(57)【要約】本発明は、女性被験者における卵巣の予備能を評価したり、そして卵巣の応答を予測する方法およびキットを提供する。本発明はまた、血清中ＭＩＳレベルが成熟卵母細胞の産生および回収と正に相関し、そしてこのものが受精処置に対する女性の応答の予後的な指標として機能することをも開示する。本発明はまた、該ＭＩＳレベルを受精処置の前およびその間に追跡することができ、そしてこのものが個々の患者において最適な結果を得るために処置の時期および用量を調節するのに有用であることをも開示する。本発明は更にＭＩＳを女性に投与して、卵胞の発育を刺激したりおよび卵巣の予備能の枯渇を防止することができることをも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清中ＭＩＳレベルと卵巣の予備能とを相関させる方法であって、
（ａ）被験者中の血清中ＭＩＳレベルを測定し；および
（ｂ）該被験者から回収される卵細胞の数を測定する、
ことを含む、該方法。
【請求項２】
血清中ＭＩＳレベルと卵巣の予備能とを相関させる方法であって、
（ａ）被験者中の血清中ＭＩＳレベルを測定し；および
（ｂ）該被験者から回収される卵細胞の質を測定する、
ことを含む、該方法。
【請求項３】
被験者における卵巣の予備能を評価する方法であって、
（ａ）被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定し；および
（ｂ）該測定血清中ＭＩＳレベルを、ＭＩＳ血清中レベルと回収卵母細胞の数とを相関するデータと比較し、その結果、被験者における卵巣の予備能を評価する、
ことを含む、該方法。
【請求項４】
血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するデータをチャートによって示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するデータをコンピュータープログラムによって示す、請求項３記載の方法。
【請求項５】
卵巣の予備能を測定するための診断用キットであって、
（ａ）血清中ＭＩＳレベルを測定する方法；
（ｂ）血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するチャート；および、
（ｃ）使用のための指令、
を含む、該キット。
【請求項６】
ＭＩＳに対するモノクローナル抗体を用いて血清中ＭＩＳレベルを測定する、請求項５記載のキット。
【請求項７】
ＭＩＳに対するポリクローナル抗体を用いて血清中ＭＩＳレベルを測定する、請求項５記載のキット。
【請求項８】
排卵誘発に対する卵巣の応答を予測する方法であって、
（ａ）被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定し；
（ｂ）該測定レベルを標準レベルと比較し；その結果、排卵誘発に対する卵巣の応答を予測する、
ことを含む、該方法。
【請求項９】
排卵誘発に対する卵巣の応答を予測するキットであって、
（ａ）血清中ＭＩＳレベルを測定する方法；
（ｂ）血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するデータ；および
（ｃ）指令、
を含む、該キット。
【請求項１０】
血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するデータをチャートによって示す、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
血清中ＭＩＳレベルと回収卵細胞の数とを相関するデータをコンピュータープログラムによって示す、請求項９記載のキット。
【請求項１２】
過剰刺激に対する卵巣応答の予後指標として血清中ＭＩＳレベルを測定するための、モノクローナル抗体を含有するキット。
【請求項１３】
被験者における卵巣の過剰刺激の危険を評価する方法であって、
（ａ）該被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定し；および
（ｂ）該血清中ＭＩＳレベルと標準レベルとを比較する、
ことを含む、該方法。
【請求項１４】
卵巣の過剰刺激の危険を排卵誘発の間に評価する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
被験者における卵巣過剰刺激の危険を評価するためのキットであって、
（ａ）該被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定するための方法；および、
（ｂ）比較のための標準的な血清中ＭＩＳレベルのデータ、
を含む、該キット。
【請求項１６】
卵細胞の質の予後指標として生理学的なＭＩＳレベルを測定するための、ＭＩＳに対するモノクローナル抗体を含有するキット。
【請求項１７】
卵細胞の量の予後指標として生理学的なＭＩＳレベルを測定するための、ＭＩＳに対するモノクローナル抗体を含有するキット。
【請求項１８】
被験者における卵胞発育を刺激する方法であって、女性被験者に治療学的に有効な用量のＭＩＳを投与することを含む、該方法。
【請求項１９】
ＭＩＳを医薬的に許容し得る担体と組み合わせる、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＭＩＳを非経口的に投与する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
被験者におけるゴナドトロピンを変える方法であって、女性被験者に治療学的に有効な量のＭＩＳを投与することを含む、該方法。
【請求項２２】
ＭＩＳを医薬的に許容し得る担体と組み合わせる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＭＩＳを非経口的に投与する、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
不妊症処置に対する良いレスポンダーを同定する方法であって、被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定することを含む、該方法。
【請求項２５】
不妊症処置に対する乏しいレスポンダーを同定する方法であって、被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定することを含む、該方法。
【請求項２６】
排卵誘発薬物の使用を追跡しおよびその結果を予測するために、ＭＩＳの有無を同定するためのキット。
【請求項２７】
被験者における卵巣過剰刺激を予測するためのキットであって、被験者における血清中ＭＩＳ濃度を測定するための手段を含有する、キット。
【請求項２７】
体外受精周期のキャンセルを予測するためのキットであって、被験者における血清中ＭＩＳ濃度を測定するための方法を含有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の関心）
本発明は一部、アメリカ国立衛生研究所の特別研究第ＡＧ１５４２５号を財源とする。政府は、本発明のある権利を有し得る。
【０００２】
（関連出願のクロス・リファレンス）
本発明の実用出願は、米国仮出願番号第６０／３１３,５４５号（２００１年８月２０日出願）（このものは、本明細書の一部を構成する）による優先権を主張する。
【０００３】
(技術分野)
本発明は、生殖技術、発生および分子生物学の分野、並びに女性の生殖状態の評価に関する。特に、本発明は、受精処置に対する女性の応答を予測しおよび追跡するための、並びに女性の卵巣の予備能の枯渇を防止するための、新規な方法を提供する。
【０００４】
（背景技術）
多数の刊行物または特許を、本発明が属する分野の状況を記載するのに、本出願全般にまたは本出願の最後に引用する。これらの刊行物または特許の各々は、本明細書の一部を構成する。
【０００５】
不妊症は、ヒトの生殖系の異常な機能が原因で生じる疾患である。そのものは、無防備な性交の１年後に妊娠するのが不能なこと、または妊娠を出生にまで持っていくことが不能なことと、定義される。米国防疫センター(the Centers for Disease Control (CDC)）によれば、２．１百万人の成婚夫婦が、不妊症または彼女らの子供を持つ能力を損なう他の疾患を患っており、そして米国における推定６．１百万人の子供を生む年齢の女性が不妊症である。
【０００６】
女性の受精能は、継続的な規則正しい排卵周期に関わらず、閉経期の開始前の長年において減少が始まる。女性の後天的な生殖年齢の正確な定義は存在しないが、不妊症とは３５歳の年齢後がより一般的である。出産の平均年齢は、より多くの女性がより高い教育および経歴を追及するにつれて、過去の３０歳を越えて増大しているので、前例のない数の女性が家族を開始する準備をする時期までに遅い生殖年齢に達するであろう。結論として、多くの人が子供を妊娠するために受精処置の助けを必要とするであろう。患者は家族を開始する夢をかなえるために処置に数千ドルを進んで投資するので、不妊症は米国において年間、２０億ドルの産業となっている。
【０００７】
卵母細胞の提供を除いて、自然に妊娠することができない女性が現在使用することができる全ての受精処置が、女性の卵巣の予備能に依存する。用語「卵巣の予備能」とは、卵胞の数および卵母細胞の質の女性の現在の供給を意味し、このものは生殖の可能性と密接に関連する。通常、残りの卵の数が多ければ多いほど、妊娠の確率は良い。逆に言えば、低い卵巣の予備能は、患者の妊娠の確率を大きく低下させる。女性の年齢と共に、女性の卵の供給は、卵が閉経期で枯渇するまで、時間経過で徐々に減少する。出生前でさえも、女性の卵は数の減少が始まる。最大約７００万の卵が報告されている場合に、大部分の卵母細胞が子宮内の生活の５ヶ月間後に失われる。出生時に、両方の卵巣は約１００万の原始卵胞を含む。生殖寿命は、初経時に約５０万の原始卵胞で開始する。その後に、卵胞の減少は１ヶ月当たり、約１０００個の決まった割合で起こり、このことは３５歳の年齢を超えて加速される。卵の数は女性の年齢と共に減少し続け、閉経時には卵は全く残っていない。
【０００８】
卵巣の予備能の低下およびその関係する生殖可能性の低下の最も重要な側面は、その開始が非常に不定であることである。卵巣の機能は、生殖性能のピークの年齢について、並びにその低下の開始および進行についての両方で、個々の個体にとって独特である。正常な月経周期を有するある女性は、２０代後半または３０代前半で妊娠障害を有するであろう。卵巣状態についての高い個別の不定性のために、医師が不妊症患者の卵巣の予備能を評価することは極めて重要である。実際に、女性の卵巣の予備能の評価は、いずれの年齢の患者の不妊症の評価において最も重要な因子の１つである。卵巣の予備能が低下している女性は、排卵誘発に対する応答が低下しており、より高い用量のゴナドトロピンを必要とし、より高いＩＶＦ（体外受精）周期のキャンセル率(cancellation rate)を有し、そしてＩＶＦによるより低い妊娠率を被る。
【０００９】
卵巣の予備能を評価するための現在利用可能な方法は、受動的な(passive)試験および動力学的な(dynamic)試験に分類することができる。両方法の目標は、女性がある不妊症処置の方法の候補であるかどうかを評価するために、卵母細胞の質および量に関する情報を得ることである。卵巣の予備能についての標準的な受動的な試験は、月経周期の３日目の血清基底ＦＳＨおよびエストラジオールの測定から構成される。２０〜２５ｍＩＵ／ｍＬの高いＦＳＨのカットオフ値が異なるＦＳＨアッセイ比較標準の使用の理由で報告されているが、初期の卵胞期ＦＳＨレベルが１０ｍＩＵ／ｍＬより低いことおよびエストラジオールのレベルが８０ｐｇ／ｍＬよりも低いことは典型的に正常な卵巣の予備能の指標であると考えられる。どれほどの高いＦＳＨレベルが実験室の評価および処置方法において不定の原因となり得るかを決める絶対値を確立することは困難である。その上、正常な範囲内のベースライン値を有する女性は予備能が低下することがあり得て、そして該ＦＳＨレベルの上昇が明白となる時期までには、彼女らが妊娠に達したりまたは受精処置を受けるには遅すぎることがある。正常なＦＳＨを有するある女性は、彼女らの卵巣の予備能が徐々に低下しており、そして家族を始める見込みに関する保証の偽りの感覚の状態にあることに、全く気づいていないことがある。卵巣の予備能の他の受動的な試験は研究中であるが、それらの予後の値についてのデータが限られるために、通常の臨床的な使用には未だ推奨されていない。卵巣の予備能の静的な測定と対照的に、クロミフェンクエン酸負荷試験(clomiphene citrate challenge test (CCCT))は動力学的な方法である。その目的は、受精薬物のクロミフェンに対する応答の際に、卵の産生を開始するために卵巣を刺激することである。クロミフェンクエン酸負荷試験は通常、基底血清中ＦＳＨ試験よりもより正確であると考えられているが、現在利用可能な試験のいずれも、卵巣の予備能を正確に反映していないことが分かっている。
【００１０】
従って、不妊症処置に対する女性の応答を予測しそして追跡するためのより正確で且つ信頼できる方法についての要求が存在することは明白である。加えて、卵巣の予備能の枯渇を防止するであろう新規な方法が生殖技術の分野において非常に所望され得るであろう。
【００１１】
（発明の詳細な記載）
現在、女性の卵巣の予備能の状態を正確に反映する血清マーカーに対する大きな要求が存在する。卵巣の予備能についての現在の血清マーカーとしては、例えば間接的なホルモン（ＦＳＨ）および様々な直接的なホルモン（例えば、エストラジオール（Ｅ２）またはインヒビンＢ）の組み合わせを含む（Shararaらによる、Am J. Obstet. Gynecol. 1998; 179: 804-812）。初期の卵胞期の血清ＦＳＨは、視床下部および下垂体にフィードバックする卵巣ホルモン（Ｅ２、インヒビン、アクチビン、フォリスタチン）の混合物の活性を反映する。エストラジオールは、前胞状卵胞および胞状卵胞中の顆粒膜によって優位に分泌される。インヒビンＢは、小胞状卵胞中の顆粒膜から直接に分泌される。インヒビンＡは、優勢な卵胞の黄体形成顆粒膜細胞の産物であって、このものは黄体−卵胞の移行の間にその存在によって初期の卵胞血清中ＦＳＨを反映する。従って、現行の臨床的な使用における血清中マーカーの別の欠点は、初期の腔(antral)から排卵前期の状態に進行するにつれて、主に発育中のＦＳＨ−依存性卵胞の影響であることは明らかである。臨床的な関連値を見積もり、そして実験上の変動を減少させた差違を提示する以外に、ＦＳＨ−依存性の優勢な卵胞の発育に基づく現行で入手可能な血清中マーカーは、非成長性(nongrowing)の卵巣の卵胞の予備能を評価する際に有限値を有する。
【００１２】
卵巣の予備能のより正確な評価は必然的に、休止のＦＳＨ−依存性原始卵胞の数を測定することを含む。休止の原始卵胞は、生涯にわたって、卵巣中の成長性卵胞プールに持続的に入る。動物研究は、卵胞の減少が卵巣中に存在する原始卵胞の数に逆に関連することを示している（Hirshfield A. N.による、Biol. Reprod. 1994; 50: 421-428）。一旦卵胞が刺激されて成長した後は、それらは十分な成熟に達してそして排卵されるか、または閉鎖(atretic)となるかのいずれかであり得る。ヒトにおける原始および初期の胞状卵胞の間の発生の推定時間スパンは数ヶ月であると考えられているが、一方で初期の腔段階から前胞状卵胞までの発生は約３ヶ月かかると見積もられている。従って、典型的な受精処置の時間枠（数ヶ月から数年間）内で女性が子供を妊娠する見込みを測定するために、成熟に達するのが早く、そして現在の月経周期において排卵を支配しているプロセスによって失われるであろう少数の卵胞を評価するのとは反対に、女性の原始卵胞プールのサイズの信頼できる見積もりを得ることはより重要である。
【００１３】
ミューラー管抑制物質(Mullerian Inhibiting Substance)（ＭＩＳ）は、顆粒膜細胞によって産生される卵胞液成分であり（Vigierらによる、Endocrinology, 1984; 114: 1315-20; Takahashiらによる、Biol. Reprod., 1986; 35: 447-53; Bezardらによる、J. Reprod. Fertil., 1987; 80: 509-16; Rajpert-De Metysらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab 1999; 84: 3836-44）、そしてこのものは初期の思春期から成人期の間、ヒト血清中に見られるが、閉経期では消滅する（Hudsonらによる、J Clin Endocrinol Metab 1990; 70: 16-22; Jossoらによる、J Clin Endocrinol Metab 1990; 70: 23-7; Leeらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996; 81: 571-6）。ＭＩＳのＤＮＡ配列およびタンパク質配列の両方が、当該分野においてよく知られる（LeeおよびDonahoeによる、Endocrine Reviews 1993; 14(5): 152-164; Cateらによる、Cell, 1986; 45: 685-689）。ＭＩＳレベルは、月経周期により若干変わるが（Cookらによる、Fertil Steril 2000; 73: 859-61）、後期の卵胞期には最大に達する。
【００１４】
体外受精のために回収を受けた女性からのＭＩＳ卵胞液レベルが測定されており、過排卵の女性の排卵前期卵胞中にその存在が実証されている（Seiferらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4）。該ＭＩＳタイプＩＩ受容体は、げっ歯類の顆粒膜細胞中で発現し（di Clementeらによる、Mol Endocrinol 1994; 8: 1006-20; BaarendsらによるEndocrinology 1995; 136: 4951-62; TeixeiraらによるEndocrinology 1996; 137: 160-5）、そしてＭＩＳはパラクリン様式で作用して、顆粒膜細胞および卵母細胞の機能を調節すると考えられている（Takahashiらによる、Mol Cell Endocrinol 1986; 47: 225-34; Kimらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992; 75: 911-7; SeiferらによるJ. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76: 711-4）。ＭＩＳノックアウトマウスを用いた最近の研究は、ＭＩＳヌル雌性および該ＭＩＳヌル突然変異におけるそれらの異種接合体が、それらの原始卵胞プールの比較的に早い枯渇を有することを示している（DurlingerらによるEndocrinology 1999; 140: 5789-96）。それらの研究は、原始卵胞の補充の調節因子としてのＭＩＳの役割を示唆しており、このことはＭＩＳ分泌が該原始プールのサイズを反映することを意味する。開始前の非成長性ＦＳＨ−依存性卵胞の原始プールの指標である血清中マーカーは、生殖補助技術(an assisted reproductive techniques)の周期のための製剤に使用される排卵誘発薬に対する最終的な卵巣応答の予測において非常に有用となるであろう。
【００１５】
従って、本発明は血清中ＭＩＳレベルと卵巣の予備能とを相関させるための新規な方法、並びにＡＲＴ周期の一部として排卵誘発を受けている女性における卵巣の応答を予測する新規な方法を提供する。本発明の方法により、女性が現在入手可能な不妊症処置に対して良いレスポンダーであろうことおよび乏しいレスポンダーであろうこと、を医師が正確に予測することが可能となる。その上、本発明は、受精処置の間の女性の卵巣の応答を追跡する方法を提供する。このことにより、卵母細胞の回収のより正確な計画および時期が可能となり、そのことにより、キャンセルされる周期を減少させ、そして受精処置の財政的な代価および感情的な代価を有意に減少させることが可能となるであろう。体外受精周期の料金の平均は１０,０００ドル〜１７,０００ドルの間であるので、本発明の方法は患者および保証人(insurers)にとっての代価を実質的に低下させるであろう。重要なことに、本発明はまた、卵巣の過剰刺激症候群を予測し、追跡し、および防止する方法をも提供する。卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）は、弱から重度に及び且つ潜在的に生命の危険を脅かす症候群の障害の群を特徴とする。ＯＨＳＳとしては、例えば激しい骨盤の痛み、腹腔の膨張、卵巣の拡張、血液濃縮腹水、胸水もしくは心のう貯留液またはその両方、腎不全、乏尿症(oligourea)、カルシウム過剰血症(hypercalemia)および凝固性亢進症(hypercoagulation)を含むことが多い。そのものはほとんどの場合、外因性のゴナドトロビンの投与に関連することが多い。ｈＣＧ投与の排除によるのと同様に、本発明のキットおよび方法により、医師は卵巣の過剰刺激症候群を防止することができる。従って、ＭＩＳレベルを測定することによって、医師は卵巣の過剰刺激の危険のために、ｈＣＧを投与する納得した決定(informed decision)を行なうことができる。卵巣過剰症候群の防止における別の作用方法は、胎児を患者に戻すよりもむしろ胎児を凍結すること、凍結保存として知られる方法である。本発明の方法によって、過剰量のｈＣＧによる卵巣の過剰刺激の危険が過ぎるまで、妊娠を遅らせ、そしてｈＣＧレベルを最小に保つことができる。
【００１６】
最後に、本発明は、卵胞の予備能の枯渇を防止する方法、および卵胞の発育を刺激して、その結果女性の不妊症を処置する方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法は、受精処置に対する良い、最適下限または乏しい応答を予測する結果を得るために使用することができる。本発明は従って、体外受精（ＩＶＦ）処置を受けている女性にとっての最適な用量の受精薬を決めるための指針としての臨床的な使用にとって非常に有用である。ＩＶＦクリニックは通常、投与する受精薬の量を具現化するための唯一の指標として、患者の年齢をたよる。しかしながら、年齢は卵巣応答の非特異的で且つ信頼できない指標であって、そこで本発明は現在入手可能な診断用ツールを越える有意な改善を示す。本発明の方法は、ＩＶＦ処置を受ける前に全ての患者に使用して、乏しいレスポンダーを同定して、結果キャンセル(cancellation)の割合を低下させることができたり、並びに過度のレスポンダーを同定して、結果過剰刺激の危険を低下させることができる。従って、本発明は最適下限のレスポンダーとして同定される女性における卵巣の予備能の低下を補うために、卵巣刺激レジメを調節することを可能とする。
【００１８】
１態様において、本発明は、血清中ＭＩＳレベルと卵巣の予備能とを相関させる方法を提供する。ＭＩＳレベルと卵巣の予備能との間の相関は、ある被験者から回収される卵母細胞の数を測定し、被験者のＭＩＳの血清中レベルを測定し、そして得られたデータについての図示を選ぶことによって得ることができる。有効且つ効率的な分析のためのツールおよびデータの表示が、当該分野においてよく知られる。それらは、該データおよび見積もり誤差を分析するための統計学の使用、並びにこれらの方法および他の分析方法を実行するためのコンピューターの使用を含む。更に、該データおよび関数の図示とは、表、チャートおよび他の図表、並びに計算しそして該チャート、図および表を得るためのコンピュータープログラムの使用を含む。
【００１９】
本発明の別の態様は、女性における血清中ＭＩＳレベルを測定することによって、受精処置を探す女性の卵巣の予備能を評価する方法；および、該測定レベルを、ＭＩＳ血清中レベルと回収成熟卵母細胞の数とを相関するデータと比較することを含む。ＭＩＳ血清中レベルと回収成熟卵母細胞の数とを相関するデータの典型的な図示は、図２に示すチャートである。血清中ＭＩＳレベルとその相関する卵母細胞の回収値を測定することによって、女性の卵巣の予備能を信頼して評価することができ、そして適当な受精処置プロトコールを選択することができる。
【００２０】
関連する態様において、本発明は、女性の血清中ＭＩＳレベルを測定することによって女性の卵巣の予備能を測定し、そして統計学的なデータ（例えば、図２で提示する図で示す）を用いることによって、得られたＭＩＳレベルと回収成熟卵母細胞の経験値とを相関させるための、診断用キットを提供する。血清中ＭＩＳレベルの測定は、ＭＩＳに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いることによって達成することができ、そしてこのものとしては該ＭＩＳ特異的な抗体のための標識試薬を含み得る。加えて、該ＭＩＳ受容体およびそれらから誘導されるペプチドを用いて、ＭＩＳレベルを検出することができる。該キットは更に、その使用のための指令を含み得る。
【００２１】
別の好ましい態様は、女性の血清中ＭＩＳレベルを測定し、そして該測定レベルを標準レベルと比較し、その結果、排卵誘発に対する卵巣の応答を予測することによって、排卵誘発に対する女性の卵巣応答を予測する方法である。関連する態様において、本発明は、排卵誘発に対する卵巣の応答を予測するためのキットを提供する。該キットとしては、試薬（例えば、ＭＩＳに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）、および血清中ＭＩＳレベルを測定するための標識物質、並びにいずれかのある血清中ＭＩＳレベルと回収成熟卵母細胞の数とを相関するためのチャートを含む。該キットは更に、その使用のための指令および得られるデータの解釈のための指令を含み得る。
【００２２】
本発明において、過剰刺激に対する卵巣応答の予後的な指標としての女性被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定するための方法およびキットを企図する。該方法およびキットは、卵母細胞の量、重要なことは卵母細胞の質の予後的な指標としての生理学的なＭＩＳレベルを測定するための診断用試薬として、ＭＩＳに対するモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用することができる。女性被験者によって産生される内因性ＭＩＳの濃度が高くなるにつれて、該女性の本来の生殖可能性は増大し、このことはＭＩＳレベルの増大が生殖可能性に正に相関することを示す。図１および２を参照。
【００２３】
本発明の更なる態様は、女性被験者にＭＩＳを投与することによって、女性における卵胞発育(development)を刺激する方法である。臨床投与の目的で、該ＭＩＳを医薬的に許容し得る担体と組み合わせることができる。該ＭＩＳ投与の方法は、非経口的な経路またはいずれかの他の医学的に適当な経路によることができる。平均的なヒトの女性において、わずか約４００個の卵胞が成熟排卵前期の段階に達し、そして生涯において排卵される。女性の生涯にわたって非常に多数の卵胞が、成長および続く排卵によるよりもむしろ、根底にある分子学的な機構としてのプログラム細胞死を伴う閉鎖として知られるプロセスによって失われる。従って、ＭＩＳの投与によって卵胞の成長を刺激することは、さもなければアポトーシスを受けることを運命づけられているであろうあるパーセントの卵胞を助け得るであろう。これらの卵胞の生存の増大は、女性の卵巣の予備能を増大し、そして受精処置における女性の成功の確率を改善するであろう。
【００２４】
関連する態様において、本発明は、女性被験者においてゴナドトロピンを変える方法を提供し、該方法は該被験者にＭＩＳを投与することを含む。アポトーシスを抑圧するためのゴナドトロピンおよび様々な成長因子の重要性は、本発明の研究の主題である。ＦＳＨは、下垂体切除したラットから得られる顆粒膜細胞におけるアポトーシスを減少し、そして培養された排卵前期卵胞のアポトーシスの変化を防止することが分かっている（Chun S.Y.らによる、Endocrinology 1994; 135: 1845-1853）。
【００２５】
本発明の別の好ましい態様は、受精処置に対する良いレスポンダーを同定する方法であって、該方法は被験者における血清中ＭＩＳレベルを測定することを含む。本発明によって提供される重要な利点は、ＦＳＨレベルの上昇を示す女性の中で、現行の方法下で受精処置を試みることを思いとどまっているであろう女性を区別する能力である。従って、本発明により、医師が従来の診断値が最適以下である被験者中の可能性のあるレスポンダーを同定することを可能とする。
【００２６】
更に別の態様において、本発明は、排卵誘発薬の使用を追跡し、そして結果を予測するために、ＭＩＳの質、存在または非存在を同定するためのキットを提供する。
【００２７】
本発明の１態様は、卵胞の発育、従って卵母細胞の産生および成熟を刺激するために、ＭＩＳを用いてインビボで不妊症を処置する方法であり、これにより最終的に、女性被験者における受精が増大する。該ＭＩＳタイプＩＩ受容体は、げっ歯類の顆粒膜細胞中で発現し、そしてＭＩＳはパラクリン様式で作用して顆粒膜細胞および卵母細胞の機能を調節する。ＭＩＳに対する受容体の位置の理由で、治療学的に有効な用量のＭＩＳは、卵胞に直接的かまたは被験者の別の部分に非経口的かのいずれかで投与して、その結果ＭＩＳが卵巣に達することが好ましい。
【００２８】
インビボ投与のための治療学的に有効な用量のＭＩＳは、典型的に医薬的に許容し得る担体（このものは、使用する用量および濃度でレシピエントにとって毒性がなく、そして製剤の他の成分と適合し得るものを意味する）と一緒に製剤化する。例えば、製剤は、ＭＩＳにとって有害であると知られるいずれの物質をも含まない。該担体は、添加物（例えば、等張性および化学的安定性を増大させる物質）を含み得る。該添加物質としては例えば、緩衝化剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１２残基より少ない）ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性高分子（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（このものは、セルロースまたはその誘導体、トレハロース、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー(poloxamers)またはＰＥＧ）を含み得る。最終的なＭＩＳ製剤は、液体または凍結乾燥した固体であり得る。該ＭＩＳ、その適当な誘導体または代謝産物は、単独でまたは１つ以上の別の活性薬物と混合して使用することができる。
【００２９】
本発明の方法において記載するＭＩＳおよびその治療学的な組成物はまた、徐放性システム（例えば、成型した物品の形態である半浸透性高分子マトリックス、例えばマイクロカプセル）によっても適当に投与される。徐放性マトリックスとしては例えば、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)、エチレンビニルアセテートまたはポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸を含む。徐放性組成物はまた、リポソーム封入の化合物をも含む。該リポソームは、約２００〜８００オングストロームの単層タイプであることが好ましい。
【００３０】
治療学的な投与に使用するＭＩＳは減菌であることが好ましく、そしてこのものは、約０．２ミクロンサイズの減菌ろ過膜を用いるろ過を用いて達成することができる。治療学的なＭＩＳ組成物は一般に、減菌アクセスポート(sterile access port)（例えば、静脈内溶液のう(bag)）を有する容器、または皮下注射針によって穴をあけることが可能なストッパーを有するバイアル中に置く。上記の製剤はまた、インビトロの使用にも適当である。
【００３１】
ＭＩＳは通常、１回投与または複数回投与用の容器（例えば、封したアンプルまたはバイアル）中、水溶液または再構築のための凍結乾燥製剤として、保存される。凍結乾燥製剤の例としては、１０ｍＬバイアルを、減菌ろ過した１％（ｗ／ｖ）ＭＩＳ水溶液（５ｍＬ）で満たし、そして得られた混合物を凍結乾燥する。
【００３２】
本発明における治療学的に有効な用量のＭＩＳは通常、１日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。０．１〜１μｇ／ｋｇが好ましい。医師は、不妊症の症状を改善する用量に達するまで、年齢、体重、健康などの通常の因子および被験者にとって個別の他の因子を考慮して、本発明のＭＩＳ製剤を投与する。本療法の進行は、通常のアッセイによって容易に追跡される。
【００３３】
本発明の別の態様は、卵母細胞の質および受精を改善することである。本発明の態様において、卵母細胞は、インビボまたはエキソビボのいずれかで改善することができる。本態様において、卵母細胞は、未熟または十分な発育のいずれかであり得る。本発明は、ヒトまたは非ヒトの雌性動物被験者に使用することができる。ヒト被験者に使用する場合には、好ましい方法は、不妊症である被験者、臨床的介入(clinical intervention)がないことを想像することができない被験者、または将来、臨床的介入がないことを想像することができない被験者（例えば、化学療法を受ける準備をしている被験者）について使用する。非ヒト被験者に使用する場合には、該方法はとらわれの状態にある動物について使用することが好ましく、そして絶滅の危機に瀕している種について使用することが最も好ましい。
【００３４】
本発明の態様のエキソビボ方法は、第１に卵母細胞（未熟な卵母細胞が好ましい）を卵巣内の卵胞から取り出すことを必要とする。このことは、通常の方法、例えば自然周期または排卵誘発法を用いることによって、外科的な介入（例えば、卵巣摘出術）の間で、ＩＶＦプログラムの状況で過剰刺激プロトコールの間で、または検死によって、達成することができる。自然周期の場合には、超音波検査または腹腔鏡検査により、中間期(midcycle)近くで卵巣表面上の１つ以上の急速に成長する(burgeoning)卵胞の同定が可能である。排卵に達する卵胞は、膨張し、そして実質的に半透明になる。次いで、該卵胞を針を用いて吸引し、そして１つ以上の卵母細胞を経腟的に抽出する。次いで、該卵母細胞を、周りにある下流膜細胞の数および密度、第一極体の有無、および透明帯の厚さ、並びに他の因子に基づいて評価する。
【００３５】
本発明はまた、ホルモン刺激被験者由来の卵母細胞を含めた既に成熟した卵母細胞の受精を改善し、その結果該卵母細胞は非刺激性の卵巣由来の卵母細胞よりもより成熟することを企図する。それらコントロールされた複数の卵胞の成熟を誘起するために使用する薬物としては、卵巣に直接的に投与するインヒビン、クロミフェンクエン酸もしくはヒト閉経期ゴナドトロピン、またはＦＳＨとＬＨの混合物、および／またはヒト絨毛性ゴナドトロピンを含む。これら受精薬は、治療学的に有効な量で投与する。ゴナドトロピン放出ホルモン性作動薬または拮抗薬はまた、ＦＳＨと組み合わせて使用することもできる。
【００３６】
抽出後の本態様において、治療学的に有効な用量のＭＩＳを卵細胞に投与する。該ＭＩＳは、顆粒膜細胞および／または卵細胞上のその受容体と結合し、そして卵細胞の成長および成熟を刺激し、このことにより、受精の準備ができた成熟した健康な卵母細胞を生じることが好ましい。投与するＭＩＳは、単独でまたは好ましくは医薬的に許容し得る担体と混合するかのいずれかである。本発明の方法をインビボで行なう場合には、該被験者は、受精の準備刺激がされた(primed)１つ以上の成熟した健康な卵母細胞を与えることが好ましい。本発明の方法をインビトロで行なう場合には、該卵母細胞は成熟しており、そしてこのものは適当な時期に精子と受精するであろう。得られる胚が４〜８の細胞期に達したりまたは胞胚である場合には、そのものは担体中にインプラントしたりおよび誕生まで発育させることが好ましい。
【００３７】
（定義）
本発明に関連する様々な用語を、明細書および特許請求の範囲中で使用する。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＭＩＳ」とは、天然の配列もしくは遺伝子改変の形態のいずれかの種（このものは、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリを含むが、ヒトが好ましい）由来の、および自然に、合成的に、もしくは組み換え的に産生される場合にはいずれかの源由来の、ミューラー管阻害物質(Mullerian inhibiting substance)を意味する。
【００３９】
用語「非経口」とは、ポリペプチドを静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、脳室内、頭蓋内、皮下、真皮下、経腟的、経口、鼻腔または直腸の経路によって導入することを意味する。
【００４０】
「治療学的に有効な用量」とは、投与するものが効果を与える用量を意味する。
【００４１】
「パラクリン」とは、標的細胞がシグナル放出細胞に近い場合のシグナル伝達の形態を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「卵母細胞」とは、雌性動物の卵胞由来の配偶子を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、並びにＦａｂフラグメント（このものは、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリの産物を含む）を含む。
【００４４】
「モノクローナル抗体」とは、ある抗原に対する抗体の実質的に均一な個体群を意味する。そのものは、培地中での継代細胞系によって抗体分子の産生を与えるいずれかの方法によって得ることができる。モノクローナル抗体は、当該分野の当業者にとって知られる方法によって得ることができる。例えば、Kohlerらによる、Nature 256:495497, 1975および米国特許第4,376,110号を参照。
【００４５】
「ポリクローナル抗体」とは、同じ抗原に対する応答の際に異なるＢ型リンパ球（ここで、該群における異なる抗体は該抗原の異なる部分を認識する）によって産生される異種抗体の群を意味する。
【００４６】
「ゴナドトロピン」とは、脳下垂体の前葉由来の糖タンパク質ホルモンの群を意味する。それらは、性腺の成長および性ホルモンの分泌を刺激する。ゴナドトロピンの例としては、特に例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などの物質を含む。
【００４７】
本明細書で使用する用語「標準」および「標準レベル」とは、読み数（図２などに示す、統計学的に有意な読み数が好ましい）を計ることから得られる測定濃度のＭＩＳを定義するのに使用する。該標準は、成功の大きさに応じて、指し示す該標準の上または下に読みを任意に固定することができる。
【００４８】
（実施例）
以下の実施例は、本特許請求する発明をより例示するために提供し、このものは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。具体的な物質を記載する程度については、そのものは単に例示の目的であって、そのものは本発明を限定することを意図するものではない。
【００４９】
（実施例１）
１９９９年３月から２００１年３月の間、−８０℃で保存した３日目の血清試料を解凍し、そしてＭＩＳのバッチ中でアッセイする。ロイプロリド酢酸（Lupron; TAP Pharmaceuticals, North Chicago, IL）を用いる下垂体の脱感作を受ける２ヶ月内に、血清を採取され、続いてＩＶＦ用製剤でゴナドトロピン刺激を受けた１０７女性の各々からの試料を分析する。刺激プロトコールの詳細は、従来の刊行物に記載されたものと同様とする（Seiferらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993; 76:711-4）。卵胞刺激ホルモンの刺激は、ゴナドトロピン刺激の代わりにほとんど排他的に使用する。時々、一旦ゴナドトロピンを開始すると、ロイプロリド酢酸を止める。研究する２群は、＜６回収卵母細胞（範囲は、１〜６個の卵母細胞）を有する女性由来の２８個の試料、および＞１１回収卵母細胞（範囲は、１１〜４４個の卵母細胞）を有する女性由来の７９個の試料からなる。
【００５０】
＜６および＞１１の回収卵母細胞の選択基準は任意に選択して、異なる卵巣の応答を有する女性群の中で潜在的な生理学的な差違を誇張するよう努力する。ＦＳＨが上昇した（＞１０  ＩＵ／Ｌ）女性由来の血清を除いて、３日目の血清中ＭＩＳが３日目の血清中ＦＳＨ値の「正常な」範囲内で回収される卵母細胞の数と関連し得るかどうかを測定するように努力する。直径が＞１８ｍｍで測定される卵胞を、ｈＣＧ注射の３６時間後に、患者の鎮静下で吸引する。この研究は、治験審査委員会(institutional review board)の承認から免除されている。その理由は、血清試料は実験室的な質の保証の役目で保存するが、それらは臨床的には廃棄される物質であると考えるからである。
【００５１】
(実施例２）
ミューラー管阻害物質−ＥＬＩＳＡ
ヒトＭＩＳを測定するのに使用するＥＬＩＳＡは、広く記載されている（Hudsonらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 16-22; Leeらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996; 81: 571-6）。６回段階希釈の試料を２回分析する；報告する結果は、４個のパラメーターのロジスチックな曲線フィッティングDeltaSoft II（BioMetallics, Inc., Princeton, NJ）を用いることで構成される、該標準曲線の直線部分内にある３個の希釈物の平均値である。本アッセイの感度は、０．５ｎｇ／ｍＬである；アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、それぞれ９％および１５％である。該ＭＩＳ  ＥＬＩＳＡは、ＬＨ、ＦＳＨ、アクチビン、インヒビンまたはＴＧＦ−βを認識せず、そしてこのものはウシまたはげっ歯類のＭＩＳと交差反応しない（Hudsonらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 16-22）。
【００５２】
（実施例３）
統計学的な分析
血清値は、全ての場合において平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。StatView（Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA）によって実施された片側ｔ検定を用いて、比較群間の差違が統計学的に有意であるかどうかを測定する。Ｐ値が＜０．０５である差違は、統計学的に有意であるとみなす。血清中のＭＩＳ、ＦＳＨ、Ｅ２、回収卵母細胞の数、および回収成熟卵母細胞の数の間の相関は、直線軸上にプロットしたデータの線形曲線フィット(linear curve fit)を構築することによって測定する。得られた線の勾配を、対応する相関係数の臨界値の表からそれらのＰ値を得ることによって、０からの統計学的に有意な差違について調べる。
【００５３】
（結果）
平均年齢、３日目の血清中のＦＳＨ、Ｅ２、ＭＩＳ、刺激周期Ｅ２最大濃度、並びに＜６回収卵母細胞を有する女性と＞１１回収卵母細胞を有する女性との間の卵母細胞の数、の比較を、図１にまとめる。平均年齢は、群間で同じである。３日目の血清中ＦＳＨの平均値±ＳＥＭ（５．９ＩＵ／Ｌ±０．４  対  ４．９ＩＵ／Ｌ±０．２）、および３日目の血清中Ｅ２の平均値（４１ｐｇ／ｍＬ±３  対  ３２ｐｇ／ｍＬ±１）は統計学的に有意に異なるが（それぞれ、Ｐ＝０．０１およびＰ＝０．００３）、それらの個々の値の差違は臨床的に有意ではない。達成される最大Ｅ２レベルは、高い卵細胞数の群においてはより有意に大きい（２，９５０ｐｇ／ｍＬ±１４０  対  １，７２０ｐｇ／ｍＬ±１６０；Ｐ＜０．０００１）。ＭＩＳ濃度の平均値は、１．０ｎｇ／ｍＬ±０．４  対  ２．５ｎｇ／ｍＬ±０．３であるか、または群間で＞２．５倍よりも大きい濃度のＭＩＳ（Ｐ＝０．００６）である（表１）。
【００５４】
血清中ＭＩＳおよび卵巣機能の他の測定値の間の相関は、ＭＩＳと、３日目のＥ２（ｒ＝−０．１６９、Ｐ＜０．０５）およびＦＳＨ（ｒ＝−０．２９５、Ｐ＜０．００５）との間で統計学的に有意な逆の関係を示す。排卵誘発期間の間に得られる、ＭＩＳと、回収卵母細胞の数（ｒ＝０．５２２、Ｐ＜０．００１）および最大血清中Ｅ２濃度（ｒ＝０．３２８、Ｐ＜０．００１）との間の統計学的に有意な正の相関を示す。
【００５５】
更に、３日目の血清中ＭＩＳ（Ｅ２でもＦＳＨでもない）は、最終的に回収される成熟卵母細胞の数と正に相関する（図１）。全ての相関は統計学的に有意であるが、該ＭＩＳ相関（ｒ＝０．４８、Ｐ＜０．００５）は、卵巣の予備能の他のマーカーのいずれか（すなわち、Ｅ２またはＦＳＨ）のものよりもかなり強い。
【００５６】
（考察）
ミューラー管阻害物質は、二量体の糖タンパク質であって、そして成長因子のトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員である。そのものは、卵巣顆粒細胞によって産生され（Vigierらによる、Endocrinology 1984; 114: 1315-20; Takahashiらによる、Biol. Reprod. 1986; 35: 447-53; Bezardらによる、J. Reprod. Fertil. 1987; 80: 509-16; Rajpert-De Meytsらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1999; 84: 3836-44）、そしてそのものは、初期の思春期から成人期を通じてヒト血清中に見られるが、閉経期に消滅する（Hudsonらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 16-22; Jossoらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 23-7; McGeeらによる、Biol. Reprod. 2001; 64: 293-8）。ＩＶＦのために回収を受けている女性由来のミューラー管阻害物質の卵胞液レベルが測定されており、これは過排卵の女性の排卵前期卵胞中にその存在を示している（Seiferらによる、J Clin Endocrinol Metab 1993; 76: 711-4）。
【００５７】
該データは最初に、臨床的に同じ３日目の血清中ＦＳＨおよびＥ２の濃度に関わらず、初期の卵胞期血清中ＭＩＳと、回収卵母細胞の数との間の関連を示す。具体的には、より高い血清中ＭＩＳ濃度は、回収卵母細胞のより多い数と関連する。更に、３日目の血清中ＭＩＳは、いわゆる正常な範囲の３日目のＦＳＨが＜１０  ＩＵ／Ｌであるにも関わらず、回収卵母細胞の数および成熟卵母細胞の数と関連する。血清中ＭＩＳ濃度は、原始卵胞プールのサイズに影響を及ぼし得て、そしてこのものはＩＶＦのための制御した卵巣刺激後に回収される卵母細胞の予測数と関連するマーカーを与え得る。原始プール、および前(preantral)胞状卵胞および初期胞状卵胞のどれほどの相対的な寄与が周期の３日目での血清中ＭＩＳ濃度を測定する際にあり得るかは、不明のままである。ＭＩＳ発現は妊娠期間の第３の三半期(trimester)において（Rajpert-De Metysらによる、J. Clin. Endocrinol. Metab 1999; 84: 3836-44）、実際にはそのものが血清中に検出され得る前の長期に始まるので、ＭＩＳはこれまで考えられてきたよりもずっと早い時期に初期の卵胞の発育に重要な役割を果たしているようである。その上、ＭＩＳ発現は、出生後およびゴナドトロピン効果の十分な前に、全てではないがほとんどの卵胞中で続いているようである。
【００５８】
しかしながら、一旦卵巣周期が始まると、血清中ＭＩＳレベルは、おそらく小コホートの卵胞の刺激の結果として安定なベースライン値からわずかに変動し（Cookらによる、Fertil. Steril. 2000; 73: 859-61）、そして黄体としてのＭＩＳの産生の低下が生じる。初期の卵胞期ＭＩＳレベルは、視床下部−下垂体軸とは独立して子宮内でのＭＩＳ産生を開始する卵胞プールから生じるものであり、従って、このものは卵巣の予備能の他のゴナドトロピン依存性指標と区別されると考えられ得る。
【００５９】
本発明は、３日目の血清中ＭＩＳが卵巣の予備能を評価するのに現在使用されている血清中マーカーの組に臨床的な寄与を付与することができることを示す。原始プールの状態のそれらマーカーは、現在の血清中マーカーによって得られず、また超音波検査によっては直接的に測定することができない、特異な展望を与えることができる。この可能性は、ＭＩＳが卵胞の成長を誘発すると結論付ける２つの最近の報告によって支持される（Durlingerらによる、Endocrinology 1999; 140: 5789-96; McGeeらによる、Biol. Reprod. 2001; 64: 293-8）。本発明は、より多数の患者の個体群におけるキャンセル(cancellation1)の割合および妊娠の結果を調べる別の研究を企図する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、＜６対＞１１の回収卵母細胞を有する女性群の比較を示す図面である。該２群における女性は同年齢であり、そして彼女らの３日目のＦＳＨ値は有意な差違はなかった。しかしながら、＞１１回収卵母細胞群における女性の血清中ＭＩＳ阻害物質（ＭＩＳ）値は、６よりも少ない回収卵母細胞の女性群の値よりも２.５倍高かった。従って、血清中ＭＩＳレベルは、産生する成熟卵母細胞の数と正に相関し、そしてこのものは卵巣の予備能の有用なマーカーである。
【図２】図２は、回収成熟卵母細胞の数の関数としての、３日目の血清中のＦＳＨ、エストラジオールおよびＭＩＳを示す図面である。該ｐ値はこれらの関係の重要性を確認するものであり、そしてこのものは卵母細胞の数との最も高い相関は血清中ＭＩＳ濃度であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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