(57)【要約】本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する単離されたポリペプチドおよびそれをコードする核酸に関する。本発明はまた、本発明に従う核酸を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明に従うポリペプチドを製造する方法および使用する方法に関する。本発明はまた、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを単離する方法、上記ポリペプチドをコードする核酸を単離する方法およびα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを含む微生物を単離する方法に関する。本発明はまた、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを含む新規微生物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ配列ID : NO. 2で表されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも約35%、好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約50%、さらにより好ましくは少なくとも約55%、特に少なくとも約65%、より特に少なくとも約75%、さらにより特に少なくとも約85%、さらにより特に少なくとも約90%、さらにより特に少なくとも約95%、最も特に少なくとも約97%である単離されたポリペプチド。
【請求項２】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ配列ID : NO. 9で表されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、特に少なくとも約90%、より特に少なくとも約95%、最も特に少なくとも約97%である単離されたポリペプチド。
【請求項３】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下で、より好ましくは高いストリンジェンシー条件下で、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列ID : NO. 1もしくはその相補鎖と、または配列ID: NO. 8もしくはその相補鎖とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項４】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ配列ID : NO. 2 または配列ID : NO. 9に従うアミノ酸配列の断片に対する抗体との免疫学的交差反応性を示す単離されたポリペプチド。
【請求項５】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する、少なくとも100のアミノ酸、好ましくは125〜350のアミノ酸、より好ましくは200〜300のアミノ酸の単離されたポリペプチドまたはその断片。
【請求項６】
１以上のマーカーポリペプチドをコードする１以上の核酸配列に作動可能に連結された、請求項１〜５の何れか１項記載のポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって得られる単離された融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項記載のポリペプチドまたは請求項６記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項７記載の核酸配列または請求項８記載のベクターを含みかつ発現する宿主細胞。
【請求項１０】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物を単離する方法において、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養する工程、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験する工程、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１１記載の方法によって得られ得る微生物。
【請求項１２】
ＮＣＩＭＢ４１１２７の番号で寄託されたアグロバクテリウム  リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）Ｎａ、ＮＣＩＭＢ４１１２８の番号で寄託されたアグロバクテリウム  リゾゲネスＢｉ、ＮＣＩＭＢ４１１２６の番号で寄託されたアースロバクター  ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）、およびＮＣＩＭＢ４１１２９の番号で寄託されたオクロバクトラム  アントロピ（Ochrobactrum anthropi）１Ａ。
【請求項１３】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を単離する方法において、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養する工程、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験する工程、
ｃ）得られた微生物から自体公知の方法で核酸配列を単離する工程、
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法によって得られ得る核酸配列。
【請求項１５】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法において、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養する工程、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験する工程、
ｃ）得られた微生物から核酸配列を自体公知の方法で単離する工程、
ｄ）上記核酸配列を適する宿主において発現させてα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを製造する工程、
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法によって得られ得る、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜６および１６の何れか１項記載のポリペプチドの存在下、または請求項９記載の宿主細胞の存在下、または請求項１１もしくは１２記載の微生物の存在下でラセミ化が行われる、エナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化法。
【請求項１８】
エナンチオ選択的アミダーゼの存在下、および請求項１〜６および１６の何れか１項記載のポリペプチドの存在下または請求項９記載の宿主細胞の存在下または請求項１１もしくは１２記載の微生物の存在下で行われる、対応するＤ−およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの混合物からエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸を製造する方法または対応するＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸を製造する方法または対応するＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する単離されたポリペプチドおよびそれをコードする核酸に関する。本発明はまた、本発明に従う核酸を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明に従うポリペプチドを製造する方法および使用する方法に関する。本発明はまた、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを単離するための、それをコードする核酸を単離するための、およびα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを含む微生物を単離するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドは容易に入手できる化合物であり、薬剤のおよびα−Ｈ−α−アミノ酸の製造における重要な前駆体である。例えば、ランダムに選択されたエナンチオマー過剰（ｅｅ）を有するＤ−およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの混合物から、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのエナンチオマーの１つをエナンチオ選択的酵素的加水分解することによって、エナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸が得られ得る。そのようなエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸の製造法では、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの同時ラセミ化が非常に有利である。なぜならば、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドを所望の光学活性α−Ｈ−α−アミノ酸へ完全に転化することが可能であるからである。また、他のプロセスでは、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化がしばしば望ましい。酵素的ラセミ化は化学的ラセミ化より好ましいので（温和な反応条件、環境上の利点など）、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する微生物を同定するためおよびα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドおよびこの活性をコードする遺伝子を単離するために多くの試みがなされている。
【０００３】
本発明の目的のために、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性は、エナンチオマーに富む、式１に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化を触媒する能力として定義される。
【０００４】
【化１】
2005529611.tif 000002
【０００５】
ここで、Ｒ1は１〜２０の炭素原子の所望により置換されたアルキルまたは３〜２０の炭素原子の所望により置換された（ヘテロ）アリールであり（炭素原子数は置換基の炭素原子を含む）、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は各々独立して、Ｈまたは所望により置換された１〜２０の炭素原子のアルキルまたは３〜２０の炭素原子の所望により置換された（ヘテロ）アリールであり（炭素原子数は置換基の炭素原子を含む）、Ｒ1はそれらが結合している炭素および／または窒素原子と一緒にＲ2と環を形成してもよくおよび／またはＲ3はそれらが結合している炭素および／または窒素原子と一緒にＲ4と環を形成してもよい。各環は好ましくは５〜８員環である。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4は各々独立して、１〜１０の炭素原子のアルキルまたは３〜１０の炭素原子の（ヘテロ）アリールである（炭素原子数は置換基の炭素原子を含む）。アルキルまたは（ヘテロ）アリール上の置換基は、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、チオアルキル、アルキル、カルボキシ、アミノ、イミノ、ニトロ、ハロゲン、カルバモイル、シアノ、アシル、パーオキシ、スルホまたはホスホの群から選択され得る。式１に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドの例は、プロリンアミド、ロイシンアミド、グルタミン酸アミド、フェニルアラニンアミド、ｔ−ロイシンアミド、メチオニンアミド、トリプトファンアミド、ロイシル−グリシン、バリル−グリシン、バリル−アラニン、ロイシル−アラニンである。
【０００６】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼは、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。
【０００７】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミド以外の化合物に作用するラセマーゼのラセミ化活性を決定するために使用される方法に類似した方法によって検出され得る。そのような方法は、当業者に公知である。例えば、Ｌ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドまたはＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのエナンチオマー過剰の減少を測定することによって、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性が決定され得る。
【０００８】
Fukumaurら、1977, Agric. Biol. Chem., vol.41, p1509-1510には、アクロモバクター  オバエ（Achromobacter obae）から単離されたα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼが開示されている。この酵素をコードする核酸配列およびこの酵素のアミノ酸配列がNaokoら、1987, Biochemistry of vitamin B6, p449-452に発表された。その酵素活性に関して、アクロモバクター  オバエから単離されたα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼは、ピリドキサール−５−ホスフェートを補因子として必要とする（Ahmedら、1983, Agric. Biol. Chem., vol47, p1887-1893）。
【０００９】
アクロモバクター  オバエから単離されたα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼは、α−アミノ−ε−カプロラクタムのラセミ化を排他的に触媒することが知られている。アクロモバクター  オバエからのα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼは、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して、下記基質、すなわち式１に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドである、Ｌ−トリプトファンアミド、Ｌ−ロイシンアミド、Ｌ−ロイシル−グリシン、Ｌ−バリル−グリシン、Ｌ−バリル−Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニンを用いて試験されたが、過剰量の酵素が使用されたときですらα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性は認められなかった（Ahmedら、1983, Agric. Biol. Chem., vol47, p1887-1893）。
【００１０】
欧州特許出願公開第３８３４０３号は、クレブシエラ（Klebsiella）属および関連する属におけるα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を開示し、欧州特許第３７８５９２号は、アースロバクター（Arthrobacter）ｓｐ．ＡＴＣＣ３１６５２（ＤＳＭ４６３９）およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）ｓｐ．ＡＴＣＣ３１６６２（ＤＳＭ４６４０）におけるα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を開示している。しかし、これらの文献に開示された微生物を使用してラセミ化を検出することはできなかった。したがって、上記欧州特許出願公開第３８３４０３号および欧州特許第３７８５９２号は公知文献として考えられるべきでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを見つけるべく多くの研究がなされているが、今までα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼは開示されていない。
【００１２】
本発明はそのようなα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを今提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
出願人は驚いたことに、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物を単離するのに適する方法をも見出した。上記方法では、微生物含有サンプルが、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として使用することによって豊富化され、そしてこうして認められた培養物がα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
そのような方法を行うための適する方法は、例えば以下の通りである。この方法は、以降、豊富化法（enrichment）と呼ばれる。本発明に従うポリペプチドを見出すために、微生物含有サンプル、例えば、環境サンプル、例えば土壌サンプルまたは廃水サンプルが、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で増殖が検出され得るまで培養される。
【００１５】
サンプルは、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として有する適する増殖培地上に／中に直接添加され得る。サンプルを上記培地へ、例えばサンプルの洗浄に使用された洗浄溶液の濾液を添加することにより適用する他の方法もある。
【００１６】
Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で環境サンプルを培養することはいわゆる豊富化である。これは、Fukumuraら、1977, Agric. Biol. Chem., vol41, p1321-1325に記載されており、この豊富化をα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼの単離法において使用している。好ましくは、豊富化は、培養された微生物を、モノ培養物（混合培養物に対する用語）に達するまで、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を唯一の窒素源として含む「新鮮な」適する増殖培地中または上に１回以上継代することによって続けられる。典型的には、これは、４または５回の継代後であろう。
【００１７】
Ｄ−またはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物以外の窒素源を添加することは、例えば培養物が増殖し始めるのを助けるために有用であり得る。しかし、良好な豊富化のために、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物が、Ｄ−および／またはＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを転化する能力を有する微生物は増殖し続け得るが他の微生物はそうでないような量で存在する。
【００１８】
当業者は、培養条件をどのように選択するかを知っており、例えば、培養条件は、環境サンプルの源および／または所望プロセスの所望条件に依存し得る。
【００１９】
豊富化によって得られた微生物は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験される。このα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関する試験は、培養された微生物をプレーティングした後に得られたコロニーの全細胞に対してまたは浸透細胞に対して直接行われ得る。あるいは、得られたコロニーが、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中で別個に培養され、その後、無細胞抽出物がそこから作製され、それが次いで、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験される。
【００２０】
無細胞抽出物は当業者に公知の標準的方法に従って、例えば超音波処理、フレンチプレスなどによって、作製され得る。細胞浸透は、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば少量のトルエンの添加によって得られ得る。適する増殖培地は、実際には、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む全ての培地である。適する増殖培地は当業者に周知である。それらは、例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の指針を用いて当業者によって構成され得る。
【００２１】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関する試験は、好ましくはモノ培養物に対して行われるが、混合培養物に対して行うこともできる。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様では、豊富化法の後に得られた混合および／またはモノ培養物が、一窒素源としてまたは唯一の窒素源としてＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを使用する能力およびＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを使用する能力に関して試験される。
【００２３】
したがって、本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物を単離する方法にも関し、これは、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養すること、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験すること、
を含む。
【００２４】
驚いたことに、豊富化法が、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物の単離に適することが見出された。これは、この豊富化がα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼ活性に関して選択し、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関してではないので、より驚くべきことである。したがって、本発明は、上記方法によって得られ得る、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する新規微生物（ポリペプチドを含む）にも関する。
【００２５】
こうしていくつかの微生物が単離され得る。例えば、次の属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、オクロバクトラム（Ochrobactrum）、アースロバクター（Arthrobacter）、ミクロコッカス（Micrococcus）、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、ルブロバクター（Rubrobacter）、ノカルディオイデス（Nocardioides）、テラバクター（Terrabacter）属の微生物を単離することができる。
【００２６】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物の菌株のいくつかのモノ培養物が豊富化法によって単離され、そして、これらの微生物が、ブダペスト条約下で２００２年５月８日にThe National Collections of Industrial and Marine Bateria Limited（ＮＣＩＭＢ）（スコットランド、アバディーン）に寄託された。アグロバクテリウム  リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）ＮａがＮＣＩＭＢ４１１２７の番号で寄託され、アグロバクテリウム  リゾゲネスＢｉがＮＣＩＭＢ４１１２８の番号で寄託され、アースロバクター  ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）がＮＣＩＭＢ４１１２６の番号で寄託され、オクロバクトラム  アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）１ＡがＮＣＩＭＢ４１１２９の番号で寄託された。
【００２７】
豊富化法を用いて得られた、単離された微生物から、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を単離することおよびこの核酸をクローン化し発現させて本発明に従うポリペプチドを作ることが可能である。核酸配列の単離および続くその再クローン化および発現は、当業者に公知の標準方法に従ってなされ得る。
【００２８】
したがって、本発明はまた、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を単離する方法に関し、上記方法は、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養すること、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験すること、
ｃ）α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをコードする核酸配列を、得られた微生物から、自体公知の方法で単離すること、
を含む。
【００２９】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する微生物から単離することは、例えば、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する微生物からDNAライブラリー、cDNA ライブラリーまたは発現ライブラリーを作製することによって、またはα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドの（部分）精製および続く逆向き遺伝学によって、または核酸アレイ（array）を使用することによって行われ得る。これらの技術は全て当業者に公知である。例えば、DNA またはcDNAライブラリーを作製した後、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、相同遺伝子の配列情報またはα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドの配列情報に基づくプローブまたはPCRプライマーを使用することによって選択され得る。例えば、発現ライブラリーの作製後、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するライブラリーのクローンが、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性アッセイを使用して、本発明の豊富化法を使用して、またはα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドに対する抗体を使用して選択され得る。例えば逆向き遺伝学は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドの（一部の）精製および配列決定、およびα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドの配列情報に基づく、例えばプローブまたはPCRプライマーを用いての所望の核酸の単離によって行われ得る。例えばDNAアレイは、微生物がα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示さない条件下での微生物の発現パターンを、微生物がα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す条件下でのものと比較することによってα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する微生物のゲノム配列が知られるならば、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を誘導するために使用され得る。
【００３０】
本発明の一実施態様では、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性をコードする核酸配列が以下のようにして単離される。
【００３１】
第１の工程では、豊富化法によって得られた微生物から全ＤＮＡが単離され、遺伝子ライブラリーが作製され、そして適する宿主中で適するベクターにおいて発現される（例えば、実施例に記載されている）。第２の工程で、インサート（インサートは、微生物から単離されたＤＮＡ片である）を有するベクターを含む遺伝子ライブライーのクローンが、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化を触媒する能力に関して試験される。例えば、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関するクローンの試験は、実施例に記載された方法にしたがって行われ得る。
【００３２】
続く工程で、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化を触媒する能力を有するクローンにおけるベクターのインサートの核酸配列が決定され、こうして決定された核酸配列からオープンリーディングフレームが同定され、その後、オープンリーディングフレームが、適するベクター中および適する宿主中で再クローン化されそして発現され、そしてα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して再び試験される。適するベクター中、適する宿主中でのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性をコードするオープンリーディングフレームの発現によって、本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドが製造され得る。
【００３３】
豊富化法および続く核酸配列の単離によって、NCIMBにNCIMB 41129の番号で寄託されたオクロバクトラム  アントロピ（Ochrobactrum anthropi）1Aとして識別される菌株からの、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをコードする核酸配列が得られた。この核酸配列は、配列 ID : NO. 1で表される。対応するポリペプチドのアミノ酸配列は配列ID : NO. 2で表される。そのアミノ酸配列が配列ID : NO. 2で表される上記α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼは広いｐＨおよび温度範囲にわたって活性であることが分かった。この豊富化法により、NCIMBにNCIMB 41126 の番号で寄託されたアースロバクター  ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）として識別される菌株からの、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをコードする核酸配列も同定された（配列ID : NO. 8）。対応するポリペプチドのアミノ酸配列は配列ID : NO. 9で表される。
【００３４】
本発明は、上記方法によって得られ得る、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列にも関する。
【００３５】
本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、例えば配列ID : NO. 1または配列ID : NO. 8の配列を有する核酸配列は、標準の分子生物学技術および本明細書中に与えられた配列情報を使用して単離することもできる。例えば、配列ID : NO. 1または配列ID : NO. 8の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本発明に従う核酸配列を、標準のハイブリダイゼーションおよびクローン化法（例えば、Sambrook, J. , Fritsh, E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載）を使用して単離され得る。
【００３６】
さらに、配列ID : NO. 1または配列ID : NO. 8の全部または一部を包含する核酸配列は、夫々配列ID : NO. 1 もしくは配列ID : NO. 2または配列ID : NO. 8 もしくは配列ID : NO. 9に含まれる配列情報に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
【００３７】
本発明の核酸配列は、例えば鋳型としてのゲノムDNA、cDNA またはmRNAおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準の(RT)−PCR増幅技術に従って増幅され得る。そうして増幅された核酸は、適するベクター中でクローン化され、そしてDNA配列分析によって解析され得る。
【００３８】
さらに、本発明に従う核酸配列に対応するまたはハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準合成法によって、例えば自動化DNA合成機を使用して、作製され得る。
【００３９】
なお、本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の突然変異体をも包含し、上記突然変異体は、天然に存在する宿主から単離された対応するポリペプチドと比較して１以上の突然変異を有する。突然変異を生じさせる方法は、当業者に公知であり、例えば、ランダム突然変異誘発（例えば、誤りがちな（error prone）ＰＣＲ またはＵＶ放射による）、部位特異的突然変異誘発などによる。
【００４０】
また、本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを製造する方法に関し、上記方法は、
ａ）Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムまたはＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの混合物を一窒素源としてまたは唯一の窒素源として含む適する増殖培地中または上で微生物含有サンプルを１以上の継代工程において培養すること、
ｂ）こうして得られた微生物をα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験すること，
ｃ）α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをコードする核酸配列を、得られた微生物から、自体公知の方法で単離すること、
ｄ）上記核酸配列を適する宿主において発現させてα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドを製造すること、
を含む。
【００４１】
本発明に従うポリペプチドをコードする核酸配列を発現させることは、例えば、核酸を適するベクター中でクローン化し、そして適する宿主に導入した後、当業者に公知（例えば、Sambrook, J. , Fritsh, E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載）の標準のクローン化および発現方法にしたがって上記配列を（過）発現させて本発明に従うポリペプチドを製造することによって行われ得る。したがって、本発明は、本発明に従う核酸配列を含むベクターにも関する。
【００４２】
あるいは、本発明に従うポリペプチドを製造するために、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸配列が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そして（過）発現され得る。これは、当業者に公知の方法にしたがって行われ得る。したがって、本発明は、本発明に従う核酸配列を含みそして発現する宿主細胞、好ましくは、本発明に従う核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００４３】
あるいは、本発明に従うポリペプチドは、その天然の宿主において過発現され得、それは例えば、適するプロモーターを本発明に従う核酸配列の上流に置くことによって、本発明に従う核酸配列の１以上のコピーをその天然宿主のゲノムに組み込むことによって、好ましくは本発明に従う核酸をその天然宿主において適するベクターにおいて発現させることによって（これらは全て当業者に公知の方法である）行われ得る。
【００４４】
適する宿主は、クローン化および発現のために通常使用される宿主であり、当業者に公知である。適する大腸菌（E. coli）宿主菌株の例は、TOP10F'、TOP10、DH10B、DH5α、HB101、 W3110、BL21(DE3) および BL21(DE3)pLysSである。
【００４５】
適するベクターは、クローン化および発現のために通常使用されるベクターであり、当業者に公知である。大腸菌（E. coli）での発現に適するベクターの例は、例えば、Makrides, S. C. , 1996, Microbiological Reviews, p. 512-538の表１に示されている。好ましくは、上記ベクターが、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むクローン化部位の上流にプロモーターを含み、上記プロモーターは、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する対応するポリペプチドを発現するために宿主が増殖された後にスイッチオンされ得る。 スイッチオンおよびオフされ得るプロモーターは当業者に公知であり、例えば、lac プロモーター、araBAD プロモーター、T7プロモーター、trcプロモーター、tac プロモーター、trpプロモーターおよびaroHプロモーターである。
【００４６】
本発明はしたがって、上記方法によって得られ得る、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様では、本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ配列ID : NO. 2で表されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも約35%、好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約50%、さらにより好ましくは少なくとも約55%、特に少なくとも約65%、より特に少なくとも約75%、さらにより特に少なくとも約85%、さらにより特に少なくとも約90%、さらにより特に少なくとも約95%、最も特に少なくとも約97%である単離されたポリペプチドに関する。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性 を有し、かつ配列ID : NO. 9 で表されるアミノ酸配列との同一性が少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約80%、特に少なくとも約90%、より特に少なくとも約95%、最も特に少なくとも約97%である単離されたポリペプチドに関する。
【００４９】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性は、同一性表および次の配列パラメータ（ミスマッチ ＝−３、ペナルティ＝−３、ギャップイクステンド（gap extend）＝１、マッチボーナス＝１、ギャップｘ−ドロフ（droff）＝５０、イクスペクト（expect）＝１０、ワードサイズ（wordsize）＝３）を用いてブラストペアワイズ配列アルゴリズム（blastp pairwise alignment algorithm）（NCBI）によって決定される。
【００５０】
本発明はまた、低いストリンジェンシー条件下、好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは高いストリンジェンシー条件下、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列ID : NO. 1のコード配列もしくはその相補鎖または配列ID:NO. 8のコード配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズする核酸配列によってコードされる、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００５１】
ハイブリダイゼーション実験は、当業者によく利用され得る種々の方法によって行われ得る。これらの種々の方法の間でなされる選択のための一般的なガイドラインは、例えばSambrook, J. , Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual、 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年の第９章に見い出され得る。
【００５２】
ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、実際のハイブリダイゼーション工程および洗浄工程から成るハイブリダイゼーションが行われるところの条件を意味する。洗浄工程は、例えばニトロセルロース膜上に固定化された標的核酸とハイブリダイズしない核酸を除去するために使用される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、例えば、洗浄溶液の塩濃度を変えることによっておよび／または洗浄工程が行われる温度（洗浄温度）を変えることによって変えられ得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄溶液の塩濃度を低くすることによってまたは洗浄温度を上げることによって高まる。この適用のために、ハイブリダイゼーションは、約４５℃で約１２時間、６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で行われる。1 X SSC、0.1 % SDS中で５０℃での２つの連続する３０分間の洗浄工程が低いストリンジェンシーの例であり、５５℃の場合が中程度のストリンジェンシーの例であり、６０℃の場合が高いストリンジェンシーの例であり、６５℃の場合が非常に高いストリンジェンシーの例である。
【００５３】
本発明はまた、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有し、かつ配列ID : NO. 2または配列ID : NO. 9に従うアミノ酸配列のフラグメントに対する抗体との免疫学的交差反応を示す、単離されたポリペプチドに関する。
【００５４】
免疫学的交差反応は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する本発明に従う単離されたポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに対する（すなわち、それと反応する）抗体を使用してアッセイされ得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、従来公知の方法、例えばHudson ら、Practical Immunology、第３版(1989)、Blackwell Scientific Publicationsに記載されている方法によって生成され得る。免疫学的交差反応は、従来公知のアッセイを使用して決定され得、その例はウエスタンブロット法であり、これは例えばHudsonら、Practical Immunology、第３版(1989)、Blackwell Scientific Publicationsに記載されている。
【００５５】
本発明はまた、少なくとも100のアミノ酸、好ましくは125〜350のアミノ酸、より好ましくは200〜300のアミノ酸の、本発明に従いかつα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドの断片に関する。
【００５６】
本発明はまた、マーカーポリペプチドをコードする１以上の核酸配列に作動可能に連結された、本発明に従うポリペプチドをコードする核酸配列の発現によって得られる融合タンパク質に関する。「作動可能に連結された」は、発現されると、本発明に従うポリペプチドがそのＮ−および／またはＣ−末端にマーカーポリペプチドを有して製造されるように上記核酸配列が連結されることを意味する。マーカーポリペプチドは、多くの目的のために使用され得る。例えばそれは、融合タンパク質の安定性または溶解性を高めるために使用され得、または融合タンパク質を細胞内の特定のコンパートメントに向けるシグナルであるところの分泌シグナルとして使用され得、または融合タンパク質の精製を促進するために使用され得る。融合タンパク質の精製を促進するために使用されるマーカーポリペプチドの例は、ヘキサヒスチジンペプチドである。ヘキサヒスチジンタグを有する融合タンパク質の精製は、例えば、Gentz ら、1989年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、vol. 86、p. 821-824に記載されている。ヘキサヒスチジンタグを有する融合タンパク質は例えば、pQEベクター（Qiagen社）において、上記供給者のプロトコルにしたがって製造され得る。
【００５７】
本発明はまた、本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に関する。このような核酸配列は、上記したように、豊富化法および続く所望の核酸の単離によって得られ得る。
【００５８】
本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼおよびα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物は、エナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化法において使用され得る。したがって、本発明は、エナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ化法に関し、上記ラセミ化は、本発明に従うポリペプチドまたは本発明に従う微生物の存在下で行われる。
【００５９】
本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼは、Ｄ−およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの混合物からのエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法においてエナンチオ選択的アミダーゼと共に適切に使用され得る。そのような方法におけるα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの使用は、（理論的には）α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの、対応するエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸への１００％転化（１００％収率）をもたらす。本発明はしたがって、Ｄ−およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの混合物からのエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法において本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをエナンチオ選択的アミダーゼと組み合わせて使用する方法にも関する。本発明はまた、対応するＤ−およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドの混合物からのエナンチオマーに富むα−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法、または対応するＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドからのＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸の製造法に関し、ここで、上記方法は、エナンチオ選択的アミダーゼおよび本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有するポリペプチドまたは本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を示す微生物の存在下で行われる。
【００６０】
好ましくは、上記方法において、エナンチオ選択的アミダーゼが、少なくとも90%のエナンチオ選択性、より好ましくは少なくとも95%のエナンチオ選択性、さらにより好ましくは少なくとも98%のエナンチオ選択性、最も好ましくは少なくとも99% のエナンチオ選択性を有する。本発明に関して、アミダーゼ（例えば、Ｄ−アミダーゼ）の９０％エナンチオ選択性は、アミダーゼが、α−Ｈ−α−アミノ酸アミド混合物の５０％総転化率において、ＤＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドのラセミ混合物をα−アミノ酸の１つのエナンチオマー（例えば、Ｄ−α−Ｈ−α−アミノ酸）の９０％およびα−Ｈ−α−アミノ酸の他方のエナンチオマー（例えば、Ｌ−α−Ｈ−α−アミノ酸）の１０％に転化する能力として定義される。９５％エナンチオ選択性（例えば、９５％のＤ−および５％のＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸）は、５８．４のＥ値（ｅ．ｅ．９０％）に対応し、９８％エナンチオ選択性（例えば、９８％のＤ−および２％のＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸）は、１９３．６のＥ値（ｅ．ｅ．９６％）に対応する。９９％エナンチオ選択性（例えば、９９％のＤ−および１％のＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸）は、４５８．２のＥ値（ｅ．ｅ．９８％）に対応する。
【００６１】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して、補因子、例えばピリドキサール−５−ホスフェートを添加することが有利である場合があり得る。
【００６２】
好ましくは、上記方法において、本発明に従うα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼが、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性、すなわちＤ−α−Ｈ−α−アミノ酸およびＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸のラセミ化を触媒する能力、を示さない。
【００６３】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００６４】
一般手順
標準的分子クローニング技術、例えばプラスミドDNA単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素的制限変性、大腸菌形質転換などが、Sambrook ら、1989年、"Molecular Cloning : a laboratory manual"、Cold spring Harbor Laboratories、Cold Spring Harbor、NYまたは供給者のマニュアルに記載されているように行われた。標準的分子クローニング酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNAリガーゼなどは、特に断らない限り、Invitrogen (オランダ国ブレダ)から得られた。合成オリゴデオキシヌクレオチドは、Sigma-Genosys (英国ケンブリッジ)およびInvitrogen (英国スコットランド、ペーズリー)から得られた。DNA配列分析は、色素ラベルされたジデオキシターミネーターを用いる連鎖停止法を使用してBaseClear (オランダ国ライデン)によって行われた。
【実施例１】
【００６５】
豊富化法
この豊富化法では、−８０℃で貯蔵された種々の土壌およびスラッジサンプルが、ラセミ化ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム（２ｇ／リットル）を唯一の窒素源として含む５０ｍｌの液体培地Ａ（酵母炭素ベース (Difco、11.7g/リットル)、KH2PO4 (6.7g/リットル)、K2HPO4 (8. 9 g/リットル)、pH 7.0）に直接接種するために使用された。フラスコ毎に、１スパチュラの接種物を使用した。種々のフラスコを28℃および200 rpmでインキュベートした。
【００６６】
約２日後、良好な増殖が全フラスコにおいて認められた。全培養物における土壌粒子の沈降後、２ｇ／リットルのＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを含む培地Ａ中における1:1,500 希釈物を調製し、28℃および200 rpmでインキュベートした。十分な増殖を得た後、各フラスコからサンプルを採取し、培養基中のＬ−およびＤ−の両方のα−アミノ−ε−カプロラクタムの濃度を決定した。これらのサンプルを遠心分離し、0.45 μＭフィルターによって上清を濾過して全ての細胞を除去した。次いで、これらのサンプルをHPLCによって分析した。このHPLC では、両方のα−アミノ−ε−カプロラクタムエナンチオマーの分離のためのキラル試薬として、o-フタルアルデヒドをD-3-メルカプト-2-メチルプロピオン酸と組み合わせて使用した (Duchateau ら、1992年、J.Chromatogr.、vol. 623、p 237-245)。
【００６７】
α−アミノ−ε−カプロラクタムの両方のエナンチオマーを使用した培養物が増殖したフラスコのみを次の工程のために選択した。これらの培養物の種々の希釈物を、２ｇ／リットルのＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを唯一の窒素源として含む培地Ａを有するプレートにプレーティングし、28℃でインキュベートした。コロニーをランダムに選択し、同じ型の選択的プレート上に再単離してモノ培養物を得た。次いで、各モノ培養物のコロニーを、２ｇ／リットルのＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを含む５ｍｌの培地Ａに移した。28℃および200 rpmで３日間インキュベートした後、得られた培養物を、Ｄ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの使用に関して上記した通りに分析した。Ｄ−およびＬ−の両α−アミノ−ε−カプロラクタムを使用することができたモノ培養物を20%(v/v) グリセロール中で-80℃で貯蔵した。
【００６８】
最後に、これらのモノ培養物からの細胞をα−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼ活性に関して試験した。ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム（２ｇ／リットル）を含む培地Ａ中で28℃および200 rpm で３日間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって取得し、20 mMのHEPES-NaOH 緩衝液(pH 7.7)で洗浄し、そして凍結乾燥した。
【００６９】
次いで、各モノ培養物からのこれら凍結乾燥された細胞１００ｍｇを、10 mMのHEPES-NaOH 緩衝液(pH 7.7)、トルエン(2.5体積%)、ピリドキサール-5-ホスフェート(20μＭ)およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム(2.5 m%)から成る反応混合物に添加した。負の対照として、化学ブランク（凍結乾燥された細胞を含まないアッセイ混合物）を使用した。全ての反応混合物（ブランクを含む）を40℃で約72時間インキュベートした後、 9体積の 1 M H3PO4の添加によって反応を停止した。0.45 μＭのフィルターによる濾過によって細胞を除去した後、これらの反応混合物を上記HPLC法によって分析してＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの濃度を決定した。最後に、Ｌ−α−アミノ−ε−カプロラクタム基質からＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを生成したモノ培養物を菌株決定のためにNCIMBへ送った。化学ブランクでは、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムは決定され得なかったことに注意。 
【００７０】
菌株の決定
Ｌ−α−アミノ−ε−カプロラクタムをラセミ化することができたこうして得られたモノ培養物の１つがNCIMBによってオクロバクトラム  アントロピ（Ochrobactrum anthropi）菌株として同定され、ブタペスト条約に基づいてオクロバクトラム  アントロピ（Ochrobactrum anthropi）1A としてNCIMBにNCIMB 41129の番号で寄託された。決定の結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
2005529611.tif 000003
2005529611.tif 000004
【００７２】
凍結乾燥されたオクロバクトラム  アントロピ 1A細胞のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性の測定
O．アントロピ（0. anthropi）1A細胞を、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム（２ｇ／リットル）を唯一の窒素源として含む培地Ａ中で培養した。28 ℃および200 rpm で３日間インキュベートした後（OD620 nm = 4.7）、細胞を遠心分離によって取得し、20 mMのHEPES-NaOH 緩衝液（pH 7.7）で洗浄し、そして凍結乾燥した。
【００７３】
凍結乾燥した細胞を使用してα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を実証した。アッセイ混合物は、トルエン(2.5 v/v %)を含む10 mMのHEPES-NaOH緩衝液(pH 7.7) 、ピリドキサール−５−ホスフェート (20μM)、D-または L-ロイシンアミド (2.5 m%)およびいくつかの場合にはEDTA (20 mM)で構成された。アッセイごとに150 mg の凍結乾燥した細胞が使用された。化学ブランク（O．アントロピ1A細胞を含まないアッセイ混合物を有する）が負の対照として使用された。全ての混合物（ブランクを含む）を40℃で約72時間インキュベートした後、9 体積の1 MのH3PO4を添加することによって反応を停止した。最後に反応混合物をHPLCによって分析してD-およびL-ロイシンアミドおよびD-および L- ロイシンの濃度を決定した。このHPLCでは、これらのアミノ化合物のエナンチオ分離のためのキラル試薬として、o-フタルアルデヒドをD-3-メルカプト-2-メチルプロピオン酸と組み合わせて使用した (Duchateau ら、 1992年、J. Chromatogr.、vol. 623、p 237-245)。
【００７４】
多くの反応において、O．アントロピ1A細胞中に存在するL-および／または D-特異的アミダーゼを阻害するためにEDTAを添加した。このアミダーゼを阻害することによってL- および／またはD-アミノ酸アミドが対応するアミノ酸へ転化されず、あるいは部分的にも転化されず、それによって、他方のアミノ酸アミドエナンチオマーの検出によってアミノ酸アミドラセマーゼ活性の実証が可能である。EDTAを用いるこれらの反応 (No. 3 および4)は、O．アントロピ1A細胞がα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を含むことを明らかに示した。なぜならばD-ロイシンアミドがL-ロイシンアミドへ、およびその逆へ転化されたからである。化学ブランクはこのラセミ化反応を示さなかった。
【００７５】
EDTAなしでは、アミダーゼが、基質および／または生成物α−Ｈ−α−アミノ酸アミドをα−Ｈ−α−アミノ酸に転化し、それによって、ラセミ化生成物としての他方のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドエナンチオマーの直接の検出を妨害する。しかし、D-ロイシンアミドから出発すると、EDTAなしの反応も、O．アントロピ1A中のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性の存在を明らかに示した。なぜならば、この基質が有意な量のL-ロイシンへ転化されたからである。そして対照実験はD-ロイシンを介するその生成を排除した。なぜならば、O．アントロピ1Aはロイシンをラセミ化しなかったからである。化学ブランクでは、D-ロイシンアミドからのL-ロイシンの生成が検出され得なかった。
【００７６】
【表２】
2005529611.tif 000005
示された濃度は反応混合物中で測定された濃度であり、最初の反応混合物と比較して１０倍に希釈されている。
【実施例２】
【００７７】
豊富化法
種々の場所からの新鮮な土壌サンプル約３０ｇを、唯一の窒素源としての２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムで補充された50mlの培地Aに再懸濁し、4 ℃および200rpmで30分間振とうした。懸濁物をろ紙によってろ過して土壌粒子を除去した。得られた濾液に関して、以下の２つの異なる方法を用いて、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを窒素源として使用し得る菌株を選択した。
・  種々の濾液5 mlを空の100 mlフラスコに移した。全てのフラスコを、OD6oo nmが約 2.5に達するまで28℃および200 rpmでインキュベートした。次いで、培養物を、２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを含む新鮮な培地Aで１：１００に希釈し、その後再び培養工程を行った。これらの希釈および再培養工程をさらに３回繰り返した。次いで、良好な増殖培養物の種々の希釈物を、２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを唯一の窒素源として含む培地Aを有するプレート上にプレーティングし、それを28℃でインキュベートした。コロニーをランダムに選択し、同一の選択プレート上に５回再単離して純粋なモノ培養物を得た。最後に、これらの モノ培養物を-80 ℃で20% (v/v) グリセロール中に貯蔵した。
・  別の豊富化法として、全ての濾液の種々の希釈物を、２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを唯一の窒素源として含む培地A上に直接プレーティングした。28℃で２日間インキュベートした後、最初のコロニーがほとんど全てのプレート上に現れた。さらに数日〜３週間後、多くのモルホロジー的に異なるコロニーが得られた。モルホロジー的に異なるコロニーをランダムに選択し、同一の選択プレート上に５回再単離して純粋なモノ培養物を得た。最後に、これらのモノ培養物を-80 ℃で20% (v/v) グリセロール中に貯蔵した。
【００７８】
これらのモノ培養物からの細胞は、最後に、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験された。２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを含む培地A 800 ml中で28 ℃および200 rpmで培養した後、細胞を遠心分離 (5,000 x g、4℃で20分)することによって取得し、40 mlの超音波処理緩衝液(NaCl、16g/リットル；KCl、0.74 g/リットル；Na2HP04、0.27 g/リットル；グルコース、2 g/リットル；HEPES、10g/lリットル、pH 7.0) に再懸濁した。次いで、MSEのSoniprep 150 を使用し、２０ミクロンの振幅で、１０分のサイクルで、１０秒の時間間隔を使用し（すなわち、１０秒の超音波処理、１０秒の冷却）、氷／アセトン中で冷却しながら超音波処理を行うことによって細胞を破壊した。各サイクル後、細胞を顕微鏡で観察し、細胞の50〜70%が破壊されたときに超音波処理を停止した。
【００７９】
次いで、各モノ培養物の破壊された細胞懸濁物にＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムおよびピリドキサル−５−ホスフェートをそれぞれ５ｇ／リットルおよび０．０１ｍMの濃度まで添加した。20℃および20 rpmで１．５時間インキュベートした後、2 mlのサンプルを1 MのH3PO4の1 ml中に移した。遠心分離および続いて0.22μMのフィルターによるろ過を行うことにより全ての粒子を除去した後、サンプル中のＤ−およびＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムの濃度を、実施例１に記載したプロトコルを使用してHPLCにより決定した。最後に、Ｄ−α−アミノ−ε−カプロラクタム基質からＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを生成したモノ培養物を菌株決定のためにNCIMB へ送った。
【００８０】
菌株の決定
こうして得られたモノ培養物は、NCIMBによって、16S rDNA配列決定により、アグロバクテリウム  リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）Biおよびアグロバクテリウム  リゾゲネスNaおよびアースロバクターニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae） として同定された。この16S rDNA 配列決定の結果を以下に示す。上記微生物は、ブダペスト条約に基づいてNCIMBに寄託された。アグロバクテリウム  リゾゲネスNaはNCIMB 41127の番号で寄託され、アグロバクテリウム  リゾゲネスBiはNCIMB 41128の番号で、アースロバクターニコチアナエはNCIMB 41126の番号で寄託された。
【００８１】
16S rDNA配列の分析
方法
DNA抽出：Prepman精製キットを使用してDNAを抽出し、使用するまで氷上で貯蔵した。
ポリメラーゼ連鎖反応：16SリボソームDNA遺伝子を、普遍的真正細菌プライマーを使用して増幅し、そして 1 %アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。
DNAクリーンアップ：500 bp断片をスピンカラム遠心分離によって精製し、そして滅菌蒸留水に再懸濁した。
DNA塩基配列決定：精製したDNA生成物の塩基配列を、ジデオキシチェインターミネーター法 (Sangerら、 1997)を使用して自動的に決定した。
データベース比較による配列分析：16S rDNA 遺伝子の配列を核酸配列データベースと比較した。
【００８２】
結果
アグロバクテリウム  リゾゲネスNa、NCIMB 41127（配列ID : NO. 5）、アグロバクテリウム  リゾゲネスBi、NCIMB 41128 (配列ID : NO. 4)およびアースロバクターニコチアナエ、NCIMB 41126 (配列ID : NO. 3) の16S rDNA塩基配列を配列リストに示す。
【００８３】
アグロバクテリウム  リゾゲネスNa、アグロバクテリウム  リゾゲネスBiおよびアースロバクターニコチアナエの破壊された細胞のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性の測定
破壊された細胞の作製
これら３つの菌株を、２ｇ／リットルのＤ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを含む培地A中で増殖させた後、遠心分離（12.000 x g）によって細胞を取得した。遠心分離の後、上清をデカンテーションし、ペレットの湿重量を測定した。ペレットに超音波処理緩衝液 (NaCl、16g/ l；KCl、0.74 g/ l；Na2HPO4、0. 27g/ l；グルコース、2g/ l；HEPES、10g/l、pH 7.0) を1:2の比（細胞ペレットの湿重量：緩衝液ml ）で添加した。細胞の取得と超音波処理との間の貯蔵中、ペレットを超音波処理緩衝液中で-86℃で凍結した。
【００８４】
超音波処理は、MSEのSoniprep 150を用いて20ミクロンの最大振幅で１０分の間、１０秒の時間間隔を使用して(すなわち、１０秒の超音波処理、１０秒の冷却)、サンプルを氷／アセトン上で冷却しながら行われた。１０分ごとに細胞を顕微鏡で観察した。細胞の>70%が破壊されたときに超音波処理手順を停止した。
【００８５】
破壊された細胞を用いたα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
３つの菌株の各々の破壊された細胞1 mlを、HEPES-NaOH緩衝液(20 mM)（pH 7.7）中でインキュベートし、これにピリドキサール−５−ホスフェート(0.01 mM) を補因子としておよびD-ロイシンアミド (60.8 mM) を基質として総体積10 ml (0.79 w/w%のD-ロイシンアミド)で添加した。0および139時間後、1 ml のサンプルを採取し（その正確な重量が測定された）、そしてこれらのサンプル中での反応を、1 mlのメタノールを添加することによって停止した（希釈度を計算することができるように、メタノールの正確な重量も測定された。）。停止された反応混合物を遠心分離して粒子を除去した。実施例１に示した方法に従うHPLC分析を行うまで上清を-86℃で凍結した。
【００８６】
同じ方法でブランクの反応混合物を調製し、サンプリングし、停止した。ただし、基質は添加されず、破壊された細胞の代わりにHEPES-NaOH緩衝液 (20 mM、pH 7.7)のみを添加した。
結果を表３に示す。
【００８７】
【表３】
2005529611.tif 000006
【００８８】
表から、D-ロイシンアミドがL-ロイシンに転化されるので、アグロバクテリウム  リゾゲネスNa、アグロバクテリウム  リゾゲネスBiおよびアースロバクターニコチアナエの破壊された細胞にはα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性が存在することが分かる。この転化は化学ブランクでは検出されない。化学ブランクでは、139時間後ですら、D-ロイシンもL-ロイシンも検出され得なかった。D-ロイシンアミド濃度は一定 (0.7 w/w%)であった。これは、D-ロイシンアミドが、適用された反応条件下で非常に安定であることを意味する。
【実施例３】
【００８９】
オクロバクトラム  アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子の単離
発現ライブラリーの構築
単一コロニーを得るために、0.5% (w/v)のＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタムを唯一の窒素源として含む酵母炭素ベースプレート上にＯ．アントロピ1A のグリセロールストックを画線培養し、28℃で培養した。単一のコロニーを150 mlのLB液体培地に移し、激しく振とうしながら0.9 のOD620 nm まで28℃で増殖させた。次いで、細胞を遠心分離によって取得し、-20 ℃で凍結した。
【００９０】
細胞を解凍した後、細菌のためのQiagen Genomic DNA 精製手順に従ってQiagen Genomic-tip100/G先端を使用して全DNAを単離した。標準のQiagenプロトコルに従ったが、以下の改変を伴った。
・  細胞溶解を行うための第一インキュベーション工程を、プロテイナーゼKを用いないで37℃で2時間行い、その後、示唆された量の２倍のプロテイナーゼKを添加し、そして溶液を50℃でさらに2時間インキュベートした。
・  溶解産物をQiagen 先端に適用する前に、遠心分離工程 (10分、5,000 x g、4℃)を適用して粒状物質をペレット化した。
・  150 mlの培養物の細胞からの溶解産物を3 G/100カラムに適用した。
次いで、得られた染色体DNAの50μg を、Sau3A Iを用いてDNA １μgにつき1/12 Uで30分間、部分的に消化した。消化されたDNAの半分を0.6%アガロースゲルにかけ、4〜10 kbの大きさのDNA断片を単離し、20μlの10 mM Tris-HCl（pH 8.0緩衝液）中に再溶解した。
【００９１】
ベクターDNA を、1μg のpZErO-2(Invitrogen、オランダ国グロニンゲン)をBamH Iを用いてInvitrogenのプロトコルにしたがって消化することにより作製した。
【００９２】
直線にされたベクターDNA (50 ng)およびO.アントロピ1A 染色体DNA断片(10μｌ) をT4 DNA リガーゼによって連結した(Invitrogenのプロトコルに従う)。次いで、連結混合物を NaAc/エタノールによって析出させ、そして20μlのTE緩衝液に再懸濁させた。この溶液の1μlを、BioRad遺伝子パルサー(条件：2.5 kV、25μF、100Ω、0.1 cm キュベット、40μl細胞懸濁物)を使用して供給者のプロトコルにしたがってエレクトロコンピテント大腸菌 DH10B細胞(Life Technologies) のエレクトロポレーションを行うために使用した。形質転換体を、50mg/リットルのカナマイシンを有するLB培地上にプレーティングし、28℃で24時間インキュベートした。全部で12,000を超えるコロニーが得られ、これはプライマリー遺伝子ライブラリーを形成した。12, 000のコロニー全てを、50mg/リットルのカナマイシンで補充されたLB培地にプールした。得られた細胞懸濁物の一部を使用して、 QiaPrep法(Qiagen)に従う全プラスミド単離を行った。この「プラスミド形態でのライブラリー」を、更なる使用まで-20℃で貯蔵した。細胞懸濁物の残りの部分に、グリセロールを20% (v/v)の最終濃度まで添加した。得られた懸濁物をプライマリー遺伝子ライブラリーとして-80℃でアリコート中に貯蔵した。
【００９３】
L-アミノペプチダーゼヘルプ溶液の調製
プラスミドpTrcLAPを含む組換え大腸菌菌株から、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼスクリーニング法のためのL-アミノペプチダーゼヘルプ溶液を調製した。大腸菌発現ベクターpTrcLAPは、trcプロモーターの制御下でのシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）ATCC 12633pepA遺伝子を含む。このP. プチダ L-アミノペプチダーゼをコードする遺伝子に関する詳細な情報は、T. Sonke、B. Kaptein、W. H. J. Boesten、Q. B. Broxterman、H. E. Schoemaker、J. Kamphuis、F. Formaggio、C. Toniolo、F. J. T. Rutjes、Stereoselective Biocatalysis (R. N. Patel編)、Dekker、ニューヨーク、2000年、第23-58頁に見ることができる。
【００９４】
大腸菌TOP10/pTrcLAPの新鮮な一晩の培養物を使用して、0.4 mMのIPTGおよび100mg/リットルのアンピシリンを含む200mlのLB培地に接種した。30℃で一晩増殖させた後、細胞を遠心分離によってペレット化し、そして4 ml の50 mM Tris-HCl（pH 7.5）に再懸濁した。フレンチプレス(4 mlのフレンチプレス細胞中で140 Mpaの圧力)による一回の通過によって細胞を破壊した後、固体粒子を遠心分離(45分、40,000 x g、4℃)によって集めた。ペレットを、100 mMのMgS04を含む2 mlのTris-HCl（pH 7.5）に再懸濁した。この懸濁物を4℃で30分間静かに撹拌した。粒子を遠心分離(45分、40,000 x g、4℃)によって除去した後、透明な溶液を、スクリーニングアッセイでの使用のために-20℃でアリコート中に貯蔵した。
【００９５】
スクリーニング
「プラスミド形態でのライブラリー」溶液を水で1,000倍に希釈した。このプラスミド溶液の 1μlを使用してエレクトロコンピテント大腸菌TOP10 細胞(Invitrogen)の形質転換を行い、形質転換体を、50mg/lのカナマイシンを有するLB培地上にプレーティングした。 28〜30℃で２日間インキュベートした後、得られたコロニーは、マイクロタイタープレート中の50mg/lのカナマイシンを含む液体スクリーニング培地(トリプトン16g/l、酵母エキス3 g/l、NaCl 5 g/l、グリセロール2 g/l、pH 7.3) 200μlに移すのに十分大きかった。培養物を28〜30℃で２日間増殖させた。次に、各ウェルの数マイクロリットルを、50mg/lのカナマイシンを有する固体(0.8%寒天)LB培地を含む新しいマイクロタイタープレートに移すことによってマイクロタイタープレートのレプリカを作製した。これらのプレートを28〜30℃で16〜20時間インキュベートし、その後、マスタープレートとして4℃で貯蔵した。細胞懸濁物の残りの部分からの細胞を遠心分離 (10 分、1,500 x g、室温)によって取得し、50 mMのTris-HCl緩衝液（pH 7.5）で２回洗浄し、最後に50μl の50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）に再懸濁した。
【００９６】
50 mMのTris-HCl（pH 7.5）および2 mMのMnCl2中の各々140 mMのD-フェニルアラニンアミド、D-ロイシンアミドおよびD-バリンアミドの混合物を含む50μlの基質溶液を添加することによって スクリーニング反応を開始した。30℃で振とう器上でマイクロタイタープレートを20時間インキュベートした後、2μlのL-アミノペプチダーゼヘルプ溶液 (調製に関しては先の記載を参照)を添加した。30℃でさらに1.5 時間インキュベートした後、100μlの0.15 M HClを添加することによって全ての反応を停止した。
【００９７】
次いで、これらの混合物の7μlを、１ウェルにつき93μlのGDH 試薬を含む新しいマイクロタイタープレートに移すことによって、全反応混合物中のアンモニウム濃度を決定した。このGDH試薬は100mlにつき、150 mMのTris-HCl（pH 8.0）中に43 mgのNADH、116 mgのα-ケトグルタル酸、11.8 mgのADPおよび1200Uのグルタメートデヒドロゲナーゼ (Sigma)を含んでいた。37℃で15分インキュベートした後、各ウェルでのOD340 nmをSpectramax plus マイクロタイタープレートリーダー (Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール)を使用して測定した。以下のクローンを潜在的な正のクローンとみなした。すなわち、このクローンを含むマイクロタイタープレートの平均値より低く、その同じマイクロタイタープレートの標準偏差の３倍低下したOD340 nm を示すクローンを潜在的な正のクローンとみなした。
【００９８】
スクリーニングされた11,272のクローンのうち、32のクローンを潜在的な正のクローンとして識別することができた。
【００９９】
潜在的な正のクローンの確認
スクリーニングで識別された全32の潜在的な正のクローンについて、マスタープレートからの物質を使用して、50mg/lのカナマイシンを含む3 mlの液体スクリーニング培地に接種した。30℃で２日間増殖させた後、これらの細胞培養物の2 mlを遠心分離することによって細胞を集めた。次いで、細胞ペレットを25 mMのTris-HCl緩衝液（pH 7.5）で４回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、50 mMのTris-HCl（pH 7.5）および1 mMのMnCl2中の70 mMのD-フェニルアラニンアミドまたはD-ロイシンアミドまたはD-バリンアミドを含む100μIの基質溶液に再懸濁した。 30℃で20時間インキュベートした後、100μlの0.15 M HClを添加することによって反応を停止し、その後、実施例１に記載されたHPLC法によって反応混合物を分析した。
【０１００】
スクリーニングで識別された32の潜在的な正のクローンのうち、１つはD-ロイシンアミドからのL-ロイシンの有意な生成を示した。このクローンは、その7.7 kbプラスミド上に O. アントロピ1A α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を含んでいた。これは、このプラスミドの大腸菌TOP10細胞への形質転換が、 D-ロイシンアミドをL-ロイシンへ転化する組換え細胞を必ずもたらすという事実から結論された。pOa(1)PLV49B10と命名されたこのプラスミドの塩基配列決定は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示した。この遺伝子の配列は、以下に示す配列ID : NO. 2のタンパク質をコードする配列ID : NO. 1のヌクレオチド98〜1417 (TAA停止コドンを含む) として記載される。
【０１０１】
実施例３A
アースロバクター  ニコチアナエ（Arthrobacter nicotianae）NCIMB 41126からのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子の単離
発現ライブラリーの構築
アースロバクター  ニコチアナエNCIMB 41126のグリセロールストックを、0.2% (w/v) のD−α−アミノ−ε−カプロラクタムを唯一の窒素源として含む酵母炭素ベースのプレート上にプレーティングし、28℃で3〜4日間培養して、所望のサイズの単離されたコロニーを得た。１個のコロニーを50 mlのLB培地に移し、激しく振とうしながら28℃で一晩増殖させた。この増殖期間の最後３０分の間、カルベニシリン(最終濃度200μg/ml)を添加して細胞壁を弱めた。遠心分離によって細胞を取得し、得られたペレットを、50 mMのEDTA を含む5 mlの50 mM Tris-HCl（pH 8.0）に再懸濁した。100μlのリゾチーム (100 mg/ml) および25μlのプロテイナーゼK(20 mg/ml)を添加した後、懸濁物を37℃で30分間インキュベートした。次いで、 6 mlのNuclei Lysis Solution (Promega Corporation、米国マディソン)を添加し、続いて80℃で15分間インキュベートした。最後に、完全な溶菌が得られるまで溶液を65℃でインキュベートした。37℃で30分間Rnase処理（最終濃度4μg/ml） を行った後、2 mlのProtein Precipitation Solution (Promega Corporation、米国マディソン) を添加し、その溶液を20秒間撹拌した後、氷上でインキュベートした。遠心分離 (10分、4,500 x g、4℃)後、上清を、0.1体積のNaAc (3M、pH 5)および2体積の無水エタノールの混合物に移した。析出したゲノムDNAを滅菌ピペットに引っ掛け、 2 mlの10 mM Tris-HCl (pH 8)を有するチューブに移した。ｇDNΑが溶解した後、A260nmおよびA280nm の測定は、約2.3 mgの良好な品質のgDNΑが単離されたことを示した。アガロースゲル電気泳動は、単離されたgDNAがrRNAを含まないことおよびその大きさが15 kbより大きいことを示した。
【０１０２】
50μgのgDNAを、1μgのDNAにつき1/24 UのSau3A I を用いて37 ℃で30分間、部分的に消化した。消化されたDNAの一部を分離用（preparative）0.6%アガロースゲルにかけ、QlAquick 抽出キット (Qiagen)を使用してゲルから4〜10 kbの大きさのDNA断片を単離し、NaAc/エタノール析出によって濃縮し、10μlの10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に再溶解した。
【０１０３】
1μgのpZErO-2 (Invitrogen、オランダ国ブレダ)をBamH Iを用いて供給者のプロトコルにしたがって消化することによりベクターDNAを作製した。
【０１０４】
直線にされたベクターDNA (10 ng)およびA. ニコチアナ NCIMB 41126 gDNA断片(2.5μl) を、16℃で１時間、2.5 UのT4 DNA リガーゼと、10μl の総体積で連結した。次いで、連結混合物をNaAc/エタノールによって析出させ、5μlのTE緩衝液に再懸濁させた。この溶液の2.5μl(約5 ngのベクター)を、BioRad 遺伝子パルサー (条件：2.5 kV、25μF、100Ω、0.1 cm キュベット、40μl細胞懸濁物)を使用して、供給者のプロトコルにしたがって、エレクトロコンピテント大腸菌 DH10B細胞(Life Technologies)のエレクトロポレーションのために使用した。形質転換体を、50mg/lのカナマイシンを有するLB 培地上にプレーティングし、28℃で24時間インキュベートした。全部で約100,000のコロニーが得られ、これは、プライマリー遺伝子ライブラリーを形成した。全100, 000のコロニーが、50mg/lのカナマイシンで補充されたLB 培地中にプールされた。この細胞懸濁物の一部を使用して、QiaPrep法(Qiagen)にしたがって全プラスミド単離を行った。この「プラスミド形態でのライブラリー」を、更なる使用まで-20℃で貯蔵した。細胞懸濁物の残りの一部に、グリセロールを8% (v/v)の最終濃度まで添加した。得られた懸濁物をプライマリー遺伝子ライブラリーとして-80℃でアリコート中に貯蔵した。
【０１０５】
スクリーニング
A. ニコチアナエ NCIMB 41126ライブラリーを、実施例３に示したプロトコルを使用してα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ含有クローンに関してスクリーニングした。ただし、わずかに改変された基質溶液を用いた。このスクリーニングでの基質溶液は、実施例３で言及された全成分のほかに、20μMのピリドキサール−５−ホスフェートをも含んだ。
【０１０６】
全部で10,691 のクローンのA. ニコチアナエNCIMB 41126ライブラリーをスクリーニングした。これらのクローンのうち２個が潜在的な正のクローンとして認識された。
【０１０７】
潜在的な正のクローンの確認
両方の潜在的な正のクローンの確認が、実施例３に示されたプロトコルにしたがって行われた。ただし、使用された３つの基質は全て、10μM のピリドキサール−５−ホスフェートを含んでいた。
【０１０８】
この実験は、両方のクローンが、D-ロイシンアミドをL-ロイシンに、およびD-バリンアミドをL-バリンに有意に転化したことを示した。実施例１に示されるように、これらの転化は、これらのクローンにおけるα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性の存在を示した。再形質転換実験におい手両方のクローンが大腸菌TOP10 細胞に導入され、これは、このα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性が、コードされたプラスミドであることを示した。なぜならば、試験された全ての組換え細胞がD-ロイシンアミドをL-ロイシンに、およびD-バリンアミドをL-バリンに転化したからである。
【０１０９】
両方の正のクローンからのプラスミドを次いで、制限酵素分析に付した。この分析は、両方の組換えプラスミドが、重複するインサートを含むことを示した。したがって、これらプラスミドの１のみ、すなわちpAn(1) PLV36D6が配列決定された。全体の大きさが7.1 kbであるこのプラスミドのヌクレオチド配列の分析は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列を示した。この遺伝子の配列は、以下に示す配列ID : No. 9 のタンパク質をコードする配列ID : No. 8 のヌクレオチド80〜1417 (TGA停止コドンを含む) として記載される。以下に示すように、配列ID : NO. 8のヌクレオチド位置41 (GTG) から出発して活性α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを発現することもできる。
【実施例４】
【０１１０】
プラスミドpKEC-AZARの構築
O. アントロピ1A α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を、PCRを使用して大腸菌発現ベクターpKECaroPにおいてサブクローニングした。発現ベクターpKECaroPは、その構築が国際特許出願公開WO 00/66751に記載されているところの構築物pKECtrpに似ている。ただし、pKECaroPは、pSC101誘導される同等の機能および、trpプロモーターの代わりに大腸菌aroH プロモーターを含む。α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼオープンリーディングフレームが、前進プライマーとして
5'-GCCTCACATATGCAAACACCGCTTTCATTGCG-3' [配列ID : NO. 6] (下線部はNde I切断部位である)、
および復帰プライマーとして
5'-GCCTCACCCGGGTTACCACATCATAAAATGGGCGACATC-3' [配列ID : NO. 7] (下線部はXma I切断部位である)、
および鋳型としてプラスミドpOa(1)PLV49B10を使用して増幅された。このPCRはPCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies) を用いて供給者のプロトコルにしたがって行われ、単一の断片を生じた。増幅された断片の正確な大きさ(1,341 bp)は、アガロースゲル電気泳動によって確認された。 
【０１１１】
増幅された断片をQlAquick PCR精製キット (Qiagen)を用いて精製した後、上記ベクターpCR（商標）4Blunt-TOPO (Invitrogen)中でクローン化した。次いで、クローニング混合物を使用してOne Shot（商標）化学的コンピテント大腸菌TOP10 細胞 (Invitrogen)を形質転換した。形質転換混合物全体を、100μg/mlのカルベニシリンを含むLBプレート上にプレーティングし、次いで28℃で一晩インキュベートすることにより、組換え細胞を選択した。
【０１１２】
100μg/mlのカルベニシリンを含む5mlのLB 培地中の６個のコロニーからの物質を一晩培養した後、QlAprep Spin Miniprep キット(Qiagen)を使用してプラスミドDNAを単離した。制限酵素Nde I およびXma Iによる消化は、これら６個のコロニーのうち５個が所望の組換えベクターを含んでいることを示した。
【０１１３】
５つの正しいクローンのプラスミドDNA をプールし、Nde I およびXmaIを用いて消化を完了した。全消化混合物を分離用1 %アガロースゲルに適用して種々の断片の分離を行った。正しい断片 (1,322 bp) を次いで、QlAquick ゲル抽出キット (Qiagen) によってゲルから単離し、インサート断片としてのさらなる使用まで-20℃で貯蔵した。
【０１１４】
プラスミドpKECaroP をNde IおよびXma Iを用いて消化し、分析用アガロースゲル電気泳動によって示されるように2,850 および3,036 bpの２つの断片を生じた。Nde IおよびXma I 制限酵素の熱不活性化 (20分、65℃)の後、Bsa Iを混合物に添加して、望ましくない2,850 bpの断片を２つのより小さい片に切断した。完全な消化混合物を1 % 分離用アガロースゲルに載せ、次いでQlAquick ゲル抽出キット (Qiagen)を使用して所望の 3,036 bp断片の単離を行い、それを、ベクター断片としてのさらなる使用まで-20℃で貯蔵した。
【０１１５】
ベクターおよびインサート断片をT4 DNA リガーゼを使用して連結し、得られた連結混合物を使用して、One Shot（商標）化学的コンピテント大腸菌TOP10 細胞の形質転換を行った。形質転換混合物を、50μg/mlのカナマイシンを含むLB プレート上にプレーティングし、これを、十分に大きいコロニーが現われるまで28℃でインキュベートした。
【０１１６】
PCR SuperMix (Life Technologies) および上記プライマー ([配列ID : NO. 6]および[配列ID : NO. 7] ) を使用してコロニーPCR を行って正しい組換えベクターを含むコロニーのスクリーニングを行った。１２のPCR陽性からの物質を使用して、50μg/mlのカナマイシンを含む5 mlのLB 培地を有する12のチューブに接種した。QlAprep Spin Miniprep キットを使用してプラスミドDNAを単離した。制限酵素HindIII を用いる消化により、１２のプラスミド全てに関して1,731 および 2,627 bpの２つの断片が得られた。これは、１２のコロニー全てが所望の組換えベクターを含んでいることを示す。
【０１１７】
これら１２の正のクローンのうち５個を、50μg/mlのカナマイシンで補充された25 mlのLB 培地中で培養した。28℃で一晩インキュベートした後、遠心分離によって細胞を取得し、実施例２で使用されたものと同じ超音波緩衝液で洗浄した。細胞ペレットを超音波緩衝液に再懸濁した後（湿重量細胞と超音波緩衝液との比 1: 10）、超音波処理によって細胞を破壊した。遠心分離によって粒子を除去することにより、粗細胞抽出物が得られた。
【０１１８】
５個の得られた粗細胞抽出物を、その0.5 ml を4.5 mlの基質溶液と混合することによってα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性の試験を行った。上記基質溶液は、0.01 mMの ピリドキサール−５−ホスフェートおよび66 mMのD-ロイシンアミドを含む22.2 mMのHEPES-NaOH 緩衝液（pH 7.7）から成る。反応物を室温でインキュベートした。0、18および44時間後にサンプルを採取し、これらを同量の1 M H3PO4 に移して反応を停止した。これらのサンプルを実施例１に示す方法に従ってHPLCによって分析した。
【０１１９】
５個のクローンのうち２つの粗抽出物（大腸菌/pKEC AZAR 3および大腸菌/pKEC AZAR 11と言う）に関しては、0時間サンプルにおけるよりも18および44時間サンプルにおいて有意により多いL-ロイシンおよびL-ロイシンアミドが検出された。最後に、 pKEC AZAR 3およびpKEC AZAR 11のヌクレオチド配列決定が、これら２つの組換えプラスミドにおけるα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子およびフランキングベクター部分の正しいヌクレオチド配列を示した。
【０１２０】
実施例4A
プラスミドpBADAn36D6-DESTの構築
A. ニコチアナエNCIMB 41126 α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を、PCR および GATEWAY クローニング法 (Invitrogen)を使用して、大腸菌発現ベクターpBAD/Myc-His-DEST においてサブクローニングした。最初に、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼオープンリーディングフレームが、前進プライマーとして
2005529611.tif 000007
[配列ID : No. 10] (下線部は Shine-Delgarno 部位であり、イタリック体部分はATG開始コドンであり、二重下線部はattB1部位である)、 
および復帰プライマーとして
2005529611.tif 000008
[配列ID : No. 11] (イタリック体部分は停止コドンであり、二重下線部はattB2 部位である)、
および鋳型としてプラスミド pAn(1) PLV36D6 を使用してPCR増幅された。プラスミド pAn(1) PLV36D6 の同定は実施例3Aに記載されている。Expand High Fidelity ポリメラーゼ (Roche Applied Science、ドイツ国マンハイム)を用いて供給者のプロトコルに従って行われたPCRによって単一の断片が得られた。増幅された断片の正確な大きさ (1,449 bp)はアガロースゲル電気泳動によって確認された。
【０１２１】
増幅された断片をQlAquick ゲル抽出キット (Qiagen)を用いて分離用アガロースゲルから精製した後、その断片をいわゆるBPインビトロ（in-vitro）組換え反応（供給者(Invitrogen)のGATEWAYマニュアルに従って行われる）のための基質として使用した。attB-PCR 断片とpDONR207ドナーベクターとの間の組換えおよびその後の得られた混合物の大腸菌DH5αコンピテント細胞 (Invitrogen) への形質転換の結果、ENTRYクローンpAn36D6-ENTRYが得られた。全形質転換混合物を、7μg/ml のゲンタマイシンを含む2*TYプレート上にプレーティングし、次いで37℃で一晩インキュベートすることによって組換え細胞が選択された。7μg/ml のゲンタマイシンを含む2*TY培地で16 時間培養した後、プラスミドDNAがQlAprep Spin Miniprep キット (Qiagen)を使用していくつかの単一コロニーから単離された。夫々、制限酵素Pvu II、Nsp I (New England Biolabs、ドイツ国フランクフルト) および BssS I (New England Biolabs、ドイツ国フランクフルト)を用いて消化すると、試験された全てのコロニーが所望の組換えベクターを含んでいることが分かった。次いで、これらの正しいクローンのうちの４つattB-PCR インサートが塩基配列決定された。配列決定された４つのpAn36D6-ENTRY プラスミドは全て、配列ID : No. 8および使用された２つのPCRプライマーに基づいて予想される配列を含むことが分かった。
【０１２２】
次いで、PCR断片を含むα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼが、正しいpAn36D6-ENTRY クローンおよびpBAD/Myc-His-DESTのうちの１つを使用していわゆるLR インビトロ（in-vitro）組換え反応によって消化ベクターpBAD/Myc-His-DEST (下記参照) に導入された。この反応も供給者の手順に従って行われた。組換え混合物を使用して、One Shot（商標）化学的コンピテント大腸菌TOP10 細胞 (Invitrogen)を形質転換した。全形質転換混合物を、100μg/ml のアンピシリンを含む2*TY 培地上にプレーティングし、次いで37℃で一晩インキュベートすることによって組換え細胞を選択した。100μg/ml のアンピシリンを含む2*TY 培地中でいくつかのコロニーを一晩培養した後、QlAprep Spin Miniprep キット(Qiagen)を使用してプラスミドDNAを単離した。夫々、制限酵素Acc IおよびRsr II (New England Biolabs、ドイツ国フランクフルト)を用いて消化すると、全てのコロニーが所望の組換えベクターpBADAn36D6-DESTを含むことが分かった。
【０１２３】
大腸菌 TOP10/pBADAn36D6-DEST の単一コロニーを使用して、100μg/ml のカルベニシリンで補充された50 mlの 2 x TY培地 に接種した。28℃で一晩インキュベートした後、この培養物の500μlを使用して、100μg/ml のカルベニシリンおよび0,005 %のアラビノースで補充された500 mlの2*TY 培地 に接種した。28℃で一晩インキュベートした後、遠心分離(15 分、6,200 g、4℃)によって細胞を取得し、20 mMのHEPES-NaOH（pH 7.5）、20μM のピリドキサール−５−ホスフェートおよび1.3 mMのジチオスレイトールを含む溶液で洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝溶液に再懸濁(湿重量細胞と超音波処理緩衝液との比1:3)した後、10秒の時間間隔 (すなわち、10秒の超音波処理および10秒の冷却)および氷／アセトン上での冷却を使用して最大振幅で操作されるMSEのSoniprep 150を用いて10分超音波処理することにより細胞を破壊した。遠心分離によって粒状物を除去することにより粗細胞抽出物を得た。最後に、無細胞抽出物にスクロースを0.25 Mの最終濃度まで添加した。
【０１２４】
細胞抽出物を、その0.5 mlを9.5 mlの基質溶液と混合することによってラセマーゼ活性を試験した。反応物は 37℃でインキュベートされた。サンプルが一定の時間間隔で採取され、それが同体積の1 M H3PO4に移されて反応が停止された。これらのサンプルは実施例１に示した方法に従ってHPLCにより分析された。 
【０１２５】
この実験は、基質が20分以内に完全にラセミ化されたことを示した。したがって、A. ニコチアナエNCIMB 41126 α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼは、配列ID : No. 8に示されるオープンリーディングフレームによってコードされることが結論される。
【０１２６】
実施例4B
GATEWAY DestinationベクターpBAD/MYc-His-DESTの構築
大腸菌におけるA. ニコチアナエ NCIMB 41126からのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子の発現のために使用されるDestinationベクター pBAD/Myc-His-DESTが、市販されている大腸菌発現ベクターpBAD/Myc-HisCにcat/ccdBカセットを導入することによって作製された。cat/ccdBカセットは、前進プライマーとして
2005529611.tif 000009
[配列ID : No. 12] (二重下線部はプロモーター配列であり、下線部はBpi I認識および切断部位であり、イタリック体部分はattR配列である)、 
および復帰プライマーとして
2005529611.tif 000010
[配列ID : No. 13] (下線部はSnaB I 切断部位であり、イタリック体部分はattR配列である)、
および鋳型としてベクター pDEST15(Invitrogen)を使用してPCRにより増幅された。Expand High Fidelity ポリメラーゼ (Roche Applied Science、ドイツ国マンハイム)を用いて供給者のプロトコルに従って行われたPCRによって単一の断片が得られた。増幅された断片の正確な大きさ (1792 bp)はアガロースゲル電気泳動によって確認された。増幅された断片をQlAquick ゲル抽出キット (Qiagen)を用いて分離用アガロースゲルから精製した後、その断片をBpi I (MBI Fermentas、ドイツ国セントレオンロット) (BamH Iに相補的なオーバーハングを生じる)およびSnaB I (New England Biolabs、ドイツ国フランクフルト)を用いて完全に消化し、BamH IおよびSnaB Iで消化された大腸菌発現ベクターpBAD/Myc-HisC(Invitrogen)にT4 DNAリガーゼによって連結した。連結混合物を次いで、化学的にコンピテントな大腸菌DB3. 1細胞 (Invitrogen)を形質転換するために使用した。35μg/mlのクロラムフェニコールを含む2*TYプレート上に全形質転換混合物をプレーティングし、次いで37℃で一晩インキュベートすることにより組換え細胞を選択した。３つの個々のコロニーから組換えプラスミドを単離した後、インサートの塩基配列決定を行った。これらのクローンのうちの１つが所望のインサートを含むことが分かり、これをpBAD/Myc-His-DESTと命名した。プラスミドpBAD/Myc-His-DESTの配列決定された部分のヌクレオチド配列と参照塩基配列(Invitrogen；pDEST15のヌクレオチド配列)との間に７つの省略が認められたが、pBAD/Myc-His- DESTの本質的な特徴(クロラムフェニコール耐性、ccdB 選択およびattR組換え)は全て完全に機能的であった。
【実施例５】
【０１２７】
D-ロイシンアミドを基質として使用し、オクロバクトラム アントロピ（Ochrobactrum anthropi） 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を含む全大腸菌細胞をバイオ触媒として使用するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
細胞の作製
プラスミドpOA (1)PLV49B10を含む大腸菌DH10Bの単一コロニーをカナマイシン(50mg/l)を有するLB培地に移してプレ培養物を調製した。28℃および200 rpmで一晩インキュベートした後、このプレ培養物を使用して、カナマイシン(50mg/l)を含む500 mlの2*TY培地(10 g/lの酵母エキス、16g/l のトリプトン、5g/lのNaCl)を有するフラスコに接種した。28 ℃(OD620nm = 4.4)および200 rpmで一晩増殖させた後、遠心分離 (15分、6,200 x g、4℃)によって細胞を取得し、50 mMのHEPES-NaOH緩衝液（pH 7.7）で洗浄した。
【０１２８】
活性試験において大腸菌宿主−ベクター系のバックグランド活性を決定できるように、突然変異体Green Fluorescent Protein (GFPuv)をコードする遺伝子をインサートとしてベクターのlacプロモーターと反対の方向に有するpZErO-2ベースの構築物を含む大腸菌DH10B 菌株を同じ手法によって培養した(大腸菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation)。この組換え大腸菌の増殖により、3.8のOD620nmを有する一晩培養物が得られた。
【０１２９】
次いで、両方の培養物からの細胞ペレットを洗浄し、25 mlの50 mM HEPES-NaOH緩衝液（pH 7.7）に再懸濁した。両方の細胞懸濁物の2 mlのアリコートをもう一度遠心分離し、ペレットを、下記の活性試験を行うまで-20℃で貯蔵した。これらの細胞懸濁物の残りの部分を、実施例６での使用のために-20℃で貯蔵した。
【０１３０】
D-ロイシンアミドに対するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性
大腸菌/pOA (1)PLV49B10および対照の大腸菌の活性を決定するために、上記細胞ペレットを解凍し、50 mMのHEPES-NaOH緩衝液（pH 7.7）を用いて再懸濁して総体積1 ml にした。次いで、各10 mlの反応混合物を調製した。上記混合物は、50 mMのHEPES-NaOH緩衝液(pH 7.7)、10μMのピリドキサール−５−ホスフェート(PLP)、2.5 wt%のD-ロイシンアミド、適用可能ならば大腸菌アミダーゼ活性を抑制するための20 mMのEDTA、および0.5 mlの大腸菌l pOA (1)PLV49B10 および大腸菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation細胞懸濁物または水（化学ブランク用）を含む。反応は、細胞の添加によって開始された。反応混合物を30℃および175 rpmでインキュベートした。細胞の添加直後(t = 0時間)および27および43 時間後にサンプルを採取し、ここで反応は、遠心分離および続く0.22μMろ過によって細胞を除去することによって停止された。最後に、濾過されたサンプルを、下記のキラルHPLCによって分析するまで-20℃で貯蔵した。
2005529611.tif 000011
この実験の結果を表4に示す。
【０１３１】
【表４】
2005529611.tif 000012
【０１３２】
表４のデータは、大腸菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientationがD-ロイシンアミドを転化することができなかったことを明らかに示す。反応の43時間後ですら、反応混合物は、反応の開始時と同じ量の D-ロイシンアミドを含んでいた。これは、全化学ブランクの場合もそうであった（データ示さず）。
【０１３３】
他方、大腸菌DH10B / pOA (1)PLV49B10細胞の場合には、D-ロイシンアミドの量が時間とともに明らかに減少した。追加のEDTAなしでは、この基質は比較的少量のL-ロイシンアミドおよび多量のL-ロイシンに転化された。追加のEDTAを用いると、はるかに高い濃度のL-ロイシンアミドが得られた。なぜならば、EDTA、キレート化化合物、は大腸菌のアミダ−ゼ活性を部分的に抑制し、それによって、L-ロイシンアミドのL-ロイシンへの転化を低下させるからである。
【０１３４】
この実験で得られた結果は、大腸菌DH10B / pOA (1)PLV49B10 細胞がD-ロイシンアミドに対するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を含むことを示す。さらに、上記結果は、このα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをL-選択的アミダーゼ/アミノペプチダーゼ(例えば大腸菌DH10Bに存在する)と組み合わせることにより、Ｄ−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドがＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸に転化され得ることを示す。
【実施例６】
【０１３５】
DL-ロイシンアミドを基質として使用し、オクロバクトラム アントロピ（Ochrobactrum anthropi） 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を含む全大腸菌細胞をバイオ触媒として使用するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
実施例５（細胞の作製）からの大腸菌DH10B/pOA (1)PLV49B10および大腸菌DH10B/pZErO- GFPuv-wrong-orientation細胞懸濁物を使用した。ラセミ化DLロイシンアミドに対するの活性を決定するために実施例５と同じ反応混合物を調製したが、ただし2.5 wt%のDL−ロイシンアミドを使用し、全ての反応においてEDTAを省き、そして反応を2 mlの細胞懸濁物を用いて開始した。反応開始直後 (t = 0時間)および8および24時間後にサンプルを採取した。
この実験の結果を表５に示す。
【０１３６】
【表５】
2005529611.tif 000013
【０１３７】
表５のデータから、大腸菌ブランク細胞 (大腸菌DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation)は、95%より高いエナンチオマー過剰を伴って L-ロイシンアミドをL-ロイシンに転化することができるのみであることが明らかである。D-ロイシンアミドはそのまま残され、それによって50%の最大収率が得られるに過ぎない。
【０１３８】
α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをコードする遺伝子を含む大腸菌DH10B / pOA (1)PLV49B10 細胞懸濁物の場合には、明らかにL-およびD-ロイシンアミドの両方がL-ロイシンに転化され、50%を超え、最大100%の収率をもたらす。ここでも、得られるL-ロイシンのエナンチオマー過剰は95%より十分上である。
【０１３９】
この実験は、O. アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをL-選択的アミダーゼ/アミノペプチダーゼ(例えば大腸菌DH10Bに存在する)と組み合わせることにより、ＤL−α−Ｈ−α−アミノ酸アミドが50%より高い収率でＬ−α−Ｈ−α−アミノ酸に転化され得ることを示す。
【実施例７】
【０１４０】
大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3からの無細胞抽出物を使用するオクロバクトラム アントロピ（Ochrobactrum anthropi） 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性の決定
無細胞抽出物（cell free extract）の調製
大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3の２つのプレ培養物(実施例4を参照)を、50mg/ lのカナマイシンを含む100 mlの2*TY培地(10g/lの酵母エキス、16 g/lのトリプトン、5g/lのNaCl)を有する２つのエーレンマイヤーフラスコにフラスコ１つにつき10μlのグリセロールストックを接種することによって調製した。28℃および200 rpmで一晩培養した後、プレ培養物をプールし、次いで1リットルの同じ培地を含む２つのエーレンマイヤーフラスコに接種するために使用した。これらのフラスコも、28℃および200 rpmで16〜18時間培養した。遠心分離(15分、6,200 x g、4 ℃)によって細胞を取得し、20 mMのHEPES-NaOH（pH 7.5）で洗浄し、プールし、秤量し、 20 mMのHEPES-NaOH（pH 7.5）、20μMのピリドキサール−５−ホスフェート、および 1.3 mM のジチオスレイトールを含む溶液に、湿重量細胞と溶液との比1:3 で再懸濁した。次いで、10秒の時間間隔 (すなわち、10秒の超音波処理、10秒の冷却)および氷／アセトン中での冷却を使用して最大振幅で操作されるMSEのSoniprep 150を用いて10分超音波処理することにより細胞を破壊した。遠心分離によって粒状物を除去し、その後、無細胞抽出物にスクロースを0.25 Mの最終濃度まで添加した。得られた無細胞抽出物 (CFE)を-20℃でアリコート中に貯蔵した。大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisC (Invitrogen)細胞を全く同じ方法で処理し、負の対照とした。
【０１４１】
基質特異性の決定
多数のエアンチオマー的に純粋なアミノ酸アミドに対する上記CFEのラセマーゼ活性を測定することによって、O. アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性を決定した。10 ml (CFEを含む)の各反応混合物は、50 mMのHEPES-NaOH（pH 8.0）、20μM のピリドキサール−５−ホスフェート、0,4 mg/mlのBSA、1 mMのジチオスレイトール、20 mM のEDTA および75 mMの試験されるアミノ酸アミドの１つを含んでいた。反応は、大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3 または大腸菌TOP10/ pBAD/Myc-HisC (ブランク)の解凍されたCFEの 1 mlを添加することによって開始され、そして 37℃でインキュベートされた。規則的な時間間隔で1 mlのサンプルを採取し、1 ml の1 M H3PO4を含むバイアルに移して反応を停止した。サンプルを0.4 Mのホウ酸塩緩衝液（pH 9.4）で十分希釈した後、得られた混合物をHPLCを使用して分析して２つのアミノ酸および２つのアミノ酸アミドエナンチオマーの正確な濃度を下記方法に従って決定した。
【０１４２】
2005529611.tif 000014
【０１４３】
2005529611.tif 000015
【０１４４】
試験された種々の基質の初期活性を、転化が反応時間に対してプロットされた進捗曲線の直線部分から計算された。進捗曲線の直線部分の使用は、基質濃度がなおも十分高い時点で採取されたサンプルのみが計算に使用されることを確実にした。転化は、ラセマーゼ反応によって形成された（したがって、基質分子と比較して反対の立体化学を有する）アミノ酸およびアミノ酸アミドの量を２つのアミノ酸エナンチオマーおよび２つのアミノ酸アミドエナンチオマーの総量で割ることによって計算された。こうして、計算された転化は、反応混合物中のEDTAによって完全には阻害されないところのアミダーゼ／アミノペプチダーゼによるアミド基質および／または生成物の潜在的な加水分解に関して較正された。
【０１４５】
大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisC のCFEの場合には、使用されたエナンチオマー的に純粋なα−Ｈ−α−アミノ酸アミド基質はいずれもラセミ化されなかった。大腸菌TOP10は、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを明らかに含んでいない。大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3からのCFEを用いたこの実験の結果を表６に示す。
【０１４６】
【表６】
2005529611.tif 000016
【０１４７】
表６の結果は、大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3からのCFE がロイシンアミドのみでなく、他のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドをもラセミ化できることを明らかに示す。この組換え菌株は、O. アントロピ1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ遺伝子を含むので、この広い基質特異性は、この遺伝子によってコードされるラセマーゼにのみ起因し得る。
【実施例８】
【０１４８】
オクロバクトラム アントロピ（Ochrobactrum anthropi） 1Aからの部分的に精製されたα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性の決定
部分的精製
O.アントロピ1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10から部分的に精製した。この精製のために十分な細胞物質を得るために、この組換え菌株を10リットルの規模で醗酵させた。最初に、50mg/l のカナマイシンを含む500 mlの2*TY 培地にこの菌株のグリセルールストック10 μlを接種することによって種培養物を調製した。 28℃および170 rpmで22時間インキュベートした後、2.2のOD620 nmが得られた。 次いで、全種培地を、50mg/l のカナマイシンを含む9リットルの2*TY 培地を含む醗酵器 (タイプISF-200、Infors、スイス国ボットミンゲン（Bottmingen）) に移した。5 NのH3PO4および／または5 N のKOHを添加することによってpHを7.0で制御し、通気（１分につき1〜2リットルの空気）および撹拌速度(250〜750 rpm)の両方を変えることによってp02を手動で調整した。醗酵器を28 ℃で19時間操作し、その結果、5.7 のOD620 nmを有する細胞懸濁物が得られた。遠心分離(15 分、12,000 x g、4℃)によって細胞を取得し、20 mMのHEPES-NaOH（pH 7）で１回洗浄し、-20 ℃で湿細胞ペレット(約125 g)として貯蔵した。
【０１４９】
細胞ペレットを解凍した後、細胞を2.66 mMのMgCl2を含む緩衝液A (20 mMのHEPES-NaOH（pH 7.5）、1.3 mM のジチオスレイトール、20μMのピリドキサール−５−ホスフェート)に再懸濁した。１ｇの湿重量細胞につき、３ｇの緩衝液A が使用された。破壊直前に、ベンゾナーゼ (30 U/1ｇ湿重量細胞、Merck KgaA、ドイツ国ダルムシュタット)を細胞懸濁物に添加した。 1,500 バールの操作圧力でホモジナイザー(Haskel、モデルNJ1600HD15、ドイツ国ヴェーゼル)による１通過（one passage）によって細胞を破壊した。次いで、遠心分離 (30分、34,000 x g、4℃)によって粒子を除去し、得られた無細胞抽出物(CFE)を-20℃でアリコート中に貯蔵した。
【０１５０】
全ての続く精製工程は4℃で行われた。第１精製工程は、40% 飽和での硫安沈殿であった。この工程は、80%飽和(NH4)2SO4溶液を同体積のCFEに滴下することによって行われた。濁った溶液を1.5時間ゆっくり振とうし、その後、沈殿したタンパク質を遠心分離 (30分、15,000 x g)によって集めた。タンパク質ペレットを緩衝液Aに溶解し、次の精製工程で使用した。
【０１５１】
第２精製工程としての陰イオン交換クロマトグラフィーを可能にするために、硫安沈殿後のタンパク質溶液は脱塩されなければならなかった。したがって、20 mMのTris-HCl（pH 8.0）で平衡にされた(PD-10脱塩カラム(Amersham Biosciences、オランダ国ローゼンダール)に2.5 mlずつ適用した。タンパク質の溶離は、PD-10カラムごとに3.5 mlの緩衝液Bを用いて行われた。脱塩されたタンパク質溶液を緩衝液Bで平衡にされたMono Q HR 10/10 カラム(Amersham Biosciences、オランダ国ローゼンダール)に適用した。このカラムを4 ml/分の流速で操作し、4 mlの画分を集めた。このカラムから、100ml中の0〜100%のNaClの直線勾配を利用する1 MのNaClを含む緩衝液Bを用いてα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを溶離した。約0.34 MのNaClで溶離されたα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼおよび活性画分をプールした。
【０１５２】
タンパク質溶液を含むα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを次いで、1 MのNaClを含む緩衝液Bによって平衡にされたHiLoad 26/60 Superdex 200 prep グレードゲル濾過カラム (Amersham Biosciences、オランダ国ローゼンダール)に適用した。平衡緩衝液によって3ml/分の流速で α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼが溶離された。3 mlの画分が集められた。ラセマーゼ活性を含む画分がプールされ、スクロースが0.25 M の濃度まで添加された後、-20 ℃でアリコート中に貯蔵された。
【０１５３】
この精製プロトコルを使用して、O.アントロピ 1A α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼが、大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10 CFEから19%の全収率で部分的に精製された。MES緩衝液を用いて還元条件下でNuPAGE システム(invitrogen)を使用するSDS-PAGEは、ゲル濾過後の調製物中の約50%のタンパク質が上記ラセマーゼで構成されていることを示した。
【０１５４】
基質特異性の決定
O. アントロピ 1A α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性が、上記プロトコルによって得られた部分的に精製された酵素調製物を使用して決定された。総体積1 mlの反応混合物が、772μlの66.6 mM HEPES-NAOH（pH 8.0）、10μIの0.1 M ジチオスレイトール、20 mg/ml のBSAおよび1 mMのピリドキサール−５−ホスフェートを含む18μlの溶液、および100μl の0.75 M 基質溶液（pH 8. 0）を混合することによって調製された。37℃で5分間平衡にした後、100 μlの酵素溶液を添加することによって反応を開始した。反応混合物を、振とうすることなく37℃でインキュベートした。規則的な時間間隔で 50μlのサンプルを採取し、950μlの1 M H3P04を含むバイアルに移して反応を停止した。サンプルを0.4 Mのホウ酸塩緩衝液（pH 9.4）で十分希釈した後、得られた混合物をHPLCを使用して分析して、２つのアミノ酸アミドエナンチオマーの正確な濃度を実施例７の方法にしたがって決定した。
【０１５５】
試験された種々の基質の初期活性が、形成された（したがって、基質分子と反対の立体化学を有する）アミノ酸アミドエナンチオマーの量が反応時間に対してプロットされた進捗曲線の直線部分から計算された。この実験の結果を表７に示す。
【０１５６】
【表７】
2005529611.tif 000017
2005529611.tif 000018
【０１５７】
表７のデータは、O. アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼが、緩和された基質特異性を有することを明らかに示す。なぜならば、所望によりそのCβ原子において置換され得る、短鎖および長鎖アルキル側鎖を有するアミノ酸アミドに対して、ならびにアリール側鎖を有するアミノ酸アミドに対して活性が認めらたからである。
【実施例９】
【０１５８】
大腸菌DH10B/pAn (1) PLV36D06からの無細胞抽出物を使用するアースロバクターニコチアナエNCIMB 41126からのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性の決定
無細胞抽出物の調製
大腸菌DH10B/pAn (1) PLV36D06のCFEの調製を大腸菌TOP10/pKEC AZAR 3に関して実施例７に記載したように行った。
【０１５９】
基質特異性の決定
種々のエナンチオマー的に純粋なα−Ｈ−α−アミノ酸アミドとの反応において大腸菌DH10B/pAn (1) PLV36D06からのCFEを適用して A. ニコチアナエ α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの基質特異性を決定する前に、このCFEにおける大腸菌 アミダーゼ／アミノペプチダーゼが、阻害剤カクテルによる前処理によって阻害された。Complete Mini プロテアーゼ阻害剤カクテル (Roche Applied Science、ドイツ国マンハイム)の１錠が9 mlのCFEに溶解され、次いで室温で1時間インキュベートされた。次に、各10 mlの反応混合物 (CFEを含む) が調製された。上記混合物は、50 mMのHEPES-NaOH（pH 8.0）、20μMのピリドキサール−５−ホスフェート、0.4mg/mlのBSA、1 mMのジチオスレイトールおよび75 mMの試験されるアミノ酸アミドの１つを含む。大腸菌DH10B/pAn (1) PLV36D06または大腸菌 TOP10/pBAD/Myc-HisC (ブランク)の前処理されたCFEを1 ml添加することによって反応が開始され、37℃でインキュベートされた。規則的な時間間隔で1 mlのサンプルを採取し、1 mlの1 M H3P04を含むバイアルに移して反応を停止した。サンプルを0.4 Mのホウ酸緩衝液（pH 9.4）で十分希釈した後、得られた混合物をHPLCを使用して分析して、２つのアミノ酸および２つのアミノ酸アミドエナンチオマーの正確な濃度を実施例７にしたがって決定した。また、種々の基質α−Ｈ−α−アミノ酸アミドに対するCFEの初期活性の計算を実施例７に記載したように行った。これは、阻害剤カクテルによるCFE の前インキュベートによって完全には阻害されないアミダーゼ／アミノペプチダーゼによるアミド基質および／または生成物の潜在的な加水分解に関する較正を含む。
【０１６０】
実施例７においてすでに認められるように、大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisCの前処理された CFEはまた、使用されたエナンチオマー的に純粋なα−Ｈ−α−アミノ酸アミド基質のラセミ化を何ら示さなかった。大腸菌TOP10/pAn (1) PLV36D06からCFE を用いたこの実験の結果を表８に示す。
【０１６１】
【表８】
2005529611.tif 000019
【０１６２】
表８に示される結果は、A. ニコチアナエNCIMB 41126  α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼがロイシンアミドに対してのみでなく、他のα−Ｈ−α−アミノ酸アミドに対しても活性を有することを明らかに示す。
【実施例１０】
【０１６３】
基質としてのDL-2-アミノ酪酸アミドおよびO.アントロピ1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを含む大腸菌DH10B/pOa(1)PLV49B10からのCFEを使用するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
無細胞抽出物の調製
大腸菌DH10B/pOa(1)PLV49B10の培養ならびに無細胞抽出物の調製を、実施例７に匹敵しうるやり方で行った。この場合にも、大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisCを全く同じ方法で処理して負の対照とした。
【０１６４】
DL-2-アミノ酪酸アミドに対するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ
大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10および大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisCからのCFEの活性を決定するために、各 10 mlの反応混合物を調製した。上記混合物は、 50 mMのHEPES-NaOH（pH 8. 0）、20μMのピリドキサール−５−ホスフェート、0,4 mg/mlのBSA、1 mMのジチオスレイトールおよび75 mMのDL-2-アミノ酪酸アミドを含む。大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10または大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisC (ブランク)の解凍したCFEの1 mlを添加することによって反応を開始し、そして 37℃で21.5 時間インキュベートした。規則的な時間間隔で1 mlのサンプルを採取し、1 ml のMeOHを含むバイアルに移して反応を停止した。L-およびD-2-アミノ酪酸およびL-およびD-2-アミノ酪酸アミドの濃度を決定するためのこれらのサンプルの分析を、下記プロトコルにしたがってHPLCにより行った。
【０１６５】
2005529611.tif 000020
この実験の結果を表9に示す。
【０１６６】
【表９】
2005529611.tif 000021
【０１６７】
表９のデータから、大腸菌ブランク細胞(大腸菌TOP10/pBAD/Myc-HisC)からのCFEによって得られる最大転化が50%を超えないことが明らかである。これらの細胞はα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性を含まないので、L-アミノ酪酸アミドのみが転化され、他の基質エナンチオマーはそのままである。したがってこの場合の最大理論収率は、（酵素的）動的分割反応に関して標準的であるように、50%にすぎない。このシリーズの最後２つの時点のデータは、大腸菌 TOP10からの L-アミダーゼ／アミノペプチダーゼが、L-基質の濃度が０に近づくときにD- アミノ酪酸アミドをゆっくり転化し、その結果、21.5 時間の反応後に91.7% のエナンチオマー過剰を有するL -アミノ酪酸を生じることを示す。
【０１６８】
O. アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼを含む大腸菌DH10B/pOA (1)PLV49B10からのCFEを用いると、明らかにD-アミノ酪酸アミドも転化され、21.5 時間後には85.4% のL-アミノ酪酸への総転化をもたらす。反応混合物中の得られたL-アミノ酪酸のエナンチオマー過剰は、反応を通じて95%よりまだなお十分上である。これは、α−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼの作用による、反応の終りでのより高いL-アミノ酪酸アミド濃度によって引き起こされる。
【０１６９】
この実験は、O. アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをL-選択的アミダーゼ／アミノペプチダーゼ(例えば、大腸菌TOP10細胞からのCFEに存在する)と組み合わせることによって DL-α−Ｈ−α−アミノ酸アミドが50%より上の収率および優れたエナンチオマー過剰でL-α−Ｈ−α−アミノ酸に転化され得ることを示す。
【実施例１１】
【０１７０】
基質としてのDL-2-アミノ酪酸アミドおよび大腸菌DH10B / pOa(1)PLV49B10からのCFEをシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼと組み合わせて使用するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
この実験では、実施例11からの大腸菌DH10B/pOA (1) PLV49B10 CFE を使用した。それを、P.プチダ（P. putida）ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼを含む調製物と組み合わせた。これは、O.アントロピ 1A およびA. ニコチアナエ NCIMB 41126 遺伝子ライブラリーのスクリーニング (実施例3および3A) においてL-アミノペプチダーゼヘルプ溶液として使用されたものと同じL-エナンチオ選択的酵素である。
【０１７１】
50 mMのHEPES-NaOH（pH 8.0）、20μMのピリドキサール−５−ホスフェート、 0,4 mg/mlのBSA、1 mMのジチオスレイトール、および75 mMのDL-2-アミノ酪酸アミドを含む10 ml(酵素調製物を含む全体積)の反応混合物を調製した。大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10の解凍したCFEの0.4mlおよびP. プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼを含む溶液0.17mlを添加することによって反応を開始した。反応混合物を37℃で18時間インキュベートした。一定の時間間隔で1 mlのサンプルを採取し、1 mlのMeOHを含むバイアルに移して反応を停止した。L-およびD-2-アミノ酪酸およびL-およびD-2-アミノ酪酸アミドの濃度を決定するためのこれらのサンプルの分析は、実施例11のプロトコルに従って HPLCにより行われた。この実験の結果を表10に示す。
【０１７２】
【表１０】
2005529611.tif 000022
【０１７３】
表１０のデータは、O.アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼおよびP.プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼの組み合わせによってL-2-アミノ酪酸への極めて高い転化 (97.3%)が得られ得ることを示す。得られたこの転化は、動的分割のために得られ得る最大理論値 (すなわち100%)に非常に近い。さらに、L-2-アミノ酪酸のエナンチオマー過剰はなおも95%より上である。
【実施例１２】
【０１７４】
DL-2-アミノ-5-［1, 3］ジオキソラン-2-イル-ペンタン酸アミドを基質としておよび大腸菌DH10B / pOa(1)PLV49B10からのCFEをシュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼと組み合わせて使用するα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼ活性試験
非常に類似した構成において、O.アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼおよびP.プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼの組み合わせた活性をより複雑な基質DL-2-アミノ-5-［1, 3］ジオキソラン-2-イル-ペンタン酸アミドに対して決定した。このアミドの分子構造は実施例８の基質の表に見ることができる。この実験では、大腸菌DH10B/pOa (1) PLV49B10 からの解凍したCFEの1 mlを、P.プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼを含む溶液と一緒に使用した。反応は、120時間進行した。L-およびD-2-アミノ-5-［1, 3］ジオキソラン-2-イル-ペンタン酸およびL-およびD-2-アミノ-5-［1, 3］ジオキソラン-2-イル-ペンタン酸アミドの濃度を決定するためのこれらのサンプルの分析は、下記プロトコルに従って.  HPLCにより行われた。
【０１７５】
2005529611.tif 000023
この実験の結果を表１１に示す。
【０１７６】
【表１１】
2005529611.tif 000024
【０１７７】
表１１のデータは、O.アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼおよびP.プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼの組み合わせによって、DL-2-アミノ-5-［1, 3］ジオキソラン-2-イル-ペンタン酸アミドのL-酸への65%を超える転化が120時間の反応において得られることを示す。形成されたL-酸のエナンチオマー過剰は98%より高い。
【０１７８】
この実験で得られた結果は、O.アントロピ 1Aからのα−Ｈ−α−アミノ酸アミドラセマーゼをL-選択的アミダーゼ／アミノペプチダーゼ(例えば、P.プチダ ATCC 12633からのL-アミノペプチダーゼ)と組み合わせることによる動的分割は、 官能性を有する側鎖を含むより複雑なα−Ｈ−α−アミノ酸アミドに関しても可能であることを示す。
【配列表】
2005529611000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月17日(2004.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005529611000001.app
【国際調査報告】
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