(57)【要約】  本発明は、感染性ＤＮＡクローン、ブタサーコウイルスの感染性キメラＤＮＡクローン、ワクチンおよびウイルス感染もしくはＰＣＶ２によって引き起こされる離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）からブタを守る方法に関する。新たなキメラ感染性ＤＮＡクローン、およびその誘導物である無毒性キメラウイルスは、病原性ＰＣＶ２の免疫原性ＯＲＦ遺伝子を非病原性ＰＣＶ１遺伝子のほぼ同じ部位に置換した非病原性ＰＣＶ１から構築される。キメラウイルスはＰＣＶ１の非病原性形質を有利に保持するが、病原性ＰＣＶ２に対する特異的免疫応答を誘発する。さらに本発明は免疫原性ポリペプチド発現産物も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性、非病原性ＰＣＶ１をコードする核酸分子を有することを特徴とするブタサーコウイルスの感染性キメラ核酸分子であって、病原性ＰＣＶ２の免疫原性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を、ＰＣＶ１核酸分子のＯＲＦ遺伝子の代わりに含む核酸分子。
【請求項２】
免疫原性ＰＣＶ２のＯＲＦ遺伝子が、ＰＣＶ１核酸分子における同じＯＲＦ遺伝子位置を置換していることを特徴する請求項１に記載のキメラ核酸分子。
【請求項３】
免疫原性ＯＲＦ遺伝子がＯＲＦ２キャプシド遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のキメラ核酸分子。
【請求項４】
該キメラ核酸分子が配列番号２に記載の核酸配列、その相補鎖もしくは配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つ核酸配列を有することを特徴とする請求項３に記載のキメラ核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載のキメラ核酸分子を含むことを特徴とする生物学的に機能的なプラスミドもしくはウイルスベクター。
【請求項６】
ＡＴＣＣ特許寄託物番号ＰＴＡ―３９１２を有することを特徴とする請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
請求項４に記載のキメラ核酸分子を含むことを特徴とするベクターによってによってトランスフェクトされた適当なホスト細胞。
【請求項８】
請求項４に記載のキメラ核酸分子を含む細胞によって産生されることを特徴とする無毒性、感染性キメラブタサーコウイルス。
【請求項９】
キメラ核酸分子を含む前記細胞が、ＡＴＣＣ特許寄託物ＰＴＡ―３９１２中に含まれる、あるいはそれから得られることを特徴とする請求項８に記載の感染性キメラブタサーコウイルス。
【請求項１０】
免疫原性ポリペプチド産物の産生のための方法であって、前記ポリペプチド産物の発現を許容する方法にて請求項４に記載の核酸分子でトランスフェクトされた原核もしくは真核ホスト細胞を、適当な栄養条件下で増殖させ、次いで、前記核酸分子の発現による所望のポリペプチド産物を単離することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現の免疫原性ポリペプチド産物。
【請求項１２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫原性ポリペプチド産物もしくはその生物学的に活性を有する変種。
【請求項１３】
ＰＣＶ２によって引き起こされるウイルス感染もしくは離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）からブタを予防するウイルスワクチンであって、非毒性で生理学的に許容される担体および免疫原性量の：
(a)  配列番号２に記載の核酸配列、その相補鎖もしくは配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つ核酸配列を有するキメラ核酸分子；
(b)  該キメラ核酸分子、その相補鎖もしくは配列番号２の核酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つ核酸配列を含む生物学的に機能的なプラスミドもしくはウイルスベクター；
(c)  無毒性、感染性のキメラブタサーコウイルス；
(d)  配列番号４に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドもしくはその生物学的に活性を持つ変種ポリペプチド；
(e)  ＡＴＣＣ特許寄託物番号ＰＴＡ―３９１３を有する感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンもしくはそれに由来するＰＣＶ２  ＤＮＡクローン；および
(f)  ＡＴＣＣ特許寄託物番号ＰＴＡ―３９１３を有する感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンもしくはそれに由来するＰＣＶ２  ＤＮＡクローンを含む生物学的に機能的なプラスミドもしくはウイルスベクター
からなる群から選択される成分を含むことを特徴とするウイルスワクチン。
【請求項１４】
前記のワクチンが生キメラブタサーコウイルスを含むことを特徴とする請求項１３に記載のウイルスワクチン。
【請求項１５】
ＰＣＶ２によって引き起こされるウイルス感染もしくは離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）からブタを防御する方法であって、防御を必要とするブタに免疫学的有効量の請求項１３に記載のワクチンを投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ブタに該キメラ核酸分子もしくは生キメラブタサーコウイルスを投与することを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブタに該ワクチンを、非経口的に、鼻腔内に、皮内にもしくは経皮的に投与することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ブタに該ワクチンをリンパ内もしくは筋内に投与することを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
感染性、非病原性ＰＣＶ１をコードする核酸分子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を除去し；病原性ＰＣＶ２由来の免疫原性ＯＲＦ遺伝子でＰＣＶ１のＯＲＦ遺伝子位置を置換し；次いでキメラ核酸分子を回収することを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＣＶ２の感染性キメラ核酸分子を調製する方法。
【請求項２０】
前記免疫原性ＰＣＶ２  ＯＲＦ遺伝子が、ＰＣＶ１核酸分子の同じＯＲＦ遺伝子位を置換することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫原性ＯＲＦ遺伝子がＯＲＦ２であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子が、ＡＴＣＣ特許寄託物番号ＰＴＡ―３９１３を有する発現ベクターに含まれるＰＣＶ２の核酸分子より得られることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ特許寄託物番号ＰＴＡ―３９１３を有することを特徴とするＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン、もしくはそれを由来とするＰＣＶ２  ＤＮＡクローン。
【請求項２４】
請求項２３に記載の感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンを含むことを特徴とする生物学的に機能的なプラスミドもしくはウイルスベクター。
【請求項２５】
ＰＣＶ２核酸分子のＯＲＦ２遺伝子の代わりに非病原性ＰＣＶ１由来の免疫原性ＯＲＦ２遺伝子を有する、感染性、病原性ＰＣＶ２をコードする核酸分子を含むことを特徴とするＰＣＶ２−１の感染性交互キメラ核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（米国出願に関連した出願）
この本出願は、２００１年１２月１２日出願の米国仮出願第６０／３４０７７５号についての35 U.S.C. § 119(e)に基づく利益を主張する、２００２年１１月８日出願の米国仮出願第６０／４２４８４０号35 U.S.C. § 119(e)に基づく利益を主張する。２つの先行出願は、参照により、全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（連邦委託研究および開発に関する記述）
適用不可。
【０００３】
（「配列表」の参照）
本出願において提供される配列表ファイルを含む１枚のコンパクトディスク上のデータは、参照として組み込まれる。作成日は２００３年 日であり、そのサイズは約 である。
【０００４】
（本発明の背景）
発明の分野
本発明は、ワクチンとして有用な感染性ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）および２型（ＰＣＶ２）ＤＮＡクローン、キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンおよび該ＤＮＡクローン由来の生キメラウイルスに関する。
【０００５】
関連技術の記載
本明細書において引用された全ての特許および出版物は、全体として参照のため本明細書に組み込まれる。
【０００６】
ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、もともと、ブタ腎臓細胞株ＰＫ−１５細胞培養汚染物として単離された（I. Tischer et al., "A very small porcine virus with circular single-stranded DNA," Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer et al., "Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines," Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)）。ＰＣＶは、約１．７６ｋｂの一本鎖環状ＤＮＡゲノムを含む小型正二十面体の非エンベロープウィルスである。ＰＣＶは、他の３種の動物サーコウイルス（ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、オウム嘴羽病ウイルス（ＰＢＦＤＶ）および近年ハトから発見されたハトサーコウイルス（ＣｏＣＶ））ならびに３種植物サーコウイルス（バナナ萎縮病ウイルス、ヤシ葉腐朽ウイルス（coconut foliar decay virus）およびサブタレニアンクローバ矮化ウイルス(subterranean clover stunt virus)）を含むサーコウイルス科（Circoviridae）に分類される（M. R. Bassami et al., "Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus," Virology 249:453-459 (1998); J. Mankertz et al., "Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)," Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons," Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000); B. M. Meehan et al., "Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses," J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997); B. M. Meehan et al., "Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs," J. Gen. Virol. 79:2171-2179 (1998); D. Todd et al., "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes," Arch. Virol. 117:129-135 (1991)). Members of the three previously recognized animal circoviruses (PCV, CAV, and PBFDV) do not share nucleotide sequence homology or antigenic determinants with each other (上記のM. R. Bassami et al., 1998; 上記のD. Todd et al., 1991）。新たに同定されたＣｏＣＶのゲノムは、約４０％のヌクレオチド配列の相同性をＰＣＶのゲノムと共有していた（A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons," Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000)）。近年、トランスフュージョントランスミッテッドウイルス（transfusion transmitted virus）またはＴＴウイルス（ＴＴＶ）と名付けられた、環状ゲノムを持つ新たなヒトサーコウイルスが、輸血後肝炎に感染した人から同定された（H. Miyata et al., "Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus," J. Virol. 73:3582-3586 (1999); T. Nishizawa et al., "A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology," Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97 (1997)）。さらに、ヒトＴＴＶ様ミニウイルス（human TTV-like mini virus）（ＴＬＭＶ）は、正常血液提供者から同定され（P. Biagini et al., "Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates," J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi et al., "Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus," Arch. Virol.  145:979-93  (2000)）、第３の新たなサーコウイルスも、ＳＥＮウイルス（ＳＥＮＶ）として知られており、輸血後肝炎に感染した人から発見された（T. Umemura et al., "SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis," Hepathology 33:1303-1311 (2001)）。ヒトＴＴＶおよびＴＬＭＶの���ノムの構成はいずれも、ＣＡＶのものと類似していた（上記のP. Biagini et al., 2001; 上記のH. Miyata et al., 1999; 上記のK. Takahashi et al., 2000）。ＰＣＶに対する抗体は、ヒト、マウス、ウシおよびブタを含む様々な動物種で見つかっているが（G. M. Allan et al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs," Can. J. Vet. Res.  53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs," Vet. Rec. 134:680-1 (1994); J. C. Harding and E.G. Clark, "Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)," Swine Health and Production 5:201-203 (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, "Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States," Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar et al., "Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses," Can. Vet. J.  40:277-278 (1999); I. Tischer et al., "Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms," Arch. Virol. 140:737-743 (1995); I. Tischer et al., "Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle," Arch. Virol.  140:1427-1439 (1995)）、これらの動物種におけるＰＣＶの病原論に関してはほとんど知られていない。ＰＫ−１５細胞由来のＰＣＶでブタを実験的に感染させたが臨床疾患にならなかったことから、このウイルスはブタにとって病原性はないと考えられる（G. M. Allan et al., "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material," Vet. Microbiol.  44:49-64 (1995); I. Tischer et al., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus," Arch. Virol. 91:271-276 (1986)）。汚染したＰＫ−１５細胞株由来の非病原性ＰＣＶは、ブタサーコウイルス１型もしくはＰＣＶ１と名付けられた。
【０００７】
１９９１年に初めて記載された（上記のJ. C. Harding and E.G. Clark, 1997）離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）は、急速に広まりつつある離乳した子ブタの複合疾病である。豚産業に対する潜在的で深刻な経済的衝撃の脅威とともに、ＰＭＷＳの初期の原因であるＰＣＶ２に対するワクチンの開発が急を要する。ＰＭＷＳは主に５〜１８週のブタに影響を与える。臨床的なＰＭＷＳの兆候は、進行性の体重の減少、呼吸困難、頻呼吸、貧血、下痢、黄疸を含む。死亡率は１％から２％の間で、およびイギリスにおける複合事例のいくつかにおいては４０％まで変動する（M. Muirhead, "Sources of information on PMWS/PDNS," Vet. Rec. 150:456 (2002)）。ＰＭＷＳに特有の顕微鏡下の損傷は、肉芽腫性間質性肺炎、リンパ節症、肝炎、および腎炎を含む（G. M. Allan and J. A. Ellis, "Porcine circoviruses: a review," J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); 上記のJ. C. Harding and E.G. Clark, 1997）。ＰＭＷＳは今やカナダ、アメリカ合衆国（G. M. Allan et al., "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; J. Ellis et al., "Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," Can. Vet. J.  39:44-51 (1998); A. L. Hamel et al., "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs," J. Virol. 72:5262-5267  (1998); M. Kiupel et al., "Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana," Vet. Pathol. 35:303-307  (1998); R. Larochelle et al., "Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR," Vet. Rec. 145:140-142 (1999); 上記のB. M. Meehan et al., 1998; I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Clin. Microbiol.  36:2535-2541 (1998)）、殆どのヨーロッパの国（G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; 上記のS. Edwards and J. J. Sands, 1994; S. Kennedy et al., "Porcine circovirus infection in Northern Ireland," Vet. Rec. 142:495-496 (1998); A. Mankertz et al., "Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France," Virus Res. 66:65-77 (2000); C. Rosell et al., "Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome.  Vet. Rec.  146:40-43  (2000); P. Spillane et al., "Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland," Vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg et al., "Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands," Vet. Quart. 22:167-72 (2000))、アジアのいくつかの国（C. Choi et al., "Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction," J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153  (2000); A. Onuki et al., "Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan," J. Vet. Med. Sci. 61:1119-1123 (1999)）におけるブタにおいて存在が認められている。ＰＭＷＳは、世界中の豚産業に対する深刻な経済的衝撃を潜在的に持っている。
【０００８】
ＰＭＷＳ主要な病原体は、ブタサーコウイルス２型もしくはＰＣＶ２と命名されたＰＣＶの病原性株である（G. M. Allan et al., "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes," Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe," J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland," Vet. Microbiol.  66:115-23 (1999); 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; 上記のJ. Ellis et al., 1998; 上記のA. L. Hamel et al., 1998; 上記のB. M. Meehan et al., 1998; 上記のI. Morozov et al., 1998）。ＰＭＷＳに関連したＰＣＶ２の完全なゲノム配列が決定された（M. Fenaux et al., "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 38:2494-503  (2000); 上記のA. L. Hamel et al., 1998; 上記のJ. Mankertz et al., 1998; 上記のB. M. Meehan et al., 1997; 上記のB. M. Meehan et al., 1998; 上記のI. Morozov et al., 1998）。
【０００９】
ＰＣＶ１はブタに広く存在しているが、ブタにとって病原性はない。一方、遺伝学的に関連したＰＣＶ２は病原性があり、ブタにおいてＰＭＷＳを引き起こす。配列解析により、ＰＭＷＳに関連したＰＣＶ２は、非病原性ＰＣＶ１と約７５％しかヌクレオチド配列の相同性を有していないことが明らかとなった。非病原性ＰＣＶ１および病原性ＰＣＶ２遺伝子のＯＲＦ２遺伝子はいずれも、主要な免疫原性ウイルスキャプシッドタンパク質をコードしている（P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002); P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol.  81:2281-2287  (2000)）。
【００１０】
ＰＣＶ２接種による、臨床的ＰＭＷＳを従来のブタにおいて再現するための最初の試みは成功しなかった（M. Balasch et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol.  121:139-148 (1999); M. Fenaux et al., "Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions," J. Virol. 76:541-551 (2002)）。ノトバイオートブタ、ならびに自然発生したＰＭＷＳブタ由来の組織破砕物およびＰＣＶ２の増殖した培養細胞をもつ従来のブタにおける臨床的ＰＭＷＳの実験的再現により、混合した結果が得られた。臨床的ＰＭＷＳは、ＰＣＶ２およびブタパルボウイルスを共接種した、ノトバイオート（ＳＰＦ）ブタならびに初乳を奪われ帝王切開で生まれたブタにおいて（G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka et al., "Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus," Vet. Pathol. 37:254-263 (2000)）、ＰＣＶ２を接種したノトバイオートブタにおいて、その免疫系が、フロイント不完全アジュバント中のスカシ貝ヘモシアニンによって活性化されたときに（S. Krakowka et al., "Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2)," Vet. Pathol. 38:31-42 (2001)）再現された。
【００１１】
臨床的ＰＭＷＳは、ＰＣＶ２を単独で接種した帝王切開で生まれた／初乳を奪われたブタ（ＣＤ／ＣＤ）において（P. A. Harms et al., "Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus," Vet. Pathol. 38:528-539 (2001)）、およびＰＣＶとブタパルボウイルス（ＰＰＶ）もしくはブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のいずれかを共接種した従来のブタにおいて(A. Rivora et al., "Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2," J. Virol. 76: 3232-3239 (2002))再現された。ＰＲＲＳＶ／ＰＣＶ２の共接種の場合、リンパ球の減少、肉芽腫性炎症および壊死性肝炎のようなＰＭＷＳに特徴的な病理学的兆候は、ＰＲＲＳＶによってではなく、ＰＣＶ２によって誘導される(上記のP. A. Harms et al., 2001)。しかし、臨床的ＰＭＷＳはＰＣＶ２を単独で感染させたノトバイオートブタにおいては再現されなかった(G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); 上記のM. Balasch et al., 1999; J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S. Kennedy et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus" J. Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); 上記のS. Krakowka et al., 2001; 上記のS. Krakowka et al., 2000; R. M. Pogranichnyy et al., "Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection," Viral. Immunol.  13:143-153  (2000))。本研究で使用されたウイルス接種物は、自然発生したＰＭＷＳブタ由来の組織破砕物、もしくはＰＫ−１５培養細胞中で増殖したウイルスである（G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); 上記のM. Balasch et al., 1999; 上記のJ. Ellis et al., 1999; 上記のS. Kennedy et al., 2000; 上記のS. Krakowka et al., 2001; 上記のS. Krakowka et al., 2000; 上記のR. M. Pogranichnyy et al., 2000）。組織破砕物は、ＰＰＶおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のごとき他の共通のブタ病原体を含むこともあり（G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; J. A. Ellis et al., "Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Vet. Diagn. Invest.  12:21-27  (2000); 上記のC. Rosell et al., 2000）、ＰＣＶ２の増殖に使用したＡＴＣＣ  ＰＫ−１５細胞株は、ＰＣＶ１に永続的に感染していたため（上記のG. C. Dulac and A. Afshar, 1989)、臨床疾病および病理的損傷は、ＰＣＶ２感染単独によるものではないかもしれない（G. M. Allan et al., "Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication," Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan et al., "A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus," J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; 上記のJ. A. Ellis et al., 2000）。
【００１２】
臨床的ＰＭＷＳは、ＰＣＶ２接種ＣＤＣＤブタにおいて、マイコプラズマ・ヒオニューモニア（Mycoplasma hyopneumoniae）でワクチンした時にも再現されている（G. M. Allan et al., "Immunostimulation, PCV-2 and PMWS," Vet. Rec. 147:171-172 (2000)）。G. M. Allan et al."Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome: a field trial," Pig J. 48:34-41 (2001)、およびS. C. Kyriakis et al."The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome," J. Comp. Pathol. 126:38-46 (2002)による２つの最近のフィールド・スタディーによって、固有群（endemic herds）におけるＰＭＷＳの進行に対するマイコプラズマ・ヒオニューモニア（Mycoplasma hyopneumoniae）ワクチンによる免疫調節の効果が試験され、ワクチン接種した動物と比較して、未ワクチン群におけるＰＭＷＳ症例の有意な減少が示された。しかし、制御された実験室の条件下で従来のＳＰＦ子ブタを用いたもう１つの近年の研究は、Ｍ．ニューモニア（M. hyopneumoniae）での予防接種は潜在的に臨床的ＰＭＷＳの進行に影響するが、明らかにＰＣＶ２感染に対する第２の役割であることを示唆する効果を再現することができなかった。これらおよび他の研究をもとに、ＰＣＶはやはりＰＭＷＳの主要病原体であるが、それだけが病原体ではないと考えられる。
【００１３】
生物学的に純粋な形態のＰＣＶ２の感染性ウイルスストックの欠如によって、ＰＣＶ２の病原性およびＰＭＷＳにおける病因的役割の理解が妨げられる。ＰＰＶあるいはＰＲＲＳＶに対する予防接種は、ＰＣＶ２感染ブタにおいてＰＭＷＳの開始を予防していると一貫して示されていない。従って、ＰＭＷＳを特異的に狙った安全で有効なワクチンを見つけることは困難であった。獣医学分野において、有効で安全なＰＣＶ２およびＰＭＷＳに対するワクチンを作成するための、明確な当該分野で認識された必要性が存在する。
【００１４】
米国特許第６，２８７，８５６号(Poet et al.)およびＷＯ９９／４５９５６は、鳥類に感染するサーコウイルスであるオウム嘴羽病ウイルス（ＰＢＦＤＶ）、およびブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の核酸に関連している。該特許は、裸のＤＮＡもしくはｍＲＮＡを含むワクチン組成物を提案し、核酸配列と作動可能に結合したヒトサイトメガロウイルス即時型もしくは初期遺伝子エンハンサーもしくはプロモーター由来のシス作用転写もしくは翻訳調節配列を含む真核細胞において、ＰＣＶを一過的発現させるための核酸ベクターを開示している。しかし、ＰＣＶのＤＮＡは、単にＰＫ−１５細胞株由来であるため、上記のI. Tischer et al., 1974によって約３０年前に発見された非病原性ＰＣＶ１を含むようであり、そのため、ＰＣＶ２もしくはＰＣＶ２によって引き起こされる感染に対する免疫反応を誘発するのに有効ではないようである。オープンリーディングフレームを含むベクターから作製された組み換えタンパク質のサブユニットワクチンは、あまり特徴がないまたはそれぞれ区別がつかない。ＰＣＶのＤＮＡ源はＰＫ−１５細胞であるため、ＰＣＶ１のオープンリーディングフレームを含むベクターから作製されたタンパク質は、確実な免疫原特性を有していないか、有していてもＰＣＶ２に対するものは有していないであろう。
【００１５】
米国特許第６，２１７，８８３号(Allan et al.)およびフランス特許第２，７８１，１５９Ｂ号は、カナダ、カリフォルニアおよびフランス（ブリタニー）においてＰＭＷＳに感染したブタから採取した肺または神経節サンプルからの５つのＰＣＶ株の単離、および免疫原性組成物において１つ以上のブタパルボウイルス抗原と組み合わせたそれらの使用に関するものである。ＯＲＦ１〜ＯＲＦ１３からなるＰＣＶ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされたタンパク質は、該特許に広く記載されているが、免疫原特性を示す特定のタンパク質の例示は何もなかった。さらに、該特許はＤＮＡプラスミド、直鎖状ＤＮＡ分子、およびＰＣＶ抗原をコードする核酸分子を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現する組み換えウイルスからなるベクターを開示している。他のいくつかの参考文献、例えば、米国特許第６，３９１，３１４ Ｂ１号、米国特許第６，３６８，６０１  Ｂ1号、フランス特許第２，７６９，３２１号、フランス特許第２，７６９，３２２号、ＷＯ０１／９６３７７  Ａ２、ＷＯ００／０１４０９、ＷＯ９９／１８２１４、ＷＯ００／７７２１６  Ａ２、ＷＯ０１／１６３３０  Ａ２、ＷＯ９９／２９８７１などにも、ＰＣＶ１もしくはＰＣＶ２ポリペプチドもしくは様々な株のポリペプチドをコードする核酸の投与について記載されている。
【００１６】
しかし、非病原性ＰＣＶ１は、ＰＣＶ２の感染および当技術分野において記載された病原性ＰＣＶ２株に対して有効ではなく、例え減毒されても、有毒状態に戻る生ウイルスの通常の傾向のため限られた値であろう。従って、今でも当該技術分野において、深刻な感染もしくはＰＣＶ２によって引き起こされるＰＭＷＳに対する、有効かつ動物ワクチン中で安全なままである、ブタに接種するための、生きた、感染性の、非病原性抗原への長期にわたる要求が存在する。これらのゴールは、I. Tischerらによって約３０年前に単離された非病原性ＰＣＶ１のゲノム骨格をもとにした、本明細書に記載された新しい生キメラブタサーコウイルスの構築によって達成される。本発明の新しいキメラブタサーコウイルスは、単独かつ有利にＰＣＶ１の非病原性形質を保持するが、病原性ＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発することによって、長期的な要求を満たすことが可能である。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、ワクチンとして有用なブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の感染性キメラDNAクローンおよびＤＮＡクローン由来の生キメラウイルスに関する。新しい生きたキメラの、遺伝的に無毒性のウイルスは、典型的には、同じ対応部位において、病原性ＰＣＶ２株の免疫原性遺伝子でＰＣＶ１遺伝子を置換した、非病原性ＰＣＶ１のゲノム構造から作製される。本発明は、本明細書に記載した新しい組み換え核酸分子を含む生物学的に機能的なプラスミド、ウイルスベクターおよびその類似物、該ＤＮＡを含むベクターによってトランスフェクトされた適切なホスト細胞、ならびに免疫原性ポリペプチド発現産物を包含する。さらに本発明の範囲内に含まれるものは、ブタをウイルス感染もしくはＰＣＶ２によって引き起こされる離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）から守る新しい方法であり、該方法は、かかる防御が必要なブタに、例えば、プラスミドにおいてクローン化したキメラＤＮＡ、キメラＤＮＡクローン由来のキメラウイルス、本明細書に記載したＤＮＡから発現されたポリペプチド産物などを含む、免疫学的有効量のワクチンを投与することを含む。本発明は、さらに、この新しい無毒性ワクチンを得る、または特徴づける際に実験モデルとしての用途を見つけた、新しい感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡ、およびＰＣＶの交互キメラＤＮＡクローンを提供する。
【００１８】
本発明の背景およびその技術的進歩は、添付の図面を参考に以下にさらに記載される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明によって、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の感染性分子およびキメラ核酸分子、キメラ核酸分子から作られる生キメラウイルス、ブタをウイルス感染もしくはＰＣＶ２によって引き起こされる離乳後多臓器性発育不良症候群(PMWS)から防御するための動物ワクチンが提供される。本発明は、さらに、ワクチンとして用いられ得る免疫原性ポリペプチド発現産物を提供する。
【００２０】
ＰＣＶの新たな無毒性、感染性キメラＤＮＡ分子（ＰＣＶ１−２）は、ＰＣＶ１ゲノム中のＯＲＦ遺伝子の代わりに病原性ＰＣＶ２の免疫原性オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を含んだ、感染性、非病原性ＰＣＶ１をコードする核酸分子を含む。該感染性キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、感染性非病原性ＰＣＶ１  ＤＮＡクローンのゲノム骨格内に、ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンの免疫原性キャプシド遺伝子（ＯＲＦ２）を含んでいることが好ましい。通常、非病原性ＰＣＶ１ゲノム構造において、ＰＣＶ２  ＤＮＡのキャプシド遺伝子はＰＣＶ１  ＤＮＡのＯＲＦ２遺伝子に置換するが、位置の変更の多様性が、他の無毒化もしくは弱毒化キメラＤＮＡクローンを得るための遺伝子操作を通じて構築されるであろうと考えられる。ＰＣＶ１およびＰＣＶ２間の交互キメラ感染性ＰＣＶ２−１は、本発明のキメラＰＣＶ１−２の解析のための対照として開示され、病原性ＰＣＶ２感染性ＤＮＡ骨格クローン中にて、ＰＣＶ２のキャプシド遺伝子をＰＣＶ１のもので置換することによって構築される。実験モデルであることに加え、交互キメラＰＣＶ２−１は、特別注文のワクチンの作成における用途があり得る。
【００２１】
本明細書に記載されたＰＣＶ２のクローン化されたゲノムＤＮＡは、ＰＫ−１５細胞へトランスフェクトした場合およびブタに与えた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて感染性を示す。感染性ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンは、ブタにおけるＰＭＷＳに特徴的な病理学的損傷を生み出し、臨床疾患の改善された特徴づけおよび組織細胞におけるウイルスの分布の理解を可能にする。この新しい、容易に再現できる病原体は、ブタにおけるＰＭＷＳを予防するための適切なワクチン接種プログラムの開発に役立つ。
【００２２】
新しいキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンも、ＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションおよびブタへのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のいずれによっても感染することができる。トランスフェクトしたＰＫ−１５細胞において、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、ＰＣＶ２−１キャプシド抗原（ＰＣＶ２の免疫原性キャプシドタンパク質）を発現するが、交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンは、ＰＣＶ１キャプシド抗原を発現することが、ＰＣＶ１もしくはＰＣＶ２キャプシド抗原に特異的な抗体を用いた免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって証明された。ＰＣＶ２特異的抗体へのセロコンバージョンは、感染性ＰＣＶ２クローンをキメラＰＣＶ１−２クローンと共に接種したブタにおいて検出される。ＰＣＶ２特異的抗体へのセロコンバージョンの検出は、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンが、感染したブタにおいてＰＣＶ２特異的抗体を誘導し、次に、ＰＣＶ２の感染から接種したブタを守るために働くことを立証している。
【００２３】
以下の例は、接種したブタにおけるキメラＤＮＡクローンの免疫原性および病原性の評価を、さらに詳細に記載している。本質的にＰＣＶ２のＯＲＦ２抗原に対する抗体へのセロコンバージョンは、ＰＣＶ２  ＤＮＡクローン（グループ３）およびキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローン（グループ４）を接種されたブタにおいて検出される。ＰＣＶ１クローンおよび交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローン（それぞれ、グループ２および５）を接種した全てのブタは、ＰＣＶ１抗体へセロコンバートする。それぞれの群から選択されたブタから回収したウイルスを、部分的に配列解読し、本当に接種に用いたそれぞれの感染性ＤＮＡクローンであるかを確認した。ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンを接種した動物のさまざまな組織における全体および微細な損傷は、ＰＣＶ１、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンを接種したブタで観察されたものより、かなり深刻であった。
【００２４】
驚くべきことに、また有利なことに、非病原性ＰＣＶ１ゲノム骨格内にクローン化された病原性ＰＣＶ２の免疫原性キャプシド遺伝子（ＯＲＦ２）もつ、キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンは、病原性ＰＣＶ２キャプシド抗原に対する特定の免疫応答を誘導するが、ブタ中で非病原性ＰＣＶ１の性質を単独で保持する。キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンを接種された動物では、ＰＣＶ感染動物に類似した緩やかな感染を示したが、病原性ＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシドタンパク質に対する抗体へのセロコンバートが生じた。ＰＣＶ１およびキメラＰＣＶ１−２を接種された動物において観察されたウイルス血症の平均的な長さは、それぞれ０．６２５週および１週となり、病原性ＰＣＶ２を接種された動物の約２．１２週よりも短かった。いくつかの接種された動物における検出可能なキメラＰＣＶ１−２ウイルス血症の不足は、ＰＣＶ１−２を接種されたブタ（グループ４）において、ＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシドタンパク質に対する抗体へのセロコンバージョンに影響しなかった。この結果は、キメラＰＣＶ１−２ウイルス血症がいくつかの接種した動物において短いまたは検出不可能であっても、キメラＰＣＶ１−２ウイルスはＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシドタンパク質に対する免疫応答を誘導できることを示す。未だブタに非病原的であるＰＣＶ２免疫原性ＯＲＦ２キャプシドタンパク質に特異的な免疫反応を誘導するための、キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンの特別な能力によって、キメラＰＣＶ１−２クローンは、遺伝子操作された生―弱毒化ワクチンおよび他のワクチンとして、特に有用なものになる。
【００２５】
新しい、精製および単離された本発明の核酸分子は、配列番号２に記載され、図９に示され、および特許寄託物番号PTA-3912としてAmerican Type Culture Collectionに寄託された、クローン化されたキメラＰＣＶ１−２の全長ＤＮＡ配列、その相補鎖（すなわち、逆向きかつ反対の塩基対）、またはキメラヌクレオチド配列と少なくとも９５％の相同性をもつ核酸配列（すなわち、遺伝子全体の主要な有効成分）を含む。当該技術でよく知られた従来の方法、例えば当該技術で認められた標準もしくは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション技術を、相補鎖もしくは高い相同性を持つ核酸配列を作製するために用いることができる。クローン化されたキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡの免疫原性キャプシド遺伝子ＤＮＡ配列を含む精製および単離した核酸分子も、配列番号３および図１０に記載されている。
【００２６】
キメラ核酸分子を含む適当な細胞は、単独で、生きた、感染性のキメラブタサーコウイルスを産生する。生きた、感染性のキメラウイルスは、本明細書で図解されたようなｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのトランスフェクションを介したＰＫ−１５細胞のトランスフェクトによるキメラＤＮＡクローン由来のものである。クローン化されたキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡの好ましい例は、配列番号２および図９に記載された核酸配列である。さらに、本発明は、キメラウイルスが、キメラ核酸配列の相補鎖もしくは少なくとも９５％の高い相同性を持つ核酸配列由来であることを想定している。
【００２７】
生物学的に機能的な本明細書に記載された新たな組み換え核酸分子を含むプラスミド、ウイルスベクターおよびその類似物、該キメラおよび分子ＤＮＡクローンを含むベクターによってトランスフェクトされた適切なホスト細胞、ならびに該免疫原性ポリペプチド発現産物も、本発明の範囲内に含まれる。特に好ましい免疫原性タンパク質は、配列番号４および図１１に記載のアミノ酸配列を持つ。さらに、その生物学的に活性のある変種は、本発明により想定されている。通常の技術を有する者は、ポリペプチド配列からアミノ酸の修飾、置換、欠失させる、および親配列と同じもしくは本質的に同じ活性を保持した生物学的に活性のある変種を過度な努力を必要とせず作製する方法を知っているであろう。
【００２８】
本発明の免疫原性ポリペプチド産物を作製するための過程は、以下の手順：前記ポリペプチド産物の発現を許容する方法にて、本明細書に記載の新たな組み換え核酸分子でトランスフェクトされた原核もしくは真核ホスト細胞を適当な栄養条件下で生育させる手順、および前記核酸分子が発現した所望のポリペプチド産物を、当該技術において知られた標準的な方法によって単離する手順を含んでいてもよい。免疫原性タンパク質は、他の技術、例えば生化学的合成およびその他の類似技術のごとき他の技術によって調製されてもよい。
【００２９】
キメラウイルスおよび分子ＤＮＡクローンのワクチン、ならびにこれらを用いた方法も本発明の範囲内に含まれる。予防接種したブタは、深刻なウイルス感染およびＰＣＶ２によって引き起こされるＰＭＷＳから守られる。新たな方法は、ブタに免疫学的有効量の本発明に記載のワクチン、例えば免疫原性量のキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡ、クローン化されたキメラウイルス、ＰＣＶ１−２のキメラＤＮＡを含むプラスミドもしくはウイルスベクター、ポリペプチド発現産物、組み換えＰＣＶ２  ＤＮＡ等を含むワクチンを投与することによって、ウイルス感染もしくはＰＭＷＳの予防を必要とするブタを守る。ウイルス感染に対する広範囲の防御を提供するために、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、他のブタ感染性病原体および免疫賦活薬のごとき他の抗原を、ブタに同時に与えてもよい。
【００３０】
該ワクチンは、非毒性、生理学的に許容される担体および、任意で１つもしくはそれ以上のアジュバントとの組み合わせで、例えば、感染性キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡ、ｐＳＫベクターのごとき適当なプラスミドもしくはベクター中でクローン化されたＰＣＶキメラＤＮＡゲノム、無毒性のキメラ生ウイルス、不活化キメラウイルス等を含む。該ワクチンは、本明細書に記載の感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンも含む。感染性キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡ、感染性キメラウイルスゲノムを含むプラスミドＤＮＡ、および生キメラウイルスが好ましく、生キメラウイルスが最も好ましい。本発明の無毒性の生ウイルスワクチンは、有毒状態に復帰する危険を冒す弱毒化した生ウイルス、もしくはウイルス疾患の予防に十分な抗体免疫応答を誘導しないかもしれないウイルス全体を増殖させた死細胞培養物のいずれかを用いた従来のウイルスワクチンに対する利点を提供する。
【００３１】
本発明のワクチンと共に投与されうるアジュバントは、ワクチンに対するブタの免疫応答を増大させる物質である。該アジュバントは、同時およびワクチンと同じ部位にて、または異なる時、例えばブースターとして投与されてもよい。アジュバントも、ワクチンが投与された手順もしくは部位と異なる手順もしくは部位にて、ブタに都合よく投与されてもよい。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、非イオン性ブロック重合体もしくは共重合体、サイトカイン（IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等のような）、サポニン、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびその類似物を含むがそれらに限定されない。他の適切なアジュバントは、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）から単離された易熱性もしくは熱安定性エンテロトキシン、コレラ毒素もしくはそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、フロイント完全もしくは不完全アジュバント等を含む。毒素、例えばジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素をもとにしたアジュバントは、使用前に、例えば、ホルムアルデヒドでの処理によって不活化してもよい。
【００３２】
さらに、該ワクチンは、のごとき感染性キメラＰＣＶＤＮＡクローンの免疫活性を促進するさらなる抗原、例えばブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、他のブタ感染性病原体、および免疫賦活薬を含む。
【００３３】
本発明の新たなワクチンは、特定の型もしくは調製方法に全く限定されない。クローン化ウイルスは、感染性ＤＮＡワクチン（すなわち、ＤＮＡをブタに直接接種するためにプラスミド、ベクターもしくは他の従来の担体を用いること）、生ワクチン、修飾された生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、弱毒化ワクチン、遺伝子操作されたワクチン等を含むがそれらに限定されない。これらのワクチンは、当該分野において知られた標準的な方法によって調製される。
【００３４】
生ウイルスワクチンは、ワクチンを受けた人において、全身性、局所性、体液性および細胞性免疫反応を含む全ての可能な免疫反応が活性化されるため、通常最も望ましいワクチンである。一方、不活化ワクチンは体液性免疫応答のみを誘導できる。しかしながら、最も望ましい生ウイルスワクチンには、生きた外来ウイルス病原体での汚染の潜在的危険、もしくはその場でウイルスが有毒なものに戻りうる危険のような不利な点が数点ある。注目すべきことに、本発明の固有のＰＣＶ１−２  ＤＮＡによってこれら不利な点を克服することができる。ＰＣＶ２の免疫原性遺伝子のみを用いた場合、キメラＤＮＡは、非病原性であるが、病原性ＰＣＶ２ウイルスに対する生ウイルスワクチンの完全かつ有益な免疫応答を誘発する生きた複製性のキメラウイルスを構築する。キメラウイルスをもとにした生ウイルスワクチンには、病原性形質に復帰する機会があるとしてもわずかである。よって、非病原性ＰＣＶ１の構造をもとにした新たなキメラウイルスには、ＰＣＶ２の感染に対する免疫性のための、あらゆる組み換えＰＣＶ２  ＤＮＡウイルス、あらゆる弱毒化ＰＣＶ２生ワクチンもしくはＰＣＶ２に単独で基づくあらゆる型のワクチンに対して、巨大な利点がある。
【００３５】
生ウイルスワクチンは最も好ましいが、ブタに新しいキメラウイルスおよび本明細書に記載の他の抗原を接種するために、他の型のワクチンを使用してもよい。不活化ウイルスワクチンを調製すること、例えば、感染性ＤＮＡクローンからのウイルス増殖は、当業者に知られたもしくは本明細書に記載の方法によって行われる。一連のウイルスの不活化は、一般的に知られたプロトコルによって最適化される。
【００３６】
不活化ウイルスワクチンは、ホルマリンもしくは疎水性溶媒、酸等のごとき不活化剤で、紫外線光もしくはＸ線照射によって、加熱によってなど、クローン化ＰＣＶのＤＮＡ由来のキメラウイルスを処理することにより、調製されてもよい。不活化は、当技術分野において理解された方法で行われる。例えば、化学的不活化において、ウイルスを含む適当なウイルスサンプルもしくは血清サンプルを、不活化するのに十分な時間の長さで、十分な量もしくは濃度の不活化剤で、十分な高さ（もしくは低さ、不活化剤による）の温度もしくはｐＨにて処理する。熱による不活化は、ウイルスを不活化するのに十分な温度および時間にて行われる。照射による不活化は、ウイルスを不活化するのに十分な時間にて、光もしくはその他エネルギー源の波長を用いて行われる。ウイルスは、感染可能な細胞に感染することができないならば、不活化されたと考えられる。
【００３７】
典型的には、サブユニットワクチンの調製は、修飾した生ワクチンもしくは不活化ワクチンの調製と異なる。サブユニットワクチンの調製前に、ワクチンの保護性もしくは抗原性成分が同定されなければならない。かかる保護性もしくは抗原性成分は、ブタにおいて特定の強い保護性もしくは免疫性応答を上昇させる、ウイルスキャプシドタンパク質のあるアミノ酸の部分もしくは断片；１つもしくは複数のウイルスキャプシドタンパク質自身、それらのオリゴマー、およびウイルスの基礎構造または同一のかかる基礎構造の部分もしくはユニットを形成するウイルスキャプシドタンパク質のより高次構造を有する会合体；ウイルスの表面もしくは表面付近またはウイルス基本構造中に存在するオリゴグリコシド、糖脂質もしくは糖タンパク質、例えばウイルス等と結合したリポタンパク質もしくは脂肪基を含む。好ましくは、ＯＲＦ２遺伝子によってコードされたような、キャプシドタンパク質が、サブユニットワクチンの抗原成分として用いられる。感染性ＤＮＡクローンによってコードされた他のタンパク質を用いてもよい。これらの免疫原性成分は、当業者に知られた方法によって容易に同定される。一度同定された、保護性もしくは抗原性のウイルスの部分（いわゆる「サブユニット」）は、次いで、当業者に知られた手順によって精製および／またはクローン化される。サブユニット、例えばウイルスの高純度のサブユニットは、ウイルス全体よりも毒性が少ないため、サブユニットワクチンによって、生ワクチンをもとにした他のワクチンに対する利点が提供される。
【００３８】
サブユニットワクチンが遺伝子組み換え法によって生産される場合、クローン化サブユニット、例えば、ＯＲＦ２（キャプシド）遺伝子の発現は、当業者に知られた方法によって最適化されてもよい（例えば、Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MA., 1989を参照）。使用されるサブユニットがウイルスの完全な構造的特徴、例えば全体のキャプシドタンパク質を示す場合、ウイルスからのその単離手順は最適化されなければならない。いずれの場合においても、不活化プロトコルの最適化後に、製造前にサブユニット精製プロトコルは最適化してもよい。
【００３９】
病原性クローンからの弱毒化ワクチンの調製のために、順応させられた、生きた病原性ＰＣＶ２組織培養は、まず、当業者に知られた方法によって、一般的には連続継代細胞培養によって、弱毒化される（非病原性もしくは無害にされる）。病原性クローンの弱毒化は、遺伝子欠失もしくはウイルス産生遺伝子の変異によって作られてもよい。このとき、該弱毒化ＰＣＶウイルスは、ＰＣＶ１の非病原性形質を保持するが、組み換え技術を通じてＰＣＶ２ゲノムから選択される免疫原性形質の強さにおいて多様となりうる、さらなるキメラＰＣＶ１−２ウイルスを構築するために用いられてもよい。
【００４０】
最も好ましいワクチンは、生キメラウイルスＤＮＡクローン、特に、非病原性ＰＣＶ１の骨格にＰＣＶ２の免疫原性遺伝子を含むクローンを使用する。有利には、遺伝子操作を通じて構築された場合にも本来無毒性である生キメラウイルスは、時間のかかる弱毒化手順を必要としない。該ウイルスは、病原性ＰＣＶ２に対する全範囲の免疫応答を誘導することのできる、ＰＣＶ２に対する免疫原性タンパク質をウイルス複製の間生産する、生きているが非病原性の複製ウイルスとして、独自に働く。
【００４１】
さらなる利点として、好ましい本発明の生キメラウイルスによって、他の弱毒化ワクチンよりも作製、保存および送達が容易である、遺伝学的に安定したワクチンが提供される。キメラウイルスをもとにした無毒性もしくは弱毒化ワクチンは、通常、従来の修飾した生ワクチンよりも安全でなくとも、同じくらい安全であるとみなされる（J. Arroyo et al., "Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)," J. Virol. 75(2):934-942 (2001); F. Guirakhoo et al., "Recombinant chimeric yellow fever-dengue type 2 virus is immunogenic and protective in nonhuman primates," J. Virol. 74(12):5477-5485 (2000); S. Tang et al., "Toward a poliovirus-based simian immunodeficiency virus vaccine: correlation between genetic stability and immunogenicity," J. Virol. 71(10):7841-7850 (1997)）。例えば、日本脳炎ウイルス（ＩＥＶ）に対するChimeriVax-JEワクチンは、黄熱ウイルスワクチンYFV17Dの構造タンパク質prMおよびEをコードする遺伝子を、弱毒化JEV SA14-14-2株の対応遺伝子で置換したYFV17Dの遺伝子組み換え派生物であり、長期経過後にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏいずれにおいても遺伝学的に安定であることが示されていた(上記のJ. Arroyo et al., 2001)。もう一つのデングウイルス２型に対するキメラウイルスワクチンChimeriVax-D2も、弱毒化黄熱（ＹＦ）−デングウイルス２型（デング−２）ウイルスであり、遺伝学的に安定である；ベロ（Vero）細胞において１８回継代後、その配列が変化してないことが報告されている(上記のF. Guirakhoo et al., 2000)。
【００４２】
本発明のもう１つの好ましいワクチンは、ブタに非病原性キメラＤＮＡクローンをデリバリーするために適当なプラスミドを用いる。ウイルス全体を増殖させた、生きたもしくは死んだ培養細胞を用いる従来のワクチンとは逆に、本発明は、感染性キメラウイルスゲノムを含むプラスミドＤＮＡでのブタの直接接種を提供する。
【００４３】
本発明において望ましいさらなる遺伝子組み換えワクチンは、当業者に知られた技術によって生産される。かかる技術は、さらなる組み換えＤＮＡの操作、アミノ酸配列の修飾もしくは置換、および類似技術を含むがそれらに限定されない。
【００４４】
組み換えＤＮＡ技術をもとにした遺伝子組み換えワクチンは、例えば、ブタにおける強い免疫もしくは保護応答の誘導の原因であるタンパク質をコードするウイルス遺伝子の別の部分（例えば、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４等由来のタンパク質）の同定によって作られる。かかる同定された遺伝子もしくは免疫優性断片を、標準的なタンパク質発現ベクター、例えば、バキュロウイルスベクターにクローン化し、適切なホスト細胞の感染に用いることができる（例えば、O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992を参照）。ホスト細胞は、培養され、そして望ましい程度に精製され、適当なワクチン製品に処方されうる所望のワクチンタンパク質を発現する。
【００４５】
該クローンが、疾病を引き起こす望ましくない天然の能力を保持している場合、毒性の原因となるウイルスゲノム中の核酸配列を特定し、遺伝子操作、例えば部位特異的変異誘発によりウイルスを無毒にすることも可能である。部位特異的変異誘発は、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドを不可、欠失、置換することもできる（例えば、Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984を参照）。オリゴヌクレオチドを、所望の変異を含めて合成し、一本鎖ウイルスＤＮＡの部分にアニールさせる。この手順によって生じた該ハイブリッド分子を用いて、バクテリアを形質転換する。そして、適切な変異を含む単離された二本鎖ＤＮＡを用いて、次に適当な培養細胞へトランスフェクトされる後者の制限酵素断片と連結させて全長ＤＮＡを作製する。移動のための適当なベクターへのゲノムの連結は、当業者に知られたあらゆる標準的な技術によって行われてもよい。ウイルス子孫の産生のためのホスト細胞への該ベクターのトランスフェクションは、あらゆる従来の方法、例えばリン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、エレクトロポーレーション、プロトプラスト融合および他の周知の技術を用いて行われてもよい（例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。そして、クローン化されたウイルスは、所望の変異を示す。あるいは、適切な変異を含む２つのオリゴヌクレオチドを合成することもできる。これらをアニールさせて、二本鎖ＤＮＡを得て、全長ＤＮＡを作製するためにウイルスＤＮＡに挿入してもよい。
【００４６】
ワクチンにおいて有用である遺伝子組み換えタンパク質は、例えば、昆虫細胞、酵母細胞もしくは哺乳類細胞において発現されてもよい。従来の方法によって精製もしくは単離された遺伝子組み換えタンパク質を、ＰＣＶ２によって引き起こされるウイルス感染もしくは離乳後多臓器性発育不良症候群(PMWS)から守るために、ブタに直接接種することができる。
【００４７】
ウイルスから得られた、もしくは１つもしくはそれ以上のウイルスの免疫優性タンパク質をコードするウイルスゲノムから複製された核酸分子を含むトランスファーベクターで、昆虫細胞株（HI-FIVEのような）をトランスフェクトすることができる。トランスファーベクターは、例えば、直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ、および所望のポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む。組み換えバキュロウイルスを作製するために、ホスト細胞株を直鎖状バキュロウイルスＤＮＡおよびプラスミドで同時トランスフェクトしてもよい。
【００４８】
あるいは、ＰＭＷＳに病んでいる関連ブタから得られた、１つもしくはそれ以上のキャプシドタンパク質をコードするＤＮＡ、感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンもしくはクローン化されたＰＣＶキメラＤＮＡゲノムを、ポックスウイルスもしくはアデノウイルスのごとき生ベクター（live vector)へ挿入し、ワクチンとして用いることができる。
【００４９】
免疫学的有効量の本発明のワクチンは、ウイルス感染もしくはＰＭＷＳに対する防御を必要とするブタに投与される。定期試験によって、ブタに接種する免疫学的有効量もしくは免疫学的量を、容易に決定もしくは難なく力価判定することができる。有効量とは、ワクチンに対する十分な免疫応答が、ＰＭＷＳを引き起こすウイルスにさらされたブタを防御するに達する量のことである。ウイルス病の有害な生理学的症状または作用が、著しく減少、改善もしくは完全に予防される程度にブタを防御することが好ましい。
【００５０】
該ワクチンを、単回投与もしくは反復投与にて投与することができる。投与量は、例えば、１から１０００μｇの範囲の感染性キメラＤＮＡゲノムを含むプラスミドＤＮＡでもよいが（ワクチンの免疫活性成分の濃度による）、副作用もしくはウイルスの生理学的症状を引き起こすのに十分な量のウイルスベースの抗原を含んではならない。ブタの体重をもとにした活性のある抗原剤の適当な用量、抗原の濃度および他の典型的な要素の決定もしくは力価判定のための方法は、当業者に知られている。感染性キメラウイルスＤＮＡクローンをワクチンとして使用する、または生きた感染性キメラウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生し、そして該生キメラウイルスをワクチンとして用いるのが好ましい。その場合、１００〜２００μｇのクローン化キメラＰＣＶＤＮＡもしくは約１０，０００の５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の生キメラウイルスをブタに与えることができる。
【００５１】
該ワクチンを、ＰＣＶウイルスにさらされていないブタに投与することが望ましい。キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡもしくは他のその抗原型を含むワクチンを、鼻腔内に、経皮的に（すなわち、全身吸収のための皮膚表面上もしくは皮膚表面における投与）、非経口的に等、都合よく投与することができる。投与の非経口経路は、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内およびそれらの類似経路を含むがそれらに限定されない。予防接種の筋肉内および皮内経路は、ウイルス感染性ＤＮＡクローンを用いた他の研究において成功していたことから（E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology  238:157-160 (1997); L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)）、実際的な鼻腔内投与経路に加えて、これらの経路が最も好ましい。より都合よくないが、リンパ内接種経路によって該ワクチンをブタに与えることも考えられる。ユニークで、かなり好ましい投与方法は、ＰＣＶ１−２キメラを含むプラスミドＤＮＡを、筋肉内、皮内、リンパ内等に直接注入することを必要とする。
【００５２】
液体として投与する場合、本ワクチンは、水性溶液、シロップ、エリキシル、チンキおよびその類似物の形に調製されてもよい。かかる処方は、当業者に知られており、適当な担体もしくは溶媒系中で抗原および他の典型的な添加物の溶解によって典型的に調製される。適当な担体もしくは溶媒は、水、塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセロール等を含むがそれらに限定されない。典型的な添加物は、例えば、認可染料、香料、甘味料およびチメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）のような抗菌性防腐剤である。かかる溶液は、例えば、部分加水分解ゼラチン、ソルビトールもしくは細胞培養培地の添加によって安定化され、当業者に知られた試薬、例えばリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、それらの混合物およびそれらの類似物を用いた従来の方法によって緩衝されてもよい。
【００５３】
液剤は、他の標準的なコフォーミュラント（co-formulant）と組み合わせた懸濁剤もしくは乳化剤を含む懸濁液および乳化液を含んでいてもよい。これらの種類の液剤は、従来の方法によって調製されてもよい。懸濁液を、例えば、コロイドミルを用いて調製してもよい。乳化液を、例えば、ホモジェナイザーを用いて調製してもよい。
【００５４】
体液系に注入するために設計された非経口剤は、適切な等張性およびブタの体液の対応するレベルにｐＨを緩衝することを必要とする。等張性は、塩化ナトリウムおよび必要な他の塩で適切に調製されうる。エタノールやプロピレングリコールのごとき適当な溶媒を用いて、製剤中の成分の溶解度および液体調製の安定性を増大させることができる。本発明で使用されたさらなる添加物は、デキストロース、通常の抗酸化剤および通常のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むがそれらに限定されない。非経口剤形は、使用前に滅菌もされなくてはいけない。
【００５５】
本発明のもう１つの態様は、感染性非病原性ＰＣＶ１をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子の核酸分子を除去し、同部位を感染性病原性ＰＣＶ２をコードする免疫原性ＯＲＦ遺伝子の核酸分子で置換し、次いでキメラ核酸分子を回収することを含む、ＰＣＶ１−２の感染性、非病原性キメラ核酸分子の新たな調製方法に関する。該核酸分子は、典型的にＤＮＡである。好ましい方法は、非病原性ＰＣＶ１  ＤＮＡのＯＲＦ２遺伝子を、本明細書に記載のＰＣＶ２の感染性病原性ＤＮＡの免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子で置換する。他のＯＲＦ部分もしくはそれらの免疫原性断片を、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２  ＤＮＡ間で交換して、本明細書に記載の方法に従って弱毒化感染性キメラＤＮＡクローンを構築することができると考えられる。
【００５６】
組み換え核酸分子を用いて、ＰＣＶ１の非病原性性質を有利に保持し、病原性ＰＣＶ２の免疫原性ＯＲＦ２タンパク質を発現し、病原性ＰＣＶ２に対する完全な免疫応答を誘発する、本発明の生きた感染性の複製性キメラウイルスを構築した。ＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、ブタにおけるＰＣＶ２の感染およびＰＭＷＳに対する遺伝子操作された無毒性の生ワクチンとして役に立つことが望ましい。
【００５７】
ＰＣＶ２の感染性ＤＮＡクローンは、本明細書に記載のように構築されていることから、生物学的に純粋かつ均一な感染性ウイルスストックを、病原研究および非病原性キメラワクチンの開発のために産生することができる。ＰＣＶ２感染と関連した臨床疾病、ウイルスの分配および病理学的病変の進行は、この分子ＤＮＡクローン、ならびに生物学的に純粋および均一な該分子ＤＮＡクローン由来の感染性ＰＣＶ２ウイルスストックを用いることによって過去に観察されたものよりも明確に特徴付けされ、本発明の所望のワクチン産物の開発に役に立つ。
【００５８】
ＰＣＶ２分子クローンは、２コピーの完全なＰＣＶ２ゲノムを直列にしてｐＳＫベクターへ連結することにより得られる。従来技術において開示された単一コピーゲノムとは著しく対照的に、本明細書に記載の方法によって作製された感染性ＤＮＡＰＣＶ２クローンは、直列反復において共に連結されたＰＣＶ２ゲノムの２つの完全なコピーを含む。２コピーのゲノムを直列に連結することによって、ＰＣＶ２の通常の環状ゲノムを真似した類似の環状ゲノムが提供される。感染性ＤＮＡＰＣＶ２クローンにおいて、２コピーのゲノムを直列に持つことの利点は、感染性ＤＮＡクローンがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてトランスフェクトされる際に、複製を最大化できることである。よって、本発明のクローンは、以前の単一コピーゲノムよりも、より効率よく効果的に作用する。
【００５９】
分子ウイルスクローンでの動物の感染は、ウイルス複製およびホストにおける毒性の遺伝的な決定を研究する際に実に有用である。２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）は、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）の病原体としてみなされてきた。ＰＭＷＳは、ブタにおける複合病症候群であり、複数の要因がＰＭＷＳの臨床症状において関与しているかもしれない。しかし、病気のブタの組織破砕物中の他の一般的な物質が存在することによる、生物学的に純粋な形のＰＣＶ２を生産する際の困難は、ＰＣＶ２感染単独に起因する臨床疾病および病理学的病変の明確な特徴づけを妨げてきた。ＰＣＶ２の感染性分子ＤＮＡクローンが構築され、また、該分子クローンでのブタの直接的ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションによって、ＰＣＶ２感染と関連した疾病の特徴づけおよび病理学的病変に用いられたのは、今回が初めてである。
【００６０】
分子クローン由来の均一なＰＣＶ２の生ウイルスストックは、ＰＫ−１５細胞へトランスフェクトされた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感染性があることが示されている。クローン化ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡも、特定病原体不在（ＳＰＦ）ブタの肝臓およびへ浅腸骨リンパ節（superficial iliac lymph nodes）へ直接注射した場合、感染性がある。クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡで注射した動物は、均一な、感染性ＰＣＶ２の生ウイルスストックで鼻腔内接種することにより誘導されるものと類似した感染および疾病が進行する。ＰＣＶ２特異的抗体へのセロコンバージョンは、接種後３５日の接種集団のブタの大半で検出された。
【００６１】
キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンを接種されたブタにおけるウイルス血症の開始と継続は、非病原性ＰＣＶ１  ＤＮＡクローンを接種されたブタのものと類似していたが、ＰＣＶ２クローンを接種されたブタにおけるウイルス血症は、より早く、より長く継続したようようである。接種後１４日にて開始し、約２〜４週間継続したウイルス血症は、ＰＣＶ２接種動物の大多数において検出された。同じく、接種後３５日に検死された接種されたブタの大多数が、ＰＣＶ２抗体にセロコンバートしていた。ＰＣＶ抗原は、接種されたブタの様々な組織および臓器において検出された。肉眼的病変は、肺およびリンパ節に限られ、体系的に肥大化した褐色のリンパ節、虚脱しなかった肺、ならびに軽度の多巣性褐色硬化病巣(multifocal tan-colored foci of consolidation)によって特徴づけられる。非病原性ＰＣＶ１およびキメラＰＣＶ１−２接種ブタいずれにおいても、リンパ節に影響する肉眼的病変は、穏やかかつ少数の動物だけに限られたが、病原性ＰＣＶ２接種ブタの全てで、中程度から重度の腫れ、およびリンパ組織の変色が起こっている（表９、下側）。統計的解析により、キメラＰＣＶ１−２を接種した動物のリンパ節における肉眼的病変のスコアが、非病原性ＰＣＶ１接種ブタのものと類似していることが示される。接種後２１日にて、ＰＣＶ２接種ブタおいて、ＰＣＶ１およびキメラＰＣＶ１−２接種ブタのものよりも、統計学的により重度の肉眼的病変が起きている。組織病理学的病変およびＰＣＶ２特異的抗原は、接種された（感染した）ブタの脳、肺、心臓、腎臓、扁桃、リンパ節、脾臓、回腸および肝臓を含む多くの組織および臓器において検出された。ＰＭＷＳのものと類似した多くの組織および臓器における組織病理学的病変は、分子ＤＮＡクローンからｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製された感染性ウイルスと同じくＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンで再現される。顕微鏡的に、接種後２１日および４９日いずれにおいても、キメラＰＣＶ１−２接種動物では、ＰＣＶ２接種動物よりも顕微鏡的病変が統計的に少ない。キメラＰＣＶ１−２接種ブタのリンパ節における顕微鏡的病変スコアは、非病原性ＰＣＶ１、交互キメラＰＣＶ２−１、および未接種の対照動物のものと類似していた。中程度から重度の顕微鏡的病変は、肺、肝臓、リンパ節、脾臓、脳、心臓、腎臓および病原性ＰＣＶ２接種動物の多くの組織において見られた。しかし、キメラＰＣＶ１−２接種動物において、中程度から重度の顕微鏡的病変は、肝臓、リンパ節および腎臓組織に限られる（表１０、下側参照）。
【００６２】
対照もしくは接種されたブタのいずれにおいても、ＰＭＷＳの注目すべき臨床兆候はない。クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡ（感染性ＰＣＶ２  ＤＮＡクローン）もしくは生物学的に純粋な感染性ウイルスストックで、ＰＭＷＳの特徴的な臨床症状は観察されなかったが、ＰＣＶ２は明らかに、以下にの図示された例において再現されたＰＭＷＳ様の組織病理学的病変の原因である。ＰＣＶ２は、臨床的ＰＭＷＳの始まりの原因となる単独ではなく初期の病原体であると通常考えられている。
【００６３】
本発明は、ＰＣＶ２感染にのみ起因する臨床経過および病理学的病変を明確に特徴づける。下に図示した例における本発明のデータは、容易に再現された、クローン化ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡが、ＰＣＶ２の病原論および予防注射の研究のための感染性ウイルスを置換できることを示す。ＰＣＶ２はＰＭＷＳの進行に不可欠であるとして示されるが、他の成分もしくは病原体、例えばＰＲＲＳＶ，ＰＰＶ等は、ＰＭＷＳの進行例と関連した臨床兆候および病変の全ての範囲の誘導に必要であるかもしれない。しかし、ＰＣＶ２が主要因であるという知見とともに、本発明の新たな感染性、複製ウイルスクローンを、所望の最適な免疫原性効果を得るために、免疫学および分子遺伝学における当業者に知られた方法にて、さらに修飾し、遺伝子操作することができる。
【００６４】
本明細書に記載のＰＣＶ２の感染性ＤＮＡの有用性は、ブタにおけるＰＣＶ２およびＰＭＷＳを予防するための遺伝子操作された弱毒化ワクチンの開発を可能にする。ＰＣＶ２は、本来の感染の間に、リンパ節、肺および肝臓において複製し、主な病的効果の一つは、リンパ構造の分解による免疫系の損傷であることが知られている（上記のS. Krakowka et al., 2001; 上記のG. M. Allan and J. A. Ellis, 2000; 上記のS. Kennedy et al., 2000; 上記のG. J. Wellenberg et al., 2000; G. M. Allan et al., "Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus,"  J. Comp. Pathol.  121:1-11 (1999); J. Ellis et al., "Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets," J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); 上記のJ. C. Harding and E.G. Clark, 1997）。この新たな感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンを用いることによって、ＰＣＶ２感染による臨床疾病、病原性病変およびウイルスの分布が、より明確に特徴づけられる。
【００６５】
ＰＣＶ遺伝子の構造的および機能的相関は、本明細書に記載のＰＣＶ２、ＰＣＶ１、キメラＰＣＶ１−２、および交互キメラＰＣＶ２−１感染性ＤＮＡクローンの利用可能性によってさらに理解される。Will et al., "Cloned HBV DNA causes hepatitis in chimpanzees," Nature 299:740-742 (1982)は、クローン化Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡを用いて、直接ｉｎ  ｖｉｖｏの注射によってチンパンジーを感染させられることを初めて示した。それ以来、このアプローチは、ウイルスの複製および他の数種類のウイルスの病原性を研究するために用いられてきた（T. W. Dubensky et al., "Direct transfection of viral and plasmid DNA into the liver or spleen of mice," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7529-7533 (1984); R. Girones et al., "Complete nucleotide sequence of a molecular clone of woodchuck hepatitis virus that is infectious in the natural host," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1846-1849 (1989); N. L. Letvin et al., "Risks of handling HIV," Nature 349:573 (1991); C. Seeger et al., "The cloned genome of ground squirrel hepatitis virus is infectious in the animal.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:5849-5852 (1984); E. E. Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone," Virology 238:157-160 (1997); R. Sprengel et al., "Homologous recombination between hepadnaviral genomes following in vivo DNA transfection: implications for studies of viral infectivity," Virology 159:454-456 (1987); 上記のH. Will et al., 1982; L. Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep," Virology 189:775-777 (1992)）。
【００６６】
感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンの構築、ならびに本発明に関連したブタの肝臓およびリンパ節へのクローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡを直接注射することによる感染の実証は、ＰＣＶ２の研究のために有利である。このｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション系は、ウイルス複製およびホスト中での発病におけるＰＣＶ２遺伝子の役割に関して、ＰＣＶ２遺伝子の異なる領域を試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて構築された組み換えプラスミドを用いる、ＰＣＶ２遺伝子の構造および機能の相関についての研究を促進するであろう。ＰＣＶ２の複製および病原論を、培養細胞内でＰＣＶ２を増殖させることによって、感染性ウイルスストックなしでｉｎ  ｖｉｖｏで研究することもできる。これは、連続継代細胞培養はウイルス変種を選抜することがあるため、有利である。動物研究のために、ウイルスの代わりにクローン化ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを用いるもう１つの利点は、接種量の定量が比較的容易であることである。動物の接種のためのクローン化ＰＣＶ２  ＤＮＡの使用量は、分光光度計によって容易に決定できるが、生ＰＣＶ２ウイルスの投与量は、培養細胞における感染力価測定およびＩＦＡによる感染の確認を必要とする。クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡでの動物の直接的な注射は、動物の研究における組織破砕物接種物中の他のブタ固有病原体の存在と関連した問題を排除する。
【００６７】
本発明において、免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子は、キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローン独自の構造を作り出すため、病原性ＰＣＶ２および非病原性ＰＣＶ１の間に連結されている。驚くべきことに、かつ有利なことに、キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンは、複製し、免疫原性ＯＲＦ２キャプシド抗原をｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発現し、ＰＣＶ２のＯＲＦ２に対する特異的免疫応答を誘導したが、ＰＣＶ１の非病原的性質を保持していた。キメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンは、強い免疫応答を誘導することができる一方で、非病原性ＰＣＶ１のものと類似した穏やかな病原性病変と限られた感染を誘導した。ワクチンの開発のための、クローン化ＤＮＡの比較的容易な貯蔵および安定化、ならびに大規模な組み換えＰＣＶ２プラスミドＤＮＡおよびキメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローン生産の節約は、ブタに、生の感染性ウイルスＤＮＡワクチンもしくは遺伝子操作された弱毒化ウイルスワクチンを与えることの魅力的な意味を提供する。よって、本発明に記載のキメラＰＣＶ１−２感染性ＤＮＡクローンは、ＰＣＶ２感染およびＰＭＷＳに対する有用なワクチンの候補である。
【００６８】
当然のことながら、本明細書で使用された全ての科学技術用語は、当業者において共通に理解されるものと同じ意味を持つものと理解される。本発明の目的のために、「感染性がある」という語は、ウイルスが病気を引き起こすか否か関係なく、ウイルスがブタ内で複製することである。「ＳＰＦ」は、特定病原体不在ブタのことである。「ノトバイオートの」ブタとは、病原菌不在のブタのことである。「ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡ」「ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡ」および「ＰＣＶ２分子ＤＮＡ」は、同じクローン化された核酸配列に関して互換的に用いられている。
【００６９】
感染性ＰＣＶ１／ＰＣＶ２キメラＤＮＡクローン（菌株表示「ＰＣＶ１−２キメラ」）、感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン（菌株表示「ＰＣＶ２クローン」）、および重度のＰＭＷＳに冒されたブタから単離され、単離体番号（isolate number）４０８９５（菌株表示「ＰＣＶ２  ＃４０８９５」）として同定されたＰＣＶ２のアイオワサンプル（Iowa sample）由来の生物学的に純粋かつ均一なＰＣＶ２ストックは、37 C.F.R. § 1.808によって規定された条件下で寄託され、ブダペスト条約に従ってAmerican Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A.にて維持される。本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、Bluescript SK(+) vector (pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA)中にクローン化された６４９０ｂｐのプラスミド中に含まれ、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５αコンピテントセルへ形質転換される。感染性キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローン（「キメラブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）および２型（ＰＣＶ２）感染性ＤＮＡクローン」として同定された）ならびに感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン（「２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）の感染性ＤＮＡクローン」として同定された）は、２００１年１２月７日にＡＴＣＣにおいて寄託され、それぞれにATCC特許寄託物番号  PTA-3912およびPTA-3913が付与されている。当然のことながら部位特異的変異誘発および本明細書に記載の技術を用いて容易に構築されうる他のプラスミドも、本発明の範囲内に包含される。単離体番号（isolate number）４０８９５（「２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）」として単離された）も、２００１年１２月７日にＡＴＣＣにおいて寄託され、ATCC特許寄託物番号  PTA-3914を付与されている。単離体番号（isolate number）４０８９５のＰＣＶ２のゲノム（核酸）配列は、Genbankデータベースに寄託され、２０００年７月２３日より受託番号AF264042にて公に入手可能となっている。
【００７０】
以下の例は、本発明のある態様を説明する。しかしながら、これらの例は説明のためだけであって、本発明の条件および範囲に関して完全には限定的なものでないことは当然である。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられれば、一般的にはあまり都合のよくないことであるが、特定の範囲の上および下いずれの条件も使用できる。実施例は、室温（約２３℃〜約２８℃）および常圧にて行われる。本明細書中に示される全ての部分およびパーセントは、重量をもとにしたものであり、全ての温度は、特に断りのない限り摂氏温度にて表記されている。
【００７１】
以下の限定されない例より本発明のさらなる理解が得られるであろう。
【実施例】
【００７２】
実施例１
ＰＣＶ１に汚染されていないＰＫ−１５細胞株の産生
ＰＣＶ２単離の原料は、自然発生のＰＭＷＳに冒されたブタの脾臓組織サンプル由来である（ＰＣＶ２シリアル識別番号４０８９５であり、「単離体（isolate)４０８９５」として示される）(上記のM. Fenaux et al., 2000)。ＰＣＶ２特異的抗体での免疫組織科学的染色（ＩＨＣ）によって、組織内のＰＣＶ２抗原の存在が確認された。脾臓組織は使用まで−８０℃にて保存した。
【００７３】
American Type Culture Collection（ATCCアクセッション番号 CCL-33）より購入したＰＫ−１５細胞株は、ＰＣＶ１で持続的に感染させた（上記のG. C. Dulac and A. Afshar, 1989）。ＰＫ−１５細胞のサブ集団のみを持続的に感染させた（ＩＤ．）ため、終点希釈によってＰＣＶ１の汚染のないＰＫ−１５細胞株が産生された。プロトコルは、以下のものである：ＰＫ−１５細胞を、Earle's saltsおよびＬ−グルタミン(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)を加え、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｘ抗生物質(Life Technologies, Inc.)を添加したＭＥＭ中で生育させる。集密になった細胞の単層をトリプシン処理後、細胞を計数し、終点が１細胞／０．２ｍｌになるように連続希釈した。終点希釈を９６ウェルプレートに撒き、単一の細胞から開始して単層へ成長するようにした。各ウェルの細胞を、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の検出および区別できるＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイを用いて、ＰＣＶ１  ＤＮＡの試験をした(上記のM. Fenaux et al., 2000)。ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイによって、ＰＣＶ１が陰性であると判定されたウェルのＰＫ−１５細胞を、次に増殖させた。ＰＣＶ１のないＰＫ−１５細胞株を、さらに５回継代し、各継代時にＰＣＶによってＰＣＶ１  ＤＮＡ陰性であることを確認した。
【００７４】
ＰＣＶ１汚染が陰性であった４つの細胞株を、ＡＴＣＣからの持続的感染ＰＫ−１５細胞の終点希釈によって作製した。細胞株は、追加の５回継代後もＰＣＶ陰性のままであることが、ＰＣＲによって判明した。該細胞株の１つを増殖させ、細胞をＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン（図２）でトランスフェクトする、およびＰＣＶウイルスに感染させた場合、該細胞株はＰＣＶ２の複製を補助できることがわかった。さらに、クローン化された細胞を、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションに用いて、動物の接種実験のための生物学的に純粋なウイルスストックを産生した。
【００７５】
実施例２
ＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンの構築
ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンを構築するために、ＰＣＶ２単離体(isolate)４０８９５（上記のM. Fenaux et al., 2000）の公開配列をもとに１対のＰＣＲプライマー：配列番号５に示される順方向プライマー  Ｆ−ＰＣＶＳＡＣ２（5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3'）、および配列番号６に示される逆方向プライマー  R-PCVSAC2（5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'）を設計した。この対のプライマーは、単一のＳａｃＩＩ制限酵素サイト（図１）を含む重複領域を持つ完全なＰＣＶ２のゲノムを増幅する。ＤＮＡを、QIAamp DNA Minikit (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて、自然発生のＰＭＷＳに冒されたブタの脾臓組織サンプル(単離体(isolate)40895) (上記のM. Fenaux et al., 2000)から抽出した。抽出したＤＮＡを、AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)を用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は、９５ｏＣで９分間の最初の酵素活性化処理、次いで、３５サイクルの９４℃で１分間の変成、４８℃で１分間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長、および７２℃で７分間の最後の伸長からなる。予想される大きさのＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分離し、Geneclean Kit (Bio 101, Inc., La Jolla, CA)を用いたガラスミルク処理で精製した。
【００７６】
ＰＣＶ２ゲノムの直列２量体を含む分子ＤＮＡクローンを構築するために、完全なＰＣＶ２ゲノムを含むＰＣＲ産物を、まずadvanTAgeプラスミドベクター(Clontech, Palo Alto, CA)に連結した。イー・コリ（E. Coli）ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。組み換えプラスミドを、制限酵素消化によって確認した。全長ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、ＳａｃＩＩ制限酵素での消化によって、advanTAgeベクターから切り出した。消化したＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、直列２量体の生成に好ましいＴ４ＤＮＡリガーゼで３７℃で１０分間だけ処理して連結した。次に、直列２量体を、pBluescript SK(+)ベクター(pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA)にクローニングした（図１）。ＰＣＶ２ゲノム（本明細書中ではＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンと示す）の直列２量体を含む組み換えプラスミドを、ＰＣＲ、制限酵素消化およびＤＮＡ配列解読によって確認した。組み換えプラスミドのＤＮＡ濃度を分光光度計によって測定した。
【００７７】
特異的に、ＰＣＶ２の完全なゲノム（単離体(isolate)４０８９５）は、感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンを構築するために、ＰＣＲによって増幅された。２コピーの完全なＰＣＶ２ゲノムを、直列に、ｐＳＫベクターへ連結し、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン（図２）を得た。ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンの感染性は、ＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションによって測定した。該分子ＤＮＡクローンはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感染性であり、約１０〜１５％のＰＫ−１５細胞がトランスフェクトされたことが、ＰＣＶ２特異的抗体でのＩＦＡによって認められた。ＰＣＶ２特異的抗原は、核において、それより少ないがトランスフェクトされた細胞の細胞質において、ＩＦＡによって可視化された（図２）。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞は、ＰＣＶ２抗体について陰性であった。
【００７８】
実施例３
ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンでのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションおよび生物学的に純粋かつ均一なＰＣＶ２感染性ウイルスストックの産生
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける該分子ＤＮＡクローンの感染性を試験するために、ＰＣＶ１で汚染されていないＰＫ−１５細胞を８ウェルLabTek chamber slidesにおいて生育させた。ＰＫ−１５細胞が約８５％の集密度に達した時、Lipofectamine Plus Reagentsを用いて、製造者(Life Technologies, Inc)によって提供されたプロトコルに従って、細胞を該分子ＤＮＡクローンでトランスフェクトした。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞は、対照として含まれた。トランスフェクションの３日後、４℃で２０分間、８０％アセトンおよび２０％メタノールを含む溶液で細胞を固定した後、ＰＣＶ２特異的ウサギポリクローナル抗血清を用いて免疫蛍光アッセイを行い、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける該分子ＤＮＡクローンの感染性を測定した（下記参照）。
【００７９】
動物の接種実験のための、生物学的に純粋かつ均一なＰＣＶ２感染性ウイルスストックを産生するために、ＰＣＶ１に汚染されていないＰＫ−１５細胞をＴ−２５培養フラスコ中で培養し、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンでトランスフェクトした。ＰＫ−１５細胞を、Ｔ−２５培養フラスコ中で、約８５％の集密度に生育した。トランスフェクションの前に、細胞を滅菌ＰＢＳバッファーで１回洗浄した。Ｔ−２５フラスコにおける各トランスフェクション反応のために、１２μｇのＰＣＶ２プラスミドＤＮＡを、０．３５ｍｌＭＥＭ培地中で、１６μｌのPlus Reagentと混合した。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞のフラスコは、負の対照として含まれた。室温で１５分間インキュベートした後、０．３５ｍｌＭＥＭ培地で希釈した５０μｌのLipofectamine Reagentを混合物に加え、室温でさらに１５分間インキュベートした。次に、トランスフェクション混合物を、２．５ｍｌの新鮮なＭＥＭ培地を含むＰＫ−１５細胞のＴ−２５フラスコに加えた。３７℃で３時間培養後、培地を、２％ＦＢＳおよび１ｘ抗生物質を含む新鮮なＭＥＭ培地と交換した。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクション３日後に回収し、使用するまで−８０℃で保存した。ウイルスストックの感染力価をＩＦＡによって測定した（下記参照）。
【００８０】
基本的に、生物学的に純粋かつ均一なＰＣＶ２感染性ウイルスストックは、ＰＫ−１５細胞を、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンでトランスフェクトすることによって産生される。トランスフェクトされた細胞の溶解物をＰＫ−１５細胞の感染にうまく使用することができるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションによって生じるＰＣＶ２ビリオンは、感染性があった。よって、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた時、感染性ＰＣＶ２ビリオンを産生することができる。トランスフェクトされた細胞から調製された均一なＰＣＶ２ウイルスストックの感染力価は、１ｘ１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌと測定された。このウイルスストックを用いて、グループ２においてブタに接種した。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞の溶解物は、ＰＫ−１５細胞に感染できなかった。
【００８１】
実施例４
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるウイルス力価測定
均一なＰＣＶ２ウイルスストックの感染力価を測定するために、ＰＫ−１５細胞を８ウェルLabTek chamber slides上で培養した。ウイルスストックを、ＭＥＭ中で１０倍に連続的希釈し、各希釈物を、LabTek chamber slide上で生育した１０ウェルの単層ＰＫ−１５細胞に接種した。非接種細胞のウェルは、対照として含まれる。接種後３日に、感染細胞を、４℃で２０分間、８０％アセトンおよび２０％メタノールを含む溶液で固定した。細胞をＰＢＳバッファーで洗浄した後、感染細胞を１：１０００に希釈したＰＣＶ２特異的ウサギポリクローナル抗体(S. D. Sorden et al., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999))と、３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、２次ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc, Gaithersburg, MD)と、３７℃で４５分間インキュベートした。スライドグラスをＰＢＳバッファーで３回洗浄した後、スライドグラスをフルオロマウントＧ（fluoromount-G）で封じ込み、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡の下で観察した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を計測した。初めは、細胞は単一コピーのＰＣＶ２ゲノムを含むプラスミド構築物でトランスフェクトされたが、単一ゲノム構築物由来の感染性ＰＣＶ２の力価は、直列ゲノムをもつものよりもはるかに低かった。従って、２量体型のＰＣＶ２ゲノムを含むプラスミド構築物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション実験に使用した。
【００８２】
実施例５
分子ＤＮＡクローンでのブタのｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションおよび均一ＰＣＶ感染性ウイルスストックでのブタの実験的接種
４週齢の特定病原菌不在（ＳＰＦ）ブタ４０匹を、無作為に１０匹ずつ４部屋に割り当てた。接種の前に、ＳＰＦブタは、ＰＣＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶおよびブタ肝炎Ｅウイルスに対する抗体について検査された。グループ１のブタは未接種であり、負の対照とされた。グループ２のブタは、それぞれ、約１．９ｘ１０５ＴＣＩＤ５０のＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン由来のＰＣＶ２感染性ウイルスストックで、鼻腔内に接種された。グループ３のブタは、ＰＣＶ２分子クローンの組み換えプラスミドＤＮＡの直接肝内注射を受けた。それぞれのブタは、計２００μｇの組み換えプラスミドＤＮＡ（クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡ）で、超音波誘導技術を通して、肝臓の６カ所の異なる部位へ注射された。グループ４のブタは、それぞれ、計２００μｇの組み換えＰＣＶ２プラスミドＤＮＡを、直接浅腸骨リンパ節（superficial iliac lymph nodes）へ注射され、各リンパ節は２つの独立した注射を受けた。疾病の臨床兆候に関して、動物を毎日監視した。血清サンプルは、接種後日数（ＤＰＩ）０、７、１４、２１、２８、３５の各動物から回収した。２１ＤＰＩに、５匹のブタが無作為に選抜され、検死された。各グループ中の残りの５匹の動物は、３５ＤＰＩに検死された。様々な組織および臓器が検死中に回収され、組織学的試験および免疫組織科学的染色のために処理した（下記参照）。
【００８３】
結果を以下の表１に示す。グループ２、３および４の全ての感染したブタは、０ＤＰＩに、ＰＣＶ２抗体について陰性であった。未接種の対照グループ１内の２匹のブタは、０ＤＰＩに、検出可能なＰＣＶ２母系抗体を持っていた。これらの２匹の子ブタにおける母系抗体は、７ＤＰＩまでに減少した。１０匹の未接種の対照のブタのいずれにおいても、ＰＣＶ２抗体へのセロコンバージョンは検出されなかった。ＰＣＶ２感染性ウイルスを鼻腔内に接種されたグループ２のブタにおいて、２１ＤＰＩまでに１匹の子ブタはＰＣＶ２抗体へセロコンバートした。３５ＤＰＩまでに、グループ２の残りの５匹のブタのうち４匹が、セロコンバートしていた。グループ３および４の感染した動物におけるセロコンバージョンは、２８ＤＰＩに初めて出現した。３５ＤＰＩまでに、グループ３の残り５匹のブタの５匹、およびグループ４残り５匹のブタの３匹が、ＰＣＶ２抗体へセロコンバートしていた。
【００８４】
３および２１ＤＰＩに全てのブタ、接種後３５日に残りのブタにおいて、ＰＰＶ抗体の検査をした。ブタ共通の病原体であるＰＰＶに対する母系抗体は、ＳＰＦ子ブタにおいて検出された。３ＤＰＩ（平均力価１：２６６５）から２１ＤＰＩ（平均力価１：２４６）にかけて、明らかに減少した１匹のブタ以外の全てのブタにおけるＰＰＶ  ＨＩ抗体力価は、これらのブタにおいて検出された抗体が受動的に生成されたことを示すものである。１匹の子ブタのＰＰＶ  ＨＩ力価は、３ＤＰＩにおいて１：３２であったものが２１ＤＰＩにおいて１：６４にわずかに上昇したが、これは検査のばらつきのためであると思われる。０、２１および３５ＤＰＩに全てのブタから血清を採取し、公開されたＰＣＲアッセイ(J. M. Soucie et al., "Investigation of porcine parvovirus among persons with hemophilia receiving Hyate: C porcine factor VIII concentrate," Transfusion 40:708-711 (2000))で、さらにＰＰＶを検査した。いずれのＤＰＩのいずれのブタからもＰＰＶウイルス血症は検出されなかったことから、ブタはＰＰＶに感染していないことがさらに示された。
【００８５】
【表１】
2005511075.tif 000002
【００８６】
実施例６
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析
ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンに感染したブタ、およびＰＣＶ２感染性ウイルスストックに感染したブタにおけるＰＣＶ２ウイルス血症を測定するために、異なるＤＰＩに採取した血清サンプルを、前述のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析の通常の方法(上記のM. Fenaux et al., 2000)によって、ＰＣＶ２  ＤＮＡの存在について検査した。DNAzol（登録商標） reagentを用いて、製造者(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)により提供された方法に従って、ウイルスＤＮＡを各血清サンプル５０μｌから抽出した。抽出されたＤＮＡを、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、およびプロテイナーゼの含まれない水に再懸濁し、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（同文献）によってＰＣＶ２  ＤＮＡについて検査した。選択された動物由来のＰＣＲ産物を配列解読し、ブタに感染したウイルスの起源を確認した。
【００８７】
０、７、１４、２１、２８および３５ＤＰＩに、血清サンプルを、全ての対照および接種された動物から回収し、ＰＣＶ２  ＤＮＡ検出（同文献）によってＰＣＶ２ウイルス血症検査を行った。結果を以下の表２に示す。ＰＣＶ２  ＤＮＡは、いずれのＤＰＩでもグループ１の未接種の対照のブタにおいて検出されなかった。ウイルス血症は、１４ＤＰＩにグループ２の７／１０のブタにおいて、および３５ＤＰＩまでに８／１０のブタにおいて検出された。グループ２の残りの５匹全てのブタにおいて２８ＤＰＩおよび３５ＤＰＩで、ＰＣＶ２  ＤＮＡが検出不能であったことから、ウイルス血症はわずか数週間しか継続しなかった。ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンを肝臓内に注射されたグループ３のブタにおいて、８／１０のブタが１４ＤＰＩでウイルス血症となり、３５ＤＰＩまでに９／１０のブタが検出可能なウイルス血症にかかっていた。グループ４のブタは、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンでリンパ節へ注射された。１４ＤＰＩではグループ４の１０匹中２匹のブタが、２１ＤＰＩでは１０匹中８匹のブタがウイルス血症であった。その結果、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンは、ＳＰＦブタの肝臓および浅腸骨リンパ節（superficial iliac lymph nodes）へ直接注射された場合、感染性があることが示された。選抜された動物由来のＰＣＲ産物は、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンの対応領域と同じであった。
【００８８】
【表２】
2005511075.tif 000003
【００８９】
実施例７
臨床評価
０ＤＰＩおよび検死時にブタを計量した。直腸温度および臨床的呼吸器疾患スコアは、０から６（０＝正常、６＝重度）の範囲にわたり(P. G. Halbur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995))、０から３５ＤＰＩの１日おきに記録した。中枢神経疾患、肝臓病（黄疸）、筋骨格疾患、および体調の変化を含む臨床観察を毎日記録した。
【００９０】
肉眼的病理学および組織病理学を評価するために、各グループから５匹の豚を、２１および３５ＤＰＩにおける検死のために無作為に選択した。検死班は、検死時にブタの感染状況が見えなかった。全てのブタで、完全な検死が行われた。評価された肉眼で見える肺炎に冒された肺の割合を、前記スコア系（同文献）をもとに、各ブタについて記録した。スコア系は、おおよその体積をもとにしている。スコア系は、各肺葉が肺全体に占めるおおよその体積に基づく：右上葉、右中葉、左上葉の上部および左上葉の下部は、それぞれ肺の全体積の１０％を、副葉（accessory lobe）はそれぞれ５％、ならびに右および左下葉はそれぞれ２７．５％を占める。リンパ節の肥大のような他の病変は、別に記録した。組織病理学的試験のための切片を、鼻甲介、肺（７切片）（同上）、心臓、脳、リンパ節（気道内、腸骨、腸間膜、鼠径下部（subinguinal））、扁桃、胸腺、肝臓、胆嚢、脾臓、関節、小腸、大腸、膵臓、および腎臓より採取した。組織は盲検法にて検査され、肺、リンパ節および肝臓病変の主観的スコアを与えられた。肺のスコアは０（正常）から３（重度リンパ組織球性（lymphohistiocytic）間質性肺炎）にわたった。肝臓のスコアは、０（正常）から３（重度リンパ組織球性（lymphohistiocytic）肝炎）にわたった。リンパ節のスコアは、小節のリンパ枯渇予測値のために、０（正常もしくはリンパ枯渇のない）から３（重度のリンパ枯渇および小節の組織球の置換）にわたっている。
【００９１】
血清学のプロトコルは、１１から１２日齢に達したとき、および０、７、１４、２１、２８、および３５ＤＰＩの全てのブタから血液を採取する際に用いられた。Herd Check PRRSV ELISA(IDEXX Laboratories, Westbrook, MA)を用いて、ＰＲＲＳＶに対する血清抗体を検査した。hemagglutination inhibition (HI) assay (H. S. Joo et al., "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976))によってＰＰＶに対する血清抗体を検出した。ＰＣＶ２に対する血清抗体を、ＰＣＶ２の組み換えＯＲＦタンパク質をもとに、修正された間接的ＥＬＩＳＡ(P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002))によって検出した。部分的に精製されたＰＣＶ２抗原を、ＰＣＶ２の主要キャプシドＯＲＦ２タンパク質(P. Nawagitgul et al., "Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein," J. Gen. Virol.  81:2281-2287  (2000))を含む組み換えバキュロウイルスに感染させたＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)から調製した。野生型バキュロウイルスに感染したＨｉ  Ｆｉｖｅ細胞の細胞溶解物を、同様に調製し、負の対照抗原とした。Immulon 2 HB polystyrene microtiter plates (Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA)を、４℃で３６時間、最適な濃度の正および負の対照抗原で覆った。100μｌの５％ミルク希釈剤(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)で１：１００に希釈した各血清サンプルを、各ウェルに加えた。血清サンプルを４連：負の対照抗原のための２ウェル、およびＰＣＶ抗原のための２つの平行したウェル、で試験した。正の対照および負の対照血清は、各プレートに含まれている。血清を３７℃で３０分間インキュベート後、０．１％Tween-20を含む０．１Ｍ  ＰＢＳバッファーで５回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識２次抗ブタＩｇＧ（Sigma Co, St. Louis, MO）を、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを再び洗浄し、発色のために２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）(Kirkegaard & Perry Laboratories Inc)と３７℃で１５分間インキュベートした。４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定した。各試験および対照血清の修正後のＯＤを、負の抗原を含むウェルの平均ＯＤ値を、ＰＣＶ２抗原を含む平行ウェルの値から引いて計算した。試験した血清サンプルの修正したＯＤ値（Ｓ）を、正の対照の血清の値（Ｐ）で割ることによってデータを標準化し、Ｓ／Ｐ値として報告した。Ｓ／Ｐ値が０．１２以下、０．１２から０．２、および０．２より大きいサンプルは、それぞれ陰性、どちらでもない、および陽性と考えられる。
【００９２】
臨床評価の結果から、対照および接種したブタの中で１匹も、臨床的なＰＭＷＳの兆候に似た病気の明確な兆候が見られなかった。４つのグループのいずれの間でも体重増加もしくは平均直腸温度に違いはなかった。グループ１の対照のブタは、実験の間中、正常のままであった。８から１４ＤＰＩに、ＰＣＶ２ウイルスを感染させたグループにおけるブタの大半が軽度の一過性呼吸器疾患であった。これは、ブタの各個体において１〜２日継続し、グループとして５〜６日継続する、軽度の呼吸困難（１から２の臨床呼吸器スコア）によって特徴づけられた。
【００９３】
検死時に、対照のブタにおいて肉眼的病変は観察されなかった。３つの接種グループのブタには、肺およびリンパ節に限定される肉眼的病変があった（以下の表３参照）。病変は、ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡ感染およびＰＣＶ２ウイルス感染グループ間で類似していた。肺は虚脱せず、任意で、多病巣性の、適度に区別された、黄褐色から紫の硬化した領域が、２１ＤＰＩに肺の０〜２％を、３５ＤＰＩに０〜１３％を占めた。２１および３５ＤＰＩいずれにおいても、３つの全てのＰＣＶ２接種グループのブタの大半においてリンパ節は、正常の大きさの２〜５倍に組織的に肥大し、硬化、褐色となった（図３）。
【００９４】
顕微鏡検査により、対照のブタの肝臓を除くいずれの組織においても、病変は発見されなかった。８匹中１０匹の対照のブタは、肝臓の門脈周囲の領域において、目立って非常に軽度の多巣性肉芽腫性炎症を起こしていたが、これは正常ブタにおいて共通して見られるものであり、正常のバックグラウンドであると考えられる(上記のP. G. Halbur et al., 2001)。
【００９５】
２つのＰＣＶ２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたグループ（肝臓内およびリンパ内）、ならびにＰＣＶ２ウイルスに感染させたグループ（鼻腔内）のブタは、脳、肺、心臓、リンパ組織(扁桃、リンパ節、脾臓)、回腸および肝臓において、類似した病変を起こしていた（以下の表４を参照）。脳の病変は、３つの接種されたグループの２３／３０のブタにおいて観察され、血管周囲の肥厚および神経膠症を伴う軽度〜中程度の多巣性リンパ形質細胞性髄膜脳炎として特徴づけられる。肺の病変は、３つの接種されたグループの２８／３０のブタにおいて観察され、軽度〜中程度の細気管支周囲リンパ形質細胞性および組織球性細気管支間質性（bronchointerstitial）肺炎として特徴づけられる（図３Ｃ）。２１ＤＰＩに検死されたＰＣＶウイルス感染グループ２のうち１匹のブタ、および３５ＤＰＩに検死された２つのＰＣＶ２プラスミドＤＮＡ感染グループのうち１匹のブタは、粘膜固有層および気管支の細気管支周囲における線維増殖症および肉芽腫性炎を伴う潰瘍性および増殖性細気管支炎に冒されていた。軽度の多巣性リンパ形質細胞性心筋炎も、１８／３０のＰＣＶ２感染したブタにおいて観察された。１４／３０のＰＣＶ２に感染したブタにおいて、軽度〜中程度の多巣性リンパ形質細胞性間質性腎炎が観察された。胸腺において、病変は観察されなかった。ＰＣＶ２感染ブタの８／３０の扁桃、７／３０の脾臓、および２６／３０のリンパ節において、軽度〜中程度のリンパ枯渇（図４Ｂ）およびリンパ小節の組織球性置換（histiocytic replacement）が観察された。２１ＤＰＩに、ＰＣＶ２ウイルスを鼻腔内に接種された３匹のブタそれぞれにおいて、および３５ＤＰＩに、ＰＣＶ２プラスミドを鼻腔内にトランスフェクトされたグループ１匹のブタにおいて、巨細胞に伴う中程度の肉芽腫性リンパ節炎（図４Ｃ）が観察された。３／５のＰＣＶ２ウイルスに感染したブタ、３／５のＰＣＶ２プラスミドＤＮＡで肝臓内にトランスフェクトされたブタ、１／５のＰＣＶ２プラスミドＤＮＡをリンパ内にトランスフェクトされたブタにおいて、３５ＤＰＩに、軽度のリンパ形質細胞性および組織球性腸炎が観察された。ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたグループそれぞれにおける、１匹のブタは、パイエル板において、組織球性置換（histiocytic replacement）および少数の巨細胞を伴う軽度のリンパ枯渇に冒されていた。２９／３０の３つのＰＣＶ２接種ブタにおいて、軽度〜中程度のリンパ形質細胞性肝炎が観察された。ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたグループそれぞれの１匹のブタにおいて、２１ＤＰＩに、リンパ組織球性炎症（lymphohistiocytic inflammation）によって囲まれた、少数の広く分散した個々に壊死性の肝細胞が観察された。他の組織における病変は顕著ではなかった。
【００９６】
肺、肝臓およびリンパ節における顕微鏡的病変は、公開された評価系に従って評価した（以下の表４）(上記のP. G. Halbur et al., 2001; 上記のP. G. Halbur et al., 1995)。他の組織および臓器のための許容できる評価系はなかった。３つのＰＣＶ２を接種されたグループのブタにおける、肺およびリンパ節における病変の平均スコアは、グループ１の対照のブタにおけるものと、統計学的に異なった。３つのＰＣＶ２を接種されたグループのブタにおける、肝臓の病変平均スコアは対照のブタのものと統計学的に異なってはいなかった。
【００９７】
【表３】
2005511075.tif 000004
【００９８】
【表４】
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【００９９】
実施例８
免疫組織化学
ＰＣＶ２特異的抗原の免疫組織化学（ＩＨＣ）検出は、ＤＰＩ２１および３５における検死中に採取された全ての組織について行われた。ウサギポリクローナルＰＣＶ２特異的抗血清をＩＨＣに使用し、一般的な手順は前に記載されている(上記のS. D. Sorden et al., 1999)。
【０１００】
ＰＣＶ２の検出および組織内分布のために、ＰＣＶ２抗原のＩＨＣ染色を、２１および３５ＤＰＩに検死された全てのブタの脳、肺、鼻甲介、心臓、腎臓、扁桃、リンパ節、脾臓、胸腺、回腸、肝臓、胆嚢および脾臓に行った。対照のブタ由来の全ての組織は、ＰＣＶ２抗原陰性であった。３つのＰＣＶを接種されたグループにおける、ＰＣＶ２抗原の組織内分布は類似していた（以下の表５参照）。脳において、ＰＣＶ２抗原は、髄膜および脈絡叢の単核細胞、線維芽細胞様細胞、および内皮細胞において優位に、大脳および小脳の内皮細胞および血管周囲の単核細胞においては、それより少なく見られた。肺において、ＰＣＶ２抗原は、肺胞および隔膜マクロファージ内、ならびに気道の固有層内の線維芽細胞様細胞において検出された（図３Ｄ）。心臓において、ＰＣＶ２抗原は、広く分散したマクロファージおよび内皮細胞において検出された。腎臓において、ＰＣＶ２抗原は、尿細管上皮細胞および間質の単核細胞に内で検出された。リンパ組織（リンパ節、脾臓、扁桃およびパイヤー板）において、ＰＣＶ２抗原は、初めにマクロファージおよび樹状細胞様細胞およびリンパ小節内の巨細胞内で検出された（図４Ｄ）ＰＣＶ２抗原は、小腸の固有層におけるマクロファージ内でも検出された。肝臓において、ＰＣＶ２抗原は、単核細胞およびクッパー細胞内で検出された。ＰＣＶ２抗原は、胸腺、鼻甲介または胆嚢において検出されなかった。
【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
実施例９
非病原性ＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンの構築
ＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンの構築に用いた手順は、本明細書に記載されたＰＣＶ２のものと本質的に同じである。１対のプライマー、配列番号７に記載のKPNPCV1.Uおよび配列番号８に記載のKPNPCV1.L（以下の表６参照）を、ＰＣＶ１の公開された配列をもとに設計した。このプライマーペアは、単一のＫｐｎＩ制限酵素サイトを含む重複部分をもつＰＣＶ１の完全なゲノムを増幅する。ＰＣＶ１ウイルスのＤＮＡは、American Type Culture Collection (ATCC受託番号 CCL-33)より得られた、汚染したＡＴＣＣ  ＰＫ−１５細胞株より抽出された。ＰＣＶ１  ＤＮＡを、QIAamp DNA Minikit (Qiagen, Inc., Valencia, CA)を用いて、持続的にＰＣＶ１に感染したＡＴＣＣ  ＰＫ−１５細胞より抽出した。抽出されたＤＮＡをAmpliTaq Gold Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT)を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応は、９５℃で９分間の最初の酵素活性化処理、次いで、３５サイクルの９４℃で１分間の変性、４８℃で１分間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長、および７２℃で７分間の最後の伸長からなる。予想される大きさのＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分離し、Geneclean Kit (Bio 101, Inc., La Jolla, CA)を用いたガラスミルク処理で精製した。完全なＰＣＶ１ゲノムを含む精製したＰＣＲ産物を、まず、advanTAgeプラスミドベクター(Clontech, Palo Alto, CA)に連結した。イー・コリ（E. Coli）ＤＨ５αコンピテントセルを形質転換した。組み換えプラスミドを、制限酵素消化によって確認した。全長ＰＣＶ１ゲノムＤＮＡを、ＫｐｎＩ制限酵素での消化によって、advanTAgeベクターから切り出した。全長ＰＣＶ１ゲノムＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、３７℃にて一晩処理して、pBluescript SK(+)ベクター(pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA)に連結した。全長ＰＣＶ１ゲノムを含む組み換えプラスミドを、Qiagen plasmid mini kit (Qiagen, Valencia, CA)によって単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列解読によって確認した。全長ＰＣＶ１ゲノムＤＮＡを、ＫｐｎＩ消化によってｐＳＫベクターから切り出し、２量体化し、前の実施例２に記載のＰＣＶ２感染性クローンのように、ＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンを作製した。これらの直列２量体を作製したのは、２量体化直列ＤＮＡクローンを、細胞にトランスフェクトさせ、感染性ビリオンを得ることが、より簡単であることが有利に判明したからである。ＰＣＶ１  ＤＮＡの直列２量体を作製するために、消化したＰＣＶ１ゲノムＤＮＡを、直列２量体の生成に好ましいＴ４ＤＮＡリガーゼで、３７℃で１０分間だけ処理して連結した。次に、直列２量体を、pBluescript SK(+)ベクター(pSK) (Stratagene Inc., La Jolla, CA)にクローニングした。ＰＣＶ１ゲノムの直列２量体を含む組み換えプラスミド（本明細書中ではＰＣＶ１  ＤＮＡクローンと示す）を、ＰＣＲ、制限酵素消化およびＤＮＡ配列解読によって確認した。組み換えプラスミドのＤＮＡ濃度を分光光度計によって測定した。
【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
実施例１０
ウイルス汚染のないＰＫ−１５細胞へトランスフェクトした場合のＰＣＶ１  ＤＮＡクローンの感染性の評価
ＰＣＶ１分子ＤＮＡクローンの感染性は、ＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションによって測定した。ＰＣＶ１特異的モノクローナル抗体（Dr. Gordon Allan, Belfast, U.K.からから贈与された）でのＩＦＡによって、ＰＣＶ１分子ＤＮＡクローンはＰＫ−１５細胞において感染性があることが確認された。ＰＣＶ１特異的抗原は、核において、それより少ないがトランスフェクトされた細胞の細胞質において、ＩＦＡによって可視化された（図２）。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞は、ＰＣＶ１抗体について陰性であった。
【０１０５】
実施例１１
キメラＰＣＶ１−２ウイルスＤＮＡクローンの構築
キメラウイルスは、非病原性ＰＣＶ１およびＰＭＷＳと関連したＰＣＶ２の間で、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の感染性ＤＮＡクローンを用いて構築された。キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンを構築するために、非病原性ＰＣＶ１のＯＲＦ２キャプシド遺伝子をＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンから除去し、ＰＣＶ１ゲノム骨格において、病原性ＰＣＶ２の免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子で置換した（図５および６参照）。二対のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２用の１つ目のプライマーペアは、配列番号１１に記載のPsi I-5および配列番号１２に記載のAcl I-6であり、プライマーの５’末端における点変異を用いて制限酵素サイトＡｃｌＩおよびＰｓｉＩを生じさせて、ＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子を増幅し、点変異により隣接するＰｓｉＩおよびＡｃｌＩ制限酵素サイトを導入する。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２増幅のためのＰＣＲ反応は、９５℃で９分間の最初の酵素活性化処理、次いで、３８サイクルの９５℃で１分間の変成、４８℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長、および７２℃で７分間の最後の伸長で構成された。
【０１０６】
２つめの対のＰＣＲプライマーは、配列番号９に記載のHpa I-2、および配列番号１０に記載のNar I-3であり、ｐＳＫ＋ベクターおよびそのＰＣＶ１ゲノム挿入物の増幅のために設計された。点変異をＰＣＲプライマーの５’末端に導入して、隣接したＮａｒＩおよびＨｐａＩ制限酵素サイトを作った。このプライマーペアで、ｐＳＫ＋ベクターおよびＯＲＦ２キャプシド遺伝子を欠いたその挿入ＰＣＶ１ゲノムＤＮＡ、つまり、ＰＣＶ１ゲノムマイナスＰＣＶ１  ＯＲＦ２（ｐＳＫ−ＰＣＶ１ΔＯＲＦ２）を、ＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンをＰＣＲの鋳型として用いて増幅した。ＰＣＲ反応は、９５℃で９分間の最初の酵素活性化処理、次いで、３８サイクルの９５℃で１分間の変性、４８℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長、および７２℃で７分間の最後の伸長で構成された。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２のＰＣＲ産物を、ＡｃｌＩおよびＰｓｉＩで消化し、導入された点変異を除去した。ｐＳＫ−ＰＣＶ１ΔＯＲＦ２産物（ｐＳＫベクター−ＰＣＶ１のＯＲＦ遺伝子を欠くＰＣＶ１ゲノムＰＣＲ産物）を、ＮａｒＩおよびＨｐａＩで消化し、ＰＣＲで導入された点変異を除去した。後者の消化によって、ＡｃｌＩおよびＰｓｉＩ制限酵素により消化されたＰＣＶ２  ＯＲＦ２のＰＣＲ産物に相補的な、粘着末端と平滑末端が得られた。消化されたＰＣＶ２  ＯＲＦ２産物、およびＯＲＦ２欠失ｐＳＫ−ＰＣＶ１産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ＰＣＶ１のＯＲＦ２遺伝子がＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子で置換された、キメラＰＣＶ１−２ゲノムＤＮＡクローンを作製した。一度、２つのＰＣＲ産物を消化し再連結すれば、生じたキメラクローンにおいて、クローニングをしやすくするために用いられたすべてのＰＣＲで導入された点変異が除去された。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）DH5α（コンピテントセルを形質転換した。キメラＤＮＡクローンを含む組み換えプラスミドを単離し、ＰＣＲ、制限酵素消化および部分的なＤＮＡ配列解読によって確認した。全長キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡゲノムを、ｐＳＫ＋ベクター（組み換えプラスミド）から、ＫｐｎＩ消化によって切り出した。次いで、ＰＣＶ１−２キメラ感染性ＤＮＡクローン（図６）を得るために、キメラＤＮＡゲノムを、直列２量体の形成を好むＴ４リガーゼでの、短い１０分間の連結反応によって２量体化した。２コピーのキメラウイルスゲノムを含む組み換えプラスミドを、ＰＣＲ、制限酵素消化およびＤＮＡ配列解読によって確認した。
【０１０７】
実施例１２
ＰＣＶ１−２キメラＤＮＡクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染性の評価
キメラＰＣＶＤＮＡクローン（ＰＣＶ２の免疫原性キャプシド遺伝子をもつ非病原性ＰＣＶ１）の生存性を、ＰＫ−１５細胞において試験した。ＰＫ−１５細胞をキメラウイルスＤＮＡクローンでトランスフェクトしたとき、トランスフェクション約２日後において、ＩＦＡによって、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２キャプシドに特異的なウイルス抗原が検出された。ＰＣＶ１キャプシド抗原は、トランスフェクトされた細胞において検出されなかった。この実験によって、キメラＤＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感染性があり、ＰＫ−１５細胞において複製し、免疫原性キャプシドタンパク質を産生していることが示された。
【０１０８】
実施例１３
交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンの構築
相互ＰＣＶ２−１キメラＤＮＡクローンを構築するために、ＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシド遺伝子を、非病原性ＰＣＶ１のものにより、病原性ＰＣＶ２ゲノム骨格において置換した（図６）。２対のＰＣＲプライマーを設計した：配列番号１３に記載のＢｇｌ−ＩＩ−ＯＲＦ、および配列番号１４に記載のＳｐＨ−Ｉ−ＯＲＦ２の対は、ＰＣＶ１  ＯＲＦ２遺伝子を増幅し、点変異によって、隣接したＢｇｌＩＩおよびＳｐＨＩ制限酵素サイトを導入する。２つめのプライマーペアは、配列番号１５に記載のＢｇｌ−ＩＩ−ＰＣＶ２、および配列番号１６に記載のＳｐＨ−Ｉ−ＰＣＶ２であり、ＰＣＲの鋳型としてＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンを用いることによって、ｐＳＫベクターおよびＯＲＦ２遺伝子のないＰＣＶ２ゲノム（ｐＳＫ−ＰＣＶ２  ΔＯＲＦ２）を増幅し、点変異によって、隣接したＢｇｌＩＩおよびＳｐＨＩ制限酵素サイトを導入する。ｐＳＫ−ＰＣＶ２  ΔＯＲＦ２産物およびＰＣＶ２  ＯＲＦ２のＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＳｐＨＩ制限酵素によって消化し、相補的付着および平滑末端を得て、互いを連結した。イー・コリ（E. Coli）細胞へ形質転換した後、正しい組み換えプラスミドを単離し、制限酵素消化およびＤＮＡ配列解読によって確認した。全長交互キメラＰＣＶ２−１ゲノムを、ＳａｃＩＩ消化によって組み換えプラスミドから切り出し、本明細書に記載のように２量体化し、交互キメラＰＣＶ２−１感染性クローンを得た。
【０１０９】
実施例１４
ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンでのＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
ＰＣＶ２クローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける感染性は、前記実施例３〜５において明らかにされた。ＰＣＶ１および２つのキメラクローンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける感染性を試験するために、実施例１の方法によって調製されたＰＣＶ１汚染のないＰＫ−１５細胞を、８ウェルLabTek chambers slides (Nalge Nunc Int., Denmark)において生育した。ＰＫ−１５細胞が約８０％の集密度に達したとき、Lipofectamine Plus Reagentを用いて、製造者(Life Technologies, Inc)によって提供されたプロトコルに従って、細胞をそれぞれＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンでトランスフェクトした。空のｐＳＫベクターで擬似的にトランスフェクトされた細胞は、対照として含まれた。トランスフェクションから３日後に、８０％アセトンおよび２０％メタノールを含む溶液で、４℃で２０分間処理して細胞を固定した。ＰＣＶ１およびＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされた細胞における感染性およびウイルス複製の証拠は、Dr. G. M. Allan (G. M. Allan et al., "Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus," Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994))によって快く提供してもらった、ＰＣＶ１  ＯＲＦ２キャプシド遺伝子に対するモノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光アッセイによって確認された。固定された細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１：２０に希釈したＰＣＶ１モノクローナル抗体と、３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳバッファーで３回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗マウスイムノグロブリンＧ（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.）と、３７℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳバッファーで３回洗浄した後、スライドグラスをフルオロマウントＧ（fluoromount-G）で封じ込み、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡の下で試験した。ＰＣＶ２およびＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされた細胞の感染性は、実施例４に記載されたように、ＰＣＶ２に特異的な抗体を用いたＩＦＡによって確認された。
【０１１０】
ＰＣＶ１、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡおよび交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンの感染性を、ＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションによって実証した。完全なＰＣＶ１ゲノムの２つの同一コピーを、直列にｐＳＫベクターに連結することによってＰＣＶ１  ＤＮＡクローンを得た。キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、非病原性ＰＣＶ１ゲノム骨格において、病原性ＰＣＶ２のものによって置換されたＰＣＶ１のＯＲＦ２キャプシド遺伝子を持つ（図６）。交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンは、病原性ＰＣＶ２ゲノム骨格において、非病原性ＰＣＶ１のものによって置換されたＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシド遺伝子を持つ。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて感染性があるならば、ＰＫ−１５細胞において、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、ＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシド抗原を産生するであろうし、交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンは、ＰＣＶ１  ＯＲＦ２キャプシド抗原を発現するであろう。結果は、ＰＣＶ１、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンは、驚くべきことに、ＰＫ−１５細胞へトランスフェクトされた場合に、全てが感染性であり、ＰＣＶ１もしくはＰＣＶ２に特異的な抗体を用いたＩＦＡによって証明されるように、それぞれのウイルスキャプシドタンパク質を発現することを示した。ＰＣＶ１  ＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体およびＰＣＶ２に対する抗体を用いたＩＦＡによって、ＰＣＶ１  ＤＮＡおよびＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは感染性であることが確認された。ＰＣＶ１  ＯＲＦ２特異的モノクローナル抗体を用いたＩＦＡによって、ＰＣＶ１−２キメラＤＮＡクローンも感染性であることが示された。トランスフェクトされたＰＫ−１５細胞の約１０〜２０％は、ＰＣＶ１キャプシド抗原およびＰＣＶ２抗原について陽性であり、トランスフェクトされた細胞の核内において、ＰＣＶ１  ＯＲＦ２抗原を発現した（図７）。
【０１１１】
実施例１５
ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１クローンでのブタの実験的接種
キメラＤＮＡクローンの免疫原性および病原性を評価するために、４０匹の４〜６週齢の特定病原体不在（ＳＰＦ）ブタを、無作為に８匹ずつ５部屋に割り当てた。接種前に、動物を、ＰＣＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、およびブタ肝炎Ｅウイルスに対する抗体について検査した。さらに、接種前の血清サンプルを、ＰＣＲによって、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２核酸について検査し、ブタがウイルスのいずれかに自然感染していないことを確認した。ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローン全てを、プラスミドＤＮＡの、ブタ浅腸骨リンパ節（superficial iliac lymph nodes）への直接注射によって接種した。グループ１のブタは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳバッファー）を接種され、負の対照とされた。グループ２のブタは、それぞれ、浅腸骨リンパ節（superficial iliac lymph nodes）に、２００μｇの感染性ＰＣＶ１  ＤＮＡクローンを注射された。グループ３のブタは、それぞれ、２００μｇの感染性ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンで注射された。グループ４のブタは、それぞれ、２００μｇの感染性キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンの注射を受けた。グループ５のブタは、それぞれ、２００μｇの感染性相互ＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンを注射された。疾病の臨床兆候のため、動物を毎日監視した。接種後（ＤＰＩ）−２、７、１４、２１、２８、３５、４２および４９において、それぞれの動物から血清を採取した。２１ＤＰＩにおいて、各グループから４匹の無作為に選択された動物を検死した。各グループに残った４匹の動物は、４９ＤＰＩに検死された。実施例７に記載したように、様々な組織および臓器を検死中に採取し、組織学的試験を行った。
【０１１２】
ＰＣＶ１、ＰＣＶ２およびキメラ感染性ＤＮＡクローンの免疫原性を、ブタにおいて試験した。−２（０）、７、１４、２１、２８、３５、４２および４９ＤＰＩに、全ての対照および接種された動物から採取した血清を、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１ウイルス血症について、クローン特異的ＤＮＡ配列のＰＣＲ検出によって、抗ＰＣＶ１抗体についてＩＦＡによって、ならびに抗ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗体についてはＥＬＩＳＡによって検査した。接種前の−２ＤＰＩに、５つ全てのグループのブタは、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２いずれについても陰性であることを、ＰＣＲによって検査されている
【０１１３】
負の対照動物は、研究を通してずっと、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルス血症いずれについても陰性であった（以下の表７を参照）。−２ＤＰＩにおいて、未接種の対照グループにおける５匹のブタは、検出可能なＰＣＶ２母系抗体を持っており、７ＤＰＩにおいて２匹のブタは検出可能なＰＣＶ１母系抗体を持っていた（以下の表８参照）。子ブタにおける、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２いずれに対する母系抗体も、２１ＤＰＩまでに消滅した。研究を通して、８匹の未接種の対照のブタのいずれにおいても、ＰＣＶ１またはＰＣＶ２へのセロコンバージョンは検出されなかった。
【０１１４】
ＰＣＶ１接種グループにおいて、ウイルス血症は、７ＤＰＩに初めて接種されたブタにおいて検出され（以下の表７）、最後は３５ＤＰＩに検出された。ＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンで接種された８匹の動物のうち５匹は、ＰＣＶ１ウイルス血症について陽性であった。ＰＣＶ１ウイルス血症が継続した平均の長さは、０．６２５週であった。ＰＣＶ１接種グループ中全ての動物が、２１ＤＰＩまでにＰＣＶへセロコンバートし、４９ＤＰＩの研究終了時までＰＣＶ１抗体に対して陽性のままであった。
【０１１５】
ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンは、ブタにおいて感染性であると本明細書に示されている。ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンを接種されたグループにおいて、ＰＣＶ２ウイルス血症は、７ＤＰＩに初めて検出された（以下の表７）。２１ＤＰＩまでに、全てのＰＣＶ２接種グループ３の動物は、ＰＣＶ２ウイルス血症について陽性となった。ＰＣＶ２ウイルス血症が継続した平均の長さは、２．１２週であった。ＰＣＶ２接種グループ中２匹のブタは、７ＤＰＩにおいて、母系ＰＣＶ２抗体を検出可能な程度持っていたが（以下の表８）、これらの子ブタにおける母系抗体は１４ＤＰＩまでに消滅した。ＰＣＶ２特異的ＥＬＩＳＡによって検査されるＰＣＶ２へセロコンバージョンは、３５ＤＰＩにおいて初めて検出された。４２ＤＰＩまでに、ＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンで接種された全てのブタは、ＰＣＶ２へセロコンバートした。
【０１１６】
ＰＣＶ１−２キメラ感染性ＤＮＡクローンで接種されたグループ４のブタにおいて、キメラウイルス特異的なウイルス血症は、１４ＤＰＩに初めて検出された（以下の表７）。接種された動物の７匹中４匹は、１４ＤＰＩと４２ＤＰＩの間にＰＣＶ１−２に対するウイルス血症となった。キメラＰＣＶ１−２ウイルス血症が継続した平均の長さは、１週であった。１匹のブタは、７および１４ＤＰＩにおいて、検出可能なレベルの母系ＰＣＶ２抗体を持っていたが、母系抗体は２１ＤＰＩまでに消滅した（以下の表８）。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的抗体へのセロコンバージョンは、２８ＤＰＩに初めて起こった。４９ＤＰＩまでに、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンで接種された全てのブタが、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的抗体へセロコンバートした。
【０１１７】
交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンで接種されたブタにおいて、ＰＣＶ２−１キメラウイルスに特異的なウイルスＤＮＡは、血清サンプルにおいて検出されなかった（以下の表７）。しかし、２１ＤＰＩまでに、グループ５の全ての動物が、ＰＣＶ１抗体へセロコンバートした。各グループから選択されたブタより増幅されたＰＣＲ産物を、配列解読したところ、それぞれのグループにおいて接種に用いられたそれぞれの感染性クローンそのものであることが確認された。
【０１１８】
【表７】
2005511075.tif 000008
【０１１９】
【表８】
2005511075.tif 000009
【０１２０】
実施例１６
臨床評価
０ＤＰＩおよび検死時に、ブタを計量した。直腸温度および臨床的呼吸器疾患スコアは、０から６（０＝正常、６＝重度）の範囲にわたり(P. G. Halbur et al., "Comparison of the pathogenicity of two U.S. porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates with that of the Lelystad virus," Vet. Pathol. 32:648-660 (1995))、０から４９ＤＰＩの１日おきに記録した。中枢神経疾患、肝臓病（黄疸）、筋骨格疾患、および体調の変化を含む臨床観察を毎日記録した。二人組で全ての臨床評価を行った。
【０１２１】
対照または感染したブタは、１匹も、広範囲の臨床的ＰＭＷＳの明確な兆候を示さなかった。いずれのグループ間でも、体重増加もしくは平均直腸温度に違いはなかった。接種１日後に、ＰＣＶ１−２で接種されたグループ３のブタのうち１匹が死亡した。検死および臨床分析後、病原体は検出されず、死は接種手順もしくはキメラＰＣＶ１−２ウイルスと関連していなかった。
【０１２２】
実施例１７
肉眼的病理学および組織病理学
各グループより４匹のブタが、それぞれ２１および４９ＤＰＩに検死された。検死班は、検死時にブタの感染状況がわからないようにした。全てのブタで、完全な検死が行われた。評価された肉眼で見える肺炎に冒された肺の割合を、前記のスコア系（上記のP. G. Halbur et al., 1995）をもとに、各ブタについて記録した。リンパ節の肥大のような他の病変は、別に記録した。組織病理学的試験のための切片を、鼻甲介、肺（７切片）（同上）、心臓、脳、リンパ節（気道内、腸骨、腸間膜、鼠径下部（subinguinal））、扁桃、胸腺、肝臓、胆嚢、脾臓、関節、小腸、大腸、膵臓、および腎臓より採取した。実施例７に記載のように、組織を盲検法にて試験し、肺、リンパ節および肝臓の病変に主観的スコアを与えた。肺のスコアは０（正常）から３（重度リンパ組織球性（lymphohistiocytic）間質性肺炎）にわたった。肝臓のスコアは、０（正常）から３（重度リンパ組織球性（lymphohistiocytic）肝炎）にわたった。リンパ節のスコアは、小節のリンパ枯渇予測値のために、０（正常もしくはリンパ枯渇のない）から３（重度のリンパ枯渇および小節の組織球の置換）にわたっている。
【０１２３】
ブタにおけるＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１感染性ＤＮＡクローンの病原性を判定するために、まず肉眼的病変を検査した。結果を以下の表９に示す。未接種対照グループ１の動物のリンパ節は、２１および４９ＤＰＩいずれにおいても正常であった。４つの接種グループのブタの、リンパ節に限定された肉眼的病変の程度は多様であった。ＰＣＶ１接種グループ２のブタにおいて、２１ＤＰＩにはリンパ節は正常であったが、４９ＤＰＩに軽度〜中程度のリンパ節の腫れおよび変色が検出された。ＰＣＶ２接種グループ３の全てのブタのリンパ節は、２１および４９ＤＰＩいずれにおいても、正常の大きさの２〜５倍に肥大し、硬化および黄褐色に変色していた。
キメラＰＣＶ１−２接種グループ４の動物のリンパ節は、７匹中５匹のブタで、２１および４９ＤＰＩいずれにおいても、軽度〜中程度に腫れおよび変色していた。ＰＣＶ２−１クローンで接種されたグループ５のブタにおいて、８匹中１匹の動物のリンパ節が、２１ＤＰＩに腫れおよび変色していた。２１および４９ＤＰＩいずれにおいても、キメラＰＣＶ１−２クローンで接種されたブタにおけるリンパ節の肉眼的病変の平均スコアは、統計的にグループ１、２および５のものと異なるが、病原性ＰＣＶ２接種グループ３のものとも統計学的に異なっていた。ＰＣＶ１、ＰＣＶ２およびＰＣＶ１−２接種動物から得られた４９ＤＰＩにおけるリンパ球の平均肉眼的病変スコアは、互いに統計的に異なるものであったが、全てグループ１および５の平均肉眼的病変スコアとも統計的に異なっていた。
【０１２４】
次いで、顕微鏡的病変を検査した。結果を以下の表１０に示す。いずれのＤＰＩでも、未接種対照グループ１、もしくはＰＣＶ１接種グループ２のブタのいずれにおいても、顕微鏡的病変は検出されなかった。軽度の細気管支周囲リンパ形質細胞性および組織球性細気管支間質性（bronchointerstitial）肺炎を特徴とする顕微鏡的な肺の病変は、ＰＣＶ接種動物の８匹中１匹で観察された。ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１接種動物において、肺における顕微鏡的病変は観察されなかった。いずれの接種ブタの胸腺においても、病変は観察されなかった。軽度の多巣性リンパ形質細胞性心筋炎は、ＰＣＶ２接種グループの８匹中２匹において観察された。ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１接種動物の心臓組織に、顕微鏡的病変はなかった。ＰＣＶ２接種グループの８匹中４匹、ＰＣＶ１−２接種ブタの７匹中２匹、ＰＣＶ２−１接種ブタの８匹中１匹において、軽度の多巣性リンパ形質細胞性間質性腎炎が観察された。軽度から中程度のリンパ枯渇およびろ胞の組織球性置換（histiocytic replacement）は、ＰＣＶ２接種グループの８匹中５匹の扁桃、８匹中３匹の脾臓、および８匹中８匹のリンパ節において観察された。キメラＰＣＶ１−２接種動物において、軽度から中程度のリンパ枯渇およびろ胞の組織球性置換（histiocytic replacement）は、７匹中２匹のリンパ節で観察されたが、脾臓もしくは扁桃いずれにおいても検出されなかった。交互キメラＰＣＶ２−１接種動物のリンパ節、脾臓もしくは扁桃において、軽度から中程度のリンパ枯渇およびろ胞の組織球性置換（histiocytic replacement）は観察されなかった。軽度から中程度のリンパ形質細胞性肝炎は、ＰＣＶ２接種ブタの８匹中７匹において観察された。軽度から中程度のリンパ形質細胞性肝炎は、キメラＰＣＶ１−２接種ブタの７匹中２匹において観察された。交互キメラＰＣＶ２−１接種ブタにおいて、リンパ形質細胞性肝炎は観察されなかった。他の組織における病変は、顕著ではなかった。
【０１２５】
肺、肝臓およびリンパ節における顕微鏡的病変は、公開されたスコア系（上記のP. G. Halbur et al., 1995）に従って点数をつけた。結果を以下の表１０に示す。キメラＰＣＶ１−２接種グループ４のブタのリンパ節における病変の平均スコアは、グループ１、２および５のものと類似していたが、病原性ＰＣＶ２接種グループ３のブタのものとは、２１および４９ＤＰＩいずれにおいても、統計的に異なっていた。２１ＤＰＩにおけるキメラＰＣＶ１−２接種グループの平均顕微鏡的肝臓病変スコアは、ＰＣＶ２接種グループ３のものと統計的に異なっていたが、２１ＤＰＩにおけるグループ１、２および５のものと類似していた。４９ＤＰＩにおいて、グループ４のキメラＰＣＶ１−２接種ブタの平均顕微鏡的肝臓病変スコアは、グループ１、２、３および５のものと統計的に異なってはいなかった。他の組織および臓器のための許容できる評価系はなかった。
【０１２６】
【表９】
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【表１０】
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【０１２７】
実施例１８
血清学
−２、７、１４、２１、２８、３５、４２および４９ＤＰＩに、全てのブタから血液を採取した。ＰＲＲＳＶに対する血清抗体を、Herd Check PRRSV ELISA (IDEXX Laboratories, Westbrook, MA)を用いて検査した。ＰＰＶに対する血清抗体を、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ(H. S. Joo et al., "A standardized haemagglutination inhibition test for porcine parvovirus antibody," Aust. Vet. J. 52:422-424 (1976)).によって検出した。ＰＣＶ２に対する血清抗体を、前記のＰＣＶ２の組み換えＯＲＦ２キャプシドタンパク質をもとにした、修正間接ＥＬＩＳＡ(P. Nawagitgul et al., "Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV," Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)も参照)によって検出した。ＰＣＶ１に対する血清抗体を、間接的免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって検出した。ＰＣＶ１に感染したＰＫ−１５細胞を、８ウェルLabTek chamber slides上で生育させた。感染したＰＫ−１５細胞が、約９５〜１００％の集密度に近づいた時、感染した細胞を、８０％アセトンおよび２０％メタノールを含む溶液で、４℃２０分間固定した。固定された細胞を、ＰＢＳバッファーで１回洗浄した。１００μｌの１：１０にＰＢＳで希釈したブタ血清サンプルを、チャンバーに加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ブタ２次抗体と、３７℃で４５分間インキュベートした。スライドグラスをＰＢＳバッファーで３回洗浄した後、スライドグラスをフルオロマウントＧ（fluoromount-G）で封じ込み、カバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡の下で試験した。正の対照として、感染した細胞を希釈したＰＣＶ１特異的モノクローナル抗体（Dr. G. M. Allanからから贈与された）とインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.）と、３７℃で４５分間インキュベートした。負の対照として、ＰＣＶに感染した細胞を、１：１０希釈のＰＣＶ１およびＰＣＶ２抗体を含まない血清とインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Md.）と、インキュベートした。
【０１２８】
実施例１９
ＰＣＲ検出
接種されたブタの血清におけるＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡウイルス血症を検出するために、血清サンプルを異なるＤＰＩに採取し、ＰＣＲによって試験した。各血清サンプル１００μｌから、DNAzol reagentを、製造者(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)によって提供されたプロトコルに従って用いて、ウイルスＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよびプロテイナーゼを含まない水に再懸濁した。ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１のクローン特異的ゲノム配列を増幅するために、２セットのネステッドＰＣＲプライマーペアを設計した（上記表６）。１つめのネステッドプライマーのセットは、公開されたＰＣＶ１の配列をもとに設計した。配列番号２０に記載のGen.PCV1プライマー、および配列番号１９に記載のOrf.PCV1のプライマーは、ＰＣＶ１ゲノムの存在下において、４００ｂｐの断片を増幅した。配列番号２２に記載のnested.Gen.PCV1、および配列番号２１に記載のnested.Orf.PCV1のネステッドプライマーは、２２０ｂｐの断片を増幅した。
【０１２９】
ＰＣＶ２ウイルス血症を検出するために、配列番号２４に記載のGen.PCV2、および配列番号２３に記載のOrf.PCV2のプライマーペアは、１回目のＰＣＲにおいて、ＰＣＶ２の存在下で、９００ｂｐの断片を増幅した。配列番号２６に記載のnested.Gen.PCV2、および配列番号２５に記載のnested.Orf.PCV2のプライマーは、ネステッドＰＣＲにおいて、６００ｂｐの断片を増幅した。
【０１３０】
キメラＰＣＶ１−２ウイルス血症を検出するために、１回目のＰＣＲ反応に配列番号２０に記載のＰＣＶ１特異的プライマーGen.PCV1、および配列番号２３に記載のＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的プライマーOrf.PCV2を用いて、５８０ｂｐのキメラ断片を増幅した。ネステッドＰＣＲには、配列番号２２に記載のＰＣＶ１特異的プライマーnested.Gen.PCV1、および配列番号２５に記載のＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的プライマーnested.Orf.PCV2を用いて、３７０ｂｐのキメラ断片を増幅した。
【０１３１】
交互キメラＰＣＶ２−１ウイルス血症を検出するために、１回目のＰＣＲ反応に、配列番号２４に記載のＰＣＶ２特異的プライマーGen.PCV2、および配列番号１９に記載のＰＣＶ１  ＯＲＦ２特異的プライマーOrf.PCV1を用いて、７００ｂｐのキメラ断片を増幅した。ネステッドＰＣＲには、配列番号２６に記載のＰＣＶ２特異的プライマーnested.Gen.PCV2、および配列番号２１に記載のＰＣＶ２  ＯＲＦ１特異的プライマーnested.Orf.PCV1を用いて、４６０ｂｐのキメラ断片を増幅した。全てのＰＣＲパラメーターは、本質的に同一であり、３８サイクルの９４℃で１分間の変性、４５℃で１分のアニーリング、および７２℃で１．５分の伸長から構成された。負の対照のブタの全ての血清サンプルを、前記のように(M. Fenaux et al., "Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2," J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503  (2000))、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の両方を検出および分離できるＰＣＲ−ＲＦＬＰ診断アッセイによって検査した。各グループより選択された動物のＰＣＲ産物を、配列解読し、ブタに感染したウイルスの起源を確認した。
【０１３２】
実施例２０
免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＰＣＶ２特異的抗原のＩＨＣ検出は、２１および４９ＤＰＩ検死された全てのブタから採取したリンパ節組織にて行われた。ＰＣＶ２に対するウサギポリクローナル抗血清を、前記の通常の手順(S. D. Sorden et al., "Development of a polyclonal-antibody-based immunohistochemical method for the detection of type 2 porcine circovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue," J. Vet. Diagn. Invest. 11:528-530 (1999))に従って、ＩＨＣに使用した。
【０１３３】
ＰＣＶ２特異的抗原のＩＨＣ染色に基づき、未接種対照、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２−１接種ブタのリンパ組織は、ＰＣＶ２抗原について陰性であった。ＰＣＶ２抗原は、ＰＣＶ２接種グループの８匹の動物中７匹のリンパ組織において検出された。ＰＣＶ２抗原は、キメラＰＣＶ１−２接種グループの７匹中１匹のブタのリンパ組織においても検出された。
【０１３４】
前記において、説明のために、本発明の特定の具体例の詳細な記載が提供されているが、限定するものではない。本発明に基づいて、当業者にとって明らかな他の修正、派生、等価物の全ては、請求される本発明の範囲内に含まれることは理解されよう。
【０１３５】
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、感染性ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンの構築物を表す。完全ＰＣＶ２ゲノムを増幅するために用いたプライマーペアの相対的な位置は、矢印で示される（逆方向プライマー  PCVSAC2、正方向プライマー  PCVSAC2）。ＰＣＲによって増幅されたＰＣＶ２ゲノムＤＮＡは、ＳａｃＩＩ制限酵素で切断され、精製される。精製され、ＳａｃＩＩで切断されたゲノムＤＮＡを連結し、コンカテマーを形成した。連結したコンカテマーを、ゲル電気泳動によって分離し、ＰＣＶ２の直列ゲノムダイマーを精製し、あらかじめＳａｃＩＩで切断したｐＳＫベクターへクローニングして、分子ＰＣＶ２クローンを作製した。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、ＰＫ−１５細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクトされた場合、クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡは感染性があることを示している。図２Ａは、クローン化ＰＣＶ２プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞における、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるＰＣＶ２抗原の検出を示す。ＰＣＶ２抗原の強い免疫標識は、核において見られ、またそれ以下ではあるが、トランスフェクトされた細胞の細胞質において見られた。図２Ｂは、擬似的にトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞を示す。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａは、ＰＣＶ２  ＤＮＡでリンパ内に接種された２１ＤＰＩのブタの肺を示す。肺は弾性があり、虚脱せず、赤褐色に斑点ができている。気管気管支リンパ節は、著しく肥大し、褐色になっている（矢印）。図３Ｂは、対照のブタの正常な肺の顕微鏡切片を表す。図３Ｃは、図３Ａのブタの肺の顕微鏡切片を表す（２５ｘ）。細気管支周囲リンパ組織球性（peribronchiolar lymphohistiocytic）炎症および穏やかな壊死性細気管支炎（２５Ｘ）に注意する。図３Ｄは、図３Ａにおける肺の免疫組織化学的染色を示す。気管の周囲のマクロファージ（矢印）および繊維芽様細胞（矢じり）ＰＣＶ２抗原に注意する（６４Ｘ）
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａは、対照のブタの正常なリンパ節を示す。はっきりしたリンパ小節（矢印）に注意する（２５Ｘ）。図４Ｂは、２１日前にリンパ内にクローン化ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡで接種した図３Ａのブタの気道内のリンパ節の顕微鏡切片を表す。リンパ小節はあまりはっきりせず、軽度〜中程度のリンパ枯渇および軽度多巣性肉芽腫性炎症が起きている（２５Ｘ）。図４Ｃは、図４Ｂにおけるリンパ節の１小節をさらに拡大した顕微鏡切片を表す。マクロファージ、および小節リンパ球に取って代わった巨細胞（矢印）と、あまりはっきりしない小節に注意する（６４Ｘ）。図４Ｄは、図４Ｂと同じリンパ節における、ＰＣＶ２抗原の免疫組織化学的検出を示し、小節におけるマクロファージ（矢印）および巨細胞（小矢じり）、および樹状様細胞（大矢じり）である（６４Ｘ）。
【図５】図５は、病原性ＰＣＶ２の免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子をもった非病原性ＰＣＶ１ゲノムを伴ったキメラＰＣＶ１−２（ＰＣＶ１／ＰＣＶ２）ＤＮＡクローンの構築物を示す。２量体化したＤＮＡクローンを、ＰＣＶ２のＯＲＦ２タンパク質を発現する生キメラウイルスを得るための、ＰＫ−１５細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション、および活性を確認するためのｉｎ  ｖｉｖｏの動物実験に使用した。
【図６】図６は、感染性ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１分子ＤＮＡクローンの構築物および構成を示す。ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンは、２つの全長直鎖状ＰＣＶ２ゲノムを、直列に、前記の一般的な方法（上記のM. Fenaux et al., 2002）により、Bluescript  SKベクター（ｐＳＫ）へ連結することによって構築される。ＰＣＶ１  ＤＮＡクローンは、２つの全長直鎖状ＰＣＶ１ゲノムを、直列に、ｐＳＫベクターへ連結することによって構築される。キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンは、ｐＳＫベクター中の非病原性ＰＣＶ１ゲノム骨格において、ＰＣＶ１のＯＲＦ２キャプシド遺伝子を、ＰＣＶ２のもので置換することによって構築される。交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンは、ｐＳＫベクター中の病原性ＰＣＶ２ゲノム骨格において、病原性ＰＣＶ２のＯＲＦ２キャプシド遺伝子を、非病原性ＰＣＶ１のもので置換することよって構築される。いずれのキメラクローンも、ｐＳＫベクター内において２量体である。矢印は、接種された動物において、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、ＰＣＶ１−２およびＰＣＶ２−１のウイルス血症を検出するためのＰＣＲプライマーの相対的位置である。
【図７Ａ−７Ｊ】図７Ａ−７Ｊは、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２、キメラＰＣＶ１−２および交互キメラＰＣＶ２−１分子ＤＮＡクローンは、感染性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＫ−１５細胞をトランスフェクトした時に、それぞれのウイルス抗原を発現することを示している。左のパネル（７Ａ、７Ｃ、７Ｅ、７Ｇおよび７Ｉ）は、ＰＣＶ１のＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体で染色されている。右のパネル（７Ｂ、７Ｄ、７Ｆ、７Ｈおよび７Ｊ）は、ＰＣＶ２に対する抗体で染色されている。パネル７Ａおよび７Ｂは、擬似的にトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞である。パネル７Ｃおよび７Ｄは、ＰＣＶ１  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞である。パネル７Ｅおよび７Ｆは、ＰＣＶ２  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞である。パネル７Ｇおよび７Ｈは、キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞である。パネル７Ｉおよび７Ｊは、交互キメラＰＣＶ２−１  ＤＮＡクローンでトランスフェクトされたＰＫ−１５細胞である。
【図８】図８は、クローン化ＰＣＶ２ゲノムＤＮＡ（配列番号１に対応）の全長ＤＮＡ配列を示す。
【図９】図９は、クローン化キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡ（配列番号２に対応）の全長ＤＮＡ配列を示す。
【図１０】図１０は、クローン化キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡの免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子（配列番号３に対応）の全長ＤＮＡ配列を示す。
【図１１】図１１は、クローン化キメラＰＣＶ１−２  ＤＮＡの免疫原性ＯＲＦ２キャプシド遺伝子（配列番号３に対応）の推定アミノ酸翻訳を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005511075000001.app
【国際調査報告】
2005511075.tif 000027
2005511075.tif 000028
2005511075.tif 000029
2005511075.tif 000030
2005511075.tif 000031