(57)【要約】本発明は、グルコースに応答してインスリンを産生する安定な細胞株へインサイチュにおいて成熟され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関連する。これらの細胞は、培養において増幅可能かつ安定であるという両方の点で有利である。本発明は、中間段階の幹細胞を後期段階の膵臓細胞へ培養する工程を回避する。増殖する膵臓細胞の細胞培養物をカプセル化する工程は、以下：カプセルを作製するためにアルギン酸を用いて細胞を包囲する工程、二価カチオンを用いてアルギン酸を架橋する工程、およびカプセルを囲むためにポリリジン膜を提供する工程を包含し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インサイチュにおいて、哺乳動物にインスリンを提供する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）増殖する膵臓細胞の細胞培養物をカプセル化する工程であって、該細胞は以下：（ｉ）第１培養容器から第２容器へと１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で継代されて、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増殖する能力、および（ｉｉ）増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方が、９０％  ＰＤＸ−１陽性であり、そして、１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比を有する、という特性を有する、工程；
（ｂ）インスリン分泌細胞を成熟させるために、該カプセル化された細胞を該細胞を許容する哺乳動物へ挿入する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記細胞が、細胞凝集物へ成熟する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、細胞凝集物へ成熟する、請求項１に記載の方法であって、ＣＫ１９陽性細胞のカプセル化膜および内部細胞塊を含み、ここで、該凝集物が、５０〜５０００の膵臓細胞を含み、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する細胞。
【請求項４】
前記哺乳動物が、糖尿病のヒトである、請求項１の記載の方法。
【請求項５】
前記細胞培養が、１：１０と１００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カプセル化工程は、以下：カプセルを作製するためにアルギン酸を用いて前記細胞を包囲する工程、二価カチオンを用いて該アルギン酸を架橋する工程、および該カプセルを囲むためにポリリジン膜を提供する工程、を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
カプセル化膵臓細胞を含む組成物であって、該細胞は以下：（ｉ）第１培養容器から第２容器へと１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で継代して１平方センチメートルあたり約１，８００細胞へと増殖する能力、および（ｉｉ）増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方は９０％  ＰＤＸ−１陽性であり、そして、１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比を有する、という特性を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮出願第６０／３４２，２５０号（２００１年１２月２１日出願）の利益を主張し、この内容は、本明細書中に全ての目的に対して参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府によって支援された研究および開発の下で行われた発明に対する権利についての言及）
該当なし。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出された「配列表」、表またはコンピュータプログラム表の付属書の言及）
該当なし。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、グルコースに応答してインスリン産生を産出する細胞の安定した培養物を産出するために、インサイチュの条件下でカプセル化および成熟され得る、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在するとの知見に関連する。これらの細胞は、培養において増大可能（ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ）かつ安定の両方であり、そして後期発生段階へと誘導され得るという点で有利である。本発明は、中間の分化段階の細胞を、後期膵臓細胞へと、インビトロで培養する工程を回避する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
哺乳動物膵臓は、胚前腸芽から発生する。胚芽が成長するにつれ、管系は、分岐形態形成によって発達する。腹側および背側の原基が融合した後、新たな器官が成長し、そして２つの連結した構造（外分泌系および内分泌系）へと成熟する。膵臓の大部分は、消化酵素を産生する腺房細胞から構成される。内分泌系は、β細胞（これは、インスリンを産生する）、α細胞（これは、グルカゴンを産生する）およびδ細胞（これは、ソマトスタチンを産生する）を含む。内分泌細胞は、島と呼ばれるクラスターへと組織化される。
【０００６】
動物研究は、β細胞形成の少なくとも２つの機構（管前駆体細胞からの新生および成熟β細胞の複製）を示した。分化したβ細胞の複製は、生後、成人期まで維持される。β細胞の複製は、例えば、高グルコース注入、部分膵切除および妊娠中の結果として、インスリンについての需要の増大によって加速される。これらの条件下で、β細胞塊は、細胞肥大（個々の細胞の容積の拡大）および過形成（β細胞の数の増加）の両方を通して迅速に増大する。
【０００７】
Ｉ型糖尿病、すなわち、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）では、β細胞に対する自己免疫攻撃に起因して、β細胞の数の明確な減少が存在する。Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１４：１３６０−１３６８（１９８６）。Ｉ型糖尿病についての処置は、Ｉ型糖尿病を患っている被験体におけるβ細胞数の増加を含み得る。Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１４１：１９２６−１９２９（２０００）。
【０００８】
膵島細胞を用いる糖尿病についての別の処置は、免疫適合ドナー由来の膵臓組織を移植レシピエントへと移植することを含む。代表的に、移植レシピエントは、移植された器官の拒絶反応を防ぐために、免疫抑制剤療法を受ける必要がある。近年開発された免疫抑制剤レジメンは、ヒトにおける臨床的膵島移植の結果を改善している。この技術は実験的にとどまるが、膵島細胞移植物が器官全体の膵臓移植物と同じ機能を果たし得る場合、この非常に単純な外科手順は、糖尿病の処置において重要な役割を果たす。
【０００９】
ヒトの膵島の移植は、糖尿病についての有力な処置としての見込みを示すが、この手順の有用性を現在制限する多数の障害が存在する。１つの顕著な障害は、この手順において使用するために充分な数の膵島細胞を産生できないことである。現在、移植のために膵島を得るために用いられるこの手順は代表的に、膵臓組織の単離、周囲の組織から個々の細胞を遊離させる膵臓組織の酵素消化、および勾配遠心分離精製技術の使用を包含する。勾配遠心分離精製技術は、当該分野で周知であり、そして多くの膵島移植センターで実施される。残念ながら、標準的な手順を用いて処理された単一の膵臓からの膵島の収率は通常、移植には不充分である。従って、この手順に対する代替物が求められており、そして開発されている。
【００１０】
中間段階の膵臓幹細胞を選択的に増殖する方法が、開発されている。簡潔には、ドナーの膵臓から単離後、細胞は高血清培地で修復され、次いで、中間段階の膵臓幹細胞の増殖を促進するために、低血清培地へ切り替えられる。これらの細胞は、馴化培養のディッシュ上でのコンフルエントまでの増殖により、インスリン分泌細胞凝集物へと成熟され得る。しかしながら、直接移植された場合、この細胞は宿主において有害な免疫反応を生じ得るため、これらの凝集細胞は、臨床的使用に限りがある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、以下：（ｉ）細胞が、１平方センチメートルあたり約１８０細胞の初濃度で第２容器への第１培養容器から継代して、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞まで増殖され得る、および（ｉｉ）増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方が、９０％のＰＤＸ−１が陽性であり、そして１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する、という特性を有する、増殖する膵臓細胞の細胞培養物をカプセル化することにより、インサイチュで哺乳動物へインスリンを供給する方法を提供する。カプセル化後、この細胞は、インスリン分泌細胞に成熟させるために、この細胞を許容する哺乳動物に移植されるかまたは埋め込まれる。
【００１２】
一つの実施形態において、この細胞は、細胞の凝集物へ成熟する。この細胞性凝集物は、ＣＫ１９陽性細胞の周囲被膜および５０〜５０００の膵臓細胞の内部細胞塊を有し、そして５０ミクロンと３００ミクロンとの間の直径を有する。本発明の別の実施形態において、哺乳動物は、糖尿病のヒトである。
【００１３】
本発明の一つの局面において、細胞培養物は、１：１０と１００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する。
【００１４】
別の実施形態において、このカプセル化は、以下の工程：カプセルを作製するためにアルギン酸塩を用いて細胞を取り囲む工程、二価カチオンを用いてアルギン酸塩を架橋する工程、そしてカプセルを囲むためにポリリジン膜を提供する工程、を包含する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、以下の特性：（ｉ）増殖する能力、および（ｉｉ）増殖されていない細胞および増殖された細胞の両方が、９０％  ＰＤＸ−１陽性であり、そして１：１００と１０００：１との間のインスリン：アクチンｍＲＮＡ比を有する、カプセル化膵臓細胞を提供する。
【００１６】
（定義）
「カプセル化」は、細胞が、生体適合性無細胞性材料（例えば、アルギン酸ナトリウム、ポリリジン）により取り囲まれるプロセスをいう。好ましくは、低分子（糖および低分子量のタンパク質のようなもの）は、カプセル化細胞を取り囲む環境から吸収され得るかまたは、カプセル化細胞を取り囲む環境へと分泌され得る。同時に、大きい分子および免疫細胞による、カプセル化された細胞へのアクセスは、限定される。
【００１７】
「インサイチュ」は、カプセル化される間の細胞成熟または細胞増殖をいう。インサイチュの増殖または成熟は、培養容器内にある間に、あるいは動物へ移植後に起こり得る。
【００１８】
「成熟した」または「成熟」は、細胞が未分化段階から分化段階へ進行するプロセスをいう。例えば、未分化膵臓細胞は増殖し得、そして、特徴的なマーカー（ＰＤＸ−１のような）を発現し得る。成熟膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵性内分泌ホルモンを分泌する。例えば、成熟β細胞は、高レベルでインスリンを分泌する。細胞が未分化細胞のマーカーを欠失する場合、または分化細胞のマーカーを得る場合に、細胞相互作用における変化および成熟が生じる。単一マーカーの欠失または獲得は、細胞が「成熟した」ことを表し得る。
【００１９】
細胞の状況における「凝集物」とは、三次元構造体をいう。
【００２０】
「ＣＫ−１９」は、４０Ｋｄの酸性ケラチンである、サイトケラチン１９である。
【００２１】
「インスリン：アクチンｍＲＮＡ比」は、ゲルスキャナーを用いてバンド密度によって、またはインスリンおよびアクチンについて異なるラベルを用いるリアルタイムＰＣＲによって、測定される。これは、細胞の集団をまたがった平均である。
【００２２】
「移植する」は、レシピエントへの細胞の移植または配置である。これは、カプセル化細胞および非カプセル化細胞を含む。この細胞は、皮下に、筋肉内に、門脈内に、または腹腔内に（ｉｎｔｅｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、当該分野で公知の方法によって配置され得る。
【００２３】
表面に付着した単層として増殖する細胞の「継代」とは通常、播種した培養容器の、部分的にコンフルエントな状態からコンフルエントな状態への移行であって、この時点で細胞が培養容器から取り出されて、より低い密度で培養容器中に再度播種される移行をいう。しかし、細胞は、コンフルエンスに達する前に継代され得る。継代は代表的に、細胞が増殖してコンフルエントに達するにつれて、細胞集団の増大をもたらす。細胞集団の増大は、最初の播種密度に依存するが、代表的に、１〜１０、１〜５、１〜３または１〜２倍の増大である。従って、継代することは一般に、細胞が培養において複数回細胞分裂し得ることを必要とする。
【００２４】
細胞の「集団」とは、特定の単離手順または培養手順によって得られた複数の細胞をいう。本発明の選択プロセスは、比較的均質な特性を有する集団を生じるが、細胞の集団は、マーカー発現または他の表現型についてアッセイした場合、不均質であり得る。細胞集団の特性は一般に、特定の特性を有する個々の細胞の百分率（例えば、特定のマーカーについて陽性に染まる細胞の百分率）または集団全体について測定した場合の特性のバルク平均値（例えば、細胞集団から作製された溶解産物中のｍＲＮＡの量）によって規定される。
【００２５】
「９０％  ＰＤＸ−１陽性」とは、ランダムに選択された細胞の統計的サンプリングをいう。標準的免疫化学技術が用いられ、そして陽性に染色された細胞が顕微鏡下にて目視で計数される。百分率は、適切に制御された（すなわち、同一の細胞を調製し、そして類似のアイソタイプの抗体であるがＰＤＸ−１に特異的ではない抗体を用いる）サンプルとの比較によって決定される。
【００２６】
「血清」とは、血液から得られた、血球以外の材料をいう。血清は代表的に、血球を凝固させるかまたは遠心分離および線維素除去によって血球を物理的に分離することによって得られる。本明細書中で用いられる場合、血清は、その生物学的活性によって機能的に定義され得る：血清は一般に、培養培地に添加された場合に培養中の哺乳動物細胞の増殖を支持する。血清は、種々の種（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、ニワトリなど）および種々の発生段階（例えば、胎児、若年期または成人）から得られ得る。特定の実施形態では、「血清」とはまた、分画した血清または他の供給源（例えば、Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））から得られた血清補充製品もしくは血清置換製品、または他の市販の製品をいう。このような血清等価物は、完全または部分的に定義され得る。
【００２７】
「被膜（ｍａｎｔｌｅ）」とは、内部細胞塊を三次元で取り囲む細胞の膜をいう。
【００２８】
（詳細な説明）
本発明は、中間の分化段階の膵臓幹細胞が存在し、そして膵臓幹細胞はカプセル化される間、インスリン産生凝集物へと成熟され得るという知見に関する。これらの膵臓幹細胞は、膵臓から直接単離された細胞性構造物およびカプセル化膵島の機能
を再利用する。膵臓幹細胞は、培養において増殖できる有益を提供するが、このカプセル化手順は、凝集物を有する細胞のサイズおよび数に対するコントロールを可能にする。
【００２９】
（Ｉ．膵臓細胞の単離方法）
本発明は、中間段階の膵臓幹細胞の集団の、インスリン分泌細胞凝集物への成熟を誘導する方法を提供する。代表的に、初期工程として、中間段階の膵臓幹細胞が、膵臓から単離される。膵臓から収集された細胞は、内分泌および外分泌可能な分化細胞を産生し得る多様な集団である。これらの分化細胞は、膵性内分泌分子（例えば、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンならびに他の内分泌ホルモン）、および膵性外分泌分子（例えば、アミラーゼ）を発現する。さらに、培養された細胞集団の一部は、培養において複製および増殖が可能である。従って、本発明で使用されるこの中間段階の膵臓幹細胞集団は、ドナーの膵臓から単離され得る。次いで、新鮮に単離された膵臓細胞は、中間段階の膵臓幹細胞の増殖を促進する条件下で培養される。
【００３０】
（Ａ．ドナー供給源）
ドナー供給源は、培養膵臓細胞由来の１以上のドナー膵臓、または膵臓内分泌ホルモンおよび膵臓外分泌ホルモンを産生し得る細胞を生じ得る他の供給源であり得る。好ましい実施形態では、その後の培養のために単離された細胞は、１以上の寄贈された膵臓から得られる。本明細書中に記載される方法は、寄贈された膵臓の年齢に依存しない。従って、胎児から成体の年齢にわたるドナーから単離された膵臓材料が用いられ得る。
【００３１】
別の実施形態では、膵臓細胞は、培養された供給源から単離される。例えば、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ」との発明の名称の、Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇらに対する米国特許第５，７６２，９５９号の微小カプセル化方法に従って調製された細胞は、ドナー細胞の供給源として収集され得る。
【００３２】
（Ｂ．膵臓細胞集団の単離）
一旦、膵臓がドナーから収集されたら、これは代表的に、種々の方法を用いて、培養するための個々の細胞または細胞の小さな群を生じるように処理される。１つのこのような方法は、回収された膵臓組織が酵素消化のために清浄および調製されることを要する。酵素処理は、回収された組織の実質が、より小さな単位の膵臓細胞材料へと解離されるように、結合組織を消化するために用いられる。収集された膵臓組織は、収集された器官の全体的構造から、膵臓細胞材料、部分構造および個々の膵臓細胞を分離するために１以上の酵素を用いて処理される。コラゲナーゼ、ＤＮＡｓｅ、Ｌｉｂｅｒａｓｅ調製物（米国特許第５，８３０，７４１号および同第５，７５３，４８５号を参照のこと）ならびに他の酵素は、本明細書中に開示される方法での使用が意図される。
【００３３】
単離された供給源材料は、１以上の所望の細胞集団を富化するためにさらに処理され得る。しかし、未分画膵臓組織もまた、培養のために一旦解離されたら、本発明の培養方法において、さらなる分離をすることなく直接用いられ得、そして中間細胞集団を生じる。１つの実施形態では、単離された膵臓細胞材料は、密度勾配（例えば、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌ）を通した遠心分離によって精製される。例えば、米国特許第５，７３９，０３３号に記載される勾配方法は、処理された膵臓材料を膵島において富化するための手段として用いられ得る。ドナー供給源から収集された細胞の混合物は代表的に、不均質であり、従って、α細胞、β細胞、δ細胞、管細胞、腺房細胞、条件的前駆細胞および他の膵臓細胞型を含む。
【００３４】
代表的な精製手順は、多数の層または界面への、単離された細胞材料の分離をもたらす。代表的に、２つの界面が形成される。上の界面は膵島が豊富であり、そして代表的に１０％〜１００％の膵島細胞を懸濁して含む。第二の界面は代表的に、膵島細胞、腺房細胞および管細胞を含む細胞の混合集団である。底の層はペレットであり、ペレットは、勾配の底に形成される。この層は代表的に、主に（＞８０％）腺房細胞、いくつかの捕獲された膵島およびいくつかの管細胞を含む。管の樹成分は、さらなる操作のために別々に収集され得る。
【００３５】
さらなる操作のために選択される画分の細胞密度（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）は、どの勾配画分が選択されるか、および各単離の最終結果に依存して変動する。膵島細胞が所望の細胞型である場合、単離された画分内に適切に富化された膵島細胞集団は、少なくとも１０％〜１００％の膵島細胞を含む。他の膵臓細胞型および濃度はまた、富化後に収集され得る。例えば、本明細書中に記載される培養方法は、用いられた精製勾配に依存して、第２の界面、ペレットまたは他の画分から単離された細胞について用いられ得る。
【００３６】
１つの実施形態では、中間膵臓細胞培養物は、膵島富化（上の）画分から作製される。しかし、さらに、それぞれ、膵島細胞、腺房細胞および管細胞の混合された細胞集団、または管樹成分、腺房細胞およびいくつかの捕獲された細胞の混合された細胞集団を代表的に含む、より不均質な第２の界面および底の層の画分もまた培養において用いられ得る。両方の層が、本明細書中に記載される中間段階の集団を生じ得る細胞を含むが、各層は、開示された方法について用いるための特定の利点を有し得る。
【００３７】
（ＩＩ．中間段階の膵臓幹細胞集団の生成および増殖）
（Ａ．一般的細胞培養手順）
一旦膵臓細胞が入手および単離されたら、これらは、所望の中間段階集団の増殖を、または他の実施形態では、より成熟した細胞型の分化を選択する条件下で培養される。一般的細胞培養方法論は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２０００）に見出され得る。代表的に、膵臓細胞は、他の哺乳動物細胞に適切な条件下で、例えば、加湿インキュベーター中に３７℃で、５％  ＣＯ２の条件下で培養される。細胞は、当該分野で公知の種々の基材（例えば、負の表面電荷を有する、ホウケイ酸ガラス製のチューブ、ボトル、ディッシュ、クローニングリング、プラスチック製の組織培養チューブ、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレート、増大した増殖表面積（ＧＳＡ）または食道ドップラーモニタ（Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒ；ＥＤＭ）仕上げを有する容器、ＧＳＡを増大させるための複数の内部シートを有するフラスコ、Ｆｅｎｗａｌバッグおよび他の培養容器）で培養され得る。
【００３８】
一旦膵臓細胞材料が収集され、そして培養について選択されたら、または一旦集団がコンフルエントになり、そして新たな基材に移植されたら、細胞の集団は、培養のために適切な組織培養容器へと播種される。播種密度は、開示された方法を用いて培養される膵臓細胞の生存率に影響を有し得、そして特定の培養条件について最適な播種密度は、種々の密度の範囲で細胞を播種し、そして得られる細胞の生存率および増殖速度をモニタリングすることによって経験的に決定され得る。ある範囲の播種密度は、ホルモン分泌細胞を培養において産生する際に有効であることが示されている。代表的に、細胞濃度は、１枚の１００ｍｍ培養ディッシュあたり約１０２細胞〜約１０８細胞、例えば、１枚の１００ｍｍ培養ディッシュあたり１０２細胞、１０３細胞、１０４細胞、１０５細胞、１０６細胞、１０７細胞または１０８細胞の範囲に及ぶが、より低い細胞濃度が、クローニング手順のために用いられ得る。他の培養容器についての細胞濃度は、種々の培養容器について相対基材表面積および／または培地気体交換表面積を計算することによって調整され得る。例えば、代表的な１００ｍｍ培養ディッシュは、５５平方センチメートルの基材表面積（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと）を有し、そして１枚のディッシュあたり１０，０００細胞の細胞濃度は、１平方センチメートルあたり約１８０細胞に相当し、一方、１枚のディッシュあたり１００，０００細胞の細胞濃度は、１平方センチメートルあたり約１，８００細胞に相当する。培養容器の表面積に関する細胞濃度は、培養表面積あたりの適切な培地容積（０．２ｍｌ／ｃｍ２〜０．５ｍｌ／ｃｍ２が静置培養について代表的な範囲である）を用いることによって、培地容積に関する細胞濃度に関連付けられ得る。１０倍の増大が生じたか否かを決定するために、細胞は、酵素消化によって取り出され、そして既知容積の流体中にて顕微鏡下で計数される。細胞はまた、増殖および分化を促進する規定の細胞外マトリクス成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマトリクスおよび好ましくはコラーゲンＩＶまたはラミニン）で予めコーティングした培養表面で増殖され得る。
【００３９】
標準的な細胞培養増殖技術は、本発明の実施のために適切である。細胞が、培養表面に付着して増殖する場合、この細胞は代表的に、８０％〜９０％コンフルエンスが達成されるまで単層として増殖し、この時点で、この細胞は、タンパク質分解消化によって表面から遊離され、そして新たな容器中での培養のために１：２または１：３に分けられる。この細胞のより高い希釈（一般に、１：４〜１：１０の範囲の間）もまた適切であるが、さらに低い細胞濃度は、クローニング手順において適切である。タンパク質分解酵素およびキレート剤の濃度は通常、細胞が無血清培地（例えば、０．０２５％トリプシンおよび０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に継代される場合、より低くされる。培養培地は代表的に、毎週２回交換されるか、または培地のｐＨが新鮮な培地が必要とされることを示すときに交換される。
【００４０】
本発明の膵臓細胞は、種々の培地において培養され得る。本明細書中で記載されるように、特定の成分（特に血清）を含むかまたは欠く培地は、単離手順および増殖手順の特定の段階で好ましい。例えば、膵臓から新たに単離された細胞は、高血清培地中で維持されて、細胞が単離手順から回復するのを可能とし得る。逆に、低血清培地は、中間段階集団の選択および増殖に有利に働く。従って、多数の培地処方は、本発明の実施において有用である。本明細書で開示される培地処方は、例示的な目的のためであり、そして培地の重要でない成分は、本明細書中に記載されるアッセイを用いて、細胞集団の複製または分化に対するバリエーションの影響をアッセイすることによって、単純に省略、置換、変更または添加され得る。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５４（１９９９）を参照のこと。
【００４１】
培養培地は通常、基本培地を含み、基本培地は、無機塩、緩衝剤、アミノ酸、ビタミン、エネルギー源およびいくつかの場合、タンパク質代謝、核酸代謝、炭水化物代謝または脂質代謝に関与する有機中間体および前駆体の形態のさらなる栄養素を含む。基本培地としては、Ｆ１２、ＥａｇｌｅのＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ１２とＤＭＥＭとの１：１混合物などが挙げられる。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと。細胞の増殖を支持するために、基本培地には通常、増殖因子、他のタンパク質、ホルモンおよび微量元素の供給源が補充される。これらの補充物は、細胞の増殖、維持および／または分化を促進し、他の培地成分中の不純物または毒素を相殺し、そして基本培地中に欠けている微量養分を提供する。多くの培養培地では、血清は、これらの補充物の供給源である。血清は、種々の哺乳動物供給源（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマなど）から、および成人、若年期または胎児の供給源から補充され得る。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと。胎児ウシ血清は、通常用いられる補充物である。血清の濃度は、総培地溶液の百分率として、血清の容積に関して表され、そして代表的には、約０．１％〜約２５％、例えば、約０．１％、約０．２％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％または約２５％の範囲にわたる。いくつかの適用では、基本培地には、血清よりむしろ、増殖因子、ホルモンおよび微量元素の規定のまたは半規定の混合物が補充される。血清置換補充物についての処方は、本明細書中に開示される；他のものは、当該分野で公知であるかまたは商業的供給源から入手可能である（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，前出を参照のこと）。いくつかの実施形態については、血清の濃度は、低くされるが除去されず、そして規定または半規定の補充混合物が規定培地に添加される。高濃度または低濃度の血清を含む培地についての好ましい適用は、本明細書中に記載される。
【００４２】
（Ｂ．高血清中の単離された膵臓細胞の維持および増殖）
ドナー膵臓から収集された細胞は通常、ドナーの死と単離手順の開始との間に、温かい虚血または冷たい虚血の期間を経ている。さらに、単離手順の間に、膵臓細胞は通常、タンパク質分解消化ならびに機械的ストレスおよび剪断ストレスに供される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらの細胞によって経験された種々の外傷は、膵臓幹細胞集団（例えば、条件的前駆細胞）の増大をもたらす種々の細胞プロセスをアップレギュレートし得る。中間細胞集団は、単離または精製後に細胞を低血清培地中に直接配置することによって満足のいく効率で作製され得る。それにもかかわらず、単離手順の間に細胞によって経験された外傷は、細胞の生存および培養への適応に有害な影響を有し得るので、新鮮に単離された細胞を、高濃度の血清（例えば、＞４％）を含む安定化培地中で維持して、培養プロセスの効率を改善することがときどき所望される。この維持期間は、短くてもよい（例えば、一晩）。必要に応じて、細胞は、高血清培地中で長期の増殖期間にわたって維持され得る。
【００４３】
安定化のための高血清培地は代表的に、少なくとも４％の血清を含み、そしていくつかの実施形態では、より高濃度の血清（例えば、１０％または２０％）を含む。安定化または増殖のために用いられる培地は、多くの商業的供給源から入手可能な、そしてＭｏｏｒｅら，Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  １９９：５１９−５２４（１９６７）によって記載される、基本培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０）から誘導され得る。維持または増殖のための例示的な高血清培地としては、培地３（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５μＭ  ＺｎＳＯ４および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））および培地７（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、５μＭ  ＺｎＳＯ４および２０％  ＦＢＳ）が挙げられる。高血清培地はまた、特定の容積の高血清培地（例えば、培地３または培地７）を特定の容積の無血清培地（例えば、ＳＭ９５、ＳＭ９６またはＳＭ９８（本明細書中に記載される））と混合して所望の血清濃度（例えば、４％〜９％）に達することによって誘導され得る。
【００４４】
収集後の安定化のために、細胞は、培養容器中で、高血清培地中で比較的高密度（例えば、７０ｍｌの培地７（２０％  ＦＢＳ）中で１０９細胞）で便利に培養される。しかし、より低い細胞密度および血清濃度もまた用いられ得る。細胞は代表的に、比較的短時間（例えば、一晩）にわたって元の容器中で維持されて、収集手順からの回復が可能にされる。
【００４５】
維持期間後、細胞は、本明細書中に記載されるように、中間細胞集団の選択および増殖のために低血清培地へと移植され得る。必要に応じて、細胞は、高血清培地中で培養されて、混合細胞集団の増殖が可能にされ得る。代表的な実施形態では、維持培養からの細胞は、培地３（１０％  ＦＢＳ）、培地７（２０％  ＦＢＳ）または培地３と培地７との混合物（１５％  ＦＢＳ）を含む新たな培養容器中に再度播種される。細胞は代表的に、この培地中で７日間〜１０日間にわたって培養され、その間に、これらはコンフルエンスまで増殖し得る。一旦細胞がコンフルエンスに到達したら、これらは、本明細書中に記載される中間細胞集団の選択的増殖のために低血清培地中へと継代され得る。
【００４６】
（Ｃ．低血清培地における培養による、中間段階の膵臓幹細胞集団の増大および増殖）
一旦膵臓細胞が単離されたら、増殖している中間段階集団の出現を促進するために、細胞は選択的培地へと移植される。この選択的培地は、膵臓内分泌ホルモンを分泌する能力を保持する細胞の増殖、または高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌する、より分化した細胞へと成熟する可能性を保持する細胞の増殖に好都合である。一般に、選択的培地は、線維芽細胞および間葉細胞を犠牲にして、上皮細胞または上皮様細胞の増殖に好都合であるが、純粋な上皮培養物は、本発明の方法における膵臓細胞の有利な使用のために必要とされるとは示されていない。代表的に、上皮選択的培地は、培養中での一定期間の増殖（例えば、各継代における集団の増大に依存して、２回、３回、４回または５回の継代）後に、ほぼ純粋な（例えば、＜１０％の線維芽細胞または間葉細胞）細胞の集団を生じる。
【００４７】
胎児組織からの上皮細胞増殖に好都合なように用いられている１つの型の選択的培地は無血清培地である（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら，前出；ＰｅｅｈｌおよびＨａｍ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １６：５２６−４０（１９８０）を参照のこと）。成長ホルモンの供給源を含む、上皮特異的培地、そしてより好ましくは低血清培地が、成体哺乳動物から、膵臓細胞発達のマーカー（例えば、ＰＤＸ−１）を保持するが、適切な条件下でさらに分化して高レベルの膵臓内分泌ホルモンを発現し得る、増殖する膵臓細胞の別個の集団を選択するために用いられ得る。膵臓細胞の培養に適切な特定の上皮選択的培地は本明細書中に開示されるが、上皮細胞または上皮様細胞の優先的増大に好都合な、当該分野で公知の他の培地処方もまた用いられ得る。
【００４８】
上皮選択的低血清培地への移動は、高血清培地中での一定期間の維持（「離脱（ｗｅａｎｉｎｇ）」）後に、または単離および分離手順後に細胞を選択的低血清培地中へ直接移動させること（「ショック」）によって、達成され得る。いずれの方法論も、所望の中間細胞集団の作製のために適切である。
【００４９】
（１．選択的低血清培地の調製）
この状況で用いられる場合、「低血清培地」とは、約１％未満の血清を有する培地をいう。従って、無血清培地は、一種の低血清培地である。０％と１％との間の血清、例えば、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％または０．９％の血清の濃度を有する培地は、適切な濃度の血清を無血清培地へと添加することによってか、または無血清培地と血清含有培地とを混合して所望の濃度の血清を達成するかのいずれかによって調製され得る。
【００５０】
完全無血清培地は、基本培地（例えば、ＳＭ９６または１：１  Ｆ１２／ＤＭＥＭ）に増殖因子、他のタンパク質、ホルモンおよび微量養分の混合物（これは、血清によって提供される生物学的機能を代理する）を補充することによって調製される。無血清培地の利点は、補充混合物の組成が、所望でない細胞（例えば、腺房細胞または結合組織細胞（例えば、線維芽細胞））の増殖を防止しながら、所望の細胞集団（例えば、中間細胞集団）の増殖を促進するために、容易に操作され得ることである。補充混合物はまた、より成熟した細胞への幹細胞集団の分化を促進するために、または増殖の高率を維持するために幹細胞集団の分化を妨害するために、操作され得る。
【００５１】
（ａ）成長ホルモン）
成長ホルモン（ＧＨ）を含む上皮選択培養培地は、中間分化の有益な膵臓細胞集団の出現を促進するために使用される。特定の理論によって束縛されることを望まないが、細胞増殖を支持する、血清中に通常見出されるマイトジェン性物質をＧＨが代理し得るが、血清は、それほど望ましくない細胞集団（例えば、線維芽細胞および間葉細胞）の過剰増殖を促進する他のマイトジェン性因子を含むことが仮定される。それゆえ、ＧＨを含有する補充混合物での血清の置換は、中間の分化状態の細胞集団の増殖を選択する。無血清培地中でのＧＨの機能は、本発明の代替実施形態では他の補充成分で置換され得るが、天然抽出物中で、または組換えタンパク質として、ＧＨが容易に利用可能であることによって、ＧＨ含有培地は、本明細書中に開示された方法について適切な上皮選択培地となる。
【００５２】
成長ホルモン（ソマトトロピンとしても公知）は、下垂体前葉において合成され、正常な身体の成長および乳汁分泌を促進し、そして細胞代謝の種々の局面に影響を与える、ポリペプチド性ホルモンである。ＧＨは、細胞に直接的影響、ならびにＩＧＦ−Ｉおよび類似の分子によって媒介される間接的影響の両方を有する；インタクトな膵臓では、膵島細胞の増殖は、ＧＨならびに相同なホルモンプロラクチンおよびラクトゲンの発現に結び付けられている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７７（１）：６２−６（１９９９）を参照のこと）。ヒトでは、成熟ＧＨは、１９１アミノ酸残基を含み、そして２２ｋＤａの分子量を示す。しかし、通常観察されるジスルフィドダイマーに加えて、ヒトＧＨの一部（残基１〜４３および４４〜１９１）から作製される２つのペプチドが血清中に検出されており、そして成人膵島組織に対して別個の効果を有する（Ｌｅｗｉｓら，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ  ４７増補：Ｓ１−８（２０００）を参照のこと）。ヒトＧＨの種々の天然に存在する、誘導体、改変体、代謝産物および操作された誘導体が公知であり、これらとしては、グリコシド化ＧＨ、メチオニルＧＨ、２０ｋＤａ  ＧＨ、アセチル化ＧＨ、タンパク質分解切断ＧＨ、脱アミド（ｄｅｓａｍｉｄｏ）ＧＨ、スルホキシドＧＨおよび短縮形態のＧＨが挙げられる。
【００５３】
ＧＨは、ホルモンの保存されたファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ヒトにおけるＧＨ−Ｖ１およびＧＨ−Ｖ２、コリオマンモトロピンおよびプロラクチン、ならびに他の脊椎動物由来のタンパク質（例えば、齧歯類の胎盤性ラクトゲンＩおよびＩＩならびに他のウシおよびヒツジのラクトゲン、マウスのプロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、ならびにプロリフェリン関連タンパク質、ウシプロラクチン関連タンパク質Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、ラットプロラクチン様タンパク質ＡおよびＢ、ならびに種々の魚由来のソマトラクチンを含む。このファミリーのメンバーは、以下のコンセンサス配列によって特徴付けられる：Ｃ−ｘ−［ＳＴ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ−［ＬＩＶＭＳＴＡ］−Ｐ−ｘ（５）−［ＴＡＬＩＶ］−ｘ（７）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（６）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−［ＳＴＡ］−ＷまたはＣ−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−Ｄ−［ＬＩＶＭＦＹＳＴＡ］−ｘ（５）−［ＬＩＶＭＦＹ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＦＹＴ］−ｘ（２）−Ｃ。
【００５４】
本発明の実施のために適切な成長ホルモンは、種々の天然供給源および人工供給源から入手され得る。同種のＧＨをしばしば必要とするＧＨの治療的用途とは対照的に、霊長類種、哺乳動物種または脊椎動物種の範囲由来のＧＨは、膵臓細胞の培養のための低血清培地の処方において用いられ得る。成長ホルモンの便利な供給源は、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）であり、これは、天然のＧＨの豊富な供給源である。ＢＰＥ（７５μｇ／ｍｌタンパク質）は、培養培地中に約０．１μｌ／ｍｌ〜約１００μｌ／ｍｌ、好ましくは０．５μｌ／ｍｌ〜５０μｌ／ｍｌ、そして最も好ましくは５μｌ／ｍｌまたは３７．５ｍｇ／ｌで含まれ得る。他の種から入手可能な下垂体抽出物（例えば、ブタ、ヒツジなど）もまた、同様の濃度で用いられ得る。下垂体抽出物中に存在する他の因子は、その効果を増強し得るが、満足のいく結果がまた、精製したＧＨを用いて、および組換えＧＨを用いて達成され得る。組換えウシＧＨおよび組換えヒトＧＨは、広範に入手可能であり、そしてＧＨ活性の適切な供給源である。組換えＧＨは、培養培地に、０．０１ｍｇ／ｌと１００ｍｇ／ｌとの間、好ましくは０．１ｍｇ／ｌと１０ｍｇ／ｌとの間、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｌ、約０．５ｍｇ／ｌ、約０．７５ｍｇ／ｌ、約１ｍｇ／ｌ、約１．２５ｍｇ／ｌ、約２ｍｇ／ｌまたは５ｍｇ／ｌ、そして最も好ましくは約１．２５ｍｇ／Ｌで添加され得、ここで、１ｍｇの組換えタンパク質は、３  ＩＵのＧＨにほぼ等価である。
【００５５】
（ｂ）他の補充物）
完全無血清培地のために基本培地へと添加される代表的成分としては、以下が挙げられる：組換えヒトインスリン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、上皮増殖因子（０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ）、ホスホエタノールアミン（０．１μＭ〜１００μＭ）、トリヨードチロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｏｎｅ）（０．１ｐＭ〜１００ｐＭ）、セレン（０．１ｎＭ〜１００ｎＭ）、ヒドロコルチゾン（０．０１μＭ〜１００μＭ）、プロゲステロン（０．１ｎＭ〜１０ｎＭ）、フォルスコリン（０．１μＭ〜１００μＭ）、ヒレグリン（０．１ｎＭ〜１００ｎＭ）およびウシ下垂体抽出物（０．１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ）。細胞増殖を支持するために全ての補充成分が必要とされるわけではない；特定の補充物についての最適な濃度または必要性は、単一成分を省略するかまたはその濃度を低減し、そして細胞増殖に対する影響を観察することによって経験的に決定され得る（Ｓｔｅｐｈａｎら，前出を参照のこと）。
【００５６】
一般に、補充成分は、同じ生物学的特性を有する天然産物または合成産物によって置換され得る。例えば、トリヨードチロニン、ヒドロコルチゾンおよびプロゲステロンは全て、同じ細胞内レセプター（甲状腺レセプター、グルココルチコイドレセプターおよびプロゲステロンレセプター）を活性化することが公知の天然または合成のホルモンによって置換され得る。インスリンおよびＥＧＦは代表的に、組換えＤＮＡ方法論によって産生されるヒトタンパク質であるが、天然の供給源から精製されたポリペプチドによって、他の種由来のポリペプチドによって、またはインスリンレセプターおよびＥＧＦレセプターの他のアゴニストによって、置換され得る。ＧＨは、いくつかの場合、ＧＨレセプターの他のアンタゴニストによって置換され得る。同様に、ＥｒｂＢ３レセプターのリガンドであるヒレグリンは、ヒレグリンアイソフォームならびに他のＥｒｂＢ３アゴニスト（例えば、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３およびＮＲＧ４、感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子、ニューレスチン（ｎｅｕｒｅｓｔｉｎ）ならびにＥｂｐ−１、ヒレグリンα、ヒレグリンβ、ヒレグリンγ、ニューレグリン−１およびニューレグリン−２（ＮＲＧ−１α；ＮＲＧ−１β、ＮＲＧ−２αおよびＮＲＧ−２β））によって置換され得る。
【００５７】
例示的な無血清培地としては、基本培地ＳＭ９６および完全培地ＳＭ９５（これは、以下の表に示されるように補充されたＳＭ９６からなる）が挙げられる。ＳＭ９８は、Ｓｔｅｐｈａｎら，前出によって記載された培地補充物１４Ｆの改変物が補充された、１：１のＦ１２／ＤＭＥＭからなる。ＳＭ９８は、１４Ｆよりも少ないヒレグリン（８ｎｇ／ｍｌに対して１ｎｇ／ｍｌ）を含む。従って、ＳＭ９８は、以下が補充された、１：１のＦ１２／ＤＭＥＭからなる：組換えヒトインスリン、１０μｇ／ｍｌ；トランスフェリン、１０μｇ／ｍｌ；上皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ；エタノールアミン、６１ｎｇ／ｍｌ；アプロチニン、２５μｇ／ｍｌ；グルコース、５ｍｇ／ｍｌ；ホスホエタノールアミン、１４１ｎｇ／ｍｌ；トリヨードチロニン、３．３６５ｐｇ／ｍｌ；セレン、４．３２５ｎｇ／ｍｌ；ヒドロコルチゾン、１８１ｎｇ／ｍｌ；プロゲステロン、３．１５ｎｇ／ｍｌ；フォルスコリン、４１０ｎｇ／ｍｌ；ヒレグリン、１ｎｇ／ｍｌ；およびウシ下垂体抽出物、７５μｇ／ｍｌ。ＳＭ９５およびＳＭ９８中のＥＧＨおよびヒレグリンの例示的供給源は、組換えヒトＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ  Ｅ９６４４）およびヒトヒレグリン−β１のＥＧＦドメイン（アミノ酸１７６〜２４６）（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ３９６−ＨＢ／ＣＦ）である。
【００５８】
【化１】
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【００５９】
【化２】
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【００６０】
【化３】
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（２．低血清培地への細胞の移動）
低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移動することは、中間分化状態を有する、規定された細胞集団の選択を促進する。この細胞集団は、継代培養された場合増殖し続けるが、膵臓マーカー（例えば、ＰＤＸ−１）の高い発現レベルを維持する。刺激されていない、この集団は、比較的低レベルの膵臓内分泌ホルモン（例えば、インスリン）を分泌するが、本発明の方法に従って成熟して、高分泌細胞が得られ得る。低血清培地へと膵臓細胞の培養物を移送するために、細胞は、高血清培地から低血清培地へと離脱され得るか、または単離後に低血清培地中に直接配置され得る。ＳＭ９５およびＳＭ９８のような培地は、適切な低血清培地であるが、ＳＭ９５は、膵臓細胞の成熟の際にわずかに改善されたインスリン分泌を生じる。
【００６１】
中間の細胞集団は、代表的に、増殖する能力および高い分泌内分泌細胞へとさらに分化する能力の両方を保持する。増殖能力は、一般的に、増大するために第１の密度で播種された培養物が第２の密度まで拡大する能力（例えば、１平方センチメートルあたり約１８０細胞でプレートされた細胞は、単一の継代において１，８００細胞まで増大され得る）によって評価される。増殖および継代のサイクルを繰り返すので、単離された膵臓細胞の初期集団は、約１０，０００倍以上（例えば、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約５０００倍、約１０，０００倍、約５０，０００倍、約１００，０００倍、約５００，０００倍または約１，０００，０００倍）まで増大され得るが、内分泌マーカー（例えば、ＰＤＸ‐１およびインスリンｍＲＮＡ発現）は保持し、さらに成熟した高い分泌内分泌細胞へ分化する能力を保持する。
【００６２】
（ＩＩＩ．適応できる細胞培養）
成熟プロセスにおける予備的な工程において、中間段階の膵臓幹細胞は、適切な培養条件下で増殖する。簡潔に、中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培地皿または新しい培養皿で増殖し、この細胞がコンフルエンスに達しないことを確実にするように注意する。両タイプの皿由来の細胞は混合され、以下に記載されるようにカプセル化されるかまたは培養皿に再度播種される。
【００６３】
（Ａ．馴化培地皿）
馴化培地皿は、中間段階の膵臓幹細胞を増殖するために、あらかじめ使用していた培養皿である。一旦、この細胞が単層を形成すると（代表的には約５日で、初回継体培養の播種密度に依存する）、これらはトリプシン処理によって除去される。馴化培養皿を生産するために、１００％のコンフルエント細胞培養の増殖は必要とされない。低濃度のトリプシン（代表的には、標準的な細胞培養で使用された濃度の１／２または１／４）は、マトリックスの広範囲の分解を防ぐために好ましい。あるいは、細胞の単層は、界面活性剤を用いて基材を抽出することによって除去され得、界面活性剤は、細胞を除去するが、分泌されたマトリックスを残す（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４０９４−８（１９８０）を参照のこと）。
【００６４】
都合がよいことに、基材または培養皿で予め増殖され除去された細胞は、分けられ、そして今は馴化された同じ培養皿に再度播種され得る。しかし、基材を馴化させる培養物と基材に播種される培養物とが同じ培養物である必要はない。従って、１つの細胞培養物は、基材を馴化させるために基材上で増殖され、この細胞は除去され、そして別の培養物由来の細胞は馴化基材上に播種される。馴化細胞は、その後培養される細胞と同じまたは異なるドナーまたは種に由来し得る。
【００６５】
（Ｂ．適応培養を用いる細胞増殖）
中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培養容器と新しい培養容器との混合体上に分配される。培養時間は、これらの細胞が増殖可能である限りは重要でない。好ましい実施形態において、膵臓から単離されたばかりの細胞（例えば、１回または２回のみ継代される）が使用される。既に述べられたように、中間段階の膵臓幹細胞の集団の増殖を促進するために、これらの細胞は、低血清培地で増殖される。これらの細胞がお互い接触せず、好ましくはコンフルエンスに達する前に収集されるような密度で、細胞は播種される。当業者は、播種された細胞数は、コンフルエントに達する前の培養時間に影響するということを認識している。
【００６６】
収集後、馴化プレートおよび新しいプレート由来の細胞が組み合わされる。新しいプレートで増殖された細胞と馴化プレートで培養された細胞との比率は、いくらかの細胞が馴化プレートで増殖される限り、本発明には重要ではない。
【００６７】
次いで、収集された細胞は、下記の通りカプセル化されるか、または新しい組織培養プレート上に播種され得る。次いで、適応培養を受けている細胞および次いで培養で増殖される細胞は、増殖し得、かつグルコース調節様式において高値のインスリンを分泌し得る。インスリン対アクチンの比は、適応培養の前の比と同様である。
【００６８】
（ＩＶ．中間の増殖膵臓細胞のカプセル化）
適応培養後、中間の増殖幹細胞のカプセル化は、カプセル内に細胞性凝集体の形成を生じる。この凝集体は、膵臓から新しく単離されたカプセル化膵島に類似する細胞性構造物およびタンパク質の発現表現型を有する。
【００６９】
カプセルはまた、糖尿病の宿主に膵臓細胞を移植させ得る一方で、宿主動物の免疫応答を最小限にしている。カプセル膜の多孔性は、カプセルからインスリンのような生体材料の分泌を可能にするために選択され得る一方で、外来細胞に対する宿主の免疫系のアクセスを制限している。
【００７０】
カプセル化法は、当該分野で公知であり、そして以下の参考文献に開示される：ｖａｎ  Ｓｃｈｅｌｆｇａａｒｄｅおよびｄｅ  Ｖｏｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：１９９−２０５（１９９９），Ｕｌｕｄａｇら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ  Ｒｅｖ．４２：２９−６４（２０００）および米国特許出願第５，７６２，９５９号，同第５，５５０，１７８号および同第５，５７８，３１４号。以下は、一般的な中間段階の膵臓幹細胞のカプセル化の記述である。特定の実施例は、本出願の実施例の節で見出される。
【００７１】
（Ａ．カプセル化材料）
カプセル化細胞は、ヒドロゲルによって取り囲まれている。ヒドロゲルは、種々の材料で作製され得、アルギン酸、アガロースおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。これらの材料は、架橋される場合、イオン結合または共有結合のいずれかで、水中にヒドロゲルを形成する。
【００７２】
膵臓細胞のカプセルに使用する好ましい材料は、アルギン酸（マンヌロン酸（Ｍ）およびグルロン酸（Ｇ）から構成される多糖類）である。二価カチオン（例えば、カルシウムまたはバリウム）で架橋される場合、アルギン酸はヒドロゲルを形成する。
【００７３】
（Ｂ．カプセル形成）
細胞のカプセルの例として、ポリリジン膜を有するアルギン酸カプセルの形成が記述される。当業者は、カプセルはまた、アルギン酸およびポリリジンまたは他の材料の改変体を用いて形成され得ること、そしてこの形成プロセスは、カプセル化細胞の機能に影響しないで同様に修飾され得るということを認識している。この細胞の機能を試験するためのアッセイは、本願における第ＩＶ節のカプセル化細胞の埋め込みおよび第ＶＩの表現型アッセイで提供する。
【００７４】
細胞およびアルギン酸を含む小滴は、小滴を形成する装置（例えば、空気駆動の小滴発生装置または高電圧静電気パルスシステム）で作製される。小滴はまた、重力を用いて作製され得る。アルギン酸溶液は、イオンクロスリンカー（例えば、カルシウム）を含む溶液内で、小滴をインキュベートすることによって、ゲルの中に形成される。
【００７５】
膜を形成するために、ポリリジンを含む溶液中に小滴を懸濁することによって、ポリアニオン性のアルギン酸はポリカチオンポリジン（ｐｏｌｙｓｉｎｅ）でコートされる。当業者は、ポリリジンの分子量ならびに濃度、およびインキュベーション時間を変化させることは、膜の多孔性に影響を及ぼすということを認識している。
【００７６】
一旦、膜がヒドロゲルの周りに形成されると、利用者は、カルシウムイオンを除去することにより（通常、クエン酸ナトリウムの溶液中にカプセルを浸漬することにより）、ゲルを液化するオプションを有する。当業者は、液化が適切であるという状況を認識している。生体適合性を促進する最後の工程は、アルギン酸中にカプセルを懸濁すること、または他の何らかの荷電した分子が正に荷電したポリリジンと結合することである。
【００７７】
（Ｃ．マクロカプセルの中へのマイクロカプセルの取り込み）
当業者は、ある状況下において、さらなる工程が、埋め込みされたカプセル化膵臓細胞に対して実施され、宿主応答を減少させ得るということを認識している。好ましい方法は、マイクロカプセルをマクロカプセルへ取り込みさせることである。この技術は、本明細書中において参考として援用される米国特許第５，５４５，４２３号に記載される。
【００７８】
簡潔に言えば、マイクロカプセルは、前節で記載されるように、本質的に作製される。液化された内部を有するマイクロカプセルが使用され得るが、ゲル状の内部を有するマイクロカプセルが好ましい。次いで、マイクロカプセルのポリカチオン層は、免疫系からより効果的にマスクされるという結果をもって、多数のマイクロカプセルは、ゲル状の材料の厚い層で覆われる。
【００７９】
マイクロカプセルを覆うマクロカプセル層は、任意の厚さであり得るが、少なくとも約１ミクロンの厚さであり、好ましくは少なくとも約５０ミクロンの厚さである。マクロカプセルは、マイクロカプセルに対して記載されるように、ヒドロゲルを作製するのに適した任意のポリマーで作製され得、そして、イオンまたは共有結合法で架橋され得る。マクロカプセルは種々の形状に作製され得、シリンダー、球体またはディスクが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、マクロカプセルの特定の組成は、カプセル化細胞の機能に影響を及ぼさず、そしてさらに、本願の技術を用いて、カプセル化細胞の機能に対してアッセイし得ることを認識している。
【００８０】
（Ｄ．カプセル化細胞の凝集体および培養におけるこれらの維持）
カプセル化後、中間の増殖幹細胞は凝集体を形成する。凝集体の細胞性構造物およびタンパク質の発現形態は、本願の第ＶＩ節に記載されるように、免疫染色によって分析され得る。代表的な細胞の凝集体は、以下の表現型を有する：細胞の単層は、凝集体の外周を取り囲み、ＣＫ−１９を発現するが、凝集体の内部の細胞は、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンを発現する。ＣＫ−１９を発現する細胞は、おそらく未分化細胞である；中心の、ホルモンを発現する細胞は、おそらく成熟細胞である。
【００８１】
カプセル化された膵島と同様に培養中で、カプセル化細胞は増殖され得る。従って、カプセル化された中間の増殖幹細胞は、カプセル化膵島において使用される培養と類似の様式で、培養中に維持され得る。二価カチオンは、液体状態を保持するために、培養培地へ添加され得る。例えば、ヒドロゲルがカルシウムで架橋されたアルギニン酸である場合、０．０３ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが培養培地へ添加され得る。
【００８２】
（Ｖ．カプセル化膵臓細胞の埋め込み）
哺乳動物への埋め込みまたは移植、および内分泌機能をその後モニターすることは、膵島移植で一般に使用される方法に従って実施され得る：例えば、Ｒｙａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７１０−１９（２００１）；Ｐｅｃｋら、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ３３：１８６−９２（２００１）；Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ３４３（４）：２３０−８（２０００）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｕｐｓ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  １０５（２）：１０７−２３（２０００）およびＫｕｈｔｒｅｉｂｅｒ，ＷＭ，Ｃｅｌｌ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９９を参照のこと。埋め込みの好ましい部位は、腹腔、肝臓および腎臓カプセルを含む。
【００８３】
（Ａ．マイクロカプセルの投薬量）
当業者は、意図したレシピエントに対して、マイクロカプセルの適切な投薬量を決定し得る。この投薬量は、レシピエントのインスリン必要量に依存する。マイクロカプセルによって分泌されたインスリンレベルは、免疫学的にまたは生物学的活性量によって決定され得る。レシピエントの体重はまた、投薬量を決定する場合、考慮に入れられ得る。必要に応じて、カプセル化細胞に対するレシピエントの応答がモニターされるように、一つより多い埋め込みが実施され得る。従って、埋め込みに対する応答は、カプセル化細胞の投薬量に対するガイドとして、使用され得る。（Ｒｙａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７１０−１９（２００１））
（Ｂ．動物におけるカプセル化細胞機能のモニタリング）
レシピエントにおけるカプセル化細胞の機能は、グルコースに対するレシピエントの応答をモニターすることによって決定され得る。カプセル化細胞の埋め込みは、血中グルコースレベルのコントロールを生じ得る。さらに、膵臓内分泌ホルモン、インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの上昇したレベルの徴候は、移植されたカプセル化細胞の機能を表し得る。
【００８４】
当業者は、血中グルコースのコントロールが異なる方法でモニターされ得ることを認識している。例えば、体重とインスリン必要量を対比することにより、血中グルコースは直接的に測定され得る。経口グルコース負荷試験がまた与えられ得る。腎機能はまた、代謝パラメターとして決定され得る。（Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ，Ｐ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９０：５８４３−５８４７（１９９３）；Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ，Ｐ．ら、Ｌａｎｃｅｔ３４３：９５０−９５１（１９９４））。
【００８５】
（ＶＩ．表現型アッセイ）
成熟膵臓細胞が存在するときを知るために、インビボまたはインビトロで増殖するかどうかを、培養の特定段階でおよびカプセル化後に、膵臓細胞の表現型をアッセイすることが有用である。特定のタンパク質の発現は、細胞の正体または分化状態と相関するので、細胞は、マーカー遺伝子またはマーカータンパク質の発現について分析されて、これらの正体または分化状態が評価され得る。例えば、新鮮に単離した膵臓組織では、アミラーゼの発現は、この細胞を外分泌腺房細胞と同定し、一方、インスリンの発現は、この細胞を内分泌膵島細胞と同定する。同様に、初期分化段階の膵島細胞は通常、サイトケラチンＣＫ−１９について陽性であり、一方、成熟島細胞は、ＣＫ−１９のより少ない発現を示す。
【００８６】
表現型特性は、細胞毎の様式で、または集団平均としてアッセイされ得る。アッセイ形式は、アッセイ技術の特定の必要要件および方法論に依存する。従って、ＦＡＣＳ分析によって懸濁細胞で実施されるか、または固定切片で実施される免疫組織化学によるマーカー発現のアッセイは、個々の細胞が所定のマーカーを発現する頻度および強度を測定する。一方、細胞集団全体についてのインスリン対アクチンｍＲＮＡ発現比の平均のような特性を測定することが所望され得る。このような場合、アッセイは代表的に、細胞プールからｍＲＮＡを収集し、そしてインスリンメッセージおよびアクチンメッセージの総量を測定することによって行われる。多くの表現型特性は、細胞または集団のいずれかに基づいてアッセイされ得る。例えば、インスリン発現は、分泌顆粒中のインスリンの存在について個々の細胞を染色することによってか、または細胞プールを溶解して総インスリンタンパク質についてアッセイすることによってかのいずれかでアッセイされ得る。同様に、ｍＲＮＡ量は、細胞集団について、細胞を溶解してｍＲＮＡを収集することによって、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって個々の細胞に基づいて測定され得る。
【００８７】
（Ａ．細胞分化マーカー）
膵臓細胞の集団を同定するために用いられ得る、多数の細胞性マーカーが存在する。単離されて培養されたドナー細胞は、分化した膵臓細胞の種々の表現型指標および遺伝子型指標を提示し始める。これらの指標またはマーカーにおける変化は、初期増殖期の後であるかまたは単離および精製の直後であるかにかかわらず、無血清環境への膵臓細胞のシフトに対する応答であると考えられる。表現型指標および遺伝子型指標の例としては、調節される（例えば、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれか）条件的前駆細胞集団中に存在する種々の分子マーカーが挙げられる。これらの分子マーカーとしては、ＣＫ−１９が挙げられ、ＣＫ−１９は、膵臓の条件的幹細胞のマーカーであると仮定される。
【００８８】
代表的に、哺乳動物幹細胞は、最終的な発達終点まで成熟するにつれて、多数の発達段階を経る。発達段階はしばしば、発達中の細胞に存在するかまたは存在しない、マーカーを同定することによって決定され得る。ヒト内分泌細胞は同様の様式で発達するので、細胞が幹細胞様表現型から偽島表現型へと移行するときの、細胞を同定するために種々のマーカーが使用され得る。
【００８９】
本発明の方法によって増殖または分化するように誘導された細胞におけるマーカーの発現は、正常なヒト膵臓の発達におけるマーカー発現の順番に対していくらかの類似性を保有する。発達の非常に初期では、始原上皮細胞は、ホメオドメイン核因子である初期細胞マーカーであるＰＤＸ−１を発現する。細胞が発達するにつれ、細胞は、出芽するようになり、そして管を形成する。これらの細胞は、上皮管細胞についてのマーカーであるサイトケラチン１９を発現し、そしてＰＤＸ−１を一時的に発現して、発生的に内分泌細胞となる。これらの細胞が発達し続けるにつれて、これらは、インスリン、ソマトスタチンまたはグルカゴンを発現する能力を獲得する。最終的な分化細胞は、１つしか発現し得ず、そしてα細胞（グルカゴン）、β細胞（インスリン）およびδ細胞（ソマトスタチン）となる。本発明の中間の細胞集団は、充分には分化していない発達段階にあると考えられ、増殖する能力および成熟内分泌細胞へと分化する可能性を保持している。この細胞が発達経路における前駆体の実際の例であるか、または単純にインビトロの操作の結果であるかにかかわらず、中間段階の細胞は、増殖し得、そして内分泌ホルモンを発現し得、従って、任意の型の膵島細胞における不全を修正するために用いられる可能性を有する。
【００９０】
目的のマーカーは、膵臓において時間的パターンおよび組織特異的パターンで発現される分子である（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８８０：３８−４９（１９９９）を参照のこと）。これらの分子マーカーは、以下の３つの一般的カテゴリーに分けられる：転写因子、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）経路マーカーおよび中間フィラメントマーカー。転写因子マーカーの例としては、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ−６．１、Ｉｓｌ−１、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３およびＨＥＳ−１が挙げられる。ノッチ経路マーカーの例としては、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１およびＲＢＰｊｋが挙げられる。中間フィラメントマーカーの例としては、ｃｋ−１９およびＮｅｓｔｉｎが挙げられる。
【００９１】
培養または単離された細胞におけるタンパク質マーカーおよび核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該分野で標準的であり、そして以下を含む：定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２００１年補遺）を参照のこと）および免疫アッセイ（例えば、切片化した材料の免疫組織化学的分析）、ウェスタンブロッティング、ならびに、インタクトな細胞において接近可能なマーカーについては、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照のこと）。内分泌細胞分化の従来の組織化学的マーカーもまた用いられ得る。免疫組織化学によって調べられるべき細胞は、検鏡のためにガラスチャンバスライド上で培養され得る。あるいは、従来の組織培養において増殖した細胞は、この培養物から手で取り出され、そしてパラフィン中に切片化のために包埋され得る。ＰＤＸ−１抗体は、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９３年１０月７日，（１０）１２７５−８３の教示に従って作製され得る。
【００９２】
細胞分化マーカーは変動し、そして従来の免疫組織化学によって検出され得る。一般的に適用可能なプロトコルが以下に続く。
【００９３】
染色プロセスは、スライドのチャンバ部分を除去することで始まる。細胞は、緩衝液中で非常に穏やかにリンスされ、そしてパラホルムアルデヒド溶液中で固定された。次いで、細胞は、正常な血清を含むブロッキング溶液中で室温でインキュベートされる。細胞は、ブロッキング溶液中で、非イオン性界面活性剤を用いて透過化された。以下に列挙した通りの一次抗体は、適切な希釈でブロッキング溶液中に調製され、細胞に添加され、そしてインキュベートされる。一次抗体とのインキュベートに続いて、細胞は、緩衝液中でリンスされ、そしてブロッキング溶液中で再度ブロッキングされた。
【００９４】
適切な希釈でブロッキング溶液中に調製された二次抗体は、細胞中に添加され、そして暗所にてインキュベートされる。インキュベーション後、この細胞はリンスされ、核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で対比染色された。過剰の流体は除去され、そしてスライドが取り付けられ、そしてカバースライドで覆われる。スライドは乾燥し、そして暗所において保存される。
【００９５】
あるいは、この細胞は、免疫細胞化学のためにＡＢＣ法を用いて調製され得る。手短には、この細胞はパラフィン中に包埋され、そしてパラフィン切片を有するスライドは３７℃にて一晩乾燥される。この細胞は、パラフィン除去され、そして過酸化水素メタノール溶液中に浸漬されて、内因性ペルオキシダーゼ活性が阻害される。スライドは、０．０１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で３０分間煮沸されて、特定のエピトープが回収される。スライドは緩衝液でリンスされ、そして湿潤チャンバ中で室温にて正常な血清を用いてブロックされた。
【００９６】
ブロッキング溶液中で調製された一次抗体は、サンプルに添加され、そして湿潤チャンバ中でインキュベートされる。スライドは洗浄され、そしてブロッキング溶液中に調製された二次抗体とともにインキュベートされる。スライドは緩衝液で再度リンスされ、そして市販のキット（例えば、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からのアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ試薬またはＡＢＣ複合体とともにインキュベートされた。スライドは、再度リンスされ、そして金のラップ中でジアミノベンジジン発色溶液；尿素過酸化水素と共にインキュベートされる。蒸留水を用いた洗浄の後、スライドはＭａｙｅｒのＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中に５分間に浸漬され、次いで、スライドは、水が無色になって核が青色になるまで、流水中に保持される。スライドは脱水され、そして観察のために覆った。
【００９７】
（Ｂ．インスリンｍＲＮＡ発現）
膵臓細胞の正体、分化または成熟度を特徴付けるために用いられ得る１つのマーカーは、インスリンｍＲＮＡのレベルである。例えば、本発明の中間の細胞集団は、規定された範囲内のインスリンｍＲＮＡの発現を示す。インスリンｍＲＮＡを定量するための方法としては、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護およびプライマー伸長が挙げられる。１つの実施形態では、ＲＮＡは、培養細胞の集団から抽出され、そしてプロインスリンメッセージの量が定量的逆転写ＰＣＲによって測定される。逆転写の後、インスリンｃＤＮＡは、インスリンｃＤＮＡ配列にハイブリダイズするプライマー、および増幅産物の量がサンプル中に存在するｍＲＮＡの量に関連する増幅条件を用いてサンプルから特異的かつ定量的に増幅される（例えば、Ｚｈｏｕら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２５６４８−５１（１９９７）を参照のこと）。反応速度定量手順は、出発ｍＲＮＡレベルが決定され得る精度に起因して好ましい。
【００９８】
頻繁に、インスリンｍＲＮＡの量は、構成的に発現されるｍＲＮＡ（例えば、アクチン）に対して正規化され、アクチンは、アクチン特異的プライマーを用いて同じＲＮＡサンプルから特異的に増幅される。従って、インスリンｍＲＮＡの発現レベルは、インスリンｍＲＮＡ増幅産物の、アクチンｍＲＮＡ増幅産物に対する比として、または単に、インスリン：アクチンｍＲＮＡ比として報告され得る。他の膵臓ホルモン（例えば、ソマトスタチンまたはグルカゴン）をコードするｍＲＮＡの発現は、同じ方法によって定量され得る。
【００９９】
（Ｃ．グルコース刺激インスリン分泌）
β細胞の重要な機能の１つは、グルコースレベルに従ってそのインスリン分泌を調整することである。代表的に、静的グルコース刺激（ＳＧＳ）アッセイは、増殖している付着膵臓細胞で行われて、これらの細胞が異なるグルコースレベルに応答してインスリンを分泌し得るか否かを同定し得る。細胞は一般に、ほぼコンフルエントになるまで適切な基材上で培養される。ＳＧＳ試験の３日前、培養培地は、同様の特徴だがインスリンを欠き、そして１ｇ／Ｌのグルコースのみを含む培地によって交換される。この培地は、毎日、３日間にわたって変更され、そしてＳＧＳ試験が４日目に行われる。
【０１００】
この試験の前に、培養培地は、グルコースおよびインスリンの分析のために収集され得る。この試験のために細胞を調製するために、細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．５％  ＢＳＡで２回洗浄され（各洗浄について５分間にわたってインキュベートされる）、次いでＤＰＢＳ単独で１回洗浄される（これもまた５分間にわたってインキュベートされる）。洗浄後、この細胞は、６０ｍｇ／ｄｌグルコースを含む、１０ｍｌ（１００ｍｍディッシュ中）または５ｍｌ（６０ｍｍディッシュ中）のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ  ＳＧＳ溶液（ＫＲＢ−６０）と共に、３７℃のインキュベーター中で３０分間にわたってインキュベートされる。次いで、このインキュベーションは繰り返される。
【０１０１】
ＳＧＳアッセイを実施するために、細胞は、３ｍｌ（１００ｍｍディッシュ）または４ｍｌ（Ｔ７５フラスコ）または２ｍｌ（６０ｍｍディッシュ）ＫＲＢ−６０中で、３７℃で２０分間にわたってインキュベートされる。この培地は吸引され、そしてスピンされ、そしてＬＧ−１（低グルコース刺激工程）として、インスリンアッセイのために収集される。次いで、ＫＲＢ−４５０＋テオ（４５０ｍｇ／ｄｌグルコースおよび１０ｍＭテオフィリンを有するＫＲＢ）は、上記と同じ容量で添加され、そして細胞は、上記と同じ条件下で培養される。上清は、ＨＧ（高グルコース刺激）としてインスリンアッセイのために収集される。次いで、この細胞は、ＫＲＢ−６０と共に再度インキュベートされ、そしてこの培地はＬＧ−２として収集され、そして次のときにはＬＧ−３として収集される。この培地は、インスリン分析のために収集され、そしてインスリン含量が放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または他の適切なアッセイによって決定されるまで−２０℃で保存される。
【０１０２】
ＳＧＳ試験の結果はしばしば、ＬＧ−１インスリン値によって割ったＨＧインスリン値として規定される、刺激指数として表現される。一般に、約２以上の刺激指数は、ＳＧＳアッセイにおいて陽性の結果であるとみなされるが、他の値（例えば、１．５、２．５、３．０、３．５など）を用いて特定の細胞集団を規定し得る。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は、例示するために提供されるが、請求の範囲に記載されている発明を制限しない。
【０１０４】
（実施例１：インサイチュ成熟に対する中間段階の膵臓幹細胞集団の発生）
代表的に、中間段階の膵臓幹細胞をドナー膵臓から単離する。単離された膵臓細胞の混合集団を、中間段階の膵臓幹細胞の増殖を促進する条件下で培養する。
【０１０５】
（器官の入手）
膵臓細胞は、死体膵臓から単離した。膵臓は、多臓器ドナー（５９歳白人男性）から取り出した。臓器の取り入れは、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ（ＵＮＯＳ）および局所臓器ドナー機構（ｌｏｃａｌ  ｏｒｇａｎ  ｄｏｎｏｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって調整された。
【０１０６】
膵臓を取り除くために、まず初めに、腎動脈ジャンクションの下の腹部大動脈にカニューレを挿入した。下腸間膜の静脈のカニューレ挿入によって、門脈潅流を施行した。カニューレを門脈ジャンクションおよび腎臓静脈ジャンクションまで挿入し、さらに、門脈ジャンクションおよび腎臓静脈ジャンクションの上に挿入した。門脈ジャンクションにおいて、２−０の結び目を脾臓静脈の周囲につけた。別の２−０の結び目を脾臓動脈周囲につけた。
【０１０７】
脾臓静脈を連結し、そして潅流を開始する直前に、脾臓側を切開した。この方法は、高い圧力（これは、膵島を損傷し得る）を形成することなく、膵臓の潅流をより効率的に行う。この方法はまた、脾臓および膵臓から肝臓へ、潅流液が排出することを避ける。網嚢を開口し、標準生理食塩水のスラッシュを膵臓に用いた。１Ｌの大動脈潅流後、脾臓動脈を連結した。
【０１０８】
肝臓および腎臓を解剖した脾臓静脈および下方胃腸管とつなげる際、膵臓を十分に保護した。膵臓の損傷のリスク、またコンタミネーションのリスクを減少させるために、膵臓を十二指腸の縁で分離した。
【０１０９】
臓器をＵＷ溶液で満たされたプラスチックバックに保管し、そして移植のために、滅菌標準生理食塩水スラッシュを有するＮａｌｇｅｎｅ瓶に入れた。
【０１１０】
（ドナー膵臓からのヒト膵島の単離）
膵臓組織を、機械的分散およびＨＢＳＳ中のＬｉｂｅｒａｓｅ（１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いた消化によって解離した。管カニューレを介して、２４０ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ溶液を膵臓へ注入した。臓器を８００ｍｌ焼なましビーカーにて、この組織が軟らかくなるまで、３７℃で約１０〜２０分間インキュベートした。
【０１１１】
主要の管をこの組織塊（次いで、これを金属消化チャンバーへ移す）から取り除き、自動循環消化を開始した。遊離膵島がサンプル中に見えた場合、２００ｍｌの消化薬を収集し、そして、さらに消化するために、１２０ｍｌ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）新しいＬｉｂｅｒａｓｅ溶液をこの系へ添加した。
【０１１２】
膵島の大部分が周辺組織から遊離した後、この消化薬を収集し、そして、Ａ１０（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中）培地で希釈した。この細胞を、Ａ１０で３回洗浄した（２分間、１，０００ｒｐｍで遠心分離（４℃）することによる）。
【０１１３】
膵島を、米国特許第５，７３９，０３３に記載されるように、ＰＩＰＳ（ＵＷ溶液中のＮｙｃｏｄｅｎｚ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  ＡＳ，Ｎｏｒｗａｙ）溶液の三層密度勾配分離により、腺房細胞から分離した。
【０１１４】
洗浄した膵臓細胞のペレットを３２０ｍｌ  ＰＩＰＳ（密度１．１１４）と混合し、１０分間、氷上でインキュベートした。八つの２５０ｍｌ平底遠心管に７０ｍｌ  ＰＩＰＳ（密度１．０９０）を満たした。４０ｍｌの細胞／ＰＩＰＳ懸濁液を各管の中に下敷きした。６０ｍｌのＲＰＭＩ（２％ＦＢＳ含有）をＰＩＰＳの上へ置いた。管を１，５００ｒｐｍで、ブレーキなしで６分間、０５，ＡＲＣローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｃ  Ｐｌｕｓを用いて遠心分離した。
【０１１５】
上部の界面（４１３，４００ＩＥＱ，６７％純度）、下部の界面（捕捉した膵島の混合物、フラグメント化膵島、腺房細胞ならびに管細胞）およびペレット（主に腺房細胞および管細胞）を別々に収集した。
【０１１６】
細胞をＡ１０倍地でさらに２回洗浄し、次いで、臨床的な移植（７５％）もしくは増殖試験（２５％）のいずれかに用いた。
【０１１７】
（中間段階の膵臓幹細胞の優先的な培養）
膵島を単離後、約５７％の膵島を含む細胞画分を、増殖のために直ちに組織培養容皿へ置いた。初代培養は、継代０（ｐ０）細胞と称された。最初に、８７％の無血清ＳＭ９５および１３％の＃７培地（２０％ＦＣＳ含有）からなる混合培地で、細胞を増殖した。培地の組成は、本願のＩＩＩＡ２節に列挙する。４日目の最初の培地交換において、ｐ０細胞を１００％の無血清ＳＭ９５培地へ転換した。培養期間中、培養培地を１週間に２回交換し、そして、浮遊細胞を使用済みの培地と共に取り除いた。
【０１１８】
培養１２日後、ｐ０細胞はコンフルエントに達した。この細胞を、約１０分間トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、培養皿の底から解離し、次いで、１０％  ＦＢＳ  ＨＢＳＳ培地で洗浄した。ｐ０細胞を、新しい組織培養皿に１〜２回分割して継代培養した（継代１（ｐ１）細胞になる）。この細胞継代および後の継代において、１ｃｍ２の培養表面あたり約１２，０００細胞の密度で、細胞を播種した。
【０１１９】
（実施例２：中間段階の膵臓幹細胞の適応的培養）
成熟の前段階として、中間段階の膵臓幹細胞は、馴化培養皿と新しい培養皿との組み合わせで生育する。
【０１２０】
Ｐ１細胞を７日間培養し、次いで継代した（継代２（ｐ２）細胞になる）。ｐ１由来の約２／３の収集細胞を、馴化細胞培養皿へ播種した。馴化細胞培養皿は、別のドナー（ＨＤ３８６ｉ）由来の膵臓細胞の培養に以前使用されていた。残りの１／３の細胞を新しい非馴化組織培養皿へ播種した。馴化プレートおよび新しいプレートの両方のプレート上の細胞は、増殖し続けた。
【０１２１】
Ｐ２細胞を７日間培養した。混合された継代１および継代２のおよその細胞の増殖は、約１０倍であった。新しい皿および馴化皿由来の細胞を収集し、そして組み合わせた。これらの増殖された細胞の一部を、新しい組織培養皿へ播種した（培養して継代３（ｐ３）細胞になる）。カプセル化されたｐ３細胞に関連するアルギン酸−ポリリジンマイクロカプセルで、この細胞の別の一部をカプセル化した。
【０１２２】
（実施例３：カプセル化しない培養におけるｐ３細胞増殖の特徴付け）
ｐ３細胞を新しい皿に播種し、標準培養条件下の無血清ＳＭ９５培地で増殖した。この細胞のインビトロでの分析は、安定したインスリンレベルを示し、そしてグルカゴンｍＲＮＡを発現したということを示した（ｐ１細胞およびｐ２細胞と比較）。しかしながら、培養中のｐ３細胞は、グルコース調節様式において、高値のインスリンを分泌し、これはｐ３細胞が標準的な膵島様機能を有したことを示している。
【０１２３】
（インスリンおよびグルカゴンｍＲＮＡレベルのアッセイ）
培養したｐ０細胞、ｐ２細胞およびｐ３細胞からのインスリンおよびグルカゴンｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって決定した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＃７４１０４）を用いて製造業者の指示に従って単離した。簡潔には、溶解緩衝液（６５０μｌ／１０ｃｍプレート）をこの細胞に添加し、使い捨ての細胞スクレーパー（Ｆｉｓｈｅｒ＃０８７７３２）を用いて収集し、次いでＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ＃７９６５４）を用いて破壊した。総ＲＮＡを溶解産物から単離し、次いでＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ＃Ｒ−１１４９０）を用いて定量した。ＲＮＡサンプルを、ｃＤＮＡ合成まで−８０℃で凍結保存した。各サンプルの二連のアリコート（各々０．５μｇ）を、２０ｐｍｏｌｅのオリゴ（ｄＴ）１６を用い、製造業者の指示に従って、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ＃２０５１１１）を用いて逆転写し、次いで各ｃＤＮＡサンプルを、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１００μｌになるように希釈し、そして−２０℃にて保存した。リアルタイムＰＣＲを、２μｌの各ｃＤＮＡサンプルおよび望ましいプライマーを用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで実施した。製造業者の指示に従って、ハイブリッドプローブプロトコルおよびＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎミックス（Ｒｏｃｈｅ＃２１５８８２５）を用いて、アクチンおよびインスリンを測定した。並行して増幅された各産物の検量線との比較により、ＰＣＲで定量した。
【０１２４】
【化４】
2005532259.tif 000005
培養されたｐ０細胞、ｐ２細胞およびｐ３細胞のインスリンｍＲＮＡの発現およびグルカゴンｍＲＮＡの発現を決定し、結果を表１に示した。インスリンｍＲＮＡレベルおよびグルカゴンｍＲＮＡレベルの両方は、三つの細胞継代の全ての間において、安定したレベルを発現した。
【０１２５】
【表１】
2005532259.tif 000006
（静グルコース刺激（ＳＧＳ）アッセイ）
ほぼコンフルエントになるまで、細胞を培養した。ＳＧＳ試験の３日前に、インスリンを欠乏しかつ１ｇ／Ｌのグルコースのみを含む類似特性の培地によって、培養培地を交換した。この培地を３日毎に交換し、ＳＧＳ試験を４日目に施行した。
【０１２６】
試験前に、グルコースおよびインスリン分析のために、培養培地を収集した。この試験における細胞を調製するために、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．５％  ＢＳＡで２回洗浄（各洗浄に対して５分間インキュベート）し、次いで、再度ＤＰＢＳ単独で洗浄（これもまた、５分間インキュベート）した。洗浄後、細胞を６０ｍｇ／ｄｌグルコース（ＫＲＢ−６０）を有する１０ｍｌ（１００ｍｍ皿内）または５ｍｌ（６０ｍｍ皿内）のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ  ＳＧＳ溶液で、３７℃のインキュベーターで、３０分間インキュベートした。このインキュベーションを繰り返した。
【０１２７】
ＳＧＳアッセイを実施するために、細胞を３ｍｌ（１００ｍｍ皿）または４ｍｌ（Ｔ７５フラスコ）または２ｍｌ（６０ｍｍ皿）のＫＲＢ−６０にて、３７℃で２０分間インキュベートした。この培地を吸引し、スピンし、そしてＬＧ−１（低グルコース刺激工程）と同様のインスリンアッセイのために収集した。次いで、ＫＲＢ−４５０＋ｔｈｅｏ（４５０ｍｇ／ｄｌグルコースおよび１０ｍＭテオフィリンを有するＫＲＢ）を上記と同量を添加し、上記と同じ条件下で細胞を培養した。上清をＨＧ（高グルコース刺激）として、インスリンアッセイのために収集した。再度、細胞をＫＲＢ−６０と共にインキュベートし、そして培地をＬＧ−２として、この次はＬＧ−３として収集した。インスリン分析のため培地を収集し、そして放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によってインスリン量を決定するまで−２０℃で保管した。
【０１２８】
ＳＧＳ試験の結果は、しばしば刺激指標として表され、ＬＧ−１インスリン値で割ったＨＧインスリン値として規定される。一般的に、約２以上の刺激指標は、ＳＧＳアッセイにおいて陽性の結果と考えられている。
【０１２９】
表２は、非カプセル化で培養されたＰ３細胞に対するＳＧＳ試験の結果を示す。細胞は、１４９．５μＵ／６０ｍｍ皿／時間の基礎インスリン放出レベル、および７８１．６μＵ／６０ｍｍ皿／時間（グルコース刺激インスリン放出の５．２倍の増加）の刺激グルコースレベルを有した。さらに、この細胞は、刺激後、正常（基礎レベルのインスリン放出）へ戻った。従って、培養されたｐ３細胞は、正常の膵島様機能を示した。
【０１３０】
【表２】
2005532259.tif 000007
（実施例４：Ｐ３細胞のカプセル化および凝集）
およそ１４００万の培養されたＰ２細胞を、カプセル化Ｐ３細胞になるように、高Ｇアルギン酸および高Ｍアルギン酸の混合物中でカプセル化した。Ｐ２細胞を３ｍｌの１．４％アルギン酸塩溶液に懸濁し、次いで、直径約７００μｍのアルギン酸ゲル球体を含む細胞を形成するために、０．３３％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液へジェットヘッドを介して噴霧した。このゲル球体を、５〜９分間、０．３３％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液に浸漬し、次いで８分間、０．１３％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ溶液に浸漬した。次いで、膜を形成するため、および細胞内にカプセル化するために、ゲル球体を２分間、０．１％  ポリ−Ｌ−リジン溶液で処理した。次いで、このカプセルを１分間、０．３３％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏに浸漬した。カプセルを生理食塩水で洗浄し、１０分間、０．２％アルギン酸に浸漬し、そして生理食塩水で再度洗浄した。次いで、カプセルを５分間、０．０５％ポリリジンに浸漬し、その後、生理食塩水で洗浄した。カプセル内のアルギン酸ゲルを、５分間、５５ｍＭクエン酸ナトリウムで処理することにより液化した。別の生理食塩水の洗浄後、カプセルを１０分間０．２％アルギン酸で処理し、次いで、生理食塩水で再度洗浄した。カプセル化を完成するために、カプセルを８分間、ＲＰＭＩに浸漬した。
【０１３１】
２４時間後、カプセル内の細胞は凝集し始め、そして、膵島様構造を形成し始めた。カプセル化Ｐ３細胞を、Ｔ７５フラスコにおいてＭ４培地（０．０３ｍＭ（３０μＭ）のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび１０％胎児ウシ血清を含む）で培養した。培地を１週間につき２回取り替えた。カプセル化細胞を１３日間インビトロで維持し、次いで、移植に用いた。
【０１３２】
（実施例５：カプセル化、凝集化Ｐ３インスリン産生細胞の特徴付け）
カプセル化後２４時間以内に、増殖膵臓細胞は凝集し、そして、これは膵臓から直接単離されたカプセル化膵島と類似の細胞性構造物を表した。インビボのアッセイおよびインビトロのアッセイは、カプセル化増殖膵臓細胞が、インビトロにおいて再構築された膵島のように機能し得ることを示した。
【０１３３】
（培養において増殖したカプセル化、凝集化Ｐ３細胞の組織学）
免疫組織化学により調べる細胞は、顕微鏡検査のためのスライドガラスチャンバー上で培養し得る。あるいは、従来の組織培養で増殖した細胞またはカプセル化細胞を、手動で培養物から取り除き、薄切のためにパラフィンで包埋し得る。ＰＤＸ−１抗体を、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９３，１０月７日（１０）１２７５−８３の技術に従って作製し得る。
【０１３４】
細胞分化マーカーは変動され、従来の免疫組織化学によって検出され得る。一般的に適用されるプロトコルに従う。
【０１３５】
染色プロセスは、スライドのチャンバ部分を取り除いて開始する。細胞を緩衝液で非常に穏やかにリンスし、パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。次いで、細胞を室温で、標準血清を含むブロッキング溶液でインキュベートした。ブロッキング溶液中に非イオン性洗剤を用いて、細胞を透過した。以下に列挙されるような一次抗体をブロッキング溶液で適切な希釈に調製し、細胞に添加し、インキュベートした。一次抗体と共にインキュベートした後、細胞を緩衝液でリンスし、ブロッキング溶液で再ブロックした。
【０１３６】
ブロッキング溶液で適切な希釈に調製された二次抗体を細胞へ添加し、暗所でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をリンスし、核をＨｏｅｃｈｓｔ染料で対比染色した。過剰な液体を取り除き、スライドをマウントし、カバーガラスで覆った。このスライドを乾燥させ、暗所に保管した。
【０１３７】
あるいは、ＡＢＣ方法を用いて、この細胞を免疫細胞化学に対して調製し得る。要するに、この細胞をパラフィンで包埋し、パラフィン切片のスライドを３７℃で一晩乾燥した。細胞を脱パラフィンし、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、過酸化水素メタノール溶液中に浸漬した。特定のエピトープを回復させるために、スライドを０．０１クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で３０分間煮沸した。スライドを緩衝液でリンスし、そして湿潤チャンバ中において室温で、正常血清中でブロックした。
【０１３８】
ブロッキング溶液で調製された一次抗体をサンプルに添加し、そして湿潤チャンバ中でインキュベートした（表３は、一般に使用される一次抗体および二次抗体を列挙する）。スライドを洗浄し、そしてブロッキング溶液で調製された二次抗体と共にインキュベートした。再度、スライドを緩衝液でリンスし、アビジン−西洋ワサビペルオキシド（ａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ）試薬または市販キットからのＡＢＣ複合体（例えば、Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共にインキュベートした。再度、スライドをリンスし、そしてジアミノベンジジン発色溶液（金製のラップ中の尿素過酸化水素）と共にインキュベートした。蒸留水で洗浄後、スライドを５分間、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンに浸し、次いで、水が無色になりかつ核が青くなるまで、流れる水道水中にスライドを保持した。スライドを脱水し、そして観察のためにマウントした。
【０１３９】
【表３】
2005532259.tif 000008
組織学的分析のために、マイクロカプセル内の凝集物をＣＫ−１９、ＰＤＸ−１および内分泌ホルモンに対して免疫染色した。結果は、図１Ａに示す。ＣＫ−１９染色は、内部細胞塊周囲の上皮基底層に類似するＣＫ−１９陽性細胞の単層を表した。内部細胞塊は、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンに対して鮮明な染色を示した（図１Ｂ〜Ｄ）。従って、カプセル化ｐ３凝集物の染色パターンは、再構築した膵島に類似の細胞性構造を示した。
【０１４０】
（凝集後のカプセル化ｐ３細胞のインビトロでの機能）
カプセル化ｐ３凝集物のインビトロでの機能を、ＳＧＳアッセイによって決定した（表４）。細胞は、３．７μＵ／カプセル／時間の基礎インスリン放出レベルおよび２．３μＵ／カプセル／時間の刺激性グルコース放出レベルを有した。この割合は、培養されたｐ３細胞の割合よりも低かった。この抑えられた応答に対する一つの説明は、アルギン酸がインスリンに結合するということである。ＳＧＳ試験は、細胞がカプセル化された後であるが、アルギン酸のインスリン結合能力が満足される前に実施された。インスリンに対するアルギン酸の結合は、インスリン産生細胞周囲のアルギン酸によるインスリン染色の存在によって示された（図３Ｅ）。
【０１４１】
【表４】
2005532259.tif 000009
（凝集後のカプセル化ｐ３細胞のインビボでの機能）
カプセル化ｐ３凝集物のインビボでの機能を決定するために、カプセル化細胞をＳＴＺ誘導性糖尿病ＳＣＩＤマウスへ移植した。この実験動物（ＳＣＩＤマウス）を、ストレプトゾトシン（２２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内単回注射を用いて糖尿病にした。この動物は、一週以内に高血中グルコース（＞４００ｍｇ／ｄｌ）になった。
【０１４２】
カプセル化細胞を移植するために、動物の腹膜を滅菌した。１ｍｌシリンジおよび１４ゲージ血管カテーテルを用いて、全身麻酔下で、１２０，０００細胞を含む８００マイクロカプセルを糖尿病マウスの腹腔へ無菌的に移植した。
【０１４３】
移植後、血中グルコースおよび体重を定期的に測定した。ヘパリン処理したガラスキャピラリーを用いて、血液サンプルをいずれかの眼の眼窩から収集した。このキャピラリーを遠心分離し、血漿をエッペンドルフチューブへ収集した。グルコースレベルをＢｅｃｋｍａｎ  ＩＩグルコース分析器を用いて測定した。
【０１４４】
図２は、カプセル化ｐ３細胞がインビボで機能したことを示す。移植後、レシピエントマウスは、１８日間、高いグルコースレベルを有した。しかしながら、移植後４８日目に、このレシピエントは正常のグルコースレベルを示した。この正常なグルコースレベルは、移植後５５日目の付加試験によって確認された。
【０１４５】
組織学的分析のために、移植されたカプセル化ｐ３凝集物をレシピエントマウスから回収した。この移植された移植片および網からの生検である肝臓および腎臓を組織学試験のために収集した。図３Ａ〜Ｆは、二つの拡大率において、回復した凝集物の二つの領域を示す。免疫染色は、移植後のカプセル化ｐ３凝集物内のインスリン産生細胞の存在を示した。周囲のアルギン酸もまたインスリン陽性であり、これはアルギン酸のインスリン結合能を示している（図３Ｅ）。
【０１４６】
（実施例６：カプセル化後にインビトロで再構築された膵島の特徴付け）
比較のために、ｐ３膵臓細胞を膵臓から直接単離された膵島細胞（糖尿病処置に対するモデル系）と比較した。膵臓からの単離直後、アルギン酸マイクロカプセルで簡単にカプセル化した場合、この膵島細胞は、目に見える構造を呈する。カプセル化膵島細胞は、培養において維持され、そしてインスリン発現試験およびＳＧＳ試験によって測定されたように、機能的な膵島活性を保持した。糖尿病ラットへ移植された場合にいつ機能するかについて、カプセル化膵島細胞はまたインビボで証明した。
【０１４７】
（インビトロで再構築された膵島のカプセル化）
ヒト膵島を上記のようにドナー膵臓から単離した（これは少なくとも６０％純粋）。カプセル化前に、新たに単離された膵島を、非付着性のＦｅｎｗａｌｌ培養バッグ内に４〜４８時間、血清を含むＭ７培地中での浮遊培養に維持した。カプセル化後、カプセル化膵島細胞を２年半までの間、培養を維持した。６ヶ月間（ＨＤ３０２）および２８ヶ月間（ＨＤ３１４）培養を維持したカプセル化膵島の二つの集団を分析した。
【０１４８】
上記のように、カプセルを固定し、そして組織学的分析のために切片にした。カプセル内の細胞をＣＫ−１９、ＰＤＸ−１、内分泌ホルモンおよびアミラーゼについて染色した（図４Ａ〜Ｅは６ヶ月目の膵島、および図５Ａ〜Ｆは２８ヶ月目の膵島）。
【０１４９】
ＣＫ１９染色は、天然の膵島とカプセル化膵島との間に明らかな相違を示した。天然の膵島におけるＣＫ−１９陽性細胞は、弱い染色で、そして目に見える組織化細胞性構造を持たなかった。対照的に、インビトロで維持される膵島を取り囲むＣＫ−１９陽性細胞の単層があった。細胞性構造におけるこれらの相違は、この膵島が膵臓からの単離後に、そしてインビトロでの培養において、再構築されたことを示した。再構築された膵島由来のＣＫ１９陽性細胞の特有の単層構造は、上皮の基底層に似ていた。内分泌ホルモンの染色は、インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチン陽性細胞が、ＣＫ−１９陽性細胞によって取り囲まれた内部細胞塊に存在したことを示した。
【０１５０】
ＣＫ−１９陽性細胞はまた、大部分がＰＤＸ−１陽性であり、これらは、Ｂ．Ｗｅｉｒ（Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９７：７９９９−８００４（２０００））によって報告されたように、膵臓前駆細胞であったことが示唆される。周囲のＣＫ−１９陽性細胞層、ＰＤＸ−１陽性細胞層は、数において、そして染色強度において経時的に減少するように見えた（図２と図３とを比較のこと）。
【０１５１】
（インビトロで再構築された膵島のカプセル化、インビトロでの機能）
９ヶ月間（ＨＤ３５７）培養を維持していたカプセル化膵島のインビトロでの機能を、静グルコース刺激（ＳＧＳ）アッセイ（異なるグルコースレベルに対する応答において、この細胞がインスリンを分泌する能力を測定する）を用いてアッセイした。
【０１５２】
各マイクロカプセルは、約０．７５膵島当量を有した。この結果を表５に示す。ＳＧＳ試験は、１７μＵ／膵島ＥＱ／時間の基礎インスリン放出および７３μＵ／膵島ＥＱ／時間の刺激性インスリン放出を示した。この刺激指標は４であった。
【０１５３】
【表５】
2005532259.tif 000010
（インビトロで再構築された膵島のインビボでの機能）
９ヶ月間培養を維持したカプセル化膵島（ＨＤ３５７）のインビボでの機能を、ＳＴＺ誘導性糖尿病ヌードラットへ移植することによりアッセイした（図６）。ラット１においては、移植二日以内に、４５９ｍｇ／ｄｌ（移植前レベル）から９９ｍｇ／ｄｌまで、血中グルコースレベルが減少した。ラット２においては、二日以内に、５６１ｍｇ／ｄｌ（移植前値）から７９ｍｇ／ｄｌまで、血中グルコースレベルが減少した。
【０１５４】
移植後３５日目に、ラットに経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を与えた。この動物を一晩中、または約１０〜１６時間の間絶食させた。絶食後、血液サンプルを血漿グルコース測定のために採取した（サンプル０）。動物に経口で１．７５ｇｍ／ｋｇグルコース（４５％溶液）を与えた。摂食３０分後（サンプル１）、摂食１時間後（サンプル２）、摂食９０分後（サンプル３）および摂食２時間後（サンプル４）に血液サンプルを収集した。血液サンプルを尾静脈穿刺によってドレーンし、そしてヘパリン処理したキャピラリーを採血および血漿分離に対して使用した。血中グルコースをＢｅｃｋｍａｎ  ＩＩグルコース分析器を用いて測定した。移植後３５日目にＯＧＴＴを与えた場合、移植された両方のラットは正常、もしくはほとんど正常に機能した（図７）。比較のために、正常値は、表６に見出される。
【０１５５】
【表６】
2005532259.tif 000011
移植後５９日目に、ラット１は、目の感染で死亡した。１１８日目に、５０％のカプセル化膵島片をラット２から取り除いた。この直後に、この動物の血中グルコースレベルは変動し始めた。移植片除去後４３日目、血中グルコースレベルは３００ｍｇ／ｄｌのレベルまで増加した。移植片除去後９３日目、血中グルコースレベルは４０３ｍｇ／ｄｌだった。
【０１５６】
これらの最近の試験結果はさらに、膵臓から直接単離されたカプセル化膵島は、インビトロおよびインビボの両方で機能的であったという、以前の前臨床試験および臨床試験を確認した。
【０１５７】
（実施例７：ヒト膵臓における天然の膵島の特徴付け）
比較のために、膵島をＣＫ−１９陽性細胞ならびにＰＤＸ−１陽性細胞の位置および構造を決定するために、膵臓組織において分析した。膵臓組織において、ＣＫ−１９陽性細胞およびＰＤＸ−１陽性細胞と関連する目に見える構造は見出されなかった。
【０１５８】
（ドナー膵臓由来の膵島の組織学的特徴付け）
ドナー膵臓の組織サンプルを、膵島単離のためにドナー膵臓をトリミングする時点に得た。サンプルを組織学的特徴付けのために処理した。天然の膵島および膵臓周囲組織を、ＣＫ−１９、ＰＤＸ−１、内分泌ホルモンおよびアミラーゼに対して染色した（図８、Ａ〜Ｆ）。
【０１５９】
ＣＫ１９陽性細胞は、膵臓全体に分散し、そしてこれらは予想通りに膵管に局在するということを、ＣＫ−１９染色は示した。弱く染色されたＣＫ１９陽性細胞は、膵島内に見出されたが、目に見える組織的構造を持たなかった。ＰＤＸ−１についての染色は、核染色パターン（膵島内）を有する多数のＰＤＸ−１陽性細胞を示した。直接のオーバーラップは、ＣＫ１９陽性細胞とＰＤＸ−１陽性細胞との間では検出されなかった。内分泌ホルモンおよびアミラーゼは、典型的な教科書様の細胞染色パターンを示した。
【０１６０】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のためのみであること、そしてそれらを考慮した種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして本出願および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、移植前にカプセル化された増殖化Ｐ３凝集物を示す。この細胞を、（Ａ）ＣＫ１９−１、（Ｂ）インスリン、（Ｃ）グルカゴンおよび（Ｄ）ソマトスタチンで免疫染色した。倍率は６０倍である。
【図２】図２は、１０５  ＨＤ３９４ｉ（２００の流動カプセル中のＰ３細胞）の移植前後におけるＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベルを示す。
【図３】図３は、動物から取り出した後の、カプセル化された増殖化Ｐ３凝集物を示す。インスリンに対して特異的な抗体を用いてこの細胞を染色した。倍率は以下に示す：（Ａ）領域１、４Ｘ；（Ｂ）領域１、１０倍；（Ｃ）領域１、６０倍；（Ｄ）領域２、１０倍；（Ｅ）領域２、６０倍；（Ｆ）領域２、６０倍。
【図４】図４は、６ヵ月後に（Ａ）ＣＫ１９−１、（Ｂ）ＰＤＸ−１、（Ｃ）インスリン、（Ｄ）グルカゴンおよび（Ｅ）ソマトスタチンで免疫染色した培養における、カプセル化された単離化膵島を示す。倍率は６０倍であった。
【図５】図５は、２８ヵ月後に（Ａ）ＣＫ１９−１、（Ｂ）ＰＤＸ−１、（Ｃ）インスリン、（Ｄ）グルカゴン、（Ｅ）ソマトスタチンおよび（Ｆ）アミラーゼで免疫染色した培養における、カプセル化された単離化膵島を示す。倍率は６０倍であった。
【図６】図６は、４，０００のカプセル化ＨＤ３５７膵島（２００のカプセル中）の移植前後におけるヌードラットの血中グルコースを示し、これらは、９ヶ月を超えて、培養を維持していた。移植した１００のカプセルを１１８日目に回収した。
【図７】図７は、４，０００のカプセル化ＨＤ３５７膵島（２００のカプセル中）のレシピエントにおける、経口耐糖能試験の結果を示す。試験は移植後３５日目に実施した。
【図８】図８は、生来のヒト膵臓におけるタンパク質の発現を示す。サンプルを以下のタンパク質で免疫染色した：（Ａ）ＣＫ−１９、（Ｂ）ＰＤＸ−１、（Ｃ）インスリン、（Ｄ）グルカゴン、（Ｅ）アミラーゼ。倍率は６０倍であった。
【配列表】
2005532259.tif 000012
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005532259.tif 000017
【図６】
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【図７】
2005532259.tif 000019
【図８】
2005532259.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月29日(2005.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005532259000001.app
【国際調査報告】
2005532259.tif 000021