(57)【要約】本発明は、CK-18関連癌および悪性腫瘍の進行を検出、診断、予後診断、およびモニタリングするための方法および組成物、ならびに前記方法において使用するためのキットを提供する。さらに、CK-18関連癌および悪性腫瘍に関連する癌抗原のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造を有する化合物:
【化１】
2005500812.tif 000006
【請求項２】
次の構造を有する化合物:
【化２】
2005500812.tif 000007
【請求項３】
次の構造を有する化合物:
【化３】
2005500812.tif 000008
【請求項４】
配列番号：1のアミノ酸配列を含むペプチドであって、アミノ酸213位、214位、216位、218位、および220位が各々L、D、A、M、およびVであるペプチド。
【請求項５】
配列番号：1のアミノ酸配列を含むペプチドであって、アミノ酸213位、214位、216位、218位、219位、および220位が各々L、D、G、M、Y、およびVであるペプチド。
【請求項６】
配列番号：1のアミノ酸212〜221位からなるペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドに結合した生物学的に活性な免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項4〜6のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドに共有結合した物質をさらに含み、該物質が該ペプチドを抗原提示細胞に対して標的化することができる、請求項4〜6のいずれか1項記載のペプチド。
【請求項９】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項8記載のペプチド。
【請求項１０】
MHCクラスII結合ヘルパーペプチドをさらに含有する、請求項4〜6記載のいずれか1項のペプチド。
【請求項１１】
配列番号：3のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号：5のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号：7のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項7〜12のいずれか1項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項4〜6のいずれか1項記載の化合物を特異的に認識して結合する抗体。
【請求項１６】
被験者に、有効量の請求項4〜6のいずれか1項記載の化合物を送達することを含む、被験者において免疫応答を誘導する方法。
【請求項１７】
化合物がMHC分子に関連して送達される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
MHC分子が抗原提示細胞の表面上で化合物を提示する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
化合物がポリヌクレオチドとして送達される、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
有効量の請求項15記載の抗体を被験者へ投与する段階を含む、免疫療法の方法。
【請求項２１】
MHC分子に関連する請求項4〜6記載のいずれか1項の化合物を提示する抗原提示細胞の存在下および使用により、インビトロまたはインビボで生じた免疫エフェクター細胞。
【請求項２２】
有効量の請求項21記載の免疫エフェクター細胞を投与する段階を含む、養子免疫療法の方法。
【請求項２３】
1つまたは複数の免疫原性リガンドを含む組成物であって、免疫原性リガンドが同一天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって個々に特徴付けられており、該免疫原性リガンドが配列番号：3、5および7からなる群から選択される組成物。
【請求項２４】
免疫原性リガンドに結合した生物学的に活性な免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
免疫原性リガンドに結合したMHC分子をさらに含む、請求項23記載の組成物。
【請求項２６】
免疫原性リガンドが共有結合する、請求項23記載の組成物。
【請求項２７】
免疫原性リガンドに共有結合した物質をさらに含み、該物質が抗原提示細胞に対して該免疫原性リガンドをターゲティングできる、請求項23記載の組成物。
【請求項２８】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
MHCクラスII結合ヘルパーペプチドをさらに含む、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
担体をさらに含む、請求項23記載の組成物。
【請求項３１】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
1つまたは複数の免疫原性リガンドを含む宿主細胞であって、該免疫原性リガンドが同一天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって個々に特徴付けられており、該免疫原性リガンドが配列番号：3、5および7からなる群から選択される宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞が抗原提示細胞であり、免疫原性リガンドが細胞の表面上で提示される請求項32記載の宿主細胞。
【請求項３４】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項33記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項32記載の宿主細胞および担体を含む組成物。
【請求項３６】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
被験者において免疫応答を誘導するための方法であり、被験者に1種または複数種の、有効量の免疫原性リガンドを含む組成物を送達する段階を含む方法であって、該免疫原性リガンドの各々が同一天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが配列番号：1、3、5および7からなる群から選択される方法。
【請求項３８】
新生物状態、または動物の細胞もしくは組織の新生物状態に対する感受性の診断において役立つ方法であって、
該細胞または組織から単離された試験試料中のCK-18タンパク質の発現量を決定する段階、および
CK-18タンパク質の発現量に基づいて、新生物状態または新生物状態への感受性を診断する段階を含む方法。
【請求項３９】
タンパク質の発現量が、該タンパク質を転写するmRNAの量を検出することによって決定される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
検出する段階が、試験試料を中等度または高度にストリンジェントな条件下において、CK-18mRNAと特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを用いて試験することによる、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
プローブまたはプライマーが、配列番号：1に挙げた配列またはそれらの相補体をコードする核酸によってコードされたタンパク質の少なくとも9個の連続残基を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
プローブまたはプライマーが固体支持体上に不動化されている、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
プローブまたはプライマーが検出可能に標識されている、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
プローブまたはプライマーが配列番号：2または配列番号：8の少なくとも9個の連続するポリヌクレオチド、およびこれらの配列の相補体からなる配列を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
プローブまたはプライマーが配列番号：1または7からなる群から選択されるペプチド、および該ペプチドをコードする核酸の相補体をコードする核酸配列を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
発現が、正常または対照試料中より少なくとも2倍高い、請求項38記載の方法。
【請求項４７】
検出が、タンパク質を特異的に認識して結合する物質を用いて試料を試験することにより決定される、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
物質が、タンパク質またはその抗原結合断片を特異的に認識または結合する生物学的に活性な免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
物質がポリクローナルまたはモノクローナル抗体である、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
物質がタンパク質へ結合する細胞である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
細胞が配列番号：1、3、5および7からなる群から選択されるペプチドの存在下および使用により生じた免疫エフェクター細胞である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
試験試料が乳房または肺から選択される細胞または組織の群から単離される、請求項38記載の方法。
【請求項５３】
検出する段階がインビボイメージングによる、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
モノクローナル抗体が配列番号：1、3、5および7からなる群から選択されるペプチドを用いて免疫化された動物から調製される、請求項49記載の方法。
【請求項５５】
物質が、配列番号：1、3、5および7からなる群から選択されるペプチドを用いて免疫化した動物から調製した抗体から単離された、生物学的に活性な免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項47記載の方法。
【請求項５６】
検出がポリメラーゼ連鎖反応またはハイブリダイゼーションアッセイ法による、請求項40記載の方法。
【請求項５７】
固体支持体がチップである、請求項42記載の方法。
【請求項５８】
タンパク質の発現が、mRNAの同一性および発現レベルの発現解析により決定され、mRNAの配列および量を対照試料の発現解析と比較する、請求項38記載の方法。
【請求項５９】
CK-18タンパク質を特異的に認識して結合する少なくとも1種の物質、および試験試料中のCK-18タンパク質と該物質間との結合を検出するための取扱説明書を含む診断キット。
【請求項６０】
物質が固体支持体上で不動化されている、請求項59記載のキット。
【請求項６１】
固体支持体がニトロセルロース、ラテックス、プラスチック、およびチップからなる群から選択される、請求項60記載のキット。
【請求項６２】
物質が抗体であり、検出試薬が抗免疫グロブリン、タンパク質G、タンパク質A、またはレクチンを含む、請求項60記載のキット。
【請求項６３】
検出が、ラジオアイソトープ、蛍光基、発光基、酵素、ビオチン、および色素粒子からなる群から選択される、請求項59記載のキット。
【請求項６４】
請求項40記載のプローブまたはプライマーを含む診断キット。
【請求項６５】
CK-18タンパク質がそのリガンドへ結合するのを調節する物質についてスクリーニングするためのアッセイ法であって、該タンパク質および該リガンドを含む試料を幾つかの条件下および被験物質の存在下で接触させる段階、ならびにタンパク質と該リガンドとの間の任意の結合、CK-18の結合を調節する物質の指標である該結合における変化を検出する段階とを含むアッセイ法。
【請求項６６】
調節が、物質とタンパク質との間の増加した結合活性または親和性を含む、請求項65記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(技術分野)
本発明は、ヒトの癌および関連悪性腫瘍のための治療、診断、およびスクリーニング法において有用な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
年間の癌が原因で死亡する人数は上昇し続けている。米国内における男女の癌死の最も一般的な原因は、順に肺癌、結腸癌、および乳癌である。過去数十年間にわたってこれらの疾患を有する患者の生存に関して穏当な客観的改善は行われて生きたが、発生率の上昇はこれを上回り、総死亡数は増加し続けている。
【０００３】
肺癌は、世界中で最も多く見られる形態の癌である。典型的な肺癌の診断は、喀痰細胞診とX線とを組み合わせる。あいにくなことに、症状が出たために患者が医療を求めようとする時点には、癌は通例、治癒不能であるほど進行してしまっている。その結果として、癌は臨床的には明白になっていないが既に局在化していて治療に対して反応する時点で早期に腫瘍マーカーを検出することに研究の焦点が置かれてきた。Mulshineら、「Applications of monoclonal antibodies in the treatment of solid tumors」、「BIOLOGIC THERAPY OF CANCER」、V.T.Devita、S.Hellman、および S.A.Rosenberg編集。フィラデルフィア:J.B.Lippincott, 1991, pp.563〜588。
【０００４】
結腸直腸癌は、世界中で3番目に一般的な悪性新生物であり、米国では2番目に多い癌死の原因である。Shike, M.、Winawer, S.J.、Greenwald, P.H.ら、(1990)Primary Prevention of Colorectal Cancer:the WHO Collaborating Centre for the Prevention of Colorectal Cancer(結腸直腸癌の一次予防:結腸直腸癌を予防するためのWHO研究協力センター);Bulletin of the WHO 68(3):377-85;Greenlee, R.T.ら、(2001)Cancer Statistics,2001.CA:A Cancer Journal for Clinicians 51(1):15-36を参照。米国では、この疾患に関連して135,400例の新規症例および56,700人の死亡が発生すると推定されている。患者の約65%は進行した疾患を提示する。
【０００５】
乳癌は、30代から始まって生涯に渡って持続する女性にとって主要な医学的問題である。現在は、米国内では女性は8人に1人が一生涯(80歳まで)の間にこの疾患を発生し、28人中1人が乳癌のために死亡するリスクがあると推定されている。Harrisら編集,「DISEASES OF THE BREAST」、1996:pp.159-168を参照。乳癌は米国内の女性の癌死の2番目に多い原因であり、15〜54歳の女性については癌関連死の主要原因である。Forbes(1997)Seminars in Oncology 24(1),Suppl.1,S1-20〜S1-35を参照。
【０００６】
前立腺癌は、北米の男性において最も一般的な悪性癌である(皮膚癌を除く)。2001年には、米国内でおよそ198,100例の新規症例および31,500例の前立腺癌関連死が発生すると推定されている。上記のGreenlee, R.T.らを参照。前立腺癌は、現在は男性における癌死の第2の主要原因であり、これを上回るのは肺癌だけである。前立腺癌は、全男性の癌の29%および男性癌関連死の11%を占めている。
【０００７】
卵巣癌は、米国内の女性における5番目に多い癌死の原因であり、全婦人科癌の中で最高死亡率を有している。上記のGreenlee, R.T.ら、(2001)を参照。2001年には、23,400例の卵巣癌の新規症例が診断され、13,900人の女性がこの疾患のために死亡すると予想されている。上記のGreenlee, R.T.ら、(2001)を参照。卵巣癌から生存した場合の予後は、診断時の疾患の程度に大きく左右される。局所性疾患であると診断された女性は、遠隔性疾患を有する女性に比較して5年間生存率が3倍以上高い。しかしながら診断時に局所性疾患を提示する女性は4分の1に過ぎない。Ries, L.A.ら、(1998), SEER Cancer Statistics Review 1973-1995,ベテスダ、MD:National Cancer Institute(国立癌研究所)を参照。
【０００８】
黒色腫は全皮膚癌の約3%を占めており、黒色腫における世界的増加率を超える新生物は女性における肺癌以外にはない。「CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY」(1991)(編集)Abbas, A.K.、Lechtiman, A.H.、Pober J.S.:W.B.Saunders Company Philadelphia、pp.340-342;Kirkwood および Agarwala(1993)Principles and Practice of Oncology 7:1-16。黒色腫が明白に皮膚に局在している場合でさえ、患者の最大30%までは全身性転移を発生し、大多数は死亡する。Kirkwood および Agarwala(1993)Principles and Practice of Oncology 7:1-16。
【０００９】
癌免疫療法の主要な目標の1つは、確定された腫瘍を排除するために有効であろう腫瘍特異的Tリンパ球反応の誘導である。このような療法の見通しは、腫瘍特異的免疫応答の同定および特性付けに依存する。
【００１０】
主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の分子によって提示された抗原性エピトープの認識は、哺乳動物の免疫応答の確立、維持、および実行において中心的な役割を果たす。体細胞および白血球を提示する抗原によって発現する細胞表面MHC分子によって提示されたペプチド抗原のT細胞サーベイランスおよび認識は、例えばウイルス、細菌、および寄生虫のような感染性微生物による侵害を制御するために機能する。さらに、現在では抗原特異的細胞毒性Tリンパ球(CTL)が特定の癌細胞抗原を認識してこれらの抗原を発現する細胞を攻撃できることが証明されている。このT細胞活性は、抗癌ワクチンのための新規戦略を開発するための基礎を提供する。さらに、不適切なT細胞活性化は、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、および喘息のような特定の衰弱自己免疫疾患において中心的役割を果たす。従って、MHC分子によって提示された抗原性エピトープの提示および認識は、複数の病理的状態において免疫応答を媒介する際において中心的役割を果たす。
【００１１】
癌患者由来の腫瘍特異的T細胞は、腫瘍細胞に結合してこれを溶解させる。この特異性は、それらがMHCクラスI分子、および一部の細胞タイプではクラスII分子によって腫瘍細胞の表面上で提示された短鎖アミノ酸配列（エピトープ）を認識する能力に基づいている。これらのエピトープは、腫瘍または癌細胞中で固有にまたは異常に発現した遺伝子によってコードされた腫瘍抗原と呼ばれる細胞内タンパク質のタンパク質分解性分解に由来する。
【００１２】
特異的抗腫瘍T細胞が入手可能となったため、腫瘍抗原の同定および引き続く抗腫瘍免疫応答を誘導するよう設計された癌ワクチンの生産が可能になった。抗腫瘍T細胞は、血液(それらが末梢血単核細胞分画内で所見できる)中、例えば脾臓のような一次および二次リンパ系組織中、卵巣癌患者(腫瘍関連リンパ球またはTAL)における腹水中、または腫瘍自体(腫瘍浸潤性リンパ球またはTIL)中を含む、癌患者の体内に局在している。これらのうち、TILが腫瘍抗原およびT細胞によって認識される腫瘍抗原由来ペプチドの同定において最も有用であった。
【００１３】
TILを生成する従来方法は、腫瘍生検組織を細分化する段階およびT細胞成長因子インターロイキン-2(IL-2)の存在下のインビトロで細胞懸濁液を培養する段階を含む。数日間に渡って、腫瘍細胞およびIL-2の組み合わせは腫瘍細胞を使用して腫瘍特異的T細胞の増殖を刺激できる。このようにしてT細胞集団は増大していく。第1の増大に由来するT細胞は、引き続いてマイトマイシンC処理をした、もしくは照射した腫瘍細胞と混合され、その後の腫瘍反応性T細胞のさらなる増殖および濃縮を促進するためにインビトロでIL-2と共に培養される。数ラウンドのインビトロにおける増大後に、強力な抗腫瘍T細胞集団を回収し、これを使用して従来型であるが冗長な発現クローニング方法によって腫瘍抗原を同定できる。Kawakani Y.ら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(9):3515-3519。
【００１４】
現在インビトロで腫瘍特異的T細胞を生成するために使用されているこの方法は信頼性が低く、この方法によって同定された抗原は必ずしも抗腫瘍免疫応答を誘導しない。多数の実験によって、抗原が成熟T細胞と遭遇すると、無知、アネルギー(免疫反応不顕性)、または物理的欠失のために耐性の誘導を生じさせることが証明されている。Pardoll(1998)Nature Med.4(5):525-531。
【００１５】
特定のペプチドがT細胞エピトープとして機能する能力は、それがMHC分子の抗原提示ドメインに効果的に結合すること、およびさらにそれがT細胞受容体分子によって特異的に認識され得る適切な1組のアミノ酸を示すことを必要とする。抗原ポリペプチドに由来する天然T細胞エピトープを同定することは可能であるが、これらのペプチドエピトープは必ずしも特定の免疫応答を誘導するように最適化されている抗原を意味していない。実際に、単一アミノ酸またはそれらの配列を変化させる複数の酸の置換基を導入することによって天然エピトープの有効性を向上させるのが可能であることは証明されている(Valmoriら(2000)J.Immunol.164(2):1125-1131)。従って、慎重に最適化されたペプチドエピトープの送達は、有用な免疫応答を誘導するための改良された方法を提供する可能性を有している。
【００１６】
動物内への抗原の導入は、様々な目的で抗原への免疫応答、またはその欠如を調節するために広範に使用されてきた。これらには、病原体に対するワクチン接種、癌細胞に対する免疫応答の誘導、アレルギー反応の緩和、自己免疫障害の結果として発生する自己抗原への免疫応答の減少、同種移植拒絶の減少、および避妊を目的とする自己抗原に対する免疫応答の誘導が含まれる。
【００１７】
より近年には、特定の病原体および腫瘍関連タンパク質が、アミノ酸配列がその病原体または腫瘍関連タンパク質の既知または推定抗原決定基ドメインのアミノ酸配列に一致するペプチドを用いて免疫学的に模倣されてきた。これらの進歩にもかかわらず、このようなペプチド模倣物は一般に免疫応答を誘導することに関して最適には機能しない。
【００１８】
様々な癌に関連していることが証明された単離された抗原およびその他のバイオマーカーの例は多数あるにもかかわらず、治療、診断、予後診断、およびその他の検出用途のためのこのようなツールの有用性は、例えばそれらが非効率的である、信頼性が低い、感度および/または予測性が欠如していること等の理由で限定されている。従って、癌に関連する抗原、抗原性エピトープ、およびその他のバイオマーカーを同定し、関連癌の早期検出、治療、およびモニタリングにおいて役立つ新規材料およびキットを開発する継続的必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、同様に上記の長所を提供する。
【発明の開示】
【００１９】
(発明の開示)
本発明は、ヒトサイトケラチン18タンパク質(CK18)関連癌および悪性腫瘍の治療および診断のための新規化合物組成および方法を提供する。
【００２０】
さらに、本発明の化合物をコードするポリヌクレオチド、これらの化合物をコードする、例えば配列番号：4、6および8に提供されるような核酸配列（FLDKGHMYV(配列番号：3)、FLDKAHMEV(配列番号：5)、およびFMKKNHEEEV(配列番号：7)のアミノ酸をコードする核酸）も提供され、それらの相補体、および変種も本発明に含まれている。さらにまた、これらのポリヌクレオチドを含む組成物、遺伝子送達賦形剤および/または宿主細胞も提供される。
【００２１】
また、本発明により、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、配列番号：3、5および7に提供されるアミノ酸配列が提供され、それらの相補体および変種もまた本発明に含まれている。
【００２２】
加えて、本発明は任意でMHC分子の状況に応じて本発明の化合物および組成物の送達により被験者において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００２３】
本発明の化合物はまた、本発明の化合物を特異的に認識して結合する抗体を生成するために有用である。これらの抗体は、被験者に投与された場合は免疫療法においてさらに有用である。
【００２４】
本発明はまた、免疫エフェクター細胞、およびMHC分子と関連して本発明のペプチド組成物を提示する抗原提示細胞の存在下および使用によりインビボまたはインビトロで生じた免疫エフェクター細胞を含有する組成物、ならびに被験者に有効量のこれらの免疫エフェクター細胞を投与する段階を含む養子免疫療法の方法を提供する。
【００２５】
また本発明によって少なくとも1種、または少なくとも2種、あるいはまた少なくとも3種の免疫原性リガンドを含む組成物が提供されるが、このときこの免疫原性リガンドは、対応する天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力により個々に特徴付けられ、またこの免疫原性リガンドは配列番号：1、3、5および7からなる群から選択される配列を含む。これらの組成物は、薬学的に許容される担体のような担体と組み合わせることができる。
【００２６】
さらに本発明によって少なくとも1種、または少なくとも2種、あるいはまた少なくとも3種の免疫原性リガンドを含む宿主細胞が提供されるが、このときこの免疫原性リガンドは対応する天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力により個々に特徴付けられ、さらにこの免疫原性リガンドは配列番号：1、3、5および7からなる群から選択される配列を含む。ある局面では、宿主細胞は抗原提示細胞、例えば樹状細胞である。このような宿主細胞および担体を含む組成物もまた提供される。本発明の宿主細胞は、薬学的に許容される担体のような担体と組み合わせることができる。
【００２７】
さらに本発明によって、被験者へ有効量の少なくとも1種、または少なくとも2種、あるいは少なくとも3種の免疫原性リガンドを含む組成物を送達することによってその被験者に免疫応答を誘導する方法が提供されるが、このときこの免疫原性リガンドは各々対応する天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力により特徴付けられ、さらにこのときこの免疫原性リガンドは配列番号：1、3、5および7の配列を含む化合物群から選択される。
【００２８】
本発明はさらに、CK-18関連癌および悪性腫瘍の進行を検出、診断、予後診断およびモニタリングするための方法および組成物、ならびにこの方法において使用するためのキットを提供する。
【００２９】
さらにまたCK-18関連癌および悪性腫瘍に関連する癌抗原のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法が提供される。
【００３０】
本明細書に記載される方法および組成物は、特に自動ハイスループットアッセイシステムに採用するのに適している。
【００３１】
(配列表の説明)
配列番号：1。天然ヒトサイトケラチン18タンパク質のアミノ酸配列。この配列は、参照番号NP000215を付して国立バイオテクノロジー情報センター(「Nationl Center for Biotechnology Information: NCBI」)に収蔵されている。
【００３２】
配列番号：2。ヒトサイトケラチン18(「CK18」)をコードするmRNAの完全ヌクレオチド配列。この配列は、参照番号NM000224を付して国立バイオテクノロジー情報センター(「NCBI」)に収蔵されている。
【００３３】
配列番号：3。化合物1のアミノ酸配列。
【００３４】
配列番号：4。化合物1をコードするポリヌクレオチド配列。
【００３５】
配列番号：5。化合物2のアミノ酸配列。
【００３６】
配列番号：6。化合物2をコードするポリヌクレオチド配列。
【００３７】
配列番号：7。配列番号：1のアミノ酸212〜221位を含むCK18の天然エピトープである化合物3のアミノ酸配列。
【００３８】
配列番号：8。化合物3をコードするポリヌクレオチド配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
(本発明を実施する形態)
本開示を通して、引用元を明記することにより様々な出版物、特許、および公表された特許明細書が参考文献として引用される。これらの出版物、特許、および公表された特許明細書の開示は、本発明が関係する技術分野の最先端の状態をより詳細に記載するため、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
本発明の実施では、他に指示されていなければ、分子生物学の従来技術(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学が使用されるが、これらは当技術分野の技術の範囲内に含まれる。このような技術は文献において十分に説明されている。これらの方法は、次の出版物の中で記載されている。例えば、Sambrookら、「MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd edition」(1989);「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」(F.M.Ausubelら編集(1987); シリーズ、「METHODS IN ENZYMOLOGY」(Academic Press,Inc.);「PCR:A PRACTICAL APPROACH」(M.MacPhersonら、IRL Press at Oxford University Press(1991);「PCR2:A PRACTICAL APPROACH」(M.J.MacPherson,B.D.Hames および G.R.Taylor編集(1995));「ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL」(Harlow および Lane編集(1988));「USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL」(Harlow および Lane編集(1999));および「ANIMAL CELL CULTURE」(R.I.Freshney編集(1987))を参照されたい。
【００４１】
定義
本明細書における特定の用語は、下記に定義された意味を有することがある。
【００４２】
明細書および請求項で使用する、単数形の「a」、「an」、および「the」は、文脈が明白に他の意味を指示していない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞(a cell)」はその混合物を含む、複数の細胞を含む。
【００４３】
本明細書で使用する、「含んでいる」という用語は組成物および方法が列挙された要素を含むが、その他の要素も排除していないことを意味すると意図されている。組成物および方法を定義するときに使用した「〜から本質的に構成される」は、その組成物に本質的に重要である、他のいかなる要素をも除外することを意味する。従って、本明細書で定義した要素から本質的に構成される組成物は、単離および精製方法からの微量汚染物質ならびに例えばリン酸緩衝生理食塩液、保存剤等のような薬学的に許容される担体は除外しない。「〜から構成される」は、微量の他の成分および本発明の組成物を投与するための実質的方法段階以外の要素を除外することを意味する。これらの過渡的用語の各々によって定義された態様は本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
「天然」、「自然」、または「野生型」抗原は、自然生物学的起源から単離されており、被験者において抗原受容体、特にT細胞抗原受容体(TCR)に特異的に結合できるエピトープを含有するポリペプチド、タンパク質、または断片である。
【００４５】
用語「抗原」は、当技術分野において明確に理解されており、免疫原性である物質、即ち免疫源、および免疫学的不応性またはアネルギーを誘導する物質、即ちアネルゲンを含む。
【００４６】
「変化した、または修飾された抗原」は、対応する野生型抗原の一次配列とは相違する一次配列を有する抗原である。変化した抗原は、合成または組換え方法によって作製でき、翻訳中または翻訳後に、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性開裂、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの結合によって異なって修飾された抗原性ペプチドを含むがそれらに限定されない。(Fergusonら(1988),Ann.Rev.Biochem.57:285-320)。本発明の修飾された、または変化した抗原性エピトープは、天然または野生型エピトープと同一TCRに結合することが意図されている。
【００４７】
本明細書で天然抗原または野生型抗原とも称される「自己抗原」という用語は、抗原に対する自己免疫寛容に起因して被験者において免疫応答をほとんどまたは全く誘導しない抗原性ペプチドである。自己抗原の1つの例は、黒色腫特異的抗原gp100である。
【００４８】
用語「腫瘍関連抗原」または「TAA」は、腫瘍に関連する、または特異的である抗原を意味する。既知のTAAsの例には、gp100、MARTおよびMAGEが含まれる。
【００４９】
用語「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、T細胞への抗原提示および急速な移植片拒絶のために必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を意味する。ヒトでは、MHCは「ヒト白血球抗原」または「HLA」複合体としても知られている。MHCによってコードされたタンパク質は、「MHC分子」として知られており、クラスIおよびクラスII MHC分子に分類される。クラスI MHC分子は、β2-ミクログロブリンと非共有結合的に結合したMHC内でコードされたα鎖からできている膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスI MHC分子はほぼすべての有核細胞によって発現され、CD8+T細胞への抗原提示において機能することが証明されている。クラスI分子は、ヒトではHLA-A、B、およびCを含む。クラスII MHC分子もまた非共有結合的に結合したαおよびβ鎖から構成される膜ヘテロダイマータンパク質を含む。クラスII MHC分子は、CD4+T細胞内で機能することが知られており、ヒトではHLA-DP、-DQ、およびDRを含む。ある好ましい態様では、本発明の組成物およびリガンドは、任意のHLAタイプのMHC分子と複合できる。当業者は、HLAの血清型および遺伝子型に習熟している。例えば、bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/hla coefficient viewingのページを参照。 Rammensee H.G.、Bachmann J.、および Stevanovic S.、「MHC Ligands  and  Peptide  Motifs」、(1997), Chapman & Hall Publishers;Schreuder G.M.Th.ら、「The  HLA  dictionary」、(1999)Tissue Antigens 54:409-437。
【００５０】
本明細書で使用する用語「抗原提示マトリックス」は、T細胞の表面上で抗原がT細胞抗原受容体に結合され得るような方法で抗原を提示できる1個または複数の分子を意味する。抗原提示マトリックスは抗原提示細胞(APC)の表面上、APCの小胞調製物上にあってよく、または例えばビーズもしくはプレートのような固相支持体上の合成マトリックスの形状であってよい。合成抗原提示マトリックスの1つの例は、β2-ミクログロブリンに複合された精製MHCクラスI分子、このような精製MHCクラスI分子の多量体、精製MHCクラスII分子、または固体支持体に付着させたその機能的部分である。
【００５１】
用語「抗原提示細胞(APC)」は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識できる抗原MHC複合体の形状で1つまたは複数の抗原を提示することができ、それによって提示されている1つまたは複数の抗原に対する有効な細胞免疫応答を誘導することのできる細胞クラスを意味する。多数のタイプの細胞がT細胞認識のためにそれらの細胞表面上で抗原を提示できるが、有効量で抗原を提示し、さらに細胞毒性Tリンパ球(CTL)応答のためにT細胞を活性化する能力を有しているのはプロフェッショナルAPCだけである。APCは、例えばマクロファージ、B細胞、および樹状細胞のような無傷全細胞;または例えばβ2-ミクログロブリンに複合した精製MHCクラスI分子のような他の天然型もしくは合成分子であってよい。
【００５２】
用語「樹状細胞(DC)」は、様々なリンパおよび非リンパ組織において所見される形態学的に類似の細胞タイプの様々な集団を意味する(Steinman(1991),Ann.Rev.Immunol.9:271-296)。樹状細胞は、生体内で最も強力かつ好ましいAPCを構成する。全部ではないが樹状細胞のサブセットは骨髄前駆細胞に由来し、末梢血中を少数で循環し、未熟ランゲルハンス細胞として、または最終分化成熟細胞のどちらかとして出現する。樹状細胞は単球から分化できるが、それらは別個の表現型を有している。例えば特定分化マーカーであるCD14抗原は、樹状細胞中では所見されないが、単球によって保有されている。また、成熟樹状細胞は食作用性ではないが、単球は強度に食作用性である細胞である。DCがT細胞活性化および増殖に必要な全てのシグナルを提供することは証明されている。
【００５３】
用語「抗原提示細胞補充因子」または「APC補充因子」は、無傷の全細胞および抗原提示細胞を補充できる他の分子の両方を含む。適切なAPC補充因子の例には、例えばインターロイキン4(IL-4)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、セプラゲル(Sepragel)およびマクロファージ炎症性タンパク質3α(MIP3α)のような分子が含まれる。これらはイミュネックス(Immunex)社、シェーリング・プラウ(Schering-Plough)社、およびR&Dシステムズ(R&B Systems)社(ミネアポリス、MN)から入手できる。これらはさらにまた「CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY」(F.M.Ausubelら編集(1987)の中で開示された方法を使用して組換え技術により作製することもできる。上記の因子と同一の生物学的活性を有するペプチド、タンパク質、および化合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
用語「免疫エフェクター細胞」は、抗原に結合することができ、免疫応答を媒介する細胞を意味する。これらの細胞には、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞ならびに、例えばCTL系、CTLクローン、および腫瘍、炎症またはその他の浸潤液からのCTLのような細胞毒性Tリンパ球(CTL)が含まれるが、それらに限定されない。特定の疾患組織は特異的抗原を発現し、これらの抗原に対して特異的なCTLは同定されている。例えば黒色腫の約80%はgp100として知られる抗原を発現する。
【００５５】
本明細書で使用する用語「免疫エフェクター分子」は、抗原特異的に結合できる分子を意味し、これには抗体、T細胞抗原受容体、ならびにMHCクラスIおよびクラスII分子が含まれる。
【００５６】
「未処理」免疫エフェクター細胞は、その細胞を活性化できる抗原へ一度も曝露されたことのない免疫エフェクター細胞である。未処理免疫エフェクター細胞の活性化は、抗原特異的武装化エフェクターT細胞内へ増殖および分化させるために、ペプチド:MHC複合体の認識およびプロフェッショナルAPCによる共刺激シグナルの同時送達の両方を必要とする。
【００５７】
「免疫応答」は広範にリンパ球の異種物質への抗原特異的応答を意味する。免疫応答を誘発することのできるあらゆる物質は「免疫原性」であると言われ、「免疫原」と称されている。免疫原はすべて抗原であるが、しかしながら抗原がすべて免疫原であるわけではない。本発明の免疫応答は、体液性(抗体活性を介す)または細胞媒介性(T細胞活性化を介す)であってよい。
【００５８】
本明細書で使用する用語「リガンド」は、他の分子上の特異的部位へ結合する任意の分子を意味する。これを言い換えると、リガンドは免疫エフェクター細胞と反応してタンパク質の特異性を付与する。免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位と直接に結合するのがタンパク質内のリガンド部位である。
【００５９】
ある態様では、本発明のリガンドは例えば抗体またはT細胞受容体(TCR)のような免疫エフェクター細胞上の抗原決定基またはエピトープへ結合する。リガンドは、本発明の抗原、ペプチド、タンパク質、またはエピトープであってよい。
【００６０】
本発明のリガンドは抗体上の受容体へ結合しうる。ある態様では、本発明のリガンドは長さが約4〜約8アミノ酸である。
【００６１】
本発明のリガンドは、MHCクラスI分子上の受容体へ結合しうる。ある態様では、本発明のリガンドは長さが約7〜約11アミノ酸、または9もしくは10アミノ酸である。
【００６２】
本発明のリガンドは、MHCクラスII分子上の受容体へ結合しうる。ある態様では、本発明のリガンドは長さが約10〜約20アミノ酸である。
【００６３】
本明細書で使用する用語「抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞」は、以前に抗原に遭遇した上記のような免疫エフェクター細胞である。その未処理対応物とは対照的に、抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化には共刺激シグナルを必要としない。ペプチド:MHC複合体は十分に認識される。
【００６４】
T細胞に関連して使用した場合の「活性化」は、その細胞がもはやG0期にはなく、細胞タイプ(例、CD8+またはCD4+)に特徴的な1つまたは複数の細胞毒素、サイトカイン、およびその他の関連する膜関連タンパク質を産生し始め、その表面上で特定抗原を表示する任意の標的細胞を認識して結合し、そのエフェクター分子を放出できることを意味する。
【００６５】
本発明の状況では、用語「認識された」は、1つまたは複数のリガンドを含む本発明の組成物が免疫エフェクター細胞によって認識されて結合されることを意味しているが、このときこのような結合は効果的な免疫応答を開始する。リガンドが免疫エフェクター細胞によって認識されるかどうかを判定するアッセイ法は当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【００６６】
用語「優先的に認識された」は、本発明の組成物またはリガンドの特異性が天然リガンドを認識して結合する免疫エフェクター細胞に限定されることを意味する。
【００６７】
用語「交差反応性」は、機能的に重複している本発明の化合物の特定の免疫原性特性を説明するために使用される。より詳細には、それらによって活性化される天然リガンドおよび/または免疫エフェクター細胞の免疫原性特性は、変化したリガンドがそれによって活性化される天然リガンドおよび/または免疫エフェクター細胞と「交差反応性」であるように、ある程度は変化したリガンドに共有される。本発明の目的のためには、交差反応性は複数のレベルで明示される：(i)リガンドレベルでは、例えば変化したリガンドは天然リガンドCTLのTCRに結合して天然リガンドCTLを活性化できる;(ii)T細胞レベルでは、即ち変化した本発明のリガンドは天然リガンドを表示する細胞を効果的に標的として溶解させることのできるT細胞集団(天然リガンドCTLの集団とは別個)のTCRに結合してT細胞集団を活性化する;および(iii)抗体レベルでは、例えば「抗」変化したリガンド抗体は天然リガンドを検出、認識、結合し、さらに最終的には宿主から天然リガンド除去する免疫応答におけるエフェクターメカニズムを開始させることができる。
【００６８】
本明細書で使用する用語「被験者において免疫応答を誘導する」は、当技術分野において明確に理解された用語であり、抗原(またはエピトープ)を被験者内に導入した後の、抗原(またはエピトープ)をその被験者内に導入する前の免疫応答(もしあれば)と比較した、抗原(またはエピトープ)に対する免疫応答において少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍、より好ましくは少なくとも約100倍、さらにより好ましくは少なくとも約500倍、さらにいっそうより好ましくは少なくとも1,000倍またはそれより多くの増加を検出または測定できることを意味する。抗原(またはエピトープ)に対する免疫応答には、抗原特異的(またはエピトープ特異的)抗体の産生、およびその分子が特異的に抗原(またはエピトープ)に結合するその表面上で発現する免疫細胞の産生が含まれるが、それらに限定されない。所与の抗原(またはエピトープ)に対する免疫応答が誘導されたかどうかを決定する方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、例えば試料中の抗体の不動化抗原(またはエピトープ)への結合が検出可能な標識第二抗体(例、酵素標識マウス抗体ヒトIg抗体)を用いて検出されるELISAを含むがそれに限定されない、当技術分野で知られている任意の様々なイムノアッセイ法を使用して検出できる。
【００６９】
「共刺激分子」は、抗原提示細胞およびT細胞表面上で発現する受容体-リガンド対間の相互作用に含まれている。過去数年間に渡って蓄積されてきた研究は、静止T細胞がサイトカイン遺伝子の発現および増殖を誘導するために少なくとも2種のシグナルを必要とすることを証明し確認した(Schwartz R.H.(1990)Science 248:1349-1356 および Jenkins M.K.(1992)Immunol.Today 13:69-73)。特異性を付与するシグナルである1種のシグナルは、TCR/CD3複合体と適切なMHC/ペプチド複合体との相互作用によって発生させることができる。第2のシグナルは抗原特異的ではなく、「共刺激」シグナルと称されている。このシグナルは、最初は、マクロファージおよび樹状細胞のような骨髄由来アクセサリー細胞、いわゆる「プロフェッショナル」APCによって提供される活性として定義されていた。数種の分子は共刺激活性を増強することが証明されている。これらは熱安定性抗原(HSA)(Liu  Y.ら(1992)J.Exp.Med.175:437-445)、コンドロイチン硫酸修飾MHC不変鎖(Ii-CS)(Naujokas, M.F.ら(1993)Cell 74:257-268)、細胞内接着分子1(ICAM-1)(Van Seventer G.A.(1990)J.Immunol.144:4579-4586)、B7-1、およびB7-2/B70(Schwartz, R.H.(1992)Cell 71:1065-1068)である。これらの分子は各々T細胞上でそれらの同族リガンドと相互作用することによって共刺激を補助すると思われる。共刺激分子は、正常生理的条件下で未処理T細胞の完全活性化を達成するために必要な共刺激シグナルを媒介する。代表的な1種の受容体-リガンド対は、APCの表面上のB7共刺激分子およびT細胞上のその対応受容体CD28またはCTLA-4である(Freemanら(1993)Science 262:909-911;Youngら(1992)J.Clin.Invest.90:229およびNabaviら(1992)Nature 360:266-268)。その他の重要な共刺激分子は、CD40、CD54、CD80、およびCD86である。用語「共刺激分子」は任意の単一分子または分子の組み合わせを含み、これらはT細胞の表面上でTCRによって結合されたペプチド/MHC複合体と共に作用すると、そのペプチドに結合するT細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する。従ってこの用語には、B7、またはT細胞の表面上のTCRがそのペプチドに特異的に結合したときにペプチド/MHC複合体と共に同族リガンドに結合してT細胞の活性化を生じさせる、APC、その断片(単独、他の分子と複合した、または融合タンパク質の一部として)のような抗原提示マトリックス上の他の共刺激分子が含まれている。共刺激分子は、例えばベックマン・クールター社(Beckman  Coulter,Inc.、フラートン、CA)を含む様々な供給元から市販で入手可能である。必ずしも明記されてはいないが、野生型または精製共刺激分子と類似の生物学活性を有する分子(例、組換え生成された、またはその突然変異タンパク質)は、本発明の精神および範囲内で使用することが意図されている。
【００７０】
本明細書で使用する、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定タイプの支持体に限定されていない。相当に多数の支持体を利用でき、それらは当業者には周知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれている。本明細書で使用する「固体支持体」にはさらに、合成抗原提示マトリックス、細胞、およびリポソームが含まれている。適切な固相支持体は、所望の最終使用および様々なプロトコルに対する適合性に基づいて選択されてよい。例えば、ペプチド合成のためには、固相支持体は例えばポリスチレン(例、PAM樹脂（バッケム社(Bachem  Inc.)）、ペニンシュラ・ラボラトリーズ社(Peninsula  Laboratories)等から入手される）、POLYHIPE(登録商標)樹脂(アミノテック社(Aminotech)、カナダ)から入手される)、ポリアミド樹脂(ペニンシュラ・ラボラトリーズ社から入手される)、ポリエチレングリコールを用いてグラフト化されたポリスチレン樹脂TentaGel(登録商標)、（ラップ・ポリマー社(Rapp  Polymere)、チュービンゲン、ドイツ)、またはポリジメチルアクリルアミド樹脂(ミリゲン/バイオサーチ社(Milligen/Biosearch、カリフォルニア)から入手される)のような樹脂類を挙げることができる。固体支持体はさらにまた、その上でcDNA、オリゴヌクレオチド、ペプチド、抗体、またはその他の分子がアレイ内に固定されているマイクロチップおよびグリッドを含む。グリッドの表面はガラス、プラスチック、シリコン、金、ゼラチン、またはナイロンを含む多種多様な物質から構成されてよい。Lockhart(2000)Nature,405:827-836;Srinivas(2001)Clin.Chem.、47:1901-1911。例えば、いわゆるSELDI-MS法(表面強化レーザー脱離イオン化&質量分析法)の使用では、試料を生化学的に特徴付けられた表面(抗体や受容体のような分子を含有する)を備えるチップに曝露させ、その後に質量分析法によって結合タンパク質を可視化および同定する。最近利用できる技術を検討するためには、Srivinas, P.ら(2001) Clinical Chemistry 47(10):1901-1911、およびそこに引用される参照（De  Wildt,R.M.T.ら(2000)Nat.Biotech 18:989-94、Arenkov,P.ら(2000)Anal.Biochem.278:123-31、Haab, B.B.ら(2001)Genome Biol.2:1-13、およびCahill, D.J.(2001)J Immunol.Methods 250:81-91）を参照されたい。さらに固体支持体の範囲内に含まれるのは、何千個という個別腫瘍標本(試験される数百の個体の相違する組織から)から小さな円筒形の組織が打ち抜かれ、その後抗体、RNA等を用いて試験される組織マイクロアレイである。Hoos, A.ら(2001)Am J.Pathol.158:1245-51。
【００７１】
本明細書で使用する用語「免疫調節物質」は、免疫応答を調節し、本発明の抗原性ペプチドを単独で、または本明細書に記載する任意の様々な処方物のいずれか中に含んでいる分子、巨大分子複合体、または細胞である；本発明の抗原性ペプチドを含むポリペプチド;本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;APCおよび合成抗原提示マトリックス(共刺激分子の存在下または不在下で)を含む、抗原提示マトリックス上でクラスIまたはクラスII MHC分子に結合している本発明の抗原性ペプチド;別の分子または巨大分子構造に共有結合的または非共有結合的に複合した本発明の抗原性ペプチド;ならびに本発明のペプチドに対して特異的である抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞。
【００７２】
用語「免疫応答を調節する」は、免疫応答を誘導する(増加させる、誘発する)段階;および免疫応答を低下させる(抑制する)段階を含む。免疫調節方法(またはプロトコール)は、被験者において免疫応答を調節する方法である。
【００７３】
本明細書で使用する用語「サイトカイン」は、細胞に例えば成長または増殖を誘導するような様々な効果を発揮する多数の因子のうちの任意の因子を意味する。本発明の実施において単独または組み合わせて使用できるサイトカインの非限定的例には、インターロイキン-2(IL-2)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン-3(IL-3)、インターロイキン-6(IL-6)、インターロイキン-12(IL-12)、G-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン-1α(IL-1α)、インターロイキン-11(IL-11)、MIP-11、白血病抑制因子(LIF)、c-kitリガンド、トロンボポイエチン(TPO)、およびflt3リガンドが含まれる。本発明はさらにまた、1つまたは複数のサイトカインが培地から特異的に除外されている培養条件を含む。サイトカインは、例えばジェンザイム社(Genzyme、フラミンガム、MA)、ジーンテク社(Genetech、サウスサンフランシスコ、CA)、アムゲン社(Amgen、サウザンドオークス、CA)、R&Dシステムズ社(ミニアポリス、MN)およびイミュネックス社(シアトル、WA)のような数社の製造供給元から市販で入手できる。必ずしも明記されてはいないが、野生型または精製サイトカイン(例、組換え技術により製造された、またはその突然変異タンパク質)と類似の生物学的活性を有する分子は本発明の精神および範囲内で使用することが意図されている。
【００７４】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、ヌクレオチドの任意の長さのポリマー形を意味するために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含んでいてよい。ヌクレオチドは任意の三次元構造を有していてよく、さらに既知または未知のいずれかの機能を実施できる。用語「ポリヌクレオチド」には、例えば一本鎖、二本鎖、および三重のらせん状分子、遺伝子もしくは遺伝子断片、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、ならびにプライマーが含まれている。天然核酸分子に加えて、本発明の核酸分子はまた修飾核酸分子を含んでいてよい。
【００７５】
用語「ペプチド」は、2個またはより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を意味するため広意味に使用される。サブユニットはペプチド結合によって結合されていてよい。別の態様では、サブユニットは例えばエステル、エーテル等の他の結合によって結合されていてよい。本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、グリシンおよびDもしくはL光学異性体の両方を含む天然および/または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を意味する。3個またはより多くのアミノ酸のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合は一般にはオリゴペプチドと呼ばれている。ペプチド鎖が長い場合は、そのペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれている。
【００７６】
用語「遺伝的に修飾された」は、外来遺伝子または核酸配列を含有および/または発現し、順に細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾することを意味する。これを言い換えると、細胞の内因性ヌクレオチドへのいかなる付加、欠失、または崩壊をも意味する。
【００７７】
本明細書で使用する「発現」は、それによってポリヌクレオチドがmRNA内に転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質内に翻訳される工程を意味する。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合は、発現は、適切な真核細胞宿主が選択されればmRNAのスプライシングを含んでいてよい。発現のために必要な調節エレメントには、RNAポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターはlacプロモーターのようなプロモーターならびに転写開始のためのシャイン・ダルガルノ(Shine-Dalgarno)配列および開始コドンAUGを含む(Sambrookら(1989)前記)。同様に、真核細胞発現ベクターには、RNAポリメラーゼIIに対する異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソームを剥離させるための停止コドンが含まれている。このようなベクターは市販で入手、または例えば一般にベクターを構築するための下記に記載する方法のような当技術分野において周知の方法に記載された配列によって構築することができる。
【００７８】
「転写制御下で」は当技術分野において明確に理解された用語であり、通例はDNA配列であるポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写を促進するエレメントに機能的に連結されていることに依存することを示している。「機能的に連結された」は、エレメントがそれらが機能することを許容する配列内にある並置を意味する。
【００７９】
「遺伝子送達賦形剤」は、宿主細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを運ぶことのできる任意の分子であると定義されている。遺伝子送達賦形剤の例は、リポソーム、天然ポリマー、および合成ポリマー;リポタンパク質;ポリペプチド;多糖類;リポ多糖類;合成ウイルス外被;金属粒子;ならびに細菌、または例えばバキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターを含む生体適合性ポリマー、ならびに多種多様な真核細胞および原核細胞宿主における発現に関して記載されていて、遺伝子療法および単純タンパク質発現のために使用できる当技術分野において典型的に使用されるその他の組換え賦形剤である。
【００８０】
本明細書で使用する「遺伝子送達」、「遺伝子導入」等は、導入のために使用される方法とは無関係に、宿主細胞内への外因性ポリヌクレオチド(しばしば「導入遺伝子」と呼ばれる)の導入を意味する用語である。このような方法には、例えばベクター媒介性遺伝子導入(例えばウイルス感染/トランスフェクション、または様々な他のタンパク質もしくは脂質に基づく遺伝子送達複合体によって)のような様々な周知の技術、および「裸の」ポリヌクレオチド(エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドを導入するために使用される様々な他の技術)の送達を容易にする技術が含まれている。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定的または一過性的に維持されうる。安定的維持は、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製起源を含有しているか、または染色体外レプリコン(例、プラスミド)のような宿主細胞のレプリコンもしくは核もしくはミトコンドリア染色体内へ組み込むことを必要とする。多数のベクターが哺乳動物細胞への遺伝子送達を媒介できることが、当技術分野および本明細書に記載するように既知である。
【００８１】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかにおいて宿主細胞内へ送達されるポリヌクレオチドを含む組換え産生ウイルスまたはウイルス粒子であると定義されている。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、αウイルスベクター等が含まれている。例えばセムリキ森林ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターであるαウイルスベクターもまた遺伝子療法および免疫療法に使用するために開発されてきた。Schlesinger および Dubensky(1999)Curr Opin Biotechnol.5:434-439 および Zaksら(1999)Nat.Med.7:823-827を参照。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される局面では、ベクター構築体はレトロウイルスゲノムまたはその一部、および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する「レトロウイルス媒介性遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は、同一の意味を有しており、細胞に侵入し、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞内へ安定的に運搬される工程を意味する。ウイルスは、その通常の感染メカニズムを通して宿主細胞内に侵入、または細胞内に侵入するために異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドへ結合するように修飾され得る。本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入メカニズムを通して外因性核酸を細胞内へ導入できるウイルス粒子を意味する。
【００８２】
レトロウイルスは、それらの遺伝情報をRNAの形状で運ぶことができる;しかしウイルスがいったん細胞に感染すると、RNAは感染細胞のゲノムDNA内に組み込まれるDNAの形態へ逆転写される。組み込まれたDNAの形態はプロウイルスと呼ばれている。
【００８３】
遺伝子導入が例えばアデノウイルス(Ad)、偽アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス(AAV)のようなDNAウイルスベクターによって媒介される局面では、ベクター構築体はウイルスゲノムまたはその一部、および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。アデノウイルス(Ad)は、比較的明確に特徴付けられた、50種を超える血清型を含む同種ウイルス群である。例えば国際公開広報第95/27071号を参照。Adは容易に増殖するので、宿主細胞ゲノム内へ組み込む必要がない。組換えAd由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の能力を低下させる組換えAd由来ベクターもまた構築されている。国際公開広報第95/00655号および国際公開広報第95/11984号を参照。野生型AAVは宿主細胞ゲノム内へ組み込む高い感染性および特異性を有している。Hermonat  and  Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470およびLebkowskiら(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996を参照。
【００８４】
プロモーターおよびポリヌクレオチドを機能的に連結させることのできるクローニング部位の両方を含むベクターは当技術分野において周知である。このようなベクターはインビトロまたはインビボでRNAを転写することができ、例えばストラタジーン社(Stratagene、ラホーヤ、CA)およびプロメガ・バイオテック社(Promega  Biotech、マジソン、WI)のような供給元から市販で入手できる。発現および/またはインビトロ転写を最適化するために、クローンの5'および/または3'未翻訳部分の除去、付加、または変化させ、転写または翻訳のいずれかのレベルで、余分な潜在的に不適切な代替翻訳開始コドンまたはその他の発現を妨害もしくは減少させる可能性のある他の配列を除去することが必要な場合がある。あるいはまた、発現を増強させるためにコンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの5'の直後に挿入できる。
【００８５】
遺伝子送達賦形剤には、さらにDNA/リポソーム複合体、および標的とされたウイルスタンパク質DNA複合体を含む数種の非ウイルスベクターが含まれている。本発明の方法においてさらに標的とする抗体またはその断片も含むリポソームを使用できる。細胞への送達を強化するために、本発明の核酸またはタンパク質は、例えばTCR、CD3、またはCD4のような細胞表面抗原へ結合する抗体またはその結合断片へ共役させることができる。
【００８６】
「ハイブリダイゼーション」は、1つまたは複数のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を通して安定化されている複合体を形成する反応を意味する。水素結合は、ワトソン-クリック(Watson-Crick)塩基対合、フーグシュタイン(Hoogstein)結合、または任意の他の配列特異的方法によって発生しうる。この複合体は、二重鎖構造を形成する二本鎖、複数鎖複合体を形成する3本またはより多くの鎖、単一自己ハイブリダイジング鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいてよい。ハイブリダイゼーション反応は、例えばPCR反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素開裂のようなより広範な工程において段階を構成できる。
【００８７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には次が含まれる。約25℃〜約37℃のインキュベーション温度;約6XSSC〜約10×SSCのハイブリダイゼーションバッファー濃度;約0%〜約25%のホルムアミド濃度;および約6×SSCの洗浄溶液。中等度のハイブリダイゼーション条件の例には次が含まれる。約40℃〜約50℃のインキュベーション温度;約9×SSC〜約2×SSCのバッファー濃度;約30%〜約50%のホルムアミド濃度;および約5×SSC〜約2×SSCの洗浄溶液。高度にストリンジェントな条件の例には次が含まれる。約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1×SSC〜約0.1×SSCのバッファー濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1×SSC、0.1X  SSC、または脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は5分間〜24時間、1、2、または3回以上の洗浄段階、および洗浄インキュベーション時間は約1、2、または15分間である。SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸塩バッファーである。他のバッファー系を使用するSSCの等価物を使用できると理解されている。
【００８８】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドまたはポリペプチド領域)は、整列させて2つの配列を比較した場合塩基(またはアミノ酸)のパーセンテージが同一であることを意味する他の配列との一定のパーセンテージ(例えば、80%、85%、90%、または95%)の「配列同一性」を有している。この整列および相同性率もしくは配列同一性は、例えば「CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY」(F.M.Ausubelら編集、1987)補遺30、第7.7.18章、表7.7.1に記載されているように当技術分野で周知のソフトウエアプログラムを使用して決定できる。好ましくは、整列にはデフォルトのパラメーターを使用する。好ましい整列プログラムは、デフォルトパラメーターを使用するBLASTである。特に、好ましいプログラムは、次のデフォルトパラメーターを使用するBLASTNおよびBLASTPである。遺伝コード=標準; フィルター=なし; 鎖=両方; カットオフ（cutoff）=60; 予想=10; マトリックス=BLOSUM62; 記述=50； 配列; HIGH SCOREによるソート; データベース=非冗長性、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻訳+SwissProtein+SPupdate+PIL。これらのプログラムの詳細は次のインターネットアドレスで見出すことができる。www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。
【００８９】
本明細書で使用する「インビボ」遺伝子送達、遺伝子導入、遺伝子療法等は、外因性ポリヌクレオチドを含むベクターの例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物のような生体の身体内への直接的導入を意味する用語であり、それにより外因性ポリヌクレオチドはそのような生体の細胞へインビボで導入される。
【００９０】
用語「単離された」は、細胞およびさもなければポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が通常は結び付いている、構成要素から分離されたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離されたポリヌクレオチドは通常は染色体内で結び付いている5'および3'配列から分離されているポリヌクレオチドである。当業者には明白であるように、非天然型ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片はその天然型対応物から区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、1容積当たりの濃度または分子数がその天然型対応物と比較して「濃縮された」より大きい、または「分離された」より小さいことでその天然型対応物から区別できる。天然型対応物とその一次配列において、または例えばそのグリコシル化パターンによって相違する、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その一次配列によって、あるいは例えばグリコシル化パターンのような他の特徴によって天然型対応物から区別できるので、その単離した形態で存在する必要はない。本明細書に開示する発明の各々について明示的には言及しないが、下記に開示する適切な条件下での組成物各々についての上記の態様全てが、本発明によって提供されると理解されなければならない。従って、非天然型ポリヌクレオチドは単離された天然型ポリヌクレオチドとは別個の態様として提供される。細菌細胞内で産生するタンパク質は、細胞中でタンパク質を自然に産生する真核細胞から単離された天然型タンパク質とは別個の態様として提供される。
【００９１】
「宿主細胞」、「標的細胞」、または「レシピエント細胞」は、ベクターまたは外因性核酸分子、ポリヌクレオチドおよび/もしくはタンパク質取込みのためのレシピエントであり得るか、またはレシピエントであったことがある、任意の個々の細胞または細胞培養を含有することが意図されている。また、単一細胞の子孫を含有することも意図されており、その子孫は、自然の、偶発的、または意図的な変異を原因として、元の親細胞と(形態学的、またはゲノムもしくは全DNA相補性で)必ずしも完全に同一でなくともよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および例えばネズミ、ラット、サル、またはヒトのような哺乳動物細胞を含むが、それらに限定されない。
【００９２】
「被験者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、および愛玩動物を含むがそれらに限定されない。
【００９３】
「対照」は、比較する目的の実験において使用される代替被験者または試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が遺伝子の変化した発現レベルと特定タイプの癌との相関を判定することである場合は、一般には陽性対照(そのような変化を有し、その疾患に特徴的な症状を呈している被験者または被験者からの試料)、および陰性対照(変化した発現およびその疾患の臨床症状が欠如している被験者または被験者からの試料)を使用するのが好ましい。
【００９４】
互換的に使用され、単数形および複数形のいずれもある用語「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は、宿主生体に対して病理的になる悪性形質転換を受けた細胞を意味する。一次癌細胞(即ち、悪性形質転換部位の近くから入手された細胞)は、明確に確立された技術、特に組織学検査によって非癌細胞から容易に区別できる。本明細書で使用する癌細胞の定義には、一次癌細胞だけではなく、癌細胞祖先に由来する任意の細胞も含まれている。これには転移癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれている。通常は固形腫瘍として顕在化するタイプの癌について言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えばCATスキャン、磁気共鳴イメージング(MRI)、X線、超音波、または触診のような方法によって腫瘍塊に基づいて検出できる腫瘍である。生化学的または免疫学的所見単独では、この定義を満たすには不十分なことがある。
【００９５】
新生物は、組織の比較的に自律的な新規増殖によって産生した異常な塊または細胞コロニーである。ほとんどの新生物は、悪性形質転換を受けた単一細胞のクローン性増殖から発生する。正常細胞から新生細胞への形質転換は、細胞ゲノムを直接的かつ不可逆性に変化させる化学的、物理的、または生物学的物質(もしくは事象)によって誘発され得る。新生細胞は、一部の特殊機能の消失、および新規生物学的特性、最も重要には比較的に自律的な(制御されない)増殖の特性の獲得を特徴とする。新生細胞はそれらの遺伝性生物学的特徴を子孫細胞へ伝える。
【００９６】
新生物の過去、現在、および将来予測される生物学的挙動、または臨床経過はさらに良性または悪性と分類されるが、これは診断、治療、および予後において極めて重要な区別である。悪性新生物は極めて高度の自律性を明示し、侵襲および転移性に広がることができ、治療に抵抗性で、さらに死を誘発することがある。良性新生物は程度のより低い自律性を有し、通例は侵襲性ではなく、転移せず、さらに一般的には適切に治療されれば大きな傷害を生じさせない。
【００９７】
癌は、悪性新生物に対する一般的用語である。退形成は、癌細胞に特徴的な特性であり、正常な構造的および機能的特徴の欠如を意味する(未分化)。
【００９８】
腫瘍は、例えば炎症性または他の膨潤のような文字通りあらゆるタイプの膨潤であるが、現代の用法では一般に新生物を意味する。接尾辞「-oma(-腫瘍)」は腫瘍を意味し、通常は線維腫、脂肪腫、その他におけるような良性新生物を意味するが、ときにはいわゆる黒色腫、肝腫、および精上皮腫におけるような悪性新生物、または例えば血腫、肉芽腫、もしくは過誤腫のような非新生物病変をも表す。
【００９９】
接尾辞「-blastoma(-芽細胞腫)」は、例えば副腎の神経芽細胞腫または眼の網膜芽細胞種のような胚細胞の新生物を意味する。
【０１００】
組織発生とは、組織の起源であり、起源の組織細胞に基づいて新生物を分類する方法である。腺腫は腺上皮の良性新生物である。癌腫は上皮の悪性腫瘍である。肉腫は間充組織の悪性腫瘍である。
【０１０１】
新形成を分類する1つのシステムは、良性または悪性いずれであるかの生物学的(臨床的)挙動、ならびに組織学的および細胞学的検査によって決定されるような新生物の起源の組織または細胞である組織発生を利用する。新生物は、有糸分裂できる細胞を含有するほとんど任意の組織から発生する可能性がある。新生物の組織発生分類は、組織学的および細胞学的検査によって決定されるような起源の組織(または細胞)に基づいている。
【０１０２】
「抑制性」腫瘍増殖とは、本明細書に記載する抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞に接触していない場合の増殖と比較して縮小した増殖状態を示している。腫瘍細胞増殖は、腫瘍サイズの測定、腫瘍細胞が3H-チミジン取り込みアッセイ法を使用して増殖するかどうかの測定、または腫瘍細胞の計数を含むがそれらに限定されない当技術分野で周知の任意の手段によって評価できる。「抑制性」腫瘍細胞増殖とは、緩徐化、遅延化のいずれかまたは全部を意味し、「抑制性」腫瘍増殖は腫瘍増殖を停止させた場合の縮小している増殖状態および腫瘍収縮を意味している。
【０１０３】
用語「培養する」は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生体のインビトロ繁殖を意味する。培養中の細胞増殖の子孫は、親細胞と完全に(形態学的、遺伝学的、または表現型的に)同一ではなくてもよいと理解されている。「伸長された」は、細胞の任意の増殖または分割を意味する。
【０１０４】
「組成物」は、活性物質と例えばアジュバントのような不活性(例えば検出可能な物質または標識)または活性である、その他の化合物または組成物との組み合わせを意味する。
【０１０５】
「薬学的組成物」は、活性物質と、組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断的または治療的使用に適合させる不活性または活性の担体との組み合わせを含むことが意図されている。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、例えばリン酸緩衝食塩液、水、および例えば油/水型もしくは水/油型エマルジョンのようなエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤のような標準医薬用担体のいずれかを含む。組成物はさらにまた安定剤および保存料を含むことができる。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Martin,「REMINGTON'S PHARM.SCI.,15th Ed.」(Mack Publ.Co.,イーストン(1975))を参照されたい。
【０１０７】
「有効量」は、有益または所望の結果を達成するために十分な量である。有効量は1つまたは複数の投与、適用、または用量で投与できる。
【０１０８】
ペプチドリガンド化合物および組成物
本発明は次の構造を有する化合物を提供する。
【化４】
2005500812.tif 000002
または
【化５】
2005500812.tif 000003
または
【化６】
2005500812.tif 000004
【０１０９】
本発明はまた、MHC分子に結合し、同族天然抗原性エピトープおよびそれらの対応する天然タンパク質への免疫応答を調節するために有用である組成物を提供する。
【０１１０】
本発明は、さらに抗癌ワクチンの構成要素として、および差別的な、即ち異常な抗原CK-18の発現を特徴とする細胞に対して特異的である免疫エフェクター細胞を増大させるために有用である組成物を提供する。
【０１１１】
「CK-18関連癌または悪性腫瘍」は、抗原タンパク質の分化的発現が新生物表現型に対するマーカーとして機能する癌または悪性腫瘍である。CK-18抗原の分化的発現を示す癌のタイプの例には乳癌および肺癌が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１２】
ある態様では、本発明のリガンドは天然抗原性エピトープへのMHC結合に対して匹敵する、または増強した親和性を有する。ペプチド:MHCクラスI結合特性が免疫原性と相関することは証明されている(Sette, A.ら(1994)Immunol.153:5586;van der Burg,S.H.ら(1996)J.Immunol.156:3308)。本発明のリガンドのMHCクラスI分子への匹敵する結合は当技術分野において知られている方法によって測定でき、アルゴリズムに基づいて親和性を計算する方法(例えば、Parkerら(1992)J.Immunol.149:3580-3587を参照)および実験的に結合親和性を決定する方法(例えば、Tanら(1997)J.Immunol.Meth.209(1):25-36を参照)が含まれるがそれらに限定されない。例えば、クラスI分子へのペプチドの相対結合は、様々な濃度の被験ペプチド(例、100mM〜1nMの範囲内)を使用して、界面活性剤溶解MHC分子への放射標識標準ペプチドの結合に基づいて測定できる。MHCクラスI重鎖およびβ2-ミクログロブリンが固定濃度(例、5nM)の放射標識標準(対照)ペプチドおよび様々な濃度の被験ペプチドと共に適切な時間(例、2時間〜72時間)室温でプロテアーゼ阻害剤の混合物の存在下で共インキュベートされる。対照チューブは標準ペプチドおよびMHC分子を含むが、被験ペプチドを含んでいない。MHC結合放射能がゲル濾過によって測定される。IC50(対照ペプチドの結合の50%阻害を生じさせる被験ペプチドの濃度)が各ペプチドについて計算される。結合親和性を決定するさらなる方法は当技術分野において既知である。別の態様では、本発明のリガンドは天然抗原性エピトープに匹敵するまたは増強された抗原特異的T細胞活性化を誘発する。本発明のリガンドの免疫原性を決定する方法は当技術分野において知られており、al-Ramadiら(1992)J.Immunol.155(2):662-673;およびZuegelら(1998)J.Immunol.161(4):1705-1709に記載されている方法が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１３】
ある態様では、本発明の組成物は少なくとも1種、あるいは少なくとも2種、あるいは少なくとも3種の本発明の免疫原性リガンドを含む。ある局面では、そのような組成物は単一リガンドの2個またはより多くのコピーを含んでいてよい。また別の局面では、そのような組成物は2個またはより多くのリガンドを含んでいてよいが、このとき前記2個またはより多くのリガンドの各リガンドは前記組成物中のすべての他のリガンドとは別個である。ある態様では、2個またはより多くの免疫原性リガンドが共有結合している。
【０１１４】
本発明は、新規の抗原性ペプチド配列を提供し、これらは抗癌ワクチンの構成要素として、およびヒト癌抗原CK-18の分化的な発現を特徴とする細胞および癌細胞に対して特異的である免疫エフェクター細胞を増大させるために有用である。
【０１１５】
さらに用語「抗原性ペプチド」に含まれるのは、任意で配列番号：1、3、5、または7の配列を含む介在アミノ酸配列およびポリペプチドを含む本発明の抗原性ペプチドの多量体(鎖状体)である。本発明はまた、これらの配列を含むポリペプチドを提供するが、このときこれらのポリペプチドはヒト癌抗原CK-18細胞毒性Tリンパ球によって優先的に認識される。
【０１１６】
本発明のペプチド配列を含むポリペプチドは、天然ヒトCK-18ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの配列を変化させることによって調製できる。これは、当業者には周知の組換えDNA技術の方法によって遂行される。例えば、部位特異的突然変異は、ポリヌクレオチド配列に変化を導入するために天然ヒト癌抗原CK-18(配列番号：2)またはエピトープ(配列番号：8)をコードする組換えポリヌクレオチド上で実施されてよい。
【０１１７】
本発明のタンパク質およびポリペプチドは、例えばパーキン・エルマー/アプライド・バイオシステムズ(Perkin Elmer/Applied Biosystems,Inc.,フォスターシティ、CA、USA)製の430A型または431A型のような市販で入手できる自動ペプチド合成装置を使用した化学合成によって入手できる。合成されたタンパク質またはポリペプチドは沈降させて、さらに例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製できる。従って、本発明はさらにまた例えばアミノ酸および酵素のようなタンパク質および試薬の配列を提供し、適切な方向および直鎖状配列にあるアミノ酸と結合させることによって、本発明のタンパク質を化学的に合成する工程も提供する。
【０１１８】
あるいは、タンパク質およびポリペプチドは宿主細胞および下記で説明するベクター系を使用した本明細書で説明するような周知の組換え技術によって入手することもできる
【０１１９】
ペプチド類似体
当業者には、変化した特性を提供するために任意のペプチドに修飾を加えることができることは周知である。本明細書で使用する用語「アミノ酸」はグリシンおよびDもしくはL光学異性体両方を含む天然および/または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物のいずれをも意味する。3個またはより多くのアミノ酸からなるペプチドは、ペプチド鎖が短い場合は一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【０１２０】
本発明のペプチドは非天然アミノ酸を含むように修飾できる。従って、ペプチドは、ペプチドへ特別な特性を伝達するためにD-アミノ酸、D-およびL-アミノ酸の組み合わせ、ならびに様々な「デザイナー」アミノ酸(例、βメチルアミノ酸、C-αメチルアミノ酸、およびN-αメチルアミノ酸、等)を含んでいてよい。さらに、特異的結合段階で特異的アミノ酸を指定することによって、αへリックスβターン、βシート、γターンを備えるペプチドおよび環状ペプチドを生成できる。一般に、αらせん二次構造またはランダム二次構造が好ましいと考えられる。
【０１２１】
また別の態様では、有用な化学的および構造的特性を付与するペプチドのサブユニットが選択される。例えば、D-アミノ酸を含むペプチドは、インビボでL-アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性である。D-アミノ酸を用いて修飾された化合物は、本発明のペプチドをレトロインバーソ（retro-inverso）ペプチドとして作製するため逆の順序に整列されたアミノ酸を用いて合成できる。さらに、本発明はより明確に定義された構造特性を有するペプチドの調製、ならびに新規特性を備えたペプチドを調製するためのペプチド模倣物および例えばエステル結合のようなペプチド模倣結合の使用を想定している。別の態様は、減少させたペプチド結合、即ちR1-CH2NH-R2(式中、R1およびR2はアミノ酸残基または配列である)を組み込んだペプチドが生成されてよい。減少させたペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入されてよい。このような分子はペプチド結合加水分解、例えばプロテアーゼ活性に対して耐性であると思われる。このような分子は、例えば代謝性崩壊に対する耐性を原因とするインビボでの延長された半減期、またはプロテアーゼ活性のような独特の機能および活性を備えたリガンドを提供すると考えられる。さらに特定の系では拘束ペプチドが機能活性の強化を示すことが周知である。(Hruby(1982)Life Sciences 31:189-199およびHrubyら(1990)Biochem J.268:249-262);本発明はすべての他の位置においてランダム配列を組み込む拘束ペプチドを生成する方法を提供する。
【０１２２】
高次構造的な拘束を誘導する非古典的アミノ酸
下記の非古典的アミノ酸は、特定高次構造的モチーフを導入するために本発明のペプチド内に組み込まれてよい:1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシレート(Kazrnierskiら(1991)、J.Am.Chem.Soc.113:2275-2283);(2S,3S)-メチル-フェニルアラニン、(2S,3R)-メチル-フェニルアラニン、(2R,3S)-メチル-フェニルアラニンおよび(2R,3R)-メチル-フェニルアラニン(Kazmierski および Hruby(1991)Tetrahedron Lett.32(41):5769-5772);2-アミノテトラヒドロナフタレン-2-カルボン酸(Landis(1989)博士論文、アリゾナ大学);ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシレート(Miyakeら(1989)J.Takeda Res.Labs.43:53-76);ヒスチジンイソキノリンカルボン酸(Zechelら(1991)Int.J.Pep.Protein Res.38(2):131-138);ならびにHIC(ヒスチジン環状ウレア)、(Dharanipragadaら(1993)Int.J.Pep.Protein Res.42(1):68-77および((1992)Acta.Cryst.,Crystal Struc.Comm.48(IV):1239-1241)。
【０１２３】
下記のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物は、特異的二次構造を誘導するまたは有利にするためにペプチド内へ取り込まれてよい:LL-Acp(LL-3-アミノ-2-プロペニドン-6-カルボン酸)、βターン誘導ジペプチド類似体(Kempら(1985)J.Org.Chem.50:5834-5838);βシート誘導類似体(Kempら(1988)Tetrahedron Lett.29:5081-5082);βターン誘導類似体(Kempら(1988)Tetrahedron Lett.29:5057-5060);αヘリックス誘導類似体(Kempら(1988)Tetrahedron Lett.29:4935-4938);γターン誘導類似体(Kempら(1989)J.Org.Chem.54:109:115);次の参考文献によって提供された類似体:Nagai および Sato(1985)Tetrahedron Lett.26:647-650;およびDiMaioら(1989)J.Chem.Soc.Perkin Trans.p.1687;Gly-Alaターン類似体(Kahnら(1989)Tetrahedron Lett.30:2317);アミド結合同配体(Clonesら(1988)Tetrahedron Lett.29:38S3-38S6);テトラゾール(Zabrockiら(1988)J.Am.Chem.Soc.110:587S-5880);DTC(Samanenら(1990)Int.J.Protein Pep.Res.35:501:509); およびOlsonら(1990)J.Am.Chem.Sci.112:323-333およびGarveyら(1990)J.Org.Chem.56:436の中で教示された類似体。高次構造的に拘束されたβターンおよびβバルジの模倣物ならびにそれらを含有するペプチドは、Kahnへ1995年8月8日に発行された米国特許第5,440,013号に記載されている。
【０１２４】
抗原性ペプチド
本発明の抗原性ペプチドエピトープは様々な処方物において使用できるが、それは使用目的に依存して相違してよい。
【０１２５】
本発明の抗原性ペプチドエピトープは、様々な他の分子へ共有結合的または非共有結合的に結合(複合)されてよく、その性質は特定の目的に依存して相違してよい。例えば、本発明のペプチドは、天然および合成ポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド(アミノ酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、および脂質を含むがそれらに限定されない巨大分子担体へ共有結合的または非共有結合的に複合されることができる。ペプチドは、リポソーム内へ導入するために脂肪酸へ抱合されてよい。米国特許第5,837,249号。本発明のペプチドは、固体支持体と共に共有結合的または非共有結合的に複合されてよく、様々な固体支持体が当技術分野において既知である。本発明の抗原性ペプチドエピトープは、下記でより詳細に説明するように共刺激分子を含む、または含まない抗原提示マトリックスと結び付けられてよい。
【０１２６】
タンパク質担体の例は、スーパー抗原、血清アルブミン、破傷風トキソイド、オブアルブミン、チログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンを含むがそれらに限定されない。
【０１２７】
ペプチド-タンパク質担体ポリマーは、例えばカルボジミドのような従来型架橋剤を使用して形成しうる。カルボジミドの例は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド(CMC)、1-エチル-3-(3-ジメチアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)および1-エチル-3-(4-アゾニア-44-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。
【０１２８】
その他の適切な架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒド、および無水コハク酸である。一般に、ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性ハロゲン化アルキル、ホモ二官能性二硫化ピリジル、ホモ二官能性ハロゲン化アリール、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体、およびホモ二官能性光反応性化合物を含む多数のホモ二官能性物質のいずれかを使用できる。さらに、例えばアミン反応性およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物、アミン反応性および光反応性基を有する化合物、ならびにカルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性基を有する化合物のようなヘテロ二官能性化合物が含まれる。
【０１２９】
このようなホモ二官能性架橋剤の特別な例には、二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルであるジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、ジスクシンイミジルスベレート、およびジスクシンイミジルタルタレート;二官能性イミドエステルであるジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、およびジメチルスベリミデート;二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤である1,4-ジ-［3'(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサン、およびビス-N-マレイミド-1,8-オクタン;二官能性ハロゲン化アリールである1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンおよび4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロフェニルスルホン;例えばビス-［b-(4-アジドサリチルアミド)エチル］ジスルフィドのような二官能性光反応性物質;二官能性アルデヒドであるホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびアジプアルデヒド;例えば1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテルのような二官能性エポキシド;二官能性ヒドラジドであるアジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド;二官能性ジアゾニウムであるo-トリジン、ジアゾ化およびビス-ジアゾ化ベンジジン;二官能性ハロゲン化アルキルであるN1N'-エチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N1N'-ヘキサメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、N1N'-ウンデカメチレン-ビス(ヨードアセトアミド)、ならびに例えば各々a1a'-ジヨード-p-キシレンスルホン酸およびトリ(2-クロロエチル)アミンのようなハロゲン化ベンジルおよびハロマスタードが含まれている。
【０１３０】
ペプチドへのタンパク質の抱合を達成するために使用できる一般的なヘテロ二官能性架橋剤の例には、SMCC(スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、SIAB(N-スクシンイミジル（4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート)、SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、GMBS(N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル)、MPBH(4-(4-N-マレイミドポフェニル)ブチル酸ヒドラジド、M2C2H(4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシル-ヒドラジド)、SMPT(スクシンイミジルオキシカルボニル-a-メチル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、およびSPDP(N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)が含まれるがそれらに限定されない。
【０１３１】
架橋は、カルボニル基を還元アミノ化によってアミン基またはヒドラジド基へ結合させることによって遂行されてよい。
【０１３２】
本発明のペプチドは、さらにまたイオン性、吸着性、または生体特異的相互作用を通してのモノマーの非共有結合的付加として処方されてよい。ペプチドと高度に正電荷または負電荷分子との複合は、例えば脱イオン水中のような低イオン強度環境下での塩橋形成を通して実施されてよい。大きな複合体は、各々多数の負電荷および正電荷を含有する例えばポリ-(L-グルタミン酸)またはポリ-(L-リシン)のような電荷ポリマーを使用して作製できる。ペプチドの吸着は、架橋または化学重合タンパク質を効果的に模倣する非共有結合的関連ペプチドスーパー抗原複合体を形成する、例えば微粒子ラテックスビーズのような表面または他の疎水性ポリマーへ実施されてよい。最終的に、ペプチドは他の分子間の生体特異的相互作用の使用を通して非共有結合されてよい。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンまたはそれらの誘導体のようなタンパク質に対するビオチンの強力な親和性を利用するとペプチド複合体を形成することができる。これらのビオチン結合タンパク質は、溶液中のビオチンと相互作用できる、または別の分子へ共有結合的に付加できる4つの結合部位を含む。Wilchek(1988)Anal.Biochem.171:1-32。ペプチドは、タンパク質上で利用できるアミン基と反応する例えばD-ビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS-ビオチン)のような一般的ビオチン化試薬を使用してビオチン基を有するように修飾できる。ビオチン化ペプチドは、その後大きな複合体を作製するためにアビジンまたはストレプトアビジンと共にインキュベートできる。このようなポリマーの分子量は、アビジンまたはストレプトアビジンに対するビオチン化ペプチドのモル比を慎重に制御することを通して調節できる。
【０１３３】
さらに本出願によって、診断方法において使用するために検出可能な物質へ抱合された本明細書に記載するペプチドおよびポリペプチドが提供される。例えば、検出可能に標識されたペプチドおよびポリペプチドはカラムに結合することができ、抗体の検出および精製のために使用できる。これらはまた下記で説明する抗体を産生するための免疫原として有用である。
【０１３４】
本発明のペプチドはまた、例えば無菌または水性溶液、薬学的に許容される担体、懸濁液、ならびにエマルジョンのような様々な液相担体と組み合わせることができる。非水性溶剤の例は、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油を含む。抗体を調製するために使用した場合、担体は特異的免疫応答を非特異的に増強するために有用であるアジュバントをさらに含むことができる。当業者であれば、アジュバントが必要であるかどうかを容易に決定して1種を選択できる。しかし、例示する目的でのみ、適切なアジュバントは、フロイント(Freund)の完全および不完全アジュバント、鉱物塩、ならびにポリヌクレオチドを含むがそれらに限定されない。
【０１３５】
抗原性ペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに、配列番号：1、3、5、または7の配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドの相補体を提供する。本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド」には、DNA、RNA、および核酸模倣物が含まれている。これらのポリヌクレオチド、またはそれらの相補体に加えて、本発明は、例えば配列またはそれらの相補体へのアンチセンスRNAのようなアンチセンスポリヌクレオチド鎖をさらに提供する。配列番号：2、4、6または8に提供された配列を使用するとアンチセンスRNAを入手でき、その方法はVan der Krolら(1988)BioTechniques 6:958に記載されている。
【０１３６】
本発明のポリヌクレオチドはPCRを使用して複製できる。PCRテクノロジーは、米国特許第4,683,195号;第4,800,159号;第4,754,065号;および第4,683,202号の主題であり、「PCR:THE  POLYMERASE  CHAIN  REACTION」(Mullisら編集、Birkhauser Press,ボストン(1994))およびそこに言及される参考文献に記載されている。
【０１３７】
あるいは、当業者であれば本明細書に提供された配列および市販のDNA合成装置を使用してDNAを複製できる。従って、本発明はまたポリヌクレオチドの直鎖状配列、適切なプライマー分子、酵素のような化学物質、およびそれらの複製についての説明書を提供する段階、ならびにポリヌクレオチドを入手するためにヌクレオチドを適切な方向で化学的に複製または結合させる段階によって本発明のポリヌクレオチドを入手するための工程を提供する。別の態様では、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。さらにまた、当業者であれば複製および増幅のためにそのポリヌクレオチドを適切な複製ベクター内へ挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞(原核または真核)内へ挿入できる。このように増幅させたDNAは、当業者には周知の方法によって細胞から単離できる。この方法によってポリヌクレオチドを入手するための工程もまた本明細書に提供され、同様にしてポリヌクレオチドも入手される。
【０１３８】
RNAはまず最初にDNAポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内へ挿入することによって入手できる。DNAは例えば適切な遺伝子送達賦形剤(例、リポソーム、プラスミド、またはベクター)の使用またはエレクトロポレーションによるような任意の適切な方法によって挿入できる。細胞が複製し、DNAがRNA内に転写されると、RNAはその後、例えば上記のSambrookら(1989)に記載されているような当業者に周知の方法を用いて単離できる。例えば、mRNAはSambrookら(1989)上記参照に記載されている方法に従って様々な溶菌酵素もしくは化学薬品溶液を使用して単離、または製造業者によって提供される添付の取扱説明書に従い核酸結合樹脂によって抽出できる。
【０１３９】
少なくとも4個の連続するヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも5個または6個の連続するヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも10個の連続するヌクレオチドを有し、配列番号：1または7のペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補性または相同性である配列を示すポリヌクレオチドはハイブリダイゼーション用プローブとして有用である。
【０１４０】
当技術分野では、特異的ハイブリダイゼーションのためには「完全マッチ」プローブは必要とされないことが知られている。少数の塩基の置換、欠失、または挿入によって達成されるプローブ配列における小さな変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般に、20%塩基対ミスマッチ(最適に整列させたとき)は許容され得る。好ましくは、上記のmRNAを検出するための有用なプローブは、事前に特徴付けられた遺伝子に対応する以前に同定された配列に含まれる匹敵するサイズの相同領域と少なくとも約80%同一である。より好ましくは、プローブは相同領域の整列後に対応する遺伝子配列と85%同一である;いっそうより好ましくは、プローブは90%の同一性を示す。
【０１４１】
これらのプローブは、これらの細胞を含有する様々な細胞または組織を検出またはモニタリングするために放射標識測定法(例、サーザンおよびノーザンブロット解析)において使用できる。プローブはまた、例えば本発明の1つまたは複数のポリヌクレオチドに対応する遺伝子発現を検出するためにハイスループットスクリーニングアッセイ法において使用するチップのような固体支持体またはアレイへ付着させることができる。従って、本発明はさらに、ハイスループットスクリーニングにおいて使用するための固体支持体へ付着させた、上記に定義したような少なくとも1種のプローブおよび/またはこれらの配列の1つの相補体を提供する。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば宿主細胞内へのポリヌクレオチドの形質導入を確認するために、APCにおいて発現している遺伝子または遺伝子転写体を検出するためのプライマーとして機能できる。この状況では、増幅は合理的忠実度で標的配列を複製できるプライマー依存性ポリメラーゼを使用する任意の方法を意味する。増幅は、例えばT7 DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素のような天然または組換えDNAポリメラーゼによって実施できる。プライマーの好ましい長さは、上記のプローブに対して同定された長さと同一である。
【０１４３】
本発明はさらに、DNAまたはRNAの複製および/または一過性もしくは安定性発現のためのRNAの転写プロモーターおよび他の調節配列に機能的に連結された単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用する用語「機能的に連結された」は、プロモーターがRNA転写をDNA分子の外へ方向付けるような方法で配置されたことを意味する。このようなプロモーターの例は、SP6、T4およびT7である。特定の態様では、挿入されたポリヌクレオチドの細胞特異的発現のためには細胞特異的プロモーターが使用される。停止コドンおよび選択可能なマーカー配列、ならびに挿入されたDNAの破片がプロモーターに機能的に連結されることができるクローニング部位を含む、プロモーターまたはプロモーター/エンハンサーを含有するベクターは当技術分野で周知であり、市販で入手できる。一般的方法およびクローニング戦略については、「GENE  EXPRESSION  TECHNOLOGY」(Goeddel編集、Academic Press,Inc.(1991))およびその中で言及された参考文献、ならびにマップ、機能的特性、商業的供給業者、および様々な適切なベクターについてのGenEMBL登録番号の資料を含む「VECTORS:ESSENTIAL DATA SERIES(Gacesa および Ramji編集,John Wiley & Sons,N.Y.(1994)を参照されたい。好ましくは、これらのベクターはインビトロまたはインビボのRNAを転写できる。
【０１４４】
これらの核酸を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを作製するための宿主ベクター系を入手するために有用である。これらの発現ベクターは、染色体DNAのエピソームまたは不可欠な部分のいずれかとして宿主生体内で複製可能でなければならないことを意味している。適切な発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド等を含む。アデノウイルスベクターは、遺伝子をインビボで組織内に導入するために特に有用であるが、それはインビトロおよびインビボ両方におけるのそれらの高レベルの発現および細胞の効率的な形質転換のためである。核酸が適切な宿主細胞、例えば原核または真核細胞および宿主細胞複製物内に挿入されると、タンパク質を組換え的に産生させることができる。適切な宿主細胞はベクターに依存し、周知の方法を使用して構築された哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含むことができる。例えば上記のSambrookら(1989)を参照されたい。外因性核酸を細胞内へ挿入するためのウイルスベクターの使用に加えて、例えば細菌細胞に対する形質転換;哺乳動物細胞に対するリン酸カルシウム沈降法を使用したトランスフェクション;DEAE-デキストラン;エレクトロポレーション;またはマイクロインジェクションのような当技術分野で周知の方法によって核酸を宿主細胞内へ挿入できる。この方法については上記のSambrookら(1989)を参照されたい。従って、本発明はさらにタンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有している宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、動物細胞(ラットまたはマウス)、ヒト細胞、または例えば細菌細胞のような原核細胞を提供する。
【０１４５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを細胞内へ送達する(インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかであっても)ために適切な送達賦形剤を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、クローニングまたは発現ベクター内に含まれていてよい。これらのベクター(特に発現ベクター)は、例えば細胞内への送達および/または侵入を促進できる多数の形態のいずれかをとるために順に操作されてよい。
【０１４６】
ベクターがインビボまたはエクスビボにおける遺伝子療法のために使用される場合は、例えば複製不能レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターのような薬学的に許容されるベクターが好ましい。本発明の核酸を含有する薬学的に許容されるベクターは、さらに挿入されたポリヌクレオチドの一過性または安定性発現のために修飾できる。本明細書で使用する用語「薬学的に許容されるベクター」は、分化した細胞内へ核酸を選択的に標的として導入する能力を有するベクターまたは送達賦形剤を含むが、それらに限定されない。そのようなベクターの例は、感染した宿主細胞内でのベクターの広がりを妨げるウイルスタンパク質の産生不能によって定義された「複製不能」ベクターである。複製不能レトロウイルスベクターの例はLNL6(Miller, A.D.ら(1989)BioTechniques 7:980-990)である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介性遺伝子導入のために複製不能レトロウイルスを使用する方法は明確に確立されている(Correllら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86:8912;Bordignon(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8912-52;Culver K.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3155;およびRill D.R.(1991)Blood 79(10):2694-2700)。
【０１４７】
宿主細胞
本発明のポリヌクレオチドを含有するこれらの単離された宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え複製およびペプチドの組換え産生のために有用である。あるいは、細胞を使用して本明細書に記載する方法で被験者における免疫応答を誘導できる。宿主細胞が抗原提示細胞である場合、それらを使用により、次いで養子免疫療法において有用となる腫瘍浸潤リンパ球のような免疫エフェクター細胞の集団を増大させることができる。
【０１４８】
抗体
本発明によって、さらに本発明のポリペプチドと共に特異的に複合体を形成できる抗体も提供される。用語「抗体」には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれている。抗体は、マウス、ラット、およびウサギまたはヒト抗体を含むが、それらに限定されない。抗体は、ポリペプチドおよびそれらのポリペプチドを発現しているAPCを同定および精製するために有用である。
【０１４９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、ならびにそれらの対応する核酸配列を推定する実験方法については、当技術分野で周知である。上記のHarlow および Lane(1988)および(1999)ならびに上記のSambrookら(1989)を参照されたい。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質またはその断片を例えばマウスまたはウサギのような動物内へ導入することによって生物学的に産生できる。動物内で細胞を産生する抗体が単離され、骨髄腫細胞またはヘテロ骨髄腫細胞と融合させられると、ハイブリッド細胞またはハイブリドーマが産生する。従って、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞もまた提供される。
【０１５０】
従ってタンパク質またはその断片、および周知の方法を使用すれば、当業者はタンパク質またはポリペプチドに結合する能力を有する抗体について本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を産生およびスクリーニングできる。
【０１５１】
試験されているモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験されている抗体と本発明のハイブリドーマによって提供された抗体とは等価である。さらに過剰な実験を行わずに、試験されている抗体が、通常モノクローナル抗体が反応性であるタンパク質またはポリペプチドに本発明のモノクローナル抗体が結合するのを防止するかどうかを判定することにより、抗体が本発明のモノクローナル抗体と同一特異性を有しているかどうかを判定することも可能である。試験されている抗体が本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように本発明のモノクローナル抗体と競合する場合は、これら2種の抗体が同一または密接に関連するエピトープに結合すると思われる。あるいは、本発明のモノクローナル抗体をそれと通常は反応性であるタンパク質とを事前にインキュベートし、試験されているモノクローナル抗体の抗原に結合する能力が阻害されるかどうかを判定できる。試験されているモノクローナル抗体が阻害された場合は、ほぼ確実にそれが本発明のモノクローナル抗体と同一、または密接に関連するエピトープ特異性を有していると思われる。
【０１５２】
用語「抗体」はまた、すべてのアイソタイプの抗体を含むことが意図されている。モノクローナル抗体の特定アイソタイプは、初期融合から直接選択することによって調製するか、またはSteplewskiら(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8653またはSpiraら(1984)J.Immunol.Meth.74:307に記載されている方法を使用した、クラススイッチ変種を単離するための同胞選択技術を使用することによって相違するアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製できる。
【０１５３】
本発明はまた、上記に記載したポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生物学的活性断片も提供する。これらの「抗体断片」はその抗原または免疫原と選択的に結合する一部の能力を保持している。このような抗体断片は下記を含むことができるが、それらに限定されない。
(1)  Fab、
(2)  Fab'、
(3)  F(ab')2、
(4)  Fv、および
(5)  SCA
【０１５４】
「生物学的活性抗体断片」の特別な例は、抗体のCDR領域である。これらの断片を作製する方法は当技術分野において知られており、例えば上記のHarlow および Lane(1988)を参照されたい。
【０１５５】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体およびヒト化抗体を作製するために修飾できる(Oiら(1986)BioTechniques 4(3):214)。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖の様々なドメインが複数の種からのDNAによってコードされている抗体である。
【０１５６】
本発明のモノクローナル抗体の特異性を備えたモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離もまた、当業者であれば抗イディオタイプ抗体を産生することによって遂行できる(Herlynら(1986)Science 232:100)。抗イディオタイプ抗体は、対象とするハイブリドーマによって産生したモノクローナル抗体上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。
【０１５７】
2種のハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプ同一性は、2種のモノクローナル抗体が同一エピトープ決定基の認識に関して同一であることを証明する。従って、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体を使用することによって、同一エピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【０１５８】
さらにまた、エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するために抗イディオタイプテクノロジーを使用することも可能である。例えば、第1モノクローナル抗体に対して作られた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第1モノクローナル抗体によって結合されたエピトープの鏡像である超可変領域中に結合ドメインを有するであろう。従って、この例では、抗イディオタイプモノクローナル抗体はこれらの抗体を産生させるための免疫のために使用できる。
【０１５９】
本発明で使用する用語「エピトープ」は、本発明のモノクローナル抗体に対する特異的親和性を有する任意の決定基を含むことが意図されている。エピトープ決定基は、通常は例えばアミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な分子の表面分類から構成され、通常は特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有している。
【０１６０】
本発明の抗体は、検出可能な物質または標識へ結合させることができる。当業者には周知の極めて様々な異なる標識および標識方法がある。
【０１６１】
低分子量ハプテンへの抗体の結合は、アッセイ法の感受性を増加させることができる。ハプテンは、その後第2反応によって特異的に検出できる。例えば、一般には例えばアビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェリル、ピリドキサル、およびフルオレセインのようなハプテンを使用する。例えば、上記のHarlow および Lane(1988)および(1999)を参照されたい。
【０１６２】
本発明のモノクローナル抗体はまた、多数の相違する担体へ結合させることができる。従って、本発明はさらに抗体および活性または不活性である他の物質を含有する組成物を提供する。周知の担体の例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改質セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトを含む。担体の性質は本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者であればモノクローナル抗体に結合させるための他の適切な担体を知っている、または日常的実験を使用してそのような担体を突き止めることができる。
【０１６３】
抗体、その断片、または抗体を産生する細胞株を含有する組成物は、本発明に含まれている。これらの組成物を薬学的に使用しなければならない場合は、それらは薬学的に許容される担体と併用される。
【０１６４】
治療方法
また別の態様では、本発明はMHC分子に関連する本発明のペプチド、化合物、および組成物を送達する段階を含む免疫応答を誘導する方法を提供する。従って、本発明のポリペプチドは本明細書に記載する方法を使用して抗原提示細胞内へパルス（puls）できる。抗原提示細胞は、必要なMHC/共刺激分子を発現する樹状細胞(DC)、単球/マクロファージ、Bリンパ球、または他の細胞タイプを含むが、それらに限定されない。下記で説明する方法は、主として最も強力であるDC、好ましくはAPCに焦点を当てる。さらにポリペプチドまたはタンパク質を含有するこれらの宿主細胞が提供される。
【０１６５】
MHC分子関連する本発明のポリペプチドを提示する単離された宿主細胞は、抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を増大および単離するためにさらに有用である。免疫エフェクター細胞、例えば細胞毒性Tリンパ球は、未処理免疫エフェクター細胞をAPCの表面上のMHC分子と関連するポリペプチドを提示する抗原提示細胞と共に培養することによって産生する。この集団は当技術分野において知られている方法、例えばFACS解析またはフィコール勾配法を使用して精製できる。免疫エフェクター細胞およびそれにより産生した集団を生成および培養するための方法は本発明者の寄与および発明である。細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、養子免疫療法において有用である。インビボにおける投与の前に、免疫エフェクター細胞はそれらのCK-18を発現する細胞を溶解させる能力についてスクリーニングされる。
【０１６６】
ある態様では、免疫エフェクター細胞および/またはAPCは遺伝的に修飾される。標準の遺伝子導入法を用いて、共刺激分子および/または刺激サイトカインをコードする遺伝子は、免疫エフェクター細胞の伸長の前、同時、または後に挿入できる。
【０１６７】
本発明はまた、ポリペプチドに対して免疫応答を誘導する条件下で被験者に有効量のポリペプチドまたはその免疫原性部分投与する段階を含む、被験者において免疫応答を誘導する方法を提供する。ポリペプチドは、処方物中で、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与できる。ポリヌクレオチドは、遺伝子送達賦形剤中で、または順にコードされたポリペプチドを順に組換え的に転写、翻訳、およびプロセシングする宿主細胞内へ挿入することによって投与できる。このため薬学的に許容される担体中に本発明のポリヌクレオチドを含有する単離された宿主細胞は、有効なワクチン療法のために適切かつ有効量のアジュバント、サイトカイン、または共刺激分子と併用できる。ある態様では、宿主細胞は例えば樹状細胞のようなAPCである。宿主細胞は、有効量のサイトカインおよび/または共刺激分子のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドを挿入することによってさらに修飾できる。
【０１６８】
本発明の方法は、有効量のサイトカインまたは共刺激分子を被験者へ同時投与することによってさらに修飾できる。
【０１６９】
CK-18タンパク質の「免疫原性部分」はT細胞を抗原感作し、天然CK-18タンパク質または血清内に存在するCK-18特異的抗体に特異的に結合させることのできる部分である。本明細書に記載したタンパク質の免疫原性部分は、抗体結合アッセイ法において同定できる。このようなアッセイ法は、当業者に公知の例えば上記のHarlow および Lane、(1988)および(1999)に記載されているような多種多様な手段のいずれかを使用して一般的に実施される。例えば、免疫原性部分は血清内の抗体が不動化ポリペプチドへ結合するのを許容するために固体支持体(下記に説明するように)上で不動化させ、動物血清と接触させることができる。結合していない血清は除去され、結合した抗体は、例えば125I-標識タンパク質Aを使用して検出される。あるいは、免疫原性部分は血液、その他の試料液、細胞、または組織中のポリペプチドを検出する際に使用するためにモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を産生させるために使用される。
【０１７０】
本明細書に定義したCK-18タンパク質、ペプチドリガンド、または免疫原性部分は、さらに配列番号：1または7に示した配列の変種も含んでいる。本明細書で使用するポリペプチド「変種」は、ポリペプチドの抗原性特性および/または免疫原性特性が保持されるように、配列番号：1または7と保存置換および/または修飾においてのみ相違するポリペプチドである。配列番号：1または7の変種は、さらにまた配列番号：1または7のアミノ酸配列を修飾し、修飾ポリペプチドの免疫応答性を評価することによって同定できる。診断用結合物質を生成するために有用であるタンパク質およびポリペプチドに対し、変種は新生物細胞または組織、より詳細には卵巣および肺の存在または不在を検出する抗体を生成する能力について修飾ポリペプチドを評価することによって同定できる。このような修飾配列は、例えば本明細書に記載した代表的方法を使用して調製および試験できる。
【０１７１】
本明細書で使用する「保存的置換」は、ペプチド化学の分野における当業者であれば実質的には変化していないポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標性質を予想するように、アミノ酸が類似特性を有する他のアミノ酸と置換されている置換である。一般に、下記の群のアミノ酸は保存的変化を示す：(1)ala(アラニン)、pro(プロリン)、gly(グリシン)、glu(グルタミン酸)、asp(アスパラギン酸)、gln(グルタミン)、asn(アスパラギン)、ser(セリン)、thr(トレオニン);(2)cys(システイン)、ser、tyr(チロシン)、thr;(3)val(バリン)、ile(イソロイシン)、leu(ロイシン)、met(メチオニン)、ala、phe(フェニルアラニン);(4)lys(リシン)、arg(アルギニン)、his(ヒスチジン);および(5)phe、tyr、trp(トリプトファン)、his。変種はまた、ポリペプチドの抗原性特性、二次構造、および疎水性親水性指標性質に最小の影響しか及ぼさないアミノ酸の欠失または付加を含む他の修飾を含むことができる。例えば、ポリペプチドは共翻訳的または後翻訳的にタンパク質の移動を指令するタンパク質のN末端においてシグナル(またはリーダー)配列へ抱合させることができる。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製、もしくは同定を容易にするために（例えばポリ-His）、または固体支持体へのポリペプチドの結合を強化するためにリンカーまたは他の配列へ抱合させることができる。例えば、ポリペプチドは免疫グロブリンFc領域へ抱合させることができる。
【０１７２】
本発明のヌクレオチド、核酸、またはポリヌクレオチド「変種」は、配列番号：2もしくは8、または1つまたは複数のヌクレオチド欠失、置換、もしくは付加を有するその1部分と相違する配列である。このような修飾は、例えばAdelmanら(1983)DNA 2:183によって教示されているオリゴヌクレオチド特異的部位特異的突然変異誘発法のような標準突然変異誘発技術を使用して導入できる。ヌクレオチド変種は、天然型対立遺伝子変種、または非天然型変種であってよい。変種ヌクレオチド配列は、配列番号：2または8と好ましくは少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも約80%、および最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を示す。変種ヌクレオチド配列は、一般に高度にストリンジェントな条件下で列挙したヌクレオチド配列へハイブリダイズするであろう。
【０１７３】
診断方法
さらに本発明によって、罹患した被験者におけるCK-18関連癌または悪性腫瘍の進行、経過、または病期を検出、診断、予後診断、およびモニタリングする際に役立つ方法が提供される。本明細書で使用する用語「診断する」は罹患した被験者におけるCK-18関連癌または悪性腫瘍の進行、経過、または病期を検出、診断、予後診断、およびモニタリングすることを意味している。ある局面では、方法は細胞または組織から単離された試料中のCK-18タンパク質または抗体の分化発現を検出する段階を含み、このときタンパク質または抗体の存在および/または量は細胞または組織の新生物性状態の指標である。CK-18関連新形成は、発現またはタンパク質の発現が新生物性表現型のマーカーとして機能する新形成である。
【０１７４】
ある局面では、CK-18タンパク質または抗体の量は全身腫瘍組織量と相関する、即ち、発現したCK-18の量は疾患進行に伴って増加する、全身腫瘍組織量における減少に伴って減少する。対照試料中で観察されるレベルの少なくとも2倍のレベルでCK-18タンパク質の発現を示す試験試料は癌を指示していると考えられる。細胞または組織の試料は、遊離形で、または固体支持体へ付着させて提供することができ、組織培養物、市販で入手できる細胞株、患者生検試料から、または組織イメージングのための方法を使用した場合にはインビボで単離できる。
【０１７５】
ある局面では、この方法は、CK-18タンパク質をコードするmRNAまたはそのタンパク質自体をハイブリダイゼーションまたはPCRによって検出および/または定量することによって実施される。最新テクノロジーの向上はこの方法を可能にし、例えば検出は前記試料を前記CK-18mRNAを含む中等度または高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするプローブまたはプライマーを用いて試験することによって行う。ある局面では、プローブまたはプライマーは検出可能に標識されている。適切なプローブの例は、配列番号：2または8からなる群から選択される配列、およびそれらの相補体; 配列番号：1または7からなる群から選択されるペプチドをコードする核酸配列、およびそれらの相補体; ならびに配列番号：1または7に記載された配列をコードする核酸によってコードされたタンパク質の少なくとも9個の連続する残基、およびそれらの相補体を含むプローブまたはプライマーを含むがそれらに限定されない。
【０１７６】
別の局面では、CK-18発現は、CK-18タンパク質を特異的に認識して結合する物質を用いて試料を試験することによって検出および/または定量される。物質の例は、CK-18タンパク質を特異的に認識または結合する抗体およびその抗原結合断片である。本発明において、抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、これらは検出可能に標識されていてもいなくてもよい。抗体および抗原結合断片への様々な修飾は当技術分野において知られており、本発明の目的に含まれている。本明細書では実施例を記載する。この局面で使用するために適切なモノクローナル抗体は、配列番号：1または7からなる群から選択されるペプチドを用いて免疫された動物から調製する。抗原結合断片の例には、配列番号：1または7からなる群から選択されるペプチドを用いて免疫された動物から調製された抗体から単離された生物学的活性免疫グロブリン可変ドメインが含まれている。
【０１７７】
抗体を利用する方法は、本明細書に記載した周知の方法を適用して、インビトロまたはインビボで実践できる。
【０１７８】
別の局面では、物質は例えば配列番号：1、3、5、または7からなる群から選択されるペプチドの存在下でそれを使用して生じさせた免疫エフェクター細胞のようなCK-18タンパク質へ結合する細胞である。
【０１７９】
あるいは、異なるCK-18発現は、発現解析によってmRNAの同一性および発現レベルを決定し、例えばSAGE(米国特許第5,866,330号および第5,695,937号)のような発現解析のような方法を使用して、mRNAの配列および量を正常対照細胞または組織中の発現の配列および量と比較することによって検出および/または定量できる。
【０１８０】
さらに別の局面では、試料中のCK-18の存在および量は前記タンパク質を特異的に認識して結合する抗体によって決定および/または定量できる。本明細書に記載するような抗体結合パートナーは、この方法の局面において、および例えばウェスタンブロットのような当技術分野に周知の方法を改良することによって使用するために適切である。
【０１８１】
別の態様では、試料中に存在するCK-18の量の検出および解析が、被験者における疾患の進行、治療法への応答、または疾患再発をモニタリングするために繰り返される。この局面では、本明細書に記載するような検出/モニタリング方法は先行(対照)試料に引き続いて1回または複数回の時点に単離された1つまたは複数の試料について実施され、引き続く時点に検出されたタンパク質の量と先行(対照)試料で以前に検出された量とが比較される。
【０１８２】
さらに、本発明は本発明の組成物の活性を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。ある局面では、本発明は複数の条件下および被験物質の存在下でタンパク質を含有する試料およびリガンドを接触させ、タンパク質とリガンドとの間の何らかの結合を検出することによってCK-18タンパク質とそのリガンドとの結合を阻害する物質をスクリーニングするアッセイ法を提供し、結合の欠如はCK-18の結合を調節する物質の存在を示している。あるいは、本発明は複数の条件下および被験物質の存在下でタンパク質を含有する試料とリガンドとを接触させ、またタンパク質とリガンドとの間の何らかの結合を検出し、被験物質を含有していない対照試料と比較することによって、CK-18タンパク質とそのリガンドとの結合を増強させる物質をスクリーニングするために有用である。対照試料を超える結合の増強は、被験物質がCK-18とそのリガンドとの結合を増強する陽性指標である。結合の調節(増加または阻害)は、結合活性および親和性における変化を含む。
【０１８３】
例えば、このようなアッセイ法の1つは、哺乳動物細胞が正常に増殖する条件下で哺乳動物細胞を本発明の組成物および「試験化合物」および［3H］チミジンと接触させる段階を含む。対照アッセイ法は、「試験化合物」を含まずに実施し、「試験化合物」の存在下で細胞増殖の量と比較することにより、その化合物が増殖を刺激または阻害するかどうかを決定することができる。［3H］チミジンの取り込みは、標識の取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定できる。このアッセイ法を使用することによりアゴニストおよびアンタゴニスト化合物を同定できる。
【０１８４】
また別の実施例では、本発明のポリペプチドまたはペプチドに対する結合部位または決定基を発現する哺乳動物細胞または膜調製物が、「試験化合物」の存在下で本発明の標識ポリペプチドまたはペプチドと共にインキュベートされる。「試験化合物」の、ポリペプチドまたはペプチドとその結合部位との相互作用を増強または遮断する能力を測定することができる。さらに、「試験化合物」と結合部位との相互作用に続く既知の第2メッセンジャー系の応答を測定し、「試験化合物」の部位または決定基に結合して第2メッセンジャー応答を誘発する能力が測定でき、それにより「試験化合物」が潜在的アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定することができる。
【０１８５】
これらのアッセイ法は診断または予後マーカーとして使用できる。これらのスクリーニングアッセイ法を使用して発見された分子の使用により疾患を治療できる、またはポリペプチドまたは分子を活性化または阻害することにより患者に特定の結果を引き起こすことができる。
【０１８６】
従って、本発明は本発明のポリペプチド、ペプチド、変種、または類似体に結合する化合物を同定する、次の段階を含む方法を含む。(a)候補試験化合物を本発明のポリペプチド、ペプチド、変種または類似体と共にインキュベートする段階;および(b)結合が発生したかどうかを決定する段階。本発明はさらに、アゴニストおよび/またはアンタゴニストを同定する、次の段階を含む方法を含む。(a)候補試験化合物を本発明のポリペプチド、ペプチド、変種、または類似体と共にインキュベートする段階;(b)生物学的活性をアッセイする段階;および(c)前記生物学的活性が変化したかどうかを決定する段階。
【０１８７】
本明細書に記載した方法を実行するための診断キットもまた提供される。ある局面では、このキットはCK-18タンパク質を特異的に認識して結合する少なくとも1種の物質およびレポーター基を支持できる検出試薬とを含む。この物質として抗体を使用するときは、それらは溶液中にあっても、または例えばニトロセルロース、ラテックス、またはプラスチックのような固体支持体上で不動化されていてもよい。検出試薬の例には、抗免疫グロブリン、タンパク質G、タンパク質A、またはレクチンが含まれるが、それらに限定されない。レポーター基はキット内に提供されてよいが、必ずしも提供されなくてもよい。本方法において使用するために適切なレポーター基の例には、ラジオアイソトープ、蛍光基、発光基、酵素、ビオチン、および色素粒子が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８８】
これらのキットは、例えばプローブ、プライマー、CK-18特異的抗体、もしくは免疫エフェクター細胞のような上記で説明した1つまたは複数の結合物質、または例えば配列番号：1、3、5、もしくは7からなる群から選択されるペプチドを特異的に認識して結合するように生じさせ単離した抗体のような、CK-18特異的抗体を特異的に認識し、結合する物質を含む。取扱説明書もまた提供できる。
【０１８９】
例えば配列番号：1、3、5、または7の本発明のポリペプチドは、例えば新生物性細胞または組織を検出できる抗体またはその断片のような結合物質を生成するために、あるいは例えば乳癌または肺癌のようなCK-18タンパク質の発現に関連する新生物状態を有する動物または患者における疾患進行をモニタリングするために使用できる。本発明の結合物質は、本明細書に記載した代表的方法を含む、一般に当技術分野の当業者に既知の方法を使用して調製できる。結合物質は、本明細書に記載した代表的アッセイ法を使用して、CK-18タンパク質の発現および/または過剰発現に関連する新生物状態を伴う、または伴わない患者を区別できる。これを言い換えると、CK-18タンパク質またはその断片に対して生じた抗体またはその他の結合物質は、その疾患に罹患した患者における原発性または転移性癌の存在を示すシグナルを生じさせ、原発性または転移性疾患を有していない個体における疾患の欠如を示す陰性シグナルを生じさせると思われる。CK-18(配列番号：1)および配列番号：3、5、または7に示されているポリペプチドの適切な部分は、そのような新形成が指示されるであろう患者の実質的にすべて(即ち、少なくとも80%、および好ましくは少なくとも約90%)においてCK-18関連新形成の存在を示し、さらに全長タンパク質を用いて試験したときに陰性となるそれらの試料の実質的にすべてにおいてCK-18関連新形成の欠如を示す結合物質を生成できる。例えば2抗体サンドイッチアッセイ法のような下記に記載する代表的アッセイ法を使用により、結合物質のCK-18関連新形成を検出する能力を評価できる。
【０１９０】
本明細書に記載したようにCK-18関連新形成を検出できる抗体を生成するために調製されたポリペプチドの能力は、ポリペプチドに対して1つまたは複数の抗体を生じさせ、このような抗体が動物または患者における新形成を検出する能力を決定することによって評価できる。ある局面では、この決定は原発性または転移性CK-18関連新形成を有している、および有していない動物または患者からの生物学的試料を、生成された抗体へ結合するポリペプチドの存在についてアッセイすることによって行われる。このような試験アッセイ法は、例えば下記に記載する代表的方法を使用して実施できる。配列番号：1、3、5、または7に同定されたタンパク質もしくはポリペプチドに対して生じたポリペプチド特異的抗体、またはその断片を単独で、または組み合わせて使用することにより、感受性を向上させることができる。
【０１９１】
CK-18関連新形成を検出できるポリペプチドは、動物または患者における癌を診断するための、または疾患進行をモニタリングするための有用なマーカーである。ある態様では、これらの新形成は動物または患者から得た生物学的試料を評価し、規定のカットオフ値と比較した1つまたは複数の上記のポリペプチドのレベルを決定することによって診断される。本明細書で使用するような、適切な「生物学的試料」は血液、血清、尿、および/または分泌物を含む。
【０１９２】
1つまたは複数の本発明のCK-18タンパク質のレベルは、ポリペプチドに対して特異的な任意の結合物質を使用して評価できる。本発明に関連する「結合物質」は上記のようにポリペプチドへ結合する任意の物質(例えば化合物または細胞)である。本明細書で使用する「結合」は、「複合体」が形成されるような、2つの別個の分子(それらの各々が遊離(即ち溶液中にある)していても細胞または固体支持体の表面上に存在していてもよい)間の非共有結合的つながりを意味する。複合体は支持材料上で自由であっても不動化(共有結合的または非共有結合的のいずれかで)されていてもよい。結合する能力は、複合体を形成するための結合定数を決定することによって評価できる。結合定数は、複合体の濃度を構成要素の濃度の積で除することにより得られる値である。結合定数は、当業者に周知の方法を使用して決定される。
【０１９３】
上記の要件を満たす任意の物質は結合物質でありうる。例えば、結合物質はペプチド成分を含むもしくは含まないリボソーム、RNA分子、宿主細胞発現エピトープ、本明細書に記載したような免疫エフェクター細胞、またはペプチドであってよい。ある好ましい態様では、結合パートナーは抗体またはその断片である。抗体は、一本鎖、キメラ、CDRグラフト化、またはヒト化を含むがそれらに限定されないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体を生成する方法は、当業者には周知である。
【０１９４】
本発明はまた、上記のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、抗体、およびその断片、ならびに許容される固体もしくは液体担体のいずれかを含有する組成物を提供する。組成物が薬学的に使用される場合は、それらは診断的および治療的使用のために「薬学的に許容される担体」と組み合わされる。これらの組成物はさらに、例えば癌のような疾患の診断および治療のための薬剤を調製するためにも使用できる。
【０１９５】
下記の材料および方法は、限定することなく本発明を例示すること、ならびに上記の発明を作製および使用する方法を例示することが意図されている。
【０１９６】
材料および方法
本発明のポリペプチドの製造
最も好ましくは、本発明の単離されたペプチドは適切な固体状合成方法を使用して合成できる。Steward および Young,「SOLID  PHASE  PEPTIDE  SYNTHESIS」、フリーマントル、サンフランシスコ、カリフォルニア州(1968)。1つの好ましい方法は、メリフィールド(Merrifield)工程である。Merrifield(1967)Recent Progress in Hormone Res.23:451を参照。これらのペプチドの抗原活性は、例えば本明細書に記載したようなアッセイ法を使用して便宜的に試験できる。
【０１９７】
１度本発明の単離されたペプチドが得られると、クロマトグラフィー(例、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、差次的可溶性、またはタンパク質生成のための任意の他の標準技術を含む標準方法によって精製できる。免疫親和性クロマトグラフィーの場合は、エピトープはペプチド、または本発明の関連ペプチドに対して生じた、固定支持体へ付着させた抗体を含む親和性カラムへ結合させることによって単離できる。
【０１９８】
あるいは、例えばヘキサ-His(インビトロゲン（Invitrogen）製)、マルトース結合ドメイン(ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）製)、インフルエンザ外被配列(Kolodziejら(1991)Meth.Enzymol.194:508-509)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼのような親和性タグを本発明のペプチドへ付着させ、適切なアフィニティカラムを超えて通過させることによって容易な精製が可能になる。単離されたペプチドはまた、例えばタンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶学のような技術を使用して物理的に特徴付けることもできる。
【０１９９】
さらに本発明の範囲には、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性開裂、抗体分子、膜分子、または他のリガンドへの結合によって翻訳中または翻訳後に差次的に修飾される抗原性ペプチドが含まれる(Fergusonら(1988),Ann.Rev.Biochem.57:285-320)。
【０２００】
樹状細胞を含むAPCの単離、培養、および増大
下記はAPCの単離についての2種の基本的アプローチについての簡単な説明である。これらのアプローチは、(1)血液から骨髄前駆細胞(CD34＋)を単離し、それらを刺激してAPCへ分化させる段階;または(2)末梢血から前もって分化が決定付けられた(precommitted)APCを収集する段階を含む。第1アプローチでは、患者は末梢血中に多数の循環CD34＋幹細胞を追加免疫するために例えばGM-CSFのようなサイトカインを用いて治療されなければならない。
【０２０１】
APCを単離するための第2アプローチは、血液中で既に循環している比較的大量の前もって分化が決定付けられたAPCを収集することである。ヒト末梢血から分化が決定付けられたAPCを単離するための以前の方法はメトリザミド勾配および粘着/非粘着段階(Freudenthal  P.S.ら(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7698-7702);パーコール勾配分離(Mehta-Damaniら(1994)J.Immunol.153:996-1003);および蛍光活性化細胞選別法(Thomas R.ら(1993)J.Immunol.151:6840-6852)のような物理的方法に組み合わせを含んでいた。
【０２０２】
大量の細胞を相互に分離させる1つの技術は、向流遠心分離水簸法(CCE:countercurrent centrifugal elutriation)として知られている。この方法では、細胞は遠心分離と流速が持続的に上昇するバッファーの洗浄流とに同時に曝される。持続的に上昇するバッファーの向流は、主として細胞サイズに基づく分画細胞分離をもたらす。
【０２０３】
本発明のある局面では、APCは、例えばマウス、サル、またはヒトのような哺乳動物の白血球分画から単離できる、前もって分化が決定付けられた、または成熟した樹状細胞である(例えば、国際公開広報第96/23060号を参照)。白血球分画は、哺乳動物の末梢血由来でよい。この方法は次の段階を含む。(a)例えば白血球泳動(leukophoresis)のような当技術分野に知られている方法によって哺乳動物起源から入手された白血球分画を提供する段階;(b)交流遠心分離水簸法によって段階(a)の白血球分画を4つまたはより多くのサブフラクションへ分離する段階;(c)細胞をカルシウムイオノフォア、GM-CSFおよびIL-13、またはGM-CSFおよびIL-4と接触させることにより、段階(b)からの1つまたは複数の分画における単球の、樹状細胞への転換を刺激する段階;(d)段階(c)からの樹状細胞濃縮分画を同定する段階;ならびに(e)好ましくは約4℃で段階(d)の濃縮分画を収集する段階。樹状細胞濃縮分画を同定する1つの方法は、蛍光活性化細胞選別による。白血球分画は、例えば組換え(rh)rhIL-12、rhGM-CSF、またはrhIL-4のような他のサイトカインの存在下でカルシウムイオノフォアを用いて処理できる。白血球分画の細胞はバッファー中で洗浄し、分離段階前にCa＋＋/Mg＋＋非含有培地中に懸濁させることができる。白血球分画は、白血球分離採血法によって得られる。樹状細胞は次のマーカー:HLA-DR、HLA-DQ、またはB7.2のうちの少なくとも1種の存在、および次のマーカー:CD3、CD14、CD16、56、57、およびCD19、20の同時不在によって同定できる。これらの細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体は市販で入手できる。
【０２０４】
より詳細には、本方法は白血球分離採血法からの白血球および血小板の濃縮捕集物を収集し、これを次いで向流遠心分離水簸(CCE)によってさらに分画化する段階を必要とする(Abrahamsen, T.G.ら(1991)J.Clin.Apheresis.6:48-53)。細胞試料は特殊水簸ローター内に入れられる。ローターはその後、例えば3,000rpmのような一定速度で回転させる。ローターが所望速度に到達すると、加圧空気を使用して細胞の流速が制御される。水簸機中の細胞は、遠心分離および流速が持続的に上昇するバッファーの洗浄流とに同時に曝される。これは、排他的ではないが主として細胞サイズの相違に基づく分画別細胞分離を生じさせる。
【０２０５】
APCおよびより詳細にはDC収集の品質管理、ならびに培養中のそれらの良好な活性化の確証は、単球および樹状細胞小集団ならびに汚染している可能性があるTリンパ球の両方をモニタリングする同時多色FACS解析技術に依存する。これはDCが次のマーカーを発現しないという事実に基づいている： CD3(T細胞); CD14(単球); CD16、56、57(NK/LAK細胞); CD19、20(B細胞)。同時に、DCは、それらが血液中で循環している時点に大量のHLA-DR、有意なHLA-DQ、およびB7.2(しかしB7.1は小量または全く発現しない)を発現する(さらに、それらは単球および好中球によっても発現する脊髄マーカーである、Leu M7およびM9を発現する)。
【０２０６】
死細胞を解析するための第3呈色試薬であるヨウ化プロピジウム(PI)と組み合わせると、全細胞小集団を陽性同定できることが可能になる(表1参照)。
（表1）
新鮮末梢細胞小集団のFACS解析
2005500812.tif 000005
【０２０７】
追加の解析のために追加のマーカーを置換できる。
色#1:CD3単独、CD14単独等;Leu M7またはLeu M9;抗クラス1等。
色#2:HLA-DQ、B7.1、B7.2、CD25(IL2r)、ICAM、LFA-3等。
【０２０８】
収集時のFACS解析の目的は、好中球汚染をモニタリングするため、および適切なマーカーが発現されることを確認するために、予想される分画中でDCが濃縮されていること確証することである。臨床適用に適切なヒト末梢血からの濃縮DCのこの迅速なバルク収集は、絶対的に上記の品質管理のための解析FACS法に依存する。必要であれば、成熟DCはこの時点に「カクテル陰性」細胞についての蛍光選別によって単球から直ちに分離できる。下記で説明するように、単球自体はまだ培養物中でDCまたは機能的DC様細胞に分化できるので、単球からDCを常に分離することは必要ではない可能性がある。
【０２０９】
収集されると、DC濃縮/単球APC分画(通常は150〜190)は将来使用するためにプールおよび凍結保存する、または直ちに短期培養中に配置することができる。
【０２１０】
あるいは、他の研究者らは樹状細胞をアップレギュレート(活性化)し単球を活性化樹状細胞表現型へ転換するための方法を報告している。この方法は、単球を活性化樹状細胞へ転換する、培地へのカルシウムイオノフォアの添加を含む。例えば24〜48時間の培養期間の開始時におけるカルシウムイオノフォアA23187の添加は、プールされた「単球+DC」分画の一様な活性化および樹状細胞表現型転換を生じさせた。特徴的に、活性化集団は一様にCD14(Leu M3)陰性になり、HLA-DR、HLA-DQ、ICAM-1、B7.1、およびB7.2をアップレギュレートする。さらに、この活性化バルク集団は、その後さらに精製される少数基礎集団と同様に機能する。
【０２１１】
サイトカイン類の特異的な組合せは、カルシウムイオノフォアを用いて達成された活性化/転換のために増幅(または部分的に置換)させるために有効に使用されてきた。これらのサイトカインは精製または組換え(「rh」)rhGM-CSF、rhIL-2、およびrhIL-4を含むがそれらに限定されない。各サイトカインを単独で加えるのは、最適なアップレギュレーションのためには不適切である。
【０２１２】
APCへの抗原の提示
免疫のためには、抗原性ペプチド(配列番号：1、3、5、および7)は抗原提示細胞へタンパク質/ペプチドとして、またはタンパク質/ペプチドをコードするcDNAの形態で送達できる。抗原提示細胞(APC)は、必要なMHC/共刺激分子を発現する樹状細胞(DC)、単球/マクロファージ、Bリンパ球、またはその他の細胞タイプから構成できる。下記に記載する方法は、最も強力であるDC、好ましくはAPCに主に焦点を当てる。
【０２１３】
パルシング（pulsing）は、APCを本発明の抗原性タンパク質またはペプチドへ曝露させることによってインビトロ/エクスビボで遂行する。タンパク質またはペプチドは、1〜10μmの濃度で約3時間に渡りAPCへ添加する。パルスされたAPCは、引き続いて静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を通して宿主へ投与できる。
【０２１４】
タンパク質/ペプチド抗原もまたアジュバントと共に静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を通してインビボで送達できる。
【０２１５】
Pagliaら(1996)J.Exp.Med.183:317-322は、インビトロで全タンパク質と共にインキュベートされたAPCがMHCクラスI制限CTLによって認識されること、およびこれらのAPCを用いての動物の免疫がインビボで抗原特異的CTLの発達をもたらすことを証明した。加えて、例えばDCのようなAPCのサイトゾル中での抗原の発現をもたらした数種の異なる技術が記載されている。これらは、(1)腫瘍細胞から単離されたRNAのAPC内への導入、(2)抗原の内因性発現を誘導するために組換えベクターを用いたAPCの感染、および(3)リポソームを使用したDCサイトゾル内への腫瘍抗原の導入を含む。(Boczkowski, Dら(1996)J.Exp.Med.184:465-472;Rouseら(1994),J.Virol.68:5685-5689;およびNairら(1992)J.Exp.Med.175:609-612を参照)。
【０２１６】
フォスター（foster）抗原提示細胞
フォスター抗原提示細胞は、標的細胞として特に有用である。フォスターAPCは、内因性ペプチドと細胞表面MHCクラスI分子との関連を制限する抗原処理経路における変異を含む、T2と称されるヒト細胞株174xCEM.T2に由来する(Zweerinkら(1993)J.Immunol.150:1763-1771)。これはMHCクラスI制限CD8+CTLへの抗原提示のために必要である遺伝子TAP1、TAP2、LMP1、およびLMP2を含むMHCクラスII領域における大きなホモ接合体欠失に起因する。事実上、これらの細胞の表面上には「空の」MHCクラスI分子のみが提示される。培地へ付加された外因性ペプチドは、ペプチドが対立遺伝子特異的結合モチーフを含むことを条件にこれらのMHC分子へ結合する。これらのT2細胞は本明細書では「フォスター」APCと称される。それらは抗原を提示するために本発明と併せて使用できる。
【０２１７】
特異的組換えMHC対立遺伝子を用いたT2細胞の形質導入は、MHC制限プロフィールの方向変更を可能にする。組換え対立遺伝子に合わせて調整されたライブラリーは、アンカー残基は内因性対立遺伝子への効率的な結合を阻害するので、それらによって優先的に提示されるであろう。
【０２１８】
MHC分子の高レベル発現は、APCをCTLに対してより高度に可視化する。強力な転写プロモーター(例、CMVプロモーター)を使用したT2細胞中の対象とするMHC対立遺伝子の発現はより反応性の強いAPCを生じさせる(おそらく細胞表面上の反応性MHCペプチド複合体が高濃度であるために)。
【０２１９】
免疫原性アッセイ法
本発明のリガンドの免疫原性は、下記に例示するものを含むがそれらに限定されない周知の方法によって決定できる。ある態様では、このような方法を使用すると本発明のリガンドを対応する天然抗原性エピトープと比較することができる。
【０２２０】
51Cr遊離溶解アッセイ法。抗原特異的T細胞によるペプチドパルス51Cr標識ターゲットの溶解は、本発明のリガンドを用いてパルスされた標的細胞に対して比較できる。「より活性」であるリガンドは、時間の関数としての標的のより高度の溶解を示すと考えられる。固定時点(例、4時間)での溶解および総合的標的溶解の動態学は、リガンド性能の評価に利用できうる(Ware, C.F.ら(1983)J.Immunol.131:1312)。
【０２２１】
サイトカイン遊離アッセイ法。リガンドパルス標的に接触してT細胞が分泌するサイトカインのタイプおよび量の解析は、機能的活性の尺度とすることができる。サイトカインは、ELISAまたはELISPOTアッセイ法によって測定し、サイトカイン産生の速度および総量を決定することができる。(Fujihashi, K.ら(1993)J.Immunol.Meth.160:181; Tanquay, S. および Killion, J.J.(1994)Lymphokine Cytokine Res.13:259)。
【０２２２】
インビトロT細胞抗原感作。本発明のリガンドは、正常ドナーまたは患者由来PBMCからリガンド反応性T細胞集団を誘発する能力についてアッセイできる。このシステムでは、誘発されたT細胞を溶解活性、サイトカイン遊離、ポリクローナル性、および天然抗原性エピトープに対する交差反応性について試験できる。(Parkhurst, M.R.ら(1996)J.Immunol.157:2539)。
【０２２３】
トランスジェニック動物モデル。免疫原性は、HLA遺伝子組換えマウスに本発明のリガンドを用いてワクチン接種し、誘導された免疫応答の性質および大きさを決定することによってインビボで評価できる。あるいは、hu-PBL-SCIDマウスモデルは、ヒトPBLの養子移入によるマウスにおけるヒト免疫系の再構成を可能にする。これらの動物にリガンドを用いてワクチン接種し、上記のように免疫応答について解析できる。(Shirai, M.ら(1995)J.Immunol.154:2733; Mosier D.E.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2443)。
【０２２４】
増殖。T細胞は反応性リガンドに反応して増殖すると考えられる。増殖は、例えば3H-チミジンの取り込みを測定することによって定量的にモニタリングできる(Caruso, A.ら(1997)Cytometry 27:71)。
【０２２５】
4量体染色。MHC4量体に個々のリガンドをローディングし、それらの適切なエフェクターT細胞集団へ結合する相対能力について試験できる(Altman, J.D.ら(1996)Science 274:5284)。
【０２２６】
MHC安定化。T2細胞のような特定細胞株をHLA結合リガンドへ曝露させると細胞表面上のMHC複合体の安定化が生じる。細胞表面上のMHC複合体の定量は、安定化されているHLA対立遺伝子に対するリガンドの親和性と相関していた。従って、この方法を使用によりリガンドエピトープの相対HLA親和性を決定できる。(Stuber, G.ら(1995)Int.Immunol.7:653)。
【０２２７】
MHC競合。リガンドの、参照リガンドおよびその同族T細胞エフェクターの機能的活性を妨害する能力は、リガンドがMHC結合に対してどの程度良好に競合できるかについての尺度である。阻害の相対レベルを測定することは、MHC親和性の指標である(Feltkamp, M.C.ら(1995)Immunol.Lett.47:1)。
【０２２８】
霊長類モデル。近年報告された非ヒト霊長類(チンパンジー)モデル系の利用により、HLA制限リガンドのインビボ免疫原性をモニタリングできる。チンパンジーはヒトMHC分子と重複するMHCリガンド特異性を共有しているので、従って相対インビボ免疫原性についてHLA制限リガンドを試験することを可能にすることが証明されている(Bertoni, R.ら(1998)J.Immunol.161:4447)。
【０２２９】
TCRシグナル伝達事象のモニタリング。いくつかの細胞内シグナル伝達事象(例、リン酸化)には、MHCリガンド複合体による良好なTCRエンゲージメントが関連している。これらの事象の定性的および定量的解析は、TCR会合を通してエフェクター細胞を活性化するリガンドの相対能力と関連付けられてきた(Salazar E.ら(2000)Int.J.Cancer 85:829;Isakov N.ら(1995)J.Exp.Med.181:375)。
【０２３０】
本発明のポリペプチド、ペプチド、それらの変種、および類似体の活性を決定するための追加のアッセイ法は当技術分野において知られている。
【０２３１】
例えば、ポリペプチド、ペプチド、変種または類似体が抗体への結合について他のペプチドと競合する能力を決定するために、例えば放射免疫アッセイ法、ELISA、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、インサイチュー免疫アッセイ法、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、タンパク質Aアッセイ法、電気泳動アッセイ法その他のような技術を使用する競合的および非競合的アッセイシステムを含むがそれらに限定されない様々な免疫アッセイ法を使用できる。結合は、抗体捕捉アッセイ、抗原捕捉アッセイ法、および複数抗体サンドイッチアッセイ法を使用して検出することもできる。このようなアッセイ法において結合を検出する方法は当技術分野において知られている。
【０２３２】
免疫エフェクター細胞の増大
本発明は、これらのAPCを利用して抗原特異的免疫エフェクター細胞の濃縮集団の産生を刺激する。抗原特異的免疫エフェクター細胞は、培養中で死ぬAPCを使用して増大される。それによって未処理免疫エフェクター細胞が他の細胞によって抗原感作される工程は、本質的にはCoulie(1997)Molec.Med.Today 3:261-268に記載されている。
【０２３３】
上記の通りに調製されたAPCは、未処理免疫エフェクター細胞と混合される。好ましくは、細胞はIL-2のようなサイトカインの存在下で培養されてよい。樹状細胞は例えばIL12のような強力な免疫刺激性サイトカインを分泌するので、第1のおよび次に続く増大ラウンド中に追加的サイトカインの添加は不要となることがある。任意の事象において、培養条件は抗原特異的免疫エフェクター細胞がAPCよりはるかに高速に増大する(即ち、増殖する)条件である。APCおよび任意のサイトカインの、複数回注入の実施により、抗原特異的細胞の集団をさらに増大させることができる。
【０２３４】
ある態様では、免疫エフェクター細胞はT細胞である。別の態様では、免疫エフェクター細胞は例えばIL-2、IL-11、またはIL-13をコードする導入遺伝子を用いた形質導入によって遺伝的に修飾できる。インビトロ、エクスビボ、およびインビボで導入遺伝子を導入する方法は、当技術分野において周知である。上記のSambrookら(1989)を参照。
【０２３５】
遺伝子組換えにおいて有用なベクター
一般に、本発明で使用される細胞の遺伝子組換えは、異種または変化した抗原をコードするポリペプチドまたは導入遺伝子を含有するベクターを導入することによって遂行される。ウイルス系および非ウイルス系を含有する多様な異なる遺伝子導入ベクターを使用できる。本発明の遺伝子組換えにおいて有用なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ-レトロウイルスキメラベクターを含むがそれらに限定されない。APCおよび免疫エフェクター細胞は、下記に記載する方法を使用して、または当技術分野において既知の他の任意の適切な方法によって修飾できる。
【０２３６】
組換えアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターの構築
本発明の遺伝子組換えにおいて有用なアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは当技術分野において既に教示された方法に従って産生できる。例えば、Karlssonら(1986)EMBO J.5:2377;Carter(1992)Curr.Op.Biotechnol.3:533-539;Muzcyzka(1992)Current Top.Microbiol.Immunol.158:97-129;「GENE  TARGETING:A  PRACTICAL  APPROACH」(1992)編集 A.L.Joyner、オックスフォード大学出版、NY)を参照されたい。数種のアプローチは実現可能である。好ましいのはヘルパー非依存性複製欠損ヒトアデノウイルス系である。
【０２３７】
ヒトアデノウイルス2または5に基づく組換えアデノウイルスベクター(Virology 163:614-617(1988))にはアデノウイルスゲノム(通常はE1A/E1B)由来の必須初期遺伝子が含まれていないので、このためイントランス（in trans）で欠損遺伝子生成物を提供する許容細胞株において増殖させなければ複製することができない。欠損アデノウイルスゲノム配列の代わりに、対象とする導入遺伝子をクローニングして、複製欠損アデノウイルスを用いて感染させた細胞中で発現させてもよい。アデノウイルスに基づく遺伝子導入は宿主ゲノム内への導入遺伝子の組み込みを生じさせず(0.1%未満のアデノウイルス媒介性トランスフェクションが宿主DNA内への導入遺伝子組み込みを生じさせる)、このため安定性ではないので、アデノウイルスベクターは高力価で伝播させて非複製細胞をトランスフェクトできる。アデノウイルスE1A/E1B遺伝子を用いて形質転換されたヒト胚腎細胞であるヒト293細胞は、有用な許容細胞株を類型化する。しかしながら、複製欠損アデノウイルスベクターがその中に伝播するのを可能にする、HeLa細胞を含む他の細胞株を使用できる。
【０２３８】
本発明の方法において使用できるアデノウイルスベクターおよびその他のウイルスベクターについて記載した追加の参考文献には、次が含まれる：Horwitz M.S.「ADENOVIRIDAE AND THEIR REPLICATION,in Fields」 B.ら(編集)、VIROLOGY,Vol.2、Raven Press New York、pp.1679-1721(1990); Graham F.ら、「METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.7:GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS」、Murray E.(編集)Humana Press,Clifton,N.J.(1991)、pp.109-128; Miller, N.ら(1995)FASEB J.9:190-199; Schreier H.(1994)Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159; Schneider および French(1993)Circulation 88:1937-1942;Curiel, D.T.ら(1992)Hum.Gene Ther.3:147-154;Graham F.L.らの国際公開広報第95/00655号(1995年1月5日); Falck-Pedersen, E.S.の国際公開広報第95/16772(1995年6月22日); Denefle, P.らの国際公開広報第95/23867号(1995年9月8日);Haddada, H.らの国際公開広報第94/26914号(1994年11月24日); Perricaudet, M.らの国際公開広報第95/02697号(1995年1月26日); Zhang, W.ら国際公開広報第95/25071号(1995年10月12日)。様々なアデノウイルスプラスミドもまた、例えばオンタリオ州トロント所在のミクロビックスバイオシステムズ(Microbix Biosystems)社(例えばミクロビックス製品情報シート:アデノウイルスベクター構築用プラスミド、1996年を参照されたい)を含む商業的供給元から入手できる。さらに遺伝子組換えに使用できるアデノ-レトロウイルスキメラベクターの構築および使用を記載しているVileら(1997)Nature Biotechnology 15:840-841; およびFengら(1997)Nature Biotechnology 15:866-870による論文も参照されたい。
【０２３９】
本発明の方法において使用できるAAVベクターを記載している追加の参考文献には次のものが含まれている： Carter B. 「HANDBOOK OF PARVOVIRUSES」、Vol.I、pp.169-228、1990; Berns、「VIROLOGY」、pp.1743-1764(Raven Press 1990); Carter B.(1992)Curr.Opin.Biotechnol.3:533-539;Muzyczka, N.(1992)Current Topics in Micro.and Immunol.、158:92-129;Flotte, T.R.ら(1992)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356;Chatterjeeら(1995) Ann.NY Acad.Sci.770:79-90; Flotte, T.R.らの国際公開広報第95/13365号(1995年5月18日); Trempe, J.P.らの国際公開広報第95/13392号(1995年5月18日); Kotin, R.(1994)Hum.Gene Ther.5:793-801; Flotte, T.R.ら(1995)Gene Therapy 2:357-362;Allen J.M.の国際公開広報第96/17947号(1996年6月13日); およびDuら(1996),Gene Therapy 3:254-261。
【０２４０】
APCは、関連ポリペプチドをコードするウイルスベクターを用いて形質導入できる。最も一般的なウイルスベクターには、ワクシニアおよび鶏痘ウイルス(Bronteら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3183-3188; Kimら(1997)J.Immunother.20:276-286)のような組換えポックスウイルス、および優先的にはアデノウイルス(Arthurら(1997)J.Immunol.159:1393-1403;Wanら(1997)Human Gene Therapy 8:1355-1363;Huangら(1995)J.Virol.69:2257-2263)が含まれる。ヒトAPCの形質導入のためにはレトロウイルスもまた使用できる(Marinら(1996)J.Virol.70:2957-2962)。
【０２４１】
インビトロ/エクスビボでは、最小量の無血清培地内で16〜24時間に渡る感染多重度(MOI)500でのヒトDCのアデノウイルス(Ad)ベクターへの曝露は、90〜100%のDCにおいて導入遺伝子発現を確実に発生させる。DCまたはその他のAPCの形質導入の効率は、発現している腫瘍抗原に対して特異的な蛍光抗体を使用する免疫蛍光法によって評価できる(Kimら(1997)J.Immunother.20:276-286)。あるいは、この抗体は、基質との反応において呈色生成物を発生させる酵素(例、HRP)へ抱合させることができる。APCによって発現されている抗原性ポリペプチドの実際量はELISAによって評価できる。
【０２４２】
形質導入されたAPCは、引き続いて静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を通して宿主へ投与できる。
【０２４３】
DC、またはその他のAPCのインビボ形質導入は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚送達を含む異なる経路を介したAd(またはその他のウイルスベクター)の投与によって遂行できる。好ましい方法は、約1×1010〜1×1012i.u.の総用量を使用した複数の部位でのAdベクターの皮膚送達である。インビボ形質導入のレベルは、APCマーカーおよび発現しているTAAに対して向けられた抗体を用いた共染色によって大まかに評価できる。この染色方法は、投与部位からの生検試料に対して、または排液しているリンパ節もしくはAPC(特にDC)が移動した可能性があるその他の器官からの細胞上に対して実施できる(Condonら(1996)Nature Med.2:1122-1128およびWanら(1997)Hum.Gene Ther.8:1355-1363)。注射部位または形質導入されたAPCが移動した可能性がある他の器官で発現している抗原の量は、組織ホモジネート上でELISAによって評価できる。
【０２４４】
ウイルス遺伝子送達はより効率的であるが、DCはまたインビトロ/エクスビボで例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、またはカチオン性脂質/プラスミドDNA複合体のような非ウイルス遺伝子送達法によっても形質導入できる(Arthurら(1997),Cancer  Gene  Ther.4:17-25)。形質導入されたAPCは、引き続いて静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を通して宿主へ投与できる。
【０２４５】
DC、またはその他のAPCのインビボ形質導入は、潜在的に静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚投与経路を通して送達されたカチオン性脂質/プラスミドDNA複合体の投与によって遂行できる。裸のプラスミドDNAの、皮膚内への遺伝子銃送達または注射もまたDCの形質導入をもたらす(Condonら(1996)Nature Med.2:1122-1128;Razら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9519-9523)。プラスミドDNAの筋肉内送達は、免疫のためにも使用できうる(Rosatoら(1997)Hum.Gene Ther.8:1451-1458)。
【０２４６】
形質導入効率および導入遺伝子発現のレベルは、ウイルスベクターについて上記で記載したように評価できる。
【０２４７】
養子免疫療法およびワクチン
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞の増大した集団は、養子免疫療法およびワクチンとして利用される。
【０２４８】
養子免疫療法の方法は、ある局面では、上記のように未処理免疫エフェクター細胞をAPCと共に培養することによって作製された、抗原感作された抗原特異的免疫エフェクター細胞の実質的に純粋な集団を被験者に投与する段階を含む。好ましくは、APCは樹状細胞である。
【０２４９】
ある態様では、本明細書に記載した養子免疫療法は自家療法である。この場合、APCは単一被験者から単離された親細胞を使用して作製される。増大した集団はまた、被験者から単離されたT細胞も使用する。最後に、抗原特異的細胞の増大した集団が同一患者に投与される。
【０２５０】
また別の態様では、APCまたは免疫エフェクター細胞は例えばIL-2または共刺激分子のような有効量の刺激性サイトカインと共に投与される。
【０２５１】
本明細書でそれらの使用目的のために有効であると同定された物質は、CK-18を発現する腫瘍を有する被験者へ、および、または追加としてこのような腫瘍を発生することに感受性である、または危険性のある個体へ投与できる。この物質を例えばマウス、ラット、またはヒト患者のような被験者へ投与する場合には、この物質は薬学的に許容される担体へ添加し、全身性または局所性でその被験者へ投与できる。有益に治療され得る患者を決定するために、腫瘍退行をアッセイできる。治療量は、経験的に決定することができ、治療中の病理、治療中の被験者、ならびに治療の有効性および毒性に伴って変化するであろう。
【０２５２】
インビボ投与は、治療の経過を通して単回投与でも、持続的または間欠的にでも達成できる。投与の最も有効な手段および用量を決定する方法は当業者には周知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、治療中の標的細胞、および治療中の被験者に伴って変化するであろう。単回投与または複数回投与は、治療担当医師によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて実施できる。適切な投薬量の処方物およびこの物質を投与する方法は下記に記す。
【０２５３】
本発明の物質および組成物は、薬剤の製造ならびに例えば薬学的組成物中の有効成分のような従来型方法に従った投与によるヒトおよびその他の動物の治療において使用できる。
【０２５４】
より詳細には、本明細書では有効成分とも呼ばれる本発明の物質は、鼻腔、局所的(経皮的、エアロゾル、口腔内、および舌下を含む)、非経口(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む)および肺を含む任意の適切な経路によって治療のために投与できる。さらにまた、好ましい経路が受容者の状態および年齢、ならびに治療される疾患に伴って変動することは理解されるであろう。
【０２５５】
上記の考察および例は、単に技術を例示することが意図されている。当業者には明白であるように、上記に対しては本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更を加えることができる。
【国際公開パンフレット】
2005500812.tif 000009
2005500812.tif 000010
2005500812.tif 000011
2005500812.tif 000012
2005500812.tif 000013
2005500812.tif 000014
2005500812.tif 000015
2005500812.tif 000016
2005500812.tif 000017
2005500812.tif 000018
2005500812.tif 000019
2005500812.tif 000020
2005500812.tif 000021
2005500812.tif 000022
2005500812.tif 000023
2005500812.tif 000024
2005500812.tif 000025
2005500812.tif 000026
2005500812.tif 000027
2005500812.tif 000028
2005500812.tif 000029
2005500812.tif 000030
2005500812.tif 000031
2005500812.tif 000032
2005500812.tif 000033
2005500812.tif 000034
2005500812.tif 000035
2005500812.tif 000036
2005500812.tif 000037
2005500812.tif 000038
2005500812.tif 000039
2005500812.tif 000040
2005500812.tif 000041
2005500812.tif 000042
2005500812.tif 000043
2005500812.tif 000044
2005500812.tif 000045
2005500812.tif 000046
2005500812.tif 000047
2005500812.tif 000048
2005500812.tif 000049
2005500812.tif 000050
2005500812.tif 000051
2005500812.tif 000052
2005500812.tif 000053
2005500812.tif 000054
2005500812.tif 000055
2005500812.tif 000056
2005500812.tif 000057
2005500812.tif 000058
2005500812.tif 000059
2005500812.tif 000060
2005500812.tif 000061
2005500812.tif 000062
2005500812.tif 000063
2005500812.tif 000064
2005500812.tif 000065
2005500812.tif 000066
2005500812.tif 000067
2005500812.tif 000068
2005500812.tif 000069
2005500812.tif 000070
2005500812.tif 000071
2005500812.tif 000072
2005500812.tif 000073
2005500812.tif 000074
2005500812.tif 000075
2005500812.tif 000076
2005500812.tif 000077
2005500812.tif 000078
2005500812.tif 000079
2005500812.tif 000080
2005500812.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500812.tif 000082
【国際調査報告】
2005500812.tif 000083
2005500812.tif 000084
2005500812.tif 000085
2005500812.tif 000086
2005500812.tif 000087