(57)【要約】本発明は、細胞の分泌過程を調節する方法を含む。さらに具体的には、本発明は、炎症媒介物質の放出を調節することに関する。さらに、本発明は、気道ムチン分泌を調節する細胞内信号伝達機序を開示し、気道ムチンの異常な分泌および／または膜結合小胞からの炎症媒介物質の分泌に関与する疾患における薬理学的介入のためのいくつかの新規細胞内標的を例示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を含む治療的に有効な量の医薬組成物を投与するステップを含む被験者の炎症を調節する方法。
【請求項２】
ＭＡＮＳタンパク質の活性断片が少なくとも６つのアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炎症が、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患および疼痛症候群によって生ずる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
呼吸器疾患が、喘息、慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
皮膚疾患が、酒さ、湿疹、乾癬および重症の座瘡からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
炎症が、関節炎または嚢胞性線維症によって生ずる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
被験者が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物が、ヒト、イヌ、ウマおよびネコからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
投与するステップが、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、鼻腔投与、吸入および経口投与からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
肺投与が、エアゾール、ドライパウダー吸入器、定量吸入器および噴霧器からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験者の炎症媒介物質を調節するＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を含む治療的に有効な量の化合物を投与するステップを含む被験者の細胞分泌過程を調節する方法。
【請求項１３】
ＭＡＮＳタンパク質の活性断片が少なくとも６つのアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞分泌過程を調節することが、細胞分泌過程を遮断または低下することである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
炎症媒介物質が、呼吸器疾患、腸疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患および疼痛症候群によって生ずる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
呼吸器疾患が、喘息、慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
腸疾患が、潰瘍性大腸炎、クローン病および過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
皮膚疾患が、酒さ、湿疹、乾癬および重症の座瘡からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
炎症が、関節炎または嚢胞性線維症によって生ずる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
被験者が哺乳動物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物が、ヒト、イヌ、ウマおよびネコからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
投与するステップが、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、鼻腔投与、吸入および経口投与からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
肺投与が、エアゾール、ドライパウダー吸入器、定量吸入器および噴霧器からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳによる放出を阻害する治療的に有効な量の化合物を投与し、その結果、治療を行わない場合と比較して被験者の粘膜分泌が低下されるステップを含む被験者の炎症を低下する方法。
【請求項２５】
化合物がＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
活性断片が少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化合物がＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
化合物が、ＭＡＲＣＫＳタンパク質またはその活性断片のコード配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
活性断片が少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
炎症および粘膜分泌の両方が同時に低下される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳによる放出を阻害する治療的に有効な量の化合物を投与し、その結果、治療を行わない場合と比較して被験者の炎症が低下されるステップを含む被験者の炎症を低下する方法。
【請求項３２】
化合物がＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
活性断片が少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
化合物がＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物が、ＭＡＲＣＫＳタンパク質またはその活性断片のコード配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
活性断片が少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ムチン顆粒放出を調節する治療的に有効な量の化合物を投与し、その結果、治療を行わない場合と比較してムチン顆粒が減少するステップを含む被験者のムチン顆粒放出を調節する方法。
【請求項３８】
化合物がＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
化合物がＭＡＮＳペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ムチン顆粒放出を調節する治療的に有効な量の化合物を投与し、その結果、治療を行わない場合と比較してムチン顆粒が減少するステップを含む被験者の気道ムチン顆粒の開口分泌を調節する方法。
【請求項４１】
化合物がＭＡＲＣＫＳタンパク質の活性断片である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物がＭＡＮＳペプチドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＭＡＲＣＫＳタンパク質またはその活性断片をコードする配列に相補的である治療量のアンチセンス配列を投与するステップを含む被験者の粘液分泌を調節する方法であって、このような治療を行わない場合と比較して細胞による粘液分泌が阻害される方法。
【請求項４４】
配列が少なくとも鎖長１８の核酸である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
化合物が、ＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片をコードする配列に相補的である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
粘液分泌の調節が、粘液分泌を遮断または低下することである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
炎症部位の炎症媒介物質を調節する上で有効な治療的に有効な量のＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を投与するステップを含む被験者の炎症を低下または阻止する方法。
【請求項４８】
活性断片が少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
炎症媒介物質が、好中球、好塩基球、好酸球、単球および白血球からなる群から選択される細胞によって産生される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
薬剤が、経口、非経口、空洞内または気道経由で投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
組成物が、抗生物質、抗ウイルス化合物、抗寄生虫化合物、抗炎症化合物および免疫抑制剤からなる群から選択される第２の分子をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、開示内容が全体として参照することにより本明細書に組み入れられている２００１年６月２６日提出の米国暫定出願第６０／３００，９３３号の優先権を主張している。
【０００２】
［米国政府支援に関する記述］
本発明は、国立医療研究所の交付番号ＨＬ  ３６９８２により米国連邦政府からの支援により実施された。米国政府は本発明に一定のの権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、細胞分泌過程を調節する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、炎症媒介物質の放出を調節する方法に関する。本発明はまた、気道ムチン分泌を調節する細胞内信号伝達機序に関し、気道ムチンの異常な分泌および／または膜結合小胞からの炎症媒介物質の分泌に関与する疾患における薬理学的介入のためのいくつかの新規細胞内標的の説明に関する。
【背景技術】
【０００４】
［発明の背景］
粘液の分泌過多は、ヒトおよび非ヒト動物における数多くの気道炎症疾患の病因に寄与する。粘液分泌の増加は、喘息、ＣＯＰＤおよび慢性気管支炎などの慢性疾病状態、嚢胞性繊維症などの遺伝病、アレルギー状態（アトピー、アレルギー性炎症）、気管支拡張症および肺炎、鼻炎、インフルエンザまたは感冒などの数多くの急性感染性呼吸器疾患に見られる。従って、粘液分泌を減少または低下することができる新規方法および治療化合物が望まれる。
【０００５】
これらの呼吸器疾患の多くにおいて随伴して発症する粘液の分泌過多は、気道に炎症細胞が常に存在するからである。これらの細胞は、これらの細胞から放出される炎症媒介物質が起こす組織損傷によるこれらの疾患の病因に大きく寄与する。この慢性炎症によるこのような破壊の一例は、好中球から放出される媒介物質（すなわち、ミエロペルオキシダーゼ）が気道上皮組織の落屑を誘発する。
【０００６】
粘液の過少分泌も有害な影響を示す。気道粘膜は、吸入された生物学的に作用のある粒子に対する物理的な障壁として作用し、気道の細菌集落形成を防ぐ働きをすることができ、白血球から放出される細胞毒性産物を不活性化する。Ｋｉｎｇら、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２：４７−５９（１９８５）、ＶｉｓｈｗａｎａｔｈおよびＲａｍｐｈａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：１９７  （１９８４）、Ｃｒｏｓｓら、Ｌａｎｃｅｔ１：１３２８（１９８４）。眼では、粘液は涙液膜を維持し、眼の健康および快適さにとって重要である。消化管の粘液分泌も細胞保護機能を有する。化学的障壁、生物学的障壁および機械的障壁としての粘液の役割は、粘膜による異常に低い粘液分泌が望ましくないことを意味する。
【０００７】
哺乳動物の気道は、気道上皮細胞（杯細胞）および粘膜下腺によって産生され、分泌される粘膜が薄い層を形成している。喘息、慢性気管支炎および嚢胞性繊維症などの疾患では、粘液の分泌過多が共通の障害である。過剰な粘膜が、閉塞、感染症の罹患しやすさ並びに気道壁および隣接組織の破壊にも寄与することがある。粘膜の主要な成分は分泌細胞によって合成され、細胞質−膜結合顆粒内に貯留されるムチン糖タンパク質である。ムチンは、気道、消化管および女性の生殖管の上皮細胞を含む上皮細胞によって分泌される糖タンパク質ファミリーである。ムチンは、粘液の粘弾性性質を担い、少なくとも８つのムチン遺伝子が知られている。Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，９５６１−９５６６（１９９７）。ムチンの過剰分泌および／または粘液細胞の過形成によって生じる粘膜繊毛の障害により、慢性感染症、気流閉塞を促進し、死を促進することもある気道粘液栓を生じる。慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、喘息、嚢胞性繊維症および細菌感染症などの多数の気道疾患はムチンの産生過多によって特徴づけられる。Ｅ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，  ８：１３３３−１３３８（１９９５）、Ｋ．Ｃ．Ｋｉｍら、Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，１０：１４３８（１９９７）、Ｄ．Ｓｔｅｉｇｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：３０７−３１４（１９９５）。適度に刺激されると、顆粒が細胞周辺部に移動し、そこで顆粒膜が原形質膜に融合し、内容物の管腔への分泌が可能になる開口過程を介してムチン顆粒は放出される。
【０００８】
この過程の病態生理学的な重要性が明らかであるにもかかわらず、細胞表面の刺激をムチン顆粒放出に関連させる細胞内信号伝達機序はごく最近に解明された。Ｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７６：４０９８２−４０９９０（２００１）参照。多種多様の薬剤および炎症／液性媒介物質がムチン分泌を誘発することが知られている。これらには、コリン作動薬、脂質媒介物質、酸化剤、サイトカイン、神経ペプチド、ＡＴＰおよびＵＴＰ、細菌産物、好中球エラスターゼ並びに吸入された環境汚染物質が挙げられる。Ａｄｌｅｒら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２４５−２４８（１９９８）参照。興味深いことに、これらのムチン分泌促進物質の多くはいくつかのプロテインキナーゼを活性化することも知られており、種々の種の気道上皮細胞によるムチンの過剰分泌の調節を調査している検討は、分泌過程へのプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）またはｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＧ）の関与を常に示している。例えば、Ｋｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，１９４−１９８（１９９７）、Ａｂｄｕｌｌａｈら、Ａｍ．  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３，Ｌ２０１−Ｌ２１０（１９９７）、Ａｂｄｕｌｌａｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６，９４３−９５１（１９９６）、Ｌａｒｉｖｅｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，１９９−２０５（１９９４）およびＦｉｓｃｈｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０，４１３−４２２（１９９９）参照。ムチン分泌を調節する際のこれら２つのプロテインキナーゼの協調相互作用すなわち「クロストーク」はＭＡＲＣＫＳタンパク質に関与することがごく最近証明されている。Ｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：４０９８２−４０９９０（２００１）参照。最終的にムチン顆粒の開口放出を生ずるこれらのプロテインキナーゼの協調作用の下流の信号伝達事象は十分には解明されていない。興味深いことに、好中球からの炎症媒介物質の放出を調査している同様の実験も、キナーゼ「クロストーク」の同様の経路がこれらの炎症細胞の分泌を調節しており、多数のキナーゼ、得にＰＫＣおよびＰＫＧに関係する分泌機序の普遍性が考えられることを示唆している。
【０００９】
in vivoにおける性状および機能を模倣している、分泌細胞（杯細胞）、繊毛細胞および基底細胞を含有する不均一な集団に細胞が分化する、気／液界面系における正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）細胞を培養する手法が以前報告された。Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２，６８５−６９２（２０００）。これらの細胞培養物は、ヒト気道上皮からのムチン分泌を調節する機序を検討するためのin vitroモデル系となりうる。しかし、ヒト気道上皮細胞からのムチン分泌を調節する機序を理解し、抗炎症治療の結果ムチン分泌を調節して改善する方法を開発する必要性が当分野にはある。炎症細胞からの炎症媒介物質の分泌を担当する機序を解明するためのさらなる努力により、両方の種類の分泌経路に共通の細胞内分子または事象を標的とすることによって、両方の種類の分泌を阻害することもできる。
【発明の開示】
【００１０】
［発明の開示］
本発明は、ＭＡＮＳペプチドとしても知られている２４アミノ酸のミリストイル化ポリペプチドの新規用途に関する。本発明はまた、任意の細胞分泌過程、特にその刺激経路がプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）基質ＭＡＲＣＫＳタンパク質および膜結合小胞からの内容物の放出に関係する炎症細胞からの炎症媒介物質の放出に関係するものを遮断する新規方法に関する。さらに、被験者の粘液分泌、特に気道の粘液分泌を増加または低下する方法および化合物を記載する。
【００１１】
さらに特には、本発明は、ＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を含む治療的に有効な量の医薬組成物の投与を含む、被験者の炎症を低下する方法を含む。活性断片は少なくとも６個のアミノ酸の鎖長である。本明細書において使用する、ＭＡＲＣＫＳタンパク質の「活性断片」は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質媒介性放出に影響する（阻害または増強する）ものである。好ましくは、本発明の医薬組成物は、炎症を遮断する。本発明はまた、被験者の炎症媒介物質を調節するＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を含む治療的に有効な量の化合物の投与を含む、被験者の細胞分泌過程を調節する方法を含む。投与は、一般に、局所投与、非経口投与、直腸投与、肺投与、吸入および鼻腔または経口投与からなる群から選択され、肺投与は、一般に、エアゾール、ドライパウダー吸入器、定量吸入器および噴霧器を含む。
【００１２】
本発明はまた、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳによる放出を阻害し、それによって、治療を行わない場合と比較して被験者の粘液分泌が低下される治療的に有効な量の化合物の投与を含む、被験者の炎症を低下する方法を含む。本明細書において使用する「低下する」は、一般に、炎症の影響を低減することを意味する。好ましくは、炎症媒介物質は、開示されている方法によって阻害または遮断される。さらに、炎症および粘液分泌を同時に低下することができる。同時にという用語は、炎症および粘液分泌が同時に低下されることを意味する。
【００１３】
本発明の別の実施態様は、炎症媒介物質のＭＡＲＣＫＳによる放出を阻害し、それによって治療を行わない場合と比較して、被験者の炎症が低下される治療的に有効な量の化合物を投与するステップを含む、被験者の炎症を低下する方法を含む。本発明のさらに別の実施態様は、ＭＡＲＣＫＳタンパク質またはその活性断片をコードする配列に相補的である治療量のアンチセンス配列を投与するステップを含む、被験者の粘液分泌を調節する方法であって、このような治療を行わない場合と比較して細胞による粘液分泌が阻害される方法を含む。このような方法はまた、粘液阻害量の投与を含む。「阻害する」という用語は、粘液分泌量の低下を意味する。本発明はまた、炎症部位の炎症媒介物質を調節する上で有効な治療的に有効な量のＭＡＮＳペプチドまたはその活性断片を投与するステップを含む、被験者の炎症を低下または阻止する方法を開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［好ましい実施態様の詳細な説明］
本発明は、本発明の好ましい実施態様が例示されている添付の図面を参照して、さらに詳細に以降に記載されている。しかし、本発明は異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載されている実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、本発明の開示内容が完璧で完全であり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供されている。
【００１５】
特に規定しない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術の当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されている公報、特許出願、特許および他の参照文献は全て全体の内容が参照として組み入れられている。
【００１６】
一態様において、本発明は医薬組成物を投与する方法に関する。医薬組成物は、治療的な有効な量の既知の化合物および製薬学的に許容されうる担体を含む。本明細書において使用する「治療的に有効な」量は、被験者が示す症状を軽減するのに十分な化合物の量である。治療的に有効な量は、患者の年齢および物理的状態、治療する患者の状態の重症度、治療期間、任意の併用治療の性質、使用する製薬学的に許容されうる担体並びに当業者の知識および経験の範囲内の同様の因子により異なる。製薬学的に許容されうる担体は、好ましくは、錠剤またはカプセルなどの固形投与剤形である。経口投与用の液体製剤を使用することもでき、シロップまたは懸濁液の形態、例えば、作用成分、砂糖並びにエタノール、水、グリセロールおよびプロピレングリコールの混合物を含有する溶液に調製されてもよい。望ましい場合には、このような液体製剤は、以下の１つ以上を含んでもよい：着色剤、矯味矯臭剤およびサッカリン。さらに、カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤および他の許容されうる担体を使用することもでき、その選択は当技術上公知である。
【００１７】
上記のように、本発明は、細胞分泌過程、特に炎症細胞から炎症媒介物質を放出する過程を調節する方法に関する。本明細書において使用する「調節する」という用語は、遮断、阻止、減少、低下、増加、増強または刺激することを意味する。数多くの細胞分泌過程は、膜結合小胞からの内容物の放出に関係する。炎症細胞に含有されるものなどのこれらの小胞の内容物のいくつかは、数多くの哺乳類の組織の種々の病因の原因となっていることが見出されている。本発明は、細胞内分泌経路に重要な特定の分子を合成ペプチドで標的にすることによって、炎症細胞に見出されるものを含む、任意の膜結合小胞からの分泌を遮断する手段を提供する。本発明の方法は、ヒトおよび動物の多種多様の分泌過多および炎症状態を治療するために治療的に重要となりうる。
【００１８】
本発明の１つの利点は、粘液分泌を直接遮断することを含む療法に独自の抗炎症療法を併用してもよいことである。免疫系の全般的な抑制に影響する現在の抗炎症療法を上回る本発明の利点は、ペプチドが、炎症細胞から分泌される膜結合成分だけの分泌を遮断すると考えられているということである。従って、免疫系の多くは、損傷物質を数多く放出することなく依然として機能するはずである。
【００１９】
本発明の化合物は、細胞からの炎症媒介物質の放出を調節する、すなわち、遮断することができる。このような炎症発生阻止は、種々の疾患、例えば、炎症に関係する疾患および異常な状態を予防および治療するための興味深い手段である。従って、本発明は、このような状態の治療に有用となりうる。これらは、骨関節炎、多発性硬化症、ギラン‐バレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデスおよびインスリン依存性糖尿病を含むが、これらに限定されない慢性炎症疾患を含む慢性炎症性疾患を含む。本発明の化合物は、種々の感染菌並びに関節リウマチ、毒素ショック症候群、糖尿病および炎症性腸疾患などの数多くの自己免疫疾患への応答などの高レベルの前炎症酵素の活性に関連する他の疾患を治療するためにも使用することができる。
【００２０】
本発明のペプチドおよび方法の使用は、炎症と戦う療法および粘液分泌を遮断する能力を有するペプチドの抗炎症活性を併用する療法を含む。炎症および粘液分泌の両方を遮断するペプチドの能力によって治療することができる疾患には、炎症性腸疾患、消化性疾患（すなわち、胆嚢の炎症、Ｍｅｎｅｔｉｅｒ病）および炎症性気道疾患が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドは、膵臓の島細胞からの過剰なインスリンの放出を遮断するためにも使用することができる。
【００２１】
他の前炎症媒介物質は、炎症または損傷部位への好中球の流入に関連する種々の疾患状態に関連するとされている。遮断抗体は、急性炎症における好中球関連組織損傷に対する有用な治療法として証明されている（Ｈａｒａｒａｄａら、１９９６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ  ２，４８２）。炎症媒介物質を放出することができる他の細胞には、好塩基球、好酸球、白血球、単球およびリンパ球が挙げられ、治療はこれらの細胞からの分泌に向けることができる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、本発明のペプチドが、生理学的に重要である、基底状態の分泌機能を含む分泌過程を遮断することが可能である。発明者らは本発明の任意の特定の理論に結び付けたくはないが、このような規定状態の分泌を調節する機序は、刺激された分泌を調節する機序とは異なると考えられる。あるいは、規定状態の分泌機序は、刺激された分泌よりも少ないＭＡＲＣＫＳタンパク質しか必要としないことがある。ＭＡＲＣＫＳ媒介性の分泌を遮断する治療は全てのＭＡＲＣＫＳ機能をなくすことはないので、従って規定状態の分泌は維持される。
【００２３】
本明細書において使用する「ＭＡＲＣＫＳヌクレオチド配列」という用語は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、遺伝子のＤＮＡ配列、任意の転写されたＲＮＡ配列、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ配列およびタンパク質に結合したＤＮＡまたはＲＮＡを含むＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする遺伝子から誘導される任意のヌクレオチド配列をいう。
【００２４】
ＭＡＲＣＫＳ遮断ペプチドの正確な送達も、重要な分泌過程を遮断することの考えられるいかなる限界をも克服することができる。このような薬剤の気道への送達は吸入される製剤で容易に達成されるはずである。これらの薬剤は炎症性腸疾患を治療する際に有用となりうるので、注腸または坐剤によって遮断剤を直腸／結腸／腸管内に送達することを考えることができる。炎症のある関節内への注射または経皮的送達は、局在化した炎症細胞からの分泌を制限することによって、関節炎患者または自己免疫疾患患者の病状を軽減することができる。神経終末周囲の領域への注射は、いくつかの種類の神経伝達物質の分泌を阻止することができ、重症の疼痛または制御されない筋肉の痙攣の伝達を遮断することができる。炎症性皮膚疾患を治療するためのペプチドの送達は、当技術上公知の種々の局所的製剤を使用して容易に達成されるはずである。
【００２５】
広範に分布されているＰＫＣ基質であるミリストイル化アラニン豊富Ｃキナーゼ基質（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ  ａｌａｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（ＭＡＲＣＫＳ）は、正常なヒト気道上皮（ＮＨＢＥ）細胞によるムチン顆粒放出を調節する主要な調節分子であることを本発明は証明している。これらの細胞からのムチンの分泌は、ＰＫＣおよびＰＫＧの両方の活性化によって最大となりうる。ＭＡＲＣＫＳは、ムチン顆粒放出を制御するためにこれら２つのタンパク質キナーゼの作用を調整する集合点となると考えられる。機序はＭＡＲＣＫＳのＰＫＣ依存的リン酸化に関与すると思われ、ＭＡＲＣＫＳを原形質膜から細胞質内へ放出し、そこで、ＰＫＧによって活性化されるプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）によって脱リン酸化される。この脱リン酸化によりＭＡＲＣＫＳは膜結合能力を回復することができ、細胞質ムチン顆粒の膜への結合を可能にすることができる。また、ＭＡＲＣＫＳは、細胞質のアクチンおよびミオシンと相互作用し、細胞の収縮装置に顆粒をつなぎ、その後の顆粒の移動およびエキソサイトーシスを仲介することができる。興味深いことに、炎症媒介性ＭＰＯの好中球からの分泌も、ＰＫＣおよびＰＫＧの活性化によって最大になることがある（図１１〜１５に例示する）。また、ＭＡＲＣＫＳは、炎症細胞の膜結合コンパートメントからの分泌を制御するこれら２つのプロテインキナーゼの作用を調整する集合点として働くと考えられている（すなわち、好中球からのＭＰＯの分泌）。
【００２６】
形質転換された細胞系統の気道上皮は、改変された信号伝達経路を有する傾向があり、細胞系統または未分化の細胞は、in vivoにおいて分化した細胞と同様には外因性刺激に応答しないことがある。本発明の検討に使用したＮＨＢＥ細胞は気／液界面で培養し、in vivoにおける検討と同様の十分に証明されている構造および機能を維持した十分に分化した一次細胞培養物を生じた。Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙら、上記、Ａｄｌｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２，１４５−１５４（１９９０）、Ｋａａｒｔｉｎｅｎら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．２９Ａ，４８１−４９２（１９９３）、Ｇｒａｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４，１０４−１１２（１９９６）参照。気道上皮細胞を培養するこの気／液方法は、気道上皮の種々の細胞過程に関与する機序を検討するためのin vitroモデル系を提供するために数年前に開発された。細胞培養物は、分泌細胞並びに繊毛細胞および基底細胞を含有する。この培養系から得られる結果は、in situにおける細胞の挙動に影響する可能性のある不均一な細胞−細胞接触および局在化した上皮構造が維持されるので、in vivoにおける細胞の応答に関連する。ＭＡＲＣＫＳは非分泌細胞にも存在する可能性があるが、ＭＡＲＣＫＳの改変と分泌の成果との間には明確で、迅速な（ｒａｐｉｄ）因果関係があり、ムチン分泌は、分泌細胞内で生じているＭＡＲＣＫＳ関連分子事象の直接的な影響であることを示唆している。
【００２７】
本発明は、ＰＫＣおよびＰＫＧ両方の同時活性化は分化したＮＨＢＥ細胞からのムチン分泌を増強することができたことおよびどちらかのキナーゼ単独の活性化は活発な分泌応答を誘発するには十分ではないことを証明している。同様に、イヌまたはヒト好中球からの炎症媒介物質ＭＰＯの分泌は、ＰＫＣおよびＰＫＧ両方の同時活性化によって増強されたが、どちらかのキナーゼ単独の活性化は最大の分泌応答を誘導するには不十分であった。ＰＭＡ単独に対する高い分泌応答はＮＨＢＥ細胞（図１、カラム４）および好中球（図１１）において証明されているが、応答の大きさは杯状（ｇｏｂｌｅｔ−ｌｉｋｅ）細胞系統において他の研究者によって観察されたものよりはるかに小さかった。Ａｂｄｕｌｌａｈら、上記参照。また、ｃＧＭＰ類似物は培養中のモルモット気管上皮細胞からの有意なムチン分泌を誘導することができることが以前に報告されているが（Ｆｉｓｃｈｅｒら、上記）、この応答は、８時間の暴露までは有意なレベルに達しなかったことに注目すべきである。このような長いずれ期間のある分泌応答は直接的な影響とは思われず、事前に製造されて貯蔵されていた細胞質顆粒の放出とは異なり、おそらくde novoタンパク質合成に関係する。にもかかわらず、ＰＫＣおよびＰＫＧ両方の同時活性化に関係するみかけの相乗作用は、ムチン分泌および／または炎症媒介物質を媒介する複雑で、厳密な信号伝達機序を示唆することができる。出願人らは、以下に開示する経路は、好中球からの炎症媒介物質放出を検討するために使用され、杯状細胞分泌を検討するために使用されたものと同じ経路である可能性があることに注目している。
【００２８】
上記のように、本発明は医薬組成物に使用することができる。ある実施態様において、薬剤製品は、経口投与に好適となりうる固形の医薬組成物の形態で存在する。本発明による物質の固形組成物は製造され、賦形剤と混合されてもおよび／または賦形剤で希釈されてもよい。物質の固形組成物は、例えば、カプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、紙または他の容器の形態であってもよい担体内に封入されてもよい。賦形剤が希釈剤として働く場合には、賦形剤は、関心対象の組成物の搬送体、担体または媒体として作用する固形、半固形または液体物質であってもよい。
【００２９】
種々の好適な賦形剤は当業者によって理解されており、２４０４〜２４０６ページの開示内容が全体として本明細書に組み入れられている、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，１９：２４０４−２４０６（２０００）に見出すことができる。好適な賦形剤の例には、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、メタクリレート、セラック、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。薬剤製品製剤は、さらに、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などの潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエートなどの保存剤、甘味剤または矯味矯臭剤含んでもよい。ポリオール、緩衝液および不活性フィラーも使用することができる。ポリオールの例には、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、スクロース、マルトース、グルコース、ラクトース、デキストロース等が挙げられるが、これらに限定されない。好適な緩衝液には、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩等が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の不活性フィラーには、当技術上既知で、種々の剤形の製造に有用なものが挙げられる。望ましい場合には、固形製剤は、充填剤および／または造粒剤等などの他の成分を含んでもよい。本発明の薬剤製品は、当技術上既知の手法を使用して、患者に投与後に作用成分の迅速型、徐放型または遅延型放出を提供するように製剤化することができる。
【００３０】
経口投与用の錠剤を製造するためには、本発明の関心対象の組成物を直接打錠方法によって製造することができる。この方法では、作用薬剤成分を、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチンおよびそれらの混合物などの固形の微粉担体並びに例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびポリエチレングリコールワックスなどの減摩剤と混合することができる。次いで、望ましい錠剤サイズを得るのに適当なパンチおよびダイを有する機械を使用して混合物をプレスして錠剤を作製することができる。機械の作動パラメーターは当業者が選択することができる。または、経口投与用錠剤は湿式造粒法によって製造することができる。作用薬剤成分を賦形剤および／または希釈剤と混合することができる。固形物質を望ましい粒子サイズにすりつぶすかまたは篩い分けることができる。薬剤に結合剤を添加することができる。好適な溶媒中で結合剤を懸濁化させ、ホモジナイズすることができる。作用成分および補助薬剤を結合剤溶液と混合することができる。得られた乾燥状態の混合物を溶液で均一に湿潤させる。湿潤化により、典型的には、粒子はわずかに凝集し、望ましいサイズのステンレス鋼篩いを通過させて得られた塊をプレスする。次いで、望ましい粒子サイズおよび硬さを得るのに必要な所定の時間の間、混合物を制御式乾燥装置で乾燥する。乾燥後の混合物の顆粒を篩い分けて粉末を除去する。この混合物に、崩壊剤、減摩剤および／または抗粘着剤を添加することができる。最後に、望ましい錠剤サイズを得るのに適当なパンチおよびダイを有する機械を使用して混合物をプレスして錠剤を作製することができる。機械の作動パラメーターは当業者が選択することができる。
【００３１】
コーティング錠が望ましい場合には、上記のように製造したコアにアラビアゴム、ゼラチン、タルク、酸化チタンを含有してもよい砂糖もしくはセルロース誘導体ポリマーの濃縮溶液または揮発性有機溶媒もしくは溶媒混合物に溶解したラッカーをコーティングしてもよい。異なる作用化合物の錠剤または存在する作用化合物の量が異なる錠剤を識別するために、このコーティングに種々の染料を添加してもよい。特定の実施態様において、作用成分は、腸溶コーティング層を含む１つ以上の層が取り囲むコアに存在してもよい。
【００３２】
カプセルが作用成分および植物油の混合物を含有するソフトゼラチンカプセルを製造することができる。ハードゼラチンカプセルは、作用成分の顆粒を、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体および／またはゼラチンなどの固形微粉担体と組み合わせて含有することができる。
【００３３】
経口投与用の液体製剤は、シロップまたは懸濁液の形態、例えば、作用成分、砂糖並びにエタノール、水、グリセロールおよびプロピレングリコールの混合物を含有する溶液の形態で調製することができる。望ましい場合には、このような液体製剤は、以下の１つ以上：着色剤、矯味矯臭剤およびサッカリンを含んでもよい。カルボキシメチルセルロースなどの増粘剤も使用することができる。
【００３４】
上記の薬剤が非経口投与用に使用される予定の事象では、このような製剤は、本発明の関心対象の組成物を含む滅菌水性注射液、非水性注射液または両者を含むことができる。水性注射液を調製する場合には、関心対象の組成物は水溶性の製薬学的に許容されうる塩として存在してもよい。非経口製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい。水性および非水性滅菌懸濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含んでもよい。製剤は、単位用量または多数回投与容器、例えば、密封式アンプルおよびバイアル内に存在してもよい。即時調合注射液および懸濁液は、以前に記載した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００３５】
関心対象の組成物はまた、それが局所投与に好適となりうるように製剤化することもできる（例えば、皮膚クリーム）。これらの組成物は、当業者に既知の種々の賦形剤を含有してもよい。好適な賦形剤には、セチルエステルワックス、セチルアルコール、白蝋、モノステアリン酸グリセリン、プロピレングリコール、モノステアリン酸塩、ステアリン酸メチル、ベンジルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、鉱物油、水、カルボマー、エチルアルコール、アクリレート接着剤、ポリイソブチレン接着剤およびシリコーン接着剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明を記載したが、本発明は、例示だけの目的のために本明細書に含まれており、本発明を限定する意図のものではないある実施例を参照して例示されている。
【実施例】
【００３７】
［ＮＨＢＥ細胞からのムチンの分泌過多はＰＫＣおよびＰＫＧ両方の活性化に関係する］
ムチン分泌過程におけるＰＫＣおよび／またはＰＫＧの考えられる役割を判定するために、以下の２つの特異的なタンパク質キナーゼアクチベーターにＮＨＢＥ細胞を暴露した：ＰＫＣの活性化のためにはホルボールエステルである、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびＰＫＧの活性化のためには非加水分解性のｃＧＭＰ類似物である８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ。種々の濃度のＰＭＡ刺激に異なる時間の間応答するムチン分泌を調査する予備的な検討（１μＭ以下、２時間）により、ＰＫＣ単独の活性化はＮＨＢＥ細胞からの有意なムチン分泌を誘導しなかったが、１００ｎＭより高いＰＭＡ濃度では中程度の分泌応答が繰り返し観察されたことが示された（０．０５＜ｐ＜０．１）。また、細胞は、５００μＭもの高い濃度のｃＧＭＰ類似物の２時間以下の暴露に応答しなかった。しかし、ＰＫＣおよびＰＫＧの二重活性化に影響するＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの併用は、分泌の迅速な増加を誘発し、１５分以内の暴露でほぼ２倍にする（図１Ａ）。ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって誘導されるこの分泌応答は濃度依存的であり、１００ｎＭのＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰにおいて最大刺激が誘発された（図１Ｂおよび１Ｃ）。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃでは、ＮＨＢＥ細胞は示した試薬または培地単独（ＣＴＬ）に１５分間暴露した。図１Ｄでは、ＮＨＢＥ細胞は、示した阻害剤と共に１５分間事前インキュベーションし、次いで１００μＭのＵＴＰで２時間刺激した。処理に応答して分泌されるムチンを回収し、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝各経過時において６）として示す。＊は、培地の対照から有意に異なることを示し（ｐ＜０．０５）、＃は培地の対照から異なることを示し（０．０５＜ｐ＜０．１）、‡は、ＵＴＰ刺激から有意に異なることを示す（ｐ＜０．０５）。
【００３８】
ＵＴＰは、十分に規定されている病態生理学的に関連のあるムチン分泌促進物質である。Ｌｅｔｈｅｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９，３１５−３２２（１９９３）。本発明は、種々の濃度、好ましくは４０〜１４０μＭのＵＴＰが、２時間の暴露後にＮＨＢＥ細胞からのムチン分泌の有意な増加を誘導することをさらに証明した。ＰＫＣおよびＰＫＧが病態生理学的刺激に応答するムチン分泌の調節に関与するかどうかを判定するために、ＵＴＰ−誘導性ムチン分泌に対するＰＫＣ／ＰＫＧ阻害剤の影響を検討した。ＮＨＢＥ細胞を種々の阻害剤と共に１５分間事前インキュベーションし、次いでＵＴＰ（１００μＭ）プラス阻害剤に２時間暴露した。分泌されたムチンをＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、分泌応答は、ＰＫＣ阻害剤カルフォスチンＣ（５００ｎＭ）、ＰＫＧ阻害剤Ｒp−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（１０μＭ）または可溶性グアニリルシクラーゼ（ＧＣ−Ｓ）阻害剤ＬＹ８３５８３（５０μＭ）によって独立に減弱されたが、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤ＫＴ５７２０（５００ｎＭ）では減弱される可能性がないので（図１Ｄ）、ＵＴＰによって誘発されるムチン分泌にはＰＫＣおよびＰＫＧ両方の活性が必要であることを示した。明らかに、ＮＨＢＥ細胞におけるムチン分泌は、ＰＫＣおよびＰＫＧの両方に関係する信号伝達機序によって調節されうる。
【００３９】
分泌過程へのＰＫＧの関与に対処するために、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰをこれらの検討に使用した。８−Ｂｒ−ｃＧＭＰの主な生理学的影響はＰＫＧを活性化することであるが、いくつかの細胞では、ｃＧＭＰ感受性イオンチャネルのアゴニストとして作用し、高濃度では、ＰＫＡを交差活性化すると言うことも報告されている。ｃＧＭＰ感受性イオンチャネルおよび／またはＰＫＡがＮＨＢＥ細胞によるムチン分泌において何らかの役割を果たす可能性があるという可能性を排除するために、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに類似したｃＧＭＰ感受性イオンチャネルを活性化するが、ＰＫＧ活性を阻害することができる独自のｃＧＭＰ類似物であるＲp−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰを、ムチン放出に対するＰＫＧおよびｃＧＭＰ感受性イオンチャネルの影響を識別するためのアゴニストとして使用した。図、特に図１Ａ（カラム１１）に例示するように、Ｒp−８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、細胞にＰＭＡを添加したとき、ムチン分泌を増強しなかった。同様に、特異的なＰＫＡ阻害剤である、ＫＴ５７２０（５００ｎＭ）は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰのどちらかによって誘導されるムチン分泌を影響しなかった（図１Ｄ、カラム４）。これらの検討は、ｃＧＭＰ感受性イオンチャネルまたはＰＫＡはムチン分泌に関連するという可能性を否定している可能性があり、ＮＨＢＥ細胞におけるＰＫＧの活性は、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰが増強された分泌に寄与する機序であるということを示している。さらに、ＵＴＰ誘導性のムチン分泌過多は可溶性グアニリルシクラーゼ（ＧＣ−Ｓ）阻害剤ＬＹ８３５８３によって減弱されうるので、分化したモルモット気管上皮細胞においてin vitroにおいて以前に例示されているように、ＰＫＧの活性化は一酸化窒素（ＮＯ）→ＧＣ−Ｓ→ｃＧＭＰ→ＰＫＧの信号伝達経路を介して生じる可能性がある。
【００４０】
ムチン分泌過程へのＰＫＣおよびＰＫＧの関与を考えて、本発明は、キナーゼ活性化の下流の信号伝達事象において何らかの役割を果たしている可能性があるこれらの酵素の細胞内基質と思われるものを調査している。数多くの細胞内基質がＰＫＣまたはＰＫＧによってリン酸化され、このような基質の１つであるＭＡＲＣＫＳタンパク質のＰＫＣによるリン酸化は特に興味深いと思われる。ＭＡＲＣＫＳリン酸化は、細胞移動、有糸分裂誘発および神経伝達物質放出などのＰＫＣ信号伝達および細胞骨格の収縮に関係する数多くの細胞過程に関連することが観察されている。動的な分泌過程には、キナーゼの活性化および細胞内顆粒の細胞周辺部への移動が必要であるので、ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化およびムチン顆粒エキソサイトーシスに関連する媒介分子の候補であると思われた。
【００４１】
［ＭＡＲＣＫＳは、ＮＨＢＥ細胞においてＰＫＣ／ＰＫＧ活性化をムチン分泌に関連させるキー分子である］
プロテインキナーゼ活性化の下流の信号伝達機序に対処するために、キナーゼ活性化を顆粒放出に関連させる際に何らかの役割を果たしている可能性があるＰＫＣの特異的な細胞基質であるＭＡＲＣＫＳタンパク質を検討した。第一に、［3Ｈ］ミリスチン酸標識した免疫沈降アッセイによりＮＨＢＥ細胞内のＭＡＲＣＫＳの存在を確認した。図２Ａに例示するように、ＭＡＲＣＫＳはＮＨＢＥ細胞内で発現されており、このタンパク質の大半は未刺激の上体で膜に結合していた。図２Ａでは、細胞を［3Ｈ］ミリスチン酸で終夜標識し、次いで膜（レーン１）および細胞質ゾル（レーン２）分画を分画遠心分離によって単離した。ムチン分泌経路の主要な調節要素としてのＭＡＲＣＫＳの役割は３つの異なる方法で証明することができる。
【００４２】
上記のように、ＮＨＢＥ細胞によるムチン分泌におけるＭＡＲＣＫＳの直接的な関与は、３つの別個の証拠によって証明することができる。第一に、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰによる刺激に応答したムチン分泌は、ＭＡＲＣＫＳのＮ末端領域と同一のアミノ酸配列を有するＭＡＮＳペプチドによって濃度依存的に阻害されたが、同じアミノ酸組成を含有するが、ランダムな順序で配置された対応する対照ペプチド（ＲＮＳ）は分泌に影響しなかった。ＭＡＲＣＫＳのＮ末端ミリストイル化ドメインはＭＡＲＣＫＳ膜結合を媒介することが知られている。図８に示すように、ＭＡＲＣＫＳは、Ｎ末端ドメインにおいて顆粒膜と相互作用し、そのＰＳＤ部位のアクチンフィラメントと結合し、それによって運動およびエキソサイトーシスのための収縮性細胞骨格に顆粒を結合することによって分子リンカーとして機能することができる。図８は、ムチン分泌促進物質が気道上皮細胞（杯状細胞）と相互作用し、２つの別個のプロテインキナーゼ、ＰＫＣおよびＰＫＧを活性化することを図示する可能な機序を示す。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、原形質膜から細胞質へＭＡＲＣＫＳを移動させるが、一酸化窒素（ＮＯ）→ＧＣ−Ｓ→ｃＧＭＰ→ＰＫＧ経路を介して活性化されるＰＫＧは、ＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する細胞質ＰＰ２Ａを活性化する。この脱リン酸化は、顆粒膜へのＭＡＲＣＫＳ結合を安定化させる。また、ＭＡＲＣＫＳはまた、アクチンおよびミオシンと相互作用して、それによって、その後の移動およびエキソサイトーシス放出のための細胞収縮工場に顆粒を結合させる。細胞質内に放出された後のＭＡＲＣＫＳの顆粒への結合は、特異的な標的タンパク質またはＭＡＲＣＫＳのＮ末端ドメインが関与するいくつかの他の形態のタンパク質−タンパク質相互作用によってもガイドされうる。どちらの場合でも、ＭＡＲＣＫＳペプチドまたは少なくとも６つのアミノ酸を含むその活性断片は、ムチン顆粒膜へのＭＡＲＣＫＳの標的化を競合的に阻害し、それによって分泌を遮断する作用をすると思われる。
【００４３】
第二の試験は、ムチン分泌に対するＭＡＲＣＫＳ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害作用を証明した。図３Ａ〜３Ｃに示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮＨＢＥ細胞内のＭＡＲＣＫＳｍＲＮＡおよびタンパク質レベルをダウンレギュレーションし、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化によって誘導されるムチン分泌を実質的に減弱させた。阻害は、ＮＨＢＥ細胞内の高いレベルの内因性ＭＡＲＣＫＳタンパク質およびＭＡＲＣＫＳ  ｍＲＮＡの比較的長い半減期（ｔ1/2＝４〜６ｈ）によると思われるＭＡＮＳペプチドで見られるほど劇的ではなかった。図３Ａ〜３Ｂでは、ＮＨＢＥ細胞をアンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドで３日間処理し、次いでＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）で１５分間刺激した。ムチン分泌はＥＬＩＳＡによって分析した。総ＲＮＡおよびタンパク質が処理した細胞から単離された。ＭＡＲＣＫＳ  ｍＲＮＡはノーザンハイブリダイゼーションによって評価し、タンパク質はウェスタンブロット法で評価した。ＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）では、図３Ａは、添付のチャートの対照と比較した、ＭＡＲＣＫＳ  ｍＲＮＡの〜１５％の低下を示したノーザンブロットであり、図３Ａは、添付のグラフのＭＡＲＣＫＳタンパク質の〜３０％の低下を示したウェスタンブロットであり、図３Ｃはアンチセンスオリゴヌクレオチドによってムチン分泌過多が有意に減弱されたが対照のオリゴヌクレオチドは影響を与えなかったことを示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝各経過時点において６）として示し、†は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激から有意に異なることを示す（ｐ＜０．０５）。さらに、ＣＴＯという用語は対照オリゴヌクレオチドであるが、ＡＳＯという用語はアンチセンスオリゴヌクレオチドであることに注目される。
【００４４】
特定のＲＮＡｓに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、タンパク質としての細胞遺伝子の発現を阻害することができることは証明されている。ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＩｚａｎｔ，遺伝子調節：アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの生物学（Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  Ａｎｄ  ＤＮＡ）、１巻、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２参照。例えば、１つのヌクレオチドによって正常な遺伝子と異なっているｐ２１遺伝子の選択的阻害が報告されている。Ｃｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１，３０：８２８３−８２８６。多数の仮説が、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻害する機序を説明するために提案されているが、関与する特定の機序は検討される細胞種、標的とされるＲＮＡ、標的とされるＲＮＡの特定の部位およびオリゴヌクレオチドの化学的性質に依存することがある。Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：１８１６２−１８１７１、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９８８，４８：２６５９−２６６８。
【００４５】
第三の実験は、ＰＳＤ欠損型突然変異体ＭＡＲＣＫＳによるＨＢＥ１細胞のトランスフェクションにより、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化によって誘導されるムチン分泌が有意に抑制されることを示した。ＰＳＤの欠損は、ＭＡＲＣＫＳがアクチンに結合する能力を無効にすると思われる。図８に示すように、顆粒膜への結合に対して未変性のＭＡＲＣＫＳと競合することによって、アクチンフィラメントと相互作用することができないので、ＰＳＤ切断型ＭＡＲＣＫＳは顆粒放出を阻害すると思われる。野生型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡによるこれらの細胞のトランスフェクションは、ムチン分泌をさらに増強しなかった。ＨＢＥ１細胞における内因性ＭＡＲＣＫＳの発現レベルは極めて高く、ＮＨＢＥ細胞におけるものに匹敵し、野生型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡのトランスフェクションはこれらの細胞における全体的なＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルの顕著な増加を生じないことをウェスタンブロットアッセイは示した。これは、野生型ＭＡＲＣＫＳによるトランスフェクションが分泌をさらに増加しなかった理由およびＰＳＤ欠損型ＭＡＲＣＫＳだけが部分的にムチン分泌を妨害した理由をこれにより説明することができる。
【００４６】
ペプチド遮断検討−ＮＨＢＥ細胞をＭＡＮＳまたはＲＮＳペプチド（１〜１００μM）で１５分間事前インキュベーションし、次いでＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）またはＵＴＰ（１００μM）を添加し、細胞を、それぞれ、さらに１５分間または２時間インキュベーションした。ムチン分泌はＥＬＩＳＡによって分析した。図２Ｂに示すように、ＮＨＢＥ細胞をＭＡＮＳペプチドと共にインキュベーションすると、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化またはＵＴＰ刺激に応答してムチン分泌が濃度依存的に抑制されるが、対照ペプチド（ＲＮＳ）はこれらの同じ濃度では分泌に影響しないことがある。図２Ｂでは、ＭＡＮＳペプチドは、濃度依存的にＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰによって誘導されるムチン分泌過多を遮断する。ＮＨＢＥ細胞を、示したペプチドと共に１５分間事前インキュベーションし、次いでＰＭＡ（１００μM）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）に１５分間またはＵＴＰ（１００μM）に２時間暴露した。ムチン分泌はＥＬＩＳＡによって測定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝各経過時において６）として示し、＊は、培地の対照から有意に異なることを示し（ｐ＜０．０５）、†は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激から有意に異なることを示し（ｐ＜０．０５）、‡は、ＵＴＰ刺激から有意に異なることを示す（ｐ＜０．０５）。ＭＡＮＳおよびＲＮＳペプチドは共に乳酸脱水素酵素または細胞による［3Ｈ］デオキシグルコース取り込みに影響しなかったので、ＭＡＮＳペプチドの影響は、細胞毒性または細胞代謝活性の全体的な抑制に関連しないと思われた。
【００４７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド検討−ムチン分泌経路の主要な信号伝達成分としてのＭＡＲＣＫＳをさらに証明するために、ＭＡＲＣＫＳに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがムチン分泌に与える影響を調査した。図３に例示するように、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＨＢＥ細胞においてｍＲＮＡおよびＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルを共にダウンレギュレーションし、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって誘導されるムチン分泌を有意に減弱したが、対照のオリゴヌクレオチドは影響を与えなかった。
【００４８】
［ＭＡＲＣＫＳは、ＰＫＣおよびＰＫＧ経路のクロストークを媒介する収束性の信号伝達分子として働く］
集合的に、上記の結果は、ＭＡＲＣＫＳはムチン分泌過程に完全に関与することを証明した。次に、本発明者らは、ＰＫＣおよびＰＫＧが集合してムチン分泌を調節することにＭＡＲＣＫＳが主要な調節分子としてどのように作用するかに取り組んだ。図５に例示するように、ＭＡＲＣＫＳはＰＫＣによってリン酸化され、結果として膜から細胞質に移動された。ここでは、ＰＫＧは、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を誘導すると思われた（図５Ａ、レーン４および図５Ｂ）。この脱リン酸化は、ＰＫＧ阻害剤Ｒp−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰによって回復され（図５Ａ、レーン５）、脱リン酸化は特異的にＰＫＧ依存的であることを示した。図５では、ＮＨＢＥ細胞を［32Ｐ］オルトリン酸塩で標識し、次いで示した試薬に暴露した。処理に応答したＭＡＲＣＫＳリン酸化は免疫沈降アッセイによって評価した。図５Ａでは、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰは、ＰＭＡによって誘導されたＭＡＲＣＫＳリン酸化を回復させ、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰのこの作用はＲp−８−Ｂｒ−ＰＥＴ−ｃＧＭＰ（ＰＫＧ阻害剤）またはオカダ酸（ＰＰ１／２Ａ阻害剤）によって遮断されると思われる。図５Ｂでは、ＭＡＲＣＫＳのＰＭＡ誘導性リン酸化は、その後細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに暴露することによって回復された。レーン１、培地単独、８分間、レーン２、１００ｎＭ  ＰＭＡ、３分間、レーン３、１００ｎＭ  ＰＭＡ、３分間次いで１μM８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、５分間、レーン４、１００ｎＭ  ＰＭＡ、８分間、レーン５、培地単独、３分間、次いで１００ｎＭ  ＰＭＡ＋１μM８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ、５分間。図５Ｃでは、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ誘導性のＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化は、濃度依存的にホストリエシンによって減弱された。
【００４９】
ＰＫＧは、プロテインホスファターゼの活性化によってＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化する作用をすると考えられている。図５Ａ（レーン６）に例示するように、ＰＰ１およびＰＰ２Ａの両方を阻害すると思われる濃度である５００ｎＭのオカダ酸は、ＭＡＲＣＫＳのＰＫＧ誘導性脱リン酸化を遮断し、ＰＫＧは、ＰＰ１および／またはＰＰ２Ａを活性化することによって脱リン酸化を生じることを示唆している。ホストリエシンを用いたさらに別の検討およびホスファターゼ活性の直接アッセイは、ＰＰ２ＡだけがＰＫＧによって活性化され、ＭＡＲＣＫＳからのリン酸基の除去を担当することを示した（図５Ｃ）。ＭＡＲＣＫＳのＰＫＧ誘導性脱リン酸化を阻害した濃度のオカダ酸またはホストリエシンが、図６に示すように、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたはＵＴＰによって誘導されるムチン分泌を減弱させたと思われる。図６は、ＰＰ２Ａがムチン分泌経路の本質的な成分であることを証明する助けをする。ＮＨＢＥ細胞は、示した濃度のホストリエシン、オカダ酸（５００ｎＭ）または培地単独と共に１５分間事前インキュベーションし、次いでＰＭＡ（１００ｎＭ）＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）で１５分間またはＵＴＰ（１００μM）で２時間刺激した。分泌されたムチンはＥＬＩＳＡで測定した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝各経過時において６）として示し、＊は、培地の対照から有意に異なることを示し（ｐ＜０．０５）、†は、ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激から有意に異なることを示し（ｐ＜０．０５）、‡は、ＵＴＰ刺激から有意に異なることを示す（ｐ＜０．０５）。従って、ＰＫＧ活性化ＰＰ２ＡによるＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化は、ムチン顆粒のエキソサイトーシスを生じる信号伝達経路の本質的な成分であると思われる。
【００５０】
ＭＡＲＣＫＳがキナーゼの活性化をムチン分泌に関連させる分子的な事象を明らかにするために、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化に応答するＭＡＲＣＫＳのリン酸化を詳細に検討した。図４Ａに例示するように、ＰＭＡ（１００ｎＭ）は、ＮＨＢＥ細胞におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化の有意な増加（３〜４倍）を誘導し、このリン酸化はＰＫＣ阻害剤カルフォスチンＣ（５００ｎＭ）によって減弱された。ＭＡＲＣＫＳは、リン酸化されると、細胞膜から細胞質に移動させられた（図４Ｂ）。さらに詳細には、図４Ａは、ＮＨＢＥ細胞におけるＭＡＲＣＫＳリン酸化のＰＫＣ活性化の結果を示す。細胞を［32Ｐ］オルトリン酸塩で２時間標識し、次いで刺激剤および／または阻害剤に暴露した。処理に応答したＭＡＲＣＫＳリン酸化は、記載するように免疫沈降法によって評価した。レーン１、培地の対照、レーン２、基剤、０．１％Ｍｅ2ＳＯ、レーン３、１００ｎＭ  ４α−ＰＭＡ、レーン４、１００ｎＭ  ＰＭＡ、レーン５、１００ｎＭ  ＰＭＡ＋５００ｎＭ  カルフォスチンＣ、レーン６、５００ｎＭカルフォスチンＣ。図４Ｂは、リン酸化されたＭＡＲＣＫＳは、細胞膜から細胞質へ移動されることを証明している。32Ｐ標識した細胞をＰＭＡ（１００ｎＭ）または培地単独に５分間暴露し、次いで細胞膜および細胞質分画を単離した。ムチン分泌を誘発するのに必要な別のキナーゼ活性化事象である、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１μM）によるＰＫＧの活性化はＭＡＲＣＫＳリン酸化を生じなかったが、実際、反対の影響が観察され、ＰＭＡによって誘導されるＭＡＲＣＫＳリン酸化は８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによって回復された（図５Ａ）。ＰＭＡ誘導性のリン酸化は細胞に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰをその後添加することによって回復させることができたので、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰのこの影響はＰＫＣ活性化の抑制によるのではなかった（図５Ｂ）。従って、ＰＫＧ活性化はＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を生じる可能性がある。
【００５１】
さらに別の検討は、ＰＫＧ誘導性のＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化は、プロテインホスファターゼ（１Ａおよび／または２Ａ（ＰＰ１／２Ａ）阻害剤である５００ｎＭのオカダ酸によって遮断されることを証明した（図５Ａ、レーン６）。従って、脱リン酸化はＰＰ１および／またはＰＰ２Ａによって媒介されると思われた。関与するプロテインホスファターゼのサブタイプを規定するために、ＰＰ２Ａの新規で、さらに特異的な阻害剤であるホストリエシン（ＩＣ50＝３．２ｎＭ）をさらに別のリン酸化検討に使用した。図５Ｃに例示するように、ホストリエシンは濃度依存的に（１〜５００ｎＭ）ＰＫＧ誘導性のＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化を阻害し、ＰＫＧは、ＰＰ２Ａの活性化により脱リン酸化を誘導したことを示唆している。ＮＨＢＥ細胞においてＰＫＧによるＰＰ２Ａのさらなる活性化を確認するために、細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰに暴露後、細胞質ゾルＰＰ１およびＰＰ２Ａ活性を測定した。ＰＰ２Ａ活性は、０．１μM程度の濃度の８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで約３倍増加したが（０．１〜０．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質、ｐ＜０．０１）、ＰＰ１活性は未変化のままであった。このデータは、ＰＰ２ＡはＰＫＧによって活性化され、ＭＡＲＣＫＳの脱リン酸化を担当することを示している。従って、このＰＰ２Ａ活性はムチン分泌が生じるのに重要であると思われ、ＰＫＧ誘導性のＭＡＲＣＫＳ脱リン酸化がオカダ酸またはホストリエシンによって遮断された場合には、ＰＫＣ／ＰＫＧ活性化またはＵＴＰ刺激に対する分泌応答が改善された（図６）。
【００５２】
［ＭＡＲＣＫＳは、細胞質のアクチンおよびミオシンに結合する］
図７は、ＭＡＲＣＫＳが細胞質の２つの他のタンパク質（〜２００ｋＤａおよび〜４０ｋＤａ）に結合することを明らかにする放射性標識免疫沈降アッセイを図示する。図７では、ＮＨＢＥ細胞を［3Ｈ］ロイシンおよび［3Ｈ］プロリンで終夜標識し、膜および細胞質分画を「実験手法」に記載するように調製した。単離した分画は、非免疫性対照抗体（６Ｆ６）で事前に清浄化した。次いで、細胞質ゾルを等しく２つの分画に分割し、サイトカラシン  Ｄ（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）および抗ＭＡＲＣＫＳ抗体２Ｆ１２（レーン１２）および非免疫性対照抗体（６Ｆ６）（レーン３）の存在下においてそれぞれ実施される免疫沈降法に使用した。膜分画のＭＡＲＣＫＳタンパク質も、抗体２Ｆ１２（レーン１）を使用して免疫沈降法によって評価した。沈降したタンパク質複合体は、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、高感度オートラジオグラフィーによって可視化した。ＭＡＲＣＫＳは、それぞれ、分子量〜２００ｋＤａおよび〜４０ｋＤａの２つの細胞質タンパク質と結合すると思われた。これら２つのＭＡＲＣＫＳ結合タンパク質をゲルから切断し、マトリックス支援レーザーイオン化／飛行時間型質量分析計／内部配列決定（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ロックフェラー大学のタンパク質／ＤＮＡ技術センター（ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ニューヨーク）によって分析した。得られたペプチドの質量および配列データを使用して、インターネットプログラムＰｒｏＦｏｕｎｄおよびＭＳ−Ｆｉｔを介してタンパク質データベースを検索した。結果は、それらは、それぞれ、ミオシン（重鎖、非筋肉型Ａ）およびアクチンであることを示している。マトリックス支援レーザーイオン化／飛行時間型質量分析計／内部配列決定（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、これら２つのＭＡＲＣＫＳ結合タンパク質は、それぞれ、ミオシン（重鎖、非筋肉型Ａ）およびアクチンであることを示している。
【００５３】
これらの検討は、気道ムチン顆粒のエキソサイトーシス分泌を制御し、生理学的過程においてＭＡＲＣＫＳの特定の生物学的機能を証明する第一の直接的な証拠であると考えられるものを提供している信号伝達機序の新たなパラダイムを示唆している。ＭＡＲＣＫＳは、ヒト気道上皮細胞においてムチン顆粒放出を調節する主要な媒介分子として働く。気道ムチン分泌の誘発には、ＰＫＣおよびＰＫＧの二重の活性化および相乗作用が必要であると考えられている。活性化されたＰＫＣはＭＡＲＣＫＳをリン酸化して、ＭＡＲＣＫＳを細胞膜の内側から細胞質内に移動させる。次いで、ＰＫＧの活性化は、細胞質のＭＡＲＣＫＳを脱リン酸化するＰＰ２Ａを活性化する。ＭＡＲＣＫＳの膜結合能力はリン酸化状態に依存するので、この脱リン酸化によりＭＡＲＣＫＳは膜結合能力を回復することができ、ＭＡＲＣＫＳを細胞質ムチン顆粒膜に結合させることができる。細胞質においてアクチンおよびミオシンとも相互作用することによって（図７）、ＭＡＲＣＫＳは細胞の収縮装置に顆粒を固定し、細胞周縁部への顆粒の移動およびその後のエキソサイトーシスによる放出を媒介することができる。ＭＡＲＣＫＳが広範に分布していることは、この機序または同様の機序が正常な条件下または異常な条件下の種々の細胞種における膜結合顆粒の分泌を調節することを示唆している。
【００５４】
本発明はまた、任意の細胞分泌過程、特にその刺激経路がプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）基質ＭＡＲＣＫＳタンパク質および膜結合小胞からの内容物の放出に関係する、炎症細胞からの炎症媒介物質を放出するものを遮断する新規方法に関する。具体的には、本発明者らは、ヒト（図９）またはイヌ（図１０）好中球からの炎症媒介物質ミエロペルオキシダーゼの刺激による放出は、ＭＡＮＳペプチドによって濃度依存的に遮断することができることを示した。具体的には、図９は、１００ｎＭのＰＭＡおよび１０μMの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激されてミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌した単離する好中球を示す。１００μMのＭＡＮＳペプチドは、対照のレベルと比較してＭＰＯの低下した（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μMのＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌のわずかな低下を生じる。１０または１００μMの対照ペプチド（ＲＮＳ）は、ＭＰＯ分泌に影響を与えない。図１０では、単離された好中球は、１００ｎＭのＰＭＡおよび１０μMの８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで刺激されて、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を分泌した。１００μMのＭＡＮＳペプチドは、対照のレベルと比較してＭＰＯの分泌を低下した（＊＝ｐ＜０．０５）。１０μMのＭＡＮＳは、ＭＰＯ分泌のわずかな低下を生じる。１０または１００μMの対照ペプチド（ＲＮＳ）はＭＰＯ分泌に影響を与えない。従って、ペプチドは、任意の組織の浸潤性炎症細胞から分泌される炎症の媒介物質の放出を遮断するために治療的に使用することができる。放出されたこれらの媒介物質の多くは、種々の慢性炎症性疾患（すなわち、喘息、慢性気管支炎およびＣＯＰＤなどの呼吸器疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、酒さ、湿疹および重症の座瘡などの皮膚疾患、関節リウマチおよび線維筋痛などの関節炎および疼痛症候群）に観察される広範な組織損傷の原因となっている。本発明は、関節炎、慢性気管支炎、ＣＯＰＤおよび膿胞性線維症などの疾患を治療するのに有用となりうる。本発明は、従って、ヒトおよび動物の疾患、特に、ウマ、イヌ、ネコおよび他の家庭用ペットに罹患する疾患を治療するのに有用である。
【００５５】
図１１〜１５は、ヒトおよびイヌのＭＰＯ分泌を示す。これらの実験の全てにおいて、単離された好中球は、図に示すように刺激を加える前に、１×１０-6Ｍの濃度のＬＰＳで３７℃において１０分間刺激した。ＬＰＳは、細胞が分泌促進物質に応答することができるように細胞を前処理する。
【００５６】
［方法および材料］
ＮＨＢＥ細胞培養――気／液界面におけるＮＨＢＥ細胞の増殖、冷凍保存および培養は以前に記載されているように実施した。  Ｋｒｕｎｋｏｓｋｙら参照。簡単に説明すると、ＮＨＢＥ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を通気式Ｔ７５組織培養フラスコ（５００細胞／ｃｍ2）に播種し、細胞が７５〜８０％集密化するまで培養した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで解離し、継代−２として凍結した。気／液界面培養は、Ｉ型ラット尾コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を薄くコーティングしたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）透明培養容器（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に継代−２細胞（２×１０4細胞／ｃｍ2）を播種することによって開始した。細胞は、ほぼ集密化するまで、加湿した９５％空気、５％ＣＯ2環境下で５〜７日間液内培養した。その時点で、先端の培地を除去し、細胞を底横方向（ｂａｓａｌａｔｅｒａｌｌｙ）に供給することによって気／液界面を作成した。その後培地を毎日交換した。細胞をさらに１４日間培養して十分に分化させた。
【００５７】
ＥＬＩＳＡによるムチン分泌の測定――［ベースライン」および「試験」ムチン試料を採取する前に、リン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７．２で洗浄することによって、細胞の先端表面に蓄積した粘液を除去した。ベースライン分泌の採取は、細胞を培地とだけ培養して、培地の先端部に分泌されたムチンを採取し、保存した。細胞を２４時間安静にし、次いで選択した刺激剤および／または阻害剤（または適当な対照）を含有する培地に暴露し、その後分泌されたムチンを採取し、試験試料として保存した。ベースラインおよび試験のインキュベーション時間は同じであるが、使用する試験試薬に応じて変えた。ベースラインおよび試験分泌は共に、当技術上既知の抗体捕獲を使用したＥＬＩＳＡによって分析した。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），５７０−５７３ページ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８８）参照。このアッセイの一次抗体は、ヒト気道ムチンの炭水化物エピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体である１７Ｑ２（Ｂａｂｃｏ、カリフォルニア州リッチモンド）であった。試験／ベースラインムチンの比は、ムチン分泌を定量化するために使用される「分泌指数」とほぼ同じであり、各培養皿を自身の対照として働かせることができるので、培養ウェル間の変動によって生じる偏差を最小にすることができる。Ｗｒｉｇｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１，Ｌ８５４−Ｌ８６１（１９９６）。ムチン分泌レベルは、培地の対照に対する割合として報告した。
【００５８】
放射性標識免疫沈降アッセイ−−細胞は、［32Ｐ］リン酸塩で標識してから、０．２％ウシ血清アルブミンを含有する無リン酸塩ダルベッコ改良イーグル培地で２時間事前インキュベーションし、次いで０．１ｍＣｉ／ｍｌ［32Ｐ］オルトリン酸塩（９０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２時間標識した。［3Ｈ］ミリスチン酸または3Ｈ−アミノ酸による標識は、５０μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］ミリスチン酸（４９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）または０．２ｍＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］ロイシン（１５９Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および０．４  ｍＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］ｐｒｏｌｉｎｅ  （１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する培地で細胞を終夜インキュベーションした。標識後、細胞を５分間刺激剤に暴露した。阻害剤を使用する場合には、細胞は刺激前に１５分間阻害剤と共に事前インキュベーションした。処理の終了時点において、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ノニデットＰ−４０、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡおよび１０  μｇ／ｍｌのロイペプシンを含有する緩衝液で細胞を溶解した。トリクロロ酢酸沈降およびシンチレーション計測は各培養物中の放射性標識効率を判定することができる。ＭＡＲＣＫＳタンパク質の免疫沈降は、等しいｃｏｕｎｔｓ／ｍｉｎを含有する細胞溶解物を使用して、ＳｐｉｚｚおよびＢｌａｃｋｓｈｅａｒの方法により実施した。Ｓｐｉｚｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５５３−５６２（１９９６）。沈降したタンパク質は、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。抗−ヒトＭＡＲＣＫＳ抗体（２Ｆ１２）および非免疫性対照抗体（６Ｆ６）をこのアッセイに使用した。
【００５９】
異なる細胞下分画においてＭＡＲＣＫＳまたはＭＡＲＣＫＳ結合タンパク質複合体を評価するためには、放射性標識し、処理した細胞をホモジネーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭ  のＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプシン）に削り取り、次いで窒素空洞法（４℃において８００ｐｏｕｎｄｓ／平方インチを２０分間）によって崩壊させた。細胞溶解物は４℃において６００×ｇで１０分間遠心分離して、核および壊れていない細胞を除去した。４℃において４００，０００×ｇで３０分間超遠心分離することによって、除核後の上清を膜および細胞質ゾル分画に分離した。超音波処理によって膜ペレットを細胞溶解緩衝液に溶解した。次いで、免疫沈降法を上記のように実施した。
【００６０】
ＭＡＲＣＫＳ関連ペプチド−−ミリストイル化Ｎ末端配列（ＭＡＮＳ）およびランダムＮ末端配列（ＲＮＳ）ペプチドは共にＧｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンフランシスコ）において合成し、高速液体クロマトグラフィーで精製し（純度＞９５％）、質量分析計で確認し、各々適当な分子量の１つのシングルピークを示した。ＭＡＮＳペプチドは、ＭＡＲＣＫＳの最初の２４のアミノ酸と同一の配列、すなわち、ＭＡＲＣＫＳの膜への挿入を媒介するミリストイル化Ｎ末端領域、ＭＡ−ＧＡＱＦＳＫＴＡＡＫＧＥＡＡＡＥＲＰＧＥＡＡＶＡ（配列番号：１（ここで、ＭＡ＝Ｎ末端ミリステート鎖）からなった。対応する対照ペプチド（ＲＮＳ）は、ＭＡＮＳと同じアミノ酸組成を含有したが、ランダムな順序、ＭＡ−ＧＴＡＰＡＡＥＧＡＧＡＥＶＫＲＡＳＡＥＡＫＱＡＦ（配列番号：２）で配置された。これらの合成ペプチドに疎水性のミリステート部分が存在すると、原形質膜へのそれらの透過性が増加され、ペプチドを細胞に容易に取り込ませやすくする。ムチン分泌に対するこれらのペプチドの影響を判定するためには、分泌促進物質を添加する前に細胞をペプチドと共に１５分間事前インキュベーションし、次いでＥＬＩＳＡによってムチン分泌を測定した。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチド−−ＭＡＲＣＫＳアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその対応する対照のオリゴヌクレオチドをＢｉｏｇｎｏｓｔｉｋ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ゲッチンゲン）で合成した。ＮＨＢＥ細胞を５μＭのアンチセンスまたは対照オリゴヌクレオチドで３日間（最初の２４時間は２μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下において）局部的に（ａｐｉｃａｌｌｙ）処理した。次いで、細胞を分泌促進物質と共にインキュベーションし、ムチン分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。総ＲＮＡおよびタンパク質を処理した細胞から単離した。プローブとしてヒトＭＡＲＣＫＳのｃＤＮＡを使用して従来の手法によりＭＡＲＣＫＳのｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションで評価した。ＭＡＲＣＫＳタンパク質レベルは、一次検出抗体として、精製抗ＭＡＲＣＫＳ  ＩｇＧ１（クローン２Ｆ１２）を使用してウェスタンブロットによって測定した。
【００６２】
一時的なトランスフェクション−−ＭＡＲＣＫＳのリン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）はＰＫＣ依存的リン酸化部位およびアクチンフィラメント結合部位を含有する。ＰＳＤ欠損型ＭＡＲＣＫＳのｃＤＮＡを構築するためには、ＰＳＤ配列（２５のアミノ酸をコードする）に隣接する２つの断片をポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、ポリメラーゼ連鎖反応用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に接続したＸｈｏＩ部位を介してライゲーションした。得られた突然変異体ｃＤＮＡおよび野生型ＭＡＲＣＫＳ  ｃＤＮＡを各々哺乳動物の発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）に挿入した。単離した組換え構築物は、制限消化およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００６３】
ＨＢＥ１は、気／液界面で培養するとき、ムチンを分泌することができるパピローマウイルスで形質転換したヒト気管支上皮細胞系統である。ＨＢＥ１細胞のトランスフェクションは、製造業者の指示によりＥｆｆｅｃｔｅｎｃｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して実施した。簡単に説明すると、気／液界面で増殖した分化したＨＢＥ１細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで解離し、１×１０5細胞／ｃｍ2の量を１２ウェル培養プレートに播種した。終夜インキュベーション後、細胞に野生型ＭＡＲＣＫＳのｃＤＮＡ、ＰＳＤ切断型ＭＡＲＣＫＳのｃＤＮＡまたはベクターＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を４８時間培養して、遺伝子を発現させ、分泌促進物質に暴露し、ムチン分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。トランスフェクションは全て、トランスフェクション効率の変動をモニターするために、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｌａｃＺ  プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＮＡ比６：１、合計１μｇのＤＮＡ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｃｅ試薬に対するＤＮＡの比＝１：２５）の存在下において実施した。結果は、トランスフェクトした細胞から単離した細胞溶解物中のβ−ガラクトシダーゼ活性の有意な差は示さず、異なるＤＮＡ構築物間のトランスフェクション効率はほぼ同じであることを示している（データは示していない）。
【００６４】
プロテインホスファターゼ活性のアッセイ−−ＰＰ１およびＰＰ２Ａ活性は、当技術上既知のプロテインホスファターゼアッセイシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にわずかな改良を加えたものを使用して測定した。Ｈｕａｎｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３９６，２０９−２１５（１９９６）。簡単に説明すると、ＮＨＢＥ細胞を８−Ｂｒ−ｃＧＭＰまたは培地単独で５分間処理した。次いで、細胞を細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌのロイペプシン）に削り取り、４℃において２０秒間超音波で崩壊させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清をホスファターゼ活性のアッセイのために保存した。アッセイは32Ｐ標識ホスホリラーゼＡを基質として使用して実施した。放出された32Ｐをシンチレーションで計測した。各試料のタンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。ＰＰ２Ａ活性は、試料の総ホスファターゼ活性マイナス１ｎＭのオカダ酸の存在下において残存している活性として表した。ＰＰ１活性は、１ｎＭと１μＭのオカダ酸の存在下においてそれぞれ残存している活性の差として表した。プロテインホスファターゼ活性は、総タンパク質１ｍｇあたり１分間に放出されるＰｉのｎｍｏｌとして報告した。
【００６５】
細胞毒性アッセイ−−ＮＨＢＥ細胞を処理する際に使用した全ての試薬は、細胞からの乳酸脱水素酵素の総放出を測定することによって細胞毒性について調査した。アッセイは、製造業者の指示によりＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６キットを使用して実施した。実験は全て、細胞毒性のない濃度の試薬を用いて実施した。
【００６６】
統計分析−−データは、ボンフェローニ補正を用いた一元分散分析を使用して有意さについて分析した。処理間の差はｐ＜０．０５であるとき有意であると考えた。
【００６７】
イヌ血液からのＰＭＮｓの単離−−ＰＭＮの単離に関係するステップは、１０ｍｌのＡＣＤ抗凝固処理した血液を採取するステップを含む。次いで、ＰＭＮ単離培地（ＩＭ）が室温（ＲＩ）であることを確認しながら、３．５ｍｌの単離培地に５ｍｌを積層するステップを含む。次に、血液を、１７００ＲＰＭで５５０×ｇで室温において３０分間遠心分離した。下層の白色のバンドを１５ｍｌの遠心管（ＣＣＦＴ）に移した。次に、１０％ウシ胎仔血清を含有する２ＶのＨＥＳＳ（ＰＢＳ）を添加し、１４００ＲＰＭで４００×ｇで室温において１０分間遠心分離した。次いで、ペレットを、ＰＢＳを含有する５ｍｌの１−１ＥＳＳに懸濁させた。細胞懸濁液を、氷冷した０．８８％のＮＨ4Ｃｌ２０ｍｌを含有するＣＣＦＴ５０ｍｌに添加し、２〜３回転倒混和した。得られた生成物を２０００ＲＰＭで８００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで吸引して、ＦＢＳを含有するＨＢＳＳ５ｍｌに懸濁させた。計数およびサイトスピンによって調製物を調査し、好ましくは全血球では、細胞数は１０9〜１０11細胞の間であり、ＰＭＮｓでは、細胞数は２〜４×１０7細胞でなければならない。一般に、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  「内皮細胞の生物機械的な特性の好中球による変化：ＩＣＡＭ−１および反応性酸素種の役割（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＩＣＡＭ−１  ａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）」、  ６４８７−９４  （２０００）参照。
【００６８】
ＭＰＯ比色酵素アッセイ−−試料は、サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートでＭＰＯ活性をアッセイした。簡単に説明すると、２０マイクロリッターの試料に、３３ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．５６％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１１ｍＭの過酸化水素および０．３６ｍＭのＯ−ジアニシジン二塩酸塩を含有する基質混合物１８０マイクロリッターを個々のマイクロタイターウェル内で混合した。アッセイ混合物の最終濃度は３０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍＭの過酸化水素および０．３２ｍＭのＯ−ジアニシジン二塩酸塩である。混合後、アッセイ混合物を５分間室温においてインキュベーションし、ＭＰＯ酵素活性を５５０ｎｍで分光学的に測定した。試料はデュプリケートでアッセイした。
【００６９】
上記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定すると考慮されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲およびそこに含まれる特許請求の範囲の等価物によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＮＨＢＥ細胞によるムチンの分泌過多がＰＫＣおよびＰＫＧの両方の活性化によって最大にされることを例示する棒グラフである。
【図２】ＭＡＲＣＫＳタンパク質がムチン分泌経路の主要な成分であることを証明する。
【図３】ＭＡＲＣＫＳに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＭＡＲＣＫＳの発現をダウンレギュレーションし、ムチンの分泌過多を弱めることを例示するゲルを図示する。
【図４】ＰＫＣ−依存的リン酸化が、ＭＡＲＣＫＳを原形質膜から細胞質に放出することを例示する。
【図５】ＰＫＧは、ＰＰ２Ａを活性化することによってＭＡＲＣＫＳのリン酸化を誘導することを示す。
【図６】ＰＰ２Ａが、ムチン分泌経路の本質的な成分であることを証明する棒グラフを図示する。
【図７】ＭＡＲＣＫＳが細胞質のアクチンおよびミオシンと関連することを例示するゲルである。
【図８】ヒト気道上皮細胞によりムチン分泌を制御する信号伝達機序を図示する。
【図９】単離したイヌ好中球からのミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の分泌をＭＡＮＳペプチドが遮断することができることを図示する棒グラフである。
【図１０】単離したヒト好中球からのミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の分泌をＭＡＮＳペプチドが遮断することができることを図示する棒グラフである。
【図１１】ＬＰＳ−刺激し、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで同時刺激することによって、ヒト好中球から濃度依存的に増強されるＭＰＯ分泌のわずかな増加をＰＭＡが刺激することを示す棒グラフである。
【図１２】ＰＭＡによる同時刺激が濃度依存的に生じるまで、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激は、ＬＰＳ−刺激したヒト好中球からのＭＰＯ分泌にほとんど影響を与えないことを示す棒グラフである。
【図１３】ＬＰＳ−刺激し、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰで同時刺激することによって、イヌ好中球から濃度依存的に増強されるＭＰＯ分泌のわずかな増加をＰＭＡが刺激することを示す棒グラフである。
【図１４】ＰＭＡによる同時刺激が濃度依存的に生じるまで、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ刺激は、ＬＰＳ−刺激したイヌ好中球からのＭＰＯ分泌にほとんど影響を与えないことを示す棒グラフである。
【図１５】ＰＭＡ＋８−Ｂｒ−ｃＧＭＰによる同時刺激が、ＬＰＳ−刺激したイヌ好中球からの最大ＭＰＯ分泌に必要であることを示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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