(57)【要約】  本明細書中で開示されるのは、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターを患者に投与することによって、炎症を処置する方法である。プロテアーゼインヒビターは、切断されるとより小さなウイルス粒子になるタンパク質の切断を防ぐかまたは有意に妨げる能力について公知である。これらのインヒビターのうちの特定のものはまた、炎症および炎症応答が明らかな疾患の処置において使用され得る。さらなる方法は、ＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達を下方調節することが有利であり得る疾患状態の処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者中の炎症応答を緩和させる方法であって、該方法は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを、該炎症応答を緩和するに有効な量で該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビル、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの誘導体、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかのアナログ、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの薬学的等価物、およびこれらのプロテアーゼのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記量は、約５００ｍｇ／日〜約３，０００ｍｇ／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記炎症応答をさらに緩和するに有効な量で、さらなる治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療剤は、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１抗体、およびＣＯＸ−２インヒビターからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
薬学的に有効なキャリア中で、前記プロテアーゼインヒビターと、前記治療剤とを合わせる工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
処置レジメンにおいて、前記プロテアーゼとは別個に前記治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
患者における炎症応答を含む疾患状態を処置する方法であって、該方法は、該炎症応答を緩和するに有効な量で、該患者にＨＩＶプロテアーゼインヒビターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記疾患状態は、敗血症、重症敗血症、関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、乾癬関節症、通風、胃腸管の炎症状態、炎症性腸疾患、潰瘍性腸炎、クローン病、神経炎症状態、髄膜炎、炎症性心筋炎、糸球体腎炎、自己免疫疾患および狼瘡からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビル、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの誘導体、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかのアナログ、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの薬学的等価物、およびこれらのプロテアーゼのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記量は、約５００ｍｇ／日〜約３，０００ｍｇ／日である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症応答をさらに緩和するに有効な量で、さらなる治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療剤は、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１抗体、およびＣＯＸ−２インヒビターからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬学的に有効なキャリア中で、前記プロテアーゼインヒビターと、前記治療剤とを合わせる工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
処置レジメンにおいて、前記プロテアーゼとは別個に前記治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達を阻害することが有利である患者における疾患状態を処置する方法であって、該方法は、該疾患状態を緩和するに有効な量で、該患者にＨＩＶプロテアーゼインヒビターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記疾患状態は、敗血症、重症敗血症、関節炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節症、乾癬関節症、通風、胃腸管の炎症状態、炎症性腸疾患、潰瘍性腸炎、クローン病、神経炎症状態、髄膜炎、自己免疫疾患および狼瘡からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビル、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの誘導体、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかのアナログ、これらのプロテアーゼインヒビターのいずれかの薬学的等価物、およびこれらのプロテアーゼのいずれかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記量は、約３００ｍｇ／日〜約３，０００ｍｇ／日である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症応答をさらに緩和するに有効な量で、さらなる治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療剤は、抗ＴＮＦ抗体、抗ＩＬ−１抗体、およびＣＯＸ−２インヒビターからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
薬学的に有効なキャリア中で、前記プロテアーゼインヒビターと、前記治療剤とを合わせる工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
処置レジメンにおいて、前記プロテアーゼとは別個に前記治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロテアーゼインヒビターを用いて、免疫応答に影響を与える方法に関する。より詳細には、本発明は、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビター、そのアナログ、およびその誘導体を用いて、炎症を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
新たな感染性ウイルス粒子を生産するために、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、プロテアーゼを用いて、新たに産生されるウイルスタンパク質を、より小さなセグメントへと切断する。この発見に一部基づいて、プロテアーゼインヒビターは、これらのプロテアーゼの機能をブロックするために開発されてきた。従って、ウイルス性の感染性疾患の処置におけるプロテアーゼインヒビターの使用は、公知である。インヒビターは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の処置において一般に使用されている。事実、プロテアーゼインヒビターは、抗ウイルス（および抗レトロウイルス）薬物の最も強力なクラスとして考えられているが、ＨＩＶ感染以外の状態には、現在、プロテアーゼインヒビターでの処理はされていない。公知の研究および報告された効力は、ほとんど排他的に、ＨＩＶ感染の予防および処置におけるそれらの使用に関連する。
【０００３】
ＨＩＶ−１およびＡＩＤＳの処置における使用について示される多数のプロテアーゼインヒビターは、現在、市販されている。例えば、これらのＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターとしては、アンプレナビル（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ，から、商標ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）として入手可能）、インディナビル（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔ  Ｐｏｉｎｔ，ＰＡから商標ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）として入手可能）；サキナビル（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ，（本明細書以下「Ｒｏｃｈｅ」という）から商標ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標）として入手可能）、メシル酸サキナビル（Ｒｏｃｈｅから商標ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）として入手可能）、リトナビル（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ（本明細書以下「Ａｂｂｏｔｔ」という）から、商標ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）として入手可能）、ロピナビル／リトナビル（Ａｂｂｏｔｔから商標ＫＡＬＥＴＲＡ（登録商標）として入手可能）、およびメシル酸ネルフィナビル（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから商標ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）として入手可能）が挙げられる。これらのプロテアーゼインヒビターは、一般に、経口処方物（たとえば、カプセル中または溶液形態のいずれか）中で入手可能であるが、文献における種々の報告は、ＨＩＶ−１感染の処置のために臨床的に現在使用されていない他のＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターの非経口処方物に関する可能性を提示する。現在入手可能なＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、ヒトにおけるＨＩＶウイルスの複製を減少させることが知られ、そして従って、この複製を減少させることが有益な効果を有する状態（すなわち、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ）の処置について示される。
【０００４】
ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置におけるそれらの使用以外についてほとんど治療的品質が示されていない。リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に感染したマウスにおいて、リトナビルが、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を選択的に阻害し、それにより、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対する抗原の定義をブロックするが、ＬＣＭＶ複製は影響を受けないことが示された。２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性が、大きな疎水性残基からより小さなペプチドへの消化を担い、この小さなペプチドは、次に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原提示のために細胞表面に送達される。従って、免疫応答は、ＣＴＬへの抗原提示をブロックすることによって、プロテアーゼインヒビターにより調節され得ることが、仮定された。しかし、他のＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、有効ではなかった。サキナビルは、有意により少ない程度にキモトリプシン様活性を阻害し、一方ネルフィナビルおよびインディナビルは、全く阻害を示さなかった。Ａｎｄｒｅら「Ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３１２０−１３１２４（１９９８）。
【０００５】
リトナビルによるプロテアソーム活性調節のさらなる速度論的分析は、プロテアーゼインヒビターが、ビニルスルホンインヒビター４−ヒドロキシ−３−ヨード−２−ニトロフェニル−ロイシニル−ロイシニル−ロイシンビニルスルホン（１２５Ｉ−ＮＬＶＳ）を用いる共有結合的活性部位改変から、ＭＢ−１（Ｘ）および／またはＬＢＰ７プロテアソームサブユニットを保護することを示した。このことは、これらのサブユニットが、リトナビルによる競合的阻害のための主要標的であることを示唆した。このことは、このプロテアーゼインヒビターが、抗原プロセシングを調節し得ることを確認する。Ｓｃｈｍｉｄｔｋｅら「Ｈｏｗ  ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，」Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５０）：３５７３４−３５７４０（１９９９）。
【０００６】
いくつかのプロテアーゼインヒビターが抗炎症特性を有することが公知であるが、これらのうちのいずれも、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターではない。例えば、米国特許第４，８７１，７２７号は、Ｌ−６８１，５１２微生物から単離された種々の天然化合物の抗炎症特性および抗分解特性を記載する。治療的薬学的組成物におけるその潜在的用途が考察されるが、これらの化合物は、非ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターのみを含む。
【０００７】
ヒト細胞は、細胞性免疫応答ならびに免疫生体化学物質（例えば、サイトカインおよびＮＦ−κＢ）の生成、調節および分解において重要な役割を果す、プロテアーゼ機構を保有する。サイトカインは、感染と闘う際に身体を補助するが、過剰量生成された場合は、組織破壊および多発性器官不全ならびに敗血症性ショックを引き起こし得る。同様に、ＮＦ−κＢは、免疫応答および炎症応答、発生プロセス、細胞成長、ならびにアポトーシスを調節する細胞シグナル伝達経路の構成要素である。ＮＦ−κＢはまた、多数の疾患状態（敗血症、重症敗血症、癌、関節炎、炎症、喘息、神経変性疾患、および心臓病を含む）において活性である。
【０００８】
ＨＩＶの状況において、ＮＦ−κＢは、炎症性サイトカインのプロモーター領域に結合する重要な転写因子であり、炎症性サイトカインの発現を引き起こす。その後、サイトカインおよびケモカインは、それぞれ、優勢ＣＣＲ５発現パターンおよびＣＸＣＲ４発現パターンを伴う、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ１表現型およびＴｈ２表現型への分化に影響する。Ｔｈ１／Ｔｈ２優勢ならびにＣＸＣＲ４発現レベルおよびＣＣＲ５発現レベルは、その後、ＨＩＶ侵入および細胞感染に影響し得る。しかし、細菌抗原およびミコバクテリア抗原により誘導されるＮＦ−κＢ活性化はまた、炎症状態（例えば、敗血症、重症敗血症、関節炎、および他の炎症疾患状態）において重要な役割を果す。
【０００９】
ＮＦ−κＢは、阻害性ＩκＢタンパク質（例えば、ＩκＢ−α）との相互作用によって調節される。種々のそのようなタンパク質が公知であり、各々は、ＮＦ−κＢに対する種々の結合親和性を有する。これらのタンパク質は、差次的に調節され、組織特異的様式で発現される。ＩκＢタンパク質およびＮＦ−κＢは、一般的には、細胞質中に存在し、ＩκＢキナーゼが誘発されるまで、潜伏性不活性複合体において互いに結合されている。多くの細胞シグナル伝達経路が、ＩκＢキナーゼを活性化し得る。この酵素は、ＩκＢタンパク質をリン酸化するのを担い、ＮＦ−κＢ複合体からのその分離と、その後の適切なプロテアソームによるタンパク質分解を介する消化をもたらす。例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外部表面の主要構成要素であり、このようなシグナル伝達経路を誘発することが公知である。一旦ＩκＢタンパク質から分離されると、ＮＦ−κＢは、一般的には、細胞核へとトランスロケートし、細胞核において、ＤＮＡ上の同族結合部位に結合し、そして例えば、さらに炎症応答の構成要素の転写を開始する。
【００１０】
敗血症は、一般的には、局所的または菌血症性のいずれかである重篤な感染を指し、全身炎症発現を伴う。これは、身体中に導入された毒素に対する生理学的応答であり、しばしば、身体組織の外科的操作（例えば、カテーテルまたは慣用的歯科作業の導入）によって、引き起こされる。敗血症は、基礎をなす疾患、化学療法、または操作条件によって免疫系が損なわれた患者にとって、特に有害である。一次感染は、一般的には、肺、尿生殖器管もしくは胃腸管、または軟部組織において観察される。重症敗血症（一般的には「敗血症性ショック」または「中毒性ショック」と呼ばれる）は、しばしば、病院で得られた細菌感染により引き起こされ、最も頻繁には、免疫無防備状態にある患者および老人集団において観察される。
【００１１】
敗血症および重症敗血症は、米国単独において毎年２１５，０００例の死亡原因である。有効な処置がないことにほぼ完全に起因して、重症敗血症の死亡率は、２８％〜５０％の範囲である。抗生物質の投与、大きな膿瘍の排膿、および他の支持的医療を伴う壊死組織の除去は、この疾患を処置するためにしばしば不十分であるが、これらの処置は、現在利用可能な少数の選択肢のほぼ網羅的な詳説である。しかし、最近、食品医薬品局は、重症敗血症の処置のための活性化プロテインＣの使用を認可した。これは、このような処置について認可された最初の薬剤である。
【００１２】
炎症応答は、敗血症および重症敗血症以外の疾患に関連する。例えば、慢性関節リウマチは、患者の罹患した関節の可動範囲を制限する中程度〜重度の疼痛および硬直を生じる、複数の関節における免疫応答により部分的に特徴付けられる。慢性関節リウマチは、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン）で処置され得るが、この処置形態は、この疾患の長期経過を変化せず、頻繁に、望ましくない副作用（例えば、胃腸管の刺激）を有する。
【００１３】
炎症は、多数の他の疾患状態にも付随する。他のすべての形態の関節炎（定義による関節炎。関節の炎症のみならず、他の身体結合組織（例えば、筋肉、腱、靭帯、ならびに内部器官の保護コーティング）の炎症も包含する）とともに、炎症は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病の症状である。種々の処置選択肢が、これらの疾患状態のために利用可能であり得るが、なおこれらの選択肢のうちの多くが、慢性関節リウマチについて上記されたのと同じ制限を受ける。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
プロテアーゼインヒビターを用いて炎症または免疫応答を処置するための方法を提供することが、本発明の実施形態の目的である。これらの方法は、炎症の阻害が有益な効果を有する任意の疾患（例えば、敗血症もしくは重症敗血症、関節炎、炎症性心筋炎、糸球体腎炎、胃腸管の炎症状態（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病）、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症状態）を処置することを可能にする。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビター、そのアナログ、およびその誘導体は、本発明の方法に従って使用され得る。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。以下の詳細な説明は、例として、本発明の種々の実施形態を示す。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターが、ＩκＢタンパク質／ＮＦ−κＢ複合体からその構成部分への酵素消化を下方調節することによって、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路に影響するという、驚くべき発見に基づく。このような下方調節は、細胞シグナルに応答して細胞質から細胞核へとトランスロケートする遊離ＮＦ−κＢの量を実質的に減少し得、この細胞シグナルは、下方調節されない場合、ＮＦ−κＢに免疫応答または炎症応答に従って転写を開始させる。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、この酵素消化に影響するリン酸化および／またはタンパク質分解を、少なくとも部分的に妨害すると考えられる。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、疾患の緩和、その疾患の合併症の重篤度の軽減、その疾患が発現するのを防ぐこと、その疾患が再発するのを防ぐこと、その疾患が悪化するのを単に防ぐこと、その疾患に含まれる炎症応答を緩和すること、またはそのような治療努力が最終的には不成功である場合でさえ、上記のうちのいずれかに影響を与える治療努力を包含するが、これらに限定されない。
【００１８】
プロテアーゼインヒビターは、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置において頻繁に使用されるが、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置に適切なインヒビターは、他のどの治療目的のためにも示されない。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、切断されると感染性ウイルス粒子を生成するタンパク質の切断を防ぐことによって、機能する。これらのプロテアーゼインヒビターの例としては、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アンプレナビル、インディナビル、ロピナビル、これらの誘導体、アナログ、等価物、薬剤または他の組み合わせなど（本明細書中で以後「プロテアーゼインヒビター」）が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、プロテアーゼインヒビターは、一般的には、約４００ｍｇ〜約１２００ｍｇの経口投与量で投与され、これは、投与される特定のインヒビター、患者の年齢、性別、および重量、疾患状態の重篤度、ならびに処置される疾患状態の性質などの変数に依存する。
【００１９】
プロテアーゼインヒビターは、種々のタンパク質の切断を防ぎ、それによりＨＩＶ−１疾患の進行を遅くするかもしくは停止する能力のために、従来のように投与される一方で、プロテアーゼインヒビターはまた、細胞炎症応答または異常に悪化した免疫応答の処置においても使用され得る。特に、ＨＩＶ−１疾患の進行を妨げる能力とは別個かつ離れて、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターはまた、免疫活性化を下方調節し得、それにより抗炎症剤として機能し得る。
【００２０】
本発明のＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、ＮＦ−κＢ細胞シグナル経路を下方調節し、完全にではないがブロックすると考えられる。ＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路は、細胞生存のために重要である。この細胞シグナル伝達経路を完全にブロックすることは、毒性効果を有する可能性があり、おそらく、細胞および組織の死として発現し、そしておそらく患者における免疫抑制として発現する。
【００２１】
図１に示されるように、本発明のプロテアーゼインヒビターは、驚くべきことに、用量依存性様式でＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路の活性化をブロックする。ＬＰＳによる細胞刺激の前のネルフィナビルによるＨＭＥＣの処理は、通常はそのような刺激に関連するＮＦ−κＢ活性を減少した。さらに、この減少は、ＨＭＥＣがＬＰＳへの曝露前に処理されたネルフィナビルの濃度に関連した。同様の結果が、図２にて観察されるように、ＨＭＥＣにおいてＨＩＶ−ＬＴＲ経路を試験する際に得られた。比較データは、ＨＭＥＣをＬＰＳ曝露前に種々のプロテアーゼインヒビターで処理することによって得られた。図３に示されるように、ＨＭＥＣは、ネルフィナビル、サキナビル、インディナビル、およびリトナビルで予め処理された。すべてのプロテアーゼインヒビターは、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路をブロックした。サキナビルおよびリトナビルは、インディナビルよりも強力であり、ＨＭＥＣはまた、ネルフィナビルに対する用量依存性応答を示した。本発明のプロテアーゼインヒビターは、グラム陰性細菌抗原（例えば、ＬＰＳ）により通常は誘発される細胞シグナル伝達経路をブロックする能力を示した一方で、プロテアーゼインヒビターはまた、グラム陽性細菌抗原に関連する抗原をブロックし得る。図４に示されるように、ネルフィナビルによるＨＭＥＣの事前処理は、ＳＴＦおよびＰＳＭの両方をブロックした。
【００２２】
本発明のプロテアーゼインヒビターがＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路を阻害するように作動し得る１つの方法は、ＮＦ−κＢ阻害タンパク質であるＩκＢ−αの分解を阻害することによることが、考えられる。図５に示されるように、ウェスタンブロット分析により、ネルフィナビルは、ＬＰＳによる細胞刺激におけるこのタンパク質の分解を遅延させたことが、明らかになった。
【００２３】
本発明のプロテアーゼインヒビターは、従って、炎症応答または免疫応答が示される種々の疾患の処置において使用され得る。このような疾患または疾患状態の例としては、敗血症および重症敗血症；種々の形態の関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節炎、乾癬性関節炎、および通風）；炎症性心筋炎；糸球体腎炎；胃腸管の炎症状態（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病）；神経的炎症状態（例えば、髄膜炎）；ならびに感染後の炎症状態が挙げられ得るが、これらに限定されない。本発明のプロテアーゼインヒビターはまた、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ以外の多数の自己免疫疾患（例えば、狼瘡）を処置するために使用され得る。本発明のプロテアーゼインヒビターは、従って、サイトカイン活性化を妨害することが有利であり得る任意の疾患状態、ならびにＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路を下方調節することが有利であり得る他の任意の疾患、状態もしくは応答を処置するために、使用され得る。
【００２４】
本発明のプロテアーゼインヒビターは、任意の適切な形態でかつ任意の適切な投与量で投与され得、この形態および投与量の両方は、薬理学の当業者によって過度の実験を伴わずに容易に確認され得る。投与の形態としては、例えば、経口形態（例えば、カプセル、錠剤、溶液、または懸濁物）；静脈内形態；注射可能形態；移植可能形態（例えば、徐放性機構、または生分解性ポリマー単位）；または治療剤を患者に送達し得る他の適切な任意の機構が挙げられ得る。この投与量は、選択された投与形態に従って同様に決定され得る。例として、ＨＩＶおよびＡＩＤＳの処置において、プロテアーゼインヒビターは、一般的には、約５００ｍｇ／日〜約３０００ｍｇ／日の量で経口投与され、個々の投与量は、１回の投与当たり約４００ｍｇ〜１２００ｍｇの範囲である。投与量レベルは、投与形態および患者の特定の特徴ならびに疾患状態に依存して、広範に変化し得ることが、医療分野の当業者により容易に認識される。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、プロテアーゼインヒビターは、上記のように、炎症応答または免疫応答の処置において有効な治療組成物もしくは処置レジメンを提供するために、別の治療剤を補充され得、そして／または別の治療剤と組み合わされ得る。さらなる治療剤としては、関節炎、敗血症、重症敗血症、または他の炎症状態の処置において有効であることが公知である薬剤；炎症性サイトカインに対して有効な抗体（例えば、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体または抗インターロイキン１（ＩＬ１）抗体；またはシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）２インヒビターが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態において、さらなる治療剤は、上記プロテアーゼインヒビターの形態と適合性である形態で提供され得（例えば、両方ともが経口投与に適切であり、単一薬剤中にさらに組み合わされ得る）。そのような場合、治療組成物は、適合性プロテアーゼインヒビターと治療剤との組み合わせにより、生成され得る。
【００２７】
しかし、医学的活性因子およびプロテアーゼインヒビターが不適合性である場合（例えば、医学的活性因子は静脈内投与に適切であり、プロテアーゼインヒビターが経口投与に適切である場合）、プロテアーゼインヒビターおよび医学的活性因子は、本発明のなお別の実施形態に従う処置レジメンの一部として、患者に別個に投与され得る。そのような不適合性は、特定の薬剤（例えば、多数のプロテアーゼインヒビターおよび医学的活性因子）が静脈内形態で処方され得るという事実に起因し得、これらの特定の薬剤は経口投与により良好に適切する。このことは、その分子構造、ヒト身体におけるその好ましい送達経路、または他の要因といった点に起因し得る。なお、処置レジメンの例は、抗ＩＬ−１抗体の静脈内投与と組み合わせたプロテアーゼインヒビターの経口投与を包含し得る。
【００２８】
プロテアーゼインヒビターとさらなる治療剤との組み合わせは、本発明の方法に従って処置される炎症または他の疾患状態の処置のための、より強い医療を提供し得る。例として、プロテアーゼインヒビターは、別の細胞シグナル伝達経路を標的とする医学的活性因子の投与と組み合わせて、ＮＦ−κＢ経路を下方調節するために投与され得る。あるいは、この医学的活性因子は、その疾患状態についての他のいくらかの軽減形態を提供し得、細胞シグナル伝達経路に影響することに対して予測されない。従って、単一の薬剤中でかまたは処置レジメンを介してかのいずれかでの、これらの２つの構成要素の組み合わせの投与が、疾患状態の複数の局面を、この状態の発現が単に例えば炎症である場合でさえも、標的とし得る。
【００２９】
特に、ＮＦ−κＢの下方調節は、種々の形態の関節炎の処置において公知の利益を有し、その状態を全体として除去するために十分な医学的治療を提供し得る。しかし、他の炎症状態（例えば、敗血症および重症敗血症）は、プロテアーゼインヒビター単独の投与により完全に治療されないかもしれないが、このプロテアーゼインヒビターは、その疾患状態の重篤度を実質的に減少し得る。このことは、細胞シグナル伝達経路の大きさが、敗血症および重症敗血症に関連する炎症応答に関与するという事実に起因し得る。従って、プロテアーゼインヒビターは、ＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路に、そしておそらく他の経路にも影響し得るが、さらなる薬学的介入を伴わずに疾患状態を完全に処置するには不十分のままであり得る。従って、ＮＦ−κＢ経路以外の細胞シグナル伝達経路を標的とする医学的活性因子と、プロテアーゼインヒビターとの組み合わせは、特に、敗血症および重症敗血症の処置において、有利であり得る。
【実施例】
【００３０】
本明細書中に考察される実施例は、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターが、細胞炎症応答または細胞免疫応答を含む疾患状態の処置において有効であり得ることを示す。これらの実施例は、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターが、ＩκＢタンパク質／ＮＦ−κＢ複合体からその構成部分への消化を妨げることによって、ＮＦ−κＢ細胞シグナル伝達経路を下方調節し得、それにより、炎症応答に有意に影響を与え得ることを、さらに実証する。
【００３１】
（実施例１）
（細胞および試薬）
不死化ヒト皮膚内皮細胞（ＨＭＥＣ）は、Ｃａｎｄａｌ博士（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ；Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）からの寛大な贈与物であった。ＨＭＥＣを、１０％熱非働体化ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡから入手可能）、２ｍＭグルタミン酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（本明細書中で以後「Ｓｉｇｍａ」）から入手可能），ならびに１００μｇ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．；Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡから入手可能）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手可能）中にて、２４ウェルプレート中で培養した。この細胞を、Ｆａｕｒｅら，「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮＦ−κＢ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４（ＴＬＲ−４）  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬＲ−４  ａｎｄ  ＴＬＲ−２  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ」Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１５）：１１０５８−１１０６３（２０００）に記載されるように、１０継代と１４継代との間で慣用的に使用した。
【００３２】
フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）（これは、定常期Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ上清のフェノール抽出物により精製された）を、Ｓｅｙｍｏｕｒ  Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から得た。Ｍｅｈｌｉｎら「Ａｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（６）：９０７−９１８（１９９９）。
【００３３】
可溶性結核因子（ＳＴＦ）を、Ｔｅｒｒｙ  Ｋ．ＭｅａｎｓおよびＭａｔｔｈｅｗ  Ｊ．Ｆｅｎｔｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から得た。すべての試薬は、リムルスアメーバ様細胞分解産物アッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ，Ａｓｓｏｃ．ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ；Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，ＭＡから得た；＜  ０．０３  ＥＵ／ｍｌ）によって、ＬＰＳを含まないことを確認した。高度に精製し、フェノール−水抽出した、タンパク質を含まない（＜０．０００８％タンパク質）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＬＰＳを、Ｓ．Ｎ．Ｖｏｇｅｌ（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から得た。Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら「Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｒｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｏｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（２）：６１８−６２２（２０００）。
【００３４】
ネルフィナビルを、Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得た。他のＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビター（すなわち、リトナビル、サキナビル、およびインディナビル）を、Ｅｒｉｃ  Ｄａａｒ博士（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ；Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）から得た。
【００３５】
（実施例２）
（ＴＮＦ−α分析）
５時間のＬＰＳ刺激の後、ＨＭＥＣ由来の上清を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから得た）を製造業者の指示に従って使用することによって、ＴＮＦ−α生成について分析した。ＴＮＦ−αについてのすべてのデータは、三連のサンプルの平均±標準偏差を示す。各実験を、少なくとも２回反復した。
【００３６】
（実施例３）
（発現ベクター）
野生型ヒトＴＬＲ−２は、Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）からの贈与物であった。レポーター遺伝子であるｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ（０．５μｇ），ＥＬＡＭ−ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ（０．５μｇ）、およびインターロイキン（ＩＬ）−６−ルシフェラーゼ（０．５μｇ）を、使用した。
【００３７】
（実施例４）
（ヒト皮膚内皮細胞のトランスフェクション）
ＨＭＥＣを、２４ウェルプレート中の濃度５０，０００細胞／ウェルにてプレートし、そして上記のような１０％血清を含むＭＣＤＢ−１３１において一晩培養した。細胞を、翌日、ＦｕＧｅｎｅ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから得た）を用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトした。Ｆａｕｒｅら、１１０５８頁。
【００３８】
レポーター遺伝子であるｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ（０．１μｇ）およびＨＩＶ−ＬＴＲｗｔ−Ｌｕｃ（０．１μｇ）の発現ベクター（０．１μｇ）を、ｈＴＬＲ２（０．３μｇ）ｃＤＮＡを伴ってかまたは伴わずにＨＭＥＣ中にトランスフェクトした。細胞を、２４時間トランスフェクトし、その後、増殖培地中に懸濁した種々の濃度のＬＰＳおよび／またはＳＴＦもしくはＰＳＭを用いて、６時間刺激した。その後、細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから得た）および照度計を用いて測定した。
【００３９】
β−ガラクトシダーゼ活性を、比色アッセイにより測定した。Ｚｈａｎｇら「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１２）：７６１１−７６１４（１９９９）。
【００４０】
（実施例５）
（２０Ｓプロテアソームアッセイ）
２０Ｓプロテアソーム活性に対するネルフィナビルの効果を、２０Ｓ  Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡから得た）を製造業者の指示に従って使用して評価した。簡単に述べると、ＳＤＳにより予め活性化された赤血球２０Ｓプロテアソームを、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ蛍光発生ペプチド基質に添加した。これを使用して、ネルフィナビルを用いてかまたは用いずに、キモトリプシン様ペプチダーゼ活性を測定する。プロテアーゼインヒビターであるラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）を、コントロールとして含めた。マイクロタイタープレートを、適切な励起３６０ｎｍおよび発光４６０ｎｍにて読み取った。すべてのデータは、３連のサンプルの平均±標準偏差を示す。
【００４１】
（実施例６）  
（ＬＤＨ活性の測定）
ネルフィナビル誘導性細胞死の定量のために、ＨＭＥＣ培養上清における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ（本明細書中以後「Ｒｏｃｈｅ」）から得た）を製造業者の指示に従って用いて測定した。上清中のＬＤＨ活性のパーセンテージを、以下に従って計算した：［（実験値−未処理細胞から放出されたＬＤＨ活性）／（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による細胞中の最大放出可能ＬＤＨ活性−未処理細胞から放出されたＬＤＨ活性）］×１００。
【００４２】
（実施例７）
（ＩκＢα分解の評価）
馴化した内皮細胞を、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」、Ｓｉｇｍａから入手可能），１０ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、ならびに各１μｇ／ｍｌのプロテアーゼインヒビターであるペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニンおよびキモスタチン（すべてＲｏｃｈｅから入手可能）を含む溶解緩衝液中で、氷上にて３０分間溶解した。
【００４３】
溶解後、細胞破片を、遠心分離（１４，０００×ｇ，４℃，１〜２分間）により除去した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した。５０μｇの全タンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に添加し、５分間煮沸し、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２５０ｍＭグリシン，０．１％  ＳＤＳ）中での１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）によって分解し、そしてＩｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ  Ｐトランスファーメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｔｄ．；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（本明細書中で以後「Ａｍｅｒｓｈａｍ」）から得た）上にブロットした（１００Ｖ，１．５時間，４℃）。５％脱脂乳を含むＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する１ｘＰＢＳ；Ｓｉｇｍａから入手可能）中での一晩のブロッキングの後、メンブレンをＰＢＳＴ中で３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ中抗ＩκＢα（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を用いて、一次抗体については２．５％脱脂乾燥乳とともに４℃で３時間、二次抗体については、室温で１時間、プロービングした。その後、メンブレンをＰＢＳＴ中で５回洗浄し、そしてＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍから得た）を製造業者の指示に従って使用してバンドを検出した。
【００４４】
（実施例８）
（ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、用量依存性様式および時間依存性様式で、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックする）
本発明者らは、ＬＰＳ刺激の前およびＬＰＳ刺激時に、種々の濃度のＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビター（すなわち、ネルフィナビル）でＨＭＥＣを処理し、ルシフェラーゼ活性を測定してＮＦ−κＢ活性化を決定した。ネルフィナビルを用いる事前処理は、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を、用量依存性様式（図１）および時間依存性様式（図６）で、阻害した。
同様に、細胞を、リトナビル、サキナビル、およびインディナビルを用いて１時間事前処理すると、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化の下方調節をもたらした（図３）。乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを実施して、細胞死を評価した。細胞死は、この実験において使用したネルフィナビルの濃度によっては誘導されなかった（図７）。これらの結果は、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターが、試験した濃度では細胞死を誘導しないことを示唆する。
【００４５】
（実施例９）
（ＨＭＥＣのプロテアーゼインヒビター事前処理は、ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックする）
本発明者らは、次に、ＨＭＥＣのプロテアーゼインヒビター事前処理が、ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックするか否かを評価した。ＨＭＥＣをプロテアーゼインヒビター（すなわち、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、およびインディナビル）で１時間事前処理すると、ＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）誘導性ＮＦ−κＢ活性化を下方調節した（図９）。ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−κＢ活性化に対するリトナビル、サキナビル、およびインディナビルの効果は、用量依存性であった。ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化に対する効果と同様に、種々のプロテアーゼインヒビターは、ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害するための異なる能力を有した。従って、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターは、ＴＮＦ−α誘導性ＮＦ−κＢ活性化を阻害すると考えられる。
【００４６】
（実施例１０）
（ＨＭＥＣのプロテアーゼインヒビター事前処理は、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６転写をブロックする）
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、ＬＰＳ誘導性敗血症およびＬＰＳ誘導性敗血症性ショックの発生を媒介する、公知の炎症促進性サイトカインである。本発明者らは、ＩＬ−６プロモーター−ルシフェラーゼ構築物で一過性トランスフェクトされたＨＭＥＣの、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビター事前処理が、ＬＰＳ誘導性ルシフェラーゼ活性化を下方調節するか否かを評価した。本発明者らは、ＨＭＥＣをＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターで１時間事前処理すると、ＬＰＳ誘導性ルシフェラーゼ活性を下方調節することを観察した（図８）。これらの結果は、プロテアーゼインヒビターが、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６生成をブロックすることを示唆する。
【００４７】
（実施例１１）
（ＨＭＥＣのプロテアーゼインヒビター事前処理は、グラム陽性細菌およびマイコバクテリアにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化をブロックする）。
【００４８】
グラム陰性細菌のＬＰＳに加えて、グラム陽性細菌の細胞壁成分（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来のリポテイコ酸、ペプチドグリカン、フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）、ならびにミコバクテリア細胞壁抗原（例えば、可溶性結核因子（ＳＴＦ））は、ＮＦ−ＫＢ活性化および炎症促進性サイトカイン生成を誘導することが示されている。本発明者らは、ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターの下方調節効果が、グラム陰性細菌細胞壁成分であるＬＰＳに特異的であるか否か、またはＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターはまた、ＰＳＭ誘導性ＮＦ−κＢ活性化およびＳＴＦ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックするか否かを、試験した。ＬＰＳと同様に、ＨＭＥＣをＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターで１時間事前処理すると、ＳＴＦ誘導性ＮＦ−κＢ活性化およびＰＳＭ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックした（図４）。
【００４９】
（実施例１２）
（ＨＭＥＣのネルフィナビル事前処理は、ＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解を遅延する）
細菌抗原およびミコバクテリア抗原に対して免疫系細胞を曝露する際、ＩκＢ−α分解が、ＮＦ−κＢ活性化の前の重要な段階である。本発明者らは、ＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解に対するＨＭＥＣのネルフィナビル事前処理の効果を評価した。ＨＭＥＣを、ネルフィナビルで１時間事前処理し、そしてＬＰＳで３０分間、６０分間、および９０分間刺激した。ＩκＢ−α分解を、リン酸化ＩκＢ−αについてのウェスタンブロット分析によって評価した。予期された通り、ＬＰＳ刺激は、ＨＭＥＣにおいてリン酸化ＩκＢ−αの分解をもたらし、一方で、ネルフィナビル事前処理したＨＭＥＣにおいて、ＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解の遅延が存在した（図５）。
【００５０】
（実施例１３）
（ネルフィナビルは、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害しない）
リトナビルは、２０Ｓプロテアソーム（ＬＰＳ誘導性ＩκＢ分解を媒介するエレメント）のキモトリプシン様活性を阻害することが、示されている。本発明者らは、ネルフィナビルがＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解を遅延する能力が、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害に起因するか否かを評価した。ネルフィナビルは、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を阻害しなかった。むしろ、その阻害は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に起因した。ＤＭＳＯは、ネルフィナビルを溶解するために使用される。これらの結果は、ＮＦ−κＢ活性化に対するネルフィナビルの阻害効果が、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性の阻害を介しては媒介されないことを示唆する。
【００５１】
上記説明は、本発明の特定の実施形態に言及するが、多くの改変形が本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることが、理解される。例えば、本発明のプロテアーゼインヒビターは、過度の実験を伴わずに当業者によって容易に認識されるように、炎症が観察される多数の状態の処置において使用され得る。添付される特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および趣旨の範囲内にあるような改変形を網羅することが、意図される。従って、この開示される実施形態は、例示としてであって制限的なものとしてではなく、すべての点で考慮され、本発明の範囲は、上記説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。従って、特許請求の範囲の意味および特許請求の範囲と等価な範囲内にあるすべての変化は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ヒト皮膚微細血管内皮細胞（「ＨＭＥＣ」）におけるＬＰＳ誘導性細胞活性化に対する、本発明のプロテアーゼインヒビターの効果の図示である。ＬＰＳ活性化は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性％に関して測定された。ルシフェラーゼは、より大きなルシフェラーゼの生体発光検出がより大きなＮＦ−κＢ活性に対応するように、ＮＦ−κＢに結合されてプラスミドに含まれた。ネルフィナビルは、本発明のプロテアーゼインヒビターであり、細胞のアポトーシスも細胞死も誘導することなく、用量依存性様式でＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックした（すなわち、それぞれ、１μｇ／ｍｌ濃度、３μｇ／ｍｌ濃度、および６μｇ／ｍｌ濃度のネルフィナビルの各々にて、ＮＦ−κＢ活性化の有意に大きなブロック）。
【図２】図２は、ＨＭＥＣにおけるＬＰＳ活性化に対する、本発明のプロテアーゼインヒビターの効果の図示である。ＬＰＳ活性化は、ヒト免疫不全ウイルス長末端反復（「ＨＩＶ−ＬＴＲ」）ルシフェラーゼ活性％に関して測定された。ルシフェラーゼは、より大きなルシフェラーゼの生体発光検出がより大きなＮＦ−κＢ活性に対応するように、ＨＩＶ−ＬＴＲに結合されたプラスミドに含まれた。ネルフィナビルは、細胞のアポトーシスを誘導することなく、用量依存性様式でＬＰＳ誘導性ＨＩＶ−ＬＴＲ活性化をブロックした（すなわち、それぞれ、１μｇ／ｍｌ濃度、３μｇ／ｍｌ濃度、および６μｇ／ｍｌ濃度のネルフィナビルの各々にて、ＨＩＶ−ＬＴＲ活性化の有意に大きなブロック）。
【図３】図３は、ＨＭＥＣにおけるＬＰＳ活性化に対する、本発明のいくつかのプロテアーゼインヒビターの効果の比較図示である。ＬＰＳ誘導性細胞活性化は、図１に上記されるように、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性％に関して測定された。ネルフィナビルは、細胞のアポトーシスを誘導することなく、用量依存性様式でＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックした（すなわち、それぞれ、１μｇ／ｍｌ濃度、３μｇ／ｍｌ濃度、および６μｇ／ｍｌ濃度のネルフィナビルの各々にて、ＮＦ−κＢ活性化の有意に大きなブロック）。サキナビルは、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化をブロックした。リトナビルも同様であった。インディナビルもまた、ＬＰＳ誘導性ＮＦ−κＢ活性化を誘導したが、よりわずかな程度であった。
【図４】図４は、ＨＭＥＣにおけるＬＰＳ以外の微生物抗原に対する、本発明のプロテアーゼインヒビターの効果の図示である。ＮＦ−κＢ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓフェノール可溶性モジュリン「ＰＳＭ」）および可溶性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ因子（「ＳＴＦ」）の活性化が、図１に上記されるように、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性化％に関して測定された。ネルフィナビルは、ＰＳＭおよびＳＴＦの両方において、ＮＦ−κＢ活性化をブロックした。
【図５】図５は、３０分および９０分でのＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解に対する、本発明のプロテアーゼインヒビターの効果を示すウェスタンブロット分析の結果を示す。３０分にてネルフィナビルで予め処理したＨＭＥＣは、本発明のプロテアーゼインヒビターで処理されていないＨＭＥＣよりも顕著に少ない、ＬＰＳ誘導性ＩκＢ−α分解を示した。
【図６】図６は、本発明のプロテアーゼインヒビターによるＨＭＥＣ中のＨＩＶ−ＬＴＲルシフェラーゼのＬＰＳ活性化の、プロテアーゼインヒビター事前処理誘導性阻害の時間応答の図示である。ＬＰＳ活性化は、図２において上記されるように、ＨＩＶ−ＬＴＲルシフェラーゼ活性％に関して測定された。ネルフィナビルは、用量依存性様式でＬＰＳ誘導性ＨＩＶ−ＬＴＲ活性化をブロックした（すなわち、それぞれ、０．５μｇ／ｍｌ濃度、２μｇ／ｍｌ濃度、および４μｇ／ｍｌ濃度のネルフィナビルの各々にて、ＨＩＶ−ＬＴＲ活性化の有意に大きなブロック）。ＬＰＳに対する曝露の３０分前、６０分前、および９０分前のネルフィナビル事前処理は、ＬＰＳ誘導性ＨＩＶ−ＬＴＲ活性化を抑制する同様の効果を有した。
【図７】図７は、ＨＭＥＣにおける乳酸デヒドロゲナーゼ（「ＬＤＨ」）放出に対する、本発明のプロテアーゼインヒビターの効果の図示である。ＬＤＨは、細胞死に際して細胞から放出される。ＬＰＳ刺激の前の種々の濃度のネルフィナビルによる細胞の事前処理は、細胞死を誘導しなかった。
【図８】図８は、ＭＨＥＣにおけるインターロイキン６（「ＩＬ−６」）ルシフェラーゼ活性化に対する、本発明のいくつかのプロテアーゼインヒビターの効果の比較図示である。ネルフィナビル、サキナビル、インディナビル、およびリトナビルは、各々、ＬＰＳ誘導性ＩＬ−６ルシフェラーゼ活性化をブロックした。
【図９】図９は、ＴＨＰ−ＬＴＲ−Ｌｕｃ細胞におけるＬＰＳ誘導性腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦ−α」）生成に対する、本発明のいくつかのプロテアーゼインヒビターの効果の比較図示である。サキナビルおよびインディナビルは、各々、ＴＮＦ−α生成をブロックし、そしてリトナビルおよびネルフィナビルは、各々、より弱い程度に生成をブロックした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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