(57)【要約】酸化剤（例えばKMnO4）で処理し、反応産物MnO2の生成もしくは生成速度、またはKMnO4の消費もしくは消費速度の差を決定することにより、核酸試料のコンフォメーション変化を検出する方法。差の存在は、特にDNAが例えば環境的な塩濃度および温度または電流に曝露される場合における試験試料のコンフォメーション変化を意味する。本発明の方法では、例えばDNAが挿入剤に曝露された場合におけるDNAのコンフォメーション変化を調べる。化合物を対象に、DNAのコンフォメーション変化を調べるための本発明の方法の使用についても説明する。このようなコンフォメーション変化は、分光光度計で吸光度を測定する比色無機アッセイ法で決定される。OsO4またはクロム酸またはオゾンガス、または過酸化物または過安息香酸または電流を含むマンガン酸塩以外の他の酸化剤の使用について本明細書の本文で説明する。
2005526230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試験2本鎖試料および対照2本鎖試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験試料と対照試料との間において、
（a）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
に差が存在するかどうかを判定する段階を含み、差の存在は、試験試料のコンフォメーション変化を示す、試験条件に曝露された試験核酸2本鎖試料の、対照核酸2本鎖試料に対するコンフォメーション変化を検出する方法。
【請求項２】
酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試料の処理を、一定時間、摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験試料と対照試料との間において、
（a）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
における差を定量する段階、ならびに
コンフォメーション変化が既知程度で生じる薬剤による試験において、同様の核酸2本鎖試料の曝露により決定された定量後の差と、上記の段階で定量した差とを比較する段階を含む、試験条件に曝露された核酸2本鎖試料の、対照核酸2本鎖試料に対するコンフォメーション変化の程度を決定する方法。
【請求項３】
酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による第1および第2の核酸2本鎖試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
第1の核酸2本鎖試料と第2の核酸2本鎖試料との間において、
（c）1種類または複数の反応産物の生成または生成速度；
（d）1種類または複数の開始薬剤の消費または消費速度
に差が存在するかどうかを判定する段階を含み、差の存在は、2種類の核酸2本鎖試料間のコンフォメーションの差を示す、2種類の核酸2本鎖試料間のコンフォメーションの差を検出する方法。
【請求項４】
酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試験核酸2本鎖試料および対照核酸2本鎖試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験2本鎖試料と対照2本鎖試料との間において、
（a）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
に差が存在するかどうかを判定する段階を含み、差の存在は、試験試料がコンフォメーションの変化条件に曝露されたことを示す、試験核酸2本鎖がコンフォメーション変化条件に曝露されたか否かを判定する方法。
【請求項５】
1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度、および/または1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度の追跡を、紫外可視分光法、蛍光分光法、NMR分光法、質量分析、クロマトグラフィー、滴定、比色定量、電気化学的検出、視覚的検出、溶解温度検出、および酸化還元染色からなる群より選択される手法で行う、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度、および/または1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度が、酸化剤および/または還元状態の酸化剤の存在を追跡することに関与する、請求項5記載の方法
【請求項７】
手法が紫外可視分光法または蛍光分光法である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
酸化剤がKMnO4であり、反応産物の生成もしくは生成速度の追跡に、約420 nmでの吸光度の測定が含まれる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
酸化剤がKMnO4であり、開始薬剤の消費もしくは消費速度の追跡に、約525 nmでの吸光度の測定が含まれる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
個々の試験核酸2本鎖および対照核酸2本鎖の酸化に関する等吸収点を決定することをさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
手法が視覚的検出である、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
酸化剤による処理を受けた2本鎖の溶解温度を追跡することを手法に含む、請求項5記載の方法。
【請求項１３】
酸化剤がKMnO4である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
試験条件またはコンフォメーション変化条件が、放射能、温度変化、pH変化、電流、磁場、または塩濃度変化からなる群より選択される環境的条件であるか、あるいは潜在的な薬学的産物もしくは獣医学的産物、農薬、ヒトもしくは動物による消費を対象とした産物、化粧品もしくは他の個人使用製品、衣料品もしくは製造過程に見られる化合物、または植物の抽出物、動物の抽出物もしくは微生物の抽出物もしくは土壌試料、水試料もしくは空気試料などの供給源から同定される化合物からなる群より選択される化合物に対する曝露である、請求項1、2、または4のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
薬学的産物または獣医学的産物が抗癌剤または抗微生物剤である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
区分された状態にあり、かつ酸化剤もしくは反応剤、塩基（もしくはその塩）、試験核酸2本鎖もしくは対照核酸2本鎖、緩衝液、および分光光度測定用セルからなる群より選択される少なくとも2種類の成分を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法を行うために適合されたキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、2本鎖核酸のコンフォメーション変化の検出法および定量法に関する。特に本発明は、2本鎖核酸のコンフォメーションに及ぼす環境的条件および化合物曝露の作用を試験するための使用可能な方法に関するが、これのみに限定されるわけではない。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
DNAのコンフォメーション、ならびに低分子量の有機分子および無機分子、または環境因子によるDNAのコンフォメーションの摂動（pertubation）は、化合物および他の環境物質の毒性試験（特に製薬業、食品産業、および化粧品産業など）に関連する研究において重要な問題となっている。結果として得られる付加物のコンフォメーション変化、結合エネルギーおよび動力学を理解するための取り組みにおいては、2本鎖核酸（DNAおよびRNAなど）と、環境因子または化合物（挿入剤、他のDNA結合リガンド、またはNaCl、MgCl2、CaClなどの高濃度の塩）との間の相互作用を追跡するために多くの先進的な方法が開発されている1,2。
【０００３】
コンフォメーション変化を追跡するために過去に用いられたいくつかの物理的方法および化学的方法には、沈降測定、蛍光エネルギー移動実験、フットプリンティングアッセイ法、X線結晶解析、核磁気共鳴（NMR）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ならびに酵素による切断3および化学的切断などが挙げられる。これらの方法は強力であるが、一般に長い時間を要し、高性能の装置、および熟練した操作担当者を必要とする。実験動物、ツユクサ科（Tradescantia）の植物（放射能検出用）、および細菌または哺乳類細胞系列の使用などの他の生物学的試験法も、化合物の変異原性もしくは発癌性、または環境的条件の可能性を検討する取り組みにおいて過去に採用されている。サルモネラ菌を使用するエイムス試験は、おそらく現在利用可能な最も有名な試験法である。しかし残念ながら、このような生物学的試験手段では、対象生物の核酸における可能性の高い核酸のコンフォメーション変化の正確な予測因子が提供されず、そして実施に長い時間を要し、高額の費用がかかることが少なくない。
【０００４】
したがって、環境的条件または化合物曝露の結果として生じる可能性のある、2本鎖核酸のコンフォメーション変化を検出および/または定量するための単純で正確な手段の必要性は差し迫ったものとなっている。このような手段では、細菌細胞を培養する必要が回避されていて、そして分離段階の実施が回避されるか、または分離段階に基づく方法において高い解像度または識別能（例えば高度の分離）がもたらされることが好ましい。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は一般に、化学的条件または環境的条件に対する曝露の結果としての、2つの核酸2本鎖間におけるコンフォメーションの差、または第1すなわち試験核酸2本鎖のコンフォメーション変化を検出する方法に関する。本発明の方法は以下の段階で実施することができる：（i）第1すなわち試験核酸2本鎖を、有効量の酸化剤または反応剤と、一定時間、1種類の摂動塩基または複数の摂動塩基が第1すなわち試験核酸2本鎖内で十分酸化するかまたは反応する条件で処理する段階；（ii）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度、および/または1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度を追跡する段階；ならびに（iii）第1すなわち試験核酸2本鎖と、別個に段階（i）および（ii）と同じ条件で処理した第2すなわち対照核酸2本鎖との間において、1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度、および/または1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度に差があるか否かを判定する段階。第1すなわち試験核酸2本鎖と、第2すなわち対照核酸2本鎖との間において、1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度、および/または1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度に差があれば、2つの2本鎖間にコンフォメーションの差があるか、または第1すなわち試験核酸2本鎖にコンフォメーション変化があることを意味する。
【０００６】
したがって本発明の一つの態様では、酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試験2本鎖試料および対照2本鎖試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験試料と対照試料との間において、
（a）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
に差があるか否かを判定する段階を含み、差の存在は、試験試料のコンフォメーション変化を示す、試験条件に曝露された試験核酸2本鎖試料の、対照核酸2本鎖試料に対するコンフォメーション変化を検出する方法を提供する。
【０００７】
本発明は、試験条件に曝露された核酸分子の巻き戻し（unwinding）の程度（コンフォメーション変化の程度）を決定する際に有用な可能性もある。
【０００８】
したがって本発明の別の態様では、酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験試料と対照試料との間において、
（a）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
における差を定量する段階、ならびに
コンフォメーション変化が既知程度で生じる薬剤による試験において、同様の核酸2本鎖試料の曝露により決定された定量後の差と、上記の段階で定量した差とを比較する段階を含む、試験条件に曝露させた核酸2本鎖試料の、対照核酸2本鎖試料に対するコンフォメーション変化の程度を決定する方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による第1および第2の核酸2本鎖試料の処理を、一定時間、また2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
第1の核酸2本鎖試料と第2の核酸2本鎖試料との間における、
（a）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
に差が存在するかどうかを判定する段階を含み、差の存在は、2種類の核酸2本鎖試料間のコンフォメーションの差を示す、2種類の核酸2本鎖試料間におけるコンフォメーションの差を検出する方法を提供する。
【００１０】
本発明のさらに別の態様では、酸化剤もしくは反応有効量の酸化剤または反応剤による試験核酸2本鎖試料および対照核酸2本鎖試料の処理を、一定時間、2本鎖内の摂動塩基が十分酸化するかまたは反応する条件で個別に行う段階、ならびに
試験2本鎖試料と対照2本鎖試料との間において、
（a）1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または
（b）1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度
に差が存在するかどうかを判定する段階を含み、差の存在は、試験試料がコンフォメーション変化条件に曝露されたことを示す、試験核酸2本鎖がコンフォメーション変化条件に曝露されたか否かを判定する方法を提供する。
【００１１】
本発明の一つの態様では、試験核酸2本鎖試料を、放射能、温度変化、pH変化、電流、磁場、または塩濃度変化などの環境的条件がコンフォメーション変化を生じるか否かを判定するために、このような環境的条件に曝露させる。
【００１２】
本発明の別の態様では、試験核酸2本鎖試料を、1種類または複数の化合物が、変異原性、発癌性、または細胞死につながる可能性のあるコンフォメーション変化を生じるか否かを判定するために、このような化合物に曝露させる。
【００１３】
例えば、試験対象となる化合物は、有機分子もしくは無機分子の場合があり、そして薬学的もしくは獣医学的産物、ヒトもしくは動物によって消費される産物、化粧品もしくは他の個人使用製品（例えばシャンプー、石鹸、デオドラント、毛染め剤、日焼け止め剤）、衣料品（例えば色素、サイジング剤、防虫剤（mothproofing agent）、縮み防止剤（shrink resistance agent））、製造過程に潜在的に有用な化合物を含む場合があるほか、植物、動物もしくは微生物の抽出物、または土壌、水もしくは空気試料などの供給源から同定される化合物の場合がある。
【００１４】
本発明の別の好ましい態様では、酸化剤はKMnO4、OsO4、クロム酸、オゾンガス、過酸化物、過安息香酸、および電流、ならびにヒドロキシルアミン、カルボジイミド、および酵素に由来する反応薬剤からなる群より選択することができる。
【００１５】
本発明のさらに別の態様では、（a）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の反応産物の生成もしくは生成速度；および/または（b）酸化もしくは反応の1種類もしくは複数の開始薬剤の消費もしくは消費速度における差を判定または定量するには、分光法（例えば紫外可視）、クロマトグラフィー、滴定、比色定量、融点決定、電流、酸化種もしくは還元種と別の薬剤との結合、酸化還元染色剤の使用、または視覚的検出で実施することができる。
【００１６】
本発明の一つの好ましい態様では、試験試料と対照試料との間におけるMnO2の生成の差を、KMnO2を酸化剤として、比色無機アッセイ法により検出および/または定量する。好ましくは、このアッセイ法は、約400 nm〜約440 nm（好ましくは約420 nm）における吸光度を測定する段階を含む。好ましくは、本発明のこの態様における酸化はTEACまたはTMACの溶液中で実施する。
【００１７】
本発明は、添付の図面を参照として、例を挙げることのみを目的としてさらに説明する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本明細書および請求項を通して、文中で特に指摘しない限り、「〜を含む（comprises）」という表現、ならびに「〜を含む（comprises）」および「〜を含む（comprising）」などの類似表現は、記載された整数値もしくは段階、または整数値の群もしくは複数の段階を含む（ただし他の任意の整数値もしくは段階、または整数値の群もしくは複数の段階を除外しない）ように理解される。
【００１９】
本明細書における、任意の先行技術に関する言及は、先行技術がオーストラリアにおける一般的な知識の一部を形成しているということを認めていること、または何らかの示唆を意味せず、また認めたことを意味すべきではない。
【００２０】
上述したように、本発明が有用であることに関して数多くの目的がある。例えば本発明は、放射能（電磁気放射能もしくはイオン化放射能など）、温度変化、pH変化、電流、磁場、もしくは塩濃度の変化が、化合物による核酸2本鎖のコンフォメーションに及ぼす作用の決定に有用な可能性がある。このような化合物は合成化合物である場合もあれば天然の化合物の場合もあり、薬学的産物、獣医学的産物、農薬、ヒトもしくは動物による消費物、化粧品、または他の個人使用製品中、衣料品もしくは製造過程において使用が試みられる場合があり、またはこのような化合物は、製造過程もしくは産業過程から環境中に放出される場合があり、また例えば植物、動物、もしくは微生物の抽出物、または土壌試料、水試料、もしくは空気試料から同定される場合がある。想定される化合物には、ポリメラーゼ酵素などの酵素、および臭化エチジウム、ドキソルビシン、ダウノマイシン、および9-アミノアクリジンなどの既知のDNA結合剤などが挙げられる。特に、潜在的な薬学的産物または獣医学的産物、農薬（例えば肥料、殺虫薬、除草剤）、ヒトもしくは動物の食料、および化粧品の場合、このような化合物が、核酸のコンフォメーションの変化を生じる可能性があるか否かを判定することが可能である。
【００２１】
このような変化は、潜在的な変異原性、発癌性、または細胞死の指標となる可能性がある。薬学的産物、もしくは獣医学的産物、または抗微生物産物、もしくは農薬産物の場合は、核酸2本鎖のコンフォメーション変化（このような2本鎖核酸を含む細胞または生物体に有害な場合がある）を生じることが望ましい場合がある。特に、細胞に有害な薬剤（細胞死を生じる）は、抗癌剤、または抗微生物剤、特に抗菌剤として有用な場合がある。
【００２２】
本発明の別の局面では、また化合物によって生じるコンフォメーション変化の程度が既知の場合は、本発明の方法で、このような化合物の濃度を決定することができる。
【００２３】
核酸2本鎖の「コンフォメーション変化」または「コンフォメーションの変化」（および類似表現）という表現は、対照核酸2本鎖内における位置に対する2本鎖の成分（特に塩基）の相対的な空間配置に変化を生じることを意味する。このような対照核酸2本鎖は、好ましくは、コンフォメーション変化の検討対象となる核酸2本鎖もしくはこの試料と実質的に同一な核酸2本鎖もしくはこの試料である。対照2本鎖内の対応する位置に対して空間的な位置が変化した1種類または複数の塩基の場合、このような塩基は「摂動塩基（pertubated base）」と呼ぶことができる。1個または複数の摂動塩基を含む2本鎖核酸は、「摂動2本鎖」と呼ぶことができる。2つの核酸2本鎖における「コンフォメーションの差」という表現は、2本鎖の成分（特に塩基）の相対的な空間的配置における差を意味する。
【００２４】
当業者であれば適切に理解するように、2本鎖DNAの通常のコンフォメーションはB型コンフォメーションであり、主溝および副溝によって特徴付けられる右巻きの2本鎖の状態をとり、またすべての塩基がantiコンフォメーションである。第2の、DNAの高エネルギーコンフォメーションはZ型コンフォメーションであり、逆平行DNAの2本の鎖がワトソン-クリック塩基対合で連結されていて、塩基は、antiコンフォメーションと、また非定型のsynコンフォメーションで交互に出現する。Z型DNA内には、主鎖はジグザグの経路をとり、B型DNAの副溝に対応する唯一の狭い溝がある。B型DNAが、高い塩濃度（例えば過剰の3 M NaCl、CaCl2、MgCl2など）に曝露されると、B型はZ型コンフォメーションに変換する。2本鎖DNAの他のいくつかの一般的なコンフォメーションがあり、また環境的条件または化合物曝露によって生じる可能性のある、コンフォメーションのわずかな修飾は無数にある。特にDNA結合剤（特に挿入剤）がコンフォメーション変化を生じることはよく知られている。平面状芳香族構造の形状を誘導する場合の多い挿入剤の場合は、本発明の方法で容易に検出可能な、2本鎖構造内で、巻き戻しが誘導される場合がある。挿入剤とは対照的に、DNAの主溝または副溝に結合するリガンドは一般に、小規模なコンフォメーション変化しか生じない。
【００２５】
詳細な説明で使用される「修飾」（および類似表現）という表現は、「酸化」および「反応」（および類似表現）と互換的に使用することができる。
【００２６】
本明細書で用いる「核酸2本鎖」という表現は、ハイブリダイズした2個の1本鎖核酸分子から生じる2本鎖を意味する。好ましくは、このような核酸2本鎖は、完全に相補的に塩基対合するが、2本鎖が1個もしくは複数の誤対合の塩基または非対合の塩基を含む場合があることが考慮される。相補的塩基対形成は、第2の1本鎖分子とハイブリダイズした第1の1本鎖核酸分子からなる2本鎖の核酸2本鎖内で生じる。この場合、G塩基とC塩基が結合し、またA塩基とT塩基（またはU塩基とA塩基）が結合する。コンフォメーション変化であり、塩基変化（すなわち変異）でないことを確実に判定するためには、試験核酸2本鎖および対照核酸2本鎖は、実質的に同一の核酸配列を有する（2本の核酸2本鎖は完全に塩基対合するか、または1種類もしくは複数の誤対合塩基もしくは非対合塩基を含む）。試験核酸2本鎖および対照核酸2本鎖が、1個または複数の誤対合塩基もしくは非対合塩基を含む場合は、酸化剤または反応剤の量を増やす必要がある場合があると理解される。というのは、誤対合塩基または非対合塩基も、酸化剤または反応剤と反応する場合があるからである。
【００２７】
本明細書で用いる「1本鎖核酸分子」という表現は、少なくとも2個のヌクレオチドを含む1本鎖分子を意味する（すなわち核酸2本鎖は、少なくとも2対のヌクレオチド、好ましくは少なくとも10対のヌクレオチドを有する）。したがって本発明の方法は、2個のヌクレオチド（2対のヌクレオチドを有する2本鎖）から全ゲノムまでを有する、ハイブリダイズした1本鎖核酸分子に由来する2本鎖に適用することができる。好ましくはこのような核酸分子はヌクレオチド配列である。
【００２８】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という表現は、リン酸基、糖部分、または修飾糖部分、および窒素含有塩基を含むモノマー単位を意味する。好ましい糖部分は、リボースおよびデオキシリボースなどのペントース糖である。しかし、ヘキソース糖も「糖部分」の範囲に含まれるとみなすことができる。修飾糖部分は、1種類または複数のヒドロキシル基の数および/または位置、および/または方向が天然の糖部分とは異なり、および/または酸素原子が窒素または硫黄などの別の原子と置換された糖部分を含む。窒素含有塩基は、核酸2本鎖内の対合または誤対合の際に作用可能な部分を含む、またプロトンアクセプターとして作用する任意の窒素を意味する。好ましい窒素含有塩基は環状であり、好ましくは1個または複数の環（例えば単環または二環）を含み、また少なくとも1個の窒素原子を含む。好ましい窒素含有塩基には、ウラシル、チミン、およびシトシンなどのピリミジン塩基、ならびにアデニンやグアニンなどのプリン塩基、またはこれらの単純な誘導体（デアザプリンおよびイノシンなど）がある。
【００２９】
本明細書で用いる「ヌクレオチド配列」という表現は、以下からなる群より選択されるヌクレオチドの直線状の配列を意味する：
2'-デオキシシチジン5'-リン酸；シチジン5'-リン酸；
2'-デオキシアデノシン5'-リン酸；アデノシン5'-リン酸；
2'-デオキシグアノシン5'-リン酸；グアノシン5'-リン酸；
2'-デオキシチミジン5'-リン酸；チミジン5'-リン酸；
2'-デオキシウリジン5'-リン酸；ウリジン5'-リン酸；
または、これらの単純な誘導体（デアザプリンおよびイノシンなど）。
【００３０】
「試験核酸2本鎖」は、本明細書に記載されている条件のような、環境的条件または化学的条件（試験条件）に曝露された2本鎖を、このような条件の結果としてのコンフォメーション変化を検討することが望ましいように含む。試験2本鎖が、実際に、コンフォメーション変化条件に曝露されていない場合があるが、それでも曝露されたか否かの判定に望ましいことは言うまでもない。
【００３１】
「対照核酸2本鎖」は、実質的に同じ（好ましくは同一な）ヌクレオチド配列を含み、試験核酸2本鎖と同様に塩基対を形成するが、そのコンフォメーションがコンフォメーション変化条件への曝露によって変化していない2本鎖を含む。しかし、対照核酸2本鎖が、コンフォメーション変化条件に対する所定の曝露、または定量化された曝露の結果としてコンフォメーション変化を含む場合がある2本鎖を含むことも認識される。したがって、所定の程度または定量された程度のコンフォメーション変化を有する対照2本鎖を提供することによって、試験核酸2本鎖のコンフォメーション変化の程度を比較することができる。
【００３２】
本明細書で用いる「コンフォメーション変化条件」という表現は、このような条件に曝露された核酸2本鎖内に、コンフォメーションの変化またはコンフォメーション変化を生じる条件を意味する。このような条件は、放射能（例えば電磁気またはイオン化）、温度変化、pH変化、電流、磁場、または塩濃度変化などの環境的条件、ならびに化学的条件（本明細書に記載された酵素および他の化合物などの、化合物に対する曝露）を含む。「試験条件」という表現は、作用が検討対象となるコンフォメーション変化条件を意味する。
【００３３】
核酸2本鎖は天然供給源から抽出することが可能であり、市販品を合成済みの状態で入手可能であり、溶解および再アニーリングによって核酸2本鎖から入手することが可能であり、また精製済みのゲノムDNAもしくはRNA、またはPCR産物から得られる。核酸2本鎖を形成する第1および第2の1本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションは、当技術分野における周知の方法で実施してもよく、または核酸2本鎖を増幅するPCR過程の結果として生じさせてもよい。一つの適切な種類の2本鎖は、高温で反応させて、溶解によって酸化または反応を低下させることが可能なロックド（locked）DNAである。
【００３４】
2本鎖内の摂動塩基は、非摂動ヌクレオチド塩基と比較して、酸化剤と選択的に反応する場合があることがわかっている。本発明で使用される適切な酸化剤にはKMnO4、OsO4、クロム酸、オゾンガス、過酸化物（例えばH2O2）、過安息香酸（例えばm-クロロ過安息香酸およびその誘導体）、電流などが挙げられる。本発明では、摂動塩基を、酸化剤以外の他の反応性薬剤と反応させ、この反応を同様に検出することも可能である。この種類の反応性薬剤の例はカルボジイミドである。
【００３５】
酸化有効量または反応有効量の酸化剤または反応剤とは、1個または複数の摂動塩基を、1種類または複数の開始薬剤の消費、または1種類または複数の産物の生成が検出可能な程度に、十分に修飾または反応する（特に酸化する）薬剤の量である。
【００３６】
「開始薬剤」は、検討対象の核酸2本鎖の酸化または他の反応に使用される薬剤（酸化剤または反応剤、または第1すなわち試験核酸2本鎖など）である。「反応産物」は、酸化されたか、もしくは反応した状態の核酸2本鎖か、または還元されたか、もしくは反応した状態の開始薬剤などの、2本鎖内における摂動塩基の酸化または他の反応の結果として形成される産物である。
【００３７】
核酸分子は、末端が標識された状態であっても、標識されていない状態であってもよい。適切であれば（末端もしくは内部が）標識されたDNAもしくはRNAを使用することで、摂動位置に関する情報の入手が可能となる場合がある。例えば放射性標識、蛍光標識、および酵素標識を含む任意の簡便な標識を当業者に周知の手順で使用することができる。適切な標識には32P、33P、14C、FAM、TET、TAMRA、フルオレセイン、およびJOEなどが挙げられる。
【００３８】
核酸2本鎖の酸化は、溶液中にすべての開始薬剤を混合するか、または2本鎖、または酸化剤もしくは反応剤を固相支持体基質上に固定することで実施することができる。本発明のある態様では、2本鎖を固相支持体上に固定することは、反応溶液からの2本鎖の迅速な分離を可能とするので有利な場合があり、またこのため開始薬剤および/または反応産物の検出を単純化することができる。適切な固相支持体は適切な高分子材料から作製することが可能であり、シリコンに由来するもの（例えばシリカ/ガラス）または紙の場合がある。支持体の形状はピン、ウェル、プレート、またはビーズであってもよく、そして磁気成分を有していてもよく、またはビオチン化された2本鎖との結合を可能とするために完全または部分的にストレプトアビジンでコーティングされていてもよい。2本鎖を固相支持体に固定する際には2本鎖を支持体に結合させるか、あるいは第1の1本鎖核酸分子を支持体に結合させた後に、第2の1本鎖核酸分子をこれにハイブリダイズさせて、結合状態の2本鎖を形成させることで行うことができる。
【００３９】
開始薬剤および/または反応産物の有無の判定は、分光光度的（例えば紫外可視、NMR、質量分析、または蛍光分光法）、クロマトグラフィー（例えばHPLC、GC）、滴定、酸化剤、または、この還元状態（例えばMnO2）を検出する比色無機アッセイ法、および電流変化が酸化還元反応の指標となる電気化学的検出が含まれうる任意の適切な手段で実施することができる。酸化された、または反応した核酸2本鎖は、酸化された、または反応した摂動塩基を、別の有機分子（例えばアルデヒド）、または別の酸化還元試薬システム（例えば酸化還元染色）と結合し、結果として得られた結合状態の産物の形成を、例えば上述した適切な手法で検出することによって検出することもできる。本発明のある態様では、これは酸化剤および/または酸化剤の還元状態の有無の判定に有用な場合がある。
【００４０】
本発明の他の態様では、酸化された2本鎖、もしくは反応した2本鎖の生成、および/または開始2本鎖の消費を、溶解温度に依存する方法、例えば、酸化された2本鎖、もしくは反応した2本鎖と、開始2本鎖、もしくは対応する対照2本鎖との間で溶解温度の差を比較することにより決定または検出することができる。
【００４１】
2本鎖の溶解温度は、酸化された、または反応した塩基の存在によって、非酸化摂動塩基が存在する場合と比較して、特に非摂動2本鎖と比較して大きく低下する可能性が高い。したがって本発明の別の局面では、本明細書に記載された酸化法または反応法で、核酸2本鎖のコンフォメーション変化を検出する既存の手法（分離法）を向上させることができる。したがって本発明の他の態様では、酸化された試験2本鎖、もしくは反応した試験2本鎖の生成、および/または開始試験2本鎖の消費を、例えば、酸化された試験2本鎖、もしくは反応した試験2本鎖と、開始試験2本鎖、もしくは対応する対照2本鎖との間で溶解温度の差を比較することによって、溶解温度に依存した方法により決定もしくは検出することができる。本発明のこのような態様では、酸化法（本明細書に記載されたKMnO4を使用する方法など）による、誤対合塩基または非対合塩基の検出を、大きい温度勾配（約2℃/分など）と併せて実施することができる。したがって酸化法または反応法は、摂動塩基を含む対照2本鎖と試験2本鎖との間の溶解温度に差があることによって向上する（試験2本鎖の初期溶解温度は低いので、酸化剤もしくは反応剤による酸化もしくは反応に対する感受性は高くなる）。反応後の摂動塩基は、試験2本鎖の溶解温度をさらに低下させて、試験2本鎖と対照2本鎖の溶解温度の差を強調させる作用を有する。
【００４２】
DNA 2本鎖の溶解温度は、現代的な手法で、通常の吸光度（straight absorbance）によって、または2本鎖特異的色素（例えばシーバーグリーンI（Syber green I））を、酸化された2本鎖および非摂動2本鎖に添加して、温度を徐々に上げてゆくことで容易に測定することができる。より多くの1本鎖DNAが作られると蛍光が減少する。これは検出が容易で、差を示すことができる。1本鎖特異的色素を使用することで溶解曲線を示すこともできる。
【００４３】
適切な方法には、コンフォメーション選択的ゲル電気泳動（CSGE）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）、または変性高圧液体クロマトグラフィー（dHPLC）などがあり、これらの区別は、酸化過程または反応過程によって強化される可能性が高い。
【００４４】
CSGE、dHPLC、またはDGGEなどの方法は、2本鎖と、対応する摂動2本鎖との間における溶解温度の差に基づく。しかし場合によっては、溶解温度のこの差は、適切に解決されて、コンフォメーション変化の有無を示すには十分でない場合がある。しかし、酸化された2本鎖、または反応した2本鎖（摂動塩基が酸化剤または反応剤によって酸化されているか、または酸化剤もしくは反応剤と反応している）は、酸化されていない2本鎖、または反応していない2本鎖の場合と比較して低温で溶解することが予想されるため、非摂動2本鎖と比較して溶解温度に大きな差が生じる。このような大きな差は分解能を高めるように作用する可能性があるので、「溶解温度」法は、コンフォメーション変化を含む2本鎖を同定する際に、より有用な方法となる。
【００４５】
高い変性剤（加熱）圧力をかけるDGGEの過程の場合は、この方法に依存する物理的現象が、酸化された2本鎖、もしくは反応した2本鎖、酸化されていない2本鎖、もしくは反応していない2本鎖、および非摂動2本鎖を分離することなく検出可能なことが予想される。したがってこの方法では、2本鎖の突然の開口が、電気泳動による分離中における、緩やかに温度または変性濃度を低下させる過程で起こる。このような開口は、摂動2本鎖内で速やかに生じ、また2本鎖の酸化もしくは反応後であっても早期に生じることが予想される。非摂動2本鎖は、後に開口し、さらに遠くまで動く。摂動2本鎖は、このようにして検出される。仮に、酸化剤または反応剤の存在下で、チューブ中で変性剤（例えば温度、もしくは化学的変性剤）を緩やかに増加させてゆく場合、2本鎖が開くときに、酸化剤または反応剤（または産物の生成）の消費の急激な増加の検出が可能であると推定することができる（摂動2本鎖を含むチューブの場合には早期に開く）。
【００４６】
摂動塩基を検出する別の方法では、チップ、ビーズ、ピン、ウェルなどの上で、または液相中で実施可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを行う。したがって、酸化された摂動2本鎖、もしくは反応した摂動2本鎖が溶解して、別のDNA片（例えばプローブ）とハイブリダイズする温度は、対応する酸化されていないか、もしくは反応していない摂動2本鎖の温度より低くなるので、ハイブリダイゼーションシグナルの差が潜在的に大きくなり、また摂動塩基の検出が容易になると考えられる。
【００４７】
本明細書に記載された酸化過程もしくは反応過程によって促進可能な他の分離法には、当技術分野で周知であるSSCPおよび配列決定などが挙げられる。アガロースゲルを使用して反応産物を検出することができる。本発明の方法はさらに、摂動塩基と反応する、ヒドロキシルアミンまたはカルボジイミドなどの他の試薬とともに使用することができる。したがって、このような試薬は、摂動塩基と酸化剤または反応剤（例えばKMnO4またはカルボジイミド）が反応した後に、摂動塩基に対して高い反応性を示す場合がある。あるいは最初に摂動塩基と試薬を反応させることで、摂動塩基の酸化または反応を促進することができる。ヒドロキシルアミンまたはカルボジイミドと摂動塩基との反応の適切な条件は例えば、欧州特許第329311号、およびNovackら、PNAS、83、586-60にそれぞれ記載されている。他の試薬には、修復酵素などの酵素（例えばmut Y、mut A、除去ヌクレアーゼ、S1ヌクレアーゼ、およびレソルバーゼ）が挙げられる。
【００４８】
摂動塩基の修飾速度は、塩基そのものの性質に依存する。ある酸化試薬（例えばKMnO4、OsO4）は、チミンおよびウラシルに対して選択性が高いが、シトシンとの反応の速度は遅い。反応速度は一般に、摂動塩基がグアニンまたはアデニンの場合は遅い。したがって好ましくは、修飾対象となる摂動塩基は、チミン、ウラシル、またはシトシンである。好ましくは、摂動塩基の2つの相補的な対がある場合は、これらはチミン（またはウラシル）、およびシトシンを含む場合がある。というのは、これが、すべてのコンフォメーション変化の検出を可能とし、各変化に2回の検出の機会をもたらすからである。近傍の塩基が、局所的な摂動のために反応する場合もある。
【００４９】
本発明の他の態様では、2つの核酸2本鎖間のコンフォメーションの差を、摂動2本鎖の溶解温度をわずかに下回る温度で修飾することにより検出することができる。したがって摂動2本鎖および非摂動2本鎖の両方が、摂動2本鎖の溶解温度をわずかに下回る温度で酸化剤または反応剤と反応する場合は、このように形成された、酸化された摂動2本鎖、または反応した摂動2本鎖がT塩基およびC塩基を露出することになる。この結果、本明細書に記載された手法で、例えばMnO2の生成またはKMnO4の消費によって追跡可能な、摂動2本鎖に対する酸化活性または反応活性の「バースト」が生じる。
【００５０】
試験核酸2本鎖もしくは試料と、対照核酸2本鎖もしくは試料の間におけるコンフォメーション変化を検出するための酸化反応または他の反応は、約0℃から2本鎖の溶解点までの範囲（例えば約10〜50℃）で実施することができる。好ましくは、酸化または他の反応は約20〜40℃の温度範囲で、より好ましくは約25℃または37℃でも実施することができる。酸化または他の反応は、各2本鎖内におけるT塩基またはC塩基の数に差があることなどによる、酸化速度または反応速度を比較することにより、2本鎖の溶解点以上（例えば最大約80℃）で実施することもできる。
【００５１】
酸化または反応に要する時間は、反応温度および修飾対象塩基の性質に依存する場合がある。好ましくは、この時間は約1分〜約10時間（例えば約5分から約3〜4時間）の範囲内にある。好ましくは修飾は、約10分〜約1時間（例えば約30分間）行われる。
【００５２】
修飾は、水溶液中、または水性溶媒および非水性溶媒の混合物中で適切に実施され、酸性、中性、または塩基性の条件で実施される場合があり、また任意選択で緩衝液などの他の薬剤（例えばクエン酸またはリン酸の緩衝液）の存在下で実施される場合がある。このような修飾は、アミノ塩基（amino base）、またはその塩の存在下または非存在下で実施することができる。塩基が存在する場合、適切なアミノ塩基には、アルキルアミン（モノおよびジ）などが含まれる場合があり、またこの適切な塩には、硫酸塩、硝酸塩、およびハロゲン化塩（例えば塩化物）などが挙げられる。塩基の例には、テトラエチルアミン、テトラメチルアミン、ジイソプロピルアミン、テトラエチレンジアミンヒドラジン、およびピリジンなどが挙げられる。好ましいアンモニウム塩の例には、塩化テトラエチルアンモニウム（TEAC）、および塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）などが挙げられる。この塩基（または塩）の溶液の濃度は、約0〜約6 M、好ましくは約2〜4 M、特に約3 Mの場合がある。
【００５３】
本発明の一つの好ましい態様では、酸化剤はKMnO4である。摂動ヌクレオチド塩基（チミンなど）の過マンガン酸塩による酸化（修飾）により、塩基性条件で分解してジオールおよび可溶性のMnO2を放出する、不安定な中間体である環状過マンガン酸ジエステルが形成される。
【００５４】
MnO2は420 nmで強力に吸収する（MnO4-は、同波長でほぼ透明である）。しかしMnO4-は525 nmで強い吸収を示す。したがって好都合なことに、酸化反応は、約400〜440 nmの範囲、より好ましくは410〜430 nmの範囲（MnO2の生成の場合は約420 nmなど）で、および/または約505〜545 nmの範囲、より好ましくは515〜535 nmの範囲（KMnO4の消費の場合は約525 nmなど）の波長でUV分光法で追跡することができる。
【００５５】
好ましくは、1残基の摂動塩基あたり、KMnO4をモル過剰で、例えば少なくとも約3倍モル過剰、より好ましくは約5倍モル過剰で使用する（MnO2の生成を検出する場合）。KMnO4（MnO4-）の消費を追跡する場合は、好ましくは、1残基の摂動塩基あたり、ほぼ等モル量のKMnO4を使用する。
【００５６】
好ましい態様では、摂動型のT塩基、U塩基、またはC塩基がKMnO4によって修飾される。
【００５７】
2種類のマンガン種はいずれも可視領域で強い吸収を示すので、MnO4-またはMnO2の有無の判定を、単純な視覚的解析によって実施することもできる。例えば、MnO4-はTEACでは桃色を示し、MnO2はTEACで黄色を示す。
【００５８】
摂動塩基の存在は、試験（例えば摂動）2本鎖、およびこれに対応する対照（例えば非摂動）2本鎖の個々の等吸収点の比較によって決定することもできる。2種類の物質（例えばMnO2およびMnO4）の吸収スペクトル中にある、相互に平衡状態にある等吸収点は、2種類の物質が同じモル吸光係数を有する波長である。紫外可視領域における適切な時間間隔を経時的にスキャンすることで、2本鎖核酸試料のコンフォメーションの修飾の等吸収点を決定することができる。2本鎖内の非摂動ヌクレオチド塩基は、摂動塩基より緩やかに反応する。したがって所定の間隔後に、摂動2本鎖の等吸収点には、非摂動2本鎖の等吸収点に対して差がつくことが推定される。この等吸収点を、吸光度の変化速度と組み合わせて使用することで、より正確な判定を行うことができる。
【００５９】
2種類の核酸2本鎖を対象とした等吸収点の相対比較でも、異なる環境的条件および/または化学的条件に曝露された可能性のある2種類の核酸2本鎖間のコンフォメーションの差を検出することができる。このような2種類の核酸2本鎖間における差を検出するための酸化法を、本明細書に記載された手順で実施することができる。
【００６０】
本発明は特に、複数の試料のハイスループットのスクリーニングにも応用することができる。本発明のこの局面は例えば、変異原性、発癌性、抗癌または抗微生物（特に抗生物質）活性に関して、潜在的な薬物などの化合物のスクリーニングを行う状況に特に応用することができる。
【００６１】
本発明の他の局面では、本発明を実施するための成分および/または試薬をキット内に呈示することができる。このようなキットは、本発明において使用するために適合させた、区分された状態で提供される場合があり、酸化剤もしくは反応剤、塩基（またはその塩）、試験核酸2本鎖または対照核酸2本鎖（例えば仔ウシ胸腺）、緩衝液、分光光度測定用セルおよび固相支持相の1つまたは複数を含む場合があり、そしてさらに本発明の実施法が記載された指示書が提供される場合がある。
【００６２】
本発明の方法は、哺乳類細胞（例えばヒト；サル；ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタなどの家畜動物；ラット、マウス、モルモット、ウサギなどの実験動物；イヌ、ネコなどの愛玩動物；または捕獲野生動物）、魚類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、またはウイルス作用因子、寄生虫作用因子（例えばプラスモジウム、クラミジア、リケッチア、および原虫）、および植物細胞（タバコ、装飾用樹木、低木、および顕花植物（例えばバラ）、樹木、ヒトもしくは動物によって消費される果実および野菜をつける植物（例えばリンゴ；ナシ；バナナ；柑橘類果物；モモ、サクランボ、プラムなどを含む核果；ジャガイモ；根菜類；キャベツ類など）、および農業用作物（オーツムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、ワタ、ヒマワリ、コムギ、イネ、およびエンドウマメおよびダイズなどのマメ科植物など）、およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）などの実験用植物を含む）から得られたDNAを調べる際に特に有用である。
【００６３】
当業者は、本明細書に記載された本発明が、本明細書に具体的に記載された手順以外についても変更および修飾の対象となりうることを理解すると思われる。本発明が、精神および範囲に含まれるすべての変形形態および修飾を含むことを理解すべきである。本発明は、個別に、または集合的に本明細書に言及されたか、または示された、すべての段階、特徴、組成物、および化合物、ならびにこのような段階または特徴の任意の2つまたは2つ以上の任意かつすべての組み合わせも含む。
【００６４】
以下の実施例に関して本発明をさらに説明するが、以下の実施例は、本発明の特定の態様を説明する目的で提供され、上述の一般性を制限することを意図しない。
【００６５】
実施例
化合物および分光光度計：
化合物、溶媒、および仔ウシ胸腺DNAは、アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemical Company）（Castle Hill、オーストラリア）から購入した。
【００６６】
過マンガン酸カリウムによるDNAの酸化反応は、ガラス1.2 ml石英キュベット内で実施し、事前に選択した波長における吸光度-時間曲線を記録することによって、および/または紫外可視領域（200〜800 nm）を繰り返しスキャンすることによって、Cintra-10分光光度計（GBC Scientific Equipment Ply Ltd.、Victoria、オーストラリア）、またはCary 300紫外可視分光光度計（Varian Inc.、Victoria、オーストラリア）でスペクトルデータを得た。
【００６７】
仔ウシ胸腺のZ型DNA試料の調製：
Z型DNAを、市販の仔ウシ胸腺DNAを3 M NaCl溶液で処理して調製した。
【００６８】
実施例1：B型およびZ型の仔ウシ胸腺DNA試料の酸化反応
仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）試料を、965 μlの3 M NaCl水溶液と40℃で1時間インキュベートした。結果として得られた混合物（Z型DNA）を30 μlの10 mM KMnO4溶液で処理した。この混合物を直ちに1.2 mlの石英キュベットに移し、200〜800 nmを25℃（10分毎）で120分間かけてスキャンした。対照実験（NaClを含まない）では、仔ウシ胸腺B型DNA（5 μl、8.27 μg）と965 μlの滅菌済みのH2Oと溶解し、上記の同一反応条件で処理した。この結果を表1に示す。
【００６９】
（表１）  無機物質によって誘導したDNAコンフォメーション変化を検出するための酸化法
2005526230.tif 000003
B型DNA（仔ウシ胸腺DNA）；Z型DNA（仔ウシ胸腺DNA、溶媒は3 M NaCl）
酸化レベル（任意の単位）は420 nmにおける吸光度を元にした。
すべての実験は、Cintra-10分光光度計を用いて25℃で実施した。
【００７０】
完全なDNAの物理的特性および化学的特性は、正常な条件（低イオン強度および生理的pH）で適切に調べられている。DNAのコンフォメーション変化は、塩濃度を高くすることでDNA試料をZ型DNAに変換したとき、劇的に促進されうる。特定の条件では、巻き戻しDNAの化学的特性および物理的特性は、ヌクレオチド塩基およびZ型2本鎖DNAの程度の異なる曝露が、B型DNAと比較して化学反応に対して過剰に亢進したことにより、変化する。実験の結果から、2本鎖B型DNAが、過マンガン酸塩との反応に高度に感受性を示すようになったZ型と比較して、KMnO4とほとんど反応しないことがわかった（表1）。B型およびZ型のDNAのいずれも、酸化スペクトルのパターンおよび等吸収点を用いることで明瞭に区別された。
【００７１】
実施例2：挿入剤との仔ウシ胸腺DNAの反応
滅菌済みのH2O（950 μl）中、仔ウシ胸腺DNA（5 μ1、8.27 μg）を、臭化エチジウム（10 μl、6.3 nmol）と混合した。この混合物を振盪器で40℃で1時間かけて緩やかに混合した。インキュベーション後に、KMnO4（35 μlの10 mM溶液）を反応混合物に添加し、結果として得られた混合物を石英キュベットに移し、この試料を200〜800 nmで25℃（10分毎）で120分間かけてスキャンした。挿入剤によって誘導される酸化のレベルは、正味の吸光度（420 nmで測定）に基づき、以下のように計算される：
正味のA420 nm＝［実験のA420 nm（120分）−実験のA420 nm（2分）］−［対照のA420 nm（120分）−対照のA420 nm（2分）］
上式で、正味のA420 nmは、DNA化合物付加物の酸化のレベルを意味する。
実験＝仔ウシ胸腺DNA＋DNA結合剤＋KMnO4
対照＝DNA結合剤＋KMnO4
【００７２】
対照実験では、滅菌済みのH2O（950 μl）中、仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）を、グルコース（10 μl、6.3 nmol）と混合した。この反応は、上記と同一の条件で実施した。結果を表2に示した。
【００７３】
（表２）  挿入剤によって誘導した仔ウシ胸腺DNAの、過マンガン酸塩による酸化
2005526230.tif 000004
酸化レベル（任意の単位）は420 nmにおける正味の吸光度を元にした。
すべての実験は、Cary 300分光光度計を用いて35℃で実施した。
【００７４】
臭化エチジウム挿入剤の作用：
臭化エチジウムは、非配列特異的挿入剤としてよく知られている。この分子がヌクレオチド塩基間を挟むと2本鎖は28°巻き戻される。この巻き戻し効果は、ヌクレオチド塩基の曝露を劇的に上昇させたので、酸化過程を促進する。得られた結果から、この方法でDNA結合剤を同定可能なことが確認された。というのは、対照実験（DNA＋グルコース）では、2時間のインキュベーション中に酸化レベルの上昇が認められなかったからである（表2）。
【００７５】
臭化エチジウムは、Z型コンフォメーションの「スーパーコイル」特性をB型コンフォメーションに緩めることで、Z型DNAに逆の作用をもたらすことも報告されている。この結果として、Z型DNA溶液に挿入剤を添加したところ、酸化レベルは低下した。DNA結合剤が、仔ウシ胸腺DNAのB型およびZ型に作用することを明らかにするために以下の2つの実験を実施した：
（i）挿入剤がZ型DNAに及ぼす作用（DNAの巻き戻しの程度の決定の応用）；および
（ii）挿入剤の濃度がB型DNAに及ぼす作用。
【００７６】
（i）挿入剤がZ型DNAに及ぼす作用（巻き戻しの程度の決定の応用）：
挿入剤の巻き戻しの程度に関する情報は少ないため、巻き戻しの程度が異なる4種類の挿入剤（ドキソルビシン（10°）、ダウノルビシン（12°）、9-アミノアクリジン（17°）、および臭化エチジウム（28°））のみを実験に用いた。Z型DNA試料を等量の挿入剤と混合し、反応を同一の条件で実施した。滅菌済みのH2O（355 μl）中、仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）を、NaCl（600 μl、5 M NaCl溶液）、DNA結合剤または挿入剤（10 μl、6.3 nmol）とインキュベートした。ドキソルビシン、ダウノルビシン、9-アミノアクリジン、および臭化エチジウムの4種類の非配列特異的挿入剤をモデル試験で使用した。この反応混合物を、振盪器に40℃で1時間かけて穏やかに混合した。インキュベーション時間後に、KMnO4（30 μl）を反応混合物に添加し、結果として得られた混合物を石英キュベットに移し、35℃で2分および60分の時点における吸光度（420 nm）を得た。挿入剤で誘導される酸化のレベルは、正味の吸光度に基づき、以下のように計算される：
正味のA420 nm＝［実験のA420 nm（60分）−実験のA420 nm（2分）］−［対照のA420 nm（60分）−対照のA420 nm（2分）］
上式で、正味のA420 nmは、DNA化合物付加物の酸化のレベルを意味する。
実験＝仔ウシ胸腺DNA＋NaCl＋DNA結合剤＋KMnO4
対照＝DNA結合剤＋KMnO4
【００７７】
対照実験（DNA結合剤を含まない）は、上記と同一条件で処理した。
【００７８】
動力学的データから、DNA試料を臭化エチジウムとインキュベートした際に酸化が極めて遅く、またドキソルビシンとインキュベートした時に最も速いことが確認された（表3）。1時間の酸化過程後に、酸化レベルと巻き戻しの程度の間の相関は、高い相関係数（0.94）で直線となる。仔ウシ胸腺DNA試料の酸化レベルと巻き戻しの程度の相関を、直線グラフにプロットした（図1）。回帰式、相関係数、および他の統計データ（平均および分散）の計算はMedCalcソフトウェアを用いて行った。この試験では、巻き戻しの程度と関連する公開データ（ドキソルビシン（10°）、ダウノルビシン（12°）、9-アミノアクリジン（17°）、および臭化エチジウム（28°））を用いた（図1）。対照試料（挿入剤を含まない）を、Z型DNAの初期程度に対する標準として使用した。対数値を計算する目的で、1度をZ型DNAの初期程度に割り当てた。この相関曲線が、各挿入剤とDNAとの結合1モルあたり等モルであると推定される他の任意の物質の巻き戻しの程度を推定するための標準曲線として作用することを想定できる。
【００７９】
（表３）  挿入剤によって誘導した仔ウシ胸腺DNAの、過マンガン酸塩による酸化
2005526230.tif 000005
酸化レベル（任意の単位）は420 nmにおける正味の吸光度を元にした。
すべての実験は、Cary 300分光光度計を用いて35℃で実施した。
【００８０】
（ii）挿入剤の濃度の作用：
1種類の挿入剤（臭化エチジウム）の濃度の作用を表4にまとめた。仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）を、4通りの濃度（1.57 nmol、3.15 nmol、6.3 nmol、および12.6 nmol）の臭化エチジウムとインキュベートした。すべてのチューブ（4種類の実験試料および4種類の対照試料（DNAを含まない））を、振盪器に40℃で60分かけて穏やかに混合した。インキュベーション後に、混合物を35 μlの10 mM KMnO4で処理し、キュベットに直ちに移し、2分、および120分の時点における420 nmでの吸光度を測定した。各試料の酸化レベルを上述の手順で計算し、結果を直線グラフにプロットした（表4および図2）。すべての実験は2回実施した。この結果から、酸化のレベルが臭化エチジウムの濃度に強く依存することがわかった。エチジウムの濃度の上昇に伴い、DNA配列上の挿入剤結合部位の数は増えたので、酸化のレベルは、この実験の範囲内において臭化エチジウム濃度に高度に比例する。標準曲線（「臭化エチジウム濃度」対「酸化レベル」）は直線であり、相関係数は極めて高い（0.97）。濃度が、この限界を超える場合、同曲線は、挿入剤結合が飽和するために平坦となる（結果は示していない）。
【００８１】
（表４）  さまざまな濃度の臭化エチジウムで誘導した仔ウシ胸腺DNAの、過マンガン酸塩による酸化
2005526230.tif 000006
酸化レベル（任意の単位）は420 nmにおける正味の吸光度を元にした。
すべての実験は、Cintra-10分光光度計を用いて25℃で実施した。
【００８２】
参考文献：
2005526230.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】過マンガン酸塩の酸化レベル（Log10 A420 nm）と、挿入剤によって誘導された仔ウシ胸腺DNAの巻き戻しの程度との間における相関曲線を示す。挿入剤（10 μl、6.3 nmol）を、仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）およびNaCl（600 μl、5 M NaCl溶液）と水（355 μl）中で40℃、1時間インキュベートした。この反応混合物を、KMnO4（10 mM溶液を30 μ）で処理し、35℃で60分間維持した。420 μmにおける吸光度を、2分後および60分後の時点でCary 300 分光光度計（Varian社）により測定した。酸化のレベルは、実験の項に記載されているように、実験および対照実験（DNAを含まない）のA420 nmにおける吸光度を元にした。ドキソルビシン（10°）、ダウノマイシン（12°）、9-アミノアクリジン（17°）、および臭化エチジウム（28°）の4種類の挿入剤（括弧内は巻き戻しの程度に関する公開データ）を実験に使用した。
【図２】過マンガン酸塩の酸化レベル（A420 nm）と、さまざまな濃度（nmol）の臭化エチジウムとの間における相関曲線を示す。仔ウシ胸腺DNA（5 μl、8.27 μg）を、臭化エチジウム（1.575、3.15、6.3、12.6 nmolの4通りの濃度を使用）と40℃で1時間インキュベートした。反応混合物を、35 μlの10 mM KMnO4溶液と35℃で処理した。この混合物の吸光度を、2分後および60分後の時点でCintra-10分光光度計（GBC）により測定した。酸化のレベルは、実験の項に記載されているように、実験および対照実験（DNAを含まない）のA420 nmにおける吸光度を元にした。
【図１】
2005526230.tif 000008
【図２】
2005526230.tif 000009
【国際調査報告】
2005526230.tif 000010
2005526230.tif 000011