(57)【要約】被験者の体液サンプル中のグリピカン−３（ＧＰＣ３）のレベルを決定することにより、肝細胞癌に関して、被験者をスクリーニングする方法を提供する。肝組織サンプル中のＧＰＣ３を検出することにより、肝細胞癌を診断するためのさらなる方法を提供する。ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体も提供する。
2005526979.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者を肝細胞癌（ＨＣＣ）に関してスクリーニングする方法であって、
被験者から体液サンプルを得るステップと、
サンプル中のグリピカン−３（ＧＰＣ３）レベルを決定するステップと
を含み、
検出可能なレベルのＧＰＣ３がサンプル中に存在することにより、被験者のＨＣＣが示唆されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記サンプル中のαフェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルを決定するステップをさらに含み、前記サンプル中の検出可能なレベルのＧＰＣ３および前記サンプル中の正常なコントロール被験者のＡＦＰレベルより高いＡＦＰレベルの少なくとも１つにより、被験者のＨＣＣが示唆される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル中のＡＦＰレベルが、２０ｎｇ／ｍｌより高い、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中のＡＦＰレベルが、１００ｎｇ／ｍｌより高い、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル中のＧＰＣ３レベルが、免疫学的方法で決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ヒトＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する抗体または抗体断片を使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または断片が、ヒトＧＰＣ３の７０連続したカルボキシ末端アミノ酸内のエピトープに特異的に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体または断片が、ポリクローナル抗体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体または断片が、モノクローナル抗体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体または断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖからなる群から選択される断片である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体または抗体断片が、検出可能な標識を担持する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗ＧＰＣ３抗体または抗体断片に特異的に結合し、かつシグナル発生系の成分を含む、二次抗体を使用することにより、前記抗体または抗体断片が検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＧＰＣ３抗体または断片が、固体の基剤に付着されており、前記サンプルを、前記固体基質と接触させて、前記サンプル中のＧＰＣ３を、付着している抗ＧＰＣ３抗体または断片に結合させ、前記固体基剤を洗浄し、結合したＧＰＣ３を、抗ＧＰＣ３抗体または抗体断片に特異的に結合しかつシグナル発生系の成分を含む二次抗体を使用して決定する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記二次抗体が、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされている、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＦＰレベルが、ＥＬＩＳＡアッセイで決定される、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記体液が、血清または血漿である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験者が、ヒト被験者である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、実質的に精製された抗体またはその断片。
【請求項１９】
ポリクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体または断片。
【請求項２１】
一本鎖抗体分子、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）2断片、Ｆｖ断片およびキメラ分子からなる群から選択される、請求項１８に記載の抗体または断片。
【請求項２２】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびそれらのサブクラスからなる群から選択される抗体である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体または断片。
【請求項２３】
前記抗体断片が、ヒトＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の抗体または断片。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項２５】
被験者のＨＣＣを診断する方法であって、
前記被験者から肝組織サンプルを得るステップと、
前記組織サンプル中にＧＰＣ３が存在することを決定するステップと
を含み、
前記サンプル中にＧＰＣ３が検出されることにより、ＨＣＣが示唆されることを特徴とする、方法。
【請求項２６】
前記組織サンプル中にＧＰＣ３が存在することが、前記組織の切片を、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合する抗体または抗体断片と接触させ、前記組織切片に結合した抗ＧＰＣ３抗体または断片を検出することにより決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合した抗ＧＰＣ３抗体または断片が、抗ＧＰＣ３抗体または断片に特異的に結合しかつシグナル発生系の成分を含む二次抗体を使用して決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記二次抗体が、ビオチン化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
サンプル中にＧＰＣ３が存在することを検出する方法であって、
サンプルを、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させて、抗体−ＧＰＣ３複合体、または抗体−ＧＰＣ３断片複合体の形成を可能にするステップと、
抗体−ＧＰＣ３または抗体−ＧＰＣ３断片複合体を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
サンプル中のＧＰＣ３レベルを測定する方法であって、
サンプルを、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させて、抗体−ＧＰＣ３または抗体−ＧＰＣ３断片複合体の形成を可能にするステップと、
抗体−ＧＰＣ３または抗体−ＧＰＣ３断片複合体を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３１】
ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、実質的に精製された抗体またはその断片を含む、サンプル中のＧＰＣ３を検出またはＧＰＣ３レベルを測定するためのキット。
【請求項３２】
前記抗体またはその断片が、ヒトＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記抗体または断片が、ヒトＧＰＣ３の７０連続したカルボキシ末端アミノ酸内のエピトープに特異的に結合する、請求項３１または３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記抗体または断片が、ポリクローナル抗体である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記抗体または断片が、モノクローナル抗体である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記抗体または断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖからなる群から選択される断片である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
ＧＰＣ３抗体複合体またはＧＰＣ３抗体断片複合体を検出またはその量を決定するための手段をさらに含む、請求項３１〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜発明の分野＞
本発明は、肝細胞癌の診断に関する。特に、本発明は、肝細胞癌のマーカーとしてのグリピカン−３のレベルを決定するための抗体および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜発明の背景＞
本発明に関係する技術水準を十分に記述するために、本出願の全体にわたって様々な参考文献を引用する。これらの参考文献の開示内容を、参照することにより本開示内容に組み込むものとする。
【０００３】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中で最も多くみられる充実性臓器腫瘍であり、年間１００万人を超える死亡原因である（パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）ら、ＣＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，４９：３３−６４（１９９９年）およびオクダ（Ｏｋｕｄａ）ら著、Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ）、第７版１２３６（１９９３年））。
【０００４】
ＨＣＣの発生率は、ほとんどの西洋諸国で増加している（デューフィック（Ｄｅｕｆｆｉｃ）ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：２１４−２１５（１９９８年））。優れた疫学研究は入手できないが、カナダ保健省（Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ）のデータから、男性のＨＣＣによる死亡率は、過去１５年間で、ほぼ２倍になった。ウイルス性肝炎患者の人口統計データから、この発生率が、次の１０年で、また２倍になったことが示唆される（ズー（Ｚｏｕ）ら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１４：５７５−５８０（２０００年））。
【０００５】
ＨＣＣは、通常は、初期段階では無症候性であり、原発腫瘍が小さいときでさえも、血管内または胆管内を浸潤する傾向が大きい（フォング（Ｆｏｎｇ）ら著、肝癌および癌における２分木：原理および実践腫瘍学（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｔｒｅｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版、１１６２−１１９９（２００１年））。結果として、ＨＣＣは、発見されたとき、概して、進行した段階である。組織学的には、診断時に、原発性ＨＣＣのわずか１０〜２０％が切除可能であった（フォング（Ｆｏｎｇ）ら著、肝癌および癌における２分木：原理および実践腫瘍学（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｔｒｅｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ），１１６２−１１９９（２００１年））。最近になって、ＨＣＣスクリーニングプログラムの出現により、潜在的に治癒可能な腫瘍の比率が増大しているものの、ほとんどの患者は、やはり診断時に不治の疾患を有する。
【０００６】
ＨＣＣは、慢性肝障害、主として慢性ウイルス性肝炎およびアルコール性肝疾患と関係がある（ラストギ（Ｒｕｓｔｇｉ），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．，１６：５４５−５５１）（１９８７年））。ＨＣＣの最高の発生率は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が地方特有である地域で確認されている。ＨＢＶの場合には、ＨＣＣが発生する相対的リスクは、慢性感染の証拠がある患者では、非感染患者より５０〜１００倍大きいことが証明されている（ビースレイ（Ｂｅａｓｌｅｙ）ら、ウイルス性肝炎および肝疾患における肝細胞癌の疫学（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）２０９（１９９４年））。ＨＣＣの他の原因とは違って、慢性Ｂ型肝炎性硬変は、ＨＣＣ発生に必要な事前条件ではない。慢性ＨＣＶに伴う相対的リスクの推定値はないが、ＨＣＶの硬変キャリヤーにおけるＨＣＣの発生率は、１年に５％に上ると考えられるのに対して、ＨＢＶキャリヤーでは０．５％である（ディ・ビシェリエ（Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ），Ｓｅｍｉｎ  ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．，１５：６４−６９（１９９５年）。持続性ＨＣＶ感染は、日本におけるＨＣＣの原因の７０％の原因であり、北米で上昇するＨＣＣ発生率の最も公算が高い原因は、全市民におけるＨＣＶ感染の蔓延増加である（ハッサン（Ｈａｓａｎ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２：５８９−５９１（１９９０年）、およびＥＩ・セラグ（ＥＩ−Ｓｅｒａｇ）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４０：７４５−７５０（１９９９年））。
【０００７】
幾つかの化学物質が、ＨＣＣの発生と関連がある。その中で最も重要なものはエタノールであり、アルコール乱用は、ＨＣＣと関連がある（シッフ（Ｓｃｈｉｆｆ），Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２６：３９Ｓ−４２Ｓ（１９９７年）およびナルパス（Ｎａｌｐａｓ）ら、Ａｌｃｏｈｏｌ，１２：１７−１２０（１９９５年））。エタノールは、肝硬変の誘発を介して、またはＨＢＶおよびＨＣＶ等の他の作因との共発癌物質として、ＨＣＣを引き起こす。数種の真菌類によって生成されるアフラトキシンも、ＨＣＣと関連付けられている（ユ（Ｙｕ），Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，１０：６７４−６８２（１９９５年））。これらの真菌は、穀類、ピーナッツ、および他の食品上で増殖する傾向があり、食品損傷の最多原因である。
【０００８】
ＨＣＣの診断は、占拠性病変患者では、超音波検査法またはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）を用いて、また５００ｎｇ/ｍｌを超える血清αフェトプロテイン（ＡＦＰ）で、比較的確実である（フォング（Ｆｏｎｇ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｔｒｅｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版、１１６２−１１９９（２００１年））。しかし、ＡＦＰは診断に役立つほど上昇していないことが非常に多いため、概して、こうした条件を満たすまでに、ＨＣＣは処置不能になる。
【０００９】
超音波検査法であろうと、ＣＴスキャンまたはＭＲＩであろうと、画像法による小病変の診断は、比較的不正確である（フォング（Ｆｏｎｇ）ら著、Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｔｒｅｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版、１１６２−１１９９（２００１年）；およびムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら著、Ｄｅｔｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｐｈａｓｅ  ｉｍａｇｅｓ  ｏｆ  ＭＲ  ａｎｄ  ｓｐｉｒａｌＣＴ）。Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌ．，３６：３７２−３７６（１９９５年））。特に、放射線学的にＨＣＣによく似ている可能性がある２病変は、硬変性小結節および異形成小結節である。小病変の肝生検もまた、感度または特異性が不十分である（レビー（Ｌｅｖｙ）ら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，２３４：２０６−２０９（２００１年））。針生検を用いても、この手技で通常得られる検体の量が限られているため、十分に分化した癌を、良性病変と識別することは困難かもしれない（フォング（Ｆｏｎｇ）ら著、肝癌および癌における２分木：原理および実践腫瘍学（Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｔｒｅｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、第６版、１１６２−１１９９（２００１年））。したがって、画像技術の進歩にもかかわらず、難しい症例で、ＨＣＣを良性の肝病変と識別するための適当な分子マーカーが依然として必要である。
【００１０】
腫瘍のサイズは、ＨＣＣの肝間拡大および転移の重大な危険因子である（ユキ（Ｙｕｋｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ，６６：２１７４−２１７９（１９９０年））。加えて、小さい腫瘍を有する患者に、より多くの治療選択肢を利用することができる。症候性腫瘍は、概して大きく、治療的介入の域を越える。敏感でかつ特異的なＨＣＣマーカーが有用であろう別の状況は、等の、危険にさらされている患者、たとえばＨＢＶの慢性キャリヤーおよび硬変性ＨＣＶを有する者のスクリーニングにおいてである。このスクリーニングは広く応用されているが、疾患の緩和に有効なことを示唆するデータは、今までのところほとんどない（コリヤー（Ｃｏｌｌｉｅｒ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７：２７３−２７８（１９９８年））。スクリーニングが有効であることが証明されていない理由の１つは、現在使用されている血清検査、すなわち逐次ＡＦＰアッセイの、感度および特異性が低いことである（コリヤー（Ｃｏｌｌｉｅｒ）ら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４：３１−４１（１９９８年））。
【００１１】
したがって、ＨＣＣスクリーニングを向上させるためには、改良されたテストシステムが必要である。ＨＣＣのスクリーニングおよび診断に広く使用されてきた唯一の分子マーカーは、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）である。このタンパク質は、卵黄嚢および肝臓により、胚発生中に大量に合成される（チャン（Ｃｈａｎ）ら著、ティエツ（Ｔｉｅｔｚ）臨床化学教科書、３版、の中の、腫瘍マーカー（Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ.Ｔｉｅｔｚ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ），７２２-７４９（１９９９年）、Ｋ，タケタ（Ｔａｋｅｔａ，Ｋ），Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２：１４２０-１４３２（１９９０年））。ＡＦＰ濃度は、誕生後１２〜１８ヶ月で、＜１０ｎｇ/ｍｌに、徐々に減少する。ＡＦＰは、妊娠中に、母体血清中に再び現れる。循環ＡＦＰ上昇は、ＨＣＣ、胃癌、肺癌、膵癌、胆管癌、および精巣癌（チャン（Ｃｈａｎ）ら著、ティエツ（Ｔｉｅｔｚ）臨床化学教科書、３版、の中の、腫瘍マーカーに関係がある（Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ.Ｔｉｅｔｚ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ），７２２-７４９（１９９９年））。
【００１２】
２０ｎｇ/ｍｌまたはそれ以上のＡＦＰレベルが診断に役立つと考えるのであれば、ＨＣＣ症例の６０〜８０％が検出されるが、小さい腫瘍の場合には、感度が著しく低い（４０％）（トレヴィザーニ（Ｔｒｅｖｉｓａｎｉ）ら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３４：５７０−５７５（２００１年））。ＨＣＣマーカーとしてのＡＦＰ使用に伴うもう１つの問題は、特異性に欠けることである；ＡＦＰの有意な上昇（２０〜２００ｎｇ/ｍｌ）は、かなりの数の慢性肝疾患患者でみられる（コリヤー（Ｃｏｌｌｉｅｒ）ら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，４：３１−４１（１９９８年））。慢性肝炎患者の１５〜５８％、および硬変患者の１１〜４７％が、高い血清ＡＦＰを有することが報告されている（タケタ（Ｔａｋｅｔａ），Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２：１４２０−１４３２（１９９０年））。したがって、ＨＣＣ患者および硬変患者の血清ＡＦＰレベルが重複することは珍しくなく、これが、ＡＦＰアッセイの結果の解釈を混乱させる。結果として、ＨＣＣの危険に曝されている患者に関する調査ツールとしてのＡＦＰ測定の有用性は、疑問視されてきた（シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３４：６０３−６０５（２００１年））。そこで、ＡＦＰの測定が正当であると判断される唯一の環境は、画像技術に基づいた初期診断の確認のためであることが提唱されてきた（シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ），Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３４：６０３−６０５（２００１年））。
【００１３】
ＡＦＰレベルの信頼性欠如を考慮して、ほとんどのスクリーニング方式は、肝腫瘤に極めて敏感である超音波検査法を含む。しかし、超音波検査法は特異性を欠き、したがって、病変が約２ｃｍより小さいとき、ＨＣＣ、硬変性小結節および異形成小結節を、確実には識別することができない。
【００１４】
この数年間で、幾つかの新しい潜在的なＨＣＣ用マーカーが研究されたが、ＡＦＰより明らかに優れたものは発見されていない（スカウ（Ｓｃｏｗ）ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１：１２４９−１２６３（２００１年））。たとえば、ｄｅｓ−γ−カルボキシプロトロンビンが潜在的マーカーとして提案された。しかし。この分子は、ＡＦＰと同様に、小さい腫瘍の検出に有用ではない（ノムラ（Ｎｏｍｕｒａ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，９４：６５０−６５４（１９９９年））。
【００１５】
１９９７年に、スウ（Ｈｓｕ）らは、正常肝およびＨＣＣのｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ分析を実施することにより、ＨＣＣで、アップレギュレートされている転写物を同定したと報告した（スウ（Ｈｓｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：５１７９−５１８４（１９９７年））。彼らがＭＸＲ７と名づけたこの転写物は、結局、グリピカン−３（ＧＰＣ３）であることが分かった。ＧＰＣ３は、脂質尾部により細胞表面に結合されているヘパラン硫酸プロテオグリカンである（ドゥエナス・ゴンザレス（Ｄｕｅｎａｓ  Ｇｏｎｚａｌｅｓ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４１：１４０７−１４１４（１９９８年））。スウ（Ｈｓｕ）らは、ＧＰＣ３  ｍＲＮＡは、原発性および再発性ＨＣＣ  １９１のうち１４３（７４．８％）で発現するが、正常肝では１５４のうち５（３．２％）で発現するにすぎないことを発見した。
【００１６】
第２の研究は、ＨＣＣ症例の７５％でＧＰＣ３  ｍＲＮＡの過剰発現を確認したが、限局性結節性過形成および硬変肝では、過剰発現は検出されなかった（ジュウ（Ｚｈｕ）ら、Ｇｕｔ，４８，５５８−５６４（２００１年））。
【００１７】
これらの研究は、ｍＲＮＡレベルのみを分析しており、また、ｍＲＮＡレベルは、タンパク質発現および分泌と常に相関関係があるとは限らないことが知られている。加えて、限られた数の肝タンパク質のみが、通常は循環に分泌される。
【００１８】
これらの結果から、肝組織におけるＧＰＣ３のｍＲＮＡ分析は、ＨＣＣの検出に有用かもしれないが、この種の分析は、腫瘍組織の単離を必要とするため、侵襲的である。さらに、ｍＲＮＡ分析は多くの時間を必要とし、日常的に実施することは困難である。
【００１９】
したがって、スクリーニングに使用することができる（すなわち小さいＨＣＣを有する無症候性患者の高い比率で陽性になる）血清マーカーが必要である。超音波で小さい塊病変が確認された患者では、このテストは、ＨＣＣ患者と非悪性病変を有する患者とを、確実に分けることもできなければならない。
【００２０】
最後に、特に確定された硬変を有するＨＣＶ患者等の、高リスク人口の調査のための、より優れたＨＣＣ用分子マーカーが依然として必要である。ＨＣＣの特徴をなす高度の異質性のため、このようなマーカーの探索は非常に困難である（トルゲイルソン（Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３１：３３９−３４６（２００２年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
＜発明の概要＞
本発明者は、ＨＣＣの診断において改良された特異性を提供する、新規で、速やかで、便利かつ非侵襲的なアッセイの基礎をもたらす、新規なＨＣＣ用血清マーカーである、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、
被験者から体液サンプルを得るステップと、
該サンプル中のグリピカン−３（ＧＰＣ３）レベルを決定するステップと、
を含み、
該サンプル中に検出可能レベルのＧＰＣ３が存在することが、被験者の肝細胞癌（ＨＣＣ）を示唆することを特徴とする、肝細胞癌（ＨＣＣ）について被験者をスクリーニングする方法が提供される。
【００２３】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、実質的に精製された抗体またはその断片が提供される。
【００２４】
本発明のもう１つの実施形態によれば、
被験者から肝組織サンプルを得るステップと、
組織サンプル中のＧＰＣ３の存在を決定するステップと
を含み、
該サンプル中にＧＰＣ３が検出されることが、ＨＣＣを示す、
被験者におけるＨＣＣを診断する方法が提供される。
【００２５】
本発明のもう１つの実施形態によれば、サンプル中のＧＰＣ３の存在を決定する方法であって、
サンプルを、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させて、抗体−ＧＰＣ３複合体、または抗体−ＧＰＣ３断片複合体の形成を可能にするステップと、
抗体−ＧＰＣ３または抗体−ＧＰＣ３断片複合体を検出するステップと
を含む、方法を提供する。
【００２６】
本発明のもう１つの実施形態によれば、
サンプルを、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する抗体またはその断片と接触させて、抗体−ＧＰＣ３複合体または抗体−ＧＰＣ３断片複合体の形成を可能にするステップと、
抗体−ＧＰＣ３または抗体−ＧＰＣ３断片複合体を測定するステップと
を含む、サンプル中のＧＰＣ３のレベルを決定する方法が提供される。
【００２７】
本発明のもう１つの実施形態によれば、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、実質的に精製された抗体またはその断片を含む、サンプル中のＧＰＣ３を検出するため、またはＧＰＣ３のレベルを決定するための、キットが提供される。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態を、図面に関して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
＜本発明の詳細な説明＞
本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）について哺乳動物被験者を、スクリーニングする方法を提供する。本発明者は、ＨＣＣを有する被験者の、循環中、血清または血漿中で、細胞表面プロテオグリカンＧＰＣ３を検出できるが、健常な被験者の血清または血漿中には、検出可能レベル、すなわちバックグラウンドより有意に高いレベルで存在しないことを、本明細書に記載の標準有意性検定法を使用して実証していた。肝炎、または肝炎に加えて硬変に罹患している被験者の血清または血漿中では、ＧＰＣ３は、ほとんどまたは全く検出できないことも証明されている。
【００３０】
したがって、被験者の体液中のＧＰＣ３レベルを測定することにより、ＨＣＣについて、被験者をスクリーニングする便利な非侵襲的方法が提供される。テストに適当な体液は、血清、血漿および全血を包含する。血清または血漿のスクリーニングが好ましい。
【００３１】
体液中のＧＰＣ３レベルは、該タンパク質を測定するための任意の適当な方法で測定することが可能である。ＧＰＣ３レベルを測定する免疫学的方法は非常に便利であり、適当なタイプの方法は、当業者に周知であり、本明細書でさらに説明する。
【００３２】
たとえば、ヒトＧＰＣ３に特異的に結合する抗体または抗体断片は、ＧＰＣ３を測定するための、様々な抗体に基づくアッセイ方法の基礎をもたらす。抗体ＧＰＣ３複合体の形成を可能にする条件で、被験者の体液を、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体または断片と接触させ、次いで、該複合体を検出しおよび／または該複合体のレベルを測定することによって、ＨＣＣを診断することが可能である。抗体−ＧＰＣ３複合体の量は、サンプル中のＧＰＣ３のレベルと相関関係がある。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、かつ特に明記されていなければ、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体を包含する。
【００３４】
用語「抗体断片」は、親抗体の特異的を示す抗体の一部を意味し、またＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ断片を包含する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、抗体または抗体断片が、標的分子を認識して結合するが、標的分子を含有するサンプル中に存在する他の分子は、実質的に認識せず、結合しなければ、抗体または抗体断片は、標的分子に「特異的に結合する」と言われる。
【００３６】
キメラ抗体は、異なる種に由来する抗体の一部を含有する抗体である。たとえば、キメラ抗体は、ヒト定常部および別の種に由来する可変部を有してもよい。キメラ抗体は、米国特許第５，３５４，８４７および第５，５００，３６２号、ならび科学文献（コート（Ｃｏｕｔｏ）ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１２：４８５−４８９（１９９３年））に記載の周知の組換え方法で、作ることが可能である。
【００３７】
ヒト化抗体は、抗原結合および特異性に関与する相補性決定領域だけは非ヒト起源に由来するが、抗体分子の残りの実質的に全てが、ヒトである抗体である。ヒト化抗体およびそれらの作製もまた当該技術分野で周知である。たとえば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号の各明細書を参照されたい。
【００３８】
一本鎖抗体は、ペプチドまたはエピトープに特異的に結合することができるポリペプチド配列であって、該一本鎖抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の軽鎖または重鎖のいずれかに由来する。一本鎖抗体は、ヒト化、キメラまたは全ヒト抗体に由来するポリペプチドを包含し、該一本鎖抗体は、その軽鎖または重鎖のいずれかに由来する。
【００３９】
＜抗体＞
＜ポリクローナル抗体＞
ポリクローナル抗体を作製するために、精製ＧＰＣ３、ヒトまたは非ヒトを得ることが可能である。
【００４０】
ＧＰＣ３は、たとえば、ヒト胎盤から、たとえばボネー−バークレー（Ｂｏｎｎｅｈ−Ｂａｒｋａｙ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．２７２，ｐｐ．１２４１５−１２４２１（１９９７年）に記載の従来の方法で、精製することが可能である。
【００４１】
該精製タンパク質は、必要に応じて、当該技術分野で周知のキーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質に連結させ、次いでフロイントアジュバントと混合し、ウサギまたは他の適当な実験動物に注射することが可能である。あるいは、ＧＰＣ３タンパク質の全部または一部を、細菌等の適当な宿主で、適当なクローニング媒体に挿入された適切なＤＮＡ配列の発現により、組み換え技術で合成することができる。ＧＰＣ３をコード化するＤＮＡは、既述の方法でクローニングすることが可能である（フィルムス（Ｆｉｌｍｕｓ）ら、Ｍｏｌｅｃ．＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｖ．８，ｐｐ．４２４３−４２４９（１９８８年）；リンズレイ（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖ．１１，ｐｐ．１９１−２１２（１９９３年）；ピーチ（Ｐｅａｃｈ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖ．１８０，ｐｐ．２０４９−２０５８（１９９４年））。同様の方法で、ＧＰＣ３またはその一部を融合タンパク質として発現させることも可能である。
【００４２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え融合タンパク質を産生させるために広く使用されている２つの発現システムは、ｐＵＲシリーズのベクターを使用するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質融合、およびｐＡＴＨベクターを使用するｔｒｐＥ融合である。
【００４３】
次いで、発現したＧＰＣ３タンパク質を、たとえば、グルタチオンカラムを使用して精製し、必要に応じて担体タンパク質に連結させ、フロイントアジュバントと混合し（動物の抗原性応答の刺激を助けるため）、ウサギまたは他の適切な実験動物に注射することができる。１週間間隔のブースター注射後、該ウサギまたは他の実験動物から採血し、血清を単離しする。血清は、すぐに使用してもよく、または使用前に、プロテインＡ−セファロース、抗原セファロースまたは抗マウス−Ｉｇ−セファロースを使用するアフィニティクロマトグラフィーを含む様々な方法で、精製してもよい。
【００４４】
ポリクローナル抗体は、ＧＰＣ３の断片を抗原として使用して作製することも可能である。ＧＰＣ３アミノ酸配列由来の３つ以上連続したアミノ酸の断片を使用してもよい。７０アミノ酸カルボキシ末端アミノ酸配列、またはその一部を含むＧＰＣ３断片が、好ましい抗原である。断片は、場合により、本明細書に記載の融合タンパク質として作ることも可能である。このようなペプチド抗原をキーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートさせて、ｉｎ  ｖｉｖｏ抗原性を改良することが可能である。
【００４５】
＜モノクローナル抗体＞
モノクローナル抗ＧＰＣ３抗体もまた、ポリクローナル抗体の作製について上述した通りに得た、精製ＧＰＣ３またはその断片を、場合により融合タンパク質として、マウスに注射した後、従来の方法で作ることが可能である。
【００４６】
簡単に記載すると、フロイントアジュバント中の該精製タンパク質またはペプチドを、たとえば３週間にわたって９回、マウスに注射する。マウス脾臓を摘除し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させる。脾細胞は、リンパ球源の役割を果たし、その一部は、適切な特異性の抗体を産生する。次いで、これらを永久増殖骨髄腫パートナー細胞と融合させ、融合産物であるハイブリドーマを、ＨＡＴ等の選択剤の存在下で、多数の組織培養ウェルにプレーティングする。次いで、このウェルをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ＧＰＣ３に特異的な抗体を作る細胞を含有するものを識別する。次いで、これらの細胞をプレーティングし、増殖期間の後、抗体産生細胞を識別するために、これらのウェルを再度スクリーニングする。ウェルの９０％以上が、抗体産生陽性である単一クローンを含むまで、クローニング手順を実施する。この手順により、抗体を産生する安定したクローン系が確立される。次いで、プロテインＡセファロースを使用するアフィニティクロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの技術の変形および組合せで、該モノクローナル抗体を精製することができる。
【００４７】
さらなる実施形態では、ＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体由来のＦ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ1）2およびＦｖ断片または一本鎖成分を包含するが、これらに限定されない、抗体断片を作製する。このような断片は、たとえば、リン（Ｌｉｎ）ら、ＰＮＡＳ、７５（６）；２６４９−２６５３（１９７８年）に記載の通りに、完全な抗ＧＰＣ３抗体のタンパク質分解的切断を使用して、または、このような断片をコード化する遺伝子の遺伝子操作、およびこのような抗ＧＰＣ３抗体断片を分泌することができるトランスフェクション産生系の発酵によって、作製することが可能である。
【００４８】
少なくとも１×１０8の抗原アフィニティの抗ＧＰＣ３抗体が好ましい。
【００４９】
様々なタイプのアッセイ形式を使用して、サンプル中のＧＰＣ３をアッセイすることができる。これらの中には、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定法、ドットブロット、ディップスティックおよびウエスタンブロットが含まれる。
【００５０】
好ましい実施形態では、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合し、かつ検出可能な標識を担持する抗体が使用され、結果として生じるＧＰＣ３−抗体複合体は、該検出可能な標識を測定することによって決定され、それによって、サンプル中のＧＰＣ３レベルを決定する。あるいは、ＧＰＣ３またはその断片に特異的な一次抗体を使用し、続いて、かつ直接検出可能な標識であってもよく、またはシグナル発生系の成分であってもよい、一次抗体に特異的な標識を担持する、二次抗体を使用する。このような標識抗体および系は、当該技術分野で周知である。
【００５１】
適当な較正標準と比較した、標識、またはシグナル発生系で発生したシグナルの検出および決定は、サンプル中に存在するＧＰＣ３−抗体複合体、したがってＧＰＣ３の決定を可能にする。
【００５２】
二次抗体は、任意の適当な直接検出可能な標識であってもよく、または任意の適当なシグナル発生系の成分であってもよい、標識を担持する。
【００５３】
これらの多くの例は、イムノアッセイの分野から周知である。検出可能な標識またはシグナル発生系の成分で、二次抗体を標識することは、当該技術分野で周知の技術で実施することが可能である。抗体を検出可能にするために使用することができる標識の例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質および化学発光物質等が挙げられる。たとえば、放射性元素を直接検出可能な標識として使用することが可能である。典型的な放射性標識としては、γ−エミッタ124Ｉ、125Ｉ、128Ｉ、および131Ｉなどがある。蛍光標識もまた、直接検出可能な標識として使用することが可能である。たとえば、適当なフルオロフォアとしては、クマリン、希土類金属イオン類、キレート類またはキレート錯体、フルオレセイン、ローダミンおよびローダミン誘導体などがある。
【００５４】
適当な標識は、金属錯体、安定なフリラジカル類、小胞、リポソーム、コロイド粒子、ラテックス粒子、スピン標識、ビオチン／アビジンおよびそれらの誘導体も包含する。
【００５５】
アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ルシフェラーゼ、カタラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ラクタマーゼ、ウレアーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼを包含する、酵素連結シグナル発生系を使用することが可能である。酵素の活性は、酵素を適切な基質と反応させた後、吸光度、蛍光または発光強度を測定することにより、検出することができる。酵素を標識として使用するとき、酵素と抗体との間の連結は、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸およびマレイミド方法等の従来の方法で達成することが可能である。
【００５６】
抗体の固定化に適した固体担体の役割を果たす固体マトリックスとしては、マイクロタイタープレート、たとえば、カリフォルニア州オックスナードにあるファルコン・プラスティックス（Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手できるもの等、または、たとえば、普通のＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（バージニア州シャンティリーのダイネックスにあるイムロンＩＩ（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ，Ｄｙｎｅｘ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ））およびストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（イリノイ州ロックフォードのピアスにあるリアクチ・バインド（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））、ならびにマイクロタイターストリップ、たとえばバージニア州アレキサンドリアにあるダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ）から入手できるものなどがある。該ストリップまたはマイクロタイタープレートのウェルは、透明なプラスチック材料、好ましくは塩化ポリビニルまたはポリスチレンでできている。抗体固定化に有用な他の固体マトリックスとしては、便利なサイズのポリスチレンチューブ、スティックもしくはパドル、あるいはポリスチレンビーズまたはポリアクリルアミドマトリックスなどがある。
【００５７】
抗体は、たとえば米国特許第５，３５２，５８３号に記載の、当該技術分野で周知の従来の方法で、固体担体上に固定化することができる。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＧＰＣ３と特異的に結合して複合体を形成する一次抗体であって、固体担体上に固定化されている一次抗体と、体液サンプルを接触させる。十分な時間を与えて、該サンプルのＧＰＣ３を、該固定化された抗体に結合させる。次いで、該固体担体を洗浄し、一次抗体に特異的に結合し、かつ検出可能な標識で標識されているか、またはシグナル発生系を結合した、二次抗体と接触させる。サンプル中に存在する複合体の量を与える、したがってサンプル中のＧＰＣ３のレベルを決定する、固体担体に結合した標識または発生シグナルを測定する。
【００５９】
さらなる実施形態によれば、該サンプルを、該固体担体上に固定化された一次抗体および標識された二次抗体に、同時に接触させる。
【００６０】
さらなる実施形態では、二次抗体は、標識またはシグナル−発生系成分がなくてもよく、該固体担体に結合した二次抗体は、検出可能な標識またはシグナル発生系成分を担持する三次抗体を用いて測定され、該三次抗体は、結合した二次抗体に選択的に結合する。
【００６１】
さらなる実施形態によれば、ＧＰＣ３に特異的に結合し、かつ捕獲対（ｃａｐｔｕｒｅ  ｐａｉｒ）の一方のメンバーが結合されている一次抗体と、一次抗体に結合する標識された二次抗体とに、同時にまたは段階的に、該サンプルを接触させる。次いで、結果として得られる混合物を、捕獲対の他方のメンバーが上に固定化されている固体担体と接触させる。捕獲対のメンバーの相互作用によって、該標識された複合体を該固体担体に結合するのに十分な時間を与えた後、該固体担体を洗浄し、該固体担体に結合した標識の量を測定して、サンプル中のＧＰＣ３のレベルを決定する。適当な捕獲対としては、ビオチン／ストレプトアビジンなどがある。他の好適な対は、当該技術分野で周知である。該抗体の特異性は逆であってもよい、すなわち一次抗体が該複合体に特異的に結合し、標識された二次抗体がＧＰＣ３に特異的に結合してもよい。
【００６２】
本明細書に記載のスクリーニング方法は、健常な被験者および肝炎罹患者からのサンプルでは、ＧＰＣ３を検出できず、またたまにみられる肝炎に加えて硬変に罹患した者では、無視できるレベルで確認されたため、ＨＣＣに極めて特異的と考えられる。
【００６３】
ＨＣＣが診断された被験者を使用した治験では、被験者の５３〜５５％が、１５１〜２９２４ｎｇ／ｍｌの範囲の、検出可能な血清ＧＰＣ３レベルを有していた。
【００６４】
同じ患者で、血清ＡＦＰをＨＣＣマーカーとして使用し、また２０ｎｇ／ｍｌを異常の閾値として使用して、ＨＣＣ患者の５９％が検出された。疾患を示すＡＦＰの閾値レベルを１００ｎｇ／ｍｌに上げると、ＨＣＣ症例の３２％のみが検出された。ＨＣＣ以外の多くの慢性肝疾患で２０ｎｇ／ｍｌより高いＡＦＰレベルが見られるため、２０ｎｇ／ｍｌＡＦＰという閾値レベルは、多数の擬陽性を包含する。ＨＣＣ患者における上昇したＧＰＣ３レベルは、ＡＦＰレベルと良好な相関関係がないことを、本発明者は発見した（表４）。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、ＡＦＰスクリーニングで検出されないＨＣＣを同定するために有用なさらなるツールを提供する。本発明の方法は、単独で使用してもよく、または早期および治療可能な病期のＨＣＣを同定する力を向上させるために、従来の方法によるＡＦＰスクリーニングに加えて使用してもよい。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態では、ＧＰＣ３およびＡＦＰスクリーニングを使用して、スクリーニングの高レベルＡＦＰ特異性と、ＧＰＣ３スクリーニングの改良された感度とを併せ持つテストを提供することが可能である。たとえば、表４のデータからわかるように、ＡＦＰおよびＧＰＣ３血清レベルが決定され、１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＦＰという閾値を、有意性の閾値として使用した場合、ＨＣＣ患者の７０％が、ＡＦＰおよびＧＰＣ３の少なくとも一方の上昇を示したのに対して、ＨＣＣマーカーとして１００ｎｇ／ｍｌ  ＡＦＰを単独で使用した場合には３２％が、またマーカーとしてＧＰＣ３を単独で使用した場合には５３％が上昇を示した。ＡＦＰおよびＧＰＣ３の両者を考慮し、２０ｎｇ／ｍｌ  ＡＦＰという閾値を使用した場合、患者の８２％が、ＦＰおよびＧＰＣ３の少なくとも一方の上昇を示した。
【００６７】
本発明の血清学的ＧＰＣ３アッセイは、肝腫瘤の臨床徴候を示す被験者のさらなる評価に特に有用である。該アッセイは、ＨＣＣの危険にさらされている集団、たとえば慢性Ｂ型もしくはＣ型肝炎の患者またはキャリヤーの、スクリーニングに使用することも可能である。
【００６８】
さらなる実施形態で、本発明は、肝腫瘤を呈する被験者からの肝生検サンプルを検査することにより、ＨＣＣを診断するための免疫組織化学的方法を提供する。生検で得られる肝組織サンプルは、しばしば変形した形態を示し、従来の組織学的診断を困難にする。このような生検からの組織切片を、本明細書の実施例に記載の通りに、抗ＧＰＣ３抗体で染色し、該切片でＧＰＣ３が検出されることは、生検が行われた腫瘤がＨＣＣであることを示す。抗ＧＰ３抗体は、それ自体が蛍光標識等の検出可能な標識を担持していてもよく、あるいは抗ＧＰＣ３の一次抗体は、検出可能に標識された二次抗体により検出されてもよい。
【００６９】
本発明はまた、ＧＰＣ−３に特異的に結合する抗体も提供する。これらの抗体と同じエピトープに結合する抗体もまた、本発明の中に含まれる。該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤならびにそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンであってもよい。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明は、ＧＰＣ３またはその断片に特異的に結合する、実質的に精製された抗体またはその断片を含むキットを提供する。
【００７１】
さらなる実施形態では、該キットは、ＧＰＣ３特異的な一次抗体が、流体サンプル中に存在するＧＰＣ３を捕獲し、および二次抗体が、捕獲されたＧＰＣ３の存在を検出する、標準的な２抗体サンドイッチアッセイ用である。捕獲抗体は、一般的には、ＥＬＩＳＡプレート、ニトロセルロース膜、ビーズまたは当該技術分野で周知の他の担体等の、固相上に固定化されている。検出抗体は、熱量測定用標識または放射性同位元素標識で直接されているか、またはそれ自体が、検出抗体の同位元素に特異的な、標識された二次抗体で検出されるかのいずれかである。
【実施例】
【００７２】
実施例は、例示する目的のために記載されており、本発明の範囲を制限する意図はない。
【００７３】
本開示および実施例で言及されているが明白に記載されていない、化学、分子生物学、タンパク質およびペプチド生化学および免疫学の方法は、科学文献に報告されており、また当業者に周知である。
【００７４】
＜方法＞
患者組織：肝組織サンプルは、トロント総合病院病理学部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から入手した。全ての肝標本は、外科的に切除された腫瘍および隣接した実質由来の大きい塊であった。全ての組織を、１０％ホルマリンで固定し、定型的な組織検査用にパラフィン中に包埋した。
【００７５】
患者血清：血液サンプルは、患者からの署名付同意書のもとに、ＨＣＣ患者３４例（患者特徴については表３参照）、肝炎に加えて肝硬変を有する患者２０例（ＨＣＶ  １２例およびＨＢＶ  ８例）、肝炎患者１８例（ＨＣＶ  １２例、ＨＣＶに加えてＨＩＶを有する患者１例、ＨＣＶに加えてサラセミアを有する患者１例、ＨＣＶおよびＨＢＶの同時感染者１例およびＨＢＶ  ３例）（トロント総合病院（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））、および健常な血液ドナー５３例（サニーブロック・アンド・ウィメンズ・カレッジ・ヘルス・サイエンシーズ・センター（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ'ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ＨＣＣは、欧州肝疾患研究協会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）20のガイドラインに従って、肝生検が入手できるときは組織学的に、または臨床情報から、診断された。血清は、直ちに遠心分離で分離させ、−２０℃で凍結した。血清採取時に非悪性肝疾患（肝硬変を伴う肝炎および肝炎）を有すると診断された患者の血清は、このような採取の６ヶ月後に悪性疾患の徴候がなければ、この試験のみに含めた。
【００７６】
細胞株：ＨＣＣ細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３ＢおよびＰＬＣ−ＰＲＦ−５を、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を加えた、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。該２９３細胞株を、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳで培養した。全ての細胞株は、アメリカ培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手し、加湿した、５％ＣＯ2を含む雰囲気で、３７℃で維持した。ならし培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）を得るために、血清の非存在下で、該細胞株を高密度で一晩増殖させた。回収した培地を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ−１０，０００フィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して濃縮した。
【００７７】
ＧＰＣ３のトランスフェクション：該２９３細胞系に、ｐＥＦベクター（またはコントロールとしての空ベクター）に導入された赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）タグ付ＧＰＣ３ｃＤＮＡ21をトランスフェクションし、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を用いて、トランスフェクションされた細胞をスクリーニングした。Ｇ４１８で選択された細胞を抗ＨＡ１２ＣＡ５ＭａｂおよびＦＩＴＣ−コンジュゲート二次抗体で染色した後、高レベルのＧＰＣ３を発現している細胞を、ＦＡＣＳで保存した。次いで、分類された細胞を組織培養で増殖させた。
【００７８】
抗ＧＰＣ３マウスモノクローナル抗体の産生：コアタンパク質の最後の７０アミノ酸を含有するＨｉｓタグ付ＧＰＣ３断片５０μｇの単回腹腔内注射で、Ｂａｌｂ／Ｃメスマウスを免疫化した。免疫源を、チターマックス・ゴールド（Ｔｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ）（セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ））アジュバントで乳化した。２１日後、アジュバントを含まない同一免疫原５０μｇで、該マウスを追加免疫した。２日後、尾静脈から血液サンプルを採取し、対応する血清を得た。同一マウスの免疫化前血清をネガティブコントロールとして使用して、血清サンプル中の抗ＧＰＣ３抗体価を、ＥＬＩＳＡで推定した。最高の抗体価を有していたマウス２匹から得た脾細胞を、ポリエチレングルコール４０００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の存在下で標準手順を使用して、ＳＰ２／０Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞と融合させた（６：１の関係）。該融合細胞を、９６ウェルプレートに入れ、α−ＭＥＭ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、ヌトリドーマ（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）−ＣＳ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））ならびにヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴサプリメント、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を加えた２０％ＦＢＳ中で増殖させた。ハイブリドーマ産生に関して選択するために、ウェル当たり０．０５μｇのＧＰＣ３免疫原を負荷した９６ウェルプレートを使用して、増殖したクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。プレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロックし、各クローンから得られたならし培養液を加えた。セイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスｌｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＭ（ストレスジェン（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ））を、基質としてのＯ−フェニレンジアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および過酸化水素と共に使用して、抗原に結合した抗ＧＰＣ３抗体の存在を検出した。次いで、陽性のクローンをさらに増殖させ、それらが、ＧＰＣ３トランスフェクションした２９３細胞を染色する力を、免疫蛍光法でテストした。１Ｇ１２および８Ｈ５と名付けられた陽性のハイブリドーマを２回クローニングし、アイソストリップ（Ｉｓｏｓｔｒｉｐ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、それらのアイソタイプ（ＩｇＧ１，Ｋ）を決定した。プロテインＡカラム（バイオ・ラドから販売されているアフィ・ゲル・プロテインＡ  ＭＡＰＳ  ＩＩキット（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳ  ＩＩ  ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して、ならし培養液上澄から抗体を精製した。
【００７９】
免疫蛍光：ＧＰＣ３またはベクターのみトランスフェクションした２９３細胞を、ポリ−Ｌ−リシン処理スライド上に播種し、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。抗ＧＰＣ３  Ｍａｂまたは正常マウスＩｇＧ（サンタ・クルツ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））（１５μｇ／ｍｌ）と共に１時間インキュベートした後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、一次抗体の結合を、ＦＩＴＣコンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2断片（ストレスジェン（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ））で検出した。
【００８０】
ウエスタンブロット分析：氷上のプロテアーゼインヒビターを含有するＲＩＰＡ緩衝液（２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン）中で、細胞を３０分間溶解した。タンパク質サンプルを、６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動させ、ＰＶＤＦ膜（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に移した。この膜を、ブロッキング緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５％脱脂粉乳）中、室温で１時間ブロックし、次いで、１ｇ／ｍｌ  １Ｇ１２Ｍａｂまたは１２ＣＡ５Ｍａｂと共に、４℃で一晩インキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ抗マウスＩｇＧ二次抗体と共に１時間インキュベートした後、化学発光ＥＣＬ試薬（デュポン・ＮＥＮ（ＤｕＰｏｎｔ  ＮＥＮ））を使用して、タンパク質バンドを検出した。
【００８１】
免疫組織化学：パラフィン包埋組織切片を、キシレンで脱パラフィン処理し、段階的な一連のエタノール溶液で再水和した。次いで、ケンモア（Ｋｅｎｍｏｒｅ）電子レンジで（出力１０で２分、出力６で１．５分および出力９で２．５分、さらにこれらの３段階を２回繰り返す）、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６中のスライドを加熱して、抗原回復技術を実施した。このスライドを蒸留水ですすぎ、段階的な一連のエタノール溶液で脱水し、メタノール中１０％の過酸化水素中に１０分間浸漬して、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。このスライドを再水和し、ヒストステイン−ＳＰキット（Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ−ＳＰｋｉｔ）（ザイメッド・ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））およびＴＳＡＴＭビオチン・システム（ＴＳＡＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の説明書に従って、２０μｇ／ｍｌの抗ＧＰＣ３Ｍａｂを（またはネガティブコントロールとして正常マウスＩｇＧおよびＰＢＳを）使用して、免疫染色を実施した。、１／４００の希釈率の、ＡＦＰに対するウサギポリクローナル抗体（ダコ（Ｄａｋｏ），Ａ００８）で連続切片を染色した。内因性ペルオキシダーゼを過酸化水素水でブロックし、ウルトラＨＲＰシステム（Ｕｌｔｒａ  ＨＲＰ  ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＤラブズ（ＩＤ  Ｌａｂｓ））で抗体結合を検出した。
【００８２】
サンドイッチＥＬＩＳＡ：９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ウェル当たり、０．５μｇの抗ＧＰＣ３  Ｍａｂ１Ｇ１２を含むＰＢＳ  ５０μｌで覆った。このプレートをＰＢＳ中１％のＢＳＡで２時間ブロックし、希釈した血清サンプル（ＰＢＳで１：３）５０μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡで未結合材料を洗浄した後、抗ＧＰＣ３ヒツジポリクローナル抗体22を使用して、結合したＧＰＣ３を検出し、続いて、Ｏ−フェニレンジアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および過酸化水素を基質として使用して、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせたロバ抗ヒツジＩｇＧ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共にインキュベートした。血清中に存在するＧＰＣ３を定量化するために、同一希釈の正常血清のプールに加えた精製ＧＰＣ３の検量線を、並行して実施した。正常な血清中におけるＧＰＣ３の存在を決定するために、ＰＢＳでＧＰＣ３検量線を作成した。各サンプルを３回×４倍測定した。
【００８３】
統計解析：群間差の有意性を、マン・ホィットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定で決定した。
【００８４】
血清学的ＡＦＰ濃度：並行血清サンプル中のＡＦＰレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（アボットから販売されているアキシム（Ａｘｓｙｍ，Ａｂｂｏｔｔ））で測定した。
【００８５】
＜実施例１：ＧＰＣ３に対するポリクローナル抗体の作製および特性決定＞
ヒトＧＰＣ３の７０個連続したＣ末端アミノ酸をコード化しているクローン化ＧＰＣ３のｃＤＮＡ（フィルムス（Ｆｉｌｍｕｓ）ら、上掲）の一部を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として、従来の大腸菌発現システムで発現させた。
【００８６】
標準プロトコールを使用してヒツジを免疫化するために、グルタチオンカラムで精製した、融合タンパク質を使用した。７０アミノ酸免疫原に対するポリクローナル抗体を、「抗体、実験マニュアル」、ハーローら編、１９８８年コールド・スプリング・ハーバー発行、（"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，（１９８８），Ｅｄ.Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ.）に記載の従来の方法で、アフィニティ精製した。該ポリクローナル抗体を、ウエスタンブロットおよび免疫沈降試験に使用した。
【００８７】
＜実施例２：ＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体を生じるハイブリドーマの作製＞
同一免疫原である、ヒトＧＰＣ３のＣ末端７０アミノ酸を含むＧＳＴ融合タンパク質を使用して、モノクローナル抗体を作った。この７０アミノ酸領域は、生物種間で保存される最小のものであり、したがって、ヒトＧＰＣ３に特異的な抗体を生じさせるために使用される。ハイブリドーマは、たとえばケーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，（１９７５年）に記載の、当業者に周知の方法を使用して生じさせる。
【００８８】
簡単に記載すると、チターマックス・ゴールド（Ｔｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ（商標））（セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ））アジュバントで乳化したＨｉｓタグ付カルボキシル末端７０アミノ酸ヒトＧＰＣ３断片５０μｇを含む単回腹腔内注射で、Ｂａｌｂ／Ｃメスマウスを免疫化した。２１日後、アジュバントを含まない同一免疫原５０μｇで、マウスを追加免疫した。２日後、尾静脈から血液サンプルを採取し、血清を得た。同一マウスの免疫化前血清をネガティブコントロールとして使用して、血清サンプル中の抗ＧＰＣ３抗体価をテストした。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で推定した。標準手順（パーキン（Ｐａｒｋｉｎ），Ｄ．Ｍ．，ピサニ（Ｐｉｓａｎｉ），Ｐ．＆  ファーレイ（Ｆｅｒｌａｙ），Ｊ.著、包括的癌統計学（Ｇｌｏｂａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。ＣＡ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，４９，３３−６４，１，（１９９９年））を使用し、ポリエチレングルコール４０００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いて、最高の抗体価を有していたマウス２匹から得た脾細胞を、ＳＰ２／０Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞と融合させた（６：１の関係）。該融合細胞を、９６ウェルプレート中の、α−ＭＥＭ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、成長因子源としてのヌトリドーマ（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）−ＣＳ（商標）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））ならびにハイブリッドを選択するためのヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴサプリメント、ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））を加えた２０％ＦＢＳ中にプレーティングした。カルボキシル末端ＧＰＣ３断片０．０５μｇ／ウェルを負荷した９６ウェルプレートを使用して、得られたクローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。このプレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間ブロックし、ならし培地上澄と共にインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスｌｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＭ（ストレスジェン（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ）（商標））を、基質としてのＯ−フェニレンジアミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および過酸化水素と共に使用して、一次抗体の結合を検出した。ＧＰＣ３をトランスフェクションした細胞を使用して、免疫蛍光により、陽性クローンを再スクリーニングした。選択されたハイブリドーマ（１Ｇ１２および８Ｈ５）を２回クローニングし、アイソストリップ（Ｉｓｏｓｔｒｉｐ）（商標）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、それらのアイソタイプを決定し（ＩｇＧ１、Ｋ）、プロテインＡカラムクロマトグラフィー・アフィ・ゲル・プロテインＡ  ＭＡＰＳ  ＩＩキット（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＭＡＰＳ  ＩＩ  ｋｉｔ）（バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（商標））を使用して、ならし培地上澄からそれらを精製した。
【００８９】
ハイブリドーマにより産生された、７０アミノ酸ＧＰＣ３断片に対する抗体を、ＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングした。次いで、ＧＰＣ３をトランスフェクションした細胞を特異的に染色する能力について、陽性のクローンをテストした。２つのハイブリドーマ（１Ｇ１２および８Ｈ５）が、ＧＰＣ３をトランスフェクションした細胞の、強くかつ特異的な免疫染色を示す抗体を産生した。図１は、１Ｇ１２抗体に続いて、蛍光性の二次抗体を用いた、２９３細胞の染色を示す。パネルＡおよびＣは、位相差顕微鏡写真であり、パネルＢおよびＤは、蛍光顕微鏡写真である。パネルＡおよびＢは、ベクターのみをトランスフェクションした２９３細胞を示し、パネルＣおよびＤは、ＧＰＣ３含有ベクターによりトランスフェクションした細胞を示す。この実施例では、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１Ｇ１２の存在下で、細胞を染色した。パネルＤは、ｍＡｂ  １Ｇ１２による特異的染色を明らかに示す。ベクターのみでトランスフェクションした細胞では、染色は見られない（パネルＢ）。
【００９０】
＜実施例３：モノクローナル抗体の特性決定＞
１Ｇ１２および８Ｈ５ハイブリドーマにより産生された２つのモノクローナル抗体の特異性を、ＨＡタグ付ＧＰＣ３をトランスフェクションした細胞からのタンパク質溶解物のウエスタンブロット分析で確認した。図２から分かる通り、抗体１Ｇｌ２は、ＧＰＣ３コアタンパク質に相当するバンド、およびＧＰＣ３のグリカン化形に相当するスメアを検出した。コントロールとして、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）を用いて、ウエスタンブロットを並行実施した。
【００９１】
＜実施例４：組織切片におけるＧＰＣ３＞
ＨＣＣ腫瘍および周囲の非悪性細胞のパラフィン切片を、上述の通り、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体１Ｇ１２で免疫組織化学的に染色した。該抗ＧＰＣ３抗体は、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン二次抗体を使用して検出し、結合した二次抗体は、セイヨウワサビ過酸化物にコンジュゲートしたストレプトアビジンを使用して検出した。図３は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体１Ｇ１２は、腫瘍細胞に強く結合したが、正常な肝細胞とは全く結合しなかったことを示す。予想通り、細胞膜上にＧＰＣ３が存在したのに加えて、細胞質内の顕著な染色もみられた。細胞質の染色は、大部分は粒状であり、また細胞表面に近かった。時々、核周囲の染色が確認された。非実質細胞は、マクロファージ以外は、一般に陰性であった。以上の結果から、ＧＰＣ３の検出により、肝組織切片におけるＨＣＣを診断するために、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体を使用できることが分かる。
【００９２】
＜実施例５：悪性病変および良性病変におけるＧＰＣ３発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定＞
表１に、１５の異なる肝細胞癌と反応するＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体の免疫組織化学的研究の結果をまとめる。これらのＨＣＣのうち１２（８０％）は、ＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体と反応した。各腫瘍で、抗ＧＰＣ３ｍＡｂと反応した、染色された細胞の数には幾らかのばらつきがあった。陽性細胞は、通常はクローン様領域内に密集していた。全例で、腫瘍周囲の非悪性肝細胞は陰性であった。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
表２に、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体と悪性および非悪性肝組織との反応の結果をまとめる。６つの肝腺腫および９つの肝異形成は、ＧＰＣ３陰性であった。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
データから、ＧＰＣ３は、正常肝および良性病変で発現されないが、ＨＣＣの大半が検出可能なレベルのグリピカン−３を発現することが分かる。
【００９７】
＜実施例６：ＧＰＣ３検出用免疫学的アッセイ＞
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＨＣＣを有すると診断された患者の血清中ＧＰＣ３を決定した。ＥＬＩＳＡの場合、９６ウェルプレートを抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体１Ｇ１２で被覆し、被験血清のアリコートを加えた。未結合材料を洗浄により除去し、実施例１の場合と同様に調製して、免疫複合体の存在を検出するのに有用な検出試薬と直接または間接に複合体形成した抗ＧＰＣ３ヒツジポリクローナル抗体を使用して、結合したＧＰＣ３を検出した。サンプルの光学密度を測定し、標準曲線の結果と比較した。図４は、該アッセイ用の標準曲線を示す。アッセイの結果は、試験した範囲内で、直線状であった。
【００９８】
トロント総合病院（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）でＨＣＣの治療を受けており、かつ書面による同意が得られた患者から、血清を得るためのプロトコールを確立した。予備研究で、確定されたＨＣＣ患者９例から血清を得た。血液ドナー３８人から正常な血清も得て、プールした。サンプルの１：３（血清：ＰＢＳ）希釈物を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイでＧＰＣ３レベルを測定した。各サンプルを四重に分析した。各サンプルから得たＯＤを、正常な血清のプールの同一希釈液に様々な量のＧＰＣ３を加えることによって作成した標準曲線と比較することにより、ＧＰＣ３濃度を得た。
【００９９】
表３に、研究結果をまとめる。ＨＣＣ患者９例中５例（５５％）が、有意に上昇したＧＰＣ３値を有していた。これらの患者の中で、有意に上昇したＡＦＰレベルを有する者はいなかった。正常なサンプルのいずれでも、ＧＰＣ３は検出できなかった。
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
健常者５３例、肝炎患者１８例、肝炎に加えて硬変を有する患者２０例、およびＨＣＣ患者３４例における血清ＧＰＣ３レベル測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、さらに研究を実施した。ＧＰＣ３は、全ての健常者で検出できず、またＨＣＣ患者３４例中１８例（感度５３％）が有意に上昇した血清ＧＰＣ３レベルを有し、その値は１５１〜２９２４ｎｇ／ｍｌの範囲であった（図５および表４）。加えて、ＧＰＣ３は、全ての肝炎患者で検出できず、肝炎に加えて硬変を有する患者２０例中１例（５％）のみで検出され、そのレベルは１１７ｎｇ／ｍｌであった（９５％特異性）。マン・ホィットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）検定を使用した統計解析は、ＨＣＣ患者におけるＧＰＣ３の平均血清レベル（ｎｇ／ｍｌ）は、肝炎に加えて硬変を有する患者、肝炎患者および健常なドナーより有意に高く、また最後の３群間に有意差はなかった。
【０１０２】
＜実施例７：ＧＰＣ３レベルおよびＡＦＰレベルの比較＞
市販のＥＬＩＳＡ（アボットから販売されているアキシム（Ａｘｓｙｍ，Ａｂｂｏｔｔ））を使用して、実施例６に記載の、同一セットのＨＣＣ患者３４例で、血清ＡＦＰレベルを測定した。表４に、得られたＡＦＰ値およびＧＰＣ３値の比較を示す。
【０１０３】
【表４】
2005526979.tif 000006
【０１０４】
本発明は、本明細書に記載の実施形態の特徴に限定されるのではなく、特許請求の範囲の範囲内の全ての変更および修飾を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体１Ｇ１２で染色した、ＧＰＣ３をトランスフェクションした２９３細胞（パネルＣおよびＤ）およびベクターのみでトランスフェクションしたコントロール細胞（パネルＡおよびＢ）の顕微鏡写真を示す。パネルＡおよびＣは、位相差顕微鏡写真であり、パネルＢおよびＤは、蛍光顕微鏡写真である。
【図２】ベクターのみ（ＥＦ）またはＨＡタグ付ＧＰＣ３（ＧＰＣ３）によりトランスフェクションした２９３細胞由来のタンパク質のウエスタンブロット（ＷＢ）分析を示す図である。膜を、抗ＧＰＣ３抗体１Ｇ１２または抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５）とインキュベートした。中実の矢印：ＧＰＣ３コアタンパク質；アウトライン形の矢印：グリカン化形のＧＰＣ３；矢じり：１Ｇ１２により検出される、エピトープを含まない、ＧＰＣ３のＮ末端を含む切断生成物。右側の数字は、分子量マーカーに対応する。
【図３】モノクローナル抗体１Ｇ１２を使用して、免疫組織化学的に染色された肝細胞癌の切片の顕微鏡写真を示す。パネルＡ：染色されていない非腫瘍肝組織（Ｎ）に包囲された、高度ＧＰＣ３陽性のＨＣＣ（Ｔ）の、全体像（１６倍）；パネルＢ：細胞質顆粒および膜染色を示す同一組織の全体像（４００倍）。
【図４】ＧＰＣ３用のＥＬＩＳＡアッセイにおける、ＧＰＣ３濃度と光学密度との間の関係を示す図である。
【図５】ＥＬＩＳＡで測定された、コントロール、肝炎患者（Ｈ）、肝炎に加えて硬変を有する患者（Ｈ+ＬＣ）および肝細胞癌患者（ＨＣＣ）の血清中ＧＰＣ３レベルを示す図であり、示した結果は、４重の平均値を表す。ＨＣＣ患者および硬変患者の平均ＧＰＣ３値間の有意差を、図の上部に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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