(57)【要約】本発明はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＹが記載したとおり定義される式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物に関する。式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）および他のキナーゼ（ＫＤＲ）を阻害し、細胞増殖抑制特性を有し、そして、腫瘍の治療に特に適している。式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物は植物Ｕｖａｒｉａ  ｋｌａｉｎｅｒｉ、ＰＬＡ１００４８４の抽出により、植物Ｕｖａｒｉａ  ｋｌａｉｎｅｒｉの細胞培養により、或いは、化学合成により得ることができる。本発明はまた式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物の製造方法、悪性疾患およびＣＤＫおよびＫＤＲの阻害により治療できる疾患を治療するための医薬の製造のための該化合物の使用にも関する。式Ｉ：【化１】2005500976.tif 000016式ＩＩ：【化２】2005500976.tif 000017
2005500976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉ
【化１】
2005500976.tif 000012
および式ＩＩ
【化２】
2005500976.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は相互に独立して各々の場合、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニルまたは、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルで、これらは未置換であるかまたはＯＨ１個またはそれ以上で置換されたものであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は相互に独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｎ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｎ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、アシル、アリールまたはＳであり；
Ｙは１またはそれ以上のＨ、ハロゲン、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｏ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｏ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、ＮＨ２、ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、ＮＨ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、ＮＨ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、ＮＨ−アシル、ＳＨ、Ｓ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｓ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｓ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、アシルまたはアリールである］
の化合物、その全ての立体化学的形体、何れかの比率における該形態の混合物、およびその生理学的に許容される塩ならびに化学的等価物。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が相互に独立してＯ、ＮＨまたはＳであり、そして、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は相互に独立してＨまたはＣ１−Ｃ６−アルキルである、請求項１記載の式ＩまたはＩＩの化合物およびその生理学的に許容される塩ならびに化学的等価物。
【請求項３】
下記式ＩＡ
【化３】
2005500976.tif 000014
の化合物、その全ての立体化学的形体、何れかの比率における該形態の混合物、およびその生理学的に許容される塩ならびに化学的等価物。
【請求項４】
下記式ＩＩＡ
【化４】
2005500976.tif 000015
の化合物、その全ての立体化学的形体、何れかの比率における該形態の混合物、およびその生理学的に許容される塩ならびに化学的等価物。
【請求項５】
植物Ｕｖａｒｉａ  ｋｌａｉｎｅｒｉまたはその変異体もしくは突然変異体の何れかを抽出すること、または、植物ウバリア・クライネリを式ＩＡおよび／またはＩＩＡの化合物が植物内に蓄積するまで生育させること、およびその後の化合物の単離、そして、適宜、その化学的誘導体および生理学的に許容される塩への変換により得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。
【請求項６】
植物ウバリア・クライネリまたはその変異体もしくは突然変異体の何れかを培地中適当な条件下、式ＩＡおよび／またはＩＩＡの化合物が植物内に蓄積するまで培養すること、その後植物材料から単離し、適宜、その化学的誘導体および生理学的に許容される塩に変換することを包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の式ＩおよびＩＩの化合物またはその生理学的に許容される塩の調製方法。
【請求項７】
植物を熱帯または亜熱帯条件下で培養する請求項６記載の方法。
【請求項８】
医薬として使用するための請求項１〜５のいすれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容される塩。
【請求項９】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を阻害する医薬として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容される塩。
【請求項１０】
細胞増殖抑制剤として使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容される塩。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容される塩の少なくとも１つを含有する医薬処方物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物またはその生理学的に許容される塩の少なくとも１つを適当な賦形剤および／または担体を用いて適当な投与形態とすることを包含する、請求項１１記載の医薬処方物の調製方法。
【請求項１３】
細胞増殖抑制剤を製造するためのウバリア・クライネリの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、下記式Ｉ：
【化５】
2005500976.tif 000003
および式ＩＩ：
【化６】
2005500976.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＹは後に記載するとおり定義される］
の新しい化合物に関する。式Ｉおよび式ＩＩの化合物はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）および他のキナーゼ（例えばＫＤＲ）を阻害し、細胞増殖抑制作用を有し、そして、腫瘍の治療に特に適している。式Ｉおよび式ＩＩの化合物は植物ウバリア・クライネリ（Ｕｖａｒｉａ  ｋｌａｉｎｅｒｉ）、ＰＬＡ１００４８４の抽出により、植物ウバリア・クライネリの細胞培養により、或いは、化学合成により得られる。即ち本発明は式Ｉおよび式ＩＩの化合物の製造方法、悪性疾患およびＣＤＫおよびＫＤＲの阻害により治療できる疾患を治療するための医薬の製造のための該化合物の使用、並びに、式ＩまたはＩＩの化合物少なくとも１つを含有する医薬組成物にも関する。
【０００２】
癌は多くの場合致命的であり、内因性の細胞の制御不可能な成育により起こるヒトおよび動物の疾患である。「癌」という用語は悪性成育（悪性状態）および新生物（腫瘍または癌腫）の形成、または、白血球の悪性変性および成熟不全（白血病）を指す。癌または腫瘍の細胞は内因性細胞の変換により形成される。癌細胞の悪性状態は成育の自律性において、即ち、抑制されずに、そして臓器系統に統合されること無く成育し、浸潤し、組織破壊を伴うという能力において、自らを発現する。悪性状態の確かな徴候は、腫瘍細胞の血液原性またはリンパ原性の伝播の後に腫瘍から遠位に転移物が形成されることである。癌はヒトにおける最も頻度の高い死亡原因の１つであり、したがって、悪性変性の治癒または治療のための方法および薬剤が大きく望まれている。
【０００３】
可能であれば根本的な外科的腫瘍摘出に加えて、悪性腫瘍の治療法の選択肢にはＸ線、α、β、γ線による放射線療法、免疫両方および化学療法が含まれる。しかしながら今のところ、免疫療法の使用は制限されている。腫瘍の化学療法は、腫瘍細胞および局所的手術または放射線照射の後に残存する腫瘍細胞の治療のための細胞毒（細胞増殖抑制剤）の投与を意味すると理解されている。これらの物質は、急速に成育している腫瘍組織のような分裂細胞を高比率で有する組織がより高感度に応答するように、細胞分裂の特定の過程を特異的に妨害する。使用される薬剤はアルキル化剤、例えばシクロホスファミド（メルクインデックス、１２版、４６３頁）、抗代謝剤、例えばメトトレキセート（メルクインデックス、１２版、１０２５頁）、アルカロイド、例えばビンクリスチン（メルクインデックス、１２版、１７０４頁）および効性物質、例えばダウノマイシン（メルクインデックス、１２版、４７９頁）およびアドリアマイシン（メルクインデックス、１２版、５８１−５８２頁）である。しかしながら、多大な副作用のため、これらの薬剤は全て、患者の死亡を遅延させるのみで、これを防ぐものではないという大きな難点を有している。更にまた変性（癌）細胞は使用薬剤に対して耐性となり；このような場合は、従来の医薬はもはや細胞増殖抑制作用を有さず、副作用のために毒性を示すようになる。更にまた、細胞増殖抑制剤を組み合わせて、そして／または逐次的に使用することは個々の細胞増殖抑制剤の活性（一剤療法）を超過し、したがって、多剤化学療法における相当な副作用は相加的ではない可能性がある。このような理由全てのために、新しい化学療法剤が緊急に望まれており、従って全世界で研究されている。
【０００４】
意外にも、アフリカの植物ウバリア・クライネリが極めて低濃度でも細胞成育を抑制する高度に有効な新しい細胞増殖抑制剤を形成することができることを発見した。新しい化合物は以下にクライネチンと記載するが、これはクライネチン誘導体と共に、本発明の要件である。クライネチンはサイクリン依存性キナーゼを抑制する置換フェノールであり、したがって、細胞周期調節に影響する。癌においては細胞の増殖は異常に加速され、調節不可能となっているため、ＣＤＫ阻害剤は悪性変性の治療のための価値ある薬剤である。式Ｉの化合物は置換２，３−ジヒドロフラボン型に属し、環構造は、Ｈ．Ａｃｈｅｎｂａｃｈ等によりＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４４，ｐ．３５９−３６４，１９９７において最も新しく記載されているイソカマネチンの構造に相当する。本発明の式Ｉの化合物は新しい置換イソカマネチンである。
【０００５】
式ＩＩの化合物はカルコン種の化合物に属し、環構造および炭素骨格はウバレチンのものに相当する。ウバレチンは多くのＵｖａｒｉａ種において検出されている（Ｍ．Ｈ．Ｈ．Ｎｋｕｎｙａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．５７，３４１−３４３，１９９１；Ｉ．Ｍｕｈａｍｍａｄ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４８，５７１−８０，１９８５）。式ＩＩの本発明の化合物は置換と脱水素によりウバレチンとは異なり、文献にはまだ記載されていない。その化学構造が異なることにより、式ＩＩおよびＩＩの化合物は新規性および物理化学的、生物学的および薬理学的特性を有する。一方、現在まで知られている物質は不十分な作用水準、高い毒性および／または望ましくない副作用として表される不都合な点を有している場合が多い。
【０００６】
したがって本発明は全ての立体化学的形体の、式Ｉ：
【化７】
2005500976.tif 000005
および式ＩＩ：
【化８】
2005500976.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は相互に独立して各々の場合、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニルまたはＣ２−Ｃ６−アルキニルで、これらは未置換であるかまたはＯＨ１個、またはそれ以上で置換されたものであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は相互に独立して、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｎ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｎ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、アシル、アリールまたはＳであり；
Ｙは１、またはそれ以上のＨ、ハロゲン、ＯＨ、Ｏ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｏ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｏ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、ＮＨ２、ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、ＮＨ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、ＮＨ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、ＮＨ−アシル、ＳＨ、Ｓ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｓ−Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｓ−Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、アシルまたはアリールである］
の化合物、何れかの比率における該形態の混合物、およびその生理学的に許容性のある塩に関する。
【０００７】
式ＩおよびＩＩにおいて、
Ｃ１−Ｃ６−アルキルは炭素原子１〜６個を有する直鎖または分枝鎖のアルキル、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチルおよびヘキシルであり、Ｃ２−Ｃ６−アルケニルは炭素原子２〜６個を有する直鎖または分枝鎖のアルケニル、例えばアリル、クロチルおよびペンテニルであり、そして、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルは炭素原子２〜６個を有する直鎖または分枝鎖のアルキニル、例えばプロピニル、ブチニルおよびペンチニルである。
【０００８】
アリールは例えば、フェニル、ベンジル、１−または２−ナフチルであり、これらは未置換であるか、または、例えば、塩素、臭素およびフッ素のようなハロゲンにより、炭素原子１〜４個のアルキル、好ましくは、メチルにより、ヒドロキシルにより、炭素原子１〜４個のアルコキシ、特にメトキシにより、および／またはトリフルオロメチルにより置換されていてよい。
【０００９】
アシルは脂肪族または芳香族のアシル基であることができる。脂肪族アシルは、炭素原子１〜７個、好ましくは１〜４個を有し、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ヘキサノイル、アクリロイル、クロトノイル、プロピオロイルであり、これらは更に、例えば塩素、臭素およびフッ素のようなハロゲンにより、アミノにより、および／または炭素原子１〜４個を有するアルキルアミノ、好ましくはメチル−またはエチルアミノ基により置換されていてよい。芳香族アシルは、例えば、ベンゾイルまたはナフトイルであり、これはまた更に例えば塩素、臭素およびフッ素のようなハロゲンにより、炭素原子１〜４個を有するアルキル、好ましくはメチルにより、ヒドロキシルにより、アミノ基、例えばエチルアミノにより、または、炭素原子１〜７個、好ましくは炭素原子１〜４個を有するアルコキシ基、特にメトキシにより置換されていてよい。
【００１０】
式Ｉにおいて、Ｘ１Ｒ１、Ｘ２Ｒ２およびＸ３Ｒ３は好ましくはＯＨであり、Ｘ４Ｒ４は好ましくはＯ−Ｃ１−Ｃ４−アルキルであり、そしてＹはＨであり；式ＩＩにおいて、Ｘ１Ｒ１、Ｘ２Ｒ２、Ｘ３Ｒ３およびＸ４Ｒ４は好ましくはＯＨであり、Ｘ５Ｒ５は好ましくはＯ−Ｃ１−Ｃ４−アルキルであり、そしてＹはＨである。
【００１１】
即ち本発明は全ての立体化学的形体の、式ＩＡ：
【化９】
2005500976.tif 000007
のクライネチンＡ、および何れかの比率における該形態の混合物、およびその生理学的に認容性のある塩に関する。
【００１２】
本発明は更に、式ＩＩＡ：
【化１０】
2005500976.tif 000008
のクライネチンＢに関する。
【００１３】
本発明によれば式Ｉの化合物は植物ウバリア・クライネリまたはその変異体または突然変異体の何れかを適当な条件下に抽出することにより得られる。クライネチンはその後の化合物の単離、および、適宜、その化学的誘導体および生理学的に許容性のある塩に変換することにより製造される。
【００１４】
従って本発明は更に式Ｉおよび／またはＩＩの化合物の調製方法に関し、これは、植物ウバリア・クライネリまたはその変異体または突然変異体の何れかを適当な条件下、式ＩＡおよび／またはＩＩＡのクライネチン１種、またはそれ以上が植物材料内に蓄積するまで培養すること、その後植物部分から単離し、適宜、その化学的誘導体および／または生理学的に許容性のある塩に変換することを包含する。
【００１５】
植物ウバリア・クライネリ、その突然変異体および／または変異体は好ましくは、植物内に新規なクライネチンが蓄積するまで熱帯または亜熱帯の気候における適当な土壌中で成育され；クライネチンがその後植物から単離され、適宜、個々の活性成分に分画される。
【００１６】
植物は好ましくは熱帯条件下、特に１８〜４５℃の温度の高湿度において良好に生産される。
【００１７】
別の可能性は細胞培養による作物の生産である。この目的のためには、植物ウバリア・クライネリの生存細胞を適当な培地に移し、本発明の化合物が培地中に蓄積されるまで培養細胞を成育させる。
【００１８】
細胞培養は好ましくはカルス培養により行なう。培地は無機質およびビタミンのほかに、炭素源、例えばスクロース、および窒素源、例えば窒素塩を含有する。次にクライネチンを培養細胞から単離し、そして、適宜、個々の活性成分に分画する。
【００１９】
フラボン類またはフェノール類の化学修飾のための多くの反応が文献に記載されている。従って本発明の化合物のフェノール性ＯＨは自体公知の化学反応を用いて誘導体化することができる。例えば水素を用いて接触還元により飽和化合物とするか、または、金属水素化物、例えば水素化アルミニウム、またはホウ化水素を用いてカルボニル基を還元することができる。他の好ましい例はカルボニル基のヒドロキシルアミンまたはその誘導体との反応によりオキシムを生じさせ、これを、その部分について、更に化学変換させることができる。
【００２０】
本発明は、特にその好ましい実施態様において以下に詳述する。本発明のクライネチンはウバリア・クライネリにより生産される。ウバリア・クライネリはバンレイシ科の広範に生息する常緑のつる植物である。バンレイシ科には多くの熱帯の有用な薬草が含まれる。その地理的範囲は全熱帯であり；クライネチンが単離される試料はガボン、特にラビ／ガンバ周辺の地区で収集されている。
【００２１】
クライネチンの単離のためにＵｖａｒｉａ属の他の種または異なる地域に生じる同種の別の植物を用いることも可能である。クライネチンの含量および組成は地域の条件、例えば土壌の質、温度、湿度および日照等により異なり得る。
【００２２】
本発明の方法は実験室規模（１００ｇ〜１ｋｇ）の乾燥植物材料および工業的規模（１００〜１０００ｋｇ超）で抽出および単離するために使用してよい。
ウバリア・クライネリは植物材料中のクライネチンの混合物を与える。植物の収穫期およびその部分に応じて、本発明のクライネチンの一種、またはそれ以上の量的比率は変動し得る。更に、クライネチン１種、またはそれ以上が植物から少しも生成されないか、或いは検出限度未満の量で生成されるように、個々のクライネチンの合成を成育条件を介して制御することができる。
【００２３】
植物材料は好ましくは、検出可能なクライネチンを含有する。クライネチンＡおよびＢが形成されることが好ましい。
クライネチンＡおよびＢ（それぞれ式ＩＡおよびＩＩＡの化合物）のほかに、植物ウバリア・クライネリはその上また、ヒドロキシル化またはグリコシル化が異なることにより式ＩＡおよびＩＩＡで表される化合物とは区別される関連化合物を生成する。従って４０８Ｄａの分子量を有する別のクライネチンが副生成物として検出された。
【００２４】
植物は路地栽培してよく、または、好ましくは、温室栽培し、そして、別法として、代謝産物を生成するために植物細胞培養を用いることもできる。通常は、原料はカルス培養物である。植物培養細胞の成育のための適当なバイオリアクターの選択により、植物細胞、細胞成育および代謝産物生産に影響するような大きすぎる剪断力を用いることなく、培養物に対して旨適な混合および通気を行なうことが可能である。培養物は例えばエアリフトリアクターまたはバブルカラムリアクターを用いて混合してよく、そしてまたブレードまたはプロペラ攪拌機も使用される。細胞は個々の細胞として、または、分枝状または未分枝状の細胞凝集塊または細胞連鎖物として成育できる。代謝産物の生産は外因性の因子、例えば重金属塩または植物誘導剤で刺激することにより誘導され得る。
【００２５】
植物内の生成物の形成は培養物のｐＨに基づき、または、クロマトグラフィー法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーにより、または、生物活性の試験によりモニタリングすることができる。本発明のクライネチンは葉および植物の他の部分に含有される。後に記載する単離方法により本発明のクライネチンを精製、好ましくは、クライネチンＡおよびＢを精製することができる。
【００２６】
本発明のクライネチンは天然物質の化学的、物理的および生物学的性質に関する既知の方法に従って植物および培地から単離精製した。原料および個々の単離段階におけるクライネチンの濃度は例えばシリカゲル上で、移動相としてクロロホルム／メタノール／氷酢酸／水の混合物（例えば定量的な８：１：１：０．２の比）を用いて薄層クロマトグラフィーにより、または、ＨＰＬＣにより測定することができる。薄層クロマトグラフィーの分画のためには、検出は、例えば、発色試薬、例えばヨウ素蒸気、塩化鉄（ＩＩＩ）、バニリン−Ｈ２ＳＯ４またはパウリ試薬（スルファニリン酸、ジアゾ化）を用いて行なうことができ、形成された物質の量を標準溶液と適宜比較する。
【００２７】
本発明のクライネチンは植物を収穫し、即ち、先ず葉、茎、木部、樹皮または根を採取し、好ましくは新鮮時または乾燥後に上記植物を定法に従って抽出し、次に場合により含水した有機溶媒を用いて植物材料からクライネチンを抽出することにより、単離する。有機溶媒層は本発明のクライネチンを含み、それらは、適宜、減圧下で濃縮され、下記のように、さらに精製される。
【００２８】
抽出液を合わせ、水で希釈し、水非混和性の適当な有機溶媒、例えばｎ−ブタノールで抽出する。その後、分離した有機層を、適宜、減圧下に濃縮する。脂質は本発明のクライネチンが殆ど溶解しない非極性溶媒、例えばヘキサン、石油エーテルおよびジエチルエーテル等で濃縮物を希釈することにより目的生成物から除去することができる。その際クライネチンが沈殿し、ワックス等の親油性夾雑物は溶液中に残存し、従来の固液分離法により除去される。全てのクライネチンを含有する沈殿を初期容量の１／３０の水／メタノールに溶解する。沈殿を徐々に溶解させ、凍結乾燥する。凍結乾燥物は以下に記載する「粗生成物」であり、０．５〜１０％のクライネチンを含有し、その後の単離に用いる。
【００２９】
１種またはそれ以上の本発明のクライネチンは、適当な物質上、好ましくは、モレキュラーシーブ上、例えばシリカゲルおよび酸化アルミニウムのような正相支持体上、例えばイオン交換剤上、または、吸着樹脂または逆相（ＲＰ）物質上のクロマトグラフィーにより更に精製する。クライネチンは上記クロマトグラフィーにより分離される。クライネチンのクロマトグラフィーは緩衝水溶液または水溶液と有機溶液の混合物を用いて行なわれる。
【００３０】
「水溶液と有機溶液の混合物」という用語は、水と混和性の全ての有機溶媒、好ましくは、メタノール、２−プロパノールおよびアセトニトリルで、濃度１０〜８０％溶媒、好ましくは１５〜５５％溶媒であり、残余が有機溶媒と混和性の全ての緩衝水溶液であるものを意味する。使用される緩衝剤は上記したものと同様である。
【００３１】
クライネチンは、その異なる極性により、逆相クロマトグラフィーを用いて、例えばＭＣＩ（Ｒ）（吸着樹脂、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，Ｊａｐａｎ）またはアンバーライトＸＡＤ（Ｒ）（ＴＯＳＯＨＡＡＳ）上で、他の疎水性材料、例えばＲＰ−８またはＲＰ−１８相上で、または「ポリアミド」上で分離する。さらに、分離は正相クロマトグラフィーを用いて、例えばシリカゲル、酸化アルミニウム等の上で行ってよい。
【００３２】
クライネチンのクロマトグラフィーは緩衝された、または酸性化された水溶液、或いは、水溶液とアルコールまたは他の水混和性の有機溶媒との混合物を用いて行なわれる。好ましく使用される有機溶媒はプロパノールおよびアセトニトリルである。
【００３３】
「緩衝された、または酸性化された水溶液」という用語は、例えば、水、リン酸塩緩衝液、酢酸アンモニウム、クエン酸塩緩衝液が濃度１ｍＭ〜０．５Ｍ、および、更に、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸および当業者が知る全ての市販の酸が好ましくは濃度０．０１〜３％、特に０．１％であるものを意味する。
【００３４】
クロマトグラフィーは１００％水性緩衝液から始まり、１００％溶媒で終わる勾配を用いて行なわれ；１０〜５０％２−プロパノールまたはアセトニトリルの連続した直線勾配が好ましい。
【００３５】
或いは、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水相上のクロマトグラフィーを行なうことも可能である。
ゲルクロマトグラフィーはポリアクリルアミドゲル、または、混合重合体ゲル、例えばバイオゲル−Ｐ２（Ｒ）（Ｂｉｏｒａｄ）、フラクトゲルＴＳＫＨＷ４０（Ｒ）（Ｍｅｒｃｋ，ＧｅｒｍａｎｙまたはＴｏｓｏ  Ｈａａｓ，ＵＳＡ）またはセファデックス（Ｒ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で行なわれる。
上記したクロマトグラフィーの順序は可逆である。
【００３６】
別の極めて有効なクライネチン精製工程は結晶化である。クライネチンは有機溶媒中の溶液から、および、水と有機溶媒の混合物から結晶化する。結晶化は自体公知の方法、例えば飽和クライネチン溶液を濃縮または冷却することにより行われる。
【００３７】
本発明のクライネチンは固体状態、および、ｐＨ３〜８の範囲、特に４および６の溶液中で安定であり、従って、慣用的な医薬組成物に製剤できる。
式ＩおよびＩＩのクライネチンおよび誘導された化学誘導体は当業者の知る方法で相当する生理学的に認容性のある塩に変換することができる。
【００３８】
式ＩおよびＩＩの化合物の「生理学的に許容性のある塩」という用語は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅ  １４１８（１９８５））に記載の有機および無機の塩の双方を意味する。物理学的および化学的安定性および溶解度に鑑みて、酸性の基には、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびアンモニウム塩が殊に好ましく；塩基性の基には、塩酸、硫酸、リン酸またはカルボン酸またはスルホン酸、例えば酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびｐ−トルエンスルホン酸の塩が殊に好ましい。
【００３９】
本発明は更に、化学的にはわずかに異なっており、即ち、同様の有効性を有するか、または穏やかな条件下で本発明の化合物に変換できる式ＩおよびＩＩの化合物の化学的等価物を包含することも当然である。このような等価物には例えば本発明の化合物のエステルおよびエーテルおよび還元生成物が包含される。
【００４０】
エステルおよびエーテル誘導体並びに還元生成物は、文献記載の方法、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．，１９９２に記載の方法に従って調製することができる。
【００４１】
本発明は式ＩおよびＩＩの化合物の全ての立体異性型を包含する。式ＩＡおよびＩＩＡの化合物中に含まれる不斉中心はすべて相互に独立してＳ配置またはＲ配置の何れかを有する。本発明は全てのあり得るエナンチオマーおよびジアステレオマーおよび同様に立体異性型２種またはそれ以上の混合物、例えばエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物の如何なる比率のものも包含する。即ち本発明は左旋性および右旋性の双方の対掌体としての、ＲおよびＳ配置の鏡像的に純粋なエナンチオマー、全ての比率のラセミ混合物の形態、そして、エナンチオマー２種の混合物の形態に関する。シス／トランス異性がある場合は、本発明はシス型およびトランス型の双方、全ての比率におけるこれらの形態の混合物に関する。
【００４２】
生物学的クライネチン活性の測定のための分析：
分析系はＣＤＫファミリーのキナーゼ、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ）およびＫＤＲ（チロシンキナーゼ受容体）であり、これらは細胞周期の調節および血管形成において重要な役割を有する。ＣＤＫ４はリン酸化反応を介して反応カスケードを開始し、その終点において、細胞周期はＧ１期からＳ期に進行する。即ち、その後の細胞分裂およびその後の非調節の細胞成育はこのキー酵素が阻害されると止められる。ＫＤＲは内皮細胞の成育および血管形成において重要な役割を有するチロシンキナーゼ受容体であり、従って同様に腫瘍形成に関与している。即ちＣＤＫ４およびＫＤＲは癌および他の増殖性疾患の重要な治療標的分子となる。分析には特異的なペプチド基質のリン酸化に基づくＣＤＫ４およびＫＤＲキナーゼ活性の測定が含まれる。上記したキナーゼに対する阻害活性のほかに、癌の形成および炎症カスケードに同様に関与する他のキナーゼもまたクライネチンにより阻害される。
【００４３】
価値ある薬理学的特性により、本発明の化合物はヒトにおける医薬および／または家畜用の医薬としての特定の用途に適している。本発明の化合物は癌に対して、特に化学療法剤として使用してよい。細胞増殖抑制特性、特に、その強力な抗腫瘍活性により、そして抗微生物作用により、特に動物およびヒトにおける悪性変性に対する細胞増殖抑制剤として使用してよい。
【００４４】
従来の薬剤に対して耐性を獲得した腫瘍細胞において、新しい薬剤のみが治療上十分な作用を有する。即ち、式ＩおよびＩＩの本発明のクライネチンおよびその化学誘導体は上記した問題となる細胞型に対しても潜在的に顕著な作用を有する。
【００４５】
本発明は本発明のクライネチンおよび／またはその化学誘導体の１種、またはそれ以上を含有する医薬製剤に関する。適当な賦形剤または担体物質との混合物として使用するのが好ましい。ヒトにおいて使用してよい担体物質は全ての薬理学的に許容される担体物質および／または賦形剤である。
【００４６】
本発明はまた本発明の化合物の少なくとも１つを製薬上適する、そして、生理学的に認容性のある担体、および、適宜、更に別の適当な活性物質、添加剤または賦形剤と共に、適当な投与形態とすることを包含する本発明の医薬の調製方法に関する。
【００４７】
本発明の医薬は一般的に、経口、局所または非経腸投与するが、直腸投与も原則として可能である。適当な固体または液体の医薬製剤の形態は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、座剤、シロップ、乳液、懸濁液、エアロゾル、ドロップ剤またはアンプル中の注射用溶液および／または除放性製剤であり、これらの製剤形態の製造には通常、担体および添加剤および／または補助剤、例えば錠剤崩壊剤、バインダー、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤または潤滑剤、フレーバー剤、甘味料または可溶化剤の使用が含まれる。頻繁に使用される担体または賦形剤として挙げられるものは、例えば、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖類、タルク、ラクトアルブミン、ゼラチン、澱粉、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物性または植物性の油脂、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコール等である。
【００４８】
適宜、コーティングにより、または、適当な重合体、ワックス等の中に粒子形態の活性物質を包埋することにより、放出を遅延させるかより長期間に渡り延長するために、経口投与のための単位用量をマイクロカプセル化することも可能である。
【００４９】
本発明のクライネチンおよび／またはその化学誘導体１種、またはそれ以上の特定の用量を活性成分として各々の単位が含有する、投与単位中に医薬製剤を製造して投与するのが好ましい。１日につき、錠剤、カプセルおよび座剤のような固体剤単位の場合は、上記用量は約５００ｍｇまで、好ましくは約０．１〜２００ｍｇ、アンプル内の注射溶液の場合は約５００ｍｇまで、好ましくは約０．１〜１００ｍｇとする。
投与すべき一日当たり用量は患者の体重、年齢、性別および状態により異なる。しかしながら、より高用量または低用量の一日当たり用量も特定の状況下には適する場合がある。一日当たり用量は単回投与単位の形態における、または数回のより低用量の単位における単回投与、および、特定の間隔を置いて細分された用量の複数回の投与の双方により投与され得る。
【００５０】
本発明は更に以下の実施例により説明される。パーセンテージは重量によるものである。液体の混合非は特段の記載が無い限り容量によるものである。
【００５１】
【実施例】
実施例１  ウバリア・クライネリの一次抽出液の調製
ウバリア・クライネリの葉を新鮮な状態で採取し、次に約４０℃で風乾する。乾燥後、乾燥した材料１００ｇを粉砕し、８時間４０℃でメタノール１Ｌで攪拌しながら抽出する。最終抽出の後、植物破砕物を濾去し、メタノール抽出液を減圧下に蒸発させ、概ね乾固させる。残留物を再度少量の水に再懸濁し、次に凍結乾燥する。この様にして製造した一次抽出液を４℃または−２０℃で保存するか、実施例３に示すとおり更なる単離に用いる。生物学的活性はタンニンおよび他の強親水性または親油性の妨害物質をポリアミドおよびポリスチレン吸着樹脂上のクロマトグラフィーにより除去することにより分析する。
【００５２】
実施例２
植物の生産：種子の収集、播種、生育条件および収穫条件
ウバリア・クライネリの種子を成熟後に採取し、温室中で植物を更に栽培するために播種することができる。旨適温度は湿度７０〜９０％で約２８℃である。植物を数週間〜数箇月、好ましくは約４〜６ヶ月、葉を収穫できるまで栽培する。
【００５３】
実施例３
植物ウバリア・クライネリからのクライネチン混合物の単離
ウバリア・クライネリ収穫後、実施例１に従って得られた乾燥葉２００ｇを粉砕機で粉砕し、メタノール２リットル中で１６時間攪拌し、その後濾過する。活性物質含有メタノール溶液を減圧下に濃縮し、乾燥塊３．０５ｇとする。濃縮物を（Ｒ）ＭＣＩ  ＧＥＬ，ＣＨＰ２０Ｐ４１２ｍｌの入った調製済みカラムに適用する。溶離は水中９０％アセトニトリルの後、水中１０％アセトニトリルの勾配を用いて行なう。カラムのフロースルー（５０ｍｌ／分）を画分（各５０ｍｌ）として収集し、クライネチン含有画分３１および３２（クライネチンＡ）および５１〜５６（クライネチンＢ）を合わせる。減圧下に濃縮し、凍結乾燥し、２６ｍｇ（クライネチンＡ粗生成物）および７０ｍｇ（クライネチンＢ粗生成物）の茶色粉末を得る。
【００５４】
実施例４
逆相ＲＰ−１８上でのクライネチンＡ成分の精製
（Ｒ）スーパースフィア１００ＲＰ−１８ｅ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を１９．７ｍｌのプレパラティブＨＰＬＣカラム（１ｃｍ（ＩＤ）×２５ｃｍ Ｈ）に導入し、実施例３において得られたクライネチンＡ粗生成物混合物２６ｍｇを適用する。適用したカラムを予め水中２５％アセトニトリル１４０ｍｌ、ついで水中３０％アセトニトリル６０ｍｌで洗浄した後に、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液ｐＨ７中３０％アセトニトリルで溶離する。カラムのフロースルーを１０ｍｌ／分とし、各々１０ｍｌの画分を採取する。クライネチンＡはフラクション２５および２６に存在する。減圧下に濃縮して凍結乾燥した後、純度＞９７％のクライネチンＡ９．８ｍｇが得られる。
ＥＳＩ＋ＭＳ：３９３．４ Ｄａ（Ｍ＋Ｈ）＋，４３１．２ Ｄａ（Ｍ＋Ｋ）＋；ＥＳＩ−ＭＳ：３９１．５ Ｄａ（Ｍ−Ｈ）−
【００５５】
実施例５
クライネチンＡの定性
外観：明黄色の物質、極性有機溶媒には可溶であるが水には僅かに溶解するのみである。化合物は中性および弱酸性の環境で安定であるが、アルカリ性および強酸性の領域では不安定である。
ＵＶ極大：２０７、２８６、３１８（Ｓｈ）ｎｍ、水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ２中、および、２５３、２８８（Ｓｈ）および３２５ｎｍ、水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ７中。
【００５６】
高分解能質量スペクトル分析によれば、分子質量（Ｍ＋Ｈ）＋：３９３．１３３９４Ｄａであり、クライネチンＡの分子式Ｃ２３Ｈ２０Ｏ６に相当する。
ＭＳ／ＭＳフラグメント化を用いた電子スプレーイオン化（ＥＳＩ、正イオン）におけるイオン：３９３、２８９、２８３、２７１、１３１および１２３Ｄａ。ＭＳ／ＭＳフラグメント化を用いた電子スプレーイオン化（ＥＳＩ、負イオン）におけるイオン：３９１、２６９および１０９Ｄａ。
ＮＭＲシグナル：表１参照。
【００５７】
【表１】
2005500976.tif 000009
【００５８】
実施例６
逆相ＲＰ−１８上でのクライネチンＢ成分の精製
（Ｒ）スーパースフィア１００ＲＰ−１８ｅ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を１９．７ｍｌのプレパラティブＨＰＬＣカラム（１ｃｍ（ＩＤ）×２５ｃｍ Ｈ）に導入し、実施例３において得られたクライネチンＢ粗生成物混合物７０ｍｇを適用する。溶離は酢酸アンモニウム水溶液中５０％アセトニトリル、ｐＨ７．３の後の０．０１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液中３５％アセトニトリル、ｐＨ７．３の勾配により行なう。カラムのフロースルーを１０ｍｌ／分とし、各々１０ｍｌの画分を採取する。クライネチンＢはフラクション１０〜１４に存在する。減圧下に濃縮して凍結乾燥した後、クライネチンＢ３８ｍｇが得られる。
ＥＳＩ＋ＭＳ：３９３．３ Ｄａ（Ｍ＋Ｈ）＋，ＥＳＩ−ＭＳ：３９１．５ Ｄａ（Ｍ−Ｈ）−
【００５９】
実施例７
クライネチンＢの定性
外観：明黄色の物質、極性有機溶媒には可溶であるが水には僅かに溶解するのみである。化合物は中性および弱酸性の環境で安定であるが、アルカリ性および強酸性の領域では不安定である。
ＵＶ極大：２１５（Ｓｈ）、３４８ｎｍ、水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ２中、および、２１９（Ｓｈ）、３０２および３８５ｎｍ、水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ７中。
【００６０】
高分解能質量スペクトル分析によれば、分子質量（Ｍ＋Ｈ）＋：３９３．１３３９１Ｄａであり、クライネチンＢの分子式Ｃ２３Ｈ２０Ｏ６に相当する。
ＭＳ／ＭＳフラグメント化を用いた電子スプレーイオン化（ＥＳＩ、正イオン）におけるイオン：３９３、２８９、２８３、２７１および１２３Ｄａ。ＭＳ／ＭＳフラグメント化を用いた電子スプレーイオン化（ＥＳＩ、負イオン）におけるイオン：３９１、２８１、２６９および１０９Ｄａ。
【００６１】
クライネチンＢは分子式Ｃ２３Ｈ２０Ｏ６を有しており、分子質量は３９２，４１Ｄａである。
ＮＭＲシグナル：表２参照。
【００６２】
【表２】
2005500976.tif 000010
【００６３】
実施例８
細胞増殖抑制効率分析（ＩＣ５０決定）
細胞増殖抑制活性は３８４ウェルのマイクロプレート（コーティングされたフラッシュプレート、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）中の精製酵素を用いて決定する。酵素活性は各々の特異的ペプチド基質のリン酸化により決定する。予め準備した１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６２５、０．７８１３、０．３９０６、０．１９５、０．０９４、０．０４７および０μＭの濃度のクライネチンの連続希釈物を適切な順序でウェルに分注する。次に反応混合物（放射標識ＡＴＰ、緩衝溶液、ｐＨ７．４および酵素溶液）を添加し、ついで、１時間室温でインキュベートする。
【００６４】
ＣＤＫ４反応混合物の性状：
キナーゼ緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、１ｍＭオルトバナデート、１ｍＭフッ化ナトリウム、および、１ｍＭ  ＤＴＴ；
フラッシュプレートコーティング用ビオチニル化ペプチド基質（１ｍｇ／ｍｌ溶液、ＰＢＳ緩衝液中）
ＡＴＰ溶液：１００μＣｉ／ｍｌ３３Ｐ−γ−ＡＴＰおよび１０μＭ  ＡＴＰサイクリンＤ１／ＣＤＫ４酵素溶液：キナーゼ緩衝液中１００ｍｇ／ｍｌ
洗浄溶液：３％リン酸
最終容量：５０μｌ
希釈クライネチン溶液３０μｌ、ＡＴＰ／酵素溶液２０μｌ（終濃度、１μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ、２μＭ  ＡＴＰおよび酵素１μｇ）
室温で２時間インキュベーションし、その後洗浄溶液８０μｌで３回洗浄、そしてマイクロベータカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で３０秒計測。
【００６５】
ＫＤＲ反応混合物の性状：
キナーゼ緩衝液：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ  １０ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、１ｍＭオルトバナデートおよび１ｍＭフッ化ナトリウム。
ペプチド基質：ＰＬＣγ１
ＡＴＰ溶液：２５μＣｉ／ｍｌ３３Ｐ−γ−ＡＴＰおよび１２．５μＭ  ＡＴＰ
ＫＤＲ酵素溶液：キナーゼ緩衝液中３．５μｇ／ｍｌ
洗浄溶液：ＰＢＳ（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋非含有）
最終容量５０μｌ
１０μｌ希釈クライネチン溶液、酵素溶液２０μｌ（３．５μｇ／ｍｌ；７０ｎｇ／ウェル）、ＡＴＰ溶液２０μｌ（終濃度０．５μＣｉおおび５μＭ  ＡＴＰ／ウェル）
室温で１時間インキュベーションし、その後、洗浄溶液７５μｌで３回洗浄、そしてマイクロベータカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で３０秒計測。
キナーゼ（ＣＤＫ４またはＫＤＲ）の活性はＡＴＰから基質への放射性ホスフェートの取り込みにより測定し、それからクライネチンの阻害活性（ＩＣ５０）を計算する。
【００６６】
【表３】
2005500976.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2005500976.tif 000018
2005500976.tif 000019
2005500976.tif 000020
2005500976.tif 000021
2005500976.tif 000022
2005500976.tif 000023
2005500976.tif 000024
2005500976.tif 000025
2005500976.tif 000026
2005500976.tif 000027
2005500976.tif 000028
2005500976.tif 000029
2005500976.tif 000030
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2005500976.tif 000032
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2005500976.tif 000040
2005500976.tif 000041
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2005500976.tif 000043
2005500976.tif 000044
2005500976.tif 000045
2005500976.tif 000046
【国際調査報告】
2005500976.tif 000047
2005500976.tif 000048
2005500976.tif 000049
2005500976.tif 000050
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2005500976.tif 000053
2005500976.tif 000054