(57)【要約】サイトカインと腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ）との複合体及び製薬上許容できる賦形剤を含み、サイトカインが負のフィードバック機構を誘発しない量で存在している製薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインと腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ）との複合体、及び製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含み、サイトカインが負のフィードバック機構を誘導しない量で存在する、製薬組成物。
【請求項２】
前記サイトカインが、可溶性サイトカイン受容体の流出を誘導しない量で存在する請求項１に記載の製薬組成物。
【請求項３】
前記複合体が、０．５〜５００ｎｇ／ｋｇの範囲の投与量を提供する量で存在する請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項４】
前記複合体が、１〜５０ｎｇ／ｋｇの範囲の投与量を提供する量で存在する請求項３に記載の製薬組成物。
【請求項５】
前記複合体が、５〜１５ｎｇ／ｋｇの範囲の投与量を提供する量で存在する請求項４に記載の製薬組成物。
【請求項６】
前記複合体又はその代謝物が、７０ｋｇの患者に約３５，０００ｎｇ／日以下の量で治療を受ける患者の血漿に提供されるような量で、前記複合体が存在する請求項１又は２に記載の製薬組成物。
【請求項７】
前記サイトカインが、炎症性サイトカインである請求項１〜６のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項８】
前記サイトカインが、化学療法用サイトカインである請求項１〜７のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項９】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインである請求項１〜８のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項１０】
前記サイトカインが、ＴＮＦα、ＴＮＦβ又はＩＦＮγである請求項９に記載の製薬組成物。
【請求項１１】
前記ＴＴＭが、腫瘍血管系標的指向部分（ＴＶＴＭ）である請求項１〜１０のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項１２】
前記ＴＶＴＭが、腫瘍血管系の受容体、マーカー又は他の細胞外成分に対する結合相手である請求項１１に記載の製薬組成物。
【請求項１３】
前記ＴＴＭが、腫瘍の受容体、マーカー又は他の細胞外成分に対する結合相手である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製薬組成物。
【請求項１４】
前記ＴＴＭが、抗体若しくはリガンド、又はその断片である請求項１〜１３のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項１５】
前記ＴＴＭが、ＮＧＲ又はＲＧＤモチーフを含有するか、又はＨＩＶ−ｔａｔ、アネキシンＶ、オステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型若しくはＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸塩、エフリンであるか、又は癌胎児性フィブロネクチンに対する結合相手であるか；或いはその断片である請求項１〜１４のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項１６】
前記ＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項１５に記載の製薬組成物。
【請求項１７】
前記ＴＴＭが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣである請求項１６に記載の製薬組成物。
【請求項１８】
前記ＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項１５に記載の製薬組成物。
【請求項１９】
前記ＴＴＭが、ＶＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ１、２又は３、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１，ＣＤ１３、ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩ、ＡｃｔＲＩＢ、ＣＤ４４、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、ＦＧＦ−１、２、３又は４、ＩＬ１Ｒ、ＥＰＨＲ、ＭＭＰ、ＮＧ２、テナシン、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤ−ＥＣＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ又はＰＳＭＡを標的とする請求項１４に記載の製薬組成物。
【請求項２０】
前記複合体が、融合蛋白質の形態をとる請求項１〜１９のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項２１】
前記複合体が、核酸の形態をとる請求項１〜１９のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、他の抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物をさらに含む請求項１〜２１のいずれかに記載の製薬組成物。
【請求項２３】
抗腫瘍剤が、さらにドキソルビシン、メルファラン又はシスプラチンである請求項２２に記載の製薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに規定した複合体、又は請求項１〜２３のいずれかに記載の製薬組成物の癌の治療又は診断用薬剤調製のための使用。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれかに規定した複合体、又は請求項１〜２３のいずれかに記載の製薬組成物を、負のフィードバック機構を誘導しない有効量で、癌の治療又は診断を必要とする患者に投与することを含む癌を治療又は診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物及びその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いくつかのサイトカイン類の抗腫瘍活性はよく知られ、かつ記載されている。既にヒトの治療に用いられているサイトカイン類もある。例えば、ＩＬ２及びＩＦＮγなどのサイトカイン類は、腎臓転移癌、毛様細胞白血病、カポジ肉腫、黒色腫、骨髄腫などの種々のタイプの腫瘍を有する患者において陽性の抗腫瘍活性を示している。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＩＬ１、４、６、１２、１５及びコロニー刺激因子（ＣＦＳ）類は、いくつかのタイプの腫瘍にある一定の抗腫瘍活性を示している。
【０００３】
一般に、サイトカイン類の治療上の利用は、それらの全身毒性によって強く制限されている。例えば、ＴＮＦは、最初いくつかの腫瘍の出血性壊死を誘導する能力、及び種々の腫瘍系に及ぼすインビトロ細胞毒作用に関して発見されたが、その後、過剰産生条件の場合は、ヒトの身体に危険な影響を与え得る強い前炎症性活性を有することが判った。
【０００４】
全身毒性は、ヒトに対してサイトカイン類の薬理学上有効量を用いる場合の基本的な問題であるので、それらの治療有効性を維持しつつ、このクラスの生物学的エフェクターの毒性作用を減少させることを目指した新規誘導体並びに治療法が現在評価中である。
【０００５】
いくつかの新規手法は以下のことに関する：
ａ）ＴＮＦを腫瘍内に送達し局在濃度を高めることのできる融合蛋白質の開発。例えば、ＴＮＦ及び腫瘍特異性抗体からなる融合蛋白質が産生されている；
ｂ）抗腫瘍活性を維持しつつ全身毒性の低下したＴＮＦ変異体の開発。このように１つの受容体だけを選択的に認識できる変異体が既に調製されている；
ｃ）ＴＮＦの抗腫瘍活性を損なうことなくその毒性作用をいくらか低下させることのできる抗ＴＮＦ抗体の利用。そのような抗体は文献にすでに記載されている；
ｄ）半減期のより長いＴＮＦ誘導体（例えば、ポリエチレングリコールと複合したＴＮＦ）の利用。
【０００６】
腫瘍部位を選択的に標的にできるＴＮＦ誘導体の調製が最近報告された。例えば、抗トランスフェリン受容体ｍＡｂ重鎖の遺伝子とＴＮＦ遺伝子との融合によって得られる融合蛋白質、又はＴＮＦと腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対する単クローン抗体の「ヒンジ」部位との融合蛋白質、又はＦｖ−ＴＮＦ融合蛋白質が記載されている。
【０００７】
ＥＰ２５１４９４は、アビジン又はストレプトアビジンと複合した抗体並びに複合抗体と、ビオチンと複合した診断薬又は治療薬からなる化合物とを複合化できる試剤を含み、抗体によって認識された標的細胞上のビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して診断薬又は治療薬の局在化が可能になるように、連続的に又は適切に遅らせて投与される、診断薬又は治療薬投与のシステムを開示している。前記の診断薬又は治療薬は、金属キレート類、特に放射性核種のキレート類並びにシスプラチン、ドキソルビシンなどの低分子量の抗腫瘍剤を含む。
【０００８】
ＥＰ４９６０７４は、ビオチン化抗体、アビジン又はストレプトアビジン及びビオチン化診断薬又は治療薬の連続的投与を提供する方法を開示している。リシンのような細胞毒性試剤が一般的に挙げられるが、多くは放射標識化合物に関する適用が開示されている。
【０００９】
ＷＯ９５／１５９７９は、リガンド又は抗リガンドと複合した特定の標的分子を含む第１の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の投与に続いて抗リガンド又はリガンドに結合した毒性試剤からなる第２の複合体の投与に基づく、細胞標的上に毒性の高い試剤を局在化する方法を開示している。
【００１０】
ＷＯ９９／１３３２９は、ある分子とＮＧＲ受容体のリガンドとの複合体に基づき、前記分子に腫瘍新生血管を標的とさせる方法を開示している。可能な候補として多数の分子が示唆されているが、具体的に記載されているのはドキソルビシンだけである。免疫応答を誘導するサイトカイン媒介物としてのＮＧＲ受容体リガンドの利用は開示されていない。
【００１１】
ＷＯ０１／６１０１７で、当発明者は、驚くべきことに、ある一定のサイトカイン類の治療指数が著しく改善でき、アミノペプチダーゼ−Ｎ受容体（ＣＤ１３）のリガンドとのカップリングによりそれらの免疫療法特性を増強できることが判明したと記載している。ＣＤ１３は、１５０ｋＤａの膜貫通糖蛋白であり、様々な種における保存性が高い。これは正常細胞並びに骨髄腫瘍系、脈管形成内皮及びいくつかの表皮において発現する。ＣＤ１３受容体は、通常、「ＮＧＲ」受容体として同定され、そのペプチドリガンド類は、アミノ酸「ＮＧＲ」モチーフを共有している。
【特許文献１】ＥＰ２５１４９４
【特許文献２】ＥＰ４９６０７４
【特許文献３】ＷＯ９５／１５９７９
【特許文献４】ＷＯ９９／１３３２９
【特許文献５】ＷＯ０１／６１０１７
【特許文献６】米国特許第５，５３６，８１４号
【特許文献７】米国特許第４，５７８，０７９号
【特許文献８】米国特許第５，５４７，９３６号
【特許文献９】米国特許第４，９８８，６２１号
【特許文献１０】米国特許第４，８７９，２３７号
【特許文献１１】米国特許第５，１６９，９３０号
【特許文献１２】米国特許第５，４９８，６９４号
【特許文献１３】米国特許第５，７００，９０８号
【特許文献１４】ＷＯ９７／０８２０３
【特許文献１５】米国特許第５，６１２，３１１号
【特許文献１６】米国特許第５，６７２，５８５号
【特許文献１７】米国特許第５，１２０，８２９号
【特許文献１８】米国特許第５，５８７，４５６号
【特許文献１９】米国特許第５，６４８，３３０号
【特許文献２０】ＥＰ−Ａ−２３９４００
【特許文献２１】ＷＰＩ−９９−２１５１５８／１９９９１８
【特許文献２２】米国特許第５，０９１，１７６号
【特許文献２３】米国特許第５，２１４，１３１号
【特許文献２４】米国特許第５，２６４，２０９号
【特許文献２５】米国特許第５，５８０，８５３号
【特許文献２６】米国特許第５，８９１，４１８号
【特許文献２７】米国特許第５，８１１，５１２号
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）
【非特許文献２】Ａｕｓｕｂｅｌら著、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社
【非特許文献３】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｈら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０〜７頁
【非特許文献４】Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  Ｘら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜９頁
【非特許文献５】Ｈａｌｉｎら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁
【非特許文献６】Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ  １８：２４３〜２５１頁
【非特許文献７】Ｈｒｕｂｙら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：２５９〜３４５頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．１９９２年）
【非特許文献８】Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ、１９９２年、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５３３〜３９頁
【非特許文献９】Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、編集者Ｗａｄｅ  ＆  Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
【非特許文献１０】Ｃｏｆｆｉｎら、１９９７年、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、編集者
【非特許文献１１】ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁
【非特許文献１２】Ｃａｓｓｅｌら１９９３年Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２１：５８５〜５９１頁
【非特許文献１３】Ｂｒｅｇｎｉら１９９２年Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８〜１４２２頁
【非特許文献１４】Ｌｕら１９９３年Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７８：２０８９〜２０９６頁
【非特許文献１５】Ｍｏｒｏ、１９９７年＃２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、癌の治療及び診断のためのさらなる、そして改善された製薬組成物及び方法の必要性は依然として存在している。
【００１３】
薬剤送達と新生物細胞内への浸透は、腫瘍化学療法の有効性にとって肝要である。驚くべきことに、本発明者らは、サイトカインのピコグラム用量の標的送達が、化学療法剤の浸透性を増大させることを見出した。より詳しく言うと、腫瘍及び腫瘍血管系などの腫瘍関連環境に対する極低用量のサイトカイン類の送達が、負のフィードバック機構を避け、薬剤浸透バリアを変化させる能力を保持する新たな手法であることを本発明者らは見出した。したがって、本発明は、化学療法剤の治療指数を向上させるための、新規な驚くべき方法である。好ましい実施形態において、ＴＮＦと腫瘍血管系を標的にするペプチドであるＣＮＧＲＣとのカップリングによって達成された血管標的化を用いて、この治療が、毒性を高める証拠なしで、ドキソルビシンの治療有効性を８〜１０倍高めることを本発明者らは見出した。同様に、血管標的化は、異なった化学療法剤であるメルファランの有効性を高めた。ＬＤ５０の１０６倍低く、非標的化ＴＮＦに要される用量（腹腔内注射）の１０５倍低い３〜５ｎｇ／ｋｇの標的化ＴＮＦ（腹腔内注射）によって、化学療法剤との相乗作用が認められた。さらに、腫瘍血管に対する低用量ＴＮＦの標的誘導送達は、循環している可溶性ＴＮＦ受容体の遊離を誘発しないことも本発明者らは見出した。又、ＲＧＤ−ＴＮＦ及びＩＦＮγ−ＮＧＲは、ピコグラム範囲で有効であることも見出した。本発明者らは又、ＮＧＲ−ＴＮＦがシスプラチンの効果を高めることも示した。これらの結果は、腫瘍血管への微量のサイトカイン類の送達が、負のフィードバック機構を避け、薬剤浸透バリアを変化させる能力を保持する新たな手法を提供することを示している。この方法における血管標的化は、化学療法剤の治療指数を向上させるための、新規の方法を示している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様により、サイトカインと腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ；tumor targetingmoiety）との複合体及び製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含み、サイトカインが負のフィードバック機構を誘発しない量で存在している製薬組成物が提供される。したがって、サイトカインは、可溶性サイトカイン受容体の流出を誘発しない量で存在する。
【００１５】
前記複合体は、好ましくは０．５ｎｇ／ｋｇから５００ｎｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｎｇ／ｋｇから５０ｎｇ／ｋｇ、最も好ましくは、５ｎｇ／ｋｇから１５ｎｇ／ｋｇの範囲の投与量を提供する量で存在する。
【００１６】
一実施形態において、サイトカインは炎症性サイトカインである。
【００１７】
他の実施形態において、サイトカインは化学療法用サイトカインである。
【００１８】
サイトカインは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインから選択されることが好ましい。
【００１９】
より好ましい実施形態において、サイトカインは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ又はＩＦＮγであり、最も好ましくはＴＮＦα又はＴＮＦβである。
【００２０】
一実施形態において、ＴＴＭは、受容体、マーカーなどの腫瘍細胞表面分子、又は他の細胞外成分のリガンド、又はそれらに対する抗体などの結合相手である。
【００２１】
他の実施形態において、ＴＴＭは腫瘍血管系標的指向部分（ＴＶＴＭ；tumor vasculature targeting moiety）であって、受容体、マーカーなどの腫瘍細胞表面分子、又は他の細胞外成分のリガンド、又はそれらに対する抗体などの結合相手となり得る。
【００２２】
一実施形態において、ＴＴＭは抗体又はその断片である。
【００２３】
他の実施形態において、ＴＴＭはリガンド又はその断片である。
【００２４】
好ましい一実施形態において、ＴＴＭはＮＧＲ又はＲＧＤモチーフを含有するペプチド、又はＨＩＶ−ｔａｔ、アネキシンＶ、オステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型又はＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸塩又はエフリン、若しくは癌退治性フィブロネクチンに対する抗体などの結合相手；又は前記いずれかの断片である。より好ましい一実施形態において、ＴＴＭはＮＧＲモチーフを含有する。最も好ましい一実施形態において、ＴＴＭは、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣであることが好ましい。
【００２５】
他の好ましい実施形態において、ＴＴＭは、ＲＧＤモチーフを含有する。
【００２６】
一実施形態において、ＴＴＭは、ＶＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ１、２又は３、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ１３、ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩ、ＡｃｔＲＩＢ、ＣＤ４４、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、ＦＧＦ−１、２、３又は４、ＩＬ１Ｒ、ＥＰＨＲ、ＭＭＰ、ＮＧ２、テナシン、癌退治性フィブロネクチン、ＰＤ−ＥＣＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ又はＰＳＭＡを標的とする。
【００２７】
本発明で使用し得る好ましい標的指向部分及びサイトカイン類の組合せは下記の表に示してある。
【００２８】
【表１】
2005526117.tif 000002
2005526117.tif 000003
2005526117.tif 000004
2005526117.tif 000005
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2005526117.tif 000012
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2005526117.tif 000019
2005526117.tif 000020
2005526117.tif 000021
【００２９】
上記の表において、用語「Ａｂ」は抗体を表わし、抗体及びリガンドはそれらの断片を含むことが理解されよう。
【００３０】
特に好ましい実施形態において、前記複合体は、ＴＮＦα又はＴＮＦβ及びＮＧＲ含有ペプチド又はＴＮＦα又はＴＮＦβ及びＲＧＤ含有ペプチドを含む。好ましい実施形態において、前記複合体は、融合蛋白質の形態をとる。
【００３１】
他の実施形態において、前記複合体は、核酸の形態をとることが好ましい。
【００３２】
他の実施形態において、前記組成物はさらに他の抗腫瘍剤または診断用腫瘍画像形成化合物を含む。さらなる抗腫瘍剤はドキソルビシン、メルファラン又はシスプラチンであることが好ましい。
【００３３】
本発明の他の態様により、癌の治療又は診断用の薬剤を調製するために、本発明による複合体又は製薬組成物の使用が提供される。
【００３４】
言い換えれば、本発明は、癌の治療又は診断を必要とする患者に、本発明による複合体又は製薬組成物の有効量であって、負のフィードバックを誘発しない量を投与することを含む癌の治療又は診断の方法を提供する。
【００３５】
本発明のいくつかの主要な利点
化学療法剤は、固形腫瘍に到達するためには、腫瘍血管に入り、血管壁を通過し、最終的に間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、腫瘍血管から離れた新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る（１）。したがって、腫瘍内への薬剤浸透の改善を目指す方法には実験的及び臨床的に大きな関心が向けられている。
【００３６】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）及び強力な抗腫瘍活性を有する炎症性サイトカインがこの目的に開発し得ることを示唆する証拠は増大している。例えば、孤立させた一肢の部位潅流にメルファラン又はドキソルビシンと共にＴＮＦを加えることにより、末端軟組織肉腫又は黒色腫を有する患者において、化学療法剤単独で得られる応答率よりも高い応答率が得られている（２〜６）。ＴＮＦに誘導された内皮バリア機能の変化、腫瘍間質圧の低下、化学療法剤の浸透増大及び腫瘍血管の損傷が、ＴＮＦと化学療法との共同作用の重要な機構であると考えられている（３、４、７〜１０）。遺憾ながら、ＴＮＦの全身投与は、毒性が高すぎて適用できず、その忍容最高用量（８〜１０μｇ／ｋｇ）は予想される有効用量より１０〜５０倍低い（１１、１２）。このため、ＴＮＦの全身投与は放棄され、このサイトカインの臨床利用は、局所部位治療に限定されている。それにもかかわらず、ＴＮＦ活性のいくつかの特徴、特に腫瘍関連血管に関する選択性及び化学療法剤との共同作用により、より広汎な療法適用への可能性に関する希望は続いて育まれてきた（１３）。
【００３７】
ＴＮＦの血管作用は、局所有効性の増大及び療法用量の全身投与を可能にする方法を目指す「血管標的」法の開発に根拠を与えている。本発明者らは最近、腫瘍血管に対するＴＮＦの標的送達が、この蛋白質とＣＮＧＲＣペプチドとのカップリング、腫瘍新生血管系を標的とするアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）リガンドによって達成できることを示した（１４）。本研究において本発明者らは、ＮＧＲ−ＴＮＦと呼ばれるこの複合体の低用量による血管標的化が化学療法剤の腫瘍内への浸透を増大し、それらの有効性を改善し得るかどうかを調べた。ＬＤ５０より６桁低い、ＮＧＲ−ＴＮＦ（３〜５ｍｇ／ｋｇ）のピコグラム用量のマウスに対する全身投与が、毒性増加の徴候なしに、メルファランとドキソルビシンの抗腫瘍性活性を高めるのに十分であることを示す。さらに本発明者らは、ＮＧＲ−ＴＮＦによる血管標的化が、薬剤浸透バリアを低下させ癌細胞に到達するドキソルビシン量を増加させ得る証拠を提供する。最後に本発明者らは、腫瘍血管に対する微量ＮＧＲ−ＴＮＦの送達が、比較的高用量のＴＮＦの全身投与に関連したもう１つの大きな問題、すなわち、可溶性ＴＮＦ阻害剤の誘発を克服することを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
次に、本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を非限定例により説明する。
【００３９】
一般に本明細書に挙げられた技術は当業界でよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら著、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（並びに分子生物学における現プロトコルの完全版）を参照とした。
【００４０】
負のフィードバック機構
負のフィードバック機構が当業界に知られており、それには、可溶性受容体の流出並びに、本発明の標的誘導サイトカインの活性を直接的又は間接的に損なうような全身的又は局所濃度での他のサイトカイン類、ホルモン類又は生物学的作用物質の誘導を挙げることができる。可溶性阻害剤又はデコイ（ｄｅｃｏｙ）受容体は直接的阻害剤の例である、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、又は他の抗炎症性サイトカイン類は、炎症性サイトカイン類によって引き起こされた事象のカスケードを間接的に防止し得る。
【００４１】
受容体流出
この用語は、サイトカイン受容体の細胞外ドメインを分離し、それを可溶性産物として循環内放出する細胞の能力に関する。多くの場合、これらの分離産物は、依然としてそれらのリガンドと結合する能力がある。しかし、これと対照的に、膜結合受容体の残りの部分は、もはやリガンドと結合せず、したがって、これらの細胞は、一定のサイトカインの作用に対して、脱感受性となる。このような可溶性受容体は、ＩＬ−４、６、６、ＩＧＦ、ＴＮＦα及びＴＦＮγなどの種々のサイトカイン類に関して記載されている。
【００４２】
複合体
本発明は、遺伝子融合又は化学結合によって形成された少なくともサイトカインに結合した少なくとも１つの標的指向蛋白質を含む分子である複合体に関する。「結合した」とは、第１の配列によって、第２の配列が標的細胞へと輸送されることが可能となるように、第１の配列と第２の配列とが結合していることを意味する。したがって、複合体は、輸送蛋白質をコードするＤＮＡ分子の遺伝子発現によるそのポリペプチド骨格を介して、輸送蛋白質がサイトカインと結合している融合蛋白質、直接合成された蛋白質及び予備形成した配列が架橋剤によって会合しているカップリング蛋白質を含む。この用語は、また、サイトカインと標的指向蛋白質との凝集体などの会合も含むものとしてここでは使用される。一実施形態によれば、該第２の配列は、ポリヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態は蛋白質／核酸複合体として認め得る。
【００４３】
前記第２の配列は、第１の配列と同一種からのものであってよいが、天然状態とは異なった仕方で本発明の複合体に存在しているか、若しくは異なった種からのものとなり得る。
【００４４】
本発明の複合体は、輸送配列にカップリングしているペプチド配列に相当するエフェクター機能が発揮できるように、細胞に誘導することができる。
【００４５】
前記ペプチドは、サイトカインに直接、若しくは単独アミノ酸、アミノ酸配列又は６−アミノカプリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの有機残基であるスペーサーを介して間接的にカップリングできる。
【００４６】
前記ペプチドは、好ましくはサイトカインのＮ−末端に結合させて修飾サイトカインとその受容体との結合における妨害を最小にする。或いは、前記ペプチドは、分子上に天然に存在し得る、又は遺伝子工学法を用いて人工的に挿入したアミド又はカルボキシル結合アクセプターであるアミノ酸残基に結合できる。修飾サイトカインは、前記ペプチドをコードする５’隣接配列を含むｃＤＮＡを用いて調製することが好ましい。
【００４７】
好ましい実施形態により、ＴＮＦのアミノ末端がスペーサーＧ（グリシン）を介してＣＮＧＲＣペプチドと結合している、ＴＮＦとＣＮＧＲＣ配列との複合生成物が提供されている。
【００４８】
サイトカイン類
固形腫瘍化学療法の有効性にとって、新生物細胞内への薬剤浸透性は重要である。固形腫瘍内の癌細胞に到達するためには、化学療法剤は血管に入り、その血管壁を通過し、最終的には、間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る。したがって、これらの要因に影響する作用を有するサイトカイン類が、本発明において有用である。本発明に使用し得るサイトカイン類の非限定的リストは、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインである。
【００４９】
ＴＮＦ
ＴＮＦは炎症性サイトカインであり、内皮バリア機能変化の誘導、腫瘍間質圧の低下及び化学療法剤浸透性の増大並びに腫瘍血管損傷の効果を有している。
【００５０】
腫瘍壊死分子の存在は、癌患者が細菌感染後、彼らの腫瘍の自然な後退を時々示したことが見られた時に先ず示唆された。引き続く１９６０年代の研究により、細菌産生物に応じて作成された宿主関連（又は内因性）媒介物が、前記の観察された効果の原因になっている可能性が示された。１９７５年に、細菌誘導循環因子がマウスの皮膚に移植された腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を有していることが示された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と名付けられたこの因子は、その後単離、クローン化され、免疫調節と炎症に関与する分子ファミリーのプロトタイプであることが判明した。ＴＮＦ及びＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーの受容体もまた、関連蛋白質のスーパーファミリーを構成している。
【００５１】
ＴＮＦ関連リガンド類は、通常、共通の特徴を多数有している。これら特徴の中には、全体的なアミノ酸（ａａ）配列相同性の程度の高さは含まれていない。神経増殖因子（ＮＧＦ）及びＴＮＦβを除いて、リガンド類はすべて、短い細胞質セグメント（１０〜８０のａａ残基）及び比較的長い細胞外部位（１４０〜２１５のａａ残基）を含有するタイプＩＩの膜貫通蛋白質（細胞外Ｃ−末端）として合成される。構造的には、ＴＮＦと関連していないＮＧＦは、ＴＮＦＲＳＦ低親和性ＮＧＦ受容体（ＬＮＧＦＲ）と結合する能力があるという理由だけで、このスーパーファミリーに含まれる。ＮＧＦは、古典的なシグナル配列ペプチドであり、分泌されている。ＴＮＦβは、やはり十分に分泌されているが、対照的にＩＩ型膜貫通蛋白質にはるかに多く関連した一次構造を有している。ＴＮＦβは、非機能的又は非有効的な膜貫通セグメントを有するＩＩ型蛋白質と考えることができよう。一般に、ＴＮＦＳＦのメンバーは、三量体構造を形成し、それらの単量体は、２つのシート構造に自身を配向させているβ類から成り立っている。これらの分子の三量体構造の結果、ＴＮＳＦ及びＴＮＦＲＳＦスーパーファミリーのリガンド類及び受容体類は、シグナル導入の間に「集合化」を受けることが示唆される。
【００５２】
ＴＮＦα：ヒトＴＮＦαは、２３３ａａの残基で、膜貫通蛋白質又は可溶性蛋白質のいずれかとして存在する非グリコシル化ポリペプチドである。２６ｋＤａ膜貫通蛋白質として発現された場合、ＴＮＦαは、２９ａａ残基の細胞質ドメイン、２８ａａ残基の膜貫通セグメント及び１７６ａａ残基の細胞外部位からなる。可溶性蛋白質は、８６ｋＤａのＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）を介した蛋白質分解の開裂事象により生成し、通常はホモ三量体として循環する１７ｋＤａ、１５７ａａ残基の分子を生成する。
【００５３】
ＴＮＦβ／ＬＴα：他にリンフォトキシンα（ＬＴα）としても知られているＴＮＦβは、そのクローニングがＴＮＦαのクローニングと同時期であった分子である。ＴＮＦβは、１７１ａａ残基、２５ｋＤａグリコシル化ポリペプチドとして循環するが、１９４ａａ残基長のより大きな形態が見つかっている。ヒトＴＮＦβｃＤＮＡは、２０５ａａ残基（マウスでは２０２）のオープンリーディングフレームをコードし、恐らく分泌時に何らかのタイプの蛋白質加水分解処理が生じていると思われる。ＴＮＦαと同様、循環しているＴＮＦβは非共有結合三量体として存在しており、ＴＮＦαと同じ受容体に結合することが知られている。
【００５４】
一実施形態において、ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体の１つと選択的に結合できるＴＮＦの変異体形態をとる（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｈら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０〜７頁）；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  Ｘら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜９頁）。
【００５５】
他の多くの炎症性サイトカイン類もまた、内皮血管透過性を高める性質を有しており、本発明がこのようなサイトカインの発現を増加させる薬剤と共にこのようなサイトカインへ適用できることが理解されるであろう。前炎症性サイトカイン類としても知られている炎症性サイトカイン類は５ｋＤａから７０ｋＤａの間の分子量を有する多数のポリペプチド及び糖蛋白質である。それらは、炎症応答に刺激的効果を有する。最も重要な炎症性サイトカイン類は、ＴＮＦ、ＩＬ１、ＩＬ６及びＩＬ８である。
【００５６】
炎症性サイトカイン類として分類されたいくつかのサイトカイン類の表を下記に示してある。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
ＴＧＦβ：悪性転換増殖因子、ＬＩＦ：白血球阻害因子；ＯＳＭ：オンコスタチンＭ；ＣＮＴＦ：シリア線毛神経栄養因子；ＰＦ４：血小板因子４；ＰＢＰ：血小板塩基性蛋白質；ＮＡＰ２：好中球活性化蛋白質２；βＴＧ：βトロンボグロブリン；ＭＩＰ：マクロファージ炎症性蛋白質；ＭＣＰ：単球化学誘引蛋白質。
【００５９】
炎症応答のアップレギュレーションは、またＩＬ１１、ＩＦＮα、ＩＦＮβ及び特にケモカインスーパーファミリーのメンバーによって行われる。いくつかの状況においてＴＧＦβは、好中球、Ｔリンパ球及び不活性単球に対する化学誘引効果を含め、多数の炎症性活性を有する。
【００６０】
ＩＬ２
免疫及び炎症応答の媒介におけるＩＬ２／ＩＬ２Ｒ系の中心的役割のため、この系のモニタリングと操作が重要な診断的及び治療的意味を有していることは明らかである。ＩＬ２は、腫瘍攻撃性のＬＡＫ及びＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）細胞の増殖及び活性を刺激する能力の点で、抗癌剤としての有望性を示している。しかし、ＩＬ２毒性による問題に対してなお、懸念と利点調査がされている。本発明はこの問題を扱っている。
【００６１】
ＩＬ１５
インターロイキン１５（ＩＬ１５）は、ＩＬ２と多くの生物学的性質を共有しているが、アミノ酸配列の相同性を欠いている新規のサイトカインである。ＩＬ１５は、元々マウスＴ細胞系、ＣＴＬＬ２に対するサル腎臓上皮細胞系（ＣＶＩ／ＥＢＮＡ）のマイトジェン活性に基づき、条件付けされた培地中に確認された。ＩＬ１５はまた、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−Ｔと称された、ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞系（Ｈｕｔ−１０２）によって産生されるサイトカインとして独立に発見された。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及びＴＩＬ類の刺激剤としての活性に関して、ＩＬ２は現在、癌及びウィルス感染の治療におけるその利用可能性を試験する臨床試験中である。ＩＬ１５は同様な生物活性のため、同様の治療上の可能性を有しているはずである。
【００６２】
ケモカイン類
ケモカイン類は、リンパ球の輸送、補充及び再循環において機能する、多くは小型の分泌蛋白質のスーパーファミリーである。それらはまた、アレルギー応答、感染性及び自己免疫疾患、血管形成、炎症、腫瘍増殖及び血液形成発達などの多くの病理生理学的過程において重要な役割を演じている。この蛋白質の略８０パーセントが、成熟形態において、６６個から７８個のアミノ酸（ａａ）を有している。残りのものは、蛋白質コアの上流に生じるか、又は伸長したＣ末端セグメントの一部として、追加のａａを有して、より大型である。ケモカイン類はすべて、７つの膜貫通ドメインＧ蛋白結合受容体を介してシグナル伝達する。少なくとも１７種のケモカイン受容体が知られており、これらの受容体の多くはいくつかの異なったケモカインが同一の受容体を介してシグナル伝達できる無差別結合性を示す。
【００６３】
ケモカイン類は、保存されたａａ配列モチーフに基づきサブファミリーに分けられる。多くのファミリーメンバーは２つの分子内ジスルフィド結合を形成する少なくとも４個の保存されたシステイン残基を有している。サブファミリーは、最初の２つのシステイン残基の位置によって規定する：
・ＣＸＣケモカインとも称されるαサブファミリーは、最初の２つのシステイン残基を分けている１個のａａを有している。このグループは、最初のシステイン残基のすぐ前にあるｇｌｕ−ｌｅｕ−ａｒｇ（ＥＬＲ）ａａモチーフが存在するかしないかに基づいて、さらに小さく分けることができる。現在５種のＣＸＣ特異的受容体があり、それらはＣＸＣＲ１〜ＣＸＣＲ５と称されている。ＥＬＲ＋ケモカイン類は、ＣＸＣＲ２と結合し、一般に好中球化学誘引剤及び活性剤として作用する。ＥＬＲケモカイン類は、ＣＸＣＲ３〜ＣＸＣＲ５に結合し、主にリンパ球に対して作用する。本文執筆時に、科学文献にＣＸＣケモカイン類をコードする１４種の異なったヒト遺伝子が、場合によってはスプライシングにより与えられたさらなる多様性を有して報告された。
・ＣＣケモカイン類とも称されるβファミリーにおいては、最初の２つのシステインが介入ａａなしに互いに隣接している。現在、２４種のヒトβサブファミリーメンバーが識別されている。このグループの受容体は、ＣＣＲ１〜ＣＣＲ１１と称される。種々のＣＣファミリーメンバーの標的細胞としては、白血球の大抵の型が挙げられる。
・α及びβサブファミリーに入らないケモカイン相同性を有する２つの蛋白質が知られている。リンホタクチンは、第１と第３のシステインを欠いたγクラス（Ｃケモカイン）の単独メンバーである。リンホタクチン受容体は、ＸＣＲ１と称される。デルタクラス（ＣＸ３Ｃケモカイン）の唯一のメンバーであるフラクタルカインは、最初の２つのシステイン残基の間に３個の介入ａａを有している。この分子は、長いムチン様の柄に融合したＮ末端ケモカインドメインを有する膜貫通蛋白質であるという点で、ケモカイン類の中でも独特である。フラクタルカイン受容体は、ＣＸ３ＣＲ１として知られている。
【００６４】
ＶＥＧＦ
本発明はまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）にも適用できる。新血管形成は、先に存在する血管系から新たな血管が発達する過程である。それは、胚の発達、組織の正常な成長、傷の治癒、女性の生殖サイクル（すなわち、排卵、月経及び胚盤発達）における必須の役割並びに多くの疾患において主要な役割を演じている。特に関心が集中するのは癌に対してである。なぜなら、腫瘍は、新しい血液供給の発達がなければ、数ミリメートルの大きさ以上には増殖できないからである。また、新血管形成は腫瘍細胞転移の拡散と増殖にも必要である。
【００６５】
内皮にとって最も重要な増殖及び生存因子の１つがＶＥＧＦである。ＶＲＧＦは脈管形成と内皮細胞増殖を誘導し、脈管形成の調節に重要な役割を演じている。ＶＥＧＦは、４５ｋＤａのホモ二量体として分泌されるヘパリン結合性糖タンパクである。通常は、内皮細胞自身以外の大抵のタイプの細胞はＶＥＧＦを分泌する。最初に発見されたＶＥＧＦであるＶＥＧＦ−Ａは血管透過性を高めるため、それは血管透過性因子として知られていた。また、ＶＥＧＦは部分的には内皮細胞内の一酸化窒素シンターゼの刺激を介して血管拡張を引き起こす。ＶＥＧＦはまた、細胞移動を刺激し、アポトーシスを阻害することもできる。ＶＥＧＦ−Ａのいくつかのスプライシング変異体がある。主なものとしては、１２１、１６５、１８９、２０６アミノ酸（ａａ）が挙げられ、各々が特定のエキソン付加体を含む。
【００６６】
ＥＭＡＰＩＩ
内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ（ＥＭＡＰＩＩ）は、腫瘍血管発達における抗血管形成因子であるサイトカインであり、腫瘍の増殖を強力に阻害する。組み換えヒトＥＭＡＰＩＩは１６６個のアミノ酸残基を含有する１８．３ｋＤａの蛋白質である。ＥＭＡＰＩＩもまた、内皮血管透過性を高めることが判明している。
【００６７】
ＰＤＧＦ
血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストが、一般的な固形腫瘍において広範囲の抗腫瘍剤の薬剤取り込みと治療効果を高め得ることも示唆されている。ＰＤＧＦは、３０ｋＤＡのサイトカインであり、創傷時に血小板により放出され、近隣の細胞が増殖して傷を修復することを促す。
【００６８】
ＰＤ−ＥＣＧＦ
その名称に示唆されるように、血小板由来の内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）は、最初は内皮細胞における有糸分裂を誘導する血小板の能力に基づいて、血小板から単離された。その関連蛋白質はグリオスタチンである。
【００６９】
標的指向部分
本発明者らは、腫瘍血管に対するサイトカイン標的化の方向付けによってサイトカイン類の治療指数を高めることができることを見出した。さらに、腫瘍細胞は、腫瘍血管系の内層の一部を形成し得ることが知られていることから、本発明は腫瘍細胞の血管系と同様、腫瘍細胞を直接標的にすることも包含する。任意の便利な腫瘍又は腫瘍血管系、特定の内皮細胞、標的指向部分が、本発明の複合体において使用できる、このような多くの標的指向部分が知られており、これら及び引き続いて利用可能な任意のものが本発明の範囲内に包含される。一実施形態において、標的指向部分は、腫瘍細胞によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手又は腫瘍細胞に伴う細胞外マトリックスのマーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。より具体的には、標的指向部分は、腫瘍関連血管によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手、又は血管形成脈管に伴う細胞外マトリックスの内皮マーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。用語の結合相手は、本発明では最も広い意味で用いられ、リガンドや抗体又はその結合断片などの天然、合成双方の結合ドメインを含む。したがって、前記結合相手は、受容体、細胞の細胞外成分のマーカーに結合できるＦａｂ、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ、ペプチド、又はペプチド模倣物、すなわちペプチド様分子などの抗体又はその断片となり得る。
【００７０】
以下のものは、前記複合体が標的化され得る好適な標的ドメイン及び受容体／マーカーの非限定例を表わす。
【００７１】
ＣＤ１３
驚くべきことに、アミノペプチダーゼ−Ｎ受容体（ＣＤ１３）のリガンドとのカップリングによって、ある一定のサイトカイン類の治療指数が著しく改善でき、その免疫療法特性が増強できることが判明した。ＣＤ１３は、様々な種において保存性の高い１５０ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である。それは正常な細胞並びに骨髄腫瘍系、血管形成内皮及びいくつかの上皮において発現する。ＣＤ１３受容体は、通常、そのペプチドリガンドがアミノ酸の「ＮＧＲ」モチーフを共有している「ＮＧＲ」受容体として同定される。前記リガンドはＮＧＲモチーフを含む、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ又はシクロＣＮＧＲＣなどの直鎖又は環状ペプチドであることが好ましく、ペプチドＣＮＧＲＣであることがより好ましい。さらに詳細は、参照として本明細書に組み込まれている本発明者らのＷＯ０１／６１０１７に見ることができる。
【００７２】
ＴＮＦ受容体
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと同様に、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーもまた共通の特徴を多く共有している。特に、ＴＮＦＲＳＦの分子はすべて、それらの細胞外ドメインに１つから６つのリガンド結合、４０ａａ残基のシステインの多いモチーフを含有するＩ型（Ｎ末端細胞外）膜貫通糖蛋白質である。また、機能性ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、通常、システイン内ジスルフィド結合によって安定化している三量体又は多量体の複合体である。ＴＮＦＳＦの多くのメンバーと違って、ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、膜結合形態と可溶性形態の双方において存在する。最後に、前記スーパーファミリーメンバーの細胞質ドメインにおけるａａ配列の相同性は２５％を超えないが、多くの受容体が様々な細胞にアポトーシスのシグナルを導入することができ、共通の機能を示唆している。
【００７３】
ＣＤ４０：ＣＤ４０は、Ｂ細胞の増殖と分化に関連することが最も多い５０ｋＤａ、２７７ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。様々なタイプの細胞に発現したヒトＣＤ４０ｃＤＮＡは、２０ａａ残基のシグナル配列、１７３ａａ残基の細胞外部位、２２ａａ残基の膜貫通セグメント、及び６２ａａ残基の細胞質ドメインをコードする。細胞外部位に、４つのシステインの多いモチーフがあり、それにセリンとトレオニンの多いジャクスタ膜近傍配列が伴っている。ＣＤ４０を発現することが知られている細胞としては、内皮細胞が挙げられる。
【００７４】
ＴＮＦＲＩ／ｐ５５／ＣＤ１２０ａ：ＴＮＦＲＩは、核のある哺乳動物細胞の事実上すべてで明らかに発現する５５ｋＤａ、４５５ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。前記分子は、１９０ａａ残基の細胞外部位、２５ａａ残基の膜貫通セグメント、及び２２０ａａ残基の細胞質ドメインを有する。ＴＮＦαとＴＮＦβの双方が、ＴＮＦＲＩと結合する。ＴＮＦＲＩを発現することが知られている細胞の中に内皮細胞がある。
【００７５】
ＴＮＦＲＩＩ／ｐ７５／ＣＤ１２０ｂ：ＴＮＦＲＩＩは、元々ヒト肺線維芽細胞ライブラリーから単離された７５ｋＤａ、４６１ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。この受容体は、２４０ａａ残基の細胞外部位、２７ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１７３ａａ残基の細胞質ドメインからなる。明らかに、ＴＲＲＥ（ＴＮＦ受容体遊離酵素）と呼ばれるメタロプロティナーゼによる蛋白加水分解開裂から生じるＴＮＦＲＩＩの可溶性形態が同定されている。その脱離過程は、可溶性ＴＮＦＲＩのそれとは独立していると思われる。ＴＮＦＲＩＩを発現することが知られている細胞の中に内皮細胞がある。
【００７６】
ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ：ＯＸ４０Ｌの受容体であるＯＸ４０は、炎症部位においてＣＤ４＋Ｔ細胞の生存（及び恐らく免疫応答の延長）を促進すると思われる、発現の限定されているＴ細胞活性化マーカーである。ＯＸ４０Ｌの発現もまた限定されている。現在、活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及び血管内皮細胞のみがこの因子を発現すると報告されている。ヒトのリガンドは、２１ａａ残基の細胞質ドメイン、２３ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１３９ａａ残基の細胞外部位からなる３２ｋＤａ、１８３ａａ残基のグリコシル化ポリペプチドである。
【００７７】
ＶＥＧＦ受容体ファミリー
ＶＥＧＦ受容体ファミリーには３つの受容体がある。それらは、複数のＩｇＧ様細胞外ドメイン及びチロシンキナーゼ活性という共通の性質を有している。ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１、Ｆｌｔ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ又はＦｌｋ−１としても知られる）及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｋ−４としても知られる）の酵素ドメインは、挿入配列によって分けられている。内皮細胞は、その他のＶＥＧＦ受容体であるニューロピリン−１とニューロピリン−２も発現する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２並びにニューロピリン−１とニューロピリン−２に結合する。ＰＩＧＦとＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ１とニューロピリン−１に結合する。ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄとは、ＶＥＧＦＲ３とＶＥＧＦＲ２に結合する。ＨＩＶ−ｔａｔとそれに由来するペプチドもまた、ＶＥＧＦＲを標的にすることが判っている。
【００７８】
ＰＤＧＦ受容体
ＰＤＧＦ受容体は、多くの一般的な固形腫瘍における間質画分に発現する。ラット結腸癌モデルにおいて間質に発現したＰＤＧＦ受容体を阻害すると、腫瘍間質液圧が低下し、腫瘍の毛細管輸送が増加する。
【００７９】
ＰＳＭＡ
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もまた、優れた腫瘍内皮マーカーであり、ＰＳＭＡ抗体を生成できる。
【００８０】
細胞接着分子（ＣＡＭ類）
細胞接着分子（ＣＡＭ類）は、細胞、通常は、白血球を互いに、内皮細胞に、又は細胞外マトリックスに結合することに関与している細胞表面蛋白質である。創傷や感染に応じて産生された特定のシグナルが、ある一定のこれら接着分子の発現と活性化を制御する。次にこれらＣＡＭ類の、それらの受容体／リガンドに対する結合によって開始された相互作用や応答が、これら損傷に対する生体防衛の一系列を構成する炎症反応及び免疫反応の媒介において重要な役割を演じる。今までに特定されたＣＡＭ類の多くは、３つの一般的な蛋白質ファミリーに分けられる。すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、インテグリンファミリー又はセレクチンファミリーである。
【００８１】
細胞表面分子のセレクチンファミリーのメンバーであるＬ−セレクチンは、ＮＨ２−末端レクチンＣ型ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、２つの相補的制御ドメイン、１５アミノ酸残基のスペーサー、膜貫通配列及び短い細胞質ドメインからなる。
【００８２】
内皮細胞上にＬ−セレクチンに対する３種のリガンドが同定されているが、すべてがＯ−グリコシル化ムチン又はムチン様ドメインを含有している。第１のリガンド、ＧｌｙＣＡＭ−１は、ほとんど末梢及び腸間膜のリンパ節高内皮細静脈においてのみ発現する。第２のＬ−セレクチンリガンドは、元はｓｇｐ９０と呼ばれていたが、今ではＣＤ３４であることが示されている。多能性幹細胞の精製のための表面マーカーとしてしばしば用いられるこの唾液ムチン様糖蛋白質は非リンパ組織の広範囲において並びに末梢リンパ節の毛細血管に血管発現を示す。Ｌ−セレクチンに対する第３のリガンドは、粘膜リンパ節高内皮細静脈に見られるムチン様糖蛋白質であるＭａｄＣＡＭ１である。
【００８３】
細胞表面分子のセレクチンファミリーのメンバーであるＰ−セレクチンは、ＮＨ２−末端レクチンＣ型ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、９つの相補的制御ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインからなる。
【００８４】
四糖類のシアリルＬｅｗｉｓｘ（ｓＬｅｘ）は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン双方のリガンドとして同定されているが、Ｐ、Ｅ、及びＬ−セレクチンはすべて適切な条件下でｓＬｅｘ及びｓＬｅａに結合できる。Ｐ−セレクチンはまた、マウス骨髄細胞上に存在する１６０ｋＤａの糖蛋白質及び骨髄細胞、血液好中球、単球、リンパ球上の糖蛋白質であって、Ｐ−セレクチン糖蛋白リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）と称され、Ｅ−セレクチンとも結合できるリガンドに選択的に結合することが報告されている。Ｐ−セレクチン媒介の白血球のローリングは、ＰＳＬＧ−１に特異的な単クローン抗体によって完全に阻害することができ、Ｐ−セレクチンがインビトロの条件下では様々な糖蛋白質と結合できるとはいえ、生理学的に重要な結合はより限定されている可能性が示唆される。Ｐ−セレクチンが骨髄細胞並びにＢ細胞及びＴ細胞の亜群の接着に関与して内皮を活性化することを示す様々な証拠がある。
【００８５】
ＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類
ＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類は、カルシウム非依存性膜貫通糖蛋白質である。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーとしては、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ類）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）、血小板−内皮−細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）及び神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）が挙げられる。各ＩｇスーパーファミリーＣＡＭは、いくつかのＩｇ様鎖内ジスルフィド結合したループを含有する細胞外ドメインと、保存されたシテイン残基、膜貫通ドメイン、細胞骨格と相互作用する細胞内ドメインを有している。典型的には、それらは、インテグリン類又は他のＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類と結合する。ニューロンのＣＡＭ類は、ニューロンのパターン形成に関係していた。内皮ＣＡＭ類は免疫応答及び炎症に重要な役割を演じている。
【００８６】
より詳述すると、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１０６、又はＩＮＣＡＭ−１１０）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１）及び細胞間接着分子１、２、３（ＩＣＡＭ−１、２、３）は、白血球接続組織／内皮細胞相互作用に決定的に関与している５つの機能関連ＣＡＭ／ＩｇＳＦ分子である。主に内皮細胞上に発現したこれらの分子は一般に、血管壁を越えた白血球の移動を調節し、血管形成時の上皮発達のための付着点を提供し、すべて本発明における標的に好適である。
【００８７】
ヒトＣＤ３１は、細胞接着分子（ＣＡＭ）又はＩｇＳＦ１のＣ２様亜群に属する１３０ｋＤａのＩ型（細胞外Ｎ末端）膜貫通糖蛋白質である。成熟分子は、長さが７１１アミノ酸（ａａ）残基であって５７４ａａ残基の細胞外部位、１９ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１１８ａａ残基の細胞質尾部を含有する。細胞外部位には、９つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位があり、８０ｋＤａの予想分子量を有して、これらの部位の多くは占有されているようである。細胞外部位の最も顕著な特徴は、ＩｇＳＦのＣ２ドメインと類似した６つのＩｇ相同性単位の存在である。数に変化はあっても、これらのモジュールの存在は、すべてのＩｇＳＦ接着分子（ＩＣＡＭ−１、２、３及びＶＣＡＭ−１）の共通の特徴である。
【００８８】
インテグリン類
インインテグリン類は、α及びβサブユニットの非共有結合したヘテロ二量体である。現在までに、１６αサブユニットと８βサブユニットが同定されている。これらは、様々な仕方で結合して、種々のタイプのインテグリン受容体を形成することができる。いくつかのインテグリンに関するリガンドには、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン類及びラミニンなどの細胞外接着マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質がある。多くのインテグリン類は、フィブロネクチンや他の接着蛋白質に存在している、それらが結合するアミノ酸配列、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を認識する。ＲＧＤ配列を含有するペプチド及び蛋白質断片をＲＧＤ認識インテグリンの活性を調節するために使用できる。したがって、本発明は、標的指向部分として、インテグリンに認識されるペプチドを使用できる。これらのペプチドは従来「ＲＧＤ含有ペプチド」として知られている。これらのペプチドは、インテグリンに結合するペプチドモチーフとして同定されたものを含む。これらのモチーフはアミノ酸配列：ＤＧＲ、ＮＧＲ及びＣＲＧＤＣを含む。前記ペプチドモチーフは線状でも環状でもよい。このようなモチーフは、ＲＧＤペプチドの記載に関連して参照として本明細書に組み込まれている以下の特許に、より詳細に記載されている：米国特許第５，５３６，８１４号は、シクラサイズ化ＣＲＧＤＣＬ、ＣＲＧＤＣＡ及びＧＡＣＲＧＤＣＬＧＡを記載している。米国特許第４，５７８，０７９号は、ＸとＹがアミノ酸である式Ｘ−ＲＧＤ−Ｔ／Ｃ−Ｙの合成ペプチドに関する。米国特許第５，５４７，９３６号は、Ｘがアミノ酸となり得る配列Ｘ−ＲＧＤ−ＸＸを含むペプチドを記載している。米国特許第４，９８８，６２１号は、多数のＲＧＤを含むペプチドを記載している。米国特許第４，８７９，２３７号は、Ｙがアミノ酸であるＲＧＤ−Ｙの一般的ペプチド及びペプチドＧ−ＲＧＤ−ＡＰを記載している。米国特許第５，１６９，９３０号は、αｖβ１インテグリンに結合するペプチドＲＧＤＳＰＫを記載している。米国特許第５，４９８，６９４号及び米国特許第５，７００，９０８号は、配列ＲＤＧを含有しているが、厳密に言えばＲＧＤ含有ペプチドではないβ３インテグリンサブユニットの細胞質ドメインに関する。ＷＯ９７／０８２０３は、構造的模倣体又はＲＧＤ結合部位である環状ペプチドを記載している。米国特許第５，６１２，３１１号は、Ｃ−Ｃ結合か、若しくはペニシルアミン又はメカプトプロピオン酸類縁体などの他の基を介して環化され得る１５個のＲＧＤ含有ペプチドを記載している。米国特許第５，６７２，５８５号は、ＲＧＤ含有ペプチドを包含する一般式を記載している。好ましいペプチド群は、ＲＧＤのアスパラギン酸残基がＯ−メトキシチロシン誘導体へと誘導化されるものである。米国特許第５，１２０，８２９号は、ＲＧＤ細胞接着促進結合部位及び疎水性接着ドメインを記載している。米国特許第５，５８７，４５６号には、Ｄ体が記載されている。米国特許第５，６４８，３３０号は、ＧＰＩｉｂ／ＩＩＩａに高親和性を有する環状ＲＧＤ含有ペプチドを記載している。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態において、標的指向部分は、αｖβ３又はαｖβ５インテグリンに対するリガンドである。
【００９０】
アクチビン
ＡｃｔＲＩＩを発現することが知られている細胞としては、内皮細胞が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢの発現は、ＡｃｔＲＩＩの発現と類似しており、やはり内皮細胞において見られる。ＡｃｔＲＩを発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。ＡｃｔＲＩＢもまた内皮細胞において確認された。
【００９１】
アンジオゲニン
アンジオゲニン（ＡＮＧ）は、新血管増殖を誘導する能力に関して名付けられた１４ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。
【００９２】
アネキシンＶ
アネキシンＶは、血管抗凝集活性を有する蛋白質のカルシウム及びリン脂質結合ファミリーのメンバーである。アネキシンＶには種々の同義語がある。すなわち、胎盤蛋白４（ＰＰ４）、胎盤抗凝集蛋白Ｉ（ＰＡＰＩ）、カルホビンジンＩ（ＣＰＢ−Ｉ）、カルシウム依存リン脂質結合蛋白３３（ＣａＢＰ３３）、血管抗凝集蛋白α（ＶＡＣａ）、アンコリンＣＩＩ、リポコルチンＶ、エンドネキシンＩＩ、及びトロンボプラスチン阻害剤である、アネキシンＶに対する結合部位の数は腫瘍細胞では６〜２４×１０６／細胞、そして内皮細胞では、８．８×１０６／細胞と報告されている。
【００９３】
ＣＤ４４
白血球接着事象に明らかに関与している他の分子はＣＤ４４であり、これは造血細胞及び非造血細胞の双方に偏在して発現する分子である。ＣＤ４４は、場合によっては、スプライシングされた形態（その多くは活性が異なる）を生成させる能力が顕著である。腫瘍細胞が増殖と転移によって首尾よく発達するために用いる方法のいくつかにおいて、ＣＤ４４がその性質を変化させて、ある役割を演じているという推測が、この顕著な柔軟性から導かれた。ＣＤ４４は、８０〜２５０ｋＤａのＩ型（細胞外Ｎ末端）膜貫通糖蛋白質である。ＣＤ４４を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【００９４】
ＣＤ４４に対しオステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲン及びヒアルロン酸塩などの複数のリガンドがある。フィブロネクチンとの結合は硫酸コンドロイチンを発現し、エクソンＶ８〜Ｖ１１に局在化した硫酸コンドロイチン付着部位を有するＣＤ４４変異体に限られていることが報告されている。ヒアルロン酸塩の結合は、事実上すべてのＣＤ４４イソ体で可能であることが示唆されている。主な結合部位の１つは、エクソン２に集中し、リジン残基とアルギニン残基を含むことが示唆されている。ヒアルロン酸塩結合のためには、知られているヒアルロン酸塩結合モチーフの単独発現以外の因子も必要であると思われる。ヒアルロン酸結合の成功は、発現エクソン、特有の細胞質尾部、グリコシル化パターン及び細胞の活性化状態の組合せによって助長される。このように、そのヒアルロン酸塩結合機能に関しては、各ＣＤ４４発現細胞内に、多くの「潜在的」融通性が存在する。
【００９５】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）」という名称は、このサイトカインファミリーの限定的な表現である。ＦＧＦ類の機能は、細胞増殖に限定されていない。いくつかのＦＧＦ類は、確かに線維芽細胞の増殖を誘導するが、元々のＦＧＦ分子（ＦＧＦ−２又はＦＧＦ塩基）は、内皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、メラニン細胞、並びに他の細胞の増殖も誘導することが現在知られている。それはまた、脂肪細胞の分化を促進し、マクロファージ及び線維芽細胞ＩＬ６の産生を誘導し、星状細胞の移動を刺激し、ニューロンの生存を延長化することができる。現在までのところ、ＦＧＦスーパーファミリーは、２３のメンバーからなり、それらはすべて、６個の散在した同一アミノ酸を含有する１２０アミノ酸（ａａ）の保存コア部位を含有する。
【００９６】
ＦＧＦ−１：ヒトＦＧＦ−１（ＦＧＦ酸、ＦＧＦａ、ＦＣＧＦ、及びＨＢＧＦ−１としても知られている）は、３つの胚芽層すべての様々な細胞によって発現される１７〜１８ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。結合分子はＦＧＦ受容体のいずれかとなり得る。ＦＧＦ−１を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【００９７】
ＦＧＦ−２：ＦＧＦ塩基、ＨＢＧＦ−２及びＥＤＧＦとしても知られているヒトＦＧＦ−２は、細胞内活性と細胞外活性の双方を示す１８ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。分泌後、ＦＧＦ−２は、細胞表面のＨＳ又はマトリックスのグリコサミノグリカン上のいずれかに隔離される。ＦＧＦ−２は単量体として分泌されるが、細胞表面のＨＳは、後に二量体化してＦＧＦ受容体を活性化できる非共有の左右配置において、単量体のＦＧＦ−２を二量体化すると思われる。ＦＧＦ−２を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【００９８】
ＦＧＦ−３：ヒトＦＧＦ−３は、ｉｎｔ−２遺伝子産物である［すなわち、レトロウィルス挿入後に偶然活性化された遺伝子（ｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３）を含有するマウス染色体７上の部位である部位−２の組み込みに由来］。この分子は、多数のペプチドモチーフを含有する２８〜３２ｋＤａの２２２ａａ糖蛋白質として合成される。ＦＧＦ−３を発現すると報告された細胞は、発生細胞と腫瘍とに限られている。ＦＧＦ−３を発現することが知られている腫瘍としては、乳癌及び結腸癌細胞が挙げられる。
【００９９】
ＦＧＦ−４：ヒトＦＧＦ−４は、発生調節遺伝子産物である２２ｋＤａ、１７６ａａ糖蛋白質である。この分子は、大型の定義不適切な３０ａａシグナル配列の他に２つのヘパリン結合性モチーフ（５１〜５５ａａ及び１４０〜１４３ａａに）を含有する２０６ａａの前駆体として合成される。ヘパリン結合性部位は、ＦＧＦ−４の活性に直接関連する。すなわち、ヘパリン／ヘパランがＦＧＦ−４の能力を調節して、ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２を活性化する。ＦＧＦ−４を発現することが知られている細胞としては、抗腫瘍細胞と胎芽細胞の双方が挙げられる。ヒト胃がんにおける同定によって、替わりの名称の１つ（／ｈｓｔ−１／ｈｓｔ）が生まれ、一方、カポジ肉腫における単離が、他の名称（Ｋ−ＦＧＦ）を生む根拠となっている。
【０１００】
ＩＬ１Ｒ
ＩＬ１は、特定の受容体に結合することによりその作用を発揮する。２つの異なるＩＬ１受容体結合性蛋白質に加え、非結合性シグナル伝達付属蛋白質が同定されている。各々が３つの細胞外免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを有しているこから、ＩＶ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーになっている。２つの受容体結合蛋白質は、それぞれＩ型ＩＬ１受容体（ＩＬ１ＲＩ）、ＩＩ型ＩＬ１受容体（ＩＬ１ＲＩＩ）と称される。ヒト（ＩＬ１ＲＩ）は、内皮細胞から単離された５５２ａａ、８０ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である。
【０１０１】
ＲＴＫ
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の新規のファミリーであるＥｐｈ受容体とそれらのリガンドであるエフリン類は、血管の組立て、血管形成、腫瘍形成及び転移に関与していることが判っている。クラスＡのＥｐｈ受容体とそれらのリガンド類が、腫瘍及び関連血管系において増加することも判っている。
【０１０２】
ＭＭＰ
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）類は、腫瘍の増殖、血管形成、浸潤及び転移に関与していた。それらを腫瘍マーカーとして利用することも示唆されている。
【０１０３】
ＮＧ２
ＮＧ２は、最初、未成熟神経細胞によって発現した細胞表面分子として同定された大型の膜構成硫酸コンドロイチンプロテオグリカンである。その後、ＮＧ２は、多種多様な未成熟細胞並びに悪性度の高いいくつかのタイプの腫瘍によって発現することが判った。ＮＧ２は、腫瘍血管系における標的分子として示唆されている。特に、コラゲナーゼ１（Ｃ１）は新たに形成された微小血管に存在する主なマトリックスメタロプロテイナーゼであり、新生血管形成のマーカーとして役立つ。
【０１０４】
癌退治性フィブロネクチン
フィブロネクチン（Ｆｎ−ｆ）の癌退治性断片の発現が血管形成時に増加することも判っており、腫瘍血管形成のマーカーとして示唆されている。一実施形態において、ＴＴＭは、フィブロネクチンの癌退治性ＥＤ−Ｂドメインに対する抗体又はその断片である。このような抗体及びＩＬ１２との複合体の調製は、Ｈａｌｉｎら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁に記載されている。
【０１０５】
テネイシン
テネイシンは、脳腫瘍、乳癌及び黒色腫などの悪性腫瘍に見られるマトリックス糖蛋白質である。その発現は悪性であるが、十分には分化されていない腫瘍であり、腫瘍血管との関連があることから悪性腫瘍生物学、血管形成の双方を理解する上で重要な標的となっているだけでなく、癌の治療標的又はマーカーでもある。
【０１０６】
標的指向部分は、腫瘍細胞又は腫瘍血管系表面分子に結合することができるポリペプチドであることが好ましい。上記に挙げたものと同様、知られている、又は利用可能となった他のこのような表面分子もまた、第１の配列によって標的化できる。
【０１０７】
表面分子に結合する分子を同定するために従来の蛋白質結合アッセイが適用できることは理解されるであろう。また、表面分子に結合する配列を開発するための構造に基づいた薬剤デザインが適用できることも理解されよう。
【０１０８】
標的分子を同定するために、合成化合物に対する上記のような高スループットスクリーニングも使用できる。
【０１０９】
本発明は、標的に結合できる中和性抗体が標的との結合に関して試験化合物と特異的に競合する競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も考慮している。
【０１１０】
結合相手（ＢＰ）
標的指向部分は、一般に１個または複数の結合ドメインを含むか又はそれで構成されている表面分子に対して、結合相手（ＢＰ）の形態をとる。
【０１１１】
リガンド
本発明の標的指向部分はリガンドの形態をとることができる。前記リガンドは、天然又は合成となり得る。用語「リガンド」は、また化学的に修飾されたリガンドも言う。ＢＰの１つ以上の結合ドメインは、例えば、受容体に対する天然リガンドからなってもよく、その天然リガンドは、前記受容体に結合親和性を保持している接着分子、又は増殖因子受容体リガンド（例えば、表面増殖因子）又は天然リガンドの断片となり得る。
【０１１２】
合成リガンドとしては、デザイナーリガンド類が挙げられる。本明細書で用いられる用語「デザイナーリガンド類」とは、受容体の形状と対比される三次元的形状に基づいて受容体と結合しやすい試剤を言う。
【０１１３】
抗体
或いは、結合ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変部位の重鎖配列及び軽鎖配列に由来してもよい。このような可変部位は、天然ヒト抗体又はげっし動物の抗体などの他の種からの抗体に由来し得る。或いは、前記可変部位は、ヒト化抗体などの設計抗体、若しくは免疫化又は非免疫化動物又は変異誘発ファージディスプレイライブラリーからのファージディスプレイライブラリーに由来し得る。第２の代替として前記可変部位は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来し得る。前記ＢＰは、多量体得るため、又は結合ドメイン間のスペーサーとして作用するための他の配列、若しくはＩｇヒンジ配列又は新規スペーサーなどのＢＰをコードする遺伝子内で制限部位の挿入から生じた配列及び設計リンカー配列を含有し得る。
【０１１４】
前記ＢＰは、１つ以上の免疫グロブリン可変部位に加えて、Ｉｇ重鎖不変部位の全部又は一部を含むことができ、したがって、天然Ｉｇの全体、設計Ｉｇ、又は設計Ｉｇ様分子、一本鎖Ｉｇ又は一本鎖Ｉｇ様分子を含むことができる。或いは、若しくはそれに加えて、前記ＢＰは、トキシンなど他の蛋白質からの１つ以上のドメインを含有できる。
【０１１５】
本明細書に用いられる「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなる蛋白質を言う。抗体は、完全な免疫グロブリン、又は種々のペプチダーゼ類による消化によって産生した十分に特定された断片などの多数の断片として存在し得る。種々の抗体断片が完全な抗体の消化に関して規定しているが、抗体断片が化学的に、又は組み替えＤＮＡの方法論を利用して、新規に合成できることを当業者は理解するであろう。したがって、本明細書において抗体という用語は、完全抗体の修飾によって産生した、又は組み替えＤＮＡの方法論を利用して、新規に合成された抗体断片も含む。用語「抗体」の使用に包含された抗体断片としては、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ完全体、及びＦｄ断片が挙げられる。
【０１１６】
本発明はまた、単クローン抗体又は多クローン抗体を表面蛋白質に提供する。したがって、本発明のポリペプチドに対する単クローン抗体又は多クローン抗体を産生する方法をさらに提供する。
【０１１７】
多クローン抗体が望まれる場合は、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、エピトープ（類）を担持する免疫原生ポリペプチドによって免疫化する。免疫化した動物の血清を採取し、知られた操作によって処理する。エピソープに対する多クローン抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合は、この多クローン抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。多クローン抗血清の産生と加工の技術は、当業界に知られている。このような抗体が製造できるように、本発明は、動物又はヒトにおける免疫原として使用するための、他のポリペプチドに対して部分抗原化した本発明のポリペプチド又はその断片も提供する。
【０１１８】
ポリペプチド内の細胞表面結合性エピトープに向けられた単クローン抗体もまた、当業者により容易に製造できる。ハイブリドーマにより単クローン抗体を製造する一般的方法論はよく知られている。永続性の抗体産生細胞系は、細胞融合及び腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接的形質転換又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスによるトランスフェクションなどの他の方法によっても創製できる。エピトープ類に対して産生された単クローン抗体の一群を種々の性質、すなわちイソタイプやエピトープ親和性に関してスクリーニングできる。
【０１１９】
代替法としては、例えば、多様な相補性決定部位（ＣＤＲ類）を有する膜の表面に、ファージがｓｃＦｖ断片を発現するファージディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。この方法は当業者によく知られている。
【０１２０】
本発明の目的のため、用語「抗体」は、反する特記がされない限り、標的抗原に対する結合活性を保持する完全抗体の断片を含む。上記のように、このような断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。さらに、前記抗体とその断片は、例えば、ＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されたヒト化抗体となり得る。
【０１２１】
スクリーニング
一態様において、本発明は腫瘍又は腫瘍血管系細胞表面分子に結合することできる試剤をスクリーニングする方法に関するものであって、この方法は、前記細胞表面分子と試剤とを接触させ、前記試剤が、前記細胞表面分子と結合するかどうかを決定することを含む。
【０１２２】
本明細書に用いられている用語「試剤」としては、限定はしないが、天然又は非天然の任意の好適な供給源から得ることのできる若しくはそれらにより産生できる試験化合物などの化合物が挙げられる。前記試剤は、設計されるか、又はペプチド類並びに小型の有機分子などの他の化合物、特に新規の主要化合物を含み得る化合物のライブラリーから入手できる。例えば、前記試剤は、細菌、真菌、又は動物（特に哺乳動物）細胞又は組織から製造される天然物質、生物高分子又は抽出物、有機又は無機分子、合成試験化合物、半合成試験化合物、構造的又は機能的模倣物、ペプチド、ペプチド模倣物、試験化合物の誘導体、完全蛋白質から開裂したペプチド又は合成的に（例えば、ペプチド合成器を用いてなど）又は組み換え法により、又はそれらの組合せにより合成されたペプチド類、組み換え試験化合物、天然又は非天然試験化合物、融合蛋白質又はその等価物及び変異体、それらの誘導体又は組合せとなり得る。
【０１２３】
前記試剤は、アミノ酸配列又はその化学的誘導体となり得る。前記物質は、有機化合物又は他の化学物質となり得る。前記試剤はさらにヌクレオシド配列でもよく、それはセンス配列でもアンチセンス配列でもよい。
【０１２４】
蛋白質
用語の「蛋白質」は、一本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合的手段又は非共有結合的手段によって結合している複数のポリペプチド複合体を含む。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸長さ、典型的には５、１０、又は２０個のアミノ酸長さのペプチドを含む。
【０１２５】
ポリペプチド相同体
本発明に用いられるポリペプチド配列は特定の配列又はその断片に限定されず、任意の供給源から入手される相同配列、例えば、関連ウィルス／細菌蛋白質、細胞相同体及び合成ペプチド類並びにそれらの変異体又は誘導体も含むことは理解されよう。本発明のポリペプチド配列は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドも含む。
【０１２６】
ポリペプチド変異体、誘導体及び断片
本発明のアミノ酸配列に関連する用語「変異体」又は「誘導体」は、好ましくは、標的活性、好ましくは配列表に示されたポリペプチドの少なくとも２５％から５０％の前記活性、より好ましくは実質的に同一の前記活性を有するアミノ酸配列を結果として提供する配列からの、又はその配列への、１個（又はそれ以上）のアミノ酸の置換、変化、修飾、交換、削除又は添加を含む。
【０１２７】
このように、本発明における使用のために配列は修飾できる。典型的には、配列の活性を維持する修飾がなされる。例えば、一実施形態において、アミノ酸置換は修飾された配列が少なくとも２５％から５０％の前記活性、又は実質的に同一の活性を保持するという条件で１、２、又は３から１０、２０、又は３０の置換を行うことができる。しかし、代わりの実施形態において、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列への修飾は、前記ポリペプチドの生物活性を意図的に低下させるために行うことができる。例えば、標的分子に結合する能力は残しているが、機能的エフェクタードメインを欠いている端を切り取ったポリペプチドが有用なことがある。
【０１２８】
一般に、配列表に示された相当する部位に比して変異体又は誘導体のアミノ酸残基の、好ましくは、２０％、１０％又は５％未満を変更する。
【０１２９】
アミノ酸置換は、例えば、治療に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増加させるために、非天然類縁体の使用を含んでもよい（治療に使用されるペプチド誘導体の産生に関するさらなる詳細については下記を参照）。
【０１３０】
保存的変換は、例えば、下表によって行うことができる。２段目の同一ブロック、好ましくは３段目の同一行のアミノ酸は互いに置換してもよい。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
本発明のポリペプチドは、上記ペプチド類の断片及び配列断片を含むその変異体も含む。好ましい断片としては、エピトームを含むものが挙げられる。好適な断片は少なくとも５、例えば１０、１２、１５又は２０個のアミノ酸長である。それらは、また２００、１００又は５０個のアミノ酸長となり得る。蛋白質並びにその対立変異体及び種変異体のポリペプチド断片は保存置換を含めて１つ以上の（例えば、２、３、５又は１０の）置換、削除又は挿入を含有し得る。置換、削除及び／又は挿入が、例えば、組み換え技術によって行われた場合、配列表に示されたアミノ酸残基の２０％、１０％又は５％未満を変更することが好ましい。
【０１３３】
本発明の蛋白質は、典型的には、例えば、下記のような組み換え法によって作製される。しかしながら、それらは、固相合成などの当業界によく知られた技術を用いた合成法によっても作製できる。ペプチド類を化学合成する種々の技術は、Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ  １８：２４３〜２５１頁により調査されており、詳細は、本明細書に含まれた文献に記載されている。
【０１３４】
治療用ペプチド類
本発明のペプチド類は、患者に対し、治療用に投与し得る。例えば、免疫原生を低下させるため、患者体内での循環半減期を増加させるため、生物学的利用能を高めるため、及び／又は有効性及び／又は特異性を高めるために、単に天然アミノ酸からなるのではなく、修飾したペプチドを用いることが好ましい。
【０１３５】
治療適用に、ペプチドを修飾するための多くの方法が用いられてきた。１つの方法は、ペプチド又は蛋白質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの様々なポリマー類に結合させることである。例えば、米国特許第５，０９１，１７６号、米国特許第５，２１４，１３１号、米国特許第５，２６４，２０９号を参照されたい。
【０１３６】
天然アミノ酸とＤ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの様々な未コード化アミノ酸又は修飾アミノ酸との交換もまた、ペプチド修飾に使用できる。
【０１３７】
他の方法は、３−（２ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノン酸スクシンイミジル及び６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノン酸スルホスクシンイミジルなどの二官能性架橋剤を使用することである（米国特許第５，５８０，８５３号を参照）。
【０１３８】
本発明のペプチドのコンホメーションが束縛されている誘導体を用いることが望ましい。コンホメーションの束縛は、安定性及びペプチドがとる三次元形状の好ましいコンホメーションに関連している。コンホメーションの束縛としては、ペプチド内の１つの残基のコンホメーション移動性制限などの局所束縛、いくつかの二次構造単位を形成し得る残基群のコンホメーション移動性制限などの部位束縛、及びペプチド構造全体などの全体的束縛が挙げられる。
【０１３９】
ペプチドの活性コンホメーションは、環化などの共有的修飾により、又はγラクタムの組み込み、又は他のタイプの架橋により安定化し得る。例えば、相互作用部位の両側にＬ−γラクタム部分を創製するために、側鎖を骨格に環化できる。一般的には、Ｈｒｕｂｙら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：２５９〜３４５頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．１９９２年）を参照されたい。また、環化は、例えばシステイン架橋の形成、各々の末端アミノ酸のアミノ基と末端カルボキシル基とのカップリング、若しくはＬｙｓ残基又は関連相同体のアミノ基とＡｓｐ、Ｇｌｕ又は関連相同体のカルボキシル基とのカップリングによっても達成できる。ヨード酢酸無水物を用いてポリペプチドのαアミノ酸とリジン残基のεアミノ基とのカップリングも行われる。Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ、１９９２年、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５３３〜３９頁を参照されたい。
【０１４０】
米国特許第５，８９１，４１８号に記載された他の方法は、ペプチド構造に金属イオン錯体骨格を含めることである。典型的には、好ましい金属ペプチド骨格は、所与の錯体金属イオンの配位球に必要な特定の配位基の必要数に基づく。一般に有用であることが証明し得る多くの金属イオンは４から６の配位数を有する。ペプチド鎖中の配位基の種類としては、アミン、アミド、イミダゾール、又はグアニジン官能基の窒素原子；チオール類又はジスルフィド類の硫黄原子；及びヒドロキシ、フェノール、カルボニル、又はカルボキシ官能基の酸素が挙げられる。また、ペプチド鎖又は個々のアミノ酸は、例えば、オキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、又はモルホリノなどの配位基を含むように化学的に変化させることができる。ペプチド構築物は線状又は環状となり得るが、典型的には線状構築物が好ましい。小型の線状ペプチドの一例は、主鎖に４個の窒素（Ｎ４錯体化システム）を有し、配位数４を有する金属イオンと錯体化し得る、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。
【０１４１】
治療用ペプチドの性質を改善するさらなる方法は、非ペプチドのペプチド模倣物の使用である。ペプチドの正確な構造を明らかにするために様々な有用な方法が使用し得る。これらの方法としては、アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、質量分析、核磁気共鳴分析、コンピュータ支援分子モデリング、ペプチドマッピング及びこれらの組合せが挙げられる。ペプチドの構造分析は一般に、ペプチドのアミノ酸配列、並びにその原子成分の三次元配置を含む膨大なデータを提供する。この情報から、治療活性にとって必要な化学的機能性を有するが、より安定な、例えば、生物学的分解に対し、より感受性の低い非ペプチドのペプチド模倣物を設計できる。この方法の一例は、米国特許第５，８１１，５１２号に提供されている。
【０１４２】
本発明の治療用ペプチドを化学合成する方法は、上記の文献に記載されており、又、Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ１８：２４３〜２５１によっても調べられ、その中に含まれる文献に詳述されている。
【０１４３】
二官能性誘導体
本発明のさらなる態様は、腫瘍抗原又は他の腫瘍血管形成マーカー類、例えばα−インテグリン類、メタロプロテイアーゼ類又は血管増殖因子或いは抗テネイシン抗体又は抗フィブロネクチンＥＤＢドメインなどの細胞マトリックスの成分に向けられた抗体又はその断片に対してＴＴＭで修飾されたサイトカイン類が抗体又はその断片と複合している二官能性誘導体によって提供される。胃線癌及び卵巣線癌によって発現する腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するＴＮＦとｍＡｂのヒンジ部との間の融合蛋白質の調製が最近報告された。
【０１４４】
本発明のさらなる態様は、ビオチン／アビジン系による腫瘍前標準化によって提供される。この方法によると、三次複合体が腫瘍の抗原性部位に種々の段階で得られるが、それは以下のものによって形成される：１）ビオチン化ｍＡｂ、２）アビジン（又はストレプトアビジン）及び３）ＴＴＭ及びビオチンで修飾された二価サイトカイン。免疫複合体による従来の標的化に比して予備標的化法は、標的に向かう活性分子の比率を実際に増加させ、活性分子を遊離し、したがって治療毒性を低下させることができることを多数の論文が証明した。この方法は、通常のＴＮＦが不活性の条件下、インビトロ細胞毒性を誘導し、腫瘍細胞増殖を低下させる能力のあるビオチン化ＴＮＦによって良好な結果を生じた。予備標的化法はまた、腫瘍抗原と修飾サイトカインに同時に結合する二重特異性抗体を用いて、二段階操作で実施できる。癌胎児性抗原及びＴＮＦに対して方向付けられた二重特異性抗体の利用は最近、ＴＮＦ腫瘍予備標的化の手段として記載された。
【０１４５】
さらなる実施形態により、本発明は、抗体又はその断片が、腫瘍細胞に発現した抗原又は他の腫瘍支質成分、例えば、テネイシンやフィブロネクチンＥＤＢドメインに対して方向付けされている、種々のＴＮＦサブユニット上でＴＴＭと抗体、又はその断片双方に複合したサイトカイン（直接的に、又はビオチンアビジン架橋を介して間接的に）を含む。このことにより、修飾サイトカインの腫瘍方向付け特性のさらなる改善と三量体−単量体−三量体遷移によって、腫瘍ミクロ環境内での修飾サイトカインの緩やかな放出をもたらす。例えば、ＴＮＦ複合体の修飾サブユニットは、標的複合体から脱会合し、非修飾三量体ＴＮＦ分子を形成するために再会合し、次に腫瘍ミクロ環境内に拡散する。生物活性ＴＮＦの遊離は、標的化後２４〜４８時間以内に生じることが示されている。
【０１４６】
リポソームの形態でのサイトカイン類の調製は、その生物活性を向上させることができる。事実、ＴＮＦアミノ基のアシル化が、インビトロで生物活性の損失なしにその疎水性増大を誘導することが認められている。さらに脂質に結合したＴＮＦはインビトロの細胞毒性、免疫調節作用に影響を与えず、インビボで毒性を低下させたことが報告されている。
【０１４７】
ポリヌクレオチド類
本発明に使用するポリヌクレオチド類は、本発明のポリペプチド複合体をコードする核酸配列を含む。遺伝コードの縮重の結果、多数の異なったポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードできることは当業者に理解されるであろう。さらに、本発明のポリペプチドを発現すべきいずれか特定の宿主生物のコドン使用を反映させるために、本発明のポリヌクレオチド類にコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を、当業者が慣例的方法を用いて実施できることを理解すべきである。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチド類はＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖、又は二本鎖となり得る。また、それらは、中に合成又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチド類に対する多数の異なったタイプの修飾が当業界に知られている。これらには、ホスホン酸メチル骨格やホスホロチオアート骨格、分子の３’及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書に記載されたポリヌクレオチドは当業界で利用できる方法によって修飾できることを理解すべきである。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性を高める、又は寿命を延ばすために実施できる。
【０１４９】
ヌクレオチドベクター類
本発明のポリヌクレオチドは、複製可能な組み換えベクター内へ組み込むことができる。前記ベクターは、適合性宿主細胞内の核酸を複製するために使用できる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター内に導入し、そのベクターを適合性宿主細胞内へ導入し、そのベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリヌクレオチド類を製造する方法を提供する。このベクターは宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞系及び他の真菌細胞系、例えば昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【０１５０】
ベクター内の本発明ポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することのできる制御配列に作動可能に結合していること、すなわち、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。用語の「作動可能に結合している」とは、前記の構成要素が、意図するように機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に結合している」調節配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で結合している。
【０１５１】
制御配列により支配される転写レベルが転写モジュレーターに対してより良く応答するように、制御配列は、例えば、さらなる転写調節要素の付加により修飾できる。
【０１５２】
本発明の蛋白質を発現するために、本発明のベクター類は、下記の好適な宿主細胞内へ形質転換又はトランスフェクションをすることができる。この方法は、上記の発現ベクターによって形質転換した宿主細胞を、蛋白質をコードするコード配列をベクターにより発現する条件下で培養すること、及び場合によっては、発現した蛋白質を回収することを含む。
【０１５３】
前記ベクターは、例えば複製源、場合によっては前記ポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、及び場合によっては、前記プロモーターの調節因子を備えたプラスミド、又はウィルスベクターとなり得る。前記ベクターは１種又は複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン抵抗性遺伝子、又は哺乳動物ベクターでのネオマイシン抵抗性遺伝子を含有できる。ベクターは、例えば宿主細胞のトランスフェクション又は形質転換のために利用できる。
【０１５４】
本発明の蛋白質をコードする配列に、作動可能に結合している制御配列は、プロモーター類／エンハンサー類及び他の発現調節シグナル類を含む。これらの制御配列は、宿主細胞に適合するように選択でき、この宿主細胞の中で利用されるように発現ベクターが設計される。用語「プロモーター」は当業界でよく知られており、サイズと複雑さにおいて、最小のプロモーターから上流の要素及びエンハンサー類などのプロモーターまでの範囲の核酸部位を包含する。
【０１５５】
原核プロモーター及び他の真核細胞において機能的プロモーターが使用できるが、典型的には、プロモーターは哺乳動物において機能的なプロモーターから選択される。プロモーターは典型的には、ウィルス又は真核遺伝子のプロモーター配列から誘導される。例えば、発現を生じさせる細胞のゲノムから誘導されるプロモーターとなり得る。真核プロモーターに関しては、それらは、遍在的に（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターなど）、或いは組織特異的に（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなど）機能するプロモーターであってもよい。ある一定の細胞に特異的な組織特異性プロモーターも使用できる。それらはまた、特定の刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターとなり得る。ウィルスプロモーター、例えばモロニーネズミ白血球ウィルスの長端末反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、又はヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターもまた使用できる。
【０１５６】
非相同遺伝子の発現レベルを細胞の寿命の間、調節できるようにプロモーターを誘導できることも有利となり得る。誘導できるとは、プロモーターを用いて得られた発現レベルが調節できることを意味する。
【０１５７】
また、これらのプロモーターはいずれも、さらなる調節配列、例えば、エンハンサー配列の付加により修飾できる。上記の２種以上の異なったプロモーターからの配列要素を含むキメラプロモーターも使用できる。
【０１５８】
宿主細胞
ベクター／ポリヌクレオチドを複製し、及び／又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされた本発明の蛋白質を発現させるために、本発明のベクター及びポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる。本発明の蛋白質は宿主細胞として原核細胞を用いて産生できるが、真核細胞、例えば酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞、特に哺乳動物の細胞を用いることが好ましい。
【０１５９】
本発明のベクター／ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換、及び電気穿孔法などの当業界に知られた種々の方法を用いて、好適な宿主細胞内へ導入できる。本発明のベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの方法、例えば、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス及びアデノウィルスなどの組み換えウィルスベクターによる感染、核酸の直接注入及び微粒子銃法形質転換が当業界に知られている。
【０１６０】
蛋白質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の蛋白質を発現させるために使用できる。宿主細胞は、本発明の蛋白質が発現できる好適な条件下で培養できる。本発明の蛋白質の発現は、継続的に産生されるように構成的であるか、又は誘導的で、発現の開始に刺激を必要としてもよい。誘導発現の場合、例えば、培養培地に誘導物質、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧの添加により、必要な時に開始できる。
【０１６１】
本発明の蛋白質は、酵素的、化学的及び／又は浸透圧的な溶解並びに当業界に知られた種々の方法によって宿主細胞から抽出できる。
【０１６２】
投与
本発明の蛋白質は、本発明の組成物を産生するために、種々の成分と組み合わせることが好ましい。前記組成物は、製薬組成物（ヒト又は動物用でもよい）を産生するために、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせることが好ましい。好適な担体及び希釈剤として、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類液が挙げられる。賦形剤についての詳細は、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、編集者Ｗａｄｅ  ＆  Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに見ることができる。本発明の組成物は、直接注射により投与できる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口又は経皮投与のために製剤化できる。典型的には、各蛋白質は、０．５ｎｇ／ｋｇから５００ｎｇ／ｋｇ、好ましくは１ｎｇ／ｋｇから５０ｎｇ／ｋｇ、より好ましくは５ｎｇ／ｋｇから１５ｎｇ／ｋｇの範囲の用量で投与できる。
【０１６３】
他の態様において、本発明は前記複合体又はその代謝物が、治療する患者の血漿に、約３５，０００ｎｇ／日以下、好ましくは約３，５００ｎｇ／日以下、より好ましくは約１，０００ｎｇ／日以下の量で供給されるような量で存在する複合体を含む製薬組成物を提供する。
【０１６４】
前記投与量は、７０ｋｇの患者に対する投与量に関する。当業者は、７０ｋｇ以外の重さを有する患者に対して前記に挙げた投与量を容易に変更できると考えられる。
【０１６５】
１日当たりの投与量は、患者に投与される投与量を、予想された投与期間（日数）で割って計算される。予想された投与期間は、典型的には次の投与までの期間、その投与量が有効であるべき期間、又はその投与量が有効であることが必要とされる期間になる。
【０１６６】
前記複合体は、典型的には、約１ｍｇから約１０ｍｇの用量で投与できる。
【０１６７】
前記組成物は、毎日の、週ごとの、又は月ごとの投与が所望の１日用量を提供するように製剤化できる。前記組成物は、２、４、６、８、１０又は１２時間ごとなど、より少ない回数で投与されるように便利に製剤化し得ることは理解されるであろう。
【０１６８】
ポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド／ベクターは裸の核酸構築体として直接投与できるが、好ましくはさらに、宿主細胞ゲノムに対し相同なフランキング配列を含む。
【０１６９】
哺乳動物細胞による裸の核酸構築体の取り込みは、いくつかの知られたトランスフェクション法、例えばトランスフェクション剤の使用などの方法によって増加する。これらの試剤の例としては、カチオン性試剤（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン）及びリポフェクタント類（例えば、リポフェクタム（商標）及びトランスフェクタム（商標））が挙げられる。組成物を産生するために、典型的には核酸構築体をトランスフェクション剤と混合する。
【０１７０】
製薬組成物を製造するために、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを製薬上許容できる担体又は希釈剤と組み合わせることが好ましい。好適な担体及び希釈剤として、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類液が挙げられる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与のために製剤化できる。
【０１７１】
熟練した実務医であれば具体的な患者及び状態のための最適な投与経路及び用法用量を容易に決定できるであろうから、前記の投与経路及び用法用量は、単なる指針として意図している。
【０１７２】
ウィルスベクター
好ましい実施形態において、前記複合体は、ウィルスベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いて投与される。
【０１７３】
レトロウィルス
本発明に使用するレトロウィルスベクターは、任意の好適なレトロウィルスから誘導され得るか、又は誘導可能となり得る。多数の種々のレトロウィルスが同定されている。例としては、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウィルス、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、ウマ伝染性貧血症ウィルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウィルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウィルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウィルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンネズミ白血病ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄球腫症ウィルス−２９（ＭＣ２９）及び鳥類赤芽球腫症ウィルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウィルスのより詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら、１９９７年、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、編集者：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁に見ることができる。
【０１７４】
いくつかのレトロウィルスのゲノム構造の詳細を当業界で見ることができる。例えば、ＨＩＶとＭｏ−ＭＬＶの詳細は、ＮＣＢＩジーンバンクから見られる（ゲノムアクセッション番号は、それぞれＡＦ０３３８１９及びＡＦ０３３８１１）。
【０１７５】
レトロウィルスは、大きく２つの種類、すなわち「単純」と「複雑」に分けることができる。レトロウィルスはさらに７つの群に分けることができる。これらの群のうち５つの群は、腫瘍形成可能性を有するレトロウィルスである。残りの２つの群は、レンチウィルスとスプーマウィルスである。これらのレトロウィルスの調査がＣｏｆｆｉｎら、１９９７年（同書）に示されている。
【０１７６】
レンチウィルスの群は、さらに「霊長目」と「非霊長目」に分けることができる。霊長目レンチウィルスの例としては、ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長目レンチウィルス群としては、プロトタイプの「スローウィルス」であるビスナ／マエディウィルス（ＶＭＶ）並びに関連のヤギ関節炎−脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血症ウィルス（ＥＩＡＶ）、又、最近記載されたネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）が挙げられる。
【０１７７】
本発明は、ヌクレオチド配列の形態で複合体を、造血幹細胞（ＨＳＣ）へ送達するためのベクターの使用にも関連する。
【０１７８】
遺伝子移入は、１種又は複数のヌクレオチド配列及びそれらの発現を制御する配列から作成された発現カセットをＨＳＣ類などの標的細胞へ送達することを含む。これは、カセットが実験室内で細胞に移入され、次に修飾された細胞が受容者に投与される手順でエクスビボで実施できる。或いは、遺伝子移入は、発現カセットが個体内の細胞に直接移入される手順でインビボで実施できる。両方とも、その移入過程は、適切な細胞内部位へのカセット移入を助けるベクターによって通常補助される。
【０１７９】
骨髄は、形質導入のための伝統的なＨＳＣ源であったが、最近の研究により、末梢血幹細胞又は臍帯血細胞が等しく良好な、又はより良好な標的細胞となり得ることが示唆された（Ｃａｓｓｅｌら１９９３年Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２１：５８５〜５９１頁；Ｂｒｅｇｎｉら１９９２年Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８〜１４２２頁；Ｌｕら１９９３年Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７８：２０８９〜２０９６頁）。
【０１８０】
さらなる抗癌剤
本発明の複合体は、１種又は複数の細胞毒性剤などの１種又は複数の他の活性剤と併用できる。したがって、本発明の一態様では、本法は、細胞毒性剤などの他の有効製薬成分を、前記複合体との組合せ剤形で、又は別の剤形で投与することをさらに含む。このような別の細胞毒性剤の剤形としては、経口固体、経口溶液、シロップ、エリキシル、注射用、経皮、経粘膜又は他の剤形を挙げることができる。前記複合体及び他の有効な製薬成分は、１つの剤形に組み合わせるか、或いは、一緒に又は順に使用できる別々の剤形で供給することもできる。
【０１８１】
本発明に使用できる細胞毒性剤の例としては、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ズスルファン、ロムスチン、カルムスチン、クロルメチン（ムスチン）、エストラムチン、トレオスルファン、チオテパ、ミトブロニトルなどのアルキル化剤；ドキソルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン（ミトザントロン）、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、及びマイトマイシンなどの細胞毒性抗生物質；ミトトレキサート、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、フルオロウラシル、ラルチトレキセド、メルカプトプリン、テガフール、及びチオグアニンなどの抗代謝剤；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどのビンカアルカロイド類及びエトポシド；アムサクリン、アルトレタミン、クリサンタスパーゼ、ダカルバジン、及びテモゾロミドなどの他の腫瘍用薬剤、ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシ尿素）、ペントスタチン、白金化合物のカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンなど、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、ラゾキサン、タキサン類のドセタキセル、パクリタキセルなど、トポイソメラーゼＩ阻害剤のイリノテカン、トポテカンなど、トラスツズマブ及びトレチノインが挙げられる。
【０１８２】
好ましい実施形態において、さらなる細胞毒性剤は、ドキソルビシン、メルファラン又はシスプラチンである。
【０１８３】
本発明の複合体は、診断目的の化合物に対する腫瘍細胞及び腫瘍血管の透過性を利用するためにも使用できる。例えば、前記複合体は、放射免疫シンチグラフィ又は腫瘍の放射線療法において、腫瘍による放射標識抗体又は放射標識ホルモン（腫瘍画像形成化合物）の取り込みを増加させるために利用できる。
【０１８４】
図面及び実施例
本発明を以下の非限定的な実施例と図を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【０１８５】
腫瘍細胞系及び試剤
マウスのＢ１６Ｆ１黒色腫細胞及びＲＭＡ−Ｔリンパ腫細胞を前記のとおり培養した（１４、１５）。産生されたＭＡｂ６Ｇ１（ラット抗ｐ７５ｍＴＮＦ受容体アンタゴニスト）を前記のとおり特定した（１６、１７）。ＭＡｂＶ１ｑ（ラット抗ｍＴＮＦ）は、Ｄ．Ｍａｎｎｅｌ博士（ドイツ国レーゲンスブルク大学）より恵与された。メルファラン（アルケラン）は、Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ（英国ロンドン）から入手した。ドキソルビシン（アドリブラスチナ）は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ（イタリー国ミラノ）から購入した。
【実施例２】
【０１８６】
ヒト及びマウスのＴＮＦ及びＮＧＲ−ＴＮＦの調製
ヒト及びマウスのＴＮＦ及びＮＧＲ−ＴＮＦ（ＣＮＧＲＣＧのＣ末端と融合させたＴＮＦからなる）を、（１４）に記載されたとおり組み換えＤＮＡ法により調製し、大腸菌細胞抽出物から精製した。クロマトグラフィー段階で用いた溶液はすべて滅菌したエンドトキシンのない水であった（Ｓａｌｆ、イタリー国ベルガモ）。蛋白質濃度は、市販の蛋白質定量アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）で測定した。Ｌ−Ｍマウス線維芽細胞（１８）による標準的細胞可溶性アッセイから予想したヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）のインビトロ細胞可溶性活性は５．４×１０７単位／ｍｇであり、一方、精製ＮＧＲ−ｈＴＮＦのそれは１．４×１０８単位／ｍｇであった。マウスＴＮＦ（ｍＴＮＦ）の細胞可溶性活性は、７．６×１０７単位／ｍｇであり、一方、ＮＧＲ−ｍＴＮＦのそれは９．１×１０７単位／ｍｇであった。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン国）上ゲルろ過クロマトグラフィーにより、ＮＧＲ−ｍＴＮＦ、ＮＧＲ−ｈＴＮＦ及びｍＴＮＦの流体力学的体積は、相同三量体蛋白質であるｈＴＮＦ（１９）と同様であった。各生成物の電気スプレー質量分析により、以下の分子量が測定された：ＮＧＲ−ｈＴＮＦ、１７９３７．６±１．９Ｄａ（ＣＮＧＲＣＧ−ｈＴＮＦ１〜１５７単量体についての予想値１７９３９．４Ｄａ）；ｈＴＮＦ、１７３４９±１．３（ｈＴＮＦ１〜１５７についての予想値１７３５０．７）；ＮＧＲ−ｍＴＮＦ、１７８４１．１６±２．５（ＣＮＧＲＣＧ−ｍＴＮＦ１〜１５６についての予想値１７８４４．２）、ｍＴＮＦ、１７３８４．９±２（Ｍｅｔ−ｍＴＮＦ１〜１５６についての予想値１７３８６．７）。定量的色素産生カブトガニ変形細胞ライゼート（ＬＡＬ）試験（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を用いて測定した各生成物のエンドトキシン含量は、ＮＧＲ−ｈＴＮＦ、０．０７９単位／μｇ；ｈＴＮＦ、０．１１７単位／μｇ；ＮＧＲ−ｍＴＮＦ、０．０８２単位／μｇ；ｍＴＮＦ、１．６１単位／μｇであった。
【実施例３】
【０１８７】
インビボ試験
動物モデルに対する研究は、Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会により承認され、規定されたガイドラインに従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリー国カルコ）（１６〜１８ｇ）を５×１０４ＲＭＡ−Ｔ又はＢ１６Ｆ１生細胞の各々で、左腹皮下注射により誘発した。４〜１２日後、マウスをＴＮＦ又はＮＧＲ−ＴＮＦ溶液（１００μｌ）で処理し、その２時間後、メルファラン又はドキソルビシン溶液（１００μｌ）を投与した。特記しない限り、薬剤はすべて腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与した。０．９％塩化ナトリウムだけで希釈したドキソルビシンを除くすべての薬剤は、１００μｇ／ｍｌのエンドトキシンのないヒト血清アルブミン（Ｆａｒｍａ−Ｂｉａｇｉｎｉ、イタリア国ルッカ）を含む０．９％塩化ナトリウムで希釈した。腫瘍の増殖は、以前記載したとおり（２０）、カリパスで腫瘍を測定することにより毎日モニターした。腫瘍が直径１．０〜１．５ｃｍに達する前にマウスを殺処理した。腫瘍サイズは平均±ＳＥ（５匹／群）として示してある。
【実施例４】
【０１８８】
可溶性ＴＮＦ受容体アッセイ
マウス血清中の可溶性ｐ５５−ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ１）及び可溶性ｐ７５−ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ２）を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍキット（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ５５４１３）を用いて測定した。
【実施例５】
【０１８９】
腫瘍中ドキソルビシンの検出
Ｂ１６Ｆ１腫瘍又はＲＭＡ−Ｔ腫瘍（直径０．５〜１ｃｍ）を有するＣ５７／ＢＬ６マウスを、ＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ、ｉ．ｐ．）で処理するか、又は処理なしで、２時間後、ドキソルビシン（３２０μｇ、ｉ．ｐ．）で処理した。２時間後、マウスを殺処理し、腫瘍を切除した。各腫瘍を秤量し、固まりを解き、冷リン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）中に再懸濁し、７０μｍフィルターを通してろ過した。細胞を冷ＰＢＳ（５０ｍｌ）によって再懸濁し、遠心分離し（１５００ｒｐｍ、１０分、４℃）、冷ＰＢＳ（２．５ｍｌ／腫瘍組織１ｇ）中に再懸濁し、新鮮調製した８％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（２．５ｍｌ／組織１ｇ）と混合した。前記細胞を４℃で暗所に一晩保存してから、ＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、未処理腫瘍から回収した細胞で較正した。次に各試料をＦＬ−３ろ過器及びＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて解析した。
【実施例６】
【０１９０】
マウスのリンパ腫モデルにおけるＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦの用量応答曲線
先ず、化学療法剤不在下で、ＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦの抗腫瘍活性を特定した。ＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦの用量応答曲線を比較するため、本発明者らは、ＲＭＡ−Ｔリンパ腫又はＢ１６Ｆ１黒色腫を有するマウスに対し、種々の用量（０．０１ｎｇから１００００ｎｇ）でのＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦの単回投与又は反復投与（ｉ．ｐ．）に基づくいくつかの実験を行った。単回投与（図１Ａ）又は反復投与（図１Ｂ）のいずれによっても、高用量（１００００ｎｇ）で投与された時に、マウスＴＮＦは腫瘍増殖を遅延化し（図１Ａ）、１００ｎｇ未満の用量では効果が誘発されなかった。ＮＧＲ−ｍＴＮＦは際立って、より強力であった。この場合、僅か０．０１ｎｇの低用量で抗腫瘍効果が見られた（図１Ａ、Ｂ）。しかし、用量応答曲線はより複雑である。例えば、驚くべきことに、１０ｎｇの効果は、０．０１ｎｇ〜０．１ｎｇの効果、及び１０００〜１００００ｎｇの効果よりも低かった。ＲＭＡ−Ｔモデル並びにＢ１６Ｆ１黒色腫モデルにおいて行われたいくつかの他の実験において、釣鐘型の用量応答曲線が見られた（示していない）。これらの結果は以下のことを示唆している：１）低用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦの有効性は、ｍＴＮＦの有効性よりも際立って高いこと、そして２）１〜１０ｎｇより多い用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦは、その潜在的腫瘍活性を阻害する負のフィードバック機構を活性化すること。
【実施例７】
【０１９１】
ピコグラムではなくナノグラム用量のＮＧＲ−ＴＮＦが可溶性ＴＮＦ受容体の流出を誘発する。
次にＮＧＲ−ｍＴＮＦの釣鐘型用量応答曲線の原因となる防御機構を調べた。外来投与ＴＮＦがインビボでの可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒｓ）流出を誘発するため（２１）、１０ｎｇのＮＧＲ−ＴＮＦのより低い有効性は、ＴＮＦ−Ｒ１及び／又はｓＴＮＦ−Ｒ２の誘発、そして結果的に膜受容体との相互作用の中和化に関連すると本発明者らは仮定した。
【０１９２】
この仮定を試験するため、種々の用量のｍＴＮＦ及びＮＧＲ−ｍＴＮＦ投与１時間後に採取した、腫瘍を有するマウス血清中のｓＴＮＦ−Ｒ１及びｓＴＮＦ−Ｒ２を測定した。予想どおり、４ｎｇより多い用量では、双方の生成物ともｓＴＮＦ−Ｒ２の流出を誘導したが、ＴＮＦ−Ｒ１の流出は誘発しなかった（図２Ａ）。
【０１９３】
ｓＴＮＦ−Ｒ２流出がＮＧＲ−ｍＴＮＦの活性を調節しているかどうかを評価するために、このサイトカインと、可溶性及び膜マウスＴＮＦ−Ｒ２に対するｍＴＮＦの結合を防ぐアンタゴニスト抗ｓＴＮＦ−Ｒ２抗体であるｍＡｂ６Ｇ１とを共に投与した（１６）。ｓＴＮＦ−Ｒ２がＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍効果の阻害にある役割を演じているという仮説に一致して、１０ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍性活性はｍＡｂ６Ｇ１により増強した（図２Ｂ）。
【０１９４】
この仮説をさらに支持するために、ヒトのサイトカインがマウスのｓＴＮＦ−Ｒ２とは結合しないという事実（２２）を利用してＮＧＲ−ｍＴＮＦのインビボ用量応答曲線をＮＧＲ−ｈＴＮＦのそれと比較した。ＮＧＲ−ｈＴＮＦの用量応答曲線は釣鐘型ではなく、また、１０ｎｇのＮＧＲ−ｈＴＮＦは、１ｎｇと同じく活性であることを本発明者らは見出した（図２Ｃ）。最大抗腫瘍効果を誘発するために１ｎｇで十分であったことも注目すべきであった。このことにより、血管上の受容体結合は、極低量のＮＧＲ−ｈＴＮＦによって達成できることが示唆され得る。
【０１９５】
まとめると、これらの実験結果は、４ｎｇ以上の用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦが、それらの抗腫瘍活性を阻害するのに十分な量でｓＴＮＦ−Ｒ２の流出を誘発することを強く示唆する。
【実施例８】
【０１９６】
メルファラン及びドキソルビシンの治療効果を高めるのに十分なピコグラム用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦ。
次に本発明者らは、腫瘍血管に対する低用量ＮＧＲ−ｍＴＮＦの標的誘導送達が化学療法剤の抗腫瘍活性を増強し得るかどうかを調べた。これらの実験は、免疫原性がごく少なく、メルファランに対して低感受性であることを特徴とする自発性のマウス黒色腫であるＢ１６Ｆ１モデルにおいて行われた。メルファラン（９０μｇ）単独で注射された場合は、腫瘍増殖に影響を与えることはできなかった（図３Ａ）。同様にｍＴＮＦ（０．１ｎｇ単独、ｉ．ｐ．）は実際に不活性であったが、同用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦは、少しだけ腫瘍増殖を遅延化した（図３Ｂ、上部パネル）。メルファランと０．１ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦとの併用が単剤よりも強力な抗腫瘍効果を発揮し、相乗効果を示している（図３Ｃ）。注目すべきことに、メルファランと０．１ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦとの併用は、５０００ｎｇのｍＴＮＦとの併用よりも効果的であった（図３Ｃ〜Ｄ）。ＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）が静脈内注射された場合でもこの相乗作用が見られた（示していない）。
【０１９７】
Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて、ドキソルビシンにより同様の実験が２回行われた。マウスを腫瘍移植５日後にＮＧＲ−ｍＴＮＲで処理し、又は処理せずに２時間後、種々の用量のドキソルビシン（２０〜３２０μｇ、ｉ．ｐ．）で処理した。双方の実験において、ドキソルビシンプラスＮＧＲ−ｍＴＮＦの効果は、ドキソルビシン単独の効果よりも強く（図４Ａ、Ｂ、Ｅ）、ＮＧＲ−ｍＴＮＦがこの薬剤の有効性を著しく改善することを示した。例えば、ドキソルビシン（４０μｇ）プラスＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）の効果は、３２０μｇのドキソルビシン単独よりも強力であったが（図４Ｂ）、ドキソルビシン（２０μｇ）プラスＮＧＲ−ｍＴＮＦの効果は、より低かった（図４Ａ）。これらの結果から、ドキソルビシンの活性は、ＮＧＲ−ｍＴＮＦによって、８〜１０倍増強されると予想される。
【０１９８】
結論を述べると、これらの結果によりメルファラン及びドキソルビシン双方にとって、腫瘍応答の改善にはピコグラム用量のＮＧＲ−ＴＮＦで十分であることが示唆される。
【実施例９】
【０１９９】
低用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦは毒性を示さず、また、メルファランの毒性を増大させない。
各処理の有効性／毒性比を予想するために、処理後の毎日のマウス体重及びマウスの生存率をモニターした。ｍＴＮＦの治療用量（１００００ｎｇ）は、ＲＭＡ−Ｔを有するマウスに著しい体重減少を引き起こした（図１Ｃ、左）が、ＮＧＲ−ｍＴＮＦの治療用量（０．０１〜１ｎｇ）は体重減少を生じなかった（図１Ｃ、右）。さらに、ＮＧＲ−ｍＴＮＦとｍＴＮＦの双方とも（各１ｎｇ）、ＲＮＡ−Ｔ腫瘍を有するマウスにおいて、メルファランの致死量２００μｇを増加させなかった（表１）。
【０２００】
【表Ｉ】
2005526117.tif 000024
【０２０１】
Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて、ＮＧＲ−ｍＴＮＦの治療用量（０．１ｎｇ）はメルファランを併用しても、体重減少を生じなかった（図３Ｅ）。これとは対照的に、ｍＴＮＦの治療用量（５μｇ）と併用したメルファランは著しい体重減少を引き起こした（図３Ｆ）。また、ＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）は、高用量のドキソルビシンによって生じた体重減少を増大させなかった（図４Ｃ〜Ｄ）。
【０２０２】
これらの結果により、ピコグラム用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦは、毒性を増加させる徴候がなく、メルファラン及びドキソルビシンに対する腫瘍の応答性を増加させることが示唆される。
【実施例１０】
【０２０３】
ＴＮＦ−Ｒ１の活性化は、ＮＧＲ−ＴＮＦと化学療法剤との間の相乗作用のために必要かつ十分である。
次に低用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦと化学療法剤との間の相乗作用の機構を調べた。
【０２０４】
これらの機構が、ＴＮＦ−Ｒ類の活性化に依存するかどうかを評価するため、メルファラン（９０μｇ）と併用したＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）の抗腫瘍活性に及ぼす中和化抗ｍＴＮＦ抗体であるｍＡｂＶ１ｑの効果を試験した。ｍＡｂＶ１ｑは、Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて、これらの薬剤の抗腫瘍活性を、少なくとも部分的に阻害した（図５Ａ）。これにより、ＴＮＦ部分とＴＮＦ−Ｒ類との間の相互作用が、前記複合体の活性にとって重要であることが示唆される。
【０２０５】
次にＴＮＦ−Ｒ１とＴＮＦ−Ｒ２の役割を調べた。この目的のために、ＴＮＦ−Ｒ１特異的アゴニストであるＮＧＲ−ｈＴＮＦ（２２）の０．０１ｎｇ又は０．１ｎｇと併用したメルファランの効果を評価した。Ｂ１６Ｆ１モデルにおけるメルファランの効果は、ＮＧＲ−ｈＴＮＦによって増強し（図５Ｂ）、前記相乗作用にとってＴＮＦ−Ｒ１の活性化は十分であることを示唆した。
【実施例１１】
【０２０６】
ＮＧＲ−ＴＮＦと化学療法との間の相乗作用は、腫瘍細胞の細胞毒性に依存しない。
前記相乗作用が、腫瘍細胞に対する直接の細胞毒性によるものか否かを評価するために、各化合物単独、又は併用の培養Ｂ１６Ｆ１細胞に対する効果を測定した。インビトロアッセイにおいて、メルファラン又はＮＧＲ−ｍＴＮＦは、単独、又は併用で、双方とも４８時間内に、これらの細胞を死滅させなかった（示していない）。同様に、ＮＧＲ−ｍＴＮＦは、インビトロでドキソルビシンの細胞毒性を増大させなかった（示していない）。これらの結果は、インビボで見られる相乗作用は、腫瘍細胞に対する細胞毒作用に直接依存しておらず、腫瘍支質、例えば、腫瘍血管の内皮内張りの成分の間接的役割を指していることを示唆している。
【実施例１２】
【０２０７】
ＮＧＲ−ＴＮＦはマウスの黒色腫及びリンパ腫においてドキソルビシンの浸透を増加させる。
次に、ＮＧＲ−ｍＴＮＦが腫瘍内への化学療法剤の浸透を増加し得るかどうかを調べた。これを目的としてドキソルビシン投与２時間後に、この薬剤の蛍光特性を利用して、Ｂ１６Ｆ１腫瘍及びＲＭＡ−Ｔ腫瘍に浸透したドキソルビシンの量を測定した（２３）。予備実験では、インビトロでＢ１６Ｆ１細胞をドキソルビシンに曝露させた後、Ｂ１６Ｆ１細胞の核が蛍光を放つことが示された（図６Ａ）。ＦＡＣＳで測定した蛍光シグナルは用量依存的であり、前記細胞をホルムアルデヒドで固定し、４℃で保持する場合、少なくとも２４時間安定である（図６Ｂ）。このように、処理後のマウスから回収した腫瘍細胞の蛍光強度は、腫瘍に浸透したドキソルビシン量の表示である。ドキソルビシンの２時間前に投与された０．１ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦが、処理の２時間後にＢ１６Ｆ１腫瘍及びＲＭＡ−Ｔ腫瘍双方から回収された陽性細胞の蛍光強度とパーセンテージを増大させることが認められた（２〜５倍、図６Ｃ〜Ｈ）。このことは、ＮＧＲ−ｍＴＮＦが、ドキソルビシンが到達した細胞数並びに薬剤の細胞内の量を増加させたことを示唆する。
【実施例１３】
【０２０８】
腫瘍に対するＲＧＤ−ＴＮＦの効果
ＲＭＡ−Ｔ細胞を有するＣ５７／ＢＬ６マウス（５匹／群）を、腹腔内注射により、メルファラン単独で、若しくはＲＧＤ−ＴＮＦ又はＮＧＲ−ＴＮＦと併用して処理した。腫瘍体積に及ぼす効果を図８Ａに示し、マウス体重に及ぼす効果を図８Ｂに示している。これらの結果は、ＲＧＤ−ＴＮＦもまた、ピコグラム範囲で有効であることを立証している。
【実施例１４】
【０２０９】
腫瘍に対するＩＦＮγ−ＮＧＲの効果
ＲＭＡリンパ腫を有するＣ５７／ＢＬ６マウスをＩＦＮγ（３ｎｇ）又はＩＦＮγ−ＮＧＲ（３ｎｇ）で処理したか、又は処理なしとした。２１日後、マウスを殺処理した。腫瘍体積及びマウス体重の減少は図９Ａ及び９Ｂに見ることができる。また、ＲＭＡリンパ腫を有するＣ５７／ＢＬ６マウスをＩＦＮγ（３ｎｇ）、ＩＦＮγ−ＮＧＲ（３ｎｇ）、ＩＦＮγ−ＮＧＲ（３ｎｇ）プラス抗ＣＤ１３Ｒ３−６３ｍＡｂ（２５μｇ）又はＩＦＮγ−ＮＧＲ（３ｎｇ）プラスｍＡＢ１９Ｅ１２（５０μｇ）で処理したか、又は処理なしとした。ｍＡＢ１９Ｅ１２は、この実験における陰性対照として用いた無関係のＩｇＧである。この結果は、ＩＦＮγ−ＮＧＲがピコグラム範囲で有効であることを証明している。
【実施例１５】
【０２１０】
シスプラチンの治療効果増大にはピコグラム用量のＮＧＲ−ＴＮＦで十分である。
本発明者らは、低用量のＮＧＲ−ＴＮＦの標的送達が抗癌剤、シスプラチンの抗腫瘍活性を増大し得るかどうかを調べた。これらの実験は、当初８週齢のＲＭＡ−Ｔ腫瘍を有するＣ５７／ＢＬ６／Ｎマウスにおいて実施した。マウスを１０日目にシスプラチンで処理したか、又は処理なし、又はＮＧＲ−ｍＴＮＦと共に処理した。その結果は図１０に示してある。この図でＣｙｓ＝シスプラチノテバ（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｏ  Ｔｅｖａ）溶液０．５ｍｇ／ｍｌ；ＮＧＲ＝ＮＧＲ−ｍＴＮＦ。希釈剤は０．９％ＮａＣｌ中１００ｍｇ／ｍｌＨＡＳであった。この結果は、シスプラチンの治療効果増大にはピコグラム用量のＮＧＲ−ＴＮＦで十分であることを示している。
【０２１１】
利点の要約
ＴＮＦ単独、又は化学療法剤と併用したＴＮＦの抗腫瘍活性にとって、血管透過性と間質圧の変化、内皮細胞損傷及びフィブリン沈着は重要な機構である。ＴＮＦもまた、動物又は患者への注入後、これらの効果の多くを中和する負のフィードバック機構を誘発できる。例えば、ＴＮＦは、それほど多くない用量でも膜受容体との相互作用を妨げ得る可溶性ｐ５５及びｐ７５ＴＮＦ受容体の放出を誘発できる（２１、２４）。これらの可溶性阻害因子は、このサイトカインの有害な作用から身体を防御できるが、その抗腫瘍活性もまた妨げ、有効な治療のために高用量のＴＮＦを必要とする原因の一部となっていると言える。この研究では、低用量のＴＮＦを腫瘍血管に向かわせることが、毒性反応、並びに負のフィードバック機構を避ける一方、化学療法との相乗作用を保持する新規な方法となると本発明者らは仮定した。この仮定を確証するため、本発明者らは、皮下ＲＭＡ−Ｔリンパ腫及びＢ１６Ｆ１黒色腫腫瘍に基づく２つのマウスモデルにおいて、ピコグラム量からマイクログラム量の範囲の高用量と低用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びｍＴＮＦの抗腫瘍活性を調べた。これらのサイトカインを単独で、若しくはメルファラン又はドキソルビシンと併用して試験を実施した。ｍＴＮＦは、１００〜１０００ｎｇ未満の低用量では、これらのモデルにおいて実際に有効でなかったが、ＮＧＲ−ｍＴＮＦは単独でも、わずか０．０１〜０．１ｎｇの低用量で抗腫瘍効果を誘発し得ることを見出した。ｍＴＮＦとＮＧＲ−ｍＴＮＦのＬＤ５０値は同様であり、ＲＭＡ−Ｔ腫瘍を有するマウスにおいて約５０，０００ｎｇに相当するため（１４）、これらの結果は、ＮＧＲ−ｍＴＮＦの有効性／毒性比がｍＴＮＦのそれの１０４〜１０５倍高いことを示している。
【０２１２】
腫瘍を有するマウスに対するＮＧＲ−ｍＴＮＦの微量投与（０．１ｎｇ）は、処理後の腫瘍質量減少、マウス生存率及び体重減少によって判断すると、毒性の増加なしで、メルファラン及びドキソルビシンの抗腫瘍活性を増強した。これは、ＮＧＲ−ｍＴＮＦが、これらの薬剤の治療指数を改善することを示唆する。メルファランの効果をこれに相当するレベルに上げるためには、５×１０４倍高い用量のｍＴＮＦが必要であり、著しい体重減少を生じさせることは注目すべきである。
【０２１３】
Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて、実際に有効でない用量のメルファランとドキソルビシンの双方ともＮＧＲ−ｍＴＮＦと併用した場合に腫瘍増殖を低下させる事実は、これらの薬剤が相乗的に作用することを示している。作用機構の研究により、この相乗作用は支質細胞、多くは内皮細胞上のＮＧＲ−ｍＴＮＦとＴＮＦ−Ｒ１との相互作用に依存しており、腫瘍細胞上では、はるかに少ないことが示された。またＮＧＲ−ｍＴＮＦによる血管標的化は、細胞毒性薬剤の腫瘍内への浸透を改善することを本発明者らは見出した。ＮＧＲ−ｍＴＮＦが、２時間以下にドキソルビシンが到達できる癌細胞のパーセンテージ、並びに薬剤の細胞内の量の双方を増加し、ＮＧＲ−ｍＴＮＦが薬剤浸透バリアを変更できることを示唆したことは注目すべきことである。先の研究では、ＴＮＦが迅速に内皮の浸透性を増加させることができ（２５、２６）、腫瘍内への薬剤浸透にとって重要なバリアであると考えられている（１）間質液圧を低下させることができることを示した（８）。これらの機構が、腫瘍血管壁と間質を通る薬剤の対流輸送を増加させ、その結果腫瘍による薬剤取り込みを増加させるのかもしれない。ＴＮＦはまた、血管内凝集を誘発でき（２７）、血管閉鎖と腫瘍灌流の減少を導くことから、これらの機構に関しては、恐らく投与のタイミングが肝要である。この観点により、本発明者らはメルファランの効果が、この薬剤をＮＧＲ−ＴＮＦの６時間後よりも２時間後に投与した場合により高いことを観察した（データは示していない）。
【０２１４】
血管標的化が、通常、ＴＮＦ療法に伴う負のフィードバック機構を回避し得るという仮説は、ピコグラム用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦが可溶性受容体の流出を誘発せず、一方、４〜１０ｎｇより多い用量では、ＮＧＲ−ｍＴＮＦとｍＴＮＦの双方が、循環内へのｓＴＮＦ−Ｒ２の放出を急速に誘発するという観察に支持される。これらの濃度のｓＴＮＦ−Ｒ２は、１０ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍活性の大部分を阻害した。それで１０ｎｇが０．１ｎｇよりも有効でないという矛盾した所見の原因が説明できる。恐らく注入された分子の大部分がｓＴＮＦ−Ｒ類によって素早く複合体となり、それらの活性が阻害されたのであろう。
【０２１５】
低用量のＮＧＲ−ｍＴＮＦと腫瘍血管との選択的相互作用のもとになっている分子機構は、部分的に明らかになった。本発明者らは最近、上皮細胞において、また骨髄細胞において、種々のＣＤ１３イソ体が、腫瘍関連血管内に発現すること、また、ＮＧＲ−ＴＮＦのＮＧＲドメインが腫瘍血管に伴うＣＤ１３イソ体を選択的に認識することを示した（２８）。したがって、低血中濃度のＮＧＲ−ｍＴＮＦが、ＣＤ１３及びＴＮＦ−Ｒ類の双方を含む高結合活性の多価結合によりＣＤ１３陽性内皮細胞と素早く相互作用することができ、正常血管のＣＤ１３陰性内皮細胞とは、結合活性の低さにより、ほとんど、又はまったく相互作用できないという仮設を立てた。これらのコンセプト及びＮＧＲ−ＴＮＦと可溶性受容体及び膜受容体との仮定上の相互作用の図式的表示は図７に示している。
【０２１６】
また、本発明者らは、ＲＧＤ−ＴＮＦ及びＩＦＮγ−ＮＧＲがピコグラム範囲において有効であることも見出した。又、ＮＧＲ−ＴＮＦがシスプラチンの効果を高めることも示した。
【０２１７】
結論として、腫瘍血管に対するピコグラム用量のサイトカイン類の標的誘導送達が、マウスにおいて可溶性受容体を流出させることなく、化学療法剤の抗腫瘍性活性を高めることを本発明者らは見出した。ＣＮＧＲＣモチーフがマウスと同様にヒトの腫瘍関連血管を標的にすると考えられるならば（２９）、本発明者らの結果は低用量の標的誘導サイトカインと抗癌剤との併用が、ヒト患者におけるそれらの治療指数を増加させ得ることを示唆している。
【０２１８】
上記明細書に挙げたすべての刊行物は参照として本明細書内に組入れてある。本発明の記載された方法とシステムの種々の修飾と変更は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、請求された本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、本発明の実施に関して前記の方法の分子生物学又は関連分野の業者に明らかな種々の修飾は、以下の請求項の範囲内に入ることが意図されている。
【０２１９】
（参考文献）
2005526117.tif 000025
2005526117.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】ＲＭＡ−Ｔリンパ腫を有するマウスの腫瘍増殖と体重に及ぼすｍＴＮＦ及びＮＧＲ−ｍＴＮＦの効果を示す図である。  ＲＭＡ−Ｔ腫瘍を有するマウス（５匹／群）を２つの別の実験（実験１と実験２）において腫瘍移植後１２日目に（Ａ）、又は１０、１１、１２日目に腹腔内注射（ｉ．ｐ．）でＮＧＲ−ｍＴＮＦ又はｍＴＮＦにより処理した。処理１〜４日後の実験１（Ａ）及び実験２（Ｂ）における腫瘍容積及び実験１（Ｃ）におけるマウスの体重を示してある。パネルＣにおける矢印は処理時を示す。
【図２】ＴＮＦ−Ｒ２の循環濃度及びＮＧＲ−ｍＴＮＦ及びＮＧＲ−ｈＴＮＦの活性の調節における役割を示す図である。  パネルＡ：Ｂ１６Ｆ１腫瘍を有するマウスにおける種々の投与量のＮＧＲ−ｍＴＮＦ又はｍＴＮＦによる処理１時間後のｓＴＮＦ−Ｒ１及びｓＴＮＦ−Ｒ２の血清濃度。マウス（３匹／群）は６日目に処理した。  パネルＢ：ＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍性に及ぼす抗ｓＴＮＦ−Ｒ２ｍＡｂ６Ｇ１の効果。ＭＡｂ６Ｇ１（１００μｇ）を、Ｂ１６Ｆ１腫瘍を有するマウスに５日目と８日目に投与した。１時間後、各マウスをＮＧＲ−ｍＴＮＦの示された投与量で処理し、２時間後、メルファラン（９０μｇ、５匹／群）で処理した。  パネルＣ：ＲＭＡ−Ｔ腫瘍の増殖に及ぼすＮＧＲ−ｈＴＮＦ及びｈＴＮＦの効果。マウスを、各サイトカインの種々の投与量で１１日目に処理した。Ｎ．Ｓ．：有意でない（ｔ−検定）。
【図３】Ｂ１６Ｆ１黒色腫を有するマウスの腫瘍増殖（Ａ〜Ｄ）と体重（Ｅ〜Ｆ）に及ぼすメルファラン単独（Ａ）又はＮＧＲ−ｍＴＮＦ（Ｃ）又はｍＴＮＦ（Ｄ）との併用での効果を示す図である。  マウスは腫瘍移植４、７、９日後に（矢印で示される）、各パネル（５匹／群）に示された薬剤と投与量で処理した（ｉ．ｐ．）。
【図４】Ｂ１６Ｆ１黒色腫を有するマウスの腫瘍増殖（Ａ、Ｂ）、体重（Ｃ、Ｄ）及び生存率（Ｅ）に及ぼす種々の投与量のドキソルビシン単独（白色棒）又はＮＧＲ−ｍＴＮＦとの併月（黒色棒）の効果を示す図である。  腫瘍移植の５日後に、薬物を動物（ｉ．ｐ．でマウス５匹／群）に投与した。
【図５】ＮＧＲ−ｍＴＮＦとメルファランの相乗作用におけるＴＮＦ受容体の役割を示す図である。  パネルＡ：Ｂ１６Ｆ１モデルにおけるＮＧＲ−ｍＴＮＦと併用したメルファランの抗腫瘍活性に活性に及ぼすｍＡｂＶ１ｑ（抗ｍＴＮＦ中和抗体）の効果。前記薬剤は５日目に投与した。ｍＡｂＶ１ｑ及びＮＧＲ−ｍＴＮＦは予備混合し、マウス注射前に１時間温置した。  パネルＢ：示された投与量のＮＧＲ−ｈＴＮＦと併用したメルファランの効果。
【図６】Ｂ１６Ｆ１腫瘍及びＲＭＡ−Ｔ腫瘍におけるドキソルビシンの浸透性に及ぼすＮＧＲ−ｍＴＮＦの効果を示す図である。  パネルＡ：１００μｇ／ｍｌのドキソルビシンと共にインビトロ温置（３０分、３７℃）したＢ１６Ｆ１細胞の明視域（上方パネル）と蛍光（下方パネル）顕微鏡検査。挿入図：明視域と蛍光画像の合成。  パネルＢ：ドキソルビシンによるインビトロ処理後のＢ１６Ｆ１蛍光シグナルの安定性。Ｂ１６Ｆ１細胞を培地中、種々の投与量のドキソルビシンと共に温置し（３０分、３７℃）、０．９％塩化ナトリウムで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定した。次にこれらの細胞を、４℃の培地中、０時間又は２４時間温置し、再度洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。  パネルＣ、Ｆ：ドキソルビシン単独（３２０μｇ）又はＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）と併用してインビトロ投与２時間後、Ｂ１６Ｆ１（Ｃ）腫瘍又はＲＭＡ−Ｔ（Ｆ）腫瘍から回収した細胞の代表的なＦＡＣＳ分析。ダッシュの線は陽性と考えられる蛍光間隔。  パネルＤ、Ｇ：腫瘍から回収したＢ１６Ｆ１（Ｄ）細胞又はＲＭＡ−Ｔ（Ｇ）細胞の平均±ＳＥ蛍光。  パネルＥ、Ｈ：Ｂ１６Ｆ１（Ｅ）腫瘍、ＲＭＡ−Ｔ（Ｈ）腫瘍から回収した陽性細胞の平均±ＳＥ。  両側ｔ−検定による統計解析、Ｐ＜０．０５（＊）。
【図７】低用量（Ａ）、中等量（Ｂ）及び高用量（Ｃ）のＮＧＲ−ＴＮＦと正常血管（ＣＤ１３−陰性）及び腫瘍関連血管（ＣＤ１３−陽性）における可溶性受容体及び膜受容体との仮定的相互作用の図式描写を示す図である。  黒色矢印は、ＴＮＦ受容体のシグナル伝達、又は細胞外ドメインへの流出を示している。
【図８】ＲＭＡ−Ｔを有するマウスの腫瘍増殖（図８Ａ）及び体重（図８Ｂ）に及ぼすＲＧＤ−ＴＮＦの効果を示す図である。
【図９】Ｃ５７Ｂ６マウスにおけるＲＭＡリンパ腫腫瘍の増殖（図９Ａ及び図９Ｃ）及びマウス体重（図９Ｂ）に及ぼすＩＦＮγ−ＮＧＲによる単独治療（矢印）の効果を示す図である。
【図１０】Ｃ５７／Ｂ６マウスにおけるＲＭＡ腫瘍に及ぼすＮＧＲ−ＴＮＦ及びシスプラチンの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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