(57)【要約】本発明は、タンパク質または小分子などの標的分析物を検出するのに有用な、非ヌクレオチドのポリアニオンポリマーを含むポリアニオンポリマー複合物を提供する。また本発明は、ポリアニオンポリマー複合物に結合したナノ粒子ならびにその製造方法および使用方法も提供する。本発明のポリアニオンポリマー複合物は、次式：    Ｌ‐Ｏ［ＰＯ２‐Ｏ‐Ｚ‐Ｏ］ｎ‐ＰＯ２‐Ｏ‐Ｘ（式中、ｎは１〜２００であり、Ｌはポリアニオンポリマーをナノ粒子表面に結合させるための官能基を含んでなる部分であり、Ｚは架橋基であり、ＸはＱ、Ｘ’、または‐Ｑ‐Ｘ’であり、Ｑは認識プローブをポリアニオンポリマーに結合させるための官能基、Ｘ’は認識プローブである）を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式のポリアニオンポリマー複合物。
Ｌ‐Ｏ‐［ＰＯ２‐Ｏ‐Ｚ‐Ｏ］ｎ‐ＰＯ２‐Ｏ‐Ｘ
（式中、ｎは１〜２００であり、Ｌはポリアニオンポリマーをナノ粒子表面に結合させるための官能基を含んでなる部分を表し、Ｚは架橋基を表し、ＸはＱ、Ｘ’、または‐Ｑ‐Ｘ’  を表し、Ｑは認識プローブをポリアニオンポリマーに結合させるための官能基、Ｘ’は認識プローブを表す）
【請求項２】
ポリアニオンポリマーにさらに検出用の標識が結合している、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項３】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項２に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項４】
認識プローブをポリアニオンポリマーに結合させるための官能基がカルボン酸またはアミノ基からなる、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項５】
認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項６】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項５に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項７】
認識プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項８】
Ｌが、アルカンチオール含有基、ホスホロチオエート含有基、置換アルキルシロキサン含有、ポリチオール含有基、または環状ジスルフィド含有基からなる、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項９】
Ｚが、ポリマー、‐Ｃ１‐Ｃ１０‐アルキル‐、‐ＣＯＯ‐、‐ＣＨ２（ＣＨ２）ｖＣＯＯ‐、‐ＯＣＯ‐、Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐ＮＲ１‐、‐ＯＣ（ＣＨ２）ｖ‐、‐（ＣＨ２）ｖ‐、‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｖ‐Ｏ‐、‐Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐、
【化１】
2005532456.tif 000006
（式中、ｖは０〜３０、Ｒ１はＨまたはＧ（ＣＨ２）ｖであり、Ｇは‐ＣＨ３、‐ＣＨＣＨ３、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯ２（ＣＨ２）ｖＣＨ３、‐ＯＨ、または‐ＣＨ２ＯＨである）からなる、請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物が複数結合しているナノ粒子。
【請求項１１】
ポリアニオンポリマーにさらに検出用の標識が結合している、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
プローブをポリアニオンポリマー複合物に結合させるための官能基がカルボン酸またはアミノ基からなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項１４に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
認識プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
Ｌが、アルカンチオール含有基、ホスホロチオエート含有基、置換アルキルシロキサン含有、ポリチオール含有基、または環状ジスルフィド含有基からなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
Ｚが、ポリマー、‐Ｃ１‐Ｃ１０‐アルキル‐、‐ＣＯＯ‐、‐ＣＨ２（ＣＨ２）ｖＣＯＯ‐、‐ＯＣＯ‐、Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐ＮＲ１‐、‐ＯＣ（ＣＨ２）ｖ‐、‐（ＣＨ２）ｖ‐、‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｖ‐Ｏ‐、‐Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐、
【化２】
2005532456.tif 000007
（式中、ｖは０〜３０、Ｒ１はＨまたはＧ（ＣＨ２）ｖであり、Ｇは‐ＣＨ３、‐ＣＨＣＨ３、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯ２（ＣＨ２）ｖＣＨ３、‐ＯＨ、または‐ＣＨ２ＯＨである）からなる、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
試料中の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物が複数結合しているナノ粒子を提供する工程であって、ポリアニオンポリマー複合物に結合している認識プローブが標的分析物に選択的に結合することを特徴とする工程と、
認識プローブが標的分析物に結合するのを可能にする有効な条件下でナノ粒子を試料と接触させる工程と、
認識プローブが標的分析物に結合することにより生じた検出可能な変化を観察する工程と
からなる方法。
【請求項２０】
ポリアニオンポリマー複合物に結合している認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
認識プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
検出可能な変化は色の変化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
検出可能な変化はナノ粒子が標的に結合することに伴う光学的変化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
試料中の１以上の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
請求項１に記載のポリアニオンポリマー複合物が複数結合している１種類以上のナノ粒
子を提供する工程であって、各種類のナノ粒子に結合しているポリアニオンポリマー複合物に、標的分析物に特異的な認識プローブと、特定の標的分析物を識別する役割を果たす検出用の標識が結合していることを特徴とする工程と、
認識プローブと標的分析物とが結合するのを可能にする有効な条件下でナノ粒子を試料と接触させる工程と、
認識プローブが標的分析物に結合することにより生じた、各分析物についての検出可能な変化を観察する工程と
からなる方法。
【請求項２７】
ポリアニオンポリマー複合物に結合している認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
認識プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
検出可能な変化は色の変化である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能な変化はナノ粒子が標的に結合することに伴う光学的変化である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
試料中の、少なくとも２つの結合部位を有する１以上の標的分析物の有無を検出するための方法であって、
基板であって、標的分析物を同基板上に固定化するための、各々が１つの標的分析物に特異的な１種類以上の捕捉プローブが結合している基板を提供する工程と、
ポリアニオンポリマー複合物が複数結合している１種類以上のナノ粒子を提供する工程であって、各種類のナノ粒子に結合しているポリアニオンポリマー複合物に、（ｉ）標的分析物に特異的な認識プローブ、および（ｉｉ）特定の標的分析物を識別する役割を果たす検出用の標識、が結合していることを特徴とする工程と、
試料中に１以上の標的分析物が存在する場合にはナノ粒子と複合体形成している検出用基板が得られるように、標的分析物、捕捉プローブ、およびナノ粒子の間の特異的な結合相互作用を可能にする有効な条件下で、ナノ粒子、試料、および基板を接触させる工程と、
試料中に１以上の標的分析物が存在することを示すものとして、検出用基板上の複合体の存在を測定する工程と
からなる方法。
【請求項３４】
複数の種類の標的分析物の検出を可能にするために、基板に複数の異なる捕捉プローブがアレイ状に結合している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
基板が、スライドガラス、マイクロプレートのウェル、またはガラスビーズである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ポリマーに結合している認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
ポリアニオンポリマー複合物に結合している認識プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体からなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
認識プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
検出可能な変化は色の変化である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
検出可能な変化はナノ粒子が標的に結合することに伴う光学的変化である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
試料中の標的分析物の有無を検出するためのキットであって、
（ａ）ポリアニオンポリマー複合物が結合しているナノ粒子であって、該ポリアニオンポリマーが下式、すなわち
Ｌ‐Ｏ‐［ＰＯ２‐Ｏ‐Ｚ‐Ｏ］ｎ‐ＰＯ２‐Ｏ‐Ｘ
（式中、ｎは１〜２００であり、Ｌはポリアニオンポリマーをナノ粒子表面に結合させるための官能基を含んでなる部分を表し、Ｚは架橋基を表し、ＸはＱ、Ｘ’、または‐Ｑ‐Ｘ’  を表し、Ｑはプローブをポリアニオンポリマーに結合させるための官能基、Ｘ’は認識プローブを表す）
を有することを特徴とするナノ粒子と、
（ｂ）検出可能な変化を観察するための任意選択の基板と
を備えたキット。
【請求項４４】
ポリアニオンポリマー複合物にさらに検出用の標識が結合している、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
検出用の標識が、クロモフォア、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性同位体、ラマン標識もしくはＳＥＲＳ（表面増強ラマン分光）標識、または酵素からなる、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
プローブをポリアニオンポリマー複合物に結合させるための官能基がカルボン酸またはアミノ基からなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
プローブが、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質、アプタマー、ウイルス、
細胞断片、または細胞全体からなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４８】
脂質に結合しているタンパク質はＧタンパク質共役受容体からなる、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
プローブが、抗体、抗原、受容体、またはリガンドからなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項５０】
基板が透明な基板または不透明な白色の基板である、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヌクレオチドのポリアニオンポリマーを含むポリアニオンポリマー複合物（「ポリアニオン」）、ポリアニオンポリマー複合物に結合したナノ粒子、ならびにそれらの製造法およびタンパク質や小分子などの標的分析物の検出における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００２年７月２日出願の米国仮特許出願第６０／３９３，２５５号の優先権を主張し、同出願の内容はその全体が本願に援用される。
高分子電解質を金ナノ粒子に結合させて安定化することが知られている（非特許文献１）。高分子電解質溶液を金ナノ粒子とともに混合すると、該高分子電解質の組成、長さ、濃度、および総塩濃度の全てが高分子電解質による粒子のコーティングに影響を及ぼす（非特許文献２）。より具体的には、高塩濃度（０．０５〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ）では、高分子電解質により安定化された金ナノ粒子の凝集が引き起こされることが見出されている（非特許文献１および２）。このことは、高分子電解質によるナノ粒子のコーティングが著しく制限されることを意味しており（非特許文献２）、またポリアニオンコーティング技術の利用性をも著しく制限している。というのも、生体分子の検出などの多くの用途には電解質ならびに温度に対する安定性が要求されるからである。例えば、核酸の検出は一般に核酸のハイブリダイゼーションを促進する塩を含む緩衝液中で実施され、体液（尿など）にも高分子電解質とナノ粒子の複合体を不安定化するであろう高濃度の電解質が含まれている。従って、電解質ならびに温度、生体分子の検出などの用途において一般に見られる条件に対して安定な複合物を生じる、高分子電解質を金ナノ粒子に結合させる方法が強く求められているであろう。
【非特許文献１】エム．エイ．ハヤト（M. A. Hayat ）編、「金コロイド：原理、方法および応用（Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications ）」第１巻、１９８９年、米国サンディエゴ所在のアカデミックプレス（Academic Press）
【非特許文献２】ディ．アイ．ギッティンス（D. I. Gittins ）、エフ．カルーソ（F. Caruso ）、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌Ｂ、第１０５巻、ｐ．６８４６〜６８５２、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
電解質ならびに温度、生体分子の検出などの用途において一般に見られる条件に対して安定な複合物を生じる、高分子電解質を金ナノ粒子に結合させる方法が強く求められているであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、ポリアニオンをナノ粒子表面に共有結合させるために官能基で修飾したポリアニオンを利用する、安定性の高いポリアニオンナノ粒子複合物を製造する方法について述べる。この方法はナノ粒子表面に高密度のポリアニオン部分を生じ、バイオセンシングの用途において使用可能な安定性の高いポリアニオン‐ナノ粒子複合物を提供する。
【０００５】
核酸が他の核酸、タンパク質、および小分子に結合しうることが当技術分野において良く知られているとおり、バイオセンシングの用途において認容しかねるバックグラウンドを生じる可能性のある、リン酸を基本とする核酸部分を利用する従来の方法（３）と、本方法とは異なっている。本発明においては、核酸を構成する糖及び塩基部分が除去されるので、バイオセンシングの用途におけるバックグラウンドが低減または排除される。本方
法は、メルカプトウンデカン酸の単層を利用して、複雑な重層アセンブリ技法（２）を用いて静電気引力を介して高分子電解質部分を金ナノ粒子表面へ固定する従来の方法とも異なっている。本明細書に記載の方法では、ナノ粒子表面への結合に関与する官能基は結合に関わるポリアニオンに直接取り付けられ、その結果得られた複合物はわずか１回のステップで粒子上に固定化されうる。さらに、生体分子の認識に使用可能な任意のリガンドを、ナノ粒子を修飾する前または後に該ポリマーに結合させることもできる。
【０００６】
本発明は、非ヌクレオチドのポリアニオンを含むポリアニオンポリマー複合物と、ポリアニオンポリマー複合物に結合したナノ粒子と、ポリアニオンポリマー複合物が結合しているナノ粒子の合成方法と、標的分析物を検出する方法とを提供する。ポリアニオンは、正味負に荷電し、ナノ粒子表面に結合可能な官能基を少なくとも１つ有する、水溶性で水に安定な任意のポリマーまたはコポリマーでありうる。
【０００７】
より具体的には、本発明は、非ヌクレオチドのポリアニオンを含むポリアニオンポリマー複合物、ナノ粒子、ならびに、該ナノ粒子の表面と認識部分（例えば認識用オリゴヌクレオチドプローブ）との間の「スペーサー」分子として、あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの間のナノ粒子表面を被覆する「充填物」分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを共有結合する方法を提供する。このような「スペーサー」および「充填物」を用意することにより、ナノ粒子プローブと目的の生体分子との間の一層効果的な結合が可能となる。ポリアニオンポリマーおよび認識要素からなるこれらのナノ粒子プローブは、生体分子の検出（例えば核酸配列またはタンパク質）、タンパク質‐リガンド相互作用の検出、標的オリゴヌクレオチド配列の配列集団からの分離、または、例えば２００１年３月２８日出願の国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号および２００２年３月２６日発行の米国特許第６，３６１，９４４号（いずれもその全体を本願に援用する）にすでに記載されているその他の方法に有用である。
【０００８】
ポリアニオンポリマーをナノ粒子プローブに組み込むことにより、溶液中のナノ粒子、特に高濃度の塩溶液におけるコロイド状金ナノ粒子の安定性が増大する。ナノ粒子複合物の作製において非核酸のポリアニオンポリマーを使用することは、核酸およびタンパク質の検出に有利である。というのも、分析物とナノ粒子複合物プローブとの間の非特異的な結合による障害が排除可能であるからである。
【０００９】
一実施形態において、本発明はポリアニオンポリマー複合物を提供する。
別の実施形態において、本発明はポリアニオンポリマー複合物が結合しているナノ粒子を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は複数のポリアニオンポリマー複合物を含んでなるナノ粒子プローブを製造するための合成法を提供する。ポリアニオンポリマー複合物を、目的のリガンドまたは生体分子を結合するために官能化してもよい。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面とオリゴヌクレオチドプローブ配列との間のスペーサー分子または連結分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面と、生体分子を検出もしくは生体分子に結合するための小分子リガンドとの間のスペーサー分子または連結分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面と、生体分子を検出もしくは生体分子に結合するためのタンパク質との間のスペーサー分子または連結分子としての役割を果
たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面と、生体分子を検出もしくは生体分子に結合するためのオリゴヌクレオチドとの間のスペーサー分子または連結分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面と、生体分子を検出もしくは生体分子に結合するための炭水化物との間のスペーサー分子または連結分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ナノ粒子の表面に結合したプローブ（例えばオリゴヌクレオチド、タンパク質など）どうしの間のナノ粒子の表面上を充填する分子としての役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、充填物分子およびスペーサー分子の両方の役割を果たすポリアニオンポリマーを備えたナノ粒子プローブを合成する方法を提供する。
上記およびその他の本発明の実施形態は、以下の詳細な説明に照らせば明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、金ナノ粒子を安定化するために非ヌクレオチドのポリアニオンを使用可能であるという発見に基づいている。よって一実施形態において、本発明は非ヌクレオチドのポリアニオンを含有するポリアニオンポリマー複合物を提供する。非ヌクレオチドのポリアニオンを含有するポリアニオンポリマー複合物をナノ粒子に結合して、分析物の検出に有用なナノ粒子プローブを形成することが可能である。ポリアニオンポリマー複合物は、下式
Ｌ‐Ｏ‐［ＰＯ２‐Ｏ‐Ｚ‐Ｏ］ｎ‐ＰＯ２‐Ｏ‐Ｘ
（式中、ｎは１〜２００であり、Ｌはポリアニオンポリマーをナノ粒子表面に結合させるための官能基を含んでなる部分を表し、Ｚは架橋基を表し、ＸはＱ、Ｘ’、または‐Ｑ‐Ｘ’  を表し、Ｑは認識プローブをポリアニオンポリマーに結合させるための官能基、Ｘ’は認識プローブを表す）を有する。
【００１９】
上述のように、Ｌはポリアニオンポリマー複合物をナノ粒子表面に結合させるための官能基を含んでなる部分である。適切な官能基の例としては、アルカンチオール基、ホスホロチオエート基（例えば米国特許第５，４７２，８８１号を参照のこと）、置換アルキルシロキサン（例えばバーウェル（Burwell ）、ケミカルテクノロジー誌（Chemical Technology ）、第４巻、ｐ．３７０‐３７７、１９７４年、ならびにオリゴヌクレオチドのシリカおよびガラス表面への結合についてはマッテウキ（Matteucci ）およびカルサース（Caruthers ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌、第１０３巻、ｐ．３１８５‐３１９１、１９８１年を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合についてはグラバー（Grabar）ら、アナリティカル・ケミストリー誌、第６７巻、ｐ．７３５‐７４３を参照のこと）が挙げられる。
【００２０】
このＬ部分は、環状ジスルフィド基などの多官能基、またはナノ粒子に結合可能な複数の官能基を備えたポリチオールもしくはポリマーをも含みうる。環状ジスルフィドはその環内に、硫黄原子２つを含めて５または６個の原子を含むことが好ましい。適切な環状ジスルフィドは市販されているし、周知の手順で合成することもできる。還元型の環状ジスルフィドも使用可能である。炭化水素部分が環状ジスルフィドに結合していることが好ま
しい。適切な炭化水素は市販されており、環状ジスルフィドに結合される。この炭化水素部分はステロイド残基であることが好ましい。環状ジスルフィドの２つの硫黄原子は、好ましくは同硫黄原子が両方同時にナノ粒子に結合可能なように互いに十分近接しているべきである。最も好ましいのは、２つの硫黄原子が互いに隣接していることである。環状ジスルフィドおよびポリチオールの例は、２００１年１月１２日出願の米国特許出願第０９／７６０，５００号明細書および２００１年１月１２日出願の国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号に記載されており、これらはいずれもその全体が本願に援用される。
【００２１】
上述のように、Ｚは架橋基である。架橋として、Ｚは所望の任意の化学基でありうる。例えば、Ｚは、ポリマー（例えばポリエチレングリコール、ポリメチレンなど）、‐Ｃ１‐Ｃ１０‐アルキル‐、‐ＣＯＯ‐、‐ＣＨ２（ＣＨ２）ｖＣＯＯ‐、‐ＯＣＯ‐、Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐ＮＲ１‐、‐ＯＣ（ＣＨ２）ｖ‐、‐（ＣＨ２）ｖ‐、‐Ｏ‐（ＣＨ２）ｖ‐Ｏ‐、‐Ｒ１Ｎ（ＣＨ２）ｖ‐、
【００２２】
【化１】
2005532456.tif 000002
【００２３】
（式中、ｖは０〜３０、Ｒ１はＨまたはＧ（ＣＨ２）ｖであり、Ｇは‐ＣＨ３、‐ＣＨＣＨ３、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯ２（ＣＨ２）ｖＣＨ３、‐ＯＨ、または‐ＣＨ２ＯＨである）でありうる。Ｚはポリエチレングリコールであることが好ましい。
【００２４】
Ｘ’は認識プローブを表す。「認識プローブ」という用語は、標的分析物に対する結合親和性を備えた結合部分を少なくとも１つ含む分子を意味する。本発明において使用するのに適した認識プローブの例には、受容体、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、抗体、糖、ハプテン、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、アミノ酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、炭水化物、脂質、脂質に結合しているタンパク質（lipid bound protein ）、アプタマー、ウイルス、細胞断片、または細胞全体が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２５】
Ｑ（存在する場合）は、認識プローブをポリアニオンポリマー複合物に結合させるための官能基を表し、例えばアミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシ基、カルボキシレート基、または任意の適当な部分などの、元々存在するかまたはポリアニオンポリマーや認識プローブに化学的に付加された求核でありうる。Ｑは‐ＮＨ、‐Ｓ‐、‐Ｏ‐、または‐ＯＯＣ‐であってもよい。
【００２６】
本発明の実施において有用なナノ粒子には、金属（例えば金、銀、銅および白金）、金属酸化物（例えばＴｉＯ２）、半導体（例えばＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆さ
れたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）ならびに磁性（例えば強磁性体）コロイド材料が挙げられる。本発明の実施において有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子の大きさは好ましくは約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均粒径）、より好ましくは約５〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子は棹状でもよい。
【００２７】
金属、半導体、および磁性のナノ粒子を作製する方法は当業界で周知である。例えば、シュミット、ゲー．（Schmid, G.）編「クラスターとコロイド（Clusters and Colloids ）」、ヴァインハイム（Weinheim）所在のＶＣＨ、１９９４年；ハヤト、エム．エイ．（Hayat, M.A. ）編「金コロイド：原理、方法および応用（Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications ）」米国サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Academic Press）；マサート、アール．（Massart, R. ）、ＩＥＥＥトランスアクションズ・オン・マグネティクス誌（IEEE Transactions On Magnetics）第１７巻、ｐ．１２４７、１９８１年；アーマディ、ティ．エス．（Ahmadi, T.S.）ら、サイエンス誌、第２７２巻、ｐ．１９２４、１９９６年；ヘングレイン、エイ．（Henglein, A.）ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９９巻、ｐ．１４１２９、１９９５年；カーティス、エイ．シー．（Curtis, A.C.）ら、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ）、第２７巻、ｐ．１５３０、１９８８年を参照されたい。
【００２８】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓのナノ粒子を作製する方法は当業界で周知である。例えば、ウェラー（Weller）、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ）第３２巻、ｐ．４１、１９９３年；ヘングレイン（Henglein）、トピックス・イン・カレント・ケミストリー誌（Top. Curr. Chem.）第１４３巻、ｐ．１１３、１９８８年；ヘングレイン（Henglein）、ケミカル・レビューズ誌（Chem. Rev.）第８９巻、ｐ．１８６１、１９８９年；ブラス（Brus）、アプライド・フィジックス・エイ誌（Appl. Phys. A.）第５３巻、ｐ．４６５、１９９１年；バーンクマン（Bahncmann ）「太陽エネルギーの光化学変換と貯蔵（Photochemical Conversion and
Storage of Solar Energy）」、ペリツェッティ（Pelizetti ）およびスキアヴェロ（Schiavello）編、１９９１年、ｐ．２５１；ワン（Wang）およびヘロン（Herron）、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９５巻、ｐ．５２５、１９９１年；オルシャフスキー（Ols havsky ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１１２巻、ｐ．９４３８、１９９０年；ウシダ（Ushida）ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J.
Phys. Chem.）第９５巻、ｐ．５３８２、１９９２年を参照されたい。
【００２９】
適切なナノ粒子は、例えばテッドペラ・インコーポレイテッド（Ted Pella, Inc. ）（金）、アマシャムコーポレイション（Amersham Corporation）（金）およびナノプローブス・インコーポレイテッド（Nanoprobes, Inc.）（金）からも市販されている。
【００３０】
核酸の検出に使用するために現在好適なのは、２００１年１月１２日出願の国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号および２００３年１月１４日発行の米国特許第６，５０６，５６４号明細書に記載されているような金ナノ粒子であり、これらの文献はいずれもその全体が本願に援用される。金コロイド粒子は美しい色を生じる波長域に高い吸光係数を有している。これらの強烈な色は粒子の大きさ、濃度、粒子間の距離、および凝集の程度や凝集体の（幾何学的）形状によって変化し、これらの材料は比色アッセイにおいて特に魅力的なものとなっている。例えば、金ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドが
、オリゴヌクレオチドおよび核酸とハイブリダイゼーションすると、肉眼で認識可能な迅速な色の変化が生じる（例えば実施例を参照されたい）。
【００３１】
ポリアニオンポリマー複合物をナノ粒子に結合させるために、ポリアニオンポリマー複合物を、同ポリアニオンポリマー複合物の少なくとも一部が官能基によりナノ粒子に結合するのを可能にする十分な時間、水中でナノ粒子と接触させる。そのような時間は実験的に決定可能である。例えば、約１２〜２４時間では良好な結果が得られることが知られている。ポリアニオンポリマー複合物の結合のための他の適切な条件も、実験的に決定可能である。例えば、濃度が約１０〜２０ｎＭのナノ粒子を用いて室温でインキュベートすることにより良好な結果が得られる。
【００３２】
ポリアニオンをナノ粒子に結合させる前に、ポリアニオンに認識プローブＸ’を結合させてもよい。この実施形態では、ポリアニオン複合物中のＸは‐Ｑ‐Ｘ’またはＸ’を表す。代替例として、ポリアニオンをナノ粒子に結合させてしまった後で該ポリアニオンに認識プローブＸ’を結合させてもよい。
【００３３】
ポリアニオンポリマー複合物をナノ粒子に結合させる好適な方法は、１９９９年６月２５日出願の米国特許出願第０９／３４４，６６７号明細書、２０００年６月２６日出願の同第０９／６０３，８３０号明細書、２００１年１月１２日出願の同第０９／７６０，５００号明細書、２００１年３月２８日出願の同第０９／８２０，２７９号明細書、２００１年８月１０日出願の同第０９／９２７，７７７号明細書、ならびに１９９７年７月２１日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号、２０００年６月２６日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号、２００１年１月１２日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号、２００１年３月２８日出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（これらの開示内容はその全体を本願に援用する）に記載されているエイジング法に基づいている。
【００３４】
エイジング法により、安定性および選択性が増大したナノ粒子プローブが提供される。ポリアニオンポリマー複合物を、同ポリアニオンポリマー複合物の少なくとも一部が官能基によりナノ粒子に結合するのを可能にする十分な時間、水中でナノ粒子と接触させる。そのような時間は実験的に決定可能である。例えば、約１２〜２４時間では良好な結果が得られることが知られている。ポリアニオンポリマー複合物の結合のための他の適切な条件も、実験的に決定可能である。例えば、濃度が約１０〜２０ｎＭのナノ粒子を用いて室温でインキュベートすることにより良好な結果が得られる。
【００３５】
次に、少なくとも一種の塩を水に添加して塩溶液を作製する。塩は、任意の好適な水溶性の塩でよい。例えば、塩は塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸リチウム、硝酸セシウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム、酢酸セシウム、酢酸アンモニウム、これらの塩のうち２種以上の組合せ、またはこれらの塩のうち１種をリン酸緩衝物に含めたものでありうる。塩は濃縮液として添加することが好ましいが、固体として添加することも可能である。塩は全て１度に水に添加しても良いし、時間をかけて徐々に添加しても良い。「時間をかけて徐々に」とは、塩を少なくとも２つに分けて時間の間隔を空けて添加することを意味する。好適な時間は実験的に決定することができる。
【００３６】
塩溶液のイオン強度は、ポリアニオンポリマー複合物相互の静電反発力、ならびに、負に荷電したポリアニオンポリマー複合物と正に荷電したナノ粒子との静電気引力または負に荷電したポリアニオンポリマー複合物と負に荷電したナノ粒子との静電反発力のうちいずれかに対し、少なくとも部分的に打ち勝つのに十分なものでなければならない。時間をかけて徐々に塩を添加して静電気引力および静電反発力を徐々に低減すると、ナノ粒子上
に最も高い表面密度のポリアニオンポリマー複合物が提供される。好適なイオン強度は、各々の塩または塩の組合せに応じて実験的に決定することができる。リン酸緩衝液中に塩化ナトリウムを終濃度約０．１Ｍ〜約３．０Ｍとし、好ましくは時間をかけて塩化ナトリウムの濃度を徐々に増大させると、良好な結果が得られることが見出されている。
【００３７】
塩を添加した後、ポリアニオンポリマー複合物とナノ粒子を、十分量のさらなるポリアニオンポリマー複合物がナノ粒子に結合して安定なナノ粒子‐ポリアニオンポリマープローブを生じるのを可能にするのに十分な時間をさらにかけて、該塩溶液中でインキュベートする。このインキュベーション時間は実験的に決定可能である。総インキュベーション時間が約２４〜４８時間、好ましくは４０時間のときに良好な結果が得られる（上述のようにこれは総インキュベーション時間であり、この時間全体にわたって塩濃度を徐々に増大させることが可能である）。塩溶液中におけるこの第２のインキュベーション期間を、本明細書では「エイジング」ステップと呼ぶ。この「エイジング」ステップに好適な他の条件も、実験的に決定可能である。例えば、室温かつｐＨ７．０でのインキュベーションでは良好な結果が得られる。次いでこの溶液を遠心分離し、ナノ粒子プローブを目的に応じて処理する。
【００３８】
「エイジング」ステップを用いて作製されたプローブは、「エイジング」ステップを用いずに作製されたプローブよりも安定である。上述のように、このような安定性の増大は、「エイジング」ステップにより達成された、ナノ粒子表面におけるポリアニオンポリマー複合物密度の増大に起因するものである。「エイジング」ステップにより達成される表面密度は、ナノ粒子の大きさおよび種類、ならびにポリアニオンポリマー複合物の長さおよび濃度によって変わるであろう。ナノ粒子を安定化するのに適した表面密度、ならびにナノ粒子およびポリアニオンポリマー複合物の所望の組合せについてナノ粒子を安定化するのに適した表面密度を得るために必要な条件は、実験的に決定することが可能である。
【００３９】
本発明のポリアニオンポリマー複合物が結合しているナノ粒子（本明細書中では「ナノ粒子プローブ」または「ナノ粒子複合物」と呼ぶ）には、様々な用途がある。例えば、分析物の検出または定量にプローブとして使用することができる。例えば、国際出願国際公開第９８／０４７４０号パンフレット；同第９８／２１５８７号パンフレット；ストルホフ（Storhoff）ら、ジャーナル・オブ・クラスター・サイエンス誌（J. Clust. Sci.）、第８巻、ｐ．１７９、１９９７年；ブルソー（Brousseau ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）、第１２０巻、ｐ．７６４５、１９９８年；フリーマン（Freeman ）ら、サイエンス誌、第２６７巻、ｐ．１６２９、１９９５年；チュー（Zhu ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）、第１１９巻、ｐ．２３５、１９９７年；ミルキン（Mirkin）ら、ネイチャー誌、第３８２巻、ｐ．６０７、１９９６年；エルガニアン（El
ghanian ）ら、サイエンス誌、第２７７巻、ｐ．１０７８、１９９７年；ストルホフ（Storhoff）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）、第１２０巻、ｐ．１９５９、１９９８年を参照されたい。本発明に従っ
て検出または定量可能な分析物には、多糖、脂質、リポ多糖、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および核酸が挙げられる。具体的な分析物としては、抗体、免疫グロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、血液凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン（例えばインスリン、ゴナドトロピン、ソマトトロピン）、非ペプチド性ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、その他のサイトカイン、腫瘍特異的エピトープ（すなわち腫瘍特異的タンパク質にのみ見いだされるエピトープ）を含むペプチド、細胞（例えば赤血球）、細胞表面分子（例えばＣＤ抗原、インテグリン、細胞受容体）、微生物（ウイルス、細菌、寄生虫、カビおよび真菌）、微生物の断片、一部分、成分または生産物、有機小分子（例えばジゴキシン、ヘロイン、コカイン、モルヒネ、メスカリン、リセルグ酸、テトラヒドロカンナビノール、カン
ナビノール、ステロイド、ペンタミジン、およびビオチン）などが挙げられる。検出または定量可能な核酸およびオリゴヌクレオチドには、遺伝子（例えば特定の疾患に関連する遺伝子）、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、哺乳類ＤＮＡ（例えばヒトのＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖の核酸、天然および合成の核酸などがある。
【００４０】
プローブとしての役割を果たすために、本発明のナノ粒子プローブには、該プローブに結合したポリアニオンポリマー複合物の一部として認識プローブ部分Ｘ’が含まれているため、ナノ粒子プローブは分析物に特異的に結合することができる。適切な認識プローブＸ’およびその作製法は当業界において周知である。例えば、本質的にあらゆる分析物について、該分析物に特異的な抗体を使用して検出または定量することが可能である。さらに、分析物に特異的に結合する任意の分子を使用可能であり、そのような分子は当業界において多数知られている。例えば、分析物である核酸の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、核酸を検出または定量することが可能である。同様に、レクチンを使用して多糖および糖タンパク質を検出または定量することも可能である。別例として、受容体を用いてそのリガンドを検出することや、逆にリガンドを用いてその受容体を検出することも可能である。他の多くの適切な認識プローブＸ’が知られている。
【００４１】
本発明に従ってアッセイを実施するために、分析物を含有している疑いのある試料を、認識プローブＸ’が結合しているナノ粒子プローブと接触させる。任意の種類の試料を使用可能である。例えば、試料は生物学的液体（例えば血清、血漿、血液、唾液、および尿）、細胞、細胞溶解物、組織、化合物ライブラリー（例えば有機化学物質またはペプチド）、ＰＣＲの成分を含む溶液などでありうる。そのようなアッセイを実施するための条件および方式は、当業界で周知であるか（例えば上述の参照文献を参照されたい）、または当業者であれば実験的に決定可能である。最終的に、ナノ粒子の１つまたは複数の性質を、分析物を検出または定量するために検出または測定する。該性質は、レドックス活性または光学活性（例えば蛍光もしくは後述の色）であることが好ましい。これらの性質を検出または測定する方法は、当業界において周知である。
【００４２】
標的分析物が核酸である場合の、標的分析物検出方法の一実施例には、該核酸を１種類以上の本発明のナノ粒子プローブと接触させることが含まれる。検出すべき核酸は少なくとも２つの部分を有する。これらの部分の長さおよびもしあればそれらの間の距離は、ナノ粒子プローブ上の認識プローブが該核酸にハイブリダイズするときに検出可能な変化が生じるように選択される。このような長さおよび距離は実験的に決定可能であり、使用する粒子の種類および大きさならびにアッセイに使用する溶液中に存在するであろう電解質の種類によって変わるであろう（当業者には周知であるように、ある種の電解質は核酸のコンホメーションに影響を及ぼす）。
【００４３】
同様に、核酸を他の核酸の存在下で検出すべき場合には、該核酸の一部分であってナノ粒子プローブ上の認識プローブが結合しようとする部分を、該核酸の検出が特異的となるように、その部分が十分に特異な配列を含むように選択しなければならない。そのようにするためのガイドラインは当業界で周知である。
【００４４】
核酸が相互に十分近接した反復配列を含む可能性がある場合はナノ粒子プローブを１種類だけ使用する必要があるが、このようなことはまれであろう。通常は、核酸の選択部分どうしは異なる配列を有しており、この選択部分が、ポリアニオンポリマー複合物が結合しているナノ粒子と接触することになるが、このときポリアニオンポリマー複合物は２つ以上の異なる認識プローブを備え、好ましくは別個のナノ粒子に結合している。ＤＮＡの
別の部分を対応するナノ粒子とともに標的とすることも可能であろう。核酸のいくつかの部分を標的とすることにより、検出可能な変化の規模が増大する。
【００４５】
ナノ粒子プローブと核酸との接触は、ナノ粒子に結合したポリアニオンポリマー複合物上の認識プローブと核酸の標的配列とのハイブリダイゼーションに有効な条件下で実施する。このようなハイブリダイゼーション条件は当業界において周知であり、使用する個々の系に合わせて容易に最適化することができる。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular cloning: A Laboratoy Manual ）」（第２版、１９８９年）を参照されたい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することが好ましい。
【００４６】
検出しようとする核酸とナノ粒子プローブとを含んだ溶液を凍結融解することにより、ハイブリダイゼーションを加速することができる。同溶液を、凍結させるのに十分な時間（一般に溶液１００マイクロリットルでは約１分）ドライアイス‐アルコール浴に供するなど、任意の手軽な方法で凍結させればよい。溶液は、熱変性する温度よりも低い温度で融解させなければならないが、ほとんどのナノ粒子プローブと核酸との組合せの場合その温度は好都合なことに室温でよい。溶液の融解後に、ハイブリダイゼーションが完了して検出可能な変化が観察されうる。
【００４７】
ハイブリダイゼーションの速度は、検出しようとする核酸とナノ粒子プローブとを含んだ溶液を、ナノ粒子プローブ上の認識プローブと標的核酸との間で形成される複合体の解離温度（Ｔｍ）より低い温度に暖めることによっても増大させることができる。別例として、該溶液を解離温度（Ｔｍ）を超えて加熱し、放置して冷ますことにより、迅速なハイブリダイゼーションを達成することも可能である。
【００４８】
ハイブリダイゼーションの速度は、塩濃度を増大させる（例えばＮａＣｌを０．１Ｍから１Ｍにする）ことにより高めることも可能である。この反応の速度は、デキストラン硫酸などの容積を排除する試薬を添加することにより高めることもできる。
【００４９】
ナノ粒子プローブ上の認識プローブが核酸にハイブリダイズすると生じる検出可能な変化は、光学的な変化（例えば色の変化）でも、ナノ粒子凝集体の形成でも、または凝集したナノ粒子の沈殿でもよい。光学的な変化は、肉眼で観察しても、分光学的に観察してもよい。ナノ粒子凝集体の形成は、電子顕微鏡または比濁法により観察可能である。凝集したナノ粒子の沈殿は、肉眼で観察しても、顕微鏡により観察してもよい。肉眼で観察可能な色の変化が好ましい。
【００５０】
肉眼による色の変化の観察は、対照的な色を背景にすれば一層容易である。例えば、金ナノ粒子を用いる場合、色の変化の観察は、ハイブリダイゼーション溶液の試料を白色の固体表面（シリカもしくはアルミナのＴＬＣプレート、ろ紙、硝酸セルロース膜、およびナイロン膜、好ましくはナイロン膜）にスポットし、該スポットを放置して乾燥させることにより容易になる。最初、スポットはハイブリダイゼーション溶液の色（ハイブリダイゼーションが起きていない場合のピンク色／赤色から、ハイブリダイゼーションが起きた場合の紫がかった赤色／紫色まで変動する）を維持している。室温または８０℃（温度は重要ではない）で乾燥させると、スポットする前にポリアニオンポリマー‐ナノ粒子複合物が標的核酸とのハイブリダイゼーションにより連結されていれば青色のスポットが生じる。ハイブリダイゼーションが起きていない場合（例えば標的核酸が存在しない場合）、スポットはピンク色である。この青色およびピンク色のスポットは安定であり、その後の冷却、過熱により、または時間を経ることにより変化することはない。同スポットは試験の便利で永続的な記録となる。その他のステップ（ハイブリダイズしたナノ粒子とハイブリダイズしなかったナノ粒子との分離など）は、色の変化を観察するためには必要ない。
フラットベッド・スキャナもしくはＣＣＤカメラなどの光学スキャン装置を用いてプレートの画像を記録し、個々のスポットの色の量および種類を分析することにより、色の変化を定量することもできる。別例として、カラー・フィルタ（例えば赤色フィルタ）を用いて特定の色を排除し、各スポットのシグナル強度を記録および分析することもできる。
【００５１】
アッセイの結果を簡単に視覚化する別の方法は、標的核酸にハイブリダイズしたナノ粒子プローブに試料をガラス繊維フィルタ（例えば大きさが１３ｎｍの金ナノ粒子に使用する場合、ホウケイ酸マイクロ繊維フィルタ、孔径０．７μｍ、ＦＧ７５グレード）にスポットし、液体をフィルタに吸わせることである。その後ハイブリダイズしていない過剰なナノ粒子プローブを水ですすいでフィルタを通して洗浄すると、ナノ粒子プローブ上の認識プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより生じた凝集体を含むスポットが残る（これらの凝集体はフィルタの孔よりも大きいために維持される）。この技法により、過剰量のナノ粒子プローブを使用可能であるため感度が高くなりうる。
【００５２】
２００３年５月３０日出願の米国仮出願番号第６０／４７４，５６９号明細書（その全体を本願に援用する）に記載の技法など、光散乱技法により結合を検出することも可能である。そのような方法では、結合している分析物（例えば核酸またはタンパク質）を光散乱技法により検出しうるが、この場合、導波路のエバネッセント波が滲入する深さの範囲内でナノ粒子・標識複合体が形成されることによる光散乱の変化が分析物の存在を表す。
【００５３】
核酸を検出する方法の一部の実施形態では基板を利用する。基板を用いることにより、検出可能な変化（シグナル）が増幅され、アッセイの感度が増大する。
検出可能な変化を観察することのできる任意の基板を使用可能である。適切な基板には、透明な固体表面（例えばガラス、石英、プラスチックおよびその他のポリマー）、不透明な固体表面（例えば、ＴＬＣシリカプレート、ろ紙、ガラス繊維フィルタ、硝酸セルロース膜、ナイロン膜などの白色の固体表面）、ならびに伝導性の固体表面（例えばインジウム‐スズ酸化物（ＩＴＯ））が挙げられる。基板は任意の形状や厚さでよいが、一般には平板で薄いものであろう。ガラス（例えばスライドガラス）またはプラスチック（例えばマイクロタイタープレートのウェル）などの透明な基板が好ましい。
【００５４】
基板を用いて核酸を検出する方法の一実施形態では、オリゴヌクレオチドを基板に結合させる。オリゴヌクレオチドは、例えばクリセイ（Chrisey ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌（Nucleic Acids Res.）、第２４巻、ｐ．３０３１〜３０３９、１９９６年；クリセイ（Chrisey ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌（Nucleic Acids Res.）、第２４巻、ｐ．３０４０〜３０４７、１９９６年；マキック（Mucic ）ら、ケミカル・コミュニケーションズ誌（Chem. Commun. ）ｐ．５５５、１９９６年；ツィマーマンおよびコックス（Zimmermann and Cox）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌、第２２巻、ｐ．４９２、１９９４年；ボトムレイ（Bottomley ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バキューム・サイエンス・テクノロジー・エイ誌（J. Vac. Sci. Technol. A ）、第１０巻、ｐ．５９１、１９９２年；ならびにヘグナー（Hegner）ら、エフイービーエス・レターズ誌（FEBS Lett.）、第３３６巻、ｐ．４５２、１９９３年に記載されているようにして基板に結合させることができる。
【００５５】
基板に結合させたオリゴヌクレオチドは、検出しようとする核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有している。基板上のオリゴヌクレオチドを核酸にハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、核酸を基板と接触させる。このようにして、核酸は基板に結合するに至る。ナノ粒子プローブを添加する前に、結合していない全ての核酸を基板から洗浄除去することが好ましい。
【００５６】
次に、基板に結合した核酸を第１の種類のナノ粒子プローブと接触させる。該ナノ粒子
プローブ上の認識プローブは核酸の第２の部分に相補的な配列を有しており、ナノ粒子プローブ上の認識プローブを核酸とハイブリダイズさせるのに有効な条件下で接触が行われる。このようにして、第１の種類のナノ粒子プローブが基板に結合することになる。ナノ粒子プローブを基板に結合させた後に、基板を洗浄して結合していないナノ粒子プローブと核酸とを全て取り除く。
【００５７】
第１の種類のナノ粒子プローブ上の認識プローブは、全て同じ配列を有していてもよいし、検出しようとする核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有していてもよい。異なる配列を有する認識プローブを用いる場合には、各ナノ粒子に異なる認識プローブが全て結合していてもよいが、異なる認識プローブが異なるナノ粒子に結合していることが好ましい。代替例として、各々の第１の種類のナノ粒子プローブ上の認識プローブが複数の異なる配列を有していてもよいが、該配列のうち少なくとも１つが検出しようとする核酸の一部分とハイブリダイズしなければならない。
【００５８】
基板に結合した第１の種類のナノ粒子プローブを、任意選択で第２の種類のナノ粒子プローブと接触させる。この（第２の種類のナノ粒子プローブ上の）認識プローブは第１の種類のナノ粒子プローブ上の認識プローブの少なくとも一部分に相補的な配列を有し、第１の種類のナノ粒子プローブ上の認識プローブを第２の種類のナノ粒子プローブ上の認識プローブとハイブリダイズさせるのに有効な条件下で接触が行われる。ナノ粒子を結合させた後に、基板を洗浄して結合していない複合物を全て取り除くことが好ましい。
【００５９】
ハイブリダイゼーションが組み合わさることにより検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は、第２の種類のナノ粒子プローブを使用してハイブリダイゼーションを多重に生じる結果検出可能な変化が増幅されることを除けば、上述したものと同じである。特に、第１の種類のナノ粒子プローブには各々複数の（同一または異なる配列を有する）認識プローブが結合しているので、第１の種類のナノ粒子プローブ各々が複数の第２の種類のナノ粒子プローブにハイブリダイズすることができる。同様に、第１の種類のナノ粒子プローブを、検出しようとする核酸の複数の部分にハイブリダイズさせることもできる。多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅によって初めて検出可能な変化が生じてもよいし、多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅が検出可能な変化の規模を大きくしてもよい。このような増幅がアッセイの感度を高め、少量の核酸の検出を可能にする。
【００６０】
所望であれば、連続的に第１および第２の種類のナノ粒子プローブを添加することにより追加のナノ粒子プローブ層を積み重ねても良い。このようにして、標的核酸１分子あたりに固定化されるナノ粒子の数をさらに増やし、これに伴ってシグナルの強度を高めることができる。
【００６１】
核酸以外の分析物の検出（例えば２００１年３月２８日出願の米国特許出願第０９／８２０，２７９号、および２００１年３月２８日出願の国際出願番号ＰＣＴ／０１／１００７１号（いずれも本願に援用される）を参照のこと）に関する一実施形態では、分析物を、共有結合または非共有結合の作用を介して直接または間接的に基板に結合させることができる。基板は上述したものと同じ種類のものである。間接的な結合としては、分析物を、リンカー、例えばオリゴヌクレオチドまたはその他のスペーサー分子を介して基板に結合させることができる。代替例として、分析物を、基板に結合させた捕捉プローブ（オリゴヌクレオチドなど）の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに結合させて修飾してもよい。次いで、分析物にハイブリダイズすることのできる認識プローブを備えたナノ粒子プローブを、認識プローブが基板に結合した分析物に特異的に結合しうる有効な条件下で接触させると、分析物の存在は基板上のスポット形成により、あるいは染色材料の使用（金上の銀染色など）によって視覚的に検出可能となる。
【００６２】
分析物を検出するための別の方法では、標的分析物を認識プローブとしてポリアニオンポリマー複合物に結合させ、該ポリアニオンポリマー複合物をナノ粒子に結合させることにより、標的分析物を修飾することができる。その後、修飾されたナノ粒子プローブを、認識対の第２の要素が結合している基板と接触させる。分析物の存在は、基板上のスポット形成により、あるいは染色材料の使用（金上の銀染色など）によって視覚的に検出可能である。
【００６３】
分析物を検出するためのさらに別の方法では、標的分析物を、ナノ粒子プローブ上の認識プローブの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに結合させて修飾してもよい。次いで、標的に結合したオリゴヌクレオチドとナノ粒子上の認識プローブとがハイブリダイゼーションするのに有効な条件下で、修飾された標的とナノ粒子とを接触させることにより、修飾された標的をナノ粒子上の認識プローブに結合させる。次に、ハイブリダイズした複合体を、分析物を認識する官能基が結合している基板と接触させる。分析物の存在は、基板上のスポット形成により、あるいは染色材料の使用（金上の銀染色など）によって視覚的に検出可能である。
【００６４】
基板を使用する場合、検出可能な変化を染色により発生もしくは増強することができる。染色材料、例えば金、銀などを使用して、上述のアッセイなど基板上で実施される全てのアッセイにおける検出可能な変化を発生もしくは増強することができる。例えば、銀染色は、銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子とともに使用することができる。貴金属（金および銀など）製のナノ粒子が好ましい。バセル（Bassell ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー誌（J.Cell Biol.）、第１２６巻、ｐ．８６３〜８７６、１９９４年；ブラウン‐ハウランド（Braun-Howland ）ら、バイオテクニクス誌（Biotechniques ）、第１３巻、ｐ．９２８〜９３１、１９９２年を参照されたい。分析物の検出に用いられるナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合は、還元を触媒するために銀イオンを標的分析物と複合体形成させてもよい。ブラウン（Braun ）ら、ネイチャー誌、第３９１巻、ｐ．７７５、１９９８年を参照されたい。核酸のリン酸基と反応しうる銀染色剤も知られている。
【００６５】
本発明は、試料中の標的分析物の有無を検出するためのキットをさらに提供する。キットは、認識プローブが結合しているポリアニオンポリマー複合物の入った容器を備えていてもよい。キットが認識プローブを有するポリアニオンポリマー複合物の入った容器を備え、該ポリアニオンポリマー複合物がナノ粒子に結合していても良い。これらのキットが、アッセイを実施するために有用な他の試薬および品目をさらに含んでいても良い。試薬には、対照品、標準品、ＰＣＲ試薬、ハイブリダイゼーション試薬、緩衝剤などがありうる。キットの一部として提供されるその他の品目には、反応用装置類（試験用チューブ、マイクロタイタープレート、固体表面（捕捉用分子が結合していても良い）、シリンジ、ピペット、キュベット、コンテナなど）が挙げられる。
【００６６】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６７】
本発明を例示するために、非ヌクレオチドを基本とする典型的なポリアニオンポリマー複合物を作製した（スキーム１）。該複合物は３つの部分、すなわち、１）金ナノ粒子表面用のリンカーとして使用される、ステロイドの環状ジスルフィドのアンカーなどのリンカー７、２）ナノ粒子を安定化するように設計された架橋基（ポリエチレングリコールなど）を備えた、リン酸を基本とするポリアニオン骨格、ならびに３）精製および定量用タグとしてのフルオレセイン標識、を含む。
【００６８】
【化２】
2005532456.tif 000003
【００６９】
（ａ．ポリアニオンポリマーの作製と精製）
ポリアニオンポリマー分子は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９を用いて標準的なホスホロアミダイト法により作製し、フルオレセインタグの４９４ｎｍにおける吸収極大をモニターしながら標準的な条件５を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。４９４ｎｍでモニターすると、精製物はそれぞれ３７．８分および３８．２分の２つの保持時間を示したが、これはステロイドの環状ジスルフィドおよびフルオレセインタグがいずれも存在することを示している（図１）。精製物について観察された保持時間および保持時間データが２つであることは、ステロイドの環状ジスルフィドのリンカーで修飾されたオリゴヌクレオチドに一致し、４９４ｎｍに吸収があることはフルオレセインクロモフォアに特徴的である。ポリアニオン精製物を、４９４ｎｍにおける吸光度を用いて定量した（ε４９４＝７５０００Ｍ−１ｃｍ−１）。
【００７０】
（ｂ．ナノ粒子上への装着）
前記ポリアニオンを、クエン酸法６で作製した粒径約１６．５ｎｍの金ナノ粒子上に、以下の手順で装着させた。金ナノ粒子溶液（２ｍＬ、約１４ｎＭ）をポリアニオンＤＮＡ（終濃度＝３．６ｕＭ）と混合し、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）でｐＨ７に緩衝して室温で一晩インキュベートした。続いて４ＭのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）を用いて塩濃度を調節して０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）とし、この溶液を４０時間を超えてインキュベートした。遠心分離（１３０００ｒｐｍ×２５分）によりプローブを単離し、水で１回洗浄し、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）緩衝液、０．０１％アジドを用いて金ナノ粒子の終濃度が１０ｎＭとなるように再分散させた。ポリアニオンで被覆された金ナノ粒子は、単離後のＵＶ〜可視スペクトルが同じ手法で作製されたＤＮＡ修飾金ナノ粒子に特徴的な５２４ｎｍの吸収極大を示すことにより証明されたように、遠心分離および０．１ＭのＰＢＳに対して安定であった（図２）５。
【００７１】
（ｃ．金ナノ粒子に結合したポリアニオン複合物の定量）
ポリアニオン複合物がナノ粒子に結合していることを示すために、金ナノ粒子に結合させたポリアニオン複合物を、フルオレセインに関連する吸収信号を利用して定量した。フルオレセインの吸収信号を定量するために、以下の手順を用いて、金ナノ粒子を溶解させて粒子に関連する吸収を取り除いた。ポリアニオン複合物を結合させた金ナノ粒子（２００ｕｌ、１０ｎＭ）を０．１ＭのＩ２（１０ｕｌ）と混合して室温で１０分間インキュベ
ートすることにより、金ナノ粒子を溶解させて黄色味を帯びた色の溶液とした。ヨウ素を還元するために０．１Ｍのチオ硫酸ナトリウム（２０ｕＬ）を添加し、室温で５分間インキュベートした。この溶液を希釈せずに５１６ｎｍ（Ｉ２／チオ硫酸処理により修飾されたフルオレセインの吸収極大）における吸光度を測定して存在するフルオレセイン量を定量し、同じ手順で調製したポリアニオン（金ナノ粒子なし）の標準濃度曲線と比較した（図３）。目的の濃度範囲の標準線は直線であった。最も良くフィッティングした線の式を用いて金プローブ溶液のポリアニオン濃度を測定すると１．５１ｕＭであった（５１６ｎｍにおける吸光度＝０．１７ＡＵ）。開始時のプローブ濃度が約１０ｎＭであることから、この結果はポリアニオン分子が１粒子あたり約１５１個であることに相当する。
【００７２】
（ｄ．金ナノ粒子に結合したポリアニオン複合物の安定性）
電解質濃度ならびに温度の上昇に対する安定性は、一般にそのような条件下で実施される生体分子のアッセイにとって重要である。クエン酸で安定化した金ナノ粒子に比べてポリアニオンと金の複合物が頑強であることを、これら２種の０．５Ｍ  ＰＢＳ溶液の安定性を４時間にわたってモニターすることにより調べた（図４）。このアッセイでは、ポリアニオンプローブの溶液（５ｎＭ、１００ｕＬ）を１００ｕＬの１Ｍ  ＰＢＳ（終濃度０．５ＭＰＢＳ）と室温で混合し、ＵＶ〜可視スペクトルを時間の関数としてモニターした。この処理工程を、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）で粒子濃度５ｎＭに調整したクエン酸修飾金ナノ粒子についても実施した。ポリアニオンと金の複合物は４時間にわたってシグナルの損失がほとんどなく、ＵＶ〜可視スペクトルにおける検出可能なシフトを示さない。これに対し、クエン酸修飾金ナノ粒子は混合して１５秒以内に赤色へシフトして不安定であることを示し、その後４時間にわたってほとんど全てのシグナルが失われる。このデータは、ポリアニオン複合型の金ナノ粒子がクエン酸修飾金ナノ粒子に比べて著しく高い安定性を示すことを明確に実証している。従って、以上の検討から、ポリアニオンで安定化した金ナノ粒子を、ＤＮＡなどの生体分子の検出に一般的に用いられる条件下で、かつ光学的またはその他の方法５により検出可能な金ナノ粒子濃度で使用することができる、ということを示すデータが提示されている。このような安定性の向上により、本明細書に記載のポリアニオン金プローブは、以前に作製されたポリアニオン金プローブ複合物１，２とは明確に区別される。
【００７３】
ポリアニオン金ナノ粒子複合物（図４のアッセイにおいて述べたように０．５Ｍ  ＰＢＳ中に調製）の熱安定性について、その溶液を５分間および１０分間９５℃に加熱して生じるＵＶ〜可視スペクトルを、同一の溶液で加熱処理しなかったものと比較することによって調べた（図５）。この条件下では、ポリアニオン金ナノ粒子複合物は９５℃で５分間処理してもＵＶ〜可視スペクトルの変化がほとんど観察されず安定である。１０分間の加熱の後では、ＵＶ〜可視スペクトルの赤色へのシフトがわずかに観察され、加熱の延長に対してはわずかに不安定であることが示されている。いずれにしても、これらのデータはポリアニオン金ナノ粒子複合物が短時間（５分未満）の高温に対しては安定であることを実証している。
【００７４】
（ｅ．生体分子の検出）
ポリアニオンが金ナノ粒子の良好な安定化剤であることを実証した後は、次の目標は生体分子の検出におけるポリアニオンプローブの利用について実証することであった。ビオチン／ストレプトアビジンの結合対をモデル系として選択し、その高い結合親和性とストレプトアビジンの複数の結合部位とを背景として上記の原理を実証した。ビオチンを組み込むためにＢｉｏｔｉｎ‐ＴＥＧ  ＣＰＧ支持体を用いる標準的なホスホロアミダイト法により、ポリアニオン配列６を合成した（スキーム２）。このポリアニオンは、４つの別個の部分、すなわち、１）ステロイドジスルフィドアンカー７、２）精製および定量に使用するニトロインドールのＵＶタグ、３）リン酸を基本とするポリアニオン骨格（ポリエチレングリコールを基本とするスペーサーなど）、ならびに４）ストレプトアビジンを認
識するために使用するテトラエチレングリコールとビオチンの複合体、に分けることができる。
【００７５】
【化３】
2005532456.tif 000004
【００７６】
逆相ＨＰＬＣを用いて、ニトロインドールタグに特徴的な吸収極大である２６５ｎｍおよび３２８ｎｍにおける吸光度をモニターしながら、ポリアニオン１と同じプロトコールによりポリアニオン６を精製した。ポリアニオン６はモニターしたいずれの波長においても３９．８分および４０．１分の２つの保持時間を示し、ステロイドジスルフィドリンカーとニトロインドールタグの存在が示された（図６）。
【００７７】
ポリアニオン６を、ビービーアイ・インコーポレイテッド（ＢＢＩ，Ｉｎｃ）から購入した粒径約３０ｎｍの金粒子（ＢＢＩがＴＥＭにより測定した平均粒径＝３０．９ｎｍ）と複合させた。最初の金コロイド溶液（０．３３ｎＭ）をポリアニオン６（終濃度＝８００ｎＭ）と混合し、室温で６４時間インキュベートした。遠心分離（５，０００ｒｐｍで２０分間）により溶液からプローブを単離し、水で１回洗浄し、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）緩衝液、０．０１％アジドに再分散させて金粒子の濃度を１．７ｎＭとした。
【００７８】
以前の実験において、ＤＮＡで修飾された金ナノ粒子プローブを用いて、粒子の凝集に伴う色の変化を溶液中でモニターすること、あるいは溶液の一部を逆相プレート上へ供して乾燥させてモニターすること（これをスポットテスト５と呼ぶ）によって、溶液中のＤＮＡなどの生体分子を検出可能であることが実証されている。ポリアニオン金ナノ粒子複合物が生体分子の検出に利用可能であることを実証するために、ビオチン官能基を有するポリアニオン６結合型の金ナノ粒子プローブを用いてストレプトアビジン結合実験を実施した。典型的な実験では、プローブ（２４μｌ、１．１ｎＭ）を以下の試薬、すなわち、水、ウシ血清アルブミン（４μｇ／ｍｌ）、またはストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）のうちの１つ（３μｌ）と合わせ、２０ｕｌの１×ＰＢＳ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム）および７ｕｌの水を用いて０．０５５Ｍ  ＮａＣｌに希釈した。室温で１５分間インキュベートした後、溶液の一部３ｕｌを逆相プレート上にスポットして乾燥させ、粒子の凝集に伴う色の変化を観察した（図７、Ａ）５。ストレプトアビジンを含む溶液はいずれも赤色から紫色もしくは青色へと色が変化したが、このことはストレプトアビジンにより粒子の凝集が誘導されたことを示している。ＢＳＡタンパク質を含む、もしくは標的を全く含まない対照溶液はスポットされた時に赤色を示したが、このことは有意な粒子の凝集は起きなかったことを示している。ストレプトアビジンにより誘導されたポリアニオンプローブの凝集に伴う色の変化は、ＵＶ〜可視スペクトル分析によっても観察可能であった（図７、Ｂ）。ＵＶ〜可視スペクトルデータは、ストレプトアビジン存在下では粒子の凝集に伴って生じるが対照のＢＳＡタンパク質存在下では生じない特徴的な赤
色へのシフトを明らかに示している。
【００７９】
ビオチン化した金プローブ／ストレプトアビジンの反応の特異性をさらに実証するために、ストレプトアビジンをプローブとのインキュベーションに先立って予め遊離のｄ‐ビオチンとともにインキュベートする、競合結合実験を実施した。典型的な実験では、ストレプトアビジン（１μｇ／ｍｌを３ｕｌ）を遊離ｄ‐ビオチンの希釈系列（９００μＭ、９０μＭ、９μＭを４．６μｌ）とともに調製し、水で希釈した（総容積１０μｌ）。これらの溶液を室温で１０分間インキュベートしてからポリアニオン６の溶液（１．１ｎＭの金プローブを２４μｌ）に添加し、１×ＰＢＳ（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを２０μｌ）で緩衝化した。１５分間インキュベートした後、試料の一部３ｕｌを逆相ＴＬＣプレート上にスポットして乾燥させた（図８、Ａ）。残りの溶液をリン酸緩衝液で希釈し（０．１Ｍリン酸ナトリウムで総容積２００μｌとした）、ＵＶ〜可視スペクトルを記録した（図８、Ｂ）。スポットした試料およびＵＶ〜可視スペクトルのいずれも、遊離ｄ‐ビオチン濃度が上昇するにつれて赤色へのシフトが減少する傾向を示し、最も高濃度の遊離ｄ‐ビオチンを含む溶液はＢＳＡ対照および標的を含まない対照と類似の色およびＵＶ〜可視スペクトルを示している。このような傾向は、遊離ｄ‐ビオチン濃度の上昇につれてビオチン化プローブのストレプトアビジンへの結合の阻害が高まり、その結果粒子の凝集の阻害をもたらすことを示している。結論として、これらの実験から明らかに実証されるように、ナノ粒子プローブに関連する信号を観察することに基づく生体分子の検出スキームにおいて、官能化したポリアニオンプローブを用いることができる。
【００８０】
［ポリアニオン複合物の実験的な作製および特徴解析］
（試薬および方法の概略）
スペーサーのホスホロアミダイト９，３’‐（６‐ＦＡＭ）ＣＰＧ、５‐ニトロインドールＣＥホスホロアミダイト、およびビオチンＴＥＧ  ＣＰＧはグレン・リサーチ・インコーポレイテッド（Glen Research, Inc. 、米国バージニア州スターリング所在）から購入した。「ステロイドジスルフィド」のホスホロアミダイトは、レスティンガーらが開発した方法７に従って作製した。粒径１６．５ｎｍの金ナノ粒子はクエン酸法６により作製した。粒径３０．９ｎｍの金ナノ粒子はビービーアイ・インターナショナル（BBI International 、英国カーディフ所在）から購入した。
【００８１】
アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）の８９０９型核酸合成機を用いてポリアニオン合成を実施した。ポリアニオンの高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析は、アジレント（Agilent ）シリーズ１１００型ＨＰＬＣを用いて実施した。電子吸収スペクトルは、アジレント８４５３型ダイオードアレイ分光光度計を用いて記録した。ナノ粒子溶液は、ベックマン・コールター（Beckman Coulter ）のＭｉｃｒｏｆｕｇｅ（登録商標）１８遠心機を用いて遠心分離した。
【００８２】
（プロトコール）
ポリアニオン分子を、標準的なホスホロアミダイト法７を用いて作製した。ポリアニオン１は、３’‐（６‐ＦＡＭ）ＣＰＧ支持体を用いて１ｕｍｏｌスケールで合成した。ポリアニオン６は、ビオチンＴＥＧ  ＣＰＧ支持体を用いて１ｕｍｏｌスケールで合成した。合成の後に、ＣＰＧに結合したポリアニオンを、１ｍＬの濃水酸化アンモニウム中５５℃で１４時間処理して固体支持体から切り出した。続いて窒素流を用いてアンモニアを飛ばした。Ｖｙｄａｃ（登録商標）逆相分取用カラム（５ｕｍ、２５０×１０ｍｍ）を装備したＨＰＬＣをポリアニオンの精製に用いた。精製は、０．０３Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７緩衝液を用い、流速４ｍＬ／分で９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ  ＴＥＡＡの１％／分グラジエントにより実施した。精製後、緩衝液を蒸発させ、ポリアニオンを２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に再懸濁した。精製後、同じバッファ系を用いて、Ｖｙｄａｃの逆相分析用カラム（５ｕｍ、２５０×４ｍｍ）を使用
し流速１ｍＬ／分で分析ＨＰＬＣを実施して、ポリアニオンについて得られた純度を評価した。ポリアニオンと金ナノ粒子の複合物は、本明細書に記載のとおりに作製した。
【００８３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ａ：精製後のポリアニオン１のＨＰＬＣクロマトグラム。  Ｂ：精製後のポリアニオン１のＵＶ〜可視スペクトル。
【図２】装着させて単離した後の金ナノ粒子‐ポリアニオン１複合物の可視光吸収スペクトル。
【図３】金粒子あたりのポリアニオン分子数を測定するために使用する標準曲線を示すグラフ。
【図４】Ａ：ポリアニオン１‐金ナノ粒子複合物の０．５Ｍ  ＰＢＳに対する安定性を示すグラフ。  Ｂ：クエン酸修飾されたナノ粒子の０．５Ｍ  ＰＢＳに対する安定性を示すグラフ。
【図５】ポリアニオン１‐金ナノ粒子複合物の０．５Ｍ  ＰＢＳに対する加熱後の安定性を示すグラフ。
【図６】精製後のポリアニオン６のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】Ａ：ストレプトアビジンまたは対照の溶液とともにインキュベートしたポリアニオン６溶液から得られたスポット試験の結果を示す、逆相プレートの図。  Ｂ：ストレプトアビジンまたは対照の溶液とともにインキュベートしたポリアニオン６のＵＶ〜可視スペクトル。
【図８】Ａ：ストレプトアビジンに対する、遊離ｄ‐ビオチン／ポリアニオン６の競合的結合実験に関するスポット試験結果を示す図。Ｂ：ストレプトアビジンに対する遊離ｄ‐ビオチン／ポリアニオン６の競合的結合実験のＵＶ〜可視スペクトル。
【図１】
2005532456.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005532456.tif 000011
【図５】
2005532456.tif 000012
【図６】
2005532456.tif 000013
【図７】
2005532456.tif 000014
【図８】
2005532456.tif 000015
【国際調査報告】
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2005532456.tif 000017