(57)【要約】  精神神経疾患に対する個体の易罹患性を判定する方法、または精神神経疾患(特に、統合失調症)の診断もしくは予後判定方法であって、染色体領域8p21-22中に位置する中心小体周辺物質1(PCM1)マーカー、例えば、PCM1遺伝子座内もしくはその1000kb以内にあるマーカーの使用を含む、前記方法が提供される。本発明はまた、新規なマーカー、ならびに関連物質およびそれらを検出する方法、ならびに治療および診断における使用のためのさらなる分子を同定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体領域8p21-22中に位置するマーカーの使用を含む、精神神経疾患に対する個体の易罹患性を判定する方法、または該精神神経疾患の診断もしくは予後判定方法。
【請求項２】
前記疾患が統合失調症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
(i) 前記個体から核酸またはタンパク質のサンプルを取得すること；
(ii) 中心小体周辺物質1(PCM1)遺伝子によりコードされるポリペプチドの構造、発現レベル、および／または活性を測定すること、
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、
(i) 前記個体から核酸のサンプルを取得すること、および
(ii) そのサンプル中の、中心小体周辺物質1(PCM1)マーカーの存在または非存在を決定すること、
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がRNA、cDNAまたはゲノムDNAである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
PCM1マーカーが、染色体8p21.3-22上のNT_000501コンティグ中に存在する以下のマイクロサテライト反復配列：D8S2612；D8S2613；D8S2614；D8S2615；D8S2616；D8S2617；D8S2618；もしくはD8S261、またはこれらのいずれかと連鎖不平衡状態にある多型マーカーのいずれかからなる群より選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
PCM1マーカーがD8S261；D8S2615；またはD8S2616である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
PCM1マーカーがPCM1遺伝子内にある、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
PCM1マーカーがエクソン4に対して3'側のイントロン配列；エクソン4中のイントロン配列；エクソン5の5'側のイントロン配列中にあり、そのエクソン-イントロンが図6に示されるものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
PCM1マーカーが、図2〜5に示されるクローンAB020866の配列に従って番号付けされた以下の位置：
(i) 80254、
(ii) 80123、
(iii) 87366、
(iv) 87507、
またはこれらのいずれかと連鎖不平衡状態にある多型マーカー、
からなる群より選択されるSNPである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記SNPにおけるヌクレオチドの同一性が図2〜5のいずれか1つにおける対応する番号の位置に示される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記PCM1マーカーSNPの2個以上を評価する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドプローブの核酸サンプルへの結合を、これらの試薬のその相補配列への特異的なアニーリングにとって好ましい条件下で測定することによって、前記8p21-22領域を評価する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが、(i)図1〜5のいずれか1つに示されるPCM1配列、もしくは(ii)図1〜5のいずれか1つに示されるPCM1配列の多型形態、もしくは(iii)そのいずれかの相補体の、全部または一部を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが、ストリンジェントな条件下で、PCM1マーカーのある特定の対立遺伝子と特異的に結合するが、PCM1マーカーの他の対立遺伝子とは特異的に結合しない核酸配列を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブを標識し、該プローブの結合を該標識の存在により測定する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、少なくとも1個のPCM1マーカーを含む8p21-22領域の一領域を増幅することを含む、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
PCM1遺伝子を増幅する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
増幅するPCM1遺伝子の領域がエクソン4に対して3'側のイントロン配列；エクソン4中のイントロン配列；またはエクソン5に対して5'側のイントロン配列内にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
8p21-22領域の一領域を、2個のオリゴヌクレオチドプライマーの使用により増幅する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
PCM1マーカーを、鎖コンフォメーション多型マーカー分析；ヘテロ二本鎖分析；RFLP分析からなる群より選択される方法により評価する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
PCM1遺伝子のmRNA発現のレベルを、ノーザン分析または逆転写酵素PCRにより測定する、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
図2〜5に示されるクローンAB020866の配列に従って番号付けされた以下の位置：
(i) 80254、
(ii) 80123、
(iii) 87366、
(iv) 87507、
からなる群より選択されるSNPであるPCM1マーカーの試験サンプル中での存在または非存在を決定する方法であって、(i)図2〜5のいずれか１つに示されるPCM1配列、もしくは(ii)図2〜5のいずれか1つに示されるPCM1配列の多型形態、もしくは(iii)そのいずれかの相補体、の全部または一部を含むオリゴヌクレオチドプローブの前記核酸サンプルへの結合を測定することを含む、前記方法。
【請求項２４】
図2〜5に示されるクローンAB020866の配列に従って番号付けされた以下の位置：
(i) 80254、
(ii) 80123、
(iii) 87366、
(iv) 87507、
からなる群より選択されるSNPであるPCM1マーカーの試験サンプル中での存在または非存在を決定する方法であって、少なくとも1個の前記SNPを含むPCM1配列の一部を増幅することができる2個のオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む、前記方法。
【請求項２５】
PCM1マーカーをヌクレオチド配列決定により評価または確認する、請求項４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
染色体8p21.3-22上のNT_000501コンティグ中に存在するマイクロサテライト反復配列であるD8S2612；D8S2613；D8S2614；D8S2615；D8S2616；D8S2617；もしくはD8S2618であるPCM1マーカー、または図2〜5に示されるクローンAB020866の配列に従って番号付けされた以下の位置：
(i) 80254、
(ii) 80123、
(iii) 87366、
(iv) 87507、
からなる群より選択されるSNPであるPCM1マーカーを含む、請求項１３〜１６または請求項２３のいずれか１項に記載の方法における使用のためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２７】
(i)図2〜5のいずれか1つに示されるPCM1配列、もしくは(ii)図2〜5のいずれか1つに示されるPCM1配列の多型形態、もしくは(iii)そのいずれかの相補体、の全部または一部を含む、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２８】
PCM1マーカーを含むか、またはそれにフランキングする領域中のDNAにハイブリダイズする第1および第2のプライマーを含む、請求項１７〜２０または請求項２４のいずれか１項に記載の方法における使用のためのPCRプライマー対。
【請求項２９】
前記２つのプライマーの少なくとも一方が、
5’-GGATAACAATTTCACACAGG-TGAGCCATTGATTATG-3’
5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-AGTTGTCCCTGCAACCT-3’
5’-GGATAACAATTTCACACAGG-CCAAGTGTCTTTGGTTATCTTCG-3’
5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-AGTCCGAACATCCTCCTCCT-3’
からなるリストより選択される、請求項２８に記載のプライマー対。
【請求項３０】
前記２つのプライマーの少なくとも一方が、
5'AAT TCC CCA AAC AAA ACA ACA3'
5'AGG CTA TCC TTT CCT CAG CA3'
5'ATG TTC AGC CAC CAT CGT CT3'
5'CAG TGT CGC TGG AAA GTT GA3'
5'TCC CGA AGT GCT AGG ATT ACA3'
5'GCT CAG CAG GAA GAG GAA TG3'
5'AGA GGC CAG GCA CAA AAG TA3'
5'AAC ATT CCA GCA TCC CAA AG3'
5'GAC CCA CTG CCA CAC TCT TT3'
5'GGA GTG CGG CAT GAA ATT AT3'
5'ATA TGT ATA CAA TGT GTA TCT GTA TC3'
5'CCT TTT AGT TCC CAT TCC CAT T3'
5'TGA TGC AGG AGA ATT GCT TG3'
5'CCT ACT TGG CTG GGA TTC TG3'
からなるリストより選択される、請求項２８に記載のプライマー対。
【請求項３１】
請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のプローブおよび／またはプライマーを含む、統合失調症に対する個体の易罹患性を判定する方法のため、または統合失調症の診断もしくは予後判定方法のためのキット。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法に従って統合失調症に対する遺伝的素因について個体をスクリーニングして、その遺伝的素因をPCM1マーカーと相関させること、および素因が同定された場合には、該個体に治療的処置を提供することからなる工程を含む、統合失調症の治療方法。
【請求項３３】
染色体領域8p21.3中に位置するPCM1多型マーカーから誘導された遺伝子配列を有するゲノムライブラリーをスクリーニングすること、および前記遺伝子配列に隣接する領域中のオープンリーディングフレームを同定することを含む、統合失調症に対する易罹患性に関連する遺伝子座を同定または単離する方法。
【請求項３４】
染色体8p21.3-22上のNT_000501コンティグ中に存在するマイクロサテライト反復配列であるD8S261; D8S2612; D8S2613; D8S2614; D8S2615; D8S2616; D8S2617;もしくはD8S2618であるPCM1マーカー、または図2〜5に示されるクローンAB020866の配列に従って番号付けされた以下の位置：
(i) 80254、
(ii) 80123、
(iii) 87366、
(iv) 87507、
からなる群より選択されるSNPであるPCM1マーカーと連鎖不平衡状態にある多型マーカーを同定することを含む、統合失調症に対する易罹患性と関連する多型マーカーをマッピングする方法。
【請求項３５】
PCM1遺伝子またはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドと、試験物質とを混合すること、および該ポリペプチドの活性レベルを測定することを含む、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法。
【請求項３６】
PCM1遺伝子またはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドと、試験物質とを混合すること、および該ポリペプチドへの該試験物質の結合を測定することを含む、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法。
【請求項３７】
統合失調症の診断剤および予後判定剤としての使用のための、PCM1遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項３８】
統合失調症の治療における使用のための、PCM1遺伝子またはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子を含む核酸分子。
【請求項３９】
統合失調症の治療における使用のための、PCM1遺伝子またはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子によりコードされるポリペプチド。
【請求項４０】
PCM1遺伝子もしくはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子からの発現を調節する物質を、患者に投与すること、またはPCM1遺伝子産物もしくはPCM1遺伝子座の1000 kb以内に位置し、かつそれと連鎖不平衡状態にある遺伝子の活性レベルを調節する化合物を投与することを含む、統合失調症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は統合失調症への易罹患性に影響を及ぼす遺伝子配列と連鎖した第8染色体上の染色体領域の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
統合失調症は種々の精神病性精神障害(psychotic psychiatric disorders)の集まった疾患であり、一般集団のその生涯有病率は約0.85%である。統合失調症は、最も有病率が高く、また荒廃しかねない精神神経疾患の１つであり、幻聴、妄想、思考障害、不適当な情動、奇矯な行動、および認知異常といった症状の発現により特徴付けられる。
【０００３】
現在のところ、統合失調症か否かは、一般的には国際疾病分類(International Classification of diseases)または米国精神医学協会精神疾患診断・統計マニュアル(American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM))の最新版で規定されている判断基準を用いて評価されている。現在利用することのできる薬剤療法のいくつかは統合失調症と診断された患者の約3分の1に対してしか有効でなく、3分の1は部分的に応答し、残りの3分の1は応答が低い。ある特定の統合失調症の患者に対してどの薬物療法が有効であるかを予測することは現在のところ不可能である。
【０００４】
統合失調症に遺伝的要素が存在することは、双子での研究と遺伝的連鎖の研究によって裏付けられている(Gurling, 1996, 「統合失調症の遺伝学(The Genetic of the Schizophrenias)」, 「精神疾患の遺伝学  第II部：臨床上の事項(Genetics of Mental Disorders Part II: Clinical Issues)」中,  Papadimitriou, G.N., Mendlewicz編, J. Balliere's Clinical Psychiatry, International Practice and Research 2:15-46)。
【０００５】
統合失調症などのようなよく見られる疾病の遺伝子のマッピングは、統合失調症の表現型の定義が様々であり、病因が一様でなく、この疾患の特徴の遺伝的伝達様式が不確かであることから、複雑である。精神神経疾患では、罹患遺伝子型を有する個人と、遺伝的に罹患していない個人とを見分ける上で、あいまいな部分がある。
【０００６】
従って、精神遺伝学者が直面する最大の困難性の１つは、表現型指定の妥当性が不確実なことであり、それは、臨床的診断が臨床的観察および主観的報告のみに基づいて行われるからである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは統合失調症に関する易罹患性遺伝子座を有する第8染色体上の領域を同定した。特に、本発明者らは、統合失調症において役割を果たすと思われる遺伝子(PCM1)を同定した。
【０００８】
以前から、連鎖研究は、第8染色体(8p21-22)の領域が統合失調症と関連していることを指摘してきた(Kendlerら、1996；Livinsonら、1996)。例えば、マーカーD8S261がこの領域に位置付けられることが示された。しかしながら、そのような連鎖解析から得られた結果は、この疾患を約3000万〜6000万塩基対に局在化させることができるにすぎない。そのような連鎖の結果は単一の遺伝子を表すにはあまりに広すぎる領域に伸びている。さらに、その大きな領域中で統合失調症の易罹患性遺伝子が存在する部位を、そのような連鎖解析から予測することもできず、また、ポジショナルクローニングもしくはそのような大きな領域内での候補遺伝子分析によって単一遺伝子を同定することもできない。
【０００９】
本発明者らは、連鎖不平衡マッピング及び対立遺伝子連関試験を用いて、統合失調症に関与する第8染色体8p21-22の領域を同定した。
【００１０】
第1の段階において、本発明者らは、ジ、トリおよびテトラCA/GTヌクレオチド反復モチーフを探索し、7つの新規な多型、すなわちマイクロサテライトマーカー座位 D8S2612；D8S2613；D8S2614；D8S2615；D8S2616；D8S2617；D8S2618 を同定した。これらは全て、染色体8p21.3に局在していた。統合失調症との対立遺伝子連関は、英国人集団中の、137人の統合失調症患者および300人の民族的に一致した対照を用いた試験において、これらのうちの2つ(D8S2615；D8S2616)について証明された。
【００１１】
さらに、本発明者らは、公知のマイクロサテライトマーカー(D8S261)との強力な対立遺伝子連関を証明した。
【００１２】
本発明者らは、これらのマーカーが染色体領域8p21.3に局在していることを示した。D8S261、D8S2615およびD8S2616はPCM1遺伝子に局在していた。
【００１３】
D8S2612；D8S2613；D8S2614；D8S2617；D8S2618は、DS261との対立遺伝子連関状態にあることが示された第1のマーカーから1メガ塩基未満であるものとして局在化された。
【００１４】
次いで、本発明者らはPCM1遺伝子内の多型性について探索した。イントロン-エクソン境界を同定した後、PCR増幅されたエクソンおよび該エクソンの片側のイントロン配列の100 bpについて自動化された二方向配列決定を実施した。この分析を、連関試験において用いたサンプルに由来する19人の統合失調症症例、英国の多発性統合失調症家系に由来する26人の症例、および10人の健常な対照に対して実施した。統合失調症と連鎖不平衡状態にある多型を検出する可能性を増大させるために、統合失調症に関連するD8S2616、D8S2615、またはD8S261における多型を担持する罹患した個体を選択した。
【００１５】
本発明者らは、エクソン4および5の2つのエクソンの境界に位置するD82616が統合失調症との強力な対立遺伝子連関を有するという理由から、これらの2つのエクソンをスクリーニングした。
【００１６】
結果として、本発明者らは、以下の位置：エクソン4に対して3'側のイントロン配列中の位置80254；エクソン4中の位置80123；エクソン5に対して5'側のイントロン配列中の位置87366；エクソン5に対して5'側のイントロン配列中の位置87507において、単一ヌクレオチド多型を同定した。
【００１７】
これらの結果は、治療方法；診断または予後判定方法；治療、予後判定または診断方法における使用のための化合物の同定方法；そのような治療、予後判定または診断方法における使用のための化合物の提供に関して、主たる含蓄を有する。
【００１８】
本出願の目的のために、様々な態様を、特にPCM1遺伝子を参照して記述する。しかしながら、本発明者らにより同定された領域内の別の遺伝子がその該当する遺伝子として認められるはずであること、また本発明の様々な態様がその遺伝子に同等に適用されることは、当業者にとって明らかであろう。
【００１９】
用語「PCM1マーカー」を用いる場合、これはPCM1遺伝子のイントロンもしくはエクソン内のマーカーを意味するものとして受け取られるか、またはPCM1遺伝子との対立遺伝子連関もしくは連鎖不平衡状態にあるものとして受け取られる。
【００２０】
本発明者らは、PCM1遺伝子の周囲の領域が低い進化速度での組換えを示すことを見出した。従って、連鎖不平衡が認められる距離は比較的大きい。従って、PCM1多型マーカーはPCM1遺伝子の3000 kb以内(片側)にあり、好ましくはPCM1遺伝子の1000 kb以内、より好ましくはPCM1遺伝子の500 kb以内、より好ましくはPCM1遺伝子の100 kb以内、より好ましくはPCM1遺伝子の50 kb以内、最も好ましくはPCM1遺伝子の10 kb以内にある。
【００２１】
本発明の第1の態様においては、統合失調症に関する個体の易罹患性を評価する方法、または統合失調症の診断もしくは予後判定方法であって、(i)個体からゲノムDNAのサンプルを取得すること(このサンプルは分析しようとする材料の全部または一部であってよい)、(ii)染色体領域8p21.3中に位置するPCM1マーカーを用いて、前記易罹患性を評価するか、または前記診断もしくは予後判定を行うこと、を含む前記方法が開示される。
【００２２】
好ましいPCM1マーカーは上記で定義されたような対立遺伝子多型マーカーまたは他の多型マーカーであってよい。これらのマーカーはPCM1遺伝子内にあるのが好ましい。
【００２３】
好ましいPCM1マーカーは、D8S2612；D8S2613；D8S2614；D8S2615；D8S2616；D8S2617；D8S2618、D8S261である。より好ましいものはD8S2615およびD8S2616、ならびにD8S261であり、最も好ましいものはD8S2615およびD8S2616である。これらのマーカーの位置は本明細書の他の場所に記載される。
【００２４】
本発明者らにより対立遺伝子連関が英国人集団においてD8S2615、D8S2616およびD8S261について示されたが、これらのマーカーならびに残りのPCM1マーカー；D8S2612、D8S2613、D8S2614、D8S2617、およびD8S2618も他の(例えば、非英国人)集団において有用な診断マーカーを提供し得ることに留意すべきである。
【００２５】
あるいは、またはさらに、本明細書に記載の単一ヌクレオチド多型(SNP)をマーカーとして用いることもできる。これらのものとしては、AB020866ゲノムクローンの位置80254のSNP；AB020866ゲノムクローンの位置80123のSNP；AB020866ゲノムクローンの位置87366のSNP；およびAB020866ゲノムクローンの位置87507のSNPが挙げられる。これらのSNPのさらなる詳細は本明細書の他の場所に与えられる。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症に関する個体の易罹患性を同定するための方法、または統合失調症の診断もしくは予後判定方法における、PCM1遺伝子、またはPCM1遺伝子によりコードされるポリペプチドの使用を開示する。
【００２７】
PCM1遺伝子は配列決定されており、その野生型コード配列および調節配列はコンティグNT_000501のクローンAB020866およびAB020867に見出すことができる[Genome Channel:http//genome.ornl.gov/GC/cgi-bin/GCKSearchForm.cgi]。参照のため、最も長いオープンリーディングフレームのmRNA配列を、野生型について図1に示す。
【００２８】
8p21.3領域の配列はクローンAB020866および隣接するクローンにおいてENTREZデータベース中で公開されている。
【００２９】
本発明の様々な態様がPCM1遺伝子によりコードされるポリペプチドを使用するか、またはこれを含む場合、このポリペプチドは図1に示されるものであるのが好ましい。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症に関する個体の易罹患性を同定するための方法、または統合失調症の診断もしくは予後判定方法であって、個体から核酸サンプルを取得すること；およびそのサンプル中で、PCM1遺伝子における突然変異もしくは多型の存在または非存在を決定すること、を含む前記方法を開示する。
【００３１】
対応する方法は、個体から核酸またはタンパク質のサンプルを取得すること；およびPCM1遺伝子からの発現のレベルを測定すること、を含んでもよい。
【００３２】
核酸サンプルを用いる場合、発現レベルを、mRNAの量を測定することにより決定することができる。タンパク質サンプルを用いる場合、PCM1遺伝子発現のレベルを、PCM1ポリペプチド産物の量を測定することにより決定することができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、統合失調症に対する易罹患性と連関する遺伝子座を同定または単離するための方法であって、染色体領域8p21.3中に位置するPCM1多型マーカーから誘導される遺伝子配列を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすること、および該遺伝子配列に近接する領域中のオープンリーディングフレームを同定すること、を含む前記方法である。好ましいマーカーは上記で指摘されたものである。
【００３４】
遺伝子配列に「近接する」ものとして記載される領域は、マーカーの約3000 kb以内にあってよく、好ましくはマーカーの約500 kb以内、より好ましくは約100 kb以内、より好ましくは50 kb以内、より好ましくは10 kb以内にある。
【００３５】
例えば、PCM1遺伝子に近接するオープンリーディングフレームはマーカーの約3000 kb以内にあってよく(先に考察したように、組換え頻度が非常に低いため)、好ましくはマーカーの約1000 kb以内、約500 kb以内、およびより好ましくは約100 kb以内、より好ましくは50 kb以内、より好ましくは10 kb以内にあってよい。
【００３６】
本発明の別の態様は、染色体領域8p21.3中に位置するPCM1多型マーカーの特定の対立遺伝子を含むゲノム領域と、同じマーカーの異なる対立遺伝子を含むゲノム領域とを比較することにより、統合失調症に対する易罹患性に影響する遺伝子座をマッピングする方法である。好ましいマーカーは上記で指摘されたものである。
【００３７】
本発明が個体の核酸またはタンパク質の分析に関する場合、そのような個体は統合失調症を有する個体、統合失調症の危険性を有すると考えられる(例えば、統合失調症を有する兄弟がいるか、および／または統合失調症の家族歴を有することにより)個体であってもよく、または無症候であってもよい。この個体からのサンプルを、任意の都合のよいサンプル、例えば、血液または皮膚組織から調製することができる。個体から得られたサンプルを、本発明の方法に従って分析することができる。従って、本発明の方法は個体から得られる核酸、またはタンパク質のサンプルを提供することを含む。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は統合失調症の治療における使用のためのPCM1遺伝子を含む核酸分子を提供する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は統合失調症の治療のための医薬の製造におけるPCM1遺伝子の使用を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、患者にPCM1遺伝子の配列を有する核酸分子を投与することを含む、統合失調症の治療方法を提供する。この核酸分子は細胞内のものであってもよく、また核酸分子を含む細胞を前記患者に投与してもよい。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は統合失調症の治療における使用のためのPCM1遺伝子によりコードされるポリペプチドを提供する。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症の治療のための医薬の製造におけるPCM1遺伝子によりコードされるポリペプチドの使用を提供する。
【００４３】
さらなる態様において、本発明は、患者にPCM1遺伝子の配列を有する核酸分子によりコードされるポリペプチドを投与することを含む、統合失調症の治療方法を提供する。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、患者にPCM1遺伝子からの発現を調節する物質を投与すること、またはPCM1遺伝子産物の活性のレベルを調節する化合物を投与することを含む、統合失調症の治療方法を提供する。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法を提供する。
【００４６】
従って、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法は、試験物質と、PCM1遺伝子を含む核酸分子とを混合すること；およびその核酸分子からの発現のレベルを測定することを含んでよい。後により詳細に述べるように、そのような方法を、典型的にはPCM1遺伝子を含む核酸分子を含む発現系を用いて実施する。発現のレベルを、その発現系において、PCM1 mRNAもしくはPCM1ポリペプチド産物、またはPCM1遺伝子に連結されているリポーター遺伝子（あるいはそれらの一部、例えばプロモーター）の量を測定することにより測定することができる。
【００４７】
例えば、治療用分子の同定のためには、統合失調症に関連する多型を含むPCM1の発現が低下するか、またはその効果を相殺するタンパク質の発現が増加するように、PCM1もしくはPCM1と相互作用する他のタンパク質と相互作用する治療的分子を同定することができる。例えば、発現もしくは過剰発現の後、PCM1タンパク質のタンパク質単離および結晶化を達成すれば、それによってX線を用いたタンパク質の折り畳みおよび3D構造の同定が可能になる。さらに、PCM1タンパク質中のアミノ酸残基の種類およびそれらの位置から推測することにより、該タンパク質の特異的標的領域を、統合失調症の新しい治療が標的とし得る部位として同定することができる。
【００４８】
他の方法としては、「酵母ツーハイブリッド系」およびトランスジェニック突然変異体PCM1動物、条件付(CRE/LOX)突然変異体またはノックアウトモデル動物の使用が挙げられ、それに続いて、PCM1の非存在もしくは相対的非存在もしくは過剰発現を用いて、非常に多量、ごく少量、もしくは異常な突然変異体PCM1タンパク質の発現が改善されるような小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは抗体などの新規医薬品を開発することができる。さらに、in vivo、ex vivoもしくはin vitro法で増殖させた細胞中のPCM1タンパク質の発現により、治療用薬剤の候補分子を試験して、新規治療剤を作製することができるような、正常および異常な突然変異PCM1タンパク質ならびにPCM1と相互作用するタンパク質の発現に対する効果を、検出することができる。さらに、そのような方法の説明を後に記載する。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法であって、試験物質と、PCM1遺伝子を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドとを混合すること；および該ポリペプチドの活性のレベルを測定することを含む、前記方法を提供する。そのような方法を、単離されたポリペプチドのサンプルを用いて実施するか、または該ポリペプチドがPCM1遺伝子を含む核酸分子から発現されるように発現系内に含まれる該核酸を用いて実施することができる。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、統合失調症の診断、予後判定または治療における使用のための分子を同定する方法であって、試験物質と、PCM1遺伝子を含む核酸分子、またはPCM1遺伝子を含む核酸分子によりコードされるポリペプチドとを混合すること；および該試験物質の該ポリペプチドへの結合を測定することを含む、前記方法を提供する。そのような方法を、発現系内に含まれるPCM1遺伝子を含む核酸分子を用いて実施することができる。
【００５１】
統合失調症の診断または予後判定方法における使用のための分子を同定するさらなる方法は、PCM1核酸配列もしくはPCM1ポリペプチド産物に結合する物質を同定する方法、およびPCM1遺伝子もしくはPCM1遺伝子産物の、その「結合パートナー」との相互作用を阻害する物質を同定する方法を含む。
【００５２】
上記方法のいずれにおいても、その結果を、試験物質が含まれなかった対照サンプルから得られた結果と比較することができる。
【００５３】
従って、上記方法により同定された物質(新規物質を含みうる)は、本発明のさらなる態様である。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、図1に示される配列を有する核酸配列の多型変異体である単離された核酸を提供し、そのような配列は図2、3、4、もしくは5のいずれか1つに示される多型変異体、またはこれらの組合せを有してもよい。本発明はさらに、図1によりコードされるものとは異なるこれらの配列によりコードされるポリペプチドを提供する。本発明者らは、これらの核酸が統合失調症において役割を果たすことを示した。
【００５５】
統合失調症の染色体8p21-22 PCM1サブタイプも他の精神疾患として兆候を示すこともあり得ることに留意すべきである。例えば、Kendlerら、1988 (Kendler, K. S., Gruenberg, A. M. & Tsuang, M. T. (1988) A family study of the subtypes of schizophrenia. Am J Psychiatry, 145, 57-62.)は、異なるサブタイプの統合失調症、分裂情動性障害および分裂性障害が、統合失調症が存在する家系内で同じ遺伝的病因を共有すると考えられることを見出した。さらに、一般的な精神疾患のサブタイプも、Tsuangら、1991 (Tsuang, M. T. (1991) Morbidity risks of schizophrenia and affective disorders among first-degree relatives of patients with schizoaffective disorders. Br J Psychiatry, 158, 165-170.8p21-22)により示されたように、統合失調症と同じ遺伝的病因を共有し得る。
【００５６】
一般的ではないが、情動障害、強迫神経症、恐怖症および不安神経症などの神経症のサブタイプも、統合失調症と同じ遺伝的病因により引き起こされることがある。これらの障害は、時には「偽神経症性統合失調症」と診断されることがある。かくして、本明細書において用語「統合失調症」を用いる場合、それはこれらの関連障害をも包含し、本発明の様々な態様は、妄想性障害、現実歪曲症候群、精神運動遅延症候群、錯乱症候群、パラフレニー、妄想性精神障害、分裂性障害、分裂情動性障害、分裂情動性統合失調症、心因性精神障害、緊張症、周期性統合失調症、循環病質性人格障害、統合失調症関連情動障害ならびに単極情動性障害、注意欠陥障害および呪術思考のサブタイプなどの関連する精神神経疾患などのPCM1遺伝子に関連する他の精神神経疾患にも適用されるものと理解される。
【００５７】
以下に本発明の種々の態様をより詳細に述べることとする。
【００５８】
診断方法
本発明の方法では、統合失調症の診断もしくは予後判定のため、または統合失調症の素因を有する、もしくは統合失調症に罹患しやすい被験者を同定するために、種々の技法を用いることができる。
【００５９】
本明細書に記載の方法は、PCM1遺伝子を含んでいる少なくとも1種の核酸、またはPCM1ポリペプチド産物、またはPCM1に特異的な抗体を含むあらかじめパッケージ化された診断用キットを用いて行うことができ、それは例えば、臨床応用において、統合失調症の診断もしくは予後判定法で用いることができる。従って、そのようなキットは本発明のさらなる態様を示すものである。
【００６０】
本発明の方法で用いることのできる技法の例は下記のとおりである。
【００６１】
PCM1核酸分子の検出
PCM1の変異体の存在をスクリーニングするため、およびPCM1核酸配列の検出および/またはそのレベルをアッセイするために種々の方法を用いることができる。
【００６２】
PCM1遺伝子内の変異は様々な技法を用いて検出することができる。任意の有核細胞由来の核酸をそのようなアッセイ技法の出発点として用いることができ、その核酸は当業者にはよく知られた標準的な核酸調製法に従って単離することができる。
【００６３】
PCM1核酸配列を、PCM1遺伝子構造の異常（点突然変異、挿入、欠失、逆位、転座、染色体再構成を含む）を検出するために生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで用いることができる。そのようなアッセイとしては、限定はされないが、サザン分析、一本鎖コンホメーション多型解析(SSCP)、およびPCR分析が含まれる。
【００６４】
該遺伝子中の変異および多型はDNA(またはRNA)配列分析を用い、当業界では標準的な技法を用いて検出することができる。適切な技法の例はSambrookら, 1987中に見出すことができる。
【００６５】
PCM1遺伝子に特異的な変異の検出のための診断方法には、例えば、あるサンプル、例えば患者のサンプルもしくはその他の適切な細胞供給源から得られた核酸（組換えDNA分子、クローン化された遺伝子、またはそれの縮重した変異体を含む）を、1種以上の標識された核酸試薬（本明細書の別の部分に記載しているとおり、組換えDNA分子、クローン化した遺伝子、またはそれの縮重した変異体を含む）と、これらの核酸試薬がPCM1遺伝子内のその相補配列と特異的にアニーリングするために好ましい条件下で、接触させ、インキュベートすることを含む方法とすることができる。好ましくは、これらの核酸試薬は少なくとも15ヌクレオチド〜30ヌクレオチドである。
【００６６】
インキュベーション後、アニールしなかった核酸は全て、核酸：PCM1分子ハイブリッドから除去する。次いで、ハイブリダイズした核酸の存在が、もしもそのような分子が存在すれば、検出される。このような検出スキームを用いれば、対象とする細胞タイプまたは組織から得た核酸を、例えば膜または、マイクロタイタープレートもしくはポリスチレンビーズ上などのプラスチック表面などの固相担体に固定化することができる。この場合には、インキュベーション後に、アニールされていない標識核酸試薬は容易に除去される。残存した、アニールした標識PCM1核酸試薬の検出は当業者にはよく知られた標準的な技法を用いて行われる。PCM1遺伝子の変異が存在するか否かを調べるために、該核酸試薬がアニールしたPCM1遺伝子配列を、正常なPCM1遺伝子配列から予測されるアニーリングパターンと比較することができる。
【００６７】
患者のサンプルまたはその他の適切な細胞供給源中のPCM1遺伝子特異的核酸分子の検出のための診断方法の別法では、そのような分子を、例えばPCRによって増幅した後(この実験の実施形態はMullis, 1987, 米国特許第4,863,202号に記載されている)、その増幅された分子を当業者にはよく知られている技法を用いて検出する。この結果得られた増幅された配列を、その増幅される核酸がPCM1遺伝子の正常なコピーのみを含んでいる場合に予測される配列と比較して、PCM1遺伝子の変異が存在するか否かを調べることができる。
【００６８】
さらに、PCM1遺伝子に変異を有する個体を同定するためによく知られた遺伝子型決定技法を行うことができる。そのような技法としては、例えば、制限酵素断片長多型(RFLP)の使用が含まれ、その多型は用いる特定の制限酵素の認識部位のうちの1箇所での配列の変異を伴う。
【００６９】
さらに、PCM1遺伝子の変異の同定に用いることのできる、DNA多型を分析するための改良法が報告されており、これは制限酵素切断部位間の短くタンデムに反復されたDNA配列が様々な数で存在することを利用したものである。例えば、Weber(米国特許第5,075,217号)は、(dC-dA)n-(dG-dT)nの短いタンデムリピートのブロックについての長さの多型に基づいたDNAマーカーについて報告している。(dC-dA)n-(dG-dT)n ブロックの分離したものの平均は30,000bpから60,000bpと推定されている。非常に近接して位置しているマーカーは高頻度で共遺伝し、例えばPCM1遺伝子内の変異などの遺伝的変異の同定、およびPCM1変異に関連する疾患や障害の診断に非常に有用である。
【００７０】
また、Caskeyら(米国特許第5,364,759号)はトリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチドという短い反復配列を検出するためのDNAプロファイリングアッセイについて述べている。その方法は、PCM1遺伝子などの対象となるDNAを抽出し、その抽出したDNAを増幅し、反復配列を標識してその個体のDNAの遺伝子型マップを作成することを含むものである。
【００７１】
PCM1遺伝子発現のレベルはアッセイすることができる。例えば、脳などの、PCM1を発現していることが知られているかもしくは発現しているのではないかと考えられる細胞タイプまたは組織から得たRNAを単離し、例えば上述したようなハイブリダイゼーションまたはPCR技法を用いて試験することができる。単離細胞は細胞培養物由来、または患者由来のものとすることができる。培養物から得た細胞の分析は、細胞をベースとした遺伝子治療技法の一部として用いられることとなる細胞の評価に必要な工程であり、あるいはまた、PCM1遺伝子の発現に及ぼす化合物の影響を調べるために必要な工程であろう。このような分析によってPCM1遺伝子の発現パターンの定量的および定性的な様相（PCM1遺伝子発現の活性化または不活化が含まれる）が明らかとなろう。
【００７２】
このような検出スキームの1実施形態においては、対象とするRNA分子からcDNA分子が合成される(例えば、そのRNA分子からcDNAへの逆転写によって)。次いでそのcDNA内の配列が、PCR増幅反応などの核酸増幅反応の鋳型として用いられる。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬として用いられる核酸試薬(例えば、プライマー)は、本明細書に記載のPCM1遺伝子核酸試薬の中から選択される。そのような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも9〜40ヌクレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長、より好ましくは19〜28ヌクレオチド長である。
【００７３】
増幅された産物の検出には、放射性標識したかまたは放射性標識していないヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことができる。あるいはまた、標準的な臭化エチジウム染色またはその他の何らかの適切な核酸染色法を用いて可視化するのに十分な量の増幅産物を作製することができる。
【００７４】
さらに、そのようなPCM1遺伝子発現アッセイをin situ、すなわち生検または切除によって得られた患者の組織の切片(固定したおよび/または凍結したもの)の上で直接的に行うことも可能であり、その場合は核酸の精製は必要とされない。本明細書に記載しているものなどのような核酸試薬はこのようなin situ法でのプローブおよび/またはプライマーとして用いることができる(例えば、Nuovo, G. J., 1992, 「ＰＣＲ  in  situハイブリダイゼーション：プロトコールと応用」"PCR In Situ Hybridization:Protocols And Applications", Raven Press, NYを参照せよ)。
【００７５】
あるいはまた、適切な細胞を十分な量得ることができる場合には、PCM1遺伝子のmRNA発現のレベルを測定するために、標準的なノーザン分析を行うことができる。
【００７６】
(2)  PCM1遺伝子産物の検出
傷のないもしくは変異体であるPCM1遺伝子産物に対する、またはその保存された変異体に対する、あるいはそれらのペプチド断片に対する抗体については、本明細書の別のところで述べているが、それらも統合失調症の診断および予後判定に用いることができる。そのような方法を、PCM1遺伝子産物の合成もしくは発現のレベルの異常、またはPCM1遺伝子産物の構造、一時的発現、および/もしくは物理的位置の異常の検出に用いることができる。従って、このような抗体の、統合失調症の診断法もしくは予後判定法における使用、ならびにこれらの抗体を用いる診断法もしくは予後判定法は、本発明のさらに別の態様である。
【００７７】
下記の抗体およびイムノアッセイ法は、例えば、統合失調症などのPCM1疾患または精神神経疾患に対する治療法の有効性を評価する際に重要なin vitroでの用途を有する。下記に述べるものなどの抗体、または抗体のフラグメントを用いれば、治療薬となる可能性のある化合物をin vitroでスクリーニングし、PCM1遺伝子発現およびPCM1ペプチド産生に及ぼすその影響を調べることができる。統合失調症などのPCM1疾患または精神神経疾患に対して有益な作用を示す化合物を同定することができ、治療上有効な投与量を決定することができる。
【００７８】
in vitroのイムノアッセイは例えば、統合失調症に対する細胞をベースとした遺伝子治療の有効性を評価するために用いることもできる。PCM1ペプチドに対する抗体は、in vitroで例えば、PCM1ペプチドを産生するように遺伝子操作された細胞中でのPCM1遺伝子発現のレベルを測定するために用いることができる。細胞内のPCM1遺伝子産物について調べる場合には、測定は好ましくは細胞溶解物または抽出物を用いて行われる。そのような分析によって、in vivoでの治療上の有効性を達成するために必要な形質転換された細胞数を測定することができ、また、遺伝子置換のプロトコールの最適化を行うことができる。
【００７９】
分析しようとする組織または細胞タイプは通常は、PCM1遺伝子の発現が既知であるもの、または発現している可能性のあるものが含まれる。本明細書中で用いられるタンパク質単離方法は、例えば、HarlowとLane(1988, 「抗体：実験室マニュアル」"Antibodies:A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, New York)中に記載されている方法などとすることができる。単離細胞は、細胞培養物由来または患者由来のものとすることができる。培養物から得た細胞の分析は、細胞をベースとした遺伝子治療技法の一部として用いられることとなる細胞の評価に必要な工程の１つであり、また、PCM1遺伝子の発現に及ぼす化合物の影響を調べるための細胞の評価に必要な工程の１つである。
【００８０】
PCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片の検出のために好ましい診断方法（そして、すなわち好ましい統合失調症の診断または予後判定方法）は、PCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片を、それらと抗PCM1遺伝子産物特異的抗体との相互作用によって検出する、イムノアッセイを含む。
【００８１】
例えば、本明細書に記載のものなどの、本発明に有用な抗体、または抗体のフラグメントは、PCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片の存在を定量的もしくは定性的に検出するために用いることができる。このような検出は、例えば、蛍光標識した抗体(下記参照)を用いる免疫蛍光測定技法を、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光分析検出と組み合わせて用いることによって行うことができる。このような技法は細胞表面上に発現されているPCM1遺伝子産物の検出には特に好ましい。
【００８２】
本発明に有用な抗体(またはそのフラグメント)はさらに、PCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片のin situでの検出のために、免疫蛍光法もしくは免疫電子顕微鏡観察法で組織学的に用いることができる。in situでの検出は患者から組織検体を採取し、それに本発明の標識抗体をアプライすることによって行うことができる。抗体(またはフラグメント)は好ましくは生物学的サンプル上に該標識抗体(またはフラグメント)を重層することによって適用することができる。このような方法を用いることによって、PCM1遺伝子産物または保存された変異体またはペプチド断片の存在のみならず、観察した組織中の分布をも調べることができる。本発明を用いれば、そのようなin situでの検出を行うために種々の組織学的方法(例えば、染色方法など)のいずれかを改変して用いることができることは当業者であれば容易に理解されよう。
【００８３】
PCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片のイムノアッセイは典型的には、生体液、組織抽出物、細胞培養でインキュベートされた新鮮な採取細胞もしくは細胞の溶解物などのサンプルを、検出しうるように標識され、かつPCM1遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチド断片を同定することのできる抗体の存在下でインキュベートし、結合した抗体を当業界ではよく知られた多数の技法のいずれかで検出することを含んでなる。
【００８４】
生物学的サンプルは、細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化しうる固相支持体もしくは担体、例えばニトロセルロースなどまたはその他の固相支持体と接触させその上に固定化させることができる。次いでその支持体を適切なバッファーで洗った後、検出しうる標識を施したPCM1遺伝子特異的抗体で処理する。次いで、その固相支持体を同じバッファーで2度目の洗浄を行って結合していない抗体を除去することができる。その後、固相支持体上の結合した標識の量を従来法で検出することができる。
【００８５】
「固相支持体もしくは担体」とは、抗原または抗体を結合することのできる何らかの支持体を意味している。よく知られた支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、ハンレイ岩(gabbros)、および磁鉄鉱(magnetite)が含まれる。本発明で用いるためにの担体の性質としてはある程度可溶性なものかまたは不溶性のもののいずれかとすることができる。支持体の材料としては、それに結合させた分子が抗原または抗体と結合することができる状態でさえあれば、実質的にどのような構造形態のものであっても良い。従って、支持体の立体的な形態としては、ビーズのような球状のもの、試験管の内部表面または棒状の外表面のような円筒状のものとすることができる。あるいはまた、表面はシート、テストストリップ、その他のような平坦なものとすることができる。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者であれば、抗体または抗原を結合させるために適したその他の担体を多数知っているであろうし、または日常的な実験を行うことによってそのようなものを確認することができよう。
【００８６】
所定のロットの抗PCM1遺伝子産物抗体の結合活性は、よく知られた方法に従って測定することができる。当業者であれば、日常的な実験を行うことによって各測定のための実施可能で最適なアッセイ条件を定めることができよう。
【００８７】
PCM1遺伝子ペプチド−特異的抗体を検出しうる形で標識する方法の１つは、それを酵素と結合させ、酵素免疫定量法(EIA)で用いることである(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2, 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Vollerら, 1978, J. Clin. Pathol. 31, 507-520; Butler, J. E. 1981, Meth. Enzymol. 73, 482-523; Maggio, E.(ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishizaka, E.ら, (編), 1981, Enzyme Immunoassay, Kagaku Shoin, Tokyo)。抗体と結合した酵素は適切な基質、好ましくは色素産生性の基質と、例えば分光光度計で、蛍光定量で、または可視的方法で検出することのできる化学的部分が産生されるように反応させる。抗体を検出可能なように標識するために用いることのできる酵素としては、限定はされないが、リンゴ酸脱水素酵素、連鎖球菌のヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母のアルコール脱水素酵素、α-グリセロホスフェート脱水素酵素、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラキナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース6-ホスフェート脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。その検出は該酵素に対する色素産生性基質を用いる比色法で行うことができる。検出はまた、基質の酵素反応の程度を、同様にして調製した標準品と肉眼的に比較することによっても行うことができる。
【００８８】
検出はその他の種々のイムノアッセイ法のいずれかを用いても行うことができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ(RIA)を用いてPCM1遺伝子ペプチドを検出することができる(例えば、Weintraub, B., 「ラジオイムノアッセイの原理」, "Principles of Radioimmunoassay", Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endcrine Society, March, 1986を参照せよ)。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの方法、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
【００８９】
また、抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に暴露されると、その存在は蛍光によって検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、およびフルオレスカミンが挙げられる。
【００９０】
抗体はまた、蛍光発光性の金属、例えば152Eu、またはその他のランタニド類のものなどを用いて標識し検出可能なものとすることもできる。それらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)などの金属キレート基を用いて抗体に付着させることができる。
【００９１】
抗体はまた、化学発光性の化合物と結合させることによって標識し検出可能なものとすることもできる。化学発光標識された抗体の存在を、化学反応の際に生ずる発光を検出することによって調べる。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【００９２】
同様にして、生物発光化合物を本発明の抗体の標識に用いることができる。生物発光は生物系で認められる化学発光の一種であり、その系では触媒となるタンパク質が化学発光反応の効率を増大させている。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって調べる。標識するために用いられる生物発光化合物の重要なものとしては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、およびエクオリンが挙げられる。
【００９３】
本発明の診断方法および予後判定方法は、以前に採取したサンプルについて行うこともでき、変異の存在もしくは不在の測定、または本明細書に記載の多型の対立遺伝子の判定はデータベース上に保存されたDNA配列を分析することによって行うことができる。このような本発明の診断方法は、例えば、PCM1遺伝子内の変異について、野生型PCM1遺伝子の配列を有するPCM1遺伝子と比較すること、または本明細書の図に示したPCM1遺伝子配列のうちの１つと比較することによって、データバンクを検索することを含んでなるものとすることができる。
【００９４】
PCM1遺伝子活性を調節する化合物の同定方法
下記のアッセイを本発明の方法中で用いることができ、それらには、PCM1遺伝子からの発現を調節する、もしくはPCM1遺伝子産物の活性を調節する分子、またはPCM1遺伝子産物と結合する分子、またはPCM1遺伝子産物と細胞内タンパク質(「結合パートナー」)との相互作用を妨害する分子を同定することが含まれる。従って、下記のアッセイに基づいて行うことのできる、統合失調症の診断、予後判定、または治療に用いる化合物の同定方法は、本発明のさらに別の態様である。
【００９５】
PCM1遺伝子調節配列(例えば、プロモーター配列；例えばPlatt, 1994, J. Biol. Chem. 269, 28558-28562)と結合する化合物、およびPCM1遺伝子発現のレベルを変えることのできる化合物を同定するアッセイを用いることができる。化合物としては、限定はされないが、例えば脳血管関門を通過することのできるもの、適切な細胞中に入り込みPCM1遺伝子もしくはPCM1調節経路に含まれるいくつかのその他の遺伝子の発現や細胞内タンパク質に影響を及ぼすもの、などの小さな有機分子を含むものとすることができる。
【００９６】
そのような細胞内タンパク質の同定方法を下記に示す。そのような細胞内タンパク質はおそらく気分の制御および/もしくは調節に関与しているか、またはPCM1遺伝子発現および/もしくはPCM1遺伝子産物の活性に影響を及ぼすものであろう。そのような化合物を下記のとおり統合失調症の治療に用いることができる。
【００９７】
このような方法で同定した化合物(新規の化合物を含む)は、本発明のさらに別の態様である。このような化合物としては、限定はされないが、例えば可溶性ペプチド、そのようなペプチドとしては限定はされないが、Igのテイルを有する融合ペプチドが含まれ、ならびにD体および/もしくはL体のアミノ酸から作製されたランダムペプチドライブラリー(例えば、Lamら, 1991, Nature 354, 82-84; Houghtenら, 1991, Nature 354, 84-86を参照せよ)およびコンビナトリアル化学反応由来の分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド(限定はされないが、ランダムにもしくは部分的に縮重した、指向性ホスホペプチドライブラリーのメンバーが含まれる；例えばSongyangら, 1993, Cell 72, 767-778を参照せよ)、抗体(限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、または一本鎖抗体、ならびにFab、F(ab')2、およびFab発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合フラグメントが含まれる)、ならびに小さな有機もしくは無機の分子が含まれる。このような化合物はさらに、統合失調症などの精神神経疾患の症状を改善または悪化させることが知られている特定の薬剤もしくは薬剤のクラスもしくはファミリーのメンバーの化合物を含んでなるものとすることができる。そのような化合物としては、リチウム塩などの抗うつ剤、フルペンチクソール、リスペリドン、クロザピン、クエチアピン、オランザピン、ハロペリドール、ドロペリドール、クロルプロマジン、プロクロペラジン、フェノチアジン誘導体、プロマジン、トリフルオプロマジンtrifluopromazine、ブチロフェノン誘導体、クロルプロチキセンおよびジベンゾジアゼピンなどのチオキサンテン誘導体、カルマゼピンなどの抗精神病抗てんかん薬、ならびに、バルプロ酸、レセルピンなどが含まれる。ブロモクリプチン、アポモルヒネ、アンフェタミン、メチルフェニダート、メチルアンフェタミン、ケタミン、などの精神病発現薬の多くは組み合わせて用いられる。
【００９８】
本明細書で記載したアッセイなどで同定された化合物は、例えば、PCM1遺伝子産物の生物学的機能を発揮させることにおいて、および統合失調症などのPCM1関連疾患または精神神経疾患を改善するために有用であろう。
【００９９】
統合失調症の診断、予後判定、または治療で使用するための化合物の同定における下記の方法の使用は、本発明のさらに別の態様である。
【０１００】
(1)PCM1遺伝子産物と結合する化合物のin vitroスクリーニングアッセイ
PCM1遺伝子産物と結合することのできる化合物を同定するようにin vitroシステムをデザインすることができる。同定された化合物は、例えば、傷のないおよび/または変異体であるPCM1遺伝子産物の活性を調節することに有用である可能性があり、PCM1遺伝子産物の生物学的機能を発揮させることにおいて有用である可能性があり、正常なPCM1遺伝子産物の相互作用を妨害する化合物を同定するためのスクリーニングに用いうる可能性があり、またはそれら自体のそのような相互作用を妨害する可能性がある。
【０１０１】
PCM1遺伝子産物に結合する化合物を同定するために用いられるアッセイの原理としては、PCM1遺伝子産物と試験化合物とを含んでいる反応混液を調製し、その2種の化合物が相互作用し結合するのに十分な条件と時間をかけ、取り出しうる、および/またはその反応混液中で検出しうる複合体を形成させることを含んでいる。これらのアッセイは種々の方法で行うことができる。例えば、そのようなアッセイを行うための1方法には、PCM1遺伝子産物または試験物質を固相上に固定させ、反応完了時にその固相上に固定したPCM1遺伝子産物/試験化合物複合体を検出することを含んでいる。そのような方法の1実施形態においては、該PCM1遺伝子産物は固相表面上に固定させることができ、該試験化合物は、固相には固定しておらず、直接的または間接的のいずれかで標識することができる。
【０１０２】
実際には、固相としてはマイクロタイタープレートを用いることが好都合であろう。固定させた成分は非共有結合性または共有結合性の付着によって固定化することができる。非共有結合性の付着は、固相表面を該タンパク質の溶液で単純にコートし乾燥させることによって行うことができる。あるいはまた、固定化されることとなるタンパク質に特異的な固定化されている抗体、好ましくはモノクローナル抗体であるが、その抗体を該タンパク質を固相表面に固定させるために用いることができる。その表面はあらかじめ作成して保存しておくことができる。
【０１０３】
そのアッセイを行うためには、固定化されていない成分を、固定させた成分を含有しているコートされた表面に添加する。反応が完了した後、複合体が形成されたものはそのまま固相表面に固定化されて残るような条件下で未反応の成分を除去する(例えば、洗浄によって)。その固相表面上に固定した複合体の検出は、多数の方法で行うことができる。前もって固定化していない成分があらかじめ標識してあるものである場合には、その表面上に標識が固定化されていることが検出されれば、それは複合体が形成されたことを示している。前もって固定化していない成分があらかじめ標識していないものである場合には、間接的な標識を、その表面上に固定した複合体を検出するために用いることができる；それは例えば、前もって固定化していない成分に対して特異的な標識抗体を用いて行うことができる(その抗体は、その次には直接的に標識するか、または標識された抗Ig抗体を用いて間接的に標識することができる)。
【０１０４】
あるいはまた、反応を液相中で行うこともでき、反応生成物を未反応の成分から分離し、複合体を検出する。それは例えば、PCM1遺伝子産物に対して、または試験化合物に対して特異的な固定化された抗体を用いて、溶液中に形成された複合体を全て付着させ、複合体のもう一方の成分に対して特異的な標識抗体で固定した複合体を検出することによって行う。
【０１０５】
(2)PCM1遺伝子産物と相互作用する細胞内タンパク質のアッセイ
PCM1タンパク質-タンパク質相互作用を同定するために、タンパク質-タンパク質相互作用を検出することに適したいかなる方法を用いてもよい。
【０１０６】
用い得る従来法としては、同時免疫沈降、架橋、およびグラディエントもしくはクロマトグラフィー用カラムを通過させる同時精製が挙げられる。これらの方法を用いれば、PCM1遺伝子産物と相互作用する、細胞内タンパク質を含むタンパク質の同定を行える。そのようなタンパク質はひとたび単離されれば、同定することができ、標準的な技法と共に用いてPCM1が相互作用するタンパク質を同定することができる。たとえば、PCM1遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部分を、エドマン分解法などの当業者にはよく知られた技法を用いて確認することができる(例えば、Creighton, 1983, 「タンパク質：構造と分子的原理」"Proteins :  Structures and Molecular Principles", W.H.Freeman & Co., N.Y., pp.34-49を参照せよ)。得られたアミノ酸配列を、そのようなタンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするために用いることのできるオリゴヌクレオチドの混合物を作成するためのガイドとして用いることができる。スクリーニングは例えば、標準的なハイブリダイゼーションまたはPCR技法によって行うことができる。オリゴヌクレオチドの混合物を作成しスクリーニングするための技法はよく知られている(例えば、Ausubel，同上, および1990, 「PCRプロトコール：その方法と応用へのガイド」"PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications", Innisら編, Academic Press, Inc., New Yorkを参照せよ)。
【０１０７】
さらに、PCM1タンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定が行える方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、よく知られた技法であるλ.gtllおよびλ.gt10ライブラリーの抗体によるプロービングと類似の方法でPCM1タンパク質を用いて、標識PCM1タンパク質で発現ライブラリーをプロービングすることが含まれる。
【０１０８】
in vivoで相互作用するタンパク質を検出する1方法である、2ハイブリッドシステムについて詳述するが、これは説明の目的のみ行うものであって、限定しようとするものではない。このシステムの1つのバージョンについては報告されており(Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,9578-9582)、Clontech(Palo Alto, Clif.)から市販されている。
【０１０９】
簡潔に記せば、このようなシステムを用いて、2つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される：１つはPCM1遺伝子産物と融合させた転写アクチベータータンパク質のDNA結合ドメインからなるものであり、もう1つはcDNAライブラリーの一部としてこのプラスミド中に組換えで組み込まれたcDNAによってコードされる未知のタンパク質と融合させた転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインからなるものである。このDNA結合ドメイン融合プラスミドおよびcDNAライブラリーをレポーター遺伝子(例えば、HBSまたはlacZ)を含んでいる酵母Saccharomyces cerevisiaeの株に形質転換する。このレポーター遺伝子の調節領域には、転写アクチベーターの結合部位が含まれている。どちらのハイブリッドタンパク質も単独ではそのレポーター遺伝子の転写を活性化することはできない。というのも、DNA結合ドメインのハイブリッドは単独では活性化できないが、それは活性化機能を提供しないからであり、活性化ドメインハイブリッドは単独では活性化できないが、それはアクチベーターの結合部位を適当な位置に置くことができないからである。2つのハイブリッドタンパク質が相互作用することによって機能を有するアクチベータータンパク質が再構成され、レポーター遺伝子の発現がもたらされるが、その発現はそのレポーター遺伝子産物についてのアッセイを行うことによって検出される。
【０１１０】
「ベイト(bait)」の遺伝子産物と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするためにこの2ハイブリッドシステムまたはそれに関連した方法を用いることができる。例として、限定はされないが、PCM1遺伝子産物をベイト遺伝子産物として用いることができる。ゲノム配列またはcDNA配列の全てを活性化ドメインをコードするDNAに融合させる。このライブラリーおよびベイトPCM1遺伝子産物をDNA結合ドメインに融合させたハイブリッドをコードするプラスミドを酵母レポーター株中に同時形質転換し、得られた形質転換体からレポーター遺伝子を発現しているものをスクリーニングする。例えば、限定はされないが、PCM1遺伝子のオープンリーディングフレームなどのベイトPCM1遺伝子配列はベクター中にクローン化して、それがGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNAに翻訳されて融合するようにすることができる。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子の発現に関わっているこのライブラリーのプラスミドを単離する。次いで、このライブラリープラスミドによってコードされるタンパク質を同定するためにDNA配列分析を用いる。
【０１１１】
ベイトPCM1遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出しようとする細胞系統のcDNAライブラリーは当業界で通常行われている方法を用いて作製することができる。本明細書に記載のシステムに従って、例えば、該cDNA断片をベクター中に挿入してそれらが翻訳されてGAL4の転写活性化ドメインと融合するようにすることができる。このライブラリーを、GAL4活性化配列を含んでいるプロモーターによって駆動されるlacZ遺伝子を含んでいる酵母株中に、ベイトPCM1遺伝子-GAL4融合プラスミドとともに同時形質転換させることができる。GAL4転写活性化ドメインと融合させた、cDNAがコードするタンパク質でベイトPCM1遺伝子産物と相互作用するものは、活性のあるGAL4タンパク質を再構成し、それによってHIS3遺伝子の発現を駆動することとなる。HIS3を発現しているコロニーは半固形寒天をベースとしたヒスチジンを含まない培地を入れたペトリ皿上での増殖によって検出することができる。次いで該cDNAをこれらの株から精製し、当業界で日常的に行われている技法を用いてベイトPCM1遺伝子相互作用性タンパク質の産生と単離に用いることができる。
【０１１２】
(3)PCM1遺伝子産物と巨大分子との相互作用を妨害する化合物のアッセイ
PCM1遺伝子産物と巨大分子との相互作用を妨害する化合物を同定するためのアッセイを下記で説明する。
【０１１３】
本発明のPCM1遺伝子産物はin vivoでタンパク質などの細胞内巨大分子を含む1種以上の巨大分子と相互作用させることができる。このような巨大分子としては、限定はされないが、核酸分子、および上述の方法などによって同定されたタンパク質が含まれる。ここでの論述の目的で、該巨大分子を本明細書中では「結合パートナー」と呼ぶ。このようにしてPCM1結合を崩壊させる化合物はPCM1遺伝子産物、特に変異型PCM1遺伝子産物の活性を調節することに有用なものとなろう。そのような化合物としては、限定はされないが、ペプチドおよびそれに類似したものなどの分子が含まれ、それらはPCM1遺伝子産物へアクセスすることができる。
【０１１４】
PCM1遺伝子産物とその結合パートナー(単数または複数)との相互作用を妨害する化合物を同定するために用いられるアッセイシステムの原理には、PCM1遺伝子産物およびその結合パートナーを含有する反応混液を、それらの2者が相互作用して結合し、その結果複合体を形成することのできる条件および十分な時間をかけて調製することが含まれる。
【０１１５】
ある化合物の阻害活性を試験するためには、その試験化合物が存在している、およびそれを含まない反応混液を調製することができる。その試験化合物は反応混液中に始めから含まれているものとすることができ、またはPCM1遺伝子産物およびその結合パートナーの添加後のある時点で添加することができる。対象の反応混液は試験化合物のない状態でまたはプラシーボとともにインキュベートする。PCM1遺伝子タンパク質と結合パートナーとの間に形成される複合体を全て検出する。対照の反応で複合体が形成され、試験化合物を含んでいる反応混液中で形成されない場合には、その化合物がPCM1遺伝子タンパク質とそれが相互作用する結合パートナーとの相互作用を妨害するものであることを示している。
【０１１６】
試験化合物と正常なPCM1遺伝子タンパク質を含有している反応混液内での複合体形成を、試験化合物と変異型PCM1遺伝子タンパク質を含有している反応混液内での複合体形成と比較することもできる。このような比較は、変異型の相互作用は崩壊させるが正常なPCM1遺伝子タンパク質では影響しない化合物を同定することが望ましいような場合にはおそらく重要であろう。
【０１１７】
PCM1遺伝子産物および結合パートナーの相互作用を妨害する化合物のアッセイは、不均一な系または均一な系の様式で行うことができる。不均一な系でのアッセイ法にはPCM1遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを固相上に固定させ、反応の終了時にその固相上に固定した複合体を検出することを含んでいる。均一な系でのアッセイ法では、反応全体が液相内で行われる。どちらのアプローチを取るとしても、試験しようとする化合物についての種々の情報を得るために、反応物の添加の順番を変えることができる。例えば、PCM1遺伝子産物および結合パートナーとの間の相互作用を、例えば競合によって妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって；すなわち、試験物質を反応混液にPCM1遺伝子タンパク質およびそれと相互作用する細胞内の結合パートナーの添加に先立ってまたはそれらと同時に添加することによって、同定することができる。あるいはまた、既に形成されている複合体を崩壊させる試験化合物、例えばその複合体の成分のうちの1つと置き換わる、より高い結合定数を有する化合物を試験するには、複合体が形成された後にその試験化合物を反応混液中に添加することによって行うことができる。種々のフォーマットについては下記に簡潔に述べる。
【０１１８】
不均一な系のアッセイシステムにおいては、PCM1遺伝子産物またはそれと相互作用する結合パートナーのいずれかを固相表面上に固定させ、一方、固定させなかった方の分子種は直接的または間接的に標識する。実際には、マイクロタイタープレートを用いることが好都合である。固定させた分子種は非共有結合または共有結合での付着によって固定化することができる。非共有結合による付着は固相表面をPCM1遺伝子産物または結合パートナーの溶液で単純にコートして乾燥することによって行うことができる。あるいはまた、付着させる分子種に特異的な固定化抗体を固相表面へのその分子種の固定に用いることができる。そのような表面は前もって作成して保存しておくことができる。
【０１１９】
アッセイを行うためには、固定化された分子種のパートナーを、試験化合物とともに、またはそれを伴わずに、コートされた表面に暴露させる。反応が完了した後に、未反応の成分を除去し(例えば洗浄によって)、形成された全ての複合体は固相表面上に固定化されて残ることとなる。その固相表面上に付着した複合体の検出は多数の方法で行うことができる。固定化されなかった方の分子種があらかじめ標識してある場合には、その表面上に固定化された標識が検出されればそのことは複合体が形成されたことを示している。固定化されなかった方の分子種が標識していない場合には、その表面上に付着した複合体の検出には間接的標識；例えばもともとは固定化されていなかった方の分子種に対して特異的な標識抗体が用いられる(その抗体は、その後標識された抗Ig抗体を用いて直接的または間接的に標識される)。反応の成分の添加順を変えることによって、複合体形成を阻害する、または既に形成されていた複合体を崩壊させる試験化合物を検出することができる。
【０１２０】
あるいはまた、この反応は液相中でも試験化合物の存在または不在下で行うことができ、反応生成物を未反応の成分から分離し、複合体を検出することができる；例えば、溶液中で形成された全ての複合体を固定させるために、結合成分のうちの１つに対して特異的な固定化抗体を用い、結合成分のもう一方のものに対して特異的な標識抗体を付着した複合体の検出に用いる。ここでも、液相への反応の成分の添加順を変えることによって、複合体形成を阻害する、または既に形成されていた複合体を崩壊させる試験化合物を同定することができる。
【０１２１】
本発明の別の1実施形態においては、均一な系でのアッセイ法を用いることができる。このアプローチでは、PCM1遺伝子タンパク質とそれと相互作用する結合パートナーとのあらかじめ形成させた複合体を、PCM1遺伝子産物またはその結合パートナーのいずれかが標識されるように調製するが、その標識によって生ずるシグナルは複合体形成によって抑えられている(例えば、Rubensteinによる米国特許第4,109,496号を参照すればよいが、この特許では、このアプローチをイムノアッセイに用いている)。あらかじめ形成させておいた複合体の分子種のうちの一方と競合し、それに置き換わるような試験物質があれば、バックグラウンドを上回るシグナルの発生をもたらすこととなる。このような方法で、PCM1遺伝子タンパク質/結合パートナー相互作用を崩壊させる試験物質を同定することができる。
【０１２２】
特別な1実施形態においては、PCM1遺伝子産物は、本明細書に記載の組換えDNA技法を用いて固定化用として調製することができる。例えば、pGEX-5X-1などの融合ベクターを用いて、PCM1コード領域をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)に融合させ、それによって得られた融合タンパク質中でその結合活性が維持されるようにすることができる。相互作用する結合パートナーは精製して、当業界で日常的に行われている方法、例えば、本明細書に記載した方法などを用いてモノクローナル抗体を作成するために用いることができる。
【０１２３】
この抗体を、例えば当業界で日常的に用いられている方法によって放射性同位元素125Iで標識することができる。不均一な系のアッセイ法では、例えばGST-PCM1融合タンパク質はグルタチオン-アガロースビーズへ付着させることができる。次いで、相互作用する結合パートナーを、相互作用と結合が起こるように、試験化合物の存在または不在下で添加することができる。反応時間の終了時に未結合物質を洗って除去し、その系に標識されたモノクローナル抗体を添加し、複合体成分と結合させることができる。PCM1遺伝子タンパク質と相互作用する結合パートナーとの間の相互作用はグルタチオン-アガロースビーズとともに残存している放射活性の量を測定することによって検出することができる。試験化合物によって相互作用の阻害が行われていれば、放射活性測定量の減少になってあらわれることとなる。
【０１２４】
あるいはまた、GST-PCM1遺伝子融合タンパク質および相互作用する結合パートナーを固体のグルタチオン-アガロースビーズを含まない液体中で混合する。試験化合物はこれらの分子種が相互作用している間またはその後のいずれかに添加することができる。次いで、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに添加し、未結合物質は洗って除去する。ここでも、PCM1遺伝子タンパク質/結合パートナー相互作用の阻害の程度は、標識された抗体を添加し、ビーズとともに存在する放射活性を測定することによって検出することができる。
【０１２５】
本発明のまた別の1実施形態においては、これらと同じ技法を、2種の分子種のうちの1方または両方の完全長タンパク質を用いる代わりに、PCM1タンパク質の結合ドメインに対応するペプチド断片および/または相互作用するもしくは結合パートナー(結合パートナーがタンパク質である場合)に対応するペプチド断片を用いて行うことができる。当業界で日常的に行われている多数の方法のうちのいずれでも結合部位を同定し単離するために用いることができる。そのような方法としては、限定はされないが、2種のタンパク質のうちの1方をコードする遺伝子の突然変異誘発、および同時免疫沈降アッセイで結合の崩壊についてスクリーニングすることが含まれる。複合体の第2の分子種をコードする遺伝子中の変異が補正されているものを選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析によって相互作用性結合に関与するタンパク質の領域に対応する変異が明らかとなる。あるいはまた、一方のタンパク質を固相表面上に上述の方法を用いて固定させ、それの標識された結合パートナーでトリプシンなどのタンパク分解酵素で処理されたものと相互作用させて結合させることができる。洗浄後、結合ドメインを含んでいる、短い標識されたペプチドは固形材料に結合したままであり、それを単離しアミノ酸配列分析で同定することができる。また、そのセグメントをコードする遺伝子を操作して該タンパク質のペプチド断片を発現するようにすることができれば、次いでそれの結合活性を試験し、精製、または合成することができる。
【０１２６】
例えば、限定はされないが、PCM1遺伝子産物は、本明細書に記載のとおりSDT-PCM1融合タンパク質を作成しそれをグルタチオンアガロースゲルに結合させることによって、固形材料に固定させることができる。得られた相互作用性の結合パートナーを35Sなどの放射性同位元素で標識し、トリプシンなどのタンパク分解酵素で分解させることができる。次いで分解産物を、固定させたGST-PCM1融合タンパク質に添加して結合させることができる。未結合のペプチドを洗って除去し、標識された結合した材料、それは結合パートナーが結合しているドメインを示しているが、それを溶出させ、精製し、よく知られた方法によってアミノ酸配列を分析することができる。このようにして同定されたペプチドは合成して作成することができ、または組換えDNA技法を用いて適切かつ促進的な(facilitative)タンパク質と融合させることができる。
【０１２７】
(4)PCM1遺伝子の発現のレベルを変える化合物の同定方法
概念的に述べれば、PCM1遺伝子の発現のレベルはPCM1 mRNA、またはポリペプチド産物の量を測定して調べることができる。適切な技法については「診断方法」の項に述べている。
【０１２８】
あるいはまた、PCM1遺伝子発現のレベルを変える化合物はレポーター遺伝子系を用いて同定することが容易になる。このような系では、該PCM1核酸配列、またはその一部分(例えばプロモーターなど)がレポーター遺伝子と機能を有する形で連結される。
【０１２９】
レポーター遺伝子を用いれば、タンパク質産生と関連づけて遺伝子発現のレベルを調べることができる。そのレポーター遺伝子は、検出可能なシグナル、好ましくは肉眼的に検出できるシグナル、例えば着色した産物などを産生する反応を触媒する酵素をコードするものが好ましい。多数の例が知られており、そのようなものとしては、β-ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼが含まれる。β-ガラクトシダーゼ活性は基質に青色が産生されることによってアッセイすることができ、そのアッセイは肉眼的に、または分光光度計を用いて吸光度を測定して行われる。蛍光、例えばルシフェラーゼ活性の結果として産生される蛍光は、分光光度計を用いて定量することができる。放射活性アッセイを用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを用いて行うことができるが、このものはまた放射活性を用いないアッセイでも用いることができる。レポーター遺伝子からの発現の結果得られる遺伝子産物の存在および/または産物の量は、その産物と結合することのできる分子、例えば抗体またはそのフラグメントなどを用いて測定することができる。結合する分子は標準的な技法を用いて直接的または間接的に標識することができる。
【０１３０】
当業者であれば、プロモーターの活性を調べるために用いることのできるレポーター遺伝子およびアッセイ技法が多数あることは十分に承知している。適切なものであればどのようなレポーター/アッセイを用いることもでき、本発明に特別な選択が必須であったり、特別な選択に限定されたりする必要はないことは理解すべきである。
【０１３１】
(5)PCM1疾患または精神神経疾患を改善する化合物の同定のためのアッセイ
化合物としては、限定はされないが上述のものなどのアッセイ技法によって同定された結合化合物を含むが、そのような化合物を、統合失調症または思考および/もしくは気分の疾患の症状の改善能について試験することができ、そのような疾患としては、思考の疾患および精神神経疾患を含んでいるが、そのような疾患としては、妄想性障害、パラフレニー、妄想性精神障害、分裂性障害、分裂情動性障害、分裂情動性統合失調症、心因性精神障害、緊張症、周期性統合失調症、循環病質性人格障害、分裂症性人格障害、妄想性人格障害、統合失調症関連情動障害、および単極情動性障害のサブタイプが含まれる。
【０１３２】
本明細書に記載のアッセイは、PCM1遺伝子発現に影響を及ぼすか、またはPCM1遺伝子産物の活性のレベルに影響を及ぼすかのいずれかによって、PCM1遺伝子活性に影響を与える化合物を同定することができることに注目すべきである。例えば、PCM1遺伝子および/またはPCM1遺伝子産物が関与している経路の別の工程に関わっている化合物を同定することができ、この同じ経路に影響を及ぼすことによって統合失調症などの精神神経疾患の発症に対するPCM1の影響を変えうる化合物を同定することができる。そのような化合物はその疾患の治療のための治療方法の一部として用いることができる。
【０１３３】
第1に、PCM1関連疾患または統合失調症などの精神神経疾患の症状の改善に作用しうる化合物を同定するために、細胞をベースとした系を用いることができる。そのような細胞の系としては、例えば、PCM1遺伝子を発現する組換えまたは非組換え細胞、例えば細胞系統などが含まれる。
【０１３４】
そのような細胞系の使用において、PCM1を発現する細胞をPCM1関連疾患または統合失調症などの精神神経疾患の症状を改善する能力がある可能性のある化合物に対して、暴露された細胞中にそのような症状の改善を引き出すために十分な濃度と十分な時間をかけて、暴露させることができる。暴露後に、細胞をアッセイしてPCM1遺伝子の発現の変化を、例えば、細胞溶解物にPCM1 mRNA転写物があるかアッセイすること(例えばノーザン分析によって)、またはその細胞によって発現されるPCM1遺伝子産物についてアッセイすることによって、調べることができる；PCM1遺伝子の発現を変える化合物は治療薬として良い候補となる。あるいはまた、それらの細胞を調べて、PCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患に関連する細胞の一種以上の表現型が、より正常なもしくは障害されていない、影響を受けていない表現型、または疾患の発症率、もしくは重症度を低下させる可能性の高い表現型に変えられていないかを調べる。
【０１３５】
さらに、PCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の動物をベースとした系またはモデル、そのようなものとしては例えばPCM1マウスが含まれるが、その系またはモデルを疾患の症状を改善することのできる化合物を同定するために用いることができる。このような動物モデルを、それらの疾患の治療に有効である可能性のある薬剤、医薬品、治療法、および介入的治療の同定のための試験台として用いることができる。例えば、PCM1関連疾患または統合失調症などの精神神経疾患の症状を改善する能力がある可能性のある化合物に対して、暴露された動物にそのような症状の改善を引き出すために十分な濃度と十分な時間をかけて、暴露させることができる。その暴露に対する動物の応答を、その症状の復帰について評価することによってモニターすることができる。
【０１３６】
介入的治療に関しては、PCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の症状のどのような様相であってもそれを逆行させる治療法は全て、そのような疾患のヒトでの治療的介入の候補と考えるべきものである。試験薬剤の投与量は、下記に述べるとおり、投与量-応答曲線から決定することができる。
【０１３７】
統合失調症の治療方法およびその方法に用いる化合物
統合失調症の治療方法は、哺乳類のPCM1遺伝子の発現を変える、および/または哺乳類のPCM1遺伝子産物の合成もしくは活性を変える化合物を投与することを含んでなるものとすることができる。このようにしてその化合物の投与によって疾患の症状の改善がもたらされる。
【０１３８】
そのような方法は、該哺乳類に傷のないPCM1遺伝子産物をコードする核酸を、その傷のないPCM1遺伝子産物が発現されその疾患の症状が改善されるように供給することを含んでなるものとすることができる。このような方法はその疾患がPCM1遺伝子の変異に起因するものである場合には有用なものとなるであろう。
【０１３９】
あるいはまた、もしくはさらに、その方法は傷のないPCM1遺伝子産物をコードする核酸分子を含んでいる細胞を、その細胞が障のないPCM1遺伝子産物を発現しその疾患の症状が改善されるように哺乳類に供給することを含んでなるものとすることができる。
【０１４０】
正常なPCM1遺伝子産物の機能が失われることによって統合失調症の発症が起こるような場合には、PCM1遺伝子産物活性を増大させることによって、PCM1遺伝子発現のレベルが低い、および/またはPCM1遺伝子産物活性のレベルが低い個体での無症候状態への進行(改善)が行われることとなる。PCM1の発現または合成を増大させる方法を下記に示す。
【０１４１】
統合失調症の症状は、PCM1遺伝子発現レベルおよび/またはPCM1遺伝子産物活性のレベルを変える化合物を投与することによって改善することができる。統合失調症の治療に用いるためのそのような化合物は、本発明のさらに別の態様である。
【０１４２】
そのような方法で用いるために適切な化合物としては、統合失調症などの精神神経疾患の症状を改善または悪化させることが報告されている化合物、特に薬剤を含むことができる。そのような化合物としては、リチウム塩などの抗うつ剤、フルペンチクソール、リスペリドン、クロザピン、クエチアピン、オランザピン、ハロペリドール、ドロペリドール、クロルプロマジン、プロクロペラジン、フェノチアジン誘導体、プロマジン、トリフルオプロマジン、ブチロフェノン誘導体、クロルプロチキセンおよびジベンゾジアゼピンなどのチオキサンテン誘導体、カルマゼピンなどの抗精神病抗てんかん薬、ならびに、バルプロ酸、レセルピンなどが含まれる。LSD、ブロモクリプチン、アポモルヒネ、アンフェタミン、メチルフェニダート、メチルアンフェタミン、ケタミン、などの精神病発現薬の多くは組み合わせて用いられる。
【０１４３】
(1)阻害性の、アンチセンス、リボザイム、および三重鎖を用いるアプローチ
別の1実施形態においては、PCM1遺伝子発現レベルおよび/またはPCM1遺伝子産物活性のレベルを、PCM1遺伝子配列と既知のアンチセンス、遺伝子ノックアウト、リボザイム、および/または三重鎖法を共に用いてPCM1遺伝子発現レベルを低下させることによって統合失調症の症状を改善することができる。PCM1遺伝子の活性、発現、または合成を変える能力、それにはPCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の症状を改善する能力が含まれるが、そのような能力を示す可能性のある化合物としては、アンチセンス、リボザイム、および三重鎖分子が挙げられる。そのような分子は傷のない、またはそれが適切である場合には、変異のある標的遺伝子活性のいずれかを低減させる、または阻害するようにデザインすることができる。そのような分子の産生および使用のための技法は当業者にはよく知られている。
【０１４４】
アンチセンスRNAおよびDNA分子は標的となるmRNAとハイブリダイズしタンパク質への翻訳を妨げることによってmRNAの翻訳を直接的にブロックする。アンチセンスを用いるアプローチには、標的遺伝子のmRNAに対して相補的なオリゴヌクレオチドをデザインすることが含まれる。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な標的遺伝子mRNA転写産物と結合し、翻訳を妨げる。完全に相補的であることが好ましいとはいえ、それは必要ではない。
【０１４５】
本明細書で用いている、RNAの一部分に「相補的」な配列とは、該RNAとハイブリダイズすることが可能な程度の十分な相補性を有し、安定な二本鎖を形成する配列を意味する；二本鎖アンチセンス核酸の場合には、該二本鎖DNAの一本の鎖について試験することができ、または三本鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズできる能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの双方によって変わる。通常はハイブリダイズする核酸の長さが長くなるほど、それに含まれるRNAとの塩基のミスマッチが多くなるが依然として安定な二本鎖(または、場合によっては三本鎖)が形成される。当業者であれば標準的な方法を用いてハイブリダイズした複合体の融点を測定することによって、どの程度のミスマッチまで許容しうるか確かめることができる。
【０１４６】
1実施形態においては、PCM1遺伝子の非コード領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドを、内因性PCM1 mRNAの翻訳を阻害するためのアンチセンス法で用いることができよう。アンチセンス核酸はその長さが少なくともヌクレオチド6個なければならず、好ましくは6〜約50個の範囲のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドの特別な態様では、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドのものである。
【０１４７】
標的配列をどのように選択するかに関わらず、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害能を定量するためのin vitro研究を最初に行うことが好ましい。それらの研究には、アンチセンスによる遺伝子の阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的効果を区別するための対照を用いることが好ましい。また、これらの研究で標的RNAまたはタンパク質のレベルを、内部対照のRNAまたはタンパク質と比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照のオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と比較することも意図している。対照のオリゴヌクレオチドが試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、その対照のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、アンチセンスの配列とは、標的配列と特異的なハイブリダイゼーションが起こることを妨げるために必要な程度を越えるほどは異ならないものであることが好ましい。
【０１４８】
該オリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNAまたはそれのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは改変されたものとすることができ、一本鎖もしくは二本鎖のものとすることができる。該オリゴヌクレオチドはその塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格の部分で、例えばその分子の安定性、ハイブリダイゼーション、その他の改善のために改変することができる。該オリゴヌクレオチドには、その他の付加基を含むことができ、そのようなものとしては例えば、ペプチド(例えば、in vivoで宿主細胞のレセプターを標的とするために)、または細胞膜を通過する輸送を容易にするための薬物(例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 648-652; PCT公開 WO88/09810, 1988年12月15日公開、を参照せよ)もしくは脳血管関門を通過する輸送を容易にするための薬物(例えば、PCT公開 WO89/10134, 1988年4月25日公開、を参照せよ)、ハイブリダイゼーションによって誘導される分解剤(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques" 6, 958-976を参照せよ)、または挿入剤(intercalating agents)(例えば、Zon, 1988, Pharma. Res. 5, 539-549を参照せよ)などがある。この目的のために、該オリゴヌクレオチドを別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘導される架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによって誘導される分解剤、その他と結合させることができる。
【０１４９】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの改変された塩基部分を含んでなるものとすることができ、そのような塩基としては限定はされないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンを含む群から選択されたものである。
【０１５０】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの改変された糖部分を含んでなるものとすることができ、そのような糖としては限定はされないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含む群から選択されたものである。
【０１５１】
また別の1実施形態においては、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの改変されたリン酸骨格を含んでなるものとすることができ、そのようなリン酸としてはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似体を含む群から選択されたものである。
【０１５２】
また別の1実施形態においては、該アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノマー性オリゴヌクレオチドである。α-アノマー性オリゴヌクレオチドは相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、その中では、通常のβ-ユニットとは逆に、二本の鎖はお互いに同一方向に向いている(Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641)。そのオリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res, 15, 6131-6148)、または、キメラRNA-DNA 類似体(Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215:327-330)である。
【０１５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは当業界では既知の標準的な方法、例えば、自動DNA合成機(Biosearch、Applied Biosystems、その他から市販されているものなど)を用いることによって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinらの方法(1988, Nucl. Acids Res. 16, 3209)で合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは球状ガラスビーズ(controlled pore glass) ポリマー支持体の使用によって調製することができる(Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451)、などである。
【０１５４】
標的遺伝子のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いうるが、転写はされるが翻訳されない領域に対して相補的なものが最も好ましい。例えば、本発明では下記の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる：
アンチセンス分子は、標的遺伝子をin vivoで発現する細胞へと運ばれなければならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞へ運ぶための方法は多数開発されている；例えば、アンチセンス分子は直接的に組織部位中へ注射することができ、または所望の細胞を標的とするようにデザインされた、改変したアンチセンス分子(例えば、標的細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体と連結されたアンチセンス)を全身的に投与することができる。
【０１５５】
しかし、内在性のmRNAの翻訳を抑えるのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難なことが多い。従って、好ましいアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下に置かれている組換えDNA構築物を用いる。患者の体内の標的細胞をトランスフェクトするためにこのような構築物を用いると、内在性の標的遺伝子転写産物と相補的な塩基対を形成する一本鎖のRNAが十分な量転写され、それによって標的遺伝子mRNAの翻訳が妨げられることとなる。例として、あるベクターを、例えばそのベクターが細胞に取り込まれてアンチセンスRNAの転写を指令するように導入することができる。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを産生することができる状態であるならば、染色体外に存在し続けるか、または染色体内に組み込むことができる。そのようなベクターは当業界では標準的な、組換えDNA技法によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、またはその他の当業界で既知の、哺乳類細胞中での複製と発現に用いられるものとすることができる。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞中で作用することが当業界で既知であるプロモーターであればどのようなものによっても行うことができる。そのようなプロモーターは誘導的なものまたは構成的なものとすることができる。そのようなプロモーターとしては、限定はされないが次のものが含まれる：SV40初期プロモーター領域(BernoistとChambon, 1981, Nature 290, 340-310)、ラウス肉腫ウイルスの31 LTPに含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22, 787-797)、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296, 39-42)、その他。組織部位中に直接的に導入することのできる組換えDNA構築物を調製するためには、プラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスのベクターのいずれのタイプのものも用いることができる。あるいはまた、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いることができ、その場合には投与は別の経路で(例えば、全身投与)で行うことができる。
【０１５６】
標的遺伝子mRNA転写産物の切断の触媒をするようにデザインされたリボザイム分子も、標的遺伝子mRNAの翻訳を妨げ、従って標的遺伝子産物の発現を妨げるために用いることができる。(例えば、PCT国際特許公開WO90/11364、1990年10月4日公開；Sarverら, 1990, Science 247, 1222-1225を参照せよ。)
【０１５７】
リボザイムはRNAの特異的な切断を触媒することのできる酵素活性を有するRNA分子である。(総説として、Rossi, 1994, Current Biology 4, 469-471を参照せよ。) リボザイムの作用機作としては、リボザイム分子のそれと相補的な標的RNAへの配列特異的なハイブリダイゼーションと、それに引き続くRNA内部の切断イベントが含まれる。リボザイム分子の組成には、標的遺伝子mRNAと相補的な1個以上の配列が含まれていなければならず、またmRNA切断を行う、よく知られた触媒配列が含まれていなければならない。この配列については、例えば、米国特許第5,093,246号を参照すればよく、この特許はその全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【０１５８】
部位特異的認識配列の位置でmRNAを切断するリボザイムは、標的遺伝子mRNAを破壊するために用いることができるが、ハンマーヘッドリボザイムを用いることが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムはmRNAを、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって示される位置で切断する。唯一の必要事項はその標的mRNAが2個の塩基からなる次の配列を有していることである：5'-UG-3'。ハンマーヘッドリボザイムの構築と産生については当業界ではよく知られており、より詳細にはMyers, 1995, 「分子生物学とバイオテクノロジー：理解を助けるためのデスクレファレンス」"Moleculara Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference", VCH Publishers, New York, (特にp.833の図4を参照せよ)、およびHaseloffとGerlach, 1988, Nature, 334, 585-591を参照すればよく、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる。
【０１５９】
好ましくは、リボザイムは切断認識部位が標的遺伝子mRNAの5'末端に近いところに位置するように、すなわち、効率を高め、機能を有さないmRNA転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように作成される。例えば、ハンマーヘッドリボザイムを用いることができる。
【０１６０】
本発明のリボザイムはまた、Tetrahymena thermophilaの体内に天然に生じているもの(IVS、またはL-19 IVS RNAとして知られているもの)などのRNAエンドリボヌクレアーゼ(以後、「Cechタイプリボザイム」と呼ぶ)をも含み、それについてはThomas Cechと共同研究者らによって非常に詳細に述べられている(Zaugら, 1984, Science, 224, 574-578；ZaugとCech, 1986, Science, 231,470-475；Zaugら, 1986, Nature, 324, 429-433；University Patents Inc.による公開国際特許出願番号WO 88/04300；BeenとCech, 1986, Cell, 47, 207-216)。このCechタイプリボザイムは、標的RNA配列とハイブリダイズしその後に標的RNAの切断が起こる、8個の塩基対からなる活性部位を有している。
【０１６１】
アンチセンスのアプローチの場合と同様に、リボザイムは改変されたオリゴヌクレオチドからなるものとすることができ(例えば、安定性、ターゲティング、その他の改善のための)、in vivoで標的遺伝子を発現している細胞へ送達されなければならない。好ましい送達方法としては、強力な構成性のプロモーターであるpol IIIまたはpol IIの制御下にある、リボザイムをコードするDNA構築物を用いることが含まれ、それによってトランスフェクトされた細胞が、内在性の標的遺伝子のメッセージを破壊し翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生することとなる。アンチセンス分子とは異なりリボザイムは触媒能があり、高い効率を得るために必要な細胞内濃度はより低いものでよい。
【０１６２】
内在性の標的遺伝子発現はまた、標的を定めた相同組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活化または「ノックアウト」することによって低減させることができる(例えば、Smithiesら, 1985, Nature 317, 230-234；ThomasとCapecchi, 1987, Cell 51, 503-512；Thompsonら, 1989, Cell 5, 313-321；それらの各々はその全体を本明細書中に参照により組み入れる)。例えば、内在性の標的遺伝子と相同なDNAが隣接している(その標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか)ような、変異体で機能を持たない標的遺伝子(または全く無関係のDNA配列)を、選択マーカーおよび/もしくは負の選択マーカーとともにもしくはそれらを伴わずに、in vivoで標的遺伝子を発現している細胞をトランスフェクトするために用いることができる。該DNA構築物の、標的を定めた相同組換えによる挿入によって標的遺伝子の不活化がもたらされる。このようなアプローチは、不活性な標的遺伝子を有する動物の子孫を作るために胚性幹(ES)細胞への改変を用いることのできる農業分野には特に適している(例えば、ThomasとCapecchi, 1987、およびThompson, 1989, 同上の文献を参照せよ)。しかし、このアプローチは、その組換えDNA構築物が、直接的に投与されるかまたは適切なウイルスベクターを用いてin vivoの必要とされる部位へその部位を標的とするものであれば、ヒトでの使用に適合させることができる。
【０１６３】
あるいはまた、内在性の標的遺伝子発現は、その標的遺伝子の調節領域(すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび/もしくはエンハンサー)に対して相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を用いて、体内の標的細胞内での標的遺伝子の転写を妨げる三重鎖構造を形成することによって低減させることができる。(概説として、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Heleneら, 1992, Ann. N.Y.Acad.Sci., 660, 27-36; およびMaher, 1992, Bioassays 14(12), 805-815を参照せよ。)
転写の阻害のための三重鎖形成に用いられる核酸分子は一本鎖で、デオキシリボヌクレオチドで構成されたものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成はHoogsteen塩基対則による三重鎖形成を促進するようにデザインされたものでなければならず、それには通常はプリンまたはピリミジンのいずれかのかなりの大きさのストレッチが2本鎖のうちの1本に存在することを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンをベースとすることができ、結果として得られた三重鎖の3本の会合している鎖にわたってTATおよびCGC+のトリプレットがもたらされることとなる。このピリミジンに富んだ分子は、2本鎖のうちの１本の鎖のプリンに富んだ領域に対して、その鎖と平行な方向で塩基の相補性を提供する。さらに、プリンに富んだ、例えばG残基のストレッチを含んでいる核酸分子を選択することができる。これらのような分子はGCの対に富むDNA2本鎖、その標的となる2本鎖では大多数のプリン残基が一方の鎖上に位置しているが、その2本鎖と三重鎖を形成して、その三本差の3本の鎖を通じてGTGCトリプレットがもたらされることとなる。
【０１６４】
あるいはまた、三重鎖形成の標的とすることができる配列をいわゆる「スイッチバック」核酸分子を作ることによって増加させることができる。スイッチバック分子は、それらの分子が2本鎖のうちの1本と塩基対を作り、次いでもう一本の鎖と塩基対を作ることとなるように、5'-3'、3'-5'が交互となるように合成され、それによって2本鎖のうちの一本の鎖に作らなければならないプリンまたはピリミジンのいずれかのかなりの大きさのストレッチの必要性がなくなる。
【０１６５】
本明細書に記載したアンチセンス、リボザイム、および/または三重鎖分子を変異のある遺伝子の発現の阻害に用いる場合には、この技法が正常な標的遺伝子対立遺伝子によって産生されるmRNAの転写(三重鎖の場合)、および/または翻訳(アンチセンス、リボザイムの場合)の低減または阻害を非常に効率的に行ってしまい、存在する正常標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型で必要とされる濃度よりも低くなってしまうという可能性が生じうる。そのような場合には、実質的に正常なレベルの標的遺伝子活性の維持が確保されるように、正常な標的遺伝子活性を示している、標的遺伝子ポリペプチドをコードし発現する核酸分子であって、その核酸分子内にアンチセンス、リボザイム、または三重鎖による処理のいずれが用いられてもそれに感受性のあるような配列の含まれていないものを、下記に示すような方法などの遺伝子治療法によって細胞中に導入して用いることができる。あるいはまた、該標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合には、標的遺伝子活性の必要とされるレベルを維持するために、正常な標的遺伝子タンパク質を同時に投与することが好ましいであろう。
【０１６６】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイム、ならびに三重鎖分子は上述のとおり、当業界でDNAおよびRNA分子の合成法として既知のいかなる方法によっても調製することができる。それらの方法としては、当業界ではよく知られているオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学的合成技法が含まれ、それは例えば、固相ホスホラミド化学合成法などである。あるいはまた、RNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivoでの転写によって作成することができる。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適切なRNAポリメラーゼプロモーターを組み入れた種々のベクター中に組み入れることができる。
【０１６７】
あるいはまた、アンチセンスRNAを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスcDNA構築物は、用いるプロモーターの如何によるが、細胞系統中に安定に導入することができる。
【０１６８】
(2)遺伝子置換療法
正常なPCM1遺伝子発現および/またはPCM1遺伝子産物活性の増加に関しては、例えば上述のPCM1遺伝子核酸配列をPCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の治療に用いることができる。このような治療は、例えば遺伝子置換療法の形で投与することができる。特に、正常なPCM1遺伝子機能を示すPCM1遺伝子産物の産生を指令する正常なPCM1遺伝子またはそのPCM1遺伝子の部分の1つ以上のコピーを、患者の体内の適切な細胞中に、リポソームなどの、細胞中にDNAを導入する粒子のほか、ベクターを用いて挿入することができ、そのようなベクターとしては、限定はされないが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターが含まれる。
【０１６９】
PCM1遺伝子は脳内で発現されるので、このような遺伝子置換療法の技法はPCM1遺伝子配列を患者の体内のそれらの細胞タイプへと送達することのできるものでなければならない。従って、1実施形態においては、PCM1遺伝子配列を脳血管関門を容易に通過させその配列を脳内の細胞に送達させることができるようにするために、当業界ではよく知られた技法を用いることができる(例えばPCT公開 WO89/10134、1988年4月25日公開を参照せよ)。脳血管関門を通過することのできる送達については、例えば上述のものなどのウイルスベクターが好ましい。また、in vivo、ex vivo、またはin vitroのいずれかでのリポソームを用いる方法も含まれる。PCM1センスDNAまたはアンチセンスDNA標的細胞の細胞質および核に送達される。リポソームはPCM1センスまたはナンセンスRNAをヒトおよびヒトの脳に送達することができ、または哺乳類ではウイルスベクターの一部として、もしくは核に局在するタンパク質もしくはその他の細胞核中への取り込みを増加させるタンパク質とコンジュゲートさせたDNAとして髄腔内に送達させることができる。
【０１７０】
別の1実施形態においては、送達のための技法には、PCM1遺伝子配列を発現させようとする細胞の部位へこのPCM1遺伝子配列を直接投与することを含む。PCM1遺伝子発現および/またはPCM1遺伝子産物活性の総体的なレベルを増加させるために用いることのできる別の方法としては、適切なPCM1発現細胞、好ましくは自己細胞の、PCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の症状の改善に十分な位置と数で患者の体内に導入することが含まれる。そのような細胞は組換え体または組換え体でないもののいずれであっても良い。
【０１７１】
患者の体内でのPCM1遺伝子発現の総体的なレベルを増加させるために投与しうる細胞としては、正常細胞、好ましくは脳細胞、およびCNS内の脈絡叢細胞があり、それらは髄腔内注射によって接近可能である。あるいはまた、細胞、好ましくは自己細胞を操作してPCM1遺伝子配列を発現するようにした後、患者の体内のPCM1関連疾患もしくは統合失調症などの精神神経疾患の症状の改善のために適切な位置に導入することができる。あるいはまた、傷のないPCM1遺伝子を発現している細胞で、MHCがマッチしている個体からの細胞を用いることができ、そのような細胞としては例えば脳細胞を含めることができる。このPCM1遺伝子配列の発現は適切な遺伝子調節配列によって、その発現がそれを必要とする細胞タイプ内で起こるように制御される。このような遺伝子調節配列は当業者にはよく知られている。このような細胞をベースとした遺伝子治療技法は当業者にはよく知られており、例えば、Anderson, 米国特許第5,399,349号を参照せよ。
【０１７２】
投与される細胞が非自己の細胞である場合には、その導入された細胞に対する宿主の免疫応答が生じないようにするよく知られた技法を用いて投与することができる。例えば、該細胞を被覆した形態で導入することができ、その形態では直接の細胞外環境と成分を交換できるが導入された細胞が宿主の免疫系に認識されることはない。
【０１７３】
さらに、上述したものなどの技法によって同定されたものなどの化合物でPCM1遺伝子産物活性を変えることのできる化合物を当業者にはよく知られた標準的な技法を用いて投与することができる。投与される化合物が脳細胞との相互作用に関わる場合には、その投与の技法としては、髄腔内注射などの脳血管関門を通過することのできるもの、および脳血管関門を通過する輸送が可能な化合物とのコンジュゲーションが含まれなければならない。
【０１７４】
医薬品および投与方法
PCM1遺伝子発現またはPCM1遺伝子産物活性に影響を及ぼす化合物を、統合失調症の治療または改善のために、治療上有効な投与量、患者に投与することができる。
【０１７５】
治療上有効な投与量とは、そのような疾患の症状の改善をもたらすために十分な、該化合物の量を意味する。
【０１７６】
(1)有効投与量
このような化合物の毒性および治療上の有効性は標準的な薬学的方法によって、細胞培養物で、または実験動物で、例えばLD50(試験集団の50%に対して致死的な投与量)およびED50(試験集団の50%に対して治療上有効な投与量)の決定などによって調べることができる。毒性を示す投与量と治療効果を示す投与量との比は治療指数であり、それはLD50/ED50の比で表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性のある副作用を示す化合物を用いることはできるが、そのような化合物が感染していない細胞に対して起こしうるダメージを最小限のものとし、そうすることによって副作用を最小限のものにするために、その化合物が罹患組織の部位を標的とするように送達システムのデザインには注意を払うべきである。
【０１７７】
細胞培養アッセイおよび動物を用いた研究から得られたデータはヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために用いることができる。そのような化合物の投与量は、その血中濃度が、毒性がほとんどまたは全くなく、ED50値を含んだ範囲の濃度であることが好ましい。投与量は用いる投与形態および投与経路の如何によってこの範囲内で変えることができる。本発明の方法で用いる化合物は全て、治療上有効な投与量は最初は細胞培養アッセイからの推定で求めることができる。動物モデルでの投与量は、細胞培養で求めたIC50値(すなわち、症状の阻害の最大値の2分の1を達成する試験化合物の濃度)を含むような循環血漿中濃度範囲が達成されるように処方することができる。このような情報はヒトにおける投与量として有用な量をより正確に定めるために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。
【０１７８】
(2)剤型と使用法
本発明に従って用いるための医薬組成物は1種以上の生理学的に許容される担体または添加剤を用いて従来法で製剤化することができる。
【０１７９】
従って、該化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入もしくは通気(口または鼻のいずれかを経由して)による投与、または髄腔内、経口、バッカル、腸管外、もしくは直腸投与用として製剤化することができる。
【０１８０】
経口投与用には、該医薬組成物は例えば、製薬上許容される添加剤、例えば、結合剤(例えば、あらかじめゼラチン化した(pregelatinised)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、乳糖、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)；崩壊剤(例えば、バレイショデンプン、またはグリコール酸ナトリウムデンプン)；または湿潤化剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)などとともに、従来法で調製した錠剤またはカプセル剤の形態とすることができる。錠剤は当業界ではよく知られた方法でコーティングすることができる。経口投与用の液状製剤は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態とすることができ、または使用前に水もしくはその他の適切なヴィークルと混ぜる乾燥製剤とすることができる。そのような液状製剤は、製薬上許容される添加剤、例えば懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム)；非水性ヴィークル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画した植物油)；および保存剤(例えば、メチル-もしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸)などとともに、従来法で調製することができる。また、製剤には緩衝塩、香料、着色料、および甘味料を必要に応じて含有させることができる。経口投与用の製剤は活性化合物の放出を制御するための適切な剤型とすることができる。
【０１８１】
バッカル投与には、該組成物は従来法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。吸入での投与には、本発明に従って用いる化合物は、適切な噴射剤その他を用いて、加圧パックからまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で送達すると好都合であり、噴射剤としては例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切な気体が挙げられる。加圧エアロゾルの場合には、投与量ユニットはある定められた量を送達するバルブを備えることによって定めることができる。吸入器または通気器中で用いるための、例えばゼラチンのカプセルやカートリッジを、該化合物および乳糖やでんぷんなどの適切な粉末ベースの混合粉末を含有するように製剤化することができる。
【０１８２】
該化合物は注射、例えばボーラス注射または持続点滴注射などによる腸管外投与用に製剤化することができる。注射用の剤型はユニット投与量の形態、例えば、アンプルまたは複数回投与用容器で、保存剤を添加して提示することができる。該組成物は油性または水性のヴィークル中に作成した懸濁液、溶液、または乳剤の形態とすることができ、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤などの製剤化用剤を含有することができる。あるいはまた、該有効成分を使用前に滅菌した発熱性物質不含の水などの適切なヴィークルで溶解するための粉末の形態とすることができる。
【０１８３】
また、該化合物は坐剤または浣腸剤などの、例えばカカオ脂や他のグリセリドなどの従来から用いられている坐剤の基剤を含有する、直腸用組成物の形に製剤化することもできる。
【０１８４】
上述の製剤に加えて、該化合物はデポ製剤として製剤化することもできる。そのような長期持続型の製剤はインプラント(例えば、皮下もしくは筋肉内)、または筋肉内注射によって投与することができる。従って、例えば、該化合物を、適切なポリマー性もしくは疎水性材料(例えば許容される油中に作成した乳剤として)またはイオン交換樹脂と共に、またはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として製剤化することができる。
【０１８５】
該組成物は所望により、該有効成分を含有する1つ以上のユニット投与量の形態のものを入れているパックまたはディスペンサー器具の形で提示することができる。そのようなパックは例えば金属またはプラスチックのフォイルからなる、ブリスターパックなどとすることができる。パックまたはディスペンサー器具には使用説明書を添付することができる。
【０１８６】
核酸分子
本発明の種々の態様で用いるための核酸分子はそれらの天然の環境から単離および/または精製し、実質的に純粋なもしくは均一な形態で、または起源となった動物種の他の核酸を含まないもしくは実質的に含まないものとして提供することができる。本明細書で用いている「単離された」という用語はこれらの可能性の全てを包含するものである。該核酸分子はその全体的にまたは部分的に合成したものとすることができる。とりわけ、それらの核酸は組換え体とすることができ、その組換え体では天然の状態では一緒に見出されることのない(隣接していない)複数の核酸配列が連結されているかまたは人工的に結合されている。あるいはまた、それらの核酸は直接的に、例えば自動合成機を用いて、合成することができる。本発明の核酸としては、cDNA、RNA、および修飾した核酸もしくは核酸類似体を含むことができる。DNA配列が、例えば、図を参照して特定されている場合、コンテクストからそうでないことが要求されていない限りは、その配列のRNA同等物、それはTがあればそれをUに置換したものであるが、そのような同等物を包含する。本発明の核酸(またはヌクレオチド配列)が本明細書中で言及される場合には、その核酸(またはヌクレオチド配列)の相補体も本発明に包含されることとなる。各場合における「相補体」とは、元のものと同じ長さを有するがそれに対して100%相補的であって、それによって各ヌクレオチドがその対となるもの、すなわちGに対するC、およびAに対するTまたはUと塩基対を形成しうるものである。
【０１８７】
該核酸は組換え体の形態とすることができ、また、好ましくは複製可能なベクターの形態とすることができる。好ましくは、該核酸はPCM1核酸配列からの発現を指令することのできる調節エレメントの制御下にあり、そのエレメントと機能しうる形で連結されたものである。
【０１８８】
本明細書で用いている調節エレメントとしては、限定はされないが、誘導可能なおよび誘導可能でないプロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を駆動し調節するものとして当業者には既知のその他のエレメントが含まれる。そのような調節エレメントとしては、限定はされないが、サイトメガロウイルス hCMV 前初期遺伝子、SV40 アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、CRE/LOX系、ファージAの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の調節領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母α-接合因子のプロモーターが含まれる。
【０１８９】
ポリペプチドとタンパク質
本発明の種々の態様で用いるポリペプチドは、化学合成、または遺伝子組換え技法で、当業者には理解されているように、調製することができる。
【０１９０】
PCM1遺伝子コード配列を発現させるために種々の宿主-発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主-発現ベクター系とは、運搬体を意味し、それによって対象のコード配列が産生され次いで精製されることができるが、それのみならず細胞をも意味し、その細胞は、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると、in situで本発明のPCM1遺伝子産物を出現させることのできるものである。適切な宿主-発現系としては、限定はされないが、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換させた細菌(例えば、大腸菌(E.coli)、枯草菌(B.subtilis)などの微生物；組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えばSaccharomyces、Pichia)；組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス, CaMV；タバコモザイクウイルス, TMV)を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Ti プラスミド)で形質転換した植物細胞系；哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)、または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5K プロモーター))を含んでいる組換え発現構築物を内部に収めている哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が含まれる。
【０１９１】
細菌の系では、発現させようとするPCM1遺伝子産物のための使用の如何によって多数の発現ベクターのうちの有利なものを選択することができる。例えば、そのタンパク質を大量に産生させる場合には、例えば、PCM1タンパク質の医薬組成物の作成のためまたはPCM1タンパク質に対する抗体を作成させるために産生させる場合には、高レベルの融合タンパク質の発現を指令するベクターで、そのタンパク質が容易に精製できるものであることが好ましい。そのようなベクターとしては、限定はされないが、大腸菌(E.coli)の発現ベクターpUR278(Rutherら, 1983, EMBO J. 2, 1791)、そのベクター中ではPCM1遺伝子産物コード配列はlacZコード領域とインフレームでそのベクター中にここに連結させて融合タンパク質が産生されるようにすることができる；pINベクター(InouyeとInouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109; Van HeekeとSchuster, 1989, J. Biol. Chem. 263, 5503-5509)；ならびに類似のものを含む。pGEXベクターも外来のポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させるために用いることができる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、融解させた細胞からグルタチオン-アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって容易に精製することができる。このpGEXベクターはトロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位が含まれるようにデザインされており、それによってクローン化された標的遺伝子産物はGST部分から放出されうる。
【０１９２】
昆虫の系では、Autographa californicaの核多角体病ウイルス(AcNPV)を外来遺伝子発現のためのベクターとして用いることができる。このウイルスはSpodoptera frugiperda細胞中で増殖する。PCM1遺伝子コード配列はこのウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)中に個々にクローン化し、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。PCM1遺伝子コード配列の挿入がうまくいけばポリヘドリン遺伝子の不活化が行われ、非包埋組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子でコードされるタンパク質性被覆を欠いたウイルス)が産生される。これらの組換えウイルスをSpodoptera frugiperda細胞に感染させ、その細胞中で挿入された遺伝子が発現する。(例えば、Smithら, 1983, J. Virol. 46, 584 ; Smith, 米国特許第4,215,051号を参照せよ。)
【０１９３】
哺乳類の宿主細胞では、ウイルスをベースとした多数の発現系を用いることができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、対象のPCM1遺伝子コード配列はアデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパルタイト(tripartite)リーダー配列と連結させることができる。このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)中へ挿入すると、感染した宿主中で生存可能でPCM1遺伝子産物を発現することのできる組換えウイルスが得られる。(例えば、LoganとShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659を参照せよ。)
【０１９４】
挿入されたPCM1遺伝子産物コード配列の効率的な翻訳には特別な開始シグナルも必要であろう。そのようなシグナルとしては、ATG 開始コドンおよび隣接配列が含まれる。PCM1遺伝子がそれ自身の開始コドンおよび隣接配列を含めてその全体が適切な発現ベクター中に挿入されている場合には、翻訳調節シグナルをさらに追加することは不要であろう。しかし、PCM1遺伝子コード配列の一部分のみが挿入されている場合には、外因性の翻訳調節シグナル、おそらくはATG開始コドンが含まれるが、そのようなシグナルが提供されなければならない。さらに、その開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実に行うために、所望のコード配列のリーディングフレームと同一相になければならない。これらの外因性翻訳調節シグナルと開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、その他を含ませることによって増強させることができる。(Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153, 516-544を参照せよ。)
【０１９５】
さらに、挿入された配列の発現に変化を与える、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾し加工するような宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えば糖鎖付加)および加工(例えば、切断)はそのタンパク質の機能にとって重要なものとなることがある。種々の宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後の加工および修飾に特徴的で特異的な機作を有している。発現される外来タンパク質の正しい修飾と加工を確実なものとするために適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適切な加工、遺伝子産物の糖鎖付加、およびリン酸化のための細胞内機械類を有している真核生物の宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳類宿主細胞としては、限定はされないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、およびWI38細胞が含まれる。
【０１９６】
組換えタンパク質を長期間にわたって高収率で産生させるためには、安定な発現が好ましい。例えば、PCM1遺伝子産物を安定に発現する細胞系統を作成することができる。ウイルスの複製起点を含んでいる発現ベクターを用いずに、適切な発現調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他)で調節されるDNAと選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、操作された細胞を濃厚培地中で1〜2日間増殖させ、次いで選択培地へと転換することができる。この組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、その細胞がそのプラスミドをその細胞の染色体中に安定に組み入れ、増殖してフォーカスを形成し、それが今度はクローン化されて細胞系統へと拡張することを可能とする。この方法はPCM1遺伝子産物を発現する細胞系統の作成に用いると有利である。このようにして作成された細胞系統は該PCM1遺伝子産物の内在性の活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングと評価に特に有用なものとなろう。
【０１９７】
多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11, 223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaとSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22, 817)の遺伝子をそれぞれtk-、hgprt-、またはaprt-細胞中で用いることができる。また、抗代謝抵抗性を次の遺伝子の選択のベースとして用いることができる：dhfr、これはメトトレキセートに対する抵抗性を付与し(Wiglerら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527)；gpt、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を付与し(MulliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072)；neo、これはアミノグリコシドG-418に対する抵抗性を付与し(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150, 1)；およびhygro、これはハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する(Santerreら, 1984, Gene 30, 147)。
【０１９８】
あるいはまた、発現される融合タンパク質に対して特異的な抗体を用いることによってどのような融合タンパク質も容易に精製することができる。例えば、Janknechtらによって報告された経はヒトの細胞系統有で発現された、変性していない融合タンパク質を容易に精製することができる(Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976)。この系では、対象の遺伝子はワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化されてその遺伝子のオープンリーディングフレームが、6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳しうる形で融合する。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにロードし、ヒスチジンがタグされたタンパク質はイミダゾール含有バッファーを用いて選択的に溶出される。
【０１９９】
PCM1遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物の体内で発現させることもできる。PCM1トランスジェニック動物の作成にはどのような種の動物を用いることもでき、そのような動物としては、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、およびヒト以外の霊長類、例えばヒヒ、小型サル(monkey)、およびチンパンジーが含まれる。本明細書で用いている「トランスジェニック」という用語はPCM1遺伝子配列をそのもともとの動物とは異なる動物種から発現している動物(例えば、ヒトPCM1配列を発現しているマウス)、遺伝子操作されて内因性(すなわち、同種の)PCM1配列を過剰発現する動物、または内因性PCM1遺伝子配列を発現しないように遺伝子操作された動物(すなわち「ノックアウト」動物)、ならびにその子孫を意味する。
【０２００】
PCM1遺伝子トランスジーンを動物に導入してトランスジェニック動物の創始者系統を作るためには、当業界で既知のどの技法でも用いることができる。そのような技法としては、限定はされないが、前核中へのマイクロインジェクション(HoppeとWagner, 1989, 米国特許第4,873,191号)；レトロウイルスが媒介する生殖細胞系への遺伝子導入(Van der Puttenら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152)；胚性幹細胞中へのジーンターゲティング(Thompsonら, 1989, Cell 56, 313-321)；胚の電気穿孔(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814)；精子が媒介する遺伝子導入(Lavitranoら, 1989, Cell 57, 717-723)が含まれる(これらの技法の総説として、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115; 171-229を参照せよ)。
【０２０１】
トランスジェニック動物が作成されさえすれば、組換えPCM1遺伝子の発現は標準的な技法を用いてアッセイすることができる。一次スクリーニングはサザンブロット分析またはPCRで動物組織を分析してトランスジーンの組み込みが起こっているか否かをアッセイすることによって行うことができる。トランスジェニック動物の組織中でのトランスジーンのmRNA発現のレベルは、限定はされないが、トランスジェニック動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、in situハイブリダイゼーション分析、およびRT-PCR(逆転写酵素PCR)などの技法を用いても調べることができる。PCM1遺伝子を発現している組織のサンプルは、PCM1トランスジーン産物に対して特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的にも調べることができる。
【０２０２】
抗体
PCM1遺伝子でコードされるポリペプチドを特異的に認識することのできる抗体、またはPCM1遺伝子でコードされるポリペプチドの断片もしくはエピトープを特異的に認識することのできる抗体を本発明の種々の態様で用いることができる。
【０２０３】
例えば、そのような抗体は生物学的サンプル中のPCM1遺伝子産物の検出に用いることができ、従って診断または予後判定技法の一部として用いることができ、それによって患者のPCM1遺伝子産物のレベルが異常でないか、および/またはPCM1遺伝子産物の異常な形態のものが存在していないか試験することができる。
【０２０４】
そのような抗体はまた、試験化合物のPCM1遺伝子産物レベルおよび/または活性に対する影響を評価するために、例えば本明細書に記載の化合物スクリーニングスキームとともに用いることもできる。
【０２０５】
そのような抗体は異常なPCM1遺伝子産物活性を阻害するために用いることができる。従って、それらの抗体は統合失調症の治療方法で用いることができる。
【０２０６】
例えば、抗体は、本明細書に記載している遺伝子治療技法において、正常なおよび/または操作したPCM1発現細胞を患者の体内に導入する前に調べるために用いることができる。
【０２０７】
そのような抗体としては、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが含まれる。
【０２０８】
PCM1遺伝子産物に対する抗体の産生には、PCM1遺伝子産物またはそれの一部を注射することによって種々の宿主動物を免疫することができる。そのような宿主動物としては、限定はされないが、多数あるなかでウサギ、マウス、およびラットを挙げることができる。宿主動物種によって異なるが、種々のアジュバントを免疫応答を増強させるために用いることができ、そのようなアジュバントとしては、限定はされないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、プルロニックポリオール、ポリアニオン、リゾレシチンなどの界面活性物質、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(Bacille Calmette-Guerin)およびコリネバクテリウム(Corynebacterium)などのヒト用のアジュバントとして有用である可能性のあるものが含まれる。
【０２０９】
ポリクローナル抗体は、PCM1遺伝子産物またはそれの抗原性の機能を有する誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来の、抗体分子の不均一な集団である。ポリクローナル抗体の産生には、上述のものなどの宿主動物に、上述のアジュバントを添加したPCM1遺伝子産物を注射することによって免疫することができる。
【０２１０】
モノクローナル抗体はある特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるが、それは培養液中で連続的細胞系統によって抗体分子の産生を行えるいずれかの技法で、得ることができる。そのような技法としては、限定はされないが、KohlerとMilsteinのハイブリドーマ技法(1975, Nature 256, 495-497; および米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kosborら, 1983, Immunology Today 4, 72; Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030)、およびEBV-ハイブリドーマ技法(Coleら, 1985, 「モノクローナル抗体と癌治療」"Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)が含まれる。このような抗体は免疫グロブリンのいずれのクラスのものとすることもでき、そのようなものとしてはIgG、IgM、IgE、IgA、IgD、およびそれらの全てのサブクラスが含まれる。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養することができる。in vivoでmAbを高力価で産生させることは現在のところ好ましい産生法である。
【０２１１】
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子から得た遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子とともにスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技法(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312, 604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314, 452-454)を用いることができる。キメラ抗体は抗体の別々の部分が別々の動物種から由来したものである抗体で、例えば、マウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。(例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号; およびBossら, 米国特許第4,816,397号を参照せよ。)
【０２１２】
さらに、ヒト化抗体産生のための技法も開発された。(例えば、Queen, 米国特許第号を参照すればよく、この特許はその全体を本明細書中に参照により組み入れる。) 免疫グロブリン軽鎖または重鎖の可変領域が3つの超可変領域によって隔てられた「フレームワーク」領域からなっており、それは相補性決定部位(CDR)と呼ばれる。フレームワーク領域とCDRの長さは精密に定義されている(「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services(1983)を参照せよ)。簡潔に記せば、ヒト化抗体はヒト以外の動物種の抗体であって、ヒト以外の動物種からの1つ以上のCDRとヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有するものである。
【０２１３】
あるいはまた、一本鎖抗体の産生のための技法が報告されており(米国特許第4,946,778号; Bird, 1988, Science 242, 423-426; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883; およびWardら, 1989, Nature 334, 544-546)、その技法をPCM1遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するために改変させることができる。一本鎖抗体はFv領域の重鎖および軽鎖フラグメントをアミノ酸の架橋を介して連結させることによって単鎖のポリペプチドとさせて形成したものである。
【０２１４】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは既知の技法によって作成することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定はされないが、F(ab')2フラグメント、これは抗体分子のペプシン消化によって産生させることができ、Fabフラグメント、これはF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって作成される。あるいはまた、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの同定を迅速かつ容易に行うためにFab発現ライブラリーを構築することができる(Huseら, 1989, Science, 246, 1275-1281)。
【０２１５】
変異体と誘導体
本発明がPCM1遺伝子を用いる方法に、またはPCM1遺伝子の使用に関する場合には、それらの方法(および使用)では、PCM1遺伝子の変異体を用いることができる。そのような変異体についてここでより詳細に述べる。
【０２１６】
変異体の核酸分子は、上述のコード配列の全てまたは一部と相同性を共有する、または全く同一なものである。通常は、変異体は、PCM1核酸配列でコードされるポリペプチドと同じ活性を有するポリペプチド、および/またはPCM1核酸配列によってコードされるポリペプチドに対して作成された抗体と特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸を、コードすることができる、またはその核酸を単離もしくは増幅するために用いることができる。
【０２１７】
本発明の変異体は人工的に作成した核酸とすることができ(すなわち、天然のものを起原としない配列を含んでいる)、それは当業者であれば本明細書の開示事項を見れば調製することができる。あるいはまた、新規の、天然の核酸とすることができ、それは本明細書で開示した配列を用いて単離することができる。
【０２１８】
従って、変異体はPCM1遺伝子配列の一部分に対応する特有の部分またはフラグメント(しかしながら産生はされる)とすることができる。そのフラグメントは該ポリペプチドの特定の機能を有する部分をコードすることができる。同様に、そのフラグメントはここで提供された配列またはそれと密接に関連した配列のプロービング、または増幅に利用することができる。
【０２１９】
また、3'または5'末端で伸長させた核酸も含まれる。  
人工的変異体(誘導体)は当業者であれば例えば、部位指定もしくはランダムな突然変異誘発によって、または直接的な合成によって調製することができる。本明細書で用いている「変異体」核酸という用語はこれらの可能性の全てを包含する。
【０２２０】
変異体に関する本発明の態様のいくつかについてここでより詳細に述べる。  
相同性(すなわち、類似性または同一性)とは、FASTAおよびFATPを用いて行う配列比較を用いて定義されるとおりのものである(PearsonとLipman, 1988, Methods in Enzymology 183:63-98を参照せよ)。パラメーターはデフォルトもマトリクスを用いて下記のとおりセットすることが好ましい：Gapopen(ギャップ中の第1の残基についてのペナルティー)：タンパク質では-12 / DNAでは-16；Gapext(ギャップ中の追加の残基のペナルティー)：タンパク質では-2 / DNAでは-4；KTUPワード長：タンパク質では2 / DNAでは6。相同性はヌクレオチド配列レベルおよび/またはコードされたアミノ酸配列レベルとすることができる。好ましくは、該核酸配列および/またはアミノ酸配列は、PCM1遺伝子の配列と、少なくとも60%、または70%、または80%の相同性を共有し、最も好ましくは少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を共有することである。
【０２２１】
このように、本発明の変異体ポリペプチドはその配列の内部に、PCM1遺伝子でコードされるポリペプチドと比較して、単一のアミノ酸、または2、3、4、5、6、7、8、もしくは9個の変化、約10、15、20、30、40、もしくは50個の変化、または約50、60、70、80、90、100、200個を超える変化を含むことができる。ここに示したアミノ酸配列内の1個以上の変化に加えて、変異体ポリペプチドはさらに別のアミノ酸をC末端および/またはN末端に含むことができる。当然のことながら、核酸変異体に関しては、コードされるポリペプチドに変化を与えないような核酸の変化(すなわち「縮重した等価物」)は本発明の範囲内に含まれる。
【０２２２】
誘導体を産生するための配列の変化は、該核酸中の1個以上のヌクレオチドの1個以上の付加、挿入、欠失、または置換とすることができ、それがコードされるポリペプチド内の1個以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失、または置換となる。
【０２２３】
変化させることは多数の理由で望ましいが、そのような理由としては、次の特徴の導入または除去が含まれる：制限エンドヌクレアーゼ配列；コドンの使用法；翻訳後の修飾に必要なその他の部位；コードされるポリペプチド内の切断部位；コードされたポリペプチド内のモチーフ(例えば結合部位)。リーダー配列またはその他の標的配列(例えば、疎水性固定領域)を、発現後のその位置を決定するために、発現されたタンパク質に付加、またはそのタンパク質から除去することができる。これらのことの全ては効率的なクローニングおよび活性のあるポリペプチドの発現を、組換えの形態で支援することができる(下記に示すように)。
【０２２４】
その他の望ましい変異は、コードされるポリペプチドの活性(例えば特異性)または安定性に変化を与えるための、ランダムまたは部位指定突然変異誘発であろう。
【０２２５】
変化は保存的な変異、すなわち、イソリシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの疎水性残基の1個を別の疎水性残基と置換すること、または極性の残基の1個を別の疎水性残基と置換すること、例えばアルギニンをリジンと、グルタミン酸をアスパラギン酸と、またはグルタミンをアスパラギンと置換することによるものとすることができる。当業者にはよく知られているとおり、ポリペプチドの一次構造を保存的置換によって変えることはそのペプチドの活性を顕著に変えない可能性があるが、それはおそらくその配列中に挿入されたアミノ酸の側鎖は、置換されてはずれたアミノ酸の側鎖と類似の結合およびコンタクトを形成するためであろう。置換がそのペプチドのコンホメーションを決定することにきわめて重要な領域中で行われる場合ですら、このことは言えることである。
【０２２６】
また、非保存的置換を有する変異体も含まれる。当業者にはよく知られているとおり、コンホメーションの決定にきわめて重要ではないペプチドの領域での置換はそのペプチドの活性に大きな影響を及ぼさない可能性があるが、それはそれらの置換がそのペプチドの三次元構造を大きくは変えないからである。
【０２２７】
ペプチドのコンホメーションまたは活性の決定にきわめて重要な領域中では、このような変化はそのポリペプチドに有利な性質を付与する可能性がある。事実、上述のようなものなどの変化はペプチドに例えば安定性または特異性の変化などの少し有利な性質を付与することができる。
【０２２８】
本発明を、以下の非限定的な実施例および図面を参照して説明する。
【０２２９】
図面、表
図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。コード配列は6075ヌクレオチドの長さを有し、翻訳産物は2024アミノ酸の長さである。翻訳開始コドン(atg)はPCM1 mRNAの位置410にあり、終止コドン(tga)は位置6482にある。
【０２３０】
図2は、PCM1のエクソン4に対して3'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す(AB020866クローンの位置80254)。クローンAB020866の配列はEntrezヌクレオチドデータベースから得られた参照ゲノム配列であり、1行目(ex4gnm)に見出すことができる。変異はAB020866クローンのヌクレオチド位置80254(マークしたX)に生じる。AlignIRから得られたコンセンサス配列は最後の行(「コンセンサス配列」)に見出すことができる。ヘテロ接合体はマークされたRであり、Gホモ接合体はマークされたGであり、Aホモ接合体はマークされたAである。
【０２３１】
図3は、PCM1のエクソン4中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す(AB020866クローンの位置80123)。PCM1のcDNAの配列(NM_006197)を1行目(ex4cDNA)に見出すことができるが、クローンAB020866は参照ゲノム配列であり、2行目(ex4gnm)に見出すことができる。両配列はEntrezヌクレオチドデータベースから取得したものである。変異は該cDNAのヌクレオチド位置1100およびAB020866の位置80123に生じ、これはマークされたXで表される。AlignIRから得られたコンセンサス配列を最後の行(「コンセンサス配列」)に見出すことができる。ヘテロ接合体をRとして示し、Gホモ接合体をGとして示す。
【０２３２】
図4は、PCM1のエクソン5に対して5'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す(AB020866クローンの位置87366)。クローンAB020866の配列はEntrezヌクレオチドデータベースから得られた参照ゲノム配列であり、1行目(ex5gnm)に見出すことができる。変異はAB020866クローンのヌクレオチド位置87366(マークされたX)に生じる。AlignIRから得られたコンセンサス配列は最後の行(Consensus)に見出すことができる。ヘテロ接合体をYとしてマークし、Cホモ接合体をCとしてマークし、Tホモ接合体をTとしてマークしてある。
【０２３３】
図5は、AB020866クローンの位置87507に同定された新規なDNA変異体のAlignIRアラインメントの報告を示す。クローンAB020866の配列はEntrezヌクレオチドデータベースから得られた参照ゲノム配列であり、1行目(ex5gnm)に見出すことができる。変異はAB020866クローンのヌクレオチド位置87507に生じ、Xでマークしてある。AlignIRから得られたコンセンサス配列を最後の行(「コンセンサス配列」)に見出すことができる。ヘテロ接合体はマークされたRであり、Gホモ接合体はマークされたGであり、Aホモ接合体はマークされたAである。
【０２３４】
図6(表4)は、実施例2中で言及されるエクソン-イントロン境界を示す。
【０２３５】
発明の詳細な説明
第1に、精神神経疾患と関連する領域が位置するヒト第8染色体の短腕上の約500 kbの間隔を定め、第2に、この領域内に存在し、精神神経疾患に関与する、本明細書ではPCM1-EX41と呼ぶ遺伝子内の新規な突然変異を同定した本実験を説明する。
【０２３６】
実施例1-連鎖不平衡
材料および方法
連鎖不平衡
連鎖不平衡(LD)試験を、精神神経疾患(統合失調症)患者の集団サンプルから得たDNAを用いて実施した。この集団サンプルおよびLD技術は以下に記載されたとおりのものであった。本LD試験は、以下に記載の物理マッピングおよび配列決定技術によって同定されたさらなる物理マーカーの発見を利用したものである。
【０２３７】
細菌人工染色体(BAC)マッピング
物理マッピングのために、ヒト配列を含む細菌人工染色体(BAC)を、公共に入手可能なマップ(ヒトゲノムデータベース、Toronto 1999)に基づいて、分析しようとする領域に対してマッピングした。次いで、このBACを順序付けし、マイクロサテライトマーカーならびにHMDGおよびEBにより発見された多型SNPを用いる標準的なマッピングを実施することによりコンティグを再構築した。
【０２３８】
細菌人工染色体(BAC)マッピング。マイクロサテライト多型にフランキングする配列を用いて、ヒトBACライブラリーをスクリーニングした。BACの末端をクローニングし、サブクローンを配列決定した。そのようなBACの1つ、および生の配列データから、さらなるマイクロサテライトを同定した。サブライブラリーに由来するマイクロサテライトの配列を、対応するマイクロサテライトプローブにより同定した。そのような反復配列の周囲の配列を取得し、ゲノムDNAのためのPCRプライマーの開発を可能にした。
【０２３９】
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて、分析しようとする領域に対する新しいBACをマッピングした。
【０２４０】
次いで、得られた配列を、BLASTアルゴリズム(Altschulら、1990, J. Mclec. Biol., 215, 403-410)を用いて、公共のDNAおよびタンパク質データベースと比較した。
【０２４１】
結果
統合失調症に関与する遺伝子領域は、ヒト第8染色体の短腕(8p)の一部にマッピングされると以前に報告された。第8染色体の短腕8pの大部分ではマーカー間に約60 cMの広い遺伝子領域を含む。
【０２４２】
遺伝子配列を同定することを試みる前に、精神神経疾患領域をさらに狭めるために試験を実施した。
【０２４３】
具体的には、連鎖不平衡(LD)解析を、以下に記載の物理マッピングおよび配列決定技術を用いて同定されたさらなる物理マーカーを利用し、上記の集団サンプルおよび技術を用いて実施した。
【０２４４】
連鎖およびLDマッピングに必要な遺伝的マーカーの正確な順序を提供するために、そしてよりよいマッピングのための新しいマイクロサテライトマーカー開発を導くために、8p21-22.3候補領域の高解像度物理マップを開発した(表1)。11個の多型(そのうちの7個は本明細書で初めて記載されるものである(表2を参照))について、英国系の134人の統合失調症患者および316人の民族的に一致した正常な対照のサンプル中で遺伝子型を決定した。
【０２４５】
表1：ヒト8p21.3-p22配列のNT 000501コンティグ(121,0381塩基)を構成するクローンを示す
2個の既知のマーカー(D8S261およびAFM333th1)と共にこの配列から開発された7個の新規なマイクロサテライトマーカーの位置、ならびにそれらの対応するクローンおよび9個のマーカー間のマーカー間距離を示す。
【表１】
2005511094.tif 000002
【０２４６】
【表２】
2005511094.tif 000003
2005511094.tif 000004
2005511094.tif 000005
2005511094.tif 000006
2005511094.tif 000007
2005511094.tif 000008
2005511094.tif 000009
【０２４７】
約108 kbの領域に広がる3個の隣接するの多型、D8S66181、D8S6687およびD8S261は、複数の対立遺伝子に関するMonte Carlo補正後にそれぞれp値0.004、0.024および0.055を示すという統合失調症との対立遺伝子連関に関する有意な証拠を示した(表2)。統計的に有意なマーカー間の連鎖不平衡が、この領域中で正に連関したマーカーと、該マーカーの物理的距離とよく連関した全体との間に認められた。配列決定および遺伝子型決定により同定された新規なマイクロサテライトおよびSNPマーカーを、統合失調症の症例から回収したサンプルのLD分析において遺伝子型決定した。このLD分析の結果、精神神経疾患に関与する遺伝子は、染色体8p腕の、公共に入手可能なマーカーD8S261にフランキングする70 kbの間隔に横たわる領域に狭められた。遺伝子PCM1は、70 kbの領域にわたり最大の不平衡を示す位置に正確にマッピングされ、それによってそれが精神神経疾患に関与し得ることが示される、唯一の遺伝子であった。
【表３】
2005511094.tif 000010
【０２４８】
上記表中、
T1：「生」の分割表の単純ピアソンχ2統計値、
T2：小規模な期待セルカウントを回避するために一緒にグループ化された稀な対立遺伝子を含む表のχ2統計値、
T3：各々が、1個の対立遺伝子を、一緒にグループ化された残りの対立遺伝子に対して比較するものである2×2の表のχ2統計値の最大値、
T4：残りの対立遺伝子に対して任意の対立遺伝子の組合せを比較するものである、可能性のある全ての2×2の表のχ2統計値の最大値、
である。
【０２４９】
中心小体周辺物質1遺伝子(PCM1)は染色体8p21.3-33にマッピングされている[Ohata, (1994) Genomics 24, 404-406]。
【０２５０】
さらに、それはGenome Channelにて注釈付けされており、その配列はNT_000501コンティグのクローンAB020866およびAB020867の一部を占める。2つの連関する多型、D8S2616とD8S261はこの遺伝子のイントロン配列内にあるが、第3の多型、D8S2615はこの遺伝子の翻訳開始コドンの約75 kb上流に存在する。Balczonら、[Balczon, 1991, Cell Motil Cytoskeleton 20: 121-135]は、約220 kDの中心体自己抗原を同定した。タンパク質全体をコードするcDNAを、ヒト胎児肝臓cDNAライブラリーから単離した。クローニングされた配列の分析により、2,024個のアミノ酸をコードする6,072ヌクレオチドのオープンリーディングフレームが同定された。推定アミノ酸配列から、PCM1の正確な分子量は228,705ダルトンであると算出された[Balczon, 1994]。PCM1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図1に示す。
【０２５１】
実施例2-PCM1のゲノム構成
推定コード配列は、PCM1 mRNAの位置410に位置する翻訳開始コドン(ATG)を、そしてそれに先行するKozakコンセンサス(CCAXXATGG)開始配列[Kozak, 1984, Nature 308: 241-246]を有志、さらに終止コドン(TGA)がPCM1 mRNAの位置6482に位置している(図1)。
【０２５２】
エクソン-イントロンゲノム構成を定めるために、NCBIから入手した「BLAST 2配列」プログラムを用いた。これは、BLASTプログラムを用いて2つの所与の配列のアラインメントを作成するツールである。この場合、2つの配列は対応するゲノム配列(NT_000501コンティグのクローンAB020866およびAB020867)に対するPCM1のmRNA配列(アクセッション番号NM_006197)であった。これらのデータから誘導されたPCM1転写物のエクソン-イントロン接合部を表4(図6)に示す。推定されるエクソン-イントロン境界は、エクソン-イントロン境界のヌクレオチドはランダムではなく、イントロンは常にGTから始まり、AGで終わるようであるという「GT-AG則」とよく一致している。さらに、推定されるエクソンは、ゲノム配列の自動注釈付けを提供するサイトであるGenome Channelによる遺伝子推定に用いるGRAILEXPプログラムにより作成されたエクソンと一致している。
【０２５３】
このコード配列は6075ヌクレオチドの長さを有し、その翻訳産物は2024アミノ酸長である。翻訳開始コドン(atg)はPCM1 mRNAの位置410にあり、一方、終止コドン(tga)は位置6482にある。National Institute of Biotechnology Information (NCBI) Open Reading Frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/html)から入手した。
【０２５４】
このデータは、PCM1遺伝子がゲノム配列の約92 kbの領域にわたって広がる37個のエクソンから構成され、PCM1オープンリーディングフレームの全6075ヌクレオチドを完全にカバーすることを示している。
【０２５５】
さらに、翻訳開始コドンの上流の20 kbのゲノム配列のNucleotide Identify X (NIX, http://menu.hgmp.mrc.ac.uk/menu-bin/Nix/Nix.pl)分析により、PCM1転写物の5'末端の一部を包含する868ヌクレオチドの推定CpG島(67％GC)が同定された。Blast 2.0相同性検索は、このCpG島の一部と、Sanger Centreにより単離されたCpG島との完全な一致を示した[Cross, 1994, Nature Genetics 6, 236-244]。潜在的なプロモーター部位も、このCpG島の周囲に推定された。潜在的なコンセンサスポリアデニル化シグナルは終止コドンの63ヌクレオチド下流に存在する。
【０２５６】
エクソン37
gtttttcagAAACGGTGGGAGCCCAGAGTATATGAGATGTCTTCAGAGGCTCATCTAACTCTGTCCTTACATACTCAATGCATATATGAAAACAATACTAAATAAACATCTGATCTGTATAAAAATGTAA
PCM1はUnigeneデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)中でいくつかのESTにより表され、Unigene識別番号Hs.75737を割当てられている。Unigeneで入手可能な発現データは、PCM1が、脳を含む様々な組織(副腎、大動脈、骨、脳、胸、CNS、結腸、眼、生殖細胞、頭部および頸部、心臓、腎臓、肺、リンパ、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、胎盤、前立腺、平滑筋、脾臓、胃、精巣、甲状腺、扁桃腺、子宮、全胚)中で発現されることを示している。
【０２５７】
PCM1のオープンリーディングフレームは、2024個のアミノ酸からなる推定タンパク質をコードする。アミノ酸1167〜1174から伸びるコンセンサスヌクレオチド結合部位が見出された。ARILSGKTのこのアミノ酸ストレッチは、いくつかのATPase、キナーゼおよびGTP結合タンパク質において同定されているコンセンサスATP/GTP結合モチーフに対応する。さらに、それはコイルドコイルを形成する能力を有する。
【０２５８】
実施例3-増幅されたエクソンの自動化二方向DNA配列決定によるPCM1 DNA変異の分析
この分析のために、連関試験に用いたサンプルに由来する19人の統合失調症症例と共に、染色体8p21-22に陽性のロッドを示した英国人の多発性統合失調症家系(26人の罹患した個体)に各々由来する2人の症例および10人の関連しない健康な対照を用いた。統合失調症との連鎖不平衡状態にある突然変異を検出する可能性を増大させるために、マイクロサテライトマーカーD8S261、D8S2616およびD8S2615に関して前章で記載された対立遺伝子連関試験における対照においてよりも前記症例においてより高い頻度でその対立遺伝子を担持する罹患個体を選択した。
【０２５９】
PCM1は、ゲノム配列の約92 kbに広がる37個のエクソンからなる。しかしながら、各エクソンは比較的小さく、約60〜360 bpに及ぶサイズである。マーカーD8S2616はエクソン4と5の間のPCM1のイントロン配列内にあり、一方D8S261はエクソン19と20の間にある。
【０２６０】
突然変異およびDNA変異のスクリーニングのために選択した戦略は、PCR増幅したエクソンの自動化された二方向配列決定であった。全エクソン配列ならびに各エクソンの片側にある100 bpを超える長さのイントロン配列を、記載したM13尾部プライマーを用いてPCR増幅した。次いで、PCR産物をThermo Sequenaseキットを用いて配列決定した。各シークエンス反応物は、前記PCR産物の両方のDNA鎖から配列を取得する(二方向配列決定)ための、異なるIR色素(IRD700およびIRD800)で標識した2つの異なるM13プライマーを含む。このようにして、PCR産物の両方の鎖を完全に配列決定することができる。この手法は、フォワード鎖およびリバース鎖の双方を変異の存在について同時に評価する際の突然変異の検出に特に有用である。さらに、ヘテロ接合体の検出が高度に正確である。さらに、この配列に基づく方法は、各突然変異の特定の位置を検出することができる。最後に、全てのPCR産物に関して同じ配列決定プライマーを使用することにより、二方向尾部プライマーの配列決定が経済的に実現可能になる。従って、LI-COR上の直接配列決定は、より信頼性が高く、より迅速な手法としてSSCPと配列決定の組合せよりも好ましいとされた。
【０２６１】
LI-CORの二色素自動化DNA配列決定装置(Model 4200 IR2 System)を用いて、二方向シークエンス反応のフォワードおよびリバース配列を並行して電気泳動し、分析した。配列データを、LI-CORのBase ImagIR(商標)ソフトウェアの自動ベースコーリングアルゴリズムを用いて読み取った。
【０２６２】
自動アラインメントを、LI-CORのAlignIR(商標)ソフトウェアにより実施した。このソフトウェアは、全てのサンプルに由来するフォワードおよびリバース鎖について配列をアラインさせ、コンセンサス配列を作成する。このコンセンサス配列は、全ての塩基文字を考慮し、その位置での塩基の組合せについてのIUPACアンビギュイディー(ambiguity)コードを作製する最小法により作成した。このコンセンサス配列を、最後のサンプル配列の下の列に示すが、下の注釈付けの列により、コンセンサス配列中のあいまいさおよび不一致を発見することが容易になる。あいまいさまたは不一致が特定の位置でぶつかった場合、全てのサンプルのフォワードおよびリバース鎖の双方に関するクロマトグラムファイル(.scfファイル)を含むウィンドウを開いて、ベースコーリングの妥当性を評価することができる。誤ったベースコーリングを、前記配列を単に反転表示させ、適当な文字またはIUPACアンビギュイティーコードを記入することによりAlignIRウィンドウ中で編集した。
【０２６３】
ヘテロ接合部位を、(i)ある位置でホモ接合である全個体についての対応する蛍光ピーク高と比較した場合の、その位置での蛍光ピーク高の降下の存在および(ii)蛍光ピーク高における降下に付随する別の塩基の存在(第2のピーク)について、組み立てた配列トレースを走査することにより同定した。
【０２６４】
さらに、多型および変異も以下のように同定した：
クローンAB020866の塩基番号75915でのAからGへのSNP
クローンAB020866の塩基番号79215でのTからCへのSNP
クローンAB020866の塩基番号80123でのGからAへのSNP
クローンAB020866の塩基番号87366でのCからTへのSNP
クローンAB020866の塩基番号96961でのGからAへのSNP
クローンAB020866の塩基番号97759でのGからAへのSNP
クローンAB020867の塩基番号510でのAからCへのSNP
クローンAB020867の塩基番号2450でのCからTへのSNP
クローンAB020867の塩基番号10153でのCCからCへの挿入/欠失
クローンAB020867の塩基番号30364でのAからGへのSNP
クローンAB020867の塩基番号32005でのTからCへのSNP
クローンAB020867の塩基番号61847でのCからTへのSNP
クローンAB020867の塩基番号51659でのAからCへのSNP
クローンAB020867の塩基番号78722でのTからCへのSNP
クローンAB020866の塩基番号75925でのTからCへのSNP
クローンAB020866の塩基番号79214でのAからGへのSNP
クローンAB020866の塩基番号80254でのAからGへのSNP
クローンAB020866の塩基番号87507でのGからAへのSNP
クローンAB020867の塩基番号61873でのAからCへのSNP
クローンAB020867の塩基番号51745での挿入／欠失。
【０２６５】
本発明はこれらのマーカーおよびそれらとの連鎖不平衡状態にあるものも包含すると理解されるであろう。
【０２６６】
実施例4-エクソン4およびそのエクソン／イントロン境界の分析
統合失調症との対立遺伝子連関の証拠を示すマーカーD8S2616はエクソン4と5の間のPCM1のイントロン配列内にあるため、エクソン4を最初に突然変異およびDNA変異についてスクリーニングした。
【０２６７】
507 bpの配列を、M13尾部プライマーを用いてPCR増幅した。そのプライマーの配列は以下の通りである：
5’-GGATAACAATTTCACACAGG-CCAAGTGTCTTTGGTTATCTTCG-3’
M13リバースプライマー    (-21)    フォワードPCRプライマー
5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-AGTCCGAACATCCTCCTCCT-3’
M13フォワードプライマー    (-29)    リバースPCRプライマー。
【０２６８】
この産物は、エクソン4の全部(170 bp)を含んでいたが、増幅された配列の残りはこのエクソンの両側に由来するイントロン配列であった。続いて、PCR産物を二方向に配列決定した。配列を、全部で10人の対照および45人の症例について取得した。
【０２６９】
LI-CORのAlignIR(商標)ソフトウェアによる配列分析を行った。単一ヌクレオチド多型を、エクソンに対して3'側であるイントロン配列中で同定した。これは患者および対照の双方で起こったAからGへの置換である。全体として、対照の個体に由来するサンプルにおいては6つのGGホモ接合体、1つのAAホモ接合体および3つのヘテロ接合体が同定されたが、統合失調症を有する個体では23のGGホモ接合体、3つのAAホモ接合体および19のヘテロ接合体が同定された。DNA変異は、AB020866ゲノムクローン中のヌクレオチド位置80254で起こる。配列分析を用いてPCM1中で同定された新規なDNA変異を含むAlignIR報告を図2に提示する。
【０２７０】
候補となる単一ヌクレオチド多型を、PCM1 mRNA(NM_006197)の位置1100およびAB020866クローンの位置80123のコード配列中で同定した。それは唯一のGGホモ接合体としての比較的低い頻度でのGからAへの置換であり、ヘテロ接合体はほとんど観察されなかった。より具体的には、前記症例間で7つのヘテロ接合体が観察されたが、対照においてはヘテロ接合体は存在しなかった。残りの個体はGGホモ接合体であった。アラニン(gct)からトレオニン(act)へのタンパク質配列におけるアミノ酸変化をもたらすようであるので、これは非常に興味深い多型である。この多型を検証するためには、より多くの個体を試験しなければならないであろう。このDNA変異を含むAlignIR報告を図3に提示する。
【０２７１】
クローンAB020866の配列は、Entrezヌクレオチドデータベースから得られた参照ゲノム配列であり、図2の1行目(ex4gnm)に見出すことができる。変異はAB020866クローンのヌクレオチド位置80254に生じる。AlignIRから得られたコンセンサス配列は最後の行(「コンセンサス配列」)に見出すことができる。ヘテロ接合体はマークされたRであり、Gホモ接合体はマークされたGであり、Aホモ接合体はマークされたAである。
【０２７２】
実施例5-エクソン5およびそのエクソン／イントロン境界の分析
統合失調症との対立遺伝子連関の証拠を示すマーカーD8S2616がエクソン4と5の間のPCM1のイントロン配列内にあるため、この段階ではエクソン5を突然変異およびDNA変異についてスクリーニングした。
【０２７３】
595 bpの配列を、M13尾部プライマーを用いてPCR増幅した。このプライマーの配列は以下の通りである：
5’-GGATAACAATTTCACACAGG-TGAGCCATTGATTATG-3’
M13リバースプライマー    (-21)    フォワードPCRプライマー
5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-AGTTGTCCCTGCAACCT-3’
M13フォワードプライマー    (-29)    リバースPCRプライマー。
【０２７４】
この産物はエクソン5の全体(180 bp)を含んでいたが、増幅された配列の残りはこのエクソンの両側に由来するイントロン配列であった。続いて、PCR産物を二方向に配列決定した。配列を、5人の対照および42人の症例について取得した。
【０２７５】
LI-CORのAlignIR(商標)ソフトウェアによる配列分析を行った。2個の単一ヌクレオチド多型を、エクソン5に対して5'側にあるイントロン配列中で同定した。1個はAB020866ゲノムクローンの位置87366でのエクソン5の開始部位から171 bpで生じるCからTへの置換である。試験した個体中、前記症例のうちTTホモ接合体が１人、そしてヘテロ接合体が5人同定されたが、5人の対照全員を含むその残りはCCホモ接合体であった。このDNA変異を含むAlignIR報告を図4に提示する。
【０２７６】
GからAへの置換である第2の単一ヌクレオチド多型は、AB020866ゲノムクローンのヌクレオチド位置87507での前記エクソンの開始部位に対して5'側の30 bpで生じる。試験した対照においては2つのGGホモ接合体および3つのヘテロ接合体が同定されたが、前記症例においては11のGGホモ接合体、10のAAホモ接合体および21のヘテロ接合体が同定された。このDNA変異を含むAlignIR報告を図5に提示する。
【０２７７】
PCM1中で同定され、そのエクソン4および5の周辺にある全部で4個の単一ヌクレオチド多型を、制限酵素切断部位の変化の可能性について試験したが、そのような部位を生成または喪失するものはないようであった。
【０２７８】
考察
PCM1は中心体構築の一部である。中心体の完全性の維持および微小管細胞骨格の調節における可能性のある役割については記述されているが、精神神経疾患におけるその機能はこれまで解明されていない。そのタンパク質構造はミオシン、構造タンパク質ならびに運動性および／または輸送に関与するタンパク質(微小管結合タンパク質)との類似性を有する。Millarら[2000]により記載されるように、そのような構造タンパク質の多くは軸索誘導、シナプス形成、シナプスの機能化ならびに軸索および樹状突起に沿った細胞内輸送などのプロセスに関与している。それは今や、PCM1が神経系および／またはニューロンの活動の発達にこのタンパク質を関与させる同様の役割を有し、従って、統合失調症、PCM1障害および精神神経疾患の病因に関与するという症例である。
【０２７９】
さらに、PCM1は脳特異的タンパク質であるハンチンチン結合タンパク質1(HAP1)と相互作用する。HAP1は長さ依存的な様式でグルタミン反復中でハンチンチンと結合し、ならびに細胞骨格タンパク質、小胞タンパク質および運動タンパク質と相互作用する。このように、それは、これらの異なる分子全部の間の相互作用を媒介するためのアダプタータンパク質として働く[Engelender, 1997, Hum Mol Genet 6: 2205-2212]。
【０２８０】
PCM1が神経機能と直接関連するタンパク質と相互作用するという事実は、それが、神経細胞の正常な機能を担うタンパク質の広大なネットワークに関与する可能性があることを示唆している。
【０２８１】
突然変異ならびにDNA配列の変異を同定するために、蛍光二方向DNA配列決定法を用いた。DNA配列決定は、DNAの多型および突然変異を発見するための最も感度の高い方法である。その感度に加えて、完全長DNA配列分析は、変異が1個のヌクレオチド置換であるか、または挿入／欠失変異であるかに関わらず、変異毎のタイプ、位置および内容の完全な知識を提供する。
【０２８２】
これまでのところ、2つのエクソン、エクソン4およびエクソン5と、各エクソンの片側上の少なくとも100 bpのイントロン配列が、単一ヌクレオチド多型についてスクリーニングされた。統合失調症との対立遺伝子連関の証拠を示すマーカーD8S2616はこれら2つのエクソン間のイントロン配列中に存在するため、これらのエクソンを最初にスクリーニングした。
【０２８３】
エクソン4においては、患者および対照の双方においてこのエクソンの3'側イントロン配列でGからAへのトランジションが同定された。スクリーニングされた個体において代替的な対立遺伝子の各々についてのホモ接合体として、またこれらの代替的な対立遺伝子を含むいくつかのヘテロ接合体として、それは高頻度の変異であるようである。さらに、エクソン4において単一ヌクレオチド多型が同定された。それはやはりGからAへのトランジションであるが、ホモ接合体よりも頻度の低いヘテロ接合体により同定されたため、この変異の相対頻度は低い。この多型は、統合失調症であると同定された個体においてヘテロ接合体として同定したが、正常な対照では認められなかった。それは、中心小体周辺物質1の推定タンパク質配列において、アラニンからトレオニンへのアミノ酸変化をもたらす。そのような突然変異は少なくとも140個の他の例において、疾患と関連することが判明している。
【０２８４】
エクソン5に対して5'側のイントロン配列において、2個の単一ヌクレオチド多型を同定した。両方の置換はトランジションであり、1個はCからTであり、もう1個はGからAであり、140 bp離れている。
【０２８５】
これまでのところ、PCM1のゲノム配列の小部分のみをスクリーニングしてきたが、その結果は、217 bp毎に平均1個の可変部位にて同定されてきたヒトDNA配列変異に関する他の研究と一致している[Halushka, 1999, Nat Genet 22: 239-247]。さらに、この研究で同定された全てのヌクレオチド置換はトランジションであり、これは他の研究と一致している[Halushka, 1999, 上掲]。特に、機能性遺伝子の間でA/G置換が最も高い有病率を示す[Gojobori, 1982, J Mol Evol 18, 414-423]。PCM1の調節配列およびコード配列のさらなるスクリーニングにより、統合失調症および他の精神神経疾患ならびにPCM1障害を引き起こす他の型の突然変異が得られる可能性がある。本発明の開示を考慮に入れると、配列決定の分野の当業者は、患者数を増やしてそのような突然変異を発見するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１−１】図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。
【図１−２】図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。
【図１−３】図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。
【図１−４】図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。
【図１−５】図1は、ヒト中心小体周辺物質1(PCM1) mRNAの最も長いオープンリーディングフレームおよびその翻訳産物を示す。
【図２−１】図2は、PCM1のエクソン4に対して3'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図２−２】図2は、PCM1のエクソン4に対して3'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図３−１】図3は、PCM1のエクソン4中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図３−２】図3は、PCM1のエクソン4中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図３−３】図3は、PCM1のエクソン4中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図４−１】図4は、PCM1のエクソン5に対して5'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図４−２】図4は、PCM1のエクソン5に対して5'側のイントロン配列中で同定された新規なDNA変異体のLI-COR AlignIRアラインメントの報告を示す。
【図５−１】図5は、AB020866クローンの位置87507に同定された新規なDNA変異体のAlignIRアラインメントの報告を示す。
【図５−２】図5は、AB020866クローンの位置87507に同定された新規なDNA変異体のAlignIRアラインメントの報告を示す。
【図６−１】図6(表4)は、実施例2中で言及されるエクソン-イントロン境界を示す。
【図６−２】図6(表4)は、実施例2中で言及されるエクソン-イントロン境界を示す。
【図６−３】図6(表4)は、実施例2中で言及されるエクソン-イントロン境界を示す。
【図６−４】図6(表4)は、実施例2中で言及されるエクソン-イントロン境界を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【国際調査報告】
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