(57)【要約】この発明は、蛍光光線のスペクトル微分画像を測定する方法に関し、その方法では異なった種の蛍光体を包含する試料がスペクトル特性及び／又は励起時間によって定義された少なくとも一つの励起通路の励起光によって投射され、試料から放射された蛍光光線はスペクトル検出特性及び／又は検出時間によって定義された少なくとも一つの検出通路により受けられてデイジタル信号に変換され、この場合にデイジタル信号はデイジタルデータ処理装置の記憶装置において更に処理するために記憶されている。この発明の方法は、それぞれ励起通路と検出通路の特定組合せとして形成された複数の測定通路の特性がデイジタルデータ処理装置の算出ユニットにより実施されて利用者により試料において推測される少なくとも若干の蛍光体の蛍光特性を考慮する数学的最適化方法の成果に基づく測定の実施前に自動的に調整されるか、或いは利用者による手動調整に対する適切な指示を与えられることを特徴とする。さらに、この発明はこの発明の方法を実施する装置に関する。
2005526246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光光線のスペクトル微分画像を測定する方法であって、異なった種の蛍光体を包含する試料がスペクトル特性及び／又は励起時間によって定義された少なくとも一つの励起通路の励起光によって投射され、試料から放射された蛍光光線はスペクトル検出特性及び／又は検出時間によって定義された少なくとも一つの検出通路により受けられてデイジタル信号に変換され、この場合にデイジタル信号はデイジタルデータ処理装置の記憶装置において更に処理するために記憶されているスペクトル微分画像測定方法において、それぞれ励起通路と検出通路の特定組合せとして形成された複数の測定通路の特性はデイジタルデータ処理装置の演算ユニットにより実施されて利用者により試料において推測される少なくとも若干の蛍光体の蛍光特性を考慮する数学的最適化方法の成果に基づく測定の実施前に自動的に調整されるか、或いは利用者による手動調整に対する適切な指示を与えられることを特徴とする方法。  
【請求項２】
考慮すべき蛍光特性はデイジタルデータ処理装置の記憶ユニットから呼び出されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
数学的最適化方法の範囲内で、利用者により推測される試料の化学的構成と測定通路の最適化すべき特性に基づいて生じる信号との間の関係を記載する線形方程式システムが編成されていることを特徴とする請求項１或いは請求項２に記載の方法。
【請求項４】
数学的最適化方法は、測定通路の特性を記載した係数の変動によって線形方程式システムの解答の明白性が最適化される第一最適化工程を包含することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
線形方程式システムの解答の明白性が利用者により導き得る一つ又は複数の二次的条件の考慮の下で最適化されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
数学的最適化方法は、線形方程式システムの係数により形成されたマトリックスを含有するマトリックス記号の条件数の最適化を包含することを特徴とする請求項４或いは請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マトリックス記号のマトリックス要素は利用者により期待された測定誤差に一致する値Ｘ2 を最小化するように決定されていることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
係数マトリックスを含有するマトリックス記号は実質的に移項による係数マトリックスの左側マトリックス積であることを特徴とする請求項６或いは請求項７に記載の方法。
【請求項９】
条件数は実質的にマトリックス記号の行列式を含有することを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
条件数は実質的にマトリックス記号の軌跡を含有することを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
条件数は実質的にdet/(N/n-1) (n-1)/2 の値に一致し、この場合にdet は行列式であり、N は軌跡であり、n はマトリックス記号の次元であることを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
条件数は実質的にマトリックス記号の最小対最大固有値の関係を含有することを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
最適化すべき条件数は利用者により選択できることを特徴とする請求項６乃至請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
最適化すべき条件数は利用者により、期待すべき信号の全体的特徴がデイジタルデータ処理装置に入力されて、条件数が自動的に伝達されることによって選択できることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
数学的最適化方法は一つの第二最適化工程を含有し、この工程において測定通路の特性を記載する係数の変動によって期待すべき信号の雑音が最適化されることを特徴とする請求項３乃至請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
期待すべき信号の雑音は利用者により導入可能な一つ又は複数の二次的条件の考慮の下で最適化されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
二次的条件として一つ又は複数の蛍光体の漂白用の最大限或いは最適値が利用されることを特徴とする請求項５乃至請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
二次的条件として規定強度の信号の雑音の最小化が利用されることを特徴とする請求項５乃至請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
二次的条件として前もって記録された試験画像の領域における種々の蛍光体の最大スペクトル解像が利用されることを特徴とする請求項５乃至請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
二次的条件として相対的誤差の最小化が利用されることを特徴とする請求項５乃至請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
最適化方法は二次的条件を定義するための反復対話式に制御された工程を包含することを特徴とする請求項５乃至請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
測定通路特性の自動調整はＡＯＴＦs,ＬＣＴＦs,カットオンフィルタ、帯域フィルタ、中立単調フィルタ及び／又は分光器の装着及び／又はモータによる運動によって行われることを特徴とする請求項１乃至請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光光線のスペクトル微分画像を測定する装置であって、異なった種類の蛍光体を包含する試料がスペクトル特性及び／又は励起時間によって定義された少なくとも一つの励起通路の励起光によって投射でき、試料から放射された蛍光光線がスペクトル検出特性及び／又は検出時間によって定義された少なくとも一つの検出通路により検出できてデイジタル信号に変換でき、この場合にデイジタル信号はデイジタルデータ処理装置の記憶装置において更に処理するために記憶されているスペクトル微分画像測定装置において、それぞれ励起通路と検出通路の特定組合せとして形成された複数の測定通路の特性はデイジタルデータ処理装置の算出ユニットにより実施されて、試料を含有する蛍光体の少なくとも若干の蛍光特性を考慮する数学的最適化方法の成果に基づく測定の実施前に自動的に調整できるか、或いは利用者による手動調整に対する適切な指示を提示できることを特徴とする装置。
【請求項２４】
考慮すべき蛍光特性はデイジタルデータ処理装置の記憶ユニットから呼び出されることを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
数学的最適化方法の範囲内で、利用者により推測される試料の化学的構成と測定通路の最適化すべき特性に基づいて生じる信号との間の関係を記載する線形方程式システムが編成されていることを特徴とする請求項２３或いは請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
数学的最適化方法は、測定通路の特性を記載した係数の変動によって線形方程式システムの解答の明白性が最適化できる第一最適化工程を包含することを特徴とする請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
線形方程式システムの解答の明白性が利用者による導き得る一つ又は複数の二次的条件の考慮の下で最適化できることを特徴とする請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
数学的最適化方法は、線形方程式システムの係数により形成されたマトリックスを含有するマトリックス記号の条件数の最適化を包含することを特徴とする請求項２６或いは請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
マトリックス記号のマトリックス要素は利用者により期待された測定誤差に一致する値Ｘ2 を最小化するように決定されることを特徴とする請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
係数マトリックスを含有するマトリックス記号は実質的に移項による係数マトリックスの左側マトリックス積であることを特徴とする請求項２８或いは請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
条件数は実質的にマトリックス記号の行列式を含有することを特徴とする請求項２８乃至請求項３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
条件数は実質的にマトリックス記号の軌跡を含有することを特徴とする請求項２８乃至請求項３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
条件数は実質的にdet/(N/n-1) (n-1)/2 の値に一致し、この場合にdet は行列式であり、N は軌跡であり、n はマトリックス記号の次元であることを特徴とする請求項２８乃至請求項３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
条件数は実質的にマトリックス記号の最小対最大固有値の関係を含有することを特徴とする請求項２８乃至請求項３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
最適化すべき条件数は利用者により選択できることを特徴とする請求項２８乃至請求項３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
最適化すべき条件数は利用者により、期待すべき信号の全体的特徴がデイジタルデータ処理装置に入力されて、条件数が自動的に確定されることによって選択できることを特徴とする請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
数学的最適化方法は一つの第二最適化工程を含有し、この工程において測定通路の特性を記載する係数の変動によって期待すべき信号の雑音が最適化できることを特徴とする請求項２５乃至請求項３６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３８】
期待すべき信号の雑音は利用者により導入可能な一つ又は複数の二次的条件の考慮の下で最適化できることを特徴とする請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
二次的条件として一つ又は複数の蛍光体の漂白用の最大限或いは最適値が利用できることを特徴とする請求項２７乃至請求項３８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４０】
二次的条件として規定強度の信号の雑音の最小化が利用できることを特徴とする請求項２７乃至請求項３９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４１】
二次的条件として前もって撮影された試験画像の領域における種々の蛍光体の最大スペクトル解像が利用できることを特徴とする請求項２７乃至請求項４０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４２】
二次的条件として相対的誤差の最小化が利用できることを特徴とする請求項２７乃至請求項４１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４３】
最適化方法は二次的条件を定義するための反復対話式に制御された工程を包含することを特徴とする請求項２７乃至請求項４２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４４】
測定通路特性の自動調整はＡＯＴＦs,ＬＣＴＦs,カットオン−、帯域−、中立単調フィルタ及び／又は分光器の装着及び／又はモータによる運動によって行われることを特徴とする請求項２３乃至請求項４３のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、請求項１の上位概念に挙げられた種類の蛍光光線のスペクトル微分画像を測定する方法に関する。
【０００２】
この発明は、更に、請求項２２の上位概念に挙げられた種類の蛍光光線のスペクトル微分画像を測定する装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
この種の方法と装置は、特に最近の生物学において今日の種々の用途を見出す。特に、蛍光顕微鏡のために多数の特殊蛍光ゾンデが開発されている。これは、例えば抗体、一定ＤＮＡシーケンス或いは他の生物学的構造の特殊標識に適する。それらは、更に、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）或いはＹＳＰ（黄色蛍光蛋白質）などのような蛍光を発する蛋白質を備える一定蛋白質の融合構造を包含する。さらに、指示色素はその蛍光が強度及び／又は発生スペクトルに関して一定イオン、例えばカルシウムの濃度により修正されることによって包含される。  
【０００４】
最近の生物学は、分析された試料の複雑性に測定方法の複雑性を適合するように企てており且つそれで試料における出来るだけ多数の異なる標識を配置して互いに立体的に解像することに興味をもっている。  
【０００５】
他の特定の現実問題は、互いに蛍光なしのエネルギー伝達ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）によって交換作用を生じる蛍光体の定量的検出である。ドーナーとアクセプターから成るＦＲＥＴ対は、光学的顕微鏡にて立体的に互いに解像できない。むしろ、ドーナーとアクセプタースペクトル或いはその関係の重ね合せが互いに計測されている。
【０００６】
他の現実問題は、リガンデン( Liganden )の活動性の割合形成とその算出のために蛍光体の固定されて自由な態様の割合における指示色素の蛍光の発生である。              
【０００７】
画像形成するほぼすべての画像蛍光方法では生物学において持ち得る現実問題は、例えば細胞や基礎担体のような多くの構造を示す所謂自動蛍光、即ち不特定背景蛍光の考慮である。
【０００８】
この方法の本質原理的限定は、通例に使用された有機的蛍光体が比較的幅広い退出や放出スペクトルを有し、そのスペクトルがこの有機分子に関係した多数の音響的副水準に帰することにある。それ故に、蛍光体の試料に含有された個々の種子を特別に励起するか、或いは特別に検出することが比較的難しくなる。むしろ、通例は、信号として異なる種子の寄与の複雑な関係を得る。
【０００９】
従来、出来るだけ幅広く互いに離れて位置する励起経路や出来るだけ狭い検出経路を使用することで間に合わせている。励起経路の概念は、この関係において蛍光体を励起する光の特性の総和として理解すべきである。これは、特にスペクトル特性を包含し、この明細書の範囲内においてそれぞれのスペクトル成分の強度が正当に評価される。無論、例えば励起時点及び／又は励起期間のような他の特性も、励起時間として要約されて励起経路を定義するように使用され得る。類似な形式において、ここで検出経路の概念は試料から放射された蛍光光線を導いて濾過して検出する要素の特性の総和として理解される。これは更に一方では個々のスペクトル成分用のそれぞれの感度を含むスペクトル特性を包含し、並びに他方では検出時間、検出時点と検出期間を包含できる。一つづつの励起経路と検出経路の特定の組合せは次に総括的に測定経路と呼ばれる。
【００１０】
慣例の実務において、種々の蛍光体の種類の最適スペクトル解像を相互にねらい、蛍光体の特性とその組合せに依存する種々の方法が知られている。それで、例えば所定検出通路において複数の記録が順々に異なる励起波長により実施することが可能であり、励起波長はそれぞれの蛍光体種の最高吸収が出来るだけ正確に行われるようにそれぞれに選定されている。この場合には測定毎に測定路が利用される。他の可能性は、複数の蛍光体種の励起スペクトルの領域にある放出波長における試料を励起し、放射光を分光器のフィルタユニット或いはカスケードを通してスペクトル領域に分割し、この分光を分けられた光センサーに供給することにある。この方法では、複数の測定路が同時に利用される。注意を引く蛍光体の放射或いは放出バンドが十分に広く互いに分離される場合には、個々の測定路の周波数範囲は各通路が一つの蛍光体に一致するように選択される。
【００１１】
この技術において、大抵は通路間の或るダビングが回避できないと言う欠点がある。多数の異なる蛍光体が試料にて使用される時に、このことが起こり、そのスペクトルは利用可能な波長の制限されたバンド幅に基づいて重なる。そのスペクトルには、個々の検出路のスペクトル制限が例えば狭い帯域（バンドパス）フィルタによって急激に限定されることによって反対に作用される。これは、無論、放射された蛍光体光の大部分が信号発生を与えることがなく、それが否定的に検出された信号の特質に影響を及ぼすことを生じる。特に、これは、試料における蛍光体の漂白処理のために所定標本から放射できる光子の総数が限定されているので、望ましくないけれども、しかし他方では光子雑音に基づき測定の品質と解像がより良くなればなるほど、多くの光子が測定に役立つ。ほぼすべての蛍光体光子は、確かに、放射された蛍光体光線がスペクトルに分解され、スペクトルが多数のスペクトル通路によって再処理されることによって利用され得る。けれども、その場合に、それぞれ個々の通路にとっては比較的僅かな光子しか利用できないので、この方法が特に光の強い用途の場合にのみ適しているから、それぞれ個々の極めて狭い通路における相対的雑音が著しく増大する。    
【００１２】
該当する問題は、幅広い測定通路が選定されて、その測定路のダビングが故意に甘受され、著しい計数的後処理或いは評価の記録されたデータを受けるときにひどく減少される。このために、記録された信号が検出器或いは後方に接続された変換ユニットにおいてディジタルデータに変換されて、ディジタルデータ処理装置の記憶ユニットに記憶される。例えばレーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）のような多くの用途の場合には、データのディジタル化と後処理は確かに技術の本質的構成要素である。
【００１３】
データの前もって要求された評価は通常はディジタルデータ処理装置の演算ユニットによって行われる。特に良好な成果は人に所謂「直線不混光」の方法によって達成された。この方法は、測定路の公知の特性を介して試料における測定された信号と蛍光体構成の間に一つの関係を作成する不均一線形方程式システムの作成と解答を基礎にしている。この方程式システムは数学的にマトリックス記載形式で式（１）として図示される、
【数１】
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或いは成分記載形式で式（２）として図示される。
【数２】
2005526246.tif 000004
【００１４】
この公式は次のように理解すべきである：ベクトル
【数３】
2005526246.tif 000005
は所定画像点の相対濃度における種々の種の蛍光体を表わす。種々の蛍光体種の数はｐである。それによりベクトル
【数４】
2005526246.tif 000006
はｐ成分Ｂμを有する。ベクトル
【数５】
2005526246.tif 000007
は各測定路にて検出された信号を表わす。測定路の数はｑである。それによりベクトル
【数６】
2005526246.tif 000008
はｑ成分ｙr を有する。測定のために例えば四つの種々の励起波長と四つの種々のスペクトル検出窓が使用されたならば、測定路の数はｑ＝１６である。ベクトル
【数７】
2005526246.tif 000009
は各測定路に使用された励起強度を示し、それでｑ成分Ｉr を有する。マトリックスＡは化学的構成
【数８】
2005526246.tif 000010
を蛍光体から励起通路の励起強度Ｉr と測定路のその他の特性
【数９】
2005526246.tif 000011
を介して成果信号
【数１０】
2005526246.tif 000012
と連結する係数マトリックスである。それ故に、マトリックスＡはｐｑ要素
【数１１】
2005526246.tif 000013
を有する。最後にｑ成分ｂr を備えるベクトル
【数１２】
2005526246.tif 000014
は分散光或いは他の背景光を各測定路に再現する修正値である。値Ｂμは通例は場所依存として理解すべきであり、その間にその他の値が方程式（１）と（２）のそれぞれ右面に通常はすべてのピクセルのために同じであるパラメータを示す。測定目的物の自動蛍光体は補助的蛍光体Ｂμの蛍光として或いは背景光ｂr （場所独立の場合）として取り扱われ得る。蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）の存在の場合に、そのＦＲＥＴ対が独立色彩体として理解され、その濃度は一つの値Ｂμによって与えられている。
【００１５】
「直線不混光」の目標は前記線形方程式システムの解答
【数１３】
2005526246.tif 000015
を見出すことであり、それは、方程式の数ｑが異なる蛍光体種の数ｐより大きい、或いは同じである限り、数学的に係数マトリックスＡの簡単な逆転によって可能である。この数学的作業のアルゴリズム変換のために、専門家には連続数値的方法が知られている。この技術の説明は、Farkas他著: 「光学生命画像における非侵入画像取得と進歩した処理」、Computerized Medical Imagingand Graphics社( コンピュータ化医療画像兼製図法) 、22巻(1998 年) 、89ー102 頁（非特許文献１）、或いはDickinson 他著: 「レーザー走査蛍光顕微鏡検査に対する全新次元における多スペクトル画像兼直線不混光」、BioTechnics 社、31巻、6 号(2001 年) 、1272ー1278頁（非特許文献２）、並びに Boardman 著: 「単一値分解を使用する画像顕微鏡検査の逆転」、Proc.IGARSS 社、89巻、4 号(1989 年) 、2069ー2072頁（非特許文献３）に開示される。LSM-装置におけるこの評価方法の履行は、ドイツ国イエナのCarl Zeiss社によりレーザー走査顕微鏡LSM 510 で実現された。
【００１６】
説明の如く、「直線不混光」の方法は、使用された測定路の特性の知識におけるデータ評価の確かな手段を提供する。けれども、適した測定路の選択、即ち励起波長、強度、時間と検出波長と時間のようなすべてのパラメータの調整が依然として利用者の洞察力に支配されると言う欠点がある。けれども、洞察力は、依然として出来るだけ蛍光体種の一個づつの測定路に付属させることを利用者の近くにある明白な規則に基づいて判断するから、複雑なデータ分析を提供する可能性は通常は利用されない。
【非特許文献１】Farkas他著: 「光学生命画像における非侵入画像取得と進歩した処理」22巻(1998 年) 、89ー102 頁
【非特許文献２】Dickinson 他著: 「レーザー走査蛍光顕微鏡検査に対する全新次元における多スペクトル画像兼直線不混光」31巻、6 号(2001 年) 、1272ー1278頁
【非特許文献３】Boardman著: 「単一値分解を使用する画像顕微鏡検査の逆転」89巻、4 号(1989 年) 、2069ー2072頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、簡単な方法で得られたデータの品質が改良されるように、この種の方法を再現することである。
【００１８】
本発明の他の課題は、装置により得られた成果が簡単な方法で改良されるように、この種の方法を再現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この課題は、独立請求項の特徴を備える方法或いは装置によって、解決される。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様は、従属請求項において挙げられている。
【発明の効果】
【００２１】
この発明は、複数の測定路の特性が測定の実施前に自動的に調整される、或いは利用者に手動調整する適切な指示を与えられることによって、この種の方法を組み立てる。自動的調整或いは指示はディジタルデータ処理装置の演算ユニットにより実施された数学的適正化方法の成果によって行われる。その場合に、試料に包含される少なくとも若干の蛍光体の蛍光体特性が考慮されれている。そのような数学的適正化方法は、製品からプログラムされ得る、或いは利用者自体から提出された調整ライブラリーに配向されている一定の標準調整の自動的制御により精確に分離すべきである。むしろディジタルデータ処理装置の利用者に利用者がどんな蛍光体を推測するか、或いはその特性が与えられる。この課題は、利用者の特殊な関係のために測定路の最適調整を算出する数学的適正化方法を基礎にしている。それによって特に洞察力に広範に抵抗して、記録されたデータの数学的評価を考慮するが、しかし特に全蛍光体スペクトルの有効な分割が行われ、その代わりに狭いバンドのフィルタを裁断し、信号を与える光子の数とそれによる信号品質を不必要に減少させる。
【００２２】
好ましくは多数の蛍光体の特性は、ディジタルデータ処理装置の記憶ユニットの一個又は複数個のライブラリーに記憶されるので、完全な特性を入力する必要なしに利用者は試料に推測された蛍光体と確認する場合にはそれで充分である。
【００２３】
特に、数学的適正化方法の範囲内で利用者により推測される試料の化学的組成と測定路の最適化すべき特性に生じる信号の間の関係を記載する線形方程式システムが作成されるならば、それで充分である。この特徴は直線不混光の数学的根拠を取り上げている。無論この基礎着想は技術水準におけるように正確に逆の方法で使用される。公知の成分ｙr と公知の測定路を記載する係数
【数１４】
2005526246.tif 000016
における直線不混光にて、個々の蛍光体種の相対濃度Ｂμが探求されている間に、この発明による方法はむしろ測定路を記載する係数
【数１５】
2005526246.tif 000017
の変化によってシステムの最適化は方程式システムの解答が出来るだけ一義的に行われる方向でもたらされることを狙っている。従って、最適化は方程式システムの解答に、特にその明白性に整合される。この方法では、「直線不混光」の方法を基礎とする測定に引き続く評価方法は、システムの線形独立方程式の数が現存蛍光体種の数を下回り、それで方程式システムがもはや一義的に解答できないように、測定路を記載する係数は特定の場合に選定されたから、失敗はない。
【００２４】
けれども、好ましくは、最適化方法は、柔軟に構成されているので、専ら方程式システムの解答の解答可能性と明瞭性に適合されるのではなく、むしろ補助的に利用者により選定された二次条件が考慮される。例えばこの種の二次条件のために、さらに以下に説明される。
【００２５】
好ましくは、最適化方法は、所謂線形方程式システムの係数により形成されているそのマトリックスを含有するマトリックス記号の条件数の最適化を包含する。この発明の範囲内においてこれは、この発明の方法のアルゴリズム的履行が数学的に所謂マトリックス記号の条件数の最適化として示されていることと理解すべきである。具体的変換に応じて、コンピュータプログラムの範囲内のマトリックス或いはアレイの明確な定義を断念することが可能である。
【００２６】
特に好ましい方法では、条件数の計算を基礎としているマトリックス記号は、移項ＡT をもつマトリックスＡの左側マトリックス積、つまりＡT Ａとして形成される。それは、式１と２の記号はＡT をもつ左側乗法によって
【数１６】
2005526246.tif 000018
に変換され得ると言う考慮が基礎となっている。  
【００２７】
公知のように、マトリックスの移項をもつ左側乗法は付与マトリックス記号の対称性を導く、それは誤差平方和のガウスの最小化の方向における補正計算に一致する。
【００２８】
測定路の雑音の明確な考慮の際には、利用者により期待された測定誤差で重要さの程度を決定したマトリックスが援用されることができる、それは統計学から知られた量ｘ2 （ヒー平方）の最小化として見做される。
【００２９】
例えば好ましい実施態様では、最適化すべき条件数が実質的にマトリックス記号、特に記号ＡT Ａの行列式に一致する。別の手段として、最適化基準としてマトリックス記号のトラックＮを包含する条件数が使用され得る。この発明の方法の他の実施例において、最適すべき条件数として値は、
【数１７】
2005526246.tif 000019
が使用され、この式においてdet は行列式であり、Ｎは軌跡（トラック）であり、ｎはマトリックス記号の次元である。この発明の方法の他の好ましい実施例において、条件数としてマトリックス記号の最小対最大固有値の関係が利用される。各この条件数の最適化がマトリックス要素
【数１８】
2005526246.tif 000020
の変動によって測定路特性の選択を導く、その測定路特性が確かに洞察力を多くの場合に強力に抵抗するけれども、測定の後に続くデータ評価を考慮して、特に「直線不混光」の方法によって卓越した成果が与えられる。
【００３０】
その際に、種々の情勢における種々の条件数の最適化が種々の良好な成果を導く。それ故に、特に好ましくは、利用者に期待された測定成果の全体的特性、例えば極めて弱い蛍光体、スペクトルの特に近い蛍光体などを挙げて、それによって或いは直接に最適化すべき条件数を確定する可能性が与えられるようにこの発明の方法を再現することである。
【００３１】
算出された最適化成果の測定路の物理的特性の実現化への変換は好ましい方法で実施され得る。それで例えば励起及び／又は検出光線路における周波数或いは周波数バンドの選択は例えばＡＯＴＦs ( アクスト光学同調可能フィルタ）或いはＬＣＴＦs ( 液晶同調可能フィルタ）のような調整可能フィルタによって提供される。同様に、例えばモータで駆動されるフィルタスライダ或いは歯車に配置されている固体カットオンフィルタ、バンドパスフィルタ及び／又は分光器が挿入され得る。測定路特性の自動影響の他の可能性は例えば所謂灰色楔の励起光線路への導入による励起強度の変動にある。測定路の時間的特性もこの発明の最適化方法の変換で変動される。例えば励起時間が変動するか、或いは短長寿命をもつ蛍光体成分を分離するために時間的検出窓が定義され得る。このために、専門家には多数の変換可能性が知られている。
【００３２】
上述した様に、マトリックスの条件数は実際にしばしば広く下回り得る最高誤差の評価を与えられ得る。これは特に、所定の問題の公知の構造が考慮される場合にば、的確である。それ故に、この発明の方法の特に好ましい再現は、実験的障害源の特殊特性が蛍光体測定において的確に述べられている進展した最適化の可能性が企図されている。特に、好ましくは、測定路の特性を記載する係数の変動によって期待すべき信号の雑音が最適化される第二最適化工程が企図されている。
【００３３】
この発明の着想は次の知識に基づいている。マトリックスＡ或いはマトリックス記号ＡT Ａの係数が求められるときには、特に上記第一最適化工程の使用によって最適化されるときには、一次方程式システムの解答は
【数１９】
2005526246.tif 000021
である。
【００３４】
その際に
【数２０】
2005526246.tif 000022
は解答
【数２１】
2005526246.tif 000023
の期待値を示し、それによってベクトル
【数２２】
2005526246.tif 000024
は実験的偏差
【数２３】
2005526246.tif 000025
を取り付けていることが考慮されている。ベクトル
【数２４】
2005526246.tif 000026
は、それぞれに測定値ｙr の変化の期待値として理解すべきである記号σ2 r の成分として平方根と理解すべきである。これは二つの成分、即ち変化が信号レベルに比例している光子雑音と、それぞれの検出器の暗電流と選別器雑音から構成される信号レベルから統計的に独立した一定検出器雑音とから構成される。
【００３５】
【数２５】
2005526246.tif 000027
この場合にｓは比例定数（適した算出個別光子寄与）であり、σ20,rは通路ｒにおける信号の変化に対するすべての一定寄与の和である。
【００３６】
ガウスの誤差伝播の方法によりベクトル
【数２６】
2005526246.tif 000028
の成分Ｂμの偏差σ
【数２７】
2005526246.tif 000029
は、    
【数２８】
2005526246.tif 000030
として記載されている。
【００３７】
方程式５は線形方程式システムであり、
【数２９】
2005526246.tif 000031
がｙr に依存しないから、
【数３０】
2005526246.tif 000032
であり、この場合にｃ
【数３１】
2005526246.tif 000033
はｒ−１０列の要素であり、マトリックスのμ−１０行は
【数３２】
2005526246.tif 000034
である。それ故に、
【数３３】
2005526246.tif 000035
である。  
【００３８】
この式、或いはすべての偏差平方の和
【数３４】
2005526246.tif 000036
はすべての測定路パラメータの範囲内で最小にされる。無論、方程式（６）によれば値σ2 r は測定値ｙr を包含するので、利用者によるＳ2 B の最小化のために期待された信号の値に関する報告が行われなければならない。
【００３９】
この発明の方法の特に好ましい実施態様において、それは実質的に測定路を記載する係数の変化によって最適化されるこの値Ｓ2 B である。  
【００４０】
その場合に、特に期待すべき信号の雑音が一個又は複数個の利用者によって導入できる二次的条件を考慮して最適化されることが企図されている。上記第一最適化工程の範囲内にも使用できるこの二次的条件は、この発明の方法の好ましい構成では一個又は複数個の蛍光体の漂白用の最高限度である。進歩した漂白の場合には、雑音の一定割合が時間と無関係である間に信号が減少するから、最適化は照明期間或いは照明強度に関する状況も事情によっては行われる。他の可能な二次的条件として利点と共に、一定の特に利用者により与えられた強度の信号の雑音の最小化が利用され得る。この二次的条件は特に測定路の全雑音が検出器の暗電流と選別器雑音によって優勢にされるように期待された信号が低いときに、提供する。
【００４１】
他の可能な二次的条件として、この発明の方法の好ましい実施態様において種々の蛍光体の最高スペクトル解像が前もって記録された試験画像の一定の領域において利用され得る。これは特に、一個又は複数個の種々の蛍光体が試料の一般に特定されていない自動蛍光体の背景の前に解像されるべきである場合に、或いは利用者の一定画像領域が特別興味をもつ場合に支持し得る。
【００４２】
この発明の方法の他の有利な実施態様では、二次的条件として測定路の相対誤差の最小化を利用することが企図されている。二次的条件のこの態様は特におよそＦＲＥＴ測定におけるような関係測定が実施され得るときに、導入される。
【００４３】
特に、利用者が可能性を得る、補助的に一個又は複数個の二次的条件に対して或いはその代わりに情報を雑音の推測されたモデルに対して、例えばポイズンを基礎とする（poisonbasiert)、入力をすることができる場合に、有効である。    
【００４４】
特に好ましい方法では、この発明の方法は反復的対話式に制御された処理の範囲内で、仮最適化工程の実施後に他の情報を入力して一個又は複数個の新たな最適化工程を付加することを利用者に許容する二次的条件を定義するように実施される。  
【００４５】
この発明の方法の利点と詳細を特に好ましい方法に転換できるために、例えばレーザー走査顕微鏡のようなこの発明の装置が企図され、そのディジタルデータ処理装置は予め記載されたこの発明の最適化方法が実施できるようにプログラムされており、この発明の装置は測定路特性を自動調整する他の上記技術的手段を所持している。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
この発明の方法とこの発明のシステムの好ましい実施態様は、次に添付された図面に基づいて説明される。図１はこの発明により提案されたレーザー走査顕微鏡の概略的構成を示す。
【実施例】
【００４７】
この発明の装置の図１に示された特に好ましい実施例において、この装置はレーザー走査顕微鏡として実現されている。システムは実質的に三つの部材、即ちデータ処理装置１０、利用者インタフェース２０並びに光学／電子的構成３０から成る。データ処理装置は演算ユニット１１を包含し、この演算ユニットにおいてこの発明の最適化方法を実施するために並びに特に記録されたデータを評価するために必要な演算が実施される。更に、記憶ユニット１２を包含し、この記憶ユニットに一方では撮影されたデータが記憶される、あるいは中間記憶され得て、しかし他方ではこの発明の方法を実施するために必要なプログラム命令並びにライブラリーも記憶されていて、このライブラリーにこの発明の演算のために必要なデータが記憶されている。これらは例えば励起、蛍光体スペクトル並びに多数の蛍光体の蛍光体寿命、多数のフィルタ或いは分色器のスペクトル特性並びに種々の検出器の感度特性である。種々の光源、特にレーザーのスペクトルと電子的特徴も、データ処理装置１０の記憶ユニット１２に記憶され得る。
【００４８】
さらに、データ処理装置１０はデータインタフェース１３を包含し、このインタフェースによって記録された測定データ並びに利用者入力が利用者インタフェース２０を介してデータ処理装置１０に記憶され、装置の光学／電子的構成３０の調整可能な成分に関する制御命令並びに利用者インタフェース２０に関する情報が出力され得る。
【００４９】
データ処理装置１０の前記要素は多数の専門家に知られた方法に実現され得て特殊な各構成の技術的細部に適合され得る。
【００５０】
蛍光体試料４０を測定するために、この試料は顕微鏡対物レンズ３９の下に置かれている。利用者インタフェース２０によって利用者が種々のデータをデータ処理装置１０に入力でき、データ処理装置１０は推測された化学的蛍光体組成、予知できる強度及び／又は例えば漂白限度のような最適化二次的条件を入力する。これらの有利な条件に基づいてデータ処理装置１０の演算ユニット１１はこの発明の最適化方法によって、光学／電子的構成３０を調整すべきである値を演算する。これによって、測定路は特別の励起通路と検出通路の特殊組合せとして定義される。図１に示された実施例において励起通路は比較的簡単に実施されている。励起通路は実質的に二つのレーザー源３１ａと３１ｂからなり、レーザー源はモータ操縦可能なコリメーター３２ａ、３２ｂ、転向鏡３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、モータ操縦可能な分光輪３４ａ、走査鏡３５と走査レンズ３６を介して顕微鏡対物レンズ３９によって試料４０を照明する。波長と強度に関する励起光の特性はレーザー３１ａ、３１ｂ、コリメーター３２ａ、３２ｂ並びに分光輪３４ａの操縦によって制御導体１３１ａ、１３１ｂと１３４ａを介して調整できる。無論、他の種類及び／又は他の数の光源を使用する、或いは例えば中立単調フィルタスライダ（NeutralgrauFilterschieber)のような他の或いは別の操縦可能な成分によって励起光の特性の調整を実現することは、この発明の範囲内にある。
【００５１】
制御導体１３５を介して走査鏡３５の操縦は従来の方法で行われる。
【００５２】
図１に概略的に点線で図示されている蛍光光線は、試料４０から顕微鏡対物レンズ３９、転向鏡３３ｃ、走査レンズ３６と走査鏡３５を通してモータ操縦可能な分光輪３４ａへ走る。輪３４ａの適切な調整の場合には、蛍光光線の本質的割合は調整された分光器を通過し、その間に光線が励起波長の領域で反射される。検出通路の調整はこの分光輪３４ａの調整並びに他の分光輪３４ｂと３４ｃの調整によって行われ、分光輪３４ｂと３４ｃは制御導体１３４ｂと１３４ｃを介してこの発明の最適化方法によって求められたパラメータに一致して調整される。別の通路特定はフィルタ輪３６ａと３６ｂの調整によって行われ、フィルタ輪３６ａと３６ｂは制御導体１３６ａと１３６ｂを介してこの発明の最適化方法によって求められたパラメータによって調整される。    
【００５３】
予め選定された蛍光光線は種々の検出器３７ａ、３７ｂと３７ｃに入射し、そのデータは入力導体１３７ａ、１３７ｂと１３７ｃを介してデータ処理装置１０に記憶される。特別構成に応じてデータは既に検出器３７ａ、３７ｂと３７ｃにて或いはデータ処理装置１０のデータインタフェース１３にて初めてディジタル化される。記録されてディジタルデータ処理装置１０の記憶ユニット１２に記憶されたデータは公知のデータ評価プログラムの演算ユニット１１により評価され、この場合には特に「直線不混光」の方法は用途を見出す。
【００５４】
測定路のこの発明の調整或いは定義は、示された実施例において蛍光光線のスペクトル的分解並びに使用された測定路の数、即ち励起通路と検出通路の使用された組合せの数に関係する。この場合には、検出器の数や種類は光源の数や種類と同様に可変である。特に、図１に示されていない、検出器は使用され、例えばその検出時間、即ち検出期間及び／又は検出時点に関して算出された最適化パラメータによって操縦され得る。勿論、ＬＳＭ構成のために必要なピンホール３８ａーｃを操縦可能に構成し、その直径を最適化パラメータの列に記録することが可能でもある。
【００５５】
当然に、この発明の装置の記載され且つ図１に示された実施態様は、特に好ましい態様の単なる例示的図解を示す。けれども、この発明の範囲内で種々の変更が考慮できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】この発明により提案されたレーザー走査顕微鏡の概略的構成を示す。
【符号の説明】
【００５７】
１０．．．．．ディジタルデータ処理装置
１１．．．．．１０の演算ユニット
１２．．．．．１０の記憶ユニット
１３．．．．．１０のデータインタフェース
１２０．．．．．制御導体
１３１ａ，ｂ．．．制御導体
１３４ａ−ｃ．．．制御導体
１３５．．．．．制御導体
１３６ａ，ｂ．．．制御導体
１３７ａ−ｃ．．．制御導体
２０．．．．．利用者インタフェース
３０．．．．．光学／電子的構成
３１ａ，ｂ．．．レーザー
３２ａ，ｂ．．．コリメーター
３３ａ−ｃ．．．転向鏡
３４ａ−ｃ．．．分光車輪
３５．．．．．走査鏡
３６．．．．．走査レンズ
３７ａ−ｃ．．．検出器
３８ａ−ｃ．．．ピンホール
３９．．．．．顕微鏡対物レンズ
４０．．．．．試料
【図１】
2005526246.tif 000037
【国際調査報告】
2005526246.tif 000038
2005526246.tif 000039
2005526246.tif 000040
2005526246.tif 000041