(57)【要約】  有効皮膚浸透量の、１もしくは複数の医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る局所製剤が提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効皮膚浸透量の、１もしくは複数の医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る局所製剤。
【請求項２】
前記局所製剤が、吸収動態を０次放出に変化せしめる目的の１又は複数の持続放出系を含んで成る経皮デリバリーシステムである、請求項１に記載の局所製剤。
【請求項３】
前記医薬ヒドロキシ化合物が、エストロゲン、エストラジオール、テストステロン、アトロピン、モルヒネ及びそれらの混合物からなる群から選択されている、請求項１又は２に記載の局所製剤。
【請求項４】
前記リン酸誘導体が、遊離リン酸；その塩；２分子の医薬ヒドロキシ化合物を有するフォスフェートエステル；遊離リン酸の酸素がアルキル基又は置換されているアルキル基と結合を形成するフォスファチジル化合物；又は両性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び窒素官能基を有するアミノ酸及びこれらのアミノ酸に富むタンパク質からなる群から選択された１又は複数の錯化剤との錯体；及びこれらの混合物から成る群から選択された形態において存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の局所製剤。
【請求項５】
前記医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体が、エストロゲンフォスフェートエステル、エストラジオールフォスフェートエステル、テストステロンフォスフェートエステル、アトロピンフォスフェートエステル、モルヒネフォスフェートエステル及びこれらの混合物から選択されている、請求項４に記載の局所製剤。
【請求項６】
前記リン酸誘導体が、両性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び窒素官能基を有するアミノ酸及びこれらのアミノ酸に富むタンパク質からなる群から選択された１又は複数の錯化剤と錯体を形成している、請求項４に記載の局所製剤。
【請求項７】
前記錯化剤が、アルギニン、リジン、ヒスタジン(histadine)及び第三置換アミン、例えば、以下の式：
NR1R2R3
（式中、
R1は、直鎖又は枝分かれした鎖を混合したC6〜C22のアルキル基及びそれらのカルボニル誘導体を含んで成る群から選択されており；
R2及びR3は、独立して、H、CH2COOX、CH2CHOHCH2SO3X、CH2CHOHCH2OPO3X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2SO3X又はCH2CH2CHOHCH2OPO3Xを含んで成る群から選択されており且つXはH、Na、K又はR2及びR3がどちらもHではない場合にアルカノールアミンであり；そしてここで、R1がRCOであるならばR2はCH3であって良く、そしてR3は（CH2CH2）N（C2H4OH）-H2CHOPO3又はR2及びR3が一緒にN（CH2）2N（C2H4OH）CH2COO-であって良い）
のものから選択されている、請求項６に記載の局所製剤。
【請求項８】
前記錯化剤は、エストロゲンフォスフェートエステル、エストラジオールフォスフェートエステル、テストステロンフォスフェートエステル、アトロピンフォスフェートエステル、モルヒネフォスフェートエステル及びこれらの混合物からなる群から選択された医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体と錯体を形成している、請求項７に記載の局所製剤。
【請求項９】
前記担体は、トコフェリルフォスフェートと錯化剤との錯体を含んで成り、そして当該錯化剤は、アルギニン、リジン、ヒスタジン及び第三置換アミン、例えば、以下の式：
NR1R2R3
（式中、
R1は、直鎖又は枝分かれした鎖を混合したC6〜C22のアルキル基及びそれらのカルボニル誘導体を含んで成る群から選択されており；
R2及びR3は、独立して、H、CH2COOX、CH2CHOHCH2SO3X、CH2CHOHCH2OPO3X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2SO3X又はCH2CH2CHOHCH2OPO3Xを含んで成る群から選択されており且つXはH、Na、K又はR2及びR3がどちらもHではない場合にアルカノールアミンであり；そしてここで、R1がRCOであるならばR2はCH3であって良く、そしてR3は（CH2CH2）N（C2H4OH）-H2CHOPO3又はR2及びR3が一緒にN（CH2）2N（C2H4OH）CH2COO-であって良い）
のものからなる群から選択されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の局所製剤。
【請求項１０】
前記担体が、ラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルホスフェートを含んで成る、請求項９に記載の局所製剤。
【請求項１１】
前記担体が、６１.９５％の脱イオン水、５．００％のグリセリン、０．０５％のEDTA三ナトリウム、０．５０％のカルボマー、７．５０％のラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェート、２．００％のセテアリルアルコール及びceteareth-20、１．００％のステアリン酸グリセリル、５．００％のミリスチン酸イソプロピル、３．５０％のセチルエチルヘキサノエート、３．５０％のベヘン酸イソセチル、３．００％のエルカ酸オレイル、０．５０％のジメチコーン、５．００％の脱イオン水、０．５０％のトリエタノールアミン(９９％)及び１．００％のプロピレングリコール、ジアゾリジニルウレア、メチルパラベン及びプロピルパラベンを含んで成る請求項１０に記載の局所製剤。
【請求項１２】
医薬ヒドロキシ化合物の皮膚吸収を向上させるため及び／又は長期に渡り適度な血中量を維持するための方法であって、当該方法は、有効皮膚浸透量の、医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る製剤を局所的に適応する段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
有効皮膚浸透量の、エストロゲンの１又は複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る製剤を患者に対して局所的に投与することを含んで成る、ホルモン補充療法のための方法。
【請求項１４】
対応する医薬ヒドロキシ化合物の対象者に対する投与を向上させるための、経皮デリバリーシステムにおける医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体の使用。
【請求項１５】
（a）医薬組成物を対象者の皮膚に対して適用するための装置；及び
（b）当該装置における医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体、
を含んで成る経皮デリバリーシステム。
【請求項１６】
前記装置が、パッチ、湿布薬、ゲル、クリーム、膏薬又は０次放出へ向けて吸収動態を変化せしめる目的の他の持続放出系である、請求項１５に記載の経皮デリバリーシステム。
【請求項１７】
医薬ヒドロキシ化合物を対象者に対してデリバリーするための方法であって、当該方法は、請求項１５又は１６に記載の経皮デリバリーシステムを対象者の皮膚の一部に対し、当該医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体が当該対象者の皮膚のバリアーを通じて輸送されそして血流中へと送達されるように適用することを含んで成る方法。
【請求項１８】
医薬ヒドロキシ化合物製剤の効果を向上せしめるための方法であって、当該方法は：
(a)医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体を形成し；そして
(b)医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体を局所製剤へと処方する、
ことを含んで成り；ここで当該医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体は、対象者の皮膚に対し投与することによって、対応するリン酸化されていない医薬ヒドロキシ化合物製剤を上回る向上した効果を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬物化合物を適用するための経皮薬物輸送及び当該化合物の皮膚浸透力を向上せしめるための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中、知識の文書、記録又は要素は参照とされているかあるいは論じられており、この参照又は議論は、知識の文書、記録又は項目が優占日にて：
（a）通常の一般的な知識の一部；又は
（b）本明細書が関連している任意の問題を解決する試みに関連するとして知られているような容認事項として扱われてはいない。
【０００３】
治療物質は長年に渡り皮膚に対して局所的に使用されてきた。最初の記録は、エジプト人が軟膏を皮膚に対し治癒のために適用したことに遡る。しかし、いくつかの化合物は、他のものよりもよりよく吸収されるということが発見されたのは、１９世紀後半になってからである。それ以来、科学者は経皮吸収を調節するメカニズム及びこれらの経路をどのようにして操作するのかを特定するために研究をしてきた。
【０００４】
皮膚は、体の最大の器官であり、内部の器官を、外部の化学的、物理的及び病理的な危険から保護する働きをする。正常な皮膚は、３つの層、即ち、表皮、真皮、及び皮下組織に分かれている。表皮の外側の角化した層の、角質層は、強度、柔軟性並びに高い電気インピーダンス及び微生物の浸透及び増殖を妨げる乾燥の特性を有する。角質層は、経皮薬物輸送に対する主要なバリアーでもある。通常は、薬物輸送に対するバリアーであるとは考えられていない皮膚を保護する皮質の層がある。
【０００５】
皮膚を通過して移動する場合、分散する薬物の分子は、多くの潜在的輸送経路を使用できる。これらには、付属的な、例えば、外分泌性、小胞性、又は、表皮の例えば、内細胞性又は細胞内部へと向かうものが挙げられる。前記輸送経路について、現在の理論は、２つの可能性あるメカニズムを示唆している。それは即ち、（ｉ）受動的経細胞輸送及び（ii）細胞内表皮輸送である。皮膚における活動輸送系は、恒常性を調節するために重要であり、そしてこのプロセスは化合物に膜を通過させ真皮全体に移動せしめるように働くことにも証拠が存在する。活動性輸送メカニズムは、ドラッグデリバリー経路としては考えられていないかあるいは活用されておらず、何故ならこの吸収プロセスが主として浸透プロセスであると考えられているからだ。
【０００６】
薬物は、いくつかの方法、例えば、軟膏、パッチ、溶液、皮下デポット、湿布薬、膏薬、及び経皮デリバリー装置などにおいて局所的に適用されている。経皮デリバリー装置は、真皮の表層上で薬物が作用する単なる局所適用とは対照的に、薬物が真皮に浸透することを伴う局所適用の一部である。
【０００７】
経皮デリバリー装置としては、分散調節ポリマー性膜リザーバシステムが挙げられる。かかる装置は往々にしてパッチの形態にあり、定常条件下で長期に渡り薬物放出を一定の速度に維持する目的があり、これは時として「０次放出」又は「０次動態」に言及されている。かかるパッチは通常、薬物溶液を取り囲み薬物の放出を一定の速度に維持するように働く、１又は複数の律速膜からなる。これは一般に、膜装置の、マイクロカプセル、リポソーム、及び例えば、シリコーンゴム、エチレンビニル酢酸、酢酸セルロース、コポリマー、ポリウレタン及びヒドロゲルなど様々なポリマー性材料における中空繊維を使用することによって達成されている。
【０００８】
経皮デリバリーは、複数の潜在的な利点を示すことが認められてきた。それは例えば、不都合を伴わずに緩やかな静脈内注入と類似する血液内量、経口投与に比べてより良い吸収及び代謝の調節、薬物、特に短い半減期を有する薬物の効果の連続性、肝臓初回通過除去を経ることによって薬物投与量を減らしたのに等しい効果、投与下又は過剰投与下での危険性の低下及び簡単な投与計画による患者のより良い服用を達成することである。
【０００９】
経皮デリバリー装置は、経口により送達することが難しい、短い半減期を有する又は０次放出が必要となる薬物に対して有用である。それらは現在、ある数の治療領域において薬物を送達するために使用されており、それは限定されないが、出産の調節及び閉経の管理における性ホルモン（Ciba-GeigyによるEstraderm（登録商標）、OragonによるOestradiol implants）、抗ガン治療における性腺ホルモン（Pharmacia-UpjohnによるDepo-Provera（登録商標））、慢性疼痛抑制における鎮痛皮下デポット、狭心症治療における硝酸塩（Pharmacia-Schwarz/LohmannによるDeponit（登録商標）、SearleによるNitrodisc（登録商標）、KeyによるNitro-Dur（登録商標）及びCiba-GeigyによるTransiderm-Nitro（登録商標）、YamanouchによるFrandol（登録商標））、動揺病及び嘔吐における制吐薬（Chiba-GeigyによるScop（登録商標））及び禁煙治療におけるニコチン（Marion Merrell DowによるNicobate（登録商標）、Chiba-GeigyによるNicotinell（登録商標））に及ぶ。
【００１０】
経皮エスとラジオール投与は、青年期の女性における閉経症状及び性腺機能低症状を治療するための十分に確立された方法であるが、このパッチを使用する女性の最大１７％において皮膚の刺激が報告されている。経皮投与が経口投与よりも好まれており、その理由は、それにより肝臓初回通過代謝並びに腸壁を介する吸収及び代謝の問題が回避されるからである。加えて、経口治療において使用されているよりも低い投与量を投与できうる。理想的には、エストロゲンの生理的に活性のある代謝産物が生物活性を向上させうる。しかしながら、それらの非常に脂質性である性質によりデリバリーが非常に送達困難になる。
【００１１】
Morgan,TM.、Parr,RA.、Reed,BL及びFinnin,BCによる研究（1988）Enhanced transdermal delivery of sex hormones in swine with a novel topical aerosol.J.Pharm.Sci.  Vol.87（10）:pp.1219〜1225は、浸透増進剤パジメートO（Padimate O）を含有する新規定量局所エアロゾルを使用してブタにおけるテストステロンとエストラジオールの経皮デリバリーを調べた。濃度勾配を作り出すことにより薬物吸収を刺激する試みにおいて、揮発性及び非揮発性溶媒の混合物をビヒクルとして含有する薬物溶媒システム中の揮発性化合物が皮膚から蒸発して、皮膚上で飽和溶液が作り出される。これらのシステムの１つの主たる問題は、再現性のある系を作り出すことが困難であり、その理由は、揮発性溶媒の蒸発の速度と程度が、適用中の周囲の条件に依存するだろうからである。吸収動態の多彩さによりドラッグデリバリーの変動及び不都合な臨床効果が生じる。
【００１２】
定用量装置は、効率的使用のために、調整及び手動の器用さ（manual dexterity）も必要になる。発明者は、この投与システムは柔軟性も供し且つより広い適用の表層領域を供するために動くことができうることも主張している。更に尚、用量周辺を動くことも必要であり、何故なら、前記増進剤が皮膚を損傷して刺激及び紅斑を生じるヒドロキシシンナメートであるからだ。従って、このエアロゾル投与システムは、増進剤を含有するパッチ以上には臨床的な利点を提供しないだろう。
【００１３】
経皮ドラッグデリバリーシステムにおける注目は高まりつつあるが、いくつかの基本的な制限がこの技術のより広汎な適用を制限している。経皮デリバリーの使用に関する主な制限は、薬物の、皮膚を通じての輸送の速度及び患者の服用である。
【００１４】
全ての薬物が経皮的に投与されて全身的治療のために治療上有利であるのに十分な血液レベルを非常に高い速度で達成するわけではない。類似する分子量及びサイズの薬物が、例えば、皮膚を介して異なる速度で吸収されうる。例えば、ephedrineが皮膚に２００μg/cm2/時間で浸透するのに比べて、Fentanylは２μg/cm2/時間で浸透する。Fnatanylのためには、より大きいサイズの経皮デリバリーシステムが必要となり、従って、投与経路の利点をよそに実用的又は経済的のどちらでもなくなるだろう。
【００１５】
皮膚を通じての薬物吸収を向上させるために、皮膚増進剤及び様々な調剤技術が開発されてきた。皮膚増進剤としては、カプリオン酸、オレイン酸、アゾーン（azone）、デシルメチルスルホキシド及びヒドロキシシンナメートなど、典型的には、特に角質層の構造を、脂質マトリクスを溶かすことによって変化させ、薬物化合物の浸透性を高める働きをする化合物である。例えば、プロゲステロンの真皮による吸収は、角質層が脱脂質化されている場合、１４３％に上昇する。角質層が完全に除去されている場合、増進は８４３％へと高まる。かかる積極的な変更により、かかるシステムを繰り返し使用することに共通に報告されている問題とは、従って明らかであり、真皮の接触、皮膚の炎症、パッチの取り外し又は局部炎症を避けるために体周辺での薬物の適用を必要とする痒み及び火傷、などが挙げられる。炎症はパッチを取り外した後に数時間のうちに消えるといわれている。しかし、この種類の経皮デリバリーシステムを使用することによる長期の危険性及び安全性に関する懸念が持ち上がっている。その理由は主に、薬物浸透性の上昇は、代償として、基本的に重要な皮膚の保護層に傷害を与えることによって達成されているからである。
【００１６】
経皮デリバリーシステムに関する他の制限は、リン脂質膜を介する吸収のために十分に脂溶性であるが、更にサイトゾル及び通常は親水性懸濁媒体中を移動するために水溶性のでもある両方の、薬物化合物を処方することにおける問題である。薬物分子は皮膚を移動する際に親油性及び親水性バリアーの両方を通過することが必要である。これらは達成することが難しく且つ輸送を遅くする。
【００１７】
従って、製剤における改良は、経皮デリバリーシステムからの化合物の放出の速度及び生物利用効率を理解するためにも重要であるべき一方で、装置の幾何学及び性質、病気及び膜の使用されている領域にも依存しうる。放出の時間は、薬物リザーバのサイズ及び薬物化合物の生物利用効率に支配されている。薬物放出の動態を推定するために、数学的モデルが提案されている。全ての物理化学的、数学的なアプローチと同様に、生物学的なファクターは、通常十分に記載されていない。
【００１８】
かかるモデルから生ずる後の戦略は、可溶性及び投与形態からの薬物の溶解速度を高める目的がある。理論的に、これらの戦略により、薬物は一層、膜を介する吸収のために使用可能になり、そして共溶媒の添加、錯体形成、皮膚増進剤による膜の固体状態での操作及びプロドラッグ修飾（prodrug modification）などの技術を伴う。しかし、これらの数学的なアプローチは、三次元特徴、例えば疎水性及び薬物相互作用のためのいくつかの電気的な効果、例えば、水素結合のための記述子（descriptor）を効率的に生じさせることができないことについて批判を受けてきた。数学的記述子は、様々な生物学的プロセス、例えば、皮膚吸収、胃腸吸収、分配、代謝及び排泄を記述することにおいて不十分である。数学的なモデルから生ずる現在の解決策は、三次元的な問題に対し二次元的なアプローチとして記載されているものが最も良い。
【００１９】
このことに基づいて、一般の経皮デリバリーシステムの設計には欠点があり、そして積極的及び活動的生物学的輸送プロセスの重要な特徴を全ては説明することができない。経皮治療を向上させるための一般の戦略は普遍的に成功してはおらず、そして更なる向上の見通しはない。特に、より広汎な薬物をデリバリーすることができる経皮デリバリーシステムの使用に対する要請がある。
【発明の開示】
【００２０】
発明の概要
ヒドロキシ基を有する医薬のリン酸誘導体は、親医薬化合物の輸送と比較した場合、驚くべきほどより早い皮膚を介する輸送を示すことが発見されている。このことは、クリーム、パッチ及びスプレーなどの形態の医薬の、治療上有効且つ皮膚の完全性に危険を及ぼす又は傷害を与えることがない、有用な局所製剤をもたらす。
【００２１】
本発明の最初の観点によれば、有効皮膚浸透量の、１もしくは複数の医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る局所製剤が提供されている。
【００２２】
本発明のこのような観点は、１もしくは複数の医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体及び０次放出をするように吸収動態を変化させる目的の１もしくは複数の持続放出系を含んで成る経皮デリバリーシステムをも提供する。
【００２３】
用語「医薬ヒドロキシ化合物」とは、本明細書中、ヒドロキシ基が立体的に妨害される傾向にはないヒドロキシ化合物からなる群から選択された医薬活性化合物を意味する。医薬ヒドロキシ化合物の例はとしては、麻酔鎮痛薬の例えば、モルヒネ及びレボルパノール、非麻酔鎮痛薬の例えば、コデイン及びアセトアミノフェン、コルチコステロイドの例えば、コルチゾン、麻酔の例えば、プロポフォル、制吐薬の例えば、スコポルアミン、交感神経興奮薬の例えば、アドレナリン及びドーパミン、抗てんかん薬の例えば、フォスフェニトイン、抗炎症薬の例えば、イブプロフェン、甲状腺ホルモン及び抗甲状腺薬の例えば、チロキシン、植物化学物質の例えば、α−ビサボロール、ユージノール、シリビン、ソイイソフラボン、イリドイド配糖体の例えば、アウクビン及びカタルポール、セスキテルペン及びラクトンの例えば、アルニカ・カミッソニス（Arnica chamissonis）に由来するシュードグアイナノリド（pseudoguaianolide）、テルペンの例えば、ローズマリー酸及びローズマノール、フェノール配糖体の例えば、サリチル酸塩のサリシン、サリゲニン及びサリサイクリック酸、トリテルペンのテキサステロール又はα−ラクトウセロール（α−lactucerol）、及びイソラクトウセロール、p-ヒドロキシフェニル酢酸誘導体のタラキサコシド（taraxacoside）、ヒドロキノン誘導体の例えば、アルブチン、フェニルアルカノンの例えば、ジンゲロール及びシャガオール、ヒペルシン、及びアシルフィルオロ糖質（acylphloroglucides）の例えば、キサントモール、ルプロン、フムロン及び２−メチルブト−３−エン−２−オルが挙げられるがそれらに限定はされない。
【００２４】
医薬ヒドロキシ化合物の特定の例は次の通りである。
【化１】
2005511725.tif 000002
【化２】
2005511725.tif 000003
【化３】
2005511725.tif 000004
【化４】
2005511725.tif 000005
【００２５】
好適に、前記医薬ヒドロキシ化合物は、エストロゲン、エストラジオール、テストステロン、アトロピン、モルヒネ及びそれらの混合物からなる群から選択されている。
【００２６】
アトロピンはナス科植物に由来するアルカロイドであり且つ有機リン酸塩系の農薬、殺虫剤又は除草剤にさらされて神経伝達が妨げられ、分泌の阻害、徐脈、散瞳、胃腸運動性の阻害、並びに毒性用量では死を生じるアドレナリンに類似する興奮作用をもたらす中毒の治療において使用されている。アトロピンは典型的に、このような状況において有効な解毒剤として使用されており、アルカロイドはムスカリン性受容体におけるアセチルコリンの競争的アンタゴニストであるので、有機リン酸塩曝露のムスカリン効果を後退せしめる。モルフィネもアルカロイドであり且つ有力な麻酔薬でもある。
【００２７】
「医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体」とは、リン酸基のリン酸原子に対して酸素が共有結合し、それにより炭素−酸素−リン酸の結合が形成されている化合物を含んで成る。酸素原子は典型的に、医薬ヒドロキシ化合物上のヒドロキシ基に由来する。このリン酸誘導体は、遊離リン酸；その塩；２分子の医薬ヒドロキシ化合物を有するフォスフェートエステル；遊離リン酸の酸素がアルキル基又は置換されているアルキル基と結合を形成するフォスファチジル化合物；又は両性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び窒素官能基を有するアミノ酸及びこれらのアミノ酸に富むタンパク質からなる群から選択された１又は複数の錯化剤との錯体; 又はこれらの混合物である。
【００２８】
医薬ヒドロキシ化合物の好適なリン酸誘導体はとしては、エストロゲンフォスフェートエステル、エストラジオールフォスフェートエステル、テストステロンフォスフェートエステル、アトロピンフォスフェートエステル、モルヒネフォスフェートエステル及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２９】
例えば、エストラジオールのリン酸誘導体の典型的な混合物としては、モノ−エストラジオールフォスフェート誘導体及びジ−エストラジオールフォスフェート誘導体が挙げられ、ここでモノ−エストラジオールフォスフェートの量は、ジ−エストラジオールフォスフェート誘導体の量に対して当モル未満である。次いで、エストラジオールフォスフェートのこのような混合物は、両性界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び窒素官能基を有するアミノ酸及び国際特許出願PCT/AU01/01476において開示されているようなこれらのアミノ酸に富むタンパク質からなる群から選択された１又は複数の錯化剤と錯体を形成して良い。
【００３０】
好適に、前記錯化剤は、アルギニン、リジン、ヒスタジン(histadine)及び第三置換アミン、例えば、次の式：
NR1R2R3
（式中、
R1は、直鎖又は枝分かれした鎖を混合したC6〜C22のアルキル基及びそれらのカルボニル誘導体を含んで成る群から選択されており；
R2及びR3は、独立して、H、CH2COOX、CH2CHOHCH2SO3X、CH2CHOHCH2OPO3X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2SO3X又はCH2CH2CHOHCH2OPO3Xを含んで成る群から選択されており且つXはH、Na、K又はR2及びR3がどちらもHではない場合にアルカノールアミンであり；そして
ここで、R1がRCOであるならばR2はCH3であって良く、そしてR3は（CH2CH2）N（C2H4OH）-H2CHOPO3又はR2及びR3が一緒にN（CH2）2N（C2H4OH）CH2COO-であって良い）
によるものから選択されている。
【００３１】
医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体の錯体の形成は、製造方法における個々の段階として生じうるかあるいはin situにて最終局所製剤中で生じうる。例えば、モルヒネホスフェートとリジンの錯体が形成されそして局所製剤を形成するために担体を加えられうる。代わりに、モルヒネフォスフェートエステルは、錯体化したリン酸塩種の例えば、ラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェートを含む担体が加えられ、そしてある場合、モルヒネホスフェートとラウリルイミノジプロピオン酸の錯体のin situ形成に至るだろう。
【００３２】
リン酸化は任意の適切な方法によって達成されうる。好適に、ヒドロキシ基を含む化合物は、国際特許出願PCT/AU00/00452中の方法によりP4O10を使用することでリン酸化されている。過剰の二リン酸誘導体は、当業界で公知の方法を使用することで加水分解されうる。
【００３３】
用語「有効皮膚浸透量」とは、本明細書中で使用されている場合、角質を浸透して皮膚の表皮及び皮層へと、皮膚病を患う患者によって示されている１又は複数の症状をある程度有効に軽減する量で到達する量を意味する。当業者は、実際の量が、ある薬物からある薬物まで多彩であることを理解するだろう。前記有効皮膚浸透量は、治療範囲内の薬物量を提供するのに十分であるだろう。ある場合において、前記皮膚有効浸透量は、一般に知られている治療薬物に関する治療I.V用量の１〜１０倍であるだろう。例えば、本発明の局所製剤中のエストラジオールフォスフェートの有効皮膚浸透量は、エストラジオールの一般に知られているIV用量の１．２倍でありうる。アトロピンフォスフェートについて、有効皮膚浸透量は、アトロピンの一般に知られているIV用量の３倍でありうる。もし一般に薬物が経口的に提供されているならば、その場合は、前記有効皮膚浸透量は一般に知られている治療上摂取可能用量の一部であり、何故なら摂取可能用量とは肝臓による即時除去を可能にしなければならないからである。
【００３４】
本発明の局所製剤は、ヒト又は他の動物の皮膚に対して、全身又は皮膚による効果を達成するため、薬物を局所的にデリバリーすることができるような、医薬当業者によって考え出された任意の適切な局所に適用されるデリバリーシステムでありうる。それとしては、クリーム、ローション、ゲル、乳濁、リポソーム、エアロゾル、パッチ、湿布薬、皮下デポット、膏薬、０次放出のために吸収動態を変化せしめる目的の持続放出系が挙げられるが、それらには限定されない。
【００３５】
用語「経皮デリバリーシステム」とは、本明細書中で使用されている場合、０次放出のために吸収動態を変化せしめる目的の持続放出系を意味する。
【００３６】
用語「許容できる担体」とは、本明細書中で使用されている場合、ヒト又は他の動物の皮膚上で局所的に使用することができる局所製剤及び経皮デリバリーシステム中で有用である医薬当業者によって考えられた担体を意味する。このことは、他の賦形剤の、例えば、皮膚浸透増進剤、溶媒、界面活性剤、皮膚軟化剤、防腐剤、着色剤及び香料の使用も含む。当業者は、本発明の製剤のために何の成分が許容できる担体として使用されて良いかを知るだろう。常用の医薬方法が、組成物のこれら共通の形態を作製することにおいて使用されて良い。
【００３７】
本発明の局所製剤のための好適な担体は、トコフェリルフォスフェートと錯体形成剤との錯体を含んで成り、そして当該錯化剤は、アルギニン、リジン、ヒスタジン及び第三置換アミン、例えば、以下の式：
NR1R2R3
（式中、
R1は、直鎖又は枝分かれした鎖を混合したC6〜C22のアルキル基及びそれらのカルボニル誘導体を含んで成る群から選択されており；
R2及びR3は、独立して、H、CH2COOX、CH2CHOHCH2SO3X、CH2CHOHCH2OPO3X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2SO3X又はCH2CH2CHOHCH2OPO3Xを含んで成る群から選択されており且つXはH、Na、K又はR2及びR3がどちらもHではない場合にアルカノールアミンであり；そしてここで、R1がRCOであるならばR2はCH3であって良く、そしてR3は（CH2CH2）N（C2H4OH）-H2CHOPO3又はR2及びR3が一緒にN（CH2）2N（C2H4OH）CH2COO-であって良い）
から選択されている。
【００３８】
一層好適に、前記担体は、ラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェートを含んで成る。
【００３９】
本発明の局所製剤のための典型的な担体は、６１.９５％の脱イオン水、５．００％のグリセリン、０．０５％のEDTA三ナトリウム、０．５０％のカルボマー(Carbopol Ultrez10)、７．５０％のラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェート、２．００％のPhoenoxolT(セテアリルアルコール及びceteareth-20)、１．００％のステアリン酸グリセリル(Emerest 2400)、５．００％のミリスチン酸イソプロピル(Pelemol IPM)、３．５０％のセチルエチルヘキサノエート（Pelemol 168）、３．５０％のベヘン酸イソセチル（Pelemol ICB）、３．００％のエルカ酸オレイル(Cetiol J-600)、０．５０％のジメチコーン(Dow 200、100cSt)、５．００％の脱イオン水、０．５０％のトリエタノールアミン(９９％)及び１．００％のGermabenII(プロピレングリコール、ジアゾリジニルウレア、メチルパラベン及びプロピルパラベン)を含んで成る。
【００４０】
本発明の第二の観点において、医薬ヒドロキシ化合物の皮膚吸収を向上させるため及び/又は長期に渡り血中量を適度に維持するための方法が供されており、当該方法は、有効皮膚浸透量の、医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る製剤を局所的に適用する段階を含んで成る。
【００４１】
本発明の第二の観点の方法は、本発明の第一の観点の局所製剤を適用することによって行われている。
【００４２】
本発明の一つの観点は、患者に対して、有効皮膚浸透量の、エストロゲンの１又は複数のリン酸誘導体及び許容できる担体を含んで成る製剤を局所的に投与することを含んで成るホルモン補充療法のための方法に関する。
【００４３】
本発明の利点は、医薬ヒドロキシ化合物の皮膚を通じての驚くべき吸収(移動)、経皮デリバリーシステムが対象者上で使用できうる有効性及び長い時間枠に関連する。
【００４４】
本発明の第三の観点によれば、対応する医薬ヒドロキシ化合物の対象者に対する投与を向上させるために、医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体の経皮デリバリーシステム中での使用を供する。
【００４５】
本発明の第四の観点によれば、
(a)対象者の皮膚に対して医薬組成物を適用するための装置；及び
(b)前記装置における医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体、
を含んで成る経皮デリバリーシステムが提供されている。
【００４６】
好適に、前記装置は、パッチ、湿布薬、ゲル、クリーム、膏薬又は０次放出へ向けて吸収動態を変化せしめる目的の他の持続放出系である。
【００４７】
医薬ヒドロキシ化合物の１もしくは複数のリン酸誘導体は、１もしくは複数の適切な希釈剤もしくは賦形剤との混合物にあって良い。
【００４８】
本発明の第五の観点によれば、医薬ヒドロキシ化合物を患者に対してデリバリーするための方法が提供されており、当該方法は、本発明の第四の観点の経皮デリバリーシステムを対象者の皮膚の一部に対し、当該医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体が当該対象者の皮膚のバリアーを介して輸送されそして血流中へと送達されるように、適用することを含んで成る。
【００４９】
本発明の第六の観点によれば、医薬ヒドロキシ化合物製剤の効果を向上せしめるための方法であって、当該方法は：
(a)医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体を形成し；そして
(b)医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体を局所製剤へと処方すること、
を含んで成り、ここで当該医薬ヒドロキシ化合物の１又は複数のリン酸誘導体は、対象者の皮膚に対し投与することによって、対応するリン酸化されていない医薬ヒドロキシ化合物製剤を上回る向上した効果を有する、方法。
【００５０】
本発明者は、医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体は、皮膚増進剤を伴わず使用した場合、リン酸化されていない医薬ヒドロキシ化合物よりも一層有意に有効に皮膚の層に浸透することを発見した。皮膚増進剤を使用する必要がないので、医薬ヒドロキシ化合物のリン酸誘導体が使用されている場合、そこに皮膚の刺激又は紅斑はない。
【００５１】
本発明は、以下の図面及び例を参照することにより一層明らかに理解され、好適な形態が説明されるだろう。
【実施例】
【００５２】
実施例
本発明を以下の限定することのない例により更に説明及び例示している。
【００５３】
実施例１
１２g(０．０３g/mol)の二ナトリウム−N−ラウリルβ−イミノジプロピオネートを８８gの蒸留水中に溶かして１２％(wt/wt)の透明な溶液(pH１２)を供した。モルヒネ−３−リン酸エステル(１１．４３g(０．０３g/mol))を徐々に加えて均一になる迄混合した。生じる産物は、水性分散体としてN−ラウリルβイミノジプロピオネート−モルヒネ(3)フォスフェートを２１．０３％(wt/wt)からなる錯体であった。この錯体産物をゲル化剤と一緒に保水性緩衝剤による希釈により処方し、そして皮膚に対して適用し、経皮ドラッグデリバリーを導いた。
【００５４】
前記錯体産物には必要に応じ、二ナトリウム−N−ラウリルβ−イミノジプロピオネートのモル比を増減することによって変更が加えられて良い。
【００５５】
実施例２
この例では、エストラジオール及びエストラジオールフォスフェートのヘアレスラットモデルにおける経皮デリバリーを評価した。
【００５６】
方法
動物： メスのアルビノヘアレスラット１１匹をイソフラン誘導麻酔の下で卵巣除去し、そして実験の前、１０日に渡り回復させた。これにより、体内から全てのエストロゲンを除去可能にした。
【００５７】
血液採取：、エストラジオール(n＝５)及びエストラジオールフォスフェート(n＝６)製剤を適用した両方の意識がはっきりしていない(conscious restrained)ラットの尻尾の血管から、０、１、２、４、８、１６及び２４時間後に血液試料(５００μl)を獲得した。血液をEDTAチューブ中へと回収し、次いで５０００rpmで１０分に渡り遠心した。血しょうを取り除いてアッセイ迄−８０℃で保存した。
【００５８】
経皮製剤の調製及び適用：エストラジオール及びエストラジオールフォスフェートは、Tocovite Pty Ltd.により提供され、そして以下のようにして調製した担体クリーム中で適用する前に約１時間に渡り２０μg/mlの濃度で調製した。
【表１】
2005511725.tif 000006
【００５９】
手順：カルボマーを除く相Aの要素とラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェートと組み合わせる。溶液が得られている場合、この溶液中でカルボマーを分散させる。相Aを適度な撹拌をしながら７０〜７５℃へと加熱し始める。急激な撹拌をしながらカルボマー粘液中でラウリルイミノジプロピオン酸トコフェリルフォスフェートを分散させる。相Bの要素を組み合わせて適度な撹拌をしながら７５〜８０℃に加熱する。そして相Aは均一且つ７０〜７５℃、そして相Bは均一且つ７５〜８０℃であり、相Bを相Aに対して適度に撹拌しながら加える。ABを５０℃に冷却せしめ、そして相Cを溶液ABに対して加える。ABCの適度な撹拌を４５℃に到達する迄続ける。相DをABCに対して加える。３５℃に至るまで適度な撹拌を続ける。
【００６０】
エストラジオールフォスフェート(EP)：４．３mgのEPを１７．３mlのアセトン中に溶かした(０．２５mg/ml)。２０μlをEppendorfチューブに移して溶媒を窒素流中で蒸発させた。次いで、０．９９９gの担体クリームを加え、そしてガラス棒で混合して遠心した。これを５回繰り返した。最終濃度＝４.９０μg/ml。
【００６１】
エストラジオール(E)：６．７mgを２６．８mlの無水エタノール中に溶かした(０．２５mg/ml)。２０μlをEppendorfチューブに移して溶媒を窒素流中で蒸発させた。次いで、１．００３gの担体クリームを加え、そしてガラス棒で混合して遠心した。これを５回繰り返した。最終濃度＝４.８９μg/ml。
【００６２】
各製剤を麻酔にかけたラットの、消えないフェルトチップマーカーで印をした約４cm2の領域の、背部皮膚に対し適用した。約３０mgの製剤(０.１７gのE又はEPを含む)を、曲がったガラス棒塗布器により前記部位に対して適用した。製剤は、それが見掛け上、皮膚の中へと吸収される迄に「消えた」。それには５〜１０分かかった。この手順中、一貫して製剤には何の変化も確認されなかった。適用した製剤の量と適用部位の領域は、各動物について重要であった。
【００６３】
器官の回収：２４時間後、モニタリング用動物を過剰量の麻酔薬により殺した。全ての器官を取り出して、重量を計りそしてアッセイする迄−８０℃で保存した。
【００６４】
合計エストロゲンRIA：RIAを、商業的に入手可能な、１７β−エストラジオール及びエストロンに対して１００％の交差反応性を有する合計エストロゲンキット(ICN Pharmaceuticals、Catalogue＃07-140250)を使用して行った。このアッセイに関する標準曲線範囲は２．５〜１００pg/ml(r2＝−０.９４３)である。抽出効率を、１組の注射アッセイにより決定し、そしてそれはジエチルエーテルをラット血しょう及び器官のいずれかのための抽出溶媒として使用することで、９０〜９８％であった。この溶媒はアッセイに干渉を及ぼさなかった。１００μlの体積の血しょうをアッセイのために使用した。
【００６５】
結果
製剤の適用：動物の背部上、製剤を適用した平均領域(±SE)は、E及びEP群についてそれぞれ３.８８±０.０３cm2及び３.８８±０.０７cm2であった。E及びEP群において適用したこれらの製剤の平均量は０.１７μgであった。
【００６６】
血しょう中の合計エストロゲン：エストロゲンの測定可能量(標準曲線範囲２.５〜１００pg/mlの間)を、両方の動物の群中、適用後２、８及び１６時間でE群において測定した最大濃度１６.３３±８.１８(平均±SE)pg/ml血しょう及び適用後１６時間でEP群において測定した最大濃度４９.１６±１３.２１pg/ml血しょうで表している(図１)。t＝０で取った基底測定値を全ての値から差し引き、血しょう中に存在するバックグランド量を補正した。
【００６７】
考察
この研究ではメスのヘアレスラットにおけるEP及びEの経皮デリバリーを評価した。血中のエストラジオールの濃度は、エストラジオールフォスフェートを２４時間を越えて適用した場合、一貫してより高かった(統計的に有意、２、４及び１６時間でP＜０．０１)。EPを当用量で適用した場合、ホルモンの血しょう濃度はE処理に比べ２倍以上になった。このことは、EP処方物はEをデリバリーするために一層有効な製剤を提供しうることを示唆する。
【００６８】
結論
このトライアルにより、エストラジオールの有用用量はヘアレスラットモデルに基づきデリバリーされて良く且つそれはヒトの皮膚に対してもヘアレスラットの特性の類似性から推定されて良いことが証明された。しかし、更に一層驚くことは、EPが、循環する血液中に遊離エストラジオールを送達し、従ってエストラジオールホスフェートがホルモン補充療法のために有効でありうることが証明された。
【００６９】
実施例３
3H−エストラジオール(3H-E)と3H−エストラジオールフォスフェート(3H-EP)のへアレスラットモデルにおける急性経皮浸透性をこのモデルで評価した。
【００７０】
方法
動物：６匹のメスのアルビノヘアレスラットをこの試験において使用した(n＝３/処理群)。
【００７１】
経皮製剤の調製及び適用：3H-Eと3H-EPはTocovite Pty Ltdによって提供されそして適用の約１時間前に実施例２で使用した担体クリーム中で適用し、製剤に調製した。
【００７２】
２０μlの3H-Eと3H-EPをアリコートで１mlのEppendorf tubeへと入れた。3H-Eと3H-EPの両方から溶媒を窒素流の下で蒸発させた。一度完全に乾燥させた担体クリーム０．４９８gを3H-Eに、そして０．５０２gを3H-EPに対して加え、ガラス棒で混合して１分に渡り遠心した。これを５回繰り返した。
【００７３】
各製剤を、麻酔にかけたラットの、消えないフェルトチップマーカーで印をした約４cm2の領域の背部皮膚に対し適用した。約３０mgの製剤(５μgの3H-E又は3H-EPを含む)を、曲がったガラス棒塗布器により前記部位に対して適用した。製剤は、それが見掛け上、皮膚の中へと吸収される迄に「消えた」。それには５〜１０分かかった。この領域に対して、動物が製剤を除去してしまわないように、テガダーム(３M)パッチを適用した。
【００７４】
結果と考察
この研究によって、EPは経皮的に適用された場合、Eよりも一層容易に吸収されたことがはっきりと証明された(図２)。この研究では、個々の皮層の分析も行ない、そして最小のE又はEPが適用の２４時間後に皮膚に残留していたことも明らかになった。より多量のEPが表皮及び真皮中で発見され、その理由は２４時間の間により多量のEPが皮膚を通じて移動することによる。これは、より一層のEPが処理時間の間に皮膚を通じて輸送されたことを示差している。
【００７５】
実施例４
この例では、テストステロンとテストステロンフォスフェートのヘアレスラットモデルにおける経皮輸送を調べた。
【００７６】
方法
動物： メスのアルビノヘアレスラット１２匹をイソフラン誘導麻酔の下で卵巣除去し、そして実験の前、１５日に渡り回復させた。
【００７７】
血液採取：テストステロン(n＝６)及びテストステロンフォスフェート(n＝６)製剤を適用した両方の意識がはっきりしていないラットの尻尾の血管から、０、１、２、４、８、１６及び２４時間後に血液試料(５００μl)を獲得した。血液をEDTAチューブ中へと回収し、次いで５０００rpmで１０分に渡り遠心した。血しょうを取り除いてアッセイ迄−８０℃で保存した。
【００７８】
経皮製剤の調製及び適用：テストステロン及びテストステロンフォスフェートは、Tocovite Pty Ltd.により提供され、そして実施例２において使用した担体クリーム中で適用する約１時間前に調製した。
【００７９】
テストステロンフォスフェート(TP)：４．４１mgのTPを１５mlの水に溶かしてエタノールで１００mlにした。１mlをEppendorfチューブに移し、そして溶媒を窒素流の下で蒸発させた。実施例２に由来する担体クリーム１．００gを加えてガラス棒で混合し、そして遠心した。これを５回繰り返した。
【００８０】
テストステロン(T)：３．９４mgのTを１５mlの水に溶かしてエタノールで１００mlにした。１mlをEppendorfチューブに移し、そして溶媒を窒素流の下で蒸発させた。実施例２に由来する担体クリーム１．００gを加えてガラス棒で混合し、そして遠心した。これを５回繰り返した。
【００８１】
各製剤を、麻酔にかけたラットの、消えないフェルトチップマーカーで印をした約４cm2の領域の背部皮膚に対し適用した。約３０mgの製剤(１μgのT又はTPを含む)を、曲がったガラス棒塗布器により前記部位に対して適用した。製剤は、それが見掛け上、皮膚の中へと吸収される迄に「消えた」。それには５〜１０分かかった。この手順中、一貫して製剤には何の変化も確認されなかった。
【００８２】
結果
製剤の適用：T及びTP群において適用したこれらの製剤の平均量は、１μg±０．０２μgであった。
【００８３】
血しょう中の合計テストステロン：テストステロンの測定可能量(標準曲線範囲２.５〜１００pg/mlの間)を、両方の動物の群中、適用後１、８及び１６時間でT群において測定した最大濃度３０.９０±１１.００(平均±SD)pg/ml血しょうで表している(図１)。t＝０で取った基底測定値を全ての値から差し引き、血しょう中におけるバックグランド量を補正した(図３)。
【００８４】
考察
テストステロン及びテストステロンフォスフェートを適用した両方の場合に血中のテストステロンの濃度が増加した。
【００８５】
実施例５
アトロピンスルフェートに比較した場合のアトロピンフォスフェートの効果をこの例で調べた。
【００８６】
アトロピンスルフェート及びリン酸緩衝液中で処方したアトロピンホスフェートを、２匹のラットそれぞれに対し静脈内(IV)２mg/kgで与え、類似する心拍数の増加がもたらされた。
【００８７】
例えば、ラットの基底心拍数は、約３５０bpmであり、そしてアトロピン(アトロピンフォスフェート又はアトロピンスルフェートのいずれか)の投与後、１５分以内に４５０bpmに増加した。約２時間後、正常な心拍数が回復した。これを心拍数の有意な変化としてみなしている。
【００８８】
これらの結果より、アトロピンフォスフェートは心拍数を上げるのに有効であることが示される。それを経皮的に適用した場合、類似する結果が得られるであろうことが予測されている。
【００８９】
本明細書中で使用されている場合、用語「comprising」及び用語「comprising」の形態は、本発明の主張を限定せず、任意の変形又追加も排除しない。
【００９０】
本発明に対する変更及び改良は当業者には明らかであるだろう。かかる変更及び改良は本発明の範囲内にあると解されている。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】約０．１７μgのエストロゲン(E)又はエストロゲンホスフェート(EP)含む製剤を適用した卵巣を切除したヘアレスラットから獲得した血しょう試料において測定した総エストロゲンにおける変化(平均±SD)である。
【図２】トリチウム化したE又はEPを含む製剤を適用した卵巣を切除したヘアレスラットにおけるトリチウム化したEPに対するトリチウム化したEの変化(％)である。
【図３】約１．００μg±０．０２μgのT又はTP含む製剤を適用した卵巣を切除したヘアレスラットから獲得した血しょう試料において測定した総テストステロンにおける変化(平均±SD)である。
【図１】
2005511725.tif 000007
【図２】
2005511725.tif 000008
【図３】
2005511725.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月26日(2004.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
Morgan,TM.、Parr,RA.、Reed,BL及びFinnin,BCによる研究（1988）Enhanced Transdermal delivery of sex hormones in swine with a novel topical aerosol.J.Parm.Sci.  Vol.87（10）:pp.1219〜1225は、浸透増進剤パジメートO（Padimate O）を使用する新規局所定量エアロゾルを使用してブタにおけるテストステロンとエストラジオールの経皮デリバリーを調べた。濃度勾配を作り出すことにより薬物吸収を刺激する試みにおいて、揮発性及び非揮発性溶媒の混合物をビヒクルとして含有する薬物溶媒システムの揮発性化合物が皮膚から蒸発して、皮膚上で飽和溶液が作り出される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
定用量装置は、効率的使用のために、調整及び手動の器用さ（manual dexterity）も必要になる。発明者は、この投与システムは柔軟性も供し且つより広い適用の表層領域を供するために動くことができうることも主張している。


【国際調査報告】
2005511725.tif 000010
2005511725.tif 000011
2005511725.tif 000012
2005511725.tif 000013
2005511725.tif 000014