(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明で開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの調節を行なうSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1、またはZNF216相同タンパク質を開示する。また、本発明は、代謝疾患および障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの配列の使用法に関するものである。
2005519947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異型、または当該核酸分子または当該ポリペプチドのエフェクター,例えば抗体、SRM, NPFF2, NPFF1, OX1R, OX2R, SLC25A11, PRKAR2A, PRKAR2B, Cab45, FtsJ2, AWP1, or ZNF216の核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体、またはそれによってコードされた当該ポリペプチドから成る医薬品組成物であって、望ましくは医薬用に許容できるキャリア、希釈液および(または)補助剤と共にある医薬品組成物。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫のSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216核酸である請求項1に記載の組成物、特にショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG8327、ヒトスペルミジン合成酵素(SRM; 配列識別番号1; GenBankアクセッション番号NM_003132)、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG10823、ヒト神経ペプチドFF2(NPFF2; 配列識別番号4;  GenBankアクセッション番号NM_053036)、ヒト神経ペプチドFF 1(NPFF1; 配列識別番号6; GenBankアクセッション番号NM_022146)、ヒトオレキシン受容体1(OX1R; 配列識別番号8; GenBankアクセッション番号NM_001525)、ヒトオレキシン受容体2(OX2R; 配列識別番号10; GenBankアクセッション番号NM_001526)、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG18418、ヒト溶質キャリアファミリー25(ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(SLC25A11; 配列識別番号12; GenBankアクセッション番号NM_003562)、ショウジョウバエPka-R2(Gadflyアクセッション番号CG15862)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(PRKAR2A; 配列識別番号14; GenBankアクセッション番号NM_004157)、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (PRKAR2B; 配列識別番号16; GenBankアクセッション番号NM_002736)、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG31475、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質varaint1または2(Cab45; 配列識別番号18および20; GenBankアクセッション番号SNM_016176およびNM_016547)、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG11447、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (FtsJ2; 配列識別番号22; GenBankアクセッション番号NM_013393)、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG16751、ヒトタンパク質に関連するPKR1(AWP1; 配列識別番号24; GenBankアクセッション番号NM_019006)、および(または)ヒト亜鉛フィンガータンパク質216 (ZNF216; 配列識別番号26; GenBankアクセッション番号NM_006007)、または断片そのまたはその変異型、および(または)それに対して相補的な配列をコードする請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
当該核酸分子が下記の場合の請求項1または2に記載の組成物。
(a)  50℃にて、1x SSCおよび0.1％のSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を含んだ溶液中において、請求項2で定義した核酸分子またはそれに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする場合;
(b)  核酸分子(a)に対して縮重する場合、
(c)  請求項2において定義したように、ヒトスペルミジン合成酵素(SRM; 配列識別番号2; GenBankアクセッション番号NP_003123)、ヒト神経ペプチドFF2(NPFF2; 配列識別番号5; GenBankアクセッション番号NP_444264)、ヒト神経ペプチドFF 1(NPFF1; 配列識別番号7; GenBankアクセッション番号NP_071429)、ヒトオレキシン受容体1(OX1R; 配列識別番号9; GenBankアクセッション番号NP_001516)、ヒトオレキシン受容体2(OX2R; 配列識別番号11; GenBankアクセッション番号NP_001517)、ヒト溶質キャリアファミリー25(ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(SLC25A11; 配列識別番号13; GenBankアクセッション番号NP_003553)、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(PRKAR2A; 配列識別番号15; GenBankアクセッション番号NP_004148)、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (PRKAR2B; 配列識別番号17; GenBankアクセッション番号NP_002727)、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1または2(Cab45; 配列識別番号19および21; GenBankアクセッション番号SNP_057260およびNP_057631)、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (FtsJ2; 配列識別番号23; GenBankアクセッション番号NP_037525)、ヒトタンパク質に関連するPKR1(AWP1; 配列識別番号25; GenBankアクセッション番号NP_061879)、および(または)ヒト亜鉛フィンガータンパク質216 (ZNF216; 配列識別番号27; GenBankアクセッション番号NP_005998)に対して少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で 99,6％の同一性を持つポリペプチドをコードする場合:
(d) (a)〜(c)の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような突然変異による核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がDNA分子、特にcDNAまたはゲノムDNAである請求項1〜3の任意の1項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドをコードし、エネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝の調節に寄与する請求項1〜4の任意の1項の組成物。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項1〜6の任意の1項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項1〜5の任意の1項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項8の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項1〜7に記載の任意の1項の組成物。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項1〜10の任意の1項の組成物。
【請求項１３】
肥満症およびその他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害、および他の細胞内、細胞塊、器官臓器および(または)被検体における障害の治療、軽減および(または)予防のための、検出および(または)検証用の薬剤製造のための、請求項1〜12の任意の一項に記載の組成物。
【請求項１４】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドによって影響および(または)修飾された遺伝子および(または)遺伝子産物の機能 を管理するための、SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216遺伝子ファミリーまたはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたはRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するエフェクター、例えば抗体、アプタマーまたは別の受容体、またはそれによってコードされたポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１５】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1、またはZNF216遺伝子ファミリー、またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片、または当該核酸分子の変異型、または当該ポリペプチド、またはSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216遺伝子ファミリーの核酸分子を認識するエフェクター、例えば抗体、アプタマーまたは別の受容体、またはSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するそれによってコードされたポリペプチドの核酸分子の使用法。
【請求項１６】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項１７】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドの発現が増加および(または)低下された請求項16に記載の動物。
【請求項１８】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドの修飾発現を示す組換え(型)の宿主細胞。
【請求項１９】
ヒト細胞である請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および(または)中性脂肪の代謝に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである。
(a)  当該(ポリ)ペプチド結合を可能にする条件下のSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドまたは断片を有する(ポリ)ペプチドのコレクションに接触するステップ;
(b)  結合しない(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c)  当該SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドに結合する(ポリ)ペプチドを同定するステップ。
【請求項２１】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドの結合標的/薬剤との相互作用を調節する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  ASRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチド、またはその断片;
(ab)  当該SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドまたはその断片の結合標的/薬剤; および
(ac)  当該SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216ポリペプチドまたはその断片が基準親和性で当該結合標的/薬剤に特異的に結合する条件下の候補薬剤:
(b)  (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216ポリペプチドまたはその断片の当該結合標的に対する結合親和性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ。
【請求項２２】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドの活性を調節する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a)  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa)  SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216相同性ポリペプチドまたはその断片; および
(ab)  当該SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216ポリペプチドまたはその断片が基準活性示す条件下にある候補薬剤;
(b)  (候補)薬剤偏向活性を決定するため、当該結合標的に対する当該ポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップ; および
(c)  (候補)薬剤偏向活性と基準活性間との差異を確定するステップ。
【請求項２３】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および(または)アジュバントを有する請求項20または22に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21の方法によって同定された薬剤を含む組成物を作り出す方法。
【請求項２４】
当該組成物が、肥満症および他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害、および他の疾患および障害を防止、軽減または治療するための医薬品組成物である請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
肥満症および他の体重調節障害のような代謝疾患を始めとする疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症のような関連障害、および他の疾患および障害の治療、軽減および(または)予防のための医薬品組成物の調製のための請求項20に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項21または22に記載の方法によって同定された薬剤の使用法。
【請求項２６】
SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1、またはZNF216遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物を生成するためのSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216ファミリー、またはその断片の核酸分子の使用法。
【請求項２７】
少なくとも下記の1つを備えたキット。
(a)  ASRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216 核酸分子またはその断片;
(b)  (a)の核酸をから成るベクター;
(c)  (a)の核酸または(b)のベクターから成る宿主細胞;
(d)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(e)  (a)の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(f)  (a)の核酸または(d)または(e)のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2 (cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475 (Gadflyアクセッション番号SCG14281およびCG3768とも参照される)、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751(Gadflyアクセッション番号SCG16750とも参照される)相同タンパク質、およびそれによってコードされたポリペプチドをコードする核酸配列の使用法に関するものであり、さらに、体重調節、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患、同様に、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害に関連する疾患および障害の診断、研究、予防、および治療におけるその使用またはそのエフェクター分子に関するものでもある。
【０００２】
エネルギー消費量に対比して摂取熱量がアンバランスというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝のさまざまな代謝疾患、例えば肥満症や体重の激減が存在する。肥満症は世界に最も蔓延している代謝障害の1つである。この肥満症は、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であり、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満症は体脂肪過多として特定され、多くの場合、著しい健康障害を招く。高血圧、中性脂肪高値および空腹時血糖高値、同様に、低HDLコレステロール値のような心血管系危険因子は、多くの場合肥満と関連する。この典型的な一群の症状は「代謝症候群」として一般に定義されている(Reaven、2002、Circulation106(3): 286-8 レビュー済)。高脂血症および遊離脂肪酸の上昇は、肥満症、インスリン耐性を始めとするさまざまな疾患間の連鎖として定義される「代謝症候群」と明確に相関する。これは多くの場合、同一患者において生じ、そして2型糖尿病および心疾患の発生の主要な危険因子である。脂質値および血糖値のコントロールが、2型糖尿病、心臓病、およびその他の代謝症候群を治療するために必要であることが示されている(例えば、Santomauro A. T. らの(1999)Diabetes、48(9):1836-1841を参照)。代謝症候群は多くの場合、2型糖尿病および心疾患の発生に先行する(McCook、2002、JAMA288:2709-2716)。
【０００３】
ヒト肥満は、環境的要因および遺伝的要因によって強く影響を受けるので、環境的な影響が多くの場合(ヒト)肥満症の遺伝子を同定する上の障害物となっている。肥満症は、遺伝的要因、代謝要因、生化学的要因、心理学的要因、および行動的要因によって影響を受ける。このような事情から、肥満症は、好ましく持続可能な臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。
【０００４】
肥満症は単一障害と考慮されるべきでなく、潜在的に複数の原因をともなう異種の条件群から成る障害と考慮されるべきである。また、肥満症は、空腹時血漿インスリンの上昇およびグルコースの経口摂取に対する過度なインスリン反応を特徴とし(Kolter mann、J. Clin. Invest 65、1980、1272〜1284)、2型真性糖尿病における明らかな肥満症の関与が確認されている(Kopelman、Nature 404、2000、635〜643)。
【０００５】
他のホルモンの中でも、インスリンは特に燃料代謝の調節において重要な役割を演ずる。高血糖値は、すい臓β細胞によるインスリン分泌を促がす。インスリンはグリコーゲンおよび中性脂肪の貯蔵およびタンパク質の合成につながる。グルコースの筋肉および脂肪細胞への流入はインスリンによって促進される。真性糖尿病に苦しむ患者では、すい臓の膵島細胞によって産生されるインスリン量が少なすぎるか(糖尿病1型またはインスリン依存型真性糖尿病IDDM)、あるいは肝臓および筋細胞の正常な血中インスリン値に応答する能力が失われている(インスリン耐性)かのいずれかである。次の段階では、すい臓細胞が十分な量のインスリンを作り出すことができなくなる(糖尿病2型または非インスリン依存型真性糖尿病 NIDDM)。
【０００６】
たとえ、レプチン、VCPI、VCPL、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重/重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子についての記述がいくつかあるとしても、肥満調節または体重/重量調節に影響を及ぼす特有の分子機構および(または)分子は知られていない。
【０００７】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および(または)エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす(病理学的な)代謝条件の調節のための手段と方法を提供することにあった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴付けられた実施例を提供することによって達成する。
【０００８】
従って、本発明は、体重調節における新規機能を有する遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症の調節、ひいては、それらに関連する代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような障害の調節に関与する特異的な遺伝子を開示する。本発明では、ショウジョウバエGadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751遺伝子のヒトホモログを、上述したそれら状態に関与するものとして記述する。
【０００９】
ポリアミン(プトレシン、スペルミジン、およびスペルミン)は、RNA、DNA、ヌクレオチドイノシトール三リン酸、タンパク質、およびその他の酸性物質の機能を調節することができる(Igarashi K.およびKashiwagi K.、2000、Biochem Biophys Res Commun271(3):559-564)。ポリアミンは、ウシ腎臓および異なるラット組織から取り出したグリコーゲン合成酵素(カゼイン)キナーゼ1の活性を促がす(Singh T.J.、1988、Arch Biochem Biophys 267(1):167-175)。細胞機能にとって普遍的に必須であるポリアミンの生合成は、アルギニンおよびメチオニンから行われ、そして4 固有酵素: スペルミジン合成酵素、オルニチンデカルボキシラーゼ、S-アデノシル-L-メチオニンデカルボキシラーゼ、およびスペルミン合成酵素を関与する(Janne J. らの、1991、AnnMeD23(3):241-259)。 WahlforSらの(1990、DNA Cell Biol. 9:103-110)クローニングするcDNAコードfor 完全長サブユニットof ヒトスペルミジン合成酵素.Myohanenら(1991、DNA Cell Biol. 10(6):467-474)はゲノムライブラリからの遺伝子を分離し、それを染色体1にマッピングした。遺伝子導入マウスラインは、ヒトスペルミジン合成酵素遺伝子を過剰発現する。スペルミジン合成酵素の高活性は、組織のプトレシン、スペルミジンまたはスペルミンのレベルに影響がない(KauppinenL.らの、1993、Biochem J 293 (Pt2):513-516)。
【００１０】
神経ペプチドFF (NPFF)は、複数機能を有する哺乳動物の神経ペプチドである。NPFFには、記憶および自律神経調節への影響がある可能性があり、また、神経内分泌調節の視床下部・下垂体経路に関与する可能性もある。NPFF受容体は、Gタンパク質と共役していると思われる(PanulAP. らの、1996、Prog Neurobiol 48(4-5):461-487)。神経ペプチドFF受容体は、心血管制御を調節するため、メラノコルチンのための受容体である可能性がある(Versteeg D.H. らの、1998、Eur J Pharmacol 360(1):1-14)。神経ペプチドFF (NPFF)は痛覚調節およびオピオイド耐性に関与する。このペプチドはGタンパク質共役受容体(GPCR)を介して作用する。NPFFは神経伝達物質システムの一部であり、そして神経ペプチドAFと共に痛覚調節およびオピオイド耐性に関与する(Kotani、M. らの、2001、Br J Pharmacol 133(1):138-144)。抗アヘン神経ペプチドFFとAF (NPFFとNPAF)は、オピオイド耐性のみならず痛覚調節にも関与し、そして本プロセスにおいて不可欠な役割を演じ得る。神経ペプチドFF受容体は、アヘン活性に関連する脳領域、および脂肪組織において発現される(Elshourbagy N.A.、2000、J Biol Chem 275(34):25965-25971)。
【００１１】
ミトコンドリア内のエネルギー伝達には、この原核細胞小器官の内膜全域にわたる多くの特異的な代謝物の輸送を必要とする。ミトコンドリアのキャリアファミリー(MCF)は少なくとも37タンパク質から成る(KuanJ.およびSaier M.H.、1993、Crit Rev Biochem Mol Biol 28(3):209-233)。ADP/ATP、ミトコンドリア内膜に見出されるリン酸とオキシグルタミン酸/リンゴ酸のキャリアタンパク質、および哺乳動物の茶色脂肪組織内のミトコンドリアから取り出した脱共役タンパク質は、同一のタンパク質スーパーファミリーに属する(Walker JE、Runswick MJ.、1993、J Bioener g BiomembR25(5):435-446)。ヒト2オキシグルタミン酸キャリアの過剰発現が、HEK-293細胞におけるミトコンドリアの膜電位を低下し、2-オキシグルタミン酸キャリアの脱共役活性をシグナル伝達することが明らかにされている(Yu X.X. らの、2001、Biochem J 353(Pt2):369-375)。ピリドキサール5'-リン酸および他のいくつかのリジン試薬は、精製、再構成されたミトコンドリアのオキシグルタミン酸輸送タンパク質を不活化する。他のミトコンドリアのキャリアタンパク質のグルタラートおよび基質は、キャリアを保護することが不可能であった。ピリドキサール5'-リン酸は、基質転移にとって必須である部位(すなわち、リジン残基および(または)アミノ末端グリシン残基)でオキシグルタミン酸キャリアと相互作用し、そして基質結合部位か、またはその近くに局在し得る(Natuzzi D. らの、1999、J Bioenerg BiomembR31(6):535-541)。
【００１２】
ショウジョウバエPka-R2は、日周期およびタンパク質アミノ酸のリン酸化に関与するcAMP依存型タンパク質キナーゼ制御因子タンパク質に対してコードする。2種類のcAMP依存型タンパク質キナーゼ(PKA)、すなわち1型および2型はショウジョウバエの頭に存在しており、また、2型のPKAが主要なアイソザイムであることがわかっている。2型PKA(RII)の調節サブユニットは、ショウジョウバエの脳、あるいはヒトの脳におけるニューロン活性の調節において重要な役割を果たす(Inoue H.およびYoshiokAT.、1997、Biochem Biophys Res Commun 235(1):223-226)。
【００１３】
cAMP依存型タンパク質キナーゼ(PKA)は、第2メッセンジャーcAMPのシグナル伝達経路における必須酵素である。標的タンパク質のリン酸化を介して、PKAは、代謝調節、イオン移動、および遺伝子転写を始めとした細胞における多くの生化学的事象を制御する。PKAホロ酵素は、2調節サブユニットと2触媒サブユニットから成る四量体であって、cAMPの不在の場合には不活性となる。活性化は、2cAMP分子が、各調節サブユニットに結合して活性触媒サブユニットを放出する可逆的な構造変化を誘発するときに起こる。4つの固有調節サブユニット、RIα、RIβ、RIIα、およびRIIβが確認されている。固有の組織特異性の発現パターンを持つアイソフォームがそれぞれに4つ発見されている。それぞれ別個の遺伝子によってコードされた4調節サブユニットの進化と保存は、核における学習機能と遺伝子転写機能を始めとする中間代謝とニューロン機能の調節のような多種多様な機能を達成するために必要であったかも知れない。
【００１４】
白色脂肪細胞および茶色脂肪細胞における脂肪分解の主要な制御因子はcAMPであり、そしてcAMP作用はタンパク質キナーゼ(PKA)によって媒介される。RIIβ、R1α、Cα、およびCβ1を始めとする複数のPKAサブユニットは脂肪細胞において発現されるが、主要なホロ酵素は、RIIβおよびCαを含む通常の条件下で構築される。マウスにおけるRIIβ遺伝子の標的破壊により、白色および茶色の両脂肪細胞が、RIαのレベルを増加することによって補償能力を有することが明らかにされた。いずれにせよ、脂肪のない表現型を示すマウスは、茶色脂肪における脱共役タンパク質の活性化と誘発に起因する高い代謝率、および食物由来肥満症に対する耐性とインスリン耐性を持つ(McKnight G.S., 1998, Recent Prog Horm Res 53:139-159)。
【００１５】
CRECファミリーは、複数のEFハンド、低親和性Ca(2+)結合タンパク質のファミリーであり、哺乳動物細胞の分泌経路に局在する、本発明のタンパク質、Cab45を始めとするさまざまなタンパク質から成る。類似のタンパク質は、かなり多様な無脊椎動物個体において見出される。本タンパク質はCa(2+)調節活性に関与し得る。いくつかのCRECファミリーメンバーは、悪性細胞形質転換、ヘビ毒の毒素の毒性効果媒介およびアミロイド形成における推定関与のような病理活動に関与する(Honore B.およびVorum H.、2000、FEBS Lett 466(1):11-18)。Cab45は、偏在的に発現され、NH2末端シグナル配列を含むが、膜アンカー配列は含まず、そして6EFハンドモチーフの存在に起因してCa2+を結合する。カルシウム結合タンパク質のスーパーファミリー内では、それは、最近になって同定された、レティキュロカルビンとERC55(共にEFハンドモチーフ外側でCab45と有意な配列相同性を共有する)から成るタンパク質群に属する。Cab45はゴルジ内腔に常在する可溶タンパク質である(Scherer P.E., 1996, J Cell Biol 133(2):257-268)。
【００１６】
リボソームRNAは、メチル化を始めとするさまざまなヌクレオチド修飾を受ける。FtsJは23 S-rRNAの大腸菌メチルトランスフェラーゼである。メチル化されたヌクレオチドは2'-O-メチルウリジン2552である(CaldaST. らの、2000、J Biol Chem 275(22):16414-16419)。細胞分裂タンパク質FtsJは、細菌からヒトに至るまでよく保存される(Bugl H. らの、2000、Mol細胞6(2):349-360)。真核生物における細胞RNAは大規模な転写後修飾を受ける。ヒト遺伝子をコードするRNAメチルトランスファーゼであるFTSJ2(FtsJ相同体2)は、進化的に保存されたS-アデノシルメチオニン結合タンパク質ファミリーに属する。FTSJ2転写物は、ガン細胞はもとより、骨格筋、胎盤、および心臓にも豊富に存在する。FTSJ2は、原核RNA処理および修飾に関与する核小体RNAメチルトランスフェラーゼである(Ching Y.P. らの、2002、Genomics 79(1):2-6)。
【００１７】
AWP1は、生体内セリン/トレオニンキナーゼPRK1と関係する偏在的に発現されるタンパク質(Duan W. らの、2000、Gene 256(1-2):113-121)。Awp1遺伝子スイッチは、ヒトおよびマウス初期発生中にオンになります。AWP1は、そのアミノ末端領域にて保存zf-A20亜鉛フィンガードメインを、そしてカルボキシル末端にてAzf-AN1亜鉛フィンガードメインをそれぞれ有する。AWP1は、哺乳動物のシグナル伝達経路において調節の役割を果たす。PRK1は、RhoAによって活性化されることが明らかにされているセリン/トレオニンキナーゼである(Amano M. らの、1996、Science 271、648-650)。セリン/トレオニンキナーゼPrk1pは、酵母菌におけるアクチン細胞骨格構造を調節する因子である(Zeng GおよびCai M.、1999、J Cell Biol 144(1):71-82)。
【００１８】
これまでは、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751にコードされたタンパク質および近縁のタンパク質、特にヒトタンパク質スペルミジン合成酵素(SRM)、神経ペプチドFF2 (NPFF2; 神経ペプチドGタンパク質共役受容体とも呼ばれる; Gタンパク質共役受容体74; GPR74)、神経ペプチドFF 1(NPFF1; RFアミド関連ペプチド受容体とも呼ばれる)、オレキシン受容体1(OX1R)、オレキシン受容体2(OX2R)、溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(SLC25A11)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節、2型、α(PRKAR2A)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節、2型、β (PRKAR2B)、カルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質(Cab45; 間質細胞由来の因子4とも呼ばれる)、細胞分裂タンパク質FtsJ (FtsJ2)、タンパク質関連PKR1(AWP1)、および(または)亜鉛フィンガータンパク質216 (ZNF216)が、エネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与することが言われてきたので、上述の代謝疾患および他の疾患における機能は論考されていない。
【００１９】
本発明では、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751の正しい遺伝子量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子スクリーニングを用いて、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同遺伝子の突然変異が、主要なエネルギー貯蔵物質である中性脂肪含有量の著しい増加が反映される肥満症の原因となることを同定した。
【００２０】
Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751に対して相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上記の疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに、上記のような疾患および障害の診断、治療、および予後に有用である新規組成物を提供する。
【００２１】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、説明した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬によって本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載する方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料はここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００２２】
本発明では、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同タンパク質がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪の代謝および貯蔵、および本発明で開示したタンパク質を同定しコードするポリヌクレオチドを調節することを開示する。また、本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作り出すためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関連するものである。また、本発明は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患などの疾患および障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の診断、研究、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法に関するものである。
【００２３】
用語「GenBankアクセッション番号に示されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド」とは、対応するGenBankアクセッション番号下に保管されるヌクレオチド配列の発現可能な遺伝子に関するものである。用語「GenBankアクセッション番号」とは、NCBI GenBankデータベースエントリに関するものである(Bensonらの(2000) Nucleic Acids Res.28: 15-18を参照)。
【００２４】
よって、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同タンパク質および核酸分子コーディングは以上の点から、昆虫または脊椎動物種、例えば哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同核酸、特にヒトスペルミジン合成酵素(SRM)、神経ペプチドFF2(NPFF2)、神経ペプチドFF 1 (NPFF1)、オレキシン受容体1 (OX1R)、オレキシン受容体2 (OX2R)、溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)のメンバー11(SLC25A11)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(PRKAR2A)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (PRKAR2B)、カルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質(Cab45)、細胞分裂タンパク質FtsJ (FtsJ2)、PKR1(AWP1)に関連するタンパク質、または亜鉛フィンガータンパク質216 (ZNF216)をコードする核酸である。
【００２５】
本発明は特に、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝の調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、そして当該核酸分子は下記より成るものとする。
(a)   下記のヌクレオチド配列、または下記をコードするヌクレオチド配列: (i) Gadflyアクセッション番号CG8327、ヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号1; GenBankアクセッション番号NM_003132)、(ii) Gadflyアクセッション番号CG10823、神経ペプチドFF2(配列識別番号4; GenBankアクセッション番号NM_053036)、神経ペプチドFF 1(配列識別番号6; GenBankアクセッション番号NM_022146)、オレキシン受容体1(配列識別番号8; GenBankアクセッション番号NM_001525)、オレキシン受容体2(配列識別番号10; GenBankアクセッション番号NM_001526)、(iii) Gadflyアクセッション番号CG18418、溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号12; GenBankアクセッション番号NM_003562)、(iv) Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号14; GenBankアクセッション番号NM_004157)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号16; GenBankアクセッション番号NM_002736; 旧番号GenBankアクセッション番号XM_004959)、(v) Gadflyアクセッション番号CG31475、カルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1または変異型2(配列識別番号s: 18および20; GenBankアクセッション番号SNM_016176およびNM_016547)、(vi) Gadflyアクセッション番号CG11447、細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号22; GenBankアクセッション番号NM_013393)、(vii) Gadflyアクセッション番号CG16751、PKR1(配列識別番号24; GenBankアクセッション番号NM_019006; 旧番号GenBankアクセッション番号XM_044547)に関連するタンパク質、および(または)亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号26; GenBankアクセッション番号NM_006007)、および(または)それに対して相補的な配列,
(b)  50℃にて、1 x SSCおよび0.1％のSDSを含んだ溶液中で(a)の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
(c)  遺伝暗号の変性内における(a)または(b)の配列に対応する配列、
(d)  Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751のアミノ酸配列に対して少なくとも85％、望ましくは少なくとも90％、より望ましくは少なくとも95％、より望ましくは少なくとも98％および最大で 99,6％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列,
(e)  Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同タンパク質、望ましくはヒトGadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同タンパク質、特にヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号2; GenBankアクセッション番号NP_003123)、神経ペプチドFF2(配列識別番号5; GenBankアクセッション番号NP_444264)、神経ペプチドFF 1(配列識別番号7; GenBankアクセッション番号NP_071429)、オレキシン受容体1(配列識別番号9; GenBankアクセッション番号NP_001516)、オレキシン受容体2(配列識別番号11; GenBankアクセッション番号NP_001517)、溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号13; GenBankアクセッション番号NP_003553)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号15; GenBankアクセッション番号NP_004148)、タンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号17; GenBankアクセッション番号NP_002727)、カルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1または変異型2(配列識別番号s: 19および21; GenBankアクセッション番号SNP_057260およびNP_057631)、細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号23; GenBankアクセッション番号NP_037525)、タンパク質に関連するPKR1(配列識別番号25; GenBankアクセッション番号NP_061879)、および(または)亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号27; GenBankアクセッション番号NP_005998)をコードする配列、
(f)  突然変異によって(a)〜(d)の核酸分子と異なる配列であり、コードされたポリペプチドにおいて当該突然変異が改変、削除、複製および(または)早期停止を引き起こす配列、または
(g)  少なくとも15塩基、望ましくは少なくとも20塩基、より望ましくは少なくとも25塩基および最も望ましくは少なくとも50塩基の長さを有する(a)〜(e)のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２６】
本発明は、Gadflyアクセッション番号CG8327、Gadflyアクセッション番号CG10823、Gadflyアクセッション番号CG18418、Pka-R2(cAMP依存型タンパク質キナーゼR2; Gadflyアクセッション番号CG15862)、Gadflyアクセッション番号CG31475、Gadflyアクセッション番号CG11447、および(または) Gadflyアクセッション番号CG16751相同タンパク質(本明細書中ではSRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216,またはaS本発明のタンパク質と呼ぶ)、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが、中性脂肪貯蔵の調節に関与し、よって、エネルギー恒常性にも関与するという知見に基づくものである。本発明では、肥満症のような代謝疾患、同様に、代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および(または)胆石症のような関連障害を始めとする疾患および障害とその関連の診断、研究、予防、または治療のためのこれらポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびそのエフェクターの使用法を記載する。
【００２７】
従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症、当該遺伝子の断片、当該遺伝子またはその断片によってコードされたポリペプチドコード、および当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するエフェクター、例えばアンチセンス分子、RNAi分子またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは低分子量有機化合物のような抗体、生物学的に活性な核酸において新規機能を有する遺伝子に関するものである。
【００２８】
キイロショウジョウバエのようなモデル個体のゲノムを操作およびスクリーニングする能力は、遺伝子、細胞プロセス、および経路の有意な進化的保存に起因する、より複雑な脊椎動物個体に対する直接的な関連性を有する生物学的および生化学的プロセスを分析するための強力なツールを提供する(例えば、Adams M. D. らの、(2000) Science 287:2185-2195を参照)。モデル個体における新規遺伝子機能の同定は、哺乳動物(ヒト)における反応経路の解明およびそれらの調節方法の解明に直接的に貢献する。病理モデル(例: 肥満症を始めとする代謝症候群の徴候としての中性脂肪値の変化)とハエ遺伝子の修飾発現との関係によって、ヒトの相同分子種の特定のヒト疾病との関連を同定することができる。
【００２９】
一実施例では、フォーワード遺伝子スクリーニングを、既知の遺伝子の異所性発現に起因する変異表現型を示すハエにおいて実施する(Johnston Nat Rev Genet 3: 176-188 (2002); Rorth P.、(1996) Proc Natl Acad Sci U SA 93: 12418-12422を参照)。中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー貯蔵場所である。肥満した人々は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。本発明において、発明者らは、遺伝子スクリーニングを用いて、中性脂肪値の著しい変化が反映される体重の変化の原因となる、本発明のタンパク質および相同遺伝子をコードする遺伝子の突然変異を同定した。エネルギー恒常性において機能をともなう遺伝子を分離するために、数千の専売的および公的に提供されているEPラインの中性脂肪含有量を長期にわたる摂食期間後に検査した(詳細は実施例を参照)。さらなる分析のための好ましい候補として、中性脂肪含有量が顕著に変化したラインを選択した。遺伝子機能の損失に起因する中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪として貯蔵されたエネルギー量を制御する用量依存的な態様で、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００３０】
エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において新規機能をともなう遺伝子を発見するため、モデル生物体キイロショウジョウバエ(Meigen)を用いて機能的な遺伝子スクリーニングを実施した。スクリーニングのためのリソースは、専売のキイロショウジョウバエEPラインの在庫コレクションであった。加えて、公的に提供されているEPコレクションをスクリーニングした。両コレクションのPベクターは、UAS部位へのGal4の結合時に、隣接するゲノムショウジョウバエ配列に転写できる基底プロモーターに融合したGal4-UAS結合部位を有する。これによって、EPラインのコレクションの内因性側方遺伝子配列の過剰発現が可能となる。加えて、UAS部位の活性化なしに、EPエレメントの遺伝子への統合は、遺伝子活性の低下を引き起こす可能性があるので、機能喪失の表現型を評価することによって、その機能を確定することができる。
【００３１】
一実施例では、ショウジョウバエラインEP(3)3054、HD-EP(3)31068、HD-EP(3)31149、EP(3)3322、EP(2)2162、EP(3)0650、HD-EP(3)31393、およびHD-EP(3)32007のベクター統合にホモ接合のハエを、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイにおいて分析し、その詳細を本発明の実施例セクションに図解した。中性脂肪含有量の分析結果を図1、5、9、13、17、21、25に示す。
【００３２】
遺伝子機能の損失に起因する中性脂肪含有量の増加は、中性脂肪として貯蔵されたエネルギー量を制御する用量依存的な態様で、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００３３】
本発明のタンパク質をコードする核酸をプラスミド救出技術を用いて同定した。ベクター(本明細書中ではEP(3)3054、HD-EP(3)31068、HD-EP(3)31149、EP(3)3322、EP(2)2162、EP(3)0650、HD-EP(3)31393、およびHD-EP(3)32007)統合に局在して近接するゲノムDNA配列を分離した。それら分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly; FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27:85-88も参照)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってベクター統合部位、および実施例の項においてより詳細に記載した対応遺伝子を同定した。遺伝子の分子構造図を2、6、10、14、18、22、26に示す。それらによってコードされた中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し(より詳細は実施例を参照)、そして哺乳動物の相同体を同定した(図3、7、11、15、19、23、および27)。異なる種類(ヒト、マウスおよびショウジョウバエ)のタンパク質間の比較(Clustal分析)を行った(図3、7、11、15、19、23、27を参照)。相同性に基づくと、本発明のショウジョウバエタンパク質および各相同タンパク質またはペプチドは、少なくともある程度の活性を共有する。本発明の遺伝子に関し、体重制御の調節および肥満症のような関連代謝疾患を記載した機能的データは、従来の技術では提供されていない。
【００３４】
エネルギー恒常性における哺乳動物相同体の機能(作用)を、異なる組織における転写物の発現を分析することによって、そして脂肪細胞分化における役割を分析することによって、本発明においてさらに確証した(図4、8、12、16、20、および24を参照)。発現プロファイル実験(詳細は実施例を参照)により、本発明タンパク質の特定の関連性が哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認される。さらに、本発明者らは、本発明のタンパク質が、絶食または遺伝的に誘発された肥満によって調節されることを明らかにする。本発明では、本発明のタンパク質の発現を研究するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病のマウスモデルを使用した(例えば、ob (レプチン)マウスまたはdb (レプチン受容体)マウス)。そのような糖尿病の典型的な症状を呈するマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして多くの場合、増大した血漿脂質値を有する(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。加えて、本発明では、本発明のタンパク質のmRNAが脂肪細胞の試験管内分化中に制御され(詳細は実施例を参照)、脂肪細胞脂質蓄積の修飾因子としての役割を示唆することを証明する。従って、本発明者らは、本発明のタンパク質(またはその変異体)が成熟脂肪細胞の代謝における機能(作用)を有することを結論する。
【００３５】
さらに本発明では、SRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1、ZNF216、および相同タンパク質のアミノ酸配列から成るポリペプチドを記述する。相同性に基づいて、本発明のタンパク質および各相同タンパク質またはペプチドは、少なくともある程度の活性を共有する。本発明の遺伝子に関し、体重制御の調節および肥満症のような関連代謝疾患を記載した機能的データは、従来の技術では提供されていない。
【００３６】
また、本発明には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含される。従って、本発明のタンパク質のアミノ酸配列または相同タンパク質をコードする任意の核酸配列を用いて、本発明または相同タンパク質のタンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列(一部は任意の既知の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する)を作り出すことが可能である。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって作り得る、ありとあらゆる種類のあるヌクレオチド配列変異体を網羅し得る。
【００３７】
また、本発明に包含されるのは、請求項に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力のあるポリヌクレオチド配列、そして特に、種々のストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl、G. M.およびS.L. Berger (1987:Methods Enzymol. 152:399-407)およびKimmel、A. R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度(Tm)に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、1時間 1 x SSCおよび0.1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を用いて50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて、特に1時間 0.2 x SSCおよび0.1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中で50℃にて、望ましくは55℃にて、より望ましくは62℃にて、および最も望ましくは68℃にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含される本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする変性核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または置換が含まれており、同一または機能的に等価なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００３８】
コードされたタンパク質には、サイレント変化を作り出し、機能的に等価なタンパク質を結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入、または置換も含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、タンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および(または)両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。さらには、本発明は、タンパク質のペプチド断片または、少なくとも4、望ましくは少なくとも6および最大で50長のアミノ酸を有する環状ペプチド、レトロ(retro-inverso)ペプチドまたはペプチド擬態のような該ペプチドの誘導体に関するものである。
【００３９】
また、本発明の範囲内に含まれているものには、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子もある。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも1つの突然変異から生じ得る、遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、構造または機能を改変し得るかどうかわからない変性mRNAまたはポリペプチドを結果としてもたらし得る。任意の遺伝子には、ゼロ、単一、または多くの対立遺伝子形態が含まれ得る。対立遺伝子を誘発する一般の突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加、または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で1回以上生じ得る。
【００４０】
本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用可能な方法の１つである「制限部位PCR法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である(Sarkar、G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。逆PCR法も、既知の領域に基づいた分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために使用することが可能である(Triglia、T. らのNucleic Acids Res. 16:8186)。また、別の使用可能な方法としては、ヒトおよび酵母菌の人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅を伴うキャプチャPCR法があげられる(Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker 、J. D.らの方法が挙げられる(1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR法、ネステッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリを用いて、ゲノムDNAの中に入ることができる(Clontech社, Palo Alto, Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００４１】
生物学的に活性なタンパク質を発現するために、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列または機能的等価物を好適な発現ベクター、すなわち、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、タンパク質をコードする配列、好適な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、試験管内組換えDNA技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。その技術は、Sambrook, J.らの(1989)Molecular Cloning、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、およびAusubel, F. M.らの(1989)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons, New York, N.Y.に記載されている。
【００４２】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列を保持および発現することができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV)または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」とは、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する5'および3'の非翻訳領域のことである。このような要素の強度および特異性は様々である。利用したベクターシステムおよび宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターなどの幾つかの適切な転写および翻訳要素を使用することが可能である。
【００４３】
本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのプライマー、プローブ、または部分または断片を用いて、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリッド形成法、および(または)増幅によって検出することが可能である。核酸増幅試験法には、タンパク質をコードするDNAまたはRNAを含んだ形質転換体を検出するために、本発明のタンパク質および核酸に特異的な配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本詳細書で使用した「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約10のヌクレオチド、そして約60もの数のヌクレオチド、望ましくは約15〜30ヌクレオチド、およびより望ましくは約20〜25のヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプライマーとして使用することが可能である。
【００４４】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質の発現を検出かつ測定するための種々のプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、および蛍光細胞分析分離装置(FACS)が含まれる。タンパク質上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫測定法は好適ではあるが、競合結合実験を使用することも可能である。これらを含めた他のアッセイは、Hampton、R.らの(ミネソタ州セントポール市、1990; Ser ological Methods, Laboratory Manual, APS Press)およびMaddox、D. E.らの(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)の諸所に記載されている。
【００４５】
多岐にわたる標識技術および抱合技術が当業者には周知であり、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプローブを作り出す方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。
【００４６】
あるいは、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列、またはその任意の一部分をmRNAプローブを産生するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において周知であり、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、試験管内でRNAプローブの合成に用いてもよい。このような手順は、市販されている種々のキット(ミシガン州カラマズーのPharmacia & Upjohn社、Promega社(ウィスコンシン州マディソン)、およびU.S. Biochemical Corp社(オハイオ州クリーブランド))を用いて実行することが可能である。
【００４７】
また、使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００４８】
本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって作り出されたタンパク質は、使用する配列および(または)ベクターによるが、分泌または細胞内含有させることが可能である。タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。他の組換え構造を用いて、所望のタンパク質をコードする配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列に対して結合することができる。そのような精製を促進する領域には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン分子などの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質A領域、およびFLAG伸長/親和性の精製装置(Immunex Corp社, Seattle, Wash.)で利用される領域などが含まれるが、これらによって限定されるものではない。
【００４９】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター分子が関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝障害、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害において有用であることを明らかにする。従って、本発明の核酸およびタンパク質、および相同核酸および本発明のタンパク質の診断用途および治療用途は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである: (i)タンパク質治療、(ii)小分子薬剤標的、(iii)抗体標的(治療、診断、ターゲッティング/細胞毒性抗体)、(iv)診断および(または)予後マーカー、(v)遺伝子療法(遺伝子送達と遺伝子除去)、(vi)研究ツール、および(vii)生体外および生体内における組織再生(これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生)。
【００５０】
本発明の核酸とタンパク質は、下記のように種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードするcDNAおよび特にそのヒトホモログは、遺伝子療法において有用であり、また、本発明のタンパク質および特にそのヒトホモログは、それを必要とする被検体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害およびその他の疾患および障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００５１】
また、本発明のタンパク質、または相同タンパク質、またはその断片をコードする新規核酸は、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される診断目的においてもさらに有用であり得る。これらの材料はさらに、治療法または診断法における使用のため、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体の作成に有用である。
【００５２】
例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異な抗体は、アンタゴニストとして直接的に、またはタンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティングまたは輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作り出された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体(すなわち、二量体の形成を阻害する抗体)は特に治療用に望ましい。
【００５３】
抗体を作り出すため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、本発明のタンパク質、または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。 宿主の種類にもよるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。抗体を誘導するために使用するペプチド、断片、またはオリゴペプチドが、少なくとも5つのアミノ酸、およびより望ましくは少なくとも10つのアミノ酸から成るアミノ酸配列を有することが望ましい。
【００５４】
モノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を作り出す任意の技術を用いて作ることが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術(Kohler 、G.らの(1975) Nature 256:495-497; Kozbor、D.らの(1985)J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote、R. J.らのProc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole、S.P.らの(1984)Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００５５】
加えて、「キメラ抗体」を作り出すために開発された技術には、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である(Morris on, S. L.らの(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger , M. S. らの(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.らの(1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の作成のための記載された技術を適用して、特異的一本鎖抗体を作り出すことができる。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ組成物の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である(Burton、D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11120-3)。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生を誘導することによって作り出すことが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても作り出すことが可能である(Orlandi、R.らの(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837; Winter 、G.らの(1991) Nature 349:293-299)。
【００５６】
また、タンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることができる。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作り出すことができるF(ab')2断片、およびF(ab')2のスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。あるいは、Fab発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる(Huse、W. D. らの(1989) Science 254:1275-1281)。
【００５７】
種々の免疫測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、本発明のタンパク質または相同タンパク質とその特異性抗体との間の複合体形成の測定が関与する。2つの非干渉性タンパク質エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースの免疫測定法が望ましいが、競合結合実験を用いることも可能である(前出のMaddox)。
【００５８】
本発明の別の実施例によれば、ポリヌクレオチドまたはその断片、またはアンチセンス分子のような核酸エフェクター分子、アプタマー、RNAi分子またはリボザイムを治療目的のために使用することが可能である。一実施態様によれば、組み合わせ核酸ライブラリの使用を含んだ手順のスクリーニングおよび選択によって、アプタマー、すなわち、本発明のタンパク質に対して結合し、その活性を調節する能力のある核酸分子を作成することが可能である。
【００５９】
さらなる実施態様によれば、ポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子を、mRNAの転写を阻止することが望ましいような状況において使用することが可能である。具体的には、細胞は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を用いて形質転換することができる。このように、アンチセンス分子を用いて、タンパク質活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、タンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニアウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することが可能である。当業者であれば公知の方法を用いて、タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Sambrookら(前出)およびAusubelら(前出)の両方の文献に記載されている。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはタンパク質をコードするその断片を用いて細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることができる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。DNAへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、RNA分子が内因性ヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によって使用不可能になるまで継続してRNA分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって1ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より一層長く持続することが可能である。
【００６０】
上述したとおり、遺伝子、すなわちプロモーター、エンハンサー、およびイントロンの制御領域に関するような遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、DNA、RNA、またはPNA核酸アナログを設計することによって達成することができる。転写開始部位(例えば始動部位から-10〜+10の間)由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に対して二重らせんが充分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんDNAを用いる最近の治療における進歩は文献に記載がある(Gee, J. E.らの(1994) In; Huber , B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publis hing Co., Mt. Kisco, N. Y.)。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、mRNAの翻訳を阻止する目的で設計することも可能である。
【００６１】
酵素性RNA分子であるリボザイムは、RNAの特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムには、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれる。使用可能な実施例には、タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的RNA標的内の特異性リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む15〜20リボヌクレオチド間の短いRNA配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造的特徴に対して評価することが可能となる。また、候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護試験法(ribonuclease protection assay)を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性を検査することによって行うことができる。
【００６２】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で周知の任意の方法を用いて作ることが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。或いは、タンパク質をコードするDNA配列の生体外及び生体内転写によってRNA分子を作り得る。このようなDNA配列は、T7またはSP6のような好適なRNポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことができる。あるいは、アンチセンスRNAを構成的または誘導的に合成するこれらcDNA構成物は、細胞株、細胞または組織の内に導入することができる。RNA分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、分子の5'末端および(または)3'末端でのフランキング配列の追加、またはホスホロチオネートの使用、または分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく2'O-メチルが含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、PNAの作成に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００６３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、それらの方法は生体内、生体外および生体内外交通の使用に同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて達成することが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を始めとする好適な被検体に適用することが可能である。
【００６４】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、本発明のタンパク質または相同タンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体または相同タンパク質、擬態、アゴニスト(作用薬)、アンタゴニスト,または本発明のタンパク質または相同タンパク質阻害剤よる成り得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも1つの安定化化合物などの他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水など(これらに限定されるものではない)の滅菌した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明に用いられる医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (ペンシルベニア州イーストンのMaack Publishing社)の最新版を参照。
【００６６】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知であるような方法で製造することができ、それらの態様としては、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥工程等があげられる。本医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填し、適応条件の治療のために標識する。本発明のタンパク質または相同タンパク質の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記されるであろう。
【００６７】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養試験法、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養試験法、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの実験動物のいずれかにおいて、当初に治療に有効な投与量を推定することができる。また、実験動物を好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、特定の状態の治療に有効な活性成分の量、例えば本発明のタンパク質または相同タンパク質、その断片、本発明のタンパク質の抗体または相同タンパク質などを言及する治療効力および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準調剤手順 、例えばED50 (50％の集団における治療に有効な用量: 50％有効量)およびLD50 (50％の集団に対して致死的な用量: 50％致死量)によって確定し得る。治療効果と毒性効果間の投与量の比は、治療指数、すなわちLD50/ED50比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養試験法および動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、本範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被検体に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するために調節する。
【００６８】
配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、個別製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、3〜4日毎、1週間毎、または2週間毎に1回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約0.1〜100,000マイクログラムと異なり、合計投与量は最大で約1グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、通常、当分野の実務家に提供されている。当業者であれば、タンパク質または阻害剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、個別の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００６９】
別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質を特異的に結合する抗体は、タンパク質の過剰発現または低発現と関連を有することによって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはCG3842相同タンパク質、アゴニストまたは阻害剤で治療を受けている患者を監視するためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療のために記載した方法と同様の態様で調製することが可能である。タンパク質に対する診断アッセイには、ヒトの体液または細胞または組織の抽出物において本発明のタンパク質または相同タンパク質を検出するための抗体および標識を利用する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、その抗体を共有的または非共有的のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を使用することが可能であり、そのさまざまなレポーター分子は上記で説明した。
【００７０】
本発明のタンパク質または相同タンパク質を測定するためのELISA、RIA、およびFACSを始めとする種々のプロトコルは、当分野で周知であり、発現の変化値または異常値を診断するための基準を提供する。タンパク質発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被検体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をタンパク質に対する抗体と結合させることによって確定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的方法を用いることが望ましい。対照試料および疾患試料、例えば生検組織において発現したタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被検体値の偏差は、疾患を診断するためのパラメータを樹立する。
【００７１】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同核酸に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNA分子とDNA分子、およびPNAが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、該タンパク質の発現と相関関係にあり得る生検組織内の遺伝子発現を検出し、定量化することができる。診断アッセイを用いて、遺伝子の不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中に発現レベルの調節を監視することが可能である。
【００７２】
一実施形態によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質、または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとする、ポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つプローブ、例えばPCRプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、タンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性は、それが高度に特異的な領域、例えば5'調節領域における独特のヌクレオチド、またはそれほど特異的ではない領域、例えば特に3'コード領域のいずれから作られたに拘わらず、またそのハイブリダイゼーションまたは増幅(最大、高、中、または低)のストリンジェントの度合に拘わらず、そのプローブが本発明のタンパク質または相同タンパク質、対立遺伝子、または関連配列をコードする天然の配列のみを同定するかどうかを確定する。また、プローブは、関連配列の検出に用いることもでき、望ましくは少なくとも50％のタンパク質をコードする任意の配列からのヌクレオチドが含まれている必要がある。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRNAであっても良いし、また、望ましくは本発明のタンパク質から成るポリヌクレオチドのヌクレオチド配列由来または本発明のタンパク質または相同遺伝子をコードする天然配列のプロモーター、エンハンサーエレメント、およびイントロンを始めとするゲノム配列由来であっても良い。タンパク質をコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作り出す方法には、核酸配列を、mRNAプローブを作り出すためのベクターにクローニングする方法が含まれる。当分野で周知であり、かつ市販されている該ベクターを用いて、適切なRNポリメラーゼと適切に標識されたヌクレオチドを追加することによって、生体外RNAプローブを合成することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては32Pまたは35S等の放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブと共役したアルカリホスファターゼ等の酵素標識等が挙げられる。
【００７３】
本発明のタンパク質または相同核酸に特異的なポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の例には、肥満症および糖尿病を始めとする代謝疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明のタンパク質または相同核酸に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、肥満症および糖尿病を始めとする代謝の疾患と障害に対して治療を受けている患者の進渉状況を監視することができる。ポリヌクレオチド配列は、変性遺伝子発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびPCR法、またはディップスティック法、ピンELISA法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。このような定性的または定量的方法は当分野で周知である。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質または相同核酸に特異的なヌクレオチド配列は、肥満症のようなさまざまな代謝疾患、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害の活性または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後には、その試料を洗浄し、そしてそのシグナルを定量化して標準値と比較する。本試料において、ヌクレオチド配列の変更値の存在は、関連疾病の存在を示す。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療監視において、特定の治療上療法の有効性を評価することも可能である。
【００７５】
本発明のタンパク質または相同タンパク質の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロファイルまたは標準プロファイルを樹立する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被検体から抽出した体液または細胞を、本発明のタンパク質または相同核酸に特異的な配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被検体から得た値を、既知量の十分に精製したポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被検者値間の偏差を用いて疾病の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を樹立して、治療プロトコルを開始した時点では、患者の発現レベルが正常患者において観察されるレベルに近づき始めるかどうかを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返すことが可能である。連続アッセイから得た結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療効果を明らかにすることができる。
【００７６】
肥満症のような代謝疾患、同様に代謝症候群、摂食障害、悪質液、糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、および胆石症のような関連障害に関しては、個々から取り出した生検組織におけるかなり高い量の転写物存在が疾病発生の素因を示すか、または実際の臨床症状の出現に先行する疾病を検出する手段を提供することが可能である。この種のより一層信頼のおける診断により、医療の専門家が予防措置または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発生またはさらなる進行を防止することが可能となる。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上のさらなる用途は、PCR法の使用に関与し得る。このオリゴマーは、化学的に合成しても良いし、酵素的に作成するか、または組換えソースから作り出しても良い。オリゴマーは望ましくは2つのヌクレオチド配列から構成され、1つはセンス方向(5'.fwdarw.3')、他の1つアンチセンス方向(3'.rarw.5')で、特異的な遺伝子または条件の識別のために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセット、または縮重オリゴマーの集積である2つの同一オリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したDNA配列またはRNA配列の検出あるいは(または)定量化を行なうことができる。
【００７７】
本発明のタンパク質の発現を定量化するために使用可能な方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる(Melby, P.C. らの(1993) J. Immunol Methods, 159:235-244; Duplaa, C. らの(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるELSA形態のアッセイを実行することによって加速し得る。
【００７８】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または周知の方法を用いて染色体の特異的な領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、FISH、FACS、または酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1構築または単一染色体cDNAライブラリのような人工染色構造があり、Price, C. M. (1993) Blood Rev. 7:127-134,およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154. FISH (Vermaらによって記述されているとおり、(1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York, N.Y.)などの文献で論評されているように、他の物理的染色体のマッピング技術および遺伝地図データと相関させることが可能である。遺伝地図データの例は、1994 Genome issue of Science (265:1981f)にある。物理的染色体地図上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の位置と、特異的な疾患または特異的な疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子病に関連するDNAの領域を画定するのに役立ち得る。
【００７９】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。遺伝子多型、例えば単一ヌクレオチド遺伝子多型の分析を行うことが可能である。さらに、樹立した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析などの物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することも可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これによって、位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報が提供される。一旦疾患または症候群が、特定のゲノム領域への遺伝子連鎖、例えばAT〜11q22-23 (Gatti, R.A.らの(1988) Nature 336:577-580)によって大まかに位置決めがされると、その領域にマッピングする全ての配列は、さらなる研究のための関連遺伝子または調節遺伝子に相当し得る。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することもできる。
【００８０】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質、それらの触媒断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチドは、例えば、ペプチドまたは低分子重量の有機化合物などの化合物スクリーニングライブラリのために、種々の薬剤スクリーニング技術において使用することができる。
【００８１】
1つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合、乃至は該作用を調節または模倣するエフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定することができる。このようなスクリーニングで用いた断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内にあっても構わない。また、本発明のタンパク質と検査する薬剤間の結合複合物の形成を測定することも可能である。
【００８２】
また、直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼす薬剤を同定することもできる。直接的な影響の機構は、例えば、限定するものではないが、基質または補助因子の認識、結合および変換のいずれかとの薬剤干渉であり得る。例えば、脱水素酵素活性は、遺伝子組換えによって発現および精製したCG3842相同体タンパク質またはその断片を用いて、試験管内で測定し得る。
【００８３】
例えば、本発明のタンパク質のオキシドレダクターゼ活性の試験管内測定は、トリチウム化したステロイド、例えば、限定するものではないが、ジヒドロ検査ステロン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルドステロン、アンドロステロン、アロプレグナノロン,またはアンドロスタンジオールを用いて実施することができる。その反応は、補助因子NADP+/NAD+の存在下では酸化方向に駆動することができ、あるいはNADPH/NADHの存在下では還元方向に駆動することができる。反応産物は、シリカゲルTLCプレート上で抽出および分析できる。あるいは、レチノイド基質、すなわち、レチノイドのオールトランスおよびシス異性体は、オキシドレダクターゼ基質として使用することができ、そして産物作成は、HPLC分離のような当分野で周知の手順で分析することができる(Kedishvili らの(2002)、J. Biol. Chem.277 (No. 32)、28909-28915)。本発明の別の実施例によれば、酵素のオキシドレダクターゼ活性は、NADPHまたはNADHからNADP+またはNAD+へのそれぞれ変換(逆方向の変換も同様)によって、蛍光の変化を追跡することによって監視できる。
【００８４】
加えて、その生理的基質またはその誘導体に対するCG3842相同体タンパク質の活性は細胞ベースアッセイにおいて測定することができる。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸化、ファルネシル化、パルミトイル化、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性および劣化のようなのようなタンパク質の翻訳後の修飾を妨害し得る。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼすか、または異種態様で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼすことができる。また、薬剤は、本発明のタンパク質の、タンパク質機能、例えば、限定するものではないが、タンパク質下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質との物理的相互作用に影響を与えることができる。
【００８５】
タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で周知である。例えば、タンパク質と相互作用するCG3842相同体タンパク質(またはその逆も同様)由来の蛍光標識されたペプチドの結合は、分極の変化によって検出することができる。両結合パートナー(完全長タンパク質またはその断片のいずれでもよい)が蛍光標識されている場合、結合は一つの蛍光色素から他の蛍光色素への蛍光エネルギー移動(FRET)によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間の相互作用を検出するために好適なアッセイ原理は、当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがAlphaScreen(PerkinElmer 社)またはAmersham社によるシンチレーション近接測定法(SPA)が提供されている。 あるいは、CG3842相同体タンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光標識され、そして両タンパク質の相互作用を、例えば、限定するものではないが、「セロミクス」またはEvotecOAIによって作り出された細胞画像処理読取装置を用いて両タンパク質に共通する転位置を分析して検出できるスクリーニングアッセイのための細胞ベース基準であり得る。すべての事例においては、2以上の結合パートナーは異なるタンパク質であって良く、その1つはCG3842相同体タンパク質、または二量体化および(または)オリゴマー形成の場合にはCG3842相同体タンパク質自体であっても良い。対象となる一つの標的機構(一つのみとは限らない)がそのようなタンパク質/タンパク質相互作用であるCG3842相同体タンパク質は、不特定のヒトタンパク質BAB70811およびヒトPSDR1であろう。
【００８６】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書中で使用した用語「薬剤」は、1つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品である。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは50〜約2,500ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上の相互作用に必要な機能グループが含まれ、そして典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも2つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には、多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および(または)1つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８７】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを始めとするさまざまな原料から取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が提供されている。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に作り出すことができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を介して、天然または合成的に作り出したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを作り出すことが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化(amidification)などのような公知の薬剤は、構造上の類似体を作り出すために、有向またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合実験である場合、1つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８８】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、PCT出願公開番号WO84/03564に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法では、本発明のタンパク質または相同タンパク質に対して適用したように、多数の異なる小さな試験化合物を、プラスチックのピンまたはその他の表面のような固形基質上で合成した。試験化合物は、タンパク質またはその断片と反応させ、洗浄した。次ぎに、結合されたタンパク質が、当分野で周知の方法で検出される。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例によれば、タンパク質に対する中和抗体がタンパク質と結合するため試験化合物と特に競合し、競合的な薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法によれば、抗体を用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質と1つ以上の抗原決定因子を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。別の実施例では、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その新規技術が既知のヌクレオチド配列の特性、例えば、限定するものではないが、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用などを含む特性に依存する限り、今後開発される任意の分子生物学技術においてでも使用することができる。
【００８９】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて遺伝子導入細胞株および動物を作成することができる。これらの遺伝子導入非ヒト動物は、本発明生体外のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子導入動物、特に哺乳動物の遺伝子導入動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの検討のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子を検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現(例えば過剰発現または発現の欠如)、特定の摂食条件、および(または)生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作ることができる。
【００９０】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および(または)糖尿病のマウスモデルが使用される(例えば、ob (レプチン)またはdb (レプチン受容体)マウス)。糖尿病の典型的な症状を呈するそのようなマウスは、肝脂質蓄積を示し、そして高い頻度で血漿脂質値を増加した(Bruningらの1998、Mol.Cell.2:449-569を参照)。感受性の野生型マウス(例えばC57Bl/6)は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて(実施例セクションを参照)、これらのマウス用いて、候補修飾因子の投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、FPLC、比色法、血糖検査、インスリン耐性検査などのようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準アッセイを用いて検査することもできる。
【００９１】
遺伝子導入動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座が突然変異する場合、胚幹細胞における相同組換えを介して作ることが可能である。別法としては、タンパク質をコードする核酸構成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。また、本発明の遺伝子またはその変異体を、通常には発現されないか、または異常発生するような場所に発現することもあり得る。さらには、アンチセンス分子を発現する特異的な構成物または本発明のタンパク質の発現を阻止または改変する優性阻害突然変異の発現のような本発明の遺伝子の変異体は、ランダムにゲノムに統合することが可能である。本発明の遺伝子発現の上方制御が表現型の容易に検出可能な変化を結果としてもたらすlac Zまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーは、本発明遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスおよびその他の動物ウィルス、酵母菌人工染色体(YACs)などが含まれる。相同組換えDNA構成物には、少なくとも所望の遺伝子組換えをした本発明の遺伝子の一部が含まれ、そして標的遺伝子座に対する相同領域が含まれるであろう。都合よく、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーを含む。ランダム統合のためのDNA構成物には、組換えを仲介するための相同領域が含まれる必要はない。ランダム統合のためのDNA構成物には、本発明のタンパク質、調節エレメント(プロモーター)、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は本分野で周知である。
【００９２】
胚幹(ES)細胞は、ES細胞株を用いても良いし、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得しても良い。そのような細胞は、適切な線維芽細胞-支持細胞層の上で増殖さしめてから、白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ES細胞または胚細胞は形質移入することが可能であり、それらを用いて遺伝子導入動物を作り出すことができる。形質移入後、ES細胞を適切な培地の支持細胞層上にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同組換えの発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、後の胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を4〜6週間目の過排卵メスから取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小凹部に入れる。ES細胞をトリプシン処理し、そしてその修飾細胞は桑実胚に密接して凹部に置く。次の日には、凝集体を偽妊娠のメスの子宮角に移す。次に、メスに出産させる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする(F1世代)。F1-世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾したオスおよびメスを交尾させ、ホモ接合の子孫を作り出す。その遺伝子改変が成長の過程における死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植用または類遺伝子性移植用、または生体外培養用として維持することができる。遺伝子導入動物は、実験動物、家畜など、例えばマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタなどのような任意の非ヒト哺乳動物であり得る。遺伝子導入動物は、機能的研究、薬物スクリーニングおよび他の用途において用いることが可能であり、そして試験管内における本発明タンパク質の機能および調節の研究に有用である。
【００９３】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の1つから成るキットに関するものである。
(a)  ASRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216 核酸分子またはその断片;
(b)  ASRM、NPFF2、NPFF1、OX1R、OX2R、SLC25A11、PRKAR2A、PRKAR2B、Cab45、FtsJ2、AWP1,またはZNF216アミノ酸分子または断片またはそのアイソフォーム;
(c)  (a) の核酸を備えているベクター;
(d)  (a)の核酸または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(e)  (a)の核酸によってコードされたポリペプチド;
(f)  (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(g)  (a)の核酸または(d)または(e)または(f)のポリペプチドに対するエフェクター、例えば抗体、アプタマーまたは別の受容体、および
(g)  (a)の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【００９４】
本キットは、上述のように、診断用または治療用またはスクリーニング用に使用することが可能である。本キットには、さらに取扱説明書が含まれ得る。
【００９５】
各図は下記を示す:
図1は、スペルミジン合成酵素(GadFlyアクセッション番号CG8327)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、ゲノムの他の部分のベクター型統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされたEP(3)3054ハエ(「EP(3)3054」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加である。
【００９６】
図2は、変異型スペルミジン合成酵素(Gadflyアクセッション番号CG8327)遺伝子座の分子構造を示す。
【００９７】
図3は、GadFlyアクセッション番号CG8327の哺乳動物の相同体を示す。
【００９８】
図3Aは、最良マッチのヒトホモログ(被検体)を有するCG8327遺伝子産物(クエリー)のBLASTP検索結果を示す。
【００９９】
図3Bは、ヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号1; GenBankアクセッション番号NM_003132)の核酸配列を示す。
【０１００】
図3Cは、ヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号2; GenBankアクセッション番号NP_003123)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１０１】
図3Dは、ヒトスペルミジン合成酵素(「HSNP_003123」と呼ぶ)、マウススペルミジン合成酵素(「Mm NP_033298」と呼ぶ)、およびショウジョウバエスペルミジン合成酵素(「Dm CG8327」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１０２】
図4は、哺乳動物組織におけるスペルミジン合成酵素の発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図4Aおよび図4Bにおいて、検査した組織はX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。図4Cおよび4Dでは、X軸は時間軸を表す。「d0」は第0(ゼロ)日目(実験開始日)を参照し、「d2」〜「d10」は脂肪細胞分化の第2日目目〜第10日目目を参照する。
【０１０３】
図4A:  野生型マウス組織におけるスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR分析。
【０１０４】
図4B: 異なるマウスモデルにおけるスペルミジン合成酵素発現のリアルタイム PCR 法を介した分析。
【０１０５】
図4C: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR間接比較。
【０１０６】
図4D: 3T3-F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR間接比較。
【０１０７】
図5は2GPCR (GadFlyアクセッション番号CG10823)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、ゲノムの他の部分の本ベクター統合を有する対照(「EP対照 」; コラム1と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされる、HD-EP(3)31068 ハエ(「HD-EP(3)31068」; コラム2と呼ぶ)およびHD-EP(3)31149 ハエ(「HD-EP(3)31149」; コラム3と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加である。
【０１０８】
図6は、Gadflyアクセッション番号CG10823の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１０９】
図7は、CG10823のGadFlyアクセッション番号CG10823およびヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
図7Aは、ショウジョウバエCG10823のタンパク質のアミノ酸配列を示す(配列認識番号3)。
【０１１１】
図7Bは、ヒトGタンパク質共役受容体74 (神経ペプチドFF2; 配列識別番号4; GenBankアクセッション番号NM_053036とも呼ぶ)の核酸配列を示す。
【０１１２】
図7Cは、神経ペプチドFF2(配列識別番号5; GenBankアクセッション番号NP_444264)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１１３】
図7Dは、ヒト神経ペプチドFF 1(配列識別番号6; GenBankアクセッション番号NM_022146)の核酸配列を示す。
【０１１４】
図7Eは、ヒト神経ペプチドFF 1(配列識別番号7; GenBankアクセッション番号NP_071429)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１１５】
図7Fは、ヒトオレキシン受容体1(配列識別番号8; GenBankアクセッション番号NM_001525)の核酸配列を示す。
【０１１６】
図7Gは、ヒトオレキシン受容体1(配列識別番号9; GenBankアクセッション番号NP_001516)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１１７】
図7Hは、ヒトオレキシン受容体2(配列識別番号10; GenBankアクセッション番号NM_001526)の核酸配列を示す。
【０１１８】
図7Iは、ヒトオレキシン受容体2(配列識別番号11; GenBankアクセッション番号NP_001517)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１１９】
図7Jは、ヒト神経ペプチドFF1受容体(「NPFF1Hs」と呼ぶ)、ヒト神経ペプチドFF2受容体(「NPFF2Hs」と呼ぶ)、ヒトオレキシン受容体1(「HCRTR1Hs」と呼ぶ)、ヒトオレキシン受容体2(「HCRTR2Hs」と呼ぶ)、およびショウジョウバエCG10823タンパク質(「CG10823 Dm」と呼ぶ)のClaustal W (1.83)複数配列アライメント分析を示す。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１２０】
図8は、哺乳動物組織におけるGpr74 (NPFF2相同体)およびRFアミド関連ペプチド受容体(NPFF1相同体)の発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図8A、8B、8C、8Dには、検査した組織をX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。図8Eおよび図8Fでは、X軸は時間軸を表す。「d0」は第0(ゼロ)日目(実験開始日)を参照し、「d2」〜「d10」は脂肪細胞分化の第2日目目〜第10日目目を参照する。
【０１２１】
図8A: 野生型マウスの組織におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR 分析。
【０１２２】
図8B: 野生型マウス組織におけるGpr74発現のリアルタイムPCR分析。
【０１２３】
図8C: 異なるマウスモデルにおけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイム PCR 法を介した分析。
【０１２４】
図8D: 異なるマウスモデルにおけるGpr74発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１２５】
図8E: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への試験管内分化中におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１２６】
図8F: 3T3-F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への試験管内分化中におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１２７】
図9は、ショウジョウバエキャリアタンパク質(Gadflyアクセッション番号CG18418)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるEP(3)3322ハエ(「EP(3)3322」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加である。
【０１２８】
図10は、ショウジョウバエキャリアタンパク質(Gadflyアクセッション番号CG18418)の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１２９】
図11は、GadFlyアクセッション番号CG18418の哺乳動物の相同体を示す。
【０１３０】
図11Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG18418 (クエリー)のBLASTP検索結果 を示す。
【０１３１】
図11Bは、ヒト溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号12; GenBankアクセッション番号NM_003562)の核酸配列を示す。
【０１３２】
図11Cは、ヒト溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号13; GenBankアクセッション番号NP_003553)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１３３】
図11Dは、ヒト溶質キャリア(「HSNP_003553」と呼ぶ)、マウス推定 溶質キャリア(「Mm BAB26319」と呼ぶ)、およびショウジョウバエCG18418 (「Dm CG18418」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１３４】
図12は、哺乳動物組織における溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)、メンバー11(Slc25a11)の発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図12Aおよび図12Bにおいて、検査した組織はX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。
【０１３５】
図12A: 野生型マウスの組織におけるSlc25a11発現のリアルタイムPCR 分析。
【０１３６】
図12B: 異なるマウスモデルにおけるSlc25a11発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１３７】
図13は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるEP(2)2162ハエ(「EP(2)2162」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１３８】
図14は、ショウジョウバエPka-R2 (GadFlyアクセッション番号CG15862)の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１３９】
図15は、ショウジョウバエPka-R2の哺乳動物の相同体を示す。
【０１４０】
図15Aは、Pka-R2 (クエリー)のBLASTP検索結果を示した。ここに示したのは、最も高い相同値を有するヒトホモログ(被検体)のみである。
【０１４１】
図15Bは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号14; GenBankアクセッション番号NM_004157)の核酸配列を示す。
【０１４２】
図15Cは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号15; GenBankアクセッション番号NP_004148)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１４３】
図15Dは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号16; GenBankアクセッション番号NM_002736)の核酸配列を示す。
【０１４４】
図15Eは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号17; GenBankアクセッション番号NP_002727)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１４５】
図15Fは、ヒトPRKAR2Bタンパク質(「Hs PRKAR2B」と呼ぶ)、マウスPRKAR2Bタンパク質の断片(「MmPRKAR2B FR」と呼ぶ)、マウスPRKAR2Aタンパク質(「MmPRKAR2A」と呼ぶ)、ヒトPRKAR2Aタンパク質(「Hs PRKAR2A」と呼ぶ)、およびショウジョウバエPka-R2タンパク質(「Dm CG15862」と呼ぶ)のClaustal X (1.81)複数配列アライメント分析を示す。アライメントにおけるギャップは、「-」として表す。
【０１４６】
図16は、哺乳動物組織におけるPRKAR2Aの発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図16A、16B、16Cには、検査した組織をX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。図16Dでは、X軸は時間軸を表す。「d0」は第0(ゼロ)日目(実験開始日)を参照し、「d2」〜「d10」は脂肪細胞分化の第2日目目〜第10日目目を参照する。
【０１４７】
図16A: 野生型マウス組織におけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR分析。
【０１４８】
図16B: 異なるマウスモデルにおけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１４９】
図16C: 糖尿病(db/db)マウスモデルにおけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１５０】
図16D: 3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１５１】
図17は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるEP(3)0650ハエ(「EP(3)0650」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１５２】
図18は、GadFlyアクセッション番号CG3768の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１５３】
図18Aは、変異型CG3768遺伝子座のGadFlyデータベース入力を示す。
【０１５４】
図18Bは、変異型CG3768遺伝子座のBLAST検索結果を示す。
【０１５５】
図19は、GadFlyアクセッション番号CG31475 (Gadflyアクセッション番号SCG14281およびCG3768とも呼ぶ)のヒトホモログを示す。
【０１５６】
図19Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG31475 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す。
【０１５７】
図19Bは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号18; GenBankアクセッション番号NM_016176)の核酸配列を示す。
【０１５８】
図19Cは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号19; GenBankアクセッション番号NP_057260)の核酸配列(1文字コード)を示す。
【０１５９】
図19Dは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型2(配列識別番号20; GenBankアクセッション番号NM_016547)の核酸配列を示す。
【０１６０】
図19Eは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号21; GenBankアクセッション番号NP_057631)の核酸配列(1文字コード)を示す。
【０１６１】
図19Fは、GadFlyアクセッション番号CG3768 (「CG3768」と呼ぶ)およびヒトCab45タンパク質(GenBankアクセッション番号NP_057260.2;「Cab45」 と呼ぶ)によってコードされたショウジョウバエタンパク質のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０１６２】
図20は、哺乳動物組織におけるCab45の発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図20Aおよび図20Bにおいて、検査した組織はX軸上に示した。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。
【０１６３】
図20A: 野生型マウス組織におけるCab45発現のリアルタイムPCR分析。
【０１６４】
図20B: 異なるマウスモデルにおけるCab45発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１６５】
図21は、ショウジョウバエrRNA(ウリジン-2'-O-)-メチル-トランスファーゼのタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG11447)変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「HD-EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるHD-EP31393(3)31393ハエ(「HD-EP31393」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加である。
【０１６６】
図22は、ショウジョウバエrRNA(ウリジン-2'-O-)-メチルトランスフェラーゼ(Gadflyアクセッション番号CG11447)の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１６７】
図23は、GadFlyアクセッション番号CG11447の哺乳動物の相同体を示す。
【０１６８】
図23Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG11447 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す。
【０１６９】
図23Bは、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号22; GenBankアクセッション番号NM_013393)の核酸配列を示す。
【０１７０】
図23Cはヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号23; GenBankアクセッション番号NP_037525)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１７１】
図23Dは、ヒトリボソームRNA(rRNA)メチルトランスフェラーゼ(「HSNP_037525」と呼ぶ)、マウスrRNAメチルトランスフェラーゼ(「Mm NP_080786」と呼ぶ)、およびショウジョウバエrRNAメチルトランスフェラーゼ(「Dm CG11447」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す。
【０１７２】
図24は、哺乳動物組織における細胞分裂周期によるタンパク質FtsJの発現を示す。相対RNA発現はX軸上に示す。図24Aおよび図12Bにおいて、検査した組織はX軸上に示す。「WAT」は白色脂肪組織を参照し、「BAT」は茶色脂肪組織を参照する。
【０１７３】
図24A: 野生型マウス組織における細胞分裂周期によるタンパク質FtsJの発現のリアルタイムPCR分析。
【０１７４】
図24B: 異なるマウスモデルにおける細胞分裂周期によるタンパク質FtsJ発現のリアルタイムPCR間接分析。
【０１７５】
図25は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「HD-EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるHD-EP32007(3)2007ハエ(「HD-EP32007」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す。
【０１７６】
図26は、GadFlyアクセッション番号CG16750の変異型遺伝子座の分子構造を示す。
【０１７７】
図27は、GadFlyアクセッション番号CG16750のヒトホモログを示す。
【０１７８】
図27Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG16750 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す。
【０１７９】
図27Bは、PKR1(配列識別番号24; GenBankアクセッション番号NM_019006)に関連するヒトタンパク質の核酸配列を示す。
【０１８０】
図27Cは、PKR1に関連するヒトタンパク質(配列識別番号25; GenBankアクセッション番号NP_061879)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１８１】
図27Dは、ヒト亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号26; GenBankアクセッション番号NM_006007)の核酸配列を示す。
【０１８２】
図27Eは、ヒト神経ペプチド亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号27; GenBankアクセッション番号NP_005998)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す。
【０１８３】
図27Fは、マウスタンパク質NP_075361.2(「Mm NP_075361」と呼ぶ)、ヒトAWP1タンパク質(「HSXP_044547」と呼ぶ)、およびGadFlyアクセッション番号CG16750によってコードされたショウジョウバエタンパク質(「Dm XP_0081233」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０１８４】
この実施例は本発明を図解するものである。
【０１８５】
実施例 1: 中性脂肪含有量の測定
変異体ハエは、専売のハエ突然変異在庫コレクションおよび公的に提供されている在庫コレクションから取得した。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加の摂食としてベーカーの酵母菌(サッカロミセスセレビジエ)を与えた。ホモ接合またはヘミ接合の生存可能な統合におけるEPベクターを含むショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均増加を対照ハエと比較して検討した(図1、5、9、13、17、21、25を参照)。中性脂肪の確定のため、ハエを、5分間、90℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を用いてインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる5分間、90℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Sigma社の中性脂肪(INT 336-10または-20)アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエ抽出物の中性脂肪含有量を確定した。基準としてBIO-RAD DCタンパク質アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って同一抽出のタンパク質含有量を測定した。アッセイを3回繰り返した。
【０１８６】
EPコレクション(「EP対照」と呼ぶ)の全ハエの平均中性脂肪値を100％として、図1、5、9、13、17、21、および25の第1コラムに、標準偏差を含んで示す。
【０１８７】
EP(3)3054ホモ接合のハエは、検査した対照ハエと比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図1におけるコラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座85E4における遺伝子活性の減少は、EP(3)3054ハエのEPベクターがホモ接合の生存可能に結合している場合、エネルギーを貯蔵する中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１８８】
ItwaSことを本発明において見出した。thatホモ接合のHD-EP(3)31068およびHD-EP(3)31149 ハエは、を示す。常に一層高い中性脂肪含有量than対照ハエ検査した(columns2および3 in図5)。つまり、染色体3R上の遺伝子座93D4-5における遺伝子活性の減少は、HD-EP(3)31068ハエおよびHD-EP(3)31149ハエのEPベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギーを貯蔵する中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１８９】
EP(3)3322ホモ接合のハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図9におけるコラム2)。つまり、染色体3L上の遺伝子座64C1における遺伝子活性の減少は、EP(3)3322ハエのEPベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギー貯蔵中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１９０】
EP(2)2162ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図13におけるコラム2)。つまり、染色体2R上の遺伝子座46D1-3における遺伝子活性の減少は、EP(2)2162ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギー貯蔵中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１９１】
EP(3)0650ホモ接合性ハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図17におけるコラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座91F8における遺伝子活性の減少は、EP(3)0650ハエのEP-ベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギー貯蔵中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１９２】
HD-EP(3)31393ホモ接合のハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図21におけるコラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座92B6における遺伝子活性の減少は、HD-EP(3)31393ハエのEPベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギーを貯蔵する中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１９３】
EP(3)32007ホモ接合のハエは、対照群と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す(図25におけるコラム2)。つまり、染色体3R上の遺伝子座85D11における遺伝子活性の減少は、HD-EP(3)32007ハエのEPベクターがホモ接合性生存結合されている場合、エネルギーを貯蔵する中性脂肪代謝における変化の原因である。
【０１９４】
実施例 2: 代謝制御に関連するショウジョウバエ遺伝子の同定 
本発明のタンパク質をコードする核酸をプラスミド救出技術を用いて同定した。ベクター(本明細書中ではEP(3)3054、HD-EP(3)31068、HD-EP(3)31149、EP(3)3322、EP(2)2162、EP(3)0650、HD-EP(3)31393、およびHD-EP(3)32007)統合に局在して近接するゲノムDNA配列を分離した。それらの分離したゲノム配列を用いて、Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト(GadFly)のような公共データベースをスクリーニングし、それによってそのベクター統合部位、および対応する遺伝子を同定した。これらの遺伝子座位の分子構造を図2、6、10、14、18、22、26に示す。
【０１９５】
図2では、ゲノムDNA配列は、EP(3)3054ラインのベクター統合部位を含む、縮尺した中央の黒色線としてアセンブリで表す(数字はゲノムDNAの塩基対の長さを表す)。転写したDNA配列(EST)および予測遺伝子は、上部側(センス鎖)上にバーとして示す。GadFlyアクセッション番号CG8327を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色ラインとして、そしてイントロンは薄灰色バーとしてそれぞれ示す。タンパク質は、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG8327として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(3)3054ラインの統合部位を同定した。EP(3)3054は、アクセッション番号CG8327を有するcDNAアンチセンス方向における第1cDNAに統合する(統合部位は図の下半分における三角形として示す)。以上の点から、アクセッション番号CG8327をコードするcDNAの発現は、EP(3)3054ラインのベクターのホモ接合の生存可能な統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加をもたらし得る。
【０１９６】
HD-EP(3)31068およびHD-EP(3)31149ベクターは、それぞれ5'アンチセンス方向およびセンス方向におけるショウジョウバエ遺伝子のエンハンサー領域にホモ接合性生存統合する。遺伝子をBerkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG10823として同定した。図6はこの遺伝子座の分子構造を示す。HD-EP(3)31068およびHD-EP(3)31149のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座3R, 93D4-5にある。図6において、ゲノムDNA配列をHD-EP(3)31068統合部位およびHD-EP(3)31149統合部位を含んだ中間の黒色点線として表した。数字は、ゲノムDNA座標を表す(染色体3R上の17023997位置から始まり、染色体3R上の17048997位置で終わる)。図の上半分はセンス方向(+)を表し、下半分はアンチセンス方向 (-)を表す。2つの「cDNA」ライン上の灰色バーは予測遺伝子を表す(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、GadFly、Magpieによって予測されたように)。ショウジョウバエcDNA(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG10823)の予測エキソンは、濃灰色バーとして示し、そして予測イントロンは薄灰色バーとして示す。下部「EST」ライン上の灰色バーは転写したDNAを表す。同定したcDNA配列は、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG10823として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBIまたはGenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(3)31068ラインおよびHD-EP(3)31149ラインの統合部位を同定した。以上の点から、GadFlyアクセッション番号CG10823をコードするcDNAの発現は、HD-EP(3)31068ラインまたはHD-EP(3)31149ラインのベクターのホモ接合の統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加につながり得る。
【０１９７】
図10において、ゲノム配列は、EP(3)3322ラインのベクター統合部位を含む黒色点線としてアセンブリによって表されている(染色体3L上の4660000位置から4666250位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは下部の2行目にバーとして示す。GadFlyアクセッション番号CG18418を有するcDNAの予測エキソンは濃灰色バーとしてを示す。CG18418は、アクセッション番号CG18418としてGadFly配列分析プログラムによって予測される遺伝子に対してコードする(例えば、特許WO0140519からの配列190を参照)。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(3)3322ラインの統合部位を同定した。EP(3)3322は、アクセッション番号CG18418を有するcDNAのアンチセンス方向におけるCG18418のエンハンサー領域に統合する。以上の点から、アクセッション番号CG18418をコードするcDNAの発現は、EP(3)3322ラインのベクターのホモ接合の統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加をもたらす。
【０１９８】
図14において、ゲノムDNA配列をEP(2)2162の統合部位を含んだ中間の黒色細線として表した。数字はゲノムDNAの塩基対における長さを表す。下位側の黒色バーは予測遺伝子を表す(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクト、GadFly、Magpieによって予測されたように)。ショウジョウバエcDNA(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG15862)の予測エキソンは黒色バーとして示し、そして予測イントロンは連結する薄灰色線として示す。図の下半分上の薄灰色バーは転写したDNAを表す。該記号は、その詳細を図14の底部にて記載する。Pka-R2は、GadFly配列分析プログラムにより、アクセッション番号CG15862として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(2)2162ラインの統合部位を同定した。EP(2)2162をアクセッション番号CG15862を有するcDNAのセンス方向におけるプロモーターに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG15862をコードするcDNAの発現は、EP(2)2162ラインのベクターのホモ接合の統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加をもたらす。
【０１９９】
図18Aおよび18Bにおいて、ゲノムDNA配列をEP(3)0650の統合部位を含んだ中間の細い黒色バーとして表した。数字はゲノムDNAの塩基対における長さを表す。図180Aおよび180Bにおける上部黒色バーは、繰り返し配列を表し、下の灰色バーはcDNA配列を表す。灰色三角形はP挿入を表し、CG番号で標識した黒色バーは遺伝子を表す。図18Aでは、遺伝子CG14281およびCG3768が不正に注釈されている。図18Bでは、対応するBLAST検索結果を示す。BLAST検索結果によれば、GadFlyアクセッション番号CG3768 (GenBankアクセッション番号XP_081345)を有する遺伝子は、5プライム方向においてより一層伸長する。図18Aおよび18Bでは、ショウジョウバエcDNA(Berkeleyショウジョウバエゲノムプロジェクトアクセッション番号CG3768)の予測エキソンを、黒色バーとして示し、そして予測イントロンを黒色線として示す。
【０２００】
図22において、ゲノム配列は、HD-EP(3)31393ラインのベクター統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表す(染色体3R上の15613200位置から15614763位置まで)。予測遺伝子は、最上部の線上にバーとして示す。GadFlyアクセッション番号CG11447を有するcDNAの予測エキソンは濃灰色バーとしてを示す。タンパク質は、GadFly配列分析プログラムによってGadFlyアクセッション番号CG11447として予測される遺伝子に対してコードする。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すHD-EP(3)31393ラインの統合部位を同定した。HD-EP(3)31393をアクセッション番号CG11447を有するcDNAのセンス方向におけるエンハンサー領域に統合する。以上の点から、アクセッション番号CG11447をコードするcDNAの発現は、HD-EP(3)31393ラインのベクターのホモ接合の統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加をもたらす。
【０２０１】
図26では、ゲノム配列を、EP(3)32007ラインのベクター統合部位を含む黒色の点線としてアセンブリによって表す(染色体3R上の5145000位置から5165000位置まで)。転写されたDNA配列(EST)および予想エキソンは上部の2 行にバーとして示した。GadFlyアクセッション番号CG16750を有するcDNAの予測エキソンは、濃灰色のバーとしておよびイントロンは薄灰色のバーとしてそれぞれ示した。公共DNA配列データベース(例えば、NCBI GenBank)をスクリーニングし、それによって中性脂肪含有量の上昇を引き起すEP(3)32007ラインの統合部位を同定した。EP(3)32007をアクセッション番号CG16750を有するcDNAのセンス方向におけるCG16750のプロモーターに統合する。以上の点から、アクセッション番号CG16750をコードするcDNAの発現は、EP(3)32007ラインのベクターのホモ接合の統合によって影響され、エネルギーを貯蔵する中性脂肪の増加をもたらす。
【０２０２】
実施例 3: ヒトの相同遺伝子およびタンパク質の同定
それによってコードされた中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、BLASTアルゴリズム探索を用いて、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し、そして哺乳動物の相同体を同定した(図3、7、11、15、19、23、および27)。
【０２０３】
図3Aに示したように、ショウジョウバエCG8327の遺伝子産物は、283以上のアミノ酸(302アミノ酸中)で、ヒトスペルミジン合成酵素(スペルミジン合成酵素1; SRMとも呼ぶ; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_003132、タンパク質のNP_003123)に対して76％の相同性を持つ。さらにはショウジョウバエCG8327の遺伝子産物は、283以上のアミノ酸(302アミノ酸中)で、マウススペルミジン合成酵素(cDNAのGenBankアクセッション番号NM_009272、タンパク質のNP_033298)に対して76％の相同性を持つ。図3Bおよび3Cでは、ヒトスペルミジン合成酵素の核酸およびアミノ酸配列を示した。図3Dは、ヒト、マウス、およびショウジョウバエのスペルミジン合成酵素相同体のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０２０４】
よって、CG10823相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ショウジョウバエCG10823タンパク質(GadFlyアクセッション番号CG10823)、AGタンパク質共役受容体74 (GPR74、神経ペプチドFF2受容体; cDNAのGenbankアクセッション番号NM_053036、タンパク質のNP_444264.1)、神経ペプチドFF1受容体(cDNAのGenbankアクセッション番号NM_022146、タンパク質のNP_071429.1)、オレキシン受容体1(OX1R; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_001525、タンパク質のNP_001516)、およびオレキシン受容体2(OX2R; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_001526、タンパク質のNP_001517)をコードする核酸である。GadFlyアクセッション番号CG10823 (配列識別番号3; 図7Aを参照)のABLASTP検索を実行した。ヒトの最良マッチは、神経ペプチドFF2受容体(NP_444264; 38％の同一性、58％の相同性、データ図示せず)、ヒトの第2最良マッチは、神経ペプチドFF1受容体(NP_071429; 34％同一性、52％相同性、データ 図示せず)である。図7B、C、D、E、F、G、H、Iでは、CG10823のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示した。異なる種から取り出したCG10823相同タンパク質のアライメントは、Clustal W複数配列アライメントプログラムによって行い、図3Jにおいて示した。
【０２０５】
CG18418相同タンパク質および核酸分子コーディングは、それゆえ昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、GadFlyアクセッション番号CG18418およびヒト溶質キャリアファミリー25(ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11タンパク質(SLC25A11; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_003562、タンパク質のNP_003553)から成る核酸である。図11Aに示したように、GadFlyアクセッション番号CG18418 (特許出願WO0140519; GenBankアクセッション番号AX154841.1から取り出した配列190と同一)の遺伝子産物は、297以上のアミノ酸(314のアミノ酸中)で、ヒトSLC25A11(GenBankアクセッション番号NM_003562; Iacobazzi、V.らの1992、DNA Seq. 3(2):79-88)に対して70％の相同性を持つ。また、CG18418は、279以上のアミノ酸(314のアミノ酸中)で、マウス溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)、メンバー11タンパク質(GenBankアクセッション番号BAB26319.1)に対して、タンパク質レベル上、69％の相同性を示す。図11Bおよび11Cでは、CG18418のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示した。図11Dは、ヒト(NP_003553)、マウス(BAB26319)、およびショウジョウバエ(CG18418)の溶質キャリアファミリー相同体のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０２０６】
よって、Pka-R2相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、ショウジョウバエPka-R2タンパク質(GadFlyアクセッション番号CG15862)、ヒトcAMP依存型タンパク質キナーゼ(PRKAR2A; cDNAのGenbankアクセッション番号NM_004157の調節サブユニットRII α、タンパク質のNP_004148.1)、またはヒトcAMP依存型タンパク質キナーゼ(PRKAR2B; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_002736、タンパク質のNP_002727、cDNAの旧番号Genbankアクセッション番号XM_004959、タンパク質のXP_004959.3)の調節サブユニットRII βをコードする核酸である。GadFlyアクセッション番号CG15862(Pka-R2)のBLASTP検索結果を図15Aに示した; ここに示したのは、最も高い同一性値を有する2ヒトの相同タンパク質のみである。図15B、15C、15D、および15Eでは、Pka-R2のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示した。異なる種から取り出したPka-R2のアライメントは、Clustal X複数配列アライメントプログラムによって行い、図15Fにおいて示した。
【０２０７】
よって、CG3768相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、GadFlyアクセッション番号CG3768 (GenBankアクセッション番号XP_081345)、およびヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質(Cab45; cDNAのGenBankアクセッション番号SNM_016176およびNM_016547、タンパク質のNP_057260およびNP_057631)から成る核酸である。図19Aに示したように、ショウジョウバエCG3768 (GenBankアクセッション番号XP_081345)の遺伝子産物は、260以上のアミノ酸(362のアミノ酸中)で、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質(Cab45; GenBankアクセッション番号NP_057260.2とも呼ぶ; Scherer P.E. らの、1996、J Cell Biol 133(2):257-268)に対して54％の相同性を持つ。ショウジョウバエCG3768の遺伝子産物は、261以上のアミノ酸(361のアミノ酸中)で、マウスカルシウム結合タンパク質Cab45b (GenBankアクセッション番号AAB01813.1)に対して53％の相同性を持つ。図19B、19C、19D、および19Eでは、CG3768のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示した。図19Fは、ショウジョウバエ(CG3768)およびヒト(Cab45)のCab45相同体のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０２０８】
よって、メチルトランスフェラーゼ相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、GadFlyアクセッション番号CG11447、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (FtsJ2; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_013393、タンパク質のNP_037525; 特許WO0107471、GenBankアクセッション番号AX078268から取り出した配列72)をコードする核酸である。図23Aに示したように、GadFlyアクセッション番号CG11447の遺伝子産物は、215以上のアミノ酸(246のアミノ酸中)で、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (GenBankアクセッション番号NM_013393)に対して61％の相同性を持つ。加えて、GadFlyアクセッション番号CG11447の遺伝子産物は、215以上のアミノ酸(246のアミノ酸中)で、マウスrRNAメチルトランスフェラーゼ(RIKEncDNA2310037B18; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_026510、タンパク質のNP_080786)に対して63％の相同性を持つ。図23Bおよび23Cでは、CG11447のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示す。図23Dは、ヒト、マウス、およびショウジョウバエのメチルトランスファーゼ相同体のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０２０９】
よって、CG16750相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または脊椎動物各種、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、GadFlyアクセッション番号CG16750、PRK1(AWP1; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_019006に関連するヒトタンパク質、タンパク質のNP_061879、旧番号GenBankアクセッション番号XP_044547.1)、およびヒト亜鉛フィンガータンパク質216 (ZNF216; cDNAのGenBankアクセッション番号NM_006007、タンパク質のNP_005998)から成る核酸である。図27Aに示したように、GadFlyアクセッション番号CG16750の遺伝子産物は、209以上のアミノ酸(208のアミノ酸中)で、PRK1(AWP1; GenBankアクセッション番号XP_044547.1)に関連するヒトタンパク質に対して62％の相同性を持つ。GadFlyアクセッション番号CG16750の遺伝子産物は、227以上のアミノ酸(223のアミノ酸中)で、マウスタンパク質に関連するPrkcl1(GenBankアクセッション番号NP_075361.2)に対して55％の相同性を持つ。図27B、27C、27D、および27Eでは、CG16750のヒトホモログの核酸およびアミノ酸配列を示した。図27Fは、マウス(Mm NP_075361)、ヒト(HSXP_044547)、およびショウジョウバエ(Dm XP_081233)の相同体のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す。
【０２１０】
実施例4: 発現プロファイル実験
本発明において開示した哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、さまざまなマウス菌株(望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究である、マウス菌株C57Bl/6J、C57Bl/6 ob/obおよびC57Bl/KSdb/db)は、Harlan Winkelmann(33178 Borchen、Ger many)から購入し、一定の温度に維持し(望ましくは22℃)、湿度を40パーセントおよび望ましくは明暗サイクルを14/10時間とした。マウスには標準食を与えた(例えば、ssniff Spezialitaten有限責任会社、製品番号sniff M-Z V1126-000)。絶食実験(「絶食マウス」)に関しては、野生型マウスを食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで48時間飢えさしめた(例えば、Schnetzler らのJ ClinInvest1993 Jul;92(1):272-80、MizunoらのProc Natl Acad Sci U SA1996 Apr 16;93(8):3434-8を参照)。動物は6〜8週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば公知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで-80℃にて貯蔵した。
【０２１１】
本発明において開示した試験管内分化におけるタンパク質の役割を分析するため、異なる哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞(3T3-L1)細胞(例えば、Green& Kehinde、Cell 1: 113-116、1974)をAmericanTissue Culture Collection(米国バージニア州ハナサスのATCC、; ATCC- CL 173)から入手した。3T3-L1細胞は線維芽細胞として維持し、従来技術に記述されているように脂肪細胞に分化した(例えばQiu.らのJ. Biol. Chem. 276:11988-95、2001; Slieker らのBBRC 251: 225-9、1998)。分化手順の異なる時点、第0日目(密集日)を始めに、第2日目(ホルモン追加; 例えば、デキサメタゾンおよび3-イソブチル-1-メチルキサンチンの追加)、および10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。別法として、哺乳動物の線維芽細胞3T3-F442A細胞(例えば、Green& Kehinde, Cell 7: 105-113, 1976)を、ハーバード大学医学部,細胞生物学科 (米国マサチューセッツ州ボストン)から取得した。3T3-F442A細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞に分化した(Djian、P.らの、J. Cell. Physiol.、124:554-556、1985)。分化手順のさまざまな時点、第0日目(密集日およびホルモン、例えばインスリン追加)を始めに、10日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを2日毎に採取した。3T3-F442A細胞は、ホルモン(インスリン)追加後に既に密集段階の生体外で分化を始める。
【０２１２】
RNAをTrizol試薬(例えば、ドイツ、KarlsruheのInvitrogen社製)を用いて、マウス組織または細胞の培養細胞から分離し、さらに、RNeasyキット(例えば、ドイツ、Qiagen社製)と共に、DNase-treatmentを使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全RNAを逆転写(望ましくはInvitrogen社、Karlsruhe、ドイツからのSuperscriptII RNaseH- Reverse Transcriptaseを利用する)し、そして全RNAをTaqman分析の対象とし、望ましくはTaqman2xPCR Master  Mix(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ; このミックスには、製造者によれば、例えば、AmpliTaq ゴールドDNポリメラーゼ、Amper ase UNG、dUTP を有するdNTP、受動基準Roxおよび最適化された緩衝液成分などが含まれる)をGeneAmp 5700配列検出システム(Applied Biosystems社、Weiterstadt、ドイツ)上に用いる。
【０２１３】
スペルミジン合成酵素(Srm)のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスSrmフォーワードプライマー(配列識別番号28)5'- CCG TGC CGC CTT CGT AC -3'; マウスSrm 逆プライマー(配列識別番号29)5'- ACC TGG ATT CAG CTT ATG TCATTG -3'; マウスSrm Taqmanプローブ(配列識別番号30)(5/6-FAM)CCT GAG TTC ACC CGG AAG GCC C (5/6-TAMRA)。
【０２１４】
RFアミド関連ペプチド受容体のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスRFアミド関連ペプチド受容体フォーワードプライマー(配列識別番号31)5' GCAGCT GCACTT GCT GTC C -3'; マウスRFアミド関連ペプチド受容体逆プライマー(配列識別番号32)5'- TGC TGT GGAAGAAGG CCAG -3'; マウスRFアミド関連ペプチド受容体Taqmanプローブ(配列識別番号33)(5/6-FAM)TCT ACG CCT TCC CGT TGG CAC 作用する(5/6-TAMRA)。
【０２１５】
Gタンパク質共役受容体74 (Gpr74)のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスGpr74 フォーワードプライマー(配列識別番号34)5'- TGAGAG CGAAAC GCAACATG -3'; マウスGpr74 逆プライマー(配列識別番号35)5'- GTT TTG AGACAC CGG TTC CTG -3'; マウスGpr74 Taqmanプローブ(配列識別番号36)(5/6-FAM)TCATAAACACAT CGG GCC TGC TGG T (5/6-TAMRA)。
【０２１６】
溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)、メンバー11(Slc25a11)のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスSlc25a11フォーワードプライマー(配列識別番号37)5'-CAT CCC TAC CAT GGC TCG AG-3'; マウスSlc25a11逆プライマー(配列識別番号38)5'-TGC TタグAT TGAGAG TAAGAG GCAAG-3'; マウスSlc25a11Taqmanプローブ(配列識別番号39)(5/6-FAM)TGT CGT TGT CAATGC CGC CCA(5/6-TAMRA)。
【０２１７】
タンパク質キナーゼ、cAMP依存型調節、2型α(Prkar2a)のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスPrkar2Aフォーワードプライマー(配列識別番号40)5'- GCC ACAAGAACACAC ACAGAAAA-3'; マウスPrkar2A逆プライマー(配列識別番号41)5'- ATG GCAGCG GCG GAG-3'; マウスPrkar2ATaqmanプローブ(配列識別番号42)(5/6-FAM)AGACAC GAC AGAACC GCT CCT GCT G (5/6-TAMRA)。
【０２１８】
Cab45のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスCab45フォーワードプライマー(配列識別番号43)5'- CGC AAC GTG CAT GAAGAG TT -3'; マウスCab45逆プライマー(配列識別番号44)5'- AGACAG GAC 作用するGGC GAC CT -3'; マウスCab45Taqmanプローブ(配列識別番号45)(5/6-FAM)TGAGCATGC CCC TCAGCT GGG (5/6-TAMRA)。
【０２１９】
細胞分裂タンパク質FtsJ (FstJ)のTaqman分析を、望ましくは次のプライマー/プローブ対を用いて実施した: マウスFstJ フォーワードプライマー(配列識別番号46)5'- GCAGGACTG AGG AAC AAG CC -3'; マウスFtsJ 逆プライマー(配列識別番号47)5'- CCT GGAGGC AGC AGC AAC -3'; マウスFtsJ Taqmanプローブ(配列識別番号48)(5/6-FAM)CAT CCATAC CCC 作用するCCC CGT CTC C (5/6-TAMRA)。
【０２２０】
哺乳動物の(マウス)組織におけるスペルミジン合成酵素の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、スペルミジン合成酵素がWATおよびBATを始めとする種々の成人マウス組織において発現されることを明らかにした。(図4A)。これらの組織におけるスペルミジン合成酵素の高い発現レベルは、スペルミジン合成酵素が代謝症候群に関連性のある組織代謝に関与することを示す。茶色脂肪組織におけるスペルミジン合成酵素の発現は代謝の制御下におかれ、遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスの発現レベルは野生型に比較して適度に誘導される(図4B)。加えて、脂肪細胞、3T3-F442A細胞株への前脂肪細胞の試験管内分化の追加モデル系の発現のみならず、スペルミジン合成酵素の発現も、3T3-L1細胞の試験管内分化中に調節される(図4Cおよび4D)。スペルミジン合成酵素が、3T3-L1細胞において発現の一過性の上方制御を示すのに対して、3T3-F442A細胞における発現の安定した上方制御が認められた。スペルミジン合成酵素は、前脂肪細胞分化のクローン拡張期末によって上方制御される。これは、脂肪細胞の最終成熟の兆候を示す間にはスペルミジン合成酵素が必要とされることを示唆する(図4Cおよび4Dを参照)。
【０２２１】
哺乳動物の(マウス)組織におけるRFアミド関連ペプチド受容体およびGpr74の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、両相同体、すなわちRFアミド関連ペプチド受容体およびGpr74が、視床下部においてその最も高い発現を明示することを明らかにした(図8Aおよび8B)。全体的には、RFアミド関連ペプチド受容体は、Gpr74と比べて一層高い発現レベルを示す。Gpr74は、その発現がわずかな組織に限定されているのに対して、RFアミド関連ペプチド受容体は、極めて低いレベルであるが、WATおよびBATを始めとする種々の組織において検出され得る。肝臓および脾臓におけRFアミド関連ペプチド受容体の発現は代謝制御下におかれ、絶食マウスの発現は、野生型の発現レベルに比較して、これらの組織において活性化される(図8C)。茶色脂肪組織におけるGpr74の発現は代謝の制御下におかれ、遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスの発現レベルは野生型に比較して適度に誘導される(図8D)。加えて、脂肪細胞、3T3-F442A細胞株への前脂肪細胞の試験管内分化の追加モデル系の発現のみならず、RFアミド関連ペプチド受容体の発現も、3T3-L1細胞の試験管内分化中に活性化される(図8Eおよび8F)。
【０２２２】
DIE AUSWERTUNGEN ZU Slc25a11 (FIGURE 12A, WT-EXPRESSION UND FIGURE 12B, MAUSMODELLE) UND Prkar2a (FIGURE 16A, WT-EXPRESSION; 16B UND 16C, MAUSMODELLE UND 16D ADIPOZYTEN-DIFFERENZIERUNG) FEHLEN NOCH.
哺乳動物の(マウス)組織におけるCab45の発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、Cab45がWATおよびBATを始めとする種々の成人マウス組織において発現されることを明らかにした(図20A)。これらの組織におけるCab45の高い発現レベルは、Cab45が代謝症候群に関連性のある組織代謝に関与することを示す。Cab45の発現は代謝制御下におかれ、遺伝的に肥満したob/obマウスにおいては、BAT、肝臓、およびすい臓におけるCab45の相対発現は上方制御される(図20B)。
【０２２３】
哺乳動物(マウス)組織における細胞分裂タンパク質FtsJの発現のリアルタイムPCR法(Taqman)分析は、細胞分裂タンパク質FtsJがむしろ偏在的に発現されることを明らかにした(図24A)。茶色脂肪組織における細胞分裂タンパク質FtsJの発現は代謝の制御下におかれ、遺伝的に肥満した(ob/ob)マウスの発現レベルは野生型に比較して強く誘導される(図24B)。
【０２２４】
実施例 5: 中性脂肪貯蔵、合成および輸送の定量のための試験管内試験法
肥満症は、非インスリン依存型糖尿病、中性脂肪の増加、炭水化物接合エネルギーの増加および低エネルギー消費のような異なる理由に起因することが現在わかっている。例えば、エネルギー消費の増加(よって体重が減少する)には、循環/細胞内グルコースおよび中性脂肪の利用度の上昇、エネルギーおよび(または)熱産生のための燃料としてのグリコーゲンまたは脂質の遊離または貯蔵が含まれる。本発明のタンパク質を過剰発現する細胞における中性脂肪値および血糖値のを分析する。
【０２２５】
代謝物の分析のための細胞可溶化液の調製
集密日(d0)以来、細胞培地は48時間毎に変えた。細胞および培地は次のように培地交換に8時間先行して収穫した。培地を収集し、PBSにおいて2回洗浄した600 μlのHB-緩衝剤(0.5％ポリオキシエチレン10 tridecylethan、1mMのDTA、0.01MのNaH2PO4、pH 7.4)における溶解に先行して、細胞を2回洗浄した。70℃にて5分間の不活性化後、細胞可溶化液をBio 101系溶解マトリックスB (0.1mm シリカ ビーズ; Q-Biogene社、Carlsbad、USA)上で、2 x 45秒間、4.5 (Fastprep FP120、Bio 101Ther mosavant社、Holbrock、USA)の速度で攪拌することによって調製した。溶解細胞の上澄みを、3000 rpmにて2分間の遠心分離後に収集し、後の分析のため、-80℃にてアリコットに貯蔵した。
【０２２６】
脂質作成中の細胞の中性脂肪値における変化
細胞可溶化液および培地のタンパク質および中性脂肪含有量の総量を、製造者の指示従って、Bio-Rad DCタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)および修飾酵素性中性脂肪キット(GPO-Trinder ; Sigma社)を用いて、6-ウェルプレートにおいて同時に分析し、簡潔に、試薬の最終容量を次のように96-ウェル形式に調節した: 10 μlの試料を200 μlの試薬Aを用いて5分間37℃でインキュベートした。グリセローム(初期の吸光度: 540 nm)の定量後、50 μl 試薬Bを添加し、継いで、別のインキュベーションを5分間、37℃にて行った(最終吸光度: 540 nm)。グリセローム濃度および中性脂肪濃度を、標準曲線を各アッセイに含むためにグリセローム標準セット(Sigma社)を用いて計算した。
【０２２７】
脂質作成中の細胞の血糖値における変化
細胞可溶化液および培地は、タンパク質およびグリコーゲン総含有量を96-ウェルプレートにおいて製造者の指示に従ってBio-Rad DCタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad社、Munich、ドイツ)およびHoffmann-LARoche社(Basel、スイス)からの酵素性でんぷんキットを用いて同時に3通り分析した。 10-μLの試料を、20-μl アミログルコシダーゼ溶液を用いて15分間60ＥＸにて、グリコーゲンをグルコースに消化するためインキュベートした。そのグルコースは、100 μlの蒸留水および100 μlの酵素補助因子緩衝剤および12 μlの酵素緩衝剤(ヘキソキナーゼおよびグルコースリン酸脱水素酵素)を用いてさらに代謝する。背景(基礎)血糖値は、アミログルコシダーゼを添加しない複製プレートから減算することによって決定する。最終吸光度は340 nmとした。HB-緩衝剤をブランクとして用い、そしてグリコーゲンの標準曲線(Hoffmann-LARoche社)を各アッセイの一部とした。試料中のグリコーゲン含有量は、標準曲線を用いて算出した。
【０２２８】
脂質作成中の脂質の合成
脂質作成の末端段階中(第12日目)では、脂質を代謝する能力に関して細胞を分析した。脂質合成のため、Jensenらの(2000)の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。細胞は、0.1％のFCSで補充したKrebs-Ringer -Bicarbonate-Hepes緩衝剤(KRBH; 134 nMのNaCl、3.5mMのKCl、1.2 mMのKH2 PO4、0.5mMのMgSO4、1.5mMのCaCl2、5mMのNaHCO3、10 mMのHepes、pH 7.4)における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSで3回洗浄した。インスリン刺激脂質合成に関しては、細胞を1μMのウシインスリン(Sigma社; キャリア: 0.005NのHCl)で45分間、37℃にてインキュベートした。基礎脂質合成は、キャリアのみを用いて確定した。14C(U)-D-グルコース(NEnLife Sciences社) (1μCi/ウェル/mlの最終活性における)を5mMのグルコースの存在下で30分間37℃にて添加した。背景放射能の算出のためには、25μMのサイトカラシンB (Sigma社)を使用した。すべてのアッセイは、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度は、標準Biuret方法(タンパク質アッセイ試薬; Bio-Rad社)を用いて評価した。全脂質は、Insta-Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出後に水溶性の位相から分離し、継いでシンチレーションカウンティングを行った。
【０２２９】
脂質作成中の遊離脂肪酸の輸送および代謝
脂質作成(d12)の末端段階中、細胞の長鎖脂肪酸を血漿膜全域に輸送する能力を分析した。脂肪酸の細胞輸送のため、Abumradらの(1991) ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1991: 88; 6008-12)の方法に対する修飾プロトコルを樹立した。要約すれば、血清飢餓に先行して、細胞をPBSで3回洗浄した。これに継いで、0.1％のFCSで補充したKRBH緩衝剤において、2.5時間、37℃にてインキュベートした。外来性遊離脂肪酸の取り込みは、非放射性のオレイン酸および5 mMのグルコース存在下で、1 μCi/ウェル/mlの最終活性において血清アルブミンに対して複合型の(3H)オレイン酸(NEN Life Sciences社)を含んだ同位体の培地の追加により、30分間、室温(RT)にて開始した。血漿膜全域で能動輸送(AT)の不在下における、受動拡散(PD)の算出するため、グルコース遊離培地(Sigma社)における20 mMのフロレチンを30分間、室温(RT)にて添加した。すべてのアッセイは、二通りのウェルにおいて実施した。能動輸送を終結するため、グルコース遊離培地における20 mMのフロレチンを細胞に添加した。細胞を1ml 0.1NのNaOHに溶解し、そして標準Biuret方法(タンパク質アッセイ試薬; Bio-Rad社)を用いて各ウェルのタンパク質濃度を評価した。エステル型の脂肪酸は、Insta-Fluorシンチレーション反応混液(Packard Bioscience社)において一晩抽出を用いて遊離脂肪酸から分離し、継いで、シンチレーションカウンティングを行った。
【０２３０】
実施例6: グルコース取り込みアッセイ
グルコース取り込みの定量に関しては、0.1％のFCSおよび0.5mMのグルコースで補充したKRBH緩衝剤における2.5時間、37℃にての血清飢餓に先行して、PBSを用いて細胞を3回洗浄した。インスリン刺激グルコース取り込みに関しては、1μMのウシインスリン(Sigma社; キャリア: 0.005NのHCl)を用いて45分間、37℃にて細胞をインキュベートした。基底グルコース取り込みはキャリアのみで決定した。0,4 μCi/Well/mlの最終活性における代謝不可能な2-デオキシ-3H-D-グルコース(NEnLife Science社、Boston、USA)を30分間、37℃にて添加した。背景放射能の算出のためには、25μMのサイトカラシンB (Sigma社)を使用した。すべてのアッセイは、二通りのウェルにおいて実施した。反応を終結するため、細胞を氷のように冷たいPBSで3回洗浄し、1ml 0.1NのNaOHにおいて溶解した。各ウェルのタンパク質濃度を標準ビウレット法(タンパク質アッセイ試薬; Bio-Rad社)を用いて評価し、そして細胞可溶化液のシンチレーションカウンティング(計数)を10体積のUltima-gold反応混液(Packard Bioscience社、Groningen、Nether lands)中で実施した。
【０２３１】
実施例 7: 遺伝子導入マウスの作成および分析
遺伝子導入動物の作成
当業者であれば公知のような標準プロトコルを用いて、、マウスcDNAをマウス茶色脂肪組織(BAT)から分離した。RT-PCR により、cDNAを増幅し、そして点変異をcDNAに導入した。
【０２３２】
結果として得られた変異型cDNAをに好適な遺伝子導入発現ベクターにクローニングした。導入遺伝子を、受精したマウス胚(望ましくは菌株C57/BL6/CBAF1(Harlan Winkelmann))の雄性前核へ微量注入した。注入した胚は偽妊娠の仮親マウスへ移した。遺伝子導入創始者をPCR分析によって検出した。構成物を含んだ2つの非依存性遺伝子導入マウスラインを樹立し、C57/BL6の背景に保持した。手短に、分析用のF1マウスを作成するために、初代動物をC57/BL6マウスと戻し交配させた。遺伝子導入マウスをC57/Bl6背景上へ連続的に繁殖せしめた。本発明のタンパク質の発現は、上記のようにtaqman分析によって分析することができ、当業者であれば周知のように、マウスのさらなる分析を行うこともできる。
【０２３３】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２３４】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり、特異的な好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図1は、スペルミジン合成酵素(GadFlyアクセッション番号CG8327)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２】図2は、変異型スペルミジン合成酵素(Gadflyアクセッション番号CG8327)遺伝子座の分子構造を示す
【図３Ａ】図3Aは、最良マッチのヒトホモログ(被検体)を有するCG8327遺伝子産物(クエリー)のBLASTP検索結果を示す
【図３Ｂ】図3Bは、ヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号1; GenBankアクセッション番号NM_003132)の核酸配列を示す
【図３Ｃ】図3Cは、ヒトスペルミジン合成酵素(配列識別番号2; GenBankアクセッション番号NP_003123)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図３Ｄ】図3Dは、ヒトスペルミジン合成酵素(「HSNP_003123」と呼ぶ)、マウススペルミジン合成酵素(「Mm NP_033298」と呼ぶ)、およびショウジョウバエスペルミジン合成酵素(「Dm CG8327」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す
【図４Ａ】図4Aは、野生型マウス組織におけるスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図４Ｂ】図4Bは、異なるマウスモデルにおけるスペルミジン合成酵素発現のリアルタイム PCR 法を介した分析を示す
【図４Ｃ】図4Cは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR間接比較を示す
【図４Ｄ】図4Dは、3T3-F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のスペルミジン合成酵素発現のリアルタイムPCR間接比較を示す
【図５】図5は、2GPCR (GadFlyアクセッション番号CG10823)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図６】図6は、Gadflyアクセッション番号CG10823の変異型遺伝子座の分子構造を示す
【図７Ａ】図7Aは、ショウジョウバエCG10823のタンパク質のアミノ酸配列を示す(配列認識番号3)
【図７Ｂ】図7Bは、ヒトGタンパク質共役受容体74 (神経ペプチドFF2; 配列識別番号4; GenBankアクセッション番号NM_053036とも呼ぶ)の核酸配列を示す
【図７Ｃ】図7Cは、神経ペプチドFF2(配列識別番号5; GenBankアクセッション番号NP_444264)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図７Ｄ】図7Dは、ヒト神経ペプチドFF 1(配列識別番号6; GenBankアクセッション番号NM_022146)の核酸配列を示す
【図７Ｅ】図7Eは、ヒト神経ペプチドFF 1(配列識別番号7; GenBankアクセッション番号NP_071429)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図７Ｆ】図7Fは、ヒトオレキシン受容体1(配列識別番号8; GenBankアクセッション番号NM_001525)の核酸配列を示す
【図７Ｇ】図7Gは、ヒトオレキシン受容体1(配列識別番号9; GenBankアクセッション番号NP_001516)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図７Ｈ】図7Hは、ヒトオレキシン受容体2(配列識別番号10; GenBankアクセッション番号NM_001526)の核酸配列を示す
【図７Ｉ】図7Iは、ヒトオレキシン受容体2(配列識別番号11; GenBankアクセッション番号NP_001517)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図７Ｊ】図7Jは、ヒト神経ペプチドFF1受容体(「NPFF1Hs」と呼ぶ)、ヒト神経ペプチドFF2受容体(「NPFF2Hs」と呼ぶ)、ヒトオレキシン受容体1(「HCRTR1Hs」と呼ぶ)、ヒトオレキシン受容体2(「HCRTR2Hs」と呼ぶ)、およびショウジョウバエCG10823タンパク質(「CG10823 Dm」と呼ぶ)のClaustal W (1.83)複数配列アライメント分析を示す
【図８Ａ】図8Aは、野生型マウスの組織におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR 分析を示す
【図８Ｂ】図8Bは、野生型マウス組織におけるGpr74発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図８Ｃ】図8Cは、異なるマウスモデルにおけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイム PCR 法を介した分析を示す
【図８Ｄ】図8Dは、異なるマウスモデルにおけるGpr74発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図８Ｅ】図8Eは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への試験管内分化中におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図８Ｆ】図8Fは、3T3-F442A細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への試験管内分化中におけるRFアミド関連ペプチド受容体発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図９】図9は、ショウジョウバエキャリアタンパク質(Gadflyアクセッション番号CG18418)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図１０】図10は、ショウジョウバエキャリアタンパク質(Gadflyアクセッション番号CG18418)の変異型遺伝子座の分子構造を示す
【図１１Ａ】図11Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG18418 (クエリー)のBLASTP検索結果 を示す
【図１１Ｂ】図11Bは、ヒト溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号12; GenBankアクセッション番号NM_003562)の核酸配列を示す
【図１１Ｃ】図11Cは、ヒト溶質キャリアファミリー25 (ミトコンドリアのキャリア; オキシグルタミン酸キャリア)メンバー11(配列識別番号13; GenBankアクセッション番号NP_003553)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図１１Ｄ】図11Dは、ヒト溶質キャリア(「HSNP_003553」と呼ぶ)、マウス推定 溶質キャリア(「Mm BAB26319」と呼ぶ)、およびショウジョウバエCG18418 (「Dm CG18418」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す
【図１２Ａ】図12Aは、野生型マウスの組織におけるSlc25a11発現のリアルタイムPCR 分析を示す
【図１２Ｂ】図12Bは、異なるマウスモデルにおけるSlc25a11発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図１３】図13は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるEP(2)2162ハエ(「EP(2)2162」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す
【図１４】図14は、ショウジョウバエPka-R2 (GadFlyアクセッション番号CG15862)の変異型遺伝子座の分子構造を示す
【図１５Ａ】図15Aは、Pka-R2 (クエリー)のBLASTP検索結果を示した。ここに示したのは、最も高い相同値を有するヒトホモログ(被検体)のみである
【図１５Ｂ】図15Bは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号14; GenBankアクセッション番号NM_004157)の核酸配列を示す
【図１５Ｃ】図15Cは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、α(配列識別番号15; GenBankアクセッション番号NP_004148)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図１５Ｄ】図15Dは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号16; GenBankアクセッション番号NM_002736)の核酸配列を示す
【図１５Ｅ】図15Eは、ヒトタンパク質キナーゼ、cAMP依存型、調節型、2型、β (配列識別番号17; GenBankアクセッション番号NP_002727)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図１５Ｆ】図15Fは、ヒトPRKAR2Bタンパク質(「Hs PRKAR2B」と呼ぶ)、マウスPRKAR2Bタンパク質の断片(「MmPRKAR2B FR」と呼ぶ)、マウスPRKAR2Aタンパク質(「MmPRKAR2A」と呼ぶ)、ヒトPRKAR2Aタンパク質(「Hs PRKAR2A」と呼ぶ)、およびショウジョウバエPka-R2タンパク質(「Dm CG15862」と呼ぶ)のClaustal X (1.81)複数配列アライメント分析を示す
【図１６Ａ】図16Aは、野生型マウス組織におけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図１６Ｂ】図16Bは、異なるマウスモデルにおけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図１６Ｃ】図16Cは、糖尿病(db/db)マウスモデルにおけるPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図１６Ｄ】図16Dは、3T3-L1細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のPRKAR2A発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図１７】図17は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるEP(3)0650ハエ(「EP(3)0650」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す
【図１８Ａ】図18Aは、変異型CG3768遺伝子座のGadFlyデータベース入力を示す
【図１８Ｂ】図18Bは、変異型CG3768遺伝子座のBLAST検索結果を示す
【図１９Ａ】図19Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG31475 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す
【図１９Ｂ】図19Bは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号18; GenBankアクセッション番号NM_016176)の核酸配列を示す
【図１９Ｃ】図19Cは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号19; GenBankアクセッション番号NP_057260)の核酸配列(1文字コード)を示す
【図１９Ｄ】図19Dは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型2(配列識別番号20; GenBankアクセッション番号NM_016547)の核酸配列を示す
【図１９Ｅ】図19Eは、ヒトカルシウム結合タンパク質Cab45の前駆物質変異型1(配列識別番号21; GenBankアクセッション番号NP_057631)の核酸配列(1文字コード)を示す
【図１９Ｆ】図19Fは、GadFlyアクセッション番号CG3768 (「CG3768」と呼ぶ)およびヒトCab45タンパク質(GenBankアクセッション番号NP_057260.2;「Cab45」 と呼ぶ)によってコードされたショウジョウバエタンパク質のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す
【図２０Ａ】図20Aは、野生型マウス組織におけるCab45発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図２０Ｂ】図20Bは、異なるマウスモデルにおけるCab45発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図２１】図21は、ショウジョウバエrRNA(ウリジン-2'-O-)-メチル-トランスファーゼのタンパク質(GadFlyアクセッション番号CG11447)変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２２】図22は、ショウジョウバエrRNA(ウリジン-2'-O-)-メチルトランスフェラーゼ(Gadflyアクセッション番号CG11447)の変異型遺伝子座の分子構造を示す
【図２３Ａ】図23Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG11447 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す
【図２３Ｂ】図23Bは、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号22; GenBankアクセッション番号NM_013393)の核酸配列を示す
【図２３Ｃ】図23Cは、ヒト細胞分裂タンパク質FtsJ (配列識別番号23; GenBankアクセッション番号NP_037525)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図２３Ｄ】図23Dは、ヒトリボソームRNA(rRNA)メチルトランスフェラーゼ(「HSNP_037525」と呼ぶ)、マウスrRNAメチルトランスフェラーゼ(「Mm NP_080786」と呼ぶ)、およびショウジョウバエrRNAメチルトランスフェラーゼ(「Dm CG11447」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質配列アライメントを示す
【図２４Ａ】図24Aは、野生型マウス組織における細胞分裂周期によるタンパク質FtsJの発現のリアルタイムPCR分析を示す
【図２４Ｂ】図24Bは、異なるマウスモデルにおける細胞分裂周期によるタンパク質FtsJ発現のリアルタイムPCR間接分析を示す
【図２５】図25は、ゲノムの他の部分のこれらのベクター統合を有する対照(「HD-EP対照」と呼ぶ)と比較した、ホモ接合の生存可能なPベクター統合によって引き起こされるHD-EP32007(3)2007ハエ(「HD-EP32007」と呼ぶ)の中性脂肪含有量の増加を示す
【図２６】図26は、GadFlyアクセッション番号CG16750の変異型遺伝子座の分子構造を示す
【図２７Ａ】図27Aは、最良マッチのヒト相同性(被検体)を有するCG16750 (クエリー)のBLASTP 検索結果 を示す
【図２７Ｂ】図27Bは、PKR1(配列識別番号24; GenBankアクセッション番号NM_019006)に関連するヒトタンパク質の核酸配列を示す
【図２７Ｃ】図27Cは、PKR1に関連するヒトタンパク質(配列識別番号25; GenBankアクセッション番号NP_061879)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図２７Ｄ】図27Dは、ヒト亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号26; GenBankアクセッション番号NM_006007)の核酸配列を示す
【図２７Ｅ】図27Eは、ヒト神経ペプチド亜鉛フィンガータンパク質216 (配列識別番号27; GenBankアクセッション番号NP_005998)のアミノ酸配列(1文字コード)を示す
【図２７Ｆ】図27Fは、マウスタンパク質NP_075361.2(「Mm NP_075361」と呼ぶ)、ヒトAWP1タンパク質(「HSXP_044547」と呼ぶ)、およびGadFlyアクセッション番号CG16750によってコードされたショウジョウバエタンパク質(「Dm XP_0081233」と呼ぶ)のClustal X (1.81)タンパク質アライメントを示す
【図１】
2005519947.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
2005519947.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
2005519947.tif 000033
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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