(57)【要約】花、特に、 その花がβ-カロテンまたはゼアキサンチンなどのβ-イオネン環を含有するカロテノイド化合物を産生するが、アスタキサンチンまたはカンタキサンチンは産生しない高等植物の花の花冠および生殖器官におけるアスタキサンチンまたはカンタキサンチンなどの4-ケト-β-イオネン環を含有するカロテノイド化合物の生成を開示する。プロモーターにより制御される1以上の遺伝子を高等植物に挿入する（により形質転換する）。挿入された遺伝子は(a)少なくとも1種のケトラーゼであるカロテノイド生成酵素を含むキメラ酵素をコードする。その遺伝子は(b)色素体を標的とするトランジットペプチドに機能しうる形で連結されている。形質転換される高等植物には形質転換前にそれらの花で少なくとも ゼアキサンチンまたはβ‐カロテンを産生するものもあるが、他の植物は形質転換前にほとんど有色カロテノイド色素を産生せず、カロテノイド生成遺伝子のカセットで形質転換される。形質転換の方法および形質転換植物の使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムにキメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードするトランスジーンを含むトランスジェニック植物またはその再分化可能な部分であって、該キメラケトラーゼ酵素は、(i)色素体トランジットペプチド部分を含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分との、2つの部分を有するものであり、該トランスジーンの発現を制御するプロモーターに機能しうる形で該トランスジーンが連結されており、
該キメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁は4位が非置換であるβ-イオネン環を含有するカロテノイド化合物を産生するのに対し、該トランスジェニック植物の花弁は4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物を蓄積することを特徴とする、上記トランスジェニック植物またはその再分化可能な部分。
【請求項２】
4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物が4,4’-ジケト-β-イオネン環カロテノイド化合物である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
4,4’-ジケト-β-イオネン環カロテノイド化合物がカンタキサンチンである、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
4,4’-ジケト-β-イオネン環カロテノイド化合物がアスタキサンチンである、請求項１に記載の植物。
【請求項５】
色素体トランジットペプチド部分がRUBISCOトランジットペプチドである、請求項１に記載の植物。
【請求項６】
ゲノムに第2キメラポリペプチドをコードする第2トランスジーンを含む請求項１に記載の植物であって、該第2キメラポリペプチドは、(i)N末端色素体トランジットペプチドと、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環式化合物をカロテノイド3-ヒドロキシ-β-イオネン環式化合物へと変換するヒドロキシラーゼ酵素とを含むものであり、該第2トランスジーンの発現を制御するプロモーターに機能しうる形で該第2トランスジーンが連結されている、上記植物。
【請求項７】
3-ヒドロキシル-β-イオネン環を含有するカロテノイド化合物が3, 3’-ジヒドロキシ-β-イオネン環カロテノイド化合物である、請求項６に記載の植物。
【請求項８】
3, 3’-ジヒドロキシ-β-イオネン環カロテノイド化合物がゼアキサンチンである、請求項７に記載の植物。
【請求項９】
色素体トランジットペプチド部分がRUBISCOトランジットペプチドである、請求項６に記載の植物。
【請求項１０】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素部分が、アドニス・アエスチヴァリス（Adonis aestivalis）、アグロバクテリウム・アウランチアキュム（Agrobacterium aurantiacum）、アルカリゲネス種(Alcaligenes sp.)、ブラディリゾビウム種（Bradyrhizobium sp.）、ブレヴンデモナス・アウランチアカ（Brevundimonas aurantiaca）、ヘマトコッカス・プルヴィアィス（Haematococcus pluvialis）、ネンジュモ種(Nostoc sp.)、パラコッカス・マルクジイ（Paracoccus marcusii）、キサントフィマイセス・デンドロロス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、ラン藻種(Synechocystis sp.)、サーモシネコッカス・エロゲーテス（Thermosynechococcus elongates）、およびトリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）からなる群から選択される１種以上の生物に存在する遺伝子によりコードされるβ-カロテン-4-オキシゲナーゼである、請求項１に記載の植物。
【請求項１１】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素部分が、ヘマトコッカス・プルヴィアィスのbkt遺伝子およびcrtO遺伝子の一方もしくは両方、またはアグロバクテリウム・アウランチアキュムのcrtW遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の植物。
【請求項１２】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素部分が、アドニス・アエスチヴァリスのAdK1遺伝子およびAdK6遺伝子の一方または両方によりコードされる、請求項１に記載の植物。
【請求項１３】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素部分が、アルカリゲネス種PC-1のcrtW遺伝子によりコードされる、請求項１に記載の植物。
【請求項１４】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド3-ヒドロキシ-β-イオネン環へと変換するヒドロキシラーゼ酵素部分が、エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）およびエルウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）のcrtZ遺伝子の一方または両方によりコードされる、請求項７に記載の植物。
【請求項１５】
トランスジーンの発現を制御するプロモーターが花弁優先的なプロモーターである、請求項１に記載の植物。
【請求項１６】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁で産生される、4位が非置換であるβ-イオネン環を含有するカロテノイド化合物が、β-カロテンおよびゼアキサンチンの一方または両方である、請求項１に記載の植物。
【請求項１７】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物が１種以上のカロテノイドを生成させるケトラーゼ以外の酵素をコードする１以上のDNAセグメントで形質転換されている、請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】
(a)エルウィニア・ウレドボラのcrtE、crtB、crtI、crtYおよびcrtZ遺伝子または(b) エルウィニア・ヘルビコラのGGPPシンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ(4H)、リコペンシクラーゼ、およびβ-カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子からなる群から選択される１以上のさらなるトランスジーンをさらに含み、さらなるトランスジーンが各々、(i)該トランスジーンの花弁優先的な発現を誘導するプロモーターに機能しうる形で連結され、かつ、(ii)N末端色素体トランジットペプチド部分を含むキメラポリペプチド酵素を発現することを特徴とする、請求項１に記載の植物。
【請求項１９】
ヒガンバナ科(Amaryllidaceae); キョウチクトウ科(Apocynaceae); キク科(Compositae); ツリフネソウ科(Balsaminaceae); シュウカイドウ科(Begoniaceae); ナデシコ科(Caryophyllaceae); アカザ科(Chenopodiaceae); ウリ科(Cucurbitaceae); アブラナ科(Cruciferae); リンドウ科(Gentinaceae); フウロソウ科(Geraniaceae); イネ科(Graminae); トウダイグサ科(Euphorbiaceae); シソ科(Labiatae); マメ科(Leguminosae); ユリ科(Liliaceae); ミゾカクシ科(Lobeliaceae); アオイ科(Malvaceae); イソマツ科(Plumbaginaceae); ハナシノブ科(Polemoniaceae); サクラソウ科(Primulaceae); キンポウゲ科(Ranunculaceae); バラ科 (Rosaceae); アカネ科(Rubiaceae); ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae); ナス科(Solanaceae); セリ科(Umbelliferae); クマツヅラ科(Verbenaceae); およびスミレ科(Violaceae) からなる群から選択される、請求項１に記載の植物。
【請求項２０】
ゲノムにキメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードするトランスジーンを含むトランスジェニック植物またはその再分化可能な部分であって、該キメラケトラーゼ酵素ポリペプチドは、(i)それと融合されている色素体トランジットペプチドを含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分との、2つの部分を有するものであり、該トランスジーンの発現を制御するプロモーターに機能しうる形で該トランスジーンが連結されており、該キメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁はβ-カロテンおよびゼアキサンチンの一方または両方を産生するのに対し、また、該トランスジェニック植物の花弁は4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物を蓄積することを特徴とする、上記トランスジェニック植物またはその再分化可能な部分。
【請求項２１】
β-カロテンがキメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁で生成される、請求項２０に記載の植物。
【請求項２２】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のβ-カロテン産生植物が、同種の非突然変異体または非形質転換植物と比べて約5〜約200倍高い量で花弁にβ-カロテンを蓄積する突然変異体または示差的に形質転換されたトランスジェニック植物である、請求項２１に記載の植物。
【請求項２３】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のβ-カロテン産生植物が突然変異植物である、請求項２２に記載の植物。
【請求項２４】
突然変異植物の花弁のβ-カロテン量の比が約1:10〜約1を示す、請求項２３に記載の植物。
【請求項２５】
突然変異植物がマリーゴールドである、請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のβ-カロテン産生植物が示差的に形質転換されたトランスジェニック植物である、請求項２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】
示差的に形質転換されたランスジェニック植物が１種以上の異種カロテノイドを生成させる酵素をコードし発現する１以上のDNAセグメントを含む、請求項２６に記載の植物。
【請求項２８】
トランスジェニック植物がペチュニアである、請求項２７に記載の植物。
【請求項２９】
トランスジーンの発現を制御するプロモーターが花弁優先的なプロモーターである、請求項２０に記載の植物。
【請求項３０】
ゼアキサンチンがキメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁で生成される、請求項２０に記載の植物。
【請求項３１】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のゼアキサンチン産生植物が、花弁にゼアキサンチンを蓄積し、同種の非突然変異体または非形質転換植物と比べて約10〜約20倍高いゼアキサンチンを示す突然変異体または示差的に形質転換されたトランスジェニック植物である、請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のゼアキサンチン産生植物が、花弁にゼアキサンチンを蓄積し、約1:10〜約1のゼアキサンチン比を示す突然変異体または示差的に形質転換されたトランスジェニック植物である、請求項３０に記載の植物。
【請求項３３】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のゼアキサンチン産生植物が突然変異植物である、請求項３１に記載の植物。
【請求項３４】
突然変異植物の花弁のゼアキサンチン量とゼアキサンチンおよびルテイン合計量との比が約1:10〜約1.0を示す、請求項３３に記載の植物。
【請求項３５】
突然変異植物がマリーゴールドである、請求項３４に記載の植物。
【請求項３６】
色素体トランジットペプチドとプロモーターが異なる種由来である、請求項２０に記載の植物。
【請求項３７】
ゲノムにキメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードするトランスジーンを含むトランスジェニック植物またはその再分化可能な部分であって、該キメラケトラーゼ酵素ポリペプチドは、(i)それに融合されている色素体トランジットペプチドを含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分との、2つの部分を有するものであり、該トランスジーンの発現を制御しかつ該色素体トランジットペプチドのものとは異なる種由来である花弁優先的なプロモーターに機能しうる形で該トランスジーンが連結されており、該キメラケトラーゼで形質転換されていない同種の植物の花弁はβ-カロテンおよびゼアキサンチンの一方または両方を産生するのに対し、該トランスジェニック植物の花弁は4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物を蓄積することを特徴とする、上記トランスジェニック植物またはその再分化可能な部分。
【請求項３８】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のβ-カロテンまたはゼアキサンチン産生植物が、花弁にゼアキサンチンおよびβ-カロテンの一方または両方を蓄積し、同種の非突然変異体または非形質転換植物と比べて約10倍〜約20倍高いゼアキサンチンおよび約5〜約200倍高いβ-カロテンの一方または両方を示す突然変異体または示差的に形質転換されたトランスジェニック植物である、請求項３７に記載の植物。
【請求項３９】
カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換する該ケトラーゼ酵素部分が、ヘマトコッカス・プルヴィアィスのbkt遺伝子およびcrtO遺伝子の一方または両方、アドニスアドニス・アエスチヴァリスのAdK1遺伝子およびAdK6遺伝子の一方または両方、アグロバクテリウム・アウランチアキュムのcrtW遺伝子ならびにアルカリゲネス種PC-1のcrtW遺伝子、さらにその混合物からなる群から選択される遺伝子によりコードされる、請求項３７に記載の植物。
【請求項４０】
キメラケトラーゼで形質転換されていない同種のゼアキサンチンまたはβ-カロテン産生植物が突然変異植物である、請求項３９に記載の植物。
【請求項４１】
突然変異植物の花弁のゼアキサンチン比およびβ-カロテン比の一方または両方が約1:10〜約1を示す、請求項４０に記載の植物。
【請求項４２】
突然変異植物がマリーゴールドである、請求項４１に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は2002年12月19日出願の一部継続出願番号第10/325,265号であり、2002年3月21日出願の米国仮出願番号第60/366,444号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、カロテノイド生合成およびアスタキサンチンのバイオテクノロジー生産に関する。さらに詳しくは、本発明は、花、特に、花の花冠および生殖器官、例えば、花弁における、花弁が4-ケト-β-イオネン環を含有するカロテノイド化合物を蓄積するための、β-カロテンなどのβ-イオネン環を含有するカロテノイド化合物を4-ケト-β-イオネン環を含有するカロテノイド化合物へと変換する酵素をコードする遺伝子の優先的発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド類は生体に見られる多くの黄、橙および赤色に関与する天然色素である。カロテノイド類は、連結された8つのイソプレン(C5)単位を一般に含んでなる40個の炭素(C40)のテルペノイドである。これらの単位の連結は分子の中心にて逆転する。「ケトカロテノイド」とは、分子のイオネン環部分にケト基を含有するカロテノイド色素の総称であり、一方、「ヒドロキシカロテノイド」とは、イオネン環にヒドロキシル基を含有するカロテノイド色素を指す。本開示を通して、慣用名および略称を用いているが、IUPAC推奨の準体系的名称は通常、慣用名を最初に記載した後に括弧内に入れて示している。
【０００４】
カロテノイド類は5個の炭素原子の代謝前駆体、イソペンテニルピロリン酸(IPP)から合成される。IPP、偏在イソプレン単位の生成において少なくとも2つの知られた生合成経路が存在する。
【０００５】
1つの経路は、アセチル-CoAからHMG-CoA(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA)を経て生成されるテルペノイドの最初の特異的な前駆体であるメバロン酸から出発し、それ自体がイソペンテニルピロリン酸(IPP)へと変換する。この経路では、IPPはその異性体ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)と縮合して10個の炭素原子を含有するゲラニルピロリン酸(GPP)を生成する。IPPはGPPと縮合して15個の炭素原子を含有するファルネシルピロリン酸(FPP)を生成する。FPPは再びIPPと縮合して20個の炭素原子を有するゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)を生成する。2分子のGGPPが互いに縮合して、最初のカロテノイドである無色のフィトエンを生成する。
【０００６】
研究により、IPP生成に関して別の経路、数種類の真正細菌、緑藻で、また、高等植物の色素体で最初に同定された非メバロン酸経路が存在することも分かった。この別の経路での最初の反応はピルビン酸塩とD-グリセルアルデヒド-3-リン酸のトランスケトラーゼタイプの縮合反応であり、中間体として1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸(DXP)を生成する。中間体DXPは2-C-メチル-D-エリトリトール-4-リン酸へと変換され、これが後にIPPへと変換される [Harker ら, FEBS Letters, 448:115-119頁 (1999)を参照]。
【０００７】
一連の不飽和化反応を通じて、フィトエンはフィトフルエン、ζ-カロテン、ニューロスポレン、最後にリコペンへと変換される。続いて、リコペンは同定された環化反応により2つのβ-イオネン環を含有するβ-カロテンへと変換される。ケト基および／またはヒドロキシル基がβ-カロテンの各環に導入され、これによりカンタキサンチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンが合成される[Britton, Plant Pigments, Goodwin, T. W.編, London, Academic Press, (1988), 133-182頁を参照; また、Misawa ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)も参照。]。
【０００８】
ヒドロキシラーゼ酵素は、カンタキサンチンをアスタキサンチンへと変換することが知られている。また、ケトラーゼ酵素 はゼアキサンチンをアスタキサンチンへと変換することが知られている。ケトラーゼはまた、β-カロテンをカンタキサンチンへと変換し、また、ヒドロキシラーゼはβ-カロテンをゼアキサンチンへと変換する[Kajiwara ら, Plant Mol. Biol., 29:343-352頁 (1995); およびFraser ら, Eur. J. Biochem., 252:229-236頁 (1998) を参照。]。
【０００９】
A. アウランチアキュムおよびE. uredovora の研究から得られた結果から、ケトラーゼおよびヒドロキシラーゼをコードする遺伝子各々が1つのβ環で結合し、反応した後、生成物を放出し、また、再び結合し、反応し、第2の生成物を放出することができるということでこれらの酵素が二機能を有することが示唆されている。中間体カロテノイドの各変換にケトラーゼおよびヒドロキシラーゼ酵素だけを用いてアスタキサンチンを生成することができるβ‐カロテンからの異なる生合成経路がいくつかある [Misawa ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。
【００１０】
以下に構造式を示すカンタキサンチン
【化１】
2005532791.tif 000002
【００１１】
は、赤色キサントフィルカロテノイドであり、これは通常、花弁では生じないが、数種のキノコに、また、フラミンゴの羽毛に見られる。カンタキサンチンは食品着色料として用いられている。また、経口用日焼け剤としても用いられる。
【００１２】
以下に構造式を示すアスタキサンチン
【化２】
2005532791.tif 000003
【００１３】
は、赤色キサントフィル、は養殖魚および貝類の着色剤として広く用いられている。アスタキサンチンの生物医学的特性については、依然として完全には解明されていないが、最初の結果からは、癌および腫瘍予防、ならびに免疫系からのポジティブ応答の誘導で重要な役割を果たしうることが示されている[Tanaka ら, Carcinogenesis 15(1):15-19頁 (1994), Jyonouchi ら, Nutrition and Cancer 19(3): 269-280頁 (1993) およびJyonouchi ら, Nutrition and Cancer 16(2): 93-105頁 (1991)を参照。]。
【００１４】
アスタキサンチンは、特に、サケ科およびタイ科などの魚類、ならびにカニ、ロブスター、およびエビなどの甲殻類動物をはじめとする種々の海生動物で生じるカロテノイドである。一般に、動物はカロテノイドを生合成することができないため、食することで微生物または植物に存在するカロテノイドを獲得する。こういった理由で、アスタキサンチンは、タイ、サケ、およびエビなどといった養殖魚および貝類の赤色強化を目的とした飼料添加物として広く用いられてきた。さらに、アスタキサンチンは癌の原因となる、体内に生じる活性化酸素を取り除く酸化防止剤としても注目されている[Matuno ら, KAGAKU TO SEIBUTU (Chemistry and Organisms), 28:219-227頁 (1990)を参照。]。
【００１５】
甲殻類動物、酵母、および緑藻などの生物源から供給されるアスタキサンチンは、有機合成方法によって得られるものと比べて低収率で費用のかかる抽出方法により制限される。しかしながら、通常の合成方法では、許容されないと考えられる副生成物が生成する。そのため、水産養殖での飼料補助剤として、また、他の工業的用途で有用な化学物質として用いられる(3S, 3'S)-アスタキサンチンの比較的安価な供給源を見つけることが望ましい。
【００１６】
アスタキサンチンは多様な生物学的機能を有することが分かってきた。これはビタミンA前駆体であり、フリーラジカルおよび活性酸素種の捕捉剤および／またはクエンチャーとして作用し、癌に対する予防薬と考えられており、免疫応答を増強することが分かっている[Misawa ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。アスタキサンチンの特性についての研究から、医薬、「栄養補助食品」（ビタミンAの前駆体および他の特性として）、また、食品産業にとって重要なカロテノイドである。
【００１７】
アスタキサンチンの供給源としては、南氷洋のオキアミなどの甲殻類動物、酵母 Phaffiaの培養産物、緑藻 ヘマトコッカス・プルヴィアィス（Haematococcus pluvialis）の培養産物、および有機合成方法により得られる生成物が挙げられる。しかしながら、甲殻類動物、例えば、オキアミなどを用いる場合には、回収および抽出時にアスタキサンチンを混入物質、例えば、脂質などから単離するのに多大な労力と費用が必要である。さらに、酵母 Phaffiaの培養産物の場合には、酵母 が堅い細胞壁を有し、低収率でしかアスタキサンチンを産生しないため、アスタキサンチンの採取および 抽出には多大な費用が必要である。
【００１８】
H. プルヴィアィスは、生物において最高レベルに入るアスタキサンチン（0.5〜2%乾燥重量）を産生しうるが、この藻により合成されたアスタキサンチンのほとんどはエステル化されている。このようなエステル化は、魚のそのバイオアベイラビリティーを低下させる可能性がある。さらに、H. プルヴィアィスはアスタキサンチンの生成に高レベルの光を必要とする。
【００１９】
このような理由で、生物源から生成されたアスタキサンチンは費用の面では有機合成方法によって得られたものより劣ると見なされる。しかしながら、有機合成方法では、魚および貝類の飼料として、また、食物への添加剤としてのアスタキサンチンの使用を考えて、反応中に生成する副生成物の問題がある。有機合成方法によって得られた生成物は自然生産物に対する一部の消費者の好みに反していることがある。そのため、混入する副生成物を含まず、かつ、生物源から生成された安価なアスタキサンチンを提供することが望まれる。
【００２０】
生物系でのアスタキサンチンまたはカンタキサンチン生産の生産力を高める1つのアプローチが遺伝子工学技術の利用である。この変換に好適な遺伝子が報告されている。
【００２１】
本明細書においてケトラーゼ（β-カロテンケトラーゼまたはβ-カロテンオキシゲナーゼあるいは単にケトラーゼ）とは、ケトン（オキソ）基をカロテノイドβ-イオネン環の4位の炭素原子に付加して、カロテノイド生合成経路の後半段階で種々のケトカロテノイド化合物を生成させる酵素を指す。カロテノイドβ-イオネン環をカンタキサンチンおよびアスタキサンチンに存在する4-ケト-β-イオネン環へと変換しうるケトラーゼ酵素をコードする遺伝子の供給源はいくつかある。
【００２２】
例えば、Misawa ら（米国特許第6,150,130号を参照）は、基質としてのカロテノイドβ-イオネン環式化合物から4-ケトゼアキサンチンを経由するアスタキサンチンの生産に用いられるcrtWと呼ばれる遺伝子をコードする、海洋細菌アグロバクテリウム・アウランチアキュム種（Agrobacterium aurantiacum sp.）nov. MK1 またはアルカリゲネス属 PC-1から単離されたものをはじめとするDNA配列を明示している。Cunningham（WO 99/61652を参照）は1つにはケトカロテノイドアスタキサンチンの蓄積によって深紅花色を有する植物種であるアドニス・アエスチヴァリス（Adonis aestivalis）由来のケトラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAの単離を報告している。
【００２３】
カロテノイドβ-イオネン環式化合物をアスタキサンチンへと変換する2つの異なる遺伝子が緑藻ヘマトコッカス・プルヴィアィスから単離された。クローニングしたcDNAはβ-イオネン環メチレン基をβ-イオネン環ケト基へと変換する異なるβ-カロテンケトラーゼ酵素をコードする（よって、「ケトラーゼ」として作用する）ことが示された。
【００２４】
その単離を報告する最初のグループによってbktと名づけられた1つの遺伝子産物は、宿主微生物または植物からの(3S, 3'S)-アスタキサンチンの生産に関しβ-C-4-オキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする[Kajiwara ら, Plant Molecular Biology, 29:343-352頁 (1995); およびKajiwara ら 米国特許第5,910,433号を参照。]。もう1つのアスタキサンチン生成遺伝子およびその翻訳産物は、アスタキサンチンを合成する酵素をコードする遺伝子を単離した研究者によりcrtOと分類されている[Harker ら, FEBS Letters, 404:129-134頁 (1997) およびLotan ら, FEBS Letters, 364:125-128頁 (1995); ならびにHirschberg ら 米国特許第5,965,795号を参照。]。HirschbergのグループのcrtO cDNAはKajiwaraのグループのbkt遺伝子と約75〜76%の配列同一性を有していた。crtO遺伝子のタンパク質産物はbkt遺伝子によりコードされているものの約78%の配列同一性を有していた。Lotan らの研究論文では、大腸菌(E. coli)で発現されるゼアキサンチンをH. プルヴィアィスのcrtO遺伝子産物で形質転換するという試みにおける芳しくない結果が報告されている。
【００２５】
ゼアキサンチンまたはβ-カロテンなどのカロテノイドβ-イオネン環式化合物からアスタキサンチンを生成させうる酵素をコードする遺伝子はまた、海洋細菌 アグロバクテリウム・アウランチアキュムおよびAlcaligenes PC-1で見出されている。crtWと呼ばれるこれらの遺伝子およびそれらの酵素産物は互いに約75%の同一性を示し、また、H. プルヴィアィスのbkt遺伝子産物に対しては約37%の相同性を示す。3つのβ-カロテンケトラーゼは4つの高度に保存された領域を有している[Kajiwara ら, Plant Mol. Biol., 29:343-352頁 (1995); さらに、Misawa ら 米国特許第5,811,273号および同第5,972,690号も参照。]。
【００２６】
本明細書において「ヒドロキシラーゼ」とは、ヒドロキシル基をカロテノイドβ-イオネン環の3位の炭素原子に付加して、カロテノイド生合成経路の後半段階でゼアキサンチンまたは別のヒドロキシル化された中間体を生成させる遺伝子またはコードされた酵素を指す。さらに具体的にいえば、意図されるヒドロキシラーゼ（またはβ-カロテンヒドロキシラーゼ）は、β-カロテンまたは4-ケト-β-カロテンをβ環の3位にてヒドロキシル化されている1種以上の化合物へと変換する酵素である。
【００２７】
カロテノイドβ-イオネン環を3-ヒドロキシ-β-イオネン環へと変換するヒドロキシラーゼ酵素をコードする種々の起源が同定されている。エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）のcrtZ 遺伝子はこういったものの1つであるヒドロキシラーゼをコードする [Kajiwara ら., Plant Mol. Biol., 29:343-352頁 (1995)を参照。]。好適なヒドロキシラーゼはエルウィニア・ヘルビコラのcrtZ 遺伝子によってもコードされている[Ausich ら, 米国特許第5,684,238号 (1997)を参照。]。
【００２８】
カロテノイド生合成遺伝子クラスターがアスタキサンチン産生細菌、アグロバクテリウム・アウランチアキュムで同定されている。そのクラスターのcrtZ 遺伝子はβ-カロテンヒドロキシラーゼをコードすることが確認されている[Misawa ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。Misawa らの開示では、A. アウランチアキュム crtZ遺伝子を、オールトランス型β-カロテンを蓄積する大腸菌形質転換体に導入した。このように作製した形質転換体はゼアキサンチンを産生した。
【００２９】
試験データからはアスタキサンチンの最終的な生成は示されず、これらのデータによりアグロバクテリウム・アウランチアキュム crtZ 遺伝子がヒドロキシラーゼをコードすることは立証されなかった。A. アウランチアキュムがアスタキサンチン産生株であることから、二機能であることが立証されたヒドロキシラーゼがカンタキサンチンをアスタキサンチンへと変換すると推測される。少なくとも、このヒドロキシラーゼはβ-カロテンをゼアキサンチン、β-カロテンからアスタキサンチンへのカロテノイド生合成経路における中間体へと変換する。
【００３０】
さらに、A. アウランチアキュムのcrtZ遺伝子に対して約90%の同一性を有するcrtZ遺伝子がアルカリゲネス属の株PC-1で同定されている。crtZ はA. アウランチアキュムおよびエルウィニア属(Erwinia)ファミリーにおいてヒドロキシラーゼとしての役割がある[Misawa, " J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。
【００３１】
アスタキサンチンの生産に関するカロテノイド生合成遺伝子クラスターがA. アウランチアキュムから単離されている。このクラスターで見られた同じ位置づけにある5つのカロテン生成遺伝子を各々、crtW、crtZ、crtY、crtI、およびcrtBと名づけられている。各crt遺伝子の終止コドンはcrtBを除き、次のcrt 遺伝子の開始コドンとオーバーラップされている[Misawa, " J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。ケトラーゼ、ヒドロキシラーゼおよびリコペンシクラーゼ酵素をコードするcrtW、crtZおよびcrtY 遺伝子に関するA. アウランチアキュムおよびアルカリゲネス属株PC-1のDNA配列は、米国特許第5,811,273号および同第5,972,690号で開示されている。
【００３２】
カロテノイド生合成経路に関する酵素をコードする遺伝子クラスターはまた、紅色光合成細菌ロードバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）からもクローニングされた[Armstrong ら, Mol. Gen. Genet., 216:254-268頁 (1989)を参照。]。
【００３３】
ファルネシルピロリン酸およびゲラニルピロリン酸などの遍在前駆体からのカロテノイド生合成に関する類似クラスターは非光合成細菌エルウィニア・ヘルビコラからクローニングされている。E. ヘルビコラから同定された遺伝子クラスターのメンバーとしては、GGPPシンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ(4H)、リコペンシクラーゼ、およびβ-カロテンヒドロキシラーゼをコードするとされる遺伝子が挙げられる[Ausich ら 米国特許第5,684,238号; Sandmann ら, FEMS Microbiol. Lett., 71:77-82頁 (1990); Hundle ら, Photochem. Photobiol., 54:89-93頁 (1991); およびSchnurr ら, FEMS Microbiol. Lett. 78:157-162頁(1991)を参照。]。
【００３４】
さらにもう1つのカロテノイド生合成遺伝子クラスターがエルウィニア・ウレドボラからクローニングされている。E. ウレドボラでは、これらの遺伝子はcrtE、crtB、crtI、およびcrtZであることが確認されている[Misawa ら 米国特許第5,429,939号; およびMisawa ら, J. Bacteriol., 172:6704-6712頁 (1990)を参照。]。
【００３５】
エルウィニア属およびロードバクター（Rhodobacter）種では、crtEはGGPPシンターゼをコードする。しかしながら、CrtEはA. アウランチアキュムには存在しない。上記の遺伝子クラスターでコードされる酵素の最初の基質は種間で異なるが、存在するカロテノイド前駆体からのアスタキサンチンの生産で重要な役割を果たすことが示された後半のcrt遺伝子である。海洋性アグロバクテリア(Agrobacteria)でアスタキサンチンが生産されることより、多様な種で確認されるようなcrtWおよびcrtZ 遺伝子産物がβ-カロテンのケトカロテノイド中間体を経たアスタキサンチンへの変換に主として関与することが示される[Misawa ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照。]。
【００３６】
Fraser ら, Eur. J. Biochem., 252:229-236頁 (1998)で報告された研究では、in vitro 環境で調査した場合にはβ-カロテンがA. アウランチアキュム ケトラーゼに対するゼアキサンチンおよび他の可能性ある酸素付加β-カロテン誘導体と比べて好ましい基質であることを示している。これらの著者はまた、A. アウランチアキュムヒドロキシラーゼ酵素による一方の環にヒドロキシル基と、もう一方（3-ヒドロキシエキネノン）にケト基を含有する化合物の選好がβ-カロテンまたは他の酸素付加β-カロテン誘導体と比べてもあまりはっきりしないことを報告している。in vitroで観察された基質選好がin vivoでA. アウランチアキュムまたはこれらの酵素に関する遺伝子で形質転換した植物に適用されるかどうかは不明であり、予測不可能である。また、他の生物によりコードされている酵素が高等植物の細胞への形質転換後にA. アウランチアキュムのものと同様にin vitroまたはin vivoで機能を果たすかどうかも不明であり、予測不可能である。
【００３７】
多くの植物では、リコペンがカロテノイド生合成の分岐点である。それゆえ、植物のリコペンの一部はβ-カロテンおよびゼアキサンチン、時に、ゼアキサンチンジグルコシドへと合成され、リコペンの残りの部分から別のヒドロキシル化化合物であるα-カロテンおよびルテイン(3,3’-ジヒドロキシ-α-カロテン)が合成される。
【００３８】
高等植物、すなわち、被子植物のカロテノイドは色素体、すなわち、葉緑体および有色体で見られる。色素体は、一重膜でなく二重膜で囲まれているという点で小胞とは異なる細胞内貯蔵体である。また、葉緑体などの色素体はそれら独自のDNAおよびリボソームを含み、独立に再分化し、それら独自のタンパク質の一部を合成することができる。このように、色素体はミトコンドリアのいくつかの特徴を共有している。
【００３９】
葉では、カロテノイドは通常、光防護機能を有する葉緑体のグラナに存在している。β-カロテンおよびルテインが主要なカロテノイドであり、少量のエポキシ化カロテノイド、ビオラキサンチンおよびネオキサンチンが同時に存在している。カロテノイドは、通常、クロロフィルが消失している発達中の花弁有色体に蓄積する。花弁などの場合、カロテノイドは、葉緑体から発達する果実有色体に現れる。
【００４０】
β-カロテン生産の典型的な生合成経路では、酵素が主要なイソプレノイド経路のゲラニルゲラニルピロリン酸をフィトエンおよびリコペンを経由してβ-カロテンへと変換する。ゼアキサンチン、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンはβ-カロテンから生ずるキサントフィル類に含まれる。フィトエンのカロテンおよびキサントフィルへの変換に関与する多くの酵素は、可溶化により失活する不安定な膜関連タンパク質である[Breyer ら, Eur. J. Biochem., 153:341-346頁 (1985)を参照; また、Hirschberg ら 米国特許第5,965,795号 (1999)も参照。]。
【００４１】
現在のところ、商業用有色カロテノイドの生産に広く用いられているのはほんの数種類の植物だけである。しかしながら、これらの植物のほとんどの有色カロテノイド合成の生産性は比較的低く、結果として、カロテノイドの生産には費用がかかる。さらに、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンはそのように生産されるカロテノイドではない。
【００４２】
Hirschberg ら 米国特許第5,965,795号では、アスタキサンチンがトランスジェニックタバコ植物の蜜腺で産生しうることを教示している。これらのトランスジェニック植物は、crtOと命名されたH. プルヴィアィス由来のケトラーゼをコードする遺伝子と、プロモーターとしての、また、リーダー配列をコードするトマト由来のPds遺伝子をともに含むベクターを用いたタバコ植物のアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Argobacterium tumifaciens)に媒介される形質転換により作製された。Pds遺伝子は転写および植物の葉緑体および／または有色体含有組織における発現を誘導するワーカーと考えられた。
【００４３】
その 形質転換の結果から、蜜腺でアスタキサンチンをはじめとする5種類のケトン含有カロテノイドが生成することが示されている。これらの結果から、形質転換植物の花に見られる約75%のカロテノイドがケト基を含有していることが分かった。しかしながら、花に存在する最初のカロテノイド量についても、実際に産生したカロテノイド総量についても、花の花弁または生殖器官でのカロテノイド産生量についても検証されていない。
【００４４】
マンジュギク(Tagetes)属はキク科（Compositae、あるいはAsteraceaeとしても知られる）植物のメンバーであり、30数種類の強く香る一年生または多年生草本を含む。マンジュギク属はアリゾナ州およびニューメキシコ州からアルゼンチンにかけて自生する [Hortus Third A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States and Canada, MacMillan Publishing Company, New York (1976)を参照。]。栽培用の属としては、一般にセンジュギクと呼ばれるタゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）、一般にコウオウソウと呼ばれるTagetes patula、一般に三倍体マリーゴールドと呼ばれるタゲテス・エレクタ x パチュラ（patula）、およびタゲテス・シグネータ（Tagetes signata）またはホソバクジャクソウとしても知られるタゲテス・テヌイフォリア（Tagetes tenuifolia）が挙げられる。
【００４５】
マリーゴールド花序は、小筒花としても知られる数百の無柄またはほとんど無柄の小さな花が密集してなる単頭(solitary head)である。マリーゴールドは、中央に筒形の筒状花、その周りに舌状またはストラップ形の舌状花を有する放射相称の頭状花序である。ある種のマリーゴールド頭状花序では、中心花の大部分が周辺花に変わり、中心花があるとしてもわずかである。このような頭状花序を八重という。
【００４６】
頭状花序を花とも呼ぶ一般の人は、周辺花または小筒花を花弁と呼んでいることが多い。理解しやすくするために、マリーゴールド頭状花序を本明細書においては花または頭状花序と記載し、頭状花序の構成花または小筒花、雄蘂、および雌蕊を花弁と記載する。
【００４７】
栽培されるマリーゴールドは目にも鮮かな花を有し、観賞用にも有用である。さらに、この種は天然色素、精油、およびチオフェンの供給源として知られている。いわゆるキサントフィルマリーゴールドから得られた乾燥マリーゴールド花弁およびマリーゴールド花弁濃縮物は、養鶏業において卵黄およびブロイラーの皮膚の黄色を強めるために飼料添加物として用いられる[Piccalia ら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51頁 (1998)を参照。]。家禽はde novoでカロテノイドを合成する能力がないため、家禽の組織に望まれるカロテノイドは食餌濃度の関数となる[Balnave ら, Asian-Australiasian J. Animal Sci., 9(5): 515-517頁 (1996)を参照。]。
【００４８】
マリーゴールド花弁ミールの着色能力は、キサントフィルとして知られるカロテノイド成分、主としてルテインエステルによるところが大きい[Piccalia ら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51頁 (1998)を参照。]。マリーゴールド花弁にも見られるキサントフィルゼアキサンチンが、大変喜ばれる黄色〜黄橙色を発色するブロイラー着色剤として有効であることは公知である[Marusich ら, Poultry Sci., 55:1486-1494頁 (1976)を参照。]。キサントフィルのうち、色素ルテインおよびゼアキサンチンは市販されているハイブリッドで最も豊富に存在する。ルテインおよびゼアキサンチンの構造式を以下に示す。
【化３】
2005532791.tif 000004
【００４９】
ルテインおよびゼアキサンチンの各末端環構造が1つのヒドロキシル基を含有するため、各分子が2つのヒドロキシル基を含有する。ルテインはα-カロテンの2つの独立したヒドロキシル化により生物学的に産生すると考えられる。また、ゼアキサンチンはβ-カロテンの2つの独立したヒドロキシル化により生物学的に産生すると考えられる。α-カロテンおよびβ-カロテンの両方については、リコペンの環化により生成したδ-カロテンおよびγ-カロテン各々において好適なシクラーゼ酵素が作用することにより生成すると理解されている。リコペン、δ-カロテン、γ-カロテン、α-カロテンおよびβ-カロテンは各々、炭化水素カロテノイドであり、それらの40個の炭素からなる前駆体はカロテン類と呼ばれる。ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンおよびビオラキサンチンなどの酸素付加カロテノイドはキサントフィル類と呼ばれる。
【００５０】
図1は、ルテインおよびゼアキサンチンの産生に関する生物学的合成経路の略図およびその経路での最初のC40カロテノイド、フィトエンからのさらに進んだ生成物を示している。ルテインおよびゼアキサンチンはマリーゴールド花弁に、大部分が脂肪酸のモノおよびジエステルとして存在している。図1はまた、ゼアキサンチンから、ビオラキサンチンをアブシジン酸合成経路における中間体として生じうるエポキシドを含有するさらに進んだ生成物についても示す。
【００５１】
カロテノイドは多種多様な高等植物の貯蔵器官および花弁に見られる。例えば、マリーゴールド花弁は、主要なキサントフィルカロテノイドとして大量のエステル化ルテイン（約75〜90%を超える）を少量のエステル化ゼアキサンチンとともに蓄積する。マリーゴールド花弁はルテインおよびゼアキサンチンの他にも、通常、β-カロテンおよびエポキシ化キサントフィルの少量の蓄積を示すが、天然マリーゴールドまたはそれらのハイブリッドには4-ケト-β-イオネン環形成酵素が存在しないため、カンタキサンチンまたはアスタキサンチンを生成または蓄積しない。
【００５２】
キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドといくつかの特徴において違いがある。第一に、キサントフィルマリーゴールドはカロテノイドの抽出可能な供給源として用いられており、観賞用マリーゴールドとは異なる植物の習性を有している。観賞用マリーゴールドは通常、地上約45〜約60cmにしか生長しないが、キサントフィルマリーゴールドは地上約65〜約70cmまで生長する。キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドよりも株立ち性の強い生育をし、条植え作物として栽培できるが、観賞用マリーゴールドは通常できない。キサントフィルマリーゴールドの色は通常、暗橙色であるが、観賞用のものの色は白、黄、または橙色である場合もあるし、または混合色である場合もあり、キサントフィルマリーゴールドではあまり豊富にないアントシアニン色素による赤褐色もある。
【００５３】
生合成の生産能力を高める1つの方法が組換えDNA技術の適用である。これを受けて、一般には有色カロテノイドを生産すること、およびβ-カロテンからカンタキサンチンまたはアスタキサンチン、またはその両方へのカロテノイド生合成の決定に関する最近の進展から、カロテノイド、とりわけ、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの生産を制御することが望まれる。こういったタイプの生産では最も好適で効率の良い産生生物の特性、量および選択の制御が可能である。後者のことは商業生産経済学、それゆえ、消費者の入手可能性に関して、特に重要である。
【００５４】
マリーゴールドまたは他の植物を１以上の好適なヒドロキシラーゼ遺伝子および好適なケトラーゼ遺伝子で形質転換して、得られた形質転換体の花よりアスタキサンチンが生成されるように、その花が大量のβ-カロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、または他のアスタキサンチン前駆体と、少量のルテインを産生するか、またはルテインはまったく産生しないこのような植物が入手できるならば有利である。以下に述べる本発明は、いくつかの実施形態において、このような形質転換植物、特に形質転換マリーゴールド植物に関する。
【発明の概要】
【００５５】
本発明は、花、特に、少なくとも花の花冠および生殖器官、例えば、形質転換高等植物の花弁でのカンタキサンチンおよびアスタキサンチンなどの4-ケト-β-イオネン化合物の生成に関する。花弁優先的なプロモーターなどのプロモーターにより制御される１以上の遺伝子を高等植物に挿入する（これにより形質転換する）。挿入された遺伝子は、(b)色素体を標的とするトランジットペプチドに機能しうる形で連結された、ケトラーゼ、ヒドロキシラーゼまたはその両方の酵素である(a)カロテノイド生成酵素を含むキメラ酵素をコードする。このような必要最小限に形質転換される植物の花弁は形質転換前に少なくともβ-カロテンまたはゼアキサンチンを産生し、好ましくは、蓄積する。
【００５６】
アスタキサンチンは、通常β-カロテンの2つのβ環各々の二重ヒドロキシル化および二重ケト化により生成するが、カンタキサンチンはβ-カロテンの2つのβ環各々の二重ケト化により生成すると考えられている。高等植物にはそれらの花弁でβ-カロテンまたは他のアスタキサンチン前駆体を産生し、蓄積するものがあり、それらをβ環ケト化酵素およびβ環ヒドロキシル化酵素をコードする遺伝子の一方または両方で形質転換することができる。他の高等植物では花弁に含まれるβ-カロテンまたは他の好適なカロテノイド前駆体の量では不十分であるため、ゲラニルピロリン酸およびファルネシルピロリン酸などの遍在前駆体をはじめとする存在する前駆体からのアスタキサンチン生産に必要な酵素をコードする１以上のさらなる遺伝子で形質転換される。
【００５７】
本発明により意図される1つの態様は、その花および少なくとも花冠または他の花の生殖器官が、4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物、好ましくは、それ自体が各々、4-ケト基を含有する2つのβ-イオネン環を有するカロテノイド化合物を産生し、好ましくは、 蓄積する形質転換高等植物（トランスジェニック植物）またはその再分化可能な部分である。そのトランスジェニック植物は、(a)キメラケトラーゼ酵素をコードし、かつ、(b)そのキメラ酵素の発現を制御するプロモーターを含む異種ゲノムDNAセグメント（トランスジーン）を含んでいる。キメラケトラーゼ酵素は、(i)色素体トランジットペプチド部分を含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分とからなる。プロモーターと色素体トランジットペプチドは、好ましくは、異なる種由来である。意図された植物でトランスジーンが発現することで、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、アドニルブイン(adonirubuin)、アドニキサンチン、およびアスタキサンチンなどの4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物が花弁に蓄積する。1つの実施形態での好ましい実施において、これらのカロテノイド化合物はそれらのβ-イオネン環に3-ヒドロキシル基も含有している。
【００５８】
意図される植物は、1つの実施形態では、トランスジェニック植物のF1ハイブリッドもしくは後世代ハイブリッド、またはトランスジェニック植物の自殖後代である。1つの好ましい実施形態では、植物がF1ハイブリッドである。本実施形態の1つの態様では、ハイブリッドの両方の親がトランスジェニックであるが、本実施形態の別の態様では、一方の親がトランスジェニックであり、もう一方の親がトランスジェニックではない。一方または両方の親植物が、１以上のカロテノイド色素の発現異常、すなわち、通常、植物には単離できる量で存在しないカロテノイド色素の発現、または通常見つかる、異常に多量に存在する１以上のカロテノイド色素の発現を示す突然変異植物であってよい。
【００５９】
マリーゴールドは、通常、β-カロテンおよびゼアキサンチンなどのβ-イオネン環を有するカロテノイド色素を産生することから、こういった植物が形質転換に向けての1つの好ましい宿主植物である。特に好ましい非形質転換変異体マリーゴールド宿主植物は、その花弁でキサントフィルを約4〜約20mg/g生重量にて産生し、約1:10を超える、好ましくは、約2:10を超えるゼアキサンチン比を示す突然変異体である。その比が1に近づくように、より好ましくは、キサントフィルの少なくとも 約70%、最も好ましくは、少なくとも約90%がゼアキサンチンである。別の非形質転換変異体マリーゴールド宿主は、約1:10を超える、好ましくは、約2:10を超えるβ-カロテン比を示す。
【００６０】
形質転換植物の花粉および胚珠は別々に考えられる。意図されるこのような形質転換植物の再分化可能な部分としては、胚、子葉、胚軸、分裂組織、花粉、葉、葯、根、根端、および花、またはプロトプラストもしくはそれらから誘導したカルスからなる群から選択される細胞が挙げられる。
【００６１】
さらなる実施形態は、好適な環境へ植え付け、成熟させることにより、その花弁および生殖器官がエキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、アドニルブイン、アドニキサンチン、およびアスタキサンチンなどの１以上の4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド色素を蓄積する（なお、非トランスジェニックの同種の植物の花弁このような色素を蓄積しない）トランスジェニックマリーゴールドなどのトランスジェニック植物を生み出す種子を意図する。
【００６２】
本発明により意図されるトランスジェニック植物は、好ましくは、少なくとも花弁にカロテノイド4-ケト-β-イオネン環式化合物を蓄積し、雄蘂および雌蕊などの花の生殖器官、ならびにそれ以外花の器官にもこのような化合物を蓄積することがある。しかし、意図されるトランスジェニック植物は、カロテノイド4-ケト-β-イオネン環式化合物を、存在する場合、萼片または蜜腺には蓄積しないことが好ましい。カロテノイド4-ケト-β-イオネン環式化合物がカンタキサンチン、アドニルブインおよびアスタキサンチンなどのカロテノイド4,4’-ジケトβ-イオネン環式化合物、特に、アスタキサンチンまたはカンタキサンチンであることがさらに好ましい。β-カロテンまたはゼアキサンチンが非形質転換宿主植物の花で生成されるβ-イオネン環式化合物であり、かつ、アスタキサンチンが形質転換植物（形質転換体）の花に蓄積される4,4’-ジケト-β-イオネン環式化合物であることが最も好ましい。また、他の実施形態では、カンタキサンチンが形質転換植物（形質転換体）の花に蓄積される4,4’-ジケト-β-イオネン環式化合物であることが特に好ましい。
【００６３】
カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの一方または両方を含む花弁などの花の器官もまた意図される。花の器官は、通常、細分化された形態で存在している。実施形態のさらなる態様は１以上のエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、アドニルブイン、アドニキサンチン、およびアスタキサンチンを含むトランスジェニックマリーゴールドの花弁である。トランスジェニックマリーゴールドの花弁は、好ましくは、細分化された形態で存在している。
【００６４】
カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの脂肪酸エステルの一方または両方からなる植物の含油樹脂 もまた意図される。補助食品としての使用に好適な組成物もまた意図される。補助食品は食用媒質に溶解しているか、または、分散しているカンタキサンチンおよびアスタキサンチンの脂肪酸エステルの一方または両方を含んでなる。また、含油樹脂加水分解（鹸化）物は、エステル化ヒドロキシル基を含有していないカロテノイド4-ケト-β-イオネン環式化合物を含む補助食品または栄養補助食品に用いることもできる。
【００６５】
本発明により意図されるもう1つの態様は、精製および単離されたDNAセグメントに関する。DNAセグメントは、それ自体が (i)色素体トランジットペプチド部分を含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ 酵素である第2部分とを含むキメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードする。そのDNAは、(iii)キメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードする配列に機能しうる形で連結された、発現を誘導する、好ましくは、花弁優先的な発現を誘導するプロモーターを含む。このDNAにより 高等植物を形質転換することで、カロテノイドβ-イオネン環のカロテノイド4-ケト-β-イオネン環への変換を触媒する酵素の発現が花の器官で起こり、その結果として、形質転換されたβ-イオネン環含有カロテノイド化合物産生植物で4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド化合物が蓄積される。4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド化合物の例としては、エキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、カンタキサンチン、アドニルブイン、アドニキサンチン、およびアスタキサンチンが挙げられる。
【００６６】
本発明のさらにもう1つの実施形態は、その花の器官、例えば、花冠または他の花の生殖器官により3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環を有するカロテノイド化合物が生成されるトランスジェニック植物を意図する。そのトランスジェニック植物は、キメラケトラーゼ酵素ポリペプチドをコードするゲノム第1トランスジーン（上記の通り）と、さらに、(a)キメラヒドロキシラーゼ酵素ポリペプチドをコードし、また、(b)キメラヒドロキシラーゼ酵素の、好ましくは、花弁優先的な、発現を誘導するプロモーターを含むゲノム第2トランスジーンを含んでいる。その第2の、コードされるキメラヒドロキシラーゼ酵素ポリペプチドは、(i)N末端第1部分と、(ii)カロテノイドβ-イオネン環を3-ヒドロキシ-β-イオネン環へと変換するヒドロキシラーゼ酵素部分と融合されている色素体トランジットペプチドの第2部分とを含んでなる。また、プロモーターおよび色素体トランジットペプチドは、好ましくは、異なる種由来である。意図された植物でトランスジーンが発現することで、花優先的な3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物の蓄積が起こる。
【００６７】
本発明のこの態様により意図されるトランスジェニック植物は、花弁などの花の器官に3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物を蓄積し、また、雄蘂および雌蕊などの花の生殖器官にもこのような化合物を蓄積することがある。しかし、意図されるトランスジェニック植物は、カロテノイド3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環式化合物を、存在する場合、萼片または蜜腺には好ましくは蓄積しない。β-イオネン環に3-ヒドロキシ基および4-ケト基を有するカロテノイド化合物の例としては、アスタキサンチン、アドニキサンチン、アドニルブイン、3-ヒドロキシエキネノンおよび3'-ヒドロキシエキネノンが挙げられる。カロテノイド3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環式化合物がアスタキサンチンまたはアドニキサンチンなどのカロテノイド3, 3’-ジヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環式化合物であることが好ましい。
【００６８】
キメラポリペプチドのいずれかまたは両方に好ましい色素体トランジットペプチドはRUBISCOトランジットペプチドである。好ましいプロモーターは約1kbセグメントのClarkia breweriリナロールシンターゼ 1(LIS1)遺伝子5'上流域、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のユビキチン 3(UBQ3)プロモーターまたはユビキチン 11(UBQ11)プロモーターである。LIS1プロモーターは花弁優先的であるが、UBQ3およびUBQ11プロモーターは構成的である。
【００６９】
カロテノイドβ環を4-ケト-β環へと変換する好ましい ケトラーゼ酵素は、ヘマトコッカス・プルヴィアィスのbkt遺伝子によりコードされ、ヘマトコッカス・プルヴィアィスのcrtO遺伝子によりコードされるものであり、アグロバクテリウム・アウランチアキュムのcrtW遺伝子によりコードされる酵素またはアルカリゲネス種（Alcalignes sp.）PC-1のcrtW遺伝子によりコードされる酵素である。記載を容易にするために、遺伝子配列の起源に関係なく、ケトラーゼ遺伝子を以下、crtW遺伝子と記述する。
【００７０】
カロテノイド β-イオネン環をカロテノイド3-ヒドロキシ-β-イオネン環へと変換する好ましいヒドロキシラーゼ酵素は、エルウィニア・ウレドボラのcrtZ遺伝子によりコードされ、エルウィニア・ヘルビコラのcrtZ遺伝子によりコードされるものであり、アグロバクテリウム・アウランチアキュムのcrtZ遺伝子によりコードされる酵素またはアルカリゲネス種PC-1のcrtZ遺伝子によりコードされる酵素である。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態は、ケトラーゼ酵素をコードするゲノムDNA、前記のヒドロキシラーゼ酵素、および１以上のさらなるカロテノイド生成トランスジーンを含むトランスジェニック植物を意図する。さらなるトランスジーンとしては、各々、N末端色素体トランジットペプチド部分を含むキメラポリペプチドカロテノイド生成酵素を発現し、各遺伝子は、好ましくは、花弁優先的な発現を誘導するプロモーターに機能しうる形で連結される。さらなるカロテノイド生成トランスジーンは、(a)Misawa ら 米国特許第5,429,939号にて定義されるように、エルウィニア・ウレドボラのcrtE、crtB、crtI、crtY、およびcrtZ遺伝子、または(b)Ausich ら 米国特許第5,684,238号にて定義されるように、エルウィニア・ヘルビコラのGGPPシンターゼ、フィトエンシンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ(4H)、リコペンシクラーゼ、およびβ-カロテンヒドロキシラーゼ遺伝子を含む多くの起源から得られる。
【００７２】
よって、本発明は、アスタキサンチン生産におけるβ-カロテン、または他のカロテノイド前駆体化合物が宿主として選択される顕花植物（例えば、マリーゴールド）の花に存在する実施形態を意図する。本発明はまた、宿主植物の花がβ-カロテンまたは他のカロテノイド前駆体を欠いている（例えば、ビンカ）実施形態を意図する。後者のタイプの植物では、挿入されるDNAは、存在しない場合にカロテノイド前駆体（生物学的にβ-カロテンへと変換することができる化合物）およびケトラーゼ、ならびにヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を含む。
【００７３】
好ましい顕花植物としては、限定されるものではないが、ヒガンバナ科(アリウム属(Allium)、スイセン属(Narcissus)); キョウチクトウ科(カタランツス属(Catharanthus)); キク科(Asteraceae、あるいはCompositae)(アスター属(Aster)、キンセンカ属(Calendula)、エゾギク属(Callistephus)、キクニガナ属(Cichorium)、ハルシャギク属(Coreopsis)、ダリア属(Dahlia)、デンドランテマ属(Dendranthema)、ガザニア属(Gazania)、ガーベラ属(Gerbera)、ヒマワリ属(Helianthus)、ヘリクリサム属(Helichrysum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、オオハンゴンソウ属(Rudbeckia)、マンジュギク属(Tagetes)、ジニア属(Zinnia)); ツリフネソウ科(ホウセンカ属(Impatiens)); シュウカイドウ科(ベゴニア属(Begonia)); ナデシコ科(ナデシコ属(Dianthus)); アカザ科(フダンソウ属(Beta)、ホウレンソウ属(Spinacia)); ウリ科(スイカ属(Citrullus)、カボチャ属(Curcurbita)、キュウリ属(Cucumis)); アブラナ科(イワナズナ属(Alyssum)、アブラナ属(Brassica)、エリシマム属(Erysimum)、アラセイトウ属(Matthiola)、ダイコン属(Raphanus)); リンドウ科(Gentinaceaeトルコギキョウ属(Eustoma)); フウロソウ科(ペラルゴニウム属(Pelargonium)); イネ科(Graminaeあるいは、Poaceae)(カラスムギ属(Avena)、オオムギ属(Horedum、イネ属(Oryza)、キビ属(Panicum)、チカラシバ属(Pennisetum)、イチゴツナギ属(Poa)、サトウキビ属(Saccharum)、ライムギ属(Secale)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)、トウモロコシ属(Zea)); トウダイグサ科(ユーフォルビア属(Poinsettia)); シソ科(サルビア属(Salvia)); マメ科(ダイズ属(Glycine)、レンリソウ属(Lathyrus)、ウマゴヤシ属(Medicago)、インゲンマメ属(Phaseolus)、エンドウ属(Pisum)); ユリ科(ユリ属(Lilium)); ミゾカクシ科(ロベリア属(Lobelia)); アオイ科(オクラ属(Abelmoschus)、ワタ属(Gossypium)、ゼニアオイ属(Malva)); イソマツ科(リモニウム属(Limonium)); ハナシノブ科(フロクス属(Phlox)); サクラソウ科(シクラメン属(Cyclamen)); キンポウゲ科(トリカブト属(Aconitum)、アネモネ属(Anemone)、アクイレギア属(Aquilegia)、リュウキンカ属(Caltha)、デルフィニウム属(Delphinium)、キンポウゲ属(Ranunculus)); バラ科(バラ属(Rosa)); アカネ科(ペンタス属(Pentas)); ゴマノハグサ科(アンゲロニア属(Angelonia)、キンギョソウ属(Antirrhinum)、トレニア属(Torenia)); ナス科(トウガラシ属(Capsicum)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、ナス属(Solanum)); セリ科(オランダミツバ属(Apium)、ニンジン属(Daucus)、アメリカボウフウ属(Pastinaca)); クマツヅラ科(バーベナ属(Verbena)、ランタナ属(Lantana)); スミレ科(スミレ属(Viola))が挙げられる。
【００７４】
用語の定義
アミノ酸: 本明細書において記載する全てのアミノ酸残基は天然のL型である。標準ポリペプチド命名法、J. Biol. Chem., 243:3557-59頁 (1969)に従い、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示すとおりである:
2005532791.tif 000005
注意すべきは、全てのアミノ酸残基配列が本明細書では左から右への方向をアミノ末端からカルボキシ末端への慣例的な方向とする式で表されていることである。
【００７５】
カロテン: リコペン、α-カロテンおよびβ-カロテンなどの炭化水素カロテノイド色素。
【００７６】
発現: ポリペプチドを生み出すために構造遺伝子により受ける転写および翻訳をはじめとする細胞内プロセスの組合せ。
【００７７】
発現ベクター: ベクター内のそれらの遺伝子に機能しうる形で連結されたときに構造遺伝子の発現を調節する制御エレメントを形成するDNA配列。
【００７８】
花弁優先的なプロモーター: 機能しうる形で連結された遺伝子の過剰発現または産生を花弁において優先的に誘導するプロモーターを指す。
【００７９】
ハイブリダイゼーション: 「ハイブリダイゼーション」とは、相補的核酸鎖の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸鎖間の結合強度）は、核酸間の相補性の程度、塩濃度などの条件により影響を受ける関連条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm（融解温度）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの存在または不在）、ハイブリダイズした鎖のモル濃度および核酸鎖のG:C含量をはじめとする当技術分野では周知の多くの因子により影響を受ける。
【００８０】
ヒドロキシラーゼ: ヒドロキシル基をカロテノイドβ-イオネン環の3位の炭素原子に付加して、カロテノイド生合成経路の後半段階でゼアキサンチンまたは別のヒドロキシル化された中間体を生成させる遺伝子およびコードされた酵素を指す。とりわけ、「ヒドロキシラーゼ」（またはβ-カロテンヒドロキシラーゼ）は、β-カロテンまたは4-ケト-β-カロテンをβ-イオネン環の3位にてヒドロキシル化されている1種以上の化合物へと変換する酵素である。
【００８１】
カロテノイドβ-イオネン環を3-ヒドロキシ-β-イオネン環へと変換するヒドロキシラーゼ酵素部分をコードする異なる起源が同定された。エルウィニア・ウレドボラのcrtZ遺伝子はヒドロキシラーゼをコードし、同様に、エルウィニア・ヘルビコラのcrtZ遺伝子もコードする。（Misawa ら 米国特許第5,419,939号; およびAusich, ら 米国特許第5,684,238号を参照）。
【００８２】
組み込まれる:宿主染色体(ゲノム)に取り入れられた異種DNA配列が組み込まれる。
【００８３】
ケトラーゼ: ケトン（オキソ）基をカロテノイドβ-イオネン環の4位の炭素原子に付加して、カロテノイド生合成経路の後半段階で種々のケトカロテノイド化合物を生成させる遺伝子およびコードされた酵素（β-カロテンケトラーゼまたはβ-カロテンオキシゲナーゼ）を指す。カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素をコードする遺伝子、例えば、crtW遺伝子、bkt遺伝子およびcrtO遺伝子の供給源はいくつかある [Kajiwara ら, Plant Molecular Biology, 29:343-352頁, (1995); Misawa ら 米国特許第5,811,273号および同第5,972,690号; Kajiwara ら 米国特許第5,910,433号; Harker ら, FEBS Letters, 404:129-134頁 (1997); Lotan ら, FEBS Letters, 364:125-128頁 (1995); ならびにHirschberg ら 米国特許第5,965,795号を参照。] 。
【００８４】
ヘマトコッカス・プルヴィアィスから単離された2つのcDNA分子は別々に、カロテノイドβ環のメチレン基をケト基へと変換する（このように「ケトラーゼ」として作用する）β-カロテンケトラーゼ（β-カロテンオキシゲナーゼ）酵素をコードすることが分かった。一方の遺伝子および遺伝子産物はbktと名づけられた[Kajiwara ら. 米国特許第5,910,433号; およびKajiwara ら, Plant Mol. Biol., 29:343-352頁 (1995)を参照.]もう一方の遺伝子はβ-カロテン4-オキシゲナーゼのcrtOと名づけられた[Hirschberg ら 米国特許第5,965,795号; Harker ら, FEBS Letters, 404:129-134頁 (1997) およびLotan ら, FEBS Letters, 364:125-128頁 (1995)を参照。]。
【００８５】
bktに相当する遺伝子は海洋細菌アグロバクテリウム・アウランチアキュムおよびAlcaligenes PC-1で見出されている。これらの遺伝子および推定遺伝子はcrtWと呼ばれ、H. プルヴィアィスのbkt遺伝子産物と約37%の同一性を有している[Misawa ら 米国特許第5,972,690号を参照。]。
【００８６】
核酸ハイブリダイゼーション: 他にも変数はあるが、配列同一性（相同性）、配列のG+C含量、バッファー塩含量、配列長および二本鎖融解温度(Tm)の関数。[Maniatis ら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982), 388頁を参照。] 高いストリンジェンシー条件では、例えば、4X〜6X SSC（1X SSC = 0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）を含有する水溶液中での高温ハイブリダイゼーション（例えば、65℃〜70℃）または50%ホルムアミド中40〜45℃、を低塩濃度の溶液（例えば、0.1X SSC）中、高温（例えば、Tmより低い5℃〜25℃）での洗浄と組み合わせて用いる。中程度のストリンジェンシー条件では、通常、0.2〜0.3M NaCl中、約50℃〜約65℃の温度でのハイブリダイゼーション、および0.2X SSC、0.1%SDS中、約50℃〜約55℃での洗浄を用いる。低いストリンジェンシー条件では、より低いハイブリダイゼーション温度（例えば、20%〜50%ホルムアミド中、35℃〜45℃）、をより高い塩濃度の洗浄液（例えば、2X〜6X SSC）中、低い中間温度（例えば、40〜55℃）にて行われる洗浄と合せて用いることができる。開示されるポリヌクレオチド分子を本発明のヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードするクローンを同定するためのプローブとして組み合わせて使用するには中程度のストリンジェンシー条件が好ましい[Ausich, ら 米国特許第5,684,238号を参照。]。
【００８７】
機能しうる形で連結される、または挿入される: プロモーターDNA配列が構造遺伝子DNA配列の転写または翻訳に影響を及ぼすように、両者が正確なリーディングフレーム内で共有結合し、配置される場合に、ベクターDNA配列が構造遺伝子DNA配列に機能しうる形で連結される。
【００８８】
プロモーター: 遺伝子に発現制御エレメントを提供するものであり、RNAポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のRNA合成（転写）を開始するDNA配列またはDNA配列群における認識部位。
【００８９】
組換えDNA分子: 天然では通常、一緒には見られない少なくとも2つのヌクレオチド配列を含んでなるハイブリッドDNA配列。
【００９０】
同種の植物: 本明細書において「同種の植物」とは、花弁カロテノイド蓄積の比較に関する比較の基礎として用いられる典型的な植物を記すために用いられる。「同種の植物」は同じ属および種の植物であり、好ましくは、比較される突然変異体および／または形質転換植物と同じ親（交配種）のものである。このような比較に用いられる植物は、一般に、本明細書にて例示に用いられるマリーゴールド”Scarletade”などの市販されているハイブリッドであり、特に断りのない限り、それ自体は１以上のカロテノイドの生産力を増強した突然変異体でも形質転換植物でもない。よって、以下より明らかなように、マリーゴールド”Scarletade”の花弁および葉から抽出されるカロテノイドは、突然変異を誘導または形質転換したT. erecta マリーゴールドから抽出されるものとの比較に用いられる。広範な同系交配の植物のように、交配種の姉妹細胞間の対立遺伝子の変化が小さい場合、姉妹細胞間の比較を利用してもよいし、またはいくつかの姉妹細胞から平均をとってもよい。また、クローンは突然変異または形質転換させた植物との比較に好ましい。
【００９１】
いくつかの比較では、示差的に突然変異を誘導または形質転換した植物を抽出カロテノイドに関して比較する場合には、突然変異を誘導または形質転換した植物自体がその対照となる典型的な植物である。このように、例えば、予め突然変異誘導した植物を形質転換したものから抽出されるカロテノイドは、突然変異誘導植物から抽出されるものと比較することができる。
【００９２】
ストリンジェンシー: 「ストリンジェンシー」とは、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および他の化合物の存在についての条件に関して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列を高頻度に有する核酸断片間でのみ核酸塩基対合が起こる。そのため、互いに完全には相補的でない核酸を一緒にハイブリダイズ、またはアニーリングすることが望まれる場合には大抵「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件が求められる。低いストリンジェンシー条件を構成するために数多くの等価な条件を使用できることは当技術分野では周知のことである。ハイブリダイゼーション条件の選択については、一般に当業者には明らかであり、通常、ハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションのタイプ（DNA-DNA、またはDNA-RNA）、および配列間の所望の類似レベルにより決定される[例えば、 Ausich ら, 米国特許第5,684,238号を参照。] 。
【００９３】
核酸二本鎖の安定性は、誤対合した塩基数が増えるとともに低下し、さらにハイブリッド二本鎖での誤対合の相対位置に応じて大なり小なり低下することが分かっている。よって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを利用することで、このような二本鎖の安定性を最大または最小にすることができる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションの温度の調整; ハイブリダイゼーションミックス中のホルムアミドなどのヘリックス不安定化剤の割合の調整; および洗浄液の温度および／または塩濃度の調整によって変えることができる。フィルターハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションの最終的なストリンジェンシーは、多くの場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄に用いられる塩濃度および／または温度によって決まる。一般に、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシー自体は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合を下げることにより低くすることができる。
【００９４】
高いストリンジェンシー条件では、例えば、4〜6X SSC（1X SSC = 0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）を含有する水溶液中での高温ハイブリダイゼーション（例えば、65℃〜68℃）または50%ホルムアミド中42℃、を低塩濃度の溶液（例えば、0.1X SSC）中、高温（例えば、Tmより低い5℃〜25℃）での洗浄と組み合わせて用いることができる。低いストリンジェンシー条件では、より低いハイブリダイゼーション温度（例えば、20〜50%ホルムアミド中、35℃〜42℃）、をより高い塩濃度の洗浄液（例えば、2〜6X SSC）中、中間温度（例えば、40〜60℃）にて行われる洗浄と合せて用いることができる。0.2〜0.3M NaCl中、50℃〜65℃の温度でのハイブリダイゼーション、および0.2X SSC、0.1%SDS中、50℃〜55℃での洗浄を用いることができる中程度のストリンジェンシー条件が、開示されるポリヌクレオチド分子をNDPKをコードするクローンを同定するためのプローブとして組み合わせて使用することができる。
【００９５】
構造遺伝子:ポリペプチドとして発現されるDNA配列; すなわち、アミノ酸残基配列。
【００９６】
Tm（融解温度）: 「Tm」とは、「融解温度」に関して用いられる。融解温度は二本鎖核酸分子集団の50%が一本鎖に解離した状態になる温度である。核酸のTmについての算出式は当技術分野では周知である。ハイブリッド核酸のTmは、多くの場合、1M塩中のハイブリダイゼーションアッセイから採用されている、PCRプライマーのTmの算出に一般に用いられる式: [(A + T数) x 2℃ + (G + C数) x 4℃]を用いて推定される。C.R. Newton ら PCR, 第2版, Springer-Verlag (New York: 1997), 24頁。この式は20ヌクレオチドより長いプライマーには不正確であることが判明している（同上）。当技術分野ではTmの算出に構造特性ならびに配列特性を考慮する他のより精巧な計算法が存在する。算出されたTmは推定値にすぎない; 一般的に、最適な温度は経験に基づいて決定される。
【００９７】
ベクター: 細胞での複製が可能であり、および／または付属セグメントの複製が起こるように、別のDNAセグメントがそれと機能しうる形で連結されうるDNA分子。プラスミドが典型的なベクターである。本明細書において、記号"::"はプラスミドまたは他のベクターの隣接するエレメント間、例えば、LIS1プロモーター、crtWカロテノイド酵素生成遺伝子およびnos終止配列間の融合物を示すのに用いられる。
【００９８】
キサントフィル: 一方または両方のイオネン環に存在するヒドロキシル基、ケト基またはエポキシ基などの酸素含有基を有するカロテノイド色素。
【発明の詳細な説明】
【００９９】
概説
多くの顕花植物（限定されるものではないが、好ましい顕花植物を含む）は、それらの花の器官、例えば、それらの花弁および／または生殖器官にカロテノイドまたはカロテノイド前駆体を含む。高等植物は、β-カロテンが存在しない場合でも、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンなどの4-ケト基を有するβ環を含有するカロテノイド化合物のバイオテクノロジー生産で宿主としての役割を果たしうる。
【０１００】
カロテノイドは、一度生成されると、生合成経路に沿って次ぎに生成されるカロテノイドの前駆体となる。カロテノイドが選択された経路でカロテノイドを次のカロテノイド分子へと変換させる好適な酵素とともに存在する場合、前駆体カロテノイド基質および好適な酵素が花の好適な器官に存在する限り、その変換は通常、経路の各ステップで起こる。
【０１０１】
先に生成した前駆体カロテノイドの蓄積は少ないか、または全くないのに対し、前駆体としての上記の生成物から、植物に生合成反応経路の後半で生成する１種以上のカロテノイドが蓄積する。前駆体カロテノイドの蓄積が比較的少ないことは、α-もしくはβ-カロテン、ルテインまたはゼアキサンチンが最終的に生成するカロテノイドである場合、果実などの成熟植物の器官に通常、前駆体リコペンがほとんどまたは全く見られないことにより特に明らかである。
【０１０２】
周知のように、意図される4,4’-ジケトカロテノイドなどの生物学的に産生する物質の相対量は、本明細書においては、前駆体カロテノイドの濃度、次のカロテノイドへの酵素変換の速度および生成したカロテノイドがそれ自身のさらなる反応を阻害する生成物フィードバック阻害の可能性といったいくつかの変数の影響を受ける。また、機能しないまたは十分には機能しない変換酵素を生成するために、後に一見生産可能であるカロテノイドが生成されないか、または比較的少量でしか生成されない植物もある。初期変換酵素ではなく、遅れて作用する人工的な阻害剤もカロテノイドの蓄積において1つの役割を果たしうる。
【０１０３】
本発明は、トランスジェニック植物、およびその植物、ならびにその植物から生成される生成物の利用プロセスを意図する。トランスジェニック可能な有用顕花植物としては、ヒガンバナ科(アリウム属、スイセン属); キョウチクトウ科(カタランツス属); キク科(アスター属、キンセンカ属、エゾギク属、キクニガナ属、ハルシャギク属、ダリア属、デンドランテマ属、ガザニア属、ガーベラ属、ヒマワリ属、ヘリクリサム属、アキノノゲシ属、オオハンゴンソウ属、マンジュギク属、ジニア属); ツリフネソウ科(ホウセンカ属); シュウカイドウ科(ベゴニア属); ナデシコ科(ナデシコ属); アカザ科(フダンソウ属、ホウレンソウ属); ウリ科(スイカ属、カボチャ属)、キュウリ属); アブラナ科(イワナズナ属、アブラナ属、エリシマム属、アラセイトウ属、ダイコン属); リンドウ科(Gentinaceae)、トルコギキョウ属); フウロソウ科(ペラルゴニウム属); イネ科(カラスムギ属、オオムギ属(Horedum)、イネ属、キビ属、チカラシバ属、イチゴツナギ属、サトウキビ属、ライムギ属、モロコシ属、コムギ属、トウモロコシ属); トウダイグサ科(ユーフォルビア属); シソ科(サルビア属); マメ科(ダイズ属、レンリソウ属、ウマゴヤシ属、インゲンマメ属、エンドウ属); ユリ科(ユリ属); ミゾカクシ科(ロベリア属); アオイ科(オクラ属、ワタ属、ゼニアオイ属); イソマツ科(リモニウム属); ハナシノブ科(フロクス属); サクラソウ科(シクラメン属); キンポウゲ科(トリカブト属、アネモネ属、アクイレギア属、リュウキンカ属、デルフィニウム属、キンポウゲ属); バラ科(バラ属); アカネ科(ペンタス属); ゴマノハグサ科(アンゲロニア属、キンギョソウ属、トレニア属); ナス科(トウガラシ属、トマト属、タバコ属、ペチュニア属、ナス属); セリ科(オランダミツバ属、ニンジン属、アメリカボウフウ属); クマツヅラ科(バーベナ属、ランタナ属); スミレ科(スミレ属)が挙げられる。上記の植物のうち、マンジュギク属の植物が好ましく、タゲテス・エレクタ（マリーゴールド）植物が特に好ましい。
【０１０４】
本発明により意図される1つの態様は、その花の器官、例えば、花冠または他の花の生殖器官がβ-イオネン環を有するカロテノイド化合物を産生し、好ましくは、蓄積する形質転換された高等植物（トランスジェニック植物）またはこのような植物の再分化可能な部分である。そのトランスジェニック植物は、(a)キメラケトラーゼ酵素をコードし、および(b)キメラ酵素の発現を誘導するプロモーターを含む異種ゲノムDNA配列（トランスジーン）を含む。コードされたキメラケトラーゼ酵素自体は、(i)色素体トランジットペプチド部分を含んでなるN末端第1部分と、(ii)これに融合した、カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分とからなる（すなわち、crtW 遺伝子によりコードされる酵素）。プロモーターと色素体トランジットペプチドは、好ましくは、異なる種由来である。意図された植物でトランスジーンが発現することで、4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物が花弁優先的に蓄積する。
【０１０５】
意図される植物は、花の器官でβ-イオネン環含有カロテノイド化合物を産生する。典型的なβ-イオネン環含有カロテノイド化合物としては、β-カロテン、ゼアキサンチン、β-クリプトキサンチン、アドニキサンチン、3-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、エキネノン、カンタキサンチン、およびアドニルブインが挙げられる。意図される花の器官としては、花弁（花冠）、雄蘂および雌蕊をはじめとする花の生殖器官が挙げられる。ゼアキサンチンの場合には、(3R,3'R)-ゼアキサンチンが産生することが好ましく、アスタキサンチンの場合には、(3S,3'S)-アスタキサンチンが産生する産物であることが好ましい。(3S,3'S)-アスタキサンチンはケトラーゼ酵素の基質としての(3R,3'R)-ゼアキサンチンの二重ケト化により産生する産物である。
【０１０６】
カロテノイドβ-イオネン環を4-ケト-β-イオネン環へと変換し、キメラ酵素の一部を形成する好ましい典型的な非高等植物ケトラーゼ酵素はこれまでに論じられたものであり、Kajiwara ら, Plant Molecular Biology, 29:343-352頁, (1995); Misawa ら 米国特許第5,811,273号および同第5,972,690号; Kajiwara ら 米国特許第5,910,433号; Harker ら, FEBS Letters, 404:129-134頁 (1997); Lotan ら, FEBS Letters, 364:125-128頁 (1995); およびHirschberg ら 米国特許第5,965,795号にて開示されている。
【０１０７】
その発現産物が本明細書にて用いられるさらなるケトラーゼ遺伝子を、遺伝子が単離された起源の生物の属/種（括弧に入れた名前はNCBIの新しい名称または別名であるが、正式に認められているものではない）により、以下に記載する。括弧で囲んで示した遺伝子名があるが、その遺伝子が報告されている引用は以下の通りである: アドニス・アエスチヴァリス(Adonis palaestina; ケトラーゼ 1) WO99/61652; アドニス・アエスチヴァリス(Adonis palaestina; ケトラーゼ 2) WO99/61652; アグロバクテリウム・アウランチアキュム(Paracoccus属 MBIC1143) Misawa ら (1995) J. Bacteriol. 177:6575-6584頁; アルカリゲネス属, Misawa ら (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 209:867-876頁; Bradyrhizobium属 ORS278, Hannibal ら (2000) J. Bacteriol. 182:3850-3853頁; Brevundimonas aurantiaca WO02/079395 A2; ヘマトコッカス・プルヴィアィス (crtW), Kajiwara ら (1995) Plant Mol. Biol. 29:343-352頁; ネンジュモ属 PCC 7120 (アナベーナ(Anabaena)属株 PCC 7120), Kaneko ら (2001) DNA Res. 8:205-213頁; Paracoccus marcusii, 米国特許第5,935,808号; Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous)(アスタキサンチンシンテターゼ), 米国特許第6,365,386号; ラン藻 PCC 6803, Kaneko ら (1995) DNA Res. 2:163-166頁およびFernandez-Gonzalez ら (1997) J. Biol. Chem. 272:9728-9733頁; ラン藻(Synechococcus sp.) WH 8102, GenBank ZP_00115639(機能未知タンパク質 Synwh1213); Thermosynechococcus elongatus BP-1 (crtZ), Nakamura ら (2002) DNA Res. 9:135-148頁; およびTrichodesmium erythraeum IMS101, GenBank ZP_00070906 (機能未知タンパク質 Tery0029)。それらの酵素をコードする好適なDNA配列もまた、それらの引用に記載されている。
【０１０８】
意図されるキメラのN末端部分はキメラのケトラーゼ部分とペプチド結合により融合されている色素体トランジットペプチドを含んでなる。トランジットペプチド部分のC末端がケトラーゼ酵素部分のN末端と融合されている。
【０１０９】
色素体トランジットペプチドは、実質的にはいずれの起源のものであってもよく、通常、約30〜約80アミノ酸残基を含む。典型的な有用ペプチドについては、von Heijne ら, Eur. J. Biochem., 180:535-545頁 (1989); およびClark ら, J. Biol. Chem., 264(29):17544-17550頁 (1989)にて開示されている。さらなる色素体特異的（葉緑体）トランジットペプチドについては、della-Cioppa ら, Plant Physiol., 84:965-968頁 (1987)にてより一般的に記述されている。
【０１１０】
典型的なトランジットペプチドとしては、ホウレンソウフェレドキシンレダクターゼ、Rieske型Fe-Sタンパク質、シレネ属(silene)フェレドキシン、エンドウ熱ショックタンパク質、Glnシンターゼ、およびアブラナ属アシルキャリアタンパク質トランジットペプチドが挙げられる。これらのトランジットペプチドおよび他のもののアミノ酸残基配列については、von Heijne ら、上記による公報により示されている。好ましい色素体トランジットペプチドは、タバコRUBISCO、ペチュニアEPSPシンターゼ、およびコショウPSY遺伝子トランジットペプチドのうちの1つである。
【０１１１】
Romer ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 196(3):1414-1421頁 (1993)により報告されているように、PSY遺伝子に隣接するコショウ属植物トランジットペプチド遺伝子を、上記のケトラーゼをコードする遺伝子の1つと融合するか、または機能しうる形で連結して、形質転換植物とは異種である意図されるキメラポリペプチドコンジュゲートを作出することができる。Shah ら, Science, 233:478-481頁 (1986)により開示されるように、EPSPシンターゼの72コドン(216bp)トランジットペプチドをコードするペチュニア(petunia hybrida)(MP4-G)トランジットペプチド遺伝子もまた用いることができる。
【０１１２】
特に好ましい色素体トランジットペプチドはMazur ら, Nucl. Acids Res., 13:2343-2386頁 (1985)により報告されたタバコ (Nicotiana tabacum)の改変型リブロース二リン酸カルボキシラーゼ-オキシゲナーゼ(RUBISCO; RBSC)シグナル（トランジット）ペプチドである。遺伝子の高頻度変異では、NcoI部位を5'末端に、また、切断するNarI部位を塩基73と74との間に導入する。どちらの改変もアミノ酸残基配列を変更しない。
【０１１３】
得られた色素体トランジットペプチド遺伝子は177塩基対(bp)を含む。この遺伝子は、好ましくは、上記のケトラーゼ遺伝子に連結される177bp Sal I-Sph I断片として利用される。このような連結反応により、そのC末端がケトラーゼ活性を示すポリペプチドのN末端に連結されているN末端トランジットペプチドを有する異種（キメラ）ポリペプチドをコードする遺伝子(約900〜約1200bp)が生み出される。Hauptmann ら 米国特許第5,618,988号に関連して寄託されたプラスミド pATC1616(ATCC 40806)は、RUBISCOトランジットペプチドをコードするSal I-Sph I 177bp DNAが組み込まれている。
【０１１４】
意図されるDNA配列（トランスジーン）は、意図されるキメラポリペプチドをコードするだけでなく、指定する花の器官でのキメラの発現を誘導または制御するプロモーターを含み、さらに、好ましくは、キメラをコードする配列に続く、すなわち、キメラをコードする配列の下流にあるか、またはその3'にある終止/ポリアデニル化配列を含む制御配列を含む。花の器官での優先的な発現または花弁または他の花の生殖器官などでの部位特異的な発現は、使用されるプロモーターにより制御される。このようなプロモーターを本明細書では花弁優先的な発現のプロモーターと呼ぶ。
【０１１５】
典型的な花弁優先的発現は、花弁でのみ強く作用する、いわゆるペチュニア・シャルコン（petunia chalcone）シンターゼ(CHS)遺伝子を用いて得ることができる(van der Meer ら, Plant Mol. Biol., 15:95-109頁, 1990)。さらなる目的のプロモーターとしては、Clarkia breweriリナロールシンターゼ 1(LIS1)遺伝子の5'上流域である約1キロベース(kb)セグメント[Cseke ら, Mol. Biol. Evol., 15(11):1491-1498頁 (1998)を参照]、APETALA 3に関するプロモーター[Hill ら, Development 125: 1711-1721頁 (1998)を参照]およびBrassica napus由来の花弁優先的な植物プロモーター(Institut National De La Recherche Agronomique INRA, Fr 2768746を参照)が挙げられる。さらに、外来遺伝子の転写に関する構成的プロモーターは、植物プロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV) 35S プロモーターおよびその誘導体、強化型35S("E35S")、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーターなどにより制御される [Gruber ら, "Vectors for Plant Transformation," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick ら編, CRC Press, 89-119頁 (1993); Odell ら, Nature 313:810頁 (1985); および Kay ら, Science 236:1299頁 (1987)を参照。]。シロイヌナズナ由来のポリユビキチン遺伝子プロモーター、UBQ3、UBQ10およびUBQ11は花弁での遺伝子発現を誘導するのに有用である [Norris ら, Plant Molecular Biology 21: 895-906頁 (1993)を参照。]。本明細書においてはLIS1またはUBQプロモーターが好ましい。
【０１１６】
LIS1プロモーターは花優先的であるが、UBQ3プロモーターは構成的である。いずれの場合においても、所望の4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物は花の器官に蓄積する。LIS1プロモーターの場合においては、花の器官に蓄積する理由は、プロモーターによる発現の場所にあると理解される。構成的UBQ31プロモーターの場合においては、酵素のカロテノイド基質が植物全体ではなく、花の器官に位置するために所望の4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物が花の器官に蓄積する。
【０１１７】
図1に示すように、所望の4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物、例えば、アスタキサンチンは、完成されたカロテノイド合成経路において数ステップ後に生成する生成物である。それらの必須ステップは、通常、意図される宿主植物の花の器官でのみ進行する。このように、その酵素が植物の他の場所で発現しても、必要な前駆体の基質および酵素が花以外の植物の器官には実質的には存在しないことから、4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物生成物を生成することはなく、4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物生成酵素が花の器官でのみ発現することは必要ではない。
【０１１８】
用いられるプロモーター配列各々は、細胞内のカロテノイド量により実質的に影響を受けていない。本明細書において「実質的に影響を受けていない」とは、プロモーターが形質転換細胞またはトランスジェニック植物に蓄積されたカロテノイドによる直接フィードバック制御（阻害）に応答しないことを意味する。
【０１１９】
終止／ポリアデニル化配列もまたよく知られている。本明細書において用いられる典型的な終止／ポリアデニル化配列としては、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするAgrobacterium Ti-DNA由来の3’終止配列、ならびにオクトパインシンターゼ(ocs)由来の3'配列、CaMV 35S RNA遺伝子、β-コングリシニン由来の終止配列、カルコンシンターゼ、およびRUBISCO小サブユニットが挙げられる[米国特許第5,618,988号; Fujiwara ら, Plant Mol. Biol., 20:1059頁 (1992); van den Meer ら, Plant Cell, 4:253頁 (1992); Tieman ら, Plant Cell, 4:667頁(1992); およびMazur ら, Nucleic Acids Res., 13(7):2373-2386頁 (1985)を参照。]。nos配列は1つの特に好ましい3’終止配列である。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態としては、マリーゴールド花弁発現を誘導するDNAセグメントに機能しうる形で連結されたキメラケトラーゼ酵素ポリペプチドコンジュゲートをコードするDNAが挙げられる。マリーゴールド花弁はβ-カロテンを産生し、ゼアキサンチンおよびルテインの天然源である。そのため、存在するβ-カロテンまたはゼアキサンチンの量がアスタキサンチンの有益な量を提供するのに十分であるならば、アスタキサンチンを生産するための優れた宿主を提供することができる。しかしながら、市販されているマリーゴールドは、たった約5〜約7%ゼアキサンチン、約90%以上のルテイン、そして、約1%未満のβ-カロテンを含有している。このような植物は花弁に存在するゼアキサンチンまたはβ-カロテンの量が比較的低いため、宿主としては不適当である。
【０１２１】
突然変異を誘導した種子の選択的交配を通じて、ルテインに対するゼアキサンチンの割合が正常な株よりも異常に高い（高められている）か、またはほとんど全てがゼアキサンチンである（ルテインがほとんど〜全くない）、または高濃度のβ-カロテンを有するマリーゴールドが生育した。それらを以下に例示する。ルテインと比べて高い割合でゼアキサンチンを有するこれらの突然変異体マリーゴールド植物は、カロテノイドβ-イオネン環ケトラーゼをコードするDNAを挿入するための1つの好ましい宿主植物である。カロテノイドβ-ケトラーゼをコードするDNAを挿入するための好ましい宿主植物である別のマリーゴールド突然変異体は、ルテインに対して異常に高いβ-カロテンの比を示す。
【０１２２】
ケトラーゼ遺伝子形質転換前の宿主突然変異体または形質転換マリーゴールド植物の例は、約1:10を超える、好ましくは、約2:10を超えるゼアキサンチン比を有するマリーゴールド花弁を有する。より好ましくは、ゼアキサンチンがキサントフィルの少なくとも約70%、最も好ましくは、少なくとも約90%である。このように、ゼアキサンチンは、同種の非突然変異体または非形質転換植物に存在するものと比べて約10倍〜約20倍高く、意図される花弁に存在する。かなりの量の遊離型ゼアキサンチンはいくつかの突然変異体マリーゴールド植物の花弁から単離されたが、ゼアキサンチンおよびルテインは、通常、脂肪酸エステルとして花弁に存在する。別の実施形態では、宿主突然変異体または形質転換マリーゴールド植物が少なくとも約1:10を超える、より好ましくは、約2:10を超える、最大約1(1)であるβ-カロテン比を示す。このように、β-カロテンは、同種の非突然変異体または非形質転換植物に存在するものと比べて約5〜約200倍高く存在する。さらなる実施形態では、ゼアキサンチンおよびβ-カロテンの一方または両方が、同種の非突然変異体または非形質転換植物に存在する量と比べた上記の一方または両方の程度に増強されている。
【０１２３】
意図される宿主植物の花弁は、多くの場合、形質転換前には測定可能な量のζ-カロテン、通常、少なくとも1%以上を含む。ζ-カロテンは通常、マリーゴールド花弁には見られず、それが存在することは１以上のカロテノイド色素の発現異常の一例である。
【０１２４】
「ゼアキサンチン比」とは、花弁に存在するゼアキサンチンとルテインとを合せた量で除したその花弁に存在するゼアキサンチン量[ゼアキサンチン/(ルテイン + ゼアキサンチン)]と定義される。マリーゴールド花弁の通常のゼアキサンチン比はおよそ約1:15〜約1:25であり、その結果、ゼアキサンチンおよびルテイン量だけを算出に用いると、ゼアキサンチンはルテインとゼアキサンチンとを合せた量の約5〜約7%である。本明細書において意図される花弁の好ましいゼアキサンチン比はさらに大きく、約1:10を超える、好ましくは、約2:10を超える〜最大約1(1)である。
【０１２５】
Quackenbush ら, J. Assoc. Off. Agri. Chem., 55:617-621頁 (1972)による論文では、アメリカ産で黄色の、T. erecta マリーゴールドの花弁の一群におけるゼアキサンチンとルテインの比が通常、約1:4.4と高く、それらの花弁にあるキサントフィルの総濃度が通常、約0.4mg/g乾燥重量と低いことを報告している。メキシコ産品種については、それらの著者は、凍結乾燥した花弁をアッセイした場合には11.1%ゼアキサンチンを含有し、新鮮な花弁をアッセイした場合には3.8%含有していると述べた。この高い値は残りのデータと一致せず、不正確な値であると思われる。
【０１２６】
「β-カロテン比」とは、本明細書において記載する他の「比」と同様に、すなわち、β-カロテン/(ルテイン + β-カロテン)と定義される。非突然変異植物でのβ-カロテン比は通常、花弁に関しておよそ0.007未満である。意図される突然変異体マリーゴールドでは、その比花弁で約1:10であり、好ましくは、約2:10を超える。より好ましくは、さらに、意図されるマリーゴールド植物は約3:10を超えるβ-カロテン比の花弁を有する。最も好ましくは、その比は5:10を超え、約1(1)である場合もある。
【０１２７】
以下で記載するように、これらの量は、ルテインおよびゼアキサンチンが各々、鹸化後に存在する、新鮮な花弁に存在するエステル化型ではなく、アルコール型で測定されるように、花弁抽出物の鹸化後に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により決定される。植物抽出物のカロテノイドレベルを決定するために業界にて用いられる標準分析方法は、AOAC 1984, Official Methods of Analysis (第14版), the Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USAのものであり、そのアッセイでの結果は、本明細書において得られたものと類似している。
【０１２８】
意図されるマリーゴールド植物は親系統の突然変異体である。すなわち、第1代系統または交配種または種子を突然変異原で処理し（突然変異を誘導し）て突然変異誘導植物を提供する。これを、通常、１回以上自家受粉する（自殖する）。本明細書において意図される植物は、突然変異誘発自体から、自殖の1つからまたは突然変異誘導植物の交配種または別の突然変異誘導もしくは非突然変異誘導植物の子孫から生じる。よって、このような植物は同種に属する。
【０１２９】
実質的には、いずれの種類の突然変異原を用いても意図される植物は得られる。また、典型的な突然変異原については、以下にて述べる。いくつかの意図される突然変異体マリーゴールドは隣接栽培した非突然変異体マリーゴールド親植物のものとは実質的に異なる表現型を有するが、他の意図される突然変異体は、カロテノイドに関連した表現型の特性を除き、隣接栽培した非突然変異体親植物のものと実質的に同じ表現型を示す。さらに具体的にいえば、後者の植物で親植物と突然変異植物との植物特性、例えば、植物の丈、植物の径、頭花の径、頭花の高さ、開花期、分岐量、枝の長さ、花茎の長さ、胚軸の長さ、子葉の長さおよび子葉の幅を比較すると、いくつかの意図される突然変異植物の特性値は、各々、親植物の値の約90%以内である（測定結果の標準偏差を含む）。より好ましくは、突然変異体に関するこれらの特性の値は親の約95%以内であり、最も好ましくは、これらの値が同じ（標準偏差以内）である。それに対し、他の突然変異植物では１以上の表現型の特性において著しく異なる。
【０１３０】
親植物と突然変異植物とのカロテノイドに関連する表現型の違いは突然変異体の花から得ることができるキサントフィルまたはカロテン色素の量である。”Scarletade”または”Deep Orangeade”などの親植物は、通常、約10〜約18mg/g乾燥全頭花重量の抽出可能なキサントフィル色素を有し、カロテンをほとんど含まない。高ゼアキサンチン比を有する意図される突然変異植物は、好ましくは、花弁にほぼ同量のカロテノイドを含むが、特に、ゼアキサンチンとルテインの比が非常に高い（例えば、約9:1以上）場合には、約4mg/g乾燥重量ほどが含まれる。他の突然変異体はキサントフィルをほとんど含まず、比較的多量の１以上のカロテンを含む場合もある。上記のように、β-カロテンは通常、マリーゴールド花弁には存在しない。
【０１３１】
表現型の比較は隣接栽培した植物間で行われる。本明細書において「隣接栽培した」とは、成長条件が表現型を左右しないように達成しうる、光、熱、成長培地、湿度および養分についての同じ条件下で栽培し植物を指すのに用いられる。温室栽培植物では、「隣接栽培した」とは、同じベンチでできる限り同じ条件下で栽培した植物を意味する。圃場栽培植物では、「隣接栽培した」とは、同じまたは隣接する圃場でできる限り同じ条件下で栽培した植物を意味する。
【０１３２】
植物を改変するのに有用な突然変異誘発剤については当技術分野では周知であり、このような薬剤の使用方法についても同様である。典型的な化学的突然変異原としては、ニトロソメチル尿素(NMU)、メタンスルホン酸エチル(EMS)、メタンスルホン酸メチル、ジエチル硫酸、ニトロソグアニジン、およびエチルニトロソ尿素が挙げられ、本明細書においてはこれらのうちのEMSが好ましい。NMUは、Cetl ら., Folia Fac. Sci. Nat. Univ. Purkynianae Brun. Biol., 21(1): 5-56頁 (1980)にて記載されているように使用することができるが、EMSは通常、約0.25〜約1容量%(v/v)、好ましくは、約0.2〜約0.8%にて使用される。γ線照射もまた、線量200〜約20,000ラド(0.2〜約20キロラド)での種子の照射に使用される場合、有用な突然変異誘発要因である。
【０１３３】
化学的突然変異体の他、γ線または中性子などによる電離放射線を使用して植物を変異させることができるし、また、組換えDNA技術によっても変異させることができる。よって、電離放射線および遺伝子サイレンシングなどの組換えDNA技術を利用して、カロテノイドプロフィールの変更を行ってもよい。これを受けて、これらの植物は各々、化学的誘発突然変異体、電離放射線誘発突然変異体および組換え誘発突然変異体と呼ばれる。結果として、好ましいマリーゴールドなどの突然変異体宿主植物は、本明細書において、化学的誘発突然変異、電離放射線誘発突然変異または組換え誘発突然変異により得られたマリーゴールド植物と定義される。
【０１３４】
こういったことから、γ線および高速中性子衝撃を他の植物に利用して１以上の遺伝子の欠失を引き起こした。遺伝子サイレンシングは、同時抑制と呼ばれる機構を介してダウンレギュレーションを誘導する遺伝子のセンス鎖の過剰発現によって達成しうる。ダウンレギュレーションは、カロテノイド生成経路に存在する１種以上の酵素に対するアンチセンス遺伝子の発現によっても達成することができる。当業者ならば、さらなる技術についても周知である。
【０１３５】
利用する突然変異原に関係なく、得られた突然変異植物のほとんどの表現型（カロテノイドに関連する特性、例えば、花弁におけるゼアキサンチン比およびキサントフィル量を含む）は、通常、親のものと実質的に同じであるため、得られた突然変異体の大部分は役に立たない。さらに、所望の突然変異植物を見つけるために、親と同じ表現型を有するように見えている植物をスクリーニングする必要がある。それらのスクリーニングは、面倒ではあるが、日常的に行われ、１以上の、単一花の花弁もしくは葉またはその両方のカロテノイド色素の分析を含む。このように、所望の突然変異体の準備は比較的稀ではあるが、再現可能な事象である。例えば、本明細書における1つの研究では、ゼアキサンチン比が約1:10以上であることが検証されたおおよそ22,000突然変異植物から23の有用突然変異体しか得られず、ゼアキサンチン比が約9:1を超える23のものからは2の植物しか得られなかった。別の研究では、調べた約8200の植物のうち、約43の突然変異体がゼアキサンチン比約1:10以上を示した。
【０１３６】
すでに記載したように、意図される植物は突然変異を誘導した種子から成長した植物であってよいし、または自殖後代もしくは交配種であってもよい。1つの好ましい実施形態では、マリーゴールドなどの意図される植物宿主が、独立したM1植物由来の2つの異なる突然変異誘導植物から生じる2植物の花の交配により形成されたハイブリッド(M1 x M1)である。別の実施形態では、意図されるマリーゴールド宿主が、1つの突然変異誘導植物と非突然変異誘導植物とから生じる1植物の花の交配により形成されたハイブリッドである。さらに別の実施形態では、意図される植物が、ハイブリッドとその直接の親花のいずれか一方との戻し交配により形成されたハイブリッドである。2つの異なるハイブリッド植物の交配による産物が意図され、ハイブリッドの自殖産物も同様に意図される。
【０１３７】
すでに記載してきたように、意図される宿主植物はそれ自体が突然変異事象の直接の産物、例えば、突然変異プロセス後に生じた種子産物である場合がある。また、その植物は1つの突然変異体ともう1つのものとの１以上の交配または突然変異体の自殖の産物である場合もある。さらに、意図される植物は突然変異体親植物と非突然変異体親植物間の交配の所産である場合もある。生じた植物は所望のカロテノイド特性に関してスクリーニングされ、選抜される。
【０１３８】
意図される宿主植物は、突然変異誘導した種子から成長した植物である場合もあるし、または自殖または交配後代である場合もある。1つの好ましい実施形態では、意図されるマリーゴールドが、2つの異なる突然変異誘導植物から生じる2植物の花の交配により形成されたF1ハイブリッド(M1 x M1)である。別の実施形態では、意図されるマリーゴールドが、1つの突然変異誘導植物と非突然変異誘導植物とから生じる1植物の花の交配により形成されたF1ハイブリッドである。さらに別の実施形態では、意図される植物が、F1ハイブリッドとその直接の親花のいずれか一方との戻し交配により形成されたハイブリッドである。2つの異なるF1ハイブリッド植物の交配による産物が意図され、F1ハイブリッドの自殖産物も同様に意図される。
【０１３９】
β-カロテンまたはゼアキサンチン豊富な花弁を有するマリーゴールド植物突然変異体の、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの一方または両方を生産させるための形質転換に向けた宿主植物としての使用は商業的に実現可能であり、また、高効率である。マリーゴールドは、ルテインの生産でのこのような植物の成育に関する業界の幅広い経験から、経済的に有利な宿主を提供する。トランスジェニックマリーゴールドはまた、単離が容易なアスタキサンチンの費用効率の高い供給源も提供する。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明は、キメラケトラーゼ酵素ポリペプチドコンジュゲートをコードするDNAセグメントの挿入およびキメラヒドロキシラーゼ酵素ペプチドコンジュゲートをコードするDNAセグメントの挿入に向けられており、本明細書において4-ケトβ-イオネン環および3-ヒドロキシβ-イオネン環各々の生成に関してすでに記載したように、これらの酵素のいずれもがカロテノイドβ-イオネン環を基質として利用する。ケトラーゼおよびヒドロキシラーゼの各々をコードするDNAは別々に、花弁優先的なプロモーターに機能しうる形で連結されている。
【０１４１】
E. ウロドボラ（米国特許第5,429,939号を参照）、E. ヘルビコラ （米国特許第5,684,238号を参照）、H. プルヴィアィス（米国特許第5,811,273号および同第5,972,690号を参照）、ならびにアグロバクテリウム・アウランチアキュムおよびアルカリゲネス属株 PC-1[Misawa, ら, J. Bacteriol., 177:6575-6584頁 (1995)を参照]由来の有用なヒドロキシラーゼ酵素をコードする典型的な遺伝子(crtZ)については、これまでに記載している。
【０１４２】
ヒドロキシラーゼおよびケトラーゼ酵素、例えば、上記のものを、その花弁がβ-イオネン環を含有するβ-カロテンなどの好適なカロテノイド前駆体を産生する高等植物に挿入してもよい。いくつかの実施形態では、非高等植物のヒドロキシラーゼが好ましい。その後、β-カロテンはアスタキサンチンへと変換される。ゼアキサンチン、β-クリプトキサンチン、アドニキサンチン、3-ヒドロキシエキネノン、3'-ヒドロキシエキネノン、エキネノン、カンタキサンチン、およびアドニルブインを含む少なくとも8種類のβ-イオネン環含有カロテノイド化合物がβ-カロテンとアスタキサンチンの間にある中間体である。
【０１４３】
その発現が花弁優先的なプロモーターにより制御されているヒドロキシラーゼおよびケトラーゼキメラ酵素は高等植物の花弁においてカンタキサンチン、その後、アスタキサンチンの産生を引き起こす。カンタキサンチンとアスタキサンチンは、β-カロテンまたは他のカロテノイド前駆体の、種々のカロテノイドを経由した4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド化合物、その後の、3-ヒドロキシ-4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド化合物への変換によって生じる。ヒドロキシラーゼおよびケトラーゼ酵素が高等植物宿主以外の種由来のものであるため、形質転換遺伝子が宿主植物にすでに存在するものと同じである場合に見られる同時抑制現象は見られない。
【０１４４】
本発明の異なる態様は、その花が、通常、カロテノイド産生を示さないトランスジェニック植物(すなわち、「正常な」非トランスジェニック植物の花は目に見えるほどのβ-カロテンおよびそのカロテノイドファミリーの産生をしない)を包含しており、ビンカおよびトルコキキョウ(lisianthus)がこのような植物の例である。このような植物を、その花弁がアスタキサンチンを産生するように、共通の前駆体からのカロテノイド中間体、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの生産を触媒する酵素をコードする遺伝子群またはクラスターで形質転換することができる。遺伝子群としては、β-カロテンを生成させるのに十分な酵素、ならびにβ-カロテンをゼアキサンチンに、またはカンタキサンチンを経てアスタキサンチンに変換させるヒドロキシラーゼおよびケトラーゼの一方または両方が含まれる。
【０１４５】
上記の遺伝子群としては、これまでに述べたようにケトラーゼおよびヒドロキシラーゼをコードする遺伝子、ならびにゲラニルピロリン酸およびファルネシルピロリン酸などの遍在前駆体をGGPPに、また、GGPPをβ-カロテンへと変換する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。Ausich ら 米国特許第5,684,238号は、形質転換宿主植物にてGGPPを生成し、また、GGPPをフィトエンへ、フィトエンをリコペンへ、さらに、リコペンをβ-カロテンへと変換するための、好適な方法、E. ヘルビコラ 核酸配列および寄託されたE. ヘルビコラ DNA含有細胞を開示している。また、その特許は、宿主植物にてβ-カロテンをゼアキサンチンへと変換するための方法、E. ヘルビコラ 核酸配列および寄託されたE. ヘルビコラ DNA含有細胞を教示している。それらの遺伝子の各々、さらに、上記のケトラーゼ遺伝子、N末端トランジットペプチド配列を含むキメラ酵素をコードする各遺伝子を発現させるための宿主植物の形質転換により、花弁でアスタキサンチンを産生するトランスジェニック植物が提供される。
【０１４６】
さらに具体的にいえば、GGPPの生産にはエルウィニア・ヘルビコラ酵素ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼの構造遺伝子を定義する少なくとも850塩基対を含むヌクレオチド配列を含んでなるDNAセグメントを利用することができる。例示的なDNAセグメントは、ATCC受託番号40755を有するpARC417BH、ATCC受託番号40758を有するpARC489BおよびATCC受託番号40757を有するpARC489Dからなる群から選択されるプラスミドに存在しているものである。
【０１４７】
リコペンの生産にはエルウィニア・ヘルビコラ酵素フィトエンシンターゼの構造遺伝子を定義する少なくとも1000塩基対を含むヌクレオチド配列を含んでなるDNAセグメントを群のもう1つの遺伝子として利用することができる。例示的なDNAセグメントは、ATCC受託番号40756を有するプラスミドpARC285またはATCC受託番号40754を有するプラスミドpARC140Nに存在しているものである。
【０１４８】
リコペンの生産にはエルウィニア・ヘルビコラ酵素フィトエンデヒドロゲナーゼ-4Hの構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでなるDNAセグメントも有用である。例示的なDNAセグメントは、ATCC受託番号40803を有するpARC496A、ATCC受託番号40801を有するpARC146D、ATCC受託番号40802を有するpATC228、およびATCC受託番号40806を有するpATC1616からなる群から選択されるプラスミドに存在しているものである。
【０１４９】
β-カロテンの調製にはエルウィニア・ヘルビコラ酵素リコペンシクラーゼの構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでなるDNAセグメントを利用することができる。典型的なDNAセグメントは、ATCC受託番号40850を有するpARC1509、ATCC受託番号40851を有するpARC1510、およびATCC受託番号40852を有するpARC1520からなる群から選択されるプラスミドに存在しているものである。
【０１５０】
ゼアキサンチンの調製にはエルウィニア・ヘルビコラ酵素β-カロテンヒドロキシラーゼの構造遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含んでなるDNAセグメントを利用することができる。例示的なDNAセグメントは、pARC406BH、pARC429BHおよびpARC145Hからなる群から選択されるプラスミドに存在しているものである。
【０１５１】
また、それらの遺伝子の１つと少なくとも80%の同一性を有し、6 x SSC中、約50℃〜約65℃の温度でのハイブリダイゼーションおよび1〜3 x SSC中、68℃の温度での最終洗浄を含む適度に高いストリンジェンシー条件下でその遺伝子とハイブリダイズする上記のDNAセグメントの１以上のDNA変異体も利用することができる。
【０１５２】
上記のE. ヘルビコラ遺伝子または変異体の各々はこれまでに記述したようにN末端トランジットペプチドを含むキメラ酵素をコードし、また、各遺伝子はこれまでにも述べたとおり、キメラの花弁優先的な発現を提供するプロモーターにより制御されると考えられる。
【０１５３】
また、N末端色素体トランジットペプチドを有するキメラ酵素をコードするこれまでに記述したようなE. ウレドボラ、A. アウランチアキュム、アルカリゲネス属、A. アウランチアキュムおよびアルカリゲネス属またはロードバクター・カプスラタス由来の好適な遺伝子または上記の変異体のDNA配列をE. ヘルビコラ由来のDNA配列の代わりに用いてもよいと考えられる。宿主植物がその各々の配列が複数の供給源由来の遺伝子に対応する遺伝子混合物を含む場合もある。
【０１５４】
植物が通常、その花弁にて有色カロテノイドを産生しない、すなわち、非形質転換植物の場合、有色カロテノイドの発現を誘導するには、構成的プロモーターではなく花特異的なプロモーターを利用することが好ましい。よって、すでに述べたように、4-ケト-β-イオネン環-生成酵素は構成的プロモーターを用いて発現させることができるが、リコペン、β-カロテン、γ-カロテンおよびキサンチンの産生を触媒する酵素の発現には花特異的なプロモーターを用いることが好ましい。
【０１５５】
ベクターを含んでなる組換えDNA分子は、(a)キメラケトラーゼ酵素をコードし、および(b)そのキメラ酵素の発現を誘導するプロモーターを含む異種ゲノムDNA配列（トランスジーン）に機能しうる形で連結されている。キメラケトラーゼ酵素は、(i)色素体トランジットペプチド部分を含んでなるN末端第1部分と、(ii)これと融合した、カロテノイドβ-イオネン環をカロテノイド4-ケト-β-イオネン環へと変換するケトラーゼ酵素の第2部分とからなる。プロモーターと色素体トランジットペプチドは、好ましくは、異なる種由来である。意図される植物でトランスジーンが発現することで、4-ケト-β-イオネン環カロテノイド化合物が花特異的に蓄積する。構造遺伝子はこれまでに記載したヌクレオチド塩基配列を有する。
【０１５６】
生体では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝子コードによりタンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸(DNA)配列に直接関連する。構造遺伝子はアミノ酸残基配列、すなわち、それがコードするタンパク質またはポリペプチドの観点から定義することができる。
【０１５７】
よって、遺伝子コードのよく知られた冗長性から、同じアミノ酸残基配列をコードするが、上記の遺伝子配列とは十分に異なる、2配列が高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが、適度に高いストリンジェンシーではハイブリダイズするさらなるDNAと対応するRNA配列を作製することができる。これを受けて、例えば、発現される酵素の同じ残基が１以上の異なるコドンを用いて発現されるようにDNA配列を変更するのにin vitro 突然変異誘発を利用することができる。さらに、特異的な制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入または欠失することが望ましい場合に、同じ技術を利用して、1つのアミノ酸残基を別のものに変更することができる。さらに、構造遺伝子の変異型対立遺伝子は有用である他の生物に存在する可能性があり、適度に高いストリンジェンシーでのみハイブリッド二本鎖分子を形成する。
【０１５８】
そのDNAがケトラーゼまたは他の意図される酵素をコードするDNAセグメントの5'に連結されている色素体トランジットペプチドをコードするDNAに機能しうる形で連結されたプロモーターをコードしているDNA配列を含むDNAセグメントは、寄託されているプラスミドから好適な制限断片を切除し、機能しうる形で連結することにより、または周知の方法を用いた、本明細書の他の場所で記述するDNAからのPCRにより作製することができる。このように作製される本明細書において有用なDNA分子は、通常、接着末端、すなわち、分子の二本鎖部分を越えて伸びる「オーバーハンギング」一本鎖部分を有する。平滑末端を有する分子もまた意図されるが、本発明において有用なDNA分子に接着末端が存在することが好ましい。
【０１５９】
本明細書において有用な組換えDNA分子は、ベクターを意図された単離DNAセグメントに機能しうる形で連結して、本明細書において記述するものなどのプラスミドを得ることにより作製することができる。特に好ましい組換えDNA分子については以下の実施例にて詳細に記述する。遺伝子の発現を誘導することができるベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【０１６０】
上記の発現ベクターはプロモーターをはじめとする発現制御エレメントを含む。キメラポリペプチドのコード遺伝子は発現ベクターに機能しうる形で連結されており、プロモーター配列によるRNAポリメラーゼ結合および所望のポリペプチドのコード遺伝子の発現の制御が可能になっている。ポリペプチドコード遺伝子の発現には、Poszkowski ら, EMBO J., 3:2719頁 (1989)およびOdell ら, Nature, 313:810頁 (1985)により記載されるような、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、ならびに、Chua ら, Science, 244:174-181頁 (1989)にて示されるような、時間制御型プロモーター、空間制御型プロモーター、および時空制御型プロモーターが有用である。
【０１６１】
ポリペプチドコード遺伝子の発現ベクター、最終的にはそれが機能しうる形で連結される予め選択しておいたプロモーターの選択は、所望の機能特性、例えば、発現効率、タンパク質発現の位置およびタイミング、および形質転換する宿主細胞により直接影響を受ける。これらは組換えDNA分子の構築に関する技術分野においてある周知の制限である。しかしながら、本発明の実施において有用なベクターは、キメラポリペプチドコード遺伝子が機能しうる形で連結されるDNAセグメントに組み入れられているその遺伝子の複製、さらに、発現を誘導可能な宿主高等植物のゲノムに組み込まれている。発現ベクター全体が宿主植物ゲノムに組み込まれているわけではないが、一部のみ組み込まれていることはよく知られている。それでも、ベクターは発現を容易にするために組み込まれているといえる。
【０１６２】
1つの好ましい実施形態では、ベクターは原核生物レプリコン、すなわち、組換えDNA分子により形質転換された原核生物宿主細胞においてその組換えDNA分子の染色体外での自己複製および維持を誘導する能力を有するDNA配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野では周知である。
【０１６３】
原核生物レプリコンを含むベクターは、フィトエンシンターゼコンジュゲート遺伝子により形質転換された大腸菌などの宿主細胞においてそのフィトエンシンターゼコンジュゲート遺伝子の発現を誘導することが可能な原核生物プロモーター領域を含む。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、通常、本発明のDNAセグメントを挿入するための１以上の便宜な制限部位を含むプラスミドベクターに与えられている。このようなベクタープラスミドの典型例がGibco BRL, Gaithersburg, Mdから入手可能なpUC18、pUC19、およびpBR322、ならびにPharmacia, Piscataway, N.Jから入手可能なpPLおよびpKK223-3である。これらのベクターは組み込み発現ベクターに存在するDNAセグメントの合成に用いることができる。
【０１６４】
高等植物における遺伝子の発現に有用な典型的なベクターについては当技術分野では周知であり、Rogers ら, Meth. in Enzymol., 153:253-277頁 (1987)により記載されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの腫瘍誘導(Ti)プラスミドから誘導されたベクターが挙げられる。これらのベクターは形質転換においての植物組み込みベクターであり、ベクターはベクターDNAの一部を宿主植物のゲノムに組み込む。Tiプラスミドに基づく組み込みベクターでは、宿主植物染色体に組み込まれる領域はTiプラスミドの左右境界配列の間にあるものである。
【０１６５】
本明細書において有用である典型的なA.ツメファシエンスベクターはSchardl ら, Gene, 61:1-11頁 (1987)およびBerger ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:8402-8406頁 (1989)のプラスミド pKYLX6およびpKYLX7である。プラスミドpKYLX6は中間体構築物用に設計された大腸菌ベクターであり、プラスミドpKYLX7はクローニングされた遺伝子の組み込み用に設計されたA. ツメファシエンスベクターである。改変型ベクターpKYLX61およびpKYLX71は、最初のHind III-Sst I断片多重クローニング部位領域の代わりにHind III、Xho I、BamH I、Pst IおよびSst I部位を含む。本明細書において有用なもう1つのベクターは、Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CAから入手可能なプラスミドpBI101.2である。プラスミドpKYLX7、pKYLX71およびpB7101.2は、A. ツメファシエンスにおいてvir遺伝子を有するもう1つのベクターとともに用いられるバイナリーベクターである。
【０１６６】
もう1つの植物形質転換系は、形質転換において腫瘍よりも毛状根を誘導するアグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)に基づくものである。出願PCT/US87/02512(1988年4月7日公開のWO 88/02405)では、キュウリ Cucumis sativas L., cv, Straight Eightを形質転換し、再分化キュウリ植物を作製するためのA.リゾゲネス株A4およびそのRi プラスミドのA. ツメファシエンスベクターpARC8またはpARC16との使用について記載している。
【０１６７】
本発明の組換えDNAを作製するためのレトロウイルス発現ベクターの使用もまた意図される。本明細書において「レトロウイルス発現ベクター」とは、レトロウイルスゲノムの長い末端反復配列(LTR)領域由来のプロモーター配列を含むDNA分子を指す。これらのカロテノイド産物のいくつかは食品生産および着色と関係があるため、レトロウイルス発現ベクターは真核細胞細胞において複製能力がないことが好ましい。レトロウイルスベクターの構築および使用については、Verma, PCT公開番号WO 87/00551により、また、Cocking ら, Science, 236:1259-62頁 (1987)により記載されている。
【０１６８】
好ましい実施形態では、キメラのコード遺伝子の発現に使用されるベクターとしては、植物細胞において有効である選択マーカー、好ましくは、薬剤耐性選択マーカーが挙げられる。1つの好ましい薬剤耐性マーカーはその遺伝子の発現によりカナマイシン耐性がもたらされる遺伝子、すなわち、Rogers ら, in Methods For Plant Molecular Bioloqy, A. WeissbachおよびH. Weissbach編, Academic Press Inc., San Diego, CA (1988)により記載されたノパリンシンターゼプロモーター、Tn5 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ IIおよびノパリンシンターゼ 3'非翻訳領域を含むキメラ遺伝子である。もう1つの好ましいマーカーはトランスポゾン Tn9からのアッセイ可能なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子である。
【０１６９】
DNAを相補的接着末端または平滑末端を介してベクターに機能しうる形で連結するために種々の方法が開発されてきた。例えば、相補的ホモポリマートラクトを、挿入するDNAセグメントとベクターDNAに付加してもよい。次いで、相補的ホモポリマーテール間を水素結合することによりベクターとDNAセグメントを結合して、組換えDNA分子を形成する。
【０１７０】
また、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いて、DNAセグメントを組み込み発現ベクターと結合してもよい。バクテリオファージ T4 DNAリガーゼなどの平滑末端DNA分子の連結を触媒しうる酵素の存在下で、平滑末端DNAセグメントを過剰の合成リンカー分子とともにインキュベートすることにより合成リンカーを平滑末端DNAセグメントと結合する。そのため、この反応産物はそれらの末端に合成リンカー配列を有するDNAセグメントである。次いで、これらのDNAセグメントを好適な制限エンドヌクレアーゼで切断し、合成リンカーのものと適合する末端を生み出す酵素で切断された組み込み発現ベクターに連結する。種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、New England BioLabs, Beverly, MAをはじめとする数多くの供給元より市販されている。
【０１７１】
上記の組換えDNA分子のRNA等価物もまた、本発明により意図される。
【０１７２】
ポリペプチドコード遺伝子をより高等な多細胞顕花植物に導入する方法としては、アグロバクテリウム媒介性植物およびカルス形質転換、プロトプラスト形質転換、花粉への遺伝子導入、生殖器官への注入および未成熟胚への注入が挙げられる。これらの方法には、各々、固有の利点と欠点がある。よって、特定の植物種に遺伝子を導入する1つの特定の方法は必ずしも別の植物種にとって最も有効であるものではないが、特定の植物種にとってどの方法が有用であるかは十分に分かる。
【０１７３】
アグロバクテリウム媒介性導入は、DNAが植物組織全体に導入されることにより、プロトプラストからの完全な植物の再分化を必要としないため、遺伝子を植物細胞に導入するのに応用範囲が広い系である。DNAをTi-DNAを介して植物細胞に導入するためのアグロバクテリウム媒介性発現ベクターの使用については、当技術分野では周知である。例えば、Fraley ら, Biotechnology, 3:629頁 (1985)およびRogers ら, Methods in Enzymology, 153:253-277頁 (1987)により記載された方法を参照。さらに、Ti-DNAの組み込みはほとんど再構成が起こらない比較的精密なプロセスである。Spielmann ら, Mol. Gen. Genet., 205:34頁 (1986)およびJorgensen ら, Mol. Gen. Genet., 207:471頁 (1987)により記載されるように、DNAが導入される領域は境界配列により規定され、介在するDNAが通常、植物ゲノムに挿入される。
【０１７４】
Klee ら, Plant DNA Infectious Agents, T. HohnおよびJ. Schell編, Springer-Verlag, New York (1985) 179-203頁により記載されるように、最新のアグロバクテリウム形質転換ベクター、例えば、これまでに記述したものなどは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムで複製可能であることから、都合よく操作することができる。
【０１７５】
さらに、アグロバクテリウム媒介性遺伝子導入用のベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクターにおける遺伝子および制限部位の構成が改良され、種々のポリペプチドコード遺伝子を発現することができるベクターの構築が容易となっている。Rogers ら, Methods in Enzymology, 153:253頁 (1987)により記載されるベクターは、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためにプロモーターおよびポリアデニル化部位がフランキングする便宜なマルチリンカー領域を有しており、本目的に好適である。
【０１７６】
アグロバクテリウム媒介性形質転換が有効である植物種では、多くの場合、遺伝子導入の容易性と明確性を理由として最適な方法である。しかしながら、Bytebier ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345頁 (1987) により記載されるように、アグロバクテリウムベクターを用いてアスパラガスでトランスジェニック植物が作製されたが、ほとんどの単子葉植物はアグロバクテリウムの天然宿主ではないと思われる。
【０１７７】
葉切片およびカルスなどの他の組織のアグロバクテリウム媒介性形質転換はアグロバクテリウムが自然感染する植物種に限定されると考えられる。それゆえ、アグロバクテリウム媒介性形質転換は双子葉植物において最も有効である。しかしながら、上記のように、アグロバクテリウムを用いたアスパラガスの形質転換も実現可能である。
【０１７８】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組合せに基づく方法を用いて実現可能である [例えば、Potrykus ら, Mol. Gen. Genet., 199:183頁 (1985); Lorz ら, Mol. Gen. Genet., 199:178頁 (1985); Fromm ら, Nature, 319:791頁 (1986); Uchimiya ら, Mol. Gen. Genet., 204:204頁 (1986); Callis ら, Genes and Development, 1:1183頁 (1987); Marcotte ら, Nature, 335:454頁 (1988); Wang ら, Bio/Technology, 10:691-696頁 (1992); およびFennell ら, Plant Cell Reports, 11:567-570頁 (1992)を参照。]。
【０１７９】
これらの系の異なる植物種への適用は、その特定の植物種をプロトプラストから再分化する能力によって決まる。プロトプラストからの再分化が首尾よくいかない植物種を形質転換するためには、DNAを完全な細胞または組織に導入する他の方法を利用することができる。
【０１８０】
例えば、「パーティクルガン」または高速マイクロプロジェクティル法が用いられる。Klein ら, Nature, 327:70頁 (1987); Klein ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:8502頁 (1988); およびMcCabe ら, Biotechnology, 6:923頁 (1988); およびVasil ら, Bio/Technology, 9:667-674頁 (1992) にて記載されるように、このような技術を用いて、小型金属粒子の表面にあるDNAは細胞壁を通過し、細胞質内に運ばれる。金属粒子は、これまでに記載したベクター、例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換に通常、用いられるベクターのすべてまたは一部によりコーティングされている。例えば、この粒子はベクターを細菌よりもむしろ植物細胞に運ぶのに用いられる。一度、細胞内に入れば、アグロバクテリウム媒介性形質転換ベクターは、アグロバクテリウムに用いて形質転換をもたらす場合にそれが作用するのとほぼ同じように作用する。
【０１８１】
金属粒子は細胞のいくつかの層を通過するため、組織外植片内での細胞の形質転換が可能になる。組織外植片の形質転換では、プロトプラストステージを通過する必要性が排除されるため、トランスジェニック植物の作製が加速する。
【０１８２】
また、Zhou ら, Methods in Enzymology, 101:433頁 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367頁 (1987); Luo ら, Plant Mol. Biol. Reporter, 6:165頁 (1988)により記載されるように、花粉へ直接DNAを導入することにより、DNAを植物に導入してもよい。Pena ら, Nature, 325:274頁 (1987)により記載されるように、ポリペプチドコード遺伝子の発現は、DNAを植物の生殖器官へと注入することにより達成することができる。また、Neuhaus ら, Theor. Apl. Genet., 75:30頁 (1987); およびBenbrook ら, Proceedings Bio Expo. 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., 27-54頁 (1986) により記載されるように、DNAを未成熟胚の細胞および乾燥した胚の再水和物に直接注入してもよい。
【０１８３】
単一植物のプロトプラストまたは種々の外植片のいずれかからの植物の再分化については当技術分野では周知である[例えば、Methods for Plant Molecular Biology, A. WeissbachおよびH. Weissbach編, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988)を参照。]。この再分化および成長プロセスは、形質転換体の細胞およびシュートの選抜ステップ、形質転換体のシュートの発根ステップおよび土壌での小植物の成長ステップを含む。
【０１８４】
Horsch ら, Science, 227:1229-1231頁 (1985)により記載されるように、葉の外植片からの、アグロバクテリウム により導入された外来遺伝子を含む植物の再分化は実現可能である。この手法では、形質転換体を選択因子の存在下、Fraley ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803頁 (1983) により記載されるように、形質転換された植物種でのシュートの再分化を誘導する培地で成長させる。この手法では通常、2〜4週でシュートが生じたら、これらの形質転換体シュートを選択因子および抗生物質を含有する好適な発根誘導培地に移して細菌増殖を回避する。
【０１８５】
次いで、小植物を形成する選択因子の存在下で発根させた形質転換体シュートを土壌または他の成長培地に移植して、発根させる。これらの手法は使用する植物種によって異なり、こういったバリエーションについては当技術分野で周知である。
【０１８６】
これまでに記述したような交配または自殖による種子もまた本明細書において意図される。このような種子は、好適な環境へ植え付け、成熟させることで、花弁にアスタキサンチンを含有するトランスジェニックマリーゴールドなどのトランスジェニック植物を生み出す。
【０１８７】
本発明はまた、意図されるトランスジェニック植物の花粉および胚珠も意図する。意図されるトランスジェニック植物の再分化可能な部分自体も意図され、それらとしては、胚、子葉、胚軸、分裂組織、花粉、葉、葯、根、根端、および花からなる群から選択される細胞、またはプロトプラストもしくはそこから誘導されるカルスが挙げられる。細胞から植物を再分化する方法については、当業者ならば周知であり、マリーゴールドなどの双子葉植物がこのような再分化を特に従いやすい。
【０１８８】
本発明のもう1つの意図される態様が、トランスジェニックな花の器官、例えば、カンタキサンチンまたはアスタキサンチン（ここで、アスタキサンチンは通常、ラウリン酸、パルミチン酸およびミリスチン酸などの酸のアスタキサンチン脂肪酸エステルとして存在する）を含有するマリーゴールド花弁である。これらの花弁は一般に乾燥され、細分化された形態で存在する。
【０１８９】
カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの脂肪酸エステルの一方または両方からなる含油樹脂もまた、意図される。当技術分野では周知のように、含油樹脂は、植物色素（例えば、自由な遊離型カンタキサンチンおよび本明細書においてはエステル化形態のアスタキサンチンエステル）、時には、少量の他の植物生成物および色素（例えば、他のキサントフィルエステル）、ならびに少量の抽出溶媒（例えば、ヘキサンまたはアセトン）を伴って含む植物組織の固体抽出物である。意図されるトランスジェニックな、好ましくは、マリーゴールドの含油樹脂は、カンタキサンチンおよびアスタキサンチンの一方または両方と意図されるトランスジェニック植物の花弁に存在するような他のキサントフィル脂肪酸エステルを含有する。含油樹脂は市販品であり、ヒトまたは他の動物向け補助食品、栄養補助食品、酸化防止剤などの製造におけるさらなる加工用に製造加工業者に販売されている。
【０１９０】
例示的なトランスジェニックマリーゴールド含油樹脂の製造では、遊離型キサントフィルおよびキサントフィルエステル（アスタキサンチンエステル、場合によっては他のキサントフィルエステルまたはカロテンを含む）が乾燥トランスジェニックマリーゴールド花からヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出される。この抽出は当技術分野では公知の手法に従って行われる。溶媒を除去すると、高レベルの遊離型キサントフィルおよびキサントフィルエステルを含有し、かつ、約99重量%、好ましくは、約99.9重量%の抽出用有機溶媒が除去されている、すなわち、約1重量%未満、好ましくは、約0.1重量%未満の有機溶媒を含む抽出物が得られる。得られた溶媒不含の抽出物を、トランスジェニックマリーゴールドの含油樹脂、あるいはアスタキサンチンを含有するマリーゴールドの含油樹脂と呼ぶ。
【０１９１】
ヒトまたは他の動物、例えば、ニワトリおよびシチメンチョウのような家禽、マスおよびサケのような魚類、ならびにエビ、ロブスターおよびカニのような甲殻類動物に向けた補助食品としての使用に好適な組成物もまた意図される。意図される補助食品を用いて、それらの動物の肉身または皮膚、ならびにこのような動物、特にニワトリの卵を着色することができる。補助食品は、１種以上のカンタキサンチンとマリーゴールドの含油樹脂に存在するようなアスタキサンチンの脂肪酸エステル混合物を含んでなり、その含油樹脂に存在するカロテンおよび他のキサントフィルの脂肪酸エステルを含むことがある。脂肪酸エステルの混合物は食用媒質に溶解しているか、または、分散している。よって、この補助食品は、上記の含油樹脂の好適な精製（溶解し、濾過し、続いて、精製した混合エステルを食用植物油などの好適な食用媒質に溶解または分散させるなど）により製造することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、食用媒質が食用トリグリセリド油である。混合物の遊離型キサントフィルとしての4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド（例えば、カンタキサンチンを含有するキサントフィルエステルまたはアスタキサンチンエステルを含有するキサントフィルエステルもしくはその両方）の含量は通常、約0.2〜約40重量%、より好ましくは、約2〜約20重量%である。典型的な食用油としては、カンデリラ蝋、ココヤシ油、タラ肝油、綿実油、メンハーデン油、オリーブ油、パーム油、コーン油、大豆油、落花生油、ケシの実油、紅花油およびヒマワリ油が挙げられる。比較的高濃度の不飽和脂肪酸を含む油の使用が好ましい、すなわち、ヨウ素価約100〜150を有する油の使用が好ましい。よく知られているように、混合は、通常、高剪断混合装置を用いて行われる。米国特許第5,382,714号で記載されているように、補助溶媒および添加剤、例えば、各々、エタノールおよびα-トコフェロールもまた存在していてもよい。
【０１９３】
4-ケト-β-イオネン環含有組成物（例えば、カンタキサンチン、アスタキサンチンまたはその両方の混合物）はまた、0.5〜約20%、好ましくは、約1〜約4%の、遊離型カンタキサンチン、アスタキサンチン、アスタキサンチンエステルのような遊離型アスタキサンチン含有キサントフィル、またはカンタキサンチン含有キサントフィルエステルとアスタキサンチン含有キサントフィルエステルの混合物を含有する、従来、「ビーズレット」と呼ばれる、一般に球状の小型ペレット形態で提供することができる。これらのビーズレットを、米国特許第5,270,063号にて開示されるように、即席シリアルなどのヒト食品に所望の量で混合して、または米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号および同第5,043,170号にて飼料添加物に関して開示されたビーズレットまたは他の粒子のように、ニワトリまたは他の動物の飼料に混合して用いてもよい。
【０１９４】
典型的なビーズレットは水に溶けず、米国特許第4,670,247号にて開示されるように、架橋ゼラチンまたはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩により4-ケト-β-イオネン環含有組成物をカプセル化することにより作製する。水に溶けない所望のカロテノイドを含有するビーズレットは、カロテノイド、水、ゼラチン、および糖を含有するエマルションを形成することにより作製する。エマルションを液滴に変え、これらの液滴を、液滴からの粒子が、それらの粒子形態が恒常的に確立されるまで、互いに分離されている状態に保たれるように、多量のデンプン粉末に個々に回収する。カロテノイドを含有する粒子は回収用デンプン粉末から分離し、約90℃〜約180℃の温度で熱処理する。熱処理ステップでは糖のカルボニル基とゼラチン分子の遊離型アミノ部分の反応によりビーズレットのゼラチン基質が不溶化する。得られたビーズレットは水に溶けず、飼料のペレット化のストレスに対する安定性の高まりを示す。架橋プロセスではビーズレットの作製に使用する成分は利用するが、架橋試薬または添加剤を組成物に添加する必要はない。
【０１９５】
米国特許第5,695,794号は、本明細書において動物の飼料用の添加剤としての使用に適合させうる別の形態のビーズレットを開示している。例えば、径が約30〜約55ミクロンのビーズレットは、硬化植物油（例えば、硬化綿実油、小麦胚種油、紅花油、大豆油など）中の所望の量のアスタキサンチン含有キサントフィルエステルの溶解溶液（これにモノおよびジグリセリド（例えば、硬化した大豆モノおよびジグリセリド、綿実モノおよびジグリセリドなどから調製したものなど）と酸化防止剤としてクエン酸および2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール(BHT)が含まれていてもよい）を噴霧することによりを作製する。他の酸化防止剤、例えば、エトキシキン、ビタミンEなどを用いてもよいこともまた、周知である。溶解混合物を約160°F（約70℃）の温度でNiro, Inc., Columbia, MDから入手可能なものなどの噴霧冷却装置のサイクロン気流中に噴霧して、ビーズレットを作製する。これを冷却により凝固させる。飼料に補給剤として添加することが好ましいビーズレットの作製でよく知られているように、冷却したビーズレットにヒュームドシリカ、リン酸カルシウム、粉末デンプンまたはセルロースなどの固化防止剤をまぶす。典型的なビーズレットは、グラム当たり約10〜約100ミリグラムのアスタキサンチン含有キサントフィル(mg/g)を含み、好ましくは、約10〜約50mg/gで含む。
【０１９６】
意図される4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド組成物（例えば、カンタキサンチン、アスタキサンチン、アスタキサンチン含有キサントフィルエステルの混合物またはその両方の混合物）が添加される動物の飼料については当技術分野では周知である。上記の米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号および同第5,043,170号では、家禽に特に有用な典型的な食餌を提供している。米国特許第5,935,624号および同第2,918,370号では、さらなる家禽の食餌を例示している。
【０１９７】
米国特許第5,258,189号では、β-カロテンが、植物油中に分散されているか、または乾燥形態の調理済みシリアル製品と混合されているヒト向け即席シリアル製品へのβ-カロテンの添加を教示している。においては、β-カロテンの代わりに4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド組成物を所望のレベルで用いることができる。
【０１９８】
補助食品としての使用に好適なもう1つの組成物は、食用媒質に溶解しているか、または、分散している4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド組成物を含む。この組成物は、カンタキサンチンおよび加水分解された4-ケト-β-イオネン環含有カロテノイド組成物（例えば、マリーゴールド含油樹脂に存在するエステルに対し、遊離型アルコール（またはケト）化合物であるアスタキサンチン含有キサントフィル）の一方または両方を含む。
【０１９９】
マリーゴールド含油樹脂を鹸化して遊離型キサントフィルを得る方法については、周知である。例えば、Tcyczkowski ら, Poultry Sci. 70(3): 651-654頁, 1991; および米国特許第5,382,714号（鹸化したマリーゴールド含油樹脂から有機溶媒の添加によりルテインを結晶化する）を参照。
【０２００】
さらに、Ausich ら 米国特許第5,648,564号では、含油樹脂をプロピレングリコールとアルカリ水溶液、好ましくは、水酸化カリウムを含有する組成物と混合して、含油樹脂とプロピレングリコールとで少なくとも75重量%を構成している反応混合物を生成させることによるマリーゴールド含油樹脂からの結晶性ルテインの製造を教示している。このようにして生成した反応混合物は、キサントフィルエステルを鹸化し、結晶形態の遊離型キサントフィルを含む鹸化反応混合物を生成させるのに十分な時間（通常、少なくとも3時間）、約65℃〜約80℃の温度で維持される。鹸化抽出物を希釈量の水と混合して水溶性不純物を溶かし、反応混合物の粘度を下げる。希釈混合物を均質になるまでゆっくりと混合した後、濾過し、キサントフィルの結晶を回収する。回収されたキサントフィル結晶は温水で洗浄し、乾燥させる。キサントフィルエステルを含有する含油樹脂からのキサントフィルの単離および精製では、プロピレングリコール以外の有機溶媒は用いない。このようにして形成した乾燥キサントフィル結晶を、通常、以上で記述したトリグリセリドなどの食用媒質と混合する。混合物のキサントフィル含量は、通常、約0.1〜約35重量%、好ましくは、約1〜約10重量%である。
【０２０１】
アスタキサンチンエステルを鹸化（加水分解）して遊離型キサントフィルを得る方法については、周知である。例えば、KamataおよびSimpson, Comp. Biochem. Physiol. 86B(3):587-591頁, 1987; およびYuanおよびChen, J. Agric. Food Chem. 47: 31-35頁, 1999（いずれも窒素下でのアスタキサンチンエステルの鹸化を教示している）を参照。
【０２０２】
脂肪酸分析では、KamataおよびSimpsonは、アドニス・アエスチヴァリス由来の精製アスタキサンチンジエステルを0.1Nメタノール性KOHを用い、窒素下、100℃にて40分間加熱することにより鹸化した。鹸化後、0.5N HClを添加してサンプルを酸性化し、アスタキサンチンの構造転換体であるアスタシンを石油エーテルで抽出した。
【０２０３】
以上のYuanおよびChenは、ヘマトコッカス・プルヴィアィスの色素抽出物中のアスタキサンチンエステルを、アスタキサンチンを著しく分解または構造転換することなく、加水分解するための鹸化方法を確認した。アスタキサンチンエステルの完全加水分解は、異なる濃度(10〜100mg/l)の色素抽出物に関し、0.018Mメタノール性NaOHを用いて、窒素下、暗所で6時間以内に達成された。より高濃度のメタノール性NaOH溶液では、加水分解の反応速度は速かったが、アスタキサンチンの分解がかなり起こった。
【０２０４】
これ以上詳述しなくても、当業者であれば、これまでの説明から本発明を最大限に活用することができるであろう。よって、次の好ましい特定の実施形態は単なる例示であり、他の開示を何ら限定しないものとする。
【実施例】
【０２０５】
実施例1: β-カロテンケトラーゼ(β-カロテンオキシゲナーゼ)発現ベクターの構築
A. H. プルヴィアィス 由来のβ-カロテンケトラーゼ
ヘマトコッカス・プルヴィアィス由来のβ-カロテンケトラーゼ遺伝子(crtW)[Kajiwara ら, Plant Mol Biol., 29(2):343-352頁 (1995) を参照]は、Toshihiro Toguri博士, Kirin Brewery Co., Ltdから入手した遺伝子のクローンを鋳型として用いるポリメラーゼ鎖反応(PCR)により調製した。遺伝子の3’末端にKpn I制限部位(crtW-L28: GCCAGTGCCAAGGTACCTCTGTCATGCC; 配列番号1)および5’末端にNde I部位(crtW-U28: CCGGGGATCCTCTACATATGCACGTCGC; 配列番号2)を導入した特定のプライマーを用いた。Kpn IおよびNde Iで消化した後、crtW遺伝子をノパリンシンターゼポリアデニル化シグナルを含むプラスミドpBHX533（図2）に連結した。得られたベクターをpBHX539と名づけた（図3）。
【０２０６】
ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット(RUBISCO; rbcs)由来のトランジットペプチド[Mazur ら, Nucleic Acids Res., 13(7):2373-2386頁 (1985) を参照]を、5’末端にXma I部位(rbcsU30: CTCGTCGACCCGGGATGGCTTCCTCAGTTC; 配列番号3)および3’末端にNde I部位(rbcsL30: CCCATATGTTGCACTCTTCCGCCGTTGCTG; 配列番号4)を導入したプライマーを用いたPCRにより調製した。このトランジットペプチド配列をpBHX539のNde IとXma I制限部位の間に連結した。得られたプラスミドをpBHX543と名づけた（図4）。
【０２０７】
シロイヌナズナ由来のユビキチン3(UBQ3)遺伝子プロモーターを、5’末端にHind III部位およびSal I部位を導入したプライマー(UBQ3U37: ACAAGCTTTCAGAGTCGACTTCGGATTTGGAGCCAAG; 配列番号5)および3’末端にXma I部位を導入したプライマー(UBQ3L28: TCATCCCCGGGATGTGAAAGAGAGAGTC; 配列番号6)を用いるPCRにより調製した。UBQ3 PCR産物をpBHX 543のHind IIIとXma I制限部位の間に連結した。得られたプラスミドをpBHX546と名づけた（図5）。
【０２０８】
プラスミドpBHX544
完全LIS1::rbcs::crtW::nos発現カセットを含む約2.4kbセグメントを、Hind IIIおよびEcoR Iで消化することよりpBHX657（図10; 実施例2を参照）から除去した。この断片をpUC19のHind IIIとEcoR I部位の間に連結した。得られたプラスミドをpBHX544と名づけた（図6）。このプラスミドはLIS1プロモーターの制御下にヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW遺伝子の発現用の完全カセットを含む。
【０２０９】
B. シロイヌナズナ由来のプロモーター
プラスミドpBHX560
シロイヌナズナ由来のユビキチン11(UBQ11)遺伝子の上流（プロモーター）領域[Callis ら, Genetics, 139(2):921-939頁 (1995); およびSun ら, Plant J., 11(5):1017-1027頁 (1997) を参照]を、5’末端にHind III部位を付加したプライマー(UBQ11U30: CAAAGCTTCAGACTAGTCGACTTGCCTCAA; 配列番号7)および3’末端にXma I部位を付加したプライマー(UBQ11L30: CAATTCGATGGGGCCCGGGATCTTGATCAC; 配列番号8)を用いたPCRにより調製した。プラスミドpBHX544をHind IIIおよびXma Iで消化してLIS1プロモーターを除去し、UBQ11プロモーターをこれらの部位に連結した。得られたプラスミドはUBQ11プロモーターの制御下にヘマトコッカス・プルヴィアィス crtWの発現用の完全カセットを含んでおり、これをpBHX560と名づけた（図7）。
【０２１０】
C. A. アウランチアキュム由来のβ-カロテンケトラーゼ
プラスミドpBHX562
アグロバクテリウム・アウランチアキュム由来のcrtW遺伝子[Misawa ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 209(3):867-876頁 (1995); Misawa ら, J. Bacteriol., 177(22):6575-6584頁 (1995) を参照]を、(Toshihiro Toguri博士, Kirin Brewery Co., Ltd.から入手した)その遺伝子のクローンを鋳型として用いるPCRにより調製した。ヘマトコッカス・プルヴィアィス遺伝子の場合と同様に、遺伝子の3’末端にKpn I制限部位を導入したプライマー(Ag-crtWL24: CCAGTGCCAAGCTGGTACCGTCAT; 配列番号9)および5’末端にNde I部位を導入した特定のプライマー(Ag-crtWU26: GGGGATCCTCTACATATGAGCGCACA; 配列番号10)を用いた。プラスミドpBHX544をKpn IおよびNde Iで消化してH. プルヴィアィス crtW遺伝子を除去し、A. アウランチアキュム遺伝子をそれらの部位に連結した。得られたプラスミドはLIS1プロモーターの制御下にアグロバクテリウム・アウランチアキュム crtW遺伝子の発現用の完全カセットを含んでおり、これをpBHX562と名づけた（図8）。
【０２１１】
プラスミドpBHX564
同様の手順で、プラスミドpBHX560をKpn IおよびNde Iで消化してH. プルヴィアィス crtW遺伝子を除去し、A. アウランチアキュム遺伝子をそれらの部位に連結した。得られたプラスミドはUBQ11プロモーターの制御下にアグロバクテリウム・アウランチアキュム crtW遺伝子の発現用の完全カセットを含んでおり、これをpBHX564と名づけた（図9）。
【０２１２】
プラスミドpBHX650
バイオリスティックな(biolistic)（衝撃による形質転換）形質転換に向けた一般クローニングベクターを、市販のベクター pUC18を改変することで構築した。
【０２１３】
プラスミドpBHX598（上記）をKpn Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、プラスミドをHind IIIで消化してUBQ3プロモーターとnptIIコード配列を含むDNA断片を遊離させた。その断片を、Nde Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し、続いて、Hind IIIで消化したプラスミドpUC18に連結した。得られたプラスミドをpBHX650と名づけた（図22）。
【０２１４】
D. 大腸菌によるアスタキサンチン生産
pBHX611
大腸菌における遺伝子発現に向けたヘマトコッカス・プルヴィアィス β-カロテンケトラーゼ(crtW)プラスミドを構築した。プラスミドpBHX543（実施例1を参照）をKpn Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、プラスミドをNde Iで消化してcrtW遺伝子を含むDNA断片を遊離させた。その断片を、BamH Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し、続いて、Nde Iで消化した市販のプラスミド pET15b(Novagen, Madison, WI)に連結した。得られたプラスミドをpBHX611と名づけた。
【０２１５】
プラスミドpBHX611によりゼアキサンチン産生大腸菌株[pAC-ZEAX; Lotan ら, FEBS Letters, 364:125-128頁 (1995)]およびβ-カロテン産生大腸菌株[pAC-BETA; Cunningham ら, Plant Cell 8:1613-1626頁 (1996)]を形質転換した。形質転換pAC-BETA株のHPLC分析では、70.7%カンタキサンチン、9.9%β-カロテン、さらに、未確認の推定ケトカロテノイドを示した。形質転換pAC-ZEAX株の分析では、70.8%アスタキサンチン、11.8%ゼアキサンチンおよび3.3%β-カロテンを示した。これらの結果は上記のLotanらの論文で報告された結果（同様の研究ではアスタキサンチンが生じないと思われた）およびゼアキサンチンがコードされるケトラーゼの基質ではないという結論と矛盾している。
【０２１６】
実施例2: バイナリーベクター
プラスミドpBHX103
Clarkia breweri LIS1遺伝子の5’-フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学のEran Pichersky博士から入手した。LIS1 5’-フランキング領域を含む約1kb断片を、プライマー: BHX30: CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(配列番号11)およびBHX36: CAGCCCGGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(配列番号12)を用いたPCRにより合成した。これらのプライマーは、一端の5’フランキング領域に、また、3’末端の5’非翻訳リーダー領域内にアニーリングするよう設計した。PCR産物を、その断片の5’および3’末端各々にて切断する制限酵素、Hind IIIおよびSma Iで消化した。消化された断片をゲル精製し、続いて、多重クローニング部位領域(MCS)、続いて、nosポリAシグナル含有領域を含むHind III-およびSma I消化プラスミドに挿入してLIS1::MCS::nosトランスジーン（プラスミド pBHX103と名づけた）を作製した。
【０２１７】
プラスミドpBHX107
プラスミドpATC921（米国特許第5,618,988号; crtBタンパク質コード領域のN末端と融合しているrbcsトランジットペプチドを有するcrtB遺伝子を含む）の1.5kb Hinc II断片を、LIS1プロモーターとプラスミド pBHX103のnos 断片の間に位置するSma I部位にセンス方向に挿入して、プラスミド pBHX107を作製した。
【０２１８】
プラスミドpBHX112
プラスミドpBHX107をHind IIIおよびEcoR Iで消化してLIS1::rbcs::crtB::nosトランスジーンを含む断片を遊離させた。この断片を、Hind IIIおよびEcoR Iで予め消化したT-DNAバイナリーベクターに連結してプラスミドpBHX112を作製した。
【０２１９】
プラスミドpBHX113
Clarkia breweri LIS1遺伝子のプロモーターを含む領域からなるHind III‐EcoR I断片を、上記のように、5’末端にHind III部位を導入したプライマー(LIS1U29: CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC; 配列番号13)および3’末端にSma I部位を導入したプライマー(LIS1L31: CAGCCCGGGATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG; 配列番号14)を用いたPCRにより調製した。GFP遺伝子（Arabidopsis Biological Resource Center in Columbus, OHから入手可能なプラスミドpCD3-327内に含まれるsm-RSGFP型）およびnosポリAシグナルを含む領域と融合されているLIS1 PCR産物を単離した。次いで、この断片を、Hind IIIおよびEcoR Iで予め消化した市販のT-DNAバイナリーベクターpBI101[Jefferson ら., EMBO J., 6(13):3901-3907頁 (1987) を参照]に連結してpBHX113を作製した。
【０２２０】
プラスミドpBHX567
プラスミドpBHX546を制限酵素Sma IおよびEcoR Iで消化してRUBISCOトランジットペプチド、crtW遺伝子およびnosポリアデニル化シグナルを含むDNA断片を遊離させた。プラスミドpBHX113をSma IおよびEcoR Iで消化し、子ウシ小腸アルカリ性ホスファターゼ(CIP)で処理して、GFP遺伝子配列およびnosポリアデニル化シグナルを除去した。pBHX546のそのDNA断片を、連結反応により、消化したバイナリーベクターpBHX113に挿入してプラスミドpBHX567（図10）を作製した。このバイナリー植物発現ベクターは、リナロールシンターゼ1(LIS1)プロモーターによって機能するH.プルヴィアィス β-カロテンケトラーゼ(crtW)遺伝子を含む。
【０２２１】
プラスミドpBHX522
一般バイナリークローニングベクターを、市販のベクター pBI101を改変することで構築した[Jefferson ら, EMBO J., 6(13):3901-3907頁 (1987) を参照]。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)選択マーカー遺伝子を、5’末端にHind IIIおよびMfe I部位を付加したプライマー(nptU38: GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT; 配列番号15)および3’末端にKpn I部位を付加したプライマー(nptL32: CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA; 配列番号16)を用いたPCRにより調製した。このPCR産物を、Hind IIIおよびKpn Iで消化したベクターpBHX533（図2）に連結した。得られたプラスミドをpBHX503と名づけた（図11）。pSAN237のUBQ11プロモーター[Norris ら, Plant Mol. Biol., 21:895-906頁 (1993) を参照]をHind IIIおよびEcoR Iで消化し、Hind IIIおよびMfe Iで消化したプラスミドpBHX503に連結した。得られたプラスミドをpBHX510と名づけた（図12）。
【０２２２】
プラスミドpBHX510をEcoR Iで消化し、クレノウDNAポリメラーゼプラスdNTPsで処理して平滑末端を作製した。次いで、このプラスミドをHind IIIで消化してUBQ11プロモーター、nptII遺伝子およびノパリンシンターゼポリアデニル化シグナル(nos)を含むDNA断片を遊離させた。その断片を、EcoR IおよびPme Iで消化して抗生物質耐性カセットを除去したプラスミド pBI101（上記）に連結した。得られたプラスミドをpBHX522と名づけた（図13）。
【０２２３】
ベクターpBHX522をHind IIIおよびEcoR Iで消化してβ-グルクロニダーゼ(GUS)コード領域およびノパリンシンターゼポリアデニル化シグナルを除去した。上記の各非バイナリーベクターのcrtW発現カセットをHind IIIおよびEcoR Iでの消化により除去し、消化したプラスミドpBHX522に連結した。
【０２２４】
バイナリー型プラスミドpBHX544(LIS1/H. プルヴィアィス crtW)をプラスミドpBHX561と名づけた（図14）。バイナリー型プラスミドpBHX560(UBQ11/H. プルヴィアィス crtW)をプラスミド pBHX565と名づけた（図15）。バイナリー型プラスミドpBHX562(LIS1/A. アウランチアキュム crtW)をプラスミドpBHX563と名づけた（図16）。バイナリー型プラスミドpBHX564(UBQ11/A. アウランチアキュム crtW)をプラスミドpBHX566と名づけた（図17）。第2のLIS1/H. プルヴィアィス crtW バイナリーベクターを、pBHX567と同じ方法で構築し、pBHX586と名づけた（図18）。
【０２２５】
プラスミドpBHX689
カロテノイド発現カセットLIS1::rbcs::crtI::nosを含むバイナリーベクターpBI101を、Hind IIIおよびEcoR Iで消化して発現カセットを単離した。ベクターpUC19をHind IIIおよびEcoR Iで消化し、カロテノイド発現カセットと連結した。得られたプラスミドをプラスミドpBHX612と名づけた（図26）。プラスミドpBHX612をSma IおよびKpn Iで消化してcrtIコード配列を除去した。カロテノイドカセットrbcs::crtB::nosの一部を含むベクターpUC19をSma IおよびKpn Iで消化してcrtB コード配列を単離し、次いで、これを消化したプラスミドpBHX612に連結した。得られたプラスミドをプラスミドpBHX663と名づけた。
【０２２６】
カロテノイド発現カセットUBQ3::rbcs::crtI::nosを含むバイナリーベクターpBI101をSal IおよびEcoR Iで消化して発現カセットを単離した。プラスミドpBHX663を、Xho IおよびEcoR Iで消化し、続いて、単離されたcrtI発現カセットとのライゲーションにより線状化した。得られたベクターをpBHX671と名づけた。
【０２２７】
デュアルカロテノイドカセットを、Hind IIIおよびEcoR Iで消化することによりベクターpBHX671から単離し、次いで、同じ2酵素で消化した一般的な植物形質転換ベクターpBHX650に連結した。得られたプラスミドをプラスミドpBHX689と名づけた（図19）。
【０２２８】
プラスミドpBHX607
一般的なバイナリークローニングベクターを、市販のベクターpBI101を改変することで構築した[Jefferson ら, EMBO J., 6(13):3901-3907頁 (1987) を参照]。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ II(nptII)選択マーカー遺伝子を、5’末端にHind IIIおよびMfe I部位を付加したプライマー(nptU38: GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT; 配列番号15)および3’末端にKpn I部位を付加したプライマー(nptL32: CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA; 配列番号16)を用いたPCRにより調製した。このPCR産物を、Hind IIIおよびKpn Iで消化したベクターpBHX533（図2）に連結した。得られたプラスミドをpBHX520と名づけた。pSAN155のUBQ3プロモーター[Norris ら, Plant Mol. Biol., 21:895-906頁 (1993) を参照]をHind IIIおよびEcoR Iで消化し、Hind IIIおよびMfe Iで消化したプラスミドpBHX520に連結した。得られたプラスミドをpBHX598と名づけた。
【０２２９】
プラスミドpBHX598をKpn Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、このプラスミドをHind IIIで消化してUBQ3プロモーターおよびnptIIコード配列を含むDNA断片を遊離させた。その断片を、EcoR IおよびPme Iで消化して抗生物質耐性カセットを除去したプラスミドpBI101（上記）に連活した。得られたプラスミドをpBHX607と名づけた（図23）。
【０２３０】
プラスミドpBHX658
一般的なバイナリークローニングベクターを、市販のベクターpBI101を改変することで構築した[Jefferson ら, EMBO J., 6(13):3901-3907頁(1987)を参照]。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)選択マーカー遺伝子を、5’末端にHind IIIおよびMfe I部位を付加したプライマー(nptU38: GCACAAGCTTTGGATCGCAATTGATGATTGAACAAGAT; 配列番号15)および3’末端にKpn I部位を付加したプライマー(nptL32: CCCAGGTACCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGA; 配列番号16)を用いたPCRにより調製した。このPCR産物を、Hind IIIおよびKpn Iで消化したベクターpBHX533（図2）に連結した。得られたプラスミドをpBHX520と名づけた（図XX）。pSAN155のUBQ3プロモーター[Norris ら, Plant Mol. Biol., 21:895-906頁 (1993) を参照]をHind IIIおよび EcoR Iで消化し、Hind IIIおよびMfe Iで消化したプラスミドpBHX520に連結した。得られたプラスミドをpBHX598と名づけた。
【０２３１】
プラスミドpBHX598をKpn Iで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、このプラスミドをHind IIIで消化してUBQ3プロモーターおよびnptIIコード配列を含むDNA断片を遊離させた。その断片をDra IIIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製し、続いて、Hind IIIで消化して抗生物質耐性カセットを除去したプラスミドpBI101（上記）に連結した。得られたプラスミドをpBHX654と名づけた。
【０２３２】
pUC19の多重クローニング部位を、Pme III部位を付加したプライマー(pUC19mcsL24 CACGTTTAAACTACCGCACAGATG; 配列番号17)、およびHind III部位を保持したプライマー(pUC19mcsU20 GGCCGCATACAGGCTGTCAG; 配列番号18)を用いたPCRにより調製した。このPCR産物を、Hind IIIおよびPme Iで消化して存在するnpt II選択マーカーを除去したベクターpBHX654に連結した。得られたプラスミドをpBHX658と名づけた（図24）。
【０２３３】
プラスミドpBHX691
カロテノイド発現カセットLIS1::rbcs::crtI::nosを含むバイナリーベクターpBI101をSma IおよびKpn Iで消化してcrtIコード配列を除去した。カロテノイドカセットrbcs::crtW::nosの一部を含むベクターpUC19をSma Iおよび Kpn Iで消化してcrtW コード配列を単離し、次いで、これを、消化したプラスミドpBI101ベクターに連結した。得られたプラスミドをプラスミドpBHX586と名づけた。カロテノイド発現カセットをHind IIIおよびEcoR Iで消化することによりプラスミドpBHX586から除去し、次いで、これをHind IIIおよびEcoR Iで消化したバイナリーベクターpBHX607に連結した。得られたベクターをpBHX665と名づけた。
【０２３４】
E. uredovora crtZ 遺伝子を、5’末端にNde I部位を付加したプライマー(crtZU30 CGGGGATCCTCTACATATGACCAATTTCCT; 配列番号19)および3’末端にKpn I部位を付加したプライマー(crtZL30 CGACGGCCGGTACCAAGCTAGATCTGTCAC; 配列番号20)を用いたPCRにより調製した。PCR産物をNde IおよびKpn Iで消化し、同じ酵素で消化してcrtI遺伝子を除去したカロテノイドカセットUBQ3::rbcs::crtI::nosを含むpUC19 ベクターに連結した。得られたベクターをプラスミドpBHX667と名づけた。
【０２３５】
ベクターpBHX667をHind IIIおよびSal Iで消化することにより線状化した。カロテノイド発現カセットをHind IIIおよびXho Iで消化することによりプラスミド pBHX665から除去し、次いで、プラスミドpBHX667に連結してデュアルカロテノイド発現カセットを作製した。得られたデュアルカロテノイド発現ベクターをプラスミドpBHX683と名づけた。
【０２３６】
プラスミドpBHX683のデュアルカロテノイド発現カセットを、Hind IIIおよびEcoR Iで消化することにより除去し、同じ2酵素で消化した植物発現ベクターpBHX650に連結した。得られたプラスミドをプラスミドpBHX691と名づけた（図20）。
【０２３７】
プラスミドpBHX701
アドニス・アエスチヴァリスケトラーゼ遺伝子を、5’末端にNde I部位を付加したプライマー(ketoU28 GAAACCTCATATGGCAGCAGCAATTTCA; 配列番号21)および3’末端に Kpn I部位を付加したプライマー(ketoL32 CACGGTACCTTCAGGTAGATGGTTGCGTTCGT; 配列番号22XX)を用いたA. aestivalis ゲノムDNAのPCRにより調製した。未消化のPCR産物を市販のベクターpGEM-T Easy（商標）に連結した。スクリーニングにより、Adonis ケトラーゼ 1, AdK1コード配列を含むもの(プラスミド pBHX604)とAdonis ケトラーゼ 2 コード配列, AdK6を含むもの (プラスミド pBHX603)の2つのクローンを同定した。
【０２３８】
プラスミドpBHX612をNot Iおよび Hind IIIで消化し、アニーリングされたオリゴヌクレオチド対(LisAd 1 GGCCGCAAGCTTGAGGAGGTCGAC; 配列番号23、およびLisAd 2 AGCTGTCGACCTCCTCAAGCTTGC; 配列番号24)に連結した。これはNot IおよびHind III部位を修復し、Hind III部位より下流にSal I 部位を付加した。得られたベクターをプラスミドpBHX669と名づけた。
【０２３９】
プラスミドpBHX603をEcoR Iで消化し、クレノウDNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、このプラスミドをKpn Iで消化し、Sma IおよびKpn Iで消化したベクターpBHX669に連結した。得られたプラスミドは、LIS1プロモーターにより駆動され、かつ、ノパリンシンターゼポリアデニル化配列で終結するAdonis ケトラーゼ 2遺伝子, AdK6を含んでおり、これをpBHX685と名づけた。
【０２４０】
プラスミドpBHX685をHind IIIおよびEcoR Iで消化してケトラーゼ発現カセットを単離し、これを、同じ2酵素で消化したバイナリー発現ベクターpBHX607に連結した。得られた発現プラスミドをプラスミドpBHX701と名づけた（図21）。
【０２４１】
プラスミドpBHX749
プラスミドpBHX604をEcoR Iで消化し、クレノウ DNAポリメラーゼで処理して平滑末端を作製した。次いで、このプラスミドをKpn Iで部分的に消化し、Sma IおよびKpn Iで消化したプラスミドpBHX669に連結した。得られたプラスミドは、LIS1プロモーターにより駆動され、ノパリンシンターゼポリアデニル化配列で終結するAdonis ケトラーゼ1, AdK1遺伝子を含んでおり、これをプラスミドpBHX687と名づけた。
【０２４２】
プラスミドpBHX685（上記）をHind IIIおよび EcoR Iで消化してケトラーゼ発現カセットを単離し、次いで、これを、同じ2酵素で消化したバイオリスティックな発現ベクターpBHX650に連結した。得られたケトラーゼ2発現プラスミドをプラスミドpBHX743と名づけた。
【０２４３】
ベクターpBHX743をEcoR IおよびXho Iで消化することにより線状化した。ケトラーゼ 1発現カセットを、EcoR IおよびSal Iで消化することによりプラスミドpBHX687（上記）から除去し、次いで、ベクターpBHX743に連結した。得られたデュアルケトラーゼ発現ベクターをpBHX747と名づけた。
【０２４４】
プラスミドpBHX747をHind IIIおよびEcoR Iで消化してデュアルケトラーゼ発現カセットを単離し、次いで、これを同じ2酵素で消化したバイナリー発現ベクターpBHX658に連結した。得られた発現プラスミドをpBHX749と名づけた（図25）。
【０２４５】
実施例3: タゲテス・エレクタ “Scarletade”のEMS処理
“Scarletade”と呼ばれているタゲテス・エレクタ キサントフィルマリーゴールドの種子（PanAmerican Seed Co. 622 Town Road, West Chicago, IL 60185より市販されている）をメタンスルホン酸エチル（EMS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178より市販されている）で処理した。約2,500種子を400mlの0.4%(v/v)または0.8%(v/v)EMSに加え、周囲温度で8時間ゆっくりと攪拌した。EMS処理後4時間、種子を、各回、400mlの蒸留水で連続攪拌することによる洗浄にて16回洗浄した。次いで、処理した種子（M1種子とする）を水耕栽培用培養土の入ったトレイに播種した。
【０２４６】
数週間後、苗を水耕栽培用培養土の入ったポットに移植し、温室内に維持した。これらの植物から生じた花を自然に自家受粉させた。得られた種子（M2種子とする）を約2,300植物から採取した。これらの2,300植物のうち、約1,500のものが0.4%EMSで処理した種子から成長したものであり、約800のものが0.8%EMSで処理した種子から成長したものであった。突然変異植物の同定を容易にするため、50M1植物ごとのM2種子を合せて1ロットにし、合計47種子ロットを得た。2000年の夏の間に、47ロットの各ロットから500種子を播き、得られた植物をPanAmerican Seed Co. in Santa Paula, CA 93060にて圃場栽培した。
【０２４７】
実施例4: EMS処理したタゲテス・エレクタ “Scarletade”のHPLCによるスクリーニング
EMS処理した“Scarletade”植物をPanAmerican Seed Co. in Santa Paula, CA 93060にて圃場栽培し、HPLCによりゼアキサンチン比の変化に関してスクリーニングした。約98%開花した花を分析用に選択した。各々の花から1つの花弁を花中央から3分の1の範囲を採取し、約5gのガラスビーズを入れた3.5" x 0.75"ガラスバイアルに入れた。-80℃で保存するまで、バイアルをドライアイスと一緒に封入した。
【０２４８】
分析では、溶媒の送達およびアリコートの採取は、シングルインジェクターバルブ Gilson 232XLおよび402 2S1V 希釈装置を備えたロボットシステム[Gilson, Inc. USA, 3000 W. Beltline Highway, Middleton, WI]を用いて行った。鹸化では、3mlの50%水酸化カリウム 水/エタノール性溶液（4 水:1 エタノール）を各バイアルに添加し、続いて、3mlのオクタノールを添加した。鹸化処理を室温にて実施した。その際、バイアルはIKA HS 501 水平型シェーカー[Labworld-online, Inc., Wilmington, NC] （250動作/分にて15時間、続いて、約1時間の静止期）上で維持した。
【０２４９】
鹸化後、上清を0.9mlのメタノールで希釈した。メタノールの添加は、サンプルを確実に均質にする圧力下で実施した。0.25mlシリンジを用いて、0.1mlアリコートを取り出し、分析用のHPLCバイアルに移した。
【０２５０】
HPLC分析では、クォータナリポンプ、真空脱気系、6ウェイインジェクションバルブ、温度調節機能付オートサンプラー、カラムオーブンおよびフォトダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard 1100 HPLCを使用した[Agilent Technologies、Ultra Scientific Inc., 250 Smith Street, North Kingstown, RIを通して入手可能]。カラムはWaters YMC30、5ミクロン、4.6 x 250mm（同じ材料のガードカラム付き）[Waters, 34 Maple Street, Milford, MA]であった。移動相の溶媒は0.2%BHT(2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール)で安定化させた81 メタノール: 4 水: 15 テトラヒドロフラン(THF)であった。注入は20μlであった。分離は30℃で流速1.7ml/分にて定組成とした。ピーク応答は、447nmでの吸光度により測定した。
【０２５１】
このプロトコールを用いて、最初の2,546サンプルの結果を統計解析し、ルテインおよびゼアキサンチン含量の平均値を求めた。これは半定量的な分析スクリーニングであるため、ピーク面積値を用いた。平均より高いルテインおよび／またはゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均に3標準偏差を加えた値を算出した。算出したピーク面積の平均、標準偏差およびゼアキサンチン比を以下の表1に示している。
【表１】
2005532791.tif 000006
【０２５２】
上記の値に基づいて、ルテインピーク面積が1565より大きく、かつ／またはゼアキサンチンピーク面積が91より大きいサンプルを選抜した。また、ルテインピーク面積が大きいことのみ、また、ゼアキサンチン比が10%より大きいことのみに関してもサンプルを選抜した。これらの選抜パラメーターを用いて21,754のアッセイしたサンプルから合計88突然変異体が同定された。各EMS種子処理で得られた突然変異体の総数を以下の表2に示している。
【表２】
2005532791.tif 000007
【０２５３】
これらのアッセイのルテインとゼアキサンチンの相対量に関するさらに具体的な結果を以下の表3に示している。
【表３】
2005532791.tif 000008
【０２５４】
約21,700植物が典型的なゼアキサンチン比 約4〜約7%(約1:25〜約1:15)を示した。上記のデータは、考えられる突然変異が比較的希少であり、また、ほぼ同数の植物がゼアキサンチンレベルの低下を示すことを示している。また、このデータでは、あるレベルの突然変異原の使用が本明細書において用いた他のものに比べて好ましいかどうかは分からない。
【０２５５】
実施例5: タゲテス・エレクタ 13819のEMS処理
13819と名づけられたタゲテス・エレクタ キサントフィルマリーゴールドの種子(PanAmerican Seed Co. 622 Town Road, West Chicago, IL 60185の育種選抜種)をメタンスルホン酸エチル（EMS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178より市販されている）で処理した。約7,000種子を600mlの0.2%(v/v)または0.4%(v/v)EMSに加え、周囲温度で8時間ゆっくりと攪拌した。EMS処理後4時間、種子を、各回、600mlの蒸留水で連続攪拌することによる洗浄にて16回洗浄した。
【０２５６】
次いで、処理した種子（M1種子とする）を水耕栽培用培養土の入ったトレイに播種した。3〜4週間後、苗を圃場に移植した。これらの植物から生じた花を他花受粉させないように袋がけし、自然に自家受粉させた。得られた種子（M2種子とする）を約2,391植物から採取した。これらの植物のうち、約951のものが0.2%EMSで処理した種子から成長したものであり、約1,440のものが0.4%EMSで処理した種子から成長したものであった。
【０２５７】
突然変異植物の同定を容易にするため、50植物ごとのM2種子を合せて1ロットとした。このグルーピングにより、合計48種子ロットを得た。2000年の10月下旬から11月中旬に、0.4%EMS処理の15ロットの各ロットから1000種子を播き、各ロットの700植物をSeaview Nursery in El Rio, CA 93060にて温室栽培した。さらに、2000年10月下旬に、48ロットの全てから1,500種子を播き、各ロットとの765植物をSemillas Pan American Chile LTDA, in Pichidegua, Chileにて圃場栽培した。
【０２５８】
実施例6: EMS処理したタゲテス・エレクタ 13819のHPLCによるスクリーニング
EMS処理した13819 M2植物をSeaview Nursery in El Rio, CA 93060にて温室栽培し、また、Semillas PanAmerican Chile LTDA, in Pichidegua, Chileにて圃場栽培し、ゼアキサンチン比の変化に関してスクリーニングした。約98%開花した花を分析用に選択した。これらの花から花弁を花中央から3分の1の範囲を採取した。約100mgの花弁組織をプラスチックバックに入れ、分析まで冷凍保存した。約5gのガラスビーズを入れた3.5" x 0.75"ガラスバイアルに入れた2花弁の乾燥重量を測定した。
【０２５９】
分析では、溶媒の送達およびアリコートの採取は、シングルインジェクターバルブ Gilson 232XLおよび402 2S1V 希釈装置を備えたロボットシステムを用いて行った。鹸化では、3mlの50%水酸化カリウム 水/エタノール性溶液（4 水:1 エタノール）を各バイアルに添加し、続いて、3mlのオクタノールを添加した。鹸化処理を室温にて実施した。その際、バイアルはIKA HS 501 水平型シェーカー（250動作/分にて15時間、続いて、約1時間の静止期）上で維持した。
【０２６０】
鹸化後、上清を0.9mlのメタノールで希釈した。メタノールの添加は、サンプルを確実に均質にする圧力下で実施した。0.25mlシリンジを用いて、0.1mlアリコートを取り出し、分析用のHPLCバイアルに移した。
【０２６１】
HPLC分析では、クォータナリポンプ、真空脱気系、6ウェイインジェクションバルブ、温度調節機能付オートサンプラー、カラムオーブンおよびフォトダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard 1100を使用した。カラムはWaters YMC30、5ミクロン、4.6 x 250mm（同じ材料のガードカラム付き）であった。標準をDHI-Water & Environment, DK‐2970 Horsholm, Denmark and Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178から入手した。移動相の溶媒は0.2%BHTで安定化させた81 メタノール: 4 水: 15 テトラヒドロフラン(THF)であった。注入は20μlであった。分離は30℃で流速1.7ml/分にて定組成であった。ピーク応答は、447nmにて測定した。
【０２６２】
このプロトコールを用いて、最初の507サンプルの結果を統計解析し、ルテインおよびゼアキサンチン含量の平均値を求めた。平均より高いか、または低いルテインおよびゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均に3標準偏差を加えるか、または引いた値を算出した。算出した平均、標準偏差およびゼアキサンチン比を以下の表4に示している。
【表４】
2005532791.tif 000009
【０２６３】
上記の値に基づいて、ゼアキサンチン比が10%より大きい、ルテインとゼアキサンチンの混合含量が1.12mg/g 生重量より大きい、およびルテインとゼアキサンチン混合含量が0.24mg/g 生重量より小さいサンプルを選抜した。これらの選抜パラメーターを用いて8192サンプルから、ルテインとゼアキサンチンの総量が1.12mg/gより大きい合計347突然変異体が同定され、また、ゼアキサンチン比が10% より大きい43突然変異体が同定された。各EMS種子処理で得られた突然変異体の総数を以下の表5に示している。
【表５】
2005532791.tif 000010
【０２６４】
ゼアキサンチン比が約10%ゼアキサンチンより大きい突然変異体のうち、約47%が10〜13%未満であり、53%が13%以上を示した。
【０２６５】
実施例7: 選抜マリーゴールドの花弁におけるカロテノイド組成物
実施例4に記載のスクリーニング手順により同定されたものから選抜された”Scarletade”野生型および突然変異型サンプルに関してカロテノイド組成物を測定した。花弁サンプルは突然変異体が同定されるまで-80℃のフリーザーで保存した。サンプルを凍結乾燥し、乾燥させた組織を分析直前まで、アルゴン下、-80℃にて保存した。
【０２６６】
抽出手順は赤色光下で行った。乾燥花弁を粉砕してメッシュサイズNo.40の篩いに通した。粉砕したサンプルを正確に秤量し、100mlの褐色メスフラスコに移した。そのサンプルに、500マイクロリットル(μl)のH2Oを添加し、混合物を1分間攪拌した。30mlの抽出溶媒（10mlヘキサン + 7mlアセトン + 6ml無水アルコール + 7mlトルエン）を添加し、フラスコを160rpmにて10分間振盪した。
【０２６７】
鹸化では、2mlの40%メタノール性KOHをフラスコに添加し、次いで、これを1分間攪拌した。このフラスコを56℃のH2O浴に20分間置いた。空気冷却機を取り付けて溶媒の喪失を防いだ。取り付けた冷却機でサンプルを暗室で1時間冷却した。冷却後、30mlのヘキサンを添加し、フラスコを160rpmにて10分間振盪した。
【０２６８】
振盪したサンプルに10%硫酸ナトリウム溶液を加えて定容(100ｍl)にし、1分間激しく振盪した。サンプルは少なくとも30分間暗室に置いた。約50mlの上層から35mlアリコートを取り出し、サンプルカップに移した。さらに30mlのヘキサンをフラスコに添加し、次いで、これを160rpmにて10分間振盪した。約1時間後、これらの上層を合せた。HPLC分析では、10mlアリコートを窒素下にて乾燥させ、アルゴン下、-80℃にて保存した。
【０２６９】
HPLC装置は、冷蔵機能付オートサンプラー、カラムヒーターおよびWaters フォトダイオードアレイ 996検出器(Waters Corp., 34 Maple Street Milford, MA 01757)を備えたAlliance 2690を使用した。分離には、YMC30カラム、3μm、2.0 x 150mm（同じ材料のガードカラム付き）を使用した。標準をICC Indofine Chemicals Somerville, New Jersey 088876およびDHI-Water & Environment, DK‐2970 Horsholm, Denmarkから入手した。
【０２７０】
乾燥させた突然変異体サンプルをテトラヒドロフランおよびメタノールに再懸濁して全容量200μlとし、濾過した。対照にはさらに濃縮は行わなかった。グラジェント法によりカロテノイドを分離した。開始グラジェント条件は、流速 0.4ミリリットル/分(ml/分)にて90%メタノール: 5%水: 5%メチル tert-ブチルエーテルであった。移動相を開始条件から80 メタノール: 5 水: 15 メチル tert-ブチルエーテル（0〜15分）、さらに20 メタノール: 5 水: 75 メチル tert-ブチルエーテル（15〜60分）に変更した。その後10分間、移動相を開始条件に戻し、さらに10分間、カラムを平衡状態にした。カラム温度を27℃に維持し、流速は0.4ml/分であった。注入は10μlとした。ピーク応答の大部分を450nmにて測定し、286、348、400および472nm抽出チャンネルよりさらなるエリアを追加した。
【０２７１】
選択された突然変異体のカロテノイドプロフィールの値を、総面積の割合%としてピーク面積を用い、以下の表6a、6bおよび6cに示した。示されている化合物の同定は、各クロマトグラムでの主要なピークに関して得られた抽出スペクトルおよびエタノール中での最大吸光度(λ最大; ETOH)に基づいて行い、それらのうちのいくつかは既知の標準の保持時間より確認された。値にはその化合物の異性体も含まれている疑いがある。少量の不純物を含む化合物もあるかもしれない。Quackenbush ら, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 55(3):617-621頁 (1972)にて記載されている黄色のアメリカ産マリーゴールド（イエローマリーゴールド）に関する値を表に含めた。表6a〜6cでは、本明細書において使用する手順では分離することができなかったネオキサンチン/ビオラキサンチンおよびクリサンテマキサンチン/フラボキサンチン化合物組に関しては一記載とする。
【表６ａ】
2005532791.tif 000011
【表６ｂ】
2005532791.tif 000012
【表６ｃ】
2005532791.tif 000013
【０２７２】
実施例8:選抜マリーゴールドの葉におけるカロテノイド組成
いくつかのマリーゴールド植物の葉を、存在する有色カロテノイドの相対濃度に関してアッセイした。突然変異植物の葉と比較するために、“Scarletade”および13819の葉を対照として用いた。実施例5の場合のようにアッセイを行い、以下の表7aおよび7bに示している。これらの表では、分離することができなかったネオキサンチン/ビオラキサンチンおよびクリサンテマキサンチン/フラボキサンチン化合物組に関しては一記載とする。表7aおよび7bのデータは、異なる条件下で成長した植物の異なる群から集めた。
【表７ａ】
2005532791.tif 000014
【表７ｂ】
2005532791.tif 000015
【０２７３】
実施例9: 突然変異体の品種改良によるルテインをほとんど含まず、ゼアキサンチン、フィトエン、リコペンまたはβ-カロテンを高レベルに含むマリーゴールドの作製
野生型に比べて高いゼアキサンチンとルテインの比を示すマリーゴールド突然変異体選抜種 124-257を自殖させ、得られた種子を維持した。マリーゴールド選抜種 124-257の自殖から得た植物を父方として、母方PanAmerican Seed 交配系統 F9 Ap(85368-4)との交配に用いた。この交配によりF1植物が作出され、さらに、自殖によりF2集団を得た。
【０２７４】
F2交配による15の苗をルテインの不在に関して、薄層クロマトグラフィー(TLC)により分析した。各苗の約50mgの新鮮な葉組織を秤量して、5個のガラスビーズを入れた100 x 13mm ネジ蓋付試験管に入れた。栓をしたバイアルを-20℃にて保存した。
【０２７５】
分析では、500μlの抽出溶媒（10mlヘキサン + 7ml アセトン + 6ml無水アルコール + 7mlトルエン）を添加し、栓をした試験管を少なくとも45分間攪拌した。攪拌後、この溶液を4mlの琥珀色バイアルに移し、窒素下にて蒸発させた。サンプルを125μlの上記抽出溶媒に再懸濁し、10μlを19チャンネルシリカゲルプレートにスポットした。プレートを約10分間乾燥させた後、100mlの2:1 酢酸エチル: ヘキサン溶液の入った2チャンネル 25cm展開槽で25分間展開させた。取り出して、ルテインの不在に関してサンプルを評価した。
【０２７６】
このスクリーニングから、F2マリーゴールド選抜種 14649-3が同定された。この選抜種を母方として、野生型に比べてエポキシカロテノイド（例えば、ネオキサンチンおよびビオラキサンチン）産生が減少している上、高いゼアキサンチンとルテインの比を示す突然変異体101-190および100-198との交配に用いた。
【０２７７】
マリーゴールド突然変異体選抜種100-198を自殖させ、得られた種子を維持した。マリーゴールド選抜種100-198の自殖から得た植物を父方として、上記の母方選抜種14649-3との交配に用いた。この交配から、F1種子を採取し、これらのうち30種子を植え付けた。得られた植物のうち11のものを自殖させた。この交配から、F2種子を採取し、それらの種子のうち400を植え付け、成長させた。
【０２７８】
上記のように、TLC分析により151の苗の葉を調べた。突然変異体選抜種100-198に特有のエポキシカロテノイドの産生の減少に基づき、32の植物を同定した。残留するTLC抽出物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、実施例5のプロトコールに変更を加えて実施した。変更した点としては、以下のことが挙げられる: 乾燥させたサンプルをメチル tert-ブチルエーテルおよびメタノールに再懸濁し、全てのグラジェント条件では水を6%高め、それに対応してメタノールを1%減少させ、また、カラム温度を25℃に維持した。
【０２７９】
分析から、32の植物のうち7個体が突然変異体選抜種 124-257に特有の高いゼアキサンチンとルテインの比を示すことが確認された。7選抜種の花弁および葉のサンプルを抽出し、上記の変更を加えた実施例5のプロトコールに従って分析した。花弁に関する結果を以下の表8aに示し、葉に関する結果をその後の表9aに示している。さらに、非エステル化ゼアキサンチンが少しでも存在する場合にはその割合%を調べるために、非鹸化花弁サンプルを分析した。それらのデータは表10に示している。
【０２８０】
マリーゴールド突然変異体選抜種101-190を自殖させ、得られた種子を維持した。マリーゴールド選抜種101-190を父方として、上記の母方選抜種14649-3との交配に用いた。この交配からF1種子を採取し、これらの種子うち30のものを植え付けた。得られた植物のうち6のものを自殖させた。この後の交配からF2種子を採取し、植え付け、成長させた。
【０２８１】
現在のTLC分析方法がこの集団について決定付けるものではないことが分かった。そのため、橙色の萼片表現型を所有していることに基づいたHPLC分析に向けて約30植物を選抜した。
【０２８２】
HPLC分析を行った（TLCでは、サンプルが抽出される）。選抜種のうち10のもので、選抜種124-257に特有の高いゼアキサンチンとルテインの比を有する上、突然変異体選抜種 101-190に特有のエポキシカロテノイド産生の減少があることが判明した。
【０２８３】
10選抜種の花弁および葉のサンプルを抽出し、上記の変更を加えた実施例5のプロトコールに従って分析した。花弁に関する結果を表8bおよび8cに示し、葉に関する結果を表9bおよび9cに示している。さらに、非エステル化ゼアキサンチンの割合%を調べるために、非鹸化花弁サンプルを分析した。それらのデータは表10に示している。
【表８ａ】
2005532791.tif 000016
【表８ｂ】
2005532791.tif 000017
【表８ｃ】
2005532791.tif 000018
【表９ａ】
2005532791.tif 000019
【表９ｂ】
2005532791.tif 000020
【表９ｃ】
2005532791.tif 000021
【表１０】
2005532791.tif 000022
【０２８４】
野生型に比べて高いゼアキサンチンとルテインの比を有するとされる突然変異体選抜種 119-494(表6a)を自殖させ、得られた種子を維持した。野生型に比べて高いフィトエンとルテインの比を有するとされる突然変異体選抜種115-004(表6c)を自殖させ、得られた種子を維持した。
【０２８５】
自殖選抜種115-004を母方として、自殖父方119-494との交配に用いた。この交配によりF1植物が生まれ、さらに、自殖によりF2集団を得た。野生型タゲテス・エレクタに比べて高いリコペン異性体の蓄積を示すF2植物は、温室栽培にてそれらの赤い色によって確認された。分析により、リコペンの蓄積、ならびにフィトエンおよびβ-カロテンレベルの上昇が確認された。2回目のヘキサン抽出を実施しないことを除き、上記のHPLCプロトコールに従ってサンプルを分析した。33457-1、33458-1、33459-1、33456-2、33458-2および33461-1と名づけられた６選抜種のデータを以下の表11にて報告する。
【０２８６】
リコペン、フィトエンおよびβ-カロテンを蓄積するさらなる種を後に示した。選抜種 27774-105は、この実施例にて前述した母方14649-3と父方101-190(表8b)の交配によるものである。上記のように、花弁を分析し、データを表11にて報告する。
【０２８７】
選抜 23012-3は、花が2倍大のPanAmerican Seed 交配系統 85394-2を母方、124-257を父方とした交配により生まれたF3植物である。自殖後、ルテインレベルが低いとされるF2選抜種をTLC法により同定し、得られたF3種子をPanAmerican Seed Santa Paula, CAにある圃場に播いた。この集団において、選抜種 23012-3は、その赤い色をした花弁により確認された。上記のように、花弁を分析し、データを表11にて報告する。
【表１１】
2005532791.tif 000023
【０２８８】
実施例 10: タゲテス・エレクタのカロテノイドプロフィールを変更するための別法
化学的突然変異誘発の利用による、変更されたカロテノイドプロフィールを有するタゲテス・エレクタの作製に加えて、変更されたカロテノイドプロフィールを提供するための別法を利用してもよい。別法の例示としては、電離放射線の使用および組換えDNA技術による遺伝子サイレンシングが挙げられる。
【０２８９】
さらに具体的にいえば、電離放射線を利用して、欠失突然変異により遺伝子発現を変更した。γ線は、Dendranthema、Gladiolus およびZinniaをはじめとする観賞用の種の花色を変更することが報告されている[Datta ら, Zeitschrift fur Pflanzen., 120(1):91-92頁 (2001); Masakazu, ら, J. Japanese Soc. For Hort. Sci., 70(1):126-128頁 (2001)およびVenkatachalam ら, Ind. Jour. Gen. & Plant Breed., 57(3):255-261頁 (1997) を参照]。高速中性子は、植物において欠失突然変異を起こすのに有効であった。そのため、51,840植物からなる変異型シロイヌナズナ集団の標的とした遺伝子座の84%に欠失突然変異体が得られた[Li ら, The Plant Journal, 27(3):235-242頁(2001) を参照]。一方、Love ら, Amer. Soc. Hort. Sci., 88:627-630頁 (1966)は、Coleusにおいて葉アントシアニンの突然変異を誘導した。最近になって、Dahliaの花色突然変異体が報告されている[Abe ら, In Vitro Cell. & Dev. Bio. 38:93A頁 (2002) を参照]。
【０２９０】
また、遺伝子サイレンシングを利用して、標的とする遺伝子を不活性化し、花色素形成プロフィールの変更などの所望の表現型を準備することができる。このような方法としては、転写レベル、ならびに転写後レベルでの遺伝子サイレンシングが挙げられる。組換えにより誘導され、安定して組み込まれたトランスジーン、ならびに複製DNAおよびRNAウイルスは、サイレンシング現象を媒介しうる。転写遺伝子サイレンシングは、プロモーターのメチル化および／またはクロマチン縮合を通じて転写開始に障害を起こすことによって起こる。赤レンガ色ペラルゴニジンの花色素形成に関するトランスジーンを含むトランスジェニックペチュニアのホモ接合型後代から、予期せぬことにハイパーメチル化CaMV 35Sプロモーターを有する白色の誘導体が得られた[Meyer ら, Plant Journal 4(1):89-100頁 (1993) を参照]。
【０２９１】
転写は起こるが、RNAを蓄積しない転写後遺伝子サイレンシングは、異常なセンス、アンチセンス、または二本鎖型RNAが生じた際のmRNAの分解によって起こる。ペチュニアでは、フラボノイド生合成経路の酵素カルコンシンターゼをコードする、組換えにより導入され、転写されたセンストランスジーンが、同種の内在性遺伝子およびトランスジーンRNAの発現、同時抑制と呼ばれる現象をダウンレギュレートすることがある。予測されるコードされた酵素の生成増加の代わりに、42%のトランスジェニック植物が白色の花、および／または白色の文様のある花を付けた[Napoli ら, Plant Cell, 2(4):279-289 (1990) を参照]。
【０２９２】
同時抑制が認知されるまで、内在性遺伝子のダウンレギュレーションはアンチセンストランスジーンによって行われた。センスおよびアンチセンスカルコンシンターゼトランスジェニックペチュニアの比較により、75%のセンストランスジェニックと花の色素形成が変更された82%のアンチセンストランスジェニックを確認した[Jorgensen ら, Plant Mol. Biol., 31(5):957-973頁 (1996) を参照]。
【０２９３】
小さな干渉RNA(siRNA)は二本鎖RNAからプロセシングされ、これらは植物での遺伝子のサイレンシングにおいて有効であることが分かっている[Hamilton ら, Science, 286(5441):950-952頁 (1999) を参照]。RNA分解の中間体が同時抑制されたペチュニア植物で確認された[Metzlaff ら, Cell 88(6):845-854頁 (1997) を参照]。二本鎖形成しうるRNAを生み出す形質転換ベクターは、シロイヌナズナの4つの花または分裂組織関連遺伝子の特異的かつ遺伝性の遺伝子干渉を引き起こした[Chuang ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97(9):4985-4990頁 (2000) を参照]。
【０２９４】
さらに、転写後遺伝子サイレンシングは、RNAを切断しうるリボザイムを発現するよう組換えられたベクターによっても達成される。「小型リボザイム」と呼ばれる種類のものとしては、ヘアピンリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムが挙げられる。効率的な遺伝子サイレンシングは、自己相補的ヘアピンRNAをコードする構築物を用いて多様な植物種で例示もされている。イントロンを含む構築物は、一般に、90〜100%の独立したトランスジェニックを示す遺伝子サイレンシングをもたらした[Wesley ら, Plant Journal, 27(6):581-590頁 (2001) を参照]。ジャガイモやせいも病RNAに対するハンマーヘッドリボザイムを発現するトランスジェニックジャガイモ植物は、その複製に対して高い耐性を示した。この耐性は安定して後代に継承された[Yang ら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4861-4865頁 (1997) を参照]。
【０２９５】
本発明において、遺伝子サイレンシングに好適な組換えトランスジーンとしては、カロテノイド産生に必要な酵素をコードするマンジュギク属植物の1以上の配列を含む発現ベクターが挙げられる。発現ベクターを植物組織に導入する方法としては、直接遺伝子導入方法、例えば、マイクロプロジェクティル媒介性送達、DNA注入、エレクトロポレーションなどが挙げられる[Gruber ら, 下記; Miki ら, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick ら編, CRC Press, Boca Raton, FL, 67-88頁 (1993); Klein ら, Biotechnology 10:268頁 (1992) を参照]。発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物組織の直接感染または同時培養によっても植物組織に導入される[Horsch ら, Science 227:1229頁 (1985) を参照]。アグロバクテリウム媒介性遺伝子導入に関するアグロバクテリウムベクター系および方法の説明は、Gruber ら, "Vectors for Plant Transformation," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology , Glick ら (編集), 89-119頁 (CRC Press, 1993), Miki ら, 上記, およびMoloney ら, Plant Cell Reports 8:238頁 (1989)にて示されている。
【０２９６】
実施例11:花の花弁にケトカロテノイドを有するペチュニア
ケトカロテノイドがペチュニアで生成され得るかどうかを調べるため、PanAmerican Seed ペチュニア交配系統6923-1をLIS1::crtW::nos構築物、pBHX586（実施例2）でトランスフェクトした。トランスジェニックペチュニア植物を再分化し、586-3401-1-1および586-2901-1-1と名づけられた2系統をHPLC分析により評価した。花弁組織を凍結乾燥し、乾燥植物材料のカロテンおよびキサントフィルの公定抽出方法に従い、2回目のヘキサン抽出も加えて抽出した（Official Methods of Analysis (1980) 第13版, AOAC, Arlington, VA, sec. 43.018-43.023を参照）。抽出中、組織を鹸化しなかった。
【０２９７】
HPLC装置は、冷蔵機能付オートサンプラー、Cera 250カラムヒーター/クーラー、およびWaters フォトダイオードアレイ 996検出器(Waters Corp., Milford, MA)を備えたWaters Alliance 2690を使用した。分離には、YMC30カラム、3μm、2.0 x 150mm（同じ材料のガードカラム付き）を使用した。標準をICC Indofine Chemicals(Somerville, NJ)、Sigma Chemicals(St. Louis, MO)およびDHI-Water & Environment(Horsholm, Denmark)から入手した。乾燥させたサンプルを酢酸エチルおよびメタノールに再懸濁し、注入は10μlであった。
【０２９８】
グラジェント法によりカロテノイドを分離した。開始グラジェント条件は、91容量%メタノール: 4容量%水: 5容量%酢酸エチルであった。移動相を開始条件から81%メタノール: 4%水: 15%酢酸エチル（0〜15分）、さらに21%メタノール: 4%水: 75%酢酸エチル（15〜60分）に変更した。その後10分間、移動相を開始条件に戻し、さらに10分間、カラムを平衡状態にした。カラム温度を15℃に維持し、流速は初めから終わりまで0.4ml/分であった。
【０２９９】
選択された突然変異体のカロテノイドプロフィールの変更された値を、474nmでの標準化したピーク面積により示す。その値にはその化合物の異性体も含まれている疑いがある。少量の不純物を含む化合物もあるかもしれない。
【０３００】
以下の表12に示すように、トランスジェニックペチュニア系統 586-3401-1-1および586-2901-1-1は、対照ペチュニア花弁組織に存在しないケトカロテノイドアスタキサンチン、アドニルビンおよびカンタキサンチンを含有している。
【表１２】
2005532791.tif 000024
【０３０１】
トランスジェニックペチュニア系統 586-3401-1-1および586-2901-1-1を各々、父方または母方のいずれかとして、合計6つの独立した交配に用いた。交配の際のもう一方の親を、LIS1::rbcs::crtB::nos(pBHX112)構築物でトランスフェクトした“Mitchell”ペチュニア系統の群を用いた別の交配研究[Ausubel ら, Plant Mol Biol Rep 1: 26-32頁 (1980)]から選抜した。crtB遺伝子は酵素フィトエンシンターゼをコードする。この研究では、HPLC分析に45植物を選抜した。花弁組織抽出手順、HPLC装置、および使用した標準は上記の通りとした。
【０３０２】
乾燥させたサンプルをメチル tert-ブチルエーテルおよびメタノールに再懸濁して全容量200マイクロリットル(μl)とし、濾過した。グラジェント法によりカロテノイドを分離させた。開始グラジェント条件は、流速 0.4ミリリットル/分にて90%メタノール: 5%水: 5%メチル tert-ブチルエーテルであった。移動相を開始条件から80メタノール: 5 水: 15 メチル tert-ブチルエーテル（0〜15分）、さらに20 メタノール: 5 水: 75 メチル tert-ブチルエーテル（15〜60分）に変更した。その後10分間、移動相を開始条件に戻し、さらに15分間、カラムを平衡状態にした。カラム温度を27℃に維持した。注入は10μLであった。
【０３０３】
10種の最大のβ-カロテン蓄積植物のデータを以下の表13に示している。カロテノイドの値を、ピーク面積を用いて450nmでの総面積に対する割合%として示した。スペクトル特性に基づいてフィトエンを同定し、マックスプロットからフィトエンエリアを決定した。データを標準化したピーク面積として表し、括弧内の数字は、総カロテノイドピーク面積を構成している各カロテノイド化合物の割合%を示している。これらのトランスジェニック植物では、“Mitchell”対照と比べて、β-カロテンレベルの約5〜約10倍の増加が認められた。また、対照花弁組織では検出されないフィトエンがトランスジェニック植物花弁では存在することも認められた。
【表１３】
2005532791.tif 000025
【０３０４】
crtBに関する交配研究では、形質転換体をPanAmerican Seed ペチュニア交配系統 6923-1と交配させた。得られた植物を自殖させ、種子を採取し、播種し、得られた植物を成熟させ、開花させた。この集団から、13021-1、13023-1、13040-1および13041-2と呼ばれる植物を一方の親として、586-3401-1-1または586-2901-1-1いずれかとの交配に用いた。これらの交配から、種子を採取し、播種し、得られた植物を成長させて開花させた。この分離集団から、花色の変化に基づき、HPLC分析用に27植物を選抜した。
【０３０５】
花弁組織を凍結乾燥し、2回目のヘキサン抽出を実施しないことを除き、上記の通り抽出した。グラジェント法によりカロテノイドを分離させた。開始グラジェント条件は、92容量%メタノール: 3容量%水: 5容量%酢酸エチルであった。移動相は、0〜13分まで開始条件で維持し、13〜45分まで32%メタノール: 3%水: 65%酢酸エチル、さらに45〜50分まで維持した。その後10分間、移動相を開始条件に戻し、さらに10分間、カラムを平衡状態にした。カラム温度を15℃に維持し、流速は初めから終わりまで0.40ml/分であった。
【０３０６】
系統586-3401-1-1および586-2901-1-1の形質転換誘導材料、PanAmerican Seed ペチュニア交配系統6923-1を対照として用いた。さらに、一方の親、系統586-3401-1-1を分析に加えた。以下の表14に示すように、トランスジェニック分離集団中のいくつかのペチュニア系統は、対照ペチュニア花弁組織には存在していないアスタキサンチン、アドニルビン、およびカンタキサンチンを含有している。
【０３０７】
既知の標準の保持時間で溶出されていない多数のピークは、それらが１以上の4-ケト-β-イオネン環を有することを明示するUV-可視スペクトルを有している。これらは完全には同定されてはいないが、3-ヒドロキシエキネノン、3’-ヒドロキシエキネノン、ならびにアスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、3-ヒドロキシエキネノン、および3’-ヒドロキシエキネノンのモノまたはジエステルを含む可能性がある。
【表１４】
2005532791.tif 000026
【０３０８】
PanAmerican Seed 交配系統2088-2をLIS1::AdK6::nos::-LIS1::AdK1::nos構築物、pBHX749でトランスフェクトした。この形質転換により、1つの顕花植物が得られた。上記のようにHPLC分析を利用して、ペチュニアトランスジェニック系統が、450nmにて測定したアスタキサンチンと同じ保持時間であるカロテノイドを有することが確認された。
【０３０９】
実施例12: 花の花弁にケトカロテノイドを有するマリーゴールド
PanAmerican Seed 交配系統13819をLIS1::rbcs::crtW::nos構築物、pBHX586でトランスフェクトし、得られた形質転換植物を成熟させ、開花させた。約200の顕花植物集団から、花色の変化に基づき、薄層クロマトグラフィー(TLC)スクリーニング用に26植物を選抜した。系統13819を対照として用いた。
【０３１０】
各成熟個体の花の約100mgの新鮮な花弁組織を秤量して、5個のガラスビーズを入れた100 x 13mmネジ蓋付試験管に入れた。栓をしたバイアルを-80℃にて保存した。分析では、1mlの抽出溶媒、ヘキサン:アセトン:エタノール:トルエン、10:7:6:7(v:v)を添加し、栓をした試験管を1時間攪拌した。攪拌後、この溶液を4mlの琥珀色バイアルに移し、窒素下にて乾固させた。この手順を30分の攪拌により繰り返し、抽出物を合せた。サンプルを125μlの上記抽出溶媒に再懸濁し、10μlを19チャンネルシリカゲルプレート(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ)にスポットした。プレートを約5分間乾燥させた後、100mlのヘキサン:アセトン、4:1(v:v)の入った2チャンネル 25cm展開槽で20分間展開させた。
【０３１１】
マリーゴールドトランスジェニック系統により得られた結果を、ケトカロテノイドの存在に関してアドニス・アエスチヴァリス参照と肉眼で比較した。アドニス・アエスチヴァリス はアスタキサンチンおよび他のケトカロテノイドの蓄積を1つの要因として深紅の花色を有する植物種である。586-3201-1-12および586-3701-1-22Aと名づけられた2系統は、ケトカロテノイドを有することが判明した。
【０３１２】
この系統586-3201-1-12を母方として、父方124-257、野生型に比べて高いゼアキサンチンとルテインの比を示すことが実施例4で判明した突然変異体との交配に用いた。種子を採取し、播種した。得られた26植物を成長させて十分に開花させた。
【０３１３】
全ての植物はヘテロ接合体であったため、劣性突然変異体のカロテノイドプロフィールを有するものはなかった。花の予備TLCスクリーニングを、対照として124-257および13819、ならびにケトカロテノイド参照としてアドニス・アエスチヴァリスを用いて実施した。スクリーニングは、攪拌は少なくとも1時間30分であり、また、攪拌を繰り返さないことを除き、上記の同じ手順に従った。F1-1〜F1-6と名づけられた6系統がケトカロテノイドを有することが判明した。
【０３１４】
トランスジェニックのケトカロテノイドレベルを定量するため、系統F1-1〜F1-6、586-3201-1-12および586-3701-1-22A、ならびに対照系統13819の花弁を採取し、凍結乾燥し、分析まで、アルゴン下、-80℃にて保存した。乾燥花弁材料を粉砕してメッシュサイズNo.40の篩いに通し、正確に秤量した50mgのサンプルを、5個のガラスビーズを入れた100 x 13mmネジ蓋付試験管に移した。2ミリリットルの上記抽出溶媒を添加し、栓をした試験管を1時間攪拌した。攪拌後、サンプルを5分間遠心分離し、抽出溶液を4mlの琥珀色バイアルに移し、窒素下にて乾固させた。抽出溶液が無色であり続ける限り、この手順を3〜5回繰り返した。乾燥サンプルをアルゴン雰囲気下、-80℃にて保存した。
【０３１５】
デンシトメトリーを利用し、サンプルをアドニス・アエスチヴァリス参照曲線との比較により定量した。この分析では、サンプルを1.5μlの上記抽出溶媒に再懸濁し、攪拌した。アスタキサンチンエステルの参照曲線を作成するため、アドニス・アエスチヴァリス抽出物から0.2%〜10.0%の10希釈物を作製した。サンプルを5.5インチ綿栓付きパスツールピペットで抜き取り（濾過し）、2 mlオートサンプラーバイアル（スナップキャップ付）に移した。
【０３１６】
CAMAG自動TLCサンプラー4(CAMAG Scientific Inc., 515 Cornelius Harnett Drive, Wilmington, NC 28401)を用いて、各サンプルの6μlをHPTLC シリカゲル 60 F 254、20 x 10cmプレート(E. MERCK KgaA)に8 mmのバンドとして付くように噴霧した。プレーティング溶媒を蒸発させ、プレートをCAMAGツイントラフチャンバーで展開させた。10ミリリットルのヘキサン:アセトン、4:1(v:v)を両側のチャンバーに入れ、プレートを60mmまで展開させた。取り出した後、溶媒を蒸発させ、プレートをCAMAG TLCスキャナー 3でスキャンニングし、プレートのイメージをCAMAG Reprostar（商標）3で記録した。
【０３１７】
Rf 0.37、Rf 0.28およびRf 0.54の吸光度は、Adonis抽出物のアスタキサンチン、アドニルビンおよびアドニキサンチンのスペクトル特性各々と関連した。マリーゴールドサンプルでは、Rf 0.38の吸光度がアスタキサンチンのスペクトル特性と関連した。この差異は付加される脂肪酸部分の違いによると考えられる。アスタキサンチンおよびアドニルビンの値は、アドニス・アエスチヴァリス参照に対する割合%として算出した。データを以下の表15に示している。対照13819で検出された低い吸光度はケトカロテノイド化合物との関連がなかった。調べた全てのトランスジェニックでは、アドニキサンチンの値がアドニス・アエスチヴァリス参照より高かった。算出した吸光度より、最大の測定値を有する3種の植物は、最大〜最小の順に、F1-3、586-3201-1-12、およびF1-5であった。
【表１５】
2005532791.tif 000027
【０３１８】
以上で分析した植物F1-1〜F1-6を母方として、父方124-257、実施例4で確認された突然変異体との独立した戻し交配に用いた。種子を採取し、播種した。植物を成長させて十分に開花させ、カロテノイド突然変異体および野生型プロフィールのいずれにおいてもトランスジーンの分離を確認した。
【０３１９】
突然変異体および野生型カロテノイドプロフィールの両方を有する59植物を、濾過の前に、1.5 mlの再構成したサンプルから150μlを除去したことを除き、上記と同じデンシトメトリー手順により評価した。最大のケトカロテノイド生産株20種のデータを以下の表16に示している。最大のアスタキサンチン生産株2種が、高いゼアキサンチンとルテインの比という突然変異体 124-257プロフィールを有する植物由来のものであったことに注目すべきである。上記のように、調べた全てのトランスジェニックでは、アドニキサンチンの値はアドニス・アエスチヴァリス参照よりも高かった。算出した吸光度より、最大の測定値を有する3種の植物は、最大〜最小の順に、F2#3-4、F2#1-37およびF2#1-20である。
【表１６】
2005532791.tif 000028
【０３２０】
PanAmerican Seed 交配系統13819をLIS1::AdK6::nos構築物、pBHX701で形質転換し、得られた形質転換植物を成熟させ、開花させた。AdK6配列はトランジットペプチド、ならびにケトラーゼをコードする。61顕花植物からなるこの集団から、花色の変化に基づき、薄層クロマトグラフィー(TLC)スクリーニング用にこれらのうちの1つ、系統701-2502-1-35を選抜した。スクリーニングは、攪拌は少なくとも1時間30分であり、また、攪拌を繰り返さないことを除き、上記の同じ非定量的手順に従った。系統13819を対照として用いた。アドニス・アエスチヴァリスケトカロテノイド参照との目視比較により、マリーゴールドトランスジェニック系統がケトカロテノイドを有することが判明した。
【０３２１】
実施例14: ペチュニアのカロテノイドトランスジーンでの粒子衝撃形質転換
ペチュニアでのケトカロテノイド産生をさらに調べるため、PanAmerican Seed Co., 622 Town Road, West Chicago, IL 60185から市販されるEasy Wave（商標）whiteをプラスミド pBHX689 UBQ3::nptII::LIS1::rbcs::crtB::nos::UBQ3::rbcs::crtI::nosまたはプラスミド pBHX691 UBQ3::nptII::LIS1::rbcs::crtW::nos::UBQ3::rbcs::crtZ::nosのいずれかで形質転換した。形質転換系は葉由来のプロトプラストの粒子衝撃であった。ペチュニアプロトプラストの単離および再分化に関する技術は当技術分野では周知である[Binding, Mongr Theor Appl Genet, 9:123-132頁 (1984) を参照]。
【０３２２】
本研究では、温室栽培の4分の3展開〜完全展開した葉をプロトプラストの単離用に選抜した。プロトプラストの単離前に、全ての葉をTween（登録商標）20を数滴加えた12%Clorox（登録商標）溶液で約12分間表面殺菌した。表面殺菌した後、葉を滅菌蒸留水で4回洗い流した。次いで、葉を約0.2〜0.5mm片に切断し、約25mlの原形質分離液に入れ、約40分間インキュベートした。13グラムのマンニトールを加えた原形質分離液を、それ自体0.272mg/l KH2PO4、1.01mg/l KNO3、2.46mg/l MgSO4.5H2O、0.0016mg/l KI、0.00025mg/l CuSO4.2H2O、および148.0mg/l CaCl2.2H2Oを含有するCPWと呼ばれる塩溶液100mlに溶かした。原形質分離液は、オートクレーブ滅菌の前にpH値を5.7に調整した。
【０３２３】
インキュベーション後、原形質分離液を除去し、消化酵素液と置き換えた。500mgセルラーゼ R10(Yakuit Honsha Co., Tokyo, Japan)および100mgマセラーゼ(CalBiochem, La Jolla, CA)を含む消化酵素液を上記のような100ml CPW 塩溶液に溶かし、滅菌濾過の前にpH値を5.7に調整した。組織を揺動シェーカー上に置き、約14時間インキュベートした。
【０３２４】
次いで、プロトプラストを50ml円錐型遠心管に移し、45 x gにて10分間の遠心分離によりペレット化し、その後、それらをプロトプラスト洗浄媒質で洗浄した。プロトプラスト洗浄媒質は、以下の添加剤: 1.9g/l KNO3、100mg/lグルタミン、20mg/lカゼイン加水分解物、10mg/lチアミンHCl、2mg/lグリシン、0.5mg/lニコチン酸、0.1mg/lセリン、2g/lミオイノシトール、および90g/lソルビトールを添加した、窒素不含のMurashigeおよびSkoog基礎塩培地、M531(PhytoTechnology Laboratories LLC, Shawnee Mission, KS)で構成された。オートクレーブ滅菌の前に培地のpH値を5.7に調整した。
【０３２５】
精製では、プロトプラストをペレット化し、5mlの上記プロトプラスト洗浄媒質に再懸濁し、15ml円錐型遠心管に入れた7mlの密度勾配溶液上に重層した。50mlの上記CPW塩溶液および25mlのhistopaque(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)に8.56gのスクロースを溶かして密度勾配を準備した。滅菌濾過の前に密度勾配のpH値を5.7に調整した。混合物を95 x gにて12分間回転させ、プロトプラストを界面で回収した。
【０３２６】
精製後、プロトプラストをペレット化し、以下の添加剤: 250mg/lカゼイン加水分解物、20ml/lココナッツミルク、17.1g/lスクロース、63.8g/lマンニトール、2g/lミオイノシトール、1mg/l 2, 4-ジクロロフェノキシ酢酸、1mg/l 1-ナフタレン酢酸、および0.5mg/l 6-ベンジルアミノプリンを添加したK427(PhytoTechnology Laboratories LLC, Shawnee Mission, KS)で構成される改変KaoおよびMichayluk液体培地に再懸濁した。
【０３２７】
滅菌濾過の前に培地のpH値を5.7に調整した。次いで、プロトプラスト懸濁物を、以下の添加剤: 1.9g/l KNO3、100mg/lグルタミン、20mg/lカゼイン加水分解物、10mg/lチアミンHCl、2mg/lグリシン、0.5mg/lニコチン酸、0.1mg/lセリン、2g/lミオイノシトール、17.1g/lスクロース、31.9g/lマンニトール、31.5g/lグルコース、1mg/l 2, 4-ジクロロフェノキシ酢酸、1mg/l 1-ナフタレン酢酸、および0.5mg/l 6-ベンジルアミノプリンを添加した、上記M531を含有する改変MurashigeおよびSkoog固体培地に播種した。5g/l洗浄済寒天の添加およびオートクレーブ滅菌の前に培地のpH値を5.7に調整した。
【０３２８】
培養では、約4mlの上記改変KaoおよびMichayluk液体培地を上記改変MurashigeおよびSkoog固体培地の上部に重層した後、約1mlのプロトプラスト懸濁物を液体培地にゆっくりとに移した。次いで、培養した細胞を約23〜24℃にて暗室培養条件に置いた。最初の培養約8〜10日後、プロトプラスト由来の細胞を、以下の添加剤: 250mg/lカゼイン加水分解物、20ml/lココナッツミルク、103g/lスクロース、2g/lミオイノシトール、1mg/l 1-ナフタレン酢酸、および0.5mg/l 6-ベンジルアミノプリンを添加したK427で構成されている改変KaoおよびMichayluk固体培地に播種した。5g/l精製済寒天(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の添加およびオートクレーブ滅菌の前に培地のpH値を5.7に調整した。
【０３２９】
固体培地への播種3日後、Biolistic（登録商標）粒子送達系、型PDS 1000(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)により培養物に粒子を撃ち込んだ。衝撃条件としては、ラプチャーディスクが破裂する圧力900psi、ストッピングスクリーンから培養物表面までの距離9cm、および各衝撃につき0.6μm金粒子にコーティングされるDNAベクター約800ngが挙げられる。
【０３３０】
各培養プレートには、2種類の衝撃処理を行った。衝撃直後にプレートを約23〜24℃にて48時間暗室条件に置いた。この後、培養物をスクロースを80g/lに下げ、寒天を7g/lに上げ、さらに、滅菌濾過した100mg/lカナマイシンを添加した上記改変KaoおよびMichayluk固体培地に移した。さらに8〜14日後、培養物を滅菌濾過した100mg/lカナマイシンを含有する再分化培地に移した。以下の添加剤:30g/lスクロース、0.5mg/l 6-ベンジルアミノプリン、および1mg/lインドール-3-酢酸で再分化を行った。8g/l寒天の添加およびオートクレーブ滅菌の前に培地のpH値を5.7に調整した。
【０３３１】
シュートが再分化されるまで3〜4週間おきに、発生したコロニーを100mg/lカナマイシンを含有する再分化培地に二次培養した。根付いた植物を温室内で定着させ、成長させて開花させた。
【０３３２】
フィトエンシンターゼ（ゲラニルゲラニルピロリン酸からフィトエンを作製する）をコードする遺伝子crtBおよびフィトエンデサチュラーゼ（フィトエンをリコペンへと変換する）をコードするcrtIを有するプラスミド pBHX689構築物を用いて、225植物を温室内で定着させた。これらの植物のうち、5のものが花喉に橙色の着色がある目で確認できる表現型を有していた。以前の調査により、この表現型がβ-カロテンの増加と関係していることが分かっている。この構築物ではケトカロテノイド産生は見込めない。
【０３３３】
遺伝子crtW β-カロテンケトラーゼ（β-カロテンに存在するような4位が非置換であるカロテノイドβ-イオネン環を4-ケト基を有するカロテノイドβ-イオネン環へと変換する）、およびβ-カロテンヒドロキシラーゼ（3位が非置換であるカロテノイドβ-イオネン環を3-ヒドロキシ基を有するカロテノイドβ-イオネン環へと変換する）のcrtZを有するプラスミド pBHX691構築物を用いて、219植物を温室内で定着させた。これらの植物でケトカロテノイド産生を明らかにする表現型を示すものはなかった。いずれの理論にも縛られるものではないが、これらの結果は reflect研究したこの一連の植物における基質β-カロテンの限定されたアベイラビリティーを反映していると考えられる。
【０３３４】
本明細書において引用する特許および論文各々は、参照により本明細書に組み入れられる。論文で使用する "a"または"an"は、「１以上の」を含むと考えられる。2003年3月20日出願の、"Plant Expression Cassette"と題する、共同所有する出願番号不明の開示内容もまた、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３３５】
上記の内容から、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、数多くの修飾および変形を行うことができることが分かるであろう。記載した特定の実施例に関して何ら制限は意図されないし、または、そう考えるべきではない。この開示内容は、添付の特許請求の範囲により、請求項の範囲に入るような修飾を包含するよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】ルテイン、アスタキサンチンおよび他のキサントフィルの産生に関する生物学的合成経路の略図である。その経路での最初のC40カロテノイド、フィトエンは数ステップで（2つの矢印）リコペンへと変換される。その後、この経路は、1つのε環を含有するδ-カロテン、次ぎに、1つのε環と1つのβ環を含有するα-カロテン、続いて、α-クリプトキサンチンからルテインを生成するか、または1つのβ環を含有するγ-カロテン、次ぎに、2つのβ環を含有するβ-カロテンを生成するよう分かれる。β-カロテンからこの経路は、β-クリプトキサンチン、次ぎに、ゼアキサンチンを生成し、このゼアキサンチンからエポキシド含有キサントフィル、アンテラキサンチン、ビオラキサンチンおよびネオキサンチンへと続くか、またはさらなるステップ（2つの矢印）によりアスタキサンチンへと続くように分岐する。β-カロテンは別の枝を通じて、エキネノン、次ぎに、カンタキサンチンへと変換され、さらなる1つのステップ（2つの矢印）によりアスタキサンチンへと変換される。
【図２】ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列を含む約2948塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX533、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図３】ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列に機能しうる形で連結されたケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)ポリペプチドをコードする配列を含む約3919bp DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX539、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図４】RUBISCO(RBCS)/ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)キメラポリペプチドをコードしている遺伝子、ならびにノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列を含む約4076塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX543、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図５】RUBISCO(RBCS)/ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)キメラポリペプチドをコードしている遺伝子、ならびにシロイヌナズナ由来のユビキチン 3プロモーター(UBQ3)、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列を含む約5422塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX546、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図６】RUBISCO(RBCS)/ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW) キメラポリペプチドをコードしている遺伝子、ならびにリナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1)5'上流域プロモーター、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列を含む約5099塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX544、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図７】LIS1プロモーターの代わりに、シロイヌナズナ由来のユビキチン 11(UBQ11)プロモーターを組み込んだプラスミド pBHX544から作製した約4652bp DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX560、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図８】ヘマトコッカス・プルヴィアィス由来の遺伝子の代わりに、アグロバクテリウム・アウランチアキュム crtW遺伝子を組み込んだプラスミド pBHX544から作製した約4862bp DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX562、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図９】ヘマトコッカス・プルヴィアィス由来の遺伝子の代わりに、アグロバクテリウム・アウランチアキュム crtW遺伝子を組み込んだプラスミド pBHX560から作製した約4325bp DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX564、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１０】RUBISCO(RBCS)/ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)キメラポリペプチドをコードしているDNA、ならびにノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーターを含む約14,188bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX567、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１１】約3718bpオマイシンホスホトランスフェラーゼ II(nptII)選択マーカーが組み込まれた市販のベクターpBI101からPCRにより作製した、インサートの5’末端にHind IIIおよびMFE I部位を、また、3’末端にKpn I 部位がさらに付加された中間体プラスミド pBHX503、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１２】UBQ11 プロモーターが3'末端に機能しうる形で連結されたプラスミド pBHX503から、プラスミド が約4255bp DNAセグメントを含むように作製した中間体プラスミドpBHX510、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１３】プラスミドpBHX510から作製した、UBQ11プロモーターにより制御されるnptIIマーカー遺伝子およびnos ポリアデニル化部位を含む約13,046bp DNAセグメントが組み込まれた中間体プラスミドpBHX522、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１４】プラスミドpBHX522のβ-グルクロニダーゼコード領域(gusA)およびnos ポリアデニル化部位の代わりに、プラスミドpBHX544のキメラ酵素をコードしているDNAおよび制御配列を含む約13,320bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX561、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１５】プラスミドpBHX522のβ-グルクロニダーゼ(gusA) コード領域およびnos ポリアデニル化部位の代わりに、プラスミドpBHX560のキメラ酵素をコードしているDNAおよび制御配列を含む約12,783bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX565、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１６】プラスミドpBHX522のβ-グルクロニダーゼ(gusA)コード領域およびnos ポリアデニル化部位の代わりに、プラスミドpBHX562のキメラ酵素をコードしているDNAおよび制御配列を含む約13,083bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX563、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１７】プラスミドpBHX522のβ-グルクロニダーゼ(gusA)コード領域およびnos ポリアデニル化部位の代わりに、プラスミドpBHX564のキメラ酵素をコードしているDNAおよび制御配列を含む約12,546bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX566、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１８】RUBISCO(RBCS)/ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)キメラポリペプチドをコードしているDNA、ならびにノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーターを含む約14,188bp DNAセグメントを組み込んだバイナリープラスミドpBHX586、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図１９】リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、RUBISCO(RBCS)小サブユニット、フィトエンシンターゼ(エルウィニア・ウレドボラ crtB)ポリペプチドをコードする配列、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、ユビキチン3プロモーター、RUBISCO(RBCS)小サブユニット、フィトエンデサチュラーゼ(エルウィニア・ウレドボラ crtI)ポリペプチドをコードする配列、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来のもう1つの3’終止配列、もう1つのユビキチン 3プロモーター、および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約10259塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミド pBHX689、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図２０】リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、RUBISCO(RBCS)小サブユニット、ケトラーゼ(ヘマトコッカス・プルヴィアィス crtW)ポリペプチドをコードする配列、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、ユビキチン 3プロモーター、RUBISCO(RBCS)小サブユニット、ヒドロキシラーゼ(エルウィニア・ウレドボラ crtZ)ポリペプチドをコードする配列、ノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来のもう1つの3’終止配列、もう1つのユビキチン 3プロモーター、および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約9356塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX691、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図２１】リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、ケトラーゼコード配列、Keto2 cds、(アドニス・アエスチヴァリス AdK6)およびノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、ユビキチン 3プロモーター、および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約13697塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX701、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図２２】多重クローニング部位(mcs)、ユビキチン 3プロモーター(UBQ3)および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約4623塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX650を図式に示す。
【図２３】多重クローニング部位(mcs)、ユビキチン 3プロモーター、および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約13611塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX607を図式に示す。
【図２４】多重クローニング部位、ユビキチン 3プロモーターおよび選択マーカー遺伝子nptIIを含む約11373塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX658を図式に示す。
【図２５】リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、ケトラーゼコード配列、Keto2 cds、(アドニス・アエスチヴァリス AdK6)およびノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、ケトラーゼコード配列、Keto1 cds、(アドニス・アエスチヴァリス AdK1)およびノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列、ユビキチン 3プロモーター、および選択マーカー遺伝子nptIIを含む約15847塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX749、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【図２６】リナロールシンターゼ 1遺伝子(LIS1) 5'上流域プロモーター、RUBISCO(RBCS)小サブユニット、フィトエンデサチュラーゼ(エルウィニア・ウレドボラ crtI)ポリペプチドをコードする配列、およびノパリンシンターゼ(nos)をコードするアグロバクテリウム Ti-DNA由来の3’終止配列を含む約5627塩基対(bp)DNAセグメントを組み込んだプラスミドpBHX612、ならびにいくつかの重要な制限酵素部位およびそれらの位置番号を図式に示す。
【配列表】
2005532791.tif 000029
2005532791.tif 000030
2005532791.tif 000031
2005532791.tif 000032
2005532791.tif 000033
2005532791.tif 000034
【図１】
2005532791.tif 000035
【図２】
2005532791.tif 000036
【図３】
2005532791.tif 000037
【図４】
2005532791.tif 000038
【図５】
2005532791.tif 000039
【図６】
2005532791.tif 000040
【図７】
2005532791.tif 000041
【図８】
2005532791.tif 000042
【図９】
2005532791.tif 000043
【図１０】
2005532791.tif 000044
【図１１】
2005532791.tif 000045
【図１２】
2005532791.tif 000046
【図１３】
2005532791.tif 000047
【図１４】
2005532791.tif 000048
【図１５】
2005532791.tif 000049
【図１６】
2005532791.tif 000050
【図１７】
2005532791.tif 000051
【図１８】
2005532791.tif 000052
【図１９】
2005532791.tif 000053
【図２０】
2005532791.tif 000054
【図２１】
2005532791.tif 000055
【図２２】
2005532791.tif 000056
【図２３】
2005532791.tif 000057
【図２４】
2005532791.tif 000058
【図２５】
2005532791.tif 000059
【図２６】
2005532791.tif 000060
【国際調査報告】
2005532791.tif 000061
2005532791.tif 000062
2005532791.tif 000063
2005532791.tif 000064