(57)【要約】本発明は、デオキシグアノシン（ｄＧ）の代わりにデオキシイノシン（ｄＩ）を含んでなる小さなサイズのプローブ配列を用いて核酸を分析する方法に関する。本発明は、このようなプローブ配列、および試料中のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）分子に存在するターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法におけるそれらの使用、特にセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）のｍＲＮＡエディティング率にも関する。本発明は、このようなプローブ配列を含んでなる液体媒質におけるバイオチップまたはリアクター、並びに特に遺伝子多形を検出しおよび／または同定し、または５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡまたはエディティングすることができる任意の他のＲＮＡのエディティング率に関係なくｍＲＮＡエディティング率を決定するためのそれらの使用にも関する。本発明は、特殊な分析条件下でエディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールおよび／または速度を得ることができる一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）の単離に基づく方法、並びにｍＲＮＡのエディティング度と関連した疾患または疾患への罹病性を診断する方法にも関する。最後に、本発明は、ｍＲＮＡエディティング率、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのエディティング率を調節することができる化合物の選択方法、並びに有機流体を処理するための医薬組成物を製造するための上記化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の１つで特異的なデュープレックスを形成することができる配列を含む、少なくとも２種類のオリゴデオキシヌクレオチドのプローブの配列であって、
前記配列が、試料中において、哺乳類細胞からの膜受容体をコードするｍＲＮＡ断片由来の任意のターゲットオリゴヌクレオチドの潜在的な存在を検出しおよび／または定量する別個のプローブのセットからなるまたはを含んでなり、この断片の配列に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることができ、プローブの少なくとも１個上の少なくとも１個のヌクレオチドｄＧがヌクレオチドｄＩで置換されており、ハイブリダイゼーション条件がプローブのそれぞれについて同一であることを特徴とする、前記配列。
【請求項２】
プローブにおけるヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置を、プローブのそれぞれで形成することができるデュープレックスのＴｍ値が同一または十分に近くなり、プローブのそれぞれについて同一ハイブリダイゼーション条件下で特異的ハイブリダイゼーションによってデュープレックスを得ることができるようにする、請求項１に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項３】
プローブでのヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置を、デュープレックスのｄＣまたはＣと対をなすことができる残りのｄＧがプローブのそれぞれについて同一またはほとんど異ならないように決定する、請求項１または２に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項４】
プローブが一本鎖ＤＮＡ型である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項５】
プローブが少数の塩基、好ましくは２０以下の塩基を含んでなる、請求項１〜４に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項６】
プローブが同数の塩基または多くとも１０％だけ異なる塩基の数を用いる、請求項１〜５に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項７】
上記の異なるプローブの数がターゲットポリヌクレオチドの予想される変異体の数に少なくとも等しく、その少なくとも１個は分析を行う試料中に存在する傾向がある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項８】
ヌクレオチドｄＧの少なくとも１個がヌクレオチドｄＩで置換されているプローブの数が少なくとも２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項９】
受容体がセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）またはグルタメート受容体Ｂサブユニット（GluR-B）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列であって、
前記配列が、５−ＨＴ２Ｃ−ＲのエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片由来の任意のターゲットオリゴヌクレオチドを試料中で検出しおよび／または定量するための３２種類の異なるプローブのセットからなるまたはを含んでなり、前記配列が下記のプローブのセット：
下記の配列番号（SEQ ID No.）１〜３２の配列の３２個のプローブのセット：
【化１】
2005533510.tif 000006
2005533510.tif 000007
または
配列番号１〜３２のヌクレオチド３〜ヌクレオチド１５の断片の配列を含んでなる３２個のプローブセット
からなるまたは含んでなる、配列。
【請求項１１】
同じ個体支持体上に沈着した、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなるバイオチップ。
【請求項１２】
固体支持体が、ガラス、プラスチック、ナイロン（商標）、シリコーン、ケイ素または多糖類から作られた固体支持体から選択される、請求項１１に記載のバイオチップ。
【請求項１３】
プローブが、好ましくは共有結合によって固体支持体に結合されている、請求項１１または１２に記載のバイオチップ。
【請求項１４】
溶液中で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなる、リアクター。
【請求項１５】
少なくとも２個の容器、好ましくは２個のキューピュールからなる装置、特にプレートまたはマイクロプレートであって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなり、それぞれの容器が前記プローブの１つを含んでなる、上記装置。
【請求項１６】
試料中のターゲット核酸を検出し、または定性的または定量的に分析するための試薬のキットであって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも２種類のプローブの配列、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオチップ、または請求項１５に記載の装置を含んでなる、キット。
【請求項１７】
試料中のターゲットオリゴヌクレオチドの検出および／または定量方法であって、
ターゲットオリゴヌクレオチドが哺乳類細胞からの膜受容体をコードするｍＲＮＡ断片に由来し、この断片の配列に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることができ、
ａ）  存在を検出しようとするターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料を、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオチップ上または請求項１５に記載の装置の容器のそれぞれに、ターゲットオリゴヌクレオチドとプローブの特異的ハイブリダイゼーションのための条件下で沈着させ、
ｂ）  適当な場合には、段階ａ）で得たバイオチップをハイブリダイゼーションによって捕捉されていない試料の核酸を除去する条件下で洗浄し、
ｃ）  プローブのそれぞれでの特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する
段階を含んでなる、方法。
【請求項１８】
ターゲットオリゴヌクレオチドが、５−ＨＴ２Ｃ−ＲのエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列から誘導される、請求項１７に記載の試料中のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法。
【請求項１９】
同一試料に存在するエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの総量に対して、少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがある哺乳類細胞からの膜受容体をコードするｍＲＮＡ断片のエディティングされたまたはエディティングされていない形態のそれぞれの同一試料における百分率を決定する方法であって、
請求項１７に記載の方法を含んでなり且つ請求項１７に記載の方法の段階ｃ）の終了時にプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対するプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量の百分率として表される比をプローブのそれぞれについて決定する、方法。
【請求項２０】
少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがある膜受容体をコードするｍＲＮＡ断片が５−ＨＴ２Ｃ−ＲのエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片であり、請求項１７に記載の方法の段階ａ）において、バイオチップまたは装置の容器が請求項１０に記載のプローブの配列を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ターゲットオリゴヌクレオチドがのエディティングされたおよびエディティングされていないｍＲＮＡのアンチセンスｍＲＮＡまたは相補的ＤＮＡであり、プローブがエディティングされたおよびエディティングされていないｍＲＮＡの断片の配列相当するＤＮＡである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される断片が、ヒトなどの哺乳類からの生物学的試料から抽出された核酸の断片である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ターゲットオリゴヌクレオチドに、検出可能なシグナル、好ましくは蛍光または放射性シグナルを直接または間接的に生成することができる標識を予備標識する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳類細胞からの膜受容体をコードするｍＲＮＡのエディティング率を決定するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオチップ、または請求項１５に記載の装置の使用。
【請求項２５】
哺乳類細胞に存在する膜受容体をコードするｍＲＮＡの断片上に位置したエディティング部位のエディティングを調節することができる化合物を選択する方法であって、
エディティングされたｍＲＮＡ断片が「Ｅ」と表示される配列を有し、エディティングされていないｍＲＮＡ断片が「ＵＥ」と表示される配列を有し、
Ａ）  評価を行う化合物を、エディティングすることができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する細胞の個体群と接触させ、
Ｂ）  ｍＲＮＡ断片から誘導され、段階Ａ）で得られた細胞から誘導される核酸抽出物から得られるターゲットオリゴヌクレオチドの試料を用いて、請求項１７に記載の方法によって細胞中のｍＲＮＡのエディティング部位のエディティングの調節または非調節を明らかにし、方法において、プローブの少なくとも２個は２個のＤＮＡであって、一方が断片「Ｅ」のＤＮＡ配列に相当し、他方が断片「ＵＥ」のＤＮＡ配列に相当し、
Ｃ）  適当な場合には、請求項１７に記載の方法の段階ｃ）において、プローブのそれぞれにおいて捕捉されたターゲットオリゴヌクレオチド検出および／または定量をコントロール細胞の個体群を用いて得たものと比較し、
Ｄ）  この化合物がエディティング部位のエディティングを調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２６】
哺乳類細胞に存在する膜受容体をコードするｍＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物の選択方法であって、
Ａ）  評価を行う化合物を、エディティングすることができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する細胞の個体群と接触させ、
Ｂ）  ｍＲＮＡ断片から誘導され、段階Ａ）で得られた細胞から誘導される核酸抽出物から得られるターゲットオリゴヌクレオチドの試料を用いて、請求項１７に記載の方法によって細胞中のｍＲＮＡのエディティング部位のエディティング率の調節または非調節を明らかにし、
Ｃ）  請求項１７に記載の方法の段階ｃ）の終了時にプローブのそれぞれについて、１個のプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量のプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対する百分率として表される比に相当するエディティング率を決定し、
Ｄ）  適当な場合には、得られたエディティング率をコントロール細胞の個体群について得られたエディティング率と比較し、
Ｅ）  この化合物がエディティング率を調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載のｍＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物の選択方法であって、ｍＲＮＡが膜受容体５−ＨＴ２Ｃ−Ｒをコードし、ｍＲＮＡ断片が５−ＨＴ２Ｃ−ＲｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなり、方法の段階Ｂにおいて、ｍＲＮＡ断片のエディティング率の調節または非調節を請求項１８に記載の方法の段階ａ）においてバイオチップまたは装置の容器が請求項１０に記載のプローブの配列を含んでなる方法によって明らかにし、
Ｃ）  請求項１８に記載の方法の段階ｃ）の終了時にプローブのそれぞれについて、１個のプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量のプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対する百分率として表される比に相当するエディティング率を決定し、
Ｄ）  適当な場合には、得られたエディティング率をコントロール細胞の個体群について得られたエディティング率と比較し、
Ｅ）  この化合物がエディティング率を調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２８】
所定の分析条件下で、エディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールを、特定の組織試料を用いてまたは真核生物細胞の個体群の試料を用いて得るためのＳＳＣＰ法であって、
ａ）  試料の総ＲＮＡの抽出の後、適当な場合には、ｍＲＮＡの精製、
ｂ）  段階ａ）で抽出したＲＮＡの逆転写および二本鎖ＤＮＡの合成、
ｃ）  エディティングすることができるｍＲＮＡに特異的なプライマーの対であって、ＲＮＡ抽出物に存在する可能性がある総てのエディティング形態を増幅することができるように選択されるこのプライマーの対であり、蛍光団で標識したこれらのプライマーを用いる、段階ｂ）で得られたＤＮＡのＰＣＲ増幅、
ｄ）  適当な場合には、段階ｃ）で得たＰＣＲ生成物の精製、
ｅ）  適当な場合には、段階ｄ）で得たＰＣＲ生成物の精製、
ｆ）  特に、加熱の後急激な冷却による二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、
ｇ）  毛細管電気泳動による一本鎖ＤＮＡの分離、および
ｈ）  蛍光の読み取りによるエディティングプロフィールの取得、および適当な場合には、蛍光リーダーに関連した活用系によるプロフィールデータの獲得
の段階を含んでなる、方法。
【請求項２９】
段階ｃ）で用いたプライマーの対を、得られるＰＣＲ生成物の長さが少なくとも１００塩基となるように選択する、請求項２８に記載のＳＳＣＰ法。
【請求項３０】
エディティングすることができるｍＲＮＡが、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−ＲのｍＲＮＡであるか、またはグルタメート受容体サブユニットＢ（ＧＩｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡである、請求項２８または２９に記載のＳＳＣＰ法。
【請求項３１】
エディティングすることができるｍＲＮＡが、５−ＨＴ２Ｃ−ＲのｍＲＮＡであるか、またはグルタメート受容体サブユニットＢ（ＧＩｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡである、請求項３０に記載のＳＳＣＰ法。
【請求項３２】
エディティングすることができるｍＲＮＡが５−ＨＴ２Ｃ−ＲのｍＲＮＡであり、プライマーの対が、
ＰＣＲ９  ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣＴ（配列番号３６）、および
ＰＣＲ１０  ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧ（配列番号３７）
のプライマーの対であって、好ましくは蛍光団で標識したものである、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法。
【請求項３３】
所定の分析条件下で、エディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールおよびエディティング率を、特定の組織試料を用いてまたは真核生物細胞の個体群の試料を用いて得るためのＳＳＣＰ法であって、
ａ）  請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｂ）  段階ａ）で得たプロフィールを、
これらの所定の条件下でｍＲＮＡのエディティングされた（またはエディティングされていない）分離形態のそれぞれについて得た特徴的プロフィール、および／または
これらの所定の条件下で得たこれらのエディティングされたまたはエディティングされていない形態のそれぞれの既知の定性的および／または定量的混合物の特徴的プロフィール、および／または
これらの同一の所定の条件下での、正常患者または病状が確かめられた患者、特定組織のｍＲＮＡ抽出物、あるいは真核生物の個体群についてのこの同じｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィール
に相当する標準的プロフィールと比較し、
ｃ）  段階ａ）で得たエディティングプローブに相当する既知のエディティングプロフィールを選択し、
ｄ）  段階ｃ）で得たプロフィールのエディティング率を、段階ａ）で得たエディティングプロフィールと結合させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項３４】
エディティングすることができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する真核生物細胞、特にヒトまたはマウスのような哺乳類由来の特定組織または個体群においてｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う化合物を特定組織または真核生物細胞の個体群と接触させ、
ｂ）  所定の分析条件下で、エディティングプロフィールを請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法によって得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
同一の所定の分析条件下で、同一の特定組織または同一の真核生物細胞の個体群についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィール、または
評価を行う化合物と接触させていない同一の特定組織または同一の真核生物細胞の個体群について平行して決定され且つ得られたエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが互いに有意差を有するときには、評価を行う化合物を選択する
段階を含んでなる、方法。
【請求項３５】
患者において、エディティングを行うことができるｍＲＮＡのエディティングと少なくとも部分的に関連した病状を予防しおよび／または治療することができる化合物の選択方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う化合物を、エディティングを行うことができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する特定組織または真核生物の個体群と接触させ、特定組織または真核生物細胞の個体群は、所定の分析条件下で試験を行う化合物と接触させる前に関連した病状に特徴的なｍＲＮＡのエディティングプロフィールを示し、
ｂ）  これらの所定の条件下で請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
α）  同一の所定の分析条件下で、同一の特定組織または同一の細胞個体群についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィールであって、正常患者または前記の関連した病状を示さない患者に典型的なこのエディティングプロフィール、および適当な場合には、
β）  同一の所定の分析条件下で、同一のコントロールの特定組織または評価を行う化合物と接触させていないコントロール細胞の同一の個体群について得たエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが段階ｂ）で得たものが段階ｃ）α）で得たものと有意に同一であるときには、評価を行う化合物を選択し、段階ｂ）で得たプロフィールが段階ｃ）β）で得たものと有意に異なるときにはこの選択を確認する
段階を含んでなる、方法。
【請求項３６】
エディティングを行うことができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールを調節することが知られ且つ患者において、同一の関連病状を予防しおよび／または治療することが知られている化合物と同一の治療機構または有効性を有するエディティングを行うことができるＲＮＡのエディティングまたは非エディティングと少なくとも部分的に関連した患者の病状を予防しおよび／または治療することができる化合物の選択方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う化合物を、エディティングを行うことができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する特定組織または真核生物の個体群と接触させ、特定組織または真核生物細胞の個体群は、所定の分析条件下で試験を行う化合物と接触させる前に関連した病状に特徴的なｍＲＮＡのエディティングプロフィールを示し、
ｂ）  これらの所定の条件下で請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
α）  同一の所定の分析条件下で、イン・ビボまたは細胞中で、ＲＮＡのエディティングプロフィールを調節することが知られており且つ患者で同一の関連病状を予防および／または治療することが知られている化合物と接触させた同一の特定組織または同一の細胞個体群について、この同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィール、および適当な場合には、
β）  同一の所定の分析条件下で、同一のコントロールの特定組織または評価を行う化合物と接触させていないコントロール細胞の同一の個体群について得たエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが段階ｂ）で得たものが段階ｃ）α）で得たものと有意に同一であるときには、評価を行う化合物を選択し、段階ｂ）で得たプロフィールが段階ｃ）β）で得たものと有意に異なるときにはこの選択を確認する
段階を含んでなる、方法。
【請求項３７】
試験を行う患者から採取した組織または細胞試料を用いて、エディティングすることができるｍＲＮＡと少なくとも部分的に関連した疾患を診断し、適当な場合には予測する方法であって、
ａ）  所定の条件下で請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のＳＳＣＰ法によってＲＮＡのエディティングプロフィールを得て、
ｂ）  段階ａ）で得たプロフィールを、正常患者または確認された病状を示す患者、同一の所定の分析条件下で同一組織または同一細胞のｍＲＮＡ抽出物、あるいは細胞系由来の細胞についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィールと比較し、
ｃ）  段階ａ）で比較したエディティングプロフィールに相当する既知のエディティングプロフィールを選択し、
ｄ）  段階ｃ）で選択したプロフィールに関連した診断を試験した患者と関連付ける
段階を含んでなる、方法。
【請求項３８】
請求項２７に記載の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物を選択する方法、または請求項３４に記載の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する方法であって、
請求項２７に記載の方法の段階Ｅ）、または請求項３４に記載の方法の段階ｄ）において、化合物がＲＮＡ断片のエディティング率またはエディティング部位を減少させるときに、この化合物を選択し、エディティング部位は、エディティングされると、エディティングされていないｍＲＮＡの翻訳によって生じる５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのアミノ酸配列を変更する、方法。
【請求項３９】
請求項２７に記載の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物を選択する方法、または請求項３４に記載の５−ＨＴ２Ｃ−ＲをコードするｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する方法であって、
請求項２７に記載の方法の段階Ｅ）、または請求項３４に記載の方法の段階ｄ）において、化合物がＲＮＡ断片のエディティング率またはエディティング部位を増加させるときに、この化合物を選択し、エディティング部位は、エディティングされると、エディティングされていないｍＲＮＡの翻訳によって生じる５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのアミノ酸配列を変更する、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、デオキシグアノシン（ｄＧ）の代わりにデオキシイノシン（ｄＩ）を含んでなる小型プローブを用いる核酸の分析方法に関する。本発明は、このようなプローブ配列、および試料中のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）またはＲＮＡ（リボ核酸）分子に存在するターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法、特にセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のエディティング率（ediding rate）の決定におけるそれらの使用でもある。本発明は、このようなプローブ配列を含んでなる液体媒質中のバイオチップまたはリアクター、および特に遺伝子多形を検出しおよび／または同定し、または５−ＨＴ２Ｃ−ＲｍＲＮＡまたはエディティングすることができる任意の他のＲＮＡのエディティング率に関係なくｍＲＮＡエディティング率を決定するためのそれらの使用にも関する。本発明の主題は、特殊な分析条件下でエディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールおよび／またはエディティング率を得ることをできるようにする一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を明らかにすることに基づく方法、およびｍＲＮＡのエディティング度と関連した疾患または疾患への罹病性を診断する方法にも関する。本発明の主題は、ｍＲＮＡエディティング率、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのエディティング率を調節することができる化合物の選択方法、並びに体液を処理するための医薬組成物を製造するための上記化合物の使用に関する。
【０００２】
背景技術
所定の配列における１または数個のヌクレオチドの差を検出することができるようにする核酸の分析方法は、一本鎖配列(single suquence)に特異的な方法と、デュープレックスの形態またはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロデュープレックスの形態でのハイブリダイゼーションによって数個の（数千までの）異なる配列を同時に検出することができる方法の２種類の主要な方法に区別することができる。
【０００３】
第一の種類では、極めて多くの変異法があるので限定なしに且つ総てが様々な程度まで広く用いられてきているのでそれらを記載することなく、ＤＮＡシークエンシング、直接シークエンシング、または逆転写反応が先行する可能性があるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による反復増幅後のシークエンシング（ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写に続くＰＣＲ）、１以上の制限部位に影響を与える１以上の点突然変異の後の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の実例およびその変異法であるＡＦＬＰ（増幅断片長多型）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびその変異法であるリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、ＰＣＲ−突然変異体対立遺伝子特異的増幅（ＰＣＲ−ＭＡＳＡ）、プライマー伸張などが挙げられる。これら総ての方法およびそれらから誘導される方法については、「分子生物学の最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」， John Wiley & Sons出版，４巻，３ヶ月毎に改訂，ISBN 0-471-50338-Xを参照されたい。
【０００４】
第二の種類には、液体媒質でのハイブリダイゼーションによる分析の方法、および最初にＤＮＡについて記載されたサザンブロット法から誘導される方法が挙げられる(Southern, J. Mol. Biol., 1975, 98: 503-517)。後者としては、ＲＮＡに応用したサザンブロット法（またはノーザンブロット法、Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5350-5354およびAlwine et al., Methods Enzymol., 1979, 68: 220-242を参照されたい）、支持体上のハイブリダイゼーションであるマクロアレイおよびマイクロアレイハイブリダイゼーション（Fotin et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26 (6): 1515-1521およびそこに引用されている文献を参照されたい。また、Diehl et al., Nucleic Acids Res., 2001, 29 (7) e38およびそこに引用されている文献も参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ型ヘテロデュープレックスを形成する核酸分子間のこれらのハイブリダイゼーションは、液体媒質中のリアクター中でまたは更に一般的には、疎水性膜（例えば、ナイロン（商標）上のニトロセルロース）、または活性化して一本鎖または二本鎖ＤＮＡプローブを結合させるガラススライド（後者の場合には、次にハイブリダイゼーションが可能になるように変性される）であってもよい支持体上で得られる。沈着したＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションのプローブとして働く沈着したＤＮＡ配列は長いことがあり、またそれらは一般にＰＣＲによって増幅されたゲノムＤＮＡ配列であるか、または更に一般的にはｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）配列であり、後者の場合には、それらは様々な起源のｃＤＮＡライブラリーに由来し、二本鎖ＤＮＡの形態である。ＤＮＡ配列は一本鎖ＤＮＡの形態であることもでき、後者の場合には、それらは大抵の場合には長い（６０−８０塩基）または短い（約２０塩基以下）のオリゴデオキシリボヌクレオチドとなる。オリゴデオキシリボヌクレオチドが短くなれば、１個のヌクレオチドだけが異なる配列を識別することができるようになる。しかしながら、この識別は、ハイブリダイズする配列の融点が極めて類似しているかまたは同一である場合にのみ可能である。
【０００５】
実際に、第二の種類の方法によって一本鎖ヌクレオチドに関する配列の差を明らかにすることができるが、これを可能にするには、ハイブリダイゼーション条件（本質的には、塩濃度および温度）を十分に厳密にして、ただ１個の塩基のミスマッチもプローブとターゲット核酸の間のハイブリダイゼーションを防止するようにする必要がある。これらの条件を満足すると、正確に相補的な配列を有するプローブだけが所望な配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいターゲット核酸とハイブリダイズする。このためには、プローブは、十分に長く、安定且つ特異的なハイブリダイゼーションを行うことができる配列を持たなければならないが、また十分に短く、互いに一本鎖ヌクレオチドの配列の差を示す核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）個体群を区別できるものでなければならない。
【０００６】
いずれのものも特に断らない限りは同じく、特異的ハイブリダイゼーションが得られる温度は、本質的に対となる配列の塩基組成である、ＤＮＡにデオキシリボヌクレオシド一リン酸およびＲＮＡにリボヌクレオシド一リン酸（ウラシル、次いでチミンに取って代わる）の形態で存在するアデニン、チミン（またはウラシル）、グアニンおよびシトシンであって、３’−５’−ホスホジエステル結合によって互いに結合したものによって変化する。略号ｄＡ、ｄＴ、ｄＧおよびｄＣをそれぞれデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン一リン酸について用い、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣをそれぞれアデノシン、ウリジン、グアノシンおよびシチジン一リン酸について用いる。配列のグアニンおよびシトシンが多くなれば、対になったアデニンとチミン（またはウラシル）の間には水素結合が２個だけであるのに対して、これら２つの対になった塩基の間には３個の水素結合が形成されるため、特異的ハイブリダイゼーションを得ることができるようにする温度は高くなる。しかしながら、層状になったプリンおよびピリミジン塩基のプレートのある種の炭素原子が互いに入り込む疎水的相互作用によって、対になった配列中のこれらの塩基の相対的位置はＤＮＡ二重らせんまたはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロデュープレックスの安定性にも役割を演じている。従って、特異的ハイブリダイゼーション、従って互いに１個の塩基だけが異なる２個の配列を識別することができる温度は、それぞれ対になったアデニンとチミン（またはウラシル）、およびグアニンとシトシンの割合、および所定の配列におけるこれらの対になった塩基の相対的位置によっても変化する。
【０００７】
特異的ハイブリダイゼーションが可能な温度は、対になる配列の長さおよびそれらの塩基組成も考慮に入れた幾つかの式にほぼ準じて計算することができる（特に、Ｗａｌｌａｃｅ則によるＴｍの計算については、Wallace et al., Nucleic Acids Res. 1979, 6(11): 3543-3557を、また隣接法によるＴｍの計算については、Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(11): 3746-3750を参照されたい）。しかしながら、現在提案されている総ての式では、第一にｄＩ、および第二にｄＡ、ｄＧまたはｄＴの間で対をなすエネルギーを同一と考えているが、これは不正確であるので（下記を参照）、どのような計算法もｄＩを含む二本鎖ＤＮＡのＴｍを正確に決定することはできない。この温度は、温度の関数としてＤＮＡの高色素効果を測定することによって実験的に決定することもできる。このために、二本鎖ＤＮＡの光学密度を２６０ｎｍで温度の関数として測定する。完全に一本鎖形態の場合には、ＤＮＡは２６０ｎｍにおいて二本鎖形態のときの約１．４倍吸収する。ＤＮＡの半分が二本鎖形態であり且つ半分が一本鎖形態であるときの温度は、融点またはＴｍである。ＴｍはＤＮＡの温度変性曲線の変曲点で測定され、これは温度の関数として２６０ｎｍで測定した光学密度の値を表す。所定の配列における対になったグアニンとシトシンの数が大きくなれば、Ｔｍは高くなる。従って、これは、塩基組成による所定の長さの二本鎖ＤＮＡ配列を特徴付けるものである。
【０００８】
１個のヌクレオチドから高々数個のヌクレオチドだけが異なる２個の配列を区別するのに最適なハイブリダイゼーション温度は、対になる配列が比較的短いという条件で容易に決定される。
【０００９】
しかしながら、数個のプローブと、互いに１個のヌクレオチドのみが異なるまたは完全に異なる配列を有しそれぞれ対になったアデニンとチミン（またはウラシル）およびグアニンとシトシンの割合が異なっている同数の核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の間の特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションを行う配列と同数のハイブリダイゼーション条件が必要である。実際に、特異的ハイブリダイゼーションが可能な条件はハイブリダイゼーションを行う配列の塩基組成によって変化するので、特異的ハイブリダイゼーションを得るのに必要な温度は、同数の対になったアデニンとチミン（またはウラシル）の置換としての対になったグアニンとシトシンの数が増加するので高くなる。
【００１０】
従って、Ｔｍの決定によって明らかなように、ハイブリダイゼーション特異性を保証する温度はハイブリダイゼーションを行うそれぞれの配列について異なるものでなければならないので、同一固体支持体上で小さなサイズのセットの配列を有する特異的ハイブリダイゼーションを同時に得ることはできない。
【００１１】
これが不可能であることは、液体媒質中で小さなサイズのセットの配列を用いてこれらの特異的ハイブリダイゼーションを、同一の特異的ハイブリダイゼーション条件、特に温度を適用することが所望な同じリアクターまたはリアクターのセット、例えば、同一プレートまたは同一マイクロプレート上に配列したキューピュール（cupule）のセットで行おうとするときにも真実のままである。
【００１２】
従って、小さなサイズのセットの配列である１個のヌクレオチドのみが互いに異なっている配列または完全に異なる配列の核酸の間で特異的ハイブリダイゼーションを行い、それぞれ対になったアデニンとチミン（またはウラシル）およびグアニンとシトシンの割合が異なるデュープレックスを同時に形成するハイブリダイゼーションを同一固体支持体上でまたは液相中で同じリアクターまたは同一の特異的ハイブリダイゼーション条件、特に温度を適用することが所望なリアクターのセットで行うための分析方法を得ることが求められている。
【００１３】
これが正に本発明の主題である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明により解決法が提供される課題は、提供することができる核酸プローブのセット、およびこのプローブのセットについて同様なハイブリダイゼーション条件が得られるヌクレオチド組成を定義して、これらのプローブがアデニンとチミンおよびグアニンとシトシンの相対的割合がどのようなものであってもＤＮＡ型および／またはＲＮＡ型核酸のセットの配列に特異的にハイブリダイズすることができるようにすることである。
【００１５】
セット配列のターゲット核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて総てのプローブのハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーションの温度をそれぞれ対になっているアデニンとチミンおよびグアニンとシトシンの相対的割合がどのようなものであっても同一且つ同時に絶対的ハイブリダイゼーション特異性を保持するようにするために、本明細書において、（ｄＧ）の代わりにデオキシイノシン（ｄＩ）を有する短いプローブを用いて、ｄＣまたはＣと２個の水素結合によって特異的対形成を行うだけでなく、ｄＧとｄＣまたはｄＧとＣの間に形成した３個の水素結合の代わりに２個の水素結合によりｄＣまたはＣとのこの特異的対形成を確保することを提案する。
【００１６】
セットプローブの配列においてｄＧを置換するｄＩの数および位置は、このようにして変更されたセットプローブの配列が互いに類似した、好ましくは等しいグアニンおよびシトシンの含量を有し、これらの変更したプローブのハイブリダイゼーションにより、Ｔｍ値が十分に類似しておりこれらのプローブについて特異的なハイブリダイゼーション条件を同一にすることができるＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスまたはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロデュープレックスが形成されるような方法で決定される。
【００１７】
ｄＧを置換するｄＩの数および位置は、別の所定のプローブ配列のｄＡとｄＴまたはｄＡとＵの間の対形成を置換する所定のプローブの配列中のｄＧとｄＣまたはｄＧとＣの間の対形成の数および位置によって決定される。
【００１８】
本明細書で提案した解決法では、ｄＩはｄＣと、ｄＡ、ｄＧおよびｄＴとのいずれとも、またはＣと、Ａ、ＧおよびＵとのいずれとも対形成できるヌクレオチドとしては用いられない。実際に、ｄＩは２個の水素結合によってこれらのデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドと対形成することができるが、対形成エネルギーは場合によって極めて異なっている。減少順序の対形成エネルギーによれば、これはｄＩ：ｄＣ ＞ ｄＩ：ｄＡ ＞ ｄＩ：ｄＧ ＝ ｄＩ：ｄＴおよびｄＩ：Ｃ ＞ ｄＩ：Ａ ＞ ｄＩ：Ｇ  ＝ｄＩ：Ｕとなる。更に、ｄＩの環境によれば、対形成エネルギーは厳密には同一ではなく、このｄＩがｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴまたは別のｄＩの前または後に位置するかどうかによって変化する。しかしながら、いずれの場合にも、ｄＩは常にｄＣまたはＣとｄＴまたはＵとよりも一層良好に対形成し、後者の２つのハイブリダイゼーションの可能性は常に最も不都合である。他のデオキシリボヌクレオチドとのｄＩの対形成特性に関しては、Case-Green et al. (Nucleic Acids Res., 1994, 22(2): 131-136)およびMartin et al. (Nucleic Acids Res., 1995, 13(24): 8927-8938)、およびそれらに引用されている文献を参照することができるが、これらに限定されない。
【００１９】
従って、第一の態様では、本発明の主題は、（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子中に）ターゲットポリヌクレオチドおよび／またはその変異体であって、上記ターゲットポリヌクレオチドに対して１個以上の塩基置換を含んでなる上記変異体の一つを含む試料を分析する方法であって、
ａ）  上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つと、少なくとも２個の異なるオリゴデオキシリボヌクレオチド（以後、一般的名称「プローブ」と表す）を含む試料を提供し、プローブは固体支持体上に独特な方法で配列され、または同じリアクターに含まれ、あるいはリアクターのセットを含んでなる装置上に独特な方法で分布されており、上記プローブのそれぞれはターゲットポリヌクレオチドまたはその予想変異体の一つと特異的なデュープレックスを形成することができる配列を有し、
ｂ）  上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つを上記プローブと共に特異的ハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションして、上記ターゲットポリヌクレオチドとその予想変異体の一つが１個のヌクレオチドだけが互いに異なる場合であっても、上記ポリヌクレオチドまたはその予想変異体の一つと上記プローブの一つとの間にデュープレックスを形成し、
ｃ）  上記固体支持体上に形成した、または上記の同じリアクターで溶液中に形成した、または上記リアクターのセットのリアクターのそれぞれで溶液中に形成したデュープレックスを検出する
段階を含んでなり、
上記プローブの少なくとも１個における少なくとも１個のヌクレオチドｄＧがヌクレオチドｄＩで置換され、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその予想変異体の一つと段階ｂ）における上記プローブの一つとの間でデュープレックスを形成するための特異的ハイブリダイゼーション条件は上記プローブのそれぞれについて同一となることを特徴とする、方法である。
【００２０】
好ましくは、本発明は、本発明による分析の方法であって、段階ａ）において、上記の少なくとも２種類のプローブが独特な方法で固体支持体上に配置され、または同じリアクターで溶液に含まれ、あるいは同じリアクターのセットを含んでなる装置で独特な方法で溶液中に分布しており、且つ段階ｃ）において、形成したデュープレックスはそれぞれ固体支持体上で検出され、または溶液中で形成したデュープレックスは上記の同じリアクター（またはこの同じリアクターに含まれる分量を用いて）または上記の同じリアクターのセットのリアクターのそれぞれにおいて検出されることを特徴とする方法に関する。
【発明の具体的説明】
【００２１】
「リアクターのセット」という用語は、本明細書の説明においてリアクターのセット、好ましくは同じリアクター、更に好ましくは、一緒に１個の、またはリアクターの数によっては、数個の同じ装置に分類されたものであって、同じハイブリダイゼーション条件がこのセットのリアクターのそれぞれに適用されるものを表す。
【００２２】
好ましい態様では、リアクターの数が１個より多いときには、リアクターの数は上記の異なるプローブの数に等しい。
【００２３】
更に好ましくは、このリアクターのセットは、リアクターのサイズおよび／または数によって、１個以上の同じプレートまたはマイクロプレートであって、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つを上記プローブと共に液体培地でインキュベーションする容器、キューピュール（cupule）またはウェルが配置される形状で提供される。
【００２４】
この第一の態様では、本発明の特別な主題は、ターゲットポリヌクレオチドおよび／またはその変異体の一つであって、上記ターゲットポリヌクレオチドに関して１個以上の塩基置換を含んでなる上記変異体を含む試料を分析する方法であって、
ａ）  上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つと、少なくとも２個の異なるオリゴデオキシリボヌクレオチド（以後、一般的名称「プローブ」と表す）を含む試料を提供し、プローブは固体支持体上に独特な方法で配列され、上記プローブのそれぞれはターゲットポリヌクレオチドまたはその予想変異体の一つと特異的デュープレックスを形成することができる配列を有し、
ｂ）  上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つを上記プローブと共に特異的ハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションして、上記ターゲットポリヌクレオチドとその予想変異体の一つが１個のヌクレオチドだけが互いに異なる場合であっても、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つと上記プローブの一つとの間にデュープレックスを形成し、
ｃ）  上記固体支持体上に形成したデュープレックスを検出する
段階を含んでなり、
上記プローブの少なくとも１個における少なくとも１個のヌクレオチドｄＧがヌクレオチドｄＩで置換され、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその予想変異体の一つと段階ｂ）における上記プローブの一つとの間でデュープレックスを形成するための特異的ハイブリダイゼーション条件は上記プローブのそれぞれについて同一となることを特徴とする、方法である。
【００２５】
「核酸」、「核酸プローブ」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の他の詳述がない場合には、本明細書では、ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣまたはＡ、Ｕ、ＧおよびＣ以外のヌクレオチドを含んでなることができるまたはできない、および二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡのような上記ＤＮＡの転写産物に相当することがある核酸の断片または領域を定義することができる変更したまたは変更されないヌクレオチドの正確な鎖を表すものである。
【００２６】
「プローブ」という用語は、本明細書ではプローブとして用いられるオリゴデオキシリボヌクレオチドを表すものである。
【００２７】
「小さなサイズのプローブ」という用語は、本明細書では、サイズが十分に短くて、２種類の異なるターゲットポリヌクレオチドの差が１個の塩基のみに関する場合にでも、これらのターゲットポリヌクレオチドの間で特異的ハイブリダイゼーションと区別を行うことができるプローブを表すものである。好ましくは、これらのプローブは長さが４０ヌクレオチド未満であり、更に好ましくは長さが３５、３０、２５、２４、２３、２２、２１ヌクレオチド未満である。更に好ましくは、上記プローブは少なくとも１０ヌクレオチドを含んでなり、更に一層好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドを含んでなる。
【００２８】
「ターゲットオリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書では、試料中で「プローブ」という用語とは反対に、一般に生物試料、組織、細胞、または細菌、酵母、真菌、藻類、またはウイルスまたはファージのような微生物から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡの完全な部分から誘導されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出し、および／または同定し、および／または定量しようとするオリゴヌクレオチドを表すものである。
【００２９】
「ＤＮＡまたはＲＮＡ由来のターゲットオリゴヌクレオチド」という表現は、本明細書では、オリゴヌクレオチド（一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）であって、配列が上記ＤＮＡ、または上記ＲＮＡの配列、またはそれらの断片の一つの配列の１００％に同一または相補的であるものを表すものである。
【００３０】
「ターゲットオリゴヌクレオチドの変異体または予想変異体」という表現は、本明細書では、配列が上記ターゲットオリゴヌクレオチドに関して１個以上の塩基置換を含んでなり、試料中での存在を検出しおよび／または同定しおよび／または定量使用とする変異体であるものを表すものである。
【００３１】
「デュープレックス」（duplex）という用語は、本明細書の説明では、２本の厳密に相補的または厳密には相補的でないＤＮＡ鎖（ＤＮＡ／ＤＮＡホモデュープレックス）またはＤＮＡ鎖とこれに厳密に相補的または厳密には相補的でないＲＮＡ鎖（ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロデュープレックス）の間の特異的ハイブリダイゼーションから生じる二本鎖核酸を表すものである。本明細書の説明では、ヌクレオチドｄＣまたはＣのみがｄＩに相補的であると考えられる。
【００３２】
「ＲＮＡエディティング」（RNA editing）という用語、またはより簡単に「エディティング」という用語は、本発明において、活性が二本鎖ＲＮＡに依存しているアデノシンデアミナーゼによるＲＮＡ配列中のアデノシン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への脱アミノ化を表し、これらのアデノシンデアミナーゼは、ターゲットＲＮＡがｍＲＮＡである場合にはＡＤＡＲ（ＲＮＡ依存性アデノシンデアミナーゼ）であり、またはターゲットＲＮＡがｔＲＮＡである場合にはＡＤＡＴ  （ｔＲＮＡ依存性アデノシンデアミナーゼ）である（総説については、Maas et al. BioEssays, 2000, 22(9), 790-802、およびReenan, TRENDS in Genetics, 2001, 17(2), 53-56、およびGerber et al. TRENDS in Biochemical Sciences, 2001, 26(6), 376-384、およびBaas, Ann. Rev. Biochem. 2002, 71, 817-846、およびそれらに引用されている文献を参照されたい）。
【００３３】
「エディティングされたＲＮＡ」という用語は、本明細書の説明では、少なくとも１個のアデノシンがアデノシンデアミナーゼによってイノシンへ脱アミノ化された任意のＲＮＡ配列を表すものである。
【００３４】
好ましい態様では、上記プローブでのヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置は、上記プローブの一つと上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つとの間に形成されることがあるデュープレックスの融解温度（Ｔｍ）が同一であるかまたは十分に類似しており、上記プローブのそれぞれに対する同じハイブリダイゼーション条件下での特異的ハイブリダイゼーションによって上記デュープレックスを得ることができるように決定される。好ましくは、上記デュープレックスの間のＴｍ値の最大値は、高々１０℃であり、更に好ましくは、９、８、７、６、または５℃以下である。
【００３５】
二本鎖ＤＮＡについてのＴｍ値を測定する方法は、以前から確立されており、当業者に周知である。それらは本明細書では詳細に説明しないが、興味があれば、Lehman et al. (J. Chem. Phys. 1968, 4(7): 3170-3179)、Crothers (Biopolymers, 1968, 6(10): 1391-1404)、および総説についてはLazurlin et al.(Biopolymers, 1970, 9(11): 1253-1306)を参照することができる。
【００３６】
もう一つの好ましい態様では、上記プローブでのヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置は、上記デュープレックスにおけるｄＣまたはＣと対を形成することができる残りのｄＧが、好ましくは上記プローブのそれぞれについて同一であるかまたはほとんど異ならないように決定される。更に好ましくは、上記デュープレックスでｄＣまたはＣと対を形成することができる残りのｄＧの数の差は、上記デュープレックスの全長の１０％未満である。
【００３７】
もう一つの好ましい態様では、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つは一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ型である。
【００３８】
もう一つの好ましい態様では、上記プローブは少数の塩基、好ましくは３０個の塩基または３０個未満の塩基、好ましくは２５個の塩基または２５個未満の塩基、更に好ましくは、２０個の塩基または２０個未満の塩基を含んでなる。
【００３９】
もう一つの好ましい態様では、上記プローブ、および上記ターゲットポリヌクレオチドまたはそれらの予想変異体の一つは、同数の塩基、または１ユニットまたは多くとも１０％だけ異なる数の塩基を用いている。
【００４０】
もう一つの好ましい態様では、上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つは、上記プローブが固体支持体上に配置されているときには検出可能なシグナル、好ましくは蛍光によってまたは放射能を測定することによって検出可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる標識で予備標識する。
【００４１】
例えば、上記標識は、蛍光性であるときには、蛍光色素、特に蛍光色素Ｃｙ５またはＣｙ３のようなシアニンから誘導されたものから選択される。
【００４２】
もう一つの好ましい態様では、プローブと上記ターゲットポリヌクレオチドとの特異的対形成は、分子エネルギー移動、特に蛍光エネルギー移動（蛍光共鳴エネルギー移動については「ＦＲＥＴ」と呼ばれる）によって検出することができる化合物を用いて立証される。
【００４３】
「ＦＲＥＴ」法によって、プローブと上記ターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つとの特異的対形成は、例えば、蛍光団の対であって、第一の蛍光団が光子受容体または光子供与体であり、プローブの５’位または３’位に位置しており、次に、第二の蛍光団はそれぞれ光子供与体または光子受容体であり、第二のプローブの３’位または５’位に位置しているものによって可視化され、この第二のプローブは、厳密に同じやり方で上記ターゲットポリヌクレオチドと同一且つ隣接した配列にハイブリダイズすることができ、且つ光子供与体または光子受容体である第二の蛍光団は第一の蛍光団に十分近い距離に配置されて、供与体蛍光団から受容体蛍光団へのエネルギー移動を確実に行うことができるように画定される。
【００４４】
本発明の分析または工程の方法において、プローブをコーティングした固体支持体上に形成したまたは均質液相中に形成したデュープレックスの存在を検出しおよび／または定量するための標識および手法は、当業者に周知であり、本明細書では詳細には説明しない。
【００４５】
均質液相で２種類のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを分子エネルギー移動、特に「ＦＲＥＴ」によって検出する標識系については、Livak et al. (PCR Methods Appl. 1995, 4: 357-362)および米国特許第６，１１７，６３７号明細書、およびそれらの引用されている文献を参照することができるが、それらに検定されない。
【００４６】
もう一つの好ましい態様では、上記固体支持体は、適当な場合には、上記プローブを共有結合させるために活性化または官能化することができ、特にガラス、プラスチック、ナイロン（商標）、シリコーン、ケイ素、または多糖類またはヘテロ多糖類（poly(heterosaccharides)）、例えばセルロース製の、好ましくはガラス製であって、後者はシラン化されている可能性がある固体支持体から選択される固体支持体である。
【００４７】
もう一つの好ましい態様では、上記プローブは、上記固体支持体と共有結合を形成するように上記支持体と反応することができる官能基によって官能化することができ、後者を活性化し、官能化し、またはスペーサー剤を備えさせることができる。
【００４８】
もう一つの好ましい態様では、分析を行う上記試料は上記ターゲットポリヌクレオチドと、少なくとも１個のその予想変異体を含む。
【００４９】
もう一つの好ましい態様では、上記の様々なプローブの数は少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０および２５であるか、あるいは少なくとも上記ターゲットポリヌクレオチドの予想変異体の数に等しく、その少なくとも１個は分析を行う上記試料に存在する傾向があり、上記変異体の数は少なくとも２である。
【００５０】
もう一つの好ましい態様では、ヌクレオチドｄＧの少なくとも１個がヌクレオチドｄＩで置換されている上記プローブの数は少なくとも２であり、好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０または１５であるか、あるいは上記ターゲットポリヌクレオチドに含まれる別のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドｄＣまたはＣを含んでなる上記ターゲットポリヌクレオチドの予想変異体の数である。
【００５１】
もう一つの態様では、本発明の主題は、少なくとも２種類のオリゴデオキシヌクレオチドプローブの配列であり、上記プローブの少なくとも１個のヌクレオチドｄＧの少なくとも１個がヌクレオチドｄＩで置換されて、ハイブリダイゼーション条件が上記プローブのそれぞれについて同一であり、後者がターゲットポリヌクレオチドまたはその変異体の一つと特異的デュープレックスを形成することができる配列を含むようにすることを特徴とする、配列である。
【００５２】
好ましくは、本発明による少なくとも２個のプローブは、上記プローブ上のヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置が、上記プローブのそれぞれで形成することができるデュープレックスのＴｍ値が同一であるかまたは十分に近く、上記プローブのそれぞれについて同一ハイブリダイゼーション条件下での特異的ハイブリダイゼーションによって上記デュープレックスを得ることができるように決定されることを特徴とする。
【００５３】
更に好ましくは、本発明による少なくとも２種類のプローブの配列は、上記プローブでのヌクレオチドｄＧのヌクレオチドｄＩによる置換の数および位置が、上記デュープレックスにおいてｄＣまたはＣと対形成することができる残りのｄＧの数が上記プローブのそれぞれについて同一またはほぼ同じとなるように決定されることを特徴とする。
【００５４】
更に好ましくは、本発明による少なくとも２種類のプローブは、上記プローブが一本鎖ＤＮＡ型であることを特徴とする。
【００５５】
更に好ましくは、本発明による少なくとも２種類のプローブの配列は、上記プローブが少数の塩基、好ましくは３０個の塩基または３０個未満の塩基、好ましくは２５個の塩基または２５個未満の塩基、更に好ましくは、２０個の塩基または２０個未満の塩基を含んでなることを特徴とする。
【００５６】
更に好ましくは、本発明による少なくとも２種類のプローブの配列は、上記プローブが同数の塩基または１ユニットまたは高々１０％異なる塩基数を用いることを特徴する。
【００５７】
もう一つの好ましい態様では、上記の異なるプローブの数は少なくとも３、５、７、１０、１５、２０および２５であるか、あるいは少なくとも上記ターゲットポリヌクレオチドの予想変異体の数に等しく、それらの少なくとも１個は分析を行う上記試料に存在する傾向があり、上記変異体の数は少なくとも２である。
【００５８】
更に好ましくは、本発明による少なくとも２種類のプローブは、ヌクレオチドｄＧの少なくとも一つがヌクレオチドｄＩで置換されている上記プローブの数が少なくとも２であり、好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０または１５であるか、あるいは上記ターゲットポリヌクレオチドに含まれる別のヌクレオチドの代わりにヌクレオチドｄＣまたはＣを含んでなる上記ターゲットポリヌクレオチドの予想変異体の数であることを特徴とする。
【００５９】
特に好ましい態様では、本発明の主題は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列であって、上記配列が試料中でターゲットオリゴヌクレオチドおよび予想変異体のセットの存在を検出しおよび／または定量するプローブのセットからなりまたはを含んでなることを特徴とする。
【００６０】
好ましくは、上記ターゲットオリゴヌクレオチドは、上記ターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される配列において少なくとも１個の塩基置換を含んでなることがある遺伝子断片または転写産物から誘導される。
【００６１】
更に好ましくは、上記ターゲットオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ断片の配列中の少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがあるこの断片から誘導される。
【００６２】
更に一層好ましくは、上記ターゲットオリゴヌクレオチドは、真核生物細胞、特に哺乳類の膜受容体のｍＲＮＡ断片であって、セロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）またグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）などから誘導され、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒが最も好ましい。
【００６３】
もう一つの好ましい態様では、本発明の主題は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列であって、上記配列が試料中で、エディティングすることができるまたはできないｍＲＮＡ断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドの存在の可能性を検出しおよび／または定量するプローブのセットからなりまたはを含んでなることを特徴とする。
【００６４】
特に好ましい態様では、本発明の主題は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列であって、上記配列が試料中で、エディティングされていないｍＲＮＡから誘導されるターゲットポリヌクレオチド、およびエディティングによりエディティングされていないｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列を変更することがあるｍＲＮＡ断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドの存在の可能性を検出しおよび／または定量する別個のプローブの少なくとも１セットからなりまたはを含んでなることを特徴とする。
【００６５】
更に一層好ましい態様では、本発明の主題は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列であって、上記配列が、試料中でエディティングされたまたはエディティングされていない５−ＨＴ２Ｃ−ＲのｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する３２個の異なるプローブのセットからなるまたはを含んでなることを特徴とする。
【００６６】
この特別な場合には、「５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ ｍＲＮＡ断片であって、エディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチド」という表現は、
３２個のアンチセンスＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドのセットのオリゴヌクレオチドのいずれか、すなわち５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡ断片に１００％相補的であるものであって、上記断片は配列番号３３の配列を含んでなり、配列番号３３において、エディティング部位に相当するそれぞれのヌクレオチドＡ（配列番号３３の１、３、７、８または１３位のヌクレオチド）はエディティングすることができまたはできない、または
３２個のアンチセンスＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドのセットのオリゴヌクレオチドのいずれか、すなわち５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ ｍＲＮＡ断片に１００％相補的であるものであって、上記断片は配列番号３３の配列を含んでなり、配列番号３３において、エディティング部位に相当するそれぞれのヌクレオチドＡ（配列番号３３の１、３、７、８または１３位のヌクレオチド）はエディティングすることができまたはできない
ものを表すものである。
【００６７】
更に一層好ましい態様では、本発明の主題は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列であって、上記配列が、下記のプローブのセット：
配列番号１−３２のヌクレオチド３からヌクレオチド１５までの断片の配列を含んでなる配列の３２個のプローブのセットであって、ヌクレオチド３からヌクレオチド１５までの上記断片の外側に配置されたこれらのプローブの部分は５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの（ＤＮＡにおける）相当する部分と同一であるもの、または
配列番号１−３２の配列の３２個のプローブのセット
からなる群から選択されるるまたはを含んでなることを特徴とする配列である。
【００６８】
もう一つの態様によれば、本発明の主題は、同じ固体支持体に配置された本発明による少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなるバイオチップであって適当な場合には、上記固体支持体を活性化または官能化して、特に上記の固体支持体から選択される上記プローブを共有結合させることができるものである。
【００６９】
もう一つの態様では、本発明の主題は、溶液中で本発明による少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなるリアクターである。
【００７０】
もう一つの態様では、本発明の主題は、装置、特に少なくとも２種類の容器またはキューピュール（cupule）からなるプレートまたはマイクロプレートであって、上記装置は本発明による少なくとも２種類のプローブの配列を含んでなり、容器またはキューピュール（cupule）のそれぞれは上記プローブの一つを含んでなる。
【００７１】
好ましくは、本発明は、上記プローブが上記固体支持体に、特に共有結合によって結合しているバイオチップに関する。
【００７２】
もう一つの態様では、本発明の主題は、試料中のターゲット核酸を検出し、または定性的または定量的に分析するための試薬のキットであって、本発明による少なくとも２種類のプローブの配列および／または本発明によるバイオチップを含んでなることを特徴とするものである。
【００７３】
更にもう一つの態様によれば、本発明の主題は、試料中のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法であって、
ａ）  上記ターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料を沈着させ、その存在の検出を、本発明によるバイオチップ上、または本発明による装置の容器またはキューピュール（cupule）のそれぞれ中で、上記ターゲットオリゴヌクレオチドを上記プローブと特異的にハイブリダイゼーションする条件下で探索し、
ｂ）  適当な場合には、段階ａ）で得たバイオチップをハイブリダイゼーションによって捕捉されていない試料の核酸を除去する条件下で洗浄し、
ｃ）  上記プローブのそれぞれでの特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する
段階を含んでなることを特徴とする、方法である。
【００７４】
本発明は、試料中のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法であって、上記ターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される断片の配列中に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることができるｍＲＮＡ断片から上記ターゲットオリゴヌクレオチド誘導され、
ａ）  上記ターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料を沈着させ、その存在の検出を、本発明によるプローブの配列で被覆したバイオチップ上、または本発明による装置の容器またはキューピュール（cupule）のそれぞれ中で、上記ターゲットオリゴヌクレオチドを上記プローブと特異的にハイブリダイゼーションする条件下で探索し、
ｂ）  適当な場合には、段階ａ）で得たバイオチップをハイブリダイゼーションによって捕捉されていない試料の核酸を除去する条件下で洗浄し、
ｃ）  上記プローブのそれぞれでの特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する
段階を含んでなることを特徴とする、方法である。
【００７５】
本発明は、任意のターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される断片の配列に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることができるｍＲＮＡ断片から誘導される上記ターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法であって、
ａ）  上記ターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料を沈着させ、その存在の検出を、
本発明によるプローブの配列で被覆したバイオチップ上、または
本発明による装置の容器またはキューピュール（cupule）のそれぞれ中、特に少なくとも２個のキューピュール（cupule）からなるマイクロプレートのキューピュール（cupule）のそれぞれにおいて
上記ターゲットオリゴヌクレオチドを上記プローブと特異的にハイブリダイゼーションする条件下で探索し、上記マイクロプレートは本発明によるプローブの配列を含んでなり、キューピュール（cupule）のそれぞれは上記プローブの一つだけを含み、上記プローブの配列は、エディティングすることができるまたはできないｍＲＮＡ断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドの存在の可能性を試料中で検出しおよび／または定量することができる異なるプローブのセットからなりまたは含んでなり、
ｂ）  適当な場合には、段階ａ）で得たバイオチップをハイブリダイゼーションによって捕捉されていない試料の核酸を除去する条件下で洗浄し、
ｃ）  上記プローブのそれぞれでの特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する
段階を含んでなることを特徴とする、方法である。
【００７６】
本発明は、試料中に存在し且つ５−ＨＴ２Ｃ−ＲのエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する方法であって、
ａ）  上記ターゲットオリゴヌクレオチドを含む試料を沈着させ、その存在の検出を、
本発明による３２個の異なるプローブのセットからなるまたは含んでなる配列で被覆したバイオチップ上、または
本発明による装置であって、本発明による３２個の異なるプローブのセットからなるまたは含んでなる配列を含んでなる装置の容器またはキューピュール（cupule）のそれぞれ中、特に３２個のキューピュール（cupule）を含んでなるキューピュール（cupule）のそれぞれであって、３２個のプローブのセットの上記プローブの一つだけを含むこれらのキューピュール（cupule）のそれぞれにおいて
上記ターゲットオリゴヌクレオチドと上記プローブの特異的ハイブリダイゼーションの条件下で探索し、３２個のプローブのセットにより、試料中で５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡ断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量することができ、上記断片はエディティングすることができるまたはできない配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなり、
ｂ）  適当な場合には、段階ａ）で得たバイオチップをハイブリダイゼーションによって捕捉されていない試料の核酸を除去する条件下で洗浄し、
ｃ）  上記プローブのそれぞれでの特異的ハイブリダイゼーションによって捕捉されるターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する
段階を含んでなることを特徴とする、方法である。
【００７７】
更にもう一つの態様では、本発明は、試料に存在するエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの総量に対して少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがあるｍＲＮＡのエディティングされたまたはエディティングされていない形態のそれぞれの上記の同じ試料における百分率を決定する方法であって（「エディティング率」と呼ばれる）、試料に含まれ且つエディティングすることができるまたはできないｍＲＮＡ断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量する本発明による方法を含んでなり、その方法において、段階ｃ）の終了時にプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対するプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量の百分率として表される比を上記プローブのそれぞれについて決定することを特徴とする、方法である。
【００７８】
本発明による上記方法の特に好ましい態様では、ターゲットオリゴヌクレオチドはアンチセンスｍＲＮＡであるか、または上記のエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの断片の相補的ＤＮＡであり、上記プローブは上記のエディティングされたまたはエディティングされていないｍＲＮＡの断片の配列に相当するＤＮＡである。
【００７９】
本発明による上記方法の同様に好ましい態様では、ターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される上記断片は、真核生物、特にヒトなどの哺乳類由来の生物試料から抽出された核酸の断片である。
【００８０】
もう一つの好ましい態様では、本発明による方法で用いられるターゲットオリゴヌクレオチドに、検出可能なシグナル、好ましくは蛍光または放射性シグナルを直接または間接的に生成することができる標識を予備標識する。
【００８１】
もう一つの態様では、本発明は、核酸を精製しまたは核酸をシークエンシングするためのアフィニティーマトリックスとしての本発明によるバイオチップまたは装置の使用である。
【００８２】
本発明は、遺伝子多型、特にＳＮＰ（「単一ヌクレオチド多型」）を検出しおよび／または検討するための、または遺伝子発現を定性的または定量的に分析するための本発明によるバイオチップまたは装置の使用でもある。
【００８３】
例えば、バイオチップ上または容器、特に本発明による装置のキューピュール（cupule）に目的とする既知の遺伝子に相当するＤＮＡプローブを沈着することができるが、これに限定されない。それぞれの沈着物は遺伝子に相当するプローブを含むことができ、且つ沈着物毎に、プローブは多型を示す上記遺伝子に相当する。
【００８４】
組織、細胞または検討が望まれる微生物の遺伝子ＤＮＡまたはＲＮＡまたはｍＲＮＡを抽出した後、蛍光色素または放射性化合物で標識することができる（ＤＮＡはＰＣＲによって増幅することができ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡは特に逆転写によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換し、適当な場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅し、またはアンチセンスＲＮＡに転換することができる）。
【００８５】
これらのアンチセンスＲＮＡまたはｃＤＮＡを、次に本発明によるプローブで被覆したバイオチップ上に沈着させ、適当な場合には、それらに相当する予め沈着したこれらのプローブと特異的ハイブリダイゼーションによって結合することができる。シグナル、特に蛍光または放射能の量、従ってハイブリダイズしたターゲット核酸の量に相当し、特に抽出したｍＲＮＡの初期量に比例するものを、沈着したターゲットＤＮＡが逆転写したｍＲＮＡからの相補的ｃＤＮＡであるときには、それぞれの沈着物情またはそれぞれの容器に検出される。従って、ある種の遺伝子に対する細胞の転写活性を測定することができる。
【００８６】
従って、本発明によるこれらのＤＮＡバイオチップまたは装置についての多くの応用、例えば、転写研究、診断（突然変異の探求）、治療ターゲットの探求、または遺伝子型形成がある。
【００８７】
本発明は、ｍＲＮＡのエディティング率を決定するための本発明によるバイオチップまたは装置の使用でもある。
【００８８】
本発明による試薬キットにおいて、本発明によるバイオチップまたは装置を用いる工程による分析方法によって、短いＤＮＡ配列での１以上の塩基置換を明らかにすることができる。それらは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を明らかにすることもできる。それらにより、ｍＲＮＡのエディティング度を、このエディティングが単一部位に限定されていてもまたは同じｍＲＮＡ分子の幾つかの部位に影響する場合にも、測定することもできる。換言すれば、それらにより、塩基組成がどのようなものであっても所定の短い配列における１以上のヌクレオチドの任意のミスマッチを明らかにすることができる。従って、この特徴により、それらは遺伝子型形成を行うことができ、ヒト、動物および植物に感染するウイルス、原核生物または真核生物であってもよい病原体の存在を現出することができるので、点突然変異の診断を促進することができる。それらは、様々な配列に一定割合の対になったグアニンとシトシンを有することを必要としないので、今日まで用いられてきたものとは異なる方法により短いプローブを有するトランスクリトーム（transcriptome）を分析することもできる。最後に、それらは、比較ゲノミックス（comparative genomics）に関連して、同じ種または異なる種に属する個体の遺伝子型形成を行うことができる。
【００８９】
もう一つの態様では、本発明の主題は、所定の分析条件下で、エディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールを、特定の組織試料を用いてまたは真核生物細胞の個体群の試料を用いて得るためのＳＳＣＰ法であって、
ａ）  上記試料の総ＲＮＡの抽出の後、適当な場合には、ｍＲＮＡの精製、
ｂ）  段階ａ）で抽出したＲＮＡの逆転写および二本鎖ＤＮＡの合成、
ｃ）  エディティングすることができる上記ｍＲＮＡに特異的なプライマーの対であって、ＲＮＡ抽出物に存在する可能性がある総てのエディティング形態を増幅することができるように選択されるこのプライマーの対であり、蛍光団で標識したこれらのプライマーを用いる、段階ｂ）で得られたＤＮＡのＰＣＲ増幅、
ｄ）  適当な場合には、段階ｃ）で得たＰＣＲ生成物の精製、
ｅ）  適当な場合には、段階ｄ）で得たＰＣＲ生成物の精製、
ｆ）  特に、加熱の後急激な冷却による二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、
ｇ）  毛細管電気泳動による一本鎖ＤＮＡの分離、および
ｈ）  蛍光の読み取りによる、本明細書では「エディティングプロフィール」と表される様々な一本鎖ＤＮＡの電気泳動的移動プロフィールの取得、および適当な場合には、蛍光リーダーに関連した活用系によるプロフィールデータの獲得
の段階を含んでなることを特徴とする、方法である。
【００９０】
「ＳＳＣＰ法」という用語は、本明細書の説明では、一本鎖ＤＮＡコンホメーション多型（ＳＳＣＰ）の証明に基づく方法を表すものである。
【００９１】
好ましくは、本発明によるＳＳＣＰ法では、段階ｃ）で用いられるプライマーの対は、得られるＰＣＲ産物の長さが少なくとも１００塩基であり、更に好ましくは、長さが少なくとも１２５、１５０、１７５、２００、２２５または２５０塩基であって、段階ｇ）の後に分離される２本の鎖のそれぞれのエディティング形態のフォールディング特性を可能とするように選択される。
【００９２】
好ましくは、本発明によるＳＳＣＰ法では、エディティングすることができる上記ｍＲＮＡは膜受容体、特にセロトニン５−ＨＴ２Ｃ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）のもの、またはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のものであり、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒが最も好ましい。
【００９３】
好ましくは、本発明によるＳＳＣＰ法では、エディティングすることができる上記ｍＲＮＡは膜受容体５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのものであり、プライマーの対は下記の対であり、好ましくは蛍光団で標識したものである。
ＰＣＲ９  ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣＴ（配列番号３６）、および
ＰＣＲ１０  ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧ（配列番号３７）。
【００９４】
もう一つの態様では、本発明の主題は、所定の分析条件下で、エディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールおよびエディティング率を、特定の組織試料を用いてまたは真核生物細胞の個体群の試料を用いて得るためのＳＳＣＰ法であって、
ａ）  上記の本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｂ）  段階ａ）で得たプロフィールを、
これらの所定の条件下で上記ｍＲＮＡのエディティングされた（またはエディティングされていない）分離形態のそれぞれについて得た特徴的プロフィール、および／または
これらの所定の条件下で得たこれらのエディティングされたまたはエディティングされていない形態のそれぞれの既知の定性的および／または定量的混合物の特徴的プロフィール、および／または
これらの同一の所定の条件下での、正常患者または病状が確かめられた患者、上記の特定組織のｍＲＮＡ抽出物、あるいは真核生物の上記個体群であって、好ましくは上記ｍＲＮＡのエディティング率の変動を制御することができる条件下で培養した個体群についてのこの同じｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィール
に相当する標準的プロフィールと比較し、
ｃ）  段階ａ）で得たエディティングプローブに相当する既知のエディティングプロフィールを選択し、
ｄ）  段階ｃ）で得たプロフィールのエディティング率を、段階ａ）で得たエディティングプロフィールと結合させる
段階を含んでなる、方法である。
【００９５】
ｍＲＮＡのエディティングプロフィールおよびエディティング率を得るための本発明による上記ＳＳＣＰ法において、本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得るための段階ａ）を含む方法、好ましくはＳＳＣＰ法（ＰＣＲ産物の長さ、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒまたはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡについての配列番号３６および配列番号３７のプライマーの対、それらの標識）について示された方法も、本明細書で記載される。
【００９６】
更にもう一つの態様では、本発明は、哺乳類細胞に存在する膜受容体をコードするｍＲＮＡの断片上に位置したエディティング部位のエディティングを調節することができる化合物を選択する方法であって、上記のエディティングされたｍＲＮＡ断片が「Ｅ」と表示される配列を有し、上記エディティングされていないｍＲＮＡ断片が「ＵＥ」と表示される配列を有し、
Ａ）  評価を行う上記化合物を、エディティングすることができる上記ｍＲＮＡの遺伝子を発現する細胞の個体群と接触させ、
Ｂ）  上記ｍＲＮＡ断片から誘導され、段階Ａ）で得られた上記細胞から誘導される核酸抽出物から得られるターゲットオリゴヌクレオチドの試料を用いて、試料中のターゲットオリゴヌクレオチドであって、このターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される断片の配列上に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがあるｍＲＮＡ断片から誘導される上記ターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量するための本発明による方法によって上記細胞中の上記ｍＲＮＡのエディティング部位のエディティングの調節または非調節を明らかにし、上記方法において、上記プローブの少なくとも２個は２個のＤＮＡであって、一方が上記断片「Ｅ」のＤＮＡ配列に相当し、他方が上記断片「ＵＥ」のＤＮＡ配列に相当し、
Ｃ）  適当な場合には、段階Ｂ）で上記した方法の段階ｃ）において、上記プローブのそれぞれにおいて捕捉されたターゲットオリゴヌクレオチド検出および／または定量をコントロール細胞の個体群を用いて得たものと比較し、
Ｄ）  この化合物が上記エディティング部位のエディティングを調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法である。
【００９７】
この他の態様では、本発明は、真核生物細胞、特に哺乳類細胞に存在するｍＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物の選択方法であって、
Ａ）  評価を行う上記化合物を、エディティングすることができる上記ｍＲＮＡを発現する真核生物細胞の個体群と接触させ、
Ｂ）  上記ｍＲＮＡ断片から誘導され、段階Ａ）で得られた上記細胞から誘導される核酸抽出物から得られるターゲットオリゴヌクレオチドの試料を用いて、ターゲットオリゴヌクレオチドが誘導される断片の配列上に少なくとも１個のエディティング部位を含んでなることがあるｍＲＮＡ断片から誘導される上記ターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量するための本発明による方法によって上記細胞中の上記ｍＲＮＡのエディティング部位のエディティング率の調節または非調節を明らかにし、
Ｃ）  段階Ｂ）における上記方法の段階ｃ）の終了時に上記プローブのそれぞれについて、１個のプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量のプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対する百分率として表される比に相当するエディティング率を決定し、
Ｄ）  適当な場合には、得られたエディティング率をコントロール細胞の個体群について得られたエディティング率と比較し、
Ｅ）  この化合物がエディティング率を調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法でもある。
【００９８】
気分は、ヒトをその応答を制御する出来事や感情によって最高の喜びから最も深い苦痛へと変える基本的な情緒的素質であり、ヒトを社会的、情緒的および職業的環境にできるだけ適合させる。気分の調節は、モノアミン作動系、すなわちノルアドレナリン作動系、セロトニン作動系およびドパミン作動系に属する神経伝達物質を伴う複雑な過程である。これらの神経伝達物質は、血漿膜にある受容体を介して作用する。これらの受容体がチャンネル受容体であるときには、リガンドの結合がその活性を調節し、一方、細胞内エフェクターにカップリングしているときには、同じリガンドの結合により血漿膜を通るシグナル伝達を生じる。このシグナル伝達は、受容体の細胞外部分へリガンド結合した後の受容体におけるコンホメーション変化の結果である。これらの神経伝達物質に対する細胞応答の特異性は、第一に受容体の性質によって変化し、従ってコンホメーション変化の後に細胞内部に生じる相互作用の種類によって変化し、第二に、このようにして誘導される関係した細胞の種類に特異的な生化学反応カスケードの性質によって変化する。
【００９９】
単一の神経伝達物質に応答する気分の調節に単独で関与する受容体はなく、これらの受容体の遺伝子の発現は相互に連絡しているので、ますますその通りである。しかしながら、「第二世代」と呼ばれる新しい抗鬱剤であって、三環系抗鬱剤類にも、またはものアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）にも属さないものでは、フルボキサミン（Floxyfral（商標））、フルオキセチン（Prozac（商標））およびパロキセチン（Deroxat（商標））のようなそれらの幾つかは、シナプス間隙におけるセロトニン再捕捉の強力で特に特異的な阻害薬であると考えられている（これに関しては、Goodnick et al. J. Psychopharmacol. 1998, 12(3) (Suppl B) S5-20を参照されたい）。換言すれば、この種の抗鬱剤はシナプス間隙でのセロトニン濃度の増加を引き起こすことによって作用し、従ってシグナル伝達の数または効率に関してセロトニンが不十分であるかまたはセロトニン受容体が不十分であるため、シグナル伝達を極めて弱くする。
【０１００】
セロトニンまたは５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）は、様々なサブタイプの受容体に結合することによって極めて多様な生理学的効果を引き起こす神経伝達物質である。セロトニン受容体の５−ＨＴ２ファミリーは、７個の膜貫通ドメインを有する三量体性のＧタンパク質にカップリングした受容体の大きな群に属する。このファミリーは、ＧｑによってホスホリパーゼＣβを活性化する３種類の受容体のサブタイプ（５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂおよび５−ＨＴ２Ｃ）を含んでなる。後者のホスホリパーゼは、活性化した後、膜リン脂質を加水分解し、その結果、イノシトールリン酸（ＩｎｓＰ）の細胞内濃度および血漿膜と会合したままになっているジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の出現が増加する。５−ＨＴ２Ｃサブタイプ受容体（５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ）は、皮質、線条、視床下部、嗅球および脈絡叢などの中枢神経系に存在する。５−ＨＴ２Ｃ−Ｒは、気分の調節に関与するセロトニン受容体の一つと思われる。これはまた、性的欲望の認知（これに関しては、Lane, J., Psychopharmacol., 1997, 11(1): 72-82を参照されたい）および空腹感（これに関しては、Bickerdike et al., Diabetes, Obesity and Metabolism, 1999, 1: 207-214を参照されたい）にも関与していると思われる。５−ＨＴ２ファミリーの受容体の分類およびそれらのシグナル伝達の様式に関しては、Baxter et al.(Trends Pharmacol. Sci., 1995, 16(3): 105-110)、およびRoth et al. (Pharmacol Ther., 1998, 79(3): 231-257)、およびそれらに引用されている文献を参照されたい。同様に、５−ＨＴ２受容体の薬理特性決定については、Jerman et al. (Eur. J. Pharm., 2001, 414: 23-30)およびそこに引用されている文献を参照されたい。最後に、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの完全なｃＤＮＡ配列、その遺伝子の構造、および後者の一次転写体の選択的スプライシングの説明はXie et al. (Genomics, 1996, 35: 551-561)に記載されており、相当する配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢ
ＬデータバンクにおいてｃＤＮＡについてはＵ４９５１６、また遺伝子の５’位に位置する配列についてはＵ４９６４８に記載されている。
【０１０１】
７個の膜貫通ドメインを有する三量体性のＧｑタンパク質にカップリングした受容体の機能様式によれば、ホスホリパーゼＣβを活性化するαｑサブユニットは、セロトニンによって５−ＨＴ２Ｃ−Ｒを刺激することによって、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）を加水分解してイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）とＤＡＧとする。このようにして生成したＤＡＧはまた、タンパク質キナーゼＣを活性化し、これにより生化学反応のカスケードによる遺伝子発現が変更される。遺伝子発現の変更の特異性は、関係する細胞の種類によって変化する。ＰＩＰ２の加水分解によって生成したＩＰ３は小さな水溶性分子であり、速やかに細胞質ゾルに拡散し、受容体チャンネルの相互作用によって小胞体からカルシウムを放出する。細胞質ゾルないのカルシウム濃度の突然の増加により、関係した細胞の種類の応答の特性が生成するタンパク質の活性の変更により直ちに細胞応答を生じる。２種類の機構が、細胞質ゾル内のカルシウム濃度を減少させることによる細胞応答の停止状態を制御する。第一のものは、細胞質ゾル、主として細胞からカルシウムが放出される結果であり、第二のものは、ＩＰ３が主として特異的ホスファターゼによって脱リン酸化されることにより、これが速やかに不活性化される結果である。
【０１０２】
ＩＰ３脱リン酸化段階は、リチウム塩である炭酸リチウム（Teralithe（商標））およびグルコン酸リチウム（Neurolithium（商標））によって表されるこの他の薬理化合物のターゲットである。リチウム塩は、１８５０年に通風の治療に用いられ、次いで、１９世紀の終わりに躁病の治療に用いられ、２０世紀の半ばまで忘れられていたが、１９７０年初頭以来、躁期、特に大気分障害の治療に用いられて顕著な成功を収めてきて、双極性気分障害の再発の有効な予防法であることも明らかになっている。リチウム塩は、ＩＰ３の完全な脱リン酸化に関与するイノシトール−１−ホスファターゼの活性を阻害し、ＰＩＰ２合成に本質的なイノシトールの形成および再循環を行う。これらの条件下で、血漿膜の細胞内面でのＰＩＰ２濃度の減少は活性化したホスホリパーゼＣβに対する基質の減少より少なく、その結果、三量体性Ｇｑ−タンパク質にカップリングした受容体の活性化の効果が損なわれる。換言すれば、リチウム塩は、とりわけ、利用可能なＰＩＰ２を減少させ、これによってシグナル伝達が損なわれ、シグナルの伝達数および効率に関して、過剰セロトニンまたは過剰なセロトニン受容体により多くなりすぎる（リチウム塩の作用様式の最新の理解に関しては、Coyle et al., 2002, Nature Medicine, 8(6): 557-558、およびそこに引用されている文献を参照されたい）。
【０１０３】
従って、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒは、細胞からの応答を可能にし、その大きさはシグナル伝達の効率によって変化するので、気分の調節におけるセロトニン応答の重要な分子の一つと思われる。Ｘ染色体によって運ばれる唯一の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒがあり、従って男性でのこの遺伝子の対立形質は１個であり、女性では２個であり、その一方は２個のＸ染色体の一方の不活性化により潜在的に不活性である。従って、細胞外セロトニン濃度および所定時間に膜に存在する受容体の数のみがセロトニンに応答するシグナル伝達の効率に寄与することが予想される。実際に、５−ＨＴ２Ｃ−ＲのプレｍＲＮＡの示差スプライシングの存在は立証されているが、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの一形態だけが７個の膜貫通ドメインを有し且つ活性であることができると思われる。しかしながら、エディティングと呼ばれる遺伝子発現の転写後調節の機構の結果であるので、同じ遺伝子の発現産物である少なくとも２４種類の異なる受容体がある。
【０１０４】
エディティングは、遺伝子に含まれる情報が転写後に修飾される機構である。「ｍＲＮＡエディティング」という一般的用語は、これらのｍＲＮＡの配列の修飾であって、翻訳中にタンパク質に組込まれるアミノ酸の性質または数に関して変化が生じ、合成を指示する遺伝子の配列からタンパク質の配列を推定することはできなくなる。５−ＨＴ２Ｃ−ＲのプレメッセンジャーＲＮＡは、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループに配置されたアミノ酸の組込みを指示する限定的ｍＲＮＡとなる部分において、ある種のアデノシン（Ａ）の特異的酵素修飾を行うことができる。実際に、一次転写体の５番目のエキソンの末端部および５番目のイントロンの基端部は、２種類の酵素ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２（二本鎖ＲＮＡ依存性アデノシンデアミナーゼ）によって潜在的に認識されるシュテム−ループ構造を形成することができ、これにより、スプライシング前にプレメッセンジャーＲＮＡをエディティングすることができる。このエディティングは、Ａの脱アミノ化によって生成し、次にイノシン（Ｉ）に転換される。スプライシングが完了したならば、エディティングを行ったＡを含むｍＲＮＡの部分は、Ｉを含む。５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡを翻訳するときには、ＩはＧとして読まれると思われる。実際に、Ａの脱アミノ化を行ってＩとした５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡからのｃＤＮＡのイン・ビトロ合成の際には、逆転写体は、通常はＡに対して組込まれてきたｄＴの代わりに、Ｉに対してｄＣを組込む。従って、二本鎖ｃＤＮＡを形成する第二の鎖の合成中に、ｄＧは第一の鎖に組込まれたそれぞれのｄＣに向かい合って導入される。このようにして得られる二本鎖ｃＤＮＡのシークエンシングによって、エディティングを行ったｍＲＮＡにおけるＡのＩへの初期脱アミノ化によるｄＡのｄＧによる置換を観察することができる。従って、ｍＲＮＡのエディティングでは、ＡがＩに置換されるコドンの意味が変更され、従ってこれはＧと読まれると考えられる（更に具体的には、ヒト５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのエディティングに関しては、Fitzgerald et al., Neuropsychopharmacology, 1999, 21(2S), 82S-90Sを参照されたい）。
【０１０５】
第一に、再捕捉を阻害することによるセロトニン濃度を増加することによって作用する第二世代抗鬱剤の作用様式、および第二にＰＩＰ２の利用可能性を制限することによって躁病に作用するリチウム塩の作用様式に関する上記したことを考慮すれば、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒのエディティングの程度（または率）は、気分の調節に確実に役割を演じている。これに関して、ポスト・モルテム（post-mortem）で行ったNiswander et al.の研究（Neuropsychopharmacol., 2001, 24: 478-491）は、特に部位Ａでの５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡが、自殺した患者の脳の前前頭皮質では他の理由で死亡した患者の脳の同じ部位より統計学的に高いことを立証した。
【０１０６】
Gurevich et al. (Neuron, 2002, 34(3): 349-356)によって行われたもう一つの研究を挙げることができ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率が部位Ｅ（文献では、Ｃと表した）で増加し、大鬱病を患っていた自殺した患者の脳の前頭皮質における部位Ｄでは減少したことを明らかにした。
【０１０７】
逆に、Sodhi et al.(Mol. Psychiatry, 2001, 6(4): 373-379)は、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率が、分裂病として分類された患者の脳の前頭皮質で減少することを示した。
【０１０８】
従って、エディティングされていない受容体は躁病状態を生じるが、過度に高度にエディティングされた受容体は鬱状態を生じる。この概要およびその解釈を考慮して、本発明者らは、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率の調節によって、セロトニンによる刺激に対する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの応答が調節されることによって気分が調節されると結論した。従って、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒエディティング率を阻害すると、セロトニンによる刺激に対する応答が増加するが、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率を刺激または増加すると、セロトニンによる刺激に対するこの同じ応答が減少する。これにより、一般に、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率を阻害することができる化合物の抗鬱効果および５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡエディティング率を刺激しまたは増加することができる化合物の躁病に対する阻害効果が生じる。
【０１０９】
従って、特に好ましい態様では、本発明は、真核生物細胞、特に哺乳類細胞の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物の選択方法であって、
Ａ）  評価を行う上記化合物を、上記ｍＲＮＡの遺伝子を発現する真核生物細胞の個体群と接触させ、
Ｂ）  上記ｍＲＮＡ断片から誘導され、段階Ａ）で得られた上記細胞から誘導される核酸抽出物から得られるターゲットオリゴヌクレオチドの試料を用いて、上記細胞中の上記ｍＲＮＡのエディティング率の調節または非調節を試料に含まれるおよび５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの断片から誘導される任意のターゲットオリゴヌクレオチドを検出しおよび／または定量するための本発明による方法によって明らかにし、上記断片は、エディティングすることができるまたはできない配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなり、
Ｃ）  段階Ｂ）における上記方法の段階ｃ）の終了時に、上記プローブのそれぞれについて、１個のプローブによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの量のプローブのセットによって捕捉されるオリゴヌクレオチドの総量に対する百分率として表される比に相当するエディティング率を決定し、
Ｄ）  適当な場合には、得られたエディティング率をコントロール細胞の個体群について得られたエディティング率と比較し、
Ｅ）  この化合物がエディティング率を調節するときには、それを選択する
段階を含んでなる、方法である。
【０１１０】
もう一つの態様では、本発明は、エディティングすることができるｍＲＮＡの遺伝子を発現する真核生物細胞、特にヒトまたはマウスのような哺乳類由来の特定組織または個体群において上記ｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う上記化合物を上記特定組織または上記真核生物細胞の個体群と接触させ、
ｂ）  所定の分析条件下で、エディティングプロフィールを本発明によるＳＳＣＰ法によって得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
同一の所定の分析条件下で、同一の特定組織または同一の真核生物細胞の個体群についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィール、または
評価を行う化合物と接触させていない同一の特定組織または同一の真核生物細胞の個体群について平行して決定され且つ得られたエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが互いに有意差を有するときには、評価を行う上記化合物を選択する
段階を含んでなる、方法である。
【０１１１】
本発明によるｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択し且つ段階ｂ）において本発明によるＳＳＣＰ法によるエディティングプロフィールの取得を含む上記方法において、好ましくはＳＳＣＰ法（ＰＣＲ産物の長さ、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒまたはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡについての配列番号３６および配列番号３７のプライマーの対、それらの標識）について示された方法も、本明細書で記載される。
【０１１２】
もう一つの態様では、本発明の主題は、患者において、エディティングを行うことができるｍＲＮＡのエディティングと少なくとも部分的に関連した病状を予防しおよび／または治療することができる化合物の選択方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う上記化合物を、エディティングを行うことができる上記ｍＲＮＡの遺伝子を発現する特定組織または真核生物の個体群と接触させ、上記特定組織または上記真核生物細胞の個体群は、所定の分析条件下で試験を行う化合物と接触させる前に関連した病状に特徴的な上記ｍＲＮＡのエディティングプロフィールを示し、
ｂ）  これらの所定の条件下で本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
α）  同一の所定の分析条件下で、同一の特定組織または同一の細胞個体群についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィールであって、正常患者または上記の関連した病状を示さない患者に典型的なこのエディティングプロフィール、および適当な場合には、
β）  同一の所定の分析条件下で、同一のコントロールの特定組織または評価を行う化合物と接触させていないコントロール細胞の同一の個体群について得たエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが段階ｂ）で得たものが段階ｃ）α）で得たものと有意に同一であるときには、評価を行う上記化合物を選択し、段階ｂ）で得たプロフィールが段階ｃ）β）で得たものと有意に異なるときにはこの選択を確認する
段階を含んでなる、方法である。
【０１１３】
患者において、本発明によるｍＲＮＡのエディティングと関連した病状を予防しおよび／または治療することができる化合物を選択し、且つ段階ｂ）において、本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得ることを包含する上記方法において、好ましくはＳＳＣＰ法（ＰＣＲ産物の長さ、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒまたはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡについての配列番号３６および配列番号３７のプライマーの対、それらの標識）について示された方法も、本明細書で記載される。
【０１１４】
特定の態様では、本発明の主題は、エディティングを行うことができるｍＲＮＡのエディティングプロフィールを調節することが知られ且つ患者において、同一の関連病状を予防しおよび／または治療することが知られている化合物と同一の治療機構または有効性を有するエディティングを行うことができる上記ＲＮＡのエディティングまたは非エディティングと少なくとも部分的に関連した患者の病状を予防しおよび／または治療することができる化合物の選択方法であって、
ａ）  イン・ビボまたは細胞中で、評価を行う上記化合物を、エディティングを行うことができる上記ｍＲＮＡの遺伝子を発現する特定組織または真核生物の個体群と接触させ、上記特定組織または上記真核生物細胞の個体群は、所定の分析条件下で試験を行う化合物と接触させる前に関連した病状に特徴的な上記ｍＲＮＡのエディティングプロフィールを示し、
ｂ）  これらの所定の条件下で本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得て、
ｃ）  段階ｂ）で得たプロフィールを、
α）  同一の所定の分析条件下で、イン・ビボまたは細胞中で、上記ＲＮＡのエディティングプロフィールを調節することが知られており且つ患者で同一の関連病状を予防および／または治療することが知られている上記化合物と接触させた同一の特定組織または同一の細胞個体群について、この同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィール、および適当な場合には、
β）  同一の所定の分析条件下で、同一のコントロールの特定組織または評価を行う化合物と接触させていないコントロール細胞の同一の個体群について得たエディティングプロフィール
と比較し、
ｄ）  段階ｃ）で比較したエディティングプロフィールが段階ｂ）で得たものが段階ｃ）α）で得たものと有意に同一であるときには、評価を行う上記化合物を選択し、段階ｂ）で得たプロフィールが段階ｃ）β）で得たものと有意に異なるときにはこの選択を確認する
段階を含んでなる、方法である。
【０１１５】
患者において、エディティングすることができるｍＲＮＡのエディティングまたは非エディティングと少なくとも部分的に関連した病状を本発明による既知化合物と同じ治療機構または有効性で予防しおよび／または治療することができる化合物を選択し、且つ段階ｂ）において、本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得ることを包含する上記方法において、好ましくはＳＳＣＰ法（ＰＣＲ産物の長さ、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒまたはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡについての配列番号３６および配列番号３７のプライマーの対、それらの標識）について示された方法も、本明細書で記載される。
【０１１６】
更にもう一つの態様では、本発明の主題は、試験を行う患者から採取した組織または細胞試料を用いて、エディティングすることができるｍＲＮＡと少なくとも部分的に関連した疾患を診断し、適当な場合には予測する方法であって、
ａ）  所定の条件下で本発明によるＳＳＣＰ法によって上記ＲＮＡのエディティングプロフィールを得て、
ｂ）  段階ａ）で得たプロフィールを、正常患者または確認された病状を示す患者、同一の所定の分析条件下で同一組織または同一細胞のｍＲＮＡ抽出物、あるいは細胞系由来の細胞についてこの同一のｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィールに相当する標準的プロフィールと比較し、
ｃ）  段階ａ）で比較したエディティングプロフィールに相当する既知のエディティングプロフィールを選択し、
ｄ）  段階ｃ）で選択したプロフィールに関連した診断を試験した患者と関連付ける
段階を含んでなる、方法である。
【０１１７】
本発明によるｍＲＮＡと少なくとも部分的に関連した疾患を診断し、且つ段階ａ）において、本発明によるＳＳＣＰ法によってエディティングプロフィールを得ることを包含する上記方法において、好ましくはＳＳＣＰ法（ＰＣＲ産物の長さ、膜受容体、特に５−ＨＴ２Ｃ−Ｒまたはグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のｍＲＮＡ、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡについての配列番号３６および配列番号３７のプライマーの対、それらの標識）について示された方法も、本明細書で記載される。
【０１１８】
もう一つの特定の態様によれば、本発明は、本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCUA-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物を選択する第一の方法、または段階ｂ）において、エディティングプロフィールを得るための上記ＳＳＣＰ法を含む本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する第二の方法であって、本発明によって記載した第一の方法の段階Ｅ）において、または本発明によって記載した第二の方法の段階ｄ）において、化合物がグルタメート受容体Ｂサブユニット（ＧｌｕＲ−Ｂ）のエディティング率またはエディティングプロフィールも調節しないときには、この化合物を選択することを特徴とする、方法である。
【０１１９】
もう一つの特定の態様によれば、本発明は、本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCUA-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物を選択する第一の方法、または段階ｂ）において、エディティングプロフィールを得るための上記ＳＳＣＰ法を含む本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する第二の方法であって、本発明によって記載した第一の方法の段階Ｅ）において、または本発明によって記載した第二の方法の段階ｄ）において、化合物が上記ＲＮＡ断片の少なくとも１個のエディティング部位のエディティング率を減少させ、このエディティング部位がエディティングされるときに５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループのアミノ酸の配列を変更する場合、特にこのエディティング率の減少がセロトニンによる刺激に応答する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子を発現する細胞の能力を増加させる場合には、この化合物が選択されることを特徴とする、方法である。
【０１２０】
もう一つの特定の態様では、本発明は、本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCUA-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節することができる化合物を選択する第一の方法、または段階ｂ）において、エディティングプロフィールを得るための上記ＳＳＣＰ法を含む本発明による５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率および／またはエディティングプロフィールを調節することができる化合物を選択する第二の方法であって、本発明によって記載した第一の方法の段階Ｅ）において、または本発明によって記載した第二の方法の段階ｄ）において、化合物が上記ＲＮＡ断片の少なくとも１個のエディティング部位のエディティング率を増加させ、このエディティング部位がエディティングされるときに５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループのアミノ酸の配列を変更する場合、特にこのエディティング率の増加がセロトニンによる刺激に応答する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子を発現する細胞の能力を減少させる場合には、この化合物が選択されることを特徴とする、方法である。
【０１２１】
更にもう一つの態様では、本発明は、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率を調節することができる化合物であって、本発明によって真核生物細胞、特に哺乳類細胞の５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡのエディティング率を調節することができる化合物を選択する方法によって選択されたまたは選択することができる上記化合物の、上記治療を必要とする患者の気分を調節することを目的とした医薬組成物を調製するための、特にこの選択された化合物が上記エディティング部位のエディティング率を減少させる場合には鬱病の治療、またはこの選択された化合物が上記エディティング部位のエディティング率を増加させる場合には躁病またはある種の分裂病の治療を目的とした医薬組成物を調製するための使用である。
【０１２２】
更にもう一つの態様によれば、本発明の主題は、気分の治療のための５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCUA-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片のエディティング率を調節する活性を有する化合物である。
【０１２３】
５−ＨＴ２Ｃ−Ｒエディティングを調節する医薬生成物で改良することができる気分障害については、「精神障害の診断および統計便覧（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)」，第４版，本文改訂，the American Psychiatrie Association, Washington DC, 2000, DSM-IV（商品名）を参照されたい。
【０１２４】
鬱病については、特に
１以上の鬱的エピソードを特徴とする大鬱病（すなわち、少なくとも４回の追加的鬱症状を伴う興味の喪失を有する少なくとも２週間の鬱的気分）（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ３４９−３６９参照）、
双極性鬱病：
双極性Ｉ：  １以上の躁または混合エピソード、一般に鬱病の主エピソードを伴うことを特徴とする（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ３８２参照）、
双極性ＩＩ：  １以上の大鬱病のエピソード、少なくとも１回の軽躁エピソードを伴うことを特徴とする（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ３９２参照）、
循環病：  少なくとも２週間の軽躁症状と鬱的症状の多数の器官を特徴とする（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ３９８参照）、
憂鬱：  憂鬱状態は大鬱病患者および双極性鬱病の患者で見られる。この状態は総ての活動における興味および／または喜びの喪失を特徴とし、通常は喜びを誘発する刺激に対する反応の減少をも特徴とする（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ４１９参照）、および
分裂病：  少なくとも６ヶ月間継続し、少なくとも１ヶ月間の陽性症状（妄想、幻覚、言語混乱）および陰性症状（鬱型）（ＤＳＭ−ＩＶ  ｐ２９８参照）
が挙げられる。
【０１２５】
この他の態様では、本発明の特別な主題は、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片の少なくとも１個のエディティング部位のエディティング率を減少させることができる化合物であって、このエディティング部位をエディティングするときには、鬱病の治療のため５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループのアミノ酸の配列を変更し、特にこれがエディティング率が減少するときには、セロトニンによる刺激に応答する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子を発現する細胞の能力を増加する、化合物でもある。
【０１２６】
この他の態様では、本発明の特別な主題は、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなるＲＮＡ断片の少なくとも１個のエディティング部位のエディティング率を増加させることができる化合物であって、このエディティング部位をエディティングするときには、躁病またはある種の分裂病の治療のため５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループのアミノ酸の配列を変更し、特にこれがエディティング率が増加するときには、セロトニンによる刺激に応答する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子を発現する細胞の能力を減少する、化合物でもある。
【実施例】
【０１２７】
下記の例、および図および以後の説明文は、当業者への説明を完全にして、本発明を実施し、使用することができるように選択した。これらの例は、本発明者がその発明であると考えているものの範囲を限定しようとするものではなく、以後の実験だけを行ったことを示そうとするものではない。
【０１２８】
例１：  ５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの３２の形態のそれぞれの割合を特異的ハイブリダイゼーションによって一段階で決定する方法
以後に記載される方法によって、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡに含まれる情報の増幅が必要であっても、これらのｍＲＮＡの３２の形態のそれぞれの割合を特異的ハイブリダイゼーションによって一段階で決定することができる。
【０１２９】
ｍＲＮＡエディティングの後、ＡをＩに置換し、次にこれをｃＤＮＡ中のｄＧで置換する。換言すれば、初期のｍＲＮＡエディティング中にＩに転換されるＡの数が大きくなれば、特異的ハイブリダイゼーションに要する温度は高くなる。ｄＧをｄＩで置換することによって、下記の方法によって単一温度でハイブリダイゼーションを行うことができる。
【０１３０】
必要な場合には、出発ｍＲＮＡの量が少なすぎる場合には、イン・ビトロで増幅される情報を一本鎖ＲＮＡの形態で線形的にイン・ビトロ転写（ＩＶＴ）によって行うことができ、これは、ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）に続いてＰＣＲによる指数的増幅の後に、ＲＴ−ＰＣＲによって二本鎖ＤＮＡの形態で行うこともできる。情報が一本鎖ＲＮＡの最終形態または二本鎖ＤＮＡの最終形態で増幅されるかどうかに関わらず、総ての場合に、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成の際には、ｄＣはそれぞれのＩに向き合って組込まれ、相補鎖の合成の際には、ｄＧがそれぞれのｄＣに向き合って組込まれるので、Ｉの同定の問題がある。これにより、様々なプローブにハイブリダイズする配列が初期のｍＲＮＡに相補的な配列であるときには、配列がＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＡの形態でまたはＩＶＴによるＲＮＡの形態で得られるかどうかによって、それらはそれぞれエディティングされていないＡに向き合ったｄＴまたはＵ、およびそれぞれのＩに向き合ったｄＣまたはＣを含むということができる。
【０１３１】
出発ｍＲＮＡに含まれる情報がセンス鎖のＩＶＴによって増幅されるときには、合成されるＲＮＡ分子はｍＲＮＡと同一配列を有するが、Ｉに対してエディティングされたＡはＧで置換される。逆に、アンチセンス鎖のＩＶＴによって、配列が出発ｍＲＮＡの配列に相補的であるが、ＣはＡからＩにエディティングされた部位に向き合ったＵを置換しているＲＮＡ分子を合成することができる。
【０１３２】
従って、ハイブリダイゼーション温度を総てのプローブについて同一にするには、支持体上にプローブの形態で沈着した一本鎖ＤＮＡは初期ｍＲＮＡと同じ配列を有するが、ｄＡはエディティングされていないＡを置換し、ｄＩはこれらのＡのＩへのエディティングから生じるＩを置換している。従って、初期のＲＮＡが二本鎖ＤＮＡの形態でＲＴ−ＰＣＴによってまたは初期のｍＲＮＡからアンチセンスＲＮＡの形態でＩＶＴによって増幅されるかどうかに関わらず、一方では、ｄＡとｄＴまたはＵとの間の、および他方ではｄＩとｄＣまたはＣとの間の２個の水素結合が常に形成される。
【０１３３】
５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの様々なエディティングされたまたはエディティングされていない形態を同定するのに要する３２個のプローブの配列を、下記に示す。
【０１３４】
Ｔｍ値はプローブのそれぞれについて個々に測定し、温度以外の総ての条件は同一であり、総てのプローブについてのハイブリダイゼーション温度は、測定した２つの極限Ｔｍ値の間で選択し、この場合には、配列番号（SEQ ID No.）１の配列のプローブと配列番号３２の配列のプローブについて測定した。
【０１３５】
Ｔｍ以外の条件は、測定した２つの極限Ｔｍ値の差ができるだけ小さくなるように画定する。
【０１３６】
５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの様々な初期形態を、対になった３２の配列の放射能または蛍光強度を測定することによって定量する。測定した３２個の値の和は５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの様々な初期形態の和に直接比例するので、このｍＲＮＡの形態のそれぞれの割合は、それぞれの形態について個々に測定した値を３２個の形態の値の和で割ることによって推定することができる。
【０１３７】
【化１】
2005533510.tif 000002
2005533510.tif 000003
2005533510.tif 000004
【０１３８】
Ｔｍ値はプローブのそれぞれについて個々に測定し、温度以外の総ての条件は同一であり、本発明者らは、正常プローブ（ｄＩがｄＧで置換されている本発明のプローブの配列）について測定した２つの極限Ｔｍ値の間で得た差と比較した配列番号１の配列のプローブと配列番号３２の配列のプローブについて測定した２つの極限Ｔｍ値の間で得た差を極めて有意に減少させることができることを示した。
【０１３９】
結果
本発明の配列番号１〜３２の配列のプローブの配列について：
ΔＴｍｅｘｔ（℃）＝６１．１±０．１３−５４．１３±０．４４、すなわち、約６．９７℃；
正常プローブの配列（ｄＩなし）について：
ΔＴｍｅｘｔ（℃）＝７４．１±０．２−６１．１±０．１３、すなわち、１３．００℃。
【０１４０】
本発明のプローブの配列の特異性
本発明者らは、本発明の総てのプローブについて選択されたハイブリダイゼーション温度（６１．１および５４．１３℃、好ましくは５７．６℃の平均値の範囲）では、本発明の配列番号３２のプローブは、配列番号３２のプローブの１５位に配置されたｄＩに相補的な一に配置された塩基を除き（Ｔｍ  ４９．４℃）、このプローブに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないことも示した。
【０１４１】
例２：  実施した例
下記に展開される実施例は、ｍＲＮＡエディティングと、応用のためのセロトニン受容体の一つのｍＲＮＡのエディティングに関する。この例は、初期に対になったグアニンとシトシンの割合が短い配列では３０％未満から６０％附近になるときでも、単一温度条件下でハイブリダイゼーションを行うことができることを示す。
【０１４２】
５個のアデノシンは３個の異なるコドンで潜在的にエディティングすることができ、２５＝３２個のｍＲＮＡ配列の異なる組合せと、３ｘ４ｘ２＝２４個のアミノ酸配列の異なる組合せを生じる（下図参照）。Ａ−Ｅ（またはＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＣ’）の標記を与えられたエディティングすることができる５個の部位におけるアデノシンの脱アミノ化によって、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループの３個のアミノ酸が置換される。エディティングされていないｍＲＮＡ（配列番号３４）の翻訳によって合成された５−ＨＴ２Ｃ−Ｒは、第二の細胞内ループにおけるアミノ酸Ｉ−Ｎ−Ｉ（イソロイシン−アスパラギン−イソロイシン）からなり、完全にエディティングされたｍＲＮＡ（配列番号３５）またはＡ、Ｅ、ＣおよびＤの部位で同時にエディティングされたｍＲＮＡの翻訳によって合成されたものはアミノ酸Ｖ−Ｇ−Ｖ（バリン−グリシン−バリン）からなり、Ｉが効果的にＧと読まれるときには、コドンＩＵＩまたはＩＵＡはいずれもバリンの組込みを指定する。コドンＡＵＩ、ＡＩＵおよびＩＡＵはそれぞれＭ（メチオニン）、Ｓ（セリン）およびＤ（アスパラギン酸）の組込みを指定するので、アミノ酸の２４個の組合せは５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループにおいて、そのｍＲＮＡの異なる配列の３２の組合せについて実際に可能である。
【０１４３】
【化２】
2005533510.tif 000005
【０１４４】
５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの第二の細胞内ループは、受容体の三量体性Ｇｑタンパク質へのカップリングに関与している。エディティングされたｍＲＮＡの翻訳によって合成された５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ（Ｉ−Ｎ−Ｉ）は構成的カップリング活性を示し、従ってホスホリパーゼＣβの恒久的活性化を示すが、完全にエディティングされたｍＲＮＡの翻訳によって合成された５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ（Ｖ−Ｇ−Ｖ）は三量体性Ｇｑタンパク質へのカップリングの欠落によってセロトニンによる刺激に余りよく応答しない。換言すれば、エディティングの程度によって、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒはセロトニンによる刺激に応答する能力は大きくまたは小さくなる。
【０１４５】
ｍＲＮＡの３２の可能な形態のそれぞれによって表される割合を測定することができることは、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒの２４の形態のそれぞれの割合を予測し、従ってセロトニンによる刺激に対する５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ応答の有効性を間接的に推計できることに等しい。２つの方法を用いて、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの様々な形態の割合を評価した。これらの２つの方法は、同等な情報を与えない。
【０１４６】
技術的に最も面倒で最も費用のかかる第一の方法によって、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの３２の形態のそれぞれの割合を統計的に評価することができる。これは、様々なｍＲＮＡ形態に共通な特異的プライマーによって５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの総てのｃＤＮＡを同時に合成し、次に総てのこれらのｃＤＮＡをプラスミドに挿入した後、これを細菌にトランスフェクションすることからなっている。形質転換および選択の後、これらの細菌をクローニングする。次に、これらのクローニングした細菌を増幅し、プラスミドＤＮＡをそこから抽出して精製した後、挿入されたｃＤＮＡをシークエンシングする。クローニングおよびシークエンシングしたｃＤＮＡの数がｃＤＮＡ、従ってｍＲＮＡの初期個体群を統計的に表すのに十分であるときには、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの初期形態のそれぞれの割合を推定することができる。この数が不十分であるときには、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの主要形態のみが統計的に表される。
【０１４７】
第二の方法は一層速やかに行うことができるが、これにより５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの３２の形態のそれぞれの割合を評価することはできない。一方、エディティングすることができる５個の部位のそれぞれで、Ｉに対するエディティングされたそれぞれのＡの割合を決定することができる。このため、上記の場合と同様に、ｃＤＮＡを合成した後、４個の通常のデオキシリボヌクレオシド三リン酸の３個と、性質を決定することが所望なデオキシリボヌクレオシドに向かい合ったプライマー伸張を終結するジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で行う。例えば、３個のデオキシリボヌクレオシド三リン酸はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰでよく、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸はｄｄＣＴＰ（ジデオキシシチジン三リン酸）であり、これはであった第一のｄＧに向かい合ってそれ自身を組込むことによって、ｃＤＮＡ合成のマトリックスとして働くｍＲＮＡにおけるＩがある位置でのプライマー伸張を停止する。初期アデノシンがエディティングされておらず、従ってｃＤＮＡ中でｄＧで置換されているときには、プライマーは第一のｄＧまで伸長された後、エディティングされていないアデノシンから生じるｄＡ  が続く。これらの条件下では、プライマーはｃＤＮＡの２本の鎖の一方または他方に相補的になるように慎重に選択されねばならず、また５’位において３２Ｐで標識されており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離後のオートラジオグラフィーによって可視化されるものでなければならない。様々な分離した断片に含まれる放射能を測定することによって、エディティングすることができる５個の部位のそれぞれでエディティングされたＡの割合を評価することができる。エディティングすることができる部位があるのと少なくとも同数のプライマーが必要である。
【０１４８】
例３  様々な（エディティングされたまたはエディティングされていない）形態の同定および定量、および相補的ＤＮＡのＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型）によるｍＲＮＡエディティングプロフィールの決定
Ｉ）  プロトコール
１．  総ＲＮＡ抽出：
ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ溶液（付表Ｃ）中の凍結組織または新たに切開した組織からＲＮＡを抽出するため、これらの組織をβ−メルカプトエタノール（付表Ｃ）３．５μｌを加えたNucleoSpin RNA II抽出キット（付表Ｂ１）のＲＡ１溶液３５０μｌ中で摩砕する。溶解物を、濾過カラム（付表Ｂ１）上で１１０００ｘｇで１分間遠心分離することによって濾過する。濾液を７０°エタノール溶液３５０μｌでホモジナイズした後、全混合物をNucleospin RNAIIシリカカラム（付表Ｂ１）上で８０００ｘｇで３０秒間遠心分離する。次に、カラムをＭＤＢ（膜脱塩緩衝剤）溶液（付表Ｂ１）３５０μｌを用いて洗浄し、１１０００ｘｇで３０秒間遠心分離する。任意の可能な汚染性ゲノムＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液（付表Ｂ１）１０μｌをカラムに周囲温度で３０分間加える。ＤＮＡが完全に消化した後、ＤＮａｓｅ ＩをＲＡ２溶液（付表Ｂ１）２００μｌで洗浄することによって除去した後、ＲＡ３溶液（付表Ｂ１）６００μｌで更に洗浄し、それぞれの洗浄の後に８０００ｇで３０秒間遠心分離を行う。カラムに付着したＲＮＡを最終回にＲＡ３溶液（付表Ｂ１）２５０μｌで洗浄し、最後に１１０００ｘｇで２分間遠心分離することによって乾燥する。１１０００ｇで１分間遠心分離した後、ＲＮＡｓｅ不含水（付表Ｂ１）６０μｌで溶出する。
【０１４９】
２．  逆転写：
この段階については、ThermoScript ＲＴ−ＰＣＲシステムキットおよびプロトコール（付表Ｂ２）を用いる。それぞれのＲＮＡ試料に対して、総ＲＮＡ  ５００ｎｇをポリ−（ｄＴ）２０  （５０μＭ；  付表Ｂ２）と混合し、場合によってはＲＮａｓｅ不含水（付表Ｂ２）で最終容積を１０μｌとする。この容積を６５℃で５分間インキュベーションした後、直ちに氷中で冷却する。次に、ｃＤＮＡ合成緩衝液（５倍濃縮；  付表Ｂ２）４μｌ、ＤＴＴ溶液（ジチオトレイトールについてＤＴＴ）（０．１Ｍ；付表Ｂ２）、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ；付表Ｂ２）１μｌ、ＲＮａｓｅ不含水（付表Ｂ２）１μｌ、ｄＮＴＰの混合物（ｄＮＴＰ：デオキシリボヌクレオチド三リン酸）２μｌ（それぞれ１０ｍＭ；付表Ｂ２）、およびthermoScript RT (１５Ｕ／μｌ；付表Ｂ２）１μｌを加え、全混合物を５０℃で６０分間インキュベーションする。次に、反応混合物を８５℃で５分間加熱することによって反応を停止する。ＲＮＡを除去するため、反応媒質をＲＮａｓｅ  Ｈ（付表Ｂ２）１μｌの存在下で３７℃で２０分間インキュベーションする。
【０１５０】
３．  ＰＣＲ増幅：
この例では、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子について具体的に説明する。当業者であれば、容易にこのようなＰＣＲ増幅プロトコールの順序を入れ替えて、またはエディティング部位を含んでなるｍＲＮＡ断片を特異的に増幅するためのプライマーの対を選択することによってエディティングすることができる他のｍＲＮＡに適合させることができる。
【０１５１】
５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子の断片のＰＣＲ増幅に用いたプライマーの対ＰＣＲ９、ＰＣＲ１０は、ヒト、マウスおよびラットで同一であるＤＮＡ領域で選択した。プライマーの対の配列は、
ＰＣＲ９  ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣＴ（配列番号３６）、および
ＰＣＲ１０  ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧ（配列番号３７）
である。
【０１５２】
生成するＰＣＲ増幅産物は、ヒト、マウスおよびラットの３種で大きさが２５０塩基対である。
【０１５３】
ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型）の説明のために、これらのプライマーをＣ６−ＦＡＭまたはＨＥＸのような様々な蛍光団で標識することができる。
【０１５４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅段階については、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼプロトコールおよびキット（付表Ｂ３）を用いる。５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ遺伝子エディティング部位を含む領域のＰＣＲ増幅については、反応混合物は、ｃＤＮＡ溶液２μｌ、増幅緩衝液（１０倍濃縮；付表Ｂ３）５μｌ、ＭｇＣｌ２溶液（５０ｍＭ；付表Ｂ３）１．５μｌ、４種類のｄＮＴＰ混合物（それぞれ１０ｍＭ；付表Ｂ３）１μｌ、プライマーＰＣＲ９およびＰＣＲ１０（１０μＭ溶液）１μｌ、Platinum Taq酵素（５Ｕ／ｍｌ；付表Ｂ３）０．５μｌを含んでなり、滅菌蒸留水で５０μｌとした。この反応容積を、最初にＰＴＣ２００サーモサイクラー（付表Ａ）中で９４℃で２分間加熱する。次に、９４℃で３０秒間の変性の後、それぞれの後のサイクルについて０．３℃ずつ減少させた６５℃で３０秒間のハイブリダイゼーション、および７２℃で３０秒間の伸長を含んでなる３０サイクルを行う。最後の伸長段階は、７２℃で６分間行う。
【０１５５】
４．  ＰＣＲ産物の精製：
この精製段階については、Nucleospin Extractプロトコールおよびキット（付表Ｂ４）を用いる。ＰＣＲ（５０μｌ）によって得た反応容積をＮＴ２溶液（付表Ｂ４）２００μｌ  と混合して、直ちに精製カラムに装填する。１１０００ｘｇで１分間遠心分離した後、カラムに付着したＰＣＲ増幅産物をＮＴ３溶液（付表Ｂ４）６００μｌを用いて洗浄し、１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。最終洗浄をＮＴ３溶液（付表Ｂ４）２００μｌを用いて行い、次にカラムを１１０００ｘｇで２分間遠心分離することによって乾燥する。ＤＮＡの溶出は、カラムをＮＥ溶出緩衝液（付表Ｂ４）５０μｌと周囲温度で１分間インキュベーションした後に、１１０００ｘｇで１分間遠心分離することによって得られる。
【０１５６】
５．  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いるＰＣＲ産物の定量：
DNA 1000 Assayキットおよびプロトコール（付表Ｂ５）および２１００バイオアナライザー（付表Ａ）を用いて、ＰＣＲ増幅およびカラム精製の後に得られるＤＮＡの濃度を決定する。ゲルは、ゲルの一部（付表Ｂ５）を色素（付表Ｂ５）２５μｌと激しく混合することによって調製される。次に、このマトリックスを２４００ｇで１５分間遠心分離した後、ＤＮＡチップ（付表Ｂ５）のマイクロキャピラリーに注入する（９μｌ）。定量については、ＰＣＲ  ＤＮＡ（１μｌ）を、内部サイズインジケーター（internal size indicator）（５μｌ；付表Ｂ５）と別のサイズマーカー（１μｌ；付表Ｂ５）の存在下で、相当するウェルに装填する。ＤＮＡの電気泳動および濃度の計算は、2100 Bioanalyzer（付表Ａ）のBioSizingプログラムを作動させることによって行う。
【０１５７】
６．  毛細管電気泳動による一本鎖ＤＮＡの分離：
Ｃ６−ＦＡＭおよびＨＥＸ型の蛍光団（付表Ｃ）を２本の鎖のそれぞれにおいて標識したＰＣＲ増幅ＤＮＡの分析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００装置（付表Ａ）での毛細管電気泳動によって行う。分析を行うＤＮＡ試料を、先ず水で希釈して、濃度を２５０ｐｇ／μｌとする。それぞれの試料について、精製して希釈したＰＣＲ産物溶液１μｌ、GeneScan 500 ROX移動標準０．５μｌ、ＮａＯＨ溶液（０．３Ｎ）０．５μｌ、およびホルムアルデヒド１０．５μｌを含む混合物を調製する。この混合物を９０℃に２分間した後、直ちに氷中で冷却する。毛細管電気泳動は、１５０００ボルトでの３分間の予備移動で始まる。ＤＮＡを、１０００ボルトで２２秒間注入する。最後に、ＤＮＡの電気泳動を、GeneScanPolymerゲル（５％）とグリセロール（１０％）を含む一回濃縮したＴＢＥ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）中で１５０００ボルトおよび１８℃で行う。この段階において、蛍光の読みとデータの取得は、自動的に行われる。これらのデータをＧｅｎｅＳｃａｎ分析プログラムを用いて可視化され、加工される。
【０１５８】
これらの結果によって、特に所定条件下（ＰＣＲ産物の長さ、ＳＳＣＰプロトコールの上記段階の条件、データ加工のためのパラメーターなど）で上記ｍＲＮＡのエディティングプロフィールを得ることができる。このプロフィールのパラメーター（例えば、このプロフィール上で観察されるピークの移動時間、高さおよび表面積）を、標準的プロフィール、例えば、
上記ｍＲＮＡの別途にエディティングした（またはエディティングされていない）形態のそれぞれについてこれらの所定条件下で得られる特徴的プロフィール（例えば、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの３２個のエディティングされたまたはエディティングされていない形態の１３について得られた特徴的プロフィールを示す図１Ｃ−１Ｏを参照されたい）、および／または
所定条件下で得られるこれらのエディティングされたまたはエディティングされていない形態のそれぞれのキノリンの定性的および／または定量的混合物に相当するプロフィール、および／または
これらの同じ所定条件下で特定組織のｍＲＮＡ抽出物（例えば、図１Ａ−１Ｂを参照されたい）について、正常患者または病状の確かめられた患者について同じｍＲＮＡの既知のエディティングプロフィール
と比較し、または比較することができ、
これら総てのプロフィールは、分析プログラムのメモリーに保存し、または保存することができる。シグナル分析および加工の熟練者であれば、このようなエディティングプロフィールについて、メモリーに保存され且つ注釈を付けられた標準化したエディティングプロフィール（エディティングの割合および比率、誘発した病状、適当な治療処理など）との類似性および／または差を容易に示すことができる。
【０１５９】
分析プログラムのメモリーに保存されたおよびこれらの所定条件下で得られるこれらの「標準的」プロフィールのそれぞれについて、形態のそれぞれについてのエディティングの割合および／または比率を知ることもできる。
【０１６０】
所定条件下でＳＳＣＰによって上記ｍＲＮＡのエディティングされた（またはエディティングされていない）形態のそれぞれの特徴的プロフィールを得るために、
特徴的プロフィールを得ることが所望なエディティングされたまたはエディティングされていない形態のシークエンシングによるクローニングおよび確認、
同定され、クローニングした配列のＰＣＲ増幅（例３の段階３）、
例３の段階４−６の実施
の工程を行うことができる。
【０１６１】
エディティングされたまたはエディティングされていない形態の既知混合物に相当する標準的プロフィールについてのエディティング割合および／またはエディティング率を決定するには、上記工程の段階３の前に、混合物に含まれるエディティング形態を所望な比で混合することで十分である。
【０１６２】
分析系のメモリーにある可能性がある参照エディティングプロフィールに相当する標準的プロフィールのエディティング割合および／または率を決定するために、治療処理などの前後に特定の組織について、これらのプロフィールを、特に正常患者または病状の確かめられた患者について得られたエディティングプロフィールに相当させることができ、ｍＲＮＡ抽出物に存在する上記ｍＲＮＡの配列の典型的部分または総てをクローニングし、シークエンシングすることで十分である。もう一つの方法では、本発明のバイオチップを用いて、その上に上記ｍＲＮＡのエディティング形態を付着させることもできる。
【０１６３】
II)  付表
Ａ．  材料のリスト：
ABI Prism 3100 (Applied Biosystems);
2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies; No. DE13701290);
Eppendorf Centrifuge 5415 D(シリーズ番号: 5425 39 178);および
MJ Research PTC200 Thermocycler (シリーズ番号:AL046013およびEN015975)。
【０１６４】
Ｂ．  キットのリスト：
1  NucleoSpin RNA II (Invitrogen; 参考文献: 740.955.50);
2  -ThermoScript RT-PCRシステム(Invitrogen; 参考文献: 11146-024); 
3  Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen; 参考文献: 10966-026);
4  Nucleospin Extract(Macherey-Nagel ; 参考文献: 740.588. 50); および
5  DNA 1000 Assay (Agilent Technologies ; 参考文献: 5065-4449)。
【０１６５】
Ｃ．  溶液のリスト：
β-メルカプトエタノール(Sigma ; 参考文献: M 3148);
プライマーPCR 9 (Proligo; 5'が蛍光団C6-FAMで標識され、精製された);
プライマーPCR10(Proligo; 5'が蛍光団HEXで標識され、精製された); および
TBE 10 x (Invitrogen; 参考文献: 15581-044)。
【０１６６】
例４：  マウスにおける５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片のエディティング率を調節することができる化合物の選択
１）  評価を行う上記化合物を、(イン・ビトロ、細胞内、またはイン・ビボで）上記ｍＲＮＡの遺伝子を発現する真核生物細胞、特にネズミ細胞の個体群と接触させる。
例（イン・ビボ）
Ｂａｌｂ  Ｃマウスの腹腔内へ試験を行う化合物約２０ｍｇ／Ｋｇを投与。
例えば、３日目までの所定時間に、マウスを屠殺し、前前頭皮質のような特定組織の試料を取り出し、冷凍した後、顕微解剖。
２）  ｍＲＮＡ抽出物を用いる細胞中の上記ｍＲＮＡ断片の調節のプライマー対ＰＣＲ９  （配列番号３６）およびＰＣＲ１０  （配列番号３７）による証明。
例3参照。
３）  得られたエディティング率および/またはエディティングプロフィールの、評価を行う化合物と接触させていないコントロールマウスからの同じ細胞の個体群から誘導されるmRNA抽出物について得られたものとの比較、およびエディティング率および/またはエディティングプロフィールの調節または非調節の証明。
４）  得られたエディティング率および/またはエディティングプロフィールの、上記mRNAのエディティング率および/またはプロフィールを調節することが知られている化合物で処理した後の同一細胞個体群について同じ分析条件下で得た標準的プロフィールとの比較、および知られている治療効果、および試験した産物について観察された調節が既知化合物について観察されたものと同様であるときには、同じ治療効果を示す有力な薬剤として試験した上記化合物の選択。
【０１６７】
例５：  治療活性を示す５−ＨＴ２Ｃ−Ｒ  ｍＲＮＡの配列番号３３（5'-AUA CGU AAU CCU A-3'）の配列を含んでなる断片のエディティング率を調節することができる化合物
活性な抗鬱剤であることが知られている化合物は、５−ＨＴ２Ｃ−Ｒエディティング率を調節することができることを示すことができた。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ＳＳＣＰ法によって得た５−ＨＴ２Ｃ受容体エディティングの分析プロフィール。この例の条件下（２５０塩基対断片の増幅、および毛細管電気泳動による分析）では、ラット脈絡叢（図１Ａ）およびラット全脳（図１Ｂ）由来のＲＮＡを用いて得たエディティングプロフィールは、これらの構造のそれぞれに特徴的である。突然変異のそれぞれの相対的重要性を、同じ条件下（図１Ｃ−１Ｏ）で増幅し、分析した５個のエディティング部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＣ’）の１以上での５−ＨＴ２Ｃ受容体の所定の突然変異体の組合せに相当するそれぞれの形態に特徴的な別のエディティング形態のそれぞれについて標準的エディティングプロフィールから決定することができる。
【図１】
2005533510.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
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