(57)【要約】本発明には、標的物質を検出するための方法及び装置が含まれている。本方法及び装置には、表面をもつ基体を準備するステップ及びその上に付着物質のドメインを形成するステップが含まれている。付着物質が表面上に置かれ表面に直接非特異的に結合されることができ、表面に特異的に又は非特異的に結合されてもよい。付着物質は、特定の標的物質に親和性を有する。このように作られたドメインは、親和性ドメイン又は付着ドメインと呼ばれる。付着物質の複数の親和性ドメインが単一表面上に付着されることができ、複数の標的物質に特異的な複数の特異的結合親和性ドメインが作られる。標的物質には、例えば、ウイルス、細菌、細菌の胞子、寄生虫、プリオン、真菌、カビ又は花粉の胞子のような病原体又は病原体マーカーが含まれてもよい。このように作成した装置を試験溶液、気体又は1種以上の標的物質を含有することが疑われる他の支持環境とインキュベートされる。標的物質と具体的な親和性ドメインとの間に特異的な結合相互作用が生じ、種々の方法によって検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的病原体を検出する方法であって;
表面をもつ基体を準備するステップ;
表面上にパターン形成金層を付着させるステップ;
標的病原体と相互作用することができる付着物質を表面上に付着させるステップ; 及び
付着物質を標的病原体を含有し得る標的試料にさらし、表面を原子間力顕微鏡で画像化することにより付着物質と標的病原体との間に生じた分子相互作用事象を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項２】
病原体がウイルスであり、付着物質が抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
表面がガラス及びシリコンからなる群より選ばれる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
パターン形成金層を表面上にスパッタ付着させる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
表面がクロム層を更に含んでいる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
抗体を自然吸着により表面上に結合させる、請求項2記載の方法。
【請求項７】
抗体を表面に化学的に繋げる、請求項2記載の方法。
【請求項８】
配向タンパク質層を表面上に付着させて抗体を配向させるステップを更に含む、請求項2記載の方法。
【請求項９】
配向タンパク質がプロテインA、プロテインG及びプロテインA/Gからなる群より選ばれる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
配向タンパク質を金表面上に受動的に吸着させる、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
配向タンパク質を表面に化学的に繋げる、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
C11〜C18アルカンリンカーを金層に共有結合で結合させるステップを更に含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
アルカンリンカーが、COOH、NH2、及びスクシンイミドからなる群より選ばれる機能部分を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
アルカンリンカーがタンパク質の第一アミンと相互作用する、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
抗体をインクジェットを用いて付着させる、請求項2記載の方法。
【請求項１６】
抗体を表面上の付着ドメイン内に付着させる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
抗体を配向タンパク質に付着させるステップが、表面をその上の抗体と共に湿潤環境でインキュベートして抗体を配向タンパク質に受動的に結合させることができる段階を更に含んでいる、請求項8記載の方法。
【請求項１８】
結合事象後に表面から過剰量の抗体を洗浄する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがイヌパルボウイルスである、請求項2記載の方法。
【請求項２０】
抗体が抗パルボウイルスである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ウイルスを対照にさらすステップを更に含む、請求項2記載の方法。
【請求項２２】
対照抗体が抗伝染性胃腸炎ウイルスである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
対照が抗イヌジステンパーウイルスである、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項2記載の方法。
【請求項２５】
抗体がワクシニアウイルスに対向するモノクローナル抗体である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ワクシニアウイルスの検出用装置であって、
基体上に付着させた金層;
金層に共有結合で結合したC(x)アルカンリンカー;
アルカンリンカーを介して表面に繋がれたプロテインA/G; 及び
付着した抗体の一部が活性を保持するようにドメイン内の表面上に付着した抗ワクシニア抗体
を含む、前記装置。
【請求項２７】
基体、金層、アルカンリンカー層、プロテインA/G、その上に付着した抗体がチップを形成している、請求項26記載の装置。
【請求項２８】
xの炭素主鎖の長さが炭素11〜18個であり、末端がスクシンイミド基である、請求項26記載の装置。
【請求項２９】
ドメイン内の表面上に付着した対照抗体を更に含む、請求項26記載の装置。
【請求項３０】
対照が抗アデノウイルス抗体である、請求項30記載の装置。
【請求項３１】
抗体がマイクロジェット付着されている、請求項26記載の装置。
【請求項３２】
基体がガラス及びシリコンからなる群より選ばれる、請求項26記載の装置。
【請求項３３】
金層が表面上にグリッドパターンで付着されている、請求項26記載の装置。
【請求項３４】
グリッドパターンが、孔サイズが100μmでバーサイズが15μmの400メッシュグリッドである、請求項33記載の装置。
【請求項３５】
グリッドパターンが200μm×600μmのスロットグリッドである、請求項33記載の装置。
【請求項３６】
グリッドパターンが600μmの孔グリッドパターンである、請求項33記載の装置。
【請求項３７】
標的病原体を検出する方法であって、
表面をもつ基体を準備するステップ;
標的病原体と相互作用することができる付着物質を表面上に付着させるステップ;
標的病原体を含有し得る標的試料に付着物質をさらし、付着物質と標的病原体との間に生じた分子相互作用事象を検出するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３８】
1種以上の標的病原体を含有し得る標的試料に付着物質をさらす前に、第二標的病原体と相互作用することができる表面上に第二付着物質を付着させるステップを更に含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
付着物質がウイルスであり、標的病原体がウイルスである、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
付着物質がアプタマーである、請求項37記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は、2000年3月7日出願の先願米国出願第09/519,271号と2000年5月18日出願の米国特許出願第09/574,519号の恩典を主張する。
発明の分野
本発明は、病原体、ウイルス、他の生物体の検出及び特徴付けに関する。
発明の背景
病原体は、ヒト、動物、植物の健康に重要な問題である。病原体は、感染症を引き起こすことがあり、結果として様々なヒト病気を生じ、多数が死に至ることがある。その病原体には、多くの種類のウイルス、細菌、プリオン、真菌、カビ、真核微生物、寄生虫が含まれてもよい。更に、病原体は農業的に重要な植物種や動物種に感染し、経済上の困難を生じる。関連した材料(例えば、水、空気、血液、組織、器官等)中の検出、同定は、感染の伝達や拡散を最小限にするために不可欠である。更に、迅速な同定によって有効な治療の戦略を講じるのに援助することができる。
病原体の1種はウイルスである。ウイルスは一例としてここに用いられ、決して本発明の範囲を限定するものではない。ウイルス感染症は、ヒト集団での罹患率と死亡率が著しいものとなる。これらの感染症の多くは、水、食品、空気中の検出されないウイルスから生じ、社会の絶え間なく増大する相互接続によって広がる。血液、血液誘導体、組織、器官のような医学的に重要な材料における検出、同定は病院や診療所内、これらのセンターのスタッフに対する伝達や拡散の可能性を最小限にするのに重要である。
ウイルスや病原体の検出と同定に慣用のいくつかの方法がある。一般的には、3つのカテゴリー: A)感染性分析と感染性低下分析; B)個体がさらされたかを求めるために抗体検出を用いる血清学的分析; C)抗体を試料中の抗原の存在を検出するために用いられる直接ウイルス学的分析又はウイルスゲノムの要素が検出される核酸に基づく分析に該当する。感染性に基づく分析は診断にはめったに用いられていないが、試料中ウイルスの細胞培養と動物に基づく増幅は共に現在の診断法の多くに必要なものである。感染性分析の動物の使用は、コストがかかり、時間を要し、倫理的な議論を受けやすい。主に一部の感染について良い代替法がないことから多くの病院では血清診断がなお存在している。抗体レベルを求めるために、また、感染の確率を推定するために、血清学が主に行われる。抗体に基づく試験が普通であるが、通常は巨視的方式での一組の個別試験に制限される(例えば、酵素結合免疫吸着分析、又はELISA)。炭疽や他の細菌病原体を検出する微生物学的標準法は、栄養寒天上での物質の増殖と種々の染色手順後の目視同定を必要とする。種々の培地における炭素源利用によって同定され、密接に関連した分離物間で区別される。ウイルス病原体は、通常は、動物、特に孵化鶏卵、マウス又は細胞培養内での投与、感染、増幅後に同定される。これが今日行われている基本的な微生物同定スキームである。病原体同定の検査には正確であるが、これらの方法は非常に緩慢である。
擬陽性や擬陰性、特に他の感染症によって生じた抗原と既知の交差反応がある場合には非常に重要である。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)試験は非常に感受性があり、通常は、HIV抗原の陽性試験後のように具体的な病原体の存在が疑われる理由が前もってある場合に用いられている。しかしながら、PCR法は、比較的コトスがかかり、時間を要する。更に、PCR試験は、酵素活性を必要とすることから、また、擬陽性がしばしば起こることから適用が比較的制限される。
【０００２】
発明の概要
本明細書に記載される本発明は、病原体、生物体、ウイルス等を検出する簡便で迅速で感度が高く且つ高処理能力の方法の原子間力顕微鏡(AFM)又は他のタイプの走査型プローブ顕微鏡(SPM)で読み取ることができる、親和性捕捉基体（substrate）、又はセンサである。本方法は、ウイルス全体、ウイルスタンパク質又はウイルス核酸を含む標的試料中の標的物質を検出するために、また、同様の病原体や生物体の株を区別するために適用することができる。更に、蛍光又は生物学的結合事象の検出に一般に実施される他の方法も所望される場合に使うことができる。
標的病原体の検出方法であって、表面をもつ基体（substrate）を準備（provide）するステップ、表面上にパターン形成金層（patterned gold layer）を付着（deposit）させるステップ、標的病原体と相互作用することができる付着物質を表面上に付着させるステップ、及び標的病原体を含有し得る標的試料に付着物質をさらし、付着物質と標的病原体との間に生じた分子相互作用事象を原子間力顕微鏡で表面を画像化することにより検出するステップを含む、前記方法。
ワクシニアウイルスの検出用装置であって、基体上に付着させた金層、金層に共有結合で結合したC(x)アルカンリンカー、アルカンリンカーを介して表面に繋がれたプロテインA/G、及び付着した抗体が活性を保持するようなドメイン内の表面上に付着した抗ワクシニア抗体を含む、前記装置。
標的病原体を検出する方法であって、表面をもつ基体を準備するステップ、標的病原体と相互作用することができる付着物質を表面上に付着させるステップ、標的病原体を含有し得る標的試料に付着物質をさらすステップ、付着物質と標的病原体との間に生じた分子相互作用事象を検出するステップとを含む、前記方法。
【０００３】
詳細な説明
定義
次は本発明の説明を理解するのに有益なものであるいくつかの定義である。これらは一般定義としてのものであり、下の説明をより良く理解するために示されているが、本発明の範囲を制限すべきものではない。
本明細書に用いられる“病原体”なる用語は、一種のウイルス、細菌、真菌、プリオン、微生物又は本明細書の教示を用いて検出し得る他の物質を意味するために用いられる。本明細書に用いられる“病原体”なる用語は、天然の生物学的物質又は人工物であり得る。病原体には、例えば、ウイルス、真核微生物、細菌、真菌、寄生虫、プリオンが含められてもよいが、これらに限定されない。特に、病原体は、パルボウイルス科のイヌパルボウイルス又はポックスウイルス科のワクシニアウイルスであり得る。
“標的物質”なる用語は、検出すべき病原体である。
“標的試料”なる用語は、標的物質がその中に含有しているかを求めるために試験される物質である。これらの標的試料は、天然又は人造物質であり得る。或いは、標的試料は生物学的に生産される産物又は人工的に作られた物であり得る。標的試料は溶液、気体又は他の媒質であり得る。
“付着物質”又は“付着した物質”なる用語は、標的物質が既知のある親和性を有するチップに付着した物質、例えば、結合剤である。付着物質は、親和性ドメインとしても知られる付着ドメイン内に付着し得る。付着物質や標的物質は、非特異的結合事象、例えば、静電的又は疎水性の非特異的相互作用、又は共有結合又はイオン結合のような特定の分子相互作用事象を受けることができるが、これらに限定されない。その付着物質としては、抗体、タンパク質、ぺプチド、核酸、ぺプチドアプタマー、又は核酸アプタマーが含まれ得るが、これらに限定されない。下記実施態様においては、付着した物質は既知のウイルス病原体に対する抗体である。抗体は、標的に特異的に結合するタンパク質である。
本発明に用いられる“チップ”なる用語は、表面をもつ基体が含まれる。“チップ”はその上に付着された付着物質を含んでも含まなくてもよい。後に、チップは標的物質を検出するために標的試料にさらされる。
【０００４】
本実施例は、標的物質としてウイルスの検出を示すものである。付着物質は対応する抗体である。抗体は、標的に特異的に結合する天然に存在する又は合成のタンパク質である。本実施例においては、イヌパルボウイルス(CPV)とワクシニアウイルスを検出した。
CPVは、ウイルスのパルボウイルス科に属し、最小のウイルスであることが知られている。パルボウイルスは最も簡単な真核ウイルスであり、1960年代に発見されただけである。パルボウイルス粒子は、直径が18〜26 nmの正二十面体であり、タンパク質(50％)とDNA(50％)からなっている。ビリオンはエンベロープがなく、ヌクレオカプシドは粒子に対してかなりの安定性を与える。3種類のカプシドタンパク質VP1、VP2、VP3がある。CPVの感染性ビリオン、主にVP2は、60タンパク質サブユニットを有する。
ワクシニアウイルスはポックスウイルス科に属し、最大ウイルスであることが知られている。ワクシニアウイルスは、天然痘の類似体、指定された生物戦争材料である。更に、ワクシニアウイルスはヒトに影響する最大のDNAウイルスである。ワクシニアウイルスはエンベロープされ、わずかに多形性であり、卵形、又はれんが形である。ウイルス粒子は、直径が140〜260 nm、長さが220〜450nmである。ウイルス粒子は、1つ又は2つの側方体を囲んでいる脂質と管状又は球状タンパク質構造を有する外コートと、ゲノムを含有するコアから構成されている。ヌクレオカプシドはれんが形〜卵形である。コアは、通常は、2つの外側体をもつ両凹形である。
本発明の教示で示されるチップを形成するために、まず基体を調製しなければならない。7 mm×7 mm平方に切断した#1カバーガラススリップ(Fisher Scientific)を用いて調製し、超音波浴を用いてエタノール中で30分間十分に洗浄した。ガラス基体は使用するまでエタノール中で保存し得る。次に、ガラス基体を0.1 nm/sのクロムの薄層(〜3 nm)で被覆し、続いて0.2 nm/sの20 nmの金をIBC 2000(South Bay Technologies)を用いて付着させた。コーティングプロセス中にガラス上に銅電子顕微鏡グリッド(400メッシュ、孔サイズ100μm、バーサイズ15μm)(Electron Microscopy Sciences)を載置してガラス基体上に100μm2金パッドを形成することにより表面をパターン形成した。表面をパターン形成するためにスロットグリッド(200×600 nm)又は単孔グリッド(600 nm)を交互に使用することができる。予備的実験においては、抗体がはだかの(清浄な)金表面に固く結合し、あるレベルの生物活性を保持することが認められた。ウイルス粒子が金に結合するとともにバックグラウンドの問題を生じ得る。
【０００５】
受動吸着を使ってプロテインGを金表面に結合してウイルス粒子の非特異的結合を最小限に維持した。プロテインGは4つの結合部位を示し且つ抗体を配向させることから表面上に層として用いられる。プロテインGはFc領域に強固に結合する天然に存在するタンパク質である。更に、抗体がプロテインG上に付着する場合、各々の抗体は表面に相対する特定の方法で配向させる。抗体が表面に相対して配向させる方法の制御によって、活性抗体結合部位の多くがさらされ且つ活性であることが保証される。受動吸着の一代替的実施態様においては、他のタンパク質は、例えば、プロテインA(プロテインGと似ている)又はハイブリッドプロテインA/G(双方の結合特性を合わせたプロテインAとプロテインGの組換え混合物)を使用し得る。他の実施態様においては、チップには非特異的方法で抗体を表面に結合するために付着した金表面が使われてもよい。他の実施態様においては、更に、付着した抗体が非常に特異な方法で、例えば、化学的に表面に結合するように金表面をアルカンチオレート物質で被覆し得る(下記実施例IIを参照のこと)。
プロテインG層を付着させるために、金パッドを新たに調製したガラス基体を1×PBS(10mMリン酸緩衝液、137 mM NaCl、1.37 mM KCｌ)中1 mg/mlのプロテインG(Sigma)溶液に室温で30分間浸漬する。プロテインGは調製した金表面に受動的に吸着され、金被覆ガラス基体上に一様なタンパク質表面を形成する。次に、基体をタンパク質溶液から取り出し、ろ過した蒸留水で洗浄し、アルゴンでブロー乾燥し、抗体付着まで4℃で保存した。
抗体は、インクジェットプリンタに用いられるインクジェットに似たマイクロジェット装置を用いて表面上に付着させることができる。マイクロジェット装置と方法はエアゾール微小液滴を用いて表面上に抗体のドメインを生成するものである。本実施態様においては、30μmのノズルを備えた単一のマイクロジェットと、MicroJet IIIコントローラ(MicroFab Technologies, Inc.,テキサス)を用いた。マイクロジェットをX、Y、Z軸に沿って移動する特注コンピュータ制御ステージに取り付けた。約数十ミクロンの抗ウイルス抗体の付着ドメインをプロテインG表面に生成した。
マイクロジェット法は、ゲノム配列を含む商業的適用において広範囲の現場試験や以前の利用が有利である。マイクロジェットは、ナノリットルからピコリットル範囲内の流体の正確な送達に圧電ポンプを用いる。マイクロジェットは、30〜80μmの直径範囲内のスポットサイズが20μmだけ離れた抗体の配列を一貫してつくることができる。スポットサイズが50μmでスポット間距離が20μmを用いて面積が120×120μmの2×2配列の作成を達成することができる。AFMスキャン範囲は、約120μmであるので、単一AFM走査範囲に全部で4つのスポットを調べることができる。
抗体付着に続いて、基体を高湿度環境に30分間入れることにより再水和した。そのような環境は50％より大きく、更に好ましくは約90％でもよい。チップを高湿度にさらすとともにチップを再水和することにより抗体をプロテインG表面に結合することが援助される。
【０００６】
ウイルスの典型的な直径は約20〜200 nmの範囲にあってもよい。それ故、ウイルス粒子が単一抗体より著しく大きく、いくつかの抗体の領域を覆うことから、すべての抗体が生物活性を保持することは重大ではない。抗体がウイルス表面の25％まで到達させることができる分子可撓性の十分な表面と相接する場合、半径が25 nm(大体CPVのサイズ)のウイルスは約500 nm2の面積を覆っている。抗体の抗原結合部位は、約2 nm×5 nm、又は10 nm2の空間的エンベロープを包含する。それ故、表面上の抗体の20％だけが正しく配向し生物学的に活性である場合には、ウイルス粒子は約10の潜在的結合部位と接触している。これらの考察に基づき、本実施態様には固態ウイルス検出同定分析を構成するために化学吸着抗体が用いられる。
次に、チップを標的試料にさらし、付着物質と標的物質との間のあらゆる分子相互作用事象を試験する。
図1に示されるように、本発明は、検出装置として原子間力顕微鏡を用いる。AFMにおいては、鋭くミクロンスケールのプローブと試料との間の相互作用がプローブが試料上を走査するにつれてモニタされ制御される。圧電結晶を用いてAFMプローブの動きの非常に細かい制御が達成される。従って、AFMは〜2 nmの横からの分解能と＜1 nmの縦の分解能が可能である。この分解能レベルによってオングストローム範囲でのトポグラフィの変化を検出する能力がAFMに得られる。1 nm程度の高さの変化を検出するAFMの能力を抗体-抗原相互作用の検出に使った。核酸、タンパク質、ウイルス、細菌、生細胞、他の生物体を画像化するためにもAFMを用いた。AFMは溶液で操作することができ、ほぼリアルタイムで分子結合事象を同定することができる。典型的なAFM免疫分析の場合、高さの変化は1〜3ナノメートル(nm)程度であり、100％のシグナルの変化が得られる(例えば、3〜6ナノメートル)。ウイルスの場合、この変化は30〜300 nm程度で非常に大きくなり、シグナルとノイズの比率は10〜100倍である。
120μmチューブスキャナを備えたディメンション3000シリーズAFM(Digital Instruments/Veeco、サンタパーバラ、カリフォルニア州)をチップの大規模トポグラフィ測定に用いた。全画像を、周囲条件下シリコンウルトラレベラー(Park Instruments)を用いたタッピング方式で捉えた。画像を平坦化し、分析のためにローパスフィルタろ過した。
本実施態様は無標識検出装置としてAFMを用いるが、表面プラズモン共鳴、質量分析、電子符号差、光学的方法、又は他の方法を含むがこれらに限定されない代替的方法も本発明にその種類と範囲を変えることなく組込むことができる。
【０００７】
実施例I
図2a、図2b、図4a〜図4c、図6a〜図6c、図7a〜図7cを参照すると、抗イヌパルボウイルスモノクローナル抗体がその上に付着したチップを作成し、チップを標的試料にさらし、次にAFMを用いてチップを読み取り、CPVがチップ表面に結合しているかを求めることによりCPVが検出される。
ウイルス粒子を0.3mg/mlの保存濃度で調製した。CPVカプシドを認識する精製モノクローナル抗体、A3B10(0.9 mg/ml)を用いた。他のテスト実験では、結果に変化が見られない別の製造元(Custom Monoclonal International、カリフォルニア州)から精製パルボウイルスモノクローナル抗体(2 mg/ml)を入手した。
CPVに対する抗体を特定の領域に付着させるためにプロテインGが表面に被覆されたチップを用いた。上記マイクロジェット法を用いてドメインを形成した。マイクロジェットを用いて表面に付着させる前に本実施態様の抗体を1×PBS中0.1 mg/mlに希釈した。注射器でマイクロジェットに充填し、抗ウイルス抗体を表面上に40〜80μmの範囲のスポットサイズで付着させた。すべての抗体スポットが付着した後、チップを湿潤環境において室温で30分間インキュベートして抗体をプロテンG表面に結合させた。次にチップを蒸留水で洗浄し、アルゴンでブロー乾燥し、使用まで4℃で保存した。
所望の表面がチップ上に形成された後、チップを蒸留水で洗浄し、画像化して表面上に粒子状物質がない清浄で平滑な表面を保証した。その画像は図7aと図6aに見られる。本実施態様は、付着物質を標的物質にさらすために抗体をチップと共にインキュベートすることを用いた。チップを標的試料、この場合には200μlのウイルス検出緩衝液(0.25 mM NaClと、0.2% トゥイーン-80を含有するPBS)をロッカープラットフォーム上で室温において15分間インキュベートした。CPVとのインキュベーション中に、ウイルスはCPV抗体をもつチップ上の特定のドメインに結合するだけでなく、チップ上の他の領域にも非特異的に結合する。図6bを参照のこと。インキュベーション後、チップを洗浄緩衝液(0.4 M NaClと0.2% T-80を含有するPBS)で3回、それぞれ10分間と、水で1回洗浄した。これにより非特異的に結合したウイルスが除去される(図6c)。各チップを水ですすぎ、アルゴン流でブロー乾燥し、AFMにより画像化した。チップは高CPV濃度(＞100 ng/ml)の2μlでインキュベートすることができる。ウイルス濃度の低いチップは、標的試料検出緩衝液中200μlのウイルスでロッカー上いろいろな長さの時間室温でインキュベートすることができる。
【０００８】
結果
上記ステップを種々の濃度でCPVを含有する試験試料を試験するために用いた。後に、各チップを画像化し、粒子数分析を行った。5組のデータを集め、X軸の時間とY軸のウイルス粒子の結合数によるグラフにプロットした。図8に見られるように、濃度が低下するのにつれていかなる時間においてもウイルス粒子の結合数は減少する。また、いかなる濃度においても結合プロファイルは単一ステップ結合プロファイルに見られる漸近的標準曲線をたどると思われる。
CPV抗体が付着された領域はそれにウイルス粒子が結合した(＞500粒子/5μm領域)。結合が結合していない領域はそれに結合したウイルス粒子が非常に少なかった(＜10粒子/5μm領域)。CPV抗体が付着した結合は、プロテインG表面とウイルス間の非特異的相互作用によるものであり得る。図7a〜図7cを参照のこと。
CPVによる希釈系実験を行うことにより、ウイルス粒子が300 pg/mlの濃度で検出し得ることがわかった。CPVゲノムは、約5キロベースの一本鎖DNAである。全DNAの分子量がタンパク質の分子量と同じであると考えると、中空カプシドの分子量は約2000 kDaであり、その結果1μgの中空カプシドは約3×1011粒子(1014粒子/mlの保存濃度)を有する。これらの数字は、107粒子/mlの力価のウイルスが特定のウイルスの存在を報告するのに十分なシグナルを与えることを示している。
試料濃度に対する実測結合の程度に関係する更に定量的データ分析を行うことができる。例えば、実測粒子数は時間の関数であり、試料濃度の誘導体であるので、時間的経過を行うとともに絶対試料濃度を求めることが可能である。いくつかの時点、例えば、1分、5分、20分、60分で結合したウイルスの数が測定される。これを既知の濃度のウイルスの標準曲線と比較することができる。結合が拡散によって促進され、それ故単位時間当たりの結合事象の数が濃度の関数であるので、結合と時間の曲線を既知のウイルス濃度を用いて得られた標準曲線にあてはめることにより不明のウイルスの濃度を計算することができる。
【０００９】
このデータは、形態分析、局部接着、弾性、粘性、又はAFMが可能である他の分析とつながり、センサ面に結合した物質の同定及び特徴付けを著しく高める情報の多次元データベースをつくることができる。
図7a〜図7cは、チップ表面を示すAFMスキャンである。上の画像はスケールが局在形状を表している二次元レンダリングを示す図である。明るい強度の形状は、暗い形状より長く(全Z範囲300 nm)、照射野は2μ×2μである。下の画像は同じデータの3D投影である。図7bは、CPVと反応した後の表面を示している。明るい形状は、結合したCPV粒子の存在に対応している。
図2a-図2bにはAFMを用いてマイクロアレイに結合するウイルスの例示的画像が示されている。このように、試料が存在しない場合、プローブのたわみは捕捉プローブ(対照)の存在によるものである。試料が捕捉プローブに結合した場合、たわみの高さの増大は捕捉プローブの上に載っている結合した大分子量粒子によるものであり、明らかに検出される(陽性)。この分析により、標的粒子に結合したスポット当たりの捕捉プローブの数を積分することによりチップに結合した粒子の定量化が可能である。
図6a〜図6cに示されるように、ユニークなウイルスに特異的な各抗体は異なるドメインにスポットすることができる。チップ表面全体がウイルスにさらされる場合、ウイルス粒子は特異抗体をもつドメインに強く結合し、他のドメインには弱く非特異的に結合する。図6bを参照のこと。チップ表面を洗浄した後、ほとんどの弱い非特異的結合の抗原が除去され、残存する表面結合の抗原はその抗体をもつドメインに特異的である。図6cを参照のこと。
本発明においては、結合結果は対照を用いることにより調べることができる。対照はウイルスをチップにさらすことにより達成され、標的物質に対する結合親和性を有しない。本実施態様においては、TGEVを検出するためのチップをCPVにさらした。図7aは、分析物が添加されていない(対照)AFMにより検出したチップ表面を示している。図7cは、チップ上で抗TGEV抗体に結合しないCPVと反応した伝染性胃腸炎ウイルス(TGEV)に対するチップを示している。そのレンダリングは、結果が同じCDV(イヌジステンパーウイルス)に対する抗体で行った。(精製モノクローナル抗ジステンパーウイルス抗体(0.1 mg/ml)を入手した(Biodesign International、メーン州)。
【００１０】
実施例II
抗ワクシニアと抗アデノウイルス(対照)抗体をBiodesignから入手した。ワクシニアウイルス株WR(アメリカンタイプカルチュアコレクション(ATCC)1354)を7% v/vウシ胎児血清とペニシリンで補足したRPMI 1640、ストレプトマイシン、ファンギゾーンで維持したヒーラーS3(ATCC CCL-2.2)細胞中で増殖した。ブレークびん中のほぼ集密的S3細胞に感染多重度(MOI)0.2で感染させた。約3日以内に解離が明らかになったときに細胞を集めた。凍結乾燥した細胞から沈降速度と平衡密度遠心分離の連続サイクルによりウイルスを精製した。精製ウイルス株を終点希釈分析で力価測定し、-80℃で保存した。ウイルスの保存濃度は、107pfu/mlであった。精製したウサギ抗ワクシニア(B65101R、ロット8304600)とヤギ抗アデノウイルスヘキソン(B65101G、ロット4A01901)抗体をアリコートに分け、使用するまで-20℃で保存した。
ワクシニアチップをつくるために、上記実施例Iのタンパク質層に受動吸着する代わりにチップ表面に抗ワクシニア抗体を付着するために活性固定化方法を用いた。対照的に、いくつかのアデノウイルス粒子はワクシニアチップに結合し、ワクシニアチップの特異性が証明される。更にワクシニアチップの特徴付けから、ワクシニアのチップへの結合が最初の12時間は経時線状であり、AFMで見た900μ2面積には最高200粒子が付着することがわかった。
まずアルカンチオレート単層を金上に置くことにより抗ワクシニア結合剤を表面に繋ぐことができる。次に、抗ワクシニアウイルスがアルカンチオレートの露出部分の-COOH基と反応する。他の実施態様においては、結合剤はスクシンイミド基又はNH2基で固定することができる。
【００１１】
ウイルスは、典型的なれんが様形態を保持している。洗浄乾燥したチップをヒーラーS3単層に置くことにより感染性ワクシニアウイルスが得られる感染が引き起こされるのでウイルスはその感染性の一部又は全部を保持することができる。
異種実験における抗アデノウイルス抗体は、2、3の結合ビリオンを示した。これらの抗体を用いたいくつかの実験において同種シグナルと異種シグナルとの比は約1 logである。抗アデノウイルスを用いた900μ2領域においては、典型的には3〜8ワクシニア粒子が検出された。
チップ表面に活発に固定化された抗体付着については、スロットグリッド又は単孔グリッドによってパターン形成された新たに調製された金表面を、16-メルカプトヘキサデカン酸の0.5 mmエタノール溶液中に室温で一晩浸漬した。表面をエタノールですすぎ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)(100 mM(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)(MES)緩衝液中10 mg/ml pＨ4.8)を室温で2時間インキュベートすることにより活性化した。各チップをPBSですすぎ、乾燥アルゴン流でブロー乾燥した。中央金パターン(スロットグリッドで形成された)が1μlの抗体(PBS中0.1 mg/ml)で覆われ、室温で2時間インキュベートした。次に、チップをPBSですすぎ、室温で2時間インキュベートした。次にチップをPBSですすぎ、未反応チップ表面をPBS中の10 mMメチルアミン中で30分間インキュベートすることにより阻止した。チップを水洗し、ブロー乾燥し、4℃で保存した。
105感染量/mlとTEMに基づき測った106の粒子数を含む分析から、最初の12時間は経時線状であり、AFMで見た900μ2においては最高200粒子が付着した。
結合は濃度の関数であった。30倍まで濃度を上げることによりウイルス数の30倍増加分が認められた。
【００１２】
代替的実施態様
一代替的実施態様においては、走査プローブによって試料の迅速な移動のためのメカニズムと共に大きなスポットを用いることができる。本実施態様においては、60〜100μ(μm)径のスポットサイズが配列において数十ミクロン(ミクロンメートル)離れて位置し得る。次にAFMが、反応測定領域に対してスポットの正確な移動に頼っている既知の順序でスポットを走査する。この操作は、慣用の高分解能移動ステージを用いて容易に達成することができる。速い走査速度(例えば、3 Hzと1 Hz)と低い分解能(例えば、256と512ライン/走査)データがデータの過度の分解を加えずにステージを物理的に移動するのに必要とされる追加時間を相殺するために用いることができることから、処理能力が損なわれない。
理解することができるように、本発明は、他のウイルス、細菌、細菌胞子、プリオン、病原性微生物、例えば、真菌、寄生虫、カビ、花粉胞子であるがこれらに限定されない広範囲の生物体の検出及び特徴付けに適用することができる。
本明細書に記載される情報と実施例は、説明のためのものであり、本発明の概念的文脈の範囲内であるあらゆる誘導又は代替法を排除することを意味しない。本発明の範囲からそれることなく本実施態様に様々な誘導がなされ得ることが企図される。従って、本発明の範囲は本実施態様の上記説明よりは添付の特許請求の範囲によって決定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】AFM検出法を示す図である。
【図２】図2aは付着物質が上にあるチップとそのAFMスキャンの図である。図2bは標的物質が結合した表面上に付着物質があるチップとそのAFMスキャンの図である。
【図３】2種類の異なる付着物質が2つの異なるドメインに置かれたチップの図である。
【図４】図4aは標的物質の結合前後の付着物質が表面と対照表面上にあるチップの図である。図4bは図4aのチップの他の図である。図4cは図4aのチップのAFMスキャンの図である。
【図５】図5aは付着物質が受動吸着により結合するチップの層を示す図である。図5bは付着物質が能動固定化によって結合するチップの層を示す図である。
【図６】図6aは付着物質がその上に付着した本発明のチップの斜視図である。図6bは標的物質を含有する標的試料にさらした後の本発明のチップの斜視図である。図6cは洗浄後の図6bのチップの斜視図である。
【図７】図7aは付着物質の付着後の本発明のチップのAFMスキャンである。図7bはチップを標的物質にさらした後の図7aのチップのスキャンである。図7cはチップを対照にさらした後の本発明のチップのスキャンである。
【図８】種々の濃度の標的物質についてチップ表面に結合した標的物質粒子の数と露出時間のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【国際調査報告】
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