(57)【要約】４週齢までに、トランスジェニックマウスにおいて、重篤な粥状動脈硬化症を発症する、機能的なＳＲ−ＢＩおよびＡｐｏＥを発現しないトランスジェニックの動物モデルを用いて、あるクラスの薬物（ＰＲＯＢＵＣＯＬ（４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール））およびＰＲＯＢＵＣＯＬのモノエステル、ならびにＢＯ  ６５３、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフラン）が異常なリポタンパク質レベルおよび／またはリポタンパクＸにおいて見出されるような特徴を正常化するにおいて有用であることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常なリポタンパク質またはコレステロールの代謝によって特徴付けられる障害または疾患を処置または予防するための方法であって、
該処置または予防を必要とする個体に、４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール）、そのモノエステルおよび他の誘導体、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフランまたはその誘導体、ビタミンＥおよびビタミンＣからなる群より選択される化合物を投与する工程であって、該化合物は、リポタンパク質レベルを減少させるに有効な量で投与されるか、またはリポタンパク質構造を正常化するに有効な量で投与されるか、または異常なコレステロール代謝を減少するに有効な量で投与される、工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記化合物が４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール）、そのモノエステルおよび他の誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフランまたはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ビタミンＥおよびビタミンＣからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が胆汁鬱帯を有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が粥状動脈硬化症を有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物がリポタンパク質Ｘを有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、コレステロール代謝における異常に起因する疾患を有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が、ニーマンピック病Ｃ型またはタンジアー病である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法において使用するための処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府支援研究に関する陳述）
米国政府は、National Institutes of Health-National Heart, Lung and Blood Instituteから、Monty Kreigerへの助成金番号HL41484、HI-52212およびHL20948、ならびにNational Institutes of HealthからM. Simons and M.J.Pへの助成金番号HL63609およびHL53793により、本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
本願は、米国出願番号10/147,651（２００２年５月１６日；発明の名称「Screening of Compounds for Treatment of Atherosclerosis and Heart Attack」、出願人Monty Krieger、Anne BraunおよびHelena Miettinen）に対して優先権を主張する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、概して、異常リポタンパク質疾患、粥状動脈硬化症および心臓発作の予防方法または処置方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
粥状動脈硬化症は、西洋の工業化諸国において主要な死因である。粥状動脈硬化症は、脂肪性物質、コレステロール、細胞老廃産物、カルシウムおよび他の物質の蓄積が動脈の内張りにおいて形成されるプロセスである。この蓄積物は、斑と呼ばれる。通常、この斑は、大きな動脈および中程度のサイズの動脈に影響を与える。人間は、老化すると、ある程度動脈がしばしば硬化する。斑は、動脈を通じた血流を顕著に減少させるのに十分なほど大きく成長し得、そしてそれらが、脆弱になり、そして破断すると、多大な障害が発生すると考えられている。破断した斑により、血餅が形成され、これが、血流を停止させ得、あるいは、破壊し得、そして身体の他の部分に移動し得る。いずれか（閉塞性血餅があるまたはない閉塞性斑）が起こり、心臓に栄養を与える血管をブロックするとき、それは、心臓発作を生じる。斑が脳に栄養を与える血管をブロックするとき、脳卒中を生じる。
【０００５】
粥状動脈硬化症は、遅発性の複雑な疾患であり、この疾患は、代表的には、小児期に始まり、そしてしばしば、老化すると進行する。いく人かの人々において、粥状動脈硬化症は、３０代ですら迅速に進行する。多くの科学者が、内皮と呼ばれる最も内層の細胞を含む動脈に対する炎症または傷害とともに発症すると考えている。動脈壁に対する傷害の原因としては、血液におけるコレステロールおよびトリグリセリドのレベルの上昇、高血圧、喫煙、および糖尿病が挙げられる。粥状動脈硬化症を発症するリスクは、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルに直接関連しており、ＨＤＬコレステロールレベルに逆に関連する。内皮への炎症および／または傷害のため、脂肪、コレステロール、血小板、細胞老廃産物、カルシウムおよび他の物質が動脈壁に蓄積する。これらは、さらに細胞の蓄積物を生じる他の物質を生産するように動脈壁細胞を刺激し得る。これらの細胞および周囲の物質が、動脈壁を顕著に肥厚化する。動脈の内腔直径が減少し、そして血流が減少し、下流の組織への酸素および他の栄養供給が減少する。血餅がこの斑の近くに形成され得、そして動脈をブロックし、血流を停止させる。あるいは、斑は、血管を有効に閉塞させるに十分大きく成長し得る。研究によって、炎症が心臓発作および脳卒中を引き起こすのに重要な役割を果たし得ることが示唆されている。炎症は、感染および傷害に対する身体の応答であり、血液凝固は、しばしばその応答の一部である。
【０００６】
粥状動脈硬化症は、しばしば、血管内での流れが重度に損なわれるまで症状を示さない。粥状動脈硬化症の代表的な症状は、冠状動脈が関与する胸痛、または足の動脈が関与する足の痛みが挙げられる。時々、症状は、運動時のみに生じる。しかし、人々の中には、それらが休止中に生じる。
【０００７】
胆汁鬱滞は、肝臓からの胆汁排出が遮断される任意の状態であり、これは、肝管または胆管のいずれかにおいて生じ得る。胆汁鬱滞には多くの原因が存在する。肝外胆汁鬱滞（これは、肝臓の外側で生じる）は、胆管腫瘍、狭窄、嚢胞、憩室、および他の損傷によって引き起こされ得る。この型の他の潜在的な原因としては、総胆管における胆石、膵炎、膵臓腫瘍または偽嚢胞、原発性硬化性胆管炎、ならびに近接する器官上での腫瘤または腫瘍に起因する圧縮が挙げられる。肝内胆汁鬱滞（これは、肝臓の内側で生じる）は、敗血症（全身的な感染）、細菌性膿瘍（ｃａｃｔｅｒｉａｌ  ａｂｓｃｅｓｓ）、薬物、全非経口栄養（静脈内に供給される）、リンパ腫、ヒト型結核菌、サルコイドーシスならびにアミロイドーシスによって引き起こされ得る。この型のこの障害の他の原因としては、原発性胆管肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ウイルス性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃなど）、アルコール性肝疾患、妊娠、シェーングレン症候群などが挙げられる。
【０００８】
胆汁鬱滞の細胞機構は、未だ完全には理解されていない。診断は、病歴、身体試験、幾つかの実験室パラメータ、血清学およびＥＲＣをまた使用してなされ得る。処置は、胆汁鬱滞の原因に大きく依存する。通常、胆汁は、肝臓において生成され、胆嚢に移動し、胆管を通って腸管へと排出され、脂肪の消化および身体からの低分子の排出を補助する。肝臓から胆嚢、そして最終的には腸管への流れは、特定の薬物によって遅延され得るか、または停止され得る。胆汁の流れが阻害される場合、個体は黄疸を呈し得る。ウルソデオキシコール酸のような薬物および免疫抑制剤は、主要な障害（例えば、ＰＢＣおよびＰＳＢ）の原因である。多くの薬物が胆汁鬱滞を引き起こし得る。幾つかのより一般的な原因としては、以下が挙げられる：金塩、ニトロフラントイン、タンパク質同化ステロイド、経口避妊薬、クロルプロマジン、プロクロルプロマジン、スリンダク、シメチジン、エリスロマイシン、トブタミド（ｔｏｂｕｔａｍｉｄｅ）、イミプラミン、アンピシリンおよび他のペニシリンベースの抗生物質。このリストは、包括的ではない。なぜなら、他の医薬もまた、幾人かの個体において予期せずに胆汁鬱滞を引き起こし得るからである。
【０００９】
脂質代謝の障害は、幾つかの遺伝的疾患において見られ、また、ある種の基礎疾患に罹患する患者においても見られる。その障害の存在は、血清中のコレステロールおよびトリグリセリドの濃度を測定することによって検出され得る。高脂血症または低脂血症は、異常な脂質代謝の結果であり得るが、高脂血症は、粥状硬化症および腎臓疾患により緊密に関連するので、医師にとってより関心が高い。幾つかの原発性（または遺伝性）高脂血症の原因となる遺伝子は、以下のように確認されている：原発性乳糜血症に対してＬＰＬまたはアポＣ−ＩＩ、家族性高コレステロール血症に対してＬＤＬレセプターならびに家族性アポＢ−１００欠損に対してアポＢ−１００。しかし、家族性複合性高脂血症について原因となる遺伝子は、議論されているところではあるが、ＡＩ／ＣＩＩＩ／ＡＩＶクラスターは、可能性のある候補遺伝子のうちの１つである。続発性高脂血症は、種々の疾患（例えば、真性糖尿病および胆汁鬱滞）によって引き起こされる。この型の高脂血症は、基礎疾患に対する治療によって改善される。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールレベルの顕著な増加を伴う高脂血症は、慢性コレステロール性肝疾患に罹患する患者において共通の特徴である。心臓血管疾患に由来する過剰な罹患率および死亡率は、これらの患者において報告されていない。これは、慢性胆汁鬱滞の間に観察される特定のリポタンパク質パターンに起因し得、上昇した血清ＨＤＬコレステロールによって特徴付けられ、これは、心臓保護効果を有し得る。しかし、慢性胆汁鬱滞に罹患する患者の下位グループにおいて、高脂血症は、正常または低いＨＤＬレベルと同時に顕著に上昇したＬＤＬレベルによって特徴付けられ、恐らく、共存家族性起源および栄養起源である高コレステロール血症を反映する。
【００１０】
リポタンパク質−Ｘ（Ｌｐ−Ｘ）は、肝疾患および家族性レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）不全症候群に罹患する患者において頻繁に見出される異常な低密度リポタンパク質である。それは、肝内および肝外のコレステロールの診断についての最も感度のある、特異的な生化学的パラメータと考えられる。さらに、Ｌｐ−Ｘは、胆汁鬱滞肝疾患における高コレステロール血症の発生に寄与すると考えられる。なぜなら、それは、デノボでのコレステロール合成を阻害しないからである。他のリポタンパク質と比較した場合、Ｌｐ−Ｘは、ホスファチジルコリン（６０％、ｗ／ｗ）に対して高含有量のエステル化されていないコレステロール（３０％、ｗ／ｗ）を含む。閉塞性黄疸に罹患する患者の血清から単離されたＬｐ−Ｘは、高含有量のエステル化されていないコレステロールおよびホスファチジルコリンおよび含まれたアポリポタンパク質Ｅ、ａｐｏＣｓ、ならびにアルブミンを有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、障害（例えば、胆汁うっ滞およびリポタンパク質Ｘ）における使用のため、およびコレステロール代謝の異常（例えば、Ｃ型ニーマン−ピック病およびタンジアー病）に起因する疾患を処理するための、異常なリポタンパク質を処置または予防するための方法および薬剤を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、粥状動脈硬化症を処置するための方法および化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
動物モデルである、機能的なＳＲ−ＢＩおよびａｐｏＥを発現せず、４〜５週齢までに重度の粥状動脈硬化症を発症するトランスジェニック動物を使用して、１つのクラスの薬物である、ＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）（４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール））およびＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）のモノエステル、ならびにＢＯ  ６５３、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフランを発見した。これらは、異常なリポタンパク質のレベルおよび／または特徴を正常化する際に有用である。これらの動物は、４〜６週齢までに始まる進行性心臓機能不全を示し、８週齢（５週と８週との間）までに死ぬ。病理学によって、心臓の広範囲な繊維症および冠状動脈の閉塞が示される。この閉塞は、脂肪の堆積がその血管壁に存在するので、粥状動脈硬化症に起因するようである。これらの動物は、以下の疾患のための、そして、これらの障害の処置および／または予防において有用である薬物をスクリーニングするための良好なモデルである：心臓虚血、心臓繊維症、心筋梗塞、ＥＫＧ（電気伝導度を含む）の欠陥、心不全、心臓機能不全（例えば、駆出率の減少）、心臓肥大／拡張（ｄｉａｌａｔｉｏｎ）、および閉塞性冠状動脈疾患（例えば、粥状動脈硬化症）。これらの動物はまた、リポタンパク質の障害（例えば、胆汁うっ滞およびリポタンパク質Ｘ）を処置する際の使用のための薬物をスクリーニングするためにも使用され得る。
【００１４】
動物（ａｐｏＥ  −／−  ＳＲ−ＢＩ  ＋／−）に、交配時に始めてＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）を給餌した。仔を３週間で離乳させ、ＰＲＯＢＵＣＯＬを給餌した。生存率を図１Ａに示す。その５０％が６週齢で死んだ、ＰＲＯＢＵＣＯＬを給餌していない動物とは対照的に、ＰＲＯＢＵＣＯＬを与えた全ての動物が６週目に正常な表現型（心臓機能のＭＲＩ、ＥＣＧ、心エコー図、組織学）を有する。７〜８週目では、処置した動物において粥状動脈硬化症およびいくつかの心筋梗塞の証拠が存在する。これは、この化合物が予防的作用を有することを実証する。離乳時にＰＲＯＢＵＣＯＬを摂取する動物は、１０〜１２週目内に全て死亡する。
【００１５】
別の研究において、その親はＰＲＯＢＵＣＯＬを給餌されず、５週齢の前または後に始めてＰＲＯＢＵＣＯＬを受容した動物の大部分が、数週間生存した（図１Ｂを参照のこと）、このことは、この化合物がまた、治療的利点も有することを実証する。ＰＲＯＢＵＣＯＬによる処置が早いほど、動物の生存は長くなる。これらの研究は、ＰＲＯＢＵＣＯＬ処置が、重大なレベルの心臓疾患の発症の後で投与された場合ですら、これらの動物の寿命を延ばし得ることを示した。さらなる研究は、これらの動物が、リポタンパク質Ｘ（ＰＲＯＢＵＣＯＬでの処置によって正常化される）の発生を生じる症例に存在するものと類似する異常な脂質構造を有することを実証する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．薬学的組成物）
（薬理学的活性化合物）
異常なリポタンパク質のレベルおよび／または構造を正常化し得る化合物を同定するために、アポリポタンパク質ＥおよびＨＤＬレセプター（ＳＲ−ＢＩ）についてのダブルノックアウト（ｄＫＯ）マウスを使用した。ＳＲ−ＢＩは、ＨＤＬの構造および代謝を制御し、逆方向のコレステロール輸送に対して重要であるようである。これらのマウスは、冠状動脈疾患（例えば、高レベルの血清コレステロール、粥状動脈硬化症、斑状心筋梗塞、心臓肥大および早期の死）の特徴を示す。それらはまた、異常な脂質のレベルおよび構造によっても特徴付けられる。
【００１７】
実施例によって示されたように、ＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）は、ｄＫＯマウスの寿命予測値を劇的に増加する。未処理マウスは、６週間の寿命中央値を有するが、一方、ＰＲＯＢＵＣＯＬ処置マウスは、４１９日まで（平均３６週）生存し得る。６週齢の心臓組織の組織学的研究は、ＰＲＯＢＵＣＯＬもまた、閉塞性粥状動脈硬化性冠状動脈疾患、心筋梗塞および心臓機能不全の機能的および形態学的指標の大部分を除去したことを実証する。心筋梗塞、粥状動脈硬化性斑または大動脈弓の根の粥状動脈硬化症に起因する線維症は、この年齢で処置されたマウスにおいて見られた。血清コレステロールレベルは、ＰＲＯＢＵＣＯＬ処置マウスにおいて２分の１に減少し、ＰＲＯＢＵＣＯＬはまた、ｄＫＯマウスにおいて見られる欠損性赤血球変異を矯正する。
【００１８】
これらの研究に基づいて、多くの化合物は、脂質レベルおよびコレステロール代謝を変更する際に有用である。好ましいクラスの化合物は、例えば、Ｓｏｍｅｒｓに対する米国特許第６，１２１，３１９号に記載されるような、ＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）（４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール））およびＰＲＯＢＵＣＯＬのモノエステル、ならびにＦＲ  ２１６８１３７、ＦＲ  ２１４０７７１、ＦＲ  ２１４０７６９、ＦＲ  ２１３４８１０、ＦＲ  ２１３３０２４、およびＦＲ  ２１３０９７５によって記載されるような他の誘導体（Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された誘導体を含む）がある。これらの化合物は、強力な抗酸化剤特性を有し、そしてＬＤＬの酸化的改変を遮断する。日本の中外から入手可能な別の有用な化合物は、ＢＯ  ６５３、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフラン（抗酸化剤）である。Ｎｏｇｕｃｈｉら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１：３４７（１９９７）。
【００１９】
ＰＲＯＢＵＣＯＬデータに基づいて、有効な他の化合物は、ビタミンＥおよびビタミンＣ、低コレステロール血症化合物および抗酸化剤化合物の両方、受精能増強剤ならびに心臓血管疾患または粥状動脈硬化症の処置および／または予防の両方を含む。好ましい化合物は、両方の活性を有する。
【００２０】
（薬学的キャリア）
化合物は、好ましくは、経口投与のために薬学的受容可能なビヒクルで投与される。適切な薬学的ビヒクルは、当業者に公知である。非経口投与のために、化合物は、通常、滅菌水または生理食塩水中に溶解または懸濁される。腸内投与のために、化合物は、錠剤、液体またはカプセルの形態で不活性なキャリアに組み込まれる。適切なキャリアは、デンプンまたは糖であり得、適切なキャリアとしては、潤滑剤、人工甘味料、結合剤、および同じ性質の他の材料が挙げられる。
【００２１】
あるいは、この化合物は、リポソームまたはミクロスフェア（または微粒子）で投与され得る。患者への投与のためのリポソームおよびミクロスフェアを調製するための方法は、当業者に公知である。米国特許第４，７８９，７３４号は、リポソーム中の生物学的材料をカプセル化するための方法を記載する。基本的に、材料は、水溶液に溶解され、適切なリン脂質および脂質が、界面活性剤（必要な場合）とともに添加され、そして材料が、必要に応じて、透析および超音波処理される。公知の方法の総説は、Ｇ，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、１４章、”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”，Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｐｐ．２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９）による。ポリマーまたはタンパク質から形成されるミクロスフェアは、当業者に周知であり、血流内へ直接的に胃腸管を通して通過させるために調整され得る。あるいは、この化合物は、組み込まれ得、そしてミクロスフェアまたはミクロスフェアの複合物が、ある期間（数日〜数ヶ月の範囲）で徐放するために移植され得る。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、同第４，９２５，６７３号および同第３，６２５，２１４号を参照のこと。
【００２２】
（ＩＩ．障害または疾患の処置）
処置され得る障害としては、胆汁うっ滞、リポタンパク質Ｘ、およびＬＣＡＴ欠損によって引き起こされる障害が挙げられる。他の障害としては、粥状動脈硬化症および不安定斑が挙げられる（ここで、これらの処方物は、リポタンパク質レベルおよび／または構造を正常化するか、斑沈着を減少させるか、あるいは他の指標のレベルを減少させるのに有効な量で投与される）。薬学的組成物はまた、障害の発症を改変または予防するのに有効な量で投与され得る。症状の減少は、以下に実証されるように、臨床的に入手可能な試験を使用して、血液、尿および／または組織サンプル測定することによって容易に決定される。
【００２３】
本発明は、さらに、以下の非限定的な例に対する参照によって理解される。
【実施例】
【００２４】
（実施例１：ＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＥダブルノックアウトマウスにおけるＣＨＤおよび粥状硬化症の分析）
高密度リポタンパク質レセプターであるＳＲ−ＢＩとアポリポタンパク質Ｅとの両方の遺伝子においてホモ接合性ヌル変異を有するマウス（ＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＥダブルノックアウト（ＫＯ）（「ｄＫＯ」マウス）は、ＣＨＤの多くの特徴を発現する。低脂肪低コレステロール食餌を供給したｄＫＯマウスを、種々の組織学的方法、血管造影的方法、および機能的方法（心電図検査法、結構力学、ＭＲＩ）を使用して試験した。それらは、自然に、以下の特徴を示した：高コレステロール血症、粥状硬化症、広範な脂質リッチな冠状動脈閉塞、多発性心筋梗塞、心筋機能不全（例えば、心臓肥大、顕著に減少した駆出率（約５０％）および顕著に減少した収縮性（約３分の１））、ならびに約６週齢での死亡。その冠状動脈病変は、ヒト粥状動脈硬化症性斑と著しく類似した。その線維性粥状斑のうちの多くは、コレステロール性裂を暗示する構造および広範なフィブリン沈着を含んだ。これは、斑破裂／その斑への出血の可能性を示唆した。
【００２５】
（材料および方法）
（動物）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９バックグラウンドと混合）を収容し、通常の固形飼料を与えた。遺伝子型を、本特許出願において記載されるようにＰＣＲ分析によって決定した。記載される分析すべてを、４〜６週齢の雄マウスおよび／または雌マウスに対して実施した。雄動物と雌動物との間に、有意な差異は観察されなかった。この研究は、実験室動物の使用についてのすべての制度上の指針およびＮＩＨの指針に従った。
【００２６】
（組織学）
マウスを安楽死させ、組織を凍結切片化用に調製した。パラフィン切片用の組織を、１０％緩衝化ホルマリン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ＮＪ）中でまず固定した。いくつかの場合、ヘパリンを、安楽死前に投与し（４５０Ｕ／２０ｇ、静脈内）、全身凝固を防止した。組織を切片化し、そしてＭａｓｓｏｎトリクローム（Ｓｉｇｍａ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（プロトコールに対する参照）、またはオイルレッドＯ（脂質）およびＭａｙｅｒヘマトキシリンで、染色した。免疫組織化学法を、マウスモノクローナル抗フィブリン抗体（ＮＹＢ−Ｔ２ＧＩ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，ＮＹ，１：ｇ／ｍｌに希釈）を用いて、Ｍ．Ｏ．Ｍ．ＴＭ染色手順を（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍ．ＴＭ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡに記載されるように）使用して実施した。ペルオキシダーゼ活性を、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）に記載されるように用いて明らかにした。マクロファージの免疫検出を、モノクローナルラット抗マウスＦ４／８０抗体（ＭＣＡ  ４９７，Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＮＣ，１：１０に希釈）、およびビオチニル化ウサギ抗ラットマウス吸着二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）を使用して、実施した。染色を、アビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）およびジアミノベンジジン基質（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）を製造業者により示唆されるように使用して、明らかにした。切片を、Ｍａｙｅｒヘマトキシリンで対比染色した。
【００２７】
（重量分析）
マウスを、致死量の麻酔薬（アベルチン（ａｖｅｒｔｉｎ）２．５％；０．８ｍｌ／２０ｇ）を用いて安楽死させ、すぐに秤量した。灌流後に、心臓を切除し、結合組織および主要な全身脈管を含まないように解剖し、そして秤量した。その後、動脈を取り出し、左室遊離壁をを取り出して秤量し、左室＋中隔を開き、ブロットして内部液を除去して秤量した。
【００２８】
（磁気共鳴画像法）
マウスを、抱水クロラール（腹腔内２００−３２０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて麻酔し、ＥＣＧ電極パッチも含む注文設計本体コイル上の２Ｔ小穴磁石（Ｂｒｕｋｅｒ）中に配置した。麻酔を、この実験の間の心拍数を一定に維持するように、１〜２％イソフラリンにより調節した。画像取得を、ＥＣＧゲート制御（ｇａｔｅ）した。１組の調査（ｓｃｏｕｔ）画像の後で、１ｍｍ厚断面スライス（図５に示される心臓の長軸に対して垂直であり、心臓全体に及ぶ）に対応する６〜７枚の画像を、収縮末期および拡張末期の両方で収集した。各スライスについて、寸法（断面積）を、左室（ＬＶ）壁＋中隔およびＬＶ腔について計算した。これらに、各スライスの厚さを乗算し、適切なスライスすべてについて合計して、全ＬＶ組織体積、ならびに左室収縮末期容積および左室拡張末期容積（それぞれ、ＬＶＥＤＶおよびＬＶＥＳＶ）を得た。これらの値を使用して、駆出率（ＥＦ（％）＝（（ＬＶＥＤＶ−ＬＶＥＳＶ）／ＬＶＥＤＶ）×１００）を決定した。
【００２９】
（血流力学的評価）
ヘパリン（１Ｕ／１０  ｇ  ｉ．ｐ．）を投与し、マウスを、上記のように、抱水クロラールで麻酔した。マウスに挿管し、１３０／分の速度および１回換気量０．１４μｌ／ｇで室内空気を通気した（ｍｏｄｅｌ  ６８７，  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ，  Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）。局所麻酔（０．５％  リドカインＨＣＩを０．０５ｍｌ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を頸部に施した。右頸動脈を頸部の正中切開によって鈍的剥離（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を介して露出させ、１．４  Ｆｒマイクロマノメーターカテーテルをカニューレ挿入した（ＳＰＲ−６７１，Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）。カテーテルを、大動脈圧測定のために大動脈へと進め、次いで、心室圧の直接測定のために、ＬＶへと進めた。右迷走神経および左迷走神経の両方を切断する前およびその後に測定を行って、迷走神経の逆流（ｖａｇａｌ  ｒｅｆｌｅｘ）の効果を決定した。マイクロマノメーターからの圧力データを、Ｗｉｎｄａｑ  ＤＩ  ２２０変換器およびＷｉｎｄａｑ  Ｐｒｏソフトウェア（Ｄａｔａｑ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）を用いて記録した。このソフトウェアもまた使用して、収縮期および拡張期の左心室圧、心拍数ならびに最大の陽性および陰性ｄＰ／ｄｔ値を計算した。
【００３０】
（エキソビボ血管造影法）
血流力学測定の後に、各心臓を、胸骨正中切開により露出させ、上行大動脈にポリエチレンチュービング（ＰＥ５０：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）をカニューレ挿入した。右心房を開いて、廃液した。心臓をＰＢＳで（逆方向に）、廃液が透明になるまで洗い流し、この廃液を採取し、次いで、硫酸バリウム懸濁液（Ｅ−Ｚ−ＥＭ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を、最大圧８０ｍｍＨｇで手動で注射した。冠動脈血管造影図を、Ｍｉｃｒｏ  ５０  Ｘ線（Ｍｉｃｒｏ  ５０，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，２０ｋＶ，２０秒曝露）を用いて得た。
【００３１】
（心電図記録）
心電図（ＥＣＧ）を２つの方法を用いて記録した。アバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）（参考）で麻酔したマウスについては、測定を、標準的な四肢誘導を用いて行った。意識のある、麻酔していないマウスについては、ＥＣＧを、ＡｎｏｎｙＭＯＵＳＥ（登録商標）ＥＣＧ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ（Ｍｏｕｓｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ）を用いて記録した。この装置は、プラットフォームに埋め込まれた足のサイズに調節された導電性パッドと、３つの単一のパッドが、拘束されていないマウスの３肢と接触した場合に、ＥＣＧを記録するようにプログラムされた固体状態ゲーティング（ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ  ｇａｔｉｎｇ）を備えた電子機器とを備える。そのシグナルを、２５００サンプル／秒のサンプリング速度でデジタルで獲得した（ＤＩ−２２０，ＤＡＴＡＱ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）。データを、２〜３秒間記録して、２０〜３０のＥＣＢシグナルの連続記録を提供した。これらのシグナルから、形状、ＱＲＳ幅および心拍数を決定した。平均心拍数は、ＳＲ−ＢＩヘテロ接合ヌルマウス（ｎ＝４）については６４６±８０であり、ＳＲＢＩ  ＪＩマウス（ｎ＝６）については６９８±７０であり、ａｐｏＥ  ＫＯマウス（ｎ＝９）については７６１±５４であり、そしてｄＫＯマウス（ｎ＝１２）については６５２±８２であった（ｐ＝０．０１）。コントロールとして、３匹のアバーティン麻酔ダブルＫＯマウスのＥＣＧを、ＡｎｏｎｙＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して記録した。３匹の動物のうち２匹において、しばしば標準的な四肢誘導法で観察されるパターンと類似した異常なコンダクタンスのパターンを、同様に麻酔したマウスにおいて観察した。
【００３２】
（統計学的分析）
データを、２つの群の比較については両側独立ステューデントｔ検定、または３つもしくは４つの群の比較についてはＡＮＯＶＡ検定のいずれかを用いて、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアで分析した。
【００３３】
（結果）
通常の低脂肪／低コレステロール標準食餌を与えた場合には、ｄＫＯマウスは、約５週齡までに大動脈洞中に広範囲にわたる加速した粥状動脈硬化症を発症させ、若年期で死亡する。コントロールマウスはいずれも、離乳（３週齢）から８週齢までのこの期間の間には死亡しなかった。コントロールには、ホモ接合性ａｐｏＥ欠損（ａｐｏＥ  ＫＯ）マウスおよびヘテロ接合性ＳＲ−ＢＩヌル変異を有するａｐｏＥ  ＫＯマウス、ならびに野生型かつホモ接合性ＳＲ−ＢＩ欠損（ＳＲ−ＢI  ＫＯ）マウスを含めた。対照的に、そのｄＫＯマウスは、５週齡〜８週齢の間に死亡し、その死亡の５０％は、６週齡までに起こった。それらが死亡する前に、ｄＫＯマウスは、１〜２日間の期間、外観の変化（逆立った被毛、異常な足取り）と関連した、徐々に減少した一般的活動を示した。４〜６週齡のｄＫＯマウスの心臓形態学、生理学、および組織学の一連の研究を、野生型ＳＲ−ＢＩ  ＫＯおよびａｐｏＥ  ＫＯマウスをコントロールとして使用して行った。
【００３４】
（ｄＫＯマウスの心筋層における、肉眼的病変および心臓線維症）
コントロールマウスおよびｄＫＯマウス由来の心臓の肉眼的試験は、ｄＫＯマウスの心臓において、２つの著しい異常を示した。まず、ｄＫＯマウスの心臓は、コントロールの野生型または単独のＫＯマウスの心臓に比べて、拡張したことを表わした。さらに、ｄＫＯマウス由来の心臓は、青白い、染色した班が現われ、これらは、どのコントロールマウス由来の心臓でも観察されなかった。これら病変は、拡張した心筋層の梗塞および瘢痕の存在を示唆した。これらの病変は、いつも左心室のＡＶ溝に存在し、しばしば、しかしいつもではないが、右心室壁、左心室壁および／または尖上の様々な場所に存在する。
【００３５】
心臓薄片の組織学的分析を実施して、これらの病変の性質を特徴づけた。ｄＫＯマウスの心臓の縦断面を、トリクロム染色させた。トリクロムは、健康な心筋層を赤色に、線維組織を青色に染色する。線維領域は、例外なく、僧帽弁および左心室流出管周囲の領域で見られた。僧帽弁自体に影響は示されなかった。トリクロムおよびＨ＆Ｇ染色された薄片のより高い倍率から、これらの病変は、線維接合組織、非常に少量の残留筋細胞、および大きな拡張細胞（これらの多くは、単核炎症性細胞のようである）から構成されていた。これらは、拡張した線維症、炎症および幾つかの場合、治癒された梗塞に典型的な、拡散した壊死および心筋層の瘢痕により、特徴づけられた。これらの病変は、流出管領域よりも十分に組織化され、かつ流出管領域にあるよりも少ない拡張細胞を含むようであった。多くのマクロファージが、これらの病変ならびに乳頭筋における病変でも検出された。したがって肉眼的および微視的な観察は、多発性心筋梗塞が、ｄＫＯマウスで発症したことを示す。
【００３６】
高コレステロール血症の動物において、マクロファージは、拡張したサイトゾルの脂質沈着物（泡沫細胞）を蓄積し得る。ｄＫＯマウスは、高コレステロール血症なので、流出管および乳頭筋薄片を、オイルレッドＯを用いて染色した。ここで、このオイルレッドＯは、中性脂質の小滴を赤に染色する。脂質の染色は、拡張した線維症を示すマクロファージ豊富な領域で特に強かった。これらの領域において、オイルレッドＯ染色は、濃縮した、強い、球状のパターン（細胞内脂質を思わせる）および斑点状のパターン（細胞外脂質を思わせる）の両方で現れた。幾つかのオイルレッドＯ染色がまた、心臓全体にわたって、心筋線維内ではなく間の、非線維性組織内で、検出された。この染色は、線維症の領域での染色よりも、実質的により拡散していた。脂質およびマクロファージの同時の分布は、明かに、少なくとも幾つかの細胞内脂質が、心筋層内のマクロファージ泡沫細胞内に存在することを示唆した。
【００３７】
（ｄＫＯマウスの心臓機能）
ダブルＫＯマウスの心臓に存在する、拡張する病変が、変化した心臓機能と関連するかどうかを決定するために、コントロールマウスおよびｄＫＯマウスを使用して、一連の形態学的分析および機能分析を行った。これらの分析には、心臓サイズの評価（重量測定およびＭＲＩ）、生理学的パラメーター（血行力学および左心室の拍出分画）の測定および心電図（ＥＣＧ）分析が挙げられる。
【００３８】
（心臓肥大）
肉眼的に、ｄＫＯマウス由来の心臓は、年齢の一致したコントロールマウスの心臓よりも大きい心臓を示した。重量測定およびＭＲＩ分析を行い、インタクトな心臓およびその心室のサイズを、量的に特徴づけた。重量測定分析は、全てのコントロールマウスについて、心臓と体重の間に、強い直線の相関関係（ｒ２＝０．７４、ｐ＜０．０００１）を表わした。しかし、ｄＫＯマウスは、年齢の一致したコントロールマウスより小さかったこと、およびｄＫＯマウスの完全な心臓のサイズは、より大きかったことの両方の理由から、ｄＫＯマウスの心臓は、異常に大きかった。ｄＫＯマウスの場合、平均的な体重に対する心臓重量比（９．４ｍｇ／ｇ±２．３、ｎ＝９）は、アポＥＫＯマウス（５．９±０．５ｍｇ／ｇ、ｎ＝９、Ｐ＝０．００２）の場合よりも１．６倍大きく、ＳＲ−ＢＩＫＯマウスおよび野生型マウス（５．３±０．３ｍｇ／ｇ、各ｎ＝８、Ｐ＝０．００１）の場合よりも、１．８倍大きかった。ｄＫＯマウスの心臓重量の増加には、左心室プラス隔壁および右心室の組織質量（体重に対して標準化した）の増加分を含んだ。このことは、体重に対するＬＶ＋Ｓ組織用量の比のＭＲＩ分析により、確認された。対照的に、体重はＬＶを補正し、そして心室容積は、ｄＫＯ心臓の場合よりもわずかに高く、わずかな拡張のみを示唆した。従って、ｄＫＯ心臓の増加したサイズは、主に、増加した心室組織の質量に起因し、これは、心臓の活動の根底にある異常に起因する相殺的な心臓肥大と一致した発見だった。
【００３９】
（血行動態分析およびＭＲＩ分析）
心臓の機能は、血行動態分析およびＭＲＩにより評価された。平均した大動脈の拡張期および収縮期の血圧ならびに心拍数（ＨＲ）は、野生型またはシングルＫＯコントロールマウスよりｄＫＯで顕著に低かった。左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）および収縮性（正値のｄＰ／ｄｔ）における実質的な減少は、これらのｄＫＯマウスで観察され、左心室収縮期機能障害を呈示する。負値のｄＰ／ｄｔにおいて、同様な顕著な（３倍）減少があり、左心室の弛緩もまた障害性であることを呈示した。中程度に上昇したＬＶＥＤＰは、統計学的に有意ではなかった。ｄＫＯマウスの平均ＨＲは、迷走神経の両側の破壊の後に、コントロールと比較して低いままであり、ＨＲにおけるこの差異が心臓外神経の影響のためでないことを呈示した。減少したＨＲが、低血圧および低収縮性（ｄＰ／ｄｔ）に寄与し得て、そしてＬＶＥＤＰおよびＨＲにおける小さい差異によりこれらの系統間のｄＰ／ｄｔの差異の解釈が困難となるにもかかわらず、これらの比較的小さいベースラインの差が、＋ｄＰ／ｄｔおよび−ｄＰ／ｄｔにおける大きな変化を引き起こすことは、起こりにくい。それゆえ、この結果は、減少した大動脈血圧ならびに収縮および弛緩の両方における異常を含む、初期心臓機能障害と矛盾しない。
【００４０】
ＭＲＩを、コントロールａｐｏＥ  ＫＯおよびｄＫＯマウスの心臓の駆出率（ＥＦ）、心臓機能の重要な尺度を決定するために使用した。拡張期終端または収縮期終端でのＭＲＩ像は、ＬＶＥＤＶが同様である一方、ＬＶ終端収縮期体積（ＬＶＥＳＶ）がｄＫＯ心臓においてコントロールより高かったことを示す。その結果、ｄＫＯの心臓のＥＦは、コントロールのＥＦより実質的に低かった（約５０％）。
【００４１】
心電図（ＥＣＧ）を、無麻酔の、意識のあるマウス上で実施した。コントロールのＥＣＧが正常であった一方、顕著な異常が、１２匹の中で６匹の無麻酔のｄＫＯマウスのＥＣＧにおいて観察された。１匹は、不明確な病因のＳＴの上昇を呈示し、そして５匹は、重篤なＳＴ抑制を示し、心内膜下虚血を呈示した。ＥＣＧをアバーティン麻酔マウス上で実施した場合、８匹のｄＫＯマウスの中で５匹において、麻酔は、誘導されるかまたは心臓の伝達欠陥を明白にするが、任意のコントロールにおいてはそうではなく、この麻酔は、いくつかの場合において、ＱＲＳを免れていてそしてＡＶ阻止および徐脈死を完全にするために進行した。これらの結果は、重量測定の所見、血行動態の所見およびＭＲＩの所見と一緒に、おそらく広範囲の心筋線維症が原因で、ｄＫＯマウスにおける障害性の心臓機能を明確に呈示する。
【００４２】
（冠状動脈疾患：血管造影法および組織学）
閉塞性冠状動脈性心臓病が心臓の機能障害に寄与し得たかどうかを決定するため、エキソビボ血管造影法を，実施した。明確な欠損は、コントロール心臓において何も見当たらなかった。対照的に、７個のｄＫＯの試験した心臓の中で５個は、狭窄症および左冠状動脈の分枝の閉塞を明確に示した。明確な狭窄症の２つの例もまた、主要な冠状動脈において観察された。
【００４３】
心臓の組織学的分析により、ｄＫＯマウスにおける広範囲の冠状動脈疾患（ＣＡＤ）が明らかとなった。ＬＶがない壁（１０匹の分析したマウスの中の９匹）、中隔（１１匹の分析したマウスの中の１０匹）および／またはＲＶ壁（１２匹の中の１１匹）において、主要な動脈分枝の複雑な閉塞が存在した。年齢が一致するコントロールにおいては、何の閉塞も、見られなかった。左冠状分枝動脈の内腔をほとんど完全に閉塞する、部分的な細胞性の、脂質が豊富な損傷が、観察された。別のｄＫＯマウスのＲＶ壁において閉塞された動脈を取り囲む線維症および炎症細胞がまた、観察された。冠状小孔における近位の損傷もまた、１０匹のｄＫＯマウスの中の７匹において見られた。これらの損傷は、おそらくＬＶおよびＲＶにおける斑状ＭＩの原因となる。異なるｄＫＯマウスからの閉塞した冠状動脈を通しての一連の横断切片を、トリクロームおよび脂質染色と共に染色し、これにより脂質が多いコアの中でのコレステロール性裂を想起させる多数の構造が明白になった。免疫学的染色により、１０個の損傷の中で８個のコア領域における繊維素析出が３匹のｄＫＯマウスの中の３匹で観察されたが、しかし年齢を合わせた任意のａｐｏＥ  ＫＯコントロールマウス（ｎ＝３）においては観察されなかったことを示した。ｄＫＯマウスにおいて冠状動脈を閉塞させる斑中のフィブリンの存在は、おそらくこれらの複雑な損傷の破裂またはこれらの複雑な損傷への出血から生じる血栓症を示す。
【００４４】
（実施例２：ＳＲ−ＢＩ／ＡｐｏＥダブルノックアウトマウスにおける異常リポタンパクの分析）  
（ノックアウトマウス）
（材料と方法）
動物は、実施例１において、粥状硬化症および心疾患について分析したのと同じである。
【００４５】
（血漿および胆汁の分析）
血液を、ヘパリン処理したシリンジに、一晩絶食させたマウスから、心穿刺によって収集した。血漿を、単離直後かまたは４℃で保存後のどちらかに、ＦＰＬＣ分析に供した。総コレステロールを、アッセイした。リポタンパクを含む非ａｐｏＢからのコレステロールを、ＥＺ  ＨＤＬキット（Ｓｉｇｍａ、非ＨＤＬリポタンパクにおいてコレステロールの検出をブロックする抗体に基づく。本発明者らによって、ヒトリポタンパクまたはマウスリポタンパクを用いて確認された。データは示さない）を用いるか、またはマグネシウム／硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）による沈殿後のいずれかに、測定した。血漿（０．４μｌ）およびＦＰＬＣ画分（すなわちプール）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法またはアガロースゲル電気泳動法、ならびに一次抗アポリポタンパク抗体（ＳｉｇｍａまたはＪ．ＨｅｒｚおよびＨ．Ｈｏｂｂｓから贈られた）および対応する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＡｍｅｒｓｈａｍ）を用い、化学発光検出で免疫ブロッティングによって、分析した。Ａｔｔｏｐｈｏｓ化学蛍光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄ．Ｈｏｕｓｍａｎから贈られた）を、Ｓｔｏｒｍ  Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）と共に、定量分析のために使用した。血漿プロゲステロン濃度を、ラジオイムノアッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｒｐ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）によって決定した。コレステロールを、胆嚢の胆汁から抽出し、アッセイした。
【００４６】
（組織学および免疫蛍光顕微鏡法）
２．５％  Ａｖｅｒｔｉｎ（登録商標）で麻酔したマウスを、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２０ｍｌの氷冷ＰＢＳで左心室を通じて灌流した。心臓を、直接収集するか、またはマウスをパラホルムアルデヒドで灌流（５ｍｌ）し、そして心臓を収集し、処理した。心臓および卵巣を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）内で冷凍した。連続断面切片（大動脈洞を通して１０μｍ厚、卵巣については５μｍ厚、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  ｃｒｙｏｓｔａｔ）を、オイルレッドＯおよびマイヤーのへマトキシリンで染色した。画像を、コンピューター評価顕微鏡検査画像化システムおよび用いる形態計測分析のためにキャプチャーし、損傷の大きさを、ＮＩＨ画像化ソフトウェアを用い、切片中の各オイルレッドＯ染色粥状硬化症性斑の断面積の合計として、定量した。モノクローナル抗α平滑筋アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｒ．Ｈｙｎｅｓから贈られた）による免疫組織化学を、実施した。過剰排卵の雌性の卵管から単離された卵丘／卵母細胞複合体または裸にした卵細胞（透明体を除去した）を、ポリクローナルウサギ抗マウスＳＲ−ＢＩ抗体（Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙから贈られた）およびＣｙ３標識化ロバ抗ウサギ二次抗体（Ｒ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇから贈られた）で免疫染色した。
【００４７】
（統計分析）
データを、両側独立スチューデントｔ検定（血漿、胆汁またはＦＰＬＣ画分についての総コレステロールレベルまたはＥＺ  ＨＤＬコレステロールレベル、プロゲステロンレベル、およびａｐｏＡ−１レベル）または対応のないノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（粥状硬化症性斑病変サイズ）（ＳｔａｔｖｉｅｗおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）のどちらかを使用して、分析した。値は、平均±標準偏差で示す。
【００４８】
（結果と考察）
粥状硬化症に対するＳＲ−ＢＩの効果を分析するため、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスおよびａｐｏＥ  ＫＯ（自然発生粥状硬化症性）マウスを交配させ、そして４〜７週齢のシングルホモ接合体ＫＯ雌性およびダブルホモ接合体ＫＯ雌性において、リポタンパクプロフィールおよび粥状硬化症の進行を、比較した。雄性についての結果も、示さない限り、類似の結果であった。この結果は、図２に示す。シングルＳＲ−ＢＩ  ＫＯ群の血漿総コレステロールは、大型の、ａｐｏＥ富化ＨＤＬ粒子の増加が原因で、コントロールと比較して上昇した。一方、シングルａｐｏＥ  ＫＯ群における、さらにより高い相対的血漿コレステロール増加は、ＶＬＤＬおよびＩＤＬ／ＬＤＬサイズの粒子のコレステロールの劇的な上昇の結果であった。ダブルＫＯ群においては、シングルａｐｏＥ  ＫＯ群と比較して、主にＶＬＤＬサイズ粒子で、血漿コレステロールが高かった。リポタンパクを含むａｐｏＢを結合し得るＳＲ−ＢＩが、直接または間接に、が、シングルａｐｏＥ  ＫＯマウスにおいて、ＶＬＤＬサイズ粒子のコレステロールのクリアランスに寄与する（その非存在下において、クリアランスが低下した場合、これは起こり得た）。
【００４９】
シングルａｐｏＥ  ＫＯにおいて見られた通常のサイズのＨＤＬコレステロールのピークが、ダブルＫＯにおいて、実質的に消失した。しかし、ＨＤＬの主要なアポリポタンパクであるａｐｏＡ−Ｉの血漿レベルにおいて、統計学的に有意な差異（Ｐ＝０．１）は検出されなかった。シングルＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスにおけるリポタンパクの分析に基づいて、異常に大きなＨＤＬ様の粒子が、ダブルＫＯにおいて表れることが予測された。実際、ダブルＫＯにおける、通常のサイズのＨＤＬコレステロールおよびａｐｏＡ−Ｉの欠損は、ａｐｏＡ−ＩのＶＬＤＬおよびＩＤＬ／ＬＤＬサイズ画分中へのシフトを伴っていた。さらに、ＥＺ  ＨＤＬアッセイを使用するＦＰＬＣ画分中のＨＤＬ様コレステロールの分析によって、ダブルＫＯマウス中の異常に大きなＨＤＬ様粒子の存在についての証拠が提供された。シングルａｐｏＥ  ＫＯ雄性において、このコレステロールのほとんどが通常のＨＤＬのサイズを有する粒子中にあり、その一方で、そのダブルＫＯの対応物においては、このコレステロールのほとんど全てが、異常に大きな粒子中にあった。さらに、ダブルＫＯマウス（１３３±２４ｍｇ／ｄｌ）においては、シングルＫＯマウス（３６±１６ｍｇ／ｄｌ  Ｐ＝０．００５）よりも約３．７倍多いＨＤＬ様コレステロールが存在した。ａｐｏＥ  ＫＯバックグラウンドにおけるＳＲ−ＢＩ遺伝子の不活性化によるＨＤＬ様コレステロールの量およびサイズにおけるこれらの増加は、野生型バックグラウンドにおいて見られるものを連想させる（コレステロールの約２．２倍の増加）。しかし、ダブルＫＯマウスにおけるＨＤＬ様粒子は、ＳＲ−ＢＩシングルＫＯマウスにおけるものよりも、かなりより大きく、不均一である。雄性と比較して、シングルａｐｏＥ  ＫＯ雌において、異常に大きなＨＤＬ様コレステロールのレベルの増加があった以外は、類似の傾向が、雌性マウスにおいても見られた。リポタンパクのマグネシウム／硫酸デキストラン沈殿を使用する予備的なコレステロール測定は、ダブルＫＯ動物における大きなＨＤＬについてのＥＺ  ＨＤＬでの結果を支持する。
【００５０】
雄性および雌性の両方由来の、ＩＤＬ／ＬＤＬサイズ範囲内の異常に大きなＨＤＬ様粒子についてのさらなる証拠を、アガロースゲル電気泳動およびイムノブロッティングを用いて、得た。ダブルＫＯのＩＤＬ／ＬＤＬのサイズの粒子の画分中において、総コレステロールは等量であったか、またはより多かったが、シングルａｐｏＥ  ＫＯと比較して、ダブルＫＯ由来のＩＤＬ／ＬＤＬのサイズの粒子中に存在する免疫検出可能なａｐｏＢの量が顕著に減少した。さらに、ａｐｏＡ−Ｉを含むＩＤＬ／ＬＤＬサイズの粒子の電気泳動度において、顕著に大きな不均一性があった。このことは、部分的には、新規のａｐｏＡ−Ｉを含み、ａｐｏＢを含まないＨＤＬ様粒子の存在に起因する。対照的に、シングルａｐｏＥ  ＫＯ中のａｐｏＡ−Ｉのほとんどは、ａｐｏＢと同時に移動するようである。従って、シングルａｐｏＥ  ＫＯ動物中の通常サイズのＨＤＬは、ダブルＫＯ動物中では、非常に大きな（ＶＬＤＬ／ＩＤＬ／ＬＤＬサイズ）ＨＤＬ様粒子に置き換わるようである。実質的に減少した、選択的（ＳＲ−ＢＩ媒介性）、およびａｐｏＥ媒介性の、ＨＤＬ粒子からのコレステロールの取り込みまたは移送ゆえに、ａｐｏＥおよびＳＲ−ＢＩの両方が欠失する場合、通常のサイズのＨＤＬは、これら大きなＨＤＬ様粒子に変換され得る。
【００５１】
血漿コレステロールの試験に加えて、胆汁コレステロールを、マウスにおいて測定した。胆嚢の胆汁中のコレステロールレベルは、ＳＲ−ＢＩ＋／＋コントロールと比較して、ＳＲ−ＢＩシングルＫＯマウス（３０％、Ｐ＜０．００５）およびＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＥダブルＫＯマウス（４７％、Ｐ＜０．０００５）において顕著に減少した。このことは、肝臓におけるＳＲ−ＢＩの過剰発現が胆汁中のコレステロールレベルを上昇させるという知見と一致し、そして、ＳＲ−ＢＩが、血漿ＨＤＬコレステロールの胆汁中への反対のコレステロール輸送−移送の最後の段階において重要な役割を通常は担い得ることを示す。このデータはまた、ａｐｏＥ発現がＳＲ−ＢＩ  ＫＯにおいて胆汁のコレステロール含量を制御し得るが、ＳＲ−ＢＩ＋／＋バックグラウンドでは制御し得ないことを示唆する。
【００５２】
動物における粥状動脈硬化症を、大動脈洞中の斑領域、およびａｐｏＥ  ＫＯマウスにおける血漿リポタンパクに対するＳＲ−ＢＩ遺伝子破壊の影響を分析することによって、さらに評価した。マウスは、４−７週齢であった。血漿ａｐｏＡ−Ｉレベル（平均±標準偏差、相対単位で示す）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動、それに続く、ａｐｏＥ−／−（ｎ＝７）およびＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−雌性（ｎ＝５）（Ｐ＝０．１）についての、定量性イムノブロッティングによって決定した。リポタンパクコレステロールプロファイル：個体ａｐｏＥ−／−またはＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−雌性由来の血漿リポタンパクを、サイズに基づいて分離し（ＳＵＰＥＲＯＳＥ  ６−ＦＰＬＣ）そして各画分中の総コレステロール（血漿１ｄｌ中のｍｇとして表す）を測定した。独立した実験において、雌性由来のプールしたＳＵＰＥＲＯＳＥ  ６−ＦＰＬＣの画分（プールあたり約２１μｌ）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド勾配（３−１５％）ゲル電気泳動、および抗ａｐｏＡ−Ｉ抗体を用いるイムノブロッティングによって、分析した。各プールは３つの画分を含み、そしてレーンを各プールの真ん中の画分の番号で標識する。ａｐｏＥ−／−またはＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−雄性（ｎ＝３）または雌性（ｎ＝３）についての、平均ＥＺ  ＨＤＬコレステロールＦＰＬＣプロファイル。アガロースゲル電気泳動およびイムノブロティング：個々のａｐｏＥ−／−またはＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−雌性由来のリポタンパクプロファイルのＩＤＬ／ＬＤＬ領域からのプールした画分（１１−２１、３．５μｌ）を、抗ａｐｏＡ−Ｉ抗体または抗ａｐｏＢ抗体のどちらかを使用して分析した。移動は、負から正に向けて、上方向であった。胆嚢胆汁のコレステロール（平均±標準偏差）：示した遺伝型の雄性マウスおよび雌性マウスの両方（遺伝型あたり、ｎ＝１０または１１）からの総胆嚢胆汁コレステロールを測定した。野生型の値およびａｐｏＥ−／−の値を除いて、全ての二つ一組の差異が、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０２５−０．０００５）。
【００５３】
ａｐｏＥ  ＫＯマウスにおける粥状動脈硬化症に対するＳＲ−ＢＩ遺伝子破壊の影響を決定するために、ＳＲ−ＢＩ−／−（ｎ＝８、４−６週齢）、ａｐｏＥ−／−（ｎ＝８、５−７週齢）、またはＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−（ｎ＝７、５−６週齢）の雌性マウスにおける粥状動脈硬化症を、方法に記載したように、オイルレッドＯおよびマイアーのヘマトキシリンを用いて染色した大動脈洞の凍結切片において分析した。大動脈根（ａｏｒｔｉｃ  ｒｏｏｔ）領域中のオイルレッドＯ染色した病巣の、大動脈根領域を通る代表的な切片および断面積は、ＳＲ−ＢＩ−／−ａｐｏＥ−／−、ａｐｏＥ−／−、またはＳＲ−ＢＩ−／−マウスについての平均病巣面積（ｍｍ２±標準偏差）を示し、以下のとおりであった：０．１０±０．０７、０．００２±０．００２、および０．００１±０．００２（Ｐ＝０．０００５）。この比較的若年（４−７週）でのシングルＫＯ動物において、実質的に、検出可能な病巣は存在しなかった。しかし、ダブルＫＯでは、大動脈根領域中、大動脈洞中の別の場所、および冠状動脈中において、実質的に、統計的に有意な病巣の発達があった。脂質に富む病巣は、細胞性であり（ヘマトキシリン染色した核が、高倍率において見られた）、そして、いくつかの場合、平滑筋アクチンに対する抗体を用いて染まる細胞性のキャップ（ｃａｐ）を有した。従って、粥状動脈硬化症の斑は、比較的進行していた。
【００５４】
この時点において、ほとんどが、疾患の明白な徴候を示さなかったが、全てが、６週齢付近で急に死亡した。心電計の研究によって、ダブルＫＯの成熟前の死亡が進行性の心臓ブロック（心臓伝導欠陥）に起因し、そして組織学によって、広範な心臓の線維症、ならびに、冠状動脈が狭くなるか、または閉塞することが明らかとなった。このことは、心筋梗塞（ＭＩ）が、進行性の粥状動脈硬化症疾患に起因することを示唆する。ａｐｏＥ  ＫＯマウスにおけるＳＲ−ＢＩ発現による抗粥状動脈硬化症効果は、コレステロールおよび脂肪を与えたＬＤＬＲ  ＫＯマウスにおける、アデノウイルス媒介性、またはトランスジーン媒介性の肝臓でのＳＲ−ＢＩの過剰発現が粥状動脈硬化症を減少するという報告と一致する。従って、内在性のＳＲ−ＢＩ活性の薬理学的な刺激は、おそらく、ＲＣＴに対するその重要性のために、抗粥腫発生性（ａｎｔｉ−ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ）であり得る。ダブルＫＯにおける加速された粥腫発生および通常のサイズのＨＤＬコレステロールの欠損は、高脂肪食餌を与えられたシングルａｐｏＥ  ＫＯマウスについて報告されたものと類似する；しかし、これらのマウスは、かなりより高い、総血漿コレステロールレベルを有する（１８００〜４０００  対  約６００ｍｇ／ｄｌ）。この類似性は、部分的には、脂肪を与えられたシングルａｐｏＥ  ＫＯにおける、非常に高レベルの大きなリポタンパクによって、ＳＲ−ＢＩがＨＤＬおよび他のリガンドと相互作用することがブロックされ得るために生じる（競合に起因する機能的ＳＲ−ＢＩの欠損）か、または肝臓でのＳＲ−ＢＩ発現の食餌による抑制のために生じると考えられる。
【００５５】
（結果）
内在性の基質アッセイによって、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯ血漿中のＬＣＡＴ活性が、野生型活性の２０％を有することが示された。このことは、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウス中の異常なリポタンパクの減少した基質活性またはＬＣＡＴ酵素の減少した活性は、エステル化されていない形態である血漿中のコレステロールの増加した画分が原因であるという可能性と、一致する（上記実施例３を参照のこと）。
【００５６】
（実施例３：粥状動脈硬化症の予防または処置、およびＳＲ−ＢＩノックアウトマウスにおける脂質のレベルおよび構造の正常化）
上記の実施例において記載された動物は、粥状動脈硬化症および心疾患の予防または処置、ならびに血漿中のリポタンパクＸの蓄積をもたらす疾患（肝疾患（胆汁うっ滞）、ＬＣＡＴ欠損）およびコレステロール代謝に影響を与える他の疾患（ＮＰＣ１、タンジアー病）の処置のために有効な化合物のスクリーニングのために有用である。いくつかの研究が、このことを実証するために、行われた。
【００５７】
（材料および方法）
上記の実施例と同じ動物を使用した。
【００５８】
（動物）
マウスを飼育し、そして通常の固形食または固形飼料（Ｔｅｋｌａｄ  ７００１）（０．５％（ｗｔ／ｗｔ）４，４’−（イソプロピリデン−ジチオ）−ビス−（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール）（ＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を補充）を与えた。マウス系統（遺伝的背景）は、以下のとおりであった：野生型およびＳＲ−ＢＩ  ＫＯ（両方とも、１：１混合のＣ５７ＢＬ／６ｘ１２９背景）、ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯ（Ｃ５７ＢＬ／６；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）。ダブルＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯマウスを、（ａ）ＳＲ−ＢＩ  ＫＯの雄とａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯの雌とを交配し、（ｂ）生じた胚をＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒレシピエントに移し、そして（ｃ）ダブルヘテロ接合性子孫を異種交配することによって、作製した。ダブルＫＯの雄と、ＳＲ−ＢＩヌル突然変異に対してヘテロ接合性でありかつａｐｏＡ−Ｉ変異に対してホモ接合性である雌とを交配することによって、コロニーを維持して、ＳＲ−ＢＩホモ接合体の低収量を最適化した。
【００５９】
これらの動物に、結果に記載されるように、出生前または後の種々の時点で、ＰＲＯＢＵＣＯＬを与えた。
【００６０】
（結果）
（雌性ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスの受胎能に対するａｐｏＡ−Ｉ遺伝子の遺伝子破壊の生存率またはＰＲＯＢＵＣＯＬ処置の効果）
野生型の雄を、雌性ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウス（ｎ＝１３、平均同腹子サイズ＝１、２〜６ヶ月の交配）、ＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＡ−Ｉ  ＫＯマウス（ｎ＝１７、暗灰色のバー、平均同腹子サイズ＝２．２、４ヶ月の交配）ＰＲＯＢＵＣＯＬ（プロブコール）を与えたＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウス（ｎ＝１４、平均同腹子サイズ＝５．７、１〜２ヶ月の交配）、およびＰＲＯＢＵＣＯＬを与えた野生型マウス（ｎ＝９、白色のバー、平均同腹子サイズ＝５．３、１〜２ヶ月の交配）と交配した。
【００６１】
第１の研究において、ＰＲＯＢＵＣＯＬを交配対（ＡｐｏＥ  −／−およびＳＲ−ＢＩ＋／−）に与えた。その子孫（受胎時からＰＲＯＢＵＣＯＬを受けた）を、３週齢で離乳させた。これらの子孫に、飼料中のＰＲＯＢＵＣＯＬを与え続けた。６週目で、代表的には、処置なしにおいて、動物の５０％が死亡し、心臓機能のＭＲＩ、ＥＣＧ、心エコー図および組織学により測定したところ、異常な表現型はない。粥状動脈硬化症の証拠はない。
【００６２】
７〜８ヶ月目において、ＰＲＯＢＵＣＯＬを受けた動物の多くがまだ生存している。しかし、これらの動物は、かなりの粥状動脈硬化症および幾分かの心筋梗塞を有する。逆に、正常な野生型マウスは、心臓疾患の証拠も粥状動脈硬化症の証拠も示さない。
【００６３】
第２の研究において、ＰＲＯＢＵＣＯＬを受けた動物に、離乳時（約３週齢）でこの処置を中断した。全ての動物は、１０〜１２週以内に死亡する。
【００６４】
第３の実験において、離乳後まで、５週齢の前（ｄＫＯ−Ｐ＜５；平均年齢４．１週齢、３．９〜４．６週の範囲）または後（ｄＫＯ−Ｐ＞５；平均年齢５．２週齢、５．１〜５．３週の範囲）のいずれかまで、動物にＰＲＯＢＵＣＯＬ処置を行わなかった。５週齢前にＰＲＯＢＵＣＯＬを与えられた動物のほとんどは、数ヶ月生存する。
【００６５】
受胎からＰＲＯＢＵＣＯＬを受けた動物の生存率を図１Ａに示す；５週齢の前または後からＰＲＯＢＵＣＯＬを受けた動物の生存率を図１Ｂに示す。
【００６６】
これらの結果は、薬物が予防剤および治療剤として使用され得ることを実証する。
【００６７】
（リポタンパク質および赤血球細胞の成熟に対するＰＲＯＢＵＣＯＬ処置の効果）
ＰＲＯＢＵＣＯＬ処置は、ｄＫＯマウスにおける血漿中総コレステロール（表１）およびリン脂質（表２）のレベルを、未処置のａｐｏＥ  ＫＯマウスにおけるものと比較して約２倍低下させた。処置は、ｄＫＯマウスの血漿中トリグリセリドレベル（これはａｐｏＥ  ＫＯマウスの血漿中トリグリセリドレベルより幾分か低い）を低下しなかった（表２）。ｄＫＯマウスにおける異常に大きいＨＤＬ粒子は、ＶＤＬ／ＩＤＬ／ＬＤＬサイズ範囲において見出されるが、ＨＤＬサイズ範囲においては見出されず、これはＳＲ−ＢＩ媒介性選択的脂質取込みの欠失に起因する。予想外に、ＰＲＯＢＵＣＯＬ処置（白丸）は、正常なサイズのＨＤＬの位置（フラクション２９−３４）においてコレステロールのピークの出現を誘発し、このピークは、未処置のａｐｏＥ  ＫＯマウスにおいても見られるａｐｏＡ−Ｉを含んでいた。逆に、ＰＲＯＢＵＣＯＬは、ａｐｏＥ  ＫＯマウスにおける正常なサイズのＨＤＬピークを減少する。リポタンパク質非エステル化コレステロールおよびリン脂質のＦＰＬＣのプロフィールの形状は、総コレステロールの形状と類似していた。主要なＦＰＬＣリポタンパク質フラクション中の、非エステル化コレステロール（ＵＣ）  対  総コレステロール（ＴＣ）、およびリン脂質（ＰＬ）  対  ＴＣの相対量の比を、表１および／または表２に示す。
【００６８】
ＳＲ−ＢＩポジティブコントロールと比較して、ｄＫＯマウスおよびＳＲ−ＢＩＫＯマウスの両方において、総コレステロールに対する非エステル化コレステロールの比が驚くほど高かった（表１）。ｄＫＯマウスにおける結果として、コア／非極性（エステル化コレステロールおよびトリグリセリド）脂質に対する表面／極性（ＵＣおよびＰＬ）脂質の比は、ａｐｏＥ  ＫＯコントロールよりも約６倍高かった（表２）。この高い比は、ｄＫＯマウスにおけるリポタンパク質の構造が異常であることを示唆した。ネガティブ染色総血漿およびｄＫＯマウス由来の主要リポタンパク質フラクションの電顕図は、多くの層状／小胞、および異常な形態を有する積重なった円板状粒子、ＬＣＡＴ欠損、胆汁鬱滞、および他の異常に高いＵＣの場合に見られるそれら（例えば、リポタンパク質Ｘ）の形跡（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）の存在を示した。血漿の非エステル化コレステロールにおける大きなＰＲＯＢＵＣＯＬ誘導性の減少（約４．８倍）により、ＳＲ−ＢＩポジティブコントロール（表１）における正常な値に対するｄＫＯマウスおよびＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスの両方においる異常に高いＵＣ：ＴＣ比が低下し、そしてａｐｏＥ  ＫＯコントロールに対してｄＫＯマウスにおける表面脂質：コア脂質の比が低下した（表２）。結果として、ｄＫＯ−Ｐマウスにおける主要なリポタンパク質フラクションの形態は、ａｐｏＥ  ＫＯコントロールにおける形態へ回復した。
【００６９】
非エステル化コレステロールの網状赤血球前駆体における過剰な蓄積に起因して、はっきりとした可逆的欠損が、ｄＫＯマウスにおけるＲＢＣ成熟において存在する（コレステロール結合性蛍光色素フィリピン染色により可視化した）。表３を参照のこと。野生型マウスおよびａｐｏＥ  ＫＯマウスと比較して、未処理ｄＫＯマウスは無気力であり、そしてはっきりと網状赤血球増加症を示した（異常な形態の網状赤血球前駆体、両凹の成熟赤血球はない）。それらの大きな大赤血球細胞（増加した平均小体量）は、ＬＣＡＴ欠損患者に見られる古典的な異常な「標的」細胞から形態学的に異なり、そして大きなコレステロールリッチなオートファゴリソソーム（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍａｌ）封入体を含んだ。これらの異常のほとんど全てを（いくつかの不規則な形態を除いて）、ＰＲＯＢＵＣＯＬ処理により矯正した。ＰＲＯＢＵＣＯＬによるｄＫＯマウスにおける網状赤血球増加症の矯正は、それらのＣＨＤのその抑制に寄与した（例えば、組織の酸化を改善することにより）。
【００７０】
低脂肪食中の、ＨＤＬレセプターＳＲ−ＢＩ遺伝子およびａｐｏＥ遺伝子（ｄＫＯマウス）におけるホモ接合性ヌル変異を有するマウスは、ヒトＣＨＤ（高コレステロール血症、大動脈洞における粥状動脈硬化症、閉塞性冠動脈班、班状ＭＩ、心臓肥大化および機能障害の多くの基本的な特徴（低下した心臓収縮機能および駆拍率、ＥＣＧ異常）、ならびに早熟死（約６週間で５０％の死亡率）を含む）を迅速に発達させた（１、１６）。それらはまた、ＲＢＣ成熟においてブロックを示した。それらの異常に高い、リポタンパク質表面（非エステル化コレステロール（ＵＣ）、リン脂質）脂質  対  コア（エステル化コレステロール、トリグリセリド）脂質の比は、異常なリポタンパク質の形態（層状／小胞および積み重なった円板状粒子、他の高いＵＣ（例えば、ＬＣＡＴ欠損、胆汁鬱滞、およびａｐｏＥ／肝リパーゼ（ＨＬ）欠損の場合のそれらの形跡を誘導した。ＳＲ−ＢＩヌル（ｄＫＯ、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯ）マウスにおいて過剰なＵＣを示す機構は未知であるが、ＬＣＡＴ、ＨＬ、または他のリポタンパク質代謝タンパク質の活性に関与し得る。
【００７１】
脂質抑制薬および抗酸化薬ＰＲＯＢＵＣＯＬによるｄＫＯマウスの処理は、それらの生存性を延長させ（６週から３６週）、そして本質的に全ての早期発症性ＣＨＩＤ関連の、解剖学的病理、機能的病理、細胞病理、および生化学的病理を逆転させた。ＰＲＯＢＵＣＯＬ感受性病理の実質的な部分は、見かけ上、３週齢から５週齢の間に起こった。
【００７２】
（表１．血漿非エステル化コレステロールおよび総コレステロールに対するプロブコールの効果）
【００７３】
【表１】
2005526128.tif 000002
【００７４】
データは、ＡＮＯＶＡ試験により、全ての他の群と比較した場合の、平均±標準偏差＊Ｐ＜０．０００１として表す。プロブコール処理をした、またはしていないｔ試験比較についてのＰ値：†、＜０．０００１；§、＜０．０２０；¶＜０．０００３；＊＊＜０．００３１；￥、＜０．３５。＃低脂肪食を与えられた４〜５週齢動物由来の血液サンプルを採取し、同じ動物にプロブコール補充食をさらに７〜２５日与え、そして第２セットのサンプルを採取した（総コレステロールのデータは、Ｐｆｅｕｆｆｅｒら（１９９２）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１２，８７０−８７８由来である）。
【００７５】
（表２．血漿リン脂質、トリグリセリド、および脂質の比に対するプロブコールの効果）
【００７６】
【表２】
2005526128.tif 000003
【００７７】
§個々のマウスからの３回（ｄＫＯおよびｄＫＯ−Ｐ）または２回（ａｐｏＥ）の独立した測定の平均。ＦＰＬＣプロフィールからの各主要リポタンパク質における示される脂質の量（ＶＬＤＬ、フラクション３〜９；ＩＤＬ／ＬＤＬ、フラクション１０〜２６；ＨＤＬフラクション３０〜３７）を一緒に添加し、そしてその平均を用いて総コレステロール（ＴＣ）に対する非エステル化コレステロール（ＵＣ）の相対量（ＵＣ＊１００／ＴＣ）およびＴＣに対するリン脂質（ＰＬ）の相対量（ＰＬ＊１００／ＴＣ）を算出した。†（ＰＬ＋ＵＣ）／（エステル化コレステロール＋トリグリセリド）；ｎｄ、決定されず。
【００７８】
（表３．ａｐｏＥ  ＫＯマウスおよびｄＫＯマウスにおける赤血球細胞パラメータに対するプロブコールの効果）
【００７９】
【表３】
2005526128.tif 000004
【００８０】
全ての動物は４〜６週齢であった（プロブコール処理ｄＫＯおよびａｐｏＥ  ＫＯの各々１匹（６月齢）を除く）。§全ての値は、平均±標準偏差である。†未処理ｄＫＯマウスからの値は全て、他の３群からの値と有意に異なった（平均小体量および％網状赤血球についてＰ＜０．０００１；ヘマトクリットについてＰ＜０．００１）。正常マウス網状赤血球計数は、２％〜６％の範囲であった。＊未処理動物についてのデータは、Ｍａｓｈｉｍａら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１２，４１１−４１８由来である。
【００８１】
（実施例４：ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスにおけるＬＣＡＴの測定）
酵素ＬＣＡＴの減少したレベルは、特定の障害（リポタンパク質Ｘを含む）において見出される。従って、ＤＫＯ動物におけるＬＣＡＴレベルを測定した。
【００８２】
（材料および方法）
内因性基質によるＬＣＡＴ活性をアッセイするために、トレーサー［３Ｈ］コレステロールを、４℃で一晩血漿に添加し、次いで、血漿を暖めそしてエステル形成を測定する。
【００８３】
このアッセイを、コントロール（ｗｔ）マウスおよびＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウス由来の血漿について実施した。
【００８４】
（結果）
内因性基質アッセイは、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯ血漿におけるＬＣＡＴ活性が、野生型活性の２０％を有することを示した。このことは、ＳＲ−ＢＩ  ＫＯマウスにおける異常なリポタンパク質の減少した基質活性またはＬＣＡＴ酵素の減少した活性が、非エステル化形態の血漿中の増加したコレステロールフラクションを担う可能性と一致する（上記実施例３を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１ａおよび１ｂは、ＰＲＯＢＵＣＯＬを給餌されたマウスと比較したダブルノックアウトｄＫＯマウスについての生存％  対  齢のグラフである。図１ａ、ｄＫＯマウス、ｎ＝１３、通常の餌（ｃｈｏｗ）を給餌、点線（８週までに死んだ）；ｄＫＯマウス、ｎ＝１０、受胎時から０．５％  ＰＲＯＢＵＣＯＬ食を給餌、実線（６０週目に最後の死亡）；およびｄＫＯ−Ｐｗｗマウス、ｎ＝９、受胎時から離乳までＰＲＯＢＵＣＯＬ食を給餌（約１８週目に死亡）。図１ｂ、ｄＫＯ−Ｐ＜５マウス（ＰＲＯＢＵＣＯＬ食を離乳後、５週齢まで投与、ｎ＝９；および、ｄＫＯ−Ｐ＞５、ＰＲＯＢＵＣＯＬ食を５週齢後すぐに投与、ｎ＝７）。
【図２】図２は、コレステロールリポタンパク質プロフィール（ＦＰＬＣを使用してサイズで分画されたリポタンパク質）のグラフであり、処置されていないｄＫＯマウス（黒丸）または受胎時から０．５％  ＰＲＯＢＵＣＯＬを給餌されたマウス（白丸）についてのＶＬＤＬ、ＩＤＬ／ＬＤＬ、およびＨＤＬについての総コレステロール（ｍｇ／ｄｌ）を示す。
【図１】
2005526128.tif 000005
【図２】
2005526128.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月19日(2004.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＲ−ＢＩによって媒介される異常なリポタンパク質およびコレステロールの代謝によって特徴付けられる、粥状動脈硬化症以外の障害または疾患を処置または予防するための方法であって、
該処置または予防を必要とする個体に、４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール）、そのモノエステルおよび他の誘導体、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフランまたはその誘導体、ビタミンＥおよびビタミンＣからなる群より選択される化合物を投与する工程であって、該化合物は、リポタンパク質レベルを減少させるに有効な量で投与されるか、またはリポタンパク質構造を正常化するに有効な量で投与されるか、または異常なコレステロール代謝を減少するに有効な量で投与される、工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記化合物が４，４’−（イソプロピリデンジチオ）ビス（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール）、そのモノエステルおよび他の誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、２，３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２，２−ジペンチル−４，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンゾフランまたはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、ビタミンＥおよびビタミンＣからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が胆汁鬱帯を有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物がリポタンパク質Ｘを有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、コレステロール代謝における異常に起因する疾患を有する個体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が、ニーマンピック病Ｃ型またはタンジアー病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法において使用するための処方物。
【国際調査報告】
2005526128.tif 000007
2005526128.tif 000008