(57)【要約】本発明は、対象における神経毒性、特にベータ‐アミロイド誘導神経毒性に関連した障害または病気およびアルツハイマー病、またはそれに伴う症状を処置、予防またはその発現の危険性を低減化するための方法、キット、組合わせおよび組成物に関するものである。本発明化合物は、共通のスピロスタ−５−エン−３−オール構造を含む生物活性２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体である。さらに本発明は、神経学的疾患または障害、例えば全般的および焦点的虚血性および出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導性神経細胞損傷、心停止または胎児仮死により誘発される神経細胞損傷、癲癇、不安、真性糖尿病、多発性硬化症、幻肢痛、カウザルギー、神経痛、帯状疱疹、脊髄病変、痛覚過敏、異痛症、ハンティングトン舞踏病、およびパーキンソン病を有する患者の処置方法であって、患者に２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールまたはその治療活性類似体の治療有効量を投与することによる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする対象における神経変性疾患の処置方法であって、式(Ｉ)：
【化１】
2005526077.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ３に示された置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ１７に示されている置換基である］
で示される化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
化合物が表１に列挙されている化合物から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物が、化合物の治療有効量を含む用量形態である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
用量形態が、錠剤、ゼラチン軟カプセル、ゼラチン硬カプセル、懸濁用錠剤、発泡性錠剤、散剤、発泡性散剤、チュアブル錠剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ゲル、パッチおよび坐剤から成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
用量形態が、さらに医薬上許容される賦形剤を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
医薬上許容される賦形剤が、結合剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、抗付着剤、流動促進剤、または医薬適合性担体を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに、少なくとも１種のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
神経変性疾患が、全般的および焦点的虚血性および出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導性神経細胞損傷、心停止または胎児仮死により誘発される神経細胞損傷、癲癇、不安、真性糖尿病、多発性硬化症、幻肢痛、カウザルギー、神経痛、帯状疱疹、脊髄病変、痛覚過敏、異痛症、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、およびパーキンソン病から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
式(Ｉ)：
【化２】
2005526077.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ３に示された置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ１７に示されている置換基である］
で示される化合物の治療有効量および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
化合物が、表１に列挙された化合物から成る群から選択される、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が、錠剤、ゼラチン軟カプセル、ゼラチン硬カプセル、懸濁用錠剤、発泡性錠剤、散剤、発泡性散剤、チュアブル錠剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ゲル、パッチおよび坐剤から成る群から選択される用量形態である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
医薬上許容される賦形剤が、結合剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、抗付着剤、流動促進剤、または医薬適合性担体を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１４】
さらに少なくとも１種のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含む、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１５】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の同定方法であって、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの構造相同性について既知の化学的化合物のデータベースをスクリーニングし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの相同性の程度に基いてデータベースにおける化合物をランク付けし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの最高の構造相同性を有する化合物をデータベースから抽出し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って抽出された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１６】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、
２個またはそれ以上の個別ビルディングブロックへ２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールをマッピングし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの１個またはそれ以上のブロックを修飾することにより新規化合物を設計し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って設計された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１７】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、
β−アミロイドをマッピングし、
β−アミロイドまたはそのフラグメントの構造を補う化合物をコンピュータースクリーン上で構築し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って構築された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項１８】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１７〜４０から成る、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１５〜４０から成る、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１７〜３８から成る、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１６〜３９から成る、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
生物流体におけるＡβの検出および定量方法であって、
試料流体を入手し、
式(Ｉ)
【化３】
2005526077.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ３に示された置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ１７に示されている置換基である］
で示される標識化合物と流体をインキュベーションし、
インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、
膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そして
膜の内容物を分析する
ことを含む方法。
【請求項２３】
式(Ｉ)の標識化合物と流体とのインキュベーションが、増加濃度の式(Ｉ)の非標識化合物の存在下で行なわれる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
膜の内容物の分析段階が、Ａβの存在を検出するためのホスホイメージングおよび生物流体に存在するＡβの量の定量の少なくとも一つによる膜の内容物の分析を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
対象におけるアルツハイマー病の診断方法であって、
対象の脳から試料流体を入手し、
流体を、式(Ｉ)：
【化４】
2005526077.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ３に示された置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ１７に示されている置換基である］
の標識化合物とインキュベーションし、
インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、
膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そして
膜の内容物を分析する
ことを含む方法。
【請求項２６】
式(Ｉ)の標識化合物と流体とのインキュベーションが、増加濃度の式(Ｉ)の非標識化合物の存在下で行なわれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
膜の内容物の分析段階が、Ａβの存在を検出するためのホスホイメージングおよび生物流体に存在するＡβの量の定量の少なくとも一つによる膜の内容物の分析を含む、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願データ
この出願は、２００２年３月１５日付米国仮特許出願第６０／３６４１４０号および２００３年１月９日付米国仮特許出願第６０／３１９８４６号について優先権を主張しており、両方とも出典明示により援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、β−アミロイドの沈着が細胞毒性を誘導する病気の新規予防または処置方法に関するものである。さらに具体的には、本発明は、スピロステノールを含む医薬組成物、処置を必要とする対象に上記医薬組成物を投与することを含む処置方法、上記組成物の製造方法、病気の処置における上記組成物の使用、上記組成物と他の治療剤との組合わせ、および上記組成物を含むキットに関するものである。
【０００３】
背景
神経細胞死(変性)は、個体に関する潜在的に破壊的で不可逆的な作用を誘発し得、例えば発作の結果として、心臓発作または他の脳または脊髄虚血または外傷を起し得る。さらに、神経細胞死を伴う神経変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮側索硬化症、ダウン症候群およびコルサコフ病がある。
【０００４】
アルツハイマー病(ＡＤ)は、知的機能の進行性喪失を臨床的特徴とする進行性神経変性疾患である。年齢が６５歳を越える集団では約１０％がＡＤに罹患している。年齢７５〜８５歳の個体の１９％が冒されており、８５歳を越える個体では４５％が冒されている。ＡＤは、心臓病、癌および脳卒中に続く、成人死亡原因の４位である。ＡＤは老人性痴呆症の約７５％を占める。この中枢神経系疾患については、様々な症状、例えばニューロンの変性、アミロイド斑の出現、神経原線維変化、アセチルコリンの低下、および大脳皮質の萎縮が注目される。ＡＤ患者の病状としては、短期記憶喪失から始まり、次いで認知機能の低下を経て、最後には自己管理能力の喪失に至る。診断、看護、在宅ケアおよび労働収入の喪失を含め、患者にかかる医療費用は、年間約８００億〜９００億ドルであると見積もられる。
【０００５】
ＡＤに伴う機能の激烈な障害は、新皮質および海馬における神経炎性局面の存在およびコリン作用性ニューロンのシナプス前部マーカーの消失により誘発される。神経炎性局面は変性している軸索および神経末端から成り、多くの場合アミロイドコアを取り囲み、通常は反応性神経膠(グリア)成分を含む。アルツハイマー病特有の別の病理学的特徴は、ニューロン内の塊である神経原線維変化であり、これは、二重らせん状細線維と呼ばれる原線維構造へポリマー化された異常リン酸化タウタンパク質の蓄積に相当する。さらに、神経原線維変化はまた、高リン酸化神経系タンパク質を含有する。
【０００６】
病気の病態生理学的機構の解明については著しく進歩しているが、ＡＤの原因は依然としてあまり判明していない。幾つかの原因が疑われており、例えば遺伝的素因(ＰＳ−１、ＰＳ−２、ＡＰＰ、ａｐｏＥ、ＣＯ１、ＣＯ２遺伝子突然変異)、神経伝達物質欠損(アセチルコリン欠乏)、炎症、代謝低下、フリーラジカル(遊離基)ストレス、または興奮性アミノ酸毒性が挙げられる。
【０００７】
現在、幾つかの化合物は、その病因について現時点で判明している情報に従ったＡＤの処置に関する臨床試験にかけられている。これらの薬剤の中で際立つのはアセチルコリンエステラーゼ(ＡｃｈＥ)阻害剤である。最近、２種のＡｃｈＥ阻害剤、タクリンおよびドネペジルは、ＡＤ処置について規制機関による認可を受けた。タクリンは認知機能の衰退に対して中等度の有益な効果をもたらすが、血清肝酵素の増加を誘発するため不利な影響を被ることになる。
【０００８】
すなわち、新規神経防御剤、特に、例えば卒中、心臓発作または脳もしくは脊髄外傷に伴って起こり得る神経細胞死(変性)の範囲を制限するかまたは別な方法で処置するか、または神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮側索硬化症、ダウン症候群およびコルサコフ病を処置する薬剤を得ることは非常に望ましい。
【０００９】
アルツハイマー病は、細胞外アミロイド斑として、および脳血管壁内アミロイドとして存在する、原線維形態のβ−アミロイドタンパク質またはＡβと呼ばれる３９〜４３アミノ酸ペプチドの蓄積を特徴とする。アルツハイマー病における原線維状Ａβアミロイド沈着は、患者にとって有害であると考えられ、最終的にＡＤの顕著な特徴である、毒性および神経細胞死をまねく。蓄積している証拠から、アミロイドはＡＤ病因の主たる誘発因子であると考えられる。
【００１０】
ヒトの様々な他の病気もまた、アミロイド沈着を示し、通常は全身的器官(すなわち、中枢神経系の外側にある器官または組織)を巻き込み、アミロイド蓄積は器官機能障害または機能不全をまねく。ＡＤおよび「全身的」アミロイド疾患では、現在治療法または有効な処置が無く、患者は通常発病から３〜１０年以内に死亡している。
【００１１】
β−アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質加水分解的開裂による生成されるＡβは、老人班および脳血管アンギオパチーの主要素である。遺伝学、生化学および組織学的試験は、進行性認知障害および記憶欠損を臨床的特徴とする、ＡＤの病因におけるＡβの関与を強く示唆している。Selkoe,D.J(１９９９)Nature ３９９、Ａ２３−３１；Yankner,B.A.(１９９６)Neuron １６、９２１−９３２；Selkoe,D.J.(１９８９)Cell ５８、６１１−６１２；Kalaria,R.N.(１９９６)Pharmacol.Ther. ７２、１９３−２１４。
【００１２】
ＡＤについて多くの業績は得られたが、ＡＤおよび他のアミロイドーシスで起こるアミロイド形成、沈着、蓄積および／または存続を阻止するための治療プログラム用の化合物または薬剤について通常ではほとんど判明していない。
【００１３】
従って、ＡＤおよび他のアミロイドーシスで起こるアミロイド形成、沈着、蓄積および／または存続を阻止または打ち消すための治療プログラムに関する新規化合物または薬剤が要望されている。
【００１４】
従って、Ａβ機能阻害剤としての活性を示す同定された既存化合物、合理的に修飾された化合物および／または新たに設計された化合物に基いて新規治療法を設計することができれば、非常に有益である。
【００１５】
発明の要約
本発明は、対象における神経毒性、特にベータ‐アミロイド誘導神経毒性に関連した障害または病気またはそれに伴う症状を処置、予防またはその発現の危険性を低減化するための方法、キット、組合わせおよび組成物に関するものである。本発明化合物は、共通のスピロスタ−５−エン−３−オール構造を含み、下記に開示されている式(Ｉ)の構造を有する生物活性２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体である。
【００１６】
本発明は、式(Ｉ)の神経毒性阻害性薬剤による処置が指示されている状態または疾患の処置方法であって、処置を必要とする対象への本発明組成物の投与を含む方法に関するものである。さらに具体的には、本発明は、患者におけるＡβ形成または脳β−アミロイド沈着の存続の神経毒性作用を阻止する方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
一局面では、本発明は、記憶、集中力および短期記憶から成るβ−アミロイド形成に伴う精神的または認知の質の群から選択される精神的または認知の質の一つまたはそれ以上を患者において促進、維持または向上させる方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
別の局面では、本発明は、認知または記憶の衰退および精神的衰退から成るβ−アミロイド形成に伴う精神的または認知作用の群から選択されるβ−アミロイド形成に伴う精神的または認知作用の一つまたはそれ以上を患者において低減化する方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
さらに別の局面では、本発明は、患者におけるβ−アミロイド形成または存続に伴う精神状態の処置方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
さらに別の局面では、本発明は、全般的および焦点的虚血性および出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導性神経細胞損傷、心停止または胎児仮死により誘発される神経細胞損傷、癲癇、不安、真性糖尿病、多発性硬化症、幻肢痛、カウザルギー、神経痛、帯状疱疹、脊髄病変、痛覚過敏、異痛症、ＡＤ、ハンティングトン舞踏病、およびパーキンソン病から成る群から選択される神経学的疾患または障害を有する患者の処置方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
さらなる局面では、本発明は、患者の心臓、脾臓、腎臓、副腎皮質または肝臓におけるβ−アミロイド沈着を特徴とする病気の処置方法であって、患者に式(Ｉ)で示される化合物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
さらなる別の局面では、本発明は、β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の同定方法であって、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの構造相同性について既知の化学的化合物のデータベースをスクリーニングし、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの相同性の程度に基いてデータベースにおける化合物をランク付けし、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの最高の構造相同性を有する化合物をデータベースから抽出し、β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って抽出された化合物をランク付けし、そして最高のインビトロ親和力を有する化合物を選択することを含む方法を提供する。
【００２３】
さらに別の局面では、本発明は、β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、２個またはそれ以上の個別ビルディングブロックへ２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールをマッピングし、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの１個またはそれ以上のブロックを修飾することにより新規化合物を設計し、β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って設計された化合物をランク付けし、そして最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択することを含む方法を提供する。
【００２４】
さらなる局面では、本発明は、β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、β−アミロイドをマッピングし、β−アミロイドまたはそのフラグメントの構造を補う化合物をコンピュータースクリーン上で構築し、β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って設計された化合物をランク付けし、そして最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択することを含む方法を提供する。
【００２５】
さらに別の局面では、本発明は、生物流体におけるＡβの検出および定量方法であって、試料流体を入手し、所望により増加濃度の非標識化合物の存在下、式(Ｉ)の標識化合物と流体をインキュベーションし、インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そしてＡβの存在を検出するためのホスホイメージングまたは生物流体に存在するＡβの量の定量により膜の内容物を分析することを含む方法を提供する。
【００２６】
さらに別の局面では、本発明は、対象におけるＡＤの診断方法であって、対象の脳から試料流体を入手し、流体を、所望により増加濃度の非標識化合物の存在下、式(Ｉ)の標識化合物とインキュベーションし、インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そしてＡβの存在を検出するためのホスホイメージングまたは生物流体に存在するＡβの量の定量により膜の内容物を分析することを含む方法を提供する。
【００２７】
従って、本発明の主たる局面は、対象においてベータ−アミロイド誘導神経毒性に関連した疾患または神経変性疾患を処置するための医薬組成物に関するものである。この組成物は、式(Ｉ)で示される化合物の有効量および医薬上許容される担体を含む。また、上記疾患の一つを処置する場合に使用される医薬の製造における式(Ｉ)で示される化合物の使用も本発明の範囲内に含まれる。これらの状態の処置は、本発明化合物または組成物の治療有効量の対象への投与を伴う。
【００２８】
本発明の一つまたはそれ以上の実施態様の詳細は以下に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の記載および請求の範囲から明らかである。
【００２９】
図面の簡単な説明
図面は、若干の本発明化合物、それらの化合物の同定方法および実例となる本発明化合物の活性を立証するインビトロおよびインビボ生物学的試験の結果を説明している。
【００３０】
図１は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および天然に存する誘導体の化学構造の(構造の)幾つかを明らかにしている。
【００３１】
図２は、ＡＤおよび対照脳試料における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールレベルを描くチャートである。
【００３２】
図３Ａは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【００３３】
図３Ｂは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のコレステロールの効果を描く線グラフである。
【００３４】
図３Ｃは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のプレグネノロンの効果を描く線グラフである。
【００３５】
図３Ｄは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の１７α−ヒドロキシプレグネノロンの効果を描く線グラフである。
【００３６】
図３Ｅは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【００３７】
図３Ｆは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【００３８】
図４は、Ａβ１−４２の不存在または存在下で測定された分化したヒトＮＴ２Ｎニューロンの生存能力に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【００３９】
図５Ａは、ラットＰＣ１２神経細胞についてのＡβ１−４２誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【００４０】
図５Ｂは、ラットＰＣ１２神経細胞についてのＡβ２５−３５誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【００４１】
図５Ｃは、ヒトＮＴ２細胞についてのＡβ１−４２誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【００４２】
図５Ｄは、ヒトＮＴ２細胞についてのＡβ２５−３５誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【００４３】
図６Ａは、Ａβ凝集に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描くクーマシーブルーゲルである。
【００４４】
図６Ｂは、Ａβ凝集に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く図６Ａのクーマシーブルー染色ゲルの免疫ブロット分析である。
【００４５】
図７Ａは、ＣＰＢＢＡによりＡβ１−４２−２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合および結合部位を同定する免疫ブロット分析である。
【００４６】
図７Ｂは、図７Ａで示されたブロットにおけるポリクローナルウサギ抗β−アミロイドペプチド抗血清によりＡβ１−４２を同定する免疫ブロット分析である。
【００４７】
図７Ｃは、Ａβにおける２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合部位を同定する免疫ブロット分析である。
【００４８】
図７Ｄは、コンピューターによるＡβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【００４９】
図７Ｅは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【００５０】
図７Ｆは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【００５１】
図７Ｇは、コンピューターによるＡβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【００５２】
図７Ｈは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【００５３】
図７Ｉは、Ａβ１−４２における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合部位の位置を確認するアミノ酸配列である。
【００５４】
図８は、増加濃度のＡβへのＰＣ１２細胞の３日間曝露が用量依存的細胞死をまねいたことを明らかにする棒グラフである。
【００５５】
図９Ａ〜９Ｐは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【００５６】
図１０Ａ〜１０Ｐは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【００５７】
図１１Ａ〜１１Ｐは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【００５８】
図１２Ａは、Ａβ曝露が膜電位評価性ルミネセンスの用量関連減少を誘導することを示す棒グラフである。
【００５９】
図１２Ｂは、０.１μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６０】
図１２Ｃは、１.０μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６１】
図１２Ｄは、１０.０μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６２】
図１３Ａは、Ａβが、０.１、１.０および１０.０μＭのＡβ誘導神経毒性の存在下におけるＰＣ１２細胞によるＡＴＰ生産を用量依存的に減少させたことを示す棒グラフである。
【００６３】
図１３Ｂは、０.１μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６４】
図１３Ｃは、１.０μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６５】
図１３Ｄは、１０.０μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【００６６】
図１４Ａは、Ａβ単独、Ａβ＋ＳＰ２３３  ３０μＭ、およびＡβ＋ＳＰ２３３  ５０μＭの存在下における細胞によるトリパンブルー取込を示す線グラフである。
【００６７】
図１４Ｂは、ラットＰＣ１２神経細胞についての０.１、１.０および１０.０μＭのＡβ誘導神経毒性に対する増加濃度のＳＰ２３３の効果を示す線グラフである。
【００６８】
図１５は、ＭＡ−１０ライディヒ細胞ステロイド形成に対するＳＰ２３３の効果を明らかにする線グラフである。
【００６９】
図１６は、ＣＰＢＢＡによりＡβ−ＳＰ結合および結合部位を同定する棒グラフである。
【００７０】
図１７Ａ〜１７Ｑは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【００７１】
図１８Ａは、Ａβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)およびＳＰ２３３の結合エネルギー頻度を描くコンピュータによるドッキングシミュレーションである。
【００７２】
図１８Ｂは、Ａβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)およびＳＰ２３３結合の確率を描くコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【００７３】
図１９は、神経防御性ＳＰ化合物に存在する基本的スピロステノール構造のコンピューターシミュレーションである。
【００７４】
発明の詳細な記載
本発明は多くの異なる形態で具体化され得、幾つかの実施態様を本明細書では検討しているが、本開示は本発明の原理の典型的な具体例に過ぎないものと見なすべきであり、本発明を説明した実施態様に限定する意図はないものとする。
【００７５】
本明細書で使用されている略語は以下の通りである：５−コレステン−３β,２２Ｒ−ジオール、(２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール)；５−コレステン−３β,２２Ｓ−ジオール、(２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール)；５−コレステン−３β−オール(コレステロール)；５−アンドロステン−３β−オール−１７−オンまたはデヒドロエピアンドロステロン(ＤＨＥＡ)；５−プレグネン−３β,１７α−ジオール−２０−オン(１７α−ヒドロキシプレグネノロン)；５−プレグネン−３β−オール−２０−オン(プレグネノロン)；Ｎｔｅｒａ２／Ｄ１奇形癌細胞(ＮＴ２)；分化ヒトＮＴ２ニューロン(ＮＴ２Ｎ)；β−アミロイドペプチド、(Ａβ)；アルツハイマー病、(ＡＤ)；コレステロール−タンパク質結合ブロット検定法(ＣＰＢＢＡ)。
【００７６】
本発明は、コレステロールからのプレグネノロン形成経路におけるステロイド中間体である、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが、年齢同等対照の場合と比べてＡＤ海馬および前頭皮質組織試料では低いレベルで存在しているという予想外の発見に基いている。上記で検討しているように、アミロイドβ(Ａβ)ペプチドは神経毒性を有することが示されており、脳におけるその存在はＡＤ病因と関連付けられている。
【００７７】
下記で記述しているように、本発明者らは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが、Ａβ−誘導ラット交感神経クロム親和性細胞腫(ＰＣ１２)および分化ヒトＮＴ２Ｎ神経細胞死に対して用量依存的に防御性を示すことを予想外にも発見した。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果は、その鏡像体２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールがＡβ誘導細胞死からニューロンを防御できないことから、立体特異的であることが見出された。上記ラットモデルは、ヒトへの全般的適用可能性を有する。
【００７８】
本発明の一局面は、神経毒性に関連した疾患、特にＡＤの処置方法であって、処置を必要とする対象に式(Ｉ)：
【化１】
2005526077.tif 000002
で示される化合物を投与することを含む方法に関するものである。
【００７９】
式(Ｉ)において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ３に示された置換基であり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、表１および図１に列挙されている化合物のＲ１７に示されている置換基である。ただし、式(Ｉ)に示された炭素原子は、特記しない場合水素で飽和されているものとする。
【００８０】
「アルキル」の語、接頭辞「ａｌｋ」(例えばアルコキシの場合)および接尾辞「−アルキル」(例えばヒドロキシアルキルの場合)は、各々線状(例、ブチル)または分枝状(例、イソブチル)のＣ１−８炭化水素鎖をいう。アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンは、それぞれ２価Ｃ１−８アルキル(例、エチレン)、アルケンおよびアルキン基をいう。
【００８１】
特に定義していない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、本発明が属する業界の通常レベルの者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００８２】
本発明の実践に使用され得る上記式(Ｉ)の幾つかの化合物を下記表１に示す。
表１．２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール先導構造を含む天然化合物の化学名、名称および起源
【表１】
2005526077.tif 000003
【００８３】
他の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体は、構造に基くデータベース検索を通じて識別され得る。２つの方法が適用され得る。一方法は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの構造に基づく。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを幾つかのビルディングブロックに小分割し、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのビルディングブロックの１個またはそれ以上を含む化合物についてデータベースを検索する。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの２２Ｒヒドロキシ官能基が保存されるように、本出願で提示された結果に基づく精密な検索が考案され得る。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと構造類似性を有する化合物を、データベースから抽出し、Ａβへのそれらの結合親和力についてインビトロで試験する。最高の結合親和力を有する化合物をさらなるインビボ試験用に選択する。第二の方法はＡβの構造に基づく。簡単に述べると、(受容体)構造に基く３Ｄデータベース検索法において、標的分子Ａβの３Ｄ構造をＮＭＲ分析により測定し、次いで、何十万もの構造的に多様な合成化合物および天然産物の３Ｄ構造を含む大型化学データベースを、コンピューターによる分子ドッキングを通じて検索することにより、Ａβと有効に相互作用し得る小分子が同定される。
【００８４】
Ａβの鋳型３−Ｄ構造を形成する際には、Ａβのバックボーンの各原子に出発立体配座による位置を割当て、側鎖の原子についての位置を各側鎖に関する最小エネルギーの内部座標に従って割当てる。鋳型の内部エネルギーを最小限にすることにより、かくして得られた鋳型構造を精密化する。Ａβの精密化構造に基き、Ａβのまわりに化合物データベースから化合物を配置させることにより、ホスト−ゲスト複合体が形成される。ホスト−ゲスト複合体の構造は、三次元レファレンシャルでの複合体において各原子が占める位置により特定される。
【００８５】
Ａβの原子と著しく不利な重複を伴うことなく標的結合部位に配置され得る化合物を選択することにより、ジオメトリー‐フィット群を形成させる。ジオメトリー・フィット群における各化合物について、化合物の原子およびＡβの原子間の相互作用を描くエネルギー関数を最小限にすることにより、Ａβの受容体部位への予測される結合親和力を測定する。エネルギー関数の最小限化は、エネルギー関数の最小値に対応するゲスト−ホスト複合体構造が得られるように化合物の位置を変えることにより実施される。結合部位の原子との最も有利なエネルギー相互作用を有する化合物が、所望によるさらなるプロセス用に同定され、例えば、合成Ａβ複合体の表示および視覚検査により最も有望な化合物候補が同定される。
【００８６】
表示された複合体を視覚的に調べることにより、インビトロ試験用の候補化合物の一群を形成させる。例えば、複合体を観察することにより、Ａβの受容体部位への化合物のドッキングの質を視覚的に測定する。視覚的検査により、インビトロ試験用化合物を同定するための有効な基礎が提供される。
【００８７】
推定結合性化合物が同定された後、上記化合物がＡβと特異的に結合する能力をインビトロおよび／またはインビボで確認する。
【００８８】
別の局面では、本発明は、Ａβへの結合を阻止するように合理的に設計された新規化合物を提供する。新規化合物の合理的設計は、Ａβへの結合部位に関する情報に基づいている。Ａβの結合部位への結合において可能な活性を有する化合物構造が考案されるように、Ａβおよび先導化合物の構造を分析する。
【００８９】
先導化合物の構造を設計ブロックに分け、その修正版を、先導化合物およびＡβの結合部位間の相互作用に対する影響について厳密に調べる。次いで、異なる設計ブロックの組合わせを有する化合物を合成し、同定された機構に関するそれらの活性を試験する。上記試験は、上記と同様にしてインビトロおよび／またはインビボで実施される。次いで、上記試験を通じて得られた情報を、合理的薬剤設計の新たなサイクルに組み入れる。所望の特性を有する先導化合物が同定されるまで、設計−合成−試験サイクルを反復する。先導化合物を臨床的に試験する。
【００９０】
本明細書で使用されている「処置する」または「処置」の語は、対象における、神経毒性またはベータ−アミロイド誘導神経毒性に関連した病気または障害に伴う障害または病気の処置をいい、限定する訳ではないが、障害または病気に罹患しやすい素因をもつが、まだ障害または病気に罹患しているとは診断されていない対象において障害または病気の発症を予防すること、障害または病気を阻止、例えば障害または病気の発現を阻止すること、障害または病気を軽減、例えば障害または病気の退縮を誘発すること、または病気または障害により誘発される状態を軽減、例えば病気または障害の症状を停止させることを含む。本明細書で使用されている「神経変性疾患」とは、上記疾患を全て包含するものとする。
【００９１】
対象における、神経毒性またはベータ−アミロイド誘導神経毒性に関連した病気または障害に関する「予防する」または「予防」の語は、何も発病していない場合には病気または障害の発現が無いことを意味し、既に障害または病気が発現している場合には、さらなる障害または病気の発現が無いことを意味する。
【００９２】
効果的な化合物の有効量を医薬上許容される担体と共に処方することにより、神経毒性に関連した病気を処置するために投与される医薬組成物が形成され得る。「有効量」または「薬理学的有効量」とは、処置対象に治療効果を与えるのに必要とされる化合物の量をいう。動物およびヒトに関する用量(体表面積１平方メートル当たりのミリグラム数に基く)の相互関係については、Freireich et al.、Cancer Chemother.Rep.、１９６６、５０、２１９に記載されている。体表面積は患者の身長および体重から概算的に決定され得る。例えば、Scientific Tables、ガイギー・ファーマシューティカルズ、ニューヨーク、１９７０、５３７参照。有効用量はまた、当業者が認識しているところによると、投与経路、賦形剤の使用および所望による他の治療剤との併用投与により変化する。
【００９３】
有効成分の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０(集団の５０％に対する致死用量)およびＥＤ５０(集団の５０％において治療上有効な用量)を測定する標準的医薬手順により測定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物も使用され得るが、非罹患細胞への損傷の可能性を最小限にとどめることにより副作用を低減化するために、罹患組織部位へ上記化合物をターゲッティングする送達系の設計には注意すべきである。
【００９４】
本発明の方法、キット、組合わせおよび医薬組成物には、記載された化合物およびその医薬上許容される塩類の結晶形態(例、多型)、異性体形態および互変異性体も包含される。実例となる医薬上許容される塩類は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン(パモ)酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、ｂ−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸から製造される。
【００９５】
「プロドラッグ」の語は、体内の代謝プロセスによる変換から生じる薬理学的作用を発揮する薬剤または化合物(活性部分)をいう。一般的にプロドラッグは、対象へ投与され、それに続いて吸収されると、何らかのプロセス、例えば代謝プロセスを介して活性またはさらに活性の高い種に変換される薬剤前駆体と考えられている。変換プロセスから生じる他の生成物は身体によって容易に処理される。プロドラッグは、一般的に、これを活性の低いものにし、および／または溶解性または他の何らかの特性を薬剤に付与するプロドラッグに存在する化学基を有する。一旦化学基がプロドラッグから開裂されると、さらに活性の高い薬剤が生成される。プロドラッグは、可逆性薬剤誘導体として設計され、部位特異的組織への薬剤輸送を高めるためのモディファイアーとして使用され得る。現在までのところ、プロドラッグの設計は、水が主溶媒である領域にターゲッティングするために治療化合物の有効な水溶性を高めることであった。例えば、Fedorak et al.、Am.J.Physiol.、２６９：Ｇ２１０−２１８(１９９５)は、デキサメタゾン−ベータ−Ｄ−グルクロニドについて報告している。McLoed et al.、Gastroenterol.、１０６：４０５−４１３(１９９４)は、デキサメタゾン−スクシネート−デキストランについて報告している。Hochhaus et al.、Biomed.Chrom.、６：２８３−２８６(１９９２)は、デキサメタゾン−２１−スルホベンゾエートナトリウムおよびデキサメタゾン−２１−イソニコチネートについて報告している。さらに、J.LarsenおよびH.Bundgaard、Int.J.Pharmaceutics、３７、８７(１９８７)は、可能性のあるプロドラッグ誘導体としてのＮ−アシルスルホンアミドの評価について報告している。J.Larsen et al.、Int.J.Pharmaceutics、４７、１０３(１９８８)は、可能性のあるプロドラッグ誘導体としてのＮ−メチルスルホンアミドの評価について記載している。プロドラッグはまた、例えばSinkula et al.、J.Pharm.Sci.、６４：１８１−２１０(１９７５)にも記載されている。
【００９６】
「誘導体」の語は、一原子、分子または基を別のものと置換することにより類似構造の別の化合物から生成される化合物をいう。例えば、化合物の水素原子をアルキル、アシル、アミノなどにより置換すると、その化合物の誘導体が生成され得る。
【００９７】
「血漿濃度」とは、血漿または血清中の物質の濃度をいう。
【００９８】
「薬剤吸収」または「吸収」とは、全身循環系に向かう、例えば対象の血流中への薬剤の投与部位からの移動プロセスをいう。
【００９９】
「生物学的利用能」とは、活性部分(薬剤または代謝物)が全身循環系へ吸収され、身体における薬剤作用部位で利用可能となる程度をいう。「代謝」とは、身体における薬剤の化学変換のプロセスをいう。
【０１００】
「薬効」とは、作用部位での薬剤濃度に対して観察される生物学的応答を決定する因子をいう。
【０１０１】
「薬物動態」とは、作用部位における薬剤の適切な濃度の達成および維持を決定する因子をいう。
【０１０２】
「血漿半減期」とは、血漿薬剤濃度がその最大濃度から５０％減少するのに要する時間をいう。
【０１０３】
本開示における「約」の語の使用は「だいたい」を意味し、そして実例を示すと、「約」の語の使用は、挙げられた範囲外の用量でも有効かつ安全であり得ることを示しており、上記用量もまた、本発明の請求の範囲内に包含される。
【０１０４】
「測定可能な血清濃度」の語は、投与後に血流中へ吸収された治療剤の血清濃度(典型的には血清１ｍｌ、ｄｌまたはｌ当たりの治療剤のｍｇ、μｇまたはｎｇ数で測定される)をいう。
【０１０５】
「医薬上許容される」の語が本明細書において形容詞的に使用されている場合、修飾された名詞が医薬製品での使用に適切であることを意味する。医薬上許容されるカチオンには、金属イオンまたは有機イオンがある。さらに好ましい金属イオンとしては、限定するわけではないが、適切なアルカリ金属(Ｉａ群)塩類、アルカリ土類金属(IIａ群)塩類および他の生理学的に許容される金属イオンがある。実例としてのイオンには、通常の原子価でのアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛がある。好ましい有機イオンには、一部としてトリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(Ｎ−メチルグルカミン)およびプロカインを含む、プロトン化第３級アミンおよび第４級アンモニウムカチオンがある。医薬上許容される酸の例としては、限定するわけではないが、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸などがある。
【０１０６】
本発明組成物は、通常医薬組成物形態で投与される。これらの組成物は、適切な経路、例えば、限定するわけではないが、経口、経鼻胃、直腸、経皮、非経口(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、骨髄内および皮内注射、または注入技術による投与)、鼻腔内、経粘膜、移植、経膣、局所、口腔内頬部および舌下経路により投与され得る。上記調整物は、常用的に緩衝剤、保存剤、浸透促進剤、適合性担体および他の治療的または非治療的成分を含み得る。
【０１０７】
本発明はまた、医薬上許容される担体または賦形剤と共に本発明組成物を含有する医薬組成物の使用方法を含む。本明細書で使用されている「医薬上許容される担体」または「医薬上許容される賦形剤」の語は、溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを全て包含する。経口摂取物質についての上記媒質および薬剤の使用は、当業界ではよく知られている。慣用的媒質または薬剤が組成物と不適合性である場合以外、その使用が考えられる。また、補足的有効成分も組成物中に組み入れられ得る。本発明組成物を製造するときには、組成物(複数も可)を医薬上許容される賦形剤と混合し、賦形剤により希釈し、またはカプセル、小袋または他の容器の形態であり得る担体内に封入し得る。本発明組成物の製造に使用され得る担体材料は、医薬で常用される賦形剤のいずれかであり、活性薬剤との適合性および所望の用量形態の放出プロフィール特性に基いて選択されるべきである。
【０１０８】
実例を示すと、医薬賦形剤は、例えば以下のものから選択される：
(ａ)結合剤、例えばアラビアゴム、アルギン酸およびその塩類、セルロース誘導体、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、珪酸アルミニウムマグネシウム、ポリエチレングリコール、ガム類、多糖酸、ベントナイト、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポビドン、ポリメタクリレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、澱粉、前ゼラチン化澱粉、エチルセルロース、トラガカント、デキストリン、微晶性セルロース、スクロースまたはグルコースなど。
【０１０９】
(ｂ)崩壊剤、例えば澱粉、前ゼラチン化コーンスターチ、前ゼラチン化澱粉、セルロース、架橋カルボキシメチルセルロース、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、微晶性セルロース、カルシウム、アルギン酸ナトリウム複合体、クレー、アルギネート、ゴム類または澱粉グリコール酸ナトリウム、および錠剤製造で使用される崩壊剤。
【０１１０】
(ｃ)充填剤、例えば乳糖、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、澱粉、前ゼラチン化澱粉、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなど。
【０１１１】
(ｄ)界面活性剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポラキソマー(polaxomer)、胆汁酸塩、グリセリンモノステアレート、プルロニック(登録商標)ライン(ＢＡＳＦ)など。
【０１１２】
(ｅ)可溶化剤、例えばクエン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、グルタル酸、重炭酸ナトリウムおよび炭酸ナトリウムなど。
【０１１３】
(ｆ)安定剤、例えば酸化防止剤、緩衝液または酸なども使用され得る。
【０１１４】
(ｇ)滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、水酸化カルシウム、タルク、ステアリルフマル酸ナトリウム、硬化植物油、ステアリン酸、グリセリンベハペート、ステアリン酸マグネシウム、カルシウムおよびナトリウム、ステアリン酸、タルク、蜜蝋、ステアロウェット(Stearowet)、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＤＬ−ロイシン、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムなど。
【０１１５】
(ｈ)湿潤剤、例えばオレイン酸、グリセリンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、オレイン酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウムなど。
【０１１６】
(ｉ)希釈剤、例えば乳糖、澱粉、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微晶性セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、スクロース基剤の希釈剤、粉糖、一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストレート、イノシトール、加水分解穀物固形物、アミロース、粉末化セルロース、炭酸カルシウム、グリシンまたはベントナイトなど。
【０１１７】
(ｊ)付着防止剤または流動促進剤、例えばタルク、コーンスターチ、ＤＬ−ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウム、カルシウムまたはナトリウムなど。
【０１１８】
(ｋ)医薬適合性担体は、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、珪酸マグネシウム、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラゲーニン、モノグリセリド、ジグリセリドまたは前ゼラチン化澱粉などを含む。
【０１１９】
さらに、薬剤処方物は、例えばRemington's The Science and Practice of Pharmacy(２０００)で検討されている。別の薬剤処方物については、Liberman,H.A.およびLachman,L.編、Pharmaceutical Dosage Forms、マーセル・デッカー、ニューヨーク、ニューヨーク(１９８０)で検討されている。本発明組成物を含む錠剤または顆粒は、コーティングまたは腸溶コーティングされたフィルムであり得る。
【０１２０】
ヒトの処置に有用であることに加えて、本発明はまた、獣医学的動物、爬虫類、鳥類、外来動物および家畜、例えば哺乳類、げっ歯動物などを含む他の対象にも有用である。哺乳類には、霊長類、例えばサル、またはキツネザル、ウマ、イヌ、ブタまたはネコがある。げっ歯動物としては、ラット、マウス、リスまたはモルモットがある。
【０１２１】
本発明医薬組成物は、神経毒性阻害剤の投与が適応される場合に有用である。これらの組成物は、老人性認知障害および／または痴呆(例えば、ＡＤ)の処置において特に有効であることが見出された。
【０１２２】
神経変性疾患の処置については、本発明組成物を用いて、治療応答、例えばＡβ誘導細胞毒性の低減化を誘発するのに十分な用量、例えば約５ｎｇ〜約１０００ｍｇ、または約１００ｎｇ〜約６００ｍｇ、または約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、または約２０ｍｇ〜約４００ｍｇの用量の本発明化合物が提供され得る。典型的には、投薬有効量は、体重１ｋｇ当たり約０.０００１ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１〜１５０ｍｇ／ｋｇ、そして最も好ましくは体重１ｋｇ当たり約５０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。治療効果を誘発するための投与量は、１日当たり１〜約４回用量で、または１日当たり多用量で投与され得る。実例を挙げると、本発明組成物の用量単位は、典型的には例えば約５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、５００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇまたは１０００ｍｇの本発明化合物を含有し得る。用量形態は、特定投薬量の達成に使用される所望の投与頻度に適応するように選択され得る。投与される組成物の単位用量形態の量および病状または疾患を処置するための投薬量摂取法は、対象の年齢、体重、性別および医学的状態、病状または疾患の重篤度、投与経路または頻度を含む様々な因子により異なり、これはよく知られているように広範囲で変動し得る。
【０１２３】
本発明の一実施態様では、組成物は有効量で対象に投与され、すなわち、組成物は、ある一定期間対象血清中で本発明化合物の治療有効用量を達成することにより所望の治療効果を誘発する量で投与される。実例を挙げると、絶食中の成人(一般には少なくとも１０時間絶食)では、組成物は、組成物投与後約５分から対象血清中で本発明化合物の治療有効量を達成するように投与される。本発明の別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約１０分で対象血清中において達成される。本発明の別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約２０分で対象血清において達成される。本発明のさらに別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約３０分で対象血清において達成される。本発明のさらに別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約４０分で対象血清において達成される。本発明の一実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約２０分〜約１２時間で対象血清において達成される。本発明の別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約２０分〜約６時間で対象血清において達成される。本発明のさらに別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約２０分〜約２時間で対象血清において達成される。本発明のさらに別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約４０分〜約２時間で対象血清において達成される。そして本発明のさらに別の実施態様では、本発明化合物の治療有効量は、対象への組成物投与の時点から約４０分〜約１時間で対象血清において達成される。
【０１２４】
本発明の一実施態様では、本発明組成物は、本発明化合物の半最大用量での血清濃度を供するのに適切な用量で投与される。実例として、本発明組成物投与後に約０.０１〜約１０００ｎＭ、または約０.１〜約７５０ｎＭ、または約１〜約５００ｎＭ、または約２０〜約１０００ｎＭ、または約１００〜約５００ｎＭ、または約２００〜約４００ｎＭの血清濃度が対象において達成される。
【０１２５】
本発明組成物によると、投与後約５〜約２４時間の間隔をおいて本発明薬物療法の化合物としての治療効果が提供され、所望ならば１日１回または１日２回投与も可能と考えられる。本発明の一実施態様では、組成物は、対象への組成物投与の約１０、２０、３０または４０分後、対象において少なくとも約１μｇ／ｍｌ、または少なくとも約５μｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、または少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、または少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍｌの本発明化合物の半最大用量での平均血清濃度を与えるのに適切な用量で投与される。
【０１２６】
治療効果を引き出すのに必要な治療剤の量は、例えば血清中への薬剤吸収速度、薬剤の生物学的利用能および疾患処置についての効力に基いて経験的に決定され得る。しかしながら、特定対象についての本発明治療剤の特定用量レベルは、当然、使用される特定化合物の活性、対象の年齢、体重、全般的健康状態、性別および食餌療法(例えば、対象が絶食状態であるか非絶食状態であるかを含む)、投与時間、排出速度、薬剤の組合わせ、および処置されている特定疾患の重篤度および投与形態を含む様々な因子により異なるものとする。一般的に、処置投薬量を滴定することにより一般的に安全性および効力が最適化され得る。典型的には、最初にインビトロおよび／インビボ試験からの用量−効果関係により、対象投与についての適正用量に関する有用なガイダンスが提供され得る。動物モデルでの試験は、一般的に、本発明による胃腸障害または疾患の処置に有効な用量に関するガイダンスについて使用され得る。処置プロトコールについては、投薬用量が、投与される特定薬剤、投与経路、特定対象の状態などを含む幾つかの因子により異なることは容易に理解できるはずである。概して、治療効果を引き出すのに十分な期間インビトロで有効であることが見出された濃度と同程度の血清レベルを達成するのに有効である量の化合物を投与することが望ましい。すなわち、化合物が、例えば２００ｎＭの半最大有効用量でインビトロ活性を示すことが見出される場合、例えば、高いベータ‐アミロイド誘導神経毒性および当業者により適切な尺度として選ばれている他の指標に関連した疾患を処置する、所望の治療効果を引き出すある一定期間２００ｎＭインビボ濃度のほぼ半最大有効用量を提供するのに有効な薬剤の量を投与することが望ましい。これらのパラメーターの決定は当業者であれば十分行えるはずである。これらの考察は当業界では熟知されており、標準教科書に記載されている。
【０１２７】
対象へ送達されるべき本発明化合物の有効量を測定および決定するために、本発明化合物の血清濃度は標準検定技術を用いて測定され得る。
【０１２８】
本発明組成物は、対象への投与後約３０分〜約２４時間の間隔をおいて治療効果をもたらすと考えられる。一実施態様では、組成物は約３０分で上記治療効果を提供する。別の実施態様では、組成物は、約２４時間にわたって治療効果を提供するため、１日１回投与により患者のコンプライアンスを改善することが可能となる。
【０１２９】
本発明方法、キット、および組成物はまた、神経変性疾患を処置または予防するのに指示される別の薬剤、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤(すなわち、ガランタミン、ドネゼピル塩酸塩)と組合わせて使用され得る(すなわち、「組合わせ治療」)。本発明と連係的に、すなわち組合わせ治療で使用するとき、望ましくない副作用の全部ではないにしてもその多くが低減化または排除され得るように付加または相乗効果が達成され得る。これらの薬剤の副作用プロフィールの低減化は、一般に、例えば、投与される組合わせによる治療効果の達成に必要な用量の低減化によるものとされる。
【０１３０】
「組合わせ治療」の語は、対象における神経変性疾患の処置または予防に指示される別の医薬との連係的な本発明組成物の投与を含むもので、神経変性疾患の処置を目的としてこれらの薬剤の相互作用から有益な効果を引き出すことを意図した特定処置プログラムの一部として包含される。組合わせから得られる有益な効果には、限定はされないが、治療剤の組合わせから生じる薬物動態的または薬力学的相互作用がある。これらの治療剤の組合わせ投与は、典型的にはある特定期間(通常、選択された組合わせにより実質的同時、分、時間、日、週、月または年単位で)にわたって実施される。「組合わせ治療」は、付随的および自由裁量によって本発明の組合わせという結果になった個別の単独治療プログラムの一部としてこれら治療剤の２種またはそれ以上の投与を含むわけではない。「組合わせ治療」は、これらの治療剤の逐次方式での投与、すなわち各治療剤を異なる時点で投与する場合、並びにこれらの治療剤、または少なくとも２種の治療剤を実質的に同時に投与する場合を包含するものとする。実質的同時投与は、例えば、各治療剤を一定比で含有する単一錠剤またはカプセル剤または治療剤の各々についての単一カプセル剤または錠剤を多数で対象に投与することにより実施され得る。各治療剤の逐次的または実質的同時投与は、任意の適切な経路により実施され得る。本発明組成物は経口的または鼻腔胃管的に投与され得、組合わせの他方の治療剤は、限定するわけではないが、経口経路、経皮経路、静脈内経路、筋肉内経路または粘膜組織を通す直接吸収を含む、特定薬剤にとって適切な経路により投与され得る。例えば、本発明組成物は経口的または鼻腔胃管的に投与され、組合わせの治療剤は経口的または経皮的に投与され得る。治療剤が投与される順序はあまり厳密なものではない。「組合わせ治療」はまた、他の生物学的有効成分、例えば限定はされないが、鎮痛薬とのさらなる組合わせ、および非薬剤療法、例えば限定はされないが手術との組合わせにおける上記治療剤の投与を包含する。
【０１３１】
組合わせ治療を構成する治療化合物は、組合わされた用量形態または実質的に同時投与が意図された個別用量形態であり得る。組合わせ治療を構成する治療化合物はまた逐次投与され得、いずれかの治療化合物は２段階投与を要する摂取法により投与される。すなわち、摂取法は、別々の有効成分を間隔をあけて投与する治療化合物の逐次投与を必要とし得る。多投与段階間の時間間隔は、各治療化合物の特性、例えば治療化合物の効力、溶解度、生物学的利用能、血漿半減期および速度論プロフィールによって、並びに食物摂取効果および対象の年齢および状態によって、例えば数分〜数時間〜数日の範囲に及び得る。また標的分子濃度の概日変動により最適用量間隔が決定され得る。同時、実質的同時または逐次投与のいずれであろうと組合わせ治療の治療化合物は、例えば、経口経路による一治療化合物の投与および経口経路、経皮経路、静脈内経路、筋肉内経路または粘膜組織を通る直接吸収による別の治療化合物の投与を要する摂取法を必要とし得る。組合わせ治療の治療化合物が、別々または一緒に、経口、噴霧吸入、直腸、局所、口腔内頬側、舌下または非経口(例えば、皮下、筋肉内、静脈内および皮内注射)のいずれで投与されようと、上記の各治療化合物は、医薬上許容される賦形剤、希釈剤または他の処方成分の適切な医薬処方物に含有される。
【０１３２】
経口投与の場合、医薬組成物は、式(Ｉ)の化合物の所望量を含有し、例えば錠剤、硬または軟カプセル剤、ロゼンジ、カシェ剤、トローチ、分散剤(dispensable powder)、顆粒、懸濁液、エリキシル、液体、または経口投与に適合化される他の形態であり得る。実例を示すと、かかる医薬組成物は、予め定められた量の活性化合物を含む個別用量単位、例えば錠剤またはカプセル剤形態で製造され得る。上記経口用量形態は、さらに例えば緩衝剤を含み得る。さらに錠剤、丸薬などは腸溶コーティングにより製造され得る。
【０１３３】
口腔内頬側または舌下投与に適切な医薬組成物には、例えば味の良い基剤、例えばスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に活性化合物を含むロゼンジ、および不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム中に活性化合物を含むトローチ剤がある。
【０１３４】
経口投与用液体用量形態は、当業界で常用される不活性希釈剤、例えば水を含む、医薬上許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含み得る。上記組成物はまた、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、および甘味料、調味料および香料を含み得る。
【０１３５】
適切な液体用量形態の例には、限定はされないが、活性化合物およびベータ‐シクロデキストリンまたはベータ‐シクロデキストリンの水溶性誘導体、例えばスルホブチルエーテル・ベータ‐シクロデキストリン、ヘプタキス−２,６−ジ−Ｏ−メチル−ベータ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、およびジメチル−ベータ−シクロデキストリンを含む水溶液がある。
【０１３６】
本発明医薬組成物はまた注射(静脈内、筋肉内、皮下)により投与され得る。上記注射可能組成物は、適切な担体物質として例えば食塩水、デキストロース、または水を用い得る。組成物のｐＨ値は、必要ならば、適切な酸、塩基または緩衝液により調節され得る。適切な増量、分散、湿潤または懸濁剤、例えばマンニトールおよびポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)もまた組成物に含まれ得る。適切な非経口組成物はまた、注射バイアル中で凍結乾燥させた活性化合物を含み得る。注射前に水溶液を加えることにより組成物が溶解され得る。
【０１３７】
医薬組成物は坐剤等の形態で投与され得る。上記直腸処方物は、好ましくは活性化合物を合計量として例えば約０.０７５〜約７５％ｗ／ｗ、または約０.２〜約４０％ｗ／ｗ、または約０.４〜約１５％ｗ／ｗの割合で含む。担体材料、例えばカカオバター、テオブロマ油および他の油およびポリエチレングリコール坐剤基剤が上記組成物で使用され得る。他の担体材料、例えばコーティング(例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのフィルムコーティング)および崩壊剤(例えば、クロスカルメロースナトリウムおよび架橋ポビドン)もまた所望ならば使用され得る。
【０１３８】
対象化合物は、マイクロカプセル、コロイド状薬剤送達系、例えばリポソーム、マイクロエマルジョンおよびマクロエマルジョン中で遊離しているかまたは包括され得る。
【０１３９】
これらの医薬組成物は、本発明活性化合物および一担体材料または複数担体材料を一つにまとめる段階を含む適切な製薬方法により製造され得る。一般に、組成物は、活性化合物と液体または微細分割固体担体、またはその両方とを均一および緊密混合したもので、次いで必要ならば、製品を形作る。例えば、錠剤は、化合物の粉末または顆粒を、所望により１種またはそれ以上の付属成分と圧縮または成型することにより製造され得る。圧縮錠剤は、適切な機械で化合物の遊離−流動形態、例えば粉末または顆粒を所望により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤および／または界面活性／分散剤(複数も可)と混合して圧縮することにより製造され得る。成型錠剤は、適切な機械において、不活性液体希釈剤で湿らした粉末化合物を成型することにより製造され得る。
【０１４０】
本発明錠剤はまた、慣用的コーティング材料、例えばオパドリー(Opadry、登録商標)ホワイトＹＳ−１−１８０２７Ａ(または別の色)でコーティングされ得、コーティングの重量比率はコーティング錠剤の総重量の約３％であり得る。本発明組成物は、当業界で公知の手順を用いることにより患者への投与後組成物を迅速、持続または遅延放出させるように処方され得る。
【０１４１】
賦形剤が希釈剤としての役割を果たすとき、それは固体、半固体または液体材料であり得、有効成分についての賦形剤、担体または媒質として作用する。すなわち、組成物は、錠剤、チュアブル錠剤、丸薬、散剤、ロゼンジ、小袋、カシェ剤、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル(固体として、または液体媒質中で)、ゼラチン軟または硬カプセル剤および滅菌パッケージ粉末の形態であり得る。
【０１４２】
本発明の一実施態様では、製造工程は、(１)乾燥混合、(２)直接圧縮、(３)粉砕、(４)乾式または非水性造粒、(５)湿式造粒、または(６)融合を含む方法の一つまたは組合わせを使用し得る。Lachman et al.、The Theory and Practice of Industrial Pharmacy(１９８６)。
【０１４３】
本発明の別の実施態様では、固体組成物、例えば錠剤は、本発明治療剤を医薬用賦形剤と混合して、治療剤および賦形剤の均一混合物を含む固体前処方組成物を形成させることにより製造される。均一なものとしてこれらの前処方組成物(複数も可)をいうとき、組成物が容易に均等な有効単位用量形態、例えば錠剤、丸薬およびカプセル剤に小分割され得るように治療剤が組成物全体に均一分散されていることを意味する。次いで、この固体前処方物は、本明細書記載のタイプの単位用量形態に小分割される。
【０１４４】
圧縮錠剤は、有効成分および加工処理をし易くし、製品の特性を改良するように選択された賦形剤を含む処方物を成形することにより製造される固体用量形態である。「圧縮錠剤」の語は、一般的に、単一圧縮または前成形タッピング、次いで最終圧縮により製造される、平たい経口摂取用非コーティング錠剤をいう。
【０１４５】
本発明の錠剤または丸薬は、コーティングされるかまたは他の方法で調合されることにより、長期作用という利点を与える用量形態を提供し得る。例えば、錠剤または丸薬は、内部用量および外部用量成分を含み得、後者は前者全体を覆うエンベロープ形態であり得る。若干のポリマー酸およびポリマー酸とセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースといった材料との混合物を含め、様々な材料が上記腸溶層またはコーティング用に使用され得る。
【０１４６】
長期持続放出移植体の使用は、本発明組成物の逐次投与を必要とする患者における神経変性疾患の処置に適切であり得る。本明細書で使用されている「長期」放出とは、移植体が少なくとも３０日、および好ましくは６０日間治療レベルの有効成分を送達するように構築され、配置されていることを意味する。長期持続放出移植体は、当業者にはよく知られており、上記放出系の幾つかを含む。
【０１４７】
本発明の別の実施態様では、神経変性疾患処置用化合物は、本発明治療化合物の１種またはそれ以上を含むキットまたはパッケージの形態をとる。本発明のこれらの治療化合物は、１時間、１日、１週間または１ヶ月(または他の定期的)用量が適正な逐次または同時投与用に配列されているキットまたはパッケージ形態でパッケージされ得る。さらに本発明は、連続毎日投与用に適合化された、複数の用量単位を含むキットまたはパッケージを提供し、各用量単位は少なくとも１種の本発明治療化合物を含む。この薬剤放出系は、本発明治療化合物の様々な実施態様のいずれかの投与を容易にするのに使用され得る。一実施態様では、系は、毎日または毎週投与される複数の投薬量を含む。キットまたはパッケージはまた、用量形態の適正な投与を容易にするように組合わせ治療で使用される薬剤を含有し得る。キットまたはパッケージはまた、対象用の使用説明書のセットを含む。
【０１４８】
本明細書の記載に基くと、当業者であれば本発明をその最大限まで利用し得ると考えられる。したがって、以下の実施例については、本明細書の残りの部分をいかなる点にせよ限定するのではなく、単に説明的なものとして見なすべきである。
【０１４９】
実施例１
材料
Ａβ１−４２およびＡβペプチドフラグメントは、アメリカン・ペプタイド・カンパニー(サニーベール、カリフォルニア)から購入された。ポリクローナルウサギ抗β−アミロイドペプチド(カタログ番号７１−５８００)は、ザイムド・ラボラトリーズ(サンフランシスコ、カリフォルニア)から入手された。[２２−３Ｈ]Ｒ−ヒドロキシコレステロール(比活性２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ)は、アメリカン・ラジオラベルド・ケミカル(セントルイス、ミズーリ)により合成された。コレステロール、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール、プレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロンおよびＤＨＥＡは、シグマ−アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ)から購入された。細胞培養供給品は、ＧＩＢＣＯ(グランドアイランド、ニューヨーク)から購入され、細胞培養プラスチックウェアは、コーニング(コーニング、ニューヨーク)から購入された。電気泳動試薬および材料は、バイオ‐ラッド(リッチモンド、カリフォルニア)から供給された。使用された他の化学物質は全て分析用グレードであり、様々な市場供給源から入手された。
【０１５０】
組織標本
ヒト組織標本は全て、ハーヴァード・ブレーン・ティッシュー・リソース・センター(ベルモント、マサチューセッツ)から入手された。ステロイド測定用標本は、急速冷凍または液体窒素で(受動？)冷凍されていた。脳海馬および前頭皮質標本は、１９患者、すなわちＡＤ１２人(男性６人および女性６人)および同等年齢対照患者７人(男性４人および女性３人)から入手された。ＡＤ患者は、ハーヴァード・ティッシュー・リソース・センターにより「高度ＡＤ」を有するものとして分類された。全患者の平均年齢は、ＡＤ患者については７４.６±７.２歳および対照については７３.４±１０.５歳であった。平均死後期間は、ＡＤ患者については１０.２時間であり、対照については１４.７時間であった。ヒト組織使用プロトコールは、ジョージタウン・ユニバーシティー・インターナル・レビュー・ボードにより認可された。
【０１５１】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの精製および測定
以前に報告された要領で逆相ＨＰＬＣにより試料を抽出および精製した。Brown,R.C.、Cascio,C. & Papadopoulos,V.(２０００)J.Neurochem.７４：８４７−８５９。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール含有フラクションを集め(２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの保持時間＝５５分)、コレステロールオキシダーゼ検定法を用いて２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのレベルを測定した。Gamble,W.、Vaughan,M.、Kruth,H.S. & Avigan,J.(１９７８)J.Lipid Res.１９、１０６８−１０７０。
【０１５２】
細胞培養、細胞毒性および生存能力検定法
ラットＰＣ１２細胞を以前に報告された要領で培養した。Yao,Z.、Drieu K.およびPapadopoulos,V.(２００１)Brain Res.８８９、１８１−１９０。ヒトＮＴ２前駆体(Ｎｔｅｒａ２／Ｄ１奇形癌)細胞を、ストラタジーン(ラジョラ、カリフォルニア)から入手し、供給者の使用説明書に従って培養した。ＮＴ２前駆体細胞をレチノイン酸で処理した後、分化ヒトＮＴ２ニューロン(ＮＴ２Ｎ)を得た。Andrews,P.W.(１９８４)Dev.Biol.１０３、２８５−２９３。Ａβを培地に溶かし、凝集(４℃で一晩放置)または可溶性(オリゴマー、例えば二量体および四量体含有)形態で使用し、以前に報告された要領で電気泳動により調べた。Yao,A.et al.、Brain Res.(２００１)。ＡβおよびＡβフラグメントについての細胞毒性を、以前に報告された要領(同上)に従って３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)検定法(トレヴィゲン、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いて検定した。以前に報告された要領(同上)でトリパンブルー排除法を用いて、細胞生存能力を測定した。これらの試験について簡単に述べると、細胞を７２時間、増加濃度のＡβの存在または不存在下においてステロイドで処理した。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１５分間室温で０.１％トリパンブルー染色溶液とインキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、０.１ＮのＮａＯＨを細胞に加え、４５０ｎｍのビクター定量的検出分光光度計(ＥＧＧ−ワラック、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いてトリパンブルー染色を定量した。クーマシーブルー染色を５９０ｎｍで検出する、Bradford方法(Bradford,M.M.(１９７６)Anal.Biochem.７２、２４８−２５４)により、細胞タンパク質レベルを同試料中で測定した。
【０１５３】
コレステロール−タンパク質結合ブロット検定法(ＣＰＢＢＡ)
精製Ａβ１−４２タンパク質(５０μＭ)または様々なＡβフラグメント(５０μＭ)および３Ｈ−２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを、３７℃で２４時間、体積２０μｌで単独または増加濃度の非標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下においてインキュベーションした。インキュベーション時間の最後に、試料を１.５％アガロース(Ｉ−Ｂタイプ)ゲル電気泳動により分離し、１０ＸＳＳＣ緩衝液中のニトロセルロース膜(シュライヒェル＆シュエル、キーン、ニューハンプシャー)に移した。膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、サイクロン・ストレージリン光体システム(パッカード、バイオサイエンス、メリディエン、コネティカット)を用いるホスホイメージングにより分析した。ＯｐｔｉＱｕａｎｔソフトウェア(パッカード)を用いて、画像デンシトメーター分析を実施した。この方法により、天然条件下で放射性標識コレステロール(Yao,Z.およびPapadopoulos,V.、手書きで提出)および２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを取込んだＡβ複合体の分離、視覚化および同定が可能となる。電気泳動中に低分子量非取込２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが分離され、排除される。
【０１５４】
Ａβ凝集検定法
細胞培養培地中の精製Ａβ１−４２タンパク質(５０ｍＭ)を、３７℃で２４時間、単独または増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下でインキュベーションした。インキュベーションの最後に、タンパク質を、１２５Ｖの４〜２０％勾配アクリルアミド−ビス−アクリルアミドゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。クーマシーブルー染色によりタンパク質を視覚化した。免疫ブロット分析によりＡβ種を同定した。Yao,Z.et al.、Brain Res.(２００１)。
【０１５５】
免疫ブロット分析
次いで、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール−Ａβペプチド複合体を伴う膜を用いて、Ａβレベルを調べた。５％ミルク中でニトロセルロースをインキュベーションすることにより膜を遮断し、ＥＣＬ試薬(アマシャム‐ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)を用いてＡβの免疫検出用に処理した。Li,H.、Yao,Z.、Degenhardt,B.、Teper,G.＆ Papadopoulos,V.(２００１)Proc.Natl.Acad.Sci.USA９８、１２６７−１２７２。抗Ａβ抗体および二次抗体をそれぞれ０.２μｇ／ｍｌおよび１：５０００希釈率で用いた。
【０１５６】
ペプチドモデリングおよび２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキング
ＣＤおよびＮＭＲ分光法により作製されたデータから得られたＡβ１−４０Ｍｅｔ(Ｏ)(ＭＭＤＢ Ｉｄ：７９９３ＰＤＢ Ｉｄ：１ＢＡ)の分解構造から作製されたＡβ構造を用いて、Ａβ１７−４０およびＡβ２５−３５と２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのコンピュータードッキングを実施した。Watson,A.A.、Fairlie,D.P. および Craik,D.J.(１９９８)Biochemistry ３７、１２７００。Ｍｅｔ(Ｏ)ＳＭＥ３５残基を、隣接バックボーン二面角を保持するＭｅｔにより置き換え、残基１７〜４０についての座標を抽出した。Ａｌｃｈｅｍｙ２０００プログラム(トリポス、セントルイス、ミズーリ)を用いて２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール構造を展開した。モンテカルロシミュレーションアニーリング(Li,H.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(２００１))を用いてドッキングを実施し、Ａｕｔｏｇｒｉｄ／Ａｕｔｏｄｏｃｋの修正版で実行した。Morris,G.M.、Goodsell,D.S.、Halliday,R.S.、Huey,R.、Hart,W.E.、Belew,R.K.およびOlson,A.J.(１９９８)。J.Comput.Chem.１９、１６３９−１６６２。約１０９立体配座の最少エネルギーの立体配座を見積もった。各々標的とリガンドのランダムな初回相対位置および配向から出発し、１００ランから成る５セッションを実行した。各ランは、約２×１０４改良段階を用いる１００アニーリングサイクルにより構成された。修正プログラムを用いた全コンピューター処理時間は、１.７ＧＨｚ、１ＧＢ ＲＡＭ ＰＣを用いると約１５分であった。
【０１５７】
統計
一方向分散分析(ＡＮＯＶＡ)およびＩＮＳＴＡＴ３.００パッケージ(ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア)を用いる片側スチューデントｔ試験により、統計分析を実施した。
【０１５８】
結果
図２に示されているように、ヒト脳における内在性２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールレベルを、ＨＰＬＣ精製後コレステロールオキシダーゼ検定法により測定した。提示されたデータは、１２ＡＤおよび７年齢同等対照標本からのデュプリケイト測定値についての平均±ＳＥＭである。図２は、ＡＤ患者脳標本の海馬における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのレベルが、年齢同等対照と比べて６０％減少(ｐ＝０.０４)していたことを示す。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールレベルはまた、無視できるものではあるが、年齢同等対照と比べてＡＤ患者脳標本の前頭皮質では５０％減少していた。
【０１５９】
ＰＣ１２細胞を、増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(図３Ａ)、コレステロール(図３Ｂ)、プレグネノロン(図３Ｃ)または１７α−ヒドロキシプレグネノロン(図３Ｄ)、ＤＨＥＡ(図３Ｅ)または２２Ｓ−ヒドロキシコレステロール(図３Ｆ)の不存在または存在下において示された濃度のＡβ１−４２により２４時間処理した。示された結果は、平均±ＳＤ(ｎ＝６〜１２)である。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβ誘導細胞毒性からラットＰＣ１２神経細胞を救う能力を、ミトコンドリアジアホラーゼ検定法ＭＴＴを用いて調べた。
【０１６０】
Ａβ１−４２は、それぞれ５.０および５０μＭのＡβの存在下において２６％(ｐ＜０.００１)および４０％(ｐ＜０.００１)細胞死に達する用量依存的神経毒性を誘導した(図３Ａ)。増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールはＰＣ１２細胞生存能力に影響を及ぼさなかったが、１０および１００μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下では無視できる改善が見られた(図３Ａ)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、２５μＭのＡβ−誘導細胞毒性から全細胞を救うことができ(ｐ＜０.００１)、５０μＭのＡβの存在下では細胞の５０％を細胞死から救うことができた(ｐ＜０.０１)。興味深いことに、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、Ａβ徒同時に存在するときのみ有効であった。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールによりＰＣ１２細胞を前処理した後にＡβで処理しても、細胞は全く防御され得なかった(データは示さず)。
【０１６１】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの神経防御効果は、その前駆体コレステロール(図３Ｂ)またはその代謝物プレグネノロン(図３Ｃ)を用いても反復され得なかった。対照的に、コレステロールおよびプレグネノロンは両方とも単独で細胞に毒性を示した。さらに、コレステロールの存在により、低濃度のＡβの毒性効果は強められた。１７α−ヒドロキシプレグネノロン単独でも細胞に毒性を示した(図３Ｄ)。１００μＭのＤＨＥＡは、細胞生存能力に対して正の効果を示した。同濃度のＤＨＥＡは、５μＭのＡβ誘導細胞毒性に対しては防御を示したが(ｐ＜０.００１)、５０μＭに対しては示さなかった(図３Ｅ)。２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールはＡβ誘導神経毒性に対して防御し得なかっただけでなく、１００μＭ濃度では神経毒性を示したことから、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果は立体特異的であった(図３Ｆ)。
【０１６２】
ただし、示された試験においては、凝集したＡβ(４℃で一晩放置)を使用した。別々の実験において、可溶性Ａβ(オリゴマー含有)を直接ＰＣ１２細胞に加えたところ、毒性のあることが見出された(データは示さず)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールはまた、Ａβオリゴマー誘導毒性に対しては防御しなかった(データは示さず)。
【０１６３】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの神経防御効果は、ＰＣ１２細胞に限定されなかったが、分化ヒトＮＴ２Ｎニューロンに対しては反復された(図４)。分化ヒトＮＴ２Ｎニューロンを、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在または不存在下で７２時間２５μＭのＡβ１−４２により処理した。２５μＭのＡβはヒトニューロン生存能力を５０％阻害し(ｐ＜０.００１)、１および１０μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、Ａβ誘導毒性に対してそれぞれ５０％(ｐ＜０.０１)および１００％(ｐ＜０.００１)防御を示した(図４)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがヒトＮＴ２細胞を他の毒性傷害から救うか否かを評価するため、ＮＴ２細胞を、１〜５０μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在または不存在下で３日間５ｍＭのグルタメートにより処理した。グルタメートは、ＭＴＴ検定法を用いて測定されたところ細胞生存能力の３０％減少を誘導し、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在では細胞を防御し得なかった(データは示さず)。
【０１６４】
ＭＴＴ検定法を用いて得られた結果を、トリパンブルー染色排除検定法によりさらに確認した。ＰＣ１２細胞を、１００μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールまたはＤＨＥＡの存在または不存在下で７２時間増加濃度のＡβ１−４２(図５Ａ)またはＡβ２５−３５(図５Ｂ)により処理した。ＮＴ２細胞を、２５μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールまたはＤＨＥＡの存在または不存在下で７２時間増加濃度のＡβ１−４２(図５Ｃ)またはＡβ２５−３５(図５Ｄ)により処理した。材料および方法の項で記載されているように、トリパンブルー検定法を用いて生存能力のレベルを測定した。対照非処理細胞全体に対する全細胞タンパク質についてのトリパンブルー染色細胞比率として結果を表す。示された結果は平均±ＳＤである(ｎ＝６〜１２)。図５Ａおよび５Ｃは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがラットＰＣ１２(図５Ａ)およびヒトＮＴ２(図５Ｃ)細胞の両方をＡβ１−４２誘導細胞死から救うことを示している。対照的に、ＤＨＥＡのみ、ＮＴ２細胞ではなくラットＰＣ１２細胞をＡβ１−４２誘導細胞死から防御した(図５Ａおよび５Ｃ)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとＤＨＥＡは、どちらもＰＣ１２およびＮＴ２細胞をＡβ２５−３５誘導細胞死から救えなかった(図５Ｂおよび５Ｄ)。
【０１６５】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβ凝集を改変する能力についても調べた。細胞培養培地における精製Ａβ１−４２タンパク質(５０μＭ)を、２４時間３７℃で、単独または増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下においてインキュベーションした。インキュベーションの最後に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クーマシーブルーにより視覚化した(図６Ａ)。形成されたＡβ種は、抗Ａβポリクローナル抗血清を用いる免疫ブロッティングにより同定された(図６Ｂ)。Ａβ凝集はゲルの上部で見られるが、対照培地レーンには存在しない。図６Ａおよび６Ｂは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが、クーマシーブルー染色ゲル(図６Ａ)の免疫ブロット分析(図６Ｂ)により同定されたＡβ凝集に影響を及ぼさなかったことを示している。対照培地を含む全試料で使用されたＡβポリクローナル抗血清により認められた１００ｋＤａバンドは、抗血清の非特異的結合を反映していると思われる。
【０１６６】
次いで、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの作用機序を調べた。２２Ｒ−ヒドロキシＡβの存在時のみコレステロールが神経防御性であることを考慮して、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＡβ間の直接相互作用を新規方法、ＣＰＢＢＡ方法で調査した。３７℃で２４時間Ａβ１−４２と一緒に放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを共インキュベーションすることにより、Ａβに特異的な抗体により認識される(図７Ｂ)高分子量放射性標識バンド(図７Ａ)の存在が示された。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールによるＡβ１−４２の放射性標識の特異性は、非標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを用いる競合試験により立証された(図７Ａ)。これらの試験において、放射性標識Ａβ１−４２の画像分析により示されたところによると、５０および２００μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、５０μＭのＡβ１−４２への放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの結合をそれぞれ５０および９０％阻害した(図７Ａ)。インキュベーション反応およびＣＰＢＢＡにおけるＡβ１−４２の均等ローディングを、放射性標識Ａβ１−４２の免疫ブロット分析により評価した(図７Ｂ)。ただし、５０〜２００μＭの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下で観察されたＡβ１−４２の放射性標識の減少にもかかわらず、各レーンに存在するＡβ１−４２の量に差異は無かった。これらのデータは、自然条件下で２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβに結合することを立証している。ＣＰＢＢＡおよび様々なＡβ合成ペプチドを用いて、Ａβにおける２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合部位を、Ａβのアミノ酸１７〜４０にマッピングした(図７Ｃおよび７Ｅ)。興味深いことに、ペプチドＡβ２５−３５は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下でその神経毒性を維持していたが(図７Ｂおよび７Ｄ)、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとは結合しなかった(図７Ｃ)。コンピューターによるドッキングシミュレーションを用いて、これらのデータをさらに確認した。ドッキングの結果は、Ａβ１７−４０が、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがドッキングし得るポケットを形成することを示している(図７Ｄ)。アミノ酸Ｇ２９Ａ３０Ｉ３１により形成されるポケットは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのＣ２７−２９原子を捕獲する。Ｒ対Ｓの配向は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングにとって許容できるものである。Ａβ２５−３５を用いる類似試験は、１９〜３６領域に存在する若干のアミノ酸の存在にもかかわらず、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールに関するＡβ２５−３５のドッキングエネルギー(−６.０５１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ)が、Ａβ１７−４０(−８.６９３９ｋｃａｌ／ｍｏｌ)およびＡβ１−４２(−９.６９６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ)に対して高いことを示していたことから、このステロイドがＣＰＢＢＡデータと一致してＡβ２５−３５には結合しないことを示唆している。
【０１６７】
検討
脳では、ニューロステロイド(プレグネノロンおよびＤＨＥＡ)が、末梢内分泌器官による供給とは独立して蓄積し(Baulieu,E.E. & Robel,P.(１９９０)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.３７、３９５−４０３)、ニューロモジュレーターとして作用し(Paul,M.P. ＆ Purdy,R.H.(１９９２)FASEB J.６、２３１１−２３２２)、様々な神経病理についての薬理学的ツールとしての役割を果たし得る(Costa,E.、Cheney,D.L.、Grayson,D.R.、Korneyev,A.、Longone,P.、Pani,L.、Romeo,E.、Zivkovich,E. & Guidotti,A.(１９９４)Ann.N.Y.Acad.Sci.７４６、２２３−２４２)。グリア細胞は、コレステロールをプレグネノロンに変換し得る。インビトロ試験は、稀突起神経膠細胞、神経膠腫セルラインおよびシュヴァン細胞が、コレステロールの側鎖開裂、すなわちプレグネノロン形成に関与するシトクロムＰ４５０を発現することを示している。Jung‐Testas,I.、Hu,Z.、Baulieu,E.E. & Robel,P.(１９８９)Endocrinology １２５、２０８３−２０９１；Papadopoulos,V.、Guarneri,P.、Krueger,K.E.、Guidotti,A. & Costa,E.(１９９２)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８９、５１１３−５１１７；Akwa,Y.、Schumacher,M.、Jujg-Testas,I. & Baulieu,E.E.(１９９３)C.R.Acad.Sci III(France)３１６、４１０−４１４。Ｐ４５０側鎖開裂酵素はまた、げっ歯動物脳(Stromstedt,M. & Waterman,M.R.(１９９５)Mol.Brain Res.３４、７５−８８)およびＡＤおよび年齢同等対照の両ヒト脳標本にも存在する(Brown,R.C.、Han,J.Cascio,C. & Papadopoulos,V.(２００２)Neurobiol.Aging,投稿中)。この酵素反応中、形成される３種のヒドロキシル化中間体の一つが２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールであることは十分に報告されている。Dixon,R.et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.(１９７０)；Hall,P.F.(１９８５)Vitamins & Hormones ４２、３１５−３６８。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、コレステロールより極性が高く、細胞膜を通って容易に輸送される。本試験では、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのレベルは、ＡＤ患者脳標本では年齢同等対照と比べて低いことが見出された。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのレベルは、学習および記憶といった認知機能にとって重大なものであり、ＡＤの場合に異常が見られる脳の辺縁系における構造である、海馬では顕著に減少していた。Ａβの生理学的機能は、コレステロール輸送を制御することである(Yao,Z. & Papadopoulos,V.、FASEB Journal、１６：１６７７−１６７９)。この発見に基くと、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの減少は、コレステロールの動きを遮断するかまたは細胞によるコレステロール取込を減少させるＡＤ患者脳でのＡβの過剰生産に起因し得るものであり(Roher,A.E.、Lowenson,J.D.、Clark,S.、Wolkow,C.、Wang,R.、Cotter,R.J.、Reardon,I.M.、Zurcher-Neely,H.A.、Heinrikson,R.L.、Ball,M.J. & Greenberg,B.D.(１９９３)J.Biol.Chem.２８６、３０７２−３０８３；Younkin,S.G.(１９９８)J.Physiol.９２、２８９−２９２)、すなわちニューロステロイド形成のための基質コレステロールの利用能が冒された結果、ＡＤ患者脳における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの合成が減少することになる。択一的に、ＡＤ脳標本におけるコレステロールからのプレグネノロンおよびＤＨＥＡの新たな合成の増加はまた、ＡＤにおいて利用可能な中間体２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを消耗させる。ＡＤ海馬における高レベルのプレグネノロンおよびＤＨＥＡの存在(Brown,R.C.、Han,Z.、Cascio,C. & Papadopoulos,V.(２００３)Neurobiology of Aging、２４��５７−６５)は、Ａβにより誘導される(Brown,R.C.、Cascio,C. & Papadopoulos,V.(２０００)J.Neurochem.７４：８４７−８５９)。また、Ａβ誘導によるコレステロール輸送の減少およびコレステロール代謝の増加という両事象が、ＡＤで起こり、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールレベルの減少をまねき得ることは可能である。
【０１６８】
これらの試験については、十分に確立されたラットＰＣ１２神経細胞モデルを使用した。しかしながら、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの神経防御効果はげっ歯動物ニューロンに限られたものではなく、ヒトＮＴ２およびＮＴ２Ｎ神経細胞でも見られた。ＮＴ２細胞は、ヒト奇形癌細胞およびＮＴ２Ｎのクローンラインであり、ＮＴ２細胞から誘導されたＮＴ２Ｎは、中枢神経系のニューロンと一致する細胞表面マーカーを有する有糸分裂後の末端分化ニューロンである。Andrews,P.W.、Dev.Biol.(１９８４)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは、用量依存的にラットおよびヒトニューロンを両方ともＡβ誘導毒性から防御することが見出され、ＰＣ１２およびＮＴ２Ｔ細胞についてのＩＣ５０はそれぞれ１０および３μＭであった。細胞を２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールで処理すると、２５μＭ濃度で使用されたＡβに対しては完全な防御性を呈し、５０μＭで使用された同ペプチドに対しては５０％神経防御性を呈した。
【０１６９】
若干のステロイドを、Ｂ１２ラット神経細胞におけるアミロイド原線維誘導ＭＴＴホルマザンエキソサイトーシス検定法を用いて調べた、Ａβに対するそれらの推定的神経防御特性について試験した。Liu Y. & Schubert,D.(１９９８)J.Neurochem.７１、２３２２−２３２９。これらの試験において、LiuおよびSchubertは、対照細胞については全く影響を及ぼさずに、アミロイド原線維誘導ＭＴＴホルマザンエキソサイトーシスを遮断する化合物が、上流標的で作用しており、すなわち神経防御性であることを示唆した。同上。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果に加え、ブルーホルマザンの形成を測定するＭＴＴ検定法を用いて、コレステロールの代謝に関与する様々なステロイドの神経防御特性を調べた。Ａβ誘導ＰＣ１２神経毒性について試験されたステロイドのうち、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡ以外は全て毒性であった。げっ歯動物ニューロンに対するＤＨＥＡの神経防御効果は、以前の試験結果と一致している。Kimonides,ＶＧ、Khatibi,NH、Svendsen,CN、Sofroniew,MV & Herbert,J(１９９８)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９５、１８５２−１８５７；Cardounel,A、Regelson,W & Kalimi,M(２０００)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、２２２、１４５−１４９。しかしながら、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとは対照的に、ＤＨＥＡはＡβ誘導ヒトＮＴ２細胞死に対しては全く効果を示さず、恐らくこのステロイドはＡβと直接相互作用すると思われるため、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果は種特異的ではないことが示唆される。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの前駆体、コレステロールは神経毒性であることが見出された。しかしながら、炭素２２(Ｒ)でのヒドロキシル基の存在は、コレステロールの毒性作用を軽減するだけでなく、Ａβ誘導神経毒性に対する防御性を呈する。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果の特異性は、その鏡像体２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールが不活性であり、高濃度では神経毒性であるという観察結果によりさらに立証されている。
【０１７０】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＡβ間の直接相互作用は、新規検定法、ＣＰＢＢＡを用いて示された。この検定法により、放射性標識ステロイドおよびＡβまたはＡβペプチドフラグメント間の自然条件下での直接相互作用が試験および視覚化され得る。放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールはＡβと結合し、非標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールは結合ステロイドと置換わる。ＣＰＢＢＡは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβ１−４２およびＡβ１７−４０には結合するがＡβ１−４０とはほとんど相互作用しないことを示した。精製アミロイド斑の質量分析計による分析結果は、Ａβ１−４２がアミロイド沈着の主成分であることを明らかにしたため、Ａβ１−４２は、ＡＤの病因における主たる元凶であると考えられる。Roher,A.E.et al.、J.Biol.Chem.(１９９３)；Younkin,S.G.、J.Physiol.(１９９８)。４０アミノ酸の短いＡβ形態は病理学的作用を全く有しないと考えられ(Brown,R.C.、et al.、J.Neurochem.(２０００))、ＡＤ脳にはそれほど多くは存在しない(Roher,A.E. et al.、J.Biol.Chem.(１９９３)；Younkin,S.G.、J.Physiol.(１９９８))。Ａβの報告された構造に基くコンピューターモデリングシミュレーションは、ヒドロキシル基がＲ配向を有するとき、アミノ酸１９〜３６が２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの側鎖を捕えることを示していた。興味深いことに、毒性作用について知られているペプチドＡβ２５−３５(Schubert,D.、Behl,C.、Lesley,R.、Brack,A.、Dargusch,R.、Sagara,Y. & Kimura H.(１９９５)Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９２、１９８９−１９９３)は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの存在下でさえその神経毒特性を保持していた。コンピューターモデリングシミュレーションおよびＣＰＢＢＡは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびペプチドＡβ２５−３５間の相互作用を示し得なかったことから、アミノ酸１９〜３６に２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの相互作用能力を付与するのは一次アミノ酸配列ではなくＡβ１−４２およびＡβ１７−４０の三次元立体配座であることが示唆される。
【０１７１】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβ１−４２のアミノ酸１７〜４０に結合することにより、げっ歯動物およびヒト神経細胞は両方ともＡβ１−４２誘導細胞毒性および細胞死から防御／救護される。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールがＡβの神経毒性作用を遮断すべく作用する正確な機序については知られていない。しかしながら、本明細書で提示されたデータは、それがＡβ重合に影響を及ぼさないことを示していた。Ａβ１−４２へ２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが結合すると、Ａβモノマーまたはポリマーの立体配座が変えられることにより不活性にされるか、またはＡβが細胞と相互作用するかまたはその毒性作用を伝達する細胞内機構を活性化するのが妨げられ得る。すなわち、ＡＤ脳におけるＡβ１−４２の生産増加に加えて、年齢同等対照と比べてＡＤ患者脳における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールのレベルが低い結果、脳がＡβ１−４２誘導神経毒性と闘う能力を減少／喪失させることになる。これは、最高レベルのＡβ１−４２を有するプレセニリン１異常家族性アルツハイマー病(ＦＡＤ)患者については特に当てはまり得る。Borchelt,D.R.、Thinakaran,G.、Eckman,C.B.、Lee,M.K.、Davenport F.、Ratovitsky,T.、Prada,C-M.、Kim,G.、Seekins,S.、Yager,D.、Slunt,H.H.、Wang,R.、Seeger M.、Levey A.I.、Gandy S.E.、Copeland N.G.、Jenkins N.A.、Price DL、Younkin S.G. & Sisodia S.S.(１９９６)、Neuron １７、１００５−１０１３。
【０１７２】
実施例２
材料
Ａβ１−４２ペプチドは、アメリカン・ペプタイド・カンパニー(サニーベール、カリフォルニア)から購入された。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)は、シグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入された。[２２−３Ｈ]Ｒ−ヒドロキシコレステロール(比活性２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ)は、アメリカン・ラジオラベルド・ケミカル(セントルイス、ミズーリ)により合成された。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体(ＳＰ２２３−２３８)は、インターバイオスクリーン(モスクワ、ロシア国)から購入された。細胞培養供給品は、ＧＩＢＣＯ(グランドアイランド、ニューヨーク)から購入され、細胞培養プラスチックウェアは、コーニング(コーニング、ニューヨーク)およびパッカード・バイオサイエンシーズ・カンパニー(メリデン、コネティカット)から購入された。
【０１７３】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体についてのインシリコスクリーニング
ＩＳＩＳソフトウェア(インフォメーション・システムズ、インコーポレイテッド、サンレアンドロ、カリフォルニア)を用い、天然物質のインターバイオスクリーン・データベースを、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール構造を含む化合物についてスクリーニングした。選択および試験された２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体(ＳＰ２２３−２３８)の構造は図１に示されており、これらの化合物の各々についての名称、化学名および起源は表１に示されている。
【０１７４】
細胞培養および処理
ＡＴＣＣ(マナッサス、ヴァージニア)から得たＰＣ１２細胞(ラットクロム親和性細胞腫ニューロン)を、グルタミンを欠き、１０％胎児牛血清および５％馬血清を補ったＲＰＭＩ１６４０培地中において３７℃および５％ＣＯ２で培養した。Yao Z、Drieu KおよびPapadopoulos V、ギンゴビロバ(Gingko biloba)抽出物ＥＧｂ ７６１は、β−アミロイド誘導拡散性神経毒性リガンドの形成を阻害することによりＰＣ１２ニューロン細胞をβ−アミロイド誘導細胞死から救う、Brain Res ２００１、８８９：１８１−１９０。細胞を９６ウェルプレート(８×１０４細胞／ウェル)に播種した。一晩のインキュベーション期間後、増加濃度の凝集Ａβ(０.１、１および１０μＭ)を、指示濃度の試験すべきＳＰ化合物の存在または不存在下で細胞に加えた。７２時間インキュベーション期間後、様々なパラメーター、細胞生存能力のマーカーを測定した。マウスＭＡ−１０腫瘍ライディヒ細胞を、５％ＣＯ２中、５％加熱不活化胎児牛血清および２.５％馬血清を補ったＤＭＥＭ／ハムＦ１２(ロックビル、メリーランド)培地において３７℃で維持した。細胞を、一晩２.５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにおいて平板培養した。０.２ｍｌ／ウェル血清不含有培地中で２時間示された濃度の様々なＳＰ化合物により細胞に刺激を加えた。培養培地を集め、ラジオイムノアッセイによりプロゲステロン生産について試験した。
【０１７５】
ＭＴＴ細胞毒性検定法
Ａβの細胞毒性を、３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)検定法(トレビゲン、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いて評価した。簡単に述べると、１０μｌのＭＭＴ溶液を１００μｌ培地中の培養細胞に加えた。４時間インキュベーション後、１００μｌのデタージェントを加え、細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。ビクター定量的検出分光光度計(ＥＧＧ−ワラック、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いてホルマザンブルー形成を６００ｎｍおよび６９０ｎｍで定量し、結果を(ＤＯ６００−ＤＯ６９０)として表した。ＭＴＴ検定法はＡβで処理されたニューロン細胞における細胞毒性を評価するのに広く用いられているが、様々なステロイドの存在下で得られた結果は、ＭＴＴホルマザンエキソサイトーシス増加および喪失に至るＡβ依存的小胞リサイクリングを反映し得ることが示唆された。Liu YおよびSchubert D、ステロイドホルモンはアミロイド原線維誘導３−(４,５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(ＭＴＴ)ホルマザンエキソサイトーシスを遮断する：神経毒性との関係、Ｊ Neurochem １９９８、１９：１６３９−１６６２。その理由のため、追加的細胞毒性および細胞生存能力検定法を用いた。
【０１７６】
トリパンブルー細胞生存能力測定
前記トリパンブルー排除方法を用いて細胞生存能力を測定した。Yao Z、Drieu KおよびPapadopoulos V、ギンゴビロバ(Gingko biloba)抽出物ＥＧｂ ７６１は、β−アミロイド誘導拡散性神経毒性リガンドの形成を阻害することによりＰＣ１２ニューロン細胞をβ−アミロイド誘導細胞死から救う、Brain Res ２００１、８８９：１８１−１９０。簡単に述べると、細胞を、増加濃度のＡβの存在または不存在下、７２時間ＳＰ化合物で処理した。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で０.１％トリパンブルー染色溶液と１５分間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、０.１ＮａＯＨを細胞に加え、ビクター定量的検出分光光度計を用いて４５０ｎｍでトリパンブルーを定量した。
【０１７７】
膜電位の測定
また、製造業者の推奨に従ってルミネセンスに基づくキットＣｙｔｏＬｉｔｅ(登録商標)(パッカード・バイオサイエンス・カンパニー)を用いて細胞生存能力を評価した。簡単に述べると、細胞を９６ウェルプレートにおいて培養および処理し、７２時間のインキュベーション期間後、２５μｌのアクチベーター溶液、次いで１５０μｌのアンプリファイアー溶液を細胞に加えた。５分のプレカウント遅延後トップカウントＮＸＴ(登録商標)計数管(パッカード・バイオサイエンシーズ・カンパニー)でルミネセンスを測定した。
【０１７８】
細胞ＡＴＰレベルの測定
ＡＴＰＬｉｔｅ−Ｍ(登録商標)ルミネセンス検定法(パッカード・バイオサイエンシーズ・カンパニー)を用いて、細胞ＡＴＰ濃度を測定した。この検定のために、細胞を黒色９６ウェルのビュープレート(登録商標)で培養し、製造業者の勧告に従ってＡＴＰ濃度をトップカウントＮＸＴ(登録商標)計数管(パッカード・バイオサイエンシーズ・カンパニー)で測定した。
【０１７９】
ラジオイムノアッセイ
ＭＡ−１０細胞によるプロゲステロン生産を、製造業者が勧める条件に従って、抗プロゲステロン抗血清(ＩＣＮ、コスタメサ、カリフォルニア)を用いるラジオイムノアッセイにより測定した。プロゲステロン生産を各ウェルにおけるタンパク質の量により正規化した。ＭｕｌｔｉＣａｌｃソフトウェア(ＥＧ＆Ｇワラック、ガイザーズバーグ、メリーランド)を用いてラジオイムノアッセイデータを解析した。
【０１８０】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール−タンパク質結合ブロット検定法(ＣＰＢＢＡ)
精製Ａβ(５０μＭ)および３Ｈ−２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを、３７℃で８または２４時間、２０μｌ容量で単独または１００μＭの非標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ−２２２)または様々な２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体の存在下においてインキュベーションした。インキュベーション時間の最後に、試料を自然条件下１.５％アガロース(Ｉ−Ｂ型)ゲル電気泳動により分離し、１０ＸＳＳＣ緩衝液中のニトロセルロース膜(シュライヒェル＆シュエル、キーン、ニューハンプシャー)に移した。膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、サイクロン・ストレージリン光体システム(パッカード・バイオサイエンシーズ)を用いるホスホイメージングにより分析した。ＯｐｔｉＱｕａｎｔソフトウェア(パッカード・バイオサイエンス)を用いて画像デンシトメーター分析を実施した。この方法は、放射性標識コレステロール(Yao ZおよびPapadopoulos V、コレステロール輸送におけるβ−アミロイドの機能：神経毒性へのリード、FASEB J ２００２、１６：１６７７−１６７９)、および２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(Yao Z.X.et al.、J Neurochem ２００２、８３：１１１０−１１１９)、または２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体が自然条件下で取込まれたＡβ複合体の分離、視覚化および同定を可能にする。低分子量非取込２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよび誘導体が電気泳動中に分離および排除される。
【０１８１】
ペプチドモデリングおよびドッキングシミュレーション
ＣＤおよびＮＭＲ分光法により作製されたデータから得られたＡβ１−４０Ｍｅｔ(Ｏ)(ＭＭＤＢ Ｉｄ：７９９３ＰＤＢ Ｉｄ：１ＢＡ)の分解構造により開始されＡβ構造を用いて、Ａβ１−４２と２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよび１６のその誘導体のコンピュータードッキングを実施した。Watson,A.A.、Fairlie,D.P. および Craik,D.J.、メチオニン酸化アミロイドベータ−ペプチド(１−４０)の分解構造。酸化は配座スイッチングに影響を及ぼすか？、Biochem.１９９８、３７、１２７００−１２７０６。Ｍｅｔ(Ｏ)ＳＭＥ３５残基を、隣接バックボーン二面角を保持するＭｅｔにより置き換え、Ｉ４１およびＡ４２残基を追加した。次いで、Ａｌｃｈｅｍｙ２０００プログラム(トリポス、セントルイス、ミズーリ)を用いて構造のエネルギーを最小限にした。また、Ａｌｃｈｅｍｙ２０００を用いて、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体構造を作製した。前記モンテカルロシミュレーションアニーリングを用いて分子ドッキングを実施した。Li,H.、Yao Z.、Degenhardt B.、Teper G.およびPapadopoulos V.、末梢型ベンゾジアゼピン受容体のコレステロール認識／相互作用アミノ酸共通配列(ＣＲＡＣ)でのコレステロール結合およびＨＩＶ ＴＡＴ−ＣＲＡＣペプチドによるステロイド生成の阻害、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ２００１、９８：１２６７−１２７２、Ａｕｔｏｇｒｉｄ／Ａｕｔｏｄｏｃｋの修正版で実行。Morris,G.M.、Goodsell,D.S.、Halliday,R.S.、Huey,R.、Hart,W.E.、Belew,R.K.およびOlson,A.J.、タンパク質への可撓性リガンドの分散型自動ドッキング：ＡｕｔｏＤｏｃｋ２.４の並行適用、J.Comput.Chem.１９９８、１９：１６３９−１６６２。化合物／Ａβ対の各々については、約１０ ８配座の最少エネルギーの配座を評価し、選択された最少エネルギーのものを得た。各々標的に関するリガンドのランダムな初回相対位置および配向から出発し、１００ランから成る３セッションを実行した。各ランは、約２×１０４改良段階を用いる１００アニーリングサイクルにより構成された。各リガンド／標的対についての平均コンピューター処理時間は、１.７ＧＨｚ、１ＧＢ ＲＡＭ ＰＣを用いると約２.５時間であった。
【０１８２】
統計分析
一方向分散分析(ＡＮＯＶＡ)およびＩＮＳＴＡＴ３.００(ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア)を用いる片側スチューデントｔ試験により、統計分析を実施した。
【０１８３】
結果
ＰＣ１２細胞を増加濃度のＡβに３日間曝露すると、用量依存的細胞死(図８)がもたらされ、細胞の５０％の最大に達しており、我々の以前のデータを一致していた。Yao Z.X.et al.、J Neurochem ２００２、８３：１１１０−１１１９、およびYao Z.、Drieu K.およびPapadopoulos V.、ギンゴビロバ(Gingko biloba)抽出物ＥＧｂ ７６１は、β−アミロイド誘導拡散性神経毒性リガンドの形成を阻害することによりＰＣ１２ニューロン細胞をβ−アミロイド誘導細胞死から救う、Brain Res ２００１、８８９：１８１−１９０。ＡＤ脳に存在するＡβの濃度に近い状態にするため、０.１〜１０μＭ濃度のＡβを使用した。神経防御特性について試験された化合物を、３０および５０μＭ濃度で調べた(図９〜１５)。
【０１８４】
図９〜１１は、ＭＴＴ検定法、ＮＡＤＰＨジアホラーゼ活性の測定を用いて測定されたＡβ誘導神経毒性に対する先導化合物２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール構造を含む化合物(ＳＰ２２３〜２３８)の効果を示す。図９〜１１は、ＮＡＤＰＨジアホラーゼ活性の阻害パーセンテージとして表された、それぞれ０.１、１.０および１０.０μＭのＡβ誘導神経毒性に対するこれらの化合物の効果を示す。１００％阻害レベルは、単独投与されたＡβにより誘導されるブルーホルマザン形成の減少に対応する。
【０１８５】
ＳＰ２２２は、Ａβ０.１μＭおよび１μＭに対してＰＣ１２細胞を防御するが、１０μＭで与えられたＡβに対する神経防御性は限られていた。ただし、大きな変異性は、使用された細胞の継代により、高濃度のＡβに対するＳＰ−２２２の効果について観察されたものとする。ＳＰ２２８、ＳＰ２２９、ＳＰ２３３、ＳＰ２３５、ＳＰ２３６、ＳＰ２３７およびＳＰ２３８は、Ａβ０.１μＭに対する神経防御活性を示したが、ＳＰ２３３、ＳＰ２３５、ＳＰ２３６およびＳＰ２３８のみ、ＳＰ２２２よりも著しく強い効果を発揮した(図９Ａ−９Ｐ)。ＳＰ２３３、ＳＰ２３６およびＳＰ２３８は、１μＭのＡβ誘導毒性に対する神経防御特性を維持していたが(図１０Ａ−１０Ｐ)、ＳＰ２３３およびＳＰ２３８のみ１０μＭのＡβの存在下でこの特性を保持していた(図１１Ａ−１１Ｐ)。
【０１８６】
ＳＰ２２２、ＳＰ２３３、ＳＰ２３５、ＳＰ２３６およびＳＰ２３８についての膜電位評価サイトライト(Cytolite)検定法を用いて、ＭＭＴ検定で得られた結果を確認した。図１２Ａは、Ａβ曝露が膜電位評価ルミネセンスの用量関連減少を誘導することを示している。ＳＰ２２２は０.１μＭのＡβに対して防御したが(図１２)、２つの最高濃度のＡβに対しては防御し得なかった(図１２Ｃおよび１２Ｄ)。使用された様々なＳＰ化合物は、測定されたルミネセンスの増加により示されたところによると、ＳＰ２２２と比べて著しく優れた神経防御効果を示した。ＭＴＴ検定法を用いて見られた(図１１)１０μＭのＡβに対するＳＰ２３３およびＳＰ２３８の神経防御効果は、同条件下でのシグナルの発生により反復された(図１２Ｄ)。
【０１８７】
ＡＴＰレベル、ミトコンドリア機能の指数を、ＳＰ２２２−ＳＰ２３８化合物の存在または不存在下、増加濃度のＡβで処理したＰＣ１２細胞において測定した(図１３Ａ−１３Ｄ)。Ａβは、ＰＣ１２細胞によるＡＴＰ生産を用量依存的に減少させた。ＡＴＰレベルの１８％、２２％および２５％減少は、それぞれ０.１、１.０および１０μＭのＡβ野存在下で測定された(ＡＮＯＶＡによるｐ＜０.００１；図１３Ａ)。試験された化合物から、ＳＰ２３３およびＳＰ２３６のみＡＴＰレベルにおける０.１および１.０μＭのＡβ誘導減少を打ち消すことができた(図１３Ｂおよび１３Ｃ)。ＡＴＰ合成に対するＳＰ化合物の有益な効果は、１０μＭのＡβの存在下では全く見られなかった。
【０１８８】
細胞によるトリパンブルー取込は、Ａβ誘導毒性に対する有望なＳＰ２３３化合物の影響を評価するのに使用される第四の試験であった(図１４Ａ)。予想通り、０.１、１および１０μＭのＡβは、ＰＣ１２細胞によるトリパンブルー取込の用量依存的(それぞれ３３％、３６％および９７％、ＡＮＯＶＡによるｐ＜０.００１)増加を誘導した。３０および５０μＭでのＳＰ２３３は、Ａβ誘導細胞死を阻止した(ＡＮＯＶＡによるｐ＜０.００１)。図１４Ｂは、ＳＰ２３３の神経防御効果が用量依存的であり、その効力は、高い、生理病理学的レベルを超えたＡβの存在下では減少するが、それが３濃度全部のＡβの存在下で維持されることを示す。
【０１８９】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体同定における理由の一つは、Ｐ４５０ｓｃｃによりプレグネノロン、次いで組織特異的最終ステロイド産物に代謝され得ない生物活性(神経防御性)化合物の必要性である。ステロイド生成細胞によるこれらの化合物の代謝を評価するため、我々は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが優れたＰ４５０ｓｃｃ基質であり、多量のステロイドを生産し得る十分に特性確認されたステロイド生成細胞モデルである、ＭＡ−１０マウス腫瘍ライディヒ細胞においてそれらのステロイド形成能力を調べた。Li H.、Yao Z.、Degenhardt B.、Teper G.およびPapadoppoulos V.、末梢型ベンゾジアゼピン受容体のコレステロール認識／相互作用アミノ酸共通配列(ＣＲＡＣ)でのコレステロール結合およびＨＩＶ ＴＡＴ−ＣＲＡＣペプチドによるステロイド生成の阻害、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ２００１、９８：１２６７−１２７２。図１５は、ＳＰ２２２とは対照的に、ＳＰ２３３は最終ステロイド産物に代謝され得ないことを示している。
【０１９０】
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＡβ間の直接相互作用が実施例１でＣＰＢＢＡ方法を用いて示された、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)の神経防御作用の基礎をなす機構に関する以前の試験を考慮して、類似実験を企てることにより、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール誘導体がＡβに結合するか否かを調べた。Ａβに対するこれらの化合物の直接作用は、放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール／Ａβ複合体に対して実施された置換試験で示された(図１６)。３７℃で２４時間放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールをＡβと一緒に共インキュベーションすると、Ａβに特異的な抗体により認識される高分子量放射性標識バンドの存在(図１６)が立証された(Yao et al.、２００２およびデータは示さず)。２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールによるＡβの放射性標識の特異性は、非標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを用いる競合試験により立証されており、その場合１００μＭのＳＰ２２２がＡβに結合した放射性標識ＳＰ２２２化合物により８０％置換された(図１６)。試験されたＳＰ化合物のうち、ＳＰ２３７、ＳＰ２３８、ＳＰ２２６、ＳＰ２２７およびＳＰ２３３により、Ａβへ結合している放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールはそれぞれ４６、４４、６５、３８および３５％置換された(図１６)。
【０１９１】
Ａβとのコンピュータードッキングシミュレーションを用いて、これらのデータをさらに確認した。ドッキング結果は、Ａβ１−４２が１９〜３６アミノ酸領域(図１７)にポケットを形成し、そこでは２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが結合しており、我々の以前のデータと一致することを示している。Yao Z.X. et al.、J Neurochem ２００２、８３：１１１０−１１１９。試験された様々な化合物に関するドッキングエネルギーを、Ａβへの結合に要求されるエネルギーが小さい順に並べた：(−１０.３４ｋｃａｌ／ｍｏｌ)ＳＰ２２９＜ＳＰ２３２＜ＳＰ２２４＜ＳＰ２３７＜ＳＰ２２２＜ＳＰ２３３＜ＳＰ２２８＜ＳＰ２２３＜ＳＰ２３０＜ＳＰ２３４＜ＳＰ２２５＜ＳＰ２３８＜ＳＰ２３６＜ＳＰ２２６＜ＳＰ２３５＜ＳＰ２３１＜ＳＰ２２７(−８.３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ)。図１８Ａおよび１８Ｂは、ＳＰ２３３とＳＰ２２２の結合特性を比較している。これは、化合物の各々により実施された１００ドッキングの分析である。データは、約２３％の頻度でＳＰ２３３が−７.０〜−７.５Ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギーによりドッキングし、ＳＰ２２２が僅か５.５〜６.０ｋｃａｌ／ｍｏｌにより約２５％の頻度でドッキングすることを示す。より強い(さらなる負の)ドッキングエネルギーを有するＳＰ２３３の確率は、ＳＰ２２２の場合より著しく大きい。ほぼ１００％の頻度でＳＰ２３３は、−６.０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満で結合し、ＳＰ２２２についての同等数は僅か約−４.０ｋｃａｌ／ｍｏｌに過ぎない。結合エネルギー頻度の分布分析は、Ａβにおける２個の結合部位の存在を示唆する最頻値を２つもつプロフィールを示している。ＳＰ２３３については、ピークは−７〜−７.５および−８〜−８.５ｋｃａｌ／ｍｏｌの両方に存在し得、ＳＰ２２２については、ピークは−５.５〜−６.０および−４.０〜−４.５ｋｃａｌ／ｍｏｌにあると思われる。
【０１９２】
検討
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールが、年齢同等対照標本と比べてＡＤ脳の海馬および前頭皮質では下降しているという出願人らの発見によって、脳におけるこのステロイドの機能の探索が促進されたことにより、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールはラットＰＣ１２およびヒト分化ＮＴ２Ｎ細胞をＡβ毒性から防御するという発見がもたらされた。
【０１９３】
出願人らは、最初にＭＴＴ検定法、細胞生存能力、すなわち細胞毒性の広く使用されているマーカーを用いた。この検定法を用いると、ＰＣ１２細胞が１０μＭといった高濃度のＡβに曝露されたときでさえ試験化合物の幾つか、すなわちＳＰ２３３、ＳＰ２３５、ＳＰ２３６およびＳＰ２３８は神経防御活性を呈した。興味深いことに、これらの化合物は、レファレンスの２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)分子より有効であった。
【０１９４】
Ａβの作用機構における後期事象は、単独で細胞死に至り得るＡＴＰ生産の減少をまねく、ミトコンドリア呼吸鎖の直接または間接破壊である。ＰＣ１２細胞をＡβ誘導毒性から救い得る、ＳＰ２２２、ＳＰ２３５およびＳＰ２３８化合物は、ＡＴＰ合成においてＡβ誘導による変化を遮断しなかった。このような見かけ上の不一致はまだ説明がつかないままであるが、ＭＴＴ検定法(ミトコンドリアジアホラーゼ活性)およびＡＴＰ合成が、呼吸鎖の同じ部分の状態を反映しないことはあり得る。対照的に、ＳＰ２３３およびＳＰ２３６は、部分的ではあるが、ＡＴＰ生産におけるＡβ誘導減少を遮断した。ＳＰ２３３がＡＴＰストックを保存する能力は、この化合物の強力な神経防御効果を説明し得、これはさらにトリパンブルー取込細胞生存能力検定法により確認された。ただし、ＳＰ２３３は、使用された全検定法において最も有効であるのみならず、最も強力であり、１０μＭといった低濃度でＡβに対してインビトロで神経防御効果を呈することが見出された。
【０１９５】
本明細書に示された試験は、０.１、１.０および１０μＭのＡβ１−４２を用いて実施された。ＡＤ患者および対照の脳脊髄液に存在するＡβ１−４２の濃度は５００‐１０００ｎｇ／ｌ(０.１〜０.２ｎＭ)の範囲であるため、これらの濃度は生理病理学的レベルを超えている。Ａβ１−４２が１０倍高い濃度でＡＤ脳に存在し得る場合でも、Ａβ１−４２の推定病理生理学的濃度は１〜２ｎＭの範囲であり、これは出願人の実験で使用した濃度の１００〜１００００分の１ということになる。これらを考慮に入れると、０.１μＭのＡβに対してＳＰ２３３により提供される７５％防御は薬理学的に直接関連性があることは明らかである。
【０１９６】
十分に確立されたＭＡ−１０マウスライディヒ細胞モデルを用いて、出願人らは、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとは異なり、その生物活性誘導体ＳＰ２３３はステロイド形成を誘導し得ないことを立証した。
【０１９７】
ＳＰ化合物の神経防御特性は、構造／活性相関(ＳＡＲ)に従うと思われる。ＳＰ２３１およびＳＰ２３５はジオスゲニンの立体異性体であるが(図１)、ＳＰ２３５のみＡβ誘導神経毒性に対して防御性を示す。ＳＰ２３５の立体化学は、Ｃ３Ｒ、Ｃ１０Ｒ、Ｃ１３Ｓ、Ｃ２０Ｓ、Ｃ２２Ｓ、Ｃ２５Ｓ、ＳＰ２３３およびＳＰ２３６と共有するモチーフである(図１および１９)。高い神経防御活性を呈し、高濃度のＡβの存在下では活性を示すＳＰ化合物は、Ｃ３にエステル、好ましくは脂肪酸または脂肪酸様構造を含んでいた。実際に、Ｃ３に非置換ヒドロキシル基を有するＳＰ２３５は、０.１μＭのＡβに対してのみ作用する神経防御性は制限されている。対照的に、ＳＰ２３５のＣ３がコハク酸エステルであるＳＰ２３６は、高いＡβ濃度に対して活性を示し、ＳＰ２３５のＣ３がヘキサン酸エステルであるＳＰ２３３は最も強力な化合物である。ＳＰ２３８が、ＡＴＰレベルの維持に対する効果は全く有しないが、Ａβ誘導毒性からＰＣ１２細胞を防御し得るという発見は、Ｃ３(ＳＰ２２６)に側鎖を伴わないその誘導体が神経防御性を呈しないことから、この仮説をさらに裏付けるものである。ＳＰ２３２に存在する安息香酸置換は神経防御において有効ではないという発見は、このレベルでの脂肪族鎖の存在が芳香族構造よりも直接関連性のあることを示唆するものであった。これらのデータはＳＡＲを示すものであり、Ｃ３における脂肪酸鎖の存在の重要性を強調しているが、神経防御性についてＳＰ２３３構造を最適化するためには、さらなるモデリングおよびＳＡＲ試験を実施する必要がある。
【０１９８】
Yao et al.は、最近、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの神経防御効果が、Ａβ１−４２と結合し、不活化するその能力に存することを立証した。この観察結果に基き、出願人らは、同様に作用することにより神経防御性を呈するＳＰ２２２誘導体の能力を調べた。出願人らの発見は、Ａβ誘導細胞死に対して神経防御特性を呈するＳＰ化合物が、アミロイドペプチドに結合した放射性標識２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールと置換わることを示している。
【０１９９】
コンピュータードッキングシミュレーションを用いることにより、ＳＰ−Ａβ相互作用のさらなる特性確認を行った。これらの試験は、生物活性ＳＰ化合物について２つの結合部位がＡβに存在し得ることを明らかにした。一結合部位は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)により特異的であると思われ、第二結合部位は例えばＳＰ２３３およびＳＰ２３６といった化合物について高い親和力を示す。ＳＰ２２６はこの第二結合部位にも結合することが示されているが、この化合物について計算された結合エネルギーは、神経防御性ＳＰ分子が示したエネルギーよりもかなり低い。後続のコンピュータードッキングシミュレーション試験は、ＳＰ２２２およびＳＰ２３３の結合エネルギーが双峰分布に従うこと、すなわちＡβにおける２つの結合部位の存在を強く立証する発見を示した。結合エネルギーのさらなる計算結果は、ＳＰ２２２が有する親和力はＳＰ２３３と比べて第二結合部位については弱いことを示しており、エステル鎖の存在が、Ａβにおける両部位へのＳＰ２３３の結合能力に関与し得ることを示唆している。これらの観察結果に基づき、出願人らは、Ａβ第二結合部位の占拠がアミロイドペプチドの不活化持続に必要とされ得ると仮定した。出願人らはインビトロおよびインシリコでこの仮説を試験している途中である。
【０２００】
Ａβの直接不活化に関連していない他の機構もまた、ＳＰ２３３の神経防御活性の一因となり得る。核受容体におけるスピロステノールの結合についてはほとんど知られていないが、ステロイド受容体ファミリーの可能なモジュレーションは排除され得ない。ＡβがＧＬＵＴ３−含有小胞の融合を阻害し、ミトコンドリアホメオスタシスの破壊、すなわちニューロン死をまねくことが示された。他方、グルコース吸収は、ポリゴナチ・リゾーム(Polygonati rhizome)から抽出されたスピロステノール誘導体により正常およびストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスでは高められる。これらを考え合わせると、これらの結果は、細胞の内側におけるグルコース輸送の回復が、スピロステノールＳＰ２３３により活性化された我々のモデルにおける防御機構であり得ることを示唆している。ジオスゲニンの天然および合成誘導体はまた、細胞によるコレステロール吸収を低下させ、鍵酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼを阻害することによりコレステロール合成を減少させることが示されている。また、細胞コレステロール濃度の増加は、Ａβ産生をまねくβ−およびγ−セクレターゼの活性化を誘導することも知られている。さらに、ジオスゲニン誘導体は、Ａβの産生を積極的にモジュレーションすることが報告された酵素である、コレステリルエステル転送タンパク質を阻害することにより細胞内コレステロールプールを修飾することが示された。培養培地においてＡβを加えるため、これらの防御機構が出願人らのモデルで起こるとは思われないが、それらはＳＰ２３３に対するインビボ応答の一部であり得る。
【０２０１】
ＡＤを治療および／またはその進行を遅らせるための新規治療モダリティーを発見するために過去数年間多大な努力が為されたにもかかわらず、患者の１０〜１５％においてある限られた期間病気の進行を遅らせることができるアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の導入以来、主たる臨床面では前進していない。ＡＤを処置する試みにおいて、多くの化合物が実際に臨床試験で用いられたが、それらの大部分にとって、ＡＤの病理はそれらの一次作用に次ぐ二次的な標的である。上記薬剤には、酸化防止剤、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害剤、スタチンおよび脳血管拡張剤がある。出願人らの結果は、天然に存するスピロステノール化合物がＡβからニューロン細胞を防御することを示している。
【０２０２】
本発明の若干の実施態様を記載した。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修飾が加えられ得ることは容易に理解できるはずである。したがって、他の実施態様も請求の範囲内に含まれ、そして本発明の範囲から逸脱することなく上記組成物、処方物、組合わせおよび方法に対して様々な変化が加えられ得るため、上記の記載事項に含まれるものは全て説明的なものとして解釈すべきであり、限定的意図は無いものとする。本明細書列挙されている特許文献および参考文献は全て、出典明示により援用する。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
図面は、若干の本発明化合物、それらの化合物の同定方法および実例となる本発明化合物の活性を立証するインビトロおよびインビボ生物学的試験の結果を説明している。
【図１】図１は、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および天然に存する誘導体の化学構造の(構造の)幾つかを明らかにしている。
【図２】図２は、ＡＤおよび対照脳試料における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールレベルを描くチャートである。
【図３Ａ】図３Ａは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のコレステロールの効果を描く線グラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のプレグネノロンの効果を描く線グラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の１７α−ヒドロキシプレグネノロンの効果を描く線グラフである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度のＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、増加濃度のＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【図４】図４は、Ａβ１−４２の不存在または存在下で測定された分化したヒトＮＴ２Ｎニューロンの生存能力に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く線グラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ラットＰＣ１２神経細胞についてのＡβ１−４２誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ラットＰＣ１２神経細胞についてのＡβ２５−３５誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ヒトＮＴ２細胞についてのＡβ１−４２誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ヒトＮＴ２細胞についてのＡβ２５−３５誘導毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールおよびＤＨＥＡの効果を描く線グラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、Ａβ凝集に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描くクーマシーブルーゲルである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ａβ凝集に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの効果を描く図６Ａのクーマシーブルー染色ゲルの免疫ブロット分析である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＰＢＢＡによりＡβ１−４２−２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合および結合部位を同定する免疫ブロット分析である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａで示されたブロットにおけるポリクローナルウサギ抗β−アミロイドペプチド抗血清によりＡβ１−４２を同定する免疫ブロット分析である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ａβにおける２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合部位を同定する免疫ブロット分析である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、コンピューターによるＡβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【図７Ｆ】図７Ｆは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【図７Ｇ】図７Ｇは、コンピューターによるＡβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【図７Ｈ】図７Ｈは、コンピューターによるＡβ１７−４０への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールドッキングシミュレーションである。
【図７Ｉ】図７Ｉは、Ａβ１−４２における２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール結合部位の位置を確認するアミノ酸配列である。
【図８】図８は、増加濃度のＡβへのＰＣ１２細胞の３日間曝露が用量依存的細胞死をまねいたことを明らかにする棒グラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｅ】図９Ｅは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｆ】図９Ｆは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｇ】図９Ｇは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｈ】図９Ｈは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｉ】図９Ｉは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｊ】図９Ｊは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｋ】図９Ｋは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｌ】図９Ｌは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｍ】図９Ｍは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｎ】図９Ｎは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｏ】図９Ｏは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図９Ｐ】図９Ｐは、０.１μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｈ】図１０Ｈは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｉ】図１０Ｉは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｊ】図１０Ｊは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｋ】図１０Ｋは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｌ】図１０Ｌは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｍ】図１０Ｍは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｎ】図１０Ｎは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｏ】図１０Ｏは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１０Ｐ】図１０Ｐは、１.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｉ】図１１Ｉは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｊ】図１１Ｊは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｋ】図１１Ｋは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｌ】図１１Ｌは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｍ】図１１Ｍは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｎ】図１１Ｎは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｏ】図１１Ｏは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１１Ｐ】図１１Ｐは、１０.０μＭのＡβ１−４２の不存在または存在下におけるラットＰＣ１２神経細胞生存能力に対する増加濃度の２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を明らかにする一連の棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ａβ曝露が膜電位評価性ルミネセンスの用量関連減少を誘導することを示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、０.１μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、１.０μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、１０.０μＭのＡβ−誘導神経毒性に対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ａβが、０.１、１.０および１０.０μＭのＡβ誘導神経毒性の存在下におけるＰＣ１２細胞によるＡＴＰ生産を用量依存的に減少させたことを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、０.１μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、１.０μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、１０.０μＭのＡβ−誘導神経毒性の存在下でのＡＴＰに対する２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)および誘導体の効果を示す棒グラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ａβ単独、Ａβ＋ＳＰ２３３  ３０μＭ、およびＡβ＋ＳＰ２３３  ５０μＭの存在下における細胞によるトリパンブルー取込を示す線グラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ラットＰＣ１２神経細胞についての０.１、１.０および１０.０μＭのＡβ誘導神経毒性に対する増加濃度のＳＰ２３３の効果を示す線グラフである。
【図１５】図１５は、ＭＡ−１０ライディヒ細胞ステロイド形成に対するＳＰ２３３の効果を明らかにする線グラフである。
【図１６】図１６は、ＣＰＢＢＡによりＡβ−ＳＰ結合および結合部位を同定する棒グラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｇ】図１７Ｇは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｈ】図１７Ｈは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｉ】図１７Ｉは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｊ】図１７Ｊは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｋ】図１７Ｋは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｌ】図１７Ｌは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｍ】図１７Ｍは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｎ】図１７Ｎは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｏ】図１７Ｏは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｐ】図１７Ｐは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１７Ｑ】図１７Ｑは、Ａβ１−４２への表１の化合物のコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、Ａβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)およびＳＰ２３３の結合エネルギー頻度を描くコンピュータによるドッキングシミュレーションである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、Ａβ１−４２への２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール(ＳＰ２２２)およびＳＰ２３３結合の確率を描くコンピューターによるドッキングシミュレーションである。
【図１９】図１９は、神経防御性ＳＰ化合物に存在する基本的スピロステノール構造のコンピューターシミュレーションである。
【図１】
2005526077.tif 000008
【図２】
2005526077.tif 000009
【図３】
2005526077.tif 000010
【図４】
2005526077.tif 000011
【図５】
2005526077.tif 000012
【図６】
2005526077.tif 000013
【図７−１】
2005526077.tif 000014
【図７−２】
2005526077.tif 000015
【図８】
2005526077.tif 000016
【図９−１】
2005526077.tif 000017
【図９−２】
2005526077.tif 000018
【図９−３】
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【図１０−１】
2005526077.tif 000020
【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
2005526077.tif 000023
【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
2005526077.tif 000026
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2005526077.tif 000030
【図１６】
2005526077.tif 000031
【図１７Ａ】
2005526077.tif 000032
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
2005526077.tif 000042
【図１７Ｌ】
2005526077.tif 000043
【図１７Ｍ】
2005526077.tif 000044
【図１７Ｎ】
2005526077.tif 000045
【図１７Ｏ】
2005526077.tif 000046
【図１７Ｐ】
2005526077.tif 000047
【図１７Ｑ】
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【図１８Ａ】
2005526077.tif 000049
【図１８Ｂ】
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【図１９】
2005526077.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月17日(2004.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする対象における神経変性疾患の処置方法であって、式(Ｉ)：
【化１】
2005526077.tif 000052
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)２ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)４ＣＯ２−、ＨＯ２Ｃ(ＣＨ２)２ＣＯ２−、トルエン−４−スルホニルオキシまたはベンゾイルオキシであり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)またはＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ３)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２Ｎ(Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３)２であるか、またはＲ１６およびＲ１７は、それらが結合している原子と一緒になって、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−、−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルにより置換された、テトラヒドロフリル環を形成するか、または２基はメチル、トルエン−４−スルホニル−またはアセチルにより置換されたスピロ複素環を形成する］
で示される化合物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
化合物が、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−ヒドロキシフロステ−５−エン−３ξ−イルアセテート、(２０α)−２５ξ−メチル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−オール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−メトキシフロステ−５−エン−３α−イルアセテート、(２０ξ)−２５ξ−メチル−Ｎ−アセチル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−オール、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−(２α,３ξ)−ジオール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−エトキシフロステ−５−エン−３ξ−イルアセテート、(２０α)−２５ξ−メチル−Ｎ−パラトルエンスルホニル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−イルパラトルエンスルホネート、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−(１４α,２０α)−スピロステ−５−エン−(３β,１２β)−ジオール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０ξ)−スピロステ−５−エン−３ξ−オール、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−イルベンゾエート、(２２Ｓ,２５Ｓ)−(２０Ｓ)−スピロステ−５−エン−３β−イルへキサノエート、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−(１ξ,３ξ)−ジオール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−オール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−イルスクシネート、２６−ジアセチルアミノ−(２２ξ)−アセトキシ−(１６ξ)−アセトキシ−コレステ−５−エン−イルアセテート、および(２０α)−２５Ｓ−メチル−Ｎ−アセチル−(２２Ｓ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３β−イルプロパノエートから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
化合物が２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
化合物が、(２２Ｓ,２５Ｓ)−(２０Ｓ)−スピロステ−５−エン−３β−イルへキサノエートを含む、請求項２記載の方法。
【請求項５】
化合物が、化合物の治療有効量を含む用量形態である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
用量形態が、錠剤、ゼラチン軟カプセル、ゼラチン硬カプセル、懸濁用錠剤、発泡性錠剤、散剤、発泡性散剤、チュアブル錠剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ゲル、パッチおよび坐剤から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
用量形態が、さらに医薬上許容される賦形剤を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
医薬上許容される賦形剤が、結合剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、抗付着剤、流動促進剤、または医薬適合性担体を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
さらに、少なくとも１種のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を投与することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
神経変性疾患が、全般的および焦点的虚血性および出血性発作、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導性神経細胞損傷、心停止または胎児仮死により誘発される神経細胞損傷、癲癇、不安、真性糖尿病、多発性硬化症、幻肢痛、カウザルギー、神経痛、帯状疱疹、脊髄病変、痛覚過敏、異痛症、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、およびパーキンソン病から成る群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
式(Ｉ)：
【化２】
2005526077.tif 000053
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)２ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)４ＣＯ２−、ＨＯ２Ｃ(ＣＨ２)２ＣＯ２−、トルエン−４−スルホニルオキシ、またはベンゾイルオキシであり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)、またはＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ３)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２Ｎ(Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３)２であるか、またはＲ１６およびＲ１７は、それらが結合している原子と一緒になって、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−、−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルにより置換された、テトラヒドロフリル環を形成するか、または２基はメチル、トルエン−４−スルホニル−またはアセチルにより置換されたスピロ複素環を形成する］
で示される化合物の治療有効量および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
化合物が、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−ヒドロキシフロステ−５−エン−３ξ−イルアセテート、(２０α)−２５ξ−メチル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−オール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−メトキシフロステ−５−エン−３α−イルアセテート、(２０ξ)−２５ξ−メチル−Ｎ−アセチル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−オール、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−(２α,３ξ)−ジオール、(２０ξ)−２６−アセチルアミノ−(２２ξ)−エトキシフロステ−５−エン−３ξ−イルアセテート、(２０α)−２５ξ−メチル−Ｎ−パラトルエンスルホニル−(２２Ｒ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３ξ−イルパラトルエンスルホネート、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−(１４α,２０α)−スピロステ−５−エン−(３β,１２β)−ジオール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０ξ)−スピロステ−５−エン−３ξ−オール、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−イルベンゾエート、(２２Ｓ,２５Ｓ)−(２０Ｓ)−スピロステ−５−エン−３β−イルへキサノエート、(２２Ｒ,２５ξ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−(１ξ,３ξ)−ジオール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−オール、(２２Ｒ,２５Ｓ)−(２０α)−スピロステ−５−エン−３β−イルスクシネート、２６−ジアセチルアミノ−(２２ξ)−アセトキシ−(１６ξ)−アセトキシ−コレステ−５−エン−イルアセテート、および(２０α)−２５Ｓ−メチル−Ｎ−アセチル−(２２Ｓ,２６)−アザシクロフロステ−５−エン−３β−イルプロパノエートから成る群から選択される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
化合物が２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールを含む、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
化合物が、(２２Ｓ,２５Ｓ)−(２０Ｓ)−スピロステ−５−エン−３β−イルへキサノエートを含む、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物が、錠剤、ゼラチン軟カプセル、ゼラチン硬カプセル、懸濁用錠剤、発泡性錠剤、散剤、発泡性散剤、チュアブル錠剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、ゲル、パッチおよび坐剤から成る群から選択される用量形態である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
医薬上許容される賦形剤が、結合剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、抗付着剤、流動促進剤、または医薬適合性担体を含む、請求項１２〜１６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１８】
さらに少なくとも１種のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含む、請求項１２〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の同定方法であって、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの構造相同性について既知の化学的化合物のデータベースをスクリーニングし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの相同性の程度に基いてデータベースにおける化合物をランク付けし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールとの最高の構造相同性を有する化合物をデータベースから抽出し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って抽出された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項２０】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、
２個またはそれ以上の個別ビルディングブロックへ２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールをマッピングし、
２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールの１個またはそれ以上のブロックを修飾することにより新規化合物を設計し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って設計された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項２１】
β−アミロイドへの結合親和力を有する化合物の設計方法であって、
β−アミロイドをマッピングし、
β−アミロイドまたはそのフラグメントの構造を補う化合物をコンピュータースクリーン上で構築し、
β−アミロイドへのインビトロ結合性に従って構築された化合物をランク付けし、そして
最高のインビトロ結合親和力を有する化合物を選択する
ことを含む方法。
【請求項２２】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１７〜４０から成る、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１５〜４０から成る、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１７〜３８から成る、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
フラグメントが、β−アミロイドのアミノ酸１６〜３９から成る、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
生物流体におけるＡβの検出および定量方法であって、
試料流体を入手し、
式(Ｉ)
【化３】
2005526077.tif 000054
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)２ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)４ＣＯ２−、ＨＯ２Ｃ(ＣＨ２)２ＣＯ２−、トルエン−４−スルホニルオキシ、またはベンゾイルオキシであり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)、またはＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ３)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２Ｎ(Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３)２であるか、またはＲ１６およびＲ１７は、それらが結合している原子と一緒になって、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−、−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルにより置換された、テトラヒドロフリル環を形成するか、または２基はメチル、トルエン−４−スルホニル−またはアセチルにより置換されたスピロ複素環を形成する］
で示される標識化合物と流体をインキュベーションし、
インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、
膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そして
膜の内容物を分析する
ことを含む方法。
【請求項２７】
式(Ｉ)の標識化合物と流体とのインキュベーションが、増加濃度の式(Ｉ)の非標識化合物の存在下で行なわれる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
膜の内容物の分析段階が、Ａβの存在を検出するためのホスホイメージングおよび生物流体に存在するＡβの量の定量の少なくとも一つによる膜の内容物の分析を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
対象におけるアルツハイマー病の診断方法であって、
対象の脳から試料流体を入手し、
流体を、式(Ｉ)：
【化４】
2005526077.tif 000055
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１５およびＲ１６は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸、または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−または−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルであり、Ｒ３は、ヒドロキシ、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)２ＣＯ２−、ＣＨ３(ＣＨ２)４ＣＯ２−、ＨＯ２Ｃ(ＣＨ２)２ＣＯ２−、トルエン−４−スルホニルオキシ、またはベンゾイルオキシであり、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３およびＲ１４は各々、独立して、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシまたはヒドロキシであり、そしてＲ１７は、ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＨ)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)、またはＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ(ＯＣ(＝Ｏ)ＣＨ３)(ＣＨ２)２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２Ｎ(Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ３)２であるか、またはＲ１６およびＲ１７は、それらが結合している原子と一緒になって、アルキル、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシル、オキソ、スルホン酸または所望により−ＮＨ−、−Ｎ(アルキル)−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｏ−ＳＯ２−、−ＳＯ２−Ｏ−、−ＳＯ３−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＲ'−、−ＮＲ'−ＣＯ−が挿入されていてもよいアルキルにより置換された、テトラヒドロフリル環を形成するか、または２基はメチル、トルエン−４−スルホニル−またはアセチルにより置換されたスピロ複素環を形成する］
の標識化合物とインキュベーションし、
インキュベーション流体から試料を分離し、試料をニトロセルロース膜へ移し、
膜をトリチウム感受性スクリーンに曝露し、そして
膜の内容物を分析する
ことを含む方法。
【請求項３０】
式(Ｉ)の標識化合物と流体とのインキュベーションが、増加濃度の式(Ｉ)の非標識化合物の存在下で行なわれる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
膜の内容物の分析段階が、Ａβの存在を検出するためのホスホイメージングおよび生物流体に存在するＡβの量の定量の少なくとも一つによる膜の内容物の分析を含む、請求項２９記載の方法。
【国際調査報告】
2005526077.tif 000056