(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療するための方法であって、該阻害剤が、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法であって、該阻害剤が、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が、非毒性で選択的かつ強力なc-kit阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
阻害剤が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
以下からなる群より選択される非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法であって、該阻害剤が、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法：
ピリミジン誘導体、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン、
単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、ならびに
キナゾリン誘導体。
【請求項５】
阻害剤が、以下の式IIを有するN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体からなる群より選択される、請求項2記載の方法：
2005511506.tif 000013
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、または環状基もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、該少なくとも一つの置換基は、アミノ基、好ましくは以下の基のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する：
2005511506.tif 000014
【請求項６】
阻害剤が、4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
c-kit阻害剤が、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項5または6記載の方法。
【請求項８】
阻害剤が、構成的に活性化された変異体c-kitおよび/またはSCF活性化c-kitから選択される活性化c-kitの阻害剤である、請求項2記載の方法。
【請求項９】
活性化変異体c-kitが、Y823に近接した、より詳細にはc-kit自己リン酸化反応に関与する配列番号:1の800位〜850位アミノ酸の間に位置する変異体、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体から選択される少なくとも一つの変異体、ならびにc-kitの膜近傍ドメイン、好ましくは573コドン〜579コドンの間に欠失を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含むスクリーニング法によって得ることができる、活性化c-kitの選択的で強力かつ非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法：
a）（i）活性化c-kitと、（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、成分（i）および成分（ii）が複合体を形成することができる条件下で、接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験し選択する段階。
【請求項１１】
スクリーニング法が、SCF活性化野生型c-kitをも阻害することができる変異体活性化c-kitの阻害剤である、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験し選択する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
活性化c-kitがSCF活性化野生型c-kitである、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
推定の阻害剤が、段階a）において10μMより高い濃度で試験される、請求項10から12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
IL-3が、IL-3依存的細胞の培養培地中に0.5ng/mlから10ng/ml、好ましくは1ng/mlから5ng/mlの濃度で存在する、請求項10から13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度を、インビトロまたはインビボで測定することができる、請求項10から14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
スクリーニング方法が、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物をインビトロまたはインビボにて試験し選択する段階をさらに含む、請求項10から15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
試験が、肥満細胞、トランスフェクト肥満細胞、BaF3、およびIC-2からなる群より選択される細胞系を用いて行われる、請求項10から16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
試験が、c-kitリン酸化の量の決定を含む、請求項10から17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
スクリーニングが以下の段階を含む、請求項10〜17のいずれか一項記載の間質性膀胱炎を治療する方法：
a）永続的に活性化されたc-kitである変異体c-kitを（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）発現する細胞を用いて、活性化c-kitを標的とし、それぞれがIC50＜10μMを有する候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することにより同定するために、複数の被験化合物を用いて増殖アッセイ法を行う段階、
b）c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階（a）において同定された候補化合物のサブセットに増殖アッセイ法を行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイ法を行い、それぞれがIC50＜10μMを有する、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【請求項２０】
阻害剤が経口投与される、請求項1から19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するための医薬品の製造を目的とする、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤の使用。
【請求項２２】
阻害剤が、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項21記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療するための方法であって、該阻害剤がIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性膀胱炎(IC)は、組織の損傷へと至る、特に膀胱の内層にある細胞の間質における、膀胱壁の慢性炎症である。アメリカ合衆国において最大700,000人の女性がICに罹患している。徴候には、排尿の疼痛、切迫、および頻回、ならびに出血を含む膀胱鏡検査異常が含まれる(Oravisto, K. J. (1975) Ann. Chir. Gynaecol. Fenn. 64: 75)。その結果、IC患者における生活スコア(life score)の質は極めて低い。さらに、今日現在、提示された医薬品のいずれも治療法をもたらすものはない。
【０００３】
ICの仮説的原因としては、感染性、リンパ管閉塞、および神経性、内分泌学的、精神神経症的、炎症性、および自己免疫の病状が含まれる。患者の膀胱壁へリンパ球が浸潤するという事実は特に興味深い。膀胱の炎症は、肥満細胞の数および大きさの双方における有意な増大によっても示される。さらに、組織病理学研究により、IC患者の膀胱壁における肥満細胞が脱顆粒されていることが実証された。
【０００４】
肥満細胞(MC)は、CD34、c-kit、およびCD13抗原を発現する造血幹細胞のある特定のサブセットに由来する組織要素である(Kirshenbaumら、Blood. 94: 2333-2342, 1999；およびIshizakaら、Curr Opin Immunol. 5: 937-43, 1993)。未成熟MC前駆体は血流中を循環し、組織中で分化する。これらの分化および増殖プロセスは、キットリガンド(KL)、スチールファクター(SL)、または肥満細胞増殖因子(MCGF)とも呼ばれる最重要な幹細胞刺激因子(SCF)の一つであるサイトカインの影響下にある。SCF受容体は、III型レセプターチロシンキナーゼサブファミリーに属する癌原遺伝子c-kitにコードされる(BoissanおよびArock, J, Lukoc Biol. 67: 135-48, 2000)。この受容体は他の造血幹細胞または非造血幹細胞でも発現される。SCFによるc-kitレセプターのライゲーションにより、その二量体化、続いてリン酸転位反応が誘導され、様々な細胞質内基質の漸増および活性化へと至る。これらの活性化された基質は、細胞増殖および活性化を担う複数の細胞内シグナル伝達経路を誘導する(BoissanおよびArock, 2000)。肥満細胞は、組織の位置および構造に関してだけでなく、機能的および組織学的レベルにおいても不均一であることにより特徴付けられる(AldenborgおよびEnerback., Histochem. J. 26: 587-06, 1994; Braddingら、J Immunol. 155: 297-307, 1995; Iraniら、J Immunol. 147: 247-53, 1991; Millerら、Curr Opin Immunol. 1: 637-42, 1989;ならびにWelleら、J Leukoc Biol. 61: 233-45, 1997)。
【発明の開示】
【０００５】
ここで、肥満細胞が、ICにおいて観察される炎症に直接的または間接的に関係しており、膀胱壁の細胞の間質の破壊を導くことが提唱される。
【０００６】
Sant GRらは、膀胱で見出される肥満細胞が、それぞれが多くの血管作用性および侵害分子を分泌することができる顆粒球を多数含むことを示した(Urol Clin North Am 1994 Feb; 21(1): 41-53)。さらに、Saban Rらによると、野生型マウスでは刺激により炎症が観察されるのに対して、肥満細胞欠損体(Kit(W)/Kit(Wv))では膀胱の炎症が生じない(Physiol Genomics 2001 Aug 8)。
【０００７】
本発明に関して、活性化された肥満細胞は、膀胱粘膜に損傷を与える一方Tリンパ球およびマクロファージなどの他の炎症性細胞をも引き集める多数のサイトカインおよびプロテアーゼを分泌し、それらは炎症および破壊プロセスにさらに関与していることを前提とする。
【０００８】
実際、刺激により肥満細胞は、次の3つの群に分類される多種多様な媒体を生産する：
- 前もって形成された顆粒球結合媒体(ヒスタミン、プロテオグリカン、および中性プロテアーゼ)
- 脂質由来媒体(プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン)、ならびに
- 様々なサイトカイン(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-a、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1b、IFN-γ)。
【０００９】
より具体的には、SCF/IL-6駆動(SCF/IL-6-driven)肥満細胞応答がICにおいて見出され、それにより、肥満細胞が間質性膀胱炎の発生および発症に重要な役割を果たしていることが示される。
【００１０】
したがって、本発明は、肥満細胞の増殖、生き残り、および活性化を阻害するc-kit特異的キナーゼ阻害剤の使用を目的とする新しい治療方法を提供する。膀胱粘膜の破壊に関与する肥満細胞を破壊することを含む、間質性膀胱炎を治療するための新しい経路が提供される。
【００１１】
チロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができないc-kit阻害剤が、この目的を達成するのに特に適していることが見出された。
【００１２】
説明
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与することを含む、間質性膀胱炎を治療するための方法であって、該阻害剤がIL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない方法に関する。
【００１３】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導体（国際公開公報第94/14808号）、および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、セレオインドール（seleoindole）およびセレニド（国際公開公報第94/03427号）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際公開公報第91/15495号）、ピリミジン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）から選択される。
【００１４】
好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤は非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である。そのような阻害剤は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択することができる。
【００１５】
好ましい化合物の中でも、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）のようなピリミジン誘導体、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、4-アミノ置換キナゾリン（米国特許第3,470,182号）、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン（米国特許第3,800,039号）、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）、4-アニリノキナゾリン化合物（米国特許第4,464,375号）、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン（米国特許第3,551,427号）に注目することは興味深い。
【００１６】
そのため、好ましくは本発明は、ピリミジン誘導体、より詳細には式IのN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体である、非毒性の強力かつ選択的なc-kit阻害剤を投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法に関する：
2005511506.tif 000002
式中、R1、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の説明に組み入れられる、欧州特許第564 409 B1号に記載される意味を有する。
【００１７】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式IIに対応する化合物から選択される：
2005511506.tif 000003
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキルまたは環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００１８】
好ましくはR7は以下の基である：
2005511506.tif 000004
これらの化合物において、以下のように定義されることが好ましい：
R1は、複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4はC1-C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基、例えば以下の基：
2005511506.tif 000005
のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００１９】
したがって好ましい態様において、本発明は、以下の式に対応するCGP57148B：4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドとして当技術分野で公知である化合物の有効量を投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法に関する：
2005511506.tif 000006
【００２０】
本化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載され、特に有用であるβ型は国際公開公報第99/03854号に記載されている。
【００２１】
または、c-kit阻害剤は以下から選択することができる：
インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン；
単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、キナゾリン誘導体；ならびに
2-フェニル-キナキソリン誘導体、例えば2-フェニル-6,7-ジメトキシキナキソリンのようなキナキソリン。
【００２２】
好ましい局面において、本発明は、c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、上記の方法を意図する。
【００２３】
別の態様において、上記のc-kit阻害剤は、活性化c-kitの阻害剤である。本発明の枠組みにおいて、「活性化c-kit」という表現は、点突然変異、欠失、挿入から選択される少なくとも一つの変異を含む、構成的に活性化された変異体c-kitを意味するが、天然のc-kit配列（配列番号：1）の改変および変化型も意味する。そのような変異、欠失、挿入、改変および変化は、トランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、ならびにc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインにおいて起こりうる。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitを意味する。c-kitを活性化するために好ましい、選択的なSCF濃度は、5×10-7 M〜5×10-6 Mを含み、好ましくは2×10-6 M付近である。好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kitの自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位に、少なくとも一つの変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を有する。もう一つの好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。そのような欠失は、例えば、c-kit d(573-579)と呼ばれるコドン573と579の間にある。c-kitの膜近傍ドメインに近位の点突然変異V559Gもまた重要である。
【００２４】
この点において、本発明は、以下を含むスクリーニング法によって得ることができる活性化c-kitの、選択的で強力な非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、間質性膀胱炎を治療する方法を意図する：
a）（i）活性化c-kitと（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、（i）と（ii）の成分が複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）で同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【００２５】
本スクリーニング法はさらに、SCF活性化野生型c-kitを阻害することもできる、活性化変異体c-kitの阻害剤（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）である段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階からなる段階を含みうる。または、段階a）において活性化c-kitは、SCF活性化野生型c-kitである。
【００２６】
本発明を実施するための最良の様式は、段階a）において10μMを超える濃度で推定の阻害剤を試験する段階からなる。適切な濃度は、例えば10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、または40μMである。
【００２７】
段階c）において、IL-3は、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地において、0.5 ng/ml〜10 ng/mlの濃度で、好ましくは1 ng/ml〜5 ng/mlの濃度で存在する。
【００２８】
IL-3依存的細胞の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
増殖および生存に関して、c-kitを本来発現してそれに依存している細胞株。そのような細胞において、以下の技法を用いてヒト肥満細胞株を確立することができる：正常なヒト肥満細胞を、c-kitシグナルペプチドとTAG配列とを含む変異体c-kitをコードする配列を含むレトロウイルスベクターに感染させることができ、それによって変異体c-kitおよび造血細胞において発現された野生型c-kitを、抗体によって区別することができる。
【００２９】
この技術は、細胞の死を誘導せず、遺伝子移入が安定であり満足できる収率（約20％）を生じることから都合がよい。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られた血液に由来する前駆細胞を培養することによって、日常的に得ることができる。この点において、他の血液成分から単核球を分離するために、臍帯静脈からのヘパリン処置（heparinated）血をフィコール勾配上で遠心する。次に、免疫磁気選択系MACS（Miltenyi biotech）を用いて、上記の単離細胞からCD34+前駆細胞を精製する。次に、CD34+細胞をMCCM培地（L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5×10-5 M β-メルカプトエタノール、20％仔ウシ胎児血清、1％ウシ血清アルブミン、および100 ng/ml組換え型ヒトSCFを添加したα-MEM）において、105個/mlの細胞濃度で5％CO2大気中、37℃で培養する。培地を5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合（％）は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはトルイジンブルー染色を用いて毎週評価する。抗トリプターゼ抗体も同様に、培養物における肥満細胞を検出するために用いることができる。培養10週間後、肥満細胞の純粋な細胞集団（＜98％）が得られる。
【００３０】
標準的な技法を用いて、上記のように確立された細胞株をトランスフェクトするために、c-kitを発現するベクターを調製することが可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenら（1987）EMBO J. 6（11）、3341〜3351に記載されている。c-kitのコード部分（3000 bp）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅することができ、かつクローニングすることができる：
2005511506.tif 000007
【００３１】
NotIおよびXhoIによって消化したPCR産物を、T4リガーゼを用いてpFlag-CMVベクター（SIGMA）に挿入して、ベクターをNotIおよびXhoIによって消化して、CIP（Biolabs）を用いて脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを用いて細菌クローンXL1-blueを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを用いて確認する：
2005511506.tif 000008
適切なカセットを用いて、当技術分野において日常的で一般的な技法によって部位特異的変異誘発を行う。
【００３２】
ベクターMigr-1（ABC）は、成熟肥満細胞をトランスフェクトするために用いられるレトロウイルスベクターを構築するための基礎として用いることができる。このベクターは、IRESの3'末端でGFPをコードする配列を含むことから都合がよい。これらの特徴によって、蛍光血球計算器による直接分析を用いてレトロウイルスに感染した細胞を選択することができる。先に述べたように、c-kit cDNAのN末端配列は、異種のc-kitを内因性のc-kitと区別するために有用であるFlag配列を導入するために、改変することができる。
【００３３】
用いることができる他のIL-3依存的細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：
‐c-kitの野生型または変異型（膜近傍および触媒部位において）を発現するBaF3マウス細胞は、Kitayamaら（1996）、Blood 88：995〜1004、およびTsujimuraら（1999）、Blood 93：1319〜1329に記述される。
‐c-kitWTまたはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14665〜14669に示される。
【００３４】
IL-3非依存的細胞株は以下の通りである：
‐HMC-1、肥満細胞白血病患者に由来する因子非依存的細胞株は、構成的キナーゼ活性を有する膜近傍変異体c-kitポリペプチドを発現する（Furitsu Tら、J. Clin. Invest. 1993、92：1736〜1744；Butterfieldら、「Establishment of immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia.」、Leuk Res. 1988、12：345〜355、およびNagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92：10560〜10564）。
‐P815細胞株（814位でc-kit変異を本来発現する肥満細胞腫）は、Tsujimuraら（1994）、Blood、83：2619〜2626に記述されている。
【００３５】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。インビボで測定する場合、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位の間に、少なくとも一つの変異を有する活性化変異体c-kit、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を発現する細胞株が好ましい。活性化変異体c-kitを発現する細胞株の例は先に述べた通りである。
【００３６】
もう一つの好ましい態様において、方法はさらに、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階を含む。これは、インビトロまたはインビボで測定することができる。
【００３７】
したがって、上記の方法に従って同定および選択された化合物は、強力で選択的な非毒性の野生型c-kit阻害剤である。
【００３８】
または、本発明に係るスクリーニング法はインビトロで実施することができる。この点において、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学技術を用いて、活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量を測定する。
【００３９】
なおさらなる態様において、本発明はスクリーニングが以下を含む、先に記載した間質性膀胱炎を治療する方法を意図する：
a）それぞれがIC50＜10μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって同定するために、永続的な活性化c-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）を発現する細胞を用いて、複数の被験化合物によって増殖アッセイを行う段階、
b）特にc-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階a）において同定された候補化合物のサブセットによって増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイを行い、それぞれがIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【００４０】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される一般的な技術である。
【００４１】
したがって、本発明は、ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するための医薬品の製造を目的とする、上記に定義された化合物の使用を包含する。本発明で用いられる薬学的組成物は、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、くも膜下内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所的、舌下、または直腸手段を含むがこれらに限定されない経路をいくつでも用いて投与することができる。
【００４２】
活性成分の他に、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体を含んでもよい。製剤および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）の最新版において見いだされる。
【００４３】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調剤することができる。そのような担体によって、患者が摂取するために薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調剤することができる。
【００４４】
経口使用のための薬学的製剤は、有効化合物を固体賦形剤と組み合わせることにより得られる。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質といった、炭水化物またはタンパク質充填剤である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩といった崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【００４５】
糖衣錠コアを、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタンをも含みうる濃縮糖溶液、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物などの適当なコーティング剤と組み合わせて使用してもよい。生成物の同定または有効化合物の量、すなわち用量を特徴分析するために錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を加えてもよい。
【００４６】
経口使用可能な薬学的製剤には、ゼラチンでできたカプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどのゼラチンとコーティングとでできた柔らかい密閉カプセルが含まれる。プッシュフィット(push-fit)カプセルは、有効成分を、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、および選択的に安定化剤と混合して含みうる。軟カプセルにおいては、有効成分を、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの、安定化剤を含むかまたは含まない適当な液体に溶解または懸濁してもよい。
【００４７】
非経口投与に適した薬学的製剤は、水性溶液として、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理緩衝塩類溶液などの生理学的に適合する緩衝液として処方することができる。水性注入懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでいてもよい。さらに、有効化合物の懸濁液は適当な油性注入懸濁液として調製することもできる。適当な親油性溶媒または賦形剤には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーを輸送のために用いてもよい。選択的に、懸濁液は、非常に濃縮された溶液の調製を可能にするため化合物の溶解度を増加させる物質または適当な安定化剤を含んでもよい。
【００４８】
薬学的組成物は塩として提供されてもよく、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、および琥珀酸などを含むがこれらに限定されない多くの酸と共に形成されうる。塩は、相当する遊離塩基の形態よりも水性溶剤または他のプロトン溶剤に、より可溶性である傾向がある。他の場合において、好ましい製剤は、以下のいくつかまたはすべてを含みうる凍結乾燥粉末であってもよく、使用する前に緩衝液と混合される：pH4.5〜5.5の範囲において1〜50mMヒスチジン、0.1〜2%スクロース、および2〜7%マンニトール。
【００４９】
本発明の使用に適した薬学的組成物には、c-kit阻害剤が意図した目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。有効用量の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。治療的に有効な用量とは、症状または状態を改善する有効成分の量を指す。例えばED50(集団の50％において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50％に対して致死的な用量)といった、治療的有効性および毒性は、培養細胞または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表される。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。上述したように、本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【配列表】
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【国際調査報告】
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