(57)【要約】【課題】新たな腎線維症の治療又は予防剤を提供する。【解決手段】Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤を有効成分として含有する、腎線維症の治療又は予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ  ｍｅｍｂｅｒ  ７（Ｋｃｎｈ７）タンパク質の活性化剤を有効成分として含有する、腎線維症の治療又は予防剤。
【請求項２】
被験物質の存在下でＫｃｎｈ７タンパク質の活性を測定する工程と、
前記活性が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７タンパク質の活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、
を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験物質の存在下でＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、
前記発現量が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、
を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎線維症の治療又は予防剤及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織の線維化は、全身の主要な臓器に生じ得る。線維化を起こした臓器は最終的に機能不全に陥る。例えば、腎臓の線維化は、病因を問わず腎不全に至る進行性腎臓病の共通進展機序であり、急性腎障害の瘢痕形成や慢性腎臓病の進行に関与している。また、一度生じた線維化は不可逆的であり、腎臓の線維化の末期には、透析導入や腎移植を迫られてしまう。
【０００３】
ところで、ＩＣＧＮマウスは、腎臓の血液濾過装置である糸球体足細胞の傷害と尿中へのタンパク漏出、漏出タンパクによる尿細管間質傷害（線維化）や腎性貧血、最終的に末期腎不全に至る慢性腎臓病の病態ステージを順次示す、ヒトの病態に極めて似た自然発症モデルである。ＩＣＧＮマウスにおける腎症の原因はＴｅｎｓｉｎ２（Ｔｎｓ２）遺伝子の欠失変異であることが明らかにされている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Cho A-R., et al., Deficiency of the tensin2 gene in the ICGN mouse, an animal model for congenital nephrotic syndrome, Mammalian Genome, 5, 407-416, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腎線維化の機序を解明し、新たな腎線維症の治療又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｈ  ｍｅｍｂｅｒ  ７（Ｋｃｎｈ７）タンパク質の活性化剤を有効成分として含有する、腎線維症の治療又は予防剤。
［２］被験物質の存在下でＫｃｎｈ７タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７タンパク質の活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
［３］被験物質の存在下でＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、前記発現量が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、新たな腎線維症の治療又は予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】免疫組織染色により、ＩＣＧＮマウスの腎臓におけるＫｃｎｈ７タンパク質の発現を検出した結果を示す写真である。
【図２】初代培養尿細管上皮細胞におけるα−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）の発現量を検出した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［腎線維症の治療又は予防剤］
１実施形態において、本発明は、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤を有効成分として含有する、腎線維症の治療又は予防剤を提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、ＩＣＧＮマウスのＴｎｓ２遺伝子の欠失変異をＣ５７ＢＬ／６Ｊ（以下Ｂ６）に導入したコンジェニック系統を作製し、解析した。なお、コンジェニック系統とは、実験動物の系統の種類の１つであり、ドナー系統のある遺伝子領域を残しながら、その他の遺伝情報がレシピエント系統と同一となるように交配・選択して得られた系統である。コンジェニック系統の実験動物は特定の遺伝子の働きを厳密に比較し調べるのに適している。その結果、意外なことに、Ｂ６のコンジェニック系統では、ＩＣＧＮマウスと比較して、腎症が著しく軽減することが明らかとなった。
【００１１】
発明者らは、この結果から、Ｂ６が腎症抵抗性遺伝子を有していると仮定し、腎症抵抗性遺伝子を探索した。その結果、腎症抵抗性遺伝子としてＫｃｎｈ７遺伝子を特定した。Ｋｃｎｈ７タンパク質はカリウムチャネルの一種である。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、更に、ＩＣＧＮマウスでは、Ｋｃｎｈ７タンパク質の発現が低下していることを明らかにした。また、初代培養尿細管上皮細胞において、Ｋｃｎｈ７遺伝子をノックダウンすることにより、腎線維化マーカーであるα−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）の発現量が顕著に増加し、逆に、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤を添加することにより、α−ＳＭＡの発現量が低下することを明らかにした。
【００１３】
以上のことから、Ｋｃｎｈ７は腎抵抗性遺伝子であることが明らかとなった。また、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性を増大させる物質は、腎線維症の治療又は予防剤として用いることができることが明らかとなった。
【００１４】
本実施形態の治療又は予防剤が対象とする腎線維症としては、慢性腎線維症、急性腎線維症等が挙げられる。
【００１５】
Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤としては、具体的には、ＲＰＲ２６０２４３（ＣＡＳ番号：６６８４６３−３５−２）、Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ  Ｒｇ３（ＣＡＳ番号：１４１９７−６０−５）、ＩＣＡ−１０５５７４（ＣＡＳ番号：３１６１４６−５７−３）、Ｍａｌｌｏｔｏｘｉｎ（ＣＡＳ番号：８２−０８−６）、ＫＢ１３００１５（ＣＡＳ番号：１４７０３０−４８−６）、ＰＤ−１１８０５７（ＣＡＳ番号：３１３６７４−９７−４）、ＰＤ−３０７２４３（ＣＡＳ番号：３１３５３３−４１−４）、ＮＳ１６４３（ＣＡＳ番号：４４８８９５−３７−２）、ＮＳ３６２３（ＣＡＳ番号：３４３６３０−４１−１）、Ａ−９３５１４２（ＣＡＳ番号：１０３１３３５−８５−９）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１６】
［腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下でＫｃｎｈ７タンパク質の活性を測定する工程と、前記活性が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７タンパク質の活性と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１７】
上述したように、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤は、腎線維症の治療又は予防剤として用いることができる。したがって、本実施形態のスクリーニング方法により、腎線維症の治療又は予防剤をスクリーニングすることができる。
【００１８】
Ｋｃｎｈ７タンパク質はカリウムチャネルの一種である。したがって、被験物質の存在下でＫｃｎｈ７タンパク質の活性を測定する工程は、細胞レベルで行うか、Ｋｃｎｈ７タンパク質を埋め込んだリポソーム等を用いて行うことが好ましい。
【００１９】
Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性は、例えば、Ｋｃｎｈ７タンパク質のカリウムチャネルとしての活性を測定することにより測定することができる。具体的には、例えば、被験物質の存在下で、Ｋｃｎｈ７タンパク質を発現させた細胞又はＫｃｎｈタンパク質を再構成したリポソームに、カリウム濃度に対応した強度の蛍光を発する蛍光カリウム指示薬を添加し、細胞内又はリポソーム内のカリウムイオン濃度を蛍光を用いて測定すること等により、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性を測定することができる。
【００２０】
そして、細胞内又はリポソーム内のカリウムイオン濃度を上昇させる物質は、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤であると判断することができる。
【００２１】
蛍光カリウム指示薬としては、例えば、Ａｓａｎｔｅ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ−２（アブカム社）、ＰＢＦＩ（ＣＡＳ番号：１２４５４９−２３−１）等が挙げられる。
【００２２】
被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７タンパク質の活性と比較して、被験物質の存在下でＫｃｎｈ７タンパク質の活性が上昇した場合、当該被験物質は、腎線維症の治療又は予防剤であると判断することができる。
【００２３】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下でＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、前記発現量が前記被験物質の非存在下におけるＫｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して上昇していた場合に、前記被験物質は腎線維症の治療又は予防剤であると判断する工程と、を備える、腎線維症の治療又は予防剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２４】
上述したように、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤は、腎線維症の治療又は予防剤として用いることができる。したがって、Ｋｃｎｈ７遺伝子又はタンパク質の発現を上昇させる物質も、腎線維症の治療又は予防剤として用いることができる。したがって、第２実施形態のスクリーニング方法によっても、腎線維症の治療又は予防剤をスクリーニングすることができる。
【００２５】
Ｋｃｎｈ７遺伝子の発現量の測定方法は特に限定されず、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析等により測定することができる。また、Ｋｃｎｈ７タンパク質の発現量の測定方法も特に限定されず、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、腎臓組織の免疫染色等により測定することができる。
【００２６】
第２実施形態のスクリーニング方法は、マウスやヒト等の細胞を用いて細胞レベルで実施してもよいし、マウス等のモデル動物を用いて個体レベルで実施してもよい。しかしながら、ハイスループットスクリーニングが容易な観点からは、細胞レベルで実施することが好ましい。
【実施例】
【００２７】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００２８】
［実験例１］
（コンジェニック系統の作製）
ＩＣＧＮマウスが腎症を生じる原因はＴｎｓ２遺伝子の欠失変異である。そこで、Ｔｎｓ２遺伝子の欠失変異を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（以下Ｂ６）に導入したコンジェニック系統を作製し、解析した。その結果、意外なことに、Ｂ６のコンジェニックマウスでは、ＩＣＧＮマウスと比較して、腎症が著しく軽減することが明らかとなった。
【００２９】
［実験例２］
（腎症抵抗性遺伝子の探索）
発明者らは、実験例１の結果から、Ｂ６が腎症抵抗性遺伝子を有していると仮定し、腎症抵抗性遺伝子を探索した。具体的には、腎障害を量的形質にした全ゲノム関連解析を行った。その結果、Ｂ６のマウス第２染色体上に、尿細管間質傷害に対して抵抗する領域（Ｔｎｓ２ｎｐｈ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  Ｔｔｉｒ）が存在することを明らかにした。
【００３０】
発明者らは、更なる遺伝学的解析により、ＩＣＧＮマウスでは、抵抗性遺伝子座に座位するＫｃｎｈ７タンパク質の発現が低下していることを明らかにした。
【００３１】
図１（ａ）〜（ｄ）は、Ｂ６コンジェニックマウス（１２週齢）及びＩＣＧＮマウス（１２週齢）の腎臓の組織切片を抗Ｋｃｎｈ７抗体で免疫染色した結果を示す写真である。図１（ａ）及び（ｂ）はＢ６コンジェニックマウスの結果であり、図１（ｃ）及び（ｄ）はＩＣＧＮマウスの結果である。図１（ａ）及び（ｃ）の倍率は４００倍であり、図１（ｂ）及び（ｄ）の倍率は１００倍である。また、図１（ａ）及び（ｃ）中、点線で囲んだ領域は尿細管を示す。
【００３２】
その結果、Ｋｃｎｈ７タンパク質は、尿細管上皮細胞の管腔側に発現していることが明らかとなった。また、腎症を発症するＩＣＧＮマウスでは、腎症が軽減したＢ６コンジェニックマウスと比較して、Ｋｃｎｈ７タンパク質の発現が減少していることが明らかとなった。この結果は、Ｋｃｎｈ７が腎症抵抗性遺伝子であることを示す。
【００３３】
［実験例３］
（腎線維化マーカーの発現の検討）
実験例１で作製したＢ６コンジェニックマウス由来の初代培養尿細管上皮細胞を用いて、Ｋｃｎｈ７遺伝子をノックダウンした場合、及びＫｃｎｈ７タンパク質の活性化剤であるＮＳ１６４３を添加した場合の腎線維化マーカーの発現量をウエスタンブロッティングにより検討した。
【００３４】
Ｋｃｎｈ７遺伝子のノックダウンはｓｉＲＮＡの導入により行った。使用したｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１及び２にそれぞれ示す。また、陰性対照として、市販の対照ｓｉＲＮＡ（センス鎖：型式「Ｍｉｓｓｉｏｎ＿ＳＩＣ−００１＿ｓ」、アンチセンス鎖：型式「Ｍｉｓｓｉｏｎ＿ＳＩＣ−００１＿ａｓ」、シグマアルドリッチ社）を使用した。
【００３５】
また、腎線維化マーカーとして、α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）の発現量を測定した。
【００３６】
図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、図２に示すように、Ｋｃｎｈ７遺伝子のノックダウンによりα−ＳＭＡが顕著に発現上昇することが明らかとなった。また、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤の投与により、濃度依存的にα−ＳＭＡの発現上昇が抑制されることが明らかとなった。
【００３７】
以上の結果から、Ｋｃｎｈ７遺伝子のノックダウンにより腎線維化が亢進し、Ｋｃｎｈ７タンパク質の活性化剤の投与により腎線維化が抑制されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、新たな腎線維症の治療又は予防剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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