(57)【要約】本発明は、基礎作用時間でさえ延長させる、インスリン分子を提供する。インスリン分子は、Ａ鎖のＮ末端、場合によりＢ鎖のＮ末端、Ｂ鎖リジンの修飾、および場合によりＡ鎖のＣ末端に修飾を含む。本発明はまた、インスリン分子の投与を含む、真性糖尿病の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｉ：
【数１】
2005519041.tif 000038
［式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載されている。］
で示されるＡ鎖、および
（ｂ）式ＩＩ：
【数２】
2005519041.tif 000039
［式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。］
で示されるＢ鎖を有するインスリン分子であって、
配列中、
Ａ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、
Ｂ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒ、Ａｌａであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれか１つはＬｙｓであり、
Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａの両方共がＬｙｓであることはなく、
Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基は正に荷電したアミノ酸のα−カルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−アミノ酸誘導体を形成している、インスリン分子。
【請求項２】
Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基がＡｒｇのαカルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇを形成している、請求項１に記載のインスリン分子。
【請求項３】
Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基がＬｙｓのαカルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓを形成している、請求項１に記載のインスリン分子。
【請求項４】
Ａ−１位のＸａａおよびＢ−１位のＸａａが存在しない、請求項１に記載のインスリン分子。
【請求項５】
Ｂ−１位のＸａａおよびＢ０位のＸａａが存在しない、請求項１に記載のインスリン分子。
【請求項６】
Ａ−１位のＸａａ、Ｂ−１位のＸａａおよびＢ０位のＸａａが存在しない、請求項１に記載のインスリン分子。
【請求項７】
Ａ０位のＸａａがＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ｂ０位のＸａａがＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在しない、請求項４に記載のインスリン分子。
【請求項８】
Ａ０位のＸａａがＡｒｇであり、
Ｂ０位のＸａａが存在しない、請求項７に記載のインスリン分子。
【請求項９】
Ａ０位のＸａａがＡｒｇであり、
Ｂ０位のＸａａがＡｒｇである、請求項７に記載のインスリン分子。
【請求項１０】
真性糖尿病の治療用の医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のインスリン分子の使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のインスリン分子を含有する組成物。
【請求項１２】
組成物が医薬組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
１種以上の製薬上許容される賦形剤をさらに含有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
二価の金属カチオンをさらに含有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒトインスリンをさらに含有する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
迅速に作用する（速効型）インスリンアナログをさらに含有する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
真性糖尿病の治療用の医薬の製造のための、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のインスリン分子、および二価の金属カチオンを含有するが、プロタミンを含有しない、微結晶。
【請求項２０】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項１９に記載の微結晶。
【請求項２１】
請求項４、６、７、８または９のいずれか１項に記載のインスリン分子、二価の金属カチオンおよびプロタミンを含有する微結晶。
【請求項２２】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項１９に記載の微結晶。
【請求項２３】
インスリン分子を含有する成分を二価の金属カチオンと、インスリン分子のヘキサマーの形成を可能とするｐＨで水性溶媒中で接触させることを含む、請求項１９に記載の微結晶の製造方法。
【請求項２４】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記成分をヘキサマー安定化化合物と接触させることをさらに含み、該ヘキサマー安定化化合物がヘキサマー形成を容易にする濃度で存在している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
真性糖尿病の治療用の医薬の製造のための、請求項１９に記載の微結晶の使用。
【請求項２７】
（ａ）インスリン鋳型の各遊離アミノ基を保護アミノ酸または保護アミノ酸誘導体でアシル化してアシル型インスリン分子を形成すること、
（ｂ）アシル型インスリン分子を精製すること、
（ｃ）各保護型アミノ酸または保護型アミノ酸誘導体から保護基を除去して脱保護型アシル型インスリン分子を形成すること、および
（ｄ）脱保護型アシル型インスリン分子を精製することを含む、インスリン分子の製造方法。
【請求項２８】
保護型アミノ酸が活性型カルボン酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
活性型カルボン酸がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
インスリン鋳型が組換えヒトインスリンまたはそのアナログである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
インスリン鋳型がＡ２１Ｘａａ−インスリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のインスリン分子を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、高血糖の治療方法。
【請求項３３】
請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の組成物を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、高血糖の治療方法。
【請求項３４】
被検体が真性糖尿病に関して処置される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１９に記載の微結晶を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、真性糖尿病の治療方法。
【請求項３６】
（ａ）式Ｉ：
【数３】
2005519041.tif 000040
［式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載されている。］
で示されるＡ鎖、および
（ｂ）式ＩＩ：
【数４】
2005519041.tif 000041
［式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。］
で示されるＢ鎖を有するインスリン分子であって、
配列中、
Ａ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、
Ｂ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであり、
Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒ、Ａｌａであるか、または存在せず、
Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれか１つはＬｙｓであり、
Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａの両方共がＬｙｓであることはない、インスリン分子。
【請求項３７】
Ａ−１位のＸａａが存在せず、
Ｂ−１位のＸａａが存在しない、請求項３６に記載のインスリン分子。
【請求項３８】
Ａ０位のＸａａがＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｂ０位のＸａａがＡｒｇまたはＬｙｓである、請求項３７に記載のインスリン分子。
【請求項３９】
Ａ０位のＸａａがＡｒｇであり、
Ｂ０位のＸａａがＡｒｇである、請求項３８に記載のインスリン分子。
【請求項４０】
請求項３６に記載のインスリン分子および二価のカチオンを含有する微結晶。
【請求項４１】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項４０に記載の微結晶。
【請求項４２】
プロタミンをさらに含有する、請求項４０または４１に記載の微結晶。
【請求項４３】
請求項３６に記載のインスリン分子を含有する組成物。
【請求項４４】
二価の金属カチオンをさらに含有する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
二価の金属カチオンが亜鉛である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
組成物が医薬組成物である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
製薬上許容されるキャリアをさらに含有する、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
真性糖尿病の治療用の医薬の製造のための、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のインスリン分子の使用。
【請求項４９】
真性糖尿病の治療用の医薬の製造のための、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項５０】
請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のインスリン分子を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、高血糖の治療方法。
【請求項５１】
請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の組成物を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、高血糖の治療方法。
【請求項５２】
被検体が真性糖尿病に関して処置される、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４０〜４２に記載の微結晶を被検体の血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に投与することを含む、真性糖尿病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮出願番号60/344,310(2001年12月20日出願)および米国仮出願番号60/414,604(2002年９月27日出願)の優先権を主張する（これらを本明細書中に参照してそのまま組み込む）。
【０００２】
本発明は、真性糖尿病の特徴である高血糖の処置に有用であるインスリン分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリンに対する生理学的要求は次の２つの相に分けることができる。(ａ)食事に関連する血中グルコースの上昇に対処するために、インスリンのパルス(pulse)を必要とする栄養吸収相、および(ｂ)最適な空腹時血糖を維持するための肝臓のグルコース産出を調節するためのインスリンの持続的な送達（「基礎」インスリン分泌としても公知）を必要とする吸収後相。
【０００４】
糖尿病を有する人々に有効なインスリン治療は、通常、２つのタイプの外来性インスリン製剤（ボーラス注射により提供される即時作用型（速効型）食事時インスリン、および食事間の血糖レベルを制御するために１日１回または２回注射により投与される長期作用型（持続型）インスリン）の併用使用に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
理想的な外来性基礎インスリンは、継続した、「フラットな」時間作用を提供する。すなわち、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間の間、重篤な低血糖の危険性を伴わずに血糖レベルを制御する。
【０００６】
市販され用いられている長期作用型インスリン分子は、２４時間の間のインスリン効果を提供しない。従って、２４時間までのインスリン効果を提供するインスリン分子に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下：
（ａ）式Ｉ：
【数１】
2005519041.tif 000002
［式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載されている。］
で示されるＡ鎖、および
（ｂ）式ＩＩ：
【数２】
2005519041.tif 000003
［式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。］
で示されるＢ鎖を有するインスリン分子を提供し、配列中、
Ａ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、
Ｂ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒ、Ａｌａであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれか１つはＬｙｓであり、
Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａの両方共がＬｙｓであることはなく、
Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基は正に荷電したアミノ酸のα−カルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−アミノ酸誘導体を形成している。
【０００８】
また本発明は真性糖尿病を治療する方法を提供し、この方法は被検体に本発明のインスリン分子を血糖濃度を調節するために十分な量で投与することを含む。
【０００９】
また、本発明は本発明のインスリン分子を含む微結晶、微結晶を製造する方法、および微結晶を投与することによる糖尿病の治療方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は不溶相および溶液相を含む懸濁製剤を提供し、この不溶相は本発明の微結晶を含み、溶液相は水を含む。また、本発明は懸濁製剤の製造方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は真性糖尿病の治療方法を提供し、この方法は懸濁製剤を被検体の血糖濃度を調節するために十分な量で投与することを含む。
【００１２】
また、本発明は懸濁製剤を製造する方法を提供する。また、本発明は真性糖尿病の治療方法を提供し、この方法は被検体の血糖濃度を調節するために十分な量で被検体に懸濁製剤を提供することを含む。
【００１３】
また、本発明はインスリン分子の製造方法を提供し、この方法は（ａ）インスリン鋳型の各遊離アミノ基を保護アミノ酸または保護アミノ酸誘導体でアシル化してアシル型インスリン分子を形成すること、（ｂ）アシル型インスリン分子を精製すること、（ｃ）各保護型アミノ酸または保護型アミノ酸誘導体から保護基を除去して脱保護型アシル型インスリン分子を形成すること、および（ｄ）脱保護型アシル型インスリン分子を精製することを含む。１つの好ましい実施態様において、保護型アミノ酸は保護型Ａｒｇであり、アミノ酸はＡｒｇである。別の好ましい態様において、保護型アミノ酸は保護型Ｌｙｓであり、アミノ酸はＬｙｓである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
１つの好ましい態様において、本発明はインスリンＡ鎖のＮ末端、インスリンＡ鎖のＣ末端、インスリンＢ鎖のＮ末端、およびＢ鎖のＬｙｓの１ヶ所以上に修飾を含むインスリン分子を提供する。
【００１５】
別の好ましい態様において、本発明のインスリン分子はＡ鎖のＮ末端の修飾、Ｂ鎖のＮ末端の修飾、Ｂ鎖Ｌｙｓの修飾および場合によりＡ鎖のＣ末端の修飾を含む。例えば、このようなインスリン分子は、ＡｒｇがＡ鎖のＮ末端に共有結合により付加され、ＡｒｇがＢ鎖のＮ末端に共有結合により付加され、Ｂ鎖Ｌｙｓが修飾され、場合によりＡ鎖のＣ末端アミノ酸がＧｌｙのような別のアミノ酸で置換されているインスリン分子である。
【００１６】
別の好ましい態様において、本発明のインスリン分子はＡ鎖のＮ末端の修飾、Ｂ鎖リジンの修飾、場合によりＡ鎖のＣ末端の修飾を含む。例えば、このようなインスリン分子は、ＡｒｇがＡ鎖のＮ末端に共有結合し、Ｂ鎖Ｌｙｓが修飾されており、場合によりＡ鎖のＣ末端アミノ酸がＧｌｙのような別のアミノ酸で置換されているインスリン分子である。
【００１７】
別の好ましい態様において、本発明は以下：
（ａ）式Ｉ：
【数３】
2005519041.tif 000004
［式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載されている。］
で示されるＡ鎖、および
（ｂ）式ＩＩ：
【数４】
2005519041.tif 000005
［式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。］
で示されるＢ鎖を有するインスリン分子を提供し、配列中、
Ａ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、
Ｂ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジンホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒ、Ａｌａであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれか１つはＬｙｓであり、
Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａの両方共がＬｙｓであることはなく、
Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基は正に荷電したアミノ酸のα−カルボキシル基に共有結合している。
【００１８】
１つの好ましい態様において、Ａ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、Ｂ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在しない。
【００１９】
別の好ましい態様において、Ａ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａはＡｒｇであり、Ｂ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在しない。
【００２０】
別の好ましい態様において、Ａ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａは誘導体型Ｌｙｓであり、Ｂ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在しない。
【００２１】
「式Ｉ」は以下：
【数５】
2005519041.tif 000006
により示されるものであり、式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載されている。式ＩのＡ−１〜Ａ２１位のアミノ酸は、それぞれ、配列番号１の１〜２３位のアミノ酸に対応する。式ＩのＡ１〜Ａ２０位および配列番号１の３〜２２位のアミノ酸は、ヒトインスリンＡ鎖（配列番号３）の１〜２０位のアミノ酸に対応する。
【００２２】
「式ＩＩ」は以下：
【数６】
2005519041.tif 000007
により示されるものであり、式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。式ＩＩのＢ−１〜Ｂ３０位のアミノ酸は、それぞれ、配列番号２の１〜３２位のアミノ酸に対応する。式ＩＩのＢ１〜Ｂ２７位および配列番号２の３〜２９位のアミノ酸は、ヒトインスリンＢ鎖（配列番号４）の１〜２７位のアミノ酸に対応する。
【００２３】
多数の異なる種由来のインスリン分子のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列が当業者に周知である。好ましくは、「インスリン」はヒトインスリンを意味する。「ヒトインスリン」は、以下：
【数７】
2005519041.tif 000008
で示される２１個のアミノ酸Ａ鎖、および以下：
【数８】
2005519041.tif 000009
で示される３０個のアミノ酸Ｂ鎖を有する。
【００２４】
ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖はジスルフィド結合により架橋されている。鎖間ジスルフィド結合の１つは式ＩのＡ７位のＣｙｓと式ＩＩのＢ７位のＣｙｓとの間にあり、他方の鎖間ジスルフィド結合は式ＩのＡ２０位のＣｙｓと式ＩＩのＢ１９位のＣｙｓとの間にある。鎖内ジスルフィド結合は式ＩのＡ６位およびＡ１１位のシステイン間にある。
【００２５】
用語「宿主細胞」は、１種の宿主細胞および１種より多くの宿主細胞の両方を意味する。
【００２６】
本明細書中で用いる「インスリン分子」は、野生型インスリン、インスリン誘導体およびインスリンアナログを含む。
【００２７】
「正に荷電したアミノ酸」は、天然または非天然のアミノ酸であり、ｐＨ６．０で正味の正の荷電を有する。１つの好ましい態様において、正に荷電したアミノ酸はＡｒｇである。別の好ましい態様において、正に荷電したアミノ酸はＬｙｓである。
【００２８】
本明細書中で用いる「インスリン誘導体」は、Ｌｙｓが誘導体化されてＬｙｓのε−アミノ基（−Ｎε）と別の部分との間で共有結合を形成しているインスリン分子を意味する。好ましい態様の１つにおいて、Ａ鎖Ｌｙｓを誘導体化してＬｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成する。別の好ましい態様において、Ｂ鎖Ｌｙｓを誘導体化してＬｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成する。別の好ましい態様において、Ａ鎖ＬｙｓおよびＢ鎖Ｌｙｓの両方を誘導体化して各Ｌｙｓのεアミノ基および別の部分の間に共有結合を形成する。
【００２９】
別の好ましい態様において、正に荷電したアミノ酸を用いてアシル化することにより共有結合を形成する。この態様において、共有結合を形成するためのＬｙｓへのアミノ酸の共有結合の際にＬｙｓのεアミノ基由来の水素原子およびアミノ酸のαカルボキシル基のヒドロキシル部分が脱離して水を形成する場合に、共有結合はＬｙｓのεアミノ基とアミノ酸のαカルボキシル基の炭素との間に形成される。
【００３０】
別の好ましい態様において、共有結合はＬｙｓのεアミノ基とＡｒｇのαカルボキシル基の炭素との間に形成され、これは「Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ」誘導体を形成する。Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ誘導体を図１に示す。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２８位のＬｙｓから形成される。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン誘導体は式ＩＩの２９位のＬｙｓから形成され、これは配列番号４の２９位のＬｙｓに対応する。
【００３１】
別の好ましい態様において、共有結合はＬｙｓのεアミノ基とＬｙｓのαカルボキシル基の炭素との間に形成され、これは「Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ」誘導体を形成する。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２８位のＬｙｓから形成される。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２９位のＬｙｓから形成され、これは配列番号４の２９位のＬｙｓに対応する。
【００３２】
本明細書中で用いる「プロインスリン誘導体」は、ＬｙｓがＬｙｓのε−アミノ基と別の部分との間に共有結合を形成するように誘導体化されているプロインスリン分子を意味する。１つの好ましい態様において、共有結合は正に荷電したアミノ酸とのアシル化により形成される。この態様において、共有結合は、Ｌｙｓのεアミノ基と正に荷電したアミノ酸のαカルボキシル基の炭素との間に形成され、これは「Ｌｙｓ−Ｎε−アミノ酸」誘導体を形成する。好ましい態様の１つにおいて、共有結合は、Ｌｙｓのεアミノ基とＡｒｇのα−カルボキシル基の炭素との間に形成され、これは「Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ」誘導体を形成する。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２８位のＬｙｓから形成される。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２９位のＬｙｓから形成され、これは配列番号４の２９位のＬｙｓに対応する。別の好ましい様態において、共有結合はＬｙｓのεアミノ基とＬｙｓのα−カルボキシル基の炭素との間に形成され、これは「Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ」誘導体を形成する。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２８位のＬｙｓから形成される。別の好ましい態様において、Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓインスリン誘導体は式ＩＩのＢ２９位のＬｙｓから形成され、これは配列番号４の２９位のＬｙｓに対応する。
【００３３】
本明細書中で用いる「インスリンアナログ」は、本明細書中で用いる「インスリン誘導体」とは異なる。「インスリン誘導体」は、Ｌｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成するようにＬｙｓが誘導体化されているインスリン分子である。「インスリン誘導体」とは異なり、「インスリンアナログ」は野生型インスリンとは異なるように修飾されているインスリン分子であるが、Ｌｙｓは、Ｌｙｓのεアミノ基と別の部分との間の共有結合を形成するように誘導体化されていない。従って、インスリンアナログは、それぞれ、ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖と実質的に同じアミノ酸配列を有するＡ鎖および／またはＢ鎖を有し得るが、Ａ鎖および／またはＢ鎖に１つ以上のアミノ酸欠失を有する、および／またはＡ鎖および／またはＢ鎖に１つ以上のアミノ酸置換を有する、および／またはＡ鎖および／またはＢ鎖のＮおよび／またはＣ末端に共有結合したアミノ酸を１つ以上有することにより、ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖とは異なる。
【００３４】
それゆえ、例えば、Ａ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンおよびＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−ＮεＡｒｇ−インスリンはインスリン誘導体である。なぜならば、これらの分子の各々はＬｙｓが誘導体化されてＬｙｓのε−アミノ基と別の部分（Ａｒｇ）との間に共有結合を形成しているからである。インスリン誘導体とは反対に、Ａ０Ａｒｇ−インスリンはインスリンアナログである。なぜならば、Ａ０Ａｒｇ−インスリンにおいて、ＬｙｓはＬｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成するように誘導体化されていないからである。
【００３５】
本明細書中で用いる「プロインスリンアナログ」は、本明細書中で用いる「プロインスリン誘導体」とは異なる。「プロインスリン誘導体」は、ＬｙｓがＬｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成するように誘導体化されているプロインスリン分子である。「プロインスリン誘導体」とは異なり、「プロインスリンアナログ」は、野生型プロインスリンとは異なるように修飾されているプロインスリン分子であるが、ＬｙｓはＬｙｓのεアミノ基と別の部分との間に共有結合を形成するように誘導体化されていない。
【００３６】
従って、プロインスリンアナログは、それぞれ、ヒトプロインスリンにおけるＡ鎖、Ｂ鎖およびＣペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、Ａ鎖、Ｂ鎖またはＣペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸欠失、および／またはＡ鎖、Ｂ鎖またはＣペプチドにおける１つ以上のアミノ酸置換、および／またはＡ鎖、Ｂ鎖またはＣペプチドのＮおよび／またはＣ末端に共有結合した１つ以上のアミノ酸を有することにより、ヒトプロインスリンのＡ鎖、Ｂ鎖およびＣペプチドとは異なるＡ鎖、Ｂ鎖およびＣペプチドを有しうる。例えば、Ａ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇプロインスリンはインスリン誘導体であるが、Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏプロインスリンはプロインスリンアナログである。
【００３７】
式ＩのＡ−１位のＸａａのアミノ酸は存在してもよいし、存在しなくともよい。存在する場合は、Ａｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであることが好ましい。
【００３８】
Ａ０位のＸａａのアミノ酸は存在しなければならない。好ましい態様において、Ａ０位のＸａａは、Ａｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンである。好ましい態様において、Ａ０位のＸａａは正に荷電したアミノ酸で誘導体化されたＬｙｓである。別の好ましい態様において、Ａ０位のＸａａはＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇである。別の好ましい態様において、Ａ０位のＸａａはＬｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓである。
【００３９】
Ａ２１位のＸａａのアミノ酸は遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、以下からなる群から選択される：アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）。好ましい態様の１つにおいて、Ａ２１位のＸａａのアミノ酸はグリシンである。好ましい別の態様において、Ａ２１位のＸａａのアミノ酸はセリンである。Ａ２１位のＸａａのアミノ酸はトレオニンである。Ａ２１位のＸａａのアミノ酸はアラニンである。
【００４０】
式ＩＩのＢ−１位のＸａａのアミノ酸は存在してもよいし、存在しなくともよい。存在する場合は、Ａｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであることが好ましい。Ｂ０位のＸａａのアミノ酸は存在してもよいし、または存在しないかもしれない。存在する場合は、Ａｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンが好ましい。Ｂ０位のＸａａのアミノ酸が存在しない場合、Ｂ−１位のＸａａのアミノ酸もまた、存在しない。
【００４１】
Ｂ２８位のＸａａのアミノ酸はＬｙｓまたはＰｒｏである。
Ｂ２９位のＸａａのアミノ酸はＬｙｓまたはＰｒｏである。
Ｂ３０位のＸａａのアミノ酸はＴｈｒ、Ａｌａであるかまたは存在しない。
【００４２】
好ましい態様の１つにおいて、Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれかがＬｙｓであるが、Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａの両方共がＬｙｓであることはなく、Ｂ２８位またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基は正に荷電したアミノ酸のα−カルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−アミノ酸誘導体を形成する。別の好ましい態様において、Ｂ２８またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基はＡｒｇのεカルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ誘導体を形成する。別の好ましい態様において、Ｂ２８またはＢ２９位のＬｙｓのεアミノ基はＬｙｓのεカルボキシル基に共有結合してＬｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ誘導体を形成する。
【００４３】
別の好ましい態様において、インスリン分子中のアミノ酸はさらに誘導体化されている。好ましい態様の１つにおいて、アミノ酸誘導体化はアシル化である。さらに好ましくは、式ＩＩのＢ２９位のＬｙｓはアミノ酸でアシル化されている。
【００４４】
別の好ましい態様において、アミノ酸誘導体化はカルバミル化（ｃａｒｂａｍｙｌａｔｉｏｎ）である。好ましくは、Ｌｙｓは誘導体化されてホモアルギニン（ｈｏｍｏａｒｇｉｎｎｅ）を形成する。さらに好ましくは、ホモアルギニンは式ＩＩのＢ２９位のＬｙｓから形成される。
【００４５】
「ポリペプチド鎖」は、ペプチド結合を介して共に連結されている２つ以上のアミノ酸を意味する。
【００４６】
好ましい態様において、本発明のインスリン分子のＡ鎖は２個のジスルフィド結合を介してＢ鎖に架橋されており、Ａ鎖は鎖内ジスルフィド結合架橋を含む。さらに具体的には、「適切に架橋された」とは、（１）式ＩのＡ６位のＣｙｓとＡ１１位のＣｙｓとの間のジスルフィド結合、（２）式ＩのＡ７位のＣｙｓと式ＩＩのＢ７位のＣｙｓとの間のジスルフィド結合、および（３）式ＩのＡ２０位のＣｙｓと式ＩＩのＢ１９位のＣｙｓとの間のジスルフィド結合を意味する。
【００４７】
インスリンおよびプロインスリン分子を示すために、本明細書中では簡単な省略表現を用い、式ＩのＡ鎖（配列番号１）および式ＩＩのＢ鎖（配列番号２）に関して記載する。この表記法では、インスリン分子の省略名にＡ−１、Ｂ−１またはＢ０位のＸａａアミノ酸が記載されていない場合、その位置のＸａａは存在しない。Ａ２１位のＸａａのアミノ酸がインスリン分子の省略名に記載されていない場合、アミノ酸は、野生型インスリンＡ鎖（配列番号３）のＡ２１位のアミノ酸である、Ａｓｎである。Ｂ２８位のＸａａのアミノ酸がインスリン分子の省略名に記載されていない場合、アミノ酸は、野生型インスリンＢ鎖（配列番号４）のＢ２８位のアミノ酸である、Ｐｒｏである。Ｂ２９位のＸａａのアミノ酸がインスリン分子の省略名に記載されていない場合、アミノ酸は、野生型インスリンＢ鎖のＢ２９位のアミノ酸である、Ｌｙｓである。Ｂ３０位のＸａａのアミノ酸がインスリン分子の省略名に記載されていない場合、アミノ酸は、野生型インスリンＢ鎖のＢ３０位のアミノ酸である、Ｔｈｒである。「脱（Ｂ３０）（ｄｅｓ（Ｂ３０））」はＢ３０位のＸａａが存在しないことを意味する。プロインスリンのアミノ酸がプロインスリン分子の省略名に記載されていない場合、その位置のアミノ酸は野生型ヒトプロインスリン分子の位置のアミノ酸である。
【００４８】
省略名の非限定的な例において、省略名「Ａ０ＡｒｇＡ２１ＸａａＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン」は、式ＩのＡ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａはＡｒｇであり、Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、式ＩＩのＢ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａはＡｒｇであり、Ｂ２８位のＸａａはＰｒｏであり、Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇであり、Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒであることを意味する。
【００４９】
省略名の別の非限定的な例においては、省略名「Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン」は、式ＩのＡ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａはＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇであり、Ａ２１位のＸａａはＧｌｙであり、式ＩＩのＢ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在せず、Ｂ２８位のＸａａはＰｒｏであり、Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇであり、Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒであることを意味する。
【００５０】
省略名の別の非限定的な例において、省略名「Ａ２１Ｘａａ−インスリン」は、式ＩのＡ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａは存在せず、Ａ２１位のＸａａはＡ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、式ＩＩのＢ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在せず、Ｂ２８位のＸａａはＰｒｏであり、Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓであり、Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒであることを意味する。「Ａ２１Ｇｌｙ−インスリン」はＡ２１位のＸａａがＧｌｙであることを除き、Ａ２１Ｘａａ−インスリンと同じである。「Ａ２１Ｓｅｒ−インスリン」はＡ２１位のＸａａがＳｅｒであることを除き、Ａ２１Ｘａａ−インスリンと同じである。
【００５１】
省略名の別の非限定的な例において、省略名「Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリン」は、式ＩのＡ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａは存在せず、Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、式ＩＩのＢ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在せず、Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓであり、Ｂ２９位のＸａａはＰｒｏであり、Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒであることを意味する。
【００５２】
省略名の別の非限定的な例において、省略名「Ａ０Ａｒｇ−インスリン」は式ＩのＡ−１位のＸａａは存在せず、Ａ０位のＸａａはＡｒｇであり、Ａ２１位のＸａａはＡｓｎであり、式ＩＩのＢ−１位のＸａａは存在せず、Ｂ０位のＸａａは存在せず、Ｂ２８位のＸａａはＰｒｏであり、Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓであり、Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒであることを意味する。米国特許番号５，５０６，２０２、および米国特許番号５，４３０，０１６を参照のこと。
【００５３】
「ｇＨＲ」はα−グアニジルホモアルギニンを意味する。
【００５４】
好ましい態様において、本発明のインスリン分子は以下からなる群から選択される。
【数９】
2005519041.tif 000010
【数１０】
2005519041.tif 000011
【数１１】
2005519041.tif 000012
【数１２】
2005519041.tif 000013
【数１３】
2005519041.tif 000014
【００５５】
別の好ましい態様において、本発明のインスリン分子はＡ鎖のＮ末端およびＢ鎖のＮ末端の修飾を含む。例えば、このようなインスリン分子は、ＡｒｇがインスリンＡ鎖のＮ末端に共有結合し、ＡｒｇがインスリンＢ鎖に共有結合しているインスリン分子である。好ましい態様の１つにおいて、本発明は以下：
（a）式Ｉ：
【数１４】
2005519041.tif 000015
［式中、式Ｉのアミノ酸配列は配列番号１に記載される］
で示されるＡ鎖、および
（ｂ）式ＩＩ：
【数１５】
2005519041.tif 000016
［式中、式ＩＩのアミノ酸配列は配列番号２に記載される］
で示されるＢ鎖を有するインスリン分子を提供し、配列中、
Ａ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ａ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ａ２１位のＸａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸であり、
Ｂ−１位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニン、αメチルアルギニンであるか、または存在せず、
Ｂ０位のＸａａはＡｒｇ、誘導体型Ａｒｇ、ホモアルギニン、脱アミノホモアルギニン、脱アミノアルギニン、Ｌｙｓ、誘導体型Ｌｙｓ、脱アミノリジン、αグアニジノホモアルギニンまたはαメチルアルギニンであり、
Ｂ２８位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ２９位のＸａａはＬｙｓまたはＰｒｏであり、
Ｂ３０位のＸａａはＴｈｒ、Ａｌａであるかまたは存在せず、
Ｂ２８位のＸａａまたはＢ２９位のＸａａのいずれか１つはＬｙｓであり、そして
Ｂ２８位のＸａａおよびＢ２９位のＸａａは両方共はＬｙｓではない。
【００５６】
本発明のインスリンアナログおよび亜鉛を含む微結晶もまた提供される。好ましい態様において、微結晶はインスリンアナログ、亜鉛およびプロタミンを含む。
【００５７】
微結晶の製造方法もまた提供され、この方法はインスリン分子を含む成分および二価の金属カチオンをインスリン分子のヘキサマーの形成を可能とするｐＨの水性溶媒中で接触させることを含む。「接触させる」とは、広義には成分を溶液中に配置することを意味する。やや狭義には、接触させるとは、成分の溶液を転倒させる、回転させる、振盪する、または振動させることを意味する。より具体的には、接触させるとは成分を攪拌することを意味する。
【００５８】
別の好ましい態様において、インスリンアナログは以下からなる群から選択される：
【数１６】
2005519041.tif 000017
【００５９】
「インスリン鋳型」は修飾されて本発明のインスリンアナログまたは誘導体を形成するインスリン分子を意味する。続いての化学修飾用の鋳型として用いられ得るインスリン分子としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されるわけではない：天然のインスリンおよび好ましくはヒトインスリン、ヒトインスリンのアナログ、Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリン、Ａ０Ａｒｇ−インスリン、Ａ２１Ｘａａ−インスリン、Ａ０ＡｒｇＡ２１ａＸａａ−インスリン、Ｂ０Ａｒｇ−インスリン、Ｂ２８Ａｓｐ−インスリン、Ｂ３ＬｙｓＢ２９Ｇｌｕ−インスリン、および続いてのアシル化工程の反応特異性を上昇させるために１つまたは２つの遊離アミノ基が先に保護基（好ましくは、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ））で誘導体化されているインスリン分子。好ましくは、インスリン鋳型は組換えインスリンである。さらに好ましくは、インスリン鋳型は組換えヒトインスリンまたはそのアナログである。最も好ましくは、インスリン鋳型は組換えヒトインスリンである。
【００６０】
インスリン分子の脱アミド化を減少させるため、または阻害するために、および／または分子のインスリン効果を長期化させるために、式Ｉの２１位の野生型アスパラギン（配列番号２の２３位に対応する）を別のアミノ酸で置き換えることが望ましい場合、Ａ２１Ｘａａ−インスリンをインスリン鋳型として用いることができる。好ましい態様の１つにおいて、Ａ２１ＡｓｎをＡ２１Ｇｌｙと置き換えてＡ２１Ｇｌｙ−インスリンを形成する。別の好ましい態様において、Ａ２１ＡｓｎをＡ２１Ｔｈｒと置き換えてＡ２１Ｔｈｒ−インスリンを形成する。別の好ましい態様において、Ａ２１ＡｓｎをＡ２１Ａｌａと置き換えてＡ２１Ａｌａ−インスリンを形成する。別の好ましい態様において、Ａ２１ＡｓｎをＡ２１Ｓｅｒと置き換えてＡ２１Ｓｅｒ−インスリンを形成する。
【００６１】
「組換えタンパク質」は、真核生物または原核生物細胞においてタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターから発現されるタンパク質を意味する。好ましくは、組換えタンパク質は組換えインスリン分子である。
【００６２】
「組換えインスリン分子」は、真核生物または原核生物細胞においてインスリン分子のＡ鎖およびＢ鎖、場合によりプロインスリン分子のＣペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターから発現されるインスリン分子である。好ましい態様の１つにおいて、組換えタンパク質は組換えインスリンまたはプロインスリンアナログである。別の好ましい態様において、組換えタンパク質は組換えインスリンおよびプロインスリンアナログである。
【００６３】
「組換えヒトインスリン」は、野生型ヒトＡ鎖（配列番号３）およびＢ鎖（配列番号４）アミノ酸配列を有する組換えインスリンを意味する。
【００６４】
「遺伝子学的に（遺伝子上）コード可能なアミノ酸」は、デオキシリボ核酸の３個の塩基の群である遺伝コドンによりコードされるアミノ酸を意味する。Biochemistry, L, Stryer編、第３版、W. H. Freeman and Co., New York、９９〜１０７頁（１９８８）を参照のこと。遺伝子学的にコード可能なアミノ酸としては、以下のものが挙げられる：アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）。
【００６５】
臨床上正常な空腹時血漿グルコースレベルは７０〜１１０ｍｇ／ｄｌである。臨床上正常な食後血漿グルコースレベルは１４０ｍｇ／ｄｌ未満である。「被検体における血糖を調節するために十分な」とは、インスリン分子の投与が臨床上正常な空腹時血漿グルコースレベルを生じることを意味する。
【００６６】
当業者に周知であるように、長期にわたる所定の血漿グルコースレベルを維持するために必要とされる量の外来性グルコースを、インスリン分子により引き起こされるインスリン効果の程度および期間の指標として用いる「グルコース負荷（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｌａｍｐ）」技術を用いて、インスリン効果を定量することができる。例えば、Ｂｕｒｋｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４：１６３−１６７（１９８７）を参照のこと。通常、グルコース負荷調査では、グルコースを静脈内注射する。インスリン分子が血漿グルコースレベルの減少を引き起こす場合、グルコース注入速度を上昇させ、所定の血漿グルコースレベルが維持されるようにする。インスリン分子の効果が減少した場合、所定の血漿グルコースレベルが維持されるようにグルコース注入速度を低下させる。
【００６７】
「インスリン効果」とは、グルコース負荷調査において、インスリン分子の投与が、グルコース負荷実験の間、被検体における所定の血漿グルコースレベルを維持するために静脈内血糖投与速度が上昇することを必要とするインスリン分子の投与が上昇することを必要とすることを意味する。好ましい態様の１つにおいて、所定のグルコースレベルは空腹時血漿グルコースレベルである。別の好ましい態様において、所定のグルコースレベルは食後血漿グルコースレベルである。
【００６８】
インスリン分子は、そのインスリン分子が高血糖（例えば、糖尿病）患者に、ヒトインスリンよりも長く持続するインスリン効果を提供する場合、「長期作用時間」を有する。好ましくは、インスリン分子は、インスリン分子の１回の投与後、約８時間〜約２４時間の間、インスリン効果を提供する。より好ましくは、インスリン効果は約１０時間〜約２４時間持続する。さらにより好ましくは、効果は約１２時間〜約２４時間持続する。さらにより好ましくは、効果は約１６時間〜約２４時間持続する。最も好ましくは、効果は約２０時間〜約２４時間持続する。
【００６９】
あるインスリン分子が１回の投与後約２４時間持続する、被検体におけるグルコース低下効果を提供する場合、そのインスリン分子は「基礎インスリン効果」を有する。
【００７０】
本明細書中で用いる「単離（された）タンパク質」は、タンパク質が製造された環境からそのタンパク質が取り出されていることを意味する。天然のタンパク質は、そのタンパク質が存在する細胞環境から取り出されている場合に単離されている。組換えタンパク質は、そのタンパク質が発現された細胞環境から取り出されている場合に単離されている。化学的に修飾されているタンパク質は、天然であろうと、または組換えであろうと、タンパク質が化学的に修飾される反応混合物から取り出されている場合に単離されている。好ましくは、単離されたタンパク質は他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドから取り除かれている。タンパク質を単離する方法としては、遠心分離、クロマトグラフィー、凍結乾燥、または電気泳動が挙げられる。このようなタンパク質単離方法および他のものは当業者に周知である。好ましくは、本発明のインスリン分子は単離されている。
【００７１】
タンパク質の「修飾」は、アミノ酸または誘導体型アミノ酸の付加、あるアミノ酸の別のアミノ酸での置換、またはアミノ酸の欠失を意味する。修飾は、組換えＤＮＡ方法を介して達成することができる。例えば、米国特許番号５，５０６，２０２、５，４３０，０１６および５，６５６，７８２を参照のこと。あるいは、修飾はインスリン鋳型の化学的修飾を介して達成することができる（例えば、インスリン鋳型への１つ以上の化学的部分の付加、またはインスリン鋳型からの１つ以上の化学的部分の除去による）。インスリン鋳型アミノ酸側鎖基での化学的修飾としては、カルバミル化、アミド化、グアニジル化、スルホニル化、１つ以上のαアミノ基のアシル化、ε−アミノ基のアシル化（例えば、リジンεアミノ基）、アルギニンのＮ−アルキル化、ヒスチジンまたはリジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が挙げられる。末端アミノ基（例えば、αアミノ基）の修飾としては、脱アミド、Ｎ−低級アルキルアミド、Ｎ−ジ低級アルキルおよびＮ−アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。末端カルボキシ基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミドおよび低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、１種以上の側鎖または末端基を、タンパク質化学分野の当業者に公知の保護基により保護することができる。
【００７２】
本発明のインスリンアナログまたはインスリン誘導体を製造するために使用されるアミノ酸は、Ｄ体またはＬ体のいずれかであり、天然のアミノ酸または人工のアミノ酸のいずれかであり得る。
【００７３】
「誘導体型Ａｒｇ」は合成化学的アプローチを介して修飾されているアルギニンを意味する。好ましいＡｒｇ誘導体は、アシル化および／またはカルバミル化を通じて得られる。好ましい態様において、Ａｒｇは正に荷電したアミノ酸で誘導体化される。別の好ましい態様において、Ａｒｇをイプシロン（−Ｎε）アミノ基で誘導体化してＡｒｇ−Ｎε−Ａｒｇを形成する。別の好ましい態様において、Ａｒｇをイプシロン（−Ｎε）アミノ基でＬｙｓを用いて誘導体化してＡｒｇ−Ｎε−Ｌｙｓを形成する。別の好ましい態様において、誘導体型Ａｒｇはｄアルギニン（ｄＡｒｇまたはｄＲ）であり、これはα炭素位で逆転した立体化学を有するＡｒｇである。
【００７４】
「誘導体型Ｌｙｓ」は合成化学的アプローチを介して修飾されたリジンを意味する。好ましいＬｙｓ誘導体は、アシル化および／またはカルバミル化を通じて得られる。好ましい態様において、Ｌｙｓは正に荷電したアミノ酸で誘導体化される。別の好ましい態様において、Ｌｙｓをイプシロン（−Ｎε）アミノ基でＡｒｇを用いて誘導体化してＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇを形成する。別の好ましい態様において、Ｌｙｓをイプシロン（−Ｎε）アミノ基でＬｙｓを用いて誘導体化してＬｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓを形成する。別の好ましい態様において、誘導体型Ｌｙｓはホモアルギニン（ホモＡｒｇまたはｈＲ）である。別の好ましい態様において、誘導体型Ｌｙｓはｄリジン（ｄＬｙｓまたはｄＬ）であり、これはα炭素位で逆転した立体化学を有するＬｙｓである。別の好ましい態様において、誘導体型Ｌｙｓはαグアニジノホモアルギニン（ｇＨＲ）である。
【００７５】
ヒトインスリンは３個の遊離アミノ基を含む：Ａ鎖のＮ末端αアミノ基、Ｂ鎖のＮ末端αアミノ基およびＢ鎖リジン側鎖のεアミノ基。通常、タンパク質のαおよび／またはεアミノ基を活性型カルボン酸でアシル化することができる。この文脈において、アシル化とはアミンとカルボン酸との間のアミド結合の形成を意味する。
【００７６】
インスリンＡ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ酸を用いてのアシル化は、ペプチド結合の形成を生じる。同様に、インスリンＢ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ酸を用いてのアシル化は、ペプチド結合の形成を生じる。Ｌｙｓのε基のアミノ酸を用いてのアシル化は、Ｌｙｓ−Ｎε−アミノ酸誘導体を形成する。
【００７７】
「アシル型Ａｒｇ」は、アシル含有化合物の酸性基とＡｒｇのεアミノ基との間に形成された共有結合を介してＡｒｇへと共有結合されているアシル部分を意味する。
「アシル型Ｌｙｓ」は、アシル含有化合物の酸性基とＬｙｓとの間に形成される共有結合を介してＬｙｓへと共有結合されるアシル部分を意味する。
「カルバミル型インスリン」は、カルバミル含有化合物のカルバミル基のカルボニル炭素とインスリンのアミノ基との間に形成された共有結合を介してインスリンへと共有結合されているカルバミル部分を意味する。
【００７８】
「カルバミル型Ａｒｇ」は、カルバミル含有化合物のカルバミル基のカルボニル炭素とＡｒｇのαアミノ基との間に形成された共有結合を介してＡｒｇへと共有結合されているカルバミル部分を意味する。
「カルバミル型Ｌｙｓ」は、カルバミル含有化合物のカルバミル基のカルボニル炭素とＬｙｓとの間に形成された共有結合を介してＬｙｓへと共有結合されているカルバミル部分を意味する。
【００７９】
「製薬上許容可能な」は、ヒトへの投与に臨床上適切であることを意味する。製薬上許容される製剤は毒性の成分、望ましくない夾雑物などを含有せず、その中の活性化合物の活性を干渉しない。
【００８０】
「医薬組成物」とは、ヒト被検体への投与が臨床上許容可能である組成物を意味する。本発明のインスリン分子は、タンパク質が１種以上の無機塩基および無機酸および有機酸と相互作用して塩を形成するように医薬組成物中に処方することができる。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸である。このような塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、１水素リン酸塩、２水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩(sebacate)、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、マンデル酸塩などが挙げられる。
【００８１】
塩基付加塩としては、アンモニウムまたはアルカリまたはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などのような無機塩基に由来するものが挙げられる。それゆえ、本発明の塩を製造する際に有用なこのような塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。
【００８２】
「微結晶」とは、結晶状態の、および微視的なサイズ（通常、１ミクロン〜１００ミクロンの範囲内の最大直径）の物質を主に含む固体を意味する。「微晶質の」とは、微結晶である状態を意味する。
【００８３】
「非晶質沈殿物」とは、形状が結晶性ではない不溶性物質を意味する。当業者であれば、結晶を非晶質沈殿物と区別することができる。
【００８４】
「懸濁液」は液体相および固体相の混合物を意味し、コロイドサイズよりも大きい、不溶性またはあまり可溶性ではない粒子からなる。例えば、ＮＰＨ微結晶および水性溶媒の混合物は懸濁液を形成する。
【００８５】
「懸濁製剤」は、水性溶媒に微細に分散されている固体相に活性薬剤（例えば、微晶質固体、非晶質沈殿物またはその両方）が存在する医薬組成物を意味する。混合物の穏やかな攪拌により水性溶媒中にかなり均一な様式で懸濁されるように、固体は微細に分散されており、そこから投薬体積を取り出すことができるかなり均一な懸濁液を提供する。市販のインスリン懸濁製剤の例としては、例えば、ＮＰＨ、ＰＺＩおよびＵｌｔｒａｌｅｎｔｅが挙げられる。微晶質懸濁製剤中の固体物質のうちの少量は非晶質であり得る。好ましくは、非晶質物質の割合は１０％未満であり、最も好ましくは、非晶質懸濁物中の固体物質の１％未満である。同様に、非晶質沈殿物懸濁物中の固体物質の少量は、微晶質であってもよい。
【００８６】
「プロタミン」は、魚精子から得られる非常に塩基性の強いタンパク質の混合物である。プロタミン中のタンパク質の平均分子量は約４，２００である［Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１；１２７−１３３（１９９０）］。「プロタミン」は、比較的塩を含まないタンパク質の沈殿物を意味し、「プロタミン塩基」と呼ばれることも多い。プロタミンはまた、タンパク質の塩（例えば、プロタミン硫酸塩）からなる沈殿物を意味する。
【００８７】
「水性溶媒」は、水を含有する液体溶媒を意味する。水性溶媒系は水単独から構成されても、水および１種以上の混和性溶媒から構成されても、または溶質を含有してもよい。通常用いられる混和性の溶媒は、短鎖有機アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール）、短鎖ケトン（例えば、アセトン）およびポリアルコール（例えば、グリセロール）である。
【００８８】
「等張化剤（Ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）」は、生理学的に寛容され、投与した製剤と接触している細胞膜を超えての水の正味の流入を阻害するために適切な張力を製剤に付与する化合物を意味する。グリセリンとしてもまた公知のグリセロールおよびマンニトールは、通常用いられる等張化剤である。他の等張化剤としては、塩化ナトリウムのような塩、およびデキストロースおよびラクトースのようなモノサッカライドが挙げられる。好ましい等張化剤はグリセロールである。
【００８９】
「ヘキサマー安定化化合物」は、６量体会合状態で本発明のインスリン分子を安定化する非タンパク質性の低分子量化合物を意味する。フェノール性化合物、特にフェノール性保存剤は、インスリン分子に関して最もよく知られている安定化化合物である。好ましくは、ヘキサマー安定化化合物は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベンのうちの１つ、またはこれら化合物のうちの２種以上の混合物である。さらに好ましくは、ヘキサマー安定化化合物はフェノールまたはｍ−クレゾール、またはその混合物である。
【００９０】
「保存剤」とは、抗微生物薬として作用するように医薬製剤に添加される化合物を意味する。本発明の製剤中で使用される保存剤は、フェノール性保存剤であってもよく、ヘキサマー安定化化合物と同じであっても、異なっていてもよい。非経口製剤は商業的に適合する複数回用途製品であるための保存有効性についての指針に適合していなければならない。非経口製剤において有効であり、許容可能であることが当該分野において公知の保存剤のなかでも、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン、ベンジルクロロクレゾール、クロロクレゾールおよびそれらの種々の混合物が存在する。
【００９１】
「フェノール性保存剤」としては、化合物であるフェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベンおよびこれらの混合物が挙げられる。特定のフェノール性保存剤（例えば、フェノールおよびｍ−クレゾール）はインスリン様分子に結合することにより物理的または化学的安定性のいずれか、またはその両方を上昇させる立体配置的変化を誘発することが知られている。好ましくは、フェノール性保存剤はｍ−クレゾールまたはフェノールである。「緩衝剤（液）」または「薬学的に許容される緩衝剤（液）」は、インスリン製剤での使用に関して安全である化合物を意味し、製剤のｐＨを製剤に対して望ましいｐＨに制御する効果を有する。本発明の結晶性製剤のｐＨは、約６．０〜約８．０である。本発明の液体製剤のｐＨは約３．５〜約６．０である。
【００９２】
ｐＨを適度な酸性ｐＨ〜適度な塩基性ｐＨに制御するための薬学的に許容される緩衝剤（液）としては、乳酸塩、酒石酸塩、リン酸塩（特にリン酸ナトリウム）、酢酸塩（特に酢酸ナトリウム）、クエン酸塩（特にクエン酸ナトリウム）、アルギン酸塩、ＴＲＩＳ、およびヒスチジンのような化合物が挙げられる。「ＴＲＩＳ」は２−アミノ−２−ヒドロキシルメチル−１，３−プロパンジオール、およびその薬理学的に許容される任意の塩を意味する。遊離塩基および塩酸塩形態が、ＴＲＩＳの一般的な形態の２つである。また、ＴＲＩＳは当該分野においてトリメチロールアミノメタン、トロメタミン、およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとして公知である。ｐＨを所望のレベルに制御するために適している他の薬学的に許容される緩衝剤は、当業者である化学者に公知である。
【００９３】
「即時作用型（速効型）インスリンアナログ」は、（ａ）皮下投与後にヒトインスリンよりも早く開始し、および／または（ｂ）皮下投与後にヒトインスリンよりも短い作用期間を示す低血糖効果を提供する。Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリン（いわゆる「リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）」インスリン）は即時作用型インスリンアナログであり、これは野生型Ｂ鎖（配列番号４）の２８位のＰｒｏおよび野生型Ｂ鎖（配列番号４）の２９位のＬｙｓが交換されている。例えば、米国特許番号５，５０４，１８８および５，７００，６６２を参照のこと。別の即時作用型インスリンアナログはＢ２８Ａｓｐ−インスリンであり、Ｂ鎖における２８位の野生型ＰｒｏはＡｓｐで置き換えられている。米国特許番号６，２２１，６３３を参照のこと。別の即時作用型インスリンアナログはＢ３ＬｙｓＢ２９Ｇｌｕ−インスリンである。米国特許番号６，２２１，６３３を参照のこと。
【００９４】
本発明のインスリン分子を含む微結晶が本明細書中において提供される。実施態様の１つにおいて、微結晶はプロタミンを含有しない。本発明の別の局面において、微結晶はプロタミンを含有せず、二価のカチオン（例えば、亜鉛）を含有する。このような結晶は特に、液体で、または続いての製剤化のための乾燥形態でバルクの結晶を製造するために適している。
【００９５】
別の実施態様において、微結晶はプロタミンを含有する。
別の実施態様において、微結晶は本発明のインスリン分子およびヒトインスリンの両方を含有する。好ましい態様の１つにおいて、微結晶は溶液製剤を製造するために使用される。別の好ましい実施態様において、微結晶は懸濁製剤を製造するために使用される。
【００９６】
本発明のインスリン分子を含む懸濁製剤もまた、提供される。懸濁製剤を含有する組成物もまた提供される。実施態様の１つにおいて、懸濁製剤は不溶相および溶液相を含有し、不溶相は本発明の微結晶を含有し、溶液相は水を含有する。望ましい場合、溶液相はヒトインスリンまたは即時作用型インスリンアナログ（例えば、Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリン、Ｂ２８Ａｓｐ−インスリンまたはＢ３ＬｙｓＢ２９Ｇｌｕ）を含有する。
【００９７】
懸濁製剤は真性糖尿病の治療用の医薬を製造するために使用することができる。また、懸濁製剤は、被検体における血糖濃度を調節するために充分な量で被検体に懸濁製剤を投与することを含む方法で真性糖尿病を治療するために使用されうる。
【００９８】
本発明のインスリン分子は適切な二価の金属カチオンと錯体化することができる。「二価の金属カチオン」は、多数のタンパク質分子と錯体を形成するのに役立つイオンを意味する。遷移金属、アルカリ金属、およびアルカリ土類金属はインスリンと錯体を形成することが知られている金属の例である。遷移金属が好ましい。好ましくは、二価の金属カチオンは亜鉛、銅、コバルト、マンガン、カルシウム、カドミウム、ニッケルおよび鉄からなる群から選択される１種以上のカチオンである。より好ましくは、亜鉛は二価の金属カチオンである。好ましくは、亜鉛は硫酸亜鉛、塩化亜鉛、酸化亜鉛または酢酸亜鉛のような塩として提供される。通常、インスリン分子の二価金属錯体はほぼ生理学的なｐＨの水溶液中では不溶性である。従って、これらの錯体は懸濁液として皮下投与することができ、そしてインビボで低下した放出速度を示し、これにより化合物の時間作用を長期化する。
【００９９】
本発明のインスリン分子と二価の金属カチオンとの間の錯体を得るために、タンパク質を適切な緩衝液中および金属塩の存在下に溶解する。混合物を周囲温度でインキュベートして錯体を沈殿させる。適切な緩衝剤は約３．０〜約９．０のｐＨ範囲に混合物を維持するものであり、錯体化反応と干渉しない。例としては、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝液およびグード（Ｇｏｏｄｅ’ｓ）緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｓ酢酸塩）が挙げられる。適切な金属塩は、金属が錯体化に利用可能であるものである。適切な亜鉛塩の例としては、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、酸化亜鉛および硫酸亜鉛が挙げられる。
【０１００】
「保護型アミノ酸」は、反応官能基のうちの１つを除いて全てが可逆的に誘導体化されており、その結果としてただ１つの官能基のみが反応性となっているアミノ酸である。例えば、保護型の活性型カルボン酸に関しては、αカルボキシレート基は反応性であるが、活性型カルボン酸上の他の官能基は全て非反応性である。保護型アミノ酸は、保護型官能基が除去された時点で「脱保護」される。好ましくは、保護型アミノ酸は保護型アルギニンである。
【０１０１】
「保存的置換」は、同じ正味の荷電を有し、ほぼ同じサイズと形状を有する別のアミノ酸でのアミノ酸の置換である。脂肪族または置換型脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数における差がおよそ以下の場合にほぼ同じサイズである。これらは側鎖中の分岐の数の差が１つ以下の場合にほぼ同じ形状を有する。側鎖中にフェニルまたは置換型フェニル基を有するアミノ酸はほぼ同じサイズと形状を有すると見なされる。以下に５個のアミノ酸グループを列挙する。インスリン中のアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸と置き換えることにより保存的置換が生じる。
グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システインおよびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換型脂肪族側鎖（直鎖型またはモノ分岐型）を有する非天然のアミノ酸。
グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換型Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（分岐無しまたは分岐点が１つ）を有する非天然のアミノ酸。
グループＩＩＩ：リジン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニンおよびアミンまたはグアニジノ置換型Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（分岐無しまたは分岐点が１つ）を有する非天然のアミノ酸。
グループＩＶ：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換型Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（分岐無しまたは分岐点が１つ）を有する非天然のアミノ酸。
グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプトファン。
【０１０２】
本明細書中に具体的に提供されるものを除いては、好ましくは保存的置換は天然のアミノ酸を用いて行われる。
【０１０３】
「非常に保存的な置換」は、あるアミノ酸の、側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じサイズおよび形状を有する別のアミノ酸での置換である。脂肪族または置換型脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ元素の総数の差が２以下の場合にほぼ同じサイズを有する。これらは、側鎖中に同じ数の分岐を有する場合にほぼ同じ形状を有する。非常に保存的な置換の例としては、ロイシンのバリンでの置換、セリンのトレオニンでの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換、およびフェニルアラニンのフェニルグリシンでの置換が挙げられる。あまり保存的ではない置換の例としては、バリンのアラニンでの置換、セリンのアラニンでの置換およびセリンのアスパラギン酸での置換が挙げられる。
【０１０４】
本発明のインスリン分子では、Ａ鎖はＡ鎖Ｃ末端にさらに１〜３個のアミノ酸を有してもよく、これは式ＩのＡ２２、Ａ２３およびＡ２４位である。好ましくはＡ２２、Ａ２３およびＡ２４位の各々のアミノ酸はＸａａであり、Ｘａａは遺伝子学的にコード可能なアミノ酸である。
【０１０５】
Ｂ鎖はＢ鎖Ｃ末端にさらに１〜６個のアミノ酸を有してもよく、これは式ＩＩのＢ３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５およびＢ３６位である。好ましい態様の１つにおいて、Ｂ鎖はＢ３１位にＡｌａ、Ｂ３２位にＡｒｇおよびＢ３３位にＡｒｇを含む。別の好ましい態様において、Ｂ鎖はＢ３１位にＡｌａ、Ｂ３２位にＡｌａ、Ｂ３３位にＡｌａ、Ｂ３４位にＡｒｇ、Ｂ３５位にＡｒｇおよびＢ３５位にＡｒｇを有する。
【０１０６】
インスリン分子、微結晶、懸濁液、溶液非晶質沈殿物または本発明の組成物の「有効（な）量」とは、インスリン治療を必要とする被検体に投与した場合に許容できない副作用を引き起こすことなく所望のインスリン効果を生じる量である。また、被検体に投与される本発明のインスリン分子の「有効（な）量」は疾患のタイプおよび重篤度、および被検体の特徴（例えば、全体的な健康、年齢、性別、体重および薬物に対する寛容性）に依存する。当業者であれば、これらおよび他の因子に応じて適切な投薬量を決定できるだろう。通常、本発明のインスリン分子の治療上有効な量は、成人に対して約０．０１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の範囲であり得る。好ましくは、投薬量は約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは約１．０ｍｇ〜１０ｍｇ／日の範囲である。
【０１０７】
「所望の治療効果」としては、以下のもののうちの１つ以上が挙げられる：１）真性糖尿病に関連する症状の緩解、２）真性糖尿病に関連する症状の発症の遅延、３）治療しない場合と比較しての寿命の延長、および４）治療しない場合と比較しての生活の質の向上。例えば、糖尿病の治療のための本発明のインスリン分子の「有効量」とは、治療しない場合よりも優れた血糖濃度のコントロールを生じ、これにより糖尿病合併症（網膜症、神経障害または腎疾患）の発症を遅延を生じる量である。
【０１０８】
投薬量、投与経路および１日あたりの投与回数は、治療目的、患者の疾患の性質および原因、患者の性別および体重、運動レベル、食生活、投与方法、および熟練した医師に公知の他の因子のような因子を医師が考慮することにより決定されるだろう。広範囲では、１日当たりの投薬量は、約１ｎｍｏｌ／体重１ｋｇ〜約６ｎｍｏｌ／体重１ｋｇ（６ｎｍｏｌはインスリン活性の約１単位に等しいと見なす）の範囲にある。約２〜３ｎｍｏｌ／ｋｇの投薬量が本発明のインスリン治療の典型である。
【０１０９】
糖尿病を治療する際に当業者である医師は本発明の製剤を投与するための、治療上最も都合のよい方法を選択することができる。非経口投与経路が好ましい。インスリンの液体製剤および懸濁製剤の通常の非経口投与経路は、皮下経路および筋肉内経路である。本発明の組成物および製剤もまた、経鼻、経頬粘膜、経肺または眼内経路により投与することができる。
【０１１０】
本発明のインスリン分子およびその組成物は、非経口的に投与することができる。非経口投与としては、例えば、筋肉内、静脈内、皮下または腹膜内注射によるような全身投与を挙げることができる。好ましくは、投与経路は皮下である。
【０１１１】
本発明のインスリン分子およびその組成物は、高血糖を治療するための医薬組成物の一部としての１種以上の製薬上許容される賦形剤、キャリアまたは希釈剤と組合せて、被検体に投与することができる。
【０１１２】
本発明のインスリン分子およびその組成物は液剤であってもよい。あるいは、本発明のインスリン分子およびその組成物は、本発明のインスリン分子の懸濁液または二価金属カチオンと錯体化したタンパク質化合物の懸濁剤であってもよい。
【０１１３】
本発明のインスリン分子ならびに、等張化剤、二価カチオン、ヘキサマー安定化化合物、保存剤および緩衝剤からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含む組成物が本明細書中において提供される。
【０１１４】
適切な医薬キャリアは、本発明のインスリン分子と相互作用しない不活性成分を含みうる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているような標準的な医薬製剤技術が用いられ得る。非経口投与のために適した医薬キャリアとしては、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌的生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液などを挙げることができる。適切な賦形剤の例としては、グリセロール、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトールおよびマンニトールを挙げることができる。
【０１１５】
「被検体」は哺乳動物、好ましくはヒトであるが、ペット（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）のような動物であってもよい。
【０１１６】
インスリン鋳型およびインスリンアナログは、組換え方法を用いて入手することができる。例えば、組換えプロインスリンまたはプロインスリンアナログを用いることができる。あるいは、組換えインスリンＡ鎖およびＢ鎖を宿主細胞中で発現させた後、組み換えることができる。あるいは、インスリン前駆体を用いることができる。これらの方法は各々、当業者に周知である。例えば、米国特許番号４，４２１，６８５、米国特許番号４，５６９，７９１、米国特許番号４，５６９，７９２、米国特許番号４，５８１，１６５、米国特許番号４，６５４，３２４、米国特許番号５，３０４，４７３、米国特許番号５，４５７，０６６、米国特許番号５，５５９，０９４、欧州特許番号ＥＰ７４１１８８Ａ１を参照のこと。また、Ｃｈａｎｃｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １６（Ｓｕｐｐｌ３）：１３３−１４２（１９９３）、Ｃｈａｎｃｅら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、第７回アメリカペプチドシンポジウム会報（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７ｔｈＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら編、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、７２１−７３８頁（１９８１）およびＦｒａｎｋら、Ｍｕｎｃｈ  ｍｅｄ  Ｗｓｃｈ  １２５（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１４−２０（１９８３）も参照のこと。
【０１１７】
好ましい態様のうちの１つにおいて、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンは、Ａ０ＬｙｓＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−インスリンのεアミノ基を選択的にアシル化することにより製造される。εアミノ基の選択的アシル化は当業者により達成することができる。例えば、米国特許番号５，６４６，２４２を参照のこと。別の好ましい態様において、Ａ２１ＧｌｙＣ６４ＡｒｇＣ６５Ｌｙｓ−ヒトプロインスリンのεアミノ基を選択的にアシル化し、アシル型プロインスリン誘導体をプロテアーゼで消化して望ましくないアミノ酸を取り除き、他方でＣ６５Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇおよびＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇをインタクトなままで保持してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン誘導体を製造することにより、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを製造する。
【０１１８】
インスリン分子またはその前駆体をコードするＤＮＡを含み、かつ適切な栄養培地中でそのポリペプチドを発現し得る条件下でペプチドを発現しうる宿主細胞を培養することを含む方法により、組換えインスリン分子を製造することができ、この後に得られたペプチドを宿主細胞および／または培養培地から回収する。
【０１１９】
細胞を培養するために用いる培地は、最少培地または適切な補充物を含む複合培地のような、宿主細胞を増殖させるために適した任意の一般的な（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）培地であってよい。適切な培地は市販されているものか、または公開されている方法（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）から製造してもよい。次いで、目的のペプチドのタイプに応じて、遠心分離またはろ過により培地から宿主細胞を分離すること、硫酸アンモニウムのような塩により上清またはろ液のタンパク質性成分を析出させること、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のような種々のクロマトグラフィー方法による精製を含む都合のよい方法により、細胞により産生されるペプチドを培養培地から回収することができる。
【０１２０】
従って、本発明のインスリン分子を発現させる方法が本明細書中に提供され、この方法は、宿主細胞の増殖およびインスリン分子の発現に適した条件下で、インスリン分子を含む宿主細胞を培養することを含む。好ましい態様の１つにおいて、この方法はさらに宿主細胞からインスリン分子を精製することを含む。別の好ましい態様において、この方法はさらに、インスリン分子を培養培地から精製することを含む。さらに別の好ましい態様において、この方法はさらに、インスリン分子を宿主細胞および培養培地の両方から精製することを含む。
【０１２１】
好ましい態様において、宿主細胞は真核生物細胞である。好ましくは、真核生物細胞は真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、または不死化哺乳動物セルライン細胞である。別の好ましい態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。好ましくは、真核生物細胞は細菌細胞であり、より好ましくは大腸菌細胞である。
【０１２２】
インスリン分子またはその前駆体をコードする核酸配列を、組換えＤＮＡ方法に簡便に供することができる任意のベクターに挿入することができ、ベクターの選択はしばしば導入される宿主細胞に依存する。従って、ベクターは自律複製ベクター、すなわち、細胞外の存在として存在し、その複製が染色体性複製からは独立しているベクターである（例えば、プラスミド）。あるいは、ベクターは宿主細胞に導入された場合に宿主細胞ゲノムに組み込まれて、組み込まれた染色体と共に複製されるものではない。
【０１２３】
ベクターは、ペプチドをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要とされる追加のセグメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されている発現ベクターであることが好ましい。プロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。種々の宿主細胞において、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの転写を指向する適切なプロモーターの例は、当該分野において周知である。
【０１２４】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列もまた、必要であれば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列および翻訳エンハンサー配列に作動可能に連結することができる。本発明の組換えベクターは、宿主細胞中でベクターを複製させ得るＤＮＡ配列をさらに含みうる。
【０１２５】
また、ベクターは選択マーカー（例えば、遺伝子、宿主細胞における欠損を補う産物、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する産物）を含みうる。
【０１２６】
本発明の親ペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知）を組換えベクター中に提供することができる。分泌シグナル配列を正確なリーディングフレームでペプチドをコードするＤＮＡ配列に連結する。分泌シグナルは通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して５’に配置される。分泌シグナル配列は、通常ペプチドと会合していてもよいし、または別の分泌型タンパク質をコードする遺伝子由来ものであってもよい。
【０１２７】
本発明のインスリン分子は、固相ペプチド合成技術の標準的な方法を用いることにより製造することができる。ペプチド合成機は、例えば、Applied Biosystems、Foster City CAから市販されている。固相合成用の試薬は、例えば、Midwest Biotech (Fishers, IN)から市販されている。固相ペプチド合成機は、干渉基(interfering group)をブロックすること、反応させるアミノ酸を保護すること、カップリングさせること、脱カップリングさせること、および未反応のアミノ酸をキャッピングすること(capping)について、製造業者の指示に従って用いることができる。
【０１２８】
通常、樹脂上の伸張ペプチド鎖上のα-N-カルバミル保護型アミノ酸およびN-末端アミノ酸を、不活性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドンまたは塩化メチレン）中、カップリング剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）および塩基（例えば、ジイソプロピルエチルアミン）の存在下、室温でカップリングさせる。α-N-カルバミル保護基を、トリフルオロ酢酸（TFA）またはピペリジンのような試薬を用いて得られたペプチド樹脂から除去し、ペプチド鎖に付加されるべき次の所望のN-保護型アミノ酸を用いてカップリング反応を繰り返す。適切なアミン保護基は当該分野において周知であり、例えば、GreenおよびWuts、「Protecting Groups in Organic Synthesis」、John Wiley and Sons、1991（この中の技術は参照して全て組み込む）に記載されている。例として、t-ブチルオキシカルボニル（tBoc）およびフルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）を挙げることができる。
【０１２９】
ペプチドは、適切な側鎖保護を有するt-ブトキシカルボニル-またはフルオレニルメトキシカルボニル-α-アミノ酸を用いる標準的な自動固相合成プロトコルを用いて合成することができる。合成の完了の後、標準フッ化水素法またはＴＦＡ法を用いて側鎖を同時に脱保護しながら、ペプチドを固相支持体から切断する。次いで、粗ペプチドを、Vydac C18カラムでの逆相クロマトグラフィー（水-アセトニトリル線形勾配を用いる。溶媒は全て0.1％ＴＦＡを含有する）を用いてさらに精製する。アセトニトリルおよび水を除去するために、0.1％ＴＦＡ、アセトニトリルおよび水を含む溶液からペプチドを凍結乾燥させる。純度は分析逆相クロマトグラフィーにより確かめることができる。ペプチドの同定は質量分析により確認することができる。中性のｐＨで、水性緩衝液中にペプチドを可溶化してもよい。
【０１３０】
本発明のインスリン分子は、組換えインスリン鋳型を化学的に修飾することにより製造できる。実施態様の１つにおいて、組換えインスリン鋳型を、活性型カルボン酸部分を用いて１種以上の保護型アミノ酸でアシル化する。好ましくは、活性型エステルまたはアミドを用いる。さらに好ましくは、活性型エステルを用いる。さらにより好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルを用いる。
【０１３１】
本発明の方法において、インスリン分子はインスリン鋳型を化学的に修飾して製造することにより、インスリン鋳型を活性型カルボン酸部分を用いて保護型アミノ酸でアシル化する。好ましくは、活性型エステルまたはアミドを用いる。さらに好ましくは、活性型エステルを用いる。さらにより好ましくは、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルを用いる。インスリンＡ鎖および／またはＢ鎖LysのＮ末端をアシル化する技術は当業者に周知である。
【０１３２】
従って、好ましい実施態様の１つにおいて、組換えＡ２１Ｘａａ−インスリンをＡ１位およびＢ２９位でアシル化してＡ０ＡｒｇＡ２１ＸａａＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成する。別の好ましい態様において、Ａ２１Ｇｌｙ−インスリンをＡ１位およびＢ２９位でアシル化してＡ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成する。
【０１３３】
別の好ましい態様において、組換えＡ０ＡｒｇＡ２１Ｘａａ−インスリンをＢ２９位でアシル化してＡ０ＡｒｇＡ２１ＸａａＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリンを形成する。別の好ましい態様において、Ａ０ＡｒｇＡ２１Ｇｌｙ−インスリンをＢ２９位でアシル化してＡ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリンを形成する。
【０１３４】
別の好ましい態様において、組換えＡ０ＬｙｓＡ２１Ｘａａ−インスリンをＡ０位およびＢ２９位でアシル化してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＸａａＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成する。好ましくは、Ａ０ＬｙｓＡ２１Ｇｌｙ−インスリンをＡ０位およびＢ２９位でアシル化してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成する。
【０１３５】
別の好ましい態様において、プロインスリンアナログを用いて本発明のインスリン分子を製造する。野生型ヒトプロインスリンにおいて、Ｌｙｓはアミノ酸６４位であり、Ａｒｇはアミノ酸６５位である。６４位にＡｒｇおよび６５位にＬｙｓを有するプロインスリンアナログを用いてＡ０ＬｙｓＡ２１Ｘａａ−インスリンを製造した後、Ａ０位およびＢ２９位でアシル化してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＸａａＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成することができる。好ましくは、Ａ０ＬｙｓＡ２１Ｇｌｙ−インスリンをＢ２９位でアシル化してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを形成する。
【０１３６】
好ましくは、水および有機溶媒の混合物中でタンパク質アシル化反応を行うが、また反応物質の可溶性に依存して純粋な有機条件または純粋な水性条件中でもまた行うことができる。以下の実施例において、有機成分としてＭｅＯＨ、ＤＭＦまたはＣＨ３ＣＮを用いて４０〜６０％の間で有機物を含有する混合物中で反応を行った。活性型カルボン酸部分はアミノ酸、ジペプチドまたは短いポリペプチドを含み、ここでεアミノ基および全ての側鎖官能基は適切な保護基で誘導体化されており、好ましくはタンパク質誘導体化工程が完了した後に除去される。水性混合物への好ましい可溶性および得られるＮＨＳ−エステルのタンパク質アミノ基との反応性が原因で、カルボン酸活性化基はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）が好ましい。ＮＨＳ−エステルのインスリン鋳型に対する比は２〜２０の間で変化しうるが、好ましくは３〜５である。比は、モノ−、ジ−およびトリ−アシル型産物ならびに生じるＮＨＳ−エステル試薬の相対的反応性の所望の程度に応じて調節する。
【０１３７】
反応は室温（２０〜２５℃）で、通常は電磁攪拌子により攪拌しながら、またはローティッセリー（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）で混合しながら行う。好ましくは、反応は１／２時間〜６時間の間、進行させる。
【０１３８】
所望のレベルのアシル化（ＬＣ−ＭＳモニタリングにより測定する）が生じた後、反応混合物を酢酸またはトリフルオロ酢酸で酸性にすることによりクエンチする。さらに、後処理／精製を、（１）逆相ＨＰＬＣによる反応混合物の直接精製、続いて保護基除去、および得られた単離した脱保護型産物の逆相ＨＰＬＣによる再精製、または（２）水での反応混合物の、２５％未満の有機物含有物への希釈および凍結乾燥、続いての保護基除去、カチオン交換クロマトグラフィーによる精製、および逆相ＨＰＬＣまたはゲルろ過での最終的な精製／脱塩により、行うことができる。
【０１３９】
保護基としては、タンパク質およびペプチドと適合性の条件（すなわち、タンパク質／ペプチドを破壊するほど過酷ではない条件）で脱保護が行うことができる基を挙げることができる。例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）またはトリフルオロアセチル（ｔｆａ）基を用いてアミノ官能基を保護することができる。例えば、それぞれ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および水性水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を用いて保護基を取り除くことができる。グアニジノ部分の保護はＢｏｃ、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−５−スルホニル）またはＰｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルベンゾフラン−５−スルホニル）基を介するものである。ＰｍｃおよびＰｂｆ基はまた、ＴＦＡを用いて除去されるが、以下の実施例にさらに記載するようなスカベンジャーの存在を必要とする。
【０１４０】
アミノ基はアシル化で適切に反応するために中性（脱プロトン型）形態でなければならないので、反応が行われるｐＨは反応速度に非常に影響を与える。通常、水性混合物では、特定のアミノ基の反応速度は、ｐＨが非常に高い場合を除いてｐＫａに反比例する。また、反応速度は隣接基の立体効果および近接効果、および側鎖の溶媒への接近可能性の程度により影響を受けるかもしれない。インスリンの場合、３個のアミンは特徴的なｐＫａ値を有し、反応性に関して周囲環境の異なる影響を有しているので、幾らか特異性が達成されうる（Ｌｉｎｄｓｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２１：７３７−７４５（１９７１）を参照のこと）。特に、Ｂ２９：リジン側鎖のεアミノ基は１０を超えるｐＨでのアシル化反応の中心となる（Ｂａｋｅｒら、米国特許第５，６４６，２４２号参照）。以下の実施例において、所望される特定の産物に依存して、反応特異性の微調整を可能とするために、反応は約６〜１１の範囲にわたるｐＨ値で行った。
【０１４１】
以下の実施例において、最終生成物の識別はＬＣ−ＭＳ（分子量の確認）、Ｎ−末端タンパク質配列決定およびＳ．Ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８プロテアーゼ消化物（これはＧｌｕ残基のカルボキシ側鎖上のペプチド結合のこの酵素による特異的な切断に起因して特徴的なインスリンフラグメントを生じる）のＬＣ−ＭＳ分析を含む組合せ技術により確認した（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｓ．Ｈ．＆Ｔａｇｅｒ，Ｈ．Ｓ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１５０２−１１５０９（１９９１）参照）。
【実施例】
【０１４２】
実施例１
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２８Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＢ２９Ｐｒｏインスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中でのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルを有するＢ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリンのアシル化
Ｂ２８ＬｙｓＢ２９Ｐｒｏ−インスリン−Ｚｎ結晶（３２０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ（１：１）緩衝液（３０ｍＬ）に溶解した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（５０μＬ）を加えてｐＨ１０で結晶を溶解した。次いで、５Ｍリン酸を用いてｐＨを約７．５に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルを、ジクロロメタン中で３０分間、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ、ＮＨＳおよびジシクロヘキシルカルボ−ジイミド（ＤＣＣ）（各々１ｍｍｏｌ）を共に混合して製造した。次いで、混合物をろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。次いで、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルをＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル溶液（２ｍＬ）をインスリン溶液に加え、溶液を室温で２時間混合した。この点でのｐＨは約６．４まで低下した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（４０μＬ）の添加によりｐＨは７．１まで上昇した。残りのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルをインスリン混合物に加え、反応をさらに２．５時間続けた。次いで、混合物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性にし、水（３０ｍＬ）で希釈し、一晩凍結乾燥させた。脱保護型生成物を産生するために、凍結乾燥型物質（合計約９００ｍｇ、過剰なアシル化試薬およびＰＢＳ緩衝液由来の塩の存在に起因する）をＴＦＡ（２０ｍＬ）に溶解し、室温に１時間静置した。次いで、混合物をほぼ乾固するまでロータリーエバポレーターでエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ：水（１：９）（２０ｍＬ）に再溶解した。
【０１４３】
サンプルをＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（内径４．６ｍｍ×１５ｃｍカラム）での分析逆相ＨＰＬＣ（Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６０：４０）中０．０５％ＴＦＡで、１０〜１００％ＢのＡＢ線形勾配、１５分。流速１ｍＬ／分）により分析した。これらの条件で、サンプルは主要なピーク（ＬＣ−ＭＳによりトリアシル型インスリンのＭＷであることを確認した）を、それぞれ主要なピークの直前および直後に溶離する少量のテトラアシル型およびジアシル型インスリンと共に示した。それらはこれらのクロマトグラフィー条件下では完全には溶解しなかったので生成物の相対量は測定しなかったが、約７０％の物質がトリアシル型種であった。
【０１４４】
粗アシル型物質の半分を、ＳＰ−セファロース物質を充填したガラス内径２ｃｍ×３０ｃｍカラムでのカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。０〜４０％ＢのＡＢ線形勾配を、流速３ｍＬ／分で１００分かけて行った。溶媒組成は、Ａ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（７０：３０、ｐＨ４．０）中７０ｍＭ酢酸ナトリウム、およびＢ：Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（７０：３０、ｐＨ４．０）中７０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム。トリアシル型インスリン生成物を含む画分をプールし、溶液を約９６ｍＬ〜７５ｍＬに濃縮し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し戻して、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（内径２．０ｃｍ×２５ｃｍ）分取カラムに２０ｍＬ／分でかける。サンプルを２段階ＡＢ線形勾配（１５分かけて０〜１５％Ｂ、続いて１００分かけて１５〜６５％Ｂ。Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を用いて１０ｍＬ／分の流速で溶離した。合わせた精製物質を凍結乾燥させて５２ｍｇを得た（これは約３４％の全体の収率に対応する）。
【０１４５】
実施例２
Ａ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中でのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルを有するＡ０Ａｒｇ−インスリンのアシル化
Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（０．５ｍｍｏｌ）を製造し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解した。Ａ０Ａｒｇ−インスリン（１０４ｍｇ、０．０１７ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液／ＣＨ３ＣＮ（１：１、１０ｍＬ）に溶解し、５Ｍ  ＫＯＨ溶液でｐＨ１１に調節した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル溶液（０．５２ｍＬ、０．５２ｍｍｏｌ）をインスリン溶液に加えた。ｐＨを約９まで低下させ、すぐに、５Ｍ  ＫＯＨ溶液を用いて１１まで戻した。
【０１４６】
反応を室温で３０分間進行させ、続いて酢酸２００μＬで酸性にした。分析ＨＰＬＣ（上記実施例１で行った通り）に主要なピークが１つ存在し、これはＬＣ−ＭＳにより測定したモノアシル型生成物に関する正確なＭＷを有した。サンプルを上記の通り、２段階ＡＢ線形勾配でＶｙｄａｃ  Ｃ１８分取カラムでの逆相ＨＰＬＣ（１５分かけて０〜１８％Ｂ、続いて１６０分かけて１８〜１００％Ｂ）により直接精製した。生成物を含むプールした画分を凍結乾燥させると合計約６１ｍｇとなった。凍結乾燥させたサンプルをＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、３０分間攪拌し、次いでほぼ乾固するまで濃縮し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：９０、２０ｍＬ）に再溶解した。次いで、サンプルを上記の実施例１に記載の最終逆相精製にかけた。最終凍結乾燥型質量は３１ｍｇであり、全体的な収率はおよそ３０％であった。
【０１４７】
実施例３
Ａ−１ＡｒｇＡ０Ａｒｇ−インスリンを産生するための水／ＤＭＦ中での組換えヒトインスリンのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルでのアシル化
ジクロロメタン中で６０分間混合したＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、ＮＨＳおよびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（各々０．２ｍｍｏｌ）からＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル（０．２ｍｍｏｌ）を製造した。次いで、サンプルをろ過し、乾固するまでエバポレートしてＤＭＦ（４ｍＬ）に再溶解した。組換えヒトインスリン−Ｚｎ結晶（３２０ｍｇ；０．０５５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ：ＰＢＳ（１：１）緩衝液（２０ｍＬ）に溶解した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液を加えた（結晶をｐＨ１０で溶解するために５０μＬ）。５Ｍリン酸を用いてｐＨを８．２に調整し、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（３ｍＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を加えた。約１時間混合した後、分析ＨＰＬＣ（上記実施例１で行ったとおり）は、モノアシル型産物に起因する２個のピークを示した（ＬＣ−ＭＳにより確認）。ピークは約７０：３０の比で存在した。
【０１４８】
続いてのＳ．Ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８プロテアーゼ消化物のＬＣ−ＭＳ分析により、Ａ鎖Ｎ末端のアシル化に起因する豊富なピーク、およびＢ鎖Ｎ末端またはＢ２９：Ｌｙｓの側鎖アミンのいずれかでアシル化されている種の混合物を含む小さいピークが存在することを証明した。実施例１に記載したようなＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムでの精製により、保護型Ａ鎖アシル化生成物（４９ｍｇ）を得た。この物質を、ＴＦＡ：アニソール：ＭｅＯＨ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９４：２：２：２、１０ｍＬ）の混合物を用いて室温で１時間、脱保護した。
【０１４９】
次いで、混合物をほぼ濃縮乾固させ、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（２０：８０、６ｍＬ）に再溶解し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で２回抽出した。最終的な逆相ＨＰＬＣでの精製により（実施例１に記載）、Ａ−１ＡｒｇＡ０Ａｒｇ−インスリン生成物を全体的な収率を約１０％で得た（３４ｍｇ）。
【０１５０】
実施例４
Ｂ−１ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリンを産生するための水／ＤＭＦ中での組換えヒトインスリンのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルでのアシル化
Ｂ鎖Ｎ末端またはＢ２９Ｌｙｓの側鎖のいずれかでモノアシル化した生成物（上記実施例３参照）の同時溶離に起因して、組換えヒトインスリンをＡ鎖Ｎ末端およびＢ２９Ｌｙｓ側鎖アミン上でｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用いて最初に保護した。組換えヒトインスリン（３２０ｍｇ）をＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ（１：１）緩衝液（２０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを１０．６に調整した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボキシレート（２．５当量）（（Ｂｏｃ）２Ｏ）を加えた（ＣＨ３ＣＮ２７０μＬ中５５ｍｇ）。３０分後、ｐＨは約８．７まで低下した。５Ｍ  ＫＯＨを用いて約１１までｐＨを戻した後、反応をさらに２．５時間進行させた。この時点で、ＬＣ−ＭＳ分析は、それぞれ、モノ−、ジ−およびトリ−Ｂｏｃ誘導体種の質量を有する３個の主要な生成物の存在を示した。
【０１５１】
ＨＰＬＣピーク領域は、モノ−、ジ−およびトリ−Ｂｏｃ誘導体が、それぞれ、約１５：６０：２５の相対比で存在することを示した。物質の精製は実施例１に記載の通りにＣ１８分取カラムで、以下の３段階ＡＢ線形勾配を用いて行った：（１）０〜２０分の時間範囲で０〜２０％Ｂ、（２）２０〜３０分の時間範囲で２０〜２５％Ｂ、および（３）３０〜２３０分の時間範囲で２５〜７５％Ｂ。ジ−Ｂｏｃ誘導体型生成物（Ｂｏｃ２−インスリン）を、凍結乾燥後に収率８２ｍｇで得た。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８プロテアーゼ消化物のＬＣ−ＭＳ分析により、最終的に、生成物はＡ鎖Ｎ末端およびＢ２９：Ｌｙｓ側鎖にＢｏｃ基を含むことを証明した。
【０１５２】
Ｂｏｃ２−インスリン（８２ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ：ＰＢＳ（１：１）緩衝液（１０ｍＬ）に溶解し、ｐＨを約８に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルを上記の実施例３に記載するように製造し、ＤＭＦに０．０５ｍｍｏｌ／ｍＬの濃度で溶解した。ＮＨＳエステル溶液（１．４ｍＬ、０．０７ｍｍｏｌ）をＢｏｃ２−インスリンに加え、１時間反応させた。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液をさらに０．６ｍＬ（０．０３ｍｍｏｌ）添加し、反応をさらに１時間続けた。実施例１に記載されるように（しかし、Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ中で、２５分かけて２５〜１００％ＢのＡＢ線形勾配。流速１ｍＬ／分）、分析ＨＰＬＣにより生成物を分析した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｂｏｃ２−インスリン生成物の正確なＭＷを有する１個のピークが現れることが見いだされた。
【０１５３】
実施例１の通り、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラムを用いて、以下の３段階ＡＢ線形勾配で精製を行った：（１）０〜２０分の時間範囲で０〜２５％Ｂ、（２）２０〜４０分の時間範囲で２５〜４０％Ｂおよび（３）４０〜１００分の時間範囲で４０〜１００％Ｂ。精製した完全な保護型生成物を凍結乾燥後に得た（３６ｍｇ）。物質を室温で１時間、ＴＦＡ：アニソール：ＭｅＯＨ：ＴＩＰＳ（９４：２：２：２、１０ｍＬ）を用いて処理し、完全に保護した生成物を得た。次いで、混合物をほぼ乾固するまで濃縮し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：９０、１０ｍＬ）に再溶解し、これをジエチルエーテル（１５ｍＬ）で２回抽出した。最終的な逆相ＨＰＬＣ精製（実施例１に記載）により、最終的なＢ−１ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン生成物（２４ｍｇ）を約８％の全体的な収率で得た。
【０１５４】
実施例５
Ａ０ＡｒｇＢ−１ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリンを産生するためのＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ中でのＡ０Ａｒｇ−インスリンのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルでのアシル化
実施例３に記載したように、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル（０．５ｍｍｏｌ）を製造し、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中に溶解した。Ａ０Ａｒｇ−インスリン（３２０ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）をｐＨ１０でＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ緩衝液（１：１、４０ｍＬ）に溶解した。ｐＨを約７まで低下させた。約６．３のそのｐＩの近傍になるとタンパク質が原因で溶液が濁り始めた。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液の半分（０．２５ｍｍｏｌ、約４．７当量）を加え、溶液を１５分間超音波処理した後、ローティッセリーで７５分間混合した。ＨＰＬＣ分析は２つのピークを示した。これはＬＣ−ＭＳにより約８５：１５の比で存在するモノアシル型生成物であることを確認した。サンプルをＴＦＡ（１００μＬ）で酸性にしたのち、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で希釈した。逆相精製を実施例２に記載するように行い、凍結乾燥後に主なモノアシル型生成物（５５ｍｇ）を得た。ペプチドを実施例３に記載のＴＦＡカクテル（２０ｍＬ）を用いて２時間、脱保護し、ほぼ乾固するまでエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：９０、２０ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２０ｍＬ）で抽出した。実施例１に記載の最終逆相ＨＰＬＣ精製により、生成物を得た（３８ｍｇ、収率１２％）。続いて、この物質が所望のＡ０ＡｒｇＢ−１ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリンであることを確認した。
【０１５５】
実施例６
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中での組換えヒトインスリンのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルでのアシル化
組換えヒトインスリン亜鉛結晶（３０７ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ緩衝液（１：１、３０ｍＬ）に溶解した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（５０μＬ）を加えてｐＨ１０で結晶を溶解した。次いで、５Ｍリン酸を用いてｐＨを約７．５まで低下させた。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（１ｍｍｏｌ）を実施例１に記載するように製造し、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル溶液（２ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）をインスリン溶液に加え、得られた混合物を室温で２時間混合した。この点でのｐＨは約６．６まで低下した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（５０μＬ）の添加によりｐＨは７．２まで上昇した。
【０１５６】
次いで、得られたＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルをインスリン混合物に加え、反応をさらに３時間続けた。次いで、混合物をＴＦＡ（１００μＬ）で酸性にし、水（３０ｍＬ）で希釈し、一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥させた物質（過剰のアシル化試薬およびＰＢＳ緩衝液由来の塩の存在が原因で合計１．０７ｇ）をＴＦＡ（２０ｍＬ）に溶解し、室温で１．５時間静置して脱保護生成物を得た。次いで、混合物をロータリーエバポレーターでほぼ乾固するまでエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：９、２０ｍＬ）に再溶解した。
【０１５７】
サンプルを実施例１に記載するように分析逆相ＨＰＬＣにより分析し、これはトリアシル型生成物の主要なピークと、主要なピークの直前および直後にそれぞれ溶離する少量のテトラアシル型およびジアシル型インスリンを有する類似のクロマトグラフィープロフィールを示した。生成物の相対量は、これらの条件下では生成物は完全に溶解しなかったが、約７０％の物質はおそらくトリアシル型種（実施例１でも観察される）であることを決定した。
【０１５８】
粗アシル型物質を実施例１に記載のようにカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。合わせた精製トリアシル型インスリンを約９６ｍＬ〜７５ｍＬに濃縮し、Ｈ２Ｏで１００ｍＬまで希釈し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８分取カラムにかけて実施例１に記載のように精製した。合わせた精製物質を凍結乾燥して得た（９６ｍｇ、全体の収率は約３１％）。
【０１５９】
実施例７
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１Ｇｌｙ−インスリンを産生するためのＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ中でのＡ２１Ｇｌｙ−インスリンのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルでのアシル化
凍結乾燥Ａ２１Ｇｌｙ−インスリン（６５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ緩衝液（１：１、８ｍＬ）に溶解した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液を用いてｐＨを７．５に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ）を実施例１に記載のように製造し、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル溶液（１ｍＬ、０．２ｍｍｏｌ、１７当量）をＡ２１：Ｇ−インスリン溶液に加え、得られた混合物を室温で３時間混合した。この時点でｐＨは約６．４まで低下した。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（２０μＬ）の添加によりｐＨは７．５まで上昇した。次いで、得られたＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（０．２ｍｍｏｌ）をインスリン混合物に加え、反応をさらに３時間続けた。次いで、混合物をＴＦＡ（５０μＬ）で酸性にし、水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩凍結乾燥させた。ペプチド、過剰なアシル化試薬およびＰＢＳ緩衝液からの塩を含有する凍結乾燥物質をＴＦＡ（２０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間静置して脱保護生成物を得た。混合物をロータリーエバポレーターでほぼ乾固するまでエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：９、２０ｍＬ）に再溶解した後、ヘキサン（２０ｍＬ）で抽出した。サンプルを実施例１に記載するように分析逆相ＨＰＬＣにより分析し、これはトリアシル型生成物の主要なピークと、主要なピークの直前および直後にそれぞれ溶離する少量のテトラアシル型およびジアシル型インスリンを有する類似のクロマトグラフィープロフィールを示した。これらのクロマトグラフィー条件下では生成物は完全に溶解しなかったので生成物の相対量は決定しなかったが、約６０〜７０％の物質が所望のトリアシル型種であることを示した。
【０１６０】
粗アシル型物質を実施例１に記載のようにカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。合わせた精製トリアシル型インスリンを約９６ｍＬ〜７５ｍＬに濃縮し、Ｈ２Ｏで１００ｍＬまで希釈し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８セミ分取カラム（内径１０ｍｍ×２５０ｍｍ）にかけた。サンプルを２段階ＡＢ線形勾配（１５分かけて０〜２５％Ｂ、続いて１００分かけて２５〜７５％Ｂ。Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を用いて流速４ｍＬ／分で溶離した。精製物質を凍結乾燥させて２１ｍｇを得た（全体の収率は約３２％であった）。
【０１６１】
実施例８
Ａ０ＬｙｓＢ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中でのインスリンのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨＳエステルでのアシル化、およびＮ，Ｎ’−ビス−Ｂｏｃ−１−グアニルピラゾール（Ｂｏｃ２−グアニルピラゾール）を用いてのＡ０ｇＨＲＢ０ｇＨＲＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−ｇＨＲ−インスリンへのグアニジル化
「ｇＨＲ」は、α−グアニジニルホモアルギニンを意味する。組換えヒトインスリン−Ｚｎ結晶（３００ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：ＰＢＳ緩衝液（１：１、２０ｍＬ）にｐＨ１０で溶解した後、ｐＨを約７まで調整した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨＳエステル（１０当量、ＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）中に２３０ｍｇ）を加え、室温で２時間混合した。この時点でＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨＳエステル（２３０ｍｇ）をさらに加え、反応を２．５時間続けた。ＬＣ−ＭＳ分析は大量のトリアシル型種が存在し、少量のジアシル型種を示した。混合物をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で希釈し、凍結乾燥させた。ＴＦＡ（２０ｍＬ）で１時間脱保護し、続いてＬＣ−ＭＳにより、主要生成物よりわずかに早く溶出する約１０％のテトラアシル型生成物およびわずかに遅く溶出する２０％のジアシル型生成物に両側を挟まれた、トリアシル型形態のインスリン（約７０％）がまた存在することを再度示した。サンプルをほぼ乾固するまでエバポレートし、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（３０：７０、３０ｍＬ）に再溶解し、等量に２つにわけ、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた一部のうちの１つ（０．００２６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（９：１、１０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．５ｍＬ）を加えた。みかけのｐＨは９．３であった。Ｂｏｃ２−グアニルピラゾール（１６０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、反応をさらに１時間続けた。Ｂｏｃ２−グアニルピラゾールをさらに１６０ｍｇ加え、反応をさらに１時間続けた。この時点でＬＣ−ＭＳ分析は、１〜４個のＢｏｃ２−グアニル基が付加されている生成物の存在を示した。
【０１６２】
Ｂｏｃ２−グアニルピラゾールをさらに８００ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）加え、反応をさらに４時間続けた。合計３．６ｍｍｏｌのＢｏｃ２−グアニルピラゾールを加えた。これは、最初のアシル化工程で加えた過剰のリジン（１ｍｍｏｌ）のアミノ基と反応することが予測された量よりも少ない量であるが、２．６ｍｍｏｌがトリＬｙｓ−インスリンとの反応に利用された（１アミノ基あたり約１５当量試薬過剰）。
【０１６３】
６時間の反応時間の最後に、サンプルをロータリーエバポレーターでほぼ乾固するまで濃縮し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６０：４０）に再溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥させたサンプルをＴＦＡ（２０ｍＬ）で２時間処理して脱保護型生成物を得、濃縮乾固させ、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１５：８５、２０ｍＬ）に再溶解した。この時点でのＬＣ−ＭＳ分析は、予測した質量のヘキサグアニジル型生成物を有する主要なピーク（物質の約６０％）、そしてまた、同時に溶離する少量のペンタグアニジル型生成物を示した。
【０１６４】
カチオン交換クロマトグラフィーにより精製を実施例１のように（しかし、異なるＡＢ線形勾配（１００分かけて２５〜７０％Ｂ）、流速４ｍＬ／分および８ｍＬの分画）を用いる）行った。プールした画分（総体積８８ｍＬ）をロータリーエバポレーターで約６５ｍＬまで濃縮し、次いでＨ２Ｏ（９０ｍＬ）で希釈した。サンプルを実施例１に記載したような最終ＲＰ−ＨＰＬＣ精製にかけて最終生成物を得た（４３ｍｇ、全体の収率は約２９％）。
【０１６５】
実施例９
Ａ０ＬｙｓＢ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中での組換えヒトインスリンのＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｔｆａ）−ＮＨＳエステルでのアシル化
組換えヒトインスリン−Ｚｎ結晶（２００ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１：１、１０ｍＬ）にｐＨ１０で溶解し、次いで６Ｍリン酸を用いてｐＨを約７に調整した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｔｆａ）−ＮＨＳエステル（１ｍｍｏｌ）をＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｔｆａ）−ＯＨ、ＮＨＳおよびＤＣＣから実施例１に記載のように製造し、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した。インスリン溶液にＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｔｆａ）−ＮＨＳエステル溶液（１．７ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。混合物を７５分間反応させ、次いでＴＦＡ（０．５ｍＬ）を用いて酸性にし、３０ｍＬまで希釈した。分析ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより３つのモノアシル型ピーク、２つのジアシル型生成物、および１つのトリアシル型生成物の存在を確認した。
【０１６６】
実施例２に記載の逆相ＨＰＬＣ精製、続いて分離した種の凍結乾燥により、以下のような保護型生成物を得た：Ａ０ＬｙｓＢ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリン（３３ｍｇ）、Ａ０ＬｙｓＢ０Ｌｙｓ−インスリン（３６ｍｇ）、Ｂ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリン（２３ｍｇ）、Ａ０Ｌｙｓ−インスリン（１２ｍｇ）およびＢ０Ｌｙｓ−インスリン（３１ｍｇ）。
【０１６７】
脱保護を２工程で行った。最初に、リジンαアミノ基からのＢｏｃ基の除去を、５個のサンプル各々をＴＦＡ（５ｍＬ）で３０分間処理することにより達成した。次いで、溶液をほぼ乾固するまでエバポレートし、残留ＴＦＡをサンプルチューブに窒素を吹き込むことにより取り除いた。次いで、１５％ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ（ｖ：ｖ）（６ｍＬ）を添加し、サンプルを室温に３〜４時間放置することによりＴＦＡ基をリジンεアミノ基から除去した。次いで、サンプルをＨ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、酢酸（１．５ｍＬ）でｐＨ４まで酸性にした。サンプルを実施例１に記載のように最終精製にかけ、以下に示す最終量を得た：Ａ０ＬｙｓＢ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリン（１４ｍｇ）、Ａ０ＬｙｓＢ０Ｌｙｓ−インスリン（１７ｍｇ）、Ｂ０ＬｙｓＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ｌｙｓ−インスリン（８ｍｇ）、Ａ０Ｌｙｓ−インスリン（５ｍｇ）およびＢ０Ｌｙｓ−インスリン（１６ｍｇ）。
【０１６８】
実施例１０
Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中でのＡ２１Ｇｌｙ−インスリンのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルでのアシル化
Ａ２１Ｇｌｙ−インスリン（２３０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：水（１：１、２４ｍＬ）に溶解した。ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）を加えた。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（約５０μＬ）を加え、ｐＨを１０．５に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に３０分間混合したＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびジシクロヘキシルカルボジイミヂイミド（ＤＣＣ）（各０．４ｍｍｏｌ）から製造した。次いで、混合物をろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。得られたＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（１ｍＬ、０．１ｍｍｏｌ、２．５当量）をインスリン溶液に加え、混合物を室温で１時間ろ過した。この時点でのｐＨは約９．８に低下した。６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を用いてｐＨをさらに９．０まで低下させた。さらにＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（１ｍＬ、０．１ｍｍｏｌ、２．５当量）をインスリン溶液に加え、混合物を室温でさらに１時間攪拌した。この時点で、混合物がモノアシル型およびジアシル型生成物を約５７：４３の比で含むことが逆相ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８内径４．６ｍｍ×１５ｃｍカラムで行う。１５分での１０〜１００％ＢのＡＢ線形勾配。Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６０：４０）中０．０５％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分）により示された。さらに０．５ｍＬのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（０．０５ｍｍｏｌ、１．２５当量）をインスリン溶液に加え、混合物を５分間攪拌した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液の二回目の添加（０．５ｍＬ）を行い、混合物を１０分間攪拌し、次いでトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてｐＨ３まで酸性にした。溶液をＣＨ３ＣＮ：水（５０：５０、２０ｍＬ）で希釈し、ろ過した。最終反応混合物は、２２０ｎｍでのＵＶ測定からのＨＰＬＣピーク領域により決定すると、主要なモノアシル型およびジアシル型生成物を３０：７０の比で含んでいた。
【０１６９】
粗アシル型物質をＶｙｄａｃ  Ｃ１８（内径２．２ｃｍ×２５ｃｍ）分取カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。サンプルを以下の２段階ＡＢ線形勾配を用いて流速１２ｍＬ／分で溶離した：（ａ）１５分にわたり０〜１８％Ｂ、続いて（ｂ）１００分かけて１８〜６８％Ｂ。ここで、Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ。ジアシル型インスリンを含む画分をプールし、凍結乾燥させて保護型生成物１３４ｍｇを得た。この物質を、ＴＦＡ：アニソール：ＭｅＯＨ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９１：３：３：３、２０ｍＬ）の混合物を用いて室温で１．５時間、脱保護し、次いで次いでほぼ乾固するまでロータリーエバポレーターで濃縮し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：９０）（２５ｍＬ）に再溶解し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で２回抽出した。最終的な逆相ＨＰＬＣでの精製により、上記と同じＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムで１２ｍＬ／分で以下からなる２段階ＡＢ線形勾配を用いて行った：（ａ）１５分にわたり０〜１５％Ｂ、続いて（Ｂ）１００分にわたり１５〜５５％Ｂ。ここで、Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ。これにより全体的な収率の約３３％であるＡ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン生成物を得た（７７ｍｇ）。
【０１７０】
実施例１１
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１Ｇｌｙ−インスリンを産生するための水／ＣＨ３ＣＮ中でのＡ２１Ｇｌｙ−インスリンの（１）Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルおよび（２）Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））−ＮＨＳエステルでのアシル化
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））−ＯＨをＣｌ−（２’−クロロ）トリチルポリスチレンポリマー上で合成した。ポリマーに、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）混合物（９０：１０）中で二倍過剰のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨをロードした。続いて、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液を用いてＦｍｏｃ基をリジンεアミノ基から除去した。次いで、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨのα−カルボキシレート（４倍過剰）を、ＤＭＦ溶液中Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロ−フォスフェート（ＨＢＴＵ）およびＤＩＥＡ（アミノ酸：ＨＢＴＵ：ＤＩＥＡの比は１：０．９５：３）を用いる活性化を介して遊離アミノ基へと連結した。２０％ピペラジンのＤＭＦ溶液を用いてＡｒｇのεアミノ基からＦｍｏｃ基を除去し、続いて５倍過剰のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（Ｂｏｃ無水物）およびＤＩＥＡをＤＭＦ溶液中１：２の比で用いて遊離アミンをキャッピングした。ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）：ジクロロメタン（ＤＣＭ）（１：２、３０ｍＬ）で、それぞれ４０分間、２回処理することによりポリマーから化合物を切断した。併せた溶液をろ過し、ロータリーエバポレーターでエバポレートした。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステルおよびＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））−ＮＨＳエステルを実施例１に記載したように、個々の酸をＤＣＭ中で用いてＮＨＳおよびＤＣＣを同じ割合で混合して製造した。
【０１７１】
Ａ２１Ｇｌｙ−インスリン（２３０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ：水（１：１、２４ｍＬ）に溶解した。ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）を加えた。５Ｍ  ＫＯＨ溶液（約５０μＬ）を加えてｐＨを１０．５に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（０．１ｍｍｏｌ、２．５当量）をインスリン溶液に加え、混合物を室温で４０分間攪拌した。この時点で、混合物が主に出発物質およびモノアシル型生成物を４０：６０の比で含むことが逆相ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８内径４．６ｍｍ×１５ｃｍカラムで行う。１５分での１０〜１００％ＢのＡＢ線形勾配。Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６０：４０）中０．０５％ＴＦＡ、流速１ｍＬ／分）により示された。さらに０．６ｍＬのＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＮＨＳエステル溶液（０．０６ｍｍｏｌ、１．５当量）をインスリン溶液に加え、混合物を室温でさらに１５分間攪拌し、この時点で主にインスリンはモノアシル型種に変換されていた。この時点でのｐＨは、６Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の添加に伴い１０．２から９．０へと低下した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））−ＮＨＳエステル（０．１２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、インスリン溶液に添加した。混合物を室温で３０分間攪拌し、次いでＣＨ３ＣＮ：水（５０：５０、２０ｍＬ）で希釈し、ＴＦＡ（３００μＬ）で酸性にし、ろ過した。逆相ＨＰＬＣにより観察された主要なピークは、ＨＰＬＣ質量スペクトル分析により確認したＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）およびＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））の各１個で誘導体化した生成物に対応した。
【０１７２】
粗アシル型物質をＶｙｄａｃ  Ｃ１８（内径２．２ｃｍ×２５ｃｍ）分取カラムでの逆相ＨＰＬＣにより精製した。サンプルを以下の２段階ＡＢ線形勾配を用いて流速１３ｍＬ／分で溶離した：（ａ）２０分にわたり０〜３０％Ｂ、続いて（ｂ）１００分かけて３０〜８０％Ｂ。ここで、Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ。ジアシル型インスリンを含む画分をプールし、凍結乾燥させて保護型生成物を得た（１０５ｍｇ）。この物質を、ＴＦＡ：アニソール：ＭｅＯＨ：トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９１：３：３：３）の混合物（２０ｍＬ）を用いて室温で２時間、脱保護し、次いでほぼ乾固するまで濃縮し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：９０）（２５ｍＬ）に再溶解し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で３回抽出した。最終的な逆相ＨＰＬＣでの精製を、上記と同じＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムで１２ｍＬ／分で以下からなる２段階ＡＢ線形勾配を用いて行った：（ａ）１５分にわたり０〜１５％Ｂ、続いて（ｂ）１００分にわたり１５〜５５％Ｂ。ここで、Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ。これにより全体的な収率の約２５％に対してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン生成物を得た（６０ｍｇ）。
【０１７３】
実施例１２
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンの製造
ヒトプロインスリンアナログＡ２１ＧｌｙＣ６４ＡｒｇＣ６５Ｌｙｓ−ヒトプロインスリンをコードする配列を含むプラスミドを大腸菌内で発現させた。プロインスリンアナログを精製し、フォールディングさせた後、以下のようにアシル化した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステルを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（３ｍＬ）中で４０分間共に混合したＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（各々０．４ｍｍｏｌ）から製造した。次いで、混合物をろ過し、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。次いで、得られたＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（０．４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した。
【０１７４】
Ａ２１ＧｌｙＣ６４ＡｒｇＣ６５Ｌｙｓ−ヒトプロインスリン（約１０８ｍｇ）の１０ｍＭ  ＨＣｌ（１８０ｍＬ）溶液を２個に等量に分け、凍結乾燥させた。分けたプロインスリンの１つを水／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０、１２ｍＬ）に再溶解した。ＮａＨ２ＰＯ４（８０ｍｇ）を加えて濃度約５０ｍＭ  ＰＯ４とした。５Ｍ  ＫＯＨ溶液を用いてｐＨを８．２に調整した。Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル（１ｍＬ、０．１ｍｍｏｌ、約２０当量）を加え、混合物を室温で２．５時間攪拌した後、ｐＨは７．４まで低下した。ｐＨを８．２まで調整し、さらにＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨＳエステル溶液（１ｍＬ）を加えた。溶液をさらに３時間混合した後、水で５０ｍＬまで希釈し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２００μＬ）を用いて酸性にし、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた反応混合物をＴＦＡ：水（９５：５、２０ｍＬ）に再溶解し、室温に１．５時間放置した。ＴＦＡ混合物をほぼ乾固するまでロータリーエバポレーターでエバポレートした後、１０％ＣＨ３ＣＮ／水（２５ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で２回抽出した。脱保護した混合物をＺｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８（内径４．６ｍｍ×１５ｃｍカラム）での逆相ＨＰＬＣ（１５分にわたり１０〜１００％ＢのＡＢ線形勾配。Ａ＝０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２ＯおよびＢ＝ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（６０：４０）中０．０５％ＴＦＡ。流速０．９ｍＬ／分）および質量分析測定により分析し、少量の「過アシル型」生成物である予測したよりもさらに３個多いＡｒｇ残基（Ｎ末端アミンおよびＢ２９：ＬｙｓおよびＣ６５：Ｌｙｓのリジン側鎖アミンにそれぞれ１個）が付加している生成物を含有することがわかった。これはおそらく、Ｔｙｒの側鎖フェノール基、Ｈｉｓ側鎖のイミダゾール基、または他の反応側鎖部分へのＡｒｇ残基の結合に起因する。過アシル化産物の結合の塩基触媒性加水分解によりこれらの産物の量を減少させるために、３０分かけてプロインスリン溶液をｐＨ１０．５まで上昇させた。このｐＨ迂回（ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ）プロセスにより、過アシル型種の量は実質的に減少した。３０分間の高ｐＨでの処理の後、ＴＦＡを用いてｐＨを約３まで低下し戻し、溶液を−２０℃で保存した。
【０１７５】
２個目のＡ２１ＧｌｙＣ６４ＡｒｇＣ６５Ｌｙｓ−ヒトプロインスリンに対して、化学修飾、脱保護、およびｐＨ迂回方法を繰り返した。得られたＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＣ６４ＡｒｇＣ６５Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−ヒトプロインスリン誘導体溶液を合わせ、凍結乾燥させた。粗脱保護型物質の純度は、逆相ＨＰＬＣピーク領域により判定すると、約６５％であった。
【０１７６】
アシル型プロインスリン誘導体をトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで消化してリーダー配列および残基Ｃ３１ＡｒｇからＣ６４Ａｒｇの「Ｃペプチド」を除去しながら、インタクトなＣ６５Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇおよびＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ部分を残してＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン誘導体を形成した。Ｄｅｓ−３０インスリン生成物の形成は、Ｂ２９Ｌｙｓ上の修飾により効率よくブロックされた。精製したＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを、以下の通りにインビトロおよびインビボ実験で用いた。
【０１７７】
実施例１３
インビトロレセプター親和性
ヒトインスリンレセプター（ＩＲ）に対するインスリン分子の親和性を、放射性標識リガンドである［１２５Ｉ］インスリンを用いる競合結合アッセイで測定した。ヒトインスリンレセプター膜を、安定にトランスフェクトした、レセプターを過剰発現する２９３ＥＢＮＡ細胞のＰ１膜調製物として製造した。アッセイは、同様の結果を有するろ過およびＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）態様の両方で展開し、有効であったが、ＳＡＰ態様では、ＰＶＴ  ＰＥＩ処理小麦胚凝集素結合型ＳＰＡビーズ、タイプＡ（ＷＧＡ  ＰＶＴ  ＰＥＩ  ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用して行った。
【０１７８】
放射性標識リガンド（［１２５Ｉ］組換えヒトインスリン）を社内で製造するか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した（基準日の比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。ＳＰＡアッセイ緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡであった。アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，３６３２番）でのハイスループット用に構成し、Ｔｉｔｅｒｔｅｃ／Ｐｌｕｓ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により加えた放射性リガンド、膜およびＳＰＡビーズを用いて自動化した。
【０１７９】
以下のオーダーで試薬をプレートウェルに添加した。
【数１７】
2005519041.tif 000018
【０１８０】
プレートを接着性プレートカバーでシールし、１分間、ＬａｂＬｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓタイタープレート振盪機で振盪した。プレートをＷａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンターに配置し、タイマーを１２時間に設定して室温（２２℃）で１２時間インキュベートした。計測は［１２５Ｉ］に関して正規化したプロトコルを用いて１ウェルあたり１分間行った。
【０１８１】
各インスリン分子についてのＩＣ５０を４パラメーターロジスティック非線形回帰分析から決定した。データは平均値±ＳＥＭとして報告した。相対的親和性は、各実験において各インスリン分子を組換えヒトインスリンコントロールと比較した後、行った実験数にわたり相対的親和性を平均化することにより決定した。従って、インスリン分子の平均ＩＣ５０とインスリンの平均ＩＣ５０との比較は、同じ値を生じない。
【０１８２】
各インスリン分子および組換えヒトインスリンのインスリン成長因子レセプター（ＩＧＦ１−Ｒ）に対する親和性を、［１２５Ｉ］ＩＧＦ−ｌ放射標識リガンドを用いる競合結合アッセイで測定した。ヒトＩＧＦ−１レセプター膜を、安定にトランスフェクトした、レセプターを過剰発現する２９３ＥＢＮＡ細胞のＰ１膜調製物として製造した。アッセイは、同様の結果を有するろ過およびＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）態様の両方で展開し、有効であったが、ＳＡＰ態様では、通常、ＰＶＴ  ＰＥＩ処理小麦胚凝集素結合型ＳＰＡビーズ、タイプＡ（ＷＧＡ  ＰＶＴ  ＰＥＩ  ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用して行った。［１２５Ｉ］ＩＧＦ−１放射性標識リガンドを社内で製造するか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した（基準日の比活性２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。ＳＰＡアッセイ緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡであった。アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，３６３２番）でのハイスループット用に構成し、Ｔｉｔｅｒｔｅｃ／Ｐｌｕｓ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）により追加した放射性リガンド、膜およびＳＰＡビーズを用いて自動化した。
【０１８３】
以下のオーダーで試薬をプレートウェルに添加した。
【数１８】
2005519041.tif 000019
【０１８４】
プレートを接着性プレートカバーでシールし、１分間、ＬａｂＬｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓタイタープレート振盪機で振盪した。プレートをＷａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンターに配置し、タイマーを１２時間に設定して室温（２２℃）で１２時間インキュベートした。［１２５Ｉ］に関して正規化したプロトコールを用いて計測を１ウェルあたり１分間行った。
【０１８５】
各インスリン分子についてのＩＣ５０を４パラメーターロジスティック非線形回帰分析から決定した。データは平均値±ＳＥＭとして報告した。相対的親和性は、各実験における各インスリン分子を組換えヒトインスリンコントロールと比較した後、行った実験数にわたる相対的親和性を平均化することにより決定した。従って、各インスリン分子の平均ＩＣ５０とインスリンの平均ＩＣ５０の比較は、同じ値を生じない。
【０１８６】
選択性インデックスは、ＩＲ相対的親和性のＩＧＦ−１Ｒ相対的親和性の比として計算した。選択性インデックス＞１は、ＨＩＲに対する相対的親和性がより高いことを示す。選択性インデックス＜１は、ＩＧＦ−１Ｒに対する相対的選択性がより高いことを示す。
【０１８７】
表１は、各インスリン分子および組換えヒトインスリンに対するインスリンレセプター（ＩＲ）親和性、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１―Ｒ）レセプター親和性およびレセプター選択性インデックス（ＩＲ／ＩＧＦ−Ｒ）を示す。
【０１８８】
【表１】
2005519041.tif 000020
【０１８９】
実施例１４
インビトロ代謝有効性
各インスリン分子および組換えヒトインスリンの代謝有効性（グルコース取込）を、分化したマウス３Ｔ３−Ｌ１含脂肪細胞を用いるグルコース取込アッセイで測定した。未分化のマウス３Ｔ３細胞を、増殖培地（１００μｌ。ＤＭＥＭ、高グルコース、Ｌ−グルタミン不含、１０％ウシ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％抗生物質／抗真菌剤溶液）中２５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。
【０１９０】
分化培地（ＤＭＥＭ、高グルコース、Ｌ−グルタミン不含、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％抗生物質／抗真菌剤溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．２５ｍＭデキサメタゾン、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５ｍｇ／ｍｌインスリン）の添加により、プレーティング３日後に分化が開始した。４８時間後（３日目）、インスリンを含むがＩＢＭＸまたはデキサメタゾンは含まない培地に分化培地を交換し、６日目に細胞をインスリン、ＩＢＭＸまたはデキサメタゾンを含まない分化培地に切り替える。１日おきに交換しながら、細胞をＦＢＳ培地中に維持した。
【０１９１】
Ｃｙｔｏｓｔａｒ  Ｔ９６ウェルプレートを用いてグルコース輸送アッセイを行った。アッセイの２４時間前に、細胞を、０．１％ＢＳＡを含有する血清不含培地（１００μｌ）に切り替えた。アッセイ日に培地を除去し、アッセイ緩衝液（５０μｌ。いわゆるＫＲＢＨまたはクレブス−リンゲル緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（１１８ｍＭ  ＮａＣＬ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４Ｘ７Ｈ２Ｏ、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、Ｈ２Ｏ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を含有する）を加えた。インスリン希釈物を、０．１％ＢＳＡを含有する同じ緩衝液中で調製し、２×で添加した。ブランクはＫＲＢＨ、０．１％ＢＳＡおよび２０ｍＭ  ２×２−デオキシ−Ｄ−グルコース、０．２μＣｉ／ウェルの２−デオキシ−Ｄ−（Ｕ−１４Ｃ）グルコースおよび２×１０−７インスリンを含有した。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。その後、サイトカラシンＢ（１０μｌ）を、ＫＲＢＨ中で最終濃度２００μＭで添加し、プレートをＭｉｃｒｏｂｅｔａプレートリーダーで読み取った。相対的親和性は、各実験の各インスリン分子を組換えヒトインスリンコントロールと比較した後、相対的親和性を行った実験数で平均化することにより決定した。従って、各インスリン分子の平均ＥＣ５０とインスリンの平均ＥＣ５０の比較は、同じ値を生じない。
【０１９２】
表２は、インスリン分子および組換えヒトインスリン各々についてのインビトロ代謝有効性を示す。
【０１９３】
【表２】
2005519041.tif 000021
【０１９４】
実施例１５
インビトロ有糸分裂促進活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）
各インスリン分子の有糸分裂促進効力を、培養中のヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）の増殖を測定することにより決定した。ＨＭＥＣは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から７継代目で入手し、拡張させて８継代目で凍結した。各時点で新しいアンプルを用いて、全ての実験がＨＭＥＣの同じ１０継代目で行われるようにした。細胞は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒの説明書に従って培養中で維持した。細胞培養物を維持するために、増殖培地は１日置きに交換し、培養物を毎日視察した。
【０１９５】
ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒからの２つの製品を増殖培地として使用した。
１．以下のものを含有する、充分補充したＭＥＧＭ（ＣＣ−３０５１）（量はＢＰＥを除き、最終濃度を示す。）
１０ｎｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（ヒト組換え上皮細胞増殖因子）
５μｇ／ｍｌインスリン
０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン
５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシン−Ｂ
１３ｍｇ／ｍｌ  ＢＰＥ（ウシ下垂体抽出物）２ｍｌ（付属）。および
２．以下に列挙する補充物（ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ，ＣＣ−３１５０）を全て含む基本培地（ＭＥＢＭ，ＣＣ−３１５１）
１３ｍｇ／ｍｌ  ＢＰＥ（ウシ下垂体抽出物（ＣＣ−４００９）２ｍｌ
１０μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ（ＣＣ−４０１７）０．５ｍｌ
５μｇ／ｍｌ  インスリン（ＣＣ−４０３１）０．５ｍｌ
０．５ｍｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（ＣＣ−４０３１）０．５ｍｌ
５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍｌアンフォテリシン−Ｂ（ＣＣ−４０８１）０．５ｍｌ。
【０１９６】
増殖実験に関しては、アッセイ培地は５μｇ／ｍｌインスリンを含有せず、０．１％ＢＳＡを含有する増殖培地である。アッセイは、９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒｔシンチレーションマイクロプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＲＰＮＱ０１６２）で行った。組換えヒトインスリンおよびＩＧＦ−１は、各アッセイ試行で用いたコントロールであり、組換えヒトインスリンは各アッセイプレートに関するものである。
【０１９７】
アッセイは以下のプロトコルに従って行った。１日目に、ＨＭＥＣをアッセイ培地１００μｌ中４０００細胞／ウェルの密度で播種した。増殖培地中のインスリンを、最終濃度０〜１０００ｎＭで段階的な用量の組換えヒトインスリンまたは他のインスリン分子と置き換えた。４時間のインキュベーション後、アッセイ培地１０μｌ中０．１μＣｉの１４Ｃチミジンを各ウェルに加え、プレートを４８時間目および／または７２時間目にＴｒｉｌｕｘで読み取った。
【０１９８】
通常、最大増殖応答は、規定値の３〜４倍の刺激の間であった。応答データを０〜１００％応答の間に正規化した［１００×（濃度Ｘの時の応答−濃度０の時の応答）÷（最大濃度の時の応答−濃度０の時の応答）］。濃度−応答データは、ＪＭＰソフトウェアを利用して非線形回帰に適合させた。
【０１９９】
各実験の各インスリン分子をインスリンコントロールと比較した後、行った実験数で相対的効力を平均化することにより相対的有糸分裂促進効力を決定した。従って、各インスリン分子の平均ＥＣ５０とインスリンの平均ＥＣ５０の比較は、同じ値を生じない。
【０２００】
表３は、各インスリン分子についての細胞増殖に関して測定したインビトロ有糸分裂促進活性を示す。表３のデータは、各インスリン分子が組換えヒトインスリンよりも有糸分裂活性が低いことを示す。
【０２０１】
【表３】
2005519041.tif 000022
【０２０２】
実施例１６
リン酸緩衝化生理食塩水溶解性
インビボでの時間作用（ｔｉｍｅ−ａｃｔｉｏｎ）を延長する傾向の指標であるインビトロ沈殿アッセイを、以下のようにして開発した。ｐＨ４に調整し、薬理学的用量のインスリン分子（１００国際単位）およびＺｎ２＋（３０μｇ／ｍｌ）、ｍ−クレゾール（２．７ｍｇ／ｍｌ）およびグリセロール（１７ｍｇ／ｍｌ）を含有する水溶液を２国際単位までリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で中和し、１４，０００ｒｐｍで５分間、ＲＴで遠心分離した。上清を取り出し、上清の約１０分の１を分析Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８  ＲＰ−ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）に注入した。溶離ピーク下の領域を積分し、参照標準（これは０．１Ｎ  ＨＣｌ中のいずれかの組換えヒトインスリンである）のピーク下の領域と比較した。領域の比に１００をかけてＰＢＳ中への溶解性％を得た。
【０２０３】
組換えヒトインスリン製剤および各インスリン分子についてのＰＢＳ溶解性を表４に示す。
【０２０４】
【表４】
2005519041.tif 000023
【０２０５】
実施例１７
等電点
等電点電気泳動法は、等電点（ｐＩ）に基づいてタンパク質を分離する電気泳動技術である。ｐＩは、タンパク質が正味の電荷を有さず、電場で動かないｐＨである。ＩＥＦゲルは効率よくｐＨ勾配を作製するので、タンパク質は独特のｐＩ特性に基づき分離する。タンパク質バンドの検出はＮｏｖｅｘコロイド状クーマシー染色キットのような感度の良い色素染色により達成することができる。あるいは、検出は、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）メンブレン上へのゲルのブロッティングおよびポンソーレッドでの染色により達成することができる。タンパク質のｐＩは、既知の標準品のｐＩと比較することにより決定する。ＩＥＦタンパク質標準品は、均一な染色を与えるように混合された、非常に良く特徴付けられているｐＩ値を有するタンパク質の組合せである。さらに別のｐＩ測定方法は、キャピラリー電気泳動によるＩＥＦである（ｃＩＥＦ）。ｐＩは、公知のマーカーとの比較により測定される。
【０２０６】
組換えヒトインスリンおよび各インスリン分子の等電点（ｐＩ）は、ｐＨ３〜１０のＮｏｖｅｘ  ＩＥＦゲルを用いるゲル等電点電気泳動（３．５〜８．５のｐＩ性能範囲を提供する）により測定した。等電点を表５に示す。
【０２０７】
【表５】
2005519041.tif 000024
【０２０８】
実施例１８
イヌでのインビボ研究
一晩絶食させた、（大腿動静脈に）カニューレを挿入したままの（ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ）意識のある雄性および雌性ビーグル（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｆａｒｍｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏｓｅ，ＮＹ）で実験を行った。実験日には、留置血管アクセスポート（Ａｃｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）をアクセスさせて通過させ（ａｃｃｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｃｌｅａｒｅｄ）、動物を３’×３’研究用ケージに入れた。イヌをケージ環境に少なくとも１５分間順応させた後、空腹時のインスリンおよびグルコース濃度（時間＝−３０分）を測定するために動脈血サンプルを採取した。この時点で、環状ソマトスタチン（ＢＡＣＨＥＭ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）の静脈内連続注入（０．６５μｇ／ｋｇ／分）を開始し、その後２４．５時間継続した。注入開始の３０分後（時間＝０）に、動脈サンプルを採取し、生理食塩水またはインスリン調製物（２ｎｍｏｌ／ｋｇ）の皮下ボーラスを頚部背側面に注射した。その後、血漿グルコースおよびインスリン濃度の測定のために、動脈血サンプルを定期的に採取した。
【０２０９】
Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）でグルコースオキシダーゼ法を用いて試験日に血漿グルコース濃度を測定した。インスリン分析の時まで血漿サンプルは−８０℃で保存した。ヒトインスリンおよびインスリン分子に対して感受性のある市販のラジオイムノアッセイキットを用いてインスリン濃度を決定した。
【０２１０】
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇインスリンおよびＮＰＨインスリンはそれぞれ、生理食塩水コントロールよりも良好な時間作用を示した。Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン溶液は、ＮＰＨインスリンに匹敵する時間作用を示した。
【０２１１】
Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンおよびＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを生理食塩水およびインスリングラルギン（Ａ２１ＧｌｙＢ３１ＡｒｇＢ３２Ａｒｇ−インスリン）と比較した。２個の各試験において、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンおよびグラルギンは、生理食塩水コントロールよりも長い時間作用を示した。最初の研究では、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンおよびＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンはグラルギンに匹敵する時間作用を示した。第２の研究では、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンおよびＡ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンはグラルギンよりも短い時間作用を示した。
【０２１２】
実施例１９
ラットにおけるインビボ研究
一晩絶食させた後に、（大腿動静脈に）カニューレを挿入したままの（ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  ｃａｎｎｕｌａｔｅｄ）雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットで実験を行った。実験日の朝に、カテーテルの中身を吸引し、カテーテルの末端を延長ラインに取り付け、動物を１２”×１２”研究ケージに配置した。３０分の順応時間の後、動脈血サンプルを採取し、ビヒクル（０．３％ラットアルブミンを含有する生理食塩水）またはインスリン分子（０．３％ラットアルブミンを含有する生理食塩水で希釈したインスリン分子製剤。０．１、０．２、０．４、０．８または１．２ｎｍｏｌ／ｋｇ。ｎ＝５／１投薬量）のｉｖボーラスを投与した。血液は、静脈内注射の１０、２０、３０、４５および６０分後に採取した。
【０２１３】
全血液サンプルを２ナトリウムＥＤＴＡを含有するチューブに回収し、氷上に置いた。サンプルを遠心分離し、血漿を回収し、Ｍｏｎａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、試験日の血漿グルコース濃度を測定した。
【０２１４】
グルコース曲線下領域（０〜３０分）を、台形公式を用いて計算した。種々の投薬量に関して得られた値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてグラフ化した。２．４５ｇ・分／ｄＬの曲線下のグルコース領域に対応する投薬量を決定し、インスリン製剤の相対的有効性を直接比較するために用いた。
【０２１５】
１つの実験では、組換えヒトインスリンの推定有効性は０．１６０ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関しては０．１５８ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０２１６】
別の実験では、組換えヒトインスリンの推定有効性は０．１６２ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関しては０．２００ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０２１７】
別の実験では、組換えヒトインスリンの推定有効性は０．２０７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＳｅｒＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関する推定効力は０．２２６ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関する推定効力は０．２６８ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０２１８】
別の実験では、組換えヒトインスリンの推定有効性は０．３１７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関する推定効力は０．３２０ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０２１９】
別の実験では、組換えヒトインスリンの推定効力は０．２１７ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関する推定効力は０．２７５ｎｍｏｌ／ｋｇであり、Ａ０ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンに関する推定効力は０．２５８ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０２２０】
実施例２０
Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン亜鉛結晶およびプロタミン−亜鉛結晶
ストック溶液Ａは、合成グリセリン（１６．１ｇ）、フェノール（０．７３ｇ）およびｍ−クレゾール（１．６ｍＬ）を約３５０ｍＬの滅菌灌流用水に溶解することにより製造した。溶解後、滅菌水を最終溶液重量（５０３ｇ）まで加えた。硫酸プロタミンストック溶液は、硫酸プロタミン（０．０３６６ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリンストック溶液は、Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン（０．０１２１ｇ）をストック溶液（１．２８ｍＬ）に溶解することにより製造した。酸化亜鉛ストック溶液は、２５ｍｇ／ｍＬ酸化亜鉛溶液（１ｍＬ）を最終体積（２５ｍＬ）まで希釈して最終酸化亜鉛濃度（１ｍｇ／ｍＬ）を得ることにより製造した。リン酸ナトリウムストック溶液を、二塩基性リン酸ナトリウム（０．０５７７ｇ）を滅菌水（１５ｍＬ）に溶解することにより製造した。塩化ナトリウムストック溶液は、塩化ナトリウム（１．１６０７ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２２１】
Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン亜鉛結晶実験に関しては、Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン、酸化亜鉛およびストック溶液Ａを酸性のｐＨで混合した。塩化ナトリウムもまた、いくらかのサンプルに添加した。全サンプルを合わせて最終体積０．１ｍＬとした。リン酸ナトリウムストック溶液（０．１ｍＬ）を加え、析出物を形成させた。最終ｐＨを７．４〜９．３の間に調整した。硫酸プロタミンもＡ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリン、酸化亜鉛、塩化ナトリウムおよびストック溶液Ａと合わせることを除いては、後は同じ方法で、Ａ０ＡｒｇＢ０Ａｒｇ−インスリンプロタミン−亜鉛結晶を製造した。
【０２２２】
次いで、各サンプルを２つに分けた。サンプルのうちの１つを３０℃でインキュベートし、他方のサンプルを室温に放置した。試験した条件を表６に示す。試験した条件の各セットに関して結晶を観察した。濃度は全て公称である。
【０２２３】
【表６】
2005519041.tif 000025
【０２２４】
実施例２１
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン亜鉛結晶およびプロタミン−亜鉛結晶
ストック溶液Ａおよび酸化亜鉛のストック溶液、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを実施例２０に記載の通りに製造した。
【０２２５】
硫酸プロタミンストック溶液は、硫酸プロタミン（０．０３３２ｇ）をストック溶液Ａ（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリンストック溶液は、Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．０１１２ｇ）をストック溶液Ａ（１．２５ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２２６】
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン亜鉛結晶実験に関しては、Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン、酸化亜鉛およびストック溶液Ａを酸性のｐＨで混合した。塩化ナトリウムもまた、いくらかのサンプルに添加した。全サンプルを合わせて最終体積０．１ｍＬとして、異なる条件を得た。リン酸ナトリウムストック溶液（０．１ｍＬ）を加え、析出物を形成させた。最終ｐＨを７．４〜９．３の間に調整した。
【０２２７】
硫酸プロタミンもＡ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン、酸化亜鉛、塩化ナトリウムおよびストック溶液Ａと合わせることを除いては、後は同じ方法で、Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンプロタミン−亜鉛結晶を製造した。
【０２２８】
次いで、各サンプルを２つに分けた。サンプルのうちの１つを３０℃でインキュベートし、他方のサンプルを室温に放置した。試験した条件を表７に示す。試験した条件の各セットについて結晶を観察した。濃度は全て公称である。
【０２２９】
塩化ナトリウム濃度およびｐＨを最適化するために、さらに実験を行った。ストック溶液Ａは、合成グリセリン（１２．８ｇ）、フェノール（０．５９ｇ）およびｍ−クレゾール（１．２８ｇ）を約３００ｇの滅菌水に溶解することにより製造した。溶解後、滅菌灌流用水を最終総溶液重量（４０３ｇ）まで加えた。硫酸プロタミンストック溶液は、硫酸プロタミン（０．０３３ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンストック溶液は、Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．００４２ｇ）をストック溶液（０．３ｍＬ）に溶解することにより製造した。酸化亜鉛ストック溶液は、酸化亜鉛（０．０３０８ｇ）を５Ｎ塩酸（１ｍＬ）に溶解することにより製造し、滅菌水を最終体積（２５ｍＬ）まで添加した。リン酸ナトリウムストック溶液を、二塩基性リン酸ナトリウム（０．１８９３ｇ）を滅菌灌流用水に溶解して最終溶液体積５０ｍＬにすることにより製造した。塩化ナトリウムストック溶液は、塩化ナトリウム（１．１７３ｇ）を滅菌灌流用水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２３０】
Ａ０ＡｒｇＢ０ＡｒｇＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇインスリン、硫酸プロタミン、酸化亜鉛、塩化ナトリウムおよびストック溶液Ａを合わせて最終体積０．１ｍＬとした。リン酸ナトリウムストック溶液（０．１ｍＬ）を加え、析出物を形成させた。最終ｐＨを７．４〜９．３の間に調整した。
【０２３１】
次いで、各サンプルを２つに分けた。１つのサンプルを３０℃でインキュベートし、他方のサンプルを室温に放置した。試験した条件を表８に示す。試験した条件の各セットに関して結晶を観察した。濃度は全て公称である。
【０２３２】
【表７】
2005519041.tif 000026
【０２３３】
【表８】
2005519041.tif 000027
【０２３４】
実施例２２
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン亜鉛結晶
以下の実験に関して、ストック溶液Ａおよび塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、酸化亜鉛およびクエン酸ナトリウムのストック溶液を以下の通りに製造した。
【０２３５】
ストック溶液Ａは、合成グリセリン（１２８．２ｇ）、フェノール（５．９ｇ）、ｍ−クレゾール（１２．９ｇ）および二塩基性リン酸ナトリウム（３０．３ｇ）を約３５００ｍＬのｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解することにより製造した。溶解後、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を最終溶液重量（４０００ｇ）まで加えた。
【０２３６】
塩化ナトリウムストック溶液は、塩化ナトリウム（１．１６１４ｇ）を滅菌灌流用水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２３７】
リン酸ナトリウムストック溶液は、二塩基性リン酸ナトリウム（０．７５３８ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。このリン酸溶液（０．５ｍＬ）を滅菌水（９．５ｍＬ）に希釈した。
【０２３８】
酸化亜鉛ストック溶液は、２５ｍｇ／ｍＬ酸化亜鉛ストック溶液（０．４ｍＬ）を滅菌水（９．６ｍＬ）に溶解して最終酸化亜鉛濃度（１ｍｇ／ｍＬ）を得ることにより製造した。
【０２３９】
クエン酸ナトリウムストック溶液は、クエン酸ナトリウム（２．９５９７ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２４０】
１つの実験では、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンのストック溶液は、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．００３３５ｇ）をストック溶液Ａ（０．６５ｍＬ）に溶解することにより製造した。溶液は濁り、ｐＨはおよそ７．１であった。ｐＨを約３．７に調整すると、溶液は透明になった。
【０２４１】
結晶化は、まず、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを酸化亜鉛と合わせ、ストック溶液Ａおよび塩化ナトリウムストック溶液を添加することにより設定した。溶液のｐＨを４未満に維持した。次いで、リン酸ナトリウムストック溶液を加え、沈殿を形成した。最終的なｐＨは６．５〜９．５の間に調整した。次いで、各サンプルを３つに分けた。１個のサンプルを５℃でインキュベートし、１個のサンプルを３０℃でインキュベートし、他方１個のサンプルを室温に放置した。試験した条件および観測を表９に示す。濃度は全て公称である。
【０２４２】
【表９−１】
2005519041.tif 000028
【表９−２】
2005519041.tif 000029
【０２４３】
別の実験において、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンのストック溶液は、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．００３２ｇ）をストック溶液Ａ（０．６５ｍＬ）に溶解することにより製造した。溶液は濁り、ｐＨは約７．１であった。ｐＨを約３．７に調整すると溶液は、透明になった。
【０２４４】
結晶化は、まず、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを酸化亜鉛と合わせ、ストック溶液Ａおよび塩化ナトリウムおよび／またはクエン酸ナトリウムのストック溶液を添加することにより設定した。溶液のｐＨを４未満に維持した。次いで、リン酸ナトリウムストック溶液を加え、沈殿を形成した。最終的なｐＨは６．５〜９．５の間に調整した。次いで、各サンプルを３つに分けた。１個のサンプルを５℃でインキュベートし、１個のサンプルを３０℃でインキュベートし、他方１個のサンプルを室温に放置した。試験した条件および観測を表１０に示す。濃度は全て公称である。
【０２４５】
【表１０】
2005519041.tif 000030
【０２４６】
別の実験において、酢酸ナトリウムのストック溶液は、酢酸ナトリウム（０．８２０３ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンのストック溶液は、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．００３ｇ）をストック溶液Ａ（０．６３ｍＬ）に溶解することにより製造した。溶液は濁り、ｐＨは約７．１であった。ｐＨを約３．７に調整すると溶液は、透明になった。
【０２４７】
結晶化は、まず、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを酸化亜鉛と合わせ、ストック溶液Ａ、塩化ナトリウムおよび／または酢酸ナトリウムのストック溶液を添加することにより設定した。溶液のｐＨを４未満に維持した。次いで、リン酸ナトリウムストック溶液を加え、沈殿を形成した。最終的なｐＨは６．５〜９．５の間に調整した。次いで、各サンプルを３つに分けた。１個のサンプルを５℃でインキュベートし、１個のサンプルを３０℃でインキュベートし、他方１個のサンプルを室温に放置した。
【０２４８】
試験した条件および観測を表１１に示す。濃度は全て公称である。
【０２４９】
【表１１−１】
2005519041.tif 000031
【表１１−２】
2005519041.tif 000032
【０２５０】
別の実験において、塩化亜鉛ストック溶液は、１０ｍｇ／ｍＬ酸化亜鉛溶液（１．０ｍＬ）を滅菌水（１．０ｍＬ）で希釈することにより製造した。最終的な酸化亜鉛濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２５１】
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンのストック溶液は、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．００２２１ｇ）を滅菌水（０．４３ｍＬ）に溶解することにより製造した。溶液はほぼ清澄であり、ｐＨが約３．７であることをチェックした。ｐＨを約３．０に調整すると溶液は、透明になった。
【０２５２】
結晶化は、まず、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンを酸化亜鉛と、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムのストック溶液のいずれかと混合することにより、準備した。溶液のｐＨを約３未満に維持した。次いで、リン酸ナトリウムストック溶液を加え、沈殿を形成した。最終的なｐＨは６．５〜８．５の間に調整した。各サンプルを室温で放置した。試験した条件および観測を表１２に示す。濃度は全て公称である。
【０２５３】
【表１２】
2005519041.tif 000033
【０２５４】
実施例２３
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンプロタミン−亜鉛結晶
ストック溶液Ａは、合成グリセリン（１６．１ｇ）、フェノール（０．７３ｇ）およびｍ−クレゾール（１．６ｍＬ）を約３５０ｍＬの滅菌水に溶解することにより製造する。溶解後、滅菌水を最終溶液重量（５０３ｇ）まで加えた。硫酸プロタミンストック溶液は、硫酸プロタミン（０．０３６６ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造した。
【０２５５】
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリンストック溶液は、Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン（０．０１２１ｇ）をストック溶液Ａ（１．２８ｍＬ）に溶解することにより製造する。酸化亜鉛ストック溶液は、２５ｍｇ／ｍＬ酸化亜鉛溶液（１ｍＬ）を最終体積（２５ｍＬ）まで希釈して最終酸化亜鉛濃度（１ｍｇ／ｍＬ）を得ることにより製造する。リン酸ナトリウムストック溶液を、二塩基性リン酸ナトリウム（０．０５７７ｇ）を滅菌水（１５ｍＬ）に溶解することにより製造する。塩化ナトリウムストック溶液は、塩化ナトリウム（１．１６０７ｇ）を滅菌水（１０ｍＬ）に溶解することにより製造する。
【０２５６】
Ａ０Ｌｙｓ−Ｎε−ＡｒｇＡ２１ＧｌｙＢ２９Ｌｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ−インスリン、酸化亜鉛、硫酸プロタミン、塩化ナトリウムおよびストック溶液Ａを合わせて最終体積０．１ｍＬとし、異なる条件を得る。リン酸ナトリウムストック溶液（０．１ｍＬ）を加え、沈殿物を形成する。最終的なｐＨを７．４〜９．３の間に調整する。
【０２５７】
次いで、各サンプルを２個に分ける。１個のサンプルを３０℃でインキュベートし、他のサンプルを室温に放置する。試験した条件を表１３に示す。結晶を観察する。
【０２５８】
【表１３】
2005519041.tif 000034
【０２５９】
本発明を好ましい態様に関して具体的に示し、記載したが、当業者であれば、形態および詳細における種々の変更は、特許請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲を逸脱することなく行われうることを理解するであろう。当業者は、慣用的にすぎない実験を用いて、本明細書中に具体的に記載した本発明の特定の態様に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、本発明の請求の範囲に含まれることが意図される。
【０２６０】
本明細書中に記載の全ての特許、特許出願、物品、本および他の刊行物を、参照してそのまま本明細書中に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】図１は、Ｌｙｓのεアミノ基とＡｒｇのα−カルボキシル基との間に共有結合を形成することにより得られるＬｙｓ−Ｎε−Ａｒｇ誘導体を示す。
【配列表】
2005519041.tif 000035
2005519041.tif 000036
2005519041.tif 000037
【図１】
2005519041.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月2日(2004.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005519041000001.app