(57)【要約】試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、前記分析対象物と反応することができる酵素と、ひとたび前記酵素が分析対象物と反応したならば前記酵素によって酸化又は還元されることによって転換されることができる酸化還元媒介物と、を含むマイクロ電極に、試料を接触させ、分析対象物を酵素と反応させ、そこで電極に電位を印加し、転換された媒介物の得られた濃度を電気化学的に計測することを含む方法が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、前記分析対象物と反応することができる酵素と、ひとたび前記酵素が分析対象物と反応したならば前記酵素によって酸化又は還元されることによって転換されることができる酸化還元媒介物と、を含むマイクロ電極に、試料を接触させ、分析対象物を酵素と反応させ、そこで電極に電位を印加し、転換された媒介物の得られた濃度を電気化学的に計測することを含む方法。
【請求項２】
生じた電流から生じた濃度を計測する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マイクロ電極が、作用電極、対電極及び基準電極を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
対電極と基準電極とが組み合わされている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
作用電極が、パラジウム、白金、金又は炭素でできており、対電極が、炭素、Ａｇ／ＡｇＣｌ、Ａｇ／Ａｇ2ＳＯ4、パラジウム、金、白金、Ｃｕ／ＣｕＳｏ4、Ｈｇ／ＨｇＯ、Ｈｇ／ＨｇＣｌ2、Ｈｇ／ＨｇＳＯ4又はＺｕ／ＺｕＳＯ4でできている、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
媒介物が、フェリシアン化物、フェナジンエトスルフェート、フェナジンメトスルフェート、１−メトキシフェナジンメトスルフェート、フェニレンジアミン又はルテニウムヘキサミンである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
酵素が、グルコースデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、リポタンパク質リパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ又は乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
試料をマイクロ電極に塗布したのち０．５〜６０秒の時間を経過させ、その後で電極に電位を印加し、その後５秒以内に電気化学的計測を実施することを含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
印加される電位が−２〜＋２ボルトである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
電位を印加した１０〜５００ミリ秒後に計測を実施する、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
１０〜１００回の計測を実施する、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
直接的な読みを提供するためにマイクロ電極が事前に較正されている、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
媒介物が分析対象物に対して過剰に存在する、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
反応した媒介物が、分析対象物とで１：１の電子比に相当する濃度で存在する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、前記分析対象物と反応することができる酵素と、ひとたび前記酵素が分析対象物と反応したならば前記酵素によって酸化又は還元されることによって転換されることができる酸化還元媒介物と、を含むマイクロ電極に、試料を接触させ、分析対象物を酵素と反応させ、そこで電極に電位を印加し、得られる電流を計測し、電位を逆転させ、電流を再び計測し、二つの電流を比又は割合として表し、それから分析対象物の濃度を直接測定することを含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項の特徴の一以上を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
実質的に例のいずれか一つに記載されたとおりである、請求項１又は１５記載の方法。
【請求項１８】
作用電極、対電極及び基準電極と、試料がそれに塗布された後の所定の時点で正又は負の電位を電極に印加するための手段と、その後１秒以下の設定時間で得られた電流を測定するための手段と、電極の電位を逆転させ、逆転したのち設定時間で得られた電流を測定するための手段とを含むマイクロ電極。
【請求項１９】
前記すべての手段が一つのプロセッサ／マイクロチップによって提供されている、請求項１８記載のマイクロ電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の分析対象物の濃度を測定する方法、特に、濃度を電気化学的に測定する方法に関する。
【０００２】
生物学的起源の試料、たとえば血液の中の特定成分の濃度を測定することはとりわけ貴重である。この目的にはバイオセンサが使用される。測定される分析対象物と反応した酵素と相互作用する媒介物の酸化状態の変化が利用される。媒介物の酸化状態は、基質を添加したときだけ酵素と相互作用する状態にだけなるように選択される。分析対象物は、酵素を介して化学量論的濃度の媒介物と反応する。これが、媒介物を酸化又は還元させ（酵素反応に依存する）、所定の電位で発生する電流を測定することによってこの媒介物のレベルの変化を計測することができる。
【０００３】
通常、計測は、媒介物が分析対象物と反応したときの酵素による媒介物の酸化（又は還元）の間に実施される。しかし、これは、信頼性の低い結果を生じさせることがある。したがって、反応が完了するまで待ったのち計測を実施することが提案された。しかし、得られる値は時間とともに変化するため、一般に、多数の読みを実施したのち、アルゴリズムを使用して、又は数値のプロットに一致する曲線の下の面積を積分することによって濃度を決定することが必要である。この値の変化は、電極から本質的に線状に起こる拡散の影響によって生じる。したがって、媒介物の一部が電極で酸化（又は還元）するにつれ、より多くの媒介物が電極へと連続的に拡散する。しかし、この線形拡散は、作用電極の周囲の電気活性物質の枯渇を生じさせる。
【０００４】
濃度を測定するためには、まず、分析対象物が非存在の場合の値を得、この「バックグラウンド」値を、分析対象物が存在するときに得られる増強値から差し引くことが必要である。この手法は複雑であり、誤差を生じやすいということが理解されよう。
【０００５】
最近、マイクロ電極を利用することによってバイオセンサのサイズを減らす工程が実施されるようになった。マイクロ電極とは、その寸法の少なくとも一つが５０μmを超えず、しばしば１〜２５又は３０μmである電極と定義することができる。
【０００６】
マイクロ電極は、非常に小さな電流の計測の場合により良好であると認められたため、考案されたものである。理由は、マイクロ電極アレイの使用が、１個の電極の使用の場合よりも良好なＳＮ比を与えるからである。したがって、マイクロ電極は、直接電流測定のために考案されたものであり、酵素及び媒介物を伴うバイオセンサとしての利用は見いだされていない。ところが、驚くことに、マイクロ電極が、ある特定の方法で使用されるならば、マクロ電極の欠点を解消することができることがわかった。
【０００７】
マイクロ電極をこの目的に使用することができるということは、二つの主な理由から特に驚くべきことである。第一に、分析対象物の存在による、バックグラウンドレベルに対する電流の増大は、当然、マクロ電極の場合よりもマイクロ電極の場合には、はるかに小さい。したがって、サイズ減とともに、正確な計測値を得ることが不可能になる。第二に、電極の面積が試料の量に対して非常に小さいため、電極表面への拡散はもはや、マクロ電極の場合のように線形には起こらず、放射状に起こる。溶液中で反応が起こる距離はマイクロ電極のサイズに比較して大きいため、触媒による接触増強はほとんど又は全くないと予想される。したがって、電極サイズの減少により、意味のある計測値を得ることはできないと予想されよう。
【０００８】
通常の定常状態条件では、酸化状態の媒介物が、還元状態を再形成する反応を起こす前に拡散する平均距離は（ＤｔL）1/2である。ただし、Ｄは、酸化状態の拡散係数であり、ｔLは、酸化状態が再形成される前の反応半減期である。マイクロ電極のサイズがこの拡散距離に比較して小さいため、通常、触媒反応の存在で非常にわずかな電流増強しかないということが理解されよう。換言するならば、触媒反応を促進する分析対象物の存在が、初期に存在した電流に対して小さな電流増しかもたらさない。したがって、この「摂動電流」の小ささは、正確な分析結果を得ることができないことを意味する。
【０００９】
これらの大きな欠点にもかかわらず、驚くことに、反応が起こった後に測定を実施するならば、初期ピーク後の電位曲線が実質的に水平になり、その結果、第一に、バックグラウンドを差し引くことなく直接計測値を得ることができ、第二に、１回の計測しか要らないということがわかった。図１は、得ることができる典型的な曲線を示す。換言するならば、一つの値から濃度を直接測定することができる。
【００１０】
本発明にしたがって、試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、前記分析対象物と反応することができる酵素と、ひとたび前記酵素が分析対象物と反応したならば前記酵素によって酸化又は還元されることによって転換されることができる酸化還元媒介物と、を含むマイクロ電極に、試料を接触させ、分析対象物を酵素と反応させ、そこで電極に電位を印加し、転換された媒介物の得られた濃度を電気化学的に計測することを含む方法が提供される。通常、得られた電流を計測し、記憶された参照データセットとの比較によって濃度を直接測定することができる。触媒電流は、酵素が基質を絶えずターンオーバさせ、酵素が絶えず再使用されるとき発生する。本発明にしたがって、反応は、完了に至る、又は、電位を印加する前の１００％転換率に満たず、たとえば５０％転換率でしかないかもしれない安定な平衡状態に達する。反応を完了させるための駆動力は、この系における酵素の著しい過剰（触媒系におけるものとは桁違いの大きさ）から生じる。
【００１１】
このような方法により、媒介物中の反応が溶液を通じて起こり、媒介物が酵素と反応し、電圧が印加されると、得られる酸化／還元媒介物が電極でその元の酸化状態に還元／酸化されるということが理解されよう。これは、媒介物が酸化／還元されたのち、それが酵素と反応する触媒系とは対照的である。溶液中の低いレベルの酵素で触媒量が得られることは、連続的なターンオーバによる。すなわち、本発明の系では、酵素は、試験される溶液全体の中に過剰に存在すべきである。対照的に、通常の触媒系では、反応は電極面に隣接する溶液に限定されるため、試験溶液の大部分は酵素反応による摂動を受けない。この要件は、酵素が混合物中で均一でなければならないことを必ずしも意味するわけではないことに留意すべきである。実際、酵素過剰は、予想される反応時間がセンサに許容しうる計測時間よりも一桁低いようなものであることが望ましいことがわかった。したがって、細片上で乾燥した酵素の必要量（湿潤時間に関連する）は、必要な応答時間、酵素によって保持される活性の量に対する酵素再懸濁の速度、試験が完了する量及び試験される分析対象物の最大濃度によって決まる。明らかに、これらのパラメータは、試験ごと及び酵素ごとに異なる。たとえば、酵素が１０００U/mgの活性を有し、反応量が１０μlであり、所要応答時間が１０秒であり、酵素活性の５０％が再懸濁で回復し、最大分析対象物濃度が１mMであるならば、電着溶液中に２U/mlが必要である。反応した媒介物は、分析対象物とで１：１の電子比に相当する濃度で存在するということが理解されよう。
【００１２】
通常は作用電極及び基準電極を備えた従来のマイクロ電極を本発明の方法に使用することができ、そのため、その詳細な説明は不要である。好ましい実施態様では、作用電極は、さらなる詳細に関して参照すべきである英国特許出願第０１３０６８４．４に開示されているように、マイクロ電極を形成する受け器の壁の中にある。同様に、通常の酵素及び媒介物を使用することができる。たとえば、典型的な媒介物は、フェリシアン化物、フェナジンアルコキシスルフェート、たとえばフェナジンエトスルフェート及びフェナジンメトスルフェートならびに１−メトキシフェナジンメトスルフェートをはじめとする置換フェナジンアルコキシスルフェート、さらにはフェニレンジアミン及びルテニウム化合物、たとえばルテニウムヘキサミンを含む。使用することができる適当な酵素は、当然、分析対象物及び媒介物に依存する。例として、フェリシアン化物とで使用することができる適当な酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコースの場合）、コレステロールの場合にはコレステロールエステラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、トリグリセリドの場合にはリポタンパク質リパーゼ、グリセロールキナーゼ及びグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、乳酸の場合には乳酸オキシダーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼならびにジオアホラーゼを含む。酵素のための通常の安定剤、たとえばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及び非イオンポリオール界面活性剤、たとえば登録商標Triton  Xとして知られているものならびにコール酸及び他の胆汁酸塩を使用することができる。媒介物は通常、０．０１〜１モル、たとえば０．０５〜０．２５モルの濃度で使用されるが、酵素の濃度は通常、１０〜１０6U/ml、たとえば１００〜１０，０００U/mlである。媒介物は通常、分析対象物に対して過剰に存在すべきである。望ましくは、ｐＨは、緩衝剤、たとえばリン酸カリウムの添加により、試験される特定の分析対象物にとって最適なレベルに維持されるように制御される。使用することができる他の緩衝剤は、リン酸ナトリウム、Goods緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、シトレート／ホスフェート、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン（ＨＥＰＥＳ）、トリシン、ビシン、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）及び［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス［ヒドロキシメチル］エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）ならびに他の生物学的緩衝剤を含む。
【００１３】
マイクロ電極は通常、作用電極及び対電極ならびに基準電極を含む。場合によっては、対電極と基準電極とは組み合わされている。作用電極は通常、パラジウム、白金、金又は炭素でできている。対電極は通常、炭素、Ａｇ／ＡｇＣｌ、Ａｇ／Ａｇ2ＳＯ4、パラジウム、金、白金、Ｃｕ／ＣｕＳＯ4、Ｈｇ／ＨｇＯ、Ｈｇ／ＨｇＣｌ2、Ｈｇ／ＨｇＳＯ4又はＺｕ／ＺｕＳＯ4である。
【００１４】
酵素が電極のような表面に付着すると、酵素は、変性するとともに比較的不溶性の「塊」を形成する傾向がある。通常、酵素溶液はセンサ上で乾燥し、したがって、これらの問題は、酵素がその活性を保持し、妥当なタイムスケールの間に再懸濁することを保証するために対処されなければならない。この反応は、塩、たとえばカチオンが通常はカリウム、アンモニウム又はマグネシウムである塩化物又は硫酸塩、たとえば塩化カリウム及びマグネシウムならびに硫酸アンモニウム又は洗浄剤、たとえば商標Triton  X、たとえばTriton  X-100の下で知られるもの又はデオキシコール酸ナトリウム及び同様な胆汁酸塩、ＳＤＳ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコピラノシド、オクチルチオグルコンピラノシド及び種々の他のポリオール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カルボキシメチルセルロース、硫酸デキストラン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デンプン、ｎ−ドデシルマルトシド、エチルセルロース及びポリメタクリル酸又は微結晶、たとえばセファロース、Sephadex  G25の存在下、酵素溶液を電極に付着させることによって支援することができる。あるいはまた、まずこれらの成分の１種以上を電極に塗布し、次いで乾燥させたのち、酵素溶液を適用することもできる。
【００１５】
典型的な計測では、試料をマイクロ電極に塗布したのち、たとえば０．１又は１〜１８０、好ましくは０．１、０．５又は１、あるいは１０〜６０、より好ましくは０．１〜６０、特に０．５〜２０、特に約２０秒の時間（ＳＤ）を設定し、その間、すべての電極を大地電位、すなわち電流が流れない電位に保持する。これは、酵素が再懸濁し、分析対象物と実質的に完全に反応（又は安定な平衡状態に到達）し、電極及び酵素が完全に湿潤するための時間を与えるためである。そして、使用される酵素系に依存して通常は−２〜＋２Ｖ、たとえば−１〜＋１Ｖ、たとえば約０．５Ｖの電位を電極に印加すると、これが、酵素によって化学量論的にターンオーバされる媒介物の量を測定する。通常は１０〜５００ミリ秒、一般には１又は５秒以下の時間遅延（Ｄ１）を経たのち、計測を実施する。通常、計測（Ｃ１）は電流応答である。この時間遅延ののち電流を計測する。電位が最初に印加されたときの計測値を知る必要はないことが理解されよう。
【００１６】
直接的な読みを得ることができるよう、所定の濃度の分析対象物を用いて装置を事前に較正することができる。得られる電流が分析対象物の濃度に比例するということがわかった。
【００１７】
一つの読みが必要なすべてであるが、誤差をなくし、平均値を得るため、たとえば２５〜１０００Hzの試料状態で、二以上の読み、たとえば１０〜１００の読みを得ることが一般に望ましい。しかし、これらの多数の読みは、積分又は特定のアルゴリズムによって濃度値を得るために多数の読みが不可欠であるマクロ電極を使用する状況とは対照的に、平均化のためのだけに実施されるということが強調されるべきである。
【００１８】
表面的には直前のマイクロ電極と同一に製造されているとしても、マイクロ電極を予備較正することは困難であるということがわかった。換言するならば、直前のマイクロ電極の予備較正を後続のマイクロ電極に対して正確に使用することはできない。関連する小さなサイズのため、当然、得られる電流を厳密に決定する電極の面積が１個のマイクロ電極と次のマイクロ電極とで正確に同じであると保証することは非常に困難である。面積補正技術の使用が、短いタイムスケール枠組みで、異なる電極サイズによって誘発される誤差をなくす。電極面積の違いはまた、より小さな面積が、比較的大きな面積よりも速やかに準定常状態に達するという結果をもたらす。この差違は、電気化学的応答の大きさにおける相対的な増大で明らかである。電流応答の場合、これは、系が短いタイムスケールで作動するならば、準定常状態電流に加わる平面拡散による電流のせいで悪化するが、多くの場合、電極が定常状態に達したとき、より長いタイムスケールでも明らかになる。
【００１９】
独立した較正試料の使用がこれに関して有用であり、また、湿潤量の変化から生じる差をなくすのにも有用である。状況によっては、別個の酸化還元プローブを較正基準として加えることが最良であるかもしれない。このプローブの賢明な選択は、（ａ）プローブの初期酸化還元状態が、それが媒介物の酸化還元状態と反応するのに熱力学的に好ましくないようなものであること、（ｂ）酸化還元プローブのその後の酸化還元状態と媒介物との反応がわれわれの計測のタイムスケールで観察するのには遅すぎることを保証するために不可欠である。
【００２０】
本発明の特定の態様によると、電極面積の差による誤差をなくすための手段が見いだされた。これは、特定の実施方法を伴う。アンペロメトリー計測の場合、効果的には、上記のように計測値を得たのち（ｉ１）、たとえば前記のようにたとえば１０〜５００ミリ秒の時間遅延ののち電位を逆転させて、反応によって酸化された媒介物を還元させ、通常は同様な時間遅延（Ｄ３）ののち、得られた電流のもう一つの値（Ｃ２）を得る（ｉ２）。各場合、得られる電流が電極表面の面積に比例し、そのため、二つの電流の比（ｉ１／ｉ２）又は二つの電流の和に対する第一の電流の割合（ｉ１／ｉ１＋ｉ２）を得ることにより、電極の表面積から独立した値を得ることができる。図３は、その手順を図で示すものである。したがって、この比又は割合は、一つの計測値を得る場合とまったく同じ方法で較正曲線から直接読み出すことができる。所定の酸化還元対を使用するボルタンメトリー計測の場合、第二の非反応性酸化還元対を使用することができる。二つの酸化還元対の相対濃度が、試験されるすべての電極の間で一定のままであることが重要である。
【００２１】
したがって、この補正実施方法は、通常はバイオセンサとして製造されるマイクロ電極の表面積の違いをなくすのに特に貴重である。観察される電流は、平面拡散と「放射状」拡散との一次結合であるため、比例技術の使用が、異なる電極サイズから生じるこれら二つの成分の相対的割合の変化をなくすことができる。
【００２２】
したがって、本発明はまた、試料中の分析対象物の濃度を測定する方法であって、前記分析対象物と反応することができる酵素と、ひとたび前記酵素が分析対象物と反応したならば前記酵素によって酸化又は還元されることによって転換されることができる酸化還元媒介物と、を含むマイクロ電極に、試料を接触させ、分析対象物を酵素と反応させ、そこで電極に電位を印加し、得られる電流を計測し、電位を逆転させ、電流を再び計測し、二つの電流を比又は割合として表し、それから分析対象物の濃度を直接測定することを含む方法を提供する。
【００２３】
操作を簡素化するため、本発明はまた、作用電極及び対電極と、試料がそれに塗布された後の所定の時点で正又は負の電位を電極に印加するための手段と、その後１秒以下、たとえば５００ミリ秒までの設定時間で得られた電流を測定するための手段と、電極の電位を逆転させ、逆転ののち前記設定時間で得られた電流を測定するための手段とを含むマイクロ電極を提供する。一つのプロセッサ／マイクロチップによって種々の手段を提供することができることが理解されよう。
【００２４】
以下の例が本発明をさらに説明する。以下のセンサを使用した。
【００２５】
コレステロールオキシダーゼセンサ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ＠４００U/ml
コレステロールオキシダーゼ＠７００U/ml
コレステロールエステラーゼ＠７００U/ml
０．０８Ｍフェリシアン化カリウム
０．１Ｍ塩化カリウム
０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．４
１００g/dm-3Triton-X  100
０．２g/ml  Sephadex  G25
【００２６】
トリグリセリドセンサ
グリセロールリン酸オキシダーゼ＠４５００U/ml
グリセロールキナーゼ＠４５００U/ml
リパーゼ＠１０００００U/ml
０．２Ｍ塩化カリウム
０．２Ｍフェリシアン化酸カリウム
０．０２５Ｍアデノシン三リン酸
０．００２Ｍ硫酸アンモニウム
０．００２Ｍ塩化マグネシウム
０．１g/ml  Sephadex  G25
【００２７】
グリセロール濃度に対してプロットされた場合、第一の酸化電流は、酵素ターンオーバに依存し、電極表面積には依存しない。使い捨てマイクロ電極は異なる表面積を有する傾向にあるため、酸化電流とグリセロール濃度との関係は損なわれる。
【００２８】
他方、第一の電位ステップからの酸化電流を第二の電位ステップからの還元電流で割ることにより、電極面積要因を除く無単位の比が得られる。
【００２９】
図１は、二電位ステップ実験の間の電流応答を示す。電位ステップから約４００msec以内で電流値が一定になることが見てとれる。第一及び第二の電位ステップそれぞれから４００msec後に酸化ステップ及び還元電流の電流値をプロットから読む。
【００３０】
図２は、グリセロール濃度に対してプロットした、すなわち第一の電位ステップのみからの酸化電流を示す。これらの電流は電極面積の可変性の影響を受けやすい。
【００３１】
図３は、図２に示す酸化電流を第二の電位ステップから得た各還元電流（図１に示す）によって割った比のプロットである。これらの比は、面積補正の結果であり、グリセロール濃度とで線形であることがわかる。
【００３２】
例１
英国特許出願第０１３０６８４．４号に開示されているタイプの電極に対して計測を実施した。作用電極は、２５０μmのmelonex上基板にプリントされたCoates炭素であった。これを、１２５μmのmelonex下基板に被着してウェルを形成した。Ａｇ／ＡｇＣｌを上基板にプリントした。バイオセンサコーティング溶液の成分（濃度）は、ヘキサアンミンルテニウム（III）塩化物（４．８mM）、ＮＡＤ＋（０．８mM）、ＰｄＲ（１．６μM）、ポリマー洗浄剤（２．５mM）及びグルコースデヒドロゲナーゼ（１U／バイオセンサ）であった。
【００３３】
支持電解質は０．１Ｍ、ｐＨ７．４ホスフェートであった。Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋０．２Ｖの電位を印加し、電位を印加して０．５秒後に計測を実施した。得られた結果を図４に示す。
【００３４】
例２
電極は、例１におけるようにして、２５０μmのＰＥＴ層に７μmのCoates炭素インク層をスクリーンプリントしたのち３０μmのDuPont  5036絶縁層をスクリーンプリントしたものから構成した。この層を穿孔して直径１mmの穴を開けたのち、感圧積層を使用して１２５μmのＰＥＴベース層に被着し、共通のＡｇ／ＡｇＣｌ（Ercon  E0430-128を使用）対参照を細片の一番上に配した。
【００３５】
ＮＡＤ＠０．０２２g/ml、ルテニウムヘキサアミン＠０．０２１g/ml、コレステロールエステラーゼ＠１．２５kU/ml、コレステロールデヒドロゲナーゼ＠４．２kU/ml、プチダレドキシンレダクターゼ＠６５０kU/ml、０．１Ｍ  ＫＣＬ、０．１ＭトリスＨＣｌ＠ｐＨ９オクチルグルコピラノシド＠１００g/dm-3を含有する溶液０．３μlを乾燥させた電極に対し、０．１mol  dm-3ＫＣｌを含有するｐＨ７．４の０．１mol  dm-3トリス緩衝剤中、異なる量のＬＤＬコレステロールを添加して、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し、０．１５Ｖを印加したのち−０．４５Ｖを印加して１秒後にアンペロメトリー電流を計測した。
【００３６】
得られた結果を以下の表に記す。
【００３７】
【表１】
2005526260.tif 000003
【００３８】
面積補正の使用が誤差の大きさを減らし、したがって、正確なセンサの製造にきわめて有用であることがわかる。
【００３９】
例３
電極は、例１におけるようにして、２５０μmのＰＥＴ層に２０μmのCoates  268203炭素インク層をスクリーンプリントしたのち３０μmのRonseal絶縁層をスクリーンプリントしたものから構成した。この層を穿孔して直径１mmの穴を開けたのち、7841シート接着剤を使用してＰＥＴベース層に被着し、共通のＡｇ／ＡｇＣｌ（Ercon  E0430-128）対参照を細片の一番上に配した。
【００４０】
０．１mol  dm-3ルテニウムヘキサアミン、０．１５mol  dm-3硫酸アンモニウム、０．０４mol  dm-3ＮＡＤ、１５０U/mlグリセロールデヒドロゲナーゼ及び６．７kU/mlジアホラーゼを含有する溶液０．３μlを乾燥させた電極に対し、０．１mol  dm-3ＫＣｌ及び１％ＯＧＰを含有するｐＨ９の０．１mmol  dm-3トリス緩衝剤中２、５、７．５、１０、１２．５及び１５mmol  dm-3のグリセロールを添加して、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し、０．２０Ｖを印加して１秒後にアンペロメトリー電流を計測した。
【００４１】
得られた結果を以下の表に記す。
【００４２】
【表２】
2005526260.tif 000004
【００４３】
例４
電極は、例１におけるようにして、２５０μmのＰＥＴ層に７μmのCoates炭素インク268203層をスクリーンプリントしたのち３０μmのDuPont5036絶縁層をスクリーンプリントしたものから構成した。この層を穿孔して直径１mmの穴を開けたのち、感圧積層を使用して１２５μmのＰＥＴベース層に被着し、共通のＡｇ／ＡｇＣｌ（Ercon  E0430-128を使用）対基準を細片の一番上に配した。
【００４４】
ＮＡＤ＠０．０２２g/ml、ルテニウムヘキサアミン＠０．０２１g/ml、コレステロールエステラーゼ＠１．２５kU/ml、コレステロールデヒドロゲナーゼ＠４．２kU/ml、プチダレドキシンレダクターゼ＠６５０kU/ml、０．１Ｍ  ＫＣＬ、０．１ＭトリスＨＣｌ＠ｐＨ９オクチルグルコピラノシド＠１００g/dm-3を含有する溶液０．３μlを乾燥させた電極に対し、０．１mol  dm-3ＫＣｌを含有するｐＨ７．４の０．１mol  dm-3トリス緩衝剤中１、３、５mmol  dm-3のＬＤＬコレステロールを添加して、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し、０．１５Ｖを印加したのち−０．４５Ｖを印加して１秒後にアンペロメトリー電流を計測した。
【００４５】
得られた結果を図５に記す。
【００４６】
例５
電極は、例１におけるようにして、２５０μmのＰＥＴ層に１５μmのCoates炭素インク26-8203層をスクリーンプリントしたのち３０μmのRonseal層をスクリーンプリントしたものから構成した。この層を穿孔して直径１mmの穴を開けたのち、ARcare7841シート接着剤を使用して１２５μmのＰＥＴベース層に被着し、共通のＡｇ／ＡｇＣｌ対基準を細片の一番上に配した。
【００４７】
０．２mol  dm-3ルテニウムヘキサアミン及び６５０KU/mlプチダレドキシンレダクターゼを含有する溶液０．２μlを乾燥させた電極に対し、０．１mol  dm-3ＫＣｌを含有するｐＨ９の０．１mol  dm-3トリス緩衝剤中２、４、６、８及び１０mmol  dm-3のＮＡＤＨを添加した直後、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０．１５Ｖでサイクリックボルタンメトリー電流を計測した。
【００４８】
得られた結果を図６に示す。
【００４９】
例６
電極は、例１におけるようにして、２５０μmのＰＥＴ層に１５μmのCoates炭素インク26-8203層をスクリーンプリントしたのち３０μmのRonseal層をスクリーンプリントしたものから構成した。この層を穿孔して直径１mmの穴を開けたのち、ARcare7841シート接着剤を使用して１２５μmのＰＥＴベース層に被着し、共通のＡｇ／ＡｇＣｌ対基準を細片の一番上に配した。
【００５０】
０．２mol  dm-3ルテニウムヘキサアミン及び６５０KU/mlプチダレドキシンレダクターゼを含有する溶液０．２μlを乾燥させた電極に対し、０．１mol  dm-3ＫＣｌを含有するｐＨ９の０．１mol  dm-3トリス緩衝剤中２、４、６、８及び１０mmol  dm-3のＮＡＤＨを添加して、Ａｇ／ＡｇＣｌに対し、０．１５Ｖを印加して１秒後にアンペロメトリー電流を計測した。
【００５１】
得られた結果を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】二電位ステップ実験の間の電流応答を示す図である。
【図２】第一の電位ステップのみからの酸化電流を示す図である。
【図３】図２に示す酸化電流を、第二の電位ステップから得た各還元電流によって割った比のプロットを示す図である。
【図４】例１における計測結果を示す図である。
【図５】例４における計測結果を示す図である。
【図６】例５における計測結果を示す図である。
【図７】例６における計測結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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