(57)【要約】本発明は、既知作用メカニズムを有する増殖抑制物質（すなわち、細胞の増殖または生残に必要な機能を有する酵素または他の遺伝子産物を阻害し又は妨げる物質）の選択的スクリーニングを可能にする方法である。該方法は、遺伝子産物の発現を妨げうるＲＮＡ断片（例えば、ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ）をコードする核酸断片を含有する細胞（例えば、細菌細胞）を使用するものであり、該ＲＮＡ断片の発現は、該遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）において作用する物質（薬物）に対して該細胞を前感作する。該細胞は、該ＲＮＡ断片を発現する能力を喪失する。該方法においては、標的遺伝子産物において作用する物質に対して該細胞を前感作するレベルでＲＮＡ断片の発現が生じる条件下に、試験物質の存在下で栄養培地内で該組換え細胞を増殖させる。また、該ＲＮＡ断片を発現する能力を該細胞が喪失するよう、該増殖条件を制御する。試験物質が、標的遺伝子産物に作用する増殖インヒビターである場合には、該ＲＮＡ断片を欠く細胞（復帰細胞）は、該ＲＮＡ断片を含有する細胞と比較して増殖上の利点を有し、復帰細胞の増殖が生じる。本発明の方法は、復帰細胞の出現に関して細胞増殖をモニターすることを含み、これは、特定の作用様式を有する選択的増殖インヒビターの同定をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある物質が、細胞の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する細胞増殖インヒビターであるか又はそのような細胞増殖インヒビターを含有するかどうかを試験するための方法であって、
（Ａ）該遺伝子産物の発現を妨げるＲＮＡ断片を発現しうる組換え細胞を提供し、
（Ｂ）（ｉ）該ＲＮＡ断片の発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下で試験物質の存在下に、栄養培地内で該組換え細胞を増殖させ、
（Ｃ）生じた細胞増殖を分析することを含んでなり、ここで、
（１）該細胞の全て又は実質的に全ての死により細胞増殖が実質的に無い場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有し、
（２）該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により細胞増殖の抑制が実質的に無い場合には、該試験物質は増殖インヒビターではないか又は増殖インヒビターを含有せず、あるいは
（３）該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖と共に、細胞の相当な部分の死により増殖抑制が有る場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有する、方法。
【請求項２】
工程Ａにおいて該細胞により発現されるＲＮＡ断片がアンチセンスＲＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該アンチセンスＲＮＡが、該組換え細胞内に含有されるプラスミドにコードされる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該アンチセンスＲＮＡが該組換え細胞のゲノム内のＤＮＡにコードされる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該組換え細胞が、細菌株および真菌株よりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該細胞が細菌の株であり、該物質が、該細菌の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有するかどうかを判定するために、該物質を試験する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程Ａにおいて該細菌により発現されうるＲＮＡ断片が、該細菌内に含有されるプラスミドにコードされるアンチセンスＲＮＡを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程Ｂにおいて該組換え細胞を増殖させる栄養培地が、該試験物質を接種した半固形培地であり、工程Ｃが、生じた細胞増殖を分析することを含み、ここで、
（１）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての死により、実質的に非増殖を示す透明域を示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有し、
（２）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により、非増殖域を示さない場合には、該試験物質は増殖インヒビターではないか又は増殖インヒビターを含有せず、あるいは
（３）該半固形培地が非増殖域を示すが、例外として該区域内に、該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖による１以上の小さな細胞コロニーを示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該組換え細胞が細菌の株であり、該試験物質が、該細菌の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有するかどうかを判定するために、該試験物質を分析する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該半固形培地が寒天プレートまたはアガロースプレートである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
工程Ａにおいて該細菌により発現されうるＲＮＡ断片が、第１プラスミドにコードされるアンチセンスＲＮＡを含み、該第１プラスミドが、該細胞のゲノム内に組込まれた又は第２プラスミド内に含有されるレポーター遺伝子を調節するリプレッサー遺伝子をもコードし、
工程Ｂにおける栄養培地が液体培地であり、
工程Ｂにおける該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失が、該レポーター遺伝子を該リプレッサーが調節する能力の喪失を伴い、
工程Ｃにおける細胞増殖の分析において、
（１）該細胞の全て又は実質的に全ての死により細胞増殖が実質的に無い場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有し、
（２）該細胞（該細胞は該レポーター遺伝子の発現を示さない）の全て又は実質的に全ての生残および増殖により細胞増殖の抑制が実質的に無い場合には、該試験物質は増殖インヒビターではないか又は増殖インヒビターを含有せず、あるいは
（３）該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さないが該レポーター遺伝子の発現を示す復帰細胞の生残および増殖と共に、液体培地内の細胞の相当な部分の死により増殖抑制が有る場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該レポーター遺伝子が第２プラスミドにコードされ、蛍光タンパク質をコードし、復帰細胞の生残および増殖が該蛍光タンパク質からの蛍光の検出により示される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該細胞が細菌の株であり、該アンチセンスＲＮＡが、第１プラスミドにコードされるキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡであり、ｆａｂＦ、ｐｈｅＴ、ｍｕｒＡ、ｓｅｃＡ、ｄｎａＣ、ｉｌｅＳ、ｆｔｓＺ、ｓｅｃＩ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｇｙｒＥ、ｇｙｒＡ、ｍｕｒＢ、ｒｐｌ、ｐａｒＥおよびｐａｒＣよりよりなる群から選ばれる遺伝子の発現を妨げうる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
工程Ｃにおける細胞増殖の分析が、細胞数に対する蛍光のレベルを測定することを含み、吸光度を測定することにより細胞数を測定する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ある物質が、細菌の株の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有するかどうかを試験するための方法であって、
（Ａ）該遺伝子産物の発現を妨げるＲＮＡ断片を発現しうる細菌株の組換え細胞を提供し、
（Ｂ）（ｉ）該ＲＮＡ断片の発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下で試験物質の存在下に、栄養培地内で該組換え細胞を増殖させ、
（Ｃ）生じた細胞増殖を分析することを含んでなり、ここで、
（１）該細胞の全て又は実質的に全ての死により細胞増殖が実質的に無い場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有し、
（２）該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により細胞増殖の抑制が実質的に無い場合には、該試験物質は抗細菌剤ではないか又は抗細菌剤を含有せず、あるいは
（３）該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖と共に、細胞の相当な部分の死により増殖抑制が有る場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有する、方法。
【請求項１６】
工程Ａにおいて該細胞により発現されるＲＮＡ断片がアンチセンスＲＮＡを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該アンチセンスＲＮＡが、該細胞内に含有されるプラスミドにコードされる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該アンチセンスＲＮＡが該細胞のゲノム内のＤＮＡにコードされる、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該細菌株が、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選ばれる、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロバクター・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・ボゥマニイィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）よりなる群から選ばれる、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該細菌株が、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の生残または増殖に必要な遺伝子に関するキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドを含有するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該プラスミドにより発現されるキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡが、ｆａｂＦ、ｐｈｅＴ、ｍｕｒＡ、ｓｅｃＡ、ｄｎａＣ、ｉｌｅＳ、ｆｔｓＺ、ｓｅｃＩ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｇｙｒＥ、ｇｙｒＡ、ｍｕｒＢ、ｒｐｌ、ｐａｒＥおよびｐａｒＣよりなる群から選ばれる遺伝子に関するものである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該ＲＮＡ断片の標的遺伝子が、脂肪酸シンターゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、タンパク質セクレターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼまたはリボソーム関連タンパク質を発現するようコードされている、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
工程Ｂにおいて該組換え細胞を増殖させる栄養培地が、該試験物質を接種した半固形培地であり、工程Ｃが、生じた細胞増殖を分析することを含み、ここで、
（１）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての死により、実質的に非増殖を示す透明域を示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有し、
（２）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により、非増殖域を示さない場合には、該試験物質は抗細菌剤ではないか又は抗細菌剤を含有せず、あるいは
（３）該半固形培地が非増殖域を示すが、例外として該区域内に、該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖による１以上の小さな細胞コロニーを示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有する、請求項１５記載の方法。
【請求項２５】
該半固形培地が寒天プレートまたはアガロースプレートである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ある物質が、細菌の株の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有するかどうかを試験するための方法であって、
（Ａ）該遺伝子産物の発現を妨げるアンチセンスＲＮＡを発現しうるプラスミドを含有する細菌株の組換え細胞を提供し、
（Ｂ）（ｉ）該アンチセンスＲＮＡの発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該アンチセンスＲＮＡを発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下で試験物質の存在下に、寒天プレート上で該組換え細胞を増殖させ、
（Ｃ）生じた細胞増殖を分析することを含んでなり、ここで、
（１）該寒天プレートが、該細胞の全て又は実質的に全ての死により、実質的に非増殖を示す透明域を示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有し、
（２）該寒天プレートが、該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により、非増殖域を示さない場合には、該試験物質は抗細菌剤ではないか又は抗細菌剤を含有せず、あるいは
（３）該寒天プレートが非増殖域を示すが、例外として該区域内に、該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖による１以上の小さな細胞コロニーを示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有する、方法。
【請求項２７】
該プラスミドが、アンチセンスＲＮＡを発現するよう誘導され抗生物質に対する耐性をコードするプラスミドである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
工程Ｂにおいて、（ｉ）該アンチセンスＲＮＡの発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーションが、有効量のアンチセンスＲＮＡ誘導物質の存在下で該細胞を増殖させることにより得られ、（ｉｉ）該アンチセンスＲＮＡを発現する能力の該細胞による喪失が、該プラスミドが耐性である抗生物質の非存在下で該細胞を増殖させることにより得られる、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該アンチセンスＲＮＡが、脂肪酸シンターゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、タンパク質セクレターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼまたはリボソーム関連タンパク質を発現する遺伝子の発現を妨げうるキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
該アンチセンスＲＮＡが、ｆａｂＦ、ｐｈｅＴ、ｍｕｒＡ、ｓｅｃＡ、ｄｎａＣ、ｉｌｅＳ、ｆｔｓＺ、ｓｅｃＩ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｇｙｒＥ、ｇｙｒＡ、ｍｕｒＢ、ｒｐｌ、ｐａｒＥおよびｐａｒＣよりなる群から選ばれる遺伝子の発現を妨げうるキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該細菌がスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である、請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖に必要な特定の遺伝子産物に作用することにより細胞増殖を抑制する物質の同定方法に関する。１つの実施形態においては、該方法は、脂肪酸の生合成に必要な酵素の阻害のような特定の作用メカニズムを有する抗細菌剤である物質を同定するために使用される。本発明の方法においては、標的遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を妨げうるＲＮＡ断片（例えば、アンチセンスＲＮＡ）をコードする細胞を使用して、該ＲＮＡ断片の発現により、該遺伝子産物において作用する物質に対して該細胞を予め感受性化する。また、該方法においては、標的遺伝子産物において作用する物質の存在下で増殖しうる細胞（本明細書中では「復帰（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）」細胞と称する）が得られるよう、該ＲＮＡ断片を細胞が発現する能力を喪失する条件を用いる。所与の物質の存在下での本発明の方法による復帰細胞コロニーの検出は、標的遺伝子産物において作用する物質を増殖インヒビターとして同定する。
【背景技術】
【０００２】
公衆衛生上重大な脅威となる細菌の病原株には、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、特に、株ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロバクター・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・ボゥマニイィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）が含まれる。病原細菌は肺炎、チフス、下痢および結核のような疾患を引き起こす。そのような疾患に対抗するために、例えばアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アモキシシリン、アンホテリシンＢ、アンピシリン、アトバクオン、アジトロマイシン、セファゾリン、セフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）、セホタキシム、セホテタン、セフポドキシム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアクソン、セフロキシム、セファレキシン、クロラムフェニコール、クロトリマゾール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、ラクトビオン酸エリスロマイシン、イミペネム、イゾニアジド、カナマイシン、リネゾリド、メトロニダゾール、ナフシリン、ニトロフラントイン、ナイスタチン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリン、リファンピシン、チカルシリン、トリメトプリムおよびバンコマイシンなどの抗生物質が開発されている。
【０００３】
これらの物質は病原細菌に対して有効であり、したがって、細菌の存在に伴う病態の治療に有用であるが、臨床的に重要な細菌株の多くは公知抗生物質に耐性になりつつある。例えば、細胞壁活性化剤、アミノグリコシド、ペニシリン、アンピシリンおよびバンコマイシンを含む多種多様な抗微生物薬に耐性であるエンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）が認められている。院内環境において最も一般的な原因感染因子であるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は公知抗生物質の多くに耐性であり、そのような感染症の治療を困難にしている。抗生物質の性質および抗生物質耐性の発生の更なる説明はＷａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０６：７７５−７８１に記載されている。したがって、院内環境および社会環境の両方における耐性株の出現に対抗するために、新規な作用メカニズムを有し、したがって、臨床において予め選ばれた耐性を獲得する可能性の低い新規な抗細菌剤を見出すことが依然として必要とされている。特定の作用メカニズムおよび細菌細胞壁透過性を有する新規な抗細菌剤を同定するための信頼しうるハイスループット法を開発することが同時に必要とされている。
【０００４】
公衆衛生上重大な脅威となる真菌の病原株には、クリプトコッカス属真菌種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属真菌種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属真菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒストプラスマ属真菌種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、コクシディオイデス属真菌種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、パラコクシディオイデス属真菌種（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ブラストミセス属真菌種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、フザリウム属真菌種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、スポロトリックス属真菌種（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．）、トリコスポロン属真菌種（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．）、セドスポリウム属真菌種（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾプス属真菌種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードアレシェリア属真菌種（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、皮膚糸状菌、ペシリオミセス属真菌種（Ｐａｅｃｉｌｉｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アルテルナリア属真菌種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）、クルブラリア属真菌種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）、エキソフィアラ属真菌種（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｓｐｐ．）、シゾサッカロミセス属真菌種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、ワンギエラ属真菌種（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、デマチアセウス（Ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ）真菌およびニューモシスティス属真菌種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシディオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。これらの真菌に対する現在の療法は、劣悪な活性スペクトルおよび毒性のために不適当である。抗真菌剤に対する耐性は、抗細菌剤で見出されるものほど一般的ではないが、院内で使用される抗真菌剤に対する耐性は増加の一途をたどっている。免疫無防備状態の患者は、既存の抗真菌療法との薬物の相互作用が問題となりうる場合には、真菌感染を特に受けやすい。改善された治療プロフィールを示し新規な作用メカニズムを有する新規な抗真菌剤が必要とされている。
【０００５】
抗細菌剤の発見のための標準的なアプローチは、試験化合物または化合物混合物を細菌細胞にさらし、細胞増殖抑制のレベルを測定することである。増殖抑制または細胞死は、典型的には、１８時間の増殖時間の後に培養の光学密度を測定することにより液体培地内で測定する。試験化合物の増殖抑制は、典型的には、細胞増殖の９９．９％を抑制するのに要した最小阻止濃度（ＭＩＣ）として、あるいは可視増殖が観察されない場合に示される。そのようなアッセイは、例えばＷ．Ｈｅｗｉｔｔ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｓｓａｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７７），ｐｐ．１−２６１に記載されている。液体培養に基づくアッセイを単一濃度の化合物に関して行う場合、それは経済的であり、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）になじみやすく、低レベルの溶媒（例えば、０．２％  ＤＭＳＯ）に可溶性の化合物のスクリーニングに適している。ＨＴＳ液体細胞増殖アッセイの欠点は、水不溶性化合物の測定能が制限されること、化合物の相対効力の測定が難しいこと、一般に公知の抗細菌剤が繰り返し同定される（すなわち、重複率が高い）こと、および強力ではあるが哺乳動物細胞に毒性でもある化合物を同定する傾向にあることである。
【０００６】
細菌増殖インヒビターを見出すための半固形培地アプローチとしては、寒天阻止域アッセイが挙げられ、この場合、ディッシュまたはプレート内の寒天に細菌を含浸させ、該化合物を該プレートに紙ディスク上で又は成型前のウェル内に又は液滴として寒天表面上に適用する。細菌増殖抑制または細胞死は、典型的には、アッセイプレート中の阻止域を測定することにより判定する。通常の寒天アッセイ（あるいは、より一般的には、半固形培地に基づくアッセイ）は、例えばＪ．Ｆ．ＡｃａｒおよびＦ．Ｗ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉａ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ”  ｉｎ：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖ．Ｌｏｒｉａｎ編（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ，１９９６），ｐｐ  １−５１に更に詳しく記載されている。半固形培地に基づくアッセイは固体サンプルおよび新鮮な天然物および天然物の抽出物に良く適している。迅速かつ正確な検出および抑止域の測定が難しいことは、ハイスループットスクリーニングのための半固形培地に基づくアッセイの使用を制限する。これらのスクリーニングのもう１つの問題は、同定される活性剤の作用様式における重複率が高いことであり、例えば、細胞壁成分において作用する化合物が高頻度で見出される。
【０００７】
生化学的なインビトロに基づくアッセイも抗細菌剤の発見に用いられうる。このアプローチの利点は、それが、非常に特異的な（かつ所定の）標的において作用する物質の迅速な同定を可能にすることである。このメカニズムに基づくアプローチの大きな欠点は、強力な生化学的抑制活性を示すものの有効な抗細菌剤に必要な細胞壁透過性を欠く化合物が同定されてしまうことである。
【０００８】
選択的標的スクリーニングのためにスクリーニングにおいて耐性細菌を使用することが可能である。薬物耐性株および薬物感受性株を液体または半固形培地内で試験し、感受性の差を測定することが可能である。このアプローチにおいては、細胞壁を透過しうる抗細菌剤を選択するために、突然変異した標的遺伝子産物を使用する。例えば、アンピシリンと同様に作用する抗生物質をスクリーニングするために、アンピシリン感受性株を耐性株と比較することが可能であり、この場合、該感受性株には影響を及ぼすが該耐性株には影響を及ぼさない任意の化合物を陽性として選び出す。薬物耐性突然変異細菌上での抗細菌剤のスクリーニングは、その遺伝的部位において作用する抗細菌剤の同定を可能にするが、該標的の他の領域において作用する抗細菌剤を見逃してしまうことも多い。一例としては、リボソームに結合してタンパク質合成を抑制することにより作用する抗生物質が挙げられ、この場合、リボソーム結合性薬物との交差耐性は観察されないことが多い。示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）耐性／感受性アッセイは標的遺伝子産物に対してはスクリーニングしないが、選択的突然変異産物に対してはスクリーニングする。液体および寒天アッセイにおいて行う耐性／感受性ペアのスクリーニングは前記と同じ欠点を伴う。
【０００９】
全細胞における抗細菌剤に関する標的選択的スクリーニングの一例はＦｏｒｓｙｔｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，４３：１３８７−１４００に概説されており、これは、スタヒロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の増殖に必要な遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ（以下、ａｓＲＮＡと称する）の発現が標的抗細菌剤に対する感受性を増加させることを開示している。Ｆｏｒｓｙｔｈらに概説されているａｓＲＮＡアッセイは液体培地内で行われ、二重に行う７点力価測定による非感受性化株との比較を要する。液体培地ａｓＲＮＡアッセイの欠点は、それがすべての試験サンプルに関して２つの株の比較を要すること、ハイスループットスクリーニングに適さないこと（力価測定およびばらつきのため）、全用量力価測定においては低い水溶性の化合物の測定が難しいこと、多量のサンプル化合物を要すること、および抽出物または精製された化合物を要することである。
【００１０】
細菌遺伝子の発現を改変することによる感受性化の他の例には、アンチセンスＲＮＡにより生じた条件表現型を使用する決定的に重要なスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）遺伝子の同定に関するＪｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９３：２２６６−２２６９、および抗細菌剤の発見のための株の標的特異的スクリーニングに関するＤｅＶｉｔｏら  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０：４７８−４８３に記載のものが含まれる。
【００１１】
この節における考察のほとんどは抗細菌剤の発見のための公知方法に焦点を合わせたものであるが、抗真菌剤の発見のために同一または類似の方法が用いられており、これらの方法は同一または類似の欠点を伴う。
【００１２】
公知アッセイに伴う欠点を最小限にしたり回避する新規な及び／又は改良された抗微生物スクリーニング法を開発することが必要とされている。特に、ハイスループットに適した、メカニズムに基づく全細胞スクリーニング法が必要とされている。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、既知作用メカニズムを有する増殖抑制物質（例えば、化合物または天然物）、すなわち、細胞の増殖または生残に必要な機能を有する標的細胞の酵素または他の遺伝子産物を抑制あるいは干渉する物質の選択的スクリーニングを可能にする方法である。細胞増殖に関して本発明で用いる「抑制」（または「阻害」）なる語は、細胞（例えば、細菌細胞）の増殖の低下または抑圧を意味する。本発明の方法は、発現されると細胞内の標的遺伝子産物の量を減少させうるＲＮＡ断片（例えば、アンチセンスＲＮＡ）をコードする核酸を含有する組換え細胞を使用する。例えば、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）は、標的遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にハイブリダイズし、それにより該遺伝子産物の発現を妨げうる。細胞内で誘導されるＲＮＡコード化核酸の発現のレベルに応じて、標的遺伝子産物の産生は劇的に減少（すなわち、ダウンレギュレーション）して細胞の増殖停止を引き起こしたり、あるいは、細胞増殖は実質的に影響されないが遺伝子産物に作用する物質に対する細胞の感受性を増強するレベルにまで低下しうる。例えば、標的遺伝子産物が、細胞増殖に必要な酵素である場合には、ａｓＲＮＡの発現は、該酵素を阻害する物質に対して該細胞を予め感受性化（ｐｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）しうる。ある制御可能な条件下では、該細胞は、それがａｓＲＮＡコード化核酸を喪失したり又はａｓＲＮＡを発現する能力を喪失しうる意味で不安定になりうる。ａｓＲＮＡコード化核酸を喪失した又はａｓＲＮＡを発現する能力を喪失した細胞は本発明においては復帰細胞と称される。復帰細胞は、標的遺伝子産物に作用する物質の存在下で増殖しうる。
【００１４】
本発明の方法においては、標的遺伝子産物において作用する物質に対して該組換え細胞を予め感受性化するレベルでＲＮＡ断片の発現が生じる条件下で、試験物質の存在下に栄養培地内で該組換え細胞を増殖させる。また、該ＲＮＡ断片を発現する能力を該細胞の一部が喪失するよう、該増殖条件を制御する。試験物質が、標的遺伝子産物において作用しない増殖インヒビターである場合には、それは、該ＲＮＡ断片を含有する細胞に対して及び該ＲＮＡ断片を欠く細胞（復帰細胞）に対して同等に有効となる。復帰細胞は増殖上の利点を有さず、該細胞の実質的に全てが死滅する。すなわち、増殖は全く生じない。一方、試験物質が標的遺伝子産物に作用する場合には、該ＲＮＡ断片を欠く細胞は、該ＲＮＡ断片を含有する細胞と比較して増殖上の利点を有し、復帰細胞の増殖が生じる。該細胞を増殖させるために使用する栄養培地が半固形栄養培地である場合には、復帰細胞の密度が本質的に非常に低いため（非復帰細胞と比較した場合）、阻止域の選択領域におけるその優先的な増殖は、隔離された個々のコロニーとして見出されうる。これらの復帰コロニーはまた、視覚的検査により検出されるのに十分なほどに大きい。試験物質が増殖インヒビターでない場合には、増殖の抑制は生じない。復帰細胞の出現に関する細胞増殖の分析は、特定の作用様式を有する増殖インヒビターの同定につながる。
【００１５】
より詳しくは、本発明は、ある物質が、細胞の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する細胞増殖インヒビターであるか又はそのような細胞増殖インヒビターを含有するかどうかを試験するための方法である。該方法は、
（Ａ）該遺伝子産物の発現を妨げるＲＮＡ断片を発現しうる組換え細胞を提供し、
（Ｂ）（ｉ）該ＲＮＡ断片の発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下で試験物質の存在下に、栄養培地内で該組換え細胞を増殖させ、
（Ｃ）生じた細胞増殖を分析することを含み、ここで、
（１）該細胞の全て又は実質的に全ての死により細胞増殖が実質的に無い場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有し、
（２）該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により細胞増殖の抑制が実質的に無い場合には、該試験物質は増殖インヒビターではないか又は増殖インヒビターを含有せず、あるいは
（３）該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖と共に、細胞の相当な部分の死により増殖抑制が有る場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有する。
【００１６】
本発明の１つの実施形態は、工程Ａにおいて該細胞により発現されるＲＮＡ断片がアンチセンスＲＮＡを含む前記方法である。この実施形態の１つの態様においては、該アンチセンスＲＮＡは、該細胞内に含有されるプラスミドにコードされる。この実施形態のもう１つの態様においては、該アンチセンスＲＮＡは該細胞のゲノム内のＤＮＡにコードされる。
【００１７】
本発明のもう１つの実施形態は、該方法において使用する細胞が、細菌株および真菌株よりなる群から選ばれる前記方法である。この実施形態の１つの態様においては、該細胞は細菌の株であり、該物質が、該細菌の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有するか、どうかを判定するために該物質を試験する。前記態様の特徴においては、工程Ａにおいて該細菌により発現されうるＲＮＡ断片は、該細菌内に含有されるプラスミドにコードされるアンチセンスＲＮＡを含む。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、該組換え細胞（例えば、細菌細胞）を増殖（工程Ｂ）させる栄養培地は半固形培地（これは本明細書においては半固形増殖培地または半固形栄養培地とも称されうる）、例えば寒天プレート、アガロースプレートまたは任意の固体支持体マトリックスであり、この場合、該半固形培地に試験物質を接種し、該プレート上の細胞増殖のパターンを分析する（工程Ｃ）。該接種部位に増殖阻止域が存在し、該区域内またはその周囲に１以上の視覚的に検出可能な復帰細胞コロニーが存在することは、該試験物質が標的遺伝子産物において作用し、特定の作用様式を有することを示す。一方、該接種部位に細胞非増殖の透明域が存在する（すなわち、検出可能な復帰細胞コロニーが存在しない）ことは、該試験物質が、標的遺伝子産物においては作用しない増殖インヒビターであるか又はそのような増殖インヒビターを含有することを示す。この実施形態の好ましい態様においては、該細胞は細菌細胞である。
【００１９】
本発明の方法は、「背景技術」に記載した公知アッセイ方法の欠点の多くを克服するものである。より詳しくは、本発明は、メカニズムに基づく全細胞スクリーニングであり、それは単一のサンプル点（ｓａｍｐｌｅ  ｐｏｉｎｔ）で行われ、それはサンプルの用量力価測定を必要とせず、それはハイスループットスクリーニングに適し、それは水不溶性化合物を測定することが可能であり、それは一般的に毒性な化合物の同定を排除し、それは迅速なアッセイ解読を有し、それは細胞透過性をアッセイし、それは無傷遺伝子産物に対して直接的スクリーニングを実施し、それは単一の細菌または抗真菌株で単一のアッセイプレート上で実施可能であり、それは微生物源（抽出物および生コロニー）から生じた粗化合物を測定することが可能である。
【００２０】
本発明の種々の他の実施形態、態様および特徴は以下の説明、実施例および添付の特許請求の範囲において更に詳しく説明されるか、あるいはそれらから明らかとなろう。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、物質が、細胞の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する細胞増殖インヒビターであるか又はそのような細胞増殖インヒビターを含有するか、どうかを試験するための方法である。該方法は、該遺伝子産物の発現を妨げるＲＮＡ断片を発現しうる組換え細胞（例えば、細菌細胞または真菌細胞）を使用する。標的遺伝子は、宿主細胞の増殖または生残に必要な遺伝子である。該ＲＮＡ断片は、発現されると標的遺伝子にハイブリダイズし標的遺伝子の発現を妨げて標的遺伝子産物のダウンレギュレーションを引き起こすａｓＲＮＡでありうる。このダウンレギュレーションは今度は、標的遺伝子産物において作用する増殖インヒビター（例えば、抗生物質）に対するアンチセンス発現細胞（例えば、細菌）の感受性の増強を引き起こす。同時に、該細胞は、ある増殖条件下、該ＲＮＡ断片を発現する能力を喪失しうるため、該細胞は該ＲＮＡ断片の発現に関して不安定である。前記のとおり、本発明の方法においては、該ＲＮＡ断片の発現と時間経過に伴ったこの発現能の喪失とを同時に引き起こす条件下で、試験物質の存在下にこれらの細胞を増殖させる。この場合の「喪失」なる語は、該ＲＮＡ断片を発現する能力を細胞が徐々に失うことを意味する。すなわち、工程Ｂにおける細胞の増殖および複製は、時間経過と共に、該ＲＮＡ断片を発現する能力を該細胞の一部が喪失して、これらの細胞が復帰コロニー源となるように起こる。細胞増殖は、標的遺伝子産物において試験物質が作用した場合に増殖上の利点を有する復帰細胞の検出／出現に関して、これらの条件下でモニターする。
【００２２】
該組換え細胞は、適当な誘導物質との接触により、該ＲＮＡ断片を発現するよう誘導されうる。また、該細胞は抗生物質耐性遺伝子を含有することが可能であり、該耐性遺伝子は、該抗生物質での連続的な選択により該細胞のＲＮＡ断片発現能を安定化（維持）する。この場合、（ｉ）該ＲＮＡ断片（例えば、ａｓＲＮＡ）の発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下での増殖は、有効量の該ＲＮＡ断片発現誘導物質の存在下かつ該抗生物質の非存在下での該細胞の増殖を意味する。誘導物質の有効量は、標的遺伝子産物に作用する増殖インヒビターに対して該細胞を感受性化する量を意味する。誘導物質の量が少なすぎると、不十分なＲＮＡ誘導と、それに対応する、選択的インヒビターに対する細胞感受性の喪失とが生じ、この場合、復帰細胞は選択的な増殖上の利点を有さない。誘導物質の量が多すぎると、ａｓＲＮＡの過剰発現が生じ、これは、試験物質の性質には無関係に細胞増殖を完全に停止させる。本発明で使用する誘導物質の有効量は対照の使用により確立することができる。例えば、有効量の誘導物質が本発明の方法において使用されていることの確認として、標的遺伝子産物において選択的に作用することが知られている増殖インヒビターを試験物質の代わりに使用して、試験物質に用いたのと同じ条件下で該細胞を同時に増殖させることが可能である。また、所望により、該細胞を、標的遺伝子産物において選択的に作用しないことが知られている増殖インヒビターと共に増殖させることが可能である。誘導物質が有効量で存在する場合には、該公知の選択的増殖インヒビターでの実施は復帰細胞の増殖を引き起こすが、他方、該公知非選択的インヒビターでの実施は増殖を引き起こさないであろう。該対照が、反対の又は不確定な結果を与える場合には、該試験物質での実施は妥当でないとみなされうる。
【００２３】
該組換え細胞は、通常の微生物学的培地および培養条件（例えば、ＬＢ寒天）を用いて増殖させることが可能であり、そのような条件はＷ．Ｈｅｗｉｔｔ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｓｓａｙ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７７）に記載されている。
【００２４】
本発明は液体培地または半固形培地内で行うことができる。復帰細胞は、液体培地内では、該ＲＮＡ断片の不安定性を利用することにより検出することができる。例えば、ａｓＲＮＡコード化プラスミドを使用する場合には、ａｓＲＮＡコード化核酸によりリプレッサータンパク質が欠失するよう該プラスミドを構築することができる。該細胞は、リプレッサーの調節下にあるレポーター遺伝子をも有しうる。したがって、ａｓＲＮＡコード化核酸を不安定にする条件下（すなわち、該細胞がａｓＲＮＡ含有プラスミドを喪失し及び／又は非機能的部分プラスミドを生じうる条件下）で該細胞を増殖させる場合には、リプレッサーの欠失は該レポーター遺伝子の活性化を招く。該レポーター遺伝子はグリーン蛍光タンパク質であることが可能であり、細胞ゲノム内に組み込まれたり、あるいは細胞内で別のプラスミド（ａｓＲＮＡコード化核酸とは異なるもの）上に担持されうる。生じる復帰コロニーは蛍光性であり、液体培地内で（および半固形培地内でも）検出可能である。このレポーター系は、ａｓＲＮＡコード化核酸が細菌ゲノム内に存在し別のプラスミド内に存在するのではない場合に使用することができる。
【００２５】
本発明の方法は、好ましくは、半固形培地（すなわち、半固形栄養培地）内で行う。したがって、本発明の１つの実施形態は、ある物質が、細胞の増殖もしくは生残に必要な遺伝子産物の機能を選択的に抑制することにより作用する細胞増殖インヒビターであるか又はそのような細胞増殖インヒビターを含有するか、どうかを試験するための方法である。該方法は、
（Ａ）該遺伝子産物の発現を妨げるＲＮＡ断片を発現しうる組換え細胞を提供し、
（Ｂ）（ｉ）該ＲＮＡ断片の発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下で試験物質の存在下に、半固形培地内で該組換え細胞を増殖させ（例えば、該試験物質を接種した培地を使用して行う）、
（Ｃ）生じた細胞増殖を分析することを含み、ここで、
（１）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての死により、実質的に非増殖を示す透明域（例えば、該試験物質接種部位内またはその周囲の透明域）を示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的には抑制しない抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有し、
（２）該半固形培地が、該細胞の全て又は実質的に全ての生残および増殖により、非増殖域を示さない場合には、該試験物質は抗細菌剤ではない又は抗細菌剤を含有せず、あるいは
（３）該半固形培地が非増殖域を示すが、例外として該区域内に該ＲＮＡ断片を発現する能力を有さない復帰細胞の生残および増殖による１以上の小さな細胞コロニーを示す場合には、該試験物質は、該標的遺伝子産物を選択的に抑制する抗細菌剤であるか又はそのような抗細菌剤を含有する。
【００２６】
この実施形態の１つの態様においては、該半固形培地は寒天プレートまたはアガロースプレートである。この実施形態のもう１つの態様においては、工程Ａにおける細胞により発現されるＲＮＡ断片はアンチセンスＲＮＡである。この態様の１つの特徴としては、該アンチセンスＲＮＡは該細胞のゲノム内のＤＮＡにコードされる。この態様のもう１つの特徴としては、該アンチセンスＲＮＡは、該細胞内に含有されるプラスミドにコードされる。該プラスミドは、適当な誘導物質、例えば糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）またはアンヒドロテトラマイシンまたはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）との接触により、ａｓＲＮＡを発現するよう誘導されうる。該プラスミドは更に抗生物質耐性遺伝子を含有することが可能であり、該耐性遺伝子は、該プラスミドが耐性である抗生物質での連続的な選択により該プラスミドが該細胞内に維持されることを可能にする。この場合、（ｉ）ａｓＲＮＡの発現、および該遺伝子産物の合成のダウンレギュレーション、ならびに（ｉｉ）該ＲＮＡ断片を発現する能力の該細胞による喪失を引き起こす条件下での増殖は、有効量の該ａｓＲＮＡ発現誘導物質の存在下かつ該抗生物質の非存在下での該細胞の増殖を意味する。この能力の喪失は、該細胞からの該プラスミドの喪失（すなわち、該細胞は「矯正（ｃｕｒｅｄ）」されている）および／または該プラスミド内での遺伝子再編成によるものでありうる。再編成に対するプラスミドの感受性および不安定性はＮ．Ｃ．  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，“Ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏ−ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ａ．Ｄ．Ｈｅｒｓｈｅｙ編，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）ｐｐ．１７５−１９４およびＥｈｒｌｉｃｈら，Ｇｅｎｅ  １９９３，１３５：１６１−１６６において考察されている。前記のとおり、誘導物質の有効量は、標的遺伝子産物に作用する増殖インヒビターに対して該細胞を感受性化する量を意味する。この場合、誘導物質の量が少なすぎると、不十分なａｓＲＮＡ誘導と、それに対応する、選択的インヒビターに対する細胞感受性の喪失とが生じ、この場合、復帰細胞は選択的な増殖上の利点を有さない。誘導物質の量が多すぎると、ａｓＲＮＡの過剰発現が生じ、これは、試験物質の性質には無関係に細胞増殖を完全に停止させる。試験物質に関して得られた結果の妥当性は、前記のとおりに対照を使用することにより確認することができる。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、前記の態様または特徴の２以上を含む、直前に記載のとおりに半固形培地内で行う方法を含む。アンチセンスＲＮＡをコードする核酸断片は、当業者に公知の方法を用いて該細胞のゲノム内に組み込むことが可能である。選択的インヒビターを検出する能力の喪失（前記のとおり）は、欠失によるａｓＲＮＡコード化核酸の喪失またはゲノムＤＮＡの再編成によるものでありうる。ａｓＲＮＡコード化核酸のゲノムコピーは、前記と同じ誘導メカニズム下にあり、この場合、誘導物質、例えばキシロース、アラビノース、アンヒドロテトラサイクリンまたはＩＰＴＧがａｓＲＮＡの合成を可能にするであろう。ａｓＲＮＡ遺伝子標的において作用する化合物に対する曝露はゲノムからのａｓＲＮＡコード化核酸の選択的欠失を引き起こし、復帰コロニーが増殖する。ゲノムの不安定性のため、ａｓＲＮＡコード化核酸は、高い組換え頻度でＤＮＡ断片においてゲノム内に組み込まれるであろう（例えば、Ｈａｓｈｅｍ，ＶＩら  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ．２００２，２２：３９−４６を参照されたい）。
【００２８】
本発明の方法は、半固形培地を使用することにより最良に実施され、このことは液体培地アッセイより優れた点である。半固形培地アッセイは、広範なサンプル濃度にわたって又は定量不可能な粗サンプル上で行うことが可能であり、このことは、スクリーニングを行う前のサンプルの処理を最小限にし、用量力価測定、時間のかかる抽出物調製および大量の化合物産生生物の前増殖を要しない。液体培地アッセイとは異なり、半固形培地アッセイは高濃度の有機溶媒に適合可能であり、水不溶性化合物のアッセイを可能にする。半固形培地アッセイ法は新鮮な固体サンプル、例えば細菌コロニー、真菌コロニーまたは更には粗土壌サンプルのスクリーニングに適しており、あるいは、容易には複製し得ないサンプルに適している。本発明の場合、半固形培地アッセイはまた、プラスミドまたは宿主細胞ゲノム内にレポーター遺伝子を挿入する必要性を軽減する。陽性体を同定するには、阻止域内の増殖復帰コロニーの迅速な視覚的検出で十分である。
【００２９】
半固形培地により本発明の方法を行うための典型的な手順は以下のとおりである。ブロス（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載のＬＢ培地）または溶媒に懸濁させた適当な用量の該組換え細胞を、該ＲＮＡ断片の発現を誘導するための物質で及び場合によっては他の栄養素（例えば、グルコース）で補足された溶融状態の半固形培地（例えば、溶融寒天）に加える。使用する細胞の添加は、典型的には、半固形培地（例えば、寒天）１ｍＬ当たり１０６〜１０８細胞の範囲となる量で行う（該細胞は、それを液体培養に懸濁させ、該懸濁液の光学密度を例えば６００ｎｍで測定し、該培地から該細胞を分離し、ついで、該半固形培地に加えられた適当な量のブロスまたは溶媒に該細胞を再懸濁させることにより「計数」されうる）。混合後、該溶融混合物をディッシュ内に注ぎ、ついで、所望により、成型鋳型を使用してウェルを培地内に成型処理（ｃａｓｔ）することが可能である。該ディッシュを室温に冷却した後、それぞれ適当な溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解した被検物質のサンプルおよび対照のサンプル（溶液中のこれらの物質の濃度は典型的には約０．００１〜約５ｍｇ／ｍＬである）を（例えば、該溶液約１〜約２００μＬの量で）ウェル内に分注し、該プレートを、該細胞の増殖を可能にするのに十分な時間（例えば、約１２〜約４８時間）にわたり、かつ、ａｓＲＮＡコード化核酸が該細胞内で維持されない条件下（例えば、該細胞が含有する抗生物質耐性遺伝子の対応抗生物質の非存在下）、適当な温度（例えば、約２５〜約４５℃）でインキュベートする。ついで、該試験物質が、標的遺伝子産物において作用する増殖インヒビターである又はそのような増殖インヒビターを含有するかどうかを判定するために、そのインキュベートしたプレートを各試験ウェルの周辺領域内の復帰コロニーの出現に関して視覚的に検査する。
【００３０】
前記の手順は、特定の作用様式を有する増殖インヒビターとして作用する天然物を試験するために修飾することが可能である。該アッセイプレートは、ウェルをプレート内に成型処理しないこと以外は前段落に記載のとおりに調製することができる。液体試験サンプルをアッセイプレート上のウェル内に加える代わりに、微生物が（例えば、土壌サンプルから）増殖した寒天のストリップを寒天アッセイプレートの表面に適用する。該微生物により産生された天然物は該ストリップから該寒天試験プレート内に拡散する。ついで、該試験物質が、標的遺伝子産物において作用する増殖インヒビターである又はそのような増殖インヒビターを含有するかどうかを判定するために、そのインキュベートしたプレートを、各微生物含有試験ストリップの周辺領域内の復帰コロニーの出現に関して視覚的に検査する。
【００３１】
「試験物質」および「物質」なる語は互換的に用いられ、化合物、化合物混合物（すなわち、少なくとも２つの化合物の混合物）、または１以上の化合物を含有する天然物サンプルを意味する。したがって、標的遺伝子産物の選択的インヒビターおよび非選択的インヒビターの組合せが視覚的に観察されうるよう、試験物質の細胞増殖の分析は２以上の増殖インヒビターの抑制活性を利用するものでありうる。本発明の方法は、一般には、選択的増殖インヒビターを同定するために使用する。試験物質が単一の化合物であり、本発明の方法において選択的増殖インヒビターとして同定された（すなわち、本発明の方法の工程Ｃにおける細胞増殖の分析により、該増殖が、復帰細胞の生残および増殖に相当する範疇（３）に当てはまると判定された）場合には、該試験物質は選択的増殖インヒビター「である」。試験物質が化合物混合物（例えば、天然物サンプル）であり、本発明の方法において選択的増殖インヒビターとして同定された（すなわち、本発明の方法の工程Ｃにおける細胞増殖の分析により、該増殖が範疇（３）に当てはまると判定された）場合には、該試験物質は選択的増殖インヒビターを「含有する」。より詳しくは、該試験物質は、選択的増殖インヒビターと非選択的増殖インヒビターとを含む化合物の混合物である場合には、本発明の方法における細胞増殖に関する分析（工程Ｃ）は、非選択的増殖インヒビターののため実質的に細胞増殖を示さず、選択的増殖インヒビターによる標的化遺伝子産物の選択的抑制によりＲＮＡ断片発現能を有さない復帰細胞の生残および増殖を同時に示す。例えば、試験物質が、選択的増殖インヒビターと非選択的増殖インヒビターとを含む化合物混合物であり、前記の半固形栄養培地を使用して本発明の方法を行う場合には、細胞増殖に関する分析（工程Ｃ）は、非選択的増殖インヒビターにより１以上の非増殖域を示し、さらに、復帰細胞の生残および増殖による１以上の小さな細胞コロニー以外には１以上の非増殖域を示す。このタイプの増殖（これは図５に例示されている）は工程Ｃにおける範疇（３）に当てはまり、該試験物質は選択的増殖インヒビターを「含有する」。
【００３２】
本発明の方法において使用する細胞の死に関する「実質的に全て」なる語は、細胞増殖がほとんど又は全く検出され得ないことを意味する。寒天プレートのような半固形培地上の増殖の場合、「実質的に全て」は、細胞増殖が視覚的に認められ得えないこと、例えば、未処理領域と比較して、肉眼では想定増殖域に増殖が認められないことを意味する。液体培地内の増殖の場合、「実質的に全て」は、例えば該培地の光学密度の変化による測定で、少なくとも約９０％、典型的には少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９９％）、好ましくは約９９．９％の細胞増殖抑制が認められることを意味する。
【００３３】
本発明の方法において使用する細胞の死に関する「細胞が実質的に非増殖」なる語は、細胞増殖がほとんど又は全く検出され得ないことを意味する。寒天プレートのような半固形培地上の増殖の場合、「細胞が実質的に非増殖」は、細胞増殖が視覚的に認められ得ないこと、例えば、未処理領域と比較して、肉眼では想定増殖域に増殖が認められないことを意味する。液体培地内の増殖の場合、「細胞が実質的に非増殖」は、例えば該培地の光学密度の変化による測定で、少なくとも約９０％、典型的には少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約９９％）、好ましくは約９９．９％の細胞増殖抑制が認められることを意味する。
【００３４】
本発明での使用に適した細菌は、細胞の増殖または生残に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を妨げるように発現されるＲＮＡ断片をコードする遺伝的要素を含有し、それにより、その遺伝子産物に作用する薬物（抗生物質）のクラスに対して該細菌を感受性にする、当技術分野で公知の任意の組換え細菌でありうる。該細菌は病原細菌でありうる。本発明での使用に適した細菌の典型例としては、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ブルクホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選ばれる細菌株、特に、株ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、スタヒロコッカス・アウレウス（黄色ブドウ球菌）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（大腸菌）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エンテロバクター・クロアケ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、アシネトバクター・ボゥマニイィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびブルクホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）が含まれる。本発明での使用に適した細菌の特定の具体例としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。より特定の具体例としては、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の株、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の生残または増殖に必要な遺伝子に対するキシロース誘導性アンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドを含有するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生残または増殖に必要な遺伝子には、ｆａｂＦ、ｐｈｅＴ、ｍｕｒＡ、ｓｅｃＡ、ｄｎａＣ、ｉｌｅＳ、ｆｔｓＺ、ｓｅｃＩ、ｐｏｌＣ、ｄｎａＥ、ｇｙｒＥ、ｇｙｒＡ、ｍｕｒＢ、ｒｐｌ、ｐａｒＥおよびｐａｒＣよりなる群から選ばれる遺伝子が含まれる。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生残または増殖に必要な遺伝子のサブクラスには、脂肪酸シンターゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、タンパク質セクレターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼまたはリボソーム関連タンパク質を発現するようコードしているものが含まれる。
【００３５】
細菌株の増殖および保存のための方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に開示されている。細菌の株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ．）から入手可能である。
【００３６】
本発明の方法に使用する真菌株は、細胞の増殖または生残に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を妨げるように発現されるＲＮＡ断片をコードする遺伝的要素を含有し、それにより、その遺伝子産物に作用する薬物（抗真菌物質）のクラスに対して該細菌を感受性にする、当技術分野で公知の任意の組換え真菌でありうる。使用しうる適当な真菌株には、クリプトコッカス属真菌種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、カンジダ属真菌種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）、アスペルギルス属真菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヒストプラスマ属真菌種（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．）、コクシディオイデス属真菌種（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、パラコクシディオイデス属真菌種（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、ブラストミセス属真菌種（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、フザリウム属真菌種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、シゾサッカロミセス属真菌種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、スポロトリックス属真菌種（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐ．）、トリコスポロン属真菌種（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．）、セドスポリウム属真菌種（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、リゾプス属真菌種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードアレシェリア属真菌種（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、皮膚糸状菌、ペシリオミセス属真菌種（Ｐａｅｃｉｌｉｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、アルテルナリア属真菌種（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｐｐ．）、クルブラリア属真菌種（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）、エキソフィアラ属真菌種（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ  ｓｐｐ．）、ワンギエラ属真菌種（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、デマチアセウス（Ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ）真菌およびニューモシスティス属真菌種（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシディオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。真菌株はＡＴＣＣから入手可能であり、Ｆ．Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｇ．ＦｉｎｋおよびＪ．Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８１）に記載の方法を用いて増殖させ保存することが可能である。
【００３７】
標的遺伝子産物の発現を妨げるための、本発明の方法において使用するＲＮＡ断片は、アンチセンスＲＮＡでありうる。「アンチセンスＲＮＡ」なる語は、標的一次転写産物またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の全部または一部に相補的であり標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物を意味する。「相補的」および「相補性」なる語は、許容される塩および温度条件下の、塩基対形成によるポリヌクレオチドの結合を意味する。二本鎖ＲＮＡにおける塩基対形成は、水素結合の形成によるアデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）との及びシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との対合関係である。アンチセンスＲＮＡの相補性は特定の遺伝子転写産物の任意の部分によるもの、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列におけるものでありうる。「ＲＮＡ転写産物」なる語は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により生じた産物を意味する。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の相補的コピーである場合には、それは一次転写産物と称されるか、あるいはそれは、一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であることが可能であり、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」は、イントロンを有さず細胞によりタンパク質に翻訳されうるＲＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、従って細胞によりタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物を意味する。
【００３８】
ａｓＲＮＡの遺伝子標的を同定するための方法は当技術分野においてよく知られている。適当な方法はＦｏｒｓｙｔｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，４３：１３８７−１４００；ＤｅＶｉｔｏら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，５：４７８−４８３；およびＪｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９３：２２６６−２２６９に記載されているか、あるいはそれらの教示から適合化されうる。ついで標的遺伝子に対する適当なａｓＲＮＡを、当技術分野においてよく知られている方法により構築することができる。例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のような通常の方法を用いて、ａｓＲＮＡコード化核酸断片を構築することができる。
【００３９】
ついで該ａｓＲＮＡコード化核酸を適当な発現ベクター内に組込み、ついで該発現ベクターを宿主細胞内に形質転換またはトランスフェクトすることができる。「宿主細胞」なる語は、外因性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランスフェクトされた又は形質転換もしくはトランスフェクションされうる原核性または真核性細胞を意味する。本発明の実施において使用されると意図される宿主細胞には、当技術分野においてよく知られた細胞が含まれる。適当な宿主細胞には、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（米国特許第４８８２２７９号、米国特許第４８３７１４８号、米国特許第４９２９５５５号および米国特許第４８５５２３１号を参照されたい）など）、細菌細胞（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））などが含まれる。
【００４０】
「ベクター」なる語は、所望のＤＮＡセグメントが連結している運搬分子を意味する。ベクターは、外来ＤＮＡを宿主細胞内に組込む働きをする。より詳しくは、「ベクター」は、適当な宿主内でＤＮＡの発現を引き起こしうる適当な制御配列に機能しうる形で連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物である。そのような制御配列には、転写を引き起こすプロモーター、そのような転写を制御するための所望により使用されうるオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単なる潜在的ゲノムインサートでありうる。ベクターは、適当な宿主内に形質転換されたら、宿主ゲノムから独立して複製され及び機能することが可能であり、あるいは、場合によっては、ゲノム自体に組込まれうる。プラスミドは、現在最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」なる語は本発明においては互換的に使用されることがある。しかし、本発明は、同等に機能し当技術分野において公知である又は公知となる他の形態のベクターを含むと意図される。例えば、細菌細胞培養発現のための典型的な発現ベクターはｐＥＰＳＡ５に基づく。好ましいベクターのタイプの１つはエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸である。
【００４１】
「発現ベクター」なる語は、特に、異種核酸の発現および／または複製のために細胞内に該異種核酸を運搬するために使用される組換え核酸分子を意味する。発現ベクターは、典型的には、適当な宿主細胞内に導入されると挿入ＤＮＡの発現を引き起こすプラスミドの形態で入手される。発現ベクターは環状または直鎖状であることが可能であり、その中に種々の核酸構築物を組込みうる。しかし、本発明は、同等の機能を果たしうる当技術分野で公知である又は公知となる他の形態の発現ベクターを含むと意図される。
【００４２】
本発明の実施における使用に適した発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞内で複製可能なもの、並びにエピソームとして維持されるもの及び宿主細胞ゲノム内に組込まれるものを包含する。発現ベクターは、典型的には、抗生物質耐性タンパク質をコードする発現カセットなどのような他の機能的に重要な核酸配列を更に含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）原核細胞の形質転換のための典型的な発現ベクターには、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；米国特許第４９５２４９６号を参照されたい）、例えばｐＥＴｌｌａ（これはＴ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有する）およびｐＥＴ１２ａ−ｃ（これはＴ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有する）が含まれる。もう１つのそのようなベクターとしては、ｐＩＮ−ＩＩＩｏｍｐＡ２（Ｄｕｆｆａｕｄら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８７，１５３：４９２−５０７）が挙げられ、これはｌｐｐプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーターオペレーター、ｏｍｐＡ分泌シグナルおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有する。
【００４３】
本発明で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」なる語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための当技術分野で認識されている種々の任意の技術を意味する。核酸構築物（例えば、ａｓＲＮＡコード化核酸）を含有する発現ベクターを宿主細胞内に導入（形質導入）して形質導入組換え細胞（すなわち、組換え異種核酸を含有する細胞）を得るための適当な手段は当技術分野でよく知られている。典型的な技術は、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９，２４４：１２７５−１２８１およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６０：９２６−９３２に記載されている。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０００）ならびに他の実験マニュアルに記載されている。形質導入の典型的な方法には、例えば、ウイルスベクターを使用する感染（例えば、米国特許第４４０５７１２号および第４６５０７６４号を参照されたい）、リン酸カルシウムトランスフェクション（米国特許第４３９９２１６号および第４６３４６６５号）、硫酸デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、米国特許第４３９４４４８号および第４６１９７９４号を参照されたい）、サイトフェクション、粒子ビーズ射撃などが含まれる。異種核酸は、所望により、その染色体外（すなわち、エピソーム）維持を可能にする配列を含んでいてもよく、あるいは異種核酸は、宿主のゲノム内に組込まれる供与核酸でありうる。
【００４４】
本発明において使用するａｓＲＮＡコード化核酸は発現プラスミド内にクローニングされうる。この場合の「クローニング」なる語およびその派生語（例えば、「クローン化」）なる語は、プラスミドベクター内への核酸断片の挿入、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような実験微生物株内へのその生じたクローン化プラスミドの形質転換を意味する。ａｓＲＮＡコード化核酸断片は、例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２）に記載の標準的な方法を用いてプラスミド内にクローニングされうる。ａｓＲＮＡコード化核酸を含有するプラスミドの形質転換は、例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはバクテリオファージ構築物による感染により達成されうる。該プラスミドは、抗生物質での連続的選択により該プラスミドが細胞内に維持されるのを可能にする抗生物質耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子）をも含有しうる。ａｓＲＮＡコード化核酸と抗生物質耐性遺伝子とを含む適当な発現プラスミドには、ｐＥＰＳＡ５が含まれる。また、脂肪酸シンターゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、タンパク質セクレターゼ、ペプチジルトランスフェラーゼ、トランスグリコシラーゼ、トランスペプチダーゼまたはリボソーム関連タンパク質を発現する遺伝子の発現を妨げうるａｓＲＮＡをコードするキシロース誘導性遺伝子を含有するプラスミドも適している。
【００４５】
本発明における使用に適した細菌には、Ｆｏｒｓｙｔｈら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，４３：１３８７−１４００に記載のアンチセンスＲＮＡプラスミド（該ベクターは、ｐＴ５Ｘキシロース誘導性プロモーターを含有するｐＥＰＳＡ５である）を含有する細菌が含まれる。該ベクターは、ｐＣ１９４由来プラスミドｐＲＮ５５４８（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９１，２０４：５８７−６３６）、ならびに低コピー数ｐ１５ａ起点（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９４，１６：９１６−９２３）を含有するＮｏｔＩカセットで置換されるＣｏｌＥ１複製起点を除外したプラスミドｐＬＥＸ５ＢＡ（Ｋｒａｕｓｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７４：３６５−３８０）のマルチクローニング部位、ｒｍＢ  Ｔ１Ｔ２ターミネーターおよびアンピシリン耐性遺伝子から構築される。マルチクローニング部位およびターミネーターの上流には、スタヒロコッカス・キシロシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｉｓ）ＸｙｌＲリプレッサータンパク質のオペレーター配列（Ｓｃｈｎａｐｐｉｎｇｅｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９５，１２９：１２１−１２７）（ｐＥＰＳ５の地図に示されているとおり、その遺伝子も含まれる）の環境下でグラム陽性最適化バクテリオファージＴ５ＰＮ２５プロモーター（ＬｅＧｒｉｃｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０，１８５：２０１−２１４）が存在する。
【００４６】
本発明の方法においては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのアンヒドロテトラサイクリン誘導性プラスミドまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのアラビノース誘導性プラスミドのような他の誘導性プラスミドを使用することが可能である。
【００４７】
本発明における使用に適したアンチセンスＲＮＡをコードする核酸断片は、当業者に公知の方法を用いて細胞のゲノム内に組込むことが可能である。例えば、ａｓＲＮＡコード化核酸の組込みは、Ｎａｓｈ  Ｈ．Ａ．ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編，（１９９６）ｐｐ２３６３−２３７６に記載の、細菌ゲノム内への相同組換えにより達成されうる。ａｓＲＮＡコード化核酸は、標的選択性化合物またはキシロースによる適当な選択下でａｓＲＮＡコード化核酸の効率的な切り出しを可能にする隣接する逆方向反復ＤＮＡ（それぞれ〜２００ｂｐ）と共にゲノム内に配置される（Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．Ｎａｓｈ  Ｈ．Ａ．ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ編，（１９９６）ｐｐ２３３９−２３６２）。細菌ゲノム内でのａｓＲＮＡコード化ＤＮＡの安定維持は、ａｓＲＮＡコード化核酸に隣接した薬物耐性遺伝子（すなわち、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の存在により可能となる。クロラムフェニコール選択の非存在下およびａｓＲＮＡ遺伝子産物を抑制する化合物の存在下で、ａｓＲＮＡコード化核酸のゲノムコピーはゲノムから欠失して復帰コロニーの増殖を引き起こす。
【００４８】
以下の実施例は、本発明およびその実施を例示するためのものに過ぎない。これらの実施例は本発明の範囲または精神を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４９】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＦａｂＦ作用性物質の同定
Ａ部：アッセイプロトコール
キシロース誘導性ｆａｂＦアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドであるＳ１−１９４１（ＷＯ  ００／４４９０６およびＦｏｒｓｙｔｈら，Ｍｏｌｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，４３：１３８７−１４００記載されている）を含有するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコールで補足されたＬＢブロス培地に接種し、振とう（２２５ｒｐｍ）しながら３７℃で一晩増殖させる。ついで該培養を、最終光学密度（λ＝６００ｎｍ）が０．３となるようＬＢ培地内で希釈する。ついで希釈細胞（７５０μＬ）を、キシロース（２３．６ｍＭ）およびグルコース（０．１９ｇ／１００ｍＬ）で補足された溶融ＬＢ寒天培地（３０ｍＬ）に加え、４８℃で平衡化する。該溶融混合物を手短に混合し、ついで無菌使い捨てポリスチレン８６×１２８ｍｍディッシュ（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．２４２８１１）上に注ぎ、ついでＴＳＰ（＝転移性固相スクリーニング系（ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ））成型トレイ（ＮＵＮＣ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４４５４９７）を成型ウェルの上面に配置する。該ディッシュを約１５分間室温に冷却し、ついで、サンプルの分注が可能となるまで４℃でせいぜい２日間保存する。ついで１以上の試験物質（５００μＭ）のサンプル（１０μＬ）および対照のサンプル（それぞれ１００％  ＤＭＳＯに溶解されている）をウェルに分注し、該プレートを３７℃で一晩インキュベートする。ついでそのインキュベートしたプレートを復帰コロニーの出現に関して視覚的に検査して、該試験物質がｆａｂＦタンパク質において作用するかどうかを判定する。
【００５０】
１つの対照は、ｆａｂＦ遺伝子を標的化する抗生物質であり、もう１つの対照は、ｆａｂＦ遺伝子を標的化しない抗生物質である。該ｆａｂＦ標的化対照は阻止域内またはその周囲に復帰コロニーを与え、該非ｆａｂＦ標的化対照は透明な阻止域（すなわち、復帰コロニーを欠いている）を与える。該試験物質の阻止域を該対照のものと比較してｆａｂＦ作用性物質をスクリーニングする。該プレートが適当な対照阻止域を示さない（すなわち、キシロースの用量が高すぎるため及び／又はインキュベーション時間が長すぎるため、該プレートが該アッセイプレート全体にわたり雑多なコロニーを示す）場合には、該プレートはスクリーニングに適当ではなく、廃棄する。
【００５１】
Ｂ部：アッセイ結果
Ａ部に記載のアッセイプロトコールを用いて、チオテトラマイシンがｆａｂＦ作用性抗細菌剤であるかどうかを試験した。１００％  ＤＭＳＯに溶解したチオテトラマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）のサンプル１０μＬを該プレートのウェルの１つに注いだ。また、１００％  ＤＭＳＯ中のセルレニン（２０μｇ／ｍＬ）のサンプル１０μＬおよび水中のカナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）のサンプル１０μＬを、それぞれ、対照として２つのウェルに注いだ。Ａ部に記載のとおりのインキュベーションの後、該プレートを細菌増殖域に関して視覚的に検査した。図１に示すとおり、チオテトラマイシンは、増殖阻止域内およびその周囲に小さな白色の増殖フォーカスとして出現する復帰コロニーの増殖を引き起こした。図２に示すとおり、ｆａｂＦ遺伝子を標的化する抗生物質であるセルレニンも、増殖阻止域内およびその周辺に復帰コロニーの増殖を引き起こした。一方、図３に示すとおり、ｆａｂＦ遺伝子を標的化しない抗生物質であるカナマイシンは透明の非増殖域を示し、復帰コロニーの出現を示さなかった。結果は、試験物質チオテトラマイシンが、ｆａｂＦタンパク質を選択的に標的化する抗細菌剤であることを示している。
【実施例２】
【００５２】
天然物からのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＦａｂＦ作用性物質の同定
物質を産生する微生物を以下のとおりに調製した。未同定微生物を含有する土壌サンプルを無菌水に懸濁させ、該懸濁液を、ＩＳＰ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ／Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｎｃ．）を含有する培養ディッシュの表面に適用した。表面乾燥後、可視増殖が得られるまで該ディッシュを２７℃で２〜７日間インキュベートした。微生物を含有する寒天のストリップを切断し、該ディッシュから取り出して、後記のとおりに調製したアッセイプレート上に適用した。あるいは、これらの微生物の有機溶媒（アセトン）抽出物を調製し、該溶媒を粗抽出物から蒸発させ、１００％  ＤＭＳＯに再懸濁させた。
【００５３】
寒天内でウェルを成型処理しないこと以外は実施例１に記載のとおりに、Ｓ１−１９４１を含有するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞を培養し、アッセイプレートを調製した。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）含有寒天プレートの固化の後、増殖微生物を含有する新鮮な寒天ストリップを該アッセイプレートの表面上にスポットし、ついで該プレートを３０℃で２４時間インキュベートした。粗抽出物を試験する場合には、該アッセイ法は実施例１に記載のとおりである（すなわち、サンプルを成型前ウェルに分注した）。
【００５４】
図４は、代表的なアッセイプレートのインキュベート後の表面を示す。図４Ａは幾つかの帯状域（ストリップ）を示し、ここで、中央のストリップは、矢印で示されている透明な非増殖域を有する。これは、中央ストリップの微生物の少なくとも１つが、ｆａｂＦを標的化しない抗細菌産物を産生することを示している。図４Ｂは、単一のストリップの拡大図であり、これは、非増殖域（矢印で示されている）内および／またはその周囲に小さな白色の増殖フォーカスとして出現している復帰コロニー以外は該非増殖域により包囲されている。したがって、４Ｂのストリップにおける微生物の少なくとも１つはｆａｂＦ特異的抗細菌剤を産生する。
【００５５】
図５は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための明らかでない前記粗抽出物を含有する成型前ウェルの周囲の増殖阻止域を示す。該区域は、視覚的に認められない細菌増殖の中心域の周囲に幾つかの視覚的に認められうる復帰細菌コロニーを有する。この場合、該透明域は、ｆａｂＦを選択的に抑制しない増殖インヒビターを含有し、復帰コロニーを含有する周辺域は、ｆａｂＦを選択的に抑制する増殖インヒビターを含有する。
【実施例３】
【００５６】
グリーン蛍光タンパク質を使用する液体形式でのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＦａｂＦ作用性物質の同定
以下の方法により液体培養内でｆａｂＦアンチセンス復帰体を同定するためにグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子を使用した。アンチセンスｆａｂＦ  ＤＮＡをコードするプラスミドを含有するスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を使用して、ｆａｂＦアンチセンス含有プラスミドＤＮＡが欠失または再編成されるまでＧＦＰ遺伝子が転写的にサイレントである誘導性ＧＦＰレポーター系を開発した。ｆａｂＦアンチセンスベクター（Ｆｏｒｓｙｔｈら，２００２）と、該ｆａｂＦアンチセンスＤＮＡの下流に挿入されたテトラサイクリンリプレッサー遺伝子およびそのプロモーター（Ｇｅｉｓｓｅｎｄｏｒｆｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９０，３３：６５７−６６３）とからなるプラスミドｐＭ３１０を構築した。ＥｃｏＲＩおよびＡａｔＩＩ制限部位を介してスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ベクターｐＵＢ１１０（ＡＴＣＣ  ３７０１５）に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターｐＵＣ１９（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）よりなる第２のプラスミドｐＭ３０２を構築した。ｐＵＣ１９マルチクローニング部位において、ＧＦＰ遺伝子をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限部位内に挿入し、テトラサイクリンオペレーター含有プロモーター（Ｇｅｉｓｓｅｎｄｏｒｆｅｒら，１９９０）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位内にクローニングした。プラスミドｐＭ３０１およびｐＭ３０２の両方を含有しクロラムフェニコールおよびカナマイシンに耐性であるスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ＳａｆａｂＦ／ＧＦＰを構築した。ＳａｆａｂＦ／ＧＦＰは、セルレニンに対する感受性の増強をもたらすキシロース誘導に感受性であった。セルレニンの存在下では、該アンチセンスベクターを欠失しており、この欠失と共にテトラサイクリンリプレッサー遺伝子を喪失した耐性復帰体が選択されることになる。テトラサイクリンリプレッサーはＧＦＰ転写を抑制するため、テトラサイクリンリプレッサーの喪失はＧＦＰの転写および緑色細胞の産生を引き起こす。復帰体は、細胞数に対する蛍光測定値の関数として測定されうる。
【００５７】
ｆａｂＦ復帰体を定量的に測定するために、種々の濃度の試験化合物セルレニン、チオストレプトンおよびアンピシリンと共に種々の濃度のキシロースを試験する液体アッセイを開発した。ＳａｆａｂＦ／ＧＦＰの２０時間の培養をＬＢ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃２４４６２０）、カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）中で成長させ、１ｃｍキュベット中で０．０３のＯＤ  Ａ６００に調節した。９６ウェルプレートを使用して、３７℃で１６時間のインキュベーション後、該培養の成長および最終吸光度を測定した。１００μｌの２×混合物（２００μｇ／ｍｌ  カナマイシン、０．４％  グルコース、０．４％  ＤＭＳＯ、２×ｍＭ  キシロースおよび２×濃度の試験化合物）を含有する各ウェル内に、１００μｌの該調節培養を加えて２００μｌの最終容量とした。最終吸光度を５９０ｎｍで測定し（Ａ５９０）、ＧＦＰの蛍光を、Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓを使用して４８５ｎｍの波長での励起および５３５ｎｍの発光波長（Ｅ５３５）により測定した。
【００５８】
ｆａｂＦ選択的インヒビターであるセルレニン存在下での特異的ＧＦＰ応答を検出するために、各薬物処理および各キシロース処理ごとに相対蛍光指数（ＲＦＩ）を求めた。ＲＦＩは、各薬物試験群内のキシロース非存在下での対照細胞に関して求められた対応比に対して正規化されたＥ５３５／Ａ５９０比と定義される。例えば、１５μｇ／ｍｌ  セルレニン処理では、０、７および１４ｍＭ  キシロースで処理された細胞に関してＥ５３５／Ａ５９０比を求め、それぞれに関する比を、キシロース非存在下での処理細胞からのＥ５３５／Ａ５９０比で割り算した。結果を図６Ａに示す。この場合、ＳａｆａｂＦ／ＧＦＰ細胞を、ｆａｂＦインヒビターであるセルレニンで処理した。２つの非特異的抗生物質アンピシリンおよびチオストレプトンでの該細胞の処理に関する同様の結果を、それぞれ図６Ｂおよび６Ｃに示す。キシロース非存在下での処理細胞において１６時間のインキュベーション時間中に約５０％の増殖抑制をもたらす薬物濃度を選択した。明らかに、セルレニンの各濃度について、キシロース濃度の増加と共にＲＦＩが増加し、１４ｍＭ  キシロースおよび１５μｇ／ｍｌ  セルレニンにおいて９倍の最大変化が認められた。非ｆａｂＦ抗生物質チオストレプトンおよびアンピシリンではＲＦＩの増加は認められなかった。セルレニン処理細胞のＲＦＩにおける選択的増加は、液体培養内で選択的ｆａｂＦ薬物を検出するためにＧＦＰ測定値が使用可能であることを示している。
【００５９】
前記の説明は本発明の原理を教示しており、実施例は例示目的で記載されており、本発明の実施は、特許請求の範囲の範囲内に含まれる通常の変更、適合化および／または修飾のすべてを含む。
【００６０】
本出願の全体にわたり、本発明に関連した最新技術をより完全に説明するために種々の刊行物が言及されている。これらの参考文献の開示の全体を本明細書中に参考として援用する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための実施例１に記載のアッセイで得られたアッセイプレート上での試験物質チオテトラマイシンに関する増殖阻止域を示す。該区域は幾つかの視覚的に認められうる復帰細菌コロニーを有する。
【図２】スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための実施例１に記載のアッセイで得られたアッセイプレート上でのセルレニン対照に関する増殖阻止域を示す。図１における試験物質と同様に、該区域は幾つかの視覚的に認められうる復帰細菌コロニーを有する。
【図３】スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための実施例１に記載のアッセイで得られたアッセイプレート上でのカナマイシン対照に関する増殖阻止域を示す。該区域は、視覚的に認められうる細菌増殖を示していない。
【図４】土壌サンプルから分離された未同定微生物からのスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための実施例２に記載のストリップ（ｓｔｒｉｐ）アッセイで得られたアッセイプレートの切片を示す。
【図５】スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるｆａｂＦ作用性物質を同定するための実施例２に記載のアッセイで得られた抗微生物物質産生性土壌微生物を含有する明らかでない抽出物に関する増殖阻止域を示す。該区域は、視覚的に認められない細菌増殖の中心域の周囲に幾つかの視覚的に認められうる復帰細菌コロニーを有する。
【図６】実施例３に記載の液体に基づくアッセイにおける種々の濃度のｆａｂＦ作用性物質および非ｆａｂＦ作用性物質による処理に応答したキシロース誘導性スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＳａｆａｂＦ／ＧＦＰ株に関する相対蛍光指数のプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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