(57)【要約】【課題】優れた育毛効果を奏する新たな育毛剤組成物、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤を提供する。【解決手段】本発明は、海洋深層水を有効成分として含有する育毛剤組成物に関する。また、本発明は、海洋深層水を有効成分として含有する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋深層水を有効成分として含有する、育毛剤組成物。
【請求項２】
さらに、ＤＮＡ加水分解物を有効成分として含有する、請求項１に記載の育毛剤組成物。
【請求項３】
前記海洋深層水の含有量が０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の育毛剤組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ加水分解物の含有量が０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２又は３に記載の育毛剤組成物。
【請求項５】
海洋深層水を有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤。
【請求項６】
さらに、ＤＮＡ加水分解物を有効成分として含有する、請求項５に記載の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤組成物、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、薄毛や抜け毛を予防又は改善するための育毛剤の需要は高く、様々な育毛剤が販売されている。新しい毛髪が生え、古い毛髪が抜けるサイクルをヘアサイクル（毛周期）といい、成長期、退行期、休止期に分かれるが、この正常なヘアサイクルの維持には特に毛包の根幹部分にある毛乳頭細胞が正常に働くことが必要である。毛乳頭細胞は、様々な伝達物質を分泌して毛母細胞の増殖、分化を促し、毛の成長を導く重要な役割を担っており、毛乳頭細胞が正常に機能しないと、正常なヘアサイクルを維持することが困難となり、薄毛や抜け毛を引き起こす原因となる。
【０００３】
また、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生に関与する糖タンパク質であり、毛乳頭細胞から分泌されるＶＥＧＦが、血管新生を促進することによって毛母細胞を活性化させ、毛の成長を促進する作用を有することが知られている。そのため、ＶＥＧＦ産生促進作用を有する成分を、薄毛や抜け毛の予防又は改善を目的とした育毛剤に配合する例が、これまでにも報告されている。例えば、鳳凰木、白眉草及び仮鷹爪からなる群より選ばれる植物抽出物を有効成分として含有する育毛剤（特許文献１）や、ローヤルゼリーを含有する育毛促進剤（特許文献２）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１１４０８２号公報
【特許文献２】特開２００３−１９２５４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように育毛剤の需要は高く、特に安全性や生産性に優れ、かつ薄毛や抜け毛の予防又は改善といった育毛効果に優れた、新たな育毛剤の開発が望まれているのが現状である。よって、本発明は、優れた育毛効果を奏する新たな育毛剤組成物、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、海洋深層水が、優れた血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進作用を有し、当該作用に基づく優れた育毛効果を奏することができることを見出した。本発明者らはさらに、海洋深層水と、ＤＮＡ加水分解物とを併用することで、ＶＥＧＦ産生促進作用、及び当該作用に基づく育毛効果をより向上させることができることも見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
すなわち本発明は、海洋深層水を有効成分として含有する、育毛剤組成物に関する。
好ましい形態において、育毛剤組成物は、さらにＤＮＡ加水分解物を有効成分として含有する。好ましい形態において、育毛剤組成物は、前記海洋深層水の含有量が０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌである。他の好ましい形態において、育毛剤組成物は、前記ＤＮＡ加水分解物の含有量が０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【０００８】
また、本発明は別の側面において、海洋深層水を有効成分として含有する、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤に関する。好ましい形態において、ＶＥＧＦ産生促進剤は、さらにＤＮＡ加水分解物を有効成分として含有する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、優れた育毛効果を奏する新たな育毛剤組成物、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、海洋深層水（原水）を単独で０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ添加した場合のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図２】実施例１において、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを単独で０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ添加した場合のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。図中、上下幅のないものは、ｎ＝２で実施した。
【図３】実施例１において、海洋深層水の原水を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、及び、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを２０ｍｇ／ｍｌ添加した場合のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図４】実施例１において、海洋深層水の原水を５ｍｇ／ｍｌ、及び、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを０〜２０ｍｇ／ｍｌ添加した場合のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図５】被験者が実施例２の育毛剤組成物を６ヶ月間使用した際の、平均毛髪径（μｍ）の変化を示したグラフである。
【図６】被験者が実施例２の育毛剤組成物を６ヶ月間使用した際の、平均硬毛率（％）の変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明の育毛剤組成物、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤の実施形態について説明するが、本発明は下記の実施形態に制限されるものではない。
【００１２】
本発明の育毛剤組成物は、海洋深層水を有効成分として含有し、好ましくは、ＤＮＡ加水分解物を有効成分としてさらに含有し、必要に応じて、その他の任意成分をさらに含有する。
【００１３】
海洋深層水とは、一般に水深２００ｍ以深（例えば、水深２００〜１０００ｍ程度）に存在する海水、若しくはその乾固物をいう。水深２００ｍ以深の海水には、太陽光はほとんど届かず、また水温が年間を通してほとんど変化しないため、水質を悪化させる有機物や細菌類、環境ホルモンはほとんど含まれず、また水質は安定しており、豊富なミネラルが含有されている等、表層水とは違った利点を有している。このような海洋深層水としては、現在、１０都道県で１６か所存在する取水施設で採水した海洋深層水を用いることができる。このような取水施設としては、静岡県伊豆半島、新潟県佐渡島、沖縄県久米島、鹿児島県甑島、高知県室戸、富山県滑川、北海道羅臼島等が挙げられる。これらのうち、海洋深層水は、静岡県伊豆半島沖で採水した海洋深層水が好ましく、伊豆赤沢沖の海洋深層水がより好ましい。
【００１４】
伊豆赤沢沖の海洋深層水は、例えば伊豆赤沢沖の水深２００〜１０００ｍから汲み上げられた海洋深層水であり、好ましくは伊豆赤沢沖の水深８００ｍから汲み上げられた海洋深層水である。以下、伊豆赤沢沖の水深８００ｍから汲み上げられた海洋深層水を、単に「伊豆赤沢海洋深層水」と称することがある。伊豆赤沢海洋深層水は、表層水に比べて、微生物の存在比が数千分の一程度である。さらに、伊豆赤沢は、水の大消費地である首都圏・大都市圏に最も近い海洋深層水の取水地であり、輸送その他の経費を考慮した場合、他の地域に比べてコストメリットが大きい。他方で、首都圏に最も近いということは、京浜地域によって汚染された東京湾から太平洋に向けて流れ出た海水によって汚染されることが懸念される。ところが、伊豆半島付近の海洋表層には、北東方向に向けて黒潮が流れており、また、伊豆半島南東沖海底には高い海底火山群からなる伊豆・小笠原弧が形成されている。したがって、実際には、伊豆赤沢沖には、黒潮の流れ、そして、伊豆・小笠原弧によって、東京湾から流れ出た汚染された海水が流れ込むことはない。このため、伊豆赤沢沖は、首都圏・大都市圏に最も近い海洋深層水の取水地でありながら、汚染されていない清浄性の高い海洋深層水を得ることができる場所となっている。
【００１５】
また、伊豆赤沢海洋深層水のミネラル（無機塩）バランスは、カリウム：カルシウム：マグネシウム：ナトリウム＝１：１：３：２４（質量比）である。本発明者らにより、伊豆赤沢海洋深層水中のミネラル類は、細胞の営みに大きな影響を及ぼすことが判明しており、伊豆赤沢海洋深層水に由来する利点は、単一のミネラルの多さによるものではなく、全体としてのミネラルバランスによるものと推測される。また、伊豆赤沢海洋深層水は、日本最深の８００mから取水しており、硝酸態窒素等の無機栄養塩を豊富に含んでいるという特性もある。
【００１６】
上記のような海洋深層水は、例えば、取水地点の深さに対応する長さ（通常２００〜１０００ｍ）の採水用管体を備えた採水装置を用いて採水することができる。このような採水装置及び採水方法としては、従来知られているものを使用することができる。
【００１７】
海洋深層水としては、上記のように水深２００ｍ以深から汲み上げられた海洋深層水の原水をそのまま使用してもよいし、逆浸透膜装置や電気透析装置等の処理を施した水を使用してもよい。好ましくは海洋深層水の原水、より好ましくは伊豆赤沢海洋深層水の原水をそのまま使用する。また、海洋深層水としては市販品を使用してもよく、このような市販品としては、例えば、伊豆赤沢海洋深層水を利用した飲料水である、商品名「生命のバランスＤＨＣ海洋深層水」（ディーエイチシー社製）等が挙げられる。
【００１８】
育毛剤組成物中の海洋深層水の含有量としては、海洋深層水の原水の濃度として、０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌがより好ましく、０．１〜５ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。海洋深層水の含有量が好ましい範囲内であると、育毛効果（ＶＥＧＦの発現）の点で有利である。
【００１９】
また、ＤＮＡ加水分解物とは、動植物から抽出したＤＮＡ又は合成により得られたＤＮＡを加水分解処理することにより調製することができる成分である。ＤＮＡの供給源は、動物、植物、微生物等の様々な生物であってよく、また、ＤＮＡとしては合成ＤＮＡを使用してもよいが、特に、ＤＮＡを多く含むことや水産加工上の廃棄物を有効利用できるといった観点から、鮭、鱒、鱈といった魚類の精巣（白子）由来のＤＮＡを使用することが好ましい。魚類の精巣からのＤＮＡの抽出及び精製は常法により行うことができる。例えば、魚類の精巣を粗砕し、粗砕した魚類の精巣にＤＮＡが分解しない条件下でタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）処理を行い、酵素処理した溶液を濾過する。そして分画分子量が２，０００〜１，０００，０００である中空糸膜を用いて濾液に透析処理を行い、分解したタンパク質およびイオン類を除去すると共に二本鎖ＤＮＡを濃縮する。さらに、透析等の処理を施して、ＤＮＡをＤＮＡ塩（ＤＮＡナトリウム塩）として沈殿させ、この沈殿物を回収する。
【００２０】
得られたＤＮＡ塩を、ヌクレアーゼ等の核酸分解酵素を用いて加水分解することにより、ＤＮＡ加水分解物を得ることができる。加水分解処理に使用するヌクレアーゼとしては、例えば、アオカビ由来のヌクレアーゼを使用することができる。加水分解は、例えば、６５℃前後に調整した温水に原料として粉末状ＤＮＡ−Ｎａ塩を投入し、撹拌後、さらに７０℃に加温し、原料に対してヌクレアーゼ０．２５％を加えて３時間反応させることで行うことができる。加水分解処理時の温度としては、６０〜７５℃が好ましく、７０℃がより好ましい。得られた加水分解生成物を例えば凍結乾燥させることで、粉末状のＤＮＡ加水分解物を得ることができる。上記の手法によるＤＮＡ加水分解物は、通常、ナトリウム塩（以下、「加水分解ＤＮＡ−Ｎａ」と称する場合がある）の状態で得ることができる。なお、ナトリウム塩に限られるものではなく、例えばカリウム塩又は遊離体であってもよい。
【００２１】
ＤＮＡ加水分解物は、分子量が５００〜１０，０００である画分を１０〜７０質量％含有することが好ましく、分子量が１０００〜３０００である画分を２０〜５０質量％含有することがより好ましい。また、鎖長が１〜１５のデオキシオリゴヌクレオチドを１０〜４０質量％含有することが好ましく、鎖長が２〜１２のデオキシオリゴヌクレオチドを２０質量％含有することがより好ましい。
【００２２】
育毛剤組成物中のＤＮＡ加水分解物の含有量としては、０．１〜５０ｍｇ／ｍｌが好ましく、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌがより好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍｌがさらに好ましい。ＤＮＡ加水分解物の含有量が好ましい範囲内であると、育毛効果（ＶＥＧＦの発現）の点で有利である。
【００２３】
本発明の育毛剤組成物は、少なくとも海洋深層水を含有していればよいが、ＤＮＡ加水分解物をさらに含有させることで、育毛効果をさらに向上させることができる。海洋深層水とＤＮＡ加水分解物とを併用する場合、両者の含有量比に特に制限はないが、質量比で、海洋深層水：ＤＮＡ加水分解物＝２０：１〜０．１：１が好ましく、１０：１〜１：１がより好ましい。両者の含有量比が好ましい範囲内であると、育毛効果（ＶＥＧＦの発現）の点で有利である。
【００２４】
本発明の育毛剤組成物は、海洋深層水と、好ましくはＤＮＡ加水分解物と、必要に応じてその他の成分とを常法に応じて混合することにより、所望の剤型に製造することができる。
本発明の育毛剤組成物は、頭皮及び毛髪に塗布して使用するための頭髪用化粧品として提供することができ、また、経口摂取して使用するためのサプリメント等の健康食品として提供することもできる。なお、本発明において化粧品とは薬事法の化粧品に加え、医薬部外品も包含される。また、経口投与用又は非経口投与用の医薬品として提供することも可能である。本発明の育毛剤組成物は、ヒトに対して好適に使用されるが、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物に対して使用されてもよい。
【００２５】
本発明の育毛剤組成物を頭髪用化粧品として提供する場合、例えば、液状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状、エアロゾル状等の剤型で、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアトニック、ヘアローション、ヘアクリーム、ムース、ジェル等として提供することができる。これらの各種剤型の頭髪用化粧品は、常法に応じて製造することができる。頭髪用化粧品として提供する場合、育毛剤組成物が含有し得るその他の任意成分としては、特に制限はなく、通常の化粧品に配合され得る添加剤等を使用することができる。このような添加剤としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、酸化防止剤、ビタミン剤、天然抽出物等が挙げられる。また、その他の任意成分として、ミノキシジル、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸二カリウム等の他の公知の育毛成分を含有していてもよい。育毛剤組成物中のその他の任意成分の含有量にも、特に制限はなく、所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
本発明の育毛剤組成物を医薬品として提供する場合、その投与経路としては、経口投与、非経口投与のいずれを採用してもよい。例えば、海洋深層水と好ましくはさらにＤＮＡ加水分解物とを配合した、乳剤、懸濁剤等の経口投与用液状製剤、軟膏、クリーム剤等の皮膚用外用剤、注射剤等として提供することができる。このような医薬品は常法に応じて製造することができる。医薬品として提供する場合、育毛剤組成物が含有し得るその他の任意成分としては、特に制限はなく、通常の医薬品に配合され得る製剤用担体や添加剤等を使用することができる。また、その他の任意成分として、ミノキシジル、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸二カリウム等の他の公知の育毛成分を含有していてもよい。育毛剤組成物中のその他の任意成分の含有量にも、特に制限はなく、所望の剤型等に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
本発明の育毛剤組成物は、上記のように海洋深層水と、好ましくはさらにＤＮＡ加水分解物とを有効成分として含有し、毛乳頭細胞等からの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を促進する作用を有する。本発明の育毛剤組成物は、このＶＥＧＦ産生促進作用を介して、毛包周囲の毛細血管網の発達を促進し、毛母細胞へ栄養を供給して毛母細胞の活性化を促すことで、抜け毛、薄毛の改善（抜け毛を減らす等）、髪質の改善（髪を太くする、ハリ、コシを与える等）、頭皮の健康状態の改善（フケ、かゆみ、乾燥を抑える等）等を導く育毛効果が期待できる。また、本発明の育毛剤組成物は、海洋深層水と、魚類の精巣等を原料としたＤＮＡ加水分解物という、天然由来の成分を有効成分とするため、安全性に優れるという利点もある。よって、本発明は、海洋深層水を含有し、好ましくはＤＮＡ加水分解物をさらに含有し、必要に応じてその他の任意成分をさらに含有する、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤にも関する。本発明の育毛剤組成物又はＶＥＧＦ産生促進剤がＶＥＧＦ産生促進作用を有することは、例えば、毛乳頭細胞等におけるＶＥＧＦｍＲＮＡの発現促進作用を常法により評価することで確認することができる。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［実施例１］ＶＥＧＦ産生促進作用試験
海洋深層水とＤＮＡ加水分解物（加水分解ＤＮＡ−Ｎａ）とを、各々単独で使用した場合、又は両者を併用した場合のＶＥＧＦ産生促進作用の評価を以下のようにして行った。
【００３０】
（１）三次元ヒト皮膚モデル培養（ＮＢモデル）
人工コラーゲン線維ゲル（ＦＩＢＲＩＧＥＬ  ３５Ｄ、(株)ムトウ社製）にヒト正常線維芽細胞（ＣｒｙｏＮＨＤＦ−Ｎｅｏ  ＬＯＮＺＡ(株)社製）を細胞密度が２×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種し、コンフルエントに到達したことを確認しながら７〜８日間培養した。培養後、培地を除去し、ヒト正常角化細胞（ＣｒｙｏＮＨＥＫ−Ｎｅｏ  ＬＯＮＺＡ(株)社製）を細胞密度が２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように上から播種し、混合培地（ブレッドキッドＫＧＭＧｏｌｄ（ＬＯＮＺＡ(株)社製）：ブレッドキッドＦＧＭ２（ＬＯＮＺＡ(株)社製）＝８０：２０）で共培養した。共培養後４日目に、培地中に５０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにコラゲナーゼを加え、３７℃で２時間インキュベーションさせた後、培地を除去し、滅菌ピンセットを用いてシートを１２ｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ポアサイズ３.０μｍ、ＦＡＬＣＯＮ(R)）の上へ移動し、１２ｗｅｌｌセルカルチャーインサート用プレート（ＦＡＬＣＯＮ(R)）へ設置した。プレート側に培地０．６ｍＬを添加し、５〜９日間気液界面培養（シート表面は空気へ暴露）を行い、ＮＢモデルを作製した。得られたＮＢモデルに、角層上部から、下記の各海洋深層水及び／又は加水分解ＤＮＡ−Ｎａの各試料を５０μＬ添加した。海洋深層水及び／又は加水分解ＤＮＡ−Ｎａ試料を添加後、８時間後にＰＢＳで２回洗浄し、ＮＢモデルを回収した。
【００３１】
上記のＮＢモデルへの添加に使用した各海洋深層水及び／又は加水分解ＤＮＡ−Ｎａ試料の濃度は下記の通りであった。各試料は、精製水を溶媒として下記の濃度に調整した。
（ｉ）海洋深層水を単独で添加した場合の試料（図１）：海洋深層水の濃度は０．１、１、又は１０ｍｇ／ｍｌとした。
（ｉｉ）加水分解ＤＮＡ−Ｎａを単独で添加した場合の試料（図２）：加水分解ＤＮＡ−Ｎａの濃度は０．１、１、１０、又は２０ｍｇ／ｍｌとした。
（ｉｉｉ）海洋深層水と加水分解ＤＮＡ−Ｎａとの両者を添加した場合の試料（加水分解ＤＮＡ−Ｎａの濃度は２０ｍｇ／ｍｌに固定）（図３）：海洋深層水の原水の濃度は０．１、１、又は１０ｍｇ／ｍｌとした。
（ｉｖ）海洋深層水と加水分解ＤＮＡ−Ｎａとの両者を添加した場合の試料（海洋深層水の濃度は５ｍｇ／ｍｌに固定）（図４）：加水分解ＤＮＡ−Ｎａの濃度は０．１、１、１０、又は２０ｍｇ／ｍｌとした。
【００３２】
なお、海洋深層水としては、伊豆赤沢沖の水深８００ｍから汲み上げられた伊豆赤沢海洋深層水の原水を使用した。加水分解ＤＮＡ−Ｎａとしては、北海道で採取された鮭の精巣を粗砕し、粗砕した鮭の精巣にＤＮＡが分解しない条件下でタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）処理を行い、先に記載した一連の処理を行いＤＮＡをＤＮＡ塩（ＤＮＡナトリウム塩）として沈殿させた後、６５℃に調整した温水に原料として粉末状ＤＮＡ−Ｎａ塩を投入し、撹拌後、さらに７０℃に加温し、原料に対してヌクレアーゼ（アオカビ由来のヌクレアーゼ）０．２５％を加えて３時間反応させ、得られた加水分解生成物を凍結乾燥させることで、粉末状のＤＮＡ加水分解物としたものを用いた。
【００３３】
（２）ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ作成
ＮＢモデル（２枚分）に、ＲＮＡ抽出用試薬（ＩＳＯＧＥＮ、（株）ニッポンジーン製）を添加し、クロロホルムを加えて攪拌及び遠心分離を行い、ＲＮＡを含む水溶性画分を回収した。そこにイソプロピルアルコール及び７５％エタノールを加えて遠心分離をすることで精製されたＲＮＡを０．５％ＳＤＳ溶液に溶解し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液とした。さらに得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液についてＱＩＡＧＥＮ  ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  Ｋｉｔを用い、ｃＤＮＡ作製プロトコルに準じてｃＤＮＡを作製した。
【００３４】
（３）リアルタイムＰＣＲ
得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、リアルタイムＰＣＲの条件は９４℃で１分間の初期加熱後、変性９４℃（３０秒間）、アニーリング６０℃（１０秒間）、伸長反応７０℃（３０秒間）を４０サイクル行った。
【００３５】
ＶＥＧＦ遺伝子増幅用のプライマーとしては下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）。
センスプライマー：５’−ｃｃｃａｃｔｇａｇｇａｇｔｃｃａａｃａｔ−３’（配列番号：１）
アンチセンスプライマー：５’−ｔｔｔｃｔｔｇｃｇｃｔｔｔｃｇｔｔｔｔｔ−３（配列番号：２）
【００３６】
また、内部標準としてのＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用のプライマーとしては下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（Ｓｉｇｍａ−ｇｅｎｏｓｙｓ社製）。
センスプライマー：５’−ｇａｇｔｃａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｔｃｇｔ−３’（配列番号：３）
アンチセンスプライマー：５’−ｔｔｇａｔｔｔｔｇｇａｇｇｇａｔｃｔｃｇ−３（配列番号：４）
【００３７】
（４）ｍＲＮＡ発現量解析
リアルタイムＰＣＲにより得られたＣＴ値からスタンダード曲線を作成した。次に、（ＶＥＧＦ遺伝子のＣＴ値）／（ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣＴ値）の式で補正したＶＥＧＦ遺伝子の発現量を、上記スタンダード曲線の計算式により、コントロールの値を１とした相対値として計算した。試料添加無添加で同時間培養した際のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量を１とした際の、試料添加時のＶＥＧＦｍＲＮＡ発現量の相対値（倍率）を求めた。結果を図１〜４に示す。図１には、海洋深層水を単独で０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ添加した場合の結果を示す。図２には、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを単独で０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ添加した場合の結果を示す。図３には、海洋深層水を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ、及び、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを２０ｍｇ／ｍｌ併用して添加した場合の結果を示す。図４には、海洋深層水を５ｍｇ／ｍｌ、及び、加水分解ＤＮＡ−Ｎａを０〜２０ｍｇ／ｍｌ併用して添加した場合の結果を示す（ｎ＝３：試験を３回行い、その平均値を算出した。）。
【００３８】
図１の結果から、海洋深層水（原水）は、単独でＶＥＧＦ産生促進作用を有することがわかる。さらに、図１及び図２の対比からは、特に低濃度域（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）での海洋深層水（原水）のＶＥＧＦ産生促進作用が、加水分解ＤＮＡ−ＮａのＶＥＧＦ産生促進作用よりも強いことがわかる。これにより、海洋深層水（原水）は、単独で優れたＶＥＧＦ産生促進作用を有することが確認できた。
【００３９】
さらに、図３及び図４の結果から、海洋深層水（原水）と加水分解ＤＮＡ−Ｎａとを併用することで、より顕著にＶＥＧＦ産生促進作用を向上できることがわかる。また、図３及び図４の結果を、図１及び図２の結果と照らし合わせることで、両者を併用した場合の効果の程度（図３及び図４）は、各々を単独で使用した場合（図１及び図２）の効果の程度を足し合わせたよりも顕著に大きいことがわかる。これにより、海洋深層水（原水）と加水分解ＤＮＡ−Ｎａとの相乗効果が確認できた。
なお、海洋深層水原水を単独で含む場合の処方例は、以下の通りである。
・海洋深層水                                  ０．８重量％
・β−グリチルレチン酸                        ０．１重量％
・１，３−ブチレングリコール                １０．０重量％
・ニンジン抽出液                              ２．０重量％
・エタノール                                ３６．０重量％
・精製水                                              残余
【００４０】
［実施例２］育毛剤組成物の製造
以下の組成の育毛剤組成物（育毛トニック）を常法により製造した。なお、実施例３は、ローションとして調製したものを用いた。乳液として調製したものについては、組成のみを示した。
［組成］
（ローション）
・海洋深層水                                  ０．８重量％
・加水分解ＤＮＡ−Ｎａ                        ０．２重量％
・β−グリチルレチン酸                        ０．１重量％
・１，３−ブチレングリコール                １０．０重量％
・ニンジン抽出液                              ２．０重量％
・エタノール                                ３６．０重量％
・精製水                                              残余
（乳液）
・海洋深層水                                ０．８０重量％
・加水分解ＤＮＡ−Ｎａ                      ０．２０重量％
・β−グリチルレチン酸                      ０．１０重量％
・１，３−ブチレングリコール              １０．００重量％
・トリオクタン酸グリセリル                  ３．００重量％
・ホホバ油                                  １．００重量％
・オリーブ油                                １．００重量％
・天然ビタミンＥ                            ０．１０重量％
・ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノオレエート    １．５０重量％
・ソルビタンモノオレエート                  ０．５０重量％
・Ｌ−セリン                                ０．５０重量％
・ピロリドンカルボン酸ナトリウム            ０．１０重量％
・ポリビニルピロリドン                      ０．０５重量％
・防腐剤                                              適量
・精製水                                              残余
［製法］
得られた育毛剤組成物（育毛トニック）を１００ｍｌ容量のプッシュ式の容器に常法により充填した。
【００４１】
［実施例３］育毛評価試験
実施例２で得られた育毛剤組成物（育毛トニック）の育毛評価試験を以下のように行った。毛髪や頭皮の状態（抜け毛や薄毛、髪の細さやハリ・コシ、ボリュームの無さ、フケ、かゆみ、頭皮の乾燥等）が気になっている成人男性の被験者１１名に、毎日、起床時と就寝直前（シャンプー後、毛髪を十分乾燥させた後）の１日２回、育毛トニックを予め決めた試験部位に塗布してもらった。なお、試験部位は、試験開始にあたり、デジタルカメラで頭頂部を撮影し、その画像から毛髪の薄い部位を試験部位と定めた。１回の塗布は５〜８プッシュ程度の量（約１．５ｍｌ）とし、毛髪に極力つかないように被験部に直接塗布させた。塗布は６ヶ月間継続した。１ヶ月毎に毛髪の太さ（毛髪径、硬毛率）を計測し、また被験者による評価をアンケート調査により得た。
【００４２】
毛髪径（μｍ）は、マイクロスコープにより試験部位の毛根付近を撮影し、その画像から毛髪の太さを計測した。硬毛率（％）は、マイクロスコープにより毛髪の太さを計測し、直径が４０μｍより太い毛髪を硬毛とし、直径が４０μｍ以下の毛髪を軟毛として、測定した毛髪の全本数（約２０〜８０本）の内、硬毛の本数の割合を硬毛率（％）とした。
【００４３】
図５に、被験者の平均毛髪径（μｍ）の推移を示し、図６に、被験者の平均硬毛率（％）の推移を示す。なお、平均毛髪径及び平均硬毛率としては、０〜３ヶ月目については被験者１１名の平均値を、４〜６ヶ月目については被験者９名の平均値をそれぞれ示している。事情により被験者のうち２名が３ヶ月経過後に塗付を中止したためである。図５及び図６の結果から、実施例２の育毛トニックは、被験者の毛髪径、硬毛率を大幅に改善したことがわかる。
【００４４】
また、被験者による評価は、塗付後２ヶ月〜６ヶ月の各月ごとにアンケート形式で調査した。アンケート項目は、「抜け毛が減った」、「薄毛が気にならなくなった」、「髪が太くなった」、「髪にハリ、コシが出た」、「髪のボリュームがアップした」、「フケ、かゆみが抑えられた」、「頭皮の乾燥が抑えられた」、の７項目とし、各項目について自己評価でＹｅｓ（肯定的）かＮｏ（否定的）かの回答を得た。結果を表１に示す。２〜３ヶ月目については被験者１１名の結果を、４〜６ヶ月目については被験者９名の結果をそれぞれ示している。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
塗付後２カ月目の調査では、抜け毛が減った、髪にハリ、コシが出た、フケ、かゆみが抑えられた、頭皮の乾燥が抑えられた、の各評価項目において「Ｙｅｓ」と回答した人数が「Ｎｏ」と回答した人数を上回り、塗付後３ヶ月目以降の調査では、全ての評価項目において、「Ｙｅｓ」と回答した人数が「Ｎｏ」と回答した人数を上回った。また、表には示していないが、実施例２の育毛トニックは多くの被験者から「べたつかず使用感が良い」、「使用感がさっぱりしていて良い」といった感想も得られた。上記の結果から、実施例２の育毛トニックは、薄毛の改善や髪質の改善、また頭皮の健康状態の改善が可能なものであり、また使用感にも優れていたことがわかる。
【００４７】
上記の育毛評価の結果から、本発明の育毛剤組成物は、薄毛の改善、髪質の改善、頭皮の健康状態の改善といった育毛に関連する様々な作用を有し、特に、１本１本の毛髪を太くできる（毛髪径の向上、図５）だけでなく、頭皮の一定の面積に占める太い毛髪の割合を増加させることができる（硬毛率の向上、図６）ことから、特に髪の細さやボリュームの無さの改善、薄毛の改善といった育毛効果に優れていると考えられた。また、塗付前〜２ヶ月後迄の硬毛率、毛髪径の改善及びアンケート結果から分かるように、本発明の育毛剤組成物は、例えば２〜３ヶ月間といった短期間の塗布でも所望の育毛効果を得ることができ、即効性に優れるという利点もあると考えられた。さらに、海洋深層水を有効成分とすることから、べたつきを生じづらく、使用感に優れた育毛剤組成物として製造できることもわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の育毛剤組成物は、例えば、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアトニック、ヘアローション、ヘアクリーム等の頭髪用化粧品やサプリメント等の健康食品、医薬品等に好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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