(57)【要約】本発明は、自己免疫疾患を患っている患者に、スタチンの有効量および第２の免疫調節剤を共投与することにより自己免疫疾患を治療する方法を提供する。本明細書に提供された方法により治療できる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、または自己免疫ブドウ膜炎が挙げられる。自己免疫疾患は、例えば、脱髄自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）のように、多段階的であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を治療する方法であって、
スタチンの有効量および抗原特異的免疫調節剤の有効量を、自己免疫疾患を患っている患者に共投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記抗原特異的免疫調節剤が、自己免疫疾患と関連した自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己ポリペプチドが自己蛋白質または自己ペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原特異的免疫調節剤がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが蛋白質またはペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドがポリペプチド誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドの自己抗原エピトープに相当するアミノ酸を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が、ランダムコポリマーを形成するためにランダム化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ランダムコポリマーがペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が規則配列されることにより、それによって前記ポリペプチドが規則配列アミノ酸モチーフを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患が、脱髄自己免疫疾患であり、前記指令アミノ酸モチーフは、ｎが２から６の［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチが、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）、ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）、ミエリン会合乏突起膠細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質（ＭＯＧ）、またはアルファ−Ｂクリスタリンよりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記自己ポリペプチが、インスリン、インスリンＢ鎖、プレプロインスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ｋＤＡ体、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６７ｋＤａ体、チロシンホスファターゼＩＡ２またはＩＡ−２ｂ、カルボキシペプチダーゼＨ、熱ショック蛋白質、グリマ３８、島細胞抗原の６９ｋＤａ体、ｐ５２、および島細胞グルコース輸送物体（ＧＬＵＴ２）よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己ベクターが、１つの自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己ポリペプチドがプレプロインスリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記自己ポリペプチドがインスリンＢ鎖９〜２３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチが、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ  Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；ｇｐ３９などの軟骨蛋白質；Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＩＸ型、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；およびアルドラーゼＡよりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患が自己免疫ブドウ膜炎である、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチが、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンまたはリカバリンよりなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患を治療する方法であって、スタチンの有効量および非抗原特異的免疫調節剤の有効量を、自己免疫疾患を患っている患者に共投与することを含んでなる方法。
【請求項２８】
前記非抗原特異的免疫調節剤が免疫調節配列である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫調節配列が、
（ａ）５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’および
（ｂ）５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’、
よりなる群から選択され、式中、ＸおよびＹは、シトシン−グアニンであり得ないこと以外は、任意の天然由来、または合成ヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００２年３月２９日出願の米国特許出願第６０／３６８，８０３号明細書により優先権を得ており、その全体を本出願において参照として本願明細書に援用する。
連邦政府支援の研究または開発下でなされた発明の権利に関する声明
本研究の少なくとも一部は、国立予防衛生研究所、補助金番号ＲＯＩ  ＮＳ  １８２３５からの補助により支援された。政府は、本研究における一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫系の複雑さは、免疫系機能障害の理解にとって困難な障害となっていた。近年、分子生物学の技術により、免疫の基礎となっている機構および構成要素に対する洞察が提供されている。免疫の話の筋は、大部分がリンパ球の話である。リンパ球は、リンパ球同士の相互作用、抗原提示細胞との相互作用、ならびに外来抗原および外来細胞との相互作用に関して極めて複雑で微妙なシステムを有している。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、自己免疫ブドウ膜炎、および原発性胆汁性肝硬変が挙げられる。
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、最もよく見られる中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄性疾患であり、北米で３５万人（０．１％）、世界中で１１０万人の患者が存在している。一般に、ＭＳは抗原（Ａｇ）提示細胞（ＡＰＣ）上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子に関連する特定のミエリン蛋白質を認識する前炎症性ＣＤ４（Ｔｈ１）細胞によって部分的に媒介される自己免疫疾患であると考えられている。他の自己免疫疾患と同様、ＭＳ感受性は遺伝的にＭＨＣ  ＨＬＡ−Ｄ領域（ＨＬＡ−Ｄ２（ＤＲβ＊１５０１、ＤＱＢ＊０６０２）に関連している。
【０００４】
ＭＳは多段階的である。神経学的損傷の発作は初期段階で生じ、組織学的にＣＤ４Ｔ細胞、Ｂ細胞ならびにＭＨＣクラスＩＩ陽性マクロファージと小グリア細胞の双方、ＣＮＳ内在抗原提示細胞（ＡＰＣ）を優位に含有する炎症病巣を特徴とする。急性発作が何回かあった後、持続的な神経学的損傷を伴う慢性的な「二次的進行」段階が続くことが多い。この「不可逆的」段階は、神経損失および萎縮を特徴とする。
【０００５】
米国では、２種のＩＦＮ−β薬剤、アボネックス（ａｖｏｎｅｘ）（ＩＦＮ−β  １ａ）およびベタセロン（ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）（ＩＦＮ−β  １ｂ）ならびにコパキソン（ｃｏｐａｘｏｎ）（酢酸グラチラマー（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ  ａｃｅｔａｔｅ））が初期炎症の「再発−軽減」段階の治療に承認されている。ＩＦＮ−β類は、Ａｇ非特異的様式で幾つかの作用を発揮し、一方、コパキソンは、ＣＮＳ自己抗原に対して特異的なＴ細胞に優先的影響を及ぼすようである。ＤＮＡ修復を阻害する癌の化学療法剤であるノバントロンは、二次的進行性ＭＳの治療に承認されている。それらの副作用と潜在毒性に加え、これらの薬剤は部分的にしか効果を示さないので、新たな免疫調節ＭＳ療法の開発に対する必要性が強調されている。
【０００６】
アテローム発生の予防におけるコレステロール低下作用が承認され、「スタチン類」として知られている３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤が、炎症性疾患の治療に有益であり得るとの証拠が示唆されている。１９９５年に、心臓移植患者のプラバスタチン治療が、そのコレステロール低下作用とは別に、血流力学的に重篤な拒絶発症の減少に関与し、生存率を上昇させたことが報告された。メバロネートの代謝物、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの生成物は、シグナルトランスダクションおよび細胞分化に関与する特定の蛋白質の翻訳修飾（イソプレニル化）に関与していることが知られていた。しかし、ロバスタチンが、他のＣＮＳ  ＡＰＣである小グリア細胞および星状細胞による一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）および前炎症性サイトカイン類（ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）の産生を阻害することが示されると、スタチン類の免疫調節作用の可能性に対する評価は一層高まった。スタチン類がｉＮＯＳ分泌を阻害した所見により、それらが神経保護作用もまた有し得ることが示唆された。
【０００７】
スタチン類は、クラスＩＩ発現に関する主な調節物質であるＭＨＣクラスＩＩトランス活性物質（ＣＩＩＴＡ）のＩＦＮ−γ−誘導プロモーター（ｐ）ｐＩＶにおける転写を阻害することにより、ノンプロフェッショナルＡＰＣ上のＩＦＮ−γ−誘導クラスＩＩ発現を妨げたが、ｐＩＩＩを用いるｐ１またはＢ細胞を利用する樹状突起細胞における構成的発現は変化させなかった。したがって、スタチン類は、ノンプロフェッショナル内在ＣＮＳ  ＡＰＣによってＡｇ提示を抑制し得る。
【０００８】
スタチン類は、基底膜の分解および脳血管バリアなどの内皮バリアを越えた移動に関与する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）のリンパ球分泌を阻害する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害と独立に、スタチン類は、リンパ球機能に関連した抗原−１（ＬＦＡ−１）であるβ２−インテグリンに結合し、そのリガンド、ＩＣＡＭ−１との相互作用およびＴ細胞の活性化を妨げる。これらの所見により、スタチン類は、ＭＳの病原性カスケードの複数段階において有益な作用を有し得ることが示唆される。非経口投与される現在のＭＳ治療とは対照的に、スタチン類は経口投与され、かつ忍容性が高い。スタチン類は、現在承認されているＭＳ治療とは異なる活性を有していると思われるため、単独療法の候補として考えられている他に、併用療法においても有用であると思われる。
【０００９】
自己免疫疾患の他の例としては、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、自己免疫ブドウ膜炎、および原発性胆汁性肝硬変が挙げられる。
【００１０】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の０．８％が冒されている慢性の自己免疫炎症性滑膜炎である。これは、びらん性の関節破壊を生じる慢性炎症性滑膜炎を特徴とする。ＲＡは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージによって媒介される。
【００１１】
ヒトＩ型すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫破壊を特徴とする。β細胞の欠損により血中グルコース濃度の調節が不能となる。ヒトでは糖尿病発症前に長い前症状期間が先行する。この時期の間に、膵臓β細胞の機能が徐々に失われていく。疾病の発現は、本発明による自己蛋白質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドの各例である、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびチロシンホスファターゼＩＡ２（ＩＡ２）の存在に関係がある。
【００１２】
自己免疫ブドウ膜炎は、米国では４０万人が冒され、毎年新たに４万３千人の罹患件数を有すると予測されている自己免疫眼疾患である。自己免疫ブドウ膜炎は現在、ステロイド剤、メトトレキサートやシクロスポリンなどの免疫抑制剤、経静脈免疫グロブリンおよびＴＮＦα−アンタゴニストによって治療されている。
【００１３】
原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、主に４０〜６０才の女性が冒される器官特異的自己免疫疾患である。この集団の有病率は１０００人につき約１人であると報告されている。ＰＢＣは、肝臓内胆管を裏打ちしている肝臓内胆道表皮細胞（ＩＢＥＣ）の進行性破壊を特徴とする。これは閉塞および胆汁分泌妨害に至り、その結果、肝硬変を生じる。表皮裏層／分泌系損傷を特徴とするシェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、自己免疫甲状腺疾患および慢性関節リウマチなどの他の自己免疫疾患との関連が報告されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
本発明は、自己免疫疾患を患っている患者に、スタチンの有効量および第２の免疫調節剤を共投与することにより自己免疫疾患を治療する方法を提供する。本明細書に提供された方法により治療できる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、または自己免疫ブドウ膜炎が挙げられる。自己免疫疾患は、例えば、脱髄自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）のように、多段階的であり得る。
【００１５】
特定の実施形態において、スタチンは、自己免疫疾患の最初の発症後に投与される。例えば、疾病の寛解期の間に、または活発なエピソードの間に投与され得る。スタチンは、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、またはセリバスタチンであり得る。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、第２の免疫調節剤は抗原特異的である。一実施形態において、自己免疫疾患に関連した自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの自己ベクターである。ポリヌクレオチドによってコードされる自己ポリペプチドは、例えば、蛋白質またはペプチドであり得る。特定の実施形態において、ポリペプチドを含んでなる自己ベクターは、１つの自己ポリペプチドをコードする。
【００１７】
他の実施形態において、抗原特異的免疫調節剤はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、例えば、蛋白質またはペプチドであり得る。また、前記ポリペプチドは、前記疾患に関連する自己ポリペプチドを含み得るか、または前記疾患に関連する自己ポリペプチドの自己抗原エピトープに相当するアミノ酸を含み得る。前記ポリペプチドが、自己抗原エピトープに相当するアミノ酸を含む実施形態において、前記アミノ酸はランダム化してランダムなコポリマーを形成できるか、または、前記ポリペプチドが指令されたアミノ酸モチーフを含むように指令され得る。自己免疫疾患が脱髄自己免疫疾患である一実施形態において、指令されたアミノ酸モチーフは、［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎであり、式中ｎは２から６である。
【００１８】
脱髄自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）が治療される一実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）、ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）、ミエリン会合乏突起膠細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質（ＭＯＧ）、またはアルファ−βクリスタリンであり得る。前記脱髄疾患は、例えば、多発性硬化症であり得る。
【００１９】
インスリン依存性糖尿病が治療される実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされる自己ポリペプチドは、例えば、インスリン、インスリンβ鎖、プレプロインスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６５ｋＤａ体または６７ｋＤａ体）、チロシンホスファターゼＩＡ２またはＩＡ−２ｂ、カルボキシペプチダーゼＨ、熱ショック蛋白質、グリマ３８、島細胞抗原の６９ｋＤａ体、ｐ５２、または島細胞グルコース輸送物質（ＧＬＵＴ２）であり得る。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターは、例えば、プレプロインスリンまたはインスリンβ鎖９〜２３などの１つの自己ポリペプチドをコードする。
【００２０】
他の実施形態において、自己免疫疾患は慢性関節リウマチである。慢性関節リウマチを治療する場合、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ  Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；ｇｐ３９などの軟骨蛋白質；Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＩＸ型、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；またはアルドラーゼＡであり得る。
【００２１】
自己免疫ブドウ膜炎を治療する実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンまたはリカバリンであり得る。
【００２２】
他の実施形態において、第２の免疫調節剤は非抗原特異的である。一実施形態において、非抗原特異的な免疫調節剤は、オステポンチンまたはオステポンチンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである。他の実施形態において、非抗原特異的な免疫調節剤は、免疫調節配列である。免疫調節配列は、例えば、５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’または５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’であり得、ここでＸおよびＹは、シトシン−グアニンであり得ないこと以外は、任意の天然由来、または合成ヌクレオチドである。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、自己免疫脱髄疾患（例えば、多発性硬化症）などの多段階自己免疫疾患を含む自己免疫疾患を、例えばスタチン類などのメバロネート経路阻害剤を用いて治療する併用療法を提供する。他の療法としては、自己抗原をコードする核酸類、ペプチド類の投与および他の免疫抑制療法が挙げられる。他の薬剤とスタチンなどのメバロネート経路阻害剤との併用は、個々の薬剤の必要用量がより低く、異なった薬剤の効果が相補的であるという利点を有し得る。
【００２４】
自己免疫疾患を治療する併用療法としては、前記疾患の患者に有効用量のメバロネート経路阻害剤および有効用量の第２の免疫調節剤を共投与することが挙げられる。好ましい実施形態において、メバロネート経路阻害剤はスタチンである。スタチン類は、主にＩＬ−４およびＩＬ−１０サイトカインの産生を通して、免疫応答を調節的なＴｈ２応答へと切り替え、最初の発作後に治療を開始すると、脱髄疾患の再発において首尾よく麻痺状態を逆転できることが示されている。
【００２５】
特定の実施形態において、第２の免疫調節剤は抗原特異的である。好ましい抗原特異的免疫調節剤としては、前記疾患に関連する自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターが挙げられる。他の好ましい実施形態において、治療される自己免疫疾患は脱髄自己免疫疾患であり、抗原特異的免疫調節剤は、反復モチーフ（配列番号１）［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎ（ここでｎは２から６）を含む指令ペプチドである。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、第２の免疫調節剤は抗原非特異的である。好ましい一実施形態において、抗原非特異的免疫調節剤は免疫調節オリゴヌクレオチドである。
【００２７】
有効剤（メバロネート経路阻害剤または免疫調節剤）は、疾患発症時または疾患発症後に前もって投与してもよい。当該方法は、予防的または治療的目的のために用いられるが、特に興味深いものは、疾患の発症後、例えば、寛解時、疾患発生の再発時などにおける、メバロネート経路阻害剤と抗原特異的免疫調節剤との共投与である。最初の発作後に治療が開始される場合、メバロネート経路阻害剤と抗原特異的治療薬との併用により、脱髄疾患の再発の結果生じる麻痺が首尾よく逆転できることが示されている。
【００２８】
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書をより詳細に説明する前に、本明細書でこれ以降用いられる一定の用語の定義を明らかにすることが本発明のさらなる理解を助けることになると思われる。
定義：
他に定義しない限り、本明細書に用いられた専門用語および科学用語は、本発明が属する業界の通常の技術者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書に記載されたものと同様の任意の方法および材料が使用できるが、単に例示的な方法および材料が記載されている。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義されている。
【００２９】
本明細書に用いられる「１つの」および「その」の語は、他に本文で明示しない限り、限定的ではなく複数の指示物を含む。したがって、例えば「１つの複合体」は、複数のこのような複合体を含み、「その製剤」と言った場合、当業者に公知の１つ以上の製剤およびその等価物を含む。
【００３０】
本明細書で用いられる用語、「治療」は、疾患の予防および先に存在している病態の治療の双方を言うために用いられる。
【００３１】
用語「自己免疫疾患」は、身体の健常な細胞および／または組織において、誤った方向に向けられることになる適応免疫を、少なくとも部分的に特徴とする病因を有する任意の疾患を言う。自己免疫疾患は、自己分子（例えば、自己ポリペプチド）を異常に標的にして、身体内の器官、組織または細胞型（例えば、膵臓、脳、甲状腺または胃腸管）の損傷および／または機能不全を生じるＴリンパ球および／またはＢリンパ球を特徴とする。自己免疫は、特定の組織、ならびに複数の組織を冒す疾患を含む。さらに、本明細書に用いられる「自己免疫疾患」は疾患の急性形態、慢性形態および／または再発−寛解形態を含み得る。自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、全身性硬化症、乾癬、自己免疫甲状腺炎、および血小板減少性紫斑病が挙げられる。
【００３２】
「被験者」または「患者」は、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットまたはウサギなどの任意の動物を意味する。
【００３３】
本明細書に用いられる用語の「分子」、「化合物」および「薬剤」は、同義語であり、概括的に使用されて例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス引力などの非共有相互作用、または疎水的相互作用によって、蛋白質と構造的に相互作用する潜在能力のある分子を意味する。例えば、薬剤としては、最も典型的には蛋白質との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合に関与する基が挙げられる。薬剤としては、例えば、小型分子薬剤；変異類似体、相同体、修飾ペプチドまたはペプチド擬似物またはペプトイドなどのペプチド様物質を含むペプチド；または蛋白質、蛋白質の断片を挙げることができる。薬剤は、インビトロ法の結果、生産された非天然であり得、または、例えば細胞内で内在的に発現した、またはｃＤＮＡライブラリーからの蛋白質、または蛋白質の断片であり得る。
【００３４】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーおよびその等価物を言い、特定の長さの産物を指してはいない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質が、ポリペプチドの定義内に含まれる。「断片」は、典型的にはポリペプチドの少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より典型的には少なくとも２０個、さらにより典型的には少なくとも５０個の連続したアミノ酸を有するポリペプチドの一部を言う。誘導体は、他の配列と較べて、保存的または非保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドである。誘導体は、さらに例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに「ポリペプチド」の定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似物（例えば、非天然の、または「非古典的」アミノ酸など）を含有するポリペプチド、置換結合、ならびに天然および非天然双方の当業界に公知の他の修飾を有するポリペプチドが含まれる。したがって、「ポリペプチド」はポリペプチドの製薬上許容できる塩を含み得る。
【００３５】
本明細書に用いられる用語の「製薬上許容できる塩」とは、塩酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩などの無機酸付加塩または、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩およびクエン酸塩などの有機酸付加塩を意味する。製薬上許容できる金属塩の例は、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニム塩、および亜鉛塩である。製薬上許容できるアンモニウム塩の例は、アンモニウム塩およびテトラメチルアンモニウム塩である。製薬上許容できるアミン付加塩の例は、モルホリンおよびピペラジンとの塩である。製薬上許容できるアミノ酸付加塩の例は、リシン、グリシンおよびフェニルアラニンとの塩である。
【００３６】
本明細書に用いられる「自己ポリペプチド」とは、動物のゲノム内でコードされ、動物に発現し、動物の一生のある時期、翻訳後に修飾でき、自身の抗原（すなわち自己抗原）として自己免疫疾患に関連する任意のポリペプチド、その断片または誘導体を言う。自己ポリペプチドの翻訳後修飾の例は、グリコシル化、脂質基の付加、ホスファターゼ類による脱リン酸化、ジメチルアルギニン残基の付加、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるフィラグリンおよびフィブリンのシトルリン化；アルファＢクリスタリンリン酸化；ＭＢＰのシトルリン化；ならびにカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）類およびグランザイム類によるＳＬＥ自己抗原プロテオリシスである。「抗原」とは、リンパ球または抗体などの免疫応答成分によって特異的に認識され得る任意の分子を言う。自己ポリペプチドは、免疫機能調節の目的で免疫系細胞により特異的、排他的に発現する分子である免疫蛋白質を含まない。ある一定の免疫蛋白質は、自己ポリペプチドの定義に含まれるが、しれらは、クラスＩ  ＭＨＣ膜糖蛋白質、クラスＩＩ  ＭＨＣ糖蛋白質およびオステオポンチンである。
【００３７】
「自己ベクター」とは、自己ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターを意味する。本明細書に用いられるポリヌクレオチドは、ＤＮＡなどのデオキシリボ核酸またはＲＮＡなどのリボ核酸およびそれらの誘導体の連続体である。自己ポリペプチドをコードする配列は、適切なプラスミド発現自己カセット内へ挿入される。自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが一旦発現自己カセット内へ挿入されると、そのベクターは「自己ベクター」と呼ばれる。１つ以上の自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが投与される場合、単一の自己ベクターが複数の別個の自己ポリペプチドをコードできる。一実施形態において、幾つかの自己ポリペプチドをコードするＤＮＡが、単一ＤＮＡ分子から複数の蛋白質を発現させる内部リボソーム再侵入配列、または他の方法を利用して、単一自己プラスミド内に連続的にコードされる。自己ポリペプチドをコードするＤＮＡ発現自己ベクターは、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）社から商品として入手できるものなどの、プラスミドＤＮＡの単離に一般的に利用できる方法を用いて調製され、単離される。前記ＤＮＡは、治療剤としてヒトに送達するため、細菌のエンドトキシンの無い状態で精製される。あるいは、自己ポリペプチドの各々が別々のＤＮＡ発現ベクター上にコードされる。本発明に包含される自己ベクターは、さらにＷＯ第０５３０１９号明細書に定義されている。
【００３８】
「プラスミド」および「ベクター」は、下方ケースｐとそれに続く文字および／または数字によって示される。出発プラスミドは、無限定基準に基づいて商品として入手できるか、公共的に入手できるか、または公表された操作にしたがって入手できるプラスミドから構築できる。さらに、前記プラスミドと等価のプラスミドから当業界に公知であり、通常の当業者にとって明らかであろう。「ベクター」または「プラスミド」は、宿主細胞内に存在した場合、適切な制御または調節要素を含むことにより複製能力がある遺伝要素を言う。本発明の目的のためのベクター、またはプラスミドの例としては、限定はしないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウィルスなどが挙げられる。
【００３９】
「トランスフェクション」とは、ＤＮＡを機能的に、または別の態様で発現させるように、ＤＮＡを宿主細胞内へ導入することを意味し、前記ＤＮＡはまた、染色体外要素としてまたは染色体組み込みによっても複製できる。他に示されない限り、宿主細胞の形質転換のため、本明細書に用いられる方法は、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）とファンデル・イービー（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）（１９７３）ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２巻、ｐ．４５６−４５７のリン酸カルシウム共沈法である。トランスフェクションのための代替法は、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクションおよび生物分解（クリーグラー（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ）（１９９０）遺伝子伝達および発現（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ））である。
【００４０】
薬剤に関して本明細書に用いられる「抗原特異的」とは、その薬剤が同一のクラスであるが、異なった抗原特異性を有している抗原認識分子（例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞上の表面ＩｇＭ）の中で識別できるような様式で、抗原認識分子と特異的に相互作用できることを意味する。抗原認識分子は典型的にはＢリンパ球またはＴリンパ球の中にクローン的に分布しているため、活性な抗原特異的薬剤は、その薬剤と相互作用する特定の抗原認識分子を発現する特異的なリンパ球サブセットに対して免疫調節作用を発揮できる。薬剤と抗原認識分子との相互作用は、例えば、他の分子相互作用の文脈においては、ペプチドとしてのＴ細胞受容体に対するペプチド抗原の結合：ＭＨＣ複合体などであり得る。
【００４１】
本明細書に用いられる「免疫応答の調節」とは、インビトロまたはインビボにおける既存の、または潜在的な免疫応答の何らかの変更を言う。自己免疫疾患に関連するこのような変更は、自己分子に対する免疫応答の変更である。調節としては、免疫応答に関与している、または関与する可能性を有している何らかの免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、マスト細胞、好塩基球など）の存在または機能における何らかの変更を挙げることができる。調節としては、例えば、免疫応答の一部として免疫細胞における遺伝子、蛋白質および／または他の分子の発現および／または機能の変更；免疫細胞の排除、欠失または隔離；他の例えば、自己反応性リンパ球、抗原提示細胞（ＡＰＣ）類または炎症細胞などの細胞の機能能力を調節できる免疫細胞の誘導または生成；免疫細胞における非反応状態（例えば、アネルギー）の誘導；または免疫細胞の活性、または機能の増大、減少または変化が挙げられる。免疫細胞により発現した蛋白質パターンの変更としては、例えば、サイトカイン類（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４）、ケモカイン類、成長因子、転写因子（例えば、ＮＦ−κＢ）、キナーゼ類（例えば、Ｌｃｋ、Ｌｙｎ）、ホスファターゼ類（例えば、ＰＴＰ−１Ｃ、ＰＴＰ−１Ｄ）、共刺激分子（例えば、Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ、ＩＦＡ−１）または他の細胞表面受容体などの一定クラスの分子の産生および／または分泌の変更を挙げることができる。
【００４２】
本明細書に用いられる「免疫調節配列（ＩＭＳ）類」とは、デオキシヌクレオチド類、リボヌクレオチド類、あるいは自己免疫疾患または炎症性疾患を調節するそれらの類縁体からなる薬剤を言う。ＩＭＳ類は、ベクターに取り込まれているオリゴヌクレオチド類またはヌクレオチド類の配列であり得る。本明細書に提供された方法に従って使用のＩＭＳ類は、参照としてその全体が援用されている米国特許出願第１０／３０２０９８号明細書にさらに記載されている。
【００４３】
本明細書に用いられる「免疫調節剤」は、宿主の免疫応答を調節できる分子を言う。免疫調節剤は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）またはポリペプチド（例えば、蛋白質、糖蛋白質、ペプチドなど）であり得る。さらに、免疫調節剤は、抗原特異的（例えば、自己抗原エピトープなどのポリペプチドまたは自己抗原エピトープと免疫学的に交差反応するポリペプチド）または非抗原特異的（例えば、サイトカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類または免疫調節配列）であり得る。免疫調節ポリペプチドは、ポリペプチドの組み換え体または合成体を含み得る。免疫調節ポリペプチドは、例えば、治療が求められて疾患に関連した自己抗原を含んでなるポリペプチド、あるいは自己抗原と免疫学的に交差反応するポリペプチドを含み得る。さらに免疫調節ポリペプチドは、例えば、インターロイキン類、インターフェロン類またはコロニー刺激因子などの例えば、サイトカイン類（または、それらの機能的断片）を含み得る。また、免疫調節ポリペプチドは、例えば、ケモカイン類または共刺激分子または、それらの機能的断片を含み得る。天然の蛋白質が膜結合分子（例えば、サイトカイン受容体（例えば、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−２Ｒなどの受容体類）または、例えばＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４またはＢ７分子などの共刺激分子）である場合、本明細書に記載された方法に用いられる免疫調節ポリペプチドは、例えば、Ｉｇ融合蛋白質などの溶解形態の蛋白質であり得る。受容体類の溶解性Ｉｇ融合組み換え形態を作製する方法は当業界に公知である（例えば、米国特許第５，７５０，３７５号明細書を参照）。
【００４４】
用語の「有効剤」とは、免疫応答を調節できる任意の薬剤を意味する。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「有効量」と「有効用量」とは同義語である。薬剤（スタチン、自己ベクター、または指令ペプチド）投与に関連する「有効用量」とは、患者における標的自己免疫応答の１つ以上の症状の発生を阻害、または改善するために、患者における自己免疫応答の調節に十分な分子の量を言う。したがって、試剤の有効用量とは、好適な期間投与した場合、自己免疫疾患重症度の低下を証明する用量である。自己免疫疾患重症度の低下を証明する投与に好適な期間は通常、少なくとも約１週間、および約２週間、または２週間以上の約４週間までであり得る。開始用量をこのような期間投与でき、続いて維持用量が投与できるが、それは用量を減少させて投与される場合があることは当業界に解されるであろう。
【００４６】
さらに、スタチン、自己ベクター、または規則的整列ペプチドの有効量は、本発明の方法に従って「有効な方法」において投与される。用語の「有効な用法」とは、自己免疫疾患の治療または予防の達成に適切な薬剤量および投与回数の組合せを言う。
【００４７】
また、併用療法（例えば、スタチンプラス自己ベクターまたはスタチンプラス規則的整列ペプチド）に関連する特定薬剤の有効量とは、好適な期間、第２の有効剤と共投与した場合、第２の有効剤単独で見られた場合に較べて、自己免疫疾患の重症度を低下させることを証明する特定薬剤量を意味する。幾つかの実施形態において、薬剤の併用によって治療的相乗的効果が生じる。本明細書で用いられる「相乗的とは」、相加的以上のものを意味する。本発明の他の実施形態において、第２の有効剤の有効量を投与することにより、第１の薬剤単独で見られた場合に較べて、自己免疫疾患の重症度低下の証明に要する第１の薬剤量を減少させることができる。第２の有効剤の存在下での薬剤の「有効量」減少は、本明細書において「スペアリング」と称される。すなわち、第２の薬剤投与によって、第１の薬剤の投与がスペアされる。
【００４８】
自己免疫疾患
本発明は、自己免疫疾患の治療または予防の方法を提供する。疾患の進行は、例えば後述の方法などの公知の方法を用いて、臨床的または診断的症状のモニタリングにより測定できる。
【００４９】
本明細書に提供された方法に従って、治療し得る自己免疫疾患の幾つかの例を以下に記載する。
【００５０】
本発明の方法は、多発性硬化症、ＥＡＥ、視神経炎、急性横断脊髄炎、および急性播種性脳炎などの脱髄炎症性疾患の治療にとって特に興味深い。
【００５１】
多発性硬化症多。発性硬化症の疾患経過は変化が大きく予測できず、多くの患者で弛張性である。ＭＳの病理的特徴は、多中心、多段階的なＣＮＳの炎症および脱髄である。特に疾患初期では、数ヶ月または数年の寛解によってエピソードを分けることができる。再発−寛解（ＰＲ）型患者の約７０％は、急性増悪と完全または部分的寛解を特徴とする。残りの患者は、慢性的進行性ＭＳを呈し、これらはさらに細かく以下のものに分けられる：（ａ）原発性進行性（ＰＰ）、（ｂ）ＲＰとＲＰとを合わせた特徴のパターンで臨床的重症度は中間の再発進行性（ＲＰ）およびＰＲを有する多くの患者が経時的に進行する二次的進行性（ＳＰ）。
【００５２】
ＭＳの臨床的症状としては、感覚喪失（感覚異常）、運動（痙縮性に次いで筋肉痙攣）および自律神経性（膀胱、腸、性的機能障害）脊髄症状；小脳症状（例えば、ディスアルスナ（ｄｙｓａｒｔｈｎａ）のシャルコー三徴、失調、振せん）；疲労およびめまい；神経心理学的試験における情報処理傷害；側方注視における複視などの眼症状；三叉神経痛；および視神経炎が挙げられる。
【００５３】
ＭＳにおける自己抗原はおそらく、幾つかのミエリン蛋白質（例えば、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）；ミエリン乏突起神経膠芽細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）；ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）；ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）、ミエリン会合乏突起神経膠芽細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）；シトルリン−修飾ＭＢＰ（６つのアルギニンが脱イミン化してシトルリンとなったＭＢＰのＣ８イソ体）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）、アルファ−Ｂクリスタリンなど）のうちの１つであると思われる。必須膜蛋白質ＰＬＰはミエリンの主な自己抗原である。小膠細胞およびマクロファージは、抗原提示細胞として共同して働く結果、サイトカイン類、補体および炎症過程の他の調節物質を活性化し、特定の乏突起神経膠芽細胞およびそれらの膜ミエリンを標的化する。ＩＦＮ−γを分泌する能力を有するミエリン自己反応性Ｔ細胞の量的増加が、ＭＳおよびＥＡＥの病因に関連していることから、ＭＳ患者の末梢血液中の自己免疫誘導物質／ヘルパーＴリンパ球がＭＳを有する患者における脱髄過程を開始および／または調節し得ることが示唆される。
【００５４】
慢性関節リウマチ。慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、世界人口の０．８％を冒している慢性自己免疫炎症性滑膜炎である。これは、侵食的な関節破壊を生じる慢性の炎症性滑膜炎を特徴とする。ＲＡは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージによって媒介される。
【００５５】
ＲＡにおいてＴ細胞が重要な役割を演じている証拠としては、以下のことが挙げられる：（１）滑膜に湿潤するＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢、（２）シクロスポリンなどの薬剤によるＴ細胞機能の抑制に伴う臨床的改善、および（３）ある一定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子とＲＡとの関連。ＲＡに関連したＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子は、ペプチド結合とＴ細胞への提示に関与しているβ鎖の第３の高度可変領域における６７位〜７４位のアミノ酸の同配列を含有する。ＲＡは、滑膜性連結に存在する自己蛋白質、または修飾自己蛋白質を認識する自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。自己抗原とも称される本発明の自己ポリペプチドが本発明において標的化されており、以下のエピトープを含んでなる：ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ；Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；シトルリン；ｇｐ３９などの軟骨蛋白質；Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＩｇＭ（リウマチ因子）；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；カルジオリペン；アルドラーゼＡ；シトルリン修飾フィラグリンおよびフィブリン。修飾アルギニン残基（脱イミン化してシトルリンを形成）を含有するフィラグリンペプチドを認識する自己抗体が、高い割合でのＲＡ患者血清中に確認されている。一部の患者において、自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の応答は、双方とも同じ免疫優勢ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）ペプチド２５７〜２７０に対して向けられている。
【００５６】
インスリン依存性糖尿病。ヒトＩ型すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、膵臓のランゲルハンス島におけるβ細胞の自己免疫破壊を特徴とする。β細胞の欠損により血中グルコース濃度調節不能が生じる。血中グルコース濃度がある一定のレベル、通常は約２５０ｍｇ／ｄｌ以上に上昇すると、明白な糖尿病が生じる。ヒトでは、長期の前症状期が、糖尿病発生に先行する。この期間に、膵臓のベータ細胞機能が徐々に失われる。糖尿病の発現は、各々が本発明による自己蛋白質、自己ポリペプチドまたは自己ペプチドの例であるインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびチロシンホスファターゼＩＡ２（ＩＡ２）に対する自己抗体の存在に関連している。
【００５７】
前症状段階の間に判断し得るマーカーは、膵臓におけるインスリン炎の存在、小島細胞抗体の濃度と頻度、小島細胞表面抗体、膵臓ベータ細胞上のクラスＩＩＭＨＣ分子の異常発現、血中グルコース濃度およびインスリンの血漿濃度である。膵臓におけるＴリンパ球、小島細胞抗体、および血中グルコースの数の増加は、インスリン濃度の低下と同様に、この疾患を示している。
【００５８】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、ヒトＩＤＤＭと臨床的、免疫学的および組織病理学的特徴の多くを共有する動物モデルである。ＮＯＤマウスは、自発的に小島の炎症およびβ細胞の破壊を発現し、これにより高血糖症および明白な糖尿病が導かれる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の各々の役割は不明だが、双方とも糖尿病の発現に必要である。ＮＯＤマウスに対する寛容化条件下で蛋白質として、インスリンまたはＧＡＤを投与することによって疾患が防止され、また、他の自己抗原に対する応答が、ダウンレギュレートされることが示されている。
【００５９】
血清中、種々の特異性を有する自己抗体の組合わせの存在は、ヒトＩ型糖尿病にとって感受性が高く特異的である。例えば、ＧＡＤおよび／またはＩＡ−２に対する自己抗体の存在は、対照血清からのＩ型糖尿病の同定に、約９８％感受性であり、９９％特異的である。Ｉ型糖尿病患者の非糖尿病第一親等の親族において、ＧＡＤ、インスリンおよびＩＡ−２の３つの自己抗原のうちの２つに特異的な自己抗体の存在によって、５年以内のＩ型ＤＭ発現に関して、＞９０％の陽性予測値が与えられる。
【００６０】
ヒトインスリン依存性糖尿病において標的とされる自己抗原としては、自己ポリペプチドのチロシンホスファターゼＩＡ−２；ＩＡ−２β；グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の６５ｋＤａ体および６７ｋＤａ体双方；カルボキシペプチダーゼＨ；インスリン；プロインスリン；熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）；グリマ（ｇｌｉｍａ）３８；小島細胞抗原６９ｋＤａ（ＩＣＡ６９）；ｐ５２；２つのガングリオシド抗原（ＧＴ３およびＧＭ２−１）；および小島細胞グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）が挙げられる。
【００６１】
ヒトＩＤＤＭは現在、組み換えインスリン注射またはポンプに基づく送達を扱うために血中グルコース濃度をモニターすることにより治療されている。十分な血中グルコースのコントロールを達成するために食事療法と運動療法が役立つ。
【００６２】
自己免疫ブドウ膜炎。自己免疫ブドウ膜炎は、米国で推定４０万人の人々が冒されており、１年に４万３千件の新たな発生件数を有する目の自己免疫疾患である。自己免疫ブドウ膜炎は現在、ステロイド、メトトレキサートやシクロスポリンなどの免疫抑制剤、免疫グロブリン静脈内投与およびＴＮＦα−アンタゴニストにより治療されている。
【００６３】
実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）は、目の神経網膜、ブドウ膜および関連組織を標的とするＴ細胞媒介の自己免疫疾患である。ＥＡＵは、ヒト自己免疫ブドウ膜炎と、多くの臨床的および免疫学的特徴とを共有しており、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳濁化したブドウ膜炎原性ペプチドの末梢投与により誘導される。
【００６４】
ヒト自己免疫ブドウ膜炎において、自己免疫応答によって標的化される自己蛋白質としては、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンおよびレコベリンを挙げることができる。
【００６５】
原発性胆汁性肝硬変。原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、主に４０〜６０才の女性を冒す器官特異的自己免疫疾患である。この群内で報告された有病率は約１０００人につき１人である。ＰＢＣは、肝内の小さな胆管を裏打ちしている肝内胆管上皮細胞（ＩＢＥＣ）の進行的破壊を特徴とする。これが胆汁分泌の閉塞および妨害を導き、結果的に肝硬変を生じさせる。上皮内層／分泌系損傷を特徴とする他の自己免疫疾患との関連としてはシェーグレン症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、自己免疫甲状腺疾患およびリウマチ様関節炎などが報告されている。その動因抗原に関して、５０年に亘りミトコンドリアが注目されてきたが、その結果、抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）の発見が導かれた（ガーシュウィン（Ｇｅｒｓｈｗｉｎ）ら、免疫学レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ）１７４巻：ｐ．２１０〜２２５、２０００年）；（マッケイ（Ｍａｃｋｅｙ）ら、免疫学レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ）１７４巻：ｐ．２２６〜２３７、２０００年）。臨床的症状が現れるだいぶ前から９０〜９５％の患者の血清中に存在しているＡＭＡは、まもなくＰＢＣの研究室診断の基礎となった。ミトコンドリア中の自己抗原反応性は、Ｍ１およびＭ２と称された。Ｍ２反応性は、４８〜７４ｋＤａの成分群に対して方向づけられている。Ｍ２は、２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体（２−ＯＡＤＣ）酵素の複数の自己抗原サブユニットであり、本発明の自己ポリペプチドの他の例である。ＰＢＣの病因病理発生におけるピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）抗原の役割を確認する研究によって、ＰＤＣがこの疾患誘導に中心的役割を演じているというコンセプトが支持されている（ガーシュウィン（Ｇｅｒｓｈｗｉｎ）ら、免疫学レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ）１７４巻：ｐ．２１０−２２５、２０００年）；（マッケイ（Ｍａｃｋｅｙ）ら、免疫学レビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ）１７４巻：ｐ．２２６−２３７、２０００年）。ＰＢＣの９５％の例において最も多く生じる反応性は、ＰＤＣ−Ｅ２に属するＥ２  ７４ｋＤａサブユニットである。それに関連しているが、異なった複合体としては、２−オキソグルタール酸塩デヒドロゲナーゼ複合体（ＯＧＤＣ）および分枝鎖（ＢＣ）２−ＯＡＤＣがある。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元を伴って２−オキソ酸基質をアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）へと形質転換する触媒機能に３種の構成的酵素（Ｅ１、２、３）が寄与する。哺乳動物のＰＤＣは、蛋白質ＸまたはＥ−３結合蛋白質（Ｅ３ＢＰ）と称される追加成分を含有する。ＰＢＣ患者において、主な抗原応答は、ＰＤＣ−Ｅ２およびＥ３ＢＰに対して方向づけられている。Ｅ２ポリペプチドは、２個の縦列反復リポイルドメインを含有し、一方、Ｅ３ＢＰは１個のリポイルドメインを有する。リポイルドメインはＰＢＣの多数の自己抗原標的に見られ、本明細書では「ＰＢＣリポイルドメイン」と称される。ＰＢＣは、グルココルチコイド類およびメトトレキサートやシクロスポリンＡなどの免疫抑制剤によって治療される。
【００６６】
実験的自己免疫胆管炎（ＥＡＣ）には、メスＳＪＬ／Ｊマウスにおいて、哺乳動物ＰＤＣによる腹腔内（ｉ．ｐ．）感作を用い、非化膿破壊性胆管炎（ＮＳＤＣ）およびＡＭＡの産生を誘導する（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ジャーナル・オブ・クリニカル・パソロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌ）５３巻：ｐ．８１３−２１、２０００年）。
【００６７】
他の自己免疫疾患および関連自己ポリペプチド類。重症性筋無力症に対する自己抗原としては、アセチルコリン受容体内のエピソードを挙げることができる。尋常性天疱瘡において標的化された自己抗原としては、デスモグレイン（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ）−３を挙げることができる。シェーグレン症候群抗原としては、ＳＳＡ（Ｒｏ）；ＳＳＢ（Ｌａ）；およびフォドリンを挙げることができる。重症性筋無力症に対する主な自己抗原としては、デスモグレイン−３を挙げることができる。筋炎に対する群としては、ｔＲＮＡシンターゼ類（例えば、トレオニル、ヒスチジル、アラニル、イソロイシルおよびグリシル）；Ｋｕ；Ｓｃｌ；ＳＳＡ；Ｕ１  Ｓｎリボ核蛋白質；Ｍｉ−１；Ｍｉ−１；Ｊｏ−１；Ｋｕ；およびＳＲＰを挙げることができる。強皮症に対する群としては、Ｓｃｌ−７０；動原体；Ｕ１リボ核蛋白質；およびフィブリラリンを挙げることができる。悪性貧血に対する群としては、内在性因子；および胃Ｈ／Ｋアデノシン三リン酸分解酵素を挙げることができる。全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に対するエピトープ抗原としては、ＤＮＡ；リン脂質；核抗原；Ｒｏ；Ｌａ；Ｕ１リボ核蛋白質；Ｒｏ６０（ＳＳ−Ａ）；Ｒｏ５２（ＳＳ−Ａ）；Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）；カルレティキュリン；Ｇｒｐ７８；Ｓｃｌ−７０；ヒストン；Ｓｍ蛋白質；およびクロマチンなどを挙げることができる。グレーブス病エピトープに対しては、Ｎａ＋／Ｉシンポーター；チロトロピン受容体；Ｔｇ；およびＴＰＯを挙げることができる。
【００６８】
メバロネート経路阻害剤
自己免疫疾患を治療するための本発明による方法は、メバロネート合成またはエフェクター経路の阻害剤である試剤の使用を含んでなる。メバロネート代謝物はＲａｓなどのＧ蛋白質修飾に関与する。メバロネート経路阻害剤は、Ｒａｓ蛋白質のイソプレニル化およびＲａｆ／ＭＡＰキナーゼカスケードを阻害するために使用されてきた（キクチら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６９巻：ｐ．２００５４−２００５９（１９９４））。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼおよびメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼは、メバロネート経路阻害に関する２つの有用な標的である。
【００６９】
スタチン類。好ましい実施形態において、メバロネート経路阻害剤はスタチンである。スタチン類は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の公知のクラスである。これらの試剤は以下に詳述されている：例えば、メバスタチンとその関連化合物は米国特許第３，９８３，１４０号明細書に開示されており、ロバスタチン（メビノリン）とその関連化合物は米国特許第４，２３１，９３８号明細書に開示されており、プラバスタチンとその関連化合物は米国特許第４，３４６，２２７号明細書に開示されており、シンバスタチンとその関連化合物は米国特許第４，４４８，７８４号明細書および米国特許第４，４５０，１７１号明細書に開示されており；フルバスタチンとその関連化合物は米国特許第５，３５４，７７２号明細書に開示されており；アトルバスタチンとその関連化合物は米国特許第４，６８１，８９３号明細書、米国特許第５，２７３，９９５号明細書および米国特許第５，９６９，１５６号明細書に開示されており；およびセリバスタチンとその関連化合物は米国特許第５，００６，５３０号明細書および米国特許第５，１７７，０８０号明細書に開示されている。その他の化合物は、米国特許第５，２０８，２５８号明細書、米国特許第５，１３０，３０６号明細書、米国特許第５，１１６，８７０号明細書、米国特許第５，０４９，６９６号明細書、ＲＥ第３６，４８１号明細書およびＲＥ第３６，５２０号明細書に開示されている。最近、「スーパースタチン」のロバスタチンが商品化された。ある一定のスタチン類は、その親油性によって皮下送達に特に好適となっている。
【００７０】
本明細書に提供したデータは、スタチン類が特異的ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子）蛋白質の活性化を特異的に変化させることによりＴｈ２制御Ｔ細胞の発現を促進することを示している。ＳＴＡＴ類は、チロシンキナーゼ類のヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーによるリン酸化により活性化される転写因子のファミリーである。ＳＴＡＴ６は、Ｔｈ２の分化に必須であり、一方、ＳＴＡＴ４は、Ｔｈ１の分化に重要な役割を有している。スタチン類は、リン酸化によりＳＴＡＴ６の活性化を特異的に促進する。また、スタチン類は、治療下の脳において、種々のＣＩＩＴＡプロモーターの調節を阻害し、非専門的ＣＮＳ  ＡＰＣ上の阻害されたＣＩＩＴＡ指向クラスＩＩのアップレギュレーションに影響を与え、そのことによって、Ｔｈ１細胞に対するＡｇ提示を妨げる。
【００７１】
スタチン類の製剤化と投与は周知であり、一般に通例的利用法に従う。自己免疫疾患の治療に必要とされる用量は、コレステロールの管理に用いられるレベルとは異なっており、幾つかの例においては、通例的用量（ここで、通例的用量とは、コレステロール管理に承認された用量を言うことを意図している）の約５倍ほどの増加；通例的用量の約１０倍ほどの増加；および２０倍、またはそれ以上の増加の高用量となる。
【００７２】
スタチン類は、治療的投与のために種々の剤形に組み込まれ得る。より具体的には、本発明の化合物は、適切な製剤上許容できる担体、または希釈剤と組合わせて製剤組成物中に製剤化でき、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、座剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェアおよびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体状形態における製剤に剤形化できる。このように、前記化合物の投与は、経口、経直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、イントラキアル（ｉｎｔｒａｃｈｅａｌ）などの種々の方法において達成できる。有効剤は、投与後全身性であり得るか、または領域投与、壁内投与の利用または有効量を移植部位に保持するように働く移植の利用によって局在化できる。
【００７３】
抗原特異的免疫調節剤
本発明の特定の実施形態において、抗原特異的免疫調節剤が、メバロネート経路阻害剤（例えば、スタチン）と共に共投与される。抗原特異的免疫調節剤は、例えば、前記疾患に関連する自己抗原性自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。さらに、抗原特異的免疫調節剤は、例えばポリペプチドであり得る。例えば、抗原特異剤は、前記疾患に関連する自己抗原エピトープなどのポリペプチドであり得る。このようなポリペプチドは、例えば、蛋白質自己抗原またはその断片（例えば、ペプチド断片）を含むポリペプチド、自己抗原エピトープを有するポリペプチド断片であり得る。また、例えば、ポリペプチド剤としては、自己抗原エピトープを構成するアミノ酸と同一ではないが、そのエピトープと免疫学的に交差反応するアミノ酸を挙げることができる。さらに、前記ポリペプチドとしては、例えば、自己抗原エピトープのアミノ酸に相当するもの、および例えば、ランダムに配置されたもの（例えば、酢酸グラチラマーなどのランダムポリマー）または指令モチーフとして配列されたものを挙げることができる。抗原特異的免疫調節ポリペプチドは、長さが少なくとも約６個のアミノ酸であり、典型的には約６個から約１００個のアミノ酸であり、より典型的には約８個から約５０個のアミノ酸であり、最も典型的には、約８個から約２５個のアミノ酸である。他の実施形態において、抗原特異的免疫調節ポリペプチドは、誘導ポリペプチドであり得る。ある誘導体は、他の配列に比して、保存的または非保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチドである。さらに誘導体として、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などが挙げられる。このような誘導体の例としては、例えば、Ｕ６６６９０３３、Ｕ６３２２９４９に記載されている変化したペプチドリガンド類が挙げられる。
【００７４】
自己ポリペプチド類をコードするポリヌクレオチド類。本発明の特定の実施形態において、抗原特異的免疫調節剤は、前記疾患に関連した自己抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである。自己ベクターとは、宿主細胞に移入された際にコードされた自己ポリペプチドを表現するようにデザインされた「自己カセット」を表す。
【００７５】
本発明のベクター類の構築には、当業界でよく理解されている標準的な連結法および制限法が採用される（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、（１９８７）分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）またはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら著、（１９９２）分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨークを参照）。単離プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドが所望の形態に開裂され、適合され、再連結される。合成ＤＮＡを取り込む全てのＤＮＡ構築物の配列は、ＤＮＡ配列分析によって確認された（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（１９７７）、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）。
【００７６】
発現自己カセットには、宿主細胞において機能的なプロモーターを使用する。一般に、特定の宿主細胞と共に、宿主細胞に適合する種に由来するプロモーターおよび制御配列を含有するベクター類が用いられる。原核宿主と共に使用するのに好適なプロモーターとして、例示的にベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびｔａｃプロモーター系などのハイブリッドプロモーター類が挙げられる。しかし、他の機能的な細菌プロモーターは好適である。原核動物の他に、酵母培養液などの真核微生物もまた使用できる。酵母または一般的なパン用酵母は最もよく用いられる真核微生物であるが、多数の他の株が一般的に利用できる。哺乳動物の宿主細胞において、ベクター類からの転写を制御するプロモーター類は、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィルス類、Ｂ型肝炎ウィルスおよび、好ましくは、サイトメガロウィルス、または非相同哺乳動物プロモーター類、例えば、β−アクチンプロモーターから入手し得る。ＳＶ４０ウィルスの早期および後期プロモーター類は、複製のＳＶ４０ウィルス源も含有するＳＶ４０制限断片として便宜よく入手される。ヒトサイトメガロウィルスの極早期プロモーターは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限断片として便宜よく入手される。もちろん、宿主細胞または関連する種由来のプロモーター類も本明細書において有用である。
【００７７】
本明細書に用いられるベクター類は、選択的マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。選択遺伝子は、ベクターによって形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする。哺乳動物細胞にとって好適な選択的マーカーの例としては、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、およびグルタミンシンターゼ遺伝子が挙げられる。このような選択的マーカーが哺乳動物の宿主細胞内へ首尾よく転移されると、形質転換した哺乳動物の宿主細胞は、選択圧下に置かれれば生存できる。選択機構には、２つの異なるカテゴリーが広く用いられている。第１のカテゴリーは、細胞の代謝および補足培地から独立して増殖する能力を欠く突然変異細胞系の使用に基づいている。第２のカテゴリーは、任意の細胞タイプに用いられ、突然変異細胞系の使用を必要としない選択機構である優性選択を言う。これらの機構は一般に、宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を用いる。新たな遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を伝える蛋白質を表現し、選択をくぐって生き残ると考えられる。このような優性選択の例では、薬剤のネオマイシン（サザンおよびバーグ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ）（１９８２）ジャーナル・オブ・モレキュラー・アプライド・ジェネティックス（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．）１巻、ｐ．３２７）、ミコフェノール酸（ムリガンおよびバーグ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ）（１９８０）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０９巻、ｐ．１４２２）、またはヒグロマイシン（サジェン（Ｓｕｇｄｅｎ）ら、（１９８５）モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．）５巻、ｐ．４１０−４１３）が用いられる。上記の３つの例では、各々適切な薬剤、ネオマイシン（Ｇ４１８またはゲンチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンに対する耐性を伝えるために、真核生物の制御下で細菌遺伝子が採用される。
【００７８】
本発明の自己ベクターは、医薬品として使用するためにポリヌクレオチド塩として製剤化し得る。ポリヌクレオチド塩は、非毒性無機または有機塩基によって調製できる。無機塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、亜鉛、カルシウム、アルミニウム、マグネシウムなどが挙げられる。有機非毒性塩基としては、第一級、第二級および第三級アミン類の塩が挙げられる。このような自己ＲＮＡポリヌクレオチド塩は、送達前再構成のために滅菌水または塩溶液などの凍結乾燥形態に製剤化できる。あるいは、自己ＲＮＡポリヌクレオチド塩は、送達用に水ベースまたは油ベースの媒体を含む溶液、懸濁液、または乳濁液に製剤化できる。好ましい一実施形態において、前記ＤＮＡは、カルシウムの生理的濃度（０．９ｍＭ）を有するリン酸緩衝食塩水中で凍結乾燥され、次に投与前、滅菌水で再構成される。あるいは、前記ＤＮＡは、１ｍＭから２Ｍの間のより多量のＣａ＋＋を含有する溶液中で製剤化される。また、前記ＤＮＡは、特定のイオン種の非存在下で製剤化することもできる。
【００７９】
通常の当業者に公知のように、本明細書に定義されている患者にポリヌクレオチドを送達するために多種多様の方法が存在する。自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、カチオン性リポソームなどのカチオン性ポリマーによって製剤化できる。他のリポソームもまた、自己ポリヌクレオチドを製剤化し、送達するための効果的手段となっている。あるいは、自己ＤＮＡを薬理学的送達のために、ウィルスベクター、ウィルス粒子または細菌内へ取り込むことができる。ウィルスベクターは、感染能力を有し得るか、弱毒化できるか（疾病を誘導する能力を低下させる突然変異により）、または複製欠失であり得る。病原性自己蛋白質の沈着、蓄積または活動を防止するために自己ＤＮＡを利用する方法は、コードされた自己蛋白質に対する体液性応答を高めるウィルスベクターまたは他の送達システムの使用によって増強し得る。他の実施形態において、前記ＤＮＡは、金粒子、ポリサッカライドベース支持体、あるいは注入、吸入または粒子衝撃（弾道送達）により送達される他の粒子またはビーズなどの個体支持体に共役化できる。
【００８０】
ムクレイン酸製剤の送達法は当業界に知られている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、米国特許第５，５８９，４６６号明細書を参照されたい。哺乳動物細胞内への転移のために多数のウィルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウィルスシステムが記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号明細書；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）７巻：ｐ．９８０−９９０、１９８９年；ミラー，エイ・ディー（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．）ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）１巻：ｐ．５〜１４、１９９０年；スカーパ（Ｓｃａｒｐａ）ら、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１８０巻：ｐ．８４９−８５２、１９９１年；バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国９０巻、ｐ．８０３３−８０３７、１９９３年；およびボリス−ローリーおよびテミン（Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ）、遺伝学発展の現代評価（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．）第３巻：ｐ．１０２〜１０９、１９９３年）。多くのアデノウィルスもまた記載されている。例えば、以下を参照されたい（ハジャマド（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ）ら、遺伝子ジャーナル（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）５７巻：ｐ．２６７−２７４、１９８６年；ベット（Ｂｅｔｔ）ら、ウィルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６７巻：ｐ．５９１１−５９２１、１９９３年；ミッテレーダー（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ）ら、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）５巻：ｐ．７１７−７２９、１９９４年；セス（Ｓｅｔｈ）ら、ウィルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６８巻：ｐ．９３３−９４０、１９９４年；バール（Ｂａｒｒ）ら、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）１巻：ｐ．５１−５８、１９９４年；バークナー，ケイ・エル（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．）、バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）６：ｐ．６１６−６２９，１９８８年；およびリッチ（Ｒｉｃｈ）ら、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）４巻：ｐ．４６１−４７６、１９９３年）。アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクターシステムもまた、核酸送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当業界に周知の方法を用いて容易に構成できる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号明細書および米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開ＷＯ第９２／０１０７０号明細書およびＷＯ第９３／０３７６９号明細書；レブコースキー（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ）ら、モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．）８巻、ｐ．３９８８−３９９６、１９８８年；ビンセント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）９０（コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））１９９０年；カーター，ビー・ジェイ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．）、バイオテクノロジーの現代評価（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ��ｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３巻：ｐ．５３３−５３９、１９９２年；ムジツカ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ）、微生物学および免疫学の最近のトピック（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５８巻：ｐ．９７−１２９、１９９２年；コーチン，アール・エム（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．）ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）５巻：ｐ．７９３−８０１、１９９４年；シェリング（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ）ら、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）１巻：ｐ．１６５−１６９、１９９４年；およびゾー（Ｚｈｏｕ）ら、実験医薬雑誌（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１７９巻：ｐ．１８６７−１８７５、１９９４年）を参照されたい。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドは、ウィルスベクターなしでも送達できる。例えば、患者に送達する前に、前記分子をリポソーム内にパッケージ化できる。脂質のカプセル化は一般に、核酸と安定して結合または捕捉して保持することのできるリポソームを用いて達成される。核酸送達のための担体としてのリポソーム使用の概観に関しては、ハグ（Ｈｕｇ）ら、ビオキム・ビオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．）１０９７巻：ｐ．１−１７、１９９１年；ストラウビンガー（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ）ら、酵素化学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻、ｐ．５１２−５２７、１９８３年）を参照されたい。
【００８２】
自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターの「治療的有効量」は、本発明の教示に従って投与され、例えば、前記疾患の症状および／または原因を改善または除去することによって、前記疾患を治療または予防するために十分なものである。例えば、治療的有効量は広範囲に亘り、臨床試験によって決定され、また特定の患者に対しては、疾患の重症度、患者の体重、年齢および他の要因など、通常の当業臨床医に知られた要因に基づいて決定される。自己ベクターの治療的有効量は、約０．００１マイクログラムから約１グラムの範囲にある。自己ベクターの好ましい治療的有効量は、約１０マイクログラムから約５ミリグラムの範囲にある。自己ベクターの最も好ましい治療的有効量は、約０．０２５ｍｇから約５ｍｇの範囲にある。ポリヌクレオチド療法は、６〜１２ヵ月間、月１回実施され、その後、維持用量として３〜１２ヵ月ごとに実施される。代替治療法を開発でき、疾患の重症度、患者の年齢、投与されている自己ポリペプチドおよび通常の治療を行っている医師によって考慮される他の要因などに依って、１日１回から週１回、隔週、年１回、単回投与までの範囲であり得る。
【００８３】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、筋肉内注射により送達される。他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、鼻腔内、経口、皮下、皮内、静脈内、経粘膜、皮膚の押圧、または真皮へ、または真皮を経て送達される金粒子への付着して送達される（例えば、ＷＯ第９７／４６２５３号を参照）。あるいは、核酸は、リポソームまたは荷電脂質と共に、またはこれらなしの局所適用によって皮膚細胞内へ送達できる（例えば、米国特許第６，０８７，３４１号明細書を参照）。さらに他の代替法は、吸入剤として核酸を送達することである。前記ポリヌクレオチドは、カルシウムの生理学的濃度（０．９ｍＭ）を有するリン酸緩衝食塩水において製剤化される。あるいは、前記ポリヌクレオチドは、１ｍＭから２Ｍの間の多量のＣａ＋＋を含有する溶液において製剤化される。前記ポリヌクレオチドは、亜鉛、アルミニウムおよびその他のものなど、他のカチオンと共に製剤化され得る。あるいは、またはそれに追加して、前記ポリヌクレオチドは、カチオン性ポリマー、カチオン性リポソーム形成化合物のいずれかと共に、または非カチオン性リポソームにおいて製剤化し得る。ＤＮＡ送達のためのカチオン性リポソームの例としては、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンミオニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）および他のそのような分子を用いて作製したリポソーム類が挙げられる。
【００８４】
ポリヌクレオチド送達前に、その後のポリヌクレオチド療法の送達を増強し得るブピビカン（ｂｕｐｉｖｉｃａｎｅ）、カルジオトキシン（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）または他の試剤による処置によって送達部位を予備調整できる。このような予備調整法は一般に、治療用ポリヌクレオチド送達の１２〜９６時間前、より多くの場合、治療用ＤＮＡ送達の２４〜４８時間前に送達される。あるいは、ＤＮＡ療法前に予備調整処置は行われない。
【００８５】
自己ポリペプチドをコードする自己ベクターに加えて、免疫応答を増大させるためＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる免疫応答調節用補剤を共投与できる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡワクチン接種の抗体応答を増大させることが示されている（クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３７４巻：ｐ．５４６−９、１９９５年）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に抵抗性であるホスホロチオエート化骨格などの骨格の精製オリゴヌクレオチドからなる。前記オリゴヌクレオチド内に含有する特異的配列は、プリン−プリン−Ｃ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジン、またはプリン−ピリミジン−Ｃ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジンである。これら構成体は全て、免疫応答がコード化自己ポリペプチドに対して生じるような様式で投与される。免疫応答、典型的には抗体応答は、自己ポリペプチドに関連した非生理的作用または過程に影響を与える。
【００８６】
本発明の使用に選択されるヌクレオチド配列は、例えば、標準的な方法を用いて所望の遺伝子またはヌクレオチド配列を含有する細胞から核酸を単離することによって公知の供給源から誘導できる。同様に、前記ヌクレオチド配列は、当業界で周知のポリヌクレオチド合成の標準的様式を用いて合成的に生成できる。例えば、（エッジ（Ｅｄｇｅ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９２巻：ｐ．７５６  １９８１年）；（ナムベア（Ｎａｍｂａｉｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２３巻：ｐ．１２９９  １９８４年）；（ジェイ（Ｊａｙ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９巻：ｐ．６３１１  １９８４年）を参照されたい。一般に、合成オリゴヌクレオチドは、エッジら（上記）および（ダックワース（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）９巻：ｐ．１６９１  １９８１年）によって記載されたようなホスホトリエステル法、または（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、テトラヘドロン・レターズ２２巻：ｐ．１８５９  １９８１年）、および（マットイッチ）ら、アメリカ化学会誌１０３巻：ｐ．３１８５  １９８１年）によって記載されたホスホルアミダイト法のいずれかによって調製できる。また、合成オリゴヌクレオチドは、商品として入手できる自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製することもできる。このようにヌクレオチド配列は、特定のアミノ酸配列のための適切なコドンによってデザインできる。一般に、意図される宿主において発現させるために好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準的方法によって調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから構築され、完全なコード配列へと構築される。例えば、エッジら（上記）、ナムベアら（上記）およびジェイら（上記）を参照されたい。
【００８７】
本明細書に使用する核酸配列を得るための他の方法は、組み換え手段によるものである。例えば、所望のヌクレオチド配列は、標準的な制限酵素と操作を用いて核酸を担持するプラスミドから切除できる。部位特異的なＤＮＡ開裂が、好適な制限酵素と操作を用いた処理によって実施される。部位特異的なＤＮＡ開裂は、一般に当業界で理解されている条件下で、好適な単数制限酵素（または複数酵素）による処理によって実施され、その詳細は商品入手できる制限酵素の製造元によって明記されている。所望の場合、開裂断片のサイズ分離を、標準的技法を用いて、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実施できる。
【００８８】
特定の核酸分子を単離するさらに他の簡便な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１５５巻：ｐ．３３５−３５０  １９８７年）。
【００８９】
指令ペプチド。本発明の特定の実施形態において、抗原特異的免疫調節剤は、指令アミノ酸モチーフを有するペプチドであり、ここでのアミノ酸は、抗原エピトープにおけるアミノ酸に相当する。
【００９０】
脱髄自己免疫疾患の治療のための好ましい一実施形態において、指令ペプチドは、指令アミノ酸モチーフ｛配列番号：１｝［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎを含んでなり、式中ｎは２から６である。指令モチーフは、示されているように残基１で開始でき、または異なった位置、例えば｛配列番号：６｝ＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫＥ；｛配列番号：７｝ＫＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹなどで開始できる。指令ペプチド配列の全長は通常、少なくとも約８個のアミノ酸長で、約２４個のアミノ酸長以下であり、通常少なくとも約１０個で約２０個以下である。関心対象の特定ペプチドは、配列｛配列番号：４｝ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫを含む。前記ペプチドは、指令反復のみからなってもよく、また、他のアミノ酸残基の付加によって、どちらの末端においても伸長し得る。
【００９１】
指令ペプチドの構造において修飾および変更がなされたとしても、脱髄自己免疫疾患を抑制する所望の特性を有する分子が得られる。所望の特性は、少なくとも部分的にインビトロアッセイにおいて決定でき、ここでＭＨＣ抗原ＨＬＡ−ＤＲ、特にＨＬＡ−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）に対する結合は、関連する生物活性を示している。
【００９２】
例えば、一定のアミノ酸が、機能の目立った損失なしで蛋白質構造の中の他のアミノ酸と置換し得る。指令ペプチドの配列において種々の変化（蛋白質の安定性または効率などに関して）が、特に末端アミノ酸の付加に関して目立った生物学的利用性または活性の損失なしでなされ得ることは当業技術者により解されるであろう。変化しても結合特性および免疫学的活性が維持される限り、結果として生じる蛋白質は、本発明の目的にとって生物学的に機能的等価物と考えられる。
【００９３】
前記ペプチドは、非野生型フランキング領域への結合、融合蛋白質として、結合基による結合、またはシステイン（ジスルフィド）またはペプチド結合を介した直接的共有結合などの種々の方法において提供し得る。前記ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端における単一アミノ酸またはアミノ酸の鎖に結合し得る。融合ペプチドは、便利な結合部位、例えば、システインまたはリジンの提供、安定性の増大、特定の受容体への結合、部位指向的作用の提供、精製を容易にすること、物理的特性（例えば、溶解性、電荷など）の変更、コンフォメーションの安定化などのために伸長し得る。前記ペプチドはこれらの付加配列に関連してＮ末端、Ｃ末端または内部のものであり得る。
【００９４】
前記ペプチドは、マレイミド安息香酸、メチルｄｆｈｉｏ酢酸、メルカプト安息香酸、Ｓ−ピリジルジチオプロピオネートなどの種々の二官能性試剤により結合し得る。オリゴペプチドは、部位指向作用を提供するため蛋白質に結合できる。オリゴペプチドは部位指向作用のため、特に細胞内開裂可能結合により、抗体に結合できる。共役方法については、例えば、参照のため、本明細書に援用されている米国特許第３，８１７，８３７号明細書；米国特許第３，８５３，９１４号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，９０５，６５４号明細書；米国特許第４，１５６，０８１号明細書；米国特許第４，０６９，１０５号明細書；および米国特許第４，０４３，９８９号明細書を参照されたい。また、オリゴヌクレオチドは、ベシクル、例えばリポソームの内腔に取り込むことができ、次にそれを特定の細胞または組織へ方向づけるために、リガンドまたは受容体に結合させ得る。
【００９５】
療法には、前記ペプチドを局所的または非経口的に、例えば、皮下的、腹腔内、血管内などの特定部位への注射により、または電気輸送によるなど経皮的に投与し得る。好ましい一実施形態において、前記ペプチドの送達に皮下注射が用いられる。また前記オリゴペプチドは、より長時間に亘って徐々に放出させる目的で、有効ペプチドの貯蔵を供するため、徐放製剤または浸透ポンプにおいて投与し得る。このような送達によって、必要とされる薬剤用量を減少させることができ、また、治療効果を達成するために必要な治療回数を減らすことができる。
【００９６】
本発明のオリゴペプチドは、合成法、組み換え法などの従来の方法に従って調製できる。例えば、固相ペプチド合成は、アミノ酸の連続的付加を伴い、線状のペプチド鎖を創製する（メリーフィールド（１９６３）アメリカ化学会誌、８５巻：ｐ．２１４９−２１５４を参照）。組み換えＤＮＡ法によるペプチド生産もまた実施できる。先ず、所望のペプチドをコードする核酸配列を合成、または創製する。このコード配列を、発現のために好適な制御要素、例えば、当業界に知られているプロモーター類、ターミネーター類、ＡＴＧ開始コドンなどと操作可能に連結する。この発現構築体を好適な宿主細胞に導入し、産生された組み換え蛋白質を単離する。あるいは、例えば、発現構築体を筋肉内または治療のための長期生存造血細胞内へ挿入することにより、長期療法で治療される宿主内へ前記コード配列を導入する。発現ベクターは、プラスミド、レトロウィルス、アデノウィルスなどのウィルスベクターであり得、形質導入、ＤＮＡワクチン接種などにより導入し得る。
【００９７】
前記ペプチドの製薬上許容できる塩もまた、本明細書に開示されたペプチドの範囲に入る。
【００９８】
投与には種々の方法が採用できる。前記製剤は、経口で、吸入により、または、血管内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内などの注射により投与し得る。治療製剤の用量は、疾患の性質、投与回数、投与様式、宿主からの薬剤クリアランスなどに依って大きく変化する。開始用量はより高く、その後により低い維持用量が続くと考えられる。前記用量は、週１回、２週に１回などと飛び飛びであってもよく、または低用量へと分割されて１日１回、１週間に２回などで投与でき、有効用量レベルを維持する。多くの場合、経口投与では静脈内投与の場合よりも、より高用量が必要となる。
【００９９】
本発明のペプチドは、治療的投与のために、種々の製剤へと組み込むことができる。より具体的には、前記複合体は、適切な製薬上許容できる担体または希釈剤と組合わせることによって製薬組成物内へ製剤化でき、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、座剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフェアおよびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体における製剤に製剤化できる。このように、前記ペプチドの投与は、経口、経頬側、経直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、イントラキアル（ｉｎｔｒａｃｈｅａｌ）などの種々の方法において達成できる。前記ペプチドは投与後、全身性であり得るか、または、移植部位に有効用量を保持するために働く移植片の使用によって局所化し得る。
【０１００】
医薬品投与形態において、前記ペプチドは製薬上許容できる塩の形態において投与できるか、または単独で使用できるか、または適切な会合において使用でき、また他の医薬品として有効な化合物と併用できる。以下の方法および賦形剤は単なる例示であり、決して限定するものではない。
【０１０１】
経口製剤として、前記ペプチドは、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製するために、適切な添加剤と組合わせて、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉などの通例的な添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシ澱粉またはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および所望の場合は、希釈剤、緩衝剤、湿潤化剤、保存剤および風味剤と組合わせて使用できる。
【０１０２】
前記ペプチドは、それらを植物油または類似の油類、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールなどの水性溶媒または非水性溶媒中、所望の場合は、溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤および保存剤と共に溶解、懸濁または乳化させることによって注射製剤へと製剤化できる。
【０１０３】
前記ペプチドは、吸入によって投与するためにエアロゾル製剤において利用できる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容できる加圧推進剤へと製剤化できる。
【０１０４】
さらに、前記ペプチドは、乳化基剤または水溶性基剤などの種々の基剤と混合することにより座剤へと作製できる。本発明のペプチドは、座剤によって経直腸投与できる。前記座薬は、体温で溶融するが、室温では固化するカカオバター、カルボワックス類およびポリエチレングリコール類などの媒体を含み得る。
【０１０５】
シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤などの経口または経直腸投与のための単位投与形態が供されるが、ここでの各投与単位、例えば、ティースプーン１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤または座剤は、本発明の１種以上の化合物を含有する組成物の予め決定された量を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与形態は、滅菌水、通常の食塩水または他の製薬上許容できる担体中の溶液としての組成物中に本発明の化合物を含んでなり得る。
【０１０６】
徐放製剤のための移植片は当業界で周知のことである。移植片は、生分解性または非分解性のポリマーと共にミクロスフェア；スラブ（ｓｌａｂ）などとして製剤化される。例えば、乳酸および／またはグリコール酸形態のポリマーおよび宿主に十分忍容される侵食性ポリマーである。ペプチドを含有する移植片は、作用部位の近傍に置かれ、その結果、有効剤の局所濃度は身体の他の部分に比して高くなる。
【０１０７】
本明細書に用いられる用語の「単位投与形態」とは、ヒトおよび動物患者にとって単位用量として好適な物理的個別の単位を言い、各単位は、製薬上許容できる希釈剤、担体または媒体と共同して所望の効果を生み出すのに十分な量として算出された本発明のペプチドの予め決定された量を含有する。本発明の新規な単位投与形態の明細は、採用される特定の複合体や達成しようとするその効果および宿主内における各複合体に関連する薬力学に依存する。
【０１０８】
媒体、補剤、担体または希釈剤などの製薬上許容できる賦形剤は容易に一般入手できる。さらに、ｐＨ調整剤や緩衝剤、張性調整剤、安定化剤、湿潤化剤などの製薬上許容できる補助物質が容易に一般入手できる。
【０１０９】
患者や治療対象となっている病態および投与経路に依って、前記ペプチドは、一般に１日当たり０．０１ｍｇから５００ｍｇ  Ｖ／ｋｇ体重、例えば、標準的な人では約２０ｍｇ／日の用量で投与される。一般に、種々の動物に対する治療効果の有効性は広範囲で変化し、ヒトではラットよりも、典型的には２０倍、３０倍さらに４０倍低用量（単位体重当たり）であるため、その範囲は広範囲に亘る。同様に、投与様式は、投与量に大きな影響を与え得る。例えば、ラットにおける経口投与量は、その注射用量の１０倍であり得る。典型的な投与は１日１回の注射である。
【０１１０】
特定化合物の機能、症状の重症度および副作用に対する患者の感受性によって投与濃度が変化し得ることを当業者は容易に理解されるであろう。特定のペプチドの幾つかは他のものよりも強力である。所与の複合体についての好ましい投与量は、種々の手段によって当業者により容易に決定できる。好ましい手段の１つは、所与の化合物の生理学的効力測定である。
【０１１１】
非抗原特異的免疫調節剤
本発明の特定の実施形態において、非抗原特異的免疫調節剤が、メバロネート経路阻害剤（例えば、スタチン）と共に共投与される。非抗原特異的免疫調節剤は、例えば、免疫調節オリゴヌクレオチドまたは免疫調節ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドベクターなどの、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。また、非抗原特異剤は、例えば、免疫抑制的な性質を有する小型有機分子であり得る。他の実施形態において、非抗原特異的免疫調節剤は、例えば、ポリペプチドであり得る。免疫調節ポリペプチドとしては、例えば、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）または共刺激性分子（例えば、ＣＴＬＡ−４）を挙げることができる。免疫調節ポリペプチドの天然形態が膜結合蛋白質として存在する場合、ポリペプチドは、溶解性形態（例えば、ポリペプチドの細胞外ドメインを有するＩｇ−融合体）へと修飾できる。典型的に非抗原特異的免疫調節剤は、メバロネート経路阻害剤ではない。例えば、メバロネート経路阻害剤がスタチンの場合、非抗原特異剤は非スタチン分子である。
【０１１２】
本発明の好ましい一実施形態において、非抗原特異的免疫調節剤は、オステオポンチンまたはオステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである。オステオポンチンは、自己免疫疾患において病原性役割を演じることが最近確認された多面発現性分子である。自己蛋白質、オステオポンチン、またはオステオポンチンをコードするＤＮＡによる治療によって、疾患の永続化におけるオステオポンチンの有害な影響を阻害する抗オステオポンチン免疫グロブリン応答が宿主内に誘導される。
【０１１３】
免疫調節剤。好ましい実施形態において、非抗原特異的免疫調節蛋白質は免疫調節配列を含んでなるオリゴヌクレオチドである。
【０１１４】
一実施態様において、本発明の免疫調節配列は、以下の主要構造から構成される合成オリゴヌクレオチドであり：
５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’
または
５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’；
式中、ＸおよびＹは、シトシン−グアニンであり得ないこと以外は、ＸおよびＹは任意の天然または合成ヌクレオチドである。
【０１１５】
ＩＭＳ類の中心六量体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの任意の組成または数によって５’および／または３’にフランクできる。ＩＭＳ類は、長さが６塩基対から１００塩基対の間の範囲にあることが好ましく、長さが１６〜５０塩基対の範囲にあることが最も好ましい。また、ＩＭＳ類は、１００塩基対から１００，０００塩基対の範囲にあるＤＮＡのより大きな断片部分としても送達できる。ＩＭＳ類は、ＤＮＡプラスミド、ウィルスベクターおよびゲノムＤＮＡの中に取り込まれ得るか、または既に存在し得る。ＩＭＳ類はまた、最も好ましくは６塩基対（非フランキング配列）から１０，０００塩基対、またはよりサイズが大きい範囲にあり得る。六量体の中心にフランクする存在配列は、任意の公知の免疫阻害配列（ＩＩＳ）に存在するフランキング配列に実質的にマッチするように構築され得る。例えば、フランキング配列ＴＧＡＣＴＧＴＧ−Ｐｕ−Ｐｕ−Ｘ−Ｙ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−ＡＧＡＧＡＴＧＡ、式中、ＴＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号：７６）およびＡＧＡＧＡＴＧＡ（配列番号：７７）はフランキング配列である。他の好ましいフランキング配列は、２回以上繰り返される個々のピリミジンとして、または２つ以上の長さの異なったピリミジンの混合物として、ピリミジン（Ｃ、ＴおよびＵ）の連続体を取り込む。種々のフランキング配列が、阻害調節配列の試験に用いられてきた。阻害オリゴヌクレオチドに対するフランキング配列のさらなる例は、以下の文献に含まれている：米国特許第６，２２５，２９２号明細書および米国特許第６，３３９，０６８号明細書ゾイナー（Ｚｅｕｎｅｒ）ら、関節炎とリウマチ（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、４６巻：ｐ．２２１９−２４、２００２年。
【０１１６】
本発明の特定のＩＭＳ類としては、以下の六量体配列を含有するオリゴヌクレオチド類が挙げられる：
１．  以下のＧＧジヌクレオチド中心を含有する５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’ＩＭＳ類：ＧＴＧＧＴＴ（配列番号：１２）、ＡＴＧＧＴＴ（配列番号：１３）、ＧＣＧＧＴＴ（配列番号：１４）、ＡＣＧＧＴＴ（配列番号：１５）、ＧＴＧＧＣＴ（配列番号：１６）、ＡＴＧＧＣＴ（配列番号：１７）、ＧＣＧＧＣＴ（配列番号：１８）、ＡＣＧＧＣＴ（配列番号：１９）、ＧＴＧＧＴＣ（配列番号：２０）、ＡＴＧＧＴＣ（配列番号：２１）、ＧＣＧＧＴＣ（配列番号：２２）、ＡＣＧＧＴＣ（配列番号：２３）など。
【０１１７】
２．  以下のＧＣジヌクレオチド中心を含有する５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’ＩＭＳ類：ＧＴＧＣＴＴ（配列番号：２４）、ＡＴＧＣＴＴ（配列番号：２５）、ＧＣＧＣＴＴ（配列番号：２６）、ＡＣＧＣＴＴ（配列番号：２７）、ＧＴＧＣＣＴ（配列番号：２８）、ＡＴＧＣＣＴ（配列番号：２９）、ＧＣＧＣＣＴ（配列番号：３０）、ＡＣＧＣＣＴ（配列番号：３１）、ＧＴＧＣＴＣ（配列番号：３２）、ＡＴＧＣＴＣ（配列番号：３３）、ＧＣＧＣＴＣ（配列番号：３４）、ＡＣＧＣＴＣ（配列番号：３５）など。
【０１１８】
３．  アデニンをグアニンおよびイノシンに置換したものおよび／またはシトシンまたはチミンをウリジンにしたもので、それらの置換体は、上記の指針に基づいて記載されたとおり作製できる。
【０１１９】
先に開示した免疫阻害配列、すなわちＩＩＳは、中心ヌクレオチド、ＣｐＧを含有する免疫刺激配列（ＩＳＳ）を阻害することが示された。米国特許第６，２２５，２９２号明細書。ＩＳＳ不在下のＩＩＳは、単独でまたはＤＮＡポリヌクレオチド療法と組合わせて、自己免疫疾患を予防および治療することが、本発明によって初めて示された。このＩＩＳは、中心六量体ＡＡＧＧＴＴ（配列番号：３６）を含有した。その配列は、本明細書において免疫調節配列、すなわちＩＭＳと称される。本発明のＩＭＳ内に含まれる同様のモチーフを有する他の関連ＩＩＳは、以下のものである：
１．  以下のＧＧジヌクレオチド中心を含有する５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’ＩＭＳ類：ＧＧＧＧＴＴ（配列番号：３７）、ＡＧＧＧＴＴ（配列番号：３８）、ＧＡＧＧＴＴ（配列番号：３９）、ＡＡＧＧＴＴ（配列番号：４０）、ＧＧＧＧＣＴ（配列番号：４１）、ＡＧＧＧＣＴ（配列番号：４２）、ＧＡＧＧＣＴ（配列番号：４３）、ＡＡＧＧＣＴ（配列番号：４４）、ＧＧＧＧＴＣ（配列番号：４５）、ＡＧＧＧＴＣ（配列番号：４６）、ＧＡＧＧＴＣ（配列番号：４７）、ＡＡＧＧＴＣ（配列番号：４８）など。
【０１２０】
２．  以下のＧＣジヌクレオチド中心を含有する５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’ＩＭＳ類：ＧＧＧＣＴＴ（配列番号：４８）、ＡＧＧＣＴＴ（配列番号：４９）、ＧＡＧＣＴＴ（配列番号：５０）、ＡＡＧＣＴＴ（配列番号：５１）、ＧＧＧＣＣＴ（配列番号：５２）、ＡＧＧＣＣＴ（配列番号：５３）、ＧＡＧＣＣＴ（配列番号：５４）、ＡＡＧＣＣＴ（配列番号：５５）、ＧＧＧＣＴＣ（配列番号：５６）、ＡＧＧＣＴＣ（配列番号：５７）、ＧＡＧＣＴＣ（配列番号：５８）、ＡＡＧＣＴＣ（配列番号：５９）など。
【０１２１】
３．アデニンをグアニンおよびイノシンに置換したものおよび／またはシトシンまたはチミンをウリジンにしたものは、上記の指針に基づいて記載されたとおり作製できる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、およびｃＤＮＡなどの既存の核酸源から入手できるが、オリゴヌクレオチド合成によって生産された合成オリゴヌクレオチドであることが好ましい。ＩＭＳは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはオリゴヌクレオシド類の一部であり得る。
【０１２３】
ＩＭＳは、優先的に非メチル化ＧｐＧオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドである。代わりの実施形態では、１つ以上のアデニン残基またはシトシン残基がメチル化されているＩＭＳが含まれる。真核細胞においては、一般にシトシン残基およびアデニン残基はメチル化できる。
【０１２４】
ＩＭＳは、安定化および／または非安定化オリゴヌクレオチドであり得る。安定化オリゴヌクレオチドとは、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび他の分解経路によるインビボ分解に対して比較的抵抗性のあるオリゴヌクレオチドを意味する。好ましい安定化オリゴヌクレオチドは、修飾ホスフェート骨格を有し、最も好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスフェート酸素が硫黄に置換されているホホロチオエート修飾ホスフェート骨格を有する。メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびホスホロジチオネートヌクレオチド結合などの骨格ホスフェート基修飾により、ＩＭＳに抗菌性を供することができる。ＩＭＳは、優先的にホスホロチオエート安定化オリゴヌクレオチドを用いた安定化オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【０１２５】
他に安定化オリゴヌクレオチドとしては、荷電した酸素がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルおよびアルキルホスホジエステル；荷電したホスホネート酸素がアリール基またはアルキル基で置換されている非イオン性ＤＮＡ類似物であるアリールホスホネートおよびアルキルホスホネート；または／および一方または両方の末端にヘキサエチレングリコールまたはテトラエチレングリコールまたは他のジオールを含有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。ＩＭＳのヌクレオシド塩基に糖部分を付加するために他の立体位置を用いることができる。
【０１２６】
調節ジヌクレオチドにフランクするＩＭＳのヌクレオチド塩基は、公知の天然の塩基または合成の非天然塩基であり得る。自己脂質、自己ポリペプチド、自己糖蛋白質、自己糖脂質、自己糖質および翻訳後修飾自己ポリペプチドまたは翻訳後修飾自己糖蛋白質などの他の化合物に対する他の分子を付加または結合させる手段としての付加箇所、または追加の免疫調節療法のための付加箇所として使用するために、オリゴヌクレオシドは、従来の方法を用いてＩＭＳ−ＯＮの内部領域および／または末端へと取り込み得る。ＩＭＳ−ＯＮの免疫活性に加えて、所望の特性を有するＩＭＳ−ＯＮを構築するために、通常の当業者に公知の任意の方法で、ＩＭＳ−ＯＮの塩基（単数または複数）、糖部分、ホスフェート基および末端部もまた修飾し得る。例えば、糖部分が、任意の立体配置におけるＩＭＳ−ＯＮのヌクレオチド塩基に付加し得る。
【０１２７】
これらのホスフェート基修飾体をオリゴヌクレオチドにする方法は当業界に公知であり、詳しい説明を要しない。このような有用な方法を調べるために、標的オリゴヌクレオチド産物の中間体であるホスフェートトリエステルを調製し、水性ヨウ素または無水アミンなどの他の試剤により、天然のホスフェートトリエステルへと酸化する。生じたオリゴヌクレオチドホスホルアミデートを硫黄で処理してホスホロチオエートを得ることができる。メチルホスホネートからメチルホスホアミダイトを得るために、同一の一般法（硫黄処理ステップを除いて）を適用することができる。ホスフェート基修飾法に関する詳細に関しては、通常の当業者は、米国特許第４，４２５，７３２号明細書；米国特許第４，４５８，０６６号明細書；米国特許第５，２１８，１０３号明細書；および米国特許第５，４５３，４９６号明細書；ならびにテトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ）、２１巻：ｐ．４１４９  ２５（１９９５）、７巻：ｐ．５５７５（１９８６）、２５巻：ｐ．１４３７（１９８４）およびアメリカ化学会誌、９３巻：ｐ．６６５７（１９８７）、を調べることを希望すると考えられ、それらの開示は、ＩＭＳの組成と調製に関する当業界の知識レベルを例示する目的で本明細書に援用している。
【０１２８】
特に有用なホスフェート基修飾は、ＩＭＳ−ＯＮオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート形態またはホスホロジチオエート形態への変換である。ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートは、それらの非修飾オリゴヌクレオチド対照物よりもインビボ分解に対してより抵抗性であるため、本発明のＩＭＳ−ＯＮを宿主にとってより利用可能なものにする。
【０１２９】
ＩＭＳ−ＯＮは、当業界に周知の方法と核酸合成装置を用いて合成できる。これに関する文献としては、例えば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２章および４章（ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年）；マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら著、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂ．）、ニューヨーク、１９８２年）；米国特許第４，４５８，０６６号明細書および米国特許第４，６５０，６７５号明細書、を参照されたい。これらの文献は、合成オリゴヌクレオチドの生産に関する当業界の知識レベルを示す目的で本明細書に参照のため援用している。
【０１３０】
あるいは、ＩＭＳ−ＯＮは、天然ＣｐＧモチーフおよびフランキングヌクレオチドの代わりに競合ジヌクレオチドを置換するために、単離微生物ＩＳＳ−ＯＤＮの突然変異によって得ることができる。核酸ハイブリダイゼーションに依るスクリーニング操作によって、適切なプローブまたは抗体が利用できるという条件で、任意の生物から任意のポリヌクレオチド配列を単離することが可能となる。問題の蛋白質をコードする配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成できる。これには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド伸長を知らなくてはならないという要件がある。前記蛋白質をコードするＤＮＡ配列もまた、遺伝子コードから推測できるが、そのコードの縮重を考慮する必要がある。
【０１３１】
例えば、ｃＤＮＡ由来の種々のｍＲＮＡを卵母細胞に注入し、ｃＤＮＡ遺伝子産物の発現が生じる十分な時間をおいて、例えば、関心対象のポリヌクレオチドによってコードされるペプチドに特異的な抗体を使用することにより、または繰り返しモチーフおよび関心対象のポリヌクレオチドによってコードされるペプチドに特徴的な組織発現パターンに関するプローブを使用することにより、所望のｃＤＮＡ発現産物の存在を試験することによって、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを含有すると考えられるｃＤＮＡライブラリーをスクリーンできる。あるいは、関心対象のペプチドに特異的な抗体を使用することにより、少なくとも１つのエピトープを有する前記ペプチドの発現に関して、ｃＤＮＡライブラリーを間接的にスクリーンすることができる。このような抗体は、ポリクローンまたはモノクローン由来のいずれかであり得、関心対象のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するために用いられる。
【０１３２】
一旦、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドが得られたならば、それを、例えば従来の方法を用いた酵素消化によって、所望の長さに短くできる。次に、ＩＳＳ−ＯＤＮオリゴヌクレオチド産物におけるＣｐＧモチーフの「阻害」ジヌクレオチドと置換するために突然変異させ、本発明の方法を用いて、ＣｐＧモチーフを同定する。公知の配列を有するＤＮＡにおける特定の部位に置換突然変異を起こす方法は周知であり、例えば、ＰＣＲによるＭ１３プライマー突然変異誘発がある。ＩＭＳは、非コード性であるため、置換突然変異の作製においてオープンリーディングフレームの保持に関しての懸念はない。しかし、インビボ使用のためには、ポリヌクレオチド出発物質、ＩＳＳ−ＯＤＮオリゴヌクレオチド中間体またはＩＭＳ突然変異産物は、実質的に純粋（すなわち、通常の当業者に知られ、選択された利用できる方法を用いて可能なように天然の汚染物質およびＬＰＳが無い）にする必要がある。
【０１３３】
本発明のＩＭＳは単独で使用できるか、または組み替えベクター（プラスミド、コスミド、ウィルスまたはレトロウィルス）内へ、シスまたはトランスに取り込むことができ、次にこれが、組み換え発現ベクターによって送達できる何らかの自己ポリペプチドをコードできる。便宜上、ＩＭＳは発現ベクターに取り込ませずに投与されることが好ましい。しかし、発現ベクター内への取り込みが望まれる場合は、通常の当業者に公知の従来の方法を用いて、そのような取り込みが達成し得る。通常の当業者が概観するに当たっては、上記のオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）を調べることになろう。
【０１３４】
簡潔に述べると、組み換え発現ベクターの構築には、標準的な結合法が採用される。構築されたベクター内の正しい配列を確認する分析には、宿主細胞を形質転換するために結合混合物を使用でき、連続的な形質転換体が適切な抗生物質耐性によって選択される。形質転換体からのベクターが調製され、制限により分析され、および／または、例えばメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、９巻：ｐ．３０９，１９８１年）の方法、マキサム（Ｍａｘａｍ）ら、（酵素化学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５巻：ｐ．４９９、１９８０年）、または当業者に公知の好適な方法によって配列決定される。開裂フラグメントのサイズ分離は、例えば、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ｐ．１３３−１３４、１９８２年）により記載された従来のゲル電気泳動を用いて実施する。
【０１３５】
宿主細胞は、本発明の発現ベクターによって形質転換でき、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または遺伝子の増殖に適切なように修飾された通例の栄養培地において培養できる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択した宿主細胞に以前用いた条件であり、通常の当業者にとって明白であろう。
【０１３６】
組み換え発現ベクターが、本発明のＩＭＳ−ＯＮのための担体として利用される場合は、プラスミドおよびコスミドが病原性のないことから特に好ましい。しかし、プラスミドおよびコスミドは、ウィルスよりも速やかにインビボ分解を受けるため、炎症性疾患または自己免疫疾患の予防または治療に十分なＩＭＳ−ＯＮ投与量を送達し得ないと考えられる。
【０１３７】
ベクターの構築、細胞のトランスフェクションおよび感染に用いられる多くの方法が当業界で広く実施されており、多くの実践者は特異的条件および操作を示す標準的な供給源物質に精通している。
【０１３８】
自己免疫疾患治療用薬剤の共投与
上記のように、本発明の薬剤（メバロネート阻害剤および第２の免疫調節剤）は、自己免疫疾患治療のために患者に共投与される。共投与とは、各薬剤が患者内に同時に存在し、かつ有効であるように、各々の有効用量で、薬剤（複数）を患者に投与することを意味する。したがって、共投与とは、同一の患者に対する投与ではあるが、必ずしも同一の部位への、または同一の経路による投与とは限らない投与を言う。ある実施形態において、薬剤（複数）は同時に投与される。他の実施形態において、第２の薬剤が投与される前に第１の薬剤が患者体内に存在し、有効であり、第２の薬剤投与後に、双方の薬剤が共に存在し有効であるように薬剤（複数）が調整的に投与される。前記薬剤は、一般に別々の製剤として調整的に共投与される。さらに、前記薬剤は、同一の投与経路により、または異なった投与経路によって投与され得る。異なった投与経路としては、例えば、同一の治療法における薬剤の全身経路と局所経路を挙げることができる。例えば、併用療法として、スタチンと自己ポリペプチドとをコードする自己ベクターとの共投与が挙げられる場合、スタチンを経口送達し、自己ベクターを筋肉内投与することができる。
【０１３９】
本明細書に記載された本発明の各実施形態において、治療または予防が求められている自己免疫疾患の管理に関連した従来の方法論と矛盾しない様式で、薬剤が送達される。本明細書の開示に従って、薬剤の有効な用法が、そのような治療を必要としている患者に対して、ある一定期間、自己免疫疾患の治療に十分な条件下で投与される。
【０１４０】
本発明による併用療法の患者は、自己免疫疾患を発現する危険性の高い患者、ならびに現在、自己免疫疾患を示している患者を含む。典型的には患者は、治療が求められている自己免疫疾患を有していると診断される。さらに、治療に応答した自己免疫疾患の症状における何らかの変化に関して、治療経過の間、患者をモニターできる。
【０１４１】
本発明の方法による治療のための対象患者を確認するために、受け入れたスクリーニング法を用いて、特定の自己免疫疾患に関連する危険因子を判定するか、または患者に確認された既存の疾患状態を判定する。このような方法は、例えば、ある個人が、自己免疫疾患と診断されたことのある親族を有しているかどうかを確認することを含むことができる。スクリーニング法はまた、例えば、遺伝的要素を有することが知られている、ある特定の自己免疫疾患または炎症性疾患に関する家族の状況を確認するための通例的な調査を含むことができる。この目的のために、慣例的にヌクレオチドプローブを用いて、関心対象のある特定の自己免疫疾患に関連した遺伝子マーカーを担持する個人を確認することができる。さらに、特定の自己免疫疾患に関するマーカーを確認するために有用な種々多様な免疫学的方法が当業界に知られている。例えば、自己免疫疾患の特定の生理学的マーカーに関連した自己抗体を検出するためにモノクローンの抗体プローブを用いる種々のＥＬＩＳＡ免疫アッセイ法が利用でき、当業界によく知られている。このようなスクリーニングは、既知の患者の症状、年齢因子、関連危険因子などによって示された場合に実施できる。これらの方法により、臨床医は自己免疫疾患の治療のために、本明細書に記載された方法を必要としている患者を慣例的に選択できる。これらの方法に従って、併用療法を独立した予防プログラムまたは治療プログラムとして、または他の治療に対する追跡的、補助的または対等の治療法として実施できる。
【０１４２】
治療によって患者の望ましくない臨床的症状が安定化または軽減される、進行中の疾患の治療は特に興味深い。このような治療は、冒された組織の機能の完全な損失前に実施されることが望ましい。患者の療法は、疾患の症状期の間、投与されることが望ましく、幾つかの場合は、疾患症状が再発している（すなわち、多段階の）疾患の症状期の後に投与されることが望ましい。前症状期または前臨床期は、疾患部位、例えば中枢神経などにＴ細胞の関与が存在するが、明白な疾患を示す臨床的症状を生じさせるほど機能の損失は、まだ重篤ではない時期と定義される。Ｔ細胞の関与は、疾患部位におけるＴ細胞数の上昇、自己抗原に特異的なＴ細胞の存在、疾患部位におけるパフォームス（ｐｅｒｆｏｒｍｓ）およびグランザイムの遊離、免疫抑制療法に対する応答などによって確証できる。
【０１４３】
当業者は、投与量レベルが特定化合物の機能、症状の重症度および副作用に対する患者の感受性によって変化し得ることを容易に理解するであろう。特定化合物の幾つかは、他の化合物よりも強力である。所与の化合物に対する好ましい投与量は種々の手段により当業者によって容易に判定できる。好ましい手段によって、所与の化合物の生理的な効能を測定する。
【０１４４】
ある療法の有効性を判定するには、Ｔ細胞応答の判定に関するアッセイが利用できる。例えば、未処置宿主の負の対照に比してサンプル中に見られた反応性Ｔ細胞の数に基づくか、または１人以上の患者から得られたデータ曲線に標準化して、前記アッセイにより反応性レベルを判定できる。自己抗原反応性Ｔ細胞の定性的および定量的存在の検出に加えて、炎症性応答を増大または抑制させることが知られているサイトカイン類の発現に関して、Ｔ細胞を分類できる。また、反応性Ｔ細胞のエピトープ特異性を分類することも望ましい。
【０１４５】
Ｔ細胞は、患者の末梢血、リンパ節、または好ましくは、炎症部位から単離し得る。反応性アッセイは、基本的なＴ細胞について実施してもよいし、または前記細胞を融合させてハイブリドーマを作製してもよい。このような反応性Ｔ細胞は、それらの原位置のモニタリング、Ｔ細胞受容体の利用などにより、疾患の進行についてのさらなる分析にも使用できる。Ｔ細胞応答性をモニターするアッセイは当業界に知られており、増殖アッセイおよびサイトカイン遊離アッセイが挙げられる。
【０１４６】
増殖アッセイでは、特定抗原に応答するＴ細胞の増殖レベルが測定され、当業界で広く用いられている。典型的なアッセイにおいて、患者のリンパ節、血液または脾臓細胞が得られる約１０４個から１０７個の細胞、通常は約１０５個から１０６個の細胞の懸濁液を調製し、洗浄してから対照抗原および試験抗原の存在下で培養する。試験抗原は、炎症性Ｔ細胞応答を誘導すると考えられる任意の自己由来抗原のペプチドであり得る。前記細胞は通常、数日間培養する。抗原誘導増殖を、培養によるＤＮＡの合成、例えば、培養最後の１８時間の３Ｈ−チミジンの取り込みをモニターすることによって評価する。
【０１４７】
反応性Ｔ細胞のサイトカインプロフィルを判定するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が用いられ、また、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、γ−ＩＦＮなどのサイトカイン類の発現をモニターするために用いることができる。捕捉抗体は、関心対象のサイトカインに特異的な任意の抗体でよく、ここで上記のＴ細胞増殖アッセイの上澄み液が、抗原の供給源として便宜よく用いられる。遮断および洗浄後、標識化された検出用抗体を加え、存在する蛋白質濃度を、結合している標識の関数として測定する。
【０１４８】
本発明の方法によって溶解し得る哺乳動物種としては、イヌおよびネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ；などおよび霊長類、特にヒトが挙げられる。動物モデル、特に小型哺乳類、例えばマウス、ウサギなどを実験研究に使用し得る。他の利用法としては、Ｔ細胞媒介炎症の不在下での特定の効果を調べることが望ましい研究が挙げられる。
【０１４９】
本発明は、記載した特定の方法論、プロトコル、製剤、薬剤に限定されず、したがってもちろん変化し得る。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態の説明のみが目的であって、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定される。
【０１５０】
本明細書に挙げられた刊行物は全て、例えば、当該の記載された発明に関連して使用できると思われない刊行物において記載されている方法および方法論を説明および開示する目的を含む全目的のために、それらの全体を参照として本明細書に援用している。上記および本文をとおして検討された刊行物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためにのみ提供されている。先行発明のために、発明者がそのような開示を前日付けにする資格が与えられないことを認めるものとして、本明細書の事柄を解釈すべきではない。
【０１５１】
以下の実施例は、通常の当業者に当該発明の作成法および利用法についての完全な開示および説明を提供するために記載されており、当該発明と考えられるものの範囲を限定する意図はない。用いられた数値（例えば、量、温度、濃度など）に関しては正確さを保証するよう努力したが、いくらかの実験的誤差および偏差は許容されよう。他に表示しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【実施例】
【０１５２】
実施例１：多発性硬化症に関する動物モデルの治療目的のアトルバスタチン
多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして役立つＴｈ１媒介中枢神経系（ＣＮＳ）脱髄疾患である実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）における前炎症応答を、アトルバスタチン（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）））が阻害し得るかどうかを調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＭＯＧ  ｐ３５〜５５誘導慢性ＥＡＥの発症時に開始したアトルバスタチンの毎日の経口投与によって、麻痺が好転した。また、アトルバスタチンは、ＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１によって誘発された再発寛解ＥＡＥにおいて、急性発作後に投与された場合、ＳＪＬ／Ｊマウスにおける再発を改善した。急性ＥＡＥは、ＭＢＰＡｃ１〜１１で処理したＴｇマウスにおいても予防された。アトルバスタチン処理マウスから取られた脳および脊髄の組織学的評価により、脈管周囲の病巣数、ならびにそれらの病巣における浸潤程度の双方に著しい減少が示された。個々のプロモーター（ｐ）Ｉ、ｐＩＩＩおよびｐＩＶ転写体の発現を含むＣＮＳ  ＭＨＣクラスＩＩ転写活性化因子（ＣＩＩＴＡ）発現が、アトルバスタチン処理マウスにおいて減少した。アトルバスタチン処理は、ＣＮＳ−自己抗原特異的な増殖性Ｔ細胞応答の減少、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌低下およびこれらＴ細胞によるＩＬ−４およびＩＬ−１０の分泌上昇を伴った。このように、アトルバスタチン処理により、Ｔｈ２傾向が促進された。これらの結果により、アトルバスタチンが脱髄疾患の治療に有効な免疫調節剤であることが示される。
【０１５３】
方法：
実験操作
動物。メスＳＪＬ／Ｊ、Ｂ１０．ＰＬおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（８〜１２週齢）を、ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（メイン州バーハーバー所在）から購入した。ＭＢＰ  Ａｃ１〜１１形質転換（ｔｇ）ＴＣＲマウスをＢ１０．ＰＬマウスを戻し交雑して、ＥＡＥに対する感受性を得た。全ての動物プロトコルは、スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）の比較医学部によって承認され、国立衛生研究所の指針に従った。
【０１５４】
ペプチド。ペプチドは標準的な９−フルオレニルメトキシカルボニル化学により、ペプチド合成機（モデル９０５０；ミリゲン（ＭｉｌｌｉＧｅｎ、マサチューセッツ州バーリントン所在）で合成した。ペプチドは、ＨＰＬＣによって精製した。構造はアミノ酸分析および質量分析によって確認した。これらの実験に使用されたペプチド類は、マウスＭＢＰ  Ａｃ１〜１１  １（Ａｃ−ＡＳＱＫＲＰＳＱＲＨＧ）（配列番号：６０）、ＭＯＧ３５〜５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）（配列番号：６１）、ＰＬＰ１３９〜１５１（ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）（配列番号：６２）；および増殖アッセイとサイトカインアッセイにおいて負の対照として用いられたウィルスペプチドのＨＳＶＰ１６（ＤＭＴＰＡＤＡＬＤＤＲＤＬＥＭ）（配列番号：６３）であった。
【０１５５】
薬物処理。アトルバスタチン（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）））錠は商品として入手し、ＰＢＳに溶解させた。１８ｍｍの給餌針を用いて、マウスに１日１回、０．５ＭＬアトルバスタチン（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳのみを経口投与した。アトルバスタチン処理期間は、結果の節に示してある。
【０１５６】
ＥＡＥ誘導。再発寛解ＥＡＥを１００μｇのＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドによって、ＳＪＬ／Ｊマウスに誘導し、慢性進行性ＥＡＥは、１００μｇのＭＯＧ３５〜５５ペプチド、または１００μｇのＭＢＰ  Ａｃ１〜１１ペプチドにより、それぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、またはＭＢＰ  Ａｃ１〜１１ＴＣＲ  Ｔｇマウスに誘導した。ペプチドは全て、２ｍｇ／ｍｌ濃度でＰＢＳ中に溶解させ、４ｍｇ／ｍｌの熱殺処理の結核菌Ｈ３７Ｒａ（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州デトロイト所在）により補足された不完全フロイントアジュバントからなるＣＦＡの等容量で乳化した。マウスに、０．１ｍｉのペプチド乳濁液により皮下注射した。ペプチド免疫の当日、および４８時間後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＭＢＰ  Ａｃ１〜１１ＴＣＲ  Ｔｇマウスのみに、０．１ｍｌのＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの百日咳菌毒素も静脈内注射した。マウスは、臨床的に以下のように評価した：０、麻痺なし；１、尾部脱力または麻痺；２、後肢脱力または麻痺；３、後肢麻痺および前肢脱力；４、後肢および前肢麻痺；５、動物の瀕死状態または死亡。
【０１５７】
Ａｇ特異的エクスビボＴ細胞増殖アッセイ。種々の株全てにおいて、ＥＡＥ誘導の２日前に、毎日アトルバスタチンの１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳによる治療を開始した。ＥＡＥ誘導の１０日後（すなわち、アトルバスタチン治療の１２日後）、対照、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン処理のＳＪＬ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＭＢＰ  Ａｃ１〜１１形質転換マウスから排液リンパ節および脾臓を取り出した。リンパ節細胞（ＬＮＣ）または脾臓細胞を、特定の脳遺伝子ペプチド（それぞれ、ＰＬＰ１３９〜１５１、ＭＯＧ３５〜５５またはＭＢＰ  Ａｃ１〜１１）に対する特異的増殖応答に関してインビトロ培養した。ＬＮＣ類は、５×１０６細胞／ｍｌの濃度、０．２ｍｌ／ウェルの容量で、９６ウェルマイクロ滴定プレートにおいて調製した。培養培地は、１％自己由来新鮮通常マウス血清を補足した富栄養化ＲＰＭＩ（Ｌ−グルタミン［２ｍＭ］、ピルビン酸ナトリウム［１ｍＭ］、非必須アミノ酸［０．１ｍＭ］、ペニシリン［１００Ｕ／ｍｌ］、ストレプトマイシン［０．１ｍｇ／ｍｌ］、２−ＭＥ［５×１０−５Ｍ］で補足したＲＰＭＩ）と追加の種々の濃度のペプチドで構成した。培養液は、５％ＣＯ２を含有した湿潤大気において３７℃で培養した。ＳＪＬ／ＪマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスから得た培養液は７２時間温置し、一方、ＭＢＰＡｃ−１−１１Ｔｇマウスから得た培養液は４８時間温置し、次に１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンで１８時間パルスした。次いで前記細胞を採取して、βカウンターでカウントした。
【０１５８】
サイトカインプロフィルの決定。ＥＡＥドナーからのリンパ節細胞および脾臓細胞を脳遺伝子ペプチドを用いて、または用いずに、または陽性対照としてＣｏＡを用いて、２４ウェルプレートにおいてインビトロ（２．５×１０６細胞／ｍｌ）で刺激した。サイトカイン濃度を測定するために、種々の時点で細胞培養上澄み液を採取した：ＩＬ−２に関して４８時間目、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαに関して７２時間目、ＩＬ−４およびＩＬ−１０に関しては１２０時間目。サイトカイン溶液は、製造元のプロトコル（ファーミンゲン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に従い、対応するサイトカイン用の特定のＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【０１５９】
総ＲＮＡ単離。マウスを殺処理し、２０ｍｌの冷滅菌ＰＢＳによって灌流した。脳を直ちに単離し、総ＲＮＡを製造元のプロトコルにより推奨されたトリゾール試薬（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて単離した。次に総ＲＮＡ量を２６０ｎｍで測定した。
【０１６０】
リアルタイム（動態学的）ＲＴ−ＰＣＲによるＣＩＩＴＡプロモーター特異的ｍＲＮＡ発現の評価。バランジニ（Ｂａｒａｎｚｉｎｉ）ら、（２０００）免疫学雑誌（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１６５巻：ｐ．６５７６に記載されているとおり、１ステップＲＴ−ＰＣＲを実施する。４００μＭ  ｄＵＴＰおよび各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＭＳＯ中０．２×ＳＹＢＲグリーン（最終濃度１％）；２．５％グリセロール；１ＵウラシルＮ−グリコシラーゼ；４ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２および５ＵｒＴｔｈポリメラーゼによって原混合液を調製する。ＲＴ−ＰＣＲパラメータ：賦活性ウラシルＮ−グリコシラーゼによる４５℃で１０分間の初期温置に続いて６０℃で３０分のＲＴ；９５℃で１５秒および５７℃で３０秒を５０サイクル。発現を標準化するためのハウスキーピング遺伝子としてβ−アクチンを全サンプルから増幅する。各プライマーセットに関してテンプレートなしの対照を含める。定性化のため、各反応プレートにＣＩＩＴＡラン・オフ転写体の１０倍希釈シリーズ（当初ＣＩＩＴＡの１０７〜１０２コピー）を含める。ソフトウェアの配列検出システムプログラムによってデータを解析し、ＭＳエクセルスピードシートに移して解析する。各１０倍希釈液に関するＣＩＩＴＡ（ラン・オフ転写体）を、各産物にとって必要なサイクル数に対してプロットすることにより、予備設定した閾値（Ｃｔ）を超えるように補正曲線を作成する。Ｃｔ値を標準曲線で得られたものと比較する。共通ＣＩＩＴＡ（ｎｔ２３７４〜２４５８）に関するプライマー：５’−ＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＡ（配列番号：６４）および５’−ＴＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＡ（配列番号：６５）。５’（正）プロモーター特異的プライマー：ＰＩ  ＣＩＩＴＡ（ｐｌ  ｎｔ２５９）５’−ＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡ（配列番号：６６）；ｐＩＩＩ  ＣＩＩＴＡ（ｐＩＩＩ  ｎｔ１１２）：５’−ＧＣＡＴＣＡＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡ（配列番号：６７）；ｐＩＶ  ＣＩＩＴＡ：（ｐＩＶ  ｎｔ４３）：５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＴＣＡＧＭ（配列番号：６８）。プロモーター特異的転写体に対するＣＩＩＴＡ（ｎｔ２６５）逆プライマー：５’−ＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＴＴＡＡ（配列番号：６９）。β−アクチン：（３０１〜５３８）：５’−ＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＴＴＣＴＡ（配列番号：７０）および５’−ＴＣＧＴＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＡＡ（配列番号：７１）
ＳＴＡＴ−６およびＳＴＡＴ−４リン酸化に関するウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット分析を、ガレン（Ｇａｒｒｅｎ）ら（２０００）免疫（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１５巻：ｐ．１５に記載されたとおり、少し修飾して実施した。対照マウスおよびアトルバスタチン処置マウスのリンパ節を、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１．６ｍＭのペファブロックＳＣ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および１ｍＭ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在）を加えたＴ−ＰＥＲ蛋白質抽出緩衝液（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）中で均一化した。操作は全て氷上で行った。陽性対照として、未処置マウスのリンパ節細胞を単離し、ＳＴＡＴ６発現およびＳＴＡＴ４発現の各々に関して、マウス組み換え体ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＦＮ−γ（１００単位／ｍｌ）と共に１時間培養した。ＢＣＡ蛋白質アッセイ（ピアース）によって、蛋白質濃度を測定した。４０ｍＭ  ＤＴＴを加えた３×ＳＤＳ負荷緩衝液（セルシグナリングテクノロジー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に、溶解産物を加えた。４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ））上の電気泳動により産物を分離した。前染色したマーカー（インビトロゲン）を用いてＭＷを測定した。２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシンおよび２０％（ｖ／ｖ）メタノール中１００ＶでゲルをＰＶＤＦ膜にブロットし、次に０．１％トウィーン−２０および５％無脂肪ドライミルクを含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）により室温で１時間遮断した。ＴＢＳおよび０．１％トウィーン−２０および５％ＢＳＡ中１：１０００で希釈した抗ホスホ−ＳＴＡＴ６抗体または抗ホスホ−ＳＴＡＴ４抗体（ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、カリフォルニア州サンフランシスコ所在）によって４℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、次に化学発光によるバンド視覚化のために、ＥＣＬプラスピリビトウィーンプロトコル（アマーシャム・ライフサイエンスイズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって処理した。膜を１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび６２．５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中、６０℃で３０分間、剥がしてから等負荷量を確認するための対照として、抗ＣＤ３ζ（ファーミンゲン、カリフォルニア州サンディエゴ所在）または抗Ｓｔａｔ６または抗Ｓｔａｔ４（双方ともサンタクルーズ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カリフォルニア州サンタクルーズ）によって調べた。
【０１６１】
組織病理学。マウスを殺処理し、２０ｍｌの冷ＰＢＳ、続いて２０ｍｌの冷４％パラホルムアルデヒドによって灌流した。脳および脊髄を分離し、パラフィン埋め込み操作に供した。次に各部分とヘマトキシリンおよびエオシン染色に供した。各マウスの１０切片について組織学的検査を実施し、マウスの処理状態に対する情報なしで、各部分を組織学的スコアで評価した。
【０１６２】
統計解析。データは平均値±ＳＥとして表している。２群間の差の有意性を、スチューデントｔ検定を用いて調べた。ｐ＜０．０５の値を有意と考えた。なお、多重圧縮に関しては、ｐ＜０．０５の有意レベルで、ワンウェイ多区域ＡＮＯＶＡ検定を行った。
【０１６３】
結果：
アトルバスタチンは、マウスにおける進行中の慢性再発ＥＡＥまたは慢性進行性ＥＡＥを好転し、予防する。先ず、ミエリン乏突起膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）のｐ３５〜５５の免疫優性決定遺伝子による免疫化によって誘導されたＣ５７Ｂ１／６メスマウスにおける慢性ＥＡＥの予防に関して、アトルバスタチンを試験した。図１Ａに示されるように、ＥＡＥ発症時に開始したアトルバスタチン１ｍｇ／ｋｇ（成人の最高許容用量８０ｍｇに略等しい）または１０ｍｇ／ｋｇの毎日経口治療によりＥＡＥ誘導が抑制された。発症後の治療によってもＥＡＥは改善された（図１Ｂ）。脳遺伝子プロテオリポ蛋白質（ＰＬＰ）ペプチドのｐ１３９〜１５１による免疫化によって誘導されたＳＪＬ／Ｊマウスの慢性再発ＥＡＥにおけるアトルバスタチン治療を試験した。アトルバスタチンは再発ＥＡＥの予防において有効（図１Ｃ）であるのみならず、急性ＥＡＥから回復後に治療を開始した場合の進行中再発ＥＡＥの逆転もあった（図１Ｄ）。アトルバスタチンは、脳遺伝子ミエリン基本蛋白質（ＭＢＰ）による免疫化によって誘導されたＭＢＰ  Ａｄ−１１Ｔｇマウスにおける急性ＥＡＥの進行を首尾よく予防した（図１Ｅ）。
【０１６４】
５つの実験全ての各群マウスを殺処理し、脳および脊髄をＣＮＳ組織学的評価のために取り出した。図２は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるアトルバスタチン治療開始後１１日目、すなわちＥＡＥ誘導２２日後、実験Ａ（図１Ａを参照）から得た脳の代表的なＨおよびＥ染色を示している。Ｈ＆Ｅ矢状脳部分をＰＢＳ治療Ｃ５７ＢＬ／６マウスから（ａ）１ｍｇ／ｋｇ治療から（ｂ）、１０ｍｇ／ｋｇ治療から（ｃ）および陰性対照としての未処置Ｃ５７ＢＬ／６から（ｄ）を得た。各部分は、各群のうち２匹のマウスの代表的部分である。
【０１６５】
ヘマトキシリンおよびエアシン染色により、ＰＢＳ処置マウスおよび未処置マウス（各々、図２Ａおよび２Ｄ）に比較して、アトルバスタチン治療マウスにおけるＣＮＳ湿潤の数と大きさにおける減少（図２Ｂおよび２Ｃに示す）が明らかにされた。このように、アトルバスタチンの経口治療による疾患発現の阻害および予防が確認され、炎症部位（ＣＮＳ）において組織学的に立証された。他の４つの動物実験の代表的マウスからの脊髄および脳を同じ分析に供し、同様の結果を得た。
【０１６６】
アトルバスタチンは、ＥＡＥ時に炎症部位（ＣＮＳ）におけるＣＩＩＴＡ発現をダウンレギュレートする。正常な中枢神経系（ＣＮＳ）では、ＭＨＣクラスＩＩの発現は最少であるが、マウスに誘導されたＥＡＥでは、それが、小膠細胞上で高度にアップレギュレートされることが判っている。この発現は、小膠細胞（ＣＮＳにおける主要な抗原提示細胞）における発現を調節しているＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、特にＣＩＩＴＡ  ｐＶＩの活性化に必要なクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）因子によって調節されている。また、アトルバスタチンは、ＣＩＩＴＡ  ｐＩＶ遺伝子に及ぼす作用によってＭＨＣＩＩの発現を抑制し得ることも報告された。組織学的な結果により、対照ＥＡＥマウスと比較して、アトルバスタチン治療マウスの脳への浸潤減少が指摘されたため、アトルバスタチンが、炎症部位におけるＣＩＩＴＡインビボ発現を抑制するかどうかを探索した。ＳＪＬ／Ｊマウスの３群を１ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン、１０ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳのみ（対照）で経口治療した。ＣＩＩＴＡ発現の陰性対照として未処置マウス４群を加えた。３つの治療群をＥＡＥ誘導２日前から開始した毎日の治療に供した。誘導１０日目（種々の治療１２日目）に、４群全てのマウスを殺処理し、２０ｍｌの冷ＰＢＳで灌流した。脳を単離し、方法の節に記載されたとおり、総ＲＮＡ調製に供した。炎症部位（ＣＮＳ）におけるプロモーター特異的ＣＩＩＴＡ転写体のインビボ発現に及ぼすアトルバスタチン治療および媒体治療ＥＡＥの効果を測定するために、ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）に供した。結果は、図３に示している
アトルバスタチン治療は、ＣＩＩＴＡ転写体の総発現を、用量応答的に抑制した（図３Ａ）。特定のＣＩＩＴＡ分析により、アトルバスタチン治療が、ＣＩＩＴＡの３つの特定のイソ体全てを抑制することが示された（図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）。興味深いことに、アトルバスタチンは、ＣＩＩＴＡ  Ｏｌｙ転写体（ＯＮＳにおける小膠細胞上のＭＨＣＩＩ発現調節に特異的であることが知られている）の用量依存的阻害を示したが、予想外に樹状細胞およびＢ細胞に、各々特異的であることが知られているＰＩ転写体およびＰＩＩＩ転写体に対する阻害も示した。ＰＩおよびＰｉＩＩ転写体はアトルバスタチンによりインビトロで影響を受けることが示されている。
【０１６７】
これらの結果は、ＣＮＳにおけるＭＨＣＩＩ発現を抑制する主要因子であり得るＣＩＩＴＡイソ体が、アトルバスタチンによって治療された脳内において直接阻害され、したがって、ＣＮＳ内への単核細胞の大量の浸潤が防がれ、ＥＡＥが逆転することを立証している。
【０１６８】
アトルバスタチンは、Ｔｈ２偏重の発現を促進する。ＥＡＥ誘導に対して、ＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１で免疫化されアトルバスタチンまたは媒体（対照）のいずれかによって治療されたＳＪＬ／Ｊメスマウスの脾臓およびリンパ節から単離されたリンパ球を、治療１０日後に単離し、増殖およびサイトカイン産生について調べた。図４Ａに示されるように、ＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１−特異的応答が用量関連様式で抑制された。Ｔｈ１サイトカインの１つであるＩＬ−２の産生が減少したが、１０ｍｇ／ｋｇで治療したマウスでは減少の程度ははるかに大きかった（図４Ｂ）。特徴的なＴｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの分泌が双方の治療用量において著しく減少した（図４Ｃ）。主要な抗炎症サイトカインの１つであるＩＬ−４が、双方の治療用量において誘導された（図４Ｄ）が、この実験において他の抗炎症性Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−１０の分泌は、高治療用量で見られた（図４Ｅ）。このようにアトルバスタチンは、Ｔｈ１サイトカインの産生を抑制し、Ｔｈ２サイトカイン類を助長した。これらの実験を、Ｃ５７ＢＬ／６およびＭＢＰ  Ａｃ１〜１１特異的形質転換体において繰り返して同様なデータを得た。上記のとおり、ＳＪＬ／Ｊマウスに関するアトルバスタチンは、これらのマウスにおいてほぼ等しいＴｈ２偏重を助長した。これらのインビトロ実験において細胞死の増加は見られなかった。
【０１６９】
アトルバスタチンは、Ｓｔａｔ６の活性化を引き起こす。アトルバスタチンにおけるＩＬ−４産生がＴｈ１からＴｈ２への偏重を引き起こすことを立証するため、機能的ＩＬ−４サイトカインが、アトルバスタチン治療時に、実際に発現するかどうかの探索が必要であった。ＩＬ−４は、ＩＬ−４受容体を介して、シグナル伝達物質および転写ファミリー活性化因子の一員であるＳＴＡＴ６を特異的に活性化することが公知であり、したがって、ＩＬ−４に依存したＴｈ２偏重が生じる際、それがリン酸化されると思われる。ＳＪＬ／Ｊマウスは、アトルバスタチン（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳのみのいずれかの経路によって毎日治療され、スタチン治療開始２日後、ＰＬＰ／ＣＦＡ投与によってＥＡＥを誘導した。
【０１７０】
ＥＡＥ誘導１０日後に、全軍を殺処理し、排液リンパ節を切開した。蛋白質溶解液をリンパ節細胞から単離し、ＳＴＡＴ６のリン酸化体に特異的なポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット法により、活性化ＳＴＡＴ６の存在を調べた。陽性対照として、リンパ節細胞を未処置マウスから単離し、マウス組み換え体ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に１時間温置した。蛋白質溶解液を同様に抽出した。図５に示すように、アトルバスタチン治療マウス（レーン２および３）および陽性対照（レーン４）のリンパ節においては、リン酸化ＳＴＡＴ６見られるが、ＰＢＳ治療マウス（レーン１）は、その検出可能なリン酸化を示していない。同定されたリン酸化ＳＴＡＴ６は、前染色マーカーにより約１００ｋＤａで動く。
【０１７１】
実施例２：多発性硬化症動物モデル予防のため、自己蛋白質ＰＬＰをコードするＤＮＡの投与を含んでなるポリヌクレオチド療法
ＰＬＰ自己ベクター。ＰＬＰ自己蛋白質のエピトープをコードするポリヌクレオチドを、１６ｍｅｒ重複相補配列（下線部）による２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって構築し、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰ類によって伸長させた。
【０１７２】
ＰＬＰ（１３９〜１５１）：
５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＴＡ−３’（配列番号：７２）；
ＰＬＰ（１３９〜１５１）Ｌ１４４／Ｒ１４７：
５’−ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＴＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＴＡＧＣＴＡ−３’（配列番号：７３）
これらのオリゴヌクレオチド複式は、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限部位を取り込むためにデザインした。前記産物は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される哺乳動物の発現ベクターであるｐＴＡＲＧＥＴベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン所在）の多クローニング領域へクローン化した。陽性クローンをカラースクリーニングによって同定し、挿入体の正しい位置づけをＤＮＡ自動配列決定によって確認した。プラスミドＤＮＡの精製は、製造元の使用説明書に従ってウィザード・プラス・マキシプレプス（Ｗｉｚａｒｄ  ｐｌｕｓ  Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ）（プロメガ）により行い、同一の筋肉内に０．０５ｍｌのプラスミドＤＮＡ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）を注入した。
【０１７３】
ポリヌクレオチド療法プロトコル。実験動物にＰＢＳ中０．１ｍｌの０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在）の０．０５ｍｌを左四頭筋肉内注射した。２日後および１０日後、マウスの同じ筋肉に０．０５ｍｌのプラスミドを注射した。
【０１７４】
ＥＡＥ誘導。ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドをＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ濃度に溶解し、４ｍｇ／ｍｌ加熱殺菌した結核菌Ｈ３７Ｒａ（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州デトロイト所在）で補足した不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の等容量で乳化した。マウスに、０．１ｍｌのペプチド乳濁液を皮下注射し、同じ日および４８時間後、ＰＢＳ中０．１ｍｌの４□ｇ／ｍｌ百日咳細菌毒素を静脈内注射した。実験動物は、以下のように評価した：０＝臨床的疾患なし；１＝尾部脱力または麻痺；２＝後肢脱力；３＝後肢麻痺；４＝前肢脱力または麻痺；５＝動物の瀕死状態または死亡。
【０１７５】
ＰＬＰ配列をコードするＤＮＡ注射がマウスをＥＡＥ誘導から防ぐ上で有効かどうかを判断するために、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ベクターを、１週間間隔で２回筋肉内注射した。最後の注射の１０日後に、マウスを、ＣＦＡ中乳化したＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドで刺激した。対照プラスミド群に比較して、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ベクターで治療した動物において、急性臨床疾患の改善が見られる。対照プラスミド群に比較して、疾患の発症が遅延化し（１１．５±０．５日、ｐ＜０．００８）、平均ピーク疾患重症度が低下し（ｐ＜０．００５）、平均疾患評点が低下した（ｐ＜０．０００５）。さらに、他の群に、ａ）変化したペプチドリガンドＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１（Ｗ１４４＞Ｌ、Ｈ１４７＞Ｒ）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクター、ｂ）ＰＬＰエピトープｐ１７８〜１９１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターのいずれかを注射した。変化した自己ペプチドリガンド（Ｗ１４４、Ｈ１４７）をコードする自己ベクターにより疾患の発症が遅延化し（１１．６±０．５日、ｐ＜０．００９）、平均ピーク疾患評点が低下した（ｐ＜．０２）。また、ＰＬＰ自己ペプチドｐ１７８〜１９１をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターによって、疾患の発症が遅延化し（１１．５±０．４日、ｐ＜０．００３）、平均ピーク疾患重症度が低下し（ｐ＜０．００７）、平均疾患評点が低下した（ｐ＜０．０００１）。
【０１７６】
ＤＮＡを注射し、さらに脳遺伝子ペプチド１３９〜１５１によって刺激したマウスを臨床的疾患の急性期の消散後に殺処理した。排液ＬＮＣをＰＬＰ１３９〜１５１自己ペプチドによってインビトロ再刺激し、それらの増殖応答およびサイトカイン産生に関して試験した。図６Ａは、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ペプチドをコードするＤＮＡを注射したマウスのＬＮＣが、対照マウスのＬＮＣに較べてより低い増殖応答を有したことを示している（ｐ＜０．０１）。図６（Ｂ）は、ＰＬＰ１３９〜１５１で刺激した場合、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ペプチドをコードするＤＮＡを含有する自己ベクターで治療したマウスのＬＮＣは、対照群と較べて、より低い濃度のＩＬ−２および□−インターフェロンを分泌することを示している。炎症を起こした脳におけるサイトカインｍＲＮＡ転写体の濃度を評価するため、脳組織から単離したｍＲＮＡについてのリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いた。図６（Ｃ）は、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる自己ベクターで治療したマウスにおける□−インターフェロンおよびＩＬ−１５のｍＲＮＡ濃度における低下を明らかにしている。したがって、臨床的疾患の低い発生率、細胞応答の低下、ＩＬ−２、ＩＬ−１５および□−インターフェロンの低濃度との間の関連性が、ＰＬＰ１３９〜１５１ＤＮＡで治療したマウスにおいて明白である。図６（Ｃ）に示されたサイトカインｍＲＮＡのバンドの相対的発現レベルは、デンシトメトリーによって測定した。負荷の差を補正するために、各サンプル内で、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨの発現レベルによって、値を標準化した。ｐＴａｒｇｅＴおよびＰＬＰ１３９〜１５１（Ｌ／Ｒ）自己ペプチドをコードするＤＮＡを含有する自己ベクターに比して、ＰＬＰ１３９〜１５１自己ペプチドをコードするＤＮＡを含有する自己ペプチドで治療したマウスの脳において試験したサイトカインの発現レベルの低下が、デンシトメトリーの分析によって確認された。
【０１７７】
実施例３：ＩＭＳと複数の自己蛋白質をコードするＤＮＡとを併用した多発性硬化症の動物モデルの治療
ミエリンの４つの主要成分であるＭＢＰ、ＭＡＧ、ＭＯＧおよびＰＬＰをコードする完全長ｃＤＮＡ類からなるＤＮＡポリヌクレオチド療法を、疾患発症後に投与すると、ＥＡＥ動物モデルにおける再発疾患が治療される。さらに、ミエリンＤＮＡポリヌクレオチド療法に、ＩＬ−４をコードするＤＮＡを追加すると、再発率の低下により、治療の有効性がさらに高まる。しかし、再発率の低下に関わらず、全体的な疾患の重症度は、依然として対照群と同等である。別の一連の試験において、ＳＪＬ／Ｊマウスは、疾患誘導のため、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中ＰＬＰ１３９〜１５１ペプチドで皮下免疫処理し、同時にリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁したＩＭＳを腹腔内に単回注射投与した。阻害性ＩＭＳを１回だけ注射して治療したマウスは、ＰＢＳで治療したマウスおよび刺激性ＣｐＧ−ＯＤＮで治療したマウスに較べて、全体的な疾患重症度の低下を示した（図７）。
【０１７８】
実施例４：ＭＨＣ  ＴＣＲ結合モチーフに基づく免疫調節のための指令ペプチド
ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）のアミノ酸８５から９９の間の領域は、Ｔ細胞およびＭＳ脳病巣における自己抗体のための免疫優性エピトープを含有する。ＭＳ脳に見られるＴ細胞および自己抗体によって認識されるＭＢＰの主要領域は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１  ＤＱＢ１＊０６０２（ＨＬＡ  ＤＲ２）である患者におけるＭＢＰ  ｐ８７〜９９の中心モチーフ、｛配列番号：８｝ＨＦＦＫである。
【０１７９】
先に、我々は、自己抗体認識のための構造的要件をＭＢＰ  ｐ８７〜９９に対して反応性のＴ細胞クローンのものと比較した。抗ＭＢＰ抗体は、試験した死後の１２例のＣＮＳ病巣からアフィニティー精製した。ＭＢＰ  ｐ８７〜９９ペプチドは、全例で免疫優性であり、ＭＢＰに対する自己抗体の結合を９５％以上阻害した。自己抗体結合に寄与する残基は、ＲＢ１＊１５０１およびＤＱＢ１＊０６０２関連のＭＢＰを認識するＴ細胞に対するＭＨＣ  Ｔ細胞受容体接触残基もまた含有する１０個のアミノ酸部分ｐ８６〜９５（｛配列番号：９｝ＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴ）の中に位置していた。エピトープ中心において同じ残基、｛配列番号：１０｝ＶＨＦＦＫは、Ｔ細胞およびＭＨＣ認識のために重要であった。最近、ＭＢＰｐ８５〜９９を有するＨＬＡ−ＤＲ２の結晶構造が解明され、Ｋ９１が主要なＴＣＲ接触残基であり、一方、Ｆ９０はＭＨＣ分子の疎水性Ｐ４ポケット内への主要な足場であるという予測が確認された。
【０１８０】
ＭＳ関連ＭＨＣ分子に存在するポケットに結合し、したがって、病原性Ｔ細胞の活性化を妨げるよう指令された３つのアミノ酸の反復配列を含有するペプチドが合成された。それらの予測配列の１つ（｛配列番号：４｝ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫ）は、多発性硬化症の動物モデルであるルイスラットにおける実験的自己免疫脳脊髄炎の予防および治療に有効であった。
材料および方法
動物。メスのルイスラット（６〜８週齢）をハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）（インディアナ州インディアナポリス所在）から購入した。
【０１８１】
ペプチド類。免疫処置および疾患の好転のために、ペプチド類を、標準的な９−フルオレニルメトキシカルボニル化学により、ペプチド合成機（モデル９０５０：ミリゲン（ＭｉｌｌｉＧｅｎ）、マサチューセッツ州バーリントン所在）において合成した。ペプチド類をＨＰＬＣにより精製した。構造は、アミノ酸分析および質量分析により確認した。実験に使用されたペプチド類は、｛配列番号：１１｝ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ（ＭＢＰｐ８５  ９９）、｛配列番号：４｝ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫ（四角形）、｛配列番号：５｝ＫＹＹＫＹＹＫＹＹＫＹＹであった。
【０１８２】
ＥＡＥ誘導。合成ペプチドＭＢＰｐ８５−９９を、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解し、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）の等容量で乳化し、４ｍｇ／ｍｌ熱殺処理の結核菌Ｈ３７Ｒａ（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州デトロイト所在）により補足した。ラットに、０．１ｍｉのペプチド乳濁液を皮下注射した。実験動物は、以下のように評価した：０、臨床的疾患なし；１、尾部の脱力または麻痺；２、後肢の脱力；３、後肢の麻痺；４、前肢の脱力または麻痺；５、動物の瀕死状態または死亡。
【０１８３】
ＥＡＥ処理。ＥＡＥ誘導のために予めＭＢＰｐ８５−９９により免疫処置したラットを、ペプチド注射後８日目から評価した。平均疾患発症日に、動物をＰＢＳ中０．５ｍｇペプチド溶液（１回用量０．２５ｍｌ）により腹腔内注射した。
【０１８４】
結果
ＥＡＥ発症を好転させるＴＣＲ−ＭＨＣ結合モチーフ含有指令ペプチドの注射。進行中のＥＡＥ発症を好転させるための予測配列の可能性を試験するために、０．５ｍｇペプチド含有０．２５ｍｌＰＢＳ溶液を単一用量として送達した。図８に見られるようにコントロール群と比較すると、この用量は、前記進行中の疾患を治療する上で十分である。
【０１８５】
実施例５：多発性硬化症の動物モデル治療用のアトルボスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＰＬＰ自己ベクター。ＰＬＰ自己蛋白質をコードするポリヌクレオチドを、標準的な方法を用いて構築した。簡潔に述べると、マウス完全長ＰＬＰ遺伝子を、マウスｃＤＮＡライブラリーからクローン化し、哺乳動物発現ベクター、ｐＶＡＸ１（インブチロゲン（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド所在）の多クローニング部位にクローン化した。プラスミドＤＮＡの大スケール生産と精製は、商品プラスミド精製サービス（エリム・バイオファーマシューティカルズ（Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、カリフォルニア州ヘイワード所在）を用いて標準的な方法により行われた。
【０１８６】
ポリヌクレオチド療法プロトコル。実験動物に、ＰＢＳ中０．２５％ブピバカイン−ＨＣｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在）の０．０５ｍｌを各四頭筋に注射した。２日から３日後に、マウスに０．０５ｍｇのプラスミドＤＮＡ（ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌ）を筋肉内注射した。
【０１８７】
アトルバスタチンの投与。アトルバスタチン（ファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、コネチカット州グロトン所在）（処方箋製剤）をＰＢＳ中に懸濁した。アトルバスタチンを０．５ｍｌ（１ｍｇ／ｋｇ用量では０．０４ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量では０．４ｍｇ／ｍｌ）で、２０ｍｍ給餌針（ポッパー・アンド・サンズ社（Ｐｏｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ハイドパーク所在）を用いて１日１回経口投与した。ＰＢＳは、コントロールとして投与した。
【０１８８】
ＥＡＥ誘導。ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを、ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解し、不完全フロイントアジュバントの等容量で乳化し、４ｍｇ／ｍｌ熱殺処理の結核菌Ｈ３７Ｒａ（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州デトロイト所在）を補足した。ラットに、０．１ｍｌのペプチド乳濁液を皮下注射した。実験動物は、以下のように評価した：０＝臨床的疾患なし；１＝尾部の脱力感または麻痺；２＝後肢の脱力感；３＝後肢の麻痺；４＝前肢の脱力感または麻痺；５＝動物の瀕死状態または死亡。この方法でＥＡＥ誘導したマウスの何匹かが、再発−寛解性ＥＡＥを発症させ、一方他のマウスは、慢性的進行性疾患を発症させるような様式で疾患を発症する。
【０１８９】
アトルバスタチンとの併用でＰＬＰ配列をコードするＤＮＡ注射が、進行中のＥＡＥを治療する上で有効であるかどうかを判定するために、マウスに上記のＥＡＥ疾患を誘導し、急性疾患ピークに到達させた。ＥＡＥ誘導後略１７日目に、マウスを種々の治療群にランダムに分配した。アトルバスタチンだけを与えられたマウスは、アトルバスタチンの１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの経口投与で毎日治療した。アトルバスタチンまたはＤＮＡの併用を受けたマウスは、１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで毎日を基準にアトルバスタチンを経口投与すると共に、ＰＬＰをコードするＤＮＡをマウス１匹当たり０．０５ｍｇの用量で週に１回を基準にして筋肉内投与した。対照マウスは、毎日を基準にＰＢＳを経口投与した。次にＥＡＥ臨床疾患を、ＥＡＥの誘導から略４５日間全てを追跡した。
【０１９０】
対照ＰＢＳ投与マウスならびにアトルバスタチンだけ投与したマウスの双方と比較して、アトルバスタチンおよびＰＬＰに関連のＤＮＡ（図９）の双方を与えられたこれらのマウスにおいて疾患重症度の平均ピークが有意に軽減した。さらにより有意義なことに、前記ＤＮＡは、アトルバスタチンの１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの双方に等しく利益を提供した。このことは、より低用量でより忍容性の高いアトバスタチン用量においても利益を提供できることを示唆している。さらにこの併用療法が、再発−寛解性疾患ならびに慢性的進行性疾患の双方を治療するために使用できることがこれらの結果から示唆される。
【０１９１】
実施例６：再発性−寛解性および慢性進行性のヒト多発性硬化症治療用のスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ヒト多発性硬化症を治療するポリヌクレオチド療法は、次のとおり実施する。自己ベクターは、サイトメガロウィルスまたは他の有効な転写プロモーター；ＳＶ４０大型Ｔ抗原、ウシ成長ホルモンから誘導されたポリアデニル化シグナル、または通常の当業技術者に公知の他の有効なポリアデニル化シグナル配列；およびカナマイシンまたはプラスミドの効率的な成長を可能にさせる他のＦＤＡ容認の耐性遺伝子を含んで構築される。
【０１９２】
１つ以上のヒトミエリン自己蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、ＤＮＡ自己ベクター内にクローン化する。ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）、ミエリン会合乏突起膠細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）を含んでいるＭＳ患者における自己免疫応答により標的にされたこれらのミエリン自己蛋白質をコードするＤＮＡを、自己ベクター内にクローン化する。ポリヌクレオチド療法に包含される具体的な自己抗原の選択は、本発明の教示を用いて種々の因子に基づき、被験者における病原性自己抗体の存在などの因子が挙げられる。一実施形態において、各ミエリン自己蛋白質を、個々の、または異なる自己プラスミドにコードする。他の実施形態において、幾つかのミエリン自己蛋白質をコードするＤＮＡを、内部リボソーム・リエントリー配列（ＩＲＥＳｓ）または単独プラスミドＤＮＡから複数蛋白質を発現するための他の方法を用いて単独の自己プラスミド内に連続的にコードする。ミエリン蛋白質をコードするＤＮＡ発現自己プラスミド類を調製し、商品としてキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるものなどのプラスミドＤＮＡ単離のための、通常利用できる方法を用いて単離する。前記ＤＮＡは、療法剤としてヒトへ送達するために細菌性エンドトキシンの無い状態で精製する。一実施形態において、ＭＢＰだけをコードする自己ベクターＤＮＡを、多発性硬化症患者を治療するために投与する。他の実施形態において、２つ以上のミエリン自己蛋白質（類）、自己ポリペプチド（類）または自己ペプチド（類）をコードする複数の自己プラスミドを投与する。１つ以上の自己ポリペプチド（類）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターの治療的有効量を、本発明の教示に従って投与する。例えば、自己ベクターの治療的有効量は、約０．００１マイクログラムから約１グラムの範囲である。自己ベクターの好ましい治療量は、約１０マイクログラムから約５ミリグラムの範囲である。自己ベクターの最も好ましい治療量は、約０．０２５ｍｇから約５ｍｇの範囲である。ポリヌクレオチド療法は、６〜１２ヵ月間で月１回、次いで維持用量として３〜１２ヵ月ごとに送達される。代わりの治療措置を開発してもよく、疾患の重症度、患者の年齢、投与される自己ポリペプチド（類）および通常の治療医師により考慮されると思われるような他の因子に依って、毎日から、毎週、隔月、年１回、１回投与までの範囲であり得る。
【０１９３】
一実施形態において、前記ＤＮＡを筋肉内注射により送達する。他の実施形態において、前記ＤＮＡを、吸入剤として、鼻腔内、経口、皮下、皮内、静脈内、皮膚経由押し込みにより、または真皮へまたは真皮を介して送達させる粒子またはビーズに付着させて送達する。このような粒子またはビーズは、金、他の金属、ポリスチレン、または他の粒子であり得る。一実施形態において、前記ＤＮＡは、生理的濃度のカルシウム（０．９ｍＭ）を有するリン酸緩衝生理的食塩水中に製剤化される。あるいは、前記ＤＮＡは、１ｍＭと２Ｍとの間のより高い量のＣａ＋＋を含有する溶液中で製剤化する。他の実施形態において、前記ＤＮＡは、亜鉛、アルミニウム、その他など他のカチオン類と共に製剤化される。前記ＤＮＡはまた、カチオン性リポソーム、カチオン性リポソームと共にまたは他のリポソーム内に製剤化され得る。前記ＤＮＡはまた、ウィルスベクター、ウィルスベクター、ウィルス粒子、または細菌内にコードされ、送達され得る。
【０１９４】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現許可用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０１９５】
開示されたスタチンとポリヌクレオチドとの併用治療を受けたヒトＭＳ患者を、総合的能力傷害評価、臨床的再発数、および新規ガドリニウム亢進病巣数ならびに亢進病巣容積をモニターするＭＲＩを基準にして疾患活動度をモニターする。この併用療法は、再発−寛解性ならびに慢性的進行性ＭＳの双方を治療するために使用される。
【０１９６】
実施例７：インスリン依存性糖尿病予防のためのインスリンβ鎖の自己ペプチドをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＮＯＤマウスは、自発的自己免疫糖尿病を発症し、ヒトＩＤＤＭによる多くの臨床的、免疫学的、組織病理学的特徴を共有する。ポリヌクレオチド療法は、インスリンＢ鎖アミノ酸９〜２３の自己ペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる自己ベクターにより実施され、インスリンの免疫優性エピトープがＮＯＤマウスに投与される。対照は、インスリンＡ鎖上の対応するペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるベクターである。自己ペプチドをコードする重なりオリゴヌクレオチドプライマーを、発現自己カセット、ＰｃＤＮＡ内に挿入する。自己ペプチドインスリンＢ（インスＢ−ＰｃＤＮＡ）をコードする自己ベクターによる治療により、動物の糖尿病発症が効果的に防がれることが予測される。インスリンＡ（＋）鎖のヌクレオチド配列は、５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＧＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＱＧＡＧＣ−３’（配列番号：７４）であり；インスリンＢ（＋）鎖の配列は、５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＣＴＡＧＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＡＣＣＴＣＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＡＧＧＴＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧＣ−３’（配列番号：７５）である。これらのポリヌクレオチド類は、クローニングのためのＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位を取り込むためにデザインされる。この産物を、ＰｃＤＮＡ３．１＋（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド所在）などの適切な発現ベクターの多クローニング領域内にクローン化される。自己プラスミドＤＮＡの精製は、キアゲン・エンドフリー・メガプレップ・キッツ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｇａ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔｔｓ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いて実施する。
【０１９７】
３週齢から４週齢のメスＮＯＤマウスを、タコニック・ファームス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）（ニューヨーク州ジャーマンタウン所在）から購入する。実験動物に、ＰＢＳ（１四頭筋当たり０．０５ｍｌ）中０．２５％ブピビカイン−ＨＣｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在）の０．１ｍｌを３週齢から４週齢で四頭筋内注射した。２日後、マウスに０．０５ｍｌのプラスミドＤＮＡを１．０ｍｇ／ｍｌで四頭筋内注射する。プラスミドＤＮＡを、１０日間隔で２回以上注射する。
【０１９８】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、実施例５に記載されているとおり１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで経口投与する。
【０１９９】
マウスを、ケムストリップ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．）、インディアナ州インディアナポリス所在）により、糖尿について週１回試験し、ワンタッチＩＩメータ（ジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて、糖尿病を血漿中グルコース測定により確認する。２５０ｍｇ／ｄｌ超の血漿中グルコース濃度を繰り返し有する動物を糖尿病と考える。膵臓を実験動物およびコントロール動物から切除し、１０％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに埋め込む。５０ｍ離れた３つのレベルの薄い部分を、ヘマトキシリンとエオシンで染色するために切断する。浸潤重症度を、光学顕微鏡により評価する。さらに、膵リンパ節における抗原特異的応答を、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βなどのサイトカイン類に関してＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲにより調べる。
【０２００】
実施例８：インスリン依存性糖尿病治療のための自己ポリペプチドインスリンおよび自己蛋白質グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびチロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＮＯＤマウスを、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）６５ｋＤａまたは島チロシンホスファターゼＩＡ−２をコードするＤＮＡと共にプロインスリンポリペプチド全体をコードするＤＮＡを含んでなるポリヌクレオチド療法で治療する。プロインスリン、ＧＡＤ６５およびＩＡ−２をコードするｃＤＮＡ類を単離し、発現自己カセットｐＴＡＲＧＥＴベクターにクローン化する。前記ＤＮＡを、キアゲン・エンドフリー・メガプレップ・キッツ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｇａ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔｓ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア所在）を用いて精製する。
【０２０１】
ＮＯＤマウスに、ＰＢＳ（１四頭筋当たり０．０５ｍｌ）中０．２５％ブピビカイン−ＨＣｌ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス所在）の０．１ｍｌを３週齢から４週齢で四頭筋内注射した。２日後、マウスに、０．９ｍＭカルシウムを有するリン酸緩衝食塩水中、１．０ｍｇ／ｍｌの各自己プラスミドの０．０５ｍｌを各四頭筋に注射する。プラスミドＤＮＡを、１０日間隔で２回以上注射する。
【０２０２】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、実施例５に記載されているとおり１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで経口投与する。
【０２０３】
マウスを、ケムストリップ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．）、インディアナ州インディアナポリス所在）により、糖尿について週１回試験し、ワンタッチＩＩメータ（ジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて、糖尿病を血漿中グルコース測定により確認する。２５０ｍｇ／ｄｌ超の血漿中グルコース濃度を繰り返し有する動物を糖尿病と考える。
【０２０４】
実施例９：確立されたインスリン依存性糖尿病における治療および顕性高血糖症好転のための自己ポリペプチドインスリンおよび／または自己蛋白質グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびチロシンホスファターゼをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＮＯＤマウスに対し、ワンタッチＩＩメータ（ジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、カリフォルニア州ミルピタス）を用いた血漿中グルコース測定により糖尿病を確認すると共に、尿のケムストリップ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．）、インディアナ州インディアナポリス所在）分析を用いて検出された糖尿に基づいて顕性臨床的糖尿病を有することを確認する。実施例７および８のとおり、顕性臨床的糖尿病を有するＮＯＤマウスを、自己ペプチドインスリンＢ（９〜２３）（インスＢ−ＰｃＤＮＡ）をコードするＤＮＡまたはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）６５ｋＤａまたは島チロシンホスファターゼＩＡ−２をコードするＤＮＡを含んでなるポリヌクレオチド療法で治療する。
【０２０５】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、実施例５に記載されているとおり１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで経口投与する。
【０２０６】
マウスを、ケムストリップ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．）、インディアナ州インディアナポリス所在）により、糖尿について週１回試験し、ワンタッチＩＩメータ（ジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、カリフォルニア州ミルピタス）を用いて、糖尿病を血漿中グルコース測定により確認する。３００ｍｇ／ｄｌ超の血漿中グルコース濃度を繰り返し有する動物を治療不良と考える。
【０２０７】
実施例１０：ヒトインスリン依存性糖尿病治療のためのスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
自己プラスミドを、チロシンホスファターゼＩＡ−２、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）（６５ｋＤａおよび６７ｋＤａ体のいずれか）、プレプロインスリン、または島細胞抗原６９ｋＤａ（ＩＣＡ６９）などのヒト島細胞自己蛋白質をコードするＤＮＡを含んで構築する。前記ＤＮＡは、ＰＣＲを用いて単離し、前述の発現自己カセット内にクローン化する。１つ以上の自己ポリペプチド（類）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターの治療的有効量を、本発明の教示に従って投与する。例えば、自己ベクターの治療的有効量は、約０．００１マイクログラムから約１グラムの範囲である。自己ベクターの好ましい治療量は、約１０マイクログラムから約５ミリグラムの範囲である。自己ベクターの最も好ましい治療量は、約０．０２５ｍｇから約５ｍｇの範囲である。ＤＮＡ療法は、６〜１２ヵ月間は月１回、次いで維持用量として３〜１２ヵ月ごとに送達される。代わりの治療措置を開発してもよく、疾患の重症度、患者の年齢、投与される自己ポリペプチド（類）および通常の治療医師により考慮されると思われるこのような他の因子に依って、毎日から、毎週、隔月、年１回、１回投与までの範囲であり得る。好ましい実施形態において、前記ＤＮＡを筋肉内注射により送達する。あるいは、前記ＤＮＡ自己ベクターを、吸入剤として、鼻腔内、経口、皮下、皮内、静脈内、皮膚経由押し込みにより送達し、また、金粒子に付着させたＩＤＤＭの治療の場合、真皮へのまたは真皮を介しての遺伝子ガンによって送達する。前記ＤＮＡは、生理的濃度のカルシウム（０．９ｍＭ）を有するリン酸緩衝生理的食塩水中で製剤化される。あるいは、前記ＤＮＡは、１ｍＭと２Ｍとの間のより高い量のＣａ＋＋を含有する溶液中に製剤化する。他の実施形態において、前記ＤＮＡは、亜鉛、アルミニウム、その他など他のカチオン類と共に製剤化される。
【０２０８】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現許可用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０２０９】
スタチンとポリヌクレオチド療法との開示された併用により治療を受けたヒト糖尿病患者を、外因性インスリンに対する必要性の減少、血清自己抗体プロフィルの変更、糖尿の減少、および白内障、血管機能不全、関節障害、および神経障害などの糖尿病合併症の衰退に基づく疾患活動度に関してモニターする。
【０２１０】
実施例１１：自己免疫滑膜炎および慢性関節リウマチの予防のために自己蛋白質ＩＩ型コラーゲンをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＲＡは、自己寛容性を促進する機構を逃れる病原性Ｔ細胞から生じる。マウスにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）は、ＲＡの特徴と組織学的に類似する滑膜炎および骨侵食を含むＲＡと多くの特徴を共有するＴ細胞媒介自己免疫のモデルである。ＣＩＡの再発性モデルは、ヒトＲＡ患者に見られる様式と同様の様式で炎症性侵食滑膜炎の臨床的再発および寛解を有する（マルフェイト（Ｍａｌｆａｉｔ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９７巻：ｐ．９５６１−６、２０００年）。ＣＩＡは、マウスの中の遺伝的感受性系統に完全フロイントアジュバント中のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を注入することにより誘導する。
【０２１１】
マウスＩＩ型コラーゲンをコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて単離する。コラーゲンＩＶ型およびＩＸ型などのさらなる滑膜自己蛋白質、および熱ショック蛋白質を、ポリヌクレオチド療法に含み得る。上記ペプチド類をコードするＤＮＡは、マウスＣＩＩｃＤＮＡからＰＣＲにより関連ＤＮＡ断片を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて得られる。インフレームメチオニン開始の翻訳部位ならびにＸｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を、オリゴヌクレオチドプライマー内に取り込む。ＰＣＲ生成ＤＮＡ断片を、ｐＴＡＲＧＥＴベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン所在）、ＣＭＶプロモーターにより駆動される哺乳動物発現ベクターなどの発現自己カセットのＸｈｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローン化する。単離クローンを配列決定して、所望のＤＮＡ配列が生成していることを確認する。
【０２１２】
実験開始時に６〜９週齢のオスＤＢＡ／１ＬａｃＪ（Ｈ−２ｑ）マウスを用いる。滑膜関節自己蛋白質をコードするＤＮＡを含んでなる精製自己プラスミド類の各々１００μｇを、ＣＩ予防Ａ実験のためには疾患誘導前、または再発ＣＩＡ治療実験においては臨床ＣＩＡ発症後に１週ごとの間隔で３回脛骨前部筋肉に筋内注射する。このようなＤＮＡ療法は、ブピビカン、カルジオトキシン、あるいは他の前調整剤により、またはこのような薬剤なしで投与部位の注射後に開始する。
【０２１３】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、実施例５に記載されているとおり１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで経口投与する。
【０２１４】
併用処置後、マウスは、急性ＣＩＡを誘導するために完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中１００μｇの精製異種ＣＩＩ蛋白質、または再発ＣＩＡを誘導するためにＣＦＡ中の同種ＣＩＩにより尾基部に皮内誘発させる（マルフェイト（Ｍａｌｆａｉｔ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９７巻：ｐ．９５６１−６６、２０００年）。前記マウスを、ＣＩＡの臨床証明のために肉視評価システム（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、ジョンワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）１５．５．１−１５．５．２４）、１９９４年）を基準にして１２週間毎日追跡する：０、紅斑および腫脹の証拠なし；１、肢中部（肢根）または肢根関節に限定された紅斑および軽度の腫脹；２、肢根から肢中部まで拡大して紅斑および軽度の腫脹；３、肢根から中肢関節まで拡大して紅斑および中等度の腫脹；および４、肢根、肢および趾を含んで紅斑および重度の腫脹。各動物に対する臨床評点は、その４本の各々の肢に対する肉視評点の総計である。組織学的分析は、臨床的関節炎を発生するマウスの関節に対して実施する。最も高い肉視評点を有する四肢の第１の肢は、脱石灰され、区画化され、および前述のヘマトキシリンとエオシンで染色される（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９１巻：ｐ．２７６２−２７６６、１９９４年）。染色区画を、リンパ球浸潤、滑膜肥厚化および前述の侵食に関して調べる（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９１巻：ｐ．２７６２−２７６６、１９９４年）。
【０２１５】
実施例１２：確立された自己免疫滑膜炎および慢性関節リウマチの治療のために自己蛋白質ＩＩ型コラーゲンをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
確立された進行中ＣＩＡ動物を、ＣＩＩ、ＢｉＰおよび／またはＧＰ−３９をコードする自己ベクターＤＮＡで治療して確立された進行中ＣＩＡを逆転させる。マウスを肉視評価システム（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、ジョンワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）１５．５．１−１５．５．２４）、１９９４年）を基準にしたＣＩＡの臨床証明のために１２週間毎日追跡する：０、紅斑および腫脹の証拠なし；１、肢中部（肢根）または肢根関節に限定された紅斑および軽度の腫脹；２、肢根から肢中部まで拡がった紅斑および軽度の腫脹；３、肢根から中肢関節まで拡がった紅斑および中等度の腫脹；および４、肢根、肢および趾を含んで紅斑および重度の腫脹。各動物に対する臨床評点は、その動物の４本の肢各々に対する肉視評点の総計である。組織学的分析を、臨床的関節炎を発症するマウスの関節に対して実施する。最も高い肉視評点を有する四肢の第１肢は、脱石灰し、区画化し、前述のヘマトキシリンとエオシンで染色する（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９１巻：ｐ．２７６２−２７６６、１９９４年）。染色区画を、前述のリンパ球浸潤、滑膜肥厚化および侵食に関して調べる（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）米国、９１巻：ｐ．２７６２−２７６６、１９９４年）。スタチンと、ＣＩＩ、ＢｉＰ、ＧＰ−３９、および／または滑膜関節に存在するさらなる蛋白質をコードする自己ＤＮＡとの併用処置により、肉視評点システムを基準にした、滑膜炎の臨床的再発数を減少し、重度関節炎を軽減する。
【０２１６】
実施例１３：ヒト慢性関節リウマチおよび関節を標的とする他の自己免疫疾患の予防または治療のためのスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
自己プラスミドを、ＩＩ型コラーゲン、ＢｉＰ、ｇｐ３９、ＩＶ型コラーゲン、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼおよび／またはフィブリンを含む滑膜関節に発現される蛋白質など、ヒト自己蛋白質をコードするＤＮＡを含んで構築する。前記ＤＮＡは、ＰＣＲを用いて単離し、前述の発現自己カセット内にクローン化する。１００μｇのプラスミドＤＮＡを、カルシウムを有するリン酸緩衝生理食塩水中で毎月を基準にして投与する。上記で検討された種々の緩衝剤で製剤化された種々の投薬措置で、または種々の投与経路により前記ＤＮＡを投与することも可能である。
【０２１７】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤または「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現許可用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０２１８】
アメリカ大学（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ）のリウマチ病学評価基準（診断に必要な４／７の判定基準：（ｉ）対称的な多発関節炎、（ｉｉ）ＭＣＰ類、ＰＩＰ類、または手関節の関与、（ｉｉｉ）３つ以上の異なる関節領域の関与、（ｉｖ）手または足のＸ線写真の関節侵食、（ｖ）リウマチ因子試験の陽性、（ｉｖ）１時間以上の朝のこわばり、および（ｖｉｉ）伸筋表面の結節）で診断された新規発生または進行中のＲＡヒト患者を、スタチンと併用してＩＩ型コラーゲン、ＢｉＰ、ｇｐ３９、ＩＶ型コラーゲン、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼおよび／またはフィブリンをコードする自己ポリヌクレオチド類で治療する。ＲＡに対する併用療法の有効性は、患者の圧痛のある関節カウントにおける２０％（アメリカ大学のリウマチ病学の２０％応答、ＡＣＲ２０）以上、５０％（ＡＣＲ５０）および７０％（ＡＣＲ７０）軽減率を基準にしてモニターする。ヒトＲＡに関するさらなる手段としては、ステロイド使用量減少の炎症マーカー（ＥＳＲおよびＣＲＰを含む）、Ｘ線撮影による進行（侵食および関節空間の狭小化）減少、能力傷害状態評点（健康評価アンケート−ＨＡＱなど）の改善が挙げられる。自己抗体力価およびプロフィルの変化もまたモニターする。乾癬性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、強直性症候群、およびリウマチ性多発筋痛などの関連関節炎疹に対して同一のアプローチを使用する。
【０２１９】
最近の研究では、慢性関節リウマチに対する高特異性のある一定の自己抗体（例えば、ＢｉＰ、抗シトルリン抗体、抗フィラグリン抗体）が、複数月、またはさらに複数年に亘り臨床診断を先導することを示唆している。このことは、患者を疾患発症前に確認し、予防的ポリヌクレオチド療法を用いて効果的に治療し得る可能性を高める。健康で無症候患者は、限定はしないが、上記の血清反応試験の１つなど、診断的自己抗体の存在をスクリーンする。陽性試験の患者は、疾患発症および重症度を予防する試みとして、上記のスタチンとポリヌクレオチド療法との併用で、また他の例で治療する。引き続く診断と応答を、上記評価基準を用いてモニターする。
【０２２０】
実施例１４：ヒト自己免疫ブドウ膜炎を治療するためのスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ＰＣＲヒトＳ−抗原を用いて光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンおよびリカバリンを単離し、実施例５に記載されているＤＮＡ発現自己カセットにクローン化する。自己プラスミドは、ヒトＳ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質、ロドプシンおよびリカバリンよりなる群から選択される１つ以上の自己ポリペプチド（類）をコードするポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを含んで構築する。１つ以上の自己ポリペプチド（類）をコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターの治療的有効量を、本発明の教示に従って投与する。例えば、自己ベクターの治療的有効量は、約０．００１マイクログラムから約１グラムの範囲である。自己ベクターの好ましい治療量は、約１０マイクログラムから約５ミリグラムの範囲である。自己ベクターの最も好ましい治療量は、約０．０２５ｍｇから約５ｍｇの範囲である。ＤＮＡ療法は、６〜１２ヵ月間では月１回、次いで維持用量としては３〜１２ヵ月ごとに送達される。代わりの治療措置を開発してもよく、疾患の重症度、患者の年齢、投与される自己ポリペプチド（類）および通常の治療医師により考慮されると思われるような他の因子に依って、毎日から、毎週、隔月、年１回、１回投与までの範囲であり得る。
【０２２１】
好ましい実施形態において、前記ＤＮＡを筋肉内注射により送達する。あるいは、前記ＤＮＡ自己ベクターを、吸入剤として、鼻腔内、経口、皮下、皮内、静脈内、皮膚経由押し込みにより、また、自己免疫ブドウ膜炎の治療の場合、真皮へまたは真皮を介して送達させる金粒子に付着させて送達する。他の実施形態において、前記ＤＮＡは、生理的濃度のカルシウム（０．９ｍＭ）を有するリン酸緩衝生理的食塩水中に製剤化される。あるいは、前記ＤＮＡは、１ｍＭと２Ｍとの間のより高い量のＣａ＋＋を含有する溶液中で製剤化する。前記ＤＮＡは、亜鉛、アルミニウム、その他など他のカチオン類と共に製剤化される。
【０２２２】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現承認用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０２２３】
実施例１５：原発性胆汁性肝硬変の予防および確立された原発性胆汁性肝硬変の治療のためのスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
ヒトＰＤＣ−Ｅ２および−Ｅ３をコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いて単離し、大腸菌において増幅された好適な哺乳動物発現ベクターの発現自己カセットにクローン化し、エンドトキシンの無い状態でのプラスミド精製法を用いて精製する。自己蛋白質（類）ＰＤＣ−Ｅ２および−Ｅ３をコードするＤＮＡを含んでなるポリヌクレオチド療法は、確立されたヒトＰＢＣを有するヒトに投与する。ＩＬ−４などのサイトカインをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを、自己ベクターと共に投与してもよい。
【０２２４】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現承認用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０２２５】
ＰＢＣ患者またはＰＢＣ発症の危険性のある患者は、ピルベートデヒドロゲナーゼ複合体のようなミトコンドリア蛋白質に対して向けられる血清中の自己抗体を確認することにより効率的に診断できる。無症候ヒト患者は、診断上の自己抗体の存在に関して、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、または蛋白質アレイなどの利用できる血清試験を用いて試験される。血清試験の陽性患者を、疾患発症を予防するために上記のポリヌクレオチド療法により予防的に治療する。ヒトにおけるＰＢＣｓに対する併用療法の有効性は、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの一連の肝機能検査、ならびに肝不全の進行時間の遅延を測定することにより判定される。経皮的肝生検後、肝組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色ならびに過ヨウ素酸シッフ反応により評価する。胆管異常、脈管における壊死性炎症変化および肉芽種浸潤もまた、疾患活動度の証明のために調べられる。血清中自己抗体プロフィルもまた分析される。
【０２２６】
実施例１６：スタチンとオステオポンチンをコードするＤＮＡとの併用により多発性硬化症および他の自己免疫疾患を治療する方法
オステオポンチンは、最近確認された多面性を有する分子であり、多発性硬化症およびその動物モデル、ＥＡＥにおいて病原性の役割を演じる。オステオポンチンはまた、炎症性関節炎および他のヒト自己免疫疾患において中心的な役割を演じる。自己蛋白質オステオポンチンをコードするＤＮＡによるマウスの治療により、疾患を永続させるオステオポンチンの有害作用を抑制する宿主において抗オステオポンチン免疫グロブリン応答を減少させる。
【０２２７】
ヒト多発性硬化症患者において、オステオポンチン自己ベクター療法を、診断後に開始する。上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現承認用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。有効性を、ＥＬＩＳＡ分析により測定される多発性硬化症患者における抗オステオポンチン抗体誘導に基づいてモニターする。有効性はさらに、脳ＭＲＩ走査による病巣数およびサイズの減少、疾患再発（臨床的麻痺のエピソード）数の減少および能力傷害進行の遅延化を基準にして立証する。
実施例１７：自己免疫応答により標的とされる器官または組織に発現される自己蛋白質のライブラリーをコードするＤＮＡ投与を含んでなるスタチンとポリヌクレオチドとの併用療法
自己免疫疾患の治療のための他の方法は、免疫攻撃下で組織または器官内に存在する自己蛋白質の多くまたは全てをコードするＤＮＡを投与することである。ｃＤＮＡ発現ライブラリーには、特定の組織、器官または細胞種に発現される自己蛋白質の多く、または大多数をコードするｃＤＮＡを含んでいる。このようなｃＤＮＡ発現ライブラリーを自己ベクター内に作製し、宿主への投与した際にそれらがコードするポリペプチドの発現を可能にする。確立された多発硬化症を有する動物およびヒトを、脳内の乏突起膠芽細胞内に発現したｃＤＮＡのライブラリーをコードする自己ベクターによって治療する。リウマチ様関節炎を有する動物およびヒトは、リウマチ様関節炎における自己免疫応答の標的である滑膜関節に発現したｃＤＮＡのライブラリーをコードする自己ベクターによって治療する。自己免疫糖尿病を有する動物およびヒトは、膵臓のベータ細胞に発現したｃＤＮＡのライブラリーをコードする自己ベクターによって治療する。膵臓のベータ細胞に発現したｃＤＮＡをコードする自己ベクターは、自己免疫糖尿病を発症する危険性が高いと判定された。個人における臨床的糖尿病の発症を予防するためにも利用できる。あるいは、自己免疫の治療に、ｃＤＮＡのライブラリー全体を用いる代わりに、自己ベクター内にコードされたｃＤＮＡ発現ライブラリーの大型サブセットを用いることができる。
【０２２８】
上記のポリヌクレオチド療法と併用して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤すなわち「スタチン類」を、高コレステロール血症用の現承認用量で経口投与する。例えば、患者に、１日１回１０ｍｇから８０ｍｇの用量範囲、維持用量として１日１回４０ｍｇの好ましい用量でアトルバスタチンを投与する。
【０２２９】
実施例１８：多発硬化症の治療のためにスタチンと規則的配列ペプチドとの併用
ＭＳ関連ＭＨＣ分子に存在するポケットをビングするために規則的配列された３つのアミノ酸の繰り返し配列を含んだある一定の規則的配列ペプチド類は、ＭＳの動物モデルにおいて疾患重症度を軽減し得ることが以前に示されている。例えば、ＭＳ患者において免疫優性であることが判明しているＭＢＰ  ｐ８７〜９９配列に基づいてアミノ酸の特定配列（ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫ）が、ルイスラットにおけるＥＡＥを効果的に予防し、治療し得ることが立証された。
【０２３０】
本発明の併用アプローチにおいて、ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫのような規則的配列ペプチドを、実施例６に記載されるとおり投与されるスタチンと併用して毎日、週２回、週１回、月２回、月１回、時折のいずれかでＭＳ患者に皮下投与する。
【０２３１】
開示されたスタチンと規則的配列ペプチドとの併用で治療を受けたヒトＭＳ患者を、臨床的再発数、および新規ガドリニウム亢進病巣数ならびに亢進病巣容積をモニターするＭＲＩを基準にして疾患活動度をモニターする。
実施例１９：多発性硬化症の治療のためスタチンと免疫調節配列との併用療法
六量体モチーフ５’−プリン−プリン−Ｇ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジン−３’または５’−プリン−ピリミジン−Ｇ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジン−３’を優先的に含んだＩＭＳ’ｓと呼ばれるホスホロチオエート骨格を有するある一定の１本鎖オリゴヌクレオチド類は、ＭＳの動物モデルにおいて疾患重症度を軽減し得ることが以前に示されている。
【０２３２】
本発明の併用アプローチにおいて、ＩＭＳオリゴ体を、実施例６に記載されるとおり投与されるスタチンと併用して毎日、週２回、週１回、月２回、月１回、時折のいずれかでＭＳ患者に皮下投与する。
【０２３３】
開示されたスタチンとＩＭＳとの併用で治療を受けたヒトＭＳ患者を、臨床的再発数、および新規ガドリニウム亢進病巣数ならびに亢進病巣容積をモニターするＭＲＩを基準にして疾患活動度をモニターする。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１−１】図１。経口アトルバスタチンによるＥＡＥの予防と治療。Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＭＯＧｐ３５〜５５誘導ＥＡＥの発症時治療により臨床的悪化が予防され（Ａ、各群マウス７匹）、一方、発症後治療はＥＡＥを改善する（Ｂ、各群マウス１４匹）。ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１誘導ＥＡＥの発症時治療は、再発を予防し（Ｃ、各群マウス１０匹）、一方、急性ＥＡＥの後に開始された治療は、再発ＥＡＥを逆転させ（Ｄ、各群マウス１０匹）、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１  Ｔｇマウスにおいて誘導されたＭＢＰ  Ａｃ１−１１の急性ＥＡＥの予防（Ｅ、各群マウス６匹）。各グラフの下の横線は、アトルバスタチン治療期間を示す。ＥＡＥ誘導からの日数に対して平均ＥＡＥスコアをプロットしてある。
【図１−２】図１。経口アトルバスタチンによるＥＡＥの予防と治療。Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＭＯＧｐ３５〜５５誘導ＥＡＥの発症時治療により臨床的悪化が予防され（Ａ、各群マウス７匹）、一方、発症後治療はＥＡＥを改善する（Ｂ、各群マウス１４匹）。ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１誘導ＥＡＥの発症時治療は、再発を予防し（Ｃ、各群マウス１０匹）、一方、急性ＥＡＥの後に開始された治療は、再発ＥＡＥを逆転させ（Ｄ、各群マウス１０匹）、ＭＢＰ  Ａｃ１−１１  Ｔｇマウスにおいて誘導されたＭＢＰ  Ａｃ１−１１の急性ＥＡＥの予防（Ｅ、各群マウス６匹）。各グラフの下の横線は、アトルバスタチン治療期間を示す。ＥＡＥ誘導からの日数に対して平均ＥＡＥスコアをプロットしてある。
【図２】図２。アトルバスタチン治療により脳内単核湿潤が低下する。
【図３】図３。アトルバスタチンは、ＣＮＳにおける種々のＣＩＩＴＡの転写体の発現をインビボでダウンレギュレートする。ＳＪＬマウス３群を１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのアトルバスタチンまたはＰＢＳのみで１２日間治療した。治療開始２日後、ＰＬＰ１３９〜１５１／ＣＦＡを用いてそれらマウスにＥＡＥを誘導した。治療１２日目（ＥＡＥ１０日目と同日）、各群マウス２匹および未処理マウス２匹を殺処理した。脳から総ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いて総ＣＩＩＴＡ発現および特異的ＣＩＩＴＡ発現を分析した。（Ａ）は、ＣＩＩＴＡｍＲＮＡ転写体（内部転写体としてしょうめいされている）全ての総発現を示し、（Ｂ）は、形態Ｉすなわち、設計プロモーターＩ（ＰＩ、樹状突起細胞に特異的）としての特異的発現を示し、（Ｃ）は形態ＩＩＩすなわち設計プロモーターＩＩＩ（ＰＩＩＩ、Ｂ細胞に特異的）の特異的発現を示し、（Ｄ）は、形態ＩＶ、すなわち設計プロモーターＩＶ（ＰＩＶ、ＩＦＮ−γ誘導形態で小膠細胞に特異的）を示す。治療群に対し、平均転写体コピーがプロットされている。星印は、各例におけるアトルバスタチン治療群または未処理群対ＰＢＳ治療群を較べて統計的有意差（ワンウェイＡＮＯＶＡ検定によるｐ０．０５）を示す。
【図４−１】図４。アトルバスタチンは増殖を抑制し、Ｔｈ２サイトカイン偏重を促進する。（Ａ）アトルバスタチン治療および媒体治療のＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１免役化マウスのＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１刺激脾臓細胞の増殖応答。アトルバスタチン治療は、ＩＬ−２（Ｂ）およびＩＦＮ−γ（Ｃ）の分泌減少ならびにＩＬ−４（Ｄ）およびＩＬ−１０の産生増加（１０ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン）を伴う。（Ｅ）増殖は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定し、サイトカインはＥＬＩＳＡにより測定した。
【図４−２】図４。アトルバスタチンは増殖を抑制し、Ｔｈ２サイトカイン偏重を促進する。（Ａ）アトルバスタチン治療および媒体治療のＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１免役化マウスのＰＬＰ  ｐ１３９〜１５１刺激脾臓細胞の増殖応答。アトルバスタチン治療は、ＩＬ−２（Ｂ）およびＩＦＮ−γ（Ｃ）の分泌減少ならびにＩＬ−４（Ｄ）およびＩＬ−１０の産生増加（１０ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン）を伴う。（Ｅ）増殖は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定し、サイトカインはＥＬＩＳＡにより測定した。
【図５】図５。（Ａ）ＰＢＳ（レーン１）、１ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン（レーン２）、１０ｍｇ／ｋｇアトルバスタチン（レーン３）で治療したマウスまたはｍｒＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）処理リンパ球（レーン４）におけるＳＴＡＴ６活性化の程度を測定するために、抗ホスホＳＴＡＴ６−特異的ウェスタンを実施した。サンプルは、種々のマウス群の排液リンパ節細胞の蛋白質溶解液から得た。陽性対照（レーン４）に見られるように、ＩＬ−４治療およびアトルバスタチン治療は、リンパ節細胞におけるＳＴＡＴ６の予想された１０５ｋＤａイソ体を活性化する（ＢおよびＣ）。各レーンが等負荷であることを保証するため、対照としてＳＴａｔ６に対する抗体（Ｂ）またはマウスＣＤ３に対する抗体（Ｃ）を用いて同一のブロットを除去し再調査した。示したデータは、２つの独立した実験の各々について実施された２つの別々のウェスタンブロットを表している。分子量はキロダルトンで示されている。
【図６Ａ】図６Ａ。自己蛋白質プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）のペプチドをコードするＤＮＡはＴ細胞の増殖応答を減少させる。ＤＮＡワクチン接種マウスにおいてＰＬＰｐ１３９〜１５１に対するリンパ節細胞（ＬＮＣ）の増殖応答が減少する。ＰＬＰ１３９〜１５１（Ａ）をコードするＤＮＡ、または対照ベクターを注入された疾患動物が急性期から回復後、ｐ標的（Ｂ）を殺処理し、排液ＬＮＣを単離した。種々の濃度のペプチドＰＬＰ１３９〜１５１（四角形）、または対照ペプチドＰＬＰ１７８〜１９１（三角形）で刺激することにより細胞をインビトロで試験した。マウス５匹群のプールしたＬＮＣの増殖応答を三通りのウェルの平均ＣＰＭ±ＳＤとして示している。ＬＮＣで刺激されたコンカナバリンＡ（０．００１ｍｇ／ｍｌ）のＣＰＭは、Ａ群では１０２４０１、Ｂ群では７６７０２であった。
【図６Ｂ】図６Ｂ。ＥＬＩＳＡ分析に基づいた、ＤＮＡ免疫処置動物のＬＮＣにおいてサイトカイン濃度は減少する。ＥＡＥの急性期後、ＰＬＰ１３９〜１５１をコードするプラスミドＤＮＡ、またはベクター単独（ｐ標的）でワクチン接種したマウス５匹群のＬＮＣを免疫化ペプチドＰＬＰ１３９〜１５１によりインビトロで刺激した。γ−インターフェロン（縞状バー）またはＩＬ−２（点状バー）の濃度を、上清液中のＥＬＩＳＡにより試験し公知の標準対照と比較した。結果はｎｇ／ｍｌで表してある。
【図６Ｃ】図６Ｃ。リボヌクレアーゼ保護アッセイに基づいたＤＮＡ免疫処置動物のＬＮＣにおいて、サイトカイン濃度は減少する。サイトカインｍＲＮＡ検出に関し、多プローグリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、実験動物の脳からのＲＮＡサンプルを試験し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、反応物を分析した。操作の最後にゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに曝露した。
【図７】図７。阻害性ＩＭＳによるポリヌクレオチド療法は、ＰＬＰ１３９〜１５１媒介ＥＡＥを抑制する。０日目に、７週齢のメスＳＪＬ／Ｊマウスを、ＩＦＡおよび０．５ｍｇ熱非活性化結核菌からなる、ＣＦＡ中乳化ＰＢＳ中１００μｇのＰＬＰ１３９〜１５１により皮下免疫処置した。７日目から毎日、マウスを臨床的に採点した。１２日目に、合計０．１ｍｌのＰＢＳ中０．２５％ブピバカイン（Ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）−ＨＣＬを両四頭筋内に注射した。２日後、選別したマウスの両四頭筋に個々に総量０．２ｍｌＴＥ中、ｐＴＡＲＧＥＴプラスミド（各２５μｇ）プラス完全長マウスＩＬ−４をコードする５０μｇのｐＴＡＲＧＥＴプラスミド上、各々完全長マウスＰＬＰ、ＭＡＧ、ＭＯＧおよびＭＢＰをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを筋肉内注射した。ＤＮＡ注射は、１週間間隔で６週間投与した。最初のＤＮＡ処理と同時に、２００μｌ容量のＰＢＳ中５０μｇＩＭＳを単独で、またはＤＮＡポリメラーゼ処理と共に腹腔内投与した。ＩＭＳは１週おきに６週間投与した。
【図８】図８。指令ペプチドにより処理されたラットにおけるＥＡＥの予防を表しているグラフである。図の凡例：指令ペプチド｛配列番号：４｝ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫは、ルイスラットにおけるＥＡＥの発現を予防する。ＥＡＥ誘導用完全フロイントアジュバント中０．１ｍｇのＭＢＰ  ｐ８５〜９９の乳化液をラットに注射した。１０日後、疾患の臨床発現が明らかになった場合は、ペプチド｛配列番号：４｝ＥＹＹＫＥＹＹＫＥＹＹＫ（四角形）、｛配列番号：５｝ＫＹＹＫＹＹＫＹＹＫＹＹ（三角形）の腹膜内単回用量を投与した。結果は、ラット６匹群の平均疾患評点として表している。
【図９Ａ】図９Ａ。１ｍｇ／ｋｇアトルバスタチンおよび自己蛋白質プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）をコードするＤＮＡの併用により、ＥＡＥの重症度が低下する。０日目に、７週齢のメスＳＪＬ／Ｊマウスを、ＩＦＡおよび０．５ｍｇ熱非活性化結核菌からなる、ＣＦＡ中乳化ＰＢＳ中１００μｇのＰＬＰ１３９〜１５１により皮下免疫処置した。７日目から毎日、マウスを臨床的に採点した。１５日目に、合計０．１ｍｌのＰＢＳ中０．２５％ブピバケイン（Ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）−ＨＣＬをマウスの両四頭筋内に注射した。２日後、マウスを無作為に治療群に分け、総容量０．２ｍｌ  ＴＥ中、完全長マウスＰＬＰ（各マウスにつき５０μｇ）をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを、両大腿四頭筋へ筋肉内注射した。ＤＮＡ注射は実験期間を通して１週間おきに投与した。最初のＤＮＡ処理と同時に、アトルバスタチンを１ｍｇ／ｋｇ用量で０．５ｍｌの容量において経口投与した。アトルバスタチン処理は、実験期間を通して毎日実施された。対照マウスには、０．５ｍｌのＰＢＳを毎日を基準に経口投与した。マウスはＥＡＥ疾患に関して毎日モニターされたが、治療群の平均評点を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂ。１０ｍｇ／ｋｇアトルバスタチンおよび自己蛋白質プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）をコードするＤＮＡの併用により、ＥＡＥの重症度が低下する。実験は、アトルバスタチンを１０ｍｇ／ｋｇで投与したことを除いて、図１Ａにおける場合と同様に実施した。
【図９Ｃ】図９Ｃ。アトルバスタチンの１ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量の双方でＤＮＡ処理は同等の利益を提供した図１Ａと１Ｂにおけるデータの直接比較により、アトルバスタチンの試験された２つの用量で、ＤＮＡ効果は同等であることが示される。
【図１−１】
2005527553.tif 000002
【図１−２】
2005527553.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
2005527553.tif 000011
【図６Ａ】
2005527553.tif 000012
【図６Ｂ】
2005527553.tif 000013
【図６Ｃ】
2005527553.tif 000014
【図７】
2005527553.tif 000015
【図８】
2005527553.tif 000016
【図９Ａ】
2005527553.tif 000017
【図９Ｂ】
2005527553.tif 000018
【図９Ｃ】
2005527553.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月1日(2005.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患を治療する組成物であって、
スタチンの有効量および抗原特異的免疫調節剤の有効量を含む、組成物。
【請求項２】
前記抗原特異的免疫調節剤が、自己免疫疾患と関連した自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む自己ベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記自己ポリペプチドが自己蛋白質または自己ペプチドである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原特異的免疫調節剤がポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが蛋白質またはペプチドである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドがポリペプチド誘導体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドを含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドの自己抗原エピトープに相当するアミノ酸を含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が、ランダムコポリマーを形成するためにランダム化されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ランダムコポリマーがペプチドである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が規則配列されることにより、それによって前記ポリペプチドが規則配列アミノ酸モチーフを含んでなる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患が、脱髄自己免疫疾患であり、前記規則配列アミノ酸モチーフは、ｎが２から６の［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）、ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）、ミエリン会合乏突起膠細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質（ＭＯＧ）、またはアルファ−Ｂクリスタリンよりなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記自己ポリペプチドが、インスリン、インスリンＢ鎖、プレプロインスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ｋＤＡ体、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６７ｋＤａ体、チロシンホスファターゼＩＡ２またはＩＡ−２ｂ、カルボキシペプチダーゼＨ、熱ショック蛋白質、グリマ３８、島細胞抗原の６９ｋＤａ体、ｐ５２、および島細胞グルコース輸送物体（ＧＬＵＴ２）よりなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記自己ベクターが、１つの自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記自己ポリペプチドがプレプロインスリンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記自己ポリペプチドがインスリンＢ鎖９〜２３である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ  Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；ｇｐ３９などの軟骨蛋白質；Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＩＸ型、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；およびアルドラーゼＡよりなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患が自己免疫ブドウ膜炎である、請求項２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンおよびリカバリンよりなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
自己免疫疾患を治療する組成物であって、スタチンの有効量および非抗原特異的免疫調節剤の有効量を含む、組成物。
【請求項２８】
前記非抗原特異的免疫調節剤が免疫調節配列である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫調節配列が、
（ａ）５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’および
（ｂ）５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’、
よりなる群から選択され、式中、ＸおよびＹは、シトシン−グアニンであり得ないこと以外は、任意の天然由来、または合成ヌクレオチドである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リ
ウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
自己免疫疾患を治療するキットであって、
スタチンの有効量および抗原特異的免疫調節剤の有効量を備える、キット。
【請求項３７】
前記抗原特異的免疫調節剤が、前記自己免疫疾患と関連した自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記自己ポリペプチドが自己蛋白質または自己ペプチドである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記抗原特異的免疫調節剤がポリペプチドである、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが蛋白質またはペプチドである、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記ポリペプチドがポリペプチド誘導体である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドを含んでなる、請求項３９に記載のキット。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、前記疾患に関連した自己ポリペプチドの自己抗原エピトープに相当するアミノ酸を含んでなる、請求項３９に記載のキット。
【請求項４４】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が、ランダムコポリマーを形成するためにランダム化されている、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記ランダムコポリマーがペプチドである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記自己抗原エピトープに相当するアミノ酸が規則配列されることにより、それによって前記ポリペプチドが規則配列アミノ酸モチーフを含んでなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
前記自己免疫疾患が、脱髄自己免疫疾患であり、前記規則配列アミノ酸モチーフは、ｎが２から６の［１Ｅ２Ｙ３Ｙ４Ｋ］ｎである、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４９】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、プロテオリピド蛋白質（ＰＬＰ）、ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）、ミエリン会合乏突起膠細胞塩基性蛋白質（ＭＢＯＰ）、ミエリン乏突起膠細胞蛋白質（ＭＯＧ）、またはアルファ−Ｂクリスタリンよりなる群から選択される、請求項３７に記載のキット。
【請求項５３】
前記自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である、請求項３７に記載のキット。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記自己ポリペプチドが、インスリン、インスリンＢ鎖、プレプロインスリン、プロインスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６５ｋＤＡ体、グルタミン酸デカルボキシラーゼの６７ｋＤａ体、チロシンホスファターゼＩＡ２またはＩＡ−２ｂ、カルボキシペプチダーゼＨ、熱ショック蛋白質、グリマ３８、島細胞抗原の６９ｋＤａ体、ｐ５２、および島細胞グルコース輸送物体（ＧＬＵＴ２）よりなる群から選択される、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記自己ベクターが、１つの自己ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記自己ポリペプチドがプレプロインスリンである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記自己ポリペプチドがインスリンＢ鎖９〜２３である、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
前記自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項３７に記載のキット。
【請求項５９】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ  Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；ｇｐ３９などの軟骨蛋白質；Ｉ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＩＸ型、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；およびアルドラーゼＡよりなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記自己免疫疾患が自己免疫ブドウ膜炎である、請求項３７に記載のキット。
【請求項６１】
前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記ポリペプチドが、Ｓ−抗原、光受容体間レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）、ロドプシンまたはリカバリンよりなる群から選択される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
自己免疫疾患を治療するキットであって、スタチンの有効量および非抗原特異的免疫調節剤の有効量を備える、キット。
【請求項６３】
前記非抗原特異的免疫調節剤が免疫調節配列である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記免疫調節配列が、
（ａ）５’−プリン−ピリミジン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’および
（ｂ）５’−プリン−プリン−［Ｘ］−［Ｙ］−ピリミジン−ピリミジン−３’、
よりなる群から選択され、式中、ＸおよびＹは、シトシン−グアニンであり得ないこと以外は、任意の天然由来、または合成ヌクレオチドである、請求項６3に記載のキット。
【請求項６５】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６６】
前記非抗原特異的免疫調節剤が、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる自己ベクターである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６７】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、慢性関節リ
ウマチ、および自己免疫ブドウ膜炎よりなる群から選択される、請求項６２に記載のキット。
【請求項６８】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記スタチンが、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびセリバスタチンよりなる群から選択される、請求項６２に記載のキット。
【請求項７０】
前記スタチンがアトルバスタチンである、請求項６９に記載のキット。
【国際調査報告】
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