(57)【要約】本発明では、任意のポリケチドを産生するために使用し得、従来の株改良を行なう必要がないポリケチド過剰産生細胞を提供する。本発明は、第１ポリケチドを産生する方法であって、前記方法が、第２ポリケチドを産生するために最適化された細胞中で該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードするポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子を発現する工程を包含する方法を提供する。また、本発明は、第２ポリケチドの誘導体である第１ポリケチドの産生、および遺伝子が第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するように過剰産生細胞中のＰＫＳ遺伝子を改変する工程を含む。
2005529579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ポリケチドを産生するための方法であって、該方法が第２ポリケチドの産生のために最適化された細胞中の該第１ポリケチドを産生するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードするＰＫＳ遺伝子を発現する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１ポリケチドが、前記第２ポリケチドの誘導体であって、そして前記方法が、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子である過剰産生細胞中のＰＫＳ遺伝子を改変する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、過剰産生細胞中で、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子を導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子が、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子の導入前または後に欠失されるかまたは別の方法で不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記過剰産生細胞が、前記第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを超える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記過剰産生細胞が、前記第２ポリケチドを１０ｇ／Ｌを超える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記過剰産生細胞が、前記第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを越える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記過剰産生細胞が、前記第１ポリケチドを１００ｍｇ／Ｌを越える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において有用な過剰産生宿主細胞であって、前記第２ポリケチドをコードする遺伝子が欠失され、そして該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が、容易に導入されおよび発現され得る、過剰産生宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞であって、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全てまたは実質的に全ての欠失によって改変される、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の宿主細胞であって、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、ＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化によって改変される、宿主細胞。
【請求項１２】
１０，１１−アンヒドロ−６−デオキシエリスロノリドＢを産生する、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
誘導された宿主細胞からの細胞に関連して、１以上のａｔｔＢ部位またはａｔｔＰ部位を含むように改変された組換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞であって、高水準でポリケチドを産生するための変異誘発によって最適化された細胞から誘導される細胞。
【請求項１５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８から誘導される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えて産生する細胞から誘導される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１３に記載の細胞の転換を獲得するための方法であって、インテグラーゼ存在下、前記細胞と、相補的結合部位を構成するベクターを含む細胞とを結合する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって産生される、細胞。
【請求項２０】
前記結合工程の前に、前記細胞によって産生されないポリケチドを産生する、請求項１９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術によってポリケチドを産生するための組換え方法および材料を提供する。本発明は、農業、家畜学、化学、医薬品化学、医学、分子生物学、薬理学、および獣医学の技術分野に関する。
【０００２】
（背景技術）
ポリケチドは、多くのヒトの治療用、獣医学用、および農業用の生成物の開発を担う天然物の重要な類である（例えば、ＦＫ５０６、ロバスタチン、およびアベルメクチン）。これらの化合物を合成する酵素、ポリケチドシンターゼ類（ＰＫＳ）は、既存の薬剤の改良されたアナログまたは新規ポリケチドのコンビナトリアルライブラリーのいずれかを産生することを目的とする種々の分子工学的手法の標的となっている。モジュラーＰＫＳ（例えば、図１に示す、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ））は、この種のＰＫＳ酵素中に含まれる１以上の酵素ドメインの遺伝的操作によって誘導される新規ポリケチド構造を産生するために、この種の技術によって変更されてきた（前出の、米国特許第５，９６２，２９０号およびＰＣＴ公開第９８／４９３１５号を参照のこと）。
【０００３】
これらの第１世代の成功以来、新規ポリケチドまたは「天然でない」天然物を産生する遺伝子操作されたＰＫＳの迅速な増殖をもたらした（各々、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開第９９／６１５９９号、同第００／０２４９０７号、および同第００／０２６３４９号を参照のこと）。最近の研究では、約１００の大環状化合物のライブラリーの作製に至っており、有意な複雑性および多様性を有するライブラリーを作製する可能性を示す（各々、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開第００／０６３３６１号および同第００／０２４９０７号を参照のこと）。
【０００４】
これらの多機能酵素の触媒活性を予想通りに操作するための能力は、タンパク質工学において重要な技術的成果をあらわす。しかし、非常に大きな化合物ライブラリー（１０００を越える化合物）の構築への現在の挑戦の一つは、多くの遺伝子改変されたＰＫＳ、特に、複数のドメインが改変されているＰＫＳに関連して生成水準が減少していくことである（前出の、ＰＣＴ公開第００／０６３３６１号および同第００／０２４９０７号）。ＰＫＳのより最適な操作を導くのに役立てるために、ＰＫＳの構造−活性の知識の使用が望ましいが、これらの酵素の複雑性と大きさとに起因して、現在の理解は比較的限定されており、そして進歩は緩やかである。そのため、コンビナトリアル生合成技術を進歩させるためには、酵素の構造の詳細な理解に依存しない、相補的な取り組みを開発することが重要である。
【０００５】
ひとつの可能性は、天然物薬剤を産生するための商業プロセスを確立することに対して、何年間にもわたって、一般的に供されている重要な資源に影響を与える。ほとんど必然的に、広範囲にわたる細胞株改良およびプロセス開発プログラムは、天然に産生する生物からの化合物の収率を向上させるために行なわれており、しばしば力価の１００倍より大きな増加を達成する。ペニシリン、マクロライド系抗生物質、およびロバスタチンを含む高価値の化合物の大量生産のために、多くの微生物が無作為の変異誘発を通して最適化されている。株改良へのこの従来の取り組みは、操作されたＰＫＳを有する株に適用され得るが、この取り組みは、特にコンビナトリアル生合成によって作製され得る潜在的に多くの変異株を考慮すると、労働集約的なプロセスである。しかし、既存の産業的な株の過剰産生能力が、操作されたＰＫＳから誘導されるポリケチドの力価を増加させるのに適用され得るならば、魅力的で経済的な解決策を示す。過剰産生は、スクリーニングのためには現在は少なすぎる水準で産生された化合物への接近しやすさを増大させるだけでなく、作製されるライブラリーのサイズもまた拡大し得る。その理由は、より多くの修正がＰＫＳに導入された後、生成水準が低くなりすぎたからである。しかし、この種の株の広範囲な適用性は、過剰産生の原因となる要因が何であるか、および組換え型ＰＫＳからの産生が、過剰産生環境で増加するかどうかに依存する。
【０００６】
本発明は、他の宿主細胞より顕著に高水準でポリケチドを産生することが可能な包括的な宿主細胞に対する必要性を満たす。
【０００７】
（発明の要旨）
第１の実施形態では、本発明は、第１ポリケチドを産生する方法であって、前記方法が、第２ポリケチドを産生するために最適化された細胞中で該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードするポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子を発現する工程を包含する方法を提供する。
【０００８】
ある局面では、この方法は、第２ポリケチドの誘導体である第１ポリケチドの産生、および遺伝子が第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するように過剰産生細胞中のＰＫＳ遺伝子を改変する工程を含む。
【０００９】
別の局面では、この方法は、過剰産生細胞中への、第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子の導入を含む。好ましい形態では、第２ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子は、第１ＰＫＳをコードする遺伝子の導入前または後に、欠失されるかまたは他の方法で不活性化される。
【００１０】
この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを越える水準で産生し、好ましくは２．５ｇ／Ｌを越えて、さらに好ましくは５ｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１０ｇ／Ｌを越えて産生する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを越えた水準で産生し、好ましくは２５ｍｇ／Ｌを越えて、さらに好ましくは５０ｍｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１００ｍｇ／Ｌを越えて産生する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、第２ポリケチドをコードする遺伝子が細胞中から消去され、第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が細胞内に容易に導入され得そして発現され得る、包括的な過剰産生宿主細胞を提供する。
【００１２】
ある局面では、この包括的な過剰産生細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全部もしくは実質的に全部の欠失によってまたはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化のいずれかによって修正される。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するために修正された包括的な過剰産生宿主細胞を提供する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、株の形質転換を促進する組み込みファージｐｈｉＣ３１のための結合部位を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、この種の結合部位を含むための遺伝的変更によって修正される。
【００１４】
ある面では、この包括的な過剰産生宿主細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、１０，１１−アンヒドロ−６−デオキシエリスロノリドＢを産生するＰＫＳをコードするようにｅｒｙＡ遺伝子を変更することによって、またはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化のいずれかによって修正される。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の実施形態、様式、および局面は、以下の説明、実施例、および添付の特許請求の範囲中でより詳細に記載される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
第１の実施形態で、本発明は、第１ポリケチドを産生する方法であって、前述の方法が、第２ポリケチドを産生するために最適化された細胞中で第１ポリケチドを産生するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードするＰＫＳ遺伝子を発現する工程を包含する方法を提供する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを超える水準で産生し、好ましくは２．５ｇ／Ｌを超えて、より好ましくは５ｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１０ｇ／Ｌを越えて産生する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを超える水準で産生し、好ましくは２５ｍｇ／Ｌを超えて、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌを超えて、そして最も好ましくは１００ｍｇ／Ｌを越えて産生する。
【００１７】
薬学および農業におけるポリケチドの価値、およびポリケチドが天然で発見される細胞中で産生されるポリケチドの量が典型的に少量であるため、細胞中でのポリケチドの産生を増加させるために、顕著な努力が払われてきた。従って、ポリケチドを作製する多くの「過剰産生」細胞がある。しかし、ほんの一例として、エリスロマイシンおよび半合成誘導体は、抗感染剤として重要な薬学上の用途を有する。ＤＥＢＳ（エリスロマイシンの大環状ラクトン中心である６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ、図１中の化合物１）を合成する）は、ＰＫＳのモジュラー類に属する。そのように呼ばれる理由は、合成のために必要な酵素ドメインが、触媒ドメインのモジュラーの繰り返しによって組織されるからである（図１）。ＤＥＢＳがそれから本来クローン化された生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８は、代表的に標準の実験発酵においてエリスロマイシンＡを１００〜２００ｍｇ／Ｌの間で産生する。ヒドロキシル化およびグリコシル化経路がその中に存在しないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのいずれかにおけるＤＥＢＳの異種発現は、最適条件下で約５０〜１００ｍｇ／Ｌの６−ｄＥＢ（１）を産出し、これはＮＲＲＬ２３３８によって産生される１の量と近い（本明細書において参考として援用される米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。対照的に、多くの産業的に最適化されたＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの株は、エリスロマイシンを１０ｇ／Ｌを超えて産生する。
【００１８】
しかし、この種の過剰産生に関する生化学的な理由は、公知でない。あり得る理由の一つとしては、正常な産生細胞と比較して、過剰産生細胞は、ＰＫＳの発現をコードする遺伝子中に１以上の変異を有していることである。他の理由は、過剰産生細胞は、単にポリケチド生合成において使用される前駆体化合物をより多く産生することである。過剰産生の理由がＰＫＳ遺伝子中に存在する場合、第１ポリケチドの過剰産生細胞が第２ポリケチドの過剰産生細胞であることは可能性が低い。
【００１９】
本発明の利点を示すために、バイオリアクター発酵中で少なくともエリスロマイシンを７ｇ／Ｌ産生することができるＫ１と命名されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株を、使用した。上述のように、産業的な微生物における過剰産生の決定因子についての報告は驚くほど少ない。収量の向上は、フラックス、対応する遺伝子発現のアップレギュレーション、または基質（ポリケチドの場合におけるアシルＣｏＡチオエステル）のより高い細胞内貯留を増加する生合成酵素における変異の結果生じる。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａエリスロマイシン過剰産生細胞にとって、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生細胞における高い生産水準の最も有望な理由として、後者２つの理由の組み合わせが残り、力価の大幅な増加が単にＤＥＢＳの過剰発現のみの結果であると考えることは可能性が低い。過剰産生細胞株が動力学的に改良されたＰＫＳを保有していなかったことを示すために、ＰＫＳ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中でクローン化および発現して、そして産生水準を野生型Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株由来で株単離されたＤＥＢＳと比較した。この結果が、ＰＫＳにおける変異が過剰産生の原因である可能性は低く、そしてこの株中の他の生物からのＰＫＳの発現が、親株と比較してより高い力価を導く原因であることを示唆した。
【００２０】
産業的なＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主の改良された産生特徴のいくつかまたは全部が、ＰＫＳの活性全体または一部分によるものであるかどうかを調べるために、ＰＫＳをＮＲＲＬ２３３８株由来のＤＥＢＳと比較した。さらに、この産業的な株は、多段階の変異誘発から産生されるため、ＤＥＢＳ遺伝子中に変異が導入された結果としてより高い生合成のスループットを得ることが可能である。もしそうであれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で、変異ＰＫＳ遺伝子を用いることによって、ＤＥＢＳを伴って以前に作製されたこの種の異種宿主中で産生したエリスロマイシンおよび関連するマクロライドの力価を増加する株になり得る。過剰産生株由来のＤＥＢＳ遺伝子の完全なセットは、潜在的な変異を同定するために配列決定されるが、遺伝子クラスターの大きさ（＞３０ｋｂ）が、この取り組みを難しくしている。
【００２１】
代わりに、ＤＥＢＳをコードする３種の遺伝子、ｅｒｙＡＩ〜ＩＩＩは、保存された認識部位を使用して、過剰産生株からクローン化し、そしてＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８から得られたＤＥＢＳの異種発現のために使用される同様のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ発現ベクター中に配置した。得られたプラスミド、ｐＫＯＳ１０８−０４は、ｅｒｙＡＩ〜ＩＩＩ遺伝子の供給源以外は、ｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’（野生型ＤＥＢＳを含む）と一致する。いずれの場合でも、遺伝子の発現は、発現プラスミド上でａｃｔＩプロモーターおよびａｃｔＩＩ−４調節タンパク質によって制御される（本明細書において参考として援用される米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。ｐＫＯＳ１０８−０４およびｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’の両方を、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１１４およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９を転換するために使用した。多発性形質転換株（各２〜４）を並行して増殖し、そして６−ｄＥＢの産生プロフィールを決定した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの両方において、２種の異なるＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株由来のＤＥＢＳ遺伝子は、以下の実施例に記載される培養条件下で当量の６−ｄＥＢ（約３０〜４０ｍｇ／Ｌ）を産出した。
【００２２】
過剰産生宿主由来のＰＫＳで、ポリケチド力価を増加することができないことは、この株由来のＤＥＢＳが野生型ＤＥＢＳと触媒的に異なってはいないが、６−ｄＥＢ産生水準がこれらの株において利用可能な前駆体の量によって制限されている可能性を暗示している。この実験結果は、異種宿主におけるそのＰＫＳの使用としてよりも過剰産生の宿主としての産業的な株の潜在的利点を強調する。従って、本発明の一つの利点は、あるポリケチドのための過剰産生株が、異なるポリケチドのためのＰＫＳ遺伝子を発現するために遺伝的に変更される場合に理解される。
【００２３】
１つの局面において、この方法は第２ポリケチドの誘導体であるポリケチドの産生および第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するこれらの遺伝子のような過剰産生細胞におけるＰＫＳ遺伝子の変更を含む。本発明のこの局面は、コンビナトリアル生合成のために最適化されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン過剰産生株によって説明される。ＤＥＢＳの変異株は、対応するポリケチドの構造を変化させる触媒的なドメイン置換によってこの宿主中で構築された。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（最適化されていない宿主である）において発現された同様の変異株ＤＥＢＳの発現と比較すると、変更されたポリケチドの産生量は格段に高かった。
【００２４】
ポリケチドの生合成を操作するための多くの戦略は、ＤＥＢＳおよび他のモジュラーＰＫＳを用いることで達成された。これらはドメインおよびモジュールの不活性化、欠失、および置換、タンパク質融合によるハイブリッドモジュールの構築、および異なる原料からのＰＫＳサブユニット間の相補性を含む。これらの実験は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、またはＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの比較的低い産出株のいずれかにおいて実施される。本発明に基づき、これらの株においてＤＥＢＳを改変するために通常用いられるＰＫＳ戦略によって産生されたポリケチドの力価は、過剰産生株において実質的に増強され得る。
【００２５】
この利点を説明するために、過剰産生のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株において代表的なＰＫＳドメイン置換を構築した。同種二重再結合によって過剰産生宿主の染色体内で、ＤＥＢＳの増量モジュール２（ｅｒｙＫＲ２）とラパマイシンＰＫＳの増量モジュール４由来のＤＨおよびＫＲドメイン（ｒａｐＤＨ／ＫＲ４）とにおいてケトレダクターゼ（ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）ドメインの交換が設計された（図２）。この特殊な変異が選択されたのは、ドメイン置換の全身的スクリーニングにおいて産生される機能的単一変異株の産生が中でも最も低く、そのため低い収量のＰＫＳを向上させる能力を厳格に試験するためである。プラスミドに基づくＤＥＢＳ系において改変され、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおいて発現される場合、生じる株（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１１４／ｐＫＯＳ１１−６４）は、新しく導入されたＤＨ活性の結果、約０．３ｍｇ／Ｌの６−ｄＥＢの１０，１１−アンヒドロ類似物３を産生した（図２）。本明細書において参考として援用される両ＰＣＴ公開番号  ９８／４９３１５号および００／０２４９７号を参照のこと）
置換を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ３９−１０（表１）は、大量のエリスロマイシン類似体の混合物（予想された１０，１１−アンヒドロ部分を全て含むが、ヒドロキシル化パターンにおいて異なっている）を産生した（図２）。最も量の多い生成物は、１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンＡ（化合物４）、Ｂ（化合物５）、およびＤ（化合物６）、および６−デオキシ−１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンＡ（化合物７）、Ｂ（化合物８）、およびＤ（化合物９）であった。化合物４、５、７、および９の構造を確認するため、そして化合物５および７の水酸基の位置を決定するために、１Ｈ−ＮＭＲ分光法および１Ｈ−ＴＯＣＳＹ相関を使用した。これらの産生された化合物の比は、培地依存であり得る。エリスロマイシンＡのＢ（１２−デオキシ）種およびＤ（４’’−デスメチル）種は、しばしばＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株の発酵培養液中に存在するが、６−デオキシ化合物は通常検出されない。ＥｒｙＦは、ポリケチドアグリコンのＣ−６炭素でのヒドロキシル化を引き起こすシトクロムＰ４５０である。Ｋ３９−１０における６−デオキシ化合物の存在は、ＥｒｙＦのインビトロでのヒドロキシラーゼ活性が１０，１１−二重結合を有する基質に対しては乏しいという以前の観察と一致している。
【００２６】
Ｒ５発酵培地またはＦ１発酵培地のいずれかからのエリスロマイシンの全収量は、約５０ｍｇ／Ｌであった。これは改変されたＰＫＳによって合成された大環状ラクトン生成物（化合物３）の約２６ｍｇ／Ｌに相当する。ポリケチドの収量は、親株によって産生されたエリスロマイシンの量と比較して顕著に減少したけれども、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおける化合物３の産生と比較すると、力価でほぼ１００倍の増加となる。この相対的な増加は、２種の異なる宿主中の改変されていないＤＥＢＳ由来の６−ｄＥＢ産生における相対的な増加と整合し、そして過剰産生の利点のほとんどまたは全ては、変異株ＰＫＳに翻訳されることを実証している。
【００２７】
高いポリケチド産生株の使用がポリケチドの大きなコンビナトリアルライブラリーの構築への一般的な取り組みであることを実証するこれらの実験によって、二つの重要な発見が得られた。一つ目は、変異株ＰＫＳ由来の産生水準は、過剰産生環境において発現した場合に顕著に増加し得ることである。これは作製される多くの他の単一改変体と比較して、比較的少量の化合物を産出するドメイン置換を有する例において示されている。従って、この種の収量の増加は、野生型と比較して複数の修正を有するＰＫＳ酵素を含む株を含んで、おそらく普遍的に観測される。この株のための効率的な遺伝的用具を用いて、既存のマクロライドライブラリーを、スクリーニングおよび入手可能な化合物の数を拡大するために適切な化合物の力価を作製するＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ内に移動することが比較的好都合である。
【００２８】
また、このＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの株における過剰産生の原因が宿主の環境にあり、ＰＫＳ遺伝子内の変異からではないように見えることをこれらの実験は示している。これはまた、異種ＰＫＳからのモジュールまたはドメインが、過剰産生宿主において、より高い力価を作製することを意味する。これは重要である。なぜなら、ＰＫＳ操作のための機能的単位は、異なる生物からクローン化された多くのＰＫＳから入手可能だからである。そのうえ、低産生ＰＫＳの完全な経路（例えば、抗腫瘍ポリケチドエポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）のための経路）は、株中で入手可能な十分な基質を想定し、そしてそれによって従来の株を改良する必要性を回避することで異種発現によって改良され得ることを示唆する。
【００２９】
従って、ポリケチド過剰産生株を、良好な量で設計されたＰＫＳ由来のポリケチド誘導体を産生するために使用し得る。明細書中に示すように、産業的なエリスロマイシン産生株の使用は、小スケール産生培養（＜１Ｌ）から生物学的アッセイ法のために十分な量のエリスロマイシン誘導体の産生を導き、そして適度のスケールアップ（１００〜１０００Ｌ）によって、化学的修飾による最適化を導くために十分な量のエリスロマイシン誘導体の産生を導く。従って本発明は、良好な収率でより大きな化合物ライブラリーを作製する能力を翻訳するコンビナトリアル生合成戦略によって調製されるポリケチドライブラリーからの力価の「全面的な」増加を達成するための、単純で実験に基づいた方法を提供する。さらに、ポリケチド遺伝子クラスターの識別およびクローン化が、比較的少ない時間で達成され得るため、プロセス展開時間および過剰産生宿主における異種発現によるポリケチドを導く努力を顕著に短縮することが可能となる。さらに、非常に高い産生水準のために最適化された宿主を使用することによって、改変されたＰＫＳ由来のポリケチドの力価の減少を奪還することが可能である。
【００３０】
本発明の方法は、過剰産生細胞内の既存のＰＫＳ遺伝子の変更だけではなく、過剰産生細胞中への新規ＰＫＳ遺伝子の導入も含みうる。多数のモジュールのＰＫＳ遺伝子はクローン化され、そして本発明の方法に基づく使用のために入手可能である。ＰＫＳ酵素によって産生されたポリケチドは、しばしばテーラーリング酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）と呼ばれるポリケチド修飾酵素によってＰＫＳのヒドロキシル化ポリケチド生成物、エポキシ化ポリケチド生成物、メチル化ポリケチド生成物、およびグリコシル化ポリケチド生成物へとさらに修飾される。本発明の方法に基づいて、これらの遺伝子はまた、過剰産生宿主細胞内に導入し得、目的の修飾されたポリケチドを調製する。以下の表は例示的なＰＫＳ遺伝子を記載および本発明に基づいて利用し得る対応する酵素の引例を列挙する。また、本発明の組換え型ＤＮＡ化合物を作製するために用いられ得るポリケチドテーラリング酵素および修飾酵素および対応する遺伝子を記載する種々の引例を示す。
【００３１】
【表１】
2005529579.tif 000003
2005529579.tif 000004
ポリケチド修飾のための遺伝子を含むかまたは含まない上述の遺伝子のうち任意のものは、もしあれば、本発明の過剰産生宿主細胞中で用いられ得る。さらに、本発明の宿主細胞は、所望のＰＫＳの一部および修飾酵素遺伝子クラスターを各々含む複数ベクターとの形質転換によって構築され得る：本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと。
【００３２】
好ましい様式において、目的のＰＫＳをコードする遺伝子の導入の前または後に、過剰生産株の内在性のＰＫＳ遺伝子は、欠失されるかまたはそうでなければ不活性化される。ある重要な面では、本発明は「過剰産生された」ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が欠失されて、そして目的のＰＫＳをコードする遺伝子が容易に導入および発現され得る遺伝的過剰産生宿主細胞を提供する。ある好ましい実施形態では、この遺伝的過剰産生宿主細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えるレベルで産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全部もしくは実質的に全部の欠失またはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの変異的不活性化のいずれかによって修飾される。
【００３３】
本発明のこの局面を説明するために、ポリケチドシンターゼＤＥＢＳ上の遺伝ブロックが、６−デオキシエリスロノリドの非産生を生じるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン過剰産生株に導入された。このブロックされた株におけるオレアンドマイシンＰＫＳのｏｌｅＡＩ遺伝子の発現は、１５−ノル−エリスロマイシンＡを産生することが見い出された。このブロックされた変異株の培養物に合成分子が外因性付加することによって、新規な生物学的に活性なエリスロマイシンアナログのＣ−１３誘導体の産生が生じた。この後者の戦略は、前駆体指向型生合成と呼ばれ、ＰＫＳにおける変異の下流に化学的に指向されたプライミング単位または中間体を組込み得る生合成的にブロックされたＰＫＳ変異株を利用する。６−ｄＥＢの多数のＣ−１３誘導体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおいて、ＰＫＳに合成的部分鎖の組込むことにより、ＤＥＢＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ１）に変異を導入することによって、産生され得る（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／０３９８６号および同９７／０２３５８号を参照のこと）。しかし、この方法論がＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株において実行され得る場合、より多くのポリケチドが作製されるというだけではなく、完全にグリコシル化およびヒドロキシル化された化合物が産生されるという点で有利である。
【００３４】
この目的を達成するため、プラスミドｐＫＯＳ４０−５７を送達ベクターとして構築し、ＤＥＢＳ１モジュール１のＫＳ１ドメインに活性部位Ｃｙｓ７２９＞Ａｌａ変異を導入した（前出の、ＰＣＴ公報９９／０３９８６号および同９７／０２３５８号に記載されている）。不活性なＫＳ１ドメインは、開始単位の増殖を防ぎ、そして外因性の合成のジケチドチオールエステルがＰＫＳへ導入されるのを可能にする（本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ公報００／０４４７１７を参照のこと）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１プロトプラストはｐＫＯＳ４０−５７で形質転換され、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して生物活性を有さない８種の形質転換株が得られた。ｐＫＯＳ４０−５７の組込みが染色体の適切な場所で起こっていることを確認するために、ＰＣＲ分析用に形質転換株の一つからゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、二重交差現象を介してのプラスミドの立ち退き（ｅｖｉｃｔｉｏｎ）を可能にする非選択的な成長が行われた。アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）に過敏なコロニーの５分の３が所望のＫＳ１ヌル（ＫＳ１°）変異株にあることが見い出された。Ｋ３９−１４と称される１つのこのようなＫＳ１°ヌル株は、検出可能なエリスロマイシンまたは６−ｄＥＢ様産物をいずれも産生せず、Ｒ２ＹＥ培地中で増殖させた場合に生物活性を示さなかった。このＫ３９−１４株は、ＫＳ１ヌル変異株を補完するｏｌｅＡＩ遺伝子の異種発現のため、および新規エリスロマイシンアナログの前駆体指向型生合成のために使用された。
【００３５】
異種モジュラーＰＫＳ由来のサブユニットは、混成ポリケチドを作製するために機能的に組み立てられ得る。例えば、ＤＥＢＳ３サブユニットおよびＯｌｅＡ３サブユニット（８，８ａ−デオキシオレアンドリドＰＫＳのサブユニット３）の両方は、ピクロマイシンＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶサブユニットを完全に補完し得る（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／６１５９９号を参照のこと）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来の野生型ＤＥＢＳのローディングドメインは、低レベルの１５−ノル−エリスロマイシンｃを形成するためのアセテートを受容することが示されている。ＤＥＢＳがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中で発現して１５−ノル−６ｄＥＢの（１：５の６ｄＥＢ）を形成する場合に、同様の結果が観察された（本明細書内で参考として援用される、米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。Ｏｌｅ  ＰＫＳは８，８ａ−デオキシオレアドリドを産生し、これはプライミング単位中の１つの炭素のみだけＤＥＢＳの産物である、６−ｄＥＢとは異なっている。Ｏｌｅ  ＰＫＳのサブユニットおよびＤＥＢＳのサブユニットは、有意な構造的相違を含む：これらは、機能的には同様であるにもかかわらず、ＤＥＢＳとＯｌｅ  ＰＫＳとの間で４５％しか同一ではない。
【００３６】
発現プラスミドｐＫＯＳ３９−１１０（これは、ｅｒｍＥ＊プロモーターの制御下で、ｏｌｅＡＩ遺伝子を運搬する）の発現が利用可能であり（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／０６１５９９号を参照のこと）、そしてΦＣ３１結合部位を使用して、染色体内への組込みによって株Ｋ３９−１４内にｏｌｅＡＩ遺伝子を導入するのが好都合であった。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ３９−１４のプラスミドとｐＫＯＳ３９−１１０での形質転換は、株内で生じ、これは副生成物１５−ノル−エリスロマイシンＣを伴って、１５−ノル−エリスロマイシンＡ約５〜１０ｍｇ／Ｌの抗菌活性を示した。マススペクトルおよびＬＣ保持時間は既知の標準と一致した。ｍ／ｚ７０６でのプロトン化分子イオン種は、１５−ノル−エリスロマイシンＣの提案された構造と一致している。この結果は、ＯｌｅＡＩがある程度までＤＥＢＳ１を補完し得ることを示している。また、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるこの異種ＰＫＳサブユニットを発現する能力はまた、異種ＰＫＳ酵素が本発明の包括的な過剰産生宿主細胞中で産生され得ることを示している。
【００３７】
前駆体指向型生合成は、ＤＥＢＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ１）に変異を導入し、そしてジケチド前駆体の化学的に合成されたＮ−アセチルシステアミン（ＮＡＣ）チオエステルを発酵物に添加することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中で、６−ｄＥＢの多くのＣ−１３誘導体を作製するために使用される。前駆体指向型生合成によるエリスロマイシンアナログの産生を単純化するためおよびポリケチドからのエリスロマイシンＡ類似体への産生を完全にプロセスするために、株Ｋ３９−１４を作製するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株の染色体中にＫＳ１°変異を導入し、これを、図３中に示すプロピルＮＡＣジケチド（４）またはビニルＮＡＣジケチド（５）０．２５ｇ／Ｌの存在下、Ｆ１培地で発酵させた（本明細書中で参考として援用される、Ｂｒｕｎｋｅｒら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：２４４１〜２４４８を参照のこと）。この株は、各々、対応する１５−メチルエリスロマイシンまたは１４，１５−デヒドロエリスロマイシン誘導体（図２の化合物６〜８および９〜１１）を１０〜２０ｍｇ／Ｌの間で産生した。両エリスロマイシンアナログはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して抗菌活性を示した。１５−メチルエリスロマイシンＡの構造は、ＮＭＲによって決定した。
【００３８】
エリスロマイシンの量は、おそらく膜移送障壁のために、この株の潜在的な能力よりもかなり低いものであるが、これらの収率は小培養量からの生物学的スクリーニングには充分である。化学的に合成され得る合成ジケチドの可能な配列が与えられれば、簡便な様式でより多くのエリスロマイシン誘導体を生成し、スクリーニングすることが可能である。
【００３９】
本発明の方法に基づき、天然では株によって主生成物として産生されない種々のエリスロマイシン化合物を産生するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株を使用する。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株におけるＫＳ１  ヌル変異を含むＤＥＢＳ１変異株のＯｌｅＡＩ相補は、２種の異なるＰＫＳ酵素複合体から誘導されるタンパク質からなる機能的異種ＰＫＳであって未修飾の過剰産生株によっては主生成物として作製されないポリケチドを産生するＰＫＳの例を提供する。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株における１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンの産生は、２種の異なるＰＫＳ酵素から誘導される酵素ドメインからなるモジュールを含むタンパク質を含む機能的異種ＰＫＳ複合体であって未修飾の過剰産生株によっては作製されないポリケチドを産生するＰＫＳ複合体の例を提供する。ＫＳ１ヌル変異を含むＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株におけるジケチド補給によるポリケチドの産生は、ＰＫＳのための合成化学スターターを提供することによる野生型ＰＫＳによって産生されるポリケチドと異なるポリケチドを産生するために使用され得る非機能的異種ＰＫＳ複合体の例を提供する。
【００４０】
従って、本発明は組換え宿主細胞において多くの異なるポリケチドを産生するための有用な方法および宿主細胞を提供する。しかし、高い力価のポリケチドを産生するために変異誘発を経て最適化されたポリケチド産生宿主細胞が形質転換されにくいことは公知である。さらに、このような細胞で観測される形質転換の低い効率は、細胞を形質転換するために使用されるベクターのサイズが増加するにつれて顕著に減少する。非常に大きなベクターでは、形質転換は、しばしば単純に可能ではない。通常ＰＫＳ遺伝子が非常に大きい（＞３０ｋｂ）ために、この低い形質転換効率は、本発明の利点を実現するのに顕著な障壁となる。この形質転換障壁は宿主における制限−修飾系によるものであり得るといういくつかの証拠および推測がある。
【００４１】
接合媒介性の形質転換は、この障壁をある程度克服し得る；これは制限−修飾系への接合において生じる単鎖ＤＮＡのより低い感受性の結果であり得る。しかし、接合媒介性の形質転換であっても、相同組換えによって宿主細胞の染色体内に組み込まれる非常に大きなベクターでは成功し得ない。この障壁は相同組換え事象の性質の結果であり得、制限−修飾系によって送達されたＤＮＡの開裂と比較すると低くあり得る。
【００４２】
ファージからの結合部位（ａｔｔＰ）を含むベクター（例えば、ｐｈｉＣ３１、ｐＳＡＭ、およびｐＳＬＰベクター系のベクター）は、ファージのインテグラーゼ酵素によって媒介される機構によって宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。しかし、この種のベクターがＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞での接合媒介性の形質転換に使用された場合、上述のように非常に低い形質転換効率が観測された。接合完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔ）は、ＤＮＡ配列分析によって分析され、ベクターが、他の生物中のファージによって利用され、そして以前確認された好ましい結合部位の配列（ａｔｔＢ配列）とは配列において異なる部位に無作為に組み込まれたことを発見した。この低い形質転換効率の障壁は、ａｔｔＢ配列を含むように宿主細胞の染色体を変化させることによって克服された。得られた組換え宿主細胞は、ＰＫＳ遺伝子クラスター全体を含む非常に大きなベクターとであっても、ｐｈｉＣ３１結合部位配列を含むベクターとの接合によって、比較的高い形質転換効率で形質転換され得る。
【００４３】
従って、ある実施形態において、本発明はＥ．Ｃｏｌｉまたはヒト宿主細胞以外の組換え宿主細胞を提供し、この組換え細胞は、この細胞が誘導される細胞と比較して１以上のａｔｔＢ部位を含むように改変されている（本明細書中で参考として援用される、Ｔｈｏｒｐｅら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５５０５〜５５１０，およびＧｒｏｔｈら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５９９５〜６０００を参照のこと）。複数の結合部位を含むように修飾された細胞は、染色体の異なる場所に複数の遺伝子を導入する目的のために好ましくあり得る。１つの実施形態において、変異誘発によって最適化された細胞からこの細胞が誘導され、高レベルでポリケチドを産生する。別の実施形態において、この細胞は、ＮＲＲＬ２３３８のようなＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞またはエリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えて産生する細胞である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、ｐｈｉＣ３１結合部位を含むように改変された細胞の形質転換体を得るための方法を提供し、この方法は、前述の細胞と、相補的な結合部位（ａｔｔＢとａｔｔＰは互いに相補的である）を含むベクターを含む細胞とをインテグラーゼ（これはｐｈｉＣ３１インテグラーゼであり得、従って遺伝子が、ベクター中または宿主細胞中にあり得、そして異種プロモーターの制御下であり得る）存在下で、接合する工程を包含する。一方ａｔｔＰは、典型的にベクターおよび染色体上のａｔｔＢ上で使用されるが、一つはまた本発明の方法に従って、染色体中にａｔｔＰをそしてベクター上にａｔｔＢを配置し得る。別の実施形態において、本発明はこのような方法によって産生された細胞を提供する。好ましい実施形態において、このような方法によって産生された細胞は、前述の接合工程の前に細胞によって産生されないポリケチドを産生する。
【００４５】
以下の実施例は本発明を説明する目的のために与えられ、本発明または特許請求の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４６】
（実施例１）
（株、培地条件、およびＤＮＡ操作）
ＤＮＡ操作はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で行なった。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株は、エリスロマイシンを７ｇ／Ｌを越えて産生した（株Ｋ１）。この株の形質転換を、ＹＥＭＥの代わりにＴＳＢ培地を用いた以外は、標準Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロトプラスト法に従って行った。形質転換体は、Ｒ２ＹＥ再生プレートまたはＲ５再生プレート上のチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）（５０μｇ／ｍＬ）またはアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）（１００μｇ／ｍＬ）とともに選別した。
【００４７】
（実施例２）
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＫＳ１ヌル変異株の構築）
プラスミドｐＫＯＳ４０−５７を、ＤＥＢＳ  ＫＳ１ヌル変異体（アラニンとＤＥＢＳ  ＫＳ１ドメインの活性部位システインとの特殊な置換；本明細書中で参考として援用される、Ｋａｏら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１２３６３〜１２３６８を参照のこと）を含む４．０ｋｂ  ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、送達ベクターとしての自殺ベクター（アプラマイシン耐性付与遺伝子を含むｐＵＣ１８誘導体）に導入することによって構築した。プラスミドｐＫＯＳ４０−５７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１に形質転換された。アプラマイシン耐性株  （Ｋ１−１）をアプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ培地内で増殖させて、耐性を確認し、そして組み込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した。二重交差決定のために、形質転換株をＴＳＢ倍地中でアプラマイシンなしで２回継代した。プロトプラストをＲ２ＹＥプレート上で再生した。再生プレートで生じる個々のコロニーを、次いで、アプラマイシンへの感受性についてスクリーニングした。所望の変異を含むコロニーは、エリスロマイシンを産生しないことが実証され、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ３９−１４と命名された。上述のように、ｏｌｅＡＩ遺伝子をコードするプラスミドｐＫＯＳ３９−１１０と形質転換した場合、Ｋ３９−１４株は１５−ノルエリスロマイシンを産生し、そしてプロピルＮＡＣジケチド（図３の化合物４）を与えた場合、１５−メチル−エリスロマイシンを産生した。
【００４８】
（実施例３）
（エリスロマイシン誘導体の産生および分析）
本明細書中で記載されるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を、Ｒ２ＹＥ  ２５ｍＬ中で３０℃で５日間増殖させた。培養物を、エリスロマイシン誘導体についてＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した。構造決定は、操作された株に関して予測された構造とマススペクトルとＨＰＬＣプロフィールとの間の一致に主として基づいた。マススペクトルおよびＨＰＬＣに関して、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ野生型株を参照として使用した。また、実施例４に記載されるように、１５−メチルエリスロマイシンＡのＮＭＲスペクトルによってさらなる構造確認が行なわれた。生物活性を、指標菌としてのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた寒天プレート拡散アッセイによって評価し、阻害領域を視覚化するために３７℃で一晩中インキュベートした。
【００４９】
（実施例４）
（１５−メチルエリスロマイシンＡの特性決定）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ３９−１１４を、実施例３に記載されるように、発酵開始２４時間後に培養物に与えられた０．２５ｇ／ＬのプロピルＮＡＣジケチド（図３の化合物４）存在下で、発酵させた。発酵から抽出された１５−メチルエリスロマイシンＡを、特性決定のためにトルエン／アセトン  １：１を用いるカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、白色固体を得た。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを、４００ＭＨｚ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ）でＣＤＣｌ３溶液中で記録した。薄層クロマトグラフィーをシリカゲル６０でプレコートされたガラス上で行い、そしてスポットをバニリン染色によって視覚化し、次いで、加熱した。ＮＭＲ値：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，８．８），４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），４．０５−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，１０．４，），３．１２（ｂｒ  ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．０），３．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６），２．９０（ｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，９．１），２．７７−２．６７（ｍ，１Ｈ），２．５２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，９．６，１２．４），２．４３−２．３７（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｓ，６Ｈ），２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．５５（ｍ，３Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ），１．３６−１．０９（ｍ，２７Ｈ），０．９４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２２１．２，１７４．６，１０２．２，９５．４，８２．５，７９．０，７７．０，７６．３，７６．０，７４．１，７３．５，７１．６，６９．９，６８．０，６４．６，６４．５，４８．５，４４．２，４３．９，３９．２，３８．５，３７．６，３６．８，３４．０，２９．２，２７．８，２６．１，２０．５，２０．４，１８．５，１７．７，１７．３，１５．２，１４．９，１３．０，１１．０，８．１。
【００５０】
（実施例５）
（ネイティブなＰＫＳ遺伝子を欠失している包括的産生宿主）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ高プロデューサの収量を向上する多くの変異がＰＫＳ遺伝子以外の染色体領域に存在し、前駆体プール、調節プロセス、栄養の利用、そして他の要因に影響を及ぼす。このような収量を向上する変異は、変異体および異種ＰＫＳ遺伝子によってコードされたポリケチドの過剰産生のための包括的な宿主として株を使用することによって、直接的および速やかに開発され得る。このことは主に、特定のポリケチドを作製するためにＰＫＳおよび補酵素によって使用される全ての出発物質を供給する能力を要求する。運良く、モジュラーＰＫＳは全て、単純なカルボン酸の１以上の小さな基（例えば、アセテート、プロピオネートまたはブチレートならびにこれらの２−カルボキシ誘導体）を使用して、炭素骨格およびジデオキシヘキソースまたはトリデオキシヘキソース（主要なポリケチドのグリコシドを形成するための１−チミジンジホスホグルコースから作製される）を構築する。他のテーラーリング（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）反応は全て、ほとんどの細菌性細胞中で利用可能な共通の補助因子を含む。従って、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａは、出発物質の全てまたはほとんどを提供し得る；特定のポリケチドにとって必要とされる特殊な出発物質のいくつかは、遺伝子操作によって導入される。
【００５１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａエリスロマイシン過剰産生体由来のＤＥＢＳ遺伝子を、非過剰産生株由来の異種ＰＫＳで交換し得る。導入されたＰＫＳ遺伝子によって作製された代謝産物の増強された産生は、他のポリケチドの産生のために開発され得る代謝産物過剰産生のための因子を宿主が実際に含むことを実証し得る。異種遺伝子をＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株に導入する前に、ネイティブのＤＥＢＳ遺伝子を最初に欠失し得る。以下にさらに詳細に記載されているように、これは２段階相同組換え手順によって達成された。ＤＥＢＳ遺伝子に隣接する配列（約１．５ｋｂ）は、ＰＣＲによって増幅され、そして選択マーカー（アプラマイシン耐性のための）を有する自殺ベクターにクローン化された。この株を、プラスミド、および選択可マーカーを用いることによって選択された単一交差を用いて形質転換した。コロニーを選択せずに増殖させ、そして二重交差組換えを示すアプラマイシン耐性の損失についてスクリーニングした。二重交差候補の遺伝子型を、ＰＣＲを用いた分析、エリスロマイシン産生の損失、およびサザンブロットハイブリダイゼーションによって確認した。このように確認された株の一つをＫ９７−７１と命名された。
【００５２】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１は３種のｅｒｙＡ遺伝子の染色体欠失およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｘｙｌＥ遺伝子の挿入を染色体中の適所に含む。この株を作製するために、プラスミドｐＫＯＳ９７−４９ｂを最初に以下のように構築した。ｅｒｙＡ遺伝子をフランキングした２種のフラグメントは、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａゲノムＤＮＡから以下のようなプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位は下線が引かれている）：
ｅｒｙＡＩ左フランク順方向：
５’−ＴＴＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣ，
ｅｒｙＡＩ左フランク逆方向：
５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＣＣＣＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣ；
ｅｒｙＡＩＩＩ右フランク順方向：
５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣ，
ｅｒｙＡＩＩＩ右フランク逆方向：
５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴ。
次いで２種のフラグメントを、下線を引かれた制限部位およびｐＳＥＴ１５２中の対応する部位を用いてｐＳＥＴ１５２内にクローン化した(本明細書中に参考として援用される、Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｇｅｎｅ  １１６：４３〜４９を参照のこと）。得られたプラスミドはｐＫＯＳ９７−４９ａと命名された。
ｘｙｌＥ遺伝子をＰＣＲ増幅して、ｐＫＯＳ−９７−４９ａのＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化して、ｐＫＯＳ９７−４９ｂを作製した。このプラスミドはもはやｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子およびｐＳＥＴ１５２由来のａｔｔＰ遺伝子座を含んでおらず、そして相同組換えによる送達のための自殺ベクターとして役立つ。
【００５３】
過剰産生株Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１のプロトプラストは、細胞をＴＳＢ培地中で成長さ、そして成長３日後に収集することを除いて、標準手順によって生成した（本明細書中に参考として援用される、Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫを参照のこと）。プラスミドｐＫＯＳ９７−４９ｂ  ＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７から調製して、非メチル化ＤＮＡを生成して、ＰＥＧ３３５０（Ｓｉｇｍａ）を使用する以外は標準手順を使用するプロトプラストの形質転換に使用した（上述のＨｏｐｗｏｏｄらの文献を参照のこと）。プレートはアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）１ｍｇで覆って、相同組換えによるプラスミドの組込みのために選択した。アプラマイシン耐性コロニーはサザンハイブリダイゼーションによって分析し、予期される位置での単一交差を確認した。以下に示す二重交差を実行するために、１つのコロニーを選択した。株はＩＴ寒天培地（１Ｌあたり、５ｇ  グルコース、５ｇ  トリプトン、０．５ｇ  ベタイン塩酸塩、５ｇ  コーンスターチ、１ｇ  コーンスティープ液（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）（５０％）、２００ｍｇ  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２ｍｇ  ＺｎＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、０．８ｍｇ  ＣｕＳＯ４＿５Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ  ＣｏＣｌ２＿６Ｈ２Ｏ、４ｍｇ  ＦｅＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、８０ｍｇ  ＣａＣｌ２＿６Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ  ＫＨ２ＰＯ４、  １０ｇ  ＮａＣｌ、２０ｇ  寒天）上で十分に胞子成長するまで、非選択に成長した。胞子を収集し、ＩＴプレート上に希釈して、そして単一コロニーをアプラマイシン耐性の欠損についてスクリーニングした。エリスロマイシンを産生しない１つのアプラマイシン感受性のコロニーを単離した。サザンハイブリダイゼーションによって二重交差を確認した。この株をＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１と命名した。
【００５４】
株Ｋ９７−７１は、他の非６−ｄＥＢポリケチドについてのＰＫＳ遺伝子を挿入し得る本発明の包括的な過剰産生宿主である。それらの大きなサイズ（３０ｋｂまたはそれ以上）に起因して一度にＰＫＳ遺伝子の完全なセットを移動することが困難であり得るので、その構築は必要であれば一連の２〜３の二重相同組換え工程に分けられ得る。ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子は本発明のこの面の実例として役立つ。ピクロマイシンＰＫＳはＤＥＢＳに関するが、顕著に異なる化合物を産生する。ピクロマイシンＰＫＳは、ナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）（炭素１０のメチル基、炭素１０と１１間に二重結合、および炭素３のケトンがないこと以外は６−ｄＥＢと類似）を合成する。これらはピクロマイシンＰＫＳのモジュール２およびモジュール６における違いに起因している。ＰＫＳのモジュール２のＡＴドメインはプロピオナートの代わりにアセテートを組み込み、モジュール２においてさらなるデヒドラターゼ（ＤＨ）活性があって、モジュール６におけるケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインがない。また、ピクロマイシンおよびＤＥＢＳ  ＰＫＳの構築は、ピクロマイシンのモジュール５およびモジュール６が２種のＯＲＦに分かれている以外は類似している。２種のＰＫＳ間のアミノ酸配列の類似性は約４０％である。同時に、ピクロマイシンＰＫＳのこれらの特徴的な特徴は、ピクロマイシンＰＫＳをエリスロマイシン過剰産生生物に移入される場合、ＤＥＢＳと異なるモジュラーＰＫＳがポリケチドを過剰産生することを説明するための理想的な選択にする。
【００５５】
異種ＰＫＳ遺伝子を導入するために、ａｔｔＰ結合部位を含むプラスミドを使用し得る。あるいは、上述の二重組換え手順を使用し得る。一旦完全なＰＫＳが導入されると、株は代謝産物の産生のために分析される。エリスロマイシンデオキシ糖生合成遺伝子およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子がインタクトなままであるため、ｅｒｙ遺伝子クラスター中に存在するグリコシルトランスフェラーゼの活性に依存して、ポリケチドアグリコン（すなわち、ナルボノリド）、デソスアミニル化（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｙｌａｔｅｄ）誘導体（ナルボマイシン）のいずれかまたは両方が産生され得る可能性がある。さらに、Ｃ−６またはＣ−１２ヒドロキシル化反応のいずれかが起こり得る。親株中の、産生するポリケチドの合計量は、過剰産生を示すための同様の条件下でのエリスロマイシンＡの産生水準と直接的に比較される。
【００５６】
他のＰＫＳ遺伝子は容易に株Ｋ９７−７１メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子内に導入され得る（本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ特許出願番号  ＵＳ００／２７４３３、２０００年１０月４日出願を参照のこと）および、オレアンドリド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ遺伝子（本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ公開番号  ００／０２６３４９を参照のこと）を含むがこれらに限定されない。また、この宿主は、ＦＫ５０６およびエポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）のような、エリスロマイシンに遠くにのみ関係したポリケチドの産生のために使用され得る。これはまた、ＰＫＳ酵素に対する独特の基質（例えば、２−エチルマロネートまたは２−ヒドロキシマロネート）の産生を確実にするか、またはそれが形成されるとき、ポリケチド骨格を修飾する（例えば、脱水または酸化）酵素を提供するために、特定の非ＰＫＳ遺伝子の導入を伴う。さらに、種々のプロモーター（例えば、エリスロマイシン過剰産生株からのａｃｔプロモーター、ｅｒｍＥ＊プロモーター、ｅｒｙＡプロモーター）のうち任意のものを利用して、異種ＰＫＳ遺伝子クラスターの発現を駆動しうる。
（実施例６）
（ＰｈｉＣ３１結合部位を含むＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株の構築）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株は、ｐｈｉＣ３１の結合部位配列に実際に対応する染色体のＤＮＡ配列を含まない。従って、ｐｈｉＣ３１から誘導されたプラスミドとの結合効率は、このような株とでは高くなく、このような株への非常に大きなプラスミドの導入は不可能ではないとしても、困難であり得る。結果として、本発明は、ポリケチド産生株の染色体ＤＮＡ内にｐｈｉＣ３１結合部位配列を挿入することによって改良された種々のポリケチド産生株（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を含むがこれに限定されない）を提供する。
【００５７】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ２４−１は３種のｅｒｙＡ遺伝子の染色体欠失ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓファージｐｈｉＣ３１のためのａｔｔＢ遺伝子座、次いでｅｒｍＥ＊プロモーターの適所での挿入を含む。この株を作製するために、プラスミドｐＫＯＳ１３４−０４が最初に以下のように構築された。以下の２種のアニーリングされたオリゴヌクレオチドを使用して、ｐｈｉＣ３１  ａｔｔＢ部位をｐＫＯＳ９７−４９ａのＨｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉ部位との間に挿入した：
順方向：
５’−ＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＴＡＡ−ＣＴＡＧＴＧ、
および
逆方向：
５’−ＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧ−ＣＡＣＣＣＧＡ。
このプラスミドは、ｐＫＯＳ０２４−８７と命名された。プラスミドｐＫＯＳ０１３４−０４は、ｐＫＯＳ０２４−８７の得られたＳｐｅＩとＢａｍＨＩ部位との間のｅｒｍＥ＊プロモーターを含む約３００ｂｐのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを挿入することによって作製した。
【００５８】
プラスミドｐＫＯＳ０１３４−０４は、以下に記載するように、Ｅ．Ｃｏｌｉからの結合を経てＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１に導入された。相同組換えによる単一交差および二重交差についてのスクリーニングを上述のように行なった。サザンハイブリダイゼーションによって確認された二重交差株が得られ、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ２４−１と命名された。
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ９７−７１およびＫ２４−１は、１〜２のＩＴプレート上で増殖した株から胞子を収集することによって調製し、滅菌綿でこの胞子を濾過して、そして２０％グリセロール１ｍｌで再懸濁した。胞子懸濁液を約２０℃で保存した。胞子懸濁液２０μＬのアリコートを２×ＹＴ  ５ｍｌに添加し、そして振盪しながら３０℃でインキュベートした。１時間後、胞子を遠心分離によって収集した（レシピエント細胞）。ドナー細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＺ８００２をｐＳＥＴ１５２またはｐＫＯＳ９７−１１３またはｐＫＯＳ９７−６９ａを用いて形質転換し、そしてアプラマイシン耐性のみを選択することによって調製した。プラスミドｐＫＯＳ９７−１１３およびｐＫＯＳ９７−６９ａはそれぞれ、ｍｅｇＡＩ−ＩＩＩ遺伝子およびｅｒｙＡＩ−ＩＩＩ遺伝子を保有する約３０ｋｂ挿入物を含むｐＳＥＴ１５２の誘導体である。
【００５９】
一次形質転換プレートからいくつかのコロニーを選び、そしてクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アプラマイシン（６０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ  ５ｍｌに播種するために使用した。細胞を３７℃で３〜４時間増殖させ（０．４〜０．６のＯＤ６００）、遠心分離によって収集し、ＬＢ  ５ｍｌで洗浄し、遠心分離して、そしてＬＢ  １００μＬに再懸濁した。ドナー細胞とレシピエント細胞との間の接合移入は、ドナー懸濁液１００μＬにレシピエント細胞を再懸濁させ３７℃で１５〜３０分間振盪せずにインキュベートすることによって行なった。５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＲ５プレート上に細胞を塗布し、３４℃で１６時間インキュベートした。次いでプレートをナリジクス酸１ｍｇおよびアプラマイシン２ｍｇを含む軟栄養寒天３ｍｌで覆った。接合完了体をさらに４８時間インキュベートした後に観測した。
【００６０】
接合頻度はおおよそ、Ｋ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２で５×１０−５、Ｋ９７−７１：：ｐＳＥＴ１５２で３×１０−７、Ｋ２４−１：：ｐＫＯＳ９７−１１３で１×１０−６、およびＫ９７−７１：：ｐＫＯＳ９７−１１４で１×１０−７未満であった。
【００６１】
Ｋ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体およびＫ９７−７１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体の染色体へのプラスミド組み込みは以下のように確認した。ゲノムＤＮＡを、各株のいくつかの接合完了体から調製しＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩと共に消化し、再連結し、そしてＥ．Ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。アプラマイシンは染色体中に組み込まれたｐＳＥＴ１５２ベクターおよびａｔｔＢ／ａｔｔＰ接合配列を含む再び環状にしたＤＮＡを選択するために使用した。プラスミドＤＮＡをアプラマイシン耐性コロニーから調製し、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ接合を、ｐＳＥＴ１５２中のａｔｔＰ部分の上流にアニーリングしたプライマーを使用して配列させた。分析された４種の別々のＫ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体において、ｐＳＥＴ１５２は４つの異なる染色体位置に組み込まれ、これらは、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．中の公知のａｔｔＢ部位との類似性を示さなかった。分析された７種のＫ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体において、ｐＳＥＴ１５２は、いずれの場合も操作されたｐｈｉＣ３１  ａｔｔＢに組み込まれた。
【００６２】
これらの結果は、インテグラーゼｐｈｉＣ３１が媒介するベクターの組み込みが、操作されたａｔｔＢ部位が存在しないＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｓｐｐ．において部位特異的ではなく、比較的低い頻度で起こることを示している。染色体中での適切なａｔｔＢ部位またはａｔｔＰ部位の配置は、この実施例で示した一例のように、ｐｈｉＣ３１をベースとするベクターの接合頻度が顕著に増加し、結果として部位特異的組み込みが起こる。
【００６３】
記載された説明および実施例によって、本発明が記述されるが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ることを理解し、そして前述の記載および実施例は例示を目的とし、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＥＢＳを構成する３種のタンパク質（ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３）のモジュラー組織、６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の合成における各工程で形成される中間体、および６−ｄＥＢの修正から生じるエリスロマイシンの構造（エリスロマイシンＣは示されていない）を含む、エリスロマイシン生合成における重要な工程を示す。
【図２】
図２は、モジュール２のＫＲドメインと、ラパマイシンＰＫＳのモジュール４のＫＲおよびＤＨドメインとのＤＥＢＳ中での置換ならびに得られた組換えＰＫＳによって産生した生成物ならびにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ中のポリケチド修飾酵素の作用、を示す。
【図３】
図３は、前駆体からの直接生合成によるエリスロマイシン誘導体の産生を示し、２種のジケチド（化合物４および５）およびＫＳ１°変異を含む本発明のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞にこれらを提供して形成した生成物（化合物６〜１１）を示している。
【図１】
2005529579.tif 000005
【図２】
2005529579.tif 000006
【図３】
2005529579.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月8日(2005.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【特許請求の範囲】
【請求項１】  第１ポリケチドを産生するための方法であって、該方法が第２ポリケチドの産生のために最適化された細胞中の該第１ポリケチドを産生するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードするＰＫＳ遺伝子を発現する工程を包含する、方法。
【請求項２】  前記第１ポリケチドが、前記第２ポリケチドの誘導体であって、そして前記方法が、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子である過剰産生細胞中のＰＫＳ遺伝子を改変する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記方法が、過剰産生細胞中で、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子を導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  前記第２ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子が、該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子の導入前または後に欠失されるかまたは別の方法で不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】  前記過剰産生細胞が、前記第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを超える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】  前記過剰産生細胞が、前記第２ポリケチドを１０ｇ／Ｌを超える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】  前記過剰産生細胞が、前記第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを越える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】  前記過剰産生細胞が、前記第１ポリケチドを１００ｍｇ／Ｌを越える水準で産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】  請求項１に記載の方法において有用な過剰産生宿主細胞であって、前記第２ポリケチドをコードする遺伝子が欠失され、そして該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が、容易に導入されおよび発現され得る、過剰産生宿主細胞。
【請求項１０】  請求項９に記載の宿主細胞であって、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全てまたは実質的に全ての欠失によって改変される、宿主細胞。
【請求項１１】  請求項９に記載の宿主細胞であって、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、ＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化によって改変される、宿主細胞。
【請求項１２】  １０，１１−アンヒドロ−６−デオキシエリスロノリドＢを産生する、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】  誘導された宿主細胞からの細胞に関連して、１以上のａｔｔＢ部位またはａｔｔＰ部位を含むように改変された組換え宿主細胞。
【請求項１４】  請求項１３に記載の細胞であって、高水準でポリケチドを産生するための変異誘発によって最適化された細胞から誘導される細胞。
【請求項１５】  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８から誘導される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】  エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えて産生する細胞から誘導される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】  請求項１３に記載の細胞の転換を獲得するための方法であって、インテグラーゼ存在下、前記細胞と、相補的結合部位を構成するベクターを含む細胞とを結合する工程を包含する、方法。
【請求項１９】  請求項１８に記載の方法によって産生される、細胞。
【請求項２０】  前記結合工程の前に、前記細胞によって産生されないポリケチドを産生する、請求項１９に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、組換えＤＮＡ技術によってポリケチドを産生するための組換え方法および材料を提供する。本発明は、農業、家畜学、化学、医薬品化学、医学、分子生物学、薬理学、および獣医学の技術分野に関する。
【０００２】
（背景技術）
ポリケチドは、多くのヒトの治療用、獣医学用、および農業用の生成物の開発を担う天然物の重要な類である（例えば、ＦＫ５０６、ロバスタチン、およびアベルメクチン）。これらの化合物を合成する酵素、ポリケチドシンターゼ類（ＰＫＳ）は、既存の薬剤の改良されたアナログまたは新規ポリケチドのコンビナトリアルライブラリーのいずれかを産生することを目的とする種々の分子工学的手法の標的となっている。モジュラーＰＫＳ（例えば、図１に示す、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ））は、この種のＰＫＳ酵素中に含まれる１以上の酵素ドメインの遺伝的操作によって誘導される新規ポリケチド構造を産生するために、この種の技術によって変更されてきた（前出の、米国特許第５，９６２，２９０号およびＰＣＴ公開第９８／４９３１５号を参照のこと）。
【０００３】
これらの第１世代の成功以来、新規ポリケチドまたは「天然でない」天然物を産生する遺伝子操作されたＰＫＳの迅速な増殖をもたらした（各々、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開第９９／６１５９９号、同第００／０２４９０７号、および同第００／０２６３４９号を参照のこと）。最近の研究では、約１００の大環状化合物のライブラリーの作製に至っており、有意な複雑性および多様性を有するライブラリーを作製する可能性を示す（各々、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開第００／０６３３６１号および同第００／０２４９０７号を参照のこと）。
【０００４】
これらの多機能酵素の触媒活性を予想通りに操作するための能力は、タンパク質工学において重要な技術的成果をあらわす。しかし、非常に大きな化合物ライブラリー（１０００を越える化合物）の構築への現在の挑戦の一つは、多くの遺伝子改変されたＰＫＳ、特に、複数のドメインが改変されているＰＫＳに関連して生成水準が減少していくことである（前出の、ＰＣＴ公開第００／０６３３６１号および同第００／０２４９０７号）。ＰＫＳのより最適な操作を導くのに役立てるために、ＰＫＳの構造−活性の知識の使用が望ましいが、これらの酵素の複雑性と大きさとに起因して、現在の理解は比較的限定されており、そして進歩は緩やかである。そのため、コンビナトリアル生合成技術を進歩させるためには、酵素の構造の詳細な理解に依存しない、相補的な取り組みを開発することが重要である。
【０００５】
ひとつの可能性は、天然物薬剤を産生するための商業プロセスを確立することに対して、何年間にもわたって、一般的に供されている重要な資源に影響を与える。ほとんど必然的に、広範囲にわたる細胞株改良およびプロセス開発プログラムは、天然に産生する生物からの化合物の収率を向上させるために行なわれており、しばしば力価の１００倍より大きな増加を達成する。ペニシリン、マクロライド系抗生物質、およびロバスタチンを含む高価値の化合物の大量生産のために、多くの微生物が無作為の変異誘発を通して最適化されている。株改良へのこの従来の取り組みは、操作されたＰＫＳを有する株に適用され得るが、この取り組みは、特にコンビナトリアル生合成によって作製され得る潜在的に多くの変異株を考慮すると、労働集約的なプロセスである。しかし、既存の産業的な株の過剰産生能力が、操作されたＰＫＳから誘導されるポリケチドの力価を増加させるのに適用され得るならば、魅力的で経済的な解決策を示す。過剰産生は、スクリーニングのためには現在は少なすぎる水準で産生された化合物への接近しやすさを増大させるだけでなく、作製されるライブラリーのサイズもまた拡大し得る。その理由は、より多くの修正がＰＫＳに導入された後、生成水準が低くなりすぎたからである。しかし、この種の株の広範囲な適用性は、過剰産生の原因となる要因が何であるか、および組換え型ＰＫＳからの産生が、過剰産生環境で増加するかどうかに依存する。
【０００６】
本発明は、他の宿主細胞より顕著に高水準でポリケチドを産生することが可能な包括的な宿主細胞に対する必要性を満たす。
【０００７】
（発明の要旨）
第１の実施形態では、本発明は、第１ポリケチドを産生する方法であって、前記方法が、第２ポリケチドを産生するために最適化された細胞中で該第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードするポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子を発現する工程を包含する方法を提供する。
【０００８】
ある局面では、この方法は、第２ポリケチドの誘導体である第１ポリケチドの産生、および遺伝子が第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するように過剰産生細胞中のＰＫＳ遺伝子を改変する工程を含む。
【０００９】
別の局面では、この方法は、過剰産生細胞中への、第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子の導入を含む。好ましい形態では、第２ポリケチドを産生するＰＫＳを発現する遺伝子は、第１ＰＫＳをコードする遺伝子の導入前または後に、欠失されるかまたは他の方法で不活性化される。
【００１０】
この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを越える水準で産生し、好ましくは２．５ｇ／Ｌを越えて、さらに好ましくは５ｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１０ｇ／Ｌを越えて産生する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを越えた水準で産生し、好ましくは２５ｍｇ／Ｌを越えて、さらに好ましくは５０ｍｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１００ｍｇ／Ｌを越えて産生する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、第２ポリケチドをコードする遺伝子が細胞中から消去され、第１ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が細胞内に容易に導入され得そして発現され得る、包括的な過剰産生宿主細胞を提供する。
【００１２】
ある局面では、この包括的な過剰産生細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全部もしくは実質的に全部の欠失によってまたはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化のいずれかによって修正される。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するために修正された包括的な過剰産生宿主細胞を提供する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、株の形質転換を促進する組み込みファージｐｈｉＣ３１のための結合部位を含む。ある実施形態では、宿主細胞は、この種の結合部位を含むための遺伝的変更によって修正される。
【００１４】
ある面では、この包括的な過剰産生宿主細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越える水準で産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、１０，１１−アンヒドロ−６−デオキシエリスロノリドＢを産生するＰＫＳをコードするようにｅｒｙＡ遺伝子を変更することによって、またはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの突然変異不活性化のいずれかによって修正される。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の実施形態、様式、および局面は、以下の説明、実施例、および添付の特許請求の範囲中でより詳細に記載される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
第１の実施形態で、本発明は、第１ポリケチドを産生する方法であって、前述の方法が、第２ポリケチドを産生するために最適化された細胞中で第１ポリケチドを産生するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）をコードするＰＫＳ遺伝子を発現する工程を包含する方法を提供する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第２ポリケチドを１ｇ／Ｌを超える水準で産生し、好ましくは２．５ｇ／Ｌを超えて、より好ましくは５ｇ／Ｌを越えて、そして最も好ましくは１０ｇ／Ｌを越えて産生する。この方法の好ましい実施形態では、過剰産生細胞は、第１ポリケチドを１０ｍｇ／Ｌを超える水準で産生し、好ましくは２５ｍｇ／Ｌを超えて、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌを超えて、そして最も好ましくは１００ｍｇ／Ｌを越えて産生する。
【００１７】
薬学および農業におけるポリケチドの価値、およびポリケチドが天然で発見される細胞中で産生されるポリケチドの量が典型的に少量であるため、細胞中でのポリケチドの産生を増加させるために、顕著な努力が払われてきた。従って、ポリケチドを作製する多くの「過剰産生」細胞がある。しかし、ほんの一例として、エリスロマイシンおよび半合成誘導体は、抗感染剤として重要な薬学上の用途を有する。ＤＥＢＳ（エリスロマイシンの大環状ラクトン中心である６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ、図１中の化合物１）を合成する）は、ＰＫＳのモジュラー類に属する。そのように呼ばれる理由は、合成のために必要な酵素ドメインが、触媒ドメインのモジュラーの繰り返しによって組織されるからである（図１）。ＤＥＢＳがそれから本来クローン化された生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８は、代表的に標準の実験発酵においてエリスロマイシンＡを１００〜２００ｍｇ／Ｌの間で産生する。ヒドロキシル化およびグリコシル化経路がその中に存在しないＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのいずれかにおけるＤＥＢＳの異種発現は、最適条件下で約５０〜１００ｍｇ／Ｌの６−ｄＥＢ（１）を産出し、これはＮＲＲＬ２３３８によって産生される１の量と近い（本明細書において参考として援用される米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。対照的に、多くの産業的に最適化されたＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの株は、エリスロマイシンを１０ｇ／Ｌを超えて産生する。
【００１８】
しかし、この種の過剰産生に関する生化学的な理由は、公知でない。あり得る理由の一つとしては、正常な産生細胞と比較して、過剰産生細胞は、ＰＫＳの発現をコードする遺伝子中に１以上の変異を有していることである。他の理由は、過剰産生細胞は、単にポリケチド生合成において使用される前駆体化合物をより多く産生することである。過剰産生の理由がＰＫＳ遺伝子中に存在する場合、第１ポリケチドの過剰産生細胞が第２ポリケチドの過剰産生細胞であることは可能性が低い。
【００１９】
本発明の利点を示すために、バイオリアクター発酵中で少なくともエリスロマイシンを７ｇ／Ｌ産生することができるＫ１と命名されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株を、使用した。上述のように、産業的な微生物における過剰産生の決定因子についての報告は驚くほど少ない。収量の向上は、フラックス、対応する遺伝子発現のアップレギュレーション、または基質（ポリケチドの場合におけるアシルＣｏＡチオエステル）のより高い細胞内貯留を増加する生合成酵素における変異の結果生じる。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａエリスロマイシン過剰産生細胞にとって、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生細胞における高い生産水準の最も有望な理由として、後者２つの理由の組み合わせが残り、力価の大幅な増加が単にＤＥＢＳの過剰発現のみの結果であると考えることは可能性が低い。過剰産生細胞株が動力学的に改良されたＰＫＳを保有していなかったことを示すために、ＰＫＳ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中でクローン化および発現して、そして産生水準を野生型Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株由来で株単離されたＤＥＢＳと比較した。この結果が、ＰＫＳにおける変異が過剰産生の原因である可能性は低く、そしてこの株中の他の生物からのＰＫＳの発現が、親株と比較してより高い力価を導く原因であることを示唆した。
【００２０】
産業的なＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主の改良された産生特徴のいくつかまたは全部が、ＰＫＳの活性全体または一部分によるものであるかどうかを調べるために、ＰＫＳをＮＲＲＬ２３３８株由来のＤＥＢＳと比較した。さらに、この産業的な株は、多段階の変異誘発から産生されるため、ＤＥＢＳ遺伝子中に変異が導入された結果としてより高い生合成のスループットを得ることが可能である。もしそうであれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で、変異ＰＫＳ遺伝子を用いることによって、ＤＥＢＳを伴って以前に作製されたこの種の異種宿主中で産生したエリスロマイシンおよび関連するマクロライドの力価を増加する株になり得る。過剰産生株由来のＤＥＢＳ遺伝子の完全なセットは、潜在的な変異を同定するために配列決定されるが、遺伝子クラスターの大きさ（＞３０ｋｂ）が、この取り組みを難しくしている。
【００２１】
代わりに、ＤＥＢＳをコードする３種の遺伝子、ｅｒｙＡＩ〜ＩＩＩは、保存された認識部位を使用して、過剰産生株からクローン化し、そしてＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８から得られたＤＥＢＳの異種発現のために使用される同様のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ発現ベクター中に配置した。得られたプラスミド、ｐＫＯＳ１０８−０４は、ｅｒｙＡＩ〜ＩＩＩ遺伝子の供給源以外は、ｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’（野生型ＤＥＢＳを含む）と一致する。いずれの場合でも、遺伝子の発現は、発現プラスミド上でａｃｔＩプロモーターおよびａｃｔＩＩ−４調節タンパク質によって制御される（本明細書において参考として援用される米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。ｐＫＯＳ１０８−０４およびｐＫＡＯ１２７’ｋａｎ’の両方を、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１１４およびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９を転換するために使用した。多発性形質転換株（各２〜４）を並行して増殖し、そして６−ｄＥＢの産生プロフィールを決定した。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓおよびＳ．Ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの両方において、２種の異なるＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株由来のＤＥＢＳ遺伝子は、以下の実施例に記載される培養条件下で当量の６−ｄＥＢ（約３０〜４０ｍｇ／Ｌ）を産出した。
【００２２】
過剰産生宿主由来のＰＫＳで、ポリケチド力価を増加することができないことは、この株由来のＤＥＢＳが野生型ＤＥＢＳと触媒的に異なってはいないが、６−ｄＥＢ産生水準がこれらの株において利用可能な前駆体の量によって制限されている可能性を暗示している。この実験結果は、異種宿主におけるそのＰＫＳの使用としてよりも過剰産生の宿主としての産業的な株の潜在的利点を強調する。従って、本発明の一つの利点は、あるポリケチドのための過剰産生株が、異なるポリケチドのためのＰＫＳ遺伝子を発現するために遺伝的に変更される場合に理解される。
【００２３】
１つの局面において、この方法は第２ポリケチドの誘導体であるポリケチドの産生および第１ポリケチドを産生するＰＫＳを発現するこれらの遺伝子のような過剰産生細胞におけるＰＫＳ遺伝子の変更を含む。本発明のこの局面は、コンビナトリアル生合成のために最適化されたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン過剰産生株によって説明される。ＤＥＢＳの変異株は、対応するポリケチドの構造を変化させる触媒的なドメイン置換によってこの宿主中で構築された。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（最適化されていない宿主である）において発現された同様の変異株ＤＥＢＳの発現と比較すると、変更されたポリケチドの産生量は格段に高かった。
【００２４】
ポリケチドの生合成を操作するための多くの戦略は、ＤＥＢＳおよび他のモジュラーＰＫＳを用いることで達成された。これらはドメインおよびモジュールの不活性化、欠失、および置換、タンパク質融合によるハイブリッドモジュールの構築、および異なる原料からのＰＫＳサブユニット間の相補性を含む。これらの実験は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、またはＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの比較的低い産出株のいずれかにおいて実施される。本発明に基づき、これらの株においてＤＥＢＳを改変するために通常用いられるＰＫＳ戦略によって産生されたポリケチドの力価は、過剰産生株において実質的に増強され得る。
【００２５】
この利点を説明するために、過剰産生のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ
ｅｒｙｔｈｒａｅａ株において代表的なＰＫＳドメイン置換を構築した。同種二重再結合によって過剰産生宿主の染色体内で、ＤＥＢＳの増量モジュール２（ｅｒｙＫＲ２）とラパマイシンＰＫＳの増量モジュール４由来のＤＨおよびＫＲドメイン（ｒａｐＤＨ／ＫＲ４）とにおいてケトレダクターゼ（ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）ドメインの交換が設計された（図２）。この特殊な変異が選択されたのは、ドメイン置換の全身的スクリーニングにおいて産生される機能的単一変異株の産生が中でも最も低く、そのため低い収量のＰＫＳを向上させる能力を厳格に試験するためである。プラスミドに基づくＤＥＢＳ系において改変され、そしてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおいて発現される場合、生じる株（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  Ｋ４−１１４／ｐＫＯＳ１１−６４）は、新しく導入されたＤＨ活性の結果、約０．３ｍｇ／Ｌの６−ｄＥＢの１０，１１−アンヒドロ類似物３を産生した（図２）。本明細書において参考として援用される両ＰＣＴ公開番号  ９８／４９３１５号および００／０２４９７号を参照のこと）
置換を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ３９−１０（表１）は、大量のエリスロマイシン類似体の混合物（予想された１０，１１−アンヒドロ部分を全て含むが、ヒドロキシル化パターンにおいて異なっている）を産生した（図２）。最も量の多い生成物は、１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンＡ（化合物４）、Ｂ（化合物５）、およびＤ（化合物６）、および６−デオキシ−１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンＡ（化合物７）、Ｂ（化合物８）、およびＤ（化合物９）であった。化合物４、５、７、および９の構造を確認するため、そして化合物５および７の水酸基の位置を決定するために、１Ｈ−ＮＭＲ分光法および１Ｈ−ＴＯＣＳＹ相関を使用した。これらの産生された化合物の比は、培地依存であり得る。エリスロマイシンＡのＢ（１２−デオキシ）種およびＤ（４’’−デスメチル）種は、しばしばＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株の発酵培養液中に存在するが、６−デオキシ化合物は通常検出されない。ＥｒｙＦは、ポリケチドアグリコンのＣ−６炭素でのヒドロキシル化を引き起こすシトクロムＰ４５０である。Ｋ３９−１０における６−デオキシ化合物の存在は、ＥｒｙＦのインビトロでのヒドロキシラーゼ活性が１０，１１−二重結合を有する基質に対しては乏しいという以前の観察と一致している。
【００２６】
Ｒ５発酵培地またはＦ１発酵培地のいずれかからのエリスロマイシンの全収量は、約５０ｍｇ／Ｌであった。これは改変されたＰＫＳによって合成された大環状ラクトン生成物（化合物３）の約２６ｍｇ／Ｌに相当する。ポリケチドの収量は、親株によって産生されたエリスロマイシンの量と比較して顕著に減少したけれども、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおける化合物３の産生と比較すると、力価でほぼ１００倍の増加となる。この相対的な増加は、２種の異なる宿主中の改変されていないＤＥＢＳ由来の６−ｄＥＢ産生における相対的な増加と整合し、そして過剰産生の利点のほとんどまたは全ては、変異株ＰＫＳに翻訳されることを実証している。
【００２７】
高いポリケチド産生株の使用がポリケチドの大きなコンビナトリアルライブラリーの構築への一般的な取り組みであることを実証するこれらの実験によって、二つの重要な発見が得られた。一つ目は、変異株ＰＫＳ由来の産生水準は、過剰産生環境において発現した場合に顕著に増加し得ることである。これは作製される多くの他の単一改変体と比較して、比較的少量の化合物を産出するドメイン置換を有する例において示されている。従って、この種の収量の増加は、野生型と比較して複数の修正を有するＰＫＳ酵素を含む株を含んで、おそらく普遍的に観測される。この株のための効率的な遺伝的用具を用いて、既存のマクロライドライブラリーを、スクリーニングおよび入手可能な化合物の数を拡大するために適切な化合物の力価を作製するＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ内に移動することが比較的好都合である。
【００２８】
また、このＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの株における過剰産生の原因が宿主の環境にあり、ＰＫＳ遺伝子内の変異からではないように見えることをこれらの実験は示している。これはまた、異種ＰＫＳからのモジュールまたはドメインが、過剰産生宿主において、より高い力価を作製することを意味する。これは重要である。なぜなら、ＰＫＳ操作のための機能的単位は、異なる生物からクローン化された多くのＰＫＳから入手可能だからである。そのうえ、低産生ＰＫＳの完全な経路（例えば、抗腫瘍ポリケチドエポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）のための経路）は、株中で入手可能な十分な基質を想定し、そしてそれによって従来の株を改良する必要性を回避することで異種発現によって改良され得ることを示唆する。
【００２９】
従って、ポリケチド過剰産生株を、良好な量で設計されたＰＫＳ由来のポリケチド誘導体を産生するために使用し得る。明細書中に示すように、産業的なエリスロマイシン産生株の使用は、小スケール産生培養（＜１Ｌ）から生物学的アッセイ法のために十分な量のエリスロマイシン誘導体の産生を導き、そして適度のスケールアップ（１００〜１０００Ｌ）によって、化学的修飾による最適化を導くために十分な量のエリスロマイシン誘導体の産生を導く。従って本発明は、良好な収率でより大きな化合物ライブラリーを作製する能力を翻訳するコンビナトリアル生合成戦略によって調製されるポリケチドライブラリーからの力価の「全面的な」増加を達成するための、単純で実験に基づいた方法を提供する。さらに、ポリケチド遺伝子クラスターの識別およびクローン化が、比較的少ない時間で達成され得るため、プロセス展開時間および過剰産生宿主における異種発現によるポリケチドを導く努力を顕著に短縮することが可能となる。さらに、非常に高い産生水準のために最適化された宿主を使用することによって、改変されたＰＫＳ由来のポリケチドの力価の減少を奪還することが可能である。
【００３０】
本発明の方法は、過剰産生細胞内の既存のＰＫＳ遺伝子の変更だけではなく、過剰産生細胞中への新規ＰＫＳ遺伝子の導入も含みうる。多数のモジュールのＰＫＳ遺伝子はクローン化され、そして本発明の方法に基づく使用のために入手可能である。ＰＫＳ酵素によって産生されたポリケチドは、しばしばテーラーリング酵素（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）と呼ばれるポリケチド修飾酵素によってＰＫＳのヒドロキシル化ポリケチド生成物、エポキシ化ポリケチド生成物、メチル化ポリケチド生成物、およびグリコシル化ポリケチド生成物へとさらに修飾される。本発明の方法に基づいて、これらの遺伝子はまた、過剰産生宿主細胞内に導入し得、目的の修飾されたポリケチドを調製する。以下の表は例示的なＰＫＳ遺伝子を記載および本発明に基づいて利用し得る対応する酵素の引例を列挙する。また、本発明の組換え型ＤＮＡ化合物を作製するために用いられ得るポリケチドテーラリング酵素および修飾酵素および対応する遺伝子を記載する種々の引例を示す。
【００３１】
【表１】
2005529579.tif 000008
2005529579.tif 000009
ポリケチド修飾のための遺伝子を含むかまたは含まない上述の遺伝子のうち任意のものは、もしあれば、本発明の過剰産生宿主細胞中で用いられ得る。さらに、本発明の宿主細胞は、所望のＰＫＳの一部および修飾酵素遺伝子クラスターを各々含む複数ベクターとの形質転換によって構築され得る：本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと。
【００３２】
好ましい様式において、目的のＰＫＳをコードする遺伝子の導入の前または後に、過剰生産株の内在性のＰＫＳ遺伝子は、欠失されるかまたはそうでなければ不活性化される。ある重要な面では、本発明は「過剰産生された」ポリケチドを産生するＰＫＳをコードする遺伝子が欠失されて、そして目的のＰＫＳをコードする遺伝子が容易に導入および発現され得る遺伝的過剰産生宿主細胞を提供する。ある好ましい実施形態では、この遺伝的過剰産生宿主細胞は、エリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えるレベルで産生するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞から誘導され、そしてｅｒｙＡ遺伝子の全部もしくは実質的に全部の欠失またはＤＥＢＳ  ＰＫＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインの変異的不活性化のいずれかによって修飾される。
【００３３】
本発明のこの局面を説明するために、ポリケチドシンターゼＤＥＢＳ上の遺伝ブロックが、６−デオキシエリスロノリドの非産生を生じるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのエリスロマイシン過剰産生株に導入された。このブロックされた株におけるオレアンドマイシンＰＫＳのｏｌｅＡＩ遺伝子の発現は、１５−ノル−エリスロマイシンＡを産生することが見い出された。このブロックされた変異株の培養物に合成分子が外因性付加することによって、新規な生物学的に活性なエリスロマイシンアナログのＣ−１３誘導体の産生が生じた。この後者の戦略は、前駆体指向型生合成と呼ばれ、ＰＫＳにおける変異の下流に化学的に指向されたプライミング単位または中間体を組込み得る生合成的にブロックされたＰＫＳ変異株を利用する。６−ｄＥＢの多数のＣ−１３誘導体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおいて、ＰＫＳに合成的部分鎖の組込むことにより、ＤＥＢＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ１）に変異を導入することによって、産生され得る（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／０３９８６号および同９７／０２３５８号を参照のこと）。しかし、この方法論がＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株において実行され得る場合、より多くのポリケチドが作製されるというだけではなく、完全にグリコシル化およびヒドロキシル化された化合物が産生されるという点で有利である。
【００３４】
この目的を達成するため、プラスミドｐＫＯＳ４０−５７を送達ベクターとして構築し、ＤＥＢＳ１モジュール１のＫＳ１ドメインに活性部位Ｃｙｓ７２９＞Ａｌａ変異を導入した（前出の、ＰＣＴ公報９９／０３９８６号および同９７／０２３５８号に記載されている）。不活性なＫＳ１ドメインは、開始単位の増殖を防ぎ、そして外因性の合成のジケチドチオールエステルがＰＫＳへ導入されるのを可能にする（本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ公報００／０４４７１７を参照のこと）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１プロトプラストはｐＫＯＳ４０−５７で形質転換され、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して生物活性を有さない８種の形質転換株が得られた。ｐＫＯＳ４０−５７の組込みが染色体の適切な場所で起こっていることを確認するために、ＰＣＲ分析用に形質転換株の一つからゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、二重交差現象を介してのプラスミドの立ち退き（ｅｖｉｃｔｉｏｎ）を可能にする非選択的な成長が行われた。アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）に過敏なコロニーの５分の３が所望のＫＳ１ヌル（ＫＳ１°）変異株にあることが見い出された。Ｋ３９−１４と称される１つのこのようなＫＳ１°ヌル株は、検出可能なエリスロマイシンまたは６−ｄＥＢ様産物をいずれも産生せず、Ｒ２ＹＥ培地中で増殖させた場合に生物活性を示さなかった。このＫ３９−１４株は、ＫＳ１ヌル変異株を補完するｏｌｅＡＩ遺伝子の異種発現のため、および新規エリスロマイシンアナログの前駆体指向型生合成のために使用された。
【００３５】
異種モジュラーＰＫＳ由来のサブユニットは、混成ポリケチドを作製するために機能的に組み立てられ得る。例えば、ＤＥＢＳ３サブユニットおよびＯｌｅＡ３サブユニット（８，８ａ−デオキシオレアンドリドＰＫＳのサブユニット３）の両方は、ピクロマイシンＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶサブユニットを完全に補完し得る（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／６１５９９号を参照のこと）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来の野生型ＤＥＢＳのローディングドメインは、低レベルの１５−ノル−エリスロマイシンｃを形成するためのアセテートを受容することが示されている。ＤＥＢＳがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中で発現して１５−ノル−６ｄＥＢの（１：５の６ｄＥＢ）を形成する場合に、同様の結果が観察された（本明細書内で参考として援用される、米国特許第５，６７２，４９１号を参照のこと）。Ｏｌｅ  ＰＫＳは８，８ａ−デオキシオレアドリドを産生し、これはプライミング単位中の１つの炭素のみだけＤＥＢＳの産物である、６−ｄＥＢとは異なっている。Ｏｌｅ  ＰＫＳのサブユニットおよびＤＥＢＳのサブユニットは、有意な構造的相違を含む：これらは、機能的には同様であるにもかかわらず、ＤＥＢＳとＯｌｅ  ＰＫＳとの間で４５％しか同一ではない。
【００３６】
発現プラスミドｐＫＯＳ３９−１１０（これは、ｅｒｍＥ＊プロモーターの制御下で、ｏｌｅＡＩ遺伝子を運搬する）の発現が利用可能であり（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報９９／０６１５９９号を参照のこと）、そしてΦＣ３１結合部位を使用して、染色体内への組込みによって株Ｋ３９−１４内にｏｌｅＡＩ遺伝子を導入するのが好都合であった。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ３９−１４のプラスミドとｐＫＯＳ３９−１１０での形質転換は、株内で生じ、これは副生成物１５−ノル−エリスロマイシンＣを伴って、１５−ノル−エリスロマイシンＡ約５〜１０ｍｇ／Ｌの抗菌活性を示した。マススペクトルおよびＬＣ保持時間は既知の標準と一致した。ｍ／ｚ７０６でのプロトン化分子イオン種は、１５−ノル−エリスロマイシンＣの提案された構造と一致している。この結果は、ＯｌｅＡＩがある程度までＤＥＢＳ１を補完し得ることを示している。また、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるこの異種ＰＫＳサブユニットを発現する能力はまた、異種ＰＫＳ酵素が本発明の包括的な過剰産生宿主細胞中で産生され得ることを示している。
【００３７】
前駆体指向型生合成は、ＤＥＢＳのモジュール１のケトシンターゼ（ＫＳ１）に変異を導入し、そしてジケチド前駆体の化学的に合成されたＮ−アセチルシステアミン（ＮＡＣ）チオエステルを発酵物に添加することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ中で、６−ｄＥＢの多くのＣ−１３誘導体を作製するために使用される。前駆体指向型生合成によるエリスロマイシンアナログの産生を単純化するためおよびポリケチドからのエリスロマイシンＡ類似体への産生を完全にプロセスするために、株Ｋ３９−１４を作製するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株の染色体中にＫＳ１°変異を導入し、これを、図３中に示すプロピルＮＡＣジケチド（４）またはビニルＮＡＣジケチド（５）０．２５ｇ／Ｌの存在下、Ｆ１培地で発酵させた（本明細書中で参考として援用される、Ｂｒｕｎｋｅｒら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：２４４１〜２４４８を参照のこと）。この株は、各々、対応する１５−メチルエリスロマイシンまたは１４，１５−デヒドロエリスロマイシン誘導体（図２の化合物６〜８および９〜１１）を１０〜２０ｍｇ／Ｌの間で産生した。両エリスロマイシンアナログはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して抗菌活性を示した。１５−メチルエリスロマイシンＡの構造は、ＮＭＲによって決定した。
【００３８】
エリスロマイシンの量は、おそらく膜移送障壁のために、この株の潜在的な能力よりもかなり低いものであるが、これらの収率は小培養量からの生物学的スクリーニングには充分である。化学的に合成され得る合成ジケチドの可能な配列が与えられれば、簡便な様式でより多くのエリスロマイシン誘導体を生成し、スクリーニングすることが可能である。
【００３９】
本発明の方法に基づき、天然では株によって主生成物として産生されない種々のエリスロマイシン化合物を産生するために、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａの過剰産生株を使用する。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株におけるＫＳ１  ヌル変異を含むＤＥＢＳ１変異株のＯｌｅＡＩ相補は、２種の異なるＰＫＳ酵素複合体から誘導されるタンパク質からなる機能的異種ＰＫＳであって未修飾の過剰産生株によっては主生成物として作製されないポリケチドを産生するＰＫＳの例を提供する。Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株における１０，１１−アンヒドロエリスロマイシンの産生は、２種の異なるＰＫＳ酵素から誘導される酵素ドメインからなるモジュールを含むタンパク質を含む機能的異種ＰＫＳ複合体であって未修飾の過剰産生株によっては作製されないポリケチドを産生するＰＫＳ複合体の例を提供する。ＫＳ１ヌル変異を含むＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株におけるジケチド補給によるポリケチドの産生は、ＰＫＳのための合成化学スターターを提供することによる野生型ＰＫＳによって産生されるポリケチドと異なるポリケチドを産生するために使用され得る非機能的異種ＰＫＳ複合体の例を提供する。
【００４０】
従って、本発明は組換え宿主細胞において多くの異なるポリケチドを産生するための有用な方法および宿主細胞を提供する。しかし、高い力価のポリケチドを産生するために変異誘発を経て最適化されたポリケチド産生宿主細胞が形質転換されにくいことは公知である。さらに、このような細胞で観測される形質転換の低い効率は、細胞を形質転換するために使用されるベクターのサイズが増加するにつれて顕著に減少する。非常に大きなベクターでは、形質転換は、しばしば単純に可能ではない。通常ＰＫＳ遺伝子が非常に大きい（＞３０ｋｂ）ために、この低い形質転換効率は、本発明の利点を実現するのに顕著な障壁となる。この形質転換障壁は宿主における制限−修飾系によるものであり得るといういくつかの証拠および推測がある。
【００４１】
接合媒介性の形質転換は、この障壁をある程度克服し得る；これは制限−修飾系への接合において生じる単鎖ＤＮＡのより低い感受性の結果であり得る。しかし、接合媒介性の形質転換であっても、相同組換えによって宿主細胞の染色体内に組み込まれる非常に大きなベクターでは成功し得ない。この障壁は相同組換え事象の性質の結果であり得、制限−修飾系によって送達されたＤＮＡの開裂と比較すると低くあり得る。
【００４２】
ファージからの結合部位（ａｔｔＰ）を含むベクター（例えば、ｐｈｉＣ３１、ｐＳＡＭ、およびｐＳＬＰベクター系のベクター）は、ファージのインテグラーゼ酵素によって媒介される機構によって宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。しかし、この種のベクターがＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞での接合媒介性の形質転換に使用された場合、上述のように非常に低い形質転換効率が観測された。接合完了体（ｅｘｃｏｎｊｕｇａｎｔ）は、ＤＮＡ配列分析によって分析され、ベクターが、他の生物中のファージによって利用され、そして以前確認された好ましい結合部位の配列（ａｔｔＢ配列）とは配列において異なる部位に無作為に組み込まれたことを発見した。この低い形質転換効率の障壁は、ａｔｔＢ配列を含むように宿主細胞の染色体を変化させることによって克服された。得られた組換え宿主細胞は、ＰＫＳ遺伝子クラスター全体を含む非常に大きなベクターとであっても、ｐｈｉＣ３１結合部位配列を含むベクターとの接合によって、比較的高い形質転換効率で形質転換され得る。
【００４３】
従って、ある実施形態において、本発明はＥ．Ｃｏｌｉまたはヒト宿主細胞以外の組換え宿主細胞を提供し、この組換え細胞は、この細胞が誘導される細胞と比較して１以上のａｔｔＢ部位を含むように改変されている（本明細書中で参考として援用される、Ｔｈｏｒｐｅら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５５０５〜５５１０，およびＧｒｏｔｈら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５９９５〜６０００を参照のこと）。複数の結合部位を含むように修飾された細胞は、染色体の異なる場所に複数の遺伝子を導入する目的のために好ましくあり得る。１つの実施形態において、変異誘発によって最適化された細胞からこの細胞が誘導され、高レベルでポリケチドを産生する。別の実施形態において、この細胞は、ＮＲＲＬ２３３８のようなＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞またはエリスロマイシンを２．５ｇ／Ｌを越えて産生する細胞である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、ｐｈｉＣ３１結合部位を含むように改変された細胞の形質転換体を得るための方法を提供し、この方法は、前述の細胞と、相補的な結合部位（ａｔｔＢとａｔｔＰは互いに相補的である）を含むベクターを含む細胞とをインテグラーゼ（これはｐｈｉＣ３１インテグラーゼであり得、従って遺伝子が、ベクター中または宿主細胞中にあり得、そして異種プロモーターの制御下であり得る）存在下で、接合する工程を包含する。一方ａｔｔＰは、典型的にベクターおよび染色体上のａｔｔＢ上で使用されるが、一つはまた本発明の方法に従って、染色体中にａｔｔＰをそしてベクター上にａｔｔＢを配置し得る。別の実施形態において、本発明はこのような方法によって産生された細胞を提供する。好ましい実施形態において、このような方法によって産生された細胞は、前述の接合工程の前に細胞によって産生されないポリケチドを産生する。
【００４５】
以下の実施例は本発明を説明する目的のために与えられ、本発明または特許請求の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４６】
（実施例１）
（株、培地条件、およびＤＮＡ操作）
ＤＮＡ操作はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で行なった。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株は、エリスロマイシンを７ｇ／Ｌを越えて産生した（株Ｋ１）。この株の形質転換を、ＹＥＭＥの代わりにＴＳＢ培地を用いた以外は、標準Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロトプラスト法に従って行った。形質転換体は、Ｒ２ＹＥ再生プレートまたはＲ５再生プレート上のチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）（５０μｇ／ｍＬ）またはアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）（１００μｇ／ｍＬ）とともに選別した。
【００４７】
（実施例２）
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＫＳ１ヌル変異株の構築）
プラスミドｐＫＯＳ４０−５７を、ＤＥＢＳ  ＫＳ１ヌル変異体（アラニンとＤＥＢＳ  ＫＳ１ドメインの活性部位システインとの特殊な置換；本明細書中で参考として援用される、Ｋａｏら，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１２３６３〜１２３６８を参照のこと）を含む４．０ｋｂ  ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、送達ベクターとしての自殺ベクター（アプラマイシン耐性付与遺伝子を含むｐＵＣ１８誘導体）に導入することによって構築した。プラスミドｐＫＯＳ４０−５７は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１に形質転換された。アプラマイシン耐性株  （Ｋ１−１）をアプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ培地内で増殖させて、耐性を確認し、そして組み込みを染色体ＤＮＡのＰＣＲ分析によって確認した。二重交差決定のために、形質転換株をＴＳＢ倍地中でアプラマイシンなしで２回継代した。プロトプラストをＲ２ＹＥプレート上で再生した。再生プレートで生じる個々のコロニーを、次いで、アプラマイシンへの感受性についてスクリーニングした。所望の変異を含むコロニーは、エリスロマイシンを産生しないことが実証され、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ３９−１４と命名された。上述のように、ｏｌｅＡＩ遺伝子をコードするプラスミドｐＫＯＳ３９−１１０と形質転換した場合、Ｋ３９−１４株は１５−ノルエリスロマイシンを産生し、そしてプロピルＮＡＣジケチド（図３の化合物４）を与えた場合、１５−メチル−エリスロマイシンを産生した。
【００４８】
（実施例３）
（エリスロマイシン誘導体の産生および分析）
本明細書中で記載されるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を、Ｒ２ＹＥ  ２５ｍＬ中で３０℃で５日間増殖させた。培養物を、エリスロマイシン誘導体についてＨＰＬＣ／ＭＳによって分析した。構造決定は、操作された株に関して予測された構造とマススペクトルとＨＰＬＣプロフィールとの間の一致に主として基づいた。マススペクトルおよびＨＰＬＣに関して、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ野生型株を参照として使用した。また、実施例４に記載されるように、１５−メチルエリスロマイシンＡのＮＭＲスペクトルによってさらなる構造確認が行なわれた。生物活性を、指標菌としてのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを用いた寒天プレート拡散アッセイによって評価し、阻害領域を視覚化するために３７℃で一晩中インキュベートした。
【００４９】
（実施例４）
（１５−メチルエリスロマイシンＡの特性決定）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ３９−１１４を、実施例３に記載されるように、発酵開始２４時間後に培養物に与えられた０．２５ｇ／ＬのプロピルＮＡＣジケチド（図３の化合物４）存在下で、発酵させた。発酵から抽出された１５−メチルエリスロマイシンＡを、特性決定のためにトルエン／アセトン  １：１を用いるカラムクロマトグラフィーによってさらに精製して、白色固体を得た。１Ｈおよび１３Ｃスペクトルを、４００ＭＨｚ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ）でＣＤＣｌ３溶液中で記録した。薄層クロマトグラフィーをシリカゲル６０でプレコートされたガラス上で行い、そしてスポットをバニリン染色によって視覚化し、次いで、加熱した。ＮＭＲ値：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，８．８），４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２），４．０５−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，１０．４，），３．１２（ｂｒ  ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．０），３．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６），２．９０（ｄｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，９．１），２．７７−２．６７（ｍ，１Ｈ），２．５２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，９．６，１２．４），２．４３−２．３７（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｓ，６Ｈ），２．０５−１．９０（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．７９−１．５５（ｍ，３Ｈ），１．５０（ｓ，３Ｈ），１．３６−１．０９（ｍ，２７Ｈ），０．９４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ２２１．２，１７４．６，１０２．２，９５．４，８２．５，７９．０，７７．０，７６．３，７６．０，７４．１，７３．５，７１．６，６９．９，６８．０，６４．６，６４．５，４８．５，４４．２，４３．９，３９．２，３８．５，３７．６，３６．８，３４．０，２９．２，２７．８，２６．１，２０．５，２０．４，１８．５，１７．７，１７．３，１５．２，１４．９，１３．０，１１．０，８．１。
【００５０】
（実施例５）
（ネイティブなＰＫＳ遺伝子を欠失している包括的産生宿主）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ高プロデューサの収量を向上する多くの変異がＰＫＳ遺伝子以外の染色体領域に存在し、前駆体プール、調節プロセス、栄養の利用、そして他の要因に影響を及ぼす。このような収量を向上する変異は、変異体および異種ＰＫＳ遺伝子によってコードされたポリケチドの過剰産生のための包括的な宿主として株を使用することによって、直接的および速やかに開発され得る。このことは主に、特定のポリケチドを作製するためにＰＫＳおよび補酵素によって使用される全ての出発物質を供給する能力を要求する。運良く、モジュラーＰＫＳは全て、単純なカルボン酸の１以上の小さな基（例えば、アセテート、プロピオネートまたはブチレートならびにこれらの２−カルボキシ誘導体）を使用して、炭素骨格およびジデオキシヘキソースまたはトリデオキシヘキソース（主要なポリケチドのグリコシドを形成するための１−チミジンジホスホグルコースから作製される）を構築する。他のテーラーリング（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）反応は全て、ほとんどの細菌性細胞中で利用可能な共通の補助因子を含む。従って、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａは、出発物質の全てまたはほとんどを提供し得る；特定のポリケチドにとって必要とされる特殊な出発物質のいくつかは、遺伝子操作によって導入される。
【００５１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａエリスロマイシン過剰産生体由来のＤＥＢＳ遺伝子を、非過剰産生株由来の異種ＰＫＳで交換し得る。導入されたＰＫＳ遺伝子によって作製された代謝産物の増強された産生は、他のポリケチドの産生のために開発され得る代謝産物過剰産生のための因子を宿主が実際に含むことを実証し得る。異種遺伝子をＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ過剰産生株に導入する前に、ネイティブのＤＥＢＳ遺伝子を最初に欠失し得る。以下にさらに詳細に記載されているように、これは２段階相同組換え手順によって達成された。ＤＥＢＳ遺伝子に隣接する配列（約１．５ｋｂ）は、ＰＣＲによって増幅され、そして選択マーカー（アプラマイシン耐性のための）を有する自殺ベクターにクローン化された。この株を、プラスミド、および選択可マーカーを用いることによって選択された単一交差を用いて形質転換した。コロニーを選択せずに増殖させ、そして二重交差組換えを示すアプラマイシン耐性の損失についてスクリーニングした。二重交差候補の遺伝子型を、ＰＣＲを用いた分析、エリスロマイシン産生の損失、およびサザンブロットハイブリダイゼーションによって確認した。このように確認された株の一つをＫ９７−７１と命名された。
【００５２】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１は３種のｅｒｙＡ遺伝子の染色体欠失およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｘｙｌＥ遺伝子の挿入を染色体中の適所に含む。この株を作製するために、プラスミドｐＫＯＳ９７−４９ｂを最初に以下のように構築した。ｅｒｙＡ遺伝子をフランキングした２種のフラグメントは、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａゲノムＤＮＡから以下のようなプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位は下線が引かれている）：
ｅｒｙＡＩ左フランク順方向：
５’−ＴＴＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＣＧＣＧＣＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣ，
ｅｒｙＡＩ左フランク逆方向：
５’−ＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＣＣＣＣＴＡＣＴＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣ；
ｅｒｙＡＩＩＩ右フランク順方向：
５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＣ，
ｅｒｙＡＩＩＩ右フランク逆方向：
５’−ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴ。
次いで２種のフラグメントを、下線を引かれた制限部位およびｐＳＥＴ１５２中の対応する部位を用いてｐＳＥＴ１５２内にクローン化した(本明細書中に参考として援用される、Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．，Ｇｅｎｅ  １１６：４３〜４９を参照のこと）。得られたプラスミドはｐＫＯＳ９７−４９ａと命名された。
ｘｙｌＥ遺伝子をＰＣＲ増幅して、ｐＫＯＳ−９７−４９ａのＮｄｅＩおよびＸｂａＩ部位にクローン化して、ｐＫＯＳ９７−４９ｂを作製した。このプラスミドはもはやｐｈｉＣ３１インテグラーゼ遺伝子およびｐＳＥＴ１５２由来のａｔｔＰ遺伝子座を含んでおらず、そして相同組換えによる送達のための自殺ベクターとして役立つ。
【００５３】
過剰産生株Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ１のプロトプラストは、細胞をＴＳＢ培地中で成長さ、そして成長３日後に収集することを除いて、標準手順によって生成した（本明細書中に参考として援用される、Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫを参照のこと）。プラスミドｐＫＯＳ９７−４９ｂ  ＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７から調製して、非メチル化ＤＮＡを生成して、ＰＥＧ３３５０（Ｓｉｇｍａ）を使用する以外は標準手順を使用するプロトプラストの形質転換に使用した（上述のＨｏｐｗｏｏｄらの文献を参照のこと）。プレートはアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）１ｍｇで覆って、相同組換えによるプラスミドの組込みのために選択した。アプラマイシン耐性コロニーはサザンハイブリダイゼーションによって分析し、予期される位置での単一交差を確認した。以下に示す二重交差を実行するために、１つのコロニーを選択した。株はＩＴ寒天培地（１Ｌあたり、５ｇ  グルコース、５ｇ  トリプトン、０．５ｇ  ベタイン塩酸塩、５ｇ  コーンスターチ、１ｇ  コーンスティープ液（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）（５０％）、２００ｍｇ  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、２ｍｇ  ＺｎＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、０．８ｍｇ  ＣｕＳＯ４＿５Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ  ＣｏＣｌ２＿６Ｈ２Ｏ、４ｍｇ  ＦｅＳＯ４＿７Ｈ２Ｏ、８０ｍｇ  ＣａＣｌ２＿６Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ  ＫＨ２ＰＯ４、  １０ｇ  ＮａＣｌ、２０ｇ  寒天）上で十分に胞子成長するまで、非選択に成長した。胞子を収集し、ＩＴプレート上に希釈して、そして単一コロニーをアプラマイシン耐性の欠損についてスクリーニングした。エリスロマイシンを産生しない１つのアプラマイシン感受性のコロニーを単離した。サザンハイブリダイゼーションによって二重交差を確認した。この株をＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１と命名した。
【００５４】
株Ｋ９７−７１は、他の非６−ｄＥＢポリケチドについてのＰＫＳ遺伝子を挿入し得る本発明の包括的な過剰産生宿主である。それらの大きなサイズ（３０ｋｂまたはそれ以上）に起因して一度にＰＫＳ遺伝子の完全なセットを移動することが困難であり得るので、その構築は必要であれば一連の２〜３の二重相同組換え工程に分けられ得る。ピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子は本発明のこの面の実例として役立つ。ピクロマイシンＰＫＳはＤＥＢＳに関するが、顕著に異なる化合物を産生する。ピクロマイシンＰＫＳは、ナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）（炭素１０のメチル基、炭素１０と１１間に二重結合、および炭素３のケトンがないこと以外は６−ｄＥＢと類似）を合成する。これらはピクロマイシンＰＫＳのモジュール２およびモジュール６における違いに起因している。ＰＫＳのモジュール２のＡＴドメインはプロピオナートの代わりにアセテートを組み込み、モジュール２においてさらなるデヒドラターゼ（ＤＨ）活性があって、モジュール６におけるケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメインがない。また、ピクロマイシンおよびＤＥＢＳ  ＰＫＳの構築は、ピクロマイシンのモジュール５およびモジュール６が２種のＯＲＦに分かれている以外は類似している。２種のＰＫＳ間のアミノ酸配列の類似性は約４０％である。同時に、ピクロマイシンＰＫＳのこれらの特徴的な特徴は、ピクロマイシンＰＫＳをエリスロマイシン過剰産生生物に移入される場合、ＤＥＢＳと異なるモジュラーＰＫＳがポリケチドを過剰産生することを説明するための理想的な選択にする。
【００５５】
異種ＰＫＳ遺伝子を導入するために、ａｔｔＰ結合部位を含むプラスミドを使用し得る。あるいは、上述の二重組換え手順を使用し得る。一旦完全なＰＫＳが導入されると、株は代謝産物の産生のために分析される。エリスロマイシンデオキシ糖生合成遺伝子およびグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子がインタクトなままであるため、ｅｒｙ遺伝子クラスター中に存在するグリコシルトランスフェラーゼの活性に依存して、ポリケチドアグリコン（すなわち、ナルボノリド）、デソスアミニル化（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｙｌａｔｅｄ）誘導体（ナルボマイシン）のいずれかまたは両方が産生され得る可能性がある。さらに、Ｃ−６またはＣ−１２ヒドロキシル化反応のいずれかが起こり得る。親株中の、産生するポリケチドの合計量は、過剰産生を示すための同様の条件下でのエリスロマイシンＡの産生水準と直接的に比較される。
【００５６】
他のＰＫＳ遺伝子は容易に株Ｋ９７−７１メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子内に導入され得る（本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ特許出願番号  ＵＳ００／２７４３３、２０００年１０月４日出願を参照のこと）および、オレアンドリド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ遺伝子（本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ公開番号  ００／０２６３４９を参照のこと）を含むがこれらに限定されない。また、この宿主は、ＦＫ５０６およびエポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）のような、エリスロマイシンに遠くにのみ関係したポリケチドの産生のために使用され得る。これはまた、ＰＫＳ酵素に対する独特の基質（例えば、２−エチルマロネートまたは２−ヒドロキシマロネート）の産生を確実にするか、またはそれが形成されるとき、ポリケチド骨格を修飾する（例えば、脱水または酸化）酵素を提供するために、特定の非ＰＫＳ遺伝子の導入を伴う。さらに、種々のプロモーター（例えば、エリスロマイシン過剰産生株からのａｃｔプロモーター、ｅｒｍＥ＊プロモーター、ｅｒｙＡプロモーター）のうち任意のものを利用して、異種ＰＫＳ遺伝子クラスターの発現を駆動しうる。
（実施例６）
（ＰｈｉＣ３１結合部位を含むＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株の構築）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ株は、ｐｈｉＣ３１の結合部位配列に実際に対応する染色体のＤＮＡ配列を含まない。従って、ｐｈｉＣ３１から誘導されたプラスミドとの結合効率は、このような株とでは高くなく、このような株への非常に大きなプラスミドの導入は不可能ではないとしても、困難であり得る。結果として、本発明は、ポリケチド産生株の染色体ＤＮＡ内にｐｈｉＣ３１結合部位配列を挿入することによって改良された種々のポリケチド産生株（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株を含むがこれに限定されない）を提供する。
【００５７】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ２４−１は３種のｅｒｙＡ遺伝子の染色体欠失ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓファージｐｈｉＣ３１のためのａｔｔＢ遺伝子座、次いでｅｒｍＥ＊プロモーターの適所での挿入を含む。この株を作製するために、プラスミドｐＫＯＳ１３４−０４が最初に以下のように構築された。以下の２種のアニーリングされたオリゴヌクレオチドを使用して、ｐｈｉＣ３１  ａｔｔＢ部位をｐＫＯＳ９７−４９ａのＨｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉ部位との間に挿入した：
順方向：
５’−ＡＧＣＴＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＧＴＡＡ−ＣＴＡＧＴＧ、
および
逆方向：
５’−ＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧ−ＣＡＣＣＣＧＡ。
このプラスミドは、ｐＫＯＳ０２４−８７と命名された。プラスミドｐＫＯＳ０１３４−０４は、ｐＫＯＳ０２４−８７の得られたＳｐｅＩとＢａｍＨＩ部位との間のｅｒｍＥ＊プロモーターを含む約３００ｂｐのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを挿入することによって作製した。
【００５８】
プラスミドｐＫＯＳ０１３４−０４は、以下に記載するように、Ｅ．Ｃｏｌｉからの結合を経てＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ９７−７１に導入された。相同組換えによる単一交差および二重交差についてのスクリーニングを上述のように行なった。サザンハイブリダイゼーションによって確認された二重交差株が得られ、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｋ２４−１と命名された。
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ株Ｋ９７−７１およびＫ２４−１は、１〜２のＩＴプレート上で増殖した株から胞子を収集することによって調製し、滅菌綿でこの胞子を濾過して、そして２０％グリセロール１ｍｌで再懸濁した。胞子懸濁液を約２０℃で保存した。胞子懸濁液２０μＬのアリコートを２×ＹＴ  ５ｍｌに添加し、そして振盪しながら３０℃でインキュベートした。１時間後、胞子を遠心分離によって収集した（レシピエント細胞）。ドナー細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＵＺ８００２をｐＳＥＴ１５２またはｐＫＯＳ９７−１１３またはｐＫＯＳ９７−６９ａを用いて形質転換し、そしてアプラマイシン耐性のみを選択することによって調製した。プラスミドｐＫＯＳ９７−１１３およびｐＫＯＳ９７−６９ａはそれぞれ、ｍｅｇＡＩ−ＩＩＩ遺伝子およびｅｒｙＡＩ−ＩＩＩ遺伝子を保有する約３０ｋｂ挿入物を含むｐＳＥＴ１５２の誘導体である。
【００５９】
一次形質転換プレートからいくつかのコロニーを選び、そしてクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アプラマイシン（６０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ  ５ｍｌに播種するために使用した。細胞を３７℃で３〜４時間増殖させ（０．４〜０．６のＯＤ６００）、遠心分離によって収集し、ＬＢ  ５ｍｌで洗浄し、遠心分離して、そしてＬＢ  １００μＬに再懸濁した。ドナー細胞とレシピエント細胞との間の接合移入は、ドナー懸濁液１００μＬにレシピエント細胞を再懸濁させ３７℃で１５〜３０分間振盪せずにインキュベートすることによって行なった。５０μｇ／ｍＬのナリジクス酸を含むＲ５プレート上に細胞を塗布し、３４℃で１６時間インキュベートした。次いでプレートをナリジクス酸１ｍｇおよびアプラマイシン２ｍｇを含む軟栄養寒天３ｍｌで覆った。接合完了体をさらに４８時間インキュベートした後に観測した。
【００６０】
接合頻度はおおよそ、Ｋ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２で５×１０−５、Ｋ９７−７１：：ｐＳＥＴ１５２で３×１０−７、Ｋ２４−１：：ｐＫＯＳ９７−１１３で１×１０−６、およびＫ９７−７１：：ｐＫＯＳ９７−１１４で１×１０−７未満であった。
【００６１】
Ｋ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体およびＫ９７−７１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体の染色体へのプラスミド組み込みは以下のように確認した。ゲノムＤＮＡを、各株のいくつかの接合完了体から調製しＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩと共に消化し、再連結し、そしてＥ．Ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。アプラマイシンは染色体中に組み込まれたｐＳＥＴ１５２ベクターおよびａｔｔＢ／ａｔｔＰ接合配列を含む再び環状にしたＤＮＡを選択するために使用した。プラスミドＤＮＡをアプラマイシン耐性コロニーから調製し、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ接合を、ｐＳＥＴ１５２中のａｔｔＰ部分の上流にアニーリングしたプライマーを使用して配列させた。分析された４種の別々のＫ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体において、ｐＳＥＴ１５２は４つの異なる染色体位置に組み込まれ、これらは、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．中の公知のａｔｔＢ部位との類似性を示さなかった。分析された７種のＫ２４−１：：ｐＳＥＴ１５２接合完了体において、ｐＳＥＴ１５２は、いずれの場合も操作されたｐｈｉＣ３１  ａｔｔＢに組み込まれた。
【００６２】
これらの結果は、インテグラーゼｐｈｉＣ３１が媒介するベクターの組み込みが、操作されたａｔｔＢ部位が存在しないＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｓｐｐ．において部位特異的ではなく、比較的低い頻度で起こることを示している。染色体中での適切なａｔｔＢ部位またはａｔｔＰ部位の配置は、この実施例で示した一例のように、ｐｈｉＣ３１をベースとするベクターの接合頻度が顕著に増加し、結果として部位特異的組み込みが起こる。
【００６３】
記載された説明および実施例によって、本発明が記述されるが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ることを理解し、そして前述の記載および実施例は例示を目的とし、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＥＢＳを構成する３種のタンパク質（ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ３）のモジュラー組織、６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ）の合成における各工程で形成される中間体、および６−ｄＥＢの修正から生じるエリスロマイシンの構造（エリスロマイシンＣは示されていない）を含む、エリスロマイシン生合成における重要な工程を示す。
【図２】
図２は、モジュール２のＫＲドメインと、ラパマイシンＰＫＳのモジュール４のＫＲおよびＤＨドメインとのＤＥＢＳ中での置換ならびに得られた組換えＰＫＳによって産生した生成物ならびにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ中のポリケチド修飾酵素の作用、を示す。
【図３】
図３は、前駆体からの直接生合成によるエリスロマイシン誘導体の産生を示し、２種のジケチド（化合物４および５）およびＫＳ１°変異を含む本発明のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ宿主細胞にこれらを提供して形成した生成物（化合物６〜１１）を示している。
【００６４】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KOSAN BIOSCIENCES,INC.
<120> OVERPRODUCTION HOSTS FOR BIOSYNTHESIS OF
POLYKETIDES
<130> F102E15Q35
<140> JP 2001-580410
<141> 2001-05-01
<150> US 60/201,287
<151> 2000-05-02
<160> 6
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eryAI left flank, forward  primer
<400> 1
tttgcatgcg gccacgcgca cgtcgtgacc                                  30
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eryAI left flank, reverse primer
<400> 2
ttaagcttca tatgtccccc tactcgacga ccac                             34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eryAIII right flank, forward primer
<400> 3
tttggatccg gcggagggaa tacatgacca cgac                             34
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eryAIII right flank, reverse primer
<400> 4
tttgaattcc cgctcgctga agtccaggct                                  30
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> annealed oligonucleotide
<400> 5
agcttcgggt gccagggcgt gcccttgggc tccccgggcg cgtaactagt g          51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> annealed oligonucleotide
<400> 6
gatccactag ttacgcgccc ggggagccca agggcacgcc ctggcacccg a          51
【国際調査報告】
2005529579.tif 000010
2005529579.tif 000011
2005529579.tif 000012
2005529579.tif 000013