(57)【要約】本発明は、ゴムの木すなわちＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのラテックスでのイソペンテニル二リン酸の生物生産に関する。アセテートからのイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の合成は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡとして単離された６種類の遺伝子にコードされる一組の酵素によって媒介される。また、これらの酵素のうちのひとつであるアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼのバリアント配列も見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子と、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子と、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子と、からなる群から選択される、イソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１と、配列番号２と、配列番号４と、配列番号５と、配列番号６と、からなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号８と、配列番号９と、配列番号１１と、配列番号１２と、配列番号１３と、からなる群から選択される請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法によるアライメントで４１１アミノ酸長にわたって少なくとも６５％の同一性をもつアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、あるいは第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号９に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法によるアライメントで４６４アミノ酸長にわたって少なくとも８２％の同一性をもつＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、あるいは第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１１に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法によるアライメントで３８６アミノ酸長にわたって少なくとも６８％の同一性をもつメバロン酸キナーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、あるいは第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法によるアライメントで５０３アミノ酸長にわたって少なくとも７３％の同一性をもつホスホメバロン酸キナーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、あるいは第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号１３に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法によるアライメントで４１５アミノ酸長にわたって少なくとも７７％の同一性をもつメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、あるいは第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１０】
好適な制御配列に作動的に結合された請求項１または５〜９のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、藻類と、緑色植物と、からなる群から選択される請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）と、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）と、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）と、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）と、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）と、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）と、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）と、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）と、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）と、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）と、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）と、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）と、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）と、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）と、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）と、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）と、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）と、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）と、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）と、からなる群から選択される請求項１２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
宿主細胞が、ゴムの木（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）と、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）と、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓｐｐ．）と、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）と、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓｐｐ．）と、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）と、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）と、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）と、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）と、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）と、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）と、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓｐｐ．）と、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）と、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）と、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）と、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）と、他のマメ種（Ｖｉｇｎａ  ｓｐｐ．）と、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）と、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）と、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）と、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）と、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）と、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）と、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）と、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  ｓａｔｉｖａ）と、からなる群から選択される請求項１２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
（ａ）請求項１または５〜９のいずれか一項に記載の核酸分子をプローブとしてゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）請求項１または５〜９のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片の配列を決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がイソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードする、イソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１と、配列番号２と、配列番号４と、配列番号５と、配列番号６と、からなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅することを含んでなり、
増幅されたインサートが、イソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、イソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法の産物。
【請求項１８】
好適な成長条件下で形質転換宿主細胞を有効量の炭素基質に接触させることでイソペンテニル二リン酸経路の化合物を生成することを含んでなり、前記形質転換宿主細胞が、好適な制御配列の制御下に配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６をコードする一組の核酸分子を含んでなる、イソペンテニル二リン酸経路における化合物の生成方法。
【請求項１９】
形質転換宿主が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、藻類と、緑色植物と、からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
形質転換宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）と、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）と、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）と、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）と、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）と、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）と、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）と、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）と、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）と、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）と、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）と、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）と、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）と、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）と、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）と、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）と、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）と、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）と、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）と、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）と、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）と、からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
形質転換宿主細胞が、ゴムの木（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）と、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）と、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓｐｐ．）と、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）と、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓｐｐ．）と、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）と、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）と、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）と、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）と、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）と、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）と、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓｐｐ．）と、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）と、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）と、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）と、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）と、他のマメ種（Ｖｉｇｎａ  ｓｐｐ．）と、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）と、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）と、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）と、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）と、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）と、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）と、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）と、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  ｓａｔｉｖａ）と、からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つのイソペンテニル二リン酸遺伝子を、イソペンテニル二リン酸の生合成が生物において変化するように該生物にて過発現させることを含んでなる、生物におけるイソペンテニル二リン酸生合成の調節方法。
【請求項２３】
前記イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子をマルチコピープラスミドにて過発現させる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子を、誘導プロモーターまたは調節プロモーターに作動的に結合させる請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子をアンチセンス方向に発現させる請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
外来ＤＮＡをコード領域に挿入して前記イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子を中断する請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）ａ）天然イソペンテニル二リン酸遺伝子と、
ｂ）前記天然イソペンテニル二リン酸遺伝子にハイブリダイズする第１のヌクレオチド断片の集合と、
ｃ）前記天然イソペンテニル二リン酸遺伝子にハイブリダイズしない第２のヌクレオチド断片の集合と、を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して制限断片の混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）前記制限断片の混合物を変性させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の変性させた前記制限断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートするステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返し、生物学的活性の変化したタンパク質をコードする変異イソペンテニル二リン酸遺伝子を生成するステップと、を含んでなる方法によって生成される、生物学的活性の変化したイソペンテニル二リン酸経路の酵素をコードする変異遺伝子。
【請求項２８】
配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学および植物学の分野に関する。特に、本発明はイソペンテニル二リン酸の生物生産に役立つ酵素をコードする核酸断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物には、ポリイソプレノイドと呼ばれる、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成されるさまざまな炭化水素を合成する機能がある（非特許文献１）。４５から１１５個の炭素原子を含み、かつ、シス型とトランス型（Ｚ−とＥ−）の二重結合をさまざまな数で含むものがポリプレノールと呼ばれるのに対し、これよりも鎖長が長いものはゴムと呼ばれる（非特許文献２）。これらの化合物の合成を担っているのは、開始分子へのＣ５イソペンテニル二リン酸単位の連続付加を触媒する、プレニルトランスフェラーゼと呼ばれるファミリの酵素である（図１）。パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のゴムではＣ５単位がシス構成で付加されるため、これに関与するプレニルトランスフェラーゼ（ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）（単数または複数）をｃｉｓ−プレニルトランスフェラーゼまたはＺ−プレニルトランスフェラーゼと呼んでいる。
【０００３】
現在、生きている生物では全く異なる２通りのイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）合成経路があることが知られている（非特許文献３）。植物のプラスチドに限られる一方の経路では、グリセルアルデヒド３−リン酸およびピルビン酸がＩＰＰの前駆体である（非特許文献４）。第２の（細胞質の）経路では、アセテートが中間体であるメバロン酸を介してＩＰＰに変換される（非特許文献５）、（非特許文献６）。後者の経路であるアセテート／メバロン酸経路は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのゴム合成用ラテックスにおいて機能する唯一の経路であると考えられてきた。この経路では、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼという６種類の酵素の連続的な作用でアセテートがＩＰＰに変換される（図２）。
【０００４】
Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓにおいて上記経路の酵素をコードする最低６つの遺伝子のうち、クローンが得られているのはＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼの遺伝子のみである。ＨＭＧＲ１およびＨＭＧＲ２と呼ばれる酵素をコードする２つのｃＤＮＡが異種ハイブリダイゼーションプローブを使って単離されており、ゲノムサザンブロット解析によってＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓゲノムにＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼの少なくとも２つの遺伝子が確認された（非特許文献７）。Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスのライブラリではＨＭＧＲ１と相同なＥＳＴも同定された（非特許文献８）。パラゴムＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼの第３のアイソフォームをコードする遺伝子、すなわちＨＭＧＲ３と呼ばれる遺伝子についても報告がなされている（非特許文献９）。他の５つの遺伝子のうち、いくつかは他の植物種において同定されているものの、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのホモログは同定されておらず、その遺伝子は単離されていない。
【０００５】
ポリプレノールやゴムの合成に用いられる開始分子にはＩＰＰに由来するものやジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）などのアリル性テルペノイド二リン酸に由来するものもあるが、Ｃ１０化合物のゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、Ｃ１５化合物のファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）またはＣ２０化合物のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）（図１）を経て誘導される形の方が一般的である。ＤＭＡＰＰはＩＰＰイソメラーゼと呼ばれるイソメラーゼ酵素の作用でＩＰＰから生成される。この酵素をコードする遺伝子については、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓをはじめとする多くの種から単離されている（非特許文献１０）。アリル性二リン酸であるＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰは、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを使ってｔｒａｎｓ−プレニルトランスフェラーゼまたはＥ−プレニルトランスフェラーゼによって合成される。これらのアリル性テルペノイド二リン酸の合成酵素をコードする遺伝子については、植物を含む多数の生物から単離されている（非特許文献１１）、（非特許文献１２）。これらの遺伝子産物はいずれもイソプレン単位をトランス構成で縮合させるものである。
【０００６】
植物のポリイソプレノイドが持つ機能についてはいくつかの意見がある。光リン酸化および呼吸鎖リン酸化に最も強く関与しているのがテルペノイドキノンである。ゴムは草食動物に対する植物の自己防御と関連付けられており、おそらくは植物樹脂と似たような方法で昆虫を撃退したり捕獲したり、傷をふさいだりする機能を果たしている。Ｃ４５〜Ｃ１１５ポリプレノールの役割は依然として不明であるが、ほとんどの二次代謝産物の場合と同様にこれらのポリプレノールも植物の自己防御機能を担っている可能性が非常に高い。また、動物の代謝にドリコールが果たす役割から類推して、短鎖ポリプレノールが植物でのタンパク質のグリコシル化に関与しているのではないかとも思われる。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｙ．タナカ著、Ｒｕｂｂｅｒ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｐｒｅｎｏｌｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、デイ，ピー・エム（Ｄｅｙ，Ｐ．Ｍ．）およびハーボーン，ジェー・ビー（Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．）編、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９１年、第７巻、第５１９〜５３６ページ
【非特許文献２】
Ｙ．タナカ著、Ｍｉｎｏｒ  Ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、デイ，ピー・Ｍ（Ｄｅｙ，Ｐ．Ｍ．）およびハーボーン，Ｊ．Ｂ．（Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．）編、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９１年、第７巻、第５３７〜５４２ページ
【非特許文献３】
リヒテンターラー（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １０１：６４３〜６５２（１９９７）
【非特許文献４】
リヒテンターラー（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．４００：２７１〜２７４（１９９７）
【非特許文献５】
ニューマン，Ｊ．Ｄ．（Ｎｅｗｍａｎ，Ｊ．Ｄ．）、チャペル，ジェー（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．）、Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：  ｃａｒｂｏｎ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９年、３４（２）：９５〜１０６
【非特許文献６】
バッハ  ＴＪ（Ｂａｃｈ  ＴＪ）、ボロナ  エー（Ｂｏｒｏｎａｔ  Ａ）、カンポス  Ｎ（Ｃａｍｐｏｓ  Ｎ）、フェラー  Ａ（Ｆｅｒｒｅｒ  Ａ）、ボラック  ＫＵ（Ｖｏｌｌａｃｋ  ＫＵ）、Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９年、３４（２）：１０７〜２２
【非特許文献７】
チャイ（Ｃｈｙｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５６７〜５７７（１９９１）
【非特許文献８】
ハン（Ｈａｎ）ら、Ｔｒｅｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０：５０３〜５１０（２０００）
【非特許文献９】
チャイ（Ｃｈｙｅ）ら（１９９２）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：４７３〜４８４
【非特許文献１０】
オウ（Ｏｈ）ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５７：５４９〜５５７（２０００）。
【非特許文献１１】
マクガービー（ＭｃＧａｒｖｅｙ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１０１５〜１０２６（１９９５）
【非特許文献１２】
チャペル，Ｊ（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：５２１〜５４７（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
解決しようとする課題は、ポリ−ｃｉｓ−イソプレノイド（ゴム）の合成経路を提供することにある。本願出願人らは、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスにおけるアセテート／メバロン酸生合成経路の各ステップごとに未知の遺伝子（ＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼを除く）を発見することによって上記の課題を解決した。具体的には、本発明は、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼをコードするＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックス由来のＥＳＴ配列の同定とキャラクタリゼーションとに関するものである。推定上のアセチルｃｏ−Ａアセチルトランスフェラーゼのさらに短いバリアントについても同定されている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
（ａ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子と、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子と、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子と、からなる群から選択される、イソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードする単離された核酸分子を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、しかるべき制御配列に作動的に結合された本件核酸断片を含んでなるキメラ遺伝子ならびに、本願核酸断片およびキメラ遺伝子によってコードされるポリペプチドを提供するものである。
【００１１】
本発明はさらに、宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、藻類と、緑色植物と、からなる群から選択される、本件核酸配列を含んでなる形質転換宿主を提供するものである。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）単離された本願核酸配列のうちのいずれか１つの核酸分子をプローブとしてゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）本願核酸配列のうちのいずれか１つの核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片の配列を決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がイソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードする、イソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供するものである。
【００１３】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号１と、配列番号２と、配列番号４と、配列番号５と、配列番号６と、からなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、クローニングベクター中に存在するインサートを増幅することを含んでなり、
増幅されたインサートが、イソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、イソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供するものである。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、好適な成長条件下で形質転換宿主細胞を有効量の炭素基質に接触させることでイソペンテニル二リン酸経路の化合物を生成することを含んでなり、前記形質転換宿主細胞が、好適な制御配列の制御下に配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６をコードする一組の核酸分子を含んでなる、イソペンテニル二リン酸経路における化合物の生成方法を提供するものである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６からなる群から選択される少なくとも１つのイソペンテニル二リン酸遺伝子を、イソペンテニル二リン酸が生物において変化するように該生物にて過発現させることを含んでなる、生物におけるイソペンテニル二リン酸生合成の調節方法を提供するものである。このイソペンテニル二リン酸生合成の調節については、マルチコピープラスミドで遺伝子を発現させる、あるいは関連遺伝子を調節プロモーターまたは誘導プロモーターに作動的に結合させるなどの手段で達成してもよいし、アンチセンス発現または経路中の特定の遺伝子の選択的破壊によって達成してもよい。
【００１６】
また、本発明は、
（ｉ）ａ）天然イソペンテニル二リン酸遺伝子と、
ｂ）前記天然イソペンテニル二リン酸遺伝子にハイブリダイズする第１のヌクレオチド断片の集合と、
ｃ）前記天然イソペンテニル二リン酸遺伝子にハイブリダイズしない第２のヌクレオチド断片の集合と、を含んでなるヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化して制限断片の混合物を生成するステップと、
（ｉｉ）前記制限断片の混合物を変性させるステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の変性させた前記制限断片の混合物をポリメラーゼと共にインキュベートするステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返し、生物学的活性の変化したタンパク質をコードする変異イソペンテニル二リン酸遺伝子を生成するステップと、を含んでなる方法によって生成される、生物学的活性の変化したイソペンテニル二リン酸生合成酵素をコードする変異遺伝子を提供するものである。
【００１７】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
【００１８】
以下の配列の説明ならびに本願明細書に添付の配列表は、米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５に記載の特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に関する規則（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則（Ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。配列の説明では、本願明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１〜３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５〜３７３（１９８４）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って定義されるように、ヌクレオチド配列文字の表記については１文字コードを、アミノ酸については３文字コードを採用している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００１９】
配列番号１は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００６．ｏ５のヌクレオチド配列である
【００２０】
配列番号２は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ０１５．ｂ７のヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号３は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００２．ｄ１９のヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号４は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたメバロン酸キナーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００９．ｄ２のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号５は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたホスホメバロン酸キナーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００５．ｉ１３のヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号６は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ１ｃ．ｐｋ００１．ｂ９のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号７は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素の短い相同体をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００３．ｉ２２のヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号８は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００６．ｏ５の推定アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号９は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ０１５．ｂ７の推定アミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１０は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００２．ｄ１９の推定アミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１１は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたメバロン酸キナーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００９．ｄ２の推定アミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１２は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたホスホメバロン酸キナーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００５．ｉ１３の推定アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１３は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００１．ｂ９の推定アミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１４は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスから作製したｃＤＮＡライブラリから単離されたアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素の短い相同体をコードするＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００３．ｉ２２の推定アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１５はＫａｎ−２フォワードプライマーである。
【００３４】
配列番号１６はＫａｎ−２リバースプライマーである。
【００３５】
本発明は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのラテックスでのイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）合成におけるすべての酵素をコードする配列を提供するものである。具体的には、本発明は、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼをコードするＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックス由来のＥＳＴ配列の同定とキャラクタリゼーションとに関するものである。推定上のアセチルｃｏ−Ａアセチルトランスフェラーゼのさらに短いバリアントについても同定されている。
【００３６】
ＩＰＰを生成することのできる組換え生物または未形質転換生物とはＩＰＰのレベルが異なる組換え生物を作出するため、また、イソペンテニル二リン酸を協調して生成することができる、あるいは組換え生物のＩＰＰ生成レベルを個々に変えることのできるアセテート／メバロン酸経路の新たな相同遺伝子を同定するためには、遺伝子およびその発現産物が有用である。ＩＰＰの重要性は、生きている生物でイソプレノイドの生合成に対して果たす重要な役割にある。これらの化合物は、細胞構造、電子伝達、タンパク質の修飾、細胞内信号伝達に不可欠な役割を果たし、さらには多くの場合において生物間の相互作用を媒介している。また、イソプレノイドは、生きている生物によって作り出されることが分かっている最も大きな構造のファミリを含んでなり、そのクラスには、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、ステロール、カロテノイド、ユビキノン、ポリプレノール、ドリコールおよびゴムが含まれる。これらの化合物の多くが商業上重要なものである（すなわち、植物ラテックスから抽出した植物エッセンシャルオイルやゴム中のモノテルペノイドのフレーバー化合物および香気性化合物）。よって、イソプレノイド（ならびに、結果としてＩＰＰ）生成のバイオエンジニアリングには十分に商業的な価値があり得るのである。
【００３７】
当業者間で周知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用してヌクレオチド配列およびタンパク質配列の収録された公共データベースと比較することで、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのラテックスに由来する７種類のＥＳＴの全長配列を取得し、同定した。関連のＥＳＴは、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓおよび他の生物でＩＰＰの合成につながるアセテート／メバロン酸経路の酵素各々の完全長のオープンリーディングフレームをコードするものである。
【００３８】
本願の開示では、学術用語および略語をいくつか用いる。これについては、以下のように定義する。
【００３９】
「アセチル−ｃｏＡ」はアセチルコエンザイムＡの略語である。
【００４０】
「ＨＭＧ−ｃｏＡ」はヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの略語である。
【００４１】
「ＭＶＡ」はメバロン酸（３，５−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸としても知られる）の略語である。
【００４２】
「５−ホスホメバロン酸」は５−リン酸，３，５−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸の略語である。
【００４３】
「５−ピロホスホメバロン酸」は５−ピロリン酸，３，５−ジヒドロキシ−３−メチル吉草酸の略語である。
【００４４】
「ＩＰＰ」はイソペンテニル二リン酸（３−メチル，３−ブテン−１−オールピロリン酸）の略語である。
【００４５】
「ＤＭＡＰＰ」はジメチルアリル二リン酸の略語である。
【００４６】
「ＧＰＰ」はゲラニル二リン酸の略語である。
【００４７】
「ＦＰＰ」はファルネシル二リン酸の略語である。
【００４８】
「ＧＧＰＰ」はゲラニルゲラニル二リン酸の略語である。
【００４９】
「ＥＳＴ」は発現配列タグの略語である。
【００５０】
「ＯＲＦ」はオープンリーディングフレームの略語である。
【００５１】
「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応の略語である。
【００５２】
本願明細書において使用する場合、「イソペンテニル二リン酸酵素」、「イソペンテニル二リン酸生合成酵素」または「イソペンテニル二リン酸経路の酵素」とは、イソペンテニル二リン酸を生成する必要のあるアセテート／メバロン酸経路中の酵素を示す。「イソペンテニル二リン酸遺伝子」、「イソペンテニル二リン酸生合成遺伝子」または「イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子」という用語は、イソペンテニル二リン酸生合成の酵素に対応する遺伝子を示す。「炭素基質」または「炭素源」という用語は、微生物が代謝できるあらゆる炭素源を意味する。この場合の基質は少なくとも１つの炭素原子を含み、特に、単糖類、少糖類、多糖類、一炭素基質（ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）またはこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を含む。
【００５３】
本願明細書において使用する場合、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであってもよい。
【００５４】
温度と溶液のイオン強度の適した条件下で一本鎖の核酸分子を他の核酸分子にアニールできる場合に、この核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」であるという。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、その一例が、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、コールドスプリングハーバー（１９８９）の特に第１１章と表１１．１に記載されている（その内容全体を本願明細書に援用し、以下、「資料」とする）。温度およびイオン強度の条件次第でハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。
【００５５】
一般に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０から８．３、Ｎａイオンでの塩濃度約１．５Ｍ未満、一般にはＮａイオン（または他の塩）での濃度約０．０１から１．０Ｍであって、短いプローブ（１０から５０ヌクレオチド長など）の場合は温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（５０ヌクレオチド長を超えるものなど）の場合であれば少なくとも約６０℃の条件のことである。あるいは、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えてストリンジェントな条件を得ることもできる。ストリンジェンシーの低い条件の一例としては、６×ＳＳＣ（１Ｍ  ＮａＣｌ）緩衝液、３０から３５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で３７℃、さらに１×から２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中にて５０から５５℃で洗浄して行うハイブリダイゼーションがあげられる。ストリンジェンシーが中程度の条件の一例としては、６×ＳＳＣ（１Ｍ  ＮａＣｌ）、４０から４５％ホルムアミド、１％ＳＤＳで３７℃、さらに０．５×から１×ＳＳＣ中にて５５から６０℃で洗浄して行うハイブリダイゼーションがあげられる。ストリンジェンシーの高い条件の一例としては、６×ＳＳＣ（１Ｍ  ＮａＣｌ）、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳで３７℃、さらに０．１×ＳＳＣ中にて６０から６５℃で洗浄して行うハイブリダイゼーションがあげられる。あるいは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、さらに２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄に続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄してストリンジェントな条件を得ることもできる。
【００５６】
一般に、特異性はハイブリダイゼーション後の洗浄の関数になるが、ここで重要な要因に最終的な洗浄溶液の温度とイオン強度がある。プローブ−標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を計算で求め、正しいストリンジェンシー条件を判定するための開始点を得ることが可能である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８：２６７〜２８４（１９８４）に記載の式すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ（式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％Ｇ＋ＣはＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドの割合、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである）からＴｍを近似することができる。Ｔｍは、（定義されたイオン強度およびｐＨ下で）相補標的配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズされる温度である。ミスマッチ１％ごとにＴｍが約１℃ずつ低くなる。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション洗浄および／または洗浄条件を調節し、所望の同一性を持つ配列にハイブリダイズさせることが可能である。たとえば、同一性が９０％以上の配列を探査するのであれば、Ｔｍを１０℃下げればよい。通常、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその相補体の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、極めてストリンジェントな条件では熱融点（Ｔｍ）よりも１、２、３または４℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を行い、中程度にストリンジェントな条件では熱融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９または１０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を行い、ストリンジェンシーが低い条件では熱融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を行うことが可能である。なお、上記の式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、所望のＴｍを利用すれば、これに付随してハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが決まることは当業者であれば理解できよう。所望のミスマッチ度でＴｍが４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアミド溶液）になってしまう場合、温度を上げることができるようにＳＳＣ濃度を高めると好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する幅広いガイドが、Ｔｉｊｓｓｅｎ著、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、パートＩ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、エルゼビア、ニューヨーク（１９９３）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕ���ｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９９５）に記載されている。
【００５７】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の「一部」は、当業者による手作業での配列評価あるいは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３）、また、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）などのアルゴリズムを使用したコンピュータでの自動配列比較および同定のいずれかによって、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定できるだけの、そのポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる。通常、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であるものとして推定的に同定するには、１０以上の連続したアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関していえば、配列依存性の遺伝子同定方法（サザンハイブリダイゼーションなど）および単離（細菌コロニーまたはバクテリオファージのプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）に、２０〜３０の連続したヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを利用することができる。また、プライマーを含んでなる特定の核酸断片を得ることを目的として、塩基数１２〜１５の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増幅プライマーとして利用しても構わない。したがって、ヌクレオチド配列の「一部」は、その配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるだけの配列を含んでなる。本願明細書では、１以上の特定の真菌タンパク質をコードする部分的または完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を教示している。これによって、本願明細書に提示の配列から利益を得られる当業者であれば、ここに開示の配列の全部または大部分を当業者にとって周知の目的で利用することができるであろう。したがって、本発明は、添付の配列表に記載の完全配列のみならず、上記にて定義したこれらの配列の大部分を含んでなる。
【００５８】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を示す際に使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、添付の配列表に記載の完全配列に対して相補的である単離された核酸断片のみならず、実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００５９】
「同一率」という用語は、従来技術において周知のように、配列同士を比較することで求められる２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。従来技術において、「同一性」とは、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のストリング間のマッチによって求められる、このような配列間の配列の関連度を意味することもある。「同一性」および「類似性」については、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（レスク，エー・エム（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編）、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミス，ディ・ダブリュ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ（グリフィン，エー・エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，エイチ・ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）、アカデミックプレス（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９１）に記載されているものなどを含むがこれに限定されるものではない周知の方法で容易に算出することが可能である。試験配列間のベストマッチを得るべくして、同一性を求める好ましい方法が設計されている。また、同一性および類似性を求める方法が、一般利用可能なコンピュータプログラムの形で体系的にまとめられたものもある。配列のアライメントおよび同一率の計算については、ベクターＮＴＩバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージのＡＬＩＧＮＸプログラム（メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使用して行えばよい。さらに、Ｃｌｕｓｔａｌ法をデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＯＰＥＮＩＮＧ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．０５、ＧＡＰ  ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＰＥＮＡＬＴＹ  ＲＡＮＧＥ＝８）で使ったアライメントによって配列のマルチプルアライメントを行った例もある（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）。Ｃｌｕｓｔａｌ  法を使う場合のペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータに関しては、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００６０】
好適な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であり、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸断片である。好適な核酸断片は、上記の相同性を持つだけでなく、一般には少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、一層好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードするものである。
【００６１】
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に役立つあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列解析ソフトウェア」は市販のものであってもよいし、独自開発のものであってもよい。一般的な配列解析ソフトウェアとしては、ＧＣＧパッケージのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）、ベクターＮＴＩバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージ（メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））、スミス・ウォーターマンアルゴリズムを取り入れたＦＡＳＴＡプログラム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１〜２０、編集者（ら）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、出版社：ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））があげられるが、これに限定されるものではない。本願の内容に関してだけ言えば、配列解析ソフトウェアを解析に利用する場合、特に明記しない限り、その解析結果は引用したプログラムの「デフォルト値」でのものとなる点は理解できよう。本願明細書において使用する「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化したときに最初からロードされるあらゆる値またはパラメータの組を意味するものとする。
【００６２】
「コドンの縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなくヌクレオチド配列が変わる遺伝暗号の相違を示す。したがって、本発明は、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４に記載のＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓアセテート／メバロン酸経路の酵素をコードしているアミノ酸配列の全体または大部分をコードする核酸断片に関する。
【００６３】
当業者であれば、特定のアミノ酸を表すヌクレオチドコドンを使用する宿主細胞の「コドンバイアス」について十分に理解していよう。したがって、宿主細胞での発現を改善した遺伝子を合成する際は、遺伝子のコドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計すると望ましい。
【００６４】
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手順で化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックからアセンブルすることが可能なものである。こうしたビルディングブロックを結合およびアニール処理して遺伝子セグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関する「化学的に合成された」とは、コンポーネントであるヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を使ってＤＮＡの化学合成を手作業で行ってもよいし、多様な市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学合成を行うことも可能である。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映させるために、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえて最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせることができる。当業者であれば、使用されるコドンが宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
【００６５】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなるあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて正常な位置にある天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「トランスジーン」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子のことである。
【００６６】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列があげられる。
【００６７】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んでなるものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００６８】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示し、ポリアデニル化認識配列ならびにｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響をおよぼすことのできる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響することが特徴である。
【００６９】
「ＲＮＡ転写物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列など、特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。
【００７０】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を示す。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響をおよぼすことができる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されていると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【００７１】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【００７２】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後プロセシングを受けたポリペプチドすなわち、一次翻訳産物中に存在するプレペプチドまたはプロペプチドがすべて除去されたポリペプチドを示す。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡ翻訳の一次産物すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドが残ったままの一次産物を示す。プレペプチドおよびプロペプチドとしては細胞内局在シグナルがあり得るが、これに限定されるものではない。
【００７３】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００７４】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００７５】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）（以下、「資料」）およびＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリーコールド出版局スプリングハーバー、ＮＹ（１９８４）ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）によって説明されているように、本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知のものである。
【００７６】
本発明は、アセテートからのＩＰＰ合成用の酵素をコードする新規な配列を提供するものである。これらの配列はＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓから単離されたｃＤＮＡ内に５つのオープンリーディングフレームを含んでなるものであり、いずれもＩＰＰの合成に役立つことが分かっている同定可能な酵素をコードする。本願遺伝子は、従来技術において周知のアルゴリズムを利用して、核酸配列および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較した結果に基づいて同定されたものである。具体的に言うと、ＥＳＴが、アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素（配列番号１、配列番号７）、ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素（配列番号２）、ＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ酵素（配列番号３）、メバロン酸キナーゼ酵素（配列番号４）、ホスホメバロン酸キナーゼ酵素（配列番号５）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素（配列番号６）をコードしている。
【００７７】
アセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ酵素のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷによるアライメントアルゴリズム（ベクターＮＴＩパッケージ−メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使った場合、類似度の最も高い既知の配列は本願明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号８）と４１１アミノ酸長にわたって約６５％同一であることが明らかになる。なお一層好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＥＳＴに対応する好ましいアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ核酸断片である。
【００７８】
ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷによるアライメントアルゴリズム（ベクターＮＴＩパッケージ−ネリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使った場合、類似度の最も高い既知の配列は本願明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号９）と４６４アミノ酸長にわたって約８２％同一であることが明らかになる。なお一層好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、好ましいのは、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一である、本件ＥＳＴに対応するＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素コード核酸配列である。なお一層好ましいＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素の核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ酵素の核酸断片である。
【００７９】
メバロン酸キナーゼ酵素のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷによるアライメントアルゴリズム（ベクターＮＴＩパッケージ−メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使った場合、類似度の最も高い既知の配列は本願明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号１１）と３８６アミノ酸長にわたって約６８％同一であることが明らかになる。なお一層好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、好ましいのは、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一である、本件ＥＳＴに対応するメバロン酸キナーゼ酵素コード核酸配列である。なお一層好ましいのは、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のメバロン酸キナーゼ酵素の核酸断片である。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のメバロン酸キナーゼ酵素の核酸断片である。
【００８０】
ホスホメバロン酸キナーゼ酵素のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷによるアライメントアルゴリズム（ベクターＮＴＩパッケージ−メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使った場合、類似度の最も高い既知の配列は本願明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号１２）と５０３アミノ酸長にわたって約７３％同一であることが明らかになる。なお一層好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、好ましいのは、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一である、本件ＥＳＴに対応するホスホメバロン酸キナーゼ酵素コード核酸配列である。なお一層好ましいのは、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のホスホメバロン酸キナーゼ酵素の核酸断片である。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のホスホメバロン酸キナーゼ酵素の核酸断片である。
【００８１】
メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、ＣＬＵＳＴＡＬＷによるアライメントアルゴリズム（ベクターＮＴＩパッケージ−メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））を使った場合、類似度の最も高い既知の配列は本願明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号１３）と４１５アミノ酸長にわたって約７７％同一であることが明らかになる。なお一層好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、好ましいのは、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一である、本件ＥＳＴに対応するメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素コード核酸配列である。なお一層好ましいのは、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素の核酸断片である。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ酵素の核酸断片である。
【００８２】
相同体の単離
本発明の核酸断片を利用して、相同的な酵素をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を同一の種または他の種から単離することができる。配列依存性のプロトコールを使って相同遺伝子を単離する方法については従来技術において周知である。この配列依存性のプロトコールの一例としては、核酸ハイブリダイゼーション法ならびに、核酸増幅技術のさまざまな用途（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応など）で例示されているようなＤＮＡ増幅法およびＲＮＡ増幅法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
たとえば、本件核酸断片の全体または一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして利用し、当業者間で周知の方法で所望の細菌からのライブラリをスクリーニングすることで、本件アセテート／メバロン酸経路の酵素に類似した酵素をコードする遺伝子を、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかの形で直接単離することができる。また、従来技術において周知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）で、本件核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計および合成することが可能である。さらに、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーション、あるいは末端標識法、利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を用いたＲＮＡプローブなどの当業者間で周知の方法で、配列全体を直接利用してＤＮＡプローブを合成することもできる。また、特定のプライマーを設計し、これを利用して本件配列の部分長または全長を増幅することが可能である。このようにして得られる増幅産物については、増幅反応時に直接的な標識をしてもよいし増幅反応後に標識してもよく、これをプローブとして利用して適切なストリンジェンシーの条件下で全長ｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離することができる。
【００８４】
ＰＣＲを用いる場合、本件配列番号１、２、４、５、６の短いセグメント２つをポリメラーゼ連鎖反応のプロトコールに利用し、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長めの核酸断片を増幅するようにしてもよい。あるいは、一方のプライマーの配列を本件核酸断片由来のものとし、他方のプライマーの配列でｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域を利用して、クローニングした核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を行うようにしても構わない。あるいは、第２のプライマー配列をクローニングベクター由来の配列に基づくものとしてもよい。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物中の一点と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。本件配列から、３’方向のプライマーと５’方向のプライマーとを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を利用すれば、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）、Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【００８５】
ＰＣＲタイプの増幅法では、プライマーの配列がそれぞれ違っていて互いに相補ではないのが普通である。所望の試験条件次第では、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を得られるようにプライマーの配列を設計しなければならない。ＰＣＲプライマー設計の方法は一般的なものであり、従来技術において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ケー・イー・デービス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）第３３〜５０ページ、バージニア州ヘーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、リクリーク，ダブリュ（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３）、ホワイト，ビー・エー（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第３１〜３９ページ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。ニュージャージー州トトワ、Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００８６】
あるいは、本件配列を相同体同定用のハイブリダイゼーション試薬として利用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本となる構成要素としては、プローブ、該当する遺伝子または遺伝子断片を含むのではないかと思われる試料、特異的ハイブリダイゼーション法があげられる。本発明のプローブの典型は、検出対象となる核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出対象となる核酸配列に「ハイブリダイズ可能」なものである。プローブ長については、５塩基から数万塩基まで可変であり、その長さは実施する具体的な試験に応じて決まる。検出対象となる核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。また、プローブと標的配列との間の相補性も完全である必要はない。ハイブリダイズされた領域中の塩基の一部の中には正しい相補的塩基とペアにならないものが生じるが、不完全に相補的な分子間であってもハイブリダイゼーションは起こるのである。
【００８７】
ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。一般に、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと試料とを混合しておかなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下にて、無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料とを接触させる必要がある。このとき、プローブと試料の核酸との間で生じ得るハイブリダイゼーションを起こすことができる程度に十分な時間、プローブと試料の核酸とを接触させておかなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるまでの時間は、混合物中におけるプローブまたは標的の濃度によって決まる。プローブまたは標的の濃度が高ければ高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短くなる。任意にカオトロピック剤を加えてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することで核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤を用いると、短いオリゴヌクレオチドプローブを使って感受性が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを室温にて行うことができるようになる（Ｖａｎ  ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１（１９９１））。好適なカオトロピック剤としては、特に、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウムがあげられる。このカオトロピック剤については、一般に最終濃度を約３Ｍとして含有させる。必要があれば、ハイブリダイゼーション混合物に、一般には３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを加えることもできる。
【００８８】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を用いることが可能である。これらの溶液は一般に、約２０から６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒を含んでなる。通常のハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの約０．０５から０．１Ｍの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５から０．２％の洗浄剤あるいは、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシア社）（約３００〜５００キロダルトン）と、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）および血清アルブミンとが用いられている。また、一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸と、ウシ胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡなどの断片化した核ＤＮＡ、あるいは酵母ＲＮＡなどが含まれ、任意に約０．５から２％ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンも含まれる。また、ポリエチレングリコールなどのさまざまな極性・水溶性または膨潤性の薬剤を含む体積排除剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオンポリマー、デキストラン硫酸などのアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）といった他の添加剤を含有させてもよい。
【００８９】
核酸ハイブリダイゼーションは、さまざまなアッセイフォーマットに合わせることのできるものである。最も適したもののひとつにサンドイッチアッセイフォーマットがある。サンドイッチアッセイは特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合する。サンドイッチタイプのアッセイの主要なコンポーネントのひとつに固体支持体がある。固体支持体は、これに吸着した形またはこれに共有結合した形で、未標識かつ配列の一部に対して相補的な固定化核酸プローブを有する。
【００９０】
植物での発現
また、本発明の核酸断片を使用して、本願イソペンテニル二リン酸経路の酵素が正常値よりも高いレベルまたは低いレベルで存在するトランスジェニック植物を作出することができる。あるいは、用途によっては、特定の植物組織および／または細胞型で、あるいは、通常であれば起こり得ない発達段階において本願イソペンテニル二リン酸経路の酵素を発現させると望ましいこともあろう。細菌（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒａｌｉｓなど）または植物で、植物のイソペンテニル二リン酸経路の全長ｃＤＮＡ（すなわち適切なインフレームのＡＴＧ開始コドンを取り込んだ本願配列または関連配列のいずれか）を発現させると、イソペンテニル二リン酸生合成に関与できる成熟タンパク質を得ることができる。
【００９１】
本願イソペンテニル二リン酸経路の配列を発現するトランスジェニック植物では、さまざまな病原体および自然界の捕食者に対する防御機構が変化するか調節されるであろうと予想される。たとえば、さまざまなラテックスタンパク質が抗原性を持つことが分かっており、これらのタンパク質がＩｇＥ抗体によって認識されることから、これらのタンパク質には免疫防御における何らかの役割があるのではないかと考えられる（ヤガミ（Ｙａｇａｍｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９９８年３月）、第１０１巻、Ｎｏ．３、第３７９〜３８５ページ。さらに、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓから単離されたラテックスの重要な部分にはキチナーゼ／リゾチームが含まれているため、真菌細胞壁のキチン成分や細菌細胞壁のペプチドグリカン成分を分解できることが分かっている（マーティン，エム・エヌ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｎ．）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（ベセスダ）、９５（２）：４６９〜４７６（１９９１））。したがって、本発明の一目的は、さまざまな病原体や草食動物に対する防御機能を変化させた、調節した、あるいは高めたトランスジェニック植物を提供することにある。
【００９２】
本願配列の発現に適した植物種としては、ゴムの木（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｐ．）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓｐｐ．）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓｐｐ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｓｐｐ．）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓｐｐ．）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、他のマメ種（Ｖｉｇｎａ  ｓｐｐ．）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  ｓａｔｉｖａ）があげられる（が、これに限定されるものではない）。
【００９３】
まず最初に、所望の発達段階で所望の組織での遺伝子の発現を指示できるプロモーターにコード領域が作動的に結合されたキメラ遺伝子を構築することで、本願イソペンテニル二リン酸経路の相同体を過発現させることができる。便宜上の理由から、同一遺伝子に由来するプロモーター配列と翻訳リーダー配列とをキメラ遺伝子に含んでなるようにしてもよい。また、転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も提供しなければならない。本願キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にするための１以上のイントロンを含んでなるものであってもよい。
【００９４】
このようにすれば、本願キメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを作製することができる。プラスミドベクターに何を用いるかは、宿主植物の形質転換に使う方法次第である。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞の形質転換、選択、増殖を成功させるには、プラスミドベクター上にどの遺伝因子を存在させなければならないかを十分に知っている。たとえば、植物の発現ベクターには、（１）５’制御配列および３’制御配列による転写制御下での植物のクローン化遺伝子と、（２）優性選択マーカーとを含み得る。このような植物の発現ベクターは、必要に応じて、プロモーター調節領域（誘導型または構成的、環境調節性または発達調節性、あるいは細胞特異的または組織特異的／選択的発現を生み出す領域）、転写開始開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位および／またはポリアデニル化シグナルを含むものであってもよい。
【００９５】
再生植物のすべての組織におけるイソペンテニル二リン酸経路の遺伝子の発現を指示する植物のプロモーター断片を用いることが可能である。このようなプロモーターを本願明細書では「構成的」プロモーターと呼ぶ。これらのプロモーターは、ほとんどの環境条件や発生または細胞分化の状態でアクティブである。構成的プロモーターの一例としては、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’−または２’−プロモーター、ユビキチン１プロモーター、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、Ｎｏｓプロモーター、ｐＥｍｕプロモーター、ルビスコプロモーター、ＧＲＰ１−８プロモーターがあげられる。
【００９６】
あるいは、植物プロモーターによって特定組織におけるイソペンテニル二リン酸経路の遺伝子の発現を指示してもよいし、それ以外の場合であれば、環境または発生をさらに厳密に制御しても構わない。このようなプロモーターを本願明細書では「誘導」プロモーターと呼ぶ。誘導プロモーターによる転写に影響し得る環境条件としては、病原体の攻撃、嫌気条件または光の存在があげられる。誘導プロモーターの一例に、低酸素または寒冷ストレスによって誘導可能なＡｄｈ１プロモーター、熱ストレスによって誘導可能なＨｓｐ７０プロモーター、光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモーターがある。
【００９７】
発生制御下にあるプロモーターの一例としては、葉、根、果実、種子または花などの特定の組織においてのみ、またはこれらで優先的に転写を開始するプロモーターがあげられる。代表的なプロモーターとしては、葯特異的プロモーター５１２６（米国特許第５，６８９，０４９号および同第５，６８９，０５１号）、ｇｌｏｂ−１プロモーター、γ−ゼインプロモーターがあげられる。プロモーターの動作については、そのプロモーターがゲノムのどこに位置しているかによって変わることがある。よって、誘導プロモーターであっても特定の位置で完全または部分的に構成的なものとなる場合がある。
【００９８】
イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子の発現を指示するには、異種性プロモーターおよび非異種性（すなわち内在性）のプロモーターのどちらでも使うことができる。また、これらのプロモーターをたとえば組換え発現カセットに利用してアンチセンス核酸の発現を駆動し、所望の組織におけるイソペンテニル二リン酸経路のタンパク質の濃度および／または組成を低減、増大または変化させることも可能である。したがって、実施形態によっては、核酸コンストラクトは、イソペンテニル二リン酸経路生合成遺伝子に作動的に結合された、Ｚｅａ  ｍａｙｓまたはタバコなどの植物細胞で機能するプロモーターを含んでなる。これらの実施形態において有用な遺伝子プロモーターには、イソペンテニル二リン酸経路のタンパク質の発現を駆動する内在性プロモーターがある。
【００９９】
いくつかの実施形態では、イソペンテニル二リン酸経路のポリヌクレオチドの発現を上方制御または下方制御すべく、プロモーター因子またはエンハンサー因子として機能する単離された核酸を、イソペンテニル二リン酸経路のポリヌクレオチドの非異種形態の適当な位置（通常は上流）に導入することができる。たとえば、遺伝子の発現を制御するために、変異、欠失および／または置換によって内在性プロモーターをｉｎ  ｖｉｖｏにて変化させたり（Ｋｍｉｅｃによる米国特許第５，５６５，３５０号、Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号を参照のこと）、単離したプロモーターを、適切な配向でイソペンテニル二リン酸経路の遺伝子から適切な距離をあけて植物細胞に導入したりすることができる。植物細胞中におけるイソペンテニル二リン酸経路のタンパク質の総濃度を変えるおよび／または組成を変えるには、イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子の発現を植物の成長に適した条件下で調節すればよい。したがって、本発明は、天然の内在性（すなわち非異種）形態のイソペンテニル二リン酸経路のタンパク質に作動的に結合された、異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを作製するための組成および方法を提供するものである。
【０１００】
イソペンテニル二リン酸経路のポリペプチドの発現が望まれる場合は、イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子のポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域が含まれていることが望ましいのが普通である。このポリアデニル化領域は、自然界の遺伝子から、さまざまな他の植物遺伝子から、あるいはＴ−ＤＮＡから誘導可能なものである。付加対象となる３’末端配列については、たとえば、ノパリンシンターゼ遺伝子またはオクトピンシンターゼ遺伝子から、あるいは別の植物遺伝子から、さらにはそれほど好ましくはないが他のあらゆる真核生物遺伝子から誘導することが可能である。
【０１０１】
部分コード配列の５’未翻訳領域またはコード配列にイントロン配列を付加すれば、サイトソルに蓄積される成熟メッセージ（ｍａｔｕｒｅ  ｍｅｓｓａｇｅ）の量を増やすことができる。植物と動物のどちらの発現コンストラクトでも転写単位に接合可能なイントロンを持たせることでｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルのいずれでも遺伝子発現量が最大１０００倍まで増すことが分かっている。バックマン（Ｂｕｃｈｍａｎ）およびブレッグ（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４３９５〜４４０５（１９８８）、Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：１１８３〜１２００（１９８７）。このようなイントロンによる遺伝子発現の増大は一般に転写単位の５’末端付近におかれた場合に最大になる。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンを使用することが従来技術において周知である。概要については、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１６章、フリーリング（Ｆｒｅｅｌｉｎｇ）およびＷａｌｂｏｔ編、シュプリンガー、ニューヨーク（１９９４）。イソペンテニル二リン酸経路の配列を含んでなるベクターは、植物細胞に選択可能な表現型を持たせるマーカー遺伝子を含んでなることになるのが普通である。高等植物での遺伝子発現に役立つ典型的なベクターは従来技術において周知であり、ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：２５３〜２７７（１９８７）による説明のあるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド由来のベクターがあげられる。
【０１０２】
任意に、イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子を植物に導入してもよい。通常、まず最初に従来技術において周知のさまざまな方法によって遺伝子を組換え発現カセットまたはベクターに取り込む。たとえば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１〜４７７（１９８８）を参照のこと。たとえば、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、穿孔（ｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃、シリコンファイバデリバリー、あるいは植物細胞プロトプラストまたは胚形成カルスのマイクロインジェクションなどの手法を利用して、ＤＮＡコンストラクトを植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入すればよい。たとえば、Ｔｏｍｅｓら、Ｄｉｒｅｃｔ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ、第１９７〜２１３ページ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｏ．Ｌ．Ｇａｍｂｏｒｇおよびジー・シー・フィリップス（Ｇ．Ｃ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、シュプリンガーフェアラーク、ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク（１９９５）。Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．３：２７１７〜２７２２（１９８４）にはＰＥＧ沈殿を利用したＤＮＡコンストラクトの導入について記載されている。エレクトロポレーション法については、Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：５８２４（１９８５）に記載がある。微粒子銃による形質転換法については、クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０〜７３（１９８７）に記載がある。たとえば、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの微粒子による銃形質転換が米国特許第５，５８０，７６８号に記載されている。
【０１０３】
あるいは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換法を利用してもよい。たとえば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６〜４９８（１９８４）、Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：４８０３（１９８３）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第８章、クラーク（Ｃｌａｒｋ）編、シュプリンガーフェアラーク、ベルリン（１９９７）を参照のこと。ＤＮＡコンストラクトを好適なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合わせ、従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの宿主ベクターに導入してもよい。細胞が細菌に感染すると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの宿主の病原機能によってコンストラクトならびに隣接するマーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入が指示される（米国特許第５，５９１，６１６号）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは主に双子葉植物において有用なものであるが、単子葉植物によってはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換することが可能である。たとえば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍでのトウモロコシの形質転換が米国特許第５，５５０，３１８号に記載されている。
【０１０４】
他の形質移入法または形質転換法としては、（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓによる形質転換（リヒテンシュタイン（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ）およびフラー（Ｆｕｌｌｅｒ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第６巻、ＰＷＪ  Ｒｉｇｂｙ編、ロンドン、アカデミックプレス（１９８７）、リヒテンシュタイン，シー・ピー（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｐ．およびドレーパー，ジェー（Ｄｒａｐｅｒ，Ｊ．）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩＩ巻、ディ・エム・グラバー（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）編、オックスフォード、ＩＲＩ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５））、出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２５１２（ＷＯ８８／０２４０５号、１９８８年４月７日公開）には、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ系統Ａ４とそのＲｉプラスミドをＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベクターｐＡＲＣ８またはｐＡＲＣ１６と併用することが記載されている）、（２）リポソームによるＤＮＡ取り込み（フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５：１３５３（１９８４））、（３）ボルテックス法（Ｋｉｎｄｌｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８７：１２２８（１９９０）など）があげられる。
【０１０５】
核酸導入法によって直接得られる植物細胞あるいは、この方法によって誘導される植物細胞を培養し、導入された遺伝子型を持つ植物全体を再生することができる。このような再生方法は、組織培養成長培地中で特定の植物ホルモンを操作することに頼っているものが多い。植物の細胞は、標準的な植物組織培養法を使ってたとえば単細胞やカルス組織、あるいは茎盤からの再生が可能である。ほぼすべての植物から得られるさまざまな細胞、組織および器官をうまく培養し、植物全体を再生できることは従来技術において周知である。培養プロトプラストからの植物の再生については、エバンズ（Ｅｖａｎｓ）ら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、マクミラン出版、ニューヨーク、第１２４〜１７６ページ（１９８３）およびＢｉｎｄｉｎｇ，  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、第２１〜７３ページ（１９８５）に記載されている。
【０１０６】
単一植物プロトプラストまたはさまざまな外植体からの植物の再生が従来技術において周知である。たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、エー・ヴァイスバッハ（Ａ．Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびエイチ・ヴァイスバッハ（Ｈ．  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）編、アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ（１９８８）を参照のこと。この再生および成長の過程には、形質転換体の細胞とシュートを選択し、形質転換体のシュートならびに苗の成長した部分を土壌中に活着させるステップが含まれる。トウモロコシの細胞培養および再生の概要については、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、フリーリング（Ｆｒｅｅｌｉｎｇ）およびＷａｌｂｏｔ編、シュプリンガー、ニューヨーク（１９９４）、Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、第３版、スプレーグ（Ｓｐｒａｇｕｅ）およびダッドリー（Ｄｕｄｌｅｙ）編、アメリカ農学会、ウィスコンシン州マディソン（１９８８）を参照のこと。トウモロコシの形質転換および再生については、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２：６０３〜６１８（１９９０）を参照のこと。
【０１０７】
イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子を含む植物の再生と葉の外植体から得られるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる導入を、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１２２９〜１２３１（１９８５）に記載されているようにして行うことができる。この手順では、フレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８０：４８０３（１９８３）に記載されているようにして、選択因子の存在下にて、形質転換対象となる植物種でシュートの再生を誘導する培地中で、形質転換体を成長させる。この手順では一般に、２から４週間以内でシュートが形成される。続いて、この形質転換シュートを細菌の増殖を防ぐための抗生物質と選択因子とを含有する適当な根誘導培地に移す。本発明のトランスジェニック植物は稔性であっても不稔性であってもよい。
【０１０８】
組換え発現カセットをトランスジェニック植物に安定的に取り込み、機能していることを確認した後、これを受粉交配させることによって他の植物に導入できることは、当業者であれば理解できよう。交雑対象となる種に応じて、多数ある標準的な育種方法のうちのどれを使用してもよい。栄養繁殖性植物では、茎端を取るか、あるいは組織培養法によって、成熟したトランスジェニック植物を繁殖させ、全く同じ植物体を複数得ることができる。望ましいトランスジェニックを選択し、商業用途を目的として新たな品種を得て栄養繁殖させる。種子繁殖性植物では、成熟したトランスジェニック植物を自然交配させて同型接合性の自殖植物を得ることが可能である。自殖植物は、新たに導入された異種性の核酸を含む種子を作り出す。これらの種子を播種育苗し、選択された表現型が得られるであろう植物を作出することができる。花、種子、葉、枝、果実などの再生植物から得られる構成要素も、これらの構成要素が本発明の単離された核酸を含んでなる細胞を持つ限りにおいて本発明に含まれる。再生植物の後代およびバリアントならびに変異体についても、これらの構成要素が誘導された核酸配列を含んでなる限りにおいて本発明の範囲に包含される。
【０１０９】
たとえば標準的なイムノブロットおよびＤＮＡ検出の手法を利用して、イソペンテニル二リン酸経路の遺伝子を発現するトランスジェニック植物を本発明の核酸の伝達についてスクリーニングすることが可能である。最初にＲＮＡレベルでの発現を判断して発現陽性植物を同定および定量化することができる。この場合、ＲＮＡ分析の標準的な手法を利用することができるが、こうした手法としては、異種性ＲＮＡ鋳型のみを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅アッセイならびに、異種性核酸特異的プローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションアッセイがあげられる。続いて、本発明の特異的に反応性を呈する抗体を用いてＲＮＡ陽性植物のタンパク質発現をウェスタンイムノブロット解析法によって解析する。さらに、異種性核酸特異的ポリヌクレオチドプローブおよび抗体をそれぞれ使用して標準的なプロトコールに準拠したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫細胞化学を行い、トランスジェニック組織内に発現部位を局在化することも可能である。通常、多数のトランスジェニック系を核酸の取り込みについてスクリーニングし、発現プロファイルが最も適している植物を同定および選択するのが普通である。
【０１１０】
用途によっては、イソペンテニル二リン酸経路の酵素を異なる細胞コンパートメントに向けたり、あるいはこれらの酵素を細胞から分泌しやすくしたりすると有用な場合がある。適切な細胞内または細胞外の標的配列を上述したキメラ遺伝子のコード領域に付加することでこれをさらに修飾してもよい。これには、葉緑体輸送ペプチド（Ｋｅｅｇｓｔｒａら、Ｃｅｌｌ  ５６：２４７〜２５３（１９８９））、タンパク質を小胞体に送るシグナル配列（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））、核局在化シグナル（Ｒａｉｋｈｅｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））が含まれる。上記にてあげた参考文献にはそれぞれの例が掲載されているが、その一覧ですべてが網羅されているわけではなく、将来的には有用性のあるさらに別の標的シグナルが発見されるかもしれない。
【０１１１】
また、用途によっては植物におけるイソペンテニル二リン酸経路の遺伝子の発現を低減またはなくしてしまうと望ましい場合がある。これを達成するには、これらの酵素の一部をコードする遺伝子または遺伝子断片を植物プロモーター配列に結合させ、イソペンテニル二リン酸経路相同体のアンチセンスまたはコサプレッション用に設計したキメラ遺伝子を形成すればよい。よって、イソペンテニル二リン酸経路の相同体遺伝子または遺伝子断片を逆向きで植物プロモーター配列に結合し、ＵＰＰＳ相同体の全部または一部についてのアンチセンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子を生成すればよい。対応する内在性遺伝子の発現を低減させるかなくしてしまう周知の形質転換プロトコールによって、コサプレッションまたはアンチセンスのキメラ遺伝子コンストラクトを植物に導入することができよう。
【０１１２】
微生物での発現
本願のイソペンテニル二リン酸経路の相同体タンパク質は、異種性の宿主細胞、特に微生物宿主の細胞中で生成させることができ、これを利用して当業者間で周知の方法により、タンパク質に対する抗体を生成することが可能である。この抗体は、本願のイソペンテニル二リン酸経路酵素を細胞内にてｉｎ  ｓｉｔｕで検出する、あるいは細胞抽出液中にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出するのに役立つであろう。本願のイソペンテニル二リン酸経路酵素を生成するための好ましい異種宿主細胞は微生物宿主である。外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含んでなる微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本願のイソペンテニル二リン酸経路の相同体生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。さらに、このキメラ遺伝子を形質転換によって適当な微生物に導入し、本願のイソペンテニル二リン酸経路酵素を高いレベルで発現させることができる。好適な宿主の具体例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの酵母、あるいはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココックス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１３】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本願明細書に記載の核酸断片の遺伝子産物のどれを生成するためのキメラ遺伝子を構築しても構わない。さらに、これらのキメラ遺伝子を形質転換によって適切な微生物に導入し、酵素を高いレベルで発現させることができる。
【０１１４】
さらに、キメラ遺伝子は宿主植物の特性を変える上でも効果的であろう。たとえば、適切なプロモーターの制御下で本願明細書に記載の本件配列のうちの１以上をコードするキメラ遺伝子を、これらの遺伝子の少なくとも１つのコピーを含んでなる宿主細胞に導入すると、ＩＰＰの前駆体のうちの１以上を適切な酵素産物に変換する機能が示されると思われる。さらに、このような配列を別々または一緒に発現させると、これらのタンパク質の宿主中での有無に応じて、ＩＰＰへのアセテートの伝達あるいは中間ステップのうちのいずれかを容易にできることがある。
【０１１５】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んでなる。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同的な遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【０１１６】
所望の宿主細胞での本件配列の発現を駆動するのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子を駆動できるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）、ＡＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉでの発現に有用）、ＣａＭＶ  ３５Ｓ（植物での発現に有用）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１７】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。任意に、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を含む形が最も好ましい。
【０１１８】
活性を亢進させたイソペンテニル二リン酸経路の遺伝子
本願ヌクレオチドを使用して、活性を亢進または変化させた遺伝子産物を生成できると考えられる。天然遺伝子の配列を突然変異させ、活性を変化または亢進させた遺伝子産物を生成する方法にはさまざまなものが周知であり、その一例として、ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９９年２月１５日）第２７巻、Ｎｏ．４、第１０５６〜１０６２ページ）、部位特異的突然変異誘発（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１、１プレート、編集者（ら）：Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ、出版社：カリフォルニア州サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ）、「遺伝子シャッフリング」（本願明細書に援用する、Ｕ．Ｓ．第５，６０５，７９３号、Ｕ．Ｓ．第５，８１１，２３８号、Ｕ．Ｓ．第５，８３０，７２１号、Ｕ．Ｓ．第５，８３７，４５８号）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
遺伝子シャッフリングの方法は、実現しやすく、突然変異誘発率が高く、かつスクリーニングが容易であることから、特に魅力的である。遺伝子シャッフリングの方法では、該当する遺伝子と類似したＤＮＡ領域または異なるＤＮＡ領域からなる集合が別に存在する状態で該当する遺伝子を特定サイズの断片に制限する必要がある。こうした断片のプールを変性させた後、再アニールして変異遺伝子を作り出した。この変異遺伝子の活性の変化をスクリーニングする。
【０１２０】
本件植物配列については、この方法を使って変異させ、活性の変化または亢進をスクリーニングすることができる。この配列を従来技術において周知（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の制限エンドヌクレアーゼでランダムに消化し、約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲の断片を得る。本件配列だけでなく、配列の全部または一部とハイブリダイズ可能な断片の集合を加えてもよい。同様に、本件配列とハイブリダイズできない断片の集合を加えてもよい。一般に、こうして断片集合を追加する場合は、全核酸に対して重量で約１０から２０倍過剰になるようにして行う。通常、このプロセスが続く場合、混合物中の異なる特異的核酸断片は約１００から約１０００になる。ランダムな核酸断片の混合集合を変性させ、一本鎖核酸断片を形成した後、再アニール処理を施す。他の一本鎖核酸断片と相同な領域を持つ一本鎖核酸断片のみが再アニールされる。このとき、ランダムな核酸断片を熱によって変性させることができる。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決めることができよう。好ましくは、温度を８０℃から１００℃とする。また、核酸断片を冷却によって再アニールさせてもよい。好ましくは、温度を２０℃から７５℃とする。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を加えれば再生を加速することが可能である。塩濃度については０ｍＭから２００ｍＭとすると好ましい。次に、アニール後の核酸断片を核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートする。この核酸ポリメラーゼは、クレノー断片やＴａｑポリメラーゼであってもよいし、従来技術において周知の他のどのようなＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼをランダム核酸断片に加える作業は、アニーリングの前に行ってもよいし、アニーリングと同時またはアニーリング後に行ってもよい。上記のポリメラーゼの存在下における変性、再生、インキュベーションのサイクルを、所望の回数繰り返す。好ましくは、サイクルを２から５０回繰り返し、一層好ましくは、シーケンスを１０から４０回繰り返す。このようにして得られる核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂの大きめの二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングおよび発現のプロトコール（上記Ｍａｎｉａｔｉｓ）を使って発現および活性の変化についてのスクリーニングが可能なものである。
【好ましい実施形態の記述】
【０１２１】
本発明は、アセテートのＩＰＰへの変換に役立つ酵素をコードする遺伝子の単離に関するものである。メッセンジャーＲＮＡを単離し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成することで、樹木種であるＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓにて採取したラテックスから関連遺伝子を単離した。このｃＤＮＡを使用して標準的な方法で遺伝子ライブラリを構築し、続いてこれを配列解析用にランダムにサンプリングした。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１２３】
一般法
実施例で使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局、コールドスプリングハーバー（１９８９）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８４）ならびにオーズベル，エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）に記載されている。
【０１２４】
細菌培養の管理と増殖に適した材料および方法は従来技術において周知である。以下の実施例で使用するのに適した手法については、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤ．Ｃ．（１９９４））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州サンダーランド（１９８９）などの記載に見つけることができよう。
【０１２５】
データベースでの類似性の検索に使うことのできるＢＬＡＳＴファミリのプログラムを利用して、遺伝子配列を操作した。このファミリには、ヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチドのデータベース配列と比較するためのＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドのクエリー配列をタンパク質のデータベース配列と比較するためのＢＬＡＳＴＸ、タンパク質のクエリー配列をタンパク質のデータベース配列と比較するためのＢＬＡＳＴＰ、タンパク質のクエリー配列をヌクレオチドのデータベース配列と比較するためのＴＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチドのデータベース配列と比較するためのＴＢＬＡＳＴＸが含まれる。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１９章、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（１９９５）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは一般公開されており、たとえばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）および他の提供元（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ）ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０））から入手可能である。
【０１２６】
また、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを利用しているベクターＮＴＩパッケージ（メリーランド州ベセスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．））のプログラムＡＬＩＧＮＸでの配列比較も実施し、アライメントを生成するとともに類似率と同一率とを算出した。特に明記しない限り、どの配列解析アルゴリズムもデフォルト値で使用した。
【０１２７】
実施例１
Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓラテックスからのｃＤＮＡクローンの同定に使用するｃＤＮＡライブラリの組成
樹液採取サイクルのさまざまな段階で採取したゴムの木ラテックスからのｍＲＮＡを表しているｃＤＮＡライブラリを作製した。ｃＤＮＡライブラリの作製には、利用可能な多くの方法のうちどれを使ってもよい。たとえば、まず最初に製造業者のプロトコール（ストラタジーンクローニングシステムズ、カリフォルニア州ラホーヤ）に従ってＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターでｃＤＮＡライブラリを作製してｃＤＮＡをプラスミドベクターに導入することができる。ストラタジーンから提供されているプロトコールに従ってこのＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲライブラリをプラスミドライブラリに変換する。変換時、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにｃＤＮＡインサートが含まれることになる。あるいは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、予め切断しておいたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン）にｃＤＮＡを直接導入した後、製造業者のプロトコール（ギブコＢＲＬプロダクツ）に従ってＤＨ１０Ｂ細胞に形質移入してもよい。ｃＤＮＡインサートがプラスミドベクターに入ったら、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含むランダムに採取した細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製するか、あるいは挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異なプライマーを使ってポリメラーゼ連鎖反応でインサートｃＤＮＡ配列を増幅する。増幅されたインサートＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを、色素−プライマーシークエンシング反応で配列決定し、部分ｃＤＮＡ配列（発現配列タグすなわち「ＥＳＴ」。アダムズ（Ａｄａｍｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５１〜１６５６（１９９１）を参照のこと）を生成する。
【０１２８】
実施例２
ＥＳＴの同定
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（非冗長ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳの翻訳配列、三次元構造のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク由来の配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースの最新のメジャーリリースをすべて含んでなる）に収録された配列に対する類似性についてのＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３）、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）検索を行ってＥＳＴを同定した。実施例１で得られたｃＤＮＡ配列と、「ｎｒ」データベースに収録された一般利用可能なすべてのＤＮＡ配列との類似性を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から提供されているＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで解析した。これらのＤＮＡ配列をすべての読み枠に翻訳し、「ｎｒ」データベースに収録された一般利用可能なすべてのタンパク質配列との類似性を、ＮＣＢＩから提供されているＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３））で比較した。便宜上、ｃＤＮＡ配列と検索対象としたデータベース内の配列とのマッチがＢＬＡＳＴでの計算時に単なる偶然で観察されるＰ値（確率）を、本願明細書では「ｐＬｏｇ」値として示す。この値は、得られるＰ値の対数を負にした値を示している。したがって、ｐＬｏｇ値が大きくなればなるほど、ｃＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同タンパク質を表す尤度が高くなる。
【０１２９】
実施例３
アセテート／メバロン酸経路の酵素のｃＤＮＡクローンの同定
実施例１および２で説明したデータベースでの照会結果（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）に基づいて、ライブラリから得られるｃＤＮＡを同定した。よって、１）キーワード検索、２）Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から提供されているＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムと既知のアセテート／メバロン酸経路の遺伝子の配列とを使用したデータベースの検索、３）ＦＡＳＴＡプログラムを使用して行う、企業内のデータベース内にある１および２で発見されたｃＤＮＡの他の相同体の同定を含む多くの方法でｃＤＮＡを同定した。これらの手段で同定したｃＤＮＡを以下の表１にあげておく。
【０１３０】
【表１】
2005500840.tif 000002
【０１３１】
実施例４
ＥＳＴの全長配列決定と同一性の検証
推定上の同定を行ったＥＳＴを完全配列決定し、その同一性を確認した。キアゲンミニプレップキット（バレンシア、キアゲン社）を使用し、製造業者による指示に従って、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＋（ストラタジーン、カリフォルニア州ラホーヤ）にＥＳＴを含むプラスミドＤＮＡを生成した。ＥＺ：ＴＮ  ＜Ｋａｎ−２＞インサートキット（ウィスコンシン州マディソン、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用し、製造業者による指示に従って、プライマー結合部位とカナマイシン耐性選択マーカーとを含むトランスポゾンを全長配列決定の標的ＥＳＴを含むプラスミドそれぞれにランダムに挿入した。次に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（カリフォルニア州ヘラクレス、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、２５ｕＦ、１．８ＫＶおよび２００Ωにて、上記のプラスミドをエレクトロポレーションでＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ  ＥＣ１００  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（ウィスコンシン州マディソン、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）に形質転換した。このトランスポゾンインサートを含むプラスミドを、カナマイシン５０μｇ／ｍＬとアンピシリン５０μｇ／ｍＬとを含むＬＢ−Ａｇａｒプレートごとに選択した。Ｍｏｎｔａｇｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ９６  Ｋｉｔ（マサチューセッツ州ベッドフォード、ミリポア）を使用し、各ＥＳＴについて、ＥＺ：ＴＮ  ＜Ｋａｎ−２＞トランスポゾンを含む２０のプラスミドＤＮＡを調製した。ＥＺ：ＴＮ  ＜Ｋａｎ−２＞トランスポゾンに結合するＫａｎ−２フォワードプライマー５’ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ  ３’（配列番号１５）とＫａｎ−２リバースプライマー５’ＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧ  ３’（配列番号１６）とを使用して、ＡＢＩシーケンサでプラスミドを配列決定した。元の宿主ベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋に対する相同性しか認められなかった配列については破棄した。ＥＺ：ＴＮトランスポゾンを表すＤＮＡ配列を除去し、ベクターＮＴＩ  Ｃｏｎｔｉｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（メリーランド州ノースベセスダ、インフォマックス社（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．））を使って全長遺伝子配列をアセンブルした。
【０１３２】
このようにして公共データベースに収録された相同体を使って同定したｃＤＮＡの推定アミノ酸配列のアライメントは高い度合いで相同性を示していた（表２）。
【０１３３】
【表２】
2005500840.tif 000003
【０１３４】
表２に示すデータのアライメントについては、ソフトウェアパッケージベクターＮＴＩに含まれるＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムをデフォルト値で使用して行った。
【０１３５】
これらの比較結果に基づいて、同定されたＥＳＴ配列（表１）が、Ｈｅｖｅａラテックスでは、他の種で過去に記述された配列と相同であるという結論を導き出すことができる。いずれの場合も、既知配列との同一率（％）は６４％を上回っている（表２）。比較に利用した公共の配列はいずれも、実験または相同性によって、植物でアセテート−メバロン酸経路の酵素をコードする遺伝子として同定済みである。よって、もっとも高い尤度で同定されたＨｅｖｅａ遺伝子は、この種のラテックスでのアセテートからＩＰＰへの経路で同じ酵素活性を達成している。相同性によってＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ酵素をコードしていると同定されたＥＳＴ配列（配列番号３）は、既知のＨｅｖｅａアイソフォームＨＭＧＲ１の配列と１００％同一（表２）であって、この生物のＨＭＧＲ２およびＨＭＧＲ３とは異なる推定アミノ酸配列（配列番号１０）を生じる。しかしながら、このＥＳＴのヌクレオチド配列は、ＨＭＧＲ１の配列とは１５塩基分だけ異なっており、さらに、３’非コード領域はポリ（Ａ）テールの保持の点で顕著に異なっていた。したがって、ＥＳＴ  ｅｈｂ２ｃ．ｐｋ００２．ｄ１９（配列番号３）は、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ中に存在するＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼの新たなアイソフォームであり、これをＨＭＧＲ４と呼ぶ。
【０１３６】
まとめると、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ（配列番号１）、ＨＭＧ−ｃｏＡシンターゼ（配列番号２）、ＨＭＧ−ｃｏＡレダクターゼ（配列番号３）、メバロン酸キナーゼ（配列番号４）、ホスホメバロン酸キナーゼ（配列番号５）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（配列番号６）についての完全かつ新規なｃＤＮＡ配列が得られた。さらに、これらのＤＮＡ配列を、それぞれ対応するタンパク質配列である、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３に翻訳した。
【０１３７】
ＥＳＴとして単離したさらに別の配列（配列番号７）には、既知のアセチル−ｃｏＡアセチルトランスフェラーゼの配列との間に相当な相同性が認められたが、この配列の場合よりもかなり短いポリペプチド（配列番号１４）をコードしていた。ｃＤＮＡクローンにポリ（Ａ）テールが存在する（配列番号７）ことから、このペプチドはＨｅｖｅａでの遺伝子発現の真の産物であると思われる。この短い遺伝子産物は、これよりも長いアセチルｃｏＡアセチルトランスフェラーゼ（配列番号１）と同様の反応を触媒する可能性があり、同じようにＨｅｖｅａでのＩＰＰ合成に関与しているのかもしれない。しかしながら、内部または外部のデータベースでこれほど短い相同体は同定できなかったため、この同定については思索的なままである。結論として、既知の遺伝子産物との相同性によって、ＩＰＰ合成に関与している尤度が最も高いコード酵素として一組のＨｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ｃＤＮＡを同定した。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ポリプレノール（ゴム）生合成の経路を示している。
【図２】アセテートからのＩＰＰの生合成を示している。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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