(57)【要約】【課題】画像形成顕微鏡システム、それも特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光性試料の検査のための方法および／または装置【解決手段】試料が少なくとも１つの切断面で点状または線状に走査され、走査の間試料から発せられるビームが分散および分解され、分解されたビームが少なくとも１組の検出素子ＤＥにより波長別に検出され、これらの検出素子ＤＩの少なくとも１つおよび／またはその他検出素子の少なくとも１つにより記録および保存された強度分布を手掛かりとして、試料から反射したビームに関し、予備保存された２次元または３次元の幾何学形状対象物に相当する、または類似する２次元または３次元の試料部分の選択が画像加工を通して行われる、およびこれら試料領域の少なくとも一部について、それらに配置された蛍光マーカーを基にスペクトル像および／または立体スペクトル配列の分析が行われる方法および／または装置。【特許請求の範囲】
【請求項１】
画像形成顕微鏡システム、それも特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光性試料の検査のための方法および／または装置であって；
試料が少なくとも１つの切断面で点状または線状に走査され、走査の間試料から発せられるビームが分散および分解され、分解されたビームが少なくとも１組の検出素子により波長別に検出され、これらの検出素子の少なくとも１つおよび／またはその他検出素子の少なくとも１つにより記録および保存された強度分布を手掛かりとして、試料から反射したビームに関し、予備保存された２次元または３次元の幾何学形状対象物に相当する、または類似する２次元または３次元の試料部分の選択が画像加工を通して行われる、およびこれら試料領域の少なくとも一部について、それらに配置された蛍光マーカーを基にスペクトル像および／または立体スペクトル配列の分析が行われる方法および／または装置。
【請求項２】
撮影が複数の切断面で行われ、その試料内分布の３次元画像が保存され、試料点または試料領域毎に検出、保存された試料光のスペクトル分布が、試料内分布に振り分けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定によって得られたスペクトル像および／またはスペクトル配列が予備保存されている値と比較され、その比較に基づき予備保存された値に振り分けられる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項４】
試料領域の幾何学特性および／またはスペクトル特性についての測定が時間別に行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項５】
３次元対象物のスペクトル分析の前にその形態が変えられる、それも特に平面的広がりの方向において変えられる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項６】
参照スペクトルが、試料上に存在する蛍光マーカーに基づき生成される、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項７】
幾何学形態の計測が、複数の検出波長領域で行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項８】
検出が、受信器走査線、特に多重チャネルＰＭＴまたはダイオード走査線を通じて行われる、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項９】
下記のステップ、すなわち
ａ）試料および／または参照試料におけるラムダスタックの記録
ｂ）使用する色素および／または色素配合の参照スペクトルの捕捉
ｃ）試料の検査対象要素／領域の選択用としての、例えばバイナリ化またはセグメント化などの画像分析方法による対象物の検知
ｄ）試料の擬似色チャネル表示のための試料のラムダスタックの成分分解
ｅ）構造的特徴分布状態の測定
ｆ）試料の構造的特徴が特定的な組み合わせで存在することによる種属の定義付け
ｇ）測定試料の種属分類を特徴とする、特に先行請求項の１つに記載の、細胞、組織または有機体の分類方法。
【請求項１０】
検査対象試料が、染色体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
検査対象試料が、ＦＩＳＨ技術（例えば、マルチカラーバンディング）の利用によって着色された染色体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞、組織または有機体が、免疫細胞学または免疫組織化学の観点から着色されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
医療診断および／または治療のための、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１４】
生体インジケータの利用による環境診断（例えば、水、土壌、空気）のための、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍の診断のための、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１６】
骨髄細胞の診断および洗浄のための、先行請求項の１つに記載の方法。
【請求項１７】
細胞流量計または光学近視野顕微鏡における、先行請求項の１つの適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として生物学上の試料、プレパラートおよびそれらの付随成分に対する蛍光顕微鏡検査、それも特にレーザ走査型顕微鏡による検査の方法に関する。
【０００２】
そのほか、例えば蛍光相関分光法、作用物質スクリーニング法（ハイスループット・スクリーニング）、内部全反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦ）および走査型近視野顕微鏡法などの蛍光検出に基づく方法も含まれる。
【０００３】
少数の広域スペクトル色素帯域の検出から完全なスペクトルの同時記録への移行により、殆どが分析面または機能面からなされる試料特性の確認、分離および分類において新たな可能性が開けてくる。その場合、スペクトル、空間、動力学に関する各特性が、またはこれら特性の組み合わせが捕捉される。染色体に対する多重マーキングによる同時検査（マルチカラーバンド形成：ＭＣＢ、ＦＩＳＨ技術または類似技術）が、有糸分裂中期および間期のプレパレーションにおいて学術目的または診断目的に実施可能である。
【０００４】
スペクトル全体の同時捕捉により、現状技術に基づく方法の場合に比べて検出効率が一段とアップする。この方法のもたらす感度の上昇が、より僅少な色素濃度の捕捉および／または使用励起光の強度抑制を可能にする。後者により、励起の漂白現象および毒性作用を最小限に抑えることができる。
【背景技術】
【０００５】
生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の一つに蛍光顕微鏡法（文献：Ｐａｗｌｅｙ  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ １９５５年）がある。この場合では、特定の色素が細胞部分の特殊マーキングに使用される。
【０００６】
色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個の吸収により基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に一光子吸収と称される（図１）。色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では、蛍光光子の放出下での移行が最も重要である。放出される光子の波長は、ストークス変位のため励起放射に比較して一般的には赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
【０００７】
蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放射から分離し別途観察される。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。
【０００８】
個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００９】
高いエネルギを持つ一光子による色素分子の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ；“Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ １９９６年）。
【００１０】
しかし、色素放出はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放出スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放出光線から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【００１１】
以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４モジュールから成っている：光源、走査モジュール、検出ユニット及び顕微鏡。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。
【００１２】
プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起には、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合、さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ヘリウムネオン、固体レーザのダイオードレーザ、ＴｉＳａレーザなど）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶素子の使用により行う。それに続き、レーザビームはファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。
【００１３】
光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査光学系、鏡筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナが試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上滞留時間は多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。
【００１４】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦平面（試料）から、およびその上・下にある平面から放出された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦平面と共役な平面内に正確に設置された絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外で生成された蛍光成分が遮断される。絞りの直径を変えることによって、顕微鏡の光学解像度を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（放出フィルタＥＦ）があり、これが改めて励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１５】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は励起強度が特に強い小ボリューム部分で行われる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用は省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
【００１６】
多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、さらに一つのデスキャン検出が行われるが、しかしこの場合では、対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（デスキャン検出）。
【００１７】
３次元に広がった試料では、それぞれ一光子吸収、多光子吸収を伴う２つの検出装置により、対物レンズの焦平面内に存在する試料平面（光学的断面）だけが再現される。それに続いて、試料の様々な深さｚにおけるｘ−ｙ平面内の光学的断面をいくつか描画することにより、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。
したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートの検査に適している。
【００１８】
異なった蛍光色素は、その吸収スペクトルおよび放出スペクトルも相違するのが特長である。色素励起のためのレーザ線は、吸収スペクトルに対応させて選択する。
色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から放出された蛍光だけを点像検出器で測定することが可能になる。
【００１９】
バイオメディカル分野においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時にマーキングされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性又は放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている（図３ａ）。
【００２０】
図３ａは各種典型的な色素の放射スペクトルを示している。
放射強度が波長別に表わされている。ナンバー１〜４の色素間には、それぞれ放射スペクトルの位置及び形態に差のあるのが認められる。
現状技術に基づく放出信号のスペクトル分離は、現状技術レベルでは次の２つのカテゴリーに分類することができる：
【００２１】
Ａ逐次的データ捕捉：
１）スペクトル分散素子と単色検出器との組み合せ
２）干渉分光法
３）マルチトラッキング、すなわち、異なった吸収特性を持つ色素の分離のための、画像または走査線記録に基づく励起波長の変更（当方の出願において参照指示）
【００２２】
Ｂ並列的データ捕捉
１）色素副成分および放出フィルタの利用による蛍光放出のスペクトル分離
Ａ１およびＢ３に記述された方法は、ツアイス社のレーザ走査型顕微鏡ＬＳＭ５１０に適用されている。細胞およびその他粒子の分析および分類には細胞流量計が用いられる。そのためには、試料を液体で溶液化または懸濁化させ、毛管を通してポンピングする。
【００２３】
試料は各種の色素または蛍光性バイオ分子でマーキングしておく。蛍光放出および散乱励起光の測定を行う。現状技術については、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著、“Ｆｌｏｗｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ”（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社刊／ニューヨーク、１９９０年発行、８１〜１０７ページ）に記述されている。
【００２４】
散乱信号から試料の大きさが測定できる。個別試料の蛍光スペクトル特性を利用して、様々な試料粒子を分離／分類または個々に計数測定することができる。
【００２５】
試料粒子の分類は、静電界を通して様々な捕捉容器に篩い分けすることによって行う。この技術の評価はヒストグラムを用いて行う。この結果より、マーキング強度および試料マーキングの種別数についての情報が得られる。
【００２６】
流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒である。
したがって、高感度の検出が必要になる。検出量を制限するため、現状技術では共焦点検出が行われている。
【００２７】
流量測定の精度は様々なファクタに影響される。そのファクタとしては、例えば、非特殊性蛍光、細胞の自己蛍光、光学系構成部の蛍光および使用検出器の雑音がある。
【非特許文献１】Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著、“Ｆｌｏｗｓ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ”（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊／ニューヨーク、１９９０年発行、８１〜１０７ページ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
励起スペクトルおよび放出スペクトルが強くオーバラップする色素間では、漏話なしの分離は殆ど不可能である。この問題は、検出対象である蛍光色素の数が増えるに連れて大きくなる。したがって、検出チャネルにおける色素放出の明確な分類は不可能である。しかし、多重マーキングされた試料の分析において正確な判定をする上でそれは絶対に必要である。
【００２９】
多重蛍光記録においてその他支障になる、あるいは望ましくない現象として、背景信号による重畳がある。このようなものとしては、試料における個別レーザの反射、あるいはまた、検査対象として蛍光マーキングされた試料部分のスペクトル信号に重なり合って、そのため試料検査を困難にしている、それどころか一部にはそれを阻みさえする試料構成成分の広帯域自己蛍光信号が考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
マルチカラー・バンディング技術、ＦＩＳＨ技術または類似技術に基づき７種類までの色素でマーキングされる染色体の場合、個別マーキングの検出および分離には特別な要求が課される。そのような試料については、現状技術では項目ＡおよびＢで列挙したすべての方法で検査することができる。
【００３１】
これらの方法の欠点は次の通りである：Ｂ１の色素副成分および放出フィルタの利用による蛍光放出のスペクトル分離の場合では、色素数が増えるに従って放出スペクトルの重畳度が増大する。それにより漏話が発生する。したがって、検出チャネルにおける色素放出の明確な分類は不可能である。
【００３２】
方法Ａ３（マルチトラッキング）では、励起スペクトルが十分に相互区別される場合にのみ問題が解消される。しかし、複数色素使用の場合ではこれは実現されない。
【００３３】
方法Ａ１（スペクトル分散素子と単色検出器との組み合せ）および方法Ａ２（干渉分光法）もそれら自体では同様に、オーバラップする放出スペクトルの問題を解決することはできない。しかし、それらは試料点のスペクトル情報の捕捉には適している。
【００３４】
方法Ａ１やＡ２とオーバラップスペクトル成分分解のための数学的アルゴリズムの組み合せは、原則としては上記問題の解消に適している（Ｓｃｈ&auml;ｆｅｒの出願？ＡＳＩ出願）。両方法の欠点は、下記発明に比べて効率の低い点にある。方法Ａ１では各検出時にはそれぞれ狭いスペクトル帯域しか検出されない。
【００３５】
その場合ではスペクトルの捕捉には連続する複数の測定が必要である。それによって、測定の信号対雑音比が低下する。さらには、励起光による試料の多重照明により蛍光色素および試料自体が（例えば、光毒性過程により）損傷される。
【００３６】
干渉法（Ａ２）の場合、理論的見解によれば検出効率は５０％に低下する（定説引用！）。生のデータからスペクトルを得るには、この場合フーリエ変換が必要である。典型例ではデータはデジタルフーリエ変換（ＤＦＴ）に、あるいはデータ点が２の冪乗の場合には高速フーリエ変換（ＦＦＴ）にかけられる。この計算には少なからぬ計算コストが必要である。
【発明の効果】
【００３７】
本発明に基づく方法の背景には、スペクトル分離による蛍光検出がある。その場合では放出光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でメインカラースプリッタ（Ｍａｉｎ  Ｄｉｃｈｒｏｉｃ  Ｂｅａｍ  Ｓｐｌｉｔｔｅｒ；ＭＤＢ）、あるいはＤＥ１９８５９３１４Ａ１又はＤＥ１９８４２２８８に基づくＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分離するための素子によって、励起光から分割される。透過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともできる。
【００３８】
それに続いて配置されている検出ユニットの構成図を図４に示してある。試料から出た光は、共焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出の場合には絞りは不要である。この場合、光は角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。
【００３９】
角分散素子としては、プリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像される。つまり、このライン検出器ＤＥは波長別に放射信号を測定し、これを電気信号ＥＳへ変換する。加えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型フィルタを直列接続することもできる。
【００４０】
様々なバリエーションが図５に描かれている（図５ではフィルタハンドルおよび絞りが装着されている）。図４のブロック接続図で示した検出ユニットを光学的経路として用いた場合の考え得る実施態様を図５に示している。
本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通され集束する。ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の結像鏡Ｓ２は蛍光をコリメートする。
【００４１】
続いて光は線形格子Ｇ、たとえばミリメートル当たり線数６５１本を有する格子上に当たる。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に回折させる。第２の結像鏡Ｓ１はスペクトル分離された個々の波長成分を、ライン検出器ＤＥの対応チャネル上へ集束させる。
【００４２】
例えば、浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネル型で高感度を有する。上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置ではライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるので、光学的分解能は約１０ｎｍとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
したがって、この装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、これを結像システムに使用するのは有利である。これは、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネルごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペクトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をＤＰだけねじることによっても行なえる。
【００４４】
上記の実施態様では、検出器ＤＥの各個別チャネルが検出する放出スペクトル幅は約１０ｎｍの帯域である。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録される。
【００４５】
図６には検出器ＤＥの個別チャネルに対する読出し装置が図式化されている。その場合、多重チャネルＰＭＴ（検出器ＤＥ）の陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続）によって電圧に変換され増幅される。電圧は、信号を一定時間（例えば画素上滞留時間）の間積分する積分器Ｉに供給される。
【００４６】
迅速に値を求めるため、積分器Ｉの後に、簡易な比較器として、スイッチング閾値を越えたときにデジタル出力信号を発する比較器Ｋを、またはウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあるときに、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置させることができる。比較器もしくはウィンドウ比較器の配置は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考え得る。
【００４７】
増幅器モードでの配置の場合、比較器Ｋは然るべき基準に適合させて設置する。比較器Ｋの出力は直接アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッチ・レジスタＳＲの制御信号として用いられるか、またはアクティブなチャネルを個別選択するために（オフライン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュータに伝えられる。スイッチ・レジスタＳＲの出力信号は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器Ａ１へ直接導かれる。
【００４８】
ＡＤ変換された値、即ち試料の各画像点で測定されたスペクトル分解蛍光信号は、データ加工のために適当なデータ伝送装置を通じてコンピュータ（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。続いて、走査モード如何では、スペクトル分解による個々の測定画像点から、付属座標ｘ、ｙ、ｚ、時間及び寿命を用いたラムダスタック（検出光線の分散、分割機能を持つ検出チャネルにより測定し、少なくとも一つの付属座標、すなわち像点［座標ｘ、ｙ］及び／又は測定時間ｔ）によって分類の上、記憶素子へ保存した画像点毎のスペクトル分布）が形成される。但し、Ｘ及びＹはＳＣによって走査する。Ｚは、例えばプレパラートを光学軸に沿って移動させることによって実現する。時間：種々の時間にデータ記録を行う。寿命：データ記録は蛍光寿命の間に時間分割して行う。
【００４９】
蛍光測定の場合では妨害信号の回避のため、試料から散乱した励起光を抑制することや、あるいは少なくともそれが放射最大値以下か同程度になるまで弱めることは有効である。それには、上記の付属光線フィルタ又は光学強度を弱めるために最適化された然るべきメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）が使用できる。
【００５０】
それに代わり、ＤＥ１９８５９３１４Ａ１またはＤＥ１９８４２２８８Ａ１に記述されているようなＡＯＴＦをメインカラースプリッタとして使用することもできる。励起レーザ光線のスペクトル幅は個別チャネルで検出される帯域幅よりはるかに小さいので、後方散乱又は反射した励起光線については、図６に描かれたＳＲにより対応の個別チャネルを特定して遮断することもできる。
【００５１】
励起波長が２つの検出チャネルに及ぶ場合、格子角度を捻るか、走査検出器を移動させるか又は図５のＳ１又はＳ２を傾斜させることにより、励起光線が一つの検出チャネルだけに入るように励起光線を移動させることができる。
【００５２】
上記の両装置構成では、個別チャネルの検出には主として積分器接続装置を使用した。
それにより、個別チャネル内の光子の計数も制限なく行える。計数された光子は、続いて加算することができる。その場合、検出器としては主にＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）が使用されよう。
【実施例１】
【００５３】
以下では試料情報、即ちラムダスタックの様々な表示法について述べる。
上記方法で記録されたラムダスタックにより、隣接する非常に狭い波長領域からの蛍光強度の値を含んだｘ−ｙ画像の積層が得られる。
このラムダスタックの記録とｚ積層又は／及び時間列とを組合せば複雑なデータが得られる。
【００５４】
これらのデータの処理は以下のように様々な方法で行われる：
ａ）ラムダ最大値の投影
ここではラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それには、各画素のｘ、ｙポジション毎にその波長領域について、投影画像の当該画素強度を定義付けする強度最大値を求める。
【００５５】
ｂ）コード化ラムダの投影
この場合もａ）と同様に投影されたラムダ最大値を算出し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。
【００５６】
ｃ）簡易ラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察
ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部はシリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度が記録されている領域の平均波長を付記表示することもできる。
【００５７】
ｄ）より複雑なラムダスタック表示画面の観察
ｘｙラムダスタックをｚ又は／及び時間の関数で記録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でｚ平面又は時点を表示させるにはスライダを使用することができる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列に、時間又はｚ平面の異なる画像を縦列に表示することにより、記録されたｘｙ画像をすべて同時に表示することができる。次の観察画面間で選択することができる：ｘｙ−λ、ｘｙ−ｚ、ｘｙ−ｔ、ｘｙ−λ−ｚ、ｘｙ−λ−ｔ、ｘｙ−ｚ−ｔ
尚、挙げていない次元はスライダによって開けることができる。
ラムダ最大値又はコード化ラムダの投影と横列及び縦列の表示画面観察との組合せにより、ｘｙ−ｚ−ｔ−λ情報の同時表示が可能になる。
【００５８】
ｅ）ラムダスタックの直交切断
これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によって切断され、生じた切断像がλ平面の横（ｙ切断面）及びλ平面の上（ｘ切断面）に投影される。擬似／真正色のコード化は自由選択により実施できる。この場合各波長領域に対応のスペクトル色素があてがわれる。画像内の個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作られる。
【００５９】
ＲＯＩを通じての参照スペクトルの定義付け
参照スペクトルは、例えば純流動状態にある、あるいは試料条件下にある、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個別領域で試料構造に結合している、個々の色素の放出スペクトルである。参照スペクトル生成のための画像領域の選択は、対象領域（Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ＲＯＩ）の定義付けを通して以下の方法により行うことができる。
ラムダスタックは各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでいる。
【００６０】
図７ａは例えば、様々に着色された試料領域を表わす、ＬＳＭ画像内に於けるそれぞれのＲＯＩ（ＲＯＩ１〜４）の分布状態を図示したものである。図７ｂには放出スペクトル１〜４の典型例がそれぞれ対応の励起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。
【００６１】
ＲＯＩに対する調整についてはオペレータは例えば次のように行なうことができる：個別ＲＯＩ内の色素励起に要するすべての、又は殆どの励起光線を使用してラムダスタックを記録し、それに基づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル枠を設けることが可能である（図６に表示されている通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４及びＬ４〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で様々な色素が強力に重なり合っているので、それらの信号の同時合算も行なわれる。これらの総合チャネルは、続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分解され、相互に重畳表示される。
【００６２】
画像チャネルに於ける様々な局部的色素混合により、オペレータ又は自動模様識別器はそれぞれのＲＯＩの位置設定が可能になる。
様々なＲＯＩに対する第２調整法では蛍光重心（ＤＥ１００３３１８０Ａ１）の測定が行われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。
したがって、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によって区別し、明確に分離することができる。
【００６３】
任意に選択した試料箇所のスペクトル像を明確化するために、オペレータはＲＯＩ関数を使用することができる（ＲＯＩ：対象領域、図８参照）。その場合、図２で記録された試料領域（図８ＲＯＩ１及びＲＯＩ２）が描画用具３（例えば、多角形、楕円形又は閉じた弧形）によってマーキングされ、当該スペクトル特性がラムダスタックの各λ平面毎にＲＯＩに含まれるｘ−ｙ画素の平均値に基づきグラフ表示される（グラフ１）。
【００６４】
原則的には、選択した様々な試料箇所の複数スペクトル像を共通の、又は別々のグラフ１に同時に描出することができる。
視覚的に具象化されたスペクトル像１により、選択試料箇所に於ける蛍光放射線のスペクトル分布が解明される。
【００６５】
様々なＲＯＩの複数スペクトル像を描出することによって、例えば使用色素の放射スペクトルが大きく重なり合っているかどうかを究明することができる。
様々なＲＯＩのスペクトル像は、図９に示されているように、カラーコード化された多重チャネル画像（「チャネル別抽出」用操作素子、図８Ｎｏ．４）の生成に利用できる。そのような多重チャネル画像（図９ｂ）の生成では、スペクトル像から波長領域を選択し（図９ａ：ＲＯＩ１〜５）、例えば、当該波長領域に於ける各画像点の総和又は平均値から当該平面に於けるラムダスタックの強度レベルを求めることができる。但しここでは、各画像チャネルは１色素を表わしている（チャネル１〜チャネル５）。
【００６６】
この操作は、加えて個別チャネルの電子総和（図６参照）を求めるのにも利用できる（「ハードウェアへの抽出」、図８Ｎｏ．６）。続いて、然るべき調整のなされた多重チャネル画像を直接走査することができる。
【００６７】
後に再利用する時のために、個別ＲＯＩの、即ち特殊環境下での個別色素のスペクトル像をスペクトルデータバンク（図８Ｎｏ．７）に保存することができる。その場合、グラフデータに加えて、ラムダスタックの記録に必要な特殊パラメータとしての使用レーザ線、強度、フィルタ構成（ＭＤＢ、ＮＦＴ、ＥＦ）、検出器の設定（増幅度、積分時間、ピンホールの位置及び直径）及び被検プレパラートの周辺条件／調製に関する付記事項も保存可能である。
【００６８】
ラムダスタックの一定時間に亘る記録では、様々な時点でのスペクトル像を求め、シリーズデータとしてまとめておくことができる。続いて、これらのデータを、例えば図１０のように３次元表示により明確化し、それより各ＲＯＩに於けるスペクトル像の経時変化を求めることができる。このグラフはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギ伝達）又はＦＲＡＰ（フォトブリーチング後の蛍光回収）など２種又はそれ以上の蛍光色素による検査の結果評価にも併用でき有用である（図１０参照）。
【００６９】
そこでは様々な時点に於ける個別チャネルのスペクトルが描かれている。この場合の各部分図は、例えば１０ｎｍの波長領域を表わしている。
【００７０】
次に、分析用アルゴリズム、例えば試料から放射された総蛍光信号に対する個別色素の割合を選択的に表示するためのアルゴリズムについて記述する。
分析は定量的又は定性的に行うことができる。定量分析では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対する各個別色素の割合（即ち濃度）を計算する。例えば、成分分解分析のための一次関数式（文献：Ｌａｎｓｆｏｒｄその他著“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ”（「バイオメディカル光学ジャーナル」）第６巻（第３号）３１１〜３１８ページ、２００１年７月刊）が使用される。
【００７１】
分析にはいわゆる参照スペクトルが必要である。これは個別色素の蛍光スペクトルを表わすものである。結果の精度は参照スペクトルの精度に決定的な影響を受ける。従って、本発明に基づく方法では参照スペクトルの記録はプレパラートの検査中に同時に行う（下記参照）。
【００７２】
各色素がそれぞれの割合で各画像チャネルに組み入れられる。その場合、各画像チャネルには特定色素が一つずつ割当てられる。色素の明度は組込割合によって決まってくる。続いて、個別画像チャネルを１画像にまとめ重ね合わせて表示することができる。そのようにして生じるのがカラーコード化された画像である（前出コード化ラムダ参照）。
【００７３】
定性分析では分類を行う。即ち、各画像点にそれぞれ、試料から放射された総蛍光信号に対して最大の割合を占める色素だけを割当てる。その割当ては、やはり１画像内の様々な画像チャネルに対して行う。その場合、各画像チャネルに特定色素を一つずつ割当てることができる。それには、例えば主要成分分析（ＰＣＡ／文献：Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著“Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”（「主要成分分析」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社／ニューヨーク、１９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種のアルゴリズムによっていわゆる画像のマスキング（色素マスク）が得られる。その場合、同色領域には同一色素が存在する。
【実施例２】
【００７４】
以下では、色素蛍光分離法の作業過程を説明する。
選択されたＲＯＩのスペクトル像がそれぞれ、使用された試料内色素のまさに１色素の放射信号（参照信号）だけを表わしている場合では、放射信号の定量分析（例えばデジタル式成分分解、図（図５））にこの方法を使用すれば非常に有利になる（図１２ａ）。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタック及びｎ個の選択試料箇所（ＲＯＩ）のスペクトル像である。尚、ｎは試料に使用した色素数である。定量分析（例えば、成分分解）の結果は、それぞれ１色素の放射信号情報しか含まないｎ個の個別チャネルからの画像である。
【００７５】
放射信号の定量分析（例えば、デジタル式成分分解）のための別な作業方法では、入力データとしてラムダスタック及びスペクトルデータバンクに予め保存されている（図１２ｂ）対応の参照スペクトルが使用される。この参照スペクトルは、試料（又は特定領域）にそれぞれまさに１蛍光色素だけでマーキングした実験（較正測定）の結果から取り出すことができる。この作業法は例えば、本来の実験では色素分布が圧倒的に局所に限定されていて、従ってどの色素についても、他からの放射によるスペクトル漏話のない純粋な放射信号を持った試料箇所が見出せない、即ちＲＯＩの書き込みができないという場合に必要である。
【００７６】
加えて、オペレータはラムダスタックの記録前にデータバンクから参照スペクトルを選択することもでき、その捕捉の間にラムダスタックの定量分析（例えば、デジタル式成分分解）を即時実施することができる。結果としてｎチャネルの画像がスクリーン上に表示される。この場合、ラムダスタック・データの集約的中間保存は省略できる。
【００７７】
図１１に図式化した別な方法では、定量分析されたデータファイル（カラーコード化された画像）及び色素数に相当する参照スペクトルがラムダスタックに代わるデータ媒体に保存される。その長所は、データファイルの規模のものが信号情報の目立った損失もなく保存できることである。
【００７８】
例えば、ラムダスタックが３２の個別チャネルにより５１２×５１２の画素点及び８ビットで検出される場合、画像スタックの大きさは約１６メガバイトである。カラーコード化された画像の保存によればデータファイルの大きさは１／３２に縮小し、参照スペクトルを含めて約０．５メガバイトとなる。参照スペクトル内のデータポイントの数は色素数に３２を掛けた値である。
【００７９】
次に、保存データ（参照スペクトル）とカラーコード化した画像からコンピュータで改めてラムダスタックを算出することができる。この計算は、最も簡単な例では参照スペクトルとカラーコード化画像のそれぞれの画像チャネルとを掛け合わせることによって行う。データ削減は、特にいわゆる時系列記録の場合、正確には３次元画像情報による時系列記録の場合に必要である。
【００８０】
その経過図式が図１２ｃに描かれている別な方法では、ラムダスタックからスタートして第１ステップでは定性分析が行われる。この分析によって、一つには、プレパラート内で同一色素が空間分布している領域を探し出すことができる。また一つには、続く定量分析に必要な参照スペクトルをオペレータの操作なしに自動的に生成させることができる。例えばＰＣＡなどの定性分析には、ラムダスタック以外に入力パラメータを追加する必要はない。そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
【００８１】
図１２Ｄに基づく別な方法では、ラムダスタックについて制限的な定性分析が行われる。制限的な定性分析では、オペレータが予め定義付けした、例えば色素データバンクに保存されているスペクトルしか対象にできない。
【００８２】
アルゴリズムは予備的に定義付けしたこれらの色素スペクトルから、スペクトル分解により測定された蛍光信号に最も適合している目的物（即ち色素）を探し出し、そのようにして参照スペクトルを改めて定義付けする。そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
【００８３】
上記方法の別な適用例として、それぞれの検査において対象から外れた、又は分析の支障になる信号の分離に使用されることがある。そのような可能性のあるのは、例えば背景光、自己蛍光、後方散乱励起光又は室内光の場合である。まずは、それ以上着色されない対照光線（自己蛍光、後方散乱励起光）の中で、あるいはプレパラート不在の光線（背景光、室内光）下で、この信号のスペクトル分布を求めれば、そうして得られたスペクトルも検査対象色素の参照スペクトルと同様、一次関数的成分分解分析に加えることができる（図１２及び１３）。それらは成分分解後に別々の画像チャネルに割り振られ、検査対象信号から分離されるので、検査対象信号は別途観察することができる。
【００８４】
概念の概説：
λスタック
検出チャネルで検出した光線を分散分割下で測定し、少なくとも１つの補助的（画像点）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時間ｔへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペクトル分布
【００８５】
定量分析
試料からの総信号（例えば、蛍光信号）に対する各スペクトル像の持分（割合）を画像点毎に計算する（成分分解法）。この計算は、個々のスペクトル発光体（例えば、色素）のスペクトルを特徴付け、画像を生成する（ＲＯＩ）データバンクに保存されている、又は定性分析（ＰＣＡ）により生成される参照スペクトルによって行われる。
【００８６】
画像チャネル：
試料の画像表示に於いて色をそれぞれの選択スペクトル領域に振り分ける（擬似色表示）。その場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チャネルで測定した色強度は、色素／スペクトル特性の割合に一致している。
試料領域に複数のスペクトル像／色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカラーコード化画像（配合画像）が生成される。
【００８７】
定性分析：
試料からの総信号に対して最大の関与割合を持つスペクトル像／色素を各画像点に振り当てる。
【００８８】
色素マスク：
異なった箇所のスペクトル像／色素を別々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にする。
【００８９】
ＲＯＩ：
オペレータによって選択、マーキングされた領域。その場合、同一のスペクトル像／色素領域は定性分析により自動的に検索、マーキングできる。
【００９０】
多重マーキングされた対象物のスペクトル像同定における上記検出法の適用
１）試料の調製
第１ステップでは、検査対象試料をその固有特性に基づき複数の色素でマーキングする。試料は、例えば、ＦＩＳＨ（本来の状態でのハイブリッド蛍光性）技術によって着色した染色体の場合もあり得る。細胞または組織も同様に蛍光技術により着色することができる（例えば、免疫細胞学および免疫組織化学の観点から着色）。この着色技術により、生物学上重要な試料情報がコード化される。
【００９１】
２）試料情報の内容
検出システムの観点から最も簡易な例は、１次元空間の試料である（例えば、細胞流量計）。その場合、試料内に含まれる情報は、異なった色素の配合比率だけでコード化される（図１４）。図の着色では構造的特徴Ｓ１、Ｓ２およびＳ３が色素Ａ、ＢおよびＣでマーキングされている。色素間の区別は、それぞれの特徴的な吸収スペクトルまたは放出スペクトルを手掛かりに可能である。したがって、スペクトル（スペクトル像）の同定から、特定の構造的特徴の存在が推察できる。
【００９２】
検査対象試料は、上記構造的特徴の発現如何で区別される。試料の種属は、発現した構造的特徴の組み合せ如何に応じて定義付けすることができる。個々の試料種属は、マーキングの組み合せからスペクトル分類によりコード化される。
【００９３】
検出用として、２次元または３次元の位置分解を可能にするシステムを使用すれば、検出可能な情報量が相当増大する。異なった試料スポットではそれぞれ構造的特徴が現われることがあり、それによって種属数が増える可能性がある。図（１５）は、３種類の構造がマーキングされた２次元、３次元の試料を示したものである。簡易化のため、そこではマーキングだけが示されていて、構造自体は描かれていない。
【００９４】
試料の種属は、様々に組み合わされた構造的特徴の２次元、３次元配置によってのみ定義付け可能である。
【００９５】
異なったマーキングが異なった強度（試料平面上の構造濃度）で現われ得ることを考慮すれば、分類に利用できるまた別なパラメータが現われる。
【００９６】
３）検出および分類
ここでは試料を７ステップで検査および評価するのが有利である。
ステップ１：ラムダスタックの記録
試料を上記（指摘）の検出器によって検査する。
その場合、スペクトル分離された個々の測定画像点よりラムダスタック、すなわち、少なくとも１つの補助的座標（画像点の座標ｘ、ｙおよび／またはＺ、および／または測定時間ｔ）への組込のもとで記憶素子に保存された試料点毎のスペクトル分布、が得られる。
【００９７】
ステップ２
使用色素参照スペクトルの検査条件下での捕捉
参照スペクトルとは、例えば検査条件下での、すなわち溶剤に溶かされた、または組織に結合した個別色素の放出スペクトルである。それはラムダスタックを手掛かりに定義付けされる。すなわちそれは、少なくとも１つの補助的座標（画像点の座標ｘ、ｙおよび／またはＺ、および／または測定時間ｔ）への組込のもとで記憶素子に保存された試料点毎のスペクトル分布である。
【００９８】
これには、大別して３つの方法が使用できる。１つには、それぞれ１色素だけのマーキングにより試料の参照スペクトルを得ることができる。その場合各試料は１スペクトルだけを提供する。そのようにして得たスペクトルは後の使用のために参照スペクトルデータバンクに保存することが可能である。この方法は特に、細胞流量測定、レーザ走査顕微鏡法、内部全反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦ）および近視野顕微鏡法に適用することができる。
【００９９】
また１つには、それぞれ１色素だけでマーキングされた試料領域の特定ができるのであれば、参照スペクトルを得るに当り、多重マーキングされた（参照）試料を使用することも可能である。
【０１００】
参照スペクトル生成のためのそのような領域の選択は、（上述した）観察対象領域の定義付けを通して行うことができる。そのような領域の定義付けは、２次元または３次元対象物の自動検知のためのアルゴリズムによっても行なうことができる。このようなアプローチ方法は、位置分解された試料情報を捕捉するシステムに適用することができる。それに属するものとして、例えばレーザ走査顕微鏡法、内部全反射蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦ）および近視野顕微鏡法が数え上げられる。
【０１０１】
参照スペクトルの生成における第３の可能性は成分分析の原理（ＰＣＡ）である。この場合では、多重マーキングされた（参照）試料のラムダスタックが上記の検出器によって記録される。このデータに対しＰＣＡを適用することによって参照スペクトルが得られる。
【０１０２】
ステップ３
対象物の検知（図２０Ａ）
試料の検査対象要素（例えば腫瘍細胞などの細胞、細胞構成成分、図１６Ａに図示されているような染色体）の選択における分析方法（バイナリ化、セグメント化）の適用
着色マーキングされた丸い腫瘍細胞は、例えばその形態を手掛かりに選択される。
【０１０３】
多次元対象物を検知すべき場合では、システムへの投影は次元を下げて行わねばならないことがある。例えば、細胞核内に３次元の広がりを持つクロモソームＣＲ３Ｄは、まず最初全体に繋がりのある対象物として定義付けし、続いてより詳しい分析のため２次元画像へ変換投影することができる（図１６Ｂ）。
【０１０４】
図１６に描かれた三角、円、四角の各種幾何学形態は各種マーカに対応している。
ステップ４
成分分解（図ＳＯＢ、Ｃ）
当ステップの目的は、多重マーキングした試料からの多重チャネル画像の生成である。その場合、当方法により、これら色素の全放出信号を擬似色チャネルに正確に振分け得ることが極めて重要である。なお、放出信号は強くオーバラップする可能性がある。多重チャネル画像の生成には２つの方法を適用することができる：
【０１０５】
１．）検査対象の試料内に、それぞれ１色素だけでマーキングされた領域Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３（図１７）が存在する場合、参照スペクトル（上記参照）の生成目的に試料自体を使用することができる。そのようにして定義付けられた参照スペクトルをベースに、線形成分分解（文献：Ｌａｎｓｆｏｒｄ他；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ第６巻（第３号）、３１１〜３１８ページ（２００１年７月）を試料のラムダスタックに適用することにより多重チャネル画像を生成することができる。
【０１０６】
２．）試料内において、それぞれ１色素だけでマーキングされた領域が定義付けできない場合（図１８）、参照スペクトルの生成には、それぞれ１色素だけでマーキングされた参照試料を使用することができる。そのようにして定義付けした参照スペクトルは、上記のとおり、スペクトルの参照データバンクに保存され、試料データ（ラムダスタック）の線形成分分解に使用される。結果として、擬似色のコード化された多重チャネル画像が得られる。
【０１０７】
３．）妨害作用をする背景信号（例えば、自己蛍光および散乱光）も同様にスペクトル面の特徴付けが可能である。すなわち、背景信号にも参照スペクトルが割り当てられる。線形成分分解の場合、背景信号の参照スペクトルを考慮に入れれば、１つのチャネルが背景信号を表わす、擬似色のコード化された多重チャネル画像が得られる。背景チャネルのフェードアウトにより多重チャネル画像を修正することができる。
それに代わり、背景信号から試料について追加情報を得ることもできる。
【０１０８】
４．）代替法
線形成分分解には、ラムダスタックからの多重チャネル画像を成分分析原理（ＰＣＡ）によって得ることもできる。
そのようにして得られた多重チャネル擬似色画像は、試料の上記情報をすべて有している。それに基づき、試料内の構造的特徴分布を推論することが可能である。
【０１０９】
ステップ５
対象物の分析（図１６および２０Ｃ）
ここでは、予め定義付けされた対象物について、その構造的特徴の分布が検査される。そのため、対象物の様々な部分で擬似色チャネル（ステップ４参照）の強度が測定される。その位置は、所期通りの内容を持つ試料情報が得られるように選択される。
【０１１０】
ステップ６
分類
分類の目的は、試料をその構造的特徴分布に基づいて区別し、各種種属に組み込むことである。
種属は、試料の構造的特徴における特定組み合せの存在により定義付けされる。
分類ではスペクトル情報の補足のため、少なくとも１つの追加座標（画像点［座標ｘ、ｙ］および／またはＺおよび／または時間ｔ）が使用される。
【０１１１】
種属の定義付けには、例えば散布グラフが使用できる。図１９には２チャネルの蛍光画像が描かれている。両軸は画像チャネルの蛍光強度を表わしている。画像ピクセルが散布グラフの座標に割り当てられる頻度はカラーコードで表示することができる（ブルー：ピクセル数小、レッド：ピクセル数大）。
【０１１２】
以下では、二重マーキングされた蛍光試料を手掛かりに、散布グラフの利用により如何にして分類できるかが示されている。まず最初に、それぞれ種属の要素しか含まない参照試料を検査する。当試料の２チャネル画像から、計算により２次元の散布グラフを作成する。各次元は色素の蛍光強度を表わしている。
【０１１３】
散布グラフでは、観察対象の窓（Ｆｆ）を通してＦ１およびＦ２タイプの強度領域が定義付けできる。Ｆ１：色素Ａの強度：３０〜５０％、色素Ｂの強度：０〜１０％、Ｆ２：色素Ａの強度：５０〜１００％、色素Ｂの強度：１０〜１００％、など。その場合、試料の種属別特性を表わす色素または色素配合の定義付けがなされる。
【０１１４】
次のステップでは検査対象試料の２チャネル蛍光画像を記録する。それらの画像から、計算により散布グラフを作成する。このグラフの評価は、予め定義付けした、参照散布グラフの色素を基に行う。
【０１１５】
上記の操作方法は２次元以上の多次元に拡大すると有利である。それらの次元では試料のスペクトル特性、立体特性または動力学特性を表わすことができる。
【０１１６】
当分類は、画像形成および分析機能を持つ顕微鏡検査システムによって捕捉されたデータの分析に使用することができる。顕微鏡システムとは、生物学上プレパラートの３次元検査のためのレーザ走査型顕微鏡、表面の高度解像検査のための走査型近視野顕微鏡および分子濃度、拡散特性の定量測定のための蛍光相関顕微鏡などの画像形成システムである。
【０１１７】
当分類はさらに、作用物質のスクリーニングシステムおよび細胞流量測定システムなど、その他蛍光検出に基づく方法に適用することができる。細胞流量測定法では、試料（例えば、人間の細胞）を分類した後にさらに物理的に相互分離させることもできる。
もちろん、試料の分類が必要ない課題もあり得る。
【０１１８】
ステップ７
評価
当分類により、試料特性または試料特性の組み合せを具現する種属を求めることができる。
評価では場合により様々な課題が出される。例えば、試料が既知の種属に分類可能かどうかが問題になることがある。試料が種属分類できるのであれば、通例、１種属に組入れられる試料数はどの程度かが関心事になる。この情報は様々な方法で描くことができる。
それには、主としてヒストグラムが使用される（図２０Ｄ参照）。
当ヒストグラムには、種属によって異なる組込頻度が描かれている。
図２０には、そのほか、上記操作ステップの要約説明がなされている。
【０１１９】
本発明は、特に、その空間的広がりおよびスペクトル像を基にした（主として）３次元対象物の同定に関する。
空間的広がりは、例えば検出チャネルからのコントラスト分析による画像加工を通じて求めることができる。
【０１２０】
同時に、選択検出装置を通じて各画像点についてのラムダスタックが得られる。
この場合、滞留時間に依存する画像点当りの強度分布は選択的に、すなわち、選択された波長または波長領域毎に求めることができる。
【０１２１】
オーバラップした蛍光団の信号は、参照スペクトルを手掛かりとした「成分分解」によって分離することができる。
【０１２２】
光学装置および電子装置の優位性（データの平行等価性、干渉測定装置のようなフーリエ変換不要、迅速性）により、特に生体試料（細胞の成長）のスクリーニング、検査方法において、および例えば神経細胞の形態変更、イオン濃度の変化など迅速経過過程の観察において新たな品質が引き出される。
【０１２３】
特に腫瘍細胞はその形態で識別できるほか、スペクトルによる分類および蛍光特性の検査も可能である。
折れ曲がった染色体は、例えば検索および同定には有利であり、またスペクトル評価には伸ばすこともできる。
【０１２４】
この場合の検査対象試料は、ＦＩＳＨ技術（例えば、マルチカラーバンディング）の利用により着色された染色体のこともある。検査対象の細胞、組織または染色体は、免疫細胞学または免疫組織化学の観点から着色することができる。上記の方法は、医療診断および／または治療に、生体インジケータの使用による環境診断（例えば、水、土壌、空気）、腫瘍診断、骨髄細胞の診断、洗浄に、および細胞流動測定または光学近視野顕微鏡への適用に適している。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ａ）一光子吸収，ｂ）多光子吸収
【図２】共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）
【図３】ａ）色素の放射スペクトル
【図４】検出ユニットの実施例
【図５】検出ユニットの実施例のバリエーション
【図６】検出器ＤＥの個別チャネルに対する読出し装置の図式化
【図７】ａ）着色された試料領域図、ｂ）放出スペクトル１〜４の典型例
【図８】検出対象領域
【図９】スペクトル像
【図１０】スペクトル像の三次元表示
【図１１】スペクトル像の図式
【図１２】放射信号の定量分析
【図１３】一次関数的成分分解分析
【図１４】ラムダスタックの記録
【図１５】ラムダスタックの記録
【図１６】組織内の腫瘍細胞
【図１７】参照スペクトルの記録
【図１８】ラムダスタックの記録
【図１９】２チャンネルの蛍光画像
【図２０】色素でマーキングされた資料の構造的特徴
【符号の説明】
【０１２６】
ＨＢＯ        鏡筒レンズ
ＰＭＴ５      点像検出器
ＥＦ５        ダイクロイックフィルタ
ＭＤＢ        ダイクロイック・ビームスプリッタ
ＤＢＳ２      ダイクロイック・ビームスプリッタ
ＰＨ３        共焦点絞り
ＰＭＴ４      点像検出器
ＥＦ３        ダイクロイックフィルタ
Ａ            レーザ
ＰＯ          結像レンズ系
ＰＨ          絞り
ＤＩ          角分散素子
ＤＥ          ライン検出器
【図１】
2005526255.tif 000002
【図２】
2005526255.tif 000003
【図３】
2005526255.tif 000004
【図４】
2005526255.tif 000005
【図５】
2005526255.tif 000006
【図６】
2005526255.tif 000007
【図７】
2005526255.tif 000008
【図８】
2005526255.tif 000009
【図９】
2005526255.tif 000010
【図１０】
2005526255.tif 000011
【図１１】
2005526255.tif 000012
【図１２】
2005526255.tif 000013
【図１３】
2005526255.tif 000014
【図１４】
2005526255.tif 000015
【図１５】
2005526255.tif 000016
【図１６】
2005526255.tif 000017
【図１７】
2005526255.tif 000018
【図１８】
2005526255.tif 000019
【図１９】
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【図２０】
2005526255.tif 000021
【国際調査報告】
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