(57)【要約】  本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。かかるＧＥＮＳＥＴ産物は、法医学分析における試薬として、発現ベクターの作製における染色体マーカー、組織／細胞／細胞器官特異的マーカーとして使用することが可能である。さらに、異常なＧＥＮＳＥＴ発現および／または生物活性についてのスクリーニングおよび診断アッセイにおいて、かつＧＥＮＳＥＴ関連疾患の治療に使用される化合物をスクリーニングするために、それらを使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）いずれか１つの偶数配列番号の６〜７７６の少なくともいずれか１つの整数個のアミノ酸をコードする、奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡの、ポリヌクレオチド；
ｂ）いずれか１つの偶数配列番号のシグナルペプチド配列をコードする、奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡの、ポリヌクレオチド；
ｃ）いずれか１つの偶数配列番号の成熟ポリペプチド配列をコードする、奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡの、ポリヌクレオチド；
ｄ）いずれか１つの偶数配列番号の完全長ポリペプチド配列をコードする、奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡの、ポリヌクレオチド；
ｅ）いずれか１つの偶数配列番号の生物活性断片のポリペプチド配列をコードする、奇数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡの、ポリヌクレオチド；
ｆ）いずれか１つの偶数配列番号の６〜７７６の少なくともいずれか１つの整数個のアミノ酸の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；
ｇ）いずれか１つの偶数配列番号のシグナルペプチドの、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされるシグナルペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；
ｈ）いずれか１つの偶数配列番号の成熟ポリペプチドの、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；
ｉ）いずれか１つの偶数配列番号の完全長ポリペプチドの、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；
ｊ）いずれか１つの偶数配列番号の生物学的ポリペプチドの、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる生物学的ポリペプチドの、ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド；
ｋ）発現ベクターをさらに含む、ａ）〜ｊ）のいずれか１つのポリヌクレオチド；
ｌ）上記のａ）〜ｋ）のポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体；
ｍ）ｋ）の宿主細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物；
ｎ）生理学的に許容される担体をさらに含む、ａ）〜ｊ）のポリヌクレオチド；
からなる群から選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）いずれか１つの偶数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの、６〜７７６のいずれか１つの整数個のアミノ酸；
ｂ）いずれか１つの偶数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる、シグナルペプチド配列；
ｃ）いずれか１つの偶数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる、成熟ポリペプチド配列；
ｄ）いずれか１つの偶数配列番号の、または寄託クローンのヒトｃＤＮＡによってコードされる、完全長ポリペプチド配列；
ｅ）生理学的に許容される担体をさらに含む、ａ）〜ｄ）のポリペプチド；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞の集団を提供する段階：
ｂ）前記宿主細胞中で請求項２に記載のポリペプチドを生成する助けとなる条件下にて、宿主細胞の前記集団を培養する段階；
ｃ）宿主細胞の前記集団から前記ポリペプチドを精製する段階；
を含む、ポリペプチドを作製する方法。
【請求項４】
ａ）プロモーターに作動可能に連結される、請求項２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の集団を提供する段階；
ｂ）前記細胞中で前記ポリペプチドを生成する助けとなる条件下にて、前記細胞集団を培養する段階；
ｃ）前記細胞集団から前記ポリペプチドを精製する段階；
を含む、ポリペプチドを作製する方法。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項６】
抗体が前記ポリペプチドに特異的に結合することができる条件下にて、前記抗体を前記ポリペプチドと接触させる段階を含む、請求項５に記載の抗体に、請求項２に記載のポリペプチドを結合させる方法。
【請求項７】
ａ）前記哺乳動物から生体試料を採取する段階；
ｂ）前記生体試料を、
ｉ）厳密な条件下にて、請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
ｉｉ）請求項２に記載のポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド、のいずれかと接触させる段階；
ｃ）前記試料中の前記ポリヌクレオチドとＲＮＡ種との間のハイブリダイゼーションの有無、または前記試料中の前記ポリペプチドのタンパク質への結合の有無を検出する段階；を含む、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子が哺乳動物中で発現されるかどうかを決定する方法であって、
前記ハイブリダイゼーションの検出、または前記結合の検出によって、前記ＧＥＮＳＥＴ遺伝子が前記動物中で発現されることが示される方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがプライマーであり、かつ前記ハイブリダイゼーションが、前記プライマーの配列を含む増幅産物の存在を検出することによって検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記哺乳動物から生体試料を採取する段階；
ｂ）前記生体試料中の、請求項２に記載のポリペプチドの量、または前記ポリペプチドをコードするＲＮＡ種の量を、対照試料で検出された、または対照試料から予想されるレベルと比較する段階；
を含む、哺乳動物が増加または減少したレベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有するかどうかを決定する方法であって、
前記対照試料で検出された、または前記対照試料から予想される前記レベルと比較して、前記生体試料中の前記ポリペプチドまたは前記ＲＮＡ種の増加量から、前記哺乳動物が増加したレベルの前記ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有することが示され、かつ前記対照試料で検出された、または前記対照試料から予想される前記レベルと比較して、前記生体試料中の前記ポリペプチドまたは前記ＲＮＡ種の減少量から、前記哺乳動物が減少したレベルの前記ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有することが示される方法。
【請求項１１】
ａ）請求項２に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させる段階；
ｂ）前記化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する段階；
を含む、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの候補修飾因子を同定する方法であって、
前記化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合することの検出によって、前記化合物が前記ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの候補修飾因子であることが示される方法。
【請求項１２】
前記候補修飾因子の存在下にて、前記ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの生物活性を試験する段階をさらに含む、請求項１１に記載の方法であって、前記化合物の非存在下での活性と比較して、前記化合物の存在下での前記ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの生物活性の変化から、その化合物が前記ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの修飾因子であることが示される方法。
【請求項１３】
ａ）請求項１１に記載の方法を用いて、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの修飾因子を同定する段階；
ｂ）前記修飾因子を生理学的に許容される担体と組み合わせる段階；
を含む、薬剤組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「ヒトｃＤＮＡおよびタンパク質およびその使用」というタイトルの、２００１年８月１０日出願の米国特許仮出願第６０/３１１，３０５号；２００１年８月２４日出願の米国特許仮出願第６０/３１４，７３４号；２００１年９月７日出願の米国特許仮出願第６０/３１８，２０４号；および２００１年１０月１日出願の米国特許仮出願第６０/３２６，４７０号からの優先権を主張し、それらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドおよびポリペプチド、およびその断片、誘導体および変異体に関する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、特にＧＥＮＳＥＴ遺伝子調節領域またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする配列を含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、およびかかる抗体およびその断片を作製する方法に関する。本発明は、試料中の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの存在を検出する方法、異常なＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現および／または生物活性を診断およびスクリーニングする方法、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性または発現を調節するそれらの能力について化合物をスクリーニングする方法もまた提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはその断片は、治療薬の特に貴重な原料（source）である。したがって、分泌およびタンパク質およびそれらをコードする核酸を同定かつ特徴付けする必要がある。
【０００３】
それら自体が治療上有用であることの他に、分泌タンパク質は、それらの分泌を指示するアミノ末端に、シグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含む。これらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード配列の５’末端に位置するシグナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプチドは、それらが作動可能にに連結されるいずれかのタンパク質の細胞外分泌を指示すると考えられるため、シグナル配列を利用して、タンパク質をコードする遺伝子にシグナル配列を作動可能に連結することによって、分泌が望まれる任意のタンパク質の効率的な分泌を指示することができる。さらに、膜移行（membrane-translocating）配列と呼ばれるシグナルペプチドの断片を使用して、対象のペプチドまたはタンパク質の細胞内輸送（インポート）を指示することもできる。これは、それが生成される細胞以外の細胞に特定の遺伝子産物を運搬することが望まれる、遺伝子治療方法において有益であることがわかっている。シグナルペプチドをコードするシグナル配列もまた、タンパク質精製技術の簡略化での用途が見出されている。かかる用途において、目的タンパク質の細胞外分泌は、目的のタンパク質がそれらから選択されなければならない、不要なタンパク質の数を低減することによって、精製を非常に容易にする。したがって、シグナルペプチドをコードする分泌タンパク質の遺伝子の ５’断片を同定し、かつ特徴付ける必要がある。
【０００４】
分泌タンパク質をコードする配列もまた、治療または診断での用途を見出すことができる。特にかかる配列を使用して、分泌タンパク質のコード配列における変異の結果として、個体が疾患などの検出可能な表現型を発現する可能性があるかどうかを決定することが可能である。かかるコード配列における変異の結果として、個体が疾患または他の好ましくない表現型を有するリスクがある場合には、遺伝子治療を用いて正常なコード配列を導入することによって、好ましくない表現型を正すことができる。代替方法としては、好ましくない表現型によって、コード配列によりコードされるタンパク質の過剰発現が生じる場合、そのタンパク質の発現を、アンチセンスまたは三重らせんに基づく方策を用いて低減することが可能である。
【０００５】
コード配列によってコードされる分泌ヒトポリペプチドもまた、ポリペプチドをコードする配列における変異から生じる、疾患などの病状を有する個体にそれらを直接投与することによって、治療として使用することができる。かかる場合には、その病状は、個体にポリペプチドを投与することによって治癒または改善することができる。
【０００６】
さらに、分泌ヒトポリペプチドまたはその断片を使用して、生体試料の起源の組織型または種類を決定するのに有用な抗体を作製することができる。この抗体を使用して、分泌ヒトポリペプチドの細胞局在またはヒトポリペプチドに融合しているポリペプチドの細胞局在を決定することもできる。さらに、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーにこの抗体を用いて、ヒトポリペプチドまたはヒトポリペプチドに融合している標的ポリペプチドを単離、精製、または濃縮することもできる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は：（ａ）配列番号：１〜２３の奇数番号の配列；（ｂ）寄託クローン・プールのクローンインサートの配列；（ｃ）配列番号：１〜２３の奇数番号のコード配列；（ｄ）寄託クローン・プールのクローンインサートのコード配列；（ｅ）配列番号：２〜２４の偶数番号のポリペプチドの１つをコードする配列；（ｆ）寄託クローン・プールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドの１つをコードする配列；（ｇ）ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするゲノム配列；（ｈ）ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の５’転写調節領域；（ｉ）ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の３’転写調節領域；（ｊ）（ｇ）〜（ｉ）のいずれかの組み合わせのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のポリヌクレオチドのいずれかの変異ポリヌクレオチド；（ｌ）（ａ）〜（ｋ）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、一本鎖、二本鎖であるか、または一部が一本鎖であり、一部が二本鎖である、ポリヌクレオチド；（ｍ）（ｌ）の一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、からなる、またはから本質的になる、精製または単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、上述の（ａ）〜（ｍ）の核酸およびポリペプチドの断片を提供する。
【０００８】
本発明の更なる実施形態は、例えば整数１０と、配列表の指定の配列の最後のヌクレオチドを表す最後の整数との間の少なくともおよそいずれかの１つの整数の隣接ヌクレオチドの領域にわたり、上記の（ａ）〜（ｍ）におけるヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも７０％、さらに好ましくは７５％同一の、またさらに好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む、からなる、またはから本質的になる、精製または単離ポリヌクレオチド、あるいは厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、上記の（ａ）〜（ｍ）を含む本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０００９】
本発明は、本発明の精製または単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞の作製方法にも関する。本発明はさらに、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの作製におけるこれらの組換えベクターおよび組換え宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、プロモーター、エンハンサー等を含む調節配列に作動可能に連結される本発明のポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
本発明はさらに、（ａ）配列番号：２〜２４の偶数番号の完全長ポリペプチド；（ｂ）寄託クローン・プールのクローンインサートによってコードされる完全長ポリペプチド；（ｃ）配列番号：２〜２４の偶数番号のポリペプチドの、エピトープを有する断片；（ｄ）寄託クローン・プールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドの、エピトープを有する断片；（ｅ）配列番号：２〜２４の偶数番号のポリペプチドのドメイン；（ｆ）寄託クローン・プールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのドメイン；（ｇ）配列番号：２〜２４の偶数番号の、または寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡによってコードされる、ポリペプチドのシグナルペプチド；（ｈ）配列番号：２〜２４の偶数番号の、または寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡによってコードされる、成熟ポリペプチド；および（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異体ポリペプチド；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、精製または単離ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、生物活性を有する、または生物機能性ドメイン（１つまたは複数）を含む断片など、上記の（ａ）〜（ｉ）のポリペプチドの断片を提供する。  本発明はさらに、例えば整数６と配列表の指定のポリペプチド配列の最後アミノ酸を表す最後の整数との間の少なくともいずれか１つの整数のアミノ酸領域にわたり、（ａ）〜（ｉ）に記載のポリペプチドと少なくとも７０％の類似性、さらに好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、その断片、ならびに（ａ）〜（ｉ）に記載のポリペプチドと少なくとも７０％同一の、さらに好ましくは、少なくとも７５％同一の、またさらに好ましくは、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片を含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチドを作製する方法に関する。  本発明はさらに、遺伝子導入植物または動物に関し、前記遺伝子導入植物または動物は、本発明のポリヌクレオチドを導入したものであり、本発明のポリペプチドを発現する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびその断片に特異的に結合する抗体、ならびにかかる抗体およびその断片を作製する方法に関する。
【００１２】
本発明は、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現および／または活性を検出するためのキット、その使用、および検出する方法もまた提供する。かかる一方法は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドを増幅かつ検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、またはＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡを検出するためにサザンブロットおよびノーザンブロット・ハイブリダイゼーションを用いて、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドの発現をアッセイすることを含む。代替方法としては、試験試料におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を検出する方法は、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはＧＥＮＳＥＴポリペプチドの一部に結合する化合物を用いて行うことができる。
【００１３】
本発明はまた、その個体がＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現をそれぞれ抑制または増強する治療から恩恵を受ける可能性のある、高レベルまたは低いレベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子産物を有する個体または非ヒト動物を同定するための、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドの診断方法および使用、ならびにＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現もしくは生物活性に関連する、特定の疾患／障害を発生するリスクが高いまたは現在有する個体または非ヒト動物を同定する方法に関する。
【００１４】
本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性または発現を調節する（増加または抑制する）それらの能力について化合物を、例えばＧＥＮＳＥＴ遺伝子調節配列と相互作用する化合物およびＧＥＮＳＥＴポリペプチドと直接もしくは間接的に相互作用する化合物などを、スクリーニングするためのキット、その使用、およびスクリーニングする方法にも関する。かかる化合物の使用もまた、本発明の範囲内である。
本発明は、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現および／または活性を検出するためのキット、その使用、および検出する方法もまた提供する。かかる一方法は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドを増幅かつ検出するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、またはＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡを検出するためにサザンブロットおよびノーザンブロット・ハイブリダイゼーションを用いて、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドの発現をアッセイすることを含む。代替方法としては、試験試料におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を検出する方法は、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはＧＥＮＳＥＴポリペプチドの一部に結合する化合物を用いて行うことができる。
【００１５】
本発明はまた、その個体がＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現をそれぞれ抑制または増強する治療から恩恵を受ける可能性のある、高レベルまたは低いレベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子産物を有する個体または非ヒト動物を同定するための、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドの診断方法および使用、ならびにＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現もしくは生物活性に関連する、特定の疾患／障害を発生するリスクが高いまたは現在有する個体または非ヒト動物を同定する方法に関する。
【００１６】
本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性または発現を調節する（増加または抑制）それらの能力について化合物を、例えばＧＥＮＳＥＴ遺伝子調節配列と相互作用する化合物およびＧＥＮＳＥＴポリペプチドと直接もしくは間接的に相互作用する化合物などを、スクリーニングするためのキット、その使用、およびスクリーニングする方法にも関する。かかる化合物の使用もまた、本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明はまた、活性剤、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体、ならびに通常、生理学的に許容可能な担体を含む、薬学的または生理学的に許容可能な組成物に関する。
【００１８】
本発明は、本発明の配列のｃＤＮＡコードおよびポリペプチドコードを収めるコンピューター・システム、および配列を比較し、相同性を同定する、または本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチド配列を使用することを特徴とする、コンピューターに関連する方法にも関する。
【００１９】
他の態様において、本発明は、単離ポリヌクレオチド、上記（ａ）〜（ｉ）のポリペプチドを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
他の態様において、本発明は、宿主細胞を含む非ヒト遺伝子導入動物を提供する。
別の態様において、本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを作製する方法であって、ａ）本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞集団を提供する段階と、ｂ）前記宿主細胞内でポリペプチドが生成される助けとなる条件下にて、宿主細胞集団を培養する段階と、を含む方法を提供する。
【００２１】
一実施形態において、この方法はさらに、宿主細胞集団からポリペプチドを精製することを含む。
【００２２】
その他の態様では、本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを作製する方法であって、ａ）本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞集団を提供する段階と、ｂ）細胞内でポリペプチドが生成される助けとなる条件下にて、その細胞集団を培養する段階と、ｃ）集団細胞からポリペプチドを精製する段階と、を含む方法を提供する。
【００２３】
その他の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかによってコードされる生物活性ポリペプチドを提供する。
【００２４】
一実施形態において、このポリペプチドは、抗原ポリペプチドまたはその抗原断片に対して産生される抗体によって選択的に認識され、その抗原ポリペプチドは、配列番号：２〜２４の偶数番号で示される配列のうちいずれか１つまたは寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの配列のうちのいずれか１つを含む。
【００２５】
その他の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体、および抗体を前記ポリペプチドに結合させる方法を提供する。
【００２６】
その他の態様において、本発明は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子が哺乳動物内で発現されるかどうかを決定する方法であって、ａ）前記哺乳動物から生体試料を採取する段階；ｂ）前記生体試料を、（ｉ）厳密な条件下にて、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかとハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ｉｉ）本明細書に記載のポリペプチドのいずれかに特異的に結合するポリペプチドのどちらかと接触させる段階；ｃ）そのポリヌクレオチドと試料内のＲＮＡ種との間でのハイブリダイゼーションの有無、または試料中のタンパク質へのそのポリペプチドの結合の有無を検出する段階であって、そのハイブリダイゼーションまたは結合の検出によって、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子が哺乳動物内で発現していることが示される段階；を含む方法を提供する。
【００２７】
一実施形態において、このポリヌクレオチドはプライマーであり、このハイブリダイゼーションは、プライマーの配列を含む増幅産物の存在を検出することによって検出される。その他の実施形態では、このポリペプチドは抗体である。
【００２８】
その他の態様において、本発明は、哺乳類動物が高レベルまたは低レベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有するかどうかを決定する方法であって：ａ）哺乳類動物から生体試料を採取する段階；ｂ）生体試料中の本明細書に記載のポリペプチドのいずれかまたはそのポリペプチドをコードするＲＮＡ種の量を、対照試料で検出される、または対照試料から予想されるレベルと比較する段階であって、対照試料で検出される、または対照試料から予想されるレベルと比較して、生体試料中の増加した量のポリペプチドまたはＲＮＡ種によって、その哺乳動物が高レベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有することが示され、かつ対照試料で検出される、または対照試料から予想されるレベルと比較して、生体試料中の減少した量のポリペプチドまたはＲＮＡ種によって、その哺乳動物が、低レベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有することが示される段階；を含む方法を提供する。
【００２９】
その他の態様において、本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの候補修飾因子を同定する方法であって、ａ）本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを試験化合物と接触させる段階；ｂ）その化合物がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する段階；を含み、その化合物がポリペプチドに特異的に結合することを検出することによって、その化合物が、特定の生物活性を抑制または活性化する、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの候補修飾因子であることが示される段階；を含む方法を提供する。
表の簡単な説明
表Ｉには、配列表の各配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ)に相当し、かつその配列が核酸配列（ＤＮＡ）であるか、またはポリペプチド配列（ＰＲＴ）であるかどうかを示す、出願人らの内部指定番号（クローンＩＤ−クローン名）を提供する。さらに、対応する核酸またはポリペプチド配列の名称に関する情報、および生体物質の寄託に関する情報が提供されている。生体物質は、それらの対応するクローンＩＤ、クローン名、またはクローンＩＤ−クローン名の両方に関して寄託されていることを理解されたい。
【００３０】
表ＩＩには、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、シグナルペプチド、成熟ペプチド、ポリアデニル化シグナル、および本発明のポリヌクレオチドのポリＡテールを含む配列表の相当する配列番号のヌクレオチドの位置を示す。
【００３１】
表ＩＩＩには、抗体産生に有用な、本発明のポリペプチドの免疫原性エピトープの位置を含む、配列表の相当する配列番号のアミノ酸の位置を示す。
配列の簡単な説明
配列は、添付の配列表に示す。
【００３２】
配列番号：１〜２３の奇数番号は、示されるようにオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。しかるべき場合には、潜在的なポリアデニル化部位およびポリアデニル化シグナルもまた示される。
【００３３】
配列番号：２〜２４の偶数番号は、配列番号１〜２３の奇数番号のｃＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列表に関する規則に従って、ヌクレオチド配列を説明するために、以下のコードが配列表に使用されている。配列において「ｒ」というコードは、ヌクレオチドがグアニンまたはアデニンであることを示す。配列において「ｙ」というコードは、ヌクレオチドがチミンまたはシトシンであることを示す。配列において「ｍ」というコードは、ヌクレオチドがアデニンまたはシトシンであることを示す。配列において「ｋ」というコードは、ヌクレオチドがグアニンまたはチミンであることを示す。配列において「ｓ」というコードは、ヌクレオチドがグアニンまたはシトシンであることを示す。配列において「ｗ」というコードは、ヌクレオチドがアデニンまたはチミンであることを示す。さらに、核酸配列における「ｎ」という記号のすべての例は、ヌクレオチドがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり得ることを意味する。
【００３５】
場合により、配列表のポリペプチド配列は、「Ｘａａ」という記号を含む。これらの「Ｘａａ」記号は、（１）ヌクレオチド配列のあいまい性のために同定することができない残基または（２）出願人らが存在しないだろうと考える決定配列における終止コドン（配列がさらに正確に決定されるならば）のいずれかを示す。場合によっては、未知のアミノ酸の可能性のあるいくらかの同一性が遺伝暗号によって示唆される。
【００３６】
分泌タンパク質の場合には、配列表を定める規則に従って、添付の配列表において、コードされるタンパク質（つまり、シグナルペプチドを含有するタンパク質および成熟タンパク質またはその断片）は、負の番号を有するアミノ酸残基から、正の番号を付けられたアミノ酸残基までわたることを留意されたい。このように、シグナルペプチドの切断から生じる成熟タンパク質の最初のアミノ酸は、アミノ酸番号１と示され、シグナルペプチドの最初のアミノ酸は、適切な負の番号で示される。
【００３７】
この場合、配列番号：１〜２４に対して本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、配列表に示される相当する配列、配列表対照において示される配列と矛盾している。
【００３８】
配列表の配列番号：１〜２４のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列がそれら全体が参照により本明細書に組み込まれることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の詳細な説明および好ましい実施形態
定義
さらに詳細に本発明を説明する前に、本明細書中で本発明を説明するために使用される用語の意味および範囲を解説かつ定義するために、以下の定義を示す。
【００４０】
本明細書で使用される「ＧＥＮＳＥＴ遺伝子」という用語は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするゲノム、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列、例えば前記配列の５’および３’非翻訳領域などを包含する。
【００４１】
「ＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性」または「ＧＥＮＳＥＴ生物活性」という用語は、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性と必ずしも同一ではないが、同様な活性を示すポリペプチドに対するものである。所定のポリペプチドのＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性は、その多くが当業者に公知の、適切な生物学的アッセイをも用いて評価される。その一方、「生物活性」という用語は、いずれかのポリペプチドが有する可能性のある、いずれかの活性を意味する。
【００４２】
「相当する（対応する））ｍＲＮＡ」という用語は、本発明のｃＤＮＡを作製するｃＤＮＡ合成のための鋳型であった、またはあり得るｍＲＮＡを意味する。
【００４３】
「相当する（対応する）ゲノムＤＮＡ」という用語は、例えば本発明のｃＤＮＡに相当する、対象のｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡを意味し、そのゲノムＤＮＡはｍＲＮＡの鎖の一方の配列を含み、ゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）の配列におけるチミジン残基はｍＲＮＡ中のウラシル残基によって置換される。
【００４４】
本明細書で使用される「寄託クローン・プール」という用語は、ＡＴＣＣまたは他の寄託機関に寄託されたクローンのプールを意味する。
【００４５】
本明細書でポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して使用される場合、「異種」という用語は、それぞれ特定のＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドまたは本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチド以外のいずれかのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを示すことが意図される。
【００４６】
例えば生体試料、細胞集団等に関して、「提供する」とは、試料、細胞集団等がある方法または手順においてなんらかの形で使用されることを示す。注目すべきことは、生体試料または細胞集団を「提供する」には、試料または細胞を本発明の目的のために、特に単離または入手することは必要ではないが、その代わりに、例えば別の目的のために別の個体によって得られた生体試料の使用を指すことができる。
【００４７】
「増幅産物」とは、いずれかの増幅反応、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ等の産物を意味する。
【００４８】
タンパク質または他の化合物の「修飾因子」とは、タンパク質への物理的結合、タンパク質の発現量または質の改変、タンパク質の測定可能または検出可能ないずれかの活性、性質または挙動の変更を含む、タンパク質に対する機能効果を有する、またはいずれにしても、タンパク質または化合物と相互作用する、いずれかの作用物質（agent）を意味する。
【００４９】
「試験化合物」とは、タンパク質または他の化合物を調節するその能力について評価されるいずれかの分子であり得る。
【００５０】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体または他の化合物は、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを「選択的に認識」するとも言われる。
【００５１】
分子に関して、「単離（された）」という用語は、その分子がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然体系において共存する物質の一部またはすべてから区別される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であることが可能であり、かつ／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であることが可能であり、さらにベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点から単離することが可能である。具体的には、「単離（された）」の定義から：天然の染色体（染色体拡散など）、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、および核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ標本として、あるいはその宿主細胞が異質ｉｎ  ｖｉｔｒｏ標本であるか、または単一コロニーの異質集団としてプレーティングされた、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞標本（preparation)として存在するｃＤＮＡライブラリーは除外される。具体的には、指定のポリヌクレオチドがベクター分子中の核酸インサート数の５％未満を占める（０％、２５％、５０％、または７５％と指定されることもある）上記のライブラリーも除外される。さらに具体的には、全細胞のゲノムＤＮＡまたは全細胞のＲＮＡ標本（機械的に切断または酵素で消化される前記全細胞標本を含む）は除外される。さらに具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本としての、または電気泳動（それのブロットトランスファーを含む）によって分離された異種混合物としての上記全細胞標本は除外され、その電気泳動において、本発明のポリヌクレオチドは、電気泳動媒体中の異種ポリヌクレオチドからさらに分離されていない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットにおいて異種バンド集合から単一バンドを切り出すことによる更なる分離）。
【００５２】
「精製（された）」」という用語は、完全な精製を必要とするわけではなく；むしろ、それらは相対的な定義として意図される。少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、さらに好ましくは４桁または５桁のオーダーに、出発物質または天然物質を精製することが特に企図される。「精製（された）」という用語はさらに、限定されないが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質等を含む他の化合物から分離された本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するために本明細書において使用される。「精製（された）」という用語は、ホモもしくはヘテロ−二量体、三量体等のオリゴマー型からの本発明の単一ポリペプチドの分離を示すのに使用する場合がある。「精製（された）」という用語はまた、共有結合で閉環した（つまり、環状）ポリヌクレオチドの、線状ポリヌクレオチドからの分離を説明するために使用される場合がある。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは通常、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド試料それぞれを約５０％（重量／重量）、好ましくは６０〜９０％含み、さらに一般的には約９５％、好ましくは約９９％を超える純度であるが、５０〜１００％のいずれかの整数で示される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの純度、または均一性は、サンプルのアガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野で公知の数多くの手段によって、またはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いて示される。代替の実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方）に対する「最低」純度％として表される。好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対してそれぞれ、少なくとも；純度１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％である。さらに好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに対して、または担体に存在するもの以外のすべての化合物および分子に対する重量／重量比として、任意の位〜小数点以下第３位の範囲の純度、９０％〜１００％を有する（例えば、少なくとも９９．９９５％の純度のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）。純度％を表す小数点以下第３位までの各数字は、純度の個々の種類として主張することが可能である。
【００５３】
本明細書において同義で使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡまたはＤＮＡ（一本鎖または二本鎖、コード、相補的またはアンチセンス）、または単鎖または二重鎖状の複数のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる（上記の種類それぞれが特に詳しく指定されているが）。「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二重鎖状の任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を説明するために、本明細書において形容詞として使用される。さらに正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸物質（nucleic material）を包含し、したがって、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生物化学的に特徴付ける配列情報（つまり、４つの塩基文字中で選択されるひと続きの文字）に限定されない。「ヌクレオチド」という用語は、プリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボースの糖部位、およびリン酸基、あるいはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの場合にはリン酸ジエステル結合を含む、分子または大きな核酸分子における個々のユニットを意味する、個々のヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドを示すために名詞としても使用される。「ヌクレオチド」という用語はまた、少なくとも１つの修飾、例えば（ａ）交互（alternative）結合基、（ｂ）プリンの類似体、（ｃ）ピリミジンの類似体、または（ｄ）例えば類似糖（例えば、ＷＯ９５／０４０６４参照）を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するために本明細書において使用される。本発明の好ましい修飾には、限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄマンノシルクエノシン（queosine）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）ｙブトキソシン、擬似ウラシル、クエノシン（queosine）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、、組換え、ｅｘ  ｖｉｖｏ作製、またはそれらの組み合わせを含む公知の方法によって、ならびに当技術分野で公知の精製方法を用いて作製することができる（修飾オリゴおよびヌクレ��チドの作製に関する教示については、例えば、米国特許第５，３７８，８２５号；同第５，３８６，０２３号；同第５，４８９，６７７号；同第５，６０２，２４０号；および同第５，６１０，２８９号、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号、米国特許第５，２２３，６１８号、米国特許第５，５０８，２７０号、米国特許第４，４６９，８６３号、米国特許第５，６１０，２８９号または同第５，６２５，０５０号、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号、国際公開番号：ＷＯ９４／１７０９３およびＷＯ９４／０２４９９，米国特許第５，４７６，９２５号、米国特許第５，０２３，２４３号、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号を参照のこと）。
【００５４】
本明細書において使用される「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端方向にある位置を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される「相補的」または「その補体」という用語は、相補領域全体を通して指定の他のポリヌクレオチドとワトソン−クリック型塩基対を形成することができる、ポリヌクレオチドの配列を意味する。本発明の趣旨では、第１ポリヌクレオチド中の各塩基がその相補的塩基と対を形成する場合、第１ポリヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドに相補的であると考えられる。相補的塩基は一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。本明細書において「補体」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」からの同義語として使用される。これらの用語は、２つのポリヌクレオチドが実際に結合すると考えられる条件の特定のセットにではなく、単にそれらの配列に基づくポリヌクレオチドの対に適用される。別段の指定がない限り、すべての相補的ポリヌクレオチが、検討されるポリヌクレオチドの全長で完全に相補的である。
【００５６】
本明細書において同義で使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ポリマーの長さに無関係に、アミノ酸のポリマーを意味し；したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学的または発現後の修飾を指定しない、または除外するが、これらのポリペプチドの化学的または発現後の修飾は特定の実施形態として包含または除外される。したがって、例えばグリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドへの修飾は、「ポリペプチド」という用語によって特別に包含される。さらに、これらの修飾を有するポリペプチドは個々の種類として指定されて、本発明に包含または本発明から除外される。上記の実施例で列挙されるような、天然または他の化学修飾は、ポリペプチドにおけるどこかで、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端などで起こり得り、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位にて同じ程度または異なる程度で存在する。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含有する場合がある。ポリペプチドは、例えばユビキチン結合の結果として分枝鎖である場合があり、それらは、分枝を含むまたは含まない環状であってもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部位の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション（selenoylation）、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン結合など、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介付加が挙げられる（例えば、Creighton, (1993), Posttranslational Covalent Modification of Proteins, W. H. Freeman and Company, New York B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 ; Seifter, et al., (1990) Meth Enzymol 182: 626-646; Rattan et al., (1992) Ann NY Acad Sci 663: 48-62を参照)。アミノ酸の１種または複数種の類似体を含有するポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生体系に天然にのみ存在するアミノ酸、哺乳類系からの修飾アミノ酸等）、置換結合ならびに当技術分野で公知の他の修飾を有するポリペプチドも（天然と非天然のどちらも）定義内に含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される「組換えポリヌクレオチド」および「ポリヌクレオチドコンストラクト」という用語は、人工的に設計され、かつそれらの最初の自然環境において隣接ヌクレオチド配列として見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含有する、直鎖または環状の、精製または単離ポリヌクレオチドを示すために本明細書において同義で用いられる。特に、ポリヌクレオチドまたはｃＤＮＡが、それがその自然環境では隣接しない「主鎖」核酸に隣接することを意味する。さらに、濃縮されたｃＤＮＡとは、核酸主鎖分子の集団における核酸インサート数の５％以上に相当するだろう。本発明による主鎖分子には、核酸、例えば発現ベクター、自己複製する核酸、ウイルス、組込み（integrating）核酸、および他のベクターまたは対象の核酸インサートを保持または操作するために使用される核酸が含まれる。濃縮されたｃＤＮＡは、組換え主鎖分子の集団における核酸インサート数の１５％以上に相当することが好ましい。さらに好ましくは、濃縮されたｃＤＮＡは、組換え主鎖分子の集団における核酸インサート数の５０％以上に相当する。大変好ましい実施形態では、濃縮されたｃＤＮＡは、組換え主鎖分子の集団における核酸インサート数の９０％以上（例えば、小数第３位までの９０〜１００％の任意の数、例えば９９．５％）に相当する。
【００５８】
本明細書において「組換えポリペプチド」という用語は、人工的に設計されたポリペプチド、およびそれらの元の自然環境において隣接するポリペプチド配列として見出されない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現したポリペプチドを指すために使用される。
【００５９】
本明細書で使用される「作動可能に連結される（された）」という用語は、機能上の関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を意味する。プロモーターなどの調節配列に「作動可能に連結される」配列とは、ＲＮＡポリメラーゼ開始および対象の核酸の発現を調節するために、前記調節因子が核酸に対して正しい位置および向きにあることを意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。
【００６０】
「ドメイン」という用語は、特定の生物学的性質を有するアミノ酸断片を意味する。この用語は、公知のすべての構造および線状の生物学的モチーフを包含する。かかるモチーフの例としては、限定されないが、ロイシンジッパー、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン結合部位、αヘリックス、およびβシート、タンパク質の分泌を指示するシグナルペプチド、翻訳後修飾の部位、酵素活性部位、基質結合部位、酵素切断部位が挙げられる。
【００６１】
これらの用語のそれぞれは明確な意味を有するが、「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」という用語は、本出願全体を通して互いに区別なく用いられる。「有する」という用語は「含む」と同じ意味を持ち、「からなる」という用語または「から本質的になる」という用語で置き換えることが可能である。
【００６２】
明細書において別段の指定がない限り、本発明のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのアミノ酸およびポリペプチドはそれぞれ隣接し、異種配列によって分断されない。
【００６３】
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性であろうと良性であろうと、過剰な細胞分裂から生じる異常細胞塊または細胞集団、およびすべての前癌および癌細胞および組織を意味する。「腫瘍」はさらに、２種類以上の物理的に関連する新生細胞として定義される。「形質転換細胞」、「悪性細胞」または「癌」は同義で用いられ、悪性転換を起こした細胞を意味し、芽球化現象を起こしたリンパ球も含まれる。形質転換細胞は、動物に注入した場合に腫瘍を引き起こす大きな能力を有し、通常、基層に接着する必要なく、増殖することができ、また接触阻害を欠いている。「癌」または「腫瘍性疾患」は、任意の組織における任意のタイプの癌を包含し、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。
【００６４】
細胞のプロセス、例えばアポトーシスに関して、「誘導」または「誘発」という用語は、所定の細胞集団において、そのプロセスを受ける細胞数、または細胞がそのプロセスを受ける速度を増加または低下することを意味する。その増加または低下は、正常の未処理またはネガティブコントロール細胞と比較して、少なくとも１．２５、１．５、２、５、１０、５０、１００、５００または１０００倍の増加または低下であることが好ましい。    
【００６５】
疾患または病状の治療に関して、「治療有効量」とは、疾患または病状のいずれかの徴候、外観、または特徴に、いずれかの検出可能な正の効果を有することが可能である化合物の量を意味する。
【００６６】
本明細書で使用される「死滅させる」または「細胞傷害性を誘導する」という用語は、アポトーシスおよび/またはネクローシスのいずれかによって細胞死を誘導することを意味し、それによって、本発明の実施形態は、アポトーシスのみ、ネクローシスのみ、およびアポトーシスとネクローシスの両方を含む。
【００６７】
本明細書で使用される「防ぐ」および「抑制する」という用語は、疾患または病状の物理的発現を防ぐために、疾患または病状の臨床症状が現れる前に、化合物を投与することを意味する。「予防」という用語は、「治療」とは異なり、「防ぐ」および「抑制する」を包含する。本明細書において、「防御」は、「予防」を含む。防御は、絶対的に有用である必要はない。
【００６８】
本明細書で使用される「治療（処置）する」という用語は、臨床症状が現れた後に化合物を投与することを意味する。本明細書で使用される「治療（処置）の必要がある」という用語は、個体または動物が治療を必要とする、または治療から恩恵を受けるだろうと介護人により下される判断を意味する。この判断は、介護人の知識の範囲にある様々な因子に基づいて下されるが、本発明による化合物による治療が可能な病状の結果として、個体または動物が病気である、または病気であるだろうという認識を含む。
【００６９】
本明細書で使用される「個体」または「患者」という用語は、任意の動物、例えば哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、最も好ましくはヒトを意味する。この用語は、雄または雌または両方を示すか、または雄または雌が考慮されない。
【００７０】
本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語は、任意の非ヒト動物、例えば昆虫、鳥類、げっ歯類、さらに一般的には哺乳動物などを意味する。好ましい非ヒト動物には：霊長類；ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ウサギなどの家畜；げっ歯類、好ましくはラットまたはマウスが含まれる。本明細書で使用される「動物」という用語は、動物界における任意の種、好ましくは脊椎動物、例えば鳥類および魚類、さらに好ましくは哺乳動物を指すために使用される。「動物」および「哺乳動物」の両方の用語は明確に、「非ヒト」という言葉が前に置かれていない限り、ヒト対象を含む。
【００７１】
本明細書で使用される「生理学的に許容される」、「薬学的に許容される」、および「薬学的な」という用語は、同義で使用される。
核酸またはポリペプチド間の同一性
「配列同一性のパーセンテージ」および「相同性パーセンテージ」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を示すために本明細書において同義で使用されており、比較ウィンドウ上で最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（つまり、ギャップ）を含む。そのパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、マッチ位置の数を得て、比較ウィンドウにおける位置の総数でマッチ位置数を割り、その結果を１００倍することによって計算され、配列同一性のパーセンテージが得られる。同一性または類似性は、当技術分野で公知の様々な配列比較アルゴリズムまたはプログラムのいずれかを用いて評価される。かかるアルゴリズムおよびプログラムには、決して限定されないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＦＡＳＴＤＢが含まれる(Pearson and Lipman, (1988), PNAS 85 (8): 24442448; Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410 ; Thompson et al. (1994), Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680; Higgins et al., (1996), Meth. Enzymol. 266: 383-402 ; Altschul et al., (1993), Nature Genetics 3: 266-272; Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6: 237-24)。
【００７２】
特に好ましい実施形態において、当技術分野でよく知られているベーシック・ローカル・アラインメント検索ツール(「ＢＬＡＳＴ」) を用いて、タンパク質および核酸配列同一性が評価される(例えば、Karlin and Altschul, (1990), PNAS 87: 2267-2268; Altschul et al., (1997), Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402を参照のこと）。特定の５つのＢＬＡＳＴプログラムを使用して、特に以下のタスクを実行する：
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３により、アミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮにより、ヌクレオチド問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸにより、問い合わせヌクレオチド配列（両方の鎖）の６つの枠の概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する；
（４）ＢＬＡＳＴＮにより、問い合わせタンパク質配列を、６つすべての読み枠において翻訳されたヌクレオチド配列（両方の鎖）データベースと比較する；
（５）ＢＬＡＳＴＸにより、ヌクレオチド問い合わせ配列の６つの枠の翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６つの枠の翻訳と比較する。
【００７３】
ＢＬＡＳＴプログラムは、問い合わせアミノ酸もしくは核酸配列と、タンパク質もしくは核酸配列データベースから得られることが好ましい試験配列との間の、本明細書において「高スコアのセグメント対」と呼ばれる類似セグメントを同定することによって相同配列を同定する。その多くが当技術分野で公知であるスコアリングマトリックスを用いることによって、高スコアのセグメント対を同定（つまり、アラインメント）することが好ましい。使用するスコアマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス(Gonnet et al., (1992), Science 256: 1443-1445; Henikoff and Henikoff, (1993), Proteins 17: 49-61)であることが好ましい。好ましさは低いが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用することができる（例えば、Schwartz and Dayhoff, (1978), eds., Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation参照)。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された高スコアのすべてのセグメント対の統計的有意性を評価し、好ましくはユーザーによって指定された相同性％など、ユーザーによって指定された有意性の閾値を満たすそれらのセグメントを選択する。高スコアのセグメント対の統計的有意性は、カーリンの統計的有意性の式（例えば、Karlin and Altschul, 1990参照）を用いて評価することが好ましい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ユーザーによって提供されるデフォルトパラメーターを用いて、または変更されたパラメーターを用いて使用することが可能である。
【００７４】
大域的配列アラインメントとも呼ばれる、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列（本発明の配列）と対象の配列との最高の全体的マッチを決定する他の好ましい方法は、Brutlag et al. (1990)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピューター・プログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列はどちらもＤＮＡまたはアミノ酸配列である。ＲＮＡ配列もまた、ＵをＴに変換することによって比較することができる。前記大域的配列アラインメントの結果は、同一性％で示される。同一性％を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメーターは：マトリックス＝ユニタリー、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ（Joining Penalty）＝３０、無作為化群長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短いほう。内部の欠失のためではなく、５’もしくは３’欠失（ヌクレオチド配列に関して）またはＮもしくはＣ末端欠失（アミノ酸配列に関して）のために、対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合には、手作業でその結果に訂正を加えなければならない。というのは、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、同一性％を計算する場合に対象配列の末端切断を計算に入れていないからである。手作業での訂正は、対象配列における切断のためにアラインされていない全問い合わせ配列のパーセントを決定することと、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントからこのパーセントを減算することを含む。この訂正されたスコアは、本発明の目的のために使用される。本発明の目的のために、他の手作業での訂正は加えられない。
本発明のポリヌクレオチド
本明細書に記載の方法の多くは、一般的な分子生物学的技術の使用に依拠する。いくつかのかかる技術が、一般に"Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 2d ed., Cole Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, et al., eds. , 1989、および"Methods in Enzymology; Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger and Kimmel eds., 1987で教示されている。
【００７５】
本発明は、ＧＥＮＳＥＴゲノムおよびｃＤＮＡ配列に関する。本発明は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子、ＧＥＮＳＥＴゲノムおよびｃＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド、ならびにその断片および変異体を包含する。これらのポリヌクレオチドは、精製、単離、または組換えポリヌクレオチドであることが可能である。
【００７６】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の対立遺伝子変異体、オルソロガス、スプライシングバリアント、および／または相同分子種もまた包含される。当技術分野で公知の手順を用い、本明細書に開示の配列およびＡＴＣＣに寄託されたクローン・プールからの情報を利用して配列番号:１〜２３の奇数番号の配列および寄託クローン・プールのクローンインサートの配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に相当する遺伝子およびｃＤＮＡの、完全長遺伝子およびｃＤＮＡ、対立遺伝子変異体、スプライシングバリアント、完全長コード部分、オルソログオ、および／または相同分子種が得られる。例えば、対立遺伝子変異体、オルソログおよび／または相同分子種は、当業者に公知のいずれかの技術、例えば「類似配列を見つけるために」というタイトルのセクションに記述されている技術などを用いて、本明細書に記載される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、対立遺伝子変異体および／または目的の相同体に対して適切な核酸ソースをスクリーニングすることによって単離および同定することが可能である。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも５、３０、５０、１００、１２５、５００、または１０００個の隣接ヌクレオチドである。その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、１．５ｋｂ、またはｌｋｂ以下の長さである。更なる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、いずれかのイントロンのすべてまたは一部を含まないが、本明細書に開示されるコード配列の一部を含む。別の実施形態では、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムフランキング遺伝子（genomic flanking gene）（つまり、ゲノムにおける対象の遺伝子に対して５’または３’）のコード配列を含有しない。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１個を超える天然ゲノムフランキング遺伝子のコード配列を含有しない。
本発明の寄託クローン・プール
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現は、そのｃＤＮＡ配列が添付の配列表に配列番号:１〜２３の奇数番号で示される、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子１個当たり少なくとも１つのｍＲＮＡ種の産生をもたらすことが示されている。これらのＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡ種に相当するｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ-(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社)ベクターまたはｐＰＴと呼ばれるベクター中でクローニングした。本発明のクローン化ｃＤＮＡを含有する細胞が、Genset, S. A. , 24 Rue Royale, 75008 Paris, Franceにて、発明者らによって永久寄託で保存された。表Ｉには、各配列番号に割り当てられるＧｅｎｓｅｔの内部指定番号を提供し、その配列が核酸配列（ＤＮＡ）かタンパク質（ＰＲＴ）配列かを示している。そのｃＤＮＡ配列はその配列内に相当する制限部位のいずれも含有しないという条件で、各ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ Ｐｓｔ Ｉ二重消化を行うことによって、挿入されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから、またはＭｕｎＩ ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化を行うことによってｐＰＴベクターから除去し、各クローンに対して適切な断片を生成することができる。代替方法としては、ベクターのマルチクローニング部位の他の制限酵素を用いて、製造元により指示されるように目的のインサートを回収することができる。
【００７８】
特定のポリヌクレオチドを含有する細胞がそれから得られる、配列表に記載のＧＥＮＳＥＴ遺伝子を含有する細胞のプールは、米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）（10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States）に寄託された、または寄託されるだろう。各ｃＤＮＡクローンは、これらの複合寄託のために、個々の細菌細胞（大腸菌）にトランスフェクトされている。
【００７９】
特定のクローンを含有する細菌細胞は、標準法を用いて、例えば複合寄託の培養物をプレーティングし、溶解されたコロニーをフィルターに移し、そのフィルターを標識プローブ、例えば対象のクローンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって、複合寄託から得られる。代替方法としては、ｃＤＮＡ挿入の両端で設計されたプライマー、例えばベクターのマルチクローニング部位で設計されたプライマーを用いたＰＣＲを利用して、細菌のプールから個々のｃＤＮＡインサートを回収することができる。
本発明のｃＤＮＡ配列
本発明のｃＤＮＡのそれぞれの構造パラメーターは、添付の配列表に示されている。それに応じて、本発明の各ｃＤＮＡのコード配列(ＣＤＳ)またはオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)は、開始コドンの最初のヌクレオチドで始まり、終止コドンの最初のヌクレオチドのすぐ５’側のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を意味する。同様に、本発明の各ｃＤＮＡの５'非翻訳領域（または５'ＵＴＲ）は、１番目のヌクレオチドで始まり、開始コドンの最初のヌクレオチドのすぐ５’側のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を意味する。本発明の各ｃＤＮＡの３'非翻訳領域（または３'ＵＴＲ）は、終止コドンの最初のヌクレオチドで始まり、そのｃＤＮＡの最後のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を意味する。
コード配列
本発明のその他の目的は、添付の配列表のポリヌクレオチド配列、寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡクローンインサートおよびその変異体のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列のコード配列を含む、単離、精製または組換えポリヌクレオチドである。
【００８０】
コード配列の範囲は、シーケンシングのエラー、逆転写または増幅のエラー、ｍＲＮＡスプライシング、コードされるタンパク質の翻訳後修飾、コードされるタンパク質の酵素切断、または他の生物学的因子の結果として、添付の配列表に示される配列と異なるであろうことは理解されよう。当業者であれば、配列表のポリヌクレオチド配列、寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡインサートおよびその対立遺伝子変異体のポリヌクレオチド配列におけるコード配列の範囲を容易に同定することができるだろう。したがって、配列表のポリヌクレオチド配列および寄託クローン・プールのｃＤＮＡインサートのポリヌクレオチド配列のうちの１つのコード配列を含有する核酸に関する、本明細書中のいずれかの請求の範囲は、添付の配列表に記載のコード配列から容易に特定できる変形形態または記載のコード配列の等価物を除外するものではない。以下に定義されるように、等価物は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにおける、アミノ酸変化をもたらさないまたは保存的アミノ酸置換をもたらすヌクレオチドコード配列のいずれかの変更を含む。同様に、ポリペプチドの範囲は、上記の因子のいずれかの結果として、添付の配列表に示されるものと異なるだろう。添付の配列表のポリペプチド配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する請求の範囲は、添付の配列表に記載の配列から容易に特定できる変形形態または記載の配列の等価物を除外するものではない。
【００８１】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子のコード配列を含有する上記のポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドを適切な発現シグナルの制御下に置いた場合に、目的の宿主細胞または目的の宿主生物中で発現させることが可能である。発現シグナルは、本発明のＧＥＮＳＥＴ遺伝子における調節領域に含まれるシグナルであるか、またはそれと異なり、外因性核酸調節配列であるシグナルのいずれかである。かかるポリヌクレオチドは、適切な発現シグナル下に置かれた場合、その発現および／または増幅のためにベクター中に挿入することも可能である。
【００８２】
更なる異種アミノ酸配列のコード配列に枠内で融合される、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに本発明に包含される。更なる非コード配列、限定されないが、例えば非コード５’および３’配列、ベクター配列、精製、プロービング、プライミングに使用される配列と共に、本発明のポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明に包含される。例えば、異種配列には、リボゾーム結合およびｍＲＮＡの安定性など、転写およびｍＲＮＡプロセッシングにおいて役割を果たす、転写、非翻訳配列が含まれる。代わりに、異種配列は、更なる機能性、例えばヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）またはＨＡタグを提供する更なるコード配列を含む場合がある。
本発明の調節配列
上述のように、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子のゲノム配列は、これらの遺伝子のエクソンを含有するＧＥＮＳＥＴポリペプチドコード領域に隣接する、非コード５’−フランキング領域において、おそらく、非コード３'-フランキング領域において、調節配列を含有する。
【００８３】
ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドの５'および３'調節領域から誘導されるポリヌクレオチドは、試験試料におけるＥＮＳＥＴ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列またはその断片の少なくとも複製の存在を検出するのに有用である。
好ましい調節配列
ＥＮＳＥＴポリペプチドコード領域の５’末端および３’末端に位置する調節因子を有するポリヌクレオチドは、対象の異種ポリヌクレオチドのプロセッシング、局在化、安定性、成熟および転写および翻訳活性を制御するのに有利に使用され、例えば：調節ポリヌクレオチドは、目的の宿主細胞または目的の宿主生物においてコード配列を発現させるのに使用することができる組換え発現ベクターの一部である（ＵＴＲの再検討に関しては、Decker and Parker, (1995) Curr. Opin. Cell. Biol. 7 (3): 36892, Derrigo et al., (2000) Int. J. Mol. Med. 5 (2): 111-23を参照のこと)。特に、３’ＵＴＲは、Makrides (1999) Protein Expr Purif 1999 Nov; 17 (2): 183-202、米国特許第５，９２５，５６４号；同第５，８０７，７０７号および同第５，７５６，２６４号を含む当業者に公知のいずれかの方法を用いて、組換えベクターにおいて異種ｍＲＡＮの安定性を制御するために使用される。
【００８４】
本発明は、５’および３’ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチド調節領域、それに相補な配列、調節活性断片およびその変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、精製または単離核酸、および厳密なハイブリダイゼーション条件下でそれとハイブリダイズする核酸にも関する。寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡクローンインサート、それに相補的な配列、調節活性断片およびその対立遺伝子変異体の、本明細書に記載のＧＥＮＳＥＴ ５'または３'調節配列、ならびに添付のポリヌクレオチド配列の５’−または３’−ＵＴＲのいずれかと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸もさらに包含される。５'および３'調節領域の断片は、２０から２０，０００のうちいずれか１つの整数個のヌクレオチドに相当する長さを有する。
【００８５】
本発明の目的では、核酸またはポリヌクレオチドは、前記調節ポリヌクレオチドが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有する場合、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドの発現に「調節領域」として「機能的」であり、かかる配列は、目的のポリペプチドまたは目的のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結される」。
【００８６】
本発明は、目的のポリペプチドをコードする核酸分子または対象の核酸分子も含み、前記核酸分子は、本明細書に記載の調節配列のいずれかに作動可能に連結される。その目的のポリペプチドは、原核生物ウイルスまたは真核生物由来のタンパク質を包含する、様々な性質または起源のポリペプチドであることが可能である。細胞内タンパク質などの真核生物タンパク質、例えば「ハウスキーピング」タンパク質、膜結合型タンパク質、例えばミトコンドリア膜結合タンパク質および細胞表面受容体、および分泌タンパク質、例えばサイトカインなどの内因性メディエーターも包含される。その目的のポリペプチドは、異種ポリペプチドまたはＧＥＮＳＥＴポリペプチドであることが可能である。
ポリヌクレオチド変異体
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体およびその断片に関する。本明細書で用語として用いられるポリヌクレオチドの「変異体（variant）」とは、参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。一般に、参照と変異体のヌクレオチド配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域においては、同一であるように、差異は限定されている。本発明は、対立遺伝子変異体と縮退変異体のどちらも包含する。
対立遺伝子変異体
ポリヌクレオチドの変異体は、天然に発生する対立遺伝子の変異体などの天然変異体であるか、または天然に発生することが分かっていない変異体である。「対立遺伝子変異体」によって、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代わりの形のうちの１つが意図される(Lewin, (1989), PNAS 86: 9832-8935参照)。２倍体生物は、対立遺伝子型に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される技術を含む、当技術分野で公知の変異生成技術によって、非天然のポリヌクレオチド変異体を作製することができる。
縮重変異体
本発明の単離ポリヌクレオチド、およびその断片の他に、本発明はさらに、遺伝暗号の縮重により本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドを引き続きコードする、上述の配列と実質的に異なる配列を含むポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチド変異体は、本出願全体を通して「縮重変異体」と呼ばれる。つまり、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする可能性のあるすべてのポリヌクレオチド配列が企図される。これは、遺伝暗号および当技術分野で公知の種特異的コドン選択を含む。
【００８７】
変異ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化はサイレントである場合があり、それは、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸は変化しないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチドの変化によって、参照配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断もまた生じる場合がある。置換、欠失または付加には、１つまたは複数のヌクレオチドが関与する。変異体は、コードもしくは非コード領域またはその両方において変化する。コード領域における変化によって、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加が引き起こされる。本発明のコンテクストにおいて、ポリヌクレオチド変異体が、ＧＥＮＳＥＴタンパク質と実質的に同じ生物学的性質または活性を保持するポリペプチドをコードすることを特徴とする実施形態が、好ましい実施形態である。保存的置換を含有するものが、さらに好ましいポリヌクレオチド変異体である。
類似ポリヌクレオチド
本発明の他の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、精製、単離または組換えポリヌクレオチドを提供する。ＧＥＮＳＥＴ生物活性を有するポリペプチドをコードする類似ポリヌクレオチドが好ましいが、特定の核酸分子が活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者であれば、例えばハイブリダイゼーション用プローブまたはプライマーとしてその核酸分子をどのように使用するかを知っているであろうことから、コードされるタンパク質におけるＧＥＮＳＥＴ生物活性の存在は必須ではない。ＧＥＮＳＥＴ活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、特に、ＤＮＡライブラリーからのＧＥＮＳＥＴ遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離、およびＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含有すると考えられる生体試料中のＧＥＮＳＥＴ  ｍＲＮＡ発現の、例えばノーザンブロット法またはＰＣＲ分析による検出が含まれる。
ハイブリダイズするポリヌクレオチド
その他の態様において、本発明は、厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、本発明のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離または精製核酸分子を提供する。かかるハイブリダイズするポリヌクレオチドは、１０から１０，０００の少なくともいずれか１つの整数個のヌクレオチドの長さであることが可能である。
【００８８】
当然、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡのいずれかの３’末端ポリＡ＋域（tract））のみにハイブリダイズする、またはＴ（もしくはＵ）残基の５’相補的ストレッチとハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の定義に含まれないだろう。というのは、かかるポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその補体（例えば、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて産生される実質的にいずれかの二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有するいずれかの核酸分子とハイブリダイズすると考えられるためである。
相補的ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本発明のいずれかのポリヌクレオチドに完全に相補的なヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供する。
ポリヌクレオチド断片
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドの一部または断片に関する。本発明のポリヌクレオチド断片の使用には、プローブ、プライマー、分子量マーカー、および本発明のポリペプチド断片を発現するための使用が含まれる。断片は、ａ)配列表のポリヌクレオチド配列、ｂ)ゲノムＧＥＮＳＥＴ配列、ｃ)本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｄ)寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡクローンインサートの配列、ｅ)寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡクローンインサートによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択されるポリヌクレオチドの一部を含む。特に、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、８００、１０００、１５００、または２０００個の連続するヌクレオチドを含む精製または単離ポリヌクレオチドが、本発明に包含される。さらに、少なくともＸヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供され、その「Ｘ」は、整数８と、配列表または本明細書の他で示される３’最高ヌクレオチド位置を表す整数との間のいずれかの整数として定義される。
【００８９】
好ましい本発明のポリヌクレオチドとして、それらの５'および３'位置に関して指定されるポリヌクレオチド断片がさらに包含される。特定の配列番号に関して５’最高ヌクレオチドが１番目であり、かつ３’最高ヌクレオチドが最後のヌクレオチドである、添付の配列表で示される位置番号によって５'および３'位置が表される場合、少なくとも８個の連続するヌクレオチド長さの本発明のポリヌクレオチド断片が本発明のポリヌクレオチド上を占めることが可能な、５'および３'ヌクレオチド位置のあらゆる組み合わせ相当するすべてのポリヌクレオチド断片が特に考えられる。ポリヌクレオチド断片のこれらの種類は、代わりに、式「ａ〜ｂ」によって示される；「ａ」はポリヌクレオチドの５’最高ヌクレオチド位置に等しく、「ｂ」は３’最高ヌクレオチド位置に等しく；さらに、「ａ」は１から、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの数−８の間の整数に等しく、「ｂ」は９から、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドの数の間の整数に等しく；「ａ」は「ｂ」よりも少なくとも８小さい整数である。これらの方法のいずれかで示されるポリヌクレオチド断片のすべてはすぐに認識することができ、したがって、不必要に明細書を長くするためだけにそれぞれに列挙しない。これらのポリヌクレオチド断片のいずれかは、本発明から具体的に除外される場合がある。上述のように、ヌクレオチドの５'および３'位置によって、またはヌクレオチドのサイズによって、指定される任意の数の断片が除外される。好ましい、除外される断片は、反復配列との、例えばＡｌｕ、ＬＩ、ＴＨＥおよびＭＥＲ反復配列、ＳＳＴＲ配列またはサテライト、マイクロサテライト、およびテロメア反復配列とのかなりの相同性を有する断片を含む。
【００９０】
本発明の他の好ましい断片は、ポリペプチドのドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。かかる断片を使用し、類似ドメインを有するポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて得られる。代替方法としては、これらの断片を使用し、特異的な生物学的性質を有するポリペプチドドメインを発現させることが可能である。
【００９１】
本発明の別の目的は、少なくとも（５から１，０００の間のいずれかの整数個の長さの連続アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも）５、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１５０または２００個の連続するアミノ酸の隣接スパンからなる、から本質的になる、を含む、ポリペプチドをコードする精製、単離または組換えポリヌクレオチドである。本発明はさらに、このセクションに示されるポリヌクレオチド断片の任意の組み合わせを包含する。
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ
本発明は、プライマーおよびプローブとして使用されるＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドの断片もまた包含する。ＧＥＮＳＥＴゲノムおよびｃＤＮＡ配列から誘導されるポリヌクレオチドは、試験試料におけるＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドまたはその断片、補体、または変異体の少なくとも複製の存在を検出するのに有用である。
構造上の定義
本発明のいずれかのポリヌクレオチドをプライマーおよびプローブとして使用することができる。本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、または１０００ヌクレオチドの隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。
【００９２】
増幅の目的のために、およそ同じＴｍを有するプライマー対が好ましい。プライマーは当技術分野で公知の方法を用いて設計することが可能である。本発明のコンテクストにおいて使用できる増幅技術には、限定されないが、ＥＰ-Ａ-３２０ ３０８、ＷＯ９３２０２２７およびＥＰ-Ａ-４３９ １８２に記載のリガーゼ連鎖反応 (ＬＣＲ)、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ)およびGuatelli et al., (1990) PNAS 35: 273-286およびCompton (1991) Nature 350 (6313) 91-92に記載の核酸配列に基づく増幅法(ＮＡＳＢＡ)、欧州特許出願第４５４４６１０号に記載のＱ−β増幅、Walker, et al. (1996), Clin. Chem. 42: 9-13およびＥＰ Ａ ６８４ ３１５に記載の鎖置換増幅、ＷＯ９３２２４６１に記載の標的仲介増幅（target mediated amplification）が含まれる。
【００９３】
本発明のプローブは、多くの目的に、例えばゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅産物の検出、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子またはｍＲＮＡ中のミスマッチの検出、およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに有用である。本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも好都合なことに、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズ、非磁気ビーズ（例えばポリスチレンビーズなど）、膜（例えば、ニトロセルロースストリップなど）、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスもしくはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適切な動物の）赤血球およびｄｕｒａｃｙｔｅなど、どの種類の固体担体にも固定化することができる。固体相に核酸を固定化するための適切な方法としては、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等が挙げられる。本明細書で使用される固体担体とは、可溶性であるか、またはその後の反応によって可溶性にすることができる任意の材料を意味する。固体担体は、捕捉剤（capture agent）を引き付け、かつ固定化するその固有の能力に関して選択することが可能であり、またはその代わりに、捕捉剤を引き付け、かつ固定化する能力を有する更なるアクセプターを保持することができる。本発明のポリヌクレオチドは、固体担体上に個々に、または１つの固体担体に対して少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０または２５個の別個の本発明のポリヌクレオチドのグループで引き付けるか、または固定化することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドと同じ固体担体に引き付けることが可能である。
オリゴヌクレオチドアレイ
複数種の本発明のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む基質を、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子における標的配列を検出または増幅するのに使用することが可能であり、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子のコードもしくは非コード配列中の変異を検出するのに使用することが可能であり、異なる組織中で、プロセスの異なる段階（胚の発生、疾患の治療）にて、本明細書の他の箇所で記載されている患者対健常な個体において、ＥＮＳＥＴ遺伝子発現を決定するのに使用することも可能である。
【００９４】
本明細書で使用される「アレイ」という用語は、遺伝子発現を特異的に検出するのに十分な長さの核酸の１次元、２次元、または多次元の配列を意味する。例えば、アレイは、本明細書に記載のＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡ、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡ、それに相補的な配列またはその断片のいずれかを含む。好ましくは、その断片は、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、または１００ヌクレオチドの長さである。
【００９５】
本明細書で提供されるいずれのポリヌクレオチドも、固体担体上に重複領域において、またはランダムな位置にて付着させることが可能である。代替方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、順序付きアレイにおいて付着させることが可能であり、そのアレイでは、各ポリヌクレオチドは、他のいずれかのポリヌクレオチドの付着部位と重複しない固体担体の別の領域に付着される。好ましくは、ポリヌクレオチドのかかる順序付きアレイは、その別個の位置が記録される「アドレス指定可能」であるように設計され、アッセイ手順の一部として評価することができる。アドレス指定可能なポリヌクレオチドアレイは通常、異なる既知の位置において基質表面に結合する、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置の正確な位置の知識によって、これらの「アドレス指定可能な」アレイはハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用となる。当技術分野で公知のいずれかのアドレス指定可能なアレイ技術、例えばＧｅｎｅｃｈｉｐｓ（登録商標）(例えば、米国特許第５，１４３，８５４号;国際公開番号：ＷＯ９０/１５０７０およびＷＯ９２/１００９２、Fodor et al., (1991) Science 251: 767-777を参照)などを、本発明のポリヌクレオチドと共に使用することができる。固体担体上へのオリゴヌクレオチドアレイの固定化は、「非常に大きなスケールの固定化ポリマー合成（Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis）」(ＶＬＳＩＰＳ（登録商標）)として一般的に認められている技術を開発することによって可能となり、その技術では通常プローブが、高密度アレイにおいてチップの固体表面に固定化される（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号および同第５，４１２，０８７号、国際公開番号：ＷＯ９０/１５０７０、ＷＯ９２/１００９２およびＷＯ９５/１１９９５を参照のこと)。ＷＯ９４/１２３０５、ＷＯ９４/１１５３０、ＷＯ９７/２９２１２およびＷＯ９７/３１２５６に開示の方法など、当技術分野で公知のの更なる作製法を用いることが可能である。
【００９６】
したがって、本発明は、少なくとも１つ、２つ、または５つの本発明のポリヌクレオチド、特に本明細書に記載のプローブまたはプライマーを含む核酸分子のアレイに関する。
本発明のポリヌクレオチドを作製する方法
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを作製する方法も含む。本発明のポリヌクレオチドは、当業者によく知られている技術、例えば本明細書に記載の増幅またはハイブリダイゼーションに基づく方法を用いて、酵素的に、または化学的に合成することができる。
【００９７】
核酸を合成する様々な化学的方法が当業者には知られている。これらの方法の多くでは、固体担体上で合成が行われる。代替方法としては、米国特許第５，０４９号に記載のように、ポリヌクレオチドを作製することができる。一部の実施形態において、上述のように作製したいくつかのポリヌクレオチドを共にライゲートして、目的の配列を有するより長いポリヌクレオチドが生成される。
本発明のポリペプチド
「ＧＥＮＳＥＴポリペプチド」という用語は、本発明のタンパク質およびポリペプチドのすべてを含めるために、本明細書において使用される。本発明は、（ａ）配列番号:２〜２４の偶数番号の完全長ポリペプチド；（ｂ）寄託クローン・プールのクローンインサートによってコードされる完全長ポリペプチド;(ｃ)配列番号:２〜２４の偶数番号の、エピトープを有する断片；（ｄ）寄託クローン・プールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドの、エピトープを有する断片；（ｅ）配列番号:２〜２４の偶数番号のポリペプチドのドメイン；（ｆ）寄託クローン・プールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのドメイン；（ｇ）配列番号:２〜２４の偶数番号の、または寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドのシグナルペプチド；（ｈ）配列番号:２〜２４の偶数番号の、または寄託クローン・プールのヒトｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチド；および（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異ポリペプチド；からなる組換え、単離または精製ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを含む、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを包含する。本発明の他の目的は、本発明のポリペプチドによってコードされるポリペプチドならびにかかるポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。
ポリペプチド変異体
本発明はさらに、対立遺伝子によってコードされるＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびスプライシングバリアント、オルソログ、および／または相同分子種を提供する。当技術分野で公知の手順を用いて、配列表のポリペプチドおよび寄託クローン・プールのクローンインサートによりコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体、スプライシングバリアント、オルソログ、および／または相同分子種を、本明細書に開示の配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンからの情報を用いて得ることができる。
【００９８】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドと少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、またさらに好ましくは７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。本発明の問い合わせアミノ酸配列と、例えば少なくとも９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドというのは、対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列のアミノ酸１００個それぞれにつき５個までのアミノ酸の変更を含み得ることを除いては、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、問い合わせ配列と同一であることを意味する。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の５％（１００個のうち５個）までが挿入、欠失（インデル）されるか、または別のアミノ酸で置換される。
【００９９】
本発明の更なるペプチドには、上述のポリペプチドと、少なくとも９０％の類似性、好ましくは少なくとも９５％の類似性、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の類似性を有するポリペプチドが含まれる。計算することを目的として、一致するアミノ酸が同一であるか、または以下に定義される「同等な」変化を表すアミノ酸であり得ることを除いては、「類似性」は、「同一性」について上述されるのと全く同様に計算される。
【０１００】
参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置またはこれらの末端位置間のどこかで生じ、参照配列中の残基間に個々に、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基中に散在する。当業者であれば、生物活性を欠く変異ポリペプチドが依然として、例えばワクチンとして、抗体を作製するのに、エピトープマッピングにおいてエピトープ標識として、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして有用であることを認識されるように、本明細書に記載の変異ポリペプチドは、それらが正常な生物活性を有するかどうかにかかわらず本発明に包含される。
本発明のポリペプチドの作製
本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知のいずれかの適切な手法で作製することができる。かかるポリペプチドには、単離天然ポリペプチド、組換えにより作製されたポリペプチド、合成的に作製されたポリペプチオド、またはこれらの方法の組み合わせによって作製されたポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドは、単離状態で提供されることが好ましく、一部または好ましくはほとんど完全に精製することが可能である。
自然源からの単離
本発明のＧＥＮＳＥＴタンパク質は、ヒトまたは非ヒト動物の直接単離された細胞だろうと、または培養細胞だろうと、自然源、例えば体液、組織および細胞から単離することができる。天然タンパク質を抽出かつ精製する方法は当技術分野で公知であり、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を乱し、続いてポリペプチドの差次的抽出（differential extraction）およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる分離を行い、密度によって沈降させ、ゲル電気泳動を行うことを含む。例えば、タンパク質の様々な精製方法に関しては「Methods in Enzymology, Academic Press, 1993」を参照のこと。本発明のポリペプチドはまた、本発明のポリペプチドに対して作られる抗体を用いて、標準法により自然源から精製することができる。
組換え源からの単離
本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドは、当技術分野で公知の通常の発現方法を用いて組換えにより作製することが好ましい。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いずれかの簡便な宿主に適した発現ベクター中で、プロモーターに作動可能に連結される。真核生物および原核生物の宿主系のどちらも、組換えポリペプチドの形成に使用される。次いで、そのポリペプチドを溶解細胞または培地から単離し、その目的の用途に必要とされる程度まで精製される。いずれかの本発明のポリヌクレオチドを使用して、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現させることができる。
【０１０１】
その結果、本発明の更なる実施形態は、本発明のポリペプチドを作製する方法であり、前記方法は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチド(例えば、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)を提供する段階と、ｃＤＮＡがプロモーターに作動可能に連結されるように、発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入する段階と、宿主細胞中にその発現ベクターを導入し、それによって、前記宿主細胞が前記ポリペプチドを生成する段階と、を含む。この実施形態の一態様において、この方法はさらに、ポリペプチドを単離する段階を含む。いずれかの適切な発現ベクターおよび発現系（例えば、３Ｔ３細胞などの細胞ベース系）を当技術分野でよく知られている方法に従って使用してもよい。
【０１０２】
一実施形態において、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡの全コード配列およびそのｃＤＮＡの３'ＵＴＲからポリＡシグナルが発現ベクター中でプロモーターに作動可能に連結される。
【０１０３】
別の実施形態において、分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基など、精製の助けとなる配列、または組換え体作製中に安定性を得るためのその他の配列をコードする、更なるヌクレオチド配列が包含される。
【０１０４】
代替方法としては、発現させるＧＥＮＳＥＴポリペプチドは、遺伝子導入動物の産物、つまり、対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または胚細胞によって特徴付けられる遺伝子導入雌ウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の成分としての産物であることも可能である。
【０１０５】
差次的抽出、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、抗体に基づく方法、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、免疫クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含むこれらの方法を用いて、発現したＧＥＮＳＥＴポリペプチドを回収するために、いずれかの標準法が用いられる。
【０１０６】
組換え体作製手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよく、宿主仲介プロセスの結果として場合によっては、最初の修飾メチオニン残基を含んでもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、アミノ末端メチオニンを含有してもよいし、または含有しなくてもよい。
化学合成からの単離
さらに、本発明のポリペプチド、特に短いタンパク質断片は、当技術分野で公知の技術（例えば、Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co. 2nd Ed. , T. E. , New York; and Hunkapiller etal., (1984) Nature. 310 (5973): 105-11参照)を用いて化学的に合成することができる。例えば、本発明のポリペプチド 配列の断片に相当するポリペプチドは、ペプチド合成装置を使用して合成することができる。代替方法としては、米国特許第５，０４９，６５６号に記載の方法を使用することができる。  さらに、所望の場合には、非古典的アミノ酸または化学アミノ酸類自体を、ポリペプチド配列中に置換または付加で導入することができる。非古典的アミノ酸には、限定されないが、一般的アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー・アミノ酸、例えばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体全般が含まれる。さらに、そのアミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることが可能である。
修飾
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解性切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合により、翻訳中または翻訳後に差次的に修飾されるポリペプチドを包含する。数多くの化学修飾のいずれも、公知の技術、限定されないが例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成等によって行うことができる。
【０１０７】
本発明により包含されるその他の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ−結合型またはＯ−結合型糖鎖、Ｎ−末端またはＣ-末端の処理、アミノ酸主鎖への化学部位の結合、Ｎ−結合型またはＯ−結合型糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞の発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる。タンパク質を検出および単離することできるように、ポリペプチドを検出可能な標識、例えば酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識で修飾してもよい。
【０１０８】
更なる利点、例えばポリペプチドの増大した溶解性、安定性および循環時間、または減少した免疫原性を提供する、本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体も本発明によって提供される(例えば、米国特許第４，１７９，３３７号参照)。誘導体化のための化学部位は、ポリエチレングリコール(好ましくは、１〜１００ｋＤ)、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマー（分枝鎖または枝なし鎖)から選択することができる。ポリペプチドは、分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾され、１つ、２つ、３つ以上の結合化学部位を含む。その化学部位は、いずれかの方法、例えば遊離アミノ、カルボキシルまたはスルフヒドリル基を介して結合される（例えば、ＥＰ ０ ４０１ ３８４、またはMalik et al., (1992), Exp. Hematol. 20: 1028-1035参照)。
多量体化
本発明のポリペプチドは、単量体または多量体（つまり、二量体、三量体、四量体以上の）形であることが可能である。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの単量体または多量体、それらの製造、およびそれらを含有する組成物に関する。
【０１０９】
本発明によって包含される多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであることが可能である。本明細書で使用される「ホモマー」という用語は、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含有する多量体を意味し、「ヘテロマー」という用語は、１つまたは複数の異種ポリペプチドを含有する多量体を意味する。
【０１１０】
本発明の多量体は、疎水、親水、イオンおよび／または共有結合の結果であり、かつ／または間接的に連結される。このように、一実施形態において、本発明の多量体、例えばホモ二量体またはホモ三量体などは、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触すると形成される。別の実施形態では、本発明のヘテロ多量体、例えばヘテロ三量体またはヘテロ四量体などは、本発明のポリペプチドが溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触すると形成される。他の実施形態では、本発明の多量体は、ポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋によって形成される。これらの結合のいずれにも、配列表に示される、あるいは融合タンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質、破骨細胞形成阻害因子（osteoprotegerin）融合タンパク質、ペプチドリンカー融合タンパク質、Ｆｌａｇ（登録商標）融合タンパク質、または本発明のロイシンジッパー融合タンパク質の異種ポリペプチド配列に示される、アミノ酸に含有される１つまたは複数のアミノ酸残基が関与する（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号、ＷＯ９８/４９３０５、または米国特許第５，０７３，６２７号、Landschulz et al., (1988), Science. 240: 1759、WO 94/10308、Hoppe et al., (1994), FEBS Letters. 344: 191 および米国特許出願第０８／４４６，９２２号参照）。多量体を生成する他の方法としては、当技術分野で公知の技術を用いて、または本発明の多量体に含まれることが望まれるポリペプチド成分を含有するリポソームを生成することによって、システインまたはビオチンをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付加する方法が挙げられる（例えば、多量体化の多数の方法については、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１１１】
本発明の多量体は、当技術分野で公知の化学的または遺伝子工学技術を用いて生成することができる。
突然変異したポリペプチド
本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドの特性を改善または変更するために、組換えＤＮＡ技術を用いて、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加を含む新規な変異タンパク質または突然変異タンパク質（ムテイン）を生成することができる。かかる修飾ポリペプチドは、例えば増大した／減少した生物活性または増大した／減少した安定性を示し得る。さらに、少なくとも特定の精製および貯蔵条件下にて、相当する天然ポリペプチドよりも、それらを高い収量で精製することが可能であり、かつ相当する天然ポリペプチドよりも、それらは優れた溶解性を示し得る。
ＮおよびＣ末端の欠失
生物学的機能を実質上損失することなく、１つまたは複数のアミノ酸をＮ末端またはＣ末端から欠失させることが可能であることは、当技術分野で公知である（例えば、Ron et al., (1993), Biol Chem. , 268 2984-2988; Dobeli, et al. 1988を参照のこと)。したがって、本発明は、アミノおよび／またはカルボキシ末端から欠失された１つまたは複数の残基を有するポリペプチドを提供する。
他の突然変異
本発明は、かなりのＧＥＮＳＥＴポリペプチド活性を示すＧＥＮＳＥＴポリペプチドの多数の変異を含む。かかる突然変異は、活性にほとんど影響を及ぼさないように、当技術分野で公知の規則に従って選択される欠失、挿入、転化、反復および置換を含む。
【０１１２】
変化させるアミノ酸配列の耐性を研究するための主な２つのアプローチがある(Bowie et al., (1994), Science. 247: 1306-1310参照)。第１の方法は、突然変異が自然淘汰によって受け入れられるか、または拒絶される、進化のプロセスに依拠する。第２のアプローチでは、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子操作、および機能性を保持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを用いる。この例としては、特定部位の突然変異またはアラニンスキャン突然変異誘発が挙げられる(例えば、Cunningham et al. (1989), Science 244: 1081-1085参照)。これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど耐性であることを明らかにした。
【０１１３】
通常、脂肪族アミノ酸、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＰｈｅ間での互いの置き換え、ヒドロキシ残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置き換えは、保存的置換として考えられる。このように、本発明のポリペプチドは例えば、アミノ酸残基のうちの１つまたは複数が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるポリペプチドである。かかる置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、またはそうでなくてもよく、かつ置換基を含むことができる。
【０１１４】
示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に著しく影響を及ぼさない、保存的アミノ酸置換などの変化が軽微なものであることが好ましい。以下のアミノ酸の群が同等の変化を表す：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。
【０１１５】
さらに、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドは、修飾アミノ酸を模倣する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。この種類の置換の例としては、リン酸化アミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の負電荷に類似する負に帯電したアミノ酸で、リン酸化することができるアミノ酸（例えば、セリン、トレオニンまたはチロシン）を置換することが挙げられる。疎水基（例えば、アルギニン）により修飾することができるアミノ酸を、トリプトファンまたはフェニルアラニンなどのバルキーな疎水性側鎖を有するアミノ酸で置換することもまた包含される。したがって、本発明の特定の実施形態は、修飾することができるアミノ酸が通常位置する位置で、修飾アミノ酸を模倣する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含むＧＥＮＳＥＴポリペプチドを包含する。さらに、修飾することができるいずれかのＧＥＮＳＥＴポリペプチドアミノ酸は、修飾−模倣アミノ酸での置換から除外されてもよい。
【０１１６】
本発明による対象の修飾ＧＥＮＳＥＴペプチド分子の特定の実施形態には、限定されないが、タンパク分解に耐性があり、その−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が、（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロインベルソ（retro inverso）結合、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ２Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ２）ケトメチレン結合、（ＣＨＯＨＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルケン結合またはまたは−ＣＨ＝ＣＨ−結合によって修飾または置換されるペプチドである、ペプチド分子が含まれる。
【０１１７】
凝集が少ないなど、非常に望ましい改善された特性を有するタンパク質を生成することができる他の荷電アミノ酸または天然アミノ酸での荷電アミノ酸の置換は、特別に関心のある対象である。凝集は活性を減少させるだけではなく、凝集塊が免疫原性であり得るために、製剤を製造する場合に問題となる（例えば、Pinckard et al., (1967), Clin. Exp. Immunol 2: 331-340; Robbins et al., (1987), Diabetes. 36: 838845; および Cleland et al., (1993) Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst. 10: 307-377参照)。
【０１１８】
本発明の更なる実施形態は、１〜５０のうちの少なくともいずれか１つの整数個の保存的アミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を有する、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。いずれかの保存的置換または置換の組み合わせもま除外され得る。
ポリペプチド断片
構造上の定義
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの断片に関する。さらに具体的には、本発明は、６〜１００の間の少なくともいずれか１つの整数個（または、その長さが１０００未満である場合、ポリペプチドアミノ酸残基−１の長さ）の連続アミノ酸残基を含む、精製、単離、および組換えポリペプチドを具体化する。その断片は、本発明のポリペプチドの少なくとも６、好ましくは少なくとも８〜１０、さらに好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５，２００、２２５、２５０、２７５、または３００個の連続アミノ酸であることが好ましい。
【０１１９】
上記のポリペプチド断片の他に、ポリペプチドのさらに好ましい亜属は、少なくともＸ個のアミノ酸を含み、その「Ｘ」は、整数６と、以下の配列表のポリペプチド配列を含む本発明のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を表す整数との間のいずれかの整数として定義される。さらに、Ｎ末端およびＣ末端位置の点からさらに指定される、上述のような少なくとも６アミノ酸長さのポリペプチド断片の種類が含まれる。しかしながら、上述のように少なくとも６アミノ酸長さのすべてのポリペプチド断片が個々の種類として本発明に包含され、Ｎ末端およびＣ末端位置によって個々に指定される。つまり、少なくとも６隣接アミノ酸残基長さの断片が、配列表のまたは本発明の所定のいずれかのアミノ酸配列を占有することがあり得る、Ｎ末端およびＣ末端位置のどの組み合わせも、本発明に包含される。
【０１２０】
配列表の偶数配列番号の配列のアミノ酸を含む好ましいポリペプチド断片、およびそれをコードするポリヌクレオチドは、１位で始まり、かつ６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、および７８６からなる群から選択されるいずれかの位置まで連続する、アミノ酸配列からなる群から選択され、いずれか１つの断片を含むアミノ酸配列の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致している。
【０１２１】
配列表の偶数配列番号の配列のアミノ酸を含むさらに好ましいポリペプチド断片、およびそれをコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質の末端アミノ酸（例えば、７８７位）で終わり、かつ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、および７８２からなる群から選択されるいずれかの位置で始まる、アミノ酸からなる群から選択され、いずれか１つの断片を含むアミノ酸配列の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致する。
【０１２２】
配列表の偶数配列番号のさらに好ましいポリペプチド断片、およびそれをコードするポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、および７３８からなる群から選択されるアミノ酸位置から始まる、いずれかの５０または１００連続アミノ酸を含む断片からなる群から選択され、いずれか１つの断片を含むアミノ酸配列の番号付けは、配列表のいずれか１つの偶数配列番号のポリペプチド配列と一致する。
【０１２３】
これらの特定の実施形態、および本明細書に記載の他のポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片の実施形態は、「少なくとも」、「等しい」、「以下」、「未満」、「少なくとも＿だが＿を超えない」または「＿から＿まで」の指定のサイズまたは指定のＮ末端および／またはＣ末端位置であるように修飾される得る。本発明のいずれかの実施形態を説明するのに使用されるすべての範囲は、別段の指定がない限り包含的であることに留意のこと。
【０１２４】
代わりに、本発明の上記の種類のポリペプチド断片は、式「ａ〜ｂ」によって示される；式中、「ａ」はポリヌクレオチドのＮ末端最高アミノ酸位置に等しく、「ｂ」はポリヌクレオチドのＣ末端最高アミノ酸位置に等しく；さらに「ａ」は、１から、本発明のポリペプチド配列のアミノ酸番号−６の間の整数に等しく、かつ「ｂ」は、７から、本発明のポリペプチド配列のアミノ酸番号の間の整数に等しく；「ａ」は、「ｂ」よりも少なくとも６小さい整数である。
【０１２５】
本発明の上記のポリペプチド断片は、上記の説明を用いてすぐに認識することができ、したがって、不必要に明細書を長くするためだけにそれぞれ列挙しない。これらのポリヌクレオチド断片のいずれかは、本発明から具体的に除外される場合がある。さらに、ＧＥＮＳＥＴ生物活性を有するポリペプチドが本発明の好ましい実施形態ではあるが、不活性断片でさえ、例えばイムノアッセイ、エピトープマッピング、エピトープタギングにおいて、ワクチン、分子量マーカーとして、ポリペプチドの特定部分に対する抗体を作製するのに有用であることから、上記の断片はＧＥＮＳＥＴ生物活性を有する必要はない。
機能的定義
ドメイン
本発明の好ましいポリヌクレオチド 断片は、本発明のポリペプチドのドメインを含む。かかるドメインは最終的に、限定されないが、ロイシンジッパー、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、翻訳後修飾部位、例えばグリコシル化部位、ユビキチン結合部位、αヘリックス、βシート、コードされるタンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関係する配列、例えばホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位を含む、線状または構造モチーフおよびシグネチャー（signature）を含み得る。かかるドメインは、特定の生物活性、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ結合、タンパク質分泌、転写調節、酵素活性、基質結合活性等を示す。
【０１２６】
好ましい実施形態において、ドメインは、６〜１００の間のいずれかの整数個の、いくつかのアミノ酸を含む。ドメインは、本明細書に開示の方法を含む、当業者に公知のいずれかの方法を用いて合成することができる。特定の生物活性を有するドメインを構成するアミノ酸を決定する方法としては、試験すべき生物活性を決定する突然変異誘発研究およびアッセイ、ならびに例えばＰｒｏｓｉｔｅ(Hofmann et al., (1999) Nucl. Acids Res. 27: 215-219; Bucher and Bairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman et al, Eds. , pp53-61, AAAIPress, Menlo Park)、Ｐｆａｍ(Sonnhammer, et al., (1997) Proteins. 28 (3): 405-20; Henikoff et al., (2000) Electrophoresis 21 (9): 1700-6; Bateman etal., (2000) Nucleic Acids Res. 28 (1) : 263-6)、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｒｉｎｔ、Ｐｒｏｄｏｍ、Ｓｂａｓｅ、Ｓｍａｒｔ、Ｄａｌｉ/ＦＳＳＰ、ＨＳＳＰ、ＣＡＴＨ、ＳＣＯＰ、ＣＯＧなどのデータベースで、ドメイン、モチーフ、またはシグネチャーを識別するバイオインフォマティクス的方法が挙げられる。利用可能なデータベースの説明については、Nucleic Acid Research (2000)の２８巻,１号を参照のこと。
エピトープおよび抗体融合：
本発明の好ましい実施形態は、エピトープを有するポリペプチドおよびエピトープを有するポリペプチド断片に関する。これらのエピトープは、「抗原エピトープ」または「抗原エピトープ」と「免疫原性エピトープ」の両方である。「免疫原性エピトープ」は、ポリペプチドが免疫原である場合、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答を誘導するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合するポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗原エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は一般に、抗原エピトープの数よりも少ない（例えば、Geysen et al., (1984), PNAS 81: 3998-4002参照)。特定のエピトープは免疫原性ではないが、それにもかかわらず、抗体を免疫原性および抗原エピトープの両方にすることができることから、それは有用であることを特に留意のこと。本発明のエピトープは、線状（つまり、ポリペプチド鎖に沿って繰り返すアミノ酸の隣接配列で構成される）または非線状（「高次構造的」とも呼ばれる、つまり、ポリペプチド鎖の折り畳みの結果として近接するようになるアミノ酸で構成される）であり得る。
【０１２７】
エピトープは、エピトープに固有な空間的コンフォメーションにおいて３個と少ないアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも６個のかかるアミノ酸、およびさらにしばしば、少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、抗原エピトープは、３〜５０の間のいずれかの整数個の、いくつかのアミノ酸を含む。エピトープとして機能する断片は、いずれかの従来の手段（例えば、Houghten (1985), PNAS 82: 5131-5135)、さらに米国特許第４，６３１，２１号にも記載されている手段を参照）によって作製することが可能である。エピトープを構成するアミノ酸を決定する方法としては、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング、例えばGeysen, et al. (1984)；ＷＯ８４／０３５６４；およびＷＯ８４／０３５０６に記載のペプスカン（Pepscan）法などが挙げられる。非線状エピトープは、タンパク質のフットプリンティング法（米国特許第５，６９１，４４８号）などの方法によって決定される。その他の例としては、Jameson and Wolf, (1988), Comp. Appl. Biosci. 4: 181-186のアルゴリズムが挙げられる。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原分析は例えば、ＰＲＯＴＥＡＮコンピューター・プログラムを使用して、デフォルトパラメーター(Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ４．０，ＤＮＡＳＴＡＲ社（ウィスコンシン州マディソン,サウスパークストリート1228））を用いて行われる。標準法を用いた抗原応答についての試験によって、ｉｎ ｖｉｖｏでエピトープもまた同定される。
【０１２８】
少なくとも６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００アミノ酸残基の長さの、本発明のすべての断片は、線状抗原エピトープとして有用であることから本発明に含まれる。免疫原性として具体的に説明されていない本発明のポリペプチドは、それらがｉｎ ｖｉｖｏで抗原性であることから、非抗原性とは見なされない。本発明のエピトープを有する断片は、本発明のポリペプチドの６〜５０（つまり、６から５０までの間のいずれかの整数）個のアミノ酸を含むことが好ましい。また、本発明のエピトープを有する任意の数の断片は除外される。
【０１２９】
非線状エピトープは、少なくとも１つのアミノ酸それぞれの、１つを超える非隣接ポリペプチド配列を含む。かかるエピトープは、二次、三次、または四次構造の特徴によって近接するようになる非隣接ポリペプチドから生じる。非線状エピトープを提供する好ましいポリペプチドは、負に折り畳まれたタンパク質の隣接表面によって形成され、したがって、本発明のポリペプチドの少なくとも１０アミノ酸、さらに好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００アミノ酸の長さである。さらに、非線状エピトープは、負のコンフォメーションにおいてタンパク質上に正常に提示される抗原部位または隣接表面を模倣する合成ペプチドによって形成される。
【０１３０】
免疫原性エピトープは、動物系（ウサギまたはマウスなど）に、アルブミンなどの担体タンパク質と共に提示されるか、またはそれが十分長い場合（少なくとも約２５個のアミノ酸）には、担体なしで提示される。しかしながら、８〜１０個と少ないアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、最低限でも、変性ポリペプチドにおける線状エピトープに結合することができる抗体を産生するのに十分であることが示されている（例えば、ウエスタンブロット法において）。
【０１３１】
本発明のエピトープを有するポリペプチドを使用して、当技術分野でよく知られている方法、限定されないが、例えばｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫化、ファージディスプレイ法（例えば、上記のSutcliffe, et al.; 上記のWilson, et al.および上記のBittle, et al.参照)などに従って、抗体が誘導される。ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化を用いる場合、動物を遊離ペプチドで免疫することができる；しかしながら、抗ペプチドの抗体価は、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドなどの標準法を用いて、巨大分子担体にペプチドを結合することによって高められる。例えば、ペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントアジュバント約１００μｇを含有するエマルションを腹腔内および／または皮内注射することによって、ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物が、遊離もしくは担体結合ペプチドのいずれかで免疫される。例えばＥＬＩＳＡアッセイによって固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いて検出することができる、抗ペプチド抗体の有用な抗体価を得るために、例えば約２週間間隔に数回のブースター注射が必要とされる場合がある。免疫動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の抗体価は、当技術分野でよく知られている方法に従って、抗ペプチド抗体の選択によって、例えば、固体担体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶離によって高められる。
【０１３２】
当業者であれば、免疫原性または抗原エピトープを含む、上述される本発明のポリペプチドを、異種ポリペプチド配列に融合することができることは理解されよう。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンの定常ドメイン(ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ)、またはその一部(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、全ドメインおよびその一部の両方を含むそのいずれかの組み合わせ）と融合することが可能であり、その結果キメラポリペプチドが生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、かつｉｎ ｖｉｖｏで半減期の増加を示す(例えば、ＥＰＡ０，３９４，８２７;およびTraunecker et al., (1988), Nature. 331: 84-86;Fountoulakis et al., (1995) Biochem. 270: 3958-3964参照)。本発明のその他の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、またはコドンシャッフリングの技術によって作製することが可能である（総称して「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる；例えば、米国特許第：５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３４，２５２号；同第５，８３７，４５８号;およびPatten, et al. (1997), Curr Opinion Biotechnol.8: 724-733 ; Harayama (1998), Trends Biotechnol. 16 (2): 76-82; Hansson et al., (1999), J. Mol.Biol. 287: 265-276;およびLorenzo and Blasco (1998) Biotechniques. 24 (2): 308-313を参照のこと)。本発明はさらに、このセクションに示されるポリペプチド断片のいずれかの組み合わせも包含する。
抗体
定義
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、さらに具体的には、本発明のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体には、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む)、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹが含まれる。「抗体」（Ａｂ）という用語は、少なくとも１つの結合ドメインで構成されるポリペプチドまたはポリペプチドの群を意味し、結合ドメインは抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成されて、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する三次元結合空間が形成され、それによって抗原との免疫反応が可能となる。本明細書に使用される「抗体」という用語は、単鎖全抗体を含む全抗体、およびその抗原結合断片を包含することを意味するものである。好ましい実施形態において、抗体は本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'Ｆ(ａｂ)２およびＦ(ａｂ')２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶLもしくはＶHドメインのいずれかを含む断片が含まれる。抗体は、鳥類および哺乳動物を含むいずれかの動物起源に由来する抗体であることが可能である。その抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来のものであることが好ましい。
【０１３３】
単鎖抗体を含む、抗原結合抗体断片は、単独で、または以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部との組み合わせで、可変領域（１つまたは複数）を含み得る。可変領域（１つまたは複数）およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのいずれかの組み合わせも、本発明に包含される。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合するキメラ、ヒト化およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプの抗体を含む。
【０１３４】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、および三重特異性であるか、またはそれ以上の多重特異性を有することが可能である。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または本発明のポリペプチドならびに異種組成物、例えば異種ポリペプチドまたは固体担体材料のどちらにも特異的である。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt, et al., (1991), J. Immunol. 147: 60-69；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Kostelny et al., (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553を参照のこと。
【０１３５】
本発明の抗体は、抗体によって認識されるまたは特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープ（１つまたは複数）またはエピトープを有する部分に関して説明されるか、または指定される。その抗体は、本発明の核酸によりコードされる完全タンパク質またはその断片に特異的に結合し得る。また、本発明のいずれかのエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体は、個々の種として除外され得る。
【０１３６】
このように、本発明の他の実施形態は、本発明のポリペプチドのいずれかに特異的に結合することができる精製または単離抗体である。この実施形態の一態様では、その抗体は、本発明のポリペプチドの、少なくとも６連続アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０連続アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００連続アミノ酸を含む、線状エピトープ含有ポリペプチドに結合することができる。この実施形態の別の態様では、その抗体は、長さで、本発明のポリペプチドの１０アミノ酸、さらに好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、または１００アミノ酸を含む非線状エピトープ含有ポリペプチドに、さらに好ましくは本発明のポリペプチドの天然コンフォメーションの隣接表面に、結合することができる。
【０１３７】
本発明の抗体はまた、それらの交叉反応性の面から説明または指定される。本発明のポリペプチドの他のいずれかの類似体、オルソログ、またはホモログに特異的に結合しない抗体が包含される。本発明のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満の同一性（当技術分野で公知かつ本明細書の記載の方法を用いて、例えば、ＦＡＳＴＤＢおよび本明細書に示されるパラメーターを用いて計算された）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に包含される。厳密なハイブリダイゼーション条件（本明細書に記載の）下にて本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに単に結合する抗体が、さらに本発明に包含される。本発明の抗体はまた、それらの結合親和性に関して説明または指定される。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-1lＭ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-l3Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-l4Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが挙げられる。
【０１３８】
本発明は、突然変異ＧＥＮＳＥＴタンパク質に、または突然変異ＧＥＮＳＥＴタンパク質のエピトープを含む、その断片または変異体に、特異的に結合することができる精製または単離抗体にも関する。
抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知の適切な方法によって作製することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原断片は、「ポリクローナル抗体」を含有する血清の生成を誘導するために、動物に投与することができる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により作製された抗体に限定されず、むしろ、真核生物の、原核生物のクローン、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を意味し、それが作製される方法を意味するものではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて作製することができる。
【０１３９】
ハイブリドーマ技術には、当技術分野で公知の技術が含まれる（例えば、Harlow and Lane, (1988) Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 53-242; Hammering (1981), Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. 563-681; Kohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495; Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY (1986), Section 21-2参照)。
【０１４０】
簡単に言えば、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその一部の数マイクログラムを、数週間にわたってマウスに繰り返し接種する。次いで、そのマウスを殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールを用いて、その脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、抗体産生クローンを同定する（例えば、Engvall, (1980) Meth. Enzymol. 70: 419参照)。選択されたポジティブクローンを増殖させ、使用のために、それらのモノクローナル抗体産物を収集する。
【０１４１】
さらに、例えばハイブリドーマにより産生された抗体から、パパイン（Ｆａｂ断片の作製のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片の作製のため）などの酵素を用いて、タンパク分解切断により、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を作製することができる。
【０１４２】
ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその一部における異質エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、未修飾であるか、または免疫原性を高めるために修飾することができるＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその一部で適切な非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、またはウマ）を免疫することによって作製することができる（例えば、Vaitukaitis et al., (1971) J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 : 988-991 ; Ouchterlony et al., (1973) Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell参照)。このタンパク質または断片は通常、適切なアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ＲＩＢＩ等）の存在下で非ヒト哺乳動物に導入される。免疫された動物由来の血清は、公知の手順に従って回収され、処理され、試験される。血清が、不要なエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する場合、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーによって、ポリクローナル抗体を精製することができる。抗原に対する抗血清の親和性が標準法を用いて決定される。
【０１４３】
代替方法としては、当技術分野で公知の方法を用いて、組換えＤＮＡ技術の適用によって、または合成化学によって、本発明の抗体を作製することができる。ファージディスプレイ法において、例えば、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面上に、機能性抗体ドメインを提示させ、抗原、通常固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原で直接選択することによって、目的の結合特性を有するファージが、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される（例えば、Brinkman et al., (1995) J. Immunol Methods, 182: 41-50 ; Ames et al., (1995), J. Immunol. Meth. , 184: 177-186.; Kettleborough et al., (1994), Eur. L Immunol. , 24: 952958; Persic et al., (1997), Gene, 1879-81; Burton et al. (1994), Adv. Immunol., 57: 191-280；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６，同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７，５号、同第５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号参照)。ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを用いて、ヒト抗体を含む全抗体、または他のいずれかの目的の抗原結合断片を作製することが可能であり、いずれかの目的の宿主、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌などにおいて発現させることができる（例えば、ＷＯ９２／２２３２４； Mullinax et al., (1992), BioTechniques. 12 (6): 864-869; and Sawai et al., (1995), AJRI 34: 26-34; and Better et al., (1988), Science. 240: 1041-1043参照)。
【０１４４】
単鎖Ｆｖｓおよび抗体の作製に関する更なる教示は、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号； Huston etal., (1991), Meth. Enymol. 203: 46_88 ; Shu, et al., (1993), PNAS 90: 7995-7999;およびSkerra, et al., (1988),およびScience 240: 1038-1040に提供されている。ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの使用およびｉｎ ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含む、いくつかの用途については、キメラ、混合（shuffled）、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい（例えば、Morrison, (1985); Oi et al., (1986), BioTechniques 4: 214; Gillies et al., (1989), J. Immunol Methods. 125: 191-202；米国特許第５，８０７，７１５号；ＥＰ  ０  ２３９  ４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号、ＥＰ  ０  ５９２  １０６；ＥＰ  ０  ５１９  ５９６；Padlan (1991), Molec. Immunol. 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., (1994), Protein Engineering. 7 (6): 805-814; Roguska et al., (1994), PNAS 91: 969-973、米国特許第５，５６５，３３２号、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号および同第５，８１４，３１８号；ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；およびＷＯ９１／１０７４１参照)。
【０１４５】
いずれかの異種分子、例えば本発明のポリペプチド、その他のポリペプチド、検出アッセイに有用な標識、または薬物または毒素などのエフェクター分子に組換え融合された、または化学結合（共有結合および非共有結合のどちらも含む）された抗体が、さらに本発明に包含される(例えば、ＷＯ９２/０８４９５;ＷＯ９１/１４４３８;ＷＯ８９/１２６２４;米国特許第５，３１４，９９５号;およびＥＰ ０ ３９６ ３８７参照)。融合された抗体を使用して、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に本発明のポリペプチドを融合または結合させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで特定の細胞型に対して本発明のポリペプチドを標的にすることも可能であり、かつ当技術分野で公知の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏイムノアッセイおよび精製法において使用することもできる（例えば、上記のHarbor, et al. ;ＷＯ９３/２１２３２;ＥＰ ０ ４３９ ０９５; Naramura et al., (1994), Immunol. Lett. 39: 91-99;米国特許第５，４７４，９８１号; Gillies et al., (1992), PNAS 89: 14281432; Fell et al., (1991), J. Immunol. 146: 2446-2452参照)。
【０１４６】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合された本発明のポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域、またはその一部、および／またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインまたはその一部に、ならびにＩｇＡまたはＩｇＭの部分に融合または結合させることができる。抗体部分に本発明のポリペプチドを融合または結合させる方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、米国特許第５，６２２，９２９号、米国特許第５，３５９，０４６号、米国特許第５，３４９，０５３号、米国特許第５，４４７，８５１号、米国特許第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ９６/０４３８８、ＷＯ９１/０６５７０; Ashkenazi et al., (1991), PNAS 88: 10535-10539; Zheng, et al. (1995), J. Immunol. 154: 5590-5600; and Vil, et al. (1992), PNAS 89: 11337-11341を参照のこと。
【０１４７】
野生型であろうと遺伝子導入動物であろうと、抗体結合が望まれるものと異なる種類のＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現する非ヒト動物または哺乳動物、およびＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現しない動物（つまり、本明細書に記載のＧＥＮＳＥＴノックアウト動物）は、かかる動物がＧＥＮＳＥＴタンパク質の露出領域のすべてまたは大部分を外来抗原として認識し、したがってＧＥＮＳＥＴエピトープのより広いアレイを有する抗体を産生するであろうことから、抗体の作製に特に有用である。さらに、わずか１０〜３０個のアミノ酸を有する小さなポリペプチドが、ＧＥＮＳＥＴタンパク質のいずれか１つへの特異的な結合を得るのに有用である。さらに、抗原配列に類似するＧＥＮＳＥＴの種を産生する、動物の体液性免疫系は、動物の天然ＧＥＮＳＥＴ種と抗原配列との間の差異を選択的に認識し、抗原配列におけるこれらの固有の部位に対する抗体を産生するだろう。かかる技術は、ＧＥＮＳＥＴタンパク質のいずれか１つに特異的に結合する抗体を得るのに、特に有用であるだろう。  本発明の好ましい実施形態は、抗体または抗体断片をＧＥＮＳＥＴポリペプチドに特異的に結合させる方法である。この方法は、抗体結合条件下にて、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド特異的抗体またはその断片をＧＥＮＳＥＴポリペプチドと接触させる段階を含む。さらに、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドのエピトープ、ドメインまたは断片に抗体または抗体断片を特異的に結合させる方法が包含される。この方法を用いて、例えば、本明細書に記載のようにＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性を検出、精製、または修飾することができる。
【０１４８】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の方法を用いて試験試料または生体試料中のタンパク質のレベルをアッセイすることができる。タンパク質を検出するのに有用な、抗体に基づく方法には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当技術分野で公知であり、グルコース、オキシターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびルカリホスファターゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）などのラジオアイソトープ；ルミノール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンなどの発光標識；蛍光標識、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレスカミンが挙げられる。
ポリヌクレオチドの使用
試薬としてのポリヌクレオチドの使用
本発明のポリヌクレオチドは、単離手順、診断アッセイ、および法医学的手順において試薬として使用することができる。例えば、本発明のＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドからの配列を検出可能に標識し、プローブとして用いて、それらとハイブリダイズすることができる他の配列を単離することが可能である。さらに、本発明のＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドからの配列を使用して、単離、診断、または法医学的手順に用いられるＰＣＲプライマーを設計することができる。
相当するゲノムＤＮＡ配列を見出すために
本発明のＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡを使用して、相当するゲノムＤＮＡ上の本発明のｃＤＮＡの近くに、好ましくは上流に位置する配列をクローニングすることも可能である。プロモーター配列、エンハンサー配列、および転写または翻訳レベルに影響を及ぼす他の配列を含む、かかる配列は、遺伝子発現を調節することができる。
ゲノムＤＮＡ由来の上流配列をクローニングするためのｃＤＮＡまたはその断片の使用
本発明のポリヌクレオチド由来の配列を使用して、染色体歩行技術を用いて(例えば、クロンテック社製のＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ ｋｉｔを用いて）、相当する遺伝子のプロモーターを単離することができる。上流のゲノム配列をクローニングし、シーケンスすると、公知の転写開始部位、転写因子結合部位、またはプロモーター配列を含有するデータベースと、本発明のポリヌクレオチドの上流の配列を比較することによって、上流配列内の予定プロモーターおよび転写開始部位が同定される。
【０１４９】
さらに、プロモーターレポーターベクターを用いて、例えばレポーター遺伝子（例えば、分泌、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または緑色蛍光タンパク質)を、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の最初のエクソンの上流に位置するＧＥＮＳＥＴプロモーター領域の調節活性ポリヌクレオチド断片または変異体の制御下に置くことによって、上流配列におけるプロモーターが同定される。多数の適切なプロモーターレポーターベクターが当技術分野で公知である。本発明のポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーターおよび他の調節配列を用いて、所望の空間的、時間的、発生的、または定量的手法において挿入遺伝子の発現を検出することができる発現ベクターを設計することができる。
類似配列を見い出すために
本発明のポリヌクレオチドを使用して、このセクションに記述されるハイブリダイゼーションまたは増幅に基づく技術を含む当業者によく知られているいずれかの方法を用いて、それに類似の核酸を単離および／または精製することができる。これらの方法を使用して、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡがそれに由来するｍＲＮＡ、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡに相当するｍＲＮＡ、またはＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡもしくはその断片に相同的な核酸、例えば変異体、相同分子種またはオルソログをコードするゲノムＤＮＡが得られる。
ハイブリダイゼーションに基づく方法
所定のプローブ配列とハイブリダイズする、ｃＤＮＡライブラリーにおいてｃＤＮＡクローンを同定する技術が、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),およびHames and Higgins (1985) Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach (Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford)に開示されている。同じ技術を用いて、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
【０１５０】
ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはその断片からの少なくとも１０連続ヌクレオチドを含むプローブは、ラジオアイソトープまたは蛍光分子などの検出可能な標識で標準法を用いて標識される。ライブラリー中のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、ニトロセルロースまたはナイロンフィルターに移され、変性される。非特異的部位をブロックした後、それにハイブリダイズすることができる配列を含有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにプローブを結合させるのに十分な時間、そのフィルターを標識プローブと共にインキュベートする。
【０１５１】
検出可能なプローブとハイブリダイズするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定するために用いられるハイブリダイゼーション条件の厳密性を変えることによって、以下に記載のように、プローブと異なるレベルの同一性を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定かつ単離することができる。
厳密な条件
「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブとの高レベルの同一性を有する核酸のみが前記プローブとハイブリダイズすることができる条件として定義される。これらの条件は、以下のように計算することができる：長さ１４〜７０ヌクレオチドのプローブについては、融解温度（Ｔｍ）は、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ（Ｎａ＋））＋０．４１（Ｇ＋Ｃ分率）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）を用いて計算される。
【０１５２】
ホルムアミドを含有する溶液中でハイブリダイゼーションが行われる場合には、融解温度は、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ（Ｎａ＋））＋０．４１（Ｇ＋Ｃ分率）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）を用いて計算される。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬（Denhardt's reagent）、０．５％ＳＤＳ、変性断片化サケ精子ＤＮＡ１００μｇ、５０％ホルムアミド中で行われる（例えば、Sambrook et al., 1986参照)。
【０１５４】
ハイブリダイゼーションは標準法に従って行われる。長さ２００ヌクレオチドを超えるプローブについては、ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより低い１５〜２５℃で行われる。オリゴヌクレオチドプローブなど短いプローブでは、ハイブリダイゼーションはＴｍより低い１５〜２５℃で行われる。好ましくは、６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションに関しては、ハイブリダイゼーションは約６８℃で行われる。好ましくは、５０％ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションに関しては、ハイブリダイゼーションは約４２℃で行われる。
【０１５５】
ハイブリダイゼーションに続いて、室温にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でフィルターを１５分間洗浄する。次いで、フィルターを室温にて０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で３０分〜１時間洗浄する。その後、その溶液を０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中にて、ハイブリダイゼーション温度で洗浄する。最終洗浄は、室温にて０．１×ＳＳＣ中で行われる。
【０１５６】
プローブとハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィまたは他の従来の技術によって同定される。
低程度および中程度の条件
ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出の厳密性の変更は主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドのパーセンテージを低くすると、厳密性が低くなる）；塩濃度または温度の操作によって達成される。上記の手順をこのように変更して、プローブ配列との同一性レベルが低い核酸を同定することができる。例えば、ハイブリダイゼーション温度は、約１Ｍのナトリウム濃度を有するハイブリダイゼーションバッファーにおいて６８℃〜４２℃の５分単位で下げられる。ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリダイゼーション温度にて２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄する。これらの条件は、「中程度」条件は５０℃を超え、「低程度」条件は５０℃未満であると見なされる。代替方法としては、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含有する６×ＳＳＣなどのバッファー中、温度４２℃で行うことができる。この場合には、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドの濃度を５０％〜０％の５％単位で低減し、プローブとの同一性レベルが低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーションに続いて、５０℃にて、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターが洗浄される。これらの条件は、「中程度」条件はホルムアミドが２５％を超え、「低程度」条件はホルムアミドが２５％未満であると見なされる。プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、オートラジオグラフィまたは他の従来の方法によって同定される。
【０１５７】
上記の条件の変化は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するのに使用される、代わりのブロッキング試薬（例えば、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ等）の包含または置き換えによって達成されることに留意のこと。
ＰＣＲに基づく方法
上述の方法の他に、以下に記載のように、本発明のＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはその断片を用いて、相同的ｃＤＮＡを得るために、他のプロトコールを利用することができる。
【０１５８】
ポリＡ選択手順または当業者に公知の他の技術を利用したｍＲＮＡ作製手順を用いて、対象の組織、細胞、または生物体由来のｍＲＮＡを得ることによって、ｃＤＮＡが作製される。ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズすることができる第１プライマー（例えば、オリゴ(Ｔ)プライマー)を、ｍＲＮＡとハイブリダイズさせ、逆転写反応を行って、第１ｃＤＮＡ鎖を作製する（例えば、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. 1997 and Sambrook, et al., 1989参照)。通常、かかるオリゴ(Ｔ)プライマーは、制限部位含有配列など、ＤＮＡのその後の操作を容易にする、ポリ（ｄＴ）ストレッチ上流の更なる配列を含む。
【０１５９】
次いで、第１ｃＤＮＡ鎖を、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１０連続ヌクレオチドを含有する第２プライマーとハイブリダイズさせる。使用される第２プライマーは、翻訳開始部位の上流に位置する配列を含有する場合が多い。第２プライマーを伸長させて、第１ｃＤＮＡ鎖に相補的な第２ｃＤＮＡ鎖を作製する。代替方法としては、得るべきｃＤＮＡの両端からのプライマーを用いて、上述のようにＲＴ-ＰＣＲが行われる。例えば、 Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1997 and Sambrook, et al., 1989参照のこと。
他のプロトコール
代替方法としては、相同的ｃＤＮＡを得るために、他の手順を用いてもよい。一アプローチにおいて、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから作製し、標準法を用いて二本鎖ファージミド中にクローニングする。次いで、二本鎖ファージミド中のｃＤＮＡライブラリーを一本鎖にし、公知のＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡ、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡもしくはその断片の断片の配列を含むビオチン化オリゴヌクレオチドを、その一本鎖ファージミドとハイブリダイズさせる。ビオチン化オリゴヌクレオチドとファージミドとのハイブリッドを単離し、相当するファージミドをビーズから放出し、ビオチン化オリゴヌクレオチドを設計するのに使用されるＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたは断片に特異的なプライマーを用いて、二本鎖ＤＮＡに転換する。代替方法としては、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｐｐｅｒ ｋｉｔ(Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製)などのプロトコールを使用することができる。
染色体マーカーとして
当技術分野で公知のいずれかの方法または技術、例えば放射線ハイブリッド(ＲＨ)マッピング（例えば、Benham et al. (1989) Genomics 4: 509-517 and Cox et al., (1990) Science 250: 245-250; and Schuler et al., (1996) Science 274: 540-546参照)、ＰＣＲに基づくマッピング、および蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)マッピングなどを用いて、以下に記載のように、ＧＥＮＳＥＴ ポリヌクレオチドをそれらの染色体位置にマッピングすることが可能である。
ＰＣＲ技術を用いた、ヒト染色体へのｃＤＮＡのマッピング
ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡは、ＰＣＲに基づく方法論を用いてヒト染色体に割り当てることができる。かかるアプローチにおいて、オリゴヌクレオチドプライマー対をｃＤＮＡ配列から設計し、ＰＣＲを用いて、ヒト染色体の定義されたセットを含有する一連の体細胞雑種細胞系をスクリーニングする。ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに相当するヒト遺伝子を含有する染色体との体細胞雑種のみが増幅された断片を生成し、増幅断片を生じるすべての細胞雑種に存在するただ１つのヒト染色体が、そのＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含有する染色体である(例えば、Ledbetter et al., (1990) Genomics 6: 475-481参照)。
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いた、染色体へのｃＤＮＡのマッピング
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)によって、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを所定の染色体上の特定の位置にマッピングすることができる。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術に使用される染色体は、細胞培養、組織、または全血を含む様々な源から得ることができる（例えば、Cherif et al., (1990) PNAS 87: 6639-6643参照)。
染色体マップを構築または拡大するためのｃＤＮＡの使用
ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが特定の染色体に割り当てられたら、それらを利用して、それらが位置する染色体の高分解能マップを構築するか、または試料中の染色体を同定することができる。
【０１６０】
染色体マッピングは、上述のように、特定の染色体に所定の固有の配列を割り当てることを含む。固有の配列が所定の染色体にマッピングされたら、それは、同じ染色体上に位置する他の固有の配列に関連して順序付けられる（例えば、Nagaraja et al., (1997) Genome Res. 1997 Mar; 7 (3): 210-22参照)。
遺伝病または薬物応答と関連する遺伝子の同定
他の実施形態では、特定のいずれかのＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを試験用プローブとして使用し、そのＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを特定の表現型特性と関連付けることができる。
【０１６１】
一実施形態において、標準技術を用いて、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをヒト染色体上の特定の位置にマッピングし、その位置をＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎで検索する(ビクトル・マキュージック（Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ）のＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ)）;Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通してオンラインで利用可能)。この検索から、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含有するヒト染色体の領域が、数種の既知の遺伝子および遺伝子がまだ同定されていない数種の疾患または表現型を含有する非常に遺伝子豊富な領域（gene rich region）であることが明らかとなる。したがって、このＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに相当する遺伝子は、これらの遺伝病それぞれの直接の候補となる。
【０１６２】
次いで、例えば、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからのＰＣＲプライマーを用いて、または疾患を持たない個体に対して、患者におけるＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現、サイズ、または配列の差異についてシークエンスすることによって、これらの疾患または表現型を有する患者由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡがスクリーニングされる。検出された差異によって、疾患または表現型におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子の役割が示される。
組換えベクターにおけるポリヌクレオチドの使用
本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および上記のベクターなどの本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞を作製し、かつ組換え技術によってＧＥＮＳＥＴポリペプチドを作製するために、それらを使用する方法ににも関する。
組換えベクター
「ベクター」という用語は、二本鎖または一本鎖であり、かつ細胞宿主中でまたは単細胞もしくは多細胞宿主生物中に導入されることが求められる対象の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、環状もしくは線状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指すために本明細書で使用される。
【０１６３】
好ましい一実施形態において、本発明は、本発明の調節ポリヌクレオチドまたはコード核酸、またはその両方を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターを用いて、精製のための、ならびに遺伝子導入動物を作製するための、また遺伝子治療（ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの方法を含む）のための、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現させることができる。そのコードされるタンパク質は、宿主生物または細胞において一過性に発現されるか、または宿主生物または細胞において安定的に発現される。コードされるタンパク質は、本明細書に記述する活性のいずれかを有する。そのコードされるタンパク質は、宿主生物に欠けているタンパク質であるか、または一方、コードされるタンパク質は、宿主生物中のタンパク質の既存のレベルを高める場合がある。
【０１６４】
本発明のベクターに見出される因子の一部は、以下のセクションでさらに詳細に記述される。
本発明の発現ベクターの一般的な特徴
本発明の通常の発現ベクターは、遺伝因子または遺伝子発現において調節的役割を有する因子、例えばプロモーター、およびｍＲＮＡに転写され、最終的にポリペプチドに翻訳される構造またはコード配列であって、上述の調節因子に作動可能に連結される構造またはコード配列、および適切な転写開始および終結配列、のアセンブリーを含む転写単位を含有する。その他の特徴としては、エンハンサー、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列、複製の起点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、リボゾーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’−フランキング非転写配列が挙げられる。
調節因子
本発明に従って発現ベクターにおいて使用される適切なプロモーター領域は、異種遺伝子を発現させなければならない細胞宿主を考慮に入れて選択される。
【０１６５】
適切なプロモーターは、それが発現を制御する核酸に対して異種であってもよいし、またはその代わりに、発現させるコード配列を含有する天然ポリヌクレオチドに内因性であることが可能である。プロモーター領域は、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、さらに好ましくはｐＫＫ２３２-８およびｐＣＭ７ベクターを用いて、いずれかの目的の遺伝子から選択することができる。好ましい細菌プロモーターとしては、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモーター(ＥＰ ００３６７７６)、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のＰ１０タンパク質プロモーター(Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ)(Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165; O'Reilly et al. (1992), 「Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual」, W. H. Freeman and Co. , New York)、λＰＲプロモーター、またはｔｒｃプロモータも挙げられる。
【０１６６】
真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｌが挙げられる。簡便なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内に十分ある。
選択マーカー
選択マーカーは、同定可能な変化を細胞に与え、その結果、発現コンストラクトを含有する細胞を容易に同定することができる。形質転換宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子は、真核細胞培養に対してジヒドロ葉酸還元酵素またはオマイシン耐性、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対してＴＲＰ１または大腸菌においてテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性、ミコバクテリアに対してレバンスクラーゼ（levan saccharase）であることが好ましく、この後者のマーカーは天然選択マーカーである。
好ましいベクター
本発明の組換えベクターは、限定されないが、ＹＡＣ(酵母人工染色体)、ＢＡＣ(細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド、および線状ＤＮＡを含むいずれかの種類のベクターである。
細菌ベクター
限定されないが、代表的なものとして、細菌の用途に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよびｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝因子を含む市販のプラスミドから誘導される細菌複製起点を含み得る。かかる市販のベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３-３(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン、ウプサラ）)、ｐＧＥＭＩ(Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社（米国ウィスコンシン州マディソン）)、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ-９(Ｑｉａｇｅｎ社)、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社);ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３-３、ｐＫＫ２３３-３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社);ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、ｐＳＧ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社);ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社);ｐＱＥ-３０(ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ社)が挙げられる。
バクテリオファージベクター
ＰＩバクテリオファージベクターは、範囲約８０〜約１００ｋｂの大きなインサートを含有し得る。ＰＩバクテリオファージベクターの作製は、当技術分野でよく知られている（例えば、Sternberg (1992) Trends Genet. 8: 1-16, Sternberg (1994) Mamm. Genome. 5: 397-404, Linton et al., (1993) J. Clin. Invest. 92: 3029-3037, McCormick et al., (1994) Genet. Anal. Tech. Appl. 11: 158-164参照)
ウイルスベクター
いずれかのウイルスベクターを用いて、本明細書に記載の方法を実施することができる。特定の一実施形態において、そのベクターは、アデノウイルス、例えばヒトアデノウイルス２型または５型に由来する（例えば , Feldman et al. (1996) Medecine/Sciences, 12: 47-55, Ohno et al., (1994) Science 265: 781-784、仏国特許出願番号ＦＲ−９３．０５９５４参照)。
【０１６７】
アデノ随伴ウイルスのベクターもまた、本明細書に記載の方法に対して好ましい。
本発明のレトロウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達媒体の作製または構築に特に好ましいレトロウイルスには、ミンク細胞増殖巣誘導ウイルス（Mink-Cell Focus Inducing Virus）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが含まれる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-９９９)、Ｆｒｉｅｎｄ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-２４５)、Ｇｒｏｓｓ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-５９０)、Ｒａｕｓｃｈｅｒ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-９９８)およびモロニーマウス白血病ウイルス(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-１９０;国際公開番号：ＷＯ９４/２４２９８)が挙げられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、ブライアン（Bryan）高力価ウイルス(ＡＴＣＣ番号ＶＲ-３３４、ＶＲ-６５７、ＶＲ-７２６、ＶＲ-６５９およびＶＲ-７２８)が挙げられる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Roth et al., (1996) Nature Medicine, 2 (9): 985-991、ＷＯ９３/２５２３４、ＷＯ９４/０６９２０, Roux et al. (1989), PNAS 86: 9079-9083, Julan et al. (1992), J. Gen. Virol. 73: 3251-3255, and Neda et al. (1991), J. Biol. Chem. 266: 14143-14146に記載されているベクターである。
ＢＡＣベクター
大腸菌においてゲノムＤＮＡの大きな断片（１００〜３００ｋｂ）を安定に維持するために、細菌人工染色体(ＢＡＣ)クローニング系（Shizuya et al. (1992), PNAS 89: 8794-8797)が開発された。好ましいＢＡＣベクターは、Kim U-J. et al. (1996), Genomics 34: 213-218によって記載されているｐＢｅＩｏＢＡＣ１１ベクターを含む。ＢＡＣベクター、およびその作製は、当技術分野でよく知られており、いずれかの適切な
バキュロウイルス
他の特定の適切な宿主ベクター系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳＦ９細胞系(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７１１)をトランスフェクトするために使用される、ｐＶＬ１３９２/１３９３バキュロウイルス導入ベクター(Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)である。バキュロウイルス発現系において本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現するのに適切な他のベクターとしては、Chai et al. (1993), Biotechnol. Appl. Biochem. 18: 259-273; Vlasak, et al. (1983), Eur. J. Biochem. 135: 123-126, and Lenhard et al., (1996) Gene. 169: 187-190に記載されているベクターが挙げられる。
組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドコンストラクトの発現を生じさせるために、そのコンストラクトは細胞中に送達されなければならない。この送達は、細胞系を形質転換する実験手順の場合と同様にiｎ ｖｉｔｒｏで、または特定の疾患状態の治療の場合と同様にｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで達成される。  発現コンストラクトが感染性ウイルス粒子中に封入されるあるメカニズムは、ウイルス感染である（米国特許第５，９６８，８２１号参照）。その発現コンストラクト、好ましくは本明細書に記述される組換えウイルスベクターは、次いで発現コンストラクトを含む感染性ウイルス粒子を産生する、パッケージング細胞に形質導入するために使用される。次いで、その粒子を使用して、真核細胞に形質導入する(Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271；米国特許第６，２２８，８４４号参照）。
【０１６８】
ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドを含む複製欠損レトロウイルスがビリオン中にパッケージングされ、次いでそれを使用して、標準技術によってヘルパーウイルスを用いて標的細胞を感染させることができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)参照)。多数のレトロウイルスのいずれかを使用することが可能であり、当技術分野でよく知られている（例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230: 1395-1398; Danos and Mulligan (1988) PNAS 85: 6460-6464; Wilson, et al. (1988) PNAS 85: 3014-3018; Armentano, et al. (1990) PNAS 87: 6141-6145; Huber, et al. (1991) PNAS 88: 8039-8043; Ferry, et al. (1991) PNAS 88: 8377-8381; Chowdhury, et al. (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem, et al. (1992) PNAS 89: 7640-7644; Kay, et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai, et al. (1992) PNAS 89: 10892-10895; Hwu, et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115参照)。
【０１６９】
本発明において有用な他のウイルスの遺伝子送達系では、アデノウイルス由来ベクターが用いられる。アデノウイルスのゲノムは、それが対象の遺伝子産物をコードするように操作することができるが、正常な溶菌性ウイルス生活環において複製するその能力面に関して不活化される（例えば、Berkner, et al. (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld, et al. (1991) Science 252: 431-434; and Rosenfeld, et al. (1992) Cell 68: 143-155参照)。いずれかの標準アデノウイルスベクターを本発明で使用することができる（例えば、Jones, et al. (1979) Cell 16: 683; Graham, et al. in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, N. J., 1991) vol. 7. pp. 109-127参照)。
【０１７０】
ポリヌクレオチドの送達に有用なさらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖的生活環のためのヘルパーウイルスとして、その他のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである(Muzyczka, et al., Curr. Top. Micro. Immunol. (1992) 158: 97-129参照)。いずれかの標準ＡＡＶベクターを本発明で使用することができる（例えば、Flotte et al., (1992) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7: 349-356; Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356;Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; and McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 19631973, Tratschin, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260, Hermonat, et al. (1984) PNAS 81: 6466-6470; Tratschin, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Wondisford, et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin, et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619; and Flotte, et al. (1993) J.Biol. Chem. 268: 3781-3790参照)。
【０１７１】
遺伝子治療における用途を有する他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、および数種のＲＮＡウイルスに由来するものである。特に、ヘルペスウイルスベクターは、中枢神経系および眼球組織の細胞における挿入遺伝子発現の存続に、固有の戦略を提供し得る(Pepose, et al. (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35 : 2662-2666)。
【０１７２】
細胞、例えば哺乳動物細胞中にポリヌクレオチドを導入するための数種類の非ウイルス的方法もまた本発明によって企図され、その方法としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿法が挙げられる(Graham et al., (1973) Virol. 52: 456457; Chen et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752); DEAE-dextran (Gopal (1985) Mol. Cell. Biol. , 5: 1188-1190); electroporation (Tur-Kaspa et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 716-718; Potter et al., (1984) PNAS 81 (22): 7161-7165); direct microinjection (Harland et al., (1985) J. Cell. Biol. 101 : 1094-1095); DNA-loaded liposomes (Nicolau et al., (1982) Biochim. Biophys. Acta. 721: 185190; Fraley et al., (1979) PNAS 76: 3348-3352); and receptor-mediated transfection. (Wu and Wu (1987), J. Biol. Chem. 262: 4429-4432; and Wu and Wu (1988), Biochemistry 27: 887-892)。
【０１７３】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで脊椎動物細胞の内部にタンパク質またはペプチドを送達する方法の特定の実施形態は、生理学的に許容される担体と、対象のポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチドとを含む製剤（preparation）を、細胞を含有する組織の間質空間中に導入し、それによって、その裸のポリヌクレオチドが細胞の内部に取り込まれる段階を含む（例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９５／１１３０７、Tascon et al. (1996), Nature Medicine 2 (8): 888-892, and Huygen et al., (1996) Nature Medicine 2 (8): 893-898参照)。本発明の裸のポリヌクレオチドは、微粒子銃（遺伝子銃）、例えばそれらが細胞膜を突き抜け、それらを殺すことなく細胞に入ることができる高速度に加速されるＤＮＡ被覆微粒子を用いて、細胞中に導入することもできる (Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73)。
【０１７４】
本発明において使用されるリポソーム製剤としては、カチオン性（正に帯電した）、アニオン性（負に帯電した）および中性製剤が挙げられる。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間に密な電荷の複合体が形成されるため、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的な形で、プラスミドＤＮＡ（Felgner, et al., PNAS (1987) 84: 7413-7416); mRNA (Malone, et al., PNAS (1989) 86: 6077-6081);および精製転写因子(Debs et al., J. Biol. Chem. (1990) 265: 10189-10192)の細胞内送達を仲介することが示されている。非常に多くのカチオン性リポソームのうちのいずれかを使用することができる。Ｎ [１−２，３−ジオレイルオキシ）ぷろぴる−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム(ＤＯＴＭＡ) リポソームが特に有用であり、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社（ニューヨーク州グランドアイランド）から商標名Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎで市販されている。他の市販のリポソームとしては、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ (ＤＤＡＢ/ＤＯＰＥ)およびＤＯＴＡＰ/ＤＯＰＥ (Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社)が挙げられる。
【０１７５】
同様に、アニオン性および中性リポソームは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社(アラバマ州バーミンガム)などから容易に入手することができるし、あるいは、容易に入手できる物質を用いて用意に作製することができる。かかる物質としては、特にホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)が挙げられる。これらの物質を、適切な割合でＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発物質と混合することもできる。リポソームの様々な組み合わせと同様に、これらの物質を用いてリポソームを製造する方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１７６】
そのリポソームは、多重小胞(ＭＬＶ)、小さな単層小胞(ＳＵＶ）、または大きな単層小胞 (ＬＵＶ）を含むことが可能であり、ＳＵＶが好ましい。様々なリポソーム核酸複合体が、当技術分野でよく知られている方法を用いて作製される(Straubinger, et al., Methods of Immunology (1983), 101: 512-527; 米国特許第５，９６５，４２１号)。一般に、ＤＮＡとリポソームとの比は、約１０：１〜約１：１０（約５：１〜約１：５または約３：１〜約１：３が好ましい）であるだろう。さらに、受容体−受容体リガンド対のメンバーなどの標的化部位を小胞の脂質エンベロープ中に埋め込むことによって、リポソームを特定の細胞型に標的化することが可能である（例えば、米国特許第６１７７４３３号、米国特許第６１１０４９０号、および国際公開番号Ｗ０９７０４７４８参照)。
【０１７７】
目的の宿主生物に注入されるベクターの量は、注入部位に応じて異なる。指示用量としては、動物の体内、好ましくは哺乳動物の体内、例えばマウス体内にベクター０．１〜１００μｇが注入されるだろう。
分泌ベクター
ベクターに挿入される遺伝子によってコードされるタンパク質の分泌を指示することができる分泌ベクターを作製するために、本発明のＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮの一部を使用することもできる。目的のタンパク質をそれから精製または濃縮しなければならないバックグラウンドのタンパク質の数を減らすことによって、かかる分泌ベクターは、それに挿入される遺伝子によりコードされるタンパク質の精製または濃縮を容易にすることができる。例示的な分泌ベクターを以下に示す。
【０１７８】
本発明の分泌ベクターは、宿主細胞、組織、または対象の生物体における遺伝子発現を指示することができるプロモーターと、コード配列、およびプロモーターから転写されたｍＲＮＡがシグナルペプチドの翻訳を指示するように、作動可能にプロモーターに連結される本発明のポリヌクレオチドからのシグナル配列と、を含む。宿主細胞、組織、または生物体は、ＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにおけるシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを認識する、いずれかの細胞、組織、または生物体であることが可能である。適切な宿主としては、哺乳動物細胞、組織または生物体、鳥類の細胞、組織、または生物体、または酵母が挙げられる。そのシグナル配列は、遺伝子治療のために設計されたベクター中に挿入することもできる。
【０１７９】
分泌ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであり、宿主の染色体に組み込み、宿主中の染色体外のレプリコンとして安定に保持することが可能であり、人工染色体であるか、または宿主に一過的に存在することができる。その分泌ベクターは、各宿主細胞における多重コピーにおいて保持されることが好ましい。
細胞宿主
本発明のその他の目的は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ、特にＧＥＮＳＥＴポリペプチド−コードポリヌクレオチド調節配列またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドで形質転換されている、またはポリヌクレオチドをトランスフェクトされている宿主細胞を含む。上記のベクターのうちの１つなどの組換えベクターで形質転換された（原核細胞）、それをトランスフェクトされた(真核細胞)、またはそれを形質導入された宿主細胞もまた包含される。本発明の発現ベクターのレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞としては、原核生物の宿主細胞、例えば大腸菌株(Ｉ．Ｅ．ＤＨ５-α株)、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびブドウ球菌属などの種からの株、ならびに真核生物の宿主細胞、例えばヒーラ細胞、Ｃｖ １細胞、ＣＯＳ細胞、Ｓｆ-９細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３、ＣＨＯ、ヒト腎細胞２９３、およびＢＨＫ細胞が挙げられる。
【０１８０】
本明細書に記載のベクターコンストラクトを含有する宿主細胞を包含することに加えて、本発明は、内因性遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失または置換するために、かつ／または、本発明のポリヌクレオチドと作動可能に関連付けられ、かつ内因性ポリヌクレオチドを活性化、変更および／または増幅する遺伝物質を含ませるために操作された、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の一次、二次、および不死化宿主細胞も包含する（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号；ＷＯ９６/２９４１１;ＷＯ９４/１２６５０; Koller, et al., (1989); および Zijlstra, et al. (1989)；米国特許第６，０５４，２８８号；同第６，０４８，７２９号；同第６，０４８，７２４号；同第６，０４８，５２４号；同第５，９９４，１２７号；同第５，９６８，５０２号；同第５，９６５，１２５号；同第５，８６９，２３９号；同第５，８１７，７８９号；同第５，７８３，３８５号；同第５，７３３，７６１号；同第５，６４１，６７０号；同第５，５８０，７３４号；およびＷ０９６／２９４１１、ＷＯ９４／１２６５０；およびKoller, et al., (1994)参照）
哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を不完全にすることが可能であり、または一方、動物細胞のゲノム中の内因性ＧＥＮＳＥＴポリペプチド−コード遺伝子を本発明によるＧＥＮＳＥＴポリペプチド−コードポリヌクレオチドで置換することによって改変することが可能である。これらの遺伝的改変は、先に記載の特定のポリヌクレオチドコンストラクトを用いた相同的組換えによって行われる。
【０１８１】
マウス接合体などの哺乳類の接合体を細胞宿主として使用してもよい。例えば、マウス接合体に、対象の精製ＤＮＡ分子を微量注入する。さらに、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つが、胚幹(ＥＳ)細胞系、好ましくはマウスＥＳ細胞系に導入される。ＥＳ細胞、およびそれらの単離および維持方法は当技術分野でよく知られており、特に、Abbondanzo et al., (1993), Meth. Enzymol., Academic Press, New York, pp 803-823, Robertson, (1987), Embryo-derived stem cell lines; E.J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cell lines: a practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 71,およびPease and William, (1990), Exp. Cell. Res. 190: 209-211に記述されている。
遺伝子導入動物
「遺伝子導入動物」または「宿主動物」という用語は、本発明による核酸のうちの１つを含むように遺伝学的かつ人工的に操作されたそれらのゲノムを有する動物を指すために、本明細書において使用される。影響を受ける細胞は、体細胞、胚細胞、またはその両方であることが可能である。好ましい動物は非ヒトの哺乳動物であり、ハツカネズミ属（例えば、マウス）、クマネズミ属（例えば、ラット）およびアナウサギ属（例えば、ウサギ）から選択される属に属する動物が含まれる。一実施形態において、本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同的組換えによって破壊されたＧＥＮＳＥＴ遺伝子を含む、非ヒトの宿主哺乳動物を包含する。このように、本発明は、本発明による核酸、組換え発現ベクター、または組換え宿主細胞を含有する遺伝子導入動物にも関する。本発明の更なる目的は、本明細書に記載の遺伝子導入動物から得られる組換え宿主細胞を含む。
【０１８２】
かかる遺伝子導入動物は、所定のＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現の増加または減少に関する多様な病理を研究するための優れた実験モデルである。遺伝子導入動物は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で対象の目的ポリペプチドを発現させるのに使用することも可能であり、対象のこのタンパク質の合成で高い収量が得られ、または遺伝子の組織特異的な発現が生じる。
【０１８３】
一実施形態では、本発明の遺伝子導入動物は、胚細胞系またはＥＳ幹細胞系中に本発明の組換えポリヌクレオチドを挿入し（例えば、Thomas, et al. (1987) Cell 51: 503-512; Mansour et al., (1988) Nature 336: 348-352参照)、ポジティブ細胞を単離し、クローニングし、かつその次にメスの宿主に挿入し、臨月まで育てられる胚盤胞に注入することによって作製される。遺伝子導入動物、および特異的遺伝子導入マウスの作製に関する更なる詳細については、米国特許第４，８７３，１９１号；同第５，４６４，７６４号；同第５，７８９，２１５号， Bradley (1987; In : E. J. Robertson (Ed.), Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. IRL Press, Oxford, pp. 113, Wood, et al. (1993), PNAS, 90: 4582-4585, Nagy et al., (1993), PNAS 90: 8424-8428を参照のこと。
【０１８４】
他の実施形態において、遺伝子導入動物は、受精卵母細胞にポリヌクレオチドを微量注入するすることによって作製される。着床前の段階に対して受精卵母細胞を培養する方法は、例えばGordon, et al. ((1984) Methods in Enzymology, 101, 414); Hogan, et al. ((1986) in Manipulating the mouse embryo, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y (マウス胚について)) ; Hammer, et al. ((1985) Nature, 315,680 (ウサギおよびブタの胚について)) ; Gandolfi, et al. ((1987) J. Reprod. Fert. 81,23-28) ; Rexroad, et al. ((1988) J. Anim. Sci. 66,947-953) (ヒツジの胚について)) ;およびEyestone, et al. ((1989) J. Reprod. Fert. 85,715-720) ; Camous et al. ((1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785); およびHeyman, et al. ((1987) Theriogenology 27,5968 (ウシの胚について))に記述されている。次いで、標準法によって着床前胚を適切なメスに導入し、導入遺伝子が導入される際の発育段階に応じて、遺伝子導入またはキメラ動物を誕生させることが可能となる。
【０１８５】
本発明の好ましい実施形態において、それらの乳中に組換えＧＥＮＳＥＴポリペプチドを分泌する遺伝子導入哺乳動物が作製される。乳腺中での発現は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的なプロモーター（例えば、カゼインまたはラクトグロブリン遺伝子からの）に、任意に他の調節因子に作動可能に連結することによって達成されることが好ましい。プロモーターおよび他の調節配列、ベクター、および他の関連する教示は、例えばClark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3: 337-50 ; Jost, et al. (1999) Nat. Biotechnol 17: 160-4; 米国特許第５，９９４，６１６号；同第６，１４０，５５２号；同第６，０１３，８５７号; Sohn, et al. (1999) DNA Cell Biol. 18: 845-52; Kim, et al. (1999) J. Biochem. (Japan) 126: 320-5; Soulier, et al. (1999) Euro. J. Biochem. 260: 533-9; Zhang, et al. (1997) Chin. J. Biotech. 13: 271-6; Rijnkels, et al. (1998) Transgen. Res. 7: 5-14; Korhonen, et al. (1997) Euro. J. Biochem. 245: 482-9; Uusi Oukari, et al. (1997) Transgen. Res. 6: 75-84; Hitchin, et al. (1996) Prot. Expr. Purif. 7: 247-52; Platenburg, et al. (1994) Transgen. Res. 3: 99-108; Heng-Cherl, et al. (1993) Animal Biotech. 4: 89107;および Christa, et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267: 1665-71によって記述されている。
【０１８６】
その他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで乳腺の体細胞中に、例えば乳腺分泌上皮細胞中に導入することによって、乳中に生成することができる。例えば、プラスミドＤＮＡは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランと結合して（例えば、Hens, et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1523: 161-171参照)、コンストラクトの受容体仲介エンドサイトーシスを導くことができるリガンドと結合して（例えば、Sobolev, et al. (1998) 273: 7928-33参照)、またはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、例えばテナガザル白血病ウイルス中で（例えば、 Archer, et al. (1994) PNAS 91: 6840-684参照）、乳頭管を通して注入することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドは、上述のように乳腺特異的なプロモーターに作動可能に連結するか、または一方、ＣＭＶまたはＭｏＭＬＶ ＬＴＲなどの強く発現するいずれかのプロモーターに作動可能に連結することができる。
かかる実施形態で使用されるポリヌクレオチドは、完全長ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはＧＥＮＳＥＴ断片をコードし得る。通常、コードされるポリペプチドは、タンパク質の乳中への分泌を確実にするためにシグナル配列を含む。
本発明のポリペプチドの使用
配列番号：２のタンパク質（内部指定クローン２４３５２５  １１６−１１９−１−０−Ｇ６−Ｆ）
クローン２４３５２５−１１６−１１９−１−０−Ｇ６−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：１）は、アミノ酸配列：ＭＰＳＧＥＦＡＲＩＣＲＤＬＳＨＩＧＤＡＶＶＩＳＣＡＫＤＧＶＫＦＳＡＳＧＥＬＧＮＧＮＩＫＬＳＱＴＳＮＶＤＫＥＥＥＡＶＴＩＥＭＮＥＰＶＱＬＴＦＡＬＲＹＬＮＦＦＴＫＡＴＰＬＳＳＴＶＴＬＳＭＳＡＤＶＰＬＷＥＹＫＩＡＤＭＧＨＬＫＹＹＬＡＰＫＩＥＤＥＥＧＳを含む、配列番号：２のタンパク質ＰＣＮＡｌｔをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン２４３５２５_１１６-１１９-１-０-Ｇ６-Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン２４３５２５_１１６-１１９-１-０-Ｇ６-Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１、配列番号：２、およびクローン２４３５２５_１１６-１１９-１-０-Ｇ６-Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド 断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０１８７】
配列番号：１のｃＤＮＡは、ＰＣＮＡＩｔと呼ばれる配列番号:２の１２３アミノ酸のタンパク質をコードする、ヒト増殖細胞核抗原 (ＰＣＮＡ)のスプライシングバリアントである。配列番号：２のタンパク質は、ＰＣＮＡのＣ末端ドメインを含む。
【０１８８】
哺乳類のＰＣＮＡも、細胞周期依存性抗原としてそれが最初に発見されたため、そのように呼ばれる(Miyachi et al, 1978)。ＰＣＮＡは、異なると思われるいくつかの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすが、ＤＮＡ代謝においては共通の役割を有する。ＰＣＮＡＩｔは、ＤＮＡ複製機構の高度に保存された必須成分である。ＰＣＮＡｌｔの細胞内分布は、細胞周期を通して変化し、細胞周期のＳ期においてＤＮＡ複製部位に局在化する。ＰＣＮＡＩｔは、ＤＮＡ複製の必須経路部分である、ＤＮＡポリメラーゼδによるリーディング鎖ＤＮＡ合成に必要とされる核タンパク質である。ＤＮＡ複製におけるその必須の役割と一致する場合、ＰＣＮＡｌｔの発現は、静止および老化細胞中では非常に低いが、血清または様々な成長因子による刺激後に増加する。さらに、ＰＣＮＡｌｔおよびポリメラーゼδはまた、損傷ＤＮＡの修復においても必須の役割を果たす。ＰＣＮＡｌｔレベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡ損傷に応じて上昇し、タンパク質は損傷後のＤＮＡ修復部位に再局在化する。ヌクレオチド除去修復におけるＰＣＮＡｌｔの直接的な役割が実証されている。このように、ＰＣＮＡｌｔのこれら２つの役割の協調は、遺伝的完全性の維持に必須である。さらに、ＰＣＮＡＩｔは、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼなど、チェックポイント制御および細胞周期の調節に関与する様々な細胞のタンパク質と相互作用し得る。
【０１８９】
一実施形態において、本発明のタンパク質またはその一部を用いて、生体試料中の細胞増殖の量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量化する。ＰＣＮＡＩｔはこのように、組織切片などの組織サンプル中または細胞培養物中での細胞増殖を定量化するためのアッセイおよび診断用キットで使用される。この方法は、ＰＣＮＡＩｔ ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに選択的に結合することができる標識化合物と生体試料を接触させる段階を含む。例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、そのＰＣＮＡｌｔ結合断片、または核酸プローブを使用することができる。この実施形態で使用される抗体は、ＰＣＮＡＩｔの非線状エピトープに対して作られることが好ましい。この実施形態で使用される抗体は、ＰＣＮＡＩｔポリペプチドに特異的に結合し、ＰＣＮＡポリペプチドには特異的に結合しないことが好ましい。公知の免疫組織学的または免疫蛍光技術を用いて、直接的または間接的に検出を行うことができる。本発明によるキットに含まれる試薬は、一般に知られている分子、限定されないが、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素およびＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Texas-Red）などの蛍光染料で直接に標識することができる。しかしながら、標識化は、二次試薬でその後に検出される、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどの分子で標識した一次抗体を使用することによって間接的に行うこともできる。
【０１９０】
その他の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにて、有効に細胞の増殖をブロックする、または細胞の成長を抑制する方法を提供する。本発明を用いて、抑制されていない細胞増殖を停止し、できる限り多くの腫瘍細胞を除去することができることが好ましい。それを用いて、Ｇａｄｄ４５およびｐ２１の制御と無関係の細胞増殖を抑制することがさらに好ましい。その方法は、ＰＣＮＡｌｔ対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞中に投与することによって行われるだろう。かかる方法は、ＰＣＮＡｌｔ対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトを細胞に導入する段階を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する、ある戦略は、カチオン性リポソームなどのリポソーム中に治療学的生理活性分子を封入または取り込むことを含む。これらのリポソームは、ｉｎ ｖｉｖｏでヌクレオチド分解に対するシールドを提供することが知られており、体の特定の領域に標的化することができ、そのポイントで、それらは内容物をゆっくりと放出する。一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドに作動可能に連結されるプラスミドＤＮＡを含む、ポリヌクレオチドコンストラクトを使用することができる。そのヌクレオチド配列は、当業者に公知の適切なバッファーまたは担体溶液中にてｉｎ ｖｉｖｏで投与される。
【０１９１】
ＰＣＮＡＩｔポリペプチドの発現を抑制、または著しく低減するいずれかの化合物を用いて、試料の１つまたは複数の細胞内の複製を抑制することもできる。かかる化合物は、ＰＣＮＡｌｔの発現を低減する試験物質をスクリーニングすることによって同定することができる。このスクリーニング方法は、試験物質を細胞と接触させ、試験化合物に暴露後の細胞におけるＰＣＮＡｌｔの発現を、非暴露対照細胞における発現と比較する段階を含む。さらに、ＰＣＮＡｌｔポリペプチドの活性を抑制または著しく低減するいずれかの化合物を用いて、試料の１つまたは複数の細胞内の複製を抑制することもできる。かかる化合物は、ＰＣＮＡｌｔ活性を低減する試験化合物をスクリーニングすることによって同定することができ、このスクリーニングは、試験物質を細胞と接触させ、試験化合物に暴露した後の細胞におけるＰＣＮＡｌｔ活性を、非暴露対照細胞と比較する段階を含む。例えば、抑制化合物は、ＰＣＮＡｌｔと、細胞の進行に関与するそれらの細胞標的との間の相互作用を乱す分子に相当し得る。
【０１９２】
代替方法としては、他の実施形態において、本発明は、細胞におけるＤＮＡ複製を有効に刺激する方法を提供する。細胞においてＰＣＮＡＩｔのレベルまたは活性を増加し、ＤＮＡ複製を刺激し、それによって細胞増殖を誘導することができる。ＰＣＮＡＩｔを使用して、Ｇａｄｄ４５およびｐ２１の制御と無関係の細胞増殖を高めることが好ましい。試料中の１つまたは複数の細胞のＤＮＡ複製を特異的に刺激するのに十分な量で、ＰＣＮＡｌｔポリヌクレオチドまたはポリペプチドを細胞中に導入することによって、ＰＣＮＡＩｔレベルが高められる。好ましくは、かかる方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われ、培養中の細胞の増殖を増加することができる。例えば、それを用いて、一部のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験に必要とされる血清飢餓条件下で細胞増殖を維持することができる。一方、増大したレベルのＰＣＮＡｌｔを用いて、Ｇａｄｄ４５またはｐ２１の制御に特異的に依存している細胞増殖も低減される。どのような場合でも、ＰＣＮＡｌｔのレベルは、多数の方法のいずれかにおいて細胞中で高めることができる。例えば、微量注入によって、またはリポソームまたはミセル仲介輸送によって、精製ＰＣＮＡｌｔタンパク質を細胞に導入することができる。かかるリポソームまたはミセルのマイクロカプセルは任意に、抗体または受容体リガンドなどの細胞型特異的標的と組み合わせることができる。代替方法としては、トランスフェクト、電気穿孔法、またはウイルス形質導入などの当技術分野で一般的な方法によって、ＰＣＮＡｌｔポリヌクレオチドを細胞に導入してもよい。上記のベクターもまた、ＰＣＮＡｌｔポリヌクレオチドを細胞に導入するために使用することができる。
【０１９３】
本発明は、動物の１種または複数種の組織中に存在するタンパク質の発現または活性を調節することによって作製される動物モデルも提供する。ＰＣＮＡｌｔの発現は、従来の発現系を用いて特定の細胞型において選択的に活性化または不活化できることが好ましい。これらの動物は、ＰＣＮＡｌｔの不活化を標的化するいずれかの誘導方法で作製することができる。本明細書に列挙する癌を含む過剰の細胞増殖に特異的に関連する疾患の様々な病態生理学的側面の治療に潜在的に有用な候補戦略として、ＰＣＮＡｌｔ不活化の有効性を試験するｉｎ ｖｉｖｏアッセイ方法を意味することから、かかる動物は多くの目的に有用である。かかるモデルは、併用治療の評価、つまり対象の１つまたは他の化合物の他にＰＣＮＡｌｔの不活化の評価にも非常に有用である。試験すべき悪性条件は、当技術分野でよく知られているいずれかの方法、化学薬品、遺伝子導入による様々な発癌遺伝子の発現、遺伝毒性因子（紫外線、γ線照射）等によって誘導することができる。
【０１９４】
その他の実施形態では、本発明は、抑制されていない細胞増殖に関連する、特に様々な癌における疾患または障害を診断するために用いられる。異常なＰＣＮＡｌｔ発現または局在化は有意な予後指標であり、好ましくは、様々な癌の臨床過程に予後因子として使用される。さらに好ましくは、ｐ５３の不活化に関連する腫瘍のケースでそれを測定することができる。かかる一実施形態において、本発明は、ある形態の化学療法に対する有効性または応答性を推定するのに適した指標もまた提供することができる。その検出方法は、試料切片上で直接行うことが好ましい。試料物質は、例えば生検材料、組織ホモジネート、細針吸引液または腫瘍切除として存在するか、またはフローサイトメトリーによって行うことができる。その方法は、疾患または病状を有する疑いのある、または疾患または病状を発生する危険性のある個体から採取した組織試料を、ＰＣＮＡｌｔポリペプチドまたは核酸に特異的に結合することができる検出可能に標識された化合物と接触させる段階を含む。例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそのＰＣＮＡｌｔ結合断片または核酸プローブを使用してもよい。好ましくは、かかる実施形態で使用される抗体は、ＰＣＮＡｌｔの非線状エピトープに対して作られる。好ましくは、その抗体は、ＰＣＮＡｌｔポリペプチドに特異的に結合し、ＰＣＮＡポリペプチドには特異的に結合しない。公知の免疫組織学的および免疫蛍光技術を用いて、直接的または間接的に検出を行うことができる。本発明によるキットに含まれる試薬は、一般に知られている分子、限定されないが例えば、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、およびＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッドなどの蛍光染料などで直接、標識することができる。しかしながら、二次試薬でその後に検出される、ビオチンまたはジゴキシゲニン等の分子で標識した二次抗体を使用することによって間接的に、標識化を行うこともできる。ＰＣＮＡｌｔの免疫反応性は、好ましくは少なくとも１つの他のマーカーを用いてではあるが、新形成を示すものとして見なすことができる。検出される第２マーカー指標は、形質転換細胞のマーカー、新生細胞に過剰発現するタンパク質、または細胞中に通常存在しない形で発現するタンパク質を含む群から選択される。例えば、その手順は、α−アクチン、ブロモデオキシウリジン、ケラチン、ＩＶ型コラーゲンおよびビメンチンと共にＰＣＮＡｌｔを二重免疫染色するために適応させることができる。さらに、第２マーカーに相当するタンパク質は、組織特異的マーカーであることが好ましい。したがって、キットは、ＰＣＮＡｌｔに対して作られる抗体および上記のマーカーの１つまたは複数に対して作られる抗体を含み得る。個体の病状は継続的にモニターすることができ、病理試料で測定されるこの特定のタンパク質の定量化された量を、正常な個体の生体試料中でまたは同じ個体からの以前の試料で定量化された量と比較することができる。上記のすべての指標の決定は、同時に、続けて、または互いの後に行うことができる。
【０１９５】
他の一実施形態において、本発明は、過剰量のＰＣＮＡｌｔを有する患者を診断し、かかる病状におけるＰＣＮＡｌｔ発現をモニターするのに有用である。好ましくは、本発明は、全身性エリテマトーデス疾患および悪性リンパ腫などの疾患を診断かつモニターする方法を提供する。その方法は、疾患または病状を有する疑いのある、または疾患または病状を発生する危険性のある個体から採取した組織試料を、ＰＣＮＡｌｔポリペプチドまたは核酸に特異的に結合することができる検出可能に標識された化合物と接触させる段階を含む。例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそのＰＣＮＡｌｔ結合断片または核酸プローブを使用してもよい。好ましくは、かかる実施形態で使用される抗体は、ＰＣＮＡｌｔの非線状エピトープに対して作られる。好ましくは、その抗体は、ＰＣＮＡｌｔポリペプチドに特異的に結合し、ＰＣＮＡポリペプチドにはそうではない。したがって、ＰＣＮＡｌｔの量は、病理試料
中の対象においてモニターかつ定量化し、正常な個体の生体試料において定量化された量と比較することができる。
【０１９６】
本発明の更なる実施形態は、過剰細胞増殖に関連する、好ましくは悪性症状を有する疾患および病状を治療または予防するのに有用な、新規な方法および組成物を提供することである。かかる方法は、疾患または病状を有する哺乳動物に、治療有効量のアンチセンスＰＣＮＡｌｔオリゴヌクレオチドを投与することを含み、「有効量」とは、細胞増殖を有意に減少させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を意味する。本発明の組成物は、生理食塩水溶液または患者への投与に適した他の生理的バッファーなどの薬学的に許容される担体中にて個体に投与することが好ましい。いずれかの特定の病状に対して哺乳動物に投与されるであろう本発明の組成物の特定の量は、患者の臨床症状、および体重、年齢、投与経路などの他の因子によって異なるだろう。かかる組成物は、適切な経路によって投与することができる。治療のために、カチオン性リポソームなどのリポソーム中に、その組成物を組み込んで、標的細胞に治療的生理活性分子を送達することもできる。これらの組成物は、ＰＣＮＡｌｔに対して作られるアンチセンスオリゴヌクレオチド、および任意に対象の１種または複数種の他の化合物を含有し得る。この同時投与は、同時に投与することによる、または別々に投与もしくは逐次投与することによるものである。これらの更なる成分のすべては、天然源から得られるか、または組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾によって生成することができる。
配列番号：４のタンパク質(内部指定クローン６４３１４４ １８１-１７-２-０-Ａ１２-Ｆ)
クローン６４３１４４−１８１−１７−２−０−Ａ１２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３）は、アミノ酸配列：ＭＱＤＥＤＧＹＩＴＬＮＩＫＴＲＫＰＡＬＶＳＶＧＳＡＳＳＳＷＷＲＶＭＡＬＩＬＬＩＬＣＶＧＭＶＶＧＬＶＡＬＧＩＷＳＶＭＱＲＮＹＬＱＤＥＮＥＮＲＴＧＴＬＱＱＬＡＫＲＦＣＱＹＷＫＱＳＥＬＫＧＴＦＫＧＨＫＣＳＰＣＤＴＮＷＲＹＹＧＤＳＣＹＧＦＦＲＨＮＬＴＷＥＥＳＫＱＹＣＴＤＭＮＡＴＬＬＫＩＤＮＲＮＩＶＥＹＩＫＡＲＴＨＬＩＲＷＶＧＬＳＲＱＫＳＮＥＶＷＫＷＥＤＧＳＶＩＳＥＮＭＦＥＦＬＥＤＧＫＧＮＭＮＣＡＹＦＨＮＧＫＭＨＰＴＦＣＥＮＫＨＹＬＭＣＥＲＫＡＧＭＴＫＶＤＱＬＰを含む、配列番号４のＬｅｃｔｉｒをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン６４３１４４_１８１-１７-２-０-Ａ１２-Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン６４３１４４_１８１-１７-２-０-Ａ１２-Ｆ中にヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４、配列番号：３、およびクローン６４３１４４＿１８１-１７-２-０-Ａ１２-Ｆの組成物に対して向けられている。
【０１９７】
Ｌｅｃｔｉｒは、Ｃ型レクチン様受容体２の多型変異体である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ３６７７７）。Ｌｅｃｔｉｒは、アンカーシグナル、膜貫通ドメイン（ＶＭＡＬＩＬＬＩＬＣＶＧＭＶＶＧＬＶＡＬＧＩＷ）、レクチンＣ型ドメイン（ＱＹＣＴＤＭＮＡＴＬＬＫＩＤＮＲＮＩＶＥＹＩＫＡＲＴＨＬＩＲＷＶＧＬＳＲＱＫＳＮＥＶＷＫＷＥＤＧＳＶＩＳＥＮＭＦＥＦＬＥＤＧＫＧＮＭＮＣＡＹＦＨＮＧＫＭＨＰＴＦＣＥＮＫＨＹＬＭＣＥ）および細胞外結合ドメイン(ＲＨＮＬＴＷＥＥＳＫＱＹＣＴＤＭＮＡＴＬ)を有する。Ｌｅｃｔｉｒは、酸化ＬＤＬ受容体(ＬＯＸ-１)と相同性である。Ｌｅｃｔｉｒは、単球、樹状細胞および顆粒球などの骨髄性細胞において発現する。
【０１９８】
Ｌｅｃｔｉｒは、抗原捕捉およびアポトーシス小体の食細胞活動に関与する。老化およびアポトーシス細胞の食細胞活動は、死にかけの細胞の有害な内容物および壊死組織片から正常細胞を保護するための必須プロセスである。アポトーシスは、選択的に切断およびリン酸化される細胞内自己抗原のクラスター形成によって、およびホスファチジルセリンなどのアニオン性リン脂質の暴露によって達成される。修飾リポタンパク質（例えば、酸化リポタンパク質）は、アポトーシスシグナル伝達で重大な役割を担う。レクチンおよびＣ型レクチン様受容体は、アポトーシスを受ける細胞および食細胞のどちらによっても発現する。Ｌｅｃｔｉｒは、リン脂質に結合し、アポトーシス小体を細くし、それらを細胞外空間から骨髄性細胞の特殊プロセシングコンパートメント（specialized processing compartment）に方向付ける、食細胞の受容体である。
【０１９９】
本発明の実施形態は、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドに対して、またはＬｅｃｔｉｒポリペプチド断片に対して作られた抗体を含有する組成物に関する。好ましくは、その抗体は、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドに特異的に結合し、Ｃ型レクチン様受容体−２ポリペプチドには特異的に結合しない。本発明の好ましい更なる実施形態は、ＬｅｃｌｉｒポリペプチドをＬｅｃｌｉｒ特異的抗体またはそのＬｅｃｌｉｒ結合断片と結合させる方法である。この方法は、結合を可能にする条件下にて、ＬｅｃｌｉｒポリペプチドをＬｅｃｌｉｒ結合抗体またはそのＬｅｃｌｉｒ結合断片と接触させる段階を含む。この方法は、Ｌｅｃｌｉｒの検出および精製、ならびにＬｅｃｌｉｒを発現する細胞の標的化に適用することができる。これらの態様は、本明細書で詳細に説明する。
【０２００】
本発明の好ましい態様は、Ｌｅｃｌｉｒポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、Ｌｅｃｌｉｒの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。好ましくは、Ｌｅｃｌｉｒの発現を指示することができるポリヌクレオチドは、Ｌｅｃｌｉｒ遺伝子の５'調節領域に位置する。さらに好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、Ｌｅｃｌｉｒコード領域の５００塩基対以内に位置する。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。
【０２０１】
本発明の実施形態は、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチを精製する方法を含む。この方法は、ｉ）Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドを発現することができる細胞を得る段階；ｉｉ）前記ポリペプチドを生成するのに適切な条件下にて前記細胞を成長させる段階；ｉｉｉ）前記ポリペプチドを精製する段階；を含む。この方法の一例は、ｉ）哺乳動物の宿主細胞に、本発明のポリヌクレオチを含有する組換え発現ベクターをトランスフェクトする段階；ｉｉ）生成されたタンパク質を精製する段階；を含む。そのタンパク質のＬｅｃｌｉｒ精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、Ｌｅｃｌｉｒ結合抗体またはその抗原結合断片をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーを形成する。その抗体は上述の抗体であることが好ましい。
【０２０２】
本発明の実施形態は、蓄積するアポトーシス細胞の食細胞活動を高めるために、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法に関する。例えば、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドまたはその一部、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはＬｅｃｔｉｒの発現または活性を増大する化合物を含有する、いずれかの組成物および方法を使用することができる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドが、アポトーシス細胞の食細胞活動を高めるための方法において使用される。この方法は、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドを細胞に導入する段階を含む。好ましい細胞は、樹状細胞およびマクロファージなどの食細胞である。Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドは、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトを細胞に導入することによって導入される。この方法は、培養すべき細胞の試料からアポトーシス細胞を除去することに向けられる。さらに、この方法は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、喘息、気管支炎、サルコイドーシス、および肺線維症などの細胞の蓄積から生じる疾患の重症度を低減するために適用することができる。この方法は、アポトーシス細胞の細胞の蓄積を低減するために、例えばシスプラチンおよびカルボプラチンなどのアポトーシス誘導薬物で患者を治療する場合にも適用することができる。特に、アポトーシス誘導薬物は、腫瘍増殖を処置するために広く使用されている。
【０２０４】
他の実施形態では、本発明の方法は、アポトーシス細胞の蓄積に関連する疾患を患う患者に、本発明のポリヌクレオチドのうちの１つを含む組換え発現ベクターを投与することに関する。好ましい発現ベクターとしては、ウイルスベクター、特にアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０２０５】
さらに他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドのうちの１つを含むベクターでの細胞の遺伝子修飾は、遺伝子治療分野でよく知られている１つまたは複数の技術を用いて達成される。例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Mulligan (Mulligan, Science, 260: 926-32 (1993))に記載の方法のうちの１つを使用することができる。
【０２０６】
さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、Ｌｅｃｔｉｒの発現を増加する物質を含む。さらに、本発明の方法は、Ｌｅｃｔｉｒの発現を増加する試験物質をスクリーニングする方法に関する。これらの方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＬｅｃｔｉｒ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。好ましくは、その試験物質が、他の細胞型においてではなく、単球、樹状細胞および／または顆粒球におけるＬｅｃｔｉｒの発現を修飾する。
【０２０７】
本発明の他の実施形態は、Ｌｅｃｔｉｒ食細胞活性を高める物質を含有する組成物に向けられている。さらに、本発明の方法は、Ｌｅｃｔｉｒ発現を増加する試験物質をスクリーニングする方法に関する。これらの方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞におけるＬｅｃｔｉｒ活性を、非暴露対照細胞における活性と比較する段階；を含む。好ましくは、試験物質は、単球、樹状細胞および／または顆粒球におけるＬｅｃｔｉｒ活性を修飾するが、他の細胞型ではそうではない。限定されないが、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Simpson et al. (J Immunol Methods 29: 221-6 (1979))によって記述されている方法を含む、いくつかの方法が、食細胞活性を定量化するのに利用可能である。かかる方法は、食細胞活動を高める本発明の組成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性および方法を検証するのに使用することもできる。
【０２０８】
好ましい実施形態では、ＬｅｃｔｉｒポリペプチドまたはＬｅｃｔｉｒ発現もしくはＬｅｃｔｉｒ活性を高める試験物質を、薬学の従来の方法に従って処理し、患者に投与するための医薬品を製造することができる。このように、Ｌｅｃｔｉｒまたはその一部またはＬｅｃｔｉｒの発現を高める物質を含む薬剤組成物は、固形（例えば、経口投与用の顆粒剤、吸入用の散剤）または液状（例えば、経口投与または注入用の液剤）で製造される。アポトーシス細胞の蓄積に関連する疾患を有する患者を治療するための本発明の組成物の有効用量は、関連する技術に従って決定することができる。
【０２０９】
本発明の他の実施形態は、骨髄性細胞を精製するために、Ｌｅｃｔｉｒポリペプチドに対して作られる抗体を使用する方法である、好ましい抗体は上述の抗体である。骨髄性細胞のためのかかる方法は、ｉ）検出可能なシグナルを提供するために使用できる分子でＬｅｃｔｉｒ特異的抗体を標識する段階；ｉｉ）選別装置（例えば、標識抗Ｌｅｃｔｉｒ抗体を含有する、蛍光活性化細胞選別装置（fluorescence-activated cell sorter）または磁気活性化細胞選別装置）を通して体液を流す段階；を含む。異物の存在のために、単球、顆粒球、および巨核球モニターを含む骨髄性細胞は、新生細胞に対する保護を提供し、異物を除去し、血小板を産生する。高度に精製された骨髄性細胞集団は、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験およびｉｎ ｖｉｖｏ指標に必要である。例えば、骨髄性細胞は、ｉ）いずれかの分類の骨髄性細胞に欠乏している宿主の造血系の強化；ｉｉ）骨髄性細胞機能不全に関連する疾患の検出；での使用が見出されている。
配列番号：６のタンパク質（内部指定クローン２１２９５０．ｃＲＥＣ  １１６−０７５−２−０−Ｈｌ−Ｆ）
クローン２１２９５０．ｃＲＥＣ＿１１６−０７５−２−０−Ｈ１−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：５）は、アミノ酸配列：
ＭＶＱＬＨＱＤＴＤＰＱＩＰＫＧＱＰＣＴＬＮＳＳＥＧＧＡＲＰＡＶＰＨＴＬＦＳＳＡＬＤＲＷＬＨＮＤＳＦＩＭＡＶＧＥＰＬＶＨＩＲＶＴＬＬＬＬＷＦＧＭＦＬＳＩＳＧＨＳＱＡＲＰＳＱＹＦＴＳＰＥＶＶＩＰＬＫＶＩＳＲＧＲＧＡＫＡＰＧＷＬＳＹＳＬＲＦＧＧＱＲＹＩＶＨＭＲＶＮＫＬＬＦＡＡＨＬＰＶＦＴＹＴＥＱＨＡＬＬＱＤＱＰＦＩＱＤＤＣＹＹＨＧＹＶＥＧＶＰＥＳＬＶＡＬＳＴＣＳＧＧＦＬＧＭＬＱＩＮＤＬＶＹＥＩＫＰＩＳＶＳＡＴＦＥＨＬＶＹＫＩＤＳＤＤＴＱＦＰＰＭＲＣＧＬＴＥＥＫＩＡＨＱＭＥＬＱＬＳＹＮＦＴ  ＬＫＱＳＳＦＶＧＷＷＴＨＱＲＦＶＥＬＶＷＶＤＮＩＲＹＬＦＳＱＳＮＡＴＴＶＱＨＥＶＦＮＶＶＮＩＶＤＳＦＹＨＰＬＥＶＤＶＩＬＴＧＩＤＩＷＴＡＳＮＰＬＰＴＳＧＤＬＤＮＶＬＥＤＦＳＩＷＫＮＹＮＬＮＮＲＬＱＨＤＶＡＨＬＦＩＫＤＴＱＧＭＫＬＧＶＡＹＶＫＧＩＣＱＮＰＦＮＴＧＶＤＶＦＥＤＮＲＬＷＦＡＩＴＬＧＨＥＬＧＨＮＬＧＭＱＨＤＴＱＷＣＶＣＥＬＱＷＣＩＭＨＡＹＲＫＶＴＴＫＦＳＮＣＳＹＡＱＹＷＤＳＴＩＳＳＧＬＣＩＱＰＰＰＹＰＧＮＩＦＲＬＫＹＣＧＮＬＶＶＥＥＧＥＥＣＤＣＧＴＩＲＱＣＡＫＤＰＣＣＬＬＮＣＴＬＨＰＧＡＡＣＡＦＧＩＣＣＫＤＣＫＦＬＰＳＧＴＬＣＲＱＱＶＧＥＣＤＬＰＥＷＣＮＧＴＳＨＱＣＰＤＤＶＹＶＱＤＧＩＳＣＮＶＮＡＦＣＹＥＫＴＣＮＮＨＤＩＱＣＫＥＩＦＧＱＤＡＲＳＡＳＱＳＣＹＱＥＩＮＴＱＧＮＲＦＧＨＣＧＩＶＧＴＴＹＶＫＣＷＴＰＤＩＭＣＧＲＶＱＣＥＮＶＧＶＩＰＮＬＥＨＳＴＶＱＱＦＨＬＮＤＴＴＣＷＧＴＤＹＨＬＧＭＡＩＰＤＩＧＥＶＫＤＧＴＶＣＧＰＥＫＩＣＩＲＫＫＣＡＳＭＶＨＬＳＱＡＣＱＰＫＴＣＮＭＲＧＩＣＮＮＫＱＨＣＨＣＮＨＥＷＡＰＰＹＣＫＤＫＧＹＧＧＳＡＤＳＧＰＰＰＫＮＮＭＥＧＬＮＶＭＧＫＬＲＹＬＳＬＬＣＬＬＰＬＶＡＦＬＬＦＣＬＨＶＬＦＫＫＲＴＫＳＫＥＤＥＥＧを含む、配列番号：６のｖＩＡＤＡＭ２０をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：６のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン２１２９５０．ｃＲＥＣ＿１１６−０７５−２−０−Ｈ１−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：５のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン２１２９５０．ｃＲＥＣ＿１１６−０７５−２−０−Ｈ１−Ｆ中にヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：６、配列番号：５、およびクローン２１２９５０．ｃＲＥＣ＿１１６−０７５−２−０−Ｈ１−Ｆの組成物に関する。
【０２１０】
以下に記述する方法において使用される好ましいｖｌＡＤＡＭ２０ポリペプチドとしては、アミノ酸配列：ＭＶＱＬＨＱＤＴＤＰＱＩＰＫＧＱＰＣＴＬＮＳＳＥＧＧＡＲＰＡＶＰＨＴＬＦＳＳＡＬＤＲＷＬＨＮＤＳＦＩを含むポリペプチドが挙げられる。
【０２１１】
精子表面タンパク質をタンパク分解処理する生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０２１２】
ｖＩＡＤＡＭ２０は、ＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、かつこのファミリーに特有のすべての構造因子を示す精子タンパク質である。特に、ｖＩＡＤＡＭ２０は、活性Ｚｎ2+-金属プロテアーゼ（ＨＥＬＧＨＮＬＧＭＱＨＤ）の触媒部位を示し、１つのディスインテグリンコンセンサス配列（ＥＥＧＥＥＣＤＣＧ）および１つの膜貫通ドメインである。タンパク質のＡＤＡＭファミリーは、ディスインテグリおよび金属プロテアーゼドメインを含有する、このファミリーのメンバーは、潜在的な接着ドメインおよびプロテアーゼドメインの両方を処理する固有の構造を有する細胞表面タンパク質である。すべてのＡＤＡＭは、同じドメイン機構を有するが、ＡＤＡＭのメンバーがすべて、同じ機能を示すわけではない。ＡＤＡＭファミリーのメンバーにより示される機能は、選択的スプライシング、差次的遺伝子発現、二量体化、およびタンパク分解処理を含むプロセスによって調節される。ＡＤＡＭは、精子形成、受精、筋芽細胞融合および神経細胞の増殖などの多様な生物学的プロセスに関与する（Wolfsberg et al, Dev Biol. 180: 389-401 (1996))。
【０２１３】
ｖＩＡＤＡＭ２０は、精子形成に関与する、新規な膜結合型精子表面プロテアーゼである。ｖＩＡＤＡＭ２０は、発達中の精子表面を再構築するのに、つまり他の精子表面タンパク質をタンパク分解処理するのに関与する。
【０２１４】
本発明の実施形態は、配列番号:６のｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド配列を含む組成物に向けられている。
【０２１５】
本発明の更なる実施形態は、精子表面タンパク質をタンパク分解処理する生物活性を有するｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド断片を含む組成物に向けられている。
【０２１６】
本発明の更なる実施形態は、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドをコードする配列番号:５のポリヌクレオチド配列を含む組成物に向けられている。
【０２１７】
本発明の更なる実施形態は、精子表面タンパク質をタンパク分解処理する生物活性を有するｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に向けられている。
【０２１８】
本発明の更なる実施形態は、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドに結合する、またはｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド断片に対する、抗体または抗原結合断片に向けられている。好ましくは、その抗体は、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドに特異的に結合し、ＡＤＡＭ２０ポリペプチドには特異的に結合しない。好ましくは、その抗体または抗原結合断片は、ＡＤＡＭ２０のアミノ末端に位置する５０アミノ酸のうちの１つまたは複数を含むエピトープを認識し、これらのアミノ酸の１つまたは複数は抗体の結合に必要とされる。さらに好ましくは、その抗体は、アミノ酸配列：ＱＬＨＱＤＴＤＰＱＩＰＫＧＱＰＣＴまたはアミノ酸配列：ＬＮＳＳＥＧＧＡＲを認識する。本明細書で使用される抗ｖｌＡＤＡＭ２０抗体という用語は、インタクトな分子ならびにその活性断片の両方、例えば抗原に結合することができるものなどを含む。
【０２１９】
本発明は、抗ｖＩＡＤＡＭ２０抗体をｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドに結合させる方法であって、結合を生じさせる条件下にて、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを前記抗体またはその抗原結合断片と接触させる段階を含む方法にも関する。かかる条件は当業者によく知られている。さらに、本発明は、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞に抗ｖＩＡＤＡＭ２０抗体または抗原結合断片を結合させる方法であって、結合を生じさせる条件下にて、ＡＤＡＭ２０ポリペプチドまたはその断片を発現する細胞を前記抗体または抗原結合断片と接触させる段階を含む方法にも関する。使用される抗体または断片は、上述のようにｖＩＡＤＡＭ２０特異的であることが好ましい。かかる方法は例えば、本明細書にさらに記述されるように精巣細胞を精製するのに有用である。
【０２２０】
本発明のその他の実施形態は、精巣細胞を精製するための、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド対して作られた抗体を含む組成物を使用する方法に関する。かかる組成物は、上述の好ましい抗体を含むことが好ましい。精巣細胞を精製するためのかかる方法は、ｉ）検出可能なシグナルを提供するのに使用することができる分子で、抗ｖＩＡＤＡＭ２０抗体を標準法によって標識する段階；ｉｉ）選別装置、例えば、標識化抗ｖＩＡＤＡＭ２０抗体を含有する、蛍光活性化細胞選別装置または磁気活性化細胞選別装置を通して、生検精巣試料または哺乳動物細胞を流す段階；を含む。精巣細胞の精製は、精巣に関連する様々な疾患、限定されないが、例えば精巣癌、精巣の上皮内新形成、精巣の微石症および不稔などのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析および診断に有用である。
【０２２１】
本発明の実施形態は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階；任意に、ｉｉ）その生成されたタンパク質を精製する段階を含む、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ｖＩＡＤＡＭ２０またはその一部に対して作られる抗体は、クロマトグラフィー担体に結合されて、アフィニティークロマトグラフィーが形成される。さらに好ましくは、その抗体は、ｖＩＡＤＡＭ２０のアミノ末端側５０個のアミノ酸を認識する。代替方法としては、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドは、ｉ)ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を検出することができるポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクトする段階を含む方法によって作製することができる。好ましくは、ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を検出することができるポリヌクレオチドは、ｖＩＡＤＡＭ２０遺伝子の５’調節領域に位置する。さらに好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、ｖＩＡＤＡＭ２０コード領域の５００塩基対内に位置する。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含有することが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。
【０２２２】
一実施形態において、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドまたはその生物活性断片は、広範囲のタンパク質を消化することができるプロテアーゼの「カクテル」に使用することができる。かかるプロテアーゼのカクテルは、試料中の好ましくないタンパク質を分解する実験アッセイにおいて、例えば、ＤＮＡ作製におけるタンパク質の除去または酵素反応後の酵素の除去に有用である。
【０２２３】
他の実施形態では、ｖＩＡＤＡＭ２０またはその生物活性断片を、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９９，４００号に記載のプロテアーゼの使用と同様に、タンパク質成分を有する染色を除去するために、洗浄剤と組み合わせて使用することができる。その組成物は、例えば、界面活性剤、起泡剤（foam enhancer）および充填剤などの公知の洗浄剤成分を含有し得る。その洗浄剤は、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを０．００１％〜１０％含有することが好ましい。ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドは、洗浄剤組成物中に含まれるか、または添加剤としての使用時に他の成分と組み合わせることができる。洗浄剤の添加剤は、液状、粉末状、顆粒状またはスラリー状で配合することができる。
【０２２４】
さらに他の実施形態は、避妊の免疫原としてのｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを使用する組成物および方法に関する。自然発生的に抗精子抗体を産生するオスおよびメスは、その他の点では健康であるが、不妊であることが示された(Bronson et al, Fertil Steril. 42: 171-83 (1984))。かかる方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９７，９４０号に記載のように、ＡＤＡＭ２０に対する抗体の産生によって、その個体の受精率を低減するのに有効な量で、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを個体に投与する段階を含む。免疫原性ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドがかかる組成物中に使用されることが好ましい。免疫原性ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドの投与量は、投与経路、種類、およびブースター投与の使用などの因子に応じて異なる。例えば、体重１ｋｇ当たりｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチド約０．１〜１００マイクログラムの用量が用いられる。本発明の組成物は、ヒトおよび家畜の両方のワクチン製剤として製造することが可能である。避妊用ワクチンは、薬学的に適切な担体と、および例えば百日咳菌（Bordatella pertussis）の免疫原性断片などの免疫系の非特異的シミュレータ（simulator）を含有するアジュバントと、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを合わせることによって製造することができる。
【０２２５】
本発明の組成物は、固形（例えば、経口投与用の顆粒剤）または液状（例えば、経口投与または注入用の液剤）で製造される。本発明の組成物は、処置される対象の受精率を低減するのに有効な量で担体中に含有される。本発明の組成物は、他の避妊分子を含んでもよい。例えば、ｖＩＡＤＡＭ２０ポリペプチドを含む女性避妊用ワクチンは、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６９３，４９６号に記載のＰＨ３０β鎖タンパク質も含むことが可能であり、男性避妊用ワクチンは、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９７，９４０号に記載のＳＰ-２２ポリペプチドも含むことが可能である。
【０２２６】
本発明の更なる実施形態は、ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を低減する物質と、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）暴露細胞中のｖＩＡＤＡＭ２０の発現を非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；ｉｉｉ）前記発現レベルを定量化する段階；ｉｖ）非暴露細胞中の発現に対する、暴露細胞中のｖＩＡＤＡＭ２０発現の比を決定する段階；を含む、かかる物質をスクリーニングする方法と、に関する。ｖＩＡＤＡＭ２０の発現は精巣細胞において研究されることが好ましい。ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を低減する物質を含む組成物は、避妊目的のためにオス個体に投与することができることが好ましい。
【０２２７】
本発明の更なる実施形態は、ｖＩＡＤＡＭ２０活性を低減する物質と、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）暴露細胞中のｖＩＡＤＡＭ２０タンパク分解活性を非暴露対照細胞の活性と比較する段階；ｉｉｉ）前記発現レベルを定量化する段階；ｉｖ）非暴露細胞における発現に対する、暴露細胞におけるｖＩＡＤＡＭ２０活性の比を決定する段階；を含む、かかる物質をスクリーニングする方法と、に関する。ｖＩＡＤＡＭ２０の発現は精巣細胞において研究されることが好ましい。ｖＩＡＤＡＭ２０のタンパク分解活性は例えば、Frosty Loechel et al (J Biol Chem 273: 16993-7 (1998))によって記述されているα２Ｍ複合体形成アッセイによって測定することができる。ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を低減する物質を含む組成物は、避妊の目的でオス個体に投与することができることが好ましい。
【０２２８】
本明細書で使用されるアンタゴニストという用語には、ｖＩＡＤＡＭ２０の発現を低減する物質、ｖＩＡＤＡＭ２０活性を低減する物質、およびＡＤＡＭ２０の活性を抑制する抗体または抗原結合断片を含む。
【０２２９】
本発明のその他の実施形態は、ｖＩＡＤＡＭ２０タンパク分解活性をブロックするために、ｖＩＡＤＡＭ２０アンタゴニストを含む組成物を使用する方法に関する。そのアンタゴニストは、上述の好ましい抗体のうちの１つであることが好ましい。かかる組成物は、細胞、組織試料または個体に投与することができる。かかる組成物は、避妊の目的において精子形成をブロックするために、オス個体に投与されることが好ましい。
【０２３０】
本発明のさらに他の実施形態は、精子を凝集および不動化するための、抗ｖＩＡＤＡＭ２０抗体を含有する組成物の使用方法に関する。かかる組成物は、上述の好ましい抗体を含むことが好ましい。かかる組成物は、細胞、組織試料または患者に投与することができる。かかる組成物は、避妊の目的において受精をブロックするために、メス個体に投与されることが好ましい。
配列番号：８のタンパク質（内部指定クローン１０００８４９８６６  １８１−４４−３−０−Ａ９−Ｆ）
クローン１０００８４９８６６−１８１−４４−３−０−Ａ９−Ｆの配列番号：７のｃＤＮＡは、配列：ＭＲＳＬＧＡＬＬＬＬＬＳＡＣＬＡＶＳＡＧＰＶＰＴＰＰＤＮＩＱＶＱＥＮＦＮＩＳＲＩＹＧＫＷＹＮＬＡＩＧＳＴＣＰＷＬＫＫＩＭＤＲＭＴＶＳＴＬＶＬＧＥＧＡＴＥＡＥＩＳＭＴＳＴＲＷＲＫＧＶＣＥＥＴＳＧＡＹＥＫＴＤＴＤＧＫＦＬＹＨＫＳＫＷＮＩＴＭＥＳＹＷＨＴＮＹＤＥＹＡＩＦＬＴＫＫＦＳＲＨＨＧＰＴＩＴＡＫＬＹＧＲＡＰＱＬＲＥＴＬＬＱＤＦＲＷＡＱＧＶＧＩＰＥＤＳＩＦＴＭＡＤＲＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰＲＶＲＲＡＡＴＰＲＲＧＲＩＲＧＷＡＴＧＮを含む、配列番号：８のＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：８のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８４９８６６＿１８１−４４−３−０−Ａ９−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８４９８６６＿１８１−４４−３−０−Ａ９−Ｆ中にヒトｃＤＮＡを含む核酸によってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。好ましい実施形態は、配列番号：７、配列番号：８、およびクローン１０００８４９８６６＿１８１−４４−３−０−Ａ９−Ｆの組成物にも関する。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた、好ましい。
【０２３１】
配列番号:８のタンパク質は、αミクログロブリンの配列（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７６０）のスプライシングバリアントである。２２１アミノ酸のＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎタンパク質は、リポカリンモチーフを示し、リポカリンスーパーファミリーに属する。これらの細胞外タンパク質は、ステロイド、ビリン、レチノイド、および脂質などの小さな疎水性リガンドに結合し、輸送する。リポカリンは、栄養輸送、細胞増殖制御、免疫応答およびプロスタグランジン合成を含む様々なプロセスにおいて機能する。
【０２３２】
Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、血漿糖タンパク質である。そのタンパク質は、黄褐色および非常に不均一な電荷をタンパク質に付与する一組の発色団を保持する。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、多くの血漿タンパク質様因子ＩＸ Ｚｕｔｐｈｅｎ、因子ＸＩＩ Ｔｅｎｒｉおよびいくつかのタンパク質Ｃ突然変異体と共有結合し得る。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは肝臓細胞において翻訳され、血液に分泌される。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、血漿、尿、および脳脊髄液を含む多くの生理学的体液に見出される。そのタンパク質は、遊離モノマーとしてだけではなく、ＩｇＡおよびアルブミンとの複合体で現れる。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、抗炎症性および免疫抑制活性にも関与する。ストレスおよび炎症性刺激に応答してＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎの循環レベルが増大する点から、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、ポジティブな急性期タンパク質の１つである。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、それが血小板および好中球の活性化を抑制し、食細胞活動を抑制する、炎症部位に蓄積する。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎの免疫調節性はグリコシル化によるものである。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは、４０％炭水化物であり、それによって著しく酸性および可溶性となる。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎのグリコシル化パターンは、急性期反応時に変化し、脱グリコシル化されたＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎは免疫抑制活性を持たない。リポカリンが、様々な疾患状態に診断および予後マーカーとして使用される。妊娠中および癌化学療法、腎機能不全、心筋梗塞、関節炎、および多発性硬化症を含む病状の診断および予後にＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎの血漿レベルをモニターすることができる。
【０２３３】
本発明のその他の好ましい実施形態は、ＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドをＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎ特異的抗体またはそのＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎ結合断片と結合させる方法である。この方法は、結合を可能にする条件下で、ＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎ特異的抗体またはそのＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎ結合断片と接触させる段階を含む。この方法は、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎの検出および精製に適用することができる。これらの態様は本明細書で詳細に説明する。
【０２３４】
本発明の実施形態は、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドを含む組成物に関する。Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階と、ｉｉ）その作製されたタンパク質を精製する段階と、を含む。そのタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎまたはその断片に対して作られる抗体、好ましくは、ＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドのＣ末端配列に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。
【０２３５】
別の実施形態において、本発明は、ＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎのｍＲＮＡ発現レベルを検出するための方法および組成物を提供する。ＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎのｍＲＮＡレベルの定量化は、本発明のタンパク質の変化した発現に関連する疾患の診断または予後に有用である。変化した発現に関連する病状、疾患または障害としては、限定されないが、特定の癌、嚢胞性線維症、潰瘍、血友病などの凝固障害、炎症および免疫に基づく障害、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ)、関節炎などの自己免疫疾患、受精障害、および甲状腺機能低下症が挙げられる。
【０２３６】
本発明のタンパク質のｍＲＮＡの検出および定量化するためのアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982),またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Eds), Wiley & Sons, Inc. 参照)。例えば、核酸分子またはプローブは標準法によって標識され、ハイブリダイゼーション複合体の形成条件下にて患者からの生体試料に添加される。インキュベーション期間後、その試料を洗浄し、ハイブリダイゼーションに関連する標識（またはシグナル）の量を定量化し、標準値と比較する。患者試料中の標識の量が標準値と比較して著しく変化している場合には、関連する条件、疾患または障害の存在が示されている。かかるアッセイを用いて、動物研究および臨床試験において特定の治療的処置療法の有効性を評価し、個々の患者の治療をモニターすることもできる。病状の存在が証明され、治療プロトコールが開始されると、診断アッセイを定型的に繰り返して、患者における発現レベルが、正常な対象において観察される発現レベルに近似し始めるかどうかを決定することができる。連続的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたる治療の有効性を示すことができる。
【０２３７】
他の実施形態では、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドまたはその断片を用いて、基質、例えば第ＩＸ因子Ｚｕｔｐｈｅｎ、第ＸＩＩ因子Ｔｅｎｒｉおよびいくつかのタンパク質Ｃの突然変異体の存在によって特徴付けられる障害を診断することができる。かかる障害には、限定されないが、第ＸＩＩ因子欠損および血友病Ｂが挙げられる。かかる方法では、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドまたはその断片が、生体試料における第ＩＸ因子Ｚｕｔｐｈｅｎ、第ＸＩＩ因子Ｔｅｎｒｉ、およびタンパク質Ｃの突然変異体などの基質の同定および／または定量化用のアッセイおよび診断キットに使用される。
【０２３８】
他の実施形態では、本発明は、特定の生体試料中に存在する本発明のタンパク質のレベルを検出かつ定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化したレベルと関連する疾患の診断または予後に有用である。本発明のタンパク質を検出するための診断アッセイは、器官または組織切片からの細胞の、または腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイを含み得る。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。
【０２３９】
特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドの検出および定量化は、当技術分野で公知である。かかる技術の例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。抗体の例は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５３，１９２号に記載されている。
【０２４０】
一実施形態において、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎまたは好ましい断片を対象に投与して、本発明のタンパク質の変化した発現または活性と関連する病状を治療または予防することが可能である。かかる病状の例としては、限定されないが、上述のものが挙げられる。
【０２４１】
他の実施形態では、薬剤担体と共に実質的に精製されたＬｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドを含む薬剤組成物を対象に投与して、内因性タンパク質、限定されないが例えば上述のような変化した発現または活性と関連する病状を処置または防ぐことができる。
【０２４２】
他の実施形態において、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎの活性を調節する物質を対象に投与して、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチド、限定されないが例えば上記のものなどの変化した半減期、発現または活性と関連する病状を処置または防ぐことができる。一態様において、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎに特異的に結合する抗体を、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎを発現する細胞（つまり肝細胞）に薬剤を運ぶための、標的化機構および送達機構として使用することができる。更なる実施形態において、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎまたは好ましい断片を発現することができるベクターを対象に投与して、限定されないが上記のものを含む本発明のタンパク質の変化した半減期、発現または活性と関連する病状を治療または予防することができる。
【０２４３】
更なる実施形態において、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを発現するベクターを投与して、限定されないが上記のものを含む本発明のタンパク質の変化した半減期、発現または活性と関連する病状を治療または予防することができる。
【０２４４】
他の実施形態において、本発明は、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドまたはその断片に結合する化合物をスクリーニングする方法に関する。かかる方法は、蛍光標識、放射性標識、もしくは酵素標識などの検出可能な標識で、試験するリガンド分子を標識する段階と、特異的結合を生じさせる条件下で、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドまたはその断片と接触させて、試験するリガンド分子を置く段階と、非特異的に結合した分子を除去する段階と、適切な手段を用いて、結合分子を検出する段階と、を含む。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質またはその一部を使用して、当業者に公知のいずれかの技術を用いて基質を同定かつ／または定量化することができる。基質を見つけるために、本発明のタンパク質、またはその一部、またはその誘導体は、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用される。かかるスクリーニングで用いられる断片は、溶液中で遊離しており、固体担体に固定化され、細胞表面上に保持され、または細胞内に位置し得る。本発明のタンパク質、またはその一部、またはその誘導体と、試験される作用物質との間の結合性複合体の形成は、ＢＩＡｃｏｒｅ（スウェーデン、ウプサラ）などの当業者に公知の方法によって測定することができる。本発明のアンタゴニストまたは阻害剤は、本発明のタンパク質に特異的に結合するものを同定するための薬物ライブラリーのスクリーニングを含む、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて作製することができる。使用することができる薬物スクリーニングの他の技術によって、本発明のタンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。例えば、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドのアンタゴニストは、Ｌｉｐｏｇｌｏｂｕｌｉｎポリペプチドによる血小板および好中球の抑制を防ぐだろう。
配列番号：１０のタンパク質（内部指定クローン１６４３４１  １１７−００１−５−０−Ｅ２−Ｆ）
クローン1６４３４１＿１１７−００１−５−０−Ｅ２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：９）は、アミノ酸配列：ＭＱＲＬＱＷＬＧＨＬＲＧＰＡＤＳＧＷＭＰＱＡＡＰＣＬＳＧＡＰＱＡＳＡＡＤＶＶＷＨＧＲＲＴＡＩＣＲＡＧＲＧＧＦＫＤＴＴＰＤＥＬＬＳＡＶＭＴＡＶＬＫＤＶＮＬＲＰＥＱＬＧＤＩＣＶＧＮＶＬＱＰＧＡＧＡＩＭＡＲＩＡＱＦＬＳＤＩＰＥＴＶＰＬＳＴＶＮＲＱＣＳＳＧＬＱＡＶＡＳＩＡＧＷＳＰＣＰＷＬＴＥＧＴＬＥＩＬＬＲＡを含む、配列番号：１０のペルオキシソームβケトチオラーゼ（ＰＢＫ）をコードする。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１０のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１６４３４１＿１１７−００１−５−０−Ｅ２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡよってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：９のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１６４３４１＿１１７−００１−５−０−Ｅ２−Ｆ中にヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：９、配列番号：１０、およびクローン１６４３４１＿１１７−００１−５−０−Ｅ２−Ｆの組成物にも関する。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０２４５】
配列番号：１０のタンパク質、ＰＢＫは、３-ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼタンパク質の配列（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９１１０)のスプライスバリアントである。ＰＢＫの１５３アミノ酸のタンパク質は、１つの膜貫通セグメント：ＣＳＳＧＬＱＡＶＡＳＩＡＧＷＳＰＣＰＷＬＴを示す。したがって、本発明の一部の実施形態は、膜貫通ドメインを含有するポリペプチドに関する。最終的には、本発明のタンパク質は、以下の配列：ＡＰＱＡＳＡＡＤＶＶＶＶＨＧＲＲＴＡＩＣＲＡＧＲＧＧＦＫＤＴＴＰＤＥＬＬＳＡＶＭＴＡＶＬＫＤＶＮＬＲＰＥＱＬＧＤＩＣＶＧＮＶＬＱＰＧＡＧＡＩＭＡＲＩＡＱＦＬＳＤＩＰＥＴＶＰＬＳＴＶＮＲＱＣＳＳＧＬＱＡＶＡＳＩＡＧＷＳＰＣＰＷＬＴＥＧＴＬＥＩＬに及ぶチオラーゼドメイン示す。したがって、本発明の好ましい実施形態は、チオラーゼドメインおよびそれをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２４６】
内因性合成により、または外因性の源から生じる多くの異なる脂肪酸およびそれらの様々な誘導体に生体が暴露される。これらの疎水性化合物は、ＣＯ2への代謝、またはそれらの排出を可能にするより高い極性の脂質代謝産物への代謝を含み得る、排出前に、特定の代謝、構造または内分泌機能を有し得る。定量的には、脂肪酸を代謝する主要経路の１つは、β−酸化であり、ＰＫＢはこの経路に関与する。
【０２４７】
ＰＢＫは、アシル酵素中間体の形成に関与し、それ自体では、脂肪酸代謝、細胞の小胞の輸送および細胞構築、細胞のタンパク分解、エンドサイトーシス、シグナルトランスダクション、リソソーム蓄積、細胞増殖および細胞分化、免疫応答および炎症反応における役割を果たす。その酵素の基質は、エステル結合、好ましくはチオールエステル結合、さらに好ましくはアシルチオエステル結合を含有することが好ましい化合物である。
【０２４８】
ＰＢＫは、肝臓などの標的器官、脂肪組織における脂質のホメオスタシスを仲介し、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲγ）によって制御される。ＰＢＫの欠損によって、ペルオキシソームβ−酸化活性が非常に低くなり、かつ胆汁酸生合成において極長鎖脂肪酸および中間体が蓄積される。かかるペルオキシソーム異常は、ペルオキシソーム欠損ツェルウェガー症候群および斑状軟骨形成不全症（Rhizomelic Chondrodysplasia  Punctata）である。
【０２４９】
本発明の好ましい更なる実施形態は、ＰＢＫポリペプチドをＰＢＫ特異的抗体またはそのＰＢＫ結合断片と結合させる方法である。この方法は、結合を可能にする条件下にて、ＰＢＫポリペプチドをＰＢＫ特異的抗体またはそのＰＢＫ結合断片と接触させる段階を含む。この方法は、ＰＢＫの検出および精製、ならびにＰＢＫ機能の修飾に適用することができる。これらの態様は本明細書で詳細に説明する。
【０２５０】
本発明の好ましい態様は、ＰＢＫポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。更なる好ましい態様は、ＰＢＫの発現を検出できるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＰＢＫの発現を検出できるポリヌクレオチドは、ＰＢＫ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＰＢＫコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞によって作製されるＰＢＫタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０２５１】
一実施形態において、本発明のタンパク質またはその一部の加水分解活性は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４４５，９４２号に記載の方法を含む、当業者に公知のアッセイのいずれかを用いて、アッセイすることができる。
【０２５２】
本発明の他の実施形態は、例えば、β−酸化ペルオキシソーム異常、例えば限定されないが、ツェルウェガー症候群、偽性ツェルウェガー（Pseudo Zellweger）、斑状軟骨形成不全症、Ｘ染色体性副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、新生児副腎白質ジストロフィー、偽性新生児（pseudoneonatal）副腎白質ジストロフィー、アシル−ｃｏＡ欠損、二機能性酵素、レフサム症候群、ＤＨＡＰアシルトランスフェラーゼ欠損、高ピペコール酸血（hyperpipecolatemia）および無カタラーゼ血症に関連する、この細胞器官の変化、トポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、本発明のタンパク質またはその一部を使用する組成物および方法に関する。
【０２５３】
例えば、そのタンパク質を、タグ配列をコードする配列を有する枠内で本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを真核細胞発現ベクターに挿入することによって容易に検出可能にすることができる。本発明のタグ付きタンパク質を発現する真核細胞は、β−酸化ペルオキシソーム障害を治療することができる薬物または遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングするために使用することもできる。
【０２５４】
本発明の実施形態は、ＰＢＫ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質を暴露した後の細胞におけるＰＢＫ発現を、非暴露対照細胞における発現と比較する段階；を含む。ＰＢＫの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＰＢＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより決定される。この方法の一例は、ｉ）２つの同じ細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物のうちの一方に試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ)指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各サンプルにおけるＰＢＫのｍＲＮＡレベルを、ノーザンブロット、ＲＴＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に記述されるような特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。更なる例は、ｉ）細胞の２つの同じ培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物のうちの一方に試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ)どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのタンパク質を精製する段階；ｖ)各サンプルにおけるＰＢＫポリペプチドのレベルを、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法により比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に記載ような特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０２５５】
主題の発明のＰＢＫの発現または活性を調節する作用物質には、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、薬物、および抗体が含まれる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造および使用される。また、ＰＢＫの発現を高める作用物質は、脂質低下性化合物である、さらに、本発明のタンパク質またはその生物活性断片は、治療化合物についてのスクリーニングアッセイで使用することができる。様々な薬物スクリーニング技術が用いられる。本発明のこの態様では、このタンパク質またはその生物活性断片は、溶液中で遊離であり、固体担体に固定化され、細胞表面上に組換え発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。本発明のタンパク質またはその生物活性断片と、試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、当技術分野でよく知られる方法、限定されないが例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ(スウェーデン、ウプサラ)などによって測定することができる。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：Ｗ０８４／０３５６４に記載のように、使用することができる薬物スクリーニングの他の技術は、本発明のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。
【０２５６】
主題の本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に高める組成物および方法を提供する。ＰＢＫを活性化することによって、ＰＢＫ活性に関連する疾患または生化学的異常をうまく処置し、かつ／または取り扱うことができる。本発明のタンパク質の発現または活性を高めることができるアゴニストは、脂肪酸のペルオキシソームの減少したβ酸化に関連する疾患、例えば偽性ツェルウェガー症候群および斑状軟骨形成不全症（ＲＣＤＰ）の治療に有用である。好ましいアゴニストには、脂質低下性化合物が含まれる。各脂質低下性化合物はさらに、個々にまたはグループとして除外され得る。
【０２５７】
他の実施形態において、本発明は、個体における病状を治療または改善するための、ＰＢＫポリペプチド、または目的の生物活性を有する断片の使用を包含する。例えば、その病状は、偽性ツェルウェガー症候群および斑状軟骨形成不全症（ＲＣＤＰ）である。かかる実施形態では、ＰＢＫポリペプチドまたはその断片は、ＰＢＫの活性のうちのいずれかを高めることが望まれる個体に投与される。ＰＢＫポリペプチドまたはその断片を個体に直接投与してもよいし、あるいは代わりに、ＰＢＫポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を個体に投与してもよい。例えば、ＰＢＫポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドは、偽性ツェルウェガー症候群および斑状軟骨形成不全症（ＲＣＤＰ）を有する患者に投与することができる組換え発現ベクター中に含まれる。好ましい発現ベクターとしては、ウイルスベクター、特にアデノウイルスおよびレンチウイルスベクターが挙げられる。代替方法としては、ＰＢＫポリペプチドの活性を高める作用物質を個体に投与してもよい。好ましいアゴニストは、脂質低下性化合物である。さらに、特定の脂質低下性化合物は、個々にまたはグループとして除外され得る。
【０２５８】
かかる方法において、ＰＢＫ活性を高める作用物質を薬学の従来の方法に従って処理し、患者に投与するための医薬品を製造することができる。このように、ＰＢＫ活性を高める作用物質を含有する薬剤組成物は、固形（例えば、経口投与用の顆粒剤、吸入用の散剤）または液状（例えば、経口投与または注入用の液剤）で製造される。限定されないが偽性ツェルウェガー症候群および斑状軟骨形成不全症（ＲＣＤＰ）などの疾患を患う患者を治療するための本発明の組成物の有効用量は、関連技術に従って決定することができる。更なる作用物質は、ＰＢＫポリペプチドまたはＰＢＫポリペプチドを含有する細胞もしくはプレパラートを作用物質と接触させ、試験作用物質がタンパク質の活性を高めるかどうかをアッセイすることによって同定される。例えば、試験作用物質は、化学化合物またはポリペプチドまたはペプチドであり得る。
【０２５９】
一実施形態において、主題の方法では、ＰＢＫポリペプチドまたはその生物活性断片を発現する組換え核酸で安定的に形質転換される、真核生物または原核生物の宿主細胞を用いる。その形質転換細胞は生細胞または固定細胞である。本発明のタンパク質、またはその生物活性断片を活性化する候補である薬物または化合物は、当業者によく知られている結合アッセイにおいて、かかる形質転換細胞に対してスクリーニングされる。代替方法としては、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、１９８４年９月１３日公開のGeysen H. N.による国際特許出願公開第８４／０３５６４号に教示されているアッセイなどを用いて、ＰＢＫポリペプチドまたはその生物活性断片に対する結合親和性またはＰＢＫポリペプチドまたはその生物活性断片を活性化する能力を示すペプチド化合物についてスクリーニングすることができる。
【０２６０】
本発明の他の実施形態は、当業者に知られているいずれかの方法によって、遺伝子導入モデル動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するための、本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを用いた組成物および方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで調節することによって、ツェルウェガー症候群、斑状軟骨形成不全症、Ｘ染色体性副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、アシル−ｃｏＡ欠損、二機能性酵素、レフサム症候群、ＤＨＡＰアシルトランスフェラーゼ欠損、高ピペコール酸血（hyperpipecolatemia）および無カタラーゼ血症になどのヒトペルオキシソーム関連疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。このように、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ  ｖｉｖｏで使用することができる。
【０２６１】
他の実施形態において、本発明は、特定の生体試料中に存在する本発明のタンパク質のレベルを検出かつ定量化する方法および組成物に関する。これらの方法は、限定されないが偽性ツェルウェガー症候群などの、本発明のタンパク質の変化したレベルに関連する疾患の診断または予後に有用である。本発明のタンパク質を検出するための診断アッセイは、器官または組織切片からの細胞の、または腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ  ｓｉｔｕアッセイを含み得る。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。
【０２６２】
タンパク質PBKを定量化するアッセイは、当技術分野でよく知られている方法に従って行われる。通常、これらのアッセイは、本発明のタンパク質のリガンドまたは本発明のタンパク質もしくはその断片を認識する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）と試料を接触させる段階と、試料中に存在する本発明のタンパク質とリガンドまたは抗体との間に形成される複合体を検出する段階と、を含む。リガンドおよび抗体の断片もまた、これらの断片が主題の発明のタンパク質と特異的に相互作用することができるという条件で、結合アッセイにおいて使用することができる。さらに、本発明のタンパク質に結合するリガンドおよび抗体は、当技術分野で公知の方法に従って標識することができる。主題の発明において有用な標識としては、限定されないが、酵素標識、放射性標識、常磁性標識、化学発光標識が挙げられる。一般的な技術は、その開示時内容全体が本明細書に組み込まれるJ. H., et al. (1976) Clin. Chim. Acta 70: 1-31；その開示内容全体が本明細書に組み込まれるSchurs, A. H. et al. (1977) Clin. Chim. Acta 81: 1-40に記述されている。例えばＰＢＫは、イムノブロット法により、対照個体の線維芽細胞で検出されるが、ツェルウェガー症患者の線維芽細胞では検出されないだろう。
【０２６３】
他の実施形態では、ＰＢＫポリペプチドまたはその断片をコードするヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築し、例えば遺伝的突然変異の効率的なスクリーニングを行うことができる。マイクロアレイを使用して、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターし、かつ遺伝的変異体、突然変異体、および遺伝的多型を同定することができる。遺伝子機能を決定し、障害の遺伝的根拠を理解し、障害を診断し、治療薬の活性を発生させ、かつモニターするために、この情報が用いられる（例えば：その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるChee, M. et al., Science, 274: 610-614 (1996)参照）。ＰＢＫの遺伝的変異体、突然変異体、および多型は、斑状軟骨形成不全症などのペルオキシソームβ−酸化障害に関係がある。
配列番号：１２のタンパク質（内部指定クローン１０００８３７０３７  ２２８−４３−２−０−Ｃ３−Ｆ）
クローン１０００８３７０３７＿２２８−４３−２−０−Ｃ３−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：１１）は、アミノ酸配列：ＭＰＦＳＨＬＳＴＹＳＬＶＷＶＭＡＡＷＬＣＴＡＱＶＱＷＴＱＤＥＲＥＱＬＹＴＴＡＳＬＫＣＳＬＱＮＡＱＥＡＬＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭＶＴＦＳＥＮＨＧＶＶＩＱＰＡＹＫＤＫＩＮＩＴＱＬＧＬＱＮＳＴＩＴＦＷＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡＣＬＴＶＹＶＱＰＩＶＳＬＨＹＫＦＳＥＤＨＬＮＩＴＣＳＡＴＡＲＰＡＰＭＶＦＷＫＶＰＲＳＧＩＥＮＳＴＶＴＬＳＨＰＮＧＴＴＳＶＴＳＩＬＨＩＫＤＰＫＮＱＶＧＫＥＶＩＣＱＶＬＨＬＧＴＶＴＤＦＫＱＴＶＮＫＧＹＷＦＳＶＰＬＬＬＳＩＶＳＬＶＩＬＬＶＬＩＳＩＬＬＹＷＫＲＨＲＮＱＤＲＥＰを含む、配列番号：１２のｍｙｅｌｏｉｄｉｎをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１２のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８３７０３７＿２２８−４３−２−０−Ｃ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡよってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８３７０３７＿２２８−４３−２−０−Ｃ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１２、配列番号：１１、およびクローン１０００８３７０３７＿２２８−４３−２−０−Ｃ３−Ｆの組成物にも関する。以下で示す方法において使用するのに好ましいｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドとしては、以下のアミノ配列：ＱＶＱＷＴＱＤＥＲＥＱＬＹＴＴＡＳＬＫＣＳＬＱＮＡＱＥＡＬＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭＶＴＦＳＥＮＨＧＷＩＱＰＡＹＫＤＫＩＮＩＴＱＬＧＬＱＮＳＴＩＴＦＷＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦＮＴＦＧＦＧＫＩＳＧＴＡＣＬＴＶＹＶＱＰＩＶＳＬＨＹＫＦＳＥＤＨＬＮＩＴＣＳＡＴＡＲＰＡＰＭＶＦＷＫＶＰＲＳＧＩＥＮＳＴＶＴＬＳＨＰＮＧＴＴＳＶＴＳＩＬＨＩＫＤＰＫＮＱＶＧＫＥＶＩＣＱＶＬＨＬＧＴＶＴＤＦＫＱＴＶＮＫＧＹＷＦＳＶＰＬＬＬＳＩＶＳＬＶＩＬＬＶＬＩＳＩＬＬＹＷＫＲＨＲＮＱＤＲＥＰを含むポリペプチドが挙げられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０２６４】
本発明のタンパク質、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、脳のＯＸ−２タンパク質(Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１２１７）の新規なスプライシングバリアントである。Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、２６２アミノ酸の長さである。ＯＸ-２は、２７４アミノ酸の長さであり、アミノ末端とカルボキシル末端のどちらにおいてもｍｙｅｌｏｉｄｉｎと異なる。ＯＸ-２の他の既知のスプライシングバリアント、ｍｙ０３３は、２６９アミノ酸の長さであり、アミノ末端においてｍｙｅｌｏｉｄｉｎと異なる。Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、シグナルペプチド(ＭＰＦＳＨＬＳＴＹＳＬＶＷＶＭＡＡＶＶＬＣＴＡ)、１つの膜貫通のドメイン(ＶＰＬＬＬＳＩＶＳＬＶＩＬＬＶＬＩＳＩＬＬＹＷ)、２つの免疫グロブリン(Ｉｇ)ドメイン(ＴＡＳＬＫＣＳＬＱＮＡＱＥＡＬＩＶＴＷＱＫＫＫＡＶＳＰＥＮＭＶＴＦＳＥＮＨＧＷＩＱＰＡＹＫＤＫＩＮＩＴＱＬＧＬＱＮＳＴＩＴＦＷＮＩＴＬＥＤＥＧＣＹＭＣＬＦおよびＥＤＨＬＮＩＴＣＳＡＴＡＲＰＡＰＭＶＦＷＫＶＰＲＳＧＩＥＮＳＴＶＴＬＳＨＰＮＧＴＴＳＶＴＳＩＬＨＩＫＤＰＫＮＱＶＧＫＥＶＩＣＱＶ)を示す。Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、中枢神経系(ＣＮＳ)の細胞を含む、多種多様な細胞によって発現される。
【０２６５】
Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、骨髄性系統細胞に抑制シグナルを送達する細胞表面タンパク質である。Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、骨髄性系統細胞に特異的に位置する受容体に結合する。特に、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、脳の小膠細胞に抑制シグナルを送達する。小膠細胞は、活性化されると様々な細胞傷害性および神経栄養性分子を生成することによって、脳の再生状態およびリモデリングを調節する。さらに一般的には、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎは、細胞傷害性細胞を抑制することによって免疫抑制に関与する。
【０２６６】
本発明の実施形態は、配列番号：１２のｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０２６７】
本発明の更なる実施形態は、骨髄性系統細胞に抑制シグナルを送達する、生物活性を有するｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０２６８】
本発明の更なる実施形態は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドをコードする配列番号:１１のポリヌクレオチド 配列を含む組成物に関する。
【０２６９】
本発明の更なる実施形態は、骨髄性系統細胞に対して抑制シグナルを送達する、生物活性を有するｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０２７０】
本発明の更なる実施形態は、配列番号：１２のｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド配列または同じ生物活性を有するｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド断片を認識する抗体を含む組成物に関する。その抗体は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎには結合するが、ＯＸ-２またはｍｙ０３３には結合しないことが好ましい。本明細書でさらに使用される、抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体とは、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドまたは同じ生物活性を有するｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド断片に特異的に結合する抗体を意味する。抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体は、全分子またはその抗原結合断片であり得る。
【０２７１】
本発明は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドに抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体を結合する方法であって、結合が生じる条件下にて、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを前記抗体と接触させる段階を含む方法にも関する。かかる条件は、当業者によく知られている。さらに、本発明は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドまたはその断片を発現する細胞に抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体を結合させる方法であって、結合が生じる条件下にて、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドまたはその一部を発現する細胞を前記抗体と接触させる段階を含む方法にも関する。抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体をｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドに結合させるかかる方法は、例えば、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを精製するのに有用である。
【０２７２】
本発明の他の実施形態は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクトする段階；任意にｉｉ）作製されたタンパク質を精製する段階；を含む、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを作製する方法に関する。タンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎをクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。代替方法としては、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドは、ｉ）ｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現を検出することができるポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクトする段階を含む方法によって作製することができる。ｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現を検出することができるポリヌクレオチドは、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。
【０２７３】
先の実施形態の更なる態様は、哺乳動物においてｉｎ ｖｉｖｏでｍｙｅｌｏｉｄｉｎを作製する方法に関する。好ましいかかる方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７６２，９２６号に記載のように、中枢神経に細胞を移植するためにｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリヌクレオチドを遺伝子導入することによって、ドナー細胞を遺伝子改変する方法である。ドナー細胞は、神経細胞または線維芽細胞であることが好ましい。かかる方法は、神経変性疾患を有する哺乳動物に適用することが最も好ましい。好ましい哺乳動物はマウスまたはヒトである。
【０２７４】
本発明の一実施形態は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを用いて、小膠細胞を単離または精製する方法に関する。単離小膠細胞および精製小膠細胞集団の研究および使用（例えば、薬物および薬物候補と、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでこれらの細胞との相互作用を特徴付けることを含む）は、神経疾患の治療に有用な情報を提供する。小膠細胞中で濃縮された細胞集団を得るための一方法は、ｉ）小膠細胞を含むプレパラートをｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドと接触させる段階であって、接触前または後に、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎがマトリックス上に固定化される段階；ｉｉ）非付着細胞を除去し、それによって、小膠細胞中で濃縮された細胞集団が作製される段階；を含む。例えば、そのマトリックスはプラスチックであり、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドは吸着によって固定化される。ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを含む組成物を用いて、小膠細胞集団を単離または精製する他の方法は、ｉ）検出可能なシグナルを提供するために使用することができる分子で、標準法によりｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを標識する段階；ｉｉ）タンパク質の結合を可能にする条件下にて、標識ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドを細胞と接触させる段階；ｉｉｉ）検出可能なシグナルの有無に基づいて細胞を選別する段階；を含む。選別および検出は、選別装置、例えば蛍光活性化細胞選別装置または磁気活性化細胞選別装置によって行うことが好ましい。好ましくは、小膠細胞を含むプレパラートは、脳から（例えば、ラットまたはマウスの脳から）作製され、正常な哺乳動物または神経疾患を有する哺乳動物由来のものであることが可能である。小膠細胞を含有する組織の細胞浮遊液の調製は、当業者によく知られているいずれかの方法、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：ＷＯ０１/５１６１８に記載の方法に従って行うことができる。
【０２７５】
他の好ましい実施形態は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現を増加または低減する物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞におけるｙｅｌｏｉｄｉｎ発現を、非暴露細胞における発現と比較する段階；を含む方法に関する。好ましくは、試験物質は、特定の細胞型におけるｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現を修飾するが、他の細胞では修飾しない。試験物質は、神経細胞において特異的にｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現を修飾することが最も好ましい。
【０２７６】
本発明の更なる実施形態は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性を増加または減少させる物質と、かかる物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性を決定する段階；ｉｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞におけるｙｅｌｏｉｄｉｎ活性を、非暴露細胞における活性と比較する段階；ｉｖ）暴露細胞におけるｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性と、非暴露細胞における活性との比を決定する段階；を含む方法と、に関する。ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性は、神経細胞において研究されることが好ましい。Ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性は、星状膠細胞の小膠細胞仲介活性化を研究することによって、つまり培養中の反応性星状膠細胞モフォロジーを妨げるその能力を決定することにより決定することができる。ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ活性は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：ＷＯ９９/２４５６５に記載のようにサイトカイン生成を測定することによって決定することもできる。
【０２７７】
本明細書でさらに使用される、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現またはｍｙｅｌｏｉｄｉｎの活性を増加する物質は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎアゴニストとして定義される。本明細書でさらに使用される、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎの発現またはｍｙｅｌｏｉｄｉｎの活性を減少させる物質は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎアンタゴニストとして定義される。アンタゴニストという用語は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドの生物活性を抑制する抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体を含む。
【０２７８】
本発明の実施形態は、骨髄性系統細胞の活性化を誘導するか、または高めるために、本発明のｍｙｅｌｏｉｄｉｎアンタゴニストを使用する方法に関する。かかる方法は、細胞、組織、または個体を、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎアンタゴニストおよび任意に薬剤担体を含有する組成物と接触させる段階を含む。好ましい実施形態において、骨髄性系統細胞を活性化するかかる方法は、脳の小膠細胞に対して向けられている。かかる方法を用いて、侵入微生物を破壊し、神経再生を促進し、または潜在的に有害な壊死組織片を除去し、かつ脳損傷に続いて組織修復を促進することができる。小膠細胞を活性化することにより、治療するか、または重症度を低減することができる感染症には、限定されないが、例えばアスペルギルスＣＮＳ感染による脳膿瘍、クリプトコックスＣＮＳ感染による髄膜炎、連鎖球菌感染に関連する神経精神障害(ＰＡＮＤＡＳ)およびインフルエンザウイルス関連脳症が含まれる。
【０２７９】
本発明の他の実施形態は、骨髄性系統細胞の活性化を防ぐまたは低減するための、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法に関する。かかる方法は、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチドまたはｍｙｅｌｏｉｄｉｎアゴニスト、任意に薬剤担体を含む組成物と、細胞、組織、または個体を接触させる段階を含む。好ましい実施形態において、骨髄性系統細胞の活性化を防ぐまたは低減するためのかかる方法は、脳の小膠細胞に対して向けられている。かかる方法を用いて、神経炎症、さらに詳細には特異的神経変性疾患、および脳損傷に続く病理学的炎症を治療または重症度を低減することができる。神経炎症と関連する神経変性疾患としては、限定されないが、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、小脳型のクロイツフェルト・ヤコブ病およびハンチントン病が挙げられる。
【０２８０】
他の好ましい実施形態では、骨髄性系統細胞の活性化を防ぐまたは低減するためのかかる方法は、自己免疫疾患と関連する炎症を予防または治療することに向けられている。本発明に従って治療または予防することができる自己免疫疾患としては、限定されないが、多発性硬化症、１型インスリン依存性糖尿病、および慢性関節リウマチが挙げられる。
【０２８１】
小膠細胞活性を調節するための本発明の組成物および方法の有効性は、星状膠細胞のモフォロジーに対する本名発明の組成物の効果を研究することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで検証することができる。小膠細胞の活性化と関連する所定の疾患を治療するための本発明の組成物および方法の有効性は、治療される疾患に応じたモデルを用いて検証することができる。例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９１，１５４号に記載のモデルを、神経系の外傷に続く現象の続発に対する組織モデルとして使用することができる。
【０２８２】
上述の疾患を患う患者を治療するために投与される、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎポリペプチド、抗ｍｙｅｌｏｉｄｉｎ抗体、ｍｙｅｌｏｉｄｉｎアゴニストまたはｍｙｅｌｏｉｄｉｎアンタゴニストの量は、特定の用途および活性成分の効力に応じて決定することができる。本発明の化合物から薬剤組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、いずれかの適切な形状（例えば、固体、液体、ゲル）であり得る。本発明は、治療用組成物を投与するための様々な技術を企図する。適切な経路としては、限定されないが、経口、直腸、もしくは経皮投与、および皮内、皮下もしくは静脈内注入が挙げられる。実際は、本発明は、特定の投与経路に限定されることを意図しない。個々の患者に対する適切な治療法の臨床的特徴の評価および設計は、最終的に処方する医師の責任である。さらに、本発明の組成物は、単独で、または上記で治療される疾患を治療するための他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。
配列番号：１４のタンパク質（内部指定クローン１０１００５  １０５−０２０−４−０−Ｈｌｌ−Ｆ）
クローン１０１００５＿１０５−０２０−４−０−Ｈ１１−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：１３）は、アミノ酸配列：ＭＥＲＭＬＰＬＬＴＬＧＬＬＡＡＧＦＣＰＡＶＬＣＨＰＮＳＰＬＤＥＥＮＬＴＱＥＮＱＤＲＧＴＨＶＤＬＧＬＡＳＡＮＶＤＦＡＬＳＬＹＫＱＬＶＬＫＡＰＤＫＮＶＩＦＳＰＬＳＩＳＴＡＬＡＦＬＳＬＧＡＨＮＴＴＬＴＥＬＫＧＬＫＦＮＬＴＥＴＳＥＡＥＩＨＱＳＦＱＨＬＬＲＴＬＮＱＳＳＤＥＬＱＬＳＭＧＮＡＭＦＶＫＥＱＬＳＬＬＤＲＦＴＥＤＡＫＲＬＹＧＳＥＡＦＡＴＤＦＱＤＳＡＡＡＫＫＬＩＮＤＹＶＫＮＧＴＲＧＫＩＴＤＬＩＫＤＬＤＳＱＴＭＭＶＬＶＮＹＩＦＦＫＡＫＷＥＭＰＦＤＰＱＤＴＨＱＳＲＦＹＬＳＫＫＫＷＶＭＶＰＭＭＳＬＨＨＬＴＩＰＹＦＲＤＥＥＬＳＣＴＶＶＥＬＫＹＴＧＮＡＳＡＬＦＩＬＰＤＱＤＫＭＥＥＶＥＡＭＬＬＰＥＴＬＫＲＷＲＤＳＬＥＦＲＥＩＧＥＬＹＬＰＫＦＳＩＳＲＤＹＮＬＮＤＩＬＬＱＬＧＩＥＥＡＦＴＳＫＡＤＬＳＧＩＴＧＡＲＮＬＡＶＳＱＷＨＫＡＶＬＤＶＦＥＥＧＴＥＡＳＡＡＴＡＶＫＩＴＬＬＳＡＬＶＥＴＲＴＩＶＲＦＮＲＰＦＬＭＩＩＶＰＴＤＴＱＮＩＦＦＭＳＫＶＴＮＰＫＱＡを含む、配列番号：１４のタンパク質ｖＡＣＴをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１４のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１０１００５＿１０５−０２０−４−０−Ｈ１１−Ｆ中のヒトｃＤＮＡよってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１３のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１０１００５＿１０５−０２０−４−０−Ｈ１１−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１３、配列番号：１４、およびクローン１０１００５＿１０５−０２０−４−０−Ｈ１１−Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０２８３】
配列番号：１３のｃＤＮＡは、１４番染色体上、特に１４ｑ３１〜ｑ３２．３の位置に位置する遺伝子によってコードされる、ｖＡＣＴと呼ばれるヒトα１抗キモトリプシン(ＡＣＴ)タンパク質の新規な多型変異体である。配列番号：１３のｃＤＮＡは、配列番号：１４の４２３アミノ酸のタンパク質をコードする。プロテアーゼは、広範囲の生物学的経路のキー成分であり、それらの触媒機構に従って４つのグループ：セリン、システイン（チオール）、アスパラギン酸（カルボキシル）、および金属プロテアーゼに分類することができる。キモトリプシンは、それらの活性部位に異常に反応性のセリン残基を有することからそう呼ばれるセリンプロテアーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバーである。ｖＡＣＴは、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害剤）ファミリーに属する。セルピンは、血液凝固、線維素溶解、補体活性化、血管形成、アポトーシス、炎症、新形成およびウイルス病原性などの多様な生理学的プロセスにおけるタンパク分解の調節に中心的役割を果たすプロテアーゼの不可逆的自殺阻害剤である。ｖＡＣＴは、その活性部位に結合し、安定な複合体を形成することによってキモトリプシンを中和する。ｖＡＣＴは主に肝臓中で合成され、好中球のカテプシンＧ、マスト細胞のキマーゼおよび膵キモトリプシンを特異的に不活化する。ｖＡＣＴの血漿濃度は炎症反応中数時間以内で上昇するため、ｖＡＣＴは急性期タンパク質でもある。ｖＡＣＴの合成は、炎症／組織損傷部位で好中球のカテプシンＧとｖＡＣＴとのネットバランスによって厳しく制御される。その機能レベルに影響を及ぼすセルピンが変化した結果、病態が生じ、特定の臨床的症候群が引き起こされる。例えば、ｖＡＣＴが欠乏している個体は、肺および肝臓疾患を早く発生しやすい。さらに、セリンプロテアーゼとｖＡＣＴのバランスが変化すると、アルツハイマー病などの一部の神経変性疾患と関連する病状と同様の病的状態が引き起こされる。
【０２８４】
本発明の実施形態は、配列番号：１４のｖＡＣＴポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０２８５】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｖＡＣＴポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０２８６】
本発明の更なる実施形態は、ｖＡＣＴポリペプチドをコードする配列番号：１３のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０２８７】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｖＡＣＴポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０２８８】
一実施形態において、ｖＡＣＴポリペプチドまたはその断片を用いて、試料中の混入プロテアーゼを阻害することができる。この方法は、タンパク質試料の分解を防ぐために、ｖＡＣＴ活性を与える条件下にて、生体試料にプロテアーゼ阻害量のｖＡＣＴポリペプチドを添加する段階を含む。好ましい生体試料は細胞培養物である。かかる組成物は、単独で、または他のプロテアーゼ阻害剤との「カクテル」として使用することができる。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを使用する利点は、どのプロテアーゼの特異性も理解することなく、広範囲のプロテアーゼを阻害することができるということである。プロテアーゼ阻害剤のカクテルを使用することによって、膨大な数の源からのタンパク質試料を今後に汚染する可能性がある広範囲のプロテアーゼから、タンパク質試料を保護することもできる。例えば、ｖＡＣＴポリペプチドまたはその断片が、混入プロテアーゼによるタンパク分解が望ましくない試料に添加される。かかるプロテアーゼ阻害剤カクテルは、アッセイが行われる対象のタンパク質を分解しやすいプロテアーゼを阻害するためにアッセイにおいて広く用いられる。代替方法としては、ｖＡＣＴまたはその一部を、当技術分野でよく知られている技術を用いて、単独で、または他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせてクロマトグラフィー担体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。望ましくないプロテアーゼを含有する試料をカラムに通し、そのプロテアーゼを除去する。代替方法としては、同じ方法を用いて、ｖＡＣＴの新規な標的プロテアーゼを同定することができる。
【０２８９】
他の好ましい実施形態では、ｖＡＣＴポリペプチドまたはその断片を、多くの感染症、限定されないが、例えば細菌性感染および寄生体媒介感染などに関係する外来性プロテアーゼを阻害するのに有用な抗菌剤として使用することができる。例えば、ｖＡＣＴは、抗生物質耐性株を含むＡ群連鎖球菌のすべての株の成長を阻害する。したがって、本発明を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで特定の微生物の成長を遅らせるか、または阻害することができる。かかる方法は、例えば精製タンパク質を投与するか、またはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞にトランスフェクトすることによって、セリンプロテアーゼを阻害することができる、ある量のｖＡＣＴポリペプチドを送達する段階を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、この方法は、有効量のｖＡＣＴポリペプチドを生体試料と接触させる段階を含む。好ましい生体試料は細胞培養物である。ｉｎ ｖｉｖｏでは、この方法は、有効量のｖＡＣＴポリペプチドを、個体の目的部位と接触させる段階を含む。好ましい個体は、微生物感染のリスクを有する個体である。
【０２９０】
更なる実施形態において、本発明は、セリンプロテアーゼを有効に調節することができる組換えセルピンを作製する方法を提供する。血清由来のヒトα１抗キモトリプシンおよびｖＡＣＴの有用性にもかかわらず、主にヒト血清の有効性が限定されているために、治療用途に十分な大量な量は入手できない。従って、治療用途で生じる必要性を満たす、ヒトα１抗キモトリプシンおよびｖＡＣＴの他の供給源が大いに必要とされている。好ましい一実施形態において、哺乳動物を用いてその乳中でｖＡＣＴを産生し、それによって精製後にこの特定タンパク質がかなりの量で得られる。本発明のタンパク質は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６８，４８７号に開示の技術を含む、当業者に公知のいずれかの技術を用いて精製することができる。十分な乳を産生するいずれかの種類の動物、例えば限定されないが、ヒツジ、ヤギ、および雌ウシをこの目的に使用することができる。これらの動物は、乳中のｖＡＣＴの過剰発現を標的化するいずれかの方法で作製することができる。この実施形態においても、本発明のタンパク質は、ｖＡＣＴをコードする核酸配列を含む適切な発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞において作製することができる。その宿主細胞は、それによってこの特定のタンパク質をコードする核酸配列が発現する条件下で培養される。その生成物が蓄積するのに適切な時間の後、タンパク質を宿主細胞またはその細胞を取り囲む培地から精製する。ｖＡＣＴをコードする核酸配列を組み込む発現ベクターの宿主細胞への導入は、限定されないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、電気穿孔法、およびリポフェクションなどの様々な方法で実施することができる。
【０２９１】
本発明は、動物の１種または複数種の組織中の本発明のタンパク質の発現または活性を調節することによって作製される動物モデルもまた提供する。かかる動物は、ｖＡＣＴの活性に特異的に関連する疾患の様々な病態生理学的側面の治療に潜在的に有用な候補分子を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ法を象徴することから、多くの目的に有用である。かかるモデルの表現型の研究によって、ｖＡＣＴ欠乏によって引き起こされるまたはｖＡＣＴ欠乏と関連する、その他の同等のヒト疾患を同定することもできる。これらの動物は、ｖＡＣＴの過剰発現または不活性化を標的化するためのいずれかの方法で作製することができる。かかるモデルは、例えば、炎症性疾患および病状の治療に用いられる候補治療法および薬物の評価に非常に有用である。
【０２９２】
本発明の更なる実施形態は、セリンプロテアーゼおよび好ましくはキモトリプシンの過剰な活性を示す疾患および病状の治療に有用な、新規な方法および組成物を提供することである。ｖＡＣＴまたはその一部を用いて、細胞のタンパク分解が起こる数多くの疾患に関係するプロテアーゼを阻害することができる。組織の分解によって特徴付けられるかかる疾患としては、限定されないが、血液凝固関連疾患、腫瘍浸潤、感染症、および炎症などが挙げられる。さらに好ましくは、本発明は、過剰レベルのカテプシンＧ、マスト細胞のキマーゼまたは膵キモトリプシンと関連する疾患、限定されないが、例えば、慢性肺気腫、肝臓疾患、膵炎、循環器疾患、およびアレルギー反応などの治療に適用される。この方法および組成物は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療にも有用である。かかる方法は、疾患または病状を有する哺乳動物に治療有効量のｖＡＣＴを投与することを含み、「有効量」とは、セリンプロテアーゼの活性を有意に低減することができるｖＡＣＴの濃度を意味する。本発明の組成物は、生理食塩水溶液などの生理学的に許容される担体または患者に投与するのに生理学的に適切な他のバッファーと組み合わせて、個体に送達されることが好ましい。皮膚炎の治療では、本発明の組成物は、生理学的に許容される軟膏またはクリームと組み合わせて、患部に塗られる。特定の病状に対して哺乳動物に投与されるであろう本発明の組成物の特定量は、患者の臨床症状、および体重、年齢、および投与経路などの他の因子に応じて異なるだろう。かかる組成物は、限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下経路を含む、いずれかの適切な経路によって、かつ局所的に皮膚の患部に、または鼻、膣、直腸などの上皮もしくは粘膜皮膚の内面からの吸収によって投与することができる。治療目的のために、本発明の組成物は、標的細胞に治療的生理活性分子を送達するために、当技術分野で公知の遺伝子治療法のいずれかを用いて投与される。これらの組成物は、本発明のタンパク質、および任意に１種または複数種のプロテアーゼ阻害剤、または対象の他のいずれかの化合物を含有する。この同時投与は、同時に投与することによる、または別々に投与もしくは逐次投与することによるものである。これらの更なる成分のすべては、天然源から得られるか、または組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾によって生成することができる。
【０２９３】
本発明のその他の好ましい実施形態は、ｖＡＣＴ特異的抗体またはそのｖＡＣＴ結合断片とｖＡＣＴポリペプチドを結合させる方法である。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ｖＡＣＴポリペプチドをｖＡＣＴ結合抗体またはそのｖＡＣＴ結合断片と接触させる段階を含む。この方法は、ｖＡＣＴの検出および精製、ならびにｖＡＣＴ機能の修飾に適用される。これらの態様は本明細書に詳細に記述される。
【０２９４】
他の実施形態では、本発明は、本発明のタンパク質の変化した発現または活性と関連する疾患または障害を診断するために使用される。特に、標的プロテアーゼの制御されていない活性をもたらす、異常に低いレベルのｖＡＣＴ発現を有する患者を診断するのに有用である。かかる疾患および障害の例としては、限定されないが、肺および肝臓疾患、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、過剰レベルのカテプシンＧと関連する炎症性疾患、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病などが挙げられる。その方法は、ｉ）ｖＡＣＴポリペプチドまたは核酸に選択的に結合することができる化合物を、体液または組織試料と接触させる段階；ｉｉ）試料におけるｖＡＣＴのレベル、または他のいずれかの検出可能な特性を検出する段階；を含む。好ましくは、対照試料に対する、その試料におけるレベルまたは他の特性の差異によって、疾患もしくは障害の存在、または疾患もしくは障害を発生する性質が示される。その体液または組織試料は、疾患または病状を有する疑いのある、または疾患または病状を発生するリスクのある個体から採取することが好ましい。例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその免疫学的活性断片または核酸プローブを使用することができる。好ましくは、かかる実施形態で使用される抗体は、変異ｖＡＣＴポリペプチドに対して特異的に作られ、α１抗キモトリプシンポリペプチドを認識しない。検出は、公知の免疫組織学的および免疫蛍光プロセスを用いて、直接または間接的に行うことができる。これに対して、本発明によるキットに含まれる試薬は、一般的に既知の分子、限定されないが、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Texas-Red）などの蛍光染料で直接標識することができる。しかしながら、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン等の分子で標識した二次抗体を使用することによって間接的に行うこともでき、次いで二次試薬で検出される。この実施形態においても、かかる病状の診断は、公知のＰＣＲまたはＲＴ-ＰＣＲ技術を用いて、特に「リアルタイム」ＰＣＲシステムで変異ｖＡＣＴを同定することにより容易となる。一方、かかる技術を用いて、本発明は、ｖＡＣＴの発現における調節（modulation）を特定の病状と関係付けるツールを提供する。このように、本発明は、かかる病状の新規な候補遺伝子を提供する。
【０２９５】
セリンプロテアーゼのそれらの阻害剤による調節は、上述の疾患における組織破壊の制御に重要であることから、更なる実施形態において、本発明のタンパク質またはその一部は、疾患状態の特徴付けのために、ｉｎ ｖｉｖｏでマーカーをモニターするアッセイを提供する。このように、本発明は、生体試料中のｖＡＣＴの量を定量化するのに有用な試験キットを包含する。そのキットは、少なくとも１種類の免疫結合性パートナー、例えばｖＡＣＴに特異的かつ検出可能なマーカーに結合されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。かかる一実施形態において使用される抗体は、ｖＡＣＴポリペプチドに特異的に結合するが、α１抗キモトリプシンポリペプチには特異的に結合しない。この実施形態では、これらのまたは他の病状を治療するために施される治療経過をモニターするため、かかるアッセイを適用することができる。さらに、このアッセイは、毒性の測定法として、または組織分解への影響を評価するための新規な薬物の臨床試験中に使用することができる。このように、病状、治療の指標、または対象に直接投与される、または対象が環境においてそれに暴露される物質の効果の指標として、本発明を用いることができる、いずれかの状況において、このアッセイを適用することができる。したがって、患者の病状を連続的にモニターし、病理試料中で測定されるかかるタンパク質の定量化された量を、健康な個体の生体試料中で定量された量または同じ患者の前の分析と比較することができる。この実施形態では、イムノアッセイを含むいずれかの適切な方法によって、このマーカーを血漿、血清または血液中で有効に測定することができる。それはまた、好ましくは、炎症部位から採取した組織および体液において測定することもできる。
配列番号：１６のタンパク質（内部指定番号５００７４３４１９  １８８−２８１−３−０−Ｈ５−Ｆ）
５００７４３４１９＿１８８−２８１−３−０−Ｈ５−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：１５）は、アミノ酸配列：ＭＧＳＡＡＬＥＩＬＧＬＶＬＣＬＶＧＷＧＧＬＩＬＡＣＧＬＰＭＷＱＶＴＡＦＬＤＨＮＩＶＴＡＱＴＴＷＫＧＬＷＭＳＣＷＱＳＴＧＨＭＱＣＫＶＹＤＳＶＬＡＬＳＴＥＶＱＡＡＲＡＬＴＶＳＡＶＬＬＡＦＶＡＬＦＶＴＬＡＧＡＱＣＴＴＣＶＡＰＧＰＡＫＡＲＶＡＬＴＧＧＶＬＹＬＦＣＧＬＬＡＬＶＰＬＣＷＦＡＮＩＶＶＲＥＦＹＤＰＳＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧＡＡＬＹＩＧＷＡＡＴＡＬＬＭＶＧＧＣＬＬＣＣＧＡＷＶＣＴＧＲＰＤＬＳＦＰＶＫＹＳＡＰＲＲＰＴＡＴＧＤＮＤＫＫＮＹＶを含む、配列番号：１６のタンパク質ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１６のポリペプチドのすべての特性および使用は、５００７４３４１９＿１８８−２８１−３−０−Ｈ５−Ｆ中に含まれる核酸によりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１５のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、５００７４３４１９＿１８８−２８１−３−０−Ｈ５−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１５、配列番号：１６、および５００７４３４１９＿１８８−２８１−３−０−Ｈ５−Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０２９６】
配列番号:１５のｃＤＮＡは、４つの膜貫通セグメントによって特徴付けられるタンパク質のＰＭＰ２２-Ｃｌａｕｄｉｎファミリーに属するヒトｃｌａｕｄｉｎ−５タンパク質の多型変異体である。Ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５は、１８アミノ酸の長さであり、かつ４つの膜貫通セグメントを含有する。Ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５は、Ｃｌａｕｄｉｎファミリーシグナチャー（signature）を含有し、２２番染色体上、特に２２ｑ１１．２位置に位置する遺伝子によってコードされる。タンパク質のＣｌａｕｄｉｎファミリーは、予測される４つの膜貫通ドメインを有する２０種類を超える小さな糖タンパク質を含む。Ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５は、細胞透過性および極性の調節において役割を担うタイトジャンクション（ＴＪ）鎖の成分である。極性化した上皮および内皮細胞は、生物学的コンパートメントを分離し、ホメオスタシスを調節するバリアを形成する。ＴＪは、細胞を囲む連続的な封止を構成する、極性化した上皮および内皮細胞の大部分の頂端領域にある特殊な膜ドメインである。これらの封止は、溶質および水が傍細胞空間を自由に透過するのを防ぐ物理的なバリアとしての役割を果たす。ＴＪはまた、細胞の極性を維持するために膜脂質およびタンパク質の側方拡散を制限する。次に、細胞バリア透過性の変化によってマークされる多くの疾患は、ＴＪ機能の変化に関連する。例えば、臨床的に重篤な病状の原因となる、腫瘍における微小血管の透過性の上昇は、ジャンクションタンパク質の調節不全の結果であると思われる。上皮のＴＪ透過性の上昇、およびその結果としての上皮バリア機能の減少は、癌腫および脂腺腫を含むいくつかの腫瘍の発生の前に起こる。肺上皮は、アレルゲンが感作を起こし得る前に通過しなければならないバリアを形成する。アレルゲンによる細胞間ＴＪの非特異的破壊は、上皮の透過性を増大し、その結果上皮バリアをアレルゲンが通過できる。最終的に、ＴＪ透過性もまた、異なる細菌毒素、サイトカイン、ホルモンおよび薬物によって変化させることができる。
【０２９７】
本発明の実施形態は、配列番号：１６のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０２９８】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０２９９】
本発明の更なる実施形態は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドをコードする配列番号:１５のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０３００】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド断片をコードするポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０３０１】
本発明の更なる実施形態は、配列番号:１６のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド配列または生物活性を有するｃｌａｕｄｉｎｙｎ-５ポリペプチド断片を認識する抗体を含む組成物に関する。その抗体は、非線状エピトープを認識し、かつｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５には結合するが、ｃｌａｕｄｉｎ−５には結合しないことが好ましい。
【０３０２】
本発明の好ましい態様は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現を検出することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現を検出することができるポリヌクレオチドは、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５コード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドはプロモーター配列を含むことが好ましい。ポリヌクレオチド配列を内因性配列に導入するための当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０３０３】
他の実施形態は、哺乳動物宿主細胞に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをトランスフェクトする段階；ｉｉ）作製されたタンパク質を精製する段階；を含む、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５またはその一部に対して作られた抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。またさらに好ましくは、その抗体は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５には結合するが、ｃｌａｕｄｉｎ-５には結合しない。
【０３０４】
他の実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの前記薬物の傍細胞透過性を増大することによって、親水性薬物の腸管吸収を高める方法を提供する。実際に、腸管上皮は、親水性薬物の吸収に対する主要なバリアである。細胞間の接着複合体（junctional complex）および特にＴＪの存在は、細胞膜の脂質二重層を通って細胞全体に拡散することができない親水性薬物に対して上皮を不透過性にする。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現は、前記タンパク質の発現を減少させるために、例えばｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５に対応するアンチセンスポリヌクレオチドを用いて抑制または低減することができる。前記アンチセンスポリヌクレオチドの設計、合成、および使用方法は当業者にはよく知られており、本明細書に記述されている。ＴＪ複合体におけるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の機能もまた、直接的もしくは間接的阻害剤分子または本発明のタンパク質に対して作られるアンタゴニスト抗体を用いて、さらに特異的に抑制することができる。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドの活性を抑制するか、または著しく低減する化合物を、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の活性を低減する試験物質をスクリーニングすることによって同定することが可能であり、そのスクリーニングは、細胞を試験物質と接触させる段階と、暴露後の細胞中のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５活性を、非暴露細胞中の活性と比較する段階と、を含む。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５活性は、例えばその開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１１０，７４７号に開示の方法を用いて、ＴＪの透過性を測定することにより決定されることが好ましい。好ましくは、かかる方法は、限定されないが、薬物送達の効率を高めることを含む治療の目的で、上皮透過性を一時的に高めるために使用される。さらに好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ目的では、製剤は、経口投与と適合する前記組成物を含む製剤である。
【０３０５】
更なる実施形態において、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド特異的抗体またはその断片を、コロイドもしくはリポソームなどの薬物送達媒体の成分として使用して、上皮細胞に治療薬を特異的に標的化することができる。かかる方法は、リポソームにより運ばれる治療薬を上皮細胞に特異的に標的化するために使用されるリポソーム中に、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチド特異的抗体またはその断片を組み込む段階を含む。かかる薬物送達システムは、当業者に公知のいずれかの技術を用いて設計することができる。かかる一実施形態において、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５特異的抗体またはその断片を、化学療法薬、ラジオアイソトープ、またはプロドラッグに直接、結合させることが可能であり（組換えにより、または化学的に活性な作用物質を用いることにより）、その後前記コンジュゲートは治療措置において使用することができる。
【０３０６】
ＴＪタンパク質の崩壊を考慮して、移植される臓器における上皮および内皮透過性に対する通常の保存溶液の負の影響は一般的に知られている。これは、観察される組織損傷および浮腫の原因である。他の実施形態において、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５発現のアゴニストを用いて、移植される臓器におけるＴＪの含有量および完全性を保持することができる。さらに好ましい実施形態は、移植される前記臓器の質を改善するために、保存溶液の成分としてかかるアゴニストを使用する方法である。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドの発現を刺激する、または著しく増加する化合物が、かかる一実施形態において使用される。かかる化合物は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現を増加させる試験物質についてスクリーニングすることによって同定することが可能であり、そのスクリーニングは、細胞を試験物質と接触させる段階と、試験物質に暴露した後の細胞中のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現を、非暴露細胞中の発現と比較する段階と、を含む。この実施形態において、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドの活性も、タンパク質の活性を高める化合物を投与することにより、ＴＪ機能を保持するために、高めることができる。かかる化合物は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５活性を高める試験物質についてスクリーニングすることによって同定することが可能であり、そのスクリーニングは、細胞を試験物質と接触させる段階と、試験物質に暴露した後の細胞中のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５活性を、非暴露細胞中の活性と比較する段階と、を含む。好ましくは、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５活性は、上記の方法を用いて、ＴＪの透過性を測定することにより決定される。
【０３０７】
本発明は、１種または複数種の組織中の本発明のタンパク質の発現を調節することによって作製される動物モデルもまた提供する。かかる動物は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の機能に特異的に関連する疾患の様々な病態生理学的側面の治療に潜在的に有用な候補分子を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ法を表すことから、多くの目的に有用である。かかるモデルの表現型の研究によって、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の欠乏によって引き起こされるまたはｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の欠乏と関連する、その他の同等のヒト疾患を同定することもできる。これらの動物は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の過剰発現または不活性化を標的化するいずれかの方法で作製することができる。かかるモデルは、例えば、炎症性疾患および病状の治療に用いられる候補治療法および薬物の評価に非常に有用である。
【０３０８】
他の実施形態において、本発明は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の変化した発現と関連する疾患または障害を診断するために使用される。特に、制御されていない細胞透過性をもたらす、欠乏量のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５を有する患者を診断するのに有用である。かかる疾患および障害の例としては、限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸症候群、アレルギー性喘息、膠芽腫、および腺腫性ポリープなどが挙げられる。この方法は、ｉ）ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドまたは核酸に選択的に結合することができる化合物を、生体試料と接触させる段階；ｉｉ）試料におけるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５のレベル、または他のいずれかの検出可能な特性を検出する段階；を含む。好ましくは、対照試料に対する、その試料におけるレベルまたは他の特性の差異によって、疾患もしくは障害の存在、または疾患もしくは障害を発生する性質が示される。その生体試料は、疾患または病状を有する疑いのある、または疾患または病状を発症するリスクのある個体から採取することが好ましい。好ましくは、生体試料は上皮細胞試料を含む。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５に特異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその免疫学的活性断片を使用して、そのタンパク質のレベルを検出することができる。その抗体またはその断片は、例えば、蛍光性化合物、放射性化合物、もしくはその他の検出可能な化合物で検出可能に標識されることが好ましい。検出は、公知の免疫組織学的および免疫蛍光プロセスを用いて、直接または間接的に行うことができる。このために、本発明によるキットに含まれる試薬は、一般的に既知の分子、限定されないが、例えばアルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Texas-Red）などの蛍光染料で直接標識することができる。しかしながら、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン等の分子で標識した二次抗体を使用することによって間接的に行うこともでき、次いで二次試薬で検出される。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５に相当する核酸プローブを使用する方法を用いて、例えば、公知のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、特に「リアルタイム」ＰＣＲシステムで、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現を決定することもできる。
【０３０９】
一方、本発明は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現における調節（modulation）を特定の病状と関係付けるツールを提供する。このように、本発明は、かかる病状の新規な候補遺伝子を提供する。この実施形態においても、生体試料中のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現レベルの決定によって、疾患状態を分類かつ／または特徴付けるためのｉｎ ｖｉｖｏマーカーについてのアッセイが提供される。かかる方法は、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸症候群、アレルギー性喘息、膠芽腫、結腸直腸腫および腺腫性ポリープなどの病状を診断または分類するために適用されることが好ましい。このように、本発明は、生体試料中のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の量を定量化するのに有用な試験キットを包含する。そのキットは、少なくとも１種類の免疫結合性パートナー、例えばｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５に特異的かつ検出可能なマーカーに結合されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を備える。これらのまたは他の病状を治療するために施される治療経過をモニターするため、かかるアッセイを適用することができる。このように、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の発現レベルを、病状、治療の指標、あるいは対象に直接投与されるまたは対象が環境でそれに暴露される物質の効果の指標として使用することができるいずれかの状況において、このアッセイを適用することができる。したがって、患者の病状を連続的にモニターし、病理試料中で測定されるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドの定量化された量を、健康な個体の生体試料中で定量された量または同じ患者の前の分析と比較することができる。この実施形態では、このマーカーをイムノアッセイを含むいずれかの適切な方法によって測定することができる。それはまた、好ましくは、炎症部位から採取した組織および体液において測定することもできる。
【０３１０】
本発明の更なる実施形態は、損なわれたＴＪ機能と関連する疾患および病状の治療に有用な新規な方法および組成物を提供することである。さらに好ましくは、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドまたはその断片は、損なわれたｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５関連機能と関係する疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性大腸症候群、アレルギー性喘息、膠芽腫、結腸直腸腫および腺腫性ポリープなどを治療するために使用することができる。かかる方法は、疾患または病状を有する哺乳動物に治療有効量のｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５を投与することを含み、「有効量」とは、生理学的ＴＪ機能を著しく回復させることができるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５の濃度を意味する。その組成物は、ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリヌクレオチドを細胞に送達するために、本明細書に記載の当技術分野で公知の方法のいずれかを用いて投与することができる。上述のように同定されるｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５ポリペプチドの発現または活性のいずれかのアゴニストもまた、この実施形態で使用することができる。かかる組成物は、生理食塩水溶液などの生理学的に許容される担体または患者に投与するのに生理学的に適切な他のバッファーと組み合わせて、個体に送達されることが好ましい。特定の病状に対して哺乳動物に投与されるであろう本発明の組成物の特定量は、患者の臨床症状、および体重、年齢、および投与経路などの他の因子に応じて異なるだろう。これらの組成物は任意に、１種または複数種の対象の化合物を含み得る。この同時投与は、同時に投与することによる、または別々に投与もしくは逐次投与することによるものである。これらの更なる成分のすべては、天然源から得られるか、または組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾によって生成することができる。
【０３１１】
更なる実施形態において、本発明は、非上皮細胞から「バイオ人工」上皮を作製する方法を提供する。本発明に従って作成される「バイオ人工」上皮は、それら自体で修復または再生することができない上皮の作製に様々な臨床用途を提供する。それは、例えば再建外科処置に、上皮損失に関する障害（遺伝的、外傷的または腫瘍学的理由のため）の治療に、または他の治療目的（例えば、火傷治療）に用いることができる。ｃｌａｕｄｉｎｙｎ−５に相当する核酸を使用する方法であって、「バイオ人工」上皮細胞が、前記核酸のトランスフェクト、その結果としての、上記の病状のいずれによっても冒されていない患者の自己細胞の再構築によって得られる方法がさらに好ましい。上皮細胞の損失と関連する障害、病状、または疾患の治療方法における、本発明の「バイオ人工」上皮細胞の作製での自己細胞の使用は、移植方法体系で通常観察される組織の拒絶反応のリスクを低減するか、または解消する。バイオ人工組織工学の方法は、一般的に当業者に知られている（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Machens H. G. et al., Cells Tissues Organs 167: 88-94 (2000)）。
配列番号：１８のタンパク質（内部指定クローン６４５７３０  １８１−１６−１−０−Ｇ９−Ｆ）
クローン６４５７３０＿１８１−１６−１−０−Ｇ９−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：１７）は、アミノ酸配列：ＭＲＬＱＧＡＩＦＶＬＬＰＨＬＧＰＩＬＶＷＬＦＴＲＤＨＭＳＧＷＣＥＧＰＲＭＬＳＷＣＰＦＹＫＶＬＬＬＶＱＴＡＩＹＳＷＧＹＡＳＹＬＶＷＫＤＬＧＧＧＬＧＷＰＬＡＬＰＬＧＬＹＡＤＱＬＴＩＳＷＴＶＬＶＬＦＦＴＶＨＮＰＧＬＡＬＬＨＬＬＬＬＹＧＬＷＳＴＡＬＩＷＨＰＩＮＫＬＡＡＬＬＬＬＰＹＬＡＷＬＴＶＴＳＡＬＴＹＨＬＷＲＤＳＬＣＰＶＨＱＰＱＰＴＥＫＳＤを含む、配列番号：１８のベンゾジアゼピン受容体３（ＢＺＲＰ−Ｒ３）タンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１８のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン６４５７３０＿１８１−１６−１−０−Ｇ９−Ｆ中に含まれる核酸によりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン６４５７３０＿１８１−１６−１−０−Ｇ９−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１７、配列番号：１８、およびクローン６４５７３０＿１８１−１６−１−０−Ｇ９−Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０３１２】
配列番号：１８のタンパク質、ＢＺＲＰ−Ｒ３は、ヒト末梢性ベンゾジアゼピン受容体／イソキノリン結合タンパク質（ＰＢＲ／ＩＢＰ）（アクセッション番号Ｑ９Ｙ５３１）の新規な多型変異体である。ＢＺＲＰ-Ｒ３は、５つの膜貫通セグメント：ＬＱＧＡＩＦＶＬＬＰＨＬＧＰＩＬＶＷＬＦＴ、ＶＬＬＬＶＱＴＡＩＹＳＶＶＧＹＡＳＹＬＶＷ、ＧＬＹＡＤＱＬＴＩＳＷＴＶＬＶＬＦＦＴＶＨ、ＧＬＡＬＬＨＬＬＬＬＹＧＬＶＶＳＴＡＬＩＷ、およびＬＡＡＬＬＬＬＰＹＬＡＷＬＴＶＴＳＡＬＴＹを表す。したがって、本発明の一部の実施形態は、膜貫通ドメインを含むポリペプチドに関する。さらに、ＢＺＲＰ-Ｒ３は、コレステロールに結合する１１アミノ酸(ＶＴＳＡＬＴＹＨＬＷＲ)のストレッチを示す。したがって、本発明の好ましい実施形態は、コレステロール認識／相互作用ドメインのアミノ酸およびそれをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３１３】
ＢＺＲＰ-Ｒ３は、ベンゾジアゼピンおよびイミダゾピリジン誘導体に結合することができるが、ＧＡＢＡ神経伝達物質受容体とは異なる。ＢＺＲＰ-Ｒ３ポリペプチドはステロイド産生細胞に最も豊富に存在し、ミトコンドリア外膜上で主に見出される。ＢＺＲＰ-Ｒ３は、ミトコンドリア外膜／内膜接触部位に位置する、３４-ｋＤａ孔形成（pore-forming）電圧依存性アニオンチャネルタンパク質と関連する。受容体に結合すると、ＢＺＲＰ-Ｒ３のリガンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでステロイド産生細胞におけるステロイド合成を刺激する。ＢＺＲＰ-Ｒ３は、ミトコンドリア外膜から内膜へのコレステロールの輸送速度を増大することによってステロイドの形成を刺激する。
【０３１４】
膜間のコレステロールの移動を仲介するその役割に加えて、ＢＺＲＰ-Ｒ３は、他のいくつかの生理学的機能、例えば細胞増殖および分化、走化性、ミトコンドリア生理機能、ポルフィリンおよびヘムの生合成、免疫応答、およびアニオン輸送などに関与している。さらに、ＢＺＲＰ-Ｒ３アゴニストは、強力な抗アポトーシス化合物である。
【０３１５】
ＢＺＲＰ−Ｒ３は、ストレスおよび不安障害と関連する。ＢＺＲＰ-Ｒ３は、視床下部−脳下垂体−副腎系（HPA axis）、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、および神経内分泌系などのいくつかのストレス系の調節で役割を果たす。これらの系では、急性ストレスによって通常、ＢＺＲＰ-Ｒ３密度が増大し、一方、慢性ストレスによって通常、ＢＺＲＰ-Ｒ３密度が減少する。例えば、全般性不安障害(ＧＡＤ)、恐慌性障害(ＰＤ)、全般性対人恐怖(ＧＳＰ)、および心的外傷後ストレス障害(ＰＴＳＤ)では、通常ＢＺＲＰ-Ｒ３密度が減少する。ＢＺＲＰ-Ｒ３は、脳において発現したグリア細胞である。さらに、ＢＺＲＰ-Ｒ３の発現は、神経変性疾患において、かつ神経毒性および外傷性−虚血性脳損傷後に増加する。ＢＺＲＰ-Ｒ３の発現は、慢性分裂病者において減少し、脳におけるＢＺＲＰ-Ｒ３密度の減少が精神分裂病の病態生理に関与している可能性があることが示唆されている。しかしながら、ＢＺＲＰ-Ｒ３は、ＰＳＥ患者（門脈‐大循環性脳症患者）由来の解剖された脳の組織において通常よりも高い。
【０３１６】
ＢＺＲＰ-Ｒ３はミトコンドリアの活性を高め、アポトーシスを防ぎ、従って、腫瘍細胞増殖に関係する。ＢＺＲＰ-Ｒ３は優先的に、肝臓癌および乳癌で発現する。さらに、ＢＺＲＰ-Ｒ３は、癌の検出、診断、予後および治療に用いるツール／マーカーとして有用である。
【０３１７】
様々な親和性を有するＢＺＲＰ-Ｒ３に結合する多くのリガンドが記述されている。いくつかのベンゾジアゼピン、Ｒｏ ５-４８６４[４-クロロジアゼパム]、ジアゼパムおよび構造的に関連のある化合物は、強力かつ選択的なＰＢＲリガンドである。外来性リガンドには、２-フェニルキノリンカルボキサミド(ＰＫ １１１９５系列)、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド(Ａｌｐｉｄｅｍ系列)、ピリダジン、およびイソキノリン誘導体も含まれる。ポルフィリンおよびジアゼパム結合阻害剤（ＤＢＩ）を含む、いくつかの内因性化合物は、ＢＺＲＰ-Ｒ３に結合する。
【０３１８】
本発明の好ましい態様は、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＺＲＰ−Ｒ３の発現を指示できるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＺＲＰ−Ｒ３の発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＢＺＲＰ-Ｒ３遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＢＺＲＰ-Ｒ３コード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるＢＺＲＰ-Ｒ３タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０３１９】
本発明の好ましい実施形態は、例えば、遺伝性痙性対麻痺、悪性症候群(ＮＭＳ)、レット症候群、アルパース病、またはミトコンドリア脳筋症などのミトコンドリア関連ヒト疾患に関連して、この細胞器官の変化、トポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、ミトコンドリアを標識するための、本発明のタンパク質またはその断片を用いた組成物および方法に関する。例えば、そのタンパク質は、タグ配列をコードする配列を有する枠内で真核細胞発現ベクター中に、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入することによって容易に検出可能にすることができる。本発明のタグ付きタンパク質を発現する真核細胞は、ミトコンドリア関連疾患または病状を治療することができる薬物または遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングするために使用することもできる。
【０３２０】
本発明の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ-Ｒ３に特異的な抗体を細胞と接触させる段階を含む、ミトコンドリアを検出する方法である。その細胞は固定化されるか、またはそうでなければ抗体に透過性であることが好ましい。その抗体は、限定されないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識、または二次酵素もしくは結合段階によって検出できる標識を含む、検出可能ないずれかの成分で標識することが好ましい。本発明はさらに、上記に列挙した疾患などの、ミトコンドリア関連疾患を診断し、これらを他の疾患と区別する方法を提供する。
【０３２１】
その他の実施形態において、本発明のタンパク質は、ステロイド産生細胞および／またはミトコンドリアに異種化合物を標的化するために使用される。かかる組換えｃＤＮＡは、例えばいずれかのベクター、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて導入することができ、ウイルスベクターは、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターであることが可能である。例えば、これらの異種ポリヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア遺伝子治療で核酸を送達すること、つまり欠損ミトコンドリア遺伝子を交換し、かつ／またはミトコンドリア遺伝子の有害な発現を抑制することができる。
【０３２２】
本発明の他の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ-Ｒ３の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法である。この方法は、ｉ）細胞を試験化合物と接触させる段階；ｉｉ）試験化合物に暴露した後の細胞におけるＢＺＲＰ-Ｒ３ポリペプチドのレベルを、非暴露対照細胞におけるレベルと比較する段階；を含む。ＢＺＲＰ-Ｒ３ポリペプチドのレベルは、ノーザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲなどの当技術分野で一般的な方法によって、ＢＺＲＰ−Ｒ３のｍＲＮＡを検出することによって推測される。ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロット法または免疫蛍光などの当技術分野で一般的な、抗体に基づく方法によっても検出することができる。ＢＺＲＰ−Ｒ３の発現を増加させる試験化合物は、本明細書に記載のようにアゴニストとして有用である。ＢＺＲＰ−Ｒ３の発現を減少させる試験化合物は、本明細書に記載のようにアンタゴニストとして有用である。ＢＺＲＰ−Ｒ３のアンタゴニストには、配列番号：１８のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを減少させる作用物質が含まれる。これらには、限定されないが、ＲＮＡｉ、本発明のタンパク質を消化することができる１種または複数種のリボザイム、またはＢＺＲＰ−Ｒ３をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡとして、ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム中に閉じ込められたＤＮＡ［その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる Kanoda, Y. et al. (1989) Science 243: 375］として、または標的細胞において発現して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを提供することができるベクターの一部として、投与することができる。特定の細胞型で発現されるベクターは、当技術分野で公知である。代替方法としては、ＤＮＡは担体と共に注入することができる。担体としては、サイトカインなどのタンパク質、例えばインターロイキン２またはポリリジン−糖タンパク質担体が挙げられる。担体タンパク質、ベクター、およびポリリジン担体系を製造かつ使用する方法は当技術分野で公知である。代替方法としては、アンチセンス分子をコードする核酸を金ビーズ上にコーティングし、例えば遺伝子銃で皮膚に導入することができる［その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるUlmer, J. B. et al. (1993) Science 259: 1745］。
【０３２３】
本発明の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ−Ｒ３ ポリペプチドに結合する化合物をスクリーニングする方法である。かかる方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ３活性のアゴニストおよびアンタゴニストを発生させるのに有用である。この方法は、ｉ）結合を生じさせる条件下で、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその断片を、試験化合物と接触させる段階；ｉｉ）前記試験化合物の結合を検出する段階；を含む。ＢＺＲＰ−Ｒ３に特異的な標識抗体との競合など、当技術分野で一般的ないずれかの方法によって、または各試験物質を直接標識することによって、結合を検出することができる。かかる方法の一実施例において、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドが、真核生物または原核生物宿主細胞に形質転換される。その形質転換細胞は生細胞または固定化細胞であることが可能である。ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドに結合する候補である薬物または化合物は、当業者によく知られている結合アッセイにおいて、かかる形質転換細胞に対してスクリーニングされる。代替方法としては、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる１９８４年９月１３日公開のGeysen H. N.による国際特許出願公開第８４／０３５６４号に教示されているアッセイを用いて、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその断片に結合親和性を示すペプチド化合物をスクリーニングすることができる。他の実施形態では、中和抗体を用いた競合薬物スクリーニングアッセイは、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその断片に結合する試験化合物と競合する。好ましい試験化合物は、ベンゾジアゼピン類、例えばジアゼパム（つまり、バリウム）、トリアゾロベンゾジアゼピン、およびアジナゾラム（adinazolam）ならびにその修飾型に含まれる化合物である。さらに好ましい試験化合物は、イミダゾピリジン類およびイソキノリン類にある。各試験化合物はさらに、個々にまたは分類として除外され得る。
【０３２４】
様々な薬物スクリーニング技術を用いることができる。本発明のこの態様では、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその断片は、溶液中で遊離しており、固体担体に固定化され、細胞表面上で組換え発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。次いで、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその生物活性断片と、試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、記載のように測定することができる。主題の本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に調節する組成物および方法を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ３を調節することによって、ＢＺＲＰ−Ｒ３に関連する疾患または生化学的異常を上手く防ぎ、処置し、または管理することができる。アゴニスト化合物は、細胞中でＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドの量を増加させるか、またはＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性を高める化合物である。本発明の好ましい実施形態は、ｉ）上述のように、ＢＺＲＰ−Ｒ３に結合する試験物質をスクリーニングする段階；ｉｉ）ＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性を検出する段階；を含む、ＢＺＲＰ−Ｒ３に結合するアゴニストをスクリーニングする方法である。この方法は、インタクトな細胞において行われることが好ましい。その細胞は、精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞であることがさらに好ましい。好ましくは、ＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性は、試験物質に暴露する前および後の細胞から放出されるステロイドホルモンの濃度を測定することにより決定される。ＢＺＲＰ−Ｒ３のアゴニストは、細胞からのステロイドホルモンの放出を増加させるだろう。アンタゴニスト化合物は、細胞中のＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドの量を減少させる、またはＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性を減少させる化合物である。本発明のその他の好ましい実施形態は、ｉ）上述のように、ＢＺＲＰ−Ｒ３に結合する試験物質をスクリーニングする段階；ｉｉ）ＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性を検出する段階；を含む、ＢＺＲＰ−Ｒ３に結合するアンタゴニストをスクリーニングする方法である。この方法はインタクトな細胞において行われることが好ましい。その細胞は、精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞であることがさらに好ましい。好ましくは、ＢＺＲＰ−Ｒ３の生物活性は、試験物質に暴露する前および後の細胞から放出されるステロイドホルモンの濃度を測定することにより決定される。ＢＺＲＰ−Ｒ３のアンタゴニストは、細胞からのステロイドホルモンの放出を減少させるだろう。
【０３２５】
本発明のタンパク質の発現または活性を低減または抑制することができるアンタゴニストは、高レベルのＢＺＲＰ−Ｒ３、増加した細胞増殖または減少したアポトーシス、および増加したコレステロール輸送に関連する疾患の治療に有用である。このように、主題の発明は、限定されないが、癌、特に肝臓癌および乳癌、および門脈‐大循環性脳症を含む、様々な疾患または障害を治療するための方法を提供する。ステロイド産生細胞のミトコンドリアへのコレステロール輸送が増加すると、プロゲステロン、テストステロン、およびエストロゲンなどのステロイドホルモンの産生が通常よりも高くなる。ステロイドホルモンのレベルが異常に高いと、副腎皮質フィードバックメカニズムの乱れ、および視床下部および下垂体からの刺激ホルモンの産生不足が引き起こされる。ＢＺＲＰ−Ｒ３およびステロイド遺伝子を抑制することによってゴナドトロピン放出ホルモンなどの刺激ホルモンのレベルが高められる。
【０３２６】
代替方法としては、主題の発明は、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドのレベルの減少およびステロイドホルモン放出の減少に関連する疾患または障害をそのアゴニストを用いて治療する方法を提供する。かかる方法は、細胞をＢＺＲＰ−Ｒ３アゴニストと接触させる段階を含む。この方法は、細胞をＢＺＲＰ−Ｒ３のアゴニストと接触させる段階を含む。このように、主題の発明は、限定されないが、精神分裂病、慢性ストレス、ＧＡＤ、ＰＤ、ＧＳＰおよびＰＴＳＤを含む障害を治療する方法を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ３のアゴニストによって治療される他の障害としては、細胞増殖の減少に関連する疾患、例えば発達遅延が挙げられる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ３が細胞中にコレステロールを輸送できることから、ＢＺＲＰ−Ｒ３アゴニストを用いて、細胞中へのコレステロール輸送を増加させることもできる。コレステロール輸送の不足に関連する疾患としては、類脂質副腎皮質過形成、卵巣嚢胞、ステロイド産生細胞における異常脂質沈着が挙げられる。ミエリンおよびミエリン形成に対するコレステロールの必要性を反映する障害としては、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊椎損傷、および脳発達神経障害（brain development neuropathy）が挙げられる。ＢＺＲＰ−Ｒ３レベルの減少と関連する障害を治療する方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ３の発現または活性を刺激するアゴニストを導入することによって実施される。
【０３２７】
さらに、ミトコンドリア活性の欠損から生じる障害は、ＢＺＲＰ−Ｒ３に対するアゴニストで治療することができる。ミトコンドリア活性の欠損によって代わりに、またはさらに、細胞および組織を損傷する可能性を有する高反応性フリーラジカルが生成される可能性がある。これらのフリーラジカルには、スーパーオキシド、パーオキシナイトライトおよびヒドロキシルラジカルなどの反応性酸素種（ＲＯＳ））、および細胞に対する毒性があり、かつアポトーシスを生じさせる他の反応性種が含まれる。例えば、酸素フリーラジカルを誘導する脂質過酸化反応は、数多くの変性疾患、および虚血（つまり、脳卒中）で見られるような中枢神経系（ＣＮＳ）損傷において十分に確立された病原性メカニズムである。変化したミトコンドリアの機能およびアポトーシスに関連する疾患には：アルツハイマー病、糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、精神分裂病、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中が含まれる。
【０３２８】
さらに好ましい実施形態は、培養中の細胞のアポトーシスを抑制する方法を包含する。この方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ３に対するアゴニストと培養中の細胞と接触させる段階を含む。かかる方法は、１次ニューロンおよびリンパ球など、周知であるがアポトーシスを受ける細胞を培養するのに有用である。
【０３２９】
一実施形態において、細胞中のＢＺＲＰ−Ｒ３のレベルは、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする核酸を標的細胞型に導入することによって増加される。かかる方法において有用なベクターは、かかる核酸を標的組織に導入する方法と同様に当業者に公知である。
【０３３０】
ＢＺＲＰ−Ｒ３の活性を低減または抑制することができる抗体または他のポリペプチドは、単離され、続いて精製された状態で得られる。代替方法としては、ＢＺＲＰ−Ｒ３の活性を抑制または低減することができる抗体または他のポリペプチドを、標的細胞中で組換えにより発現させて、調節効果を提供することができる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ３の活性を抑制または低減する化合物は、薬物送達が望まれる付近に植込まれた生分解性ポリマー中に組み込まれる。例えば、生分解性ポリマーは腫瘍部位に植込まれるか、または一方、アンタゴニスト／アゴニストを含有する生分解性ポリマーが植込まれ、化合物を全身的にゆっくりと放出することができる。生分解性ポリマー、およびそれらの使用は当業者に公知である（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるBrem et al. (1991) J. Neurosurg. 74: 441-446参照)。
【０３３１】
他の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを検出するための方法および組成物を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ３のｍＲＮＡレベルの定量化は、本発明のタンパク質の変化した発現に関連する疾患の診断または予後に有用である。ＢＺＲＰ−Ｒ３をコードするｍＲＮＡの検出および定量化のアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるManiatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982),またはCurrent Procotols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Eds), Wiley & Sons, Inc.参照）。
【０３３２】
ＢＺＲＰ−Ｒ３のｍＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号：１７のｃＤＮＡから設計することができる。プローブおよびプライマーを設計する方法は、当技術分野で公知である。その他の実施形態では、主題の発明は、細胞中での本発明のタンパク質のｍＲＮＡを検出するための診断キットを提供する。そのキットは、ＰＣＲアッセイにおいて本発明のポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの１つまたは複数の容器と、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもしくはノーザン分析ＮによりＢＺＲＰ−Ｒ３のｍＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドプローブの１つまたは複数の容器とを有するパッケージを備える。キットは任意に、様々なハイブリダイゼーションアッセイで使用される様々な試薬の容器を含み得る。そのキットはまた、任意に、以下のアイテム：重合酵素、バッファー、説明書、対照、または検出標識のうちの１つまたは複数を含み得る。キットは任意に、本発明に従ってハイブリダイゼーションアッセイ法を実施するための、適切な割合で共に混合された試薬の容器もまた含み得る。試薬容器は、主題の方法を実施する際に、測定段階が不要となる単位量で試薬を含有することが好ましい。
【０３３３】
他の実施形態において、本発明は、特定の生体試料中に存在する本発明のタンパク質のレベルを検出かつ定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化したレベルに関連する疾患の診断または予後に有用である。本発明のタンパク質を検出する診断アッセイは、器官または組織切片からの細胞の、または腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイを含み得る。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。
【０３３４】
ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドを定量化するアッセイは、当技術分野でよく知られている方法に従って行われる。通常、これらのアッセイは、本発明のタンパク質のリガンドまたは本発明のタンパク質もしくはその断片を特異的に認識する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）と試料を接触させる段階と、試料中に存在する本発明のタンパク質とリガンドまたは抗体との間に形成される複合体を検出する段階と、を含む。リガンドおよび抗体の断片もまた、これらの断片がＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドと特異的に相互作用することができるという条件で、結合アッセイにおいて使用することができる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ３に結合するリガンドおよび抗体は、当技術分野で公知の方法に従って標識することができる。主題の発明において有用な標識としては、限定されないが、酵素標識、放射性標識、常磁性標識、化学発光標識が挙げられる。一般的な技術は、その開示内容全体が本明細書に組み込まれるKennedy, J. H., et al. (1976) Clin. Chim. Acta 70: 1-31；およびSchurs, A. H. et al. (1977) Clin. Chim. Acta 81: 1-40に記述されている。
【０３３５】
主題の発明は、転移性腫瘍塊を同定するための方法および組成物もまた提供する。本発明のこの態様において、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体を、転移性腫瘍塊を同定するためのマーカーとして使用することができる。胸または肝臓から生じる転移性腫瘍は、ＢＺＲＰ−Ｒ３ポリペプチドを過剰発現するのに対して、新たに形成する腫瘍、または他の組織から生じる腫瘍は、ＢＺＲＰ−Ｒ３を保持しないと推測される。
配列番号：２０のタンパク質（内部指定クローン６４６７６２  １８１−２１−２−０−Ａ３−Ｆ）
クローン６４６７６２＿１８１−２１−２−０−Ａ３−ＦのｃＤＮＡ（配列番号:１９）は、アミノ酸配列：ＭＲＬＱＧＡＩＦＶＬＬＰＨＬＧＰＩＬＶＷＬＦＴＲＤＨＭＳＧＬＣＥＧＰＲＭＬＳＷＣＰＦＹＫＶＬＬＬＶＱＴＡＩＹＳＷＧＹＡＳＹＬＶＷＫＤＬＧＧＧＬＧＷＰＬＡＬＰＬＧＬＹＡＶＱＬＴＩＳＷＴＶＬＶＬＦＦＴＶＨＮＰＧＬＡＬＬＨＬＬＬＬＹＧＬＷＳＴＡＬＩＷＨＰＩＮＫＬＡＡＬＬＬＬＰＹＬＡＷＬＴＶＴＳＡＬＴＹＨＬＷＲＤＳＬＣＰＶＨＱＰＱＰＴＥＫＳＤを含む、配列番号：２０のベンゾジアゼピン受容体４(ＢＺＲＰ-Ｒ４)タンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２０のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローンクローン６４６７６２＿１８１−２１−２−０−Ａ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：１７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン６４６７６２＿１８１−  ２１−２−０−Ａ３−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：１９、配列番号：２０、およびクローン６４６７６２＿１８１−２１−２−０−Ａ３−Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０３３６】
配列番号:２０のタンパク質、ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ヒト末梢性ベンゾジアゼピン受容体／イソキノリン結合タンパク質（ＰＢＲ／ＩＢＰ）(アクセッション番号Ｑ９Ｙ５３１)の新規な多型変異体である。ＢＺＲＰ−Ｒ４は、５つの膜貫通セグメント：ＬＱＧＡＩＦＶＬＬＰＨＬＧＰＩＬＶＷＬＦＴ、ＶＬＬＬＶＱＴＡＩＹＳＷＧＹＡＳＹＬＶＷ、ＬＹＡＶＱＬＴＩＳＷＴＶＬＶＬＦＦＴＶＨＮ、ＬＡＬＬＨＬＬＬＬＹＧＬＶＶＳＴＡＬＩＷＨ、およびＬＡＡＬＬＬＬＰＹＬＡＷＬＴＶＴＳＡＬＴＹを表す。したがって、本発明の一部の実施形態は、膜貫通ドメインを含むポリペプチドに関する。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４は、コレステロールに結合する１１アミノ酸(ＶＴＳＡＬＴＹＨＬＷＲ)のストレッチを示す。したがって、本発明の好ましい実施形態は、コレステロール認識／相互作用ドメインのアミノ酸およびそれをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３３７】
ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ベンゾジアゼピンおよびイミダゾピリジン誘導体に結合することができるが、ＧＡＢＡ神経伝達物質受容体とは異なる。ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドはステロイド産生細胞に最も豊富に存在し、ミトコンドリア外膜上で主に見出される。ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ミトコンドリア外膜／内膜接触部位に位置する、３４-ｋＤａ孔形成（pore-forming）電圧依存性アニオンチャネルタンパク質と関連する。受容体に結合すると、ＢＺＲＰ−Ｒ４のリガンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでステロイド産生細胞におけるステロイド合成を刺激する。ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ミトコンドリア外膜から内膜へのコレステロールの輸送速度を増大することによってステロイドの形成を刺激する。
【０３３８】
膜間のコレステロールの移動を仲介するその役割に加えて、ＢＺＲＰ−Ｒ４は、他のいくつかの生理学的機能、例えば細胞増殖および分化、走化性、ミトコンドリア生理機能、ポルフィリンおよびヘムの生合成、免疫応答、およびアニオン輸送などに関与している。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４アゴニストは、強力な抗アポトーシス化合物である。
【０３３９】
ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ストレスおよび不安障害と関連する。ＢＺＲＰ−Ｒ４は、視床下部-脳下垂体-副腎系（HPA axis）、交感神経系、レニン-アンギオテンシン系、および神経内分泌系などのいくつかのストレス系の調節において役割を果たす。これらの系では、急性ストレスによって通常、ＢＺＲＰ−Ｒ４密度が増大し、一方、慢性ストレスによって通常、ＢＺＲＰ−Ｒ４密度が減少する。例えば、全般性不安障害(ＧＡＤ)、恐慌性障害(ＰＤ)、全般性対人恐怖(ＧＳＰ)、および心的外傷後ストレス障害(ＰＴＳＤ)では、通常ＢＺＲＰ−Ｒ４密度が減少する。ＢＺＲＰ−Ｒ４は、脳において発現したグリア細胞である。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現は、神経変性疾患において、かつ神経毒性および外傷性−虚血性脳損傷後に増加する。ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現は、慢性分裂病者において減少し、脳におけるＢＺＲＰ−Ｒ４密度の減少が精神分裂病の病態生理に関与している可能性があることが示唆されている。しかしながら、ＢＺＲＰ−Ｒ４は、ＰＳＥ患者（門脈‐大循環性脳症患者）由来の解剖された脳の組織において通常よりも高い。
【０３４０】
ＢＺＲＰ−Ｒ４はミトコンドリアのミトコンドリアの活性を高め、アポトーシスを防ぎ、従って、腫瘍細胞増殖に関係する。ＢＺＲＰ−Ｒ４は優先的に、肝臓癌および乳癌で発現する。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４は、癌の検出、診断、予後および治療に用いるツール／マーカーとして有用である。
【０３４１】
様々な親和性を有するＢＺＲＰ−Ｒ４に結合する多くのリガンドが記述されている。いくつかのベンゾジアゼピン、Ｒｏ ５-４８６４［４-クロロジアゼパム］、ジアゼパムおよび構造的に関連のある化合物は、強力かつ選択的なＰＢＲリガンドである。外来性リガンドには、２-フェニルキノリンカルボキサミド(ＰＫ １１１９５系列)、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−アセトアミド(Ａｌｐｉｄｅｍ系列)、ピリダジン、およびイソキノリン誘導体も含まれる。ポルフィリンおよびジアゼパム結合阻害剤(ＤＢＩ)を含む、いくつかの内因性化合物は、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合する。
【０３４２】
本発明の好ましい態様は、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＺＲＰ-Ｒ４の発現を指示できるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＺＲＰ-Ｒ４の発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＢＺＲＰ−Ｒ４遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＢＺＲＰ−Ｒ４コード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるＢＺＲＰ−Ｒ４タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０３４３】
本発明の好ましい実施形態は、例えば、遺伝性痙性対麻痺、悪性症候群（ＮＭＳ）、レット症候群、アルパース病、またはミトコンドリア脳筋症などのミトコンドリア関連ヒト疾患に関連して、この細胞器官の変化、トポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、ミトコンドリアを標識するための本発明のタンパク質またはその断片を用いた組成物および方法に関する。例えば、そのタンパク質は、タグ配列をコードする配列を有する枠内で真核細胞発現ベクター中に、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入することによって容易に検出可能にすることができる。本発明のタグ付きタンパク質を発現する真核細胞は、ミトコンドリア関連疾患または病状を治療することができる薬物または遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングするために使用することもできる。
【０３４４】
本発明の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ−Ｒ４に特異的な抗体を細胞と接触させる段階を含む、ミトコンドリアを検出する方法である。その細胞は固定化されるか、またはそうでなければ抗体に透過性であることが好ましい。その抗体は、限定されないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識、または二次酵素もしくは結合段階によって検出できる標識を含む、検出可能ないずれかの成分で標識することが好ましい。本発明はさらに、限定されないが、例えば上記に列挙した疾患などのミトコンドリア関連疾患を診断し、かかる疾患を他の疾患と区別する方法を提供する。
【０３４５】
その他の実施形態において、本発明のタンパク質は、ステロイド産生細胞および／またはミトコンドリアに異種化合物（ポリヌクレオチド）を標的化するために使用される。かかる組換えｃＤＮＡは、例えばいずれかのベクター、ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて導入することができ、ウイルスベクターは、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターであることが可能である。例えば、これらの異種ポリヌクレオチドを用いて、ミトコンドリア遺伝子治療で核酸を送達すること、つまり欠損ミトコンドリア遺伝子を交換し、かつ／またはミトコンドリア遺伝子の有害な発現を抑制することができる。
【０３４６】
本発明の他の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法である。この方法は、ｉ）細胞を試験化合物と接触させる段階；ｉｉ）試験化合物に暴露した後の細胞中のＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドのレベルを、非暴露対照細胞中のレベルと比較する段階；を含む。ＺＲＰ-Ｒ４ポリペプチドのレベルは、ノーザンブロット法またはＲＴ-ＰＣＲなどの当技術分野で一般的な方法によって、ＢＺＲＰ−Ｒ４のｍＲＮＡを検出することによって推測される。ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドのレベルは、ウエスタンブロット法または免疫蛍光などの当技術分野で一般的な、抗体に基づく方法によっても検出することができる。ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現を増加させる試験化合物は、本明細書で述べているようにアゴニストとして有用である。ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現を減少させる試験化合物は、本明細書で述べているようにアンタゴニストとして有用である。
【０３４７】
ＢＺＲＰ−Ｒ４のアンタゴニストには、配列番号：２０のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを減少させる作用物質が含まれる。これらには、限定されないが、ＲＮＡｉ、本発明のタンパク質を消化することができる１種または複数種のリボザイム、またはＢＺＲＰ−Ｒ４をコードするｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡとして、ウイルスエンベロープ受容体タンパク質を含有するプロテオリポソーム中に閉じ込められたＤＮＡ［その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kanoda, Y. et al. (1989) Science 243: 375］として、または標的細胞において発現して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを提供することができるベクターの一部として、投与することができる。特定の細胞型で発現されるベクターは、当技術分野で公知である。代替方法としては、ＤＮＡは担体と共に注入することができる。担体としては、サイトカインなどのタンパク質、例えばインターロイキン２またはポリリジン−糖タンパク質担体が挙げられる。担体タンパク質、ベクター、およびポリリジン担体系を製造かつ使用する方法は当技術分野で公知である。代替方法としては、アンチセンス分子をコードする核酸を金ビーズ上にコーティングし、例えば遺伝子銃で皮膚に導入することができる［その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ulmer, J. B. et al. (1993) Science 259: 1745］。
【０３４８】
本発明の好ましい実施形態は、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドに結合する化合物をスクリーニングする方法である。かかる方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ４活性のアゴニストおよびアンタゴニストを発生させるのに有用である。この方法は、ｉ）結合を生じさせる条件下で、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその断片を、試験化合物と接触させる段階；ｉｉ）前記試験化合物の結合を検出する段階；を含む。ＢＺＲＰ−Ｒ４に特異的な標識抗体との競合など、当技術分野で一般的ないずれかの方法によって、または各試験物質を直接標識することによって、結合を検出することができる。かかる方法の一実施例において、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドが真核生物または原核生物宿主細胞に形質転換される。その形質転換細胞は生細胞または固定化細胞であることが可能である。ＢＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドに結合する候補である薬物または化合物は、当業者によく知られている結合アッセイにおいてかかる形質転換細胞対してスクリーニングされる。代替方法としては、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる１９８４年９月１３日公開のGeysen H. N.による国際特許出願公開第８４/０３５６４号に教示されているアッセイを用いて、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその断片に結合親和性を示すペプチド化合物をスクリーニングすることができる。他の実施形態では、中和抗体を用いた競合薬物スクリーニングアッセイは、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその断片に結合する試験化合物と競合する。好ましい試験化合物は、ベンゾジアゼピン類、例えばジアゼパム（つまり、バリウム）、トリアゾロベンゾジアゼピン、およびアジナゾラム（adinazolam）ならびにその修飾型に含まれる化合物である。さらに好ましい試験化合物は、イミダゾピリジン類およびイソキノリン類である。各試験化合物はさらに、個々にまたは分類として除外され得る。
【０３４９】
様々な薬物スクリーニング技術を用いることができる。本発明のこの態様では、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその断片は、溶液中で遊離しており、固体担体に固定化され、細胞表面上で組換えで発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。次いで、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその生物活性断片と、試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、記述されるように測定することができる。
【０３５０】
主題の本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に調節する組成物および方法を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ４を調節することによって、ＢＺＲＰ−Ｒ４に関連する疾患または生化学的異常を上手く防ぎ、処置し、または管理することが可能となる。アゴニスト化合物は、細胞中でＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドの量を増加させるか、またはＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性を高める化合物である。本発明の好ましい実施形態は、ｉ）上述のように、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合する試験物質をスクリーニングする段階；ｉｉ）ＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性を検出する段階；を含む、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合するアゴニストをスクリーニングする方法である。この方法は、インタクトな細胞において行われることが好ましい。その細胞は、精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞であることがさらに好ましい。好ましくは、ＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性は、試験物質に暴露する前および後の細胞から放出されるステロイドホルモンの濃度を測定することにより決定される。ＢＺＲＰ−Ｒ４のアゴニストは、細胞からのステロイドホルモンの放出を増加させるだろう。アンタゴニスト化合物は、細胞中のＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドの量を減少させる、またはＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性を減少させる化合物である。本発明のその他の好ましい実施形態は、ｉ）上述のように、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合する試験物質をスクリーニングする段階；ｉｉ）ＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性を検出する段階；を含む、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合するアンタゴニストをスクリーニングする方法である。この方法はインタクトな細胞において行われることが好ましい。その細胞は、精巣または卵巣細胞などのステロイド産生細胞であることがさらに好ましい。好ましくは、ＢＺＲＰ−Ｒ４の生物活性は、試験物質に暴露する前および後の細胞から放出されるステロイドホルモンの濃度を測定することにより決定される。ＢＺＲＰ−Ｒ４のアンタゴニストは、細胞からのステロイドホルモンの放出を減少させるだろう。  本発明のタンパク質の発現または活性を低減または抑制することができるアンタゴニストは、高レベルのＢＺＲＰ−Ｒ４、増加した細胞増殖または減少したアポトーシス、および増加したコレステロール輸送に関連する疾患の治療に有用である。このように、主題の発明は、限定されないが、癌、特に肝臓癌および乳癌、および門脈‐大循環性脳症を含む、様々な疾患または障害を治療するための方法を提供する。ステロイド産生細胞のミトコンドリアへのコレステロール輸送が増加すると、プロゲステロン、テストステロン、およびエストロゲンなどのステロイドホルモンの産生が通常よりも高くなる。ステロイドホルモンのレベルが異常に高いと、副腎皮質フィードバックメカニズムの乱れ、および視床下部および下垂体からの刺激ホルモンの産生不足が引き起こされる。ＢＺＲＰ−Ｒ４およびステロイド遺伝子を抑制することによって、ゴナドトロピン放出ホルモンなどの刺激ホルモンのレベルが高められる。
【０３５１】
代替方法としては、主題の発明は、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドのレベルの減少およびステロイドホルモン放出の減少に関連する疾患または障害をそのアゴニストを用いて治療する方法を提供する。かかる方法は、細胞をＢＺＲＰ−Ｒ４アゴニストと接触させる段階を含む。この方法は、細胞をＢＺＲＰ−Ｒ４のアゴニストと接触させる段階を含む。このように、主題の発明は、限定されないが、精神分裂病、慢性ストレス、ＧＡＤ、ＰＤ、ＧＳＰおよびＰＴＳＤを含む障害を治療する方法を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ４のアゴニストによって治療される他の障害としては、細胞増殖の減少に関連する疾患、例えば発達遅延が挙げられる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４が細胞中にコレステロールを輸送できることから、ＢＺＲＰ−Ｒ４アゴニストを用いて、細胞中へのコレステロール輸送を増加させることもできる。コレステロール輸送の不足に関連する疾患としては、類脂質副腎皮質過形成、卵巣嚢胞、ステロイド産生細胞における異常脂質沈着が挙げられる。ミエリンおよびミエリン形成に対するコレステロールの必要性を反映する障害としては、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊椎損傷、および脳発達神経障害（brain development neuropathy）が挙げられる。ＢＺＲＰ−Ｒ４レベルの減少と関連する障害を治療する方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ４の発現または活性を刺激するアゴニストを導入することによって実施される。
【０３５２】
さらに、ミトコンドリア活性の欠損から生じる障害は、ＢＺＲＰ−Ｒ４に対するアゴニストで治療することができる。ミトコンドリア活性の欠損によって代わりに、またはさらに、細胞および組織を損傷する可能性を有する高反応性フリーラジカルが生成され得る。これらのフリーラジカルには、スーパーオキシド、パーオキシナイトライトおよびヒドロキシルラジカルなどの反応性酸素種（ＲＯＳ）、および細胞に対する毒性があり、かつアポトーシスを生じさせる他の反応性種が含まれる。例えば、酸素フリーラジカルを誘導する脂質過酸化反応は、数多くの変性疾患、および虚血（つまり、脳卒中）で見られるような中枢神経系（ＣＮＳ）損傷において十分に確立された病原性メカニズムである。変化したミトコンドリアの機能およびアポトーシスに関連する疾患には：アルツハイマー病、糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、ジストニー、レーバー遺伝性視神経症、精神分裂病、ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中が含まれる。
【０３５３】
さらに好ましい実施形態は、培養中の細胞のアポトーシスを抑制する方法を包含する。この方法は、ＢＺＲＰ−Ｒ４に対するアゴニストと培養中の細胞を接触させる段階を含む。かかる方法は、１次ニューロンおよびリンパ球など、周知であるがアポトーシスを受ける細胞を培養するのに有用である。
【０３５４】
一実施形態において、細胞中のＢＺＲＰ−Ｒ４のレベルは、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする核酸を標的細胞型に導入することによって増加される。かかる方法において有用なベクターは、かかる核酸を標的組織に導入する方法と同様に当業者には公知である。
【０３５５】
ＢＺＲＰ−Ｒ４の活性を低減または抑制することができる抗体または他のポリペプチドは、単離され、続いて精製された状態で得られる。代替方法としては、ＢＺＲＰ−Ｒ４の活性を抑制または低減することができる抗体または他のポリペプチドを、標的細胞中にて組換えにより発現させて、調節効果を提供することができる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４の活性を抑制または低減する化合物は、薬物送達が望まれる付近に植込まれる生分解性ポリマー中に組み込まれる。例えば、生分解性ポリマーは腫瘍部位に植込まれるか、または一方、アンタゴニスト／アゴニストを含有する生分解性ポリマーが植込まれ、化合物を全身にゆっくりと放出することができる。生分解性ポリマー、およびそれらの使用は当業者に公知である（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるBrem et al. (1991) J. Neurosurg. 74: 441-446参照)。
【０３５６】
他の実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを検出するための方法および組成物を提供する。ＢＺＲＰ−Ｒ４のｍＲＮＡレベルの定量化は、本発明のタンパク質の変化した発現に関連する疾患の診断または予後に有用である。ＢＺＲＰ−Ｒ４をコードするｍＲＮＡの検出および定量化のアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるManiatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982), or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Eds), Wiley & Sons, Inc.参照）。
【０３５７】
ＢＺＲＰ−Ｒ４のｍＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、配列番号:１９のｃＤＮＡから設計することができる。プローブおよびプライマーを設計する方法は、当技術分野で公知である。その他の実施形態では、主題の発明は、細胞中の本発明のタンパク質のｍＲＮＡを検出するための診断キットを提供する。そのキットは、ＰＣＲアッセイにおいて本発明のポリヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの１つまたは複数の容器と、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもしくはノーザン分析ＮによりＢＺＲＰ−Ｒ４のｍＲＮＡを検出するためのポリヌクレオチドプローブの１つまたは複数の容器とを有するパッケージを備える。キットは任意に、様々なハイブリダイゼーションアッセイで使用される様々な試薬の容器を含み得る。そのキットはまた、任意に、以下のアイテム：重合酵素、バッファー、説明書、対照、または検出標識のうちの１つまたは複数を含み得る。キットは任意に、本発明に従ってハイブリダイゼーションアッセイ法を実施するための、適切な割合で共に混合された試薬の容器もまた含み得る。試薬容器は、主題の方法を実施する際に、測定段階が不要となる単位量で試薬を含有することが好ましい。
【０３５８】
他の実施形態において、本発明は、特定の生体試料中に存在する本発明のタンパク質のレベルを検出かつ定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化したレベルに関連する疾患の診断または予後に有用である。本発明のタンパク質を検出する診断アッセイは、器官または組織切片からの細胞の、または腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ  ｓｉｔｕアッセイを含み得る。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。
【０３５９】
ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドを定量化するアッセイは、当技術分野でよく知られている方法に従って行われる。通常、これらのアッセイは、本発明のタンパク質のリガンドまたは本発明のタンパク質もしくはその断片を特異的に認識する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）と試料を接触させる段階と、試料中に存在する本発明のタンパク質とリガンドまたは抗体との間に形成される複合体を検出する段階と、を含む。リガンドおよび抗体の断片もまた、これらの断片がＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドと特異的に相互作用することができるという条件で、結合アッセイにおいて使用することができる。さらに、ＢＺＲＰ−Ｒ４に結合するリガンドおよび抗体は、当技術分野で公知の方法に従って標識することができる。主題の発明において有用な標識としては、限定されないが、酵素標識、放射性標識、常磁性標識、化学発光標識が挙げられる。一般的な技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるKennedy, J. H., et al. (1976) Clin. Chim. Acta 70: 1-31；およびSchurs, A. H. et al. (1977) Clin. Chim. Acta 81: 1-40に記述されている。
【０３６０】
主題の発明は、転移性腫瘍塊を同定するための方法および組成物もまた提供する。本発明のこの態様において、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドまたはその断片に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体を、転移性腫瘍塊を同定するためのマーカーとして使用することができる。胸または肝臓から生じる転移性腫瘍は、ＢＺＲＰ−Ｒ４ポリペプチドを過剰発現するのに対して、新たに形成する腫瘍、または他の組織から生じる腫瘍は、ＢＺＲＰ−Ｒ４を保持しないと考えられる。
配列番号：２２のタンパク質（内部指定クローン４２０５９４  １４５−１９−４−０−Ｅ７−Ｆ）
クローン４２０５９４  １４５−１９−４−０−Ｅ７−ＦのｃＤＮＡ(配列番号：２１）は、アミノ酸配列：ＭＰＦＬＤＩＱＫＲＦＧＬＮＩＤＲＷＬＴＩＱＳＣＥＱＰＹＫＭＡＧＲＣＨＡＦＥＫＥＷＩＥＣＡＨＧＩＧＹＴＲＡＥＫＥＣＫＩＥＹＤＤＦＶＥＣＬＬＲＱＫＴＭＲＲＡＧＴＩＲＫＱＲＤＫＬＩＫＥＧＫＹＴＰＰＰＨＨＩＧＫＧＥＰＷＰを含む、配列番号：２２の１０６アミノ酸Ｓｃｏｌａｋｉｎタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２２のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン４２０５９４ １４５-１９-４-０-Ｅ７-Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン４２０５９４ １４５-１９４-０-Ｅ７-Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０３６１】
Ｓｃｏｌａｋｉｎ、配列番号:２２のタンパク質は、１５キロダルトンのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニットＮＤＵＦＳ５（Ｇｅｎｂａｎｋエントリー名：ＡＦ０２０３５２）の新規な変異型である。
【０３６２】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ(ＮＡＤＨ:ユビキノンオキシドレダクターゼ、複合体Ｉ)は、ミトコンドリアの電子伝達鎖を構成する３つの複合体の鎖における最初の多サブユニット内膜タンパク質複合体である。ミトコンドリアの電子伝達系は、ＮＡＤＨから酸素への電子の伝達、およびエネルギーを必要とする細胞の多くの反応を操作するためのエネルギー源を提供するＡＴＰ合成（酸化的リン酸化）とこの酸化との共役を担っている。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨから２つの電子を受け取り、フラビン分子からユビキノンにその電子を渡すことによって、このプロセスにおける第１段階を達成し、鎖中の第２酵素複合体に電子を移行する。それは、電子の移行に関与する多数の補欠分子族、つまりフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）および少なくとも６つの鉄‐硫黄クラスター（二核および四核）を含有する。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、多種多様なサイズおよび組成の約４１ポリペプチドを含む、推定質量８００ｋＤａを有する３つの複合体の中で最も大きい複合体である。これらの複合体Ｉポリペプチドのうちの７つは、ミトコンドリアのＤＮＡによってコードされ、残りは、ミトコンドリア中にトランスフェクトされる核遺伝子産物である。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのポリペプチド組成物は、様々な哺乳動物種、例えばラット、ウサギ、雌ウシ、およびヒトにおいて非常に類似している。ヒトでは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの欠損は、ヒト脳筋症の最も多い原因の１つである。この酵素の欠損および変化した発現もまた、他の疾患病状、つまり神経変性疾患および癌に関連することが報告されている。さらに、ドキソルビシンなどの化学療法薬におけるキノン部位のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ還元は、これらの薬物の抗腫瘍活性および／または変異原性に寄与すると考えられる。複合体Ｉのミトコンドリアにコードされるサブユニットにおける欠損が記述されている。しかしながら、比較的低いパーセンテージのヒト複合体欠損が、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異と関連し、それによって、相当する突然変異の大部分が、複合体Ｉの核コードのサブユニットの発現または活性に影響を及ぼすことが示唆されている。
【０３６３】
本発明のタンパク質、Ｓｃｏｌａｋｉｎは、複合体Ｉの核コードのサブユニットの分類に属する。このサブユニットは、複合体Ｉの精製中に鉄−硫黄タンパク質画分（ＩＰ）の一部であり、この複合体の鉄−硫黄中心によって触媒される酸化還元反応に関与すると考えられる。ＮＤＵＦＳ５は、電子伝達で機能する鉄−硫黄中心の１つを形成する、システイン残基４個を含有する。興味深いことに、Ｓｃｏｌａｋｉｎは、配列番号:２２の２３位でのグリシンからシステインへの置換のために５番目のシステインを含有する。Ｓｃｏｌａｋｉｎは、心臓、脳、骨格筋、肝臓、腎臓、および胎児心臓および脳、高い代謝活性を有するすべての組織において比較的高い発現率で広く発現し、複合体Ｉ欠損患者において臨床的に影響を及ぼす場合が多い。さらに、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現は、高い代謝必要量も有する癌組織および不死化細胞株において高い。Ｓｃｏｌａｋｉｎは、筋障害、神経変性疾患および癌において役割を果たす。
【０３６４】
本発明の実施形態は、配列番号：２２のＳｃｏｌａｋｉｎポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０３６５】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＳｃｏｌａｋｉｎポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０３６６】
本発明の更なる実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎポリペプチドをコードする配列番号:２１のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０３６７】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＳｃｏｌａｋｉｎポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０３６８】
本発明の更なる実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験する物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＳｃｏｌａｋｉｎ発現を非暴露対照細胞の発現と比較する段階；を含む方法に関する。
【０３６９】
一実施形態において、２３位および１０５位に相当する配列番号：２１のヌクレオチド位１５２および３９８におけるＧからＴへの置換およびＣからＴへの置換を有し、その結果として、グリシン残基がシステインによって２３位で、アルギニン残基がトリプトファンによって１０５位でそれぞれ置換される、配列番号:２２をコードする配列を、ＤＮＡゲノタイピングに用いることができる。この遺伝子座をゲノタイピングすることは、例えば親子鑑定または法医学分析に用いられるＤＮＡフィンガープリント法において対象となり得る。それはまた、好ましくはミトコンドリアの障害に関連する病状、特に複合体Ｉ単独欠損を有する病状における遺伝的関連研究に使用することができる。
【０３７０】
その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド配列を、患者の病状もしくは疾患の治療のための、理想的な薬物（例えば、Ｓｃｏｌａｋｉｎのアゴニストまたはアンタゴニスト）の選択または薬物用量の選択を助けるために、薬理ゲノミクス用途に使用することができる。例えば、一実施形態において、本発明は、患者をゲノタイピングし、Ｓｃｏｌａｋｉｎの２３位および１０５位のアミノ酸をコードするヌクレオチドの同一性を決定し、２３位および１０５位それぞれにシステイン残基およびトリプトファン残基を有するものにおいて優先的に有効であることが証明されている（例えば、これらの位置にシステインおよびトリプトファンを有するタンパク質のアイソフォームに、その薬物が優先的に結合することから）、薬物または投薬量の薬物を患者に投与する方法を提供する。その他の実施形態において、例えば、２３位および１０５位に、それぞれシステインおよびトリプトファンを有する個体に、その薬物の投与した場合に伴う副作用が知られているため、アミノ酸２３位および１０５位をコードするヌクレオチドについて、患者は遺伝子型を判定され、薬物は投与されない。
【０３７１】
本発明の好ましい態様は、Ｓｃｏｌａｋｉｎポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、Ｓｃｏｌａｋｉｎの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。Ｓｃｏｌａｋｉｎの発現を指示することができるポリヌクレオチドは、Ｓｃｏｌａｋｉｎ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、Ｓｃｏｌａｋｉｎコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるＳｃｏｌｋｉｎタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０３７２】
他の実施形態は、Ｓｃｏｌｋｉｎポリペプチドを作製する方法に関する。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む適切な発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞において作製することができる。Ｓｃｏｌａｋｉｎのかかる発現ベクターの宿主細胞への導入は、限定されないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、電気穿孔法、およびリポフェクションなどの様々な方法で実施することができる。多種多様な発現系のいずれかを用いて、組換えタンパク質を提供することができる。適切な発現媒体には、限定されないが、プラスミド、ウイルス粒子または昆虫細胞のバキュロウイルスが含まれる。発現媒体は宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。任意に、誘導性発現ベクターを用いて、宿主細胞中の遺伝子の厳密に制御された発現を達成することができる。組換えタンパク質は宿主細胞から回収し、当業者によく知られているいずれかの技術によって精製することができる。好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。代替方法としては、固相技術を用いてＳｃｏｌａｋｉｎを化学的に合成することができる。
【０３７３】
更なる実施形態において、本発明は、ミトコンドリア脳筋症、アルパース病、遺伝性痙性対麻痺、悪性症候群(ＮＭＳ)もしくはレット症候群などのミトコンドリア関連ヒト疾患に関連する、この細胞器官の変化、トポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、ミトコンドリアを標識するためのＳｃｏｌａｋｉｎまたはその断片を用いた組成物および方法を提供する。例えば、そのタンパク質は、タグ配列をコードする配列を有する枠内で真核細胞発現ベクター中に、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入することによって容易に検出可能にすることができる。本発明の好ましい実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を細胞と接触させる段階を含む、ミトコンドリアを検出する方法である。その細胞は固定化されるか、またはそうでなければ抗体に透過性であることが好ましい。その抗体は、蛍光化合物、放射性化合物、またはそうでなければ検出可能な化合物に一次的または二次的に結合されることが好ましい。
【０３７４】
他の実施形態では、配列番号：２１のポリヌクレオチドまたはその断片が、ミトコンドリアに組換えＤＮＡ分子分子を標的化するために用いられる。例えば、キメラポリヌクレオチドは、治療対象のポリヌクレオチドに、組換えによりまたは化学的に融合された本発明のポリヌクレオチド配列で構成されるキメラポリヌクレオチドによって、ミトコンドリアに特異的に治療用ポリヌクレオチドを送達することが可能となる。かかるキメラ分子はおそらく、限定されないが上記の障害を含むミトコンドリア機能障害が原因の疾患を治療かつ／または予防するための、ミトコンドリア活性を回復または調節する遺伝子治療において特別に興味深いだろう。
【０３７５】
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを検出する組成物および方法を提供する。ＳｃｏｌａｋｉｎのｍＲＮＡレベルの定量化は、タンパク質の異常発現と関連する疾患または病状の診断に、または本明細書で述べたように治療的介入中にＳｃｏｌａｋｉｎの調節をモニターするのに有用である。ｍＲＮＡの検出および定量化のアッセイは当技術分野でよく知られている。好ましい方法は、対象の生体試料からＲＮＡを単離する段階と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＳｃｏｌａｋｉｎのｍＲＮＡレベルを測定する段階と、対象試料中の発現を対照試料の発現と比較する段階と、を含む。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅によるＳｃｏｌａｋｉｎのｍＲＮＡの検出に使用されるポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、当技術分野でよく知られている方法によって、配列番号:２１のポリヌクレオチドから設計することができる。
【０３７６】
他の実施形態では、本発明は、Ｓｃｏｌａｋｉｎを検出し、生体試料中のその発現レベルを定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化した発現または異常発現によって特徴付けられる病状または疾患の診断に、またはＳｃｏｌａｋｉｎ、アゴニストまたはアンタゴニストで治療される対象をモニターするアッセイにおいて有用である。好ましい方法は、哺乳動物の対象、好ましくはヒトからの生体試料と、Ｓｃｏｌａｋｉｎに特異的に結合する抗体とを接触させる段階と、健康な対象の代表的な対照レベルと比較して、対象試料中のＳｃｏｌａｋｉｎのレベルを決定する段階とを含み、対照レベルに対する、対象試料中のＳｃｏｌａｋｉｎのレベルが変化しているかまたは異常な場合には、その対象が疾患を有すること、または疾患を発症するリスクが高いことを示している。使用される抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれかであることが可能であり、当業者によく知られている方法、例えばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって免疫複合体を定量化するために、直接または間接的に標識することができる。本発明のタンパク質を検出するための診断アッセイは、器官または組織切片からの細胞の、または腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイを含み得る。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。
【０３７７】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物、好ましくはヒトのミトコンドリア複合体Ｉの欠損を治療または予防する方法であって、前記哺乳動物に本発明のタンパク質またはその断片または本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することを含む方法に関する。標的器官、組織または細胞集団に本発明のポリヌクレオチド配列を送達するのに、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、またはワクシニアウイルスに由来する発現ベクターを使用することができる。細胞または組織にベクターを導入するための多くの方法を利用することができ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に同様に適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、対象から採取した幹細胞にベクターを導入し、同じ対象に再び自家移植するためにクローン増殖させる。トランスフェクションおよびリポソーム注入は、当技術分野でよく知られている方法を用いて達成される。Ｓｃｏｌａｋｉｎポリペプチドを含む薬剤組成物は、単独で、または無菌生体適合性担体中で投与される少なくとも１種類の他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わせて、投与することができる。それらは、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、鼻腔内、経腸または経直腸手段を含む多くの経路によって投与される。その組成物は、単独で、または他の作用物質、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、対象に投与される。好ましくは、本発明の方法を用いて治療または予防される欠損複合体Ｉ活性と関連する疾患には、限定されないが、致死的新生児乳酸アシドーシス、運動不耐性および乳酸アシドーシを伴う筋障害、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアミオパシー、脳障害脳障害、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作）、ＭＥＲＦＦ（ミオクローヌスてんかん、および赤色ぼろ線維)、小児期および成人期の脳筋症、リー症候群、アルパース病およびパーキンソン病が含まれる。
【０３７８】
本発明の実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験する物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＳｃｏｌａｋｉｎ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。Ｓｃｏｌａｋｉｎの発現は、当技術分野で一般的な方法または本明細書に含まれる方法によって、Ｓｃｏｌａｋｉｎポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）２つの同等の細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物のうちの一方に試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ)指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各サンプルにおけるＳｃｏｌａｋｉｎのｍＲＮＡレベルを、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に記述されるような特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）細胞の２つの同等の培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物のうちの一方に試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ)どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ)各試料におけるＳｃｏｌａｋｉｎポリペプチドのレベルを、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、または当技術分野で一般的な他の方法により比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるような特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現を増加する物質（アゴニストまたは活性化剤）を用いて、複合体Ｉの活性を高めることができる。Ｓｃｏｌａｋｉｎの発現を減少させる物質（アンタゴニストまたは阻害剤）を用いて、癌を治療または防ぐことができる。Ｓｃｏｌａｋｉｎアゴニストおよびアンタゴニストを利用する方法は本明細書に包含される。
【０３７９】
本発明の好ましい実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎポリペプチドに結合する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、Ｓｃｏｌａｋｉｎポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）当技術分野で一般的な方法（例えば、免疫共沈降およびウエスタンブロット法などの競合的な抗体に基づく方法）によって、試験物質の結合を検出する段階；を含む。この方法には、抗体、抗体断片、細胞型特異的リガンドまたはその一部と結合する試験物質が含まれる。
【０３８０】
本発明のさらに好ましい実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎ活性のアゴニストについて、Ｓｃｏｌａｋｉｎに結合する試験物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験される物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＳｃｏｌａｋｉｎ生物活性を、非暴露対照細胞中の生物活性と比較する段階；を含む方法を提供する。Ｓｃｏｌａｋｉｎ生物活性の測定は、Loeffenら(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、1999, J. Inher. Metab. Dis. Vol. 22, pp 19-28 )によって述べられているように、複合体Ｉの酵素活性を測定することによって間接的に評価することが可能であり、対照試料と比較して、試験試料における複合体Ｉ活性の増加は、試験物質のＳｃｏｌａｋｉｎに対する活性化効果を示している。
【０３８１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、Ｓｃｏｌａｋｉｎ活性のアンタゴニストについて、Ｓｃｏｌａｋｉｎに結合する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＳｃｏｌａｋｉｎ生物活性を、非暴露対照細胞中の生物活性と比較する段階；を含む。Ｓｃｏｌａｋｉｎ生物活性の測定は、上述のように複合体Ｉの活性を測定することによって決定することが可能であり、対照試料と比較して、試験試料における複合体Ｉ活性の減少は、試験物質のＳｃｏｌａｋｉｎに対する抑制効果を示している。
【０３８２】
本発明のさらに他の目的は、複合体Ｉ活性の増加と関連する癌を治療または予防する方法を提供する。抗体、リボザイムまたはアンチセンスベクターまたはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現または活性をｉｎ ｖｉｖｏで減少させることによって、これを達成することができる。代替方法としては、上述のように単離された、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現または活性のアンタゴニストを使用することができ、かかる方法は、Ｓｃｏｌａｋｉｎ発現または活性のアンタゴニストを対象に投与する段階を含む。生理学的に許容される溶液中のＳｃｏｌａｋｉｎアンタゴニストは、当技術分野で一般的な方法によって、例えば経口的または非経口的に投与される。好ましくは、Ｓｃｏｌａｋｉｎアンタゴニストは、例えばアンタゴニストを細胞型特異的標的部位（例えば、リガンドまたは抗体断片）に結合させることによって、特定の細胞型に送達される。この方法は、限定されないが、心臓、卵巣，結腸、腎臓、膀胱、前立腺、膵臓、脳、胃、胸、肺、肝臓の癌および白血病を含む癌の予防および治療に有用である。
配列番号：２４のタンパク質（内部指定クローン１１９６５８  １０５−０６７−２−０−Ｈ４−Ｆ−１）
クローン１１９６５８  １０５−０６７−２−０−Ｈ４−Ｆ−１のｃＤＮＡ（配列番号：２３）は、アミノ酸配列：ＭＡＳＲＳＳＤＫＤＧＤＳＶＨＴＡＳＥＶＰＬＴＰＲＴＮＳＰＤＧＲＲＳＳＳＤＴＳＫＳＴＹＳＬＴＲＲＩＳＳＬＥＳＲＲＰＳＳＰＬＩＤＩＫＰＩＥＦＧＶＬＳＡＫＫＥＰＩＱＰＳＶＬＲＲＴＹＮＰＤＤＹＦＲＫＦＥＰＨＬＹＳＬＤＳＮＳＤＤＶＤＳＬＴＤＥＥＩＬＳＫＹＱＬＧＭＱＨＦＳＴＱＹＤＬＬＨＮＨＬＴＶＲＶＩＥＡＲＤＬＰＰＰＩＳＨＤＧＳＲＱＤＭＡＨＳＮＰＹＶＫＩＣＬＬＰＤＱＫＮＳＫＱＴＧＶＫＲＫＴＱＫＰＶＦＥＥＲＹＴＦＥＩＰＦＬＥＡＱＲＲＴＬＬＬＴＶＶＤＦＤＫＦＳＲＨＣＶＩＧＫＶＳＶＰＬＣＥＶＤＬＶＫＧＧＨＷＷＫＡＬＩＰＳＳＱＮＥＶＥＬＧＥＬＬＬＳＬＮＹＬＰＳＡＧＲＬＮＶＤＶＩＲＡＫＱＬＬＱＴＤＶＳＱＧＳＤＰＦＶＫＩＱＬＶＨＧＬＫＬＶＫＴＫＫＴＳＦＬＲＧＴＩＤＰＦＹＮＥＳＦＳＦＫＶＰＱＥＥＬＥＮＡＳＬＶＦＴＶＦＧＨＮＭＫＳＳＮＤＦＩＧＲＩＶＩＧＱＹＳＳＧＰＳＥＴＮＨＷＲＲＭＬＮＴＨＲＴＡＶＥＱＷＨＳＬＲＳＲＡＥＣＤＲＶＳＰＡＳＬＥＶＴを含む、配列番号：２４の小胞ドッキング（Docking Of Vesicles）（ＤＯＶ）タンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２４のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１１９６５８  １０５−０６７−２−０−Ｈ４−Ｆ−１中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２３のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１１９６５８  １０５−０６７−２−０−Ｈ４−Ｆ−１中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：２３、配列番号：２４、およびクローン１１９６５８  １０５−０６７−２−０−Ｈ４−Ｆ−１の組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０３８３】
ＤＯＶの配列は、シナプトタグミンファミリーのタンパク質との類似性を含む。シナプトタグミンのように、ＤＯＶは、小胞のドッキングおよび融合に関与する小胞の膜貫通タンパク質である。カルシウム依存性の高次構造変化によって、ＤＯＶの細胞質部分を原形質膜上の特定のタンパク質とドッキングすることが可能となる。小胞がドッキングした結果、細胞外空間に小胞成分が放出される。ＤＯＶポリペプチドは、その細胞における興奮性カルシウム流入に応答する、シナプス前ニューロンからの神経伝達物質放出に必要とされる。
【０３８４】
本発明の好ましい実施形態は、配列番号：２４のＤＯＶポリペプチド配列を含む組成物を包含する。
【０３８５】
本発明の好ましい実施形態は、生物活性を有するＤＯＶポリペプチド断片を含む組成物を包含する。
【０３８６】
本発明の好ましい実施形態は、ＤＯＶポリペプチドをコードする配列番号：２３のポリヌクレオチド配列を含む組成物を包含する。
【０３８７】
本発明の好ましい実施形態は、生物活性を有するＤＯＶポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を包含する。
【０３８８】
本発明の好ましい実施形態は、興奮分泌非連関（excitation-secretion uncoupling）ペプチド（ＥＳＵＰ）を包含する。
【０３８９】
好ましいＤＯＶ ＥＳＵＰは、以下のペプチド配列：ＬＬＨＮＨＬＴＶＲＶＩＥＡＲＤＬＰＰＰＩＳＨＤＧＳＲＱＤＭＡＨＳＮＰＹＶＫＩＣＬＬＰＤＱＫＮＳＫＱＴＧＶＫＲＫＴＱＫＰＶＦＥＥＲＹＴＦＥＩＰＦＬＥＡＱＲＲＴＬＬＬＴＶＶＤＦＤＫＦＳＲＨＣＶＩＧＫＶＳ；ＧＲＬＮＶＤＶＩＲＡＫＱＬＬＱＴＤＶＳＱＧＳＤＰＦＶＫＩＱＬＶＨＧＬＫＬＶＫＴＫＫＴＳＦＬＲＧＴＩＤＰＦＹＮＥＳＦＳＦＫＶＰＱＥＥＬＥＮＡＳＬＶＦＴＶＦＧＨＮＭＫＳＳＮＤＦＩＧＲＩＶＩＧ；および前記ペプチドの有効なＥＳＵＰ断片を含む。
【０３９０】
本発明の好ましい実施形態は、ＤＯＶポリペプチドの阻害剤についてスクリーニングする方法であって、試験物質を細胞と接触させる段階と、非暴露対照細胞中の生物活性に対して、暴露細胞中のＤＯＶ生物活性を検出する段階と、を含む方法を提供する。好ましい細胞はニューロンである。好ましいアンタゴニストとしては、ＤＯＶ特異的抗体およびその断片、ＥＳＵＰ、および小分子が挙げられる。
【０３９１】
本発明の好ましい実施形態は、抗痙攣薬として、かつ痛みを防ぐために、ＤＯＶポリペプチドの阻害剤を使用する方法を提供する。これらの方法は、生理学的に許容される組成物中の有効量のＤＯＶ阻害剤を治療が必要な個体に投与する段階を含む。
【０３９２】
好ましい実施形態は、ｉ）抗体結合を生じさせる条件下にて、ＤＯＶポリペプチドの細胞質部分に特異的な抗体を生体試料と接触させる段階と、ｉｉ）抗体に結合していない混入物質を除去する段階とを含む、小胞を精製する方法を提供する。かかる抗体は、精製を可能にするために不溶性マトリックスに一次的または二次的に結合されることが好ましい。
【０３９３】
好ましい実施形態は、ｉ)結合を生じさせる条件下にて、ＤＯＶポリペプチドに特異的な抗体を生体試料と接触させる段階と、ｉｉ）その抗体を検出する段階とを含む、小胞を検出する方法を提供する。好ましい抗体は、蛍光化合物、放射性化合物、またはそうでなければ検出可能な化合物で共有結合的に標識される。
【０３９４】
好ましい実施形態は、ＤＯＶの小胞部分に特異的な抗体を細胞と接触させる段階を含む、小胞の排出（extrusion）を検出する方法を提供する。好ましい抗体は、蛍光化合物、放射性化合物、またはそうでなければ検出可能な化合物で共有結合的に標識される。好ましい細胞はニューロンである。
【０３９５】
本発明の好ましい実施形態は、生体試験試料を個体から採取する段階；試験試料におけるＤＯＶの発現レベルを検出する段階；試験試料におけるＤＯＶの発現レベルを対照試料のレベルと比較する段階；を含む、神経疾患を診断する方法を提供する。この方法によって示される神経疾患としては、発作性運動誘発性舞踏アテトーゼ(ＰＫＣ)、麻痺（部分または完全）および気分障害（鬱病、双極性障害、および精神分裂病）が挙げられる。
【０３９６】
好ましい実施形態は、細胞に対する小胞のドッキングおよび融合能力を回復する方法であって、ＤＯＶポリペプチドを細胞に導入する段階を含む方法である。好ましくはこの方法は、ＰＫＣ、部分および完全麻痺、鬱病、双極性障害および精神分裂病などの気分障害の治療および予防に適用される。ＤＯＶポリペプチドは、ＤＯＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される発現制御因子を含むポリヌクレオチドコンストラクトを導入することによって細胞に送達されることが好ましい。
【０３９７】
本発明の好ましい態様は、ＤＯＶポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＤＯＶの発現を検出することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＤＯＶの発現を検出することができるポリヌクレオチドは、ＤＯＶ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＤＯＶコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるＤＯＶタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０３９８】
一態様において、本発明は、第２組成物、好ましくは核酸、ポリペプチドまたは小分子を治療薬として、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで標的生体細胞に送達するのに使用されるＤＯＶポリペプチド組成物を包含する。この第２組成物は、所望の場合には、ＤＯＶポリペプチドに共有結合的または非共有結合的に結合または融合してもよい。そのＤＯＶポリペプチド組成物はさらに、リポソームまたは脂質小胞による第２分子の送達を促進するための人工脂質または小胞成分を含有し得る。これらの方法においてＤＯＶポリペプチドを使用する方法は、当技術分野で公知であり、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０７４，８４４号および同第６，０９９，８５７号を包含する。好ましい実施形態では、培養中の細胞、好ましくはニューロン細胞への、第２組成物の送達、例えばリポソームにより仲介されるＤＮＡランスフェクションを促進するために、ＤＯＶポリペプチドが使用される。
【０３９９】
ＤＯＶポリペプチドは、シナプス前膜にシナプス前小胞がドッキングおよび／または融合するのを防ぐことによって、神経伝達物質の放出を抑制する方法においても有用である。これらのポリペプチドは、興奮分泌非連関ペプチド(ＥＳＵＰ)と呼ばれる。遮断活性を有するＤＯＶの断片は、当技術分野で公知の方法（例えば、その開示内容全体が参照により組み込まれる米国特許第６，０９０，６３１号および同第６，１６９，０７４号参照）を用いて同定することができる。本発明のＥＳＵＰは、神経伝達物質分泌前に細胞の原形質膜とドッキングする神経細胞の小胞にとって重要であるタンパク質三元複合体（「ドッキング複合体」）の集合の結合ドメインとしての役割を果たすペプチドに一次構造において相当する、合成および精製ＤＯＶペプチド断片を含む。最適な活性については、本発明のＥＳＵＰは、約２０アミノ酸の最低長さと、約１００アミノ酸の最大長さを有するが、それより大きくても、または小さくてもよい。神経伝達物質放出の抑制に使用するのに好ましいＤＯＶ ＥＳＵＰとしては、以下の配列：ＬＬＨＮＨＬＴＶＲＶＩＥＡＲＤＬＰＰＰＩＳＨＤＧＳＲＱＤＭＡＨＳＮＰＹＶＫＩＣＬＬＰＤＱＫＮＳＫＱＴＧＶＫＲＫＴＱＫＰＶＦＥＥＲＹＴＦＥＩＰＦＬＥＡＱＲＲＴＬＬＬＴＷＤＦＤＫＦＳＲＨＣＶＩＧＫＶＳ；ＧＲＬＮＶＤＶＩＲＡＫＱＬＬＱＴＤＶＳＱＧＳＤＰＦＶＫＩＱＬＶＨＧＬＫＬＶＫＴＫＫＴＳＦＬＲＧＴＩＤＰＦＹＮＥＳＦＳＦＫＶＰＱＥＥＬＥＮＡＳＬＶＦＴＶＦＧＨＮＭＫＳＳＮＤＦＩＧＲＩＶＩＧ；および前記ペプチドの有効なＥＳＵＰ断片を含むものが挙げられる。ＤＯＶ ＥＳＵＰは、標的部位に共有結合されることが好ましい。好ましい標的部位は、結合部位と機能上相互作用することができる特定の細胞型（例えば、ニューロン）上に存在する細胞表面結合部位に対するリガンドを含む。好ましい標的部位は、神経成長因子およびその機能性誘導体である。代替方法としては、ＤＯＶ ＥＳＵＰをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、ＤＯＶ ＥＳＵＰを細胞中で発現させることができる。ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法は、本明細書およびその開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６１１７４５４号および同第６１８０６０２号に述べられているように、当業者に公知である。
【０４００】
本発明の他の実施形態は、ＤＯＶポリペプチドのアンタゴニストについてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、試験物質を細胞と接触させる段階と、非暴露対照細胞中の生物活性に対して、暴露細胞中のＤＯＶ生物活性を検出する段階と、を含む。好ましい細胞はニューロンである。ＤＯＶポリペプチドは、効率的な神経伝達物質放出に必要とされる。このように、ＤＯＶ活性は、非暴露細胞と比較して暴露細胞から放出される神経伝達物質のレベルを検出することによって決定することができる。かかるアッセイは、当技術分野で一般的であり、例えば抗体に基づくアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、結合競合アッセイ（例えば、特定の神経伝達物質受容体に対して）およびカラーメトリックアッセイが挙げられる。好ましいアンタゴニストとしては、ＤＯＶ特異的抗体およびその断片、ＥＳＵＰおよび小分子が挙げられる。
【０４０１】
ＤＯＶアンタゴニストは、痛みを抑えるか、または治療するために使用することができる。米国特許第５，９８９，５４５号（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に従って、特にペプチドアンタゴニストが、神経毒の代わりに本発明のポリペプチドを使用することによって用いられる。さらに、本発明のＤＯＶアンタゴニスを抗痙攣薬として使用してもよい。抗痙攣薬は有効に、脳卒中のケースの梗塞サイズを低減し、癲癇または神経毒に対する暴露から生じる発作などの有効な治療法である。これらの方法は、生理学的に許容される組成物中の有効量のＤＯＶアンタゴニストを、治療が必要な個体に投与する段階を含む。
【０４０２】
ＤＯＶは小胞の成分であり、このため、ＤＯＶに対する抗体は、小胞、好ましくは神経伝達物質を輸送する神経細胞小胞の検出に有用である。ＤＯＶ特異的抗体は小胞の精製時に使用することができる。この方法は、ｉ）抗体結合を生じさせる条件下にて、ＤＯＶポリペプチドの細胞質部分に特異的な抗体を生体試料と接触させる段階と、ｉｉ）抗体に結合していない混入物質を除去する段階と、を含む。好ましくは、かかる抗体は、精製を可能にするために不溶性マトリックスに一次的または二次的に結合されることが好ましい。ＤＯＶ特異的抗体は、小胞に対するマーカーとして使用することもできる。例えば、小胞は、免疫組織化学などのアッセイにおいて検出することができる。ＤＯＶの小胞部分は、原形質膜で小胞内容物が排出された後で、細胞の表面に現れる。このように、ＤＯＶの小胞部分に特異的な抗体は、小胞の排出を検出およびモニターするのに有用である。この方法は、ＤＯＶの小胞部分に特異的な抗体を細胞と接触させる段階を含む。好ましい抗体は、例えば蛍光化合物、発光化合物、または放射標識化合物で検出可能に標識される。
【０４０３】
ＤＯＶの発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）レベルまたはＤＯＶの突然変異型の検出はさらに、ある人が発作性運動誘発性舞踏アテトーゼ(ＰＫＣ)、麻痺（部分または完全）および気分障害（鬱病、双極性障害、および精神分裂病）などの神経疾患を発症するリスクがあるか、またはそれを有するかどうかを決定または診断するのに有用である。この方法は、生体試験試料を個体から採取する段階；試験試料におけるＤＯＶの発現レベルを検出する段階；試験試料におけるＤＯＶの発現レベルを対照試料（１つまたは複数）のレベルと比較する段階；を含む。神経疾患を持たない個体と比較して、ＤＯＶ、ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルの低下によって、個体が疾患を有すること、または疾患を発症するリスクがあることが示される。
【０４０４】
ＤＯＶポリペプチドはさらに、小胞のドッキングおよび融合において欠陥のある細胞に導入される。この方法は、小胞のドッキングおよび融合が可能となるように、細胞にＤＯＶポリペプチドを導入する段階を含む。本明細書に記載の方法により、ＤＯＶのコード配列に作動可能に連結される発現調節因子を含むポリヌクレオチドコンストラクトを細胞に導入することによって、ＤＯＶポリペプチドを細胞に導入することができる。好ましい細胞はニューロンである。ＤＯＶポリペプチドは好ましくは、ＰＫＣ、麻痺（部分または完全）または気分障害（鬱病、双極性障害、精神分裂病）の治療に適用される。
配列番号：２６のタンパク質（内部指定クローン５００７０６４３７  ２０４−５−２−０−Ｃ９−Ｆ）
クローン５００７０６４３７＿２０４−５−２−０−Ｃ９−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：２５）は、アミノ酸配列：ＭＤＰＡＲＰＬＧＬＳＩＬＬＬＦＬＴＥＡＡＬＧＤＡＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＡＬＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＬＡＧＧを含む、配列番号：２６のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２６のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン５００７０６４３７＿２０４−５−２−０−Ｃ９−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２５のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン５００７０６４３７＿２０４−５−２−０−Ｃ９−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：２６、配列番号：２５、およびクローン５００７０６４３７＿２０４−５−２−０−Ｃ９−Ｆの組成物に対して向けられている。以下に述べる方法で使用するのに好ましいｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、ＡＱＥＰＴＧＮＮＡＥＩＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＡＬＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＬＡＧＧのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０４０５】
本発明のタンパク質ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、組織因子経路インヒビター２（ＴＦＰＩ-２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４８３０７)の変異体である。アミノ末端側８４個のアミノ酸はＴＦＰＩ-２とｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎとの間で同一であり、カルボキシル末端側４個のアミノ酸は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎに固有である。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、１つのシグナルペプチド（ＭＤＰＡＲＰＬＧＬＳＩＬＬＬＦＬＴＥＡＡＬＧＤＡ）および１つのＫｕｎｉｔｚインヒビタードメイン（ＣＬＬＰＬＤＹＧＰＣＲＡＬＬＬＲＹＹＹＤＲＹＴＱＳＣＲＱＦＬＹＧＧＣＥＧＮＡＮＮＦＹＴＷＥＡＣＤＤＬＡ）を示す。Ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、ＴＦＰＩ-２のカルボキシル末端に位置する、主要なヘパリン結合部位を欠いている。内皮細胞、ケラチン生成細胞および線維芽細胞を含む多種多様な細胞型が、正常な条件下でｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎを合成かつ分泌する。さらに、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは臍静脈内皮細胞において高度に発現し、その発現レベルは。腫瘍の悪性度と負に相関する。
【０４０６】
Ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、プラスミン、トリプシン、血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、キモトリプシン、第ＩＸａ因子−ポリリジンおよびカテプシンＧを阻害する広域セリンプロテアーゼ阻害剤である。Ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)分解の調節、および血液凝固経路の調節のどちらにおいても主要な役割を果たす。特に、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、外因性凝固経路の細胞のイニシエーター、およびプラスミンを強力に阻害し、それによって、ＥＣＭの分解を担うｐｒｏ-ＭＭＰ（マトリックス金属プロテアーゼ）のプロセシングが阻害される。ＴＦＰＩ-２と異なり、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎは、ＥＣＭのヘパリン分子に結合していない循環変異体（circulating variant）である。
【０４０７】
本発明の実施形態は、配列番号：２６のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０４０８】
本発明の更なる実施形態は、セリンプロテアーゼに結合するまたはセリンプロテアーゼを阻害する生物活性を有するｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０４０９】
本発明の更なる実施形態は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドをコードする配列番号：２５のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４１０】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４１１】
本発明の更なる実施形態は、配列番号：２６のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド配列または生物活性を有するｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド断片を認識する抗体を含む組成物に関する。好ましくは、その抗体は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎのＣ末端側４個のアミノ酸の１つまたは複数のエピトープを認識し、ＴＦＰＩ-２には結合しないがｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎには結合する。
【０４１２】
本発明の好ましい態様は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記載されている。前記宿主細胞により産生されるｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０４１３】
他の実施形態は、ｉ）哺乳動物宿主細胞に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをトランスフェクトする段階と、ｉｉ）その作製されたタンパク質を精製する段階；を含む、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはその一部に対して作られた抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。またさらに好ましくは、その抗体は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎには結合するが、ＴＦＰＩ-２には結合しない。
【０４１４】
本発明の好ましい実施形態は、セリンプロテアーゼを結合させるためにｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎを使用する方法である。この方法は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの結合を可能にする条件下にて、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはその活性断片をセリンプロテアーゼと接触させて、それによって、結合が前記セリンプロテアーゼの活性を抑制する段階を含む。好ましいセリンプロテアーゼとしては、プラスミン、トリプシン、血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、キモトリプシン、第ＩＸａ因子ポリリジンまたはカテプシンＧが挙げられる。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用（例えば、プロテアーゼの精製および検出およびタンパク分解の防止）ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの方法（例えば、血液凝固および転移などの標的プロテアーゼ依存性病態の抑制）に適用することができる。
【０４１５】
本発明の好ましい実施形態は、セリンプロテアーゼを精製する方法である。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはそのプロテアーゼ結合断片をセリンプロテアーゼと接触させる段階；混入物を除去する段階；セリンプロテアーゼをさらに厳密な条件を用いて溶出する段階；を含む。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎペプチドを固体または半固体マトリックス上に固定化して、試料の洗浄を容易にし、混入物を除去することが好ましい。好ましいセリンプロテアーゼとしては、プラスミン、トリプシン、血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、キモトリプシン、第ＩＸａ因子ポリリジンまたはカテプシンＧが挙げられる。これらは、一般的な生物学的液体、例えば細胞培養液および体液（例えば、血清、血液、リンパ液、または脳脊髄液）から精製することができる。精製されたプロテアーゼは、生物学的アッセイ、および培養皿からの付着細胞の除去および部位特異的ペプチドの設計などの技術において有用である。
【０４１６】
本発明の更なる実施形態は、試料から混入プロテアーゼを除去するために、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはそのプロテアーゼ結合断片を使用する方法であって：ｉ）ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはその一部を、単独または他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて、クロマトグラフィー担体に結合させる段階と、ｉｉ）不要なプロテアーゼを含有する試料をカラムに通す段階と、を含む方法に関する。その試料は例えば、タンパク質の試料または体液から作製された試料である。
【０４１７】
本発明の一実施形態は、試料中の混入プロテアーゼを阻害するために、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはその一部を使用する方法に関する。かかる方法は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性を可能にする条件下にて、プロテアーゼ阻害量のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドを溶液に添加する段階を含む。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、どのプロテアーゼの特異性も理解することなく、広範囲のプロテアーゼを阻害することができるプロテアーゼ阻害剤の「カクテル」に含まれることが好ましい。かかるプロテアーゼ阻害剤カクテルは、混入プロテアーゼによるタンパク質試料の分解を防ぐために、実験アッセイにおいて広く使用されている。
【０４１８】
本発明の好ましい実施形態は、セリンプロテアーゼを検出する方法である。この方法は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはその活性断片をセリンプロテアーゼと接触させる段階と、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎを検出することによって、前記セリンプロテアーゼの存在を検出する段階と、を含む。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、例えば蛍光化合物、発光化合物、放射性化合物で検出可能に標識することが好ましい。この方法によって検出される好ましいセリンプロテアーゼとしては、プラスミン、トリプシン、血漿カリクレイン、第ＸＩａ因子、組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体、キモトリプシン、第ＩＸａ因子ポリリジンまたはカテプシンＧが挙げられる。好ましくは、セリンプロテアーゼは、一般的な生物学的液体、例えば細胞培養液および体液において検出される。この方法は、細胞試料または個体におけるセリンプロテアーゼの発現レベルの定量化に適用することができる。この情報は、腫瘍の悪性度の決定または血液凝固疾患の診断に有用であり得る。
【０４１９】
本発明のその他の好ましい実施形態は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドをｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ特異的抗体またはそのｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ結合断片と結合させる方法である。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドをｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ結合抗体またはそのｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ結合断片と接触させる段階を含む。この方法は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの検出および精製、ならびにｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ機能の修飾に適用することができる。これらの態様は本明細書において詳細に述べられている。
【０４２０】
本発明の他の実施形態は、ｉ）ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する化合物と生体試料を接触させる段階と、ｉｉ）試料におけるｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎのレベル、または他の検出可能ないずれかの特性を検出する段階と、ｉｉｉ）良性腫瘍、低度、中度、高度の悪性腫瘍を示す、対照試料から得られたシグナルと、結果として得られたシグナルを比較する段階と、を含む、腫瘍の悪性度を診断する方法に関する。そのシグナルのレベルは、腫瘍の悪性度と負に相関する。この方法は、例えば神経膠腫、メラニン欠乏性黒色腫、前立腺腫瘍および肺腫瘍などの腫瘍の悪性度を診断することに向けられることが好ましい。
【０４２１】
本発明のさらに他の実施形態は、ｉ)ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する化合物と生体試料を接触させる段階と、ｉｉ）試料におけるｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎのレベル、または他の検出可能ないずれかの特性を検出する段階と、ｉｉｉ)血栓付着のリスクを示さない患者を示す、対照試料から得られたシグナルと、結果として得られたシグナルを比較する段階と、を含む、血栓付着のリスクを診断する方法に関する。かかる方法は、過凝固症候群、例えばアテローム性動脈硬化症、虚血、脳卒中、心筋梗塞、冠動脈疾患を診断することに向けられることが好ましい。
【０４２２】
その生体試料は、検出を容易にするために精製されている、または一部精製されている体液または組織試料のいずれかであることが好ましい。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドに特異的に結合する特に好ましい化合物は、上述の抗体である。好ましくは、その抗体は標識され、そのシグナルの検出は、当業者によく知られている免疫組織学的および免疫蛍光プロセスを用いて行われる。代替方法としては、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドに特異的に結合する抗体は標識されず、シグナルの検出は、標識された二次抗体を使用することによって間接的に行われる。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチドに特異的に結合する特に好ましい化合物は、配列番号：２５に相補的なポリヌクレオチド配列またはその一部である。シグナルの検出は、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ技術、または定量的ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて行うことができる。
【０４２３】
さらに他の実施形態は、腫瘍の悪性度または血栓付着のリスクを決定するためのキットに関する。かかるキットは、検出可能なマーカーに結合されるｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたは核酸に特異的な少なくとも１つの結合パートナーと、対照試料と、マーカーを検出するための反応を行うための試薬とを含む。好ましくは、このキットは、特定の腫瘍、例えば神経膠腫、メラニン欠乏性黒色腫、前立腺腫瘍および肺腫瘍の悪性度を診断することに向けられる。代替方法としては、このキットは、悪性腫瘍を治療するために施される治療の経過をモニターすることに向けられる。
【０４２４】
他の好ましい実施形態は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現を増加する物質、およびｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現を増加する物質についてスクリーニングする方法であって、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む方法に関する。その試験物質は、他の細胞型ではそうではないが、特定の細胞型におけるｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現を修飾することが好ましい。試験物質は、内皮細胞または新生細胞において、特異的にｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ発現を修飾することが最も好ましい。
【０４２５】
本発明の更なる実施形態は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性を増加する物質、およびかかる物質についてスクリーニングする方法に向けられている。この方法は、ｉ）ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドを試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性を決定する段階と、ｉｉ）非暴露対照試料中の活性と、暴露後のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性を比較する段階と、を含む。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性は、内皮細胞または新生細胞において研究されることが好ましい。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるRao et al. (Biochem Biophys Res Commun. 276: 1286-94 (2000))に記載のように、プラスミンの阻害および／または放射標識マトリックスの分解を研究することによって、Ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎ活性をモニターすることができる。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現または活性を増加させる物質は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎアゴニストとして定義される。
【０４２６】
本発明の実施形態は、哺乳動物における血液凝固を低減するために、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法に関する。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎアゴニストを含むいずれかの組成物および方法を用いることができる。好ましくは、血液凝固を低減するかかる方法は、血栓付着のリスクを示す患者を治療することに向けられる。かかる方法は、血栓疾患および／または過凝固症候群、例えばアテローム性動脈硬化症、急性虚血、脳卒中、心筋梗塞、冠動脈疾患、および移植に伴う血栓性合併症を患う患者の治療に向けられることが最も好ましい。好ましい実施形態は、生理学的に許容される組成物中のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはそのプロテアーゼ阻害断片を個体の血流に導入する段階を含む、血液凝固を低減する方法である。本明細書で詳細に述べるように、血流への送達は、直接的（例えば、静脈または動脈への注入）または間接的（例えば、吸入または経口送達）であることが可能である。
【０４２７】
更なる実施形態において、本発明は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎアゴニストを含む組成物を用いて、組織の蓄積を防ぐことによって、創傷治癒を促進する方法を提供する。かかる方法は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドまたはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎアゴニストを含む有効量の組成物と前記創傷を接触させる段階であって、その創傷には、限定されないが、心筋梗塞、皮膚創傷、動脈壁の傷、ステントおよび縫合が含まれる段階を含む。
【０４２８】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物におけるＥＣＭ分解を予防または低減するために、本発明のポリペプチドおよびアゴニストを使用する方法に関する。好ましくは、ＥＣＭ分解を予防または低減するためのかかる方法は、悪性細胞による分解からＥＣＭを保護し、したがって、悪性腫瘍の浸潤および広がりをブロックすることに向けられる。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドを含む組成物は、例えば、腫瘍成長、内皮細胞増殖などの異常または望ましくない細胞増殖、および腫瘍成長に関連する血管形成を有する個体に投与されることが最も好ましい。本発明の組成物で治療することができる腫瘍には、限定されないが、神経膠腫、メラニン欠乏性黒色腫、前立腺腫瘍および肺腫瘍が含まれる。
【０４２９】
本発明のさらに他の実施形態は、病原微生物によって産生されるプロテアーゼの阻害および／または減弱に関する。この実施形態は、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはその生物活性断片、またはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現もしくは活性を増加させる化合物を含む組成物を、寄生虫感染症を予防および／または治療するために、個体に投与する段階を含む方法に関する。Ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド、またはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現もしくは活性を増加させる化合物は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、投与することができる。代替方法としては、この方法は、哺乳動物細胞培養の寄生虫感染を防ぐことに向けることが可能である。プロテアーゼ阻害剤は、宿主生物におけるウイルス、原生動物、細菌または菌類の播種を防ぐことができることが示されている。したがって、本発明のポリペプチドは、例えばコクシジウム症、ブドウ球菌感染症、インフルエンザウイルス、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓまたはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａによる感染症、および侵襲性肺アスペルギルス症を予防または治療するのに使用することができる。
【０４３０】
一実施形態において、ＥＣＭ分解の予防、または血液凝固の抑制に使用される薬剤組成物は、有効量のｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチド、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチド、またはｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現もしくは活性を増加させる物質を、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体との混合物で含む。有効量の本発明の組成物は、疾患、哺乳動物の疾患の状態、年齢、性別、および体重などの因子に応じて異なる。用法は、最適な治療反応が得られるように調整される。好ましい実施形態では、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎの発現もしくは活性を増加させる物質および生理学的に許容される担体を含む組成物は、注射によって個体の血流に直接的に導入される。
【０４３１】
好ましい実施形態において、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、対象の組織に特異的な標的化分子に融合される。好ましくは、標的ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、腫瘍成長に伴うＥＣＭ分解を防ぐために使用される薬剤組成物に含まれることが好ましい。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、当業者によく知られているいずれかの技術によって、腫瘍細胞上に特異的に発現する受容体または抗原を認識するリガンドまたは抗体に結合されることが最も好ましい。多数の腫瘍関連抗原が、科学文献に記述されている。例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wikstrand et al (Cancer Metastasis Rev 18: 451-64 (1999))により述べられている抗原および技術を用いることができる。代替方法としては、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドは、腫瘍の脈管構造を認識するリガンドに結合される。固形腫瘍の脈管構造にｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドを標的化するのに好ましい方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００４，５５４号に記述されている。
【０４３２】
他の実施形態は、血液凝固を低減するためにｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチドを使用する方法であって、ｉ）所定の生理学的条件下にてｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎまたはその一部の発現を可能にする、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子を構築する段階と、ｉｉ）この組換え分子を細胞、哺乳動物またはヒトに導入する段階と、を含む方法に関する。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子を、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターなどの送達媒体を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞または組織中に直接導入することが可能である。それらは、生理学的技術、例えば微量注入および電気穿孔法、または共沈およびＤＮＡのリポソームへの取り込みなどの化学的方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアロゾル状で、または潅注（lavage）によって送達することもできる。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチドは、細胞への直接的な注入などによって細胞内で適用することもできる。ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチドは、内皮細胞中に、または血管細胞に導入されることが好ましい。最も好ましくは、ｐｌａｃｅｎｔａｌｉｎポリヌクレオチドが、血栓付着のリスクを示す患者の治療に向けられる場合、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：ＷＯ９９/０２１７１に記載の方法を用いることができる。
配列番号：２８のタンパク質（内部指定クローン１７６３５５  １１７−００５−２−０−Ｈｌｌ−Ｆ）
クローン１７６３５５＿１１７−００５−２−０−Ｈ１１−ＦのｃＤＮＡ(配列番号：２７）は、アミノ酸配列：ＭＡＳＭＡＡＶＬＴＷＡＬＡＬＬＳＡＦＳＡＴＱＡＲＫＧＦＷＤＹＦＳＱＴＳＧＤＫＧＲＶＥＱＩＨＱＱＫＭＡＲＥＰＡＴＬＫＤＳＬＥＱＤＬＮＮＭＮＫＦＬＥＫＬＲＰＬＳＧＳＥＡＰＲＬＰＱＤＰＶＧＭＲＲＱＬＱＥＥＬＥＥＶＫＡＲＬＱＰＹＭＡＥＡＨＥＬＶＧＷＮＬＥＧＬＲＱＱＬＫＰＹＴＭＤＬＭＥＱＶＡＬＲＶＱＥＬＱＥＱＬＲＶＶＧＥＤＴＫＡＱＬＬＧＧＶＤＥＡＷＡＬＬＱＧＬＱＳＲＷＨＨＴＧＲＦＫＥＬＦＨＰＹＡＥＳＬＶＳＧＩＧＲＨＶＱＥＬＨＲＳＶＡＰＨＡＰＡＳＰＡＲＬＳＲＣＶＱＶＬＳＲＫＬＴＬＫＡＫＡＬＨＡＲＩＱＱＮＬＤＱＬＲＥＥＬＳＲＡＦＡＧＴＧＴＥＥＧＡＧＰＤＰＱＭＬＳＥＥＶＲＱＲＬＱＡＦＲＱＤＴＹＬＱＩＡＡＦＴＲＡＩＤＱＥＴＥＥＶＱＱＱＬＡＰＰＰＰＧＨＳＡＦＡＰＥＦＱＱＴＤＳＧＫＶＬＳＫＬＱＡＲＬＤＤＬＷＥＤＩＴＨＳＬＨＤＱＧＨＳＨＬＧＤＰを含む、配列番号：２８のＮＡＡＲタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２８のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１７６３５５＿１１７-００５−２−０−Ｈ１１−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１７６３５５＿１１７−００５−２−０−Ｈ１１−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：２７、配列番号：２８、およびクローン１７６３５５＿１１７−００５−２−０−Ｈ１１−Ｆの組成物に対して向けられている。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０４３３】
本発明のタンパク質は、アポリポタンパク質モチーフ：ＭＡＡＶＬＴＷＡＬＡＬＬＳＡＦＳＡＴＱＡＲＫＧＦＷＤＹＦＳＱＴＳＧＤＫＧＲＶＥＱＩＨＱＱＫＭＡＲＥＰＡＴＬＫＤＳＬＥＱＤＬＮＮＭＮＫＦＬＥＫＬＲＰＬＳＧＳＥＡＰＲＬＰＱＤＰＶＧＭＲＲＱＬＱＥＥＬＥＥＶＫＡＲＬＱＰＹＭＡＥＡＨＥＬＶＧＷＮＬＥＧＬＲＱＱＬＫＰＹＴＭＤＬＭＥＱＶＡＬＲＶＱＥＬＱＥＱＬＲＷＧＥＤＴＫＡＱＬＬＧＧＶＤＥＡＷＡＬＬＱＧＬＱＳＲＷＨＨＴＧＲＦＫＥＬＦＨＰＹＡＥＳＬＶＳＧＩＧＲＨＶＱＥＬＨＲＳＶＡＰＨＡＰＡＳＰＡＲＬＳＲＣＶＱＶＬＳＲＫＬＴＬＫＡＫＡＬＨＡＲＩＱＱＮＬＤを表す。したがって、本発明の実施形態は、アポリポタンパク質モチーフおよびそれをコードするポリヌクレオチドのアミノ酸を含む。
【０４３４】
ＨＤＬおよびＬＤＬなどのリポタンパク質粒子は、特定の組織にそれらを標的化し、かつリポタンパク質の脂質画分、例えばコレステロールなどの輸送に必要とされる酵素を活性化する役割を担う、特有のアポリポタンパク質を含有する。ＮＡＡＲは、アポリポタンパク質ファミリーのメンバーである。
【０４３５】
アポリポタンパク質は、リポタンパク質粒子のタンパク質成分であり、細胞膜上の受容体に結合し、リポタンパク質粒子を代謝の目的部位に向ける役割を担っている。これらの高分子量粒子が主に、血漿を通じた脂質の輸送（トリグリセリドおよびコレステロールエステル型のコレステロール）を担っている。リポタンパク質粒子としては、キロミクロンおよびキロミクロンレムナント粒子、超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)、中間密度リポタンパク質(ＩＤＬ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)、および高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)が挙げられる。高レベルのリポタンパク質粒子が、アテローム性動脈硬化症と正に相関しており、血漿リポタンパク質濃度の減少は、アテローム性動脈硬化症のリスクの減少と相関する。さらに、個々のアポリポタンパク質は、異なる種類のリポタンパク質粒子との特定の会合の形成などの特有の機能を有する。一部のアポリポタンパク質は、リポタンパク質と細胞表面受容体との相互作用を制御するリガンドとしての役割を果たすのに対し、他のアポリポタンパク質は、脂質代謝に必須の酵素のコファクターとして機能する。
【０４３６】
ＮＡＡＲは、血液のキロミクロンおよびＨＤＬ画分と関連する。小腸によるＮＡＡＲの合成は、脂質の摂取後に顕著に増加し、その結果、腸間膜リンパ液中のＮＡＡＲの生産が著しく増加する。小腸の上皮細胞からの分泌中、ｐｒｅ−ＮＡＡＲシグナルペプチドが切断される。成熟ＮＡＡＲポリペプチドは、新たに合成されたトリグリセリド−リッチリポタンパク質ならびに血液のＨＤＬ画分の主な成分としてリンパ液中に分泌される。ＮＡＡＲは、腸のトリグリセリド−リッチリポタンパク質の生合成および／または代謝に関与する。小腸によるＮＡＡＲの生合成および分泌の増加は、腸のキロミクロンの形成および分泌によって引き起こされる。ＮＡＡＲレベルは、食事によって制御され、高脂肪食によってアップレギュレートされ、レプチンによってダウンレギュレートされる。脂質食後の腸間膜リンパ液中のＮＡＡＲは、食物摂取を抑制し、そのことから、ＮＡＡＲが脂肪の摂食後に血液中で循環する満腹因子としての役割も果たすことが示唆される。
【０４３７】
ＮＡＡＲは、トリグリセリドリッチなリポタンパク質代謝、コレステロール逆輸送、およびＣＥＴＰ（コレステロールエステル転送タンパク）活性において役割を果たす。結果として、ＮＡＡＲは、食事脂肪／コレステロール摂取の変化に対する血中コレステロール反応の個人間変動の一部を担う。さらに、アテローム性動脈硬化症の発症を予防するために、ＨＤＬ粒子の代わりに、ＮＡＡＲを有効に使用することができる。また、ＮＡＡＲは、糖尿病の病態生理において重要な役割を担う。ＮＡＡＲのレベルは、若年性Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）患者およびインスリン非依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)患者における血糖コントロールと関連がある。
【０４３８】
ＮＡＡＲは脂質代謝およびそれに関連する疾患において主要な役割を担う。脂質代謝に関係する疾患には、限定されないが、肥満症、アテローム性動脈硬化症などの肥満関連疾患、冠動脈心疾患などの循環器病、アルツハイマーまたは痴呆などの神経変性疾患、冠動脈疾患、ミトコンドリア細胞変性（mitochondriocytopathies）、高脂質血症、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、肥満関連動脈硬化症、肥満関連インスリン抵抗性、肥満関連高血圧症、肥満関連ＩＩ型糖尿病から生じる微小血管障害（microangiopathic lesions）、ＩＩ型糖尿病の肥満個体において微小血管障害により生じる眼球障害、およびＩＩ型糖尿病の肥満個体において微小血管障害により生じる腎臓障害が含まれる。
【０４３９】
本発明の実施形態は、配列番号：２８のＮＡＡＲポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０４４０】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＮＡＡＲポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０４４１】
本発明の更なる実施形態は、ＮＡＡＲポリペプチドをコードする配列番号：２７のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４４２】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＮＡＡＲポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４４３】
ＮＡＡＲポリペプチドは、アテローム性動脈硬化症および脂質代謝関連疾患と関連する、遊離脂肪酸(ＦＦＡ)、トリグリセリド、およびコレステロールに結合する。本発明の好ましい実施形態は、ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片を、ＦＦＡ、トリグリセリド、またはコレステロール分子と、前記分子へのＮＡＡＲポリペプチドの結合を可能にする条件下にて結合させる段階を含む方法である。好ましい実施形態において、ＮＡＡＲポリペプチドは、ＦＦＡ、トリグリセリドおよびコレステロールを精製するために使用される。かかる方法において、ＮＡＡＲポリペプチドは好ましくは、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ＦＦＡ、トリグリセリドおよびコレステロールに結合することが可能となる。この方法は、ｉ）混入物を取り除くために固体マトリックスを洗浄する段階と、ｉｉ）さらに厳密な条件を用いて、対象の粒子を溶出する段階と、を含む。
【０４４４】
この実施形態のその他の態様は、当技術分野で一般的な技術を用いて、ＦＦＡ、トリグリセリドおよびコレステロールを検出かつ定量化するために、ＮＡＡＲポリペプチドを使用する方法を包含する。この方法は、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ＦＦＡ、トリグリセリド、またはコレステロールを含有すると思われる生体試料を得る段階；ｉｉ）ＮＡＡＲの結合に適した条件下にて、ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片を前記試料と接触させる段階；ＮＡＡＲを検出することによって、ＦＦＡ、トリグリセリド、およびコレステロールの有無を検出する段階；を含む。ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片は、検出可能な化合物に共有結合で結合されることが好ましい。代替方法としては、検出可能なＮＡＡＲ特異的抗体またはその断片を用いて、ＮＡＡＲを検出することができる。この実施形態は、例えば、ＦＦＡ、トリグリセリド、およびコレステロールの血漿中レベルを検出するための診断ツールとして有用である。
【０４４５】
他の実施形態では、本発明は、生体試料中のＮＡＡＲポリペプチドの検出方法に関し、前記方法は、ｉ）生体試料を、ＮＡＡＲポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片と接触させる段階；ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。その抗体または抗体断片は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。さらに、その抗体または抗体断片は、当技術分野で一般的な検出可能な化合物（例えば、放射性、蛍光、発光、または酵素化合物）によって一次的または二次的に標識することができる。
【０４４６】
一部の実施形態において、本発明は、ＮＡＡＲポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットにも関する。このキットは、ＮＡＡＲポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片；任意にｉｉ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬；を含む。好ましくは、その抗体または抗体断片は、検出可能に標識される。かかる標識としては、蛍光、発光、および放射性化合物、ならびに酵素基質が挙げられる。任意の試薬は、検出可能なシグナルを提供し、かつ抗体に結合するか、またはかかる抗体上の標識と反応することができる。ＮＡＡＲ抗体は、肝臓関連疾患（例えば、肝炎、肝硬変、肝癌、およびＦＨＰ）、脂質代謝関連疾患、例えば糖尿病、およびアテローム性動脈硬化症を診断するために用いることができる。かかる疾患を検出するために、適切な生体試料（例えば、血清）を試験して、産生されたＮＡＡＲのレベルを決定することができる（その開示内容全体が参照により組み込まれる米国特許第６，０２７，９３５号）。（その開示内容全体が参照により組み込まれる米国特許第６，０２７，９３５号）。
【０４４７】
本発明の実施形態は、ＮＡＡＲの発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＮＡＡＲ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＮＡＡＲの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＮＡＡＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＮＡＡＲ ｍＲＮＡのレベルを、ノーザンブロット、ＲＴＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるような特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＮＡＡＲポリペプチドのレベルを、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に述べるような特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０４４８】
他の実施形態では、ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片を用いて、ＮＡＡＲ活性を活性化または抑制する化合物についてスクリーニングすることができる。この方法は、ｉ）ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）ＮＡＡＲ活性をモニターする段階を含む。ＮＡＡＲは、ＦＦＡ、トリグリセリド、およびコレステロールに結合する。したがって、ＮＡＡＲ活性は、試験物質を添加すると同時に、ＦＦＡ、トリグリセリド、またはコレステロールとの競合的結合アッセイによってモニターすることができる。本発明のこの態様では、ＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片は溶液中で遊離であり、固体担体に固定化され、細胞表面上で組換えで発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。ＮＡＡＲポリペプチドと試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、ＢＩＡｃｏｒｅ(スウェーデン、ウプサラ)などの当業者によく知られている方法によって測定することができる。他の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：Ｗ０８４/０３５６４に記載のように、本発明のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。ＮＡＡＲの発現または活性を低減する試験物質は、ＮＡＡＲの阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ＮＡＡＲの発現または活性を増加させる試験物質は、活性化剤またはアゴニストとして定義される。主題の発明のＮＡＡＲの発現または活性を調節する作用物質には、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチ、リボザイム、および抗体が含まれる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用される。
【０４４９】
本発明の他の実施形態では、ＮＡＡＲポリペプチドを使用して、ＦＦＡ、トリグリセリド、およびコレステロールをｉｎ ｖｉｖｏで結合させて、これらの分子を血流から除去する。この方法は、有効量のＮＡＡＲポリペプチドまたはその断片を個体の血流に導入する段階を含む。この実施形態では、ＮＡＡＲポリペプチドはさらに、体からの排出を特定化するポリペプチドシグナルを有する融合タンパク質として発現させることができる。ＮＡＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片を個体に送達するのに好ましい方法は、生理学的に許容される溶液（例えば、ｐＨ緩衝生理食塩液、グリセロールなどの粘性成分を添加することにより改変されたｐＨ緩衝生理食塩水）中の前記ポリペプチドまたは断片を直接注入、静脈内注入することを含む。代替方法としては、ＮＡＡＲポリヌクレオチドを導入して、血流中でＮＡＡＲポリペプチドを発現させることができる。この方法は、ｉ）本発明のヌクレオチド配列およびその発現を指示する調節配列に作動可能に連結される、細胞を感染させることができるアデノウイルスのゲノムの一部に相当する組換えウイルスベクターを構築する段階；ｉｉ）アテローム性動脈硬化症、糖尿病、または他の脂質代謝異常を有する、またはそのリスクのある個体に、有効量の組換えアデノウイルスベクターを送達する段階；を含む。
【０４５０】
これらの疾患について個体の家族性素因の決定または個体における血清リポタンパク質レベルの実際の分析など、一般的な医療技術により決定される、アテローム性動脈硬化症またはＦＦＡ、トリグリセリド、およびコレステロールの動脈リポタンパク質沈着を予防または治療するために、ＮＡＡＲポリペプチド、その断片、またはＮＡＡＲアゴニストを使用することができる。代替方法としては、ＮＡＡＲポリペプチド、その断片、またはＮＡＡＲアゴニストを、糖尿病または他の脂質代謝異常のリスクのある、またはそれを有する個体に送達することができる。
他の実施形態では、敗血症性ショックまたはリポ多糖類の高い血清中レベルと関連する病状を治療するために、ＮＡＡＲポリペプチド、その断片またはＮＡＡＲアゴニストが、生理学的に許容される組成物中で使用される（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９３２，５３６号および同第５，９４８，７５６号）。
【０４５１】
他の実施形態において、ＮＡＡＲペプチドは食欲抑制活性を有するために、ＮＡＡＲポリペプチド、その断片またはＮＡＡＲアゴニストは、肥満症を治療および予防するために適用される(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５８４０６８８号）。この方法は、生理学的に許容される溶液中のＮＡＡＲポリペプチド、その断片、またはＮＡＡＲアゴニストを個体に導入する段階を含む。好ましくは、その個体は過体重であるか、または肥満度指数（ＢＭＩ）２５以上を有する。
【０４５２】
主題の発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に調節する組成物および方法を提供する。ＮＡＡＲ活性を調節することによって、肝臓関連および脂質代謝関連疾患をうまく治療および管理することが可能となるだろう。
【０４５３】
本発明の他の実施形態は、当業者によく知られているいずれかの方法によって、遺伝子導入モデル動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するために、本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを用いた組成物および方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、癌などのヒトホルモン依存性疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
配列番号：３０のタンパク質（内部指定クローン２２２５８８  １１６-０９４-１-０-Ｈ２-Ｆ）
クローン２２２５８８＿１１６−０９４−１−０−Ｈ２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：２９）は、アミノ酸配列：ＭＴＳＧＳＫＣＰＳＴＤＳＧＫＥＥＹＩＡＴＦＫＧＳＥＹＦＣＹＤＬＳＱＮＰＩＱＳＳＳＤＥＩＴＬＳＦＫＴＬＱＲＮＧＬＭＬＨＴＧＫＳＡＤＹＶＮＬＡＬＫＮＧＡＶＳＬＶＩＮＬＧＳＧＡＦＥＡＬＶＥＰＶＮＧＫＦＮＤＮＡＷＨＤＶＫＶＴＲＮＬＲＱＶＴＩＳＶＤＧＩＬＴＴＴＧＹＴＱＥＤＹＴＭＬＧＳＤＤＦＦＹＶＧＧＳＰＳＴＡＤＬＰＧＳＰＩＱＨＥＳＴＦＡＥＤＰＭＦＱＳＱＴＡＱＬを含む、配列番号：３０のＮｅｕｒｅｘｉｎａｌタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３０のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン２２２５８８＿１１６−０９４−１−０−Ｈ２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：２９のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン２２２５８８＿１１６−０９４−１−０−Ｈ２−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：２９、配列番号：３０、およびクローン２２２５８８＿１１６−０９４−１−０−Ｈ２−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０４５４】
配列番号：２９のタンパク質、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは、ニューレキシンＩ−αタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３５３５６）のスプライシングバリアントである。本発明のタンパク質は、Ｇ−ラミニンモチーフ：ＦＫＴＬＱＲＮＧＬＭＬＨＴＧＫＳＡＤＹＶＮＬＡＬＫＮＧＡＶＳＬＶＩＮＬＧＳＧＡＦＥＡＬＶＥＰＶＮＧＫＦＮＤＮＡＷＨＤＶＫＶＴＲＮＬＲＱＶＴＩＳＶＤＧＩＬＴＴＴＧＹＴＱＥＤＹＴＭＬＧＳＤＤＦＦＹＶＧＧＳＰＳＴＡＤＬＰを示す。したがって、本発明の一部の実施形態は、Ｇ−ラミニンモチーフおよびそれをコードするポリヌクレオチドのアミノ酸を含む。
【０４５５】
ニューレキシンは、神経細胞表面タンパク質である。細胞接着分子としての機能の他に、ニューレキシンは、シグナル伝達受容体としての役割を果たす。Ｎｅｕｒｏｘｏｐｈｉｌｉｎと呼ばれるα−ニューレキシンのリガンドは、ペプチドホルモンに類似している。ニューレキシンは、ラトロトキシンの受容体としての役割も果たし得る。ニューレキシンのスプライシングバリアントは、標的神経支配および神経突起の成長からシナプス形成への移行、またはシナプス可塑性および再生時に寄与する。ニューレキシンは、仲介神経プロセス、およびシグナル伝達エキソサイトーシスと関連する。このように、これらのタンパク質は、神経発達、神経異常（例えば、発作）、および癌において役割を担う。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ、１つのニューレキシンアイソフォームは、標的神経支配中の交感神経細胞において発現し、スプライシングバリアントの相対的な発現レベルは、個々の神経細胞の分化中に変化する。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは、神経細胞のみで検出可能な膜タンパク質である。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現は出生後に、最高に達する。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは、細胞接着分子およびシグナル伝達受容体としての役割を果たす。
シグナル伝達および細胞接着において推定される機能を有する、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌに対するいくつかのリガンドが同定されている。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは、Ｃａ２＋の存在下のみで高親和性を有するα−ラトロトキシンに結合する。α−ラトロトキシンは、神経末端に適用すると、大量の神経伝達物質放出が起こる、クロゴケグモ毒由来の大きなペプチドの神経毒である。α−ラトロトキシンは膜に挿入され、その神経末端受容体のいずれかに固定された後、膜貫通イオン孔を形成する。さらに、ＮｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎはＮｅｕｒｅｘｉｎａｌおよびα−ニューレキシンに密に結合するが、β−ニューレキシンには密に結合しない。Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎは、抑制性介在ニューロンにおいてのみ高いレベルで合成され、シグナル伝達分子として機能する。ジストログリカンは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの他の生理学的リガンドであり、脳細胞間の細胞接着を仲介する。細胞表面タンパク質のジストログリカンは、細胞内の細胞骨格を細胞外マトリックスに結合させる。この結合の障害は、筋ジストロフィーの発生の一因となる。
【０４５６】
本発明の実施形態は、配列番号：３０の新規なＮｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０４５７】
本発明の更なる実施形態は、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎ、またはジストログリカンに結合する生物活性を有する、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０４５８】
本発明の更なる実施形態は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドをコードする配列番号：２９のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４５９】
本発明の更なる実施形態は、α−ラトロトキシン、ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎ、またはジストログリカンに結合する生物活性を有する、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４６０】
本発明の好ましい態様は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換体え体である。その他の好ましい態様は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換体え体である。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現を指示できるポリヌクレオチドは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞により産生されるＮｅｕｒｅｘｉｎａｌタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用される。
【０４６１】
Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドは、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンに結合する。本発明の好ましい実施形態は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドまたはその断片をα−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカン分子と、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドの前記分子への結合を可能にする条件下で結合させる段階を含む方法である。好ましい実施形態において、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドは、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンを精製するために使用される。かかる方法において、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドは好ましくは、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎまたはジストログリカンに結合される。この方法は、ｉ）固体マトリックスを洗浄して、混入物を取り除く段階と、ｉｉ）さらに厳密な条件を用いて、対象の粒子を溶出する段階と、を含む。この実施形態のその他の態様は、当技術分野で一般的な技術を用いて、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンを検出かつ定量化するために、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドを使用する方法を包含する。この方法は、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンを含有すると思われる生体試料を得る段階；ｉｉ）Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの結合に適した条件下にて、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドまたはその断片を前記試料と接触させる段階；Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌを検出することによって、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンの有無を検出する段階；を含む。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドまたはその断片は、検出可能な化合物に共有結合で結合されることが好ましい。代替方法としては、検出可能なＮｅｕｒｅｘｉｎａｌ特異的抗体またはその断片を用いて、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌを検出することができる。この実施形態は、例えば、α−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎおよびジストログリカンの神経細胞中のレベルを検出するための診断ツールとして有用である。本発明の更なる態様は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの単離、精製および特徴付けを含む。特に、本発明は、神経伝達物質放出の制御因子であり、したがって、カルシウムの存在下でα−ラトロトキシン毒性を仲介する、新規な神経細胞受容体に及ぶ。
【０４６２】
本発明の実施形態は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドを含む組成物に関する。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドを作製する方法は、ｉ）哺乳動物宿主細胞に、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをトランスフェクトする段階と、ｉｉ）その作製されたタンパク質を精製する段階；を含む。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは、当技術分野で公知の、または本明細書に開示されるいずれかの技術に従って単離することができる。好ましくは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌまたはその断片に対して作られた抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。
【０４６３】
他の実施形態において、本発明のタンパク質は、神経細胞に対して異種化合物（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を標的化するために用いることができる。例えば、対象の化合物、タンパク質、またはポリヌクレオチドに、組換えによりまたは化学的に融合された、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌまたはその断片で構成されるキメラタンパク質によって、ジストログリカンなど、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌのリガンドを発現する細胞へ特異的に送達することが可能となる。ジストログリカンは、大脳皮質、海馬、嗅球、大脳基底核、視床、および視床下部の神経細胞において発現する。これらの細胞集団を標的化する方法は、数多くの神経および気分障害、例えば癲癇、ストレス障害、精神分裂病、ハンチントン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病の治療に有用であると考えられる。さらに、肥満の個体の視床下部では、正常レベルよりも低いレベルでレプチン受容体を発現する場合が多い。したがって、異種Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌを有する視床下部へ、レプチン受容体コンストラクトまたはアゴニストを導入することは、肥満症に有効な治療である可能性がある。
【０４６４】
本発明の好ましい実施形態は、トポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、神経細胞を標識するため、本発明のタンパク質またはその断片を使用する組成物および方法に関する。かかる方法を用いて、脳卒中；神経変性疾患、例えば精神分裂病、アルツハイマー病、癲癇、ストレス障害、ハンチントン病、およびパーキンソン病；および末梢性神経筋疾患、例えば重症筋無力症およびＡＩＤＳ関連複合症；と関連する神経組織損傷をマッピングすることができる。例えば、本発明のタンパク質またはその断片を用いて、当業者によく知られている方法によって、神経細胞の可視化を可能にするであろう特異的抗体を産生することができる。その抗体は、限定されないが、蛍光標識、放射性原子、常磁性イオン、ビオチン、化学発光標識、または二次酵素もしくは結合段階によって検出できる標識を含む、検出可能ないずれかの成分で標識することが好ましい。同様の方法において、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌは神経細胞においてのみ特異的に発現することから、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ対して産生された抗体を用いて、特定の細胞型を同定することができる。代替方法としては、本発明のタンパク質またはＮｅｕｒｅｘｉｎａｌをコードする核酸の定量分析または検出を、当業者に公知の他の技術によって行うことができる。本発明はさらに。限定されないが、上記の疾患または病状を含む神経疾患または病状を診断する方法を提供する。
【０４６５】
他の実施形態では、本発明は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチドまたはその断片に結合する化合物を使用する方法に関する。かかる方法は、精神分裂病、アルツハイマー病、癲癇、ストレス障害、ハンチントン病、およびパーキンソン病などの神経変性病状を含む、異常なＮｅｕｒｅｘｉｎａｌレベルに関連する疾患の診断に向けられる。この方法は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌに特異的に結合する化合物と生体試料を接触させる段階を含む。好ましい化合物には、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ特異的抗体およびその抗原結合断片が含まれる。さらに好ましい化合物としては、蛍光、放射性、または酵素標識などの検出可能な標識で標識された化合物が挙げられる。この方法は、イムノアッセイを含む様々な診断技術に依拠し得る。
【０４６６】
他の実施形態において、本発明は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの存在の範囲を定量分析するための、またはその活性を模倣またはブロックする化合物を同定するための、試験キットの形で製造されるアッセイシステムを包含する。そのシステムまたは試験キットは：Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌに特異的に結合する成分と、任意に前記成分を検出する手段と、を備える。好ましい成分は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ特異的抗体およびその抗原結合断片である。その抗体または断片は、例えば蛍光化合物、発光化合物、または放射性化合物で標識されることが好ましい。代替方法としては、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ結合成分を検出可能な酵素基質で標識してもよく、任意の手段は、検出に必要とされる酵素である。
【０４６７】
本発明の更なる目的は、その活性を模倣するのに有効な、または哺乳動物におけるＮｅｕｒｅｘｉｎａｌの有害作用を抑制するのに有効な物質をスクリーニングする方法およびそれに関連するアッセイシステムを提供することである。
【０４６８】
本発明の好ましい実施形態は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現を増加または減少させる試験化合物についてスクリーニングする方法である。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現レベルを検出かつ定量化する段階と、ｉｉｉ）暴露細胞におけるＮｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現を、非暴露対照細胞における発現と比較する段階と、を含む。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現は神経細胞において研究されることが好ましい。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現を検出する方法は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ転写物（例えば、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および他のヌクレオチド検出法）またはＮｅｕｒｅｘｉｎａｌポリペプチド（例えば、ウエスタンブロット法または免疫組織学的方法）のいずれかに向けることが可能である。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの発現レベルは、例えばアンチセンス分子を用いて、生体試料中で低減することができる。
【０４６９】
本発明の好ましい実施形態は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの活性を増加または減少させる化合物についてスクリーニングする方法である。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの活性レベルを検出かつ定量化する段階と、ｉｉｉ）暴露細胞におけるＮｅｕｒｅｘｉｎａｌの活性を、非暴露対照細胞における活性と比較する段階と、を含む。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの活性は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌのα−ラトロトキシン、Ｎｅｕｒｅｘｏｐｈｉｌｉｎまたはジストログリカンへの結合を決定することにより検出されることが好ましい。結合は、上記に列挙される検出可能に標識されたタンパク質を用いた競合的結合アッセイによって試験される。
【０４７０】
Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性化剤またはアゴニストは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性または発現を増加する化合物として定義される。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ阻害剤またはアンタゴニストは、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性または発現を減少させる化合物として定義される。
【０４７１】
さらに他の実施形態では、本発明は、Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌの活性のアンタゴニストに関する。例えば、そのアンタゴニストは、α−ラトロトキシンを中和するために使用することが可能であり、クロゴケグモ刺咬に用いる抗毒素として使用することができる。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌアンタゴニストはさらに、異常に高いノルエピネフリンレベルに関連する疾患、例えば褐色細胞腫、注意欠陥多動障害(ＡＤＨＤ)、特発性捻転ジストニア、およびモノアミンオキシダーゼＡ欠損症を治療するのに使用することができる。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ阻害剤を使用する方法は、生理学的に許容される組成物中のＮｅｕｒｅｘｉｎａｌ阻害剤を個体に投与する段階を含む。生理学的に許容される組成物および担体は本明細書に記述されている。適切な処置は、個体の状態に応じて異なり、当業者によって決定される。
【０４７２】
Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性化剤は、神経終末の分解を調節および／または逆方向にするために、シナプス伝達を調節するために、またはＮｅｕｒｅｘｉｎａｌの異常に低い発現レベルに関連する他の病状を治療するために使用される。Ｎｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性化剤を使用する方法は、生理学的に許容される溶液中のＮｅｕｒｅｘｉｎａｌ活性化剤を個体に投与する段階を含む。生理学的に許容される組成物および担体は本明細書に記述されている。適切な処置は、個体の状況に応じて異なり、当業者によって決定される。
配列番号：３２のタンパク質（内部指定クローン１１９０３３  １０５-０６６-４-０-Ｆ１０-Ｆ)
クローン１１９０３３−１０５−０６６−４−０−Ｆ１０−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３１）は、アミノ酸配列：ＭＡＡＥＬＶＥＡＫＮＭＶＭＳＦＲＶＳＤＬＱＭＬＬＧＦＶＧＲＳＫＳＧＬＫＨＥＬＶＴＲＡＬＱＬＶＱＦＤＣＴＰＥＬＦＫＫＩＫＥＬＹＥＴＲＹＡＫＫＮＳＥＰＡＰＱＰＨＲＰＬＤＰＬＴＭＨＳＴＹＤＲＡＧＡＶＰＲＴＰＬＡＧＰＮＩＤＹＰＶＬＹＧＫＹＬＮＧＬＧＲＬＰＡＫＴＬＫＰＥＶＲＬＶＫＬＰＦＦＮＭＬＤＥＬＬＫＰＴＥＬＶＰＱＮＮＥＫＬＱＥＳＰＣＩＦＡＬＴＰＲＱＶＥＬＩＲＮＳＲＥＬＱＰＧＶＫＡＶＱＷＬＲＩＣＹＳＤＴＳＣＰＱＥＤＱＹＰＰＮＩＡＶＫＶＮＨＳＹＣＳＶＰＧＹＹＰＳＮＫＰＧＶＥＰＫＲＰＣＲＰＩＮＬＴＨＬＭＹＬＳＳＡＴＮＲＩＴＶＴＷＧＮＹＧＫＳＹＳＶＡＬＹＬＶＲＱＬＴＳＳＥＬＬＱＲＬＫＴＩＧＶＫＨＰＥＬＣＫＡＬＶＫＥＫＬＲＬＤＰＤＳＥＩＡＴＴＧＶＲＶＳＬＩＣＰＬＶＫＭＲＬＳＶＰＣＲＡＥＴＣＡＨＬＱＣＦＤＡＶＦＹＬＱＭＮＥＫＫＰＴＷＭＣＰＶＣＤＫＰＡＰＹＤＱＬＩＩＤＧＬＬＳＫＩＬＳＥＣＥＤＡＤＥＩＥＹＬＶＤＧＳＷＣＰＩＲＡＥＫＥＬＳＣＳＰＱＧＡＩＬＶＬＧＰＳＤＡＮＧＬＬＰＡＰＳＶＮＧＳＧＡＬＧＳＴＧＧＧＧＰＶＧＳＭＥＮＧＫＰＧＡＤＶＶＤＬＴＬＤＳＳＳＳＳＥＤＥＥＥＥＥＥＥＥＥＤＥＤＥＥＧＰＲＰＫＲＲＣＰＦＱＫＧＬＶＰＡＣを含む、配列番号：３２のＮＰＩＡＳＹタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３２のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１１９０３３＿１０５−０６６−４−０−Ｆ１０−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１１９０３３＿１０５−０６６−４−０−Ｆ１０−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：３１、配列番号：３２、およびクローン１１９０３３−１０５−０６６−４−０−Ｆ１０−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０４７３】
配列番号：３２のタンパク質ＮＰＩＡＳＹは、活性化ＳＴＡＴタンパク質（ＰＩＡＳＹ）のタンパク質阻害剤（アクセッション番号０７５９２６）の新規な多型変異体である。本発明のタンパク質は、ＳＡＰドメイン：ＶＭＳＦＲＶＳＤＬＱＭＬＬＧＦＶＧＲＳＫＳＧＬＫＨＥＬＶＴＲＡＬＱＬＶを示す。さらに、ＮＰＩＡＳＹは、ＭＩＺジンクフィンガーモチーフ：ＶＳＬＩＣＰＬＶＫＭＲＬＳＶＰＣＲＡＥＴＣＡＨＬＱＣＦＤＡＶＦＹＬＱＭＮＥＫＥＴＣＡＨＬＱＣＦＤＡＶＦＹＬＱＭＮＥＫを示す。インターフェロン(ＩＦＮ）および他のサイトカインによる初期応答遺伝子の活性化には、転写(ＳＴＡＴ)タンパク質のシグナル伝達因子および活性化因子と呼ばれる転写因子のファミリーのチロシンリン酸化が必要である。ＳＴＡＴタンパク質は、活性化細胞表面受容体からのシグナルを直接核に中継し、様々な造血サイトカインおよびホルモン、例えばサイトカインのインターロイキン６(ＩＬ６)ファミリー、上皮成長因子、およびレプチンによる遺伝子誘導において重要な役割を担う。すべてのＳＴＡＴタンパク質が、ＤＮＡ結合ドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン２および標的遺伝子発現の転写活性化に必要な転写活性化ドメインを含有する。Ｊａｎｕｓキナーゼ(ＪＡＫ)は、サイトカインシグナル伝達と同時に、特定のチロシン残基上のＳＴＡＴタンパク質をリン酸化する細胞質タンパク質キナーゼである。チロシンリン酸化ＳＴＡＴタンパク質は、互いの特定のＳＨ２−ホスホチロシン相互作用によって二量体化し、細胞質から核へと移行する。核に入ると、ＳＴＡＴタンパク質は、それらのプロモーターにおける応答因子に結合することによって、特定の標的遺伝子の転写を刺激する。
【０４７４】
活性化ＳＴＡＴ(ＰＡＩＳ)ファミリーのタンパク質阻害剤からのタンパク質の結合は、ＳＴＡＴシグナル伝達経路を阻害する。ＰＩＡＳ-ＳＴＡＴ相互作用は、ＳＴＡＴタンパク質のチロシンリン酸化に依存する。
【０４７５】
ＮＰＩＡＳＹは核に局在している。インターフェロン刺激と同時に、ＮＰＩＡＳＹは、ＳＴＡＴ１と会合するようになる。ＮＰＩＡＳＹ−ＳＴＡＴ１相互作用に関与しないが、ＮＰＩＡＳＹのＮＨ２末端におけるＬＸＸＬＬコレギュレーター（coregulator）配列が、ＳＴＡＴ１仲介遺伝子活性化の抑制に必要とされる。ＮＰＩＡＳＹは、ＳＴＡＴ１の転写コリプレッサーである。また、ＮＰＩＡＳＹは、前立腺癌細胞においてアンドロゲン受容体の転写活性の強力な阻害剤として働く。ＮＰＩＡＳＹはアンドロゲン受容体に結合するが、アンドロゲン受容体のＤＮＡ結合活性に影響を及ぼさない。ＮＰＩＡＳＹ−アンドロゲン受容体相互作用に必要とされないが、ＮＨ２末端ＬＸＸＬＬシグナチャー（signature）モチーフは、ＮＰＩＡＳＹの抑制活性に必須である。さらに、ＮＰＩＡＳＹはｐ５３に結合し、ｐ５３仲介転写活性化を抑制する。しかしながら、ＮＰＩＡＳＹは、ｐ５３仲介アポトーシスに影響を及ぼさない。ＮＰＩＡＳＹはｐ５３仲介機能を制御し、ｐ５３をアポトーシスの転写活性化非依存型に向ける。
【０４７６】
本発明の実施形態は、配列番号：３２のＮＰＩＡＳＹポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０４７７】
本発明の更なる実施形態は、ＳＴＡＴ、ｐ５３、またはアンドロゲン受容体に結合する生物活性を有するＮＰＩＡＳＹポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０４７８】
本発明の更なる実施形態は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドをコードする配列番号：３１のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４７９】
本発明の更なる実施形態は、ＳＴＡＴ、ｐ５３、またはアンドロゲン受容体に結合する生物活性を有するＮＰＩＡＳＹ断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４８０】
ＮＰＩＡＳＹポリペプチドは、Ｔ細胞白血病、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、および食道癌を含む癌にしばしば関連する、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体、およびｐ５３に結合する。本発明の好ましい実施形態は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片を、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３分子と、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドが前記分子に結合するのを可能にする条件下にて結合させる段階を含む。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ精製および検出方法、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ方法に向けられ、ＳＴＡＴ、ｐ５３、またはアンドロゲン受容体を抑制することができる。かかる方法は本明細書に述べられている。
【０４８１】
好ましい実施形態において、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３を精製するためにＮＰＩＡＳＹポリペプチドを使用する。かかる方法では、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドは好ましくは、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３に結合させることが可能となる。この方法は、ｉ）固体マトリックスを洗浄し、混入物を取り除く段階と、ｉｉ）より厳密な条件を用いて、対象の粒子を溶出する段階と、を含む。この実施形態のその他の態様は、当技術分野で一般的な技術を用いて、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３を検出かつ定量化するために、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドを使用する方法を包含する。この方法は、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３を含有すると考えられる生体試料を得る段階；ｉｉ）ＮＰＩＡＳＹの結合に適した条件下にて、前記試料をＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；ｉｉｉ）ＮＰＩＡＳＹを検出することによって、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体またはｐ５３の存在を検出する段階；を含む。ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片は、検出可能な化合物に共有結合で結合されることが好ましい。代替方法としては、検出可能なＮＰＩＡＳＹ特異的抗体またはその断片を用いて、ＮＰＩＡＳＹを検出することもできる。この実施形態は、例えば、ｐ５３、ＳＴＡＴ、またはアンドロゲン受容体に関連する癌、例えばＴ細胞白血病、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、および食道癌のリスクを検出するための診断ツールとして有用である。さらに、この方法は、筋萎縮および性発達障害を含む、低レベルの上記のタンパク質と関連する障害を診断するために使用することができる。
【０４８２】
本発明の好ましい態様は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＮＰＩＡＳＹ発現を検出することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＮＰＩＡＳＹの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＮＰＩＡＳＹ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＬＩＲＩＯＮコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞により産生されるＮＰＩＡＳＹタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断方法およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０４８３】
本発明の実施形態は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドを含む組成物を製造する方法に関する。ＰＩＡＳＹポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階と、ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階と、を含む。ＮＰＩＡＳＹは、当技術分野で公知のまたは本明細書に開示されている技術によって精製することができる。ＮＰＩＡＳＹまたはその一部に対して作られる抗体、好ましくはＮＰＩＡＳＹポリペプチドのＣ末端配列に対して作られる抗体が、クロマトグラフィー担体に結合され、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成されることが好ましい。代替方法としては、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドは、ｉ）ＰＩＡＳＹの発現を検出することができるポリヌクレオチドを宿主細胞にトランスフェクトする段階を含む方法によって作製される。ＮＰＩＡＳＹの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＮＰＩＡＳＹ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＮＰＩＡＳＹコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、上述のようにプロモーター配列を含むことが好ましい。
【０４８４】
その他の実施形態において、本発明は、生体試料中のＮＰＩＡＳＹポリペプチドを検出する方法に関し、前記方法は、ｉ）ＮＰＩＡＳＹ ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片と生体試料を接触させる段階；ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。その抗体または抗体断片は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。さらに、その抗体または抗体断片は、当技術分野で一般的な検出可能な化合物によって一次的または二次的に標識することができる（例えば、放射性、蛍光、発光、または酵素標識）。この方法は、ＮＰＩＡＳＹ関連疾患の診断に適用することができる。例えば、異常に低いレベルのＮＰＩＡＳＹは、ｐ５３、ＳＴＡＴ、またはアンドロゲン受容体に関連する癌、例えばＴ細胞白血病、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膵癌、肺癌、および食道癌のリスクが高いことをを示す。異常に高いレベルのＮＰＩＡＳＹは、不完全な性発達および筋萎縮などの上記のタンパク質に関連する成長および細胞増殖のリスクを示す。
【０４８５】
一部の実施形態では、本発明は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドの存在を検出する、診断キットにも関する。このキットは、ｉ)ＮＰＩＳＡＹポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片；任意にｉｉ)形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬；を備える。その抗体または抗体断片は検出可能に標識することが好ましい。かかる標識としては、蛍光、発光、および放射性化合物、ならびに酵素基質が挙げられる。任意の試薬は、抗体に結合するか、または抗体上の標識と反応する、検出可能なシグナルを提供することができる。ＮＰＩＡＳＹ抗体を用いて、上記の疾患のいずれかを診断することができる。かかる疾患を診断するために、適切な生体試料を試験して、産生されるＮＰＩＡＳＹのレベルを決定することができる。
【０４８６】
他の実施形態において、本発明は、ＳＴＡＴによって仲介されるＩＦＮ関連免疫応答を制御する方法を提供する。その免疫応答には、Ｂ細胞および／またはＴ細胞により分泌されるＩＦＮによって仲介される抗ウイルスまたは抗腫瘍応答が含まれる。この方法は、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトをＩＦＮ応答性細胞に導入する段階を含む。ポリヌクレオチドコンストラクトは、ＮＰＩＡＳＹコードポリヌクレオチドに作動可能に連結される発現制御因子を含むことが好ましい。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの適切な組成物は、炎症などのＩＦＮに関連する病態の治療方法として有用である。
【０４８７】
本発明の実施形態は、ＮＰＩＡＳＹ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ＮＰＩＡＳＹの発現を検出かつ定量化する段階；ｉｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＮＰＩＡＳＹ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＮＰＩＡＳＹの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＮＰＩＡＳＹポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も指定の時間に収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からのｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＮＰＩＡＳＹのｍＲＮＡレベルを、ノーザンブロット、ＲＴＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるような、特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＮＰＩＡＳＹポリペプチドのレベルを、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法によって比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるような、特異的な抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０４８８】
他の実施形態では、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片は、ＮＰＩＡＳＹ活性を活性化または抑制する化合部についてスクリーニングするために使用される。この方法は、ｉ）ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）ＮＰＩＡＳＹ活性をモニターする段階を含む。ＮＰＩＡＳＹは、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体、およびｐ５３に結合する。したがって、ＮＰＩＡＳＹ活性は、試験物質を添加すると同時に、ＳＴＡＴ、アンドロゲン受容体、およびｐ５３での競合的結合アッセイによってモニターすることができる。本発明のこの態様では、ＮＰＩＡＳＹポリペプチドまたはその断片は溶液中で遊離であり、固体担体に固定化され、細胞表面上で組換えで発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。ＮＰＩＡＳＹポリペプチドと試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、ＢＩＡｃｏｒｅ(スウェーデン、ウプサラ)などの当業者によく知られている方法によって測定することができる。他の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：Ｗ０８４/０３５６４に記載のように、本発明のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。ＮＰＩＡＳＹの発現または活性を低減する試験物質は、ＮＰＩＡＳＹの阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ＮＰＩＡＳＹの発現または活性を増加させる試験物質は、活性化剤またはアゴニストとして定義される。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアンタゴニストは、最終分化した心筋細胞または組織、例えば横紋筋細胞の細胞再生などにおいて、細胞周期を通して進行を刺激、促進または助長するために使用される。例えば、これは、心外傷、心筋梗塞、心筋炎、心筋症、心臓手術の結果としての外傷等の後の損傷を受けた心筋層の回復、または筋ジストロフィーによって疲労した横紋筋の過多の回復を可能にし得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアゴニストは、限定されないが、癌などの過剰増殖性疾患（例えば、白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、前立腺癌）、冠動脈疾患、肺血管疾患、原発性アイゼンメンゲル症候群またはアイゼンメンゲル症候群の特徴としての閉塞性疾患、および異常細胞増殖の他の疾患などの病状を治療するのに有用である。ＮＰＩＡＳＹの発現または活性を調節する作用物質としては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および抗体が挙げられる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造され、使用される。
【０４８９】
更なる実施形態において、核酸によってコードされるポリペプチドの発現は、宿主細胞の細胞周期欠損を防ぐ、回復させる、または減らす、あるいは宿主細胞の正常細胞周期の進行を回復させると期待される。細胞に直接送達される核酸またはポリペプチドによって提供されるかどうかにかかわらず、本発明の治療製剤は、他の形式の治療法、限定されないが、化学療法および放射線療法などに、補助剤として使用することもできる。
【０４９０】
他の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質を用いて、例えば、不妊症の治療または診断および避妊のために、受精能を調節および／または特徴付けることができる。ＮＰＩＡＳＹは、精子形成に必須の遺伝子の活性化に必要とされるアンドロゲン受容体を不活性化する。したがって、ＮＰＩＡＳＹの過剰発現または活性化を利用して、アンドロゲン受容体の転写活性を抑制し、それによって受精能を阻害することができる。例えば、避妊のために、例えば、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、そのタンパク質自体を用いて、またはタンパク質の発現または活性の活性化剤を用いて、タンパク質のレベルを増加することによって、精子形成の遺伝子の発現を人工的に乱すことができる。代替方法として、不妊症に対しては、阻害剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、そのタンパク質のドミナントネガティブ型を用いて、タンパク質の発現または活性を抑制する異種化合物を用いて、そのタンパク質レベルを低減することができる。同様に、本発明のタンパク質の発現レベルを検出することによって、多くの患者における不妊症の原因を見つけることができる。タンパク質の活性または発現レベルが異常な場合には、不妊症の原因がＮＰＩＡＳＹの抑制に関わることが示されている。かかる診断は、例えば、本発明のタンパク質の発現または活性化を増加または低減することによって、不妊症を治療する方法にも向けられるだろう。
【０４９１】
本発明の他の実施形態は、当業者に知られているいずれかの方法によって、遺伝子導入モデル動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するために、本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドを用いた組成物および方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、癌などのヒトホルモン依存性疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、癌などのヒトホルモン依存性疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
配列番号：３４のタンパク質（内部指定番号１２５４０２  １０５−０７４−４−０−Ｆ３−Ｆ）
１２５４０２＿１０５−０７４−４−０−Ｆ３−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３３）は、アミノ酸配列：ＭＬＬＬＳＬＴＬＳＬＶＬＬＧＳＳＷＧＣＧＩＰＡＩＫＰＡＬＳＦＳＱＲＩＶＮＧＥＮＡＶＬＧＳＷＰＷＱＶＳＬＱＤＳＳＤＦＨＦＣＧＧＳＬＩＳＱＳＷＶＶＴＡＡＨＣＮＶＳＰＧＲＨＦＷＬＧＥＹＤＲＳＳＮＡＥＰＬＱＶＬＳＶＳＲＡＩＴＨＰＳＷＮＳＴＴＭＮＮＤＶＴＬＬＫＬＡＳＰＡＱＹＴＴＲＩＳＰＶＣＬＡＳＳＮＥＡＬＴＥＧＬＴＣＶＴＴＧＷＧＲＬＳＧＶＧＮＶＴＰＡＲＬＱＱＶＡＬＰＬＶＴＶＮＱＣＲＱＹＷＧＳＳＩＴＤＳＭＩＣＡＧＧＡＧＡＳＳＣＱＧＤＳＧＧＰＬＶＣＱＫＧＮＴＷＶＬＩＧＩＶＳＷＧＴＫＮＣＮＶＲＡＰＡＶＹＴＲＶＳＫＦＳＴＷＩＮＱＶＩＡＹＮを含む、配列番号：３４のタンパク質ｖＣＲＴＬ−１をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３４のポリペプチドのすべての特性および使用は、１２５４０２＿１０５−０７４−４−０−Ｆ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３３のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、１２５４０２＿１０５−０７４−４−０−Ｆ３−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：３３、配列番号：３４、および１２５４０２＿１０５−０７４−４−０−Ｆ３−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０４９２】
配列番号：３３のｃＤＮＡは、１６番染色体上、特に１６ｑ２２．１位に位置する遺伝子によってコードされるヒトキモトリプシン様プロテアーゼＣＴＲＬ-１の新規な多型変異体である。ｖＣＲＴＬ−１の２６４アミノ酸のタンパク質は、シグナルペプチド(ＭＬＬＬＳＬＴＬＳＬＶＬＬＧＳＳＷＧ)およびセリンプロテアーゼドメインを含有し、かつセリンプロテアーゼファミリーに属する。プロテアーゼは、広範囲の生物学的経路のキー成分であり、それらの触媒機構に従って４つのグループ：セリン、システイン（チオール）、アスパラギン酸（カルボキシル）、および金属プロテアーゼに分類することができる。キモトリプシンは、特定のペプチド結合の加水分解を触媒するために、それらの基質結合部位において活性セリン残基を利用することから、そう呼ばれるセリンプロテアーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバーである。膵臓由来のプロテアーゼのサブファミリーは、トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、およびエラスターゼを含む。キモトリプシンは膵臓由来プロテアーゼの中で最も豊富であり、膵外分泌により合成される全タンパク質の１０〜２０％に相当し得る。ｖＣＲＴＬ−１は、活性プロテアーゼを形成するために切断しなければならない不活性な酵素前駆体として膵臓腺房細胞によって発現かつ合成される消化酵素である。ｖＣＲＴＬ−１は、キモトリプシン−およびエラスターゼ２様活性を表し、ＰＩ位置にチロシン、フェニルアラニン、またはロイシン残基、好ましくはＰ２位置にプロリンを有する基質のアミド結合を加水分解する。ｖＣＲＴＬ−１の分泌は、膵液または腸液中に（特定の十二指腸液中に）、プロテアーゼ阻害剤が存在することによって誘導され得る。
【０４９３】
本発明の実施形態は、配列番号：３４のｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０４９４】
本発明の更なる実施形態は、タンパク質基質に結合する生物活性またはセリンプロテアーゼ活性を有するｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０４９５】
本発明の更なる実施形態は、ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドをコードする配列番号：３３のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４９６】
本発明の更なる実施形態は、タンパク質基質に結合する生物活性またはセリンプロテアーゼ活性を有するｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０４９７】
本発明の更なる実施形態は、配列番号：３４のｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド配列に対して作られる抗体、またはタンパク質基質に結合する生物活性もしくはセリンプロテアーゼ活性を有するｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド断片を含む組成物に関する。その抗体は、特異的にｖＣＲＴＬ−１に結合するが、ＣＴＲＬ−１には結合しないことが好ましい。その抗体はアミノ酸配列：ＳＬＱＤＳＳＤＦＨＦを認識することがさらに好ましい。
【０４９８】
本発明のその他の好ましい実施形態は、ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドをｖＣＲＴＬ−１特異的抗体またはそのｖＣＲＴＬ−１結合断片と結合させる方法である。この方法は、ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドを、ｖＣＲＴＬ−１結合抗体またはそのｖＣＲＴＬ−１結合断片と、結合が生じる条件下にて接触させる段階を含む。この方法は、ｖＣＲＴＬ−１の検出および精製に適用することができる。これらの態様は、本明細書で詳細に記述される。    
【０４９９】
他の実施形態は、ｉ）ｖＣＲＴＬ−１をコードするポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクトする段階と、ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階とを含む、組換えｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドを作製する方法に関する。その宿主細胞は、それによってこの特定のタンパク質をコードする核酸配列が発現される条件下にて培養される。産物が蓄積するのに適切な長さの時間後、タンパク質は、宿主細胞またはその細胞を取り囲む培地から精製される。ｖＣＲＴＬ−１をコードする核酸配列を組み込む発現ベクターの宿主細胞への導入は、限定されないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、電気穿孔法、およびリポフェクションなどの様々な方法で実施することができる。この実施形態においても、哺乳動物を用いて、乳中でｖＣＲＴＬ−１を産生し、それによって、精製後にかなりの量のこの特定のタンパク質を作製することができる。十分な乳を生産する任意の種類の動物、例えば限定されないが、ヒツジ、ヤギ、および雌ウシなどをこの目的に使用することができる。これらの動物は、乳におけるｖＣＲＴＬ−１の過剰発現を標的化するいずれかの方法で作製することができる。本発明のタンパク質は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６８，４８７号に開示の方法を含む、当業者によく知られているいずれかの技術を用いて精製することができる。好ましくは、ｖＣＲＴＬ−１またはその断片に対して作られる抗体または抗原結合断片をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。さらに好ましくは、その抗体はｖＣＲＴＬ−１に特異的に結合するが、ＣＴＲＬ-１には特異的に結合しない。
【０５００】
本発明の好ましい実施形態は、基質タンパク質をタンパク分解で切断するために、ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドまたはその生物活性断片を使用する方法である。この方法は、ｖＣＲＴＬ−１プロテアーゼ活性を可能にする条件下にて、ｖＣＲＴＬ−１をタンパク質基質と接触させる段階を含む。この方法は、生化学的用途ならびに慢性および急性膵炎および嚢胞性線維症などのｖＣＲＴＬ−１関連疾患の予防および治療を含む、タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ用途のどちらにも向けられている。
【０５０１】
その他の実施形態では、本発明は、生体試料中の広範囲のタンパク質を消化するために、ｖＣＲＴＬ−１タンパク分解活性を有効に誘導する方法を提供することである。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで行うことができ、ｖＣＲＴＬ−１タンパク分解活性を可能にする条件下にて、有効量のｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドまたはその生物活性断片を生体試料と接触させる段階を含む。例えば、かかる方法は、ＤＮＡ作製においてタンパク質を除去するために、またはいずれかの酵素反応後に酵素を除去するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用いることができる。かかる組成物は、単独で、または他のプロテアーゼとの「カクテル」として使用することができる。かかるプロテアーゼのカクテルは、行われるアッセイを妨げると考えられるタンパク質を分解するために、アッセイにおいて広く用いられている。
【０５０２】
他の実施形態において、ｖＣＲＴＬ−１またはその断片は、その開示内容全体が参照により組み込まれる米国特許第５，５９９，４００号に記載のプロテアーゼの使用と同様に、タンパク質成分を有する染色を除去するために、洗浄剤と組み合わせて使用することができる。その組成物は、界面活性剤、起泡剤（foam enhancer）および充填剤などの公知の洗浄剤成分を含有し得る。ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドは、洗浄剤組成物中に含まれるか、または添加剤としての使用時に他の成分と組み合わせることができる。その洗浄剤添加剤は、液状、粉末状、顆粒状またはスラリー状で配合することができる。
【０５０３】
本発明の更なる実施形態は、ｖＣＲＴＬ−１の発現の発現を増加または低減する物質、およびｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ｖＣＲＴＬ−１の発現レベルを定量化かつ検出する段階；ｉｉｉ）暴露細胞におけるｖＣＲＴＬ−１の発現を、非暴露対照細胞における発現と比較する段階；を含む、かかる物質についてスクリーニングする方法に関する。ｖＣＲＴＬ−１の発現は、当技術分野で一般的な、いずれかの特異的ヌクレオチドまたはタンパク質検出技術（例えば、ノーザンブロット法またはウエスタンブロット法）によって決定することが可能である。ｖＣＲＴＬ−１の発現は、膵臓細胞において研究されることが好ましい。ｖＣＲＴＬ−１の発現レベルは、例えばアンチセンス分子を用いて、生体試料中で減少させることができる。
【０５０４】
本発明の更なる実施形態は、ｖＣＲＴＬ−１の活性を増加または減少させる物質と、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ｖＣＲＴＬ−１活性を検出する段階；ｉｉｉ）暴露細胞におけるｖＣＲＴＬ−１タンパク分解活性を、非暴露対照細胞における活性と比較する段階；を含む、かかる物質についてスクリーニングする方法と、に関する。ｖＣＲＴＬ−１の発現は、膵臓細胞において研究されることが好ましい。ｖＣＲＴＬ−１の活性は、直接的もしくは間接的に阻害剤分子またはアンタゴニスト抗体を用いて、抑制することができる。
【０５０５】
ｖＣＲＴＬ−１の活性化剤またはアゴニストは、ｖＣＲＴＬ−１の活性または発現を増加させる物質である。ｖＣＲＴＬ−１の阻害剤またはアンタゴニストは、活性または発現を低減する物質である。
【０５０６】
本発明は、動物の１種または複数種の組織、好ましくは脾臓における本発明のタンパク質の発現または活性を調節することによって作製される動物モデルもまた提供する。かかる動物は、急性もしくは慢性膵炎などのｖＣＲＴＬ−１の活性に特異的に関連する疾患の様々な病態生理学的側面の治療に潜在的に有用な候補分子を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ法を表すことから、多くの目的に有用である。かかるモデルの表現型の研究によって、ｖＣＲＴＬ−１の欠乏により引き起こされるまたはｖＣＲＴＬ−１の欠乏と関連する、その他の同等のヒト疾患を同定することも可能となる。ｖＣＲＴＬ−１の過剰発現または不活性化を標的化する、いずれかの方法で、これらの動物を作製することができる。かかるモデルは、例えば、かかる疾患および病状の治療に用いられる候補治療法および薬物の評価に非常に有用である。
【０５０７】
その他の実施形態において、本発明は、異常なｖＣＲＴＬ活性に関連する疾患または障害を診断するために用いられる。特に、結果としてｖＣＲＴＬ−１活性の著しい減少が起こる、膵外分泌機能不全を有する患者の診断に有用である。かかる疾患および障害の例としては、限定されないが、慢性または急性膵炎および嚢胞性線維症が挙げられる。さらに、ｖＣＲＴＬは、転移性腫瘍活性、特に膵臓腫瘍活性と関連する。したがって、ｖＣＲＴＬレベルが通常より高いと、転移活性を示し得る。この方法は、ｉ）ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに選択的に結合できる化合物と、体液または組織試料を接触させる段階と、ｉｉ）試料中のｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを検出する段階と、を含む。好ましくは、対照試料に対するその試料におけるレベルまたは他の特性の差異によって、障害の存在または障害を発症する性質が示される。好ましくは、分析される試料としては、限定されないが、腸液および特に十二指腸液、膵臓組織のホモジネート、尿および血漿が挙げられる。体液または組織試料は、疾患を有する疑いのある、または疾患を発症するリスクがある個体から採取されることがさらに好ましい。例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合活性断片または核酸プローブが用いられる。好ましくは、この実施形態で使用される抗体は、変異ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドに対して特異的に作られ、ＣＲＴＬ−１ポリペプチドを認識しない。検出は、公知の免疫組織学的および免疫蛍光プロセスを用いて、直接または間接的に行うことができる。ｖＣＲＴＬ−１結合性分子は、限定されないが、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Texas-Red）などの蛍光染料など、一般的に公知の化合物で直接標識することができる。しかしながら、標識は、二次試薬を使用することによって間接的に行うこともできる。この実施形態においても、公知のＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、特に「リアルタイム」ＰＣＲシステムで変異ＣＲＴＬ−１を同定することにより、診断が容易となる。代替方法としては、かかる方法を用いて、本発明は、ＣＲＴＬ−１の発現における調節（modulation）を特定の病状と関係付けるツールを提供する。本発明は、かかる病状の新規な候補遺伝子を提供する。
更なる実施形態では、本発明は、生体試料中のｖＣＲＴＬ−１の量を定量化するのに有用な試験キットを包含する。ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドのレベルは、臨床的に確認されている膵臓疾患の重症度の評価に有用であり、急性膵炎の動物モデルにおける病態生理および可能な治療法を調べるのに有用なマーカーでもある。さらに、ｖＣＲＴＬ−１レベルは、好ましくは膵臓癌のケースにおける、腫瘍の侵襲性および拡散転移能力の推定に有用である可能性がある。この実施形態では、これらのまたは他の病状を治療するために施される治療経過をモニターするため、かかるアッセイを適用することができる。さらに、例えば組織分解への影響を評価するための新規な薬物の臨床試験中に、毒性の測定法として、そのアッセイを用いることができる。このように、ｖＣＲＴＬ−１が、病状、治療の指標、または対象に直接投与された物質の効果の指標として使用されるいずれかの状況において、このアッセイを適用することができる。したがって、患者の病状を連続的にモニターし、病理試料におけるｖＣＲＴＬ−１の定量化された量を、健康な個体の生体試料中で定量された量または同じ患者の前の分析と比較することができる。この実施形態では、イムノアッセイを含むいずれかの適切な方法によって、腸液、特に十二指腸液、膵臓組織のホモジネート、尿および血漿中で、このマーカーを有効に測定することができる。そのキットは、少なくとも１つの免疫学的結合パートナー（例えば、ｖＣＲＴＬ−１に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体）および任意に、検出可能な二次マーカーを備える。好ましくは、キットで使用される抗体またはその抗原結合断片は、変異ｖＣＲＴＬ−１ポリペプチドに対して特異的に作られ、ＣＴＲＬ−１ポリペプチドにはそうではない。
【０５０８】
本発明の更なる実施形態は、ｖＣＲＴＬ−１の不十分な分泌と関連する疾患を発症するリスクがある、または疾患を有する個体を治療するのに有用である、新規な方法および組成物を提供することである。これらの方法および組成物は、慢性または急性膵炎および嚢胞性線維症など、脂肪便によって特徴付けられる膵外分泌機能不全の治療に有用である。この方法は、上記の病状の１つを有する、またはリスクのある個体に、有効量のｖＣＲＴＬ−１ポリペプチド、その生物活性断片、またはアゴニストを投与する段階を含む。ｖＣＲＴＬ−１またはアゴニスト組成物は、生理食塩水溶液または他の生理学的なバッファーなどの生理学的に許容される担体と組み合わせて送達されることが好ましい。いずれかの特定の病状に対して個体に投与されるであろう本発明の組成物の特定量は、患者の臨床症状、および体重、年齢、および送達経路などの他の因子によって異なるだろう。かかる組成物は、限定されないが、経口、エアロゾル、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下経路などの適切な経路によって投与される。これらの組成物は、本発明のタンパク質、および任意に、１種または複数種の他の種類のプロテアーゼ、または対象の他のいずれかの化合物を含有し得る。この同時投与は、同時に投与することによる、または別々に投与もしくは逐次投与することによるものである。これらの更なる成分のすべては、天然源から得られるか、または組換え遺伝子操作技術および／または化学修飾によって生成することができる。
【０５０９】
本発明の更なる実施形態は、正常レベルよりも高いレベルのｖＣＲＴＬ−１と関連する疾患を発症するリスクがある、またはその疾患を有する個体を治療するのに有用である、新規な方法および組成物を提供することである。この方法は、転移性細胞増殖、特に膵臓癌の治療に有用である。この方法は、転移性細胞増殖を有する、または発症するリスクがある個体に、有効量のｖＣＲＴＬ−１アンタゴニストを投与する段階を含む。ｖＣＲＴＬ−１アンタゴニスト組成物は、生理食塩水溶液または他の生理学的なバッファーなどの生理学的に許容される担体と組み合わせて送達されることが好ましい。いずれかの特定の病状に対して個体に投与されるであろう本発明の組成物の特定量は、患者の臨床症状、および体重、年齢、および送達経路などの他の因子によって異なるだろう。かかる組成物は、限定されないが、経口、エアロゾル、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下経路などの適切な経路によって投与される。
配列番号：３６のタンパク質（内部指定クローン１０７６４０  １０５−０３６−２−０−Ｈ３−Ｆ）
クローン１０７６４０  １０５−０３６−２−０−Ｈ３−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３５）は、アミノ酸配列：ＭＩＰＴＦＴＡＬＬＣＬＧＬＳＬＧＰＲＴＨＭＱＡＧＰＬＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＳＷＧＮＳＶＴＩＷＣＱＧＴＬＥＡＲＥＹＲＬＤＫＥＥＳＰＡＰＷＤＲＱＮＰＬＥＰＫＮＫＡＲＦＳＩＰＳＭＴＥＤＹＡＧＲＹＲＣＹＹＲＳＰＶＧＷＳＱＰＳＤＰＬＥＬＶＭＴＧＡＹＳＫＰＴＬＳＡＬＰＳＰＬＶＴＳＥＫＳＶＴＬＬＣＱＳＲＳＰＭＤＴＦＬＬＩＫＥＲＡＡＨＰＬＬＨＬＲＳＥＨＧＡＱＱＨＱＡＥＦＰＭＳＰＶＴＳＶＨＧＧＴＹＲＣＦＳＳＨＧＦＳＨＹＬＬＳＨＰＳＤＰＬＥＬＩＶＳＧＳＬＥＤＰＲＰＳＰＴＲＳＶＳＴＡＡＧＰＥＤＱＰＬＭＰＴＧＳＶＰＨＳＧＬＲＲＨＷＥＶＬＩＧＶＬＷＳＩＬＬＬＳＬＬＬＦＬＬＬＱＨＷＲＱＧＫＨＲＴＬＡＱＲＱＡＤＦＱＲＰＰＧＡＡＥＰＥＰＫＤＧＧＬＱＲＲＳＳＰＡＡＤＶＱＧＥＮＦＣＡＡＶＫＤＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＫＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＦＴＬＲＱＫＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＡＳＰＡＥＰＳＶＹＡＴＬＡＩＨを含む、配列番号：３６の４４７アミノ酸のＬＩＲＩＯＮタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３６のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１０７６４０  １０５−０３６−２−０−Ｈ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３５のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１０７６４０  １０５−０３６−２−０−Ｈ３−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０５１０】
ＬＩＲＩＯＮ、配列番号：３６のタンパク質は、ペプチドシグナル配列（ＭＩＰＴＦＴＡＬＬＣＬＧＬＳＬＧＰＲＴＨＭＱＡ）および２つのＣ２型免疫グロブリン様ドメイン、続いて膜貫通領域（ＶＬＩＧＶＬＷＳＩＬＬＬＳＬＬＬＦＬＬＬ）を含む２５９アミノ酸長さの細胞外ドメイン、および３つの免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）(ＩＴＩＭ）を含有する１６７アミノ酸長さの細胞内ドメインを始めとする、ＩＬＴ-３受容体前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８２９７９）の新規な変異型である。
【０５１１】
免疫系細胞活性は、細胞表面相互作用および関連するシグナル伝達プロセスの複雑なネットワークによって制御される。受容体が結合すると、活性化シグナルおよび抑制シグナルとの間のバランスによって、細胞活性が調節される。正のシグナル伝達を仲介する多くの受容体は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）として知られるチロシンリン酸化部位を含有する細胞質側末端（cytoplasmic tail）を有する。抑制経路は、タンパク質チロシンホスファターゼに結合部位を提供する、ＩＴＩＭを有する受容体を要する。
【０５１２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性は、細胞機能を惹起する正のシグナルと細胞活性を防ぐ抑制シグナルとの間のバランスによって調節される。正常細胞は、ＮＫ細胞上の抑制性受容体により認識される、ＭＨＣクラスＩタンパク質の細胞表面発現によってＮＫ細胞から保護される。キラー細胞抑制性受容体（Killer Inhibitory Receptor）(ＫＩＲ）として知られるこれらの受容体は、会合と同時に細胞に負のシグナルを送り、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性をダウンレギュレートする。ＭＨＣクラスＩの発現は、ウイルス感染した細胞において、および腫瘍細胞においてダウンレギュレートされる場合が多く、それによって、これらの細胞はＮＫ細胞の攻撃を受けやすくなる。ＫＩＲは、２つのＩＴＩＭを有する免疫グロブリンスーパーファミリー受容体である。これらのリン酸化されたＩＴＩＭは、シグナル伝達経路において分子を脱リン酸化し、かつ細胞の活性化を防ぐ、チロシンホスファターゼを補充する。
【０５１３】
本発明のタンパク質であるＬＩＲＩＯＮは、免疫グロブリン様転写物(ＩＬＴ)抑制性受容体である。この種類の受容体は、ＫＩＲと密接に関連し、同じ様式で機能する。ＬＩＲＩＯＮは、骨髄性抗原提示細胞(ＡＰＣ）、つまり樹状細胞、単球およびマクロファージ上で選択的に発現され、刺激性受容体によって引き起こされるＡＰＣの機能応答を負に制御する。その抑制機能の他に、ＬＩＲＩＯＮは、抗原取り込みおよびプロセシングに関与する。
【０５１４】
以下に記載の方法において使用するのに好ましいＬＩＲＩＯＮポリペプチドとしては、以下のアミノ配列：ＧＰＬＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＳＷＧＮＳＶＴＩＷＣＱＧＴＬＥＡＲＥＹＲＬＤＫＥＥＳＰＡＰＷＤＲＱＮＰＬＥＰＫＮＫＡＲＦＳＩＰＳＭＴＥＤＹＡＧＲＹＲＣＹＹＲＳＰＶＧＷＳＱＰＳＤＰＬＥＬＶＭＴＧＡＹＳＫＰＴＬＳＡＬＰＳＰＬＶＴＳＥＫＳＶＴＬＬＣＱＳＲＳＰＭＤＴＦＬＬＩＫＥＲＡＡＨＰＬＬＨＬＲＳＥＨＧＡＱＱＨＱＡＥＦＰＭＳＰＶＴＳＶＨＧＧＴＹＲＣＦＳＳＨＧＦＳＨＹＬＬＳＨＰＳＤＰＬＥＬＩＶＳＧＳＬＥＤＰＲＰＳＰＴＲＳＶＳＴＡＡＧＰＥＤＱＰＬＭＰＴＧＳＶＰＨＳＧＬＲＲＨＷＥＶＬＩＧＶＬＶＶＳＩＬＬＬＳＬＬＬＦＬＬＬＱＨＷＲＱＧＫＨＲＴＬＡＱＲＱＡＤＦＱＲＰＰＧＡＡＥＰＥＰＫＤＧＧＬＱＲＲＳＳＰＡＡＤＶＱＧＥＮＦＣＡＡＶＫＤＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＫＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＦＴＬＲＱＫＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＡＳＰＡＥＰＳＶＹＡＴＬＡＩＨを含むポリペプチド；
以下のアミノ酸配列：ＧＰＬＰＫＰＴＬＷＡＥＰＧＳＶＩＳＷＧＮＳＶＴＩＷＣＱＧＴＬＥＡＲＥＹＲＬＤＫＥＥＳＰＡＰＷＤＲＱＮＰＬＥＰＫＮＫＡＲＦＳＩＰＳＭＴＥＤＹＡＧＲＹＲＣＹＹＲＳＰＶＧＷＳＱＰＳＤＰＬＥＬＶＭＴＧＡＹＳＫＰＴＬＳＡＬＰＳＰＬＶＴＳＥＫＳＶＴＬＬＣＱＳＲＳＰＭＤＴＦＬＬＩＫＥＲＡＡＨＰＬＬＨＬＲＳＥＨＧＡＱＱＨＱＡＥＦＰＭＳＰＶＴＳＶＨＧＧＴＹＲＣＦＳＳＨＧＦＳＨＹＬＬＳＨＰＳＤＰＬＥＬＩＶＳＧＳＬＥＤＰＲＰＳＰＴＲＳＶＳＴＡＡＧＰＥＤＱＰＬＭＰＴＧＳＶＰＨＳＧＬＲＲＨＷＥを含むポリペプチド；
以下のアミノ酸配列：ＱＨＷＲＱＧＫＨＲＴＬＡＱＲＱＡＤＦＱＲＰＰＧＡＡＥＰＥＰＫＤＧＧＬＱＲＲＳＳＰＡＡＤＶＱＧＥＮＦＣＡＡＶＫＤＴＱＰＥＤＧＶＥＭＤＴＲＳＰＨＤＥＤＰＱＡＶＴＹＡＫＶＫＨＳＲＰＲＲＥＭＡＳＰＰＳＰＬＳＧＥＦＬＤＴＫＤＲＱＡＥＥＤＲＱＭＤＴＥＡＡＡＳＥＡＰＱＤＶＴＹＡＱＬＨＳＦＴＬＲＱＫＡＴＥＰＰＰＳＱＥＧＡＳＰＡＥＰＳＶＹＡＴＬＡＩＨを含むポリペプチド；が含まれる。
【０５１５】
本発明の実施形態は、配列番号：３６のＬＩＲＩＯＮポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０５１６】
本発明の更なる実施形態は、ＳＨＰ-１、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ Ｉ様分子（ＣＤＩ、ＭＲＩ、ＭＩＣなど）、ＭＨＣＩＩ、および補体成分（Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３，Ｃ４、Ｃ５、および因子Ｂ）と相互作用する生物活性を有するＬＩＲＩＯＮポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０５１７】
本発明の更なる実施形態は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドをコードする配列番号：３５のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５１８】
本発明の更なる実施形態は、ＳＨＰ-１、ＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ Ｉ様分子（ＣＤＩ、ＭＲＩ、ＭＩＣなど）、ＭＨＣＩＩ、および補体成分（Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、および因子Ｂ）と相互作用する生物活性を有するＬＩＲＩＯＮポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５１９】
本発明の更なる実施形態は、ＬＩＲＩＯＮ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験される物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＬＩＲＩＯＮ発現を、未処置の対照細胞中の発現と比較する段階；を含む方法に関する。
【０５２０】
好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。さらに、ＬＩＲＩＯＮ結合抗体断片が包含される。ＬＩＲＩＯＮ特異的抗体またはそのＬＩＲＩＯＮ結合断片はＬＩＲＩＯＮには結合するが、ＩＬＴ３には結合しないことが好ましい。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、異種抗体、および検出可能に標識された抗体および抗原結合断片が本発明に包含される。かかる抗体およびその断片を作製する方法は、当技術分野で一般的であり、かつ本明細書に包含される。
【０５２１】
本発明のその他の好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮ特異的抗体またはそのＬＩＲＩＯＮ結合断片とＬＩＲＩＯＮポリペプチドを結合させる方法である。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ＬＩＲＩＯＮ結合抗体またはそのＬＩＲＩＯＮ結合断片とＬＩＲＩＯＮポリペプチドを接触させる段階を含む。この方法は、ＬＩＲＩＯＮの検出および精製、ならびにＬＩＲＩＯＮを発現する細胞の標的化に適用することができる。これらの態様は、本明細書で詳細に説明される。
【０５２２】
一実施形態において、１３７、２２３、および３３５位に相当する配列番号：３５のヌクレオチド位４４７、７０５および１０４０におけるＧからＡへの置換、ＧからＡおよびＡからＧへの置換を有し、その結果として、グリシン残基がグルタミン酸によって１３７位で置換され、グリシンがアスパラギン酸によって２２３位で置換され、アスパラギン残基がアスパラギン酸によって３３５位で置換される、配列番号：３６をコードする配列をＤＮＡゲノタイピングに用いることができる。この遺伝子座のゲノタイピングは、例えば親子鑑定または法医学分析に用いられるＤＮＡフィンガープリント法において対象となり得る。それはまた、特に、Ｂ細胞自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎）および抗原提示障害（bare lymphocyte syndrome）に関連する病状の遺伝的関連研究に用いることができる。
【０５２３】
その他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド配列は、患者の病状もしくは疾患の治療のための、理想的な薬物（例えば、ＬＩＲＩＯＮのアゴニストまたはアンタゴニスト）の選択または薬物用量の選択を助けるために、薬理ゲノミクス用途に使用することができる。例えば、一実施形態において、本発明は、患者をゲノタイピングして、ＬＩＲＩＯＮの１３７位、２２３位および３３５位のアミノ酸をコードするヌクレオチドの同一性を決定し、１３７位、２２３位および３３５位それぞれにグルタミン酸、アスパラギン酸およびアスパラギン酸残基を有するものにおいて優先的に有効であることが証明されている(例えば、これらの位置にグルタミン酸、アスパラギン酸およびアスパラギン酸を有するタンパク質のアイソフォームに、その薬物が優先的に結合することから）、薬物または投薬量の薬物を患者に投与する方法を提供する。その他の実施形態において、例えば、１３７位、２２３位および３３５位それぞれにグルタミン酸、アスパラギン酸およびアスパラギン酸を有する個体にその薬物の投与した場合に伴う副作用が知られていることから、アミノ酸の１３７位、２２３位および３３５位をコードするヌクレオチドに対して患者は遺伝子型を判定され、薬物は投与されない。
【０５２４】
本発明の好ましい態様は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＬＩＲＩＯＮ発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＬＩＲＩＯＮの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＬＩＲＩＯＮ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＬＩＲＩＯＮコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。
【０５２５】
他の実施形態は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドを作製する方法に関する。本発明のタンパク質は、ＬＩＲＩＯＮをコードする核酸配列を含む適切な発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞において作製することができる。かかる発現ベクターの宿主への導入は、限定されないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、電気穿孔法、およびリポフェクションなどの様々な方法で実施することができる。多種多様な発現系のいずれかを用いて、組換えタンパク質を提供することができる。適切な発現媒体には、限定されないが、プラスミド、ウイルス粒子または昆虫細胞のバキュロウイルスが含まれる。発現媒体は宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。任意に、誘導性発現ベクターを用いて、宿主細胞中の厳密に制御された遺伝子の発現を達成することができる。組換えタンパク質を宿主細胞から回収し、当業者によく知られているいずれかの技術によって精製することができる。好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。代替方法としては、固相技術を用いて、ＬＩＲＩＯＮまたはその断片を化学的に合成することができる。
【０５２６】
他の実施形態において、本発明のタンパク質を用いて、生体試料またはｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた細胞から骨髄性ＡＰＣを精製することができる。かかる実施形態において、本発明のタンパク質対して作られるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、その細胞を免疫精製することができる。細胞を免疫精製するために用いられる方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、セファロースカラムに固定化するか、または固体担体に結合させることができる。代替方法としては、抗体を蛍光標識し、ＦＡＣＳによって細胞を精製する。
【０５２７】
他の実施形態では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを検出するための組成物および方法を提供する。ＬＩＲＩＯＮのｍＲＮＡレベルの定量化は、タンパク質の異常発現と関連する疾患または病状の診断に、または本明細書で述べたように治療的介入中にＬＩＲＩＯＮの調節をモニターするのに有用である。ｍＲＮＡの検出および定量化のアッセイは当技術分野でよく知られている。好ましい方法は、生体試料からＲＮＡを単離する段階と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＬＩＲＩＯＮのｍＲＮＡレベルを測定する段階と、対象試料における発現を対照試料における発現と比較する段階と、を含む。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅によるＬＩＲＩＯＮ  ｍＲＮＡの検出に使用されるポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、当技術分野でよく知られている方法によって、配列番号：３５のポリヌクレオチドから設計することができる。
【０５２８】
他の実施形態では、本発明は、ＬＩＲＩＯＮを検出し、生体試料中のその発現レベルを定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、変化したまたは異常なＬＩＲＩＯＮ発現によって特徴付けられる病状、例えば自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、およびウイルスにより誘導される自己免疫）、代謝性疾患（例えば、肥満症、高コレステロール血症、インスリン関連疾患）、および神経疾患（例えば、精神分裂病）などの診断に有用である。ＬＩＲＩＯＮタンパク質の発現を定量化する方法は、ＬＩＲＩＯＮ特異的抗体またはそのＬＩＲＩＯＮ特異的断片を、抗体−抗原を結合を生じさせる条件下にて生体試料と接触させる段階を含む。その抗体または断片は、検出可能に標識されることが好ましい。好ましい標識としては、蛍光標識（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ、およびローダミン）および二次標識（例えば、ビオチンおよび酵素基質）が挙げられる。好ましい方法は、ＬＩＲＩＯＮに特異的に結合する抗体を、哺乳動物対象からの生体試料と接触させる段階と、健康な対象の対照レベルと比較して、対象試料におけるＬＩＲＩＯＮレベルを決定する段階とを含み、対象試料におけるＬＩＲＩＯＮのレベルが異常な場合には、対象が疾患を有すること、または疾患を発症するリスクが高いことが示される。使用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが可能であり、当技術分野でよく知られている方法によって、例えばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって、免疫複合体を定量化するために、直接または間接的に標識することができる。ＬＩＲＩＯＮに対して作られる好ましい特異的抗体は、上記のポリペプチド断片を用いて作製される。本発明のタンパク質を検出する診断アッセイは、器官または組織切片由来の細胞の、生検の生体試料またはｉｎ ｓｉｔｕアッセイに依拠する。好ましい生体試料には、器官、組織、または血液からの全細胞および細胞抽出物が含まれる。
【０５２９】
本発明の実施形態は、ＬＩＲＩＯＮ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）ＬＩＲＩＯＮの発現を検出する段階；ｉｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＬＩＲＩＯＮ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＬＩＲＩＯＮの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＬＩＲＩＯＮポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＬＩＲＩＯＮ  ｍＲＮＡのレベルを検出する段階；を含む。ＬＩＲＩＯＮ ｍＲＮＡは、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって検出することができる。本発明は、本明細書に記載されるような、特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ)各試料におけるＬＩＲＩＯＮポリペプチドのレベルを検出する段階；を含む。酵素免疫測定法 (ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、または当技術分野で一般的な他の方法によって、ＬＩＲＩＯＮを検出することができる。本発明は、本明細書に述べるような、特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０５３０】
本発明の好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドに結合する試験物質についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、試験物質をＬＩＲＩＯＮポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；ｉｉ）当技術分野で一般的な方法（例えば、免疫共沈降およびウエスタンブロット法などの競合的な抗体に基づく方法）によって、試験物質の結合を検出する段階；を含む。この方法には、抗体、抗体断片、細胞型特異的リガンドまたはその一部と結合する試験物質が含まれる。ＬＩＲＩＯＮに特異的に結合する物質を用いて、タンパク質を検出および精製、ならびにその活性を抑制または活性化することができる。
【０５３１】
本発明の更なる好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮ活性のアゴニストについて、ＬＩＲＩＯＮに結合する試験物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験する物質を細胞と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＬＩＲＩＯＮ生物活性を、非暴露対照細胞における生物活性と比較する段階；を含む方法を提供する。ＬＩＲＩＯＮ生物活性の測定値は、活性化受容体との会合（co-engagement)に続いてシグナル伝達をモニターすることによって間接的に評価することが可能である。ＬＩＲＩＯＮ活性化を測定するためのアッセイの一例は、単球をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する段階と、その細胞を試験物質、抗ＬＩＲＩＯＮ抗体および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体と接触させる段階と、架橋結合抗体を添加する段階と、その細胞を収集する段階と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって細胞抽出物を分離する段階と、特異的な抗ホスホチロシン抗体を用いて、タンパク質のチロシンリン酸化を検出する段階を含む。対照試料と比較して、試験試料中のチロシンタンパク質リン酸化の減少は、ＬＩＲＩＯＮに対する試験物質の活性化効果を示している。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるCella et al. (1997, Journal of Experimental Medicine ; Vol. 185, pp 1743-1751）に記載のように、受容体の連結（coligation）と同時に誘導される細胞内Ｃａ＋＋動員を測定することによって、ＬＩＲＩＯＮの活性化も評価することができる。
【０５３２】
本発明の更なる好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮ活性のアンタゴニストについて、ＬＩＲＩＯＮに結合する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＬＩＲＩＯＮ生物活性を、非暴露対照細胞における生物活性と比較する段階；を含む。ＬＩＲＩＯＮ生物活性の検出は、上述のＬＩＲＩＯＮ刺激に続く、タンパク質の脱リン酸化を測定することによって検出される。この場合には、対照試料と比較して、試験試料におけるタンパク質リン酸化の増加が、ＬＩＲＩＯＮ活性に対する試験物質の抑制効果を表す。
【０５３３】
ＬＩＲＩＯＮの発現または活性を増加する物質（アゴニストまたは活性化剤）を用いて、ＡＰＣ活性を低減するか、または骨髄性癌を治療することができる。ＬＩＲＩＯＮの発現または活性を減少させる物質（アンタゴニストまたは阻害剤）を用いて、感染症を治療または予防することができる。
【０５３４】
本発明の他の実施形態は、病原体感染症などの抑制された免疫機能と関連する疾患を治療または予防する方法にも関する。この方法は、ＬＩＲＩＯＮアンタゴニストを細胞に導入する段階を含む。好ましい細胞は、ＡＰＣなど、ＬＩＲＩＯＮを発現する細胞である。
【０５３５】
本発明の好ましい実施形態は、ＬＩＲＩＯＮアゴニストまたはＬＩＲＩＯＮをコードするポリペプチドを細胞に投与することによって、ＬＩＲＩＯＮの発現または活性を増加させる方法を包含する。これらの方法は、ＬＩＲＩＯＮ関連疾患、例えば自己免疫（例えば、変形性関節症、クローン病、グレーヴス病、自己免疫性甲状腺炎、エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、喘息、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、およびウイルス誘導自己免疫）、代謝性疾患（例えば、肥満症、高コレステロール血症、インスリン関連疾患）、および神経疾患（例えば、精神分裂病）ならびに骨髄性癌などに適用される。かかる一方法は、細胞をＬＩＲＩＯＮアゴニストと接触させる段階を含む。好ましいアゴニストには、異種プロモーター配列など、ＬＩＲＩＯＮ発現に影響を及ぼすアゴニストが含まれる。その他の方法は、ＬＩＲＩＯＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する段階を含む。この方法の一例は、ｉ）個体のＡＰＣ細胞の試料を除去する段階；ｉｉ）ＬＩＲＩＯＮポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列をこれらの細胞にｅｘ ｖｉｖｏで導入する段階；ｉｉｉ）その組換え細胞を個体に再注入する段階；を含む。ＡＰＣには、単球、マクロファージおよび樹状細胞が含まれる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、またはワクシニアウイルスに由来する発現ベクターが、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を標的細胞集団に送達するために用いられる。細胞または組織にベクターを導入する多くの方法を利用することが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に同等に適している。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達は、当技術分野でよく知られている方法を用いて達成される。ＬＩＲＩＯＮアゴニスト、アンタゴニスト、またはオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物は、単独で、または無菌生体適合性担体中で投与することができる、少なくとも１種類の他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わせて、投与することができる。それらは、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、鼻腔内、経腸または経直腸手段を含む多くの経路によって投与することができる。その組成物は、単独で、または他の薬剤または薬物と組み合わせて、対象に投与される。
【０５３６】
本発明の更なる目的は、ＬＩＲＩＯＮを発現する細胞を、ＬＩＲＩＯＮ抗体に連結された分子と接触させる段階を含む、対象の分子を細胞中に送達するための組成物および方法を提供することである。これらの方法はｉｎ ｖｉｖｏで適用されることが好ましい。好ましい方法は、ＬＩＲＩＯＮの細胞外部分に特異的に結合する化合物と、対象の分子を連結する段階；ＬＩＲＩＯＮのインターナリゼーションを引き起こす条件下にて発現する細胞とそのキメラ分子を接触させる段階；を含む。その標的細胞集団は、本発明のタンパク質をそれらの細胞表面で自然に発現するか、またはキメラ抗体の添加前に、ＬＩＲＩＯＮコード配列によってトランスフェクトすることができる。かかる方法で使用される抗体は、エピトープＶＴＳＥＫＳＶＴまたはそのＬＩＲＩＯＮ特異的断片を含むことが好ましい成熟タンパク質の細胞外ドメインに対して作られる。細胞中に送達される分子は、蛍光または放射性染料または治療的に活性な分子、限定されないが、化学薬品、放射性化合物、ペプチドまたは核酸などであり得る。抗体部位を第２分子に連結する方法は、当業者にはよく知られている。代替方法としては、ＬＩＲＩＯＮ抗体を有するキメラタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで合成によって得ることもできる。これらの方法の使用は、ＡＰＣなどの特異的なＬＩＲＩＯＮ発現細胞型の遺伝子治療、放射免疫シンチグラフィー（radioimmunoscintigraphy）(ＲＩＳ)および放射免疫治療(ＲＩＴ)において特別に興味深いだろう。
配列番号：３８のタンパク質（内部指定クローン５８８３９４  １６０−１０５−４−０−Ａ１１−Ｆ）
クローン５８８３９４  １６０−１０５−４−０−Ａ１１−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３７）は、アミノ酸配列：ＭＲＴＹＷＬＨＳＶＷＶＬＧＦＦＬＳＬＦＳＬＱＧＬＰＶＲＳＶＤＦＮＲＧＴＤＮＩＴＶＲＱＧＤＴＡＩＬＲＣＶＶＥＤＫＮＳＫＶＡＷＬＮＲＳＧＩＩＦＡＧＨＤＫＷＳＬＤＰＲＶＥＬＥＫＲＨＳＬＥＹＳＬＲＩＱＫＶＤＶＹＤＥＧＳＹＴＣＳＶＱＴＱＨＥＰＫＴＳＱＶＹＬＩＶＱＶＰＰＫＩＳＮＩＳＳＤＶＴＶＮＥＧＳＮＶＴＬＶＣＭＡＮＧＲＰＥＰＶＩＴＷＲＨＬＴＰＴＧＲＥＦＥＧＥＥＥＹＬＥＩＬＧＩＴＲＥＱＳＧＫＹＥＣＫＡＡＮＥＶＳＳＡＤＶＫＱＶＫＶＴＶＮＹＰＰＴＩＴＥＳＫＳＮＥＡＴＴＧＲＱＡＳＬＫＣＥＡＳＡＶＰＡＰＤＦＥＷＹＲＤＤＴＲＩＮＳＡＮＧＬＥＩＫＳＴＥＧＱＳＳＬＴＶＴＮＶＴＥＥＨＹＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＶＴＮＡＳＬＶＬＦＫＲＶＬＰＴＩＰＨＰＩＱＥＩＧＴＴＶＨＦＫＱＫＧＩＦＬＳＥＳＱＲＧＥＴＴＫＩＴＬＮＣＧＮＬＦＬＲＮＬＨＰＴＳＤＱＥＰＱＲＬＷＴＬＣＣＬＬＰＲＫＧＱＨＲＩＹＧＱＣを含む、配列番号：３８の３８３アミノ酸のＳＬＡＭＰタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３８のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン５８８３９４  １６０−１０５−４−０−Ａ１１−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン５８８３９４  １６０−１０５−４−０−Ａ１１−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０５３７】
配列番号：３８のタンパク質、ＳＬＡＭＰは、大脳辺縁系関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ;Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔエントリー名Ｑ１３４４９）の新規なスプライシングバリアントである。ＳＬＡＭＰは、２２アミノ酸のシグナル配列（ＭＲＴＹＷＬＨＳＶＷＶＬＧＦＦＬＳＬＦＳＬＱ）、３つのＣ２型免疫グロブリン様ドメイン、および固有の８０アミノ酸のカルボキシ-末端を有する。そのタンパク質は、ＩｇＬＯＮファミリー、ニワトリ、ラットおよびヒトから単離されている神経糖タンパク質のグループに属する。これらには、ＬＡＭＰタンパク質、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ/ＣＥＰＵ−１、ＯＢＣＡＭおよびｋｉｌｏｎ/Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎポリペプチドが含まれる。このファミリーの公知のメンバーの大部分は、神経細胞原形質膜にそれらをつなぐ、Ｃ末端のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを有する細胞表面接着分子である。しかしながら、ＳＬＡＭＰは、ＧＰＩアンカーを欠いており、したがって、大脳辺縁系の皮質領域および皮質下領域において神経細胞により分泌される。ＳＬＡＭＰはそれ自体および他のＩｇＬＯＮタンパク質と相互作用し、細胞間認識、脳の発達中の神経細胞の特定のサブセットの神経突起伸長および軸索ガイダンスの接触依存性制御に関与する。ＳＬＡＭＰは、ＬＡＭＰ、ＮｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎおよびＯＢＣＡＭと相互作用し、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で辺縁系神経細胞の神経突起成長を促進し、かつ非辺縁系神経細胞の神経突起伸長を抑制する。
【０５３８】
以下に述べる方法で使用するのに好ましいＳＬＡＭＰポリペプチドは、以下のアミノ配列：ＧＬＰＶＲＳＶＤＦＮＲＧＴＤＮＩＴＶＲＱＧＤＴＡＩＬＲＣＶＶＥＤＫＮＳＫＶＡＷＬＮＲＳＧＩＩＦＡＧＨＤＫＷＳＬＤＰＲＶＥＬＥＫＲＨＳＬＥＹＳＬＲＩＱＫＶＤＶＹＤＥＧＳＹＴＣＳＶＱＴＱＨＥＰＫＴＳＱＶＹＬＩＶＱＶＰＰＫＩＳＮＩＳＳＤＶＴＶＮＥＧＳＮＶＴＬＶＣＭＡＮＧＲＰＥＰＶＩＴＷＲＨＬＴＰＴＧＲＥＦＥＧＥＥＥＹＬＥＩＬＧＩＴＲＥＱＳＧＫＹＥＣＫＡＡＮＥＶＳＳＡＤＶＫＱＶＫＶＴＶＮＹＰＰＴＩＴＥＳＫＳＮＥＡＴＴＧＲＱＡＳＬＫＣＥＡＳＡＶＰＡＰＤＦＥＷＹＲＤＤＴＲＩＮＳＡＮＧＬＥＩＫＳＴＥＧＱＳＳＬＴＶＴＮＶＴＥＥＨＹＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＶＴＮＡＳＬＶＬＦＫＲＶＬＰＴＩＰＨＰＩＱＥＩＧＴＴＶＨＦＫＱＫＧＩＦＬＳＥＳＱＲＧＥＴＴＫＩＴＬＮＣＧＮＬＦＬＲＮＬＨＰＴＳＤＱＥＰＱＲＬＷＴＬＣＣＬＬＰＲＫＧＱＨＲＩＹＧＱＣを含むポリペプチド；
以下のアミノ 配列：ＧＬＰＶＲＳＶＤＦＮＲＧＴＤＮＩＴＶＲＱＧＤＴＡＩＬＲＣＷＥＤＫＮＳＫＶＡＷＬＮＲＳＧＩＩＦＡＧＨＤＫＷＳＬＤＰＲＶＥＬＥＫＲＨＳＬＥＹＳＬＲＩＱＫＶＤＶＹＤＥＧＳＹＴＣＳＶＱＴＱＨＥＰＫＴＳＱＶＹＬＩＶＱＶＰＰＫＩＳＮＩＳＳＤＶＴＶＮＥＧＳＮＶＴＬＶＣＭＡＮＧＲＰＥＰＶＩＴＷＲＨＬＴＰＴＧＲＥＦＥＧＥＥＥＹＬＥＩＬＧＩＴＲＥＱＳＧＫＹＥＣＫＡＡＮＥＶＳＳＡＤＶＫＱＶＫＶＴＶＮＹＰＰＴＩＴＥＳＫＳＮＥＡＴＴＧＲＱＡＳＬＫＣＥＡＳＡＶＰＡＰＤＦＥＷＹＲＤＤＴＲＩＮＳＡＮＧＬＥＩＫＳＴ  ＥＧＱＳＳＬＴＶＴＮＶＴＥＥＨＹＧＮＹＴＣＶＡＡＮＫＬＧＶＴＮＡＳＬＶＬＦを含むポリペプチド；
以下のアミノ酸配列：ＫＲＶＬＰＴＩＰＨＰＩＱＥＩＧＴＴＶＨＦＫＱＫＧＩＦＬＳＥＳＱＲＧＥＴＴＫＩＴＬＮＣＧＮＬＦＬＲＮＬＨＰＴＳＤＱＥＰＱＲＬＷＴＬＣＣＬＬＰＲＫＧＱＨＲＩＹＧＱＣを含むポリペプチド；を含む。
【０５３９】
本発明の実施形態は、配列番号：３８のSＬＡＭＰポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０５４０】
本発明の更なる実施形態は、ＬＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ、ＣＥＰＵ−１、ＣＥＰＵ−１−Ｓｅ、ＯＢＣＡＭ、ｋｉｌｏｎ、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎ、およびＧＰ５５−Ａからなる群のうちのいずれか１つに結合する生物活性を有するＳＬＡＭＰポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０５４１】
本発明の更なる実施形態は、ＳＬＡＭＰポリペプチドをコードする配列番号：３７のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５４２】
本発明の更なる実施形態は、ＬＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ、ＣＥＰＵ−１、ＣＥＰＵ−１−Ｓｅ、ＯＢＣＡＭ、ｋｉｌｏｎ、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎ、およびＧＰ５５−Ａからなる群のうちのいずれか１つに結合する生物活性を有するＳＬＡＭＰポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。  本発明の更なる実施形態は、ＳＬＡＭＰ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法であって、ｉ）試験する物質を細胞と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＳＬＡＭＰ発現を、未処理の対照細胞における発現と比較する段階；を含む方法に関する。
【０５４３】
本発明の好ましい態様は、ＳＬＡＭＰポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＳＬＡＭＰ発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＳＬＡＭＰの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭＰ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭＰコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。  本発明の一実施形態は、ＳＬＡＭＰポリペプチドを作製する方法に関する。本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードする核酸配列を含む、適切な発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞において作製することができる。かかる発現ベクターの宿主への導入は、限定されないが、塩化カルシウムまたは塩化リチウム処理、電気穿孔法、およびリポフェクションなどの様々な方法で実施することができる。多種多様な発現系のいずれかを用いて、組換えタンパク質を提供することができる。適切な発現媒体には、限定されないが、プラスミド、ウイルス粒子または昆虫細胞のバキュロウイルスが含まれる。発現媒体は宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。任意に、誘導性発現ベクターを用いて、宿主細胞において厳密に制御された遺伝子の発現を達成することができる。宿主細胞または細胞培地から組換えタンパク質を回収し、当業者によく知られているいずれかの技術によって精製することができる。好ましくは、ＳＬＡＭＰ特異的抗体またはそのＳＬＡＭＰ特異的断片をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。代替方法としては、固相技術を用いて、ＳＬＡＭＰまたはその断片を化学的に合成することができる。
【０５４４】
更なる実施形態において、本発明は、これらの細胞のトポロジーまたはモフォロジーを数値で視覚化するために、神経細胞を標識するため、ＳＬＡＭＰまたはその断片を使用する組成物および方法を提供する。好ましい神経細胞は、ＬＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ、ＣＥＰＵ−１、ＣＥＰＵ−１−Ｓｅ、ＯＢＣＡＭ、ｋｉｌｏｎ、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎ、およびＧＰ５５−Ａを発現する細胞である。これらの変化は、中枢神経系疾患と関連する場合がある。検出可能な分子または抗体で標識するか、または検出可能な分子または抗体と結合させることによって、ＳＬＡＭＰを容易に検出可能にすることができる。
【０５４５】
他の実施形態において、本発明のタンパク質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた細胞などの生体試料から神経細胞を精製することができる。この方法は、ｉ）細胞試料をＳＬＡＭＰまたはその生物活性断片と接触させる段階；ｉｉ）非結合性混入物を除去する段階；ｉｉｉ）残りの細胞を溶出する段階；を含む。好ましい細胞試料は、神経細胞を含む試料である。ＬＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ、ＣＥＰＵ−１、ＣＥＰＵ−１−Ｓｅ、ＯＢＣＡＭ、ｋｉｌｏｎ、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｔｉｎ、およびＧＰ５５−Ａを発現する細胞がさらに好ましい。ＳＬＡＭＰはセファロースカラム上に固定化されるか、または固体担体に共有結合もしくは非共有結合で結合されることが好ましい。代替方法としては、神経細胞をＳＬＡＭＰと共にインキュベートし、次いでＳＬＡＭＰに対して作られるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、例えばカラム上で細胞を免疫精製することができる。代替方法としては、ＳＬＡＭＰ特異的抗体を蛍光標識し、ＦＡＣＳによって細胞を精製する。  他の実施形態では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現レベルを検出するための組成物および方法を提供する。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ＳＬＡＭＰ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を検出可能な化合物と接触させる段階を含む。検出可能な化合物は、ＳＬＡＭＰ ｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列であることが好ましい。ＳＬＡＭＰ ｍＲＮＡは細胞試料から精製されることが好ましい、ＳＬＡＭＰ ｃＤＮＡは、かかるＲＮＡ試料から作製されることが好ましい。ＳＬＡＭＰのｍＲＮＡレベルの定量化は、タンパク質の異常発現と関連する疾患または病状の診断に、または本明細書で述べたように治療的介入中にＳＬＡＭＰの調節をモニターするのに有用である。ｍＲＮＡの検出および定量化のアッセイは当技術分野でよく知られている。この方法の一例は、対照の脳試料からＲＮＡを単離する段階と、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＳＬＡＭＰ  ｍＲＮＡレベルを測定する段階と、対象試料における発現を対照試料における発現と比較する段階と、を含む。ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅によるＳＬＡＭＰ  ｍＲＮＡの検出に使用されるポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは、当技術分野でよく知られている方法によって、配列番号：３７のポリヌクレオチドから設計することができる。
【０５４６】
他の実施形態では、本発明は、ＳＬＡＭＰを検出し、生体試料中のその発現レベルを定量化するための方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化したまたは異常な発現によって特徴付けられる病状または疾患の診断に、あるいはＳＬＡＭＰ、アゴニストまたはアンタゴニストで治療される対象をモニターするためのアッセイにおいて、有用である。好ましい方法は、ＳＬＡＭＰに特異的に結合する抗体を、哺乳動物対象、好ましくはヒト由来の脳試料と接触させる段階と、対象試料中のＳＬＡＭＰレベルを、健康な対象の示す対照レベルと比較して決定する段階と、を含み、対照レベルに対して、対象試料中のＳＬＡＭＰのレベルが変化しているか、または異常な場合には、その対象が疾患を有すること、または疾患を発症するリスクが高いことが示される。使用される抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが可能であり、当技術分野でよく知られている方法によって、例えばＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって、免疫複合体を定量化するために、直接または間接的に標識することができる。ＳＬＡＭＰに対して作られる好ましい特異的抗体は、上記のポリペプチド断片を用いて作製される。本発明のタンパク質を検出する診断アッセイは、細胞の生検、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイを含む。アッセイはさらに、細胞抽出物で行うことができる。
【０５４７】
本発明の実施形態は、ＳＬＡＭＰ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＳＬＡＭＰ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＳＬＡＭＰの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＳＬＡＭＰポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ)各試料におけるＳＬＡＭＰ  ｍＲＮＡのレベルを検出する段階；を含む。検出は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって行うことができる。本発明は、本明細書に記載されるような、特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ)細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ)各試料におけるＳＬＡＭＰポリペプチドのレベルを検出する段階；を含む。酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、または当技術分野で一般的な他の方法によって、検出を行ってもよい。本発明は、本明細書に述べるような、特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。ＳＬＡＭＰの発現または活性を増加させる物質（アゴニストまたは活性化剤)は、大脳辺縁系を冒す神経変性疾患、または非辺縁系領域における異常細胞増殖を治療または予防するために使用することができる。ＳＬＡＭＰの発現または活性を減少させる物質（アンタゴニストまたは阻害剤)は、大脳辺縁系領域における異常細胞増殖に関連する病状、または主に非辺縁系領域を冒す神経変性疾患を治療または予防するために使用することができる。ＳＬＡＭＰアゴニストおよびアンタゴニストを利用する方法は本明細書に包含される。
【０５４８】
本発明の好ましい実施形態は、ＳＬＡＭＰポリペプチドに結合する試験物質についてスクリーニングする方法を提供する。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、試験物質をＳＬＡＭＰポリペプチドまたはその断片と接触させる段階；ｉｉ）当技術分野で一般的な方法（例えば、免疫共沈降およびウエスタンブロット法などの競合的な抗体に基づく方法）によって、試験物質の結合を検出する段階；を含む。この方法には、抗体、抗体断片、細胞型特異的リガンドまたはその一部と結合する試験物質が含まれる。この方法は、ＳＬＡＭＰポリペプチドの精製および検出、ならびに以下に記述するスクリーニング法に使用することが可能である。
【０５４９】
本発明の更なる好ましい実施形態は、ＳＬＡＭＰ活性のアゴニストについて、ＳＬＡＭＰに結合する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）ＳＬＡＭＰおよび試験する物質を細胞と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＳＬＡＭＰ生物活性を、ＳＬＡＭＰのみに暴露した対照における生物活性と比較する段階；を含む。ＳＬＡＭＰ生物活性の測定値は、神経突起伸長をモニターすることによって評価することが可能である。ＳＬＡＭＰ活性化を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの一例は、海馬神経細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する段階と、その細胞をＳＬＡＭＰおよび試験物質と接触させる段階と、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるMarg et al. (1999; Journal of Cell Biology, vol. 145, pp 865-876)に記載のように神経突起数／細胞または神経突起伸長を測定する段階とを含み、対照試料と比較される試験試料における増加が、ＳＬＡＭＰに対する試験物質の活性化効果を示す。
【０５５０】
本発明の更なる好ましい実施形態は、ＳＬＡＭＰ活性のアンタゴニストについて、ＳＬＡＭＰに結合する試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＳＬＡＭＰおよび試験する物質を細胞と接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後のＳＬＡＭＰ生物活性を、非暴露対照における生物活性と比較する段階；を含む。ＳＬＡＭＰ活性は、上述のように測定され、試験試料におけるＳＬＡＭＰ活性の減少は、ＳＬＡＭＰに対する試験物質の抑制効果を示す。
【０５５１】
本発明のその他の実施形態は、辺縁系領域の過剰な神経成長と関連する、哺乳動物、好ましくはヒトの疾患状態を治療または予防する方法であって、アンタゴニスト抗体、リボザイムまたはアンチセンスベクターまたはオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物に投与することを含む方法にも向けられている。かかる方法によって治療される疾患状態は脳腫瘍であることが好ましい。好ましい方法は、ＳＬＡＭＰ対して作られる、アンタゴニスト抗体を個体に注入することを含む。ＳＬＡＭＰポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列もまた、辺縁系神経細胞によるＳＬＡＭＰの発現を低減または抑制するために使用することができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、またはワクシニアウイルスに由来する発現ベクターが、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を標的細胞集団に送達するために用いられる。細胞または組織にベクターを導入する多くの方法を利用することが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に同等に適している。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達は、当技術分野でよく知られている方法を用いて達成される。代替方法としては、上述のように単離されたＳＬＡＭＰ発現または活性のアンタゴニストを使用することが可能であり、かかる方法は、ＳＬＡＭＰの発現または活性のアンタゴニストを対象に投与する段階を含む。そのアンタゴニストは、例えばアンタゴニストを細胞特異的な標的化部位（例えば、抗体断片）に結合させることによって、対象の辺縁系神経細胞に送達されることが好ましい。ＳＬＡＭＰアゴニスト、アンチセンスベクターまたはオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物は、単独で、または無菌生体適合性担体中で投与することが可能である、少なくとも１種類の他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わせて、投与することができる。それらは、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、鼻腔内、経腸または経直腸手段を含む多くの経路によって投与することができる。その組成物は、単独で、または他の薬剤または薬物と組み合わせて、対象に投与される。
【０５５２】
本発明の他の目的は、大脳辺縁系と関係する、哺乳動物、好ましくはヒトにおける神経障害を治療または予防する方法を提供することである。これは、本発明のタンパク質またはその断片または本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＳＬＡＭＰの発現または活性をｉｎ ｖｉｖｏで増加させることによって達成することができる。好ましい方法は、薬学的に許容される担体を用いて有効量のＳＬＡＭＰポリペプチドを対象にｉｎ ｖｉｖｏで導入する段階を含む。本発明のタンパク質の発現の増加は、本発明のタンパク質をコードする配列を対象の細胞中に導入することによっても達成することが可能である。ｅｘ ｖｉｖｏでの好ましい方法は、ｉ）ＳＬＡＭＰをコードするポリヌクレオチド配列を神経幹細胞に導入する段階と、ｉｉ）組換え細胞を個体に注入する段階を含む。代替方法としては、上述のように単離されたＳＬＡＭＰ発現または活性のアゴニストを使用することが可能であり、かかる方法は、ＳＬＡＭＰ発現または活性のアゴニストを対象に投与する段階を含む。生理学的に許容される溶液中のＳＬＡＭＰアゴニストを、当技術分野で一般的な方法によって送達することができる。ＳＬＡＭＰアゴニストは、対象の辺縁系神経細胞にｉｎ ｖｉｖｏで送達されることが好ましい。これらの方法は、神経変性疾患および神経障害、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳虚血、辺縁系脳炎、小脳性運動失調症、精神分裂病、およびトゥーレット症候群などの予防および治療に有用である。
配列番号：４０のタンパク質（内部指定クローン４９５７１８  １６０−２６−２−０−Ｅ１２−Ｆ）
クローン４９５７１８＿１６０−２６−２−０−Ｅ１２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：３９）は、アミノ酸配列：ＭＹＡＬＦＬＬＡＳＬＬＧＡＡＬＡＧＰＶＬＧＬＫＥＣＴＲＧＳＡＶＷＣＱＮＶＫＴＡＳＤＣＧＡＶＫＨＣＬＱＴＶＷＮＫＰＴＶＫＳＬＰＣＤＩＣＫＤＶＶＴＡＡＧＤＭＬＫＤＮＡＴＥＥＥＩＬＶＹＬＥＫＴＣＤＷＬＰＫＰＮＭＳＡＳＣＫＥＩＶＤＳＹＬＰＶＩＬＤＩＩＫＧＥＭＳＲＰＧＥＶＣＳＡＬＮＬＣＥＳＬＱＫＨＬＡＥＬＮＨＱＫＱＬＥＳＮＫＩＰＥＬＤＭＴＥＷＡＰＦＭＡＮＩＰＬＬＬＹＰＱＤＧＰＲＳＫＰＱＰＫＤＮＧＤＶＣＱＤＣＩＱＭＶＴＤＩＱＴＡＶＲＴＮＳＴＦＶＱＡＬＶＥＨＶＫＥＥＣＤＲＬＧＰＧＭＡＤＩＣＫＮＹＩＳＱＹＳＥＩＡＩＱＭＭＭＨＭＱＤＱＱＰＫＥＩＣＡＬＶＧＦＣＤＥＶＫＥＭＰＭＱＴＬＶＰＡＫＶＡＳＫＮＶＩＰＡＬＥＬＶＥＰＩＫＫＨＥＶＰＡＫＳＤＶＹＣＥＶＣＥＦＬＶＫＥＶＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬＤＡＦＤＫＭＣＳＫＬＰＫＳＬＳＥＥＣＱＥＶＶＤＴＹＧＳＳＩＬＳＩＬＬＥＥＶＳＰＥＬＶＣＳＭＬＨＬＣＳＧＴＲＬＰＡＬＴＶＨＶＴＱＰＫＤＧＧＦＣＥＶＣＫＫＬＶＧＹＬＤＲＮＬＥＫＮＳＴＫＱＥＩＬＡＡＬＥＫＧＣＳＦＬＰＤＰＹＱＫＱＣＤＱＦＶＡＥＹＥＰＶＬＩＥＩＬＶＥＶＷＩＬＰＳＣＡを含む、配列番号：４０のＳＡＰ−ＭＵ−１０をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４０のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン４９５７１８＿１６０−２６−２−０−Ｅ１２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：３９のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン４９５７１８＿１６０−２６−２−０−Ｅ１２−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４０、配列番号：３９、およびクローン４９５７１８＿１６０−２６−２−０−Ｅ１２−Ｆの組成物に対して向けられる。以下に述べる方法で使用するのに好ましいＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチド断片としては、アミノ配列：ＤＧＧＦＣＥＶＣＫＫＬＶＧＹＬＤＲＮＬＥＫＮＳＴＫＱＥＩＬＡＡＬＥＫＧＣＳＦＬＰＤＰＹＱＫＱＣＤＱＦＶＡＥＹＥＰＶＬＩＥＩＬＶＥＶＷＩＬＰＳＣＡを含む、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドが挙げられる。本明細書に記載の生物活性を有するＣ末端側７個のアミノ酸を含むポリペプチド断片、およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０５５３】
本発明のタンパク質ＳＡＰ−ＭＵ−１０は、サポシン（Ｓａｐｏｓｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０７６０２）の新規なアイソフォームである。サポシンの３つの異なるアイソフォームが記載されている。ＳＡＰ−ＭＵ−１０のアミノ末端側４７２個のアミノ酸は、ＳＡＰ−ＭＵ−９アイソフォームと同一であり、カルボキシル末端側７個のアミノ酸はＳＡＰ−ＭＵ−１０に固有のものである。
【０５５４】
ＳＡＰ−ＭＵ−１０は４種の異なるタンパク質の前駆体であり、ＳＡＰ−ＭＵ１０のタンパク分解切断によって、Ｓａｐ−Ａ１０、Ｓａｐ−Ｂ１０、Ｓａｐ−Ｃ１０およびＳａｐ−Ｄ１０タンパク質が生じる。ＳＡＰ−ＭＵ−１０前駆体のプロセッシングを受けていないＳＡＰＭＵ−１０前駆体は、スフィンゴ脂質に結合し、リポソームから膜へのガングリオシド輸送を促進する。プロセッシングされたタンパク質は、スフィンゴ脂質の加水分解の非酵素的活性化剤である。スフィンゴ脂質は、神経繊維を保護し、かつ絶縁する構造である、ミエリン鞘の重要な成分である。ＳＡＰ−ＭＵ−１０およびＳａｐ−Ｄ１０は、神経細胞のミエリン形成およびスフィンゴ脂質の蓄積のどちらにおいても主要な役割を果たす。ＳＡＰ−ＭＵ−１０は様々な組織において発現およびプロセッシングされ、神経系において特に高レベルで発現する。さらに、プロセッシングを受けていないＳＡＰ−ＭＵ−１０前駆体は、脳脊髄血漿中で分泌される。ＳＡＰ−ＭＵ−１０タンパク質は、スフィンゴ脂質およびガングリオシドに結合し、神経栄養性を示す。ＳＡＰ−ＭＵ−１０タンパク質は、スフィンゴミエリンおよびセラミドに結合し、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ活性化剤活性を示す。
【０５５５】
本明細書で用いられる、ＳＡＰ−ＭＵ−１０とは、配列番号：４０のポリペプチド配列を意味する。本明細書で用いられる、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドとは、スフィンゴ脂質またはガングリオシド結合活性のいずれか、または神経栄養性を有する配列番号：４０のポリペプチド配列の断片を意味する。本明細書で用いられる、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドとは、上述のＳａｐ−Ｄ１０ポリペプチドを含み、かつスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ活性化剤活性を有するポリペプチドを意味する。
【０５５６】
本発明の実施形態は、配列番号：４０のＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０５５７】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチド断片を含む組成物に関する。  本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するＳａｐ−Ｄ１０ポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０５５８】
本発明の更なる実施形態は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドをコードする配列番号：３９のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５５９】
本発明の更なる実施形態は、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドをコードする配列番号：３９のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
本発明の更なる実施形態は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む組成物に関する。その抗体は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０およびＳａｐ−Ｄ１０のＣ末端側７個のアミノ酸の１つまたは複数を含むエピトープを認識することが好ましく、Ｃ末端側７個のアミノ酸の１つまたは複数が抗体結合に必要とされる。好ましくは、その抗体は、特異的にＳＡＰ−ＭＵ−１０およびＳａｐ−Ｄ１０には結合するが、他のサポシンアイソフォームには結合しない。一方、その抗体は、特異的にＳＡＰ−ＭＵ−１０に結合するが、Ｓａｐ−Ｄ１０および他のアイソフォームには結合しない。一方、その抗体は、特異的にＳａｐ−Ｄ１０には結合するが、ＳＡＰＭＵ−１０および他のアイソフォームには結合しない。
【０５６０】
本発明の好ましい態様は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０の発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＳＡＰ−ＭＵ−１０の発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＳＡＰ−ＭＵ−１０遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＳＡＰ−ＭＵ−１０コード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたＳＡＰ−ＭＵ−１０タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。  その他の実施形態は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階と、ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階とを含む、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者に公知のいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ＳＡＰ−ＭＵ−１０またはその一部に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。
【０５６１】
本発明の実施形態は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドをスフィンゴ脂質またはガングリオシド分子と、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドの前記分子への結合を可能にする条件下で、結合させる段階を含む方法である。好ましい実施形態において、スフィンゴ脂質またはガングリオシド分子を精製するために、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドが用いられる。かかる方法において、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドは好ましくは、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、スフィンゴ脂質およびガングリオシドに結合させることが可能となる。この方法は、溶液中のスフィンゴ脂質またはガングリオシド分子とＳＰＡ−ＭＵ−１０を接触させる段階；ｉｉ）固体マトリックスを洗浄して、非結合性混入物を除去する段階；ｉｉｉ）さらに厳密な条件を用いて、スフィンゴ脂質またはガングリオシドを溶出する段階；を含む。スフィンゴ脂質およびガングリオシドの精製は、ガングリオシドの分解に影響を及ぼすリソソーム酵素活性の欠損を確認するのに、またはガングリオシドを添加された培養線維芽細胞におけるガングリオシド異化作用をモニターするのに有用であり得る。
【０５６２】
この実施形態のその他の態様は、当技術分野で一般的な技術を用いて、スフィンゴ脂質およびガングリオシドを検出かつ精製するために、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドを使用する方法を包含する。かかる方法は、ｉ）スフィンゴ脂質またはガングリオシドを含有すると思われる生体試料を得る段階；ｉｉ）ＳＡＰ−ＭＵ−１０の結合を生じさせる条件下にて、かかる試料をＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドと接触させる段階；ｉｉｉ）ＳＡＰ−ＭＵ−１０を検出することによって、スフィンゴ脂質およびガングリオシドの有無を検出する段階；を含む。ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドは、検出可能な化合物（例えば、酵素基質、または蛍光化合物、発光化合物、および放射性化合物）(Ｅ．Ｇ．．．．)に共有結合で結合されることが好ましい。代替方法としては、検出可能なＳＡＰ−ＭＵ−１０特異的抗体を用いて、ＳＡＰ−ＭＵ−１０を検出することが可能である。この実施形態は、例えば、脳脊髄血漿中のスフィンゴ脂質の量を定量化するための診断ツールとして有用である。かかる診断ツールは、スフィンゴリピド症および様々なリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、例えばシスチン蓄積症、ゴーシェ病、多種スルファターゼ欠損症（multiple sulfatase deficiency）、ニーマン・ピック病、ポンペ病およびウォルマン病などを診断するのに有用である可能性がある。
【０５６３】
その他の実施形態では、本発明は、生体試料中のＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドを検出する方法に向けられており、前記方法は、ｉ）ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗原結合抗体断片と生体試料を接触させる段階；ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。その抗体または抗原結合抗体断片は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることが可能である。さらに、その抗体または抗原結合抗体断片は一次的または二次的に、当技術分野で一般的な検出可能な化合物（例えば、放射性化合物、蛍光化合物、発光化合物、および酵素化合物）によって標識することができる。
【０５６４】
一部の実施形態において、本発明は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットにも関する。かかるキットは、ｉ）ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体またはその断片；任意に、ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬；を備える。抗体または抗体断片は検出可能に標識されることが好ましい。かかる標識としては、蛍光化合物、発光化合物、および放射性化合物、ならびに酵素基質が挙げられる。任意の試薬は、検出可能なシグナルを提供し、抗体に結合するか、またはかかる抗体上の標識と反応することができる。ＳＡＰ−ＭＵ−１０に対する抗体を含有するキットは、本明細書に記載されるようなＬＳＤを診断するのに使用されることが好ましい。一方、本発明のキットは、ＬＳＤの治療を受ける患者の状態をモニターするのに使用される。かかる疾患を検出するために、適切な生体試料（血液または、例えば脳脊髄血漿）を試験し、産生されるＳＡＰ−ＭＵ−１０のレベルを決定することができる。抗ＳＡＰ−ＭＵ−１０抗体を含むＬＳＣを検出するキットは、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開番号：ＷＯ００/５５６３２に記載の抗体などの他の抗体もまた含み得る。代替方法としては、かかる方法において抗Ｓａｐ−Ｄ１０抗体を使用してもよい。
【０５６５】
本発明の実施形態は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＳＡＰ−ＭＵ−１０発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＳＡＰ−ＭＵ−１０の発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ）ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＳＡＰ−ＭＵ−１０ ｍＲＮＡのレベルを比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に述べるような、特異的ポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ）ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドのレベルを比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に述べるような、特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０５６６】
他の実施形態において、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはその断片は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０活性を活性化または抑制する化合物についてスクリーニングするために使用される。この方法は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）ＳＡＰ−ＭＵ−１０活性をモニターする段階と、を含む。その開示内容全体が参照により組み込まれるHiraiwa et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 89: 11254-8 (1992))により記載されている、ガングリオシドを用いた結合アッセイによって、ＳＡＰ−ＭＵ−１０活性をモニターすることができる。
【０５６７】
他の実施形態では、Ｓａｐ−Ｄ１０活性を活性化または抑制する化合物についてスクリーニングするために、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドを使用する。この方法は、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）Ｓａｐ−Ｄ１０活性をモニターする段階と、を含む。Ｓａｐ−Ｄ１０活性は例えば、その開示内容全体が参照により組み込まれるMorimoto et al. (Biochem Biophys Res Commun 156: 403-10 (1988))によって記載されているスフィンゴミエリナーゼ活性をモニターすることによって決定することができる。
【０５６８】
ＳＡＰ−ＭＵ−１０の発現または活性を減少させる試験物質は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０の阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。Ｓａｐ−Ｄ１０の活性を減少させる試験物質は、Ｓａｐ−Ｄ１０の阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ＳＡＰ−ＭＵ−１０の発現または活性は増加させる試験物質は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０の活性化剤またはアゴニストとして定義される。主題の発明のＳＡＰ−ＭＵ−１０またはＳａｐ−Ｄ１０活性の発現または活性を調節する作用物質には、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および抗体が含まれる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用することができる。
【０５６９】
本発明の一実施形態は、ミエリン形成を増加させ、経細胞の伸長を刺激し、または脱髄および神経変性プロセスを遅くする方法に関する。この方法は、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物と細胞を接触させる段階を含む。好ましい細胞は、神経細胞および乏突起膠細胞である。その細胞は、組成物を細胞に直接投与することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置することができる。好ましい実施形態において、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物は、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、ウイルス誘導炎症性脱髄、白質脳症および白質ジストロフィー、例えばクラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ＡＬＤ、カナバン病およびアレキサンダー病）を患う個体に導入される。使用されるアゴニストまたはポリペプチドの量は、個体におけるミエリン形成を増加するのに有効な量であることが好ましい。他の好ましい実施形態では、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物は、神経変性疾患（例えば、網膜神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、ポリオ後症候群および筋萎縮性側索硬化症）を患う個体に導入される。使用されるアゴニストまたはポリペプチドの量は、個体における神経細胞伸長を刺激するのに有効な量であることが好ましい。
【０５７０】
他の実施形態において、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドまたはＳａｐ−Ｄ１０アゴニストは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでスフィンゴミエリナーゼジホスホエステラーゼを活性化するために使用される。好ましい実施形態は、スフィンゴミエリナーゼジホスホエステラーゼを、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドまたはＳａｐ−Ｄ１０アゴニストと接触させる段階を含む方法に関する。他の好ましい実施形態は、Ｓａｐ−Ｄ１０ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物と細胞を接触させる段階を含む方法に関する。さらに他の好ましい実施形態は、生理学的に許容される組成物中でＳａｐ−Ｄ１０ポリペプチドまたはＳａｐ−Ｄ１０アゴニストを含む組成物を個体に投与する段階を含む方法に関する。かかる方法は、サポシンＤ欠損と関連するテイ・サックス病を患う個体の治療に向けられることが好ましい。使用されるＳａｐ−Ｄ１０アゴニストまたはポリペプチドの量は、テイ・サックス病を患う個体におけるスフィンゴミエリナーゼジホスホエステラーゼ活性を増加させるのに有効な量であることが好ましい。
【０５７１】
本発明の組成物は、本明細書に記載の担体など、薬学的に許容される担体を含むことが可能であり、当技術分野で公知のいずれかの技術によって、個体に投与することができる。その組成物は、注入（例えば、直接的な頭蓋内注入、脳脊髄液への注入、末梢神経組織への局所注入または全身注入）によって導入することが好ましい。その組成物は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１４，４５９号および米国特許第４，９０２，５０５号に記載の方法のうちの１つによって、患者に導入されることがさらに好ましい。
【０５７２】
その他の実施形態は、ｉ)適切な生理学的条件下にて、ＳＡＰ−ＭＵ−１０またはその断片の発現を可能にするＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子を構築する段階；ｉｉ）この組換え分子を、細胞、哺乳動物またはヒトに導入する段階；を含む、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリヌクレオチドを使用する方法に関する。組換え分子は神経細胞に導入されることが好ましい。
【０５７３】
ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターなどの送達媒体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または組織中に直接導入することができる。それらは、生理学的技術、例えば微量注入および電気穿孔法、または共沈およびＤＮＡのリポソームへの取り込みなどの化学的方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアロゾル状で、または潅注（lavage）によって送達することもできる。ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリヌクレオチドは、細胞への直接的な注入などによって細胞外で適用することもできる。細胞へのＳＡＰ−ＭＵ−１０の導入を行い、脳に移植する方法が、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７６２，９２６号に記載されている。かかる方法は、例えば多発性硬化症、白質脳症および白質ジストロフィーの治療に用いることができる。
【０５７４】
本発明の他の実施形態は、当業者に公知のいずれかの方法によって、遺伝子導入動物および遺伝子導入モデル動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するために、ＳＡＰ−ＭＵ−１０ポリヌクレオチド配列またはその一部を使用する方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、ＬＳＤなどのヒトの疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
配列番号：４２のタンパク質（内部指定クローン６１２３８６  １８７−９−４−０−Ｂ２−Ｆ）
クローン６１２３８６−１８７−９−４−０−Ｂ２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：４１）は、アミノ酸配列：
ＭＥＬＣＲＳＬＡＬＬＧＧＳＬＧＬＭＦＣＬＩＡＬＳＴＤＦＷＦＥＡＶＧＰＴＨＳＡＨＳＧＬＷＰＴＧＨＧＤＩＩＳＧＨＧＰＬＶＳＴＴＡＡＦＡＡＧＫＤＳＧＬＤＷＧＩＡＳＱＲＩＰＡＥＥＬＳＨＬＳＣＰＣＰＱＰＳＰＷＷＷＰＷＲＣＴＰＡＳＧＧＴＳＬＨＴＰＲＳＲＰＳＳＰＧＰＳＴＷＡＧＳＱＬＳＳＣＳＶＱＶＰを含む、配列番号：４２のｃｙｔｏｇｒａｍをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４２のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン６１２３８６＿１８７−９−４−０−Ｂ２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン６１２３８６−１８７−９−４−０−Ｂ２−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４２、配列番号：４１、およびクローン６１２３８６＿１８７−９−４−０−Ｂ２−Ｆの組成物に対して向けられる。以下に記述する方法において使用される好ましいｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドとしては、以下のアミノ酸配列：ＡＨＳＧＬＷＰＴＧＨＧＤＩＩＳＧＨＧＰＬＶＳＴＴＡＡＦＡＡＧＫＤＳＧＬＤＷＧＩＡＳＱＲＩＰＡＥＥＬＳＨＬＳＣＰＣＰＱＰＳＰＷＷＷＰＷＲＣＴＰＡＳＧＧＴＳＬＨＴＰＲＳＲＰＳＳＰＧＰＳＴＷＡＧＳＱＬＳＳＣＳＶＱＶＰを含むポリペプチドが挙げられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０５７５】
本発明のタンパク質のｃｙｔｏｇｒａｍは、ＧＭＰ−１７（またはＮＫＧ７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ１６６１７)のスプライシングバリアントである。Ｃｙｔｏｇｒａｍ ｃＤＮＡは、ＧＭＰ−１７ ｃＤＮＡの２番目のエクソンを欠失している。Ｃｙｔｏｇｒａｍは、１４２アミノ酸の長さのタンパク質であり、ＧＭＰ−１７は、１６５アミノ酸の長さである。アミノ末端側５３個のアミノ酸は、２種類のタンパク質間で同一であり、カルボキシル末端側８９個のアミノ酸は、ｃｙｔｏｇｒａｍに固有のものである。Ｃｙｔｏｇｒａｍは、シグナルペプチド（ＭＥＬＣＲＳＬＡＬＬＧＧＳＬＧＬＭＦＣＬＩＡＬＳＴＤＦＷＦＥＡＶＧＰＴＨＳ）、膜貫通ドメイン（ＧＤＩＩＳＧＨＧＰＬＶＳＴＴＡＡＦＡＡＧＫ）、および亜鉛イオンに結合する、ＰＥＣファミリーメタロチオネインドメイン（ＳＣＰＣＰＱＰＳＰＷＷＷＰＷＲＣＴＰＡＳＧＧＴＳＬＨＴＰＲＳＲＰＳＳＰＧＰＳＴＷＡＧＳＱＬＳＳＣＳＶ）を示す。
【０５７６】
Ｃｙｔｏｇｒａｍは、ＮＫ細胞(ＮＫ)および細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)において恒常的かつ特異的に発現する細胞傷害性顆粒膜タンパク質である。ＮＫおよびＣＴＬの脱顆粒によって、ｃｙｔｏｇｒａｍが顆粒膜から原形質膜へ移行する。Ｃｙｔｏｇｒａｍは、効果細胞と標的細胞との間の結合の形成、それに続いてエキソサイトーシスをもたらす。さらに、原形質膜上に一旦位置すると、ｃｙｔｏｇｒａｍは、ＮＫおよびＣＴＬの細胞毒性に必要なイオンチャネルを制御し、細胞溶解性のエフェクター機能を促進する。
【０５７７】
本発明の実施形態は、配列番号：４２のｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０５７８】
本発明の更なる実施形態は、ＮＫおよびＣＴＬ細胞毒性を促進する生物活性を有するｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０５７９】
本発明の更なる実施形態は、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドをコードする配列番号：４１のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５８０】
本発明の更なる実施形態は、生物活性を有するｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０５８１】
本発明の更なる実施形態は、配列番号：４２のｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチド配列または生物活性を有するｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチド断片を認識する抗体を含む組成物に関する。その抗体は、非線状エピトープまたはｃｙｔｏｇｒａｍのＣ末端側８９個のアミノ酸内に位置するエピトープを認識することが好ましい。その抗体は、ｃｙｔｏｇｒａｍには結合するが、ＧＭＰ−１７には結合しないことが好ましい。その抗体は、アミノ酸配列：ＡＧＫＤＳＧＬＤを認識することが好ましい。
【０５８２】
本発明の更なる実施形態は、活性化ＮＫおよびＣＴＬを、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドを抗体に結合させる条件下にて接触させる段階を含む、活性化ＮＫおよびＣＴＬを結合させる方法に関する。好ましい実施形態において、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体は、活性化ＮＫおよびＣＴＬを精製するために用いることができる。かかる方法では、その抗体は、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに結合させることができる。この方法は、ｉ）活性化ＮＫおよびＣＴＬを、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドを抗体に結合させる条件下にて接触させる段階と、ｉｉ）その固体マトリックスを洗浄して、混入物を取り除く段階；ｉｉｉ）さらに厳密な条件を用いて、対象の細胞を溶出する段階；を含む。かかる方法は例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖前に癌患者からＮＫおよびＣＴＬを精製するのに有用であり得る。
【０５８３】
本発明の好ましい態様は、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ｃｙｔｏｇｒａｍの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ｃｙｔｏｇｒａｍの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ｃｙｔｏｇｒａｍ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ｃｙｔｏｇｒａｍコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたｃｙｔｏｇｒａｍタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０５８４】
本発明の一実施形態は、ｉ）体液、組織試料、または哺乳動物細胞培養物を、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる段階と、ｉｉ）いずれかの検出可能なシグナルを用いて、試料中のその抗体を検出する段階と、を含む、活性化ＮＫおよびＣＴＬを検出または精製する方法に関する。例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド（Texas-Red）、ビオチンおよびジゴキシゲニンなどの化合物を用いて、検出可能なシグナルを提供することができる。そのシグナルの検出は、当業者によく知られている免疫組織学的または免疫蛍光プロセスを用いて実施することができる。ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体を、検出可能なシグナルを与える化合物で直接標識することができる。代替方法としては、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体は標識されず、シグナルの検出は、標識された二次抗体を使用して間接的に行われる。好ましい実施形態では、活性化ＮＫおよびＣＴＬの検出を用いて、哺乳動物細胞培養物におけるＣＴＬまたはＮＫ活性への試験化合物の効果を測定することができる。他の好ましい実施形態では、かかる方法を用いて、患者におけるＣＴＬまたはＮＫ活性を増加または減少することを目的とする治療の効果をモニターすること、または患者における移植拒絶反応の開始を検出することができる。
【０５８５】
本発明の実施形態は、細胞毒性顆粒のマーカーとしてｃｙｔｏｇｒａｍまたはその断片を使用する方法であって、ｉ）体液、組織試料、または哺乳動物細胞培養物を、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させる段階と、いずれかの検出可能なシグナルを用いて、試料における抗体の局在を検出する段階と、を含む方法に関する。例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド（Texas-Red）、［３５Ｓ］メチオニン、［３５Ｓ］システインおよびビスベンズイミドなどの化合物を用いて、検出可能なシグナルを提供することができる。そのシグナルの検出は、免疫電子顕微鏡法または蛍光顕微鏡法を用いて行われる。ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体は、検出可能なシグナルを与える化合物で直接標識することができる。代替方法としては、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体は標識されず、シグナルの検出は、標識された二次抗体を使用して間接的に行われる。細胞毒性顆粒のマーカーとしてｃｙｔｏｇｒａｍまたはその一部を使用する、かかる方法には、その開示内容全体が参照により組み込まれる、Medley et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 93: 685-9 (1996))によって記載の方法が含まれる。ＣＴＬおよびＮＫは、ウイルス感染および形質転換細胞に対する高等生物の主要な防御を形成し、ＣＴＬの主要な機能は、潜在的に有害な細胞を検出かつ溶解により除去することである。したがって、ＮＫおよびＣＴＬの脱顆粒を検出するためのマーカーは、例えば、細胞内病原体の感染、移植片対宿主疾患、移植可能および自然発生悪性腫瘍に対する感受性、リンパのホメオスタシス、自己免疫疾患に対する傾向の、状態または進行を処置またはモニターするための薬物についてスクリーニングする際、あるいはこれらの疾患を研究する際に、非常に有用である。
【０５８６】
その他の実施形態は、ｉ）ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドを発現することができる細胞を得る段階；ｉｉ）前記ポリペプチドを産生するのに適した条件下にて、前記細胞を成長させる段階；ｉｉｉ)前記ポリペプチドを精製する段階；を含む、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者に公知のいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ｃｙｔｏｇｒａｍまたはその一部に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。その抗体は、ｃｙｔｏｇｒａｍには結合するが、ＧＭＰ−１７には結合しないことがさらに好ましい。ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドを発現することができる細胞は、当業者によく知られている技術のいずれかによって得ることが可能である。本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。その代わりに、異種プロモーターを用いてもよい。その宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であることが好ましい。
【０５８７】
他の好ましい実施形態は、ｃｙｔｏｇｒａｍ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法に関する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のｃｙｔｏｇｒａｍ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ｃｙｔｏｇｒａｍの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって決定される。ｃｙｔｏｇｒａｍの発現を決定する方法としては、限定されないが、ｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドを定量化する方法（例えば、ノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲによるｃｙｔｏｇｒａｍ ｍＲＮＡの検出）またはｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドを定量化する方法（例えば、ウェスタンブロットまたは免疫化学によるｃｙｔｏｇｒａｍタンパク質の検出）が挙げられる。試験物質は、特定の細胞型におけるｃｙｔｏｇｒａｍの発現を修飾するが、他の細胞型においてはそうではないことが好ましい。試験物質は、特にＮＫおよびＣＴＬにおいてｃｙｔｏｇｒａｍの発現を修飾することが最も好ましい。
【０５８８】
本発明の更なる実施形態は、ｃｙｔｏｇｒａｍ活性の修飾因子の試験物質と、かかる試験物質についてスクリーニングする方法であって、ｉ）細胞を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ｃｙｔｏｇｒａｍ活性を決定する段階；ｉｉｉ）暴露後の細胞におけるｃｙｔｏｇｒａｍ活性を非暴露対照細胞における活性と比較する段階；を含む方法と、に関する。Ｃｙｔｏｇｒａｍ活性は例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２９，４９４号に記載の細胞毒性アッセイを用いて、ＮＫの細胞毒性活性を研究することによってモニターすることができる。ｃｙｔｏｇｒａｍ活性はＮＫおよびＣＴＬにおいて研究されることが好ましい。ｃｙｔｏｇｒａｍ活性を調節する物質は、ＮＫおよびＣＴＬ細胞毒性の調節に、個体に投与されることが最も好ましい。
【０５８９】
ｃｙｔｏｇｒａｍの発現または活性を減少させる試験物質は、ｃｙｔｏｇｒａｍの阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ｃｙｔｏｇｒａｍの発現または活性を増加させる試験物質は、ｃｙｔｏｇｒａｍの活性化剤またはアゴニストとして定義される。ｃｙｔｏｇｒａｍの発現または活性を調節する試験物質としては、限定されないが、化学化合物、オリゴヌクレオチド、リボザイムおよび抗体が挙げられる。これらの物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用される。
【０５９０】
本発明の実施形態は、ＮＫまたはＣＴＬ細胞毒性の結果として生じる疾患を予防するため、またはその重症度を低減するために、本発明の組成物を使用する方法に関する。好ましい実施形態において、かかる方法は、生理学的に許容される組成物中のｃｙｔｏｇｒａｍアンタゴニストを個体に投与する段階を含む。ＮＫおよびＣＴＬ活性化を低減するためのかかる方法は、アレルギーおよび喘息を治療すること、かつ進行中の免疫応答を防ぐことに向けられることが好ましい。特に、移植拒絶反応、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、肝炎、慢性関節リウマチ、グレーブス病）を予防するため、またはその重症度を低減するため、および移植片の移植（例えば、細胞、骨髄、組織、固体の器官、骨の移植）に対する抵抗性（tolerance）を誘導するために、かかる方法を用いることができる。かかる方法で使用される好ましいｃｙｔｏｇｒａｍアンタゴニストは、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【０５９１】
他の好ましい実施形態において、抗ｃｙｔｏｇｒａｍ抗体は、活性化ＮＫおよびＣＴＬに薬剤を運ぶ、標的化および送達メカニズムとして使用される。かかる方法は、ｉ）抗ｃｙｔｏｇｒａｍ抗体を薬剤に結合させる段階；ｉｉ）前記コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む組成物を、ＮＫまたはＣＴＬ細胞毒性の結果として生じる疾患を有する個体に投与する段階；を含む。抗ｃｙｔｏｇｒａｍ抗体は、酵素に対する抗体のプロドラッグ治療法（antibody-directed enzyme-produrug therapy）であって、ｉ）比較的非毒性の化合物をそれよりかなり毒性の高い化合物に転換する酵素に、抗ｃｙｔｏｇｒａｍ 抗体を結合させる段階；ｉｉ）残りの酵素抗体コンジュゲートを血液から除去することができるように遅らせた後、前記の比較的非毒性の化合物を患者に投与する段階；を含む治療法で使用されることが好ましい。かかる方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるMelton et al. (J. Natl. Cancer Inst. 1996 88: 153-65 (1996))に記載のように実施することができる。
【０５９２】
本発明の実施形態は、ＮＫまたはＣＴＬ細胞毒性を高めるために、本発明の組成物を使用する方法に関する。ＮＫまたはＣＴＬ細胞毒性を高めることに向けられる好ましい方法は、免疫系への追加免疫が望まれる疾患および障害を有する個体に、生理学的に許容される担体中のｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドまたはｃｙｔｏｇｒａｍアゴニストを導入する段階を含む。特に、かかる処置は、癌を治療する場合には、放射線療法または化学療法と組み合わせて用いることが可能であり、腫瘍疾患（例えば、多発性骨髄腫、結腸癌、肝癌）、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、肝炎、麻疹およびヘルペスウイルス感染）、および様々な免疫不全を治療するために用いることができる。これらの免疫不全は、遺伝的（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ））であるか、または様々な細菌もしくは真菌感染（例えば、マイコバクテリア、リーシュマニア属、マラリアおよびカンジダによる感染）によって引き起こされる。
【０５９３】
生理学的に許容される担体は、当業者に公知のいずれかの方法によって製造することができる。生理学的に許容される担体としては、限定されないが、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA 1985)に記載の担体が挙げられる。薬剤組成物は例えば、静脈内、表面、直腸、局所、吸入または皮下、皮内、筋肉内、経口および脳内投与に対する組成物であることが可能である。その組成物は、液状（例えば、液剤、懸濁剤）、固形（例えば、丸剤、錠剤、坐剤）または半固形（例えば、クリーム剤、ゲル剤）であることが可能である。投与量は、それぞれの必要性、望まれる効果、および選択される投与経路に応じて異なる。
【０５９４】
他の実施形態は、ｉ）所定の生理学的条件下にて、ｃｙｔｏｇｒａｍまたはその一部の発現を可能にする、ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え分子を構築する段階；ｉｉ）細胞、哺乳動物またはヒトに、この組換え分子を導入する段階；を含む、ｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドを使用する方法に向けられる。例えば上記の遺伝性免疫不全および腫瘍性疾患を治療するために、かかる方法を使用することができる。組換え分子はＮＫまたはＣＴＬに導入されることが好ましい。
【０５９５】
さらに他の実施形態は、ｉ）ｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドに相補的なｃＤＭＡをコードする核酸配列を含む組換え分子を構築する段階；ｉｉ）細胞、哺乳動物またはヒトに、この組換え分子を導入する段階；を含む、アンチセンスｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドを使用する方法に向けられる。かかる方法は、自己免疫疾患を治療するのに使用することができる。代替方法としては、かかる方法は、臓器を移植する場合に、上述の自己免疫疾患、移植片対宿主疾患または移植拒絶反応を防ぐために使用することができる。その組換え分子は、ＮＫ、ＣＴＬ、または移植片細胞に導入される。
【０５９６】
ｃｙｔｏｇｒａｍポリペプチドをコードする核酸配列またはｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドに相補的なｃＤＮＡをコードする核酸配列を含む組換え分子は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターなどの送達媒体を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または組織中に直接導入することができる。それらは、生理学的技術、例えば微量注入および電気穿孔法、または共沈およびＤＮＡのリポソームへの取り込みなどの化学的方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入することもできる。組換え分子は、エアロゾル状で、または潅注（lavage）によって送達することもできる。ｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドは、細胞への直接注入などによって細胞外で適用することもできる。ｃｙｔｏｇｒａｍポリヌクレオチドは、ＮＫまたはＣＴＬに導入されることが好ましい。
配列番号：４４のタンパク質（内部指定クローン１０００８３８９８２  ２２０−２０−４−０−Ｃ２−Ｆ）
クローン１０００８３８９８２２２０−２０−４−０−Ｃ２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：４３）は、アミノ酸配列：ＭＳＡＱＥＳＣＬＳＬＩＫＹＦＬＦＶＦＮＬＦＦＦＶＬＧＳＬＩＦＣＦＧＩＷＩＬＩＤＫＴＳＦＶＳＦＶＧＬＡＦＶＰＬＱＩＷＳＫＶＬＡＩＳＧＩＦＴＭＧＩＡＬＬＧＣＶＧＡＬＫＥＬＲＣＬＬＧＬＹＦＧＭＬＬＬＬＦＡＴＱＩＴＬＧＩＬＩＳＴＱＲＡＳＷＳＥＡＣＧＴＳを含む、配列番号：４４のＴｅｔｒａｎａｂをコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４４のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８３８９８２２２０−２０−４−０−Ｃ２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４３のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン１０００８３８９８２２２０−２０−４−０−Ｃ２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４４、配列番号：４３、およびクローン１０００８３８９８２２２０−２０−４−０−Ｃ２−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０５９７】
本発明のタンパク質、Ｔｅｔｒａｎａｂは、ＣＤ３７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１１０４９）の変異体である。ＣＤ３７は、Ｔ細胞依存性のＢ細胞応答に必要な分子複合体をまとめる分子ファシリテーター（facilitator）である。ＣＤ３７は分子の相互作用を安定化し、その結果、応答がより効率的となる。Ｔｅｔｒａｎａｂは、１つのシグナルアンカー（ＦＮＬＦＦＦＶＬＧＳＬＩＦＣＦＧＩＷＩＬＩ）、２つの膜貫通ドメイン（ＶＬＡＩＳＧＩＦＴＭＧＩＡＬＬＧＣＶＧＡＬおよびＬＹＦＧＭＬＬＬＬＦＡＴＱＩＴＬＧＩＬＩＳ）を示す、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎファミリーの分岐したメンバーである。Ｔｅｔｒａｎａｂは、成熟Ｂ細胞で特異的に発現される。Ｔｅｔｒａｎａｂは、Ｂ細胞の分化中には発現されないが、その発現は、Ｂ細胞の活性化でダウンレギュレートされる。Ｔｅｔｒａｎａｂは、Ｂ細胞表面で機能複合体のＣＤ３７促進アセンブリーのドミナントネガティブな阻害剤として作用する。したがって、Ｔｅｔｒａｎａｂは、Ｂ細胞のＣＤ３７依存性活性化を防ぐ。
【０５９８】
本発明の実施形態は、配列番号：４４のＴｅｔｒａｎａｂポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０５９９】
本発明の更なる実施形態は、Ｔ細胞依存性のＢ細胞応答を防ぐ生物活性を有するＴｅｔｒａｎａｂポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０６００】
本発明の更なる実施形態は、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドをコードする配列番号：４３のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６０１】
本発明の更なる実施形態は、Ｔ細胞依存性のＢ細胞応答を防ぐ生物活性を有するＴｅｔｒａｎａｂポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６０２】
本発明の更なる実施形態は、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドを認識する抗体を含む組成物に関する。その抗体は、ＴｅｔｒａｎａｂのＣ末端側９個のアミノ酸の１つまたは複数を含むエピトープを認識することが好ましく、その末端側９個のアミノ酸の１つまたは複数は抗体結合に必要とされる。その抗体はＴｅｔｒａｎａｂに特異的に結合するが、ＣＤ３７には特異的に結合しないことが好ましい。本明細書で使用される、抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体は、Ｔｅｔｒａｎａｂ特異的抗体またはその抗原結合断片を意味する。
【０６０３】
本発明は、結合を生じさせる条件下にて、前記抗体または抗原結合断片とＴｅｔｒａｎａｂポリペプチドを接触させる段階を含む、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドにかかる抗体を結合させる方法にも関する。かかる条件は、当業者にはよく知られている。かかる方法は、本明細書に述べられているように、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドを検出するのに、またはＢ細胞を精製するのに有用である。
【０６０４】
本発明の実施形態は、生体試料においてＴｅｔｒａｎａｂポリペプチドを検出する方法に関し、前記方法は、ｉ）生体試料を抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体と接触させる段階；ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。その抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることが可能である。さらに、その抗体または抗体断片は一次的または二次的に、当技術分野で一般的な検出可能な化合物（例えば、放射性化合物、蛍光化合物、発光化合物、および酵素化合物）によって標識することができる。Ｂ細胞によるＴｅｔｒａｎａｂ発現のフローサイトメトリー分析において前記抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体または抗原結合断片を使用する方法がさらに好ましい。かかる方法は、本明細書においてさらに述べられるように、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドの存在を検出するための診断キットとして使用することができる。
【０６０５】
本発明の他の実施形態は、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットに関する。かかるキットは、ｉ）特異的にＴｅｔｒａｎａｂポリペプチドに結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体またはその断片；任意に、ｉｉ）形成された抗原-抗体複合体の検出を可能にする試薬；を備える。その抗体または抗体断片は、上述のように検出可能に標識されることが好ましい。任意の試薬は、検出可能なシグナルを提供し、抗体に結合するか、または前記抗体上の標識と反応することができる。抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体または抗原結合断片を含むキットは、非ホジキンリンパ腫を診断するのに、または非ホジキンリンパ腫の治療を受けている患者の状態をモニターするのに有用である。任意に、非ホジキンリンパ腫を診断するための前記キットは、リンパ腫を有する個体の試料、ならびに正常な個体からの対照試料を含む。
【０６０６】
他の好ましい実施形態は、抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体を用いて、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｖｏで検出する方法に関する。かかる方法は、腫瘍関与部位のイメージングに、特に非ホジキンリンパ腫のイメージングに非常に有用である。その開示内容全体が参照により組み込まれるBunn et al (Lancet 2: 1219-21 (1894))によって記述されているように、抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体に結合された111Ｉｎまたは131Ｉを用いて、イメージングを行うことが好ましい。この実施形態は、上述のキットなど、腫瘍イメージングに使用されるキットにも関する。
【０６０７】
本発明のさらに他の実施形態は、薬学的に許容される担体中の治療量の放射標識化抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体を投与する段階を含む、免疫療法の目的で抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体を使用する方法に関する。かかる方法は、非ホジキンリンパ腫および移植後のリンパ増殖性疾患を治療するために適用することができる。かかる方法では、90Ｙまたは131Ｉで標識することが好ましい。ラジオアイソトープは、当業者に公知の数多くの方法によって、例えばヨウ素同位体を抗体に直接に共有結合することによって、またはキレート化部位を抗体に共有結合し、キレート剤が金属同位体に配位できるようにすることによって、抗Ｔｅｔｒａｎａｂ抗体に結合することができる。投与経路は多種多様である。好ましい投与方法は、静脈内注入およびリンパ内投与経路、例えば皮下および筋肉内注入、またはリンパ管のカテーテル挿入である。適用される放射線量はかなりばらつきがある。リンパ腫を治療するための投与方法および投与計画は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５９５，７２１号に記述されるように決定することができる。
【０６０８】
本発明の好ましい態様は、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、Ｔｅｔｒａｎａｂの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。Ｔｅｔｒａｎａｂの発現を指示できるポリヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｎａｂ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｎａｂコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたＴｅｔｒａｎａｂタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０６０９】
本発明の実施形態は、Ｔｅｔｒａｎａｂ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＴｅｔｒａｎａｂ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。Ｔｅｔｒａｎａｂの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、Ｔｅｔｒａｎａｂポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ）ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＴｅｔｒａｎａｂ  ｍＲＮＡのレベルを比較する段階；を含む。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ）ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＴｅｔｒａｎａｂポリペプチドのレベルを比較する段階；を含む。Ｔｅｔｒａｎａｂの発現は、Ｂ細胞において測定されることが好ましい。
【０６１０】
その他の実施形態において、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドまたはその断片は、Ｔｅｔｒａｎａｂ活性を調節する化合物についてスクリーニングするために使用される。この方法は、ｉ）Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）Ｔｅｔｒａｎａｂ活性をモニターする段階と、を含む。Ｔｅｔｒａｎａｂ活性は、Ｂ細胞の活性化をモニターすることによって決定することができる。例えば、その開示内容全体が参照により組み込まれる米国特許第４，９８７，０８４号に記載のように、膜を横切るカルシウムイオン流入を測定することにより、Ｂ細胞の機能を決定することができる。
【０６１１】
Ｔｅｔｒａｎａｂの発現または活性を低減する試験物質は、Ｔｅｔｒａｎａｂの阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。Ｔｅｔｒａｎａｂの発現または活性を増加させる試験物質は、活性化剤またはアゴニストとして定義される。主題の発明のＴｅｔｒａｎａｂ活性の発現または活性を調節する作用物質には、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および抗体が含まれる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用することができる。
【０６１２】
本発明の更なる実施形態は、ＣＤ３７の作用を拮抗する方法であって、このためＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化が予防される方法に関する。かかる方法は、Ｔｅｔｒａｎａｂアゴニストを含む組成物とＢ細胞を接触させる段階を含む。本発明の組成物を細胞に直接投与することによって、Ｂ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置することができる。好ましい実施形態では、本発明は、Ｔｅｔｒａｎａｂアゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む、有効な抑制量の薬剤組成物を個体に投与する段階を含む、個体におけるＢ細胞の活性化を抑制する方法を提供する。Ｂ細胞の活性化を抑制する方法は、個体の免疫応答を抑制するのに有用な方法である。本発明の方法を用いた免疫応答の抑制は、移植拒絶反応を抑制すること、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、糖尿病、および薬剤誘発ループスなどの薬剤誘発自己免疫疾患）を有する個体を治療すること、またはアレルギー反応（例えば、喘息、枯草熱およびペニシリンアレルギーに対するアレルギー）を低減することに向けられることが好ましい。
【０６１３】
本発明の他の実施形態は、ＣＤ３７の作用を有利にする方法であって、このためＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化に必要な分子複合体が安定化される方法に関する。かかる方法は、Ｔｅｔｒａｎａｂアンタゴニストを含む組成物とＢ細胞を接触させる段階を含む。本発明のこの態様では、Ｔｅｔｒａｎａｂアンタゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む、有効な抑制量の薬剤組成物が、Ｂ細胞の活性化を高めるために個体に投与される。かかる方法は、免疫系の追加免疫が望まれる疾患、例えば免疫不全（例えば、重症複合免疫不全症）、様々な細菌もしくは真菌感染（例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、肝炎、麻疹およびヘルペスウイルス感染、マイコバクテリア、リーシュマニア属、マラリアおよびカンジダ感染）の治療に有用であり、かつ放射線治療または化学療法と関連する。
【０６１４】
ＴｅｔｒａｎａｂアゴニストまたはＴｅｔｒａｎａｂアンタゴニストを含む組成物は、当技術分野で公知の様々な許容可能な賦形剤を使用して調製することができる。通常、その組成物は、局所的、経口的に、または注入によって、静脈内に、または腹腔内に投与される。この投与を達成し、かつ投与計画を決定する方法は、当業者には公知である。
【０６１５】
その他の実施形態は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階；ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階；を含む、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドを作製する方法に関する。そのタンパク質の精製は、当業者に公知のいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、Ｔｅｔｒａｎａｂまたはその一部に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。精製された、かかるＴｅｔｒａｎａｂポリペプチドは例えば、上述の薬剤組成物を製造するのに有用である。本発明の好ましい態様は、Ｔｅｔｒａｎａｂポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、Ｔｅｔｒａｎａｂの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。Ｔｅｔｒａｎａｂの発現を指示できるポリヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｎａｂ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、Ｔｅｔｒａｎａｂコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。好ましい実施形態では、その組換え分子は、大腸菌細胞に、またはヒトＢ細胞に導入される。一方、その組換え分子は、ヒト細胞に導入される、Ｔｅｔｒａｎａｂ発現を増加させる異種プロモーターを含むベクターである。好ましい実施形態において、前記組換え分子は、動物、特に哺乳動物に導入される。前記組換え分子は、数種類の方法で動物に導入することが可能である。組換え分子を動物に導入する好ましい方法は、当技術分野で公知の手段、例えば形質転換、リポフェクション、微量注入、およびレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターの使用を含む形質導入によって、宿主細胞に組換え分子を導入する段階；動物に組換え細胞を投与する段階；を含む。例えば、その細胞は注入によって投与することができる。かかる方法は、例えば自己免疫疾患の治療に向けられる。代替方法としては、組換え分子は、配列番号：４３に相補的なｃＤＮＡまたはその一部をコードすることが可能であり、その方法は、例えば免疫不全の治療に用いることができる。
【０６１６】
他の好ましい実施形態では、前記組換え分子は、当業者に公知のいずれかの方法によって遺伝子導入モデル動物を確立するために使用される。例えば、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれるHogan et al. ("Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory)によって述べられているように、遺伝子導入マウスを確立することが可能である。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、上述の疾患などのヒト疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
配列番号：４６のタンパク質（内部指定クローン５００７２０８４０  ２０５−２０−１−０−Ｂ７−Ｆ）
クローン５００７２０８４０２０５−２０−１−０−Ｂ７−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：４５）は、アミノ酸配列：ＭＲＬＲＲＬＡＬＦＰＧＶＡＬＬＬＡＡＡＲＬＡＡＡＳＤＶＬＥＬＴＤＤＮＦＥＳＲＩＳＤＴＧＳＡＧＬＭＬＶＥＦＦＡＰＷＣＧＨＣＫＲＬＡＰＥＹＥＡＡＡＴＲＬＫＧＩＶＰＬＡＫＶＤＣＴＡＮＴＮＴＣＮＫＹＧＶＳＧＹＰＴＬＫＩＦＲＤＧＥＥＡＧＡＹＤＧＰＲＴＡＤＧＩＶＳＨＬＫＫＱＡＧＰＡＳＶＰＬＲＴＥＥＥＦＫＫＦＩＳＤＫＤＡＳＩＶＧＦＦＤＤＳＦＳＥＡＨＳＥＦＬＫＡＡＳＮＬＲＤＮＹＲＦＡＨＴＮＶＥＳＬＶＮＥＹＤＤＮＧＥＧＩＩＬＦＲＰＳＨＬＴＮＫＦＥＤＫＴＶＡＹＴＥＱＫＭＴＳＧＫＩＫＫＦＩＱＥＮＩＦＧＩＣＰＨＭＴＥＤＮＫＤＬＩＱＧＫＤＬＬＩＡＹＹＤＶＤＹＥＫＮＡＫＧＳＮＹＲＲＮＲＶＭＭＶＡＫＫＦＬＤＡＧＨＫＬＮＦＡＶＡＳＲＫＴＦＳＨＥＬＳＤＦＧＬＥＳＴＡＧＥＩＰＷＡＩＲＴＡＫＧＥＫＦＶＭＱＥＥＦＳＲＤＧＫＡＬＥＲＦＬＱＤＹＦＤＧＮＬＫＲＹＬＫＳＥＰＩＰＥＳＮＤＧＰＶＫＶＶＶＡＥＮＦＤＥＩＶＮＮＥＮＫＤＶＬＩＥＦＹＡＰＷＣＧＨＣＫＮＬＥＰＫＹＫＥＬＧＥＫＬＳＫＤＰＮＩＩＡＫＭＤＡＴＡＮＤＶＰＳＰＹＥＶＲＧＦＰＴＩＹＦＳＰＡＮＫＫＬＮＰＫＫＹＥＧＧＲＥＬＳＤＦＩＳＹＬＱＲＥＡＴＩＰＰＶＩＱＥＥＫＰＫＫＫＫＫＡＱＥＤＬを含む、配列番号：４６のＰＤＩタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４６のポリペプチドのすべての特性および使用は、クローン５００７２０８４０２０５−２０−１０−Ｂ７−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４５のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン５００７２０８４０２０５−２０−１０−Ｂ７−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４５、配列番号：４６、およびクローン５００７２０８４０２０５−２０−１０−Ｂ７−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６１７】
配列番号４６のタンパク質、ＰＤＩは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ３前駆体（アクセッション番号Ｕ４２０６８）の多型変異体である。本発明のタンパク質は、２つのチオレドキシンドメイン：ＡＳＤＶＬＥＬＴＤＤＮＦＥＳＲＩＳＤＴＧＳＡＧＬＭＬＶＥＦＦＡＰＷＣＧＨＣＫＲＬＡＰＥＹＥＡＡＡＴＲＬＫＧＩＶＰＬＡＫＶＤＣＴＡＮＴＮＴＣＮＫＹＧＶＳＧＹＰＴＬＫＩＦＲＤＧＥＥＡＧＡＹＤＧＰＲＴＡＤＧＩＶＳＨＬＫＫＱＡＧ;およびＤＧＰＶＫＶＶＶＡＥＮＦＤＥＩＶＮＮＥＮＫＤＶＬＩＥＦＹＡＰＷＣＧＨＣＫＮＬＥＰＫＹＫＥＬＧＥＫＬＳＫＤＰＮＩＶＩＡＫＭＤＡＴＡＮＤＶＰＳＰＹＥＶＲＧＦＰＴＩＹＦＳＰＡＮＫＫＬＮＰＫＫＹＥＧＧＲＥＬＳＤＦＩＳＹＬＱＲＥＡＴを示す。また、ＰＤＩの５０５アミノ酸のタンパク質は、１つの膜貫通セグメント：ＳＤＴＧＳＡＧＬＭＬＶＥＦＦＡＰＷＣＧＨＣを示す。
【０６１８】
チオレドキシンファミリーの活性部位タンパク質は、酸化還元反応に関与するタンパク質のスーパーファミリーであり、広範囲の生物の間に分布する。チオレドキシンの還元型は、それらの活性を制御するジスルフィド架橋を還元することによって、いくつかの酵素を活性化することが知られている。さらに、チオレドキシンは、リボヌクレオチドレダクターゼによって触媒される、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに還元する反応配列における電子供与体である。ヒトにおいて、チオレドキシンおよびチオレドキシンによって修飾される細胞の酸化還元状態は、アテローム性動脈硬化症における動脈の新内膜（arterial neointima）の形成で重要な役割を担うことが報告されている。チオレドキシンは、酸化的損傷に対する細胞の防御機構に関与する。チオレドキシンは、細胞の酸化的ストレス応答経路に対するグルココルチコイド応答性の制御にもまた関与している。特に、チオレドキシンは、細胞の酸化還元状態を感知し、受容体のリガンド結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインの両方を標的化することによって、グルココルチコイド受容体にその酸化還元状態を伝達することができる。ヒトチオレドキシンは、ラジカル補足剤として働くことが示唆されており、再潅流障害の程度を抑えることが示されている。チオレドキシンに対する多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ基質が同定されており、例えば、リボヌクレアーゼ、絨毛性ゴナドトロピン、凝固因子、グルココルチコイド受容体、およびインスリンが挙げられる。
【０６１９】
ＰＤＩは、反応状態に応じて、チオールの酸化、ジスルフィド結合の還元およびジスルフィドの異性化を触媒する、チオレドキシンファミリー活性部位含有タンパク質のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのクラスに属する。ＰＤＩは、新生タンパク質での正確なジスルフィド対の形成を触媒する。ＰＤＩは優先的に、システイン残基を含有するペプチドと相互作用するが、その他は区別しない。ＰＤＩの広範な基質特異性から、多様なジスルフィド含有タンパク質の折り畳みを速くすることが可能となる。ジスルフィド結合をシャッフリングすることによって、ＰＤＩによって、タンパク質は、利用可能なシステイン残基の中で最も熱力学的安定性が高い対をすぐに見つけることができる。その結果、ＰＤＩは、タンパク質のプロセシング、タンパク質の折り畳み、およびタンパク質分泌に関与する。ＰＤＩは、コラーゲンおよびコラーゲン様タンパク質生合成に関与し、ＰＤＩの突然変異はエーラース・ダンロス症候群を引き起こす。
【０６２０】
本発明の実施形態は、配列番号：４６のＰＤＩポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０６２１】
本発明の更なる実施形態は、システイン残基を有するペプチドに結合する生物活性を有するＰＤＩポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０６２２】
本発明の更なる実施形態は、ＰＤＩポリペプチドをコードする配列番号：４５のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６２３】
本発明の更なる実施形態は、システイン残基を有するペプチドに結合する生物活性を有するＰＤＩポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６２４】
本発明の好ましい態様は、ＰＤＩポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＰＤＩの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＰＤＩの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＰＤＩ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＰＤＩコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたＰＤＩタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０６２５】
チオール種を酸化する方法は、ＰＤＩポリペプチドを、還元されたシステイン残基を有するペプチドと接触させる段階を含む。チオールは、ジスルフィド結合に酸化されることが好ましい。そのジスルフィド結合は正確に異性化されることがさらに好ましい。この方法は、コラーゲン／コラーゲン様タンパク質配列を含有するタンパク質配列の組換え体の作製に適用することができる。
【０６２６】
本発明の好ましい態様は、ＰＤＩポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＰＤＩの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＰＤＩの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＰＤＩ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＰＤＩコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。
【０６２７】
本発明の実施形態は、ＰＤＩポリペプチドを含む組成物に関する。ＰＤＩポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする段階；ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階；を含む。そのタンパク質の精製は、当業者に公知のいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ＰＤＩまたはその一部に対して作られる抗体、好ましくは、そのポリペプチドのチオレドキシンドメインに対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムが形成される。
【０６２８】
本発明の他の実施形態は、タンパク質分子内ジスルフィド結合を還元するために、単独で、または還元剤もしくは還元系と組み合わせて、ＰＤＩを使用する方法を提供する。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１１３，９５１号にさらに記載されるように、生地の強度、およびパン粉の質、柔らかさ、より高いパンの体積など、パンの特性を改善するために、穀粉または種子中に存在するグルテニンまたはグリアジンと組み合わせて、ＰＤＩを使用することができる。
【０６２９】
１つまたは複数の分子内シスチンを有する毒性タンパク質を還元する方法であって、そのタンパク質を還元するのに有効な量のＰＤＩと毒性タンパク質を接触させる段階と、１つまたは複数のジスルフィド架橋を還元し、かつ毒性タンパク質を変性させるのに十分な時間、接触を維持する段階と、を含む方法がさらに好ましい（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１１３，９５１号にさらに記述されている）。
【０６３０】
一実施形態において、ＰＤＩは、１種または複数種の目的のタンパク質を作製するために使用される宿主細胞において１種または複数種の目的のタンパク質と共発現することができる。ＰＤＩの共発現により、宿主細胞から得られる、正確に折り畳まれたタンパク質の量が増加する。この方法において、ＰＤＩを発現する第１ベクターおよび目的タンパク質を発現する第２ベクターが、従来の方法を用いて宿主細胞に導入され、発現に続いて、目的タンパク質が収集される。
【０６３１】
その他の実施形態において、プロセシング中にＰＤＩをタンパク質試料に添加して、タンパク質のプロセシング効率を高めることが可能である。タンパク質のプロセシングは、宿主細胞における少なくとも１種類の目的タンパク質の発現に続いて行われ、精製、再生、可溶化段階、または目的タンパク質を純粋な状態および活性状態で得るために用いられる他のいずれかの段階を含み得る。この実施形態では、これらの段階中にＰＤＩを添加して、例えば、タンパク質の酸化、凝集、または不適当な折り畳みから結果として生じるタンパク質の損失を最小限にすることができる。添加されるＰＤＩの量は通常の方法を用いて、当業者によって決定することが可能であり、タンパク質の損失を低減するのに十分な量となるだろう。
【０６３２】
他の実施形態では、本発明は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６１９０７２３号に記載のように、ＰＤＩによって食物アレルゲンを中和する方法を提供する。アレルゲンの食物タンパク質のアレルゲン性を減少させる方法は、タンパク質のアレルゲン性を減少させるのに有効な、ある量のＰＤＩ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−ホスフェートチオレドキシンレダクターゼおよびＮＡＤＰＨ、またはある量のＰＤＩおよびジチオスレイトールと、そのタンパク質を接触させる段階を含む。
【０６３３】
その他の実施形態では、本発明は、食物タンパク質の消化性を高める方法を提供する。この方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９５２，０３４号に記載のように行うことができる。食物タンパク質の消化性を高める方法は、食物の消化性を高めるのに有効な、ある量のＰＤＩ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート−チオレドキシンレダクターゼ（ＮＴＲ）およびＮＡＤＰＨで食物を処理する段階を含む。
【０６３４】
本発明の実施形態は、ＰＤＩ発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のＰＤＩ発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ＰＤＩの発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ＰＤＩポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ）ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＰＤＩ  ｍＲＮＡのレベルを比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるように特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ）ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるＰＤＩポリペプチドのレベルを比較する段階；を含む。ＰＤＩの発現は、Ｂ細胞において測定されることが好ましい。本発明は、本明細書に述べるように、特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。この方法は、ＰＤＩに関連する疾患の診断に適用することができる。例えば、異常に高いレベルのＰＤＩは、肺癌、結腸癌、子宮頚癌および肝細胞癌などの原発腫瘍が存在することを表す。
ＰＤＩの過剰発現は、疾患の疾患の発生において役割を担う。ＰＤＩの過剰発現の増加は、シェーグレン症候群、白血病細胞およびリンパ腫細胞の増殖の増加、およびウイルス形質転換細胞の増殖と関連する。ＰＤＩの欠損は、限定されないが、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、喘息、アレルギー、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、ヘルマンスキー・パドラック症候群、アルツハイマー病、および外傷、虚血、低酸素、放射線暴露および紫外線暴露によって生じる組織への損傷を含む、免疫疾患と関連する。
【０６３５】
他の実施形態において、ＰＤＩポリペプチドまたはその断片を用いて、ＰＤＩ活性を活性化または抑制する化合物についてスクリーニングすることができる。この方法は、ｉ)ＰＤＩポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階と、ｉｉ）ＰＤＩ活性をモニターする段階と、を含む。
【０６３６】
ＰＤＩの発現または活性を低減する試験物質は、ＰＤＩの阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ＰＤＩの発現または活性を増加させる試験物質は、活性化剤またはアゴニストとして定義される。ＰＤＩの阻害剤には、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および抗体が含まれる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用することができる。異常なＰＤＩの発現によって特徴付けられる疾患は、心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症、虚血再潅流障害、心肥大、高血圧、冠動脈疾患、心筋梗塞、不整脈、心筋症、およびうっ血性心不全；結合組織障害、例えばエーラース・ダンロス症候群；肝障害、例えばアルコール性肝疾患、肝硬変および肝癌である。
【０６３７】
他の実施形態では、スクリーニングアッセイによって同定されるＰＤＩ活性に対して刺激もしくは抑制効果を有する本発明のタンパク質ならびに作用物質、または修飾因子を個体に投与して、異常なＰＤＩ活性と関連する、本明細書に記載の疾患を（予防的または治療的に）治療することができる。
【０６３８】
本発明の他の実施形態において、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて化合物ライブラリーをスクリーニングするために、ＰＤＩ、その触媒断片またはその免疫原性断片またはそのオリゴペプチドを使用することができる。かかるスクリーニングで用いられる断片は、溶液中で遊離であり、固体担体に固定化され、細胞表面上に位置するか、または細胞内に位置し得る。ＰＤＩと試験される作用物質との間の結合性複合体の形成を測定することが可能である。用いられる薬物スクリーニングのその他の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号：Ｗ０８４/０３５６４に記載のように、対象のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。この方法では、ＰＤＩに適用されるように、非常に多くの小さな異なる試験化合物が、プラスチックピンなどの固体基質または一部の他の表面上に合成される。その試験化合物を、ＰＤＩ、またはその断片と反応させ、洗浄する。次いで、当技術分野でよく知られている方法によって、結合したＰＤＩを検出する。精製されたＰＤＩもまた、上述の薬物スクリーニングに使用するためにプレート上に直接コーティングされる。代替方法としては、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、固体担体上にそれを固定化することができる。
【０６３９】
他の実施形態において、ＰＣＩに結合することができる中和抗体がＰＤＩに結合する試験化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイが用いられる。この手法では、１つまたは複数の抗原決定基をＰＤＩと共有するいずれかのペプチドの存在を検出するために、その抗体を使用することができる。
【０６４０】
一実施形態では、ＰＤＩまたはその生物活性断片が、ＰＤＩの欠損と関連する病状または疾患の治療のために対象に投与される。これらの疾患としては、限定されないが、脳癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、および甲状腺癌、および限定されないが、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、喘息、アレルギー、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、ヘルマンスキー・パドラック症候群、アルツハイマー病、および外傷、虚血、低酸素、放射線暴露および紫外線暴露によって生じる組織への損傷などの免疫疾患および感染症が挙げられる。
【０６４１】
他の実施形態では、ＰＤＩまたはその断片もしくは誘導体を発現することができるベクターもまた、上述の疾患または病状を治療または予防するために投与される。
【０６４２】
一実施形態において、ＰＤＩのアゴニストが、上述の疾患または病状を治療または予防するために投与される。
【０６４３】
他の実施形態では、ＰＤＩをコードするポリヌクレオチドのアンチセンスを発現するベクターが、ＰＤＩの過剰発現と関連する病状または疾患を治療または予防するために、対象に投与される。かかる病状または疾患としては、白血病、シェーグレン症候群、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢウイルス）、ヒト免疫不全ウイルスが挙げられる。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開番号：ＷＯ９９/３８９６３に、一例が記載されている。
【０６４４】
本発明の他の実施形態は、当業者に公知のいずれかの方法によって、遺伝子導入動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するために、本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を用いた組成物および方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、癌などのヒトホルモン依存性疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となると考えられる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
【０６４５】
他の実施形態において、ＰＤＩのヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝的突然変異または欠失の効率的なスクリーニングを行うことができる。そのマイクロアレイを使用して、非常に多くの遺伝子の発現レベルを同時にモニターし、遺伝的変異体（variant）、突然変異（mutation）、および多型を同定することができる。この情報を用いて、遺伝子機能を決定すること、疾患の遺伝的基礎を理解すること、疾患を診断すること、および治療薬の活性を発生させ、かつモニターすることが可能である（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる Chee, M. et al., Science, 274: 610-614 (1996)参照）。例えば、ＰＤＩの突然変異は、エーラース・ダンロス症候群の原因となる。
配列番号：４８のタンパク質（内部指定クローン１４６８２１  １０６−０２０−１−０−Ｇ３−Ｆ）
クローン１４６８２１＿１０６−０２０−１−０−Ｇ３−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：４７）は、アミノ酸配列：ＭＬＶＭＹＬＬＡＡＬＦＧＹＬＴＦＹＧＥＶＥＤＥＬＬＨＡＹＳＫＶＹＴＬＤＩＰＬＬＭＶＲＬＡＶＬＶＡＶＴＬＴＶＰＩＶＬＦＰＩＲＴＳＶＩＴＬＬＦＰＫＲＰＦＳＷＩＲＨＦＬＩＡＡＶＬＩＡＬＮＮＶＬＶＩＬＶＰＴＩＫＹＩＦＧＦＩＧＡＳＳＡＴＭＬＩＦＩＬＰＡＶＦＹＬＫＬＶＫＫＥＴＦＲＳＰＱＫＶＧＡＬＩＦＬＶＶＧＩＦＦＭＩＧＳＭＡＬＩＩＩＤＷＩＹＤＰＰＮＳＫＨＨを含む、配列番号：４８のＮＢＡＲＴタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４８のポリペプチドのすべての特性および使用は、１４６８２１＿１０６−０２０−１−０−Ｇ３−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４７のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン４６８２１＿１０６−０２０−１−０−Ｇ３−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４７、配列番号：４８、およびクローン４６８２１＿１０６−０２０−１−０−Ｇ３−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６４６】
ＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）およびＡＲＦ様（ＡＲＬ）タンパク質は、調節ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリー内のＡＲＦファミリーを含む。このスーパーファミリーのメンバーは、１種または複数種の酵素活性を直接活性化することができる、またはさらに複雑な多サブユニット複合体の動員および構築をコーディネートすることができるシグナル伝達において分子ノード（molecular node）として機能する。ＡＲＬ２は、ＡＲＦ様遺伝子の機能的に異なるグループのメンバーである。ＡＲＬ２は、ＧＴＰに迅速に結合し、それを加水分解する。ＧＤＰ結合型において、ＡＲＬ２は、チューブリン特異的シャペロン補助因子Ｄと相互作用する。この相互作用は、過剰発現した補助因子Ｄによるチューブリンおよび微小管の破壊を防ぐ。補助因子ＤのチューブリンＧＴＰアーゼ活性化タンパク質の活性もまた、ＡＲＬ２の結合によって抑制される。この相互作用は、微小管動力学の調節にＡＲＬ２が寄与するのを防ぐ。ＮＢＡＲＴは、高親和性を有するＡＲＬ２−ＧＴＰに特異的に結合するが、ＡＲＬ２−ＧＤＰとは相互作用しない。
【０６４７】
本発明の実施形態は、配列番号：４８のＮＢＡＲＴポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０６４８】
本発明の更なる実施形態は、ＡＲＬ２に結合する生物活性を有するＮＢＡＲＴポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０６４９】
本発明の更なる実施形態は、ＮＢＡＲＴポリペプチドをコードする配列番号：４７のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６５０】
本発明の更なる実施形態は、ＡＲＬ２に結合する生物活性を有するＮＢＡＲＴポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６５１】
本発明の好ましい態様は、ＮＢＡＲＴポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＮＢＡＲＴの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＮＢＡＲＴの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＮＢＡＲＴ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＮＢＡＲＴコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたＮＢＡＲＴタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０６５２】
本発明の好ましい実施形態は、ＡＲＬ２に結合させるためにＮＢＡＲＴを使用する方法である。この方法は、ＮＢＡＲＴの結合を生じさせる条件下にて、ＮＢＡＲＴポリペプチドまたはその活性断片をＡＲＬ２タンパク質と接触させる段階を含み、結合によってＡＲＬ２の活性が抑制される。
【０６５３】
本発明の好ましい実施形態は、ＡＲＬ２を精製する方法である。この方法は、結合を生じさせる条件下にて、ＮＢＡＲＴポリペプチドまたはその活性断片をＡＲＬ２と接触させる段階；混入物を除去する段階；さらに厳密な条件を用いてＡＲＬ２を溶出する段階；を含む。ＮＢＡＲＴペプチドを固体または半固体マトリックス上に固定化して、試料の洗浄を容易にし、混入物を除去することが好ましい。
【０６５４】
本発明の好ましい実施形態は、ＡＲＬ２を検出する方法である。この方法は、ＮＢＡＲＴポリペプチドまたはその活性断片をＡＲＬ２と接触させる段階と、ＮＢＡＲＴを検出することによって前記ＡＲＬ２の存在を検出する段階と、を含む。ＮＢＡＲＴポリペプチドは、例えば蛍光化合物、発光化合物、または放射性化合物で標識されることが好ましい。ＡＲＬ２は、細胞培地および体液などの生物体液において検出されることが好ましい。この方法は、細胞試料または個体におけるＡＲＬ２の発現レベルを定量化するために適用することが可能である。この情報は、限定されないが、癌、ヒト多発性嚢胞腎、ダウン症候群などの微小管関連疾患の決定に有用であり得る。
【０６５５】
その他の好ましい態様は、ＮＢＡＲＴの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＮＢＡＲＴの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＮＢＡＲＴ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＮＢＡＲＴコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。
【０６５６】
本発明の更なる態様は、ＮＢＡＲＴの単離および精製を含む。本発明の実施形態は、ＮＢＡＲＴポリペプチドを含む組成物に関する。ＮＢＡＲＴポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階；ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階；を含む。ＮＢＡＲＴは、当業者に公知の、または本明細書に開示されるいずれかの技術に従って単離することができる。ＮＢＡＲＴまたはその断片に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することが好ましい。
配列番号：５０のタンパク質（内部指定クローン６４４７２４  １８１−２１−１−０−Ａ１２−Ｆ）
クローン６４４７２４＿１８１−２１−１−０−Ａ１２−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：４９）は、アミノ酸配列：ＭＨＰＦＹＴＲＡＡＴＭＩＧＥＩＡＡＡＶＳＦＩＳＫＦＬＲＴＫＧＬＴＳＥＲＱＬＱＴＦＳＱＳＬＱＥＬＬＡＥＨＹＫＨＨＷＦＰＥＫＰＣＫＧＳＧＹＲＣＩＲＩＮＨＫＭＤＰＬＩＧＱＡＡＱＲＩＧＬＳＳＱＥＬＦＲＬＬＰＳＥＬＴＬＷＶＤＰＹＥＶＳＹＲＩＧＥＤＧＳＩＣＶＬＹＥＡＳＰＡＧＧＳＴＱＮＳＴＮＶＱＭＶＤＳＲＩＳＣＫＥＥＬＬＬＧＲＴＳＰＳＫＮＹＮＭＭＴＶＳＳを含む、配列番号：５０のＮＢＴＧタンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：５０のポリペプチドのすべての特性および使用は、６４４７２４＿１８１−２１−１−０−Ａ１２−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：４９のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン６４４７２４＿１８１−２１−１−０−Ａ１２−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：４９、配列番号：５０、およびクローン６４４７２４＿１８１−２１−１−０−Ａ１２−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６５７】
ＮＢＴＧは、Ｂ細胞転座遺伝子１タンパク質（アクセッション番号Ｐ３１６０７）の多型変異体である。本発明のタンパク質は、抗増殖性ドメイン:ＩＧＥＩＡＡＡＶＳＦＩＳＫＦＬＲＴＫＧＬＴＳＥＲＱＬＱＴＦＳＱＳＬＱＥＬＬＡＥＨＹＫＨＨＷＦＰＥＫＰＣＫＧＳＧＹＲＣＩＲＩＮＨＫＭＤＰＬＩＧＱＡＡＱＲＩＧＬＳＳＱＥＬＦＲＬＬＰＳＥＬＴＬＷＶＤＰＹＥＶＳＹＲＩＧＥＤＧＳＩＣＶＬＹＥＡＳＰＡＧＧＳＴＱＮＳＴＮＶＱＭＶＤＳＲＩＳＣＫＥＥＬＬＬＧＲＴＳＰＳＫＮＹＮＭＭＴＶＳＳを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、抗増殖性ドメインを含むポリペプチドに関する。
【０６５８】
細胞増殖を負に制御する能力は、すべての生物に必要である。単細胞生物は、適切な栄養素および他の環境要因が存在する時まで、それらの複製を制限しなければならず、多細胞生物は正確に形をとり、かつそれらの構成組織の構造を維持しなければならない。多細胞生物において、発達期間中の成長の適切な負の制御が失敗すると、その結果、致命的な奇形が生じ得る。発達後の期間においては、かかる失敗によって、新形成が起こり得る。負の制御は非常に重要であることから、その役割が活発に増殖を抑制する、特定の遺伝子が進化した。
【０６５９】
ＮＢＴＧは、抗増殖性遺伝子のファミリーのメンバーである。ＮＢＴＧは、成長誘発因子に対抗するのに重要であり、細胞分裂の制御においてプロトオンコジーンと同じ重要性を有する。ＮＢＴＧの減少は、不規則な細胞分化および増殖と、または胚の発達の変化と関連する。ＮＢＴＧは、過剰発現した場合にＮ１Ｈ３Ｔ３細胞増殖をダウンレギュレートする。ＮＢＴＧ遺伝子は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病における染色体転座に関与する。ＮＢＴＧは、刺激を受けると細胞周期に再び入る可能性がある非分裂細胞を含有する組織（リンパ組織、肝臓、血漿）において発現する。しかしながら、脳および筋肉などの完全に分化した組織中では、ＮＢＴＧをほとんど検出することができない。
【０６６０】
本発明の実施形態は、配列番号：５０のＮＢＴＧポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０６６１】
本発明の更なる実施形態は、細胞増殖を抑制する生物活性を有するＮＢＴＧポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０６６２】
本発明の更なる実施形態は、ＮＢＴＧポリペプチドをコードする配列番号：４９のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６６３】
本発明の更なる実施形態は、細胞増殖を抑制する生物活性を有するＮＢＴＧポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６６４】
本発明の更なる実施形態は、ＮＢＴＧポリペプチドまたは生物活性を有するＮＢＴＧポリペプチド断片に対して作られる抗体を含む組成物に関する。その抗体は、非線状エピトープを認識し、ＮＢＴＧのＣ末端配列に特異的に結合することが好ましい。
【０６６５】
本発明の好ましい態様は、ＮＢＴＧポリペプチドまたはその生物活性断片をコードするポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。その他の好ましい態様は、ＮＢＴＧの発現を指示することができるポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体である。ＮＢＴＧの発現を指示できるポリヌクレオチドは、ＮＢＴＧ遺伝子の５’調節領域に位置することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、ＮＢＴＧコード領域の５００塩基対内に位置することがさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドは、プロモーター配列を含むことが好ましい。内因性配列にポリヌクレオチド配列を導入するための、当技術分野で公知の技術は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６７０号および国際公開番号：Ｗ０９６２９４１１に記述されている。前記宿主細胞によって産生されたＮＢＴＧタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出および精製方法ならびに診断およびｉｎ ｖｉｖｏ用途に使用することができる。
【０６６６】
本発明の実施形態は、ＮＢＴＧポリペプチドを含む組成物に関する。ＮＢＴＧポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階；ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階；を含む。このタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。ＮＢＴＧまたはその断片に対して作られる抗体、さらに好ましくはＮＢＴＧポリペプチドのＣ末端配列に対して作られる抗体をクロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することが好ましい。
【０６６７】
他の実施形態において、本発明は、ＮＢＴＧ ｍＲＮＡの発現レベルを検出するための方法および組成物を提供する。ＮＢＴＧポリペプチドのｍＲＮＡレベルの定量化は、本発明のタンパク質の変化した発現と関連する疾患の診断または予後に有用である。変化した発現と関連する病状、疾患または障害としては、限定されないが、異常細胞増殖、例えば癌、乾癬、血管増殖性疾患、線維性疾患、および光線性病変が挙げられる。本発明のタンパク質のｍＲＮＡを検出かつ定量化するためのアッセイは、当技術分野でよく知られている(例えば、Maniatis, Fitsch and Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982), またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (Eds), Wiley & Sons, Inc. 参照)。例えば、その核酸分子またはプローブを標準法によって標識し、ハイブリダイゼーション複合体形成の条件下にて、患者由来の生体試料に添加することができる。インキュベーション期間の後、試料を洗浄し、ハイブリダイゼーションと関連する標識（またはシグナル）の量を定量化し、標準値と比較する。患者試料における標識の量が標準値と比較して著しく変化している場合には、次いで、関連する病状、疾患または障害が存在することが示される。動物の研究および臨床試験において特定の治療的処置の有効性を評価するために、かつ個々の患者の治療をモニターするために、かかるアッセイを用いることもできる。病状の存在が確立され、治療プロトコールが開始されたら、かかるアッセイを定期的に繰り返し行い、患者における発現レベルが、正常な対象において観察されるレベルに近似し始めるかどうかを決定することが可能である。連続的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたる治療の有効性を示すことができる。
【０６６８】
他の実施形態では、本発明は、特定の生体試料中に存在するＮＢＴＧのレベルを検出かつ定量化する方法および組成物に関する。これらの方法は、本発明のタンパク質の変化したレベルと関連する疾患または予後に有用である。ＮＢＴＧを検出するための診断アッセイには、器官または組織切片からの細胞の、腫瘍または正常組織からの細胞の吸引液の生検、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイが必要である。さらに、アッセイは、器官、組織、細胞、尿からの細胞抽出物、または血清または血液または他のいずれかの体液または抽出物で行われる。特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた、ＮＢＴＧポリペプチドの検出および定量化は、当技術分野で公知である。かかる技術の例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０６６９】
ＮＢＴＧは増殖抑制能力を有し、したがって、異常細胞増殖および悪性病状と関連する疾患または病理的病状の治療に利用することができる。このポリペプチドを用いて、腫瘍成長および細胞増殖を抑制することが可能である。創傷治癒部位に傷跡がつくのを防ぐために、ＮＢＴＧを利用することもできる。バルーン血管形成術後の動脈壁の再狭窄、または再閉塞もまた、細胞増殖によって動脈が再閉塞した場合と同様に、ＮＢＴＧで処置することが可能である。同様に、腫瘍への血管形成が抑制される。
【０６７０】
一実施形態において、ＮＢＴＧまたはその生物活性断片が、変化したＮＢＴＧ発現または活性と関連する病状を治療または予防するために投与される。かかる病状の例には、限定されないが、上述の病状が含まれる。ＮＢＴＧポリペプチドを含む組成物は、例えば腫瘍成長、内皮細胞増殖、および腫瘍成長に関連する血管形成などの異常な、または望ましくない細胞増殖を有する個体に投与されることが最も好ましい。本発明の組成物で治療することができる腫瘍としては、限定されないが、神経膠腫、メラニン欠乏性黒色腫、前立腺腫瘍および肺腫瘍が挙げられる。
【０６７１】
他の実施形態では、薬剤担体と共に、実質上精製されたＮＢＴＧポリペプチドを含む薬剤組成物を対象に投与して、限定されないが上述の病状など、内因性タンパク質の変化した発現または活性と関連する病状を治療または予防することができる。
【０６７２】
その他の実施形態では、ＮＢＴＧの活性を調節する物質を対象に投与して、限定されないが上述の病状など、ＮＢＴＧポリペプチドの変化した寿命、発現または活性と関連する病状を治療または予防することができる。一実施形態では、ＮＢＴＧに特異的に結合する抗体が、限定されないが肝臓細胞などの、ＮＢＴＧを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ、標的化および送達メカニズムとして使用される。
【０６７３】
主題の本発明の他の実施形態は、本発明のタンパク質の活性を選択的に増加させる組成物および方法を提供する。ＮＢＴＧが活性化されることによって、ＮＢＴＧ活性と関連する疾患または生化学的異常を上手く治療し、かつ／または管理することが可能となる。本発明のタンパク質の発現または活性を増加させることができるアゴニストは、限定されないが癌、乾癬、血管増殖性疾患、線維性疾患、および光線性病変などの細胞増殖に関連する疾患の治療において有用である。一方、ＮＢＴＧの発現または活性を低減することができるアンタゴニストは、不十分な細胞増殖によって特徴付けられる病状の治療において有用である。治療される病状としては、例えば骨粗鬆症、脆弱な皮膚および不十分な創傷治癒が挙げられる。
【０６７４】
その他の実施形態において、ＮＢＴＧまたは好ましい断片を発現することができるベクターを対象に投与して、限定されないが上述の病状などの、本発明のタンパク質の変化した寿命、発現または活性と関連する病状を治療または予防することができる。ＮＢＴＧ遺伝子および遺伝子産物もまた、細胞成長の調節に用いることが可能である。その増殖抑制効果のために、それらを選択的に投与すること、あるいは、特定の細胞が増殖することが望まれる場合には、もしかするとそれらを抑制することができる可能性がある。一例としては、特定の細胞の生産不足に関連する疾患が挙げられ、れらの細胞の増殖および分化は、上記の疾患を治療する助けとなるだろう。  一部の実施形態において、本発明は、ＮＢＴＧポリペプチドの存在をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出するための診断キットにも関する。このキットは、ＮＢＴＧポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはその断片；任意に、ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬；を備える。その抗体または抗体断片は、上述のように検出可能に標識されることが好ましい。かかる標識としては、蛍光化合物、発光化合物、および放射性化合物、ならびに酵素基質が挙げられる。任意の試薬は、検出可能なシグナルを提供し、抗体に結合するか、または抗体上の標識と反応することができる。ＮＢＴＧ抗体は、骨粗鬆症、脆弱な皮膚および不十分な創傷治癒などの低増殖性疾患を診断するために用いることができる。かかる疾患を診断するために、適切な生体試料を試験して、産生されるＮＢＴＧのレベルを決定することができる。
【０６７５】
その他の実施形態において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の増殖を有効にブロックする方法、または細胞の成長を有効に抑制する方法を提供する。好ましくは、本発明を用いて、抑制されていない細胞増殖を阻止すること、およびできる限り多くの腫瘍細胞を取り除くことができる。その方法は、ＮＢＴＧに対して作られるアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与することによって行われるだろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に送達するための１つの戦略は、カチオン性リポソームなどのリポソーム中に治療学的生理活性分子を封入するか、または取り込むことを含む。これらのリポソームは、ｉｎ ｖｉｖｏでヌクレオチド分解に対するシールドを提供することが知られており、体の特定の領域に標的化することができ、そのポイントで、それらは内容物をゆっくりと放出する。一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドに作動可能に連結されるプラスミドＤＮＡを含む、ポリヌクレオチドコンストラクトを使用することができる。そのヌクレオチド配列は、当業者に公知の適切なバッファーまたは担体溶液中にてｉｎ ｖｉｖｏで投与される。
【０６７６】
本発明の他の実施形態は、当業者に公知のいずれかの方法によって、遺伝子導入動物（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）、ハツカネズミ（M. musculus））を確立するために、本発明のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を用いた組成物および方法に関する。薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、癌などのヒトホルモン依存性疾患を模倣する動物モデルを作製することができる。したがって、これらの動物モデルによって、疾患の治療に用いられる潜在的な治療薬を同定することが可能となると考えられる。さらに、これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
配列番号：５２のタンパク質（内部指定５８３７０２  １８１−８−４−０−Ｃ８−Ｆ）
５８３７０２＿１８１−８−４−０−Ｃ８−ＦのｃＤＮＡ（配列番号：５１）は、アミノ酸配列：ＭＰＬＰＬＰＳＡＦＶＬＳＡＬＱＰＳＰＴＨＳＳＳＮＴＱＲＬＰＤＲＶＴＧＧＦＳＶＮＧＱＬＩＧＮＫＡＲＳＰＧＱＨＤＧＴＹＦＧＲＬＧＩＡＮＰＡＴＤＦＱＬＥＶＴＰＱＮＩＴＬＮＰＧＦＧＧＰＶＦＳＷＲＤＱＡＶＬＲＱＤＧＶＷＴＩＮＫＫＲＮＬＷＳＶＤＤＧＧＴＦＥＷＬＨＲＶＷＫＧＳＳＶＨＱＤＦＬＧＦＹＶＬＤＳＨＲＭＳＡＲＴＨＧＬＬＧＱＦＦＨＰＩＧＦＥＶＳＤＩＨＰＧＳＤＰＴＫＰＤＡＴＭＶＶＲＮＲＲＬＴＶＴＲＧＬＱＫＤＹＳＫＤＰＷＨＧＡＥＶＳＣＷＦＩＨＮＮＧＡＧＬＩＤＧＡＹＴＤＹＩＶＰＤＩＦを含む、配列番号：５２のｖＩＴＨ１タンパク質をコードする。したがって、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：５２のポリペプチドのすべての特性および使用は、５８３７０２＿１８１−８−４−０−Ｃ８−Ｆ中に含まれるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。さらに、本明細書全体にわたり記載されている配列番号：５１のポリヌクレオチドのすべての特性および使用は、クローン５８３７０２＿１８１−８−４−０−Ｃ８−Ｆ中のヒトｃＤＮＡを含む核酸にも関係することは理解されよう。本発明の好ましい実施形態は、配列番号：５１、配列番号：５２、およびクローン５８３７０２＿１８１−８−４−０−Ｃ８−Ｆの組成物に対して向けられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６７７】
配列番号：５１のｃＤＮＡは、ｖＩＴＨ１と呼ばれる配列番号：５２の２３９アミノ酸のタンパク質をコードする、ヒトインターα−トリプシン阻害剤（ＩＴＨ１）の重鎖１のスプライスバリアントである。インターα−トリプシンインヒビターは、哺乳動物におけるるＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターのスーパーファミリーに属する。軽鎖（ビクニン）に共有結合で連結された２本の重鎖(ＨＣ１およびＨＣ２)で構成されるポリペプチド鎖状構造を有するグリコシル化プロテアーゼ阻害剤である。ビクニンは、プロテアーゼ阻害剤として機能する。ｖＩＴＨ１ポリペプチドは、ビクニン結合部位を欠く、重鎖１の新規なスプライシングバリアントである。しかしながら、ＩＴＨ１はヒアルロン酸（ＨＡ）タンパク質に結合する。結合組織は、ＨＡの主要な哺乳類源であるが、細胞外マトリックス、軟骨、滑液においても見出される。エンドサイトーシス後、肝臓におけるヒアルロニダーゼ消化によって、ＨＡは正常に異化される。
【０６７８】
本発明の実施形態は、配列番号：５２のｖＩＴＨ１ポリペプチド配列を含む組成物に関する。
【０６７９】
本発明の更なる実施形態は、ＨＡ結合タンパク質生物活性を有するｖＩＴＨ１ポリペプチド断片を含む組成物に関する。
【０６８０】
本発明の更なる実施形態は、ｖＩＴＨ１ポリペプチドをコードする配列番号：５１のポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６８１】
本発明の更なる実施形態は、ＨＡ結合タンパク質生物活性を有するｖＩＴＨ１ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物に関する。
【０６８２】
本発明の更なる実施形態は、配列番号：５２のｖＩＴＨ１ポリペプチド配列またはＨＡ結合タンパク質生物活性を有するｖＩＴＨ１ポリペプチド断片に対して作られる抗体を含む組成物に関する。その抗体は、ｖＩＴＨ１に特異的に結合するが、ＩＴＨ１に対しては特異的に結合しないことが好ましい。その抗体は、アミノ酸：ＶＴＧＧ、ＴＧＧＦ、ＧＧＦＳ、ＶＴＧＧＦＳ、ＭＰＬＰ、ＰＬＰＬ、ＰＬＰＳ、ＬＰＳＡ、またはＭＰＬＰＬＰＳＡを含むエピトープを認識することが好ましい。
【０６８３】
本発明の実施形態は、ｖＩＴＨ１ポリペプチドを含む組成物に関する。ｖＩＴＨ１ポリペプチドを作製する方法は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトする段階；ｉｉ）産生されたタンパク質を精製する段階；を含む。このタンパク質の精製は、当業者によく知られているいずれかの技術に従って行うことができる。好ましくは、ｖＩＴＨ１またはその断片に対して作られる抗体を、クロマトグラフィー担体に結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを形成することができる。
【０６８４】
他の実施形態において、本発明は、生体試料中のｖＩＴＨ１ポリペプチドを検出する方法に向けられ、前記方法は、ｉ）ｖＩＴＨ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片と生体試料を接触させる段階；ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。その抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であることが可能である。さらに、その抗体または抗体断片は一次的または二次的に、当技術分野で一般的な検出可能な化合物（例えば、放射性化合物、蛍光化合物、発光化合物、および酵素化合物）によって標識することができる。
【０６８５】
更なる実施形態では、ｖＩＴＨ１ポリペプチドはＨＡを精製するために使用される。かかる方法において、ｖＩＴＨ１ポリペプチドは、固体マトリックスに共有結合または非共有結合で結合され、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ＨＡに結合させることができる。この方法は、ｉ）その固体マトリックスを洗浄して、混入物を取り除く段階；ｉｉ）さらに厳密な条件を用いて、対象の粒子を溶出する段階；を含む。この実施形態のその他の態様は、当技術分野で一般的な技術を用いて、ＨＡを検出かつ精製するために、ｖＩＴＨ１ポリペプチドを使用する方法を包含する。この方法は、ＨＡを含有すると思われる生体試料を得る段階と、ｉｉ）ｖＩＴＨ１の結合に適した条件下にて、ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片と前記試料を接触させて、ｖＩＴＨを検出することにより、ＨＡの有無を検出する段階；を含む。ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片は、検出可能な化合物に共有結合で結合することが好ましい。代替方法としては、ｖＩＴＨ１を検出するために、検出可能なｖＩＴＨ１特異的抗体またはその断片を使用することができる。この実施形態は、例えば、ＨＡの異常蓄積と関連する広範な疾患のリスクがある、またはその疾患を有する個体に関してＨＡの存在を検出するための診断ツールとして有用である。例えば、限定されないが、ムコ多糖症ＩＸ型で知られるヒアルロニダーゼ欠損症、Ramsden CA et al, J Pediatr 2000 Jan; 136 (1) : 62-68)に記載されている、皮膚の全身性のひだ（folding）および肥厚と関連するＨＡ代謝障害、硬変などの肝臓疾患、腎不全および一部の肺疾患、慢性関節リウマチおよび変形性関節症などの関節炎疾患、および中皮腫およびウィルムス腫瘍などの特定の癌などの疾患の診断にそれを適用することができる。かかる方法は、このような疾患の重症度を評価するのにも有用である。このキットは、ｖＩＴＨ１ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはその断片；任意に、ｉｉ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬；を備える。その抗体または抗体断片は、検出可能に標識されることが好ましい。かかる標識としては、蛍光化合物、発光化合物、および放射性化合物、ならびに酵素基質が挙げられる。任意の試薬は、検出可能なシグナルを提供し、抗体に結合するか、または抗体上の標識と反応することができる。ＨＡレベルを決定するため、およびかかる疾患を診断または管理するために、好ましい、適切な生体試料は、関節炎疾患の場合には血清、尿および滑液である。
【０６８６】
本発明の実施形態は、ｖＩＴＨ１発現の修飾因子について試験物質をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ｉ）試験物質と細胞を接触させる段階；ｉｉ）試験物質に暴露した後の細胞中のｖＩＴＨ１発現を、非暴露対照細胞中の発現と比較する段階；を含む。ｖＩＴＨ１の発現は、当技術分野で一般的な、または本明細書に包含される方法によって、ｖＩＴＨ１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することによって決定される。この方法の一例は、ｉ）同等な２つの細胞試料を培養する段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）指定の時間にどちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からｍＲＮＡを精製する段階；ｖ）ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるｖＩＴＨ１  ｍＲＮＡのレベルを比較する段階；を含む。本発明は、本明細書で述べるように特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計および使用を提供する。その他の例は、ｉ）同等な２つの細胞培養物を得る段階；ｉｉ）その培養物の一方には試験物質を添加し、もう一方には添加しない段階；ｉｉｉ）どちらの培養物も収集する段階；ｉｖ）細胞の各試料からタンパク質を精製する段階；ｖ）ウェスタンブロット、免疫組織化学、または当技術分野で一般的な他の方法によって、各試料におけるｖＩＴＨ１ポリペプチドのレベルを比較する段階；を含む。本発明は、本明細書に述べるように、特異的抗体および抗体断片の設計および使用を提供する。
【０６８７】
その他の実施形態において、ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片を用いて、ｖＩＴＨ１活性を活性化または抑制する化合物についてスクリーニングすることができる。この方法は、ｉ）ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片を試験物質と接触させる段階；ｉｉ）ｖＩＴＨ１活性をモニターする段階；を含む。ｖＩＴＨ１はＨＡに結合する。したがって、試験物質を添加すると同時に、ＨＡでの競合的結合アッセイによって、ｖＩＴＨ１活性をモニターすることができる。本発明のこの態様では、ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片は、溶液中で遊離であり、固体担体に固定化され、細胞表面上に組換えで発現されるか、または細胞表面に化学的に結合されるか、または細胞内に位置する。ｖＩＴＨポリペプチドと試験される化合物との間の結合性複合体の形成は、ＢＩＡｃｏｒｅ（スウェーデン、ウプサラ）などの当技術分野でよく知られる方法によって測定することができる。その他の技術は、本発明のタンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供する。ｖＩＴＨ１の発現または活性を低減する試験物質は、ｖＩＴＨ１の阻害剤またはアンタゴニストとして定義される。ｖＩＴＨ１の発現または活性を増加させる試験物質は、活性化剤またはアゴニストとして定義される。主題の発明のｖＩＴＨ１の発現または活性を調節する作用物質としては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および抗体が挙げられる。これらの作用物質は、当技術分野でよく知られている方法に従って製造かつ使用することができる。
【０６８８】
本発明の他の実施形態において、ｖＩＴＨ１ポリペプチド、その断片、またはｖＩＴＨアゴニストを用いて、ＨＡにｉｎ ｖｉｖｏで結合させ、血流からこの分子を除去する。この方法を用いて、肝クリアランスの減少、過剰合成またはヒアルロニダーゼ活性の増加が原因の疾患を含む、ＨＡの異常蓄積と関連する疾患を予防または治療することができる。例えば、ｖＩＴＨ１ポリペプチド、その断片、またはｖＩＴＨアゴニストは、限定されないが、ムコ多糖症ＩＸ型でも知られるヒアルロニダーゼ欠損症、Ramsden CA et al, J Pediatr 2000 Jan; 136 (1) : 62-68)に記載されている、皮膚の全身性のひだ（folding）および肥厚と関連するＨＡ代謝障害、硬変などの肝臓疾患、腎不全および一部の肺疾患のリスクがある、またはその疾患を有する個体に送達される組成物中に使用することができる。この実施形態において、かかる組成物は、慢性関節リウマチおよび変形性関節症などの関節炎疾患、および限定されないが中皮腫およびウィルムス腫瘍などの特定の癌など、ＨＡの高い血清中レベルと関連する他のいずれかの病状においても使用することができる。この方法は、有効量のｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその断片またはｖＩＴＨ１アゴニストを個体の血流に導入する段階を含む。この実施形態では、ｖＩＴＨ１ポリペプチドはさらに、体からの排出を特定化するポリペプチドシグナルを有する融合タンパク質として発現させることができる。ｖＩＴＨ１ポリペプチドまたはその生物活性断片を個体に送達するのに好ましい方法は、生理学的に許容される溶液（例えば、ｐＨ緩衝生理食塩液、グリセロールなどの粘性成分を添加することにより改変されたｐＨ緩衝生理食塩水）中の前記ポリペプチドまたは断片を直接注入、静脈内注入することを含む。代替方法としては、ｖＩＴＨ１ポリヌクレオチドを導入して、血流中でｖＩＴＨ１ポリペプチドを発現させることができる。この方法は、ｉ）本発明のヌクレオチド配列およびその発現を指示する調節配列に作動可能に連結された、細胞を感染させることができるアデノウイルスのゲノムの一部に相当する、組換えウイルスベクターを構築する段階；ｉｉ）上述の疾患または病状を有する、またはそのリスクのある個体に、有効量の組換えアデノウイルスベクターを送達する段階；を含む。
【０６８９】
本発明の他の実施形態は、動物の１種または複数種の組織における本発明のタンパク質の発現または活性を調節することによって作製された動物モデルに関する。これらの動物は、ｖＩＴＨ１の過剰発現または不活性化を標的化するいずれかの方法で、または薬物または変更遺伝子（活性化または抑制遺伝子）で導入遺伝子の発現をｉｎ ｖｉｖｏで調節することによって、作製することができる。かかるモデルは、ｖＩＴＨｌの活性に特異的に関連する様々な病態生理学的側面の治療に潜在的に有用な候補分子を試験するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ法を表すことから、多くの目的に有用である。これらの遺伝子導入動物に由来する組換え細胞系は、同様のアプローチにｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。
関連するタンパク質Ａｃｒｕ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１のネスト（nested）Ｎ末端断片
以下のヌクレオチド配列：ｇｇａａａａｃｔａｔｇｃｃｔｇｇｇｇｃｃｇａｃｇｃｔｃｔｇｃｃｃｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇａｇｇａａａｇｃｃｇｇｇａｃｇｃｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｃｇａｇａｇｃｔｔｃｔｔｔｇｃｔｃｃｇｇａｃｇｃｃｃｃｔｇｇａｃｇｔｇｇｃｇｇｇｃａｇｃｃｇｃｇａｇｇｇｔａａｃｃａｃｃａｔｇａｔｃｃｃｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇｃｇｃｃｔｔｔｇｃｔｃｇｃａｇｇｇａｃｔｔｃｃｇｇａａａｇｇｃｔｃｃｃｃｔｃａａｃｔｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｔｃａｇｇａａｔｇａｔｇｇｇａｃｇａａｔｇｇｇｃｔｔｔｃｃｔｇｇｃａａａｇａｃｇｇｃｃａａｇａｔｇｇａｃａｃｇａｃｇｇｃｇａｃｃｇｇｇｇｇｇａｃａｇｃｇｇａｇａｇｇａａｇｇｔｃｃａｃｃｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｇｔａａｃｃｇｇｇｇａａａｇｃｃａｇｇａｃｃａａａｇｇｇｃａａａｇｃｃｇｇｇｇｃｃａｔｔｇｇｇｃｇｇｇｃｔｇｇｃｃｃｃｃｇｔｇｇｃｃｃｃａａｇｇｇｇｇｔｃａａｃｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａａｇｃａｔｇｇｃａｃａｃｃａｇｇｃａａｇａａｇｇｇｇｃｃｃａａｇｇｇｃａａｇａａａｇｇｇｇａｇｃｃａｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｃｔｇｃａｇｃｔｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｃａｔａｃｃａａｇｔｃａｇｃｔｔｔｃｔｃｇｇｔｇｇｃａｇｔｇａｃｃａａｇａｇｃｔａｃｃｃａｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｃｃａｔｃａａｇｔｔｔｇａｃａａｇａｔｔｃｔｇａｔｇａａｃｇａｇｇｇｔｇｇｃｃａｃｔａｃａａｔｇｃｔｔｃｃａｇｃｇｇｃａａｇｔｔｃｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔｇｇｇａｔｃｔａｃｔａｃｔｔｃａｃｃｔａｃｇａｃａｔｃａｃｇｃｔｇｇｃｃａａｃａａｇｃａｃｃｔｇｇｃｃａｔｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｃａａｃｇｇｃｃａｇｔａｃｃｇｃａｔｃｃｇｇａｃｃｔｔｔｇａｔｇｃｃａａｃａｃｃｇｇｃａａｃｃａｃｇａｔｇｔｇｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｔｃｔｃａａｇｃａｇｇｇｔｇａｃｇａａｇｔｔｔｇｇｃｔｇｃａｇａｔｃｔｔｃｔａｃｔｃａｇａｇｃａｇａａｃｇｇｇｃｔｃｔｔｃｔａｔｇａｃｃｃｔｔａｃｔｇｇａｃａｇａｃａｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｃｔｔｃｃｔａａｔｃｔａｔｇｃｃｇａｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇｇｔａｔａｇａｃａｔｇｃｃａｃｇｇｃｇｇｔｃｃｔｃｃａｇｇｃａｇｇｇａａｃａａｇｃｔｔｃｔｇｇａｃｔｔｇｇｇｃｔｔａｃａｇａｇｃａａｇａｃｃｃｃａｃａａｃｔｇｔａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｇｔｃｇａｇｔｇａｇｃｇｇｔｔｃｔａｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃａｃｃｔｃｃｔｃｃｇｃｃｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃｃｃｃｔｔｃａｔｔａａａｔｃｃａａａｃｃｔｔｔｔｔａｔｔｃａを含む、アクセッション番号ＡＡＢ３０２３２のｃＤＮＡは、アミノ酸配列：ＭＩＰＷＶＬＬＡＣＡＬＰＣＡＡＤＰＬＬＧＡＦＡＲＲＤＦＲＫＧＳＰＱＬＶＣＳＬＰＧＰＱＧＰＰＧＰＰＧＡＰＧＰＳＧＭＭＧＲＭＧＦＰＧＫＤＧＱＤＧＨＤＧＤＲＧＤＳＧＥＥＧＰＰＧＲＴＧＮＲＧＫＰＧＰＫＧＫＡＧＡＩＧＲＡＧＰＲＧＰＫＧＶＮＧＴＰＧＫＨＧＴＰＧＫＫＧＰＫＧＫＫＧＥＰＧＬＰＧＰＣＳＣＧＳＧＨＴＫＳＡＦＳＶＡＶＴＫＳＹＰＲＥＲＬＰＩＫＦＤＫＩＬＭＮＥＧＧＨＹＮＡＳＳＧＫＦＶＣＧＶＰＧＩＹＹＦＴＹＤＩＴＬＡＮＫＨＬＡＩＧＬＶＨＮＧＱＹＲＩＲＴＦＤＡＮＴＧＮＨＤＶＡＳＧＳＴＩＬＡＬＫＱＧＤＥＶＷＬＱＩＦＹＳＥＱＮＧＬＦＹＤＰＹＷＴＤＳＬＦＴＧＦＬＩＹＡＤＱＤＤＰＮＥＶを含む、タンパク質Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌをコードする。
【０６９０】
したがって、本明細書全体にわたり記載されている前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のポリペプチドのすべての特性および使用は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌヌクレオチド配列に含まれる核酸によってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６９１】
Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌは：
１．アミノ酸１〜２０位付近のＮ末端の推定のシグナル配列；
２．アミノ酸２１〜３９位付近の非反復（unique）領域;
３．アミノ酸４０〜１４１位付近のコラーゲン様領域；
４．アミノ酸１４９〜２８５位付近のＣ１ｑ相同性の球状領域；を含む、少なくとも３つの領域で構成される。
【０６９２】
Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌは：
１．アミノ酸４６〜４７位間のコラゲナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ-１（ＭＭＰ−１）；
２．アミノ酸１２５〜１２６位、１２６〜１２７位、１３１〜１３２位、および１３２〜１３３位間のプラスミン；
３．アミノ酸１３３〜１３４位間のｐｒｅｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎプロセシングプロテアーゼ；を含むタンパク分解切断に対する、いくつかの注目すべき推定部位で構成される。
【０６９３】
以下のヌクレオチド配列：ｇａａｔｔｃｇｇｃａｃｇａｇｇｇｃｃｇｃｇａｇｇｇｔａａｃｃａｃｃａｔｇａｔｃｃｃｃｔｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｇｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃｃａｃｔｇｃｔｔｇｇｃｇｃｃｔｔｔｇｃｔｃｇｃａｇｇｇａｃｔｔｃｃｇｇａａａｇｇｃｔｃｃｃｃｔｃａａｃｔｇｇｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃａｃｃｃｇｇｃｃｃｃｃｃａｇｇａｇｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｔｃａｇｇａａｔｇａｔｇｇｇａｃｇａａｔｇｇｇｃｔｔｔｃｃｔｇｇｃａａａｇａｃｇｇｃｃａａｇａｔｇｇａｃａｃｇａｃｇｇｃｇａｃｃｇｇｇｇｇｇａｃａｇｃｇｇａｇａｇｇａａｇｇｔｃｃａｃｃｔｇｇｃｃｇｇａｃａｇｔｇａｃｃａａｇａｇｃｔａｃｃｃａｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｃｃａｔｃａａｇｔｔｔｇａｃａａｇａｔｔｃｔｇａｔｇａａｃｇａｇｇｇｔｇｇｃｃａｃｔａｃａａｔｇｃｔｔｃｃａｇｃｇｇｃａａｇｔｔｃｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔｇｇｇａｔｃｔａｃｔａｃｔｔｃａｃｃｔａｃｇａｃａｔｃａｃｇｃｔｇｇｃｃａａｃａａｇｃａｃｃｔｇｇｃｃａｔｃｇｇｃｃｔｇｇｔｇｃａｃａａｃｇｇｃｃａｇｔａｃｃｇｃａｔｃｃｇｇａｃｃｔｔｔｇａｔｇｃｃａａｃａｃｃｇｇｃａａｃｃａｃｇａｔｇｔｇｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃｃａｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｔｃｔｃａａｇｃａｇｇｇｔｇａｃｇａａｇｔｔｔｇｇｃｔｇｃａｇａｔｃｔｔｃｔａｃｔｃａｇａｇｃａｇａａｃｇｇｇｃｔｃｔｔｃｔａｔｇａｃｃｃｔｔａｃｔｇｇａｃａｇａｃａｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｃｔｔｃｃｔａａｔｃｔａｔｇｃｃｇａｃｃａｇｇａｔｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇｇｔａｔａｇａｃａｔｇｃｃａｃｇｇｃｇｇｔｃｃｔｃｃａｇｇｃａｇｇｇａａｃａａｇｃｔｔｃｔｇｇａｃｔｔｇｇｇｃｔｔａｃａｇａｇｃａａｇａｃｃｃｃａｃａａｃｔｇｔａｇｇｃｔｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｇｔｃｇａｇｔｇａｇｃｇｇｔｔｃｔａｇｃｃｔｃａｇｇｃｔｃａｃｃｔｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔｔｔｔｔｔｔｃｃｃｃｔｔｃａｔｔａａａｔｃｃａａａｃｃｔｔｔｔｔａｔｔｃａａａａａａａａａａａａａａａａａａａｇａｔｇｃｇｇｃｃｇを含む、アクセッション番号ＡＡＺ４５６８８のｃＤＮＡは、アミノ酸配列：ＭＩＰＷＶＬＬＡＣＡＬＰＣＡＡＤＰＬＬＧＡＦＡＲＲＤＦＲＫＧＳＰＱＬＶＣＳＬＰＧＰＱＧＰＰＧＰＰＧＡＰＧＰＳＧＭＭＧＲＭＧＦＰＧＫＤＧＱＤＧＨＤＧＤＲＧＤＳＧＥＥＧＰＰＧＲＴＶＴＫＳＹＰＲＥＲＬＰＩＫＦＤＫＩＬＭＮＥＧＧＨＹＮＡＳＳＧＫＦＶＣＧＶＰＧＩＹＹＦＴＹＤＩＴＬＡＮＫＨＬＡＩＧＬＶＨＮＧＱＹＲＩＲＴＦＤＡＮＴＧＮＨＤＶＡＳＧＳＴＩＬＡＬＫＱＧＤＥＶＷＬＱＩＦＹＳＥＱＮＧＬＦＹＤＰＹＷＴＤＳＬＦＴＧＦＬＩＹＡＤＱＤＤＰＮＥＶを含む、タンパク質Ａｃｒｐ３０Ｒ１をコードする。
【０６９４】
したがって、本明細書全体にわたり記載されている前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列のポリペプチドのすべての特性および使用は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ヌクレオチド配列に含まれる核酸によってコードされるポリペプチドにも関係することは理解されよう。本明細書に記載の生物活性を有する断片およびその断片をコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０６９５】
Ａｃｒｐ３０Ｒ１は、
１．アミノ酸１〜２０位付近のＮ末端の推定シグナル配列；
２．アミノ酸２１〜３９位付近の非反復（unique）領域;
３．アミノ酸４０〜８７位付近のコラーゲン様領域；
４．アミノ酸８８〜２１７位付近のＣ１ｑ相同性の球状領域；を含む、少なくとも３つの領域で構成される。Ａｃｒｐ３０Ｒ１は、Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌ中に存在するＭＭＰ−１切断に対する推定部位を保持する。Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１は、単一遺伝子の選択的スプライシング（differential splicing）から生成される関連タンパク質である。Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１はコラーゲンドメインおよびＣ１ｑ相同性ドメインで構成される。Ａｃｒｐ３０Ｒ１は、Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌ中に存在する内部の６８アミノ酸のセグメントを欠いている。完全長タンパク質のタンパク分解切断によってｉｎ ｖｉｖｏで産生されるＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１のＮ末端断片は、以下に述べるような、予想外かつ新規な機能を有する。
【０６９６】
ケモカインは、Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)を介してシグナル伝達する走化性サイトカインである。二次リンパ組織ケモカイン(ＳＬＣ)は、２３アミノ酸の推定シグナル配列を含む、１３４アミノ酸のポリペプチドである（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nagira, M et al., J Biol Chem 272: 1951824 (1997参照)。ＳＬＣは、高内皮細静脈、血液からリンパ節およびパイエル板へのリンパ球のホーミングに関与する特殊血管によって高度に発現される（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Murphy, PM et al., Pharmacological Reviews 52: 145-176 (2000); Dieu-Nosjean, MC et al., J Leukoc Biol 66: 252-62 (1999))。ＳＬＣはＴ細胞、Ｂ細胞、および成熟樹状細胞に対して走化性である。ＳＬＣは、ｉｎ ｖｉｖｏにて生理学的なリンパ球再循環の重要なメディエーターとして機能する（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gunn, MD et al, Proc Natl Acad Sci USA 95: 258-63 (1998); Gunn, MD et al., J Exp Med 189: 451-60 (1999))。最近、神経変性ストレスがＳＬＣのニューロン発現を誘発し、ＳＬＣが小膠細胞に働きかけることが示された（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるBiber, K et al., Glia 34: 121-33 (2001)）。
【０６９７】
ＳＬＣは、ケモカイン受容体ＣＣＲ７に結合する（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、(Yoshida, R et al., J Biol Chem 273: 7118-22 (1998))。ＥＢＩＩ-リガンドケモカイン(ＥＬＣ)もまた、ＣＣＲ７に結合する。最近、ＳＬＣは、最近同定されたケモカイン受容体ＣＣＲ１０にも結合することが示された（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gosling, J et al., J Immunol 164: 2851-6 (2000)）。ＳＬＣおよびＥＬＣは競合的に、かつＣＣＲ７およびＣＣＲ１０のみに結合する。
【０６９８】
ＳＬＣは、慢性炎症、例えば慢性関節リウマチ（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Patel, DD et al., Clin Immunol 99: 43-52 (2001)）および前糖尿病のＮＯＤマウス (その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hjelmstrom, P et al., Am J Pathol 156: 1133-8 (2000)）に関係している。ＳＬＣ（およびＥＬＣ）は、二次リンパ組織におけるＨＩＶ−１の複製を高める (その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Nagira, M et al., Virology 264: 422-6 (1999))。ＳＬＣは、骨髄性始原細胞の増殖を抑制することが示されている（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kim, CH et al., J Leukoc Biol 66: 455-61 (1999)）。ＥＬＣは（ＳＬＣはそうではない）、ヒトアテローム性動脈硬化症に関係している（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Reape, TJ et al., Am J Pathol 154: 365-74 (1999))。
【０６９９】
ＳＬＣおよびＥＬＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍反応を促進することが発見されている。ＳＬＣは、数匹のマウスモデルにおいて抗腫瘍反応を高めることが見出された（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kirk, CJ et al., Cancer Res 61: 206270 (2001) ; Nomura, T et al., Int J Cancer 91: 597-606 (2001) ; Sharma, S et al., J Immunol 164: 4558-63 (2000))。ＥＬＣは、マウス乳癌細胞の腫瘍拒絶を仲介することが見出された（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Braun, SE et al., J Immunol 164: 4025-31 (2000)）。
【０７００】
Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１は、公開タンパク質データベースのＢＬＡＳＴ解析によって決定される、それ以外ではケモカインＳＬＣに特異的であるアミノ酸モチーフによって特徴付けられる。ＳＬＣに対するこのモチーフの特異性は、種全体に及ぶ。Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１の２１位〜４６位のアミノ酸（および、したがって、Ｎ末端から、Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１内の推定上のプロテアーゼ切断部位）を包含するモチーフは：ＲｘｘＲＫｘｘＰｘＬｘＣＳｘＰ(「ｘ」は、割り当てられていないアミノ酸である)である。この特異的なモチーフは、ヒト(アクセッション番号：ＡＡＹ１２３１６、０００５８５、ＡＡＧ０３７７３、ＡＡＷ８７５８９)、マウス(００９００６、ＡＡＧ４５８３４)およびブタ(ＡＡＷ５０８８６)ＳＬＣ(ＳＬＣの４６位〜６０位のアミノ酸を包含する）の間で保存されている。このモチーフは、ＳＬＣの機能に、つまりケモカイン受容体ＣＣＲ７およびＣＣＲ１０への結合に、および結果として、前記受容体に対するケモカインＥＬＣとのその競合的結合に重要であると推測される。前記モチーフを含む、Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０ＲのＮ末端ポリペプチド断片は、ＣＣＲ７およびＣＣＲ１０に非生産的に結合し、そうすることで、ＣＣＲ７およびＣＣＲ１０を介してＳＬＣおよびＥＬＣを拮抗する。
【０７０１】
本発明は、前記モチーフを含む完全長Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端ポリペプチド断片が、ＳＬＣおよびＥＬＣケモカイン機能の拮抗作用に関する予想外の効果を有するという発見に基づく。完全長Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドが通常、効果を表さないか、または著しく減少した効果を表すと仮定すると、これらの効果は予想外かつ驚くべきことである。いずれかの効果が完全長Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドによって示される限り、効果に必要とされる完全長ポリペプチドのレベルから、ほとんどの場合に、この時点でヒトに対する潜在的な治療として実行不可能となる。それに対して、前記モチーフを含む、完全長Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端ポリペプチド断片は根本的にさらに有効であり、したがって、ヒトにおける治療に可能なレベルで提供することができる。
【０７０２】
このように、本発明は、Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片、前記ｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリヌクレオチドの細胞組換え体、ならびに前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片を含む薬剤および生理学的に許容される組成物、および慢性炎症を低減するため、アテローム性動脈硬化症を低減するため、二次リンパ組織におけるＨＩＶ複製を低減するため、骨髄造血を増加させるため、またはＳＬＣまたはＥＬＣ関連疾患または障害を治療するために、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬおよびＡｃｒｐ３０Ｒ１の薬剤および生理学的に許容される組成物を投与する方法に関する。前記ＳＬＣまたはＥＬＣ関連活性のアンタゴニストを同定するためのアッセイもまた、本発明の一部である。
【０７０３】
第１の態様において、本発明は、完全長Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドよりも著しく高い活性を有する、精製、単離、もしくは組換えＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片を特徴とし、前記活性は、限定されないが、ＳＬＣ機能の拮抗作用およびＥＬＣ機能の拮抗作用から選択される。好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列の２１〜４６、２１〜４７、２１〜４８、２１〜４９、２１〜５０、２１〜５１、２１〜５２、２１〜５３、２１〜５４、２１〜５５、２１〜５６、２１〜５７、２１〜５８、２１〜５９、２１６０、２１〜６１、２１〜６２、２１〜６３、２１〜６４、２１〜６５、２１〜６６、２１〜６７、２１〜６８、２１〜６９、２１〜７０、２１〜７１、２１〜７２、２１〜７３、２１７４、２１〜７５、２１〜７６、２１〜７７、２１〜７８、２１〜７９、２１〜８０、２１〜８１、２１〜８２、２１〜８３、２１〜８４、２１〜８５、２１〜８６、２１〜８７、２１８８、２１〜８９、２１〜９０、２１〜９１、２１〜９２、２１〜９３、２１〜９４、２１〜９５、２１〜９６、２１〜９７、２１〜９８、２１〜９９、２１〜１００、２１〜１０１、２１〜１０２、２１〜１０３、２１〜１０４、２１〜１０５、２１〜１０６、２１〜１０７、２１〜１０８、２１〜１０９、２１〜１１０、２１〜１１１、２１〜１１２、２１〜１１３、２１〜１１４、２１〜１１５、２１〜１１６、２１〜１１７、２１〜１１８、２１〜１１９、２１〜１２０、２１〜１２１、２１〜１２２、２１〜１２３、２１〜１２４、２１〜１２５、２１〜１２６、２１〜１２７、２１〜１２８、２１〜１２９、２１〜１３０、２１〜１３１、２１〜１３２、または２１〜１３３位のアミノ酸から選択され、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。
【０７０４】
他の好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列の２１〜４６、２１〜４７、２１〜４８、２１〜４９、２１〜５０、２１〜５１、２１〜５２、２１〜５３、２１〜５４、２１〜５５、２１〜５６、２１〜５７、２１〜５８、２１〜５９、２１〜６０、２１〜６１、２１〜６２、２１〜６３、２１〜６４、２１〜６５、２１〜６６、２１〜６７、２１〜６８、２１〜６９、２１〜７０、２１〜７１、２１〜７２、２１〜７３、２１〜７４、２１〜７５、２１〜７６、２１〜７７、２１〜７８、２１〜７９、２１〜８０、２１〜８１、２１〜８２、２１〜８３、２１〜８４、２１〜８５、２１〜８６、または２１〜８７位のアミノ酸から選択され、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。
【０７０５】
さらに他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列の２１〜４６、２１〜１２５、２１〜１２６、２１〜１３１、２１〜１３２、および２１〜１３３位のアミノ酸から選択され、２１位のアミノ酸は、完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるようにとられる。さらに他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列の２１〜４６位および２１〜８７位のアミノ酸から選択され、２１位のアミノ酸は、完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。
【０７０６】
さらに好ましい他の実施形態において、前記ポリペプチド断片は、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列または前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列の相当する連続アミノ酸と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【０７０７】
他の好ましい実施形態では、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片は、組換え手段によって、または完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドのタンパク分解切断によって作製される。他の好ましい実施形態では、前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片は、組換え手段によって、またはシグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのタンパク分解切断によって作製される。
【０７０８】
シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの特に好ましいタンパク分解性断片（proteolytic fragment）は、４６位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のコラゲナーゼ切断によって作製されるおよそ２１〜４６位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの特に好ましい他のタンパク分解性断片は、４６位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のＭＭＰ−１切断によって作製されるおよそ２１〜４６位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの特に好ましい他のタンパク分解性断片は、１２５位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のプラスミン切断によって作製される、およそ２１〜１２５位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの特に好ましい他のタンパク分解性断片は、１２６位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のプラスミン切断によって作製されるおよそ２１〜１２６位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの他の特に好ましいタンパク分解性断片は、１３１位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のプラスミン切断によって作製される、およそ２１〜１３１位のアミノ酸である。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの他の特に好ましいタンパク分解性断片は、１３２位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のプラスミン切断によって作製される、およそ２１〜１３２位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドの他の特に好ましいタンパク分解性断片は、１３３位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌアミノ酸配列のprecerebellinプロセシングプロテアーゼ切断によって作製される、およそ２１〜１３３位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。
【０７０９】
シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドの他の特に好ましいタンパク分解性断片は、４６位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列のコラゲナーゼ切断によって作製される、およそ２１〜４６位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドの他の特に好ましいタンパク分解性断片は、４６位付近での前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１アミノ酸配列のＭＭＰ−１切断によって作製される、およそ２１〜４６位のアミノ酸であり、２１位のアミノ酸は、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を示すと理解されるとする。
【０７１０】
第２の態様では、本発明は、第１の態様で述べた前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片を含む、から本質的になる、からなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７１１】
第３の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、免疫関連疾患を予防または治療する方法を特徴とする。前記免疫関連疾患は、限定されないが、同種移植拒絶または遅延型過敏症から選択されることが好ましい。
【０７１２】
第４の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１３】
第５の態様では、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、脳組織における虚血性神経変性に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１４】
第６の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、脳卒中に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１５】
第７の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、心筋梗塞に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１６】
第８の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、再潅流障害に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１７】
第９の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、ＨＩＶ感染症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７１８】
第１０の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、炎症関連疾患を予防または治療する方法を特徴とする。前記炎症関連疾患は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、全身性エリテマトーデス、乾癬、アレルギー性喘息、または敗血症性ショックから選択されることが好ましい。    
【０７１９】
第１１の態様では、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、注入された造血幹細胞または骨髄性始原細胞の移植および増殖を促進する方法を特徴とする。
【０７２０】
第１２の態様において、本発明は、ヒトリンパ性白血病および骨髄性白血病の異種ｉｎ  ｖｉｖｏモデルを含む、プレコンディショニング（preconditioning）療法に関連する、注入されたヒト造血幹細胞または骨髄性始原細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内の移植および増殖を促進する方法を特徴とする（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Dialynas, DP et al., Blood 97: 3218-25 (2001)）。
【０７２１】
第１３の態様において、本発明は、インタクトなＣＣＲ７またはＣＣＲ１０の機能に対する内部コントロールとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞移動アッセイにおいて、第１の態様に記載の前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片を使用する方法を特徴とする。
【０７２２】
本発明はさらに、インタクトなＴ細胞、Ｂ細胞、または成熟樹状細胞走化性応答に対する内部コントロールとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞移動アッセイにおいて、第１の態様に記載の前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片を使用する方法を特徴とする(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Patel, DD et al., Clin Immunol 99: 43-52 (2001))。
【０７２３】
第１４の態様において、本発明は、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片に特異的に結合するが、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドには特異的に結合しない抗体を提供する。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の非高次構造的または高次構造的エピトープを認識する前記抗体がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する、前記抗体がさらに好ましい。
【０７２４】
シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片でマウスが免疫される方法がさらに好ましい。前記マウス由来のモノクローナル抗体が、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドに対してではなく、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片に対する結合についてスクリーニングされる方法がさらに好ましい。前記マウス由来のモノクローナル抗体が、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドに対してではなく、成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片に対する結合について、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によってスクリーニングされる方法がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を立体的またはアロステリックに中和する能力について、前記抗体がスクリーニングされる方法がさらに好ましい。前記モノクローナル抗体をヒト化する方法がさらに好ましい。前記モノクローナル抗体を産生する方法およびＥＬＩＳＡを含む方法によって特異性を確立する方法は、当業者にはよく知られている。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を立体的またはアロステリックに中和する能力の中和について、前記抗体をスクリーニングする方法は当業者にはよく知られており、限定されないが：シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片と抗体を接触させる段階；ＣＣＲ７またはＣＣＲ１０ケモカイン受容体の存在下にて、放射標識したＳＬＣまたはＥＬＣと共に、前記の接触させたＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片をインキュベーションする段階；および前記抗体の接触により、ＣＣＲ７またはＣＣＲ１０への結合に関して、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣと競合する能力がブロックされるかどうかを決定する段階；を含む(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gosling, J et al., J Immunol 164: 2851-6 (2000))。前記モノクローナル抗体をヒト化する方法は、当業者によく知られている。
【０７２５】
第１５の態様では、本発明は、Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片には特異的に結合するが、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドには特異的に結合しない抗体を提供する。Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の非高次構造的または高次構造的エピトープを認識する前記抗体がさらに好ましい。前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。
【０７２６】
シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片でマウスが免疫される方法がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドに対してではなく、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片に対する結合について、前記マウス由来のモノクローナル抗体がスクリーニングされる方法がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドに対してではなく、成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片に対する結合について、前記マウス由来のモノクローナル抗体が、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)によってスクリーニングされる方法がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を立体的またはアロステリックに中和する能力について、前記抗体がスクリーニングされる方法がさらに好ましい。前記モノクローナル抗体をヒト化する方法がさらに好ましい。前記モノクローナル抗体を産生する方法およびＥＬＩＳＡを含む方法によって特異性を確立する方法は、当業者にはよく知られている。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力の中和について、前記抗体をスクリーニングする方法は当業者にはよく知られており、限定されないが：シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片と抗体を接触させる段階；ＣＣＲ７またはＣＣＲ１０ケモカイン受容体の存在下にて、放射標識したＳＬＣまたはＥＬＣと共に、前記の接触させたＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片をインキュベーションする段階；およびＣＣＲ７またはＣＣＲ１０への結合に関して、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣと競合する能力が、前記抗体との接触により、ブロックされるかどうかを決定する段階；を含む(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gosling, J et al., J Immunol 164: 2851-6 (2000))。前記モノクローナル抗体をヒト化する方法は、当業者によく知られている。
【０７２７】
第１６の態様では、本発明は、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片に対して作られる第１４の態様の前記抗体を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７２８】
第１７の態様では、本発明は、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片に対して作られる第１５の態様の前記抗体を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７２９】
第１８の態様において、本発明は、免疫不全症の診断のために、臨床試料における前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片の量を測定する方法において、第１４または第１６の態様に記載されている前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片に特異的な前記抗体を使用する方法を特徴とする。前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群から選択されることが好ましい。前記免疫不全は、限定されないが、反復性感染症、先天的免疫不全症、または後天性免疫不全症から選択される。高いレベルの前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片が、免疫不全の一因であると考えられる。
【０７３０】
第１９の態様において、本発明は、癌の分類のために、臨床試料における前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片の量を測定する方法において、第１４または第１６の態様に記載されている前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片に特異的な前記抗体を使用する方法を特徴とする。前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群から選択されることが好ましい。前記癌は、限定されないが、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。高いレベルの前記Ａｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１が、抗腫瘍応答の低下の一因であると考えられる。
【０７３１】
第２０の態様において、本発明は、第１６または第１７の態様に記載されている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、診断で決定された高レベルの前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片によって特徴付けられる癌を治療する方法であって、前記組成物を含む抗体が、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する方法を特徴とする。前記中和は、ｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍応答を促進すると考えられる。前記癌は、限定されないが、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。
【０７３２】
第２１の態様において、本発明は、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片には特異的に結合するが、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチドには特異的に結合しない非抗体化合物を提供する。好ましい前記化合物は、限定されないが、低分子量の有機もしくは無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択される。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の非高次構造的または高次構造的エピトープを認識する前記抗体がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。
【０７３３】
シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和することができる１種または複数種の化合物についてスクリーニングする方法がさらに好ましい。前記方法は当業者にはよく知られており、限定されないが：シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片と化合物を接触させる段階；ＣＣＲ７またはＣＣＲ１０ケモカイン受容体の存在下にて、放射標識したＳＬＣまたはＥＬＣと共に、前記の接触させたＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片をインキュベーションする段階；およびＣＣＲ７またはＣＣＲ１０への結合に関して、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣと競合する能力が、化合物との前記接触により、ブロックされるかどうかを決定する段階；を含む(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gosling, J et al., J Immunol 164: 2851-6 (2000))。
【０７３４】
第２２の態様において、本発明は、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片には特異的に結合するが、シグナルペプチドを欠く完全長成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチドには特異的に結合しない非抗体化合物を提供する。好ましい前記化合物は、限定されないが、低分子量の有機もしくは無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択される。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の非高次構造的または高次構造的エピトープを認識する前記抗体がさらに好ましい。シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。
【０７３５】
シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和することができる１種または複数種の化合物についてスクリーニングする方法がさらに好ましい。前記方法は当業者にはよく知られており、限定されないが：シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１の前記の好ましいポリペプチド断片と化合物を接触させる段階；ＣＣＲ７またはＣＣＲ１０ケモカイン受容体の存在下にて、放射標識したＳＬＣまたはＥＬＣと共に、前記の接触させたＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片をインキュベーションする段階；およびＣＣＲ７またはＣＣＲ１０への結合に関して、シグナルペプチドを欠く成熟Ａｃｒｐ３０Ｒ１Ｌの前記の好ましいポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣと競合する能力が、化合物との前記接触により、ブロックされるかどうかを決定する段階；を含む(その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gosling, J et al., J Immunol 164: 2851-6 (2000))。
【０７３６】
第２３の態様において、本発明は、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１Ｌポリペプチド断片に対して作られる、第２１の態様の前記化合物を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７３７】
第２４の態様において、本発明は、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片に対して作られる、第２２の態様の前記抗体を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７３８】
第２５の態様において、本発明は、第２３または第２４の態様に記載されている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、診断で決定された高レベルの前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片によって特徴付けられる癌を治療する方法であって、前記組成物を含む化合物が、前記の好ましいＡｃｒｐ３０Ｒ１ＬまたはＡｃｒｐ３０Ｒ１ポリペプチド断片の、ＳＬＣまたはＥＬＣケモカイン機能に拮抗する能力を中和する方法を特徴とする。前記中和は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を促進すると考えられる。前記癌は、限定されないが、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。
ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−１、ＣＲＰＦ−２Ａ、ＣＲＰＦ−２Ｂ、ＣＲＰＦ−２Ｃ、およびＣＲＰＦ−３
ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−１は、アミノ酸配列：ＳＨＨＨを含む。ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−２Ａは、アミノ酸配列：ＡＡＮＳＫＶＡＦＳＡＶＲＳＴＮＨを含む。ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−２Ｂは、アミノ酸配列：ＡＡＮＳＫＶＡＦＳＡＶＲを含む。ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−２Ｃは、アミノ酸配列:ＳＴＮＨを含む。ＣＲＰＦポリペプチドＣＲＰＦ−３は、アミノ酸配列：ＳＧＳＡＫＶＡＦＳＡＴＲＳＴＮＨを含む。ＣＲＰＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましい。
【０７３９】
ＣＲＰＦポリペプチドは、Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎに関連する。ＣＲＰＦポリペプチドは、以下に述べる予想外かつ新規な機能を有する。
【０７４０】
Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎは、特異的なタンパク分解切断によって前駆体ポリペプチド、ｐｒｅｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎから遊離された１６アミノ酸のポリペプチドである（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Urade, Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 1069-1073 (1991))。Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎは、ヒトないしニワトリの配列に保存される。Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎは、小脳において高度に発現し、脳の他の領域においては弱く発現し、副腎髄質組織でもおそらく発現する（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Satoh, F et al., Journal of Endocrinology 154: 27-34 (1997))。Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎは、副腎腫瘍、神経節芽細胞腫、および神経芽細胞腫の腫瘍組織によっても発現される（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Satoh, F et al., Journal of Endocrinology 154: 27-34 (1997))。Ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎは、ヒト副腎髄質細胞によるアドレナリンおよびノルエピネフリンの放出を誘発する（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Albertin, G et al., Neuropeptides 34: 7-11 (2000)）。ノルエピネフリンは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球のＴｈ１サブセットによる炎症性サイトカインインターフェロン−γの発現をアップレギュレートすることが示されている（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Swanson, MA et al., J Immunol 166: 232-240 (2001))。インターフェロン−γは、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生において重要な役割を果たす。最近、ｐｒｅｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎ様タンパク質は、ニジマスにおける急性期反応に関与することが示された（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gerwick, L et al., Developmental and Comparative Immunology 24: 597-600 (2000))。
【０７４１】
本発明は、ＣＲＰＦポリペプチドがｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎの炎症性作用に対抗するという発見に基づく。
【０７４２】
このように、本発明は、ＣＲＰＦポリペプチド、前記ＣＲＰＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＣＲＰＦポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ＣＲＰＦポリヌクレオチドの細胞組換え体、ならびに前記ＣＲＰＦポリペプチドを含有する薬剤および生理学的に許容される組成物、および炎症を低減するため、または炎症関連疾患を治療するために、前記ＣＲＰＦ薬剤および生理学的に許容される組成物を投与する方法に関する。ＣＲＰＦポリペプチドのアンタゴニストを同定するためのアッセイもまた、本発明の一部である。
【０７４３】
第１の態様において、本発明は、抗炎症活性を有する、精製、単離された、人工的に合成された、または組換えＣＲＰＦポリペプチドを特徴とする。好ましい実施形態において、ＣＲＰＦポリペプチドは、アミノ酸配列：ＳＨＨＨを含むＣＲＰＦ−１ポリペプチドである。他の好ましい実施形態では、ＣＲＰＦポリペプチドは、アミノ酸 配列：ＡＡＮＳＫＶＡＦＳＡＶＲＳＴＮＨを含むＣＲＰＦ-２Ａポリペプチドである。他の好ましい実施形態では、ＣＲＰＦポリペプチドは、アミノ酸配列：ＡＡＮＳＫＶＡＦＳＡＶＲを含むＣＲＰＦ−２Ｂポリペプチドである。他の好ましい実施形態では、ＣＲＰＦポリペプチドは、アミノ酸配列：ＳＴＮＨを含むＣＲＰＦ−２Ｃポリペプチドである。他の好ましい実施形態では、ＣＲＰＦポリペプチドは、アミノ酸配列：ＳＧＳＡＫＶＡＦＳＡＴＲＳＴＮＨを含むＣＲＰＦ−３である。
【０７４４】
第２の実施形態において、本発明は、第１の態様に記載されている前記ＣＲＰＦポリペプチドを含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７４５】
第３の実施形態において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、炎症を低減する必要がある個体に提供または投与することを含む、炎症を低減する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の前記投与は、全身投与または局所投与である。
【０７４６】
第４の実施形態では、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、乾癬を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７４７】
第５の態様では、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７４８】
第６の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、脳組織における虚血性神経変性に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７４９】
第７の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、脳卒中に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５０】
第８の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、心筋梗塞に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５１】
第９の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、再潅流障害に関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５２】
第１０の態様において、本発明は、第２の態様で述べられている前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、慢性関節リウマチと関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５３】
第１１の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、炎症性腸疾患と関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５４】
第１２の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、全身性エリテマトーデスと関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５５】
第１３の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、アレルギー性喘息と関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５６】
第１４の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）と関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５７】
第１５の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、敗血症性ショックと関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５８】
第１６の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、多発性硬化症と関連する炎症を予防または治療する方法を特徴とする。
【０７５９】
第１７の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、炎症部位で局所的に、もしくは血液中で高いcｅｒｅｂｅｌｌｉｎレベルと関連する炎症または本明細書に記載の他の疾患を予防または治療する方法を特徴とする。前記の高いｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎレベルの程度が、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、１００％、または５００％であることが好ましい。ｃｅｒｅｂｅｌｌｉｎレベルは、前記ＣＲＰＦポリペプチドが投与される部位で高いことが好ましい。
【０７６０】
第１８の態様では、本発明は、第２の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、炎症性病態（inflammopathology）または免疫不全の動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＴｈｌ免疫応答を抑制する方法を特徴とする。前記動物は哺乳動物であることが好ましい。前記動物はげっ歯類であることが好ましい。
【０７６１】
第１９の態様において、本発明は、第１に態様に記載の前記ＣＲＰＦポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、炎症を低減する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、リガンドに結合する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、その受容体に結合する能力を中和する前記抗体がさらに好ましい。
【０７６２】
第２０の態様において、本発明は、第１の態様に記載の前記ＣＲＰＦポリペプチドに特異的な、第１９の態様に記載の前記中和抗体を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとしては、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７６３】
第２１の態様では、本発明は、炎症関連疾患を診断または分類するため、臨床試料における前記ＣＲＰＦポリペプチドの量を測定するために、第１の態様に記載の前記ＣＲＰＦポリペプチドに特異的な、第１９の態様に記載の前記抗体を使用する方法を特徴とする。前記 臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、およびリンパ組織からなる群から選択されることが好ましい。前記炎症関連疾患は、限定されないが、本明細書に記載の疾患から選択されることが好ましい。前記ＣＲＰＦポリペプチドの低下したレベルは、前記炎症関連疾患の一因であると考えられる。
【０７６４】
第２２の態様では、本発明は、前記癌を特徴付ける目的のため、癌患者から採取した臨床試料における前記ＣＲＰＦポリペプチドの量を測定するために、第１の態様に記載の前記ＣＲＰＦポリペプチドに特異的な、第１９の態様に記載の前記抗体を使用する方法を特徴とする。前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、および癌組織から選択されることが好ましい。前記方法は、限定されないが、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学から選択されることが好ましい。前記癌は、限定されないが、副腎腫瘍、神経節芽細胞腫、神経芽腫、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。高レベルの前記ＣＲＰＦポリペプチド（例えば、腫瘍細胞によって放出される）は、抗腫瘍応答の低下の一因であると考えられる。
【０７６５】
第２３の態様において、本発明は、第２０の態様に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む、第１の態様に記載の高レベルの前記ＣＲＰＦポリペプチドによって特徴付けられる癌を治療する方法。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、炎症反応を抑制する能力を中和することによって、ｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍応答が促進されると考えられる。前記癌は、限定されないが、副腎腫瘍、神経節芽細胞腫、神経芽腫、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。
【０７６６】
第２４の態様において、本発明は、第１の態様に記載の前記ＣＲＰＦポリペプチドに特異的に結合するが、無関係のポリペプチドには特異的に結合しない非抗体化合物を提供する。好ましい前記化合物は、低分子量の有機もしくは無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択される。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、炎症を低減する能力を中和する前記化合物がさらに好ましい。
【０７６７】
前記ＣＲＰＦポリペプチド断片の、炎症を低減する能力を中和することができる１種または複数種の化合物についてスクリーニングする方法がさらに好ましい。前記方法は当業者にはよく知られており、限定されないが：前記抗体の存在下にて、前記ＣＲＰＦポリペプチドを、炎症性病態のマウスモデルに投与する段階；前記抗体の非存在下にて、前記ＣＲＰＦポリペプチドを前記マウスモデルに投与する段階；前記抗体が、前記マウスモデルにおいて、前記ＣＲＰＦポリペプチドの、炎症を低減する能力を抑制するかどうかを決定する段階；を含む。
【０７６８】
第２５の態様において、本発明は、第２４の態様の前記中和化合物を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物、およびその代わりとして、薬学的または生理学的に許容される希釈剤を特徴とする。
【０７６９】
第２６の態様では、本発明は、第１の態様に記載の高レベルの前記ＣＲＰＦポリペプチドを有する癌患者を治療する方法であって、第２５の態様に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を、かかる治療が必要な個体に提供または投与することを含む方法を特徴とする。前記ＣＲＰＦポリペプチド断片の量を測定する方法には、限定されないが、第２２の態様に記載の方法が含まれる。前記ＣＲＰＦポリペプチドの、炎症反応を抑制する能力を中和することによって、ｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍応答が促進されると考えられる。前記腫瘍は、限定されないが、副腎腫瘍、神経節芽細胞腫、神経芽腫、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、乳癌、肺小細胞癌、結腸癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、骨肉腫、子宮癌、卵巣癌、軟骨肉腫、子宮内膜癌、精巣癌、腎癌、肝癌、肺小細胞癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫から選択されることが好ましい。
抗体の使用
本発明の抗体は、限定されないが、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化するための当技術分野で公知の方法、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ両方の診断および治療方法を含む用途を有する。例えば、その抗体は、生体試料において、抗原保有物質、例えば本発明のポリペプチドなどのレベルを定性的かつ定量的に測定するイムノアッセイでの用途を有する（例えば、Harlow et al., 1988参照）。そのタンパク質を発現する細胞を死滅させる、または体内のタンパク質のレベルを低減するための治療用組成物に、その抗体を使用することも可能である。
【０７７０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を一部または完全に乱す抗体を包含する。これらの抗体は、リガンド仲介受容体の活性化によって影響を受ける、すべてまたはすべてではない生物活性に対するアゴニストとして作用し得る。その抗体は、本明細書に開示される特異的活性を含む生物活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして指定される。上記の抗体アゴニストは、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＷＯ９６/４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Deng et al., (1998) Blood. 92 (6): 1981-1988; Chen et al., (1998), Cancer Res. 58 (16): 3668-3678；Harrop et al., (1998), J. Immunol. 161 (4): 1786-1794; Zhu, et al. (1998), Cancer Res. 58 (15): 3209-3214；Yoon, et al. (1998), J. Immunol. 160 (7): 3170-3179; Prat et al., (1998), J. Cell. Sci. 11 l (Pt2): 237-247; Pitard et al., (1997), J. Immunol. Methods. 205 (2): 177-190； Liautard et al., (1997), cytokine. 9 (4): 233-241; Carlson et al., (1997), J. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301；Taryman, et al., (1995), Neuron. 14 (4): 755-762; Mulleretal., (1998), Structure. 6 (9): 1153-1167；Bartunek et al., (1996), cytokine. 8 (1) : 14-20を参照のこと。
【０７７１】
上述のように、次に、本発明のポリペプチドの抗体は、当業者に公知の技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を作製するために使用することができる（例えば、Greenspan and Bona (1989), FASEB J. 7 (5): 437444 and Nissinoff, (1991), J. Immunol. 147 (8): 2429-2438参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合し、かつ本発明のポリペプチドのポリペプチド多量体化または結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ポリペプチドの多量体化または結合ドメインを「模倣し」、結果として、ポリペプチドまたはそのリガンドに結合し、かつ中和する抗イディオタイプを作製することができる。かかる中和抗イディオタイプ抗体を用いて、本発明のポリペプチドに結合させるか、またはそのリガンド／受容体に結合させ、それによって、その生物活性をブロックすることができる。
イムノアフィニティー・クロマトグラフィー
本明細書に記載の抗体を担体に結合させる。その抗体はモノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体を用いてもよい。担体は、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーで通常使用される担体のいずれかであり、いずれかの標準試薬を用いて、担体に結合させることができる。抗体を担体に結合させた後、単離、精製または濃縮することが望まれる、標的ポリペプチドを含有する試料と、その担体を接触させる。
【０７７２】
その後、適切な洗浄液で担体を洗浄し、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーで通常使用される高ｐＨまたは低ｐＨの溶出液を使用して、特異的に結合した標的ポリペプチドを担体から溶出する。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子産物の発現
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルおよびパターンの評価
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの空間的および時間的発現パターン、ならびにそれらの発現レベルは、いずれかの適切な方法を用いて決定することができる。
【０７７３】
一実施形態において、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルおよびパターンは、プローブとの溶液ハイブリダイゼーションによって分析される（例えば、ＷＯ９７/０５２７７参照）。簡単に言えば、対象のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡが標識され、捕捉可能な成分、例えばビオチンで誘導体化される。対象の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡと溶液中でハイブリダイゼーションした後、ハイブリダイズしていないプローブが消化によって除去され、残っているハイブリダイズしたＲＮＡは、例えばマイクロタイタープレート上に捕捉され、定量化される。
【０７７４】
他の実施形態では、網羅的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）のために、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、またはその断片を、ヌクレオチド配列でタグ付けすることも可能である（例えば、英国特許出願番号：２ ３０５ ２４１ Ａ参照）。
【０７７５】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現の定量分析もまた、アレイを用いて行うことができる。例えば、遺伝子発現の定量分析は、Schena et al. (1995) Science 270: 467-470 and Schena et al. (1996), PNAS, 93 (20): 10614-10619, Pietu et al., (1996) Genome Research 6: 492-503)によって記述されているように相補的ＤＮＡマイクロアレイにおいてＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、または他のマイクロアレイ技術を用いて行うことが可能である。簡単に言うと、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたはその断片はスライド上にアレイされ、そのアレイは、対象の細胞または組織のｍＲＮＡに由来するプローブとハイブリダイズされる。洗浄した後、特定用途用フィルターセットを備えたレーザー走査蛍光装置を用いて、そのアレイを走査する。２回の独立したハイブリダイゼーションの比の平均値を取ることによって、正確に差次的発現が測定される。
【０７７６】
代替方法としては、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現解析は、Lockhart et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 1675-1680およびSosnowski, et al., (1997) PNAS 94: 1119-1123によって記述されているように高密度ヌクレオチドアレイによって行うことができる。ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドまたはその断片の配列に相当する、１５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチップ上に直接合成するか、または合成し、次いでそのチップにアドレス指定する。標識ｃＤＮＡプローブは、適切なｍＲＮＡ集団から合成され、次いで５０〜１００ヌクレオチドの平均サイズにランダムに断片化される。次いで、そのプローブはチップにハイブリダイズされる。洗浄後、標識を検出し、定量化する。異なるｃＤＮＡ試料中の同じ標的オリゴヌクレオチドに対して、ｃＤＮＡプローブから生じるシグナルの強度を比較分析することによって、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの差次的発現が示される。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現データの使用
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルおよびパターンが決定されたら、この情報を用いて、検出、同定、スクリーニングおよび診断の目的のためにＧＥＮＳＥＴ遺伝子特異的マーカーを設計すること、ならびにＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現パターンに類似の発現パターンを有するＤＮＡコンストラクトを設計することが可能である。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現および／生物活性の検出
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を用いて、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現および／生物活性を検出する方法に関する。かかる方法は、例えば、正常または異常なＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現および／生物活性のスクリーンとして使用することができ、したがって診断的に使用することができる。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの検出
本発明はさらに、細胞または試料中のＧＥＮＳＥＴポリペプチドを検出する方法に関する。特定の実施形態において、細胞または試料におけるポリペプチドの存在は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出することによって間接的に検出される。例えば、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを検出する方法において、標識ポリヌクレオチドプローブを用いることが可能であり、ｍＲＮＡの存在は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現を示す。
【０７７７】
結果として、本発明は、試料中の本発明のポリヌクレオチドの存在を検出する方法を含み、その方法は、前記試料と、ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種または複数種の核酸プローブとを接触させる段階；前記の１種または複数種のプローブと、前記ポリヌクレオチドとの間に形成されたハイブリッド複合体を検出する段階；を含む。特定の実施形態において、１種または複数種のプローブが標識され、基質上に固定化される。
【０７７８】
その他の実施形態では、ポリヌクレオチドは増幅反応を用いて検出され、その増幅反応では、試料を増幅反応試薬と接触させ、増幅反応を行って、前記の選択されたヌクレオチドの前記領域を含有する増幅産物を合成し；増幅産物が検出される。好ましい実施形態において、増幅されるポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である場合、増幅されるＤＮＡ鋳型を提供するために、事前に第２ｃＤＮＡ鎖の逆転写および合成が最初に行われる。
【０７７９】
代替方法としては、試験試料におけるＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現を検出する方法は、本発明のＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはその一部に結合する、いずれかの産物を用いて達成することができる。かかる産物は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはその断片に特異的に結合することができる、抗体、抗体の結合断片、ポリペプチド、例えばＧＥＮＳＥＴポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストなどである。抗体への特異的結合の検出から、試料中にＧＥＮＳＥＴポリペプチドが存在することが示される（例えば、ＥＬＩＳＡ）。
【０７８０】
結果として、本発明は、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴポリペプチドの存在を特異的に検出する方法にも向けられており、前記方法は、本発明のポリペプチドまたはその断片に結合できる産物と、生体試料とを接触させる段階；産物をそのポリペプチドに結合させて、複合体を形成する段階；その複合体を検出する段階；を含む。好ましい実施形態では、その産物は、抗体、例えば、基質上に固定化される抗体である。
【０７８１】
本発明は、例えば、容器手段内に配置される、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに特異的に結合する化合物（例えば、結合タンパク質、抗体またはその結合断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片））、またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（例えば、相補的なプローブまたはプライマー）を備える、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子発現産物の検出で使用することができるキットにも関する。そのキットはさらに、バッファー等の補助的試薬を備え得る。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性の検出
本発明はさらに、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性を特異的に検出し、かつＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性を調節することができる化合物を同定する方法を包含する。ＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性の評価は、本明細書に記載の技術など、様々な技術を用いて、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドと関連するいずれかの細胞特性の変化を検出することにより実施することが可能である。ポリペプチドの修飾因子を同定するために、対照を用いることが好ましい。例えば、対照試料としては、評価される化合物または作用物質は欠くが、同一試薬すべてを含み；試験試料と同じ手法で試験される。
【０７８２】
本発明は、例えば、容器手段内に配置される、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの基質、ＧＥＮＳＥＴ結合化合物、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに対する抗体等を備える、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド生物活性の検出に使用できるキットにも関する。そのキットはさらに、バッファー等の補助的試薬を備え得る。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子発現の特定のコンテクストの同定
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現パターンから、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子が所定のコンテクストにおいて特異的に発現することが示される場合、次いで、この遺伝子に特異的なプローブおよびプライマー、ならびにＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合する抗体を、特定のコンテクストにマーカーとして使用することができる。特定のコンテクストの例としては：所定の組織／細胞または組織／細胞型における特異的発現、胎芽発生または疾患発症などのプロセスの所定の発生段階での発現、特定の化合物または薬物に応答した発現、または所定の細胞器官における特異的発現が挙げられる。かかるプライマー、プローブ、および抗体は、未知の起源の組織/細胞/細胞器官、例えば、法医学的試料、異物部位に転移した分化腫瘍組織を同定するのに、または組織断面における異なる組織型を区別するのに商業的に有用である。
【０７８３】
組織／細胞／細胞器官の同一性の決定は、当技術分野でよく知られている方法（例えば、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲに基づく方法、イムノアッセイ、免疫化学、ＥＬＩＳＡ）を用いて、組織／細胞試料におけるｍＲＮＡ（または相当するｃＤＮＡまたはタンパク質）の有無を検出する方法に基づく。したがって、本発明は、組織マーカーとしての本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体の使用を包含する。
標識組織特異的抗体を用いた、組織型または細胞種の同定
特定の細胞の同定は、直接的（例えば、緑色蛍光タンパク質)もしくは間接的に検出可能なマーカーに結合される抗体プレパラートを用いた、組織特異的抗原の可視化によって達成される。選択された標識抗体種は、組織切片、細胞浮遊液、または組織試料からの可溶性タンパク質の抽出物中の、それらの特異的抗原結合パートナーに結合し、定性的または半定性的解釈のためのパターンを提供する。
Ａ．免疫組織化学技術
上述のように作製された、精製された抗力価抗体は、例えばFudenberg, (1980) Chap. 26 in: Basic 503 Clinical Immunology, 3rd Ed. Lange, Los Altos, California or Rose et al., (1980) Chap. 12 in: Methods in Immunodiagnosis, 2d Ed. John Wiley 503 Sons, New Yorkによって記述されているように検出可能なマーカーに結合される。
【０７８４】
抗体は、いずれかの適切な方法、例えば蛍光標識、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、フェリチン（ＥＭを使用する検出のため）、または放射標識を用いて標識することができる。一実施形態において、未知組織および既知の対照のクリオスタット切片を作製し、各スライドは、抗体プレパラートの異なる希釈溶液でカバーされる。インキュベーションに続いて、余分な液体を除去し、マーカーを検出する。組織切片上の色および蛍光の強度を測定し、かつ適切な標準を用いて、そのシグナルを較正することによって、上記手順によって見出された抗原を定量化することができる。
Ｂ．組織特異的可溶性タンパク質の同定
組織特異的タンパク質の可視化およびその手順からの未知組織の同定は、免疫組織化学について述べられた標識抗体試薬および検出方法を用いて行われる；しかしながら、例えばウエスタンブロット法による検出のために、分子量に基づいて順序正しい配列で、組織から抽出されたタンパク質を分配する電気泳動技術に従って作製される。例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, ed. , Elsevier Press, NY (1986), Section 19-3参照のこと。
異常なＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現および／または生物活性のスクリーニングおよび診断
さらに、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現に特異的な抗体および／またはプライマーまたはプローブもまた、異常なＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現および／または生物活性を同定し、続いて、異常なＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現と関連する疾患をスクリーニングおよび／または診断するために使用することができる。例えば、特定の疾患は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現の欠如、過剰発現または過小発現から生じ得る。健康な個体から採取した試料におけるｍＲＮＡの発現パターンおよび量を、特定の疾患を有する個体からの試料と比較することによって、この疾患の原因である遺伝子が同定される。
特定の疾患のスクリーニング
本発明は、高いまたは低いレベルのＧＥＮＳＥＴポリペプチドを有する個体を同定するための、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの方法および使用にも関し、その個体はおそらく、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制または高める治療から、それぞれ恩恵を受けるだろう。かかる方法および使用の一例は、生体試料におけるＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）の存在を検出する段階；前記試料に存在するＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする遺伝子産物の量を、対照試料における量と比較する段階；その試料が、対照試料と比較して、低いまたは高いレベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を有するかどうかを決定する段階；を含む。
【０７８５】
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドと関連するいずれかの疾患または病状に冒されている、または発症するリスクがある対象から採取された生体試料を、正常な集団（標準または対照）に対して、低いまたは高いレベルのＧＥＮＳＥＴ遺伝子の存在についてスクリーニングすることが可能であり、正常な集団に対して低いまたは高いレベルのＧＥＮＳＥＴポリペプチドは、その疾患または病状の素因を示すか、あるいはその疾患もしくは病状、またはその疾患もしくは病状に関連するいずれかの症状の現在の指標となる。かかる個体は、治療の、例えばＧＥＮＳＥＴポリペプチド、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現または活性に影響を及ぼす他のいずれかの化合物を含有する薬剤組成物での処置の候補であると考えられる。一般的に、患者における高レベルのＧＥＮＳＥＴポリペプチドの同定から、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現または活性を抑制する試薬での治療から恩恵を受けるであろう個体が示され、患者における低レベルのＧＥＮＳＥＴポリペプチドの同定からは、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現または活性を誘発する作用物質から恩恵を受けるであろう個体が示されるだろう。
【０７８６】
この方法で使用するのに適した生体試料としては、限定されないが、血液、唾液、乳、および尿などのいずれかの生物体液、ならびに生検材料などの組織試料が挙げられる。例えば、組織生検から得られる細胞培養物または細胞抽出物もまた使用することができる。好ましい実施形態では、生体試料は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子産物と関連する、いずれかの疾患または病状に伴う症状を呈する動物から採取される。この方法にしたがって、試料における変化した（例えば、増大または減少した）レベルのＧＥＮＳＥＴ産物の存在から、対象がその疾患または病状に罹患しやすいことが示される。
【０７８７】
本明細書に記載の診断方法論は、ヒト哺乳動物および非ヒト哺乳動物のどちらにも適用することができる。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子突然変異の検出
本発明は、本発明のポリヌクレオチドにおける突然変異を検出するための方法およびＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドの使用も包含する。突然変異がある疾患と関連することが証明された場合には、かかる突然変異の検出は、スクリーニングおよび診断の目的に使用することができる。
【０７８８】
一実施形態において、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子において、好ましくはそれらの調節領域において生じる突然変異を検出するために、オリゴヌクレオチドプローブマトリックスを有利に使用することが可能である。この特定の目的では、プローブは、既知の突然変異（１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換のいずれかによる）を保持する遺伝子とのそれらのハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を有するように、特異的に設計される。既知の突然変異とは、例えば Huang et al., (1996) Cancer Res 56 (5): 1137-1141 or Samson et al., (1996) Nature, 382 (6593): 722-725によって使用される技術に従って同定された、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子上の突然変異を意味する。
【０７８９】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子における突然変異を検出するために使用される他の技術としては、高密度ＤＮＡアレイの使用が挙げられる。高密度ＤＮＡアレイの各オリゴヌクレオチドプローブのユニット要素を構成する各オリゴヌクレオチドプローブは、ＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの特定の部分配列（subsequence）に一致するように設計される。このように、標的遺伝子配列の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイを用いて、標的配列の野生型遺伝子配列との同一性が決定され、その量が測定され、かつ標的配列とＧＥＮＳＥＴ遺伝子の参照野生型遺伝子配列との差異が検出される。かかる一実施形態において、４Ｌタイルアレイ（tiled array）が使用される(例えば、Chee et al., (1996) Science. 274: 610-614参照)。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現パターンを有するＤＮＡコンストラクトの構築
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの空間的および時間的発現パターンおよび発現レベルの特徴付けもまた、以下に記述するように、望ましい空間的または時間的手法において、所望のレベルの遺伝子産物を作製することができる発現ベクターを構築するのに有用である。
組換え細胞宿主および遺伝子導入動物における時間的および空間的ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を指示するＤＮＡコンストラクト
細胞レベルおよび多細胞生物レベルの両方で、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの合成欠損の生理学的および表現型的結果を研究するために、本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡの特異的対立遺伝子、例えば配列内の１つまたは複数の塩基の置換、欠失、または付加を含む対立遺伝子などの条件発現を可能にするＤＮＡコンストラクトおよび組換えベクターもまた包含する。
【０７９０】
一実施形態において、 Gossen et al., (1992) PNAS 89: 5547-5551 ; Gossen et al., (1995) Science 268: 17661769；および Furth P. A. et al. (1994) PNAS 91: 9302-9306にによって述べられているように、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を制御するために、大腸菌トランスポゾンＴｎ１０からのテトラサイクリン耐性オペロンに基づく、ＤＮＡコンストラクトが使用される。
【０７９１】
その他の実施形態において、５’末端から３’末端に：ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするゲノム配列で見出される第１ヌクレオチド配列；正の選択マーカー（例えば、ネオ（ｎｅｏ））を含むヌクレオチド配列；およびＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードするゲノム配列で見出され、かつ第１ＧＥＮＳＥＴヌクレオチド配列の下流に位置する第２ヌクレオチド配列；を含む、ＤＮＡコンストラクトが使用される。好ましい実施形態において、そのコンストラクトは、第１ＧＥＮＳＥＴヌクレオチド配列の下流または第２ＧＥＮＳＥＴヌクレオチド配列から上流に位置する、負の選択マーカー（例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンβ、ｈｐｒｔ、ジフテリア毒素Ａ断片）も含む（例えば、Thomas et al. (1986), Cell. 44: 419-428; Te Riele et al. (1990), Nature. 348: 649-651 ; Van der Lugt et al. (1991), Gene 105: 263-267; Reid et al., (1990) PNAS 87: 4299-4303; Nada et al., (1993) Cell 73: 1125-1135; Yagi, T., et al. (1990), PNAS 87: 9918-992; Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) and Koller et al., (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 705-730)参照)。
【０７９２】
他の実施形態において、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムの使用を含むベクターが使用される（Hoess et al., (1986) 核酸 Res. 14: 2287-2300）。相同的組換え技術と組み合わせて使用されるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、Gu H. et aL, (1993) Cell 73: 1155-1164 and Gu H. et al., (1994) Science 265: 103-106に記述されている。簡単に言えば、ゲノムの標的位置に挿入される対象のヌクレオチド配列は、同じ向きに少なくとも２つのｌｏｘＰ部位を有し、組換えゲノムから除去されるヌクレオチド配列のそれぞれの末端に位置する。除去現象には、組換え細胞宿主の核内にリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）酵素が存在する必要があり、数多くの方法のいずれかで、例えばこの酵素を含有する培地において組換え細胞宿主をインキュベートすることによって、Ｃｒｅ酵素を直接、目的細胞中に注入することによって、細胞中に酵素をリポフェクションすることによって、またはそうでなければ、適切なプロモーターの制御下にて、Ｃｒｅコード配列を細胞にトランスフェクトすることによって提供される(例えば、Baubonis et al (1993) Nucleic acids Res. 21 (9): 2025-9); Araki et al., (1995) PNAS 92 (1) : 160-4; Gu et al. (1993); Sauer et al., (1988) PNAS 85: 5166-5170; Gu et al. (1994); Zou, et al, (1994) Curr. Biol. 4: 1099-1103; Anton and Graham, (1995), J. Virol., 69: 4600-4606; and Kanegae et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821参照)。
【０７９３】
上述のＤＮＡコンストラクトを用いて、本発明の目的のヌクレオチド配列、好ましくはＧＥＮＳＥＴゲノム配列またはＧＥＮＳＥＴ ｃＤＮＡ配列、最も好ましくはＧＥＮＳＥＴゲノムまたはｃＤＮＡ配列の改変されたコピーを標的ゲノムの所定の位置に導入することが可能であり、その結果として、標的遺伝子の改変されたコピーが作製されるか（ノックアウト相同的組換え）、または相同的組換え現象を起こすのに十分に相同的な他のコピーにより標的遺伝子のコピーが置換される（ノックイン相同的組換え）。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現および／または生物活性の修飾
内因性ＧＥＮＳＥＴ発現および／または生物活性の修飾は特に、本発明によって企図される。
ＧＥＮＳＥＴの発現および／または生物活性を調節することができる化合物についてのスクリーニング
本発明は、ＧＥＮＳＥＴの発現および／または生物活性を調節することができる化合物、およびこれらの化合物を使用する方法に関する。かかる化合物は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の調節配列と相互作用するか、またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドと直接的または間接的に相互作用し得る。
ＧＥＮＳＥＴ調節配列と相互作用する化合物
本発明は、例えば、当業者に公知のいずれかの技術を用いて決定される、ゲノムＤＮＡの非転写領域におけるプロモーターまたはエンハンサー配列など、またはＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡの非翻訳領域に位置する調節配列など、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の調節配列と相互作用することができる物質または分子をスクリーニングする方法にも関する。
【０７９４】
本発明のポリヌクレオチドの非転写または非翻訳領域内の配列は、転写開始部位、転写因子結合部位、プロモーター配列、エンハンサー配列、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ要素などの、既知の調節配列を含有するデータベースと比較することによって同定することができる (Pesole et al., (2000) Nucleic Acids Res, 28 (1) : 193-196; http ://igs- server. cnrs-mrs. fr/-gauthere/UTR/index. html)。代替方法としては、レポータープラスミドの従来の突然変異誘発または欠失の解析によって、対象の調節配列を同定することができる。
【０７９５】
潜在的なＧＥＮＳＥＴ調節配列の同定に続いて、これらの調節配列と相互作用するタンパク質が、以下に述べるように同定される。
【０７９６】
ゲルシフトアッセイ（gel retardation assay）などの数多くの方法のいずれかを用いて、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の調節配列と相互作用することができる分子を同定することができる (例えば、Fried and Crothers, (1981) Nucleic Acids Res. 9: 6505-6525; Garner and Revzin, (1981) Nucleic Acids Res 9: 3047-3060; and Dent and Latchman (1993) The DNA mobility shift assay. In: Transcription Factors: A Practical Approach (Latchman DS, ed. ) pp: 1-26, Oxford: IRL Press参照)。ＧＥＮＳＥＴ遺伝子のプロモーター配列と相互作用することができるタンパク質をコードする核酸もまた、１ハイブリッド系（one-hybrid system）（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（カタログ参照番号Ｋ１６０３−１)）を使用して同定することができる。
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドと相互作用するリガンド
本発明の目的では、リガンドは、分子、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、あるいはＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片または変異体の１つに結合することができる、またはＧＥＮＳＥＴまたはその断片または変異体をコードするポリヌクレオチドの発現を調節する、いずれかの合成化学化合物を意味する。
【０７９７】
一実施形態において、このタンパク質と、試料の成分または定義される分子との間で複合体が形成されるかどうかを決定するために、生体試料、またはＧＥＮＳＥＴタンパク質の推定リガンドとして試験される定義された分子（例えば、コンビナトリアルケミストリーによって生成される分子）を、精製されたＧＥＮＳＥＴタンパク質と接触させる。かかる分子とタンパク質との相互作用は、いずれかの方法で、例えばＨＰＬＣに連結される微小透析を用いて、アフィニティーキャピラリー電気泳動等を用いて評価することができる（例えば、Wang, et al. (1997), Chromatographia, 44: 205-208; Bush et al., (1997), J. Chromatogr. , 777: 311-328参照）。
【０７９８】
本発明の方法においてＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの相互作用に関して、限定されないが、ペプチド、薬物、脂肪酸、リポタンパク質、もしくは小分子など、どの種類の化合物も試験することが可能であり、いずれかの源から得ることができる。例えば、試験される分子は、蛍光標識、放射標識、もしくは酵素標識などの検出可能な標識で標識され、特異的な結合を生じさせる条件下にて、固定化されたＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片と接触して置かれる。非特異的に結合した分子を除去した後、結合分子を適切な手段を用いて検出する。
Ａ．ランダムペプチドライブラリーから得られる候補リガンド
スクリーニング法の特定の実施形態において、推定リガンドは、例えば、長さ８〜２０アミノ酸のペプチドを含むランダムペプチドファージライブラリーからのファージベクターに含まれるＤＮＡインサートの発現産物である（Parmley and Smith (1988) Gene 73: 305-318; Oldenburg et al. (1992) PNAS 89: 5393-5397; Valadon et al. (1996) J. Mol. Biol., 261: 11-22; Lucas (1994) In: Development and Clinical Uses of Haempophilus b Conjugate; Westerink (1995) PNAS 92: 4021-4025; Felici (1991) J : Mol. Biol., 222: 301-310)。  組換えファージにおけるリガンドライブラリーが構築されたら、固定化されたＧＥＮＳＥＴタンパク質とファージ集団を接触させ、洗浄した後、ＧＥＮＳＥＴタンパク質に特異的に結合するファージを、バッファー（酸性ｐＨ）によって溶出するか、またはＧＥＮＳＥＴタンパク質に特異的抗体を使用して免疫沈降する。続いて、単離されたファージを細菌（例えば、大腸菌）の過剰感染によって増幅する。さらに特異的な組換えファージクローンを選択するために、その選択段階は、数回、好ましくは２〜４回繰り返し行われる。
Ｂ．競合的実験により得られる候補リガンド
代替方法としては、本発明のポリペプチドに結合するペプチド、薬物または小分子は競合的実験において同定することができる。かかる一アッセイにおいて、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片を、プラスチックプレートなどの表面に固定化する。増加量のペプチド、薬物または小分子は、検出可能な既知のＧＥＮＳＥＴタンパク質リガンドの存在下にて、固定化されたＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片と接触して置かれる。例えば、ＧＥＮＳＥＴリガンドは、蛍光標識、放射標識、または酵素標識で検出可能に標識される。ＧＥＮＳＥＴタンパク質、またはその断片に結合する試験分子の能力は、試験分子の存在下にて、結合した、検出可能に標識された既知のリガンドの量を測定することによって決定される。試験分子が存在する場合、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片に結合した既知のリガンドの量の減少から、試験分子はＧＥＮＳＥＴタンパク質、またはその断片に結合することができることが示された。
Ｃ．アフィニティークロマトグラフィーによって得られる候補リガンド
本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質または他の分子は、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片を含有するアフィニティーカラムを用いて見つけることもできる。適切なカラムマトリックス（例えば、アガロース、Ａｆｆｉ Ｇｅｌ（登録商標）等）への化学結合を含む従来の技術を用いて、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片をカラムに付ける。この方法の一部の実施形態では、アフィニティーカラムはキメラタンパク質を含有し、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片はグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合される。上述のように細胞タンパク質の混合物または発現したタンパク質のプールが、アフィニティーカラムに適用される。次いで、カラムに付けられた、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片と相互作用するタンパク質または他の分子を、Ramunsen et al., (1997), Electrophoresis, 18: 588-598に記載のように、例えば２次元ゲル電気泳動で単離し、解析する。代替方法としては、電気泳動に基づく方法によって、アフィニティーカラム上に保持されたタンパク質を精製し、シークエンスすることができる。同じ方法を用いて、抗体を単離すること、ファージディスプレイ産物をスクリーニングすること、またはファージディスプレイヒト抗体をスクリーニングすることができる。
Ｄ．光学バイオセンサー法によって得られる候補リガンド
本発明のポリペプチドと相互作用するタンパク質は、光学バイオセンサーを使用することによってスクリーニングすることもできる (例えば、Edwards and Leatherbarrow (1997) Anal. Bioch. 246: 1-6; Szabo et al., (1995) Curr Opin Struct Biol 5, 699-705参照）。この技術によって、標識分子の必要なく、リアルタイムで分子間の相互作用を検出することが可能となる。この技術は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）現象に基づく。一実施形態において、アッセイされる候補分子がそれを通って流動する、細胞の一方の側を含む表面（カルボキシメチルデキストランマトリックスなど）に、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはその断片を結合させる。試験される試料を含有しない表面の側に対して光線が向けられ、前記表面によって反射される。候補リガンド分子の結合は、表面の屈折率の変化によって起こり、その変化は、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。内因性または組換え発現ＧＥＮＳＥＴタンパク質をそれらの表面に示す、真核生物細胞または原核細胞または脂質ベシクルを固定化することによって、この技術を実施することもできる。
Ｅ．２ハイブリッド（two-hybrid)スクリーニングアッセイによって得られる候補リガンド
酵母２ハイブリッド系（yeast two-hybrid system）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質間相互作用を研究するために設計され（Fields and Song, 1989；米国特許第５，６６７，９７３号および同第５，２８３，１７３号）、酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへのベイト（bait）タンパク質の融合に依拠する。２ハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般的手順は、Harper et al., (1993), Cell 75 : 805-816; Cho et al., (1998) PNAS 95 (7): 3752-3757; Fromont-Racine et al., (1997) Nature Genetics 16 (3): 277-282 に記載のように実施することができる。通常の実施形態において、ベイトタンパク質は、本発明のポリペプチドを含み、「プレイ（prey）」は、ヒトｃＤＮＡインサートが、ＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクターにおいてヌクレオチド配列に融合するように構築されたヒトｃＤＮＡライブラリーを含む。他の実施形態において、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはその断片または変異体と、細胞タンパク質との相互作用は、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２（カタログ番号：Ｋ１６０４-１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて評価される。
ＧＥＮＳＥＴ生物活性を調節する化合物
ＧＥＮＳＥＴ発現および／または生物活性を調節する化合物についてスクリーニングする他の方法は、宿主細胞において、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、特定の生物活性、例えばＧＥＮＳＥＴ生物活性に対する試験化合物の効果を測定することによる方法である。ＧＥＮＳＥＴ生物活性は、いずれかのＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはポリヌクレオチドについて記載の活性、機能、または特性のいずれかを含み得る。一実施形態において、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドをコードする核酸コンストラクトが、宿主細胞に導入され、その宿主細胞は、コードされるＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現に適切な条件下で維持され、それによって、核酸が発現される。次いで、宿主細胞を試験作用物質と接触させ、作用物質の存在下でのＧＥＮＳＥＴポリペプチドに関連する特性の変化を検出することによって、その作用物質がＧＥＮＳＥＴ生物活性を変化させることが示される。特定の実施形態において、本発明は、ＧＥＮＳＥＴ生物活性の活性化剤である作用物質を同定する方法に関し、その方法では、作用物質の存在下でのＧＥＮＳＥＴポリペプチドに関連する特性の増加を検出することによって、その作用物質がＧＥＮＳＥＴ生物活性を活性化することが示される。他の特定の実施形態において、本発明は、ＧＥＮＳＥＴ生物活性の阻害剤である作用物質を同定する方法に関し、その方法では、作用物質の存在下でのＧＥＮＳＥＴポリペプチドに関連する特性の減少を検出することによって、その作用物質がＧＥＮＳＥＴ生物活性を抑制することが示される。その他の特定の実施形態では、ＧＥＮＳＥＴ生物活性を活性化（高める）または抑制する作用物質を同定するために、ハイスループットスクリーニングが用いられる（例えば、ＷＯ９８/４５４３８参照）。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現および／または活性を調節する化合物についてスクリーニングする方法
本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびポリヌクレオチドの活性または発現を調節する（例えば、増加または抑制する）それらの能力について化合物をスクリーニングする方法にも関する。さらに詳細には、本発明は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびポリヌクレオチドの発現または活性を増加または減少させる、それらの能力について化合物を試験する方法に関する。そのアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現する、またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現することができる細胞を、試験化合物の存在下および非存在下にてインキュベートする。試験化合物の存在下でのＧＥＮＳＥＴの発現レベルまたは試験化合物の存在下でのＧＥＮＳＥＴの生物活性レベルを決定することによって、ＧＥＮＳＥＴ発現または活性を抑制する、または高める化合物を同定することができる。代替方法としては、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＬａｃＺ、緑色蛍光タンパク質等）に作動可能に連結されるＧＥＮＳＥＴ調節配列を含むコンストラクトを宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の効果を検出することができる。結果として、本発明は、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を調節する分子をスクリーニングする方法を包含し、前記スクリーニング法は、それ自体のプロモーターの制御下に置かれるＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはＧＥＮＳＥＴ５’調節領域の制御下に置かれる検出可能なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞を培養する段階；試験される分子とその培養細胞を接触させる段階；その分子の存在下にて、ＧＥＮＳＥＴまたは検出可能なポリペプチドの発現を定量化する段階；を含む。その方法は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたは５’調節領域のいずれかの断片、変異体、もしくは誘導体を用いて実施することもできる。
【０７９９】
ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの発現の定量化は、ｍＲＮＡのレベル（例えば、対象のＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブを用いたノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは定量的ＲＴ−ＰＣＲによる）またはタンパク質のレベル（イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイ、ウェスタンブロットまたは免疫化学においてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いた）で理解される。
【０８００】
更なる実施形態では、ＧＥＮＳＥＴ５’調節領域は、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチド配列、および／またはＧＥＮＳＥＴ５'ＵＴＲ配列に対して内因性または外来性であるプロモーター配列の５'ＵＴＲ領域を含む。
【０８０１】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を調節する分子を同定する段階と、生理学的に許容される担体とその同定された分子を組み合わせる段階と、を含む薬剤組成物を製造する方法に関する。
【０８０２】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を調節する能力について候補物質をスクリーニングするためのキット。かかるキットは、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される、ＧＥＮＳＥＴ５’調節領域またはその調節活性断片または変異体、あるいはＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片または変異体を含む組換えベクターを備えることが好ましい。
【０８０３】
本発明の他の目的は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド、その断片または変異体と相互作用する候補物質をスクリーニングする方法およびキットを含む。ＥＮＳＥＴポリペプチド、その断片または変異体に共有結合または非共有結合で結合するそれらの能力によって、これらの物質または分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらでも有利に使用することができる。
【０８０４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにて、試料、好ましくは生体試料におけるＧＥＮＳＥＴタンパク質の存在を同定するために、前記の相互作用する分子を検出手段として使用することができる。
【０８０５】
一実施形態において、候補物質をスクリーニングする方法であって、ＧＥＮＳＥＴタンパク質を提供する段階；そのタンパク質を候補物質と接触させる段階；複合体がポリペプチドまたは断片と候補物質との間に形成されるかどうかを決定する段階；を含む方法を提供する。
【０８０６】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、ＧＥＮＳＥＴポリペプチド、その断片または変異体と相互作用する物質を同定する段階と、さらに、同定された物質を生理学的に許容される担体と混合する段階と、を含む、薬剤組成物を製造する方法に関する。
【０８０７】
本発明はさらに、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドと相互作用する候補物質をスクリーニングするためのキットに関し、前記キットは、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドと、任意に、ポリペプチドと候補物質との間に形成される複合体を検出する手段と、を備える。一実施形態において、検出手段は、前記ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはその断片または変異体に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏでの方法
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を抑制する、または高める化合物もまた、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを用いて同定することができる。通常のアッセイにおいて、試験化合物は、様々な投与量のレベルで動物に（例えば、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、またはその他の経路で）投与され、その化合物のＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現に対する効果は、例えばノーザンブロット、イムノアッセイ、ＰＣＲ等を用いて、対象の遺伝子を発現することが分かっている組織における、遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを比較することによって決定される。適切な試験動物としては、限定されないが、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、霊長類、およびウサギが挙げられる。その内因性マウスタンパク質が切断されている（ノックアウトされている）ヒト化マウスを使用することも可能であり、相同的ヒトタンパク質が、標準的な遺伝子導入法を用いて導入される。したがって、かかるマウスは、タンパク質のヒト型タンパク質のみを発現する。ヒトＧＥＮＳＥＴポリペプチドのみを発現するヒト化マウスを用いて、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを調節する潜在的な作用物質に対するｉｎ ｖｉｖｏの応答を研究することができる。かかる遺伝子導入動物は、疾患の生化学的および生理学的段階を分析するのに有用であり、かつ疾患処置のための治療法の開発に有用である（例えば、Loring, et al, 1996参照）。
【０８０８】
さらに、化合物を投与した後、動物のいずれかのＧＥＮＳＥＴ遺伝子関連挙動または特性の変化の検出を、その化合物が遺伝子の発現または活性を調節するという指標として使用することもできる。
ＧＥＮＳＥＴの発現および／または生物活性を調節する化合物の使用
系をｉｎ ｖｉｖｏ（またはｉｎ ｖｉｔｒｏ）で用いて、例えば副腎、骨髄、脳、小脳、結腸、胎児の脳、胎児の腎臓、心臓、肥大前立腺、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ球、筋肉、卵巣、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、脊髄、脾臓、胃、腸、黒質、精巣、甲状腺、臍帯もしくは子宮など、対象の１種または複数種の特定の組織におけるＧＥＮＳＥＴの発現または活性を増加させる組織特異的な効果を及ぼす化合物を同定することが可能である。上述の方法などのスクリーニング方法もまた、薬理学的介入方法におけるそれらの潜在的な使用に対して作用物質を同定するのに有用である。したがって、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を高める、またはその活性を刺激する作用物質を使用して、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子と関連するいずれかの表現型を誘導すること、またはＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性または発現の欠損から生じる疾患を治療することができる。ＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現を抑制する、またはその活性を阻害する化合物を使用して、増加した、または有害なＧＥＮＳＥＴポリペプチド活性または発現と関連する疾患または病状を治療することができる。
【０８０９】
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子またはポリペプチドと直接または間接的に相互作用し、かつＧＥＮＳＥＴポリペプチド発現および／または機能を高める作用物質もまた包含される。一実施形態において、その作用物質は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに、直接的（ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに結合することによって）または間接的に（例えば、ＧＥＮＳＥＴ生物活性を有する、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの能力をブロックすることによって）干渉する阻害剤である。特定の実施形態において、ＧＥＮＳＥＴタンパク質の阻害剤は、ＧＥＮＳＥＴタンパク質またはＧＥＮＳＥＴタンパク質の機能的部分に特異的な抗体である。代わりに、その阻害剤は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに結合し、かつその活性をブロックする抗体以外の作用物質（例えば、有機小分子、タンパク質またはペプチド）であり得る。例えば、その阻害剤は、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを構造的に模倣するが、その機能を欠く作用物質であり得る（例えば、そのタンパク質のドミナントネガティブ型）。一方、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドが通常それに結合する、または相互作用する、分子に結合するか、または分子と相互作用し、その結果、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドがそうするのをブロックし、通常示すであろう効果を示すのを防ぐ作用物質であり得る。
【０８１０】
他の実施形態では、作用物質は、直接的または間接的の両方で、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの活性を増加させる（所定の量またはレベルのＧＥＮＳＥＴポリペプチドの効果を高める）、それが有効である時間の長さを増大する（その分解を防ぐことによって、またはそうでなければ、それが活性な時間を延ばすことによって）ＧＥＮＳＥＴポリペプチドのエンハンサー（活性化剤）である。例えば、ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、ＧＥＮＳＥＴ生物活性を誘導する、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの能力を増加または減少させる薬物を同定することが可能であり、その薬物は、ＧＥＮＳＥＴ生物活性と関連する疾患または病状を治療または予防するのに有用である。
【０８１１】
このように、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるＧＥＮＳＥＴ生物活性を（一部または完全に）抑制する方法であって、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはポリヌクレオチドの有効量の阻害剤を哺乳動物に投与することを含む方法に関する。本発明は、哺乳動物におけるＧＥＮＳＥＴ生物活性を高める方法であって、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはポリヌクレオチドの有効量のエンハンサーを哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現の抑制
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現は、多数の方法のいずれかにおいて、例えばアンチセンスツールまたは相当するＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を抑制する三重らせんツールを使用することなどによって、例えば治療用途で抑制することができる。
アンチセンスアプローチ
アンチセンスアプローチにおいて、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列が、細胞内でｍＲＮＡとハイブリダイズされ、それによって、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現がブロックされる。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを使用する好ましい方法は、Sczakiel et al., (1995) Trends Microbiol. 3 (6): 213-217; Green et al., (1986) Ann. Rev. Biochem. 55: 569-597; Izant and Weintraub, (1984) Cell 36 (4): 1007-15; Liu et al. (1994) PNAS 91: 4528-4262; Eckner et al., (1991) EMBO J. 10: 3513-3522に記述されている手順である。
【０８１２】
そのアンチセンスツールは、ＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡに、さらに好ましくは５’末端（例えば、翻訳開始コドンＡＴＧ）またはＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡのスプライシングドナーもしくはアクセプター部位に相補的である、ポリヌクレオチド(長さ１５〜２００ｂｐ)の中で選択されることが好ましい。他の実施形態では、目的の標的遺伝子の異なる部分に相補的な異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。そのアンチセンス分子は、いずれかの方法において、例えば、細胞におけるＧＥＮＳＥＴ遺伝子のコード領域の向きを逆にすることによって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでオリゴヌクレオチドを合成し、細胞にそれを投与することによって作製することができる。
【０８１３】
本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちのいずれかの部分に相補的な、いずれかのアンチセンス配列を使用することができ、その配列は、主鎖、結合または塩基への任意の数の修飾を含むことが可能であり、その多くは当技術分野で公知である。適切な修飾、アンチセンス分子の他の形態およびその作製は、特に、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I. , ed. John Wiley & Sons, 1990; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition (1991), 30,613 ; Sanghvi, et al., eds. , (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton；米国特許第６，２４２，５９０号；Ｗ０９４／２３０２６、ＷＯ９６／３１５２３；ＷＯ９２／１８５２２；欧州特許出願番第０５７２ ２８７ Ａ２号；ＷＯ９２／１９７３２; Letsinger et al., PNAS (1989) 86: 6553-6556; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. (1994) 4: 1053-1060; Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. (1992) 660: 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. (1993) 3: 2765-2770; Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. (1992) 20: 533-538; Saison-Behmoaras et al., EMBO J. (1991) 10: 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett. (1990) 259: 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie (1993) 75: 49-54; Manoharan et al., Tetrahedron Lett. (1995) 36,3651-3654 ; Shea et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 3777-3783; Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides (1995) 14: 969-973; Manoharan et al., Tetrahedron Lett. (1995) 36: 3651-3654; Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta (1995) 1264: 229-237; Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. (1996) 277: 923-937；米国特許第６，２４２，５９０号に教示されている。
【０８１４】
標的ＧＥＮＳＥＴポリヌクレオチド配列もしくはその断片に結合する、アンチセンス核酸およびその修飾型のハイスループットスクリーニングの方法がさらに包含される（例えば、米国特許第６，０２２，６９１号参照）。
【０８１５】
遺伝子の発現を抑制するのに必要とされるアンチセンス核酸の適切なレベルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現解析を用いて決定することができる。通常、アンチセンス分子は、多くの様々な濃度、好ましくは１×１０-10Ｍ〜１×１０-4Ｍで細胞試料上に導入される。遺伝子発現を適切に制御できる最低濃度が同定されたら、最適化された用量は言い換えると、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの使用に適した投与量ということになる。例えば、１×１０-7の培養物中の抑制濃度は、およそ０．６ｍｇ/体重ｋｇの投与量ということになる。
【０８１６】
本発明に従って使用されるアンチセンス技術の代替方法は、それらの相補的ポリヌクレオチドテールにより標的配列に結合するであろう、かつその標的部位を加水分解することにより、相当するＲＮＡを切断するであろうリボザイムを使用することを含む（例えば、Rossi et al., (1991) Pharmacol. Ther. 50: 245-254 and Sczakiel et al. (1995) 参照)。
三重らせんアプローチ
細胞内の三重らせん形成に基づくＧＥＮＳＥＴ遺伝子の発現を抑制するために、ＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡを使用することもできる(例えば、Griffin et al., (1989) Science 245: 967-971参照)。三重らせんアプローチを用いた遺伝子治療法を行うために、通常、ＧＥＮＳＥＴゲノムＤＮＡの配列を最初にスキャンして、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現を抑制するための、三重らせんに基づく方法で使用できる１０ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのホモピリミジンまたはホモプリンストレッチが同定される。候補ホモピリミジンまたはホモプリンストレッチの同定に続いて、候補配列を含有する様々な量のオリゴヌクレオチドを、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子を発現する組織培養細胞に導入することによって、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現の抑制におけるそれらの効率が評価される。オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の様々な方法を用いて細胞に導入され、変化した細胞機能または誘導されたＧＥＮＳＥＴ遺伝子発現について、処理した細胞をモニターする。
【０８１７】
次いで、組織培養細胞における遺伝子の発現を抑制するのに有効なオリゴヌクレオチドが、「アンチセンスアプローチ」というタイトルのセクションに記載のように、技術を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果に基づいて算出された投与量で導入される。
ＧＥＮＳＥＴ遺伝子関連疾患の治療
本発明はさらに、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子活性および／または発現を増加させる、または低減することによって、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子と関連する疾患／障害を治療するための、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびポリヌクレオチドの方法、使用、およびＧＥＮＳＥＴポリペプチドおよびポリヌクレオチドの修飾因子の使用に関する。これらの方法論は、本明細書に記載されるようなスクリーニングプロトコールを用いて、かつ／または当技術分野および本明細書で述べられる遺伝子治療およびアンチセンスアプローチを用いることによって選択される化合物を使用して行うことができる。遺伝子治療を用いて、いずれかの組織、例えば治療される疾患または病状と関連する組織における、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子の標的発現を行うことができる。ＧＥＮＳＥＴコード配列を適切な発現ベクター中にクローニングし、特定の細胞型（１種または複数種）に標的化して、効率的な、高レベルの発現を達成することができる。ＧＥＮＳＥＴコード配列の標的細胞への導入は、例えば特定の粒子仲介ＤＮＡ送達（Haynes et al., (1996) J Biotechnol. 44 (1-3) : 37-42 and Maurer et al., (1999) Mol Membr Biol. 16 (1) : 129-40)、裸のＤＮＡの直接注入(Levy et al., (1996) Gene Ther. 3 (3): 201-11; and Felgner (1996) Hum Gene Ther. 7 (15): 1791-3)、またはviral vector mediated transport (Smith et al., (1996) Antiviral Res. 32 (2): 99-115, Stone et al., (2000) J Endocrinol. 164 (2): 103-18; Wu and Ataai (2000), Curr Opin Biotechnol. 11 (2): 205-8)を用いて達成することができる。例えば、組織特異的なウイルスベクターを使用することによって、または組織特異的なプロモーターを使用することによって、ウイルス仲介輸送のケースにおいて、組織特異的な効果を達成することができる。例えば、いずれかの組織特異的プロモーター、例えばアルブミンプロモーター（肝臓特異的プロモーター；Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame et al., 1988 Adv. Immunol. 43: 235-275)、Ｔ細胞受容体のプロモーター(Winoto et al., 1989 EMBO J. 8: 729-733)、および免疫グロブリン(Banerji et al., 1983 Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore 1983 Cell 33: 741-748)、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne et al., 1989 PNAS 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlunch et al., 1985 Science 230: 912-916)または乳腺特異的プロモーター(乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号)を用いて、特異的発現を達成することができる。マウスホメオボックスプロモーター(Kessel et al., 1990 Science 249: 374-379)またはα−フェトプロテインプロモーター(Campes et al., 1989 Genes Dev. 3: 537-546)など、発生制御（developmentally-regulated）プロモーターも使用することができる。組み合わせのアプローチを用いて、標的組織においてＧＥＮＳＥＴコード配列が活性化されるのを確実にすることもできる(Butt and Karathanasis (1995) Gene Expr. 4 (6) : 319-36 ; Miller and Whelan, (1997) Hum Gene Ther. 8 (7): 803-15)。ＧＥＮＳＥＴ ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質の発現を例えば炎症部位にて、選択的に減少または除去することができる(Wagner, et al. (1996), Nat Biotechnol. 14 (7): 840-4))。さらに詳細には、アンチセンスコンストラクトまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、例えば、転写の方向に対してアンチセン���方向に、ＧＥＮＳＥＴ遺伝子配列もしくはその一部を含有する発現ベクターを標的細胞にトランスフェクトすることによって、または標的細胞に直接、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することによって、高発現細胞におけるＧＥＮＳＥＴの産生を抑制することができる。本明細書に述べられる治療学的方法論は、ヒト哺乳動物および非ヒト哺乳動物のどちらにも適用可能である。
薬学的および生理学的に許容される組成物
本発明は、活性物質として、本発明のポリペプチド、核酸または抗体を含む、薬学的および生理学的に許容される組成物にも関する。本発明は、活性物質として、上述のスクリーニングプロトコールを用いて選択される化合物を含む組成物にも関する。かかる組成物は、生理学的に許容される塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩など、薬学的および生理学的に許容される担体と組み合わせて活性物質を含有する。裸のＤＮＡの場合には、「担体」は金粒子であり得る。組成物中の活性物質の量は、作用物質、患者および求められる効果によって異なる。同様に、投与計画は、組成物および治療される疾患／障害によって異なる。
【０８１８】
したがって、本発明は、本明細書に記載のスクリーニング法のいずれかを用いて、活性物質、化合物、物質または分子を選択し、さらに、同定された活性物質、化合物、物質または分子を生理学的に許容される担体と混合する方法を含む、薬剤組成物を製造する方法に関する。
【０８１９】
「生理学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容される塩；つまり、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。生理学的に許容される塩基付加塩が、アルカリもしくはアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンで形成される。カチオンとして使用される金属の例としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等が挙げられる。適切なアミンの例としては、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインが挙げられる（例えば、Berge et al., Pharmaceutical Salts, J. of Pharma Sci. (1977) 66: 1-19参照）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法においてその遊離酸型を十分な量の望ましい塩基と接触させて、塩を製造することによって製造される。従来の方法においてその塩を酸と接触させ、その遊離酸を単離することによって、遊離酸型を再生することができる。遊離酸型は、極性溶媒における溶解性などの特定の物理的性質において、それらのそれぞれの塩とは幾分異なるが、他の点でその塩は、本発明の目的で、それらのそれぞれの遊離酸に相当する。本明細書において使用される「薬学的付加塩」には、本発明の組成物の成分のうちの１つの酸型の生理学的に許容される塩が含まれる。これらには、アミンの有機もしくは無機酸塩が含まれる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。ほかの適切な、生理学的に許容される塩は当業者には公知であり、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸などの様々な無機および有機酸；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ（sulfo）もしくはホスホ酸（phospho acid）またはＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸；およびアミノ酸、自然界でのタンパク質の合成に関与する２０α−アミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸、およびまた、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−ホスフェート、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラミン酸塩の形成で）、またはアスコルビン酸などの他の酸性有機化合物との塩基性塩が挙げられる。化合物の生理学的に許容される塩は、生理学的に許容されるカチオンで製造することも可能である。適切な生理学的に許容されるカチオンは当業者によく知られており、例えばアルカリ、アルカリ土類金属、アンモニウムおよび第４級アンモニウムカチオンが挙げられる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である��オリゴヌクレオチドに関して、生理学的に許容される塩の好ましい例としては、限定されないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等と形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等と形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸。ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等と形成される塩；（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素アニオンから形成される塩；が挙げられる。
【０８２０】
本発明において用いられる薬剤組成物は、限定されないが：非経口的、頭蓋内、眼窩内、嚢内、髄腔内、槽内、肺内、経口的、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、直腸、皮内、脈管内などの多数の経路によって投与することができる。活性成分の他に、これらの薬剤組成物は、薬学的に使用できる製剤に、活性化合物を処理するのを容易にする賦形剤および補助剤（auxiliaries）を含む、適切な生理学的に許容される担体を含有し得る。調合および投与の技術についての更なる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co. Easton、Pa)の最新版に記述されている。
【０８２１】
経口投与用の薬剤組成物は、経口投与に適した用法において当技術分野でよく知られている生理学的に許容される担体を用いて製造することができる。かかる担体によって、患者による摂取に対して、薬剤組成物を粉剤、錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製造することが可能となる。適切な賦形剤は、糖などの炭水化物またはタンパク質充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなど；トウモロコシ、コムギ、米、ジャガイモ、または他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガントゴムなどのゴム；ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。所望の場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【０８２２】
肺または呼吸器による送達に適した剤形としては、乾燥粉末、噴霧に適した液体溶液または懸濁液、および定量吸入器（ＭＤＩ）で使用するのに適した噴射剤形態などが挙げられる。一般的な実施形態において、乾燥粉末剤形は、肺の肺胞領域内に付着させるために、好ましい範囲内の特定の粒径、通常０．５μＭ〜５０μＭを有するだろう。好ましい粒径範囲内の呼吸用粉剤は、ジェットミル、噴霧乾燥、溶媒沈殿法等の様々な従来技術によって製造することができる。次いで、粉剤を分散するために、その器具を通る患者の吸入時の呼吸を利用する従来のドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）で、またはエアロゾル雲中に粉剤を分散するために、外部粉末源を利用するエアアシスト（air-assisted）器具で、乾燥粉剤を患者に投与することができる（例えば、米国特許第５，４５８，１３５号参照）。
【０８２３】
噴霧器システムに使用される液体製剤には、５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で、酢酸、アスコルビン酸、およびクエン酸などの、わずかに酸性のバッファー（ｐＨ４〜６）が用いられることが好ましい。これらのバッファーは、酸化防止剤としての役割を果たし得る。化学安定性を高める、または維持するための生理学的に許容される成分としては：酸化防止剤、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤、等張性調節剤（isotonic modifier）、不活性ガス等が挙げられる。かかる液体製剤を送達するのに適した噴霧器の好ましい種類は、米国特許第５，４５８，１３５号に記載されている。
【０８２４】
ＭＤＩにおいて使用するために、薬剤組成物は通常、乾燥粉末製剤について述べたように呼吸用粒子に加工され、次いで、適切なエアロゾル噴霧剤（ＣＦＣまたはＨＦＣなど）中にその粒子を浮遊させ、通常、それらの分散性を高めるために界面活性剤でコーティングされる。かかるエアロゾル噴霧剤製剤はさらに、エタノールなどの低級アルコール（３０重量％まで）および化学安定性および生理学的許容性を維持または高めるための他の添加剤を含み得る(例えば、米国特許第６，０８０，７２１号)。
【０８２５】
局所または経鼻投与に対しては、透過される特定のバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は一般に、当技術分野で公知である。
【０８２６】
非経口投与に適した医薬製剤は、水性溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性のバッファー、または緩衝生理食塩水中で配合される。注入用水性懸濁剤は、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁剤は、適切な注入用油性懸濁剤として調製される。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。任意に、懸濁剤は、高濃縮溶液の調製を可能にするために、安定剤、または化合物の溶解性を高める適切な薬剤を含有してもよい。
【０８２７】
本発明の薬剤組成物は、当技術分野で公知の手法で、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、閉じ込め（entrapping）または凍結乾燥プロセスを用いることによって製造することができる。
【０８２８】
一実施形態では、その製剤は、以下の：１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２〜７％マンニトールのいずれか、またはすべてを、４．５〜５．５のｐＨ範囲で含有し得る凍結乾燥粉剤であり、使用前にバッファーと合わせられる。
【０８２９】
薬剤組成物を調製した後、それらを適切な容器に入れ、示される病状の治療のためにラベルが付けられる。ＧＥＮＳＥＴポリペプチドの投与のために、かかるラベルには、例えば投与量、投与回数、および投与方法が含まれるだろう。本発明において使用するのに適した薬剤組成物には、その活性成分が意図する目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。いずれかの化合物については、治療有効用量を、例えば新生細胞の細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて、最初に推定することができる。その動物モデルを用いて、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、かかる情報を利用して、ヒトにおいて有用な投与量および投与経路を決定することができる。
【０８３０】
治療有効用量とは、活性成分、例えばＧＥＮＳＥＴポリペプチドまたはその断片、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドに特異的な抗体、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の、症状または病状を改善する量を意味する。治療有効性および毒性、例えば、５０％有効量（ＥＤ５０）（集団の５０％において治療上有効な用量）および５０％致死量（ＬＤ５０）（集団の５０％に致死的な量）は、細胞培養または実験動物において、製薬的標準手順によって決定することができる。治療効果と毒性効果との用量比が治療指数であり、それは、ＬＤ５０/ＥＤ５０比として示すことができる。大きな治療指数を示す薬剤組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を決定するのに使用される。かかる組成物に含まれる投薬量は、ほとんど、または全く毒性を持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。その投薬量は、この範囲内で、用いられる剤形、患者の感受性、および投与経路によって異なる。
【０８３１】
正確な投薬量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして、医師によって決定されるだろう。投薬量および投与は、活性部分の十分なレベルが得られるように、または目的の効果を維持するように調節される。考慮に入れられる因子としては、疾患状態の重症度、対象の一般健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間および回数、薬物併用（１種または複数種）、反応感受性、および治療に対する耐性／応答が挙げられる。適切な投薬量を評価する際に、考慮される他の因子としては、送達されることになっている化合物の化学的性質、その化合物に関連する生物学的応答（意図する、および偶然の両方）および予測される禁忌が挙げられる。さらに、送達形式、投与期間および投与回数（例えば、ｎ回投与／時、ｎ回投与／日、ｎ回投与／週、蓄積量／日、蓄積量／週）、血漿中濃度によって示される場合が多い、標的部位へ送達される生物学的に有効な用量、および体からの化合物のクリアランスの比または効率が考慮される。長時間作用型薬剤組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス比に応じて、例えば３〜４日毎、毎週、または２週間に１回投与される。
【０８３２】
通常の投薬量は、投与経路に応じて異なる。特定の投薬量および送達方法についての指導は、文献に記載されており、一般に当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤と異なる剤形をヌクレオチドに対して用いるだろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置等に特異的であるだろう。一般に、７５ｋｇの個体に関しては、通常の投薬量範囲は以下の通りである：小分子化合物では、有効用量は通常、０．３〜５０ｍｇ/ｋｇであり；組換えポリペプチドでは、有効用量は通常、０．２５〜７．５ｍｇ/ｋｇであり；体液性免疫応答を仲介するために使用される化合物（例えば、多価肺炎球菌ワクチン、Ｒｈｏ(Ｄ)免疫グロブリン、Ｂ型肝炎ワクチン、抗ＣＤ２０抗原）では、有効量は通常、０．００１５〜１．５ｍｇ/ｋｇであり；ホルモン補助化合物（例えば、エストラジオール、ノルエチンドロン）では、有効用量は通常、用いられる送達システム（例えば、経皮的、経口的、局所的）に応じて、０．０００５〜０．５ｍｇ/ｋｇである。
【０８３３】
経皮送達システム（例えば、エストラジオール経皮システム、スコポラミン経皮システム、経皮ニコチンパッチ）は、個体に対する経皮送達の効率、経皮システム接触の表面積（ｃｍ2）、経皮送達システムに組み込まれる化合物の量および形状および位置付けられる経皮システムの解剖学的位置に基づいて、ほんのわずかな送達量に関して較正しなければならない。この手法で投与される化合物の有効用量範囲は通常、０．００５〜０．５ｍｇ/ｋｇである。
ＧＥＮＳＥＴ配列の使用：コンピューターに関連する実施形態
本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードを、コンピューターによって読み取りかつアクセスすることができるいずれかの媒体上に保存し、記録し、処理することができることは、当業者であれば理解されよう。本明細書で使用される「記録（する）」および「保存（する）」という用語は、コンピューター媒体上に情報を保存するプロセスを意味する。当業者であれば容易に、本発明の核酸コードのうちの１つまたは複数、または本発明のポリペプチドコードのうちの１つまたは複数を含む、コンピューター可読媒体上の情報を記録する現在公知の方法のいずれかを採用することができる。本発明の他の態様は、本発明の少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０の核酸コードまたはポリペプチドコードがそれに記録されているコンピューター可読媒体である。
【０８３４】
コンピューター可読媒体としては、磁気読み取り可能媒体、光学読み取り可能媒体、電子読み取り可能媒体および磁気／光学媒体が挙げられる。例えば、コンピューター可読媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（Digital Versatile Disk）（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリー（Random Access Memory）（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリー（Read Only Memory）（ＲＯＭ）である。
【０８３５】
本発明の実施形態は、システム、特に本明細書に記載の配列情報を保存かつ処理するコンピューターシステムを包含する。本明細書で使用される「コンピューターシステム」という用語は、ハードウェア要素、ソフトウェア要素、および本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列を解析するために使用されるデータ保存要素を意味する。コンピューターシステムは、配列データを処理し、アクセスし、操作するためのプロセッサーを備えることが好ましい。そのプロセッサーは、Iｎｔｅｌ社製Ｐｅｎｔｉｕｍ （登録商標）ＩＩＩなどの中央処理装置の公知の種類、またはＳｕｎ社、Ｍｏｔｏｒｏｌａ社、Ｃｏｍｐａｑ社またはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ社製の同様のプロセッサーであり得る。そのコンピューターシステムは、プロセッサーと、データを保存するための１つまたは複数の内部データ保存要素と、データ保存要素上に保存されたデータを検索するための１つまたは複数のデータ検索デバイスと、を備える汎用システムであることが好ましい。当業者であれば、現在利用可能なコンピューターシステムのいずれかが適していることは容易に判断できる。
【０８３６】
いくつかの実施形態において、コンピューターシステムは、コンピューター可読媒体上に保存された、上述の本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードを、コンピューター可読媒体上に保存された、またはデータベースに存在する参照ヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較するための配列比較子（comparer）を備え得る。「配列比較子」とは、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列を、他のヌクレオチドまたはポリペプチド配列および／または化合物、限定されないが、データ保存手段内に保存された、ペプチド、ペプチド擬態、および化学薬品と比較するためにコンピューターシステムに実装される１つまたは複数のプログラムを意味する。例えば、配列比較子は、コンピューター可読媒体に保存された、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列を、コンピューター可読媒体に保存された参照配列と比較し、相同性、生物学的機能に関与するモチーフ、または構造モチーフを同定することができる。本明細書の他で確認される様々な配列比較子プログラムが特に、本発明のこの態様において使用するのに企図される。代替方法としては、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、その配列とデータベース中の配列との間の相同性を決定するために、配列のデータベースと比較される。配列のデータベースは、コンピューターシステム内に保存された民間データベースであってもよいし、または例えばインターネットを通じて利用可能なＧＥＮＢＡＮＫ、ＰＩＲまたはＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどの公共データベースであってもよい。
【０８３７】
したがって、本発明の一態様は、プロセッサーと、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードがそれに保存されているデータ保存デバイスと、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと比較される参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列がそれに検索可能に保存されているデータ保存デバイスと、比較を行うための配列比較子と、を備えるコンピューターシステムである。
【０８３８】
その代わりに、そのコンピュータープログラムは、本発明の核酸が１つまたは複数の位置で参照核酸配列と異なるかどうかを決定するために、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を、参照ヌクレオチド配列と比較するコンピュータープログラムであってもよい。任意に、かかるプログラムは、本発明の参照ポリヌクレオチドまたは核酸コードのいずれかの配列に関して、挿入、欠失または置換ヌクレオチドの長さおよび同一性を記録する。一実施形態において、そのコンピュータープログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列に対して１つまたは複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有するかどうかを決定するプログラムである。これらの単一ヌクレオチド多型はそれぞれ、一塩基置換、挿入、または欠失を含み得る。その方法は、コンピュータープログラムを使用して、本発明の核酸コードの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０個および参照ヌクレオチド配列を読み取り、その核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の差異をコンピュータープログラムで同定することによって行うことも可能である。
【０８３９】
他の実施形態において、コンピューターをベースとするシステムはさらに、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特徴を同定するための識別子を備え得る。「識別子」とは、上述の本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特定の特徴を識別する１種または複数種のプログラムを意味する。一実施形態において、識別子は、本発明のｃＤＮＡコードにおけるオープンリーディングフレームを識別するプログラムを含み得る。
【０８４０】
その他の実施形態では、多くのコンピュータープログラムのいずれかを用いて、本発明のアミノ酸配列を解析し、タンパク質の構造的特徴、例えば二次構造、三次構造、および四次構造などを同定すること、潜在的な結合パートナー等を同定することができる。次いで、分子モデリング解析の結果を、例えば合理的な薬物設計に用いて、本発明のポリペプチドコードの活性を調節する作用物質を同定することができる。
【０８４１】
したがって、本発明の他の態様は、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコード内の特徴を同定する方法であって、その中の特徴を識別するコンピュータープログラムを使用することによって、核酸コード（１つまたは複数）またはポリペプチドコード（１つまたは複数）を読み取る段階と、コンピュータープログラムでその核酸コード（１つまたは複数）またはポリペプチドコード（１つまたは複数）内の特徴を識別する段階と、を含む方法である。単一配列または本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０個を、コンピュータープログラムを使用することによって読み取り、その核酸コードまたはポリペプチドコード内の特徴をコンピュータープログラムで識別することによって、その方法が行われる。
【０８４２】
上記のプログラムを用いて検出されるモチーフとしては、ロイシンジッパー、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン結合部位、αヘリックス、βシート、シグナル配列、転写制御に関与する配列、例えばホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位が挙げられる。
【０８４３】
本発明は特定の好ましい実施形態に関して記述されているが、本明細書における開示内容を考慮して、当業者には明白であるだろう他の実施形態もまた、本発明の範囲内である。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に照らしてのみ定義されることが意図される。
【０８４４】
本出願全体にわたり、様々な出版物、キットのマニュアル、特許および公開特許出願が記載されている。本発明が関係する当技術分野の技術現状をさらに完全に説明するために、これらの出版物、特許、マニュアルおよび公開特許明細書の開示内容全体が、参照により本発明の開示内容に組み込まれる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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