(57)【要約】本発明は、例えばフラバノールおよびその関連オリゴマーのようなカカオポリフェノール等のポリフェノールを含む組成物、ならびに例えば癌、心臓不整脈、神経変性疾患および認知障害のような、ギャップ結合を介した細胞間連絡の異常に関連する症状を治療するための方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーを含む組成物と、ヒトまたは家畜動物である哺乳類において心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすために前記組成物を用いるためのラベルおよび／または指示書とを含む包装製品。
【請求項２】
前記組成物が少なくとも１つのオリゴマーを含むことを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項３】
前記オリゴマーがダイマーであることを特徴とする請求項２記載の包装製品。
【請求項４】
前記組成物が、カテキンモノマーとエピカテキンモノマーの混合物を含むことを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項５】
前記組成物が食品であることを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項６】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項７】
前記哺乳類が家畜動物であることを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項８】
前記食品が菓子類であることを特徴とする請求項５記載の包装製品。
【請求項９】
前記組成物がコレステロール降下剤をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項１０】
前記コレステロール降下剤が、ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤であることを特徴とする請求項９記載の包装製品。
【請求項１１】
前記組成物が、大豆蛋白、可溶性繊維および／またはＬ−アルギニンをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項１２】
前記組成物が、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、およびモノまたはポリ不飽和脂肪酸よりなる群から選択される成分を少なくとも１つさらに含むことを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項１３】
前記カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーが、カカオ原料、カカオ抽出物、または少なくとも１つのフラバノールまたはそのオリゴマーを含むカカオ抽出物の画分の形態であることを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項１４】
前記組成物がペットフードであることを特徴とする請求項１記載の包装製品。
【請求項１５】
心臓不整脈を患っているかまたは心臓不整脈に罹る危険性を有するヒトまたは家畜動物である哺乳類に、効果量のカカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーを含む組成物を投与することを含む、心臓不整脈を治療しまたはその危険性もしくは発生を減らす方法。
【請求項１６】
前記組成物が少なくとも１つのオリゴマーを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴマーがダイマーであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、カテキンモノマーとエピカテキンモノマーの混合物を含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が食品であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類が家畜動物であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
前記食品が菓子類であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物がコレステロール降下剤をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記コレステロール降下剤が、ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、大豆蛋白、可溶性繊維および／またはＬ−アルギニンをさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、およびモノまたはポリ不飽和脂肪酸よりなる群から選択される成分を少なくとも１つさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
前記カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーが、カカオ原料、カカオ抽出物、または少なくとも１つのフラバノールまたはそのオリゴマーを含むカカオ抽出物の画分の形態であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物がペットフードであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
効果量のカカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーを含む組成物を、それを必要とするヒトまたは家畜動物である哺乳類に投与することを含む、認知機能を改善する方法。
【請求項３０】
前記認知機能がコネキシン４３に関連することを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳類が、短期記憶機能の改善を必要とするヒトであることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が少なくとも１つのオリゴマーを含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴマーがダイマーであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、カテキンモノマーとエピカテキンモノマーの混合物を含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が食品であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳類が家畜動物であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
前記食品が菓子類であることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物がコレステロール降下剤をさらに含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４０】
前記コレステロール降下剤が、ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤であることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、大豆蛋白、可溶性繊維および／またはＬ−アルギニンをさらに含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ビタミンＥ、ビタミンＣ、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、およびモノまたはポリ不飽和脂肪酸よりなる群から選択される成分を少なくとも１つさらに含むことを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４３】
前記カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーが、カカオ原料、カカオ抽出物、または少なくとも１つのフラバノールまたはそのオリゴマーを含むカカオ抽出物の画分の形態であることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物がペットフードであることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項４５】
ヒトまたは家畜動物におけるギャップ結合連絡阻害に関連する疾患を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅らせるのに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造におけるカカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用。
【請求項４６】
ヒトまたは家畜動物における心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすのに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造におけるカカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用。
【請求項４７】
ヒトまたは家畜動物における認知障害を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅らせるのに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造におけるカカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすための、プロシアニジン等のポリフェノール（例えばカカオプロシアニジン等のカカオポリフェノール）を含む組成物およびその使用方法に関するものである。また本発明は、神経変性疾患、および例えば認知障害のようなギャップ結合を介した細胞間連絡の阻害に関連する他の疾患を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を抑えるための、プロシアニジン等のポリフェノール（例えばカカオプロシアニジン等のカカオポリフェノール）を含む組成物およびその使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フラバノールおよびその関連オリゴマーのようなカカオポリフェノールは、高血圧、アテローム性動脈硬化、および心臓血管疾患に有益な効果を有することが分かっている。それら効果は、例えば特許文献１として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号に示されており、実施例がその出願に記載されている。その中に、カカオポリフェノールを用いて、例えばアスピリンのような非ステロイド性抗炎症薬の投与によって効果があることが分かっている症状を治療または予防することができることが記載されている。しかしながら、カカオポリフェノールは、胃の出血等、アスピリンで生じるような副作用がないことから、治療および予防においてアスピリンよりもカカオポリフェノールを使用する方が有利である。
【０００３】
驚くべきことに、フラバノールおよびその関連オリゴマーのようなカカオポリフェノールの新規な使用を発見した。心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、およびその発生を減らすために、本明細書に開示されている組成物および製品を用いることができる。さらには、例えば癌、不整脈、および神経変性、ならびに細胞間のギャップ結合連絡阻害に関連する他の疾患のような、ギャップ結合を介した細胞間連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅らせるために、それら組成物および製品を用いることができる。
【特許文献１】国際公開第９７／３６４９７号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、心臓不整脈を患っている、またはそれに罹る危険性のあるヒト、あるいはウマ、ネコ、またはイヌ等の家畜動物のような哺乳類において、心臓不整脈を治療し、予防し、その発生を減らし、またはその危険性を軽減するための組成物、製品および方法に関するものである。さらには、本発明は、ギャップ結合を介した細胞間連絡の阻害に関連する癌、心臓不整脈、神経変性疾患および認知障害のような、ギャップ結合を介した細胞間連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅らせるための方法および製品に関するものである。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、カカオポリフェノールを含む、食品、食品添加物、栄養補助食品、または医薬のような組成物に関するものである。
【０００６】
上記の組成物と、心臓不整脈、神経変性疾患、またはギャップ結合を介した細胞間連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅らせるのにその組成物を使用するためのラベルおよび／または指示書とを含む包装製品も本発明の範囲内に含まれる。
【０００７】
別の態様において、本発明は、カカオフラバノールおよび／またはその関連オリゴマーのようなカカオポリフェノールを含む組成物を、それを必要とする哺乳類に投与することによって、ヒトまたは家畜動物のような哺乳類において、心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らす方法に関するものである。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は、カカオフラバノールおよび／またはその関連オリゴマーのようなカカオポリフェノールを含む組成物を、それを必要とする哺乳類に投与することによって、ヒトまたは家畜動物のような哺乳類において、ギャップ結合を介した細胞間連絡の異常に関連する症状を治療し、予防し、その進行を遅らせ、またはその危険性を軽減する方法に関するものである。例えば、そのような症状は神経変性疾患または認知障害であり、哺乳類は神経変性疾患または認知障害を患っており、またはそれに罹る危険性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において挙げられている全ての特許、特許出願および参考文献は、参照によってその全てが本明細書に組み込まれる。
【００１０】
本発明は、少なくとも１つのカカオフラバノールおよび／またはその関連プロシアニジンオリゴマーのような、フラバノールおよび／またはその関連オリゴマーを含む組成物に関するものである。本組成物は、必要に応じて、例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤のようなコレステロール降下剤、Ｌ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、例えばビタミンＥおよびビタミンＣのような抗酸化剤、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばω−３脂肪酸）、ビタミンＤ３、レチナール、レチノイド、大豆蛋白およびセレニウムを含んでいてよい。組成物は、カカオポリフェノールに加えて、またはカカオポリフェノールに代えて、カカオポリフェノールの特性に類似の特性を有する、例えばピーナッツの表皮のようなカカオ以外の起源由来のポリフェノールを含んでいてもよい。
【００１１】
本明細書において、「カカオポリフェノール」（ＣＰ）の用語は、カカオ豆中に存在する、あるいはカカオ豆またはカカオ原料から抽出された、例えばフラバノールおよびその関連オリゴマーのようなポリフェノール物質を称する。「フラバノール」の用語は、カテキンおよびエピカテキンのモノマー（単量体）を含む。カテキンおよびエピカテキンのオリゴマーはプロシアニジンとも称される。本明細書において、カカオポリフェノールへの言及は、組合せてまたは個々に、カカオフラバノールおよびプロシアニジンにも適用されると理解すべきである。
【００１２】
本明細書において、「カカオ原料」の用語は、例えばチョコレート液、および部分または完全脱脂カカオ固形物（例えばケーキまたは粉末）のような、殻を含まないカカオニブに由来するカカオ固形物含有物質を称する。
【００１３】
「コレステロール降下剤」の用語は、効果量で投与した場合に哺乳類においてコレステロールレベルを低下させる特性を有する、天然のまたは加工された、任意の化合物、化合物の配合物、抽出物または植物成分を意味する。そのようなコレステロール降下剤が、ステロールまたはスタノール型の化合物または化合物の配合物である（すなわち誘導体および異性体を含む）場合、そのコレステロール降下剤は、「ステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤」と称される。例えば「コレステロール降下ブラックチョコレート」のような組成物に関してその用語が用いられる場合、その組成物がコレステロール降下特性を有することを意味する。
【００１４】
カカオポリフェノールは、天然由来のもの、すなわちカカオ豆由来のものであっても、あるいは合成によって調製されたものであっても差し支えない。当業者は、可用性およびコストに応じて、天然または合成カカオポリフェノールを選択して差し支えない。カカオポリフェノールは、例えばチョコレート中のチョコレート液のようなカカオポリフェノール含有カカオ原料として組成物中に含まれていて差し支えなく、あるいは例えば抽出物、抽出画分、単離および生成された個々の化合物、プールした抽出画分、または合成によって調製された化合物として、カカオ原料とは無関係に添加してもよい。
【００１５】
カカオポリフェノールは、カカオフラバノールおよびそのオリゴマーを含む。フラバノールは、(＋)−カテキン、(−)−エピカテキン、およびそれらの対応するエピマー（例えば、(−)−カテキン、(＋)−エピカテキン）を含み、以下の構造を有する：
【化１】
2005526780.tif 000002
【００１６】
プロシアニジンオリゴマーは、２から約１８、好ましくは２から約１２、さらに最も好ましくは２から約１０のモノマー単位を有する。例えば、オリゴマーは、ダイマー（二量体）、トリマー（三量体）、テトラマー（四量体）、ペンタマー（五量体）、ヘキサマー（六量体）、ヘプタマー（七量体）、オクタマー（八量体）、ノナマー（九量体）、およびデカマー（十量体）であってよい。オリゴマーでは、モノマーが（４→６）および／または（４→８）のフラバン間結合を介して結合している。もっぱら（４→８）結合のみを有するオリゴマーは直鎖であり；一方、1つ以上の（４→６）結合が存在すると分枝オリゴマーとなる。
【００１７】
したがって、以下の化学式Ａｎで表わされる高分子化合物、またはその薬剤的に許容される塩を本発明の組成物および方法において用いることができる：
【化２】
2005526780.tif 000003
【００１８】
式中、ｎは、少なくとも１つの末端モノマー単位Ａ、および複数の追加のモノマー単位が存在するように、２〜１８の整数であり；
Ｒは３−（α）−ＯＨ、３−（β）−ＯＨであり；
隣接モノマー間の結合が４、６、または８位で起こり；
４位での追加のモノマー単位の結合がαまたはβ立体化学構造を有しており；
Ｘ、ＹおよびＺは、少なくとも１つの末端モノマー単位に関して、それに対する追加のモノマー単位の結合が４位にあって、かつ必要に応じてＹ＝Ｚ＝水素であることを条件に、モノマー単位Ａおよび水素から選択される。
【００１９】
カカオ豆、カカオニブ、あるいは例えばチョコレート液、部分脱脂カカオ固形物および／または完全脱脂カカオ固形物のようなカカオ原料からの抽出によって、カカオポリフェノールを調製することができる。好ましくは、完全または部分脱脂カカオ粉末から抽出物を調製する。テオブロマ(Theobroma)、ヘラニア(Herrania)、またはそれらの種内および種間の交配物の任意の種類の豆を用いてよい。発酵した、発酵途中の、または未発酵の豆から抽出物を調製してよく、発酵豆が最も少ない量のカカオポリフェノールを有し、未発酵豆が最も多い量のカカオポリフェノールを有する。豆の発酵因子に基づいて豆の選択を行うことができ、例えば、２７５以下の発酵因子を有する豆から抽出が行われる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５８９３号（国際公開第９８／０９５３３号として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように、発酵の程度を操作することによって、カカオ原料またはその抽出物中のポリフェノールレベルを最適化することができる。
【００２０】
従来のカカオ加工法（例えば、Industrial Chocolate Manufacture and Use, ed. Beckett, S.T., Blackie Acad. & Professional, New York, 1997例えば1、５および６章に記載）、あるいは米国特許第６,０１５,９１３号明細書（Kealey et al）に記載の改善された加工法（従来の方法に比べて、カカオ原料中のポリフェノールが、その分解を防止することによって保存される）を用いて、加工されたカカオ原料からカカオポリフェノールを抽出することができる。改善された加工法は、従来の焙煎工程を省略する。したがって、以下の工程によって得られたカカオ原料を用いることができる：（ａ）カカオニブを焙煎することなくカカオ殻を軟らかくするのにちょうど十分な時間および温度でカカオ豆を加熱する工程；（ｂ）カカオ殻からカカオニブをふるい分ける工程；（ｃ）カカオニブを回転圧搾(screw press)する工程、および（ｄ）保存レベルのカカオポリフェノールを含有するカカオバターおよび部分脱脂カカオ固形物を回収する工程。本方法は、従来の方法よりも非常に高レベルの高プロシアニジンオリゴマーを保持する。本方法によって作成されたカカオ固形物は、無脂肪固形物１ｇ当り20,000μｇを超える量、好ましくは25,000μｇ／ｇを超える量、より好ましくは28,000μｇ／ｇを超える量、さらに最も好ましくは30,000μｇ／ｇを超える量の全フラバノールおよび／またはプロシアニジンを含有する。本願発明の目的において、全フラバノールおよび／またはプロシアニジン量は実施例２に記載のように特定される。
【００２１】
ポリフェノールを溶解させる溶媒を用いて上記のような供給源からカカオポリフェノールを抽出する。適切な溶媒として、水、あるいは例えばメタノール、エタノール、アセトン、イソプロピルアルコールおよび酢酸エチルのような有機溶媒が挙げられる。溶媒混合物を用いてもよい。溶媒として水を用いる場合、例えば酢酸でわずかに酸性化したものが好ましい。好ましい溶媒は、水と、例えば水性メタノール、エタノールまたはアセトン等の有機溶媒との混合物である。水性有機溶媒は、例えば約５０％から約９５％の有機溶媒を含有する。従って、水中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および約９０％有機溶媒を用いることができる。また、溶媒は、少量（例えば約０．５％から約１．０％の量）の例えば酢酸のような酸を含んでいて差し支えない。抽出物の組成、すなわち表示（すなわちオリゴマープロフィール）、およびプロシアニジンオリゴマーの量は、溶媒の選択に依存するであろう。例えば、水抽出物は主にモノマーを含有し、酢酸エチル抽出物はモノマーおよび低オリゴマー（主にダイマーおよびトリマー）を含有し、さらに水性メタノール、エタノールまたは酢酸抽出物はモノマーおよび一連の高オリゴマーを含有する。モノマーならびに高プロシアニジンオリゴマーの抽出に好ましい溶媒の１つは、７０％アセトンである。しかしながら、いずれのポリフェノール含有抽出物も本発明において有用である。カカオフェノール抽出方法は当業界で公知であり、例えば米国特許第５，５５４，６４５号明細書（Romanczyk et al.）および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（国際公開第９７／３６４９７号として公開）に記載されている。従って、１つの実施形態では、カカオ豆をカカオ粉末に粉砕し、その粉末を脱脂し、カカオポリフェノールを抽出し、さらにその抽出物を精製することによって、カカオ抽出物を調製する。カカオ豆およびパルプを凍結乾燥し、凍結乾燥カカオ豆を脱パルプ化しまたは外皮を剥ぎ、外皮を剥いだカカオ粉末を粉砕することによってカカオ粉末を調製してもよい。
【００２２】
例えば、カフェインおよび／またはテオブロミンの除去によって抽出物を精製し、その後、ゲル浸透クロマトグラフィーおよび／または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製する。ゲル浸透クロマトグラフィー（例えばセファデックスＬＨ−２０）を用いて、高プロシアニジンオリゴマーに関して抽出物の濃度を高めることができる。例えば、選択したオリゴマーがカラムから溶出を始めるまで、モノマーおよび低オリゴマーを含有する溶出物を集めない。そのような抽出の例は当業界で公知であり、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（国際公開第９７／３６４９７号として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）の実施例５に記載されている。例えば順相ＨＰＬＣのような予備ＨＰＬＣを用いることによって、例えば５０重量％以上のモノマーまたは特定オリゴマーを含有するモノマー画分およびオリゴマー画分に、抽出物を分画することができる。その画分がモノマーおよび低オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはテトラマー画分）を含む場合、その画分は約９０から９５重量％の特定オリゴマー画分を含む。分離後、所望の画分をプールし、例えばオリゴマー３−１０または５−１０を含有するように選択したオリゴマーの混合物を得ることができる。本願明細書におけるガイダンスおよび当業界における一般知識（例えば米国特許第５，５５４，６４５号明細書（Romanczyk et al.）および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５６９３号（国際公開第９７／３６４９７号として公開）に記載の技術）を鑑みて、当業者はクロマトグラフィー条件を操作して、所望のプロシアニジンプロフィールを達成することができる。
【００２３】
モノマー画分は通常、エピカテキンおよびカテキンのモノマーの混合物を含み；オリゴマー画分は通常、ダイマー（ダイマー画分中）、トリマー（トリマー画分中）、テトラマー（テトラマー画分中）等の混合物を含む。カカオは、２以上のタイプの各モノマー、ダイマー等を含むため、単離画分中にモノマーとオリゴマーの混合物が生じる。プロシアニジンの構成単位である２つのモノマー（エピカテキンおよびカテキン）、ならびにオリゴマー中でモノマーを連結する化学結合の結果として、オリゴマーの可変性が生じる。したがって、カカオダイマーは、主にＢ２およびＢ５であり、その各々が２つのエピカテキンモノマーを含む。例えばＣ１８カラムのような逆相ＨＰＬＣカラムを用いて、個々のモノマーおよびオリゴマーを得ることができる。
【００２４】
例えば溶媒抽出物のようなカカオ抽出物、カカオ画分、単離化合物として、あるいは効果量のカカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンを含むカカオ原料またはチョコレートの形態で、本発明の組成物においてカカオポリフェノールを用いることができる。従来のカカオ加工法を用いてカカオ原料を調製してもよいが、好ましくは、米国特許第６，０１５，９１３号(Kealey et al)に記載の方法を用いて調製する。あるいは、カカオポリフェノールレベルを高めるために、約２７５以下の発酵因子を有するカカオ豆から調製したチョコレート液およびカカオ固形物を用いる。それら原料は、従来のカカオ加工法（例えば焙煎工程を含む）および完全発酵豆を用いて得られるよりも高いカカオポリフェノール含有量を有する。上記の原料から従来技術を用いて、あるいは国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５４１４号（国際公開第９９／４５７８８号として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように、チョコレート製造においてカカオポリフェノールを保護するように改善された方法を用いて、チョコレートを調製することができる。少なくとも１つの以下の非従来的方法によって調製されたチョコレートは、この中で、「保存量のカカオポリフェノールを有するチョコレート」と称される：（ｉ）発酵途中または未発酵のカカオ豆からカカオ原料を調製する；(ii)カカオ原料製造においてカカオポリフェノールを保護する；および(iii)チョコレート製造工程においてカカオポリフェノールを保護する。
【００２５】
ある実施形態では、組成物は、例えばダイマーのような、少なくとも１つのオリゴマーを含む。そのような組成物は、例えばカテキンおよびエピカテキンのような、少なくとも１つのモノマーまたはモノマー混合物をさらに含んでいてもよい。別の実施形態では、カカオから単離されたモノマー画分の形態で、カテキンおよびエピカテキンのモノマー混合物を含む組成物を調製して用いる。
【００２６】
合成プロシアニジンを用いても差し支えなく、それらは、当業界で公知の方法、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／２１３９２号（国際公開第９９／１９３１９号として公開）（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）の実施例に記載の方法によって調製できる。カカオポリフェノール誘導体も有用である。それらは、没食子酸モノマーおよびオリゴマー、グリコシル化モノマーおよびオリゴマー、ならびにそれらの混合物；例えば硫酸化、グルクロン酸化、およびメチル化形態のようなプロシアニジンモノマーおよびオリゴマーの代謝物；ならびに大腸微小植物代謝または体内哺乳類代謝によるプロシアニジンの酵素切断産物を含む。それら誘導体は、天然由来であっても合成によって調製されたものであってもよい。
【００２７】
本組成物は、必要に応じて、コレステロール降下剤をさらに含んでいてよい。その作用の態様に関わらず、任意のコレステロール降下剤を用いることができる。適切な物質は、哺乳類の胆汁におけるコレステロール吸収を減らすことによって、あるいはコレステロール合成を減らすことによって作用する。適切な物質の例として、フィトステロール、フィトスタノール、ならびにそれらの誘導体および異性体；大豆蛋白；例えばカラスムギ、オオバコ、木の実、糠油由来のβ−グルカン等の可溶性繊維（それらの各々は食品、栄養補助食品、食品添加物組成物における使用に特に適している）；が挙げられる。公知のコレステロール降下薬も用いて差し支えないが、それらは食品および食品添加物組成物における使用にはあまり好ましくなく、薬剤において使用される。当業者にとって、コレステロール降下剤の選択が、意図された運搬手段（例えば食品、栄養補助食品、薬剤）ならびに投与形態に依存することは明白である。従って、胆汁におけるコレステロールの吸収を減らす物質は、静脈投与に適さないであろう。同様に、運搬手段が食品である場合には、薬の強い味または臭いを有するコレステロール降下剤は望ましくない。
【００２８】
フィトステロールは水に溶けない植物ステロールであり、コレステロールに類似の分子量および構造を有する。フィトステロールは、それ自体吸収されることなく、胆汁におけるコレステロール吸収（内因性コレステロールおよび食事性コレステロールの両方）、ならびに血清コレステロールレベル（全コレステロールおよびＬＤＬ）を低下させる。４０を超える植物ステロールが同定されているが、β−シトステロール、カンペステロールおよびスチグマステロールが最も豊富にある。有用なステロールの他の例として、ブラシカステロール(brassicasterol)、デスモステロール(demosterol)、カリノステロール(chalinosterol)、ポリフェラステロール(poriferasterol)、クリオナステロール(clionasterol)が挙げられる。個々のステロールまたはステロール混合物、天然供給源から単離したものまたは合成したもの、ならびにそれらの異性体および誘導体を用いることができる。特に有用なものは、スタノールとして知られている、環における全ての炭素−炭素結合が飽和であるステロールの飽和誘導体である。適切なスタノールは２８または２９炭素原子を有し、β−シトスタノール、クリオナスタノール、２２、２３−ジヒドロブラシカスタノール、およびカンペステノールを含む。フィトステロールは、固体状（例えば粉末、顆粒）であっても液体状（例えば油）であっても差し支えない。
【００２９】
ステロールおよびスタノールは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２３４４号中の実施例に記載のように、いくつかの植物材料中に見出されている。ステロール／スタノールの例示的供給源は、松の樹皮、大豆油、トール油、タケノコ抽出物（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２５５６号(国際公開第９８／５７５４５号として公開)に記載）、カカオ殻および脂、ならびに米糠油である。パルプおよび製紙業の副生成物であるトール油は、スタノール、すなわちβ−スタノールの優れた供給源である。
【００３０】
例えば植物性油、植物性油スラッジ(sludge)、植物性油蒸留物のような天然供給源、あるいは例えばトール油のような他の植物油供給源から、比較的簡単で安価な手段によって、植物ステロールを得ることができる。例えば、メタノールのような溶媒を用いることによる植物性油スラッジからのステロールの調製は、米国特許第４,４２０,４２７号(Hamunen)に記載されている。スタノールは、天然では少量でのみ認められているが、当業者に公知のいくつかの任意の方法によって水素化することによって、ステロールから容易に調製できる。ステロール開始物質が植物材料から調製される場合、それはいくつかの様々なステロールの混合物を含んでおり、従って、水素化の後得られるスタノールも様々なスタノールの混合物となるであろう。その混合物は本発明における使用に適している。しかしながら、純粋な特定ステロール調製物を同様に水素化して純粋なスタノールを作成することができ、それも利用可能である。
【００３１】
カカオ殻から抽出されたカカオ脂はフィトステロールの優れた供給源である。カカオフィトステロールは、フィトステロールの約９０％までの遊離ステロールを含む遊離および結合ステロールの混合物である。フィトステロールは、カンペステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、シクロアルテノイル、２４−メチレンシクロアルテノイル、ならびに少量の他のフィトステロールを含む。結合フィトステロールは、フィトステロールの脂肪酸エステルまたはフェルラ酸誘導体(ferulate derivatives)を含む。また、カカオ脂は、トコフェノール（抗酸化特性を有する）およびトコトリエノール（コレステロール降下活性を有する）を含むトコール(tocols)を含有する。以下の工程を含む方法によってカカオ脂を調製する：(i)カカオ殻を挽く工程；(ii)フィトステロールに関して、挽いたカカオ殻を溶媒で抽出する工程；(iii)溶媒を除去する工程；(iv)カカオ脂を回収する工程。カカオ豆焙煎の副生成物であるカカオ殻は，乾燥発酵カカオ豆、微粉カカオ豆、焙煎カカオ豆、および好ましくは、より高い全ステロール含有量を含む乾燥未発酵豆に由来するものである。好ましいカカオ豆はテオブロマカカオ由来である。好ましい溶媒は石油エーテル、ヘキサン、ペンタン、およびエチルエーテルである。溶媒は減圧蒸留によって回収することができる。１つの実施形態において、凍結乾燥殻をＴｅｋｍａｒミル(Cincinatti, OH)で微粉末に挽き、次いで、Ｓｏｘｔｅｃ装置(Fisher Scientific, Springfield, NJ)において、再蒸留石油エーテル(b.p. 38-39.6℃)を用いて挽いた塊を１晩抽出する。次の朝、窒素流の下、ゆっくり蒸留することによって溶媒を注意深く除去し、得られた抽出物を−４０℃で保存する。さらに、予備ＨＰＬＣまたはカラムクロマトグラフィーによってフィトステロールを精製しても差し支えない。
【００３２】
ステロールおよびスタノールの両方のエステル体を用いても差し支えない。エステル化は、ステロール／スタノールを脂肪および脂により溶け易くし、そのことは、ある場合には、食品または他の運搬手段にそれらを組み込むのを助ける。例えば、ステロールを脂肪酸エステルとエステル結合させてよい。そのようなエステル化ステロールの例として、酢酸シトステロール、オレイン酸シトステロールおよびオレイン酸スチグマステロールが挙げられる。当業界で公知の方法および例えば米国特許第６，０３１，１１８号(van Amerongen et al.)、米国特許第５，８９２，０６８号(Higgins)、米国特許第５，５０２，０４５号(Mietienen et al.)、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ９９／００６５５号（国際公開第００／０４８８７号として公開）に記載の方法のように、スタノールエステルを調製することができる。１つの実施形態では、米国特許第５，９５８，９１３号(Miettenen et al.)に記載のように、少なくとも１つのステロールを、Ｃ２からＣ２２脂肪酸とエステル結合させることによって有用なスタノールエステルを調製する。当業界で公知の他の方法を用いて、哺乳類に投与した際のステロール／スタノールの安定性を高めることができる。そのような方法の１つは、米国特許第５，９３２，５６２号(Ostlund)に記載されており、そこでは、ステロール／スタノールをレシチンと混合して水溶性の粉末を得る。
【００３３】
他の材料と混合することによって、粉末形態の組成物にステロール／スタノールを添加してもよい。食品組成物の場合、スタノール／ステロール、ならびに他のコレステロール降下剤を混合工程にタイミング良く添加する。コレステロール降下チョコレートの調製の間に、例えば、糖、融けたバターを含む乾燥混合物；製粉前のニブ；またはあまり好ましくはないが、融けたチョコレートに、ステロール／スタノールを添加してもよい。混合を容易にするため、例えば脂肪、植物性油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、トコフェノールおよびそれらの混合物のような溶媒に、ステロール／スタノールをまず溶解させてもよい。ステロール／スタノールの懸濁液およびエマルジョンを作るのに有効な担体は、水、アルコール、ポリオール、ステロール／スタノールが少なくとも部分的に溶解する食用化合物（例えばチョコレート液）、およびそれらの混合物である。
【００３４】
例えば、大豆蛋白単離物、大豆蛋白濃縮物、加工大豆蛋白、または大豆粉、フレークおよび粗挽き大豆のような、任意の公知の形態で大豆蛋白を組成物に添加してよい。例えば実施例に記載のように、大豆全体またはその一部を用いてもよい。様々な形態の大豆蛋白が当業界で公知であり、かつ市販されている。その特性およびそれを得る方法は、例えば、Soy Protein and Human Nutrition, Wilcke et al., eds., Acad. Press, NY, 1979に記載されている。任意のステロール／スタノールベースのコレステロール降下剤と併用して大豆蛋白を用いることができる。
【００３５】
例えばβ−グルカンのような適切な植物繊維は、血漿コレステロールを低下させることができる。本発明において使用するための繊維は、当業界で公知の方法に基づいて調製し、組成物に添加することができる。それら繊維は、例えば食品および栄養補助食品のような経口輸送組成物に特に適している。任意のステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤と併用して、β−グルカンおよび他の可溶性植物繊維を用いることができる。
【００３６】
また、本発明の組成物は、Ｌ−アルギニンを含んでいてもよく、例えば精製化合物、Ｌ−アルギニン含有植物からの抽出物、または種／木の実原料（例えば木の実粉末もしくは全体の種／木の実）の形態のような様々な形態で、本発明の組成物中に提供される。合成のまたは天然の任意のＬ−アルギニン供給源を用いることができる。好ましいＬ−アルギニン供給源は、大豆および木の実の仁（例えばピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツ(hezelnuts)）である。脱脂および部分脱脂した木の実の仁を用いてもよい。それらを挽いたものであってもよく、それを木の実粉末と称する。
【００３７】
本組成物は、カルシウム、カリウム、マグネシウム、例えばビタミンＥおよびビタミンＣのような抗酸化剤、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばω−３脂肪酸）を含んでいてもよく、それらは当業界で公知の方法に基づいて得られる。オリーブ油、魚油、または木の実の形態で、モノまたはポリ不飽和脂肪酸を用いてもよい。そのような使用に適した木の実の例として、ピーナッツ、アーモンド、およびクルミが挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物は、食品、食品添加物、栄養補助食品、または薬剤として有用である。本組成物は、担体、希釈剤、または賦形剤を含んでいて差し支えない。意図された用途に応じて、ヒトまたは家畜動物での使用、食品、食品添加物、栄養補助食品、または薬剤における使用に適するように、担体、希釈剤、または賦形剤が選択される。
【００３９】
本明細書中で用いられている「食品」の用語は、成長、修復および生活過程を維持し、かつエネルギーを供給するために生物の体内で用いられる、蛋白質、炭水化物および／または脂肪から実質的に成る物質である。食品は、例えばミネラル、ビタミン、および調味料のような補助的物質も含んでいて差し支えない。Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary, 10th Edition, 1993を参照。食品の用語は、ヒトまたは動物が摂取するのに適合させた飲料を含む。本明細書で用いられている「食品添加物」の用語は、ＦＤＡ(21 C.F.R. 170.3(e)(1))によって定義されており、直接的および間接的添加物を含む。本明細書で用いられている「薬剤」の用語は医薬である。Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary, 10th Edition, 1993を参照。薬剤は医薬とも称される。本明細書で用いられている「栄養補助食品」は、食事を補足することが意図された、以下の食物原料の１つ以上を有するまたは含有する製品（タバコ以外）である：ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、全１日摂取量を増やすことによって食事を補足するために男性に用いられる栄養物質、あるいはそれら原料の濃縮物、代謝物、構成成分、抽出物または配合物。
【００４０】
必要に応じてコレステロール降下剤、Ｌ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、例えばビタミンＥおよびビタミンＣのような抗酸化剤、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばω−３脂肪酸）と共に、カカオポリフェノールあるいは例えばメチル化化合物または代謝分解産物のようなその誘導体の存在によって改善された任意の飲料を含む任意の従来の食品も本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
(i)カカオポリフェノールを含有しない食品にカカオポリフェノールまたはその誘導体を添加することによって、あるいは(ii)食品が従来から例えばチョコレートのようなポリフェノールを含有する場合には、従来の食品中に含まれるレベルを越えてポリフェノールレベルを強化することによって、改良を行う。例えば抽出物、画分、または単離および精製化合物の形態の追加のカカオポリフェノールを添加することによって；原料（例えば木の実の表皮）を含む別のポリフェノールと共にカカオポリフェノールを添加することによって；食品の製造に用いられるカカオ原料中のカカオポリフェノールを保存するように、上記のようにカカオ原料加工およびカカオ豆選択を操作することによって；あるいは、上記のようにチョコレート製造工程を操作することによって；強化を行うことができる。従って、それら食品（飲料を含む）は、匹敵する従来の食品（飲料を含む）と比較して、「高められたレベルのポリフェノール」（カカオプロシアニジンを含む）。高められたレベルのポリフェノールを有するチョコレートの例は、チョコレート製造業者が、既に市販されている製品に、カカオポリフェノール含有カカオ抽出物を添加した場合に生じる。そのような食品は、「高カカオポリフェノール食品」とも称され、すなわち、それら食品は従来の対応物よりも高レベルのポリフェノールを含有する。
【００４２】
カカオポリフェノール、および必要に応じて少なくとも１つのコレステロール降下剤（例えばステロールおよび／またはスタノールベースのコレステロール降下剤）、Ｌ−アルギニン、カルシウム、カリウム、マグネシウム、例えばビタミンＥおよびビタミンＣのような抗酸化剤、任意のビタミンＢ複合体、カロチノイド、グアールガム、あるいはモノまたはポリ不飽和脂肪酸（例えばω−３脂肪酸）を含む食品を、ヒトまたは家畜動物における使用（ペットフードを含む）に適合させることができる。その食品は菓子以外であってもよいが、好ましいコレステロール降下食品は、例えばミルクチョコレート、スウィートチョコレート、およびセミスウィートチョコレート（ブラックチョコレート、低脂肪チョコレート、およびチョコレートでキャンディーを覆ったようなキャンディーを含む）のような、同一性規格(standard of identity)(ＳＯＩ)または非ＳＯＩチョコレートのような菓子類である。他の例として、焼き製品（例えばチョコレートケーキ、焼きスナック、クッキー、ビスケット等）、調味料、グラノーラバー(granola bar)、トフィーチュー(toffee chew)、食事代用バー(meal replacement bar)、スプレッド(spread)、シロップ、粉末飲料混合物、カカオまたはチョコレート風味飲料、プディング、もち、米混合物(rice mix)、風味の良いソース等が挙げられる。望ましい場合には、食品はチョコレートまたはカカオ風味である。カカオポリフェノールおよびコレステロール降下剤に加えて、Ｌ−アルギニンを含有する食品は、好ましくは、チョコレート、または例えば、木の実（例えばピーナッツ、クルミ、アーモンド、およびヘーゼルナッツ等）を含有するグラノーラバーのようなキャンディーバーである。例えばピーナッツの表皮は約１７％のプロシアニジンを含有し、さらにアーモンドの表皮は約３０％のプロシアニジンを含有するため、本明細書に記載の食品に、表皮を有する木の実を加えると、全ポリフェノール含有量を高められる。１つの実施形態では、コレステロール降下剤を含有するチョコレートキャンディーのヌガー(nougat)に、木の実の表皮を添加する。
【００４３】
ある実施形態において、非チョコレート食品は、約５μｇ／ｇ以上から約１０ｍｇ／ｇ（例えば５μｇ／ｇ以上、好ましくは１０μｇ／ｇ以上、より好ましくは１００μｇ／ｇ以上）のカカオプロシアニジンを含有する。望ましい場合には、非チョコレート食品は、以下に記載のチョコレート食品中に含まれるレベルよりもさらに高レベルのカカオプロシアニジンを含んでいてよい。
【００４４】
１つの実施形態において、チョコレート菓子は、心臓不整脈、または例えば神経変性疾患のようなギャップ結合連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすのに効果的な量のカカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンを含む。チョコレート菓子はミルクチョコレートまたはブラックチョコレートであってよい。ある実施形態では、チョコレートは、その製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、３，６００μｇ以上、好ましくは４，０００μｇ以上、より好ましくは４，５００μｇ以上、さらに好ましくは５，０００μｇ以上、最も好ましくは５，５００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。他の実施形態では、チョコレートは、その製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、６，０００μｇ以上、好ましくは６，５００μｇ以上、より好ましくは７，０００μｇ以上、最も好ましくは８，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有し、さらにより好ましくは１０，０００μｇ含有する。
【００４５】
ミルクチョコレート菓子は、そのミルクチョコレート製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、１，０００μｇ以上、好ましくは１，２５０μｇ以上、より好ましくは１，５００μｇ以上、最も好ましくは２，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。より好ましい実施形態では、ミルクチョコレート菓子は、そのミルクチョコレート製品中の無脂肪カカオ固形物の全体量に基づいて、チョコレート１ｇ当り、２，５００μｇ以上、好ましくは３，０００μｇ以上、より好ましくは４，０００μｇ以上、最も好ましくは５，０００μｇ以上のカカオプロシアニジンを含有する。
【００４６】
食品中のＬ−アルギニンの量は変動してよい。通常、カカオは、１００ｇの部分脱脂カカオ固形物１００ｇ当り、１から１．１ｇのＬ−アルギニンを含有する。それはカカオ１００ｇ当り０．８から１．５ｇに相当する。本発明のチョコレート食品は、カカオ原料中に天然で生じる量よりも多い量でＬ−アルギニンを含有する。食品中で用いられるカカオ原料およびＬ−アルギニンの量が分かれば、当業者は容易に最終製品中のＬ−アルギニンの全体量を特定できるであろう。食品は、通常、食品１ｇ当り、５μｇ／ｇ以上、好ましくは３０μｇ／ｇ以上あるいは６０μｇ／ｇ以上、さらに好ましくは２００μｇ／ｇ以上でＬ−アルギニンを含むであろう。
【００４７】
食品においてコレステロール降下剤が用いられる場合、その量は、用いられる薬剤のタイプに依存し、本明細書、特に以下に提供する１日用量、ならびに当業技術に基づいて、当業者はその量を特定することができる。例えば、食品組成物は、４５ｇの１人前分量当り約０．５から約１０ｇ、好ましくは４５ｇの１人前分量当り約１．５から約５ｇ、最も好ましくは、４５ｇの１人前分量当り約２ｇから約４．５ｇのステロール／スタノールを含有する。大豆蛋白、およびカラスムギ由来の可溶性繊維に関して、ＦＤＡは、健康促進効能表示を行うことができる食品１人前当りの最少量を提供している。ＦＤＡによると、β−グルカン含有食品１人前は、０．７５ｇ以上のβ−グルカンを含む必要があり、さらに大豆蛋白含有食品１人前は、６．２５ｇ大豆蛋白を含む必要がある。それらの値は、食品中のコレステロール降下剤の量を特定するためのガイドとしても用いることができる。
【００４８】
カカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンの１日効果量を単一の１人前量で提供する。従って、菓子（例えばチョコレート）は、１人前当り約１００ｍｇ以上（例えば１５０−２００ｍｇ、または２００−４００ｍｇ）のカカオプロシアニジンを含有する。組成物中にコレステロール降下剤が含まれる場合は、１人前当り１．５ｇ以上（例えば１．５−４．５ｇ）のステロール／スタノールが添加される。
【００４９】
必要に応じてコレステロール降下剤および／またはＬ−アルギニンと共に、カカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンを含む薬剤を、例えば経口、口腔内、経鼻、直腸、静脈内、非経口、および局所等の様々な経路で投与することができる。当業者は、投与形態に応じて、適切なコレステロール降下剤を特定することができる。従って、各投与形態に適合させた剤形も本発明の範囲に含まれ、例えば錠剤、カプセル剤、ゼラチンカプセル剤（ゲルカップ）、バルクまたは単位量の粉末または顆粒、エマルジョン、懸濁液、ペースト、クリーム、ゲル、フォームまたはゼリー等の固形状、液状、および半固形状の剤形が挙げられる。徐放性剤形も本発明の範囲に含まれ、米国特許第５，０２４，８４３号；第５，０９１，１９０号；第５，０８２，６６８号；第４，６１２，００８号；および第４，３２７，７２５号（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のように調製することができる。適切な薬剤的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤は、当業界で周知であり、当業者は容易にそれらを特定できる。例えば錠剤は、効果量のポリフェノール含有組成物、ならびに例えばソルビトール、ラクトース、セルロースまたはリン酸２カルシウムのような担体を含む。
【００５０】
カカオフラバノールおよび／またはプロシアニジン、ならびに必要に応じて少なくとも１つのコレステロール降下剤および／またはＬ−アルギニンを含有する栄養補助食品を、当業界で公知の方法を用いて調製することができ、例えば、リン酸２カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、硝酸カルシウム、ビタミン、およびミネラルのような栄養素を含む。
【００５１】
さらに、本発明の組成物（例えば食品、栄養補助食品、薬剤）、ならびにカカオフラバノールおよび／またはプロシアニジンおよび／またはその誘導体の存在、またはそれらの増強された含有量を指示する；あるいは、心臓不整脈、または例えば神経変性疾患のような、ギャップ結合連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすためにその組成物を使用することを指示したラベルを含む放送製品も本発明の範囲に含まれる。必要に応じて、そのラベルは、コレステロール降下剤および／またはＬ−アルギニン含有量、ポリフェノール、コレステロール降下剤および必要に応じてＬ−アルギニンを併用することの有益な特性を示唆していてもよい。包装製品は、心臓不整脈、または例えば神経変性疾患もしくは癌のような、ギャップ結合連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を遅くするのに使用するための指示書を含むものであってもよい。
【００５２】
本明細書で用いられている「治療」の用語は、例えば心臓不整脈またはそれに関連する症状のような、既存の病状を改善することを意味する。「予防する」の用語は、疾患の兆候を減らすことを含む、疾患を発症することに関連する危険性を減らすことを意味する。予防は、疾患を発症する危険性が高いことが分かっている個体、あるいは例えば不整脈の危険性を減らす等、良好な健康状態を維持するために広い個体群において用いられるであろう。本方法は、ヒト、または例えばイヌ、ネコ、ウマ等の家畜動物において用いることができる。
【００５３】
本方法は、必要に応じてコレステロール降下剤、Ｌ−アルギニン、抗酸化剤（例えばビタミンＥ、ビタミンＣ）と共に、例えばカカオフラバノールおよび／またはその関連オリゴマーのようなフラバノールおよび／またはその関連オリゴマーを含むある量の組成物を、哺乳類、好ましくはヒトまたは家畜動物に投与することを含み、フラバノールおよび／またはその関連オリゴマーは、心臓不整脈、または例えば神経変性疾患（例えばパーキンソン病およびアルツハイマー）のような、ギャップ結合連絡の異常に関連する任意の症状を治療し、予防し、その発生を減らすのに効果的な量で含まれる。さらに、例えばコネキシン４０および／または４３のようなコネキシンに関連する認知障害の治療も本発明の範囲に含まれる。従って、コネキシン関連機能を治療または改善することができる。本発明によって治療できる認知障害の例示は、短期記憶および鬱病である。例えばピーナッツ表皮から単離されたポリフェノールのような他のポリフェノールを用いてもよい。
【００５４】
従って、以下の使用も本発明の範囲に含まれる。ヒトまたは家畜動物におけるギャップ結合連絡阻害に関連する疾患を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を抑えるのに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造における、カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用も含まれる。
【００５５】
以下の使用は実施形態の例示である。ヒトまたは家畜動物における心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその発生を減らすのに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造における、カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用。ヒトまたは家畜動物における認知障害を治療し、予防し、その危険性を軽減し、またはその進行を抑えるに使用するための薬剤、食品、栄養補助食品の製造における、カカオフラバノールおよび／またはそのオリゴマーの使用。
【００５６】
以下の化学式Ａｎで表わされる高分子化合物、またはその薬剤的に許容される塩を本発明の組成物および使用において用いることができる：
【化３】
2005526780.tif 000004
【００５７】
式中、ｎは、少なくとも１つの末端モノマー単位Ａ、および複数の追加のモノマー単位が存在するように、２〜１８の整数であり；
Ｒは３−（α）−ＯＨ、３−（β）−ＯＨであり；
隣接モノマー間の結合が４、６、または８位で起こり；
４位での追加のモノマー単位の結合がαまたはβ立体化学構造を有しており；
Ｘ、ＹおよびＺは、少なくとも１つの末端モノマー単位に関して、それに対する追加のモノマー単位の結合が４位にあって、かつ必要に応じてＹ＝Ｚ＝水素であることを条件に、モノマー単位Ａおよび水素から選択される。
【００５８】
効果量は、本明細書中に記載のガイダンスを用いて等業者が特定できる。例えば、効果量は、哺乳類の身体において生理学的に適切な濃度を達成するような量である。そのような生理学的に適切な濃度は、２０ｎＭ以上、好ましくは約１００ｎＭ以上、さらに好ましくは約５００ｎＭ以上であろう。１つの実施形態において、血液中約１μＭ以上の濃度が達成される。
【００５９】
本発明の方法は、例えば心電図（ＥＣＧ）、移動型モニター(ambulatory monitor)、ホルターモニター、トランステレフォニックモニター(transtelephonic monitor)（必要に応じて記憶ループを備える）、ストレス試験、心エコー図、心臓カテーテル、電気生理学的検査、起立試験(head upright tilt test)などを用いて心拍数を計測する等によって、その治療の有効性を特定することをさらに含んでいてよい。
【００６０】
予防目的で健康な哺乳類に、あるいは治療を必要とするかまたは心臓不整脈に関連する１つ以上の危険因子を有する哺乳類に、本組成物を投与してよい。心臓不整脈に関連する１つ以上の危険因子を有する個体は、本明細書に記載の組成物の投与対象である。心臓不整脈、高血圧、冠動脈疾患、心臓発作、甲状腺機能異常の家族歴を有する個体、ならびに喫煙、飲酒、カフェイン愛飲者、または違法物質摂取者（例えばコカイン）、あるいは心臓外科手術から回復した個体が本明細書に記載の治療を必要とするのに好ましい個体である。血管の健康上の問題を発生しやすい他の哺乳類集団は当業者に明白であろう。
【００６１】
心臓不整脈を治療し、予防し、その危険性および／または発生を減らすために、例えばイヌ、ネコおよびウマのような家畜動物に、上記の組成物を投与してもよい。
【００６２】
心臓不整脈を治療し、予防し、またはその危険性および／または発生を減らすのに効果的な量は、本明細書に記載のガイドラインおよび当業界における一般知識を用いて、当業者が容易に特定できるであろう。カカオフラバノールおよび／またはその関連オリゴマーは、約５０ｍｇ／日から約１０００ｍｇ／日、好ましくは約１００−１５０ｍｇ／日から約９００ｍｇ／日、さらにもっとも好ましくは約３００ｍｇ／日から約５００ｍｇ／日で投与する。しかしながら、カカオポリフェノールが非毒性である場合には、上述した量より多くの量を用いて差し支えない。
【００６３】
ステロール／スタノールを用いてコレステロール降下効果をさらに得るためには、非菜食主義者の平均的食事に一般的に含まれる量よりも多い量を投与すべきである。一般的な北アメリカの食事に基づく人は、約２００−４００ｍｇ／日の量で摂取する。従って、例えばシトステロールのようなフィトステロールを用いてコレステロールレベルを下げる場合、約１ｇ／日以上、好ましくは約３ｇ／日以上を投与すべきである。好ましくは、約１ｇ／日以上、より好ましくは約４．５ｇ／日以上から約２０ｇ／日までの量を用いる。しかしながら、その量は、フィトステロールのコレステロール降下の効果によって変化し、例えばより強力なシトスタノールが用いられる場合、効果量は約１から３ｇ／日程度になるであろう。その量は、Roger et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 70(30) 1993およびCarpenter, et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 71(8) 1994に記載の解析方法を用いて特定される。例えば、約２５ｇ／日以上の量で大豆蛋白を投与する。さらに、Recommended Daily Allowances, 9th ed., National Res. Council/national Acad. sci., Washington, D.C.にガイダンスを見つけることができる。例えば３ｇ／日以上の量で可溶性繊維を投与する。
【００６４】
Ｌ−アルギニンを上記の組成物および治療において用いる場合、約２ｇ／日から約５０ｇ／日、好ましくは約３ｇ／日から約１０ｇ／日、さらにもっとも好ましくは約６ｇ／日から約８ｇ／日で投与する。この場合にも、Ｌ−アルギニンが食品中に天然に含まれる場合には、上述された量よりも多くの量を用いて差し支えない。ポリフェノールは、通常、当業界で公知の量で投与される。効果量を特定する際に、ステロール／スタノールの存在下での増強された吸収も考慮することができる。
【００６５】
必要な回数に関して熟練した医者によって特定されたように、例えば毎日、１ヶ月に１回、２ヵ月に１回、半年に１回、１年に１回といった投薬計画、あるいは他の投薬計画に従って、治療／予防的投与を継続して差し支えない。投与は、少なくともコネキシン合成を誘導するのに必要な期間継続することができる。好ましくは、毎日組成物を投与し、最も好ましくは、哺乳類の体内の効果的な化合物レベルを維持するために、例えば朝と夜というように、１日２回または３回組成物を投与する。最も有益な結果を得るために、少なくとも約３０日から約６０日間組成物を投与する。そのような投薬計画を定期的に繰り返して差し支えない。
【００６６】
以下の非限定的な実施例において本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６７】
実施例１：ギャップ結合を介した細胞間連絡に対するカカオフラバノール／プロシアニジンの効果
細胞培養
ＷＢ−Ｆ３４４ラット肝上皮細胞（Trosko博士, East Lansing, MIから供与された）を、３５ｍｍプラスチックディッシュにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ培地(Dulbecco's modification of Eagle's Medium)中で増殖させた。５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下において３７℃でインキュベートした。コンフルエント細胞をＤＭＥＭ（ＦＣＳ無し）中で２４時間インキュベートして、細胞−細胞連絡の基礎レベルを低下させた。(−)−エピカテキン、ゲニステイン（Sigma）またはＴＰＡをＤＭＳＯに溶解し、培地に添加した；対照はＤＭＳＯのみを添加した。培地中のＤＭＳＯの最終濃度は０．２％であった。Adamson et al. (J. Ag. Food Chem., Vol.7:10, 4184-4188, "HPLC Method for the Quantification of Procyanidins in Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity")（参照によって関連部分がこの中に組み込まれている）に記載のようにエピカテキンダイマーを調製した。
【００６８】
ギャップ結合連絡アッセイ
(−)−エピカテキン（４−４０μＭ）およびゲニステイン（４０μＭ）で２４時間および７２時間細胞を処理し、ＧＪＩＣを測定した。ＴＰＡを用いる実験に関して、ＴＰＡ（１、５、１０ｎＭ）、ＴＰＡ（１、５、１０ｎＭ）＋エピカテキン（４０μＭ）、およびＴＰＡ（１、５、１０ｎＭ）＋ゲニステイン（４０μＭ）；対照としてＤＭＳＯ（０．２％）を加えて９０分間インキュベーションした。マイクロマニピュレーターおよびマイクロインジェクターシステム（Eppendorf）を用いて、蛍光色素Lucifer Yellow CH（０．３３Ｍ ＬｉＣｌ中１０％））をマイクロインジェクションすることによってＧＪＩＣを測定した。注入の１分後、色素が積載された単一細胞の周りの蛍光細胞の数を計測した。ディッシュ当り１０個の個別の細胞を注入し、蛍光隣接細胞の数の平均値を計算した。ＣＣＤカメラ(ORCA II, Hamamatusu)を連結したZeiss axiovert 蛍光顕微鏡を用いて画像を撮った。
【００６９】
ウェスタンブロット分析
細胞溶解液を得るために、ＷＢ−Ｆ３４４ラット肝上皮細胞をＰＢＳ（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ細胞溶解バッファー（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１００ｍＭジチオスレイトール、０．２％ブロモフェノールブルー；ｐＨ６．８）で２回処理した。超音波処理した後、溶解液を９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド）に装填した。ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にブロットした。ウサギ抗−Ｃｘ４３ポリクロナール抗体(Zymed)を一次抗体として用い、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体(Dianova)を二次抗体として用いて、免疫検出を実施した。
【００７０】
免疫組織化学分析
免疫組織化学分析のため、ＷＢ−Ｆ３４４細胞を３５ｍｍプラスチックディッシュ中のカバースリップ上でＦＣＳを含有する完全培地中において９０％コンフルエントになるまで増殖させた。１、５、または１０ｎＭ ＴＰＡ、４０μＭ(−)−エピカテキンまたは４０μＭゲニステイン、あるいは４０μＭ (−)−エピカテキンと（１、５、１０ｎＭ）ＴＰＡとの組合せ、または４０μＭゲニステインと（１、５、１０ｎＭ）ＴＰＡとの組合せ；対照としてＤＭＳＯ（０．２％）；を用いて、細胞を９０分間インキュベートした。処理の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールを用いて−２０℃で１０分間固定した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、０．３％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を含有するＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を用いて、非特異的結合部位を室温で４５分間ブロッキングした。１％（ｖ／ｖ）ＮＧＳを含有するＰＢＳで１：１５００に稀釈した抗−Ｃｘ４３ポリクロナール抗体(Zymed)を用いて４℃で１晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ５４６結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体(Molecular Probes; ＰＢＳで１：８００に稀釈)を用いて３７℃で４５分間インキュベートした。洗浄および包埋後、ＣＣＤカメラ(ORCA II, Hamamatusu)を連結したZeiss axiovert 蛍光顕微鏡を用いて画像を撮った。
【００７１】
結果
ゲニステインは１０μＭを超える濃度で培養細胞に影響を与える(Zhang YW, Morita I, Nishida M, Murota SI. Involvement of tyrosine kinase in the hypoxia/reoxygenation-induced gap junctional intercellular communication abnormality in cultured human umbilical vein endothelial cells. J Cell Physiol 1999; 188: 305-13)。
【００７２】
本研究において、ＷＢ−Ｆ３４４ラット肝上皮細胞をゲニステインまたは(−)−エピカテキン（４０μＭ）に暴露すると、インキュベーション時間依存的に、ＧＪＩＣの促進をもたらした。暴露の２４時間後、ゲニステインおよび(−)−エピカテキンによるＨＪＩＣの促進は、それぞれ対照の２．１倍および1．５倍であった。対照はＤＭＳＯ（０．２％）のみで処理した；細胞連絡の基底値は、２４時間後で１３．４±１．０細胞、７２時間後で１２．１±１．３細胞であった。図１は、色素トランスファーアッセイ(dye transfer assay)によって細胞間連絡を測定した結果の例を示す。対照（図１Ａ）；９０分後のＴＰＡ（１０ｎＭ）での阻害（図１Ｂ）；ゲニステインでの促進（図１Ｃ）；または４０μＭの(−)−エピカテキンでの７２時間処理後（図１Ｄ）。
【００７３】
両方のフラボノイドは、共に９０分間のインキュベーション後、ＧＪＩＣに全く有意な効果を示さなかった。細胞培養中の(−)−エピカテキンの濃度を高めると（４から４０μＭ）、連絡細胞の数は増加した（表１）。最も低濃度（４μＭ）で処理した細胞でも、溶媒対照よりも１．６倍高い細胞連絡を示した。２０μＭ濃度で試験したエピカテキンのダイマー形態は、モノマー４０μＭとほぼ同レベルまでＧＪＩＣを促進させた。
【表１】
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【００７４】
ＴＰＡは、Ｃｘ４３蛋白質の修飾によってＧＪＩＣに影響を与えた。Ｃｘ４３はＷＢ３４４細胞における主なギャップ結合蛋白質であるため、(−)−エピカテキンおよびゲニステインの存在下でのＴＰＡのＧＪＩＣに対する影響を調べた（表２）。細胞をＴＰＡ単独に９０分間暴露した場合、５および１０ｎＭ濃度で細胞間連絡は完全に壊された（図１Ｂ）；１ｎＭのＴＰＡを用いた場合、ＧＪＩＣは約４０％まで低下した。０．１ｎＭのＴＰＡでは全く影響は認められなかった。全ての実験において、細胞の生存性は影響を受けなかった。ＴＰＡで７２時間インキュベートすると、ＧＪＩＣには全く影響を与えなかった；連絡細胞の数は対照と比較したものであり、すなわち９０分後に観察された損失からの完全な回復があった。
【表２】
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【００７５】
９０分後におけるＴＰＡによるＧＪＩＣの完全な喪失は、ＴＰＡを４０μＭの(−)−エピカテキンまたはゲニステインと一緒にインキュベートした場合に部分的に中和された。ゲニステインは、(−)−エピカテキンよりも僅かに高い効果を示した。両方の化合物が、１ｎＭのＴＰＡを添加した際に、基底レベルまでＧＪＩＣを回復させた。
【００７６】
並行して、Ｃｘ４３蛋白質の細胞内分布を免疫染色によって調べた（図２）。典型的な対照を図２Ａに示す。細胞はコンフルエントであり、コネキシン蛋白質は細胞膜に局在する。細胞質内であるタンパクシグナルが検出できる。ＴＰＡ（１０ｎＭ）で９０分間処理すると、膜結合Ｃｘ４３のシグナルが劇的に減少した（図２Ｂ）；蓄積Ｃｘ４３蛋白質の領域はもはや検出できなかった。(−)−エピカテキン(図２Ｃ)またはゲニステイン（図２Ｄ）が細胞培養中に存在する場合、ＴＰＡ効果は低下した。Ｃｘ４３蛋白質は、対照に匹敵する群生構造を構成する膜において検出できた（図２Ａ）。１および５ｎＭでＴＰＡを用いた場合に、類似の(−)−エピカテキンおよびゲニステインの反作用効果が認められた。
【００７７】
実施例２：フラバノール／プロシアニジンの特定
以下のようにプロシアニジンを定量化した：市販されている(−)−エピカテキン、ならびに以下の方法によって精製状態で得られたダイマーからデカマーを用いて複合標準を作成した：Hammerstone, J.F. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10)490-496, Lazarus, S.A.et al., J.Ag. Food Chem.; 1999; 47(9); 3693-3701、Adamson, G.E. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10) 4184-4188。励起波長２７６ｎｍおよび発光波長３１６ｎｍでの蛍光検出を利用して、以前挙げられたAdamson引例に記載の順相ＨＰＬＣ法を用いて、それら化合物を使用した標準ストック溶液を分析した。ピークを集め、任意の１つのオリゴマー類内の全ての異性体が含まれるようにその面積を合計し、さらに２次フィット (quadratic fit)を用いて校正曲線を作成した。モノマーおよび小さなオリゴマーはほとんど直線プロットを有しており、それはモノマーおよびダイマーに基づく校正曲線を作成するために直線回帰を事前に行ったものと一致していた。
【００７８】
それら校正曲線を用いて、以下のように調製した試料中のプロシアニジン濃度を計算した：最初に、ヘキサン（各４５ｍＬ）を用いて、カカオまたはチョコレート試料（約８ｇ）を３回脱脂処理した。次に、５ｍＬのアセトン／水／酢酸混合物（７０：２９．５：０．５ ｖ／ｖ）を用いて１ｇの脱脂材料を抽出した。次に、試料のＨＰＬＣデータを、上記のように得られた校正曲線（精製オリゴマーを用いた）と比較することによって、脱脂材料中のプロシアニジンの量を特定した。Association of Official Analytical Chemists(AOAC Official Method 920.177)による標準化方法を用いて、試料（チョコレートに関して１ｇの試料を用い、または液体に関して０．５ｇの試料を用いた）の脂肪の割合（％）を特定した。さらに、元の試料（脂肪を含む）中の全プロシアニジンの量を計算した。カラム間の変動を防ぐため、各試料について実施する前に校正を行った。
【００７９】
実施例３：カカオプロシアニジン、フィトステロール、およびそれらの組合せの経口摂取の効果
本実験の結果は、（１）酸化的ストレスおよび損傷の指標に対する、および（２）コレステロールレベルに対する、トール油から利用可能な非エステル化フィトステロールおよびフィトスタノール（「フィトステロール」）と、約７０ｍｇ／ｇの全カカオプロシアニジンを含有するカカオ粉末（ＣＰｄ）との組み合わせの供給の効果、ならびにフィトステロールとカカオプロシアニジンの併用投与の相乗効果を示す。
【００８０】
精製卵殻食(purified egg shell diet)にフィトステロール（２質量％）および／またはＣＰｄ（０、０．５、１、２質量％）を補足し、２週間オスラットの給餌に用いた。そのラットを８つの群（各群３匹のラット）に分け、以下に従って対照食および試験食を２０−２５ｇ／日与えた：
食事＋２％フィトステロール(４４０ｍｇ／日) 食事−フィトステロール              
群１      ０％ＣＰｄ（０．０ｍｇ／日）      群５      ０％ＣＰｄ（０．０ｍｇ／日）
群２  ０．５％ＣＰｄ（１１０ｍｇ／日）      群６  ０．５％ＣＰｄ（１１０ｍｇ／日）
群３      １％ＣＰｄ（２２０ｍｇ／日）      群７      １％ＣＰｄ（２２０ｍｇ／日）
群４      ２％ＣＰｄ（４４０ｍｇ／日）      群８      ２％ＣＰｄ（４４０ｍｇ／日）
自由に水を供給し、残り物／食事カップの底に集められたこぼれた食事を量ることによって消費量を特定した。食事摂取量を毎日測り、さらにラット体重を１日おきに測定した。
【００８１】
酸化的損傷／ストレスのパラメーター、コレステロールレベル、および血漿へのエピカテキン吸収を測定した。
【００８２】
Yagi(Biochem Med 15: 212-6, 1976)に記載の方法を改変させた方法を用いて血漿ＴＢＡＲＳを測定した。１００μＬの全血を１ｍＬの生理食塩水に加えて、１７００ｇで１５分間遠心分離した。上清を回収し、分析するまで−７０℃で凍結した。リンタングステン酸／硫酸系を用いて脂質を沈殿させて、脂質を単離した。脂質画分をチオバルビツール酸と反応させ、標準として１，１’，３，３’−テトラエトキシプロパンを用いて、得られた付加生成物を蛍光的に測定した。結果は、血漿１ｍＬ当りのＭＤＡのナノモル量として、および血漿ポリ不飽和脂肪酸の濃度関数として表された。
【００８３】
８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８ＯＨ２’ｄＧ）を以下のように測定した。WAKO DNA Extractor WBキット(Wako Chemical USA, Inc., Richmond, VA)を用いて核ＤＮＡを単離した。キット溶解バッファー中において組織（１００−２５０ｍｇ）または細胞（１０６細胞）をホモジナイズし、さらに４℃において１０,０００ｇで２０秒間遠心分離した。ペレットを溶解バッファーで処理し、得られたペレットをキット酵素反応溶液に溶解させた。ＲＮａｓｅを最終濃度２０μｇ／ｍｌまで添加し、さらに５０℃で１０分間試料をインキュベートした。キットプロテイナーゼ溶液を添加し、５０℃でのインキュベーションをさらに１時間継続した。室温において１０，０００ｇで５分間試料を遠心分離し、キットＮａＩ溶液およびイソプロパノールで上清を処理して、ＤＮＡを精製した。室温において１０，０００ｇで１０分間遠心分離して沈殿を回収し、さらにキット溶液ＡおよびＢで洗浄した。最終ペレットを簡単に空気乾燥させ、さらに０．１ｍＭデスフェリル／２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）２００μｌ中に再懸濁させた。Shigenagaらの方法(Methods Enzymol 234: 16-33, 1994)に基づいて、ＤＮＡ消化および分析を実施した。簡単に説明すると、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでヌクレアーゼＰ１と共に６５℃で１５分間インキュベートすることによって、ＤＮＡをヌクレオチド５’−モノリン酸に消化した。１Ｍ Tris-HCl（ｐＨ８．５）でｐＨを調整し、仔牛の腸のアルカリホスファターゼを用いて同じ試料をヌクレオチドにさらに消化した（３７℃、１時間）。３Ｍの酢酸バッファー（ｐＨ５．１）を用いて試料のｐＨを調整し、さらに０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．１ｍＭデスフェリルを添加して、金属媒介酸化を防止した。３０，０００ＭＷカットオフスピンフィルターに試料を通し、ＨＰＬＣ注入バイアルに入れた。人為的な影響を防ぐために、調製の４８時間内に試料を分析した。分析のために、電気化学検出器(ESA, Coulochem II)を備えたHewlett Packard 1100 HPLCに試料を注入した。Supelcosil LC-18-DBカラム（１５０ｘ４．６ｍｍ、３μｍ粒子サイズ）、および５％メタノールを含む１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）の移動相を用い、定組成で、流速１．０ｍｌ／分において分離を行った。電気化学検出器を用いて４５０ｍＶでＯＨ８ｄＧを検出し、さらにＵＶ検出器を用いて２４８ｎｍで２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）を検出した。ＯＨ８ｄＧのレベルを、試料中のｄＧの量に対して表した。
【００８４】
Rein et al., J. of Nutr., 2000, 130 (8S), 2109S-2114Sに記載のように、エピカテキン吸収を測定した。
【００８５】
結果 
結果は、フィトステロールとポリフェノールの併用投与の予想外の利益を確立した。
【００８６】
図３を参照すると、吸収されたエピカテキンの量は用量依存的に増加した。驚くべきことに、フィトステロールの投与はエピカテキンの吸収を増強させ、例えば２質量％のＣＰｄ食において、フィトステロールを含まない対応食と比較して、エピカテキン血漿レベルが約３０％高められた。従って、フィトステロールはエピカテキンの生体利用率を増大させた。
【００８７】
図４を参照すると、ＣＰｄは用量依存的にＤＮＡに対する酸化的損傷を阻害した。驚くべきことに、高用量のＣＰｄ（２質量％）で、ＤＮＡに対する酸化的損傷の予想外の減少が観察され、ＤＮＡに対する酸化的損傷の予防におけるフィトステロールとＣＰｄとの相乗効果が示唆された。
【００８８】
図５を参照すると、フィトステロール含有食を与えると、驚くべきことに、対照食よりも高い酸化的ストレスを生じさせ、すなわち、本出願の出願日前の当業界で推奨されていた食事と共にフィトステロールを摂取することは、酸化的ストレスを悪化させた。カカオプロシアニジンを与えると、フィトステロールのそのようなネガティブ効果を逆転させまたは鈍くさせた。
【００８９】
全血漿コレステロールも測定し、以下の表３にその結果を示す。
【表３】
2005526780.tif 000007
【００９０】
表３を参照すると、予想通り、フィトステロールはコレステロールレベルを低下させた。しかしながら、驚くべきことに、フィトステロールをＣＰｄと共に投与した場合、コレステロールレベルは用量依存的にさらに低下した。例えば、フィトステロール含有食を与えられた３匹のラットの平均全コレステロールレベルは８４ｍｇ／ｄｌであった。その食事に２質量％のＣＰｄを補足すると、結果的に８０ｍｇ／ｄｌまで全コレステロールがさらに低下し、それら２つの化合物の相乗効果が示唆された。対照食を与えられたラットは、８８．３ｍｇ／ｄｌの平均コレステロールレベルを有する。
【００９１】
実施例４：カカオプロシアニジン含有カカオまたはチョコレートと共にコレステロール降下剤を含む組成物 
コレステロール降下剤を含有するブラックチョコレート、トフィーチュー、およびグラノーラバーを調製した。
【００９２】
トフィーチューは、砂糖とカカオを事前に混合し、それをキャラメルと混ぜ合わせることによって、表４に示す材料から調製された。遊離フィトステロール（粉砕されたものとして）を糖とカカオとの混合物に添加した。
【表４】
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【００９３】
遊離ステロールを含有するブラックチョコレートは、市販されているブラックチョコレート（マーズから市販されているDOVE Dark）を用いて調製した。融けたチョコレートとの混合を容易にするため、およびチョコレートのきめに対する不都合な影響を避けるため、顆粒形態の植物ステロール／スタノールを、IKAによって製造されているUniversal Muche M20で３０−６０秒間挽き、混合し、さらに粒子径がチョコレートの粒子径に匹敵するようになるまでさらに３０秒間挽いた。ブラックチョコレートを融かし、ゆっくり混合しながらステロールを添加して、ステロール粒子を確実に均一に分布させた。得られた組成を表５に示す。
【表５】
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【００９４】
コレステロール降下カラスムギ繊維を含有するグラノーラバーは、表６および表７に挙げられた材料から調製した。ヤシ仁油(palm kernel oil)を４５℃で融かすことによってシロップ結合剤を調製し、使える状態になるまでその温度で維持した。コーンシロップ、グリセリン、カカオ粉末、黒砂糖、塩、レクチン、および没食子酸プロピルを混合し、ヤシ仁油を加えた。その混合物を保温した。グラノーラを調製するため、カラスムギまたは大豆パフ(soy puffs)(Sovex Food, Collegedale, TNから市販されている)をチョコレート片と共に混合し、上記のように調製した暖かいシロップ結合剤をその混合物中に軽く混ぜ入れる。その後、グラノーラ混合物を板状にし、１０Ｘ糖（６２％）、カカオ粉末（３３％）、およびシナモン（５％）の混合物をまぶし、さらにいくつかに切り分けた。混合物中において用いられるカカオ粉末は、米国特許第５,０１５,９１３号(Kealeyら)の方法に基づいて調製した。
【表６】
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【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１Ａ−Ｄは、Lucifer Yellow 色素トランスファーアッセイ(dye transfer assay)によって測定した、ＷＢ−Ｆ３４４におけるギャップ結合を介した細胞間連絡を示す。Ａ：対照（０．２％ＤＭＳＯ）；Ｂ：ＴＰＡ １０ｎＭ（９０分）；Ｃ：ゲニステイン４０μＭ（７２時間）；Ｄ：(−)−エピカテキン４０μＭ（７２時間）
【図２】図２Ａ−Ｄは、コネキシン４３の亜細胞分布の免疫蛍光分析を示す。Ａ：対照（０．２％ＤＭＳＯ）；Ｂ：ＴＰＡ １０ｎＭ；Ｃ：ＴＰＡ １０ｎＭ ＋(−)−エピカテキン４０μＭ；Ｄ：ＴＰＡ １０ｎＭ ＋ゲニステイン４０μＭ（全ての処理のインキュベーション時間は９０分であった）。
【図３】図３は、血漿へのエピカテキンの吸収に対する、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す。
【図４】図４は、ＤＮＡの酸化損傷に対する、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す。
【図５】図５は、脂質の酸化損傷に対する、フィトステロール、カカオプロシアニジン、およびそれらの併用の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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