔＳ０ＡＢ＊およびΔＧ０ＡＢ＊である。例えば最近傍の「３」および「４」位を含む［４］位におけるミスマッチ塩基対の最近傍パラメータに関して、識別パラメータΔΔＨ０、ΔΔＳ０、ΔΔＧ０は次のように表わせる：
ΔΔＨ０＝ΔＨ０ＡＢ−ΔＨ０ＡＢ＊＝（ΔＨ０３−ΔＨ０＊３）＋（ΔＨ０４−ΔＨ０＊４）＝ΔΔＨ０３＋ΔΔＨ０４
ΔΔＳ０＝ΔＳ０ＡＢ−ΔＳ０ＡＢ＊＝（ΔＳ０３−ΔＳ０＊３）＋（ΔＳ０４−ΔＳ０＊４）＝ΔΔＳ０３＋ΔΔＳ０４
ΔΔＧ０＝ΔＧ０ＡＢ−ΔＧ０ＡＢ＊＝（ΔＧ０３−ΔＧ０＊３）＋（ΔＧ０４−ΔＧ０＊４）＝ΔΔＧ０３＋ΔΔＧ０４
【０１３６】
本発明のひとつの実施態様において、プローブ・配列は通常のプリン、ピリミジン、およびオリゴヌクレオチドの３'−末端に連結した、マイナー・グルーブ・バインダーＣＤＰＩ３を有するオリゴヌクレオチドの熱力学的最近傍パラメータを決定するよう設計される。別の実施態様においては、通常のピリミジン、プリン、および３'−末端に連結したＣＤＰＩ３を有するオリゴヌクレオチド（但しグアニンは５-ヒドロキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オンに置き換わっている）の熱力学的最近傍パラメータである。これらのパラメータは、ＣＤＰＩ３をもつタイプともたないタイプのオリゴヌクレオチドのＴｍを計算するために、二つの実施態様において用いられる。ＣＤＰＩ３が３'−末端に塩基１を連結している場合、下に導かれるような、新しい予測アルゴリズムおよび計算式を用いる。
Σ(ΔＨ０i＋ΔＨ０init）
ＴＭ＝ 
Σ(ΔＳ０i＋ΔＳ０init）＋ＲＬｎ[(Ｃプローブ＋Ｃ標的)/４]＋ΔΔＳ０ＭＧＢ
【０１３７】
モデルは、オリゴヌクレオチドに連結したＭＧＢは付加的な純なエントロピー因子ΔΔＳ０ＭＧＢをもっているとみなす。この値はアルゴリズムに従って計算でき、塩基「１」または「２」から出発して、３'−プライム末端より６塩基（５個の最近傍）をＭＧＢでカバーする。カバーした各最近傍は独自のΔΔＳ０ｉＭＧＢ値をもつ。アデノシンが６、７または８の塩基位置にある場合に、補正因子「Ａ」を取り入れる。補正因子「Ａ」には統計的因子「ｎ」を付加的に取り入れ、ここで−ＡＡＡ−に対しｎ＝３、−ＡＡ−および−ＡＮＡ−に対し２、−Ａ−に対しｎ＝１、−ＡＮ−および−ＮＡ−（ＮはＡ以外の塩基である）に対しｎ＝０である。最終的なΔΔＳ０ＭＧＢ値を次の方程式によって決定する。
ΔΔＳ０ＭＧＢ＝ΣΔΔＳ０ｉＭＧＢ＋Ａ(任意)＋Ｒ＊Ｌｎ(Ｎ)(任意)
【０１３８】
表２ａおよび２ｂは、ＰＰＧのみを有するオリゴヌクレオチドの最近傍熱力学パラメータ、およびＭＧＢのエントロピー寄与をそれぞれ表わす。後者の表２ｂには蛍光色素およびダーク・クエンチャーの寄与が熱力学的処理に取り込まれていて、その寄与は無視できることが一般的に分かっている。クエンチャーはＭＧＢとオリゴヌクレオチド間のリンカーの一部である。グループがオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーに共有結合で連結しているとき、最近傍パラメータはその基が連結している領域で影響を受けることは、当業者には理解できることである。好ましくは、最近傍パラメータは２塩基内で影響を受けるとはいえ、６塩基以上にまで影響は及びうる。例えば、マイナー・グルーブ・バインダーが二本鎖で５ないし６塩基にわたる場合、最近傍パラメータはマイナー・グルーブ・バインダーのために６塩基内で影響を受けうる。
【０１３９】
表２ａおよび２ｂ
ａ）ＰＰＧ含有オリゴヌクレオチドの最近傍パラメータ
ｂ）ＣＤＰＩ３のエントロピー寄与
【表２】
2005532618.tif 000032
【０１４０】
ひとつの好ましい実施態様において、同数の塩基をもつ複合的修飾オリゴヌクレオチドのＴｍはアルゴリズムを用いて平準化し、最近傍パラメータを通常の塩基、普遍的な塩基、ＰＰＡ、ＰＰＧ、ＰＰＰＡ、ＰＰＰＧ、ＰＵ、ＰＣ、ＨＯＰＵ、ＨＯＢｕＵ、ＨＯＢｕＣ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡ、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＢｕＰＰＡＯＨ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ、ＨＯＢｕＰＰＧ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＢｒ、(ＮＨ２)２ＰＰＡＣｌ、ＰＰＡＩ、ＰＰＡＢｒ、ＰＰＡＣｌ、およびマイナー・グルーブ・バインダー、フルオロフォア、クエンチャー、修飾糖、修飾骨格および化学発光体をもつ塩基の組み合わせから選択する。表２ａおよび２ｂに示すように、最近傍パラメータの計算はエンタルピー（ΔＨ０）およびエントロピー（ΔＳ０）のような熱力学的パラメータ（これらはオリゴヌクレオチド、オリゴマーまたはキメラに集まった基の自由エネルギーの変化（ΔＧ０）に影響する）の測定を含んでいる。その基というのはマイナー・グルーブ・バインダー、フルオロフォア、クエンチャー等のグループである。
【０１４１】
あるいは、複合的修飾オリゴヌクレオチドのＴｍは同数の塩基に、プラスまたはマイナス１または２の塩基を含むように約±２℃の範囲で本質的に平準化する。
あるいは、オリゴヌクレオチド、オリゴマーまたはキメラのアレイのＴｍは、１個以上の塩基、骨格、または糖を変えて平準化をはかるとき、本質的に均衡が保たれる。
【０１４２】
いくつかの場合、二本鎖の安定性を低下する修飾塩基に加えて、二本鎖の安定性を改善する修飾塩基を用いる。二本鎖の安定性を低下する修飾塩基は、例えば７−デアザアデニンおよび７−デアザグアニンのように、よく知られている。
【０１４３】
修飾オリゴヌクレオチドの使用
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、優れたミスマッチ識別を含め、非修飾オリゴヌクレオチドを上回る多くの長所をそなえている。本発明の修飾オリゴヌクレオチドは特にプローブとして有用であり、この場合は標的配列へのハイブリダイゼーションが検出され、あるいはまたプライマーとして有用であり、この場合は標的配列へのハイブリダイゼーションに続いて修飾オリゴヌクレオチドの３'末端から始まるポリヌクレオチド合成が起こって、合成生成物（すなわち伸長した生成物）が検出される。
【０１４４】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの別の核酸へのハイブリダイゼーションを含む他の技術において有用である。その技術とは、これらに限定しないが、以下のものを包含する。すなわち、オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが評価項目である技術；１個以上のオリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが１個以上のポリメラーゼ介在の伸長ステップに先行し、オリゴヌクレオチドをプライマーとして、また標的核酸をテンプレートとして使う技術；オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションを別のプライマーのブロック伸長に使う技術；オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションに続く、オリゴヌクレオチドの加水分解によって結合標識を放出する技術；および２個以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッドし、複合的オリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術である。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの条件、およびハイブリダイゼーションの程度および特異性（温度、イオン強度および溶媒組成など）は当業者によく知られている。例えば、以下を参照。Sambrook et al., 前出; Ausubel et al., 前出; M. A. Innis et al., (編) PCR Protocols, Academic Press, San Diego, 1990; B. D. Hames et al., (編) Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985; および van Ness et al., (1991) Nucleic Acids Res., 19:5143-5151。
【０１４５】
プローブおよび／またはプライマーの標的配列へのハイブリダイゼーションは、アデニンとチミンまたはウラシルとの塩基対、およびグアニンとシトシンとの塩基対ような、よく知られ技術的に認知された塩基対合の性質に従って進行する。２番目の核酸との塩基対を可能にするヌクレオチドの性質を相補性と呼ぶ。従ってアデニンはチミンおよびウラシルの両方に対し相補的であり、またその逆も同じである。同様に、グアニンはシトシンと相補的であり、また逆も同じである。標的配列と全長で相補的であるオリゴヌクレオチドは標的配列に対し完全に相補的、完全にマッチ、または全体に相補的であるといわれ、またその逆も同じである。オリゴヌクレオチドとその標的配列は二つの配列中、大多数の塩基は相補的であるが、１個以上の塩基が相補的でないか、またはミスマッチであるような、関連した配列をもちうる。このような場合には、配列はお互いに本質的に相補的であるといえる。オリゴヌクレオチドの配列と標的配列が一ヶ所を除きすべてのヌクレオチドの位置で相補的であるような場合、そのオリゴヌクレオチドおよび標的配列はそれぞれ相手に対し、ひとつのヌクレオチド・ミスマッチをもつ。
【０１４６】
本発明の修飾ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンは天然由来の同族体の塩基対合特異性を維持している。すなわちＰＰＰＧ同族体はシトシンと相補的であり、一方ＰＰＰＡ同族体はチミンおよびウラシルと相補的である。ＰＰＰＧおよびＰＰＰＡ同族体は、グアニンおよびアデニンに比較して、非相補的塩基とのいわゆる「ゆれ」対合形成が弱い傾向にあるだけでなく、３−置換基は二本鎖の結合親和性を強める。同様に、修飾ピリミジンは天然由来の相手方と特異的にハイブリッドする。
【０１４７】
ハイブリダイゼーションの条件は当業者によく知られており、比較的広い制限のうちで変更しうる。ハイブリダイゼーションの厳しさは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチ・ヌクレオチドを含むハイブリッドの生成を回避する程度に関わり、それによって完全にマッチしたハイブリッドまたは殆どミスマッチを含まないハイブリッドの生成を促す。つまり厳しければ厳しいほど、相関してミスマッチ・ハイブリッドは少なくなる。ハイブリダイゼーションの厳しさに影響する要因は、これに限らないが、温度、ｐＨ、イオン強度、ホルムアミドおよびジメチルスルフォキシドのような有機溶媒の濃度、およびカオトロープ（chaotrope）を含む。当業者にはよく知られているように、ハイブリダイゼーションの厳しさは温度が高まるほど、イオン強度が低いほど、また溶媒濃度が低いほど増加する。例えば以下を参照。Ausubel et al., 前出; Sambrook et al., 前出; M. A. Innis et al., (編) PCR Protocols, Academic Press, San Diego, 1990; B. D. Hames et al., (編) Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985; および van Ness et al., (1991) Nucleic Acids Res., 19:5143-5151。
【０１４８】
オリゴヌクレオチドおよび標的配列間のハイブリッド（二本鎖）形成において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションに都合のよい温度、イオン強度、ｐＨ等の条件、すなわちハイブリダイゼーション条件にて標的配列を含むポリヌクレオチドと共に溶液中で培養する。ある状況では、ハイブリッドする配列に１個以上のミスマッチをもつ核酸対と比較して、完全マッチ配列をもつ二つの核酸間のハイブリダイゼーションが有利になるよう、ハイブリダイゼーション条件を選択する。他の状況では、ミスマッチ・配列間のハイブリダイゼーションが可能となるようハイブリダイゼーション条件を選び、ミスマッチ・ハイブリッドを殆ど含まない核酸間のハイブリダイゼーションを有利にする。
【０１４９】
オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの程度は、ハイブリダイゼーション強度として知られるが、技術的によく知られた方法によって測定する。好ましい方法はハイブリッド二本鎖のＴｍを測定することである。上述のように、この方法は溶液中で徐々に二本鎖の温度を上げ、例えば紫外線吸収により二本鎖の熱変性を追跡する。この際、変性に伴う塩基対のアンスタッキングと共に紫外線吸収が増大する。Ｔｍは、変性に伴う紫外線吸収の遷移の温度中点と一般に定義される。それとは別に、Ｔｍが既知の場合、ハイブリダイゼーション温度を（固定したイオン強度、ｐＨおよび溶媒濃度にて）望む二本鎖のＴｍより下に、また望まない二本鎖のＴｍより上に選ぶことができる。この場合、ハイブリダイゼーションの程度の測定は、ハイブリッド・プローブの存在を単に試験することによって行う。
【０１５０】
もしプローブが検出可能な標識を含むならば、ハイブリッド・プローブのアッセイは、通常二本鎖構成要素中の標識の存在を検出するよう工夫されている。これは、例えば二本鎖構成要素を特異的に選択すること、一本鎖構成要素を特異的に破壊すること、またはこれらの方法のいくつかの組み合わせを使うことによって達成できる。例えば、ハイブリダイゼーション反応混合物を厳しさの高い条件および／または一本鎖に特異的なヌクレアーゼに付してもよい。あるいはまた二本鎖を、一本鎖の核酸とは対照的に二本鎖の核酸に特異的なアフィニティー法によって精製してもよい。本発明の好ましい実施態様において、プローブが二本鎖であるときのみ標識が放出される条件で、二本鎖はプローブからの標識の放出によって検出される。別の実施態様は、標的にハイブリッドする際、標識とクエンチャーの分離を必要とする。
【０１５１】
核酸プローブと共に使用するに適切で検出可能な標識またはタグは当業者によく知られており、これに限定しないが、放射性同位体、クロモフォア、フルオロフォア、化学発光体および電子化学発光試薬、磁気標識、ミクロスフェア、コロイド状金属（Taton et al., Science, 289;1757-1760 (2000)、免疫学的標識、リガンドおよび酵素標識を含む。適切な標識はマス標識、コンビナトリアル・ケミストリーのライブラリーの解析に用いるもの、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、質量分析、光学画像ファイバー、表面プラズモン共鳴、相関関係の分光学、ナノテクノロジー（Guetence et al., J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 739:139-150 (2000)）などを包含する。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドを標識化する方法は当業者によく知られており、例えば化学的および酵素的な方法を含む。例として、反応性の化学基をオリゴヌクレオチドの特定の位置に組み込む方法は当業者によく知られている。特定の場所に位置する反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、相補的反応性基（例えば求核的反応性基をもつオリゴヌクレオチドは求電子的反応性基に連結した標識と反応しうる）に連結する標識と合わせ、化学的手法で標識をプローブに連結できる。典型的な標識および標識をオリゴヌクレオチドに連結する方法は、例えば以下に記載されている。米国特許5,824,796; 米国特許5,210,015; Kessler (編), Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Kricka (編), Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, 1992; Howard (編), Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, 1993。オリゴヌクレオチドの非特異的化学的標識は、例えばヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学物質とオリゴヌクレオチドとを結合させ、同時にまたは続いて標識とオリゴヌクレオチドとを反応させることによって行う。例えば Draper et al., Biochemistry, 19:1774-1781 (1980) を参照。オリゴヌクレオチドへの標識の酵素的取り込みは、標識前駆体を用いてオリゴヌクレオチドの酵素的修飾またはポリメリゼーションを行うか、または既存のオリゴヌクレオチドに標識を酵素的に付加することによって達成できる。例えば 米国特許5,449,767 を参照。修飾酵素の例は、これに限定しないが、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ等を含む。標識を既存のオリゴヌクレオチドに付加できる酵素の例は、これに限定しないが、キナーゼ、ターミナル・トランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼ等を含む。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドがプライマーと反応できるなら、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度は、プライマーの伸長生成物のレベルを測定することにより決定できる。この場合、プライマーを標識するか、または１個以上のポリメリゼーション前駆体（通常、ヌクレオシド・トリホスフェート）を標識してよい。伸長生成物の検出は、例えば大きさ（ゲル電気泳動）、アフィニティー法、または当業者に知られた他の技術によって行う。
【０１５４】
プライマー伸長（「ミニシーケンシング」、「ジェネティック・ビット・アナリシス」）アッセイは一般にＳＮＰタイピングに用いられており、また他のジェノタイピングおよび突然変異のスクリーニング・アプリケーションに利用できる可能性がある（Pastinen T. et al., Genome Res., 10:1031-1042 (2000)）。ある実施態様において、修飾塩基およびマイナー・グルーブ・バインダーはいくつかの方法でプライマー伸長アッセイを改善する。ＭＧＢ、または５−置換ピリミジンあるいは３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンによりもたらされる付加的な二本鎖の安定性が高温での伸長を可能にする。このことは、標的分子中の問題ある二次構造が高温で除かれるので利点となる。また標的分子のプライマーへのハイブリダイゼーションは高温でより早くなる。ＴaqポリメラーゼおよびＢstＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼも、このような反応に用いることができる。
【０１５５】
さらにＭＧBおよび修飾塩基は偽陽性シグナルのひとつのクラスを除去することによって、アッセイの特異性を改善する。ヘアーピン構造またはホモダイマーを形成するプライマー・配列はテンプレートに依存しない伸長（テンプレートとしてプライマーの機能の５'末端）をしがちであり、その結果擬陽性シグナルとなる。「テンプレート」上のＭＧＢおよび修飾塩基はＤＮＡポリメラーゼによって伸長を示す。従って５'−末端のＭＧＢ、またはプライマー５'−末端または中央の修飾塩基は、プライマー・ヘアーピンまたはプライマー・ダイマーから（偽陽性）伸長を阻止できる。最後に、ＰＰＧは、Ｇ−リッチのオリゴヌクレオチドにより形成される、非標準的な構造の除去に用いて、このような配列のプライマー伸長アッセイを可能にする。
この修飾オリゴヌクレオチドが特に役立つ他のアッセイは審理中の米国特許出願 09/054,832 に記載されている。
【０１５６】
修飾オリゴヌクレオチドが役に立つさらに別の増幅アッセイは、フラップ・エンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチド・プローブの侵襲性切断に基づく増幅アッセイ（Lyamichev et al., Nature Biotechnol., 17:292-296 (1999) および Olson et al., High-Throughput Gene Expression Monitoring with the InvaderＴＭ Assay, Poster, Society for Biomolecular Screening Conference, Vancouver, British Columbia, Canada, 2000)、自己持続性配列レプリケーション・タイプのアッセイ(Mueller et al., Histochem. Cell Biol., 108:431-437 (1997))等を含む。 意外にも、非天然塩基はCleavase（商標）によるアッセイ法のインベーダーおよびゲノム・プローブの両方で置き換えることができる。これらの修飾は、これに限定しないが、ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン、３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび５−置換ピリミジンを含み、またペプチド核酸、ロックされた核酸等に使われるモノマーのような非天然骨格も含む。さらに修飾オリゴヌクレオチドはマイナー・グルーブ・バインダー、フルオロファオ、クエンチャー等を連結しうる。当業者は、最適の酵素活性および性能を認めてキメラも使用できると評価する。
【０１５７】
本発明において、修飾塩基がインベーダーおよびゲノム・プローブの両方で通常の塩基に置き換わった場合、Cleavaseアッセイ法にて意外にも顕著な改善が見られる。すなわちヒドロキシプロピニルＰＰＡ（ＨＯＰＰＰＡ）、(ＮＨ２)２ＰＰＰＡＯＨおよび３−ヨードジアミノＰＰＡ（(ＮＨ２)２ＰＰＡＩ）のような修飾塩基を使用すると、インベーダーおよびゲノム・プローブの両方の長さを短くでき、またアッセイ性能の改善をもたらす。別の実施態様では、非天然塩基がカセット・プローブに組み込まれる。
【０１５８】
以上を考慮して、本発明はひとつの実施態様にて、関連配列をもつポリヌクレオチドの識別方法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）プリンまたはピリミジン塩基に代えて、少なくとも１個の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンまたは５−置換ピリミジンを含む、明確な配列をもつ修飾オリゴヌクレオチドと、少なくとも２個のポリヌクレオチドとを反応させること。但しここでポリヌクレオチドのひとつは修飾オリゴヌクレオチドに完全に相補的である標的配列をもち、また他のポリヌクレオチドの少なくともひとつは少なくともひとつの塩基ミスマッチを有する標的配列をもつ；および
（ｂ）修飾オリゴヌクレオチドと各ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの程度を測定すること。
【０１５９】
好ましくは、他のポリヌクレオチドの少なくともひとつは、１個または２個の塩基ミスマッチ、より好ましくはただ１個の塩基ミスマッチを有する標的配列をもつ。
【０１６０】
上述のように、標的配列とはプローブまたはプライマーのハイブリダイゼーション位置を含むヌクレオチド配列をいう。標的配列は、これに限定しないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその増幅生成物を包含する核酸中に見られ、また野生型遺伝子配列、突然変異遺伝子配列、非コード配列、調節塩基配列等を含む。標的配列は一般に長さが１００未満のヌクレオチド、好ましくは５０未満のヌクレオチド、最も好ましくは２１未満のヌクレオチドである。
【０１６１】
本発明の当実施態様にて用いる修飾オリゴヌクレオチドは本質的に修飾プローブであり、またポリヌクレオチドは、どのポリヌクレオチドが修飾プローブとハイブリッドしているかを測定することによって識別しうる。修飾プローブは検出可能などんな標識でも標識できる。すなわち標識プローブは、例えば、標的へのハイブリダイゼーションの前または後で、標識と結合できる反応性基を含めることにより、あるいは二次的標識プローブにハイブリッド可能とすることにより、ハイブリダイゼーション前後のどちらかで標識される能力をもちうる。核酸プローブのハイブリダイゼーション条件は当業者によく知られている。例えば Sambrook et al., 前出; Ausubel et al., 前出; Innis et al., 前出; Hames et al., 前出; およびVan Ness et al., 前出 を参照。
【０１６２】
ハイブリダイゼーションは、当業者によく知られたいくつかの方法のひとつにより、ハイブリッドしたプローブとフリーのプローブとを区別することでアッセイできる（すなわち、ハイブリッドした核酸が同定できる）。これらは、以下に限定しないが、直接的または間接的に（第二の担体結合プローブへのハイブリダイゼーションまたは表面結合とプローブ抱合リガンド間の相互作用による）標的核酸の固相担体への連結、続いてプローブとの直接または間接的ハイブリダイゼーション、次いでハイブリッドしていないプローブの洗浄除去；ヌクレアーゼ抵抗性の測定、浮遊密度の測定；核酸二本鎖に特異的なアフィニティー法（例、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー）；同じ標識核酸にハイブリッドした複合プローブ間の相互作用等を含む。例えば以下を参照。Falkow et al., 米国特許 4,358,535; Urdea et al., 米国特許 4,868,105 および 5,124,246; Freifelder, Physical Biochemistry, ２版, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1982; Sambrook et al., 前出; Ausubel et al., 前出; Hames et al., 前出; および他の関連文献。ＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体の二本鎖安定化能によって、より厳格な条件下（ここで標的核酸における二次構造の潜在的閉塞が最小化される）でのハイブリダイゼーションが可能となる。従ってこのようなＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチドは発明のこの実施態様において特に好ましい。
【０１６３】
関連の実施態様において、本発明はポリヌクレオチドの標的配列の存在を検出する方法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）標的配列の存在を試験するポリヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション条件下で標的配列に本質的に相補的な配列を有する修飾オリゴヌクレオチドとを培養すること、および
（ｂ）ハイブリッドした核酸を同定すること。
但しここで修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンをプリン残基の代わりに含んでいる。
【０１６４】
好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは標識プローブであり、少なくとも２個の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン塩基をもっている。このグループの実施態様において、標識プローブは標的および／または標的の伸長生成物にハイブリッドする。ここで用いるように、「プローブ」は第二の核酸分子にて標的配列にハイブリッドすることが可能な核酸分子である。例として、このタイプのひとつのアッセイ、すなわち加水分解性プローブ・アッセイは、ＤＮＡポリメラーゼのような多くの重合酵素が内在性の５'−３'エキソヌクレオ溶解活性 を有しているとの事実をうまく利用している。従って、もしプローブが重合の鋳型として役立つ配列にハイブリッドするなら（例えば、増幅反応中、二つの増幅プライマー間に位置するＤＮＡ領域にハイブリッドするなら）、上流の増幅プライマー重合を始めた重合酵素はプローブをエキソヌクレオ溶解的に消化できる。もしプローブがその標的にハイブリッドし、また増幅がプローブのハイブリッドした領域にわたって起こるなら、このようなプローブに連結した標識は放出される。放出された標識を、標識プロ−ブから分離し、当業者によく知られた方法で標識の性質に応じて検出する。例えば放射性標識フラグメントは薄層クロマトグラフィーで分離し、オートラジオグラフィーで検出できる。一方、蛍光標識フラグメントは適当な励起波長で照射し適当な放射波長を観察して検出できる。例えば 米国特許 5,210,015 を参照。
【０１６５】
この技術のバリエーションでは、プローブは蛍光標識およびクエンチャーの両方を含む。クエンチャーは蛍光標識の蛍光放射を消光する。この場合、蛍光標識は、例えばプローブから蛍光標識のエキソヌクレオ溶解性放出によってクエンチャーとの空間関係が変化するまで検出できない。つまり標的配列へのハイブリダイゼーションに先立って、二重のフルオロフォア／クエンチャーによる標識プローブは蛍光を放射しない。フルオロフォア／クエンチャー標識プローブの標的へのハイブリダイゼーションに続いて、該プローブは上流プライマーで重合を開始する重合酵素のエキソヌクレオ溶解活性の基質となる。プローブのエキソヌクレオ溶解性分解は、プローブから従ってクエンチャーの近傍から蛍光標識を放出し、適当な励起波長の照射によって蛍光シグナルの検出を可能にする。この方法には、放出された標識をもとのプローブから分離しなくてもよいという利点がある。複数のアプローチは複数のプローブを利用し、各々プローブは異なる標的配列に対し相補的であり、識別可能な標識を有し、よって数個の標的配列の同時アッセイを可能にする。
【０１６６】
この方法および関連の方法におけるＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体の使用は、これらアッセイに適用する速度、感度および識別性能をより高める。特に完全ハイブリッドと単一塩基ミスマッチを含むハイブリッド間の識別を可能にするＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体の高い能力は、単一ヌクレオチド多型等の同定における加水分解性プローブ・アッセイの使用を促進する。単一ヌクレオチド・ミスマッチの識別可能な、本発明のような組成物および方法が２、３、４、５、またはさらに６個以上のミスマッチをもつ配列を互いに識別できることを当業者は評価する。  
【０１６７】
別の実施態様において、本発明はプライマー伸長の方法を提供する。その方法は重合に望ましい条件にて重合酵素およびヌクレオチド基質の存在下、標的配列含有ポリヌクレオチドと、その標的配列に相補的な１個以上のオリゴヌクレオチド・プライマーとを培養することを包含する。ここで少なくとも１個のオリゴヌクレオチド・プライマーは、プリンまたはピリミジン塩基に代わって３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンまたは５−置換ピリミジンを含む。
【０１６８】
増幅の方法は、標的核酸配列の多くのコピーがシーケンシャル重合および／またはライゲーション反応によって通常指数関数的に生成する方法である。より伝統的な下に述べる増幅反応に加えて、本発明は三方向連結（WO 99/37085 を参照）、シグナル増幅（Capaldi et al., Nuc. Acids Res., 28:E21 (2000) を参照）、Ｔ７ポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、ＲＴ−ＰＣＲ、ローリング・サークル、切断等を含む増幅に有用である。
【０１６９】
ＰＣＲのような多くの増幅反応は反復するプライマー依存の重合反応を利用している。プライマーは第二の鋳型核酸にハイブリッド可能な核酸、および、いったんハイブリッドすれば鋳型として第二の核酸を利用し（核酸基質の存在のもと）重合酵素によって伸長が可能な核酸である。重合酵素は、これに限定しないがＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素等を含む。異なる重合酵素による重合に好適な条件は当業者によく知られている。例えば、Sambrook et al., 前出; Ausubel et al., 前出; Innis et al., 前出の各引用文献を参照。一般的に、重合酵素によって伸長が可能であるためには、プライマーはブロックされていない３'−末端、好ましくは遊離の３'−ヒドロキシル基を有していなければならない。増幅反応の生成物は伸長プライマーであって、このプライマーは重合酵素によって伸長している。
【０１７０】
本発明の実施態様において、個々に開示し主張する方法および組成は、ＰＣＲのような改良増幅反応において有用である。例えば 米国特許 4,683,202; 4,683,195; 4,800,159; Mullis ＆ Faloona, 前出; Saiki et al., 前出の各文献を参照。ＰＣＲの重合ステップは、ＰＣＲの変性に必要な高温のために、好熱性細菌から分離されるＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性重合酵素によって頻繁に触媒作用を受ける。上述の如く、ＰＣＲ法の実施に関係するこれまでの問題点のひとつは、比較的長いオリゴヌクレオチド・プライマーの必要用件であるが、ＰＣＲが行われる高い温度でプライマーとして役立つに十分なハイブリッド安定性をもっていることである。修飾オリゴヌクレオチドおよび特にＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体は、修飾塩基およびＭＧＢがハイブリッド安定性を増加し、それによって有用なプライマーの長さの下限を十分に伸長するので、ＰＣＲのような増幅反応においてプライマーとして有用である。加えて、ＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体は、短いプライマーが望ましい特殊化ＰＣＲプロトコルで有用である。これらは、限定しないが、最適プライマー長が１０ヌクレオチド以下のディファレンシャルディスプレイ法、ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法での遺伝子多型の無作為増幅、および増幅長多型分析（amplification length polymorphism analysis）を含む。Liang et al., 前出；Williams et al., 前出の引用を参照。   
【０１７１】
本発明の修飾オリゴヌクレオチドはＰＣＲ法または関連する増幅法を利用するアッセイまたは手法のどれにも適用可能であり、例えば、これに限定しないが加水分解性プローブ・アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、フラグメント長多型分析（fragment length polymorphism analysis）、一塩基多型（ＳＮＰ）法、およびμサテライト分析を含む。これらおよび他の方法は、ごくわずかの応用例をあげれば、遺伝子マッピング、疾病に関連する遺伝子の同定およにびスクリーニング、および薬理遺伝学において有用である。
【０１７２】
別の関連実施態様では、本発明はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の測定方法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）ハイブリダイゼーションの条件下、ポリヌクレオチドを修飾ヌクレオチド・アレイと培養すること、および
（ｂ）アレイ中の修飾オリゴヌクレオチドのどれに、ポリヌクレオチドがハイブリッドしているかを測定すること。
ここで、修飾オリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基に代わって少なくとも１個の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを含んでいる。
【０１７３】
これらの手法において、異なった既知配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドを含む整理アレイを、１個以上の試験ポリヌクレオチド、核酸または核酸集団へのハイブリダイゼーションの基盤として使用する。ハイブリッドしたオリゴヌクレオチドの測定およびその既知配列の整列は試験オリゴヌクレオチドの配列の再構築を可能にする。例えば、米国特許 5,492,806; 5,525,464; 5,556,752、PCT 公開 WO 92/10588 および WO 96/17957 を参照。アレイの構築のための原料は、これに限定しないがニトロセルローズ、ガラス、シリコン・ウエハー、光ファイバーおよび当業者に知られているような、アレイの構築に適した他の原料を含む。
【０１７４】
現在のアレイを基礎とするシーケンシングおよび分析方法の主たる問題は、アレイ中の異なるオリゴヌクレオチドがそれぞれ異なるＴｍをもっていることである。それゆえ、単一塩基ミスマッチを区別する能力を維持したまま、最大の感受性をもたらす厳格な条件を決めるのが困難である。このことは、すべてではないが殆どのアレイ技術の適用について特に重要な考慮すべきことである。アレイを基礎とするシーケンシングおよび分析方法において修飾オリゴヌクレオチドおよび／またはＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体を使用することは、この問題の解決をもたらす。意外にも、ＭＧＢを修飾オリゴヌクレオチドに抱合させると、そのＴｍを塩基組成とは比較的無関係にさせる。つまり、ある長さをもつ修飾オリゴヌクレオチドおよびＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体の集団のため、完全ハイブリッドのＴｍは配列に関係なく比較的狭い温度範囲に収まる。同時に、単一ヌクレオチド・ミスマッチのＴｍは完全マッチのＴｍを下回る。それゆえ、全修飾オリゴヌクレオチドが同じ長さであるように、またＭＧＢ抱合体として任意に存在するように設計したアレイは、アレイ中の異なるオリゴヌクレオチド間で最小のＴｍ変動を示し、その結果全アレイに対してより均一のハイブリダイゼーション条件を可能とする。こういった方法で修飾オリゴヌクレオチドおよびＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド抱合体を使用するさらなる利点は、単一ヌクレオチド分解能を維持したまま、より高い温度で（またそれゆえ、より厳しく）より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にすることによって、より高い感受性をもたらすことである。
【０１７５】
本発明のアレイ技術への付加的な適用は特定の細胞または組織での遺伝子発現パターンの試験にある（一般的には、Eisen et al., METHODS IN ENZYMOLOGY, 303:179-205 (1999)を参照）。この場合、異なる遺伝子に対応する修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを表面に配列し、特定の細胞または組織由来の核酸試料を、例えばハイブリダイゼーション条件にてアレイと培養する。ハイブリダイゼーションが起こったアレイ上の位置を検出すると、どの修飾オリゴヌクレオチドがハイブリッドしているか、従って試料元の特定の細胞または組織において、どの遺伝子が活性であるかを測定できる。
【０１７６】
アレイ方法は野生型および突然変異配列が表面の整理アレイに置かれた突然変異または遺伝子多型の同定にも使用できる（Hacia et al., J. Mol. Genet., 36:730-736 (1999)を参照）。厳格な条件によるポリヌクレオチド試料のアレイへのハイブリダイゼーションを行い、そしてアレイのどのヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリッドしているかを測定すれば、ポリヌクレオチドが野生型または突然変異配列をもっているかどうかの決定を可能にする。ＭＧＢオリゴヌクレオチド抱合体の高い識別力はアレイ技術のこの適用において特に有用である。
【０１７７】
従って、本発明は興味ある遺伝子の標的配列における突然変異の同定方法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）標的配列含有のポリヌクレオチドを、異なる配列のオリゴヌクレオチド・アレイとハイブリダイゼーション条件下で培養すること。但し異なる配列は野生型標的配列および異なる突然変異の標的配列を有する；および
（ｂ）アレイ中のオリゴヌクレオチドのどれが、ポリヌクレオチドにハイブリッドするかを測定すること。
ここでは、複数オリゴヌクレオチドの１個以上のプリン残基が３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンに置き換わっている。
【０１７８】
また別の関連実施態様において、本発明はポリヌクレオチド中の標的配列のヌクレオチド配列の測定法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）標的配列を含むポリヌクレオチドと、既知配列の少なくとも２個のオリゴヌクレオチドとを反応させること（ここで、オリゴヌクレオチドの１個以上のプリン残基が３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンに置き換わっていて、また少なくとも２個のオリゴヌクレオチドのひとつは標的配列に完全に相補的である配列をもっており、またオリゴヌクレオチドの少なくとも他のひとつは関連の標的配列をもっている）、およびハイブリダイゼーション条件下で各オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドと培養すること、および
（ｂ）各オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの程度を測定すること。
【０１７９】
ひとつの実施態様において、可能なすべてのｎ量体オリゴヌクレオチド（ｎはおよそ１０未満の整数）を集めて、加水分解性プローブ・アッセイに用いてヌクレオチド配列を測定する。各オリゴヌクレオチドを独自に標識し（および好ましくは修飾し）、そして放出された標識の分析によって、オリゴヌクレオチドのどれが標的配列にハイブリッドしたかが分かる。ハイブリッドしたオリゴヌクレオチドの配列の整列からヌクレオチド配列が分かる。
【０１８０】
修飾オリゴヌクレオチドおよびより好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドＭＧＢ抱合体は、もとは Sanger ら（前出）による連鎖停止法およびその派生的方法のような、ＤＮＡシーケンシングのプライマー依存の方法において有用である。連鎖停止シーケンシングでのＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチドの使用は、より厳格な条件でより短いプライマーが使えることになり、そしてシーケンシング中のミスマッチ識別の程度をより高めることになる。例をあげると、これに限定しないが（いくつかのアミノ酸の順で）ホモロジーの短い領域を共有する遺伝子の探索、およびきわめてわずかしか存在しない配列の情報が得られる領域でのシーケンシングである。ＭＧＢオリゴヌクレオチド抱合体は、このような短いプライマーのシーケンシング技術にて有用である。
【０１８１】
さらに別の実施態様において、本発明は細胞中の遺伝子発現の試験方法を提供する。その方法は以下を包含する：
（ａ）細胞に発現した遺伝子の代表的なポリヌクレオチドの集団と、異なる配列の複数の修飾オリゴヌクレオチドとをハイブリダイゼーション条件で培養すること、および
（ｂ）アレイの修飾オリゴヌクレオチドのどれがポリヌクレオチドにハイブリッドしているかを測定すること。
ここで修飾オリゴヌクレオチドはプリンの代わりに少なくとも１個の３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを含む。
【０１８２】
実施態様のひとつのグループにおいて、複数の細胞タイプまたは組織に由来する複数の発現遺伝子を用いる方法で行う。遺伝子を好ましくは異なる検出標識で標識し、アレイに同時にハイブリッドさせ、次いで標識によって追跡し各遺伝子の発現パターンを測定する。
【０１８３】
上述のアッセイおよび診断方法に加え、ここに記載の修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾塩基はアンチセンス技術で実用性がある。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは遺伝子発現を選択的に阻害し疾病の処置および予防への遺伝学的アプローチを提供する（Smith et al., Int. J. Oncol., 17:841-850 (2000)）。他の修飾オリゴヌクレオチドはアンチセンス・オリゴヌクレオチドの性能の改良に用いられている（Zhang et al., Nat. Biotechnol., 18:862-867 (2000); Flanagan et al., Nat. Biotechnol., 14:1139-1145 (1996)）。従って、本発明の他の実施態様は５−置換ピリミジン、非置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンを、モノマーとして単独または組み合わせて、アンチセンス・オリゴマーの合成に使用することである。別の実施態様において、ここに記載の修飾塩基はアンチセンス・オリゴマーの酵素的分解を減らすため、オリゴヌクレオチド中モノマーとして使用できる。
【０１８４】
新規な修飾塩基
別の実施態様において、本発明は多くの新規な修飾塩基を提供する。これらの塩基は下記一般式をもつ：
【化２６】
2005532618.tif 000033
式中、Ｚ１はＨ、ＦおよびＯＲａからなる群より選ばれる基であり、ここでＲａはＨ、(Ｃ１−Ｃ８)アルキル、および水酸基の保護基からなる群より選ばれる基；Ｚ２はＨおよび(Ｃ１−Ｃ８)アルキルから選ばれる基であるか、または任意にＺ１と結合してＯ、ＳおよびＮからなる群より選ばれる１ないし３個のヘテロ原子をもつ５員環ないし７員環を形成し；Ｙ１はＯＨ、保護された水酸基およびＯ−Ｐ１からなる群より選ばれる基であり、ここでＰ１はホスフォルアミジトまたはＨ−ホスフォナート基であり；Ｙ２はＯＨ、保護された水酸基およびＯ−Ｐ２からなる群より選ばれる基であり、ここでＰ２はホスフォルアミジト、Ｈ−ホスフォナート、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートであり；またＢは下記式からなる群より選ばれる修飾ヌクレオチドである。
【化２７】
2005532618.tif 000034
ここでＸ１１およびＸ１２はＨ、ＮＨ２および保護されたアミノ基からなる群よりそれぞれ独立して選ばれ；各Ｒ１１は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニルおよび３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニルの保護形または非保護形からなる群より独立して選ばれ；また各Ｒ１２はヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、ヘテロシクリル、３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノ−プロプ−１−イニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニルおよび３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニルからなる群より独立して選ばれ、但しＲ１２は２−ピリジルエチニルを除く。
【０１８５】
実施態様の一グループにおいて、Ｂは下記式である。
【化２８】
2005532618.tif 000035
好ましくは、Ｘ１１はＮＨ２およびＸ１２はＨである。より好ましくは、Ｘ１１はＮＨ２、Ｘ１２はＨ、Ｙ１はＯ−Ｐ１、Ｙ２は保護された水酸基、Ｚ１はＨであり、またＲ１２は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、２−フラニル、３−フラニル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピロリル、３−ピロリル、１,３−イソオキサゾル−４−イル、１,３−イソオキサゾル−５−イル、１,３−イソオキサゾル−２−イル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、２−ピリジル、３−ピリジルおよび４−ピリジルより選ばれる。特に好ましい実施態様においては、Ｙ１は−Ｏ−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミジト］およびＹ２は−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)である。      
【０１８６】
実施態様の別のグループにおいて、Ｂは下記式である。
【化２９】
2005532618.tif 000036
好ましくは、Ｘ１２はＮＨ２またはＨである。より好ましくは、Ｘ１２はＮＨ２またはＨ、Ｙ１はＯ−Ｐ１、Ｙ２は保護された水酸基、Ｚ１はＨであり、またＲ１２は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、２−フラニル、３−フラニル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピロリル、３−ピロリル、１,３−イソオキサゾル−４−イル、１,３−イソオキサゾル−５−イル、１,３−イソオキサゾル−２−イル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、２−ピリジル、３−ピリジルおよび４−ピリジルから選ばれる。特に好ましい実施態様においては、Ｙ１は−Ｏ−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミジト］およびＹ２は−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)である。
【０１８７】
他の好ましい実施態様において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは式ＩＩＩで示される少なくとも１個の塩基（アセチル保護基が除去されている塩基を含み、また他の保護形および活性型塩基を含む）をもつ。
【化３０】
2005532618.tif 000037
【０１８８】
式ＩＩＩの化合物（６−アミノ基が保護されていて、糖の水酸基がホスフォルアミジトとして保護されているかまたは活性化されている化合物を含む）の製造については、前記反応式６に示す。
【０１８９】
本発明の最も好ましい実施態様において、修飾塩基は式ＩＶａ、ＩＶｂまたはＩＶｃから選ばれる。
【化３１】
2005532618.tif 000038
【０１９０】
これらの化合物はオリゴヌクレオチド自動合成、およびここに示すある種の修飾オリゴヌクレオチドの製造での使用に特に適している。
【０１９１】
本発明において有用である他の修飾塩基は式ＶａおよびＶｂで示される化合物を含む。
【化３２】
2005532618.tif 000039
ここでＲ７はＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２から選ばれる。これらの化合物はここに述べる方法によって合成される。
【０１９２】
実施態様の別のグループにおいて、Ｂは下記式である。
【化３３】
2005532618.tif 000040
好ましくは、Ｘ１１はＮＨ２である。より好ましくは、Ｘ１１はＮＨ２、Ｙ１はＯ−Ｐ１、Ｙ２は保護された水酸基、Ｚ１はＨであり、そしてＲ１１は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、および３−メトキシプロプ−１−イニルから選ばれる。特に好ましい実施態様においては、Ｙ１は−Ｏ−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミジト］およびＹ２は−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)である。
【０１９３】
実施態様の別のグループにおいて、Ｂは下記式である。
【化３４】
2005532618.tif 000041
好ましくは、Ｙ１はＯ−Ｐ１、Ｙ２は保護された水酸基、Ｚ１はＨであり、そしてＲ１１は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、および３−メトキシプロプ−１−イニルから選ばれる。特に好ましい実施態様においては、Ｙ１は−Ｏ−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミジト］およびＹ２は−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリチル)である。
【０１９４】
関連の実施態様において、本発明は下記式を有する修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【化３５】
2005532618.tif 000042
式中、Ｚ１はＨ、ＦおよびＯＲａから独立して選ばれ、ここでＲａはＨ、(Ｃ１−Ｃ８)アルキルおよび水酸基の保護基から選ばれる基であり；Ｚ２はＨまたは(Ｃ１−Ｃ８)アルキル、またはＺ１と任意に結合して５ないし７員環を形成し；Ｚ３はＯ、ＳまたはＮＨから選ばれ；ＹはＰ(Ｏ)ＯＨ、Ｐ(Ｓ)ＯＨおよびＰ(Ｏ)ＣＨ３から独立して選ばれ；下付き文字ｎは１から９８の整数であり；Ｗ１およびＷ２は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートおよび任意に連結したレポーター基またはクエンチャーをもつマイナー・グルーブ・バインダー連結基から各々独立して選ばれ；またＢはアデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよび下記式の修飾塩基からなる群より独立して選ばれる。
【０１９５】
【化３６】
2005532618.tif 000043
式中、Ｘ１１およびＸ１２はＨ、ＮＨ２および保護されたアミノ基から各々独立して選ばれ；Ｒ１１は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニルの保護形または非保護形から独立して選ばれ；またＲ１２は３−ヒドロキシプロプ−１−イニル、３−アミノプロプ−１−イニル、３−メトキシプロプ−１−イニル、４−ヒドロキシ−１−ブチニル、４−アミノ−１−ブチニル、３−(ヒドロキシメチル)−４−ヒドロキシ−１−ブチニル、ヘテロシクリル(Ｃ１−Ｃ１２)アルキル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルケニル、ヘテロシクリル(Ｃ２−Ｃ１２)アルキニル、およびヘテロシクリルの保護形または非保護形からなる群より独立して選ばれ；但しＲ１２は２−ピリジルエチニルを除き、さらに
少なくともＢのひとつは修飾塩基から選ばれ、また任意に、Ｂのひとつ以上は、連結したマイナー・グルーブ・バインダー連結基、レポーター基またはその組み合わせを包含する。
特に好ましい修飾塩基は上述したものである。
【実施例】
【０１９６】
実施例１
本実施例は、５−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート)−５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリフェニルメチル)−２'−デオキシウリジン３'−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホラミジット]（３）の合成を示す。
【０１９７】
５−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート)−２'−デオキシウリジン（１）
無水ＤＭＦ３０ｍＬ中の５−ヨード−２'−デオキシウリジン（５.０ｇ、１４.１２ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２７０ｍｇ、１.４２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４（０.８２ｇ、０.７１４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２.４ｍＬ）の混合物に、プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート（６.１０ｇ、３５.０６ｍｍｌ）を加えた。混合物をアルゴン下で４時間攪拌し、ついで蒸発乾固した。残渣をメタノールで研和し、沈澱した過剰のプロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアートを濾去した。濾液を蒸発せしめ、残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、１０％メタノールの酢酸エチル液での溶出により精製した。純産物フラクションを蒸発乾固し、残渣を酢酸エチルエーテルから沈澱せしめた。収量３.１４ｇ（５６％） ；ＴＬＣ（1０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.５０；１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ１１.６８(１Ｈ，ｓ，ウラシルＮ−Ｈ)、８.２９(１Ｈ，ｓ，６−Ｈ)、７.８９および７.３５（４Ｈ，２xd, Ｊ＝８.２Ｈｚ，トルオイルＨｓ)、６.１０(１Ｈ，t，J=６.４Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.２４(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.４Ｈｚ，３'-ＯＨ)、５.１５(２Ｈ，ｓ，アルキニル-ＣＨ２)、５.１２(１Ｈ，t，Ｊ＝５.２Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.２４(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７９(１Ｈ，ｑ，４'-Ｈ)、３.５９（２Ｈ，ｍ，５'-Ｈｓ)、２.３９(３Ｈ，ｓ，トルオイル-ＣＨ３)、２.１３(２Ｈ，ｍ，２'-Ｈ)。
【０１９８】
５−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート)−５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリフェニルメチル)−２'−デオキシウリジン（２）
化合物１（３.０ｇ、７.５０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液４５ｍＬにジメトキシトリチルクロリド（３.０ｇ）を加えた。得た溶液を４時間室温で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液４００ｍＬ中に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し（２ｘ３００ｍＬ)、抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、５％メタノールの酢酸エチル液での溶出により精製した。純産物フラクションを集め、蒸発せしめると、泡状の化合物２を得た。収量４.１６ｇ（７９％)。
【０１９９】
５−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンゾアート)−５'−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリフェニルメチル)−２'−デオキシウリジン３'−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホラミジット]（３）
化合物２（４.０ｇ、５.７０ｍｍｏｌ）の、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン３.０ｍＬを含有する無水メチレンクロリド溶液１３０ｍＬにクロロ(２−シアノエトキシ)(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン（２.２２ｍＬ）をアルゴン下に加えた。溶液を３０分間室温で攪拌し、メタノール３０ｍＬで処理した。溶液を酢酸エチル３００ｍＬで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム液３００ｍＬで洗った。水層を酢酸エチル３００ｍＬで抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配３０から０％ヘキサンの酢酸エチル液（２％トリエチルアミン）での溶出により精製した。純産物フラクションを集め、蒸発せしめると、残渣が酢酸エチルヘキサンから沈澱した。収量３.３５ｇ（６５％）；ＴＬＣ（２０％ヘキサンの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.８２および０.７１（ジアステレオマー）；３１Ｐ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６)δ１４７.８２および１４７.４５。
【０２００】
実施例２
相１  （２Ｒ,５Ｒ)−５−(４−アミノ−３−ヨードピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（９）の調製
【０２０１】
３−ヨード−１,５−ジヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン（４）
Ｎ−ヨードサクシンイミドを用いる、本化合物の合成が Taylor et al. (Tetrahedron, 48(37): 8089-8100 (1992)) に報告されている。ヨード化剤として一ヨウ素クロリドを用いる本発明の合成を下記する。
【０２０２】
１.２Ｍ酢酸ナトリウム溶液１.０Ｌに４−ヒドロキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン（２５ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を加え、ついでヨウ素モノクロリド（４６ｇ、２８４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を密封容器中４時間１１０℃で攪拌した。完全な反応物を室温に冷やし、二亜硫酸ナトリウム３０ｇの水溶液２００ｍＬで処理した。形成した白色沈澱を濾過し、冷水で洗った。ついで固体物を３.２Ｍ水酸化カリウム液２００ｍＬに溶解した。ヒドラジン・一水和物（５ｍＬ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。濃塩酸５０ｍＬの添加で溶液を約ｐＨ７の酸性にし、ついで酢酸でｐＨを正確に調整した。形成した固体物を濾過し、冷水で洗い、乾燥した。収量５５.1（１１４％）。なお、固体物の減圧乾燥では、残渣の水を除去するのが困難である。残渣の水は次のピリジン蒸発の工程で除去する。
【０２０３】
３−ヨード−１,５−ジヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−チオン（５）
化合物４（２１.５ｇ、８２.１ｍｍｏｌ）を無水ピリジン１５０ｍＬに懸濁し、混合物を蒸発乾固した。固体物を無水ピリジン１７０ｍＬに再懸濁し（アルゴン下）、Ｐ２Ｓ５（２６.８ｇ）を加えた。混合物を１０分間６５℃で攪拌し、ついで２−６時間９５℃で攪拌した。得られた溶液を室温に冷やし、アルゴン流を溶液中に泡立たせて除気した（亜硫酸塩ガスが、水酸化ナトリウム溶液を含有するトラップを通過する）。反応溶液の容量を濃厚シロップが形成するまで減じた。過剰のＰ２Ｓ５を、水１０ｍＬの添加により、激しい反応が止むまで、さらに水５００ｍＬと酢酸１０ｍＬの添加により減じた。混合物を７０℃に１時間暖めて、硫化水素の発生を促進し、水５００ｍＬで希釈し、氷浴で冷やした。固体物を濾過し、水洗し、乾燥した。収量１９.８ｇ（８７％）。  
【０２０４】
４−エチルチオ−３−ヨードピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン（６）
化合物５（４３.５ｇ、１５７ｍｍｏｌ）を水酸化カリウム液（ＫＯＨ３８.６ｇ、水３５０ｍＬ）中で３０分間攪拌した。混合物を濾過し、濾液を酢酸の添加でｐＨ１０までにし、ついで絶対エタノール３５０ｍＬで希釈した。ヨードエタン（１０ｍＬ）を加え、溶液を室温で攪拌した。さらにヨードエタン１０ｍＬを３０分後および１時間後に加えた。反応を計９０分で完了した。他のランは反応の完了にさらなるヨードエタンの追加を必要とした。反応液を水７００ｍＬおよび酢酸２０ｍＬで希釈した。混合物を氷浴で冷やし、固体物を濾過し、水で洗い、乾燥した。この粗製産物をＤＭＦ３００に溶解し９０℃で１５分間攪拌した。不溶物を濾去し、濾液を水１Ｌで希釈し、氷−水浴で冷やした。固体物を濾取し、水で洗い、乾燥した。収量１９ｇ（４０％）。
【０２０５】
[(２Ｒ,５Ｒ)−５−(４−エチルチオ−３−ヨードピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−３−(４−メチルフェニルカルボニルオキシ)オキソラン−２−イル]メチル−４−メチルベンゾネート（７）
化合物６を対応のカリウム塩に、１モル当量の水酸化カリウム水溶液との反応で変換した。得られた溶液を蒸発乾固し、残渣を乾燥アセトニトリルから蒸発せしめた。化合物６のカリウム塩（２９.０ｇ、９４.７３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ８０ｍＬに溶解し、ついで無水アセトニトリル８３０ｍＬで希釈した。クロロ糖誘導体（４８ｇ、１２３ｍｍｏｌ）をいっきに加え、混合物を３時間攪拌し、ついで２５％水性メタノール１.５Ｌで希釈した。混合物を５℃で一夜放置した。結晶を濾過し、２５％水性メタノールで洗い、乾燥した。収量３２.２ｇ（５２％）。
【０２０６】
(２Ｒ,５Ｒ)−２−(ヒドロキシメチル)−５−(３−ヨード−４−メチルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)オキソラン−３−オール（８）
化合物７（１０.９７ｇ、１６.６６ｍｍｏｌ）のメタノール懸濁液２５０ｍＬに１Ｎナトリウム・メトキシドのメタノール液２２ｍＬを加えた。混合物を還流攪拌し、反応の進行をモニターして、混合物が澄明な溶液に変わるのに注意した。もし、化合物５への変換後も還流を続けると、副産物が形成する。所望の産物に対応する１構成成分をＴＣＬで観測すると、すぐに酢酸１.３４ｍＬの添加により反応を停止した。溶液を蒸発せしめ、残渣をメタノール−エーテル−ヘキサンから沈澱せしめた。固体物を濾過し、乾燥した。粗製産物（酢酸ナトリウムを含有）の収量６.８ｇ（１０４％）。
【０２０７】
(２Ｒ,５Ｒ)−５−(４−アミノ−３−ヨードピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（９）
化合物８（６.８ｇ、１７.３５ｍｍｏｌ）を濃水酸化アルミニウム２００ｍＬ中（密封容器）室温で３６時間攪拌した。混合物を蒸発せしめ、残渣をアセトニトリル−エーテルから沈澱せしめた。固体物を濾取し、乾燥した。収量５.３６ｇ（８２％）。本化合物のＮＭＲおよびスペクトルは類似
【０２０８】
相２  ３−{４−(１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−(シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロプ−２−イニル４−メトキシベンソエート（化合物１３，Ｒ１＝ＯＣＯＰｈＣＨ３）の調製
【０２０９】
３−{１−{(２Ｒ,５Ｒ)−４−ヒドロキシ−５−(ヒドロキシメチル)オキソラン−２−イル]−４−アミノピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル}プロプ−２−イニル}４−メチルベンソエート（１０，Ｒ１＝ＯＣＯＰｈＣＨ３）
化合物９（２.４０ｇ、６.３７ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１２４ｍｇ、０.６４８ｍｍｏｌ）、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４（３８０ｍｇ、０.３３１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１.３２ｍＬ）の混合物の無水ＤＭＦ液１２ｍＬにプロプ−２−イニル４−メチルベンソエート（１.８７ｇ、１１.８５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン下で１２時間攪拌し、ついで蒸発乾固した。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、５％メタノールの酢酸エチル液の溶出で精製した。純産物フラクションを蒸発せしめて、泡状物を得た。収量２.２９ｇ（８５％）；ＴＬＣ（１０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.４３；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ ８.２６(１Ｈ，ｓ，６-Ｈ)、７.９２および７.３７(４Ｈ，２ｘｄ，Ｊ＝８.５Ｈｚ，トルオイル-Ｈｓ)、６.５５(１Ｈ，t，Ｊ＝６.３Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.２９（２Ｈ，ｓ，アルキニル-ＣＨ２)、５.２８(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.７Ｈｚ，３'-ＯＨ）、４.７６(１Ｈ，t，Ｊ＝５.７Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.４１(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ）、３.８１(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ）、３.４９および３.５６(２Ｈ，２×ｍ，５'-Ｈｓ）、２.７６および２.２４(２Ｈ，２×ｍ，２'−Ｈｓ）、２.３９(３Ｈ，ｓ，トルオイル−ＣＨ３）。
【０２１０】
３−{４−(１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−４−ヒドロキシ−５−(ヒドロキシメチル)オキソラン−２−イル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル}プロプ−２−イニル４−メチルベンゾアート（１１、Ｒ１＝ＯＣＯＰｈＣＨ３）
化合物１０（１.７６ｇ、４.１６ｍｍｏｌ）を、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド５.０ｍＬ、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール１.９ｍＬおよび無水トリメチルアミン２.０ｍＬの溶液中で１５時間室温で攪拌した。溶媒を蒸発せしめ、残渣をキシレンから２回蒸発せしめると、泡状の化合物１１を得た。ＴＬＣ（１０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.２９； １Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ ８.５１(１Ｈ，ｓ，６-Ｈ), ７.９０および７.３７(４Ｈ，２ｘｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ，トルオイルプロトン)、７.２８，７.１４および６.７４(１３Ｈ，ｄおよび２ｍ，Ｊ＝７.１Ｈｚ、ダブレットについて)、トリチルプロトン)、６.６３(１Ｈ，ｍ，１'-Ｈ)、５.３２(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５.０Ｈｚ，３'-ＯＨ)、５.２４(２Ｈ，ｓ，アルキニル-ＣＨ２)、４.５６(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.９３(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.６８（６Ｈ，ｓ，メトキシＨｓ)、３.３２および３.１１(６Ｈ, ２ｘｓ，Ｎ−メチル)、３.０９-２.９５ (２Ｈ，ｍ，５'-Ｈｓ)、２.８１および２.３２ (２Ｈ，２ｘｍ，２'−Ｈｓ)、２.４０ (３Ｈ，ｓ，＝−Ｍｅ)、２.１９ (３Ｈ，ｓ，トルオイル-Ｍｅ)。
【０２１１】
３−{４−(１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−ヒドロキシオキソラン−２−イル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロプ−２−イニル４−メチルベンソエート（１２、Ｒ１＝ＯＣＯＰｈＣＨ３）
化合物１１の無水ピリジン溶液２５ｍＬにジメトキシトリチルクロリド（１.６７ｇ）を加えた。得られた溶液を４時間室温で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液２５０ｍＬに注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、５％メタノールの酢酸エチル液で溶出した。純産物フラクションを集め、蒸発せしめると泡状の化合物１２を得た。この２工程の収量２.０６ｇ（６２％）。
【０２１２】
３−{４−(１Ｅ)−１−アザ−２−メチルプロプ−１−エニル)−１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−(シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロプ−２−イニル４−メトキシベンソエート（１３、Ｒ１＝ＯＣＯＰｈＣＨ３）
すなわち
１−[２−デオキシ−５−Ｏ−(４,４'−ジメトキシトリフェニルメチル)−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル]−４−[(ジメチルアミノ) プロプ−１−エニル]−３−(プロプ−２−イニル−４−メチルベンソエート)１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン３'−[(２−シアノエチル)Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホラミジット（１３）
【０２１３】
化合物１２（２.０３ｇ、２.５６ｍｍｏｌ）の、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１.３３ｍＬを含有する無水メチレンクロリド溶液６０ｍＬに、クロロ(２−シアノエトキシ)(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミノ)ホスフィン１.０ｍＬをアルゴン下で加えた。溶液を１時間室温で攪拌し、ついでメタノール２.０ｍＬで処理した。溶液を酢酸エチル２５０ｍＬで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム溶液２００ｍＬで洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、２％トリエチルアミンの酢酸エチル液での溶出により精製した。純フラクションを集め、蒸発せしめた。ホスホラミジット（１３）をエーテル−ヘキサンから沈澱せしめた。収量１.８２ｇ（７１％）；ＴＬＣ（５％ヘキサンの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３２；３１Ｐ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６) δ１４７.９０および１４７.２２。
【０２１４】
実施例３
本実施例は、Ｎ−{３−[１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−(シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル]プロピル}−２,２,２−トリフルオロアセタミド（２２）の調製を示す。
【０２１５】
３−ヨード−４−メトキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−６−イルアミン（１４）
４−メトキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−６−イルアミン（６.７５ｇ、４０.８７ｍｍｏｌ）を、酢酸ナトリウム（６.０ｇ、４４.０９ｍｍｏｌ）およびヨウ素モノクロリド（９.１２ｇ、５６.１７ｍｍｏｌ）を含有する溶液に懸濁し、１００℃で密封反応器中２４時間攪拌した。得られた混合物を室温に冷やし、二亜硫酸ナトリウム（３.６ｇ、１８.９４ｍｍｏｌ）の水溶液２４ｍＬで処理した。形成した該固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。収量６.９３ｇ（５８％）；ＴＬＣ（１０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.５７。;１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ１３.０８(１Ｈ，ｂｒｓ，Ｎ−１プロトン)、１０.５８(１Ｈ，ｓ，Ｎ−５プロトン）、６.６０ (２Ｈ，ｂｒｓ，６-アミノ)。
【０２１６】
[(２Ｒ,５Ｒ)−５−(６−アミノ−３−ヨード−４−メトキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−３−(４−メチルフェニルカルボニルオキシ)オキソラン−２−イル]メチル４−メチルベンゾアート（１５）
化合物１４（６.６８ｇ、２２.９５ｍｍｏｌ）のメタノール懸濁液１５０ｍＬに２.８５Ｍメタノール性水酸化カリウム８.０５を加えた。混合物を１分間攪拌し、トルエン１００ｍＬで希釈し、蒸発せしめた。化合物１の固体カリウム塩を減圧で乾燥した。カリウム塩を無水ＤＭＦ７５ｍＬに懸濁し、ついで無水アセトニトリル４２０ｍＬで希釈した。１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオニルリボフラノース（８.９５ｇ、２２.９５ｍｍｏｌ）を直ちに加え、反応混合物を室温でアルゴン下、１時間攪拌し、ついで濾過した。濾液を蒸発せしめ、泡状の残渣を２回メタノールから再結晶した。収量６.５９ｇ（４５％）；ＴＬＣ（１：１、酢酸エチル／ヘキサン）、Ｒｆ＝０.５２；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ７.９３および７.３７(８Ｈ，ｍおよびｄ，Ｊ＝７.９ Ｈｚ, d、芳香族について)、７.１０(２Ｈ，ｂｒｓ，６-アミノ)、６.５１(１Ｈ，t，J=６.６Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.６９(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、４.４４ (３Ｈ，ｍ，４'および５'Ｈｓ)、３.９９(３Ｈ，ｓ，４-メトキシ)、３.１９および２.６３(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)、２.４０および２.３８(６Ｈ，２ｘｓ，トルオイルメチルプロトン)。
【０２１７】
[(２Ｒ,５Ｒ)−５−(６−アミノ−３−ヨード−４−メトキシピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（１６）
化合物１５（３２.４ｇ、５０.４０ｍｍｏｌ）のメタノール懸濁液６００ｍＬに１Ｍナトリウム・メトキシドのメタノール液１２.５ｍＬを加えた。反応混合物を１８時間還流攪拌し、ついで冷凍機（−１０℃）中で冷やした。形成した化合物３の結晶を濾取し、氷冷メタノールで洗った。収量１０.９５ｇ。酢酸（１２.５ｍＬ）を濾液に加え、容量を約３００ｍＬとした。溶液を冷凍機に一夜放置し、さらなる形成の結晶を集めた（３.９５ｇ）。濾液を蒸発乾固し、残渣の油状物をエーテル中で粉砕した。形成した固体物を濾取し、乾燥し、沸騰水から再結晶した。２.０３ｇ、全収量１６.９３（８３％）；ＴＬＣ（１０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.２３；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ７.０２ (２Ｈ，ｂｒｓ，６-アミノ)、６.３３ (１Ｈ，t，J=６.１Ｈｚ)、５.２４ (１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.４Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.７３(１Ｈ，t，J=５.６Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.３６ (１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.９９ (３Ｈ，ｓ，４-メトキシ)、３.７５(１Ｈ，ｍ，４'−Ｈ)、３.５１-３.３２ (２Ｈ，ｍ，５'−Ｈｓ)、２.７９および２.１７ (２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。Ｃ11Ｈ14ＩＮ5Ｏ4・０.３Ｈ２Ｏとして理論値；Ｃ３２.０２；Ｈ３.５７；Ｎ１６．９８。実測値Ｃ３２.１３；Ｈ３.３５；Ｎ１６.７７。
【０２１８】
１−[(２Ｒ,５Ｒ)−(５−ヒドロキシメチル) オキソラン−２−イル]−６−アミノ−３−ヨード−５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−オン（１７）
化合物１６（１６.８４ｇ、４１.３６ｍｍｏｌ）の１Ｎ水酸化ナトリウム懸濁液１.５Ｌを加熱還流した。混合物が均質な溶液となり、氷水浴で２５℃に冷やした。酢酸（９０ｍＬ）を加え、溶液を一夜５℃で保存した。形成した結晶を濾取し、氷冷水で洗い、乾燥した。化合物４の収量７.４７ｇ。濾液を蒸発で約５００ｍＬの量とし、一夜５℃で保存した。２度目に形成した結晶を集めた（３.７５ｇ）。濾液を蒸発で約２００ｍＬの量とした。形成した酢酸ナトリウムを濾去し、濾液を５℃で一夜保存した。さらに形成した結晶を集めた（２.２５ｇ）。全収量１３.４７ｇ（８３％）；ＴＬＣ（５：３：２、ｎ−ブタノール／水／酢酸）、Ｒｆ＝０.７４；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ６.２２(１Ｈ，t，Ｊ＝６.３ Ｈｚ，Ｆ−Ｈ)、４.３３(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７３(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.４７および３.３６（２Ｈ，２ｘｍ，５'−Ｈｓ)、２.６３および２.１２(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。Ｃ10Ｈ12ＩＮ5Ｏ4・０.７Ｈ２０として計算値；Ｃ２９.６０；Ｈ３.３３；Ｎ１７.２６。実測値Ｃ２９.８１；Ｈ３.０２；Ｎ１７.００。
【０２１９】
Ｎ−(３−{１−[(２Ｒ,５Ｒ)−４−(ヒドロキシメチル) オキソラン−２−イル]−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル)}プロプ−２−イニル)−２,２,２−トリフルオロアセタミド（１８）
化合物１７（６.００ｇ、１５.２６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２９７ｍｇ、１.５６ｍｍｏｌ）およびテトラキス[トリフェニルホスフィン]パラジウム[０]の混合物の無水ＤＭＦ液３０ｍＬに無水トリエチルアミン（３.１４ｍＬ）、ついでプロパルギルトリフルオロアセチミド（４.２９ｇ、２８.４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液をアルゴン下４０時間攪拌した。ＤＭＦを蒸発で除き、残渣の油状物をクロロホルム中で粉砕した。形成した固体状の粗製の化合物５を濾取し、クロロホルムで洗い、乾燥した。固体物を最少量のＤＭＦに溶かし、シリカゲルに吸収して、蒸発せしめた。乾燥混合物をシリカゲルカラムに充填し、１０％メタノールの酢酸エチル液で溶出した。産物フラクションを集め、蒸発せしめた。残渣を酢酸エチル／エーテルから沈澱せしめた。収量４.０ｇ（６３％）；ＴＬＣ（２０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.５９；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ１０.７９(１Ｈ，ｓ，Ｎｓ−Ｈ)、１０.１６（１Ｈ，t，Ｊ＝５.２ Ｈｚ, トリフルオロアセチミドＮ−Ｈ）、６.７７(２Ｈ, ｂｒｓ，６-アミノ)、６.２８(１Ｈ，t，J=６.３Ｈｚ,１'-Ｈ)、５.２３(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.１Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.７２(１Ｈ，t，Ｊ＝５.１Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.３２(３Ｈ，ｍ，−ＣＯＮＨ−ＣＨ２−および３'-Ｈ)、３.７５(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ）、３.５０-３.２９(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、２.６５および２.１５(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。計算値、Ｃ15Ｈ15Ｆ3Ｎ6０5・０.７４Ｈ２０；Ｃ４１.９３；Ｈ３.８７；Ｎ１９.５６。実測値Ｃ４２.３３；Ｈ３.６４；Ｎ１９.１３。
【０２２０】
Ｎ−(３−{１−[(２Ｒ,５Ｒ)−４−(ヒドロキシメチル) オキソラン−２−イル]−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[５-４−ｄ]ピリミジン−３−イル)}プロプル)−２,２,２−トリフルオロアセタミド（１９）
化合物１８（１.０ｇ、２.４０ｍｍｏｌ）の、２０％水酸化パラジウム（ギ酸で前活性化）０.１２ｇを含有するメタノール液１００ｍＬ溶液に４Ｍトリエチルアンモニウム・ホルメート緩衝液（ｐＨ６.５）２.０ｍＬを加えた。混合物を３５ｐｉｓの水素ガス下に１８時間揺すった（いくつかのランで、完全な反応のためにさらなる触媒の添加が必要であった）。混合物を Celite で濾過し、濾液を蒸発せしめた。残渣の油状物を水から結晶化した。収量０.７９ｇ（７８％）；ＴＬＣ（２０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.５２；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ １０.５９(１Ｈ，ｓ，Ｎｓ−Ｈ)、９.４７(１Ｈ，ｂｒｔ，トリフルオロアセチミドＮ−Ｈ)、６.６４ (２Ｈ，ｂｒｓ，６-アミノ)、６.２７(１Ｈ，t，Ｊ＝６.３Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.１８(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.４Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.７５(１Ｈ，t，Ｊ＝５.９Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.３６(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７５(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.４８および３.６１(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、３.２２、２.６８および１.８７(６Ｈ，３ｘｍ，プロピルメチレンプロトン)、２.６８および２.１２ (２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。Ｃ15Ｈ19Ｆ3Ｎ6Ｏ5・０.９０Ｈ2０として計算値；Ｃ４１.２７；Ｈ４.８０；Ｎ１９.２５。実測値Ｃ４１.５７；Ｈ４.５０；Ｎ１９.１１。
【０２２１】
Ｎ−(３−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)プロプ−１−エニル][(２Ｒ,５Ｒ)−４−(ヒドロキシメチル) オキソラン−２−イル]−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[５-４−ｄ]ピリミジン−３−イル)}プロプル)−２,２,２−トリフルオロアセタミド（２０）
化合物１９（０.８０ｇ、１.９８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液にＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド・ジメチルアセタール（３.１ｍＬ）を加えた。溶液を２時間アルゴン下で攪拌し、ついで蒸発せしめた。残渣を２回キシレンから蒸発せしめ、ついで減圧とした。形成した無晶形の固体物（化合物２０）をエーテルで粉砕し、集めた。収量７７３ｍｇ（８２％）；ＴＬＣ（２０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.４７；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ １１.２２(１Ｈ，ｂｒｓ，Ｎｓ−Ｈ)、９.４７(１Ｈ，t，Ｊ＝５.５ Ｈｚ，トリフルオロアセチミドＮ−Ｈ)、８.６７(１Ｈ，ｓ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ)、６.４２(１Ｈ，t，Ｊ＝６.５Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.２２(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.３Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.７５(１Ｈ，t，Ｊ＝６.1Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.４０(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７７(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.５０および３.３８ (２Ｈ，２ｘｓ，５'-Ｈｓ)、３.１８および３.０５(６Ｈ，２ｘｓ，Ｎ,Ｎ−ジメチルＨｓ)、３.２２、２.７２および１.８９(６Ｈ，３ｘｍ，プロピルメチレンＨｓ)、２.７２および２.１５(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。Ｃ18Ｈ24Ｆ3Ｎ7Ｏ5・０.４０Ｈ2０として計算値；Ｃ４４.８０；Ｈ５.１８；Ｎ２０.３２。実測値Ｃ４５.０２；Ｈ４.９６；Ｎ１９.９４。
【０２２２】
Ｎ−{３−[１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−ヒドロキシオキソラン−２−イル)−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル] プロプル)−２,２,２−トリフルオロアセタミド（２1）
化合物２０（７２３ｍｇ、１.５２ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液９.０ｍＬに４,４'−ジメトキシトリチルクロリド（０.６１ｇ、１.８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を３時間アルゴン下で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液１００ｍＬ中に注いだ。水溶液を酢酸エチル（２ｘ２００ｍＬ）で抽出し、乾燥抽出物（硫酸ナトリウム）を蒸発せしめた。粗産物をシリカゲル・クロマトグラフィー、溶媒勾配０−５％メタノールの酢酸エチル液（２％トリエチルアミン）での溶出で精製した。産物フラクションを蒸発せしめると、無晶形の固体物として化合物２１を得た。収量７２４ｍｇ（６１％）；ＴＬＣ（５％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３９；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ １１.２７ (１Ｈ，ｓ，Ｎｓ−Ｈ)、９.４３(１Ｈ，t，Ｊ＝５.３ Ｈｚ，トリフルオロアセチミドＮ−Ｈ)、８.７１(１，ｓ，Ｎ＝ＣＨ−Ｎ)、７.３２、７.１７および６.７６(１３Ｈ，３ｘｍ，芳香族)、６.４５(１Ｈ，t，Ｊ＝６.３Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.２６(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５.３Ｈｚ, ３'-ＯＨ)、４.４５(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.９０(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.７０(６Ｈ，ｓ，ＯＭｅＨｓ)、３.１８および３.０５(１０Ｈ，２ｘｓ，Ｎ,Ｎ−ジメチル，５'-ＨｓおよびＣＯＮＨ−ＣＨ２)、２.６２および１.６５(４Ｈ，２ｘｍ，メチレンＨｓ)、２.６２および２.２０(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。Ｃ39Ｈ42Ｆ3Ｎ7０7・０.３０Ｈ２０として計算値；Ｃ５９.８１;Ｈ５.４８；Ｎ１２.５２。実測値Ｃ５９.８０；Ｈ５.３９；Ｎ１２.６３。
【０２２３】
Ｎ−{３−[１−((２Ｒ,５Ｒ)−５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)−６−アミノ−４−オキソ(５−ヒドロピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−３−イル] プロプル)−２,２,２−トリフルオロアセタミド（２２）
化合物２１（７００ｍｇ、０.９００ｍｍｏｌ）の、ジイソプロピルエチルアミン０.４７ｍＬを含有する無水メチレンクロリド溶液２２ｍＬに、２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミジット（０.３４ｍＬ、１.５２ｍｍｏｌ）を加えた。３０分間アルゴン下２５℃で攪拌した後、溶液をメタノール３.０ｍＬで処理し、酢酸エチル２００ｍＬで希釈した。溶液を５％炭酸水素ナトリウム液１００ｍＬで洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発せしめた。粗産物をシリカゲル・クロマトグラフィー、２％トリエチルアミンの酢酸エチル液による溶出で精製した。産物フラクションを蒸発せしめ、残渣をエーテル−ヘキサンから沈澱せしめた。収量５８３ｍｇ（６６％）；ＴＬＣ（酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３８；31Ｐ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６,８５％リン酸と照合)δ １４５.５０および１４４.７２。
【０２２４】
実施例４
本実施例は、３−{[５−(４,６−ビス{(１Ｅ)−１−アザ−２−[ビス(２−メチルプロピル)アミノ]ビニル}−３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]−メチル}オキソラン−３−イルオキシ][エチル(メチルエチル)アミノ}−{ホスフィノ}プロパンニトリル（２６）の調製を示す。
【０２２５】
５−(４,６−ビス{(１Ｅ)−１−アザ−２−[ビス(２−メチルプロピル)アミノ]ビニル}−３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（２４）
化合物２３（１ｍｍｏｌ）を５時間室温で（ジメトキシメチル)ビス(２−メチルプロピル)アミン（０.５ｍｇ、３.３７ｍｍｏｌ）と攪拌できる。反応混合物を減圧にし、保護された化合物をシリカゲルで精製すると、化合物２４を得ることができる（Vincent et al.)。
【０２２６】
５−(４,６−ビス{(１Ｅ)−１−アザ−２−[ビス(２−メチルプロピル)アミノ]ビニル}−３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]−メチル}オキソラン−３−オール（２５）
化合物２４（１.５０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液９.０ｍＬに４,４'−ジメトキシトリチルクロリド（０.６１ｇ、１.８０ｍｍｏｌ）を加えることができる。反応溶液を３時間アルゴン下で攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム液１００ｍＬに注ぎ得る。水溶液を酢酸エチル（２ｘ２００ｍＬ）で抽出し、抽出物を乾燥（硫酸ナトリウム）で乾燥し、蒸発せしめ得る。粗産物をシリカゲル・クロマトグラフィー、適当な勾配溶媒溶出で精製すると、化合物２５を得る。
【０２２７】
３−{[５−(４,６−ビス{(１Ｅ)−１−アザ−２−[ビス(２−メチルプロピル)アミノ]ビニル}−３−プロプ−１−イニルピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]−メチル}オキソラン−３−イルオキシ][エチル(メチルエチル)アミノ}−{ホスフィノ}プロパンニトリル（２６）
化合物２５（０.９００ｍｍｏｌ）の、ジイソプロピルエチルアミン０.４７ｍＬを含有する無水メチレンクロリド溶液２２ｍＬに、２−シアノエチルＮ,Ｎ−ジイドプロピルクロロホスホラミジット（０.３４ｍＬ、１.５２ｍｍｏｌ）を加え得る。溶液を３０分間アルゴン下２５℃で攪拌し、メタノール３.０ｍＬで処理し、酢酸エチル２００ｍＬで希釈し得る。溶液を５％炭酸水素ナトリウム液１００ｍＬで洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し蒸発せしめ得る。粗産物をシリカゲル・クロマトグラフィー、適当な勾配溶媒溶出で精製すると、化合物２６を得る。
【０２２８】
実施例５
本実施例は、５−[４,６−ジアミノ−３−(２−メトキシエチニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル]−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（２７）の合成を示す。
【０２２９】
５−[４,６−ジアミノ−３−(２−メトキシエチニル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル]−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（２７）
無水ＤＭＦ３０ｍＬ中の４,６−ジアミノ−１−[２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル)−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン（４.２ｇ、１０.７１ｍｍｏｌ)、ＣｕＩ（２１１ｍｇ、１.１０ｍｍｏｌ)、Ｐｄ(ＰＰｈ３)４（６３５ｇ、０.５５３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２.２ｍＬ）の混合物に、メチルプロパルギルエーテル（１.８２ｍＬ）を加えた。混合物をアルゴン下で１６時間攪拌し、ついで蒸発乾固した。残渣をメタノールから再結晶した。収量３.２０（８９％）；ＴＬＣ（３０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.６３；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ７.４４(２Ｈ，ｂｒｄ，アミノ)、６.３２(１Ｈ，t，Ｊ＝６.６ Ｈｚ，１'-Ｈ)、６.３３ (２Ｈ，ｂｒｓ，アミノ)、５.２０(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.１Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.７５(１Ｈ，ｂｒｔ，５'-ＯＨ)、４.４０(２Ｈ，ｓ，メチレン)、４.３６(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７６(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.４７および３.３２(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、３.３２(３Ｈ，ｓ，メトキシ)、２.６８および２.１４(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。
【０２３０】
５−{６−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール,１−メトキシプロプ−１−イン（２８）の合成
化合物２７（３.１ｇ、９.２８ｍｍｏｌ）をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍＬおよびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド・ジメチルアセタール１５ｍＬの溶液中で１４時間４５℃で攪拌した。溶液を蒸発せしめ、残渣を２回キシレンから蒸発せしめ、酢酸エチルエーテルから沈澱せしめて、泡状物として化合物２８を得た。収量２.８ｇ（６８％）；ＴＬＣ（５０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３６。
【０２３１】
３−[５−{６−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル)オキソラン−３−イルオキシ)[(ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル（２９）の合成
化合物２８（２.７ｇ、６.０８ｍｍｏｌ）の無水ピリジン４５ｍＬ溶液にメトキシトリチルクロリド（２.４ｇ）を加えた。得られた溶液を３時間室温で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液２００ｍＬに注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配０−４０％メタノールの酢酸エチルによる溶出で精製した。純５'−Ｏ−ＤＭＴ誘導体フラクションを集め、蒸発せしめると、泡状物を得た。収量１.０ｇ（２２％）。
【０２３２】
ＤＭＴ誘導体（０.９８ｇ、１.３１ｍｍｏｌ）の、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.７０ｍＬを含有する無水メチレンクロリド溶液１６ｍＬに、２−シアノエチル・ジイソプロピルクロロホスホラミジット（０.５０ｍＬ）をアルゴン下に加えた。溶液を３０分間室温で攪拌し、メタノール１.０ｍＬを処理した。溶液を直接シリカゲルカラムに充填し、勾配０−２０％メタノールの酢酸エチル（２％トリエチルアミン）で溶出した。純フラクションを集め、蒸発せしめると、泡状物を得た。収量０.２５ｇ（２０％）。
【０２３３】
実施例６
本実施例は、３−[(５−{４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]−ホスフィノオキシ]プロパンニトリル（３５）の調製を示す（参照、反応式８）。
【０２３４】
(２−フリルメトキシメチレン)メタン−１,１−ジカルボニトリル（３０）
無水メチレンクロリド（５００ｍＬ）、トリエチルアミン（１００ｍＬ）およびマロニトリル（３０ｇ、４５４ｍｍｏｌ）を含有する氷冷溶液に、２−フラニルクロリド（５０ｇ、３８３ｍｍｏｌ）を２０分以上かけて滴下した。攪拌をさらに１時間周辺温度で続けた。反応溶液を氷冷２Ｎ塩酸１.５Ｌで、ついで水１.５Ｌで洗った。有機層を蒸発せしめて、油状物を得た。
【０２３５】
油状産物の一部（４.６ｇ、２８.７５ｍｍｏｌ）を、ジオキサン４０ｍＬおよび水４０ｍＬからなる溶液に溶解した。ジメチル硫酸（１５ｍＬ）および炭酸水素ナトリウム（１５ｇ）を加え、反応溶液を２.５時間８０℃で攪拌した。混合物を水１００ｍＬに溶解し、産物を酢酸エチル２００ｍＬで抽出した。有機溶液を５％炭酸水素ナトリウム液１００ｍＬ、ついで水１００ｍＬで洗った。溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめて、減圧で固体化した油状物を得た。収量２.７２ｇ；ＴＬＣ（１：１、酢酸エチル／ヘキサン）、Ｒｆ＝０.４２；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ８.２５(１Ｈ，ｍ，芳香族)、７.６３(１Ｈ，ｍ，芳香族)、６.９２(１Ｈ，ｍ，芳香族)、４.２３(３Ｈ，ｓ，メトキシ）。
【０２３６】
２−アミノ−４−(２−フリル)フラン−３−カルボニトリル（３１）
ヒドラジン・一水和物（３.４ｇ、８０ｍｍｏｌ）を化合物３０（２.７２ｇ、１５.６３ｍｍｏｌ）の氷冷メタノール溶液７５ｍＬに１５分以上かけて滴下した。固体物をエーテル中で粉砕し、濾過し、乾燥した。収量２.２ｇ（８１％）；ＴＬＣ（酢酸エチル）、Ｒｆ＝０.８１；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ７.７７(１Ｈ，ｓ，フラニル）、６.８０(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.６１(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.４１(２Ｈ，ｂｒｓ，アミン)。
【０２３７】
３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−イルアミン（３２）
化合物３１（２５.７ｇ、１４８ｍｍｏｌ）をホルムアミド２５０ｍＬ中１９０℃で４時間攪拌した。溶液を室温に冷やし、水１.２Ｌで希釈し、氷浴で冷やした。形成した固体物を濾取し乾燥した。収量２２ｇ（７４％）；ＴＬＣ（５％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.２５。
【０２３８】
[５−(４−アミノ−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−３−(４−メチルフェニルカルボニルオキシ)−２−オキソエチル]オキソラン−２−イル]メチル４−メチルベンゾアート（３３）
化合物３２（１０ｇ、４９.７ｍｍｏｌ）を０.２９Ｍメタノール性ＫＯＨ液２００ｍＬ中で５分間攪拌した。混合物を蒸発乾固し、残渣を熱無水ＤＭＦ４０ｍＬに溶解した。溶液を室温に冷やし、無水アセトニトリル２３０ｍＬで希釈した。クロロ糖誘導体（２３ｇ、５９.１４ｍｍｏｌ）を直ちに加え、混合物を４５分間攪拌し、蒸発乾固した。残渣を酢酸エチル８００ｍＬに溶解し、水で洗った（２ｘ８００ｍＬ）。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。粗産物を、シリカゲル・クロマトグラフィー、勾配３０−０％ヘキサンの酢酸エチル液で溶出した。純産物フラクションを蒸発せしめ、残渣を熱メタノールから再結晶した。収量３.４ｇ（１２％）；ＴＬＣ（酢酸エチル）、Ｒｆ＝０.４７；１Ｈ ＮＭＲ((ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ８.２７(１Ｈ，ｓ，６-Ｈ)、７.９６(１Ｈ，ｍ，フラニル)、７.９５、７.８４、７.３６および７.２３(８Ｈ，4ｘｄ，トルオイル芳香族)、６.８３(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.８０(１Ｈ，t，Ｊ＝６.３Ｈｚ，１'-Ｈ)、６.７０(１Ｈ，ｍ，フラニル）、５.８６(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、４.６４-４.４２(３Ｈ，ｍ，４'-Ｈおよび５'-Ｈｓ)、３.２８および２.７６(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)、２.３９および２.３６(６Ｈ，２ｘｓ，トルオイルメチル)。
【０２３９】
５−{４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)}−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（３４）
化合物３３（３.３６ｇ、６.０８ｍｍｏｌ）の０.１２Ｍメタノール性ナトリウム・メトキシド懸濁液１７ｍＬを３０分間還流した。得られた溶液を室温に冷やし、酢酸０.１２ｍＬの添加で中性とした。溶液を蒸発乾固し、産物をメタノール−エーテルから沈澱せしめ、ついで沸騰水から再結晶した。脱保護ヌクレオシドの収量１.６３ｇ（８５％）。
【０２４０】
上記からのすべてのヌクレオシド産物を、無水ＤＭＦ３０ｍＬおよびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド・ジメチルアセタール１５ｍＬからなる溶液中で５時間攪拌した。溶液を蒸発乾固し、残渣を２回キシレンから蒸発せしめて、泡状物を得た。収量１.８９ｇ（９９％）；ＴＬＣ（２０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.４５；１Ｈ ＮＭＲ((ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ８.９８および８.４６(２Ｈ，２ｘｓ，ホルムアミドＣ−Ｈおよび６-Ｈ)、７.９７(１Ｈ，ｍ，フラニル)、７.８１(１Ｈ，ｍ, フラニル)、６.６５(２Ｈ，ｍ，１'-Ｈおよびフラニル)、５.３０(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.５Ｈｚ, ３'-ＯＨ)、４.７９(１Ｈ，t，Ｊ＝５.５Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.５１(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.８５(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.５７および３.４０(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、３.２６および３.２１(６Ｈ，２ｘｓ，Ｎ−Ｍｅプロトン)、２.８８および２.３０(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。
【０２４１】
３−[(５−{４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]−ホスフィノオキシ]プロパンニトリル（３５）
ジメトキシトリチルクロリド（２.０１ｇ）を、乾燥ピリジン３０ｍＬに溶解した化合物３４（１.８４ｇ、４.９５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応溶液を３時間室温で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液２００ｍＬに注いだ。産物を酢酸エチル３００ｍＬで抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配０−５％メタノールの酢酸エチル液による溶出で精製した。純産物フラクションを蒸発せしめて、泡状物を得た。５'−Ｏ−ＤＭＴ誘導体の収量２.２６ｇ（６８％）。
【０２４２】
Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１.７５ｍＬを含有する乾燥メチレンクロリド４０ｍＬに溶解したＤＭＴ誘導体（２.１８ｇ、３.２３ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミジット１.２５ｍＬを加えた。溶液をアルゴン下１５分間室温で攪拌し、ついでメタノール５ｍＬで処理した。得られた溶液を酢酸エチル５００ｍＬで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム液４００ｍＬで洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配０−１０％メタノールの酢酸エチル液（２％トリエチルアミン）による溶出で精製した。純産物フラクションを蒸発せしめて、泡状物を得た。収量１.６２ｇ（５７％）；31ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４７.８１および１４７.１６。
【０２４３】
実施例７
本実施例は、３−[(５−{６−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル（３９）の調製を示す（参照、反応式８）。
【０２４４】
３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４,６−ジアミン（３６）
細粉砕化合物３１（１０.０ｇ、５４.４７ｍｍｏｌ）および炭酸グアニジン（１６.６ｇ、９１.９５ｍｍｏｌ）の混合物を２３０℃で４５分間加熱した。混合物を室温に冷やし、固体物を沸騰水１００ｍＬで粉砕した。固体物（純化合物３６）を濾取し、水で洗い、乾燥した。収量１１.１ｇ（８９％）；ＴＬＣ（４０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.６６；１Ｈ ＮＭＲ((ＤＭＳＯ−ｄ６) δ １２.６８ (１Ｈ，ｂｒｓ，Ｎ−Ｈ)、７.８６(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.９３(２Ｈ，ｂｒｓ，−ＮＨ２）、６.８５(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３.５Ｈｚ，フラニル)、６.６５(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.１０(２Ｈ，ｂｒｓ，- ＮＨ２)。
【０２４５】
５−(４,６−ジアミノ−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル)−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（３７）
化合物３６（１０.５ｇ、４８.６１ｍｍｏｌ）を０.２９Ｍメタノール性ＫＯＨ溶液２００ｍＬ中で５分間攪拌した。混合物を蒸発乾固し、残渣を熱無水ＤＭＦ１０５ｍＬに溶解した。溶液を室温に冷やし、無水アセトニトリル６２０ｍＬで希釈した。クロロ糖誘導体（２３ｇ、５９.１４ｍｍｏｌ）を直ちに加え、混合物を４０分間攪拌し、ついで濾過した。濾液を蒸発乾固し、残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、酢酸エチルで溶出した。ヌクレオシドフラクションを蒸発せしめて、トルオイル保護ヌクレオシド２.８ｇをα−とβ−アノマーの混合物として得た。この混合物を０.１９Ｍメタノール性ナトリウム・メトキシド４０ｍＬ中で４５分間還流した。反応溶液を冷凍機に一夜入れて、純β−アノマー化合物３７に相当する結晶を得た。収量６９０ｍｇ；ＴＬＣ（２０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３２；１Ｈ ＮＭＲ (ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ７.９０-(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.９９(２Ｈ，ｂｒｓ，アミノ)、６.８６(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.１Ｈｚ，フラニル)、６.６８(１Ｈ，ｍ，フラニル)、６.４１(１Ｈ，t，Ｊ＝６.６Ｈｚ，１'-Ｈ)、６.２６(２Ｈ，ｂｒｓ，アミノ)、５.２１(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.４Ｈｚ, ３'-ＯＨ)、４.８２(１Ｈ，t，Ｊ＝５.８Ｈｚ，５'−ＯＨ)、４.４２(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.７９(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.５２および３.４１(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、２.７５および２.１８(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。
【０２４６】
５−{６−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−(ヒドロキシメチル)オキソラン−３−オール（３８）
化合物３７（０.６８ｇ、２.０５ｍｍｏｌ）の、無水ＤＭＦ３０ｍＬとＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド・ジメチルアセタール１５ｍＬとの溶液を室温で２４時間攪拌した。溶液を蒸発乾固し、残渣を２回キシレンから蒸発せしめて、泡状物を得た。収量０.９０ｇ；ＴＬＣ（５０％メタノールの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３８；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)δ ８.９３および８.７７(２Ｈ，２ｘｓ，ホルムアミジンＣ−Ｈｓ)、７.９４(１Ｈ，ｍ，フラニル)、７.７６(１Ｈ，ｍ，フラニル)，６.６２(１Ｈ，ｍ，フラニル)，６.６０(１Ｈ，t，Ｊ＝６.６Ｈｚ，１'−Ｈ)、５.２５(１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４.４Ｈｚ，３'-ＯＨ)、４.８４(１Ｈ，t，Ｊ＝５.９Ｈｚ，５'-ＯＨ)、４.４７(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、３.８３(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.５６および３.４１(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、３.２５、３.１８、３.１６および３.０３(１２Ｈ，４ｘｓ，Ｎ−メチル)、２.８２および２.２２(２Ｈ，２ｘｍ，２'-Ｈｓ)。]。
【０２４７】
３−[(５−{６−[(１Ｅ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−４−[(１Ｚ)−１−アザ−２−(ジメチルアミノ)ビニル]−３−(２−フリル)ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジニル}−２−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}オキソラン−３−イルオキシ)[ビス(メチルエチル)アミノ]ホスフィノオキシ]プロパンニトリル（３９）
ジメトキシトリチルクロリド（０.８５ｇ）を化合物３８（０.９０ｇ、２.０４ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン溶液１２ｍＬに加えた。反応溶液を２時間室温で攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム液２００ｍＬに注いだ。産物を酢酸エチル（３ｘ３００ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配２０−３０％メタノールの酢酸エチル液による溶出で精製した。純産物フラクションを蒸発せしめて、泡状物を得た。５'−Ｏ−ＤＭＴ誘導体の収量２８６ｍｇ。
【０２４８】
Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.２３ｍＬを含有する無水のメチレンクロリド溶液５ｍＬに溶解したＤＭＴ誘導体（２８６ｍｇ、０.３８４ｍｍｏｌ）溶液に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミジット０.１７ｍＬを加えた。溶液をアルゴン下で１５分間室温で攪拌し、メタノール０.５ｍＬで処理した。得られた溶液を酢酸エチル１００ｍＬで希釈し、５％炭酸水素ナトリウム液７５ｍＬで洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配０−３０％メタノールの酢酸エチル液（２％トリエチルアミン）での溶出により精製した。純産物フラクションを蒸発せしめて泡状物を得た。収量２３０ｍｇ（１２％)；３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４７.７７および１４７.０８。
【０２４９】
実施例８
本実施例は、４−[１−(５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)―２,４−ジオキソ−１,３−ジヒドロピリミジン−５−イル]ブト−３−イニル４−メチルベンゾアート（４２）の調製を示す（参照、反応式１０）。
【０２５０】
３−ブチノ−１−イル ｐ−トルアート（４０）
磁気攪拌棒を備えた５００ｍＬ丸底フラスコ中、不活性気体下で、３−ブチノ−１−オール（５０.３ｇ、０.７１８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２００ｍＬ）に溶解し、溶液を氷水浴で冷やした。冷溶液に追加のじょうごでｐ−トルイルクロリド（１３６.６ｇ、０.８６ｍｏｌ、１.２当量）を滴下し、反応混合物を室温で一夜攪拌した。
【０２５１】
混合物にジエチルエーテル（３５０ｍＬ）および水（１００ｍＬ）を加えた。有機層を分離し、水溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）で洗った。有機層を合わせ、１０％ＨＣｌ（３ｘ１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３液（２ｘ１００ｍＬ）および水（１ｘ５０ｍＬ）で洗った。得られた溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を除去して、化合物４０を淡白色固体として１４２ｇ（定量的収量）を得た。産物はヘキサンまたはメタノールから再結晶できるが、次の工程に進めるのに十分純粋である。１Ｈ ＮＭＲ(ＣＤＣｌ3，３００ ＭＨｚ)δ(ppm) ７.９５(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８.１Ｈｚ)、７.２４(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８.１Ｈｚ)、４.４１(t，２Ｈ，Ｊ＝６.８Ｈｚ)、２.６7（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ１＝２.６Ｈｚ，Ｊ２＝６.８ Ｈｚ)、２.４０(ｓ，３Ｈ)、２.０３(t，１Ｈ，Ｊ＝２.４Ｈｚ)。
【０２５２】
５'−ＤＭＴ−５−[４−(ｐ−トルイルオキシ)ブチニル]−２'−デオキシウリジン（４１）
５−ヨード−２'−デオキシウリジン（４.０ｇ、１１.３０ｍｍｏｌ）、４−(ｐ−トルイルオキシ)ブチン（化合物４０）（５.７ｇ、３０.３ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（２２２ｍｇ、１.１６ｍｍｏｌ）、テトラキス[トリフェニルホスフィン]パラジウム[０] （０.６７ｇ、０.５８３ｍｍｏｌ）および無水トリエチルアミン（２.０ｍＬ）の混合物を無水ＤＭＦ３０ｍＬ中でアルゴン下１６時間攪拌した。混合物を蒸発乾固し、残渣の油状物をエーテル１００ｍＬ中での攪拌で固体化した。この固体物を濾取し、減圧で乾燥した。
【０２５３】
一部の粗産物（１.５ｇ）を無水ピリジン２０ｍＬに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（１.３ｇ）で処理した。溶液を２時間アルゴン下で攪拌し、ついで５％炭酸水素ナトリウム液１５０ｍＬに注いだ。産物を酢酸エチル２００ｍＬで抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発せしめた。残渣をシリカゲル・クロマトグラフィー、勾配３０−０％ヘキサンの酢酸エチルでの溶出で精製した。産物フラクションを蒸発せしめて、泡状物を得た。収量９５７ｍｇ；ＴＬＣ（３０％ヘキサンの酢酸エチル液）、Ｒｆ＝０.３７；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６) δ １１.６６(１Ｈ，ｓ，Ｎ−Ｈ)、７.９-６.８（１８Ｈ，芳香族プロトン)、６.１１(１Ｈ，t，Ｊ＝６.６Ｈｚ，１'-Ｈ)、５.３５(１Ｈ，ｂｒｓ，３'-ＯＨ)、４.２９(１Ｈ，ｍ，３'-Ｈ)、４.１５(２Ｈ，t，J=６.８Ｈｚ，ブチンメチレン)、３.９２(１Ｈ，ｍ，４'-Ｈ)、３.７１(６Ｈ，ｓ，メトキシ群)、３.２４および３.０７(２Ｈ，２ｘｍ，５'-Ｈｓ)、２.６４(２Ｈ，t，Ｊ＝６.８Ｈｚ, ブチンメチレン)、２.３７(３Ｈ，ｓ，トルイルメチル）、２.２３(２Ｈ，ｍ，２'-Ｈｓ)。
【０２５４】
４−[１−(５−{[ビス(４−メトキシフェニル)フェニルメトキシ]メチル}−４−{[ビス(メチルエチル)アミノ](２−シアノエトキシ)ホスフィノオキシ}オキソラン−２−イル)―２,４−ジオキソ−１,３−ジヒドロピリミジン−５−イル]ブト−３−イニル４−メチルベンゾアート（４２）
Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０.７５ｍＬを含有する無水のメチレンクロリド１５ｍＬに溶解した上記からのＤＭＴ誘導体（０.９２ｇ、１.２８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミジット（０.５６ｍＬ）を加えた。溶液をアルゴン下で３０分間室温で攪拌し、メタノール１.０ｍＬで処理した。溶液を約５ｍＬ量まで蒸発で減じ、直接シリカゲル・クロマトグラフィー、４０％ヘキサンの酢酸エチル液（２％トリエチルアミン）に掛けた。純産物フラクションを集め、蒸発せしめて泡状物を得た。化合物４２の収量０.９１ｇ（７８％)；３１ＰＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１４７.７２および１４７.３９。
【０２５５】
実施例９
本実施例は、関連標的配列間で識別するために修飾オリゴヌクレオチドの能力の高まりを示す。
【０２５６】
本実施例において、ＰＰＰＡ、ＰＰＧおよびマイナー・グルーブ・バインダーを含有する修飾オリゴヌクレオチドを調製した。図３に示すように、ＰＰＰＡおよびＰＰＧと併せてＭＧＢの使用はＴｍを増加し、ＰＣＲ伸張温度に適合の短いプローブの設計を可能にする。この修飾オリゴヌクレオチドはまた、ミスマッチの識別を増加した。十八量体フルオレセインＯＤＮレッド１３クエンチャーＭＧＢリアルタイムＰＣＢプローブの第１設計において、Ａ／Ｔミスマッチの識別は、図３Ａに示すように、ほとんど見られなかった。対抗鎖に対するプローブの再設計は、ミスマッチをＭＧＢ下に置き、表示のように、Ａの代わりにＰＰＰＡおよびＧの代わりにＰＰＧを置換して、プローブを十五量体に短縮できる。このプローブは、図３Ｂに示すように、優れたミスマッチの識別をもたらす。
【０２５７】
ミスマッチ識別の熱力学的検討を、１セットの標的完全マッチにハイブリドしているか、単一ミスマッチを含有する１セットのオリゴヌクレオチドについて行った。標的配列は、ａ）正常Ａ、ｂ）ＰＰＰＡ、ｃ）正常Ａおよび３'−ＭＧＢ、ｄ）ＰＰＰＡおよび３'−ＭＧＢをそれぞれ含有する。プローブおよび標的についての配列を表３ａおよび３ｂに下記する。Ｔｍの測定および計算
【０２５８】
【表３】
2005532618.tif 000044
【０２５９】
【表４】
2005532618.tif 000045
【０２６０】
△△Ｇ０５０を実施例９に記載する。表３ｃによると明らかに、ＡをＰＰＰＡで置換すると、ミスマッチの識別が増加し、ＰＰＰＡをＭＧＢと組み合わすと、さらに識別が大きくなる。
【０２６１】
ＭＧＢ−ＯＤＮ中で形成されるミスマッチの塩基対の熱力学的識別（３７℃）について、ＨＯ−ＰＰＰＡ／ＨＯ−ＰＵ含有とＰＰＰＡ／ＰＵ含有との比較を表４に示す。ＭＧＢと結合して修飾塩基を含有するＯＤＮはその相補体とハイブリドした。表４に示す配列において、ミスマッチに下線をつける。この表に示すように、ＨＯ−ＰＰＰＡおよびＨＯ−ＰＵ置換はＰＰＰＡおよびＰＵに比して、ミスマッチの識別が多くの場合増加する。
【０２６２】
【表５】
2005532618.tif 000046
【０２６３】
実施例１０
本実施例は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて実施されたＵＶ溶解試験を示す。
非修飾ＯＤＮまたはＭＧＢ−プローブとその相補体との間で形成されたハイブリドを、０.５℃／分の割合で、ＰＴＰ−６自動多細胞温度プログラマーをもつ Lambda 2S (Perkin-Elmer) 分光計で溶解した。Ｔｍデータの調製に０.５ｘＳＳＰＥ緩衝液 (Sigma, pH 7.4) を用いた。各ＯＤＮ（１μＭの各鎖）をその相補体と混合すると１：１比になった。溶解の前に、サンプルを１００℃で変性し、１０分間以上１０℃に冷やす。二重らせんの各型のミスマッチ識別を、５０℃での△△Ｇから下記式を用いて計算した：
△△Ｇ０５０＝Ｒ０ｌｎ（Ｋマッチ／Ｋミスマッチ）
【０２６４】
Ｋマッチ／Ｋミスマッチは、５０℃で溶解曲線から計算される二重らせんと一本鎖の相対フラクションを用いて、決定できる（参照，Lohkov, S.G. & Pyshnyi, FEBS Letters 420: 134-138 (1997))。
【０２６５】
実施例１１
本実施例は、継続中の出願番号０９／３６４,３２０に記載のように調製され、八−十量体ＭＧＢプローブについて最適化されたオリゴヌクレオチド・グラスマイクロアッセイとＤＮＡとのハイブリダイゼーションを示す。
【０２６６】
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲアンプリコン）を１−５ｘ１０−７Ｍで５ＸＳＳＰＥ、０.１％トリチオンＸ−１００、１０％ホルムアミド中、Frame-Seal Chambers (MJ Research) 中のマイクロアッセイと、下記の条件でハイブリドした：５５℃で５分間、０.１℃／秒で徐々に３５℃まで、５５℃で６０分間冷やした。ついで、スライドを０.５ＸＳＳＰＥ中５分間４５℃で洗った。スライドを空気流で乾燥させ、Array Works Fluoresent スキャナー (Applied Precision) で走査した。洗浄工程は必要に応じさらに厳密な条件で繰り返すことができる。
【０２６７】
実施例１２
本実施例は、単一塩基プライマー伸張アッセイを示す。
一本鎖テンプレートＤＮＡおよび六量体プライマー（各２０μＭ）、１Ｘ Thermopol 緩衝液（New England Biolabs）、１０％塩化マグネシウムを合わせ、５分間５０℃でインキュベートした。ついで５μＣｉα３２ＰｄｄＡＴＰおよび８単位Ｂｓｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を加え、全量を１０μｌとし、１５分間５０℃でインキュベートした。インキュベーション後、６μｌ停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＭ）を加え、反応液を室温に冷やした。サンプルを１：１０に変性染料（３５％ホルムアミド、０.０５％キシレンシアノール、０.０５％ブロモフェノールブルー、１ｍＭのＥＤＴＡ）で希釈し、アリコートを変性１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で分析した。
【０２６８】
ＳＮＰ型別についてのプライマー伸張アッセイにおける修飾塩基の使用を表５に示す。Ｂｓｔポリメラーゼでのプライマー伸張（ＮＥＢ）を異なる修飾塩基で置換されたプライマーで検討し、産物の量を、ゲル電気泳動を用いて取り込まれた放射活性を基に計算した。
【０２６９】
【表６】
2005532618.tif 000047
【０２７０】
実施例１３
本実施例は、本明細書に記載のアルゴリスムによりマイナー・グルーブ・バインダー（ＣＤＰＩ３）を有しおよび有さない両方でＰＰＧを含有する修飾オリゴヌクレオチドのＴｍを推定することを示す。
【０２７１】
表２ａ／２ｂ中の熱力学的パラメータおよびＭＧＢ寄与についての補正式を用いて、ＭＧＢを有しおよび有さないＰＰＧオリゴヌクレオチドのＴｍを本明細書に記載のアルゴリスムにより計算できる。Ｇ含有でない最近傍対の熱力学的パラメータは、オリゴヌクレオチドがＰＰＧで置換されたとき、変化しない。同様に、最近傍対の熱力学的パラメータは、ＭＧＢ含有のオリゴヌクレオチドがＰＰＧで置換されたとき、変化しない。表６は、ＰＰＧを単独で、またはマイナー・グルーブ・バインダー（ＣＤＰＩ３）と併せて含有するオリゴヌクレオチドのＴｍを推定するアルゴリスムの能力を示す。表６において、すべてのＧがＰＰＧで置換されている。
【０２７２】
【表７】
2005532618.tif 000048
【０２７３】
推定アルゴリスムの正確度は、ＰＰＧ含有オリゴヌクレオチドおよびＰＰＧ含有ＭＧＢ−オリゴヌクレオチドについてそれぞれ約＋／−１および＋／−２℃である。従って、所望の配列をジーンバンクなどの源から得ることができ、Ｔｍを１セットのプローブまたはプライマーについての必要要件として設定できる。本明細書に記載のアルゴリスムおよび最近傍対のパラメータからの情報を用いて、所望のＴｍを有するプローブまたはプライマーの収集を計算できる。
【０２７４】
あるいは、アルゴリスムを用いて、修飾された塩基の選択から最近傍のパラメータを選択し、同じ長さの１以上の配列の安定性を計算すると、選択された修飾塩基について同じ予測の熱力学的安定性を得ることができる。
【０２７５】
さらに、アルゴリスムを用いて、類似の塩基対の長さおよび実質的に同じ安定性（Ｔｍ）のオリゴヌクレオチドの設計を可能にする１以上の修飾塩基を選択できる。この修飾された塩基は、修飾プリンおよび／または修飾ピリミジンの収集から予測の熱力学的最近傍のパラメータを含有するデータベースから選択できる。好ましくは、このデータベースは３−置換ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンおよび／または５−置換ピリミジンについての最近傍のパラメータを含有する。
【０２７６】
実施例１４
本実施例は、修飾されたオリゴヌクレオチドの Invader（商標）アッセイにおける使用を示す。
【０２７７】
図４に示す解裂アッセイは、具体的なＤＮＡおよびＲＮＡを検出して、２重複オリゴヌクレオチドの標的とのハイブリダイゼーションにより形成された複合体を解裂するために、具体的なＤＮＡおよびＲＮＡを検出する。酵素が張り出し「フラップ」を解裂する。このフラップは、解裂が蛍光シグナルを放出する検出カセットプローブにおけるインベ−ダー・プローブとして働く。第１の解裂は、インベーダー中の単一塩基のミスマッチが完全な対であるときにのみ起きる。反応はミスマッチ標的Ｂでは生じない。解裂されたフラップは、検出カセットにおけるインベーターとして働き、第２の解裂工程における蛍光の放出をもたらす。
【０２７８】
表７ａおよび７ｂ
ゲノムおよびインベーター・プローブにおいて置換された異なる修飾塩基をもつ解裂−塩基増幅システムの比較
【０２７９】
【表８】
2005532618.tif 000049
【０２８０】
【表９】
2005532618.tif 000050
【０２８１】
表７ａは、インベーターおよびゲノムプローブで置換されたときの、異なる修飾塩基の効果についての比較を示す。伝統的なインベーターＴ（２）を３−ヨードジアミノＰＰＰＡで置換すると、五十九量体としての類似のＴｍ（２）をもち３２長を有するインベーターＭ１を得た。同様に、伝統的ゲノムプローブ（４）を、それぞれ３−ヒドロキシプロピニルＰＰＰＡおよび３−ヨードジアミノＰＰＰＡで置換すると、（５）および（６）と得た。これらの両プローブは伝統的（４）よりも実質的に短い。ゲノムプローブ４−６と合わせてインベーターＭ１（３）を用いると、伝統的ゲノムプローブ（４）に比して改善された、修飾塩基を含有する両ゲノムプローブ（５および６）となる（表７ｂ）。両者について、終了点でのマッチ／ミスマッチのシグナル比および終了点での蛍光が、非修飾ゲノムプローブに比して増加する。
【０２８２】
ソフトウェアおよびコンピュータ・システムの概観
図６はサーバー５０およびクライアント・システム２０を含む、ウェブ基盤オリゴヌクレオチド・プローブの設計・システムについて一般的概観を図示する。システム１０で、クライアント・システム２０はインターネット４０、またはＬＡＮまたはＷＡＮ接続のような他の通信網によってサーバー・システム５０に結ばれている。以下に述べるように、特にクライアント・システム２０およびサーバー・システム５０にて、プローブ・設計・システムは使用者の入力設計基準に応じて本発明に従って設定され、配列検出プローブを定義し創りだす。ただひとつのクライアント・システム２０をここで示し説明するが、如何にたくさんのクライアント・システムがサーバー・システム５０と通信可能なようにつながっていてもよいと理解すべきである。本発明のプローブ・設計システムは、最適または最適に近いＴｍをもつヌクレオチド配列、および特に、ここで述べるような１個以上の修飾塩基および最適または最適に近いＴｍをもつヌクレオチド・プローブを使用者が有利に設計できるようにする。一般的に、ここで用いる「プローブ」は配列検出プローブ、ＰＣＲプライマー（レフトまたはライト）またはアンプリコン（レフト・プライマーの５'末端からライト・プライマーの５'末端の配列）を意味する。
【０２８３】
図６に示すシステムのいくつかの要素は、ここで詳しく説明する必要のない、一般的なよく知られた要素を含む。例えば、各クライアント・システム２０はデスクトップ・パーソナル・コンピュータ、ワークステーション、ラップトップまたはインターネットによるのように、サーバー５０と直接的または間接的に交信可能な他のコンピュータ・デバイスを含んでいる。クライアント・システム２０は典型的に、マイクロソフト社のインターネット・エクスプローラー、ネットスケープ・ナビゲーター、オペラ等のような閲覧プログラムを作動し、クライアント・システムの使用者がインターネット４０を通してサーバー・システム５０または他のサーバー・システムから入手できる情報およびページにアクセスし操作し閲覧できるようにする。クライアント・システム２０は典型的には、サーバー・システム５０または他のサーバーによって供されるページ、フォームおよび他の情報と共に、ディスプレイ２３（例えばモニター・スクリーン、ＬＣＤディスプレイ）上にブラウザによって提供されるグラフィカル・ユーザー・インターフェース（ＧＵＩ）と橋渡しするキーボード、マウス、タッチスクリーン、ペン等のような、１個以上のユーザー・インターフェース・デバイスを含む。本発明は通信網の特別のグローバル・インターネットワークを意味するインターネットで使用するのに適している。しかし、イントラネット、エクストラネット、仮想私設通信網（ＶＰＮ）、ＴＣＰ／ＩＰ基盤でない通信網、ＬＡＮまたはＷＡＮ等のような、他の通信網もインターネットに代わり使うことができると理解すべきである。
【０２８４】
ひとつの実施態様に従って、サーバー・システムおよびその構成要素のすべては、インテル社のペンティアム・プロセッサー等のような中央演算処理装置５３を用いるコンピュータ・コード・ランを含むアプリケーション・ソフトを使って、オペレーターが設定可能である。データ内容を処理しここで述べるようなクライアント・システム２０と交信するために、サーバー・システム５０の操作・設定のための取扱説明を含むコンピュータ・コードは、好ましくはハード・ディスクに保存する。しかし全プログラム・コードまたはその一部は、ＲＯＭまたはＲＡＭのような、他のよく知られた揮発性または非揮発性記憶媒体もしくは装置に保存してよく、またはコンパクト・ディスク（ＣＤ）、デジタル・ビデオ・ディスク（ＤＶＤ）およびフロッピー・ディスク等のようなプログラム・コードを記録できる媒体に保存してもよい。加えて、全プログラム・コードまたはその一部は、よく知られているインターネットを経て、サーバー・システム５０からクライアント・システム２０へ、または他のサーバー・システムもしくはコンピュータ・デバイスからサーバー・システム５０へのように、ソフトウェア源から送信またはダウンロードしてもよく、またはよく知られた通信媒体およびプロトコル（例えばＴＣＰ／ＩＰ、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ，イーサーネット等）を用い、他の通常の通信網接続（例えばエクストラネット、ＶＰＮ、ＬＡＮ等）によって通信してよい。本発明の実施態様を実行するコンピュータ・コードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Java、Visual Basicおよびその他のような多様なコード言語、またはVBScript、JavaScript、Perl またはマークアップ言語（例えばＸＭＬ）のようなスクリプト言語で行われ、またこのことはサーバー・システム５０上および／またはクライアント・システム上で遂行されると理解すべきである。加えて、さまざまな言語が本発明の実施態様に従ってデータの外部的および内部的保存に用いられる。
【０２８５】
ひとつの実施態様に従って、サーバー・システム５０で実行するアプリケーション（モジュール５５で表わす）は、使用者の入力基準に基づいてプローブを設計するための取り扱い説明を含んでいる。アプリケーション５５は、好ましくはハード・ディスク駆動装置５２（または外付けまたは内臓のＲＡＭもしくはＲＯＭのような他のメモリー）にダウンロードして保存するが、もっともアプリケーション・モジュール５５は上述の通り、フロッピー・ディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等のソフトウェア保存媒体に保存してもよい。ひとつの実施態様において、アプリケーション・モジュール５５は、データポートを経てクライアント・システム２０にテキストおよびデータ・フレームを通信する（例えばクライアント・システム２０の閲覧ウィンドウを有効表示する）ユーザー・インターフェース・通信モジュール５７のような、データ内容を処理する種々のソフトウェア・モジュール、およびクライアント・システムからデータを受信する種々のソフトウェア・モジュールを含む。さらにユーザー・インターフェース・モジュール５７は閲覧アプリケーションをクライアント・システム２０に提供しうる。アプリケーション・モジュール５５は、先述のような最近傍熱力学的パラメータを用いて、オリゴヌクレオチド配列のＴｍを測定するための指図を含んだＴｍ計算モジュール５９を含む。最近傍熱力学的パラメータの値は、例えば、表２にあげたものを含み、Ｔｍ計算モジュール５９による検索のため、好ましくはメモリー５２または他のメモリーもしくは記憶装置に保存する。アプリケーション・モジュール５５および適当なデータをクライアント・システム２０にダウンロードしそこで実行できることは評価されて当然である。
【０２８６】
「サーバー・システム」なる用語は典型的には、論理的および／または物理的に接続していて、局在的またはひとつ以上の離れた地理的位置にわたって分布しているサーバーを含む。加えて「サーバー」なる用語は典型的に、コンピュータ・システム、および技術的によく知られている関連した記憶装置およびデータベース・アプリケーションを含む。
【０２８７】
好ましい実施態様において、プローブ設計アプリケーション５５はレフトおよびライト・プライマー、および１個以上の配列検出プローブを含むプローブ・システムを設計するように設定する。このようなプローブ・システムは遺伝子発現、ＤＮＡ検出、ＳＮＰ検出等に有用である。この実施態様において、アプリケーションは初めに候補プローブを測定し、Ｔｍ値、ＧＣ％値および最長のモノヌクレオチド値のような最小値と最大値に対するプローブの特性を評価する。ひとつの実施態様において、使用者は選択的に最小および最大制限値を入力し、または初期値を加減し、適格システムの件数を狭めたり広げたりする。好ましくは、すべての属性が最小値と最大値の間にあるプローブのみを、さらに検討するに相応しいとして得点し表示する。
【０２８８】
さらなる検討材料としてプローブをひとたび選択すれば、プローブの位置に基づいてレフトおよびライト・プライマー・ウィンドウを構成する。各ウィンドウについて、候補プライマーの生成、プライマー特異的属性値の計算、および属性値の評価といったプロセスが、プローブに関して上述の後に続く。次に、アプリケーションはレフトおよびライト・プライマーのリストからすべての可能なアンプリコンを生成する。Ｌレフト・プライマーおよびＲライト・プライマーには、Ｌ＊Ｒ候補アンプリコンがある。各候補アンプリコンに関し、長さのような属性の最小値および最大値、およびレフト・プライマーがライト・プライマーに焼き戻る性向について評価する。加えて、レフト・プライマーの位置がプローブの上流、例えば少なくともプローブの１０ｂｐ上流で終っていることを確かめる。ライト・プライマーの位置がプローブに重なっていないことを確かめる。全パラメータについて最小および最大制限に合格する適格アンプリコンのみを、さらに考慮し得点する。候補システムは適格のアンプリコンおよびプローブから構築する。すべての可能な残りのペア的比較によって、プライマーおよびプローブが互いに焼き戻りする傾向を計算し評価する。全パラメータについて最小および最大制限に合格する適格システムのみを得点し使用者に戻す。
【０２８９】
ひとつの実施態様において、各々適格のプローブ、プライマー、アンプリコンおよびシステムに得点関数を割り当てる。得点は適格のプローブ、プライマー、アンプリコンおよびシステムの、理想的プローブ、プライマー、アンプリコンおよびシステムからの距離を評価する。理想的プローブ、プライマー、アンプリコンおよびシステムというのは、全属性について理想的な値を有するものである。例えば、理想的なプライマーはＴｍ６８.０℃のＴｍおよび５０％ＧＣ含量をもつ。ひとつの実施態様において、得点関数は次の計算式をもつ：
Σ(abs(理想値−実際値)*重み)
【０２９０】
この計算式は、プライマー、プローブ、アンプリコンまたはシステムについて、計算した実際値と重み係数を乗じた理想値との差の絶対値の、属性の総和として表現する。絶対値は全パラメータにわたるポジティブとネガティブの両方の隔たりを累算するようにとってある。使用者が調節できる重み係数は、他よりもあるパラメータに重要性を置くためだけでなく、異なるパラメータのスケールを調整するために用いる。
【０２９１】
図７は、本発明のひとつの実施態様に従って、プロセスの流れを例示する。使用者はプロセスを始めるのに先ず、例えばサーバー５０にログインするとか、または局所的にアプリケーション５５を実行することにより、アプリケーション・モジュール５５を呼び出す。使用者が始めにプローブ設計アプリケーション５５にアクセスすると、ステップ１００でメイン・ウィンドウが表示される。使用者／オペレータは標的配列、または標的配列を含むオリゴヌクレオチドを入力する。使用者はステップ１０５で配列を手動入力する。例えば、１個以上のヌクレオチド配列を入力する記入欄のある書式が使用者に示される。それとは別にまたは付加的に、特定のヌクレオチド配列を特定するジーンバンクＧＩ番号を入力する。ジーンバンクＧＩ番号が受け入れられると、ステップ１１０でインターネットまたは他の通信網によってジーンバンク・サーバー６０（図６）から、特定されたヌクレオチド配列をシステムが検索する。システムはジーンバンク・サーバーにログインし、ジーンバンクＧＩ番号を入力すると、ジーンバンク・サーバーは特定されたヌクレオチド配列を供する。
【０２９２】
配列を得たあと、アプリケーションは受け取った配列に基づきひとつ以上の可能なヌクレオチド配列を識別する。例えば、ひとつの実施態様において、アプリケーションは受け取った配列に基づきひとつ以上の候補配列のリストをつくる。候補配列は受け取った配列のすべて、受け取った配列の一部、またはプローブおよびプライマーのような受け取った配列の一部に相補的な配列を包含するか、またはそれから誘導されてよい。例えば、使用者がステップ１１５で一般的なプローブ設計モードを選択すれば、アプリケーションは、上述のような受け取った配列に基づく候補プローブ、プライマーおよびアンプリコンを含む適切なプローブ・システムを判定する。ステップ１２０で、受け取った配列は有効な配列が入力されたかどうかを調べて判定する。もし間違いがあれば、間違いメッセージはステップ１２５で戻され、プロセスはメイン・ページに戻る。配列が有効であれば、最初のプローブ（例えば、プロセスの段階に応じてプローブ、プライマーまたはアンプリコン）はステップ１３０で判定される。
【０２９３】
ステップ１３５で、Ｔｍ計算モジュール５９によりプローブのＴｍを計算する。Ｔｍ計算モジュール５９は、好ましくは本発明が開示する技術に従ってヌクレオチド配列のＴｍを測定する。特にＴｍ計算モジュール５９は上述のように最近傍熱力学的パラメータを用いて各候補ヌクレオチドのＴｍを予測する。好ましい実施態様にて、候補配列の少なくともいくつかは、少なくともひとつ以上の修飾塩基、および任意であるがここの述べるようなＭＧＢを含む。Ｔｍ計算モジュール５９はメモリー５２から最近傍熱力学的パラメータを読み出し、所定の配列のＴｍを元に戻す。ステップ１４０にて計算してＴｍ値が適切な範囲内であるかどうかを判定する。適切な範囲になければ、プロセスはそのプローブを放棄して次のプローブに進む。適切な範囲にあれば、プロセスは試験プローブ配列およびＴｍの記録をステップ１５５でメモリーに（例えば表にして）保存するよう進む。任意のステップ１４５および１５０では、試験プローブの他の特徴、例えば自己相補体の数およびヘアーピンの数を測定する準備ができている。各試験プローブ（例えばプローブ、プライマー、アンプリコン）についてステップ１３５から１５５のプロセスを繰り返す。ステップ１６０にてすべての試験プローブを分析し終ってから、プローブのＴｍ値および他の妥当な特徴的データも好ましくは完全に含む表にして示される。
【０２９４】
特定のプローブまたはプライマーのＴｍは、プライマーまたはプローブの半分が一本鎖状態、および残り半分が二本鎖状態で予測された温度である。プローブおよびプライマーのＴｍは上述のように最近傍モデルを使って計算する。ひとつの実施態様において計算は次のように一般化できる：
Ｔｍ＝ｄＨ/(ｄＳ＋１.９８７＊Ｌｏｇ(Ｃ/２))−２７３.１５
但し、エントロピー（ｄＨ）およびエンタルピー（ｄＳ）はオリゴヌクレオチドを通して累算され、Ｃはオリゴの濃度である。この数式はＣプローブ＝Ｃ標的（相補体）、ｄＨ→ｄＨ０およびｄＳ→ｄＳ０を提示する。ＭＧＢを用いた場合、ＭＧＢ調整（ＭＧＢ_dds）を次のように含める：
Ｔｍ＝ｄＨ/(ｄＳ＋ＭＧＢ_dds＋１.９８７＊Ｌｏｇ(Ｃ/２))−２７３.１５。
【０２９５】
単一部位多型モードも図７に示すように選択してよい。いったん対応するヌクレオチド配列を特定または取得すると、プロセスは基本的に上述のように、一般的なプローブ設計モード（例えばステップ１２０−１６０）のプロセスを繰り返す。いくつかの実施態様において、突然変異Ｔｍプローブの分析はステップ１８５で行う。例えば、プローブを・・・・・・ＡＴＴ ＧＣＧ [Ｔ／Ｇ]ＣＴ ＡＣＴ・・・・・・のようなミスマッチに設計できる（括弧にミスマッチを示す）。アルゴリズムは「野生型」に対する相補的プローブを設計する；この場合は・・・・・・ＡＴＴ ＧＣＧ [Ｔ]ＣＴ ＡＣＴ・・・・・・である。突然変異配列に対する相補的プローブも設計する；・・・・・・ＡＴＴ ＧＣＧ [Ｇ]ＣＴ ＡＣＴ・・・・・・。いくつかの場合には、突然変異配列はプローブ領域にひとつより多いミスマッチを含む。
【０２９６】
すべての最近傍パラメータは、好ましくはメモリーのような試験パラメータ・データベースに蓄えられる。プログラムが、例えば修飾 AT または G 使用に移動すると、データベースから適切な最近傍パラメータを検索する。
【０２９７】
ひとつの実施態様においては、使用者が入力したような、ヌクレオチド配列またはその一部のＴｍは本発明が開示する技術または他の既知の技術を使ってステップ１８０で計算する。
【０２９８】
本明細書に引用した出版物および特許出願はすべて出典を明示してある。理解を明確にするため図および例示により外国の発明を少し詳しく述べてあるが、ある種の変更および修正が特許請求の趣旨または適用範囲から逸脱しない範囲でなされてもよいことは、本発明の教えるところに照らして、すでに当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、いくつかの修飾塩基の化学構造およびそれらの略語を示す。波線は連結した糖部分（非保護、保護、活性化および類似の状態のもの）の位置を示すのに使っている。
【図２】図２は、ＭＧＢ、ＰＰＰＡおよびＰＵの異なる組み合わせをもった八量体ＧＣ−リッチおよびＡＴ−リッチのプローブの均衡度を説明するグラフである。
【図３】図３は、ＭＧＢ修飾オリゴヌクレオチド・プローブでＰＰＰＡおよびＰＰＧを使用することによって得られる、ひとつの利点を説明する図である。図から分かるように、修飾塩基は、リアルタイムＰＣＲで高いミスマッチ識別を示すプローブを短くさせる。
【数４】
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はＰＰＰＡであり、
【数５】
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はＰＰＧである。
【図４】図４は、Invader（商標）アッセイを説明する。これに本発明の修飾オリゴヌクレオチドを使うことができる。
【図５】図５は、さまざまな数のＰＰＧを用いたInvader（商標）プローブ実績の比較を示す。
【図６】図６は、本発明の実施態様に従ったウェブ基盤のオリゴヌクレオチド・プローブ設計システムの一般的な概観を示す。
【図７】図７は、本発明のひとつの実施態様に従った標本プローブ設計プロセスの流れを示す。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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