(57)【要約】制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むＤＮＡセグメントにコードされた一定領域で接続された２つ以上の可変領域を有するディスプレイを特徴とする、モジュラーディスプレイライブラリーが開示される。モジュラー可変領域をコードするセグメントは、オリジナルモジュラーライブラリーの多様性を拡大するために、ディスプレイベクターのアンサー（anther）位置に再結合され又は再配置されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造Ｒ１−Ｚ−Ｒ２を含む複数のＤＮＡ分子を含み、Ｒ１及びＲ２は独立した可変領域であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼの切断部位を含む一定領域であるディスプレイベクターのライブラリー。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が少なくとも１５塩基であり、少なくとも１２塩基が可変である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２の長さが約６〜約３６塩基である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
Ｚの長さが約６〜約９塩基である、請求項３に記載のライブラリー。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２が同じ長さである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２が異なる長さである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
Ｒ１及び／又はＲ２が一定に保持された位置を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
Ｒ１−Ｚ−Ｒ２領域の両端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位が位置する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
Ｒ１及びＲ２が式：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７を有する７アミノ酸のペプチドをそれぞれコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１０】
各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項９に記載のライブラリー。
【請求項１１】
Ｒ１が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含み、Ｒ２が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１２】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ分子が配列：５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１５】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、Ｒ２が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１８】
Ｚの制限エンドヌクレアーゼ部位がＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＥＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｓａＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｓｐＩ、ＰｐｕＭＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｃＩ、ＳｔｙＩから成る群より選択される、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１９】
Ｚの制限部位がベクター中に１つしか存在しない、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２０】
Ｚの制限部位がベクター中の他の１つの部位に存在する、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項２１】
一般構造Ｒ１−Ｚ−Ｒ２を含み、Ｒ１及びＲ２は独立してそれぞれ少なくとも１５塩基の可変領域であって少なくとも１２塩基は可変であり、Ｚは第１制限エンドヌクレアーゼの切断部位を含む一定領域である、そして少なくとも１０塩基によりＲ１−Ｚ−Ｒ２から離れている第２エンドヌクレアーゼ部位を含むディスプレイコード配列を含む、環状ＤＮＡディスプレイベクターのライブラリー。
【請求項２２】
Ｒ１及びＲ２が少なくとも１５塩基であって少なくとも１２塩基が可変である、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項２３】
第１及び第２エンドヌクレアーゼが異なる突出末端を生ずる、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
第１エンドヌクレアーゼがパリンドロームでない突出末端を生ずる、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２５】
第２エンドヌクレアーゼがパリンドロームでない突出末端を生ずる、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２６】
第２エンドヌクレアーゼがＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２７】
第１及び第２制限部位を認識する制限酵素が異なる、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２８】
第１及び第２制限部位を認識する制限酵素が同じである、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２９】
Ｚ中の制限エンドヌクレアーゼ部位がＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＥＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｓａＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｓｐＩ、ＰｐｕＭＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｃＩ、ＳｔｙＩから成る群より選択される、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項３０】
Ｚの制限部位がベクター中に１つしか存在しない、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項３１】
Ｚの制限部位がベクター中の他の１つの部位に存在する、請求項２１に記載のライブラリー。
【請求項３２】
請求項１に記載のライブラリー中でファージを選択する、その際、提示されたペプチドは目的の標的と結合する；
選択されたファージに対するＲＦ  ＤＮＡを得る；
ライブラリーＲＦ  ＤＮＡを第１及び第２制限部位で切断する；
ライブラリーＲＦ  ＤＮＡを第１及び第２制限部位で切断する；
選択されたＲＦ  ＤＮＡ断片及びライブラリーＲＦ  ＤＮＡ断片を混合する；
混合した断片を連結する；
新規ライブラリーを提示するファージが産生されるように、連結した断片を細胞に導入する；及び
新規ライブラリーから結合ファージを選択して配列決定し、結合ペプチドを得る、
工程を含む、結合ペプチドを得る方法。
【請求項３３】
ａ）  式：Ｒ１−Ｚ−Ｒ２のＤＮＡ配列を含む非常に多数のＤＮＡ分子を準備する、ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して、少なくとも１５塩基（５コドン）の可変領域であって少なくとも１２塩基は可変であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である、
ｂ）  ＤＮＡ分子を１つ以上のファージディスプレイベクターカセット（例えばＭＡＮＰなど、図４Ａ〜４Ｃ）に挿入する、そして
ｃ）  宿主バクテリアをファージディスプレイベクターカセットでトランスフェクトし、モジュラーファージディスプレイライブラリーを作製する、
ことを含む、モジュラーファージディスプレイライブラリーを製造する方法。
【請求項３４】
Ｒ１及びＲ２が少なくとも１５塩基であって少なくとも１２塩基が可変である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ１及びＲ２の長さが約６〜約３６塩基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
Ｒ１及びＲ２の長さが、約６〜約９塩基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ１及びＲ２が同じ長さである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
Ｒ１及びＲ２が異なる長さである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
Ｒ１及び／又はＲ２が一定の位置を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
Ｒ１−Ｚ−Ｒ２領域の両端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位が位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
Ｒ１及びＲ２が式：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７を有する７アミノ酸のペプチドをそれぞれコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
Ｒ１が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含み、Ｒ２が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
ＮＮＫはコレクションのコドンを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
ＤＮＡ分子が配列：５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ１が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、Ｒ２が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
Ｚの制限エンドヌクレアーゼ部位がＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＥＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｓａＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｓｐＩ、ＰｐｕＭＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｃＩ、ＳｔｙＩから成る群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
Ｚの制限部位がベクター中に１つしか存在しない、請求項３２に記載のライブラリー。
【請求項５２】
Ｚの制限部位がベクター中の他の１つの部位に存在する、請求項３２に記載のライブラリー。
【請求項５３】
ａ）  一定領域Ｚ内で切断する制限エンドヌクレアーゼ及びベクターカセットを切断する第２制限エンドヌクレアーゼを用いて、Ｒ１を含む第１ベクター断片及びＲ２を含む第２ベクター断片を生ずるように、モジュラーディスプレイライブラリーからファージディスプレイベクターカセットを消化する、
ｂ）  ベクター断片を混合してこれらの断片を再連結し、リコンビナトリアルファージベクターカセットを形成する；そして
ｃ）  宿主バクテリアをリコンビナトリアルファージベクターカセットでトランスフェクトしてリコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを作製する、
ことを含む、リコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーの作製方法。
【請求項５４】
Ｒ１及びＲ２が少なくとも１５塩基であり、少なくとも１２塩基が可変である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｒ１及びＲ２の長さが約６〜約３６塩基である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
Ｒ１及びＲ２の長さが約６〜約９塩基である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
Ｒ１及びＲ２が同じ長さである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
Ｒ１及びＲ２が異なる長さである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
Ｒ１及び／又はＲ２が一定に保持された位置を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
Ｒ１−Ｚ−Ｒ２領域の両端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位が位置する、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
Ｒ１及びＲ２が式：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７を有する７アミノ酸のペプチドをそれぞれコードする、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｒ１が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含み、Ｒ２が配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＤＮＡ分子が配列：５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＮＮＫはコドンのコレクションを意味し、システイン以外の各アミノ酸はコレクションのうちの１つのコドンによりコードされている、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｒ１が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、Ｒ２が配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする、請求項５３に記載の方法。
【請求項７０】
Ｒ１及び／又はＲ２が事前選択により単離される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７１】
Ｚの制限エンドヌクレアーゼ部位がＡｃｃＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＢｓｍＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｓｔＥＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｓａＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｓｐＩ、ＰｐｕＭＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆｃＩ、ＳｔｙＩから成る群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項７２】
Ｚの制限部位がベクター中に１つしか存在しない、請求項５３に記載のライブラリー。
【請求項７３】
Ｚの制限部位がベクター中の他の１つの部位に存在する、請求項５３に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願は２００２年３月１日に出願された米国仮出願第６０／３６１，１２１号の利益を主張する。上記出願の全教示は本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
潜在的結合体のライブラリー、特に、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２２３，４０９号及びＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．のペプチド及びタンパク質のファージディスプレイ：実験室マニュアル（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）に記載されているようなファージディスプレイライブラリーは、標的分子に対する結合ポリペプチドを単離するための強力なツールを提供する。ファージディスプレイライブラリーにおいて、組換えファージのコートタンパク質遺伝子と融合した多彩なポリペプチドコード配列は、ファージ粒子表面の一部として発現される多彩なセグメントを生ずる。即ち大部分のファージ粒子のファージ表面に「提示される」。したがって、このようなライブラリーから、標的分子に特異的に結合するペプチドを選択することができる。選択された多彩なポリペプチドディスプレイ遺伝子の配列の解析により、標的結合ポリペプチドのパネルが同定される。
【０００３】
ファージディスプレイライブラリーは典型的には１０6〜１０10の異なる多彩なポリペプチドを含有し、標的分子に対してこのようなライブラリーから選択することにより、数ダース、数百、又は数千もの標的に対する結合体を提供することができる。しかしながら、標的に対して特に高親和性の結合体（例えば１μＭ未満又はわずか１〜５０ｎＭの解離定数ＫD）又は所定の標的に対する低解離速度（Ｋoff）を有する結合体のような特別の特性を有する結合体を探求する場合、１億を超えるユニーク配列を含むディスプレイライブラリーのなかで所望の特性を有するのは２、３の選択物しかないかもしれない。このような場合、たとえ何百万、何億の潜在的結合体を提供しても、ディスプレイライブラリーのサイズは、特定の標的に対する好結果の特定の結合パートナーを単離する上で限定要因となる。
【０００４】
所定の標的を非常に多くの異なる潜在的な結合ポリペプチドに曝すために、いくつかのアプローチが提唱されている。例えば、より大きなライブラリーを試みることができる。それにより、オリジナルライブラリーは可変配列上に非常に多くの順列を含有し、所望の特徴を有する結合ポリペプチドを産生するより多くの機会を有するであろう。あるいは、オリジナルライブラリーから単離された１つ以上の見込みのある結合体を、例えばこの単離された結合体を親テンプレートとして用いて類似体のライブラリーを産生し、他の残基を一定に保持しながら２、３の残基に変化を与えることを可能にすることにより、定方向又は２次ライブラリーの基礎として用いることができる。このような工程は「親和性成熟」として知られる。親和性成熟は通常、２次ライブラリー中の選択物の配列周辺に多様性を与えるために、単離配列の解析、１つ以上の親配列の選択（即ち、２次テンプレートとして用いるため）、及び選択物（テンプレート）に基づいた多彩なＤＮＡの合成を必要とする。２次ライブラリーを構築するための他の可能性は、オリジナルライブラリーからの１つ以上の好結果の単離物を変異性ＰＣＲを用いて増幅することである。これは選択された配列にランダムに変化を与えるであろう。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明はライブラリー拡張のための他のアプローチを提供する。ここで、ディスプレイポリペプチドは、制限部位を含むＤＮＡセグメントにコードされる一定領域により離れた２つ以上の多彩なモジュールで構成される。好結果の結合モジュールは、オリジナルライブラリーベクターへ交換し又はそれらの間で再結合して、オリジナルライブラリーの多様性から更なるレベルの多様性を提供する２次ライブラリーを形成することができる。
【０００６】
したがって、本発明は、一般構造：Ｒ１−Ｚ−Ｒ２を含む非常に多数のＤＮＡ分子を含むディスプレイベクターの集団又はライブラリーを提供する。ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して少なくとも３塩基（１コドン）の可変領域であって、少なくとも３塩基は可変である。そしてＺは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である。好ましい態様において、Ｒ１−Ｚ−Ｒ２カセットは、ディスプレイベクターを操作するのに有用な制限部位に結合している。酵素は、それが１ヶ所で切断する場合又は２ヶ所ある場合、操作するのに有用である。２ヶ所の場合は、１方はＺ領域にあり、他方は他の場所にある。好ましくは、これらの境界制限部位を切断する酵素は、２、３、４又はそれ以上の不対塩基を含有する突出末端を与える。好ましくは、突出末端の一方又は両方は非パリンドローム性である。好ましくは、境界部位を切断する制限酵素の１つは３’突出を与え、他方は５’突出を与える。好ましい態様において、Ｒ１及びＲ２は独立して少なくとも９塩基（３コドン）の可変領域であって、少なくとも６塩基は可変である。そしてＺは、制限エンドヌクレアーゼの切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２の長さは独立して、９〜３６塩基、１２〜３６塩基、１５〜３６塩基、９〜２４塩基、１２〜２４塩基、１５〜２４塩基、９塩基、１２塩基、１５塩基、又は１８塩基である。最も好ましくは、可変（Ｒ）領域は同じ長さであろう。特定の態様において、可変領域Ｒ１及びＲ２の全ての塩基は可変である（例えば以下の実施例４を参照されたい）。更なる態様において、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、システインをコードする３つの連続した不変塩基を含有する（例えば以下の実施例１及び２を参照されたい）。
【０００７】
好ましい態様において、一定領域Ｚのコードセグメントは６〜３６塩基、より好ましくは６〜９塩基である。Ｚに包含される制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、好ましくは非パリンドローム突出末端を生ずるものである。切認識部位及び断部位を一定（Ｚ）領域の設計に利用することができる好ましい制限酵素には、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｓＳＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＡｖａＩ等が含まれる。本発明において有用な一定領域の特に好ましい例は、５’−ｔｃＣＧＧＴＣＣＧ−３’（以後「一定領域１」という）であり、これはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする。最初の２塩基は、Ｓｅｒの代わりに他のアミノ酸を与えるために変更することができるであろう。一定領域１は、ＲｓｒＩＩ制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）を含有する。他の好ましいＺ領域配列は、５’−ＣＧＧＷＣＣＧ−３’、５’−ＣＴＣＧＴＧ−３’、５’−ＣＡＣＧＡＧ−３’、及び５’−ＣＹＣＣＲＧ−３’を含み、ここで、ＹがＣの場合ＲはＡであり、ＹがＴの場合ＲはＧである。
【０００８】
好ましい態様において、一般構造：Ｒ１−Ｚ−Ｒ２を有する非常に多数のＤＮＡ分子を含むベクターライブラリーが提供される。ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ式：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７を有する７アミノ酸のペプチドをコードし、式中、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする。好ましい特徴において、Ｒ１は配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含み、Ｒ２は配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’を含む。最も好ましくは、このＤＮＡ分子は配列：５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’（配列番号１）を含む。
【０００９】
本明細書で用いるように、「ＮＮＫ」は、２０種全てのコード可能なアミノ酸をコードする可変コドンを意味する。ＮＮＫは、例えば塩基１にいかなる塩基が存在してもよく、塩基２もいかなる塩基でもよく、塩基３はＧ又はＴであることを示す。これは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ及びＬｅｕに対する３つのコドン；Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ及びＴｈｒに対する２つのコドン；並びにＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びストップのそれぞれに対する１つのコドンを提供する。本発明におけるこれらの配列及びその他のより好ましい態様は、ＮＮＫが、各アミノ酸を一度コードする｛ＴＴＴ、ＣＴＴ、ＡＴＴ、ＡＴＧ、ＧＴＴ、ＴＣＴ、ＣＣＴ、ＡＣＴ、ＧＣＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＡＧ、ＡＡＴ、ＡＡＧ、ＧＡＴ、ＧＡＧ、ＴＧＴ、ＴＧＧ、ＣＧＴ及びＧＧＴ｝のようなコドンのコレクションを意味するものである。環状ペプチドのライブラリーに関し、本発明におけるこれらの配列及びその他の最も好ましい態様は、ＮＮＫが、システイン以外の各アミノ酸一度コードする｛ＴＴＴ、ＣＴＴ、ＡＴＴ、ＡＴＧ、ＧＴＴ、ＴＣＴ、ＣＣＴ、ＡＣＴ、ＧＣＴ、ＴＡＴ、ＣＡＴ、ＣＡＧ、ＡＡＴ、ＡＡＧ、ＧＡＴ、ＧＡＧ、ＴＧＧ、ＣＧＴ及びＧＧＴ｝のようなコドンのコレクションを意味するものである。コドンの他の選択は、大体有効に作用するであろう。例えば、ＡｓｐのコドンをＧＡＴからＧＡＣへ変化させることは有効であろう。
【００１０】
更に好ましい態様において、一般構造：Ｒ１−Ｚ−Ｒ２を有する多数のＤＮＡ分子を含むベクターライブラリーが提供される。ここで、Ｒ１は配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく；Ｒ２は配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するペプチドをコードし、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく；そしてＺはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする。
【００１１】
好ましい特徴において、このＤＮＡ分子は配列：５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’（配列番号２）を含む。
【００１２】
図１、２及び３（配列番号４４、４６及び４８）に示すように、合成遺伝子のＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ消化断片を切り出し、この断片を、図４Ａ〜４Ｃ（配列番号５７）に示すＭＡＮＰベクターのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ消化による大きい断片のようなファージディスプレイベクターの好適部位へ挿入することにより、バクテリオファージＭ１３ライブラリーの構築に好適なベクターが提供される。切断可能なシグナル配列（配列番号５９）を含む注釈版ＭＡＮＰを図５Ａ〜５Ｆ（配列番号５８）に示す。図４Ａ〜４ＣはＭＡＮＰの注釈のないＤＮＡ配列（配列番号５７）を含有する。ＭＡＮＰにおいて、遺伝子ｉｉｉの単一コピーは修飾され、シグナル配列の終わりにＮｃｏＩ部位が存在し、続いてＢＰＴＩのコドン及びリンカー、ＰｓｔＩ部位、第Ｘａ因子切断部位を含有するリンカー、並びに成熟ＩＩＩのコドンが存在する。ライブラリーは、ＭＡＮＰ  ＲＦ  ＤＮＡをＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断し、ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ突出末端を有する多彩なＤＮＡをベクターＤＮＡへ連結することにより構築される。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は連結ＤＮＡで形質転換され、この細胞はコードされたペプチドを提示するファージを産生する。ＭＡＮＰは、ｐＧＥＭ３Ｚｆより得られ、不要な制限部位を除去するように修飾されたアンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）も含有する。
【００１３】
本発明はまた、上記のようなベクターライブラリーの発現産物で構成されるポリペプチドのライブラリーを提供する。
また、本発明は：
ａ）  式：Ｒ１−Ｚ−Ｒ２のＤＮＡ配列を含む非常に多数のＤＮＡ分子を準備する、ここでＲ１及びＲ２は独立して、少なくとも１５塩基（５コドン）の可変領域であって少なくとも１２塩基は可変であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である、
ｂ）  ＤＮＡ分子をファージディスプレイベクターカセット（例えばＭＡＮＰなど、図４Ａ〜４Ｃ；配列番号５７）に挿入する、そして
ｃ）  宿主バクテリアをファージディスプレイベクターカセットでトランスフェクト  する、
ことを含む、モジュラーファージディスプレイライブラリーを製造する方法を提供する  。
【００１４】
好ましい特徴において、ファージディスプレイベクターカセットは、少なくとも１つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。そのようなモジュラーディスプレイライブラリーを準備することは：
ａ）  一定領域Ｚ内で切断する制限エンドヌクレアーゼ及びベクターカセットを切断する第２制限エンドヌクレアーゼを用いて、Ｒ１を含む第１ベクター断片及びＲ２を含む第２ベクター断片を生ずるように、モジュラーディスプレイライブラリーからファージディスプレイベクターカセットを消化する；
ｂ）  ベクター断片を混合してこれらの断片を再連結し、リコンビナトリアルファージベクターカセットを形成する；そして
ｃ）  宿主バクテリアをリコンビナトリアルファージベクターカセットでトランスフェクトする、
ことを含む、リコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを製造する本発明の方法を提供する。
【００１５】
代替リコンビナトリアルファージディスプレイライブラリー、例えば事前選択により単離されているＲ１及び／又はＲ２のコードセグメントを利用する２次ライブラリー、を製造するための更なる方法も意図され、以下に詳細に記載される。
【００１６】
本発明はまた、配列：Ａ１−Ｂ−Ａ２を含む多彩なポリペプチドを提示する組換えバクテリオファージのライブラリーを提供する。ここで、Ａ１及びＡ２は独立して５〜１２アミノ酸の可変領域ペプチドであって少なくとも４アミノ酸は可変であり；Ｂは２〜１２アミノ酸の一定領域ペプチドである。好ましい態様において、可変領域Ａ１及びＡ２は同じ長さである。好ましくはＡ１及びＡ２の長さはそれぞれ約６〜９アミノ酸であり、より好ましくは７又は８アミノ酸である。特定の態様において、可変領域Ａ１及びＡ２のすべてのアミノ酸位置は可変であり、更なる態様において、可変領域Ａ１及びＡ２のそれぞれは、不変システイン残基を含有する（例えば以下の実施例２に記載されるライブラリーＭＴＮ−１３／Ｉを参照されたい）。好ましい態様において、一定領域Ｂの長さは２〜１２アミノ酸、より好ましくは２〜３アミノ酸、最も好ましくは３アミノ酸である。
【００１７】
好ましい態様において、構造：Ａ１−Ｂ−Ａ２を有するポリペプチドのモジュラーライブラリーが産生される。ここで、Ａ１及びＡ２はそれぞれ配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７を有する７アミノ酸のペプチドであり、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく、ＢはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする。更に好ましい態様において、構造：Ａ１−Ｂ−Ａ２を有するポリペプチドのモジュラーライブラリーが産生される。ここで、Ａ１は配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有する８アミノ酸のペプチドであり、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく；Ａ２は配列：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８を有する８アミノ酸のペプチドであり、各Ｘａａはシステイン以外のいかなるアミノ酸でもよく；そしてＢはトリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏをコードする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義
以下のセクションにおいて、「組換え」という用語は、非天然に改変された若しくは操作された核酸、外来核酸でトランスフェクトされた宿主細胞、又は単離ＤＮＡの操作及び宿主細胞の形質転換により非天然に発現させたポリペプチドを記載するために用いられる。組換えは特に遺伝子工学技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡ分子を包含する用語である。そして、分子、構築体、ベクター、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの集団（ライブラリー）を記載するために「組換え」という用語を形容詞として使用することは、天然のそのような分子、構築体、ベクター、細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はライブラリーを特に除外する。
【００１９】
「バクテリオファージ」という用語は、ＤＮＡコア、及び多くの異なるタンパク質分子の凝集により構築される保護殻を含有するバクテリアウイルスとして定義される。「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は、本明細書において同義的に用いられる。特に断りがない場合、「バクテリオファージ」及び「ファージ」という用語は、当該技術分野に熟練した者に周知のような「ファージミド」（即ち、ファージミド感染宿主をヘルパーファージで共感染することによりＤＮＡをパッケージすることができるようにバクテリオファージのゲノム部分を含むプラスミド）も包含する。本発明の好ましい態様において、ファージはＭ１３ファージである。
【００２０】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチドアミド結合（−Ｃ（：Ｏ）ＮＨ−）により主鎖（側鎖に対立するものとしての）を通して連結された２つ以上のアミノ酸の化合物を意味するために用いられる。「ペプチド」という用語は、本明細書中で「ポリペプチド」と同義的に用いられるが、一般に４０アミノ酸未満、好ましくは２５アミノ酸未満のポリペプチドを意味するために用いられる。
【００２１】
本明細書で用いられる「結合ポリペプチド」という用語は、他の分子と非共有結合複合体を形成可能なポリペプチドを意味する。本明細書で時に用いられる同等の用語は「結合部分」である。「ＫＤＲ結合ポリペプチド」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで血管内皮増殖因子受容体−２（又はＫＤＲ）と複合体を形成する結合ポリペプチドである。ＫＤＲ結合ポリペプチドの具体例を以下の表１、２及び３に示す。
【００２２】
「結合」という用語は、本明細書に記載されるものを含む標準アッセイにより、結合ポリペプチドが所定の標的を認識し不可逆的に結合するのを測定することを意味する。このような標準アッセイには平衡透析、ゲルろ過、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、及び結合の結果生ずる分光学的変化のモニタリングが含まれる。
【００２３】
本明細書で用いる「相同性の」又は「相同体」という用語は、２つのポリマー（即ち、ポリペプチド分子又は核酸分子）間の配列相同性の程度を意味する。同一ヌクレオチド若しくはアミノ酸残基又は実質的に同様の特性を有するもの（即ち保存的置換）が比較される２つのポリマー中である配列位置を占有するとき、ポリマーはその位置で「相同性」であり、そのポリマーは「相同体」として表される。例えば、２つのポリペプチド配列において、１００アミノ酸位置のうちの６０のアミノ酸残基が一致するか又は相同性である場合、その２つの配列は６０％相同性である。本明細書に表す相同性の割合の数値は、２つのポリマー間で可能な最大相同性、即ち２つのポリマーを最大数の一致した（相同性の）位置を有するように並べたときの％相同性を反映する。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の％相同性又は％同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３））のように改変されたＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８（１９９０））を用いて簡便に決定することができる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムへ導入される。ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを行い、本明細書に記載される核酸分子と相同性の核酸配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いてＢＬＡＳＴタンパク質サーチを行い、参照ポリペプチドと相同性のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのある配列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（即ちＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータが用いられる。これらＢＬＡＳＴプログラムは、ワールドワイドウェブにおいてｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでアクセス可能である。
【００２４】
「特異性」という用語は、１つの標的に対して他より高い結合親和性を有する結合ポリペプチドを意味する。例えば、「ＫＤＲ特異性」という用語は、ＫＤＲに対して無関係な標的より高い親和性を有するＫＤＲ結合部分を意味するであろう。結合特異性は、２つの試験される標的材料に関する解離平衡定数（ＫD）又は結合平衡定数（Ｋａ）により特徴付けることができる。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、提示配列の多様性を増すために効率よく再結合し、それにより所望の特徴を有する結合ポリペプチドを生じるためにライブラリーの可能性を増加させることができるディスプレイライブラリーを提供するための新規アプローチを提供する。本明細書に記載されるライブラリー設計は、少なくとも２つのアミノ酸の一定領域を介して接続された２つ以上の可変領域を有するディスプレイテンプレートを特徴とし、そのコードセグメントは制限酵素切断部位を包含する。当該分野の標準技術を用いたモジュラーライブラリーの構築は、可変領域の可変位置の多様性の程度に相当する多様性の程度を有するディスプレイライブラリーを提供する。ディスプレイライブラリー又はそれからの選択物のＤＮＡを回収し、ＤＮＡを一定領域のコードセグメントに対応する制限酵素で切断することにより、この多様性を本発明にしたがい拡大させることができる。この酵素は可変領域コード配列を分離するであろう。分離された可変領域コード配列を混合して再結合させ、オリジナルライブラリーには存在しなかった、及び／又は標的に対し特定の親和性を示す好ましい選択された可変領域を更なる可変領域の範囲と組み合わせ、選択物に基づく新規ポリペプチドの大きな集団を形成する可変領域の組み合わせを提供することができる。これは、選択された結合ポリペプチド内の２、３の位置におけるポイント成熟に限定されるよりはむしろ非常に多くの相同配列を提供する選択された結合ポリペプチドの親和性成熟の手段を提供する。
【００２６】
本発明のモジュラーライブラリーは２、３、４、５、又はそれより多い可変領域を有することができ、それぞれは一定領域を介して接続される。ライブラリーのコード配列は、少なくとも１つの一定領域が、制限酵素で切断されるセグメントにコードされるように設計する必要がある。これにより少なくとも２つの可変領域の分離及び再結合を可能にする。したがって、本発明のモジュラーライブラリーをコードするオリゴヌクレオチド配列は、式：Ｒ−Ｚ−Ｒ−Ｚ−Ｒ−Ｚ−Ｒ−などを有するであろう。ここで、各Ｒは可変領域であり、各Ｚは一定領域であり、少なくとも１つのＺ領域は制限エンドヌクレアーゼの切断部位を包含する。好ましくは、Ｚ領域は制限エンドヌクレアーゼの認識配列を包含するであろう。このエンドヌクレアーゼは認識配列内を切断する。最も好ましくは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列は９塩基以下であり、エンドヌクレアーゼによる切断は非パリンドローム突出末端を生ずるであろう。更に、制限部位を包含する各Ｚ領域に関し、その部位はライブラリーベクター内でユニーク部位であることが好ましい。
【００２７】
Ｚ領域の制限エンドヌクレアーゼ認識配列はできるだけ短いほうが好ましく、一方、依然としてベクター内のユニーク部位を提供する。９塩基以下のＺ領域（即ち３アミノ酸以下をコードする）が最も好ましい。Ｚ領域が長いほど、より多くの一定アミノ酸が可変（Ｒ）領域を分離するであろう。一般に、できるだけ短いＺ領域を有し、そして非特異的結合体であり、不溶性であり、又はプロテアーゼで容易に切断されるペプチドをコードしない配列を有することが好ましい。例えば、疎水性残基のクラスターは、ペプチドを不溶性にし、非特異的に細胞構造に接着し、又は水溶液中でミセルを形成しやすくすることができる。したがって、一定（Ｚ）領域にコードされる疎水性残基のクラスターは好ましくない。また、多くのプロテアーゼはＡｒｇ又はＬｙｓの後ろで切断する。したがって、Ａｒｇ又はＬｙｓのすぐ後にＰｒｏが続く場合は通常切断はブロックされ、それゆえＡｒｇ−Ｐｒｏ又はＬｙｓ−Ｐｒｏは他のペプチド配列と同様に許容可能であるが、これらの残基がＺ領域内にコードされないことが好ましい。可変領域間の分離を最小にするように、Ｚ領域はできるだけ短いことが好ましいが、一定（Ｚ）領域を切断することによりＲモジュールが分離されるとき、多様性を限定し、不完全な再結合をもたらすため、Ｚ領域は両端に位置する可変領域と区別されるべきであり、即ち可変領域まで伸ばすべきではない。
【００２８】
先に述べたように、Ｚ領域の制限部位が非パリンドローム突出末端を生ずることも好ましい。限定されるものではないが以下の酵素の認識配列を含め、この種の多くの好適な制限エンドヌクレアーゼ認識配列は公知である：ＡｃｃＩ（ＧＴＭＫＡＣ）、ＡｆｌＩＩＩ（ＡＣＲＹＧＴ）、ＡｌｗＮＩ（ＣＡＧＮＮＮＣＴＧ）、ＡｖａＩ（ＣＹＣＧＲＧ）、ＢａｎＩ（ＧＧＹＲＣＣ）、ＢａｎＩＩ（ＧＲＧＣＹＣ）、ＢｌｐＩ（ＧＣＴＮＡＧＣ）、ＢｓａＪＩ（ＣＣＮＮＧＧ）、ＢｓｉＥＩ（ＣＧＲＹＣＧ）、ＢｓｉＨＫＡＩ（ＧＷＧＣＷＣ）、Ｂｓｐ１２８６Ｉ（ＧＤＧＣＨＣ）、ＢｓｒＩ（ＡＣＴＧＧＮＮ）、ＢｓｒＩ（ＮＣＣＡＧＴ）、ＢｓｒＤＩ（ＧＣＡＡＴＧＮＮＮ）、ＢｓｒＤＩ（ＮＮＣＡＴＴＧＣ）、ＢｓｓＳＩ（ＣＴＣＧＴＧ）、ＢｓｓＳＩ（ＣＡＣＧＡＧ）、ＢｓｔＥＩＩ（ＧＧＴＮＡＣＣ）、Ｂｓｕ３６Ｉ（ＣＣＴＮＡＧＧ）、ＤｒａＩＩＩ（ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ）、ＤｓａＩ（ＣＣＲＹＧＧ）、ＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＲＧＧＮＣＣＹ）、ＥｓｐＩ（ＧＣＴＮＡＧＣ）、ＰｐｕＭＩ（ＲＧＧＷＣＣＹ）、ＲｓｒＩＩ（ＣＧＧＷＣＣＧ）、ＳｅｘＡＩ（ＡＣＣＷＧＧＴ）、ＳｆｃＩ（ＣＴＲＹＡＧ）、ＳｔｙＩ（ＣＣＷＷＧＧ）。前記リストにおいて、酵素の認識配列を括弧内に示す。突出末端は下線で示す。制限酵素の認識配列が対称配列中に不明瞭な塩基を容認する場合、実際のＤＮＡ配列の選択が突出末端を非パリンドロームにすることが好ましい。例えばＳｆｃＩはＣＴＲＹＡＣを認識する。そしてＣＴＡＣＡＣ又はＣＴＧＴＡＣを用いることが好ましく、ＣＴＡＴＡＣ又はＣＴＧＣＡＧは好ましくない。
【００２９】
ＥｓｐＩは２つの部位が存在する場合の操作に用いられる酵素である。好ましい態様はＺ領域内に配列５’−ＧＣＴＣＡＧＣｃｔ−３’を有し、その他の場所に５’−ＧＣＴＡＡＧＣ−３’を有することである。ＥｓｐＩは両部位を切断するが、その末端は唯一の所望の方法でいっしょになるであろう。
【００３０】
また、本発明のモジュラーライブラリーのコード配列に関し、可変（Ｒ）領域はサイズが等しいかほぼ等しいことが好ましく、一定（Ｚ）領域（ｓ）は２つ以上の可変領域間で、発現の際、相互作用又は協調を促進するように設計されることが好ましい。例えば、隣接する可変領域が同時に標的に結合する能力を高めるために柔軟性を有するように一定領域を設計することができる。あるいは、隣接する可変領域を所望の空間関係に置く特定の立体配置を有するように一定領域を設計することができる。例えば、本明細書に記載される特定のモジュラーライブラリーデザインは、発現するアミノ酸配列を曲げるか又は回転させることが予想されるトリペプチド一定領域、例えばＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ又はＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを採用する。
【００３１】
２つの可変領域を有するモジュラーライブラリーは、式Ｒ１−Ｚ−Ｒ２のテンプレートコード配列により表される。ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して少なくとも３塩基（１コドン）の可変領域であって少なくとも３塩基は可変であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である。したがって、可変Ｒ領域の長さは、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９塩基以上、即ち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３コドン以上、場合により１つ以上（好ましくは１つ）の不変コドンを有することが有益であり得る。１又は２又は３コドンの非常に短い可変領域は発現の際比較的小さいライブラリーを提供し、約８以上の可変コドンを有する長い可変領域は、多様な配列のほんのわずかな画分がいつも獲得され、サンプリングされるこのように非常に大きな多様性を提供することが理解されるであろう。したがって、好ましい態様において、Ｒ１及びＲ２は独立して少なくとも９塩基（３コドン）の可変領域であって少なくとも６塩基は可変であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である。より好ましくは、Ｒ１及びＲ２の長さは独立して９〜３６塩基、１２〜３６塩基、１５〜３６塩基、９〜２４塩基、１２〜２４塩基、１５〜２４塩基、９塩基、１２塩基、１５塩基、又は１８塩基である。最も好ましくは、可変（Ｒ）領域は同じ長さであろう。特定の態様において、可変領域Ｒ１及びＲ２における全ての塩基は可変である（例えば以下の実施例４を参照されたい）。そして、更なる態様において、Ｒ１及びＲ２のそれぞれはシステインをコードする３つの連続した不変塩基を含有する（例えば以下の実施例１及び２を参照されたい）。
【００３２】
特に好ましい態様において、２つの可変領域を有するモジュラーライブラリーは、テンプレートコード配列Ｒ１−Ｚ−Ｒ２からなる。ここで、Ｒ１及びＲ２は独立して少なくとも１５塩基（５コドン）の可変領域であって少なくとも１２塩基は可変であり、Ｚは制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む少なくとも６塩基の一定領域である。したがって、テンプレートは、少なくとも５アミノ酸及び少なくとも４つの可変アミノ酸位置の第１可変領域、少なくとも２アミノ酸の一定領域、並びに少なくとも５アミノ酸及び少なくとも４つの可変アミノ酸位置の第２可変領域を含むディスプレイポリペプチドをコードする。１つの好ましい態様において、各可変領域の１つのアミノ酸位置は不変のシステインであり、最も好ましくは、残りのアミノ酸位置の多様性はシステインを除外する。これは、両可変領域を含む環状構造を形成可能なディスプレイペプチドのライブラリーをもたらす。他の好ましい態様において、どの位置にもシステインは全く認められない。
【００３３】
本明細書に記載されるモジュラーライブラリーは、複製可能な遺伝子パッケージにおいて発現させるために構築することができるが、ファージ又は酵母のディスプレイライブラリーが特に好ましい。モジュラーライブラリーは、本明細書においてファージディスプレイを参照して記載されるが、本明細書に記載される原理は、ディスプレイライブラリー又は細胞内ライブラリーを含む他のタイプの組換えライブラリーへ容易に適用され得ることが当業者には容易に理解されるであろう。モジュラーライブラリー、特に線状モジュラーライブラリーは、好ましくは「酵母ツーハイブリッド法」選択に適用可能である。
【００３４】
結合ポリペプチドをスクリーニングするためのファージディスプレイポリペプチドのモジュラーライブラリーを準備するために、候補結合ドメインが選択され、ライブラリー中に提示されるペプチドの構造テンプレートとして役立つ。ファージライブラリーは、親ドメイン又はテンプレートの非常に多くの類似体を作り出す。結合ドメインテンプレートは、天然でも合成タンパク質でもよく、タンパク質の領域でもドメインでもよい。結合ドメインテンプレートは、結合ドメインテンプレートと結合する標的とのあいだの公知の相互作用に関する知識に基づいて選択することができるが、これは重要なことではない。実際、ライブラリーのテンプレートとして作用するために選択されるドメインが標的に対していかなる親和性を有するかは全く本質的ではない。その目的は、構造を提供することであり、その構造から同様の構造をしたポリペプチド（類似体）の集団（ライブラリー）を生じさせることができ、類似体の多様性は、所望の結合特性（及びスクリーニングされる他の特性）を発揮する１つ以上の類似体を含むことが望ましい。
【００３５】
ライブラリー多様なアミノ酸配列の基礎を形成する親結合ドメイン又はテンプレートを選択する上で最も重要な考慮すべき事項は、多様なペプチドドメインを標的に対してどのように提示するか、即ちどのような立体構造においてペプチド類似体が標的と接触するかということである。ファージディスプレイ法において、例えば、類似体をコードする合成ＤＮＡをファージへ挿入することにより類似体が産生され、ファージ表面上に類似体が提示される。例えば、本明細書に援用されるＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ペプチド及びタンパク質のファージディスプレイ：実験室マニュアル（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）及び米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されるような技術を用いて、多様な異なるポリペプチドを提示するＭ１３ファージのようなファージライブラリーを準備することができる。
【００３６】
式Ｒ１−Ｚ−Ｒ２のテンプレートコード配列を有するファージディスプレイライブラリーの構築は実施例２に記載され、図２に示される。ＭＴＮ−１３／Ｉライブラリーは、３アミノ酸（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の一定領域により分離された等しいサイズ（即ち、８アミノ酸）の２つの可変領域を特徴とする１９アミノ酸のテンプレートに含有される単一マイクロタンパク質結合ループを提示するように構築された。ＭＴＮ−１３／Ｉライブラリーは、テンプレート配列５’−ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＴＧＹ  ＮＮＫ  ＮＮＫ  ＮＮＫ−３’（配列番号１）を利用し、これは配列Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｃｙｓ−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９（配列番号３）を有するディスプレイポリペプチドをコードしていた。テンプレート中の１、２、３、５、６、７、８、１２、１３、１４、１５、１７、１８、及び１９位のアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）以外のいかなるアミノ酸も可能なように変更された。Ｍ１３ファージにおいてＭＴＮ−１３／Ｉライブラリーの発現後、ＫＤＲ標的に対する結合ペプチドを選択するためにライブラリーをスクリーニングし、選択物由来のＤＮＡは可変領域コード配列を分離するために切断された。これは次に同様に切断された選択されていないオリジナルライブラリー由来のＤＮＡと再結合され、ＭＴＮ−１３／Ｉライブラリー由来のＫＤＲ標的に対して単離された選択物に更なる多様性を付加する２次ライブラリーを作製した。２次ライブラリーの２ラウンドの選択により、いくつかのユニークな高親和性ＫＤＲ結合ポリペプチドを示した。
【００３７】
本発明のディスプレイライブラリーは、ポリペプチドテンプレートのコード配列内に意図的な一連の突然変異又は変異をつくることにより作製することができる。各突然変異配列は、テンプレート配列内に１つ以上のアミノ酸変化を有する以外は全体的な構造においてテンプレートに対応するペプチド類似体をコードする。新規な多様の（突然変異した）ＤＮＡは配列多様性を提供し、各形質転換体ファージはＤＮＡにコードされる初期テンプレートアミノ酸配列の１つの変異体を提示する。これは、非常に多くの異なるが構造的に関連のあるアミノ酸配列を提示するファージ集団（ライブラリー）をもたらす。アミノ酸変異は、少なくともほとんどの置換に関し、その構造を顕著に変化させることなく結合ペプチド又はドメインの結合特性を変化させると予想される。変異のために選択されるアミノ酸位置（可変アミノ酸位置）は、表面のアミノ酸位置であること、即ちドメインが最も安定な立体構造であるときドメインの外表面に現れるアミノ酸配列内の位置（即ち溶液に曝される表面）であることが好ましい。最も好ましくは、置換の効果が最大となるように、変更するアミノ酸位置は隣接するか接近しているであろう。
【００３８】
先に示すように、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ペプチド及びタンパク質のファージディスプレイ：実験室マニュアル（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）及び米国特許第５，２２３，４０９号で議論されるような技術は、選択され又は設計される親テンプレートに対応する潜在的結合体のライブラリーを準備する上で特に有用である。本明細書で議論されるＭＴＮ−１３／Ｉのオリジナル及び２次ライブラリーは、以下の実施例で説明するように、そのような技術にしたがい準備され、固定化標的に対するＫＤＲ結合ポリペプチドに関しスクリーニングされた。
【００３９】
典型的な選択において、ファージライブラリーは標的又はその特定のサブコンポーネントと接触し、これと結合することを可能にする。結合体と非結合体の分離を容易にするには、標的を固体支持体（例えば磁気ビーズ）に固定することが簡便である。標的結合部分を有するファージは、固体支持体上の標的と複合体を形成する。一方、非結合ファージは溶液中に残り、過剰バッファーのみにより洗浄除去することができる。次に、バッファーを極端なｐＨ（ｐＨ２又はｐＨ１０）に変えること、バッファーのイオン強度を変えること、変性剤を添加すること、又は他の公知の手段により、結合ファージを標的から遊離させる。あるいは、結合ファージは全く溶出する必要がないが、好結果の結合体を増殖するために宿主バクテリアに感染させるため標的との複合体において完全なまま用いることができる。ＭＴＮ−１３／ＩライブラリーからＫＤＲ結合ファージを単離するため、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の感染のために基質に依然として結合したファージを用いることにより、ＶＥＧＦと一晩インキュベートしても固定化標的が競合除去されない非常に高親和性の結合ファージが獲得された。
【００４０】
次に、バクテリア細胞の感染、及び非結合体は枯渇し結合体に富んだ新たなプールで繰り返されるスクリーニング工程により、回収されたファージを増幅することができる。工程を完結するにはほんの２、３の結合ファージの回収で十分である。２、３ラウンドの選択後、結合プール中の選択されたファージクローン由来の結合部分をコードする遺伝子配列は、以下に記載される従来の方法で決定され、ファージの結合親和性を標的に付与するペプチド配列を明らかにする。選択工程を行うとき、集団の配列多様性は所望の結合体が残るまで各選択ラウンドとともに減少する。配列は少数の関連する結合体、典型的には各ライブラリーの１億以上のオリジナル候補から１０〜５０に収束する。各選択ラウンドで回収されるファージ数が増加すること、そしてもちろん密接に関連する配列が回収されることは、スクリーニングでライブラリーが収束していることを示す良い指標である。一連の結合ポリペプチドが同定された後、配列情報を用いて、更なる所望の特性を有するメンバーに偏った他の２次ファージライブラリーを設計することができる。
【００４１】
１以上の選択ラウンド後、選択されたファージの集団は、（ａ）第１可変領域中の配列により標的に結合するファージ、（ｂ）第２可変領域中の配列により標的に結合するファージ、及び（ｃ）第１及び第２可変領域の配列により標的に結合するファージを含有する。選択物の配列解析及び分析を行うことなく、標的結合体に富んでいるように見える１つ以上の２次ライブラリーを容易に構築することができる。そのような２次ライブラリーの例には、限定されるものではないが、以下のようなライブラリーが含まれる。
【００４２】
１）  選択物の第１可変領域をコードするオリゴヌクレオチドが、オリジナル（親）ライブラリーの第１可変領域をコードするオリゴヌクレオチドで置換されている。これは、親ライブラリーの第１可変領域の完全なレパートリーを選択物の第２可変領域と対にする（ｂ）ファージを多様化するライブラリーを生ずる。
【００４３】
２）  選択物の第２可変領域をコードするオリゴヌクレオチドが、オリジナル（親）ライブラリーの第２可変領域をコードするオリゴヌクレオチドで置換されている。これは、親ライブラリーの第２可変領域の完全なレパートリーを選択物の第１可変領域と対にする（ａ）ファージを多様化するライブラリーを生ずる。
【００４４】
３）  第１及び第２可変領域をコードするオリゴヌクレオチドは切断され、選択されたプール内で再結合される。これは、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全カテゴリーにおいて好結果の結合体に由来する可変領域の新規な組み合わせを形成する。
【００４５】
４）  選択されたファージ由来の複製型ＤＮＡ（ＲＦ  ＤＮＡ）は、一定領域に包含される制限エンドヌクレアーゼ認識部位の制限エンドヌクレア−ゼ、及びＲＦ  ＤＮＡを異なるユニーク部位で切断する第２制限エンドヌクレアーゼで消化され；親ライブラリーは同じ２つの制限酵素で消化され；ＤＮＡはおよそ等モル量で混合され、再連結され、細胞を形質転換するのに用いられる。これは、以下を有するおよそ同数のメンバーを含むライブラリーを形成する。
【００４６】
ｉ）  選択される第１可変領域及びライブラリーの第２可変領域；
ｉｉ）  ライブラリーの第１可変領域及び選択される第２可変領域；
ｉｉｉ）  選択される第１可変領域及び選択される第２可変領域；
ｉｖ）    ライブラリーの第１可変領域及びライブラリーの第２可変領域。
このライブラリーの化合物（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は、それぞれ上記ライブラリー（１）、（２）及び（３）に対応する。
【００４７】
これらのライブラリーから結合のために選択することは、オリジナルライブラリーに存在しない配列の単離を可能にする。約８以上の可変位置を有するライブラリーに関し、全ての可能な配列をつくり、１つのライブラリーに存在させることは効率的ではない（例えば、あらゆる位置でシステインを除く全ての可能なアミノ酸を容認する多様な８量体に対する２．０×１０10の異なる形質転換体は許容された１．７×１０10の約６９％を与える）。さらに、高親和性結合は、８以上のアミノ酸の適切な位置決めを必要とすることが多い。本発明のモジュラーライブラリーを用いると、多様性が拡大した２次ライブラリーにおいて可変領域を再結合することにより、より小さなオリジナルライブラリーからより大きなライブラリーをスクリーニングする効果が得られる。具体例を通して、２つの可変領域を有するオリジナルモジュラーライブラリーが３×１０9配列を含有し、選択物の第１プールが例えば６×１０3の単離物を含有する場合、通常、単離物の中で、第１可変領域の配列が多くの場合唯一の第２可変領域配列と対になるのが観察されるであろう（即ち、他の単離物配列においても見られる第１又は第２可変領域を有するオリジナルライブラリーから、非常にわずかな初期ラウンド単離物が存在する）。上記工程（４）にしたがい２次ライブラリーを準備する場合、約１．２×１０9メンバーを有するライブラリーをつくることができ、選択される第１可変領域のそれぞれは、３×１０8の第２可変領域の変異体と対になるであろう。選択される第２可変領域のそれぞれは、３×１０8の第１可変領域の変異体と対になるであろう。選択される第１及び第２可変領域の全ての可能な組合せが見られるであろう。そして、３×１０8の新規の選択されていないライブラリー配列が見られるであろう。したがって、この２次ライブラリー由来の選択物が、オリジナルライブラリーよりも１０，０００倍も大きい本来の（選択されていないオリジナル）ライブラリーからのみ単離できると計算できる（例えば３．Ｅ９×（３．Ｅ８＋３．Ｅ８）÷（６．Ｅ３）＝３×１０14）。
【００４８】
いったん単離されて配列決定されると、本発明のモジュラーライブラリーをスクリーニングすることにより同定される結合ポリペプチドは、固相ペプチド合成、固相合成等を含む従来技術を用いて直接合成することができる。固相合成が好ましい。本明細書に援用される、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，固相ペプチド合成（１９８９），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，ペプチド合成の実践（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８４）を参照されたい。あるいは、サービスとしてペプチド合成を提供する会社（例えばＢＡＣＨＥＭ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ；Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）は、そのようなポリペプチドを商業的に調整できる。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のような自動ペプチド合成機も利用可能であり、そのような合成に用いることができる。
【００４９】
あるいは、本発明のライブラリーから単離される結合ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用いて、結合ポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を利用し、次にそれを組換え技術により発現させて製造することもできる。即ち公知の方法で外来核酸分子の導入によって宿主細胞を操作することにより、そのような宿主細胞に所望の結合ポリペプチドを産生させることができる。そのような手順は当業者の能力の範囲内である（本明細書に援用されるＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，分子生物学の基本法，（１９８６）を参照されたい）。本明細書に記載されるような短いペプチドの組換え体の産生は直接合成と比較して実践的ではないかもしれないが、組換え手段による製造は、結合部分をハイブリッドポリペプチド又は融合タンパク質に導入する場合に非常に有益であり得る。
【００５０】
本発明によるモジュラーディスプレイライブラリーの設計及び構築は、以下の実施例により更に具体的に説明される。以下の実施例に含まれる特定のパラメータは本発明の実施を具体的に示すことを意図しており、いかなる場合も本発明の範囲を限定するために提供されるものではない。
【００５１】
以下の非限定的な実施例により本発明を更に説明する。本明細書中に引用される全ての出版物の教示は本明細書中にその全体を援用する。
【実施例１】
【００５２】
領域中の１つのアミノ酸位置における不変システインをそれぞれ特徴とする２つの可変領域を有するようにモジュラーディスプレイライブラリーを設計した。ディスプレイライブラリーテンプレート中のシステインの位置は、一部は可変で一部は一定領域の９アミノ酸の範囲により分離されている。ファージ又は他の遺伝子パッケージ中で発現させる際、２つのシステインはジスルフィド結合を形成することができる。その結果、ディスプレイペプチドは１１量体の環又はループを形成する。このライブラリーのテンプレートは、アミノ酸構造：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７（配列番号４）を有する。このライブラリーをＭＴＮ−１１／Ｉと呼ぶ。
【００５３】
図１は、Ｍ１３ファージディスプレイベクターに挿入されたＭＴＮ−１１／Ｉの遺伝子デザインを示す。これによりタンパク質ＩＩＩのＮ端に提示される。シグナルペプチドは、ディスプレイペプチド（５〜２１番目のアミノ酸）のための４アミノ酸Ｎ端リンカーの最初のアラニン残基（１番目のアミノ酸）の前で切断され、Ｍ１３タンパク質ＩＩＩの残りに融合するＣ端リンカー（２２〜２７番目のアミノ酸）が続く。＜１＞群は、システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいコドンの混合物を意味する。２重下線セグメントは、ディスプレイテンプレートを含有する９０塩基合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅に用いることができる。このオリゴヌクレオチドのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片の好適なディスプレイベクターへの挿入は、２．２×１０15の可能な配列、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ一定領域の両側のそれぞれ７量体の可変領域に関し４．７×１０7のライブラリーを規定する。一定領域のコード配列は、ＲｓｒＩＩの認識配列、５’−ＣＧ∧Ｇ（Ａ又はＴ）ＣＣＧ−３’（この場合、ＣＧ∧ＧＴＣＣＧは配列番号１８のヌクレオチド４５−５１である）を含有する。これは「∧」シンボルで切断し、非パリンドローム性突出末端（下線）を生ずる。
【００５４】
１ラウンド以上の選択後、ライブラリーファージゲノムをＲｓｒＩＩ、及び好ましくはゲノム中にユニーク部位を有し、異なる突出末端（即ち本実施例においてＲｓｒＩＩとは異なる突出末端）を与える第２制限酵素で切断することができる。この切断は、テンプレートの可変領域をコードするセグメントの１つをそれぞれ含有する２つの断片を生じる。第２制限酵素も非パリンドローム認識配列を有し、突出末端を生ずることが好ましく、その結果、再連結の際、セグメントの正しい方向性が促進される。好適な第２制限部位には、ＢｓｒＧＩ、ＡｌｗＮＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｇｌＩの部位が含まれ、その使用は非パリンドローム突出末端を与えるため、ＡｌｗＮＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＢｓｓＳＩ、及びＢｇｌＩが好ましい。
【００５５】
断片を分離し、その断片を所望の比率で混合し、再連結し、細胞を形質転換することにより、オリジナルＭＴＮ−１１／Ｉライブラリーの多様性を拡大させた２次ライブラリーを形成することができる。あるいは、選択の初期ラウンドでプールされた選択物からのいずれかの断片を交差させて、即ち選択物からの１つの断片をオリジナルライブラリーの反対の断片と組み合わせることにより、オリジナルライブラリーへ戻すことができる。あるいは、選択物のゲノムを切断し、場合により分離して再混合し、そしてそれら自体を再交差させることができる。好ましい工程は、選択されるファージプールのＲＦ  ＤＮＡ及びオリジナル（選択されていない）ライブラリーのＲＦ  ＤＮＡ（即ち、一定（Ｚ）領域部位に対応するユニークな制限部位及びＲＦ  ＤＮＡのどこかの他のユニークな部位）を同じ制限酵素ペアで消化し、消化されたＤＮＡ断片をおよそ等モル量で混合し、再連結し、形質転換して、例えば〜１０9の形質転換体の新規ライブラリーを得ることである。後者の手順を次の実施例に示す。
【実施例２】
【００５６】
領域内の１つのアミノ酸位置における不変システインをそれぞれ特徴とする２つの８量体可変領域を有するモジュラーディスプレイライブラリーが構築された。ディスプレイライブラリーテンプレート中のシステインの位置は、一部が可変で一部は一定領域の１１アミノ酸の範囲により分離されている。その結果、ファージで発現させる際に、２つのシステインはジスルフィド結合を形成し、１３量体の環又はループを提示するであろう。このライブラリーのテンプレートは、アミノ酸構造：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｃｙｓ−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９（配列番号３）を有する。このライブラリーをＭＴＮ−１３／Ｉと呼ぶ。
【００５７】
図２は、Ｍ１３ファージディスプレイベクター（ＭＡＮＰ，Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，図４Ａ〜４Ｃを参照されたい）へ挿入するためのＭＴＮ−１３／Ｉの遺伝子デザインを示す。これによりタンパク質ＩＩＩのＮ端に提示される。シグナルペプチドは、ディスプレイペプチド（５〜２３番目のアミノ酸）のための４アミノ酸Ｎ端リンカーの最初のアラニン残基（１番目のアミノ酸）で切断され、Ｍ１３タンパク質ＩＩＩの残りに融合するＣ端リンカー（２４〜２９番目のアミノ酸）が続く。＜１＞群は、システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいコドンを意味する。図２の２重下線セグメントに基づくプライマーは、ディスプレイテンプレートを含有する９６塩基合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅に用いた。このオリゴヌクレオチドのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片を同様にＮｃｏＩ−ＰｓｔＩで切断したＭＡＮＰベクターへ挿入することで、８．０×１０17の可能な配列のライブラリーをコードするベクターを提供した。およそ４×１０9の形質転換体のファージディスプレイライブラリーを得た。
【００５８】
テンプレートの２つの８量体可変領域は、トリペプチドＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏで構成される一定領域と接続される。この一定領域のコード配列は、ＲｓｒＩＩの認識配列、５’−ＣＧＧＴＣＣＧ−３’（配列番号１７のヌクレオチド４８〜５４）を含有し、非パリンドローム突出末端を生ずる。
【００５９】
簡便な標的、この場合ＶＥＧＦ受容体−２としても公知のキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）に対するポリペプチド結合体を選択した。選択標的を準備するために、Ｉｇ  Ｆｃ領域とヒトＫＤＲ（＃３５７−ＫＤ−０５０）及びヒトＴｒａｉｌ  Ｒ４（＃６３３−ＴＲ−１００）とのキメラ融合物を無担体型（ＢＳＡなし）でＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より購入した。Ｔｒａｉｌ  Ｒ４  Ｆｃは、標的Ｆｃ融合物（ＫＤＲ  Ｆｃ）としての同一Ｆｃ融合領域を有する無関係なＦｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ結合体のライブラリーを枯渇させるために用いた。プロテインＡ磁気ビーズ（＃１００．０２）はＤｙｎａｌから購入した。ヘパリン（＃Ｈ−３３９３）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ａ２−成分テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）システムは、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入した。
【００６０】
選択手順において、マイクロタイタープレートをＢｉｏ−Ｔｅｋ  ４０４  ｐｌａｔｅ  ｗａｓｈｅｒ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で洗浄した。ＥＬＩＳＡシグナルは、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて読んだ。９６穴プレートの振とうはＬａｂＱｕａｋｅ  ｓｈａｋｅｒ（Ｌａｂｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）上で行った。
【００６１】
ヘパリン存在下におけるＫＤＲ選択プロトコール
プロテインＡ磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％  ＨＳＡ（ブロッキングバッファー）を用いて室温で３０分間、１回ブロックし、次に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５μｇ／ｍｌ  ヘパリン（ＰＢＳＴＨバッファー）で５回洗浄した。
【００６２】
ライブラリーをＴｒａｉｌ  Ｒ４  Ｆｃ融合物（無関係なＦｃ融合物）に対して枯渇させ、次にＫＤＲ  Ｆｃ融合物に対して選択した。１００μｌのＰＢＳＴＨあたり１０11プラーク形成単位（ｐｆｕ）をライブラリーからスクリーニングした。
【００６３】
ＫＤＲ標的ビーズを準備するため、５００μｌのＫＤＲ−Ｆｃ融合物（ＰＢＳＴ（ヘパリンなし）中の０．１μｇ／μｌストック）を、５００μｌの洗浄してブロックしたビーズへ添加した。ＫＤＲ−Ｆｃ融合物を振とうしながら４℃で一晩結合させた。翌日、ビーズをＰＢＳＴＨで５回洗浄した。
【００６４】
無関係なＦｃ融合ビーズを準備するため、５００μｌのＴｒａｉｌ  Ｒ４−Ｆｃ融合物（ＰＢＳＴ（ヘパリンなし）中の０．１μｇ／μｌストック）を、１０００μｌの洗浄してブロックしたプロテインＡ磁気ビーズへ添加した。この融合物を４℃で一晩、振とうしながらビーズと結合させた。翌日、磁気ビーズをＰＢＳＴＨで５回洗浄した。
【００６５】
ファージライブラリーを、５０μｌのＴｒａｉｌ  Ｒ４  Ｆｃ融合ビーズとともに、Ｌａｂｑｕａｋｅ  ｓｈａｋｅｒ上で１時間、室温（ＲＴ）でインキュベートした。インキュベーション後、ファージの上清を除去し、別の５０μｌのＴｒａｉｌ  Ｒ４ビーズとインキュベートした。合計５ラウンドの枯渇を繰り返し、非特異的Ｆｃ融合物及びビーズ結合ファージをライブラリーから除去した。枯渇したライブラリーを１００μｌのＫＤＲ−Ｆｃビーズへ添加し、ＬａｂＱｕａｋｅ  ｓｈａｋｅｒ上で１時間、室温でインキュベートした。次にビーズをできるだけ迅速に５×１ｍｌのＰＢＳＴＨで洗浄し、磁気スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてビーズを洗浄バッファーから分離した。洗浄後も依然としてビーズに結合したファージを、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）から無担体型で購入した可溶性ＶＥＧＦ165（＃１００−２０）を用いて以下のように競合溶出させた：ビーズを２５０μｌのＶＥＧＦ（５０μｇ／ｍｌ、〜１μＭ）とともに、ＬａｂＱｕａｋｅ  ｓｈａｋｅｒ上で一晩、室温（ＲＴ）でインキュベートした。ＶＥＧＦ溶出後のビーズを細胞と混合して、依然としてビーズに結合したファージ、即ちＶＥＧＦとのインキュベーションでは競合除去されなかったＫＤＲ結合ファージを増幅させた。室温でおよそ１５分後、ファージ／細胞混合物を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した２５０ｍｌのＮＺＣＹＭアガーを含有するバイオアッセイディッシュ（２４３×２４３×１８ｍｍ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）上に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、それぞれの増幅したファージ培養物をそれぞれのプレートから回収した。翌日以降、インプット、アウトプット、及び増幅ファージ培養物をＦＯＩ（即ち、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｐｕｔ＝ファージアウトプット／ファージインプット）に関して滴定した。
【００６６】
この選択手順を、全ての結合バッファーにおいてヘパリンの非存在下、即ち、全工程でＰＢＳＴ（ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）をＰＢＳＴＨに置き換えて繰り返した。
【００６７】
ＫＤＲスクリーニングアッセイ
１００μｌのＫＤＲ−Ｆｃ融合物又はＴｒａｉｌＲ４−Ｆｃ融合物（１μｇ／ｍｌ）を重複したＩｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ｐｌａｔｅの全てのウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。ウェルをトップまで１×ＰＢＳ、１％  ＢＳＡで満たし、室温で２時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。
【００６８】
いったんプレートを準備したら、それぞれのファージの一晩培養物をＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１％  ＢＳＡで１：１（又は精製ファージストックを用いる場合は１０10ｐｆｕ）に希釈した。１００μｌの各希釈培養物を添加し、室温で２〜３時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した。結合ファージを、ＰＢＳＴで１：１０，０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ−抗Ｍ１３抗体結合体（Ｐｈａｉｍａｃｉａ）希釈液を各ウェルに添加することにより可視化させ、次に室温で１時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で７回洗浄し、次にプレートをＨＲＰ基質で（〜１０分）現像し、吸収シグナル（６３０ｎｍ）をプレートリーダーで検出した。
【００６９】
４ラウンドのスクリーニングで得たＫＤＲ結合ファージを回収し、増幅し、そして標準ＤＮＡ配列決定法を用いて結合に関与するディスプレイペプチドの配列を決定した。回収されたファージ単離物の結合ペプチドを以下の表１に記載する。
【００７０】
【表１】
2005519595.tif 000002
【００７１】
ＫＤＲ標的に対し、最初の４ラウンドの選択で得たファージ単離物のＤＮＡ（表１）を単離し、ＲｓｒＩＩ及びＢｇｌＩ（５’−ＧＴＣ及びＴＴＣ−３’突出末端を生ずる）で切断した。両者はともにＭＡＮＰベクター中でユニークな制限部位である。この切断により、２．８ｋｂ及び５．３ｋｂの２つのＤＮＡセグメントを生じた。切断ＤＮＡを、およそ等モル量の、同様に切断したオリジナルＭＴＮ−１３／Ｉの選択していないライブラリーのファージベクターＤＮＡと混合した。これらのＤＮＡ分子を連結し、細胞を形質転換するのに用いた。４×１０9の形質転換体の２次ファージディスプレイライブラリーを得た。
【００７２】
２次ライブラリーを、前のようにＫＤＲ結合ポリペプチドに関してスクリーニングした。そして単離物を回収し、配列決定した。これらの単離物の結合ポリペプチドを以下の表２に示す。
【００７３】
【表２】
2005519595.tif 000003
【００７４】
ＫＤＲ標的に対し、２次ライブラリーで第２ラウンドの選択を行い、単離されたポリペプチドを以下の表３に記載する。
【００７５】
【表３】
2005519595.tif 000004
【００７６】
上記結果から、選択されていない再結合したライブラリーにおいて、配列番号５が過剰に現れていた。配列番号５の普及率はその後の選択ラウンドにおいて減少し、再結合された可変領域成分はよりよい結合特性を有することを示している。オリジナル及び２次ライブラリーにおける特定の右又は左の可変領域の再現（例えば、配列番号２３、５、２２及び５２〜５４における右可変領域を参照されたい；例えば、配列番号７、２３、４１〜４３及び４８における左可変領域を参照されたい）は、恵まれた結合部分を示す。
【００７７】
単離配列の解析は、表２の配列が、配列番号４１〜４３及び４６を除く表１に見られる第１可変領域（Ｎ端から一定領域まで）又は第２可変領域（Ｃ端から一定領域まで）のいずれかを有することを示している。表３の配列のうち、全ては少なくとも１つの、配列番号５６を除く表１の可変領域を有する。配列番号５、２２〜２４、４８及び５５は全て表１の２つの可変領域を示す；配列番号２６、４７及び４９〜５１は表１の第１可変領域を有する；そして配列番号５２〜５４は表１の配列番号５の第２可変領域を有する。
【００７８】
表１において最も頻繁に単離される配列である配列番号５の第１可変領域は、配列番号２５、２７、４２及び４９〜５１中に起こる；配列番号６の２番目の半分は配列番号１０、２２、２３、２９〜３３、３５〜４０及び５２〜５４に起こる。表１の他のポリペプチドの第１及び第２可変領域は、表２及び表３において追跡されることができる。
【実施例３】
【００７９】
様々な選択ラウンドから選択されたペプチドの結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ  表面プラズモン共鳴分光光度計を用いて試験した。表１、２及び３から選択されるポリペプチドは、上記表に示すような配列、Ｎ端フランキングペプチドであるアセチル−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、及びＣ端フランキングペプチドである−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを用いて固相合成により合成された。ＫＤＲ−Ｆｃ融合タンパク質の標的をＢＩＡｃｏｒｅチップ上に固定し、合成ポリペプチドをチップ上に流し、ＫＤＲ標的に関するポリペプチドのＫDを測定した。配列番号６、７、２３及び２４に対応するポリペプチドは全く結合を示さなかった；配列番号５及び１２に対応するポリペプチドはＫD＞２μＭの弱い結合を示した；配列番号４９に対応するポリペプチドはＫD＝１μＭを示した；配列番号２２に対応するポリペプチドはＫD＝０．６５μＭを示した。
【００８０】
遊離ポリペプチドとしてのＫＤＲ標的に対し１μＭの結合を示す配列番号４９は、配列番号５の第１可変領域（表１）及び表１に見られない第２可変領域を含有する。おそらく、配列番号４９における可変領域の組合せは、選択された第１変領域とオリジナルライブラリーからの第２可変領域との再結合から生ずる。最も親和性の高い結合体であり、ＫＤＲ標的に関し６５０ｎＭのＫDを示す配列番号２２は、配列番号１５の第１可変領域（表１）及び配列番号５及び配列番号１０に見られる第２可変領域（表１）を含む。したがって、第１及び第２可変領域配列の再結合は、再結合していないライブラリーから単離されたものよりも高親和性の結合体を生ずる。
【実施例４】
【００８１】
一定領域トリペプチドにより結合された８アミノ酸の２つの可変領域を有するモジュラー線状ディスプレイライブラリーを設計した。このライブラリーのテンプレートはアミノ酸構造：Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｘａａ１４−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９を有する。
【００８２】
図３は、Ｍ１３ファージディスプレイベクターへ挿入するためのモジュラー線状ディスプレイライブラリーに関する遺伝子デザインを示す。これによりタンパク質ＩＩＩのＮ端に提示される。シグナルペプチドは、ディスプレイペプチド（６〜２４番目のアミノ酸）のためのＮ端リンカー中のアラニン残基（４番目のアミノ酸）の前で切断されると予想され、Ｍ１３タンパク質ＩＩＩの残りに融合するＣ端リンカー（２５〜２９番目のアミノ酸）が続く。＜１＞群は、システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいコドンを意味する。２重下線セグメントは、ディスプレイテンプレートを含有する９０塩基合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅に用いることができる。このオリゴヌクレオチドのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ断片を好適なディスプレイベクターへ挿入することは、２．９×１０20の可能な配列、両側のＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ一定領域のそれぞれの８量体可変領域に関し１．７×１０10のライブラリーを規定する。図３に示すように、一定領域のコード配列は、Ｂｓｕ３６Ｉの認識配列５’−ＣＣＴＣＡＧＧ−３’を含有し、これを切断すると突出末端を生ずる。
【００８３】
１ラウンド以上の選択後、ライブラリーファージゲノムをＢｓｕ３６Ｉ及び好ましくはゲノム内にユニーク部位を有する第２制限酵素で切断することができ、テンプレートの可変領域をコードするセグメントの１つをそれぞれ含有する２つの断片を生ずる。好ましい第２制限酵素も非パリンドローム認識配列を有し、突出末端を生ずる。その結果、再連結の際、セグメントの正しい方向性が促進される。
【００８４】
断片を分離し、所望の比率でその断片を混合し、再連結し、そして細胞を形質転換することにより、オリジナルモジュラー線状ライブラリーの多様性を拡大した２次ライブラリーを形成することができる。あるいは、初期選択ラウンドのプールされた選択物から得たいずれかの断片を交差させて、即ち選択物からの１つの断片をオリジナルライブラリーの反対の断片と組み合わせることにより、オリジナルライブラリーへ戻すこともできる。あるいは、選択物のゲノムを切断し、場合により分離して再混合し、そしてそれ自体と再交差させることができる。
【００８５】
本発明を特に好ましい態様を参照して示し、記載するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び詳細における種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明の設計されたモジュラーディスプレイライブラリーに関するＤＮＡ配列及び対応のアミノ酸配列を示す。切断しＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ−開裂ベクターに挿入するための５’ＮｃｏＩ制限部位及び３’ＰｓｔＩ制限部位を有する合成９０塩基オリゴヌクレオチドが提供される。合成遺伝子は、３アミノ酸一定領域を介して接続された２つの７量体可変領域の構造を有するディスプレイテンプレートを表示する。一定領域のコード配列は、ＲｓｒＩＩの制限部位を包含する。ディスプレイテンプレートの両端に位置する２重下線を引いたセグメントを用いて、合成遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができる。図示するように、合成遺伝子はＭ１３ファージディスプレイベクターに挿入するために設計され、その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ内でのファージ増殖中にＭ１３タンパク質ＩＩＩのＮ端に提示が現れるであろう。それぞれの可変領域内に１つの不変システイン残基を有するディスプレイテンプレートが設計され、発現に際し、環状マイクロタンパク質が形成されライブラリー中のファージ上に提示されるであろう。システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいＸとして示すアミノ酸位置の多様性は２．２×１０15の可能な配列のライブラリーを規定する。
【図２】図２は、本発明にしたがいＭ１３ファージに構築されるモジュラーディスプレイライブラリーに関するＤＮＡ配列及び対応のアミノ酸配列を示す（実施例２を参照されたい）。切断しＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ−開裂ファージディスプレイベクターに挿入するための５’ＮｃｏＩ制限部位及び３’ＰｓｔＩ制限部位を有する合成９６塩基オリゴヌクレオチドが提供される。合成遺伝子は、３アミノ酸一定領域（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を介して接続された２つの８量体可変領域の構造を有するディスプレイテンプレートを表示する。一定領域のコード配列はＲｓｒＩＩの制限部位を包含する。ディスプレイテンプレートの両端に位置する２重下線を引いたセグメントを用いて、合成遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計した。Ｍ１３ファージディスプレイベクターに挿入するために合成遺伝子を設計した。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ内でファージ増殖中にＭ１３タンパク質ＩＩＩのＮ端に提示が現れるであろう。それぞれの可変領域内に１つの不変システイン残基を有するディスプレイテンプレートが設計され、発現に際し、環状マイクロタンパク質が形成され、ライブラリー中のファージ上に提示されるであろう。システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいＸとして示されるアミノ酸位置の多様性は、８．０×１０17の可能な配列のライブラリーを規定する。単離ＤＮＡをＲｓｒＩＩ及びベクター内にユニーク部位を有する他の制限酵素で切断することにより、可変領域の２つのコードセグメントを分離し、オリジナルライブラリーでは獲得されない新たな多様性を形成するための組換えを可能にする。スクリーニングの初期ラウンドで単離されたファージ由来のＤＮＡを切断し、お互いを又は非選択ライブラリーの増幅ＤＮＡのような同様に切断されたＤＮＡの他のコレクションと再結合することができる。これにより、オリジナルライブラリーと比較して多様性が拡大した２次ライブラリーを作製する。このような多様性の拡大を実施例２に具体的に示す。図示したセグメントをＭ１３の遺伝子ＩＩＩに挿入する場合、アミノ酸Ｓ、Ｍ、Ａはタンパク質ＩＩＩシグナル配列の最後の３残基であり、シグナルペプチダーゼＩは１位のＡの直前で切断する。
【図３】図３は、本発明の設計されたモジュラー線状ディスプレイライブラリーに関するＤＮＡ配列及び対応のアミノ酸配列を示す。切断及びＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ−開裂ベクターへの挿入のための５’ＮｃｏＩ制限部位及び３’ＰｓｔＩ制限部位を有する合成９０塩基オリゴヌクレオチドが提供される。合成遺伝子は、３アミノ酸一定領域を介して接続された２つの８量体可変領域の構造を有するディスプレイテンプレートを表示する。一定領域のコード配列はＢｓｕ３６Ｉの制限部位を包含する。ディスプレイテンプレートの両端に位置する２重下線を引いたセグメントを用いて、合成遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計することができる。図示するように、合成遺伝子はM13ファージディスプレイベクターへ挿入するために設計される。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ内でファージ増殖中にＭ１３タンパク質ＩＩＩのＮ端に提示が現れるであろう。発現に際し、線状ポリペプチドが形成され、ライブラリー中のファージ上に提示されるようにディスプレイテンプレートは設計される。システイン以外のいかなるアミノ酸でもよいＸとして示されるアミノ酸位置の多様性は、２．９×ｌ０20可能な配列のライブラリーを規定する。
【図４−Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、ＭＡＮＰベクター（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のヌクレオチド配列を記載する。これは、本明細書の開示にしたがいＭ１３ファージディスプレイライブラリーを作製するのに好適なベクターである。
【図４−Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、ＭＡＮＰベクター（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のヌクレオチド配列を記載する。これは、本明細書の開示にしたがいＭ１３ファージディスプレイライブラリーを作製するのに好適なベクターである。
【図４−Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＭＡＮＰベクター（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のヌクレオチド配列を記載する。これは、本明細書の開示にしたがいＭ１３ファージディスプレイライブラリーを作製するのに好適なベクターである。
【図５−Ａ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図５−Ｂ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図５−Ｃ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図５−Ｄ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図５−Ｅ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図５−Ｆ】図５Ａ〜５ＦはＭＡＮＰの注釈付きＤＮＡ配列を記載する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
2005519595.tif 000009
【図４−Ｃ】
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【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図５−Ｃ】
2005519595.tif 000013
【図５−Ｄ】
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【図５−Ｅ】
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【図５−Ｆ】
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【国際調査報告】
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