(57)【要約】本発明は、神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成に影響を及ぼす保護物質を同定するためのスクリーニング方法、および該方法を実施するための組換え構築、宿主細胞およびトランスジェニック動物に関する。さらには、哺乳類の神経変性および／または虚血性疾患を鑑別診断するための診断方法、ならびに哺乳類の神経変性および／または虚血性疾患を治療するためのヘモグロビン、グロビンまたはムテインまたはそれらの融合タンパク質または対応する核酸の使用に関する。また本発明は、そのような疾患の遺伝子治療の構築に関する。【選択図面】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成に影響を及ぼす保護物質を同定するためのスクリーニング方法：
−試験する前記物質を、神経、心筋および骨格筋細胞から選ばれる試験細胞と接触させること、および
−前記試験細胞におけるヘモグロビン生成の変化を検出すること。
【請求項２】
前記ヘモグロビン生成の変化の検出が、少なくとも１のグロビンＲＮＡの検出により行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出されるグロビンＲＮＡが、αグロビンおよび／またはβグロビンＲＮＡであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記グロビンＲＮＡの検出が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記グロビンＲＮＡの検出が、適切なプローブとのハイブリダイゼーションにより行われることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘモグロビン生成の変化の検出が、ヘモグロビンタンパク質の検出により行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビンタンパク質の検出が、2,7-ジアミノフルオレンまたはシアンメトヘモグロビン法を用いる染色で行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘモグロビンタンパク質の検出が、抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
下記工程を含む、神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成に影響を及ぼす保護物質を同定するためのスクリーニング方法：
−試験する前記物質を、少なくとも１のグロビン遺伝子の調節エレメントの機能制御下にリポーター遺伝子を包含する、神経、心筋および骨格筋細胞から選ばれる試験細胞と接触させること、および
−前記試験細胞における前記リポーター遺伝子産物を検出すること。
【請求項１０】
前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはＥＧＦＰであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記グロビン遺伝子が、αまたはβグロビン遺伝子であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、in vitroで行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、in vivoで行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記神経試験細胞が、初代ニューロンであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記神経試験細胞が、ＰＣ１２細胞または誘導した神経芽細胞腫細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１のグロビン遺伝子の調節エレメントの機能制御下にリポーター遺伝子を含む組換え構築。
【請求項１７】
前記リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはＥＧＦＰであることを特徴とする、請求項１６に記載の組換え構築。
【請求項１８】
前記グロビン遺伝子が、αおよび／またはβグロビン遺伝子であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の組換え構築。
【請求項１９】
ベクターであることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の組換え構築。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の組換え構築を包含する宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の組換え構築を包含するトランスジェニック非ヒト 動物。
【請求項２２】
神経、心筋および／または骨格筋細胞との接触において、該細胞におけるヘモグロビン生成に影響を及ぼし、かつ請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により同定することができる物質。
【請求項２３】
神経、心筋または骨格筋細胞を包含する哺乳類由来の生物学的検体において、ヘモグロビン生成の変化を検出する工程を含む、哺乳類における神経変性および／または虚血性疾患を鑑別診断するための診断方法。
【請求項２４】
前記ヘモグロビン生成の変化の検出が、少なくとも１のグロビンＲＮＡの検出により行われることを特徴とする、請求項２３に記載の診断方法。
【請求項２５】
前記検出されるグロビンＲＮＡが、αグロビンおよび／またはβグロビンＲＮＡであることを特徴とする、請求項２４に記載の診断方法。
【請求項２６】
前記グロビンＲＮＡの検出が、ポリメラーゼ 連鎖反応 （ＰＣＲ）により行われることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の診断方法。
【請求項２７】
前記グロビンＲＮＡの検出が、適切なプローブとのハイブリダイゼーションにより行われることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘモグロビン生成の変化の検出が、ヘモグロビンタンパク質の検出により行われることを特徴とする、請求項２３に記載の診断方法。
【請求項２９】
前記ヘモグロビンタンパク質の検出が、2,7-ジアミノフルオレンを用いる染色またはシアンメトヘモグロビン法を用いる染色で行われることを特徴とする、請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３０】
前記ヘモグロビンタンパク質の検出が、抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項２８に記載の診断方法。
【請求項３１】
前記生物学的検体が液状検体であることを特徴とする、請求項２３〜３０のいずれかに記載の診断方法。
【請求項３２】
神経系疾患および／または慢性もしくは急性の虚血および／または低酸素症状態が起こり得るかもしくは包含される疾患を鑑別診断するための請求項２３〜３１のいずれかに記載の診断方法。
【請求項３３】
脳卒中、心筋梗塞後の広範な低酸素症および／または脳内の手術中酸素欠乏症を鑑別診断するための請求項３２に記載の診断方法。
【請求項３４】
哺乳類における神経変性および／または虚血性疾患を治療処置するための、ヘモグロビン、グロビンまたはムテインまたはこれらの融合タンパク質の使用。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が、哺乳類の神経、心筋または骨格筋細胞によるヘモグロビンまたはグロビンの吸収を促す、ヘモグロビンまたはグロビンに結合した成分を含むことを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
哺乳類における神経変性および／または虚血性疾患を遺伝子治療するための、少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項３７】
少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする前記核酸が、非相同の調節エレメントの機能制御下にあることを特徴とする、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする前記核酸が、ウィルスプロモーター、酵母プロモーターまたは哺乳類プロモーターの機能制御下にあることを特徴とする、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記グロビンが、αグロビンおよび／またはβグロビンであることを特徴とする、請求項３７〜３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
非相同の調節エレメントの機能制御下に、少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子治療の構築。
【請求項４１】
少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする前記核酸配列が、ウィルスプロモーター、酵母プロモーターまたは哺乳類プロモーターの機能制御下にあることを特徴とする、請求項４０に記載の遺伝子治療の構築。
【請求項４２】
前記グロビンが、αグロビンおよび／またはβグロビンであることを特徴とする、請求項４０または４１に記載の遺伝子治療の構築。
【請求項４３】
ベクターであることを特徴とする、請求項４０〜４２のいずれかに記載の遺伝子治療の構築。
【請求項４４】
請求項４０〜４３のいずれかに記載の構築を包含する宿主細胞。
【請求項４５】
胚性または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項４４に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４０〜４２のいずれかに記載の構築を包含するトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成に影響を及ぼす保護物質を同定するためのスクリーニング方法とともに該方法を実施するための組換え構築、宿主細胞およびトランスジェニック動物に関する。さらには、哺乳類の神経変性および／または虚血性（ischaemic）疾患を鑑別診断するための診断方法および哺乳類の神経変性および／または虚血性疾患を治療するためのヘモグロビン、グロビンまたはムテインまたはそれらの融合タンパク質または対応する核酸の使用に関する。また本発明は、そのような疾患の遺伝子治療の構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦統計ユーザー会議が発表した統計によれば、ドイツ連邦共和国における脳血管性の疾患による死者数は毎年ほぼ９０,０００である。１９８０年代初頭の数字では、全脳卒中（stroke）患者のほぼ半分が、発病３週間内に死亡している。最近の数値は下がりつつあるが、脳卒中は依然として、心筋梗塞と並ぶ中年世代の最も顕著な疾患のひとつに変わりない。
【０００３】
脳卒中は、短い前兆の後に突然起き、また脳領域部分の血液供給が不足するか完全に遮断されることにより引き起される、意識喪失、麻痺ならびに言語および情緒障害を伴う重篤な脳の機能障害である。優れた治療処置のおかげで、脳卒中を患う人は以前よりも長く生存しているが、生存者の約５０〜６０％ は、神経損傷によって生じた身体障害をもつことになってしまう。
【０００４】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、もとは出血したウサギの血清中に造血因子として見出された酸性糖タンパク質である。エリスロポエチンは組織酸素欠乏に抗するために誘発される。この機能は、長い間、貧血の治療、たとえば透析患者に利用されてきた。最近、エリスロポエチンのこの効能とは別に、中枢神経系でのＥＰＯの効能が注目されてきている。今日、脳におけるＥＰＯの作用効果、特に神経保護効果が明確に証明された（ブラインズ（Brines）ら， 2000，Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 97，10526-31；ディジカイリョール（Digicaylioglu）およびリプトン（Lipton），2001，ネオチャー（Nature） 412，641-7）。たとえば、大脳虚血、実験的に誘発した脳脊髄炎またはクモ膜下出血などの神経疾患モデルにおける保護効果が挙げられる。低酸素−虚血状態での神経活性存続のためのエリスロポエチンの重要性は、in vivo（ベルナーディン（Bernaudin）ら，1999， J. Cereb. Blood Flow Metab. 19，643-651；ブラインズ（Brines）ら，2000，loc. cit.）およびin vitro （サイレン（Siren）ら，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 98，4044-4049；ディジカイリョール（Digicaylioglu）およびリプトン（Lipton），2001，ネイチャー（Nature） 412，641-647）での多くの研究で証明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そのエリスロポエチン効果により、ＥＰＯの投与は神経保護効果に付随してヘマトクリットを増加させるが、一方、ヘマトクリットの増加は、微小循環上で負の効果をもつ血液の流動性低下を引起こすため、神経保護効果をある程度妨害する。このため、ＥＰＯの保護効果はもつが、望ましくない副作用はもたない物質が求められている。
【０００６】
したがって本発明の目的の１つは、神経、心筋および／または骨格筋細胞に対する保護効果のある新規な物質の同定を可能にするスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的は、神経、心筋および／または骨格筋細胞中のヘモグロビン生成に影響を及ぼす保護物質を同定するためのものであって、神経、心筋および／または骨格筋細胞から選ばれる試験細胞と接触させるべき物質と、試験細胞中のヘモグロビン生成に変化をもたらすこととを含むスクリーニング方法により解決される。
【０００８】
本発明に係るスクリーニング方法は、中枢神経系中のα（alfa）-およびβ（beta）-グロビンの分化（differential）調節に関係し、哺乳類ではこれまで知られていない保護原理に基づいている。意外にも、ヒトエリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳において（ｔｇ６およびｔｇ２１株；ルシツカ（Ruschitzka）ら，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 97，11609-13）、メッセンジャーＲＮＡレベルでも、タンパク質レベルでも、ヘモグロビン発現の増加がみられたことが見出された。その実施例に記載された結果は、トランスジェニック動物の脳中、ヘモグロビンのためのメッセンジャーＲＮＡはおよそ３〜４の係数で、ヘモグロビンタンパク質はおよそ２〜３の係数で誘発されることを示している。これまで、脳中ヘモグロビンの調節および誘発を、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルについて、言及するものはなかった。
【０００９】
“保護物質”の用語は、in vitro（細胞培養系における）および／またはin vivo（脳卒中モデル、筋萎縮性側索硬化症モデルまたはパーキンソン病モデルなどの虚血性、 低酸素および／または神経変性疾患の動物モデルにおける）および／またはヒトにおける、細胞および／または全体としての個々の器官（たとえば脳または心臓）に対し、保護効果をもつ物質を示す。この物質は、有害事項の前または後に適用することができる。
【００１０】
保護効果の試験としては、たとえば、培養した試験細胞を用いるin-vitro試験であり、該細胞が、たとえば低酸素の治療、Ｈ２Ｏ２、グルタミン酸塩、ＭＰＰまたは他の有害物質を用いる治療などの有害病毒にさらされる。保護物質の標準的なin-vitro 試験は、リンドル（Lindl），2000，ツェル  ウント  ゲヴェーベクルツール（Zell- und Gewebekultur）（細胞および組織培養），Spektrum Akad. Vlg.，ハイデルベルク（Heidelberg），およびシノール（Sinor）および グレーンベルク（Greenberg），2000，Neurosci. Lett. 290，213-215））に記載されるように、細胞の生存または細胞死を調べる細胞の生存能力試験であり、また他の試験としては、発現−アポトーシス（apoptotic）マーカーに関する研究 （サイレン（Siren）ら，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. 米国98，4044-4049）または神経保護効果の測定として梗塞容積における低減の定義（ブラインズ（Brines）ら，2000，loc. cit.）が挙げられる。
【００１１】
試験はin vivoで実施することもでき、たとえばマウスを試験されるべき物質で処置した後、たとえば脳卒中または心筋梗塞モデルにおける損傷にさらす。脳卒中モデルでは、たとえば梗塞容積の縮小によって保護効果を決定することができる。同様なことを、心筋梗塞モデルについても行う（ブラインズ（Brines）ら，2000，loc. cit.参照）。
【００１２】
“神経（neuronal）（試験）細胞”の用語は、ニューロン由来の細胞またはニューロン様の成長および分化挙動を示す細胞、すなわち、自然発生する神経細胞の本質的な性質をもつ細胞またはニューロン特性をもつ細胞から誘導される細胞、たとえばＰＣ１２細胞もしくは神経芽細胞腫細胞などに使用される。
【００１３】
“心筋（試験）細胞”の用語は、心筋由来の細胞または心筋細胞様の成長および分化挙動を示す細胞、すなわち、本質的に、自然発生する心筋細胞の性質をもつ細胞または心筋細胞性特性をもつ細胞から誘導される細胞、たとえばＨ９ｃ２（２-１）などに使用される。
【００１４】
“骨格筋（試験）細胞”の用語は、骨格筋由来の細胞または骨格筋細胞様の成長および分化挙動を示す細胞、すなわち、本質的に、自然発生する骨格筋細胞の性質をもつ細胞または骨格筋細胞性特性をもつ細胞から誘導される細胞、たとえばＳＣ-７１もしくはＬ６などに使用される。
【００１５】
“ヘモグロビン生成の変化（changed haemoglobin formation）”の用語は、試験細胞中のグロビンＲＮＡおよびヘモグロビンタンパク質レベルの量的な増加または減少をいい、それによる未処理のコントロール細胞との相対的な差異は、５％の有意水準を必要とする。
【００１６】
神経、心筋および／または骨格筋細胞における、保護効果に関連するヘモグロビンの調節は、ヘモグロビンの高度または低度の調節を介して、たとえば虚血などの有害な影響下、神経、心筋および／または骨格筋細胞の保護をもたらす物質を検出するための治療目的のために利用することができる。このような神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成に変化をもたらす保護物質の同定のためのスクリーニングシステムの基本構造は、１）ヘモグロビン誘導の刺激に反応する細胞； ２）物質バンクから試験される各種物質に加えるユニット； および３）グロビンＲＮＡまたはヘモグロビンタンパク質の検出方法、からなる。
【００１７】
本発明に係るスクリーニングシステムでは、ヘモグロビン生成に対する抑制または活性化効果をもつ物質のために、化学ライブラリがくまなく検索されるであろう。そのような物質の同定は、ヘモグロビンに関連した保護に特に影響を及ぼす新しい医薬品の同定を指向する上での第１段階であることを意味する。
【００１８】
ヘモグロビンの検出には、さまざまな方法が考えられる。原則として、検出はＲＮＡまたはタンパク質レベルで実施することができる。本発明の一態様において、ヘモグロビン生成の変化の検出は、少なくとも１のグロビンＲＮＡ、好ましくはαグロビンおよび／またはβグロビンＲＮＡの検出を介して実施することができる。本発明の用語における、“グロビン”の用語は、たとえばαグロビン、βグロビンおよび胎児性ヘモグロビンサブユニットε（epsilon）、ζ（zeta）、η（eta）およびδ（delta）を含むグロビンファミリー中のタンパク質に使用される（グロスフェルト（Grosveld）ら，1993，Baillieres Clin. Haematol. 6，31-55）。グロビンファミリーのメンバー総覧は、バムスター（Bumester）らによって、ネイチャー（Nature）407，520-23（2000）に示されている。
【００１９】
ＲＮＡは、原則的に逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応を介して検出することができ、たとえばＳＹＢＲグリーン（Green）を用いる定量化可能なＰＣＲサイクラーを用いて検出することができる。これは、試験する物質を神経、心筋または骨格筋細胞、たとえばＰＣ１２細胞、誘導した神経芽細胞腫細胞または初代ニューロンに添加後、９６または３８４ウェルのスケールで行うことができる。グロビンＲＮＡの相対定量化は、サイクロフィリン（cyclophilin）またはＳ２６などの基準遺伝子との比較において実施することができる。同様に、検出は、好適なプローブを用いるハイブリダイゼーション法、たとえばドットブロットハイブリダイゼーションを用いて実施することができる。
【００２０】
タンパク質の検出は、たとえば、極少量のヘモグロビンタンパク質を検出することができる特殊なタンパク質マイクロチップ（たとえばジオミックス（Zyomyx）社（米国カリフォルニア州ヘイワード）製マイクロチップ）を用い、場合によってはマイクロキャピラリ電気泳動を用いて実施することができる。タンパク質の検出には、ヘモグロビン特有の検出性、たとえば2,7ジアミノフルオレン（ＤＡＦ）を用いる染色または高速シアンメトヘモグロビン法を用いる染色を利用することもできる。ヘモグロビンの検出は、光度測定法を用い、初期細胞ライセートにおいて高流速で実施することもできる。
【００２１】
神経、心筋および／または骨格筋細胞におけるヘモグロビン生成の変化を直接検出するための別の方法は、リポーター遺伝子とともに、刺激に対するグロビン調節の必須成分を包含する構築の使用であってもよい。他の態様において、本発明に係るスクリーニング方法は、試験する物質を、少なくとも１のグロビン遺伝子の調節エレメントの機能制御下にリポーター遺伝子を包含する神経、心筋または骨格筋細胞から選ばれる試験細胞と接触させる工程、および試験細胞中のリポーター遺伝子産物を検出する工程を含む。
【００２２】
上記調節エレメントは、プロモーター断片およびエンハンサーエレメントであればよく、それはグロビン遺伝子の５'または３'領域またはそのイントロン中に存在してもよい。これら調節エレメントは、タンパク質生成の変化の測定を可能にするリポーター遺伝子の少なくとも１つに連結される。好ましくは、これは、膨大な数の試験物質の高速測定を可能にする簡易な測定方法（比色測定、発光測定、蛍光系または放射活性）を含む（たとえばベーム（Bohm），クレーベ（Klebe），クビニュイ（Kubinyi），1996，ヴィルクストッフデザイン（Wirkstoffdesign）（物質設計），スペクツラム−フェアラーク（Spektrum-Verlag），ハイデルベルク）参照）。好ましいリポーター遺伝子は、たとえばルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ（好ましくは分泌されたアルカリフォスファターゼ）、β-ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰまたは当業者になじみ深い同様なリポーター遺伝子である。このような構築は、好ましくは、ニューロン様、心筋細胞様または骨格筋様の性質をもつ細胞、たとえば神経芽細胞腫細胞またはＰＣ１２細胞中に発現される。
【００２３】
本発明の目的は、さらに、少なくとも１のグロビン遺伝子の調節エレメントの機能制御下にリポーター遺伝子を包含する組換え構築、ならびに宿主細胞および本発明に係る組換え構築を包含するトランスジェニック非ヒト動物である。神経、心筋および／または骨格筋細胞との接触においてヘモグロビン生成に影響を及ぼし、すなわち増加または減少させ、かつ本発明に係る方法で同定しうる物質もまた本発明に含まれる。エリスロポエチンは本発明に含まれない。
【００２４】
ニューロンにおけるヘモグロビン生成の量が保護効果に関与するという本発明のベースを形成する実施は、ヒト疾患、特には神経系疾患または心筋性虚血の診断および／または治療のために使用することができる。そのため、本発明のさらなる目的は神経変成のおよび／または虚血性の疾患の鑑別診断のための診断方法であり、これは、神経、心筋および／または骨格筋細胞を包含する生物学的検体中、たとえば液状状態（liquor）でのヘモグロビン生成の変化の検出工程を含む。
【００２５】
この診断方法の一態様において、生物学的検体中のヘモグロビン生成の変化の検出は下記工程を含む：ａ）生物学的検体を、少なくとも１のグロビンＲＮＡの増幅用プライマーとして好適な既知量のオリゴヌクレオチドとともに培養、ｂ）特定のハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅を介したグロビンＲＮＡの検出、ｃ）ハイブリッド化するグロビンＲＮＡまたはＰＣＲ増幅を介して得られた核酸の量と、定量標準との比較。検出は、ヘモグロビンタンパク質の量に基づいて実施することもできる。このタイプの診断方法は、たとえば下記の工程を含む：ａ）生物学的検体を、グロビンに特異的に標的される抗体とともに培養、ｂ）その抗体／抗原コンプレックスを検出、ｃ）これら抗体／抗原コンプレックスの数量と、定量標準との比較。同様に、確立された生物学的検出方法を用いてヘモグロビンを測定することも可能である。通常、健康な生物由来の生物学的検体を標準とする。
【００２６】
上記診断方法は、グロビン遺伝子の性質を、脳虚血などの特定の病態生理学的刺激後のグロビンのｍＲＮＡ量の調節、たとえば増加に利用する。これは、たとえば、病気（たとえば脳卒中）の進行評価、治癒の評価または病気の快復において用いることができる。
【００２７】
本発明に係る診断方法は、神経系疾患および／または慢性もしくは急性の虚血および／または低酸素状態が起こり得るかもしくは包含される疾患、特に脳卒中、心筋梗塞後の広範な低酸素症または脳内手術中酸素欠乏症の鑑別診断に好適である。本発明に係る診断方法により診断することができるさらなる疾患としては、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、遺伝変性運動失調症、ハンチントン舞踏病、神経障害または癇癪、慢性もしくは急性の虚血および／または低酸素症血中酸素減少状態が起こり得るかもしくは包含される疾患などの神経系疾患であり、たとえば心筋梗塞、心不全、心筋症、心筋炎、心膜炎、心筋周膜炎（perimyocarditis）、冠状動脈性心臓病、左−右脈路シャントをもつ先天性異常（vitia）、ファロー四徴症／五徴症、アイゼンメンゲル症候群、ショック、抹消の虚血、動脈閉塞性疾患（ＡＯＤ）、抹消ＡＯＤ（ｐＡＯＤ）、頚動脈狭窄、腎動脈狭窄、脳における微小循環器障害（細動脈硬化）、脳内出血、脳の静脈血栓および頭蓋内静脈洞血栓症、 血管異形成、くも膜下出血、血管性痴呆、ビスヴァンガー（Biswanger）症、皮質下動脈硬化性脳症、塞栓症を伴う多発皮質梗塞、血管炎、糖尿病性網膜症、さまざまな原因による貧血（anaemia）の予後（たとえば、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、真性赤血球増加症、巨赤芽球性貧血、鉄欠乏性貧血、腎性貧血、球状赤血球症（sｐＨaerocytosis）、溶血性（haemolytic）貧血、サラセミア（thalassaemia）、異常ヘモグロビン症、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症、輸血罹患、アカゲザル（Rhesus）不適合性、マラリア、弁膜形成（valvuloplasty）、急性出血後貧血、脾機能亢進症候群、肺線維症、気腫、肺水腫（oedema）： ＡＲＤＳ、ＩＲＤＳまたは再発性肺気腫である。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、神経変性および／または虚血性疾患の治療方法の提供である。この目的は、ヘモグロビン、グロビンまたはムテインまたはそれらの融合タンパク質の使用により解決される。本発明の意図する意味では、用語“融合タンパク質”は、２またはそれ以上のタンパク質の融合だけでなく、タンパク質と１またはそれ以上のペプチド、たとえば、tat配列との融合も含む。好ましい態様において、上記融合タンパク質は、神経、心筋および／または骨格筋細胞によるヘモグロビンおよび／またはグロビンの吸収を促進する、ヘモグロビンまたはグロビンと組み合わされた成分を含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、哺乳類における、たとえばヒトにおける神経変性および／または虚血性疾患遺伝子治療のための、少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする核酸の使用からなる。ここで、遺伝子治療は、グロビン配列またはその一部を体内に誘導する治療またはヘモグロビン生成に影響を及ぼす治療のすべての形態を含む。このためには、オリゴヌクレオチド、たとえばアンチセンスまたはハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またどのような修飾物も、グロビン配列の一部を含有すれば使用することができる。グロビン配列またはその一部を含有するウィルス構築を、グロビン配列またはその一部を含有する未修飾ＤＮＡとともに使用することもできる。
【００３０】
使用される核酸配列は、好ましくは少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードするが、非相同の調節エレメントの機能制御下にある。この遺伝子調節エレメントは、哺乳類系たとえば哺乳類細胞由来の細胞培養における使用が好適である。神経、心筋および／または骨格筋細胞および細胞株は、特に好ましい。核酸配列と、転写および翻訳シグナルなどの遺伝子調節エレメントとの機能的連結は、所望用途にもよるが、遺伝子発現を増大または低減させることができる。この方法で産生される組換え核酸構築は、その後、形質転移宿主生物に使用される。
【００３１】
このような新規な調節配列に加え、実際の構造遺伝子元来の調節が依然として存在していてもよく、場合によっては、その元来の調節がスイッチオフされて、遺伝子の発現が増大されるように遺伝子学的に修飾されていてもよい。遺伝子構築は、よりシンプルな構造で構成されてもよい、すなわち付加的な調節シグナルを配列の前に導入することなく、それを調節する元来のプロモーターを除去しない。その代わりに、もはや調節がまったく行われなくなるように、上記元来の調節配列を突然変異させ、遺伝子発現を増大させる。付加的な調節エレメントは、核酸配列の３'末端に導入することもできる。上記少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質のための核酸配列は、遺伝子構築中の１または複数の複製物中に含有されていても、別々の遺伝子構築中に位置していてもよい。本発明に係る方法に有利な調節配列は、たとえば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laciq、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、gal、trc、ara、ＳＰ６、Ｉ-ＰＲまたはＩ-ＰＬプロモーターなどのグラム陰性菌に都合よく使用されるプロモーター中に含有されている。さらに有利な調節配列は、たとえばamyおよびＳＰＯ２などのグラム陰性プロモーター中、ＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ-６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨなどの酵母プロモーター中、またはＣａＭ-キナーゼII（Kinasell）、ＣＭＶ、ネスチン（Nestin）、Ｌ７、ＢＤＮＦ、ＮＦ、ＭＢＰ、ＮＳＥ、βグロビン、ＧＦＡＰ、ＧＡＰ４３、チロシンヒドロキシラーゼ、カイニン酸受容体またはサブユニット１、グルタミン酸受容体またはサブユニットＢなどの哺乳類プロモーター中に含有されている。基本的に、上記したうようなそれ自体の調節配列をもつ天然プロモータのすべてのを使用することができる。また、合成プロモーターも都合よく使用することができる。
【００３２】
これらの調節配列は、核酸配列の標的した発現およびタンパク質産生を可能にすることを意図する。このことは、たとえば、宿主生物によって、遺伝子が、単に、誘発後に発現されるかまたは過剰発現されるか、あるいはそれが直ちに発現および／または過剰発現されるかを意味するといえる。上記調節配列または因子は、好ましくは正の影響をし、それにより増大発現することができる。このようにして、使用されるプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの強い転写シグナルにより、転写レベルでの調節エレメントの増強が起こり得る。しかしながら、加えて、そのｍＲＮＡの安定性などの改良により、翻訳の増強も可能である。上記用語“エンハンサー”は、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの改善された相互作用を介して、増大化した発現を生み出すＤＮＡ配列の意味に使用される。さらなる調節配列として、“遺伝子座制御領域”、“サイレンサー”またはそれらの配列の一部は、実施例として説明することができる。これらの配列は、組織特異的な発現のために有利に使用し得る。
【００３３】
本発明は、非相同の調節エレメントの機能制御下、少なくとも１のグロビンまたは１のムテインまたはそれらの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子治療の構築も提供する。好ましい態様は、核酸配列とプロモーターとを連結し、それによりプロモーターが５'“上流”に存在する想定である。３'-位の終結部位またはポリアデニル化シグナルまたはエンハンサーなどのさらなる調節シグナルを、上記核酸構築において、機能的に使用することもできる。上記用語“遺伝子治療の構築”は、遺伝子治療に適した完全なベクター構築の意味にも使用される。このようなベクター構築またはベクターは、適当な宿主生物中での発現のために使用される。本発明に係る遺伝子治療の構築は、選択した宿主中での遺伝子の最適な発現をもたらす宿主特異的ベクター中に含ませることもできる。当業者は、ベクターについて周知であり、また、たとえば書籍“クローニングベクター（Cloning vectors）”（刊行物；パウエルズ（Pouwels）P.H.ら，エルゼビア（Elsevier），アムステルダム−ニューヨーク−オックスフォード，1985）を引用して実施することができる。用語“ベクター”は、プラスミドだけでなく、ファージ、 ウィルスたとえばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウィルス、アデノウィルス、シンドビスウィルス、トランスポゾン、ＩＳ エレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状または環状ＤＮＡなどの当業者に知られている全ての他のベクターを含む。これらベクターは、宿主生物中で自己複製するか、または染色体的に複製することができる。線状ＤＮＡは、好ましくは哺乳類への共適応のために使用される。
【００３４】
本発明に係る構築中に包含される核酸配列の発現を増大させるため、多数の遺伝子複製物を、たとえば増加するか、および／または、遺伝子発現に明確に影響を及ぼす調節因子を強化することができる。調節エレメントの強化は、プロモーターおよびエンハンサーなどの強い転写シグナルの使用を介して転写レベルで行われることが好ましい。しかしながら、さらに、たとえば、ｍＲＮＡの安定性を改善するか、またはこのｍＲＮＡのリボソームにおける読取り効率を上げることによる、翻訳の強化も可能である。遺伝子複製数を増加させるため、核酸配列または相同遺伝子を、たとえば、核酸断片中に、または好ましくは当該遺伝子に付与された調節遺伝子配列を含有するベクターまたは同様の効果のプロモーター活性を有するベクターに中に導入することができる。特に、遺伝子発現を高めるような調節配列が使用される。さらに、本発明に係る遺伝子治療の構築は、治療または診断に適した断片の形態において発現することもできる。組換えタンパク質を産生するため、核酸または核酸構築を所定のヌクレオチド配列により伸長し、これにより、簡素化クリーニングのための変化したポリペプチドをコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することができる。ヘキサヒスチジン・アンカーは、たとえばこのタイプの“タグ”として文献公知であるが、さまざまな抗体の抗原として認識され得るエピトープである（スタディア（Studier）ら，Meth. Enzymol.，185，1990：60-89およびオウサベル（Ausubel）ら（編集），1998，分子生物学における最近のプロトコル（Current protocols in Molecular Biology），ジョン  ウィリー  アンド  サンズ（John Wiley & Sons），ニューヨーク）。
【００３５】
本発明は、本発明に係る遺伝子治療の構築を包含する宿主細胞も提供する。トランスフェクトされた細胞株およびトランスフェクトされた幹細胞、特に胚性および成体幹細胞を細胞の遺伝子治療方法（たとえば移植）のために使用することが好ましい。しかしながら、基本的に、すべての生物が、本発明に係る構築に包含される核酸配列を発現させる宿主細胞として好ましい。宿主生物は、たとえば、バクテリア、真菌、酵母、植物または動物細胞などであると理解される。好ましい生物は、大腸菌、ストレプトミセス、バチルスまたはシュードモナスなどのバクテリア、サッカロマイセス・セルヴィシエ、アスペルギルスなどの真核微生物、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９またはＣＨＯ細胞なｄのヒトまたは動物由来の高等真核生物細胞である。宿主生物と、該生物に適したプラスミド、ウィルスまたはファージなどのベクターとの組あわせ、たとえばプラスミドとＲＮＡポリメラーゼ ／プロモーター系、ファージＩ、Ｍｕまたは他の調節された（temperent）ファージまたはトランスポゾンおよび／またはさらなる有利な調節配列は、発現系を形成する。上記用語“発現系”は、たとえば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞とpｃＤＮＡ３neoベクターなどのベクター、またはＨＥＫ２９３細胞とＣＭＶベクターとの哺乳類細胞に適した組み合わせであることが理解される。
【００３６】
また、本発明に係る遺伝子治療の構築を包含するトランスジェニック非ヒト動物も本発明により提供される。これら動物は、無処理動物（すなわちトランスフェクトされていない動物）とは異なるヘモグロビン量をニューロン的に発現することを実効するために遺伝子学的に修飾されている。これには、たとえばマウス、ラット、ヒツジ、ウシまたはブタなどを含む。そのニューロンヘモグロビンまたはその一部が欠損しているかまたは修飾されていることを実効するものとして遺伝子学的に修飾されているトランスジェニック動物も考慮に入れることができる。トランスジェニック生物は、“ノックアウト”動物と称されるものであってもよい。トランスジェニック動物は、機能的または非機能的な本発明に係る遺伝子治療の構築を、単独でまたはグロビンをコードする機能的または非機能的な配列との組合わせで包含することができる。
さらなる態様は、その胚細胞または体細胞の全体または一部において、またはその胚細胞と体細胞の全体または一部において、本発明に係る遺伝子治療の構築が遺伝子学的方法により修飾されているか、または ＤＮＡ成分の挿入により阻害されているトランスジェニック動物に基づいている。グロビンをコードするヌクレオチド配列またはその一部のさらなる利用可能性としては、トランスジェニックまたは“ノックアウト”または条件付きまたは領域特異的“ノックアウト”動物または遺伝子学的に修飾した動物における特異的な突然変異の作製である（Ausubelら（著者）1998，Current protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，ニューヨークおよびトーレ（Torres）ら，（著者）1997，条件付き遺伝子ターゲッティングのための実験プロトコル（Laboratory protocols for  conditional targeting），オクスフォード大学出版（Oxford University Press），オクスフォード）。胚性幹細胞において、相同組換えを介してトランスジェニック過剰発現または遺伝子学的突然変異（ヌル変異または特異的欠失、挿入または修飾）を用いれば、本発明に係る構築の（病理−）生理学上価値のあるさらなる情報をもたらす動物モデルを作製することが可能である。この方法で作製される動物モデルを、新規な治療薬を評価する、特に保護物質を試験するための基本的な試験システムとして提示することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下の図面および実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【００３８】
実施例１：エリスロポエチン（erythropoetin）で調節された遺伝子としてのニューロンのαおよびβグロビンの同定
ヒトエリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニック・ポリグロブリン性マウスを、記載（ｔｇ６およびｔｇ２１株； ルシーツカ（Ruschitzka）ら，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 97，11609-13；ヴァンガー（Wagner）ら，2001，Blood 97，536-42；ヴィースナー（Wiessner）ら，2001，J. Cereb. Blood Flow Metab. 21，857-64）に準じて作製した。Ｃ５７ＢＬ６野生型同胞動物をコントロールとして使用した。
【００３９】
上記マウスは、当業者に周知の方法を用いる組換え構築により作製した。この構築は、特にニューロン細胞における組換えＥＰＯを発現させるＰＤＧＦプロモーター（ササハラ（Sasahara）ら，1991，細胞６４，217-27）およびエリスロポエチンをコードする配列からなる。いくつかのトランスジェニック株を発生させ、それのｔｇ６およびｔｇ２１を試験した。血清の研究により証明されたＥＰＯ発現の体系的な増大を示したのは、ｔｇ６のみであった（Ruschitzkaら，2000，loc. cit.）。ｔｇ２１株は、対系的なＥＰＯレベルの上昇を示さなかった。
【００４０】
マウスにおけるｔｇ６株において、ＥＰＯの増加した体系的発現は、赤血球生成の明確な増加をもたらし、結果として、ヘマトクリット０.８までのポリグロブリ（polyglobuly）および血液量の明らかな増加（４.０ｍＬまで）をもたらす。in vivoの研究で、このｔｇ６ 株における脳代謝（脳のグルコース利用）の全体的な増加が示された。その原因は、普通に高まったニューロンの活性または慢性低酸素症かもしれない。普通に高まったニューロン活性の徴候、たとえば痙攣発作または高度の自発運動などは見当たらない。そのため、上記結果は慢性低酸素症を示唆した。このようなマウスにおける概して低めの脳血流も同じ方向性を指摘する：低下した脳血流もまた組織の酸素欠乏を引き起こす（フリーツシュ（Frietsch）ら，2001，ＪＣＢＦ２１，Suppl.１，p.17）。反してｔｇ２１株は、注目すべき表現特徴をなにも示さない。
【００４１】
脳を取除くため、マウスを０.８％イソフラン、７０％Ｎ２Ｏおよび２９％酸素で麻酔した。試験中検出されるヘモグロビンが血液由来のおそれの可能性を除外するために、試験動物は、冷塩水で潅流して、血管から血液を洗出した。
【００４２】
エリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳は、経心臓（transcardial）潅流および液体窒素中急速冷凍（shock-frozen）麻酔下で除去した。コムシンスキー（Chomczynski）および サッキ（Sacchi）の方法（1987； Anal. Biochem. 162，156-159）を用いてＲＮＡを得た。その後、２トランスジェニックおよび２リターメイトコントロールのハイブリダイゼーション実験をマウスｃＤＮＡアレイ（“Chip”）において実施した（図１）。このハイブリダイゼーション実験は、一連の高度に調節された配列を産生した。１の配列は、株ｔｇ６および株ｔｇ２１の両方の動物において高度に調節されているとみられ、突出していた。この配列は、パブリックデータベースの検索により、αグロビンであると同定された。
【００４３】
実施例２：エリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳中の増加したヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡの検出
ヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡの測定には、ライトサイクラー（LightCycler）（ロシュ（Roche），マンハイム，ドイツ）半定量ＲＴ-ＰＣＲを使用した。定量は 、サイクロフィリンの検量線を用いて、検体の相対的な蛍光を比較することにより行った。
【００４４】
ＲＮeasy抽出キットを用いて、該製品（キアゲン（Qiagen），サンタクラリタ，カリフォルニア州，米国）の使用説明書に従い、全ＲＮＡをマウスの脳から分離した。該ＲＮＡ濃度を光度測定法により測定し、全ＲＮＡの品質をアガロースゲル電気泳動により分析した。上記ＲＮＡは、使用するまで−８０°に保った。
【００４５】
スーパースクリプト（Superscript）II（インビトロジェン-ライフテクノロジーズ（Invitrogen-Life Technologies），カールズバッド，カリフォルニア州，米国）を用いて逆転写後、ライトサイクラー技術を用いる反応生成物をリアルタイムオンラインＰＣＲにより相対的に定量した。
このために、３匹の野生型マウスおよび３匹のトランスジェニックマウス由来の全ＲＮＡ検体を使用した。
サイクロフィリンのためのアニーリング温度６０℃でのオリゴヌクレオチドプライマー特有の配列は、
前進（forward）プライマーが、
５'-ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-３'
復帰（reverse）プライマーが、
５'-CATTTGCCATGGACAAGATG-３'
および
ヘモグロビンαのためのアニーリング温度５５℃でのオリゴヌクレオチドプライマー特有の配列は、
forward プライマーが、
５'-GGTGCCCTGTCTGCTCTG-３'
reverseプライマーが、
５'-GGCAGCTTAACGGTACTTGG-３'
であった。
【００４６】
定量化のため、以下のスキームに従って、１：３、１：９、１：２７、１：８１および１：２４３の順次ｃＤＮＡ希釈液を増幅した：９４℃で５分間の初期変性、９４℃での５秒間（ｓ）変性の５０サイクルを超える増幅、５５℃ または６０℃−所定プライマー（上記参照）に応じて−での１０秒間のアニーリング、その後７２℃での３０秒間の伸長。各サイクルの終わりに、各検体の蛍光を８０℃ で１０秒間で測定した。反応生成物の特異性は、アガロースゲル電気泳動（図２）および溶融曲線分析（図示せず）により分析した。ＰＣＲ各反応は、各１つの反応生成物を生成した。
【００４７】
定量化のため、ＰＣＲ反応の対数期を使用した。対応する曲線範囲で漸近線を作成した。ヘモグロビンでは、直線関係に近いほぼ並行な立上がりを生じたため、これら曲線中の立上がりをサイクロフィリンの標準曲線との比較に使用することができた。標準化ＰＣＲ産物由来のｃＤＮＡ希釈液について平均値±標準偏差を求めた（図８）。トランスジェニック動物および野生型動物におけるＲＮＡ発現の相対的差異に対応するこの方法では、定量的な差異が得られた。全ての反応は、単一の反応生成物（トランスジェニックマウスおよび野生型マウスについての９０℃付近での溶融曲線における単一ピークで示される）をもたらした。ヘモグロビンαについてのインダクション係数は、３.８６±０.１８（ｎ＝３）であった。
【００４８】
実施例３：エリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳中ヘモグロビンタンパク質の増加
半定量的二次元ゲル電気泳動により、トランスジェニックｔｇ６マウス６匹および野生型マウス６匹の脳におけるヘモグロビンαおよびヘモグロビンβ発現の変化を測定した。
【００４９】
二次元ゲル電気泳動のため、脳組織を、４０mmol/Ｌのtris、７mol/Ｌの尿素、２mol/Ｌのチオ尿素、４％(w/v)ＣＨＡＰＳ、１０mmol/ＬのＤＴＴおよび１mmol/ＬのＥＤＴＡからなる検体バッファ２ｍＬ中でホモジェナイズした後、１００,０００×ｇで４５分間遠心処理した。検体のタンパク質をブラッドフォード（Bradford）法（Bradford，1976，Anal. Biochem. 72，248-254）にしたがって分析した。
【００５０】
二次元ゲル電気泳動は、標準プロトコル（ゲルク（Gorg）ら，2000，電気泳動21，1037-1053）にしたがって行った。５００μｇの検体を、非線形ｐＨ３-１０勾配ＩＥＦゲルストリップに基づく等電点電気泳動法に供した（アマルシャムバイオサイエンス（Amersham Bioscience），フライブルク，ドイツ）。６時間（ｈ）のスウェリング後、３０Ｖを６時間印加し、次いで５００Ｖを１時間さらに１０００Ｖを１時間印加した。この後、電圧を８０００Ｖに上げてそのまま１０時間保持した。これは、等電点電気泳動法のＩＰＧｐＨor ＩＥＦシステムに８１６８０Ｖｈの負荷であった。二次元での分離は、１０％ＳＤＳの存在下、１２.５％ポリアクリルアミドゲル中で行った。水冷式縦型電気泳動チャンバー（ＯＷＬサイエンティフィック（Scientific），ウォバーン，マサチューセッツ州，米国）中、上記ゲル（１８０×２００×１.５ｍｍ３）に、３０ｍＡを３０分間、１００ｍＡ をほぼ４時間流した。タンパク質を目視するため、改変プロトコル（ブラム（Blum）ら，1987，電気泳動８，93-99）に従い、ゲルを硝酸銀で乾燥した。この方法は、物質マススペクトル法と相性がよい。
【００５１】
その後、上記ゲルをスキャンし、イメージを特別なソフトウエアPHoretix ２Ｄ Professional（ノンリニアダイナミックス社（Nonlinear Dynamics Ltd.），ニューカッスル・アポン・タイン，英国）を用いて濃淡測定した。バックグラウンドの補正後、ヘモグロビンαおよびヘモグロビンβの上記タンパク質点を、光学的濃度および容積により測定した。スチューデント（Student）に従うｔ試験を用い、６匹のトランスジェニック動物由来の平均値±標準偏差を、６匹の野生型動物由来のそれらと比較した。有意差限界は、ｐ値＜０.０５とした。上記タンパク質は、マススペクトロメトリ（ＺＭＢＨ，センターオブモレキュラーバイオロジーハイデルベルク（Center of Molecular Biology Heidelberg），ハイデルベルク，ドイツ）で分析した。平均イントロダクション係数は、ヘモグロビンαについては２.６８±０.２９（ｎ＝６）で、ヘモグロビンβについては２.５９±０.３７（ｎ＝６）であった（図４）。
【００５２】
また、高速シアンメトヘモグロビン方法（ファン・カンペン（van Kampen）および ザイルストラ（Zijlstra），1961，Clin. Chim. Acta，538-544）を用いて、６匹のトランスジェニックｔｇ６マウスおよび６匹の野生型マウスの脳における全ヘモグロビン濃度を測定した。これには、対応する脳のホモジェネート検体２０μＬを、ヘキサシアノ鉄酸カリウム２００ｍｇ/Ｌ、シアン化カリウム５０ｍｇ/Ｌ、二水素リン酸カリウム１４０ｍｇ/Ｌおよび０.０５％（v/v）Triton X-100からなる形質転換溶液５ｍＬに添加し、室温で少なくとも５分間培養した。５４６ｎｍにおける消光を測定し、３６.７を乗じてｇ/ｄＬ濃度を得た。この濃度は、トランスジェニック群については、０.０２９±０.０１２ｍｇ/（ｄＬ脳ホモジェネート）（ｎ＝６）であり、野生型群については、０.０１１±０.００６ｍｇ/（ｄＬ脳ホモジェネート）（ｎ＝６）であった（図５）。
【００５３】
実施例４：エリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡの局在性
ヘモグロビンαメッセンジャーＲＮＡの発現場所は、ジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチドを用いるハイブリッド形成法（in-situ hybridisation）により可視化した。アルカリフォスファターゼが結合した抗ジゴキシゲニン抗体を用いる培養を介して、マウス脳冷凍断片における特異的結合を可視化した。
【００５４】
ジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチドプローブ（ウィスデン（Wisden）およびモリス（Morris），1994，脳のためのハイブリッド形成法プロトコル（In situ hybridization protocols for the brain），Academic Press，ロンドン；サンディエゴ）に準じて、ハイブリッド形成法を実施した。このために、１０μｍ厚みの冷凍断片を、氷冷パラホルムアルデヒド中に５分間固定し、１ｘＰＢＳ（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ3、３ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ3）中で５分間洗浄し、７０％エタノール中で５分間脱水した後、９６％（v/v）エタノール中に保存した。ヘモグロビンのためのハイブリダイゼーションプローブは、以下の配列をもち、
５'-CTTACATCAAAGTGAGGGAAGTAGGT-３'
この３'末端を、ジゴキシゲニンで標識した（ＭＷＧ-バイオテック（Biotech），エーバースベルク（Ebersberg），ドイツ）。
【００５５】
上記プローブを、５ｇの硫酸デキストランの鉄不含ホルムアミド溶液２５ｍＬ、１０ｍＬの２０ｘＳＳＣ（３Ｍ  ＮａＣｌ、０.３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）およびＲＮaseを含まない滅菌水からなるハイブリダイゼーションバッファに希釈して５０ｍＬとした。これにより、断片あたり３０ｎｇプローブの最終濃度となった。ハイブリダイゼーションは、４ｘＳＳＣにおいてホルムアミド１：１の湿度を保持しながら培養室内の水浴中４２℃で一晩実施した。翌日、断片を、室温（ＲＴ）の１ｘＳＳＣ中で１０分間、６０℃の１ｘＳＳＣ中で３０分間、ＲＴの１ｘＳＳＣ中で１分間、ＲＴ）の０.１ｘＳＳＣ中で１分間洗浄した。
【００５６】
その後、上記断片を、検出・洗浄バッファ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  tris-ＨＣｌ、ｐＨ７.５）中で培養した後、非特異的抗体結合を、０.１％（v/v）Triton X-100を含む検出・洗浄バッファ中、２％（v/v）無処理ヒツジ血清で３０分間ブロックした。この後、断片を抗ジゴキシゲニン抗体溶液（ロッシュ（Roche），マンハイム，ドイツ，１：２００ブロック溶液中）中で４時間培養した。断片を、検出・洗浄バッファ中１０分間２回洗浄した後、基質バッファ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ tris-ＨＣｌ、ｐＨ９.５）中に１０分間浸漬してｐＨ値を比べた。呈色反応は、ＢＣＩＰ/ＮＢＴを用い、充分呈色するまで２〜２４時間進行させた。該反応は、１０ｍＭ tris-ＨＣｌ、ｐＨ８.１ｍＭ  ＥＤＴＡで停止し、断片を光学顕微鏡の標本包埋化した。対照実験として、オリゴヌクレオチドが共存しないか、または抗体が共存させずに、上記断片を培養した。
【００５７】
結合した抗体は、試験動物の海馬および小脳中の基質として、ＢＣＩＰ/ＮＢＴで着色したシグナルを産生し、それによるところのトランスジェニック動物におけるシグナルは野生型動物におけるよりも強かった。オリゴヌクレオチドが共存しないか、または抗体が共存しない対照実験は、標準のバックグラウンド色を示した（図６）。小脳の顆粒層中、歯状回中、海馬の全領域中、手綱溝およびそれらの交連部中に顕著な発現がみられた。さらに、ニューロンの発現に適合する皮質、線条体および視床中に分配された、弱いシグナルがみられた。脳梁および白質の他の領域中には、シグナルはなかった。
【００５８】
実施例５：エリスロポエチンを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるヘモグロビンタンパク質の局在性
ヘモグロビンタンパク質は、2.7ジアミノフルオレン（ＤＡＦ）を用いる冷凍片の染色により、暗視野顕微鏡において可視化した。ＤＡＦ染色のためのプロトコルは、１０μｍの冷凍片を使用することができる（ワージントン（Worthington）ら，1987，Exp. Hematol.15，85-92）。断片は、氷冷アセトン中２分間固定し、空気乾燥した。０.２％ Tween-20を含む２００ｍＭ tris-ＨＣｌ，ｐＨ７.０中で３回洗浄することにより細胞膜を浸透性とした後、１％（w/v）ＤＡＦの９０％酢酸溶液１００μＬ、３０％（w/v）Ｈ2Ｏ2１００μＬおよび２００ｍＭのtris-ＨＣｌ  １０ｍＬのｐＨ７.０混合液中、断片を室温で１５分間培養した。その後、断片を暗視野顕微鏡で分析した。
【００５９】
海馬、大脳皮質および視床の傍室核において、鮮明な染色が現れた（図７）。ヘモグロビンタンパク質の発現場所は、ヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡの発現場所と関連していた。野生型動物の海馬のＤＡＦ-染色断片（Ａ）およびトランスジェニック動物の海馬のＤＡＦ-染色断片（Ｂ）（図８）は、後者の方が、明らかに強くかつより特異的なシグナル であった。
【００６０】
染色を最適化するため、ＤＡＦバッファ（１％（w/v）ＤＡＦの９０％ 酢酸溶液、１００μＬの３０％（w/v）Ｈ2Ｏ2 および１０ｍＬの２００ｍＭtris-ＨＣｌ、ｐＨ７.０）中の培養時間を１５分から６０分に長引かせた付加的な実験を行った。図７.１および８.１は、それぞれ、ヘモグロビンの局在性、野生型マウスとＥＰＯ-トランスジェニックマウスとの差異をより明確に示す。
【００６１】
実施例６：エリスロポエチンによるヘモグロビン直接誘導の検出
遺伝子導入のエリスロポエチンを過剰発現するマウスにおけるヘモグロビン発現の誘発は、原則的にエリスロポエチンのさまざまな効果で追跡することができる。マウスの初期成育段階におけるＥＰＯの過剰発現は、ニューロン、たとえば海馬回ニューロンのための変更された成育プログラムによって、ヘモグロビンの本質的な発現増大を導くといえる。また、長期間（月以上）の過剰発現のみが該効果、たとえばより複雑な中間的、間接的な機構を介して生じるともいえる。
ニューロンのヘモグロビン発現におけるＥＰＯの直接的効果を示すため、ラットに腹腔内および脳内にエリスロポエチンを投与し、脳内でのαおよびβグロビンのｍＲＮＡ発現を、投与後６または２４時間の定量的ＰＣＲにより分析した。ここでは、下記の投与を用いた：背部の海馬領域中、１回あたり２５単位（Ｕ）となる５０μＬのＥＰＯ溶液（ＣＡ３亜区領域中での概量）。これはラット４匹に実施した；これらラットのうち２匹を６時間後に屠殺し、２４時間後に２匹を屠殺した。偽（sham）処理した動物も準備した。
【００６２】
ＲＮＡは、脳の脳半球両方から、および右左両方の脳半球の小脳から得た。定位固定デバイス手段により、右脳半球に注射した。注射位置は、エバンスブルー（Evans-Blue）注射を用いて確かめた。腹腔内注射には、５０００ｕ/ｋｇの投与量で投与した；これを、各ケースとも６および２４時間のタイミングで２匹の動物に実施した。時間は、ＥＰＯの直接効果を介したｍＲＮＡ調節の検出可能性を基に選択した。再び、対応の偽注射をした動物を準備した。
【００６３】
上記ＲＮＡを獲得（ChomczynskiおよびSacchi，loc. cit.）後、キアゲンＲＮＡ_easyカラムを用い、その製品使用説明にしたがって精製し、オリゴ-ｄＴプライマーおよびスーパースクリプトII-リバーサートトランスクリプターゼ（SuperscriptII-Reverser transcriptase）を用いてｃＤＮＡを得た後、キアゲンカラムにより精製した（ｃＤＮＡ精製プロトコル）。ライトサイクラーシステム（ロッシュ，マンハイム，ドイツ）を用いて、上記と同様にして、定量的ＰＣＲを実施した。αおよびβグロビンはサイクロフィリンに対比して定量した。使用したプライマーは以下のとおり。
αグロビン：プライマー rm_a_glob_s：５'-GGGAAGATTGGTGGCCATGGTG-３'，Ｔm５９°
プライマー rm_a_glob_a：５'-GGCAAGGAATTTGTCCAGAGAGGC-３'，Ｔm５９°
βグロビン：プライマー rm_b_glob_s：５'-CTGACTGATGCTGAGAAGGCTGCT-３'，Ｔm５９°
プライマー rm_b_glob_a：５'-TCCAGCCACCACCTTCTGGAAG-３'，Ｔm＝５９°
サイクロフィリン：forwardプライマー５'-ACCCCACCGTGTTCTTCGAC-３' および
reverseプライマー５'-CATTTGCCATGGACAAGATG-３'
【００６４】
腹腔内に処理したマウスにおいて、各ケースで、αおよびβグロビンの顕著な、各ケースで２〜４倍の範囲の増加であった（図９および図１０参照）。この結果は、ヘモグロビン発現におけるＥＰＯの効果が少なくともほとんどが表現型成育ではなく、かつ該効果が短時間で有効であり、それ故、おそらく直接的であることを明確に立証している。
【００６５】
実施例７：虚血誘発した遺伝子産物としてのαおよびβグロビンの同定
病巣脳虚血（中大脳動脈閉塞，ＭＣＡＯ）の動物モデルは、ヒト虚血性脳梗塞のモデルの標本となる。病巣脳虚血の誘発には、通称スレッド（thread）モデルを使用し、表面コートしたナイロン糸を内頚動脈を介して中大脳動脈出口まで押挿し、虚血性脳梗塞を誘発した（クラーク（Clark）ら，1997，Neurol. Res. 19，641-648）。
【００６６】
ｃ５７/ｂｌ６マウスに病巣脳虚血を誘発するため（チャールズリバー（Charles-River）ＷＩＧＡ，ズルツフェルト（Sulzfeld），ドイツ）、３ケ月齢マウスを使用した。吸入麻酔 （７０％Ｎ2Ｏ，３０％Ｏ2，０.８〜１％ハロタン）導入後、０.１％のポリ-L-リシンをコートした５〜０プロレン糸（エチコン（Ethicon），ノルダーステット（Norderstedt））を、外頚動脈を介して内頚動脈内に中大脳動脈出口まで押挿した。この糸の正しい位置は、レーザードップラーシグナルを初期シグナルの１０〜２０％まで衰退させて表示した （ペリメッド（Perimed），イェルフェラ（Jarfalla），スエーデン）。この操作と、必要に応じて適切な生理学的パラメータ（血圧、脈拍、血液ガス、血糖）の測定を行った後、マウスを麻酔から覚醒した。所定時間血管閉塞した後、マウスを再度麻酔し、抜糸した。これにより組織の再潅流を生じた。所定時間再潅流した後、頚部を骨折してマウスを屠殺した。直ちに脳を取り出し、ドライアイスで凍結した。この態様では、血管閉塞は９０分実施し、再潅流は２時間、６時間および２０時間実施した。
【００６７】
１）脳からのｍＲＮＡの取り出し、およびヘモグロビンのメッセンジャーＲＮＡの検出
ChomczynskiおよびSacchi（loc. cit.）により提示された方法を適用し、ＲＮＡ精製カラム（ＲＮＡeasy，キアゲン）を用いて、その製品使用説明書に従って、さらなる精製を行った。
【００６８】
脳虚血（ＭＣＡＯモデル）によるｍＲＮＡ調節を定量するため、実施例２に記載された方法を採用したが、ここではβグロビンも分析した。使用したプライマーは、以下の配列をもつ（マウスおよびラットともに同じ）：
αグロビン：プライマー rm_a_glob_s：５'-GGGAAGATTGGTGGCCATGGTG-３'，Ｔm５９°
および      プライマー rm_a_glob_a：５'-GGCAAGGAATTTGTCCAGAGAGGC-３'，Ｔm５９°
βグロビン：プライマー rm_b_glob_s：５'-CTGACTGATGCTGAGAAGGCTGCT-３'，Ｔm＝５９°
プライマー rm_b_glob_a：５'-TCCAGCCACCACCTTCTGGAAG-３'，Ｔm＝５９°
【００６９】
ＭＣＡＯを持ち、２０時間再潅流の動物２匹において、αグロビンのインダクション係数（対側の脳半球に対する虚血性）は、２.４１±０.０７と１.７８±０.２４であった（図１１）。βグロビンのインダクション係数は、１匹の動物で３.５６±０.１２であり、第２の動物では１.９７±０.３７であった（図１２）。偽処理した動物との比較において、評価しうる値であった。
【００７０】
２）ＲＭＤＤ（レストリクション・メディエイテド・ディファレンシャル・ディスプレイ）プロトコルの実施
第１のＤＮＡ鎖（strand）を合成するため２つのug polyＡ-ＲＡを使用する改良を加えて、基本的に、ＥＰ０７４３３６７Ａ２およびＵＳ５８７６９３２に記載された手順を追試した。第１のＤＮＡ鎖合成後、第２のＤＮＡ鎖合成および制限消化を行い、アダプターを用いてアダプターライゲーションを行った。アダプターおよびｃＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、増幅産物を変性ゲルにかけ、ナイロン膜にブロットした（ＧＡＴＣ，コンスタンツ（Konstanz），ドイツ）。ビオチン標識したストリップは、標準ストレプトアビジンペルオキシダーゼ反応を用いて可視化した（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals），マンハイム，ドイツ）。虚血性脳半球と対側脳半球とからのＰＣＲ検体をともに、各ケースごとにゲルに適用した（２４時間ＭＣＡＯ右および左と、９０分ＭＣＡＯ右および左）。左右の脳半球で強度の異なるストリップを切出し、対応するＰＣＲ産物の再増幅を行った。得られた増幅産物は、ＴＯＰＯ  ＴＡベクターｐｃＤＮＡ２.１（インヴィトロゲン（Invitrogen），カールズバッド，カリフォルニア州，米国）中でクローン化し、Ｔ７プライマーおよびＭ１３revプライマー を用いて配列決定した（ＡＢＩ３７００キャピラリー電気泳動シーケンサー，ピーイーアプライドバイオシステムズ（ＰＥApplied Biosystems），フォスターシティ，カリフォルニア州，米国）。得られた配列をＥＭＢＬデータベースと照合した。これは、αおよびβグロビンの配列を示していた（図１３）。
【００７１】
実施例８：エリスロポエチン注射（腹腔内）オン・オフによる脳中の直接的ヘモグロビン誘発の検出
実施例３に次いで、腹腔内にエリスロポエチン（ジャンセン（Janssen）社製エリポ（Erypo））を投与した（５０００単位/ｋｇ体重）マウス脳中のヘモグロビン濃度も分析した。ＥＰＯ注射後、マウスは、２４時間後ロンパン（Rompun）/ケタニスト（Ketanest）を用いて注射して最終的に麻酔し、脳血管系の血液を、４０ｍＬハンクス緩衝塩溶液（Hanks balanced salt solution：ＨＢＳＳ）の経心臓潅流により洗浄した。このために、ホモジェナイドし、４５分間１００,０００×ｇの遠心処理した、４０mmol/Ｌのtris、７mol/Ｌの尿素、２mol/Ｌのチオ尿素、４％（w/v）のＣＨＡＰＳ、１０mmol/ＬのＤＴＴおよび１mmol/ＬのＥＤＴＡからなる検体バッファ２ｍＬ中の脳ホモジェネートを調製した。上記検体のタンパク質含量は、ブラッドフォード（Bradford）法（Bradford，1976，Anal. Biochem. 72，248-254）に準じて分析した。ヘモグロビン濃度は、高速シアンメトヘモグロビン法（ファン・カンペン（van Kampen）およびザイストラ（Zijlstra），1961，Clin. Chim. Acta 6，538-544）を用いて測定した。
【００７２】
次いで、対応する脳ホモジェネート検体２０μＬに、２００ｍｇ/Ｌヘキサシアノ鉄酸カリウム、５０ｍｇ/Ｌシアン化カリウム、１４０ｍｇ/Ｌ二水素リン酸カリウムおよび０.０５％（v/v）Triton X-100からなる形質転換溶液５ｍＬを加え、室温で少なくとも５分培養した。その後、５４６ｎｍにおける消光度を測定し、これに３６.７を乗じてｇ/ｄＬ濃度を得た。これらの値は、タンパク質濃度/脳組織容量に換算したところ、以下の値が得られた（実施例３からの測定したトランスジェニック動物を含む）：対照動物：３２.５４±１７.５１μｇ/ｍｇ脳タンパク質（ｎ＝１０）；ＥＰＯトランスジェニック動物（ｔｇ６株）：７９.００±３２.１２（ｎ＝１３）；ＥＰＯ注射した動物（注射して２４時間後）：７７.１４±１３.５１μｇ/ｍｇ脳タンパク質（ｎ＝３）。対照とＥＰＯ処置した動物またはＥＰＯトランスジェニック動物との間での差異は顕著であった（ＡＮＯＶＡおよび多重比較（post-hoc test））（図１４）。これらのデータは、ＥＰＯ注射のみにより示される神経保護効果は、無傷のヘモグロビンの脳中濃度を測定しうる程度に上昇させることを示している。これは、中枢神経系におけるＥＰＯによるグロビン誘発の機能的な関連性を強く示している。
【００７３】
実施例９：脳におけるエリスロポエチンによるヘム合成に不可欠な酵素の誘発
脳中無傷のヘモグロビンはニューロンにより形成され、エリスロポエチンにより誘発されることを、実施例３、５および８において証明することができた。実施例２、４および６は、ＥＰＯがαおよびβグロビンのためのメッセンジャーＲＮＡの量を直接的に増加させることを証明する。しかしながら、ヘモグロビンは、タンパク質部分αおよびβグロビン（成体中）に加えて、補綴基ヘムを含有する。ヘムはニューロン中に存在し、ヘムオキシゲナーゼにより分解されることがある。
【００７４】
ヘムの合成は既知である。合成は、グリシンおよびスクシニルＣｏＡからδ-アミノレブリン酸への縮合で始まる。この反応工程を触媒する酵素は、δ-アミノレブリン酸合成酵素（ＡＬＡＳ）である。この合成は、一般的に、ヘム合成における律速に大きな影響を及ぼす工程である。次工程において、アミノレブリン酸脱水酵素（ＤＡＬＤＨと略称）とも称されるポルホビリノゲン合成酵素は、δ-アミノレブリン酸２分子からポルホビリノゲン（ＰＢＧ）への縮合を触媒する。
【００７５】
意外にも、ＤＡＬＤＨのためのｍＲＮＡがＤＮＡアレイにおいて誘発を示す（データは示さず）ことを見出した（実施例１参照）。その後、ライトサイクラー（ロッシュ）において、定量ＰＣＲを用いたＤＡＬＤＨおよびＡＬＡＳのための高度な調節を立証した。使用したプライマー配列およびＰＣＲ条件は、以下のとおり。
ＡＬＡＳ用：
alas_m_LC_1s：ACAGACCTGCTGAGCACCATG
alas_m_LC_1as：AGCCAGCTCCTGTTCAAGCTC
（アニーリング温度：６０℃；測定温度：８３℃；４５サイクル）、および
ＤＡＬＤＨ用：
daldh_m_1s：ccaactattgaggctgtccgt、daldh_m_1as：catgagcatgtcagctccttc（アニーリング温度：６０℃；測定温度：８５℃；４５サイクル）
【００７６】
ＤＡＬＤＨは、ｔｇ６株およびｔｇ２１株のＥＰＯ過剰発現する動物、発現の増加：野生型（wt）で１±０.３５、ｔｇ６で２.１８±０.０２、ｔｇ２１で４.０２±０.５５を示した（図１５）。
【００７７】
ＡＬＡＳも、ｔｇ６株およびｔｇ２１株のＥＰＯ過剰発現する動物、発現の増加：野生型（wt）で１±０.０４、ｔｇ６で６.３９±０.６０、ｔｇ２１で１.３３±０.４２を示した（図１６）。
【００７８】
また、ＡＬＡＳについて、ＥＰＯ（５０００単位/ｋｇ体重i.p.）１回限りの投与の注射によって直接的にｍＲＮＡレベルでも誘発され得ることを証明することができた：偽（sham２４ｈ_１）：１.００±０.０８；ＥＰＯ注射した動物１（ＥＰＯ ２４ｈ_１）：１０.０７±０.００；ＥＰＯ注射した動物２（ＥＰＯ ２４ｈ_２）：８.７６±０.１８；ＥＰＯ注射した動物３（ＥＰＯ ２４ｈ_３）：１４.６９±０.２７（図１７）。毎日この投薬量のＥＰＯを７日間投与したところ、インダクション係数の上昇が１３０倍に達した：偽：１±０.６４；ＥＰＯ注射した動物１（ＥＰＯ_１）＝１１.６７±５.４６；ＥＰＯ注射した動物２（ＥＰＯ_２）＝１１８.９３±３１.０２；ＥＰＯ注射した動物３（ＥＰＯ_３）＝４４.８８±１５.１５；ＥＰＯ注射した動物４（ＥＰＯ_４）＝１２９.４７±８.７７（図１８）。
【００７９】
実施例１０： ニューログロビンは、１回のエリスロポエチン注射では誘発されない。
ニューログロビンは、グロビンとの相同性の低いタンパク質であり、また中枢神経系で見出されてもいる（トレント（Trent）ら（2001），ジャーナル  オブ  バイオロジカルケミストリ（Journal of Biological Chemistry），276，30106-10）。しかしながら、グロビンの性質、たとえばより一層酸素親和性である、とは本質的に異なる重要な生物学的特徴をもっている（デューイルド（Dewilde）ら（2001），ジャーナル  オブ  バイオロジカルケミストリ（Journal of Biological Chemistry），276，38949-55）。ニューログロビンは神経保護するが、そのメカニズムはわかっていない（サン（Sun）ら（2001），Proc. Natl. Acad. Sci. 米国，98，15306-11，ヴェニス（Venis）（2001），ランセット（Lancet），358，2055，サン（Sun）ら（2003），Proc. Natl. Acad. Sci. 米国，5，5）。
【００８０】
ニューログロビンがエリスロポエチン搬送型神経保護における役割をおそらく担うかどうかを決定するため、ＥＰＯ投与後のニューログロビンｍＲＮＡの比較含量を、サイクロフィリンとの比較における比較定量ＰＣＲを用いて分析した。５０００単位のＥＰＯ/ｋｇ体重を腹腔内（i.p.）に投与適用し、該動物は、経心臓潅流後、屠殺した。ＲＮＡおよびｃＤＮＡは、標準的な方法を用いて取得した。ｃＤＮＡの順次希釈液（３回順次希釈液）から、サイクロフィリンおよびニューログロビンのレベルを決定し、偽処理動物のニューログロビン/サイクロフィリンの比を１とした。以下に示す値の標準偏差は、それぞれに異なる希釈液での測定値（ｎ＝４）に関し、測定精度を意味する。
【００８１】
使用したプライマーは、ニューログロビン用：ngl_m_LC_1ｓ：gagtcagagctgatccggcag，ngl_m_LC_1as：caggcacttctccagcatgtaであった。サイクロフィリン用プライマー：cyc５，ACC CCA CCG TGT TCT TCG AC；acyc３００，CAT TTG CCA TGG ACA AGA TGであった。
アニーリング温度は６０℃を選択し、ＰＣＲ産物の測定温度は８６℃であり、すべてにおいて４５サイクル実施した。
αおよびβグロビンおよびδ-アミノレブリン酸合成酵素（ＡＬＡＳ）が強く誘発される（αグロビン約１４倍、βグロビン約１０倍、 ＡＬＡＳ約１０倍、上記実施例も参照）と同時に、同じ動物において、ニューログロビン誘発は全く起きないことがわかった（偽：１.１０±０.１５；ＥＰＯ注射した動物１：１.０１±０.１５；ＥＰＯ注射した動物２：０.９９±０.１５；ＥＰＯ注射した動物３：１.０４±０.１３；図１９）。これらデータから、ニューログロビンは、遺伝子発現の影響によって媒介されるエリスロポエチン搬送型神経保護に含まれないと結論づけることができる。
【００８２】
実施例１１：ニューロン細胞（ＰＣ１２細胞）に対する細胞内ヘモグロビンの機能的関与
ブルメルカンプ（Brummelkamp）らの発表（2002）：サイエンス（Science）19（296）：550-3は、特定ターゲット遺伝子のｍＲＮＡを破壊に導くための、短い二重鎖のアンチセンスＲＮＡ分子（siＲＮＡ）の細胞内発現を可能にするベクターを開示する。この方法をニューロン性グロビンの神経保護効果を確実にするために適用することが望ましい。まず、記載（Brummelkampら，2002）にしたがってベクターpSUPERを作成した。その後、Brummelkampら，2002に従い設計したαグロビン特異的ＤＮＡオリゴを合成し（サーモハイバイト（Thermohybaid）/サーモバイオサイエンス社（Thermo Biosciences GmbH）；aGlo1-s：５'-p-GATCCCCTTCCTTGCCTCTGTGAGCATTCAAGA GATGCTCACAGAGGCAAGGAATTTTTGGAAA-３'およびaGlo1-as：５'-p-GCTTTTCCAAAAA TTCCTTGCCTCTGTGAGCATCTCTTGAATGCTCACAGAGGCAAGGAAGGG-３'）、リガーゼ緩衝液中１０μＭの濃度で、温度を徐々に降下しながら（９５℃から４０℃へ１５分かけて）互いをハイブリダイゼーションした。この二重鎖ＤＮＡオリゴマーを、Bglll-Hindlllで二重消化したpSUPER中ライゲートした。この方法で創出された構築はpSaGlo1と称された。
【００８３】
上記構築およびエンプティベクターpSUPERは、各ケースにおいて、αグロビンの発現構築と、ＰＣ１２細胞中の独立遺伝子の発現構築とを互いに一過性トランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、細胞を採取し、トータルＲＮＡをこれら細胞から分離した。siＲＮＡ構築によるαグロビンｍＲＮＡ下流調節の実効性は、ライトサイクラー （ロッシュ・ダイアグノティックス（Roche Diagnostics）,マンハイム，ドイツ）中、定量的ＲＴ-ＰＣＲ法で試験した。トランスフェクション効果の目安は、独立遺伝子のｍＲＮＡレベルとしたが、ＲＴ-ＰＣＲにより測定することもでき、リファレンスとして使用した（使用したプライマー：Rm_a_glob_1s：５'-GGGAAGATTGGTGGCCATGGTG-３'；Rm_a_glob_1as：５'-GGCAAGGAATTTGTCCAGAGAGGC-３'；アニーリング温度６０℃；測定温度：８５℃；５０サイクル）。
【００８４】
独立して行われた実験において、ターゲット遺伝子の過剰発現にもかかわらず、ＲＮＡ量は、ほぼ半分に減少したことが示された（図２０）。このために、pSUPERトランスフェクトした細胞におけるαグロビン測定値を１とし（pSUPER＝１±０）、pSAGlo１の測定値はこれとの関係で見られた（aGlo1＝０.５±０.２）。
【００８５】
さらなる試験では、細胞の生存能力におけるαグロビンの効果を試験した。ＰＣ１２細胞は、ポリ-L-リシンで被覆したＬＩＡ９６ウェル平底皿中で発現された。培地中２日後、細胞をレニラルシフェラーゼ発現構築と、pSUPERまたはpSaGlo1またはbax発現構築とでトランスフェクトした。培地中、さらに１日後、細胞を種々濃度のＨ2Ｏ2に曝した。Ｈ2Ｏ2刺激して２０時間後、トランスフェクトした細胞の生存をルシフェラーゼ検定により分析した（製品使用説明書に従い：プロメガ（Promega）：レニラルシフェラーゼ検定システム（Renilla Luciferase Assay System）；ベルトールド（Berthold）：ミトラス・プレートリーダー（Mithras Platereader））。ルシフェラーゼ活性が高いほど、トランスフェクトした細胞の生存数を多く示す。
【００８６】
siＲＮＡ構築pSaGlo1（pSUPER aGlob1）によるαグロビンｍＲＮＡ発現の低減された細胞は、エンプティベクターpSUPERでトランスフェクトした細胞よりも敏感にＨ2Ｏ2と細胞死反応する（図２１）。このことは、ニューロンの細胞における細胞内ヘモグロビンの可能な神経保護機能を示している。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ダイヤグラムの形式で示すＥＰＯトランスジェニックマウスの脳における転写試験の結果である。グラフは、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション実験のデータを示す。斜線上の点は、ＥＰＯトランスジェニック動物の脳中の高度に調節された遺伝子産物を示す。
【図２】図２は、ヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡについてのＲＴ-ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。αグロビンについてのＲＴ-ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像は、野生型動物群との比較における６匹のトランスジェニック動物群の脳におけるヘモグロビンαメッセンジャーＲＮＡの高度な発現を示す。この分析は、終点分析であり、そのため半定量的である。
【図３】図３は、脳ｃＤＮＡ由来のαグロビンの定量的ＰＣＲの結果を示す。データは６匹の脳（ｔｇまたはｗｔ）由来のプールＲＮＡを示す。
【図４】図４は、野生型およびトランスジェニックマウス由来の全脳抽出物からのヘモグロビンタンパク質についての２次元ゲル電気泳動の結果を示す。全脳抽出物由来の全タンパク質と同量を適用して光学濃度およびタンパク質点容積を比較した場合の平均インダクション係数は、ヘモグロビンαについて２.６８＋０.２９（ｎ＝６）であり、βヘモグロビンについて２.５９＋０.３７（ｎ＝６）で求められる。
【図５】図５は、シアンメトヘモグロビン法で測定した、６匹の野生型マウスおよび６匹のトランスジェニックマウスの脳ホモジェネートのヘモグロビン濃度を棒グラフで示す。濃度は、トランスジェニック群が０.０２９＋０.０１２ｍｇ/(ｄＬ脳ホモジェネート) （ｎ＝６）であり、野生型群が０.０１１＋０.００６ｍｇ/(ｄＬ脳ホモジェネート）（ｎ＝６）であった。
【図６】図６は、脳におけるヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡ位置測定のためのハイブリッド形成法の結果を示す。マウス脳冷凍断片中、ジゴキシゲニンで標識した、ヘモグロビンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、抗ジゴキシゲニン抗体で検出し、呈色反応により可視化した。（Ａ）は、非トランスジェニック同胞種動物の脳を示し、（Ｂ）は、特に海馬、歯状回、小脳および皮質領域中、明らかに強まったin-situシグナルを示す。
【図７】図７は、ＤＡＦ染料を用いた脳内のヘモグロビンタンパク質の局在性を示す。Ａ．マウス (非トランスジェニック）脳内のヘモグロビン発現。海馬、大脳皮質および視床の傍室核中にシグナルが見られた。ヘモグロビンタンパク質の発現場所は、ヘモグロビンメッセンジャーＲＮＡの発現場所全体にわたって対応した。Ｂ．およびＣ．：強い発現を示す小脳および海馬の拡大図。
【図７．１．】トランスジェニックマウスの脳断片中のヘモグロビンに対するジアミノフルオレン染料の使用。大脳皮質（Ａ）および海馬（Ｂ）において鮮明な染色（黒−青)が見られる（矢印）。
【図８】図８は、ＤＡＦ染料を用いた野生型（ｗｔ）およびトランスジェニック（ｔｇ）動物の海馬における脳内ヘモグロビンタンパク質の局在性を示す。Ａ．マウス (非トランスジェニック）の海馬内ヘモグロビン発現。Ｂ．トランスジェニック動物ｔｇ６株由来の同一領域。野生型群に比べ、より強く、より特異的シグナルが見られた。
【図８．１．】野生型マウスの脳（Ａ）およびトランスジェニックマウスの脳（Ｂ）中のヘモグロビンに対するジアミノフルオレン染料を使用した比較。トランスジェニックマウスの脳では、より高度な発現（黒−青)であり；図は大脳皮質の断面を示す。
【図９】図９は、定量的ＰＣＲの結果：腹腔内ＥＰＯ投与後のαグロビン誘発を棒グラフの形態で示す。腹腔内（i.p.）ＥＰＯ投与後、６および２４時間のαグロビンメッセンジャーＲＮＡの高度な調節を示す。si-6-1：ＮａＣｌ投与後６時間の偽（sham）注射した動物；si-24-1：ＮａＣｌ投与後２４時間の偽注射した動物：ei-6-1/ei-6-2：ＥＰＯ投与６時間後のＥＰＯ注射した動物，ei-24-1/ei-24-2：ＥＰＯ投与２４時間後のＥＰＯ注射した動物。
【図１０】図１０は、定量的ＰＣＲの結果：腹腔内ＥＰＯ投与後のβグロビン誘発を棒グラフの形態で示す。腹腔内ＥＰＯ投与後、６および２４時間のαグロビンメッセンジャーＲＮＡの高度な調節を示す。si-6-1：ＮａＣｌ投与後６時間の偽（sham）注射した動物；si-24-1：ＮａＣｌ投与後２４時間の偽注射した動物：ei-6-1/ei-6-2：ＥＰＯ投与６時間後のＥＰＯ注射した動物，ei-24-1/ei-24-2：ＥＰＯ投与２４時間後のＥＰＯ注射した動物。
【図１１】図１１は、定量的ＰＣＲ法によるαグロビンの高度調節を確認するための試験結果を棒グラフの形態で示す。αグロビン特異的プライマーを用いて、対側の脳半球および偽（sham）処理した動物と比較したｍＲＮＡの相対的調節を測定した。エラーバーは、いくつかの希釈段階にわたる測定の標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、定量的ＰＣＲ法によるβグロビンの高度調節を確認するための試験結果を棒グラフの形態で示す。βグロビン特異的プライマーを用いて、対側の脳半球および偽（sham）処理した動物と比較したｍＲＮＡの相対的調節を測定した。エラーバーは、いくつかの希釈段階にわたる測定の標準偏差を示す。
【図１３】図１３は、αおよびβグロビンを示すＲＭＤＤストリップ片を示す。これは予め同定されたストリップであって、２，６および２０時間の再潅流でＭＣＡＯした後のマウス脳由来のαおよびβグロビンとして同定されたストリップを示す。各ケースで、虚血性脳半球、対側脳半球および偽処理動物群を示す。
【図１４】図１４は、腹腔内にエリスロポエチン注射した後の脳検体中、全タンパク質割合としてヘモグロビンのタンパク質測定試験の結果を、棒グラフの形態で示す。
【図１５】図１５は、野生型 (ｗｔ)およびＥＰＯトランスジェニック動物におけるＤＡＬＤＨ定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図１６】図１６は、野生型 (ｗｔ)およびＥＰＯトランスジェニック動物におけるＡＬＡＳ定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図１７】図１７は、ＥＰＯ注射した動物について２４時間後のＡＬＡＳ定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図１８】図１８は、ＥＰＯ注射した動物について７日後のＡＬＡＳ定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図１９】図１９は、エリスロポエチン注射後のニューログロビン定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図２０】図２０は、一過性トランスフェクトしたＰＣ１２細胞におけるsiＲＮＡ構築pSaGlo１の実効性を調べるためのαグロビンｍＲＮＡ定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図２１】図２１は、細胞生存能力におけるαグロビンｍＲＮＡの効果を調べるための測定結果を示す。生存細胞％は、siＲＮＡ構築pSaGlo1を用いてＰＣ１２細胞のトランスフェクション後、測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７．１】
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【図８】
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【図８．１】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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