(57)【要約】細胞壁を有する生細胞の透過性を高める為の方法であって、（ａ）細胞の表面に接触する流体またはゲルを加圧する工程と、（ｂ）流体またはゲルを減圧する工程とを含み、細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成する方法を提供する。【解決手段】細胞壁を有する生細胞の透過性を高める方法であって、（ａ）該細胞の表面に接触する流体またはゲルを加圧する工程と、（ｂ）前記流体またはゲルを減圧する工程と、を包含し、該細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞壁を有する生細胞の透過性を高める方法であって、
（ａ）該細胞の表面に接触する流体またはゲルを加圧する工程と、
（ｂ）前記流体またはゲルを減圧する工程と、
を包含し、該細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記流体またはゲルを減圧する工程が、前記細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成し得る気泡を発生させるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、２ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ）またはそれ以上である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、２〜１１ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ〜１１０Ｂａｒｒ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、５〜１１ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ〜１１０Ｂａｒｒ）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記流体またはゲルが、前記工程（ｂ）において実質的に大気圧（約１Ｂａｒｒ）まで減圧されるものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞の表面のホールが、細胞膜のホールを含むものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記圧力が、前記工程（ｂ）において１０秒未満のインターバルにわたって減少するものである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記流体またはゲルが、前記工程（ａ）において１０分間またはそれ以上の間加圧されるものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記流体またはゲルが、前記工程（ａ）において１０〜２０分間加圧されるものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記流体またはゲルが、前記工程（ａ）において約１５分間加圧されるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記流体またはゲルが、水性溶液を含むものである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記流体またはゲルが、緩衝液または細胞培養培地を含むものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
加圧される前記流体またはゲルに接触する気体が、前記流体またはゲルに対して１．０×１０-4ｍｏｌ／ｌ  ａｔｍまたはそれ以上の溶解度を有するものである前記気体の溶解度が、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記気体が、６．０×１０-4ｍｏｌ／ｌ  ａｔｍまたはそれ以上の溶解度を有するものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記気体が、空気、酸素、窒素、二酸化炭素、メタン、ヘリウム、ネオン、及びアルゴンより選択される気体を含むものである請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、単一の加圧及び減圧サイクルからなるか、または複数の加圧及び減圧サイクルからなるものである請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、植物細胞、真菌細胞または細菌細胞である請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、作物由来である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記作物が、穀類または豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、モロコシ、キビ、キャッサバ、オオムギ、エンドウマメ、及び他の根、塊茎、または種子作物より選択されるものである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記種子作物が、アブラナ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、及びモロコシである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記植物細胞が、園芸植物由来の細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記園芸植物が、レタスと、エンダイブと、キャベツ、ブロッコリ及びカリフラワーを含むアブラナ科野菜と、カーネーションと、ゼラニウムと、タバコと、ウリ科植物と、ニンジンと、イチゴと、ヒマワリと、トマトと、コショウと、キクと、ポプラと、ユーカリと、マツより選択されるものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、脂肪種子植物、穀物種子生成植物、及びマメ科植物より選択される種子生成植物由来である請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂肪種子植物が、ワタ、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、及びココナツより選択されるものである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記穀物種子生成植物が、コーン、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、及びライ、並びに他の穀粒種子生成植物より選択されるものである請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記マメ科植物が、グアール、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、ガーデンビーンズ、カウピー、ヤエナリ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、及びヒヨコマメを含むエンドウマメ類及びマメ類より選択されるものである請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、オーツ、オオムギ、野菜、鑑賞植物、及び針葉樹より選択される植物由来の細胞である請求項１８〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌細胞が、グラム陽性またはグラム陰性菌である請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｚ．ｍａｙｓ、及びＮ．ｔａｂａｃｕｍより選択した細胞である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、細胞クラスターの一部を形成するものである請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記クラスターが、胚形成クラスターである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、小胞子である請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、花粉小胞子である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記流体またはゲルの温度が、最大３７℃である請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記温度が、１５〜３０℃である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞壁を有する細胞内に物質を導入する方法であって、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法を包含しており、前記少なくとも一つのホールにより、前記細胞への物質の侵入が容易になることを特徴とする方法。
【請求項３８】
前記流体またはゲルが、前記物質を含むものである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記物質が、生体分子または巨大分子より選択されるものである請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記物質が、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含む核酸より選択されるものである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸が、遺伝子、プラスミド、クロモゾーム、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列、リボザイムまたはその断片、または発現ベクターを含むものである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記物質が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、多糖類、染料、及び薬剤等の医薬品を含む生物活性分子を含むものである請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記物質の分子量が、１００ダルトンまたはそれ以上である請求項３７〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれかに記載の方法により得られる細胞壁を有する透過性が高められた細胞であって、前記細胞の表面が、前記細胞内への物質の侵入を容易にし得る少なくとも一つのホールを含むことを特徴とする透過性が高められた細胞。
【請求項４５】
前記ホールが、細胞膜のホールを含むものである請求項４４に記載の透過性が高められた細胞。
【請求項４６】
前記細胞の細胞壁が、実質的に無傷である請求項４４または４５に記載の透過性が高められた細胞。
【請求項４７】
細胞の透過性を高める為及び／または細胞内に物質を導入する為の減圧手段の使用であって、前記細胞が細胞壁を有し、前記減圧手段が、細胞を含む流体またはゲルに与えられた圧力を２ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ）またはそれ以上の段階だけ減少させるのに用いられることを特徴とする使用。
【請求項４８】
請求項１〜４３のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する細胞内に物質を導入する装置であって、
（ａ）気体を導入する導入口と、
（ｂ）前記導入口から送り込まれる、実質的に幾何学的な断面を有する
圧力チャンバと、
（ｃ）流体またはゲルの前記細胞を収容する前記圧力チャンバ内の区画と、
（ｃ）必要に応じて、前記圧力チャンバ内の圧力をモニターする圧力計と、
（ｄ）前記圧力チャンバから気体を放出する為の排出口と
を備えており、
前記導入口及び排出口がいずれも、加圧中に前記圧力チャンバを隔離する弁を備えることを特徴とする装置。
【請求項４９】
前記導入口及び排出口が、導入管及び排出管を含むものである請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記導入管及び／または排出管の直径が、２〜４ｍｍである請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
前記加圧チャンバの幾何学的断面が、実質的に円筒形である請求項４８〜５０のいずれかに記載の装置。
【請求項５２】
流体またはゲルの前記細胞を収容する前記区画が実質的に、前記圧力チャンバの内側表面全体を含むものである請求項４８〜５１のいずれかに記載の装置。
【請求項５３】
前記圧力チャンバの内側表面が、生理的に許容されるコーティーングを含むものである請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
流体またはゲルの前記細胞を収容する前記区画が、前記圧力チャンバの内側表面に隣接して位置する受容器を含むものである請求項４８〜５１のいずれかに記載の装置。
【請求項５５】
前記受容器が、前記圧力チャンバの内側表面により支持されているものである請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
前記受容器の内側表面が、生理的に許容されるコーティーングを含むものである請求項５４または５５に記載の装置。
【請求項５７】
前記導入口及び／または排出口の前記弁が、ニードル弁を含むものである請求項４８〜５６のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁を有する細胞の透過性を高める方法に関し、更に、この様な細胞に物質を導入する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現代の分子生物学及び生化学における多くの方法は、種々の物質を生細胞内に導入することが必要とされる。外来性のＤＮＡを細胞内に導入すると、遺伝子型に遺伝的な変化が結果として生じることが多く、これは、形質移入または形質転換と呼ばれる。この技術は、近年、分子生物学の分野、特に、遺伝子工学及びタンパク質工学に関する分野において最も重要な技術の１つであることが判った。この技術により、外来性ＤＮＡを細胞内で発現させることが可能となった。この技術には、遺伝子転写研究で科学的関心が払われており、商業的に有用な遺伝子産物を好適な型の細胞に発現させることを包含する広範な商業的用途を有している。
【０００３】
更に近年になって、細胞を損傷することなく、タンパク質及び薬剤の両方を生細胞に導入することに関心がもたれる様になった。この様な技術を開発するときに解決すべき大きな問題は、細胞膜が、一般に不透過性であることである。細胞膜は通常、小さな分子であっても、親油性でない限り不透過性である。
【０００４】
細胞膜の不透過性の問題は、細胞壁を有する細胞では更に困難になる。細胞壁は一般に、侵入に対する付加的なバリアとなることにより物質が細胞内に移動することを更に制限する。原核細胞は、細胞外被を有するが、細胞外被は、細胞膜及び細胞壁、更に、存在する場合には外膜も合わせたものであると定義することができる。グラム陰性菌は、タンパク質及び多糖類から構成されるペプチドグリカン細胞壁を有し、これは、内側細菌膜と外側細菌膜との間の細胞膜周辺腔に存在する。このグラム陰性菌の付加的な外膜により、細胞外被の透過性が更に低下する。グラム陽性菌は、１個の膜（グラム陰性菌の内膜に類似する）しかないが、一般に、細胞壁の厚さが厚い。真核細胞のなかでは、植物細胞及び真菌細胞が、ヘミセルロース及びペクチンで織り合わせされたセルロースミクロフィブリルから構成されたセルロース細胞壁を有する。細胞壁によって強度が大きくなり、透過性が減少することは、（細胞壁のない）動物細胞にとっては適切な形質移入法の幾つかが、細菌、真菌及び植物細胞といった細胞壁を有する細胞には好適でないことを意味する。
【０００５】
細胞の透過性を高め、これによって外来性ＤＮＡまたは他の物質を導入することができる様にする為の幾つかの方法が考案されている。初期の方法は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースまたはヒドロキシアパタイト等の粒子にＤＮＡを結合させる工程と、ＤＮＡを含む粒子を取り込むことができる前処理した細胞を加える工程とを含むものであった。塩化カルシウムによる処理は、低温及び後続の熱ショックと組み合わせる場合もあり、通常、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に用いられている。リン酸カルシウムとの共沈により、哺乳類細胞にＤＮＡを導入する一般的な方法が与えられる。更に近年になって、細胞に融合することができるＤＮＡを組み込んだリポソームを利用する方法が開発された。電気穿孔法と呼ばれる別の技術は、細胞に電気ショックを与え、細胞にホールを形成させる工程を含む。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．６  １９９４年、１１８〜１１２５頁（Ｃｌａｒｋｅら）は、衝撃媒介手法を用いることにより、染料、タンパク質及びプラスミドＤＮＡを細胞内に導入する方法を開示している。
【０００６】
細胞壁を有する細胞に上記の方法を適用するときの重要な問題は、外来物質の取り込みが極めて非効率的であり、実質的に検出不可能な場合もあることである。この問題を解決する方法の１つは、細胞壁を除去することである。細胞壁が除去された原核生物及び真核生物は、一般にプロトプラストとして知られている。
【０００７】
プロトプラストは、一般に、細胞壁を有する細胞より遥かに形質転換をし易い。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの様なグラム陽性菌は、細胞壁を除去することによりプラスミドＤＮＡ形質転換がより行い易くなる（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、１６８、１１１〜１１５、１９７９年）。植物細胞のプロトプラストは、懸濁培養液、カルス組織または無傷組織をセルラーゼ及びペクチナーゼで処理することにより得られる。プラスミドＤＮＡによる酵母菌の形質転換は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅのスフェロプラスト（無細胞壁酵母細胞）を用いることにより初めて達成された（Ｈｉｎｎｅｎ他、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、７５、１９２９〜３３、１９７８年。
【０００８】
しかし、プロトプラストを用いることの欠点の１つは、物質を細胞に導入した後に細胞壁を再生する必要があることである。再生培地は、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの様なグラム陽性菌に対しては、栄養的に複雑である可能性がある。酵母菌スフェロプラスト細胞壁は、固体の寒天マトリクス内で再生する必要があり、その後の細胞の回収が困難になる。全体としては、細胞壁を再生する工程は遅く、利便性が低い。
【０００９】
上記の方法によりプロトプラストを用いて物質を細胞内に導入する場合でも、形質移入効率は低い場合が多い。また、上記処理により、細胞の大部分が死滅する。細胞膜の透過性を増大させる為に受ける損傷が短期間であっても、細胞死に至る傾向がある。これは、電気穿孔法に伴う特有の問題である。更に、Ｃｌａｒｋｅらの方法では、１回の処理で、限定された数の細胞にしか形質移入することができない。
【００１０】
国際特許ＷＯ０１／０５９９４は、細胞死の発生率が低い形質移入法を提供する。この特許の方法は主として、一般にスパージング技術を用いて、低圧で細胞膜にホールを形成することにより物質を細胞内に導入することについて記載されている。この特許は特に、哺乳類細胞の形質移入に言及している。詳細には、国際特許ＷＯ０１／０５９９４号の方法は、動物細胞またはプロトプラストに適用することが好ましく、プロトプラストは形質移入する前に細胞壁を除去する必要がある。細胞壁または細胞外被に関連する透過性が損なわれる為、ＷＯ０１／０５９９４号に記載された方法は、細胞外被または細胞壁を含む細胞内に物質を導入するのには適さない。
【特許文献１】
国際特許ＷＯ０１／０５９９４公報
【非特許文献１】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．６  １９９４年、１１８〜１１２５頁（Ｃｌａｒｋｅら）
【非特許文献２】
Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、１６８、１１１〜１１５、１９７９年
【非特許文献３】
Ｈｉｎｎｅｎら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、７５、１９２９〜３３、１９７８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、細胞壁を有する細胞の透過性を高める為の、改良された方法が必要とされている。また、細胞壁を有する細胞内に物質を導入する改良された方法も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記欠点を克服する為になされたものであり、細胞壁を有する細胞の透過性を高めることにより、核酸の様な物質を細胞内に移行させる効率的な方法を提供することを目的とする。従って、本発明は、細胞壁を有する生細胞の透過性を高める方法であって、細胞の表面に接触する流体またはゲルを加圧する工程と、次に、流体またはゲルを減圧する工程を含み、これにより細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成する様にする方法を提供する。
【００１３】
理論には縛られないが、流体またはゲル内の圧力変化により、細胞膜に反りが生じ、これによって、細胞膜に一過性のホールが形成されると考えられている。減圧により気泡が生じれば、これにより一過性のホールを形成することができ、形質移入を達成することができる。同様に、理論には縛られないが、細胞膜の近傍での気泡形成と膜自体との相互作用が、膜の一過性のホールの形成に寄与する可能性があると考えられる。従って、本発明の幾つかの実施形態では、流体またはゲルを減圧することにより、細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成することができる気泡を生じることが好ましい。
【００１４】
別の様態では、本発明は、細胞壁を有する細胞内に物質を導入する方法であって、上述した方法により生細胞の透過性を高める方法を含み、少なくとも一つのホールにより、細胞内への物質の移行が容易になる方法を提供する。
【００１５】
本発明の方法によれば、細胞の細胞膜に一過性のホールを形成し、これによって多数の物質に対する細胞の透過性を増大させることが可能になるので有利である。細胞膜は、細胞質を取り囲む原形質膜であり、グラム陰性菌の場合には、細胞壁の下にある内膜のことを言う。形成されたホールは、かなりの分画の細胞生存率をあまり低下させない為、細胞死の発生率は、電気穿孔法の様な多数の従来法に関連する方法を用いた場合に比べ、通常遥かに小さい。この方法によれば、プロトプラストに基づく方法の様に細胞壁を完全に除去することは必要とすることなく、細胞壁を有する細胞の透過性を高めることができる。更に、プロトプラストに基づく方法の様に、処理の後に細胞壁を再生する必要もない。
【００１６】
本発明によれば、この透過性処理は驚くべきことに、加圧／減圧処理を用いて達成される。従って、本発明は、細胞壁を有する細胞の透過性を高めることができる、迅速で効率的な方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、気泡が形成され、これが、細胞壁を有する細胞の細胞膜にホールまたはポアを形成することに寄与すると考えられている。理論には縛られないが、この様な実施形態によれば、気泡の大きさ及びその組成（流体またはゲル及び気泡の気体の組成に関する）は、気泡が細胞膜に一過性のホールを形成することができる様にするのに十分なものであると考えられる。
【００１７】
本発明の実施形態の全てにおいて、細胞膜のホールは、細胞の表面の特定の点で膜の厚さが減少したものを含むことができ、細胞表面の一部から細胞膜が完全に除去されたものを含むこともできる。ホールの大きさは、細胞の透過性を増大するものであれば、特に限定されない。好ましくはホールはまた、細胞機能に有害な影響を及ぼす程大きくない様にする必要がある。ホールにより、細胞膜で設けられる侵入バリアを低くすることによって、細胞内への外来物質の導入を容易にすることが好ましい。
【００１８】
典型的には、本発明に係る細胞の透過性を高める為の方法は、細胞の透過性を増大させる為に更に処理することなく、核酸の様な外来物質を細胞内に導入させることができるのに十分な程度まで細胞の透過性を増大させる。或いは、特定の実施形態では、本発明の方法は、方法の効率を更に高める為に、電気穿孔法または塩化カルシウム処理の様な先行技術の方法の１つと組み合わせることもできる。
【００１９】
次に、以下の図面を単なる例証として参照しながら本発明を更に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の更に好ましい実施形態は、流体またはゲル培地中に気泡を形成する工程を含む。これら及び他の実施形態を以下に詳細に説明する。
【００２１】
本発明の方法では、驚くべきことには、細胞壁を有する細胞は、殆どの細胞よりホールを形成しにくい場合が多いが、加圧／減圧処理により透過性を高めることができることが見出されている。上記から示唆される様に、減圧により、細胞壁の構造内または細胞膜と細胞壁との間に気泡が形成されると考えられている。或いは、気泡は、細胞膜を境界とする外周内の細胞の内部に形成することもできると考えられている。この様な部位に気泡が形成されると、細胞表面の局在点の細胞膜を破裂させることができる。細胞の細胞壁は、気泡形成または細胞壁の外側の破裂による透過性処理に対して細胞膜を保護すると考えられている。
【００２２】
流体またはゲル内に空気を導入して細胞の透過性を高めることを試みる他の方法（スパージング法等）は、例えば、圧力変化により細胞膜の反りを十分に与えることにより細胞膜と細胞壁との間の領域に影響を及ぼさず、細胞膜と細胞壁との間の気泡形成にも影響を及ぼさないため、細胞壁を有する細胞の透過性を高める処理には効果がないと考えられている。
【００２３】
本発明の方法の減圧工程により形成される気泡は、細胞と相互作用すると（細胞膜との接触、特に、細胞膜に接触または近接したときの破裂等）、細胞膜にホールを形成するのに十分な表面エネルギー（または表面張力）を有すると考えられている。気泡の半径を十分に小さくし、その表面エネルギーが、細胞膜を穿孔するのに十分な大きさになる様にすることが重要であると考えられている。
【００２４】
本発明の方法により細胞表面にホールを形成しても、細胞の生存率または機能の減少は、典型的には、先行技術の方法で観察される場合よりも低い。細胞に形成されたホールは、一過性であり、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡの様な巨大分子を細胞内に侵入させるのに十分な時間開いたままであるが、細胞の生存率が損なわれる前に再び閉じる。例えば、本発明の方法を用いると、細胞死は、一般に２５％未満、多くの場合５％未満である。
【００２５】
電気穿孔法の場合には、細胞死は、９０％ほどの高率になる可能性がある。この手技の即時的作用を生き抜いた細胞でも、この後２４時間にわたって死滅する可能性がある。典型的には、電気穿孔法では、壊死により細胞の５０％が即死し、残り５０％の細胞の大部分は、手技後２４時間以内にアポトーシスにより死滅する。本発明の方法による場合には、通常、壊死及び／またはアポトーシスによる細胞死の発生率は低い。
【００２６】
気泡は、減圧処理により流体またはゲル中に発生させることができる。減圧には、流体またはゲルが受ける圧力を減少させ、溶解した気体の溶解性を減少させることによって液体中に気泡を形成させることができる様にする工程が通常含まれる。理論には縛られないが、流体またはゲル内の細胞は、気泡を形成する為の核として働くことができ、気泡が細胞膜と細胞壁との間に形成されて破裂する様になると考えられている。従って、有利なことには、本発明によれば、細胞の透過性を高めて形質移入効率を増大させるのに適切な表面エネルギーの気泡を、細胞膜に極めて近接して形成することができる。或いは、上述した様に、この方法では、印加する圧力を変化させることにより細胞膜及び／または細胞壁の変動、例えば、膜の反りまたは歪みを引き起こすことができる。この様な変動により、細胞膜に脆弱点を形成することができ、これにより、一過性に膜を破裂させることができる。この破裂は、膜の一過性のホール、裂け目または断裂の形をとることができ、これにより、選択した形質移入分子（例えば核酸分子）を細胞内に侵入させることができる。
【００２７】
本発明では、減圧の工程に形成される全ての気泡の大きさを制御し、気泡が、細胞に（特に細胞表面と相互作用するときに）一過性のホールを形成することができる様にすることが望ましい。減圧を用いた、特に気泡を用いた細胞表面へのホール形成は、「エアロポレーション」と呼ばれる。気泡の大きさは、細胞の大きさに匹敵することが好ましい。例えば、好ましい気泡の半径は、細胞の半径の１／３倍から５倍である。
【００２８】
本発明の方法によれば、加圧工程により、流体またはゲルに溶解される気体の量が増大する。気泡の発生率、気泡の大きさ及び気泡の表面エネルギーは、減圧工程での圧力を減少させる速度及び程度を変動させることにより制御することができる。
【００２９】
この方法は、典型的には、流体またはゲルを加圧する工程と、流体及びゲルを一定期間開始圧力に保持する工程と、次に、圧力を減少させ、好ましくは気泡を形成させる工程とを含む。圧力の減少は、一般に０．５ＭＰａ（５Ｂａｒｒ）またはそれ以上であり、典型的には０．５〜１１ＭＰａ（５〜１１０Ｂａｒｒ）の範囲内である。該圧力の減少は、１〜１１ＭＰａ（１０〜１１０Ｂａｒｒ）が好ましく、更に好ましくは２〜１１ＭＰａ（２０〜１１０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは５〜１１ＭＰａ（５０〜１１０Ｂａｒｒ）の範囲である。幾つかの実施形態においては、圧力の減少は、２〜８ＭＰａ（２０〜８０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは３〜８ＭＰａ（３０〜８０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは４〜８ＭＰａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）、最も好ましくは６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）とすることができる。減圧工程での圧力の減少が大きくなると、ホールが形成される効率、従って形質移入効率が高くなる。しかしながら、減圧工程での圧力低下を増大させると、細胞を損傷し、細胞死に至る頻度も高くなる可能性がある。圧力の減少は、ホールが細胞膜に確実に形成されて物質を導入することができ、同時に、細胞の生存率の減少が最小限になる様にする為に、細胞の種類及び用いる気体により最適化することができる。形成することができる気泡の表面エネルギーは、細胞膜にホールを形成する役割を果たすことができると考えられている。細胞壁を有する殆どの種類の細胞は、上述の好ましい範囲の内の一つの範囲内で圧力を低下させて本発明を実施することにより透過性を高めることができると考えられる。好ましい圧力の範囲を用いると、一般に、生存し且つ形質移入される細胞の割合が増大する傾向がある。
【００３０】
開始圧力は、所望であれば、最初に気体が流体またはゲル内に溶解し易くする様に選択することができる。開始圧力は、一般に０．６ＭＰａ（６Ｂａｒｒ）またはそれ以上であり、典型的には０．６〜１１．１ＭＰａ（６〜１１１Ｂａｒｒ）の範囲である。好ましくは、１．１〜１１．１ＭＰａ（１１〜１１１Ｂａｒｒ）の範囲、更に好ましくは２．１〜１１．１ＭＰａ（２１−１１１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは５．１〜１１．１ＭＰａ（５１〜１１１Ｂａｒｒ）である。幾つかの実施形態では、圧力の減少は、２．１〜８．１ＭＰａ（２１〜８１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは３．１〜８．１ＭＰａ（３１〜８１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは４．１〜８．１ＭＰａ（４１〜８１Ｂａｒｒ）、最も好ましくは６．１〜８．１ＭＰａ（６１〜８１Ｂａｒｒ）とすることができる。
【００３１】
使用される開始圧力及び圧力減少は、（とりわけ）透過性が高められる細胞の種類に応じて、適切に変化させることができる。細胞がイネ細胞である一つの実施形態では、大気圧まで減圧する前に、２．１〜３．１ＭＰａ（２１〜３１Ｂａｒｒ）といった比較的低い開始圧力を用いる。細胞がトウモロコシ細胞である別の実施形態では、６．１〜７．１ＭＰａ（６１〜７１Ｂａｒｒ）といった比較的高い開始圧力を用いる。
【００３２】
気体が開始圧力に維持される時間の長さは、形質移入が有害な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。典型的には、気体は、１分またはそれ以上、好ましくは１０分またはそれ以上の間開始圧力に維持される。圧力は一般に、３０分未満の間維持される。幾つかの実施形態では、圧力は、５〜２０分間、好ましくは１０〜２０分間、更に好ましくは１０〜１５分間維持することができる。圧力は、約１５間維持されることが最も好ましい。所望であれば、この時間を変化させ、流体またはゲル内に最初に溶解される気体の量を変えることができる。気体を流体またはゲル内に存在させる時間は、必要なだけ長く保持することができ、細胞の透過性を高めるのに用いる条件、例えば、用いる気体、温度、圧力のほか、細胞の種類及び細胞内に導入する物質によって決定することができる。細胞内への物質の導入効率は、流体またはゲル及び細胞が加圧下に置かれる時間の長さに、特に鋭敏に反応する。
【００３３】
圧力は典型的には、大気圧（約０．１ＭＰａ、１Ｂａｒｒ）まで低下される。圧力は、例えば孤立した系を大気に暴露することによって急激な減圧を行うこと等により、速やかに低下させることが好ましい。これは、（例えば）流体またはゲルを含む容器に連結された弁または栓を単に開放することにより達成することができる。圧力の低下は、好ましくは３０秒未満、更に好ましくは１０秒未満、最も好ましくは約１秒未満のインターバルにわたって生じる。
【００３４】
減圧により生じる可能性がある気泡の発生は、単一の期間で連続的に起こる場合もあり、実質的に気泡が発生しない間隔によって分離された２つまたはそれ以上のパルスで起こる場合もある。従って、圧力の低下は、一の連続工程で達成されることもあり、例えば、圧力が一定状態の間隔で分離された０．１〜１ＭＰａ（１〜１０Ｂａｒｒ）の一連の工程で起こる場合もある。
【００３５】
加圧及び減圧のサイクルは、１回またはそれ以上繰り返すことができる。一つの実施形態において、２回または３回の加圧／減圧サイクルを用いるが、１サイクルのみを用いることが好ましい。
【００３６】
気泡がパルスで発生する場合には、この様なパルスの長さは、典型的には１〜１０秒とすることができる。例えば、パルスの長さは、１〜５秒とし、気体の発生が起こらない同様の長さの期間で分離することができる。パルスの持続時間を制御する為には、どの様な手段を用いてもよい。典型的には、パルスの持続時間は、プログラム可能な手段により制御することができる。この様な手段は、例えば、流体またはゲル上の圧力を変化させる手段の活動度を制御するのに用いるプログラム可能なタイマーを含むことができる。
【００３７】
本発明の方法に使用される気体は、流体またはゲルを加圧及び減圧するのに適切であれば、必ずしも特に一つの気体に限定されない。気体は、細胞と相互作用して細胞膜に一過性のホールを形成し得る気泡を形成できることが好ましい。適切な気体は、不活性ガス、非不活性ガス、または両方の種類の気体の１種またはそれ以上の混合気を含む広範囲の気体より選択することができる。好ましくは、気体は空気であるが、酸素、窒素、メタン、並びにヘリウム、ネオン及びアルゴンといった希ガスを用いることもできる。更に、特に流体またはゲルのｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合には、ＣＯ2を用いることもできる。ＣＯ2を用いる場合には、一般に、空気等の他の気体中に５〜７％容量濃度で用いられる。気体は可溶性である必要はないが、流体またはゲル内に気泡を形成することが望ましい場合には、気体は、該方法が実施される条件下で、流体またはゲルに少なくとも多少溶解することが必要である。
【００３８】
本発明の方法は、好ましくは、典型的には３７℃までの一定の温度で行われる。５〜３０℃、好ましくは１５〜３０℃の様な室温で行うことが好ましい。
【００３９】
本発明の方法の加圧及び減圧工程は、流体またはゲル内で行われる。流体またはゲル内に存在するイオンは、細胞が耐性であることが可能である限り、特に限定されない。ＤＮＡの様な物質の侵入を容易にする為に細胞の透過性が高められ、この物質が同一培地に導入される場合には、流体またはゲルもまた、形質移入または他の導入工程に適切でなければならない。適切なモル浸透圧濃度を有する形質移入培地は、ベースとして栄養因子を含む１０倍濃縮Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）（Ｅａｒｌｅ，Ｗ．Ｒ．１９３４年，Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｚｅｌｌ．Ｆｏｒｓｃｈ．Ｖｏｌ．１６，p１１６）を用い、必要に応じて希釈して調剤することができる。
【００４０】
細胞内に導入する物質は、流体またはゲル中に含まれることが好ましい。好ましい実施形態では、物質は、実質的に減圧工程、及び（幾つかの実施形態では）流体またはゲル中の気泡の形成工程と同時に起こる工程で細胞内に導入される。しかしながら、細胞表面の一過性のホールが再び閉じる前に物質が導入される場合には、減圧後に細胞表面に一過性のホールが生じたときに物質が細胞と接触することができる様にすることもできる。
【００４１】
用いる流体またはゲルは、好ましくは液体、更に好ましくは水性液体である。液体は、緩衝液または細胞培養培地を含むことができる。好ましくは、培地の浸透圧は、１００ｍＯｓＭより大きい。更に好ましくは、浸透圧は、３００〜６００ｍＯｓＭである。浸透圧がこの範囲内である液体を用いると、プロセス中に細胞溶解が減少する傾向がある。
【００４２】
ゲルを用いる別の実施形態では、ゲルは、水性ゲルであることが好ましい。適切なゲルには、寒天ゲルの様な細胞培養培地を含む。この実施形態では、細胞は、典型的にはゲル上で培養される。
【００４３】
培地中の物質の濃度は、特に限定されず、細胞内に導入することが必要な物質の量により選択することができる。好適な濃度は、０．２〜１０×１０-8Ｍ、更に好ましくは０．７５〜１．２５×１０-8Ｍである。
【００４４】
流体またはゲルの深さは、特に限定されない。流体またはゲルの深さは、典型的には１０ｃｍ以下である。
【００４５】
流体またはゲル中の細胞の濃度は、特に限定されない。例えば濃度は、原核生物に対しては、１×１０9細胞／ｍｌ程度とすることができる。
【００４６】
導入される物質は、どの様な物質であってもよい。好ましくは、物質は、細胞壁及び／または細胞膜を通常は通過することができない物質である。従って、細胞内に導入される物質は、親水性物質であることが好ましいが、疎水性であってもよい。細胞内にはどの様な生物分子またはどの様な巨大分子も導入することができる。この物質は、一般に、分子量が１００ダルトンまたはそれ以上である。更に好ましい実施形態では、物質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば遺伝子、プラスミド、クロモゾーム、オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド配列）またはその断片、または発現ベクターといった核酸である。また、物質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、多糖類、染料、または薬剤等の医薬品といった生物活性分子とすることもできる。
【００４７】
本発明の方法を適用することができる細胞は、細胞が強固な細胞壁を有し生存可能であれば、細胞の種類または試料の大きさに関しては特に限定されない。好ましい細胞は、生存可能な生きた宿主細胞である。これには、細胞壁が細胞外被の一部である原核細胞、及び特定の真核細胞が含まれる。従って、適切な細胞には、植物、真菌（糸状菌、及び酵母の様な非糸状菌を含む）、並びに、胞子形成細菌、グラム陽性及びグラム陰性菌を含む細菌を含む細胞が含まれる。本発明の方法は、プロトプラストを形成することは必要でなく、従って、細胞壁は、透過化性を高める前に、細胞壁が既に除去、脆弱化、薄肉化または穿孔されていない未処理細胞であることが好ましい。
【００４８】
本発明の方法を用いると、細胞群に形質移入することができる。この様な細胞は、例えば、細胞懸濁液の形態とすることができ、固体表面またはゲルに付着した細胞とすることもできる。また、この方法を用いて、複数の細胞種を含む細胞群を処理することもできる。
【００４９】
本発明の方法に従って、個々の細胞種群の透過性を高めることができ、或いは組織、臓器または生物体全体を処理することもできる。一つの実施形態では、細胞は花粉粒であり、別の実施形態では植物全体の透過性を高める。処理される組織、臓器または生物体は、流体内に浸すこともでき、或いは組織、臓器または生物体の表面の一部のみに流体を接触させることもできる。一つの実施形態では、流体は、植物の葉の様な臓器の表面上にスプレーされる。
【００５０】
本発明の方法により形質移入または形質転換することができる細胞を含む適切な組織の種類には、成長点、脱凝集化した葉細胞、リーフディスク、花粉、小胞子（＝未熟花粉）、子葉、カルス組織、体細胞胚、前胚塊、及び全ての懸濁培養組織（＝細胞壁を含む脱凝集細胞）が含まれる。
【００５１】
細胞が植物細胞である場合には、細胞は、被子植物（単子葉植物または双子葉植物）由来とすることもでき、別の目の植物とすることもできる。
【００５２】
本発明は、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、テンサイ（甜菜）（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、オーツ、オオムギ、野菜、鑑賞植物、及び針葉樹を含むが、これに限定されない何らかの植物種を形質転換するのに用いることができる。
【００５３】
好ましくは、本発明の植物は、農作物、例えば穀類及び豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、モロコシ、アワ、キャッサバ、オオムギ、エンドウマメ、及び他の根、塊茎、または種子作物である。重要な種子作物は、アブラナ、テンサイ、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、及びモロコシである。本発明を適用することができる園芸植物には、レタス、エンダイブや、キャベツ、ブロッコリ及びカリフラワーといったアブラナ科野菜のほか、カーネーション及びゼラニウムを含むことができる。本発明は、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウ、キク、ポプラ、ユーカリ、及びマツに適用することもできる。
【００５４】
農学的に望ましい関心のある種子を生成する種子生成植物には、とりわけ、脂肪種子植物、穀物種子生成植物及びマメ科植物が含まれる。農学的に望ましい種子には、コーン、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、ライ等の様な穀粒種子が含まれる。脂肪種子植物には、ワタ、ダイズ、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナツ等が含まれる。マメ科植物には、マメ及びエンドウマメが含まれる。マメには、グアール、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、ガーデンビーンズ、カウピー、ヤエナリ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等が含まれる。
【００５５】
本発明は、任意のグラム陽性菌またはグラム陰性菌を形質転換するのに用いることができる。適切なグラム陽性種には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｓｐ．，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．，といった放線菌類が含まれるが、これに限定されない。適切なグラム陰性種には、とりわけ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ．が含まれる。
【００５６】
本発明に用いられる減圧手段は、特に限定されない。典型的な減圧手段は、内部の圧力を変化させることができる流体またはゲルを保持する密封可能なチャンバと、チャンバ内の圧力を変化させる手段とを含む。圧力を変化させる手段は、典型的には、密封チャンバに連結され、チャンバ内の圧力を増大及び／またはチャンバ内の気体を圧縮する為の圧縮機（圧縮気体のシリンダ等）である。密封チャンバの大きさ及び性質は、液体を収容することができ、チャンバの内外の圧力差に耐えることができれば、特に限定されない。圧力を変化させる為の手段は、チャンバの内外に圧力差を生じさせることができれば、特に限定されない。
【００５７】
減圧手段は、プログラム可能な手段により制御することができる。典型的には、プログラム可能なタイマーを用いて減圧手段の活動度を制御する。
【００５８】
液体を保持する容器は、その形状またはそれを構成する材料については特に限定されず、ガラスまたはプラスチックまたは他の好適な材料で形成することができる。液体を保持する容器は、好ましくは、圧力を変化させることができる様に密封可能であり、容器内の圧力を変化させる手段に連結されている。
【００５９】
本発明の方法を実行するのに用いられる手段は、特に限定されないが、以下に示す装置を用いることが好ましい。本発明の装置は、上述した方法を用いて、細胞壁を有する細胞内に物質を導入する為の装置であって、
（ａ）気体を導入する為の導入口と、
（ｂ）該導入口から送り込む、実質的に幾何学的な断面の圧力チャンバと、
（ｃ）流体またはゲルの細胞を収容する為の圧力チャンバ内の区画と、
（ｃ）必要に応じて、圧力チャンバ内の圧力をモニターする圧力計と、
（ｄ）圧力チャンバから気体を放出する排出口と、
を備えており、上記導入口及び排出口はいずれも、加圧中に圧力チャンバを隔離する弁を備えている。
【００６０】
好ましくは、導入口及び排出口は、導入管及び排出管を含む。導入口及び排出口の大きさは、導入される気体により導入口を通じて流体またはゲルを加圧することが可能であり、この圧力が排出口を通じて放出可能であるならば、特に限定されない。好ましくは、導入口及び／または排出口の直径は、２〜４ｍｍである。
【００６１】
本発明において、圧力チャンバの断面に関する「幾何学的」という用語は、断面が実質的に一様な幾何学的形状を有する、即ち、円形（円筒形または球状の圧力チャンバ）、方形または直線的（立方体または長方形圧力チャンバ）であることを意味する。好ましくは、加圧チャンバの幾何学的断面は、実質的に円筒形である、
好ましい実施形態では、流体またはゲル状の細胞を収容する為の区画は、実質的に、圧力チャンバの内側の全表面を含む。この実施形態では、圧力チャンバの内側表面は、典型的には、ＰＴＦＥ（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、ステンレス鋼またはポリプロピレンといった生理的に許容されるコーティーングまたは層を含む。別の実施形態では、流体またはゲル中の細胞を収容する為の区画は、圧力チャンバの内側表面に隣接して位置する受容器を含むことができる。この様な実施形態では、受容器は、圧力チャンバの内側表面により支持される。一般に、受容器の内側表面は、生理的に許容されるコーティーングまたは層を含む。本発明では、このことは、コーティーングまたは層が、細胞の生存率に実質的に有害でないことを意味する。この様なコーティーング及び層は、当技術分野では公知である。好ましくは、チャンバの下側部分は、上側部分から取り外し可能であり、チャンバまたは受容器に流体またはゲル及び細胞を満たすことができる様にする。また、これにより、チャンバ及び／または受容器のクリーニングも容易になる。チャンバは、ねじ機構または当業者に知られている他の適切な機構により組み立てまたは分解することができる。
【００６２】
典型的には、導入口及び／または排出口の弁は、ニードル弁を含むが、圧力チャンバを隔離し、中の圧力を所望通りに制御するのに十分であれば、弁の種類は特に限定されない。
【００６３】
別の態様では、本発明は、上述した方法により得ることができる、細胞壁を含む透過性が高められた細胞であって、細胞の表面が細胞内に物質を容易に侵入し得る少なくとも一つのホールを含む細胞を提供する。
【００６４】
好ましくは、細胞の表面のホールは、細胞膜のホールを含む。典型的には、本発明の方法を実施した場合、細胞壁自体には殆ど損傷がない。従って、細胞の細胞壁は、実質的に無傷であることが好ましい。好ましい実施形態では、ホールは、細胞膜が細胞表面の少なくとも５０％にわたって実質的に無傷である様に位置している。更に好ましくは、細胞膜は、細胞の表面積の少なくとも７０％にわたり、最も好ましくは細胞の表面積の少なくとも９０％にわたり実質的に無傷である。好ましくは、細胞の細胞膜はまた、物質を細胞内に容易に侵入し得るホールを含む。
【００６５】
細胞壁は、本発明の方法により比較的損傷を受けないため、再生の必要はない。透過性が高められた細胞を用いて物質を内部に導入することが望ましい場合には、透過性が高められた細胞が形成されるのと実質的に同時か、または僅かに遅れて物質を導入することが好ましい。或いは、透過性が高められた細胞は、典型的には−２０℃またはこれよりも低い温度で必要時まで保存し、後で解凍して次のプロセスに用いることもできる。
【００６６】
また、本発明は、細胞の透過性を高める為及び／または細胞内へ物質を導入する為の減圧手段を使用する方法も提供する。この方法では、細胞は細胞壁を有しており、減圧手段は、細胞を含む流体またはゲルに与えられた圧力を２〜１１ＭＰａ（２０〜１１０Ｂａｒｒ）の段階だけ減少させるのに使用する。
【００６７】
本発明が特に有用とされる生命科学への応用には、特定の遺伝子を生細胞及び／またはその凝集物内に導入して発現させること、及び細胞の代謝に対する遺伝子生成物の影響を解析することが包含される。この様な応用には、その様なＤＮＡ生成物をコードする核酸を生細胞内に導入することにより生物学的に活性なタンパク質を発現させ、特に、代謝、タンパク質生成、及び細胞形態学に関して細胞に及ぼすこれらの作用を研究することも包含される。この様な応用は、薬学的に重要な化合物を細胞内に生成することにまで拡大される。
【００６８】
既知の方法と比較すると、本発明の方法は極めて効率的である。形質移入効率は、とりわけ気体の発生が起こる時間の長さに依存する。状況によっては、８０％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、またはほぼ１００％の効率を達成することができる。
【００６９】
以下、特定の実施形態を単に例証として参照しながら、本発明を更に説明していく。
【実施例】
【００７０】
実施例１−酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｐｏｍｂｅ）におけるエアロポレーション法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用い、酵母抽出物菌類増殖培地（Ｏｘｏｉｄ）内で増殖させた５×１０5の細胞を、１，２００ｒｐｍで２回洗浄した。次に、ペレットを１Ｍソルビトールに再び懸濁した。再懸濁した細胞をＦＡＣＳ管に移し、０．５μｇのβ−ガラクトシダーゼＤＮＡベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌ．Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ）または２．５μｇのＴＭＲデキストラン（分子量７０，０００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。
【００７１】
この管を、エアロポレーター（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ  Ｌｔｄ．）内に配置し、圧力を４〜８Ｍｐａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）の範囲に調節した。細胞は、加圧／減圧の１サイクルである１０分間、装置内に維持し、大気圧まで減圧した。
【００７２】
次に、エアロポレーターから細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗った。細胞を１ｍｌの液体培地に再懸濁し、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法（ポリ−Ｌ−リジンスライドを用いる）のいずれかにより、１２時間後に分析した。ＴＭＲデキストランの場合は、直ちに分析を行ったので（光退色を最低限にする為）、培地に再懸濁する必要はなかった。
【００７３】
トリパンブルー染色により、生存可能な細胞のパーセントが８５％より大きいことを確認した。形質移入効率は、蛍光を発する細胞の数を細胞の総数で割ることにより算出した。これによると、形質移入効率は６０〜７０％であった。
【００７４】
実施例２−タバコ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のタバコ葉の細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、再び遠心した。
【００７５】
上記ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。
【００７６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞は圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【００７７】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【００７８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、７０〜８０％であった。形質移入効率は、５５〜６０％であった。
【００７９】
実施例３−タバコ根におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のタバコ根先端細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、もう１回同様に遠心した。
【００８０】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。
【００８１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を１０分間放置して処理した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【００８２】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【００８３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、５５〜６０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。
【００８４】
実施例４−トウモロコシ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のトウモロコシ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。細胞は、７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。
【００８５】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。
【００８６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで上げた。細胞は、圧力下に１０分間放置した。細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【００８７】
次に、細胞を微量遠心管に移した。細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【００８８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて、生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６０〜７０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。
【００８９】
実施例５−トウモロコシ根におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のトウモロコシ根細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。
【００９０】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。
【００９１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力下をかけたまま１０分間放置した。細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【００９２】
次に、細胞を微量遠心管に移した。細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【００９３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、５５〜６０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。
【００９４】
実施例６−イネ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のイネ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。
【００９５】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。
【００９６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を４〜８ＭＰａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【００９７】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【００９８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６５〜７０％であった。形質移入効率は、５５〜６０％であった。
【００９９】
実施例７−コムギ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のコムギ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、更に同様に遠心した。
【０１００】
上記ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバ内に置いた。
【０１０１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。
【０１０２】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。
【０１０３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６０〜７０％であった。形質移入効率は、２０〜２５％であった。
【０１０４】
実施例２〜実施例７の結果を下記表１にまとめている。
【０１０５】
【表１】
2005500064.tif 000002
【０１０６】
実施例２〜実施例７に記載したのと同様の方法を、ダイズ及びワタの様な別の植物種に応用することができる。
【０１０７】
実施例８−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの間における、高圧エアロポレーションによる形質移入の比較
この実施例の為に選択した細胞は、酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと、Ｑｕｏｒｎ（登録商標）（Ｔｒｉｎｃｉ、１９９４年）と呼ばれる食品加工に用いられる糸状菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍであった。この特定の糸状菌は、既知の方法で形質移入するのは困難であることが証明されている。
【０１０８】
形質移入効率は、細胞壁、即ちバリアにより制限されるが、これを克服して異なる大きさ及び形状の分子を細胞の内部に自由に侵入させることができる様にする必要がある。細胞壁の組成及び厚さは、形質移入効率を求めるときに考慮しなければならない重要な因子である。酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁は、乾燥細胞重量のほぼ２５％である。この細胞外塊は、支持構造には殆ど寄与しないが、細胞の保護及び栄養のコントロールに必要であり、主に、高濃度の炭化水素を有する多糖類及び糖タンパク質で構成されている。Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの細胞壁には、これら成分の全てが見出されているが、細胞壁を構成する夫々の比率は、充分には分析されていない。殆どの糸状菌では、キチンと呼ばれるｎ−アセチルグルコサミンのポリマーが、細胞壁の主成分である。真菌の繊維状細胞壁は、一般に、酵母菌の細胞壁に比べて厚いことも知られている（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ、１９９２年）。
【０１０９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの高圧エアロポレーション
【０１１０】
【表２】
2005500064.tif 000003
【０１１１】
表２に見られる様に、形質移入は、４ＭＰａ及び６ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ及び６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした細胞に比べ、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で最も効果的であり、このとき、細胞の７６％に形質移入されている。この結果から、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で高圧エアロポレーションすることにより、細胞壁にホールを効率よく形成することができ、次いで、このホールにより、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１が細胞内に侵入することが可能になると示唆される。
【０１１２】
最も高い生存率は、４ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ）の場合に達成され、このとき、細胞の１００％がエアロポレーション後も生存した。最も低いパーセントは、６Ｍｐａ（６０Ｂａｒｒ）の場合であり、このとき、細胞の９１％が生存した。この様な高い生存率により、この工程は、細胞を死滅させたり、増殖サイクルを阻害したりしないことを示している。５及び６ＭＰａ（５０及び６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした細胞の生存率は高く、ほぼ９１％、９８％であった。
【０１１３】
Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの高圧エアロポレーション
形質移入は６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）で最も効率的であった。菌糸体に６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）をかけたときに、良好な蛍光が観察された。
【０１１４】
エアロポレーションを実行する際に、薄い１ｃｍ2断片の菌糸体を切り取り、６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした。この断片の全長にわたって蛍光が見られた。
【０１１５】
１サイクル及び２サイクルを用いるＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの高圧エアロポレーション
同じ圧力で２サイクル以上行うことにより、形質移入の発生を高めることができる。このことは、実施したのと同様の実験でも見られ、この場合、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションし、２サイクル処理したＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍは、同様に２サイクルを用いた低圧エアロポレーションと比較して、より良好な蛍光が見られた。
【０１１６】
実施例９−植物及び真菌懸濁細胞におけるエアロポレーション手技
細胞の形質移入に用いられる巨大分子
形質移入に用いられる巨大分子は、主に蛍光プローブである。これらは、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを用いて検出することができるからである。
【０１１７】
この研究課題に用いた巨大分子は、
・ＴＭＲ−デキストラン（テトラメチルローダミンデキストラン）（分子量７０，０００Ｄａ）
・ＧＦＰ  ＤＮＡベクター（緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ）（４．７６ｋｂ）（ｐＥＧＦＰ）
・β−ｇａｌＤＮＡ（８．２ｋｂ）
であった。
【０１１８】
ＴＭＲ−デキストラン
ＴＭＲ−デキストランは、ＴＭＲに共有結合した多糖類であり、蛍光標識試薬である。分子量１０，０００、４０，０００、及び７０，０００、直径５．４ｎｍのデキストランを用いた。ＴＭＲ−デキストランは、分子マーカー（Ｈｏｕｇｌａｎｄ、１９９６年）として広く用いられている。励起波長は、フローサイトメトリーを用いると５４６ｎｍであった。
【０１１９】
細胞の分析
細胞は、分光法、ゲル電気泳動法、フローサイトメトリー、光学及び蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【０１２０】
細胞増殖の方法及び条件
酵母菌細胞の増殖条件
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅの両方を、予備調製した麦芽抽出物寒天（Ｏｘｏｉｄ）の寒天板上で増殖させ、２５℃のクールインキュベータで４８時間増殖させた。次に、滅菌楊枝を用いてコロニーを採取し、これを用いて、酵母菌麦芽抽出物液体培地（ＹＭＥ−グルコース１０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母菌抽出物３ｇ、及び麦芽抽出物３ｇに蒸留水を２回加えて１リットルにした後、高圧滅菌したもの）に接種した。接種した培養液を、２５℃の冷却オービタルシェーカー内で対数増殖期になるまで増殖させた後、形質移入した。
【０１２１】
Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎａｒｉｕｍ）の増殖条件
Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎａｒｉｕｍは、固体培地上の生物体１ｃｍを２５℃で７日間継代培養することによりポテトデキストロース寒天（Ｏｘｏｉｄ）上で増殖させた。７日後、麦芽抽出物またはＣｚａｐｅｘ  ｄｏｘ液体培地に、１ｃｍ片のＦｕｓａｒｉｕｍを接種し、２５℃で５日間増殖させた。５日後、ワットマン１番濾紙入りの滅菌濾過用漏斗に通し、Ｆｕｓａｒｉｕｍを滅菌した。この菌糸体をほぼ２ｃｍ片に切り取り、洗浄して形質移入した。
【０１２２】
形質移入及び洗浄溶液
１Ｍソルビトールを形移入培地として用い、１×ＰＢＳを洗浄培地として用いた。
【０１２３】
高圧エアロポレーションを用いる細胞形質移入の方法
・細胞を計数した（ほぼ０．５〜１×１０6細胞／ｍｌ）。
・細胞を１ｍｌの滅菌ｄｄ．Ｈ2Ｏ内に入れ、１３００ｒｐｍで５分間遠心することにより洗浄する。（２回）
・氷冷した１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内で洗浄する。
・冷却した１Ｍソルビトール内に細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ管内に移す。
・０．５μｌの巨大分子を溶液に加える。
・管をエアロポレーター内に入れ、チャンバを閉じる。
・空気排出口を閉じ、必要に応じて圧力を調節する。
・空気導入口を開け、１５分間加圧する。
・導入口を閉じ、排出口を開けることによりチャンバを減圧する。
・チャンバを開け、ＦＡＣＳ管を取り出す。
・細胞を１３００ｒｐｍで回転させ、次に、培地に再懸濁し、対数増殖期になるまで細胞を増殖させる（デキストランを用いる場合には、エアロポレーション直後に分析を行う必要がある）。
・分析用の細胞を調製する。
【０１２４】
形質移入後の分析の為の細胞の調製
蛍光顕微鏡によるＧＦＰ形質移入細胞の分析
・細胞を計数する。
・１×ＰＢＳで洗浄する。
・２μｌの１×ＰＢＳに再懸濁する。
・細胞を含む溶液を、ポリ−Ｌ−リジンマルチウェルスライドに加える。
・スライドを２０分間放置する。
・液体を吸引して除去する。
・２μｌの１×ＰＢＳをスライドに加え、５分間放置する。
・ＰＢＳを除去する。
・ＤＡＢＣＯ１滴をスライドに加え、このスライドに注意深くカバーガラスを載せる。
・蛍光顕微鏡で分析する。
【０１２５】
フローサイトメトリーによるＧＦＰ処理細胞の分析
・１×ＰＢＳを用いて１３００ｒｐｍで細胞を洗浄する（２回）。
・１Ｍソルビトール中に再懸濁し、フローサイトメーターに入れて分析する。
【０１２６】
細胞内でのβ−ガラクトシダーゼ発現の分析
β−Ｇａｌ緩衝液で処理した診断用スライド上の処理細胞を２４時間インキュベートし、その後、位相差を観察することにより分析を行った。
【０１２７】
生存率及び形質移入率の分析
生存率は、エアロポレーションの前及び後の増殖曲線、及びトリパンブルーを用いることにより得た。形質移入率は、フローサイトメトリーを用いて算出する。
【０１２８】
形質移入の結果
酵母菌細胞の形質移入
エアロポレーターを用いたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅの形質移入は、簡単であるが効果的である。
【０１２９】
両タイプの酵母菌細胞のエアロポレーション実験には、３〜４ＭＰａ（３０〜４０Ｂａｒｒ）の間の圧力における空気を用いた。全ての細胞は、１５分持続する１サイクルの間に形質移入した。
【０１３０】
形質移入は、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で最も効率的に達成され、形質移入率は極めて高く、生存率も高かった（表３及び表４）。
【０１３１】
糸状菌の形質移入
糸状菌の形質移入は、１サイクルの１５分間、３〜７ＭＰａ（３０〜７０Ｂａｒｒ）（例えば６ＭＰａ、６０Ｂａｒｒ）の空気を用いて行った。これらの細胞は、更に高い圧力（７〜８ＭＰａ、７０〜８０Ｂａｒｒ）で１サイクル以上行なっても形質移入される。
【０１３２】
エアロポレーションと方形波電気穿孔法による酵母菌細胞の形質移入を比較（表３）すると、これらの細胞に対しては、エアロポレーションの方が効率的であることが分かる。
【０１３３】
【表３】
2005500064.tif 000004
【０１３４】
【表４】
2005500064.tif 000005
【０１３５】
【表５】
2005500064.tif 000006
【０１３６】
【表６】
2005500064.tif 000007
【０１３７】
【表７】
2005500064.tif 000008
【０１３８】
酵母菌の形質移入は、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で高圧エアロポレーションを用いる場合が最も効率的であることが確認された。形質移入効率は、高圧の場合でも、空気を用いると生存率を著しく損なうことはなく、極めて高いままであった（表３及び表４、表９）。
【０１３９】
エアロポレーションを用いると、Ｓ．ｐｏｍｂｅ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生存率はいずれも、４８時間後でも高いままであることから、この工程は、細胞を死滅させたり、増殖サイクルを阻害したりしないと思われる（図８）。しかし、方形波電気穿孔法を用いる形質移入では、このシステムが細胞を破壊するようであり、収率及び生存率は、低くなることが示された（図７、表５）。
【０１４０】
エアロポレーションによる酵母菌の形質移入は、電気穿孔法に比べて遥かに効率的であることが示される。細胞壁のホールを再密封するのに要する時間を調べる目的で行った実験によれば、両方の酵母菌の種において、空気中では、ホールは、４ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ）よりも５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）の方が遥かに速く再密封されることが示された。また、エアロポレーションを用いる実験では、フザリウム属も、６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションに良好に応答することが示された。
【０１４１】
上記研究より、エアロポレーションは、非常に簡便な方法ではあるが、極めて効果的で、且つ極めて有用な形質移入法であることが示される。
【０１４２】
参考文献
Ｂｅｌｌ  Ｈ．，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｗ．  Ｌ．，Ｌｉ  Ｍ．，  Ｗｉｔｔｌｅ  Ｉ．Ｒ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，９（５），ｐｐ．７９３−７９８，１９９８．
Ｆｅｎｔｏｎ  Ｍ．，Ｂｏｎｅ  Ｎ．，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ａ．  Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１２（１），ｐｐ４１−４８，１９９８．
Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ  Ｌ．，Ｓｔｒｉｐｅｃｋｅ  Ｒ．，Ｃａｓｅ  Ｓ．Ｓ．，Ｘｕ  Ｄ．Ｋ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｋ．Ｉ．，Ｋｏｈｎ  Ｄ．Ｂ．，Ｂｌｏｏｄ，９２（１０），ｐｐ３５３７−３５４５，１９９８。
【０１４３】
実施例１０−ＮＴ１及びＢＭＳ細胞培養液におけるエアロポレーション法
ＮＴ１及びＢＭＳの細胞培養液を培養／維持する為の材料及び方法
ＢＭＳ（ブラックメキシカンスィート）トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）の細胞懸濁液をＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国、ノリッジ）から入手した。ＢＭＳ細胞懸濁液は、Ｇｒｅｅｎ  Ｃ．Ｅ．（１９９７年）による「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１３１−１３４に記載されている通りの従来法で培養した。
【０１４４】
ＮＴ１タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．）の細胞懸濁液をＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国ノリッジ）から入手した。ＮＴ１細胞懸濁液は、Ｆｒｏｍｍ  Ｍ、Ｃａｌｌｉｓ  Ｊ、Ｔａｙｌｏｒ  ＬＰ、Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ（１９８７年）による、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ」１５３：３５１−３６６に記載されている従来の方法で培養した。
【０１４５】
エセックス大学にて、下記遺伝子作成物を用いた。
【０１４６】
ＰＪＩＴ５８（Ｐ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ、ＪＩＣ）植物細胞転換用（図４参照）
ＰＡＬ１４５（Ｄ．Ｌｏｎｓｄａｌｅ、ＪＩＣ）植物細胞形質転換用（図６参照）
ＰＧＶＴ５（Ｖ．Ｔｈｏｌｅ、ＵＩＣ）ＮＴ１タバコＣＳ形質転換用（図３参照）
ＰＡＬ１５６（Ｄ．Ｌｏｎｓｄａｌｅ、ＪＩＣ）ＢＭＳ  ＣＳ  及びイネＥＣＳ形質転換用（図５参照）。
【０１４７】
上述した全ての遺伝子作成物は、公に入手可能であり、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国、ノリッジ）より得ることができる。
【０１４８】
遺伝子生成物の詳細は、マップで提示される。
・ｇｕｓＡ：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のグルクロニダーゼ遺伝子
・ｂａｒ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のホスフィニトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子由来
・ｎｐｔＩＩ：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
・イントロン４：トウモロコシファージ型ポリメラーゼ遺伝子由来のイントロン４
・イントロンＳＴ−ＬＳ１：Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来のＳＴ−ＬＳ１遺伝子のイントロン２
・３５Ｓ−Ｐ：カリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモーター
・Ｕｂｉ−Ｐ：トウモロコシ由来のユビキチン１プロモーター＋エクソン１＋イントロン１
・ｎｏｓ−Ｐ：アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼプロモーター
・３５Ｓ−Ｔ：カリフラワーモザイクウイルス由来のポリアデニル化配列
・Ｓ−Ｔ：ダイズ由来のポリアデニル化配列
・ｎｏｓ−Ｔ：アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼポリアデニル化配列。
【０１４９】
１０ａ  エアロポレーションを行なう前における、イネ胚形成細胞懸濁培養液の培養／維持及び調製
胚形成イネカルスの生成
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）の成熟種子変種日本晴を用い、Ｓｉｖａｍｉｎｉら１９９６、Ｗａｎｇら１９９７、及びＢｅｃら１９９８の修正プロトコールを用いてカルスを生成した。脱皮種子を、市販の漂白剤を半分の強さにして１５分間滅菌し、滅菌蒸留水で３回リンスした。解剖顕微鏡下で胚を無菌的に除去し、ＮＢｍ培地（多量（ｍａｃｒｏ）要素Ｎ６、微量（ｍｉｃｒｏ）要素Ｂ５、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、３０ｇ／ｌのスクロース、３０ｇ／ｌの２，４−Ｄ２ｍｇ／ｌ、３００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、５００ｍｇ／ｌのＬ−グルタミン、５００ｍｇ／ｌのＬ−プロリン、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ、ｐＨ５．８、高圧滅菌後に濾過滅菌したビタミンＢ５を添加）にプレートし、２５℃の暗所に３週間置いた。大きさがほぼ１ｍｍの遊離した胚形成半透明小球（Ｕ）を、本来の胚からゲル化剤上に分離した。小球を更に１０日間培養し、胚形成結節単位（ＥＮＵ、Ｂｅｃら１９９８年）を得た。
【０１５０】
胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）の生成
４０ｍｌのＮＢｍ液体培地を入れた２５０ｍｌフラスコに、胚形成結節単位（ＥＮＵ）を分散させ、２５℃の暗所にて１００ｒｐｍで振盪した。毎週、各フラスコから古い培養培地を除去し、４０ｍｌの新鮮ＮＢｍ液体培地を入れた新しいフラスコに、５００μｌまでＰＣＶ細胞を入れて継代培養した。
【０１５１】
エアロポレーションの為のイネＥＣＳの調製
１週間経過したイネＥＣＳを、１ｍｍナイロンメッシュを通して濾過した。濾液の一定分量をエアロポレーションに用いた（２００２年７月３０日の実験では、０．２、０．５または１ｍｌのＮＢｍ液体培地中に、ＰＣＶイネ細胞を５０μｌまで）。
【０１５２】
参考文献
Ｓｉｖａｍａｎｉ，Ｅ．，Ｓｈｅｎ，Ｐ．，Ｏｐａｌｋａ，Ｎ．，Ｂｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．Ｍ．（１９９６）、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃａｌｌｉ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ」、１５：３２２−３２７
Ｂｅｃ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｆｅｒｒｉｅｒｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｌｅｇａｖｅ，Ｔ．，Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．ａｎｄ  Ｇｕｉｄｅｒｏｎｉ，Ｅ．（１９９８年）、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｌｌｉ  ｉｎ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）、ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３８：１７７−１９０．
Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｂ．，Ｕｐａｄｈｙａｙａ，Ｎ．Ｂ．，Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｓ．ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．（１９９７年）、「Ｉｎｔｒｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ」、Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  ＆  Ｂｒｅｅｄ  ５１：３２５−３３４．。
【０１５３】
１０ｂ  エアロポレーションを用いる懸濁ＢＭＳ及びＮＴ１植物細胞の形質移入
形質移入とは、核に取り込まれて発現し得る様、特定の二本鎖ＤＮＡを分裂中の真核生物細胞内に導入するのに用いられる様々な技術を言う。
【０１５４】
植物細胞の懸濁培養液は、高圧エアロポレーションを用いて形質移入できることが分った。
【０１５５】
本実施例では、高圧エアロポレーションを用いてＢＭＳ及びＮＴ１細胞の形質移入を調べる為に行った実験について記載する。
【０１５６】
形質移入の生成
この実験には、適切な培地で培養したＢＭＳ及びＮＴ１懸濁植物細胞を用いた。細胞には、上述した様に６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）で１５分間を１サイクルとする加圧／減圧を用い、エアロポレーションにより形質移入した。
【０１５７】
レポーター分子
このセットの実験には、異なるレポーターＤＮＡベクターを用いた。これらには、β−グルクロニダーゼ（ＢＭＳ細胞にはｐＡＬ１４５、ＲＴ１８、ＮＴ１細胞にはＰＪＩＴ５８、ＰＧＶＴ５。用いる全てのプラスミドは、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒより入手した）が含まれる。緑色蛍光タンパク質ベクター（ＧＦＰ）も用いた。
【０１５８】
最終的に、ＢＭＳ及びＮＴ１両方の懸濁植物細胞に、エアロポレーターを用いてＴＭＲ−デキストラン（７０，０００ＭＷ）を形質移入した。
【０１５９】
細胞の培養
ＢＭＳ細胞
ＢＭＳ懸濁細胞培地中で培養した。細胞は、毎週継代培養した。２５０ｍｌフラスコに培養液１０ｍｌと、５０ｍｌの新鮮培地を加えた。細胞は２５℃にて１５０ｒｐｍで振盪した。
【０１６０】
ＮＴ１細胞
ＮＴ１懸濁培地中で培養した。細胞は、１：５０及び１：１００希釈で毎週継代培養した。２５℃にて１２５ｒｐｍで振盪し、ホイルで遮光した。
【０１６１】
イネ胚形成細胞懸濁培養液
ＮＢｍ培地で培養した。細胞は、毎週継代培養した。暗所にて、２５℃で１０００ｒｐｍ振盪した。
【０１６２】
細胞分析
光学顕微鏡−明視野顕微鏡
明視野顕微鏡は、光学顕微鏡分野で最も広く用いられる技術である。一般に、生きている１個の細胞または１層の細胞は、通常の光学顕微鏡では殆ど観察されない。しかし、染色で補えば、明視野顕微鏡は、強力な技術となる。
【０１６３】
光学顕微鏡−蛍光顕微鏡
蛍光顕微鏡は、或る物質が特定の波長域の光を吸収した後、光の形態で放出するという特性に基づく。我々の試験では、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＭ１２顕微鏡を用いた。我々が用いた蛍光タンパク質では、通常のＦＩＴＣフィルタを用いることができる。
【０１６４】
結果
エアロポレーター（Ｂ）を用い、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間、ＧＦＰベクターで培養したＢＭＳ細胞を形質移入した。この試験細胞には有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。
【０１６５】
培養ＮＴ１細胞へのＧＦＰベクターの形質移入
細胞を夫々、６Ｐａ（６０Ｂａｒｒ）及び７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間処理した。試験細胞には有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。
【０１６６】
培養ＢＭＳ懸濁細胞へのＴＭＲ−デキストラン（７０，０００分子量）の形質移入
細胞をエアロポレーターに入れ、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間処理した。試験細胞には、有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。
【０１６７】
培養ＮＴ１細胞へのＴＭＲ−デキストラン（７０，０００分子量）の形質移入
細胞をエアロポレーターに入れ、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）でほぼ１５分間（１サイクル）処理した。試験細胞には、有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。
【０１６８】
前述した実験（即ち、１サイクル：６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）で１５分）の様に培養ＮＴ１細胞へのＰＧＶＴ５ベクター（ＧＵＳ）の安定した形質移入
選択性培地内で約２週間培養した後と、更に２週間及び３週間非選択性培地内で培養した後に撮った写真では、試験細胞に有意な染色が見られる。
【０１６９】
培養イネ胚形成培養物へのＴＭＲ−デキストラン及びＧＦＴの形質移入
試験したイネ胚形成細胞では、有意な青色着色が見られた。未処理対照には、蛍光は見られなかった。
【０１７０】
実施例１１−エアロポレーションで形質転換した後の細胞を継代培養及び選択する為の材料及び方法
エアロポレーション処理を行なった後、イネＥＣＳを、ＮＢｍ固体培地を含むペトリ皿に載せたワットマン濾紙上にプレートし、２５℃の暗所で２日間培養した。
【０１７１】
エアロポレーションの２日後に、選択培地（ＮＢｍ固体培地と５ｍｇ／ｌホスフィノトリシン（ＰＰＴ、選択ｐＡＬ１５６）、または１００ｍｇ／ｌジェネテシン（選択ｐＧＶＴ５）のいずれかの上に濾紙を移し、２５℃の暗所に２週間置いた。ＰＰＴをインキュベートするとき、全ての培養培地からＬ−グルタミンを除去した。
【０１７２】
形質転換の２週間後に、各カルス（個々のＥＮＵで増殖）を２〜５のピース（部片）に分けた。カルスの各部片は、新鮮ＮＢｍをベースとした選択培地上で更に３週間培養した。２＋３週間選択の後、個々のＥＮＵから増殖した抵抗性カルスを、全て一緒にまとめた。
【０１７３】
エアロポレーションの５週間後、抵抗性カルスを、ＰＲｍ予備再生培地（２，４−Ｄを含まないが、２ｍｇ／ｌＢＡＰ、１ｍｇ／ｌＮＡＡ、５ｍｇ／ｌＡＢＡと５ｍｇ／ｌＰＰＴ（選択ｐＡＬ１５６）または１００ｍｇ／ｌジェネテシン（選択ｐＧＶＴ５）のいずれかを含むＮＢｍ固体培地）に移し、２５℃の暗所に９日間置いた。
【０１７４】
エアロポレーションの６週間後、次いで、明らかに分化成長しているカルスを、再生培地ＲＮｍ（２，４−Ｄを含まないが、３ｍｇ／ｌＢＡＰ、０．５ｍｇ／ｌＮＡＡと５ｍｇ／ｌＰＰＴ（選択ｐＡＬ１５６）または１００ｍｇ／ｌジェネテシン（選択ｐＧＶＴ５）のいずれかを含むＮＢｍ固体培地）に移し、２５℃の明るい所に２〜３週間置いた。各植物が、独立した形質転換事象現象を確実に表す様、本来のＥＮＵから夫々、一の植物のみを再生した。
【０１７５】
エアロポレーションの８〜９週間後、５ｍｇ／ｌＰＰＴ（選択ｐＲＴ１８）または１００ｍｇ／ｌジェネテシン（選択ｐＧＶＴ５）のいずれかを含むＭＳＲ６固体培地上にて、２５℃の明るいところで２〜３週間、植物を生育させた（Ｖａｉｎら１９９８年）。
【０１７６】
エアロポレーションの１０〜１２週間後、形質転換された植物を、成熟して結実させる様に生育させる為の、コントロールされた環境下に移した。
【０１７７】
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎの方法（１９８７）による組織化学的なＧＵＳ染色により、選択工程の間におけるイネカルス及び植物のＧｕｓＡ活性をモニターした。形質転換植物の分子解析は、ＰＣＲ及びサザンブロット解析を用いて行った。
【０１７８】
参考文献
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ＲＡ，Ｋａｖａｎａｇｈ  ＴＡ，Ｂｅｖａｎ  ＭＷ（１９８７）、「β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１−３９０７．
Ｖａｉｎ，Ｐ．，Ｗｏｒｌａｎｄ，Ｂ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ｂｅａｖｉｓ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｋｏｈｌｉ，Ａ．，Ｌｅｅｃｈ，Ｍ．，Ｓｎａｐｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．（１９９８年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｏｒｙｚａｃｙｓｔａｔｉｎ−ＩＡｄ８６）  ｆｏｒ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｔｈｅｏｒ．ａｎｄ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ  ９６：２６６−２７１．
【０１７９】
【表８】
2005500064.tif 000009
【０１８０】
原液（ストック）多量要素  Ｎ６（Ｃｈｕ他、１９７５年）
2005500064.tif 000010
【０１８１】
原液（ストック）微量要素  Ｂ５（Ｇａｍｂｏｒｇ他、１９６８年）
2005500064.tif 000011
【０１８２】
原液（ストック）ビタミンＢ５（Ｇａｍｂｏｒｇ他、１９６８年）
2005500064.tif 000012
【０１８３】
参考文献
Ｇａｍｂｏｒｇ  ＯＬ、Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＡ、Ｏｊｉｍａ  Ｋ（１９６８年）、「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｒｏｏｔ  ｃｅｌｌｓ」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．５０：１５１−１５８
Ｃｈｕ  ＣＣ，Ｗａｎｇ  ＣＣ，Ｓｕｎ  ＣＳ  Ｈｕｓ  Ｃ，Ｙｉｎ  ＫＣ，Ｃｈｕ  ＣＹ，Ｂｉ  ＦＹ，（１９７５年）「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｕｒｃｅｓ」、Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．（Ｐｅｋｉｎ）１８：６５９−６６８．。
【０１８４】
実施例１２−エアロポレーションを用いる植物細胞の安定した形質移入
植物細胞の懸濁培養物は、高圧エアロポレーションを用いて形質移入することができる。しかしながら、細胞の多くは、宿主ゲノム内に組み込まれていない、形質移入されたベクター自体を発現し、これは一過性発現として知られている。
【０１８５】
外来性遺伝子が宿主ゲノムに安定して組み込まれた細胞を産生する為には、形質移入されていない細胞から、形質移入される細胞を選択する方法が必要である。これは通常、形質移入細胞に抗生物質耐性を付与する遺伝子を恒常的に発現させる為の遺伝子を、細胞内に同時に形質移入することによって行われる。抗生物質耐性遺伝子は、関心のある外来遺伝子として同じプラスミドベクターに保有されることが好ましい。通常用いられる選択法の１つは、受容細胞にＧ４１８硫酸塩耐性を付与するネオマイシン遺伝子を用いる方法である。本明細書には、高圧エアロポレーションを用いた細胞への安定した形質移入を調べる為に行った研究について記載している。
【０１８６】
形質移入の手順
全ての実験では、ＭＳまたはＢ５培地のいずれかで少なくとも３日間培養することにより、刻みタバコ及びトウモロコシ葉由来の植物細胞懸濁液を用いた。細胞は、前述した様に１サイクルの加圧／減圧を用いて７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）までエアロポレーションにより形質移入した。
【０１８７】
レポーター分子
植物細胞形質移入試験には、４つの異なる種類のレポーターＤＮＡベクターを用いた。即ち、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質ベクター（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質ベクター（ＲＦＰ）である。
【０１８８】
ＧＦＰは、細胞を死滅させずに検出することができるので、有用である。ＧＦＰ遺伝子を形質移入した細胞は、明るい蛍光を示す。ＧＦＰは分子量が小さく、安定性の高いタンパク質であり、光退色が殆ど見られない。このレポーター系は、植物を含む広範囲のの生物学的システムで機能することが示されている（Ｃｏｒｂｅｔｔ、１９９５年、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、１９９５年、Ｋａｅｔｈｅｒ、１９９５年、Ｗａｎｇ、１９９４）。一方、ＲＦＰは、自己蛍光を示さない。
【０１８９】
ＧＦＰ及びＲＦＰの利点は、レポーター遺伝子を発現する細胞を蛍光顕微鏡により識別することができ、これによって、フローサイトメトリーを用いて細胞を分別できることである。また、両方のベクターは、培養液中の形質移入細胞の選択を容易にするネオマイシン遺伝子も有している。この理由により、第１の実験では、濃度２μｇ／ｍｌのＧＦＰ及びＲＦＰＤＮＡベクターを用いて行った。
【０１９０】
細胞の培養
形質移入直後に、ＭＳ培地で細胞を培養したが、この培地には、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｓｉｇｍａ）を加え、ネオマイシン耐性遺伝子が存在することにより形質移入されている細胞が選択される様にした。開始の前に、形質移入される細胞について、選択抗生物質による細胞死の容量反応曲線を作成した。１〜３日にわたって形質移入されていない細胞の殆どを死滅させるのに丁度良い正確な濃度の選択培地を用いることが重要であった。本発明者らの実験では、完全に選択する為に１０００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いた。細胞は、必要に応じて３〜４日毎に培地を交換しつつ、上記選択培地中で少なくとも２〜３週間培養し、その後、非選択培地に移して更に増殖させた。
【０１９１】
細胞分析
蛍光活性化細胞分別
この技術を用いれば、細胞が発現する光散乱特性及び特定の表面分子に基づいて細胞を分離することができる。これらの分子は、蛍光色素で標識された特定リガンド（例えば抗体）を用いることによって検出することができる。細胞を含む微小液滴流をレーザービームに通過させる。光散乱は、レーザーにより励起された蛍光色素の蛍光と共に低角度及び９０°で検出する。光散乱及び蛍光パラメータが予め定められた限界内に含まれる細胞は、収集の為、静電的に偏向させる。この技術はまた、１個の細胞がマルチウェルプレートのウエル内に偏向する様に適合させることもできる。
【０１９２】
蛍光顕微鏡
細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＭＴ２顕微鏡を用いて、明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡のいずれかにより調べることができる。これは、両方の蛍光タンパク質に対して標準ＦＩＴＣフィルタを用いることが可能であったためである。
【０１９３】
結果
培養タバコ葉細胞培養物の安定な形質移入のＧＦＰ写真
エアロポレーターを用いて、ＧＦＰベクターを培養タバコ細胞に安定に形質移入したもの。この写真は、選択培地で２週間培養した後、及び非選択培地で更に２週間培養した後に撮影した。未処理の対照では、蛍光が見られなかったのに対し、形質移入細胞では、有意な蛍光が見られた。
【０１９４】
培養トウモロコシ及びタバコ葉細胞の安定な形質移入のＲＦＰ写真
培養トウモロコシ及びタバコ細胞に安定に形質移入したもの。細胞は、エアロポレーターを用い、ＲＦＰベクターを形質移入した。写真は、選択培地で２週間培養した後に撮った。未処理の対照では、蛍光が見られなかったのに対し、形質移入細胞では、有意な蛍光が見られた。
【０１９５】
本発明者らの実験から、エアロポレーション技術を用いれば安定な形質移入を容易に行えることは極めて明白である。ＧＦＰベクターで安定に形質移入したタバコ葉細胞の培養物は、約４週間、即ち選択培地で２週間、非選択培地で更に２週間の間、増殖に成功した。ＧＦＰベクターの場合の様に、ＲＦＰの発現レベルは、タバコに比較してトウモロコシ細胞では低いと思われる。
【０１９６】
参考文献
Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ａ．Ｈ．，Ｋｏｅｐｐ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｃｌｅｎｓｔｅｄｔ，Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｏｐｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．（１９９５年）、「Ｒｎａｌｐ，ａ  Ｒａｎ／ＴＣ４  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３０，１０１７〜１０２６
Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．，Ａｍｏｓ，Ｂ．（１９９５年）、「ＧＦＴ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」、ＴＩＧ  １１，３２８〜３２９
Ｋａｅｔｈｅｒ，Ｃ．，Ｇｅｒｄｅｓ，Ｈ．Ｈ．（１９９５年）、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６９  ２６７〜２７１
Ｗａｎｇ  Ｓ．Ｘ．，Ｈａｚｅｌｒｉｇｇ，Ｔ（１９９４年）、「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｃｄ  ｍＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍ  ｓｐａｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｏｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３６９  ４００〜４０３。
【０１９７】
実施例１３−植物細胞のエアロポレーション
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＤＮＡベクターと、赤色蛍光タンパク質をコードするｐＤｓＲｅｄｌ−Ｃｌベクターとを用い、植物細胞を異なる方法で調製するのにエアロポレーション法を用いた。３〜５日間培養したタバコ葉由来の細胞は、ＧＵＳで形質移入することができた。トウモロコシを５〜７ＭＰａ（５０〜７０Ｂａｒｒ）の圧力範囲にわたってエアロポレーションした結果、圧力が高くなると、形質移入のレベルが高くなることが示された。赤色蛍光タンパク質を用いてタバコ及びトウモロコシ葉をエアロポレーションすることにより、夫々４５〜５５％、３０〜３５％レベルの明らかな形質移入が見られた。ＧＦＰで安定に形質移入されたトウモロコシ及びタバコ細胞の培養物も、確立された。
【０１９８】
エアロポレーションを用いて植物細胞に形質移入する以前の研究では、レポーター分子としてＴＭＲ−デキストラン、ＧＲＰ及びβ−ガラクトシダーゼベクターを用いた。
【０１９９】
植物実験は、植物で発現する様に特別にデザインされたグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（１つは双子葉類用に、もう１つは単子葉類用にデザインされており、いずれもＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（ノリッジ）から入手可能）をコードするベクターを用いて行った。組織化学的、分光光度分析及び蛍光定量分析に好適なＧＵＳアッセイの基質は市販されている。
【０２００】
植物
タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）及びトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）植物は、温室内で約６〜７週間生育させた。用いた植物組織は、タバコ及びトウモロコシ葉（長さ〜１．０ｃｍ）であった。
【０２０１】
植物細胞試料
植物組織を滅菌し（Ｈａｌｌ、１９９９年）、その後、細かく刻んで１〜２ｍｍ立方体にした。刻んだ断片は、エアロポレーションに直接用いるか、１０ｍｌのＭＳまたはＢ５培養培地（Ｈａｌｌ、１９９９年）を入れたペトリ皿内で培養し、２４〜２６℃のオービタルシェーカー（１４０ｒｐｍ）で３６〜４８時間インキュベートした。
【０２０２】
滅菌篩（メッシュ０．５〜１．０ｍｍ）を用い、細胞懸濁液から凝集した全ての植物材料を除去することにより培養された培養断片から単一の細胞懸濁液を調製した。残りの細胞懸濁液を、７５０ｇで５分間遠心した。遠心後、ペレットを適切な培養培地に再懸濁し、続いて、２５℃でインキュベートした。用いた培地は、４．５μＭの２，４−Ｄ（Ｇａｍｂｏｒｇら、１９７９年）を補充したＭＳ培養培地であった。細胞は、２．５×１０3細胞／ｍｌの密度で総量１０ｍｌを接種した。植物細胞の懸濁液は、２５℃のインキュベータ内に保持した。
【０２０３】
ベクター
細胞膜にホールが生成されたＴＭＲデキストラン（７０キロドルトン）を指標として用いた。この分子の直径は、約５．４ｎｍである。
【０２０４】
双子葉類にＧＵＳを形質移入する為に、ｐＪＴＴ５８ベクター（５．２ｋｂ）を用い（図４）、単子葉類にＧＵＳを移入する為に、ｐＡＬ１４５ベクター（６．９８ｋｂ）を用いた（図６）。
【０２０５】
赤色蛍光タンパク質を発現するｐＤｓＲｅｄｋ−Ｃｌベクターは、単子葉植物及び双子葉植物の両方を形質移入するのに用いた。
【０２０６】
植物細胞におけるエアロポレーションプロトコール
容量１．０ｍｌのＭＳ培地に４×１０4の細胞を懸濁させた懸濁液をＦＡＣＳ管に入れたものを、エアロポレーターの圧力チャンバに入れ、１５分間７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）まで加圧し、その後、素早く減圧した。全工程を、室温（２０〜２２℃）で行った。エアロポレーションサイクルが終了した後、細胞をエアロポレーターから取り出し、ミクロ遠心管に移した。細胞を、２１８×ｇにて５分間、１回遠心し、ペレットを、１ｍｌの培養培地に再懸濁させた。細胞懸濁液を２４ウエルプレートに移した後、４８〜７２時間培養（２５℃）し、ＤＮＡを発現させた。
【０２０７】
植物細胞の顕微鏡分析
ＧＵＳ染色（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｓ．Ｒ．，１９９２年）
・５×１０4の形質移入細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗う。
・ポリ−Ｌ−リジンコーティーングスライド（７０％エタノール＋６ｍｌリジン溶液で１時間洗い、ｄｄ．Ｈ2Ｏで９回リンスしたもの）に細胞を移す。細胞を１５分間付着させ、過剰な液体を除去する。
・固定液（２％ホルムアルデヒド及び０．０５％グルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を用い、室温で５分間細胞を固定する。
・ＰＢＳで１回洗う。
・Ｘ−Ｇｌｕｃ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に染色液を加え、３７℃で１晩（１６時間）インキュベートする。
・細胞をＰＢＳで注意深くリンスし、全ての試料に対して同じ倍率で、倒立顕微鏡観察する。
【０２０８】
基質４−ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄグルクロニド）がβ−グルクロニダーゼ活性で切断されることにより、蛍光発生物４−ＭＵが生成し、これはＵＶ光で可視化される。使用するプロトコールは、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ（１９８９年）に記載されているものである。
【０２０９】
組織培養培地中でのＭＵＧを用いた非破壊アッセイ
４−ＭＵＧは、短期間（２日まで）のインキュベーションでは毒性がないと思われ、組織培養物における無毒性の染色方法が開発された（Ｇｏｕｌｄ及びＳｍｉｔｈ、１９８９年）。β−グルクロニダーゼは培養植物組織から培地に漏れる為、ＧＵＳ発現は、材料が培地に移行した後に、用いた培地で分析することができる。或いは、懸濁培養液は、材料を破壊することなく直接染色することもできる。
【０２１０】
アッセイプロトコール
・２ｍＭの４−ＭＵＧを含む液体または寒天培地で材料を２日間培養する。
・３０〜３７℃で１晩インキュベートする。温度は、プロモーターの強度による。
・新鮮培地に移す。
・１０〜３０μｌの０．３ＭＮａ2ＣＯ3を組織に加える。
・２０分後にＵＶ光下で染色を評価する。
【０２１１】
結果
植物組織試料での形質移入パターン
培養タバコ細胞の懸濁液を、エアロポレーターを用いてＧＵＳ（ｐＪＩＴ５８ベクター）で形質移入し、形質移入した細胞を、（Ａ）Ｘ−ｇｌｕｃ基質または（Ｂ）ＭＵＧ基質のいずれかで可視化した。この細胞を、１サイクルの１５分間エアロポレーター内で処理した。用いた圧力は７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であった。
【０２１２】
培養したトウモロコシ細胞の懸濁液には、エアロポレーターを用いてＧＵＳ（ｐＡＬ１４５ベクター）を形質移入し、ＭＵＧ基質で可視化した。この細胞を、１サイクルの１５分間エアロポレーター内で処理した。用いた圧力は、（Ａ）５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）、（Ｂ）６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）、及び（ｃ）７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であった。未処理の対照では、蛍光が見られなかった。
【０２１３】
この結果から、蛍光及び非蛍光基質の両方を用いた実験において、懸濁されたタバコ細胞には、エアロポレーション法によりＧＵＳを形質移入できることは明らかである。得られた形質移入のレベルは、約２０％と推定された。懸濁されたトウモロコシ細胞も、単子葉類に発現させる様にデザインされたベクターを用いて形質移入された。トウモロコシを、圧力範囲５〜７ＭＰａ（５０〜７０Ｂａｒｒ）にわたってエアロポレーションした結果、圧力が高ければ、形質移入のレベルも高くなることが示された。
【０２１４】
以下のＤｓＲｅｄｌベクターを用いた形質移入実験の結果、エアロポレーションにより、懸濁されたタバコ細胞では約５０％の細胞が形質移入され、トウモロコシ培養細胞にでは僅かに低い形質移入レベルである約３５％が得られることが示された。
【０２１５】
培養されたタバコ葉細胞及び培養されたトウモロコシ葉細胞を５日間培養した後、ＤｓＲｅｄｌが形質移入された。エアロポレーターで用いた圧力は、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であり、細胞を、１サイクルの１５分間処理した。用いた気体は空気であった。未処理の対照では、蛍光は見られなかった。
【０２１６】
形質移入及び細胞収量を最大にする為の好ましい圧力は、１回またはそれ以上の１５分サイクルを用い、５〜８ＭＰａ（５０〜８０Ｂａｒｒ）である。ＧＦＰで安定に形質移入されたタバコ及びトウモロコシ葉細胞の培養物は、非選択培地で少なくとも４週間以上増殖することができる。
【０２１７】
参考文献
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【０２１８】
実施例１４−Ｅ．ｃｏｌｉの形質移入
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）の増殖条件
まず、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、冷却軌道インキュベータ内にて３７℃のｌａｕｒｉｎａブロス（ＬＢ）で１晩増殖させ、その後、ＬＢ寒天プレート上に画線した。
【０２１９】
形質転換する為に、滅菌楊枝を用いてプレートから単一コロニーを採取し、１０ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で１晩増殖させた。翌朝、細胞１００μｌを取り除き、別の培地１０ｍｌに加えて２時間インキュベートした。
【０２２０】
高圧エアロポレーションを用いた形質移入の方法
細胞は、以下の様にエアロポレーション方法を用いて形質転換した。
・形質移入培地及び洗浄培地として１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
・細胞を計数した（ほぼ０．５〜１×１０6細胞／ｍｌ）
・細胞を、１．０ｍｌの滅菌２回蒸留Ｈ2Ｏに入れ、１３００ｒｐｍで５分間（２×）遠心することにより洗浄した。
・氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。
・細胞を冷却１×ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ管に移した。
・０．５μｌの巨大分子を溶液に加えた。
・管をエアロポレーターチャンバに入れ、チャンバを閉めた。
・空気排出口を閉じ、必要に応じて圧力を調節した。
・空気導入口を開け、１５分間加圧する。
・空気導入口を閉じ、空気排出口を開けることによりチャンバを減圧した。
・チャンバからＦＡＣＳ管を取り出した。
・細胞を、１３００ｒｐｍで回転した後、培地に再懸濁し、対数期になるまで増殖させた（デキストランを用いる場合は、エアロポレーションの直後に分析を行う）。
・分析用に細胞を調製した。
【０２２１】
数種の市販のベクターを用い、エアロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉの形質転換を行った。
【０２２２】
これらの実験には、ＴＭＲデキストランも用いた。
【０２２３】
エアロポレーションを行った形質転換細胞からのＤＮＡ単離
Ｑｕｉａｇｅｎ無エンドトキシンＭｉｄｉ  Ｋｉｔを用い、業者の説明書に従ってＤＮＡを単離した。
【０２２４】
結果
Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換は、１×ＰＢＳで成功した。
【０２２５】
形質転換後、細胞を選択培地内で１晩増殖させ、ＤＮＡを単離した。
【０２２６】
【表９】
2005500064.tif 000013
【０２２７】
形質移入培地として１×ＰＢＳを用いた形質転換を調べる為、ＴＭＲデキストランも用いた。
【０２２８】
【表１０】
2005500064.tif 000014
【０２２９】
上記結果より、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換が成功したことは明白である。全ての指標は、エアロポレーション法が、ＤＮＡの単離につながる細菌の形質転換に適切であることを示している。
参考文献
Ｂｅｌｌ  Ｈ．，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｗ．Ｌ．，Ｌｉ  Ｍ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、９（５）、ｐｐ７９３〜７９８（１９９８年）
Ｆｅｎｔｏｎ  Ｍ．，Ｂｏｎｅ  Ｎ．，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ａ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１２（１）、ｐｐ４１〜４８（１９９８年）
Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ  Ｌ．，Ｓｔｒｉｐｅｃｋｅ  Ｒ．，Ｃａｓｅ  Ｓ．Ｓ．，Ｘｕ  Ｄ．Ｋ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｋ．Ｉ．，Ｋｏｈｎ  Ｄ．Ｂ．，Ｂｌｏｏｄ，９２（１０）、ｐｐ３５３７〜３５４５（１９９８年）。
【０２３０】
実施例１５−Ｂ．ｓｔｕｂｔｉｌｉｓの形質移入
材料
この実施例には、以下の材料を用いた。
・０．４％トリパンブルーのＰＢＳ溶液
・滅菌蒸留水
・滅菌１×ＰＢＳ
・シャトルベクター−ＪＭ１１０（ｐＨＢ２０１）
・ＬＢ培地
・エアロポレーター
・Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ（１０１２Ｍ１５）
・エリスロマイシン。
【０２３１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの増殖とエアロポレーション
・滅菌済使い捨てループを用いて、固体ＬＢ培地にＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓを接種する。３７℃で１晩インキュベートする。
・単一のコロニーを採取し、１０ｍｌのＬＢ培地に接種した後、１８５ｒｐｍの冷却振盪インキュベータで増殖させる。
・朝、１０ｍｌの新鮮ＬＢで晩培養したものを１００μｌ接種した。３７℃で２時間インキュベートする。
・Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを氷上で１０分間冷却し、同時に、ＭＣＣ管も冷却する。
・液体培養物１ｍｌを除去し、冷却したＭＣＣ管に加え、１０００ｒｐｍで５分間回転させる。
・上清を除去し、１ｍｌの氷冷滅菌水を加え、１０００ｒｐｍ（２回）で回転させる。
・上清を除去し、１ｍｌの氷冷１×ＰＢＳを加え、１０００ｒｐｍで５分間回転させた後、上清を除去して１ｍｌの新鮮な氷冷１×ＰＢＳを細胞に加えてから、０．５μｌのＤＮＡを加えて混合した後、冷却した管に加える。
・管をエアロポレーターに入れ、チャンバを１５分間加圧する。
・減圧し、管を取り出す。
・管から細胞を取り出し、冷却したＭＣＣ管に戻す。
・上記の様にして細胞を洗う。
・１×ＰＢＳ中、１０００ｒｐｍで５分間洗い、上清を取り除く。
・加温した（３７℃）ＬＢ培地１ｍｌを加える。
・段階希釈を行う（任意）。
・選択培地、この場合はエリスロマイシンに蒔く。
・３７℃で１６時間インキュベートする。
【０２３２】
結果
【０２３３】
【表１１】
2005500064.tif 000015
【０２３４】
上記表１１の結果より、形質移入された細胞は、非形質移入細胞とは対照的に、エリスロマイシン含有培地で増殖することができた為、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、全ての圧力で、特に４及び５ＭＰａ（４０及び５０Ｂａｒｒ）で形質移入が成功したことが分った。
【０２３５】
実施例１６−ＦＩＴＣ−ＢＳＡで形質移入するＮ．ｔａｂａｃｏ植物細胞のエアロポレーション
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）で形質移入するＮ．ｔａｂａｃｕｍ（誘導葉肉組織）植物細胞のエアロポレーション。細胞は、エアロポレーター内で４５分間（３サイクル）処理した。第１の試料は、空気の存在下で形質移入を行い、第２の試料は、酸素の存在下で形質移入を行った。
【０２３６】
両方の試料を試験すると陽性であった。酸素のみの存在下でエアロポレーションした場合には、空気の存在下で行ったエアロポレーションを行った場合に比べて、得られる発現が高かった。未処理の対照では、蛍光が見られなかった。
【０２３７】
このことは、本発明の幾つかの実施形態ではて、エアロポレーション法において溶解性の高い気体を用いると、細胞の形質移入の成功率が高くなることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】本発明の一実施形態による装置の概略図であり、１は導入口、２は排出口、３は圧力計、４は圧力チャンバ、５はニードル弁、６はゲルまたは流体を保持する為の区画を定める圧力チャンバの内側表面のコーティーングである。
【図２】本発明の別の実施形態による装置を示す概略図であり、１は導入口、２は排出口、３は圧力計、４は圧力チャンバ、５はニードル弁、７は圧力チャンバの内側表面に隣接して位置決めされ、ゲルまたは流体を保持する為の区画を形成する受容器である。
【図３】ｐＧＶＴ５遺伝子構成を示す図である。
【図４】ＪＩＴ５８遺伝子構成を示す図である。
【図５】ｐＡＬ１５６遺伝子構成を示す図である。
【図６】ｐＡＬ１４５遺伝子構成を示す図である。
【図７】形質移入したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の推定生存率を示す図である。
【図８】５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）でのエアロポレーション後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の増殖率を示す図である。
【図９】酵母菌細胞での細胞形質移入のパーセントを示す図である。
【図１０】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ベクターであるｐＤｓＲｅｄｌ−Ｃｌでの制限酵素切断地図及び複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を示す図である。
【図１１】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃｌでの制限酵素切断地図及び複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を示す図である。
【符号の説明】
【０２３９】
１  導入口
２  排出口
３  圧力計
４  圧力チャンバ
５  ニードル弁
６  コーティーング
【図６】
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【図７】
2005500064.tif 000017
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月2日(2003.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
細胞壁を有する生細胞の透過性を高める方法であって、
（ａ）該細胞の表面に接触する流体またはゲルを加圧する工程と、
（ｂ）前記流体またはゲルを減圧する工程と、
を包含し、該細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成することを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記流体またはゲルを減圧する工程が、前記細胞の表面に少なくとも一つのホールを形成し得る気泡を発生させるものである請求項１に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、２ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ）またはそれ以上である請求項１または２に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、２〜１１ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ〜１１０Ｂａｒｒ）である請求項３に記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記工程（ｂ）での圧力の減少が、５〜１１ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ〜１１０Ｂａｒｒ）である請求項４に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
前記流体またはゲルが、前記工程（ｂ）において実質的に大気圧（約１Ｂａｒｒ）まで減圧されるものである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記細胞の表面のホールが、細胞膜のホールを含むものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記圧力が、前記工程（ｂ）において１０秒未満のインターＢａｒｒにわたって減少するものである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
前記流体またはゲルが、前記工程（ａ）において１０分間またはそれ以上の間加圧されるものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４５】
前記ホールが、細胞膜のホールを含むものである請求項４４に記載の透過性が高められた細胞。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４６】
前記細胞の細胞壁が、実質的に無傷である請求項４４または４５に記載の透過性が高められた細胞。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４７】
細胞の透過性を高める為及び／または細胞内に物質を導入する為の減圧手段の使用であって、前記細胞が細胞壁を有し、前記減圧手段が、細胞を含む流体またはゲルに与えられた圧力を２ＭＰａ（２０Ｂａｒｒ）またはそれ以上の段階だけ減少させるのに用いられることを特徴とする使用。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４８】
請求項１〜４３のいずれかに記載の方法を用いて、細胞壁を有する細胞内に物質を導入する装置であって、
（ａ）気体を導入する導入口と（１）、
（ｂ）前記導入口から送り込まれる、実質的に幾何学的な断面を有する
圧力チャンバと（４）、
（ｃ）流体またはゲルの前記細胞を収容する前記圧力チャンバ内の区画（６）
と、
（ｃ）必要に応じて、前記圧力チャンバ内の圧力をモニターする圧力計（３）
と、
（ｄ）前記圧力チャンバから気体を放出する為の排出口（２）と
を備えており、
前記導入口及び排出口がいずれも、加圧中に前記圧力チャンバを隔離する弁（５）を備えることを特徴とする装置。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４９】
前記導入口及び排出口が、導入管及び排出管を含むものである請求項４８に記載の装置。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５０】
前記導入管及び／または排出管の直径が、２〜４ｍｍである請求項４９に記載の装置。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５１】
前記加圧チャンバの幾何学的断面が、実質的に円筒形である請求項４８〜５０のいずれかに記載の装置。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５２】
流体またはゲルの前記細胞を収容する前記区画が実質的に、前記圧力チャンバの内側表面全体を含むものである請求項４８〜５１のいずれかに記載の装置。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５３】
前記圧力チャンバの内側表面が、生理的に許容されるコーティーングを含むものである請求項５２に記載の装置。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５４】
流体またはゲルの前記細胞を収容する前記区画が、前記圧力チャンバの内側表面に隣接して位置する受容器（７）を含むものである請求項４８〜５１のいずれかに記載の装置。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５５】
前記受容器が、前記圧力チャンバの内側表面により支持されているものである請求項５４に記載の装置。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５６】
前記受容器の内側表面が、生理的に許容されるコーティーングを含むものである請求項５４または５５に記載の装置。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５７】
前記導入口及び／または排出口の前記弁が、ニードル弁を含むものである請求項４８〜５６のいずれかに記載の装置。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明では、減圧の工程に形成される全ての気泡の大きさを制御し、気泡が、細胞に（特に細胞表面と相互作用するときに）一過性のホールを形成することができる様にすることが望ましい。減圧を用いた、特に気泡を用いた細胞表面へのホール形成は、「エアロポレーション」と呼ばれる。気泡の大きさは、細胞の大きさに匹敵することが好ましい。例えば、好ましい気泡の半径は、細胞の半径の１／３倍から５倍である。


【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の方法によれば、加圧工程により、流体またはゲルに溶解される気体の量が増大する。気泡の発生率、気泡の大きさ及び気泡の表面エネルギーは、減圧工程での圧力を減少させる速度及び程度を変動させることにより制御することができる。


【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
この方法は、典型的には、流体またはゲルを加圧する工程と、流体及びゲルを一定期間開始圧力に保持する工程と、次に、圧力を減少させ、好ましくは気泡を形成させる工程とを含む。圧力の減少は、一般に０．５ＭＰａ（５Ｂａｒｒ）またはそれ以上であり、典型的には０．５〜１１ＭＰａ（５〜１１０Ｂａｒｒ）の範囲内である。該圧力の減少は、１〜１１ＭＰａ（１０〜１１０Ｂａｒｒ）が好ましく、更に好ましくは２〜１１ＭＰａ（２０〜１１０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは５〜１１ＭＰａ（５０〜１１０Ｂａｒｒ）の範囲である。幾つかの実施形態においては、圧力の減少は、２〜８ＭＰａ（２０〜８０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは３〜８ＭＰａ（３０〜８０Ｂａｒｒ）、更に好ましくは４〜８ＭＰａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）、最も好ましくは６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）とすることができる。減圧工程での圧力の減少が大きくなると、ホールが形成される効率、従って形質移入効率が高くなる。しかしながら、減圧工程での圧力低下を増大させると、細胞を損傷し、細胞死に至る頻度も高くなる可能性がある。圧力の減少は、ホールが細胞膜に確実に形成されて物質を導入することができ、同時に、細胞の生存率の減少が最低限になる様にする為に、細胞の種類及び用いる気体により最適にすることができる。形成することができる気泡の表面エネルギーは、細胞膜にホールを形成する役割を果たすことができると考えられている。細胞壁を有する殆どの種類の細胞は、上述の好ましい範囲の内の一つの範囲内で圧力を低下させて本発明を実施することにより透過性を高めることができると考えられる。好ましい圧力の範囲を用いると、一般に、生存し且つ形質移入される細胞の割合が増大する傾向がある。


【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
開始圧力は、所望であれば、最初に気体が流体またはゲル内に溶解し易くする様に選択することができる。開始圧力は、一般に０．６ＭＰａ（６Ｂａｒｒ）またはそれ以上であり、典型的には０．６〜１１．１ＭＰａ（６〜１１１Ｂａｒｒ）の範囲である。好ましくは、１．１〜１１．１ＭＰａ（１１〜１１１Ｂａｒｒ）の範囲、更に好ましくは２．１〜１１．１ＭＰａ（２１−１１１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは５．１〜１１．１ＭＰａ（５１〜１１１Ｂａｒｒ）である。幾つかの実施形態では、圧力の減少は、２．１〜８．１ＭＰａ（２１〜８１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは３．１〜８．１ＭＰａ（３１〜８１Ｂａｒｒ）、更に好ましくは４．１〜８．１ＭＰａ（４１〜８１Ｂａｒｒ）、最も好ましくは６．１〜８．１ＭＰａ（６１〜８１Ｂａｒｒ）とすることができる。


【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
使用される開始圧力及び圧力減少は、（とりわけ）透過性が高められる細胞の種類に応じて、適切に変化させることができる。細胞がイネ細胞である一つの実施形態では、大気圧まで減圧する前に、２．１〜３．１ＭＰａ（２１〜３１Ｂａｒｒ）といった比較的低い開始圧力を用いる。細胞がトウモロコシ細胞である別の実施形態では、６．１〜７．１ＭＰａ（６１〜７１Ｂａｒｒ）といった比較的高い開始圧力を用いる。


【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
気体が開始圧力に維持される時間の長さは、形質移入が有害な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。典型的には、気体は、１分またはそれ以上、好ましくは１０分またはそれ以上の間開始圧力に維持される。圧力は一般に、３０分未満の間維持される。幾つかの実施形態では、圧力は、５〜２０分間、好ましくは１０〜２０分間、更に好ましくは１０〜１５分間維持することができる。圧力は、約１５間維持されることが最も好ましい。所望であれば、この時間を変化させ、流体またはゲル内に最初に溶解される気体の量を変えることができる。気体を流体またはゲル内に存在させる時間は、必要なだけ長く保持することができ、細胞の透過性を高めるのに用いる条件、例えば、用いる気体、温度、圧力のほか、細胞の種類及び細胞内に導入する物質によって決定することができる。細胞内への物質の導入効率は、流体またはゲル及び細胞が加圧下に置かれる時間の長さに、特に鋭敏に反応する。


【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
圧力は典型的には、大気圧（約０．１ＭＰａ、１Ｂａｒｒ）まで低下される。圧力は、例えば孤立した系を大気に暴露することによって急激な減圧を行うこと等により、速やかに低下させることが好ましい。これは、（例えば）流体またはゲルを含む容器に連結された弁または栓を単に開放することにより達成することができる。圧力の低下は、好ましくは３０秒未満、更に好ましくは１０秒未満、最も好ましくは約１秒未満のインターバルにわたって生じる。


【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
減圧により生じる可能性がある気泡の発生は、単一の期間で連続的に起こる場合もあり、実質的に気泡が発生しない間隔によって分離された２つまたはそれ以上のパルスで起こる場合もある。従って、圧力の低下は、一の連続工程で達成されることもあり、例えば、圧力が一定状態の間隔で分離された０．１〜１ＭＰａ（１〜１０Ｂａｒｒ）の一連の工程で起こる場合もある。


【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
加圧及び減圧のサイクルは、１回またはそれ以上繰り返すことができる。一つの実施形態において、２回または３回の加圧／減圧サイクルを用いるが、１サイクルのみを用いることが好ましい。


【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
気泡がパルスで発生する場合には、この様なパルスの長さは、典型的には１〜１０秒とすることができる。例えば、パルスの長さは、１〜５秒とし、気体の発生が起こらない同様の長さの期間で分離することができる。パルスの持続時間を制御する為には、どの様な手段を用いてもよい。典型的には、パルスの持続時間は、プログラム可能な手段により制御することができる。この様な手段は、例えば、流体またはゲル上の圧力を変化させる手段の活動度を制御するのに用いるプログラム可能なタイマーを含むことができる。


【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の方法に使用される気体は、流体またはゲルを加圧及び減圧するのに適切であれば、必ずしも特に一つの気体に限定されない。気体は、細胞と相互作用して細胞膜に一過性のホールを形成し得る気泡を形成できることが好ましい。適切な気体は、不活性ガス、非不活性ガス、または両方の種類の気体の１種またはそれ以上の混合気を含む広範囲の気体より選択することができる。好ましくは、気体は空気であるが、酸素、窒素、メタン、並びにヘリウム、ネオン及びアルゴンといった希ガスを用いることもできる。更に、特に流体またはゲルのｐＨを特定のレベルに維持することが望ましい場合には、ＣＯ2を用いることもできる。ＣＯ2を用いる場合には、一般に、空気等の他の気体中に５〜７％容量濃度で用いられる。気体は可溶性である必要はないが、流体またはゲル内に気泡を形成することが望ましい場合には、気体は、該方法が実施される条件下で、流体またはゲルに少なくとも多少溶解することが必要である。


【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
細胞壁は、本発明の方法により比較的損傷を受けないため、再生の必要はない。透過性が高められた細胞を用いて物質を内部に導入することが望ましい場合には、透過性が高められた細胞が形成されるのと実質的に同時か、または僅かに遅れて物質を導入することが好ましい。或いは、透過性が高められた細胞は、典型的には−２０℃またはこれよりも低い温度で必要時まで保存し、後で解凍して次のプロセスに用いることもできる。


【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
また、本発明は、細胞の透過性を高める為及び／または細胞内へ物質を導入する為の減圧手段を使用する方法も提供する。この方法では、細胞は細胞壁を有しており、減圧手段は、細胞を含む流体またはゲルに与えられた圧力を２〜１１ＭＰａ（２０〜１１０Ｂａｒｒ）の段階だけ減少させるのに使用する。


【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明が特に有用とされる生命科学への応用には、特定の遺伝子を生細胞及び／またはその凝集物内に導入して発現させること、及び細胞の代謝に対する遺伝子生成物の影響を解析することが包含される。この様な応用には、その様なＤＮＡ生成物をコードする核酸を生細胞内に導入することにより生物学的に活性なタンパク質を発現させ、特に、代謝、タンパク質生成、及び細胞形態学に関して細胞に及ぼすこれらの作用を研究することも包含される。この様な応用は、薬学的に重要な化合物を細胞内に生成することにまで拡大される。


【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
既知の方法と比較すると、本発明の方法は極めて効率的である。形質移入効率は、とりわけ気体の発生が起こる時間の長さに依存する。状況によっては、８０％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、またはほぼ１００％の効率を達成することができる。


【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
以下、特定の実施形態を単に例証として参照しながら、本発明を更に説明していく。
【実施例】


【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
実施例１−酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｐｏｍｂｅ）におけるエアロポレーション法
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用い、酵母抽出物菌類増殖培地（Ｏｘｏｉｄ）内で増殖させた５×１０5の細胞を、１，２００ｒｐｍで２回洗浄した。次に、ペレットを１Ｍソルビトールに再び懸濁した。再懸濁した細胞をＦＡＣＳ管に移し、０．５μｇのβ−ガラクトシダーゼＤＮＡベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌ．Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ）または２．５μｇのＴＭＲデキストラン（分子量７０，０００）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。


【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
この管を、エアロポレーター（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ  Ｌｔｄ．）内に配置し、圧力を４〜８Ｍｐａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）の範囲に調節した。細胞は、加圧／減圧の１サイクルである１０分間、装置内に維持し、大気圧まで減圧した。


【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
次に、エアロポレーターから細胞を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗った。細胞を１ｍｌの液体培地に再懸濁し、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法（ポリ−Ｌ−リジンスライドを用いる）のいずれかにより、１２時間後に分析した。ＴＭＲデキストランの場合は、直ちに分析を行ったので（光退色を最低限にする為）、培地に再懸濁する必要はなかった。


【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
トリパンブルー染色により、生存可能な細胞のパーセントが８５％より大きいことを確認した。形質移入効率は、蛍光を発する細胞の数を細胞の総数で割ることにより算出した。これによると、形質移入効率は６０〜７０％であった。


【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
実施例２−タバコ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のタバコ葉の細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、再び遠心した。


【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
上記ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。


【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞は圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、７０〜８０％であった。形質移入効率は、５５〜６０％であった。


【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例３−タバコ根におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のタバコ根先端細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、もう１回同様に遠心した。


【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。


【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を１０分間放置して処理した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、５５〜６０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。


【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
実施例４−トウモロコシ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のトウモロコシ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。細胞は、７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。


【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。


【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで上げた。細胞は、圧力下に１０分間放置した。細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
次に、細胞を微量遠心管に移した。細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて、生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６０〜７０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。


【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
実施例５−トウモロコシ根におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のトウモロコシ根細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。


【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。


【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力下をかけたまま１０分間放置した。細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
次に、細胞を微量遠心管に移した。細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、５５〜６０％であった。形質移入効率は、４５〜５０％であった。


【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
実施例６−イネ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のイネ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。ペレットを再懸濁し、もう一度同様に遠心した。


【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバに入れた。


【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を４〜８ＭＰａ（４０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正６７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６５〜７０％であった。形質移入効率は、５５〜６０％であった。


【手続補正６８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
実施例７−コムギ葉におけるエアロポレーション法
細胞培養液中のコムギ葉細胞を計数し、必要な濃度（０．２〜０．５×１０5細胞／ｍｌ）に調製した。この細胞を７５０ｇで５分間遠心し、その後、ペレットを洗浄培地（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）に再懸濁し、同一条件で再び遠心した。このペレットを再懸濁し、更に同様に遠心した。


【手続補正６９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
上記ペレットを１ｍｌの形質移入培地（ＭＳ培地、Ｓｉｇｍａ（英国））に再懸濁し、０．５μｇのＤＮＡ、２．５μｇのＦＩＴＣ−ＢＳＡ、または２．５μｇのＴＭＲデキストランを加えた。エアロポレーターを圧縮空気シリンダに接続し、上記細胞懸濁液を試料管に入れてエアロポレーターのチャンバ内に置いた。


【手続補正７０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
エアロポレーターのふたを閉め、圧力を６〜８ＭＰａ（６０〜８０Ｂａｒｒ）の間まで高めた。この細胞を、圧力をかけたまま１０分間放置した。上記細胞を処理した後、大気圧まで圧力を下げた。この加圧サイクルを３回繰り返した。


【手続補正７１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
次に、この細胞を微量遠心管に移した。上記細胞をＰＢＳで１回洗い、適切な培地（ＭＳ完全培地）に接種し、２５℃でインキュベートした。


【手続補正７２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
次に、形質移入後５日目に、細胞の生存率及びＤＮＡ発現を分析した。トリパンブルー染色を用いて生細胞数を測定し、蛍光を発生する細胞の数を細胞の総数で割ることにより形質移入効率を計算した。生存可能な細胞のパーセントは、６０〜７０％であった。形質移入効率は、２０〜２５％であった。


【手続補正７３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
実施例２〜実施例７の結果を下記表１にまとめている。


【手続補正７４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
【表１】
2005500064.tif 000100
【手続補正７５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
実施例２〜実施例７に記載したのと同様の方法を、ダイズ及びワタの様な別の植物種に応用することができる。


【手続補正７６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例８−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの間における、高圧エアロポレーションによる形質移入の比較
この実施例の為に選択した細胞は、酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと、Ｑｕｏｒｎ（登録商標）（Ｔｒｉｎｃｉ、１９９４年）と呼ばれる食品加工に用いられる糸状菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍであった。この特定の糸状菌は、既知の方法で形質移入するのは困難であることが証明されている。


【手続補正７７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
形質移入効率は、細胞壁、即ちバリアにより制限されるが、これを克服して異なる大きさ及び形状の分子を細胞の内部に自由に侵入させることができる様にする必要がある。細胞壁の組成及び厚さは、形質移入効率を求めるときに考慮しなければならない重要な因子である。酵母菌Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞壁は、乾燥細胞重量のほぼ２５％である。この細胞外塊は、支持構造には殆ど寄与しないが、細胞の保護及び栄養のコントロールに必要であり、主に、高濃度の炭化水素を有する多糖類及び糖タンパク質で構成されている。Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの細胞壁には、これら成分の全てが見出されているが、細胞壁を構成する夫々の比率は、充分には分析されていない。殆どの糸状菌では、キチンと呼ばれるｎ−アセチルグルコサミンのポリマーが、細胞壁の主成分である。真菌の繊維状細胞壁は、一般に、酵母菌の細胞壁に比べて厚いことも知られている（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ、１９９２年）。


【手続補正７８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの高圧エアロポレーション


【手続補正７９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【表２】
2005500064.tif 000101
【手続補正８０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
表２に見られる様に、形質移入は、４ＭＰａ及び６ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ及び６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした細胞に比べ、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で最も効果的であり、このとき、細胞の７６％に形質移入されている。この結果から、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で高圧エアロポレーションすることにより、細胞壁にホールを効率よく形成することができ、次いで、このホールにより、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１が細胞内に侵入することが可能になると示唆される。


【手続補正８１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
最も高い生存率は、４ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ）の場合に達成され、このとき、細胞の１００％がエアロポレーション後も生存した。最も低いパーセントは、６Ｍｐａ（６０Ｂａｒｒ）の場合であり、このとき、細胞の９１％が生存した。この様な高い生存率により、この工程は、細胞を死滅させたり、増殖サイクルを阻害したりしないことを示している。５及び６ＭＰａ（５０及び６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした細胞の生存率は高く、ほぼ９１％、９８％であった。


【手続補正８２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの高圧エアロポレーション
形質移入は６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）で最も効率的であった。菌糸体に６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）をかけたときに、良好な蛍光が観察された。


【手続補正８３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
エアロポレーションを実行する際に、薄い１ｃｍ2断片の菌糸体を切り取り、６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションした。この断片の全長にわたって蛍光が見られた。


【手続補正８４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
１サイクル及び２サイクルを用いるＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍの高圧エアロポレーション
同じ圧力で２サイクル以上行うことにより、形質移入の発生を高めることができる。このことは、実施したのと同様の実験でも見られ、この場合、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションし、２サイクル処理したＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍは、同様に２サイクルを用いた低圧エアロポレーションと比較して、より良好な蛍光が見られた。


【手続補正８５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
実施例９−植物及び真菌懸濁細胞におけるエアロポレーション手技
細胞の形質移入に用いられる巨大分子
形質移入に用いられる巨大分子は、主に蛍光プローブである。これらは、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーを用いて検出することができるからである。


【手続補正８６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
この研究課題に用いた巨大分子は、
・ＴＭＲ−デキストラン（テトラメチルローダミンデキストラン）（分子量７０，０００Ｄａ）
・ＧＦＰ  ＤＮＡベクター（緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ）（４．７６ｋｂ）（ｐＥＧＦＰ）
・β−ｇａｌＤＮＡ（８．２ｋｂ）
であった。


【手続補正８７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
形質移入後の分析の為の細胞の調製
蛍光顕微鏡によるＧＦＰ形質移入細胞の分析
・細胞を計数する。
・１×ＰＢＳで洗浄する。
・２μｌの１×ＰＢＳに再懸濁する。
・細胞を含む溶液を、ポリ−Ｌ−リジンマルチウェルスライドに加える。
・スライドを２０分間放置する。
・液体を吸引して除去する。
・２μｌの１×ＰＢＳをスライドに加え、５分間放置する。
・ＰＢＳを除去する。
・ＤＡＢＣＯ１滴をスライドに加え、このスライドに注意深くカバーガラスを載せる。
・蛍光顕微鏡で分析する。


【手続補正８８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
フローサイトメトリーによるＧＦＰ処理細胞の分析
・１×ＰＢＳを用いて１３００ｒｐｍで細胞を洗浄する（２回）。
・１Ｍソルビトール中に再懸濁し、フローサイトメーターに入れて分析する。


【手続補正８９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
細胞内でのβ−ガラクトシダーゼ発現の分析
β−Ｇａｌ緩衝液で処理した診断用スライド上の処理細胞を２４時間インキュベートし、その後、位相差を観察することにより分析を行った。


【手続補正９０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
生存率及び形質移入率の分析
生存率は、エアロポレーションの前及び後の増殖曲線、及びトリパンブルーを用いることにより得た。形質移入率は、フローサイトメトリーを用いて算出する。


【手続補正９１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
形質移入の結果
酵母菌細胞の形質移入
エアロポレーターを用いたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅの形質移入は、簡単であるが効果的である。


【手続補正９２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
両タイプの酵母菌細胞のエアロポレーション実験には、３〜４ＭＰａ（３０〜４０Ｂａｒｒ）の間の圧力における空気を用いた。全ての細胞は、１５分持続する１サイクルの間に形質移入した。


【手続補正９３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
形質移入は、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で最も効率的に達成され、形質移入率は極めて高く、生存率も高かった（表３及び表４）。


【手続補正９４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
糸状菌の形質移入
糸状菌の形質移入は、１サイクルの１５分間、３〜７ＭＰａ（３０〜７０Ｂａｒｒ）（例えば６ＭＰａ、６０Ｂａｒｒ）の空気を用いて行った。これらの細胞は、更に高い圧力（７〜８ＭＰａ、７０〜８０Ｂａｒｒ）で１サイクル以上行なっても形質移入される。


【手続補正９５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
エアロポレーションと方形波電気穿孔法による酵母菌細胞の形質移入を比較（表３）すると、これらの細胞に対しては、エアロポレーションの方が効率的であることが分かる。


【手続補正９６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
【表３】
2005500064.tif 000102
【手続補正９７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【表４】
2005500064.tif 000103
【手続補正９８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
【表５】
2005500064.tif 000104
【手続補正９９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
【表６】
2005500064.tif 000105
【手続補正１００】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
【表７】
2005500064.tif 000106
【手続補正１０１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
酵母菌の形質移入は、５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）で高圧エアロポレーションを用いる場合が最も効率的であることが確認された。形質移入効率は、高圧の場合でも、空気を用いると生存率を著しく損なうことはなく、極めて高いままであった（表３及び表４、表９）。


【手続補正１０２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
エアロポレーションを用いると、Ｓ．ｐｏｍｂｅ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの生存率はいずれも、４８時間後でも高いままであることから、この工程は、細胞を死滅させたり、増殖サイクルを阻害したりしないと思われる（図８）。しかし、方形波電気穿孔法を用いる形質移入では、このシステムが細胞を破壊するようであり、収率及び生存率は、低くなることが示された（図７、表５）。


【手続補正１０３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
エアロポレーションによる酵母菌の形質移入は、電気穿孔法に比べて遥かに効率的であることが示される。細胞壁のホールを再密封するのに要する時間を調べる目的で行った実験によれば、両方の酵母菌の種において、空気中では、ホールは、４ＭＰａ（４０Ｂａｒｒ）よりも５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）の方が遥かに速く再密封されることが示された。また、エアロポレーションを用いる実験では、フザリウム属も、６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）でエアロポレーションに良好に応答することが示された。


【手続補正１０４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
上記研究より、エアロポレーションは、非常に簡便な方法ではあるが、極めて効果的で、且つ極めて有用な形質移入法であることが示される。


【手続補正１０５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
参考文献
Ｂｅｌｌ  Ｈ．，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｗ．  Ｌ．，Ｌｉ  Ｍ．，  Ｗｉｔｔｌｅ  Ｉ．Ｒ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，９（５），ｐｐ．７９３−７９８，１９９８．
Ｆｅｎｔｏｎ  Ｍ．，Ｂｏｎｅ  Ｎ．，Ｓｉｎｃｌａｉｒ  Ａ．  Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１２（１），ｐｐ４１−４８，１９９８．
Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ  Ｌ．，Ｓｔｒｉｐｅｃｋｅ  Ｒ．，Ｃａｓｅ  Ｓ．Ｓ．，Ｘｕ  Ｄ．Ｋ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｋ．Ｉ．，Ｋｏｈｎ  Ｄ．Ｂ．，Ｂｌｏｏｄ，９２（１０），ｐｐ３５３７−３５４５，１９９８。


【手続補正１０６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
実施例１０−ＮＴ１及びＢＭＳ細胞培養液におけるエアロポレーション法
ＮＴ１及びＢＭＳの細胞培養液を培養／維持する為の材料及び方法
ＢＭＳ（ブラックメキシカンスィート）トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）の細胞懸濁液をＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国、ノリッジ）から入手した。ＢＭＳ細胞懸濁液は、Ｇｒｅｅｎ  Ｃ．Ｅ．（１９９７年）による「Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：１３１−１３４に記載されている通りの従来法で培養した。


【手続補正１０７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
ＮＴ１タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．）の細胞懸濁液をＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国ノリッジ）から入手した。ＮＴ１細胞懸濁液は、Ｆｒｏｍｍ  Ｍ、Ｃａｌｌｉｓ  Ｊ、Ｔａｙｌｏｒ  ＬＰ、Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ（１９８７年）による、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ」１５３：３５１−３６６に記載されている従来の方法で培養した。


【手続補正１０８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
エセックス大学にて、下記遺伝子作成物を用いた。


【手続補正１０９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
参考文献
Ｓｉｖａｍａｎｉ，Ｅ．，Ｓｈｅｎ，Ｐ．，Ｏｐａｌｋａ，Ｎ．，Ｂｅａｃｈｙ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄ  Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．Ｍ．（１９９６）、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃａｌｌｉ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｓｅｅｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｔｉｌｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ」、１５：３２２−３２７
Ｂｅｃ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｆｅｒｒｉｅｒｅ，Ｎ．Ｍ．，Ｌｅｇａｖｅ，Ｔ．，Ｆａｕｑｕｅｔ，Ｃ．ａｎｄ  Ｇｕｉｄｅｒｏｎｉ，Ｅ．（１９９８年）、「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｌｌｉ  ｉｎ  ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）、ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３８：１７７−１９０．
Ｗａｎｇ，Ｍ．Ｂ．，Ｕｐａｄｈｙａｙａ，Ｎ．Ｂ．，Ｂｒｅｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｓ．ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．（１９９７年）、「Ｉｎｔｒｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ」、Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  ＆  Ｂｒｅｅｄ  ５１：３２５−３３４．。


【手続補正１１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
１０ｂ  エアロポレーションを用いる懸濁ＢＭＳ及びＮＴ１植物細胞の形質移入
形質移入とは、核に取り込まれて発現し得る様、特定の二本鎖ＤＮＡを分裂中の真核生物細胞内に導入するのに用いられる様々な技術を言う。


【手続補正１１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
植物細胞の懸濁培養液は、高圧エアロポレーションを用いて形質移入できることが分った。


【手続補正１１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
本実施例では、高圧エアロポレーションを用いてＢＭＳ及びＮＴ１細胞の形質移入を調べる為に行った実験について記載する。


【手続補正１１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
形質移入の生成
この実験には、適切な培地で培養したＢＭＳ及びＮＴ１懸濁植物細胞を用いた。細胞には、上述した様に６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）で１５分間を１サイクルとする加圧／減圧を用い、エアロポレーションにより形質移入した。


【手続補正１１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
レポーター分子
このセットの実験には、異なるレポーターＤＮＡベクターを用いた。これらには、β−グルクロニダーゼ（ＢＭＳ細胞にはｐＡＬ１４５、ＲＴ１８、ＮＴ１細胞にはＰＪＩＴ５８、ＰＧＶＴ５。用いる全てのプラスミドは、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒより入手した）が含まれる。緑色蛍光タンパク質ベクター（ＧＦＰ）も用いた。


【手続補正１１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
最終的に、ＢＭＳ及びＮＴ１両方の懸濁植物細胞に、エアロポレーターを用いてＴＭＲ−デキストラン（７０，０００ＭＷ）を形質移入した。


【手続補正１１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
結果
エアロポレーター（Ｂ）を用い、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間、ＧＦＰベクターで培養したＢＭＳ細胞を形質移入した。この試験細胞には有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。


【手続補正１１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
培養ＮＴ１細胞へのＧＦＰベクターの形質移入
細胞を夫々、６Ｐａ（６０Ｂａｒｒ）及び７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間処理した。試験細胞には有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。


【手続補正１１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
培養ＢＭＳ懸濁細胞へのＴＭＲ−デキストラン（７０，０００分子量）の形質移入
細胞をエアロポレーターに入れ、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）で１５分間処理した。試験細胞には、有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。


【手続補正１１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
培養ＮＴ１細胞へのＴＭＲ−デキストラン（７０，０００分子量）の形質移入
細胞をエアロポレーターに入れ、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）でほぼ１５分間（１サイクル）処理した。試験細胞には、有意な蛍光が観察された。未処理の対照には、蛍光は認められなかった。


【手続補正１２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
前述した実験（即ち、１サイクル：６〜７ＭＰａ（６０〜７０Ｂａｒｒ）で１５分）の様に培養ＮＴ１細胞へのＰＧＶＴ５ベクター（ＧＵＳ）の安定した形質移入
選択性培地内で約２週間培養した後と、更に２週間及び３週間非選択性培地内で培養した後に撮った写真では、試験細胞に有意な染色が見られる。


【手続補正１２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
培養イネ胚形成培養物へのＴＭＲ−デキストラン及びＧＦＴの形質移入
試験したイネ胚形成細胞では、有意な青色着色が見られた。未処理対照には、蛍光は見られなかった。


【手続補正１２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
外来性遺伝子が宿主ゲノムに安定して組み込まれた細胞を産生する為には、形質移入されていない細胞から、形質移入される細胞を選択する方法が必要である。これは通常、形質移入細胞に抗生物質耐性を付与する遺伝子を恒常的に発現させる為の遺伝子を、細胞内に同時に形質移入することによって行われる。抗生物質耐性遺伝子は、関心のある外来遺伝子として同じプラスミドベクターに保有されることが好ましい。通常用いられる選択法の１つは、受容細胞にＧ４１８硫酸塩耐性を付与するネオマイシン遺伝子を用いる方法である。本明細書には、高圧エアロポレーションを用いた細胞への安定した形質移入を調べる為に行った研究について記載している。


【手続補正１２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
形質移入の手順
全ての実験では、ＭＳまたはＢ５培地のいずれかで少なくとも３日間培養することにより、刻みタバコ及びトウモロコシ葉由来の植物細胞懸濁液を用いた。細胞は、前述した様に１サイクルの加圧／減圧を用いて７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）までエアロポレーションにより形質移入した。


【手続補正１２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
レポーター分子
植物細胞形質移入試験には、４つの異なる種類のレポーターＤＮＡベクターを用いた。即ち、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質ベクター（ＧＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質ベクター（ＲＦＰ）である。


【手続補正１２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
ＧＦＰは、細胞を死滅させずに検出することができるので、有用である。ＧＦＰ遺伝子を形質移入した細胞は、明るい蛍光を示す。ＧＦＰは分子量が小さく、安定性の高いタンパク質であり、光退色が殆ど見られない。このレポーター系は、植物を含む広範囲のの生物学的システムで機能することが示されている（Ｃｏｒｂｅｔｔ、１９９５年、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、１９９５年、Ｋａｅｔｈｅｒ、１９９５年、Ｗａｎｇ、１９９４）。一方、ＲＦＰは、自己蛍光を示さない。


【手続補正１２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
ＧＦＰ及びＲＦＰの利点は、レポーター遺伝子を発現する細胞を蛍光顕微鏡により識別することができ、これによって、フローサイトメトリーを用いて細胞を分別できることである。また、両方のベクターは、培養液中の形質移入細胞の選択を容易にするネオマイシン遺伝子も有している。この理由により、第１の実験では、濃度２μｇ／ｍｌのＧＦＰ及びＲＦＰＤＮＡベクターを用いて行った。


【手続補正１２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
細胞の培養
形質移入直後に、ＭＳ培地で細胞を培養したが、この培地には、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｓｉｇｍａ）を加え、ネオマイシン耐性遺伝子が存在することにより形質移入されている細胞が選択される様にした。開始の前に、形質移入される細胞について、選択抗生物質による細胞死の容量反応曲線を作成した。１〜３日にわたって形質移入されていない細胞の殆どを死滅させるのに丁度良い正確な濃度の選択培地を用いることが重要であった。本発明者らの実験では、完全に選択する為に１０００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いた。細胞は、必要に応じて３〜４日毎に培地を交換しつつ、上記選択培地中で少なくとも２〜３週間培養し、その後、非選択培地に移して更に増殖させた。


【手続補正１２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
実施例１３−植物細胞のエアロポレーション
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするＤＮＡベクターと、赤色蛍光タンパク質をコードするｐＤｓＲｅｄｌ−Ｃｌベクターとを用い、植物細胞を異なる方法で調製するのにエアロポレーション法を用いた。３〜５日間培養したタバコ葉由来の細胞は、ＧＵＳで形質移入することができた。トウモロコシを５〜７ＭＰａ（５０〜７０Ｂａｒｒ）の圧力範囲にわたってエアロポレーションした結果、圧力が高くなると、形質移入のレベルが高くなることが示された。赤色蛍光タンパク質を用いてタバコ及びトウモロコシ葉をエアロポレーションすることにより、夫々４５〜５５％、３０〜３５％レベルの明らかな形質移入が見られた。ＧＦＰで安定に形質移入されたトウモロコシ及びタバコ細胞の培養物も、確立された。


【手続補正１２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
エアロポレーションを用いて植物細胞に形質移入する以前の研究では、レポーター分子としてＴＭＲ−デキストラン、ＧＲＰ及びβ−ガラクトシダーゼベクターを用いた。


【手続補正１３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
植物実験は、植物で発現する様に特別にデザインされたグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（１つは双子葉類用に、もう１つは単子葉類用にデザインされており、いずれもＪｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（ノリッジ）から入手可能）をコードするベクターを用いて行った。組織化学的、分光光度分析及び蛍光定量分析に好適なＧＵＳアッセイの基質は市販されている。


【手続補正１３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
植物
タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）及びトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）植物は、温室内で約６〜７週間生育させた。用いた植物組織は、タバコ及びトウモロコシ葉（長さ〜１．０ｃｍ）であった。


【手続補正１３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
植物細胞試料
植物組織を滅菌し（Ｈａｌｌ、１９９９年）、その後、細かく刻んで１〜２ｍｍ立方体にした。刻んだ断片は、エアロポレーションに直接用いるか、１０ｍｌのＭＳまたはＢ５培養培地（Ｈａｌｌ、１９９９年）を入れたペトリ皿内で培養し、２４〜２６℃のオービタルシェーカー（１４０ｒｐｍ）で３６〜４８時間インキュベートした。


【手続補正１３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
滅菌篩（メッシュ０．５〜１．０ｍｍ）を用い、細胞懸濁液から凝集した全ての植物材料を除去することにより培養された培養断片から単一の細胞懸濁液を調製した。残りの細胞懸濁液を、７５０ｇで５分間遠心した。遠心後、ペレットを適切な培養培地に再懸濁し、続いて、２５℃でインキュベートした。用いた培地は、４．５μＭの２，４−Ｄ（Ｇａｍｂｏｒｇら、１９７９年）を補充したＭＳ培養培地であった。細胞は、２．５×１０3細胞／ｍｌの密度で総量１０ｍｌを接種した。植物細胞の懸濁液は、２５℃のインキュベータ内に保持した。


【手続補正１３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
ベクター
細胞膜にホールが生成されたＴＭＲデキストラン（７０キロドルトン）を指標として用いた。この分子の直径は、約５．４ｎｍである。


【手続補正１３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
双子葉類にＧＵＳを形質移入する為に、ｐＪＴＴ５８ベクター（５．２ｋｂ）を用い（図４）、単子葉類にＧＵＳを移入する為に、ｐＡＬ１４５ベクター（６．９８ｋｂ）を用いた（図６）。


【手続補正１３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
赤色蛍光タンパク質を発現するｐＤｓＲｅｄｋ−Ｃｌベクターは、単子葉植物及び双子葉植物の両方を形質移入するのに用いた。


【手続補正１３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
植物細胞におけるエアロポレーションプロトコール
容量１．０ｍｌのＭＳ培地に４×１０4の細胞を懸濁させた懸濁液をＦＡＣＳ管に入れたものを、エアロポレーターの圧力チャンバに入れ、１５分間７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）まで加圧し、その後、素早く減圧した。全工程を、室温（２０〜２２℃）で行った。エアロポレーションサイクルが終了した後、細胞をエアロポレーターから取り出し、ミクロ遠心管に移した。細胞を、２１８×ｇにて５分間、１回遠心し、ペレットを、１ｍｌの培養培地に再懸濁させた。細胞懸濁液を２４ウエルプレートに移した後、４８〜７２時間培養（２５℃）し、ＤＮＡを発現させた。


【手続補正１３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
植物細胞の顕微鏡分析
ＧＵＳ染色（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｓ．Ｒ．，１９９２年）
・５×１０4の形質移入細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗う。
・ポリ−Ｌ−リジンコーティーングスライド（７０％エタノール＋６ｍｌリジン溶液で１時間洗い、ｄｄ．Ｈ2Ｏで９回リンスしたもの）に細胞を移す。細胞を１５分間付着させ、過剰な液体を除去する。
・固定液（２％ホルムアルデヒド及び０．０５％グルタールアルデヒドを含むＰＢＳ）を用い、室温で５分間細胞を固定する。
・ＰＢＳで１回洗う。
・Ｘ−Ｇｌｕｃ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に染色液を加え、３７℃で１晩（１６時間）インキュベートする。
・細胞をＰＢＳで注意深くリンスし、全ての試料に対して同じ倍率で、倒立顕微鏡観察する。


【手続補正１３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
結果
植物組織試料での形質移入パターン
培養タバコ細胞の懸濁液を、エアロポレーターを用いてＧＵＳ（ｐＪＩＴ５８ベクター）で形質移入し、形質移入した細胞を、（Ａ）Ｘ−ｇｌｕｃ基質または（Ｂ）ＭＵＧ基質のいずれかで可視化した。この細胞を、１サイクルの１５分間エアロポレーター内で処理した。用いた圧力は７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であった。


【手続補正１４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
培養したトウモロコシ細胞の懸濁液には、エアロポレーターを用いてＧＵＳ（ｐＡＬ１４５ベクター）を形質移入し、ＭＵＧ基質で可視化した。この細胞を、１サイクルの１５分間エアロポレーター内で処理した。用いた圧力は、（Ａ）５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）、（Ｂ）６ＭＰａ（６０Ｂａｒｒ）、及び（ｃ）７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であった。未処理の対照では、蛍光が見られなかった。


【手続補正１４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
この結果から、蛍光及び非蛍光基質の両方を用いた実験において、懸濁されたタバコ細胞には、エアロポレーション法によりＧＵＳを形質移入できることは明らかである。得られた形質移入のレベルは、約２０％と推定された。懸濁されたトウモロコシ細胞も、単子葉類に発現させる様にデザインされたベクターを用いて形質移入された。トウモロコシを、圧力範囲５〜７ＭＰａ（５０〜７０Ｂａｒｒ）にわたってエアロポレーションした結果、圧力が高ければ、形質移入のレベルも高くなることが示された。


【手続補正１４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
以下のＤｓＲｅｄｌベクターを用いた形質移入実験の結果、エアロポレーションにより、懸濁されたタバコ細胞では約５０％の細胞が形質移入され、トウモロコシ培養細胞にでは僅かに低い形質移入レベルである約３５％が得られることが示された。


【手続補正１４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】
培養されたタバコ葉細胞及び培養されたトウモロコシ葉細胞を５日間培養した後、ＤｓＲｅｄｌが形質移入された。エアロポレーターで用いた圧力は、７ＭＰａ（７０Ｂａｒｒ）であり、細胞を、１サイクルの１５分間処理した。用いた気体は空気であった。未処理の対照では、蛍光は見られなかった。


【手続補正１４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１６】
形質移入及び細胞収量を最大にする為の好ましい圧力は、１回またはそれ以上の１５分サイクルを用い、５〜８ＭＰａ（５０〜８０Ｂａｒｒ）である。ＧＦＰで安定に形質移入されたタバコ及びトウモロコシ葉細胞の培養物は、非選択培地で少なくとも４週間以上増殖することができる。


【手続補正１４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
参考文献
Ｂｅｖａｎ  Ｍ．（１９８４年）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、１２：８７１１
Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｓ．Ｒ．，（１９９２年）、「ＧＵＳ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＧＵＳ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ａ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、１１５−１２０
Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，  Ｓ．Ｒ．，（１９８９）、「Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａ３．９−Ａ３．１５
Ｇａｍｂｏｒｇ  Ｏ．Ｌ．，Ｓｈｙｌｕｋ  Ｊ．Ｐ．，Ｆｏｗｋｅ  Ｌ．Ｃ．，Ｗｅｔｔｅｒ  Ｌ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  Ｄ．（１９７９年）、Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．，９５，２５５
Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ，．（１９８５年）、「Ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｅｄ．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ），  ｐｐ．  １４３−１９０
Ｇｏｕｌｄ，Ｊ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｈ．（１９８９）、「Ａ  ｎｏｎ−ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＧＵＳ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐ．７、２０９−２１６
Ｈａｌｌ，Ｒ．Ｄ．（１９９９年）、「Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１１，１０−１７
ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＲＡ．，Ｋａｖａｎａｇｈ  Ｔ．Ａ．，ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ  Ｍ．Ｗ．，（１９８７年）、「ＧＵＳ  ｆｕｓｉｏｎｓ：β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．６  ３９０１−３９０８
Ｌａｃｅｙ  Ａ．Ｊ．（１９８９年）、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．  Ｊ．  Ｌａｃｅｙ
Ｍａｒｔｉｎ  Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｒ．，Ａｌｔｍａｎｎ  Ｔ．，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ  Ｌ．，Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｗ．，「Ｎｏｎ−ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ
Ｍａｔｚ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９年）、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１７：９６９−９７３
Ｐｌｏｅｍ  Ｊ．Ｓ．，（１９８９年），「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｊ．Ｌａｃｅｙ．。


【手続補正１４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
【表９】
2005500064.tif 000107
【手続補正１４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
形質移入培地として１×ＰＢＳを用いた形質転換を調べる為、ＴＭＲデキストランも用いた。


【手続補正１４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
【表１０】
2005500064.tif 000108
【手続補正１４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
結果


【手続補正１５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
【表１１】
2005500064.tif 000109
【手続補正１５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
上記表１１の結果より、形質移入された細胞は、非形質移入細胞とは対照的に、エリスロマイシン含有培地で増殖することができた為、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、全ての圧力で、特に４及び５ＭＰａ（４０及び５０Ｂａｒｒ）で形質移入が成功したことが分った。


【手続補正１５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３５】
実施例１６−ＦＩＴＣ−ＢＳＡで形質移入するＮ．ｔａｂａｃｏ植物細胞のエアロポレーション
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１μｇ／ｍｌ）で形質移入するＮ．ｔａｂａｃｕｍ（誘導葉肉組織）植物細胞のエアロポレーション。細胞は、エアロポレーター内で４５分間（３サイクル）処理した。第１の試料は、空気の存在下で形質移入を行い、第２の試料は、酸素の存在下で形質移入を行った。


【手続補正１５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
両方の試料を試験すると陽性であった。酸素のみの存在下でエアロポレーションした場合には、空気の存在下で行ったエアロポレーションを行った場合に比べて、得られる発現が高かった。未処理の対照では、蛍光が見られなかった。


【手続補正１５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
このことは、本発明の幾つかの実施形態ではて、エアロポレーション法において溶解性の高い気体を用いると、細胞の形質移入の成功率が高くなることを示している。
【図面の簡単な説明】


【手続補正１５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
【図１】本発明の一実施形態による装置の概略図であり、１は導入口、２は排出口、３は圧力計、４は圧力チャンバ、５はニードル弁、６はゲルまたは流体を保持する為の区画を定める圧力チャンバの内側表面のコーティーングである。
【図２】本発明の別の実施形態による装置を示す概略図であり、１は導入口、２は排出口、３は圧力計、４は圧力チャンバ、５はニードル弁、７は圧力チャンバの内側表面に隣接して位置決めされ、ゲルまたは流体を保持する為の区画を形成する受容器である。
【図３】ｐＧＶＴ５遺伝子構成を示す図である。
【図４】ＪＩＴ５８遺伝子構成を示す図である。
【図５】ｐＡＬ１５６遺伝子構成を示す図である。
【図６】ｐＡＬ１４５遺伝子構成を示す図である。
【図７】形質移入したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の推定生存率を示す図である。
【図８】５ＭＰａ（５０Ｂａｒｒ）でのエアロポレーション後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の増殖率を示す図である。
【図９】酵母菌細胞での細胞形質移入のパーセントを示す図である。
【図１０】赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）ベクターであるｐＤｓＲｅｄｌ−Ｃｌでの制限酵素切断地図及び複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を示す図である。
【図１１】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｃｌでの制限酵素切断地図及び複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を示す図である。
【符号の説明】


【手続補正１５６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2005500064.tif 000110
【手続補正１５７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2005500064.tif 000111
【国際調査報告】
2005500064.tif 000112
2005500064.tif 000113
2005500064.tif 000114