(57)【要約】本発明は、改変型フィターゼについて記載する。これらのフィターゼは、特に、モデル・フィターゼの熱安定性と比較して、改変型フィターゼの熱安定性を増加させるように、モデル・フィターゼと比較して種々の位置で改変されている。この改変型フィターゼはさらに、特に、Aspergillus nigerのフィターゼの特定のアミノ酸残基がこの改変型フィターゼにおいては保持されているため、Aspergillus nigerのフィターゼの好ましい特性を保持していた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モデル・フィターゼに対してアラインメントされた場合、該モデル・フィターゼと比較して、以下の位置：
5、6、13、19、21、29、31、36、39、43、53、69、78、81、85、87、99、112、113、122、125、126、128、137、147、148、157、160、163、165、169、172、176、178、180、181、182、183、189、194、197、201、203、211、213、215、218、222、223、225、232、233、242、246、247、248、249、250、251、252、254、269、291、296、310、312、315、322、330、342、346、362、365、367、368、372、374、375、382、384、395、414、417、425、428、438、440
のうちの少なくとも１つにおいて改変されているポリペプチド。
【請求項２】
以下の改変：
5QS、6SH、13G、19P、21I、29S、31FY、36D、39A、43D、53V、69S、78EA、81K、85A、87K、99T、112Q、113M、122R、125K、126A、128A、137A、147A、148E、157A、160A、163RG、165N、169A、172V、176I、178P、180AG、181A、182STG、183Y、189H、194VA、197E、201G、203D、211TL、213A、215SA、218A、222A、223H、225P、232E、233D、242SP、246V、247A、248R、249T、250S、251D、252A、254KE、269NQ、291A、296F、310Q、312H、315T、322N、330A、342M、346F、362S、365S、367E、368E、372Y、374A、375S、382A、384A、395K、414PA、417K、425D、428RKE、438N、440AE
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の改変：
5QS、6SH、13G、19P、21I、29S、31Y、36D、39A、43D、53V、69S、78A、81K、85A、87K、99T、112Q、113M、122R、125K、126A、128A、137A、147A、148E、157A、160A、163G、165N、169A、172V、176I、178P、180G、181A、182G、183Y、189H、194A、197E、201G、203D、211L、213A、215A、218A、222A、223H、225P、232E、233D、242P、246V、247A、248R、249T、250S、251D、252A、254E、269Q、291A、296F、310Q、312H、315T、322N、330A、342M、346F、362S、365S、367E、368E、372Y、374A、375S、382A、384A、395K、414A、417K、425D、428E、438N、440E
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
モデル・フィターゼに対してアラインメントされた場合、該モデル・フィターゼと比較して、以下の位置：
31、78、163、180、182、194、211、215、242、254、269、414、428、440
のうちの少なくとも１つにおいて改変されているポリペプチド。
【請求項５】
モデル・フィターゼが以下のアミノ酸：
Q27、Y28、R58、H59、R62、P64、T65、S67、K68、Y72、D103、S140、R142、V143、E179、D188、F243、KN277、K278、H282、S337、H338、D339、N340、F380、A35、A46、N130、S141、G167、Q168、D174、T191、E199、E205、L220、T235、D244、I268、H306、G341、K356、A381
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
モデル・フィターゼが以下のアミノ酸：
Q27、Y28、R58、H59、G60、R62、Y63、P64、T65、DE66、S67、K68、K71、Y72、D103、S140、R142、V143、E179、D188、E196、D239、F243、G274、KN277、K278、H282、S337、H338、D339、N340、G341、V378、F380、A35、A46、N130、S141、G167、Q168、D174、T191、E199、E205、L220、T235、D244、I268、H306、G341、K356、A381
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、以下の突然変異：31Y、78A、163G、180G、182G、194A、211L、215A、242P、254E、269Q、414A、428E、440Eのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
モデル・フィターゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号３、配列番号５または配列番号７である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドに対して、少なくとも91％、好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％または最も好ましくは少なくとも99％の配列相同性(同一性)を有するポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
DNAである請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４または配列番号６を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１５】
ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が機能し得る形で調節配列に連結されている発現ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
異種タンパク質として、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４もしくは１５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの発現がもたらされる条件下で、請求項１６または１７に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改変型フィターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィテートは、リン酸の貯蔵形態として植物中に豊富に存在する。単胃動物はフィテートからリン酸を遊離することができず、従って、それらの飼料に対してリン酸の補充を必要とする。現在では、フィテートからリン酸を遊離させるために、フィターゼ酵素を動物飼料に補充している。
【０００３】
典型的には、フィターゼを、飼料の製造過程中に動物飼料に添加する。動物飼料の生産工程のいくつかの段階において、フィターゼは、比較的高温かつ比較的高湿な状態に置かれる。これらの状態は酵素のような不安定な化合物の活性に対してネガティブな影響を与える。
【０００４】
Aspergillus nigerから誘導されるフィターゼが、そのフィターゼの好ましい性質のために飼料用途に一般的に用いられる。例えば、それは酸性範囲における広い最適pH、比較的高い比活性を伴った広い特異性およびフィチン酸に対する高い親和性を有するので、低いフィチン酸濃度でも、この酵素はフィチン酸を効率良く分解する。それはさらに、中間体を有意に蓄積することなくフィテートから６個のリン酸のうちの５個を全くスムーズに除去し、また活性または安定性のためにコファクターを必要とせず、そして飼料の成分および金属イオンによる阻害に対してそれほど感受性が高くない。
【０００５】
しかしながら、Aspergillus nigerのフィターゼの熱安定性は比較的低い。従って、Aspergillus nigerのフィターゼと同じ好ましい性質を、高温での高い安定性および活性と組み合わせて有するフィターゼに対する必要性が存在する。
【０００６】
本発明は、例えば、高温および高い湿度に対する耐性に関して好ましい性質を有する改変型フィターゼを開示する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明の内容においては、フィターゼは、フィテート(ミオイノシトールヘキサキスリン酸)の、以下の化合物：ミオイノシトールペンタ-、テトラ-、トリ-、ジ-およびモノ-リン酸ならびに／またはミオイノシトールのうちの1種以上への加水分解を、触媒する酵素である。これに関して、いくつかのフィターゼは実質的にミオイノシトールモノリン酸をミオイノシトールに加水分解することができないことは一般的に知られている。フィターゼ酵素は、加水分解される第1のエステル結合の位置に関して、3-フィターゼまたは6-フィターゼ(それぞれEC 3.1.3.8またはEC 3.1.3.26)であってよい。
【０００８】
本発明の第1の態様は、改変型フィターゼであるポリペプチドに関する。本発明によるポリペプチドは、モデル・フィターゼに対してアラインメントされた場合に、本発明によるポリペプチドが、モデル・フィターゼに存在するアミノ酸の異なるアミノ酸への置換、モデル・フィターゼに存在するアミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入からなる群より選択される改変を含むように、モデル・フィターゼと比較して改変されている。モデル・フィターゼに対する本発明によるポリペプチドのアラインメントを、本発明によるポリペプチドとモデル・フィターゼの間で相同な(同一の)残基が最大数になるように行う。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態においては、前記改変は置換である。
【００１０】
改変数は少なくとも1個、より好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも30個、より好ましくは少なくとも40個、より好ましくは少なくとも50個、より好ましくは少なくとも70個、より好ましくは少なくとも80個であってよい。
【００１１】
本発明においては、例えば、「5QS」のような表示は、問題のモデル・フィターゼの位置5のアミノ酸がQまたはSで置換されていることを意味する。元のアミノ酸残基の性質は、用いるモデル・フィターゼによる。例えば、「Q5S」のような表示は、モデル・フィターゼに存在する特定のアミノ酸残基、例えば、Qが、異なるアミノ酸、例えば、Sで置換されていることを意味する。
【００１２】
改変型フィターゼは、モデル・フィターゼと比較して、好ましくは以下の位置：5、6、13、19、21、29、31、36、39、43、53、69、78、81、85、87、99、112、113、122、125、126、128、137、147、148、157、160、163、165、169、172、176、178、180、181、182、183、189、194、197、201、203、211、213、215、218、222、223、225、232、233、242、246、247、248、249、250、251、252、254、269、291、296、310、312、315、322、330、342、346、362、365、367、368、372、374、375、382、384、395、414、417、425、428、438、440のうちの少なくとも1つにおいて；または好ましくは以下の位置：13、19、21、29、31、36、39、43、53、69、78、81、85、87、99、112、113、122、125、126、128、137、147、148、157、160、163、165、169、172、176、178、180、181、182、183、189、194、197、201、203、211、213、215、218、222、223、225、232、233、242、246、247、248、249、250、251、252、254、269、291、296、310、312、315、322、330、342、346、362、365、367、368、372、374、375、382、384、395、414、417、425、428、438、440のうちの少なくとも1つにおいて；または好ましくは以下の位置：13、19、21、29、36、39、43、53、69、81、85、87、99、112、113、122、125、126、128、137、147、148、157、160、165、169、172、176、178、181、183、189、197、201、203、213、218、222、223、225、232、233、246、247、248、249、250、251、252、291、296、310、312、315、322、330、342、346、362、365、367、368、372、374、375、382、384、395、417、425、438、440のうちの少なくとも1つにおいて、改変されている。さらにより好ましくは、前記改変型フィターゼは、モデル・フィターゼと比較して、以下の位置：31、78、163、180、182、194、211、215、242、254、269、414、428、440のうちの少なくとも1つにおいて改変されている。
【００１３】
特に、改変型フィターゼは、モデル・フィターゼと比較して、以下の改変：5QS、6SH、13G、19P、21I、29S、31FY、36D、39A、43D、53V、69S、78EA、81K、85A、87K、99T、112Q、113M、122R、125K、126A、128A、137A、147A、148E、157A、160A、163RG、165N、169A、172V、176I、178P、180AG、181A、182STG、183Y、189H、194VA、197E、201G、203D、211TL、213A、215SA、218A、222A、223H、225P、232E、233D、242SP、246V、247A、248R、249T、250S、251D、252A、254KE、269NQ、291A、296F、310Q、312H、315T、322N、330A、342M、346F、362S、365S、367E、368E、372Y、374A、375S、382A、384A、395K、414PA、417K、425D、428RKE、438N、440AEのうちの少なくとも１つ；またはより好ましくは、モデル・フィターゼと比較して、以下の改変：5QS、6SH、13G、19P、21I、29S、31Y、36D、39A、43D、53V、69S、78A、81K、85A、87K、99T、112Q、113M、122R、125K、126A、128A、137A、147A、148E、157A、160A、163G、165N、169A、172V、176I、178P、180G、181A、182G、183Y、189H、194A、197E、201G、203D、211L、213A、215A、218A、222A、223H、225P、232E、233D、242P、246V、247A、248R、249T、250S、251D、252A、254E、269Q、291A、296F、310Q、312H、315T、322N、330A、342M、346F、362S、365S、367E、368E、372Y、374A、375S、382A、384A、395K、414A、417K、425D、428E、438N、440Eのうちの少なくとも１つを含む。
【００１４】
最も好ましくは、改変型フィターゼは、モデル・フィターゼと比較して、以下の改変：31Y、78A、163G、180G、182G、194A、211L、215A、242P、254E、269Q、414A、428E、440Eのうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
本発明を通して用いられる位置番号は、配列番号１の位置番号に従うものとする。
【００１６】
本発明で用いるモデル・フィターゼは、Aspergillus属由来、好ましくはAspergillus niger由来の糸状菌から入手可能なフィターゼ、またはこれらのフィターゼのいずれかから誘導される変異型フィターゼである。ここで、Aspergillus niger種の個々の株内のフィターゼは低い程度の変異を示し、すなわち、これらのフィターゼの相同性は少なくとも90％であることが知られている。また、Aspergillus niger種はAspergillus ficuumおよびAspergillus awamoriとして以前は知られていた種を含むことも分かっている。最も好ましくは、モデル・フィターゼは、配列番号１に示されるような、Aspergillus niger NRRL 3135から入手可能なフィターゼである。
【００１７】
特に好ましいモデル・フィターゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）フィターゼに固有に存在する特定のアミノ酸残基の組合せを含むフィターゼである。
【００１８】
この特に好ましいモデル・フィターゼは、その活性部位中に、Aspergillus nigerフィターゼの対応する位置に存在するアミノ酸と同じアミノ酸残基を含む。この目的のために、本発明は、結合したフィテートの特定の距離内に存在するAspergillus nigerフィターゼの活性部位中のこれらの残基を定める方法を開示する。
【００１９】
Aspergillus nigerフィターゼの活性部位を形成し、またAspergillus nigerフィターゼによるフィチン酸の分解における触媒特性と関連するアミノ酸残基を、エントリー1IHP(Kostrewaら、Nature Structural Biology, 1997, 4, 185)としてProtein Data Bank (PDB)から入手可能なAspergillus nigerフィターゼの3D構造を用いて同定した。Aspergillus nigerの3D構造は基質フィチン酸(ミオ-イノシトールヘキサキスリン酸)を含まない。しかしながら、フィチン酸と複合体化した大腸菌（E. coli）フィターゼの3D構造が利用可能である(PDBエントリー1DKQ、Limら、Nature Structural Biology, 2000, 7, 108)。配列相同性は低いが、両フィターゼはかなりの構造類似性を示す。Aspergillus nigerフィターゼ(1IHP)と大腸菌フィターゼの原子座標の重ね合せを、両方のフィターゼにおいて類似した折畳みパターンを示すそれらの残基のα炭素原子のみを用いて開始した。続いて、重ね合せに含められた残基数を、重ね合せのさらなる改善が得られなくなるまで、反復プロセスにおいて拡張させた。重ね合せの質を、重ね合せに用いた原子の２乗平均平方根偏差を用いて判断した。最後の重ね合せにおいて、アミノ酸断片1DKQ：6-22、46-66、83-106、246-257、268-278、296-313、328-338、346-351、375-381、392-398を、1IHP:48-64、104-124、133-156、270-281、293-303、331-348、379-389、397-402、406-412、422-428上に重ね合わせた。
【００２０】
重ね合せの後、基質フィチン酸を、大腸菌フィターゼの活性部位から選び取り、Aspergillus nigerフィターゼにおける対応する部位に導入した。続いて、フィチン酸と複合体化したAspergillus nigerフィターゼを、残りの構造を固定させながら基質と活性部位残基を移動させるエネルギー最小化にかけた。エネルギー最小化は、SGI Octaneワークステーションを用いる力場CVFFを備えたInsight & Discoverプログラム(Accelrys, San Diego CA)を用いて行った。フィチン酸と複合体化したAspergillus nigerフィターゼについて得られるモデルを、IHP-Sとしてコード化した。基質フィチン酸のいずれかの原子から7Åの距離内に少なくとも1個の原子を有するそれらのアミノ酸残基について、溶媒が接近可能な表面を算出することにより、フィチン酸を完全に収容したポケットの輪郭を描く滑らかで連続した表面が得られた。この活性部位ポケットに寄与する残基の原子座標を図1に示す。さらに、IHP-Sモデルを用いて、基質周辺の異なる領域の残基を同定した。結果を図2に示す。
【００２１】
かくして、本発明の内容においては、Aspergillus nigerフィターゼの活性部位アミノ酸残基は、活性部位で結合した場合に、フィチン酸から一定の距離内にあるアミノ酸残基である。好ましくは、前記距離は6Å、より好ましくは7Åである。
【００２２】
かくして、特に好ましいモデル・フィターゼは、アミノ酸Q27、Y28、R58、H59、R62、P64、T65、S67、K68、Y72、D103、S140、R142、V143、E179、D188、F243、KN277、K278、H282、S337、H338、D339、N340、F380 (6Å以内の距離)、好ましくはアミノ酸Q27、Y28、R58、H59、G60、R62、Y63、P64、T65、DE66、S67、K68、K71、Y72、D103、S140、R142、V143、E179、D188、E196、D239、F243、Q274、KN277、K278、H282、S337、H338、D339、N340、G341、V378、F380(7Å以内の距離)を含む。
【００２３】
特に好ましいモデル・フィターゼはさらに、Aspergillus nigerフィターゼ中に存在する以下のアミノ酸：A35、A46、N130、S141、G167、Q168、D174、T191、E199、E205、L220、T235、D244、I268、H306、G341、K356、A381を含む。
【００２４】
特定されない位置では、どのアミノ酸残基が存在するかは本発明にとって重要ではない。そのような特定されない位置は、Aspergillus nigerフィターゼの活性部位内にはなく、上記でさらに特定されたAspergillus nigerのアミノ酸ではなく、上記で特定された特定の改変を受けない位置である。一般的に知られるアラインメントプログラムを用いるフィターゼのアラインメントは、アミノ酸が典型的には特定の位置に生じることを示すであろう。本発明のポリペプチド中の対応する特定されない位置には、そのようなアミノ酸のいずれか1個が存在してもよい。
【００２５】
かくして、本発明による好ましいポリペプチドは、その活性部位に、Aspergillus nigerフィターゼの対応する位置に存在するアミノ酸、並びにAspergillus nigerのさらに特定されたアミノ酸(すなわち、A35、A46、N130、S141、G167、Q168、D174、T191、E199、E205、L220、T235、D244、I268、H306、G341、K356、A381)と同じアミノ酸残基を含み、さらに上記の特定された改変を含むフィターゼである。
【００２６】
本発明による特に好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸残基：31Y、78A、163G、180G、182G、194A、211L、215A、242P、254E、269Q、414A、428Eおよび／または440Eのうちの少なくとも1つをさらに含むフィターゼである。本発明による別の特に好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸残基：180G、182G、242Pおよび／もしくは440Eのうちの少なくとも1つ；または好ましくは少なくとも180G、182Gおよび／または242Pを含む。
【００２７】
特に、本発明は配列番号3、配列番号5または配列番号7に記載の改変型フィターゼであるポリペプチドを開示する。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、上記で説明した改変を全て含んでもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、改変が該ポリペプチドの折畳みまたは活性に影響しないポリペプチド中の位置に関係するさらなる改変を含んでもよい。典型的には、そのような改変は保存的置換、すなわち、非極性アミノ酸、極性非荷電アミノ酸、極性荷電アミノ酸または芳香族アミノ酸が同じカテゴリーに由来する異なるアミノ酸に置換される置換であってもよい。
【００２９】
一実施形態においては、本発明のポリペプチドは、配列番号3、配列番号5または配列番号7と少なくとも91％、好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％またはより好ましくは少なくとも99％の配列相同性(同一性)を有するポリペプチドを含んでもよい。
【００３０】
モデル・フィターゼと比較して、改変型フィターゼを製造するのに用いる宿主生物内において熱安定性を増加させるように、および／または比活性を改変するように、および／または特定の基質に対する特異性を改変するように、および／または酵素の最適pHを改変するように、および／またはペレット安定性を改良するように、および／または生体有効性を改良するように、および／または発現、輸送、成熟などを改良するように、本発明によるポリペプチドを改変する。
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドは、Aspergillus nigerフィターゼ、特に、Aspergillus niger NRRL 3135から得られるフィターゼの生化学的特性のいくつかを保持している。保持されている生化学的特性はKm値および／または約5.5と2.5の2つのpH値の最適pHおよび／または比活性および／または生理学的温度での高い活性である。
【００３２】
好ましい実施形態においては、本発明によるポリペプチドは増加した熱安定性を得る。モデル・フィターゼと比較して、本発明による改変型フィターゼの熱安定性の増加は、所与の上昇した温度でのより長い半減期および／または改善された再折畳み／再活性化特性および／またはより高温でのアンフォールディングによって示され得る。
【００３３】
驚くべきことに、本発明によるポリペプチドは、Aspergillus nigerフィターゼのいくつかの好ましい特性と、増加した熱安定性とを併せ持つ。
【００３４】
本発明のポリペプチドの熱安定性または活性などにとって重要であり、従って置換される可能性のあるアミノ酸を、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発などの、当業界で公知の手順に従って同定および改変することができる。後者の技術においては、分子中の各残基に突然変異を導入し、得られた突然変異分子の生物活性(例えば、フィターゼ活性)を試験して、該分子の活性にとって重要であるアミノ酸残基を同定する。酵素-基質相互作用の部位を、核磁気共鳴、結晶学的標識化もしくは光親和性標識化または分子モデリングなどの技術により決定されるような結晶構造の分析によって決定することもできる。
【００３５】
本発明のポリペプチドを、合成手段により製造することができるが、通常は、それらを、好適な宿主生物中での該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現により組換え的に作製する。
【００３６】
本発明の組換え発現産物に最適な生物活性を付与するのに必要である翻訳後修飾(例えば、タンパク質分解プロセシング、ミリスチン化、グリコシル化、トランケーション、およびチロシン、セリンもしくはトレオニンのリン酸化)を提供するためには、酵母および菌類の宿主細胞の使用が予想される。
【００３７】
本発明のポリペプチドを、それらがその天然の細胞内環境の外に存在するような形態で提供することができる。すなわち、それらを、上記で考察したようにして、実質的に単離もしくは精製することができ、またはそれらが天然では生じない細胞、例えば、他の菌類種、動物、酵母もしくは細菌の細胞中で、製造することができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドを、当業者には公知の任意の好適なアッセイにより分析し、当業界で公知のモデル・フィターゼと比較して改善を評価することができる。
【００３９】
第2の態様において、本発明は第1の態様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む(例えば、単離および／または精製された)ポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号3、配列番号5もしくは配列番号7に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは配列番号2、配列番号4もしくは配列番号6を含むポリヌクレオチドを提供する。第2の態様のポリヌクレオチドはさらに、第1の態様のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の任意の縮重型を含む。例えば、当業者であれば、日常的な技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質配列に影響しないヌクレオチド置換を作製して、本発明のポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映させることができるであろう。
【００４０】
第2の態様のポリヌクレオチド配列はRNAでもDNAであってもよく、ゲノムDNA、合成DNAもしくはcDNAを含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドはDNA配列である。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドを、当業界で周知の方法に従って合成することができる。これらを、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に従って、かつこれに沿って合成されたオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより製造することができる。あるいは、これらを、任意の所望の位置で親ポリヌクレオチドを突然変異させることにより合成することができる。
【００４２】
例えば、本発明のポリヌクレオチドを、約20ヌクレオチドの重複を有する、長さ80ヌクレオチドの一連の合成オリゴヌクレオチドから構築する。典型的には10工程のPCRを、全80マーのオリゴヌクレオチドに対して校正活性を有するポリメラーゼを用いて実施して、前記オリゴヌクレオチドをアニールさせ、伸長させる。さらに、校正ポリメラーゼを用いるPCRを、所望の断片の5'および3'末端に配置されたPCRプライマーを用いて実施して、完全な所望の断片を合成する。完全な断片を好適なベクター中にクローニングし、配列決定して、正確な配列が得られるか否かを確証する。必要に応じて、例えば、Stratagene社のQuickChangeキットを、製造業者の説明書に従って用いて、配列の誤りを補正することができる。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドを用いて、例えば、本発明のポリヌクレオチドを突然変異誘発技術にかけることによって、さらに改変されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得することができる。部位特異的突然変異誘発を用いて、1個以上の特定の部位で本発明のポリヌクレオチドを変更することができる。遺伝子シャッフリング技術(例えば、WO95/22625、WO98/27230、WO98/01581および／またはWO00/46344に開示されたもの)を用いて、1個以上の本発明によるポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの出発集団の任意のメンバーに存在する任意の変異位置のランダムな組合せを有するポリヌクレオチド変異型を取得することができる。
【００４４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、クローニングベクターおよび発現ベクターも提供する。
【００４５】
本発明の発現カセットまたはポリヌクレオチドを挿入するベクターは、組換えDNA法に都合よく供することができる任意のベクターであってよく、またこのベクターの選択は、それを導入しようとする宿主細胞に依存することが多い。従って、このベクターは自律複製ベクター、すなわち、染色体外に存在するベクターであってよく、通常は複製起点を有するという前提で、その複製は染色体の複製とは独立しており、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターまたはファージベクターなどが挙げられる。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってよい。このベクターは環状のポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、または線状のポリヌクレオチド、例えば、発現カセットであってよい。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドを発現カセット中に挿入することが好ましい。発現カセット中で、本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるそのコード配列からのポリペプチドの発現をもたらし得る調節配列に機能しうる形で連結されており、すなわち、前記ベクターは発現ベクターである。用語「機能しうる形で連結された」は、記載された成分が、それらの意図された様式でそれらを機能させることができる関係にある並列を指す。コード配列に「機能しうる形で連結された」プロモーター、エンハンサーまたは別の発現調節シグナルなどの調節配列を、そのコード配列からのポリヌクレオチドの発現が該調節配列に適合する条件下で達成されるように配置する。
【００４７】
所与の宿主細胞のための発現カセットは、第1の態様のポリペプチドをコードする配列のコード鎖に関して5'末端から3'末端へ連続した順序で、互いに機能し得る形で連結された以下のエレメント：所与の宿主細胞中で前記ポリペプチドをコードするDNA配列の転写を指令することができるプロモーター配列；必要に応じて、所与の宿主細胞から培養培地への前記ポリペプチドの分泌を指令することができるシグナル配列；成熟した、好ましくは活性な形態の前記ポリペプチドをコードするDNA配列；およびそして好ましくは、前記ポリペプチドをコードするDNA配列の下流の転写を終結させることができる転写終結領域(ターミネーター)を、含んでもよい。
【００４８】
本発明のポリペプチドの天然の前駆物質をコードする遺伝子の本来のプロモーターとは別に、他のプロモーターを用いて、本発明のポリペプチドの発現を指令することができる。このプロモーターを、所望の発現宿主において、本発明のポリペプチドの発現を指令するその効率について選択することができる。
【００４９】
プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを、発現カセットまたはベクターを設計する対象とする宿主細胞に適合するように選択することができる。このプロモーター配列を高度に発現される遺伝子から誘導するのが好ましい。本発明の内容においては、高度に発現される遺伝子は、例えば、誘導条件下で、そのmRNAが全細胞性mRNAの少なくとも0.01％(w/w)を構成する遺伝子であるか、あるいは、その遺伝子産物が全細胞性タンパク質の少なくとも0.2％(w/w)を構成する遺伝子であるか、または、分泌される遺伝子産物の場合には、それが少なくとも0.05 g/lのレベルまで分泌され得る遺伝子である。好ましくはプロモーターを得る由来であり、および／または発現カセットを組込むための好ましい所定の標的遺伝子座に含まれている高発現される好適な遺伝子の例としては、限定されるものではないが、トリオース-リン酸イソメラーゼ(TPI)、グリセルアルデヒド-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ピルビン酸キナーゼ(PYK)、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)などの解糖酵素をコードする遺伝子、ならびにアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルコール(メタノール)オキシダーゼ、伸長因子およびリボソームタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。好適な高発現される遺伝子の具体例としては、例えば、Kluyveromyces sp.由来のLAC4遺伝子、それぞれハンゼヌラ（Hansenula）およびピキア（Pichia）由来のメタノールオキシダーゼ遺伝子(AOXおよびMOX)、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）およびアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）由来のグルコアミラーゼ(glaA)遺伝子、アスペルギルス・オリゼ（A.oryzae）のTAKA-アミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニドランス（A.nidulans）のgpdA遺伝子ならびにトリコデルマ・リーセイ（T.reesei）のセロビオヒドロラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００５０】
細菌中で発現させるために、原核生物プロモーター、特に大腸菌株における使用にとって好適な原核生物プロモーターを用いることができる。強力な細菌プロモーターの例は、α-アミラーゼおよびSpo2プロモーターならびに細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターである。
【００５１】
酵母プロモーターとしては、サッカロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）のGAL4およびADHプロモーター、サッカロミセス・ポンベ（S.pombe）のnmt1およびadhプロモーターが挙げられる。強力な酵母プロモーターの例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよびトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるプロモーターである。
【００５２】
菌類の発現宿主における使用にとって好ましい強力な構成性および／または誘導性プロモーターの例は、キシラナーゼ(xlnA)、フィターゼ、ATP-シンテターゼ、サブユニット9(oliC)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpi)、アルコールデヒドロゲナーゼ(AdhA)、α-アミラーゼ(amy)、アミログルコシダーゼ(glaA遺伝子由来のAG)、アセトアミダーゼ(amdS)およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)の菌類遺伝子から得られるプロモーターである。
【００５３】
植物細胞にとって好適なプロモーターとしては、ノパリンシンターゼ(nos)、オクトピンシンターゼ(ocs)、マンノピンシンターゼ(mas)、リブロース小サブユニット(rubisco ssu)、ヒストン、コメアクチン、ファセオリン、カリフラワーモザイクウイルス(CMV)35Sおよび19Sならびにサルコウイルスプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターは全て、当業界で容易に入手できる。
【００５４】
前記ポリペプチドを、分泌タンパク質として産生させる場合、発現カセット中で成熟形態のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能し得る形で連結する。
【００５５】
このシグナル配列は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にとって本来の(同種の)ものであるのが好ましい。本発明の好ましい実施形態においては、このシグナル配列はAspergillus nigerフィターゼ遺伝子から得られるものであり、特に、EP 0 420 358に開示されたシグナル配列である。あるいは、このシグナル配列は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にとって外来性(異種性)のものであり、その場合には、シグナル配列はDNA配列を発現させる宿主細胞にとって内因性のものであるのが好ましい。前記シグナル配列を、該シグナル配列を得る由来とするコード配列の発現を駆動するプロモーターと組み合わせて、例えば、Aspergillus (niger)アミログルコシダーゼ((グルコ)アミラーゼとも呼ばれる)プロモーターをアミログルコシダーゼ(AG)遺伝子由来のシグナル配列と組み合わせて(いずれも18個および24個のアミノ酸変異を有する)、ならびに他のプロモーターと組み合せて、用いることができる。
【００５６】
本発明の内容の範囲内で、ハイブリッドシグナル配列を用いることもできる。酵母宿主細胞の好適なシグナル配列の例は、酵母α-因子遺伝子に由来するシグナル配列である。細菌にとって好適なシグナル配列はα-アミラーゼ遺伝子(Bacillus)由来のものである。
【００５７】
いくつかの事例において、分泌経路を通じたポリペプチドの経過の間のシグナルペプチドの切断は2個以上の位置で起こり、これが可変N末端を有する成熟ポリペプチドに関係する。本発明は、そのような可変N末端を有するポリペプチドを包含する。
【００５８】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の下流には、1個以上の転写終結部位(例えば、ターミネーター)を含む3'非翻訳領域が存在してもよい。このターミネーターの始点は重要ではない。このターミネーターは、例えば、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にとって本来のものであってもよい。しかしながら、酵母宿主細胞においては酵母ターミネーターを使用し、糸状菌宿主細胞においては糸状菌ターミネーターを使用するのが好ましい。このターミネーターは、(前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現させるための)宿主細胞にとって内因性のものであるのがより好ましい。
【００５９】
前記ベクターは大多数の非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択を可能にする1個以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００６０】
好ましい選択マーカーとしては、限定されるものではないが、宿主細胞中での欠陥を相補するものか、または薬剤に対する耐性を付与するものが挙げられる。それらのものとしては、例えば、アセトアミダーゼの遺伝子もしくはcDNA(A.nidulans、A.orizae、もしくはA.niger由来のamdS、niaD、facA遺伝子もしくはcDNA)、またはG418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、フレオマイシンもしくはベノミル耐性(benA)などの抗生物質に対する耐性をもたらす遺伝子などの多くの糸状菌および酵母の形質転換に用いることができる様々なマーカー遺伝子が挙げられる。あるいは、対応する突然変異宿主株を必要とする栄養要求性マーカー：例えば、URA3(S.cerevisiae由来のものもしくは他の酵母由来の類似遺伝子)、pyrGもしくはpyrA(A.nidulansもしくはA.niger由来)、argB(A.nidulansもしくはA.niger由来)またはtrpCなどの特異的選択マーカーを用いることができる。好ましい実施形態においては、選択マーカー遺伝子を含まないポリペプチドを産生することができる形質転換された宿主細胞を得るために、発現構築物の導入後に形質転換された宿主細胞から前記選択マーカーを欠失させる。
【００６１】
他のマーカーとしては、ATPシンテターゼ、サブユニット9(oliC)、オロチジン-5'-リン酸-デカルボキシラーゼ(pvrA)、細菌G418耐性遺伝子(これは、菌類ではなく、酵母中で用いることもできる)、アンピシリン耐性遺伝子(大腸菌)、ネオマイシン耐性遺伝子(バチルス(Bacillus))およびβ-グルクロニダーゼ(GUS)をコードする大腸菌uidA遺伝子が挙げられる。ベクターを、例えば、RNAの産生のためにin vitroで用いることができ、または宿主細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するのに用いることができる。
【００６２】
前記ポリペプチドをコードするDNA配列を、発現カセットの一部として、好適な宿主中に導入するのが好ましい。発現カセットを用いた好適な宿主の形質転換については、当業者には周知の形質転換法が利用可能である。この発現カセットを、選択マーカーを担持するベクターの一部として、宿主の形質転換に用いることができ、またはこの発現カセットを、選択マーカーを担持するベクターと一緒に、別個の分子として同時形質転換することもできる。このベクターは、1個以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００６３】
多くの糸状菌および酵母について、安定な形質転換体を得るためには、前記ベクターまたは発現構築物を宿主細胞のゲノム中に組み込むのが好ましい。しかしながら、特定の酵母については、発現構築物を安定かつ高レベルの発現のために組み込むことができる好適なエピソームベクターが利用可能である。その例としては、それぞれサッカロミセス(Saccharomyces)およびクリュイベロミセス(Kluyveromyces)の2μおよびpKD1プラスミドに由来するベクター、またはAMA配列(例えば、Aspergillus由来のAMA1)を含むベクターが挙げられる。前記発現構築物を宿主細胞のゲノムに組み込む場合、この構築物をゲノム中のランダムな遺伝子座に組み込むか、またはこの場合に高発現される遺伝子を含むことが好ましい所定の標的遺伝子座に相同組換えを用いて組み込む。好適な高発現される遺伝子の多くの例が以前に提供されている。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞も提供される。このポリヌクレオチドは宿主細胞のゲノムにとって異種性のものであってよい。本明細書において、用語「異種」は、そのポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム中に天然に生じるものではないか、またはそのポリペプチドがその宿主細胞により天然に産生されないことを意味する。
【００６５】
好適な宿主細胞は、好ましくは細菌などの原核性微生物であり、またはより好ましくは、真核生物、例えば、酵母もしくは糸状菌などの菌類、または植物細胞である。
【００６６】
バチルス属由来の細菌は、培養培地中にタンパク質を分泌することができるため、異種性宿主として非常に好適である。宿主として好適な他の細菌はStreptomycesおよびPseudomonas属に由来するものである。
【００６７】
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列の発現のための好ましい酵母宿主細胞は、Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula、Pichia、Yarrowia、およびSchizosaccharomyces属のものである。より好ましくは、酵母宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces marxianus var. lactisとしても知られる)、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Yarrowia lipolytica、およびSchizosaccharomyces pombe種からなる群より選択される。
【００６８】
最も好ましいのは糸状菌宿主細胞である。好ましい糸状菌宿主細胞は、Aspergillus、Trichoderma、Fusarium、Disporotrichum、Penicillium、Acremonium、Neurospora、Thermoascus、Myceliophtora、Sporotrichum、Thielavia、およびTalaromyces属からなる群より選択される。より好ましくは、糸状菌宿主細胞は、Aspergillus oyzae、Aspergillus sojae、Aspergillus nidulans種のものであるか、またはAspergillus niger群(RaperおよびFennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965により定義された)に由来する種のものである。これらとしては、限定されるものではないが、Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus tubingensis、Aspergillus aculeatus、Aspergillus foetidus、Aspergillus nidulans、Aspergillus japonicus、Aspergillus oryzaeおよびAspergillus ficuum、ならびに、さらにTrichoderma reesei、Fusarium graminearum、Penicillium chrysogenum、Acremonium alabamense、Neurospora crassa、Myceliophtora thermophilum、Sporotrichum cellulophilum、Disporotrichum dimorphosporumおよびThielavia terrestrisからなる種が挙げられる。
【００６９】
本発明の範囲内での好ましい発現宿主の例は、Aspergillus種およびTrichoderma種などの菌類；Bacillus種、例えば、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Pseudomonas種などの細菌；ならびにKluyveromyces種、例えば、Kluyveromyces lactis、およびSaccharomyces種、例えば、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母である。
【００７０】
本発明による宿主細胞としてはさらに、植物細胞が挙げられ、従って本発明は、1個以上の本発明の細胞を含む、植物およびその一部などであるトランスジェニック生物に拡張される。従って、このトランスジェニック(または遺伝的に改変された)植物は、1種以上の本発明のポリペプチドをコードする配列を、そのゲノム中に挿入した(例えば、安定的に)ものであってもよい。植物細胞の形質転換を、公知の技術、例えば、Agrobacterium tumefaciensに由来するTiまたはRiプラスミドを用いて実施することができる。かくして、前記プラスミド(またはベクター)は植物に感染するのに必要な配列を含んでもよく、Tiおよび／またはRiプラスミドの誘導体を用いてもよい。
【００７１】
あるいは、葉、根または茎などの、植物の一部を直接感染させることができる。この技術においては、感染させようとする植物を、例えばかみそりを用いて植物を切断することにより、または針を用いて植物を刺すことにより、または研磨剤を用いて植物を擦ることにより、傷つければよい。次いで、この傷にアグロバクテリア菌(Agrobacterium)を接種する。
【００７２】
次いで、この植物または植物の一部を、好適な培地上で成長させ、成熟植物に発生させることができる。遺伝的に改変された植物への形質転換細胞の再生は、公知の技術を用いることにより、例えば、抗生物質を用いて形質転換されたシュートを選択することにより、ならびにこのシュートを、好適な栄養素、植物ホルモンなどを含む培地上で継代培養することにより、達成することができる。
【００７３】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを用いて、形質転換もしくはトランスフェクトされたか、またはこれを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドの複製および前記ポリペプチドの発現のためにベクター中に担持させる。この細胞は、前記ベクターと適合するように選択することができ、またこれは例えば、原核(例えば、細菌)細胞、菌類細胞、酵母細胞または植物細胞であってもよい。
【００７４】
本発明のポリペプチドを、本発明のポリペプチドと類似した活性を有する他のポリペプチドを実質的に含まない形態で産生する異種宿主を選択することもできる。これを、類似した活性を有するそのようなポリペプチドを通常は産生しない宿主を選択することにより達成することができる。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドを、複製可能な組換えベクター中に組込む場合、このベクターを用いて、適合性のある宿主細胞中で該ポリヌクレオチドを複製することができる。
【００７６】
かくして、さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、このベクターを適合性のある宿主細胞中に導入し、およびこの宿主細胞を、該ベクターの複製をもたらす条件下で増殖させることにより、本発明によるポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターを、前記宿主細胞から回収することができる。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌が挙げられる。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞(例えば、上記の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされたもの)を、本発明によるポリペプチドの発現を(前記ベクターにより)提供する条件下で培養し、必要に応じて、発現されたポリペプチドを回収することによる、本発明によるポリペプチドを製造する方法を提供する。前記発現構築物中の成熟形態の前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能し得る形で連結する場合、該ポリペプチドを分泌タンパク質として産生させるのが好ましい。
【００７８】
本発明による組換え宿主細胞は、当業界で公知の方法を用いて培養すればよい。プロモーターと宿主細胞の各組合せについては、本発明のポリペプチドの発現を助ける培養条件が利用可能である。所望の細胞密度またはポリペプチド力価に到達した後、培養を停止し、該ポリペプチドを公知の方法を用いて回収する。
【００７９】
この発酵培地は、炭素源(例えば、グルコース、マルトース、糖蜜)、窒素源(例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、例えば、酵母抽出物、麦芽抽出物、ペプトンなどの有機窒素源)、および他の無機栄養源(例えば、リン酸、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄など)を含む公知の培養培地を含んでもよい。必要に応じて、誘導物質を含有させてもよい。
【００８０】
好適な培地の選択は、発現宿主の選択および／または発現構築物の調節要件に基づくものであってよい。そのような培地は当業者には公知である。必要に応じて、この培地は、他の夾雑する可能性のある微生物よりも形質転換された発現宿主に有利に働く追加成分を含んでもよい。
【００８１】
発酵を、0.5〜30日間実施することができる。それは、バッチ式、連続式または供給バッチ式工程であってよく、好適には0〜45℃の範囲の温度で、例えば、2〜10のpHで行う。好ましい発酵条件は、20〜37℃の範囲の温度および／または3〜9のpHである。好適な条件は、通常、発現宿主および発現させようとするタンパク質の選択に基づいて選択する。
【００８２】
発酵後、必要に応じて、遠心分離または濾過により発酵培養液から前記細胞を除去する。発酵が停止した後、または細胞を除去した後、本発明のポリペプチドを回収し、必要に応じて、従来の手段により精製または単離することができる。
【００８３】
本発明のポリペプチドを、バッファーを含む好適な(固体もしくは液体の)担体または希釈剤と混合し、ポリペプチド組成物を製造するのが都合がよい。このポリペプチドを、担体に結合させるか、またはこれと混合することができ、例えば、固体担体上に固定することができる。従って、本発明は、さらなる態様において、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。これは、好ましくは前記ポリペプチドの活性が保持されるような、パッケージング、輸送および／または保存に好適な形態のものであってよい。組成物はペースト、液体、乳液、粉末、フレーク、顆粒、ペレットまたは他の成型形態のものであってよい。
【００８４】
前記組成物はさらに、1種以上の(追加の)酵素などの追加成分を含んでもよい。
【００８５】
典型的には、前記ポリペプチドを液体または乾燥形態で安定的に製剤化する。典型的には、その製品を、必要に応じて、例えば、安定化バッファーおよび／または保存剤を含む組成物として製造する。
【００８６】
本発明はさらに、1種以上の本発明のポリペプチドを含む食品または動物用飼料組成物または添加剤に関する。前記ポリペプチドは、その天然の濃度とは異なる濃度で前記飼料中に存在し得る。好ましい量は、飼料1 kgあたり、0.1〜100 mg、例えば、0.5〜50 mg、好ましくは1〜10 mgである。
【００８７】
本発明はまた、1種以上の食用飼料物質または成分に加えて、本発明のポリペプチドを添加することを含む、動物飼料組成物の製造方法に関する。このポリペプチドを、飼料物質もしくは成分とは別に、個々に、または他の飼料添加物と組み合わせて、動物飼料組成物に添加することができる。このポリペプチドは、飼料物質または成分のうちの1つの不可分の一部であってもよい。
【００８８】
本発明のポリペプチドを動物飼料に添加して、フィテートなどの植物成分の分解を改善し、それにより動物による植物栄養素の利用の改善をもたらすこともできる。有利なことに、本発明のポリペプチドはin vivoで前記飼料中のフィテートを分解し続ける。菌類に基づく本発明のポリペプチドは、特に、一般的により低い最適pHを有し、動物の胃などの酸性環境において重要な栄養素を遊離させることができる。
【００８９】
本発明のポリペプチドを、大豆からのミルク代用品(または代替品)の製造の際に用いることもできる。これらのミルク代用品はヒトおよび／または動物により消費され得る。
【００９０】
前記組成物はさらに、(特に、動物飼料中での使用のために製剤化する場合)飼料を与えようとする動物の胃腸管において天然に産生される1種以上のイオノフォア、酸化剤、界面活性剤、ルーメン保護アミノ酸、酵素増強因子または酵素を含んでもよい。反芻動物または単胃動物(例えば、家禽類またはブタ)の飼料(サイレージを包含する)に添加する場合、この飼料は大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦もしくはオート麦などの穀物、または小麦ふすまもしくはトウモロコシふすまなどの穀物副生成物、または大豆および他のマメ科植物などの他の植物材料を含んでもよい。前記酵素は、動物による植物栄養素のより優れた利用につながる植物材料の分解を大幅に改善する。結果として、成長速度および／または飼料変換を改善することができる。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、それらが動物の胃の中などの高度に酸性の条件下でも活性を維持するため、動物飼料に特に適用可能である。
【００９２】
本発明のポリペプチドの(外来的な)添加のための1つの方法は、トランスジェニック植物材料および／または(例えば、トランスジェニック)種子として、該ポリペプチドを添加することである。すなわち、このポリペプチドは、異種遺伝子発現により合成されたものであってよく、例えば、所望の酵素をコードする遺伝子を、植物発現ベクター中の好適な植物発現シグナル、例えば、種子特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターの制御下に、クローニングすることができる。続いて、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを植物細胞中に形質転換し、形質転換細胞を植物全体への再生のために選択することができる。かくして得られたトランスジェニック植物を成長させ、収穫し、異種(その植物にとって)ポリペプチドを含む植物の一部を、そのまま、またはさらなる加工の後に、組成物の1つに含有させることができる。この異種ポリペプチドを、トランスジェニック植物の種子中に含有させることができ、または根、茎、葉、木、花、樹皮および／または果実などの他の植物部分に含有させることもできる。好適な植物としては、オート麦、大麦、小麦、トウモロコシおよびイネなどの穀物が挙げられる。
【００９３】
トランスジェニック植物材料の形態での、例えば、トランスジェニック種子としての前記ポリペプチドの添加は、このポリペプチドを利用可能にするため、または少なくともその利用率を改善するために、植物材料の加工を必要としうる。そのような加工技術としては、種々の機械的(例えば、ミルおよび／もしくはグラインド)技術または押出し成型もしくは膨張などの熱機械処理が挙げられる。
【００９４】
従って、本発明は、単胃動物または非反芻動物における成長および／または飼料変換を促進する方法にも関し、この方法は本発明のポリペプチドを該動物に給餌することを含む。好適な動物としては、ブタ(もしくは子ブタ)、家禽類(鶏、七面鳥など)、子牛もしくは食肉用子牛もしくは水生(例えば、海洋)動物(例えば、魚)などの飼育用単胃動物および／または非反芻動物が挙げられる。
【実施例】
【００９５】
実施例1
フィターゼ産生株の構築
配列番号2、配列番号4および配列番号6に記載の配列を有するDNA断片を、合成法により作製した。DNA配列を確認した後、これらの合成遺伝子断片を、PCRを用いてA.nigerのフィターゼシグナル配列に融合し、グルコアミラーゼプロモーターの制御下にクローニングした。この目的のために、国際特許出願第WO 98/46772号に記載の発現ベクターpGBTOPFYT1中に存在するphyA遺伝子を、上記の改変フィターゼ遺伝子で置換し、それぞれベクターpTHFYT2、pTHFYT4およびpTHFYT6を得た。
【００９６】
この発現ベクターpTHFYT2、pTHFYT4およびpTHFYT6を、Aspergillus niger CBS 646.97(WO 98/46772に記載)中に導入した。PCRを用いて、pTHFYT2、pTHFYT4またはpTHFYT6を含む形質転換体を選択した。これらの形質転換体が活性フィターゼを分泌することができるかどうか判定するために、該形質転換体を、Clen(1988、Biotechnol. Technique 12, 759-761)により記載されたようにフィテートを含むプレート上で増殖させた。このアッセイにおいては、活性フィターゼが分泌される場合、フィテートの分解により、Aspergillusコロニーの周囲のハローが見えるようになる。このアッセイを用いて、全ての発現ベクターについて活性フィターゼFYT2、FYT4またはFYT6を培地中に分泌する形質転換体が得られたことが示された。
【００９７】
明確なハローを示す形質転換体を振とうフラスコ中で増殖させた。選択した形質転換体のスポアおよび対照株の107個を、1リットルあたり：30 g マルトース.H2O; 5 g 酵母抽出物; 10 g 加水分解カゼイン; 1 g KH2PO4; 0.5 g MgSO4.7H2O; 0.03 g ZnCl2; 0.02 g CaCl2; 0.01 g MnSO4 . 4H2O; 0.3 g FeSO4 . 7H20; 3 g Tween 80; 10 ml ペニシリン(5000 IU/ml)/ストレプトマイシン(5000 UG/ml); pH 5.5を含む20 mlの液体前培養培地を含む振とうフラスコ中に接種した。これらの培養物を、34℃にて20〜24時間増殖させた。10 mlのこの培養物を、1リットルあたり；70 g マルトデキストリン; 25 g 加水分解カゼイン; 12.5 g 酵母抽出物; 1 g KH2PO4; 2 g K2SO4; 0.5 g MgSO4.7H2O; 0.03 g ZnCl2; 0.02 g CaCl2; 0.01 g MnSO4.4H2O; 0.3 g FeSO4.7H2O; 10 ml ペニシリン(5000 IU/ml)/ストレプトマイシン(5000 UG/ml)[4 N H2SO4でpH 5.6に調整]を含むA.niger発酵培地100 mlに接種した。これらの培養物を34℃にて約6日間増殖させた。発酵培養液から取得したサンプルを遠心分離(回転式バケット遠心分離機中で5000 rpmで10分間)し、上清を回収した。
【００９８】
実施例2
FYT2、FYT4およびFYT6の熱安定性
FYT2、FYT4、FYT6および野生型A.ficuumフィターゼ(EP 0 420 358)を、実施例1に従って振とうフラスコ中で製造した。フィターゼ製造を行った後、適当な時間間隔でサンプルを取得し、van.Engelenら(Journal of AOAC International 1994, 77:760-764)により記載された方法に従って、フィターゼ活性について上清をアッセイした。活性をFTUで表すが、ここで1FTUは試験条件(pH=5.5、温度37℃、5 mMフィチン酸ナトリウム)下で1分あたり1μmolの無機オルトリン酸を放出する酵素の量である。熱安定性を、上清それ自体について測定した。必要に応じて、フィターゼ上清を超遠心分離によりさらに濃縮した。
【００９９】
熱安定性を、3つの異なる方法で測定した。第1に、フィターゼのT50を決定した。T50(℃で表す)は、サンプルを20分間加熱した後に50％の活性が失われる温度である。実験条件：ストレス試験を250 mM HAc/NaAc/Tween20 pH=4.0中で行う。フィターゼを約0.6 FTU/mlで投与する。加熱した後、サンプルをすぐに氷上で冷却した。続いて、残存フィターゼ活性を、250 mM HAc/NaAc/Tween20 pH=4.0中で測定した。結果を表1に示す。FYT2およびFYT4は約8〜9℃で、より安定である。
【表１】
2005533492.tif 000002
【０１００】
第2に、フィターゼの活性を、加熱中に測定した。加熱温度の関数として実行する場合、実験は生産能に関して該酵素の最適温度(Topt)を与える。インキュベーションを、30分の固定された期間で行う。変換される基質の量は、酵素活性ならびにその不活化に依存する。従って、用語「生産能」を活性の代わりに用いるのが好ましい。実験条件：250 mM HAc/NaAc/Tween20 pH=4.0、フィターゼ用量約0.012 FTU/ml。放出されたリン酸を、以前に記載の標準的なアッセイ方法に従って測定することができる。結果を図3に示す。FYT2ならびにFYT4は75℃での触媒生産能に関して最も効率的であり、野生型対照はその触媒活性を完全に失っていた。活性は75℃を超えると減少し始めるが、図3はFYT2ならびにFYT4が約85℃まで触媒能を有することを示している。FYT6の挙動は野生型とFYT2またはFYT4の挙動の中間にある。
【０１０１】
第3に、適当な活性アッセイを介して熱安定性を測定するのに加えて、フィターゼ酵素の3次元構造が折り畳まれない温度を測定することにより、フィターゼの熱安定性を直接測定した。アンフォールディングを伴う加熱効果を、示差的走査熱量測定法(DSC)により直接測定することができる。DSC実験条件：250 mM HAc/NaAc pH=4.0、約5 mg/mlフィターゼ、加熱速度は2.5℃／分である。結果を表1に示す。天然の酵素の構造は、改変型フィターゼFYT2およびFYT4について、野生型フィターゼよりも約9℃以上高い温度で維持されていることが認められる。
【０１０２】
実施例3
FYT2、FYT4およびFYT6のペレット安定性
2つのペレット化マトリックスを用いた試験、および従って温度設定を、FYT2、FYT4およびFYT6培養物濾液を用いて実施した。
【０１０３】
全顆粒を、培養物濾液と、必要量のコーンスターチ(Cerestar社のC-ゲル)および水とを混合／練合することにより作製した。この湿混合物の組成については表2および3を参照されたい。混合および練合の後、混合物をNica E-220成型器を用いて成型し、Fuji Paudal QJ-400G球状化機を用いて球状化した。得られた粒子を、Glatt GPCG 1.1液体床乾燥器中で乾燥させた。顆粒の活性は2500〜3000 FTU/gであった。
【表２】
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【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
250グラムの顆粒を、25 kgの飼料中で、表4に従う組成物と混合し、225 kgの同じレシピを用いた試験の直前に混合した。25 kgの飼料を、Collete MP90プラネタリーミキサー中で10分間混合した。25 kgと225 kgの飼料を、1200リットルのNautaミキサー中で混合した。この混合物のサンプルを、ペレット安定性を測定するために取得した。この250 kgの混合物を、ミキサー／コンディショナー中に、600 kg/hの速度の投入スクリューにより投入し、80℃まで直接ストリーム注入により加熱した。熱い混合物をペレット化プレス機に押し入れたが、その際の滞留時間は約10〜15秒であった。この試験に用いたマトリックスは5/45 mm(幅／長さ；RDS 05)または3/65 mm(幅／長さ；RDS A1)であった。ペレット化プレス機を離脱するペレットの温度は82〜83℃(RDS 05)または91〜93℃(RDS A1)であった。冷却ベルト上に載ったペレットをプレスした後、このベルトからサンプルを安定性試験のために取得した。
【表４】
2005533492.tif 000005
【０１０６】
【表５】
2005533492.tif 000006
【０１０７】
【表６】
2005533492.tif 000007
【０１０８】
ペレット化試験は、82℃では野生型と比較してFYT2、FYT4およびFYT6の熱安定性において類似した増加を示しているが、92℃ではFYT2およびFYT4はFYT6と比較してより高い安定性を示している。
【０１０９】
実施例4
フィターゼの生化学的特性
発酵培養液の濾過後に得られた濾液からフィターゼを精製した後、フィターゼの比活性を測定した。フィターゼの精製は、イオン交換クロマトグラフィーもしくはアフィニティークロマトグラフィーまたは両方法の組合せにより行った。
【０１１０】
グリコシル化フィターゼのアフィニティークロマトグラフィーを、ConA(コンカナバリンA)アフィニティーマトリックス(HiTrap ConA, Amersham Pharmacia Biotech)を用いて行った。フィターゼを20 mM Tris/0.5 M NaCl/1 mM MnCl2/1 mM CaCl2/pH=7.4中でカラムに結合させた。カラムをよく洗浄した後、20 mM Tris/0.5 M NaCl/0.5 Mメチル-α-グルコピラノシド／pH=7.4を用いてフィターゼを溶出させた。カラムの再生は20mM Tris pH=8.5を用いて行った。バッファーのpHは4N HClで調整した。
【０１１１】
イオン交換クロマトグラフィーを、陰イオン交換機(Resource Q, Amersham Pharmacia Biotech)を用いて行った。脱塩およびバッファー交換を、PD-10ゲル濾過カラムを用いて行った。カラムの平衡化を、50 mM Tris, pH=7.5中で行った。フィターゼサンプルを載せた後、50 mM Tris, pH=7.5中、0〜1M NaClの勾配を用いてフィターゼを溶出させた。
【０１１２】
精製されたフィターゼのタンパク質含量を、E280測定により測定した。ここで1 mg/mlのフィターゼはOD280,1cm = 0.938に相当する。FYT2、FYT4およびFYT6については、1 mg/mlでのOD280,1cmは、それぞれ0.995、0.995および0.963に相当する。この活性を、van Engelenら(Journal of AOAC International 1994, 77:760-764)により記載されたようにFTUで測定した。
【０１１３】
フィチン酸のKm値を、基質濃度の関数として初期反応速度を測定することにより決定した。このアッセイ混合物は、250 mM NaAcバッファーpH=5.5中、1.0、0.5、0.2、0、1、0.05、0.025、0.015 mMのいずれかのフィチン酸を含んでいた。酵素反応を、15％ TCA(1:1)を用いて停止させた。停止させた反応混合物と0.6M H2SO4-2％アスコルビン酸-0.5％モリブデン酸アンモニウム(1:1)とを混合し、この混合物を50℃にて20分間インキュベートし、820 nmで吸光度を測定することにより(Wyssら、Appl Env Microbiol 1999, 65:367-373)、放出された無機リン酸を測定した。結果を表7に示す。
【表７】
2005533492.tif 000008
【０１１４】
表7は、野生型と比較して、フィチン酸に対する比活性ならびに高い親和性が、行った改変により影響されないことを示している。
【０１１５】
フィターゼの活性のpH依存性を、異なるpH値でのフィチン酸からのリン酸の放出速度を測定することにより決定した。原則として、pHを変化させることを除いては標準的なフィターゼアッセイを用いた。pH=5.6での活性を100％の活性とした。以下のバッファーを用いて、この実験のpHを調整した：pH2.8〜3.2の250 mMグリシン；pH3.6〜5.6の250 mM NaAc；pH6〜7の250 mMイミダゾールおよびpH7.5〜9の250 mM Tris。結果を表8に示す。
【表８】
2005533492.tif 000009
【０１１６】
改変型フィターゼの活性のpH依存性は、野生型のものと非常に類似している。特に、野生型フィターゼが2つの最適pHを示すという特徴が維持されている。1つの最適pHはpH=2.5周辺に認められ、第2の最適値はpH=5.5周辺である。表8は、野生型Aspergillus nigerフィターゼのこの特有の特徴がFYT2、FYT4およびFYT6をもたらす改変により影響されないことを示している。
【０１１７】
フィターゼによるフィチン酸の分解に従う時間の関数としての増加曲線を250 nM NaAc, pH=5.5中、37℃にて記録した。フィターゼの用量は0.2 mMフィチン酸の基質濃度で0.05 FTU/mlであった。酵素反応を、15％ TCA(1:1)を用いて停止させた。100μlの反応混合物と、1400μlの0.3M H2SO4-1％アスコルビン酸-0.27％モリブデン酸アンモニウムとを混合した後、この混合物を50℃にて20分間インキュベートし、820 nmで吸光度を測定することにより、放出された無機リン酸を測定した。結果を表9に示す。
【表９】
2005533492.tif 000010
【０１１８】
改変型フィターゼの挙動が、フィチン酸からのリン酸の放出において、野生型フィターゼと非常に類似していることが示されている。1時間後、増加曲線は約80〜85％のリン酸が放出されたところでプラトーに達する。全てのフィターゼは同様の速度でこのプラトーに到達するが、これはフィチン酸からのリン酸の放出において、野生型フィターゼの有効性が改変型フィターゼにおける改変により影響されないことを示唆している。
【０１１９】
結論として、この結果は、FYT2、FYT4およびFYT6の改変は、野生型と比較して、所与の改変型フィターゼの触媒能に影響しないことを示している。図1に示されるアミノ酸(基質周辺の7Å以内の領域にある残基)のいかなる突然変異をも回避し、さらに追加的なAspergillus nigerのアミノ酸を保持することが、野生型Aspergillus nigerフィターゼの機能特性を維持することを示している。
【０１２０】
実施例5
改変型フィターゼの生物学的有効性
液体フィターゼを用いた試験
新規に生成された熱安定性フィターゼを比較する生物学的有効性試験を、ペレット化した後でペレットにアプライされる液体製剤中のそれらを用いて行った。酵素を、添加したフィターゼ活性が100、200または300 FTU/kg飼料となるような用量でアプライした。トウモロコシ-大豆に基づく飼料(試験の最初の14日間については1つの飼料、および最後の14日間中には1つのわずかに異なる飼料)を給餌したブロイラー(5〜33日)で試験を行った。基礎食の吸収性リン含量は2.2 g/kg飼料(5〜19日)および1.7 g/kg飼料(19〜33日)であった。これらの値は当該動物の推定上の要求性をかなり下回っている。動物を、処理あたり6つの床置の檻で飼育し、各檻に14匹の鳥を入れた。結果を、Finney(1964: Statistical method in biological assay. Charles Griffin, London.)により概説された方法を用いて、分析されたフィターゼ含量(FTU/kg)に基づいて算出した。体重についての結果を表10に提供する。
【表１０】
2005533492.tif 000011
【０１２１】
全産物について回帰直線の傾きは、0とは有意に差があった。表10から明らかであるように、その産物の間には、FYT4を除いては若干の差異が認められた。この酵素を給餌した動物だけでなく他のフィターゼを給餌した動物についても行ったが、その差異は統計学的に有意なものではなかった。
【０１２２】
顆粒化フィターゼを用いた試験
ペレット化の前にペレットにアプライされた顆粒化製剤における熱安定性フィターゼを比較する試験を行った。これは、フィターゼがペレット化プロセスを経験したことを意味する。この試験においては、ペレット化を真に高い温度で行った：ペレットは約92℃であった。その目的は、動物に与えられる飼料への100、200または300 FTU/kgの添加を得るためのものであったので、予備ペレット化試験を行ってこのプロセス中の活性損失を評価し、その産物を、言及した活性が認められる程度まで過剰投与した。この試験を、これらの動物の推定上の要求性(1.9 g/kg飼料)を大きく下回る吸収性リン含量を有するトウモロコシ-大豆に基づく飼料(全期間について1つの飼料のみ)を与えたブロイラー(5〜33日)を用いて、液体産物試験と同様の方法で行った。動物を、処理あたり6つの床置の檻で飼育し、各檻に14匹の鳥を入れた。体重増加についての回帰直線の相対的傾きの結果を表11に示す。
【表１１】
2005533492.tif 000012
【０１２３】
フィターゼFYT2がこの試験において最も良好な結果を示し、次いでFYT6、FYT4そして野生型であった。
【０１２４】
実施例6
フィターゼFYT2およびFYT6の単一突然変異体
フィターゼFYT2の以下の単一突然変異体を作製した：Y31F、A78E、G163R、G180A、G182S、A194V、L211T、A215S、P242S、E254K、Q269N、A414P、E428RおよびE440A。またフィターゼFYT6のE440Aの単一突然変異体を作製した。
【０１２５】
このために、FYT-2をコードする遺伝子(配列番号2)またはFYT6をコードする遺伝子(配列番号6)を、2.5 U Pwoポリメラーゼ(Roche diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany)、100 ng DNA鋳型、0.5 mM dNTP、1 x Pwoバッファー、10 pmol DSM-1Fおよび10 pmol DSM-1Rを用いて、総量50μlで、以下の条件：94℃で5分、(94℃で30秒、60℃で1分、72℃で2分)を30回、72℃で5分でのPCRにより増幅した。増幅断片を、PCR(登録商標)-Blunt-TOPO(Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA)ベクター中にクローニングし、Stratagene社のQuickChangeキット(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いて、供給業者の推奨に従って突然変異を導入した。
【０１２６】
プライマーDSM-1FおよびDSM-1Rの配列は以下の通りであった：
DSM-1F     5’ GGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT 3”
DSM-1R     5’ GTCATCGCGATTAATTAATCTAAGCAAAACACTCCTCCCAGTT 3’。
【０１２７】
以下のプライマーを突然変異誘発に用いた。ここで突然変異させたコドンは太字で強調表示してある。
【０１２８】
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【０１２９】
得られたフィターゼDNA断片の配列を、配列解析により確認した。フィターゼ配列をpGBTOPFYT1中にクローニングし、培養上清を実施例1に記載のように調製した。
【０１３０】
各単一突然変異体ならびにFYT2およびFYT6の、T50値を決定した(実施例2を参照)。結果を表12に示す。
【表１２】
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【０１３１】
得られた突然変異体の多くは、フィターゼFYT2に匹敵するT50値を示す。驚くべきことに、全ての単一突然変異の組合せを含むFYT6のT50値は個々の突然変異体のものよりもかなり低い。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】Aspergillus nigerの活性部位残基を示す。
【図２−１】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−２】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−３】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−４】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−５】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−６】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−７】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図２−８】フィチン酸(IHP 550H)と複合体化したAspergillus nigerフィターゼの活性部位残基のIHP-Sモデル座標を示す。
【図３】フィターゼ生産能 対 温度を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２−１】
2005533492.tif 000033
【図２−２】
2005533492.tif 000034
【図２−３】
2005533492.tif 000035
【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
2005533492.tif 000039
【図２−８】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月6日(2004.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、配列番号５または配列番号７の配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドに対して、少なくとも91％、好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％または最も好ましくは少なくとも99％の配列相同性(同一性)を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
DNAである請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４または配列番号６の配列を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項７】
ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド配列が機能し得る形で調節配列に連結されている発現ベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
異種タンパク質として、請求項１または２に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項９】
請求項３〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６もしくは７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの発現がもたらされる条件下で、請求項８または９に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１または２に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含む組成物。
【国際調査報告】
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