(57)【要約】本発明は概して卵巣特異的遺伝子（O1-180、O1-184およびO1-236）およびそれらがコードするタンパク質に関する。また、生殖組織における細胞増殖性障害または細胞変性障害を検出する方法も提供する。さらにまた本発明は、卵巣特異的遺伝子と相互作用する化合物および/または卵巣特異的遺伝子の発現または活性を調整する化合物のスクリーニング方法も提供する。これらの化合物は避妊薬および/または妊娠薬である可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号11の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号13の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
薬学的に許容できる担体中に分散したO1-180発現のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項４】
モジュレーターがO1-180遺伝子の転写を抑制する請求項3の組成物。
【請求項５】
モジュレーターがO1-180遺伝子の転写を増進する請求項3の組成物。
【請求項６】
モジュレーターがポリペプチドである請求項3の組成物。
【請求項７】
モジュレーターが小分子である請求項3の組成物。
【請求項８】
モジュレーターがポリヌクレオチド配列である請求項3の組成物。
【請求項９】
ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである請求項9の組成物。
【請求項１０】
作動的に連結したプロモーターとポリヌクレオチド配列とを含む発現ベクターをさらに含む請求項9の組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容できる担体中に分散したO1-180活性のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項１２】
O1-180活性を阻害する請求項11の組成物。
【請求項１３】
O1-180活性を刺激する請求項11の組成物。
【請求項１４】
避妊を調整する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-180活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を減少させることのできる方法。
【請求項１５】
動物が雌である請求項１４の方法。
【請求項１６】
動物が雄である請求項１４の方法。
【請求項１７】
妊性を強化する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-180活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を増加させることのできる方法。
【請求項１８】
O1-180活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、
O1-180ポリペプチドを発現させる細胞を用意するステップ、
前記細胞を候補モジュレーターと接触させるステップ、
O1-180発現を測定するステップ、および
前記候補モジュレーター存在下での前記O1-180発現を、前記候補モジュレーター不在下でのO1-180発現の発現と比較するステップ
を含み、前記候補モジュレーター不在下でのO1-180の発現と比較した、前記候補モジュレーター存在下でのO1-180の発現の相違により、前記候補モジュレーターが、O1-180発現のモジュレーターであると同定される方法。
【請求項１９】
O1-180の活性を調整する化合物を同定する方法であって、
単離されたO1-180ポリペプチドまたはその機能等価物を取得するステップ、
O1-180ポリペプチドまたはその機能的等価物を候補化合物と混合するステップ、および
O1-180の活性に対する前記候補化合物の効果を測定するステップ
を含む方法。
【請求項２０】
O1-180の活性を調整する化合物のスクリーニング方法であって、
O1-180またはそのO1-180結合断片を候補化合物に暴露すること、および
前記化合物がO1-180またはそのO1-180結合パートナーに結合するかどうかを決定すること、そして、
さらに前記化合物がO1-180またはO1-180と結合パートナーとの相互作用を調整するかどうかを決定すること、
を含む方法。
【請求項２１】
O1-180と結合する相互作用化合物のスクリーニング方法であって、
O1-180タンパク質またはその断片をある化合物に暴露すること、および
前記化合物がO1-180に結合したかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項２２】
O1-180活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって、
（a）（1）調節可能な1つまたは複数のO1-180タンパク質遺伝子、（2）1つまたは複数のO1-180タンパク質遺伝子のノックアウト、または（3）1つまたは複数のO1-180タンパク質遺伝子のノックイン、を持つトランスジェニック動物の群を用意すること、
（b）ステップ（a）のトランスジェニック動物の群に対してそれぞれ対照動物からなる第2の群を用意すること、および
（c）トランスジェニック動物群および対照動物群を候補O1-180調整化合物に暴露すること、および
（d）トランスジェニック動物群と対照動物群とを比較し、トラスジェニック動物における不妊または妊性に関係する1つまたは複数のタンパク質に対する前記化合物の効果を対照動物と比較して決定すること
を含む方法。
【請求項２３】
ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出する方法であって、
（i）選択した表現型を検出するのに適した条件下で少なくとも1つの真核細胞を培養すること（ここに、前記細胞は、
a）転写活性化タンパク質DNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
b）転写活性化タンパク質転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および
c）復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型をもたらす）
を含む）、
（ii）選択した表現型をもたらすレポーター要素の発現レベルを決定することによって前記ペプチド結合対の結合相互作用を検出すること、
を含み、
前記第1または第2ペプチドがO1-180ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法。
【請求項２４】
ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出するためのレスキュースクリーンであって、
（i）選択した表現型を検出するためまたはそのような表現型の不在を検出するための条件下で少なくとも1つの真核細胞を培養すること（ここに、前記細胞は、
a）転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
b）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および
c）復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型の発揮を妨げる）、
（ii）選択した表現型の発揮を妨げるレポータ要素の発現に試験ペプチドが影響を及ぼすかどうかを決定することによって、O1-180と相互作用する試験ペプチドの能力を検出すること
を含み、
前記第1または第2ペプチドがO1-180ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法。
【請求項２５】
O1-180の結合パートナーを同定する方法であって、
当該タンパク質を候補結合パートナーに暴露するステップ、および
前記候補結合パートナーがO1-180に結合するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
薬学的に許容できる担体中に分散したO1-236発現のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項２７】
モジュレーターがO1-236遺伝子の転写を抑制する請求項26の組成物。
【請求項２８】
モジュレーターがO1-236遺伝子の転写を増進する請求項26の組成物。
【請求項２９】
モジュレーターがポリペプチドである請求項26の組成物。
【請求項３０】
モジュレーターが小分子である請求項26の組成物。
【請求項３１】
モジュレーターがポリヌクレオチド配列である請求項26の組成物。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである請求項31の組成物。
【請求項３３】
作動的に連結したプロモーターとポリヌクレオチド配列とを含む発現ベクターをさらに含む請求項31の組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容できる担体中に分散したO1-236活性のモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項３５】
O1-236活性を阻害する請求項34の組成物。
【請求項３６】
O1-236活性を刺激する請求項34の組成物。
【請求項３７】
避妊を調整する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-236活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を減少させることのできる方法。
【請求項３８】
動物が雌である請求項37の方法。
【請求項３９】
動物が雄である請求項37の方法。
【請求項４０】
妊性を強化する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-236活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を増加させることのできる方法。
【請求項４１】
O1-236活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、
O1-236ポリペプチドを発現させる細胞を用意するステップ、
前記細胞を候補モジュレーターと接触させるステップ、
O1-236発現を測定するステップ、および
前記候補モジュレーター存在下での前記O1-236発現を、前記候補モジュレーター不在下でのO1-236発現の発現と比較するステップ
を含み、前記候補モジュレーター不在下でのO1-236の発現と比較した、前記候補モジュレーター存在下でのO1-236の発現の相違により、前記候補モジュレーターが、O1-236発現のモジュレーターであると同定される方法。
【請求項４２】
O1-236の活性を調整する化合物を同定する方法であって、
単離されたO1-236ポリペプチドまたはその機能等価物を取得するステップ、
O1-236ポリペプチドまたはその機能的等価物を候補化合物と混合するステップ、および
O1-236の活性に対する前記候補化合物の効果を測定するステップ
を含む方法。
【請求項４３】
O1-236の活性を調整する化合物のスクリーニング方法であって、
O1-236またはそのO1-236結合断片を候補化合物に暴露すること、および
前記化合物がO1-236またはそのO1-236結合パートナーに結合するかどうかを決定すること、そして、
さらに前記化合物がO1-236またはO1-236と結合パートナーとの相互作用を調整するかどうかを決定すること、
を含む方法。
【請求項４４】
O1-236と結合する相互作用化合物のスクリーニング方法であって、
O1-236タンパク質またはその断片をある化合物に暴露すること、および
前記化合物がO1-236に結合したかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項４５】
O1-236活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって、
（a）（1）調節可能な1つまたは複数のO1-180タンパク質遺伝子、（2）1つまたは複数のO1-236タンパク質遺伝子のノックアウト、または（3）1つまたは複数のO1-236タンパク質遺伝子のノックイン、を持つトランスジェニック動物の群を用意すること、
（b）ステップ（a）のトランスジェニック動物の群に対してそれぞれ対照動物からなる第2の群を用意すること、および
（c）トランスジェニック動物群および対照動物群を候補O1-236調整化合物に暴露すること、および
（d）トランスジェニック動物群と対照動物群とを比較し、トラスジェニック動物における不妊または妊性に関係する1つまたは複数のタンパク質に対する前記化合物の効果を対照動物と比較して決定すること
を含む方法。
【請求項４６】
ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出する方法であって、
（i）選択した表現型を検出するのに適した条件下で少なくとも1つの真核細胞を培養すること（ここに、前記細胞は、
a）転写活性化タンパク質DNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
b）転写活性化タンパク質転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および
c）復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型をもたらす）
を含む）、
（ii）選択した表現型をもたらすレポーター要素の発現レベルを決定することによって前記ペプチド結合対の結合相互作用を検出すること、
を含み、
前記第1または第2ペプチドがO1-236ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法。
【請求項４７】
ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出するためのレスキュースクリーンであって、
（i）選択した表現型を検出するためまたはそのような表現型の不在を検出するための条件下で少なくとも1つの酵母細胞を培養すること（ここに、前記酵母細胞は、
a）転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
b）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列
（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および
c）復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型の発揮を妨げる）、
（ii）選択した表現型の発揮を妨げるレポーター要素の発現に試験ペプチドが影響を及ぼすかどうかを決定することによって、O1-236と相互作用する試験ペプチドの能力を検出すること
を含み、
前記第1または第2ペプチドがO1-236ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは卵巣内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法。
【請求項４８】
O1-236の結合パートナーを同定する方法であって、
当該タンパク質を候補結合パートナーに暴露するステップ、および
前記候補結合パートナーがO1-236に結合するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して卵巣特異的遺伝子およびそれらがコードするタンパク質に関する。本願は、米国仮特許出願第60/106,020号（1998年10月28日出願）に基づく優先権を主張する国際出願第PCT/US99/25209号（1999年10月28日出願）の一部継続出願である米国特許出願第09/844,864号（2001年4月27日出願）の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
生殖発生および性機能は遺伝的に決定される事象と生理学的事象の両方が関与する複雑な過程である。これらの過程がどのような調節を受けるかを特徴づけるには、これらの過程に関与する重要なタンパク質遺伝子産物を同定する必要がある。哺乳類の卵形成および卵胞形成の初期相では重要な分子事象が起こるが、今までのところ、同定され十分に特徴づけられた「候補」調節分子はほとんどない。下垂体から分泌される黄体形成ホルモン（LH）および卵胞刺激ホルモン（FSH）などのエンドクリン因子と、卵母細胞から分泌されるパラクリン因子は、どちらも卵胞形成に影響を及ぼすことが、いくつかの研究によって示唆されている。FSHおよびLHは、卵母細胞の成長および成熟ならびに卵母細胞減数分裂能力の維持に必要な顆粒膜細胞および莢膜細胞に結合することが知られている。同様に、卵母細胞も正常な顆粒膜細胞機能および莢膜細胞機能に必要な因子を分泌するだろう。卵母細胞の成長は周囲の体細胞（すなわち最初は顆粒膜細胞、後に莢膜細胞）の発育および成長と協調するので、初期段階での分子事象を理解することにより、卵母細胞と体細胞の間の互恵的相互作用を媒介するパラクリン因子、栄養ホルモンの刺激に対する応答能力の発達、および卵胞動員の過程に関して、重要な手がかりが得られるだろう。
【０００３】
合成エストロゲンおよびプロゲスチンを含有するステロイドの投与による視床下部-下垂体-性腺生殖軸の破壊は最も古いホルモン避妊法の一つである。しかし、米国医学研究所（Institute of Medicine）の最新の報告では、新しい避妊手段のための戦略を開発することの重要性が強調されている。この報告によると、一部の婦人用長期避妊戦略は、排卵の抑制、受精の防止、または受精卵の子宮内膜への着床の妨害を含む。また、約15％の夫婦は不妊であり、それらの症例の約40％では、女性がその不妊の唯一の原因であると考えられる。したがって、新しい避妊薬の標的候補となりうる新規卵巣特異的遺伝子産物を同定することは非常に重要である。
【０００４】
卵巣の一機能は、受精および初期胚発生に必要なタンパク質および因子をすべて供給する能力を完全に持っている卵母細胞を産生することである。卵母細胞由来のmRNAおよびタンパク質は、精子核膜、精子核の脱凝縮（プロタミンの除去を含む）、精子DNAでのヒストンの集合およびクロマチン凝縮、卵母細胞の卵成熟の完了および第二極体の放出、雄性前核および雌性前核の形成、雄性前核および雌性前核の融合、DNAの複製、ならびに接合子および初期胚分割の開始に必要である［Perreault（1992）の総説がある］。精子は主としてDNAを含む（すなわち細胞質または核質を含まない）ので、卵母細胞由来の因子が必要であり、哺乳動物における初期受精後事象に必要な因子の多くは卵母細胞の卵成熟中に獲得される（McLayおよびClarke、1997）。卵母細胞は異種精子核または異種体細胞核を効率よく前核に作りかえることができるので、これらの卵母細胞タンパク質は進化の過程で高度に保存されていると予想される（Perreault、1992）。精子クロマチンの修飾にヒストンが関与する点は体細胞と似ているが、これらの過程に関与する他の非ヒストンタンパク質は哺乳動物ではわかっていない。アフリカツメガエル（Xenopus laevis）の場合、精子脱凝縮の鍵因子は、10年以上前に単離されクローニングされたヌクレオプラスミンである（Burglinら、1987；Dingwallら、1987）。精子クロマチン脱凝縮は精子が卵子に進入した後に起こる。アフリカツメガエルの場合、卵細胞質グルタチオンによるプロタミンジスルフィド結合の減少も重要であるが、精子核の脱凝縮を開始するにはヌクレオプラスミン（ヌクレオプラスミンAまたはXnpm2とも呼ばれる）が必要であり、ヌクレオプラスミンがあれば十分である（Philpottら、1991）。酸性の熱安定性タンパク質であるヌクレオプラスミンは、アフリカツメガエルの卵母細胞および卵の核内にもっとも豊富に存在するタンパク質であり、核タンパク質全体の7〜10％を占めている（KrohneおよびFranke、1980a；Millsら、1980）。卵核胞崩壊後に、ヌクレオプラスミン［卵核質に存在するがDNAには結合していない（Millsら、1980）］は卵質中に放出され、そこでプロタミンを強固に結合して、精子進入から5分以内にプロタミンを精子核から取り除くことにより、精子脱凝縮をもたらすように機能する（OhsumiおよびKatagiri、1991；PhilpottおよびLeno、1992；Philpottら、1991）。この過程により、続いて卵子ヒストンが精子DNAを結合することができるようになる。卵子抽出物からヌクレオプラスミンをイムノディプリーションすると精子脱凝縮が妨げられる（Philpottら、1991）。ヌクレオプラスミンとプロタミンとの直接的相互作用がインビトロ実験で観察されたが、その観察から、ヌクレオプラスミンはプロタミンに1：1の比で結合すること、およびヌクレオプラスミン中のポリグルタミン酸区間が、プロタミンへの結合に決定的な役割を果たすことが示唆される（Iwataら、1999）。興味深いことに、卵母細胞核、受精卵の雄性もしくは雌性前核、または2細胞胚の核への精子DNAの注入は精子脱凝縮につながることから（Maedaら、1998）、ヌクレオプラスミンはこれらの段階のすべてで機能することが示唆される。ヌクレオプラスミンは五量体としてヒストンと相互作用することもできる（Earnshawら、1980；Laskeyら、1993）。ヌクレオプラスミンはヒストンH2AおよびH2Bに特異的に結合し、ヒストンH3およびH4を結合するタンパク質N1/N2と共に、DNAでのヌクレオソーム構築を促進することができる（Dilworthら、1987；Laskeyら、1993）。したがってこれらの知見から、卵形成中ならびに卵形成中と受精時に、卵母細胞由来のヌクレオプラスミンは雌性前核および雄性前核と相互作用し、ヒストンと相互作用し、クロマチン構築に何らかの形で必要とされていることが示唆される（Laskeyら、1993；Philpottら、1991）。ヌクレオプラスミンに対して低いホモロジーを持つ「遍在的」タンパク質が哺乳動物およびショウジョウバエ（Drosophila）でクローニングされているが（Chanら、1989；Crevelら、1997；Itoら、1996；MacArthurおよびShackleford、1997b；Schmidt-ZachmannおよびFranke、1988）、哺乳動物での卵母細胞等価オルソログはまだ同定されていない。
【０００５】
卵巣内の基本機能単位は卵胞であり、これは卵母細胞とそれを取り巻く体細胞とからなっている。雌性哺乳動物における妊性は、月経周期の中期に受精可能な卵母細胞を排卵するグラーフ（排卵前）（排卵前）卵胞を卵巣が産生することができるかどうかに依存している（EricksonおよびShimasaki、2000）。卵胞形成と呼ばれるこの過程には、卵巣外因子と卵巣内因子との精密な協調的調節が必要である（Richardsら、1995）。卵母細胞-体細胞コミュニケーションは古くから重要であると認識されてきたが（Falck、1959）、視床下部レベル（すなわちGnRH）および下垂体前葉レベル（すなわちFSHおよびLH）での卵巣外調節ホルモンに関する知識に比して、卵巣内のパラクリン因子およびオートクリン因子については、ほとんどわかっていない。卵母細胞が分泌する因子は、卵胞形成中に、周囲の顆粒膜細胞の増殖を促進し、これらの細胞の早すぎる黄体化を抑制することを示す証拠が、蓄積されつつある（El-Foulyら、1970；Channing、1970）。卵母細胞因子は、ヒアルロン酸、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（uPA）、LH受容体、ステロイドおよびプロスタグランジンおよびプロスタグランジンの顆粒膜細胞による合成の制御に関係づけられている（El-Foulyら、1970；NekolaおよびNalbandov、1971；Salustriら、1985；Vanderhydenら、1993；Eppigら、1997a, b）。
【０００６】
最近、卵母細胞内にいくつかの新規調節タンパク質が発見された。トランスフォーミング成長因子b（TGF-b）スーパーファミリーのメンバーである成長分化因子9（GDF-9またはGdf9）はもっとも重要なシグナリング因子の一つである。マウスの場合、GDF-9の卵母細胞での発現は一次卵胞段階で始まり、排卵まで持続する（McGrathら、1995；Elvinら、2000）。雌Gdf9 ノックアウトマウスは3b型（一次）卵胞段階で卵胞形成が妨害され、顆粒膜細胞の成長および分化、莢膜細胞形成および卵母細胞の減数分裂能力の欠損を伴うので、不妊である（Dongら、1996；Carabatsosら、1998；Elvinら、1999A）。また、組換えGDF-9は、ヒアルロナンシンターゼ2（Has2）、シクロオキシゲナーゼ2（Cox2）、ステロイド産生急性調節タンパク質（StAR）、プロスタグランジンE2受容体EP2、ペンタラキシン（pentaraxin）3、LH受容体およびuPAをコードする遺伝子の発現に影響を及ぼす（Elvinら、1999B；Elvinら、2000）。
【０００７】
視床下部-下垂体-性腺軸の鍵タンパク質を同定するために、重要なノックアウトマウスモデルが、卵巣欠損を持つ4つのモデルを含めて、いくつか作出されている。性腺/下垂体ペプチドであるインヒビンが欠損しているマウスは、わずか4週齢で現れる卵巣腫瘍または精巣腫瘍の発症により、続発性不妊を呈する（Matzukら、1992）。II型アクチビン受容体（Acvr2）が欠損しているマウスは成体期まで生き延びるが、生殖欠損を示す。雄マウスには精巣サイズの低下がみられ、妊性の遅延が認められる（Matzukら、1995）。これに対して、雌マウスは初期胞状卵胞段階での卵胞形成に不妊につながる障害を持つ。FSHホメオスタシスにアクチビンが果たす既知の役割と合致して、これらのAcvr2ノックアウトマウスでは、下垂体FSHレベルと血清中FSHレベルの両方が劇的に低下する。FSHb遺伝子の突然変異のせいでFSHが欠損している雌マウスは不妊である（Kumarら、1997）。しかしこれらのマウスでは、胞状卵胞形成の前に、早期に卵胞形成が妨害される。したがって、FSHは多層前胞状卵胞の形成には必要ないが、胞状卵胞形成への進行には必要である。最後に、成長分化因子９（Gdf9）ノックアウトマウスを使って、卵胞発育のどの段階でGDF-9が必要とされるかが決定されている（Dongら、1996）。卵巣内では、Gdf9mRNAの発現は卵母細胞に限定され、初期の単層一次卵胞段階で認められ、排卵まで持続する。GDF-9が存在しないと、一次卵巣段階を越えて正常な卵胞を呈示することができない卵巣になる。単層の顆粒膜細胞によって取り囲まれた卵母細胞が存在し、それらは組織学的には正常であるように見えるが、正常な二層型の卵胞は存在しない。単層段階を越えた卵胞は異常であり、異型顆粒膜細胞を含み、これらの細胞の非対称な成長を示す。さらにまた、光学顕微鏡および電子顕微鏡によると、これらのGdf9ノックアウト卵巣では、莢膜細胞層が形成されない（Dongら、1996；Elvinら、1999）。したがって、体細胞によって合成され卵母細胞成長に影響を及ぼすkitリガンドおよび他の成長因子とは対照的に、GDF-9は体細胞機能に必要な卵母細胞由来成長因子として互恵的に機能する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、3つの卵巣特異的および卵母細胞特異的ポリヌクレオチド配列、O1-180（配列番号1、配列番号11、配列番号12、配列番号13）、O1-184（配列番号3）およびO1-236（配列番号5、配列番号7、配列番号8；配列番号10および配列番号14）、それらがコードするタンパク質産物、その断片および誘導体、ならびにこれらのタンパク質産物と免疫反応する抗体を提供する。これらの遺伝子およびそのタンパク質産物は、さまざまな細胞増殖性障害または細胞変性障害、特に卵巣腫瘍が関わるもの、例えば胚細胞腫瘍および顆粒膜細胞腫、または不妊、例えば早発性卵巣機能不全などに関係するようである。
【０００９】
したがって一態様として、本発明は、O1-180、O1-184またはO1-236に関係する卵巣起源の細胞増殖性障害または細胞変性障害を検出する方法を提供する。もう一つの態様として、本発明は、O1-180、O1-184またはO1-236の異常な発現レベルと関係する細胞増殖性障害または細胞変性障害を、それぞれの活性を抑制または強化することによって処置する方法を提供する。
【００１０】
特定の一態様として、本発明は、薬学的に許容できる担体中に分散したO1-180、O1-184および/またはO1-236発現のモジュレーターを含む医薬組成物を提供する。本モジュレーターはO1-180、O1-184および/またはO1-236遺伝子の転写を抑制または増進することができる。本モジュレーターは、ポリペプチド配列、タンパク質、小分子、またはポリヌクレオチド配列でありうる。具体的に述べると、ポリヌクレオチド配列はDNAまたはRNAである。さらなる態様では、本ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結した状態で発現ベクターに含まれる。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、薬学的に許容できる担体中に分散したO1-180、O1-184および/またはO1-236活性のモジュレーターを含む医薬組成物である。本組成物はO1-180、O1-184および/またはO1-236活性を阻害または刺激しうる。本組成物はタンパク質、ポリペプチド配列、小分子またはポリヌクレオチド配列でありうる。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、避妊を調整する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-180、O1-184および/またはO1-236活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を減少させることのできる方法である。動物は雄でも雌でもよい。
【００１３】
もう一つの態様は、妊性を強化する方法であって、薬理学的に許容できる担体中に分散したO1-180、O1-184および/またはO1-236活性のモジュレーターの有効量を動物に投与することを含み、前記の量が受胎を増加させることのできる方法である。
【００１４】
さらにもう一つの態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236活性のモジュレーターのスクリーニング方法であって、O1-180、O1-184および/またはO1-236ポリペプチドを発現させる細胞を用意するステップ、前記細胞を候補モジュレーターと接触させるステップ、O1-180、O1-184および/またはO1-236発現を測定するステップ、および候補モジュレーター存在下でのO1-180、O1-184および/またはO1-236発現を、候補モジュレーター不在下でのO1-180、O1-184および/またはO1-236発現の発現と比較するステップを含み、候補モジュレーター不在下でのO1-180、O1-184および/またはO1-236の発現と比較した、候補モジュレーター存在下でのO1-180、O1-184および/またはO1-236の発現の相違により、当該候補モジュレーターが、O1-180、O1-184および/またはO1-236発現のモジュレーターであると同定される方法である。
【００１５】
本発明の一特定態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236の活性を調整する化合物を同定する方法であって、単離されたO1-180、O1-184および/またはO1-236ポリペプチドまたはその機能等価物を取得するステップ、O1-180、O1-184および/またはO1-236ポリペプチドまたはその機能的等価物を候補化合物と混合するステップ、およびO1-180、O1-184および/またはO1-236の活性に対する前記候補化合物の効果を測定するステップを含む方法である。
【００１６】
もう一つの態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236の活性を調整する化合物のスクリーニング方法であって、O1-180、O1-184および/またはO1-236またはそのO1-180、O1-184および/またはO1-236結合断片を候補化合物に暴露すること、および前記化合物がO1-180、O1-184および/またはO1-236またはそのO1-180、O1-184および/またはO1-236結合パートナーに結合するかどうかを決定すること、そしてさらに前記化合物がO1-180またはO1-180と結合パートナーとの相互作用を調整するかどうかを決定することを含む方法である。
【００１７】
さらにもう一つの態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236と結合する相互作用化合物のスクリーニング方法であって、O1-180、O1-184および/またはO1-236タンパク質またはその断片をある化合物に暴露すること、および前記化合物がO1-180、O1-184および/またはO1-236に結合したかどうかを決定することを含む方法である。
【００１８】
もう一つの態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって、（1）調節可能な1つまたは複数のO1-180、O1-184および/またはO1-236タンパク質遺伝子、（2）1つまたは複数のO1-180、O1-184および/またはO1-236タンパク質遺伝子のノックアウト、または（3）1つまたは複数のO1-180、O1-184および/またはO1-236タンパク質遺伝子のノックイン、を持つトランスジェニック動物の群を用意すること、トランスジェニック動物の群に対してそれぞれ対照動物からなる第2の群を用意すること、およびトランスジェニック動物群および対照動物群を候補O1-180、O1-184および/またはO1-236調整化合物に暴露すること、およびトランスジェニック動物群と対照動物群とを比較すること、およびトラスジェニック動物における不妊または妊性に関係する1つまたは複数のタンパク質に対する当該化合物の効果を対照動物と比較して決定することを含む方法である。
【００１９】
特定の態様として、本発明は、ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出する方法であって、選択した表現型を検出するのに適した条件下で少なくとも1つの真核細胞を培養すること［ここに、前記細胞は、転写活性化タンパク質DNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型をもたらす）を含む］、選択した表現型をもたらすレポーター要素の発現レベルを決定することによって前記ペプチド結合対の結合相互作用を検出することを含み、前記第1または第2ペプチドがO1-180、O1-184および/またはO1-236ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは生殖組織内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法を提供する。特定の態様では、生殖組織が卵巣または精巣である。他の生殖組織として子宮、膣、卵管、頸部、性腺、輸精管、前立腺、精嚢および精巣上体も挙げることができる。
【００２０】
もう1つの態様は、ペプチド結合対の第1ペプチドと第2ペプチドの結合相互作用を検出するためのレスキュースクリーンであって、選択した表現型を検出するためまたはそのような表現型の不在を検出するための条件下で少なくとも1つの真核細胞を培養すること（ここに、前記細胞は、転写活性化タンパク質のDNA結合ドメインに接合された第1ペプチドまたはそのセグメントを含む第1異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに接合された第2ペプチドまたはそのセグメントを含む第2異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ここでは、第1ペプチドまたはそのセグメントと第2ペプチドまたはそのセグメントとの結合によって、転写活性化タンパク質が復元される）、および復元された転写活性化タンパク質の正の転写制御を受けて活性化されるレポーター要素（ここでは、前記レポーター要素の発現が、選択した表現型の発揮を妨げる）、選択した表現型の発揮を妨げるレポータ要素の発現に試験ペプチドが影響を及ぼすかどうかを決定することによってO1-180、O1-184および/またはO1-236と相互作用する試験ペプチドの能力を検出すること、を含み、前記第1または第2ペプチドがO1-180、O1-184および/またはO1-236ペプチドであり、他方が試験ペプチド、好ましくは生殖組織内に存在する選択されたペプチド/タンパク質である方法である。特定の態様では、生殖組織が卵巣または精巣である。
【００２１】
さらにもう一つの態様は、O1-180、O1-184および/またはO1-236の結合パートナーを同定する方法であって、当該タンパク質を結合パートナー候補に暴露するステップ、および前記結合パートナー候補がO1-180、O1-184および/またはO1-236に結合するかどうかを決定するステップを含む方法である。
【００２２】
本発明は、卵巣の発育および機能を研究するための、重要なインビトロおよびインビボ試薬を提供する。これらの試薬の考えうる用途は広範囲にわたり、発生の研究道具としての使用から癌に対する治療用試薬にまで及ぶと予想される。これら新規卵巣遺伝子産物の主用途は、婦人の排卵を可逆的または不可逆的に妨害するための候補避妊手段を評価するための試薬として、それらを使用することである。これらの新規卵巣遺伝子産物は、いくつかの形態のヒト不妊または婦人科癌もしくは他の生殖組織関連癌に関係するこれらのシグナリング経路の構成要素における遺伝子突然変異に関するスクリーニングにも役立つと予想される。また、これらの遺伝子またはシグナリング経路に突然変異を持つヒトの表現型によっては、本発明者らは、これらの新規卵巣遺伝子産物を試薬ツールとして使用することにより、母性効果遺伝子として、卵形成、卵胞形成および/または初期胚形成をさらに研究するための突然変異マウスをいくつか作出しようと考えるだろう。そのようなノックアウトマウスモデルにより、女性の生殖におけるこれらの遺伝子産物の役割に関する重要な洞察が得られ、新しい避妊手段を評価するための実用的試薬としてこれらの遺伝子産物を使用することが可能になる。
【００２３】
上記の説明は、以下に述べる本発明の詳細な説明がより良く理解されるように、本発明の特徴および技術上の利点をかなり大まかに概説したものである。以下に、本願特許請求の範囲の主題を形成する本発明の他の特徴および利点を説明する。本明細書に開示する概念および特定態様は、同じ本発明の目的を果たすために他の構造を変更または設計する際の基礎としてすぐに利用できることは、当業者には理解されるはずである。また、そのような等価な構築物は本願特許請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲から逸脱しないことも、当業者にはわかるはずである。その構成と作動方法の両方に関して本発明に特有であると考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と一緒に考慮することにより、より良く理解されるだろう。ただし、各図面は本発明を例示し説明するためだけにあるのであって、各図面が本発明の範囲を規定するものではないことは、明確に理解すべきである。
【００２４】
本発明がより完全に理解されるように、添付の図面を参照して、本発明を以下に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本願に開示する発明には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、さまざまな態様および変更が可能であることは、当業者には明白である。
【００２６】
本願において、特許請求の範囲および/または明細書中に「を含む（comprising）」という用語と一緒に「a」または「an」という単語を使用する場合、これは「1つ」を意味しうるが、「1つ以上」「少なくとも1つ」および「1つまたは複数」の意味とも一致する。
【００２７】
本明細書で使用する「動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ゾウ、ネコ、イヌ、ラットまたはマウスなどの哺乳動物を指す。特定の態様では、動物はヒトである。
【００２８】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、例えばIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEなどの任意の免疫学的結合剤を、広く表すものとする。一般的にはIgGおよび/またはIgMが好ましい。なぜなら、これらは、生理学的状況でもっともよく見られる抗体であり、研究室でも最も容易に作製することができるからである。したがって当業者であれば、「抗体」という用語は、抗原結合領域を持つ任意の抗体様分子を指し、例えばFab'、Fab、F(ab')2、単独ドメイン抗体（DAB）、Fv、scFv（単鎖Fv）などの抗体断片を包含すると理解する。抗体に基づくさまざまなコンストラクトおよび断片を製造し使用するための技術は、当技術分野ではよく知られている（例えば「Antibodies: A Laboratory Manual」（コールドスプリングハーバー研究所, 1988）を参照されたい）。
【００２９】
本明細書で使用する「結合タンパク質」という用語は、特定のリガンドに対して結合親和性を示すタンパク質を指す。結合タンパク質は、別々の相異なる遺伝子から産生されうる。ある与えられたリガンドに関して、特定の遺伝子から産生される結合タンパク質は、受容体のリガンド結合ドメインまたはその可溶性受容体とは異なる。
【００３０】
本明細書で使用する「受胎」という用語は、雄の精子と雌の卵子の合体、受精を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「避妊」という用語は、受胎の防止または妨害を指す。したがって避妊具は、受胎を防止する任意のプロセス、器具、または方法を指す。よく知られている避妊手段の種類には、ステロイド、化学的障壁、物理的障壁、化学的障壁と物理的障壁の併用、問題にしている生殖抗原に対する抗体を投与するかまたは投与された生殖抗原に対して自然の免疫応答を発生させることによる免疫避妊方法の使用、禁欲および永久的な外科手術などがある。避妊手段は雄または雌に適用することができる。
【００３２】
本明細書で使用する「DNA」という用語はデオキシリボ核酸と定義される。
【００３３】
本明細書で使用する「DNAセグメント」という用語は、ある特定種のゲノムDNA全体からは分離されているDNA分子を指す。「DNAセグメント」という用語には、DNAセグメントと、そのようなセグメントよりも小さい断片が包含され、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターも包含される。
【００３４】
本明細書で使用する「発現コンストラクト」または「導入遺伝子」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸を含んでいて、その核酸コード配列の一部または全部が転写を受ける能力を持つ、あらゆるタイプの遺伝子コンストラクトと定義され、ベクターに挿入することができる。転写物はタンパク質に翻訳されるが、その必要はない。ある態様では、遺伝子の転写とmRNAの遺伝子産物への翻訳との両方が、発現に含まれる。別の態様では、問題にしている核酸コード遺伝子の転写だけが、発現に含まれる。本発明では、発現コンストラクトまたは導入遺伝子を指すために「治療用コンストラクト」という用語を使用する場合もある。本発明が、不妊を処置するための治療法として発現コンストラクトまたは導入遺伝子を利用することは、当業者であればわかる。さらに本発明では、発現コンストラクトまたは導入遺伝子を、避妊のための「予防用コンストラクト」として利用する。したがって「予防用コンストラクト」は避妊手段である。
【００３５】
本明細書で使用する「発現ベクター」という用語は、ある遺伝子産物の少なくとも一部をコードしていて転写されうる核酸配列を含んでいるベクターを指す。一部の例では、RNA分子がさらにタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。また、他の例、例えばアンチセンス分子またはリボザイムを製造する例では、これらの配列は転写されない。発現ベクターはさまざまな制御配列を含むことができる。制御配列とは、特定の宿主生物内で作動的に連結されたコード配列の転写に必要な、そして場合によっては翻訳に必要な核酸配列を指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する制御配列だけでなく、他の機能も果たす後述の核酸配列も含むことができる。
【００３６】
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位を簡潔に示すために用いられる。この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および突然変異体を発現させるか、またはそれらを発現させるように改造することができる、ゲノム配列、cDNA配列および操作されたセグメントを包含する。例えば、「天然遺伝子」という用語が、自分自身の調節配列を持つ自然界に見いだされるままの遺伝子を指し、「キメラ遺伝子」という用語が、自然界では一緒には見いだされない調節配列とコード配列を含む天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指すことは、当業者には知られている。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列とコード配列、または同じ供給源に由来するが自然界に見いだされる配置とは異なる形で配置されている調節配列とコード配列を含みうる。
【００３７】
本明細書で使用する「妊性」という用語は、生殖能力を持つまたは受胎能力を持つという特性を指す。妊性は雄性動物にも雌性動物にも関係する。
【００３８】
「過剰増殖性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖によって起こる疾患と定義される。過剰増殖性疾患はさらに癌と定義される。細胞の過剰増殖は、無秩序な成長、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移をもたらす。代表的な過剰増殖性疾患には、例えば癌または自己免疫疾患などが含まれる。他の過剰増殖性疾患には、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化、または炎症性腸疾患を含めることができる。
【００３９】
本明細書で使用する「不妊」という用語は、受胎または子孫を生む能力がないか、その能力の低下を指す。不妊は雄または雌に存在しうる。本発明では、不妊を強化するためまたは妊性を低下させるために行われる組成物の投与は可逆的である。
【００４０】
本明細書で使用する用語「O1-180」と「Oo1」は可換である。
【００４１】
本明細書で使用する用語「O1-236」、「Npm2」または「NPM2」は可換である。
【００４２】
本明細書で使用する「ペプチド結合対」という用語は、既知の結合親和性を持ち、そのDNA配列がわかっているまたは推定することができる、任意のペプチド対を指す。ペプチド結合対のペプチドは、改変細胞の他のどの成分に対しても、互いに選択的な結合を示さなければならない。
【００４３】
本明細書にいう「薬学的に許容できる担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野ではよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除き、治療用および/または予防用組成物への使用が考えられる。組成物には追加活性成分も組み込むことができる。
【００４４】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書にいう核酸とポリヌクレオチドとは可換である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを「ヌクレオチド」モノマーに加水分解できるという一般知識を持っている。ヌクレオチドモノマーはヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書にいうポリヌクレオチドには、例えば当技術分野で利用できる任意の手段によって得られる核酸配列、例えば組換え手段（すなわち通常のクローニング技術およびPCR（登録商標）などを使って組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから行われる核酸配列のクローニングなど）によって得られる核酸配列、および合成手段によって得られる核酸配列がすべて含まれるが、これらに限るわけではない。さらに、ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの突然変異、例えば当技術分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの突然変異などを包含することは、当業者には知られている。
【００４５】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、通常一定の配列を有するアミノ酸残基の鎖と定義される。本明細書で使用する用語ポリペプチドは、用語「ペプチド」および「タンパク質」と可換である。
【００４６】
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列であって、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なDNA配列と定義される。
【００４７】
本明細書で使用する「精製されたタンパク質またはペプチド」という用語は、他の成分から分離することができる組成物を指すものとし、タンパク質またはペプチドは、その天然に得られる状態と比較して、任意の程度に精製される。したがって精製されたタンパク質またはペプチドは、それが天然に存在しうる環境から解放されたタンパク質またはペプチドも指す。
【００４８】
本明細書で使用する「RNA」という用語はリボ核酸と定義される。
【００４９】
本明細書で使用する「RNA干渉」または「iRNA」という用語は、問題にしている特定遺伝子を抑制するために用いられるRNA分子である。
【００５０】
本明細書で使用する「転写制御下」または「作動的に連結」という用語は、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するための核酸に対して、遺伝子のプロモーターが正しい位置および向きにあることと定義される。
【００５１】
卵巣の生理機能、受精および初期分割事象に重要な機能を果たしうる他の新規卵巣発現遺伝子を同定することを目指して、本発明者らはサブトラクティブハイブリダイゼーション法を使用した。卵形成、卵胞形成、受精および/または初期胚形成の調節に重要ないくつかの新規卵母細胞発現遺伝子が、本発明者らによって同定された。これらの卵母細胞特異的遺伝子産物の一つ、ヌクレオプラスミン2（O1-236またはNPM2）は、アフリカツメガエル・ヌクレオプラスミン（xNPM2）の哺乳類オルソログである（Burglinら、1987；Dingwallら、1987）。NMP2の207アミノ酸オープンリーディングフレームは、ヌクレオプラスミンまたはヌクレオフォスミンと呼ばれるタンパク質のファミリーに対して高いホモロジーを示した（呼称＝種：NPM2ヒト遺伝子、Npm2 マウス遺伝子、およびXnpm2アフリカツメガエル遺伝子；NPM2＝あらゆる種のタンパク質）。ヒトヌクレオフォスミン遺伝子（NPM1, NO38とも呼ばれる；アクセッション番号M23613）はヒト染色体5q35に位置し、294アミノ酸のタンパク質をコードし、マウス（Npm1、B23とも呼ばれる, アクセッション番号Q61937）およびアフリカツメガエル（Xnpm1またはN038、アクセッション番号X05496）にオルソログを持つ。マウス19番染色体にマッピングされているマウスヌクレオプラスミン/ヌクレオフォスミンホモログNpm3は、175アミノ酸のタンパク質［アクセッション番号U64450（MacArthurおよびShackleford、1997a）］をコードし、ヒトNPM3ホモログ遺伝子（アクセッション番号AF081280）があるようである。Npm2とは対照的に、Npm1およびNpm3遺伝子は遍在的に発現し、マウスNpm2遺伝子の構造はマウスNpm3遺伝子と比べるとかなり異なっている（MacArthurおよびShackleford、1997a）。
【００５２】
本発明者らは、Npm2 cDNA配列を使って、マウスNpm2遺伝子およびヒトNPM2 cDNAおよび遺伝子を取得し、これらの遺伝子をマッピングした。Npm2を欠くマウスは、初期受精後分割事象に異常があるために、妊性に欠損を持つ。アフリカツメガエル卵母細胞および卵子中に最も豊富に存在する核タンパク質の哺乳類ホモログの発見（KrohneおよびFranke、1980a；Millsら、1980）は、哺乳動物における卵形成、受精および受精後発生の明確な理解にとって重要であり、またおそらくは哺乳類クローン化実験に必要なさらなる卵母細胞因子を明らかにするためにも重要である。
【００５３】
また、いくつかの研究により、ヌクレオプラスミンのリン酸化はその機能に影響を及ぼすことが示されている。卵母細胞（すなわち卵巣中にあるもの）と卵子（すなわち排卵後、受精準備が整ったもの）から得られる形態のヌクレオプラスミンを比較すると、リン酸化のレベルに劇的な相違が認められる。アフリカツメガエル卵子ヌクレオプラスミンは、卵母細胞型よりもかなり大きく、リン酸化の相違によりSDS-PAGE上で約15,000ダルトン大きく移動する（Sealyら、1986）。ヌクレオプラスミンは卵子では約20個のリン酸基/タンパク質を持つのに対して、卵母細胞では＜10リン酸基/タンパク質であり、卵子キナーゼ調製物は卵母細胞ヌクレオプラスミンを修飾して卵子型に似るようにすることができる（Cottenら、1986）。機能面では、ヌクレオプラスミンのこの過剰リン酸化は、その核輸送を刺激すると共に（Vancurovaら、1995）、より活性な形態をもたらして、ヌクレオソーム構築の増加（Sealyら、1986）および精子脱凝縮（Lenoら、1996）につながる。過剰リン酸化型のヌクレオプラスミンはアフリカツメガエル胚形成の初期段階にも存在し、そこでは、速い細胞周期およびDNA複製中になんらかの機能を果たすと考えられている（Burglinら、1987）。カエルNPM2と哺乳類NPM2ではセリン残基とスレオリン残基の割合が高いことから、哺乳類ヌクレオプラスミン2のリン酸化も哺乳類卵子で同様の役割を持つことが示唆される。リン酸化は、NPM2がいつ作用するかを調節して、重要な時（すなわち雄性および雌性前核へのヒストン付加または転写停止時）までNPM2を不活性にしておく働きをすることができるだろう。カエルNPM2にも哺乳類NPM2にも多数の推定キナーゼ部位が存在するが、カゼインキナーゼIIはヌクレオプラスミンと特異的に相互作用して、それをリン酸化し、カゼインキナーゼIIの阻害剤はアフリカツメガエルヌクレオプラスミンの核輸送を遮断することができる（Vancurovaら、1995）。興味深いことに、予想されるカゼインキナーゼIIリン酸化部位のうちの2つが、カエル・ヌクレオプラスミン2（Ser125およびSer177）、マウスNPM2（Thr123およびSer184）ならびにヒトNPM2（Thr127およびSer191）の間で保存されている。他のリン酸化部位も重要だと思われるが、インビボでのカゼインキナーゼII-NPM2相互作用が哺乳動物でも予想できるだろう。
【００５４】
本発明は3つの新規タンパク質O1-180（配列番号2、配列番号16）、O1-184（配列番号4）、O1-236（配列番号6、配列番号9）、それらをコードするポリヌクレオチド配列、ならびにその断片および誘導体を提供する。O1-180、O1-184、O1-236の発現は高度に組織特異的であり、主に卵巣組織の細胞で発現される。一態様として本発明は、O1-180、O1-184またはO1-236の発現と関係する卵巣の細胞増殖性障害または細胞変性障害を検出する方法を提供する。もう一つの態様として本発明は、O1-O1-180、O1-184、O1-236の異常な発現と関係する細胞増殖性障害または細胞変性障害を、それぞれの活性を抑制または強化する薬剤を使って処置する方法を提供する。
【００５５】
数多くの他の卵巣特異的タンパク質が持っている既知の活性に基づいて、O1-180、O1-184およびO1-236ならびにその断片および誘導体も、それらを診断用試薬および治療用試薬として有用にするような生物学的活性を持つだろうと期待することができる。
【００５６】
例えばGDF-9はO1-180、O1-184およびO1-236と同様の発現パターンを持つ卵母細胞発現遺伝子産物である。GDF-9を欠くマウスは卵胞発達の極めて初期の段階、単層一次卵胞段階で不妊であることが明らかにされている（Dongら）。これらの研究は、GDF-9機能を遮断する薬剤が避妊薬としてヒト女性に有用であるだろうということを証明している。O1-180、O1-184およびO1-236は卵母細胞でGDF-9とほぼ同じ発現パターンを持つので（図2）、上記の知見は、これらの遺伝子産物のすべてのいずれかを欠くマウスおよびヒトまたは他の任意の哺乳動物もまた不妊であるだろうということを示唆している。したがってこれらの遺伝子産物のいずれかまたはすべての機能を遮断すれば、避妊作用が得られるだろう。
【００５７】
卵巣特異的な発現をすることが見出されているもう一つの調節タンパク質は、FSHの下垂体分泌の特異的かつ強力なポリペプチド阻害物質インヒビンである。インヒビンは卵巣濾胞液から単離されている。インヒビンはFSHを抑制するので、雄でも雌でも避妊手段候補として提案されている。O1-180、O1-184およびO1-236も卵巣特異的ペプチドであるから、これらも類似する生物学的活性を持ちうる。インヒビンは一定の卵巣腫瘍のマーカーとして役立つことも示されている（Lappohnら、1989）。O1-180、O1-184、O1-236も卵巣起源の原発性および転移性新生物を同定するためのマーカーとして役立ちうる。また、インヒビンを欠くマウスは、顆粒膜細胞腫を発症する（Matzukら、1992）。同様に、O1-180、O1-184およびO1-236は、出生前スクリーニング法において、発生異常または生殖異常の指標として役立ちうる。
【００５８】
精巣によって産生され雄の胚で起こるミュラー管の退化を担っているミュラー管抑制因子（MISまたは抗ミュラーホルモン）ペプチドは、ヌードマウスにおけるヒト卵巣癌の成長を抑制することが示されている（Donahoeら、1981）。O1-180、O1-184およびO1-236も同様に機能する可能性があり、したがって例えば卵巣癌処置剤などの抗癌剤の標的になりうる。
【００５９】
O1-180、O1-184およびO1-236タンパク質、そのアゴニストおよびアンタゴニストは、哺乳動物（例えばヒト）の妊性を抑制する（例えば避妊薬として作用する）薬剤を同定するために使用できる。また、O1-180、O1-184およびO1-236ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、哺乳動物の妊性を強化する（例えばインビボまたはインビトロ受精の成功率を向上させる）薬剤を同定するためにも使用できる。また、これらの卵母細胞発現遺伝子産物または類縁の卵母細胞発現遺伝子産物のアッセイを、不妊の型（例えばこれらの遺伝子産物の活性を解析するアッセイで）または他の疾患（例えば胚細胞腫瘍、多嚢胞性卵巣症候群）を検出するための診断アッセイとして利用することもできる。さらに、これらのタンパク質またはこれらの経路に作用する薬剤は成長刺激因子として機能する可能性もあり、したがってさまざまな細胞集団のインビトロでの生存に役立ちうる。特にO1-180、O1-184および/またはO1-236が卵母細胞の成熟に関与するのであれば、それらは、例えば体外受精法の成功率を向上させる際の有用な標的になりうる。
【００６０】
A．タンパク質
本発明は、O1-180（配列番号2、配列番号16）、O1-184（配列番号4）およびO1-236（配列番号6、配列番号9）ポリペプチド、タンパク質、またはその薬剤に関する。
【００６１】
本発明は、完全なO1-180、O1-184またはO1-236分子だけでなく、後述する機能を保っていても保っていなくてもよい、それらポリペプチドの断片にも関係する。分子のN末端を含む断片は、遺伝子操作でコード領域内に翻訳停止部位を作ることによって作製することができる。あるいは、O1-180、O1-184またはO1-236を、プロテアーゼと呼ばれるタンパク質分解酵素で処理することによって、さまざまなN末端断片、C末端断片および内部断片を製造することもできる。タンパク質の断片は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号9および配列番号16の配列の連続する6個のアミノ酸と同一な連続する6個のアミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を含有する任意のペプチドを包含すると理解される。配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号9および配列番号16の配列のいずれかの、対応する数のアミノ酸と同一な、連続する7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、200個またはそれ以上のアミノ酸を含有する断片も考えられる。断片は抗体の作製に使用することができる。特に有用な断片はO1-180、O1-184またはO1-236のドメインを構成する断片だろう。ドメインは、そのタンパク質の残りの部分がなくても保たれる独立した三次構造を持つタンパク質の一部と定義される。そのような構造は当業者に知られる技術によって見つけることができる。タンパク質をサブチリシン、トリプシン、キモトリプシンなどのプロテアーゼで部分消化した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてタンパク質断片を分離する。次に、それらの断片をPVDF膜に転写し、マイクロシークエンシングにかけて、それらの断片のN末端のアミノ酸配列を決定することができる。
【００６２】
本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、他のタンパク質、脂質、糖質、またはO1-180、O1-184およびO1-236に天然に付随している他の物質を実質的に含まないO1-180、O1-184およびO1-236を指す。当業者は標準的なタンパク質精製法を使ってO1-180、O1-184およびO1-236を精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲルで単一の主要バンドを与えるだろう。O1-180、O1-184およびO1-236ポリペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列分析によって決定することもできる。O1-180、O1-184およびO1-236ポリペプチドには、それらポリペプチドの機能的断片も、それらの活性が残っている限り包含される。O1-180、O1-184およびO1-236の生物学的活性を持つ、さらに小さいペプチド。
【００６３】
本発明のポリペプチドには、本明細書に開示する配列およびその保存的変異体が包含される。本明細書で使用する「保存的変異」という用語は、あるアミノ残基の、生物学的に類似する別の残基による置換を意味する。保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基の1つによる別の疎水性残基の置換、または極性残基の1つによる別の極性残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンよるアスパラギンの置換などがある。「保存的変異」という用語は、置換ポリペプチドに対して産生させた抗体が無置換ポリペプチドとも免疫反応するという条件で、無置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも包含する。
【００６４】
組換えO1-180、O1-184およびO1-236一次アミノ酸配列の軽微な改変は、本明細書に記載の各O1-180、O1-184およびO1-236ポリペプチドと比較して、実質的に等価な活性を持つタンパク質をもたらしうる。そのような改変は部位特異的突然変異誘発による場合のように意図的であってもよいし、自然発生的であってもよい。これらの改変によって生成するポリペプチドはすべて、O1-180、O1-184またはO1-236の生物学的活性がまだ存在する限り、本発明に包含される。さらに、1個または複数個のアミノ酸の欠失も、その生物学的活性を有意に変化させずに、結果として生じる分子の構造の改変をもたらすことができる。これは、より広い用途を持つであろうさらに小さい活性分子の開発につながりうる。例えばO1-180、O1-184またはO1-236の生物学的活性には必要とされないかもしれないアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することができるだろう。
【００６５】
「誘導体」という用語は、本発明では、対象化合物を修飾することによって製造され、誘導体化された化合物の活性を破壊しない、通常の専門家の技術で製造し使用することができる任意の分子を意味するものとする。誘導体化された化合物の活性を減少させるが破壊はしない上記の基準に合致する化合物は、「誘導体」という用語の範囲に含まれるとみなす。したがって本発明では、O1-180、O1-184またはO1-236の配列と一致する配列のアミノ酸を含む化合物の誘導体は、それが測定可能な量のO1-180、O1-184またはO1-236の活性を保っている限り、O1-180、O1-184またはO1-236の配列と正確に一致するアミノ酸の配列を含む必要はない。
【００６６】
同様に、対抗性（例えば拮抗性）を持つタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作製する場合も、同じように考えることができる。このことと、O1-180、O1-184またはO1-236突然変異体または類似体の作製が行われうる本発明との間には、関連がある。例えばO1-180、O1-184またはO1-236突然変異体を作製し、O1-180、O1-184またはO1-236活性について試験して、O1-180、O1-184またはO1-236活性にとって重要な残基を同定することができる。ヒト集団に存在し、癌の発生に関連づけられるO1-180、O1-184またはO1-236突然変異体を再現するために、O1-180、O1-184またはO1-236突然変異体を合成することもできる。また、妊性を抑制または強化するために、O1-180、O1-184またはO1-236突然変異体をアンタゴニストとして使用することもできる。したがってO1-180、O1-184またはO1-236突然変異体は、避妊組成物候補および/または妊性強化組成物候補として使用することができる。
【００６７】
B．核酸
本発明はO1-180（配列番号1、配列番号11、配列番号13および配列番号12）、O1-184（配列番号3）またはO1-236（配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10および配列番号14）タンパク質をコードするポリヌクレオチドならびにその断片および誘導体も提供する。これらのポリヌクレオチドには、O1-180、O1-184またはO1-236をコードするDNA、cDNAおよびRNA配列が包含される。O1-180、O1-184および/またはO1-236の全部または一部をコードするポリヌクレオチドもすべて、それらがO1-180（配列番号1、配列番号11、配列番号13および配列番号12）、O1-184（配列番号3）またはO1-236（配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10および配列番号14）の活性を持つポリペプチドをコードする限り、ここに包含されると理解される。そのようなポリヌクレオチドには、自然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図的に操作したポリヌクレオチドが包含される。例えばO1-180（配列番号1、配列番号11、配列番号13および配列番号12）、O1-184（配列番号3）またはO1-236（配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10および配列番号14）のポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。O1-180、O1-184およびO1-236のポリヌクレオチド配列にはアンチセンス配列も包含される。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝コードの結果として縮重している配列が包含される。天然アミノ酸は20種類あるが、その大半は2以上のコドンによって指定される。したがってすべての縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によってコードされるO1-180、O1-184およびO1-236ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、本発明に包含される。
【００６８】
本発明のDNA配列は、いくつかの方法で取得することができる。例えば、本DNAは当技術分野で周知のハイブリダイゼーション法または増幅法を使って単離することができる。そのような方法には、例えば1）ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーションによる相同ヌクレオチド配列の検出、2）発現ライブラリーの抗体スクリーニングによる、共通する構造上の特徴を持つクローン化DNA断片の検出、または3）これらの配列に関係するオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応技術の使用などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６９】
本発明のO1-180、O1-184およびO1-236ポリヌクレオチドは、好ましくは哺乳類生物に由来し、最も好ましくはマウス、ラット、ゾウ、ブタ、ウシまたはヒトに由来する。核酸ハイブリダイゼーションに基づくスクリーニング方法は、適切なプローブを入手できるのであれば、任意の遺伝子配列を任意の生物から単離することを可能にする。問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。これにはアミノ酸配列の短いオリゴペプチドストレッチが既知でなければならない。タンパク質をコードするDNA配列は遺伝コードから推定することができるが、コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重している場合は混合付加反応を行なうことができる。これには変性二本鎖DNAの不均一混合物が含まれる。そのようなスクリーニングには、ハイブリダイゼーションを、好ましくは、一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAで行なう。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するmRNA配列の存在量が極めて低い供給源に由来するcDNAクローンの検出には特に有用である。言い換えると、非特異的結合を回避するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用すれば、例えばオートラジオグラフィーによる特異的cDNAの可視化を、その完全な相補体である混合物中の単一プローブへの標的DNAのハイブリダイゼーションによって行なうことが可能である（Wallaceら、1981）。
【００７０】
O1-180、O1-184およびO1-236をコードする特異的DNA配列の開発は、1）二本鎖DNA配列をゲノムDNAから単離すること、2）目的のポリペプチドに必要なコドンが得られるようにDNA配列を化学的に製造すること、および3）真核生物供与細胞から単離されるmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のインビトロ合成、によって達成することもできる。最後の例では、一般にcDNAと呼ばれるmRNAの二本鎖DNA相補体が最終的に生成する。
【００７１】
組換え法で使用される上記3つの特異的DNA配列開発法のなかでは、ゲノムDNA単離物の単離が最も一般的でない。これは、哺乳類ポリペプチドの微生物発現を達成することが望ましい場合には、イントロンの存在ゆえに、特にそうであるといえる。
【００７２】
DNA配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列がわかっている場合には、よく選択される方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列がわかっていない場合は、DNA配列の直接合成は不可能であり、cDNA配列の合成が選択される方法になる。目的のcDNA配列を単離するための標準的手順には、遺伝子発現レベルが高い供与細胞中の豊富なmRNAの逆転写によって得られるプラスミド型またはファージ型cDNAライブラリーの作製が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応技術と併用すると、希薄な発現産物でさえクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分がわかっている場合は、標的cDNA中に存在すると推定される配列を再現した標識一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の製造物を、一本鎖型に変性させたcDNAのクローン化コピーに対して行なわれるDNA/DNAハイブリダイゼーション法に使用することができる（Jayら、1983）。
【００７３】
lgt11などのcDNA発現ライブラリーは、少なくとも1つのエピトープを持つO1-180、O1-184および/またはO1-236ペプチドについて、O1-180、O1-184および/またはO1-236に特異的な抗体を使って、間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、O1-180、O1-184および/またはO1-236 cDNAの存在を示す発現産物を検出するために使用することができる。
【００７４】
O1-180、O1-184またはO1-236をコードするDNA配列は、適切な宿主細胞へのDNA導入によってインビトロで発現させることができる。「宿主細胞」は、その中でベクターが増殖することができ、そのDNAが発現される細胞である。この用語には、対象とする宿主細胞のどの子孫も包含される。複製中には突然変異が起こりうるので、確かに、すべての子孫が親細胞と同一なわけではないかもしれない。しかし「宿主細胞」という用語を使用する場合は、そのような子孫も包含される。当技術分野では安定な導入（これは外来DNAが宿主中に継続的に維持されることを意味する）の方法が知られている。
【００７５】
本発明では、O1-180、O1-184および/またはO1-236ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、O1-180、O1-184またはO1-236遺伝子配列の挿入または組込みによって操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野で知られる他の媒体を指す。そのような発現ベクターは、宿主に挿入された遺伝子配列の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは通例、複製起点、プロモーターならびに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含有する。本発明での使用に適したベクターには、例えば、細菌で発現させるためのT7系発現ベクター（Rosenbergら、1987）、哺乳類細胞で発現させるためのpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans、1988）および昆虫細胞で発現させるためのバキュロウイルス系ベクターなどがあるが、これらに限るわけではない。DNAセグメントは、例えばプロモーター（例：T7、メタロチオネイン1またはポリヘドリンプロモーター）などの調節配列に作動的に結合した状態でベクター中に存在することができる。O1-180、O1-184またはO1-236をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物で発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物を含めることができる。真核生物配列またはウイルス配列を持つDNA配列を原核生物で発現させる方法は、当技術分野ではよく知られている。当技術分野では、宿主内で発現および複製する能力を持つ生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドDNAベクターが知られている。本発明のDNA配列を組込むには、そのようなベクターが使用される。
【００７６】
組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られている従来の技術によって行なうことができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合は、指数増殖期後に収集し、次いで当技術分野で周知の方法を使ってCaCl2法で処理した細胞から、DNAを取り込む能力を持つコンピテント細胞を調製することができる。これに代えて、MgCl2またはRbClを使用することもできる。形質転換は、所望であれば宿主細胞のプロトプラストを形成させた後に行なうこともできる。
【００７７】
宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈物などのDNAトランスフェクション法、マイクロインジェクションなどの従来の機械的方法、エレクトロポレーション、リポソームに封入したプラスミドの挿入、またはウイルスベクターなどを使用することができる。真核生物細胞は、本発明のO1-180、O1-184またはO1-236 cDNA配列をコードするDNA配列と、選択可能な表現型をコードする第2の外来DNA分子（ネオマイシン耐性遺伝子など）とで、同時形質転換することもできる。もう一つの方法は、真核細胞を一過性に感染または形質転換してタンパク質を発現させるために、シミアンウイルス40（SV40）またはウシ乳頭腫ウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用することである（例えば「Eukaryotic Viral Vectors」（コールドスプリングハーバー研究所、Gluzman編、1982）を参照されたい）。
【００７８】
本発明が提供する微生物発現ポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分取用クロマトグラフィーや、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使う免疫学的分離を含む従来の手段によって行なうことができる。
【００７９】
本発明は、O1-180、O1-184またはO1-236ポリペプチドまたはその機能的断片と免疫反応する抗体を包含する。本質的にさまざまなエピトープ特異性を持つモノクローナル抗体がプールされてなる抗体ならびに個別のモノクローナル抗体が提供される。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、タンパク質の断片を含有する抗原から作製される（Kohlerら、Nature 256:495、1975）。本発明で使用する抗体という用語は完全な分子と、O1-180、O1-184またはO1-236上のエピトープ決定基を結合することができるその断片（例えばFabおよびF(ab')2など）とを包含するものとする。
【００８０】
C．診断用途
細胞変性障害という用語は卵巣中の任意のタイプの細胞の喪失を直接的または間接的に意味する。例えば、GDF-9の不在下では顆粒膜細胞の成長に障害があり、それが結果として卵母細胞の変性（すなわち死）につながる（Dongら、1996）。この卵母細胞の死は、顆粒膜細胞の分化をもたらすようである。また、GDF-9の不在下では、正常な莢膜細胞層が卵胞の周りに形成されない。したがって、1つの卵母細胞特異的タンパク質GDF-9が存在しないと、3種類の細胞系統、すなわち卵母細胞、顆粒膜細胞および莢膜細胞に欠損が生じる。同様にして、これらのさまざまな細胞系統の死または分化は、O1-180、O1-184またはO1-236の不在または不正発現による影響も受けるだろう。
【００８１】
O1-180、O1-184またはO1-236の不在または不正発現は、卵母細胞/卵子に、卵子が精子による受精を受けることができなくなるような欠損をもたらすだろう。あるいは、これらの卵母細胞由来因子の不在に付随して、胚が発育しないか、胚形成の初期段階で発育を停止するか、または受精に欠損を示すかもしれない。したがって、O1-180、O1-184またはO1-236組成物は不妊全般の診断指標または予後指標として利用することができる。より具体的には、点突然変異、欠失、挿入または調節の乱れを同定することができる。本発明ではさらに、O1-180、O1-184またはO1-236発現レベルの変化を検出する、不妊の診断が考えられる。
【００８２】
本発明の一態様はO1-180、O1-184またはO1-236発現の変化を検出する方法を含む。この方法は、発現したO1-180、O1-184またはO1-236のレベルを決定すること、または発現産物中の特異的改変を決定することを含みうる。特定の態様は、O1-180、O1-184またはO1-236の発現で変化が検出される。
【００８３】
生物学的試料は組織または体液であることができる。さまざまな態様には精巣および卵巣から得られる細胞が含まれる。他の態様には、膣液または精液などの体液試料が含まれる。
【００８４】
使用する核酸は、標準的な方法論に従って（Sambrookら、1989）、生物学的試料に含まれる細胞から単離される。核酸はゲノムDNA、分画された細胞RNAまたは全細胞RNAであることができる。RNAを使用する場合は、RNAを相補的DNA（cDNA）に変換することが望ましいかもしれない。ある態様ではRNAは全細胞RNAであり、別の態様ではポリA RNAである。通常、核酸は増幅される。
【００８５】
フォーマットに応じて、興味ある特定核酸は、試料中に、増幅を使って直接同定されるか、または増幅後に第2の既知核酸を使って同定される。次に、同定された産物を検出する。ある応用例では、この検出を視覚手段（例えばゲルの臭化エチジウム染色）によって行うことができる。あるいは、検出には、化学発光、放射性標識または蛍光標識の放射線シンチグラフィーによる、またさらには電気または熱インパルス信号を使ったシステムによる、産物の間接的同定が含まれる場合もある（Affymax Technology；Bellus、1994）。
【００８６】
検出に続いて、与えられた患者に見られる結果を、正常患者および不妊と診断された患者の統計的に有意な基準群と比較することができる。
【００８７】
O1-180、O1-184またはO1-236ポリヌクレオチド配列中の他の突然変異は、特定核酸中のヌクレオチド変化を検出することにより、本発明に従って同定することができると考えられる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,988,617号）。これに関して、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH；米国特許第5,633,365号および米国特許第5,665,549号、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、ダイレクトDNAシークエンシング、PFGE解析、サザンまたはノーザンブロット法、一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCA）、RNアーゼ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO、例えば米国特許第5,639,611号）、ドットブロット解析、変性勾配ゲル電気泳動（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,190,856号）、RFLP（例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,324,631号）およびPCR（登録商標）-SSCPなどを含めて、多種多様なアッセイが考えられる。例えば生物学的液体中の突然変異型遺伝子および癌遺伝子などの遺伝子配列を検出し、定量する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,496,699号に記載されている。
【００８８】
さらに、Haciaら（1996）およびShoemakerら（1996）に記載されているようなDNAチップ技術を不妊の診断に使用することもできると考えられる。簡単に述べると、これらの技術は、多数の遺伝子を迅速かつ正確に解析するための定量方法を含む。オリゴヌクレオチドで、または固定化されたプローブアレイを使って、遺伝子にタグを付けることにより、チップ技術を利用して、標的分子を高密度のアレイとして分離し、これらの分子をハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングすることができる。Peaseら（1994）；Fodorら（1991）を参照されたい。
【００８９】
ELISAおよびウェスタンブロット解析などの技術によってO1-180、O1-184またはO1-236含量を特徴づけるには、抗体を使用することができる。これは出生前スクリーニングまたは子供を欲しいと思っている人々のカウンセリングに役立つだろう。
【００９０】
他にもさまざまな免疫検出方法のステップが、例えばNakamuraら（1987）などの科学文献に記載されている。免疫アッセイは、その最も簡単かつ直接的な意味で、結合アッセイである。好ましい免疫アッセイの一例は、さまざまなタイプのラジオイムノアッセイ（RIA）および免疫ビーズ捕捉アッセイである。組織切片を使用する免疫組織化学的検出も、とりわけ有用である。しかし、検出はそれらの技術に限定されるわけではなく、本発明にはウェスタンブロット法、ドットブロット法、FACS解析なども使用しうることは、すぐに理解されるだろう。
【００９１】
本発明の抗体は、多種多様な担体に結合させて、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するために使用することができる。周知の担体の具体例にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱などがある。本発明の目的には、担体の性質は可溶性でも不溶性でもよい。当業者は抗体を結合するのに適した担体を他にも知っているか、または日常的な実験によってそれらを確認することができるだろう。
【００９２】
当業者には多種多様な標識および標識法が知られている。本発明で使用することができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、燐光化合物および生物発光化合物などがある。当業者は抗体への結合に適した標識を他にも知っているか、または日常的な実験によってそれらを確認することができるだろう。
【００９３】
同様に感度の向上をもたらしうるもう一つの技術は、抗体を低分子量ハプテンに結合することからなる。この場合、第二の反応を使って、これらのハプテンを特異的に検出することができる。例えばアビジンと反応するビオチンまたは特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェニル、プリドキサール（puridoxal）およびフルオレセインなどのハプテンを使用するのが一般的である。
【００９４】
本発明のモノクローナル抗体を抗原のインビボ検出に使用する場合は、検出可能に標識された抗体を診断的に有効な用量で投与する。「診断的に有効な」という用語は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体の量が、当該モノクローナル抗体が特異性を示す本発明のポリペプチドを構成する抗原を持つ部位の検出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。投与される検出可能に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、当該ポリペプチドを持つ細胞への結合がバックグラウンドと比較して検出可能になるような十分な濃度であるべきである。さらに、検出可能に標識されたモノクローナル抗体は、最適な標的対バックグランドシグナル比を得るために、循環系から迅速に除去されることが望ましい。一般に、インビボ診断用の検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与量は、その個体の年齢、性別および疾患の程度などといった因子に依存して変動するだろう。そのような投与量は、例えば、複数回の注射を行なうかどうか、抗原負荷量および当業者に知られている他の因子などに依存して変動しうる。
【００９５】
インビボ画像診断法の場合は、利用できる検出装置のタイプが、与えられた放射性同位体を選択する際の重要な因子である。選択される放射性同位体の崩壊のタイプは、与えられた装置のタイプにとって検出可能なものでなければならない。インビボ診断用の放射性同位体を選択する際に重要なさらにもう一つの因子は、宿主に対して有害な放射線を最小限に抑えることである。インビボ画像法に使用される放射性同位体は、理想的には、粒子放射を伴なわず、従来のガンマ線カメラで容易に検出することができる140〜250keVの範囲の光子を数多く生成する。
【００９６】
インビボ診断の場合、放射性同位体は免疫グロブリンに直接的に、または中間官能基を使って間接的に、結合させることができる。金属イオンとして存在する放射性同位体を免疫グロブリンに結合させるためによく使用される中間官能基は、例えばジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）などの二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることができる金属イオンの典型例は、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zrおよび201Tiである。
【００９７】
本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像法（MRI）または電子スピン共鳴（ESR）で行なわれるようなインビボ診断のために、常磁性同位体で標識することもできる。一般に、従来の診断用画像可視化法は、どれでも使用することができる。通常、カメラ撮像にはガンマ線および陽電子放出放射性同位体が使用され、MRIには常磁性同位体が使用される。このような技術に特に有用な元素には、157Gd、55Mn、162Dy、55Crおよび56Feがある。
【００９８】
細胞増殖性障害という用語は、周囲の組織とは形態学的にも遺伝子型的にもしばしば異なって見える悪性および非悪性細胞集団を意味する。アンチセンス分子であるO1-180、O1-184およびO1-236ポリヌクレオチドは、さまざまな器官系（特に卵巣など）の悪性腫瘍を処置するのに役立つ。病因論的にO1-180、O1-184またはO1-236の発現の変化と関連する障害はいずれも、基本的には、それぞれO1-180、O1-184またはO1-236抑制試薬による処置に感受性であると考えることができるだろう。
【００９９】
本発明は、卵巣の細胞増殖性障害を検出する方法であって、抗O1-180、O1-184またはO1-236抗体を、O1-180、O1-184またはO1-236関連障害を持つ疑いがある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出することを含む方法を提供する。O1-180、O1-184またはO1-236と反応する抗体は、それぞれO1-180、O1-184またはO1-236への結合の検出を可能にする化合物で標識される。本発明では、O1-180、O1-184またはO1-236ポリペプチドに特異的な抗体を使って、生物学的液体および組織中のそれぞれO1-180、O1-184またはO1-236のレベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有する標本はどれでも使用することができる。本発明の好ましい試料は、卵巣起源の組織、具体的には卵巣濾胞液または卵母細胞を含有する組織である。疑わしい細胞中のO1-180、O1-184またはO1-236のレベルを正常細胞中のレベルと比較することで、その検査対象がO1-180、O1-184またはO1-236関連細胞増殖性障害を持つかどうかを決定することができる。検査対象は好ましくはヒトである。本発明の抗体は、インビトロまたはインビボ免疫診断もしくは免疫療法を施すことが望ましい任意の対象で使用することができる。本発明の抗体は、例えば免疫アッセイでの使用に適しており、そのアッセイでは本発明の抗体を液相で、または固相担体に結合させた状態で、利用することができる。また、これらの免疫アッセイにおける抗体は、さまざまな方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用することができる免疫アッセイのタイプの例は、直接または間接フォーマットの競合的および非競合的免疫アッセイである。そのような免疫アッセイの例にはラジオイムノアッセイ（RIA）とサンドイッチ（ELISA）アッセイがある。本発明の抗体を用いた抗原の検出は、正順、逆順または同時形式で実施される免疫アッセイ（生理学的試料に対する免疫組織化学的アッセイを含む）を使って行なうことができる。当業者は他の免疫アッセイフォーマットを知っているか、または甚だしい実験を行なわなくてもそれらを容易に識別することができる。
【０１００】
D．治療用途
O1-180、O1-184およびO1-236は生殖管で発現するので、避妊、妊性および妊娠に関して、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を使ったさまざまな用途が存在する。O1-180、O1-184およびO1-236は月経周期の調節に関与しうるので、さまざまな避妊法に役立ちうる。
【０１０１】
また、O1-180、O1-184またはO1-236ポリヌクレオチド配列、ポリぺプチド配列、抗体、その断片またはその突然変異体は、母性ゲノムを破損することによって初期胚形成を抑制または強化するために使用することもできると考えられる。胚発生で表現型を生じる母性ゲノムの破損は母性効果突然変異と呼ばれることが当業者には知られている。2つのそのような例が、ノックアウト技術を使ってマウスで特徴づけられている。どちらの例でも、遺伝子産物は成長する卵母細胞中に正常に蓄積され、初期発生胚でも持続し、その表現型はノックアウト雌の子孫に、その遺伝子型または性別とは無関係に、影響を及ぼす。最初に同定された遺伝子は、MATER（maternal antigen that embryos require：胚に必要な母性抗原）をコードしている。MATERは2細胞段階を超えた発生に必要であり、胚ゲノム転写パターンの確立に関連づけられている（Tongら、2000）。2番目に同定された遺伝子は、胚ゲノムで確立される刷込みパターンの維持および妊娠期間の最後の3分の1で発育中のマウスの成育性の維持に不可欠な卵母細胞特異的DNAメチルトランスフェラーゼDNMT1oをコードしている（Howellら、2001）。他の多くの卵母細胞由来因子も初期胚形成の複雑さをもたらすと思われ、したがって、O1-180およびO1-236は母性効果遺伝子であると考えられる。というのも、これらは初期胚形成の過程で機能するからである。
【０１０２】
さらなる態様として、O1-236またはNPM2は、初期胚発生中のクロマチン再構築に関与しうると考えられる。例えば、精子DNAの卵母細胞再構築に必要であり、卵核胞崩壊時に卵質中に放出される哺乳類核タンパク質の存在が、研究によって予測されている（Maedaら、1998）。さらに、卵母細胞は受精時の精子核だけでなく体細胞核も効率よく再構築できることが知られている。例えば本発明者らは、核移植クローニングにおけるNPM2の役割を考察した（Zuccottiら、2000）。（O1-236がコードする）NPM2は、初期胚発生中のクロマチン再構築にとって不可欠な哺乳類卵母細胞中の因子であると予想される。したがって、除核卵母細胞にNPM2を補うことにより、核移植技術によるクローニングが容易になるだろう。
【０１０３】
本発明のモノクローナル抗体は、検査対象におけるO1-180、O1-184またはO1-236関連疾患の改善の推移をモニターするためにインビトロおよびインビボで使用することができる。したがって、例えば本発明のポリペプチドを含む抗原を発現させる細胞の数の増加もしくは減少またはさまざまな体液中に存在するそのような抗原の濃度の変化を測定することにより、O1-180、O1-184またはO1-236関連疾患の改善を目的とする特定の治療的措置が有効かどうかを決定することができるだろう。改善という用語は、治療を受けている検査対象におけるO1-180、O1-184またはO1-236関連疾患の有害作用の減少を意味する。
【０１０４】
本発明により、正常細胞における発現とは違う形で発現されうるヌクレオチド配列が同定されるので、この配列に対して適切な治療技術または診断技術を設計することができる。例えば、細胞増殖性障害がO1-180、O1-184またはO1-236の発現と関係する場合は、それぞれO1-180、O1-184またはO1-236の発現を翻訳レベルで妨害する核酸配列を使用することができる。このアプローチでは、例えばアンチセンス核酸またはリボザイムを使用して、特定のO1-180、O1-184またはO1-236 mRNAをアンチセンス核酸で遮蔽するか、リボザイムでそれを切断することによって、当該mRNAの翻訳を阻止する。
【０１０５】
アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNAまたはRNA分子である（Weintraub、1990）。細胞内でアンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないだろうから、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害する。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのも、それらは合成が容易であり、また標的とするO1-180、O1-184またはO1-236産生細胞に導入する時に、これより大きい分子と比べて問題を生じる可能性が低いからである。アンチセンス法を使った遺伝子のインビトロ翻訳の阻害は当技術分野ではよく知られている（Marcus-Sakura、1988）。
【０１０６】
リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼに似た様式で他の一本鎖RNAを特異的に切断する能力を持つRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列の改変により、RNA分子中の特定のヌクレオチド配列を認識しそれを切断する分子を設計することができる（Cech、1988）。このアプローチの大きな利点は、それらが配列特異的であるために、特定の配列を持つmRNAだけが不活化されることである。
【０１０７】
リボザイムには2つの基本型、すなわちテトラヒメナ型（Hasselhoff、1988）と「ハンマーヘッド」型がある。テトラヒメナ型リボザイムは4塩基長の配列を認識し、「ハンマーヘッド」型リボザイムは11〜18塩基長の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、その配列がもっぱら標的mRNA種だけに存在する可能性は高くなる。そのため、特定のmRNA種を不活化するにはテトラヒメナ型リボザイムよりハンマーヘッド型リボザイムの方が好ましく、18塩基長認識配列は、それより短い認識配列よりも好ましい。
【０１０８】
本発明は、O1-180、O1-184またはO1-236タンパク質が媒介する細胞増殖性障害または細胞変性障害を処置するための遺伝子治療も提供する。そのような治療法は、各O1-180、O1-184もしくはO1-236 cDNAまたはO1-180、O1-184もしくはO1-236アンチセンスポリヌクレオチドを、増殖性障害または変性障害をもつ細胞に導入することによって、その治療効果を達成するだろう。O1-180、O1-184もしくはO1-236 cDNAまたはアンチセンスO1-180、O1-184もしくはO1-236ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使って達成することができる。標的指向型リポソームの使用は、cDNAまたはアンチセンス配列の治療的送達にはとりわけ好ましい。
【０１０９】
ここに教示する遺伝子治療に利用することができるさまざまなウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、また好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、好ましくは、ネズミレトロウイルスまたは鳥類レトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）およびラウス肉腫ウイルス（RSV）があるが、これらに限るわけではない。他のいくつかのレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターはすべて、形質導入細胞を同定し作出することができるように、選択可能マーカーの遺伝子を伝達するまたは組み込むことができる。目的のO1-180、O1-184またはO1-236配列を、例えば特定標的細胞上のレセプターのリガンドをコードするもう一つの遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することにより、そのベクターは標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異的にすることができる。好ましいターゲティングは、抗体を使ってレトロウイルスベクターを標的に誘導することによって達成される。当業者は、O1-180、O1-184もしくはO1-236 cDNAまたはO1-180、O1-184もしくはO1-236アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達が可能になるようにレトロウイルスゲノムに挿入することができる特別なポリヌクレオチド配列を知っているか、または甚だしい実験を行なわずにそれらをすぐに確認することができる。
【０１１０】
組換えレトロウイルスは欠損性なので、それらが感染性ベクター粒子を産生するには補助が必要である。この補助は、例えばLTR内の調節配列の制御下にレトロウイルスの構造遺伝子のすべてをコードしているプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使用することによって提供することができる。これらのプラスミドは、パッキング機構がキャプシド形成のためにRNA転写物を認識できるようにするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞系には、例えばψ2、PA317およびPA12などがあるが、これらに限るわけではない。これらの細胞系はゲノムがパッケージされないので空のウイルス粒子を産生する。そのような細胞に、パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が目的とする他の遺伝子で置換されているレトロウイルスベクターを導入すると、そのベクターはパッケージングされ、ベクターウイルス粒子の産生が可能になる。
【０１１１】
もう一つの選択肢として、NIH3T3または他の組織培養細胞にレトロウイルス構造遺伝子gag、polおよびenvをコードするプラスミドを従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって直接トランスフェクトすることもできる。次に、これらの細胞に目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドをトランスフェクトする。その結果得られる細胞は培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０１１２】
O1-180、O1-184もしくはO1-236 cDNAまたはO1-180、O1-184もしくはO1-236アンチセンスポリヌクレオチド用のもう一つの標的指向型送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに油中水型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質に基づく系が包含される。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達媒体として役立つ人工膜小胞である。サイズが0.2〜4.0mmの範囲の大きい単層小胞（large unilamellar vesicle；LUV）には、大きい高分子を含有する水性緩衝液をかなりのパーセンテージまで封入することができる。RNA、DNAおよび完全なウイルス粒子を水性の内部に封入して、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる（Fraleyら、1981）。リポソームは、哺乳類細胞だけでなく、植物、酵母および細菌細胞でもポリヌクレオチドの送達に使用されている。リポソームが効率のよい遺伝子導入媒体であるためには、以下の特徴を持つべきである：（1）目的の遺伝子が、その生物学的活性を損なわれることなく、高い効率で封入されること、（2）非標的細胞と比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること、（3）小胞の水性内容物を標的細胞細胞質に高い効率で送達すること、および（4）遺伝情報の正確かつ効果的な発現（Manningら、1988）。
【０１１３】
リポソームの組成は、リン脂質（特に高相転移温度リン脂質）と通常はステロイド（特にコレステロール）との組み合わせであることが普通である。他のリン脂質または他の脂質も使用できる。リポソームの物理特性はpH、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。
【０１１４】
リポソームの製造に役立つ脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどがある。脂質部分が14〜18個の炭素原子、好ましくは16〜18個の炭素原子を含み飽和しているジアシルホスファチジルグリセロールは特に有用である。リン脂質の一例として、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。
【０１１５】
リポソームのターゲティングは解剖学的因子と機構的因子に基づいて分類することができる。解剖学的分類は選択性のレベルに基づくものであり、例えば器官特異的、細胞特異的および細胞小器官特異的などである。機構面ではターゲティングはそれが受動的であるか能動的であるかに基づいて識別することができる。受動的ターゲティングでは、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（RES）の細胞に分布するというリポソームが自然に持っている傾向を利用する。一方、能動的ターゲティングでは、自然に起こる局在化の部位以外の器官および細胞タイプへのターゲティングが達成されるように、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドに結合するか、リポソームの組成またはサイズを変えることによって、リポソームの改変を行なう。
【０１１６】
標的指向型送達系の表面はさまざまな方法で修飾することができる。リポソーム標的指向型送達系の場合は、ターゲティングリガンドをリポソーム二重層と安定に会合させておくために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。ターゲティングリガンドへの脂質鎖の結合には、さまざまな連結基を使用することができる。
【０１１７】
E．モジュレーターのスクリーニング
本発明では、O1-180、O1-184またはO1-236を刺激するか、O1-180、O1-184またはO1-236の欠如を克服するか、O1-180、O1-184またはO1-236分子の作用を遮断または阻害する活性を持つ化合物のスクリーニングに、O1-180、O1-184またはO1-236および活性断片、ならびにそれらをコードする核酸を使用することも考えられる。これらのアッセイは多種多様なフォーマットを利用して行うことができ、そのスクリーニングが目的としている「活性」の種類に依存しうる。
【０１１８】
ある態様では、O1-180、O1-184もしくはO1-236ポリペプチドまたはその断片に結合する化合物のスクリーニングに、本発明を応用する。ポリペプチドまたは断片は溶解状態で遊離しているか、支持体に固定されているか、細胞中または細胞の表面上に発現していてよい。ポリぺプチド側または化合物側を標識して、結合を検出できるようにすることができる。
【０１１９】
もう一つの態様として、アッセイでは、天然または人工の基質または結合パートナーに対するO1-180、O1-184またはO1-236の結合の阻害を測定することができる。薬剤の1つ（O1-180、O1-184またはO1-236、結合パートナーまたは化合物）を標識する競合結合アッセイを行うことができる。通常はポリペプチドが標識分子種になる。遊離標識の量を結合している標識の量とを対比して測定することにより、結合または結合の阻害を決定することができる。
【０１２０】
化合物のハイスループットスクリーニングを行うためのもう一つの技術は、WO84/03564に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物をプラスチックピンなどの固体基盤または他の何らかの表面上に合成する。ぺプチド試験化合物をO1-180、O1-184またはO1-236と反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドをさまざまな方法で検出する。
【０１２１】
精製されたO1-180、O1-184またはO1-236は、上述の薬物スクリーニング技術で使用するために、プレート上に直接コーティングすることができる。しかし、ポリペプチドに対する非中和抗体を使って、固相にポリペプチドを固定化することもできる。また、反応性領域（好ましくは末端領域）を含む融合タンパク質を使って、O1-180、O1-184またはO1-236活性領域を固相に連結してもよい。
【０１２２】
O1-180、O1-184またはO1-236遺伝子中に自然突然変異もしくは人工突然変異または野生型を含むさまざまな細胞株を使って、O1-180、O1-184またはO1-236のさまざまな機能的特性を研究し、候補化合物がこれらの特性にどのように影響を及ぼすかを研究することができる。突然変異を人工的に作る方法は、本明細書の他の項で説明する。また、O1-180、O1-184またはO1-236中に生じて不妊につながる、不妊の一因となる、そして/または他の形で不妊を引き起こす自然突然変異も、本明細書の他の項で説明する。アッセイでは、化合物の生化学的性質を考慮して、化合物を適当に調合し、標的細胞と接触させる。アッセイによっては培養が必要な場合もある。次に、多種多様な生理学的アッセイに基づいて細胞を調べることができる。あるいは、O1-180、O1-184もしくはO1-236または関連経路の機能を探ることができるような分子解析を行ってもよい。
【０１２３】
具体的一態様として、当技術分野で標準的な手段により、本発明のポリペプチド、すなわちO1-180、O1-184またはO1-236を使って、酵母ツーハイブリッド解析を行う。ツーハイブリッドスクリーニングは、あるタンパク質の機能を、そのタンパク質と相互作用する他のタンパク質を同定することによって、解明するためまたは特徴づけるために使用される。機能がわかっていないタンパク質（ここではこれを「ベイト（bait）」という）を、GAL4のDNA結合ドメインをも含んでいるキメラタンパク質として製造する。このキメラタンパク質を発現させるヌクレオチド配列を含むプラスミドで酵母細胞を形質転換する。この酵母細胞は、さまざまな候補標的タンパク質をコードするさまざまなヌクレオチド配列に融合されたGAL4活性化ドメインを含むライブラリーに由来する代表プラスミドも含む。もしベイトタンパク質が標的タンパク質と物理的に相互作用するのであれば、GAL4活性化ドメインとGAL4 DNA結合ドメインとがつながれ、その結果、共同的に作用してレポーター遺伝子の転写を促進することができるようになる。ベイトタンパク質と、ある細胞中の候補標的タンパク質との間に相互作用が起こらない場合は、GAL4成分は離れたままであり、レポーター遺伝子の転写を単独では促進することができない。b-ガラクトシダーゼ、HIS3、ADE2またはURA3を含めて、さまざまなレポーター遺伝子を利用できることが、当業者には知られている。また、GAL4成分の相互作用（したがって特定ベイトと標的タンパク質との相互作用）を示すために、複数のレポーター配列をそれぞれ異なる誘導性プロモーターの制御下に置いて、同じ細胞内で利用することもできる。複数のレポーター配列を使用すれば偽陽性候補を取得する可能性が下がることが、当業者には知られている。また、LexAなどの代替DNA結合ドメイン/活性化ドメイン成分を使用することもできる。レポーター遺伝子のトランス活性化をもたらすことができる限り、任意の活性化ドメインを任意のDNA結合ドメインと組み合わせうることが、当業者には知られている。さらに、LexAシステムの場合と同様に、2つの成分のどちらか一方は、他方の成分が存在してそれらが共同してレポーター遺伝子のトランス活性化を可能にする限り、原核生物由来であってもよいことも、当業者には知られている。
【０１２４】
ツーハイブリッド実験の試薬類および設計は、このシステムの最新の改良版（Fashenaら、2000）を含めて、当業者にはよく知られている（P. L. BartelおよびS. Fields編「The Yeast Two-Hybrid System」オックスフォード大学出版局、1997）。当業者には、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）製のMatchmaker（登録商標）システムやHybriZAP（登録商標）2.1ツーハイブリッドシステム（Stratagene；カリフォルニア州ラホーヤ）などの市販のベクター、または研究コミュニティを通して入手できるベクター（Yangら、1995；Jamesら、1996）が知られている。これに代わる態様では、哺乳類（Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）製の哺乳類ツーハイブリッドアッセイキット）または大腸菌（Huら、2000）などの、酵母以外の生物がツーハイブリッド解析に使用される。
【０１２５】
ある代替態様では、細胞質ベースのアッセイでタンパク質-タンパク質相互作用を検出するツーハイブリッドシステムが利用される。この態様では、タンパク質を細胞質で発現させることにより、翻訳後修飾が起こるようにし、また転写活性化因子および転写阻害因子をベイトとしてスクリーニングに使用することができるようにする。そのような系の一例は、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）のCytoTrap（登録商標）ツーハイブリッドシステムであり、このシステムでは、hSos（グアニンヌクレオチド交換因子）の酵母ホモログであるcdc25遺伝子に温度感受性突然変異を持つ酵母の細胞膜に標的タンパク質が固定されることになる。ベイトタンパク質が標的に結合すると、hSosが膜に局在化し、GDP/GTP交換を促進することによるRASの活性化が可能になる。次にRASは、突然変異型酵母cdc25Hの37℃での生育を可能にするシグナリングカスケードを活性化する。このシステムのためのベクター（pMyrおよびpSosなど）およびこのシステムに関する他の実験詳細は、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）から入手することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,776,689号も参照されたい）。
【０１２６】
したがって、本発明のある態様によれば、O1-180、O1-184またはO1-236と相互作用するペプチドのスクリーニング方法であって、試験ペプチド（この試験ペプチドはDNA結合ドメインに融合されている）をコードするDNAセグメントを含む第1核酸と、O1-180、O1-184またはO1-236の少なくとも一部（このO1-180、O1-184またはO1-236の少なくとも一部はDNA活性化ドメインに融合されている）をコードするDNAセグメントを含む第2核酸とを、細胞に導入することを含む方法が提供される。次に、DNA結合ドメインとDNA活性化ドメインとの相互作用をアッセイすることによって、試験ペプチドとO1-180、O1-184もしくはO1-236ポリペプチドまたはその断片との相互作用に関するアッセイを行う。例えば、DNA結合ドメインと活性化ドメインとの相互作用のアッセイは、b-ガラクトシダーゼ発現の活性化であることができる。
【０１２７】
一つの代替方法は、組換えO1-180、O1-184またはO1-236によるl.gt11、l.LZAP（Stratagene）またはこれに等価なcDNA発現ライブラリーのスクリーニングである。組換えO1-180、O1-184もしくはO1-236またはその断片は、FLAG、HSVまたはGSTなどの小さいペプチドタグに融合される。これらのペプチドタグは、便利なキナーゼ（心筋クレアチンキナーゼなど）リン酸化部位を持つことができ、あるいはビオチン化することができる。組換えO1-180、O1-184またはO1-236は、32[P]でリン酸化するか、または標識せずに使用して、ストレプトアビジンまたはタグに対する抗体で検出することができる。l.gt11 cDNA発現ライブラリーを興味ある細胞から作製し、組換えO1-180、O1-184またはO1-236と共にインキュベートし、洗浄し、O1-180、O1-184またはO1-236と相互作用するcDNAクローンを単離する。当業者はこのような方法を日常的に使用している。例えばSambrookの前掲書を参照されたい。
【０１２８】
もう一つの方法は、cDNAをベクター中の哺乳類プロモーターとポリアデニル化部位の間にクローニングし、それを細胞に一過性にトランスフェクトする、哺乳類発現ライブラリーのスクリーニングである。48時間後に、固定洗浄した細胞を標識O1-180、O1-184またはO1-236と共にインキュベートすることによって、結合タンパク質を検出する。このようにして、目的の結合タンパク質をコードするcDNAを含むcDNAのプールを選択し、各プローブをさらに細分し、一過性トランスフェクション、結合およびオートラジオグラフィーのサイクルを繰り返すことによって、目的のcDNAを単離することができる。あるいは、cDNAライブラリー全体を哺乳類細胞にトランスフェクトし、それらの細胞を、プレートに結合させたO1-180、O1-184またはO1-236を含むディッシュ上でパンニングすることによって、目的のcDNAを単離することもできる。洗浄後に付着している細胞を溶解し、プラスミドDNAを単離し、細菌内で増幅し、トランスフェクションとパンニングのサイクルを、単一のcDNAクローンが得られるまで繰り返す。参照により本明細書に組み込まれるSeedら（1987）およびAruffoら（1987）を参照されたい。結合タンパク質が分泌される場合は、一過性トランスフェクト細胞から得られる上清をアッセイするための結合アッセイまたは中和アッセイがいったん確立されれば、同様のプール戦略によって、そのcDNAを取得することができる。上清をスクリーニングするための一般的方法はWongら（1985）に開示されている。
【０１２９】
もう一つの代替方法は、O1-180、O1-184およびO1-236と相互作用するタンパク質を細胞からの直接単離することである。O1-180、O1-184またはO1-236とGSTまたは小ペプチドタグとの融合タンパク質を作製し、ビーズに固定化する。興味ある細胞から、生合成的に標識されたタンパク質または標識されていないタンパク質抽出物を調製し、前記ビーズと共にインキュベートし、緩衝液で洗浄する。O1-180、O1-184またはO1-236と相互作用するタンパク質をビーズから特異的に溶離させ、SDS-PAGEで解析する。結合パートナー一次アミノ酸配列データをマイクロシークエンシングによって得る。所望により、細胞タンパク質のチロシンリン酸化などといった機能的応答を誘発する薬剤で細胞を処理することもできる。そのような薬剤の一例は成長因子または、インターロイキン2などのサイトカインだろう。
【０１３０】
もう一つの代替方法は免疫アフィニティー精製である。組換えO1-180、O1-184またはO1-236を標識細胞抽出物または非標識細胞抽出物と共にインキュベートし、抗O1-180、O1-184またはO1-236抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物をプロテインA-セファロースで回収し、SDS-PAGEで解析する。非標識タンパク質はビオチン化によって標識され、ストレプトアビジンを使ってSDSゲル上で検出される。結合パートナータンパク質をマイクロシークエンシングによって解析する。さらに、マイクロシークエンシングに先立って、当業者に知られている標準的な生化学精製ステップを使用してもよい。
【０１３１】
さらにもう一つの代替方法は、結合パートーナーに関するペプチドライブラリーのスクリーニングである。タグ付きのまたは標識した組換えO1-180、O1-184またはO1-236を使って、ペプチドライブラリーまたはホスホペプチドライブラリーから、O1-180、O1-184またはO1-236と相互作用するペプチドを選択する。ペプチドのシークエンシングは、相互作用するタンパク質に見いだされるかもしれない共通ペプチド配列の同定につながる。
【０１３２】
本発明はさまざまな動物モデルの使用も包含する。例えば、ヒトO1-180、O1-184またはO1-236と他の動物O1-180、O1-184またはO1-236の間に認められる一致はいずれも、それが正常に発現される丸ごとの動物系でのO1-180、O1-184またはO1-236の機能を調べる格好の機会になる。正常なO1-180、O1-184またはO1-236を発現させることができない突然変異型細胞系を開発または単離することにより、マウスに、卵形成および胚発生におけるO1-180、O1-184またはO1-236の機序およびその役割の研究を可能にするモデルを作出することができる。
【０１３３】
試験化合物による動物の処置には、化合物を適当な形態で動物に投与することが含まれるだろう。投与は、例えば経口、鼻腔、口腔、直腸、腟内または局所経路など、臨床目的または非臨床目的に利用することができる任意の経路で行われるだろう。あるいは、投与は、気管内点滴、気管支点滴、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うこともできる。特に、全身的静脈内注射、血液供給またはリンパ供給を介した局部的投与および腫瘍内注射が考えられる。
【０１３４】
ある化合物のインビボでの有効性の決定には多種多様な基準が含まれうる。そのような基準には、例えば妊性の向上、妊性の減少または避妊が含まれる。
【０１３５】
本発明の一態様では、機能的O1-180、O1-184もしくはO1-236ポリペプチドまたはその変異体をコードする機能的導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が作出される。O1-180、O1-184またはO1-236導入遺伝子を発現させるトランスジェニック動物、そのような動物から得られる組換え細胞系、およびトランスジェニック胚は、O1-180、O1-184またはO1-236の機能を誘導または抑制する薬剤のスクリーニングを行って、そのような薬剤を同定する方法に役立ちうる。本発明のトランスジェニック動物は、疾患状態を研究するためのモデルとして使用することもできる。
【０１３６】
本発明の一態様では、O1-180、O1-184またはO1-236導入遺伝子を非ヒト宿主に導入して、O1-180、O1-184またはO1-236を発現させるトランスジェニック動物を作出する。本トランスジェニック動物は、導入遺伝子が発現できるような形でゲノムに導入遺伝子を組み込むことによって作出される。トランスジェニック動物の作出方法は、WagnerおよびHoppe（米国特許第4,873,191号；この特許は参照により本明細書に組み込まれる）、Brinsterら, 1985（この文献は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）ならびにHogan, Beddington, CostantimiおよびLong「Manipulating the Mouse Embryo；A Laboratory Manual」第2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994；この文献は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）に概説されている。
【０１３７】
導入遺伝子と内在性遺伝子との相同組換えによって内在性O1-180、O1-184またはO1-236を置き換えることが望ましいだろう。あるいは、「ノックアウト」動物を作出する場合のように、欠失によって内在性遺伝子を除去することもできる。典型的には、興味ある遺伝子の一部と選択マーカーとを含むターゲティングベクターを作製し、胚性幹（ES）細胞にトランスフェクトする。これらのターゲティングベクターは、hprt陰性ES細胞系にエレクトロポレートされ、HATおよびFIAU中で選択される。正しい突然変異を持つES細胞を胚盤胞に注入して、突然変異型O1-180、O1-184およびO1-236遺伝子に関するキメラを作出し、最終的にはヘテロ接合体およびホモ接合体を作出する。例えば「ノックアウト」マウスにはO1-180、O1-184またはO1-236が存在しないことを利用して、O1-180、O1-184またはO1-236タンパク質の喪失がインビボで細胞に及ぼす影響を研究することができる。
【０１３８】
上述のように、トランスジェニック動物およびそのような動物に由来する細胞系は、ある種の検証実験に役立ちうる。この場合、野生型または突然変異型O1-180、O1-184またはO1-236を発現させる能力を持つトランスジェニック動物および細胞系を、試験物質に暴露することができる。野生型O1-180、O1-184またはO1-236発現および/または機能を強化する能力または突然変異型O1-180、O1-184またはO1-236の発現または機能を損なう能力に関して、これらの試験物質をスクリーニングすることができる。
【０１３９】
F．患者に投与するための製剤および経路
臨床的用途が考えられる場合は、意図する用途に適した形態の医薬組成物（発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体および薬物）を製造する必要があるだろう。一般に、これには、発熱物質およびヒトまたは動物に対して有害であるかもしれない他の不純物を基本的に含まない組成物の製造が必要だろう。
【０１４０】
一般的には、送達ベクターを安定化し、標的細胞による取り込みを可能にするために、適当な塩類および緩衝液を使用することが望まれるだろう。緩衝液は、組換え細胞を患者に導入する場合にも使用されるだろう。本発明の水性組成物は、薬学的に許容できる担体または水性媒質に溶解または分散された有効量の細胞向けベクターを含む。そのような組成物は接種材料とも呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容できる」という表現は、動物またはヒトに投与したときに有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない分子的実体および組成物を指す。本明細書にいう「薬学的に許容できる担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野ではよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが本発明のベクターまたは細胞と適合しない場合を除き、治療用組成物への使用が考えられる。組成物には追加活性成分も組み込むことができる。
【０１４１】
本発明の活性組成物には、古典的医薬調製物を含めることができる。これら本発明組成物の投与には、どの一般的経路であっても、その経路で標的組織に到達することができる限り、使用することができる。これには経口、鼻腔、口腔、直腸、膣内および局所経路が含まれる。あるいは、投与は、同所性、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって行うこともできる。そのような組成物は、通常は上述の薬学的に許容できる組成物として投与されるだろう。
【０１４２】
活性化合物は、非経口投与または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または薬理学的に許容できる塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中に調製することができる。分散液をグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中、ならびに油中に調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件では、これらの調製物は微生物の成長を防止するために保存剤を含む。
【０１４３】
注射用途に適した医薬形態には、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液の即時調合用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合も、剤形は滅菌されていなければならず、容易に注射器を通過する程度に流動性でなければならない。また、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、および植物油などを含む溶媒または分散媒であることができる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、浸透圧調節剤、例えば糖または塩化ナトリウムなどを含めることが好ましいだろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを組成物中に使用することによって達成することができる。
【０１４４】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒中で、上に列挙した他のさまざまな成分と必要量で混合した後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒と上に列挙したものから選択される他の必要な成分とを含む滅菌ビヒクルにさまざまな滅菌活性成分を混合することによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分＋先に滅菌濾過したその溶液に由来する所望の追加成分の粉末が得られる。
【０１４５】
本明細書にいう「薬学的に許容できる担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤などを包含する。医薬活性物質へのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野ではよく知られている。通常の媒質または薬剤は、それが本発明の活性成分と適合しない場合を除き、治療用組成物への使用が考えられる。組成物には追加活性成分も組み込むことができる。
【０１４６】
経口投与の場合、本発明のポリペプチドを賦形剤と混合し、非摂取用含嗽剤および歯磨剤の形で試用することができる。含嗽剤は必要量の活性成分を適当な溶媒、例えばホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などに混合することによって製造することができる。あるいは、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄剤に活性成分を組み込むこともできる。活性成分は、ゲル剤、ペースト剤、粉末剤およびスラリー剤を含む歯磨剤に分散させてもよい。水、結合剤、研磨材、着香剤、起泡剤および湿潤剤を含みうる練り歯磨き剤に、治療有効量の活性成分を加えることができる。
【０１４７】
本発明の組成物は、中性または塩の形で処方することができる。薬学的に許容できる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基を使って形成されるもの）が含まれ、これらは例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を使って形成される。遊離のカルボキシル基を使って形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【０１４８】
製剤化が終わったら、溶液剤は、その剤形に適した方法で、治療的に有効であるような量で投与されるだろう。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどのさまざまな剤形で、容易に投与される。例えば、水性溶液剤として非経口投与する場合は、溶液が必要に応じて適切に緩衝化されているべきであり、希釈液をまず十分量の食塩水またはグルコースで等張性になるようにする。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与にとりわけ適している。これに関して、使用することができる滅菌水性媒質は、本明細書の内容を考慮すれば、当業者にはわかるだろう。例えば、1回量を1mlの等張性NaCl溶液に溶解し、それを1000mlの皮下注入液に加えるか、注入しようとする部位に注射する（例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版の1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい）。処置対象の状態に応じて投与量には必然的にある程度の変動が生じるだろう。いずれにせよ、投薬責任者は個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒト投与の場合、調製物は、FDA生物製剤局の基準が要求する滅菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【０１４９】
G．実施例
本発明の好ましい態様を例示するために、以下に実施例を記載する。以下の実施例に開示する技術は、本発明者らが本発明の実施に際してうまく機能することを見いだした技術を表し、したがってその実施の好ましい形態を構成するとみなすことができるということは、当業者には理解されるはずである。しかし、ここに開示する具体例には数多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく、よく似たまたは同類の結果が得られることは、本明細書の開示に照らして、当業者には理解されるだろう。
【実施例１】
【０１５０】
cDNAサブトラクティブハイブリダイゼーションライブラリーの作製
Gdf9ノックアウトマウスの卵巣は、卵胞形成の初期障害により、野生型の卵巣とは組織学的に著しく異なる。特に、Gdf9ノックアウト卵巣では単層一次卵胞が比較的豊富で、卵母細胞喪失後に異常卵胞巣が形成される。本発明者らは、Gdf9ノックアウト卵巣でアップレギュレートされる新規卵巣発現転写物をクローニングするために、卵巣組成のこれらの相違を利用し、それらを遺伝子発現パターンの変化と関連付けた。
【０１５１】
Gdf9ノックアウトマウス（C57BL/6/129SvEv雑種）または野生型マウスから卵巣を集め、各プールからポリA+ mRNAを調製した。本発明者らは、CLONTECH PCR-Selectサブトラクションキットの変法を使って、Gdf9ノックアウト卵巣中でアップレギュレートされる配列が濃縮されていると予想されるpBluescript SK+プラスミド型cDNAライブラリーを作製した。
【０１５２】
ベクターに複数のインサートが挿入されることを防止するために、低いモル比のEagI消化cDNA断片インサートを使ってpBluescript SK+のNotI部位へのライゲーションを行なった。形質転換を行ない、1000個を越える独立した細菌クローンを拾い、グリセロール中−80℃で保存した。ライゲーション混合物の残りは、将来行われる形質転換に備えて−80℃で保存した。
【実施例２】
【０１５３】
pOvary1（pO1）ライブラリーインサートの初回配列解析
本発明者らは、cDNAライブラリーのpO1サブトラクティブハイブリダイゼーションによって得た331個のインサートの配列解析を行った。Applied Biosystems 373 DNAシークエンサーを使ってこれらのクローンを配列決定した。米国国立バイオテクノロジー情報センターのデータベースを使ってBLAST検索を行なった。DNASTAR解析プログラムを使って新規配列をオープンリーディングフレームに関して解析し、以前に同定された新規配列と比較した。そのデータを表１に要約する。表に示すように、クローンの大半は既知遺伝子であるか、マウスまたはヒトESTに一致した。9.4％のクローンがデータベース中のどの既知配列とも一致しなかった。
【０１５４】
【表１】
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【実施例３】
【０１５５】
卵巣発現遺伝子の発現解析とcDNAスクリーニング
どのデータベースの配列とも一致しなかったすべてのcDNAに対してノーザンブロット解析を行なった。また、主としてマウス2細胞胚cDNAライブラリーに由来するESTと一致する配列（例えばO1-184およびO1-236）も解析した。後者のEST群を解析した理論的根拠は、卵母細胞で高レベルに発現されるmRNAは2細胞期まで持続する可能性があり、卵子の受精または雄性および雌性前核の融合を含む初期胚発生に関与する可能性があるということである。
【０１５６】
新規卵巣遺伝子の初期スクリーニングの結果を表2に記載する。23個のクローンをノーザンブロット解析したところ、これらのクローンのうち8個がGdf9ノックアウト卵巣中でアップレギュレートされることが明らかになり、このことから、使用したサブトラクティブハイブリダイゼーションプロトコールは妥当であったことが示された。また、成体C57BL/6/129SvEv雑種マウス（卵巣RNA）またはSwiss WEBSTERマウス（他の全組織）から単離した全RNAを使ってノーザンブロット解析を行なったところ、これらのクローンのうち、2細胞ライブラリーから配列決定されたESTと一致する2つのクローンを含む4つのクローンが、卵巣だけに発現することが明らかになった（図1）。O1-236断片プローブ（749bp）によって、約1.0kbの転写物が検出された（図1）。現在までに数個のクローンをその卵巣局在についてインサイチューハイブリダイゼーション解析によって解析した（図2）。クローンO1-180、O1-184およびO1-236は卵母細胞特異的であり、一次（単層）前胞状卵胞から排卵に至るまで卵母細胞中に発現していた（図2）。
【０１５７】
【表２】
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O1-236遺伝子産物は卵母細胞特異的である（図3）。O1-236は原始卵胞（2型）または小さい3a型卵胞の卵母細胞では発現されないが（Pedersenら、1968）、中サイズの3a型卵胞およびすべての3b型卵胞（すなわち最大横断面内で20個を越える顆粒膜細胞が卵母細胞を取り囲んでいる卵胞）の卵母細胞で初めて検出された。O1-236 mRNAの発現は胞状卵胞段階まで持続した。興味深いことに、O1-236遺伝子産物の卵母細胞特異的発現パターンは、Gdf9（McGrathら、1995）および骨形成タンパク質15（Dubeら、1998）を含む本研究者らが研究した他の卵母細胞特異的遺伝子の発現に似ている。
【実施例４】
【０１５８】
Npm2のクローニング
野生型卵巣およびGdf9ノックアウトZAP Express卵巣cDNAライブラリーを合成し、スクリーニングして、上述した3つのクローンの完全長cDNAを単離した。各完全長cDNAを再びデータベース検索にかけ、オープンリーディングフレーム、開始ATGおよびタンパク質ホモロジーについて解析した。完全長cDNAはノーザンブロット解析から決定されたmRNAサイズに近い。予想アミノ酸配列を使ったデータベース検索により、新規タンパク質の考えうる機能と細胞局在を明確にするのに役立つ重要なドメイン（例えばシグナルペプチド配列、膜貫通ドメイン、ジンクフィンガーなど）を同定することができた。
【０１５９】
製造者の説明書に従って、Dubeら（1998）に記載したように、野生型卵巣またはGDF-9欠損卵巣から作製したMatzukラボラトリーZAP Express（Stratagene）卵巣cDNAライブラリーを、実施例1で同定されたO1-236部分cDNA断片を使ってスクリーニングした。簡単に述べると、野生型マウスまたはGDF-9ノックアウトマウス卵巣cDNAライブラリーの約300,000クローンを、チャーチ（Church）溶液中、63℃で、[a-32P]dCTPランダムプライムドプローブにハイブリダイズさせた。フィルターを0.1×チャーチ溶液で洗浄し、−80℃で終夜露出した。
【０１６０】
マウス卵巣cDNAライブラリーの一次スクリーニングでは、O1-236 cDNA断片により、スクリーニングした300,000個のうち22個の陽性ファージクローンが検出された。これらのクローンのうち、mRNAサイズに近く、2つの独立したライブラリーに由来する2つのクローン（236-1と236-3）を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびDNA配列解析によってさらに解析した。これらの独立クローンは984bpのオーバーラップコンティグ（ポリA配列を除く）を形成し、207アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードする（図4）。ポリAテールを含めると、この配列はノーザンブロット解析でみられた約1.0kb mRNAに近くなることから、5'UTR配列のほぼ全てが単離されたことが示唆される。ヌクレオチド配列を公開データベース検索にかけたが、有意な一致は得られなかった。しかし、207アミノ酸のオープンリーディングフレームを使ってデータベース検索を行なったところ、いくつかの種のいくつかのヌクレオプラスミンホモログとの高いホモロジーが明らかになった。興味深いことに、O1-236はアフリカツメガエルヌクレオプラスミンと最も高いホモロジーを示す。O1-236はアミノ酸レベルでアフリカツメガエルヌクレオプラスミンと48％一致した（図4）。このホモロジーおよび両遺伝子産物の卵母細胞における発現パターンから判断して、この遺伝子はアフリカツメガエルヌクレオプラスミン［Xnpm2と呼ばれる（MacArthurら、1997）］の哺乳類オルソログであるので、本発明者らはこの遺伝子をNpm2と命名した。
【０１６１】
Npm2cDNA配列を使ってESTデータベースを検索することにより、マウスNpm2に相同な配列を含む2つのヒトcDNAクローンが見つかった。これらの2つのESTの配列解析を行った。これら2つの独立したクローンは923bpのオーバーラップコンティグを形成し、これは214アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードしていた。アミノ酸レベルでは、ヒトNPM2はXnpm2およびマウスNpm2に対して、それぞれ48％および67％一致していた（図5）。
【０１６２】
カエルと哺乳類のNPM2配列を比較したところ、いくつかの興味深い特徴が認められた。ヌクレオプラスミンはKR-(X)10-KKKKからなる二極性核移行シグナルを持つ（Dingwallら、1987）。ヌクレオプラスミン中のこれらの塩基性アミノ酸クラスターのどちらを欠失させると、核への移行が妨げられた（Robbinsら、1991）。マウスとヒトのNPM2配列を解析したところ、この二極性配列は上記2つのタンパク質間で100％保存されていた（図5）。したがって、哺乳類NPM2は核に移行し、主にそこで機能すると予想された。
【０１６３】
また、負荷電残基の長いストレッチも、NPM2とヌクレオプラスミンの間で保存されていた。NPM2のアミノ酸125〜144と、ヌクレオプラスミンのアミノ酸128〜146は、ほとんどがグルタミン酸残基とアスパラギン酸残基であり、NPM2では20残基のうちの19残基が、またヌクレオプラスミンでは19残基のうちの16残基がAspまたはGluである。アフリカツメガエルヌクレオプラスミンのこの領域は、正に荷電したプロタミンおよびヒストンへの結合と結びつけられている。したがって、NPM2のこの酸性領域にも同様の機能が予想された。
【０１６４】
NPM2配列およびヌクレオプラスミン配列のもう一つの明白な特徴は、セリン残基およびスレオニン残基数の多さである。NPM2配列は19残基のセリンと17残基のスレオニン（すなわち全残基の17.2％）を含有し、ヌクレオプラスミンは12残基のセリンと11残基のスレオニン（すなわち全残基の11.5％）を持っていた。NPM2配列およびヌクレオプラスミン配列から、多数の推定リン酸化部位が予想された。これら2つのタンパク質の間で保存されていたいくつかの推定リン酸化配列を図5に示す。ヌクレオプラスミンのリン酸化はヌクレオプラスミンの核への移行と、その活性とを増加させると考えられた（Sealyら、1986；Cottenら、1986；Vancurovaら、1995；Lenoら、1996）。同様に、リン酸化はNPM2活性も変化させるだろう。このように、マウスおよびヒトNPM2とアフリカツメガエルヌクレオプラスミンはどちらもmRNAレベルで卵母細胞（および卵子）特異的であり、最も高い一致度を示すので、哺乳類NPM2とカエルヌクレオプラスミンとはオルソログであると結論した。
【０１６５】
【実施例５】
【０１６６】
Npm2遺伝子の構造
3つの新規卵母細胞特異的cDNAはすべてオープンリーディングフレームを持つことが、研究によってわかった。
【０１６７】
マウスNpm2遺伝子を同定するために、完全長Npm2cDNAの1つ（クローン236-1）を使って、マウス129/SvEvゲノムライブラリー（Stratagene）をスクリーニングした。500,000個のファージをスクリーニングして12個の陽性ファージを同定した。オーバーラップしたこれらのファージクローンのうちの2つ、すなわち236-13と236-14（約37kbの全ゲノム配列）を使って、マウスNpm2遺伝子の構造を決定した。マウスNpm2は9個のエクソンによってコードされ、約6.6kbにまたがっている（図6ならびに図7Aおよび7B（配列番号7A））。中サイズの2つのイントロン（イントロン4および5）が、この遺伝子サイズの大半を占めていた。開始ATGコドンはエクソン2に存在し、終止コドンはエクソン9に存在した。スプライス供与部位とスプライス受容部位（図7Aおよび7B（配列番号7））はげっ歯類動物に見いだされるコンセンサス配列とよく一致し、すべてのイントロン-エクソン境界が「GT-AG」則に従っていた（Senapathyら、1990）。コンセンサスポリアデニル化シグナル配列が、上記2つの単離cDNA中に存在するポリA領域の上流に見いだされた（図7Aおよび7B（配列番号7））。
【実施例６】
【０１６８】
マウスNpm2遺伝子の染色体マッピング
マウスで遺伝子の染色体マッピングを行うと、マウスの自然突然変異または誘発突然変異に関係する候補遺伝子が同定される。単離された新規卵巣特異的cDNAの機能解析をさらに助けるために、Research Geneticsの放射線ハイブリッドパネル（Radiation Hybrid Panel）を使って、これらのマウス遺伝子をマッピングした。この技術を使ってマッピングされた遺伝子を表3に示す。また、ヒト染色体上のシンテニー領域を同定することにより、これらの新規卵巣遺伝子の1つまたは複数が、これらの領域にマッピングされる既知のヒト疾患の候補遺伝子であると同定されうる。
【０１６９】
【表３】
2005502324.tif 000004
マウスNpm2遺伝子をマッピングするために、本研究者らは、Research Geneticsの放射線ハイブリッドパネル、ジャクソンラボラトリー戻し交雑DNAパネルマッピングリソース（Jackson Laboratory Backcross DNA Panel Mapping Resource）およびジャクソンラボラトリーマウス放射線ハイブリッドデータベース（Jackson Laboratory Mouse Radiation Hybrid Database）を利用した。最後のエクソン内にあるフォワードプライマー（配列番号17：GCAAAGAAGCCAGTGACCAAGAAATGA）およびリバースプライマー（配列番号18：CCTGATCATGCAAATTTTATTGTGGCC）を使って、マウスには存在するがハムスターには存在しない229bpの断片をPCR増幅した。これらのプライマーを使うことによって、マウスNpm2遺伝子は14番染色体の中央にマッピングされた（図8）。Npm2はD14Mit32との連鎖（LODは11.2）を示し、またD14Mit203とも7.8のLODを持っていた。この領域はヒト染色体8p21とシンテニックである。
【実施例７】
【０１７０】
新規卵巣発現遺伝子を欠くノックアウトマウスの作出
上で得た遺伝子配列を使って、胚性幹（ES）細胞中のO1-180、O1-184およびO1-236遺伝子を突然変異させるためのターゲティングベクターを作製する。これらのターゲティングベクターをhprt陰性AB2.1 ES細胞系にエレクトロポレートし、HATおよびFIAU中で選択する。クローンをサザンブロット解析のために処理し、5'および3'外部プローブを使ってスクリーニングする。正しい突然変異を持つES細胞を胚盤胞に注入してキメラを作出し、最終的には突然変異型O1-180、O1-184およびO1-236遺伝子に関するヘテロ接合体およびホモ接合体を作出する。
【０１７１】
O1-180、O1-184およびO1-236の発現は卵巣に限定されていたので、これらのO1-180ノックアウト、O1-184ノックアウトおよびO1-236ノックアウトマウスは生存可能であるが、これらの遺伝子産物を欠く雌は妊性が変化している（すなわち不妊、低受胎性または超受胎性である）可能性があると、本発明者らは予想する。通常の当業者の能力の範囲で十分に可能な技術を使って、卵胞形成、卵形成または受精に必要な卵巣内タンパク質に関係する形態学的、組織学的および生化学的情報について、突然変異マウスを解析する。これらのタンパク質の不在は妊性が増加または低下した雌マウスをもたらしうると予想される。これらの研究は、同様の特発性表現型を持つヒト生殖状態の検索につながるだろう。
【実施例８】
【０１７２】
O1-184トランスジェニック動物の作出
O1-184遺伝子の両側にゲノム配列を配置し、マイクロインジェクションによって受精卵に導入する。マイクロインジェクションを行った卵子を雌宿主に着床させ、子孫を導入遺伝子の発現に関してスクリーニングする。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類および魚類を含む（ただしこれらに限らない）多くの動物の受精卵から作出することができる。これらの動物は、O1-184を過剰発現するように、または突然変異型のO1-184を発現するように作出される。
【実施例９】
【０１７３】
マウスNpm2の卵巣特異的発現
Npm2遺伝子産物の細胞特異的発現を明確にするために、野生型マウス卵巣を使ってインサイチューハイブリダイゼーション解析を行った。
【０１７４】
インサイチューハイブリダイゼーションは既述のように行った（Albrechtら、1997；Elvinら、1999）。簡単に述べると、C57B16/129SvEvマウスの卵巣を解剖し、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、処理し、パラフィンに包埋し、5mmに薄切した。断片O1-236をテンプレートとして、[a32P]-dUTPと共に使用し、Riboprobe T7/SP6コンビネーションシステム（Promega）を使って、センス鎖およびアンチセンス鎖を作製した。ハイブリダイゼーションは、1スライドあたり各リボプローブについて5×106cpmを使って、50％脱イオンホルムアミド/0.3M NaCl/20mM Tris-HCl(pH8.0)/5mM EDTA/10mM NaPO4(pH8.0)/10％硫酸デキストラン/1×デンハート液/0.5mg/ml酵母RNA中、50〜55℃で、16時間行った。高ストリンジェンシーの洗浄を、2×SSC/50％ホルムアミドおよび0.1×SSC中、65℃で行った。脱水した切片をNTB-2乳剤（Eastman Kodak、ニューヨーク州ロチェスター）に浸漬し、40℃で4〜7日間露出した。スライドを現像し定着した後、ヘマトキシリンで染色し、マウントして写真撮影を行った。
【０１７５】
Npm2遺伝子産物は卵母細胞特異的だった（図9Aおよび9B）。プローブは成長するすべての卵母細胞での特異的発現を示す。卵母細胞特異的発現は初期単層一次卵胞（3a型）に初めて認められ、単層3b型卵胞と、胞状(an)卵胞を含むその後のすべての段階では、発現量が多くなった。「センス」プローブは、この卵母細胞特異的遺伝子のシグナルを検出しない。
【実施例１０】
【０１７６】
NPM2の細胞内局在
抗NPM2抗体を使ったマウス卵巣の免疫組織染色によって、NPM2タンパク質の細胞内局在を決定した。
【０１７７】
完全長マウスNPM2タンパク質をコードするcDNAを、PCRで増幅することにより、開始コドンの前にBamH1部位を導入し、停止コドンの前にXhoI部位を導入した。Hisタグ付きNPM2タンパク質を作製するために、このPCR断片をpET-23b(+)（Novagen）にクローニングし、配列決定を行って突然変異がないことを確認した。組換えNPM2タンパク質はpETシステムマニュアル（Novagen）に記載されているように精製した。2頭のヤギを精製Hisタグ付きNPM2で免疫処置して、特異的かつ高親和性の抗体を産生させた。
【０１７８】
卵巣をPBS中の4％パラホルムアルデヒドで2時間固定し、処理し、パラフィンに包埋し、5mmの厚さに薄切した。ヤギ抗NPM2ポリクローナル抗血清を、Common Antibody Dilute（BioGenex）で1：2000に希釈した。同じヤギから得た免疫前ヤギ血清を対照として使用した。すべての切片をUniversal Blocking Reagent（BiogGenex）中で10分間ブロックし、一次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。NPM2検出は、抗ヤギビオチン化二次抗体、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ標識、およびNew Fuschin基質（BioGenex Laboratories, Inc.、カリフォルニア州サンラモン）を使って行った。
【０１７９】
1〜8細胞胚および胚盤胞を、96ウェル丸底プレートにて、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで、2時間固定し、0.85％食塩水で洗浄し、数滴の1.5％アガロースに包埋した。そのアガロース含有胚を脱水し、パラフィンに包埋し、上述のように解析した。
【０１８０】
Npm2mRNAの発現パターンと一致して、NPM2タンパク質は3型段階から胞状濾胞段階まで卵母細胞中で発現していた。ランダム周期マウスでは、抗NPM2抗体が核を強く特異的に染色した（図9C）。卵母細胞核は卵核胞（GV）とも呼ばれる。黄体形成ホルモン（LH）の排卵前サージはGV卵母細胞の成熟を加速し、GV崩壊（GVB）を促進する。マウスにPMSGとhCGを注射して過剰排卵を誘発すると、NPM2タンパク質は卵核胞崩壊後に胞状卵胞の卵母細胞に再分布する。排卵前GVB卵母細胞では、NPM2は卵母細胞の細胞質に均等に分布していた（図9D）。xNPM2は受精後の精子DNA脱凝縮および前核形成に関与することが示唆されているので、この再分布により、細胞質NPM2が受精時に精子核と相互作用するために適正な位置についたことが示唆された。受精後のNPM2発現を調べるために、初期胚を固定し、薄切し、抗NPM2抗体で染色した。接合子では、NPM2は再び核に移行し始めた。図9Eは、一方の前核は形成されたが他方はまだ完成しておらず、多少のNPM2がまだ細胞質に存在するという中間段階を示している。その後のある時点では（図9F）、NPM2のすべてが前核内に存在した。2細胞胚（図9G）および8細胞胚（図9H）では、抗体は依然としてもっぱら核内にNPM2タンパク質を検出した。胚盤胞（胎生3.5日）では、NPM2がかなり低下したレベルで依然として検出されたが、胎生6.5日の胚では、NPM2発現は検出できなかった。
【実施例１１】
【０１８１】
マウスNpm2遺伝子の標的破壊およびNpm2ノックアウトマウスの作出
哺乳類卵母細胞発生および初期胚発生におけるNPM2の役割を調べるために、本発明者らはマウスNpm2遺伝子座をES細胞技術を使って破壊した。
【０１８２】
エクソン2および3ならびにエクソン4のスプライス接合部を欠失させるために、Npm2用のターゲティングベクターを構築した。この欠失ターゲティングベクターは、左から右に、2.2kbの5'Npm2ホモロジー、PGK-hprt発現カセット、4.6kbの3'Npm2ホモロジーおよびMC1-tk（チミジンキナーゼ）発現カセットを含む。線状化したNpm2ターゲティングベクターをAB2.1 ES細胞にエレクトロポレートした。HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）ならびにFIAU［1-(2'-デオキシ-2'-フルオロ-b-D-アラビノフラノシル)-5'-ヨードウラシル］を含むM15培地で、ES細胞クローンを選択した。ES細胞の培養および胚盤胞の収集と注入は、以前に、Matzukら（1992）に記述されている。ゲノムサザンブロット解析のために、BglII消化DNAをGeneScreen Plusナイロン膜に移し、エクソン9配列に相当する外部190bp PCR合成断片（3'プローブ）でプローブした。DNAをBamH1で消化した場合は、野生型対立遺伝子とNpm2ヌル（Npm2tm1Zuk）対立遺伝子とを識別するために、内部200bp PCR合成断片（49bpエクソン1＋150bp 5'上流配列）も使用した。DNAをPst1で消化した場合は、137bpのエクソン2配列を含むPCR合成プローブを使って、Npm2tm1Zuk対立遺伝子に関してホモ接合性のマウスにエクソン2が存在しないことを検証した。正しくターゲティングされた1つのES細胞クローン（Npm2-118-B11と呼ぶ）を増殖させ、ES細胞をC57B1/6胚盤胞に注入して、キメラマウスを取得し、最終的にはそこからC57B16/129/SvEv雑種および129/SvEv同系交配F1子孫を取得した。
【０１８３】
翻訳開始コドンを含むエクソン2ならびにエクソン3およびエクソン4スプライス接合部を欠失させるためにターゲティングベクターを構築した（図10A）。エクソン2以外の部分では、残りの配列には他にATGは1個しか存在せず（エクソン6）、このATGは酸性ドメインの下流にあって、二極性核局在化コンセンサス配列の間に位置した。したがってこのベクターは、Npm2ヌル対立遺伝子をもたらした。F1ヘテロ接合性（Npm2tmlZuk/+；ここではNpm2+/-と呼ぶ）マウスは生存可能で妊性であり、NPM2不在の発生面での帰結を調べるためにこれを交雑した。これらの交雑によって得られたF2子孫230匹の遺伝子型解析（図10B；表4）は、1:2:1という通常のメンデル比に従い、同じような数の雄および雌ホモ接合体（Npm2-/-）が生成した。したがって、Npm2ホモ接合性突然変型雄および雌マウスは生存可能であり、正常な性分化を持つように見えることから、Npm2は誕生前には必要ないことが証明された。
【０１８４】
【表４】
2005502324.tif 000005
Npm2ホモ接合体として遺伝子型別されたマウスがNpm2を欠いていることを確認するために、野生型Npm2遺伝子のエクソン2にハイブリダイズするcDNAプローブを使って、サザンブロット解析を行った。図に示すように（図10C）、このプローブは、エクソン2を欠失させたホモ接合性（Npm2-/-）マウスから得たDNAには、なんのシグナルも検出することができなかった。さらに、Npm2ホモ接合体および対照に対して、Npm2免疫組織化学的解析を行った。ヘテロ接合型対照から得た卵巣にはNPM2タンパク質の発現が認められるが（図11Aおよび11C）、ホモ接合体卵巣中の卵母細胞にはタンパク質は検出されなかった（図11Bおよび11D）。これにより、Npm2tm1Zuk突然変異はヌル対立遺伝子であり、Npm2ホモ接合体はNPM2タンパク質を完全に欠いていることが確認された。
【実施例１２】
【０１８５】
Npm2の喪失は雌の不妊および低受胎をもたらす
生殖機能におけるNPM2の機能を調べるために、成体ホモ接合性雑種（C57B1/6/129SvEv）雄または雌マウスを対照ハイブリッドマウス（C57B1/6/129SvEv）と交雑した。Npm2mRNAおよびタンパク質の雌特異的発現と合致して、Npm2-/-雄マウスは妊性があり、精巣に肉眼的または組織学的欠損はなかった（非掲載のデータ）。同様に、10匹の雌Npm2ヘテロ接合体をヘテロ接合性雄と5〜8ヶ月の間の交雑したところ、8.55匹/リターで53リターの子孫が得られた（0.97リター/月）（表5）。対照的に、12匹のNpm2-/-雌マウスのうち9匹だけが5〜8ヶ月の間に妊娠し、平均で2.75匹/リターの32リターをもたらした（0.43リター/月）（表5）。このように、Npm2の不足は、雌では低受胎および不妊につながるが、雄ではそのような影響はない。
【０１８６】
【表５】
2005502324.tif 000006
【実施例１３】
【０１８７】
Npm2ヌル受精卵中の初期分割欠損
Npm2-/-雌マウスにおける妊性欠損の原因を決定するために、卵巣をまず形態学的および組織学的に調べた。Npm2-/-卵巣と対照卵巣の間に肉眼レベルまたは組織学的レベルで相違はない（図11Eおよび11F）。Npm2-/-卵巣には黄体の形成を含む正常な卵胞形成が観察されたことから、これらのマウスでは排卵が起こることが示唆された。
【０１８８】
排卵が起こることを確認するために、またNpm2-/-マウスの不妊および低受胎の原因をさらに調べるために、野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスの薬理学的過剰排卵を行い、卵子を卵管から収集し、インビトロ培養した。
【０１８９】
既述のように（Hoganら、1994；Matzukら、1996）、未成熟（21〜24日齢）雌に5IUのPMSG（妊馬血清ゴナドトロピン）を腹腔内注射し、次に5IUのhCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を注射して、過剰排卵を誘発した。注射したマウスを野生型雄マウスと交尾させた。翌朝、これらのマウスの卵管から卵子を収集した。M2培地（Sigma）中の0.3mg/mlヒアルロニダーゼを使って卵丘細胞を卵子から取り出した。卵子は、5％CO2および95％空気の雰囲気を持つ37℃の湿潤培養器中、軽質パラフィン油で覆ったM16培地（Sigma）で培養した（Hoganら、1994）。
【０１９０】
DNAを染色するために、卵子をPBS中で1回洗浄し、10mg/mlビスベンズイミド（Hoechst 33258）を含む4％パラホルムアルデヒド/PBS中、室温で20分間インキュベートし、PBSで2回洗浄し、Fluoromount-Gでマウントし、蛍光顕微鏡（Axioplan2イメージング、Carl Zeiss）で写真撮影した。
【０１９１】
21〜24日齢マウスの妊馬血清ゴナドトロピン/ヒト絨毛性ゴナドトロピン過剰排卵処置は、Npm2-/-雌に、野生型またはヘテロ接合性対照と同じような数の排卵数をもたらした（表6）。Npm2-/-と対照との間で、受精の証拠である第二極体の生成に有意な相違はないので、Npm2-/-マウスの卵子は精子によって正常に受精されるように見える。しかし、Npm2-/-マウスでは、1細胞胚から2細胞胚への分割に、大きな欠損があった。（表6、図12A〜12D）。2細胞胚の数がかなり減少したことの他に、奇異で発生的に異常な胚が24時間のインビトロ培養中に現れた（図12B）。対照卵子（図12C）とは異なり、Npm2-/-卵子は、現在のインビトロ培養アッセイでは、4細胞胚段階まで進むことができなかった（図12D）。したがって、Npm2-/-マウスにおける欠損は、胚の生存力の低下を招くようである。
【０１９２】
【表６】
2005502324.tif 000007
【実施例１４】
【０１９３】
O1-180遺伝子およびO1-180偽遺伝子の構造
ZAP-expressマウス卵巣cDNAライブラリーをスクリーニングして、完全長O1-180 cDNAを単離した。ポリAテールを除くと、完全長O1-180 cDNAは約1.3kbで、ヌクレオチド26からヌクレオチド1108までのオープンリーディングフレームをコードしている。O1-180 cDNAは、例えばマウス16細胞胚cDNAライブラリーのEST（AU044294）およびマウス未受精卵cDNAライブラリーのEST（AU023153）など、データベース中のいくつかのESTと相同である。O1-180 cDNA ORFから予想されるポリペプチドは361アミノ酸からなり、40kDaの分子量を持つ。公開タンパク質データベースを検索したが、既知のタンパク質ホモログは見つからなかった。二極性核局在化シグナルが333〜350位に見いだされる（配列番号19：Lys-Arg-Pro-His-Arg-Gln-Asp-Leu-Cys-Gly-Arg-Cys-Lys-Asp-Lys-Arg-Leu-Ser）ことから、O1-180は卵母細胞核または胚核に移行しうることが強く示唆される。
【０１９４】
マウスO1-180遺伝子をクローニングするために、マウス129SvEv株から作製したマウスゲノムlFix IIファージライブラリーを、完全長O1-180 cDNAを使ってスクリーニングした。12個の独立したλ組換えクローンが単離された。そのうちの8つはユニークなクローンと同定されたので、サブクローニング、サザンブロット解析および配列決定によってさらに特徴づけた。驚いたことに、この遺伝子のエクソン2の650ヌクレオチド上流から始まる1つのゲノムインサートDNAだけが、O1-180遺伝子の3'部分と一致した。残りのクローンは、O1-180 cDNAと98％一致するエクソンを持つ近縁の遺伝子に対応していた。エクソンの相違に基づいて、O1-180遺伝子特異的プライマーおよび類縁遺伝子特異的プライマーを設計し、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行った。脳、心臓、肺、脾臓、肝臓、小腸、胃、腎臓、子宮、精巣および卵巣を含む8週齢C57マウス組織由来のcDNAをテンプレートとして使用した。ノーザンブロット解析と一致して、O1-180 cDNAはもっぱら卵巣だけで増幅された。一方、類縁遺伝子cDNAはどの組織にも検出できなかった。これにより、マウスゲノムlFix IIファージライブラリーから単離された類縁遺伝子は偽遺伝子であることが示された。BAC129SvJマウスゲノムライブラリーを、2組のO1-180遺伝子特異的プライマーによるPCRでスクリーニングしたところ、BACクローンが1つだけ単離された。そのBACおよびlファージクローンのコード領域全体およびエクソン-イントロン境界の配列決定により、O1-180とO1-180偽遺伝子はどちらも4つのエクソンと3つのイントロンとを含むことが明らかになった（図14）。図15に示すように、エクソン-イントロン境界はすべてGT-AGイントロンドナー-アクセプタースプライス則に合致していた。O1-180遺伝子と偽遺伝子との主な相違は、偽遺伝子のエクソン1に13ntのギャップが存在することであり、本発明者らは、これがフレームシフトをもたらし、偽遺伝子ではエクソン2で早くも停止が起きると考えている。エクソン2の配列はO1-180遺伝子でも偽遺伝子でも同一であり、エクソン3および4には一塩基対突然変異がある（図15）（配列番号11および配列番号12）。
【実施例１５】
【０１９５】
マウス5番染色体
全ゲノム放射線ハイブリッドパネルT31（McCarthyら、1997）をResaerch Genetics（アラバマ州ハンツビル）から購入し、製造者の説明書に従って使用した。パネルは照射マウス胚初代細胞（129aa）をハムスター細胞と融合させることによって構築された。O1-180のハムスターホモログの配列はわかっていないので、ハムスターホモログが同時増幅される危険を最小限に抑えるために、本発明者らは、マウス配列の3'非翻訳領域からリバースプライマーを設計した（MakalowskiおよびBoguski、1998）。O1-180遺伝子特異的プライマーは（配列番号20）5'-CTAGAAAAGGGGACTGTAGTCACT-3'フォワードおよび（配列番号21）5'-TGCATCTCCCACACAAGTCTTGCC-3'リバースとした。偽O1-180遺伝子特異的プライマーは（配列番号22）5'-CTAGAAAAGGGGACTATAGGCACC-3'フォワードおよび（配列番号23）5'-TGCATCTCTCACACAAGTGTTGCT-3'リバースとした。これら2組のプライマーの特異性を、A23ハムスターDNAおよび129マウスDNAで検証した。PCR反応は、1mlの各パネルDNA、1.25UのTaq platinum DNAポリメラーゼ（Gibco, メリーランド州ロックビル）、付随試薬類（0.25mM dNTP類、1.5mM MgCl2、1×PCR緩衝液）および0.4mMの各プライマーを含む最終液量15mlで行った。94℃で4分間の初期変性ステップの後、30サイクルの増幅（94℃で40秒、60℃で30秒、72℃で30秒）を行い、最後に72℃で7分間の伸張を行った。
【０１９６】
O1-180遺伝子特異的プライマーとO1-180偽遺伝子特異的プライマーをそれぞれ設計し、T31マウス放射線ハイブリッドパネルの細胞系DNA 100個すべてを、PCRにより、二連のアッセイでスクリーニングした。各遺伝子に関するデータをJackson Laboratory Mouse Radiation Hybrid Mapper Serverでの解析に供した。どちらの遺伝子もマウス5番染色体の同じ領域に位置していた。O1-180遺伝子座は、2つのマーカーD5Buc48およびTxkの間、40cMにあり、一方、O1-180偽遺伝子はコード遺伝子座のすぐ遠位側、TecとD5Mit356の間、41cMにある（図16）。これはヒト染色体4p12の領域とシンテニックである。
【実施例１６】
【０１９７】
マウス卵巣におけるO1-180の局在
O1-180特異的プローブを使ってインサイチューハイブリダイゼーションを行った。[α-35S]UTP標識アンチセンスおよびセンスプローブを、Riboprobe T7/T3コンビネーションシステム（Promega、ウィスコンシン州マディソン）によって作製した。ハイブリダイゼーションはAlbrechtら（1997）およびElvinら（1999A）に記載されている方法に従って行った。
【０１９８】
インサイチューハイブリダイゼーションにより、これらの卵巣内で卵母細胞に局在したO1-180の高レベルな発現が明らかになった。卵母細胞内でのO1-180の発現は、単層（一次）卵胞段階から胞状卵胞段階まで顕著であったが、原始卵胞段階では発現は認められなかった。Gdf9ノックアウト卵巣では卵胞の発育が一次卵胞段階で停止するために卵胞数が増えるので、より多くのO1-180陽性卵母細胞が各切片に検出された（図13）。
【実施例１７】
【０１９９】
O1-180の解析
当技術分野でよく知られておりよく使用されている標準的な技術を使ってノーザンブロット解析を行った。簡単に述べると、卵巣mRNAを野生型およびGDF-9(-/-)マウスから単離した。図18はO1-180が卵巣組織に特異的であることを示している。
【０２００】
当技術分野でよく知られておりよく使用されている標準的な技術を使ってウェスタンブロット解析を行った。簡単に述べると、卵巣タンパク質を野生型およびGDF-9(-/-)マウスから単離した。O1-180に対する抗体を使って、組換えO1-180タンパク質のサイズを天然O1-180タンパク質のサイズと比較した。図19により、組換えO1-180タンパク質は、GDF-9(-/-)マウスから単離された卵巣に由来する天然O1-180と、同じようなサイズを持つことが明らかになった。
【実施例１８】
【０２０１】
O1-180の細胞内局在
O1-180タンパク質の細胞内局在を、マウス卵巣を抗O1-180抗体で免疫組織染色することによって決定した。
【０２０２】
完全長マウスO1-180タンパク質をコードするcDNAをPCRで増幅することにより、開始コドンの前にBamH1部位を、そして停止コドンの前にXhoI部位を導入した。このPCR断片をpET-23b(+)（Novagen）にクローニングして、Hisタグ付きO1-180タンパク質を製造し、配列決定して、突然変異が存在しないことを確認した。組換えO1-180タンパク質はpET System Manual（Novagen）に記載されているように精製した。2匹のヤギを精製したHisタグ付きO1-180で免疫処置して、特異的かつ高親和性の抗体を産生させた。
【０２０３】
卵巣をPBS中の4％パラホルムアルデヒドで2時間固定し、処理し、パラフィンに包埋し、5mmの厚さに薄切した。ヤギ抗O1-180ポリクローナル抗血清をCommon Antibody Dilute（BioGenex）で1：2000に希釈した。同じヤギから採取した免疫前ヤギ血清を対照として使用した。すべての切片をUniversal Blocking Reagent（BiogGenex）中で10分間ブロックし、一次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。Npm2検出は、抗ヤギビオチン化二次抗体、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ標識、およびNew Fuschin基質（BioGenex Laboratories, Inc.、カリフォルニア州サンラモン）を使って行った。
【０２０４】
図20に、マウス卵巣におけるO1-180の免疫染色を示す。図20に示すように、O1-180タンパク質は、マウス卵母細胞および接合子の細胞質に特異的に局在するが、この時点より後では消失した。
【実施例１９】
【０２０５】
O1-180ノックアウトマウスの作出
O1-180遺伝子を突然変異させるためのターゲティングベクターを、単離された配列から構築した（図17）。哺乳類卵母細胞の発生および初期胚発生におけるO1-180の役割を調べるために、本発明者らはES細胞技術を使ってマウスO1-180遺伝子座を破壊した。翻訳開始コドンを含むエクソン1を欠失させるためにターゲティングベクターを構築した。したがって、このベクターはO1-180ヌル対立遺伝子をもたらした。
【実施例２０】
【０２０６】
O1-180の喪失は雌の不妊および低受胎をもたらす
生殖機能におけるO1-180の機能を調べるために、成体ホモ接合性雑種（C57B1/6/129/vEv）雄または雌マウスを対照ハイブリッドマウス（C57B1/6/129/SvEv）と交雑した。O1-180 mRNAおよびタンパク質の雌特異的発現と合致して、O1-180-/-雄マウスは妊性があり、精巣に肉眼的または組織学的欠損はなかった。同様に、雌O1-180ヘテロ接合体をヘテロ接合性雄と5〜8ヶ月の間の交雑したところ、7.1匹/リターの子孫が得られた（表7）。これに対し、5〜8ヶ月の間に妊娠したO1-180-/-雌マウスはいなかった（表7）。このように、O1-180の欠損は、雌では低受胎および不妊につながるが、雄ではそのような影響はない。
【０２０７】
【表７】
2005502324.tif 000008
【実施例２１】
【０２０８】
O1-180ヌル受精卵中の欠損
O1-180-/-、O1-180+/-雌マウスにおける妊性欠損の原因を決定するために、卵巣をまず形態学的および組織学的に調べた。
【０２０９】
排卵が起こっていることを確認するために、またO1-180-/-、O1-180+/-マウスの妊性および低受胎の原因をさらに調べるために、野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスの薬理学的過剰排卵を行い、卵子を卵管から収集し、インビトロ培養した。図21および表8に示すように、2日目までに、わずかなO1-180-/-接合子だけが2細胞段階に発育し、それらはいずれも、3日目までに4細胞段階に発育しなかった。これは大半が2日目までに2細胞胚に発育し、それらのうち大半が3日目および4日目までに胚盤胞に発育したO1-180+/-接合子とは対照的だった。したがって、O1-180-/-マウスにおける欠損は、受精後から胚盤胞の発生までに開始するようである。
【０２１０】
【表８】
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【実施例２２】
【０２１１】
ツーハイブリッド解析
ツーハイブリッドスクリーニングは、あるタンパク質の機能を、それが相互作用する他のタンパク質を同定することによって解明または特徴づけるために用いられる。
【０２１２】
タンパク質O1-180またはO1-236またはO1-184を、興味あるタンパク質のDNAと共にGAL4のDNA結合ドメインを含むキメラタンパク質として製造する。このキメラタンパク質を発現させるヌクレオチド配列を含むプラスミドで、さまざまな標的タンパク質候補をコードするさまざまなヌクレオチド配列に融合されたGAL4活性化ドメインを含むライブラリーに由来する代表プラスミドをも含む真核細胞を形質転換する。もし興味あるタンパク質（O1-180、O1-184またはO1-236）が標的タンパク質と物理的に相互作用するのであれば、GAL4活性ドメインとGAL4 DNA結合ドメインとがつながれ、その結果、共同的に作用してレポーター遺伝子の転写を促進することができるようになる。O1-180、O1-236またはO1-184タンパク質と標的タンパク質候補との間に相互作用が起こらない場合は、GAL4成分は離れたままであり、レポーター遺伝子の転写を単独では促進することができない。
【０２１３】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、本願特許請求の範囲に規定する本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、置換、改変を施すことができると解釈すべきである。さらにまた、本願の範囲は、本明細書に記載した態様のプロセス、装置、製造、組成物、手段およびステップに限定されないものとする。本明細書に記載した対応する態様と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果をもたらす、既存のまたは将来開発されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法またはステップを、本発明に従って利用してもよいことは、本発明の開示から、当業者にはすぐに理解されるだろう。したがって、本願特許請求の範囲は、そのようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法またはステップも、その範囲に包含するものとする。
【０２１４】
［参考文献］
以下の参考文献には、本明細書の説明に関して、典型的な操作上の詳細または他の詳細を補足する記載があるので、これらは特に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
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【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】卵巣特異的遺伝子の多組織ノーザンブロット解析。O1-180、O1-184およびO1-236プローブを使って、全RNAに対してノーザンブロット解析を行なった。図に示すように、これらの遺伝子産物は卵巣特異的パターンを示す（OV, 卵巣；WT, 野生型；-/-, Gdf9ノックアウト）。18Sおよび28SリボソームRNAの移動位置を示してある。どのレーンも負荷がほぼ等しいことは、18S rRNA cDNAプローブを使って証明された。Br, 脳；Lu, 肺；He, 心臓；St, 胃；Sp, 脾臓；Li, 肝臓；Si, 小腸；Ki, 腎臓；Te, 精巣；Ut, 子宮。
【図２】マウス卵巣における卵巣特異的遺伝子のインサイチューハイブリダイゼーション解析。O1-180（図2A〜2B）、O1-184（図2C〜2D）およびO1-236（図2E〜2F）に対するアンチセンスプローブを使ってインサイチューハイブリダイゼーションを行なった。図2A、2Cおよび2Eは卵巣の明視野解析である。図2B、2Dおよび2Fは同じ卵巣切片の暗視野解析である。どの遺伝子も、単層一次卵胞段階（小さい矢印）から始まり胞状卵胞段階（大きい矢印）まで続く卵母細胞における特異的発現を示している。
【図３】マウス卵巣におけるO1-236のインサイチューハイブリダイゼーション解析。プローブO1-236（部分Npm2 cDNA断片）を使ってインサイチューハイブリダイゼーションを行なった。同じ成体卵巣切片中のO1-236 mRNAの明視野解析（図3A）および暗視野解析（図3B）。このプローブにより、成長中のすべての卵母細胞で、特異的発現が示される。卵母細胞特異的発現は初期単層一次卵胞（3a型）に初めて認められ、単層3b型卵胞とそれ以降のすべての段階（胞状（an）卵胞を含む）では発現量が多くなる。
【図４】Npm2 cDNAを表す図。マウスNpm2 cDNA配列（984bp）と、マウス卵巣cDNAライブラリーから単離されたクローンのうちの2つの概略図。元のO1-236プローブ（749bp）を一番上に示す。これはNpm2オープンリーディングフレーム全体を包含する。このオープンリーディングフレーム（中実の四角形）は621bpであり、5'UTR配列と3'UTR配列（細い線）はそれぞれ155bpおよび205bpである。ポリA配列は描かれていない。クローン236-1（Npm2）は野生型卵巣cDNAライブラリーから単離され、クローン236-3はGdf9ノックアウト卵巣cDNAライブラリーから単離された。クローン236-3（ポリA配列を除いて984bp）は、クローン263-1（ポリA配列を除いて979bp）より5'末端が4bp、3'末端が1bp長い。
【図５】アフリカツメガエル（配列番号15）、マウス（配列番号6）およびヒト（配列番号9）NPM2タンパク質間のアミノ酸配列保存。NCBI blast検索ツールおよびMegalignソフトウェアを使って、マウス（m）、ヒト（h）およびアフリカツメガエルNPM2アミノ酸配列を比較すると、高い一致度（青色で強調したアミノ酸）が明らかになる。アミノ酸の間の空白は整列を助けるためのギャップを示す。保存された二極性核移行シグナル（赤色）、高度に酸性なヒストンおよびプロタミン結合領域（赤色）ならびにいくつかの保存されたカゼインキナーゼII（CK2）およびプロテインキナーゼC（PKC）リン酸化部位（下線を引き「CK」または「PKC」と記す）も特定されている。ヌクレオプラスミン中の保存されていない他の予想リン酸化部位は示していない。
【図６Ａ−Ｂ】マウスNpm2遺伝子の構造（図6A）。マウス129/SvEvライブラリーから単離した2つのオーバーラップ組換えラムダクローン（236-13および236-14）を上側に示し、Npm2遺伝子の拡大概略図も図示する。中空の四角形は非翻訳領域を表し、中実の黒い四角形はタンパク質コード領域を表す。236-13インサートは約19.0kbであり、236-14インサートは約21.0kbである。コンティグ全体は約37kbである。図に示すように、Npm2遺伝子の9個のエクソンはすべて、一本の6.9kb XbaI（X）断片上に包含される。エクソンおよびイントロンのサイズを下側に示す。略号：B, BamH1；（B）, 予想されるがマッピングされていないBamH1；（N）, ファージクローニング部位のNotI。図6BはヒトNpm2遺伝子の構造を示す。
【図７Ａ−Ｂ】マウスNpm2遺伝子（配列番号7）およびアミノ酸配列（配列番号6）。大文字はNpm2 cDNA配列との配列の一致を表し、5'および3'非転写配列ならびにイントロン配列は小文字で示す。予想転写開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナル配列にはすべて下線を引く。左側の数字はアミノ酸を表す。コドン36の下線付き太字「T」、アミノ酸26の太字「c」および3'UTR配列中の下線付き太字「C」は、cDNA配列と遺伝子配列の間の相違を示す。矢印はcDNA配列におけるO1-236断片の開始点と終了点を示している。
【図８】マウスNpm2遺伝子の染色体局在。（上）14番染色体データを示すJackson LaboratoryのT31放射線ハイブリッドデータベースから得た地図。この地図は上端近くにセントロメアを置いて描かれている。隣接する遺伝子座間の距離を、センチレイ(3000)の単位で染色体線の左に示す。いくつかの14番染色体MITマーカーの位置を右側に示す。マウスNpm2遺伝子はD14Mit203とD14Mit32の間に位置する。欠落したタイピングは割り当てが疑わしくない場合は周辺データから推論した。（下）Npm2に連鎖する遺伝子座を含む14番染色体の一部を示すJackson LaboratoryのT31放射線ハイブリッドデータベースから得たハプロタイプ図。遺伝子座は最も近位を上端にしてベストフィット順に挙げられている。黒い四角形はそのマウス断片について陽性と判定されるハイブリッド細胞株を表し、白い四角形は陰性と判定される細胞株を表す。灰色の四角形はタイピングされていない株または不明瞭な株を示す。各ハプロタイプを持つ株の数を、四角形の縦列のそれぞれの下に示す。欠落したタイピングは割り当てが疑わしくない場合は周辺データから推論した。
【図９】マウス卵巣および初期胚中のNpm2 mRNAおよびNPM2タンパク質の解析。プローブO1-236（部分Npm2 cDNA断片）を使ってインサイチューハイブリダイゼーションを行った。同じ成体卵巣切片中のO1-236 mRNAの明視野解析（図9A）および暗視野解析（図9B）。（図9C）3型卵胞（矢印）から胞状卵胞までの卵母細胞の核（明赤色）内のNPM2が染色された、5週齢のマウスから得た卵巣の免疫組織化学像。（図9D）黄体形成ホルモン（hCG）で誘発した排卵前GVB卵母細胞では、NPM2が細胞質内で一様に染色される（矢印）。LH（hCG）非応答性前胞状卵胞（右上）はNPM2タンパク質が核に局在した卵母細胞を示し続ける。（図9E）受精後、NPM2は前核に局在し始める。1つの前核（矢印）の形成は形成途中であり、一部のNPM2染色はこの初期単細胞胚の細胞質中に存在し続けている。（図9F）NPM2が細胞質にほとんど残っていない発育の進んだ単細胞胚では前核が強く染色される。NPM2抗体は2細胞胚（図9G）および8細胞胚（図9H）の核も特異的に染色する。
【図１０Ａ−Ｂ】ヘテロ接合体交雑から得られる子孫の遺伝子型解析およびNpm2のノックアウトを行うための遺伝子ターゲティングコンストラクト。（図10A）エクソン2、エクソン3、およびエクソン4の接合部を欠失させるために使用したターゲティング戦略。PGK-hprtおよびMC1-tk発現カセットを示す。組換えは5'プローブおよび3'プローブを使ったサザンブロット解析によって検出した（B, BamH1；Bg, BglII；P, PstI）。（図10B）Npm2+/-マウスの交雑によって作出したマウスから単離されたゲノムDNAのサザンブロット解析。DNAをBglIIで消化した場合、3'プローブでは野生型の7.5kbバンドと突然変異型の10.3kbバンドが確認される。（図10C）DNAをPst1で消化した場合、エクソン2プローブは野生型の4.5kb断片だけを検出した。
【図１１】野生型、Npm2+/-およびNpm2-/-マウスから得た卵巣の組織学的解析。（図11A〜11D）卵母細胞の核内のNpm2が染色された、6週齢のマウスから得られた卵巣の免疫組織化学像（図11Aおよび図11CはNpm2+/-卵巣の像；図11Bおよび図11DはNpm2-/-卵巣の像）。（図11E〜11F）12週齢マウスの野生型卵巣（図11E）およびNpm2-/-卵巣（図11F）から得られた、卵巣のPAS（過ヨウ素酸シッフ）/ヘマトキシリン染色像。矢印は大きい胞状卵胞を表す。「CL」は黄体を意味する。
【図１２】Npm2-/-マウスおよび対照マウスから得た卵子のインビトロ培養およびその受精卵のDNAの蛍光標識。過剰排卵後に未熟マウスの卵管から卵子を単離し、インビトロ培養した。24時間および48時間培養した時点で顕微鏡写真を撮影した。（図12A、12C）野生型マウスから得た卵子の大半は分裂して24時間までに2細胞胚を形成した。一部の2細胞胚は48時間の培養後に4細胞段階まで進行した。（図12B、12D）Npm2-/-マウスから得た卵子で2細胞胚に分割したものはごくわずかだった。48時間の培養後に4細胞胚は検出されなかった。Npm2-/-マウスからは発生的に異常な胚またはアポトーシスを起こしたらしい胚がいくつか検出された。
【図１３】マウス卵巣におけるO1-180の局在。PMSG処理した野生型卵巣（図13Aおよび13B）ならびにGdf9ノックアウト卵巣（図13C〜13F）におけるO1-180の発現を、特異的アンチセンスプローブを使ったインサイチューハイブリダイゼーションによって解析した。野生型卵巣では、初期一次卵胞段階（3a型）から排卵卵胞段階まではO1-180遺伝子の発現が検出できたが、原始卵胞では検出できなかった。Gdf9ノックアウト卵巣では、一次卵胞段階での卵胞発育の停止によって単位体積あたりの卵胞数が増加し、より多くのO1-180陽性シグナルが各切片に検出された。図13A、13Cおよび13Eは卵巣の明視野解析であり、図13B、13Dおよび13Fは同じ卵巣切片の対応する暗視野解析である。図13Eおよび13Fは図13Cおよび13Dに示したものと同じ切片の強拡大像である。
【図１４】O1-180遺伝子（配列番号11）およびO1-180偽遺伝子（配列番号12）の構造。O1-180偽遺伝子およびO1-180遺伝子の線図を上側に示し、この直線地図を構築する際に重要だったユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を下側に示す。エクソンとイントロンは同じ縮尺で描かれている。四角形はエクソンを表し、斜線部はタンパク質コード部分を表し、中実部は非翻訳領域を表す。四角形をつなぐ線はイントロンを表す。O1-180ps：O1-180偽遺伝子；O1-180：O1-180遺伝子；B：BamHI；S：SalI；X：XhoI。
【図１５Ａ−Ｂ】O1-180遺伝子とO1-180偽遺伝子の比較。エクソンの配列、エクソン-イントロン境界および各イントロンのサイズを示す。2つの遺伝子間で異なるヌクレオチドとコンセンサスポリアデニル化配列に下線を引く。翻訳開始コドンおよび停止コドンを太字で示す。大文字：エクソン配列；小文字：イントロン配列。
【図１６】O1-180遺伝子（A）およびその類縁偽遺伝子（B）に最もよく連鎖するマーカーの位置をセンチモルガン（cM）の単位で表すマウス5番染色体の地図（Jackson Laboratory Bioinfomatics Serverで作成されたデータおよび地図）。
【図１７】O1-180用の遺伝子ターゲティングコンストラクト。エクソン1を欠失させるために使用したターゲティグ戦略。PGK-hprtおよびMC1-tk発現カセットを示す。
【図１８】さまざまな組織におけるO1-180 mRNA発現のノーザンブロット解析。
【図１９】組換えO1-180のウェスタンブロット解析。
【図２０】マウス卵巣中のO1-180の免疫染色。抗O1-180ポリクローナル抗体（ヤギに産生させたもの）をIHCに使って、マウス卵巣切片におけるO1-180の発現を検出した。図20A〜20Dは野生型卵巣である。図20E〜図20FはGdf9ノックアウト卵巣である。図20bは正常ヤギ血清を使った陰性対照である。O1-180タンパク質はマウス卵母細胞および接合子の細胞質に特異的に局在したが、この時点後に消失する。染色はO1-180タンパク質の位置を示す。
【図２１】O1-190マウス胚のインビトロ培養。図21AはO1-180+/-マウスから培養した胚を表し、図21BはO1-180-/-マウスから培養した胚を表す。M16培地でのインビトロ培養の3日目に、ほとんどの対照胚は桑実胚段階または胚盤胞段階に進行したが、O1-180ノックアウトマウスの接合子はまだ単細胞または2細胞段階のままだった。
【図２２】ヒトO1-180タンパク質とマウスO1-180タンパク質の比較を示す図。相違する残基に下線を引く。これらのタンパク質は91.3％の類似度を持つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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