(57)【要約】酵素Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害に基づいて対真菌毒性化合物を同定する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素に結合する能力について候補化合物を評価すること、及び（ｂ）酵素活性の有意な低減を測定することを含む、有力な対真菌毒性化合物を同定する方法。
【請求項２】
殺真菌活性を確認するための１種類以上の試験に、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素を阻害する化合物を適用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
候補化合物の非存在下及び存在下に真菌由来のミクロソーム調製物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの活性をアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
飽和脂肪酸アシル−補酵素Ａ基質の不飽和脂肪酸生成物への変換を測定することによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの活性を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対真菌毒性化合物が、子嚢菌綱、担子菌綱、不完全菌類及び卵菌綱及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる真菌の綱に対して有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アッセイが、コレトトリカムの種、マグナポルテの種、ボトリティスの種、フザリウム属の種、アルテルナリアの種、ヘルミントスポリウム属の種、ベンツリアの種、セルコスポラの種、セプトリアの種、マイコスフェレラの種、モニリニアの種、スクレロチニアの種、プクシニアの種、フィトフトラの種、フハイカビ属の種、エリシフェの種、ペニシリウム属の種及びプクシニアの種及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる植物病原性真菌由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイが、カンジダ属の種、アスペルギルス属の種、フザリウム属の種、コクシジオイデス・イミチス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、小胞子菌属の種、及びトリコフィトンの種からなる群より選ばれる哺乳動物の真菌病原体由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アッセイが、植物又は哺乳動物の真菌病原体に対する適切なモデル系として働くことができるサッカロミセス・セレヴィシエ又は他の真菌由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素活性を阻害することが確認された化合物を用いて対真菌毒性組成物及び配合物を調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）（ｉ）不飽和脂肪酸及び（ii）飽和脂肪酸の外因性供給の存在下及び非存在下に対真菌毒性について少なくとも１種類の候補化合物をスクリーニングすること、及び（ｂ）不飽和脂肪酸の外因性供給の存在下に低減した対真菌毒性を示し且つ飽和脂肪酸の外因性供給の存在下に対真菌毒性の低減を示さないことによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害剤を同定することを含む、対真菌毒性化合物を同定する方法。
【請求項１１】
Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいて候補化合物を試験すること及び植物、動物又は基材上の場所にΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性を阻害する化合物を適用することを含む、植物、動物又は基材上の真菌増殖を制御する方法。
【請求項１２】
前記基材が、木材、革、コンクリート、塗料、プラスチック、金属及び保護被膜を有する面からなる群より選ばれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
活性成分として少なくとも１種類のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤を１種類以上の担体と共に含む、対真菌毒性組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル及び式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｘ（式中のＸはＨ原子、アルカリ金属及びＣ１−Ｃ８アルキル基から選ばれそしてｎは８〜２２から選ばれる整数である）を有する化合物からなる群より選ばれる１種類以上の飽和脂肪酸を含む、請求項１３に記載の対真菌毒性組成物。
【請求項１５】
６−（４−クロロフェニル）−２−（２’−ペンチン−４’−エン−１−イル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、６−（４−クロロフェニル）−２−（５’−ペントキシ−２’−ブチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジ−ノン、６−（４−クロロフェニル）−２−（４’−フルオロ−２’−ブチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、６−（２−ピリジル）−２−（２’−ノニニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン、７−クロロ−２，４，４ａ，５−テトラヒドロ−２−（２’−ペンチン−イル）−インデノ［１，２−ｃ］−ピリダジン−３−オン、６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２Ｈ）−４，
５−ジヒドロピリダジノン、６−（２−ナフチル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２
Ｈ）−ピリダジ−ノン、６−（４−クロロフェニル）−２−（２’−デシニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれるタイプのピリダジノンを除外する、請求項１３に記載の対真菌毒性組成物。
【請求項１６】
前記担体が、水、アセトン、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ピリジン及びジメチルスルホキシドからなる群より選ばれる有機溶媒及びクレー、無機シリケート及びカーボネート、及びシリカからなる群より選ばれる微粉固体から選ばれる、請求項１３に記載の対真菌毒性組成物。
【請求項１７】
（ａ）少なくとも１種類のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤、（ｂ）Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤ではない少なくとも１種類の抗真菌剤、（ｃ）場合により１種類以上の担体、及び（ｄ）場合により１種類以上の添加剤又は安定剤を含む、対真菌毒性配合物。
【請求項１８】
前記配合物が、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル及び式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｘ（式中のＸはＨ原子、アルカリ金属及びＣ１−Ｃ８アルキル基から選ばれそしてｎは８〜２２から選ばれる整数である）を有する化合物からなる群より選ばれる１種類以上の飽和脂肪酸を含む、請求項１７に記載の対真菌毒性配合物。
【請求項１９】
Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害剤を検出するアッセイにおいて候補化合物を試験すること及び真菌増殖の制御が望ましい場所に請求項１８に記載の対真菌毒性配合物を付与することを含む、植物、哺乳動物又は基材上の真菌増殖を制御する方法。
【請求項２０】
前記基材が、塗料、木材、革、コンクリート、金属、プラスチック及び動物の皮膚からなる群より選ばれる、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年６月１７日出願の米国仮出願６０／３８９，３２５に由来する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、植物に悪影響を与えることなく広範囲の真菌性(fungal)疾病を制御することにおいて有効であることが知られているピリダジノン抗真菌剤の或る種類が真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素の阻害によってその対真菌毒性効果を発揮するという驚くべき観察に関係する。より詳細には、本発明は、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害に対する有力候補を評価することによって対真菌毒性化合物を同定しそして殺真菌剤としてΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
真菌(fungi)及び哺乳動物において、一不飽和脂肪酸は、酸素を必要とする反応においてΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ、シトクロムｂ5及びＮＡＤＨ依存シトクロムｂ5レダクターゼを含む膜結合酵素系による飽和脂肪酸アシルＣｏＡ基質から生じる｛Bloomfield D.K.及びBLOCH,K.,The Journal of Biological Chemistry 235,337-345(1960),Jeffcoat,R.,Essays in Biochemistry 15,1-36(1979)｝。ラットと酵母におけるΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素の一次アミノ酸配列の比較は、哺乳動物酵素と真菌酵素との間の実質的な相同性を示す｛Stukey,J.E.,McDonough,V.M.及びMartin,C.E.The Journal of Biological Chemistry 265,20144-20149(1960)｝。シクロプロペノイド(cyclopropenoid)脂肪酸、例えば、植物に由来する(plant-derived)材料ステルクリン酸は、動物及び真菌におけるΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの公知の阻害剤であり、両方のタイプの生体中で不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の高い比率を特徴とする脂肪酸組成の大きな(profound)変化を引き起こす｛(Christie,W.W.,Topics in Lipid Chemistry Vol. 1,1-49頁,F.D.Gunstone編(1970),Moreton,R.S. Applied Microbiology and Biotechnology 22,41-45(1985))。ステルクリン酸は、植物において不飽和脂肪酸生合成を阻害することも報告されている｛James,A.T.,Harris,P. 及びBezard,J.,European Journal of Biochemistry 3,318-325(1968)｝。シクロプロペノイド脂肪酸が植物中で抗真菌性の役割を果たしているかもしれないという可能性がシュミット(Schmid)及びパターソン(Patterson)によって論じられてきた｛Lipids 23,248-252(1988)｝。この著者らは、シクロプロペノイド脂肪酸が３０μＭで、培養基(culture)中で植物病原体であるリゾクトニア・ソラニ(Rhizoctonia solani)及びユスチラゴ・メイディス(Ustilago maydis)の増殖の部分的阻害を引き起こすが、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)の増殖阻害は引き起こさないことを示した。不飽和脂肪酸であるオレイン酸は、シクロプロペノイド脂肪酸による増殖阻害を阻止し、そしてこの著者らは、シクロプロペノイド脂肪酸の可能性のある抗真菌性の役割を論じる中でシクロプロペノイド脂肪酸が生じる脂肪酸背景が重要であろうと示唆した。換言すれば、主要な細胞成分である不飽和脂肪酸が植物体中に存在するために、ステルクリン酸が植物体中で真菌を阻害することができないのかもしれない。不飽和脂肪酸環境の影響は、酵母サッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)において不飽和脂肪酸の供給が存在する場合にΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素が増殖に必要でないという事実によっても証明されている｛Stewart,L.C.及びYaffe,M.P.,Journal of Cell Biology 115,1249-1257 (1991)｝。真菌類の酵母において、モートン(Moreton)は、Applied Microbiology and Biotechnology 22,41-45(1985)中で、シクロプロペノイド脂肪酸が、増殖への有意な影響を伴うことなしに、カンジダ属の種(Candida sp.)１０７、トリコスポロン・クタネウム(Trichosporon cutaneum)及びロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)における、不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率の劇的な増加をもたらすことを開示した。植物又は動物に対して真菌の増殖を制御することにおいてシクロプロペノイド脂肪酸の効果を示すデータは従来技術には存在しないということが強調されるべき重要性を有している。
【０００４】
Δ−９脂肪酸デサチュラーゼは充分に研究された酵素でありそしてシクロプロペノイド脂肪酸はこの酵素の公知の阻害剤であるが、この酵素が有力な殺真菌剤をスクリーニングするのに良好な生化学的標的となるであろうかということは、上記の従来技術からは自明でない。実際に、種々の開示が、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素系が良好な生化学的標的であることに対して反論するものであろう。モートン(Moreton)によってApplied Microbiology and Biotechnology 22,41-45(1985)に記載のように、培養基中で、シクロプロペノイド脂肪酸は、脂肪酸組成の著しいシフトを与えるにもかかわらず種々の真菌類酵母の増殖を阻害しなかった。更に、シクロプロペノイド脂肪酸が植物又は動物の真菌感染を制御することができることは示されておらず、そして不飽和脂肪酸が植物及び動物双方由来の脂質中に多量に存在しているという事実は、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤が効果的でなくなるであろう植物及び動物中の脂肪酸環境を示唆している。
【０００５】
更に、動物酵素と真菌酵素との間の構造的類似性、及びシクロプロペノイド脂肪酸が動物及び植物中の不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率に主要な効果を及ぼすという事実は、有力な酵素阻害剤の選択性の欠如を示しており、そして哺乳動物への望ましくない毒物学的影響及び植物への悪影響の可能性を示唆している。
【発明の開示】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、植物体に悪影響を及ぼすことなく植物体において広範囲の真菌性疾病を制御するのに有効であることが知られているピリダジノン殺真菌剤の或る種類が、真菌性酵素であるΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素の阻害によってその対真菌毒性効果を発揮することを見出した。更に、本発明者らは、これらの化合物が哺乳動物系において真菌感染を制御することができそして哺乳動物のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素の活性を阻害しないことを見出した。これらの発見は、真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼが有力な抗真菌剤をスクリーニングするのに大いに魅力的な生化学的標的であることを示している。従って、真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを阻害するように設計される化合物、又は合成化学物質ライブラリ又は天然生成物のライブラリのスクリーニングを通して真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを阻害する能力に対して選択される化合物は、商業的に有用な殺真菌剤となる可能性を有する。
【０００７】
Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤の存在下で、真菌細胞は、その膜中に不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の高い比率を有する。膜の安定性又は流動性において生じる変化は、損なわれた膜機能により対真菌毒性を惹起すると推測される。ピリダジノン殺真菌剤のユニークな特徴は、ヤング(Young)らによって米国特許５,７４１,７９３に開示のように、その対真菌毒性を高める飽和脂肪酸の能力である。理論に限定されるわけではないが、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤の対真菌毒性の増大は、真菌の膜中で不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の高い比率へのシフトを促進することによる外因性飽和脂肪酸の添加から期待される。
【０００８】
従って、本発明の一つの観点は、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素活性の阻害を検出するアッセイにおいて１種類以上の候補化合物を試験すること及びそれに続いて抗真菌活性を確認するための１種類以上の通常の試験に前記酵素を阻害する化合物を適用することを含む、植物又は哺乳動物の疾病を制御し又は基材(substrate)上での真菌増殖を制御するための有力な抗真菌剤（potential fungicides）を同定する方法である。
【０００９】
本発明の第二の観点は、（ａ）不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸の外因性供給の存在下又は非存在下に対真菌毒性について候補化合物を試験すること、及び（ｂ）不飽和脂肪酸の外因性供給の存在下に低減した対真菌毒性を示しそして飽和脂肪酸の外因性供給の存在下で対真菌毒性の低減がないこと又は増進した対真菌毒性を示すことによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤を同定すること、を含むΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性を阻害する化合物を検出する方法である。
【００１０】
本発明の第三の観点は、（ａ）１種類以上の対真菌毒性のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤、及び（ｂ）１種類以上の飽和脂肪酸を含む相乗的な対真菌毒性効果を有する組成物を提供する。
【００１１】
本発明の第四の観点は、（ａ）１種類以上のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤、（ｂ）Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤ではない１種類以上の殺真菌剤、（ｃ）１種類以上の担体、（ｄ）場合により、１種類以上の添加剤、及び場合により、（ｅ）１種類以上の飽和脂肪酸を含む対真菌毒性配合剤を提供する。
【００１２】
本発明者らは、植物に悪影響を及ぼすことなく植物における広範囲の真菌性疾病を制御するのに有効であることが知られているピリダジノン殺真菌剤（欧州特許公開公報(European Patent Publication)ＥＰ４７８１９５Ａ１）の或る種類が、真菌酵素Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害によってその対真菌毒性効果を発揮することを証明した。ピリダジノン殺真菌剤は、ヤング(Young)らによって米国特許５,７４１,７９３に開示されている。本発明により有効に用いられるピリダジノン類は、米国特許５,７５３,６４２に詳細に記載された方法により調製した。
【００１３】
ピリダジノン類の適切な例は、限定的でなく、６−（４−クロロフェニル）−２−（２’−ペンチン(pentyn)−４’−エン−１−イル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；６−（４−クロロフェニル）−２−（５’−ペントキシ−２’−ブチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；６−（４−クロロフェニル）−２−（４’−フルオロ−２’−ブチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；６−（２−ピリジル）−２−（２’−ノニニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；７−クロロ−２，４，４ａ，５−テトラヒドロ−２−（２’−ペンチニル）−インデノ［１，２−ｃ］−ピリダジン−３−オン；６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２Ｈ）−４，５−ジヒドロピリダジノン；６−（２−
ナフチル）−２−（２’−ペンチニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノン；及び６−（４−ク
ロロフェニル）−２−（２’−デシニル）−３（２Ｈ）−ピリダジノンを含む。
【００１４】
本発明者らは、これらの化合物が哺乳動物系において真菌感染を制御することができることを発見した（実施例１）。更に、これらの化合物は、真菌Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素の有力な阻害剤であって、しかも哺乳動物のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素を阻害しない（実施例２）。この発見は、真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼが有力な殺真菌剤のスクリーニングに対する大いに魅力的な標的であることを示す。真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを阻害するように設計される化合物、又は合成化学物質ライブラリ又は天然生成物のライブラリのスクリーニングを通して真菌のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを阻害する能力に対して選択される化合物は、植物又は哺乳動物の疾病を制御し又は基材上での真菌の増殖を制御する商業的に有用な殺真菌剤となる可能性を有する。
【００１５】
本発明の第一の観点は、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ酵素活性の阻害を検出するアッセイにおいて１種類以上の候補化合物を試験することを含む、植物又は哺乳動物の疾病を制御し又は基材上での真菌増殖を制御するための有力な殺真菌剤を同定する方法を提供する。それに続いて、前記酵素に結合しそしてそれを阻害する化合物を１種類以上の通常の試験に付して殺真菌活性を確認する。第二の段階は、本発明の方法の要件ではない。有力な抗真菌性化合物を同定する本発明の方法は、何れの特別なΔ−９脂肪酸デサチュラーゼアッセイも用いる必要がない。適切なアッセイを本明細書中（実施例２及び３参照）に記載するが、機能的に等価なアッセイを代用することができることは当業者に理解されよう。
【００１６】
本発明の別の態様は、候補化合物の非存在下又は存在下に真菌由来のミクロソーム調製物(microsomal preparation)中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの活性をアッセイすることを含む、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性を阻害する化合物の検出方法を提供する。該酵素の活性は、典型的には、飽和脂肪酸アシル−補酵素Ａ基質の不飽和脂肪酸生成物への変換を測定することにより測定される。
【００１７】
対真菌毒性に対する通常の試験（複数を含む）及び本発明の方法を用いて、許容することができる殺真菌活性を得るために、殺真菌的有効量の組成物を用いるのが好ましい。本明細書中で、「殺真菌的有効量」は、対照群と比べて真菌集団を低減させ又は作物(crop)被害を減少させる化合物の量である。特定の真菌に対して用いる特定の化合物の殺真菌的有効量は、使用する装置のタイプ、望ましい付与の方法及び頻度、及び制御するべき疾病に依存するが、典型的には、１ヘクタール当り活性化合物０．０１〜２０キログラム（ｋｇ）である。葉面(foliar) 殺真菌剤として、ピリダジノンを、典型的には、栽培植物(growing plant)に１ヘクタール当り０．１〜５ｋｇ、そして好ましくは、０．１２５〜０．５ｋｇの割合で付与する。
【００１８】
好ましい態様において、本発明は、植物又は哺乳動物の疾病を制御し又は限定的でなく木材、革、コンクリート、塗料(paint)、プラスチック、金属及び保護被膜(protective coating)を有する面を含む基材上での真菌増殖を制御するための有力な殺真菌剤を同定する方法を提供するものであり、ここで真菌は真菌の子嚢菌綱(Ascomycete class)、担子菌綱(Basidiomycete class)、不完全菌類(Deuteromycete class)及び卵菌綱(Oomycete class)に属する。
【００１９】
別の好ましい態様において、本発明は、植物病原性真菌由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいて候補化合物を試験することを含む、植物における真菌感染の制御のための有力な殺真菌剤を同定する方法を提供する。例として限定的でなく、コレトトリカムの種(Colletotrichum spp.)、マグナポルテの種(Magnaporthe spp.)、ボトリティスの種(Botrytis spp.)、フザリウム属の種(Fusarium spp.)、アルテルナリアの種(Alternaria spp.)、ヘルミントスポリウム属の種(Helminthosporium spp.)、ベンツリアの種(Venturia spp.)、セルコスポラの種(Cercospora spp.)、セプトリアの種(Septoria spp.)、マイコスフェレラの種(Mycosphaerella spp.)、モニリニアの種(Monilinia spp.)、スクレロチニアの種(Sclerotinia spp.)、プクシニアの種(Puccinia spp.)、フィトフトラの種(Phytophthora spp.)、フハイカビ属の種(Pythium spp.)、エリシフェの種(Erysiphe spp.)、ペニシリウム属の種(Penicillium spp.)及びプクシニアの種(Puccinia spp.)を挙げることができる。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様は、哺乳動物の真菌性病原体由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいて候補化合物を試験することを含む、哺乳動物における真菌感染の制御のための有力な抗真菌剤を同定する方法を提供する。例として限定的でなく、カンジダ属の種(Candida spp.)、アスペルギルス属の種(Aspergillus spp.)、フザリウム属の種(Fusarium spp.)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、小胞子菌属の種(Microsporum spp.)、トリコフィトンの種(Tricophyton spp.) を挙げることができる。
【００２１】
本発明の更に別の好ましい態様は、植物又は哺乳動物の真菌性病原体に対して適切なモデル系として働くことができるサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)又は他の真菌由来の細胞全体又は細胞抽出物中でΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性の阻害を検出するアッセイにおいて候補化合物を試験することを含む、真菌増殖を制御するための有力な抗真菌剤を同定する方法を提供する。
【００２２】
本発明の第二の観点は、（ａ）不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸の外因性供給の存在下及び非存在下に対真菌毒性について候補化合物を試験すること、及び（ｂ）不飽和脂肪酸の外因性供給の存在下に低減した対真菌毒性を示しそして飽和脂肪酸の外因性供給の存在下に対真菌毒性の低減がないこと又は増進した対真菌毒性を示すことによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤を同定することを含む、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ活性を阻害する化合物を検出する方法である（実施例３参照）。
【００２３】
本発明の別の態様は、真菌増殖を制御することが望ましい場所(locus)に殺真菌的有効量のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤を付与することを含む、真菌の増殖を制御する方法を提供する。有効な殺真菌性組成物は、本発明の方法から決定する。前記目的に対して、これらの化合物は調製された技術的な又は純粋な形態で、又はより典型的には溶液として又は配合物として用いることができる。前記化合物は、通常、担体中に取り込む(take up)か又はその後の散布(dissemination)に適するように配合する。
【００２４】
細胞を毒性化合物で処理すると、該化合物の作用機構に特徴的であることができる多数の生理学的及び生化学的変化が生じる。これは、特定の代謝産物の量における変化及び特定の遺伝子（処理応答性(treatment-responsive)遺伝子）の転写における変化を含んでいることができる。前記変化の分析は、化合物の予想される作用機構の提示を与えることができる。Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤の場合、前記変化は、（限定的でなく）実施例４に示す細胞性脂肪酸の量における変化を含んでいることができる。処理応答性遺伝子の転写における変化の検出も、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤の同定への有力なアプローチを与える。
【００２５】
本発明の第三の観点は、（ａ）１種類以上の対真菌毒性Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤、及び（ｂ）１種類以上の飽和脂肪酸を含む、相乗的な対真菌毒性効果を有する組成物を提供する。
【００２６】
ピリダジノン殺真菌剤の別の特徴は、その内容及び開示が本発明の方法において有効に用いられるヤング(Young)らにより米国特許５,７４１,７９３に開示された、飽和脂肪酸がその対真菌毒性を高める能力である。Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤の存在下で、真菌細胞はその膜中に不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の高い比率を有する。膜安定性又は流動性において生じる変化は、推定されるように、損なわれた膜機能による対真菌毒性を惹起する。理論に限定されるわけではないが、飽和脂肪酸は、真菌膜中で不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率を高める方へのこのシフトを促進することによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤の対真菌毒性を高めることが予想される。
【００２７】
本発明に用いるのに適した飽和脂肪酸化合物は、式ＣＨ3（ＣＨ2）nＣＯ2Ｘ（式中、Ｘは、Ｈ原子、アルカリ金属及びＣ1−Ｃ8アルキル基から選ばれ、そしてｎは、８〜２２から選ばれる整数である）を有する。該化合物は、本明細書中で「Ｃ10−Ｃ24脂肪酸及び誘導体」、及び「脂肪酸及び誘導体」とも称する。
【００２８】
真菌に対してピリダジノンの効果を高めるのに有効なＣ10−Ｃ24脂肪酸の塩及びエステルの適切な例は、式中のＸがＨ原子、アルカリ金属及びＣ1−Ｃ8アルキル基から選ばれる、ナトリウム塩及び「短鎖」アルキルエステルである。本明細書中で用いる場合、「短鎖」は、長さＣ1−Ｃ8の炭素鎖を称する。本発明の脂肪酸及び誘導体はヘテロ原子、例えば、酸素原子、イオウ原子及び窒素原子を含んでいることができ、そして従って、適切な脂肪酸及び誘導体は脂肪酸エステルを含んでいることができる。
【００２９】
本発明の第四の観点は、（ａ）Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤１種類以上、（ｂ）Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤でない殺真菌剤１種類以上、（ｃ）担体１種類以上、（ｄ）場合により、添加剤１種類以上、及び場合により（ｅ）飽和脂肪酸１種類以上を含む対真菌毒性配合物を提供する。本発明の別の態様は、担体と組み合わせて又は担体なしに活性成分としてΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤を含む殺真菌剤配合物を提供する。別の態様は、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤でない殺真菌剤１種類以上と組み合わせてΔ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤を含む殺真菌剤組成物を提供する。
【００３０】
本発明の方法により対真菌毒性活性を有すると判定された化合物は、調製された技術的な又は純粋な形態で用いることができ、又はより典型的には溶液として又は配合物として用いることができる。前記化合物は、通常、担体中に取り込むか又はその後の散布に適するように配合する。殺真菌剤配合物は、植物又は哺乳動物又は基材に対して真菌増殖を制御するのに有効である。
【００３１】
本発明の殺真菌剤配合物は、米国特許５，７４１７９３に記載のように、殺真菌剤の通常の使用方法に従って付与することができる。本発明の方法によって殺真菌剤と判定された化合物は、その組成物及び配合物の双方を別々に(separately)付与することができ、又は付与する前に組み合わせて配合物を調製することができる。本明細書中で述べるように、大部分の用途において、殺真菌剤化合物は、耕種学的に(agronomically)許容することができる担体と共に用いる。「耕種学的に許容することができる担体」は、本発明の化合物と生物学的、化学的及び物理学的に相溶性(compatible)であり、そして農業的用途に用いることができる固体又は液体である。本発明の方法に用いるのに適した耕種学的に許容することができる担体は、その両者を本明細書中で例示する有機溶媒、及び微粉固体を含む。例えば、これらの殺真菌剤組成物は、水和剤(wettable powder)、乳化性コンセントレート、粉剤(dust)、粒状配合物、エーロゾル、又は流動性(flowable)エマルションコンセントレートとして配合することができる。前記配合物中で、化合物は液体又は固体担体を用いて延ばされ(extend)、そして望ましい場合には、適切な界面活性剤が加えられる。
【００３２】
殺真菌剤活性には必要ではないが他の特性に対して有効又は必要である、場合により添加される成分又は添加剤は、限定的でなく、補助剤、例えば、湿潤剤、展着剤、分散剤、固着剤(sticker)、接着剤などを含む。前記補助剤は当業者に周知であり、そして補助剤の議論は、多くの文献に、例えば、ジョン，ダブリュー．マッカチェオン社(John W. McCutcheon,Inc.)出版(publication)マッカチェオンのエマルション及び洗浄剤(McCutcheon's Emulsifiers and Detergents)（ＭＣ出版社(MC Publishing Company)のマッカチェオン・ディビジョン(McCutcheon Division)、ニュージャージーにより毎年発行）に見出すことができる。
【００３３】
一般に、本発明の方法から同定される殺真菌剤化合物は、溶媒、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ピリジン又はジメチルスルホキシド中に溶解することができ、そしてかかる溶液は水で希釈することができる。希釈後の溶液の濃度は、１重量％〜９０重量％まで変化することができるが、好ましい範囲は５％〜５０％である。
【００３４】
本発明の対真菌毒性化合物の乳化性配合物及びコンセントレートの調製に対して、適切な有機溶媒、又は溶媒の混合物中に、乳化剤と一緒に前記化合物を溶解して水中化合物の分散性を高めることができる。乳化性コンセントレート中の全活性成分の濃度は、通常、１０％〜９０％であり、そして流動性エマルションコンセントレート中では、７５％の濃さであることができる。本明細書中で用いる場合、用語「活性成分」は、殺真菌剤組成物全体、すなわち、相乗的な対真菌毒性効果に対して用いるピリダジノンと脂肪酸とを合せた量を称する。
【００３５】
噴霧用に適した水和剤配合物(wettable, powdered formulation)は、微粉固体、例えば、クレー、無機シリケート及びカーボネート、及びシリカと殺真菌剤化合物とを混合し、そして前記混合物中に湿潤剤、固着剤、及び／又は分散剤を混和することにより調製することができる。前記配合物中の全活性成分濃度は、通常、２０重量％〜９９重量％、好ましくは、４０％〜７５％である。典型的な水和剤は、ピリダジノン５０部、合成沈降水和二酸化ケイ素、例えば、商標Ｈｉ−ＳｉｌＲで販売されているもの、４５部、及びリグノスルホン酸ナトリウム５部をブレンドすることにより調製する。本発明の化合物から水和剤を調製するために、ピリダジノン５０部の代わりに、全活性成分（ピリダジノン及び脂肪酸、塩、又はエステル）５０部を用いることができる。別の調製において、前記水和剤中でＨｉ−Ｓｉｌの代わりにカオリン型（バーデン(Barden)）クレーを用い、そして別の前記調製において、Ｈｉ−Ｓｉｌの２５％を、商標ゼオレックス(Zeolex)．ＲＴＭ．７（ジェイ．エム．ハーバー社(J.M.Huber Corporation)）で販売されている合成ナトリウムシリコアルミネート(sodium silicoaluminate)で置き換える。
【００３６】
散粉(dusting)配合物は、特性上、有機又は無機であることができる微粉不活性固体と殺真菌剤化合物とを混合することによって調製する。この目的に対して有用な材料は、植物性粉末(botanical flour)、シリカ、シリケート、カーボネート及びクレーを含む。粉剤を調製する一つの常法は、微粉担体で水和剤を希釈することである。活性成分２０％〜８０％を含有する粉剤配合物又はコンセントレートが一般に調製されそしてその後に１％〜１０％使用濃度まで希釈される。
【００３７】
殺真菌剤化合物及び配合物は、一般に用いられる方法、例えば、通常の高ガロン量液圧(hydraulic)噴霧、低ガロン量噴霧、エアブラスト(air-blast)噴霧、空中噴霧及び吐粉(dust)によって殺真菌剤噴霧として付与することができる。希釈及び付与率は、用いる装置のタイプ、付与方法、処理すべき植物及び制御すべき疾病に依存する。一般に、本発明の化合物は、１ヘクタール当り活性成分０．０６〜６０キログラム（ｋｇ）、そして好ましくは、１ヘクタール当り活性成分１〜２８ｋｇの量で付与される。
【００３８】
種子保護剤として、殺真菌剤配合物を、種子上に塗布することができる。通常の投与率は、種子１００ポンド当り「活性成分」０．０５オンスから、種子１００ポンド当り２０オンスまで、好ましくは、種子１００ポンド当り０．０５〜４オンス、そしてより好ましくは、種子１００ポンド当り０．１〜１オンスである。土壌殺真菌剤として、本発明の殺真菌剤配合物を、通常、１ヘクタール当り０．０２〜２０ｋｇ、好ましくは、１ヘクタール当り０．０５〜１０ｋｇ、そしてより好ましくは、１ヘクタール当り０．１〜５ｋｇの率で土壌中に混入し又は表面に付与することができる。葉面殺真菌剤として、本発明の殺真菌剤配合物を、１ヘクタール当り０．０１〜１０ｋｇ、好ましくは、１ヘクタール当り０．０２〜６ｋｇ、そしてより好ましくは、１ヘクタール当り０．３〜１．５ｋｇの率で、栽培植物に付与することができる。
【００３９】
本発明の殺真菌剤化合物（Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤）を、他の公知の殺真菌剤Δ−９脂肪酸デサチュラーゼ阻害剤と組み合わせて広範囲の活性を提供することができる。本発明の殺真菌剤化合物と組み合わせて用いるのに適した殺真菌剤は、限定的でなく、米国特許５，２５２，５９４中に挙げられた化合物（特に、カラム１４及び１５を参照）を含む。
【００４０】
哺乳動物用の殺真菌剤配合物は、米国特許６，１０７，３１６及び６，１４０，３６２に記載のように調製する。本発明の方法を用いて、ヒト、家畜、例えば、ウシ、ブタ及び家禽を含む動物の体表又は体内の真菌により引き起こされた疾病を処理することができる。処理すべき状態に対して適切な何れかの手段により、動物に殺真菌剤配合物の薬剤学的に許容することができる量を投与する。
【００４１】
薬剤学的用途に対して、薬剤学的に許容することができる担体、例えば、液剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、エリキシル及び注射可能な組成物中に本明細書中に記載の化合物を取り込むことができる。薬剤学的製剤は、０．１重量％〜９９重量％の活性成分を含んでいることができる。単一投与量型である「単位投与量型」の製剤は、好ましくは、２０％〜９０％の活性成分を含み、そして単一投与量型でない製剤は、好ましくは、５％〜２０％の活性成分を含む。本明細書中で用いる場合、用語「活性成分」は、本明細書中に記載の化合物、その塩、及び他の薬剤学的に活性な化合物と本明細書中に記載の化合物との混合物を称する。投与単位型、例えば、錠剤又はカプセル剤は、典型的には、約０．０５〜約１．０ｇの活性成分を含む。
【００４２】
薬剤学的製剤を投与するのに適切な手段は、経口、直腸、局所的（皮膚、頬及び舌下を含む）、膣、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮膚内、鞘内及び硬膜外を含む）及び鼻胃管(naso-gastric tube)によるものを含む。好ましい投与経路は、処理すべき状態に依存するものでありそして因子、例えば、レシピエントの状態と共に変化することがあることは、当業者に理解されるであろう。
【００４３】
本発明の方法によれば、本明細書中に記載の有効な化合物は、単独で又は他の薬剤学的に活性な化合物と共に投与することができる。本明細書中に記載の化合物と組み合わせて用いられる薬剤学的に活性な化合物が、レシピエントへの悪影響又は化合物間の望ましくない相互作用を避けるように選択されることは当業者に理解されよう。本明細書中で用いる場合、用語「活性成分」は、単独で又は追加の薬剤学的に活性な化合物１種類以上と組み合わせて用いる場合の本明細書中に記載の化合物を含むことを意味する。
【００４４】
基材上での増殖を制御するための又は或る場所に付与されるための殺真菌剤配合物は、米国特許５，２９２，７６３及び５，４６８，７５９に記載のように調製する。本発明の殺真菌剤配合物の重要な用途として、限定的でなく、水性塗料及びコーティング、接着剤、シーラント、ラッテクスエマルション、及び目地セメント(joint cement)中での真菌の増殖の阻害；木材の防腐；切削液(cutting fluid)の防腐、パルプ製紙工場(pulp and paper mill)及び冷却塔(cooling tower)におけるスライム形成性真菌の制御；カビ(mold)増殖を防止するための布(textile)及び革(leather)用の噴霧又は浸漬処理として；塗膜の風化の間に生じる真菌による作用からの塗膜、特に、外面塗料(exterior paint)の保護；甘蔗糖及びビート糖の製造の間におけるスライム付着物(slime deposit)からの処理装置の保護；空気清浄器(air washer)又はスクラバーシステム(scrubber system)及び工業用清水供給系における微生物の蓄積(buildup)及び堆積(deposit)の防止；燃料の防腐；油田堀穿泥水及び二次石油回収プロセスにおける微生物汚染及び堆積の制御；紙用塗料(paper coating)及び塗被プロセスにおける真菌増殖の防止；種々の特殊板紙(specialty board)、例えば、厚紙(cardboard)及びパーティクルボードの製造の間における真菌の増殖及び堆積の制御；様々な種類の新たに切られた木材における辺材変色(sap stain discoloration)の防止；種々のタイプのクレー及び顔料スラリーにおける真菌増殖の制御；壁、床などにおける真菌の増殖を防止するための硬面の消毒剤(hard surface disinfectant)として；化粧品及び洗面用品(toiletry product)、床磨き剤、織物柔軟剤、家庭用品及び工業製品に対する、及び藻類増殖を防止するためのスイミングプールにおける防腐剤として；植物、樹木、果実、種子又は土壌における有害な酵母及び真菌の増殖の阻害；農業製剤(agricultural formulation)、電着系、診断及び試薬製品、医療用具の防腐；微生物の蓄積に対する動物浸液(animal dip)組成物の保護、及び写真処理における微生物の蓄積の防止など、を挙げることができる。
【００４５】
本発明の殺真菌剤化合物及び配合物は、限定的でなく、木材防腐剤、革防腐剤及び船舶の防汚剤(anti-foulant)を含む殺菌用途も有する。従って、本発明は、木材防腐剤及び船舶の防汚剤としての開示組成物の用途も包含する。
【実施例】
【００４６】
本発明を以下の実施例において説明する。
【００４７】
《実施例１》
マウスのカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)感染の化合物１による制御
カンジダ・アルビカンス（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション菌株１０２３１）を用いた静脈内接種の１時間前及び接種後４時間、２４時間、４８時間及び７２時間の時点で、生理的食塩水溶液中５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の化合物１〔欧州特許公開公報ＥＰ４７８１９５Ａ１中の化合物１０９に記載の、６−（４−クロロフェニル）−２−（２’−ペンチニル）ピリダジノン〕を腹腔内に投与した。各処理に対して、１０匹のマウスを用いた。１０日間にわたり死亡率を記録した。
【００４８】
表１に示すように、化合物１はマウスのカンジダ・アルビカンス感染の有効な阻害剤であることが見出された。
【００４９】
表１：マウスのカンジダ・アルビカンス感染の化合物１による制御

処理                投与量（ｍｇ／ｋｇ）  生存率％  
担体  対照                                  １０
化合物１                  １００            ５０
３０            ４０
１０            ２０
アンホテリシンＢ            １０          １００    
【００５０】
《実施例２》
真菌及び哺乳動物のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの活性への化合物１の影響
下記方法を用いて酵母からミクロソームΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを調製した。それぞれにグルコース−イースト抽出物培地(glucose-yeast extract medium)（イースト抽出物０．４％及びグルコース２％）１００ｍＬを含む２５０ｍＬ容フラスコ２個に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手したサッカロミセス・セレヴィシエ菌株１２３４１を接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４８時間増殖させた。この細胞を用いて、培地３．６リットルを含む４Ｌ容フラスコに接種した。９０ｒｐｍで緩やかに振盪しながら３０℃で２４時間、細胞を増殖させた。４℃において、２，５００×Ｇで５分間、細胞を遠心分離し、その細胞ペレットを氷冷水中での懸濁によって２回洗浄しそして再度遠心分離し、次いで、同じ容量の冷０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２中に再懸濁させた。フレンチプレス(French press)において出力圧１８，０００ｐｓｉでホモジネートすることにより細胞を溶解し、そしてそのホモジネートを４℃において８，０００×Ｇで２０分間遠心分離した。その上澄みをガラスウールの栓を通して濾過して浮遊する脂質層を除去し、そして次に、４℃において１００，０００×Ｇで９０分間遠心分離し、そして得られたミクロソームペレットを、ダンス(Dounce)ホモジナイザーを用いて、氷冷０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍＬ中に再懸濁させてタンパク質濃度約１０ｍｇ／ｍＬを得た。この調製物をドライアイス／メタノール中のアリコートとして凍結しそして−８０℃で保存した。
【００５１】
下記の方法を用いて、ラット肝臓からミクロソームΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを調製した。体重１２０〜１８０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをプリナ・ラボラトリー固形飼料(Purina laboratory chow)で飼育し、４８時間絶食させ、次いで「ファット・フリー(Fat Free)」試験食（ニュートリショナル・バイオケミカル社(Nutritional Biochemical Corporation)）で２０時間飼育した。肝臓を取り出し、そして０．２５Ｍショ糖及び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含有する冷１０ｍｍトリス−酢酸(Tris-acetate)緩衝液、ｐＨ８．１中に入れた。この組織を１０容量の冷緩衝液で２回洗浄し、吸い取り乾燥して(blotted dry)秤量した。この組織を細かく切り刻み、そして隙間嵌め(loose-fitting)テフロン製乳棒(pestle)を有するガラス製ホモジナイザーを用いて組織１ｇ当り緩衝液５ｍＬ中でホモジネートした。このホモジネートを１８，０００×Ｇで１５分間、２回遠心分離し、毎回遠心分離後にペレットを捨てた。上澄みを１２０，０００×Ｇで３０分間遠心分離して、２層を持つペレットを得た。上のゼラチン状の層がミクロソーム画分であり、一方、下層はグリコーゲンからなる。０．５Ｍ−ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．１）中に、ミクロソーム層を注意深く再懸濁させ、そして再度、１２０，０００ｇで３０分間遠心分離した。ダンス・ホモジナイザーを用いて、０．１Ｍトリス−酢酸緩衝液、ｐＨ８．１中にこのペレットを再懸濁させてタンパク質濃度約１０ｍｇ／ｍＬを得、これをドライアイス／メタノール中のアリコートとして凍結しそして−８０℃で保存した。
【００５２】
１３×１００ｍｍガラス製培養試験管中の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２、１ｍＭ−ＮＡＤＨ及び２６μＭ14Ｃ−パルミトイル−ＣｏＡ（０．０２８μＣｉ／アッセイ）を含有する０．５ｍＬ反応混合物を用いて、14Ｃ−パルミトイル−ＣｏＡのパルミトレイン酸への不飽和化を測定することにより、Δ−９脂肪酸デサチュラーゼアッセイを実施した。化合物１を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の溶液５μＭとして添加し、そして連続的に２倍希釈して試験した。氷上の培養試験管に試薬を添加し、そしてミクロソーム酵素調製物（０．２ｍｇタンパク質）を最後に添加した。試験管を３０℃において５分間２００ｒｐｍで激しく振盪させながら培養し、次いでメタノール／水（９０：１０、ｖ／ｖ）中１０％水酸化カリウム０．５ｍＬを添加することにより反応を停止させた。試験管に蓋をし、８０℃で３０分間加熱することにより鹸化した。各試験管に６Ｍ−ＨＣｌ（０．５ｍＬ）、続いてシクロヘキサン０．５ｍＬを添加した。試験管を激しく混合しそして２，０００ｒｐｍで短時間遠心分離して相分離を促進させた。上のシクロヘキサン層を取り出しそして１００μＬを、移動相としてメタノール−水−リン酸（９０：９．９：０．１、容量による）を流量１ｍＬ／分で用いたスペルコシル(Supelcosil)ＬＣ−１８カラム（２５×４．６ｍｍ）上でのＨＰＬＣによって分析した。パッカード(Packard)Ａ１２０ＲＡＭ検出器を用いて、パルミチン酸及びパルミトレイン酸画分中の放射能の量を測定した。化合物１を含有するアッセイにおけるパルミトレイン酸の産生をＤＭＳＯのみを含有するアッセイにおける産生とを比較することによって、不飽和化の阻害百分率を算出した。５０％までパルミトレイン酸の産生を阻害した化合物１の濃度を、用量−反応曲線から求めた。
【００５３】
表２のデータは、化合物１が真菌Δ−９脂肪酸デサチュラーゼの強力な阻害剤であるが哺乳動物のΔ−９脂肪酸デサチュラーゼを阻害しないことを明確に示している。
【００５４】
表２： 酵母及びラット肝臓Δ−９脂肪酸デサチュラーゼに対する化合物１の効力

酵  母            ラット肝臓
デサチュラーゼ        デサチュラーゼ
ＥＣ５０（ｐｐｍ）    ＥＣ５０（ｐｐｍ）
０．０５５            ＞  １００      
【００５５】
《実施例３》
化合物１及びセルレニンの対真菌毒性への脂肪酸の影響
２５０ｍＬ容三角フラスコ中のＹＰＧ培地（水１Ｌ当りイースト抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇ）５０ｍＬに、サッカロミセス・セレヴィシエ（菌株Ｘ２１８０−１Ａ）を接種して７００ｎｍでの吸光度０．０２を得た。この培養物を、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１８時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を集め、ＳＤ培地（水１Ｌ当りバクト−イースト(Bacto-yeast)窒素塩基６．７ｇ及びグルコース２０ｇ）で１回洗浄し、そしてＳＤ培地中に懸濁させて７００ｎｍでの吸光度０．０４を得た。細胞懸濁液のアリコート（５ｍＬ）を２０ｍＬ容ガラス製バイアル中に分配した。化合物１又はセルレニンを含有する処理は、それぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中化合物２４０ｐｐｍ又は１６０ｐｐｍの溶液２５μＬを受けた。化合物１又はセルレニンを含まない対照処理は、２５μＬ−ＤＭＳＯを受けた。脂肪酸を含有する処理は、濃度１０μＭを与えるトリトン(Triton)Ｘ−１００の１％溶液中の脂肪酸の２ｍＭ溶液２５μＬを受けた。脂肪酸を含まない処理は、２５μＬの１％トリトンＸ−１００を受けた。全ての処理は、２連で実施した。バイアルは、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２２時間インキュベートした。次いで、ＳＤ培地を用いて各処理の細胞を３倍に希釈しそして７００ｎｍでの吸光度を測定することにより、細胞の増殖を評価した。表３の結果は、化合物１、セルレニン又は脂肪酸を欠くがトリトンＸ−１００を含有するＤＭＳＯ対照における増殖の百分率として表した増殖の阻害を示している。
【００５６】
表３のデータは、化合物１の対真菌毒性が不飽和脂肪酸（オレイン酸及びパルミトレイン酸）により低減するが飽和脂肪酸（ペンタデカン酸及びパルミチン酸）によっては低減しないことを示している。対照的に、脂肪酸シンテターゼと呼ばれる脂肪酸生合成に関与した別の酵素を阻害するセルレニンの対真菌毒性は、不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸の何れによっても低減する。本発明者らは、不飽和脂肪酸の存在下で低減するが飽和脂肪酸の存在下では低減しない対真菌毒性を示す化合物をスクリーニングすることによってΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤を同定することができることを証明する。更に、本発明のアプローチにより、脂肪酸生合成に関与する他の酵素の阻害剤からΔ−９脂肪酸デサチュラーゼの阻害剤を識別することができる。
【００５７】
表３：化合物１及びセルレニンの対真菌毒性への脂肪酸の影響

脂肪酸              阻害％        阻害％
化合物１      セルレニン
（１．２ppm） （０．８ppm）
なし                ７６．９      ３５．６
オレイン酸          １８．７        ３．３
パルミトレイン酸    ２１．８        ４．５
パルミチン酸        ９５．５      １５．２
ペンタデカン酸      ９６．７      ２０．３  
【００５８】
《実施例４》
化合物１を用いた処理後のサッカロミセス・セレヴィシエの脂肪酸組成の分析
化合物１の非存在下（対照）及び存在下に、実施例３に記載のように２０ｍＬ容ガラス製バイアル中で細胞懸濁液のアリコート５ｍＬとしてＳＤ培地中でサッカロミセス・セレヴィシエを増殖させた。化合物１はＤＭＳＯ中の溶液２５μＬとして添加し、そして対照は２５μＬＤＭＳＯのみを受けた。２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１８時間増殖させた後、実施例３に記載のように化合物１による増殖の阻害を測定し、そして脂肪酸組成を以下のように測定した。２０ｍＬ容ケイホウ酸ガラス製培養試験管中で細胞を２０００ｒｐｍで遠心分離した。その上澄みをデカントし、そして細胞を水１０ｍＬ中に再懸濁させ、そして２０００ｒｐｍで再度遠心分離した。その上澄みをデカントし、そして９０％メタノール／１０％水中の１０％水酸化カリウム溶液２．５ｍＬ中で８０℃において１時間加熱することにより細胞を鹸化した。２×３ｍＬのシクロヘキサンを用いて塩基性溶液を抽出することにより非鹸化性脂質を除去した。次いで、６Ｎ塩酸を用いて塩基性溶液をｐＨ２まで酸性にし、そして２×３ｍＬのシクロヘキサンを用いてこの酸性溶液を再度抽出した。レステック・スタビルワックス(Restek Stabilwax)ＤＢキャピラリーカラム（３０ｍ×直径０．５３ｍｍ×膜厚０．２５μｍ）を備えたＨＰ５８９０ガスクロマトグラフ及び水素炎イオン化検出器を用いたキャピラリーガスクロマトグラフィーによって、これらの抽出物を直接に分析した。分析は２２５℃で恒温で実施し、そしてシグマ(Sigma)から購入した真正な(authentic)標品から調製したサンプルの遊離脂肪酸混合物と比較した。表４に示した結果は、不飽和脂肪酸（パルミトレイン酸及びオレイン酸）の量が大きく低減したのに対して、飽和脂肪酸（パルミチン酸及びステアリン酸）は比較的影響を受けていないことを示している。
【００５９】
表４．サッカロミセス・セレヴィシエの脂肪酸組成及び増殖への化合物１の影響
【表１】
2005529605.tif 000002
a細胞乾燥重量１ミリグラム当りの脂肪酸ミリグラム
【国際調査報告】
2005529605.tif 000003