(57)【要約】  本発明は、微小流体システムにおいて、未知の配列のＤＮＡフラグメントおよびオリゴヌクレオチドプライマーを含むテンプレートシステムを含む反応セルへと、個々にかつ連続的に供給される４つのヌクレオチド塩基の各々の、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される組み込みのリアルタイム検出に基づき、核酸配列を分析するための新規の方法に関する。テンプレートシステムへのヌクレオチドの組み込みは、蛍光検出および化学発光検出を含むがこれらに限定されない種々の方法のいずれかによって、検出され得る。あるいは、サーモパイル、サーミスターおよび屈折率の測定使用する、伸長しているテンプレートシステムへのヌクレオチドの組み込みによって生じる熱の熱量測定検出が、伸長反応を検出するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列決定の方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）エンドヌクレアーゼ活性が低下したＤＮＡポリメラーゼの存在下で、プライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした未知の配列の、少なくとも１つの核酸分子を含む、テンプレートシステムを提供する工程；
（ｂ）該プライマーの３’末端への少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの組み込みによって、該プライマーの伸長を可能にする条件下で、単一の型のデオキシリボヌクレオチドと、該テンプレートシステムとを接触させて伸長したプライマーを形成する工程；
（ｃ）該プライマーの伸長が生じたかどうかを決定する工程；
（ｄ）該プライマーへと組み込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出する工程；
（ｅ）組み込まれていないデオキシリボヌクレオチドを除去する工程；および
（ｆ）工程（ａ）〜工程（ｅ）を反復して、該核酸分子のヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが化学発光部分を含み、該方法は、該化学発光部分によって放射される化学発光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含し、そして前記テンプレートシステムから該化学発光部分を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが蛍光部分を含み、該方法は、該蛍光部分によって放射される蛍光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含し、そして前記テンプレートシステムから該蛍光部分を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが蛍光部分を含み、該方法は、該蛍光部分によって放射される蛍光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含し、そして該蛍光部分を除去することなく、該蛍光シグナルを破壊する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記蛍光部分が、励起状態の該蛍光部分から電子を抽出し得る化合物との反応によって破壊される、方法。
【請求項６】
前記化合物が、ジフェニルヨードニウム塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、取り込まれていないデオキシリボヌクレオチドの濃度の変化を検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの組み込みが、熱を発生させ、該方法は、該取り込みによって発生する熱を検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項９】
発生した熱を検出するために、サーモパイルが使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
発生した熱を検出するために、サーミスターが使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記テンプレートシステムが、緩衝液をさらに含み、ここで、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの取り込みが、該緩衝液に吸収される熱を発生させ、そしてさらに、該緩衝液の屈折率を測定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記プライマーの３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加によって放出されるピロリン酸の濃度を検出することによって、該プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、ピロリン酸の濃度が、該ピロリン酸を加水分解し、そして該ピロリン酸の加水分解によって発生する熱を測定することによって検出される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、アミノ酸残基Ａｓｐ１１２がＡｌａに置換され、そしてアミノ酸残基Ｇｌｕ１１４がＡｌａによって置換されたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、アミノ酸残基Ｉｌｅ４１７がＶａｌに置換されたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列決定の方法であって、以下の工程：
（ａ）エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、プライマーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした未知の配列の、少なくとも１つの核酸分子を含む、テンプレートシステムを提供する工程；
（ｂ）該プライマーの３’末端への少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの組み込みによって、該プライマーの伸長を可能にする条件下で、単一の型のデオキシリボヌクレオチドと、該テンプレートシステムとを接触させて伸長したプライマーを形成する工程；
（ｃ）該プライマーの伸長が生じたかどうかを検出し、それによって、該プライマーの３’末端に付加されたデオキシリボヌクレオチドを同定する工程；
（ｄ）該プライマーへと組み込まれたデオキシリボヌクレオチドの数を検出する工程；
（ｅ）組み込まれていないデオキシリボヌクレオチドを除去する工程；
（ｆ）エキソヌクレアーゼ能のあるＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼおよび工程（ｂ）の同定されたデオキシリボヌクレオチドを含む混合物と、該テンプレートシステムとを接触させる工程；
（ｇ）工程（ｆ）の混合物を除去する工程；ならびに
（ｈ）工程（ａ）〜工程（ｇ）を反復して、該核酸分子のヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが蛍光部分を含み、該方法は、該蛍光部分によって放射される蛍光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが蛍光部分を含み、該方法は、該蛍光部分によって放射される蛍光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含し、そして該蛍光部分を除去することなく、該蛍光シグナルを破壊する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記蛍光部分が、励起状態の該蛍光部分から電子を抽出し得る化合物との反応によって破壊される、方法。
【請求項２０】
前記化合物が、ジフェニルヨードニウム塩である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドが化学発光部分を含み、該方法は、該化学発光部分によって放射される化学発光シグナルを検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、組み込まれていないデオキシリボヌクレオチドの濃度の変化を検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの組み込みが、熱を発生させ、該方法は、該取り込みによって発生する熱を検出することによって、前記プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
発生した熱を検出するために、サーモパイルが使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
発生した熱を検出するために、サーミスターが使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１６に記載の方法であって、前記テンプレートシステムが、緩衝液をさらに含み、ここで、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドの取り込みが、該緩衝液に吸収される熱を発生させ、そしてさらに、該緩衝液の屈折率を測定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２７】
請求項１６に記載の方法であって、前記プライマーの３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの組み込みによって放出されるピロリン酸の濃度を検出することによって、該プライマーの伸長が生じたかどうかを検出する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ピロリン酸の濃度が、該ピロリン酸を加水分解し、そして該ピロリン酸の加水分解によって発生する熱を測定することによって検出される、方法。
【請求項２９】
請求項１６に記載の方法であって、前記エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、アミノ酸残基Ａｓｐ１１２がＡｌａに置換され、そしてアミノ酸残基Ｇｌｕ１１４がＡｌａによって置換されたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである、方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載の方法であって、前記エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼが、アミノ酸残基Ｉｌｅ４１７がＶａｌに置換されたＴ４  ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、方法。
【請求項３１】
混入しているヌクレオチドを溶液から除去する方法であって、該方法は、該溶液を、プライマーおよびポリメラーゼの存在下で、任意の混入しているヌクレオチドをＤＮＡに取り込むのに十分な時間にわたって、３つの可能性のある混入しているヌクレオチドの各々に相補的な、固定されたＤＮＡと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３２】
位相が一致した配列決定シグナルと位相が外れた配列決定シグナルとの間を識別するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）エラーシグナルを検出および測定し、それによってトレーリング鎖集団のサイズを決定する工程；
（ｉｉ）該トレーリング鎖プライマーの３’末端と、リーディング鎖プライマーの３’末端との間；
（ｉｉｉ）該リーディング鎖の３’末端から上流の点における伸長の発生の失敗をシミュレートし、それによって、各伸長工程において、該トレーリング鎖の３’末端が伸長された、該リーディング鎖によって以前に横切られた配列中の正確な点を予測する、工程；
（ｉｖ）導入された各ｄＮＴＰについて、該トレーリング鎖の正確な伸長から予測されるシグナルを予測する工程；および
（ｖ）該測定されたシグナルから予測されたシグナルを差し引いて、該リーディング鎖集団の正確な伸長のみに起因するシグナルを得る工程、
をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．導入）
本発明は、各４つのデオキシヌクレオシド一リン酸のＤＮＡポリメラーゼ触媒取り込みのリアルタイム検出に基づいて核酸配列を分析する新規の方法に関し、各４つのデオキシヌクレオシド一リン酸は、未知の配列のＤＮＡフラグメントおよびオリゴヌクレオチドプライマーを含むテンプレート系に、微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）系中のデオキシヌクレオシド三リン酸として個々におよび連続的に供給される。プライマーへのデオキシヌクレオシド一リン酸（ｄＮＭＰ）の取り込みは、任意の種々の方法（蛍光検出および化学発光検出が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得る。あるいは、サーモパイル、サーミスターを使用する伸長プライマーへのｄＮＭＰの取り込みによって発生する熱の微小熱量測定（ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｉｃ）検出を使用して、伸長反応を検出し得る。本発明は、誤った取り込み（ｍｉｓｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）または伸長の失敗に起因する配列決定誤差のモニタリングの方法および補正のための方法をさらに提供する。
【０００２】
本発明は、ＤＮＡフラグメントの電気泳動的分離を避け、従って、繰り返された塩基配列または一本鎖ＤＮＡにヘアピンループへの自己ハイブリダイズをもたらし得る、他の自己相補的配列に起因するＤＮＡの異常な移動に関連する問題を排除し、そして、また読まれ得るフラグメントのサイズに対する電流の制限を避けるＤＮＡを配列決定する方法を提供する。本発明の方法を使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を決定し得、あるいは患者由来のＤＮＡサンプルを配列決定するための診断用ツールとして使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
近年、２つのアプローチが、ＤＮＡ配列決定のために使用される：Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ鎖末端方法（１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７４：５４６３−５６７４）およびＭａｘａｍの化学分解方法（１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７４：５６０−５６４）。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ鎖末端方法は、最も広範に使用される方法であり、そして自動化ＤＮＡ配列決定機が頼る方法である。鎖末端方法において、ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、４つの別個の反応系に添加され、テンプレートＤＮＡ鎖の複数コピーを作製し、ここで、各反応系において、鎖の伸長が起こるデオキシリボース上の３’−ＯＨを欠損する１つのヌクレオチド型を取り込むことによって、この増殖プロセスが、一連の反応においてＡの出現、および他の一連の反応においてＧ、ＣおよびＴの各出現を、それぞれ阻止する。この手順は、異なる長さの一連のＤＮＡフラグメントを生成し、そして各４つの塩基が出現するテンプレート鎖に沿う位置をシグナル伝達するものは、伸長したＤＮＡフラグメントの長さである。ヌクレオチド配列を決定するために、ＤＮＡフラグメントは、高分解能ゲル電気泳動によって分離され、そして４つの塩基のオーダーがゲルから読まれる。
【０００４】
主要な研究の目的は、ヒトゲノム全体のＤＮＡ配列を誘導することである。この目的を達成するために、ゲル電気泳動の困難さを省き得、配列決定反応を実行する費用（試薬の費用を含む）を下げ得、そして配列決定の速さおよび正確さを上げ得、そして単一工程において読まれ得る配列の長さを増加し得る、新しいゲノム配列決定技術に対する必要性が発生した。配列決定の速さにおける潜在的な改善は、例えば、ＭａｒｓｈａｌｌおよびＰｅｎｎｉｓｉｓ（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：９９４−９９５）に記載されたような商品化したキャピラリーゲル電気泳動技術によって提供され得る。しかし、全てのゲル電気泳動アプローチに共通する主要な問題は、ＤＮＡ配列圧縮（通常、ＤＮＡフラグメントにおける二次構造から生じ、ゲルを通って、特定のＤＮＡフラグメントの異常な移動を生じる）の発生である。
【０００５】
ゲノム情報は蓄積し、そして遺伝子変異と特定の疾患との間の関係は同定されるので、変異の同定のための診断用方法に対する増大する必要性がある。対照的に、ヒトゲノムの大きなセグメントを配列決定するために必要である大きなスケールの方法（診断方法のために必要であるもの）は、ゲノムの特定の小さい単離された領域の再配列決定のための、反復性の低コストの、高い正確さの技術である。そういった場合には、ゲル電気泳動の読出しに基づく配列決定方法は、あまりにも遅く、そして費用が高くなる。
【０００６】
新規のＤＮＡ配列決定技術を意図する場合、細胞が行うとほとんど同じような、配列の直接的な読み取りの可能性は、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド適用の場合の間接的な読み取りよりも、好ましい目的である。これは、走査型プローブ顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いての、個々のヌクレオチド塩基の形を決定するための初期の失敗した試みの目的であった。
【０００７】
さらに、ヌクレオチド配列の直接的な読み取りのための別のアプローチは、Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９５，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ４１：２７９−２９４）に記載されるような、連続して放出された各ヌクレオチドを同定するための検出スキームと結合される、エキソヌクレアーゼでのＤＮＡ処理である。しかし、この技術を使用する研究者は、単一のＤＮＡ鎖から消化されるので、単一ヌクレオチドの分子を検出し、そして同定することの非常に大きな問題に直面する。より大きなシグナルを得るための複数のＤＮＡ鎖の同時のエキソヌクレアーゼ消化は、可能でない。なぜなら、この酵素は迅速に異相になり、その結果、異なる鎖上の異なる位置からのヌクレオチドは、一緒に放出され、そして配列は読み取り不可能となるからである。エキソヌクレアーゼの外部調節の何らかの手段が見出され得、その結果、複数の酵素分子が同相において無理に作動され得る場合、非常に有利である。しかし、そのポリマー基質にドッキングしたままである酵素の外部調節は、不可能でない場合、例外的に難し位。なぜなら、各消化の後、次の基質セグメントは、活性部位に即時に存在するからである。従って、任意のコントロールシグナルは、各反応の開始の際に活性部位に存在しなければならない。
【０００８】
種々の方法を使用して、各テンプレート部位でのポリマーへのデオキシヌクレオシド一リン酸（ｄＮＭＰ）のポリメラーゼ触媒化取り込みを検出し得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼが、プライマーの３’末端上に４つのｄＮＴＰの１つを添加する場合に必ず放出されるピロリン酸は、Ｈｙｍａｎ  Ｅ．Ｄ．（１９８８，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７４：４２３−４３６）および米国特許第４，９７１，９０３号に記載されるようなピロリン酸の検出に基づく化学発光を使用して検出され得る。このアプローチは、Ｒｏｎａｇｈｉ（１９９６，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４）およびＲｏｎａｇｈｉ（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５）に記載されるような「取り込みによる配列決定」と呼ばれる配列決定アプローチにおいて、近年最も使用される。しかし、このアプローチに関連する２つの重要な問題（取り込まれないヌクレオチドの破壊およびピロリン酸の検出）が存在する。第１の問題に対する解決策は、ｄＮＴＰ消化酵素（例えば、アピラーゼ）を用いた添加され取り込まれないヌクレオチドを破壊することである。第２の解決策は、米国特許第４，９７１，９０３号およびＲｏｎａｇｈｉ（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５）に記載されるようなルシフェラーゼ化学蛍光反応によって検出され得る、ＡＴＰにピロリン酸を再変換するためのＡＴＰスルフリラーゼを使用するピロリン酸の検出である。デオキシアデノシンα−チオトリホスフェートは、ルシフェラーゼと注入されたｄＡＴＰの直接的な相互作用を最小化するためにｄＡＴＰに代わって使用される。
【０００９】
不幸にも、各サイクルにおいて複数の酵素反応が完了するための要件は、このアプローチの速度に制限を課すが、この読み取り長さは、取り込まれない非相補的なヌクレオチドを完全に破壊することの不可能性によって制限される。異なるヌクレオチドの新しいアリコートが次の伸長反応のために添加される時点で、何らかの残余量の１つのヌクレオチドが、反応系において残っている場合、プライマー鎖のいくつかの画分が、２つ以上のヌクレオチド、添加ヌクレオチド型および残りの不純物型（これらがテンプレート配列にマッチする場合）によって伸長される可能性が存在し、そしてプライマー鎖のこの画分は、次いで、残りのものと異相である。この異相成分は、誤った取り込みシグナルを生成し、このシグナルは、各サイクルと共に大きくなり、そして最終的に配列を読み取り不可能にする。
【００１０】
異なる直接的な配列決定アプローチは、４つの異なる色の蛍光タグで３’ＯＨ位置でタグ化れたｄＮＴＰを使用し、４つのヌクレオチドの各々の１つは、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４２５９−４２６７）に記載される。このアプローチにおいて、プライマー／テンプレート二重鎖は、同時に４つ全てのｄＮＴＰと接触される。３’タグ化ＮＭＰの取り込みは、さらなる鎖伸長を妨害する。過剰なそして未反応のｄＮＴＰは、洗い流され、そして取り込まれたヌクレオチドは、取り込まれた蛍光タグの色によって同定される。次いで、蛍光タグは、引き続く取りこみ反応が起こるために除去されなければならない。ピロリン酸検出方法に類似して、防止蛍光タグの不完全な除去は、次の反応サイクルで伸長されないいくつかのプライマー鎖を残し、そしてこれらが後のサイクルにおいて引き続き防止されていない場合、各サイクルと共に大きくなり、そして最終的に読み取り長さを限定する異相のシグナルが、再度生成される。現在まで、この方法は、単一塩基の伸長のみについて作用することが従来証明された。従って、この方法は遅く、そしてタグの除去において９９％の効率が、５０塩基対を超えて読むために必要とされることに起因して、非常に短い読み取り長さに制限されるようである。標識の不完全な除去は、異相で伸長したＤＮＡ鎖を生じる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（３．発明の要旨）
従って、ＤＮＡフラグメントの電気泳動的分離の必要性を排除するＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を決定するための新規の方法を提供することは、本発明の目的である。デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が、ＤＮＡプライマー／テンプレート系に個々にそして連続的に供給される場合、本発明の方法（本明細書中で「反応性配列決定」と呼ばれる）は、各４つのヌクレオチド型のＤＮＡポリメラーゼ触媒化取り込みの検出に基づく。ＤＮＡプライマー／テンプレート系は、未知の配列の一本鎖ＤＮＡフラグメント、一本鎖ＤＮＡの短い領域とマッチした二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素を含む。この酵素は、テンプレート系にすでに存在し得るか、またはｄＮＴＰ溶液と一緒に供給され得るかのいずれかである。
【００１２】
代表的に、単一のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、ＤＮＡプライマーテンプレート系に添加され、そして反応される。本明細書中で使用される場合、デオキシリボヌクレオチドは、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰに加えて、これらのデオキシリボヌクレオチドの化学改変バージョンまたはそのアナログを意味し、そしてこれらを含む。このような化学改変デオキシリボヌクレオチドとしては、蛍光部分または化学発光部分でタグ化されたデオキシリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るデオキシヌクレオチドのアナログとしては、７−デアザプリンが挙げられるが、これに限定されない。本発明は、ポリメラーゼ反応に使用されるデオキシリボヌクレオチドの純度を改善する方法をさらに提供する。
【００１３】
伸長反応は、次のｄＮＴＰ塩基が、プライマーの３’末端を超えてＤＮＡテンプレートの次の非対性塩基に相補的である場合のみに起こる。反が起こっている間、または反応が起こることが可能な十分な存続時間の遅延の後、この系は、添加されたｄＮＴＰから誘導されるさらなるヌクレオチドが、ＤＮＡプライマー／テンプレート系に取り込まれたか否かを決定するために試験される。反応細胞に添加されるｄＮＴＰと取り込みシグナルの検出との間の相関は、プライマー／テンプレートへ取り込まれるヌクレオチドを同定する。取り込みシグナルの振幅は、取り込まれたヌクレオチドの数を同定し、それによって、これらが起こる場合、単一塩基の繰り返し長さを定量する。各４つのヌクレオチドを個々に用いてこのプロセスを繰り返すことによって、テンプレートの配列は、一度に１つのヌクレオチドで５’から３’の方向へと直接的に読まれ得る。
【００１４】
ポリメラーゼ媒介伸長反応の検出および反応の程度の定量化は、種々の異なる技術（伸長二重鎖へのヌクレオチドの取り込みによって生成される熱の微小熱量測定が挙げられるが限定されない）によって起こり得る。蛍光または化学発光による伸長反応の光学検出をまた使用して、伸長二重鎖への蛍光実体または化学発光実体でタグ化されたヌクレオチドの取り込みを検出し得る。取り込まれたヌクレオチドがフルオロフォアでタグ化される場合、過剰な取り込まれないヌクレオチドは除去され、そしてテンプレート系は、取り込まれたヌクレオチドから蛍光を刺激するために照射される。次いで、蛍光タグは、引き続く取り込みサイクルが始まる前に、ＤＮＡテンプレート系から切断され、取り除かれ得る。類似のプロセスは、化学発光タグについて従い、再び過剰な未反応のタグ化ｄＮＴＰが取り除かれた後、化学発光反応が、系への適切な試薬を導入することによって刺激される；しかし、化学発光タグは、代表的に、読出しプロセスにおいて破壊され、その結果、検出に続く別の切断および除去の工程は、必要とされないかもしれない。タグの蛍光または化学発光いずれかの型について、タグまはた、取り込みの後切断され得、そして蛍光または化学発光の検出のための別の検出チャンバーへ輸送され得る。この方法において、単一塩基の繰り返し配列中に取り込まれた蛍光団タグを調節することによって蛍光をクエンチすることは、避けられ得る。さらに、これは、蛍光検出に関しての可能な放射線損傷または化学発光検出に関しての可能な化学損傷からＤＮＡテンプレート系を保護し得る。あるいは、蛍光タグは、化学反応または光化学反応によって選択的に破壊され得る。このプロセスは、各読出しの後、タグを切断する必要性、または反応チャンバーから取り除き、蛍光検出のための別の検出チャンバーに輸送する必要性を排除する。本発明は、ジフェニルヨードニウムイオンまたは関連する種を用いた光化学反応によって蛍光タグを選択的に破壊する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、２サイクルの系を使用する反応性配列決定方法をさらに提供する。エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼが、第１のサイクルに使用され、そしてエキソヌクレアーゼ欠乏性酵素およびエキソヌクレアーゼ能のある酵素の混合物が、第２のサイクルに使用される。第１のサイクルにおいて、エキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼと共にテンプレート−プライマー系は、各４つの可能なヌクレオチドと共に連続して提示される。第２のサイクルにおいて、補正ヌクレオチドの同定の後、エキソヌクレアーゼ能のあるポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ欠乏性ポリメラーゼの混合物、または活性の両方の型を含むポリメラーゼは、第２のサイクルに、第１のサイクルで同定され補正されたｄＮＴＰと共に添加され、プライマー伸長を完了し、そして校正する。この方法において、補正ｄＮＴＰが存在する場合、エキソヌクレアーゼ能のあるポリメラーゼは、反応細胞にのみ存在し、その結果、正しい伸長鎖のエキソヌクレオチド鎖分解性の分解は起こらないが、以前の不正確な伸長鎖の分解および補正再伸長は起こり、従って非常に正確な鎖伸長を達成する。
【００１６】
本発明はまた、反応性配列決定反応をモニタリングする方法を提供し、誤った取り込み（すなわち、非相補的な塩基を不正確に取り込むこと）および伸長の失敗（すなわち、ＤＮＡプライマー鎖の画分を伸長しないこと）から生じる配列決定反応誤りを検出し、そして補正する。この方法は、（ｉ）トレーリング鎖集団の大きさを決定する（トレーリング鎖は、現在の反応工程前に任意の伸長で伸長の失敗を受けたプライマー鎖である）；（ｉｉ）トレーリング鎖の３’末端と対応するリーディング鎖の３’末端との間のトレーリング鎖集団の下流配列を決定する（「下流」とは、プライマー鎖の補正３’末端を超えるテンプレート配列をいい；対応して、「上流」とは、既知のテンプレートおよびプライマー鎖の５’末端に向かう相補的なプライマー配列をいい；「リーディング鎖」は、以前に伸長の失敗を行っていないプライマー鎖である）；および（ｉｉｉ）リーディング鎖の３’末端から上流の任意の点で伸長の失敗の出現のシミュレーションによって、トレーリング鎖の伸長から予測されるシグナルを各伸長工程で予測する、能力に基づく。測定されたシグナルからの予測されたシグナルの減法は、リーディング鎖集団の妥当な伸長のみに起因するシグナルを得る。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、反応性配列決定反応の誤りについてのモニタリングは、コンピューターによる。伸長の失敗をモニターする能力は、所定のテンプレート配列に対するトレーリング鎖が進行する点およびこれらの鎖とリーディング鎖との間の１、２または３塩基ギャップにおける配列の決定を可能にする。この情報を知ることにより、ｄＮＴＰプローブサイクルは、所定のテンプレート配列に対するトレーリング鎖を選択的に伸長するように改変され得るが、リーディング鎖を伸長せず、それによって集団を再同期化する。
【００１８】
本発明は、以下を含むＤＮＡ配列決定のための装置をさらに提供する：（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、プライマー鎖の３’末端にデオキシリボヌクレオチド一リン酸を取り込む場合、検出可能なシグナルを生成するＤＮＡプライマー／テンプレート系を含む少なくとも１つのチャンバー；（ｂ）反応チャンバーから、緩衝液、電解室、ＤＮＡテンプレート、ＤＮＡプライマー、デオキシリボヌクレオチド、およびポリメラーゼ酵素からなる群から選択される少なくとも１つを導入、および排出するための手段；（ｃ）前記シグナルを増幅するための手段；および（ｄ）前記シグナルを、電気的シグナルに変換する手段。
【００１９】
（好ましい実施例の詳細な説明）
本発明は、連続した１つのヌクレオチドＤＮＡポリメラーゼ媒介性伸長反応の検出に基く、ＤＮＡ分子の核酸配列の決定のための方法を提供する。下記に詳細に記載されるように、１つの実施例において、配列決定されるＤＮＡの領域に相補的かつ結合するはポリヌクレオチドプライマーを含むＤＮＡプライマー／テンプレート系が、ＤＮＡポリメラーゼ反応を起こすために必要な、多様な試薬を含む緩衝液を加えた反応セル内に封入される。反応セルに、単一の型のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を添加する。ＤＮＡプライマー／テンプレート系における次の相補的部位の同一性に依存して、伸長反応は、適切なヌクレオチドが反応セル内に存在する場合にのみ起こる。反応セル内に存在するヌクレオチドと取込みシグナルの検出との間の相関は、テンプレートの次のヌクレオチドを同定する。各伸長反応に続いて、反応セルをｄＮＴＰのない緩衝液を用いてフラッシュし、ＤＮＡプライマー／テンプレート系を保ち、全てのヌクレオチド配列が同定されるまでサイクルを繰り返す。
【００２０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位内のコントロールシグナルの存在に基く。このＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長部位のテンプレート鎖上の塩基に対する、入ってくるデオキシヌクレオチド三リン酸の高い忠実度での、相補的合致および非相補的合致を識別する（すなわち、配列を読み取り、そしてその部位に、相補的である１つの型のデオキシヌクレオチドのみを取込む）。すなわち、利用可能な型のヌクレオチドが、次のテンプレート部位に対して相補的でない場合、ポリメラーゼは不活性であり、従って、このテンプレート配列はＤＮＡポリメラーゼコントロールシグナルである。従って、４つ全てではなく、１つの型のヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼ系に接することにより、反応が起こるか否かを検出することによって配列中の次の塩基が同定され得る。さらに、１塩基繰返し長が、反応の程度の定量によって定量され得る。
【００２１】
本発明の方法の実施における第１の工程で、当該分野で公知の、種々の異なる方法のいずれかを用いて、配列決定する１本鎖テンプレートＤＮＡを調製する。２つの型のＤＮＡが、配列決定反応において、テンプレートとして用いられ得る。純粋１本鎖ＤＮＡ（例えば、組換えバクテリオファージ由来）が、用いられ得る。このバクテリオファージの使用は、大量の純粋１本鎖テンプレートの生成のための方法を提供する。あるいは、ＣｈｅｎおよびＳｕｂｒｕｎｇ，（１９８５，ＤＮＡ  ４：１６５）；ＨｕｔｔｏｒｉおよびＳｋａｋｉ（１９８６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２：２３２）；およびＭｉｅｒｅｎｄｏｒｆおよびＰｆｅｆｆｅｒ，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５５６）に載されるように、加熱条件またはアルカリ条件によって変成された２本鎖ＤＮＡ由来であり得る１本鎖ＤＮＡが、使用され得る。そのような２本鎖ＤＮＡは、例えば、患者由来のＤＮＡサンプルを含み、診断における配列決定反応において用いられる。
【００２２】
このテンプレートＤＮＡは、当業者に周知の種々の技術により調製され得る。例えば、任意の従来のクローニング方法（配列決定のために頻繁に用いられる方法を含む）を用いて、ベクター挿入物として調製され得る。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）で見出され得る。本発明の好ましい実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）に記載されるように、テンプレートＤＮＡとして用いるためのＤＮＡのフラグメントを増幅し得る。
【００２３】
ポリメラーゼ反応の正しい検出のために必要とされるＤＮＡテンプレートの量は、用いる検出技術に依存する。例えば、光学検出（蛍光検出または化学発光検出）については、フェムトモル範囲の、比較的少量のＤＮＡが必要とされる。熱検出については、ＤＮＡポリメラーゼ媒介性伸長反応の結果生じる温度変化の検出のために、１ピコモルに近い量が必要とされ得る。
【００２４】
酵素的配列決定反応において、ＤＮＡ合成のプライミングは、テンプレートＤＮＡ配列の特定の領域に相補的である、従って結合し得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって、達成される。テンプレートＤＮＡが、バクテリオファージから１本鎖ＤＮＡとして、またはプラスミド由来の２本鎖ＤＮＡとして得られる場合、ベクター（すなわち、バクテリオファージベクター、コスミドベクターおよびプラスミドベクター）内の配列に相補的であり、かつテンプレートＤＮＡに隣接する「ユニバーサル」プライマーが、用いられ得る。
【００２５】
プライマーオリゴヌクレオチドは、テンプレートＤＮＡ配列に結合し、かつ伸長サイクルの間のあらゆる洗浄工程の間、インタクトなままである、高い安定性の二重鎖を形成するように選択される。好ましくは、このプライマーオリゴヌクレオチドの長さは、１８〜３０ヌクレオチドであり、バランスの取れた塩基組成を含む。このプライマーの構造はまた、折りたたみおよび自己アニーリングして２次構造を形成し、それによってプライマーを非効率にし得る、２分子対称の領域を含まないことを確認するために分析される。テンプレート系におけるオリゴヌクレオチドプライマーの結合のための、適切なハイブリダイゼーション条件を選択するための条件は、プライマー配列に依存し、そしてそれは当業者に周知である。
【００２６】
本発明の反応性配列決定方法の利用において、種々の異なるＤＮＡポリメラーゼが用いて、ｄＮＴＰを、テンプレートＤＮＡ分子にハイブリダイズするプライマーの３’末端に取込み得る。そのようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ、およびＫｌｅｎｏｗポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、以下に詳細に記載されるＤＮＡポリメラーゼ欠失５’−３’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が、配列決定反応において用いられる。最速の反応速度理論について、各ＤＮＡ分子が非共有結合で結合したポリメラーゼ分子を反応の間、保持していることを確実にするためのポリメラーゼの量は十分である。解離平衡における約５０ｎＭの代表的な平衡定数について：
【数１】
2005511018.tif 000002
【００２７】
所望の条件は：［Ｐｏｌ］≧  ５０ｎＭ  ＋［ＤＮＡ］
さらに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列を決定するために、ＲＮＡテンプレートから１本鎖ＤＮＡの合成を触媒する逆転写酵素が、本発明の反応性配列決定法において利用され得る。このような方法は、逆転写酵素の存在下での、プライマーにアニールされるＲＮＡテンプレート（ＲＮＡプライマー／テンプレート）とｄＮＴＰとの連続的な接触を含み、ＲＮＡの配列が決定される。ｍＲＮＡは、ＤＮＡテンプレートから、ＲＮＡポリメラーゼに触媒される合成によって生成され、従って、ＤＮＡテンプレート鎖の配列情報を含むので、ｍＲＮＡの配列決定は、転写されたＤＮＡ遺伝子の配列をもたらす。真核生物ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを有し、従って、逆転写のためのプライマーは、オリゴ（ｄＴ）であり得る。代表的には、プライマーが基質上に捕捉され得、次いでテンプレートｍＲＮＡ鎖にハイブリダイズしそして捕捉し得る、末端ビオチンまたは末端アミノ基を有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを合成することが、最も都合が良い。
【００２８】
伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼ媒介性伸長の進行に必要とされる、適切な濃度の塩、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝液中で実施される。そのような条件に関する指導については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）：およびＡｕｓｕｂｅｌら，（１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｓｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと。
【００２９】
代表的には、４種類のｄＮＴＰのうちの１種類を含む緩衝液を、反応セルに加えた。プライマー／テンプレート系における、次の対合していないテンプレート部位のヌクレオシド塩基の同一性に依存して、反応セルが適切なｄＮＴＰを有する場合、反応が起こる。この反応セルが、他の３種類の正しくないｄＮＴＰのいずれかを含む場合、反応は起こらない。
【００３０】
次いで、反応セルを、ｄＮＴＰを含まない緩衝液でフラッシュし、そして完全なＤＮＡ配列が同定されるまでこのサイクルを繰り返す。ＤＮＡポリメラーゼ媒介性伸長の検出は、下記に詳細に記載される任意の検出方法（伸長反応の光学的検出および熱検出を含む）を用いてなされ得る。
【００３１】
ある場合に、ヌクレオチド溶液は、他の３種類のヌクレオチドうちのいずれかの混入が見出される。そのような場合、鎖の小分画は、提供されるｄＮＴＰの型が、伸長において正しくない場合、純粋でないｄＮＴＰの取込みによって拡張され得、次いで主な鎖集団の前方が拡張される、鎖の集団が生成される。従って、本発明の実施形態において、各ヌクレオチド溶液は、処理され、混入したあらゆるヌクレオチドが除去され得る。各ヌクレオチド溶液の処理は、使用前の、おそらく混入している各ヌクレオチドに相補的な固定ＤＮＡと溶液との反応を含む。例えば、ｄＡＴＰ溶液を、ＤＮＡ中にあらゆるｄＴＴＰヌクレオチド、ｄＣＴＰヌクレオチドおよびｄＧＴＰヌクレオチドを取込むのに十分な時間にわたって、適切なプライマーおよびポリメラーゼとともに固定ポリ（ｄＡ）、固定ポリ（ｄＧ）または固定ポリ（ｄＣ）と反応させる。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、プライマー／テンプレート系は、固相支持体に結合したテンプレートＤＮＡを含み、各伸長反応後の複雑かつ時間のかかる精製工程なしに、配列決定反応試薬の連続的な添加を可能にする。好ましくは、テンプレートＤＮＡは、共有結合で固相支持体（例えば、反応フローセルの表面、ポリマー性ミクロスフェア、フィルター材料など）に結合しており、各伸長反応後の複雑かつ時間のかかる精製工程なしに、配列決定反応試薬（すなわち、緩衝液、ｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ）の連続的な適用を可能にする。あるいは、同じベクターテンプレートまたは同じ遺伝子を含む多くのサンプルの配列決定に必要とされる適用において（例えば、診断への適用において）、ユニバーサルプライマーは、支持体に結合され得、そしてテンプレートＤＮＡは、固定プライマーにハイブリダイズすることが可能であり得る。
【００３３】
これらのＤＮＡは、改変され、固相支持体へのＤＮＡの共有結合または非共有結合を促進し得る。例えば、ＰＣＲを用いてＤＮＡフラグメントを増幅する場合、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチド鎖の１セットの５’末端が改変され、固相支持体に生成される２つの相補な型のＤＮＡ鎖のうちの一方に結合するためのリンカー部分を保持し得る。このようなリンカー部分は、例えば、ビオチンを含む。ビオチンを使用する場合、ビオチン化ＤＮＡフラグメントは、固相支持体に共有結合するストレプトアビジンに非共有結合し得る。あるいは、アミノ基（−ＮＨ２）は、ＰＣＲプライマー鎖の１つに化学的に取込まれ、そしてＤＮＡテンプレートを、標準的な化学反応（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化アガロース表面との反応）を用いて、固相支持体に共有結合するのに用いられ得る。
【００３４】
別の実施形態において、配列決定オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端は、ストレプトアビジン処理した支持体に非共有結合的に捕捉させるために、ビオチンで改変され得るか、固相支持体に化学結合させるために、アミノ基で改変され得；次いで、テンプレート鎖を、固定されたプライマー塩基配列とテンプレート鎖の相補的な配列との間の非共有結合力によって捕捉させる。固相支持体上にＤＮＡを固定するための方法は、当業者に周知であり、その方法は、選択した個体支持表面に依存して変化する。
【００３５】
本発明の反応性配列決定法において、ＤＮＡポリメラーゼは、４つの各ｄＮＴＰで連続的に提示される。反応サイクルの大部分においては、正しくないｄＮＴＰのみが提示され、それによって、伸長ＤＮＡプライマー／テンプレート系への正しくないヌクレオチドの取込みの可能性を増大させる。
【００３６】
従って、本発明は、正しくないヌクレオチドの誤った取り込みを制限しつつ、正しいヌクレオチドのＤＮＡプライマー／テンプレート系への速く完全な取り込みを達成するための、反応性配列決定反応の最適化のための方法をさらに提供する。例えば、ｄＮＴＰ濃度は、ＤＮＡプライマーへの正しくないヌクレオチドの誤った取り込みを減少させるために、低くされ得る。正しくないｄＮＴＰのＫｍ値は、正しいヌクレオチドよりも１０００倍ほど高くなり得、これは、ｄＮＴＰ濃度の減少が、ヌクレオチドの誤った取込みの速度を減少させ得ることを示す。従って、本発明の好ましい実施形態において、配列決定反応におけるｄＮＴＰ濃度は、約５〜２０μＭである。この濃度での取込み速度は、可能な限り、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの最大速度（４００ヌクレオチド／秒）に近い。
【００３７】
さらに、比較的短い反応時間を用いて、誤った取込みの確率を減少し得る。最大速度（約４００ヌクレオチド／秒）に近付いた取込み速度に対して、約２５ミリ秒（ｍｓ）反応時間は、プライマー鎖の９９．９９％の伸長を確実にするのに十分である。
【００３８】
本発明の特定の実施形態において、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼは、正しいｄＮＴＰの非存在下で起こるプライマーのヌクレオチド鎖分解性分解を制限された反応性配列決定のために用いられ得る。４種類全てのｄＮＴＰの存在下で、ヌクレオチド鎖分解性プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる誤った取込みの頻度は、ＥｃｈｏｌｓならびにＧｏｏｄｍａｎ（１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６０；４７７−５１１）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９３，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ，２８：８３−１２６）；およびＬｏｅｂおよびＫｕｎｋｅｌ（１９８２，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５２：４２９−４５７）において検討されるように、１０６〜１０８回のヌクレオチド取込みのうち１回のエラーほどの低さである。プルーフリーディング非存在下では、ＤＮＡポリメラーゼエラー率は、代表的に、およそ１０４〜１０６回のうち１回ほどである。エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を増大させるが、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼの使用は、本発明の反応性配列決定法について、技術的な困難を持ち出し得る。エキソヌクレアーゼは、あらゆる誤って取込まれたヌクレオチドを除去するだけでなく、次のテンプレート塩基に対して相補性の正しいｄＮＴＰの非存在下において、塩基が反応セル中のｄＮＴＰと相補的なテンプレート配列上の点に到達するまで、正しく対合したヌクレオチドも連続的に除去する。この点で、アイドリング反応が、ポリメラーゼが、どこで正しいｄＮＭＰを繰り返し取込み、次いでその正しいｄＮＭＰを除去するかを確立する。正しいｄＮＴＰが存在する場合にのみ、ポリメラーゼ活性速度がエキソヌクレアーゼ速度を越え、その結果、アイドリング反応が確立され、プライマーの３’末端での正しいヌクレオチドの取込みを維持する。
【００３９】
特定のアミノ酸置換を含む多数のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、減弱したエキソヌクレアーゼ活性（野生型酵素の１／１０，０００のレベル）を有する。例えば、Ｒｅｈａ−ＫｒａｎｔｚおよびＮｏｎａｙ（１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７１００−１７１０８）は、Ｔ４ポリメラーゼにおいて、Ａｓｐ  １１２がＡｌａと、そしてＧｌｕ  １１４がＡｌａと置換された（Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ）場合、これら２つのアミノ酸置換は、野生型酵素に比べて約３００倍、２本鎖ＤＮＡに対するエキソヌクレアーゼ活性が減弱した。このような変異体は、ＤＮＡプライマー／テンプレート系へのヌクレオチドの取り込みについて、本発明の実施において、有利に用いられ得る。
【００４０】
本発明のなお別の実施形態では、ＤＮＡプライマー／テンプレートへの正しいヌクレオチドの取り込みにおいて、野生型ポリメラーゼより正確なＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。例えば、Ｉｌｅ４１７がＶａｌにより置換された第３の変異を有する（Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ）変異体Ｔ４ポリメラーゼ（Ｉ４１７Ｖ／Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ）において、このＩ４１７Ｖ変異は、このポリメラーゼに関して、抗変異原性表現型をもたらす（Ｒｅｈａ−ＫｒａｎｔｚおよびＮｏｎａｙ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５６３５−５６４３；Ｓｔｏｃｋｉら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：１５−２８）。このポリメラーゼが、野生型ポリメラーゼより頻繁にポリメラーゼ部位からエキソヌクレアーゼ部位にプライマー末端を移動させ、それ故、野生型ポリメラーゼより頻繁に校正し、それ故合成の正確性を増大する傾向があるので、この抗変異性表現型が生じる。
【００４１】
本発明のなお別の実施形態において、テンプレートＤＮＡ系分子に蛍光標識ヌクレオチドをより効率的に取り込み得るポリメラーゼ変異体が、本発明の実施において使用され得る。蛍光標識ヌクレオチドの取り込み効率は、ポリメラーゼの活性部位におけるｄＮＴＰの相互作用を阻害し得る、かさ高いフルオロフォア標識の存在によって低減され得る。ＤＮＡへの蛍光標識されたｄＮＴＰの取り込みのために有利に使用され得るポリメラーゼ変異体としては、米国特許出願番号０８／６３２，７４２（１９９６年４月１６日出願）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるポリメラーゼ変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、反応性配列決定方法は、２サイクル系を利用する。エキソヌクレアーゼ−欠損ポリメラーゼが、第１サイクルにおいて使用され、そしてエキソヌクレアーゼ−欠損酵素およびエキソヌクレアーゼ能のある（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）酵素の混合物が、第２サイクルにおいて使用される。第１サイクルにおいて、エキソヌクレアーゼ−欠損ポリメラーゼを共に含むプライマー／テンプレート系が、可能性のある４つのヌクレオチドの各々で順次に表される。反応時間および反応条件は、十分なプライマーの画分が伸長して、ヌクレオチドの取り込み（複数単一塩基反復の正確な定量のためには約９８％）の検出および定量を可能にするような反応時間および反応条件である。第２サイクルにおいて、正しいヌクレオチドの同定後、エキソヌクレアーゼ−能のあるポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ−欠損ポリメラーゼの混合物または両方の型の活性を含むポリメラーゼが、第１サイクルにおいて同定された正しいｄＮＴＰと共に第２サイクルに添加され、プライマー伸長が完了および校正される。このようにして、正しいｄＮＴＰが存在する場合、エキソヌクレアーゼ−能のあるポリメラーゼは、反応セル中に存在するだけであり、その結果、正しく伸長された鎖のヌクレオチド鎖分解性の分解は起こらないが、予め誤って伸長された鎖の分解および正しい再伸長は起こり、それ故、極めて正確な鎖伸長が達成される。
【００４３】
ＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長反応の検出は、多くの様式で達成され得る。例えば、伸長反応により産生された熱が、種々の異なる技術（例えば、サーモパイル、サーミスターおよび屈折率測定を用いる技術）を用いて測定され得る。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長反応により産生された熱が、測定され得る。例えば、唯一の熱量（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍａｓｓ）としての１μｇの水およびセル中に拘束された２×１０１１のＤＮＡテンプレート分子（３００ｆｍｏｌ）を含む１００μｍ３の反応セル容量において、水の温度は、単一のヌクレオシド一リン酸によりプライマーを伸長するポリメラーゼ反応について１×１０３℃増加する。この計算は、ＤＮＡ鎖中の１塩基対伸長が、発熱反応であり、そしてこの反応に伴うエンタルピーの変化が３．５ｋｃａｌ／塩基のモル、であるという実験的決定に基づく。従って、単一の塩基による３００ｆｍｏｌのプライマーの伸長は、３００ｆｍｏｌ×３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌすなわち１×１０−９ｃａｌの熱を産生する。これは、１μｇの水の温度を、１×１０−３℃上昇させるのに十分である。このような温度変化は、サーミスター（感度≦１０−４℃）；サーモパイル（感度≦１０−５℃）；および屈折率測定（感度≦１０−６℃）を用いて用意に検出され得る。
【００４５】
本発明の特定の実施形態において、サーモパイルは、温度変化を検出するために使用され得る。このようなサーモパイルは、温度に対して高感度を有することが公知であり、そして数秒の時定数において数十マイクロ度（ｍｉｃｒｏ−ｄｅｇｒｅｅ）の範囲で測定し得る。サーモパイルは、２種の異なる金属の接合部の連続セットを構築し、そして交互の接合部が空間的に分離されるように接合部を物理的に配置することによって製造され得る。１セットの接合部は、一定の参照温度で維持され、もう一方の接合部の代りのセットは、温度が感知されるべき領域に配置される。２つの接合部セット間の温度差は、温度差、接合部の熱電性計数（ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）および接合部の数に比例する、接合部セットに亘る電位差を産生する。最適な応答のために、大きな熱電性計数を有するバイメタル対（例えば、ビスマスおよびアンチモン）が望ましい。サーモパイルは、蒸発された金属蒸気が、特別に製造されたマスクを通して絶縁基材上に蒸着される、薄層蒸着技術を使用して製造され得る。本発明の実施において使用され得るサーモパイルとしては、米国特許第４，９３５，３４５号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるようなサーモパイルが挙げられる。
【００４６】
本発明の特定の実施形態において、金属蒸着技術によって製造される小型薄層サーモパイル（例えば、米国特許第４，９３５，３４５号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される小型薄層サーモパイル）は、エンタルピーの変化を検出するために使用され得る。このようなデバイスは、約１０ｍｍ平方のマスクを通しての真空蒸着法により作製されている。フォトリソグラフィーの方法（スパッタエッチング技術および逆リフト−オフ技術）を使用して、２ｍｍ平方ほどの小さいデバイスが、現代の微小リソグラフィー技術の援助なしで構築され得る。これらのデバイスは、１５０個の熱電性接合部を備え、そして１２ミクロンの線幅を用い、そして流動中（好ましくはサーモパイルの表面に酵素が固定される）で酵素触媒反応の発熱を測定し得る。
【００４７】
反応性配列決定デバイスにサーモパイル検出技術を組み込むために、薄層ビスマス−アンチモンサーモパイル２（図１に示す）は、交互の薄いビスマスおよびアンチモンのワイヤー（これらは、連結されて２セットのビスマス−アンチモン熱電対接合部を形成する）のジグザグのアレイを作製するために、２つの異なるフォトリソグラフィーにより製造されたマスクを通して、ビスマス金属およびアンチモン金属を連続的に電子ビーム蒸着することにより製造され得る。現代の微小リソグラフィー技術は、以前に作製されたデバイスより少なくとも１オーダーの規模で小さいデバイス（すなわち、１μｍ程度の小さい線幅および１００μｍ２のオーダーの全体寸法）の製造を可能にする。１セットの接合部４（センサー接合部）は、反応セル６内に配置され（すなわち、反応セルの壁に沈積され）、一方接合部８の第２の参照セットは、参照点（この温度は、一定に保たれる）でセルの外側に配置される。センサー接合部と参照接合部との間の任意の温度差は、デバイスに亘って産生される電位を生じ、この電位差は、デバイスのいずれかの末端で測定点１２に連結された高分解能デジタル電圧計１０によって測定され得る。反応セルおよび参照接合部の温度が、ポリメラーゼ反応事象の非存在下で同じであることは必要でなく、ポリメラーゼ反応事象に起因するセンサー接合部の温度差が、サーモパイルに亘って産生される電圧の変化として検出可能であることのみが必要である。
【００４８】
サーモパイルに加えて、図２に示されるように、サーミスター１４がまた、ＤＮＡポリメラーゼに媒介される、ＤＮＡプライマー鎖へのｄＮＭＰの取り込みにより生じる反応セル６中の温度変化を検出するために使用され得る。サーミスターは、酸化マンガン、酸化ニッケル、および酸化コバルトのような酸化金属の焼結混合物からなる半導体である。この物質は、大きな抵抗の温度係数（代表的には、１℃あたり約４％）を有し、それ故、その抵抗が、安定で、高分解能の抵抗測定デバイス（例えば、デジタル電圧計（例えば、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２００２））でモニタリングされる場合、極めて小さい温度変化を感知し得る。図２に示されるようなサーミスター１４は、加熱プレスされた酸化ニッケル、酸化コバルトおよび酸化マンガンからなる単一の標的から、反応セルの表面へ活性なサーミスター物質の薄層をスパッタ堆積することによって反応性配列決定反応セル中に製造され得る。反応セルの壁を越えて外側に延びる金属相互接続１６はまた、別個の工程において製造され得、その結果、サーミスターの抵抗は、外部測定デバイス１８を使用して測定され得る。
【００４９】
温度変化はまた、屈折率測定技術を使用して感知され得る。例えば、Ｂｏｒｎｈｏｐ（１９９５，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ３４：３２３４−３２３）および米国特許第５，３２５，１７０号に記載されるような技術は、キャピラリー中の液体の屈折率変化を検出するために使用され得る。このような技術において、低出力Ｈｅ−Ｎｅレーザーは、キャピラリーに対する正しい角度には不適切であり、そして複数の内部屈折を受ける。ビームの部分は、液体を通って進むが、残りは、キャピラリーの外壁の外へのみ屈折する。２つのビームは、液体とキャピラリーとの間の屈折率の差に依存して、異なる位相シフトを受ける。この結果は、温度により引き起こされる屈折率変化を非常に受けやすい周辺位置での干渉縞である。
【００５０】
本発明のさらなる実施形態において、この系の温度応答は、ｄＮＴＰ溶液と共にテンプレート系と接触される無機ピロホスファターゼ酵素の存在によって増強され得る。さらに、テンプレート系への取り込みの際にｄＮＴＰから放出されるピロリン酸が、無機ピロホスファターゼ酵素により加水分解されるにつれて、熱が放出される。
【００５１】
別の実施形態において、ｄＮＴＰの取り込みの際に放出されるピロリン酸は、テンプレート系から取り出され、そして加水分解され、そして結果として生じた熱が、下流にある別個の反応セル中で、サーモパイル、サーミスター、または屈折率方法を用いて検出される。この反応セルにおいて、無機ピロホスファターゼ酵素は、溶液中でＤＮＡテンプレート系から取り出されたｄＮＴＰと混合され得るか、あるいは、この無機ピロホスファターゼ酵素は、反応セルの壁に共有結合され得る。
【００５２】
あるいは、このヌクレオチド塩基のポリメラーゼ触媒取り込みは、蛍光検出スキームまたは化学発光検出スキームを用いて検出され得る。ＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長は、蛍光シグナルまたは化学発光シグナルが、伸長しているＤＮＡプライマー鎖への蛍光標識されたｄＮＭＰまたは化学発光標識されたｄＮＭＰの取り込みの際に産生される場合に検出される。このようなタグは、ポリメラーゼの作用に干渉しないような様式でヌクレオチドに結合される。例えば、このタグは、かさ高いフルオロフォアが酵素の活性部位から離れて動くのに十分な長さのリンカーアームによりヌクレオチド塩基に結合され得る。
【００５３】
このような検出スキームを使用するために、ヌクレオチド塩基は、伸長しているＤＮＡプライマー／テンプレートへのｄＮＴＰの取り込み後に蛍光シグナルまたは化学発光シグナルを産生するような化合物を共有結合することによって、標識される。ｄＮＴＰを標識するための蛍光化合物の例としては、フルオレセイン、ローダミン、およびＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手可能）を参照のこと。本発明の配列決定方法において使用され得る化学発光ベースの化合物の例としては、ルミノールおよびジオキセタノンが挙げられるが、これらに限定されない（ＧｕｎｄｅｒｍａｎおよびＭｃＣａｐｒａ、「Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｌｅｂｅｒｇ、１９８７を参照のこと）。
【００５４】
蛍光標識されたｄＮＴＰまたは化学発光標識されたｄＮＴＰは、プライマーにアニーリングされたテンプレートＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよび適切な緩衝液条件を含むＤＮＡテンプレート系に個々に添加される。反応間隔の後、過剰のｄＮＴＰは、除去され、そしてこの系は、蛍光タグ化ヌクレオチドまたは化学発光タグ化ヌクレオチドが、ＤＮＡテンプレートに取り込まれたかどうか検出するために調べられる。取り込まれたヌクレオチドの検出は、利用されたタグの型に依存する異なる方法を用いて、達成され得る。
【００５５】
蛍光タグ化ｄＮＴＰについて、ＤＮＡテンプレート系は、タグ要素によって強く吸収される波長の光学的放射で照射され得る。タグからの蛍光は、例えば、励起波長の任意の散乱光を排除する光学フィルターを一緒に備える光検出器を使用して検出される。
【００５６】
先に取り込まれたヌクレオチドの標識は、最後に取り込まれたヌクレオチドにより産生されるシグナルに干渉するので、各伸長反応の完了時に、蛍光タグが除去されることが不可欠である。蛍光タグの除去を容易にするために、タグは、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４２５９−４２６７）およびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｋ．ら（１９９７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５−５１６８）により記載されるような方法を用いて、化学的にかまたは光化学的に切断可能なリンカーを介してヌクレオチドに結合され得、その結果、蛍光タグは、新たな伸長反応が行われる前に、ＤＮＡテンプレート系から除去され得る。
【００５７】
蛍光検出を利用するさらなる実施形態において、蛍光タグは、光切断可能なリンカーまたは化学的に切断可能なリンカーによってｄＮＴＰに結合され、そしてこのタグは、伸長反応後に脱離され、そしてテンプレート系から検出セルへ取り出され、ここで、タグの存在および量が、適切な波長における光学的励起および蛍光の検出によって決定される。この実施例において、テンプレートの単一塩基反復領域に相補的に伸長されたプライマー鎖上の互いにすぐ近接した複数の蛍光タグの存在に起因する、蛍光クエンチングの可能性は最小化され、そして反復の数が決定され得る正確性が、最適化される。さらに、別個のチャンバーにおける蛍光の励起は、ＤＮＡプライマー／テンプレート系に対する光分解性の損傷の可能性を最少にする。
【００５８】
蛍光検出を利用するさらなる実施形態において、蛍光タグからのシグナルは、蛍光部分を特異的に標的とし、そして反応して、もはや蛍光性でない最終産物を形成する化学反応を用いて破壊され得る。この実施形態において、ヌクレオチド塩基に結合された蛍光タグは、伸長および蛍光シグナルの検出の後に、タグを除去することなく破壊される。特定の実施形態において、ｄＮＴＰ塩基に結合されたフルオロフォアは、励起状態の蛍光部分から電子を抽出し、それにより蛍光部分のラジカルイオン（これは、次いで反応して、もはや蛍光性でない最終産物を形成する）を産生し得る化合物との反応により、選択的に破壊され得る。さらに特定の実施形態において、蛍光タグからのシグナルは、伸長および蛍光標識の検出の後に、ジフェニルヨードニウム塩のカチオンとの光化学反応により破壊される。取り込まれたヌクレオチド塩基に結合された蛍光タグは、反応セルへのジフェニルヨードニウム塩の溶液の添加、それに続くＵＶ光照射により、タグを除去することなく破壊される。ジフェニルヨードニウム塩溶液は、除去され、そして反応性配列決定が続けられる。この実施形態では、蛍光タグが、除去される必要がないので、化学的または光化学的に切断可能なリンカーを有するｄＮＴＰを必要としない。
【００５９】
この技術のさらなる実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ媒介伸長反応によって産生される応答は、増幅され得る。この実施形態において、ｄＮＴＰは、化学的にかまたは光分解的にかのいずれかで切断され得るリンカーを介するシグナリングタグの共有結合によって、化学的に改変される。このｄＮＴＰをプライマー／テンプレート系へ曝露し、そして取り込まれていない全ての化学的に改変されたｄＮＴＰを洗い流した後、取り込まれた任意のシグナリングタグが、化学反応または光分解反応によって脱離され、そして反応チャンバーから増幅チャンバーへ流し出され、ここで増幅されたシグナルが、産生および検出され得る。
【００６０】
増幅されたシグナルを産生するために、種々の方法が使用され得る。１つのこのような方法において、シグナリングタグは、触媒機能を有する。触媒性タグが切断され、そしてその基質と反応させられる場合、多くのサイクルの化学反応が、反応エンタルピーの対応する増倍と共に、触媒性タグ１モルあたり多くのモルの生成物を産生することを確実にする。反応産物が、色または吸光度のようないくつかの性質を介して検出されるか、または増幅された熱産生が、熱センサーによって検出されるかのいずれかである。例えば、酵素が、十分な長さの切断可能なリンカーアームを介してｄＮＴＰに共有結合される場合、この酵素は、ポリメラーゼ酵素の活性部位に干渉しない。ＤＮＡプライマー鎖への取り込みの後、その酵素は脱離され、そして第２のリアクタ容量に移され、ここで、その特異的基質との相互作用することが可能であり、このことによって、各酵素分子が、多くの反応のサイクルを実行するにつれて、増幅された応答が得られる。例えば、酵素カタラーゼ（ＣＡＴ）は、以下の反応：
ＣＡＴ
Ｈ２Ｏ２→Ｈ２Ｏ＋１／２Ｏ２＋約１００ｋＪ／ｍｏｌ  熱
を触媒する。各ｄＮＴＰが、ｄＮＭＰの取り込みの後、脱離され、その下流で過酸化水素と反応させられるカタラーゼ分子でタグ化される場合、各ヌクレオチドの取り込みは、約２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ×Ｎの熱（Ｎは、カタラーゼにより分解される過酸化水素分子の数である）を産生する。過酸化水素の分解熱は、ヌクレオチドの取り込みに対する熱（すなわち、３．５〜４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）より約６〜８倍高い。約１００〜１５０個の過酸化水素分子の分解について、１塩基の取り込みあたって産生される熱量は、非増幅反応の熱量の１０００倍に達する。同様に、有色生成物を産生する酵素（例えば、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）において一般に使用される酵素）は、脱離可能なタグとして組み込まれ得る。例えば、酵素アルカリホスファターゼは、無色のｐ−ニトロフェニルホスフェートを有色の生成物（ｐ−ニトロフェノール）に変換し；酵素西洋ワサビペルオキシダーゼは、無色のｏ−フェニレンジアミンヒドロクロリドをオレンジ色の生成物に転換する。これらの酵素をタンパク質（例えば、抗体）に連結するための化学は、当業者に周知であり、そしてこれらの酵素をポリメラーゼ酵素の活性部位から一定の距離に維持するリンカーアームを介して、酵素をヌクレオチド塩基に連結するように適合され得る。
【００６１】
さらなる実施形態において、シグナリングタグが、熱センサー（例えば、サーモパイルまたはサーミスター）に装着されるか、または熱センサーの近傍に保持される細胞における活性応答を刺激し得る存在物である場合、増幅された熱シグナルが産生され得る。ＰｉｚｚｉｃｏｎｉおよびＰａｇｅ（１９９７，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １２：４５７−４６６）は、回収され、そして培養されたマスト細胞集団が、カルシウムイオノフォアにより活性化され、１細胞あたり１０〜３０ｐｇ（１００〜３００ｆｍｏｌ）までのヒスタミンを放出するようにエキソサイトーシスを実施し得ることを報告した。エキソサイトーシスを導く複数の細胞反応は、それら自体が発熱性である。このプロセスは、ヒスタミンを過酸化水素およびイミダゾールアセトアルデヒドに酸化するために酵素デアミンオキシダーゼを使用し、そして過酸化水素を不均衡にするために酵素カタラーゼを使用してさらに増幅される。２つの反応が一緒に、ヒスタミン１モルあたり１００ｋＪを越える熱を放出する。例えば、カルシウムイオノフォアは、リンカーアーム（これは、連結されるカルシウムイオノフォアをポリメラーゼ酵素の活性部位から遠ざけ、そして化学的にか、または光化学的に切断可能である）を介してｄＮＴＰ塩基に共有結合される。ＤＮＡポリメラーゼに触媒される取り込み工程および取り込まれていないヌクレオチドを洗い流す工程に続いて、取り込まれたヌクレオチドに結合されたままの任意のカルシウムイオノフォアが、切断され得、そしてＰｉｚｚｉｃｏｎｉおよびＰａｇｅ（１９９７，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １２：４５７−４６６）に記載されるようなマスト細胞ベースのセンサーを備える検出チャンバーへ、下流に洗い出される。カルシウムイオノフォアは、熱の産生を伴ってヒスタミンの放出を刺激するマスト細胞上のレセプターに結合する。この熱産生は、ヒスタミンを過酸化水素およびイミダゾールアセトアルデヒドに酸化するためにデアミンオキシダーゼを導入し、そして過酸化水素を不均衡にするために酵素カタラーゼを導入することのよって、さらに増幅される。従って、反応チャンバー内にあるか、または反応チャンバーに接触しているサ−モパイルまたはサーミスターによって容易に検出され得る有意に増幅された熱シグナルが産生される。
【００６２】
化学発光検出を使用するさらなる実施形態において、化学発光タグは、光切断可能なリンカーまたは化学的に切断可能なリンカーによってｄＮＴＰに結合される。このタグは、伸長反応の後、脱離され、そしてテンプレート系から検出セル（ここで、タグの存在および量が、適切な化学反応および産生される光の鋭敏な光学検出によって決定される）へ取り出される。この実施形態において、テンプレート内の単一塩基反復領域に相補的に伸長したプライマー鎖における、互いにすぐ隣接する複数の化学発光タグの存在に起因する非直線的な光学応答の可能性は、最少にされ、そして正確性（これにより反復数が決定され得る）が、最適化される。さらに、別個のチャンバーおける化学発光の産生は、ＤＮＡプライマー／テンプレート系に対する化学的損傷を最小にし、そうでなければＤＮＡプライマー／テンプレートを化学的に損傷する過酷な化学条件下での検出を可能にする。このようにして、化学発光タグは、化学発光条件とＤＮＡプライマー／テンプレートとの適合性を問わずに、化学発光反応の速度、またはタグ化ｄＮＴＰのポリメラーゼ酵素との適合性を最適化するように選択され得る。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態において、各伸長反応後にテンプレート系から取り出されたｄＮＴＰ溶液の濃度が、ｄＮＴＰの濃度の変化、または蛍光タグ化ｄＮＴＰの蛍光応答の変化に起因するＵＶ吸光度の変化を検出することによって測定され得る。伸長されたテンプレートへのヌクレオチドの取り込みは、テンプレート系から取り出されるヌクレオチドの減少した濃度を生じる。このような変化は、各伸長サイクル後にテンプレート系から取り出される緩衝液のＵＶ吸光度を測定することによって検出され得る。
【００６４】
本発明のさらなる実施形態において、プライマー鎖の伸長は、単一のＤＮＡ分子からの蛍光を感知し得るか、または単一のＤＮＡ分子の像を解析し得るデバイスによって感知され得る。単一の分子からの蛍光を感知し得るデバイスとしては、共焦点顕微鏡および近距離（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ）光学顕微鏡が挙げられる。単一の分子の像を解析し得るデバイスとしては、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が挙げられる。
【００６５】
本発明のこの実施形態において、結合したプライマーを有する単一のＤＮＡテンプレート分子は、表面に固定され、そしてポリメラーゼ酵素および他の必須の電解質とともに単一型のｄＮＴＰを含む緩衝溶液に曝露する前および曝露した後、光学顕微鏡またはＳＴＭまたはＡＦＭを用いて見られる。光学顕微鏡が使用される場合、単一の分子が、蛍光タグ化ｄＮＴＰ溶液に順次に曝露され、そして前述の通りに、過剰の未反応ｄＮＴＰが取り除かれた後、蛍光タグを検出することによって、取り込みが感知される。また前述のように、取り込まれた蛍光タグは、次にタグが検出され得る前に、切断され、そして廃棄されねばならない。ＳＴＭまたはＡＦＭを用いて、プライマー鎖の長さの変化が、ｄＮＴＰの取り込みを検出するために画像化される。あるいは、ｄＮＴＰは、物理的にかさ高い、ＳＴＭまたはＡＦＭにおいてより容易に見ることが出来る分子でタグ化され得、そしてこのかさ高いタグは、各新規取り込み反応の前に除去および廃棄される。
【００６６】
この様式で単一分子テンプレートを配列決定する場合、誤ったシグナルおよびフェーズの一致しない（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｈａｓｅ）鎖伸長を生じる不完全な反応の可能性は、存在せず、そして読む長さにおける結果的な制限は、該当しない。単一分子テンプレートについて、反応は、起こるか、または起こらないかのいずれかであり、そして反応が起こらない場合、伸長は中断し、そして中断したことが知られるか、または次のサイクルにおいて正しいｄＮＴＰを用いて正しい伸長が起こる。誤ったヌクレオチドが取り込まれる事象において、この事象は、以前に考察されたより多くの複数鎖プロセスと同じ確率を有し、例えば、１０００のうち１のエラーが、配列中に記録されるが、このエラーは、広がりもせず、次の読み出しに影響を与えもしないので、読む長さは、誤った取込みにより制限されない。
【００６７】
（５．１．ＤＮＡポリメラーゼの誤りの検出および補正）
反応性配列決定プロセスにおいて、伸長の失敗が、代表的に、伸長反応の速度論および単一のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いる各伸長試行に分配される時間の量の制限に起因して生じる。反応が、ｄＮＴＰ供給のフラッシュによって終結される場合、プライマー鎖のいくらかの小さい画分が、伸長されないままであり得る。引き続くｄＮＴＰ反応サイクルにおけるこれらの鎖は、伸長され続けるが、大部分の鎖と同調せず、小さな異相シグナルを生じる（すなわち、大部分の鎖の伸長に対して正しくない、追加されたｄＮＴＰのポジティブな組み込みのシグナルを発する）。伸長の失敗は、統計的に、任意の伸長事象において生じ得、これらの異相シグナルは、伸長の失敗を有する鎖の集団が増大するにつれて増加する。最終的に、異相シグナルは、大部分の鎖の正しい伸長に起因するシグナルに匹敵する振幅になり、そして配列が読み取り不可能になり得る。その配列が読み取り不能になったときにそのプライマーが（それまで）伸長された長さは、配列決定読取長として公知である。
【００６８】
本発明は、２つの様式で（第一に、同相シグナルと異相シグナルとの間を弁別すること、そして第二に、異相シグナルを伸長させて大部分の鎖と同相に戻すように選択的に、ｄＮＴＰプローブ配列が変化され得る位置および方法を計算することによって）配列決定読取長を伸ばし得る方法に関する。
【００６９】
具体的には、同相配列決定シグナルと異相配列決定シグナルとの間の弁別のための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）誤差シグナルを検出および測定する工程であって、これによって、トレーリング鎖集団の大きさを決定する工程；
（ｉｉ）トレーリング鎖プライマーの３’末端とリーディング鎖プライマーの３’末端との間；
（ｉｉｉ）伸長の失敗の発生を、リーディング鎖の３’末端より上流の地点でシミュレートする工程であって、これによって、各伸長工程において、トレーリング鎖の３’末端が伸長したリーディング鎖によって以前に横断された、その配列における正確な地点を予測する、工程；
（ｉｖ）導入したｄＮＴＰの各々について、トレーリング鎖の正確な伸長から期待されるシグナルを予測する工程；および
（ｖ）予測されたシグナルを測定されたシグナルから減算して、リーディング鎖集団の正確な伸長のみに起因するシグナルを得る工程
（ｖｉ）。
【００７０】
「上流」とは、プライマー鎖に正しく組み込まれた塩基の既知の配列をいう。「下流」とは、３’末端を越えた配列をいう。従って、リーディング鎖集団について、下流配列は未知であるが、まだ読み取られていないテンプレートの鎖の配列によって予め決定される；トレーリング鎖集団について、下流配列は、トレーリング鎖の３’末端とリーディング鎖の３’末端との間のギャップについて既知である。
【００７１】
リーディングプライマー鎖とトレーリングプライマー鎖との間のギャップは１塩基、２塩基または３塩基であり得る（ここで、任意の長さの単一塩基の反復（例えば、ＡＡＡＡ）は、単一の塩基として数えられる。なぜなら、正しいｄＮＴＰが導入される場合、反復全体が、単一の反応サイクルにおいて横断されるからである）が、４つのｄＮＴＰの反応サイクルが変化せず、そして他の反応の誤り（例えば、同じプライマー鎖における第二の伸長の失敗）が起こらない場合、３塩基を決して超え得ず、かつ自発的に０に収縮し得ない。４つのｄＮＴＰの反応サイクルが変化しない場合、正しいｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ）が反応チャンバー内に存在する場合に伸長に失敗したプライマー鎖は、３塩基を超えてリーディング（主要な）鎖（伸長した）に後続し得ないことが、理解される。なぜなら、ｄＮＴＰ反応サイクルにおける第四の塩基は、常に再度、先に伸長に失敗した鎖に対して正しい塩基（ｄＡＴＰ）であるからである。同様に、伸長が引き続いて正しく進行する場合、伸長の失敗から生じるトレーリング鎖は、リーディング鎖と決して再同期し得ない。なぜなら、リーディング鎖は、トレーリング鎖が欠失したＡを追加し得る前に、少なくとも１つ以上のヌクレオチド（Ａ伸長の失敗の議論の例においては、Ｇ、Ｔ、またはＣ）が常に伸長しているからである。この影響は、各完全なｄＮＴＰサイクルの後に、トレーリング鎖が常に、配列の所定の地点において１回の完全なｄＮＴＰサイクルにおいて追加される塩基を表す伸長量で、リーディング鎖に従うことである。さらなる結果は、単一の失敗を受けた全てのトレーリング鎖が、伸長の失敗が起こった地点にかかわらず互いに同相であることである。
【００７２】
本明細書中に記載される方法を利用して、伸長の失敗によって生じる誤ったシグナルに高レベルの免疫性を提供することによって、反応性配列決定の技術によって達成され得る読取長を有意に伸ばし得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の弁別方法は、コンピューターに基づく。
【００７３】
第一に、読み出しシグナルの決定は、リーディング鎖集団の正しい伸長に起因するシグナルと、伸長の失敗から生じるトレーリング鎖の集団の伸長から生じる誤差シグナルとの間の、リアルタイム弁別を可能にする。この情報を使用して、正確な配列読み出しが、トレーリング鎖シグナルが正しいリーディング鎖シグナルをマスクし始める地点を有意に超えて得られ得る。実際に、トレーリング鎖シグナルは、リーディング鎖シグナルから常に弁別され得るので、その配列がトレーリング鎖集団において発生したシグナルから読み取られ、そしてリーディング鎖シグナルが、補正されるべき誤差シグナルとして処理される地点まで、リーディング鎖を犠牲にしてトレーリング鎖集団を成長させ続けることが可能である。最終的に、プライマー鎖が少なくとも１つの伸長の失敗を受ける確率が１に近付くにつれて、リーディング鎖集団からのシグナルが消失する。相応して、トレーリング鎖が第二の伸長の失敗を受ける確率が増加する；二重に失敗した鎖のこの第二の集団からのシグナルは、モニタリングされ得、そして単一の失敗の鎖のシグナルは、失敗のない鎖のシグナルが単一の失敗の鎖に起因するシグナルについて補正された様式と全く同じ様式で補正され得る。
【００７４】
第二に、リーディング鎖配列の知識は、この既知の配列に対する伸長の失敗の影響をコンピューターにおいてシミュレートすることによって、トレーリング鎖が進行した地点を知ること、ならびにこれらの鎖とリーディング鎖との間の１塩基、２塩基または３塩基の間隔を知ることを可能にするので、所定のテンプレート配列について、ｄＮＴＰプローブサイクルは、任意の地点で変更されて、トレーリング鎖を選択的に伸長させ得、一方でリーディング鎖を伸長させず、これによって、集団を再度同期させる。あるいは、リーディング鎖とトレーリング鎖との間のギャップは、コンピューターでシミュレートされ得、そしてこのギャップは、ギャップが単一の塩基に収縮する場合にはいつでも、ｄＮＴＰサイクルを逆転させることによって排除され得る。これらのプロセスは、「ヒーリング」と称される。多数の異なる配列が同一のｄＮＴＰ試薬と平行して読み取られる場合、所定の配列における伸長の失敗の鎖をヒーリングするために正しい、変化したｄＮＴＰプローブサイクルは、他の配列をヒーリングするためには正しくないかもしれない。しかし、十分に多くの平行した配列読み出しを用いて、これらの配列のうちのおよそ３分の１が、任意の地点に１塩基ギャップを有するトレーリング鎖を有し、従って、任意の間隔でのｄＮＴＰプローブサイクルの逆転が、伸長の失敗のギャップを有する読み出しのおよそ３分の１をヒーリングする。ｄＮＴＰプローブサイクルの反復された任意の逆転は、最終的に、全ての読み取りのおよそ３分の２をヒーリングする。これらの誤差補正および誤差排除のプロセスの全体の効果は、伸長の失敗から生じる読取長に対する任意の制限を減少させるか、または排除することである。
【００７５】
伸長の失敗により付与される読取長の制限を克服する能力は、実験設計における有意なさらなる融通性を提供する。例えば、読取長は、伸長の失敗によって制限されず、むしろ、正しくないヌクレオチドの誤った取り込み（これは、影響を受けた鎖の伸長を遮断し、そしてシグナルを定常的に減少させ、最終的に、所望の精度で検出可能ではない地点まで減少させる）によって制限されることは、あり得る。この場合、伸長の失敗の影響を排除する能力は、伸長の失敗の増加した発生を犠牲にして、誤った取り込みが最小にされるような様式で反応条件を実験者が変化させる、より大きな融通性を可能にする。誤った取り込みの頻度は、部分的に、プロービングｄＮＴＰの濃度および許容される反応時間に依存する。より長い反応時間、またはより高いｄＮＴＰ濃度は、誤った取り込みの増加した確率を生じるが、伸長の失敗の発生を減少させる。従って、より高レベルの伸長の失敗は、例えば、コンピューター支援シグナル弁別およびｄＮＴＰサイクル逆転ヒーリング方法に起因して許容され得、次いで、反応時間および／またはｄＮＴＰ試薬濃度が低下されて、誤った取り込みを最小にし得、その結果の伸長の失敗の増加は、上記コンピューター支援シグナル弁別および／またはｄＮＴＰサイクル逆転ヒーリング技術によって相殺される。
【００７６】
ポリメラーゼ反応のために使用されるデオキシリボヌクレオチドが不純である場合、鎖の小部分は、主要なヌクレオチドが正しくない場合に伸長し、そして誤ったトレーリング鎖ではなく誤ったリーディング鎖の集団を生じる。トレーリング鎖の場合と同様に、リーディング鎖集団は、同じ鎖上で第二の誤差が起こらない限り、主集団の前方に３塩基を決して超えず、そして１塩基より減少せず、そしてまた、不純物ｄＮＴＰによる正しくない伸長が起こる位置にかかわらず、リーディング鎖は全て、互いに同相である。所定の塩基部位は、正しいｄＮＴＰによって伸長されなければならない前に、正しくないｄＮＴＰで１回、２回または３回（例えば、平均２回）プローブされ得る。正しくないｄＮＴＰの各々が同じ割合のｄＮＴＰ不純物を含むと仮定される場合、正しくない伸長の確率（例えば、不純物として正しい相補塩基を含む９９％の純粋なｄＮＴＰによる）は、１％÷３（不純物の１／３のみが正しい相補塩基である）×２（各正しい伸長の間での平均２回の正しくない試行）であり、すなわち、０．６７％である。
【００７７】
トレーリング鎖の場合と同様に、リーディング鎖集団は、図１５に示されるように、大部分の鎖配列の読み出しを複雑にする、移動伸長シグナルを生じ得る。大部分の鎖の３’末端の下流の配列は、これらの鎖の伸長の時点では既知ではないので、リーディング鎖の伸長に起因するシグナルは、直接的には補正され得ず、そして変更されたｄＮＴＰサイクル（これは、所定のテンプレート配列についての大部分の鎖とリーディング鎖との間のギャップを自動的にヒーリングする）が計算され得る。しかし、類似の方法を使用して、リーディング鎖集団の影響を軽減し得る。第一に、トレーリング鎖の場合と同様に、ｄＮＴＰプローブサイクルの逆転は、ギャップが単一の塩基に収縮する場合は常に、リーディング鎖集団と大部分の鎖集団との間のギャップを自動的にヒーリングする。従って、ｄＮＴＰプローブサイクルの任意の逆転は、所定の配列についてギャップをヒーリングする１／３の確率を有する。すなわち、平行してプローブされた配列の大きな集団における配列の１／３をヒーリングする。任意の逆転を繰り返すと、最終的に、このようなギャップのおよそ３分の２をヒーリングする。第二に、大部分の鎖の３’末端の下流の配列は、直接的には既知ではないが、この配列についての情報は、大部分の鎖がギャップ領域を横断するとすぐに入手可能になる。従って、大部分の鎖の各伸長について、理想的にはコンピュータシミュレーションを使用して、リーディング鎖集団がその塩基をいつ横断したかを計算すること、従って、大部分の鎖の以前の伸長が汚染されたシグナルを計算することが可能である。この様式で、大部分の鎖伸長シグナルは、リーディング鎖シグナルについて逆向きに（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）補正され得る。
【００７８】
リーディング鎖の事象の発生の頻度を低下させる、リーディング鎖作製のための重要な局面が存在する。第一に、不純物ｄＮＴＰの濃度が十分に低い場合、リーディング鎖集団は、反復の第一の塩基の不純物の伸長によって、作製され得ない。このことは、同じ反応における同じ鎖上の２つの不純物塩基の正しくない取り込みの確率が、単一の取り込みの確率の二乗であり、従って、低い不純物レベルについては消失するほど小さいことに起因する。従って、反復長さの伸長のために正しいｄＮＴＰが供給される限り、鎖のいくらかの部分が１塩基の反復によって既に部分的に伸長されているか否かにかかわらず、正しいヌクレオチドが供給される場合、全ての鎖が完全に伸長する。第二に、正しくない伸長の全てが、永続的な位相差を生じるわけではない。永続的な位相差が生じるためには、主鎖がリーディング鎖に追い付くまで伸長するまでに、第二の伸長（正しい塩基による）が、リーディング鎖において起こらなければならない。次の４つの部位をテンプレート配列に沿って１、２、３、４と標識し、次いで、定義により、リーディング鎖が部位１での不純物塩基の組み込みによって作製され、一方で鎖の大部分が伸長しない場合、供給される主要なヌクレオチドは、部位１での伸長にとって正しくない。供給される主要なヌクレオチドが部位２での伸長のために正しい場合、２塩基のリードが作製される。反応チャンバーが部位２について正しいヌクレオチドを含む機会は、４分の１であるので、単一の工程（不純物伸長および引き続く正しい伸長）で２塩基伸長を作製する確率は、不純物伸長単独の確率の１／４である。上で言及された０．６７％の不純物伸長の確率については、このことは、単一のサイクルにおいて２塩基の伸長を作製する確率が０．１６％であることを意味する。
【００７９】
しかし、供給される主要なヌクレオチドが部位２におけるさらなる伸長のために正しくなく、そして定義により、部位１における伸長のために正しくない場合、リードが固定されるためには、部位１における伸長のために正しいヌクレオチドの前に、部位２のための正しいヌクレオチドが供給されなければならない。従って、部位２が部位１の前に伸長する確率は、５０％である；０．６７％の不純物伸長確率については、正しいヌクレオチドによる第二の伸長に起因する固定されたリードを作製する確率は、０．３３％である。全体として、１％の不純物レベルは、任意の所定の反応試行において、リーディング鎖を作製する約０．５％の確率を生じる。
【００８０】
本発明に従う特定の実施形態の準備が、ここでさらに詳細に記載される。これらの実施例は、説明を意図され、そして本発明は、これらの実施形態に記載される特定の材料および方法に限定されない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１）
微小熱量測定実験を実施した。これは、ＤＮＡポリメラーゼ反応の首尾よい熱検出を初めて実証する。その結果を、図３に示す。約２０単位のＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅを、約２０ｎｍｏｌのＤＮＡテンプレートおよび相補的プライマー、ならびに過剰のｄＮＴＰを含む３ｍＬの反応体積に注入した。このプライマーを、５２塩基対伸長させ、この予測された長さは、テンプレートの大きさを考慮した。市販の微小熱量計（ＴＡＭ  Ｍｏｄｅｌ  ２２７３：Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、１モルの塩基あたり３．５−４ｋｃａｌの反応エンタルピーを測定した（図３）。この測定は、十分に、ＤＮＡポリメラーゼ活性の熱検出のために必要とされる値の範囲内である。この測定はまた、反応セル内の最大温度上昇が１×１０−３℃の場合の熱電対検出の感度を実証する。図３に見られるより低い痕跡量は、参照セル由来であり、テンプレート形を含まない緩衝液への無酵素注入に対する注入人工物を示す。
【００８２】
（実施例２）
変異体Ｔ４ポリメラーゼの有用性を示すために、２つのプライマー伸長アッセイを、２つの異なる変異体Ｔ４ポリメラーゼ（これらの両方が、エンドヌクレアーゼ欠損である）を用いて実施した。一方の変異体において、Ａｓｐ１１２がＡｌａで置き換えられており、そしてＧｌｕ１１４がＡｌａで置き換えられている（Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ）。二本鎖ＤＮＡに対するこの変異体のエンドヌクレアーゼ活性は、Ｒｅｈａ−ＫｒａｎｔｚおよびＮｏｎａｙ（１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７１００−２７１０８）によって記載されるように、野生型酵素に対して約３００分の１に低下する。第二のポリメラーゼ変異体において、Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａアミノ酸置換に加えて、第三の置換は、Ｉｌｅ４１７をＶａｌで置き換える（Ｉ４１７Ｖ／Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ）。Ｉ４１７Ｖ変異は、このポリメラーゼによる合成の正確さを増加させる（Ｓｔｏｃｋｉ，Ｓ．Ａ．およびＲｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ，Ｌ．Ｊ，１９９５，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４５：１５−２８；Ｒｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ，Ｌ．Ｊ．およびＮｏｎａｙ，Ｒ．Ｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：５６３５−５６４３）。
【００８３】
２つの別個のプライマー伸長反応を、これらのポリメラーゼ変異体の各々を使用して実施した。第一に、単一の正しいヌクレオチドｄＧＴＰ（テンプレートＣに対応する）を添加した。次の不対テンプレート部位は、Ｇであるので、誤った取り込みが、Ｇ・Ｇ誤対合の形成を生じる。Ｇ・Ｇ誤対合は、ポリメラーゼが作製することが最も困難な誤対合のうちで、傾向がある。第二のプライマー伸長反応において、２つのヌクレオチドｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ（第一の不対テンプレート部位に対応する）を添加した。ｄＧＭＰおよびｄＣＭＰの正しい取り込みに続いて、次に利用可能なテンプレート部位は、Ｔである。Ｃ・Ｔ誤対合は、非常に困難である傾向があり、一方でＧ・Ｔ誤対合は、ポリメラーゼによって生成される最も頻繁な誤対合である傾向がある。
【００８４】
両方の変異体Ｔ４ポリメラーゼによるプライマー伸長反応についての時間経過を、図４に示す。取り込み反応が好都合な時間スケール（６０分）で測定され得るように、プライマー／テンプレート（ｐ／ｔ）に対して低濃度のＴ４ポリメラーゼを使用した。６４分までに、９８％のプライマーが伸長した。ｄＧＴＰのみを含む反応において、ほぼ完全に伸長したプライマーの両方のポリメラーゼが、Ｇに対向するｄＧＭＰの検出可能な取り込みなしで、ｄＧＭＰによって終結する。ｄＧＭＰとｄＣＭＰとの両方を含む反応において、ほぼ完全に伸長したプライマーの両方のポリメラーゼが、１つのｄＧＭＰおよび２つのｄＣＭＰの添加によって終結する。低割合（約１％）の誤った取り込みが、Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ変異体によって触媒される反応において検出可能であった。有意なことに、Ｉ４１７Ｖ／Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａ変異体によって触媒される反応においては、検出可能な誤った取り込みは見られなかった。
【００８５】
（実施例３）
本発明によれば、蛍光タグは、糖部分の３’位以外の部位で、ヌクレオチド塩基に付着され得る。ＤＮＡポリメラーゼの活性を妨害しないようなタグについての化学は、Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９５、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ４１：２７９−２９４）によって記載されるように開発されている。一般に、このタグは、取込みの間の、酵素の活性部位以外のかさ高いタグの移動のために十分な長さの、リンカーアームによって、塩基に付着される。
【００８６】
図５に示されるように、ヌクレオチドは、光切断可能なリンカー（例えば、ベンゾインエステル）によって、フルオロフォアに結合され得る。タグ化ｄＮＭＰがＤＮＡプライマー鎖の３’末端に組み込まれた後に、ＤＮＡテンプレート系は、そのフルオロフォアの吸収極大に対応する波長の光で照射され、そしてこのフルオロフォアの存在は、このフルオロフォアの発光極大における蛍光の検出によって、シグナル化される。フルオロフォアの検出に続いて、リンカーは光切断されて、化合物２を生成し得る；その結果は、改変されたが非蛍光性のヌクレオチドが付着した、伸長ＤＮＡ分子である。多くのフルオロフォア（例えば、ダンシル基またはアクリジンなどが挙げられる）が、図５に示される方法論において使用される。
【００８７】
あるいは、ＤＮＡテンプレート系は、蛍光を誘導するように照射されない。その代わりに、光切断反応が行われて、フルオロフォアを放出する化合物２を生成し、これは、テンプレート系から別の検出チャンバーに除かれる。ここで、フルオロフォアの存在が、このフルオロフォアの吸収極大での照射およびこのフルオロフォアの発光極大近くの発光の検出によって、前記のように検出される。
【００８８】
（実施例４）
本発明の具体的な実施形態において、化学発光タグ化ｄＮＴＰからなる連結した系は、図６に示されるように、化学発光基（化合物４のジオキセタン部分）、化学的に切断可能なリンカー(シリルエーテル）、および選択性の光切断可能基（ベンゾインエステル）からなり得る。フッ化物イオンによるシリルエーテルの切断によって、Ｓｃｈａａｐら（１９９１）（「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｏｆ  １，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ:Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＆  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ.Ｅ.およびＫｎｉｃｈａ，Ｌ.Ｊ.（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ.Ｙ.１９９１，ｐｐ.１０３〜１０６）に記載されるような検出可能な化学発光を発する。さらに、ヌクレオシド三リン酸をシリルリンカーに連結するベンゾインエステルは、ＲｏｃｋおよびＣｈａｎ(１９９６，Ｊ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.６１:１５２６〜１５２９）;ならびにＦｅｌｄｅｒら（１９９７，Ｆｉｒｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｐｔ.１−３０）によって示されるように光切断可能である。化学発光タグと光切断可能リンカーの両方を有することは、必ずしも、必要ではなく；このシリルエーテルは、そのヌクレオチド塩基に直接結合され得、そして、この化学発光タグは、読み取られるように破壊される。
【００８９】
化合物３に関して図６に例示されるように、フッ化物イオンで処理することによって、高効率で化学発光を発することが知られているアダマンチルジオキセタンからフェノレートイオンを遊離させる(Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら（１９９１），「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｄａｍａｎｔｙｌ  １，２−ｄｉｏｘｅｔａｎｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」，Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＆  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ.Ｅ.およびＫｒｉｃｋａ，Ｒ.Ｊ.（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ.Ｙ.１９９１  ｐｐ.７３〜８２）。この反応の他の生成物は、化合物４であり、これは、もはや化学発光性ではない。３０８ｎｍ〜３６６ｎｍの光分解の際に化合物４は、化合物２を遊離させる。
【００９０】
化合物１の合成は、ベンゾインのカルボキシル基に対するフルオロフォアの結合によって達成され、ここで、ベンゾインのαケトヒドロキシル基は９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）によって保護され、その後、そのＦＭＯＣ保護基は除去され、そしてその３’末端に活性化されたカルボン酸誘導体を保有するヌクレオチドにカップリングする。クロロ（３−シアノプロピル）ジメチルシランに対するアダマンチルフェノールのビニルエーテル形態のカップリング、シアノ基のアミンへの還元、オキセタンの生成、およびその３’末端に活性化されたカルボン酸誘導体を保有するヌクレオチドに対するこの化学発光前駆体のカップリングによって、化合物４は調製される。
【００９１】
化学発光タグはまた、切断可能な結合によってｄＮＴＰに結合され得、そして、化学発光の検出に先立って切断され得る。図７に示されるように、化合物３におけるこのベンゾインエステル結合は、光分解的に切断されて、遊離した化学発光性化合物５を生成し得る。化合物５が反応チャンバー中のＤＮＡテンプレートプライマーから流された後で、フッ化物イオンで化合物５と反応させて化学発光を発することが実施され得る。光分解性切断にかわるものとして、このタグは、化学発光を誘引しない化学処理によって切断される化学的切断可能リンカーにより結合され得る。
【００９２】
（実施例５）
この実施例において、未知の配列のＤＮＡの一部を含むテンプレート分子のヌクレオチド配列を決定する。未知の配列のＤＮＡを、Ｍ１３のような一本鎖ベクターにクローニングする。外来ＤＮＡのすぐ上流のベクターの一本鎖領域に相補的なプライマーを、ベクターにアニーリングし、そして反応性配列決定における合成をプライムするために使用する。アニーリング反応のために、等モル比のプライマーおよびテンプレート（１塩基がＤＮＡポリマーの分子量に３３０ｇ／ｍｏｌ寄与するという近似に基づいて計算される）を、６７ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．８、１６．７ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で混合する。この緩衝液は、ＤＮＡのアニーリングおよび引き続くポリメラーゼ伸長反応の両方に適切である。アニーリングは、緩衝液中のＤＮＡサンプルを８０℃に加熱し、そしてゆっくり室温に冷却させることによって達成される。サンプルを微小遠心管中で手短に回転させて、管の蓋および壁から縮合物を除く。最終反応セルが、６７ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．８、１６．７ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５ｍＭジチオトレイトールを含むように、ＤＮＡに、０．２ｍｏｌ当量のＴ４ポリメラーゼ変異体Ｉ４１７Ｖ／Ｄ１１２Ａ／Ｅ１１４Ａおよび緩衝液成分を添加する。次いで、ポリメラーゼを、１０μＭの最終濃度で一度に１つのｄＮＴＰを用いて問い合わせる。ヌクレオチドを、ポリメラーゼとともに、３７℃で１０秒間インキュベートする。ｄＮＴＰの組み込みは、蛍光、化学発光または温度変化を含む上記方法のうちの１つによって検出され得る。反応サイクルを、ＤＮＡ分子の完全な配列が決定されるまで、４つのｄＮＴＰのそれぞれを用いて繰り返す。
【００９３】
（実施例６）
図７は、本発明に従う機械的蛍光配列決定法を示す。ＤＮＡテンプレートおよびプライマーを、例えば、アビジン−ビオチンまたは−ＮＨ２／ｎ−ヒドロキシスクシンイミド化学を使用してビーズ１８上に捕捉し、図７（ａ）、工程１に示されるように、マイクロピペット２２または他の吸引デバイスの先端において多孔性フリットまたはフィルター２０を超えてロードする。エキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ酵素を添加し、ピペット先端を、蛍光標識ｄＮＴＰの溶液を含む小さなレザバ２４内に下げる。図７（ａ）の工程２に示されるように、少量のｄＮＴＰ溶液を、フィルターを通して吸引し、そして固定化ＤＮＡと反応させる。ｄＮＴＰ溶液はまた、洗浄損失を補充するのに十分な約１００ｎＭのポリメラーゼ酵素を含む。反応後、工程３に示されるように、過剰のｄＮＴＰ溶液２４を、フリット２０を通してｄＮＴＰレザバ２４内に押し戻す。このプロセスの工程４において、ピペットを緩衝溶液を含むレザバに移動させ、そして緩衝溶液のいくらかのアリコートを、フリットを通して吸引して、過剰の未結合のｄＮＴＰをビーズからリンスする。次いで、ピペットの内側の緩衝液を押し出し、そして廃棄２６に捨てる。ピペットを第２緩衝液レザバ（緩衝液２）（組み込まれたｄＮＭＰから蛍光タグを切断するために必要とされる化学物質を含む）に移動させる。タグを切断するために反応を生じさせる。工程５に示されるように、溶液中に分離した蛍光タグを有するビーズ／緩衝液スラリーを、蛍光タグを励起するために選択された波長でレーザーまたは光源２８によって照射し、蛍光検出器３０によって蛍光を検出し、組み込みが生じた場合、定量化する。
【００９４】
引き続く工程は、使用される酵素ストラテジーに依存する。図７（ｂ）に示されるように、エキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼを用いる単一段階ストラテジーが使用される場合、分離された蛍光タグを含む溶液が、廃棄に捨てられ（工程６）、これは、放出され、続いて、緩衝液１でさらなるリンス工程が行われ（工程７）、これは、その後、捨てられ（工程８）、そしてピペットが、異なるｄＮＴＰを含む第２レザバに移動し（工程９）、そしてこのプロセスが、工程３から開始し、４つ全てのｄＮＴＰを介してサイクルして繰り返す。
【００９５】
２段階ストラテジーにおいて、正しいｄＮＴＰが同定され、そして繰り返し長さが工程５において定量化された後に、反応混合物が、図７（ｂ）の工程６、７および８で示されるようにリンスされ、そしてピペットが、図８の工程（ａ）に示されるように、同じｄＮＴＰ（例えば、ｄＮＴＰ１）を含む異なるレザバに戻され、このレザバには、ある量のエキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼが添加されており、そしてこの溶液が、反応のさらなる段階のために吸引され、この反応のさらなる段階は、先の伸長をプルーフリードし、そして伸長を正確に完了する。ｄＮＴＰのこの第２のバッチは、蛍光的にタグ化される必要がない。なぜなら、ｄＮＴＰの同一性が既知であり、このプルーフリーディング工程において配列情報が獲得されないからである。タグ化ｄＮＴＰが使用される場合、蛍光タグは、好ましくは、切断され、緩衝液２を使用して、図７（ａ）の工程５に示されるように捨てられる。あるいは、図７（ａ）の工程２に示される最初の組み込み反応が、十分長く実施され、そして最初のポリメラーゼが十分に正確であり、その結果、図８の工程ａにおいてｄＮＴＰ１を組み込んだ蛍光タグのさらなる量は、少なく、引き続くｄＮＴＰの定量化を妨害しない。図８の工程ａにおけるプルーフリーディングに続いて、過剰のｄＮＴＰが放出され（工程ｂ）、そして反応混合物が、高塩緩衝液を用いてリンスされ（工程ｃ、ｄ）、ＤＮＡプライマー／テンプレートからエキソ＋ポリメラーゼを分離する。ＤＮＡプライマー／テンプレートを正しくないｄＮＴＰに暴露する場合、エキソヌクレアーゼ能のある（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）酵素を存在させないことが重要である。次いで、ピペットを工程ｅに移動させ、ここで、レザバが異なるｄＮＴＰを含み、そしてプロセスが繰り返され、４つ全てのｄＮＴＰを介して再びサイクルされる。
【００９６】
（実施例７）
電気的に励起されたフルオロフォアと電子吸収種（例えば、ジフェニルヨードニウム塩）との反応を含む、フルオロホアシグナルの破壊のための新たなプロセスを記載する。
【００９７】
ジフェニルヨードニウムイオンと電気的に励起されたフルオレセイン分子との反応は、図１０に示される。ジフェニルヨードニウムイオンは、フルオレセイン分子の励起状態から電子を抽出し、フルオレセイン分子のラジカルイオンおよび中性ジフェニルヨードニウムフリーラジカルを生じる。ジフェニルヨードニウムフリーラジカルは、迅速に、ヨードベンゼンおよびフェニルラジカルに分解する。次いで、フルオレセインラジカルイオンは、フェニルラジカルと反応するか、または内部整列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を受け、もはや蛍光しない最終生成物を生じる。
【００９８】
図１１および１２は、ジフェニルイオニウムイオンによるフルオレセインの特異的破壊についての証拠を実証する。図１１において、蛍光スペクトルは、塩化ジフェニルヨードニウムの溶液の添加の前および後での、フルオレセインおよびテトラメチルローダミン色素の混合物について提示される。フルオレセイン色素からの蛍光がすぐにクエンチされることが観察され、これは、添加された塩化ジフェニルヨードニウム溶液による色素溶液の希釈に起因する小さな減少を除いて、ローダミンからの蛍光が影響しない一方で、分子の励起状態からの電子の抽出を実証する。
【００９９】
塩化ジフェニルヨードニウムによるフルオレセイン色素からの蛍光シグナルの除去は、それ自体では、フルオレセイン分子が破壊されたことの証拠ではない。なぜなら、フルオレセインの励起状態からの電子抽出は、蛍光を効果的にクエンチし、そしてクエンチングは、フルオレセイン分子の破壊を生じる必要がないからである。しかし、図１２は、フルオレセイン分子が、ジフェニルヨードニウムとの反応によって破壊され、単純にクエンチされていないことを実証する。図１２は、塩化ジフェニルヨードニウムの溶液の添加の前および後でのフルオレセイン溶液についての紫外（ＵＶ）吸収スペクトルを示す。スペクトル１は、純粋なフルオレセイン溶液のＵＶ吸収スペクトルである。スペクトル２は、１モル過剰の塩化ジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）を含む溶液の添加およびキセノンカメラストロボからの単回フラッシュへの曝露に続く、フルオレセイン溶液のＵＶ吸収であるる。データは、フルオレセインが、ＤＰＩイオンとの光化学反応によって本質的に破壊されることを示す。図１２は、塩化ジフェニルヨードニウムが、フルオレセイン色素からの蛍光を単にクエンチするのではなく、フルオロフォアとしてもはや作用しなくなり得る程度まで分子を破壊するという明確な証拠を提供する。
【０１００】
テンプレート配列を使用する効率的な蛍光検出およびフルオロフォアの破壊を実証するために、実験を行った。５’末端にアルキルアミノリンカーを用いて合成されたテンプレートは、以下であった：
３’−Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）７−ＧＡＣＣＡＴＴＡＴＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡ−５’。
【０１０１】
決定される試行配列は、以下である：ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡ。
【０１０２】
テトラメチルローダミン標識プライマー配列を、以下のようにテンプレートに相補的であるように合成した：
５’−［ローダミン］−（ＣＨ２）６−ＣＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＴ−３’。
【０１０３】
アルキルアミノ末端テンプレート分子は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで誘導体化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズへ化学的に連結され、そしてローダミン標識プライマーが、テンプレートにアニールされた。結合されたＤＮＡテンプレートおよびアニールされたプライマーを有するビーズを、５ｍｌシリンジ中のＢ−１００使い捨てフィルターを超えてロードした。製造業者によって特定されるような、１：２の比のフルオレセイン標識ｄＣＴＰおよび未標識ｄＣＴＰの混合物、およびエキソヌクレアーゼ欠乏ポリメラーゼ酵素を反応緩衝液中に含む容量を、シリンジ内に引き込む。２０分間、３５℃で反応を進行させる。反応後、流体をシリンジから押し出し、フィルターを超えて反応したＤＮＡを有するビーズを保持し、そしてフィルターを通してシリンジ内に水を引き込み、そしてそれを排出することによって、二重蒸留水で３回の洗浄を行った。ビーズをリン酸緩衝液中に再懸濁させ、フィルターを除き、そして懸濁液を、蛍光分析のためのキュベット内に分配した。蛍光分析に続いて、ビーズ懸濁液をシリンジ内に戻してロードし、次いでこれに、フィルター先端を取付け、そしてリン酸緩衝液を分配した。ＤＰＩの溶液を理論量のＤＮＡテンプレートに対して１：１モル当量であるように計算された濃度でシリンジ内に引き上げ、フィルターを除去し、そしてビーズ懸濁液を１５分間、ＵＶ光曝露のためのキュベット内に分配した。懸濁液をシリンジ内に再び回収し、フィルターを取り外し、ＤＰＩ溶液を排出し、そしてビーズを、０．７ｍＬのリン酸緩衝液を引き上げることによって、再懸濁させた。フィルターの除去の後、ビーズ懸濁液を、ＤＰＩとの反応によるフルオレセインの破壊の完全性をチェックするために、蛍光分析のためにきれいなキュベット内に分配した。引き続くポリメラーゼ反応を、標識されたｄＴＴＰを用いて同じプロトコルを使用して行い、そいて蛍光について同様に測定した。
【０１０４】
図１３は、各ヌクレオチド取り込み反応に続く、ＤＰＩによるフルオレセイン標識の光化学破壊ついてのポリメラーゼ反応の結果を示す。曲線１は、ビーズへのローダミン標識プライマーのアニーリングに続くローダミン蛍光を示し、ビーズへのテンプレート鎖の共有結合およびローダミン標識プライマー鎖の捕捉を示す。曲線２は、プライマー鎖の３’末端上への３つの部分的にフルオレセイン標識されたｄＣＭＰのポリメラーゼ触媒組み込みに続く、フルオレセインの検出を示す。曲線３は、塩化ジフェニルヨードニウムとの光誘導反応による組み込まれたフルオレセイン標識の完全な破壊を示す。ここで、ローダミンシグナルの喪失は、洗浄の間にフィルターに衝突した有意な画分のビーズの損失に起因する。曲線４は、ｄＣＭＰへ結合されたフルオロセインの光化学破壊、およびそれに続く、プライマー鎖の３’末端上への３つの部分的にフルオレセイン標識されたｄＴＭＰのポリメラーゼ触媒組み込みに続く、新たなフルオレセイン標識の検出を示す。
【０１０５】
以下の方法は、フルオレセイン標識ｄＴＭＰの首尾良い破壊を実証するために利用された。
【０１０６】
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入し、表面を、第１級アミン基との反応のためにＮ−ヒドロキシスクシンイミドで誘導体化した。アルキルアミノ末端テンプレートを、製造業者によって推奨される標準的手順を使用して、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに化学的に連結した。
【０１０７】
結合したテンプレートを有するビーズは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４０ｎＭ  ＭｇＣｌ２を含む２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中に懸濁された。プライマー鎖を含む溶液を添加し、そして混合物を、８０℃に加熱し、そして約２時間にわたって冷却して、プライマーを表面固定化ＤＮＡテンプレート鎖にアニールした。
【０１０８】
フルオレセイン標識ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰを、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。非標識ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰをＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。
【０１０９】
任意の反応の前に、アニールされたプライマー／テンプレートを、アニールが生じたことを確実にするために、蛍光分析に供した。使用された励起波長は、３２０ｎｍであり、フルオロセインおよびローダミンからの蛍光を、それぞれ、約５２０ｎｍおよび約５８０ｎｍで検出した。
【０１１０】
試薬容量を、ＤＮＡテンプレートが１００％の効率でビーズに結合されたという仮定で計算した。
【０１１１】
５×反応緩衝液は、以下を含んだ：
１）２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５
２）２５０ｍＭ  ＮａＣｌ
３）４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
４）１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
５）２５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
二重蒸留Ｈ２Ｏを混合し、容積にした。
【０１１２】
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．から得た。ポリメラーゼを、製造業者のプロトコルに従って、ポリメラーゼ緩衝液中に溶解させた。
【０１１３】
フルオレセイン標識ｄＣＴＰおよび非標識ｄＣＴＰを、１：２の比で混合した。
【０１１４】
反応を、Ｂ−１００使い捨てフィルター（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備え付けた５ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で実施した。これは、合計５ｍＬまで反応容積を制限する：
プライマーテンプレート懸濁液    ０．７ｍＬ
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ        １．０ｍＬ
ＦｄＣＴＰ／ｄＣＴＰ            ０．０４０ｍＬ
５×反応緩衝液                  ２．０ｍＬ
二重蒸留Ｈ２Ｏ                   １．０ｍＬ。
【０１１５】
３５℃オーブンにおいて２０分間、反応を進行させた。反応に続いて、フィルターが反応したＤＮＡを有するビーズを保持し得るように、流体をシリンジから押し出した。二重蒸留水を用いる３回の洗浄を実施した。全ての廃棄物を収集し、そして将来の再利用のために保存した。ビーズを０．７ｍＬのリン酸緩衝液中に再懸濁させ、フィルターを除去し、そして懸濁液を蛍光分析のためにキュベット内に分配した。
【０１１６】
蛍光分析に続いて、ビーズ懸濁液を、１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に収集し、次いでこのシリンジに、フィルター先端を取り付けた。リン酸緩衝液を分配し、そして廃棄物を収集した。塩化ジフェニルヨードニウム（ＤＰＩ）の溶液を、ＤＮＡテンプレートの理論量に対して１：１のモル当量であるように計算された濃度で引き上げた（すなわち、ＤＰＩは、過剰な、組み込まれたフルオレセイン標識ｄＣＴＰ内に存在した）。フィルターを除去し、そして添加したＤＰＩを有するビーズ懸濁液を、キュベット内に分配し、そして１５分間ＵＶ光に曝露した。懸濁液をシリンジ内に再び収集し、フィルターを取付け、ＤＰＩ溶液を分配し、そしてビーズを０．７ｍＬのリン酸緩衝液中に再懸濁させた。ビーズ懸濁液を、蛍光分析のためにきれいなキュベット内に分配した。
【０１１７】
この手順において使用されるビーズの有意な画分がシリンジ上のフィルターに衝突するようであることが注目されるべきである。これは、フィルターがビーズによって詰まるようになるので、流体を、フィルターを通すために必要とされる圧力の有意な増加を生じ、そしてより重要なことに、組み込まれたヌクレオチドの蛍光検出に利用可能なＤＮＡの量を減少し、そして標識されたプライマーからの弱いローダミンシグナルをそれがもはや検出可能でない点まで減少する。
【０１１８】
ｄＣＴＰとの首尾良い組み込み反応に続いて、ｄＴＴＰを組み込むために、引き続くポリメラーゼ反応を実施した。組み込まれたフルオレセイン標識ｄＴＭＰを検出したが、反応シリンジと分析キュベットとの間の複数回の移動工程におけるフィルターでのビーズの損失に起因して、有意に低い強度であった。より低いシグナルがまた、一部、ｄＴＴＰの異なる標識化効率およびポリメラーゼ反応における標識化ヌクレオチドについての異なる組み込み効率から生じ得た。ローダミンシグナルが、第２の組み込み反応に続いてもはや検出可能でなかったので、ビーズ損失について訂正することは、可能でなかった。
【０１１９】
結果を図１３に示す。曲線によって示されるデータは、以下のように連続的に得られた：
曲線１は、ローダミン標識プライマーの、ビーズ固定化ＤＮＡテンプレートへのアニーリングに続く、ローダミン蛍光を示す。
【０１２０】
曲線２は、プライマー鎖の３’末端上に３つのｄＣＭＰのポリメラーゼ触媒組み込みに続いて、フルオレセイン標識ｄＣＴＰの検出を示す。
【０１２１】
曲線３は、塩化ジフェニルヨードニウムとの光誘導反応による、ｄＣＭＰ上の組み込まれたフルオレセイン標識の完全な破壊を示す。この例において、ローダミン標識もまた、消えた；これは、主に、ビーズの有意な画分が、試薬フラッシュ操作において使用されたフィルターにおいて衝突することによって、失われるからである。ローダミンがまた、ＤＰＩ光化学反応によって破壊されたことがあり得る。
【０１２２】
曲線４は、ｄＣＭＰ上のフルオレセイン標識の光化学破壊およびプライマー鎖の３’末端上への３つのフルオレセインタグ化ｄＴＭＰのポリメラーゼ触媒組み込みに続く、新たなフルオレセイン標識の検出を示す。曲線２と比較してより低いシグナルは、主に、シリンジ内のビーズ損失から生じるが、ｄＴＭＰのより低い組み込み効率および／またはより低い標識効率もまた反映し得る。標識されたプライマーからのローダミンシグナルがもはや検出可能でないので、ビーズ損失は、較正され得ない。
【０１２３】
ここに示される結果は、ＤＮＡ伸長の蛍光検出による反応性配列決定、続く、フルオロフォアの光化学破壊の概念を実証し、これは、後に添加されるフルオロフォアのさらなる伸長および検出を可能にする。このサイクルは、サンプル損失が避けられる場合、多数回繰り返され得る。このアプローチの実際の適用において、このような損失は、プライマーまたはテンプレート鎖をアレイデバイス（例えば、顕微鏡スライド）の固定化表面に取り付け、そしてアレイデバイス全体を反応容器と蛍光リーダーとの間で移動させることによって避けられる。
【０１２４】
（実施例８）
読み取り長さは、ＤＮＡ塩基の同一性における不確かさがある規定レベルを超える前に、読み取られ得るＤＮＡ配列の最大長さとして規定される。反応性配列決定アプローチにおいて、読み取り長さは、２つのタイプのポリメラーゼ失敗によって制限される：誤った組み込み（すなわち、非相補的塩基の正しくない組み込み）および伸長の失敗（すなわち、正しい相補性塩基の存在下で所定のサイクルにおけるＤＮＡプライマー鎖のある画分を伸長しないこと）。実施例２は、任意の所定の組み込み反応について約１％より多いアレイ化鎖について、いずれのタイプの失敗も影響しないように反応条件が最適化され得ることを示す。いずれのタイプの失敗も、配列読み取りにおいてエラーシグナルを直接的に生じない。なぜなら、伸長失敗の場合における、誤った組み込みについての１％の陽性シグナルも、正しい組み込みについてのシグナルの１％の減少も、正しい組み込みについて期待されるシグナルと比較して有意でないからである。しかし、蓄積された失敗は、種々の異なる方法で読み取り長さを制限する。
【０１２５】
例えば、誤った組み込みは、影響する鎖についての任意のさらなる伸長を妨げ、引き続くシグナルの減少を生じる。誤った組み込みに続く所定の鎖を伸長し続ける可能性が、０．１％以下であり、その結果、誤った組み込み、続く、誤った鎖の引き続く伸長から生じる蛍光シグナル蛍光シグナルへの任意の寄与は、無視し得ることが推定される。代わりに、鎖伸長の阻害を生じる誤った組み込みの蓄積は、正しい塩基組み込みについての全体的なシグナル振幅を、検出系におけるノイズシグナルが、真の塩基組み込みとして読まれる偽シグナルを生成する有意な可能性を有し始めるレベルまで減少する。
【０１２６】
伸長の失敗は、代表的に、伸長反応の速度論および単一のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いる各伸長試行について割り当てられた時間量についての制限に起因して生じる。反応がｄＮＴＰ供給をフラッシュすることによって終結する場合、小さな画分のプライマー鎖が、伸長されないまま残り得る。引き続くｄＮＴＰ反応サイクルにおけるこれらの鎖は、伸長し続けるが、大部分の鎖を有する相の外側であり、小さな位相外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｈａｓｅ）シグナルを生じる（すなわち、大部分の鎖の伸長について正しくない追加されたｄＮＴＰについての陽性の組み込みをシグナル伝達する）。伸長の失敗は生じ得るので、伸長事象において統計的に、相外シグナルは、伸長の失敗を有する鎖の集団が増加するにつれて増加する。反応が、例えば、首尾良い伸長反応のさらなる数Ｎの後に、所定の反応サイクルにおいて９９．９％完了するように、反応条件が選択される場合、相外シグナルは、約（１−０．９９９Ｎ）である。正しい伸長シグナルとして、相外シグナルが間違って読まれるのに十分大きくなる数Ｎは、読み取り長さである。例えば、９９．９％の完了を有する２００塩基による伸長の後に、相外シグナルは、いずれの場合における単一塩基伸長についても、相内（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）シグナルの約１８％である。４００塩基による伸長の後に、相外シグナルが、３３％まで増加する。読み取りが終了しなければならない点は、相内シグナルと相外シグナルを区別する能力によって指示される。
【０１２７】
続いて、単一塩基繰り返し（例えば、ＡＡＡＡＡ）の長さは、鎖間の相の違いを議論する目的で単一塩基として処理される。４つのｄＮＴＰの反応サイクルが変化しない場合、正しいｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ）が反応セル内にある場合に伸長しないプライマー鎖は、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）（すなわち、大部分の鎖）を引きづり得ず、これは、３塩基より多くまで正確に伸長する。なぜなら、ｄＮＴＰ反応サイクルにおける第４の塩基が、常に、もう一度、先に伸長しなかった鎖についての正しい塩基（ｄＡＴＰ）であるからである。伸長の失敗が、純粋に統計的であり、そして伸長しない任意の鎖が、正しいｄＮＴＰが供給される場合、引き続く伸長について等しい可能性を有し、そしてこの伸長の確率が、同じ鎖で繰り返される伸長の失敗の可能性が消えるほど小さいように十分に高いことが仮定とされる。例えば、１つの鎖における伸長の失敗の確率が０．１％である場合、同じ鎖についての２つの伸長の失敗の確率は、（０．００１）２または１０−６である。同様に、トレーリング（ｔｒａｉｌｉｎｇ）鎖は、伸長が引き続いて正しく進行する場合、リーディング鎖と再同期化し得ない。なぜなら、リーディング鎖は、常に、トレーリング鎖が失ったＡを追加され得る前に、Ａ伸長の失敗の例の議論において、少なくとも１つより多くのヌクレオチド（Ｇ、Ｔ、またはＣ）によって伸長されている。この効果は、各完全なｄＮＴＰサイクルの後に、トレーリング鎖が、常に、配列の所定の点における１つの完全なｄＮＴＰサイクルに添加される塩基を表す伸長の量まで、リーディング鎖に続く。これらの観察は、以下を予想する：（ｉ）リーディング鎖とトレーリング鎖との間のギャップは、永久に、１塩基と３塩基との間で振動し、そして第２の伸長の失敗が同じ鎖に生じない限り、決して増加し得ない；そして（ｉｉ）リーディング鎖とトレーリング鎖との間のギャップは、伸長の失敗が生じるトレーリング鎖に沿った位置と独立する。リーディング鎖の伸長における任意の所定の点におけるこのギャップは、単に、その時点までのリーディング鎖集団の配列およびｄＮＴＰプローブサイクルの関数である。言い換えると、トレーリング鎖の集団は、配列内の異なる点におけるランダムな伸長の失敗に起因して生じるが、これらのトレーリング鎖自体は、全て正確に互いに相内である。
【０１２８】
伸長の失敗の結果が、１ヌクレオチドと３ヌクレオチドとの間で振動する量で、永久的にリーディング鎖を引きずるトレーリング鎖集団を生成することであるので、第２の伸長の失敗がトレーリング鎖において生じず、そしてｄＮＴＰサイクルのプロービングが、変化しないままであると仮定すると、リーディング鎖集団とトレーリング鎖集団との間のギャップは、常に、例えば、コンピューターシミュレーションによってリーディング鎖配列を追跡し、そして伸長の失敗の事象を配列に沿った任意の点でシミュレーションすることによって知ることができる。
【０１２９】
従って、本発明は、第１に、配列情報のコンピュータートラッキングの一般的方法を提供し、この方法は、トレーリング鎖の伸長に起因する違相（ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ）エラーシグナルを、認識されるようにし、そして補正シグナルから引かれるようにし、第２に、プローブ化ｄＮＴＰサイクルを、トレーリング鎖を選択的に伸長するように変更する方法を提供し、その結果、これらの鎖は、リーディング鎖を有する相に戻り、従って、伸長の失敗から生じるトレーリング鎖に由来する違相シグナルに起因する配列不確実性を完全に排除する。
【０１３０】
違相鎖からの補正されないシグナルと補正シグナルとを区別する能力を支配する統計は、蛍光シグナルのノイズレベルおよび統計的変位に依存する。正しい１塩基伸長についてのシグナルが、±５％の標準偏差を有すると仮定し、次いで、統計的に９９．７５％のシグナルは、平均値が１．０であり、標準偏差が０．０５である場合、０．８５と１．１５（平均値から±３の標準偏差）との間の振幅を有する。伸長シグナルは、正しい伸長を記録する平均単一伸長シグナルの少なくとも８５％でなければならない場合、統計的に正しい伸長は、時間の０．１３％のみを損失し、すなわち、読み出し精度は、９９．８７％である。正しい伸長に対するシグナルの別の０．１３％は、１．１５より大きいが、関心は、平均より小さなシグナルにのみ関し、このことは、違相鎖からの増大シグナルと区別することをより困難にする。トレーリング鎖の違相伸長から生じる誤差に対する統計は、同様である。トレーリング鎖シグナルの標準偏差はまた、平均伸長シグナルの±５％であり、この平均伸長シグナルが、トレーリング鎖強度がリーディング鎖強度に接近する場合はいつでも正しく、トレーリング鎖強度が、０．７を超えて増加しない場合、平均を、０．８５標準偏差または４を越える標準偏差を越えるシグナルを生じるトレーリング鎖伸長の割合は、０．０１％未満である。従って、３セットのトレーリング鎖の１つにおいて単一塩基の伸長を生じる違相シグナルは、違相シグナルが同相（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）シグナルの７０％を超えて成長しない限り９９．８７％の精度を有する同相シグナルと区別されるべきである。
【０１３１】
上記議論は、全ての伸長事象が、単一塩基の伸長に対応することを仮定する。しかし、複数の単一塩基反復は、ＤＮＡ配列において共通であり、従って、違相シグナルが単一塩基伸長に対するシグナルのＭ倍大きくあり得る状況を考慮しなければならず、ここでＭは、反復数である。例えば、違相鎖の３つのセットのうち１つの集団がリーディング鎖集団の２０％まで増加する場合、このレベルで、同相シグナルおよび違相シグナルが、単一塩基伸長のために容易に区別され得、違相鎖のこのセットが、５塩基反復（例えば、ＡＡＡＡＡ）と出くわす場合、この反復のためのシグナルが、同相鎖上での単一塩基伸長に対するシグナルと同じ大きさになる。伸長シグナルのリアルタイムコンピューターモニタリングは、例えば、線形自動回帰移動平均および／または非線形自動回帰移動平均（ＡＲＭＡ）スキームによって、このような繰り返しによって増大された違相シグナルに対する区別を可能にする。ここで、重要な点は以下の通りである：（ｉ）位相外鎖は、伸長の失敗の結果として主要な鎖に続く鎖である；リーディングエラー鎖を生じ得る誤取り込み事象は、影響を受けた鎖上のさらなる伸長を終了する効果を有し、それによって、有意な違相エラーシグナルを生じない；（ｉｉ）伸長の失敗がどこで生じるかに関わらず、いつもただ１つのトレーリング鎖集団が存在する；この集団における全てのプライマー鎖は、リーディング鎖配列の１、２または３塩基後の同じ点まで伸長する；そして（ｉｉｉ）リーディング鎖は、先にいつもトレーリング鎖に実質的に出くわす配列の横に移動するので、トレーリング鎖の３’末端の向こうの少なくとも１塩基の配列は、いつも公知であり、これらのトレーリング鎖が、供給された任意のヌクレオチドに対して伸長するか否かを予測することを、そしてどの程度するかどうかを予測することを、例えば、リーディング鎖が伸長する位置の上流の公知の配列における任意の点での伸長の失敗の効果をコンピューター上で、シミュレーションすることによって可能にする。
【０１３２】
各取り込み試行において、リーディング鎖についての任意の可能な正確な伸長シグナルに加えて、トレーリング鎖の伸長に対応するエラーシグナルがまた存在し得る。例えば、トレーリング鎖集団が、リーディング鎖集団の２０％程度の大きさを有すると仮定のこと。この集団のサイズは、トレーリング鎖が伸長し、リーディング鎖が伸長しない場合、取り込みシグナルを検出することによってモニターされ得る。リーディング鎖集団が、テンプレート上の単一塩基反復領域（例えば、ＡＡＡＡＡ）をちょうど横切り、プライマー上に相補的Ｔ反復（：ＴＴＴＴＴ）を組込むことを仮定のこと。トレーリング鎖は、鎖がｄＴＴＰでプローブされる次の回まで、４つの検出ヌクレオチドの少なくとも完全なサイクルについて、この同じＡＡＡＡＡ反復を横切らない。リーディング鎖は伸長しないが、トレーリング鎖は伸長する任意の点で決定される、組込みシグナルの増幅由来のトレーリング鎖集団のサイズを知ることによって、ＴＴＴＴＴの組込みに起因するトレーリング鎖集団から期待されるシグナルが、正確に計算され得る。トレーリング鎖集団が、リーディング鎖集団の１／５の大きさである場合、このシグナルは、リーディング鎖集団上の単一のＴの取り込みを模倣する。ここで考察されるコンピューター補助のモニタリング法の非存在下において、このような偽のシグナルは、劇的な配列エラーを生じる。
【０１３３】
図１４Ａおよび１４Ｂは、配列（：［ＣＴＧＡ］ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ［Ｔ］）に対して、ｄＮＴＰサイクル（：ＣＡＧＴ）でプローブされて、どのようにしてデータが生じるかを示し、このｄＮＴＰサイクルは、６０％の鎖が伸長の失敗を受け、違相シグナルを生成し、誤取り込みが、全ての鎖の７５％で伸長を停止する点で、伸長の失敗が生じず（図１４Ａ）、そして下流で大いに生じる（図１４Ｂ）プライマーに近接する。示される読み出しは、配列において第２のＧ（括弧内の［ＣＴＧＡ］配列の前）で開始を示し、最後のＣ（括弧内の［Ｔ］の前）で終結する。図１４Ａにおけるシグナルのデジタル特性および振幅スケールは、留意されるべきである。図１４Ｂにおいて、単一塩基の伸長に対するシグナルは、伸長失敗鎖に起因して１．０から０．４まで６０％減少し、そして誤取り込みに起因してさらに４〜０．１倍され、結果として７５％のシグナルを損失する。しかし、トレーリング鎖の違相伸長に起因して、シグナルが、正確な伸長シグナルに加えられる。一見したところでは、トレーリング鎖がリーディング鎖によって先に移動する配列に出くわす場合産生される重複シグナルに起因して、読み出しは、図１４Ａに示される正確な読み出しとは完全に異なる。特に大きな間違いは、トレーリング鎖集団がＡＡＡ反復に出くわすときはいつでも生じる。例えば、第２のＴプローブは、正しい単一のＡの代わりにＡＡＡＡＡ反復に対応する単一の振幅を生じ、第３のＧプローブは、実際に、リーディング鎖配列中のこの点でＣがない場合、ＣＣＣに対応する単一のシグナルを生じ、第４のＴプローブは、正しい配列がない（トレーリング鎖が、第２のＡＡＡ反復に出くわす）場合、４つのＡを読み取る。しかし、リーディング鎖からの配列が公知であるので、トレーリング鎖から生じる偽のシグナルが、予想され、全シグナルから引かれ、正しい配列の読み出しを得る。このことは、図１４Ｃに示され、トレーリング鎖から生じるシグナルは、リーディング鎖シグナル由来の異なる影によってコードされる。トレーリング鎖に起因するシグナルが予想されるので、エラーシグナルは、図１４Ｄに示される正確なデジタル配列読み出しを得るために引かれ得る。図１４Ｄ中のデータは、ここで図１４Ａに示されるデータと同一であり、そしてリーディング鎖に対する正確な配列読み取りを産生し、わずかな違いは、取り込みの失敗および伸長の失敗に起因するシグナルの仮定される損失に起因して、全強度が減少されることであり、後者は、トレーリング鎖を構成する、ことは留意されるべきである。換言すると、コンピューター中に配列のトラックを維持することによって、この効果は、図１４Ｃ上のプロットに示されるような異なる分布を直接視覚化し得るかのようである。従って、トレーリング鎖集団からのシグナルが存在するはずである、任意のプローブヌクレオチド事象に対して正確に予想すること、およびこのエラーシグナルが測定されたシグナルから引き、リーディング鎖集団の配列を表す真のシグナルに到達し、これは、所望の結果である。
【０１３４】
議論されるように、任意のトレーリング鎖シグナルを計算し、そして引く能力を仮定すれば、リーディング鎖上へのヌクレオチド鎖の組込みまたは非組み込みが、検出されることに関する精度は、トレーリング鎖シグナルに絶対値によってではなく、これらのシグナルのノイズによって限定される。例えば、リーディング鎖集団の２０％に等しいトレーリング鎖集団の単一塩基伸長に関するシグナルが、０．２±０．０５であることを仮定のこと。トレーリング鎖が５塩基反復と出くわす場合、得られたシグナルは、リーディング鎖の単一塩基の伸長によって生成されるシグナルと振幅が同一であるが、このシグナルは、観測されたシグナルから引かれ、リーディング鎖から得られるシグナルまたはリーディング鎖の伸長がないことに対応するヌルシグナルのいずれかを生じ得る。ノイズが純粋に統計的であり、従って、シグナルの振幅の平方根まで分布が減少されることを仮定する場合、トレーリング鎖の５塩基伸長またはリーディング鎖の単一伸長について、シグナルは、１±（０．０５×√５）（すなわち１±０．１１）である。なぜなら、足されたシグナルのセットに対する統計的ノイズは、シグナルの数の平方根として増加するからである。この値からさらにより正確に知られている補正シグナルを引き得る。なぜなら、トレーリング鎖のシグナルは、この値に対するよりよい統計を得るために繰り返し測定されるからである。補正シグナルにおける不確定性は、無視できると仮定される。リーディング鎖が伸張しないことについて、得られた差シグナルは、０±０．１１であるのに対して、リーディング鎖の伸長シグナルは、１±０．１１の差シグナルを生じ；これらの２つのシグナルは、９９．９％より高い精度で区別可能である。
【０１３５】
ここで与えられる例は、極端な場合であり；実際、伸長の失敗が任意の点で補正され得、その結果、リーディング鎖配列の不確定性を提供するシグナルを生成するレベル以下に、トレーリング鎖集団を最小化し得る。
【０１３６】
提供されるコンピューター補助モニタリング法についてのさらなる利点が存在する。第１に、トレーリング鎖からのシグナルは、リーディング鎖配列に対するさらなる検査を提供する。第２に、トレーリング鎖集団は、リーディング鎖集団の大きさを超え得る。コンピューター補助モニタリングを使用しなければ、読み出しは、この点の前に良好に停止しなければならないが、コンピューター補助モニタリングを使用すれば、読み出しは継続し、ここでは、リーディング鎖ではなくトレーリング鎖を使用して、配列を示す。従って、ただ１つの伸長の失敗に起因して続く鎖集団は、ここで、コンピューター補助モニタリングの目的のためのリーディング鎖集団になる。このことは、さらなる複雑さが、同じ鎖上の２つの伸長の失敗の発生から生じるまで、読み出しを継続させ、単一の失敗鎖（ｆａｉｌｕｒｅ  ｓｔｒａｎｄ）と同じ様式で続き得る新規のトレーリング鎖集団を生成する。その一方で、誤りのない鎖の集団は、検出可能なシグナルに寄与しない点を減少する。
【０１３７】
試薬、酵素および反応条件を最適化することは、誤取り込みの可能性を１％未満にし、伸長の失敗の可能性を０．１％程度に低くする。本発明のコンピューター補助モニタリング法は、さらに、トレーリング鎖集団を選択的に伸長することによってこの集団を修復し、その結果、再びリーディング鎖と同調させるための手段を提供する。ｄＮＴＰプローブサイクル（ＧＣＴＡ）およびテンプレート配列（プライマーの３’末端の向こう）（．．．．．．ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧ．．．．）を与え、ｄＣＴＰが反応チャンバーに存在する場合、ポリメラーゼがプライマー鎖のいくつかの部分においてＣを取り込まないことを仮定して、以下を得る：
テンプレート    ．．．．．．ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧ．．．．
主鎖            ．．．．．．Ｃ
テンプレート    ．．．．．．ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧ．．．．
失敗鎖          ．．．．．．
。
【０１３８】
第１のサイクルの終わりに、主鎖は、．．．．ＣＡによって伸長する一方、失敗鎖は、伸長しない。もう１つの完全なサイクルの後、主鎖の伸長は、．．．．ＣＡＣであり、ここで、失敗鎖は、．．．．ＣＡと読まれ、すなわち、ここでちょうど１つの塩基が違相である。
テンプレート    ．．．．．．ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧ．．．．
主鎖            ．．．．．．ＣＡＣ
テンプレート    ．．．．．．ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧ．．．．
失敗鎖          ．．．．．．ＣＡ
相のずれは、プローブサイクル配列のテンプレート配列との相互作用を繰り返すことから生じるので、変更されないプローブサイクルによって、鎖を再同調させるための正しい配列を有し得ない。実際、プローブサイクルが変更されない場合、そしてさらなる伸長の失敗が生じない場合、所定の失敗鎖についての相のずれは、１塩基と３塩基との間で絶え間なく往復し、この目的について単一塩基反復を計数する。しかし、最終伸長までのリーディング鎖配列が、いつも既知であるので、幾分か上流の位置で伸長の失敗を導く効果を決定し得る。伸長の失敗の効果が、１つの完全なｄＮＴＰサイクルによって影響を受けた鎖の伸長のずれを引き起こすので、任意の上流位置または任意の塩基型で導入される伸長の失敗は、いつも同じ相のずれを生成する、ことを留意されるべきである。従って、例えば、上で議論された配列において、最後のＡの後に、Ｇの代わりにＣを有するプローブに対する、プローブサイクルの順を変更することは可能である。失敗鎖が伸長するのに対して、主鎖は修復しないが、相のずれは修復する。さらに別の実施形態において、ｄＮＴＰプローブサイクルは、相のずれがただ１塩基減少する場合はいつでも逆転し得る。相の差異が単一の塩基または１塩基の反復まで減少する場合はいつでも、プローブサイクル配列を単に逆転することは、いつも鎖を再同調する。
【０１３９】
図１５は、ヌクレオチド不純物に起因するプライマー鎖の部分の不正確な伸長に由来するリーディング鎖集団が、どのように主集団からのシグナルに逆に影響し得るかを示す。前記と同じテンプレート配列（：［ＣＴＧＡ］ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＡ  ＧＴＣ  Ｃ［ＴＣ  ＡＧＴ］）および同じプローブサイクル（：ＣＡＧＴ）を使用して、主鎖集団の２０％であるリーディング鎖集団の効果が、刺激され得、そして、主鎖配列が読まれ始めるときに主鎖の２塩基前が刺激される。リーディング鎖は、既に、−Ｃ  ＴＴＴによって伸長されている。第１のＣプローブは、１の単一塩基伸長シグナルを与える配列において、第１のＧに相補的な１つの塩基によって主プライマー鎖を伸長する。第１のＧ鎖は、−ＣＣ−反復に対して相補的な−ＧＧ−によってリーディング鎖を伸長し、０．４のシグナルを与える。より大きな任意性は、リーディング鎖が第２のＴプローブで第２の−ＡＡＡ−反復と出くわす場合に生じ、単一延期伸長に対する補正シグナルからの主鎖シグナルを１．６まで増加する。さらなる情報なしに、この値は、不明瞭になるかまたは２塩基反復として解釈され得る。
【０１４０】
これらの不明瞭性に対する補正は、主鎖の正しい配列がリーディング鎖読み出しの後に読み出されるという事実から生じる。一般的に、リーディング鎖が出くわす場合のエラーシグナルを生じ得る大きな複数の反復は、続いて、主鎖によって出くわす場合の大きなシグナルを与え、これらは、この補正シグナルに重ねられ、以下の３つの可能性が存在するリーディング鎖シグナルである：（ｉ）ゼロシグナル：リーディング鎖が伸長しない；（ｉｉ）不明確さを生じない小さなシグナル−リーディング鎖は、単一塩基または主鎖のさらなる塩基身長を刺激するのに不十分なほど小さな反復数で伸長する；（ｉｉｉ）大きなシグナル；リーディング鎖は、第２の大きな反復に出くわす。主鎖配列をモニタリングすることによって、リーディング鎖集団の効果を以前に遡って見積もり、このようなシグナルを主鎖シグナルから引き、正しい配列に到達することは可能である。リーディング鎖が、配列の不明確さを生成する程度に十分大きな反復に出くわす場合において、リーディング鎖が、次に主鎖が第１の反復に出くわす場合、第２または第３の大きな反復に出くわす場合においてさえも、主鎖は、結局、同じ領域を横切り、正しい配列を導くのに十分な情報を提供する。言い換えると、任意の点での配列情報は、いつも重複して決定され、任意の所定の配列に対するシグナルは、リーディング鎖および主鎖によって、いつも２度読まれ、そのことによって、正確な配列およびリーディング鎖の部分集団（これらは、２つの必要とされる情報である）の両方を決定するのに十分な情報を生じる。
【０１４１】
純粋でないヌクレオチドによって生成されるリーディング鎖集団の配列は、それが次に主鎖によって横切られるまで、既知ではないので、伸長の失敗によって生成されるトレーリング鎖集団に対する場合のように、どのｄＮＴＰプローブサイクルが主鎖を伸長するために作用し、一方で、リーディング鎖を伸長しないかを知り得ない。しかし、トレーリング鎖に関して、リーディング鎖と主鎖との間のギャップは、１塩基と３塩基との間で絶え間なく往復し、そしてリーディング鎖と主鎖との間のギャップが単一の塩基まで減少される場合はいつでも、ｄＮＴＰプローブ配列を逆転させることによって再結合され得る。この単一塩基ギャップが生じる場合に知られていないが、ｄＮＴＰプローブ配列は、規則的な間隔で逆転する。試行は、このようなプロセスが、リーディング鎖の約２／３を最終的に再結合する。このプロセスについての統計は、以下の通りである。
【０１４２】
統計的に、主鎖とリーディング鎖との間のギャップが１塩基、２塩基または３塩基であり得るので、リーディング鎖集団が、サイクルが逆転する場合いつでもほんの１塩基の相のずれを有する、１／３の可能性が存在する。１塩基の相の差異は、いつも、サイクルの逆転によって修復される。別の１／３の回数、リーディング鎖は、サイクルが逆転する場合の２塩基前に存在する。次の塩基の探索について、以下の可能性が存在する：
リーディング鎖  主鎖
０              ０    いずれの鎖でも伸長はない：確率３／４×３／４＝９／１６
＋１            ０    相のずれが増加する：確率１／４×３／４＝３／１２
＋１            ＋１  両方の鎖が伸長する：確率１／４×１／４＝１／１６
０              ＋１  相のずれが減少する：確率３／４×１／４＝３／１２
相のずれは２にとどまる；可能性の数＝１０／１６
相のずれは減少する      可能性の数＝３／１２
相のずれは増加する      可能性の数＝３／１２
従って、２塩基ギャップの悪化を生じる可能性は、（３／１２）／（１０／１６＋３／１２）＝２８％
３つ全てのギャップの大きさを考慮すると：
１塩基ギャップ修復（集団の３３％）
２塩基ギャップは、２８％の回数より悪くなり：ギャップの１／３のみが２塩基であり、従って、全９％がより悪化する
３塩基ギャップはまた、２８％の回数より悪くなり、さらに９％の全効果を生じる。
まとめると、所定の逆転での３３％の修復、所定の逆転での１８％の損失および残りの５０％は、変化しない。さらに、推定１８％が恒久的に損失され（そして３塩基のギャップまで増加した２塩基のギャップは、なお再結合し得る）、続く各逆転において、５０％の鎖の１／３が修復され、これは、以前の反復によって、以下のとおり変化しない：
逆転番号    ギャップが修復された割合
１          ３３％
２          １７％
３          ９％
４          ４．５％
５          ２．５％
６          １％
計          約６７％
。
【０１４３】
従って、ｄＮＴＰプローブの反復される逆転は、ヌクレオチド不純物またはランダムな伸長の失敗による不正確な伸長に起因して、違相シグナルの効果を２／３低下し、３倍のいずれかの効果によって限定される場合、読み取り長を効果的に増加する。
【０１４４】
本発明が、特定の実施形態を参照して本明細書中に記載されるにも関わらず、多くの改変およびそのバリエーションが当業者に容易に思い浮かぶ。従って、全てのこのようなバリエーションおよび改変は、本発明の意図される範囲内に含まれる。
本発明のさらなる目的および優位性が、添付の図とともに、以下に記載の読取りから明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明に従う、薄いフィルムのビスマスアンチモン熱電対列を含む反応性配列決定デバイスを示す、概略図である。
【図２】図２は、本発明に従う、サーミスターを含む反応性配列決定デバイスの概略図である。
【図３】図３は、本発明に従う、ＤＮＡポリメラーゼのマイクロ熱量検出の代表的な実施形態を示す、概略図である。
【図４】図４は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ変異体によって触媒される、プライマー伸長アッセイの時間経過を示す、電気泳動ゲルである。
【図５】図５は、本発明において使用するための光切断可能リンカーであるベンゾインエステルによって、フルオロフォアに結合するヌクレオチドを示す、概略図である。
【図６】図６は、本発明において使用するための化学発光タグに結合するヌクレオチドを示す、概略図である。
【図７】図７は、切断可能な結合によって化学発光タグに結合するヌクレオチドの概略図である。
【図８】図８（ａ）および図８（ｂ）は、ＤＮＡテンプレートおよびプライマーが、多孔性フリットによって吸着されるビーズ上に吸収される、本発明に従う機械的な蛍光配列決定法の概略図である。
【図９】図９は、２つのサイクル系を用いる、本発明に従う配列決定法の概略図である。
【図１０】図１０は、ジフェニルヨードニウムイオン（ＤＰＩ）による、フルオレセインの光化学分解の仕組みの図である。
【図１１】図１１は、塩化ジフェニルヨードニウム溶液の添加前および添加後の、等モル濃度のフルオレセインおよびテトラメチルローダミン色素の等モル濃度の蛍光スペクトルを示す。
【図１２】図１２は、キセノンカメラストロボからの単回のフラッシュの後の、（１）フルオレセインおよび（２）フルオレセイン＋ＤＰＩから検出されるＵＶ吸収スペクトルである。
【図１３】図１３は、取り込み反応間のＤＰＩ光脱色を用いた、単回のヌクレオチドポリメラーゼ反応からの蛍光スペクトルを示す。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄ。ｄＮＴＰサイクルのプローブされる［ＣＴＧＡ］ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣＣ［Ｔ］の反応性配列決定のシミュレーション。図１４Ａ。伸長の失敗が起きていないプライマーと接する配列読出し情報。図１４Ｂ。鎖の６０％が伸長の失敗を起こし、異なる位相（ｏｕｔ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ）シグナルを生成するプライマーの下流の配列読出し情報であり、誤った取込みが、全ての鎖の７５％において伸長を妨げている。図１４Ｃ。既知の後続の配列の下流配列を用いてリーディング鎖（明るい影からの）正しい読出し情報シグナルと区別される後続の鎖からのエラーシグナル（暗い影）を有する、下流の読出し情報。図１４Ｄ。後続の鎖からのエラーシグナルを減算した後の、校正した配列読出し情報。図１のデータとの類似性に注意。
【図１５】図１５。伸長シグナルにおけるリーディング鎖集団の効果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005511018000001.app
【国際調査報告】
2005511018.tif 000019
2005511018.tif 000020