(57)【要約】ＮＭＲ分光法は、タンパク質の構造を決定するために、次第に使用されてきている。本発明の交差信号パターン検索マスクは、３Ｄ三重共鳴実験およびアミノ酸型特異的２Ｄスペクトルを連帯的に評価するために使用される。発明の交差信号パターン検索マスクは、パターン同定を用いて、１つのアミノ酸またはアミノ酸の群によって生じた全ての信号ピークが連帯的に検出および評価され得ることを可能にする。尚、上記アミノ酸の群の正確な配列は、これまでにタンパク質の配列から誘導されており、特定のパターン同定のための基礎を形成している。本発明は、タンパク質の磁気活性原子核への、様々なスペクトルに生じる信号ピークの完全自動帰属を可能にする。
2005502881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
交差信号パターン検索マスクのライブラリを備える、ｎアミノ酸を含むポリペプチド鎖について記録された一連のＮＮＲスペクトルを自動的に分析するための分析システムであって、交差信号パターン検索マスクは、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて交差信号パターン検索マスクのライブラリから分析に必要な交差信号パターン検索マスクを選択する手段によって、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号を特異的に検出するために提供され、パターン認識を用いて一次配列に含まれる各断片に対して関連交差信号パターン検索マスクを選択する上記手段は、パターン認識の結果に応じてＮＭＲ信号をポリペプチド鎖の様々なスピンシステムに帰属する手段によって、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて選択された交差信号パターン検索マスクの様々な結果を組み合わせ、一連のＮＭＲスペクトルと関連付ける、分析システム。
【請求項２】
調査されたポリペプチド鎖の断片は、それぞれ、２つまたは３つの特定の連続的に配列した（隣接した）アミノ酸を含んでいることを特徴とする、請求項１に記載の分析システム。
【請求項３】
一連のＮＭＲスペクトルは、主鎖の信号を分析するためのＮＭＲ実験、および側鎖の信号を分析するためのＮＭＲ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項４】
主鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、３Ｄ実験、特にＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＣＢＣＡＮＮＨ、ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＮＮＨ、ＨＡＨＢ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＨＢＮＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡの型の３Ｄ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項５】
側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＣ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹの型の実験を含んでいることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項６】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、アミノ酸型またはアミノ酸型の群に選択的であるアミノ酸型特異的２Ｄ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項７】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために必要なアミノ酸型特異的２Ｄ実験は、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて特定されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項８】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、２Ｄ実験と３Ｄ実験との組み合わせを含んでいることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項９】
化学シフトおよびカップリング定数を決定するために、まず初めに、ポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへＮＭＲ信号を帰属することによって、ＮＭＲスペクトルの評価が行われることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１０】
まず初めに、ポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへＮＭＲ信号を帰属することによって、化学シフトが照合され、その正確性について検査されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１１】
一連のＮＭＲスペクトルは、ＮＯＥＳＹ型のスペクトルを含んでおり、該ＮＯＥＳＹ型のスペクトルの評価は、特に、ポリペプチド鎖の様々な原子核の距離についての情報を提供することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１２】
ポリペプチド鎖の様々な原子核に対するＮＯＥＳＹ型のＮＭＲスペクトルの帰属は、原子核について決定された化学シフトを基に行われることを特徴とする、請求項１１に記載の分析システム。
【請求項１３】
ＮＭＲスペクトルの評価で得られた量は、構造演算プログラムにおける入力量となることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１４】
交差信号パターン検索マスクは、それぞれ、多数の所定の信号検索領域を含んでおり、信号検索領域の領域境界内にＮＭＲ信号が生じることによって、交差信号パターン検索マスクによって定義された信号パターンが存在する可能性が増加することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１５】
交差信号パターン検索マスクは、それぞれ、多数の所定の空領域を含んでおり、従って、空領域の領域境界内におけるＮＭＲ信号の欠損に起因して、交差信号パターン検索マスクによって定義された信号パターンが存在する可能性が増加することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１６】
交差信号パターン検索マスクの閾値および検索領域は、スペクトルにおけるＮＭＲ信号数の予測から始まり、反復によって決定されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１７】
交差信号パターン検索マスクは、記録された一連のＮＭＲスペクトルの様々なＮＭＲスペクトルを分析するための副検索マスクを多数含んでいることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の分析システム。
【請求項１８】
ａ）分析に必要な交差信号パターン検索マスクを、交差信号パターン検索マスクのライブラリから選択する工程であって、交差信号パターン検索マスクは、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号を特異的に検出するために提供され、必要な交差信号パターン検索マスクは、一次配列に含まれる断片に応じて選択される工程と、
ｂ）選択された様々な交差信号パターン検索マスクと一連のＮＭＲスペクトルとを関係付けることによってパターン認識を行う工程と、
ｃ）工程ｂ）で行ったパターン認識の結果に応じてポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへＮＭＲ信号を帰属する工程と、
によって特徴付けられる、ｎアミノ酸を含むポリペプチド鎖について記録された一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するためのプロセス。
【請求項１９】
調査されたポリペプチド鎖の断片は、２つまたは３つの特定の連続的に配列した（隣接した）アミノ酸を含んでいることを特徴とする、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
一連のＮＭＲスペクトルは、主鎖の信号を分析するためのＮＭＲ実験、および側鎖の信号を分析するためのＮＭＲ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
主鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、３Ｄ実験、特にＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＣＢＣＡＮＮＨ、ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＮＮＨ、ＨＡＨＢ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＨＢＮＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡの型の３Ｄ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２２】
側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＣ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹの型の実験を含んでいることを特徴とする、請求項１８〜２１のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２３】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、アミノ酸型またはアミノ酸型の群に選択的であるアミノ酸型特異的２Ｄ実験を含んでいることを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２４】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために必要なアミノ酸型特異的２Ｄ実験は、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて特定されることを特徴とする、請求項１８〜２３のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２５】
２Ｄ実験と３Ｄ実験との組み合わせが、主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されることを特徴とする、請求項１８〜２４のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２６】
化学シフトおよびカップリング定数を決定するためのＮＭＲスペクトルの評価は、まず初めにポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへＮＭＲ信号を帰属することによって行われることを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２７】
化学シフトの照合は、初めにポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへのＮＭＲ信号の帰属から行われ、そしてその正確性について検査されることを特徴とする、請求項１８〜２６のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２８】
一連のＮＭＲスペクトルは、ＮＯＥＳＹ型のスペクトルを含んでおり、ポリペプチド鎖の様々な核に対するＮＯＥＳＹ型のＮＭＲスペクトルの帰属は、初めに様々な原子核について決定された化学シフトから行うことことを特徴とする、請求項１８〜２７のいずれか１つに記載のプロセス。
【請求項２９】
ＮＭＲスペクトルの評価で得られた量は、構造演算プログラムにおける入力量として使用されることを特徴とする、請求項１８〜２８のいずれか１つに記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ｎアミノ酸を含むポリペプチド鎖を記録する一連のＮＮＲスペクトルを自動的に分析するための分析システム、および一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するための方法に関するものである。
【０００２】
ＮＭＲ分光法はそれ自体、近年、低分子量のタンパク質およびＤＮＡ断片の構造を解明するための方法として確立されてきた。ＮＭＲ分光法は、特に動力学的現象に関する溶液中の生物学的高分子の研究を可能にし、これによって、Ｘ線結晶学に対する補完的な方法に貢献している。
【０００３】
タンパク質のＮＭＲ分光学的研究は、当初、少数の例外を除いて、最大８０個のアミノ酸からなる比較的低分子量のタンパク質に限定されていた。なぜなら、大きなタンパク質において、２次元スペクトルの信号の重複によって範囲が制限されるからである。３次元および４次元のＮＭＲ技術（３Ｄ−ＮＭＲおよび４Ｄ−ＮＭＲ）の導入のみによって、この障害を克服することができた。現在のシステムは、２Ｈ、１３Ｃおよび１５Ｎを用いたタンパク質の標識と組み合わせて、最大５０ｋＤの分子量を研究することができる。さらに研究可能なタンパク質の大きさは、基本的に横緩和時間によって測定される。ここで、上記横緩和時間は分子量が大きい程短くなる。
【０００４】
多数の存在する多次元ＮＭＲ技術は、２つの異なる部分的工程について構造決定計画の範囲内に必要とされている。第一工程において、タンパク質の１Ｈ，１３Ｃおよび１５Ｎ信号の全てが帰属（ｚｕｇｅｏｒｄｎｅｔ）されなければならない。この帰属工程（ｚｕｏｒｄｎｕｎｇｓｓｃｈｒｉｔｔ）において、スペクトルの対応する信号が、タンパク質のこれらの磁気活性原子核に対して見出される。特別なパルス系列はこの帰属作業に有用である。このタンパク質構造決定計画に使用した様々な実験およびパルス系列の概要は、文献「３次元および４次元のＮＭＲ分光法を用いたタンパク質構造決定(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｅｅ−  ａｎｄ  Ｆｏｕｒ−  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ)」、Ｈ．Ｏｓｃｈｋｉｎａｔら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、１９９４年、３３、２７７−２９３頁に提供されている。
【０００５】
文献「ＭＵＳＩＣ、選択的パルス、および同調遅延：アミノ酸型選択的１Ｈ−１５Ｎとの相関性、第ＩＩ部(ＭＵＳＩＣ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｓｅ，  ａｎｄ  Ｔｕｎｅｄ  Ｄｅｌａｙｓ：  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｔｙｐｅ  −  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  １Ｈ−１５Ｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，  ＩＩ)」、Ｍ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、１４８、２００１年、６１−７２頁において、多数のアミノ酸型に特異的な１Ｈ／１５Ｎ実験が記載されており、側鎖位相幾何学(Ｓｅｉｔｅｎｋｅｔｔｅｎｔｏｐｏｌｏｇｉｅ)を用いた特定の型のアミノ酸（例えばセリン（Ｓｅｒ））または特定の群のアミノ酸（例えば、イソロイシン／バリン（Ｉｌｅ／Ｖａｌ））の信号が含まれている。
【０００６】
これらのアミノ酸型特異的２Ｄ実験を行うために必要なパルス系列は、主鎖の構造を決定するために使用される三重共鳴実験からの単純な方法で誘導される。
【０００７】
帰属（ｚｕｏｒｄｎｕｎｇ）が完了した後、タンパク質の構造パラメータは、他のＮＭＲ技術を用いて収集される。この第二工程は、第一工程で得られた帰属を基に行なわれる。例えば、様々な磁気活性原子核の間隔は、種々の多次元式ＮＯＥＳＹ実験を用いて測定される。このようにして得られた構造パラメータは、構造決定ソフトウェアパッケージにおける入力量となる。このような構造決定プログラムは、入力した構造情報に基づいてポリペプチドの３次元構造を産生する。
【０００８】
現在、半自動手順と、ほとんどの場合社内ソフトウェアとを用いて、様々なＮＭＲ研究グループでタンパク質構造を分析するための様々な工程が行なわれている。特に帰属プロセスを容易にするための多数の試みは、特に、いわゆる電子作図表（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｓｃｈｅｎ  Ｚｅｉｃｈｅｎｔｉｓｃｈｅｎ  ｇｅｆｕｅｈｒｔ）を生み出した。上記電子作図表において、スペクトルは、スクリーンに表示されており、プログラムにより提供される補助（例えば、自動ピーク採取（ｐｅａｋｐｉｃｋｉｎｇ）およびスペクトル重複の可能性）によって補佐されている。
【０００９】
ＮＭＲ信号を自動的に帰属するための多くのプロセスは、交差信号リストの使用に基づいており、上記交差信号リストを用いることで交差信号の周波数座標が得られる。これらの交差信号リストは、当該交差信号リストに含まれる周波数の比較を提供する組み合わせ手順の補助によって評価される。交差信号リストの補助によって帰属が行われる場合、多数の不都合が考えられる。従って、低い信号／ノイズ比または強いＴ１ノイズを有するスペクトルにおいて、交差信号リストへの望ましくないさらなるエントリーを生成し、組み合わせ手順の使用の成功を複雑化する人為的スペクトル（ｓｐｅｋｔｒａｌｅ  Ａｒｔｅｆａｋｔｅ）が生じる。スペクトルの交差信号が非常に近接している場合、個々の信号はもはや互いに分解されない。この場合、様々なエントリーが欠けてているか、不正確である、交差信号リストが入手される。
【００１０】
これらの理由のために、交差信号リストの使用が中止され、代わりに、代替の方法の補助によってＮＭＲスペクトルに含まれる信号パターンを検出する試みが行われてきた。このようなアプローチは、文献「パターン認識技術に基づく高分解能３次元タンパク質ＮＭＲスペクトルの自動帰属ツール（Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｄ．Ｃｒｏｆｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ、１０、１９９７年、２０７−２１９頁に記載されている。この文献は、特に、信号パターン認識ソフトウェアＣＡＴＣＨ２３について議論している。このソフトウェアは、ＮＭＲスペクトルを分析するための検索マスク（ｓｕｃｈｍａｓｋｅｎ）を使用し、検索マスクと組み合わせてパターン検索を行う。このような交差信号パターン検索マスクは、特定の主鎖断片または側鎖断片の予測される交差信号についての多数の検索領域にまで及ぶ。例えば、アミノ酸のスレオニンに起因した全ての交差信号は、交差信号パターン検索マスクを用いて検出される。交差信号パターン検索マスクが対応のピークを同定する場合、これらのピークとアミノ酸のスレオニンとの間で帰属が行われる。
【００１１】
しかし、しばしば、一方の交差信号と他方の分子構造との間で帰属が行われる可能性がる。この帰属の両義性（ｖｉｅｌｄｅｕｔｉｇｋｅｉｔ）のために、多くの場合、手動介入が必要とされる。公開版のソフトウェアＣＡＴＣＨ２３に定義された交差信号パターン検索マスクはまた、信号ピークの完全自動帰属に対して十分な安定性および安全性を提供しない。
【００１２】
従って、本発明の目的は、一連のＮＭＲスペクトルのＮＭＲ信号を自動的に帰属するための装置およびプロセスを提供することであり、様々な磁気活性原子核に対するＮＭＲ信号の信頼性のある非両義性帰属を可能にし、必要な手動介入の回数を低減する。
【００１３】
本発明の上記目的は、請求項１に記載の一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するための分析システム、および請求項１８に記載の一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するための工程によって達成される。
【００１４】
本発明の分析システムは、ｎアミノ酸を含むポリペプチド鎖ついて記録された一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するのに有用であり、交差信号パターン検索マスクのライブラリを含む。交差信号パターン検索マスクは、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号を特異的に検出するために提供される。この点について、アミノ酸の断片の交差信号、またはいくつかの連続して続くアミノ酸の断片の交差信号、あるいはポリペプチド鎖に連結した１つ以上のアミノ酸の交差信号の全てが検出される。従って、上記断片は、単独アミノ酸または連結アミノ酸の、結合した主鎖原子（β炭素原子を含み得る）または側鎖原子のみからなる。さらに、分析システムは、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて、分析に必要なライブラリから交差信号パターン検索マスクを選択するための手段を含む。この手段において、一次配列に含まれる各断片についての関連交差信号パターン検索マスクが選択される。また、分析システムは、ポリペプチド鎖の一次配列に対応して選択された交差信号パターン検索マスクの様々な結果と組み合わせ、一連のＮＭＲスペクトルの結果と関連付けるパターン認識の手段を含む。これに加えて、分析システムは、パターン認識の結果に対応したポリペプチド鎖の様々なスピンシステムに、ＮＭＲ信号を帰属するための手段を含む。
【００１５】
タンパク質について、一連のＮＭＲスペクトルは、主鎖の信号および側鎖の信号を帰属するための３Ｄ実験に加えて、アミノ酸型特異的２Ｄ実験をもまた含んで記録される場合、本発明の解決策は、特に、極めて信頼性のある帰属を可能にするものである。これらのアミノ酸型特異的ＮＭＲ実験は、１つ以上の型のアミノ酸の交差信号のみを含み、当該交差信号は、タンパク質の主鎖に存在する原子の信号間の相関性または側鎖の信号の相関性のいずれかを形成する。
【００１６】
本発明の交差信号パターン検索マスクは、特定のアミノ酸の型またはカップリングに属する断片の信号パターンが、アミノ酸型特異的ＮＭＲ実験と３Ｄ三重共鳴実験との併用によって認識されるように設計されている。従って、断片に含まれる特定のアミノ酸型の信号の認識が、タンパク質の主鎖の信号または側鎖の信号との２次元相関性の形態で、検索の最初に開始点として使用される場合、当該認識は特に成功する。
【００１７】
本発明の交差信号パターン検索マスクを用いて、上記の様式で、特にパターンの問い合わせが行われ、２つおよび３つのアミノ酸からなる特定の組み合わせ（例えば、バリンとスレオニンの組）から誘導された断片が探求される。このような組み合わせは、ポリペプチド鎖において１箇所または数箇所しか存在せず、該当する短い標的リスト（ｋｕｒｚｅ  Ｔｒｅｆｆｅｒｌｉｓｔｅ）を作成する。２つまたは３つのアミノ酸からなる群に特異的な交差信号パターン検索マスクの高い選択性は、多くの場合、ポリペプチド鎖の検出交差信号と関連断片との間の両義性帰属を可能にする。その結果、帰属の両義性が低減される。
【００１８】
一方の交差信号と他方の様々な検出された断片との間の帰属が、交差信号パターン検索マスクの補助によって行われる場合、これらの様々な部分帰属が、第二工程で組み合わせられる。様々な部分帰属を組み合わせることによって、ポリペプチド鎖の関連磁気活性原子核に対するスペクトルの信号全ての帰属が達成される。調査されたポリペプチド鎖の断片を検出するために、本発明の交差信号パターン検索マスクを使用することによって、その都度、評価され得る様々な断片の重複がそれぞれ得られる。重複領域の磁気活性原子核について、異なる交差信号パターン検索マスクを用いてその都度測定された化学シフトが同時に得られる。特にＨＮおよびＮの化学シフトを中心に、様々な部分帰属が、この境界条件の補助と組み合わせられる。総合的帰属を構成している、選択的検索から入手された部分帰属の組み合わせは、交差信号パターン検索マスクの重複のために、本発明の交差信号パターン検索マスクを用いて、従来技術よりも実質的に簡単で信頼性のある方法によって達成される。本発明の交差信号パターン検索マスクは、従来技術の単純交差信号パターン検索マスクと比較して、実際のピークの帰属およびそれに続く部分帰属の組み合わせの両方において利点を提供する。
【００１９】
全体的に、帰属の高い信頼性および優れた認識率は、本発明の交差パターン検索マスクの使用によって可能となり、当該検索マスクを用いて、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号が検出される。帰属の際に生じる両義性の回数が低減すると、帰属の過程における手動介入の回数が減る。この点に関して、本発明は、ＮＭＲ信号ピークの半自動帰属から完全自動帰属への移行における重要な工程を表す。一旦信頼性のある完全自動帰属が可能になると、タンパク質構造決定の処理能力が著しく向上する。また、このようにして得られた構造のデータの信頼性が得られる。
【００２０】
さらに、交差信号パターンを帰属するための分析ツールの巧妙で指導的なカプセル化が、本発明の交差信号パターン検索マスクの補助によって達成される。従って、帰属の結果もまた、より簡単に再現される。
【００２１】
調査されたポリペプチド鎖の断片はそれぞれ、２つまたは３つの特定の隣接して配列したアミノ酸を含んでいることが好ましい。２つ（または３つ）のアミノ酸からなる特定の断片は、本発明の交差信号パターン検索マスクを用いて、ＮＭＲ信号に基づいて非両義的に同定される。本発明の交差信号パターン検索マスクを用いて、上記の様式で、特にパターンの問い合わせが行われ、２つおよび３つのアミノ酸からなる特定の組み合わせ（例えば、バリンとスレオニンの組）から誘導された断片が探求される。このような組み合わせは、ポリペプチド鎖において１箇所または数箇所しか存在せず、該当する短い標的リストを生じる。２つまたは３つのアミノ酸からなる群に特異的な交差信号パターン検索マスクの高い選択性は、非常に多くの場合、ポリペプチド鎖の検出交差信号と関連断片との間の両義性帰属を可能にする。その結果、帰属の両義性が低減される。
【００２２】
一連のＮＭＲスペクトルは、主鎖の信号を分析するＮＭＲ実験および側鎖の信号を分析するＮＭＲ実験を含んでいることが好ましい。側鎖と主鎖との間のカップリングは、特にＣαの原子核およびＣβの原子核の化学シフトを介して達成される。主鎖の信号および側鎖の信号は、本発明の交差信号パターン検索マスクの補助を用いて連帯的に評価され、当該検索マスクは、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号を特異的に検出するために提供される。
【００２３】
主鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、３Ｄ実験、特にＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＣＢＣＡＮＮＨ、ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＮＮＨ、ＨＡＨＢ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＡＨＢＮＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡの型の３Ｄ実験を含んでいることが好ましい。上記の実験は、主鎖の磁気活性原子核の化学シフトが検出されることによる３Ｄ実験に関するものである。しかし、多数の利用可能な３Ｄ実験はまた、結果の多重確認を可能にする。
【００２４】
側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＣ（ＣＯ）ＮＨ−ＴＯＣＳＹの型の実験を含んでいることが好ましい。
【００２５】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、アミノ酸型またはアミノ酸型の群に選択的であるアミノ酸型特異的１Ｈ／１５Ｎ実験を含んでいることが好ましい。タンパク質について、一連のＮＭＲスペクトルは、主鎖構造を検出するための３Ｄ実験に加えて、アミノ酸型特異的２Ｄ実験をもまた含んで記録される。これらのアミノ酸型特異的ＮＭＲ実験は、１つ以上のアミノ酸型の交差信号のみを含み、当該交差信号は、タンパク質の主鎖に存在する原子の信号間の相関性または側鎖の信号の相関性のいずれかを表す。アミノ酸型特異的２Ｄ実験は、アミノ酸型の側鎖またはアミノ酸型の群の側鎖の選択的な励起を可能にする。続いて、磁性が、側鎖を介して主鎖の窒素原子およびアミドプロトンに移行する。特定のアミノ酸型またはアミノ酸型の群によって生じたＮＭＲ信号は、特定のアミノ酸型またはアミノ酸型の群についての一種の「フィンガープリント（Ｆｉｎｇｅｒａｂｄｒｕｃｋ）」を構成し、アミノ酸型特異的１Ｈ／１５Ｎ実験の補助を用いた非常に特異的な様式で検出される。その後、調査されたポリペプチド鎖の断片についてのＮＭＲ信号の問い合わせが、本発明の交差信号パターン検索マスクを用いた標的化様式で行われる。このようにして、帰属のより高い信頼性および優れた認識率が可能になる。
【００２６】
アミノ酸型特異的２Ｄ実験を実施するために必要なパルス系列は、特に主鎖構造を決定するために使用される三重共鳴実験による単純な方法で誘導される。
【００２７】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために必要なアミノ酸型特異的２Ｄ実験は、ポリペプチド鎖の一次配列に応じて特定されることが好ましい。この一次配列は事前に知られている。ＮＭＲ測定を行うために必要なタンパク質は、実際、対応するＤＮＡ配列の補助を用いた生物工学的方法によって生成される。ここで、例えば、アミノ酸のシステインが、ポリペプチド鎖の一次構造において存在しない場合、システインについてのアミノ酸型特異的２Ｄ実験を行う必要性もない。次いで、ＮＭＲ実験についての必要最小限の一連のデータが、一次構造に基づいて特定される。
【００２８】
主鎖の信号および側鎖の信号を分析するために使用されるＮＭＲ実験は、２Ｄ実験と３Ｄ実験との組み合わせを含んでいることが好ましい。交差信号パターン検索マスクの補助を用いたＮＭＲ信号の評価と組み合わせた、主鎖実験とアミノ酸型特異的２Ｄ実験との併用は、ＮＭＲスペクトルの自動評価における著しい性能の向上を導く。本発明の交差信号パターン検索マスクは、特定のアミノ酸型またはそのカップリングに属する断片の信号パターンが、アミノ酸型特異的ＮＭＲ実験と３Ｄ三重共鳴実験の併用によって認識されるように設計されている。帰属の際に生じる両義性の回数が、特にアミノ酸型特異的２Ｄ実験の補助によって低減されると、帰属の過程における手動介入の回数が減る。従って、本発明は、ＮＭＲ信号ピークの半自動評価から完全自動評価への移行における重要な工程を構成する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、まず初めにポリペプチド鎖の様々なスピンシステムへＮＭＲ信号を帰属することによって、化学シフトを組み合わせ、その正確性について検査する。そして、アミノ酸の様々な磁気活性原子核について決定された化学シフトは、ＮＭＲ信号の帰属から始めることで、例えば、ベクトルの形態で組み合わせられる。次いで、特に、異なる実験で相互に独立して決定されたＨＮおよびＮの化学シフトを用いて、主鎖に関する一貫性検査を行う。異なる実験で測定された化学シフトについて、一致した値または近似した値を入手しなければならない。主鎖の実験および側鎖の実験で測定した、ＣαおよびＣβの原子核の化学シフトはそれぞれ、主鎖および側鎖に対して行う上記一貫性検査を可能にする。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態において、一連のＮＭＲスペクトルは、ＮＯＥＳＹ型のスペクトルを含み、当該ＮＯＥＳＹ型のスペクトルの評価は、特に、ポリペプチド鎖の様々な原子核の距離についての情報を提供する。ＮＯＥＳＹ型の実験において、ケルン−オーバーハウザ効果に起因した交差緩和が検出される。関与した原子核間の距離への帰還は、ＮＯＥ交差信号の振幅から入手される。従ってＮＯＥＳＹ型スペクトルは、たんぱく質構造を決定する際に特に重要である。
【００３１】
本発明のさらなる実施形態において、ＮＯＥＳＹ型のＮＭＲスペクトルは、原子核について決定された化学シフトを基に、ポリペプチド鎖の様々な原子核に対して帰属される。特に、プロトン化学シフトに基づいて、様々な磁気活性原子核に対するＮＯＥＳＹスペクトルの交差信号の帰属が行われる。しかし、プロトン化学シフトが、十分正確に事前に決定されており、すでに公知である場合でさえ、両義性は、各交差信号の複数表示のために残存したままでである。この理由のために、できるだけ正確に決定されたプロトン化学シフトを基に、できるだけ大きなＮＯＥＳＹスペクトル部分を非両義的に帰属することがより重要である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態において、ＮＭＲスペクトルの評価で入手した値は、構造演算ソフトウェアにおける入力量となる。構造演算プログラムにおいて重要な入力量は、特に、帰属されたＮＯＥＳＹスペクトルから得られた原子核の距離である。この目的のために、ＮＯＥ交差信号の振幅およびピークの周波数座標のリスト、ならびに共鳴帰属が、構造演算プログラムに使用されている。さらなる入力量として、異なる原子核の間のカップリング定数が挙げられる。なぜなら、これらのカップリング定数から、異なる原子核の間の二面角が決定されるからである。
【００３３】
交差信号パターン検索マスクはそれぞれ多数の所定の信号検索領域を含むことが好ましく、信号検索領域の領域境界内にＮＭＲ信号が生じることによって、交差信号パターン検索マスクによって定義された信号パターンが存在する可能性が増加する。このようにして、探求されるピークパターンが、多数の検索領域によって正確に定義される。従って、真のパターン認識が可能となる。検索領域の境界内に生じる信号ピークのそれぞれは、交差信号パターン検索マスクについての評価スコアを増大させる。この点について、信号パターンの個々のピークが欠けた場合でも、信号パターンがなお認識され、交差信号パターン検索マスクと十分に一致することが特に好ましい。ピークパターンが交差信号パターン検索マスクに一致しているかどうかを評価するとき、重要な要因は、総合的な確立された一致である。
【００３４】
この点について、交差信号パターン検索マスクがそれぞれ多数の所定の空領域を含んでいることが好ましく、従って、空領域の領域境界内におけるＮＭＲ信号の欠損に起因して、交差信号パターン検索マスクによって定義された信号パターンが存在する可能性が増加する。次いで、２つの異なる側鎖構造が互いに類似した２つの信号パターン（第二信号パターンは、第一信号パターンに含まれないいくつかのさらなるピークを有している）を導く場合、空領域の定義は有意義である。これらの信号ピークの欠損は、まさに第一信号パターンに典型的な欠損であり、従って、第一信号パターンを検出するために、対応する部位での空領域を定義することが推奨されることを意味している。空領域の境界内にピークが生じなかった場合、第一信号パターンの存在についての評価スコアは増加する。その結果、２つの信号パターンは、空領域の定義によって適切に区別される。
【００３５】
交差信号パターン検索マスクの閾値および検索領域は、スペクトルにおけるＮＭＲ信号数の予測から始まり、反復によって決定されることが好ましい。この手順で、検索領域は、広範に設定された境界によって開始時に定義され、閾値は比較的低く選択される。一回目の運転で見出された信号ピークの評価は、交差信号パターンが存在する可能性があるかどうかの初期予測を提供する。また、検索を向上させるために、第一検索で見出されたピークの化学シフトに依存して、検索領域は、縮小されるか取り除かれる。第二検索において増加した閾値で操作することがまた可能である。この反復法によって、交差信号パターン検索は、実際に存在する交差信号パターンへ徐々に方向性を持つ。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態において、交差信号パターン検索マスクは、記録された一連のＮＭＲスペクトルの様々なＮＭＲスペクトルを分析するための副検索マスクを多数含んでいる。この点について、異なる２次元、３次元、または高次元のスペクトルをそれぞれ検索する異なる副検索マスクの全体性として、実際の交差信号パターン検索マスクが生じる。このように、一連のＮＭＲスペクトルは、対応する組の副検索マスクを用いて分析される。特に、全ての副検索マスクに対して検索領域境界の改変が同時に起こることが好ましい。この結果、一連の検索マスクの取扱いが簡素化される。
【００３７】
ｎアミノ酸を含むポリペプチド鎖について記録された一連のＮＭＲスペクトルを自動的に分析するための本発明のプロセスにおいて、分析に必要な交差信号パターン検索マスクは、まず、交差信号パターン検索マスクのライブラリから選択される。ここで、交差信号パターン検索マスクは、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号を特異的に検出するために提供され、必要な交差信号パターン検索マスクの選択は、一次配列に含まれる断片に応じて行われる。次に、選択された異なる交差信号パターン検索マスクと一連のＮＭＲスペクトルとを関連付けることによって、パターン認識が行われる。このパターン認識の結果に応じて、ポリペプチド鎖の異なるスピンシステムへＮＭＲ信号が帰属される。
【００３８】
本発明の交差信号パターン検索マスクはそれぞれ、調査されたポリペプチド鎖の断片のＮＭＲ信号全てを評価するため、断片のＮＭＲ信号、特に２つまたは３つのアミノ酸を含む断片が、本発明のプロセスを用いた非常に選択的な方法によって検出される。ポリペプチド鎖の個々の断片において、信頼性のある信号帰属が存在する場合、ポリペプチド鎖のＮＭＲ信号の総合的帰属が、分析結果の重複から誘導される。帰属の非両義性および信頼性は、従来技術のプロセスと比較して向上された。使用者による手動介入を必要とする頻度が低くなるため、このプロセスは、特にＮＭＲスペクトルの完全自動評価に特に適切である。従って、ＮＭＲ分光法によるたんぱく質構造の決定において必要な時間および費用もさらに削減される。
【００３９】
図に示された実施例と共に、本発明を以下に詳細に記述する。図１は、必要なＮＭＲスペクトルを記録するためのフローチャートである。図２は、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸の組を読解することができる表である。図３は、アミノ酸特異的２Ｄ実験の一連の例であり、これを用いて特定の側鎖構造の存在または欠損の問い合わせが特異的に行われる。図４は、交差信号パターン検索マスクであり、スペクトルに含まれる信号パターンが、当該マスクによって認識および評価される。図５Ａおよび図５Ｂは、記録されたＮＭＲスペクトルを評価するためのフローチャートであり、生じた信号ピークとタンパク質のスピンシステムとの間で帰属が行われる。
【００４０】
図１は、必要なＮＭＲスペクトルを記録するために使用されるフローチャートを図示している。必要な実験を決定するための開始点はタンパク質の一次構造である。必要な量のタンパク質が、このように簡単に生成されるため、ほとんどの場合、必要なタンパク質は、対応するＤＮＡ断片の補助を用いた生物工学的方法によって合成される。従って、以下の記述において、タンパク質の一次構造が事前に知られており、タンパク質の構造を決定するためにＮＭＲ分光法実験が簡単に使用されると仮定する。
【００４１】
工程１において、一次配列に含まれる連続したアミノ酸の組が決定され、列挙される。一次構造が知られているため、「セルマ（ｓｅｌｍａ）」という名の自己記述式（ｓｅｌｂｓｔｇｅｓｃｈｒｉｅｂｅｎｅｎ）コンピュータプログラムによる非常に簡単な方法によって、この工程が行なわれる。タンパク質ＯＰＲについての「セルマ」プログラムによって提供された結果を図２に示す。ｘ軸およびｙ軸に沿ってプロットされた文字はそれぞれ、２０個の可能性のあるアミノ酸を表す。ｙ軸に沿って列挙されたアミノ酸は、対象となる一組のアミノ酸の第一ポジションに存在するアミノ酸を表し、ｘ軸に沿って列挙されたアミノ酸は、一組のアミノ酸の第二ポジションに存在するアミノ酸を表す。
【００４２】
タンパク質ＯＰＲのアミノ酸配列に生じる様々なアミノ酸の組が、得られた行列に入力されている。ちょうど１つのアミノ酸の組ＡＥが配列に生じ、アミノ酸の組ＥＡが配列に含まれないことが、表より見出される。数字２または３が特定の行列の位置に入力されている場合、配列において、対応するアミノ酸の組が１つより多く存在することを意味している。例えば、アミノ酸の組ＥＤの場合が該当する。
【００４３】
従って、一次配列に含まれるアミノ酸の組について得られた情報は、工程２において、タンパク質構造を決定するために行われる一連のＮＭＲ実験を特定するのに役立つ。目的は、測定時間を不必要に延長するだけの余計な実験をできるだけ減らすことである。従って、例えば、図２に示された「セルマ」プログラムの結果に基づいて、アミノ酸のシステインがタンパク質ＯＰＲには存在しないことが見出される。システイン選択的２Ｄ実験を記録する必要がなく、その結果、システイン選択的２Ｄ実験は、工程２で特定された一連のＮＭＲ実験の一部でもまたない。
【００４４】
工程３において、一連の２次元または多次元のＮＭＲスペクトルがＮＭＲ分光計で記録される。分光計は、分光計の操作パラメータ（例えば、プロトン搬送周波数および９０°パルスの長さ）を最初に決定し、調整する、分光計制御装置を備えている。従って、工程２で特定されたスペクトルは連続的に記録される。このため、分光計制御装置は、標準化ＮＭＲパルス配列の選択を含む。
【００４５】
タンパク質に必要なＮＭＲスペクトルの記録は数週間の測定時間を必要とする。記録されたスペクトルは、プロジェクト配列決定装置（Ｐｒｏｊｅｋｔｏｒｄｎｅｒ）４のデータセットとして入手可能であり、工程５においてさらに評価される。２Ｄスペクトル「２ｒｒ」および３Ｄスペクトル「３ｒｒｒ」が結果として得られる。プロジェクト配列決定装置４に含まれるデータセットに基づいて、「ナット（ｇｎａｔ）」プログラムは、さらなる評価に必要な、例えば、閾値を決定するために必要な、様々な統計パラメータ６を決定する。このような閾値の補助を用いて、スペクトルに含まれるピークはバックグラウンドノイズと区別される。
【００４６】
主鎖の磁気活性原子核の化学シフトを記録するために、代表的には、特に１３Ｃおよび１５Ｎの原子核の共鳴が検出される３Ｄ三重共鳴実験およびアミノ酸型特異的２Ｄ実験が使用される。特に、この目的のために、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨおよびＣＢＣＡＮＮＨ、ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨおよびＨＡＮＮＨ、ＨＡＨＢ（ＣＯ）ＮＮＨおよびＨＡＨＢＮＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯおよびＨＮＣＯ、ならびにＨＮ（ＣＯ）ＣＡおよびＨＮＣＡの組の３Ｄ実験が使用される。ブラケット（Ｋｌａｍｍｅｒｎ）に与えられた原子核（例えば、３Ｄ−ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ）は検出されないが、干渉移行（Ｋｏｈａｅｒｅｎｚｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与している。
【００４７】
必要な化学シフトを決定するために、少数の三重共鳴実験を行うことですでに十分である。しかし、信頼性のある結果を得るために、タンパク質に生じる異なる相関性を、それぞれいくつかの実験を用いて記録することが好ましく、結果はその一貫性について検査される。
【００４８】
ＣＡＣＢＮＮＨ実験によって、アミノ酸ｉのＨＮ、Ｎ、Ｃα、Ｃβの原子核の周波数、およびアミノ酸ｉ−１のＣαおよびＣβの原子核の周波数が得られる。ＣＡＣＢ（ＣＯ）ＮＨスペクトルは、アミノ酸ｉのＨＮおよびＨの原子核とアミノ酸ｉ−１のＣαおよびＣβの原子核との相関性を含む。
【００４９】
アミノ酸ｉのＮ、ＨＮ、Ｃαの原子核の周波数は、ＨＮＣＡ型の３Ｄ実験によって検出される。アミノ酸第ｉ＋１のＮ、ＨＮ、およびＣαの原子核の周波数もまた、ＨＮＣＡ実験による同様の方法で検出される。さらに、アミノ酸ｉから離れたＣαの原子核と、アミノ酸ｉ＋１のＮおよびＨＮの原子核とを関係付けることも可能である。
【００５０】
三重共鳴実験の基本的な利点は、スペクトルの信号ピーク数が比較的少ないことである。三重共鳴実験は、１つのアミノ酸当たり１つまたは多くても２つの交差信号しか含まない。従って、評価の広範な自動化が可能になる。
【００５１】
周波数特異的帰属は、部分的に交差している個々の「構成要素（Ｂａｕｓｔｅｉｎｅ）」の組み合わせによって行われる。Ｃβ原子の化学シフトの検出を可能にするこれらの実験は特に重要である。
【００５２】
パルス配列ＭＵＳＩＣ（多重選択的同相干渉移行（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎ−Ｐｈａｓｅ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ））の使用は、共鳴帰属の解明に特に有利であることが証明されている。アミノ酸の群または特定の型のアミノ酸の群の側鎖が特異的に励起するためのＭＵＳＩＣパルス配列は、３Ｄ三重共鳴実験（例えば、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ）のパルス配列を改変することによって得られる。
【００５３】
一連のアミノ酸型特異的２Ｄ実験におけるそれぞれの磁性移行を図３に示す。まず初めに、側鎖に位置する特定の基は、ＭＵＳＩＣ配列によって励起される。図示された例において、長方形で囲まれたＣＨ２基またはＣＨ３基がそれぞれ励起する。この位置から、磁性は、側鎖に沿ってＣα原子に移行し、そこからＮアミドプロトンに移る。左側の列および右側の列に列挙された実験の差異は、Ｃα原子から窒素Ｎへの移行の性質にある。左側の列に示された実験において、磁性は、Ｃα原子核からカルボニル基へ移り、この位置からアミノ酸ｉ＋１の窒素Ｎへ、そしてアミドプロトンＨＮへと移行する。磁性は次の連続したアミノ酸に移行するために、これらの実験は、（ｉ＋１）−ＨＳＱＣと称される。一方、右側の列に示された（ｉ、ｉ＋１）−ＨＳＱＣにおいて、磁性は、Ｃα原子から、同じアミノ酸ｉの窒素Ｎまたは、隣接したアミノ酸ｉ＋１の窒素Ｎのいずれかに移行する。図３に示された実験を用いて、２Ｄスペクトルは、特定の型のアミノ酸（例えば、第一行のセリン、第３行のロイシン（Ｌｅｕ））または特定の群のアミノ酸（第２行のイソロイシン／バリン、第４行のアスパラギン酸／アスパラギン（Ａｓｐ／Ａｓｎ）、第５行のグルタミン酸／グルタミン（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ））に対して選択的に記録される。
【００５４】
従って、スペクトルに生じる信号ピークをタンパク質の個々のスピンシステムに帰属するために、記録された２Ｄスペクトルおよび３Ｄスペクトルはパターン認識される。従来技術の解決策において、この帰属は一般的に、ピーク信号リストの補助を用いて行われた。このような解決アプローチと比較して、パターン認識のルーチン（ｒｏｕｔｉｎｅｎ）の使用は、測定された交差信号パターンが全体的に評価されるために有利である。
【００５５】
交差信号パターンの分析に使用した交差信号パターン検索マスクを図４に示す。信号ピークは、２次元スペクトルの位置３、１０、１２、ならびに鏡像位置１４、１６および１８に位置すると予測される。長方形の信号検索領域８、１１、１３、ならびに１５、１７、１９は、予測ピーク位置の周辺として定義される。このように定義された領域内に生じる信号ピークは、パターン認識ソフトウェアによって検出されるが、信号検索領域の外側に生じたピークは検出されない。従って、交差信号パターン検索マスクは、所定の信号検索領域９、１１、１３、１５、１７、１９にまで及び、ソフトウェアによって、これらの信号検索領域内で予測される信号ピークが検索される。
【００５６】
パターン認識および帰属のフローチャートを図５Ａおよび図５Ｂに示す。パターン認識ソフトウェア２０に利用されている本発明の交差信号パターン検索マスクのライブラリ９は、交差信号パターンの分析に有用である。２つ（または３つ）の連続したアミノ酸の断片の信号ピークは、本発明の各交差信号パターン検索マスクを用いて検出され、帰属される。パターン認識に必要な交差信号パターン検索マスクの選択は、「セルマ」プログラムによって行われる、２つの型の断片へのアミノ酸配列の分解に基づいて行われる。タンパク質の信号ピークの帰属に必要な交差信号パターン検索マスクは、一次配列に含まれる２つの群に応じてライブラリ１９から選択され、パターン認識ソフトウェア２０に利用されている。
【００５７】
２つの連続的に位置するアミノ酸の群に起因した全ての信号ピーク（すなわち、２つの側鎖による信号ピークおよび主鎖断片による信号ピーク）は、所定の交差信号パターン検索マスクの補助を用いて連帯的に評価される。
【００５８】
以下の記述において、３つの異なる組の三重共鳴実験（つまりＣＢＣＡＮＮＨ／ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ、ＨＮＣＯ／ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、およびＨＡＮＮＨ／ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨ）ならびにアミノ酸型特異的２Ｄ実験は、主鎖の帰属に使用されると仮定する。この場合、交差信号パターン検索マスクのライブラリ１９は、合計で３×２０×２０＝３×４００＝１２００の異なる交差信号パターン検索マスクを含んでいる。つまり、
ＣＢＣＡＮＮＨ＋ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＮＨ＋２つのアミノ酸型特異的２Ｄ実験を分析するための交差信号パターン検索マスク（４００個）、
ＨＮＣＯ＋ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ＋２つのアミノ酸型特異的２Ｄ実験を分析するための交差信号パターン検索マスク（４００個）、および、
ＨＡＮＮＨ＋ＨＡ（ＣＯ）ＮＮＨ＋２つのアミノ酸型特異的２Ｄ実験を分析するための交差信号パターン検索マスク（４００個）。
【００５９】
本発明の各交差信号パターン検索マスクは、２つのアミノ酸型特異的２Ｄ実験および１組の３Ｄ三重共鳴実験の評価に有用である。交差信号パターン検索マスクを用いて異なるスペクトルを評価するために、交差信号パターン検索マスクは、一連の副検査マスクを含み、従って、特定の型のスペクトルは各副検査マスクを用いて評価される。しかし、プログラミングの観点から、交差信号パターン検索マスクはユニットとして表示される。従って、全ての副検索マスクを備えた全体的交差信号パターン検索マスクは、特定の評価パラメータ（例えば、検索領域境界）を変更することが可能である。その結果、この変更は、首尾一貫した方法および様式で、全ての副検索マスクの検索領域境界に影響を与える。
【００６０】
ライブラリ１９に含まれる所定の交差信号パターン検索マスクは、特定の信号パターンを見出すための探索アルゴリズムを特定する。しかし、交差信号パターン検索マスクは、パラメータに非依存的な形態で表示される。必要な検索領域境界２２および、バックグラウンドノイズから信号ピークを区別するために必要な閾値２３は、外部から交差信号パターン検索マスクに利用される。
【００６１】
この手順は、検索の過程で、交差信号パターン検索を行うために使用されるパラメータおよび検索領域を変更し、当該パラメータおよび検索領域を新しく入手した情報に適合させる可能性を提供する。特に、確実に探求交差信号パターンを検出するために、初めに検索領域境界を非常に広く設定し、検索領域内に生じたピークに応じて反復的に上記境界を削減することが好ましい。同様に、最も高い評価スコアの交差信号パターンを除去するために、閾値２３は、初期の低い値から徐々に高い値へと増加させる。
【００６２】
下に記載のプログラムのルーチンは、２つの側鎖特異的２Ｄ実験（「ｓＨＳＱＣｃｏＮ」および「ｓＨＳＱＣｃａＳ」）ならびに一組の３Ｄ三重共鳴実験（「ＨＮｃｏＣＡＣＢ」および「ＨＮＣＡＣＢ」）を評価する交差信号パターン検索マスクの実行を表す。従って、一組のアミノ酸に特異的な上記交差信号パターン検索マスクは、様々な２Ｄスペクトルおよび３Ｄスペクトルを評価するための４つの副検索マスクを含む。様々なスペクトルを評価することによって見出された結果は、重複領域に存在する原子核の化学シフトを用いて、すなわち、特にＨＮ、Ｎ、ＣαおよびＣβの化学シフトを介して組み合わせられる。
【００６３】
【数１】
2005502881.tif 000003
【００６４】
【数２】
2005502881.tif 000004
【００６５】
【数３】
2005502881.tif 000005
【００６６】
【数４】
2005502881.tif 000006
【００６７】
【数５】
2005502881.tif 000007
【００６８】
抽象的に定義された形態の交差信号パターン検索マスクはまた、任意の数値特定の検索領域および閾値を有しないことが、プログラムコードから理解される。該当の可変数「ｓｕｎｍａｔｒｉｘ＿ｓｉｚｅｓ」、「ｓｗｅｅｐ＿ｗｉｄｔｈｓ」「ｐｐｍ＿ｏｆｆｓｅｔｓ」および「ｎｕｃｌｅｕｓ＿ｓｐｅｃｉｅｓ」は、抽象的な形態で簡単に定義される。
【００６９】
次のプログラムリストは、２Ｄスペクトル（「ｓＨＳＱＣｃｏＮ」および「ｓＨＳＱＣｃａＳ」）ならびに３Ｄスペクトル（「ＨＮｃｏＣＡＣＢ」および「ＨＮＣＡＣＢ」）の交差信号パターン検索マスクを示しており、検索領域境界２２および閾値２３は、その中で調整されている。
【００７０】
【数６】
2005502881.tif 000008
【００７１】
【数７】
2005502881.tif 000009
【００７２】
【数８】
2005502881.tif 000010
【００７３】
【数９】
2005502881.tif 000011
【００７４】
【数１０】
2005502881.tif 000012
【００７５】
特に、パラメータ「ｍａｔｒｉｘ＿ｓｉｚｅｓ」、「ｓｕｎｍａｔｒｉｘ＿ｓｉｚｅｓ」、「ｓｗｅｅｐ＿ｗｉｄｔｈｓ」「ｐｐｍ＿ｏｆｆｓｅｔｓ」、「ｎｕｃｌｅｕｓ＿ｓｐｅｃｉｅｓ」および「ｍａｓｋ＿ｌｏｗｅｒ＿ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」に関して、それぞれ数値範囲が定義されている。
【００７６】
検索領域境界２２および閾値２３が定義されるとすぐに、パターン認識ソフトウェア２０が実際のパターン認識を開始させる。このため、記録された２Ｄスペクトル「２ｒｒ」および３Ｄスペクトル「３ｒｒ」は、交差信号パターン検索マスク（または副検索マスクの１つ）の検索領域によって関係付けられ、交差信号パターン検索マスクによって検出された交差信号パターンの存在に対する評価スコアが得られる。
【００７７】
図４に図示した例において、信号検索領域９、１１、１３、１５、１７、１９に存在するスペクトルの値は合計され、交差信号パターンの存在についての評価スコアが得られる。予測信号ピークが信号検索領域９、１１、１３、１５、１７、１９に生じる場合、探求交差信号パターンに対して高い評価スコアが得られる。このことは、探求交差信号パターン検索マスクが存在する可能性が高いことを意味している。一方、予測ピークの全体または一部が、信号検索領域９、１１、１３、１５、１７、１９に存在しない場合、対応する低い評価スコアが得られる。この場合、探求交差信号パターンが表示される。
【００７８】
評価スコアを計算するために、いわゆるマスク走査２４が行われる。また、化学シフトの座標は、異なる空間方向に連続的に増加しているため、スペクトル全体をラスター走査することができる。このように算出された座標値は、マスクデータ２５と比較される。座標値が、交差信号パターン検索マスクの信号検索領域全ての外側に位置する場合、評価スコアは変化しないままである。一方、新しく算出された座標値が検索領域内に位置する場合、この検索値に属するスペクトル値は評価スコアに加えられる。このマスク走査２４の補助によって、特定の交差信号パターン検索マスクまたは交差信号パターン検索マスクの特定の副検索マスクに対する評価スコアは、迅速かつ簡単に決定される。
【００７９】
現在まで、交差信号パターン検索マスクは、単に多数の信号検索領域を含んでいると仮定されており、信号ピークが検索領域境界内で生じることが予測される。しかし、空領域もまた同様に定義され、空領域境界内での信号ピークの生成は、評価スコアの減少を導く。この空領域は、信号ピークが生成しない、いわば「禁制（ｖｅｒｂｏｔｅｎｅ）」領域を構成する。
【００８０】
認識正確性を向上するため、パターン認識を行う前に、重畳（Ｍｕｓｔｅｒｅｒｋｅｎｎｕｎｇ）操作によって２Ｄスペクトルおよび３Ｄスペクトルの性質を向上する試みが行われた。従って、理想ガウス信号の大きさおよび広がりが、おおよそ予測ＮＭＲ信号ピークの大きさおよび広がりに相当するため、当該理想ガウス信号はスペクトルと重畳する。このようにして、人為的産物（Ａｒｔｅｆａｋｔｅ）が抑制され、不鮮明なピークがより簡単に分解される。
【００８１】
図５Ａは、２つのアミノ酸型特異的２Ｄスペクトルおよび一組の三重共鳴実験の評価がどのようにして４つの部分結果２６、２７、２８、２９を算出するのかを示している。２つのアミノ酸型特異的２Ｄスペクトルを評価するために、この目的に適した副検索マスクが提供され、２つの三重共鳴実験を評価するために、交差信号パターン検索マスクの２つのさらなる副検索マスクが定義される。交差信号パターン検索マスクの各副検索マスクは、部分結果２６、２７、２８、２９を算出する。例えば、特定の２Ｄスペクトルの部分結果は、信号検索領域内で見出されたピークの化学シフト、および副検索マスクの評価スコアを含む。
【００８２】
２つのアミノ酸型特異的２Ｄスペクトルおよび一組の三重共鳴実験の評価において得られた４つの部分結果２６、２７、２８、２９は、併合ユニットに供給される。併合ユニット３０の目的は、異なる部分結果を結果リスト３１に一体化することである。このため、個々の部分結果の重複領域に存在する化学シフトが比較される。従って、併合、すなわち部分結果の結果リスト３１への一体化は、特にＨＮ±△ＨＮおよびＮ±△Ｎの間隔にわたるＨＮ原子核およびＮ原子核の化学シフトに基づいて行われる。結果リスト３１のエントリーは、いわゆるシフトベクトルを含んでおり、当該結果リスト３１において、２つの連続したアミノ酸内に生じる化学シフト、および２つのアミノ酸からなる群の存在について総括的に決定された評価スコアが列挙されている。
【００８３】
以下に、このように形成された結果リストが重みづけ（ｇｅｗｉｃｈｔｅｔ）される。重みづけ手順は、クリーニングユニット（Ｃｌｅａｎｉｎｇ−Ｅｉｎｈｅｉｔ）３２によって行われる。クリーニングユニット３２は、重みづけ機能を用いてシフトベクトルの正確性を検査することによって、得られた結果の信憑性を検査する。
【００８４】
アミノ酸の組Ｎ−Ｓに起因して交差信号パターンを検索する交差信号パターン検索マスクの結果リストは下で特定される。「セルマ」プログラムを用いて行われた一次構造の断片化のためにのみ予測されるように、対象となるタンパク質ＯＰＲの一次配列において、２つの連続したアミノ酸Ｎ−Ｓからなる群が１つ存在しているため、単純に１つのエントリーが見出された。結果リストのエントリーは、項目「Ｒｅｓｐ．」で与えられる化学シフトおよび評価スコアのリストを含んでいる。
【００８５】
【数１１】
2005502881.tif 000013
【００８６】
アミノ酸の組Ｎ−Ｓについて見出された結果リストの信憑性を検査するために、完全なタンパク質主鎖について記録された３Ｄ実験において、パターン検索がまた実施される。このようにして、より詳細な結果リストが得られ、当該結果リストの入力は、化学シフトの数および評価スコアを交互に含んでいる。
【００８７】
【数１２】
2005502881.tif 000014
【００８８】
【数１３】
2005502881.tif 000015
【００８９】
適合（ｕｅｂｅｒｅｉｎｓｔｉｍｍｅｎｄｅｎ）化学シフトによると、第５３番目エントリーは、アミノ酸の組Ｎ−Ｓのエントリーであることが理解できる。これは、２つのパターン検索で見出された結果の一貫性を確証している。
【００９０】
タンパク質配列に含まれる個々のアミノ酸の組に対して部分帰属が行われた後、これらの部分帰属は、一次配列にコピーされる。この工程は、配列図作製（ｓｅｑｕｅｎｚ−Ｍａｐｐｉｎｇ）３３と称される。一次配列に基づいて、アミノ酸の組が、結果リストで検索され、初めに最高の重みづけで配列にコピーされる。それぞれの反復の後に、個々の組の連鎖形成が検査され、このようにして、２個、３個、４個などのアミノ酸の断片が形成される。反復のルーチンが完了した後に、３Ｄ実験の組についてのパターン検索の結果リストで欠損断片が検索され、配列にコピーされる。主鎖検索の完了の後に、側鎖実験全ての結果リストで標的検索が行われる。
【００９１】
配列の様々なアミノ酸に対する様々なスペクトルに存在する信号ピークの完全逐次（ｓｅｑｕｅｎｚｉｅｌｌｅ）帰属３４は、配列図作製３３の結果として得られる。従って、スペクトルピークの帰属をできる限り自動化するという目的が達成される。
【００９２】
上記帰属および、タンパク質の様々な磁気活性原子核について見出された化学シフトは、ＮＯＥＳＹスペクトル３６の自動帰属における開始点とみなされる。タンパク質の様々な磁気活性原子核に対するＮＯＥＳＹスペクトル３６の上記帰属は、ＡＲＩＡ３５プログラムによって実行される。用語「ＡＲＩＡ」は、「反復帰属における両義性の抑制（Ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  Ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）」を意味する。ＡＲＩＡの開始点は、プロトン化学シフトのほぼ完全な帰属であり、当該帰属は、ＮＯＥ交差信号の振幅およびその周波数座量のリストと共に、構造演算プログラム（特別な場合「エクスプロア（Ｅｘｐｌｏｒ）」）に伝送される。ＡＲＩＡ３５プログラムの主な役割は、多様な意味の個々の交差信号を取り込み、その後反復帰属法を使用することによって、構造演算中にＮＯＥの帰属を行うことである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】必要なＮＭＲスペクトルを記録するためのフローチャートである。
【図２】アミノ酸配列に含まれるアミノ酸の組を読解することができる表である。
【図３】アミノ酸特異的２Ｄ実験の一連の例であり、これを用いて特定の側鎖構造の存在または欠損の問い合わせが特異的に行われる。
【図４】交差信号パターン検索マスクであり、スペクトルに含まれる信号パターンが、当該マスクによって認識および評価される。
【図５Ａ】記録されたＮＭＲスペクトルを評価するためのフローチャートであり、生じた信号ピークとタンパク質のスピンシステムとの間で帰属が行われる。
【図５Ｂ】記録されたＮＭＲスペクトルを評価するためのフローチャートであり、生じた信号ピークとタンパク質のスピンシステムとの間で帰属が行われる。
【図１】
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【図５Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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