(57)【要約】（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞よりなる群から選択される物質を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の、神経変性を防止または阻止するための、または神経再生を促進するための、またはグルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護するための、方法と組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤学的に許容される担体と、（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞よりなる群から選択される物質とを含む医薬組成物。
【請求項２】
物質はポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒである、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
物質はポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されている、請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞、関連する供与者またはＨＬＡが一致しているかもしくは部分的に一致している半同種異系のまたは完全に同種異系供与者から得られる同種異系Ｔ細胞である、請求項３の医薬組成物。
【請求項５】
Ｔ細胞は自己Ｔ細胞である、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
Ｔ細胞は半同種異系Ｔ細胞である、請求項４の医薬組成物。
【請求項７】
自己Ｔ細胞または半同種異系Ｔ細胞は、保存したＴ細胞から得られる、請求項５または６の医薬組成物。
【請求項８】
中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の神経変性を防止または阻止するための、ＣＮＳまたはＰＮＳの神経再生を促進するための、またはグルタミン酸毒性からＣＮＳまたはＰＮＳ細胞を保護するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
神経変性を防止または阻止するためにＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するための、または神経再生を促進するための、またはグルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化するＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するための、請求項８の医薬組成物。
【請求項１０】
損傷、障害または疾患は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通性外傷、脳衝撃、対側衝撃、出血性発作、または虚血性発作である、請求項９の医薬組成物。
【請求項１１】
損傷は脊髄損傷である、請求項１０の医薬組成物。
【請求項１２】
損傷、障害または疾患は、アルツハイマー病を含む老人性痴呆、パーキンソン病を含むパーキンソン症候群、顔面神経（ベル）まひ、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症を含む運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病を含むプリオン病、アルパーズ病、バッテン病、コケーン症候群、レーヴィ小体疾患、発作重積状態、手根管症候群、椎間円板ヘルニア、ビタミン欠乏、てんかん、健忘症、不安症、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、アヘン剤寛容と依存症、自己免疫疾患、またはアミロイド多発性神経炎のような疾患に関連する末梢血神経障害、糖尿病性ニューロパシー、尿毒症性ニューロパシー、ポルフィリン症性多発性ニューロパシー、低血糖症、シェーグレン・ラルソン症候群、急性感覚ニューロパシー、慢性失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性多血症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン血症、種々の薬剤（ニトロフラントイン、メトロニダゾール、イソニアジド、およびアルコールもしくは有機リン酸塩のような毒素）の合併症、シャルコー‐マリー‐ツース症候群、血管拡張性失調症、フリートライヒ運動失調、副腎脊髄神経障害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリ病、またはリポタンパク質血漿である、請求項９の医薬組成物。
【請求項１３】
損傷、障害または疾患は、眼が関連し、視神経症、年齢関連黄斑変性、網膜障害（例えば、網膜変性）、または異常に上昇した眼圧に関連する疾患である、請求項９の医薬組成物。
【請求項１４】
異常に上昇した眼圧に関連する疾患は緑内障である、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒは、個体の能動免疫を促進して、決定的に重要なＴ細胞応答を上昇させるように投与される、請求項２の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物の調製のための、（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞から選択される物質の使用。
【請求項１７】
医薬組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の神経変性を防止または阻止するため、ＣＮＳまたはＰＮＳの神経再生を促進するため、グルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護するため、またはグルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化する損傷、障害または疾患を治療するためである、請求項１６の使用。
【請求項１８】
医薬組成物は、神経変性を防止または阻止するためにＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するため、または神経再生を促進するため、またはグルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化するＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するためである、請求項１７の使用。
【請求項１９】
損傷、障害または疾患は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通性外傷、脳衝撃、対側衝撃、出血性発作、または虚血性発作である、請求項１８の使用。
【請求項２０】
損傷は脊髄損傷である、請求項１９の使用。
【請求項２１】
損傷、障害または疾患は、アルツハイマー病を含む老人性痴呆、パーキンソン病を含むパーキンソン症候群、顔面神経（ベル）まひ、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症を含む運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病を含むプリオン病、アルパーズ病、バッテン病、コケーン症候群、レーヴィ小体疾患、発作重積状態、手根管症候群、椎間円板ヘルニア、ビタミン欠乏、てんかん、健忘症、不安症、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、アヘン剤寛容と依存症、自己免疫疾患、またはアミロイド多発性神経炎のような疾患に関連する末梢血神経障害、糖尿病性ニューロパシー、尿毒症性ニューロパシー、ポルフィリン症性多発性ニューロパシー、低血糖症、シェーグレン・ラルソン症候群、急性感覚ニューロパシー、慢性失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性多血症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン血症、種々の薬剤（ニトロフラントイン、メトロニダゾール、イソニアジド、およびアルコールもしくは有機リン酸塩のような毒素）の合併症、シャルコー‐マリー‐ツース症候群、血管拡張性失調症、フリートライヒ運動失調、副腎脊髄神経障害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリ病、またはリポタンパク質血漿である、請求項１８の使用。
【請求項２２】
損傷、障害または疾患は、眼が関連し、視神経症、年齢関連黄斑変性、網膜障害（例えば、網膜変性）、または異常に上昇した眼圧に関連する疾患である、請求項１８の使用。
【請求項２３】
異常に上昇した眼圧に関連する疾患は緑内障である、請求項２２の医薬組成物。
【請求項２４】
中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の神経変性を防止または阻止するための、または神経再生を促進するための、またはグルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞およびＰＮＳ細胞を保護するための方法であって、必要な個体に（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞、またはこれらの組合せよりなる群から選択される物質の有効量を投与することを含む、上記方法。
【請求項２５】
中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の損傷、障害または疾患の治療のための、請求項２４の方法。
【請求項２６】
損傷、障害または疾患は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通性外傷、脳衝撃、対側衝撃、出血性発作、または虚血性発作である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
損傷は脊髄損傷である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
損傷、障害または疾患は、アルツハイマー病を含む老人性痴呆、パーキンソン病を含むパーキンソン症候群、顔面神経（ベル）まひ、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症を含む運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病を含むプリオン病、アルパーズ病、バッテン病、コケーン症候群、レーヴィ小体疾患、発作重積状態、手根管症候群、椎間円板ヘルニア、ビタミン欠乏、てんかん、健忘症、不安症、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、アヘン剤寛容と依存症、自己免疫疾患、またはアミロイド多発性神経炎のような疾患に関連する末梢血神経障害、糖尿病性ニューロパシー、尿毒症性ニューロパシー、ポルフィリン症性多発性ニューロパシー、低血糖症、シェーグレン・ラルソン症候群、急性感覚ニューロパシー、慢性失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性多血症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン血症、種々の薬剤（ニトロフラントイン、メトロニダゾール、イソニアジド、およびアルコールもしくは有機リン酸塩のような毒素）の合併症、シャルコー‐マリー‐ツース症候群、血管拡張性失調症、フリートライヒ運動失調、副腎脊髄神経障害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリ病、またはリポタンパク質血漿である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
損傷、障害または疾患は、眼が関連し、視神経症、年齢関連黄斑変性、網膜障害（例えば、網膜変性）、または異常に上昇した眼圧に関連する疾患である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
異常に上昇した眼圧に関連する疾患は緑内障である、請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、神経系（ＮＳ）の損傷、障害または疾患の作用を改善するための、神経再生の促進または神経変性の防止もしくは阻止のための組成物と方法に関する。特に本発明は、グルタミン酸毒性から中枢神経系（ＣＮＳ）細胞を保護するための、神経再生を促進するための、またはヒト被験体のＣＮＳもしくは末梢神経系（ＰＮＳ）内の神経の損傷もしくは疾患により引き起こされる神経変性を防止または阻止するための、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび／またはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒで処理した活性化Ｔ細胞を含む組成物に関する。本発明の組成物は、単独でまたは場合により任意の所望の組合せで投与される。
【０００２】
略語：ＣＦＡ：完全フロイントアジュバント；ＣＮＳ：中枢神経系；ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質；ＭＨＣ：主要組織適合遺伝子複合体；ＮＳ：神経系；ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水；ｐＥＹ：ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ；ＰＮＳ：末梢神経系；ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ：共重合体ポリ−Ｇｌｕ50，Ｔｙｒ50、Ｌ−グルタミン酸とＬ−チロシンのヘテロ共重合体；ＲＧＣ：網膜神経節細胞。
【０００３】
（発明の背景）
神経系は、中枢神経系（ＣＮＳ）と末梢神経系（ＰＮＳ）からなる。ＣＮＳは、脳脊髄と視覚系からなり、ＰＮＳは、他のすべての神経成分、すなわち脳と脊髄以外の神経と神経節からなる。
神経系への傷害は、外傷性損傷（例えば、穿通性外傷または鈍的外傷）、または疾患または障害（特に限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＣ）、糖尿病性神経症、老人性痴呆、卒中および虚血を含む）により引き起こされる。
【０００４】
ＣＮＳの完全性の維持は複雑な「バランス作用」であり、免疫系との妥協に遭遇する。多くの組織では、保護、修復および治癒に免疫系が基本的な役割を果たす。ＣＮＳでは、そのユニークな免疫優先のために、免疫反応は比較的限定される。哺乳動物ＣＮＳが損傷後に機能快復できないことは、傷害組織と免疫系との間の有効ではない対話を反映することを示す証拠が増えている。例えば、ＣＮＳと血液由来のマクロファージの間の限定された伝達は、軸索切断された軸索が再増殖する能力に影響を与えるが、活性化されたマクロファージの移植はＣＮＳ再増殖を促進することができる。
【０００５】
活性化Ｔ細胞は、その抗原特異性に無関係にＣＮＳ実質中に入ることが証明されているが、ＣＮＳ抗原と反応することができるＴ細胞のみがそこに存続するようである（ヒッケイ（Ｈｉｃｋｅｙ）ら、１９９１）。ＣＮＳ白質の抗原（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））に反応性のＴ細胞は、投薬経験の無い受容体ラットへの接種の数日以内に麻痺性疾患である実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導することができる（ベン−ヌン（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ）、１９８１）。抗ＭＢＰ  Ｔ細胞はまた、ヒト疾患である多発性硬化症に関与しているかも知れない（オータ（Ｏｔａ）ら、１９９０）。しかし、その病原性の可能性にもかかわらず、抗ＭＢＰ  Ｔ細胞クローンが、健常被験体の免疫系中に存在する（ペッテ（Ｐｅｔｔｅ）ら、１９９０）。無傷のＣＮＳを通常巡視する活性化Ｔ細胞は、ＣＮＳ白質病変の部位に一過性に蓄積する（ヒルシュバーグ（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）ら、１９９８）。
【０００６】
ＣＮＳ損傷の破滅的な結果は、初期損傷により見かけ上傷害されていないかまたはわずかに傷害されている隣接ニューロンの漸進的な２次喪失により、しばしば複雑になる（マキントッシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）、１９９３）。１次病変は、細胞外イオン濃度の変化、フリーラジカルの量の増加、神経伝達物質の放出、増殖因子の枯渇、および局所的炎症を引き起こす。これらの変化は、最初は１次損傷を免れた隣接ニューロンの破壊的イベントのカスケードを引き起こす（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、１９９４）。この２次傷害は、電圧依存性またはアゴニストゲーティッドチャネルの活性化、イオンリーク、カルシウム依存性酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼおよびヌクレアーゼ）の活性化、ミトコンドリア機能不全、およびエネルギー枯渇により仲介され、神経細胞の死滅に至る。１次損傷により直接引き起こされる喪失以上のニューロンの広範な喪失は、「２次変性」と呼ばれる。
【０００７】
１次危険因子が除去または弱められた時でも疾患の自己拡散を仲介する最も一般的なメディエーターの１つは、グルタミン酸（２重活性を示すことができる励起アミノ酸）である：これは、正常なＣＮＳにおいて基本的神経伝達物質として機能して重要な役割を果たすが、その生理学的レベルを越えると毒性になる。グルタミン酸の増加が、多くのＣＮＳ障害で報告されている。励起毒性化合物としてのその役割で、グルタミン酸は、急性および慢性（緑内障の視神経変性を含む）の変性障害の毒性の最も一般的なメディエーターの１つである（ピット（Ｐｉｔｔ）ら、２０００）。内因性グルタミン酸は、てんかん重積状態、脳虚血または外傷性脳損傷後に急性に発生する脳傷害の原因であるとされている。内因性グルタミン酸はまた、筋萎縮性側策硬化症やハンチントン舞踏病のような疾患の慢性神経変性の原因でもある。
【０００８】
局所作用性薬剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト）を使用して、グルタミン酸の細胞障害性作用を弱めるために、徹底した研究が行われている。ヒトでは、そのような化合物は、向精神性作用および他の副作用を有し、これがこれらを治療薬として不適切なものにしている。さらに、グルタミン酸の毒性作用の中和は、遍在性のＣＮＳ神経伝達物質としてのその機能を妨害するため、このタイプの従来の治療法は不満足なことがしばしばある。グルタミン酸活性は正常な生理学的機能に必須であるが、急性損傷後またはＣＮＳ疾患で破壊的になる可能性があるため、その有害作用を中和する試みは、体の他の部位でその必須の活性をなくすことは避けるべきである。
【０００９】
ＣＮＳ損傷の他の悲劇的な結末は、哺乳動物ＣＮＳのニューロンが、損傷後に自然の再生を受けないことである。すなわち、ＣＮＳ損傷は、運動機能と感覚機能の永久的な障害を引き起こす。
【００１０】
脊髄病変は、損傷の重症度に無関係に、まず完全な機能まひ（脊髄ショックとして知られている）を引き起こす。脊髄ショックからのある程度の自然の回復も観察され、損傷の数日後に開始して、３〜４週間以内に弱まっていく。損傷が軽いほど、機能的な結果はよくなる。回復の程度は、最初に傷害を受けなかった組織の量から２次変性による喪失を引いたものの関数である。損傷からの回復は、２次変性を低下させる神経保護治療法により改善されるであろう。例えば、グルタミン酸の作用の緩和は、しばしば神経保護薬物の開発の標的となる。この目的に開発されている薬物には、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）−受容体またはアルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）−受容体アンタゴニストがある。これらの薬物は、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体（これらは、正常なＣＮＳ活性に決定的に重要である）の機能を妨害するため、必ず重症の副作用がある。最もよく研究されているＮＭＤＡ−受容体アンタゴニストの１つはＭＫ８０１であり、これは、有効な神経保護を提供するが重症の副作用を有する。脳虚血と外傷性脳損傷の動物モデルにおいて、ＮＭＤＡとＡＭＰＡ受容体アンタゴニストは急性脳傷害や遅延行動欠陥から保護する。そのような化合物はヒトで試験中であるが、治療効果はまだ確立していない。グルタミン酸伝達に作用する薬物に応答する他の臨床症状には、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、および精神病がある（メルドラム（Ｍｅｌｄｒｕｍ）、２０００）。
【００１１】
本発明者らの実験室では最近、患者のＮＳの抗原を認識する活性化Ｔ細胞が神経保護を付与することが発見された。米国特許出願第０９／２１８，２７７号と０９／３１４，１６１号とＰＣＴ公報ＷＯ９９／６００２１号を参照されたい（これらの完全な内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。さらに詳しくは、ＭＢＰに反応性のＴ細胞は、部分的に破砕した視神経（モアレム（Ｍｏａｌｅｍ）ら、１９９９も参照）および脊髄損傷（ハウベン（Ｈａｕｂｅｎ）ら、２０００も参照）のラットモデルで神経保護性であることが証明された。最近まで、免疫細胞はＮＳ修復に参加しないと考えられていた。さらに、ＣＮＳ傷害における免疫活性は従来、回復にとって有害であると考えられてきた。ＮＳ特異的活性化Ｔ細胞が、ＣＮＳまたはＰＮＳの損傷または疾患により引き起こされる傷害後に起きる２次変性から、神経系組織を保護するのに使用できることを発見したことは、大きな驚きである。そのようなＮＳ特異的活性化Ｔ細胞の作用機序は、まだ見つかっていないが、ＣＮＳ損傷部位での外因性に投与したＴ細胞の多量の蓄積が、損傷部位でのＴ細胞の存在が神経保護において顕著な役割を果たすことを示唆する。しかし、蓄積は必要な条件ではあるが、非自己抗原であるオボアルブミンに特異的なＴ細胞が部位に蓄積するが、神経保護作用は無いため、この目的には充分ではない（ヒルシュバーグ（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ）ら、１９９８）。
【００１２】
ＮＳ特異的活性化Ｔ細胞以外に、上記米国特許出願およびＰＣＴ公報ＷＯ９９／６００２１号は、ＮＳの損傷または疾患の作用の緩和のための治療法が、天然のまたは合成ＮＳ特異的抗原（例えば、ＭＡＧ、β−アミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、Ｐ２、神経伝達物質受容体、および好ましくはヒトＭＢＰ、ヒトプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびヒト乏突起神経膠芽細胞糖タンパク質（ＭＯＧ））を用いて、またはＮＳ特異的抗原から得られるペプチド（例えば、ＭＢＰのアミノ酸５１〜７０またはＭＯＧのアミノ酸３５〜５５を含むペプチド）を用いて行うことができることを開示する。
【００１３】
より最近は、本発明者らの実験室で、平均モル分率０．１４１、０．４２７、０．０９５および０．３３８を有するＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−ＬｙｓおよびＬ−Ｔｙｒ残基からなる高分子量合成塩基性ランダム共重合体［コポリマー１またはＣｏｐ１と呼ばれ、多発性硬化症の治療薬であるコパキソン（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）（登録商標）（テバファーマシューチカルズ社（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｔｄ．）、イスラエル）の活性成分である］は、ＣＮＳまたはＰＮＳで、神経変性を防止または阻止することができるか、または神経再生を促進することができ、ならびにグルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護することができることが発見された。米国特許出願第０９／４８７，７９３号、０９／６２０，２１６号、および０９／７６５，６４４号、およびＰＣＴ公報ＷＯ０１／５２８７８号およびＷＯ０１／９３８９３号を参照されたい（これらの内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる）。さらに詳しくは、Ｃｏｐ１特異的活性化Ｔ細胞は、損傷を受けたニューロン組織と損傷を受けていないニューロン組織の両方で蓄積し、損傷を受けた視神経で、２次変性の破壊作用に対して保護性であることが証明され、Ｃｏｐ１を用いる免疫は、グルタミン酸毒性に対して保護することが証明された。
【００１４】
「経口寛容」を得るための自己抗原の経口投与が、種々の自己免疫疾患の治療のために開示されている。例えば、ＥＰ３５９７８３号は、多発性硬化症の治療のためのＭＢＰの経口投与を開示し、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９１／１２８１６号、ＷＯ９１／０８７６０号、およびＷＯ９２／０６７０４号は、種々の自己抗原を用いる経口寛容法を使用して他の自己免疫疾患を治療する方法を開示している。ミエリン抗原に対する自己免疫Ｔ細胞応答の抑制を達成するためのコポリマー１の摂取または吸入による多発性硬化症の治療が、ＰＣＴ公報ＷＯ９８／３０２２７号に開示されている。
【００１５】
以前はしばしばポリＧＴと呼ばれ以後はｐＥＹと呼ぶ共重合体ポリ−Ｇｌｕ５０，Ｔｙｒ５０は、平均長さ１００アミノ酸の、Ｌ−グルタミン酸とＬ−チロシンのランダムヘテロ共重合体であり、数種類のマウス株で強い免疫応答を誘発する能力を有する（ビドビック（Ｖｉｄｏｖｉｃ）ら、１９８５；ビドビック（Ｖｉｄｏｖｉｃ）とマジンガー（Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ）、１９８８）。２０年以上も前に、ｐＥＹに応答しない数種類の近交系ならびに類遺伝子性耐性株は、免疫原性担体（例えば、メチル化ウシ血清アルブミン（ＭＢＳＡ））と複合体を形成したｐＥＹにより刺激されると、特異的プラーク形成細胞（ＰＦＣ）応答を示すこと；ｐＥＹを用いるプレ免疫は、数種類のマウス株でｐＥＹ−ＭＢＳＡに対して寛容作用を有することが証明され、この寛容は、ｐＥＹでプライムした動物の脾細胞または胸腺細胞により正常な共通遺伝子受容体に移すことができた（デブレ（Ｄｅｂｒｅ）ら、１９７５）。さらに最近、ｐＥＹは、マウス表皮Ｖガンマ５／Ｖデルタ１−ＴＣＲ（＋）Ｔ細胞株を活性化することが証明された（セオ（Ｓｅｏ）ら、２００１）。これらのいずれの刊行物も、ｐＥＹの有用な生物活性、特に神経保護のためのｐＥＹの使用を記載も示唆もしていない。
【００１６】
この欄のすべての文献または本出願の他の部分の引用または記載は、そのような文献が本発明の利用可能な先行技術であることを認めるものではないと理解されたい。
【００１７】
（発明の要約）
本発明において、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよびポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞は、グルタミン酸毒性からおよび脊髄挫傷後の２次変性を受けることから、神経細胞を保護することができることがわかった。ＭＢＰに特異的なＴ細胞とポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒに特異的なＴ細胞の自発的な出現を、脊髄挫傷後のラットで調べた。さらに、グルタミン酸毒性または脊髄への機械的損傷により誘導される神経変性を弱めるために、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを用いる能動免疫を使用した。
【００１８】
すなわちある態様において本発明は、薬剤学的に許容される担体と、（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞よりなる群から選択される物質とを含む医薬組成物に関する。
本発明のある実施態様において、医薬組成物はポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを含む。別の実施態様において医薬組成物は、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞を含む。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、好ましくは自己Ｔ細胞でもよいが、関連する供与者またはＨＬＡが一致しているかもしくは部分的に一致している半同種異系のまたは完全に同種異系供与者から得られる同種異系Ｔ細胞も本発明に包含される。自己Ｔ細胞は、新鮮なＴ細胞または保存した自己Ｔ細胞から得られる細胞でもよい。
【００１９】
本発明の別の実施態様において医薬組成物は、ＣＮＳまたはＰＮＳにおいて、神経保護に、すなわち神経変性を防止または阻止するのに、または神経再生を促進するのに、特に、軸索傷害に至る、またはこれを伴うＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するのに有用である。
本発明のさらなる実施態様において医薬組成物は、グルタミン酸毒性からＣＮＳまたはＰＮＳ細胞を保護するのに、特に、グルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化するＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患を治療するのに有用である。
ある実施態様において、損傷、障害または疾患は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通性外傷、脳衝撃、対側衝撃、出血性発作、または虚血性発作を含む。ある好適な実施態様において、損傷は脊髄損傷である。
別の実施態様において、損傷、障害または疾患は、糖尿病性神経症、老人性痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベル）まひ、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＣ）、ビタミン欠乏、てんかん、健忘症、不安、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、またはアヘン剤寛容と依存症、および後述される他の障害と疾患を含む。
【００２０】
さらなる実施態様において、障害または疾患は眼が関連し、視神経症、年齢関連黄斑変性、網膜障害（例えば、網膜変性）、または異常に上昇した眼圧に関連する疾患（緑内障）を含む。ある好適な実施態様において、障害または疾患は緑内障である。
さらに別の実施態様において、損傷、障害または疾患は自己免疫疾患である。
別の態様において本発明は、医薬組成物の製造のための、（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞よりなる群から選択される物質の使用に関する。この医薬組成物は、上記した適応症に有用であろう。
【００２１】
さらなる態様において本発明は、ＣＮＳまたはＰＮＳの神経変性を防止または阻止するための、または神経再生を促進するための、またはグルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護するための方法であって、かかる方法が必要な個体に、（ａ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒおよび（ｂ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されているＴ細胞よりなる群から選択される物質の有効量を投与することを含む方法に関する。「有効量」とは本明細書において、ＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患の作用を改善するのに有効な量として定義される。
【００２２】
本明細書において用語「神経保護」は、１次危険因子が除去または弱められた後も持続する２次神経変性作用からの保護を含む、ＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患の変性作用の防止または阻止を意味する。これは、白質と灰白質の両方の保護を含む。
本明細書において用語「活性化Ｔ細胞」は、（ｉ）ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒへの暴露により活性化されているＴ細胞、および（ｉｉ）そのような活性化Ｔ細胞の子孫を含む。本明細書において「ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞」は、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒに対する特異性を有する活性化Ｔ細胞を意味する。
【００２３】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、神経再生を促進するために、あるいは１次ＮＳ損傷後の２次変性作用、または後述される疾患、障害または症状（特に限定されないが、緑内障、卒中、虚血、銃弾、および危険なスポーツによる脳傷害）により引き起こされる神経変性過程の作用を、防止または阻止するために使用される。
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、グルタミン酸毒性に対する発見された保護を考慮すると、ミエリン（白質）に関連する１次および２次危険因子のみでなく、神経細胞体自体（灰白質）に関連する１次および２次危険因子に対する神経保護を提供するように機能する。すなわち、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、本発明の目的に有用であることが期待される。
【００２４】
さらに、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒはグルタミン酸毒性から保護するため、これは、例えば制御細胞または制御物質を生成することにより、制御活性を有する必要がある。この制御活性を考慮すると、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒワクチン化およびポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、酸化ストレスにより引き起こされる傷害および神経細胞への他の傷害源から白質または灰白質を保護することが予測される。さらに、この制御活性のために、本発明はまた、自己免疫疾患から神経細胞を保護するのにも使用することができる。
本発明の医薬組成物は、Ｔ細胞をインビボまたはインビトロで活性化するのに有効な量である治療上有効量のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを含み、活性化Ｔ細胞は、ＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患の作用を阻止または改善する。
【００２５】
本発明の実施において、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞の投与を含む損傷、障害または疾患の作用の改善および治療法は、場合によりポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒと組合せてもよい。
さらにポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒの経口投与は、アジュバント中で投与されるポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒでプライムした後に、神経保護に有効なことがある。すなわち、経口ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒは、損傷直後の決定的に重要なＴ細胞応答を上昇させるために、好ましくはアジュバント中で、そのようなポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒの１次活性化後に、Ｔ細胞の活性を上昇させるのに使用することができる。
本発明の別の実施態様において、必要に応じて後の個体の神経保護治療のために、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ感作Ｔ細胞を保存するために細胞バンクを確立することができる。保存される細胞は、個体から得られる自己Ｔ細胞でもよい。あるいは、それぞれ最も一般的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ型のＴ細胞のバンクが存在するように、同種異系または半同種異系Ｔ細胞を保存してもよい。
患者の損傷が治療される場合、好ましくは自己保存Ｔ細胞が使用されるが、もし自己Ｔ細胞が利用可能ではないなら、患者とＭＨＣＩＩ型を共有する個体の細胞を使用することができ、これらの細胞はこの患者で機能すると予測される。
【００２６】
細胞は、好ましくはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒへの暴露後の活性化状態で保存される。しかし細胞はまた、休止状態および融解され使用の準備がされた活性化状態で保存してもよい。バンクの細胞株は、好ましくは低温保存される。細胞株は、当該分野で公知の任意の方法で調製される。いったん細胞が融解されると、これらは好ましくは、非生存細胞を除去するために、注入前に培養される。この培養の間、細胞は、本来の活性化で使用されるようにポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ抗原を使用して活性化または再活性化することができる。あるいは活性化は、分裂促進因子、例えばコンカナバリンＡ、または好ましくは植物性血球凝集素（ＰＨＡ）の存在下で培養することにより行われる。これは、細胞をより高い活性化状態に置くことになる。本発明による治療がまだ有効であるためには、損傷の１週間またはそれ以上後までの任意の時期に行ってもよいため、細胞を培養するのに必要な数日は患者にとって有害ではないであろう。あるいは、時間が重要であるなら、保存した細胞を融解直後に投与してもよい。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、後述するようにポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒの存在下で活性化されたＴ細胞である。本発明のそのような活性化Ｔ細胞は、ＮＳ変性に至るＣＮＳまたはＰＮＳの損傷、障害または疾患の作用を治療（すなわち、改善または阻止）するために、またはＮＳ（特にＣＮＳ）の再生を促進するために使用することができる。さらに、グルタミン酸はすべての神経変性疾患のメディエーターであるため、慢性であっても急性であっても、そのようなＴ細胞はグルタミン酸毒性からＣＮＳ細胞を保護するために、およびグルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化する疾患または症状（例えば、グルタミン酸中の異常眼圧）を治療するために使用することが企図される。
【００２８】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、好ましくは自己、最も好ましくはＣＤ４および／またはＣＤ８表現型であるが、これらはまた、関連する供与者、例えば、兄弟、親、子、またはＨＬＡが一致しているか部分的に一致している半同種異系または完全同種異系の供与者でもよい。
被験体から単離した自己Ｔ細胞の使用以外に、本発明はまた、神経保護のための半同種異系Ｔ細胞の使用を包含する。これらのＴ細胞は、短期または長期株として調製され、直後にまたは１〜３日間培養後に、ＣＮＳへの損傷を受けた被験体およびＴ細胞神経保護が必要な被験体に、融解と投与のために、従来の低温保存法により保存される。
Ｔ細胞により認識される抗原エピトープとともに、特異的な応答性Ｔ細胞集団が限定されているＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）を発現するなら、半同種異系Ｔ細胞の使用は、Ｔ細胞が、外来抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される特異的抗原エピトープを認識できるという事実に基づく。すなわち、被験体のＭＨＣ分子（好ましくはＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱまたは他のＨＬＡ分子）の少なくとも１つの対立遺伝子産物を認識することができ、かつポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒエピトープに特異的なＴ細胞の半同種異系集団は、被験体のＮＳ傷害部位のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒと交差反応性の抗原を認識し、必要な神経保護作用を示すことができるであろう。Ｔ細胞が傷害部位に移動し、そこに蓄積し、かつ活性化を受けるのに必要な、接着分子、白血球遊走分子、および付属分子には、ほとんどまたは全く多型は無い。すなわち、半同種異系Ｔ細胞は、遊走し、神経保護の必要なＣＮＳ部位に蓄積し、活性化されて所望の作用を示すことができるであろう。
【００２９】
半同種異系Ｔ細胞は被験体の免疫系により拒絶されることは公知であるが、この拒絶が出現するのに約２週間必要である。従って、半同種異系Ｔ細胞は、神経保護を示すのに２週間の機会のウィンドウがある。２週間後、被験体の体から半同種異系Ｔ細胞が拒絶されるが、この拒絶は、被験体から外来Ｔ細胞を追い出し、活性化Ｔ細胞の好ましくない結果を防止するため、この拒絶は被験体に有益である。すなわち、半同種異系Ｔ細胞は、重要な安全性因子であり、好適な実施態様である。
【００３０】
比較的少数のＨＬＡクラスＩＩ分子が集団中のほとんどのヒトに共有されることは公知である。例えば約５０％のユダヤ人は、ＨＬＡ−ＤＲ５遺伝子を発現する。すなわちＨＬＡ−ＤＲ５に限定されるポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒエピトープに反応性の特異的Ｔ細胞のバンクは、この集団の５０％に有用であろう。全集団を、基本的に数種類の他の一般的なＨＬＡ分子（例えば、ＤＲ１、ＤＲ４、ＤＲ２など）に限定された少数の追加のＴ細胞株によりカバーすることができる。すなわち、ある集団のほとんどすべての個体ですぐ使用するために、均一なＴ細胞株の機能性バンクを調製し保存することができる。そのようなＴ細胞のバンクは、治療機会のオープンウィンドウの間、神経保護の必要な被験体から充分な数の特異的Ｔ細胞を得る場合の技術問題を克服するであろう。半同種異系Ｔ細胞は、その神経保護の役割を達成後に安全に排除されるであろう。本発明のこの態様は、矛盾するものではなく、本明細書に記載の自己Ｔ細胞の使用に追加的なものである。
【００３１】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は好ましくは弱められてないが、弱められたポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞を使用してもよい。Ｔ細胞は、特に限定されないが、ガンマ放射線照射（例えば、１．５〜１０．０Ｒａｄ（ベン−ヌン（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ）ら、１９８２））；および／または、例えば米国特許第４，９９６，１９４号（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら）に記載のような加圧処理を含む当該分野で公知の方法を使用して、弱めることができる。好適な実施態様においてポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞は、後述するように単離される。Ｔ細胞は、当該分野で公知の方法に従って、単離し精製することができる（モル（Ｍｏｒ）ら、１９９５）。例については、例３．２を参照されたい。
【００３２】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを認識する被験体の循環Ｔ細胞は、公知の方法を使用して単離し拡張される。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞を得るためには、Ｔ細胞を単離し、次に公知の方法によりポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞が拡張される（例えば、ペッテ（Ｐｅｔｔｅ）ら、１９９０を参照、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
エクスビボ活性化の間、Ｔ細胞は、少なくとも１つの適当な増殖促進因子を加えた培地中で培養することにより活性化される。この目的に適した増殖促進因子には、特に限定されないが、サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）がある。
【００３３】
ある実施態様において活性化Ｔ細胞は、ＮＳにおける損傷または疾患の作用を改善する物質を内因性に産生する。
別の実施形態において活性化Ｔ細胞は、特に限定されないが、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、神経栄養因子４／５（ＮＴ−４／５）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む、他の細胞を刺激する物質を内因性に産生し、ここで他の細胞は、直接または間接に、損傷または疾患の作用を改善する。
インビトロで増殖後に、Ｔ細胞は哺乳動物被験体に投与される。好適な実施態様においてＴ細胞は、ヒト被験体に投与される。細胞拡張は好ましくは、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを使用して行われる。
【００３４】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞は、即時使用されるかまたは後の使用するために保存される（例えば、後述の低温保存）。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞はまた、あらかじめ低温保存したＴ細胞を使用して得られ、すなわち細胞を融解後、Ｔ細胞をポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒとともに、随時末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を加えてインキュベートして、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的活性化Ｔ細胞の調製物を得てもよい。
【００３５】
当業者に明らかなように、Ｔ細胞は、例えば培養の前または後に低温保存により保存することができる。使用可能な低温保存物質には、特に限定されないがジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、ｉ−エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−乳糖、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、モノ酢酸グリセロール、無機塩、およびヒドロキシエチルデンプンやヒト血清アルブミンと組合せたＤＭＳＯがある。
【００３６】
制御された冷却速度は決定的に重要である。異なる低温保存物質および異なる細胞型は、異なる最適冷却速度を有する。冷却速度は、その生存およびその移植可能性に影響を与える。水が氷になる融合期の熱は、最小であるべきである。冷却操作は、例えばプログラム可能な凍結装置またはメタノール浴法を使用して行うことができる。
プログラム可能な凍結装置は、最適冷却速度の決定を可能にし、標準的な再現性のある冷却を促進する。プログラム可能な制御速度フリーザー（例えば、クリオメド（Ｃｒｙｏｍｅｄ）またはプラナー（Ｐｌａｎａｒ））は、所望の冷却速度曲線への凍結法の調整を可能にする。
【００３７】
完全な凍結後に、細胞は急速に、長期低温保存容器に移される。ある実施態様において試料は、機械的フリーザー（例えば、約−８０℃または約−２０℃の温度を維持するフリーザー）中で低温保存される。好適な実施態様において試料は、液体窒素で（−１９６℃）またはその蒸気中で低温保存することができる。そのような保存は、高度に効率的な液体窒素冷蔵庫（これは、極度に低い真空と内部超断熱を有する大きな魔法瓶ににている）の利用可能性により大幅に促進され、その結果、熱の漏れや窒素の喪失を最小に維持する。
生存細胞の他の低温保存法またはその修飾法が利用可能であり、例えば低温金属−鏡法の使用が企図される。
【００３８】
凍結細胞は、好ましくは迅速に（例えば、３７〜４７℃に維持した水浴中）融解され、融解後直ちに冷却される。融解による細胞の凝集を防止するために、細胞を処理することが好ましいことがある。凝集を防止するために、種々の方法を使用することができ、特に限定されないが、ＤＮＡｓｅ、低分子量デキストランおよびクエン酸、ヒドロキシエチルデンプン、または酸性クエン酸デキストロースを、凍結の前または後に添加する方法がある。
【００３９】
低温保護物質は、たとえヒトに毒性が無くても、融解Ｔ細胞の治療的使用前に除去すべきである。低温保護物質を除去する１つの方法は、無視できる濃度まで希釈することである。
いったん凍結Ｔ細胞が融解され回収されると、これらは、非凍結Ｔ細胞に関して本明細書に記載のように神経再生を促進するのに使用される。Ｔ細胞は凍結前に活性化されると仮定して、いったん融解されるとＴ細胞は直ちに使用される。しかし好ましくは、非生存細胞を除去するために、融解した細胞は患者に注入する前に培養される。さらに、約１〜３日間にわたるこの培養の過程で、凍結細胞が休止Ｔ細胞なら、細胞を活性化するように、または凍結前に活性化されたなら、迅速な活性化を達成することを助けるために、適当な活性化物質を加えることができる。通常、Ｔ細胞は、損傷後１週間およびおそらくそれ以上後に投与しても、その神経再生および神経保護作用を維持しているため、投与前にそのような培養工程をする時間がある。
【００４０】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒまたはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞を含む本発明の組成物は、神経再生を促進するために、または、本来は１次ＮＳ損傷、例えば、脊髄損傷、鈍的外傷（例えば、危険な場所への参加により引き起こされるもの）、穿通性外傷（弾丸の傷）、脳衝撃または対側衝撃、出血性発作、虚血性発作、脳虚血、または腫瘍切除のような手術により引き起こされる傷害に続く、２次変性を防止または阻止するために使用してもよい。
【００４１】
さらに、そのような組成物は、変性過程［例えば、種々の疾患または障害（特に限定されないが、損傷、アルツハイマー病を含む老人性痴呆、パーキンソン病を含むパーキンソン症候群、顔面神経（ベル）まひ、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症を含む運動ニューロン疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病を含むプリオン病、アルパーズ病、バッテン病、コケーン症候群、レーヴィ小体疾患、発作重積状態、手根管症候群、椎間円板ヘルニア、ビタミン欠乏、てんかん、健忘症、不安症、痛覚過敏、精神病、発作、酸化ストレス、アヘン剤寛容と依存症、自己免疫疾患、またはアミロイド多発性神経炎のような疾患に関連する末梢血神経障害、糖尿病性ニューロパシー、尿毒症性ニューロパシー、ポルフィリン症性多発性ニューロパシー、低血糖症、シェーグレン・ラルソン症候群、急性感覚ニューロパシー、慢性失調性ニューロパシー、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、先端巨大症、吸収不良症候群、真性多血症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン血症、種々の薬剤（ニトロフラントイン、メトロニダゾール、イソニアジド、およびアルコールもしくは有機リン酸塩のような毒素）の合併症、シャルコー‐マリー‐ツース症候群、血管拡張性失調症、フリートライヒ運動失調、副腎脊髄神経障害、巨大軸索ニューロパシー、レフサム病、ファブリ病、またはリポタンパク質血漿）の結果として灰白質または白質（または両方）に起きる変性］を引き起こす疾患の作用を改善するのに使用される。
【００４２】
さらに、本発明のグルタミン酸の保護態様についての知見に関して、本発明に従って治療される他の臨床症状には、てんかん、健忘症、不安症、痛覚過敏、精神病、発作、異常に高い眼圧（例えば緑内障）、酸化ストレス、アヘン剤寛容と依存症がある。さらに本発明のグルタミン酸保護態様は（すなわち、グルタミン酸毒性により引き起こされるかまたは悪化する損傷または疾患の治療）には、術後治療（例えば、ＣＮＳからの腫瘍除去およびＣＮＳへの他の型の手術）を含み得る。
【００４３】
驚くべきことに、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ免疫がグルタミン酸毒性に対して保護するのに有用であるという事実から、本発明のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ治療またはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞治療は、上記リストの症状の治療において、ミエリンが影響を受けている後期のみでなく、グルタミン酸レベルを毒性レベルまで上昇させる因子によりニューロンが攻撃されている早期においても、有効であると予測される。すなわち本発明は、任意の適応症、すなわちグルタミン酸レベルの上昇により引き起こされるかまたは悪化する慢性もしくは急性神経変性（虚血発作、アルツハイマー病などの早期を含む）に有用である。
【００４４】
好適な実施態様において、本発明のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを含む活性化Ｔ細胞または免疫組成物は、神経再生の促進または２次神経変性の防止または阻止が必要な疾患または障害を治療するのに使用される。
好適な実施態様において本発明は、アジュバント中で投与されるポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒの使用を企図する。可能であれば、好ましくはアジュバント中のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒによる１次活性化後の、神経保護のためのポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒの経口投与が絶えず企図される。すなわち、経口ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒは、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒによる１次活性化後のＴ細胞の活性を増強するのに使用することができる。
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞はまた、免疫療法を使用することなく、新生物が引き起こす変性過程を改善するのに使用される。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒにより活性化されるＴ細胞は、神経変性の部位に蓄積し、この変性の阻止を促進するであろう。
【００４５】
本発明で使用される医薬組成物は、従来法で、１つ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して調製される。担体は、組成物の他の成分と適合性があり、その受容者に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００４６】
担体、投与方法、剤形などの以下の例は、そこから、担体、投与方法、剤形などが本発明で使用されるように選択される。しかし当業者は、選択されたある製剤や投与法はまず、所望の結果を達成するかどうかを試験すべきであることを理解するであろう。すなわち例えば、活性成分がポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒである時、具体的な製剤と投与法は、インビボでそれに対して活性化されるＴ細胞を作成するように、活性成分がワクチンとして作用することを可能にしなければならない。そのような免疫応答が得られないなら、その具体的な製剤と投与法は、本発明で使用すべきではない。
同様に、もし活性成分が活性化Ｔ細胞なら、具体的な製剤と投与法を試験して、投与される活性化Ｔ細胞が活性状態で血流に達し、その結果本発明に従ってその保護役割を果たすことを確認すべきである。
【００４７】
用語「担体」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。医薬組成物中の担体は、結合剤、例えば微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガントゴム、ゼラチン、デンプン、乳糖または乳糖１水和物；崩壊剤、例えばアルギン酸、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤または界面活性剤、例えばステアリン酸マグネシウム、またはラウリル硫酸ナトリウム；直打用滑沢剤、例えばコロイド二酸化珪素；甘味剤、例えばショ糖またはサッカリン；および／または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味がある。
【００４８】
投与法には、特に限定されないが、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻内、頬、膣、直腸、眼内）、くも膜下、局所的、および皮内経路がある。投与は、全身性でも局所性でもよい。
経口投与のためには、医薬組成物は液体型、例えば液剤、シロップ剤、懸濁剤であるか、または使用前に水または他の適切なビヒクルで復元するための薬剤として調製してもよい。そのような液体調製物は、従来法により、薬剤学的に許容される添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンヂ油、油性エステル、または分割植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を用いて調製してもよい。医薬組成物は、例えば、薬剤学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、例えば錠剤またはカプセル剤の形でもよい。錠剤は、当該分野で公知の方法により被覆される。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適切に製剤化される。頬投与には、組成物は、従来法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形でもよい。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを経口的に導入する時は、これは、他の型の食物と混合され、固体、半固体、懸濁剤、またはエマルジョン型で消費され；および薬剤学的に許容される担体（例えば、水、懸濁剤、乳化剤、香味エンハンサーなど）と混合される。ある実施態様において経口組成物は、腸溶コーティングされる。腸溶コーティングの使用は、当該分野で公知である。
【００４９】
組成物は、注射により、例えばボラス注射、または連続的注入による非経口投与用に製剤化される。注入用製剤は、単位投与型、例えば保存剤を加えたアンプルまたは多回投与用容器中で、提供される。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形でもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化物質を含有してもよい。あるいは活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、無菌パイロゲンを含まない水）で復元するための散剤型でもよい。
【００５０】
組成物はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含む直腸組成物、例えば坐剤または保持浣腸で調製される。
吸入による投与のために、本発明で使用される組成物は、適切な噴射剤、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアゾル噴霧される形で提供されることが便利である。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は、計量した量を与えるための弁を提供することにより決定される。化合物と適当な散剤基剤（例えば、乳糖またはデンプン）の粉末混合物を含有する、インヘーラーまたは注入器で使用するための例えばゼラチンのカプセル剤とカートリッジが調製される。ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒはまた、いくつかの上記剤型で吸入または点鼻剤により、鼻を介して投与される。さらに、気管および気管支の粘膜内層にポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを与えるのに、経口吸入が使用される。
【００５１】
好適な実施態様において、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒまたはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適応させた医薬組成物として、ルーチン法に従って製剤化される。典型的には静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば組成物はまた、可溶化剤と、注射部位の疼痛を緩和するための局所麻酔薬（例えば、リドカイン）を含有してもよい。一般に、成分は別個にまたは一緒に混合して供給される。注入により組成物が投与される場合は、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水または食塩水のアンプルが提供される。
【００５２】
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを含む医薬組成物は、免疫のための通常の方法で、随時アジュバントとともに投与される。そのようなアジュバントの非限定例には、ミョウバンと不完全フロイントアジュバントがある。代謝性脂質エマルジョン（例えば、イントラリピッド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）またはリポフンジン（Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ））もまた、ＷＯ９７／０２０１６号（この全内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されている方法でポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ療法のビヒクルとして使用できる。これらの物質は、ＴＨ１からＴＨ２へのサイトカインシフトを引き起こすことが知られているが、ＴＨ２サイトカインが本発明の目的に機能しないはずはなく、おそらく好適であろう。
【００５３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
好適な実施態様において本発明の医薬組成物は、ＮＳの損傷後または変性病変の検出後まもなく、哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される。本発明の治療法は、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒまたはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞、またはこれらの組合せの投与を含む。併用療法を使用する時は、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒは、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞の投与の前、同時または後に投与される。
【００５４】
ある実施態様において本発明の組成物は、以下の１つ以上と組合せて投与される：（ａ）単核食細胞、好ましくは、神経再生を促進する能力を増強するように刺激した培養単球（ＷＯ９７／０９９８５号、ＷＯ９８／４１２２０号、米国特許第５，８００，８１２号、米国特許第６，１１７，４２４号、および米国特許第６，２６７，９５５号、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）；および（ｂ）酸性繊維芽細胞増殖因子のような神経栄養因子；
別の実施態様において、ＷＯ９７／０９９８５号、ＷＯ９８／４１２２０号、米国特許第５，８００，８１２号、米国特許第６，１１７，４２４号、および米国特許第６，２６７，９５５号の単核食細胞は、損傷部位にまたはＣＮＳ内の病変中に、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒもしくはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞の非経口投与と同時に、または前、または後に、注入される。
【００５５】
別の実施態様において、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒまたはポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞は、単回投与として投与されるか、または好ましくは２週間の間隔で繰り返され、次に徐々に長くなる間隔で、１月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回などで繰り返される。治療過程は、治療される症状または疾患により、数ヶ月、数年またはまれに個人の生涯を通して続けられる。ＣＮＳ損傷の場合は、症状が安定するまで、数日から数ヶ月または数年の範囲であり、２次変性が進展するリスクは全く無いかまたはほとんど無い。慢性のヒト疾患またはパーキンソン病では、本発明の治療は１生涯の場合もある。
【００５６】
当業者には明らかなように、治療作用は時に、治療される症状または疾患に、個体の年齢および健康状態に、個体の他の肉体的パラメータ（例えば、性、体重など）に、ならびに種々の他の要因（例えば、個体は他の薬物を服用しているかなど）に依存する。
本発明のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物の最適用量は、治療される部位のＮＳ損傷または疾患により影響を受けた神経繊維の数に比例する。ある実施態様において用量は、例えばラット視神経の完全な離断で行われるように、約１０5の神経繊維に影響を与える病変を治療するために約５×１０6〜約１０7細胞、およびヒト視神経の完全な離断で行われるように、約１０6〜１０7の神経繊維に影響を与える病変を治療するために約１０7〜約１０8細胞の範囲である。当業者には明らかなように、Ｔ細胞の用量は、病変または治療される損傷の部位での影響を受けたと考えられる神経繊維の数に比例して、スケールアップまたはスケールダウンすることができる。
【００５７】
神経損傷後の２次傷害を最小にするために、患者は、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒに対して感作した自己または半同種異系Ｔリンパ球を投与することにより治療することができる。機会は正確には規定されていないが、成功のチャンスを最大にするために１次損傷後にできるだけ早く（好ましくは、約１〜２週間以内）治療をすべきである。
活性化に必要な時間または治療に必要な時間の差を縮めるために、ＮＳ損傷の場合の２次変性に対する神経保護治療法で将来使用するために調製した自己Ｔリンパ球の個人的貯蔵のバンクを確立することができる。Ｔリンパ球は、血液から単離され、次にポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒに対して感作される。次に細胞を凍結し、個人の名前、識別番号、および血液型で、必要になるまで細胞バンクに適切に保存される。
【００５８】
さらに、ＮＳの外傷性障害（例えば、虚血ならびに機械的損傷）で個々の患者で使用する可能性のために、ならびに神経変性症状（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）を治療するために、ＣＮＳの自己幹細胞を処理して保存することができる。あるいは、半同種異系または同種異系Ｔ細胞を、Ｔ細胞の供給源と１つのＭＨＣＩＩ型分子を共有する個体が使用するためのバンクで保存することができる。
【００５９】
以下の例は、本発明のいくつかの特徴を説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
例
材料と方法
動物。すべての動物は、施設動物の飼育と使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）の規制に従って扱かった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株のマウス（８〜１３週齢）と成体の雄ＳＰＤラット（８〜１２週齢）は、ワイズマン科学研究所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（レホボット（Ｒｅｈｏｖｏｔ）、イスラエル）の動物飼育センター（Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）により供給され、光と温度が制御された部屋に収容した。各実験でラットの年齢と大きさを一致させた。実験の前に、ケタミン８０ｍｇ／ｋｇとキシラジン１６ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与により動物を麻酔した。
【００６１】
抗原。モルモットの脊髄からのＭＢＰとオボアルブミン（ＯＶＡ）、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ、およびＣｏｎＡは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。Ｃｏｐ１は、テバファーマシューチカルズ社（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｔｄ．）（ペターチクバ（Ｐｅｔａｈ  Ｔｉｋｖａ）、イスラエル）から購入した。ＭＢＰ  ｐ８７−９９ペプチドは、ワイズマン科学研究所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（レホボット（Ｒｅｈｏｖｏｔ）、イスラエル）で合成された。
免疫。マウスまたはラットを、０．５ｍｇ／ｍｌの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する等量のＣＦＡで乳化した１００μｇのポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒで免疫した。エマルジョン（総量０．１ｍｌ）を、マウスの片側のわき腹とラットの背中上部に皮下注射した。対照マウスとラットに、ＣＦＡ（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト、ミシガン州、アメリカ合衆国）中のＰＢＳを注射した。
グルタミン酸注入。麻酔したマウスまたはラットの右目に、強膜の上部に２７ゲージの針を刺し、３０ゲージ針の１０μｌハミルトンシリンジを硝子体まで挿入した。マウスに、食塩水に溶解した総量１μｌ（２００ｎｍｏｌｅ）のＬ−グルタミン酸を注入した。
【００６２】
Ｔ細胞株。上記抗原（ベン−ヌン（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ）ら、１９８１）で免疫したルイスラットから得られた流れ出るリンパ節細胞から、Ｔ細胞株を作成した。抗原をＰＢＳに溶解（１ｍｇ／ｍｌ）し、４ｍｇ／ｍｌの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））を補足した等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、ミシガン州）で乳化した。０．１ｍｌのエマルジョンでラットの後ろ足の底に抗原を注射した１０日後に、ラットを屠殺し、流れるリンパ節を外科的に取り出し引き離した。細胞を洗浄し、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸（１ｍｌ／１００哺乳動物）、および自己血清１％（容量／容量）を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含有する刺激培地中の抗原（１０μｇ／ｍｌ）で活性化した。３７℃、９８％相対湿度および１０％ＣＯ2で７２時間インキュベーション後、細胞を、上記と同じ濃度のＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン酸、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および抗生物質からなり、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）（容量／容量）とコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）刺激脾細胞の上清から得られた１０％Ｔ細胞増殖因子を添加した増殖培地に移した。細胞を増殖培地で４〜１０日間増殖させた後、刺激培地中放射線照射（２０００ｒａｄ）胸腺細胞（１０7細胞／ｍｌ）の存在下でその抗原（１０μｇ／ｍｌ）で再刺激した。刺激と増殖を繰り返して、Ｔ細胞株を拡張した（ベン−ヌン（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ）ら、１９８２）。
【００６３】
視神経の破砕損傷：（ａ）視神経を破砕損傷させた。簡単に説明すると、ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）（キシラジン、１０ｍｇ／ｋｇ；ビタメド（Ｖｉｔａｍｅｄ）、イスラエル）とベタラー（Ｖｅｔａｌａｒ）（ケタミン、５０ｍｇ／ｋｇ；フォートドッジラボラトリーズ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、フォートドッジ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ）、アイオワ州）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により、ラットを深く麻酔した。双眼顕微鏡を使用して、右目に外側眼角切開を行い、角膜の横で結膜を切開した。牽引眼筋の分離後、ブラントジセクションにより視神経を眼窩露出させた。較正済みクロスアクションピンセットを使用して、視神経を眼から１〜２ｍｍ破砕損傷させた。短期の試験（２週間）で軽いおよび重い破砕損傷を与えたが、これは、この期間が２次変性と治療に対する応答を示すのに最適であったためである（ヨールズ（Ｙｏｌｅｓ）、１９９８）。損傷を与えなかった反対側の神経には、何もしなかった；（ｂ）マウスまたはラットを麻酔し、眼球から１〜２ｍｍの視神経の眼窩内部分に段階的破砕損傷を与えた。双眼顕微鏡を使用して、結膜を切開し視神経を露出させた。較正済みクロスアクションピンセットを使用して血流を妨害しないように特に注意して、神経を２ｓ（マウス）または３０ｓ（ラット）破砕した。
【００６４】
ＲＧＣの逆行性標識による視神経破砕後のラットの２次変性の測定。破砕損傷の２週間後、病変部位から離れて、蛍光性親油性色素であるヨウ化４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウム（４−Ｄｉ−１０−Ａｓｐ）（モレキュラープローブズヨーロッパ・ビーブイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ）、オランダ）を損傷後に適用して、視神経軸索とその結合ＲＧＣの２次変性を測定した。無傷の軸索のみが色素をその細胞体に戻すことができるため、２週間後に病変部位から離れて色素を適用すると、１次傷害と２次変性を生き延びた軸索のみが計測されることになる。その繊維の形態が無傷なニューロンは、損傷の部位から離れて適用された色素を摂取し、それをその細胞体まで運搬することができるため、このアプローチは、まだ機能的に無傷のニューロンと、軸索が損傷されているが細胞体がまだ生きているニューロンとを区別することができる。この方法を使用して、標識したＲＧＣの数は、まだ機能しているニューロンの数を確実に反映する。標識と測定は以下のように行った：網膜の血液供給を傷害せずに、２回目の右の視神経の露出をさせた。損傷部位の遠くの境界から１〜２ｍｍで、完全な軸索切除を行い、４−Ｄｉ−１０−Ａｓｐの固形結晶（直径０．２〜０．４ｍｍ）が、新に形成された軸索切断の部位に沈着した。色素適用の５日後にラットを屠殺した。眼から網膜を切り離し、４％パラホルムアルデヒド溶液中の平らな全マウントとして調製し、蛍光顕微鏡により標識ＲＧＣについて観察した。
【００６５】
マウスでの網膜神経節細胞（ＲＣＧ）の標識。実験終了の７２時間前にＲＣＧを標識した。マウスを麻酔し、定位固定装置に入れた。頭蓋を露出させ、乾燥させ洗浄した。ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）を確認し印を付けた。指定した注入点は、脳の表面から２ｍｍの深さで、前後方向の軸に沿ってブレグマの後ろ２．９２ｍｍで、正中線の横０．５ｍｍである。右半球と左半球の記載の座標の上で、頭蓋に窓を開けた。次に、ハミルトンシリンジを使用して、神経トレーサー色素フルオロゴールド（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）（食塩水中５％溶液；フルオロクローム（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）、デンバー、コロラド州）を適用（１μｌ、各半球に０．５μｌ／分の速度で）し、傷の上の皮膚を縫った。
マウスのＲＧＣ生存の評価。マウスに致死量のペントバルビトン（１７０ｍｇ／ｋｇ）を与えた。眼を摘出し、網膜を切り離し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）中の平らな全マウントとして調製した。同じサイズ（０．７ｍｍ2）の４〜６個の選択した視野からの標識細胞を計測した。視神経円板からの距離の関数としてのＲＧＣ密度の変動を克服するために、選択した視野は視神経円板からほぼ同じ距離（０．３ｍｍ）に位置した。視野は、マウスが受ける治療についてはブランドとした観察者が蛍光顕微鏡（倍率×８００）下で計測した。各網膜の１視野あたりのＲＧＣの平均数を計算した。
【００６６】
ラットのＲＧＣ生存の評価。視神経先端から離れた位置への、蛍光性親油性色素ヨウ化４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウム（４−Ｄｉ−１０−Ａｓｐ）（モレキュラープローブズヨーロッパ・ビーブイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ）、オランダ）の損傷後適用後の、ラット中のＲＧＣの生存を測定した。標識と測定は以下のように行った：網膜の血液供給を傷害せずに、視神経を露出させた。視神経先端から１〜２ｍｍで、完全な軸索切除を行い、４−Ｄｉ−１０−Ａｓｐの固形結晶（直径０．２〜０．４ｍｍ）が、形成された軸索切断の部位に沈着した。色素適用の５日後にラットを屠殺した。眼から網膜を切り離し、４％パラホルムアルデヒド溶液中の平らな全マウントとして調製し、蛍光顕微鏡により標識ＲＧＣについて観察した。ＩＯＰ実験動物において、神経節細胞を、逆行性輸送デキストランテトラメチルローダミン（ＤＴＭＲ）（モレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州）により標識した。３０００ＭＷのＤＴＭＲの結晶を、眼球から約２〜３ｍｍの視神経の切断した端に適用した。２４時間後、網膜を全マウントし、８つの領域（各４分の１区で２つ）（視神経円板の端から０．６６〜１．１０３ｍｍ）の標識神経節細胞を、４００×の倍率で計測した。
【００６７】
組織学的分析。マウスにグルタミン酸または食塩水を注入した７日後に、マウスに致死量のペントバルビトン（１７０ｍｇ／ｋｇ）を注入して死亡させ、眼を摘出し、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中４％）に４℃で４８時間固定した。切片（厚さ１０μｍ）をパラフィン包埋し、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
ラットの眼高血圧の作成／ラットの眼圧の上昇。雄のルイスラットを、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。眼圧（ＩＯＰ）の上昇は、辺縁強膜上静脈のレーザー光凝固により行った。ラットに、青−緑アルゴンレーザーで１週間置いて２回のレーザー処理を行った（１ワットを０．２ｓ、２回の処理で全部で５０μｍの１３０〜１５０個のスポット行った；コヘレント（Ｃｏｈｅｎｒｅｎｔ）、パロアルト、カリホルニア州）。動物用精神安定薬であるアセプロマジン３．０ｍｇ／ｋｇを筋肉内注入し、プロカイン０．５％を眼に局所投与して角膜を麻酔した後、トノペン（ＴＯＮＯ−ＰＥＮ）（メントー（Ｍｅｎｔｏｒ）、ノーウェル（Ｎｏｒｗｅｌｌ）、マサチューセッツ州）を使用してＩＯＰを週に１回測定した。
【００６８】
例１．挫傷させた動物の生理的Ｔ細胞レパートリー
ＳＰＤラットを麻酔し、Ｔ８のレベルで椎弓切除により脊髄を暴露させた。麻酔誘導の１時間後、ＮＹＵ衝撃装置を使用して、５０ｍｍの高さから１０ｇの棒を椎弓切除した脊髄上に落とした（バッソ（Ｂａｓｓｏ）ら、１９９５と１９９６）。
脊髄挫傷の８〜１０日後にラットを屠殺し、脾臓を切り出し、細かいワイアメッシュを通して押しつけた。洗浄細胞（２×１０6／ｍｌ）を、平底マイクロタイターウェル中で、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、非必須アミノ酸および自己血清１％（容量／容量）を補足したＤＭＥＭを含有する０．２ｍｌの増殖培地中で、抗原（１５μｇ／ｍｌ）またはＣｏｎＡ（１．２５μｇ／ｍｌ）、および放射線照射胸腺細胞（２０００ｒａｄ、２×１０6細胞／ｍｌ）を用いて、三重測定で培養した。異なる抗原（すなわち、Ｏｖａ、Ｃｏｐ１、ＭＢＰ、８７−９、ポリ−Ｇｌｕ，ＴｙｒおよびＣｏｎＡ）に対する増殖応答を、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）（これは、７２時間培養の最後の１６時間加えた）の取り込みを測定することにより測定した。脾細胞増殖指数（ＳＩ）を、抗原の無い培地中の脾細胞の増殖と比較して測定した（ＳＩ＝１は、抗原の無い増殖以上の、抗原に対する増殖応答が無いことを示す）。このパラメータは、挫傷させた動物中の生理的Ｔ細胞レパートリーの指標である。ＣｏｎＡは陽性対照である。図１の結果は、脾臓を挫傷させたラットでは、Ｃｏｐ１またはＭＢＰに対するよりもポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒに対して反応性のＴ細胞の頻度が高いことを示す。
【００６９】
例２．グルタミン酸毒性からの視神経繊維の保護
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒが、グルタミン酸誘導性の毒性により引き起こされる好ましくない環境条件からの、より一般的な神経保護を与えるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
励起性神経伝達物質であるグルタミン酸をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの眼の硝子体に注入すると、視神経ニューロンの細胞体の用量依存性の死滅を引き起こす。以前の研究は、ＲＧＣ死滅の開始が遅延し（グルタミン酸注入後２４時間以上）、アポトーシス様であることを示した。
【００７０】
本実験では、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、グルタミン酸注入の７日前に、１００μｇのＣＦＡに乳化したポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒで皮下免疫した。免疫の非特異作用を否定するためにＣＦＡに乳化したＰＢＳで同時に免疫したマウス群と非免疫マウスの群を、対照とした。すべての３群のマウスに、右目の硝子液にグルタミン酸（４００ｎｍｏｌｅ）を注入した。左目には注入せず、無傷の対照として使用した。グルタミン酸注入の７日後に、眼を切りだし、ＲＧＣ生存を測定した。
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ免疫したマウス、ＰＢＳ免疫したマウス、および非免疫マウスの無傷の網膜中で計測された１ｍｍ2あたりのＲＧＣの平均数は、それぞれ２７９６±１６５、２８７４±１９７および２８０７±４２であり、免疫が、反対側の無傷の眼のＲＧＣの生存には何の影響も無いことを示す。従ってすべての３つの実験群中の無傷の網膜中の１ｍｍ2あたりのＲＧＣの平均数をまとめると、１００％ＲＧＣ生存（０％毒性）と考えられる。
【００７１】
図２に示す結果は、ＣＦＡ中のポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ（ＣＦＡ−ＥＹ）によるマウスの免疫が、ＰＢＳによる免疫（ｔ検定、ｐ＝０．００７）または非免疫（ｔ検定、ｐ＝０．０１）と比較して、グルタミン酸誘導性ＲＧＣ死滅を大幅に減少させることを示す。２つの後者の群（ｔ検定、ｐ＝０．７１）間のＲＧＣ生存には差がなかった。
【００７２】
例３．脊髄損傷の神経保護
低胸部レベルの急性の不完全な脊髄損傷は、後足の運動活性の即時喪失を引き起こし、これは、損傷の最初の１２日以内に自然に回復し、欠陥のある運動能力で安定する。運動機能回復の程度は、脊髄ショックからの陽性回復と傷害の縦および横の広がりの陰性作用の合計作用である。神経保護を介する傷害の拡散を低下させることを目的とする治療法は、後足の運動活性の良好な回復を引き起こす。
【００７３】
以下の実験において、脊髄挫傷後の後足の運動活性へのポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを用いる能動免疫または受動免疫の作用を試験した。
３．１ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒを用いる能動免疫：脊髄挫傷からのラットの回復へのポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ／ＣＦＡ免疫の作用
ＮＹＵ衝撃装置を使用して５０ｍｍの高さから１０ｇの棒を椎弓切除したレベルＴ８の脊髄上に落とすことにより、麻酔した１２匹のＳＰＤ雄ラットに、脊髄の挫傷損傷を与えた。使用したＮＹＵ衝撃装置は、各動物について、棒の軌跡と暴露された脊髄とのその接触の測定して均一な病変を可能にした。
【００７４】
脊髄ショックのために、ラットの後足の運動スキルは最初消失していたが、時間とともに回復して、欠陥のある運動活性の定常状態まで達した。損傷により引き起こされたこの欠陥の程度は、充分な神経保護治療により低下させることができる。
類似の群を得るために、衝撃のエラーに従ってラットを２群（各６匹）に分けた。１つの群では、ラットをＰＢＳ／ＣＦＡ（三角）を用いて背中上部に皮下免疫した。他の群では、ラットをｐＥＹ／ＣＦＡ（１００μｇ／ラット、四角）で皮下免疫した。損傷後直ちに両群を免疫し、７日後、両群に、最初と同じ２回目の免疫を行った。動物の後足の運動スキルを、２つの実験群の後足運動活性の動態と程度に従って、バッソ（Ｂａｓｓｏ）らが開発したスコアリング方法（バッソ（Ｂａｓｓｏ）、ビーティー（Ｂｅａｔｔｉｅ）、ブレスナハン（Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）（ＢＢＢ）運動評価スケールに従って運動活性をスコアを付ける（０〜２１の範囲））を使用して、スコアを付けた。週に約２回、平滑な滑らない床（直径９０ｃｍ、壁の高さ７ｃｍ）の成形プラスチックで作成した円形のエンクロージャの真ん中に４分間ラットをおいて、オープンフィールドでの胴体、尾および後足の運動活性を評価した。図３に示す結果は、ｐＥＹ（四角）で処理したラットが、ＰＢＳ処理ラットより早く回復する傾向を示すことを証明する。
【００７５】
３．２  ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒによる受動免疫
ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ−特異的Ｔ細胞がまた、脊髄損傷後の神経保護を与えるかどうかを調べるために、以下の実験を行った。
Ｔ細胞の調製のために、４匹のＳＰＤラットをｐＥＹ／ＣＦＡ（１２５μｇ／ラット）で背中に皮下免疫した。７日後、脾細胞を採取し、シリンジのプランジャーを使用して、金属メッシュに対して脾臓を押しつけて、単一細胞懸濁物を調製した。脾細胞を、ｐＥＹ（１０μｇ／ｍｌ）で３日間培養して活性化させた。細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、計測した。
【００７６】
別の群の１２匹の雄のＳＰＤラットを手術し、例３．１に記載のように５０ｍｍの高さから１０ｇのおもりを落として、Ｔ７レベルで脊髄挫傷を行った。挫傷の直後に、衝撃エラーに従ってラットを等しい２群に分けた。１つの群には、０．５ｍｌのＰＢＳを静脈内投与し、他の群には、ｐＥＹで活性化した脾細胞（３０×１０6／０．５ｍｌ  ＰＢＳ／ラット）を投与した。オープンフィールドＢＢＢスコアを使用して、機能の回復についてラットを追跡した。
図４に示す結果は、ｐＥＹ（四角）で活性化した脾細胞で処理したラットが、対照群（三角）より早く回復する傾向を示すことを証明する。
【００７７】
参考文献等
Ｂａｓｓｏら，“ラットのオープンフィールド試験のための高感度で信頼できる運動評価スケール”，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １２（１）：１−２１（１９９５）
Ｂａｓｓｏら，“ＮＹＵおもり落下装置対離断を使用する脊髄挫傷後の段階的組織学的および運動結果”，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３９（２）：２４４−２５６（１９９６）
Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，“自己免疫脳脊髄炎を仲介できるクローン可能な抗原特異的Ｔリンパ球株の迅速な単離”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：１９５−１９９（１９８１）
Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，“Ｔ細胞株に仲介される実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（１）：３０３−３０８（１９８２）
Ｄｅｂｒｅら，“特異的免疫抑制の遺伝的制御。ＩＩ．ランダムコポリマーＬ−グルタミン酸５０−Ｌ−チロシン（ＧＴ）による免疫抑制のＨ−２結合優性遺伝的制御”，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２（６）：１４４７−５４（１９７５）
Ｈａｕｂｅｎら，“脊髄損傷の神経保護治療法候補としての自己免疫Ｔ細胞”，Ｌａｎｃｅｔ３５５：２８６−２８７（２０００）
Ｈｉｃｋｅｙ，Ｗ．Ｆ．ら，“中枢神経系へのＴリンパ球の進入”，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２８（２）：２５４−２６０（１９９１）
Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら，“中枢神経系外傷後の抗原特異性に非依存性の受動転移したプライムしたＴ細胞の蓄積”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８９（１−２）：８８−９６（１９９８）
Ｌｙｎｃｈら，“ニューロン外傷の２次機構，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．７（６）：５１０−５１６（１９９４）  ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｔ．Ｋ．，“実験的外傷性脳損傷における新規薬理学的治療法：総説”，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ１０（３）：２１５−２６１（１９９３）
Ｍｅｌｄｒｕｍ，“脳中の神経伝達物質としてのグルタミン酸：生理と病理の総説”，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０：（４Ｓ増刊）：１００７Ｓ−１０１５Ｓ（２０００）
Ｍｏａｌｅｍら，“自己免疫Ｔ細胞は、中枢神経系軸索切除後の２次変性からニューロンを保護する”，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：４９−５５（１９９９ａ）
Ｍｏｒら，“ルイスラット中のミエリン塩基性タンパク質の多様な潜在エピトープに応答するＴ細胞の病原性”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（７）：３６９３−３６９９（１９９５）
Ｏｔａら，“多発性硬化症における免疫優性ミエリン塩基性タンパク質エピトープのＴ細胞認識”，Ｎａｔｕｒｅ３４６（６２８０）：１８３−１８７（１９９０）
Ｐｅｔｔｅら，“ＭＳ患者と健常個体からのミエリン塩基性タンパク質特異的Ｔリンパ球株”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（２）：７９６８−７９７２（１９９０）
Ｐｉｔｔら，“多発性硬化症のモデルにおけるグルタミン酸励起毒性”，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，６：６７−７０（２０００）
Ｓｅｏら，“Ｇｌｕ−Ｔｙｒポリペプチドによるマウス上皮Ｖガンマ５／Ｖデルタ１−ＴＣＲ（＋）Ｔ細胞株”，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１６（６）：８８０−８８５（２００１）
Ｖｉｄｏｖｉｃら，“おそらくは自己寛容により引き起こされるポリ（Ｇｌｕ50Ｔｙｒ50）に対する劣性Ｔ細胞応答”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４（６）：３５６３−６８（１９８５）
Ｖｉｄｏｖｉｃ  ａｎｄ  Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，“外来抗原に対する非応答性は自己寛容により引き起こされる”，Ｎａｔｕｒｅ３３６：２２２（１９８８）
Ｙｏｌｅｓら，“部分的白質病変後の免れた軸索の変性：視神経ニューロパチーの意味”，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１５３：１−７（１９９８）
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、異なる抗原（オボアルブミン（Ｏｖａ）、コポリマー１（Ｃｏｐ１）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＢＰペプチドｐ８７−９９、ポリ−Ｇｌｕ，Ｔｙｒ（ｐＥＹ）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ））に応答した脾細胞の増殖測定法の結果を示すグラフである。この測定法は、ＳＰＤラットを脊髄挫傷させた８〜１０日後にラットから単離した脾細胞で行った。指数は、抗原を含有しない培地（ＳＩ＝１）中の脾細胞の増殖と比較して決定した。
【図２】図２は、グルタミン酸により誘導された網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を、ｐＥＹによる免疫がいかに大幅に減少させるかを示すグラフである。硝子体内グルタミン酸注入の７日前および７日後の、完全フロイントアジュバント中のｐＥＹ（ＣＦＡ−ｐＥＹ）またはＣＦＡ中のＰＢＳ（ＣＦＡ−ＰＢＳ）のエマルジョンで免疫しておいたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから切り出した網膜中の標識（生存）ＲＧＣ／ｍｍ2の数を計測した。棒は、投薬経験の無い網膜と比較したＲＧＣ死滅パーセントの平均±ｓｅｍである。
【図３】図３は、ラットの脊髄挫傷からの回復に対するｐＥＹ／ＣＦＡ免疫の作用を示す。グラフは、脊髄損傷直後のｐＥＹ／ＣＦＡ（四角）またはＣＦＡ−ＰＢＳ（対照；三角）で免疫した２群のＳＰＤラットにおける、脊髄損傷後の時間に伴うオープンフィールドでの後ろ足運動活性スコアの平均±ｓｄを示す。
【図４】図４は、脊髄損傷回復に対するｐＥＹで活性化した脾細胞の養子免疫細胞移入の作用を示す。グラフは、脊髄損傷直後のｐＥＹ／ＣＦＡ活性化Ｔ細胞（ＳＰｃ＋ｐＥＹ；四角）またはＣＦＡ−ＰＢＳ処理Ｔ細胞（対照；三角）を腹腔内注入した２群のＳＰＤラットにおける、脊髄損傷後の時間に伴うオープンフィールドでの後ろ足運動活性スコアの平均±ｓｄを示す。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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