(57)【要約】薬剤標的として用いることができる機能性突然変異体リボソームを同定するための組成物および方法が提供される。該組成物および方法は、通常は致死的である突然変異の単離および分析を可能にし、そして既定のレベルのリボソーム機能を有するｒＲＮＡ突然変異体の直接選択を可能にする。本発明の組成物および方法は、様々な種からの遺伝子操作したｒＲＮＡ遺伝子の使用によって多数のヒト病原体を処置する抗生物質を同定するために用いることができる。本発明はさらに、本発明の方法において使用する新規なプラスミド構築物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）。
【請求項２】
ｒＲＮＡ遺伝子がマイコバクテリウム・ツベルクローシス、シュードモナス・アエルギノーザ、サルモネラ・チフィ、エルシニア・ペスティス、スタヒロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、エンテロコッカス・ファエカリス、クラミジア・トラコマティス、サッカロミセス・セレビシアエ、カンジダ・アルビカンスおよびトリパノソーマよりなる群から選択される種に由来する請求項１のプラスミド。
【請求項３】
選択可能なマーカーがクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびＣＡＴとＧＦＰの両方よりなる群から選択される請求項１のプラスミド。
【請求項４】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される請求項１のプラスミド。
【請求項５】
突然変異体シャイン・ダルガルノ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される請求項１のプラスミド。
【請求項６】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列および突然変異体ＳＤ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される相互に適合する対である請求項１のプラスミド。
【請求項７】
相互に適合する突然変異体シャイン・ダルガルノおよび突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ対が、選択可能なマーカーの該ｒＲＮＡによる翻訳を可能にする請求項６のプラスミド。
【請求項８】
選択可能なマーカーがＣＡＴである請求項３のプラスミド。
【請求項９】
選択可能なマーカーがＧＦＰである請求項３のプラスミド。
【請求項１０】
請求項１のプラスミドを含んでなる細胞。
【請求項１１】
ｒＲＮＡ遺伝子における突然変異が、生産される選択可能なマーカーの量に影響を与える請求項１０の細胞。
【請求項１２】
細胞が細菌細胞である請求項１０の細胞。
【請求項１３】
ｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列が、誘導性プロモーターの制御下である請求項１のプラスミド。
【請求項１４】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）。
【請求項１５】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される請求項１４のプラスミド。
【請求項１６】
突然変異体シャイン・ダルガルノ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される請求項１４のプラスミド。
【請求項１７】
突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列が、図１２、１３、１５および１６に記載する配列よりなる群から選択される相互に適合する対である請求項１４のプラスミド。
【請求項１８】
相互に適合する突然変異体シャイン・ダルガルノおよび突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ対が、選択可能なマーカーＧＦＰの突然変異体１６Ｓ  ｒＲＮＡによる翻訳を可能にする請求項１７のプラスミド。
【請求項１９】
請求項１４のプラスミドを含んでなる細胞。
【請求項２０】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における突然変異が、生産される選択可能なマーカーの量に影響を与える請求項１９の細胞。
【請求項２１】
細胞が細菌細胞である請求項１９の細胞。
【請求項２２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列が、誘導性プロモーターの制御下である請求項１４のプラスミド。
【請求項２３】
（ａ）突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定し、それにより機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる機能性突然変異体リボソームを同定する方法。
【請求項２４】
（ａ）突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ＧＦＰによって細胞を単離すること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定し、それにより機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる機能性突然変異体リボソームを同定する方法。
【請求項２５】
（ａ）突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスし、それにより興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）の興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）の細胞を単離すること；ならびに
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定し、それにより薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定する方法。
【請求項２６】
（ａ）突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ＧＦＰによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスし、それにより興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）ＧＦＰによって段階（ｇ）の細胞を単離すること；ならびに
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定し、それにより薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定する方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項１のプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からのｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスして興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）からの細胞を単離すること；
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定して機能性突然変異体リボソームを同定すること；
（ｊ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに対して薬剤候補をスクリーニングすること：
（ｋ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに結合した段階（ｊ）からの薬剤候補を同定すること；
（ｌ）ヒトｒＲＮＡに対して段階（ｋ）からの薬剤候補をスクリーニングすること；ならびに
（ｍ）ヒトｒＲＮＡに結合しない段階（ｌ）からの薬剤候補を同定し、それにより薬剤候補を同定すること
を含んでなる薬剤候補を同定する方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項１４のプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からのｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスして興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体シャイン・ダルガルノ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体アンチ−シャイン・ダルガルノおよび突然変異体シャイン・ダルガルノ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）からの細胞を単離すること；
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定して機能性突然変異体リボソームを同定すること；
（ｊ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに対して薬剤候補をスクリーニングすること：
（ｋ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに結合した段階（ｊ）からの薬剤候補を同定すること；
（ｌ）ヒト１６Ｓ  ｒＲＮＡに対して段階（ｋ）からの薬剤候補をスクリーニングすること；ならびに
（ｍ）ヒト１６Ｓ  ｒＲＮＡに結合しない段階（ｌ）からの薬剤候補を同定し、それにより薬剤候補を同定すること
を含んでなる薬剤候補を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、引用することにより明白に組み込まれる、２００２年７月１日に出願された米国仮特許出願第６０／３９３，２３７号および２００３年３月５日に出願された米国仮特許出願第６０／４５２，０１２号からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
リボソームは、３もしくは４個のＲＮＡ分子および５０個を超えるタンパク質を含有する１個の大サブユニットおよび１個の小サブユニットからなる。タンパク質合成に直接関与するリボソームの部分は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。リボソームタンパク質は、ｒＲＮＡをそれらの正しい３次元構造に折りたたむことに関与する。リボソームおよびタンパク質合成プロセスは、全ての生物において非常に類似している。しかしながら、細菌と他の生物との間の１つの違いは、翻訳される状態にあるｍＲＮＡ分子をリボソームが認識する方法である。細菌では、このプロセスは、ｍＲＮＡの始まりの近くの数個のヌクレオチドと小サブユニットにおけるリボソームＲＮＡ分子の末端の等しい数のヌクレオチドとの間の塩基対合相互作用を伴う。該ｍＲＮＡ配列はシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列として知られており、そしてｒＲＮＡ上のその対応する部分は、アンチ−シャイン・ダルガルノ（ＡＳＤ）配列と呼ばれる。
【０００３】
現在、ｒＲＮＡはリボソーム機能の実質的にあらゆる面に直接関与することを示す幅広い生化学的、遺伝学的および系統発生学的証拠がある（非特許文献１）。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）および大部分の他の生物におけるｒＲＮＡ突然変異の遺伝および機能分析は、多数のｒＲＮＡ遺伝子の存在によりそして優性致死ｒＲＮＡ突然変異の発生により複雑化している。エシェリキア・コリには７個のｒＲＮＡオペロンがあるので、ｒＲＮＡ突然変異の表現型発現は、細胞における突然変異体と野生型リボソームとの相対量により影響を受け得る。従って、突然変異体表現型の検出は、野生型リボソームの存在により妨げられる可能性がある。これらの問題を回避するために様々な方法が考案されている。
【０００４】
１つの一般的な方法は、野生型ｒＲＮＡオペロンのクローン化したコピーを使用する（非特許文献２；非特許文献３）。いくつかのグループは、突然変異体リボソームの高レベルの発現に起因する表現型の違いを検出するためにこの系を使用している。最近、リボソームＲＮＡの唯一の供給がプラスミドによりコードされるエシェリキア・コリの株が構築された（非特許文献４）。この系は、ｒＲＮＡ合成の転写調節ならびにリボソームＲＮＡ機能を研究するために使用されている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；および非特許文献１３）。Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．は、ｍＲＮＡのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を同時に改変しながらリボソームのメッセージ結合部位（ＭＢＳ）を改変することによってプラスミドによりコードされるリボソームの特定のサブセットにｍＲＮＡを導くことができることを示した（非特許文献１４）。
【０００５】
上記の方法の各々は、ｒＲＮＡ機能の理解に有意に寄与しているが、この分野における進歩は、翻訳の複雑さおよびこれらの系に標準的な遺伝子選択技術を適用することの難しさの両方により妨げられている。
【０００６】
懸念が高まっている問題である抗生物質に対する耐性は、一つには、抗生物質の過度の使用に起因する。２００１年に非特許文献１５により公開された研究によれば、１９８９〜１９９９年の間に米国の成人はのどの痛みで１年に約６７０万回も医者にかかった。のどの痛みの５％〜１７％のみが、抗生物質に応答する唯一の種類である細菌感染に起因するが、これらの診察のうち７３％において、患者は抗生物質で処置されたことが該研究により見出された。特にマクロライド系抗生物質は、一つにはそれらの典型的に短い都合のよい処置経過のために、上気道感染の処置に非常に一般的になっている。研究は、そのような膨大な使用を耐性菌の増加に結び付けており、そして最近の多剤耐性の発生は、非常に特異的で且つ薬剤耐性の発生を受けつけない抗生物質の必要性を強調している。
【０００７】
微生物は、４つのメカニズムにより抗生物質に耐性であることができる。第一に、耐性は、細胞に蓄積する抗生物質の量を減らすことにより生じることができる。細胞は、細胞への抗生物質の取り込みを減らすことによりもしくは細胞から抗生物質をくみ出すことによりこれを成し遂げることができる。特定の生物は細胞表面上に抗生物質輸送タンパク質がないのでもしくは時折、細胞への抗生物質の輸送を妨げるように膜の成分が突然変異される場合に、取り込みにより媒介される耐性が生じることが多い。取り込みにより媒介される耐性は、薬剤が非必須輸送分子を通して入り込む場合にのみ可能である。抗生物質耐性の流出メカニズムは、輸送体タンパク質によって生じる。これらは、細胞からテトラサイクリンのような特定の抗生物質を輸送する非常に特異的な輸送体であることができ、もしくはそれらは細胞から同様の特性を有する分子群を輸送するもっと一般的な輸送体であることができる。非特異的輸送体の最もよく知られている例は、多剤耐性輸送体（ＭＤＲ）である。
【０００８】
抗生物質を不活性化することは、微生物が抗生物質に耐性になることができる別のメカニズムである。抗生物質の不活性化は、細胞における酵素が抗生物質をそれがもはやその意図される標的に結合しないように化学的に改変する場合に成し遂げられる。これらの酵素は、通常、非常に特異的であり、そしてそれら不活性化する抗生物質と一緒に、何百万年にわたって進化している。酵素的に不活性化される抗生物質の例は、ペニシリン、クロラムフェニコールおよびカナマイシンである。
【０００９】
耐性はまた、標的部位を改変することもしくは過剰生産することによっても生じることができる。抗生物質の標的分子は、それがもはや抗生物質に結合しないように突然変異されるかもしくは化学的に改変される。これは、標的の改変が通常の細胞機能を妨げない場合にのみ可能である。標的部位過剰生産はあまり一般的ではないが、抗生物質に耐性である細胞を同様にもたらすことができる。
【００１０】
最後に、標的バイパスは、微生物が抗生物質に耐性になることができるメカニズムである。バイパスメカニズムでは、２つの代謝経路もしくは標的が細胞に存在し、そして一方は抗生物質に感受性ではない。抗生物質での処置は、第二の抗生物質に耐性の経路へのより大きい依存を有する細胞を選択する。
【００１１】
これらのメカニズムの中で、新しい抗生物質開発の最大の懸念は、標的部位改変である。酵素的不活性化および特異的輸送メカニズムは、抗生物質を不活性化するかもしくは細胞から輸送するために基質特異的酵素の存在を必要とする。酵素は、天然に存在する抗生物質に応答して何百万年にわたって進化している。微生物は新しい酵素を自然発生的に生成することができないので、これらのメカニズムが新しい合成抗生物質の開発に多大な脅威を及ぼす可能性は低い。標的バイパスは、重複する代謝経路が存在する細胞においてのみ起こる。ＭＤＲ輸送体の理解が増すにつれて、それらにより細胞から輸送されない薬剤を開発することがますます可能である。従って、標的部位改変は、抗生物質の新しい種類の抗生物質耐性の発生に最大の危険をもたらし、そしてこれはリボソームを標的とする抗生物質に特に当てはまる。３５年の中で唯一の新しい種類の抗生物質、オキサゾリジノンは、標的部位改変のために危うくなっている抗生物質の最近の例である。ｒＲＮＡに単一の突然変異を含有する耐性株は、臨床設定におけるその使用の７ヶ月以内に発生した。
【非特許文献１】Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ
【非特許文献２】Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ  ６：１１２−１１８
【非特許文献３】Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：５６０２−５６０６
【非特許文献４】Ａｓａｉ，Ｔ．，（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：３８０３−３８０９
【非特許文献５】Ｖｏｕｌｇａｒｉｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４１７０−４１７５
【非特許文献６】Ｋｏｏｓｈａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＲＮＡ．６：１１６６−１１７３
【非特許文献７】Ｓｅｒｇｉｅｖ，Ｐ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９：３７９−３８９
【非特許文献８】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：１４２０−１４２５
【非特許文献９】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：７１０−７１５
【非特許文献１０】Ｖｉｌａ−Ｓａｎｊｕｒｊｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：４５７−４６３
【非特許文献１１】Ｍｏｒｏｓｙｕｋ  Ｓ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３００（１）：１１３−１２６
【非特許文献１２】Ｍｏｒｏｓｙｕｋ  Ｓ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（１）：１９７−２１０
【非特許文献１３】Ｍｏｒｏｓｙｕｋ  Ｓ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（１）：２１１−２２８
【非特許文献１４】Ｈｕｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：４３２−４５２
【非特許文献１５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００１
【発明の開示】
【００１２】
［発明の要約］
本発明は、抗生物質耐性の発生を起こしやすくない抗生物質を同定するために用いることができる組成物および方法を提供する。特に、エシェリキア・コリおよび他の病原生物からのｒＲＮＡ遺伝子を遺伝子操作して薬剤標的として用いることができる機能性突然変異体リボソームの同定を可能にする、例えば、化学およびペプチドライブラリーをスクリーニングして全ての機能性突然変異体リボソームに結合するがヒトリボソームに結合しない化合物を同定する。このようにして、標的分子の全ての生物学的活性型を認識しそしてそれ故に標的部位改変による薬剤耐性の発生を起こしやすくない抗生物質を同定する。
【００１３】
本発明は、図１２、１３、１５および１６に記載する突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、ならびに図１２、１３、１５および１６に記載する突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド構築物を提供する。突然変異体ＳＤ−ＡＳＤ配列は相互に適合する対であり、従って、適合する突然変異体ＳＤ配列を含有するｍＲＮＡのみの翻訳、すなわち、選択可能なマーカーの翻訳を可能にする。１つの態様として、選択可能なマーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、もしくはＣＡＴとＧＦＰの両方よりなる群から選択される。別の態様として、ｒＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、誘導性プロモーターの制御下である。
【００１４】
ｒＲＮＡ遺伝子は様々な種から選択され、それにより、選択した種に対して有効である薬剤候補を同定するために薬剤標的として用いることができる機能性突然変異体リボソームの同定を与えることができる。種の例には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（多剤耐性院内感染）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）（腸チフス）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｅｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）（ペスト）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（膿痂疹、毛嚢炎、膿瘍、腫張、感染した裂傷、心内膜炎、髄膜炎、敗血症性関節炎、肺炎、骨髄炎および毒素性ショックを引き起こす多剤耐性感染）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（連鎖球菌性咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹、丹毒、産褥熱および壊疽性筋膜炎）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（バンコマイシン耐性院内感染、心内膜炎および菌血症）、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（鼠径性病性リンパ肉芽腫、トラコーマおよび封入体性結膜炎、非淋菌性尿道炎、精巣上体炎、子宮頚管炎、尿道炎、乳児肺炎、骨盤感染症、ライター症候群（オリゴ関節炎（ｏｌｉｇｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ））および新生児結膜炎）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびトリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）が包含されるが、これらに限定されるものではない。１つの態様として、ｒＲＮＡ遺伝子はマイコバクテリウム・ツベルクローシスからである（例えば、実施例６および図１７を参照）。
【００１５】
本発明のさらに別の態様として、ｒＲＮＡ遺伝子はミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子、すなわち、真核生物のｒＲＮＡ遺伝子（例えば、ヒトミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子）である。
【００１６】
図２２〜２６に記載するプラスミド構築物のような本発明のプラスミド構築物は、本明細書に記載する新規な突然変異体ＡＳＤおよびＳＤ配列を含むことができる。特に、本発明は、本発明のプラスミド構築物および方法に用いることができる、図１２、１３、１５および１６に記載する新規な突然変異体ＡＳＤ配列および新規な突然変異体ＳＤ配列を提供する。突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対として用いることができる（図１２、１３、１５および１６を参照）。突然変異体ＡＳＤおよびＳＤ配列の相互に適合する対は、ＲＮＡの形態で対として相互作用し、そして適合する突然変異体ＳＤ配列を含有するｍＲＮＡのみの翻訳を可能にすると理解される。
【００１７】
別の態様として、本発明は、突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカー、例えばＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミドを提供する。別の態様として、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、エシェリキア・コリ以外の種からである。１つの態様として、突然変異体ＡＳＤ配列は、図１２、１３、１５および１６に記載する配列から選択される。別の態様として、突然変異体ＳＤ配列は、図１２、１３、１５および１６に記載する配列から選択される。さらに別の態様として、突然変異体ＡＳＤ配列および突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である（図１２，１３、１５および１６を参照）。各相互に適合する突然変異体ＳＤおよび突然変異体ＡＳＤ対は、選択可能なマーカーによる翻訳を可能にする。
【００１８】
１つの態様として、本発明は、本発明のプラスミドを含んでなる細胞を特徴とする。別の態様として、該細胞は細菌細胞である。
【００１９】
１つの態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定し、それにより機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる機能性突然変異体リボソームを同定する方法を提供する。
【００２０】
別の態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ＧＦＰによって細胞を単離すること；ならびに
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定し、それにより機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる機能性突然変異体リボソームを同定する方法を特徴とする。
【００２１】
さらに別の態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスし、それにより興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）の細胞を単離すること；ならびに
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定し、それにより薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定する方法を特徴とする。
【００２２】
さらなる態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）ＧＦＰによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞よりｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスし、それにより興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体ＳＤ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）ＧＦＰによって段階（ｇ）の細胞を単離すること；ならびに
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定し、それにより薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定すること
を含んでなる薬剤標的として適当であることができる機能性突然変異体リボソームを同定する方法を提供する。
【００２３】
１つの態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの点突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からのｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスして興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）からの細胞を単離すること；
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定して機能性突然変異体リボソームを同定すること；
（ｊ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに対して薬剤候補をスクリーニングすること：
（ｋ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに結合した段階（ｊ）からの薬剤候補を同定すること；
（ｌ）ヒトｒＲＮＡに対して段階（ｋ）からの薬剤候補をスクリーニングすること；ならびに
（ｍ）ヒトｒＲＮＡに結合しない段階（ｌ）からの薬剤候補を同定し、それにより薬剤候補を同定すること
を含んでなる薬剤候補を同定する方法を特徴とする。
【００２４】
１つの態様として、本発明は：
（ａ）突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、該１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの点突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）で宿主細胞を形質転換すること；
（ｂ）選択可能なマーカーによって細胞を単離すること；
（ｃ）段階（ｂ）からのｒＲＮＡを同定しそしてシーケンスして興味のある領域を同定すること；
（ｄ）段階（ｃ）からの興味のある領域を選択すること；
（ｅ）段階（ｄ）からの興味のある領域を突然変異させること；
（ｆ）段階（ｅ）からの突然変異させた興味のある領域を、突然変異体ＡＳＤ配列を有するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子および突然変異体ＳＤ配列を有するＧＦＰをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなるプラスミド（ここで、突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対である）に挿入すること；
（ｇ）段階（ｆ）からのプラスミドで宿主細胞を形質転換すること；
（ｈ）選択可能なマーカーによって段階（ｇ）からの細胞を単離すること；
（ｉ）段階（ｈ）からのｒＲＮＡを同定して機能性突然変異体リボソームを同定すること；
（ｊ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに対して薬剤候補をスクリーニングすること：
（ｋ）段階（ｉ）からの機能性突然変異体リボソームに結合した段階（ｊ）からの薬剤候補を同定すること；
（ｌ）ヒト１６Ｓ  ｒＲＮＡに対して段階（ｋ）からの薬剤候補をスクリーニングすること；ならびに
（ｍ）ヒト１６Ｓ  ｒＲＮＡに結合しない段階（ｌ）からの薬剤候補を同定し、それにより薬剤候補を同定すること
を含んでなる薬剤候補を同定する方法を提供する。
【００２５】
本発明の方法に用いるｒＲＮＡ遺伝子は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、２３Ｓ  ｒＲＮＡおよび５５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子からであることができると理解される。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な記述および請求項から明らかである。
［発明の詳細な記述］
薬剤標的として適当な機能性突然変異体リボソームを同定するための組成物および方法が提供される。該組成物および方法は、通常は致死的である突然変異の単離および分析を可能にし、そして既定のレベルのリボソーム機能を有するｒＲＮＡ突然変異体の直接選択を可能にする。本発明の組成物および方法は、ヒト病原体を一般的にそして／もしくは選択的に処置する抗生物質を同定するために用いることができる。
【００２７】
本発明の１つの態様によれば、様々な種のｒＲＮＡ遺伝子の機能ゲノム科学データベースを作製することができる。特に、汎用突然変異戦略を用いてｒＲＮＡ遺伝子をランダムに突然変異させる。次に、突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該突然変異ｒＲＮＡ遺伝子、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなる本発明の突然変異プラスミドで宿主細胞を形質転換する。ＣＡＴのような選択可能なマーカーは、例えば、クロラムフェニコールを含有する増殖培地上に形質転換細胞を平板培養することにより、機能性である突然変異体を選択するために用いることができる。各コロニーからの個々のクローンの各プラスミドＤＮＡに含まれる突然変異体ｒＲＮＡ遺伝子を選択し、そして特性化する。突然変異体ｒＲＮＡ遺伝子の各々の機能は、ｒＲＮＡオペロンの誘導の際に各クローンにより生産されるＧＦＰのような追加の選択可能なマーカー遺伝子の量を測定することにより評価する。このようにして、機能性突然変異体ｒＲＮＡ遺伝子の配列および機能データを含有する機能ゲノム科学データベースを組み立てることができる。特に、薬剤標的として役立つｒＲＮＡ遺伝子の機能的に重要な領域は、機能ゲノム科学データデータの配列を比較しそして生産されるＧＦＰタンパク質の量と該配列とを相関させることにより同定する。
【００２８】
別の態様として、上記の方法において同定される機能的に重要な標的領域におけるヌクレオチドは、例えば、分子突然変異誘発の標準方法を用いることにより、同時にランダムに突然変異させ、そして本発明のプラスミドにクローン化して標的領域におけるヌクレオチド位置の各々でランダム突然変異を含有するプラスミドプールを生成せしめることができる。次に、ランダム突然変異を含有するプラスミドの得られるプールを用いて細胞、例えばエシェリキア・コリ細胞を形質転換し、そして各々が標的領域における突然変異の独自の組み合わせを含有するクローンのライブラリーを生成せしめる。突然変異体クローンのライブラリーをＩＰＴＧの存在下で培養して突然変異体ｒＲＮＡ遺伝子の生産を誘導し、そしてＣＡＴのような選択可能なマーカーを用いて機能性リボソームを生産する標的領域のヌクレオチド組み合わせを含有するｒＲＮＡ突然変異体のクローンを選択する。機能性リボソームを生産するｒＲＮＡ遺伝子をシーケンスし、そしてデータベースに導入することができる。
【００２９】
さらに別の態様として、標的領域内の機能的に重要なヌクレオチドおよびヌクレオチドモチーフを含有する一連のオリゴヌクレオチドを合成することができ、そしてそれらを用いて化合物および化合物ライブラリーを順次スクリーニングして機能的に重要な配列およびモチーフを認識する（それに結合する）化合物を同定する。次に、オリゴヌクレオチドの全てに結合する化合物をオリゴヌクレオチドおよび／もしくは他のＲＮＡ含有分子に対してカウンタースクリーニングして（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）薬剤候補を同定する。従って、本発明の方法により選択される薬剤候補は、標的配列の機能性バリアントの全てを認識することができ、すなわち、リボソームに機能の喪失を引き起こすことなしに、薬剤が結合することができないように標的を突然変異させることはできない。
【００３０】
さらに別の態様として、全ｒＲＮＡの第一段階の突然変異誘発を当該技術分野において既知である技術、例えば変異性ＰＣＲ突然変異誘発を用いて行った後に、突然変異体を分析して機能にとって重要であるｒＲＮＡ内の領域を同定する。次に、これらの領域を本明細書に記述するようにそれらの系統発生的保存に基づいて分類し、そして次にさらなる突然変異誘発に使用する。
【００３１】
各種からのリボソームＲＮＡ配列は異なり、そして２つの種が近縁であるほど、それらのｒＲＮＡは似ている。例えば、ヒトとサルは非常に類似したｒＲＮＡ配列を有するが、ヒトと細菌は非常に異なるｒＲＮＡ配列を有する。これらの違いは、狭域作用スペクトルを有する非常に特異的な薬剤の開発にそしてまた全ての細菌のような遠縁でしかない大きい生物群を阻害する広域スペクトル薬剤の開発にも利用することができる。
【００３２】
別の態様として、上記で同定される機能的に重要な領域は、それらが近縁の生物群に存在するかどうかに基づいてグループに分類される。例えば、ｒＲＮＡのある領域は全ての細菌に存在するが、他の生物には存在しない。ｒＲＮＡの別の領域は、特定の種のメンバー、例えば、マイコバクテリウムもしくはストレプトコッカス属のメンバーの全てのような、近縁の細菌群にのみ存在する。
【００３３】
さらなる態様として、非常に大きい生物群、例えば全ての細菌もしくは全ての真菌に存在する領域は、その群内の多数の生物に起因する感染を処置するために用いることができる広域スペクトル抗生物質を開発するのに用いる。本発明の方法は、これらの領域および同定される機能性突然変異体リボソームに行うことができる。これらの機能性突然変異体リボソームは、例えば、化合物ライブラリーでスクリーニングすることができる。
【００３４】
さらに別の態様として、ストレプトコッカス属の全てのメンバーもしくはマイコバクテリウム属の全てのメンバーのような比較的小さい生物群にのみ位置する領域は、これらの小さい群内に入る生物の増殖のみを阻害する狭域スペクトル抗生物質を考案するために用いることができる。本発明の方法は、これらの領域および同定される機能性突然変異体リボソームに行うことができる。これらの機能性突然変異体リボソームは、例えば、化合物ライブラリーでスクリーニングすることができる。
【００３５】
本発明は、新規なプラスミド構築物、例えばｐＲＮＡ１２３（図１および２４）を提供する。本発明の新規なプラスミド構築物は、図１２、１３、１５および１６に記載する新規な突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列を用いる。突然変異体ＡＳＤおよび突然変異体ＳＤ配列は、相互に適合する対として用いることができる（図１２、１３、１５および１６を参照）。突然変異体ＡＳＤおよびＳＤ配列の相互に適合する対は、ＲＮＡの形態で対として相互作用し、改変されたＳＤ配列を含有するｍＲＮＡのみの翻訳を可能にすると理解される。
［定義］
本明細書において用いる場合、以下の用語の各々は、本節におけるそれと関連する意味を有する。
【００３６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つもしくは１つより多くの（すなわち、少なくとも１つの）該冠詞の文法的対象をさすために本明細書において用いる。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素もしくは１つより多くの要素を意味する。
【００３７】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかもしくは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結する場合に、該プロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合にのみ実質的に生細胞において遺伝子産物を生産させるヌクレオチド配列である。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「突然変異」という用語には、天然に存在するかもしくは通常のヌクレオチド配列からの既定の遺伝子もしくは調節配列のヌクレオチド配列における改変が包含される。突然変異は、単一のヌクレオチド改変（例えば、点突然変異を包含する、欠失、挿入、置換）または多数のヌクレオチドの欠失、挿入もしくは置換であることができる。
【００３９】
「選択可能なマーカー」という用語は、その発現が機能性突然変異体リボソームを同定することを可能にする遺伝子を意味する。
【００４０】
本発明の様々な態様は、以下の小節においてさらに詳細に記述する。
［Ｉ．単離された核酸分子］
本明細書において用いる場合、「核酸分子」という用語には、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて作製されるＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログが包含されるものとする。核酸分子は、一本鎖もしくは二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４１】
「単離された核酸分子」という用語には、該核酸の自然源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子が包含される。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語には、該ゲノムＤＮＡが生来関連する染色体から分離されている核酸分子が包含される。好ましくは、「単離された」核酸は、該核酸が得られる生物のゲノムＤＮＡにおいて該核酸に生来隣接する配列（すなわち、該核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、ＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組み換え技術により生産する場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学的に合成する場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことができる。
【００４２】
本発明の核酸分子、例えば、図１２、１３、１５および１６に記載するヌクレオチド配列を有する核酸分子、もしくはその一部は、標準的な分子生物学技術および本明細書に提供する配列情報を用いて単離することができる。図１２、１３、１５および１６に記載する核酸配列の全部もしくは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本発明の核酸分子を標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を使用して単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記述されているように）。
【００４３】
さらに、図１２、１３、１５および１６に記載する配列の全部もしくは一部を含む核酸分子は、図１２、１３、１５および１６に記載する配列に基づいて設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離することができる。
【００４４】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはまたゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのように増幅した核酸は、適切なベクターにクローン化し、そしてＤＮＡ配列分析により特定化することができる。さらに、本発明のヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。
【００４５】
別の好ましい態様として、本発明の単離された核酸分子は、図１２、１３、１５および１６に記載するヌクレオチド配列、もしくはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部の相補物である核酸分子を含んでなる。図１２、１３、１５および１６に示すヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、それがそれぞれ図１２、１３、１５および１６に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションし、それにより安定な二本鎖を形成することができるように、図１２、１３、１５および１６に示すヌクレオチド配列に十分に相補的なものである。
［ＩＩ．組み換え発現ベクターおよび宿主細胞］
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子（もしくはその一部）を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において用いる場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子をさす。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントをその中に連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡループをさす。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において実用的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に用いられるベクター形態であるので、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は代替可能に用いることができる。しかしながら、本発明には、同等な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターのそのような他の形態が包含されるものとする。
【００４６】
本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適当な形態の本発明の核酸を含んでなり、これは、発現される核酸配列に操作可能に連結されている、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択される、１つもしくはそれ以上の調節配列を組み換え発現ベクターが含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「操作可能に連結されている」は、興味のあるヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてもしくはベクターが宿主細胞に導入される場合には宿主細胞において）調節配列（１つもしくは複数）に連結されていることを意味するものとする。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）が包含されるものとする。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記述されている。調節配列には、多数のタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くものおよびある種の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば組織特異的調節配列）が包含される。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが当業者により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入し、それにより本明細書に記述するような核酸によりコードされる、融合タンパク質もしくはペプチドを包含する、タンパク質もしくはペプチドを生産することができる。
【００４７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合もしくは非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的もしくは誘導性プロモーターを含有するベクターでエシェリキア・コリにおいて実施される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は組み換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には３つの目的を果たす：１）組み換えタンパク質の発現を増加すること；２）組み換えタンパク質の溶解度を上げること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして働くことにより組み換えタンパク質の精製に役立つこと。融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製の後に融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にするために融合部分と組み換えタンパク質との連結部にタンパク質分解切断部位を導入することが多い。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが包含される。典型的な融合発現ベクターには、標的組み換えタンパク質にそれぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質もしくはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が包含される。
【００４８】
適当な誘導性非融合エシェリキア・コリ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）が包含される。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下のＴ７ｇｎ１遺伝子を保有するレジデントプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【００４９】
エシェリキア・コリにおける組み換えタンパク質発現を最大にする１つの戦略は、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌においてタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１１９−１２８）。別の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を各アミノ酸の個々のコドンがエシェリキア・コリにおいて優先的に利用されるものであるように改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なＤＮＡ合成技術により実施することができる。
【００５０】
別の態様として、発現ベクターは酵母発現ベクターであることができる。酵母サッカロミセス・セレビシアエにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が包含される。
【００５１】
さらに別の態様として、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞において発現される。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が包含される。哺乳類細胞において用いる場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素により提供されることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から得られる。原核細胞および真核細胞の両方の他の適当な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の１６および１７章を参照。
【００５２】
別の態様として、組み換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を導くことができる（例えば、核酸を発現するために組織特異的調節要素を用いる）。組織特異的調節要素は、当該技術分野において既知である。適当な組織特異的プロモーターの限定されない例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）の特定のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が包含される。例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）により、発生的に調節されるプロモーターもまた包含される。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明の核酸分子が導入される宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書において代替可能に用いる。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫もしくは潜在的子孫もさすと理解される。突然変異もしくは環境の影響のいずれかのためにその後の世代においてある種の改変が起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお本明細書において用いる場合に該用語の範囲内に含まれる。
【００５４】
宿主細胞は、任意の原核もしくは真核細胞であることができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に既知である。
【００５５】
ベクターＤＮＡは、通常の形質転換もしくはトランスフェクション技術によって原核もしくは真核細胞に導入することができる。本明細書において用いる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクションもしくは電気穿孔を包含する、宿主細胞に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための様々な当該技術分野で認められている技術をさすものとする。宿主細胞を形質転換するかもしくはトランスフェクションする適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験マニュアルに見出すことができる。
【００５６】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションには、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術により、わずかな割合の細胞のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）を同定しそして選択するために、一般的に、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入することができ、もしくは別個のベクター上で導入することができる。導入した核酸で安定にトランスフェクションされる細胞は、薬剤選択により同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を含んでいる細胞は生存し、一方、他の細胞は死ぬ）。
［ＩＩＩ．本発明の使用および方法］
本明細書に記述する核酸分子は、以下の方法：（１）本発明の方法により作製されるｒＲＮＡ遺伝子の機能ゲノム科学データベースの作成；（２）ｒＲＮＡの機能的に重要な領域を同定するためのデータベースのマイニング；（３）各標的領域内の機能的に重要な配列および構造モチーフの同定；（４）標的配列の全ての機能性バリアントに結合する化合物を同定するために標的配列の一連の機能性バリアントに対して化合物および化合物ライブラリーをスクリーニングすること：ならびに（５）ヒトリボソームもしくはリボソームＲＮＡ配列のような非標的ＲＮＡに対して化合物をカウンタースクリーニングすることの１つもしくはそれ以上を実施するためにプラスミド構築物、例えばｐＲＮＡ１２３において用いることができる。
【００５７】
本発明は、限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明される。本願の全体にわたって引用する全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図面および付属書は、引用することにより本明細書に組み込まれる。
［特定の実施例］
【実施例１】
【００５８】
突然変異体ＳＤおよび突然変異体ＡＳＤの組み合わせの同定
ＳＤおよびＡＳＤを協調的に変えることにより、改変されたＳＤを含有する特定のｍＲＮＡを改変されたＡＳＤを含有するリボソームに向けることができることが示されている。しかしながら、ＡＳＤを改変するこのおよび全ての他の取り組みは、これらの突然変異を含有する細胞が、それらを含有する遺伝子を活性化した後２時間以内に死亡したように、致死的であると判明している。
【００５９】
ランダム突然変異誘発および遺伝子選択を用いて、非致死的なＳＤ−ＡＳＤの組み合わせを同定するために突然変異体ＳＤ−ＡＳＤの組み合わせをスクリーニングした。突然変異体ＳＤ−ＡＳＤの相互に適合する対を図１２、１３、１５および１６に記載する。突然変異体配列の相互に適合する対は、ＲＮＡの形態で対として相互作用する。本発明の新規な突然変異体ＳＤ−ＡＳＤ配列の組み合わせは、改変されたＳＤ配列を含有するｍＲＮＡのみの翻訳を可能にする。
【実施例２】
【００６０】
ｐＲＮＡ１２３プラスミドの構築
ｐＲＮＡ１２３プラスミドとして同定される本発明のプラスミド構築物を図１および２４に記載する。エシェリキア・コリ細胞は、７コピーのｒＲＮＡ遺伝子およびリボソームタンパク質の遺伝子の全てを有する単一の染色体を含有する。細胞におけるプラスミド、ｐＲＮＡ１２３は、エシェリキア・コリからのｒＲＮＡ遺伝子の１つの遺伝子操作したコピーおよび本明細書において「選択可能なマーカー」と称するエシェリキア・コリに通常は存在しない２個の遺伝子操作した遺伝子を含有する。１つの遺伝子は、タンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする。このタンパク質は、クロラムフェニコールを化学的に改変することにより細胞を該抗生物質に耐性にする。もう１つの遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もまた、系に含まれる。ＧＦＰは、高処理量機能分析を容易にする。紫外線を照射した際に生成する緑色の光の量は、細胞に存在するＧＦＰの量に比例する。
【００６１】
ｐＲＮＡ１２３からのリボソームは、改変されたＡＳＤ配列を有する。従って、該リボソームは、改変されたＳＤ配列を有するｍＲＮＡのみを翻訳することができる。細胞における２個の遺伝子のみが、プラスミドによりコードされるリボソームによって翻訳されることができる改変されたＳＤ配列を有するｍＲＮＡを生産する：ＣＡＴおよびＧＦＰ遺伝子。ｒＲＮＡにおける突然変異は、タンパク質を製造する得られる突然変異体リボソームの能力に影響を与える。従って、本発明は、プラスミドによりコードされるｒＲＮＡ遺伝子における突然変異が、生産されるＧＦＰおよびＣＡＴの量にのみ影響を与える系を提供する。プラスミドリボソーム機能の減少は、細胞をクロラムフェニコールにより感受性にし、そして細胞の緑色蛍光の量を減少する。細胞における他のｍＲＮＡの翻訳は、染色体によりもたらされるリボソームによってのみ翻訳されるのでこれらのｍＲＮＡは影響を受けない。従って、機能性突然変異体を含有する細胞を選択可能なマーカーによって同定し、単離することができる。
【実施例３】
【００６２】
リボソームＲＮＡの機能分析のための遺伝系
ｒＲＮＡの機能的に重要な領域の同定．  機能ゲノム科学方法を用いて薬剤標的として用いることができるｒＲＮＡ分子の機能的に重要な領域は、一連の段階によって同定することができる。すなわち、段階Ｉ．ａ．として、変異性ＰＣＲもしくは別の汎用突然変異戦略を用いて全ｒＲＮＡ遺伝子をランダムに突然変異させる。段階Ｉ．ｂ．として、次に、突然変異体ＡＳＤ配列を有するｒＲＮＡ遺伝子、該ｒＲＮＡ遺伝子における少なくとも１つの突然変異、および突然変異体ＳＤ配列を有する選択可能なマーカーをコードする遺伝子操作した遺伝子を含んでなる突然変異プラスミドで宿主細胞を形質転換し、そして該細胞をＩＰＴＧの存在下で培養することにより該プラスミドからのｒＲＮＡ遺伝子の生産を誘導する。段階Ｉ．ｃ．として、クロラムフェニコールを含有する増殖培地上に形質転換細胞を平板培養することによりＣＡＴ遺伝子を用いて機能性である突然変異体を選択する。段階Ｉ．ｄ．として、段階Ｉ．ｃ．において得られるクローンの各々からの個々のクローンを単離する。段階Ｉ．ｅ．として、段階Ｉ．ｄ．からの個々のクローンの各々からのプラスミドＤＮＡを単離する。段階Ｉ．ｆ．として、段階Ｉ．ｅ．において単離されたプラスミドの各々に含まれるｒＲＮＡ遺伝子をシーケンスする。段階Ｉ．ｇ．として、ｒＲＮＡオペロンの誘導の際に段階Ｉ．ｅ．からの各クローンにより生産されるＧＦＰの量を測定することにより段階Ｉ．ｆ．からの突然変異体の各々の機能を評価する。段階Ｉ．ｈ．として、段階Ｉ．ｆ．およびＩ．ｇ．からの配列および機能データを含有する機能ゲノム科学データベースを組み立てる。段階Ｉ．ｉとして、薬剤標的として役立つｒＲＮＡ遺伝子の機能的に重要な領域を同定する。機能的に重要な領域は、段階Ｉ．ｇ．において構築される機能ゲノム科学データベースの全ての配列を比較し、そして生産されるＧＦＰタンパク質の量と該配列とを相関させることにより同定することができる。該領域におけるヌクレオチドの置換が機能の有意な喪失をもたらす３個もしくはそれ以上のｒＲＮＡヌクレオチドの隣接配列は、機能的に重要な領域、従って、潜在的薬剤標的を構成する。
【００６３】
標的領域の機能性バリアントの単離．  本発明の第二の態様は、下記のような、「インスタント進化」と称するプロセスを用いる抗生物質耐性をもたらす可能性のある標的部位の突然変異の同定を特徴とする。段階ＩＩ．ａ．として、段階Ｉ．ｉにおいて同定される既定の標的領域に対して、該標的領域におけるヌクレオチドの各々をカセット突然変異誘発もしくはＰＣＲ突然変異誘発のような分子突然変異誘発の標準方法を用いて同時にランダムに突然変異させ、そして段階Ｉ．ｂ．のプラスミドにクローン化して標的領域におけるヌクレオチド位置の各々でランダム突然変異を含有するプラスミドプールを生成せしめる。段階ＩＩ．ｂ．として、段階ＩＩ．ａからのランダム突然変異を含有するプラスミドの得られるプールを用いてエシェリキア・コリ細胞を形質転換し、そして各々が標的領域における突然変異の独自の組み合わせを含有するクローンのライブラリーを生成せしめる。段階ＩＩ．ｃ．として、段階ＩＩ．ｂ．からの突然変異体クローンのライブラリーをＩＰＴＧの存在下で培養して突然変異体ｒＲＮＡ遺伝子の生産を誘導する。段階ＩＩ．ｄ．として、誘導した突然変異体をクロラムフェニコールを含有する培地上で平板培養し、そしてＣＡＴを用いて機能性リボソームを生産する標的領域のヌクレオチドの組み合わせを含有するｒＲＮＡ突然変異体のクローンを選択する。段階ＩＩ．ｅ．として、段階ＩＩ．ｄ．において単離される機能性クローンをシーケンスし、そしてＧＦＰを用いてそれぞれのものにおけるリボソーム機能を測定する。段階ＩＩ．ｆ．として、段階ＩＩ．ｅ．からのデータを突然変異データベースに導入する。
【００６４】
薬剤リードの単離．  段階ＩＩＩ．ａ．として、段階ＩＩ．ｆ．におけるデータベースを分析して標的領域内の機能的に重要なヌクレオチドおよびヌクレオチドモチーフを同定する。段階ＩＩＩ．ｂ．として、段階ＩＩＩ．ａ．からの情報を用いて段階ＩＩＩ．ａ．において同定される機能的に重要なヌクレオチドおよびヌクレオチドモチーフを含有する一連のオリゴヌクレオチドを合成する。段階ＩＩＩ．ｃ．として、段階ＩＩＩ．ｂ．からのオリゴヌクレオチドを用いて化合物および化合物ライブラリーを順次スクリーニングして機能的に重要な配列およびモチーフを認識する（それに結合する）化合物を同定する。段階ＩＩＩ．ｄ．として、オリゴヌクレオチドの全てに結合する化合物をオリゴヌクレオチドおよび／もしくは他のＲＮＡ含有分子に対してカウンタースクリーニングして薬剤候補を同定する。「薬剤候補」は、１）機能的に重要なヌクレオチドおよびヌクレオチドモチーフを含有するオリゴヌクレオチドの全てに結合するが、機能的に重要なヌクレオチドおよびヌクレオチドモチーフを含有しない分子に結合せず、そして２）ヒトリボソームを認識しない化合物である。従って、本発明の方法により選択される薬剤候補は、標的配列の機能性バリアントの全てを認識し、すなわち、リボソームに機能の喪失を引き起こすことなしに、薬剤が結合することができないように標的を突然変異させることはできない。
【実施例４】
【００６５】
タンパク質合成を研究するための遺伝系
材料および方法
試薬．  全ての試薬および化学物質は、Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＲＮＡ  ２：１２７０−１２８５におけるとおりであった。ＰＣＲにより導かれる突然変異誘発は、本質的にＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｄ．），ｐｐ．６１−７０．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹの方法により行った。本発明において使用するプライマーを図９に記載する。本発明において使用するプラスミドを図１０に記載する。
【００６６】
細菌株および培地．  全てのプラスミドは、エシェリキア・コリＤＨ５（ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１およびｒｅｌＡ１）（３６）において維持し、発現させた。ｌａｃＵＶ５プロモーターからプラスミド由来のｒＲＮＡの合成を誘導するために、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるように加えた。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性は、本質的にＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：１９−２３により記述されているように決定した。ＣＡＴアッセイのための培養物は、ＬＢ−Ａｐ１００において培養した。ＭＩＣ、は、Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３に記述されているようにマイクロタイタープレートにおいて標準方法により決定した。
【００６７】
プライマー伸長．  染色体由来に対するプラスミド由来のｒＲＮＡの割合を決定するために、ＬＢ−Ａｐ１００において増殖するｐＲＮＡ１０４含有細胞を示す時間間隔で採取し、そして全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて抽出した。２００ｍＬの誘導したプラスミド含有細胞からＰｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｏｌｌｅｒ（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２２０３−２２１４）の方法により３０Ｓ、７０Ｓおよび粗リボソーム（ｃｒｕｄｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ）を単離した。精製されたＲＮＡをＳｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６４：６７３−６９０に従ってプライマー伸長により分析した。
【００６８】
実験方法
ｐＲＮＡ９構築物の作製．  最初の構築物、ｐＲＮＡ９を以下の方法を用いて作製した。プラスミドｐＲＮＡ９は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下のｐＫＫ３５３５からのｒｒｎＢオペロンのコピーを含有し；この十分に特性化されたプロモーターは異化抑制に影響されず、そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で容易にそして再現可能に誘導できる。誘導因子のない場合の転写を最小限にするために、ＰＣＲを用いてｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からｌａｃリプレッサーバリアント、ｌａｃＩｑ（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７４：７６２−７６５）を増幅し、サブクローン化した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｍ）が存在し、そして突然変異体トリプトファンプロモーター、ｔｒｐｃ（ＤｅＢｏｅｒ，Ｈ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５；Ｈｕｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４７６２−４７６６）から構成的に転写される。β−ラクタマーゼ遺伝子もまた、宿主株におけるプラスミドの維持を可能にするために存在する。遺伝子選択を可能にするために、ＰＣＲを用いてｐＪＬＳ１０２１（Ｓｃｈｏｔｔｅｌ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ  ２８：１７７−１９３）からのＣＡＴ構造遺伝子を増幅し、構成的ｔｒｐｃプロモーターの下流に置いた。エシェリキア・コリにおけるＣＡＴ遺伝子の発現は、細胞をクロラムフェニコールに耐性にし、そしてクロラムフェニコールの以下でＭＩＣと称する最小阻害濃度は、生産されるＣＡＴタンパク質の量と比例的に増加する（Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＲＮＡ  ２：１２７０−１２８５；Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３）。系を構築するために用いる段階の概要を図２に示す。
【００６９】
新しいＭＢＳ−ＲＢＳ対の選択．  非致死的でありそしてプラスミド由来のリボソームによってのみ効率よく翻訳される、以下でＭＢＳ−ＲＢＳと称する、メッセージ結合部位−リボソーム結合部位の組み合わせを単離するために、ランダム突然変異誘発および選択スキームを用いた。特に、プラスミドによりコードされる１６Ｓ  ＭＢＳおよびＣＡＴ  ＲＢＳを、各位置の野生型ヌクレオチドが除かれるようにＰＣＲを用いてランダムに突然変異させた。ｐＲＮＡ８−ｒＭＢＳ−ｒＲＢＳでのシーケンスゲルのオートラジオグラムを図３に提供する。得られる２．５ｘ１０６個の二重突然変異形質転換体を１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＳＯＣ培地において３．５時間誘導し、そして１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、３５０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ  ｂｒｏｔｈ）培地上で平板培養した。各突然変異位置の３種全ての代わりのヌクレオチドの存在を確かめるために、約２．０ｘ１０５個の形質転換体からのプラスミドＤＮＡをシーケンスした（図３）。
【００７０】
結果
該データは、除かれていないヌクレオチドの全てがランダムプールにおいて同等に表されたことを示す。平板培養した２．５ｘ１０６個の形質転換体のうち、５３６個がクロラムフェニコール選択を生き残った。選択されるＭＢＳ−ＲＢＳの組み合わせの効率は、誘導物質の有無で各生存物のクロラムフェニコールの以下でＭＩＣと称する最小阻害濃度を測定することにより決定した（図１１）（Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＲＮＡ  ２：１２７０−１２８５；Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３）。単離株のうち９個（１．７％）は、それらが選択された３５０μｇ／ｍＬの濃度より低い、誘導物質の存在下のＭＩＣを示した。これらは、最初の単離中に４８時間後に現れたゆっくり増殖する突然変異体であった。しかしながら、ＭＩＣは２４時間のみの後に記録された。単離株のうち４５１個（８４．１％）のＭＩＣは４００〜６００μｇ／ｍＬの間であり、そして残りの７６個のクローン（１４．２％）は６００μｇ／ｍＬであった。誘導細胞と非誘導細胞との間のクロラムフェニコール耐性の差（ΔＭＩＣ）は、プラスミド由来のリボソームのみによるＣＡＴ翻訳の量である。プラスミド由来のリボソームとＣＡＴ  ｍＲＮＡとの間の特異的相互作用は、７９個（１４．７％）のクローンにおいて示され、それらは、ＩＰＴＧの添加の際にＣＡＴ耐性の４〜８倍の増加を示した（図１１）。
【００７１】
これらの分析に基づいて、１１個のクローンをさらなる研究のために保有した。これらのクローンからのプラスミドにおけるＭＢＳおよびＲＢＳをシーケンスし、そしてＣＡＴアッセイおよび増殖曲線を実施した（図４および１２）。広範囲の誘導性が認められたが、特異性と予測される自由エネルギー（ΔＧ°３７）との間の相関関係はなかった。ＭＢＳ位置の全てにおいてプリンが優先されたが、ＲＢＳはこの種の選択性を示さなかった。これは、一つには、選択されるＲＢＳが１６Ｓ  ｒＲＮＡの突然変異領域に隣接する配列と塩基対合することができるという結果により説明することができる（Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＲＮＡ  ２：１２７０−１２８５）。
【００７２】
選択される突然変異体の全てに増殖曲線を実行し、そしてコントロール構築物を含有する株と比較した（図４）。１個の突然変異体（ＩＸ２４）のみを図４に示すが、選択されるＭＢＳ／ＲＢＳ配列を含有する全ての株は、この突然変異体と同じ増殖パターンを示した。株ＩＸ２４（プラスミドｐＲＮＡ１００を含有する）は、その誘導プロファイルのために、さらなる実験用に選択した。ＭＢＳおよびＲＢＳの外側の突然変異が不注意に選択された可能性を除くために、ｐＲＮＡ１００からのＭＢＳを含有するＤｒａＩＩＩおよびＸｂａＩフラグメントならびにＲＢＳ配列を含有するＫｐｎＩおよびＸｈｏＩフラグメント（図５）をｐＲＮＡ９に導入した。
【００７３】
系の特異性．  増殖の各段階でのリボソーム誘導の割合および染色体由来に対するプラスミド由来のｒＲＮＡの割合を決定した。このために、プラスミド由来のｒＲＮＡをプライマー伸長により野生型ｒＲＮＡから区別することができるように１６Ｓ  ｒＲＮＡにＣ１１９２Ｕ突然変異を含有するｐＲＮＡ１００誘導体、ｐＲＮＡ１０４を構築した（Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４６５３−４６６３；Ｔｒｉｍａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：６４５−６５３）。Ｃ１１９２Ｕ突然変異は、他の発現系においてリボソーム機能に影響を及ぼさない（Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４６５３−４６６３；Ｍａｋｏｓｋｙ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６９：８８５−８８９）。同じことが本発明の系に当てはまることを示すために、ｐＲＮＡ１００もしくはｐＲＮＡ１０４を発現するＤＨ５細胞において１ｍＭのＩＰＴＧでの３時間の誘導後にＣＡＴ活性を測定し、そしてこれら２つを比較した。これらの実験において、ｐＲＮＡ１０４（９９．２±２．８％）もしくはｐＲＮＡ１００（１００％）を発現する細胞間で有意な差は認められなかった。
【００７４】
プラスミドを含有する細胞におけるプラスミド由来のリボソームのパーセンテージを決定するために、ＩＰＴＧでの誘導の前後にｐＲＮＡ１０４を保有するＤＨ５細胞から全ＲＮＡを単離し、そしてプライマー伸長分析に供した（Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３；Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：４６５３−４６６３；Ｍａｋｏｓｋｙ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６９：８８５−８８９）。プラスミド由来のリボソームの最大誘導は誘導後３時間で起こり、その時点でそれらは全リボソームプールの約４０％を構成した（図６）。これらの細胞におけるＣＡＴアッセイは、プラスミド由来のリボソームの誘導と平行し、そしておそらく定常期の間のタンパク質分解のために、誘導後４時間で減少し始めた。非誘導細胞では、ｌａｃＵＶ５プロモーターからの基礎レベル転写のために全リボソームプールの約３％がプラスミド由来のリボソームを含有する。
【００７５】
系の最適化．ｐＲＮＡ１００を含有する非誘導細胞におけるクロラムフェニコール耐性は、７５μｇ／ｍＬであった（図１３、ＭＩＣ＝１００μｇ／ｍＬ）。野生型１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含有するｐＲＮＡ１００の誘導体におけるＣＡＴ耐性を測定することにより、このバックグラウンド活性の約半分は野生型リボソームによるＣＡＴ翻訳のためであると決定された（図１３、ｐＲＮＡ１００＋ｗｔＭＢＳ）。非誘導細胞における残りの活性は、おそらく、ｌａｃＵＶ５プロモーターの漏れやすさのためである（図６）。ｍＲＮＡにおけるＲＢＳと開始コドンとの間に位置するヌクレオチド配列は、翻訳効率に影響を与える（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７４：７６２−７６５；Ｓｔｏｒｍｏ，Ｇ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：２９７１−２９９６；Ｃｈｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４９５３−４９５７）。ｐＲＮＡ１００において、ＣＡＴ  ｍＲＮＡのこの領域に存在するヌクレオチドのうち３個は、野生型エシェリキア・コリ１６Ｓ  ＲＮＡの３’末端と相補的である（図１３、ｐＲＮＡ１００＋ｗｔＭＢＳ）。プラスミドによりコードされるリボソームがない場合にこれがＣＡＴ翻訳に寄与している可能性を除くために、ＣＡＴ遺伝子における４個のヌクレオチド（図１３において下線を引く）をランダムに突然変異させ、そして宿主リボソームによる減少した翻訳を有する突然変異体を同定するためにスクリーニングした。全部で２０００個のクローンをｐＣＡＭ９を用いてプラスミドによりコードされるリボソームなしにスクリーニングし、そして６つのあまり翻訳されないＣＡＴ配列を単離した（図１３）。次に、ｌａｃＩｑおよびｒｒｎＢオペロンを含有するｐＲＮＡ１００のＢａｍＨＩフラグメントを加え、そしてこれらの構築物を発現する細胞でＭＩＣ、ＣＡＴアッセイおよび増殖曲線を実施した（データは示さない）。
【００７６】
これらのデータに基づき、ｐＲＮＡ１２２は他のものよりわずかに優れた誘導プロファイルをもたらしたので、これを選択した（図１３および２３）。野生型リボソームによるｐＲＮＡ１２２  ＣＡＴメッセージの翻訳（図１３、ｐＲＮＡ１２２＋ｗｔＭＢＳ）は、＜１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール濃度に感受性である細胞をもたらす。特殊化したリボソームの存在下で（図１３、ｐＲＮＡ１２２）、バックグラウンドクロラムフェニコールＭＩＣは４０〜５０μｇ／ｍＬの間であり、そして誘導細胞のＭＩＣは５５０〜６００μｇ／ｍＬの間であり、ｐＲＮＡ１２２における誘導の際にＣＡＴ発現の約１３倍の増加をもたらす。ｐＲＮＡ１００におけるｒｒｎＢオペロンの誘導は、８倍のみの増加をもたらす。
【００７７】
系の使用．  系を試験するために、位置５１６に位置するエシェリキア・コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡにおける唯一のプソイドウリジンでのヌクレオチド置換の影響を調べた。プソイドウリジンおよびＵはアデノシンと同等に安定な塩基対を形成するので（Ｍａｄｅｎ，Ｂ．Ｅ．（１９９０）Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：２４１−３０３）、Ａ５３５での突然変異もまた、これら２つの場所の間の塩基対形成の能力がリボソーム機能に影響を及ぼすかどうかを決定するために構築した。突然変異は、図７に示すように、最初に、１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子を含有するｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１０９）誘導体、ｐ１６ＳＴにおいて構築し、そして次に分析のためにｐＲＮＡ１２２に移した。２つの突然変異位置の間に位置するＳａｃＩＩ制限部位は、ｐＲＮＡ１６ＳＴにおいてユニークでありそしてｐＲＮＡ１２２においてユニークではないので、この２段階の方法を用いた。インビボでのタンパク質合成へのｐＲＮＡ１２２における該突然変異の影響は、突然変異体細胞のＭＩＣおよびＣＡＴ活性を測定することにより決定した（図８）。位置５１６で、単一のトランジション突然変異、プソイドウリジン５１６Ｃを含有するリボソームは、野生型リボソームにより生産される機能性ＣＡＴタンパク質の量の約６０％をもたらした。しかしながら、トランスバージョン突然変異、プソイドウリジン５１６Ａもしくはプソイドウリジン５１６Ｇは、リボソーム機能を＞９０％減少した。位置５３５での単一の突然変異は全て、野生型リボソームの機能の＞５０％を保持した。位置５１６と５３５との間で塩基対合する能力はリボソーム機能にとって必要である可能性を調べるために、これらの場所の間の全ての可能な突然変異も同様に構築し、分析した（図８）。これらのデータは、二重突然変異体の全てが塩基対合する能力にかかわらず不活性であった（野生型の１０％以下）ことを示す。５１６突然変異体における機能の喪失の理由を調べるために、位置５１６で単一の突然変異を発現する細胞からのリボソームをショ糖密度勾配遠心分離により分画し、そして３０Ｓおよび７０Ｓピークをプライマー伸長により分析して存在するプラスミド由来の３０Ｓサブユニットのパーセンテージを決定した。図１４におけるデータは、リボソーム機能と７０Ｓリボソーム画分におけるプラスミド由来のリボソームの存在の間の強い相関関係を示し、位置５１６での突然変異は７０Ｓリボソームを形成する突然変異体３０Ｓサブユニットの能力に影響を及ぼすことを示唆する。
【００７８】
実施例４において引用する参考文献は、Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５１６  ａｎｄ  Ａ５３５  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１  Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００１）に、そしてＬｅｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５１６  ａｎｄ  Ａ５３５  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３１（１１）：２９９４−３００４で見出すことができる。
【実施例５】
【００７９】
ＲＮＡ構造−機能関係のインビボ決定
材料および方法
試薬．  制限酵素、リガーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素および子牛腸アルカリホスファターゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからそしてＧｉｂｃｏ−ＢＲＬからであった。シーケナーゼ改変ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよびシーケンスバッファーは、ＵＳＢ／Ａｍｅｒｓｈａｍからであった。オリゴヌクレオチドは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｌｉｇｏ  １０００  ＤＮＡ合成機を用いて施設内で合成した。Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓからであった。［３Ｈ］クロラムフェニコール（３０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＡｍｅｒｓｈａｍからであり、そして［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒからであった。他の化学物質は、Ｓｉｇｍａからであった。
【００８０】
ｐＲＮＡ１２２．  この構築物の重要な特徴は：（１）ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下のｐＫＫ３５３５（Ｂｒｏｓｉｕｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｌａｓｍｉｄ  ６：１１２−１１８）からのｒｒｎＢオペロンのコピーを含有し：（２）ラクトースリプレッサー対立遺伝子ｌａｃＩｑ（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７４：７６２−７６９）のコピーを含有し；（３）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｍ）が存在し、そして突然変異体トリプトファンプロモーター、ｔｒｐｃ（ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から構成的に転写され；（４）ＣＡＴメッセージのＲＢＳが野生型、５’−ＧＧＡＧＧから５’−ＡＵＣＣＣに変えられており、そして１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＭＢＳが５’−ＧＧＧＡＵに変えられており；そして（５）β−ラクタマーゼ遺伝子が宿主株におけるプラスミドの維持を可能にするために存在することである。
【００８１】
細菌株および培地．  プラスミドは、エシェリキア・コリＤＨ５（ｓｕｐＥ４４，ｈｓｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０）において維持し、発現させた。培養物は、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ，Ｓ．Ｅ．＆  Ｂｕｒｒｏｕｓ，Ｊ．Ｗ．（１９５７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７４：４６１−４７６）もしくは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地（ＬＢ−ＡＰ１００）において培養した。ｌａｃＵＶ５プロモーターからのプラスミド由来のｒＲＮＡの合成を誘導するために、各実験における示す時間でＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度になるように加えた。株はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｒａｔｏｒを用いて電気穿孔（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７）により形質転換した。他に示さない限り、形質転換体は、プラスミド由来の遺伝子の発現を可能にするために選択培地上で平板培養する前に１時間ＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，上記）において培養した。
【００８２】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイ．  ＣＡＴ活性は、本質的に記述されているように決定した（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：１９１−２２７）。ＣＡＴアッセイのための培養物は、ＬＢ−Ａｐ１００において培養した。簡潔に言えば、対数期中期の培養物（他に示さない限り）の０．５ｍｌのアリコートを等容量の５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に加え、そして０．０１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよびクロロホルムを用いて溶解した（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，ｅｄ．），ｐｐ．７１−８０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。得られる溶解物は、直接使用するかもしくは使用の前にアッセイバッファーに希釈した。アッセイ混合物は、１２５μｌの容量に細胞抽出物（５μｌもしくは１０μｌ）、２５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、２１４μＭのブチリル−補酵素Ａ（Ｂｕ−ＣｏＡ）および４０μＭの［３Ｈ］クロラムフェニコールを含有した。シグナルがタンパク質濃度に比例したことを保証するために２つの濃度の溶解物を３７℃で１時間アッセイした。生成物、ブチリル−［３Ｈ］クロラムフェニコールを２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン：キシレン（２：１）に抽出し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ−３８０１液体シンチレーションカウンターにおいて直接測定した。ブランクは、接種していないＬＢ培地を培養物の代わりに用いたことを除いて、全く上記のように調製した。
【００８３】
最小阻害濃度の決定．  ＭＩＣは、マイクロタイタープレートにおいてもしくは固形培地上で標準方法により決定した。ＬＢ−Ａｐ１００において培養した一晩培養物を希釈し、そして１ｍＭのＩＰＴＧを含有する同じ培地において３時間誘導した。次に、約１０４個の誘導細胞をＬＢ−Ａｐ１００＋ＩＰＴＧ（１ｍＭ）および増加する濃度のクロラムフェニコールを含有するウェルに加えた（もしくは固形培地上にスポットした）。培養物を２４時間培養し、そして増殖を完全に阻害したクロラムフェニコールの最低濃度をＭＩＣとして表した。
【００８４】
ランダム突然変異誘発および選択．  ７９０ループのランダム突然変異誘発は、ＰＣＲを用いて本質的にＨｉｇｕｃｈｉ（１９８９）の方法により実施し、そしてユニークなＢｇｌＩＩおよびＤｒａＩＩＩ制限部位を用いてｐＲＮＡ１２２にクローン化した（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．，ｅｄ．），ｐｐ．６１−７０，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（図１８）。各組の突然変異には、４個のプライマー：２個の「外側」プライマーおよび２個の「内側」プライマーを用いた。２個の外側プライマーは、ｐＲＮＡ１２２におけるＢｇｌＩＩおよびＤｒａＩＩＩ制限部位の両側にアニーリングするように設計した（図２）。これらのプライマーは、１６Ｓ−ＤｒａＩＩＩ、５’−ＧＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＡＣＴＡ−３’および１６Ｓ−５３５、５’−ＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴ−３’であった。内側プライマーは、１６Ｓ−７８６Ｒ、５’−ＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＧ−３’および１６Ｓ−ＡＳＳ−３、５’−ＣＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡ−３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）であった。従って、ＢｇｌＩＩもしくはＤｒａＩＩＩ制限部位のいずれかを形成するので除外した３２０の配列（２５６のＢｇｌＩＩ部位および６４のＤｒａＩＩＩ部位）を除いて、４９＝２６２，１４４の可能な組み合わせを作製した。
【００８５】
形質転換体を１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＳＯＣ培地において４時間インキュベーションしてｒＲＮＡ合成を誘導し、そして次に１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で平板培養した。全部で２ｘ１０６個の形質転換体を平板培養し、約２０００個のクロラムフェニコール耐性生存物をもたらした。次に、これらの生存物のうち７３６個をランダムに選択し、そしてアッセイして突然変異体リボソームを発現する細胞における増殖を完全に阻害するために必要なクロラムフェニコールのＭＩＣを決定した。このプールから、１００μｇ／ｍｌより大きいＭＩＣを有する１８２個の形質転換体をランダムに選択し、シーケンスした。
【００８６】
位置７８７および７９５の部位特異的突然変異．位置７８７および７９５での突然変異は、内側プライマーが１６Ｓ−７８６Ｒ（上記参照）および１６Ｓ−ＡＳＳ−４、５’−ＣＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＮＴＴＡＧＡＴＡＮＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡ−３’（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）であったことを除いて、ランダム突然変異体に関して上に記述したように構築した。形質転換体をＬＢ−Ａｐ１００寒天プレート上で選択し、そしてそれらのクロラムフェニコールのＭＩＣに従って分類した。次に、各群からの代表をシーケンスして突然変異を同定した。
【００８７】
プライマー伸長．  染色体由来に対するプラスミド由来のｒＲＮＡの割合を決定するために、３０Ｓおよび７０ＳリボソームをＰｏｗｅｒｓ  ＆  Ｎｏｌｌｅｒ（１９９１）の方法により２００ｍｌの誘導したプラスミド含有細胞から単離した。次に、精製されたＲＮＡをプライマー伸長実験（Ｔｒｉｍａｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９：６４３−６５３）において用いた。７８８および７９５突然変異部位の３’の配列に相補的な末端標識したプライマーを誘導細胞からのｒＲＮＡにアニーリングさせ、そしてＡＭＶ逆転写酵素を用いて突然変異部位を通って伸長させた。使用したプライマーは：１６Ｓ−８０６Ｒ、５’−ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴ−３’；１６Ｓ−８１４Ｒ、５’−ＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡ−３’であった。野生型ｐＲＮＡ１２２リボソームでは、１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子における位置１１９２をＣからＵに変え、そしてプライマーを上記のように構築した（Ｔｒｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，上記）。この突然変異は、以前に、サブユニット会合に影響を及ぼさないことが示されている（Ｓｉｇｍｕｎｄ，Ｃ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６４：６７３−６８９）。伸長混合物は、３種のデオキシリボヌクレオチドおよび１種のジデオキシリボヌクレオチドの混合物を含有した。ｃＤＮＡをＰＡＧＥにより分離し、そして２つのバンドの各々における放射能の量を比較することにより非突然変異体リボソームに対する突然変異体リボソームの割合を決定した。
【００８８】
オリゴリボヌクレオチド合成．  オリゴリボヌクレオチドは、Ｃｒｕａｃｈｅｍ  ＰＳ  ２５０  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機でホスホルアミダイト法（Ｃａｐａｌｄｉ，Ｄ．＆  Ｒｅｅｓｅ，Ｃ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２２０９−２２１６）を用いて固体支持体上で合成した。製造業者の推奨に従ってアンモニアおよび酸での処理によりオリゴマーを固体支持体から取り除き、脱保護した。ＲＮＡは、ｎ−プロパノール／アンモニア／水（５５：３５：１０、容量による）で５時間溶出するシリカゲルＳｉ５００Ｆ  ＴＬＣプレート（Ｂａｋｅｒ）上で精製した。バンドを紫外線ランプで視覚化し、そして最小移動性バンドを切り出し、そして１ｍｌの精製水で３回溶出した。オリゴマーをＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）でさらに精製し、そして連続フロー透析（ＢＲＬ）により脱塩した。純度は、分析Ｃ−８  ＨＰＬＣ（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により調べ、そして９５％より大きかった。
【００８９】
実験方法
機能性突然変異体の配列分析．  ランダム突然変異を７９０ループにおける９個全ての位置（７８７〜７９５）で同時に導入した。次に、機能性（クロラムフェニコール耐性）突然変異体をエシェリキア・コリＤＨ５細胞（Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，上記）において選択し、そしてリボソーム機能へのこれらの突然変異の影響を決定した。クロラムフェニコール耐性を保持した全部で１８２個の突然変異体をランダムに選択し、シーケンスした。野生型７９０ループ配列は、シーケンスした形質転換体のうち８１個から得られ、一方、残りの１０１個は突然変異体配列を含有した。形質転換体のうち１個は、おそらく、ＣＡＴ遺伝子における自然突然変異のために、誘導因子のない場合にクロラムフェニコール耐性であり、さらなる分析から除外した。１００個のシーケンスした機能性突然変異体のうち、１４個は複製物であり、そして４つの配列は３回発生した。従って、７８個の異なる機能性７９０ループ突然変異体を分析した（図１９）。再標本化理論によれば、この分布は４９＝２６２，１４４の可能な配列のうち、１９０（標準偏差３０）のみのユニークな配列が、選択される機能性突然変異体のプールに存在することを示す。７８個の突然変異体のうち、４４個は、突然変異させた９個の塩基のうち４〜６個の置換を含有し、そしてこれらのうち２１個は、野性型活性の５０％より多くを保持した。ｐＲＮＡ１２２からの野生型ｒＲＮＡを発現する細胞のクロラムフェニコールの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、６００μｇ／ｍｌである。突然変異体のＭＩＣは、３２０μｇ／ｍｌの平均（標準偏差８９）で１５０〜５５０μｇ／ｍｌの間であった。メジアンおよびモードは両方とも、３５０μｇ／ｍｌであった。
【００９０】
機能性７９０ループ突然変異体は、ランダムな分布（図２０）しかし有意な共変動を示した、位置７８８および７９２を除いて、全ての突然変異位置で強いヌクレオチド選択を示した。Ｕ７８９もしくはＧ７９１で突然変異は認められなかった。しかしながら、これらの位置での突然変異は、機能の喪失に関して選択した突然変異体に存在した（示さない）。従って、これらのヌクレオチドは、リボソーム機能に直接関与するようである。Ｕ７８９は細菌間で厳重に保存されているが、他の生物間では高い頻度でＣ７８９である（図２０）。化学物質保護研究（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ）は、Ｇ７９１が７０Ｓリボソームおよびポリソームにおいてケトキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）修飾から（Ｂｒｏｗ，Ｄ．Ａ．＆  Ｎｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６３：１１２−１１８；Ｍｏａｚｅｄ，Ｄ．＆  Ｎｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１：４８３−４９３）；そしてポリ（Ｕ）（Ｍｏａｚｅｄ  ＆  Ｎｏｌｌｅｒ，１９８６，上記）により特に保護されること、そして３０Ｓサブユニットが「不活性」から「活性」構造に転化される場合にＧ７９１がケトキサール修飾をより受けやすくなること（Ｍｏａｚｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，上記）を示している。
【００９１】
プリンは位置７８７で強く選択され（９７．４％）、一方、Ａおよびより少ない程度にＣが位置７９０で優先され（９８．７％）、そしてＵは両方の位置で完全に除外された。位置７９３および７９５の両方で、Ａ、ＣおよびＵは同等に分布しているが、Ｇは不利に選択された。アデニンおよびウラシルは、位置７９４で優先された（８１．８％）。
【００９２】
選択される機能性クローン間のヌクレオチドの非ランダム分布は、ヌクレオチド同一性がリボソーム機能のレベルに影響を及ぼすことを示唆する。これを調べるために、既定の位置で全ての突然変異を含有するリボソームの平均活性（ＭＩＣ）を各突然変異位置でのリボソーム機能（ＭＩＣ）とヌクレオチド同一性との間の１因子分散分析により比較した。リボソーム機能のレベルへのヌクレオチド同一性の有意な影響を示した位置は、７８７（Ｐ＜０．００１）、７８８（Ｐ＜０．０５）および７９５（Ｐ＜０．００１）であった。機能性クローンにおける位置Ｕ７８９およびＧ７９１での突然変異の欠如は、これらの位置の統計分析を妨げるが、これらの位置での突然変異は、おそらく、同様にリボソーム機能に強く影響を及ぼす。
【００９３】
図２０は、現在の系統発生学的データ（Ｒ．Ｇｕｔｅｌｌ，未発表の結果；Ｇｕｔｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．（１９９４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（１７）：３５０２−３５０７；Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：８２−８５）と選択される機能性突然変異体との比較を示す。選択される突然変異体におけるヌクレオチド選択は、系統発生学的データにおいて認められるものと同様であるが、本研究において選択される突然変異体配列は、天然に存在するものよりさらに多くの変動を示す。これは、ループにおける位置の全てが同時に突然変異され、天然で起こる可能性が低いプロセスである１つの位置における通常は有害な突然変異が他の位置での突然変異により相殺されることを可能にするからであり得る。さらに、突然変異体のいずれも野生型ほど機能性ではなく、野生型７９０ループ配列が最適な活性のために選択されていることもしくは翻訳機構の他の部分が野生型配列での機能に最適化されていることを示唆する。
【００９４】
ループ内の潜在的ヌクレオチド共変動を同定するために、選択されるヌクレオチドの一対の分布を適合度に関して調べた。最も有意な共変動は、位置７８７と７９５との間（Ｐ＜０．００１）および位置７９０と７９３との間（Ｐ＜０．００１）で認められた。位置７９０および７９３では、８個の二重突然変異体のみが分析に利用可能であり；従って、これらの位置の間で認められる共変動は、慎重に考慮されるべきである。ヌクレオチド特異性を示さなかった位置７８８は、位置７８７（Ｐ＜０．０１）、７９４（Ｐ＜０．０１）および７９５（Ｐ＜０．０１）と有意な共変動を示した。
【００９５】
ループの基部で構築される部位特異的突然変異の分析：位置７８７および７９５での突然変異の機能分析．  位置７８７、７８８および７９５の間で認められる共変動は、これらの位置でのヌクレオチド同一性がリボソーム機能のレベルと相関関係があったので、特に興味深い。位置７８７および７９５のヌクレオチドのさらなる分析は、７８個の機能性突然変異体のうち７２個がミスマッチ塩基対（Ａ・Ｃ、Ｇ・Ｕ、Ａ・ＡおよびＧ・Ｇ）を形成する能力を有することを明らかにした。しかしながら、Ｇ・ＡおよびＵ・Ｇのような他のミスマッチは、見出されなかった。さらに、Ａ・Ｕワトソン・クリック対を有する４つの配列のみが存在し、そしてＵ・Ａ、Ｇ・ＣもしくはＣ・Ｇ対を有する配列は存在せず、これらの位置の間の強い塩基対はリボソーム機能を阻害することを示唆する。従って、７９０ループにおける他のヌクレオチドを変えずに位置７８７および７９５での全ての可能なヌクレオチドの組み合わせを構築し、分析した。突然変異体のリボソーム機能（図２１）は、野生型の８４％（Ａ・Ａ）から１％（Ｃ・Ｇ）まで様々であった。機能性ランダム突然変異体のプールの分析により予測されるように、位置７８７および７９５の間でＧ・Ｃ、Ｃ・ＧおよびＵ・Ａワトソン・クリック対を有する部位特異的突然変異体は、強力に阻害性であった。
【００９６】
結果
これらのデータは、位置７８７および７９５のヌクレオチド間の強い対合がリボソーム機能を阻害することを示唆する。さらに、機能性リボソームをもたらした位置７８７および７９５での部位特異的置換のいくつかは、ループ位置の全てを同時に突然変異させた突然変異体のプールから主として除外された（例えば、ＣＣ、ＣＵ、ＵＵおよびＵＣ）。選択されるランダムプールにおいて位置７８７および７９５で認められるヌクレオチド選択は、おそらく、ループにおける他のヌクレオチドとこれらの位置のヌクレオチドとの相互作用を反映する。これは、これらの部位の間の大きい共変動の我々の結果と一致する。
【００９７】
７９０ループの混乱は、リボソームのサブユニット会合に影響を及ぼすことが示されている（Ｈｅｒｒ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０：４３３−４４９；Ｔａｐｐｒｉｃｈ，Ｗ．＆  Ｈｉｌｌ，Ｗ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５５６−５６０；Ｔａｐｐｒｉｃｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４９２７−４９３１）。従って、７８７〜７９５突然変異体のいくつかを７０Ｓリボソームを形成するそれらの能力に関して試験した。選択される突然変異体からリボソームを単離し、そして７０Ｓおよび３０Ｓピークの両方における突然変異体リボソームの分布をプライマー伸長により決定した（図２１）。これらのデータは、ＣＡＴ活性が７０Ｓリボソームプールにおける突然変異体３０Ｓサブユニットの存在と相関関係があることを示す。従って、機能の喪失は、突然変異体３０Ｓおよび５０Ｓサブユニットが会合することができないためであり得る。この結果の別の説明は、突然変異が、開始のようなサブユニット会合の前のタンパク質合成プロセスの段階に直接影響を与えることができ、それにより次の段階が起こるのが妨げられることである。これが事実であると思われる１６Ｓ  ｒＲＮＡにおける他の突然変異が同定されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：７１７２−７１８０）。
【００９８】
実施例５において引用する参考文献は、本発明に引用することにより明白に組み込まれる、Ｌｅｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３（１９９７）に見出すことができる。
【実施例６】
【００９９】
ハイブリッド構築物の構築
ハイブリッド構築物として同定される本発明のプラスミド構築物を図１７および２５に記載する。このハイブリッド構築物は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスからの１６Ｓ  ｒＲＮＡを含有する。ハイブリッド構築物上の特定の部位は以下の通りである：エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンからのｒＲＮＡの部分は、核酸１〜９３１に対応し；マイコバクテリウム・ツベルクローシスｒｒｎオペロンからの１６Ｓ  ｒＲＮＡの部分は、核酸９３２〜１５４２に対応し；１６Ｓ  ＭＢＳ  ＧＧＧＡＵは、核酸１５３６〜１５４０に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１は、核酸１７９１〜１８３４に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ２は、核酸１９６５〜１９９４に対応し；複製起点は、核酸３０５４〜２４３８に対応し；ｂｌａ（β−ラクタマーゼ；アンピシリン耐性）は、核酸３２１４〜４０７４に対応し；ＧＦＰは、核酸５７２６〜４９９２に対応し；ＧＦＰ  ＲＢＳ（リボソーム結合配列）ＡＵＣＣＣは、核酸５７３８〜５７３４に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸５７９５〜５７５５に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸６２７０〜６３１０に対応し；ＣＡＴ  ＲＢＳ（リボソーム結合配列）ＡＵＣＣＣは、核酸６３２７〜６３３１に対応し；ｃａｍ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ）は、核酸６３３９〜６９９８に対応し；ｌａｃＩｑプロモーターは、核酸７３０７〜７３８４に対応し；ｌａｃＩｑ（ｌａｃリプレッサー）は、核酸７３８５〜８４６７に対応し；そしてｌａｃＵＶ５プロモーターは、核酸８５１０〜８５５１に対応する。
【０１００】
本明細書に引用する全ての参考文献は、引用することにより明白に組み込まれる。
同等物
当業者は、本明細書に記述する本発明の特定の態様の多数の同等物を認識するか、もしくは日常的な実験のみを用いて確かめることができる。そのような同等物は、以下の請求項により包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】プラスミド構築物ｐＲＮＡ１２３を示す。ｐＲＮＡ１２３における特定の部位の位置は次のとおりである：エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンの１６Ｓ  ｒＲＮＡは、核酸１〜１５４２に対応し；１６Ｓ  ＭＢＳ（メッセージ結合配列）ＧＧＧＡＵは、核酸１５３６〜１５４０に対応し；１６Ｓ〜２３Ｓスペーサー領域は、核酸１５４３〜１９８２に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンの２３Ｓ  ｒＲＮＡは、核酸１９８３〜４８８６に対応し；２３Ｓ〜５Ｓスペーサー領域は、核酸４８８７〜４９８２に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンの５Ｓ  ｒＲＮＡは、核酸４９８３〜５０９８に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１は、核酸５１０２〜５１４５に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ２は、核酸５２７６〜５３０５に対応し；ｂｌａ（β−ラクタマーゼ；アンピシリン耐性）は、核酸６５７５〜７４３２に対応し；複製起点は、核酸７５７５〜８２０９に対応し；ｒｏｐ（Ｒｏｐタンパク質）は、核酸８８１３〜８６２２に対応し；ＧＦＰは、核酸１０２０１〜９４６７に対応し；ＧＦＰ  ＲＢＳ（リボソーム結合配列）ＡＵＣＣＣは、核酸１０２１３〜１０２０９に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸１０２７０〜１０２３０に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸１０７４５〜１０７８５に対応し；ＣＡＴ  ＲＢＳ  ＡＵＣＣＣは、核酸１０８０２〜１０８０６に対応し；ｃａｍ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ）は、核酸１０８１４〜１１４７３に対応し；ｌａｃＩｑプロモーターは、核酸１１７８２〜１１８５９に対応し；ｌａｃＩｑ（ｌａｃリプレッサー）は、核酸１１８６０〜１２９４２に対応し；そしてｌａｃＵＶ５プロモーターは、核酸１２９８５〜１３０２６に対応する。
【図２】ｐＲＮＡ９の構築のスキームを示す。図２における略語は、次のとおり定義する：Ａｐｒ、アンピシリン耐性；ｃａｍ、ＣＡＴ遺伝子；ｌａｑＩｑ、ラクトースリプレッサー；ＰｌａｃＵＶ５、ｌａｃＵＶ５プロモーター；Ｐｔｒｐｃ、構成的ｔｒｐプロモーター。使用する制限部位もまた示す。
【図３】ｐＲＮＡ８−ｒＭＢＳ−ｒＲＢＳでのシーケンスゲルのオートラジオグラムを示す。突然変異誘発ＭＢＳおよびＲＢＳを示す：Ｂ５  Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｄ５  Ａ、Ｇ、Ｔ；Ｈ５  Ａ、Ｃ、Ｔ；Ｖ５  Ａ、Ｃ、Ｇ。ｃａｍの開始コドンおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡの３９末端を示す。パネルＡは、ＣＡＴ遺伝子のＲＢＳを示す。パネルＢは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＭＢＳを示す。
【図４】増殖へのＭＢＳの影響のグラフを示す。図４における略語は、次のとおり定義する：ｐＰＢＲ３２２；ベクター：ｐＲＮＡ６；ＲＢＳ  ５  ＧＵＧＵＧ、ＭＢＳ  ５  ＣＡＣＡＣ：ｐＲＮＡ９；ＲＢＳ  ５  ＧＧＡＧＧ（ｗｔ）、ＭＢＳ  ５  ＣＣＵＣＣ（ｗｔ）；およびクローンＩＸ２４；ＲＢＳ  ５  ＡＵＣＣＣ、ＭＢＳ  ５  ＧＧＧＡＵ。
【図５】ｐＲＮＡ１２２の構築のスキームを示す。図５における略語は、次のとおり定義する：Ａｐｒ、アンピシリン耐性；ｃａｍ、ＣＡＴ遺伝子；ｌａｑＩｑ、ラクトースリプレッサー；ＰｌａｃＵＶ５、ｌａｃＵＶ５プロモーター；Ｐｔｒｐｃ、構成的ｔｒｐプロモーター；Ｎ５  Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ。突然変異させた４個のヌクレオチドに下線を引き、そして使用する制限部位を示す。
【図６】プラスミド由来のリボソーム分布およびＣＡＴ活性を示す。培養物を初期の対数期で誘導し（もしくは誘導しない）（図４に示すように）、そして示す時点でサンプルをＣＡＴアッセイおよび全ＲＮＡ調製用に抜き取った。開いた四角は、非誘導細胞におけるプラスミド由来のｒＲＮＡパーセントを表す。閉じた四角は、誘導細胞におけるプラスミド由来のｒＲＮＡパーセントを表す。開いた丸は、非誘導細胞におけるＣＡＴ活性を表す。閉じた丸は、誘導細胞におけるＣＡＴ活性を表す。
【図７】位置５１６もしくは５３５での単一突然変異の構築のスキームを示す。図７における略語は、次のとおり定義する：Ａｐｒ、アンピシリン耐性；ｃａｍ、ＣＡＴ遺伝子；ｌａｑＩｑ、ラクトースリプレッサー；ＰｌａｃＵＶ５、ｌａｃＵＶ５プロモーター；Ｐｔｒｐｃ、構成的ｔｒｐプロモーター。ｐＲＮＡ１２２においてＣ５１６をＶ（Ａ、ＣもしくはＧ）に置換し、そしてＡ５３５をＢ（Ｃ、ＧもしくはＴ）に置換し、そして使用した制限部位もまた示す
【図８】ｐＲＮＡ１２２における１６Ｓ  ｒＲＮＡの位置５１６および５３５で構築した突然変異の機能分析を示す。ヌクレオチド同一性は５１６：５３５の順に示し、そして突然変異に下線を引く。野生型ＭＢＳ（ｗｔ．ＭＢＳ）を含有するｐＲＮＡ１２２は、野生型リボソームによるＣＡＴ  ｍＲＮＡ翻訳に起因するＭＩＣの程度およびＣＡＴ活性のレベルを評価するために陰性コントロールとして用いた。平均の標準誤差は、アッセイ結果の範囲を示すために用いる。
【図９】オリゴデオキシヌクレオチドの説明および用途を示す。プライマー結合部位は、コーディング領域の５’ヌクレオチドからのヌクレオチドの数により示す。負の数は、コーディング領域の５’の結合部位を示す。
【図１０】実施例４において使用するいくつかのプラスミドを記述する。
【図１１】選択される組み換え体の特異性を示す。使用するクロラムフェニコールの濃度を示し、そしてＭＩＣの単位は、クロラムフェニコールのマイクログラム／ｍＬである。
【図１２】本発明の新規な突然変異体ＡＳＤ配列および新規な突然変異体ＳＤ配列を示す。図１２はまた、クロラムフェニコール耐性単離株の配列分析も示す。突然変異ヌクレオチドに下線を引き、そして潜在的二本鎖形成を四角に囲む。ＣＡＴ活性は各培養物で２回測定し、そして単位はＣＰＭ／０．１μＬの培養物／ＯＤ６００である。誘導は、非誘導細胞におけるＣＡＴ活性で誘導細胞におけるＣＡＴ活性を割ることにより測定した。−１は誘導なしを示し、一方、＋１は１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導を示す。
【図１３】本発明の新規な突然変異体ＡＳＤ配列および新規な突然変異体ＳＤ配列を示す。図１３はまた、ＣＡＴ  ｍＲＮＡ突然変異体の配列分析も示す。潜在的二本鎖形成を四角に囲み、そして突然変異ヌクレオチドに下線を引く。開始コドン（ＡＵＧ）は、ボールド体である。−１は誘導なしを示し、一方、＋１は１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導を示す。
【図１４】サブユニット組み立てへのプソイドウリジン５１６置換の影響を示す。プラスミド由来の３０Ｓパーセントデータは、各ピークにおけるそして粗リボソームにおける全３０Ｓのパーセンテージとして示す。
【図１５】本発明の新規な突然変異体ＡＳＤ配列および新規な突然変異体ＳＤ配列を示す。
【図１６】本発明の新規な突然変異体ＡＳＤ配列および新規な突然変異体ＳＤ配列を示す。
【図１７】ハイブリッド構築物を示す。このハイブリッド構築物は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスからの１６Ｓ  ｒＲＮＡを含有する。ハイブリッド構築物上の特定の部位は以下のとおりである：エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンからのｒＲＮＡの部分は、核酸１〜９３１に対応し；マイコバクテリウム・ツベルクローシスｒｒｎオペロンからの１６Ｓ  ｒＲＮＡの部分は、核酸９３２〜１５４２に対応し；１６Ｓ  ＭＢＳ（メッセージ結合配列）ＧＧＧＡＵは、核酸１５３６〜１５４０に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ１は、核酸１７９１〜１８３４に対応し；エシェリキア・コリｒｒｎＢオペロンのターミネーターＴ２は、核酸１９６５〜１９９４に対応し；複製起点は、核酸３０５４〜２４３８に対応し；ｂｌａ（β−ラクタマーゼ；アンピシリン耐性）は、核酸３２１４〜４０７４に対応し；ＧＦＰは、核酸５７２６〜４９９２に対応し；ＧＦＰ  ＲＢＳ（リボソーム結合配列）ＡＵＣＣＣは、核酸５７３８〜５７３４に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸５７９５〜５７５５に対応し；ｔｒｐｃプロモーターは、核酸６２７０〜６３１０に対応し；ＣＡＴ  ＲＢＳ（リボソーム結合配列）ＡＵＣＣＣは、核酸６３２７〜６３３１に対応し；ｃａｍ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；ＣＡＴ）は、核酸６３３９〜６９９８に対応し；ｌａｃＩｑプロモーターは、核酸７３０７〜７３８４に対応し；ｌａｃＩｑ（ｌａｃリプレッサー）は、核酸７３８５〜８４６７に対応し；そしてｌａｃＵＶ５プロモーターは、核酸８５１０〜８５５１に対応する。
【図１８】ｐＲＮＡ１２２のプラスミド地図を示す。
【図１９】機能性突然変異体の配列およびＭＩＣの表を示す。配列は、突然変異体リボソームを発現する細胞の増殖を完全に阻害するために必要とされるクロラムフェニコールの最小阻害濃度（「ＭＩＣ」）により並べる。ヌクレオチド配列（「ヌクレオチド配列」）は、機能性のランダムに選ばれた突然変異体のプールから選択される７９０ループ配列である。突然変異に下線を引く。各突然変異体配列における突然変異の数（「突然変異の数」）、ならびに示す配列を有するクローンの数に相当する発生回数（「発生回数」）を示す。非突然変異コントロール、ｐＲＮＡ１２２（ＷＴ、野生型）の配列および活性を図１９の第１列に示し、ここで、ＭＩＣは６００μｇ／ｍｌである。
【図２０】７９０ループ配列バリエーションを示す。共通配列においてＲ＝ＡもしくはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧもしくはＵ；Ｍ＝ＡもしくはＣ；Ｈ＝Ａ、ＣもしくはＵ；Ｗ＝ＡもしくはＵ；Ｙ＝ＣもしくはＵ；Δ＝欠失；そして下線を引いた数は、野生型エシェリキア・コリ配列を示す。
【図２１】位置７８７および７９５の機能および熱力学分析を示す。突然変異に下線を引き、そして「ｎ．ｄ．」は決定されないことを表す。図２１は、変異性プライマーが位置７８７および７９５にのみ対応する置換を含有したことを除いて、ランダム突然変異体に記述したように、ＰＣＲを用いて構築した部位特異的突然変異（「ヌクレオチド」）を示す。リボソーム機能（「平均ＣＡＴ活性」）を決定するために、各株を培養し、そしてＣＡＴ活性を少なくとも２回アッセイし、データを平均し、そして非突然変異コントロール、ｐＲＮＡ１２２のパーセンテージ±平均の標準誤差として示した。３０Ｓおよび７０Ｓリボソームにおける染色体由来に対するプラスミド由来のｒＲＮＡの割合（３０Ｓピーク／７０Ｓピークにおける突然変異体３０Ｓ％）は、プライマー伸長により決定した。培養物を培養し、そして少なくとも２回アッセイし、そして平均値を各ピークにおける全３０Ｓのパーセンテージ±平均の標準誤差として示す。熱力学パラメーター（「熱力学」）は、モデルオリゴヌクレオチドの高温遷移（ｈｉｇｈｅｒ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）に関してであり、そして４もしくは５つの異なるオリゴマー濃度の結果の平均である。ΔＧ°３７の標準誤差は、±５％である（１ｋｃａｌ＝４１８４Ｊ）。Ｔｍにおける誤差は、±１℃と概算される。全ての溶液は、ｐＨ７であった。
【図２２】ｒＲＮＡ８のＤＮＡ配列を示す。
【図２３】ｐＲＮＡ１２２のＤＮＡ配列を示す。
【図２４】ｐＲＮＡ１２３のＤＮＡ配列を示す。
【図２５】ｐＲＮＡ１２３マイコバクテリウム・ツベルクローシス−２（エシェリキア・コリおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシス１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のハイブリッドを含有するｐＲＮＡ１２３）のＤＮＡ配列を示す。
【図２６】ｐＲｅｐ−マイコバクテリウム・ツベルクローシス−２（ｐＲＮＡ１２２からのｒＲＮＡオペロンを含有するｐｕｃ１９誘導体を含有する；しかしながら、２３Ｓおよび５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は取り除かれている）のＤＮＡ配列を示す。
【０１０２】
図２〜１４は、Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ５１６  ａｎｄ  Ａ５３５  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１  Ｍｅｅｔｉｎｇ（２００１）に見出すことができ；そして図１８〜２１は、Ｌｅｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７３２−７４３（１９９７）に見出すことができ、これらの全ては、本明細書に引用することにより明白に組み込まれる。
【図１】
2005532053.tif 000002
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2005532053.tif 000020
【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【図２２ｅ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２３ｄ】
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【図２３ｅ】
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【図２４ａ】
2005532053.tif 000032
【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
2005532053.tif 000036
【図２４ｆ】
2005532053.tif 000037
【図２５ａ】
2005532053.tif 000038
【図２５ｂ】
2005532053.tif 000039
【図２５ｃ】
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【図２５ｄ】
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【図２５ｅ】
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【図２５ｆ】
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【図２６ａ】
2005532053.tif 000044
【図２６ｂ】
2005532053.tif 000045
【図２６ｃ】
2005532053.tif 000046
【図２６ｄ】
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【図３】
2005532053.tif 000048
【国際調査報告】
2005532053.tif 000049