(57)【要約】本発明は、癌細胞によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、LacdiNAc構造を含む癌特異的オリゴ糖鎖の存在を生物学的試料中に検出し、該糖鎖の存在を指標として、癌の検出を行う方法に関する。本発明は、該オリゴ糖鎖または該オリゴ糖鎖に結合する結合性物質を包含する抗原性物質、診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
(Sac1)xGalNAcβ4(Fucα3)yGlcNAc      （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
で表されるオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出することを特徴とする、生物学的試料を用いて癌を診断する方法。
【請求項２】
以下の工程（ａ）または工程（ｂ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
（ａ）該生物学的試料を該オリゴ糖配列に結合する結合性物質と接触させ、そして
該オリゴ糖配列を介した該結合性物質と該生物学的試料との結合を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する、または
（ｂ）酵素学的または化学的方法によって該生物学的試料中のオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を遊離させて、該生物学的試料から遊離したオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を含む画分を生成し、そして
該画分中の該オリゴ糖配列の存在を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する。
【請求項３】
該結合性物質が、オリゴ糖配列であるGalNAcβ4GlcNAcまたはその誘導体に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項４】
該結合性物質が、下記式からなる群より選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
[NeuNAcα3]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc、そして
[NeuNAcα6]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc    。
【請求項５】
該結合性物質が、アプタマー、ペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
該タンパク質が、抗体、酵素、レクチンまたはそれらの断片であることを特徴とする、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
該生物学的試料が、血液試料または血清試料であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項８】
該オリゴ糖配列を、血液試料または血清試料中の分泌糖タンパク質から検出することを特徴とする、請求項７に記載の診断方法。
【請求項９】
該糖タンパク質が、マトリックスメタロプロテアーゼタンパク質ファミリー、前立腺特異的抗原、カリクレイン２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび癌胎児性抗原からなる群より選ばれる糖タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
該オリゴ糖配列の存在を、質量分析法および／またはグリコシダーゼ酵素を用いる方法によって検出することを特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１１】
請求項２〜６のいずれかで定義されている結合性物質を包含する、癌または癌の型の診断に用いる診断剤。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかで定義されている結合性物質を用いて、癌または癌の型の診断用の診断剤を製造する方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を、化学的または生化学的に合成した多価の形態で含んでいることを特徴とする、ヒトの免疫感作に用いる抗原性物質。
【請求項１４】
請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、血清、好ましくはヒトの血清から抗体を精製する方法。
【請求項１６】
請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、抗体の検出および／または定量を行う方法。
【請求項１７】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を少なくとも一種含む多価またはオリゴ価の非免疫原性結合体。
【請求項１８】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に対する抗体、癌細胞におけるLacdiNAc生合成を阻害する物質および請求項１７の非免疫原性結合体からなる群より選ばれる少なくとも一種を包含する、癌治療用医薬組成物。
【請求項１９】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を包含する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２０】
医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含することを特徴とする、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれかの医薬組成物を、治療を必要とするヒトまたは動物の患者に投与する癌の治療方法にして、癌細胞の転移能または増殖能を低下させるか、腫瘍または癌を排除するのに十分な量の該医薬組成物を用いることを特徴とする治療方法。
【請求項２２】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体を、ヒトまたは動物の患者に投与し、癌細胞の転移能または増殖能を低下させるか、腫瘍または癌を排除することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項２３】
該抗体は、血清から精製されたものであることを特徴とする、請求項２２に記載の癌の治療方法。
【請求項２４】
該抗体によって、毒性物質が腫瘍または癌をその標的とすることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の癌の治療方法。
【請求項２５】
癌細胞におけるLacdiNAc生合成を特異的な阻害剤によって阻害し、癌細胞の転移能および悪性度を低下させることを特徴とする治療方法。
【請求項２６】
免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者を治療するための、請求項２０〜２５のいずれかに記載の治療方法。
【請求項２７】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌ワクチン。
【請求項２８】
医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含することを特徴とする、請求項２７に記載の癌ワクチン。
【請求項２９】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する物質であって、アプタマー、酵素、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、オリゴ糖鎖結合性物質。
【請求項３０】
下記式（ＩＩ）：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z                （ＩＩ）
（式中、
Ｙは非炭水化物スペーサーまたはグリコシド結合していない末端結合体であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、マンノシル残基、Man2残基、Man3残基、Man3GlcNAc残基、Man4GlcNAc残基、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、マンノシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、
好ましい態様においては、Ｘはマンノシル残基であり、ＯＳはＸにβ２−、β４−またはβ６−結合、好ましくはβ２−結合しており、
他の好ましい態様においては、Ｘはラクトシル残基またはＮ−アセチルラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはガラクトシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合している。）
で表される抗原性エピトープ構造を包含することを特徴とする、癌治療用医薬組成物。
【請求項３１】
下記式（ＩＶ）：
Gal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β3/4        （ＩＶ）
（式中、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基であり、
ｓ２およびｓ３は各々独立に０または１の整数である。）
で表される炭水化物。
【請求項３２】
下記式：
GalN(Am)r1α3(Fucα2)r2Galβ3/4        （Ｖ）
（式中、
ｒ１およびｒ２は各々独立に０または１の整数であり、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基である。）
で表される炭水化物。
【請求項３３】
GalN誘導体、特にlacdiNac構造およびその類似体を製造する方法にして、末端ヘキソサミンを受容体として下記式（ＩＩＩ）で表されるグリコシル基転移反応を行うことを包含する製造方法。
SAC-供与体  ＋  GalNβ3/4  →  SACyxGalNβ3/4    （ＩＩＩ）
［式中、
ｙはα−またはβ−結合であり、
ｘは各々独立して３位、４位または６位の結合位置を表し、
GalNβ3/4は、ヘキソース、ヘキソサミンまたはヘキソサミン誘導体、好ましくはGal、GalN、GalNAc、Glc、GlcNまたはGlcNAc、にβ３−またはβ４−結合している非還元末端GalNを表し、
ＳＡＣはシアル酸または下記式で表される糖残基を表す。
Hex(A)s1[N(Ac)s2]s3
（式中、HexはGalまたはGlcであり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は各々独立に０
または１の整数であり、但しｓ１が１である場合には、ｓ３は０である）
上記式中のｓ１が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はヘキスロン酸構造、好ましくはGlcA、を含み；ｓ３が１であり、且つ、ｓ２が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はGlcNAcまたはGalNAcを含み；そして、ｓ２が０である場合には、ＳＡＣで表される構造はGalNまたはGlcNを含んでいる。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある種の癌細胞、腫瘍および他の悪性組織が特異的に発現するオリゴ糖配列に関する。本発明は、癌特異的オリゴ糖配列と結合する試薬を製造するための方法だけでなく、癌特異的オリゴ糖配列を検出するための方法も開示する。また、本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の診断方法にも関する。さらに本発明は、オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の癌細胞または癌化組織は、同種の細胞や組織の非悪性グリコシル化産物とは異なるオリゴ糖配列を発現する。公知のまたは推測される癌関連オリゴ糖構造の例としては、次のオリゴ糖構造が挙げられる：糖脂質構造、例えばグロボ−Ｈ（Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacβCer）、ガングリオシドであるＧＭ１（Galβ3GalNAcβ4(NeuNAcα3)LacβCer）またはＧＤ２（GalNAcβ4(NeuNAcα8NeuNAcα3)LacβCer）；ルイス型フコシル化構造、例えばルイスａおよびｘ（Galβ3/4(Fucα4/3)GlcNAc）、ルイスｙ（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）、シアリルルイスｘ（NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAc）およびポリラクトサミン鎖中でのこれらの組み合わせ；ならびにＯ−グリカンコア構造、例えばＴ−抗原（Galβ3GalNAcαSer/Thr-タンパク質）、Ｔｎ−抗原（GalNAcαSer/Thr-タンパク質）またはシアリルＴｎ−抗原（NeuNAcα6GalNAcαSer/Thr-タンパク質）。非ヒト型の構造、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸、が癌に存在するとも示されている。癌においては、関連するオリゴ糖構造およびその特異性について十分に確立されている症例はわずかであり、これらの構造の中には、正常な細胞および組織に存在するものもあることから、癌には単に高濃度で存在しているだけだと考えられる。しかしながら、治療を目的とした用途においては、完全な癌特異性が必ずしも必要ではないと考えられる。
【０００３】
LacdiNAc（GalNAcβ4GlcNAc）型グリコシル化産物は、ヒト組織には一般的に提示されていないが、しかしながら、LacdiNAc型糖配列は、ヒト以外の多くの動物、ウシ糖タンパク質、ヒト糖タンパク質ホルモン（Manzella et al., 1997）およびヒトグリコデリン（glycodelin）タンパク質（van den Eijnden et al., 1997）から見出されている。一般的に、この構造は無脊椎動物や初期発生に関連すると考えられる。数種の変異型LacdiNAcは、ヒト胎児腎臓２９３細胞が発現したタンパク質から見出されている（Do et al., 1997）。近年、本発明者らは、トランスフェクトされた繊維芽細胞から得たLacdiNAcを基本とする構造について発表した（Saarinen et al., 1999）。この研究においては、グリコシル化が癌に関連するのか、繊維芽細胞のアデノウイルス由来ＥＩＡ−プロモーター配列のトランスフェクトに関連するのかは示しておらず、ＥＩＡ−プロモーターはグリコシル基転移酵素の遺伝子発現を調節してグリコシル化を修飾する場合がある。LacdiNAc型糖類は、ボーズ（Bowes）メラノーマ細胞の組織型プラスミノーゲンアクチベーターにおいて、他の構造と共に見出されたが、これらは“神経系関連”構造であると考えられた（Jaques et al., 1996）。これらの先の研究は、固形腫瘍から誘導した細胞系からの類似のオリゴ糖構造の検出についても記載している（Do et al., 1997; Jaques et al., 1996; Saarinen et al., 1999）。しかしながら、細胞間の接触が変わると（例えば固形腫瘍を単一細胞に分離すると）、炭水化物および他の表面抗原は通常変化する。さらに、細胞系の細胞はおそらく遺伝学的に修飾されており、それゆえに単一細胞として培養することが可能となる。細胞表面のグリコシル化は、細胞系または組織の分化状態に非常に特異的であり、細胞または組織の種類にも特異的である。したがって、本明細書に記載した従来技術には、単一癌細胞または固形腫瘍組織の天然のグリコシル化状態について記載されていない。しかしながら、細胞の種類または分化状態とグリコシル化との潜在的な相互関係は、癌細胞および腫瘍の型判定（typing）に癌抗原を用いることを可能にする。
【０００４】
以下の特許には、癌抗原、ならびにそれを用いた治療用および診断用の抗体の製造方法および癌ワクチンの製造方法に関する記載がある。しかし、抗原の構造は、本願で開示する糖類とは関係ない。
癌ワクチン：  米国特許第5,102,663号は、9-OAc NeuNAcα8NeuNAcα3Lac-Cer (GD3)に対する抗体の産生を刺激または増強するための、9-OAc GD3を包含する組成物を開示する。
米国特許第5,660,834号は、Ｔｎ（GalNAcα-Ser/Thr）抗原またはシアリル−Ｔｎ（NeuNAcα6GalNAcα-Ser/Thr）抗原から実質的になるムチン型糖タンパク質を含有する医薬組成物およびそれをアジュバンドとともに用いて癌細胞の増殖速度を低下させる方法を開示する。これと同じムチン配列に関する発明が、他の特許にも開示されている：米国特許第5,747,048号（ヒトに対するアジュバンド療法）および米国特許第5,229,289号。
米国特許第6,083,929号は、伸長１型鎖スフィンゴ脂質（Galβ3GlcNAc）を腫瘍関連組成物として開示し、更にそれをアジュバンドとともに用いた医薬組成物を開示する。
治療用抗体：  米国特許第4,851,511号は、ジシアロシルルイスａ−構造（NeuNAcα3Galβ3(Fucα4)[NeuNAcα6]GlcNAc）に結合するモノクローナル抗体、診断試験キット、抗体を産生するハイブリドーマ、マーカー分子および抗体と結合した抗腫瘍剤を開示する。
米国特許第4,904,596号は、NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3LacCerで表される構造に結合するモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、診断方法および抗腫瘍剤、免疫調整剤または分化誘導剤にカップリングした抗体を開示する。
米国特許第5,874,060号は、ルイスｙ−抗原（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）を認識する人体に適応させた抗体を開示する。
米国特許第6,025,481号は、ルイスｂ−抗原を認識する、人体に適応させた抗体をコードする核酸分子を開示する。ルイスｂ−構造（Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc-）の発現は、癌細胞では増加している。米国特許第5,795,961号は、さらに抗ルイスｂ抗体も開示する。
【０００５】
診断方法：  米国特許第4,725,557号は、タンパク質結合抗原であるFucα3Gal-、Fucα4Gal-およびFucα6Gal-、これらの構造を認識する抗体、癌関連炭水化物の結合を検出する方法ならびに診断キットを開示する。抗体はヒト消化器系の癌細胞に結合する。
米国特許第5,059,520号は、癌の診断に用いることのできる、血液型Ａ−抗原（GalNAcα3(Fucα2)Galβ-）を認識する数種のモノクローナル抗体を開示する。
米国特許第5,171,667号は、フコシル化２型ラクトサミン（-Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ-）に対する抗体およびそれを用いた癌の診断方法を開示する。
米国特許第5,173,292号は、癌に特異的な構造である、Gal-グロボシド（Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer）に結合するモノクローナル抗体を開示する。
米国特許第6,090,789号および5,708,163号は、Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacCer（グロボＨ、ＭＢｒ１、乳腫瘍関連抗原）結合体およびその類似体の合成、ならびにそれらを包含する医薬組成物を開示する。米国特許第5,679,769号は、糖ペプチドに結合したアスパラギンの合成を開示する。米国特許第5,543,505号は、細菌であるHelicobacter pyloriに結合する合成化合物を開示する。
米国特許第5,902,725号および6,203,999号は、前立腺特異的抗原上の少なくともトリアンテナリー（triantennary）オリゴ糖の分析による前立腺特異的癌の検出を開示する。抗体またはレクチンＰＨＡ−Ｌを検出に用いる。これらの特許は、細胞系から得た癌型ＰＳＡに存在するトリアンテナリーＮ−グリカンをクロマトグラフィーによって特徴付けている。
【０００６】
従来技術には、比較的大きなＮ−グリカン構造を含むフコシル化lacdiNAcを包含する医薬組成物（ＥＰ特許第0565241号）およびコア２型Ｏ−グリカン構造を包含する医薬組成物（ＥＰ特許第0919563号）に関する開示がある。これらの組成物は、セレクチン仲介細胞接着の阻害を目的としており、ＥＰ第0919563号では、セレクチン仲介細胞接着の阻害による転移の阻害も目的としている。しかしながら、本発明は、本発明のオリゴ糖エピトープを、抗体を含めた特異的認識分子の標的とする方法に関する。具体的には、本発明は、診断および治療に用いる抗体を誘導するのに適切な抗原性を有する結合体および組成物に関する。本発明は、特異的抗体による認識において最適なサイズのオリゴ糖配列を包含する医薬組成物に関する。最適なオリゴ糖エピトープは、末端lacdiNAc構造のみを含むものか、末端オリゴ糖配列と一種または二種の単糖残基を含むものである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、癌細胞によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、下記式（Ｉ）：
(Sac1)xGalNAcβ4(Fucα3)yGlcNAc      （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
で表される癌特異的配列を含むオリゴ糖鎖の存在を生物学的試料中に検出し、該配列の存在を指標として、癌の検出および／または癌の型判定を行う方法に関する。本発明は、多価の形態で該オリゴ糖鎖を含む抗原性物質を提供し、さらに該オリゴ糖鎖または該オリゴ糖鎖に結合する結合性物質を包含する診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。
発明の詳細の説明
いくつかのlacdiNAc（GalNAcβ4GlcNAc）型構造が分泌タンパク質、例えば糖タンパク質ホルモンから見出されている。ヒトの糖タンパク質ホルモンにおいては、通常lacdiNAcは、ホルモンの機能に重要であると考えられる4sulfo-GalNAcβ4GlcNAc-配列に修飾されているが、いくつかの異型が分泌lacdiNAc構造に存在する。糖タンパク質ホルモンは希少な可溶性タンパク質であり、一般的に比較的小さく、グリコシル化部位をほとんど有していないため、採りうるlacdiNAc構造が非常に限定されている。ヒトのグリコシル化に関する多くの構造研究がこの３０年の間に行われているが、ヒトの膜結合性の非分泌タンパク質におけるlacdiNAc配列の構造は特徴付けられていない。
【０００８】
細胞内分泌マーカーとしてのlacdiNAc構造の役割は報告されており、同じ報告は、lacdiNAc構造はＭＤＣＫ細胞の膜タンパク質に提示されていないことを明確に記述している（Ohkura, et al. 2001）。分泌タンパク質において特徴付けられたlacdiNAc構造のヒトの癌との関連は示されていない。癌による異常発現産物であるlacdiNAc構造ならびに特に希少なその異型であるフコシル化体およびシアリル化体は、正常な組織では発現されないので、このような構造の認識に基づく癌の処置および治療が有効な可能性は非常に高い。限られた量の正常組織にのみ提示されているか、低い密度で正常の組織および／または血清に存在する炭水化物を用いる方法は、診断方法および治療方法として成功している。
【０００９】
効果的な癌の処置のために診断および治療を組み合わせる方法
本発明で得られたデータは、本願で開示するlacdiNAc構造が、癌細胞に提示されている炭水化物構造を認識する診断方法および治療方法に有用であることを示している。グリコシル化のパターンは、組織間、腫瘍間、更には個々の患者間でも変化するので、本発明は、特に腫瘍から異常な炭水化物構造をスクリーニングし、特定の患者の癌が特異的に発現するグリコシル化の形態に対応した個別の治療を提供するための方法に関する。具体的には、本発明は、特に腫瘍または癌の試料に存在する、本願で開示するlacdiNAc構造のグリコシル化産物をスクリーニングし、本発明のlacdiNAc標的治療を用いて、（特に腫瘍、悪性化した組織または細胞に特異的に提示された）特定の癌関連グリコシル化産物を有する患者を治療する方法に関する。
【００１０】
本発明者らは、lacdiNAcが正常な組織上の細胞表面マーカーではないことを証明するために、効果的な質量分析法で複数の正常な組織のスクリーニングを行った。本発明の研究過程において、以下の事柄が判明した。
（ｉ）lacdiNAc配列は、単細胞癌（例えば白血病）および固形腫瘍の両方に存在する；
（ｉｉ）lacdiNAc配列は、正常な組織上で多数観察されることはなかった；
（ｉｉｉ）lacdiNAc配列は、癌細胞の形質膜または膜結合タンパク質、ならびに分泌タンパク質の両方に存在し、細胞表面に組み込まれたlacdiNAc配列は、癌診断、免疫療法および癌のlacdiNAc配列の認識に基づく他の治療のための標的となる；そして
（ｉｖ）癌細胞表面に提示されたlacdiNAc配列は、治療および診断用の特異的抗体によって認識することができる。これらの構造は、細胞表面上に有効な形態で存在し、他の細胞表面成分によって被覆されていない。
【００１１】
白血病細胞を単細胞癌細胞のモデルとして選んだ。白血病細胞は血液癌における単細胞癌細胞の代表例である。可溶性標的タンパク質は、非悪性腫瘍細胞に関する構造比較データが存在するものを選んだ。癌細胞上のLacdiNAc配列の異常発現を示すために、メタロプロテアーゼ−９（MMP-9）を白血病細胞（U-937）から単離し、Ｎ−グリコシド結合グリカンをＮ−グリコシダーゼＦで遊離させた。グリカン画分をトリヒドロキシアセトフェノンマトリックス中でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて分析したところ（図１Ａ）、無視できるほど少量のシアル酸残基の開裂が見られた。帰属された単糖組成を、続くグリコシダーゼ処理で推定された構造と共に表１に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるオリゴ糖の分析は比較的計量的であることが示されているので、各成分の相対的な存在量も示す。最も多量に存在するグリカン種を、(Hex)5(HexNAc)4(Fuc)3の[M+Na]+に帰属した。典型的なＮ−グリカン構造はわかっているので、仮にこの構造をトリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして帰属した。他の主要なグリカン種は、シアリル化、ジフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカン、および１つのアンテナに末端単糖としてGalの代わりにGalNAcを有する（いわゆるLacdiNAc構造を有する）トリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして同定した。一連のグリコシダーゼ処理によって示されるように、これらの帰属は正しいことが判った。比較のために、非悪性白血球細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼMMP-9の構造も決定したところ、このタンパク質にはlacdiNAc配列は含まれていなかった（Rudd P et al., 1999）。
【００１２】
本発明は、U-937細胞誘導MMP-9が、そのＮ−グリカンの大きな画分（およそ３０％）にLacdiNAc構造を有することを示す。LacdiNAc構造の存在は、二種の独立した方法、すなわち完全糖ペプチドのＬＣ−ＥＳＩ ＭＳだけでなく、遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析でも証明された。構造の帰属は、さらに一連のグリコシダーゼ処理によって確認した。本研究で用いた方法の有効性は、合成オリゴ糖と公知の天然の構造体の両方を用いたいくつかのアプローチで立証されている。
【００１３】
正常な組織から得たlacdiNAc構造の質量分析法によるスクリーニング
ヒトの胃、肺および結腸を含むいくつかの非悪性組織の膜タンパク質試料を、上記のように質量分析法で分析した。Ｎ−結合型またはＯ−結合型のlacdiNAc配列は観察されなかった。従来技術にも、ヒトの正常な膜タンパク質と癌の膜タンパク質のいずれかに提示されているlacdiNAcに関する報告はない。
【００１４】
固形腫瘍上のlacdiNAc構造の分析
本発明は、lacdiNAc-配列がヒトの固形腫瘍に提示されていることも初めて示す。本願の実施例の１つは、ヒト喉頭癌の試料から得たlacdiNAc構造の特徴づけを示す。
【００１５】
形質膜試料から得たlacdiNAc構造の特徴づけ
本発明は、癌における、形質膜型のlacdiNAc発現タンパク質にも関する。マトリックスメタロプロテアーゼMMP-9は、膜結合型で存在することも知られており(Koivunen et al., 1999）、これは本発明における癌の診断および免疫療法に用いる理想的な標的を形成する。他の一つの例として、メラノーマ関連膜の二種の異なる試料のグリコシル化産物を分析した。特有のＮ−グリカン構造を含む多量の種々のlacdiNAc型オリゴ糖配列が、膜結合性の糖タンパク質に見出された。グリコシル化膜タンパク質は、細胞および組織の表面に提示されていることが知られている。
【００１６】
本発明で示した癌に特異的な欠陥
本発明は、癌細胞の新規な欠陥を開示する。分泌タンパク質と関連する希少な構造は、通常lacdiNAc構造を発現しないタンパク質上に発現される。さらに、グリコシル化の不全は、より異常なシアリル化体、フコシル化体およびGalNacの４位の通常の硫酸化を欠いた異型を誘導する。癌に対する一般的な知見によると、癌細胞においては細胞内機構が乱されている。ゴルジ装置のこのような欠陥によって種々の細胞型における非常に特異的なグリコシル化が生じ、その結果が明かに上記のような問題を誘導する。可溶性タンパク質における癌を示す異常なグリコシル化産物の存在は、明かに癌の診断に有用であり、膜と結合した癌グリコシル化産物の存在によって可溶性タンパク質そのものが治療に有用となる。
【００１７】
上述のように、癌抗原の存在について、白血病細胞系U-937細胞の分泌MMP-9タンパク質、固形腫瘍および膜調製物を検討した。白血病細胞系の単一細胞は、単一細胞癌白血病との妥当な関連性を示すモデルであるとも考えられる。LacdiNAc-構造が固形腫瘍から得られ、それが膜結合性であるという知見は、グリコシル化産物を発現する固形腫瘍に対する治療において、癌グリコシル化産物が有用であることを示す。
【００１８】
本発明は、下記式（Ｉ）で表されるLacdiNAc構造が癌特異的抗原であることを示す。
(Sac1)xGalNAcβ4(Fucα3)yGlcNAc      （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
細胞結合型のMMP-9が知られていることから（Koivunen et al., 1999）、本発明は、癌細胞および腫瘍組織から癌抗原を直接検出する方法に関する。しかしながら、癌抗原は、癌細胞および腫瘍組織から検出される以外にも、本明細書で説明するように、癌細胞または組織から誘導された分泌糖タンパク質から検出される場合がある。このような癌特異的タンパク質としては、プロテアーゼ、ホルモンまたは分泌ムチン型糖タンパク質が挙げられる。
【００１９】
本発明は、癌抗原は糖タンパク質から検出できることを示し、この現象は悪性転換の際に上向き調節されることが知られている。癌関連糖タンパク質と推定されるものには癌抗原が存在するという知見は、初期の癌に対するより確実な診断手法を提供すると考えられる。このような好ましい癌関連タンパク質の例には、マトリックスメタロプトテアーゼタンパク質ファミリーに属するタンパク質（例えばMMP-9）、前立腺特異的抗原、カリクレイン２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび胎児性癌抗原が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
LacdiNAc型の癌特異的オリゴ糖は、GalNAcβ4GlcNAc-オリゴ糖配列を含んでいる。この配列は、癌細胞のオリゴ糖結合体の一部である。オリゴ糖配列は以下に示す配列のように置換することもでき、これらも癌細胞に提示されていることが知られている：GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-、NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc-、NeuNAcα6GalNAcβ4GlcNAc-、NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-またはNeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc-。癌オリゴ糖エピトープが単独でシアル酸およびフコースの両方を含む場合は、その構造は NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc- となる。癌細胞が硫酸化に必要なスルフォトランスフェラーゼを有する場合には、LacdiNAc配列は、例えば４位のGalNAcが硫酸化もされていてもよい。LacdiNAc型配列は、癌細胞または組織の糖タンパク質配列の一部であってもよく、例えばLacdiNAc型配列は糖タンパク質のＮ−結合グリカン中のマンノース残基にβ２−、β４−またはβ６−結合しているか、LacdiNAc型配列は糖タンパク質のＮ−結合グリカン中のマンノース残基にβ２−結合している。
【００２１】
フコシル化LacdiNAc糖類は、ルイス型癌関連オリゴ糖との相似性を示す。ルイス型癌関連オリゴ糖は正常な組織にも多量に存在するものの、ルイス型癌関連オリゴ糖の認識が弱いヒト抗体が産生される有望な理由は、ルイス型癌関連オリゴ糖とフコシル化LacdiNAc糖類との潜在的な弱い交差反応性である。
【００２２】
本発明は、細胞または組織の悪性化を、癌特異的グリコシル化産物を指標として検出する方法に関する。このような検出は、本願で開示する癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子によって行うことができる。好ましい分子は、アプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、抗体、モノクローナル抗体、抗体の断片、LacdiNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型である。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、LacdiNAc構造を認識する分子を有するものを検出に用いることができる。オリゴ糖配列は、エンドグリコシダーゼ酵素によって癌細胞から遊離することができる。また、オリゴ糖配列をプロテアーゼ酵素により糖脂質として遊離することができる。オリゴ糖またはその誘導体を遊離させるための化学的方法の具体例には、糖脂質の音波分解法（otsonolysis）、および糖タンパク質からオリゴ糖を遊離させるためのβ-脱離法（beta-elimination）またはヒドラジン分解法（hydrazinolysis method）が含まれる。その他の方法としては、糖脂質画分の単離が挙げられる。癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する結合性物質は、細胞表面上の該配列の分析に用いることもできる。該配列は、例えば糖結合体あるいは遊離のおよび／または単離したオリゴ糖画分として検出することができる。種々の形態の該配列の分析に用いることができる方法としては、ＮＭＲ分光法、質量分析法およびグリコシダーゼ分解法が挙げられる。特に、特異性に限定のある方法を用いる場合には、少なくとも二種の分析法を用いることが好ましい。
【００２３】
質量分析法は、試料中に存在する、少なくとも一種の本発明の癌特異的オリゴ糖配列を検出するための好ましい方法である。式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含む画分からHexNAc-HexNAc-断片を検出するために質量分析走査法（mass spectrometric scanning method）を用いることが特に好ましい。
【００２４】
本発明は、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を用いて、オリゴ糖構造を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法に関し、以下の工程に従って該抗体を製造する：
１）本願で開示するオリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を多価の形態で含んでいる結合体を、化学的または生化学的に合成する。多価の結合体は、例えば、本願で開示する癌特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖（ＯＳ）が、そのＣ１位の還元末端からスペーサー基（Ｙ）を介して、所望により単糖またはオリゴ糖残基（Ｘ）をさらに介して、オリゴ価または多価の担体（Ｚ）に原子（Ｌ）によって結合している、下記式（ＩＩ）で表される構造を形成する：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z                （ＩＩ）
（式中、
ｍは１より大きい整数であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｌは酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子であり、
Ｘは、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、あるいはＯ−グリカンまたはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部であり、
Ｙはスペーサー基または末端結合体、例えばセラミド脂質部またはＺへの結合部であり；
上記式（ＩＩ）で表される好ましい構造は、次の特徴のいずれか一つを満足する：オリゴ糖鎖（ＯＳ）はシアリル化されている、Ｘは少なくとも一つのマンノース残基またはＮ−アセチルガラクトサミン残基を含む、及びＺは炭水化物材料、例えば多糖を包含する）；そして
２）免疫応答活性化物質と共に多価結合体で動物またはヒトを免疫する。
オリゴ糖鎖は免疫応答活性化物質に多価の形態で結合していることが好ましく、結合体は単独、またはさらなる免疫応答活性化物質と共に免疫に用いる。より好ましい態様においては、オリゴ糖結合体を、少なくとも一種のアジュバンド分子と共に抗体産生生物に注射または粘膜投与する。抗体産生のためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質、例えばＢＳＡ、スカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン、リポペプチド、ペプチド、細菌の毒素、ペプチドグリカンまたは免疫活性多糖の一部、あるいは他の抗体産生活性化分子に多価の形態で結合する。当業界で知られている慣習的な抗体産生法で抗体を誘導するために、多価結合体をアジュバンド分子と共に動物に注射することができる。また、本発明の抗原性物質は、ヒトを免疫するための物質と関連して上述した、式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を化学的または生化学的に合成した多価の形態で含むものであることが好ましい。より好ましくは、抗原性物質は、末端NeuNAcα3または末端NeuNAcα6を含む（すなわち、式（Ｉ）においてＸが１である）か、糖配列がマンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンに結合する（例えば、式（ＩＩ）においてＸがManまたはGalNAcである）。
【００２５】
本発明は、本発明のオリゴ糖配列を含む一価および／またはオリゴ価の抗原性結合体にも関する。一価の抗原性結合体は抗原性脂質構造、例えば本願に記載した方法や公知の方法で抗体産生を誘導することの可能なセラミド、合成脂質または細菌型の脂質を含んでいてもよい。
【００２６】
特に本発明は、最適なサイズの抗原性エピトープおよびそれを包含する医薬組成物の用途に関する。抗体は通常、少数の単糖残基からなるエピトープしか効果的に認識することができない。また、小さなエピトープはより経済効率の高い合成が可能なため、このような構造を用いることが好ましい。
【００２７】
好ましい最適な抗原性エピトープは下記式（ＩＩ）で表される構造を含む：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z                （ＩＩ）
（式中、
Ｙは非炭水化物スペーサーまたはグリコシド結合していない末端結合体であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、マンノシル残基、Man2残基、Man3残基、Man3GlcNAc残基、Man4GlcNAc残基、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、好ましくは、Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、マンノシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基である）。
好ましい態様においては、Ｘはマンノシル残基であり、ＯＳはＸにβ２−、β４−またはβ６−結合、さらに好ましくはβ２−結合している。他の好ましい態様においては、Ｘはラクトシル残基またはＮ−アセチルラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはガラクトシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合しており；さらに好ましくは、ＸはGal残基またはGalNAc残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはラクトシル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しており；最も好ましくは、ＸはGal残基であり、ＯＳはＸにβ３−結合しているか、Ｘはラクトシル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−結合しているか、ＸはGalNAc残基であり、ＯＳはＸにβ６−結合している。より好ましい態様においては、上記の最適な抗原エピトープ中のオリゴ糖配列はフコースを含まない。
【００２８】
Man2残基、Man3残基、Man3GlcNAc残基およびMan4GlcNAc残基は、オリゴ糖配列であるManα3Man、Manα6Man、Manα3(Manα6)Man、Manα3(Manα6)ManまたはManα3(Manα6)Manβ4GlcNAcあるいはこれらのハイブリッド型の構造を含むＮ−グリカンコア構造の好ましい部分を示す。付加されたMan残基は、いずれかの非還元末端Man残基、好ましくはManα6分岐鎖に結合し、本発明のオリゴ糖配列は該分子の他の分岐鎖に結合する。
【００２９】
好ましい態様においては、次の構造を含む最適な抗原性エピトープを用いる：OSβ2Man、OSβ2Manα3ManまたはOSβ2Manα6Man。これらは、本研究の初めに見つかったＮ−グリカンlacdiNAcの部分エピトープである。別の態様においては、癌細胞のグリコシル化には欠陥があるため、上記と類似の最適抗原性エピトープであるOSβ3GalおよびOSβ3GalNAc、特にOSβ6GalおよびOSβ6GalNAcを含むＯ−グリカン型lacdiNAcおよび部分ラクトサミン型lacdiNAcは、免疫や、これらの構造を有する腫瘍に対する本願で開示する他の用途に有用である。このような腫瘍は、lacdiNAc型オリゴ糖分泌機能と、ラクトサミンおよび／またはムチン産生との組み合わせによって特徴付けられる。
【００３０】
癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を、血清、好ましくはヒトの血清、から抗体を精製するために固定することができる。癌特異的オリゴ糖配列を、好ましくは多価の結合体として、癌特異的オリゴ糖配列に結合する抗体の検出および／または定量、例えば癌の診断のための酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やアフィニティークロマトグラフィーによる分析にも用いることができる。
【００３１】
抗体産生または予防接種は、癌特異的オリゴ糖配列の類似体または誘導体によっても達成されうる。Ｎ−アセチル基を含むオリゴ糖配列の単純な類似体としては、修飾されたＮ−アセチル基、例えばＮ−プロパノイル基などのＮ−アシル基を含む化合物が挙げられる。本発明は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に対する特異的な類似体の製造にも関する。
【００３２】
さらに、癌特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体を、腫瘍や癌を破壊したり、その増殖能を低下させるために用いることができる。ヒト抗体は、癌特異的オリゴ糖配列に対する天然のヒト抗体の耐性を高めた類似体でもよい。このような類似体は、組換え遺伝子工学および／または生物工学によって製造することができ、ヒト抗体の断片または最適化した誘導体などが挙げられる。精製した天然の抗腫瘍抗体は予想されるいかなる副作用も生じることなくヒトに投与することができ、標準的な輸血の際にこのような抗体は移植されている。これは、癌特異的構造が正常の組織または細胞に提示されておらず、且つ、血液型抗原とは異なり、個体差がないとした条件下では確実であり、本発明の癌特異的オリゴ糖配列には血液型のような多様性は知られていない。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。特異的な人体適応抗体を遺伝子工学および生物工学で製造することも可能であり、人体に適応させた抗体の製造方法は、例えば米国特許第5,874,060号および第6,025,481号に記載されている。人体に適応させた抗体はヒト抗体の配列を模倣するように設計されるので、ヒトの患者に投与した際に、動物抗体のように免疫系によって拒絶されることはない。癌の増殖能を低下させたり癌を破壊するための方法は、一般的に固形腫瘍および癌細胞の両方に適用可能であることが知られている。いかなるヒト癌特異的抗原、好ましくはオリゴ糖からなる抗原を認識する精製した天然のヒト抗体を、腫瘍または癌の増殖能を低下させたりそれを破壊するために用いることが可能であることも知られている。他の一つの好ましい態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。
【００３３】
本発明によると、癌特異的オリゴ糖に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体、あるいは癌特異的オリゴ糖に結合する、生体に許容される他の物質は、腫瘍または癌細胞を毒性物質の標的とするために有用である。毒性物質としては、例えば細胞殺傷化学療法薬（cell killing chemotherapeutics medicine）（例えばドキソルビシン（Arap et al., 1998））、毒性タンパク質または放射線化学薬剤などの腫瘍の破壊に有効な物質が挙げられる。このような療法は、当業界では発表されており、特許にもなっている。毒性物質は、癌細胞または腫瘍にアポトーシスを起こさせたり、その分化を誘導したり、癌細胞または腫瘍に対する防御反応を増強したりすることもできる。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。本発明の癌結合性抗体は、例えば、いわゆる「ＡＤＥＰＴ−アプローチ」において、癌に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするために用いることもできる。
【００３４】
上記の治療用抗体は、癌の治療または予防を目的とした医薬組成物に用いることができる。本発明の治療方法は、患者が免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている時にも用いることもできる。
【００３５】
免疫抑制剤療法は、例えば、腎臓、心臓、肝臓または肺の移植の際の拒絶反応を抑制するために、臓器移植と共に実施する。このような療法を実施している間に現れる腫瘍は通常は良性であるが、貴重な移植臓器の損失をしばしば引き起こす。腫瘍または癌に特異的な抗原に対する抗体の産生能は、免疫系に見られる個体差によって異なる場合がある。癌から生還したヒトは、特に多量の天然の抗癌抗体を保有している場合がある。
【００３６】
癌に対する治療的ターゲティングを行うための他の方法
診断物質の場合と同様に、癌に対する治療的ターゲティングに用いる物質としては、抗体、抗体断片や人体に適応させた抗体以外にも、多くの薬剤が利用可能であることが知られている。癌に対するターゲティングには、非免疫原性の許容される物質を用いることが特に好ましい。癌に結合するターゲティング物質の例には、癌を破壊または抑制する特異的な毒性、細胞溶解性または細胞調節性の薬剤も含まれる。癌に対する治療的ターゲティングに用いる非抗体分子は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子を包含することが好ましく、このような結合性の分子（即ちオリゴ糖鎖結合性物質）としては、はアプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、LacdiNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、その構造を認識する分子を有するものも癌に対する治療的ターゲティングに用いることができる。本願で開示する癌結合性非抗体物質は、癌を標的とする、癌に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするためにも用いることもできる。
【００３７】
本発明は特に、本発明の癌特異的オリゴ糖配列に結合する物質および抗体を用いた、患者、好ましくはヒトの患者、の胃腸器系疾患の治療方法に関する。ヒトの胃腸器系で用いる治療用の抗体は、動物によって産生された抗体、例えば家畜（具体的には家畜用反芻動物であるウシ、ヒツジ、ヤギまたはスイギュウなど）の乳に含まれる抗体や、鶏卵で産生した抗体でもよい。公知の方法に従って、動物を癌特異的炭水化物結合体によって免疫することができる。本発明は、ヒトの胃腸器系の癌の抑制または破壊に用いることができる、他の許容される物質、好ましくは食品として許容されるタンパク質にも関し、このような物質の具体例には、癌特異的オリゴ糖配列に特異的な植物レクチンが含まれる。本発明は、胃腸器系に存在する本発明の癌特異的オリゴ糖配列を認識する抗体を含む、機能性食品および食品添加剤に関し、さらに本発明は、食品として許容される他の物質（特に胃腸器系に存在する癌特異的オリゴ糖配列に結合するレクチン）を用いた機能性食品または食品添加剤にも関する。
【００３８】
さらに、本発明によると、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体は、癌細胞を抑制するか排除するための免疫応答を刺激するためにヒトの癌ワクチンとして使用することができる。このような治療は必ずしも癌を根治しない場合もあるが、腫瘍による負担を軽減させたり、癌患者の病態を安定化し、癌の転移能も低下させることができる。ワクチンとして用いるためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質（例えばＢＳＡまたはスカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン）、脂質またはリポペプチド、細菌の毒素（例えばコレラ毒素または熱不安定毒素）、ペプチドグリカン、免疫活性多糖、あるいはワクチン分子に対する免疫反応を活性化する他の分子、細胞または細胞調製物に結合させることができる。癌ワクチンは、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドをさらに包含してもよい。適切な担体またはアジュバンドは、例えば免疫応答を刺激することが知られている脂質である。糖類あるいはその誘導体または類似体、好ましくは該糖類の結合体は、少なくとも一種の許容されるアジュバンド分子と共に癌患者に注射あるいは粘膜的（例えば経口的または経鼻的）に投与することができる。癌ワクチンは、癌に対する治療方法において薬剤として使用することができる。このような方法は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。また、この治療方法は、免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌の治療に用いることが好ましい。
【００３９】
さらに、癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌治療用医薬組成物を製造することができる。該医薬組成物は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌の治療に該医薬組成物を用いることが好ましい。上記の治療方法または医薬組成物は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列を発現していると診断された癌の治療に用いることが特に好ましい。治療方法または医薬組成物は、癌の治療のための他の治療方法または医薬組成物と共に用いることができる。他の治療方法や医薬組成物には、細胞成長抑止剤、抗血管形成薬、抗癌タンパク質（例えばインターフェロンまたはインターロイキン）または放射線療法が含まれることが好ましい。
【００４０】
癌の診断および薬剤を癌に対してターゲティングするために抗体を用いる方法は、他の抗原やオリゴ糖構造と関連して開示されている（米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号、第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,902,725号および第6,203,999号）。癌特異的オリゴ糖を癌ワクチンとして用いることも、他のオリゴ糖配列に関連して開示されている（第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号）。
【００４１】
本発明の抗原性物質は、担体に結合することができる。オリゴ糖を一価または多価の担体に結合する方法は当業界では知られている。癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をその還元末端から担体分子に結合することが好ましい。担体分子を用いると、一つの担体に多数の抗原性物質分子を結合することができるので、免疫応答の刺激および抗体結合効率が増大する。最適な抗体産生を達成するためには、分子量が１０ｋＤａよりも大きい結合体で、一般的に１０個を超えるオリゴ糖配列を担持したものを用いることが好ましい。
【００４２】
本発明のオリゴ糖配列は、グリコシル基転移酵素によって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（文献としてErnst et al., 2000を参照）。これらの酵素の特異性および補因子の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシル基転移反応を触媒するが、グリコシダーゼ反応は触媒しない酵素を得ることができる。本発明で開示する糖類および糖結合体またはそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。炭水化物材料を天然の原料から単離して、化学的または酵素学的に修飾して本願で開示する化合物とすることができる。種々の反芻動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。本発明のオリゴ糖配列は、所望により担体と共に、患者の癌の治療に適当な医薬組成物に加えることができる。本発明によって治療することのできる病態の例としては、本発明の癌特異的オリゴ糖を少なくとも一種発現している腫瘍からなる癌が挙げられる。治療可能な癌の症例は、患者から得た生物学的試料中に癌特異的オリゴ糖配列の存在を検出することによって発見することができる。該試料としては、例えば生検材料または血液試料が挙げられる。
【００４３】
LacdiNAc生合成に対する特異的な阻害剤によって、本願で開示する癌抗原の形成を阻害することができる。このような阻害剤としては、供与ヌクレオチドであるUDP-GalNAcの類似体を用いることができる。グリコシル基転移酵素に対する阻害性類似体を製造する方法は公知である。阻害剤は、LacdiNAcを合成するGalNAc-転移酵素に特異的であることが好ましい。
【００４４】
また、実質的に非抗原性である、化学的および／または酵素学的に合成したオリゴ価または多価の、本発明の癌特異的オリゴ糖配列の結合体は、癌細胞の接着および／または増殖の防止に用いることができる。それは、結合体が抗原性を有するが故に、抗体によって循環血液から阻害性オリゴマーまたはポリマーの消失が達成される。本発明の抗原性物質の例は上記した。非抗原性多糖結合体は、式（ＩＩ）（但し、式中のＸ、ＹおよびＺは免疫原性ではないものとする）にしたがって構築することができる。結合体の分子量は５０キロダルトン（ｋＤａ）未満であることが好ましく、１０ｋＤａ未満であることがさらに好ましい。本発明のオリゴ糖配列は、非タンパク質担体に結合することもできる。その場合、癌特異的オリゴ糖配列を非免疫原性多糖に結合することが好ましく、結合体の分子量が１０ｋＤａ未満であることが最も好ましい。
【００４５】
セレクチンと炭水化物との相互作用は癌転移を仲介するので、LacdiNAc型グリコシル化産物によって転移性癌細胞の標的が血管内皮上に存在するセレクチン含有部位となる場合があり、そのような部位の構造は、強力なセレクチンリガンドとして知られている（Grinnel et al., 1994; Jain et al., 1998）。LacdiNAc糖類は、Dell et al. (1995)に考察されているように、免疫応答から自らを保護することのできる免疫調節活性を有する。末端GalNAc残基は、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターを癌細胞の標的とすることもできる（Yang et al., 2000）。癌細胞におけるLacdiNAc生合成を阻害することによって、癌の転移能および悪性度を低下させる。本発明は特に、癌細胞の転移能を阻害するための、LacdiNAc生合成の阻害に関する。最適な抗原性エピトープは、転移阻害剤としては設計されていない。正常な免疫系および白血球機能にも必要なセレクチン仲介細胞接着を阻害しないように、ワクチン型のアプローチにおいては、非常に少量のLacdiNAc構造を使用する。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【００４７】
本発明の抗原性物質または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよい。治療用抗体またはワクチンの投与方法は公知である。
【００４８】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。
【００４９】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするいかなる哺乳類も意味する。
【００５０】
癌特異的オリゴ糖または本発明の癌特異的オリゴ糖を特異的に認識する化合物を診断または型の同定に用いる場合、例えば、オリゴ糖または化合物はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックが、癌患者から得た抗体を包含する試料あるいは患者の癌細胞または癌組織と接触すると、癌陽性試料の成分はプローブまたはテストスティックに結合し、試料から取り出されてさらに分析される。
【００５１】
本願において「癌」とは、「腫瘍」または「癌細胞」を意味する。「腫瘍」は、固形の多細胞腫瘍組織を意味する。さらに、本願において「腫瘍」は、前悪性状態の組織であって、固形腫瘍に分化し、癌に特異的な特徴を有するものを意味する。本願において「腫瘍」という用語は、白血病のような単一細胞癌、培養した癌細胞、またはそのような細胞のクラスターを意味するものではない。本願において「癌細胞」という表現は、腫瘍内の細胞、単一癌細胞（例えば白血病細胞）またはその他のいかなる種類の悪性細胞をも意味し、悪性細胞は癌または腫瘍に分化するもので、癌の特徴または癌特異的な特徴を有するものである。
【００５２】
LacdiNAc構造およびフコシル化LacdiNAc構造並びにそれらの類似体の酵素学的合成
末端LacdiNAcエピトープは、多量のβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば市販のウシ乳ガラクトシルトランスフェラーゼ）および受容体に対して過剰モル量のUDP-GalNAcを用いて合成することができる。例えば、UDP-GalNAcとGlcNAcβ3Galβ4Glcを比較的多量のβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼと共にNyame et al. (2000)の記載のようにインキュベートすると、GalNAcβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcが得られる。
【００５３】
上記の反応は、UDP-GalNAcから効率的にGalNAcを転移することのできる新規な組換え型ガラクトシルトランスフェラーゼによって行うこともできる（Ramakrishnan et al., 2001）。
【００５４】
GalNAcβ4GlcNAcエピトープまたはそのシアリル化誘導体（NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc）を数種類のα３−フコシルトランスフェラーゼによってフコシル化することが可能であり、例えば、Bergwerff et al. (1993)の記載と実質的に同様にヒト乳から得たフコシルトランスフェラーゼによってフコシル化したり、フコシルトランスフェラーゼＶＩによってフコシル化することができる。
【００５５】
新規なGalN誘導体、特にlacdiNAc構造およびそれらの誘導体の製造
本発明は、酵素学的合成の新規な経路にも関する。これらの経路は、lacdiNAc構造、関連構造およびそれらの類似体の製造にin vitroで用いることができる。ヘキソサミンに対するグリコシダーゼ反応およびグリコシダーゼ反応に用いるヘキソサミン供与体については、従来技術に記載がある。本発明は、通常、末端Gal残基やGalNAc残基などを含む受容体構造を使用する種々のグリコシル基転移酵素のための受容体として、末端ヘキソサミン、特にガラクトサミンおよびGalNβ4Glc(NAc)末端構造を用いる方法に関する。
【００５６】
上記の反応はこれまで報告されておらず、負に電位を帯びたヌクレオチド糖供与体の近傍に存在する正に電位を帯びたアミン基が反応を阻害していると考えられていた。電荷を帯びたアミノ基は、受容体の２位の水酸基を必要とする酵素による認識を阻害するか、または酵素の活性部位に対する望ましくない不可逆的結合を生じるとも考えられていた。本発明は、新規なグリコシル基転移酵素反応が可能であり、このような反応は哺乳類のグリコシル基転移酵素によっても可能であることを初めて開示する。グリコシダーゼ触媒反応と比較して、グリコシル基転移酵素反応は、通常、一対の供与体および受容体物質から一種類の生成物のみを形成するといった特異性を示すが、一方、グリコシダーゼ触媒によるグリコシル基転移反応は、一般的に数種類の生成物を生じる。
【００５７】
以前から、Gal受容体を用いる酵素に強制的にGalNAcを使用させることによって、lacdiNAc誘導体は合成されていた。このような方法の収率は一般的に非常に低い。ある種の転移酵素を用いた反応の中には、末端GalNAcを用いた反応よりも効率の悪いものもあるが、アミン基の存在は、天然Gal/GalNAc配列のアミン誘導体または類似体の特異的な合成を可能にする。
【００５８】
新規な反応は、悪性腫瘍または疾患に関連する新規な抗原性構造の潜在的な生合成経路も明らかにした。このような抗原性構造は正常な組織からは特徴付けることのできないものである。特に、新規な血液型関連抗原は、天然のグリコシル化酵素によって製造されている。
【００５９】
好ましい反応としては、末端ヘキソサミン（より好ましくはガラクトサミン）の３位、４位または６位に対するグリコシル基転移反応が挙げられ、ガラクトサミンの３位または６位に対する反応が更に好ましく、ガラクトサミンの３位に対する反応が最も好ましい。好ましい反応の具体例には、次の反応が含まれる：α３−シアリルトランスフェラーゼ反応、α６−シアリルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応、α３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応、β３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応、β６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ反応、β３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応およびβ３−グルクロニルトランスフェラーゼ反応。最も好ましい反応はα３−シアリルトランスフェラーゼ反応、α３−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ反応およびα３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応である。
【００６０】
好ましい合成反応は下記式（ＩＩＩ）で表される反応である。
SAC-供与体  ＋  GalNβ3/4  →  SACyxGalNβ3/4    （ＩＩＩ）
［式中、
ｙはα−またはβ−結合であり、
ｘは各々独立して３位、４位または６位の結合位置を表し、
GalNβ3/4は、ヘキソース、ヘキソサミンまたはヘキソサミン誘導体、好ましくはGal、GalN、GalNAc、Glc、GlcNまたはGlcNAc、にβ３−またはβ４−結合している非還元末端GalNを表し、好ましい態様においては、GalNβ4は非還元末端構造（GalNβ4GlcNAcまたはGalNβ4Glc）の一部である、例えば、GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcであり、
ＳＡＣはシアル酸または下記式で表される糖残基を表し、
Hex(A)s1[N(Ac)s2]s3
（式中、HexはGalまたはGlcであり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は各々独立に０
または１の整数であり、但しｓ１が１である場合には、ｓ３は０である）
上記式中のｓ１が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はヘキスロン酸構造、好ましくはGlcA、を含み；ｓ３が１であり、且つ、ｓ２が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はGlcNAcまたはGalNAcを含み；そして、ｓ２が０である場合には、ＳＡＣで表される構造はGalNまたはGlcNを含んでいる。］
【００６１】
さらに、本発明は下記式（ＩＶ）で表される新規な炭水化物に関する。
Gal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β3/4        （ＩＶ）
（式中、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基であり、
ｓ２およびｓ３は各々独立に０または１の整数である。）
アセチル基は天然のオリゴ糖配列に存在するので、上記式で表される類似体においては好ましくない。また、嵩高いイミド基（例えばフタルイミド基）は、類似体の立体構造を必要以上に変えてしまう大きな官能基であるために好ましくない。
【００６２】
さらに好ましい炭水化物としては、次の末端オリゴ糖配列が挙げられる：Gal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β4GlcNAcおよびGal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β4Glc。最も好ましい末端オリゴ糖配列としては、次の配列が挙げられる：Galα3GalN(Am)s2β4GlcNAc、Galα3GalN(Am)s2β4Glc、Galα3GalNβ4GlcNAcおよびGalα3GalNβ4Glc。
【００６３】
新規な炭水化物は、特に抗原として使用したり、免疫に用いるのに有用である。希少な、大部分が非天然または病原性関連の炭水化物は、関連構造も認識する抗体の製造を誘導するための免疫原として有用である。アミン含有炭水化物は、更なる類似体を製造するための出発物質や、グリコシダーゼの基質および／または阻害剤の候補物質、動物のまたは植物のレクチンに結合する天然オリゴ糖配列の類似体の候補物質として有用でもある。
【００６４】
本発明は、UDP-GalNをまず受容体（例えばGlcNAc、グルコースあるいは非還元末端のGlcNAcまたはグルコース）に転移する反応と、同じ反応容器内でUDP-GalNのGalNを受容体の３位、４位または６位、好ましくは３位または６位、最も好ましくは３位、に修飾する反応の二つを組み合わせた反応にも関する。他の反応の組み合わせにおいては、二種のグリコシル基転移酵素を使用することで、主要な反応系中でUDP-GalNの合成も同時に行うことができる。反応に用いるためのUDP-GalNをin situで製造する方法はすでに報告されている。
【００６５】
本発明においては、GalN1-リン酸およびUDP-GlcからUDP-GalNを作製する単純な方法が好ましい。lacdiNAc型構造の合成に関する好ましい態様には、ヘキソサミンのＮ−アセチル化によってＮ−アセチルヘキソサミンを得る反応（例えばGalNからGalNAcを得る反応）が含まれる。
【００６６】
好ましい態様においては、Ｎ−アセチルヘキソサミンまたはヘキソースを含有するオリゴ糖の類似体が製造され、lacdiNAc類似体が製造されることがより好ましい。本発明は、ヘキソサミンのアミン誘導体の製造にも関し、ヘキソサミンの好ましいアミン類似体または誘導体には、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基が含まれる。
【００６７】
好ましい態様においては、ヘキソサミンはグリコシル基転移酵素によってヘキソサミンに転移され、より好ましくはガラクトサミンがガラクトサミンに転移され、さらに好ましくは、GalNα3GalNβ4GlcNAcが形成される。この物質はアミノ基の誘導によってGalNAcα3GalNAcβ4GlcNAcまたは本発明で定義した類似体にさらに修飾することができる。
【００６８】
別の態様においては、UDP-GalNをα−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはα−GalNAcトランスフェラーゼ、好ましくはα３−ガラクトシルトランスフェラーゼによって、Galβ-末端を有する受容体に転移する。アミン基は、Ｎ−アセチル基または誘導アミン基を含む類似体にさらに誘導することができる。このような方法で得られる生成物の例としてはGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNα3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3(Fucα2)Galβ4、GalNα3(Fucα2)Galβ4、GalNAcα3(Fucα2)Galβ3、GalNα3(Fucα2)Galβ3、GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcが挙げられ、これらはヒトＡ／Ｂ血液型抗原の末端構造および類似体に相当する。
【００６９】
さらに本発明は、下記式（Ｖ）で表される新規な炭水化物に関する。
GalN(Am)r1α3(Fucα2)r2Galβ3/4        （Ｖ）
（式中、
ｒ１およびｒ２は各々独立に０または１の整数であり、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基である。）
アセチル基は天然のオリゴ糖配列に存在するので、上記式で表される炭水化物においては好ましくない。また、嵩高いイミド基（例えばフタルイミド基）は、類似体の立体構造を必要以上に変えてしまう大きな官能基であるために好ましくない。
【００７０】
さらに好ましい炭水化物としては、以下の末端オリゴ糖配列が挙げられる：
GalNα3Galβ4GlcNAcおよびGalNα3Galβ4Glc；
GalNα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNα3(Fucα2)Galβ4Glc；
GalNAmα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3(Fucα2)Galβ4Glc；ならびに
GalNAmα3Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3Galβ4Glc。
最も好ましい炭水化物としては、以下の末端オリゴ糖配列が挙げられる：
GalNAmα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3(Fucα2)Galβ4Glc；ならびに
GalNAmα3Galβ4GlcNAcおよびGalNAmα3Galβ4Glc。
【００７１】
新規な炭水化物は、特に抗原として使用したり、免疫に用いるのに有用である。希少な、大部分が非天然または病原性関連の炭水化物は、関連構造も認識する抗体の製造を誘導するための免疫原として有用である。アミン含有炭水化物は、更なる類似体を製造するための出発物質や、グリコシダーゼの基質および／または阻害剤の候補物質、動物のまたは植物のレクチンに結合する天然オリゴ糖配列の類似体の候補物質として有用でもある。
【００７２】
本発明は、特に本発明で開示する新規な物質を用いた免疫方法ならびに本発明で開示する物質に結合するレクチンおよび抗体のスクリーニング方法に関する。具体的には、本発明は、血液型抗原に結合する抗体や関連した抗体の特異性を判断するためのスクリーニングに関する。
【００７３】
本発明は、特に口腔癌の診断および／または治療に関し、該口腔癌としては、本発明のオリゴ糖配列を発現する喉頭癌または白血病型の癌が好ましい。また、本発明は、特に本願で開示するlacdiNAc構造をその表面に発現する全ての種類の癌に対する、本発明の治療にも関する。他の一つの好ましい態様においては、本発明は、通常lacdiNAc配列を含むタンパク質を発現および分泌する組織の癌の治療に関し、そのような組織としては糖タンパク質ホルモン分泌組織が挙げられる。
【００７４】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）に従った。
【００７５】
Gal、Glc、GlcNAc および NeuNAcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNと示し、ガラクトサミンはGalNと示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、NeuNAc残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれβ３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミンまたはGalβ3/4GlcNAcは、１型構造残基Galβ3GlcNAcおよび２型構造残基Galβ1-4GlcNAcのいずれかを示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸またはNeuNAcであり、Lacはラクトースを示し、Cerはセラミドを示す。SAはシアル酸、例えばNeuNAcを示す。本発明の癌関連二糖配列であるGalNAcβ4GlcNAcはlacdiNAcまたはLacdiNAcと略す。
【００７６】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
実施例１
MMP-9の分析方法
MMP-9の単離
一連のＣＭ−セルロース（ＣＭ−５２）クロマトグラフィーと続くDEAE/REDセファロースクロマトグラフィーによって、U-937細胞からMMP-9を単離した（Saarinen et al., 1999）。
【００７８】
MMP-9の４−ビニルピリジンアルキル化
MMP-9の濃縮・脱塩を、PorosTMＲ２カラム（２．１×１５０ｍｍ）を用い、アセトニトリルの直線グラジエント（０．１％トリフルオロ酢酸溶液、１５分間で３〜１００％）で溶出する逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行った。クロマトグラフィーは流速１ｍｌ／分で行い、MMP-9の溶出を２１４ｎｍにおける紫外線吸収度でモニターした。溶出したMMP-9は真空乾燥し、以下のアルキル化に付した。MMP-9 試料を６Ｍグアジン塩酸と２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス（ｐＨ７．５）溶液８０μｌに溶解し、５μｌの０．６Ｍ ＤＴＴを添加して還元し、室温で２０分間インキュベートした。還元後、１μｌの４−ビニルピリジンを加え、続いて室温で１５分間アルキル化反応を行った。反応は５μｌの０．６Ｍ ＤＴＴを添加することで停止し、アルキル化したMMP-9を得た。得られたアルキル化したMMP-9は上述のようにＲＰ−ＨＰＬＣで直ちに脱塩した。
【００７９】
トリプシン消化
２．５μｌ（１００ｐｍｏｌ）のアルキル化MMP-9を真空乾燥し、４０μｌの１．６６ｎｇ／μｌトリプシン（シークエンシング用グレード、Promega社製）含有５０ｍＭ二炭酸アンモニウム緩衝液に溶解した。消化は３７℃で一晩行った。
【００８０】
質量分析法
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは、波長が３３７ｎｍの窒素レーザーを備えたBiflex飛行時間型装置（ドイツ国、Bruker Franzen Analytik社製）で行った。総MMP-9 Ｎ−グリカンのみならず、ＮＤＶシアリダーゼ反応産物も、リニア型の陽イオン遅延引き出しモード（linear positive ion delayed extraction mode）において、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（Fluka Chemie AG社製、３ｍｇ／ｍｌ、溶媒はアセトニトリル／２０ｍＭ クエン酸ジアンモニウム水溶液（容量比は１：１））をマトリックスとして分析した。C. perfringensのシアリダーゼおよびフコシダーゼ処理で得たグリカンは、リフレクター型の陽イオン遅延引き出しモード（reflector positive ion delayed extraction mode）において、２，５−ジヒドロ安息香酸（１０ｍｇ／ｍｌ）をマトリックスとして分析した。スペクトルは、デキストラン５０００（Fluka Chemie AG社製）を用いて外部補整した。
【００８１】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルは、ハイブリッド四重極型飛行時間型質量分析計 Micromass Q-TOF（英国、Micromass社製）を用いて得た。イオン化は、シリカキャピラリー針（内径：２０μｍ、先端開口部：１０μｍ、もう一方の末端から金で被覆されている）（New Objective Inc.社製）を備えたナノスプレーイオン源（２．２ｋＶで作動）を通すことで達成した。
【００８２】
ナノフローＬＣ／ＭＳによるグリコシル化部位の決定
MMP-9をトリプシン処理して得たペプチド試料（１ｐｍｏｌ）を、PepMapカラム（０．０７５×１５０ｍｍ、NAN75-15-03-C18-PM、LC Packings社製）を用い、アセトニトリルの直線グラジエント（０．１％ギ酸溶液、３０分間で４〜４０％）で溶出するマイクロボア逆相クロマトグラフィーによって分離した。クロマトグラフィーは流速２５０ｎｌ／分で行い、２１４ｎｍにおける紫外線吸収度を記録した。ＬＣは、Micromass Q-TOF質量分析計に直接つないだ。質量分析計は、グリコシル化成分の同定を促進するために、低コーン電圧条件および高コーン電圧条件の両方でＨＰＬＣ溶出液をスキャンするように、Carr et al. (1993)の報告に従って設定した。低コーン電圧のスキャンは、コーン電圧が３５Ｖの条件でｍ／ｚ１００〜２５００の質量数範囲をスキャンし、溶出成分の質量分析スペクトルを得た。高コーン電圧のスキャンは、コーン電圧が１２０Ｖの条件、具体的には、質量分析計へ導入する全てのイオンに高衝突励起ポテンシャルを適用する条件下で得た。これは、質量に基づく分離を行う前に、導入イオンの衝突によって誘導されるフラグメント化を生じる。高コーン電位のスキャンの際には、質量分析計はｍ／ｚ１００〜１０００をスキャンするように設定した。次に、ｍ／ｚ２０４．１（HexNAcのオキソニウムイオン）、ｍ／ｚ２９２．１５（Neu5Acのオキソニウムイオン）およびｍ／ｚ３６６．１（Hex-HexNAcのオキソニウムイオン）について再構成したクロマトグラムを作成することで、溶出した糖ペプチドに選択的なクロマトグラムを得た。
【００８３】
白血病細胞から得たLacdiNAc構造の分析
癌細胞上のLacdiNAc配列の異常発現を示すために、メタロプロテアーゼ−９（MMP-9）を白血病細胞（U-937）から単離し、Ｎ−グリコシド結合グリカンをＮ−グリコシダーゼＦで遊離させた。グリカン画分をトリヒドロキシアセトフェノンマトリックス中でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて分析したところ（図１Ａ）、無視できるほど少量のシアル酸残基の開裂が見られた。帰属された単糖組成を、以下のグリコシダーゼ処理で推定された構造と共に表１に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるオリゴ糖の分析は、比較的計量的であることが示されているので、各成分の相対的な存在量も示す。最も多量に存在するグリカン種を、(Hex)5(HexNAc)4(Fuc)3の[M+Na]+に帰属した。典型的なＮ−グリカン構造はわかっているので、仮にこの構造をトリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして帰属した。他の主要なグリカン種は、シアリル化、ジフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカン、および１つのアンテナに末端単糖としてGalの代わりにGalNAcを有する（いわゆるLacdiNAc構造を有する）トリフコシル化ジアンテナリー複合体型グリカンとして同定した。一連のグリコシダーゼ処理によって示されるように、これらの帰属は正しいことが判った。比較のために、非悪性白血球細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼMMP-9の構造も決定したところ、このタンパク質にはlacdiNAc配列が含まれていなかった（Rudd et al., 1999）。
【００８４】
グリカンの構造的特徴づけを、一連のグリコシダーゼ処理をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでモニターすることで行った。二種の妥当なNeu5Ac結合（α2-3対α2-6）を見分けるために、グリカン混合物をＮＤＶノイラミニダーゼ、即ち、α2-3ノイラミン酸に非常に特異的な酵素で処理した。その結果、部分開裂が観察され（図１Ｂ）、これはＮＤＶシアリダーゼ活性に対して耐性であることが知られているＳＡのα2-3GalNAc結合から生じたものであると考えられる。他の可能性としては、α2-3結合ＳＡおよびα2-6結合ＳＡの両方が混在していると考えられる。特異性の緩やかなノイラミニダーゼ（Clostridium perfringens）でＮ−グリカン画分を処理したところ、次のような変化が観察された（図１Ｃ）：ｍ／ｚ２２４７．３、２２８７．９および２３９２．３のシグナルが消失し、ｍ／ｚ１８０９．７０、１８５０．７８、１８９１．７５、１９５５．７７および１９９６．７９のシグナルが現れた。これらの結果は、正常なバイアンテナリーＮ−グリカンの異なるフコシル化体、アンテナの一つにLacdiNAc構造（GalNAcβ1-4GlcNAc）を有するバイアンテナリーＮ−グリカンおよびアンテナの両方にLacdiNAc構造を有する少量のＮ−グリカンの存在を示す。アーモンドの実由来のα1-3(4)フコシダーゼ（アンテナからα1-3(4)結合フコース残基を除くが、Ｎ−グリカンコアからα1-6結合フコース残基を開裂しない酵素）で試料を処理したところ、１８０９．８０、１８５０．７８および１８９１．８４のシグナル（強度：６７％、２７％および６％）が出現した。これらの結果は、およそ３０％のグリカンが一つまたは両方のアンテナのいずれかにLacdiNAc配列を有することを示す。この結果は、下記のＬＣ−ＥＳＩ ＭＳのデータとよく符合する。
【００８５】
U-937細胞からMMP-9を単離し、アルキル化し、さらにトリプシンで消化した。糖ペプチドを同定するために、MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析を段階的なコーン電圧を用いて行い、総イオンのクロマトグラム（図２Ａ）および糖ペプチドと考えられるものを示すクロマトグラム（図２Ｂ、ＣおよびＤ）の両方を得た。本研究で用いたクロマトグラフィーの条件（即ち、PepMap媒体を０．１％ギ酸−アセトニトリルで溶出する条件）においては、糖ペプチドの分離はペプチド部位とグリカン部位の両方の影響を受ける。より一般的に用いられるトリフルオロ酢酸−アセトニトリル系においては、糖ペプチドの分離は、ペプチド部位の特性にのみ支配される。その結果、糖ペプチドは２３．１分および２４．３分に溶出する二種の主要なピークとして得られた。
【００８６】
２３．１分に溶出したものの質量スペクトルを図３Ａに示し、図中のシグナルは全て複合型グリカン（表１参照）を有するグリコシル化ペプチドTrp116-Arg134に帰属することができる。このスペクトルの中で最も強度の高いｍ／ｚ１１４３．４９のイオンを、(Hex)5(HexNAc)4(Fuc)3を有するTrp116-Arg134の[M+4H]4+に帰属する。２４．３分に溶出したものの質量スペクトルを図３Ｂに示す。このスペクトルの中で最も強度の高いｍ／ｚ１１７９．５４のイオンを、(Hex)5(HexNAc)4(Fuc)2(SA)1を有するTrp116-Arg134の[M+4H]4+に帰属する。
【００８７】
本発明は、U-937細胞誘導MMP-9が、そのＮ−グリカンの大きな画分（およそ３０％）にLacdiNAc構造を有することを示す。LacdiNAc構造の存在は、二種の独立した方法、すなわち完全糖ペプチドのＬＣ−ＥＳＩ ＭＳだけでなく、遊離したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析でも証明された。構造の帰属は、さらに一連のグリコシダーゼ処理によって確認した。本研究で用いた方法の有効性は、合成オリゴ糖と公知の天然の構造体の両方を用いたいくつかのアプローチで立証されている。
【００８８】
以下のグリカンを用いた同様の実験については、実施例２に記載した：
喉頭癌由来のLacdiNAc配列含有シアリル化Ｎ−グリカン、および
LacdiNAc配列、シアリル−LacdiNAc配列およびフコシル−LacdiNAc配列を有するヒトメラノーマ細胞（ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１）の膜タンパク質Ｎ−グリカン。
【００８９】
実施例２
固形腫瘍およびメラノーマ細胞膜の分析
癌試料の出発材料
喉頭癌試料としては、外科的手術の際に集めた腫瘍試料をホルマリン固定したものを用いた。グリカンを単離する前には、タンパク質をManzi et al. (2000)の記載と実質的に同様のクロロホルム−メタノール抽出を行うことで濃縮した。糖タンパク質の定量的抽出は、標準放射性標識糖タンパク質によって確認した（データは示さない）。
【００９０】
クロロホルム−メタノール抽出タンパク質からのグリカンの単離
グリカンは、試料糖タンパク質から非還元的β−脱離法によって分離し、クロマトグラフィーによって精製した。
【００９１】
ヒトメラノーマ細胞膜タンパク質の単離
ヒトメラノーマ細胞（ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１）を室温でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞培養皿から細胞をかきとり、遠心分離によって細胞を回収した。以下の精製工程は０℃〜＋４℃で行った。細胞を低浸透圧緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））でインキュベートした後にホモジナイザーで破砕し、そこに終濃度が１５０ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加して等浸透圧緩衝液に戻した。細胞膜の塊から細胞核を低速遠心分離によって分離するが、分離は顕微鏡検査でモニターした。膜および細胞質ゾル材料を含む上清を、更に４０，０００ｇで遠心分離した。得られたペレット（膜調製物）を、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む界面活性剤緩衝液中でホモジナイズした。インキュベートした後、調製物を１００，０００ｇで遠心分離し、界面活性剤抽出膜タンパク質を含む上清を回収した。緩衝塩および界面活性剤を、Verostek et al. (2000)に従った寒冷アセトン沈殿法（cold acetone precipitation）によって除去した。
【００９２】
膜タンパク質Ｎ−グリカンの単離
Nyman et al. (1998)の記載と実質的に同様の方法に従って、Chryseobacterium meningosepticum Ｎ−グリコシダーゼＦ（米国、Calbiochem社製）を用いて膜糖タンパク質からＮ−グリカンを分離し、次いでVerostek et al. (2000)とPacker et al. (1998)の記載と実質的に同様に精製した。ＲＰＭＩ−７９５１細胞から得たＮ−グリカンは、さらに１）ＡＧ−５０Ｗ強カチオン交換材料カラムおよび２）水で膨潤させたＣ18シリカのカラムを通したが、ＲＰＭＩ−７９３２細胞から得たＮ−グリカンに対しては、このような処理は行わなかった。いずれのＮ−グリカンも、Packer et al. (1998)の記載と実質的に同様に、黒鉛化炭素のカラム（graphitised carbon column）によってシアリル化画分と非シアリル化画分に分離した。
【００９３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstationを用い、Saarinen et al. (1999)、Papac et al. (1996)およびHarvey(1993)の記載と実質的に同様に行った。
【００９４】
エキソグリコシダーゼ消化
全てのエキソグリコシダーゼ反応をNyman et al. (1998)およびSaarinen et al. (1999)の記載と実質的に同様に行い、結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。使用した酵素とそれによって特徴付けられるオリゴ糖を用いた特異的な対照反応を以下に示す：Arthrobacter ureafaciensのシアリダーゼ（E. coli組換え体；英国、Glyko社製）は、オリゴ糖中のNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc-RおよびNeu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc-Rの両方を消化した；β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、GlcNAcβ1-6Gal-Rを消化したが、GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rは消化しなかった；β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ナタマメ由来；米国、Calbiochem社製）はGlcNAcβ1-6Gal-RおよびGalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rの両方を消化した；およびα1,3/4−フコシダーゼ（Xanthomonas sp.由来；米国、Calbiochem社製）は、Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-Rを消化したが、Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった。対照の消化反応も分析用のエキソグリコシダーゼ反応と並行して行い、その結果も同様に分析した。
【００９５】
結果
喉頭癌試料のLacdiNAc含有シアリル化Ｎ−グリカン
喉頭癌試料のシアリル化グリカンは、Arthrobacter ureafaciens シアリダーゼによって効率的に脱シアリル化された。脱シアリル化はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでモニターした（データは示さない）。脱シアリル化したグリカンは、はじめに、末端β−GlcNAc残基を特異的に加水分解するがβ−GalNAc残基は加水分解しない濃度のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて消化した。更にβ−アセチルヘキソサミニダーゼを添加すると、一つのＮ−グリカンから二つのHexNAc残基が除去された。この結果は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用には耐性であるが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで完全に消化されるGalNAcβ1-4GlcNAc配列の存在を示した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８５０．３８とｍ／ｚ１８５０．１６に観測される、[Hex4HexNAc5Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ：１８５０．６７）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１４４４．３０とｍ／ｚ１４４４．１５に観測される、[Hex4HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ：１４４４．５１）に対応するピークの相対シグナル強度は増加し、ｍ／ｚ１６４７．３４とｍ／ｚ１６４７．１９に観測される、[Hex4HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１６４７．５９）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度は増加しなかった。検討中のLacdiNAc含有Ｎ−グリカンのシアリル化体に対応する一つの観測されたピーク、具体的には、ｍ／ｚ２１１８．０９のイオン（[NeuAc1Hex4HexNAc5Fuc1-H]-; 計算値：ｍ／ｚ２１１８．９３）は、シアル酸残基を一つしか有していない。しかしながら、本願のデータは、もとの試料中に異なるシアリル化体が存在している可能性を排除することはできない。ここで重要なのは、多くの健康な組織から得た試料を同様に分析した場合には、LacdiNAc含有グリカンの形跡が見つからなかったことである。
【００９６】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２およびＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカン
膜結合シアリル化Ｎ−グリカンを包含するシアリル化Ｎ−グリカンは、Arthrobacter ureafaciens シアリダーゼで効率的に脱シアリル化された。脱シアリル化は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳでモニターした（データは示さない）。脱シアリル化したＮ−グリカンは、はじめに、末端β−GlcNAc残基を特異的に加水分解するがβ−GalNAc残基は加水分解しない濃度のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いて消化した。更にβ−アセチルヘキソサミニダーゼを添加すると、いくつかのＮ−グリカンからHexNAc残基が除去された。以下にβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ感受性であるが、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ非感受性の構造（構造Ａ〜Ｅ）を例示するが、上述の酵素はこれらの構造から同時に二つまたは四つのHexNAc残基のみを除去した。これらの結果をまとめると、下記の構造は、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの作用には耐性であるが、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼで完全に消化されるGalNAcβ1-4GlcNAc配列を含むことが示された。
【００９７】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来LacdiNAc含有Ｎ−グリカン（図５〜７）：
構造Ａ．  β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１７０４．７１に観測される、[Hex4HexNAc5+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１７０４．６１）に対応するピークは、ｍ／ｚ１２９８．５３に観測される、[Hex4HexNAc3+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１２９８．４５）に対応するピークに変化した。一方、ｍ／ｚ１５０１．６２に観測される、[Hex4HexNAc4+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１５０１．５３）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度は増加しなかった。
構造Ｂ．  β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８５０．７３とｍ／ｚ１８５０．７２に観測される、[Hex4HexNAc5Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１８５０．６７）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１４４４．５９とｍ／ｚ１４４４．５８に観測される、[Hex4HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１４４４．５１）に対応するピークの相対シグナル強度も有意に増加した。一方、ｍ／ｚ１６４７．６６に観測される、[Hex4HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１６４７．５９）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度の増加は見られなかった。
構造Ｃ．  β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１８９１．７８に観測される、[Hex3HexNAc6Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１８９１．６９）に対応するピークは、ｍ／ｚ１０７９．４７に観測される、[Hex3HexNAc2Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１０７９．３８）に対応するピークおよびｍ／ｚ１４８５．６５とｍ／ｚ１４８５．６１に観測される、[Hex3HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１４８５．５３）に対応するピークに完全に変化した。一方、計算値がｍ／ｚ１６８８．６１の[Hex3HexNAc5Fuc1+Na]+または計算値がｍ／ｚ１２８２．４５の[Hex3HexNAc3Fuc1+Na]+であると考えられる不完全消化産物の形跡は見られなかった。α1,3/4-フコシダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１４８５．６１に観測されるピークの一部は、ｍ／ｚ１３３９．５２に観測される、[Hex3HexNAc4+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１３３９．４８）に対応するピークに変化した。
構造Ｄ．  β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ２２１５．８５とｍ／ｚ２２１５．８４に観測される、[Hex5HexNAc6Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ２２１５．８０）に対応するピークの相対シグナル強度は有意に減少した。同時に、ｍ／ｚ１８０９．７１とｍ／ｚ１８０９．６７に観測される、[Hex5HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１８０９．６４）に対応するピークの相対シグナル強度も有意に増加した。一方、不完全消化産物と考えられるｍ／ｚ２０１２．７６に観測される、[Hex5HexNAc5Fuc1+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ２０１２．７２）に対応するピークの相対シグナル強度の増加は見られなかった。
【００９８】
ヒトメラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来LacdiNAc含有Ｎ−グリカン（図８〜９）：
構造Ｅ．  β−ヘキソサミニダーゼ消化の際には、ｍ／ｚ１５０１．５２に観測される、[Hex4HexNAc4+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１５０１．５３）に対応するピークは、ｍ／ｚ１０９５．３６に観測される、[Hex4HexNAc2+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１０９５．３７）に対応するピークに変化した。一方、ｍ／ｚ１２９８．４８とｍ／ｚ１２９８．４６に観測される、[Hex4HexNAc3+Na]+イオン（計算値：ｍ／ｚ１２９８．４５）に対応する不完全消化産物の相対シグナル強度の有意な増加は見られなかった。
【００９９】
結論
本実施例の結果は、ヒト癌化組織はLacdiNAc配列を有する糖タンパク質を含有することを示す。より具体的には、本実施例の結果は、LacdiNAc含有シアリル化Ｎ−グリカンであるNeuAc1Hex4HexNAc5Fuc1は喉頭癌腫瘍試料の糖タンパク質として発現されていることを示す。さらに、本実施例の結果は、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンの中には、LacdiNAc、シアリル−LacdiNAcおよび／またはフコシル−LacdiNAcを含有する構造がいくつも存在し、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンの中には、シアリル−LacdiNAc含有Ｎ−グリカンが存在することを示唆している。メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃ（即ちHex3HexNAc6Fuc1）においては、単離したシアリル化Ｎ−グリカンをArthrobacter ureafaciens シアリダーゼで消化してＮ−グリカンを得ているので、少なくとも一つのLacdiNAc単位はもともとシアリル化されていた。同様に、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃにおいては、二つのLacdiNAc配列の少なくとも一つはＮ−グリカンコアのα−マンノースの一つにβ−結合していなければならない。さらに、α1,3/4-フコシダーゼ消化によって、メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｃには、α1,3-フコシル化LacdiNAc配列が存在することが明らかになった。他の構造においては、Hex-HexNAc配列の存在によって、上述の構造的特徴の帰属が妨げられた。メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来脱シアリル化Ｎ−グリカンである構造Ｅ（即ちHex4HexNAc4）の単糖組成は、Man4GlcNAc2Ｎ−グリカンコアにシアリル−LacdiNAc配列を有するハイブリッドＮ−グリカンの存在を示唆する。
【０１００】
実施例３
癌細胞および糖結合体上のGalNAcβ1-4GlcNAc配列を認識する抗−LacdiNAc抗体、ならびにその製造と特徴付けに用いる免疫原性オリゴ糖結合体
抗体
抗−LacdiNAc抗体は、免疫原性LacdiNAc結合体を用い、実験動物免疫学における標準的な方法、ファージディスプレイ法で行う抗体ライブラリーのスクリーニング、または他の公知の方法で製造する。モノクローナル抗体と考えられる使用した抗体は、LacdiNAcに対して特異的であり、これは特異的なオリゴ糖またはオリゴ糖結合体で被覆したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ、あるいは特異的なオリゴ糖またはその結合体の認識を利用した他の適当な方法によって示される。LacdiNAc抗原に結合するが、対応するLacNAc類似体には結合しない抗体は、目的とする用途に適している。LacdiNAc抗原とLacNAc対照抗原とからなる特定のペアは、ネオ糖タンパク質または他の免疫原性結合体などの結合体の調製に適している。このようなペアの具体例としては、以下のペアが挙げられる。
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6Galβ1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-6Manα1-R、
GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R と Galβ1-4GlcNAcβ1-4Manα1-R、そして
上記の本発明のエピトープに対応するシアリル化類似体および／またはフコシル化類似体。
（式中、Ｒは、例えば、ラクトース、全てのＯ−グリカン、全てのＮ−グリカン、全ての糖脂質のコア構造、および公知の方法によってオリゴ糖をネオ糖タンパク質または他の免疫原性担体に結合するために用いるスペーサーから選ばれるものである。）
【０１０１】
組織片におけるLacdiNAc配列のin situの製造
対照組織をin situ LacdiNAc合成に付して、免疫組織化学または他の診断分野において正の対照（positive control）として用いることができる。例えばRamakrishnan と Qasba（2002）に記載されているウシ乳酵素Ｙ２８９Ｌ変異体に類似した変異型β−ガラクトシルトランスフェラーゼを使用し、且つこの引例に記載の反応条件と実質的に同様の反応条件を用いることで、反応を促進することができる。GalNAc転移反応の前に、組織片を５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中で、０．５Ｕ／ｍｌのナタマメβ−ガラクトシダーゼ（英国、Glyko社製）と共に３７℃で一晩インキュベートしてもよく、その後にはグリコシダーゼ反応溶液を組織片から洗い流す。こうすることによって、GalNAc転移酵素に対するさらなる受容部位を作ることができる。
【０１０２】
免疫学的診断の分野における抗体の使用
LacdiNAc特異的抗体は、免疫組織化学、免疫学的診断、および標準的な免疫学的方法に基づく他の診断分野に用いることができる。
【０１０３】
実施例４
本発明のlacdiNAc構造を認識する抗体に対する細胞溶解活性を検出するためのin vitro
溶解アッセイ
細胞表面にlacdiNAc構造を有するモデル癌細胞を８０％集密的密度となるように回収し、ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液）で４回洗浄する。細胞の生存率はトレパンブルー染色で確認する。約２００，０００個の細胞を、その細胞表面に提示されている本発明のlacdiNAc構造に結合する抗体と共にインキュベートする。一方の細胞のセットには、ウサギ補体を最終希釈度が１：５になるように加え、他方の細胞のセットは、培地を添加して体積が同じになるように調整する。さらに細胞を３７℃で１時間インキュベートする。最後に、ヨウ化プロピウム（propium iodide）を終濃度が２０μｇ／ｍｌになるように加え、細胞の色素取り込みを分析した。細胞はlacdiNAc結合抗体によって溶解するが、癌非結合性対照抗体では溶解しない。lacdiNAc構造は、抗体の認識および細胞溶解に利用できるように細胞表面に存在する。
【０１０４】
実施例５
α３−シアリルトランスフェラーゼ反応の例
過剰モル量（２０μｍｏｌ）のCMP-NeuNAcおよび１Ｕのα３−シアリルトランスフェラーゼ（ST3Gal III、ラット肝臓由来、Calbiochem社製）を、２．１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ含有５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）中で、GalNβ4GlcNAcβ3Lac（５μｍｏｌ）と共に３７℃で一晩インキュベートする。生成物であるNeuNAcα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは量的に生成され、それをゲルろ過ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによって精製する。質量分析およびＮＭＲ分析によって、予想した構造が確認される。リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、生成物のピークがｍ／ｚ９９８．３６に観測される。この生成物を所望により、α３−シアリル化LacdiNAcの類似体にＮ−アルキル化または誘導することもできる。α３−シアリル化lacdiNAcは、８μｌの無水酢酸を含む２００μｌの１Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3中でGalNをGalNAcへＮ−アセチル化することで得られる。
【０１０５】
α３−ガラクトシルトランスフェラーゼ反応の例
GalNβ4GlcNAcβ3LacからのGalα3GalNβ4GlcNAcβ3Lacの合成
UDP-Gal（３μｍｏｌ）、GalNβ4GlcNAcβ3Lac（１．５μｍｏｌ）およびα３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．１Ｕ、Calbiochem社製）を、５００μｌの２０ｍＭ ＭｇＣｌ2含有１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で３７℃でインキュベートする。生成物であるGalα3GalNβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcは、ゲルろ過ＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによって精製した。反応混合物は３７℃で４日間インキュベートした。陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析においては、予想された生成物のピークがｍ／ｚ８９１．２１０２に観測された。この生成物の構造は、ＮＭＲ分光測定によって確認する。
【０１０６】
実施例６
二種のガラクトシルトランスフェラーゼによるGlcNAcβ3LacからのGalNα3GalNβ4GlcNAcβ3Lacの合成およびin situ 供与体合成
５μｍｏｌ GlcNAcβ3Lac、１０ｍＭ GalN-1P（Sigma社製）、２０ｍＭ UDP-Glc、２．５Ｕ ガラクトース−１−リン酸−ウリジルトランスフェラーゼ、０．５Ｕ β1-4−ガラクトシルトランスフェラーゼおよび０．５Ｕ α1-3−ガラクトシルトランスフェラーゼ（米国、カリフォルニア州、Calbiochem社製）を含む反応混合物を、５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含有する０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）１．０ｍｌ中でインキュベートする。反応混合物は３７℃で４日間インキュベートした。反応生成物を陽イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に付したところ、主要な生成物のピークがｍ／ｚ８９０．２３４９に観測された。生成物の構造はＮＭＲ分光測定によって確認する。
【０１０７】
【表１】
2005500057.tif 000002
【０１０８】
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンは完全なＮ−グリカンである。
【図１Ｂ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンはＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートしたものである。
【図１Ｃ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンは、ＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートした後に、C. perfringens ノイラミニダーゼで処理したものである。
【図１Ｄ】遊離MMP-9 Ｎ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析。Ｎ-グリカンはＮＤＶノイラミニダーゼと共にインキュベートした後に、C. perfringens ノイラミニダーゼ、次いでアーモンドの実由来のフコシダーゼで処理したものである。
【図２】トリプシン消化したMMP-9のＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ分析。Ａは溶出したペプチドの全イオンを示すクロマトグラムであり、Ｂはｍ／ｚ２０４．１(Hexのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムであり、Ｃはｍ／ｚ２９２．１(ＳＡのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムであり、Ｄはｍ／ｚ３６６．１(Hex-HexNAcのオキソニウムイオン)の抽出イオンのクロマトグラムである。Ｂ、ＣおよびＤは糖ペプチドと推定される消化産物を示す。
【図３Ａ】MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析。２３．１分に溶出した糖ペプチドに対応するマススペクトルである。
【図３Ｂ】MMP-9のトリプシン処理ペプチドのＬＣ／ＭＳ分析。２４．３分に溶出した糖ペプチドに対応するマススペクトルである。
【図４Ａ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンのリニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｂ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｃ】喉頭癌試料由来シアリル化グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図５】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図６】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図７】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９３２の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、ナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化およびXanthomonas種 α1,3/4−フコシダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図８】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化およびS. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図９】メラノーマ細胞系ＲＰＭＩ−７９５１の膜タンパク質由来シアリル化Ｎ−グリカンをA. ureafaciens シアリダーゼ消化、S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメ β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化に付したものの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図１Ａ】
2005500057.tif 000003
【図１Ｂ】
2005500057.tif 000004
【図１Ｃ】
2005500057.tif 000005
【図１Ｄ】
2005500057.tif 000006
【図２】
2005500057.tif 000007
【図３Ａ】
2005500057.tif 000008
【図３Ｂ】
2005500057.tif 000009
【図４Ａ】
2005500057.tif 000010
【図４Ｂ】
2005500057.tif 000011
【図４Ｃ】
2005500057.tif 000012
【図５】
2005500057.tif 000013
【図６】
2005500057.tif 000014
【図７】
2005500057.tif 000015
【図８】
2005500057.tif 000016
【図９】
2005500057.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2005500057.tif 000018
2005500057.tif 000019
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500057.tif 000080
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月12日(2003.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
(Sac1)xGalNAcβ4(Fucα3)yGlcNAc      （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
で表されるオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出することを特徴とする、生物学的試料を用いて癌を診断する方法。
【請求項２】
以下の工程（ａ）または工程（ｂ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
（ａ）該生物学的試料を該オリゴ糖配列に結合する結合性物質と接触させ、そして
該オリゴ糖配列を介した該結合性物質と該生物学的試料との結合を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する、または
（ｂ）酵素学的または化学的方法によって該生物学的試料中のオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を遊離させて、該生物学的試料から遊離したオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を含む画分を生成し、そして
該画分中の該オリゴ糖配列の存在を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する。
【請求項３】
該結合性物質が、オリゴ糖配列であるGalNAcβ4GlcNAcまたはその誘導体に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項４】
該結合性物質が、下記式からなる群より選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
[NeuNAcα3]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc、そして
[NeuNAcα6]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc    。
【請求項５】
該結合性物質が、アプタマー、ペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
該タンパク質が、抗体、酵素、レクチンまたはそれらの断片であることを特徴とする、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
該生物学的試料が、血液試料または血清試料であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項８】
該オリゴ糖配列を、血液試料または血清試料中の分泌糖タンパク質から検出することを特徴とする、請求項７に記載の診断方法。
【請求項９】
該糖タンパク質が、マトリックスメタロプロテアーゼタンパク質ファミリー、前立腺特異的抗原、カリクレイン２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび癌胎児性抗原からなる群より選ばれる糖タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
該オリゴ糖配列の存在を質量分析法および／またはグリコシダーゼ酵素を用いる方法によって検出することを特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１１】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれる末端オリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の診断方法。
NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc、
NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc、
NeuNAcα6GalNAcβ4GlcNAc、そして
NeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc    。
【請求項１２】
ヒトの癌を診断するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１３】
請求項２〜６のいずれかで定義されている結合性物質を包含する、癌または癌の型の診断に用いる診断剤であって、該結合性物質は、請求項１１で定義されているオリゴ糖配列に結合することを特徴とする診断剤。
【請求項１４】
請求項２〜６のいずれかで定義されている結合性物質を用いて癌または癌の型の診断用の診断剤を製造する方法であって、該結合性物質は、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列に結合することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を、化学的または生化学的に合成した多価の形態で含んでいることを特徴とする、ヒトの免疫感作に用いる抗原性物質。
【請求項１６】
請求項１５の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項１７】
請求項１５の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、血清、好ましくはヒトの血清から抗体を精製する方法。
【請求項１８】
請求項１５の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、抗体の検出および／または定量を行う方法。
【請求項１９】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を少なくとも一種含む多価またはオリゴ価の非免疫原性結合体を用いて、癌治療用医薬組成物を製造する方法。
【請求項２０】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項２２】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に対する抗体を包含する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２３】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に対する抗体を用いる癌治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項２４】
該オリゴ糖鎖が請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌治療用の免疫原性医薬組成物の製造方法。
【請求項２６】
該医薬組成物が、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを包含することを特徴とする、請求項１９、２１および２３のいずれかに記載の方法あるいは請求項２０または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖あるいはその類似体または誘導体を包含し、好ましくは医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含する癌ワクチン。
【請求項２８】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌ワクチンの製造方法。
【請求項２９】
該オリゴ糖配列が、請求項３２のマンノシル残基またはＮ−グリカン構造にβ２−結合していることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する結合性物質であって、アプタマー、酵素、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、ヒトの癌の治療用物質。
【請求項３１】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する物質であって、アプタマー、酵素、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、オリゴ糖配列結合性物質。
【請求項３２】
下記式（ＩＩ）：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z                （ＩＩ）
（式中、
Ｙは非炭水化物スペーサーまたはグリコシド結合していない末端結合体であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、マンノシル残基、Man2残基、Man3残基、Man3GlcNAc残基、Man4GlcNAc残基、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、マンノシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、
ＯＳは請求項１１で定義されているオリゴ糖配列であり、
好ましい態様においては、Ｘはマンノシル残基であり、ＯＳはＸにβ２−、β４−またはβ６−結合、好ましくはβ２−結合しており、
他の好ましい態様においては、Ｘはラクトシル残基またはＮ−アセチルラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはガラクトシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合している。）
で表される抗原性エピトープ構造を包含することを特徴とする、癌治療用医薬組成物。
【請求項３３】
下記式（ＩＶ）：
Gal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β3/4        （ＩＶ）
（式中、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基であり、
ｓ２およびｓ３は各々独立に０または１の整数である。）
で表される炭水化物。
【請求項３４】
下記式：
GalN(Am)r1α3Galβ3/4
（式中、
ｒ１は０または１の整数であり、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基である。）
で表される炭水化物。
【請求項３５】
GalN誘導体、特にlacdiNac構造およびその類似体を製造する方法にして、末端ヘキソサミンを受容体として下記式（ＩＩＩ）で表されるグリコシル基転移反応を行うことを包含する製造方法。
SAC-供与体  ＋  GalNβ3/4  →  SACyxGalNβ3/4    （ＩＩＩ）
［式中、
ｙはα−またはβ−結合であり、
ｘは各々独立して３位、４位または６位の結合位置を表し、
GalNβ3/4は、ヘキソース、ヘキソサミンまたはヘキソサミン誘導体、好ましくはGal、GalN、GalNAc、Glc、GlcNまたはGlcNAc、にβ３−またはβ４−結合している非還元末端GalNを表し、
ＳＡＣはシアル酸または下記式で表される糖残基を表す。
Hex(A)s1[N(Ac)s2]s3
（式中、HexはGalまたはGlcであり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は各々独立に０
または１の整数であり、但しｓ１が１である場合には、ｓ３は０である）
上記式中のｓ１が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はヘキスロン酸構造、好ましくはGlcA、を含み；ｓ３が１であり、且つ、ｓ２が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はGlcNAcまたはGalNAcを含み；そして、ｓ２が０である場合には、ＳＡＣで表される構造はGalNまたはGlcNを含んでいる。］
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月3日(2003.11.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
(Sac1)xGalNAcβ4(Fucα3)yGlcNAc      （Ｉ）
（式中、ｘおよびｙは各々独立に０または１の整数であり、Sac1はNeuNAcα3またはNeuNAcα6である。）
で表されるオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出することを特徴とする、生物学的試料を用いて癌を診断する方法。
【請求項２】
以下の工程（ａ）または工程（ｂ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
（ａ）該生物学的試料を該オリゴ糖配列に結合する結合性物質と接触させ、そして
該オリゴ糖配列を介した該結合性物質と該生物学的試料との結合を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する、または
（ｂ）酵素学的または化学的方法によって該生物学的試料中のオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を遊離させて、該生物学的試料から遊離したオリゴ糖構造またはオリゴ糖複合体を含む画分を生成し、そして
該画分中の該オリゴ糖配列の存在を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する。
【請求項３】
該結合性物質が、オリゴ糖配列であるGalNAcβ4GlcNAcまたはその誘導体に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項４】
該結合性物質が、下記式からなる群より選ばれる少なくとも一種のオリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
[NeuNAcα3]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc、そして
[NeuNAcα6]0-1GalNAcβ4(Fucα3) 0-1GlcNAc    。
【請求項５】
該結合性物質が、アプタマー、ペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
該タンパク質が、抗体、酵素、レクチンまたはそれらの断片であることを特徴とする、請求項５に記載の診断方法。
【請求項７】
該生物学的試料が、血液試料または血清試料であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
【請求項８】
該オリゴ糖配列を、血液試料または血清試料中の分泌糖タンパク質から検出することを特徴とする、請求項７に記載の診断方法。
【請求項９】
該糖タンパク質が、マトリックスメタロプロテアーゼタンパク質ファミリー、前立腺特異的抗原、カリクレイン２、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンおよび癌胎児性抗原からなる群より選ばれる糖タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
該オリゴ糖配列の存在を質量分析法および／またはグリコシダーゼ酵素を用いる方法によって検出することを特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１１】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれる末端オリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の診断方法。
NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc、
NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc、
NeuNAcα6GalNAcβ4GlcNAc、そして
NeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc    。
【請求項１２】
ヒトの癌を診断するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１３】
請求項２〜６のいずれかで定義されている結合性物質を包含する、癌または癌の型の診断に用いる診断剤であって、該結合性物質は、請求項１１で定義されているオリゴ糖配列に結合することを特徴とする診断剤。
【請求項１４】
請求項２〜６のいずれかで定義されている結合性物質を用いて癌または癌の型の診断用の診断剤を製造する方法であって、該結合性物質は、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列に結合することを特徴とする方法。
【請求項１５】
下記式からなる群より選ばれる末端オリゴ糖配列を、化学的または生化学的に合成した多価の形態で含んでいることを特徴とする、ヒトの免疫感作に用いる抗原性物質。
NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc、
NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc、そして
NeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc    。
【請求項１６】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を、化学的または生化学的に合成した多価の形態で含んでいる抗原性物質を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項１７】
請求項１６で定義されている抗原性物質を用いて、血清、好ましくはヒトの血清から抗体を精製する方法。
【請求項１８】
請求項１６で定義されている抗原性物質を用いて、抗体の検出および／または定量を行う方法。
【請求項１９】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を少なくとも一種含む多価またはオリゴ価の非免疫原性結合体を用いて、癌治療用医薬組成物を製造する方法。
【請求項２０】
下記式で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌治療用医薬組成物。
NeuNAcα3GalNAcβ4GlcNAc、
NeuNAcα3GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc、そして
NeuNAcα6GalNAcβ4(Fucα3)GlcNAc    。
【請求項２１】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項２２】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に対する抗体を包含する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２３】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に対する抗体を用いる癌治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項２４】
該オリゴ糖鎖が請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌治療用の免疫原性医薬組成物の製造方法。
【請求項２６】
該医薬組成物が、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを包含することを特徴とする、請求項１９、２１および２３のいずれかに記載の方法あるいは請求項２０または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖あるいはその類似体または誘導体を包含し、好ましくは医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含する癌ワクチン。
【請求項２８】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を用いた、癌ワクチンの製造方法。
【請求項２９】
該オリゴ糖配列が、請求項３２のマンノシル残基またはＮ−グリカン構造にβ２−結合していることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
式（Ｉ）で表される末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する結合性物質であって、アプタマー、酵素、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、ヒトの癌の治療用物質。
【請求項３１】
請求項１１で定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する物質であって、アプタマー、酵素、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、オリゴ糖配列結合性物質。
【請求項３２】
下記式（ＩＩ）：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z                （ＩＩ）
（式中、
Ｙは非炭水化物スペーサーまたはグリコシド結合していない末端結合体であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
Ｘはラクトシル残基、ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、マンノシル残基、Man2残基、Man3残基、Man3GlcNAc残基、Man4GlcNAc残基、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、マンノシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、
ＯＳは請求項１１で定義されているオリゴ糖配列であり、
好ましい態様においては、Ｘはマンノシル残基であり、ＯＳはＸにβ２−、β４−またはβ６−結合、好ましくはβ２−結合しており、
他の好ましい態様においては、Ｘはラクトシル残基またはＮ−アセチルラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸのGal残基にβ３−またはβ６−結合しているか、Ｘはガラクトシル残基またはＮ−アセチルガラクトサミニル残基であり、ＯＳはＸにβ３−またはβ６−結合している。）
で表される抗原性エピトープ構造を包含することを特徴とする、癌治療用医薬組成物。
【請求項３３】
下記式（ＩＶ）：
Gal[N(Am)s2]s3α3GalN(Am)s2β3/4        （ＩＶ）
（式中、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基であり、
ｓ２およびｓ３は各々独立に０または１の整数である。）
で表される炭水化物。
【請求項３４】
下記式：
GalN(Am)r1α3Galβ3/4
（式中、
ｒ１は０または１の整数であり、
Ａｍはアミン基の誘導残基であるが、但し、Ａｍはアセチル（Ａｃ）基またはイミド基ではなく、好ましくはGalN残基とカルボン酸を形成するアミド基、例えば、ホルムアミド、プロピオン酸アミド、他のアルキルアミド、カルボン酸を含むシクロヘキサンラジカルのアミドなどの環状アミド、および安息香酸のアミド基のような芳香族炭化水素のアミド基である。）
で表される炭水化物。
【請求項３５】
GalN誘導体、特にlacdiNac構造およびその類似体を製造する方法にして、末端ヘキソサミンを受容体として下記式（ＩＩＩ）で表されるグリコシル基転移反応を行うことを包含する製造方法。
SAC-供与体  ＋  GalNβ3/4  →  SACyxGalNβ3/4    （ＩＩＩ）
［式中、
ｙはα−またはβ−結合であり、
ｘは各々独立して３位、４位または６位の結合位置を表し、
GalNβ3/4は、ヘキソース、ヘキソサミンまたはヘキソサミン誘導体、好ましくはGal、GalN、GalNAc、Glc、GlcNまたはGlcNAc、にβ３−またはβ４−結合している非還元末端GalNを表し、
ＳＡＣはシアル酸または下記式で表される糖残基を表す。
Hex(A)s1[N(Ac)s2]s3
（式中、HexはGalまたはGlcであり、ｓ１、ｓ２およびｓ３は各々独立に０
または１の整数であり、但しｓ１が１である場合には、ｓ３は０である）
上記式中のｓ１が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はヘキスロン酸構造、好ましくはGlcA、を含み；ｓ３が１であり、且つ、ｓ２が１である場合には、ＳＡＣで表される構造はGlcNAcまたはGalNAcを含み；そして、ｓ２が０である場合には、ＳＡＣで表される構造はGalNまたはGlcNを含んでいる。］
【国際調査報告】
2005500057.tif 000081
2005500057.tif 000082
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