(57)【要約】【課題】生体材料を安定化して、安全な状態で保存し輸送し予調合できる生成物を提供する。【解決手段】この発明は、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体に可逆的に固定化された１または複数の帯電生体材料を含む生成物であって、当該生成物が乾燥形態にあり、それがイオン交換体に固定化された予め調合した量の生体材料を含むことを特徴とする生成物に関する。この生成物は、帯電生体材料を安定化し、保存し、輸送しおよび予め調合するのに有用である。この発明は、また、当該生成物の調整にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体に可逆的に固定化された１または複数の帯電生体材料を含む生成物であって、
当該生成物が乾燥形態にあること、および
それがイオン交換体に固定化された予め調合した量の生体材料を含む
ことを特徴とする生成物。
【請求項２】
請求項１に記載の生成物において、
前記イオン交換体が弱陰イオン交換体である
ことを特徴とする生成物。
【請求項３】
請求項２に記載の生成物において、
前記弱陰イオン交換体がポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチル基を持つ化合物である
ことを特徴とする生成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の生成物において、
前記帯電生体材料が核酸類、オリゴヌクレオチド類およびヌクレオチド類からなるグループから選択される
ことを特徴とする生成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の生成物において、
前記帯電生体材料が放射線標識ヌクレオチドである
ことを特徴とする生成物。
【請求項６】
請求項５に記載の生成物において、
前記ヌクレオチドがＨ−３、Ｃ−１４、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓ−３５、Ｉ−１２５から選択される１または複数の放射性同位元素で放射線標識されている
ことを特徴とする生成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の生成物であって、
さらに、中性色素を含む
ことを特徴とする生成物。
【請求項８】
プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体に可逆的に固定化された予め調合した量の１または複数の帯電生体材料と、
随意に中性色素と
を含んでなるキット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットにおいて、
前記イオン交換体が弱陰イオン交換体である
ことを特徴とするキット。
【請求項１０】
請求項９に記載のキットにおいて、
前記弱陰イオン交換体がポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチル基を持つ化合物である
ことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載のキットにおいて、
前記帯電生体材料が核酸類、オリゴヌクレオチド類およびヌクレオチド類からなるグループから選択される
ことを特徴とするキット。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれかに記載のキットにおいて、
前記帯電生体材料が放射線標識ヌクレオチドである
ことを特徴とするキット。
【請求項１３】
請求項１に記載の生成物を１または複数種含んでなるキット。
【請求項１４】
ａ）イオン交換体を１または複数の帯電生体材料の適切な溶液で処理することにより、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体上に１または複数の予め調合した量の帯電生体材料を固定化するステップと、
ｂ）前記溶液を除去するステップと、
ｃ）固定化した生体材料／イオン交換体システムを乾燥するステップと
を含んでなり、請求項１に記載の生成物を調製する方法。
【請求項１５】
ａ）イオン交換体を１または複数の帯電生体材料の適切な溶液で処理することにより、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体上に１または複数の予め調合した量の帯電生体材料を固定化するステップと、
ｂ）前記イオン交換体を中性色素の適切な溶液で処理することにより前記イオン交換体上に前記中性色素を固定化するステップと、
ｃ）前記溶液を除去するステップと、
ｄ）固定化した生体材料／イオン交換体システムを乾燥するステップと
を含んでなり、請求項７に記載の製品を調製する方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、
前記色素の固定化が前記生体材料の固定化の前、同時または後に実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれかに記載の方法において、
前記イオン交換体が弱陰イオン交換体である
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
前記弱陰イオン交換体がポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチル基を持つ化合物である
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１４から１８のいずれかに記載の方法において、
前記帯電生体材料が核酸類、オリゴヌクレオチド類およびヌクレオチド類からなるグループから選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれかに記載の方法において、
前記帯電生体材料が放射線標識ヌクレオチドである
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、
前記放射線標識ヌクレオチドを含むイオン交換体が前記放射線標識ヌクレオチドの分解を防ぐ溶液ですすぎ洗いされる
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体上に１または複数の帯電生体材料を可逆的な形で固定化することと、
固定された生体材料／イオン交換体システムを乾燥することと
を含んでなる帯電生体材料を安定化する工程。
【請求項２３】
プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体上に１または複数の帯電生体材料を可逆的な形で固定化することと、
固定された生体材料／イオン交換体システムを乾燥することと
を含んでなる帯電生体材料を保存し輸送する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、帯電生体材料を含む新規な生成物およびそれを調製する方法に関し、したがって、前記生体材料を安定化し、保存し、輸送しおよび予め調合する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の分野が大きく進歩した結果、生体材料の利用が増大してきている。これら化合物の取扱い関連して、生体材料を取り扱うに際して多くの問題が生じている。
【０００３】
生命科学の分野で用いる各種材料や化学物質は、量的に多い形で一般に入手可能である。このため、使用者は１回の実験で必要な各種材料の量を計算して、調合(dispense)（そのために少量ずつ「分注」することも意味する）している。生命科学の分野では、溶液の調合には、一般的にピペッターと使捨て式プラスチック製チップが用いられる。調合は、なくてはならない作業ではあるが、特に同じ実験を何度も繰り返す場合には時間のかかる退屈な作業である。放射性物質の場合には、さらに放射線のリスクと汚染のリスクを伴う危険な工程である。
【０００４】
放射線分解、熱的および生物学的に分解しやすい放射線標識ヌクレオチドの需要は、特に高い。これら物質が持つ元来の性質は、それらを使用するまで確実に維持されなければならない。放射活性ヌクレオチドのような放射性物質の安全な輸送および保管は、極めて重要である。
【０００５】
各種方法の感度を上げるために、現代の分子生物学では高い比活性を持つ（実際的に無担体）放射線標識化合物を第一に必要としている。最近では、放射線標識ヌクレオチドの従来の輸送方法、すなわちドライアイス保存による凍結状態で輸送する方法を用いないことが求められている。高い比活性と輸送の室温は、分解を高める要因である。
【０００６】
肉眼で見ることのできる量の物質を予め調合しまたは分ける解決方法は、幾つかある。米国特許第６，３４３，７１７号によれば、使い捨て式ピペットが、ピペット本体内に前もって充填されている液体の医薬品または化粧品の保管および調合（分注）に用いられる。
【０００７】
しかし、この解決方法は、生命科学分野では取扱い量が極めて少量であることから、適切ではない。この問題を解決する試みは、文献には見あたらない。
【０００８】
放射線標識された有機化合物の分解、特に放射線標識ヌクレオチドの分解は、長期にわたり使用者と製造者の両方に大きな問題を提示してきた。−２０℃または−８０℃の温度での保管およびドライアイスを使った輸送といった従来用いられてきた方法に加え、最近では、分解から化合物を保護する添加物（安定化剤、ラジカル捕捉剤、阻害剤、酸化防止剤等）を併せ用いて実施される無凍結での保管および輸送が普及しつつある。
【０００９】
技術文献および特許文献には、これら不都合を除くための提案が数多く載っている。
【００１０】
米国特許第４，３９０，５１７号によれば、放射線標識化合物の溶液が、その溶液に不溶性の主鎖を持ち、その主鎖に第４アンモニウム基または水溶性の第１、第２、若しくは第３脂肪族アミンが結合している化合物を添加することで安定化する。
【００１１】
米国特許第４，４１１，８８１号では、チオカルボニル化アミン類が安定化剤として用いられている。
【００１２】
米国特許第４，７９３，９８７号によれば、放射線標識有機化合物類がピリジン・カルボン酸の誘導体で安定化される。
【００１３】
米国特許第５，７３８，８３６号によれば、β線を放射する放射性核種で標識された有機化合物がヘテロアリール類、アリール類およびアルキルアミン類からなるグループから選択される化合物により、好ましくは中性色素との組合せで安定化される。
【００１４】
米国特許第５，８１１，０７２号および第５，９２２，３０１号によれば、放射線標識されたアミノ酸およびヌクレオチドが、トリプトファン、パラアミノ安息香酸塩、酢酸インドールおよびアゾール群から選択される化合物により、好ましくは各種色素との共同で安定化される。
【００１５】
放射線標識化合物の自己分解は、原子エネルギレビュー(Atomic Energy Review)、１０巻、３〜６６頁（１９７２年）に詳しく論じられており、そして数種類の化合物が安定化剤として提案されている。
【００１６】
上記方法の全てが持つ不都合は、生成物が実際には不必要な、ある場合には有害なまたは妨害になる添加物を含むことである。安定化剤の濃度は、通常、放射線標識物質の濃度よりも数桁高い。さらなる不都合は、放射線標識物質が溶液になっている場合に生じ、それは、いくつかの応用例では容積増量物質として用いられる水でさえも妨害となり、使用者がサンプルを乾燥させなければならないからである。上記方法で提案される溶液の形の放射線標識物質が持つさらに別の不都合は、使用者が汚染の危険のあるサンプルを分けなければならないことである。
【００１７】
溶液の形の放射線標識化合物であることのさらなる不都合は、使用者による化合物の発送および回収に特殊な容器が必要なことである。米国特許第５，７８３，８３２号は、３つの部品から構成される包装システムを提案している。最も内側のコンテナは、輸送中にチューブ内面上に付着した物質を集めることができる遠心チューブである。この方法の欠点は、材料を使用する前に使用者が遠心分離を行わなければならないことであるが、それは、放射性物質の場合、危険でかつ不便な操作であり、そのうえ時間の損失を生じる。
【００１８】
米国特許第５，９２２，３０１号によれば、輸送中の内面上への物質の付着がスプラッシュガードにより内容液をバイアルの底に封じ込めることで防ぐことができる。この特許明細書の提案する解決方法の欠点は、内面の汚染を最小限に止めはするが、汚染を防ぐ訳ではなく、結果として使用者にとって物質の一部が失われることである。
【００１９】
製造者は、放射線標識ヌクレオチド類の輸送、保管および安定化に最適な解決方法を探し続けている。放射線標識ヌクレオチド類は、極めて不安定であり、放射線分解の結果として、極めて迅速に固体および液体のいずれの形での使用にも不適当なものになる。
【特許文献１】
米国特許第６，３４３，７１７号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，３９０，５１７号明細書
【特許文献３】
米国特許第４，４１１，８８１号明細書
【特許文献４】
米国特許第４，７９３，９８７号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，７３８，８３６号明細書
【特許文献６】
米国特許第５，８１１，０７２号明細書
【特許文献７】
米国特許第５，９２２，３０１号明細書
【特許文献８】
米国特許第５，７８３，８３２号明細書
【特許文献９】
ハンガリー特許出願第Ｐ０１０１１４５号明細書
【非特許文献１】
Atomic Energy Review、１０巻、３〜６６頁（１９７２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
この発明の目的は、帯電生体材料、特に放射線標識ヌクレオチドの安定化、輸送、保管および予調合（前分注）の解決方法を見いだすことである。
【００２１】
したがって、この発明の目的の一つは、生体材料を可能な最善の品質で使用者に届けるために、生体材料の製造品質を維持することである。分解からの保護は、放射線標識ヌクレオチドの場合に特に重要である。
【００２２】
この発明の別の重要な目的は、可能な最善の効率で最も簡単な方法により、輸送に用いる装置から生体材料を回収できる解決方法を見いだすことである。
【００２３】
放射線標識ヌクレオチドの場合は、さらに、危険物質としての放射活性生成物の輸送および保管に関係する諸規則の要求を満たすことも必要である。
【００２４】
これらの目的および課題は、可能な限りコストを低くし、最も簡単な方法で、経済的に解決すべきである。
【００２５】
この発明は、適当なイオン交換体層内に応用される周知のイオン交換のプロセスが、帯電生体材料の保管、輸送、安定化および予調合のための装置を提供する、可逆的に固定化された固体形態に帯電生物材料を変えるための適切な手法である、という驚くべき発見に基づいている。
【００２６】
イオン交換は、イオン化物質またはイオン化可能物質の可逆的固定化のために適切な方法である。イオン交換体のイオン基と適当な溶液に溶解した帯電生体材料のイオン基との間の静電相互作用は、溶媒除去後も保存される。そのため、帯電性生体材料を溶液から特殊な固体形態に変えることができる。この固体形態は、前記生体材料の輸送、保管および予調合に優れた可能性をもたらす。さらに、イオン結合が帯電基を分解から保護できる。
【００２７】
放射線標識ヌクレオチドの場合は、放射線標識ヌクレオチドは極めて不安定な物質であるにも拘わらず、それらを特殊なタイプのイオン交換体に結合すると、室温でさえも、その良好な品質を長期間保つことが見いだされた。ヌクレオチドのリン酸基は、大きな負の電荷を持っているため、適切に選ばれたイオン交換体と溶媒とを用いることにより、与えられた放射線標識ヌクレオチドが溶解状態またはイオン交換体に静電的に結合した形で存在する、ということが達成できる。適当な溶媒組成物を用いることにより、供給者は帯電生体材料をイオン交換体に結合でき、そして使用者はイオン交換体からこれら物質を溶出できる。これら二つの事象の間、帯電生体材料は、イオン交換体と結合した乾燥状態で保存しおよび輸送することができる。固体のイオン交換体に結合した帯電生体材料を含む生成物は、これら材料の保存、輸送および使用を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
帯電生体材料の保存、輸送、安定化および予調合に関する上記全ての必要条件は、イオン交換体をプラスチック製ピペットチップの内面上に固定化することで満たすことができる。
【００２９】
したがって、この発明は、プラスチック製ピペットチップの内面に固定化されたイオン交換体に可逆的に結合する、予め調合した量の１種または複数種の帯電生体材料と随意に中性色素とを含む乾燥形態の生成物を提供する。
【００３０】
さらに、この発明は、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体に可逆的に固定化された、予め調合した量の１種または複数種の帯電生体材料と随意に中性色素を備えてなる帯電生体材料を含むキットを提供する。
【００３１】
この発明は、また、以下のステップを含む上記生成物を調製する方法を提供する。
ａ）イオン交換体を１種または複数種の帯電生体材料の適切な溶液で処理することにより、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体上に１種または複数種の帯電生体材料の予め調合した量を固定化するステップ、
ｂ）随意に、イオン交換体を中性色素(indifferent dye)の適切な溶液で処理することにより、イオン交換体上に中性の色素を固定化するステップ。
ｃ）溶液を取り出すステップ。
ｄ）固定化した生体材料／イオン交換体システムを乾燥するステップ。
【００３２】
色素の随意の固定化は、生体材料の固定化の前、同時、または後に行うことができる。
【００３３】
さらに、この発明は、プラスチック製ピペットチップの内面に結合したイオン交換体に１種または複数種の帯電生体材料を可逆的に固定化／結合するステップ、および固定化された生体材料／イオン交換体システムを乾燥するステップを含んでなる工程（プロセス）を提供する。
【００３４】
この出願において、用語「生体材料」は、生体の維持および代謝工程（プロセス）に関与する如何なる物質をも意味し、それには、例えば、タンパク質類、酵素類、抗体類、抗原類、ペプチド類、アミノ酸類、サッカリド類、糖類、脂質類、脂肪酸類、薬物類、リガンド類、核酸類、オリゴヌクレオチド類、ヌクレオチド類、それらの共役物類または混合物類など、合成類似体およびその放射線標識体が含まれる。
【００３５】
用語「帯電生体材料」は、イオンの形態を持つまたは持ち得る如何なる生体材料をも意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
好ましくは、この発明は、ピペットチップ内におけるバッチ式イオン交換手法の原理の応用により達成される。
【００３７】
この発明によれば、いずれのタイプのイオン交換体も使用することができる。生体材料の帯電状態（負電荷または正電荷）に応じて、陰イオン交換体または陽イオン交換体が固定化のために用いられる。イオン性の電荷のｐＨ依存性および生体材料の安定性のｐＨ依存性により、使用すべきイオン交換体のタイプ（弱い、または強い）が決まるであろう。イオン交換は、平衡プロセスであることから、イオン交換の法則に従って、イオン交換体上への帯電生体材料の固定化はお低イオン強度の溶液中で行われ、そしてイオン交換体からの帯電生体材料の逆溶出は、強イオン強度の溶液中で行われる。
【００３８】
適当な濃度の帯電生体材料の溶液を加えることで、前記生体材料の予調合が可能であり、すなわち１回の実験に必要なだけの分量の帯電生体材料類を１本のチップ内に固定化できる。１本のピペットチップの中に複数の予調合された生体材料を固定化することができるし、または複数のピペットチップが同一溶出液で溶出可能であるので、ピペットチップ上に固定化された帯電生体材料から構成される各種の試薬キットを作ることができる。
【００３９】
この発明の好適な実施態様では、この発明による生成物は、弱陰イオン交換体、好ましくは、ポリエチレンアミン、またはジエチルアミノエチル基を持つ化合物を含んでいる。弱陰イオン交換体の使用は、ヌクレオチドを結合するためには好都合であるが、それは、それらが強イオン交換体に比べて扱いやすいからである。
【００４０】
この出願の目的のためには、ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ（製造者：Institute of Istopoes Ltd.、ブダペスト、ハンガリー）が好都合に使用できる（このピペットチップは、ハンガリー特許出願第Ｐ０１０１１４５号に詳しく記載されている）。このピペットチップの内面は、０．０１ｍｌの容積に相当する高さまで固定化ポリエチレンイミン層でコーティングされている。
【００４１】
プラスチック製ピペットチップの表面上に固定化されたイオン交換体は、例えばハンガリー特許出願第Ｐ０１０１１４５号に詳細に記載された工程で調製することができる。この特許出願によれば、プラスチック表面をコーティングするプロセスは、以下のステップを含んでいる。
i) コーティングすべきプラスチック内に１または複数の内部試薬（内部反応剤）を吸収させるステップ、
ii) 前記プラスチックの表面に１または複数の外部試薬（外部反応剤）を接触させるステップ、
iii) 前記プラスチックの境界層に共に拡散する内部試薬と外部試薬間の化学反応により、好ましくは添加物の存在下で、固定化コーティングを形成するステップ。
【００４２】
ポリエチレンイミンは、弱陰イオン交換体として、放射線標識生体材料のイオン交換体への結合、およびその回収を容易にするが、それはその能力がｐＨ値の変化に伴って変化し、さらにそれが第１、第２、および第３アミン基を含んでいて、それらが自己酸化を阻害するからである。イオン交換体のマトリックスの自己酸化低下効果を伴うイオン交換体上への固定化の結果、この方法で固定化されたヌクレオチド類は、室温においても保存し輸送することができ、その安定性は、安定剤を含む溶液中にあるまたは凍結状態で保存された放射線標識ヌクレオチド類の安定性と同じ、またはそれ以上でさえある。同時に、この発明が提案する生成物は、凍結または安定化剤の添加による安定化の欠点を排除しており、その結果、放射性物質が大量の不活性バラストに汚染されることを回避する。
【００４３】
この発明の好適実施態様では、生成物は中性の色素も含む。
【００４４】
帯電生体材料のイオン特性に似たイオン特性を有する中性色素を用いると、色素が吸着／脱着の工程の進行程度を示す。すなわち、固定化の終了までに、着色ローディング液が無色になり、チップの無色層に色がついてくる。これに対し、溶出の間は、チップの着色層は無色になり、無色の溶出液は着色されてくる。
【００４５】
この発明の好適な実施態様では、生成物は、核酸類、オリゴヌクレオチド類およびヌクレオチド類からなるグループから選択される１種または複数種の帯電生体材料を含む。
【００４６】
好ましくは、この発明の生成物は、Ｈ−３、Ｃ−１４、Ｐ−３２、Ｐ−３３、Ｓ−３５およびＩ−１２５からなるグループから選択された１種または複数種の放射性同位元素で放射線標識された１種または複数種のヌクレオチド（類）を含む。
【００４７】
好ましくは、この発明のキットは、弱イオン交換体、好ましくはポリエチレンイミンまたはジエチルアミノエチル基を持つ化合物を含む。好ましくは、キットは、核酸類、オリゴヌクレオチド類およびヌクレオチド類からなるグループから選択された１種または複数種の帯電生体材料を含む。より好ましくは、帯電生体材料は、放射線標識ヌクレオチドである。
【００４８】
この発明による方法の好適な実施態様では、生体材料として放射線標識ヌクレオチドを含む生成物を調製し、放射線標識ヌクレオチドを含むイオン交換体がヌクレオチドの分解を防ぐ溶液ですすぎ洗いされる。
【００４９】
随意であるが、固定化すべき生体材料に比べてイオン交換体に対する親和性が低いカウンタイオンの濃縮液で前処理してもよい。好ましくは、イオン交換体のこの前処理は、次のステップ：蒸留水を用いて洗浄することにより過剰の塩を取り除くステップ、ローディングバッファで平衡化するステップ、そして、使用が延期される場合には、アルコールで洗浄し乾燥するステップをも含む。
【００５０】
この発明による生成物の形での保存、輸送および安定化は、現在まで用いられている保存、輸送および安定化の方法（−２０℃で凍結するか、または溶液中での添加物による安定化）と本質的に異なっている。この発明が提案する形、すなわちイオン交換体に結合した形での放射線標識ヌクレオチドの安定性は、伝統的な方法により作られる形でのそれらの安定性と同じか、またはそれ以上でさえある。生成物の持つ高い安定性は、おそらくは、特定の分散形態、高いエネルギー含有量を持つリン酸基のイオン結合、ならびにヌクレオチドの糖および塩基成分とイオン交換体のマトリックスとの間の相互作用に拠るものである。
【００５１】
この発明の生成物が高い安定性を持つ別の理由は、おそらくは、水を欠いていることである。すなわち、溶液の形で調製された放射線標識生体材料の放射線の多くの部分が溶媒に吸収され、同時に放射線標識生体材料を損傷するラジカル類、イオン類、過酸化物類およびその他の化学物質が大量に形成される。
【００５２】
好ましくは、ピペットチップは、１回の実験にだけ十分な量の生体材料を含む。こうすることで、使用者は、サンプルの蒸発による損失とパラメータの変化を常に伴うサンプルを調合する必要がなくなる。この解決法の別の利点は、使用者がピペットチップから高イオン強度溶液を使って生体材料を簡単に洗い出すことができることである。この目的のために、例えば、生体材料の応用に関係する酵素反応の緩衝液も利用できる。この方法では、使用者は、生体材料、特に放射線標識物質の問題の多い調合から免除され、反応混合液の容量を増やすことなく、生体材料を反応系に加えることができる。
【００５３】
現在まで適用されてきた方法に比べて、この発明の別の利点は、イオン交換層に固定化する結果として、生体材料が溶媒を持たない乾燥状態となり、したがって、その輸送および包装が簡素化され経費が小さくなる。放射活性物質の輸送に関する規則によれば、液体に比べ固体では「除外される」包装の放射活性限界値は、１０倍高い。放射線標識物質の場合、ドライアイスによる冷却または液体の輸送に伴って生ずる問題（例えば、内表面への物質の汚着、物資回収の困難、事故の場合の環境への物質の漏洩等）を除く必要がない。
【００５４】
この発明の生成物を応用することで、放射線標識物質の使用が極めて簡素化されるが、それは、物質が溶解するのを待つ必要がないからである。さらに、物質の滴下、または開封容器の転倒の可能性による汚染の危険がない。
【００５５】
凍結調製体または溶液安定化調製体に対するこの発明の生成物のさらなる利点は、水を含めいかなる不必要な物質も、使用者のシステムに入り込まないことである。これに対して、従来の方法で調整された放射活性物質は、不必要な、時には妨害することもある成分を大量に含み、時に１０ｍＭのオーダの濃度に達すことさえある。
【００５６】
この発明の大きな利点は、この発明による生成物の生体材料が精製されることであり、それは、固定化−溶出のプロセスが実際にイオン交換精製を行うからである。
【００５７】
この発明を以下の実施例を用いて例証するが、保護の範囲を限定するものではない。前述の例は、単に特定の好適の実施例の詳しい説明をしたものであると理解しなければならない。したがって、当業者にとって、この発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更および等価をなすことが可能であることが、明らかというべきである。
【００５８】
［実施例］
プラスチック製ピペットチップの表面に固定されたイオン交換体の調製
２ｍｌの開放容器を２０ｍｌのネジ蓋付きの容器の中に入れる。塩化オキサリル（内部試薬）５μｌとトリクロロエチレン（中性溶媒）１００μｌからなる混合物を２ｍｌの開放容器に入れる。２００μｌ容積のポリプロピレン製ピペットチップ３本を、当該２０ｍｌの容器の中に当該試薬の入った容器の隣に入れる。外側の容器を閉鎖した後、このシステムを一晩インキュベートする。３０μｌの３％ポリエチレンイミン水溶液を外部試薬としてピペットチップ内に吸い込ませ、次いでこれらチップを一晩、蒸気キャビネット内でインキュベートする。溶液を取り除いた後、それらピペットチップを水とアルコールで洗い、真空乾燥オーブン内で８０℃で８時間乾燥する。
【実施例１】
【００５９】
この発明の生成物を調整する全般的手法
ピペットチップのイオン交換層の前処理
プラスチック製ピペットチップの内面上に固定化したイオン交換体を２ＭのＮａＯＨ溶液で２０分間処理してから、次いで蒸留水で中性になるまですすぎ洗いする。このイオン交換体を２Ｍの酢酸で２回、２０分間処理してから、次いで蒸留水で中性になるまですすぎ洗いする。最後に、このイオン交換体をアルコールですすぎ洗いし、乾燥する。このイオン交換層の処理は、所望の液をピペットチップ内に吸い上げ、次いでそのイオン交換体をこの溶液と一緒にインキュベーとすることにより実施した。この手法により、塩化物またはその他の形態のイオン交換体が、より好ましい酢酸型に変化する。
【００６０】
生体材料の固定化
生体材料の低イオン強度溶液（１ｍＭ以下）を前処理したピペットチップ内に吸い込ませ、２０分間インキュベートする。溶液を取り出した後、そのピペットチップを蒸留水で数回すすいぎ、次いで乾燥する。これで、このサンプルは、保管または輸送に対して準備が調う。
【実施例２】
【００６１】
各種イオン交換体の比較
以下の組成の試験液を前処理したイオン交換体に加える：
トリス−酢酸塩          １ｍＭ、ｐＨ５．０
ジチオトレイトール      １０ｍＭ
放射線標識ヌクレオチド  １００ｐｍｏｌｅ、〜４０，０００Ｂｑ（Ｔ＝合計）
実験２(ａ)から２(ｅ)に使用する放射線標識ヌクレオチドは、Institute of Isotopes Ltd.、ブダペスト、ハンガリーの製品である。２０分間インキュベートした後、取り出した試験液に残存する放射活性を測定する（Ｆ＝フリー）。試験液を取り出した後、イオン交換体を蒸留水とアルコールで数回すすぐ。アルコール除去後、各種イオン交換体を乾燥し、密封して冷蔵庫内に一晩保管する。翌日イオン交換生成品を２ＭのＮａＣｌ溶液で５分間処理する。インキュベートした後、塩溶液（Ｂ＝結合）の放射活性を測定する。結果を［表１］に示す。
実験２(ａ)
ヌクレオチド：アデノシン５’［γ−35Ｓ］チオ三リン酸：［γ−35Ｓ−ＡＴＰ］
イオン交換体：ネジ蓋付き１ｍｌボトルに入った１０×５ｍｍのＤＥＡＥセルロースのＴＬＣプレート（Macherey-Nagel、フランス）
実験２(ｂ)
ヌクレオチド：ウリジン５’［γ−35Ｐ］三リン酸：［α−33Ｐ−ＵＴＰ］
イオン交換体：ネジ蓋付き１ｍｌボトルに入った１０×５ｍｍのＰＥＩセルロースのＴＬＣプレート（Merck、ドイツ）
実験２(ｃ)
ヌクレオチド：アデノシン５’［γ−32Ｐ］三リン酸：［γ−32Ｐ−ＡＴＰ］
イオン交換体：蓋付き２００μ１アンプルに密封された５ｍｇのＤＥＡＥセファデックス（Pharmacia、スウェーデン）
実験２(ｄ)
ヌクレオチド：アデノシン５’［γ−32Ｐ］三リン酸：［γ−32Ｐ−ＡＴＰ］
イオン交換体：自動オリゴヌクレオチド合成に使用するミニクロマトグラフィカラムに密封された、５ｍｇのＤＥＡＥセファセル（Pharmacia、スウェーデン）
実験２(ｅ)
ヌクレオチド：アデノシン５’［γ−32Ｐ］三リン酸：［γ−32Ｐ−ＡＴＰ］
イオン交換体：架橋によりその内面に固定化されたポリエチレンイミン層を含むＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ（Institute of Isotopes Ltd.，ブダペスト、ハンガリー特許出願第Ｐ０１０１１４５号参照）。
【００６２】
【表１】
2005500021.tif 000002
【００６３】
上記の結果は、いくつかのイオン交換体が放射線標識ヌクレオチドを効果的に結合する（（Ｔ−Ｆ）／Ｔ）のとイオン交換体からヌクレオチドを回収する（Ｂ／（Ｔ−Ｆ））に好適であることを示している。方法全体の全効率（Ｂ／Ｔ）も良好であった。各種システムは、それぞれ結合したヌクレオチドの安全な保管と輸送に好適である。
【００６４】
実施例２(ａ)から２(ｄ)、特に実施例２(ｄ)では、ヌクレオチドの吸着と溶出に複数種類の１００μｌの溶液が必要であったのに対し、実施例２(ｅ)では、１０μｌの溶液のみで完全に可能であったという観点から、これら種々のシステムの間には、顕著な違いがある。これらシステム間のその他の違いは、イオン交換層の接着力に由来する。実施例２(ａ)および２(ｂ)では、イオン交換層の接着は完全でなく、剥がれた部分の分離が困難である。実施例２(ｃ)では、固相と液相を分離するのに遠心分離が必要である。実施例２(ｄ)では、フィルタのメッシュサイズがイオン交換体に適合していれば、問題はない。
【００６５】
これに対し、実施例２(ｅ)では、液相の分離は問題を起こさないが、それは架橋により固定されたイオン交換層が担体に強固に接着しているからである。ピペットチップ表面上に固定化されたイオン交換体の利用の最大の利点は、その応用が使用者に優しい簡便さであると同時に、ヌクレオチド「容器」が調合装置でもあることである。
【実施例３】
【００６６】
ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップを使った実験
チップを実施例１のように処理し、シチジン５’［α−32Ｐ］三リン酸［α−32Ｐ−ＣＴＰ］を上記のようにしてイオン交換層上に固定化する。各種のｐＨ値、濃度および基質の１０μｌの溶液（トリス塩酸、トリス酢酸塩、ＮａＯＨ）を前処理かつ乾燥したチップに加える。イオン交換層と溶液間の平衡を達成するために、これらチップは、１時間インキュベートする。インキュベートした後、試験溶液を取り出し、溶液中に残ったヌクレオチドの量（Ｆ）、すなわち溶液の放射活性を測定する。２ＭのＮａＣｌ溶液で溶出した後、イオン交換層に結合したヌクレオチドの量（Ｂ）を溶出物の放射活性を測定して決定する。溶液中に残ったヌクレオチドとイオン交換層に結合したヌクレオチドの合計量は、いずれの例でも−誤差範囲内で−ヌクレオチド総量（Ｔ）に等しい。［表２］は、対応する濃度ごとのイオン交換層に結合したヌクレオチドの割合（Ｂ／Ｔ）を示している。
【００６７】
【表２】
2005500021.tif 000003
【実施例４】
【００６８】
ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップへのヌクレオチドの結合
実施例１のように前処理したピペットチップを様々な時間、１ｍＭのトリス−酢酸緩衝液に溶解した［α−33Ｐ−ＣＴＰ］ヌクレオチドとともにインキュベートし、固定化したヌクレオチドを含むピペットチップを様々な時間、０．５ＭのＮａＣｌ溶液とインキュベートする。［表３］は、測定値を示す。
【００６９】
【表３】
2005500021.tif 000004
【００７０】
上記の結果は、吸着−脱着プロセスが濃度および時間に大きく依存していることを示している。
【実施例５】
【００７１】
ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップからの放射線標識ヌクレオチドの溶出
放射線標識ヌクレオチドを、実施例２に記載したようにＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップに結合する。放射線標識ヌクレオチドとして、グアノシン５’［γ−32Ｐ］三リン酸［γ−32Ｐ−ＧＴＰ］を用いる。ヌクレオチドを溶出するために、分子生物学で一般的な次の未希釈緩衝液を、それぞれの例で１０μｌの量、使用する。
【００７２】
ＰＮＫ  Ａ：Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ  １０×フォワード反応緩衝液（MBI Fermentas、リトアニア）
５００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．６
１００ｍＭのＭｇＣｌ2
５０ｍＭのＤＤＴ
１ｍＭのスペルミジン
１ｍＭのＥＤＴＡ
【００７３】
ＰＮＫ  Ｂ：Ｔ4ポリヌクレオチドキナーゼ  １０×交換緩衝液（MBI Fermentas、リトアニア）
５００ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ６．４
１８０ｍＭのＭｇＣｌ2
５０ｍＭのＤＤＴ
１ｍＭのスペルミジン
１ｍＭのＥＤＴＡ
１ｍＭのＡＤＰ
【００７４】
Ｔｄｔ：ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ  ５×反応緩衝液（MBI Fermentas、リトアニア）
１Ｍのカコジル酸カリウム、ｐＨ７．２
５ｍＭのＣｏＣｌ2
０．５ｍＭのＤＤＴ
０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
【００７５】
クレノウ：ＤＮＡポリメラーゼ・クレノウ断片  １０×反応緩衝液（MBI Fermentas、リトアニア）
５００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０
５０ｍＭのＭｇＣｌ2
１０ｍＭのＤＤＴ
【００７６】
Ｔ３／Ｔ７：Ｔ３／Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  ５×転写緩衝液（Promega、米国）
２００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．９
３０ｍＭのＭｇＣｌ2
５０ｍＭのＤＤＴ
５０ｍＭのＮａＣｌ
１０ｍＭのスペルミジン
【００７７】
ＤＮＡポリメラーゼ：ＤＮＡポリメラーゼＩ  １０×反応緩衝液（MBI Fermentas、リトアニア）
５００ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５
１００ｍＭのＭｇＣｌ2
１０ｍＭのＤＤＴ
【００７８】
放射線標識ヌクレオチドは、所定の緩衝液を１０倍に上げることによりピペットチップから溶出する。［表４］は、測定値を示す。
【００７９】
【表４】
2005500021.tif 000005
【００８０】
上記の結果は、試験した緩衝液が放射標識ヌクレオチドの溶出に完全に好適であることを示す。この結果は、放射線標識ヌクレオチドと一緒に用いた他の反応緩衝液が同様の濃度の成分を含むことから、一般化してもよい。
【実施例６】
【００８１】
ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップに結合した放射線標識ヌクレオチドの量の恒常性
同一の［γ−32Ｐ−ＧＴＰ］溶液１０μｌを７本の前処理したＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ（１から７までの印を付ける）に加える。２０分間インキュベートした後、チップから溶液を取り出し、その活性を測定する。［表５］の結果は、各ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップに結合した放射活性ヌクレオチドの量には、極僅かの違いしかないことを示している。標準偏差は、０．３％であり、変動係数の値も０．３％である。
【００８２】
【表５】
2005500021.tif 000006
【実施例７】
【００８３】
固定化された放射線標識ヌクレオチドの各種保存期間における安定性
５０μＣｉのα−33Ｐデオキシシチジン三リン酸［α−33Ｐ−ｄＣＴＰ］、７３μＣｉのα−32Ｐアデノシン三リン酸［α−３２−Ｐ−ＡＴＰ］および３１μＣｉのγ−32Ｐグアノシン三リン酸［γ−32Ｐ−ＧＴＰ］をＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ内で固定化する。［γ−32Ｐ−ＧＴＰ］の場合は、保存前のアルコールでのすすぎ洗いをジチオトレイトールの１０ｍＭアルコール液のすすぎ洗いに変える。ピペットチップ内で固定化されたヌクレオチドを＋４℃で冷蔵庫内の密封バッグに入れ保存する。時々固定化ヌクレオチドを含むピペットチップを定量的および定性的に分析する。放射線標識ヌクレオチドをチップからＰＮＫ緩衝液を用いて溶出する。液体シンチレーションカウンタを用いて溶解物質の量を測定し、薄層クロマトグラフィを用いてその質を分析する。［表６］は、測定値を示す。
【００８４】
【表６】
2005500021.tif 000007
【００８５】
回収の場合は、放射活性の減衰による損失でもって量の数値を補正する。イオン交換層に結合した放射線標識ヌクレオチドが長期間の保存後でも−実際上−損失なしに回収できることが確証できる。ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ内に非可逆的に結合したヌクレオチドの量は、無視できる。イオン交換層上に固定化したヌクレオチドの安定性は、極めて良好である。
【００８６】
これに対して、同一条件（＋４℃、冷蔵庫内）ではあるが溶液中に保存されたヌクレオチドは、有意の分解を示す。１５日間で、溶液中に保存されたα−32Ｐ−ＡＴＰの純度は、３９．３％に低下したが、γ−32Ｐ−ＧＴＰの純度は、４３．６％に低下した。
【００８７】
ヌクレオチドの輸送可能性を試験するために、放射線標識α−32Ｐ−ＡＴＰを含むピペットチップおよび放射標識γ−32Ｐ−ＧＴＰを含むピペットチップを−それぞれ冷蔵庫内で１４日間と１５日間保存した後−室温で３日間保存して、輸送状態をシミュレーションした。分析結果（表６）は、室温での保存が有害な影響を及ぼさないことを示している。イオン交換層に結合した放射線標識ヌクレオチドが冷却することなしに輸送できることが確証できる。
【実施例８】
【００８８】
ＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップ内に保存された放射線標識ヌクレオチドの生物学的利用性
冷蔵庫内に４℃で１１日間保存した後、４μｌの５×転写緩衝液を用いて５０μＣｉのα−32Ｐシチジン三リン酸［α−32Ｐ−ＣＴＰ］を含むＷＡＸ−Ｔｉｐピペットチップから放射線標識ヌクレオチドを溶出する。転写キット（Promega、米国）のさらに他の構成品を用いて、メーカー指示書に従って放射線標識ＲＮＡを調製する。
【００８９】
ＲＮＡ内に取り込まれた放射線標識ヌクレオチドおよび未変化で残っているヌクレオチドの両者の量を測定する。これら二つの数値の比は、放射線標識ヌクレオチドの生物学的利用性を表している。結果は、７８．１％で、取込率５５％の許容限界より有意に高い。
【００９０】
対照サンプル−−２０℃で凍結した状態で保存した−の結果は、７５．２％である。これら実験は、イオン交換層に結合したヌクレオチドが生物学的利用性を保持していること、さらにそのうえに、酵素反応を阻害するであろうイオン交換層からのいかなる不純物も緩衝液に溶出していないことを証している。
【実施例９】
【００９１】
ＤＮＡを含む生成物とその使用
ラムダＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ）の１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（Promega、米国）液を蒸留水で５０倍に希釈する。２５０ｍｇ／ｌのＰａｔｅｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｖ（Fluka、スイス）液１μｌ、希釈ＤＮＡ液（１０ｎｇ）１μｌ、および蒸留水８μｌからなる青色の混合液を、実施例１に従い前処理したＷＡＸ−ＴＩＰピペットチップ内に吸い上げる。３０分後、そのローディング液を濾紙にブロットする。濾紙上のスポットが無色であり、ピペットチップの端部が青色をしていることから、固定化が起こったことが分かる。チップを３回蒸留水で洗浄し、次いで乾燥する。
【００９２】
固定化されたラムダＤＮＡを１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を用いピペットチップから溶出する。この緩衝液を２００μｌの微量遠心チューブに加え、次いで緩衝液の吸上げおよび射出を数回行う。この間に、溶液は青色に変わり、ピペットは無色になる。最後に、洗浄として、７２μｌの蒸留水をチップ内に吸い上げ、それを溶出したＤＮＡに加える。この混合液に次の成分を加えることにより、ＰＣＲ反応混合液（MBI Fermentas、リトアニア）は完成する：
６μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、２μｌの１０ｍＭのｄＡＴＰ、２μｌの１０ｍＭのｄＣＴＰ、２μｌの１０ｍＭのｄＧＴＰ、２μｌの１０ｍＭのｄＴＴＰ、１μｌの１０μＭのラムダ１プライマ（ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＣＧ）、１μｌの１０μＭのラムダ２プライマ（ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＴＣ）および最後に２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ。温度サイクルのパラメータは、以下のとおりである：
初期変性：９５℃で５分間、変性：９５℃で１分間、プライマアニーリング：５５℃で１分間、伸長：７２℃で０．５分間、最終伸長：７２℃で７分間。サイクル数は、３０回。
【００９３】
この反応混合液をアガロースゲル電気泳動を用いて分析する。エチジウムブロマイドで染色後、５４０ｂｐのＰＣＲ産物が視覚化され、溶出されたＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲ反応が起こり得ることを示す。同じ手法を冷蔵庫内で＋４℃で保存された固定化ＤＮＡを使って行った場合にも、同じ結果が得られる。
【００９４】
この結果は、イオン交換層に結合したＤＮＡが溶液形態のＤＮＡと同じ生物活性を有することを示している。固定化されたＤＮＡは、長期間保存した後でさえ生物学的利用性を保持している。色素の利用は、吸着／脱着プロセスのモニタリングに好適である。予調合の形を適用することにより、調合のステップが洗浄ステップで置き換えられ、用量の正確性が向上する。
【実施例１０】
【００９５】
オリゴヌクレオチドを含む生成物およびその使用
２種類のオリゴヌクレオチドの固定化を、次のローディング液で、実施例９に記載のように、行う：１μｌの１０μＭのラムダ１プライマ、１μｌの１０μＭのラムダ２プライマ、１μｌの２５０ｍｇ／ｌのＰａｔｅｎｔ  Ｂｌｕｓｅ  Ｖ液および６μｌの１ｍＭのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）。
【００９６】
放射線標識ヌクレオチドの固定化は、次のローディング液で、実施例９に記載のように、行う：５μｌ（５０μＣｉ）のα−32Ｐ−ｄＣＴＰの０．５ｍＭのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）、１μｌの５００ｍｇ／ｌのスルホローダミンＢ（Fluka、スイス）液および４μｌの蒸留水。
【００９７】
完成したＰＣＲ反応混合液（１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、６μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、２μｌの１０ｍＭのｄＡＴＰ、０．５μｌの１０ｍＭのｄＣＴＰ、２μｌの１０ｍＭのｄＧＴＰ、２μｌの１０ｍＭのｄＴＴＰ、１μｌのラムダＤＮＡ（１０ｎｇ）、７６μｌの蒸留水、および２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）を用い、最初にプライマを、次いでα−32Ｐ−ｄＣＴＰを溶出する。溶液の色は、まず青に変わり、次にライラック色になり、異なる成分が溶出されたことを示す。温度サイクルおよび分析の方法は、アガロースゲルのオートラジオグラフ画像が加わる以外は、実施例１０に記載のものと同じである。エチジウムブロマイド染色およびオートラジオフラフの両者が、５４０ｂｐのＰＣＲアンプリコンが生じたことを示す。
【００９８】
この結果は、１本のピペットチップ内で複数の物質が固定化できること、そして１回の実験に複数本のピペットチップが適用できることを示している。異なる成分を色分けすることは、使用者が反応混合液を正しく調製することに役立つ。
【国際公開パンフレット】
2005500021.tif 000008
2005500021.tif 000009
2005500021.tif 000010
2005500021.tif 000011
2005500021.tif 000012
2005500021.tif 000013
2005500021.tif 000014
2005500021.tif 000015
2005500021.tif 000016
2005500021.tif 000017
2005500021.tif 000018
2005500021.tif 000019
2005500021.tif 000020
2005500021.tif 000021
2005500021.tif 000022
2005500021.tif 000023
2005500021.tif 000024
2005500021.tif 000025
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2005500021.tif 000027
2005500021.tif 000028
2005500021.tif 000029
2005500021.tif 000030
2005500021.tif 000031
2005500021.tif 000032
2005500021.tif 000033
2005500021.tif 000034
2005500021.tif 000035
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500021.tif 000036
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500021.tif 000037
【国際調査報告】
2005500021.tif 000038
2005500021.tif 000039
2005500021.tif 000040