(57)【要約】Aiolos遺伝子を欠失しているホモ接合型ノックアウトマウスは、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（SLE）を罹患しているヒトと共通の多数の表現系を表すことが示されている。Aiolos−／−マウスを、OBF−1転写因子遺伝子を欠失しているホモ接合型ノックアウトマウスと交配させると、得られる二重ノックアウトマウスは、すべてのSLEの兆候を示さなかった。自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤のスクリーニング方法が提供される。インビトロでの方法には、OBF−1のアンタゴニストのスクリーニング、OBF−1のoct−1またはoct−2への結合を阻害する薬剤のスクリーニング、Aiolosタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング、およびAiolosの発現をアップレギュレートする、またはOBF−1の発現をダウンレギュレートする薬剤のスクリーニングが含まれる。ノックアウトマウスおよびノックアウトマウス由来のB細胞を使用するスクリーニング方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（SLE）に有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）（i）OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ii）OBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸、
を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞を、インビトロで、試験薬剤と接触させること、および
c）試験薬剤と接触させていない対照細胞と比較することにより、前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）（i）OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ii）OBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸、
を含んでいる細胞から細胞抽出物を準備すること、
b）前記細胞抽出物を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、インビトロ転写させること、および
c）前記試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、前記レポーター遺伝子の発現レベルを
測定すること、
を含む、方法。
【請求項３】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、oct−1タンパク質およびoct−2タンパク質、およびOBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を準備すること、および
b）前記OBF−1、oct−1、oct−2、および前記核酸構築物をいっしょに、試験薬剤のある状態またはない状態で、インビトロ転写させること、および、
c）前記試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること、
を含む、方法。
【請求項４】
Aiolosタンパク質の活性を調節することができる薬剤のスクリーニング方法であって、以下の、
a）（i）Aiolosタンパク質、
（ii）Aiolos応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む、核酸、
を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞を、インビトロで、試験薬剤と接触させること、および
c）試験薬剤と接触させていない対照細胞と比較することにより、前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること、
を含む方法。
【請求項５】
Aiolosタンパク質が変異を有する、Aiolosタンパク質の不活性または部分的に不活性な形態である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）Aiolos応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞を、インビトロにて試験薬剤と接触させること、および
c）試験薬剤と接触させていない対照細胞と比較することによって、前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること、
を含む方法。
【請求項７】
前記測定段階が、たとえば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）、定量的RT−PCR、リアルタイムRT−PCR、ノーザンブロッティング、RNAse保護アッセイ、プライマー伸長アッセイまたは蛍光インサイツハイブリダイゼーション（FISH）による、前記レポーター遺伝子のRNA産物の測定を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記測定段階が、前記レポーター遺伝子のタンパク質産物を測定することを含む、請求項1、または請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記OBF−1応答性エレメントが、コンセンサス配列ATGCAAATまたはその逆相補体（ATTTGCAT）を有するオクタマーモチーフを含む、請求項1〜3、7または8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターのようなベクター内に含まれる、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）または分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）から選択される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、真核生物細胞であり、酵母、糸状菌、初代もしくは二次細胞株、または不死化細胞株より選択される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、ヒト由来のものである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が齧歯類由来、たとえばラットまたはマウス由来の細胞である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を準備すること、
b）oct−1タンパク質、oct−1タンパク質のPOUドメイン、oct−2タンパク質またはoct−2タンパク質のPOUドメインから選択した、octタンパク質を準備すること、
c）前記OBF−1タンパク質を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、前記octタンパク質と接触させること、
d）前記試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、前記OBF−1タンパク質の、前記octタンパク質への結合を測定すること、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記結合が、任意の1つまたはそれ以上の、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、蛍光共鳴エネルギー伝達（FRET）、表面プラズモン共鳴（SPR）または蛍光相間分光法（FCS）のような蛍光に基づくアッセイによって測定される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記OBF−1タンパク質と前記octタンパク質がインビトロで結合する、請求項15または請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）（i）OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
ii）oct−1タンパク質、oct−2タンパク質、oct−1タンパク質のPOUドメイン、またはoct−2タンパク質のPOUドメインから選択したoctタンパク質、
を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞から抽出物を調製すること、
c）前記抽出物を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、oct−1またはoct−2タンパク質結合部位、たとえばオクトマー部位を含む標識核酸プローブと混合すること、および、
d）試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、前記OBF−1タンパク質、前記octタンパク質および前記核酸プローブ間での複合体の形成を測定すること、
を含む方法。
【請求項１９】
前記測定段階d）が、前記抽出物／核酸プローブ混合物について電気泳動移動度シフトアッセイを行うことを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定段階に、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、蛍光に基づくアッセイおよび超ハイスループットアッセイ、たとえば表面プラズモン共鳴（SPR）または蛍光相間分光法（FCS）アッセイから選択されるアッセイを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
oct−1（またはoct−1のPOUドメイン）およびoct−2（oct−2のPOUドメイン）が前記細胞内に含まれる、請求項18〜20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記抽出物が核抽出物である、請求項18〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、原核生物細胞、たとえばグラム陽性またはグラム陰性細菌である、請求項18〜21のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が真核生物細胞、たとえば酵母、糸状菌、初代もしくは二次細胞株、または不死化細胞株である、請求項18〜22のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）OBF−1遺伝子を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞を、インビトロで試験薬剤と接触させること、および
c）試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、発現レベルを比較することにより、前記OBF−1遺伝子の発現を測定すること、
を含む方法。
【請求項２６】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、以下の、
a）Aiolos遺伝子を含む細胞を準備すること、
b）前記細胞を、インビトロで試験薬剤と接触させること、および
c）試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、発現レベルを比較することにより、前記Aiolos遺伝子の発現を測定すること、
を含む方法。
【請求項２７】
前記測定段階c）が、RNA産物を測定することを含む、請求項25または請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記測定段階c）が、タンパク質産物を測定することを含む、請求項25または請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記OBF−1遺伝子がベクター中で提供される、請求項25に記載の方法。
【請求項３０】
前記OBF−1遺伝子が前記細胞のゲノム中でコードされる、請求項25に記載の方法。
【請求項３１】
前記Aiolos遺伝子がベクター上で提供される、請求項26に記載の方法。
【請求項３２】
前記Aiolos遺伝子が前記細胞のゲノムによってコードされている、請求項26に記載の方法。
【請求項３３】
自己免疫疾患、たとえばSLEの素因を診断する方法であって、インビトロにて、個体からのAiolosタンパク質アミノ酸配列の全てまたは一部を決定することを含む、方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸配列が、前記個体の核酸配列から推測される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患の素因を診断する方法であって、個体由来の試料中のAiolos遺伝子の発現レベルを測定することを含む、方法。
【請求項３６】
前記測定段階に核酸のレベルを測定することが含まれる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記測定段階にAiolosタンパク質のレベルを測定することが含まれる、請求項35または請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
医薬品としての使用のための、Aiolosタンパク質またはその誘導体もしくは断片。
【請求項３９】
治療での使用のための、Aiolosタンパク質をコードしている核酸。
【請求項４０】
自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための医薬品の製造における、Aiolosタンパク質の使用。
【請求項４１】
自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための医薬品の製造における、Aiolosタンパク質をコードしている核酸の使用。
【請求項４２】
Aiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの予防または処置のための、医薬組成物。
【請求項４３】
Aiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードしている核酸を含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの予防または処置のための、医薬組成物。
【請求項４４】
有効量のAiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を投与することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための方法。
【請求項４５】
有効量のAiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードしている核酸を投与することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための方法。
【請求項４６】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、Aiolos欠損マウスに試験薬剤を投与すること、およびマウスでのSLEの症状に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、方法。
【請求項４７】
さらに、効果が対照との比較によって決定されるように、試験薬剤を、Aiolos欠損ではない対照マウスに投与することを含み、ここで必要に応じて前記対照マウスが野生型マウスである、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記Aiolos欠損マウスがメスである、請求項46または請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記効果が、以下、
尿中のクレアチニンおよび／または尿素のレベルの減少、
尿中のタンパク質尿素の減少、
腎臓中の免疫複合体形成の減少、
腎臓の糸球体中でのIgMの蓄積の減少、
腎臓炎症の減少、
好ましくは、抗原でマウスのチャレンジを行わない場合の自発的胚中心形成の減少、
血清IgG2A、IgAまたはIgG1の減少、
低親和性自己応答性抗体、たとえば血清IgMの増加、
のいずれか1つまたはそれ以上である、請求項46〜48のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、試験薬剤を、Aiolos欠損マウスに投与すること、マウスからB細胞またはB細胞前駆体を抽出すること、B細胞をインビトロで培養すること、およびB細胞に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、方法。
【請求項５１】
さらに、試験薬剤をAiolos欠損ではない対照マウスに投与すること、前記マウスよりB細胞またはB細胞前駆体を抽出すること、B細胞をインビトロで培養すること、およびB細胞に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む方法であって、必要に応じて、マウスおよび得られるB細胞培養が野生型である、方法。
【請求項５２】
マウスがメスである、請求項46または請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
試験薬剤が、静脈内で投与される、請求項46〜52のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法であって、Aiolos欠損B細胞を、インビトロにて試験薬剤と接触させること、およびB細胞に対する前記試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、方法。
【請求項５５】
さらに、効果が対照との比較によって測定されるように、Aiolos欠損ではない対照B細胞を、インビトロで試験薬剤と接触させることを含み、必要に応じて対照B細胞が野生型である、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
Aiolos欠損B細胞がメス遺伝型である、請求項54または請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記B細胞が、脾臓または胸腺B細胞である、請求項50〜56のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記効果が、以下、
好ましくは活性化マーカーの発現の増加によって決定される、B細胞の活性化、
B細胞の増殖、好ましくは、B細胞の過剰増殖、
dsDNA、ssDNA、ヒストンまたはANAに反応性の抗体の減少、
B1a細胞の増加、
活性化マーカーMHCII抗原のレベルの減少、または
脾臓B細胞上のCD23の発現の減少、
の1つまたはそれ以上である、請求項46〜57のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記B細胞が、1つまたはそれ以上の有糸分裂促進物質の存在下で培養される、請求項50〜58のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記有糸分裂促進物質が抗μ、抗CD40＋IL4より選択される、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の同定のための、Aiolos欠損マウスの使用。
【請求項６２】
SLEに有効な薬剤の同定が、実施例46〜53または58〜60の任意の方法にしたがって実施される、請求項61に記載の使用。
【請求項６３】
自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の同定のための、インビトロでのAiolos欠損B細胞の使用。
【請求項６４】
SLEに有効な薬剤の同定が、実施例54〜60の任意の方法にしたがって実施される、請求項63に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
自己免疫疾患は、免疫系の制御および自己抗原に対するその遺伝的寛容性の崩壊の結果と考えられている。多くの種々の自己免疫疾患が存在し、世界中で数百万の人がこれらに罹患している。一般的に、自己免疫疾患では、1つまたはそれ以上の体の組織が、免疫系によって攻撃される。たとえば、多発性硬化症（MS）、重症筋無力症および自己免疫尿症においては神経系で症状が発現する。クローン病、潰瘍性大腸炎においては消化器系で症状が発現し、乾癬、尋常性天疱瘡および白斑では皮膚で症状が発現する。多くの自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（SLE）、リウマチ様関節炎および強皮症では、多数の器官で症状が発現する。
【０００２】
複数の機構が関与すると考えられてはいるが、自己免疫疾患の原因は完全にはわかっていない。通常は隠れているかまたは隠蔽されている抗原は、組織の損傷または外傷の結果、循環系に放出されうる。そのような抗原は、T細胞およびB細胞から通常は分離されるので、免疫系によっては「自己」抗原とは認識されない。循環系への放出において、これらの抗原は、正常な「自己」タンパク質に対する免疫応答を誘発する場合があると考えられる。
【０００３】
さらに可能性のある機構は、通常は「自己」として認識される抗原が、化学的、物理的または生物学的改変によって免疫原性となることである。そのような改変は、薬剤のような化学物質、またはさらには紫外線により起こり得るか、あるいは自己抗原を改変することができる病原性生物による感染により起こり得る。任意の上記の方法によって改変されることによって、「自己」抗原は免疫原性となることができる。
【０００４】
外来抗原に対して、通常の方法で惹起された抗体の交差反応性は、自己免疫疾患のさらに可能性のある原因であり、たとえば、streptococcal  Mタンパク質に対する抗体はヒト心筋と交差反応することができる。
【０００５】
B細胞またはT細胞全体における正常な制御の崩壊が、自己免疫疾患を誘導するのに十分である可能性もある。免疫応答性細胞の変異は、免疫細胞の発生の正常なチェックおよびその制御を変化させる場合がある。特定のサプレッサーT細胞が、自己免疫応答を阻害する可能性もある。自己免疫疾患と遺伝的関連性の強い相関があることを明らかにした観察より、変異が役割を果たす可能性があるという考えが支持される。たとえば、自己免疫疾患の発症は、一卵性双生児での方が、二卵性双生児よりも高い。多くのそのような疾患において環境的な要素が高いことが明らかであるので、遺伝的な要素が、自己免疫疾患の発症の素因を提供する可能性がある。
【０００６】
全身性エリテマトーデス（SLE）は、複合型自己免疫疾患であり、多数の組織、たとえば関節、腎臓、漿液性表面および血管壁を含む慢性炎症性の結合組織疾患である。この疾患は、若年女性および小児で主に発生し、自己抗体、とりわけ抗自己dsDNA抗体および抗核抗体（ANA）の産出、および免疫複合体により媒介される糸球体腎炎によって特徴づけられる（Vyse, T. J. & Kotzin, B. L. Annu. Rev. Immunol. 16, 251−292（1998）およびRisch N.らJ. Clin. Invest. 105, 1502−1506（2000）を参照のこと）。症状には、種々の発疹、疱疹を含む皮膚障害、および粘膜の潰瘍形成が含まれる。再発性胸膜炎および振膜炎もまた一般的な症状である。多くの場合、中枢神経系の関与が、頭痛および人格変化、脳卒中、てんかん、神経疾患および器質脳症候群のような他の症状を引き起こす。腎臓が罹患するとタンパク尿となりうる。
【０００７】
軽症または弛張性SLEは、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDs）で処置することができるが、高用量のこれらの薬剤は、SLEの患者において肝臓毒性を引き起こす。さらなるアプローチとして抗マラリア薬の使用が考えられ、一部の患者で効果が見られる。より重症の疾患は、コルチコステロイド、たとえば、プレドニゾロンと免疫抑制剤との組み合わせで処置される。しかしながら、コルチコステロイドは長期間の合併症を引き起こしやすく、好ましくは、長期間にわたる使用はされない。
【０００８】
したがって、自己免疫疾患、たとえばSLEを阻害する、処置する、治療する、または予防することができる別の有効な薬剤が必要性とされている。好ましくは、そのような薬剤は、従来の治療法の一般的な非特異的抗炎症アプローチを用いるよりも、自己免疫疾患についての分子的な基本部分を標的とすべきである。
【０００９】
Wangら（Immunity 9、543−553、1998）は、Aiolos遺伝子を決失しているホモ接合型ノックアウトマウスの作製を報告した。Aiolosは、成熟B細胞で高度に発現されているジンクフィンガーDNA−結合タンパク質をコードしており、Ikarosと相同である。Aiolosホモ接合型ヌル変異体マウスは、活性化細胞表面表現系を示すB細胞を持ち、限られた量の刺激でもなお、抗原レセプター（BCR）−媒介性のインビトロ（in vitro）での増殖応答を増大させる。Aiolos欠損マウスはまた、免疫を行わなかった場合にも、胚中心（GC）の形成および血清IgGおよびIgE抗体を増加させることが報告された。加齢Aiolos変異マウスにおいては、B細胞リンパ腫が発症していたので、自己抗体が報告された。さらに、腹膜、境界域および再循環骨髄集団のB細胞は大きく減少していた。
【００１０】
OBF−1は、遺伝子転写を活性化するために、Oct−1およびOct−2のPOUドメインと相互作用する、オクタマー部位によって媒介される遺伝子転写のB−リンパ球特異的活性化因子である（Ciba−Geigyの名前で、1995年5月15日に申請され、1995年11月に公開された国際特許明細書第PCT／EP95／01834号からの第WO95／32284号を参照のこと）。
【００１１】
本発明者らはさらに、ホモ接合型Aiolos変異マウスの表現系を研究した。驚くべきことに、Aiolos転写因子を欠失しているマウスは、ヒトのSLEに極めて密接に相関している表現系を示す。たとえば、Aiolos変異体マウスからの腎臓切片は、免疫グロブリン（Ig）の蓄積を示し、重IgG、IgMおよび補体C3の蓄積が、Aiolos−／−マウスからの糸球体で見られた。明らかに、dsDNA、ssDNA、ヒストンおよび核抗原（ANA）に対する血清自己抗体もまた、野生型マウスよりもAiolos−／−マウスで有意に高かった。
【００１２】
抗dsDNA抗体に陽性であることがわかったすべてのマウスはまた、その腎臓に、免疫複合体が蓄積していた。糸球体基底膜中での免疫複合体および抗dsDNA抗体の蓄積は、SLEの重要な病理学的特徴であり（Vyse, TJ & Kotzin, BL, Annu Rev Immunol 16, 261−92（1998）およびRisch, Nら、J Clin Invest 105, 1503−1506（2000））、Aiolos−／−マウスではこれまでには報告されてはいない。さらに、自己抗体について陽性であるAiolos−／−マウスの割合は、抗ヒストン抗体をのぞいて、オスのマウスよりもメスのマウスで有意に高かった。この傾向は、性ホルモンが、SLEの発症に役割を果たすことを示唆しており、ヒトにおける以前の観察と一致する（たとえば、Lahita, RG, Curr Opin Rheumatol 11, 352−356（1999）を参照のこと）。以下の実施例でさらに詳述するように、これらの観察には、Aiolos−／−マウスが、SLEの新規の動物モデルであることを示している。
【００１３】
本発明者らは、Aiolosホモ接合型ノックアウトマウスを、OBF−1ホモ接合型ノックアウトマウスとかけあわせた。驚くべきことに、Aiolos−／−マウスはまた、転写共活性化因子OBF−1を欠失しており、SLEの兆候の全てがなくなった。さらに、分子レベルでは、二重ノックアウトマウス由来のB細胞は、もはや活性過剰の状態ではなく、このことは、Aiolosがない場合の制御されていない様式で誘発される経路の実行にOBF−1の機能が必要であることを示唆している。したがって、マウスおよび他の動物におけるAiolos不全（変異）は、少なくとも一部のSLEの症例の病因に関係していると予想される。さらに、OBF−1経路が、（Aiolosに関連しているかどうかにはかかわらず）SLEの病因に関係していることも予想される。さらに、本明細書に記載したOBF−1ノックアウトマウスおよび二重ノックアウトマウスで観察された表現系の観点から、OBF−1およびAiolosが、SLE以外の種々の自己免疫疾患、とりわけ、B細胞またはT細胞の活性化に依存する自己免疫疾患、たとえばリウマチ性関節炎または強皮症のような全身性自己免疫疾患に関係している可能性もまた考えられる。
【００１４】
したがって、OBF−1タンパク質および遺伝子、ならびにAiolosタンパク質および遺伝子が、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤に対する新規の標的を提供する。好ましい有効な薬剤は、OBF−1およびAiolos機能の多数のアッセイにより同定することができる。とりわけ、細胞に基づくスクリーニングアッセイを、OBF−1の活性を調節、たとえばダウンレギュレートする試験薬剤の能力を測定するように設計することができる（国際特許第WO95／32284号を参照のこと）。たとえば、OBF−1の、OBF−1応答性エレメント（たとえば、コンセンサス配列ATGCAAATを有するオクタマーモチーフ、またはその逆相補物）の制御下でのレポーター遺伝子の発現を活性化する能力を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合について測定することができる。
【００１５】
本発明の方法において、OBF−1応答性エレメントに連結されたレポーター遺伝子の発現が、試験薬剤が存在しない場合のレベルと比較して、試験薬剤の存在下でダウンレギュレートされる場合は、試験薬剤が、OBF−1によって媒介される遺伝子活性化に対して、陰性の、またはアンタゴニストとしての作用を有すると結論づけることができ、自己免疫疾患に有効な薬剤の候補である。
【００１６】
したがって、一つの観点において、本発明は、OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含む細胞を準備すること、およびさらに、OBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を接触させること、および上記細胞をインビトロにて標的薬剤と接触させることを含む、自己免疫疾患、たとえば全身性エリテマトーデス（SLE）に有効な薬剤を同定する方法を提供する。レポーター遺伝子の発現レベルは、試験薬剤と接触させていない対照細胞との比較によって決定することができる。
【００１７】
OBF−1の、レポーター遺伝子の発現を活性化する能力はまた、インビトロアッセイで、全面的に測定することができる。したがって、さらなる観点において、本発明は、OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含み、さらに、OBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞からの細胞抽出物を準備すること、および上記細胞抽出物を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、インビトロ転写させることを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。レポーター遺伝子の発現レベルは、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合について測定する。
【００１８】
本発明の方法の1つの実施様態において、RNA産物は、任意の適切なアッセイ、たとえば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）、好ましくは定量的またはリアルタイムRT−PCR、ノーザンブロット、RNAse保護アッセイ、プライマー伸長アッセイ、または蛍光インサイツ（in situ）ハイブリダイゼーション（FISH）を用いて決定される。当業者は、特異的にRNAを検出する他の方法を想定することができる。
【００１９】
さらなる実施様態において、レポーター遺伝子のタンパク質産物を測定する。タンパク質は、適切な技術、たとえば、電気泳動、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、または免疫蛍光顕微鏡、たとえばルシフェラーゼからの光の検出、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）アッセイのような他の免疫化学的方法を用いて検出することができる。ここでも、当業者は、他の方法を想定することができる。
【００２０】
種々の組織由来の種々の細胞型を、本発明の方法で使用することができる。好ましい実施様態においては、細胞は脊椎動物、たとえば哺乳動物である供給源に由来する細胞である。さらなる実施様態において、細胞は齧歯類、たとえばマウスまたはラットである供給源に由来する細胞である。細胞は、初代もしくは二次細胞株（すなわち不死化されていない）、幹細胞または確立された細胞株（すなわち不死化）であり得る。
【００２１】
いくつかの実施様態では、細胞はうまれつきOBF−1を発現している。好ましくは、リンパ系の細胞が使用され、より好ましくはB細胞が使用される。たとえばヒトBリンパ細胞株Namalwa（ATCC CRL 1432）またはマウスB細胞株S194を使用することができる。使用可能な他の細胞型には、限定はしないが、BJA−BヒトB細胞株、Molt3およびHut78ヒトT細胞株、HepG2（肝細胞）、J558L、MPC11、70Z／3、40E−1、18−81および220−8マウスB細胞株、ならびに脾臓および末梢血白血球、胸腺および小腸の細胞が含まれる。
【００２２】
さらなる実施様態において、本発明の方法に使用する細胞は、OBF−1を発現するように遺伝子操作されている。そのように遺伝子操作された細胞は、好ましくは真核生物細胞である（ただし、原核生物、たとえばEscherichia coli  K−12株、DH5a株、およびHB101株、またはBacilliのようなグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌のような原核生物細胞でもよい）。遺伝子操作された真核生物細胞には、Saccharomyces cerevisiae、またはSchizosaccharomyces pombeのような酵母、または他の単細胞生物、あるいは糸状菌が含まれる。より好ましくは、遺伝子操作された真核生物細胞は、高等真核生物、たとえば脊椎動物、とりわけほ乳類、好ましくは、マウスもしくはラットのような齧歯類、またはヒト由来の細胞である。遺伝子操作した細胞を、OBF−1をコードする核酸でトランスフェクトまたは形質転換することができる。好ましい実施様態においては、適切なベクターまたはプラスミドに含まれるOBF−1遺伝子を使用して、たとえばHeLa細胞またはCHO細胞のような適切な宿主細胞株をトランスフェクトする。
【００２３】
OBF−1をコードしているDNAは、当該分野で公知の方法を用いて、安定に細胞内に組み込むことができるか、または一過性に発現させることができる場合もある。安定にトランスフェクトされた細胞は、選択マーカー遺伝子を有している発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、および上記マーカー遺伝子を発現している細胞の選択のための条件下で上記トランスフェクトした細胞を増殖させることによって調製することができる。一時的なトランスフェクタントを調製するためには、細胞をレポーター遺伝子でトランスフェクトして、トランスフェクション効率をモニターする。
【００２４】
OBF−1遺伝子を発現しているトランスフェクトした細胞株および形質転換細胞株を、当該分野で公知であり、（そのすべてが本明細書に組み込まれている）国際特許第WO95／32284号により詳細に記載されている、技術およびベクターを用いて構築することができる。特に好ましいベクターとして発現ベクターを挙げることができ、ここでは、OBF−1コード領域が、選択した宿主細胞内での高レベルの発現を提供が可能であるプロモーター領域およびエンハンサー領域のような調節配列に機能するように連結されている。発現ベクターは、プラスミド、ファージ、組換え体ウイルスまたは他のベクターのような、組換え体DNAまたはRNA構築物であり得る。適切なクローニングおよび発現ベクターを使用することは、明らかに当業者の力量の範囲内である。本発明の方法のための細胞を作製するために使用するベクターは、当該分野で非常によく知られている技術にしたがって構築することができる。
【００２５】
本発明の方法で使用するOBF−1タンパク質は、第WO95／32284号に示されている配列を有している全長のOBF−1タンパク質であり得る。したがって、1つの実施様態においては、細胞を、第WO95／32284号に記載されている配列、または同じタンパク質をコードする配列を有しているヌクレオチドでトランスフェクトする。あるいは、Oct−1および／またはOct−2結合ドメイン（たとえばアミノ酸1〜44）を含む、OBF−1タンパク質の断片を使用することができる。他の有用な断片には、oct−1および／またはoct−2結合ドメイン、ならびにOBF−1由来の別の転写活性化ドメインが含まれる。
【００２６】
さらに、OBF−1タンパク質の変異体を、本発明の方法において使用することができる。変異体には、基本的にはOBF−1タンパク質と同じ生物学的活性を示すが、1つまたはそれ以上の「保存的」置換、欠失または添加を含むタンパク質である場合もある。あまりないが、変異体は、たとえばグリシンのトリプトファンでの置換のような、「非保存的」変化を有する場合もある。どの、そしていくつのアミノ酸残基を、活性を損なわずに、置換、挿入または欠失させることができるかを決定する指針は、当該分野でよく知られているコンピュータプログラムを使用して見いだすことができる。典型的には、変異体は、第WO95／32284号に記載されている配列と、少なくとも75％同一、たとえば80％同一、85％同一、90％同一、95％同一または99％同一である配列を有する。
【００２７】
変異体はまた、第WO95／32284号で示された核酸配列の相補物に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質である場合もある。適切なストリンジェントな条件を決定することは、当業者の能力の範囲内である（そして、たとえばSambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manualに記載されている）。ハイブリッドの計算Tm値より約12〜20℃下の温度を使用することができ、たとえば、0.1×SSCおよび0.5％SDSを含む溶液中での約68℃での洗浄を使用することができる。当業者は、他の洗浄緩衝液および条件を想定することができる。
【００２８】
全長OBF−1またはその活性断片または変異体を含む融合タンパク質もまた、本発明の方法で有用であると考えられる。たとえば、OBF−1の標的化された送達または検出のためのタグを、タンパク質、断片または誘導体に融合させることができる。さらに、任意のOBF−1タンパク質、その断片もしくは変異体を、その生物学的活性を損なわないあらゆる方法で導くことができる。たとえば、安定性または活性のような特徴が改良されている、改変型アミノ酸／ペプチド結合を有しているペプチド、および天然には存在しないアミノ酸および／または環状ペプチドを含むペプチドを挙げることができる。
【００２９】
上記の本発明の方法に、または上記の方法のための細胞抽出物の産出に使用する細胞には、さらにレポーター遺伝子が必要である。レポーター遺伝子は、好ましくは、OBF−1応答性ヌクレオチド配列およびコード配列が互いに異種のものである組換え体遺伝子である。適切なレポーター遺伝子として、たとえば、OBF−1応答性エレメントに対して機能するように連結された、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質または分泌型アルカリホスファターゼコード配列を挙げることができる。当業者は、他のレポーター遺伝子を想定することができる。あるいは、レポーター遺伝子は、OBF−1応答性エレメントが、通常は、コード領域、たとえば免疫グロブリン遺伝子と関係している遺伝子であることもできる。
【００３０】
1つの実施様態において、レポーター遺伝子のOBF−1応答性エレメントは、コンセンサス配列ATGCAAATまたはその逆相補物（ATTTGCAT）を有するオクタマーモチーフを含む。レポーター遺伝子は、好ましくは、組換え体核酸構築物、たとえばDNAベクター上に存在し、これはプラスミドまたはウイルスに基づくベクターであり得る。
【００３１】
OBF−1タンパク質は、転写因子Oct−1およびOct−2（第WO95／32284号を参照のこと）への、詳細にはそれらのタンパク質のPOUドメインへのその結合を介して、オクタマー部位によって仲介される遺伝子の転写を活性化することが知られている。したがって、さらなる観点において、本発明は、OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、oct−1タンパク質およびoct−2タンパク質、ならびにOBF−1応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸構築物を準備すること、上記OBF−1、oct−1、oct−2および核酸構築物をともに、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、インビトロ転写させることを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。レポーター遺伝子の発現レベルを、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合について決定する。
【００３２】
インビトロ転写技術は当業者によく知られており、Dignamら（Nucl Acids Res、11，1475、1983）に記載されている方法に基づきうる。インビトロ転写によって産出されるRNAは、任意の上記の方法を用いて測定することができる。
【００３３】
oct−1および／またはoct−2タンパク質の生物学的に活性な断片を、本発明の方法に使用することができる。適切な断片はPOUドメインを含み、さらに、その転写増強活性を増大させる他の任意のドメインを含むことができる（たとえば、Tanaker & Herr, Cell, 60，375−386（1990）；Muller−Immergluckら，EMBO J,9,1625−1634（1990）、およびTanakaら，Mol Cell Biol，14，6046−6055（1994）を参照のこと）。さらに、octタンパク質の生物学的に活性な変異体または誘導体を使用することもできる。
【００３４】
本発明はまた、Aiolosタンパク質の活性を調節することができる薬剤のスクリーニングを提供する。したがって、本発明のさらなる観点によれば、Aiolosタンパク質およびAiolos応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を含有している細胞を準備すること、上記細胞を、インビトロで試験薬剤と接触させること、および上記レポーター遺伝子の発現レベルを、たとえば試験薬剤と接触させない対照細胞と比較することにより測定することを含む、Aiolosタンパク質の活性を変化させることができる有効な薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００３５】
Aiolosタンパク質は、遺伝子発現のレプレッサーである。したがって、細胞が野生型Aiolosタンパク質を含む場合には、レポーター遺伝子は通常の条件下で抑制されると予想される。レポーター遺伝子の発現の増大を引き起こす試験薬剤は、Aiolosのアンタゴニストであると結論づけられる。レポーター遺伝子の発現をさらに抑制する有効な薬剤は、Aiolosタンパク質のアゴニストであると結論づけられる。
【００３６】
あるいは、さらなる実施様態においては、細胞は、通常は不活性であるかまたは野生型Aiolosよりも低い抑制活性を示す変異型Aiolosタンパク質を含みうる。これらの細胞中では、レポーター遺伝子からの発現は野生型Aiolosを含む細胞内でよりも高いと予想され、これは、抑制の増強の検出が容易であるので、Aiolosのアゴニストのスクリーンを容易にする。
【００３７】
さらなる観点において、本発明は、Aiolos応答性ヌクレオチド配列に対して機能するように連結されたレポーター遺伝子をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を含有している細胞を準備すること、上記細胞を、インビトロで試験薬剤と接触させること、および試験薬剤と接触させていない対照細胞と比較することにより、上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。細胞は、Aiolosタンパク質を含むべきではない。
【００３８】
この観点において、細胞内にAiolosタンパク質がないことにより、レポーター遺伝子は正常な高い転写を生じる。レポーター遺伝子は、当業者によって簡単に決定することができる任意の適切な細胞において、構成的プロモーター、たとえばウイルスの構成プロモーター（たとえばSV40プロモーター）下で発現されるべきである。Aiolosタンパク質が存在しない場合に、レポーター遺伝子の抑制を生じる試験薬剤は、Aiolosタンパク質の活性を模倣すると結論づけられ、したがって、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の候補である。一般的に、Aiolosタンパク質のアゴニストは、自己免疫疾患に有効な活性な薬剤の候補である。
【００３９】
またさらなる観点において、本発明は、OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、およびoct−1タンパク質、oct−1タンパク質のPOUドメイン、oct−2タンパク質またはoct−2タンパク質のPOUドメインから選択したoctタンパク質を準備すること、上記OBF−1タンパク質を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、octタンパク質と混合することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。試験薬剤が存在する場合または存在しない場合について、OBF−1タンパク質へのoctタンパク質の結合を測定する。
【００４０】
1つの実施様態においては、OBF−1タンパク質とoctタンパク質を、両方のタンパク質を発現している細胞内で混合する。抽出物を、トランスフェクトした細胞より調製し、OBF−1タンパク質のoctタンパク質への結合に関して、たとえば第WO95／32284号で記載されているようにアッセイする。別の実施様態においては、OBF−1タンパク質とoctタンパク質を、インビトロで混合する。OBF−1タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いる組換え手段または精製によって作製することができる。
【００４１】
さらなる実施様態において、本発明は、OBF−1タンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、およびoct−1タンパク質、oct−2タンパク質、oct−1タンパク質のPOUドメイン、またはoct−2タンパク質のPOUドメインから選択したoctタンパク質を準備することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。細胞由来の抽出物（たとえば核抽出物）を作製し、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合で、oct−1またはoct−2タンパク質結合部位、たとえばオクタマー部位を含む標的核酸プローブと混合し、OBF−1タンパク質、octタンパク質および核酸プローブ間の複合体の形成を、試験薬剤が存在する場合または存在しない場合について測定する。
【００４２】
複合体の形成は、細胞抽出物／核酸プローブ混合物を、電気泳動移動度シフトアッセイにかけることによってアッセイすることができる。電気泳動移動度シフトアッセイにおける、octタンパク質へのOBF−1の結合は、2つのシフトによって特徴づけられる。1つのシフトは、核酸プローブ上のoct−1またはoct−2タンパク質結合部位へのoctタンパク質の結合によって生じる。より低い移動度の第二のシフトは、octタンパク質とOBF−1タンパク質と核酸プローブ間の複合体によって生じる。この第二の、いわゆる「スーパーシフト」と呼ばれるものの量の減少が、octタンパク質とOBF−1タンパク質間の結合の崩壊の指標である。
【００４３】
あるいは、本発明の方法での複合体の形成は、他の方法で、たとえば酵素結合免疫吸着法、蛍光に基づくアッセイ、または表面プラズモン共鳴または蛍光相間分光アッセイのような超ハイスループットアッセイによって測定することができる。好ましくはその結合部位へのoctの結合を妨害することなくこの結合能力を乱す試験薬剤が、OBF−1タンパク質の生物学的活性を中和すると予想され、したがって、自己免疫疾患に有効な薬剤の候補である。
【００４４】
1つの実施様態において、アッセイの細胞には、Oct−1タンパク質およびOct−2タンパク質（またはそのPOUドメイン）の両方が含まれる。
【００４５】
グラム陽性またはグラム陰性細菌のような原核生物細胞、および酵母、糸状菌、脊椎動物の初代もしくは二次細胞株、または不死化細胞株のような真核生物細胞を含む、種々の細胞型を、上記の複合体形成アッセイで使用することができる。
【００４６】
さらに好ましい実施様態においては、自己免疫疾患に有効な薬剤を、OBF−1遺伝子自体の発現のダウンレギュレーションを観察することによってスクリーニングすることができる。細胞中のOBF−1タンパク質レベルの減少は、より低いレベルのOBF−1を活性化することができる遺伝子の活性化を生じると予測されうる。したがって、さらなる観点において、本発明は、OBF−1遺伝子を含む細胞を準備すること、および上記細胞をインビトロで試験薬剤と接触させることを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。OBF−1遺伝子の発現を、試験薬剤が存在しない場合の発現レベルと比較して測定する。発現レベルの低下を生じる試験薬剤は、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の候補である。
【００４７】
OBF−1の活性またはレベルのダウンレギュレーションに加え、少なくともいくつかの個体では、Aiolos遺伝子による発現のアップレギュレーションもまた、自己免疫疾患の予防または処置に有用であると予想される。したがって、さらなる観点において、本発明は、Aiolos遺伝子を含む細胞を準備すること、および上記細胞をインビトロで試験薬剤と接触させることを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。Aiolos遺伝子の発現を、試験薬剤が存在しない場合の発現レベルと比較して測定する。Aiolos発現のアップレギュレーションを引き起こす試験薬剤は、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の候補である。
【００４８】
1つの実施様態において、OBF−1遺伝子またはAiolos遺伝子の発現の測定には、RT−PCR、ノーザンブロッティング、RNAse保護アッセイ、プライマー伸長アッセイ、または当業者が想定することができる他の適切なアッセイによる、OBF−1遺伝子またはAiolos遺伝子のRNA産物を測定することが含まれる。さらなる実施様態においては、OBF−1遺伝子またはAiolos遺伝子の発現の測定には、ELISAアッセイ、ウエスタンブロッティング、またはたとえば、ルシフェラーゼからの光の検出、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ、あるいは当業者が想定することができる任意の他の適切なアッセイを用いる、OBF−1遺伝子またはAiolos遺伝子のタンパク質産物の測定が含まれる。
【００４９】
OBF−1またはAiolos遺伝子は、ベクター上の非相同核酸として提供することができ、また、アッセイの細胞のゲノム中にコードさせることができる場合もある。好ましくは、内因性OBF−1遺伝子またはAiolos遺伝子の発現を測定する。あるいは、OBF−1またはAiolos遺伝子は、ベクター内で、cDNAとして提供することができる。ベクターはさらに、天然に存在している遺伝子由来の調節エレメント、たとえばプロモーター、エンハンサーおよびサプレッサーエレメントを含むべきである（たとえばStevensら，J Immunol, 164, 6372−6379（2000）を参照のこと）。
【００５０】
Aiolos−／−変異マウスが、SLEの症状を示すという発見により、SLE（および他の自己免疫疾患）の素因に関する診断試験が提供される。個体由来のAiolosタンパク質または核酸中の変異は、Aiolosタンパク質の活性または発現を減少させるかまたは完全になくす可能性がある。任意のそのような変異は、自己免疫疾患の素因の診断であると予想される。したがって、さらなる観点において、本発明は、インビトロにて、個体由来のAiolosタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは一部を決定することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの素因を診断する方法を提供する。したがって、AiolosのDNA結合ドメインにおける変異はその機能を崩壊させると予想され、自己免疫疾患の素因の診断であり得る。同様に、他の因子に対する結合ドメインにおける変異、またはタンパク質の安定性／代謝回転に影響を与えると予想される変異もまた、診断の指標である。
【００５１】
さらなる実施様態において、Aiolosタンパク質の発現レベルの減少を生じる、調節領域における変異のスクリーニングのために、Aiolos遺伝子の核酸配列を決定することができる。
【００５２】
1つの実施様態において、個体由来のAiolosタンパク質のアミノ酸配列は、個体の核酸配列より推測できる。Hosokawaら，Genomics, 61, 326−329（1999）、アクセス番号第AF129512号から明らかである野生型配列の配列全体およびその上での配列の変化は、自己免疫疾患の潜在的な素因を示す。さらなる観点において、本発明はまた、個体由来の試料におけるAiolos遺伝子の発現レベルを測定することを含む、自己免疫疾患の素因を診断する方法も提供する。好ましい実施様態において、発現レベルは、個体のAiolos遺伝子から転写されたメッセンジャーRNAのレベル、より好ましくは、個体中で決定することができる、Aiolosタンパク質自体のレベルを決定することによって測定する。
【００５３】
Aiolosの活性の発現が低下している個体において、またはAiolosの正常な活性または発現を示しているが、自己免疫疾患、たとえばSLEに罹患している個体においてもなお、Aiolosタンパク質、またはその活性な誘導体もしくは断片の投与が、治療への道を提供しうる。したがって、さらなる観点において、本発明は、治療におけるAiolosタンパク質の使用、および自己免疫疾患、たとえばSLEの治療のための医薬品の製造におけるAiolosタンパク質の使用を提供する。自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための医薬品の製造においては、Aiolosタンパク質をコードしている核酸の使用と同時に、医薬品としての使用のためのタンパク質をコードしている核酸もまた意図される。
【００５４】
本発明はまた、Aiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、またはAiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコードしている核酸を含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの予防または処置のための、医薬品組成物も提供する。
【００５５】
別の観点において、本発明は、有効量のAiolosタンパク質、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を投与することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEの処置のための方法を提供する。
【００５６】
有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。あらゆる化合物に関して、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは適切な動物モデルいずれかでまず見積もることができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を得るためにも使用することができる。このような情報はまた、ヒトでの投与に有用な用量および経路を決定するために使用することもできる。
【００５７】
治療有効用量は、症状または状態を緩和する有効な薬剤の量をいう。そのような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる（たとえば、集団の50％において治療的に有効な用量、ED50、および集団の50％にとって致死である用量、LD50）。治療効果および毒性効果の間の用量比が治療指標であり、比LD50／ED50として表すことができる。大きな治療指標を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験により得たデータを、ヒトでの使用のための投与量範囲を策定するために使用する。そのような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くないED50を含む、循環濃度の範囲内である。用量は、使用する用量形態、患者の感受性および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【００５８】
実際の投与量は、処置すべき患者に関して個々の医師によって選択される。投与量および投与は、活性部分の十分なレベルを提供し、または望まれる効果を維持するように調整することができる。考慮されるさらなる要素として、疾患状態の重篤度（たとえば腫瘍の大きさおよび局在）、患者の年齢、体重および性別、食事、投与時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応の感受性および治療への寛容性／応答を挙げることができる。長期作用型の医薬組成物は、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して、毎日、3〜4日ごと、1週間に1回、または2週間に1回投与することができる。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与は、経口または非経口で行われる。非経口的な送達方法には、局所、動脈内、筋肉内、皮下、脊髄内、くも膜下、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内投与が含まれる。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、賦形剤、および薬学的に使用することができる調製物中へと有効な化合物を処方することを容易にする他の化合物を含む、適切な薬学的に許容される担体を含むことができる。処方および投与に関する技術のさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing Co, Easton PA）の最新版で見ることが出来る。
【００６０】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適切な投与量で、当該分野でよく知られている薬学的に許容される担体を用いて処方することができる。そのような担体は、上記医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液など、患者による摂取に適切であるように処方することを可能にする。
【００６１】
経口での使用のための薬学的調製物は、有効な化合物を固体賦形剤と混合し、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、錠剤または糖衣錠の核を得ることを望む場合には、適切な追加の化合物を加えた後に、顆粒の混合物を処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質増量剤であり、限定はしないが、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム類、ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。望ましい場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの、崩壊剤または可溶化剤を加えることができる場合もある。
【００６２】
糖衣錠の核を、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物をもまた含むこともできる、濃縮した糖溶液のような適切なコーティング剤で処理することができる。染料または着色料を、製品の同定のため、または有効な化合物の量（すなわち用量）を特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることもできる。
【００６３】
経口で使用することができる薬学的調製物には、ゼラチンからなるプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングからなる、軟らかい密封カプセルが含まれる。プッシュ−フィットカプセルには、ラクトースまたはデンプン類のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および必要に応じて安定化剤と混合された有効成分を含むことができる。軟らかいカプセル中では、有効な化合物は、安定化剤とともにまたは安定剤を含まずに、脂肪油類、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁させることができる。
【００６４】
非経口投与のための薬学的処方には、有効な化合物の水溶液が含まれる。注射のためには、本発明の医薬組成物は、水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的緩衝化生理食塩水のような、生理学的に適合可能な緩衝液中で処方することができる。水性の注射用懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁液の粘性を増加させる物質が含まれる場合がある。さらに、有効な化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製することができる。適切な脂肪親和性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油のような脂肪油類、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド類のような合成の脂肪酸エステル類、あるいはリポソーム類が含まれる。必要に応じて、懸濁液には、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための、適切な安定化剤または化合物の溶解性を増加させる薬剤が含まれる場合もある。
【００６５】
局所または経鼻投与のために、特定のバリアを透過するために好ましい浸透剤を処方物に使用することができる。そのような浸透剤が、当該分野で一般的に公知である。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、基本的には当該分野で公知の標準的な製造手順にしたがって製造することができる（たとえば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠形成、粉末化、乳化、カプセル封入、取り込みまたは凍結乾燥処理の手段による）。
【００６７】
Aiolos−／−変異マウスもまた、容易にモニターすることができるSLEの多くの症状および他の自己免疫疾患の指標を示すので、自己免疫疾患に有効な薬剤の同定に有用である。したがって、1つの観点にしたがうと、本発明は、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の同定のための、Aiolos欠損マウスの使用を提供する。本発明はまた、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤の同定のための、インビトロの、Aiolos欠損B細胞の使用を提供する。
【００６８】
さらに特に、本発明は、試験薬剤を、Aiolos欠損マウスに投与すること、および上記マウスにおけるSLEの症状に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。
【００６９】
いくつかの異なる症状をモニターすることができ、効果は、尿中のクレアチニンおよび／または尿素のレベルの減少、尿中のタンパク尿素の減少、腎臓での免疫複合体形成の減少、腎臓の糸球体におけるIgMの蓄積の減少、腎臓炎症の減少、好ましくは、抗原でマウスをチャレンジしなかった場合の自発性胚中心形成の減少、血清IgG2A、IgAまたはIgG1の減少、低親和性自己応答性抗体、たとえば血清IgMの減少であり得る。
【００７０】
好ましくは、そのような方法で使用するAiolos欠損マウスはメスであり、より好ましくは上記方法にはさらに、効果を対照との比較によって決定するように、Aiolos欠損ではない対照マウス、たとえば野生型マウスに、試験薬剤を投与することが含まれる。
【００７１】
さらに、本発明のさらなる観点で、試験薬剤をAiolos欠損マウスに投与すること、上記マウスよりB細胞またはB細胞前駆体を抽出すること、上記B細胞をインビトロにて培養すること、および上記B細胞に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法が提供される。
【００７２】
本発明はまた、インビトロにてAiolos欠損B細胞を、試験薬剤と接触させること、およびB細胞に対する試験薬剤の少なくとも1つの効果を測定することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法を提供する。好ましくはB細胞は、脾臓または胸腺B細胞である。測定されるB細胞（またはB細胞前駆体）に対する効果は、好ましくは活性化マーカーの発現の増大によって測定されるB細胞の活性化、B細胞の増殖、好ましくはB細胞の過剰増殖、dsDNA、ssDNA、ヒストンまたはANAに応答性の抗体の減少である。測定可能な他の効果は、B1A細胞の増加、活性化マーカーMHC II抗原のレベルの減少、または脾臓B細胞におけるCD23の発現の減少である。インビトロにて試験薬剤と自体を接触させたB細胞またはB細胞前駆体に対する、あるいは試験薬剤を投与したAiolos欠損マウス由来のB細胞またはB細胞前駆体に対するそのような効果を、インビトロにて測定することができる。
【００７３】
B細胞またはB細胞前駆体に対する効果を試験することを含む、自己免疫疾患、たとえばSLEに有効な薬剤を同定する方法には、さらに、試験薬剤を、Aiolos欠損ではない対照マウス、たとえば野生型マウスに投与することを含む対照実験が含まれる。この例では、得られるB細胞培養は野生型であり、そのような野生型B細胞に対する試験薬剤の効果を、Aiolos欠損B細胞に対する効果と比較することができる。同様に、試験薬剤を、直接B細胞またはB細胞前駆体に投与する場合、対照には、Aiolos欠損ではない野生型B細胞またはB細胞前駆体に試験薬剤を投与することが含まれる。
【００７４】
上記方法での使用のためのB細胞を、1つまたはそれ以上の有糸分裂促進物質、たとえば抗μ、抗CD40＋IL4の存在下で培養することができる。
【００７５】
本発明の好ましい実施様態を、実施例の方法および図面に関連して本明細書中に記載される。
【００７６】
材料と方法
マウス
Aiolos欠損マウス（Wang, J HらImmunity 9, 543−553（1998））を、二重ヘテロ接合体を作製するために、OBF−1  −／−マウス（Schubart, DB,らNature 383，538−542（1996））と交配させた。これらのヘテロ接合体の異種交配を、二重ノックアウトマウスならびに対応する対照を作製するために使用した。マウスの遺伝子型を、尾のDNAのPCRによって決定した。すべてのマウスを従来の施設内で維持した。
【００７７】
免疫組織化学および組織変化
腎臓および脾臓を、OCT化合物（Miles）中に包埋した。免疫複合体の検出のために、凍結切片を抗IgG−FITC、抗IgM−FITC（Southern Biotechnology）および抗相補3−FITC（Cappel）で染色した。脾臓の染色のために、B細胞の小胞およびGCを、それぞれ抗IgM−Rodamin（Southern Biotechnology）およびビオチニル化されたピーナッツのアグルチニン（PNA）（Vector）で明らかにした。後者は、ストレプトアビジン−FITC（Southern Biotechnology）で発色させた。組織学的試験のために、腎臓をパラフィン中に包埋し、切片をPeriodic Acid Schiff（PAS）で染色した。
【００７８】
ELISAによる自己抗体およびIgGの検出
自己抗体を、ssDNA、ヒストン、ANA（Euroimmune）およびdsDNA（Euroimmune、sigma）に関して、先にコートしたプレートを用いてELISAによって検出した。使用した血清希釈は、1：50であった。一部の二重変異マウスについては、1：5の血清希釈物を使用した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、Santa Cruz）で標識した抗マウスIgGを、二次抗体として使用した。野生型血清で得られたODの平均＋2標準偏差を、陽性とスコアされるべき試料の下限と設定した。免疫グロブリンを、捕捉抗体である抗IgM、抗IgA、抗IgE、抗IgGおよび抗IgGサブクラス（Southern Biotechnology）を用いて、ELISAによって定量した。APと結合させた関連するイソ型抗体を二次抗体として使用した。
【００７９】
フローサイトメトリー分析
単細胞懸濁液を、脾臓および骨髄より調製した。以下の抗マウス抗体を使用して、直接または間接的な免疫蛍光検査において、表面マーカーを検出した。抗CD45R−FITC（B220）、抗c−kit−ビオチン、抗CD25−ビオチン（TAC）、抗IgM−ビオチン、抗IgD−ビオチン、抗CD23−PEおよび抗CD40L−PE。ビオチニル化抗体は、ストレプトアビジン−PEで発色させた。3×105の事象を、FACScliburを用いて、リンパ球ゲート上で回収した。
【００８０】
B細胞の単離と増殖アッセイ
脾臓B細胞を、B細胞単離キット（Cytovax Biotechnologies Inc.）を用いてネガティブ選択により精製した。5×105ml-1のB細胞を、示した刺激とともに、72時間、3連で培養し、最後の12時間は1μCiのメチル−3Hチミジンでパルスした。同位元素の取り込みを、シンチレーションカウンティングによって測定した。
【実施例１】
【００８１】
Aiolos（−／−）マウスは腎臓に免疫複合体を有しており、血清自己抗体について陽性である。
Aiolos変異マウス（−／−）を、Wang, JHらImmunity 9, 543−553（1998）にしたがって作製した。これらのAiolos変異マウス由来の腎臓切片を、免疫複合体の存在について染色した。図1aにて示すように、重IgG、IgMおよび補体（C）3の蓄積は、Aiolos−／−マウス由来の糸球体で同定されたが、WTマウスでは検出されなかった。血清自己抗体も、検出され、dsDNA、ssDNA、ヒストンおよびANAに対する自己抗体について陽性であるAiolos変異体マウスの割合は、年齢が同じ野生型マウスに比べて、有意に高く、Aiolos変異マウスの82％が、抗dsDNA抗体を産出した（表1）。抗dsDNA抗体について陽性である全てのマウスはまた、その腎臓に免疫複合体が蓄積していた。さらに、自己抗体について陽性であるすべてのAiolos−／−マウスの割合は、抗ヒストンをのぞいて、オスよりもメスで有意に高かった（表2）。この傾向は、以前の観察（Lahita, R. G. Curr Opin Rheumatol 11, 352−356（1999））と一致し、性ホルモンがSLEの発祥に役割を果たしていることを示唆している。加えて、腎臓の組織学的染色は、重度の炎症が、断片化された糸球体または拡大した糸球体の形態の免疫複合体の蓄積によって引き起こされたことを示した（図1b）。
【００８２】
【表１】
2005500854.tif 000002
【００８３】
自己抗体について陽性であるマウスの割合を示した。3〜7ヶ月齢の範囲の使用したマウスの数を括弧内で示した。血清自己抗体をELISAによって検出した。野生型マウスの平均＋2標準偏差を、陽性試料についての下限と設定した。
【００８４】
【表２】
2005500854.tif 000003
【００８５】
自己抗体について陽性であるマウスの割合を示した。3〜7ヶ月齢の範囲の使用したマウスの数を括弧内で示した。血清自己抗体をELISAによって検出した。野生型マウスの平均＋2標準偏差を、陽性試料についての下限と設定した
【実施例２】
【００８６】
Aiolos（−／−）マウスは、その血清中のクレアチニンおよび／または尿素のレベルの有意な増大を示す
重度の糸球体腎炎は慢性腎不全を導きうる。したがって、腎不全の指標である、クレアチニンおよび尿素の血清レベルを測定した。3〜5ヶ月齢の24匹のAiolos−／−マウスのうち7匹が、同じ年齢の対照群と比較して、有意に高いクレアチニン（図2a）および／または尿素（図2b）のレベルを示した。さらに、これらの7匹のマウスのうち5匹が、同時に両方のマーカーレベルの増大を示した。タンパク尿素もまた、これらのマウスのいくつかで検出された。
【実施例３】
【００８７】
Aiolos−／−、OBF−1−／−二重変異体マウスは自己抗体を有さず、糸球体中で免疫複合体の蓄積を示さない
Aiolos−／−マウスを、OBF−1−／−マウスと交配させ、dsDNA、ssDNA、ヒストンおよびANAに対する自己抗体を、二重変異体マウスの血清中で検出した。表2に示すように、二重ノックアウトマウスは、試験したもっとも低い血清希釈（1：5）でもなお、完全に自己抗体を欠いた。この結果は、OBF−1が、Aiolos−／−マウスで観察された自己免疫応答の発祥に必須であることを示している。さらに、上記の観察と一致して、免疫複合体の蓄積は、Aiolos−／−OBF−1  −／−マウスの糸球体では見られず（図1a）、腎臓形態の組織学的試験では、これらのマウスについは正常な糸球体を示した（図1b）。すべてのこれらの結果は、OBF−1の欠失が、Aiolos−／−マウスにおけるSLEの発症を妨げるという結論を裏づけている。
【実施例４】
【００８８】
B細胞の発達は、二重ノックアウトマウスにおいては未成熟の段階では極めて少ない
骨髄中のプロB（B220＋c−kit＋）およびプレ−B（B220＋Tac＋）細胞の数は、すべての変異体マウスで正常に見えた。しかし、以前の結果（Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998）およびSchubart，D. B.,らNature 383, 538−542（1996））と一致して、B細胞の発達は二重ノックアウトマウスにおいては未成熟の段階（B220＋IgM＋）では極めて少なく（図3a）、単一変異体ではそうではなかった。このことは、IgD＋B細胞へのさらなる成熟に大きな影響を与え、その大部分が失われていた（図3a）。さらに、骨髄中で成熟B細胞となるCD23+B細胞もまた、二重変異マウスにおいては激しく減少していた（図3a）。細胞質μ鎖の発現は二重変異マウスで影響を受けなかったので、骨髄中のB220＋IgM＋細胞の数の大きな減少は、μ鎖遺伝子の転写の減少の結果ではない。さらに、脾臓B220＋細胞の数は、二重変異マウスの約2倍減少したことが分かった（図3b）。本発明者らのデータは、プレBから未成熟B細胞の段階への十分な転移には、AiolosまたはOBF−1いずれかが必要であることを示唆している。
【実施例５】
【００８９】
CD23の発現は、Aiolos−／−マウスの脾臓B細胞上で増大するが、二重ノックアウト変異マウスでは増大しない
SLEの発症におけるB細胞の役割をさらに明確にするために、活性化マーカーCD23の発現を分析した。図4aは、Aiolos−／−マウスの脾臓B細胞上でのCD23の発現が、WTマウスに比べて増大したことを示している。このことは、Aiolos−／−B細胞が、高いレベルで、活性化マーカーMHCII抗原を発現したという先行する結果（Wang, J. H.ら. Immunity 9, 543−553（1998））と一致している。対照的に、OBF−1欠損マウスではCD23発現は減少した。両方のタンパク質を同時に欠く場合、CD23の発現は、野生型のレベルと近くなり、このことは、OBF−1の欠失が、Aiolosが存在しないことによって生じた問題を中和し、Aiolos−／−マウスにおいてB細胞の活性化を阻害することを示している。興味深いことに、IgEについての低親和性レセプター（FcμRII）であり、IgE産出のネガティブな調節因子であると見なされる（Stief, A.らJ Immunol 152, 3378−3390（1994）およびRiffo−Vasquez, Y.らClin Exp Allergy 30, 728−738（2000））CD23のアップレギュレーションは、Aiolos変異マウスのIgE産出の増大を妨げなかった（図4d）。
【実施例６】
【００９０】
Aiolos−／−マウスによって示されるB細胞の過剰増殖は、二重ノックアウトB細胞では弱まる
精製した異なる表現系の脾臓B細胞の、LPS、抗μおよび抗CD40＋IL4のような有糸分裂促進物質に応答してインビトロで増殖をする能力を試験した。LPS刺激をのぞくすべての場合で、Aiolos−／−B細胞は、WT細胞と比較して、増大した3H−チミジン取り込みを示し（図4b）、これは、以前の知見（Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998））とよく一致する。Aiolos欠損B細胞は、野生型細胞を活性化させない濃度でもなお、抗μによって増殖している状態にあり、このことは、Aiolosの欠失が、BCR経路の限界を低下させることを示唆している（Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998））。この過剰増殖は、二重ノックアウトB細胞では弱まり（図4b）、このことは、正常なOBF−1の機能が、Aiolos欠損B細胞の過剰活性に不可欠であることを示唆している。さらに、OBF−1−／−マウスの脾臓B細胞は、抗μ刺激にはあまり応答せず（図4b）、したがって、BCRにより媒介されるシグナル伝達ができないことが、OBF−1−／−マウスにおけるTIおよびTD応答の減少に関与している可能性がある。
【実施例７】
【００９１】
Aiolos−／−マウスの免疫グロブリンの血清レベルの増大は、二重ノックアウトマウスで減少する
Aiolosおよび二重変異マウスにおける異常な自己抗体の産出から、本発明者らは血清Igレベルを試験することを考えた。Aiolos欠損マウスは総IgGレベルは増加させないが、血清IgG2a、IgAおよびIgG1の増大を示し、また血清IgMを減少させた（図4c）（Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998））。しかし、二重ノックアウトマウスでは、すべてのIgのレベルは、OBF−1欠損マウスで観察されたレベルの近くまで減少した。B1a細胞は、低親和性自己応答性IgM抗体の主な供給源の1つである（Murakami, M., Honjo, T. Immunol Today 16, 534−539（1995））。Aiolos−／−マウスは、B1a細胞を大きく減少させ、このことが、血清IgMの減少に関係している（Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998））。興味深いことに、Aiolos−／−マウスは、血清IgMが減少しているにもかかわらず、糸球体中にIgMが蓄積していた。
【実施例８】
【００９２】
AiolosおよびOBF1を欠失しているマウスは、胚中心の形成ができない
Aiolos欠損マウスは、抗原でチャレンジされていない場合に、GCを形成する（図5、Wang, J. H.らImmunity 9, 543−553（1998））。この持続的なGCの形成は、これらのマウスにおけるSLEの発症に関係している可能性がある。多数の証拠により、活性化T細胞上でのCD40Lの発現が、B細胞がGCの形成を生じるために重要であることが示された（Xu, J.らImmunity 1, 423−431（1994）およびGrammer, A. C.,らJ Immunol 163, 4150−4159（1999））。狼瘡患者由来の、活性化された未刺激のT細胞およびB細胞上でのCD40Lの高い発現が報告されている（Desai−Mehta, A.,らJ. Clin. Invest. 97, 2063−2073（1996）およびKoshy, M.,らJ Clin Invest. 98, 826−837（1996））。Aiolos−／−マウスにおける自発的なGCの形成の機構を理解するために、CD40Lの発現を検出した。CD40Lの発現は、（胸腺および脾臓からの）未刺激Tの細胞上、ならびにAiolos欠損および野生型マウス由来の脾臓B細胞上では観察されなかった。しかし、PMA＋イオノマイシンによる活性化の後、Aiolos−／−T細胞は、WT細胞と同様にCD40Lを発現する。これらの結果は、CD40Lの発現の調節障害が、Aiolos−／−マウスにおける自発的であり持続的なGCの形成に関与はしていないことを示しており、他の分子（単数または複数）がこの表現系に関係していることを示唆している。以前の結果は、OBF−1がGCの形成に不可欠であるということを示している（Schubart, D. B.,らNature 383, 538−542（1996））。AiolosおよびOBF−1両方を欠失しているマウスは、GCを形成することが全くできない（図5）。このことは、OBF−1および／またはその標的遺伝子（単数または複数）が、Aiolosの下流に存在し、Aiolos欠損マウスにおけるGCの形成に必要であることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図1は、Aiolos欠損マウスの免疫複合体媒介性糸球体腎炎を示している。（a）は、FITCを結合させた抗マウスIgG、IgMまたはC3抗体での腎臓凍結切片の免疫蛍光染色を示しており、IgG、IgMおよびC3の沈殿が、Aiolos−／−マウスの糸球体で見られたが、年齢が同じ野生型マウスまたは二重変異マウスでは見られなかった。（b）は、パラフィン中に包埋した切片のPAS染色を示している。野生型マウスは、正常な糸球体を示している。Aiolos−／−マウス由来の切片は、重度の炎症の、硬化し、拡大した糸球体の特徴を示している。二重欠損マウスでは、炎症は見られなかった。
【図２】図2は、Aiolos−／−マウスが腎不全を発症していることを示している。3〜5ヶ月齢の24匹のAiolos−／−マウス、および同じ年齢の11匹の対照マウスにおけるクレアチニン（a）および尿素（b）の血清レベルは、7匹のAiolos−／−マウスからのクレアチニンおよび尿素の値が、野生型群の平均＋2S．D．以上であることを示している。これらの7匹のマウスのうち5匹で、同時に両方のマーカーのレベルが上昇した。
【図３】図3は、異なる遺伝子型のマウスにおけるB細胞の発達を示している。（a）示した抗体で二重染色した骨髄細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。（b）脾臓を、単色フローサイトメトリーによって分析した。B220＋細胞の割合を示している。遺伝子型はパネルの上部に記してある。データは、6〜10週齢の、それぞれの遺伝子型について6匹のマウスの典型例である。
【図４】図4は、B細胞活性化、増殖および免疫グロブリン産出を示している。（a）B細胞活性化を、活性化マーカーCD23の発現についてフローサイトメトリーによってアッセイした。脾臓細胞を、B220−FITCおよびCD23−PEで染色した。B220＋細胞のみをゲートにかけ、2×104個の細胞を回収した。高レベルでCD23を発現しているB細胞をフレームし、これに対応する割合を得た。結果は、それぞれの遺伝子型について3匹の動物の典型例である。（b）インビトロでのB細胞増殖を、3H−チミジンの取り込みを測定することによって決定した。精製した脾臓B細胞を、示した条件下で培養した。それぞれの刺激に関して、野生型細胞で得られた値（cpm）を100％と設定し、変異細胞で得られた値をその割合として得た。3連でアッセイした3匹のマウスによる平均±S．D．を（c）および（d）で示す。血清免疫グロブリンをELISAによって定量した。それぞれの場合において、2〜4ヶ月齢の6匹のマウス由来の血清をアッセイした。
【図５】図5は、胚中心形成が、Aiolos変異マウスにおいてもなおOBF−1を必要とすることを示している。脾臓B細胞の小胞およびGCを、抗マウスIgM−ローダミン（赤色）およびPNA−ビオチンでそれぞれ染色した。後者はストレプトアビジン−FITC（緑色）で発色させた。それぞれの遺伝型に由来する代表的な切片を示す。
【図１ａ】
2005500854.tif 000004
【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2005500854.tif 000062
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500854.tif 000063
【国際調査報告】
2005500854.tif 000064
2005500854.tif 000065
2005500854.tif 000066
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2005500854.tif 000068