(57)【要約】  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの公開されたゲノム配列は、１０００を超える推定コードタンパク質を明らかにするが、これ自体は、これらのどのタンパク質が、免疫化およびワクチン接種のための有用な抗原であり得るかまたは診断のためであり得るかを示さない。この困難性は、本発明によって取り組まれ、本発明は、ワクチン作製および開発のため、および／または診断目的のために適切な多くのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに起因する感染の処置または予防のための医薬の製造におけるタンパク質の使用であって、該タンパク質が、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号
１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９および配列番号２６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、または（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質である、使用。
【請求項２】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに起因する感染の処置または予防のための医薬の製造における核酸の使用であって、該核酸が、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０および配列番号２６２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸である、使用。
【請求項３】
および２４２、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、または（ｃ）（ａ）ヌクレオチド配列のフラグメントを含む核酸。
【請求項４】
請求項１または２に記載の使用であって、感染が、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ基本小体に対して特異的な免疫応答を誘発する医薬によって処置または予防される、使用。
【請求項５】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体を中和するための医薬の製造における、請求項１に記載のタンパク質または請求項２に記載の核酸の使用。
【請求項６】
免疫原性組成物であって、タンパク質およびアジュバントを含み、該タンパク質が、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号
１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９および配列番号２６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列に対して５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、または（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質である、免疫原性組成物。
【請求項７】
免疫原性組成物であって、核酸およびアジュバントを含み、該核酸が、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０および配列番号２６２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して５０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸、または（ｃ）（ａ）ヌクレオチド配列のフラグメントを含む核酸である、免疫原性組成物。
【請求項８】
医薬品としての使用のための、請求項５または請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
患者におけるＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染性を中和する方法であって、請求項５または請求項６に記載の組成物、あるいは請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体を、前記患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対して患者を免疫する方法であって、請求項５または請求項６に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体に特異的な抗体を惹起する方法であって、請求項５または請求項６に記載の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体を惹起する方法であって、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体を、該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
生物学的サンプルにおけるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体を検出するための方法であって、該サンプルを、請求項１に記載のタンパク質を認識する抗体と接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、クラミジア感染、特に、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｍａｔｉｓによる感染に対する免疫化の分野に存在する。
【０００３】
（背景技術）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、地域性の性感染症および種々の他の疾患症候群に寄与する真核生物細胞の偏性細胞内寄生生物である。これらは、排他的な真正細菌の分科を占め、他のいずれの既知の生物に対しても密接な関係を有さず、これらは、単一のファミリー（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を含むこれら独自の目（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類され、次いで単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａともいわれる）を含む。Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、これらの固有の生活環が特に特徴的であり、この生活環において、細菌は、２つの形態学的に別々の形態：細胞外感染性形態（基本小体、ＥＢ）と細胞内非感染性形態（網状体（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ  ｂｏｄｉｅｓ）、ＲＢ）との間で交替する。この生活環は、ＲＢのＥＢへの再編成で完了し、ＥＢは、引き続き、分裂した宿主細胞がさらなる細胞を感染する準備をさせておく。
【０００４】
４つのクラミジア種（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍおよびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）が現在知られており［例えば、参考文献１，２］、ゲノム配列は、公表されている［参考文献３〜９］。
【０００５】
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのヒトの血清改変体（「血清型亜型」）は、２つのバイオ改変体（「ｂｉｏｖａｒ」）に分けられる。血清型亜型Ａ〜Ｋは、主に眼の組織（Ａ〜Ｃ）または泌尿生殖器管（Ｄ〜Ｋ）において上皮性感染を誘発する。血清型亜型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、浸潤性の性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）の因子である。
【０００６】
クラミジア感染自体が疾患を生じるが、幾人かの患者においては、症候群の重篤度は、実際には、異常な宿主免疫応答に起因していると考えられる。感染を排除することの失敗は持続的な免疫刺激を生じ、そして宿主を助けることよりも、これは、重篤な結果（不妊および失明を含む）を伴う慢性感染を生じる［１０］。さらに、天然のクラミジア感染により与えられる防御は、通常、不完全で、一過性で、そして株特異的である。
【０００７】
疾患の深刻な性質に起因して、適切なワクチンを提供することが所望される。これらは、（ａ）クラミジア感染に対する、またはクラミジア誘導性疾患に対する免疫のために（予防ワクチン接種）、あるいは（ｂ）確立された慢性クラミジア感染の根絶のために（治療ワクチン接種）有用であり得る。しかし、細胞内寄生生物であることから、この細菌は、一般に抗体媒介免疫応答を逃れ得る。
【０００８】
種々の抗原性タンパク質が、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓについて記載されており、そして特に細胞表面が、詳細な検索の標的となっている［例えば、１，１１］。これらとしては、例えば、ｐｇｐ３［１２、１３、１４］、ＭＯＭＰ［１５］、Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）［１６］およびＨｓｐ７０（ＤｎａＫ様）［１７］が挙げられる。しかし、これらの全てが有効なワクチンであると証明されたわけではなく、そして、ワクチン開発における使用に適切な抗原および免疫原を提供するため、天然の感染の間に免疫応答を惹起するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原を同定することが本発明の目的である。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの診断（例えば、免疫診断）に有用な抗原を同定することは、さらなる目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
参考文献１８は、種々のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質を開示する。これらは、免疫反応性、免疫受容可能および／または基本小体に存在するとして、実験的に検証された。このタンパク質のこれらの性質は、ゲノム配列情報から推論できなかった。参考文献１８は、これらのタンパク質が、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが主要な病巣であるＣｈｌａｍｙｄｉａ細菌に起因する感染症の処置または予防に使用され得ることを開示する。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質はまた、種間交差反応性に起因する、他の種のＣｈｌａｍｙｄｉａによる感染症を処置または予防するために使用され得る。
【００１０】
全ゲノムの比較［３、４、５］によって示されるように、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓと密接に関連する。
【００１１】
本発明は、参考文献１８に開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質に対応するＣ．ｔｒａｃｏｍａｔｉｓタンパク質（配列番号１〜２６１の奇数番号）に関する。これらのタンパク質は、Ｃｈｌａｍｉｄｉａ細菌（特にＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓにおいて）に起因する感染症の処置および予防において使用され得る。特に好ましいタンパク質は、以前に「仮定タンパク質」として注釈されたもの（本明細書中の表Ｉを参照のこと）か、または細胞質位置を有すると考えられたものである。
（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質）
本発明は、アミノ酸配列（配列番号１〜２６１の奇数番号）のうちの１つ以上を含むタンパク質を提供する。
【００１２】
本発明はまた、１つ以上の配列番号１〜２６１の奇数番号のアミノ酸配列と少なくともｘ％配列同一性を共有する配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に依存して、ｘは、好ましくは、５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）である。これらは、変異体および対立遺伝子改変体を含む。代表的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的同等性の指標であると考えられる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、パラメーターのギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１を用いるアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるように、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【００１３】
本発明は、配列番号１〜２６１の奇数番号のアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質をさらに提供する。これらのフラグメントは、配列から少なくともｎ連続するアミノ酸を含むはずであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００以上）である。好ましくは、これらのフラグメントは、配列から１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、シグナルペプチドを省略する。
【００１４】
本発明のタンパク質は、種々の手段（例えば、化学合成（少なくとも一部）、プロテアーゼを用いるより長いポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば、組換え発現物、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ培養物）からの精製など）によって調製され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種発現は、好ましい調製用経路である。
【００１５】
本発明のタンパク質は種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）など）を取り得る。
【００１６】
本発明のタンパク質は、好ましくは、実質的に純粋な形態（すなわち、他のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓまたは宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）で調製される。
【００１７】
本発明のタンパク質は、固体支持体に結合され得る。これらは検出可能な標識（例えば、放射活性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。
【００１８】
本発明のタンパク質は、好ましくはＣｈｌａｍｙｄｉａｌタンパク質である。
【００１９】
（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ核酸）
本発明は、配列番号２〜２６２の偶数番号のヌクレオチド配列を含むタンパク質を提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号２〜２６２の偶数番号のヌクレオチド配列の１つ以上と少なくともｘ％配列同一性を共有する配列を含む核酸を提供する。特定の配列に依存して、ｘは、好ましくは、５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）である。
【００２１】
さらに、本発明は、偶数のヌクレオチド配列である配列番号２〜２６２を含む核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増す条件は、広く知られており、当該分野で公開されている。関連する条件の例としては、（ストリンジェンシーを増大させるために）以下が挙げられる：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度および他の緩衝液系を使用するそれらの等価物；０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度；５分〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれ以上の洗浄工程；１分、２分または１５分の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液濃度または脱イオン水。いくつかの実施形態において、本発明の単離された核酸は、低いストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズする；他の実施形態において、これは、中間のストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズする；他の実施形態において、これは、高いストリンジェンシー条件下で選択的にハイブリダイズする。低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５０℃および１０×ＳＳＣである。中間のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５℃、１×ＳＳＣである。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃および０．１×ＳＳＣである。
【００２２】
偶数のヌクレオチド配列である配列番号２〜２６２のフラグメントを含む核酸もまた、提供される。これらは、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ配列に由来する少なくともｎ個の連続した核酸ヌクレオチドを含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、１０、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００以上）である。
【００２３】
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラグメントをコードする核酸を提供する。
【００２４】
本発明が上記の配列に相補的な配列を含む核酸を（例えば、アンチセンスまたはプローブ化目的のために）提供する。
【００２５】
本発明の核酸は、もちろん、多数の方法で（例えば、化学合成によって（少なくとも一部）、より長いポリヌクレオチドを制限酵素を使用して消化することによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自体からなど）調製され得る。
【００２６】
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、直鎖状、環状、ベクター、プライマー、プローブなど）を採り得る。
【００２７】
本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライドガラス、樹脂など）に結合され得る。本発明の核酸は、検出可能な標識（例えば、放射活性標識または蛍光標識、あるいはビオチン標識）を含み得る。これは、核酸検出技術（例えば、その核酸が、プライマーであるか、またはＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡなどのような技術において使用するためのプローブとしてである場合）において使用される場合に特に有用である。
【００２８】
本発明の核酸は、好ましくは、クラミジア核酸である。
【００２９】
用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ（例えば、改変された骨格もしくは塩基を含むもの）、そしてまたペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【００３０】
本発明の核酸は、単離され得、そして実質的な純度で得られ得、一般的には、インタクトな染色体以外として得られ得る。通常ポリヌクレオチドは、実質的に他の天然に存在する核酸配列なしに得られ、一般には、少なくとも約５０％（重量で）純粋、通常は、少なくとも約９０％純粋である。
【００３１】
核酸は、例えば、以下のために使用され得る：ポリペプチドを生成するため；生物学的サンプル中の核酸の検出のためのプローブとして；ポリペプチドのさらなるコピーを生成するため；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため；および一本鎖ＤＮＡプローブとしてまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとしてなど。
【００３２】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそれで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３３】
（組成物）
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、好ましくは、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）であり、免疫およびワクチン接種の目的に適している。本発明のワクチンは、予防的または治療的であり得、そして代表的に、（ａ）クラミジア付着、（ｂ）クラミジア侵入、および／または（ｃ）宿主細胞内での首尾良い複製を阻害し得る抗体を誘導し得る抗原を含む。これらのワクチンは、好ましくは、宿主からのクラミジアクリアランスに必要である任意の細胞媒介性Ｔ細胞応答を誘導する。
【００３４】
本発明はまた、医薬としての（例えば、ワクチンとしての）使用のための本発明に従う核酸およびタンパク質を提供する。
【００３５】
本発明はまた、Ｃｈｌａｍｙｄｉａに起因する感染を処置または予防するための医薬（例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物）の製造における本発明に従う核酸またはタンパク質の使用を提供する。Ｃｈｌａｍｙｄｉａは、一般的にＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓであるが、種間交差反応に起因して、これはまた、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍ、またはＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉであり得る。予防のために、その医薬は、好ましくは、ＣｈｌａｍｙｄｉａのＥＢ形態に対して特異的な免疫応答を誘発する；処置のためには、その医薬は、好ましくは、ＣｈｌａｍｙｄｉａのＲＢ形態に対して特異的な免疫応答を誘発する。
【００３６】
本発明はまた、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ基本小体を中和するための医薬（例えば、ワクチンまたは免疫原性組成物）の製造において、本発明に従う核酸またえはタンパク質の使用を提供する。
【００３７】
本発明はまた、患者（例えば、ヒト）を処置（例えば、免疫化）する方法を提供し、この方法は、本発明に従う治療的に有効な量の核酸またはタンパク質を患者に投与する工程を包含する。
【００３８】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、本発明に従う免疫学的に有効な量の核酸またはタンパク質を患者に投与する工程を包含する。この免疫応答は、患者において抗体を惹起し、そして／または細胞性免疫応答（例えば、ＣＴＬ応答）を惹起することを包含する。この免疫応答は、ＥＢタンパク質またはＲＢタンパク質に特異的であり得るか、または宿主細胞質中で発現されるタンパク質に対して特異的であり得る。抗体応答は。好ましくはＥＢに対して特異的であるのに対して、細胞免疫応答は、好ましくは、細胞質タンパク質に対して、好ましくやＲＢタンパク質に対して特異的である。
【００３９】
本発明はまた、本発明のタンパク質を認識する抗体を惹起する方法を提供し、この方法は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａの基本小体または網様体を患者に投与する工程を包含する。この抗体は、好ましくは、ＥＢに特異的である。
【００４０】
本発明はまた、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染を中和するための方法を提供し、この方法は、本発明のタンパク質、核酸または抗体を患者に投与する工程を包含する。この方法は、好ましくは、ＥＢ感染性を中和する。
【００４１】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ＥＢまたはＲＢを検出するための方法を提供し、この方法は、このサンプルと、本発明の抗体とを接触させる工程を包含する。このサンプルは、血液サンプル、別の体液、または組織サンプルであり得る。この方法は、クラミジア感染を診断するために使用され得る。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物はまた、以下の抗原のうちの１つ以上を含み得る：
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原（例えば、ＶａｃＡ、ＣａｇＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ｛例えば、ＷＯ９８／０４７０２｝）および／またはウレアーゼ。
【００４３】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８０９−１８１５、Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８１６−１８２０およびＷＯ９６／２９４１２）であり、タンパク質「２８７」および誘導体は、特に好ましい。
【００４４】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物（例えば、ＷＯ０１／５２８８５；Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８（８７７５）：１０９３−１０９６；Ｆｕｋａｓａｗａら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２９５１−２９５８；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３などにおいて開示される）。
【００４５】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のサッカリド抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：６９１−６９８において開示された、血清群Ｃ由来のオリゴサッカリド｛Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１２５１−１２６３もまた参照のこと｝）。
【００４６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のサッカリド抗原｛例えば、Ｗａｔｓｏｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  １９：３３１−３３２；Ｒｕｂｉｎ（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ４７：２６９−２８５，ｖ；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６５：１８７−２０７｝。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）{例えば、Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ  補遺８：Ｓ６３〜６８および７９〜８０}。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原{例えば、Ｈｓｕら（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ３：９０１〜９１５}。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じてペルタクチンおよび／または凝集原２および凝集原３とも組み合わされる{Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ  ９：２３２−２３８}。
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド{例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９８８）の第３章ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編  ＩＳＢＮ  ０−７２１６−１９４６−０｝例えば、ＣＲＭ１９７変異体{例えば、Ｄｅｌ  Ｇｕｉｄｉｃｅら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９：１−７０}。
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド{例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの第４章}。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来のサッカリド抗原。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原{例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０}。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原｛例えば、ＰＣＴ／ＩＢ０１／０１４４５；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：１３９７−４０６；Ｓｈｉｒａｉら（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４；ＷＯ００／３７４９４｝。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原{例えば、ＷＯ９９／２８４７５}。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原｛例えば、Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：４１３５−４１４２｝。
−ポリオ抗原｛例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ４７：２８７−３０８；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ  Ｆａｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ５９：１１３−１１８，１２５−１２６｝（例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ）。
−狂犬病抗原｛例えば、Ｄｒｅｅｓｅｎ（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ  補遺１５：Ｓ２−６｝（例えば、凍結乾燥されて非活性化されたウイルス｛例えば、ＭＭＷＲ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ  １９９８  Ｊａｎ  １６；４７（１）：１２，１９；ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ｝。
−麻疹抗原、耳下腺炎抗原および／または風疹抗原{例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの９、１０および１１章}。
−インフルエンザ抗原{例えば、ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒの１９章}。（例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面蛋白質）。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原{例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９  補遺１：Ｓ１０１−１０７}。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原{例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２６４）：１２２５−１２４０；１２１８−１２１９頁もまた参照のこと}。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来の抗原｛例えば、ＷＯ０２／３４７７１を参照のこと｝。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｒａｅｓ由来の抗原｛例えば、ＷＯ０２／３４７７１を参照のこと｝。
【００４７】
サッカリド抗原または糖鎖抗原が含まれる場合、免疫原性を高めるために、その抗原は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合される｛例えば、Ｒａｍｓａｙら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ  ３５７（９２５１）：１９５−１９６；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７  補遺２：Ｓ２８−３６；Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）ＩＳＢＮ  ３８０５５４９３２６，特に１０巻：４８−１１４等｝。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素または細菌トキソイドである（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）。ＣＲＭ９７ジフテリアトキソイドが、特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質｛例えば、ＥＰ−０３７２５０１｝、合成ペプチド｛例えば、ＥＰ−０３７８８８１，ＥＰ−０４２７３４７｝、熱ショックタンパク質｛例えば、ＷＯ９３／１７７１２｝、百日咳タンパク質｛例えば、ＷＯ９８／５８６６８；ＥＰ−０４７１１７７｝、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ｛例えば、ＷＯ００／５６３６０｝、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ｛例えば、ＷＯ００／６１７６１｝などが挙げられる。任意の適切な結合反応が、必要に応じて任意の適切なリンカーと共に使用され得る。
【００４８】
毒素タンパク質抗原は、必要に応じて、解毒され得る（例えば、百日咳毒素の解毒は、化学的手段および／または遺伝的手段による）。
【００４９】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原をも含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原をも含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原をも含むことが好ましい。
【００５０】
抗原は、好ましくはアルミニウム塩に吸着される。
【００５１】
組成物中の抗原は、代表的には、各々少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するのに十分である。
【００５２】
本発明はまた、本発明の２つ以上のタンパク質を含む組成物を提供する。
【００５３】
（プロセス）
本発明は、本発明のタンパク質を産生するプロセスを提供し、このプロセスは、タンパク質発現を誘導する条件下で、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００５４】
本発明は、本発明のタンパク質または核酸を生成するプロセスを提供し、ここで、このタンパク質または核酸は、化学的手段を使用して一部または全体的に合成される。
【００５５】
本発明は、サンプル中のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを検出するためのプロセスを提供し、ここで、このサンプルは、本発明のタンパク質に結合する抗体と接触される。
【００５６】
本発明を実行するために（例えば、免疫化について開示される配列を利用するために）使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下の通りである。この要約は、本発明を制限するのではなく、むしろ使用され得る実施例を示すが、必要とされない。
【００５７】
（概要）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版（１９８９）および第３版（２００１）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ｉｉ（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編  １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編  １９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）。
【００５８】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使用される。
【００５９】
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえを含む。
【００６０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに付加したものも含み得る。
【００６１】
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるときのように、それらは共に機能し得る。別の例は、クラミジア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられる同じタンパク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
【００６２】
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始または調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
【００６３】
「変異体」配列は、ネイティブの配列または開示された配列とは異なるが配列同一性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、ネイティブの配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出して６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸分子配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の同じ遺伝子座で本質的に生じる、核酸分子、または領域および、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子、または領域である。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
【００６４】
（発現系）
クラミジアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され得る。
【００６５】
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する｛Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版｝。
【００６６】
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターが挙げられる。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得る、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞においてグルココルチコイドで誘導され得る。
【００６７】
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、相同性プロモーターまたは異種プロモーターに連結されるとき、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反対（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離に位置するとき、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらが通常、より広い宿主範囲を有するので、特に有用であり得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７）。
【００６８】
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
【００６９】
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントおよび外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス３部分からなるリーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
【００７０】
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３’ｅｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を指示し、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写終結／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【００７１】
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位および受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物の複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
【００７２】
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。
【００７３】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定しない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
【００７４】
（ｉｉ  バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方を含む転移ベクター（通常は細菌プラスミド；転移ベクター内のバキュロウイルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地。
【００７５】
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓならびにＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下、「Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
【００７６】
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するの前に、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築される。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、クローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持されることを可能にする。
【００７７】
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計され、これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
【００７８】
そのプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および大腸菌においての選抜ならびに増殖のための複製起点を含む。
【００７９】
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有する。この転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され得るか、あるいは構成的であり得る。
【００８０】
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
【００８１】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質についての遺伝子から由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞に認識されると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されると思われるので、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
【００８２】
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
【００８３】
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントからなる、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードしている。
【００８４】
タンパク質の前駆体である発現産物をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入物は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る；挿入物はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内にあり得る。Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ４；９１。発現ベクター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ配列は、ポリへドリン特異的配列により５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへドリンプロモーターの下流に位置される。
【００８５】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）；従って、同時トランスフェクション後に産生されたウイルスの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、方法には、組換えウイルスの同定が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそれは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
【００８６】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
【００８７】
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上記）を参照のこと。
【００８８】
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖し、その改変した昆虫宿主内に存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環し、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を補給する必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中に分泌されたか、または昆虫細胞の溶解物から生じた任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を提供する。
【００８９】
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
【００９０】
（ｉｉｉ  植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号のような特許に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現の別の例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加え、以下に示すものの中においても確認される；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ  ５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ  １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ  Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編  １９８４  Ｐｉｔｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に確認され得る。他の代謝調節性遺伝子が記載される参考文献は以下である；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
【００９１】
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセットの中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する所望の発現ベクターの中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のものであり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換については、アグロバクテリウム媒介転位のためのＴ  ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が容易に検出に従順しない場合は、好ましくは、その構築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
【００９２】
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするのに適した配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換えのためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。別の機能をコードしている他のＤＮＡ配列もまた、そのベクターの中に存在し得、当該分野で公知である。
【００９３】
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットである。組換え発現カセットは、異種タンパクのコード配列に加え、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどうかに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの５’および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
【００９４】
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、そのタンパク質の適切なプロセッシングおよび輸送を可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。翻訳開始領域は、大部分は、発芽中に発現および輸送される遺伝子のためのものであるから、輸送を提供するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた、目的のタンパク質の輸送を提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞から輸送され、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過する。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌される必要がない場合、このことは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
【００９５】
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのような、宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構により、プロセッシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、仮性イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失することを防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ  ４１：９５−１０５（１９８５）。
【００９６】
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いて植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝子物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸部分の導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の物体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体とのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
【００９７】
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在中でエレクトロポレート（電気穿孔）される。高い電界の強さの電気インパルス（衝撃）により、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルス形成する。
【００９８】
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、これによって移入した遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、さとうきび、甜菜、綿、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない培養細胞あるいは組織から再生され得る。いくつかの適応した植物としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔｕｓ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｍａｎｉｈｏｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，Ｒａｐｈａｎｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔｕｒａ，Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，Ｓｏｌａｎｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，Ａｓｐａｒａｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎｅｍｅｓｉａ，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ，Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕｃｕｍｉｓ，Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
【００９９】
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織は形成され、そしてシュート（苗条）がカルスから誘導され得、続いて発根される。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特にコーン（穀草）およびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通常、同時に発生する。効果的な再生は培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして繰り返し可能である。
【０１００】
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され、あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のない不完全な種子または他の植物組織は、機械的に破壊され細胞間および組織間の任意の分泌されたタンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁され、可溶タンパクを回収し得る。次いで、慣用的なタンパク質分離および精製方法は組換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターは、慣用的な方法によって、異種タンパク質の発現および回収を最適化するように調整される。
【０１０１】
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、ＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複している。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、そのため特定の遺伝子の転写を抑制し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベーター（活性化因子）タンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、異化（カタボライト）活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。それゆえ、調節される発現は、正または負のいずれかであり得、従って転写を増強するかまたは低下し得るかのいずれかである。
【０１０２】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６号およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
【０１０３】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、ある細菌（バクテリア）あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別のバクテリアあるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する。（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくらかの遺伝子の高いレベルでの発現を生じるために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２６７８５１）。
【０１０４】
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’側との間の塩基対形成によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子および原核遺伝子の発現のためには（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）。
【０１０５】
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２１９２３７）。
【０１０６】
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内在性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結し得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するための切断酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例としては、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するための切断酵素（例えば、ユビキチン特異的切断プロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、天然外来タンパク質は分離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６９８）。
【０１０７】
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位がある。
【０１０８】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質に関する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４２）。
【０１０９】
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例は、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列を含む。
【０１１０】
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可能である染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに保持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、このことによって、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能になる。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
【０１１１】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０  １２７  ３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【０１１２】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
【０１１３】
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成され得る。
【０１１４】
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−０  ０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ７７６、ＥＰ−Ａ−０  １３６  ８２９およびＥＰ−Ａ−０  １３６  ９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許第４，７４５，０５６号）。
【０１１５】
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０  ０３６  ２５９およびＥＰ−Ａ−０６３  ９５３；ＷＯ  ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「ＣｏｌＥ１由来のプラスミドによるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの形質転換のための改良された方法」Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓの形質転換」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
【０１１６】
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節された（誘導できた）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させるかのいずれかであり得る。
【０１１７】
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−０  ２８４  ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０  ３２９  ２０３）。酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１）。
【０１１８】
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０  １６４  ５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける細菌の抗生物質耐性遺伝子の発現」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ  １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
【０１１９】
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
【０１２０】
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０  １９６  ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、プロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼが）外来タンパク質からユビキチンを切断するための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法により、ネイティブ外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
【０１２１】
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
【０１２２】
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ−００１２８７３；ＪＰＯ６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許第４，５８８，６８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（ＥＰ−Ａ−００６００５７）。
【０１２３】
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るα因子フラグメントの型は、完全長の、プレ−プロα因子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０  ３２４  ２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
【０１２４】
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする転写終結配列である。
【０１２５】
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば保持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において保持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０、そしてより好ましくは少なくとも約２０を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
【０１２６】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、産生される組換えタンパク質のレベルにおそらく影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
【０１２７】
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子（例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７）、ならびにＧ４１８耐性遺伝子（それぞれ、酵母細胞がツニカマイシンおよびＧ４１８に耐性になるようにする）を含み得る。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）。
【０１２８】
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持される選択マーカーから構成されるか、または組み込みベクターへと構築されるかのいずれかである。
【０１２９】
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
【０１３０】
外来ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処理されたインタクトな酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
【０１３１】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチドおよび／または核酸を含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【０１３２】
本明細書において使用される用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の情況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
【０１３３】
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１３４】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を与えられる個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導せず、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、遅く代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
【０１３５】
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用可能である。
【０１３６】
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
【０１３７】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１３８】
その組成物の直接送達は、一般的に、皮下に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュールであり得る。
【０１３９】
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【０１４０】
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原因子からの毒素）と結合体化され得る。
【０１４１】
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントとしては、（１）アルミニウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、（２）ｏ／ｗエマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）が挙げられるが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてミクロン未満の粒子へと処方されたＭＦ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈの第１０章、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；（ｂ）ミクロン未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）好ましくはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質である。ミョウバンおよびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【０１４２】
上記で言及したように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１４３】
免疫原性組成物（例えば、免疫抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このようなビヒクルにおいて存在し得る。
【０１４４】
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物として、注射剤として調製され；注射前に液体ビヒクル中の溶液または懸濁物として適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
【０１４５】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」とは、その量の個体への投与が、単回用量であれ、一連の（用量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、そのワクチンの処方物、処置する医師の医療的状況の評価、および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲に入り、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
【０１４６】
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）のいずれかでの注射による）（（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）に投与される）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。
【０１４７】
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンを使用し得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８；本明細書中後半部を参照のこと）。
【０１４８】
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは外因性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
【０１４９】
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８−１５３を参照のこと。
【０１５０】
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを意図する。これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）多栄養性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｏｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
【０１５１】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
【０１５２】
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みについて構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
【０１５３】
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
【０１５４】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスベクターは、寄託機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
【０１５５】
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターは、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同４，４０５，７１２号、同４，８６１，７１９号、同４，９８０，２８９号、同４，７７７，１２７号、同５，５９１，６２４号に記載されるものを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １もまた参照のこと。
【０１５６】
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものを含む。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ  １２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒ  米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ  米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅ  米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎ  ＷＯ９４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同５，１７３，４１４号、同５，１３９，９４１号、および同５，２５２，４７９号に記載される。
【０１５７】
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ｌａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１−１９に記載されるＨＳＶ  Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｅｄ）に記載されるＨＳＶ  ７１３４、２ＲＨ  １０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ  ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
【０１５８】
意図されるのはまた、本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベクターである。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）および米国特許第５，００９１，３０９号、同５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるそれらのαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルスは、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性が減少したαウイルスベクターを使用する（米国特許仮出願０８／６７９６４０号を参照のこと）。
【０１５９】
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現について有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
【０１６０】
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターは、ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５に記載されるもの；ライノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌ４０１に記載されるもの；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ．８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ  Ｍｅｄ  ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｌｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）；チクングンヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）；ムカンボウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）；ヌヅムウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）；トリニティウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−��６９）；ユナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）；オニオンウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）；西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １２１：１９０に記載のものに由来するウイルスベクターを含む。
【０１６１】
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：１５８１−１５８５に記載される。
【０１６２】
粒子媒介遺伝子送達が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子送達分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミンのような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。
【０１６３】
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生体分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
【０１６４】
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）を含む。
【０１６５】
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７６：４２０に記載されるものである。
【０１６６】
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおりである）の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０１６７】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
【０１６８】
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によって、または組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
【０１６９】
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。
【０１７０】
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１７１】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
【０１７２】
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含する：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
【０１７３】
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
【０１７４】
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥ−デキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）。
【０１７５】
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
【０１７６】
脂質カプセル化は、一般的に、核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉もしくは維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
【０１７７】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１７８】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ｛１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル｝−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用して、容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１７９】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が含まれる。これらの物質はまた、適切な比率でＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１８０】
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ  １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６を参照のこと。
【０１８１】
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例としては、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
【０１８２】
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
【０１８３】
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
【０１８４】
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：２３２に記載されている。
【０１８５】
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造において補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
【０１８６】
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６４：７４３−７５０に記載される。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  １５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６５に見い出され得る。
【０１８７】
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
【０１８８】
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
【０１８９】
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
【０１９０】
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
【０１９１】
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
【０１９２】
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
【０１９３】
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は、水素結合に好ましい条件下で互いに接触される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
【０１９４】
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも、非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
【０１９５】
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブと検出される配列との間の相同性である。研究されるフラグメント全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーの遺伝子については１０−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇのプローブを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる。
【０１９６】
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変数には、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の影響は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４｛（Ｇ＋Ｃ）％｝−０．６（ホルムアミド％）−６００／ｎ−１．５（ミスマッチ％）。
ここでＣｉは、塩濃度（一価イオン）であり、そしてｎは塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。
【０１９７】
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイズするバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
【０１９８】
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
【０１９９】
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
【０２００】
核酸プローブは、本発明のクラミジアの（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ）ヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなクラミジアの配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるべきであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるべきである。
【０２０１】
プローブ配列はクラミジアの配列（またはその相補物）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さのいくらかの変動は、アッセイの感度の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるクラミジアの配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはクラミジアの配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、クラミジアの配列とハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成するためにクラミジアの配列との十分な相補性を有する場合、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
【０２０２】
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド以上を含むが、これよりも短くてもよい。短いプライマーは、一般的には、鋳型との安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。
【０２０３】
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、産生され得る。
【０２０４】
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させるために使用され得、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるなどを行い（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ  １４：３７６−３８７）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５  ２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：３８４−３８６を参照のこと）。
【０２０５】
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、首尾よい制限部位を組み込むための配列を含む。代表的には、このような配列は、所望のクラミジアの配列に隣接する。
【０２０６】
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、クラミジアの配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
【０２０７】
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
【０２０８】
ウエスタンブロットのために、２つのサンプルを各タンパク質について試験した。対の左側のレーンは、前免疫血清で染色した膜ストリップを使用し、一方、右側のレーンは、免疫血清で染色した膜ストリップを使用した。図１〜５、３５Ｂ、３７Ｂ、３８Ｂおよび３９のウエスタンブロットにおいて、マーカーは、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０．１ｋＤａおよび１４．４ｋＤａにある。図６〜１６、２０Ｂ、２３Ｃ、２４Ｄ、２７Ｅ、３８Ａ、４０、４１、４２および４３のウエスタンブロットにおいて、マーカーは、１７２．６ｋＤａ、１１１．４ｋＤａ、７９．６ｋＤａ、６１．３ｋＤａ、４９．０ｋＤａ、３６．４ｋＤａ、２４．７ｋＤａ、１９．２ｋＤａおよび１３．１ｋＤａにある。
【０２０９】
図１〜５のウエスタンブロットにおいて、レーン２および３は、ＧＳＴ融合コントロール抗原に対して惹起されたコントロール血清を示す。図１〜５のウエスタンブロットにおいて、レーン４および５は、Ｈｉｓタグ化コントロール抗原に対して惹起されたコントロール血清を含む。
【０２１０】
低分子量マーカーは、精製ゲルのレーン１で泳動される。
【０２１１】
（発明を実施するための様式）
表Ｉは、参考文献１８由来のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質の名称、このタンパク質についてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号および表題、本発明の対応するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質についてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号および表題、ならびにこれらのＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質についての配列番号（配列番号１〜２６２、奇数はアミノ酸配列であり、そして偶数はヌクレオチド配列である）を与える。これらは、対応するＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質について参考文献１８に記載されたのと同じ方法で、発現および使用され得る。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓタンパク質は、診断目的および免疫原性目的のために有用である。これらの特性は、配列のみからでは明らかでない。
【０２１２】
種々の試験を使用して、本発明のタンパク質のインビボでの免疫原性を評価し得る。例えば、これらのタンパク質は、組換え的に発現され得、そしてイムノブロットによって患者の血清をスクリーニングするために使用され得る。タンパク質と患者の血清との間のポジティブ反応は、この患者が、問題のタンパク質に対する免疫応答を以前に生じていたことを示す（すなわち、このタンパク質は、免疫原である）。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するためにも使用され得る。
【０２１３】
この組換えタンパク質はまた、例えば、マウスにおいて、抗体を調製するために簡便に使用され得る。これらは、（例えば、インタクトなクラミジアに対するウエスタンブロットにおいてこれらの抗体を使用することによって）タンパク質がＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの細胞表面上に位置することを直接確認するために使用され得る。標識された抗体（例えば、ＦＡＣＳのための蛍光標識）は、インタクトな細菌と共にインキュベートされ得、そしてこの細菌表面上の標識の存在が、タンパク質の位置を確認する。ＦＡＣＳの図は、アッセイにおいて使用されるＣｈｌａｍｙｄｉａ調製物の散乱プロファイル、組換え抗原に対する抗体が、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ細胞に結合する場合に得られるピークシフト（白抜き領域＝コントロールサンプル；塗りつぶした領域＝抗体と反応したサンプル）、定量的Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ（Ｋ−Ｓ）統計分析、およびＦＡＣＳ分析ソフトウェアの出力を示す。
【実施例】
【０２１４】
（実施例１）
ＣＴ２４２（配列番号５７および配列番号５８）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、ＧＳＴ融合タンパク質（図１Ａ；レーン４および５、クロマトグラフィー画分１および２、予測された分子量４２．４ｋＤａ）として、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図１Ｂ；レーン２〜４、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量１６．４ｋＤａ）としての両方で精製された。
【０２１５】
この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットで使用した（図１Ｃ：Ｈｉｓタグ化：レーン１２および１３；ＧＳＴ融合：レーン２０および２１）。レーン１２は、Ｈｉｓタグ化ＣＴ２４２についての、前免疫血清で染色した膜ストリップを示し、一方、レーン１３は、Ｈｉｓタグ化ＣＴ２４２についての、免疫血清で染色した膜ストリップを示す。レーン２０は、ＧＳＴ融合ＣＴ２４２についての前免疫血清で染色した膜ストリップを示し、レーン２１は、ＧＳＴ融合ＣＴ２４２についての免疫血清で染色した膜ストリップを示す。
【０２１６】
これらの実験は、ＣＴ２４２が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）なタンパク質であること、およびこのＣＴ２４２が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２１７】
（実施例２）
ＣＴ０４５（配列番号７１および配列番号７２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図２Ａ；レーン４〜６、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量５５．８ｋＤａ）として精製された。この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図２Ｂ：レーン８および９）およびＦＡＣＳ分析（図２Ｃ、Ｋ−Ｓ値１６．８１）のために使用した。
【０２１８】
これらの実験は、ＣＴ０４５が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ０４５が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２１９】
（実施例３）
ＣＴ３８１（配列番号１０５および配列番号１０６）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、ＧＳＴ融合タンパク質（図３Ａ；レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、予測された分子量５２．７ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図３Ａ；レーン７〜９、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量２６．７ｋＤａ）として精製された。この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図３Ｂ：Ｈｉｓタグ化：レーン６および７；ＧＳＴ融合：レーン１６および１７）およびＦＡＣＳ分析（図３Ｃ、ＧＳＴタグ化、Ｋ−Ｓ値３５．９８；図３Ｄ：Ｈｉｓタグ化、Ｋ−Ｓ値３２．５４）のために使用した。
【０２２０】
これらの実験は、ＣＴ３８１が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ３８１が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２２１】
（実施例４）
ＣＴ３９６（配列番号１０７および配列番号１０８）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、ＧＳＴ融合タンパク質（図４Ａ；レーン６および７、クロマトグラフィー画分１および２、予測された分子量９９．５ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図４Ｂ；レーン５〜７、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量７３．５ｋＤａ）として精製された。この組換えＨｉｓタグ化タンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図４Ｃ：レーン１４および１５）に使用した。この組換えＨｉｓタグ化タンパク質および組換えＧＳＴ融合タンパク質をまた、ＦＡＣＳ分析（図４Ｄ：Ｈｉｓタグ化、Ｋ−Ｓ値３４．５０；図４Ｅ：ＧＳＴ融合、Ｋ−Ｓ値３２．７６）のために使用した。
【０２２２】
これらの実験は、ＣＴ３９６が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ３９６が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２２３】
（実施例５）
ＣＴ３９８（配列番号１１１および配列番号１１２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、ＧＳＴ融合タンパク質（図５Ａ；レーン８および９、クロマトグラフィー画分１および２、予測された分子量５４．８ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図５Ｂ；レーン８〜１０、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量２８．８ｋＤａ）として精製された。この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図５Ｃ：Ｈｉｓタグ化：レーン１０および１１；ＧＳＴ融合：レーン１８および１９）およびＦＡＣＳ分析（図５Ｄ：ＧＳＴ融合、Ｋ−Ｓ値３１．２４；図５Ｅ：Ｈｉｓタグ化、Ｋ−Ｓ値２６．１０）のために使用した。
【０２２４】
これらの実験は、ＣＴ３９８が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ３９８が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２２５】
（実施例６）
ＣＴ０８９（配列番号６１および配列番号６２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、ＧＳＴ融合タンパク質（図６Ｃ；レーン２、クロマトグラフィー画分１、予測された分子量７０．８ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図６Ｃ；レーン３、４および５、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測された分子量４４．８ｋＤａ）として精製された。この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図６Ａ：ＧＳＴ融合：レーン１４および１５；Ｈｉｓタグ化：レーン１６および１７）およびＦＡＣＳ分析（図６Ｂ：Ｈｉｓタグ化、Ｋ−Ｓ値２６．５９）のために使用した。
【０２２６】
これらの実験は、ＣＴ０８９が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ０８９が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２２７】
（実施例７）
ＣＴ４４３（配列番号１２５および配列番号１２６）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現された。この組換え産物は、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製された。この組換えタンパク質を、マウスを免疫化するために使用し、この血清を、ウエスタンブロット（図７Ａ：レーン１０および１１）およびＦＡＣＳ分析（図７Ｂ：Ｋ−Ｓ値２１．２８）のために使用した。
【０２２８】
これらの実験は、ＣＴ４４３が表面曝露されておりかつ免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ４４３が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独では明らかでない。
【０２２９】
（実施例８）
ＣＴ５４１（配列番号１４９および配列番号１５０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴ融合タンパク質として精製した（図８Ｃ：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量５１．６ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図８Ａ：レーン６および７）ならびにＦＡＣＳ分析（図８Ｂ：Ｋ−Ｓ値９．９４）のために使用した。
【０２３０】
これらの実験は、ＣＴ５４１が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２３１】
（実施例９）
ＣＴ５４７（配列番号１５１および配列番号１５２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴ融合タンパク質（図９Ｄ：レーン４および５、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量５８．３ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質の両方として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図９Ａ：Ｈｉｓタグ化：レーン２０および２１）ならびにＦＡＣＳ分析（図９Ｂ：ＧＳＴ融合：Ｋ−Ｓ値１４．６０および１５．５７；図９Ｃ：Ｈｉｓタグ化：Ｋ−Ｓ値２８．２１）のために使用した。
【０２３２】
これらの実験は、ＣＴ５４７が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２３３】
（実施例１０）
ＣＴ５８７（配列番号１８９および配列番号１９０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１０Ｃ：レーン５、６および７、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量４７．５ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１０Ａ：レーン１２および１３）ならびにＦＡＣＳ分析（図１０Ｂ：Ｈｉｓタグ化：Ｋ−Ｓ値２０．８５）のために使用した。
【０２３４】
これらの実験は、ＣＴ５８７が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２３５】
（実施例１１）
ＣＴ２６６（配列番号７７および配列番号７８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１１Ｃ：レーン１１および１２、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量４４．１ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１１Ａ：レーン４および５）ならびにＦＡＣＳ分析（図１１Ｂ：Ｋ−Ｓ値２１．２９）のために使用した。
【０２３６】
これらの実験は、ＣＴ２６６が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２３７】
（実施例１２）
ＣＴ４４４（配列番号１２７および配列番号１２８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴ融合タンパク質（図１２Ｂ：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量８７．３ｋＤａ）およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図１２Ｃ：レーン３および４、クロマトグラフィー画分２および３、予測分子量９．０ｋＤａ）として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１２Ａ：レーン１６および１７）ならびにＦＡＣＳ分析（図１２Ｄ：ＧＳＴ融合：Ｋ−Ｓ値１４．９８；図１２Ｅ：Ｈｉｓタグ化：Ｋ−Ｓ値１３．２８）のために使用した。
【０２３８】
これらの実験は、ＣＴ４４４が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２３９】
（実施例１３）
ＣＴ５５９（配列番号１９９および配列番号２００）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化タンパク質として精製した（図１３Ｃ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量３４．９ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１３Ａ：レーン６および７）ならびにＦＡＣＳ分析（図１３Ｂ：Ｋ−Ｓ値２３．２１）のために使用した。
【０２４０】
これらの実験は、ＣＴ５５９が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２４１】
（実施例１４）
ＣＴ６８１（配列番号１５５および配列番号１５６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１４Ｃ：レーン５および６、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量４１．８ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１４Ａ：レーン１０および１１）ならびにＦＡＣＳ分析（図１４Ｂ：Ｋ−Ｓ値３４．６６）のために使用した。
【０２４２】
これらの実験は、ＣＴ６８１が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２４３】
（実施例１５）
ＣＴ７１３（配列番号２０１および配列番号２０２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１５Ｂ：レーン４、５および６、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量３５．４ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１５Ａ：レーン１２および１３）ならびにＦＡＣＳ分析（図１５Ｃ：Ｋ−Ｓ値２５．８２）のために使用した。
【０２４４】
これらの実験は、ＣＴ７１３が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２４５】
（実施例１６）
ＣＴ８２３（配列番号２２９および配列番号２３０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１６Ｃ：レーン７、８および９、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量５３．９ｋＤａ）。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図１６Ａ：レーン１４および１５）ならびにＦＡＣＳ分析（図１６Ｂ：Ｋ−Ｓ値２６．６２）のために使用した。
【０２４６】
これらの実験は、ＣＴ８２３が、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２４７】
（実施例１７）
ＣＴ１１４（配列番号２４３および配列番号２４４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１７：レーン６および７、クロマトグラフィー画分１および２、予測分子量４８．５ｋＤａ）。
【０２４８】
（実施例１８）
ＣＴ１９８（配列番号４３および配列番号４４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１８Ａ：レーン６、クロマトグラフィー画分１、予測分子量５６．３ｋＤａ）。このＨｉｓタグ化組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ＦＡＣＳ分析のために使用した（図１８Ｂ）。
【０２４９】
これらの実験は、ＣＴ１９８がＥＢ異種集団のほんの一部において存在することを示す（クラミジア調製物が通常そうであるように）。これが存在する場合、これは、表面に露出された免疫アクセス可能なタンパク質である。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
【０２５０】
（実施例１９）
ＣＴ２４１（配列番号５５および配列番号５６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した（図１９：レーン４、クロマトグラフィー画分３、予測分子量８５．３ｋＤａ）。
【０２５１】
（実施例２０）
ＣＴ３５０（配列番号２７および配列番号２８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図２０Ａ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量６１．３ｋＤａ）およびＧＳＴ融合タンパク質（図２０Ａ：レーン７、８および９、クロマトグラフィー画分１、２および３、予測分子量８７．３ｋＤａ）の両方として精製した。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウェスタンブロット（図２０Ｂ：Ｈｉｓタグ化：レーン４および５；ＧＳＴタグ化：レーン８および９）のために使用した。
【０２５２】
（実施例２１）
ＣＴ３５１（配列番号２５および配列番号２６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図２１：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ７６．１ｋＤａ）として精製した。
【０２５３】
（実施例２２）
ＣＴ３９１（配列番号２５１および配列番号２５２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図２２：レーン８および９、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ３２．６ｋＤａ）として精製した。
【０２５４】
（実施例２３）
ＣＴ０７７（配列番号６５および配列番号６６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２３：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ５９．７ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図２３Ｃ：レーン６および７）、およびＦＡＣＳ分析（図２３Ｂ、Ｈｉｓタグ化：Ｋ−Ｓ値  ９．１７）のために使用した。
【０２５５】
これらの実験は、ＣＴ０７７が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ０７７が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２５６】
（実施例２４）
ＣＴ１８１（配列番号２４５および配列番号２４６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２４Ａ：レーン４、クロマトグラフィー画分１、推定分子量  ５０．１ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図２４Ｂ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３，推定分子量  ３２．０ｋＤａ）の両方として精製した。このＧＳＴタグ化組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図２４Ｄ：レーン４および５（矢印で示される））、およびＦＡＣＳ分析（図２４Ｃ、Ｋ−Ｓ値  ７．６２）のために使用した。
【０２５７】
これらの実験は、ＣＴ１８１が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ１８１が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２５８】
（実施例２５）
ＣＴ５８９（配列番号１８５および配列番号１８６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２５Ａ：レーン４および５、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ８９．４ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図２５Ｂ：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ６３．４ｋＤａ）の両方として精製した。このＨｉｓタグ化組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ＦＡＣＳ分析（図２５Ｃ）のために使用した。
【０２５９】
これらの実験は、ＣＴ５８９が、ＥＢ異種集団の一部のみにしか存在しないことを示す（クラミジア調製物が通常そうであるように）このＣＴ５８９が存在する場合、このＣＴ５８９は、表面露出された免疫接近可能なタンパク質である。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２６０】
（実施例２６）
ＣＴ５９７（配列番号１７９および配列番号１８０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２６Ａ：レーン５および６、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ３６．０ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図２６Ｂ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  １０．３ｋＤａ）の両方として精製した。
【０２６１】
（実施例２７）
ＣＴ６２３（配列番号１６３および配列番号１６４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２７Ａ：レーン３および４、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ７１．８ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図２７Ｂ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  ４５．８ｋＤａ）の両方として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図２７Ｅ：ＧＳＴタグ化、レーン４（矢印で示される）；Ｈｉｓタグ化、レーン１３（矢印で示される））、およびＦＡＣＳ分析（図２７Ｃ：ＧＳＴタグ化：Ｋ−Ｓ値  １５．８９；図２７Ｄ：Ｈｉｓタグ化：Ｋ−Ｓ値  ２０．２７）のために使用した。
【０２６２】
これらの実験は、ＣＴ６２３が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ６２３が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２６３】
（実施例２８）
ＣＴ７００（配列番号２６１および配列番号２６２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２８Ａ：レーン５、６および７、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  ７３．７ｋＤａ）として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ＦＡＣＳ分析（図２８Ｂ：Ｋ−Ｓ値  ８．７２）のために使用した。
【０２６４】
これらの実験は、ＣＴ７００が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ７００が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２６５】
（実施例２９）
ＣＴ７６１（配列番号２１７および配列番号２１８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図２９Ａ：レーン６および７、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ６３．９ｋＤａ）として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ＦＡＣＳ分析（図２９Ｂ：Ｋ−Ｓ値  １１．４５）のために使用した。
【０２６６】
これらの実験は、ＣＴ７６１が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ７６１が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２６７】
（実施例３０）
ＣＴ４１５（配列番号１１７および配列番号１１８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図３０：レーン３および４、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ５５．４ｋＤａ）として精製した。
【０２６８】
（実施例３１）
ＣＴ４５４（配列番号２５３および配列番号２５４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図３１：レーン２および３、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ５６．２ｋＤａ）として精製した。
【０２６９】
（実施例３２）
ＣＴ４６７（配列番号１２９および配列番号１３０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図３２：レーン３および４、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ６５．６ｋＤａ）として精製した。
【０２７０】
（実施例３３）
ＣＴ５５１（配列番号２５７および配列番号２５８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図３３Ａ：レーン５、６および７、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  ３４．１ｋＤａ）、およびＧＳＴタグ化融合タンパク質（図３３Ｂ：レーン４および５、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ６０．１ｋＤａ）の両方として精製した。
【０２７１】
（実施例３４）
ＣＴ５６７（配列番号１９５および配列番号１９６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図３４Ａ：レーン８および９、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ４４．０ｋＤａ）、およびＨｉｓタグ化融合タンパク質（図３４Ｂ：レーン７および８、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  １８．３ｋＤａ）の両方として精製した。
【０２７２】
（実施例３５）
ＣＴ５６９（配列番号１９３および配列番号１９４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図３５Ａ：レーン２、３および４、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  １１．２ｋＤａ）として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図３５Ｂ：レーン８および９、矢印で示される）で使用した。
【０２７３】
（実施例３６）
ＣＴ６４７（配列番号１６９および配列番号１７０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質（図３６：レーン６および７、クロマトグラフィー画分１および２、推定分子量  ４５．７ｋＤａ）として精製した。
【０２７４】
（実施例３７）
ＣＴ６００（配列番号１７３および配列番号１７４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質（図３７Ａ：レーン５、６および７、クロマトグラフィー画分１、２および３、推定分子量  １９．５ｋＤａ）として精製した。この組換え産物を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図３７Ｂ：レーン１０および１１、矢印で示される）、およびＦＡＣＳ分析（図３７Ｃ、Ｋ−Ｓ値  １０．４６）のために使用した。
【０２７５】
これらの実験は、ＣＴ６００が、表面露出された免疫接近可能なタンパク質であること、およびこのＣＴ６００が有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列のみからは示されない。
【０２７６】
（実施例３８）
ＣＴ２７９（配列番号２４７および配列番号２４８）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した。これらの組換えＨｉｓタグ化タンパク質および組換えＧＳＴタグ化タンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図３８Ａ：Ｈｉｓタグ化：レーン５（矢印で示される）；図３８Ｂ：ＧＳＴタグ化：レーン１２および１３（矢印で示される））において使用した。
【０２７７】
（実施例３９）
ＣＴ５６０（配列番号２５９および配列番号２６０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えＨｉｓタグ化タンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図３９：レーン６および７（矢印で示される））において使用した。
【０２７８】
（実施例４０）
ＣＴ３８９（配列番号２４９および配列番号２５０）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図４０：レーン１６および１７（矢印で示される））において使用した。
【０２７９】
（実施例４１）
ＣＴ４５６（配列番号２５５および配列番号２５６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、ＧＳＴタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図４１：レーン２および３（矢印で示される））において使用した。
【０２８０】
（実施例４２）
ＣＴ６２２（配列番号１６１および配列番号１６２）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図４２：レーン９（矢印で示される））において使用した。
【０２８１】
（実施例４３）
ＣＴ７５９（配列番号２１３および配列番号２１４）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この組換え産物を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図４３：レーン８および９（矢印で示される））において使用した。
【０２８２】
（実施例４４）
インビトロ中和アッセイは、培養物中の真核細胞に対するＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  感染性を阻害するために、本発明の種々の組換えタンパク質で免疫されたマウスから得られた血清の能力を示し、このアッセイを、ＬＬＣＭＫ２（アカゲザル腎臓内皮）細胞を使用して実施した。マウスポリクローナル血清の連続４倍希釈を、ＳＰ（スクロース−リン酸）緩衝液中に調製した。全ＥＢに対するマウス抗血清を、ポジティブコントロールとして使用し、前免疫血清およびＳＰ緩衝液のみを、ネガティブコントロールとして使用した。Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（血液型亜型Ｄ）から精製されたＥＢを、ＳＰ緩衝液中に希釈し、３×１０５ＩＦＵ／ｍｌを含むようにし、この懸濁液の１０μｌを、最終容量１００μｌで各血清希釈液に添加した。抗体ＥＢ相互作用が、３７℃で３０分間進行するようにした。次いで、各サンプルからの１００μｌの反応混合液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中のＰＢＳ洗浄ＬＬＣＭＫ２細胞単層の上に添加し、８０５×ｇで３７℃で１時間遠心分離した。全ての血清およびコントロールを、２連のサンプルで試験した。過剰の接種物の除去後、細胞を、ＰＢＳで一度リンスし、２０％ＦＣＳおよび１μｇシクロヘキシミドを補充した２００μｌのＤＭＥＭ培地を補充し、そして３７℃で４８時間インキュベートした。細胞をメタノールで固定し、進行性細胞内クラミジア感染によって生成された代表的な細胞質封入物を、抗クラミジアフルオレセイン結合モノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で染色した。宿主細胞に対する十分な希釈およびＥＢ比において、観察された封入物の数を、宿主細胞感染を最初に首尾よく確立し得た生存クラミジアの数に等しいと考えられる（これらは、Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔｓ，ＩＦＵと名づけられる）。フルオレセイン標識封入物を、４０×の倍率で１ウェル当たり４つの顕微鏡視野において計数した。抗体相互作用に起因する感染性の阻害を、ＳＰコントロール（緩衝液のみ）に比較した場合、平均ＩＦＵのパーセント減少として計算した。共通の実施に従って、血清を、これらが５０％以上の感染性の減少を引き起こし得る場合、「中和」として標識し、全スクリーニングアッセイ（例えば、宿主細胞の交換、またはケラミジア単離物、または感染性接種物の調製における環境条件のバリエーション）の複雑性を考慮して、より低い程度のＥＢ感染性を阻害し得る血清はまた、さらなる研究のためのワクチン候補として考慮されるべきである。図４４Ａは、中和ポジティブ血清から得られた結果の例を示し、一方、図４４Ｂは、中和ネガティブ血清から得られた結果の例を示す。
【０２８３】
インビトロ中和アッセイを、実施例１〜１０、１３〜２２、２４〜２６および２９〜３７において言及される組換えタンパク質で免疫されたマウスから得られた血清を使用して実施した。結果を、表ＩＩに示す。これらの結果は、ＣＴ０４５、ＣＴ２４２、ＣＴ３８１．ＣＴ３９６、ＣＴ３９８、ＣＴ４６７、ＣＴ５４７、ＣＴ５８７およびＣＴ６８１が、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによる感染を予防するワクチンに対する、特に良好な候補の全てであることを示す。これらの特性は、配列単独からは示されない。
【０２８４】
さらなる実験において、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに対して惹起された血清を、交差中和活性について、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＥＢに対して試験した。手順は、上記されるとおりであったが、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから精製されたＥＢを、ＳＰ緩衝液中に希釈し、３×１０６ＩＦＵ／ｍｌを含むようにし、この懸濁物の１０μｌを、最終容量１００μｌで各血清希釈物に添加した。ＣＴ２４２およびＣＴ４６７を使用して得られた血清は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＥＢを交差中和し得た。
【０２８５】
本発明が例示のためのみに記載され、その改変がなされ得、一方で、本発明の意図および範囲内のままであることは、理解される。
【０２８６】
【数１】
2005511076.tif 000002
【０２８７】
【表１】
2005511076.tif 000003
【０２８８】
【表２】
2005511076.tif 000004
【０２８９】
【表３】
2005511076.tif 000005
【０２９０】
【表４】
2005511076.tif 000006
【０２９１】
【表５】
2005511076.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施例３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施例４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、実施例５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、実施例５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図５Ｅ】図５Ｅは、実施例５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図８Ａ】図８Ａは、実施例８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、実施例８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、実施例８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、実施例９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、実施例９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例１０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例１０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、実施例１０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、実施例１１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、実施例１１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、実施例１１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例１２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例１２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、実施例１２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、実施例１２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、実施例１２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実施例１３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、実施例１３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、実施例１３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実施例１４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、実施例１４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、実施例１４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実施例１５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、実施例１５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、実施例１５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実施例１６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例１６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、実施例１６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１７】図１７は、実施例１７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、実施例１８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、実施例１８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図１９】図１９は、実施例１９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、実施例２０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、実施例２０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２１】図２１は、実施例２１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２２】図２２は、実施例２２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、実施例２３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、実施例２３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、実施例２３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、実施例２４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、実施例２４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、実施例２４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２４Ｄ】図２４Ｄは、実施例２４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、実施例２５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、実施例２５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、実施例２５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、実施例２６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、実施例２６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２７Ａ】図２７Ａは、実施例２７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、実施例２７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、実施例２７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、実施例２７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２７Ｅ】図２７Ｅは、実施例２７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２８Ａ】図２８Ａは、実施例２８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、実施例２８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２９Ａ】図２９Ａは、実施例２９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、実施例２９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３０】図３０は、実施例３０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３１】図３１は、実施例３１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３２】図３２は、実施例３２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３３Ａ】図３３Ａは、実施例３３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、実施例３３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３４Ａ】図３４Ａは、実施例３４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、実施例３４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３５Ａ】図３５Ａは、実施例３５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、実施例３５のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３６】図３６は、実施例３６のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３７Ａ】図３７Ａは、実施例３７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、実施例３７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３７Ｃ】図３７Ｃは、実施例３７のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３８Ａ】図３８Ａは、実施例３８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、実施例３８のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図３９】図３９は、実施例３９のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４０】図４０は、実施例４０のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４１】図４１は、実施例４１のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４２】図４２は、実施例４２のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４３】図４３は、実施例４３のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４４Ａ】図４４Ａは、実施例４４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、実施例４４のデータを示す。図はゲルの図であり、レーン１とは、その図の左側のレーンである。
【配列表】
2005511076.tif 000008
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2005511076.tif 000057
【図１Ａ】
2005511076.tif 000058
【図１Ｂ】
2005511076.tif 000059
【図１Ｃ】
2005511076.tif 000060
【図２Ａ】
2005511076.tif 000061
【図２Ｂ】
2005511076.tif 000062
【図２Ｃ】
2005511076.tif 000063
【図３Ａ】
2005511076.tif 000064
【図３Ｂ】
2005511076.tif 000065
【図３Ｃ】
2005511076.tif 000066
【図３Ｄ】
2005511076.tif 000067
【図４Ａ】
2005511076.tif 000068
【図４Ｂ】
2005511076.tif 000069
【図４Ｃ】
2005511076.tif 000070
【図４Ｄ】
2005511076.tif 000071
【図４Ｅ】
2005511076.tif 000072
【図５Ａ】
2005511076.tif 000073
【図５Ｂ】
2005511076.tif 000074
【図５Ｃ】
2005511076.tif 000075
【図５Ｄ】
2005511076.tif 000076
【図５Ｅ】
2005511076.tif 000077
【図６Ａ】
2005511076.tif 000078
【図６Ｂ】
2005511076.tif 000079
【図６Ｃ】
2005511076.tif 000080
【図７Ａ】
2005511076.tif 000081
【図７Ｂ】
2005511076.tif 000082
【図８Ａ】
2005511076.tif 000083
【図８Ｂ】
2005511076.tif 000084
【図８Ｃ】
2005511076.tif 000085
【図９Ａ】
2005511076.tif 000086
【図９Ｂ】
2005511076.tif 000087
【図９Ｃ】
2005511076.tif 000088
【図９Ｄ】
2005511076.tif 000089
【図１０Ａ】
2005511076.tif 000090
【図１０Ｂ】
2005511076.tif 000091
【図１０Ｃ】
2005511076.tif 000092
【図１１Ａ】
2005511076.tif 000093
【図１１Ｂ】
2005511076.tif 000094
【図１１Ｃ】
2005511076.tif 000095
【図１２Ａ】
2005511076.tif 000096
【図１２Ｂ】
2005511076.tif 000097
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【国際調査報告】
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