(57)【要約】核酸分子，例えば，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成，脱保護，および／または精製する方法。そのような核酸分子には，ｓｉＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ，リボザイム，アンチセンス，およびアプタマーが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）  固相ホスホルアミダイト，溶液相ホスホルアミダイト，固相Ｈ−ホスホネート，溶液相Ｈ−ホスホネート，ハイブリッド相ホスホルアミダイト，およびハイブリッド相Ｈ−ホスホネート系合成方法からなる群より選択される方法を用いて，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む核酸分子を合成し；
ｂ）  工程（ａ）からの前記核酸分子を，独立して存在していても存在していなくてもよい２’−アミノ保護基，環外アミノ（塩基）保護基および／またはリン酸保護基を前記分子から除去するのに適した条件下で，水性アルキルアミン，トリアルキルアミン，またはアルキルアミンおよびトリアルキルアミンと接触させ；
ｃ）  工程（ｂ）からの前記核酸分子を有する反応混合物を，２’−ＯＨ保護基を除去するのに適した条件下で，極性溶媒およびトリアルキルアミン・フッ化水素酸と接触させ；
ｄ）  工程（ｃ）からの前記核酸分子を有する反応混合物を，水，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノール，および約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中のアセトニトリルからなる群より選択される緩衝液を含む適当な緩衝液中で，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５，Ｂｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，およびスーパーＱ−５ＰＷ媒体からなる群より選択される媒体に負荷し；
ｅ）  適当な溶出緩衝液を用いて精製勾配を適用し，画分を分析し，純粋な画分をプールし，そして脱塩する，
ことを含む方法。
【請求項２】
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む前記核酸分子がｓｉＲＮＡ分子である，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ分子が１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドをさらに含む，請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記水性アルキルアミンが水性メチルアミンである，請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記水性アルキルアミンが４０％水性メチルアミンである，請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記トリアルキルアミン・３フッ化水素酸がトリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）である，請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記２’−ＯＨ保護基がｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）保護基およびその誘導体を含む，請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子が１またはそれ以上の化学的修飾を含む，請求項１記載の方法。
【請求項９】
核酸分子を精製する方法であって，
ａ）  前記核酸分子を，水，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノール，および約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中のアセトニトリルからなる群より選択される緩衝液を含む負荷緩衝液中で，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５，Ｂｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，およびスーパーＱ−５ＰＷ媒体からなる群より選択される媒体に負荷し；
ｂ）  適当な溶出緩衝液を用いて精製勾配を適用し，画分を分析し，純粋な画分をプールし，脱塩する，
の各工程を含む方法。
【請求項１０】
前記核酸分子が１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む，請求項１０記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が１またはそれ以上の化学的修飾を含む，請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子である，請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が二本鎖核酸分子である，請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記二本鎖核酸分子が１またはそれ以上の化学的修飾を含む，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記二本鎖核酸分子の各鎖が１９−２３ヌクレオチドの長さである，請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記二本鎖核酸分子の各鎖が１９−２３ヌクレオチドの長さである，請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記化学的修飾が糖修飾である，請求項８または１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖修飾が２’−糖修飾である，請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化学的修飾が塩基修飾である，請求項８または１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学的修飾がリン酸骨格修飾である，請求項８または１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記リン酸骨格修飾がホスホロチオエートである，請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記化学的修飾が末端修飾である，請求項８または１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記末端修飾が前記核酸分子の５’末端にある，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記末端修飾が前記核酸分子の３’末端にある，請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記末端修飾が前記核酸分子の５’末端と３’末端の両方にある，請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は，米国特許出願１０／１９４，８７５（２００２年７月１２日出願）に基づく優先権を主張する。この出願は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の合成，脱保護，および精製に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
以下は１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成，脱保護，および精製に関する説明である。この説明は，完全であることを意味するものではなく，以下に記載される本発明を理解するためにのみ提供される。この概要は，以下に記載される研究のいずれかが本発明に対する先行技術であると認めるものではない。
【０００４】
リボ核酸の多くの役割に関する研究は，過去においては，そのような生物学的に重要な分子を製造する手段が限られていたために妨げられてきた（Ｃｅｃｈ，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７３８１−７３９３；Ｆｒａｎｃｋｌｙｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，４７８−４８１；Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，１５７７−１５８３；Ｇｏｌｄ，１９８８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７，１９９−２３３）。酵素的な方法は存在したが，構造機能相関を探索することを可能とするプロトコルは限られていた。均一な合成後化学的修飾（Ｋａｒａｏｇｌｕ  ａｎｄ  Ｔｈｕｒｌｏｗ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，５２９３−５３００）または部位特異的変異誘発（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，１９９０，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌ．１９，Ｓｉｇｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｅｒ，ｅｄｓ．，１５９−２１１）のみが利用可能であった。後者の場合，研究者は，天然の塩基を使用するよう制限された。幸運なことに，ＤＮＡ合成用のホスホルアミダイトプロトコルがＲＮＡ合成に適用されることにより，ＲＮＡに対する理解が非常に加速された。所定のＲＮＡ中の任意の位置に修飾ヌクレオチドを部位特異的に導入することは今や日常的になった。さらに，単一の修飾に制限されず，各分子に多くの変更を導入することができる。
【０００５】
１つの小さい構造的修飾がそのようなジレンマを引き起こすことは釣り合いがとれないように見えるが，リボフラノース環の２’−位に１つのヒドロキシルが存在することが，ＲＮＡ分野の研究がこれに匹敵するＤＮＡ研究よりはるかに遅れていた主な理由であった。ＤＮＡ合成の方法の改良が進歩し，構造的および治療的用途のために大量のアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドを製造することが可能となった。ごく最近，リボヌクレオチドについても同様の利益が達成されている（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，２６７７−２６８４；Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，２５５−２７３；Ｖａｒｇｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，１０４６−１０５０）。
【０００６】
ＤＮＡ合成とＲＮＡ合成との間の隔たりの理由は，５’−および２’−ヒドロキシル用に直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基を同定することの困難性である。歴史的には，ＲＮＡ合成の問題点を解決しようとする科学者によって，２つの標準的なアプローチがとられている；現在のＤＮＡ合成の技術と両立しうる方法を開発すること，あるいは，ＲＮＡに特に適した方法を設計すること。ＤＮＡプロセスを適用することは，非ＲＮＡホスホルアミダイトをＲＮＡオリゴマー中に容易に取り込ませることができるより万能な方法を提供するが，後者のアプローチの利点は，ＲＮＡ合成に最良のプロセスを開発することができ，その結果，より高い収率を達成することができる。しかし，いずれの場合においても，同様の問題点，例えば合成条件に適合可能であり，かつ適当な時期に除去することができる保護基の同定における問題点がある。この問題点は，２’−および５’−ＯＨ基のみならず，塩基およびリン酸保護基についてもあてはまる。したがって，補助剤の選択に加えて，付随する脱保護工程も大きな影響を与える。別の共通の問題点は，モノマービルディングブロックの効率的な合成が必要なことである。オリゴリボヌクレオチドの固相合成はＤＮＡ合成と同じ経路で行う。ヌクレオシドが結合している固体支持体から５’−ヒドロキシル上の保護基を除去する。アクチベータの存在下で，入ってくるホスホルアミダイトを成長しつつある鎖に結合させる。未反応５’−ヒドロキシルをキャップし，次にホスファイトトリエステルを酸化して，所望のホスホトリエステル結合を得る。次に，所望の長さのオリゴマーが得られるまでこのプロセスを繰り返す。用いられる実際の試薬は，５’−および２’−保護基によって様々であろう。他の補助的な試薬もまた異なるであろう。
【０００７】
いったんオリゴリボヌクレオチドを合成すると，次にこれを脱保護しなければならない。これは，典型的には，オリゴマーの支持体からの切断，および塩基およびリン酸のブロッキング基の脱保護，次に２’−保護基の除去を含む２工程プロセスである。時々，異なる反応の順番またはリン酸基の別々の脱保護が必要である。いずれの場合も，保護基の無差別な除去が生じないようにすることが肝要である。これは，第１の工程が塩基により媒介される伝統的な状況において特に重要な点である。この場合，２’−ヒドロキシルがこれらの条件下にさらされると，近くのリン酸骨格上のビシナルヒドロキシル基の攻撃のため，鎖が切断されるであろう。
【０００８】
ＲＮＡ合成には一般的であるがＤＮＡには関係のない別の２つの懸念は，３’−２’ホスホジエステルの移動が，望ましくない２’−５’結合およびリボヌクレアーゼによる分解に対するオリゴリボヌクレオチドの感受性を与える傾向があることである。後者の事実のため，多くの研究者は，所望の実験にオリゴマーが必要となるまでそのまま残存させることができる２’−保護基を開発しようとした。
【０００９】
過去には，２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル）基を含むオリゴリボヌクレオチドの脱保護は，オリゴマーを支持体から切断し，塩基およびリン酸基を除去するという，ＤＮＡの脱保護において用いられる工程と類似の基本工程を最初に含む２工程プロセスであった。最初の工程は，３／１ＮＨ4ＯＨ／ＥｔＯＨを用いて５５℃で１−４時間で達成された。オリゴマーが厳しい脱保護条件下に長時間さらされないため，より高い質の生成物がより高い収率で得られる。最近では，ＲＮＡについて，水性メチルアミンの使用を必要とするより早い２工程の脱保護プロトコルが報告されている（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，８０４，６８３；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６，８９２９−８９３２）。インキュベート時間は６５℃で１０分間に減少した。他のＲＮＡ脱保護方法と比較すると，この試薬によって処理すると，３／１ＮＨ4ＯＨ／ＥｔＯＨを用いる標準的なプロトコルよりも多い全長産物が得られた（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，（上掲））。唯一の要件は，よく知られるアミノ転移反応のため，シチジンのＮ−保護基としてアセチルを使用しなければならないことである（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３５，４３１１−４３１４）。先に述べたように，メチルアミンを用いることにより，この工程は１０分間に短縮された。第２の工程は，オリゴヌクレオチドからの２’−シリル保護基の除去である。過去には，これはＴＨＦ中１Ｍのフッ化ｎ−テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を用いて室温で２４時間かけて行われていた（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５−７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，５４３３−５３４１）。残念ながら，この脱保護方法を使用すると，塩が生じ，分析および精製の前にこれを除去しなければならない。さらに，保護基の完全な除去に長い曝露時間が必要なこと，ならびに偶発的な水に対して試薬が感受性であるため（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１，４７３９−４７４１），これは理想的な試薬とはいえない。脱シリル化試薬としてトリエチルアミン３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）をそのままで使用することに関していくつかの報告が発表されているが（Ｄｕｐｌａａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，５５２，５３９，Ｇａｓｐａｒｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，５１５９−５１６６；Ｗｅｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，２４３０−２４３１），その結果は様々である。Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）と組み合わせたＴＥＡ・３ＨＦのカクテル（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｃｏｔｔ，米国特許５，８３１，０７１；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，（上掲））またはＤＭＦ（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，（上掲））はまた，６５℃で３０−９０分間または室温で４−８時間で完全な脱保護を行うことを記載する。付加的な利点としては，塩が生成されないため，脱シリル化試薬から生成物を直接沈殿させることができる。Ｔｒａｃｚ，米国特許５，９７７，３４３；Ｔｒａｃｚ，米国特許５，６８６，５９９は，無水メチルアミンおよび三フッ化水素酸トリエチルアミンを用いるリボヌクレオチドの脱保護のためのワンポットプロトコルを記載する。この方法は，無水メチルアミン，次にトリエチルアミン３フッ化水素酸をそのままで用いて，オリゴリボヌクレオチドをワンポット様式で効率的に脱保護することを含む。しかし，そのようなプロトコルは，プレートのフォーマット，例えば９６ウエルプレートで合成されたオリゴヌクレオチドを脱保護するには面倒であろう。２’−ヒドロキシル脱保護の前に，部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドから固体支持体を分離することが必要となるためである。また，用いられるメチルアミン溶液は無水であるため，塩基処理の後に得られる負に荷電したオリゴリボヌクレオチドを可溶化することは困難であろう。最近，エタノール中の無水メチルアミンの混合物を用い，次にＴＥＡ・３ＨＦを添加することにより，塩基性脱保護および脱シリル化反応の両方をワンポットで行うことができる方法が報告された（Ｂｅｌｌｏｎ，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，ｅｄｓ．，印刷中）。このプロトコルは，３’−２’移動の形跡なしに，２時間以内でオリゴリボヌクレオチドを完全に脱保護することを可能とする。
【００１０】
所定のオリゴヌクレオチド中に存在する異なる２’−化学に対して用いられる対応する保護基により，２’−脱保護のパラメータが議論されている。同じオリゴヌクレオチド分子中の別の２’−リボフラノシル炭素環官能基の使用は，そのような分子の合成，脱保護，および精製に関して潜在的な問題点を有しうる。触媒活性を維持しながらヌクレアーゼ耐性を高めるために，化学的に修飾された核酸の効率的な合成は，新規治療剤の開発の可能性にとって重要である。最近，Ｂｅａｕｄｒｙら（２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，印刷中）は，新規ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡホスホジエステラーゼのインビトロ選択を記載している。この酵素的核酸分子は，リボ（２’−ヒドロキシル）およびアミノ（２’−デオキシ−２’−アミノ）官能基の両方を含むことができる。リボおよびアミノ官能基の両方を有するオリゴヌクレオチドの大規模合成は，同時にリボヌクレオチド結合の完全性を維持しながら，ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）とＮ−フタロイル保護基とを共に除去することに関して実用上の問題点を有する。オリゴヌクレオチド合成の間に２’−アミノ基についてＮ−フタロイル保護基を使用することは，トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）およびＦＭＯＣ基と比較して，合成収率が改善されるという利点を提供する（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，６３１，３６０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（２１），４４３４−４４４２）。フタロイル基は水性メチルアミンを用いて６５℃で容易に切断することができ，ＴＢＤＭＳｉ基はフッ素イオン源，例えばフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）またはトリエチルアンモニウム３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）を用いて容易に切断することができる。上述した“１ポット”脱保護方法を適用すると，Ｎ−フタロイル保護の脱保護が不完全となる。この２工程脱保護方法は，リボ（２’−ＴＢＤＭＳ）およびアミノ（Ｎ−フタロイル）保護基の両方を含むオリゴヌクレオチドを完全に脱保護するために用いることができるが，このプロセスは，大規模オリゴヌクレオチド合成またはマルチウエルプレートでのオリゴヌクレオチド合成には容易に適合させることができない。
【００１１】
このように，アミノおよびリボ炭水化物成分の両方を含む分子の完全な脱保護を可能とする，高速の，効率のよい方法が必要とされている。そのような方法は，これらの分子を治療剤として使用するための大規模合成，およびこれらの分子のコンビナトリアルスクリーニング用の小規模合成を可能とするであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに対する現在のオリゴヌクレオチド脱保護方法は，完全な脱保護に必要な時間の長さおよびある種の保護基（例えばＮ−フタロイル）の不完全な脱保護の両方により制限されている。無水メチルアミンおよびトリエチルアミン３フッ化水素酸を“１ポット”脱保護カクテルとして用い，ＤＭＳＯを用いて部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを無水条件下で溶解する（Ｔｒａｃｚ，米国特許５，９７７，３４３）。この時点まで，リボヌクレオチド結合はアルカリ加水分解の結果としてこれらの条件下における分解に対して感受性であると推定されていたため（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９５２，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，２７０８），水性メチルアミンをトリエチルアミン３フッ化水素酸と組み合わせて使用することは避けられていた（例えば，本明細書の実施例３を参照）。これは，２’−ヒドロキシル保護基の除去の前に中間的に乾燥工程を用いて水性メチルアミン試薬を除去し，このことによりリボヌクレオチド結合のアルカリ加水分解を排除することによって，水性メチルアミン処理をトリエチルアミン３フッ化水素酸処理から分離することにより解決された。この２工程プロセスは，大規模オリゴヌクレオチド合成およびマルチウエルプレートでハイスループットのフォーマットで行うオリゴヌクレオチド合成には適用できない。共溶媒としてのＤＭＳＯの存在下における無水メチルアミンおよびトリエチルアミン３フッ化水素酸での処理を含む“ワンポット”脱保護方法の使用は，リボヌクレオチド結合に対して穏和である。しかし，このプロセスは，脱保護の合計時間および得られるオリゴヌクレオチドの質の両方の点で，さらに最適化が必要であろう。さらに，“ワンポット”無水方法は，ある種の保護基（例えばＮ−フタロイル）の完全な除去に非常に有効である。本発明の脱保護方法は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの完全な脱保護のための迅速な“ワンポット”方法を提供し，さらに，広範な種類のオリゴヌクレオチド保護基，例えばＮ−フタロイル基を完全に脱保護することができる。
【００１３】
本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の脱保護および精製の方法に関する。詳細には，本発明は，核酸塩基，リン酸，および２’−ヒドロキシル（２’−ＯＨ）および／または２’−デオキシ−２’−アミノ（２’−ＮＨ2）基から保護基を除去する方法を特徴とし，この方法は，大規模およびハイスループット様式の両方における１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の脱保護および続く精製を可能とする。
【００１４】
好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の迅速な脱保護のためのワンポットプロセスを特徴とする。さらに別の態様においては，本発明は，それぞれアルキルシリルおよび／またはフタロイル系保護基で保護されたリボヌクレオチドおよび／または２’−デオキシ−２’−アミノリボフラノース成分を含む分子の迅速な脱保護のプロセスを特徴とする。詳細には，本発明は，それぞれｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳｉ）および／またはＮ−フタロイル保護基で保護されたリボヌクレオチドおよび／または２’−デオキシ−２’−アミノリボフラノース成分の両方を含む分子の迅速な脱保護のプロセスを特徴とする。
【００１５】
好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む部分的に脱保護された分子に水性メチルアミン溶液を使用し，次に，分子の完全な脱保護のためにトリエチルアンモニウム３フッ化水素酸で処理することを特徴とする。別の態様においては，トリエチルアンモニウム３フッ化水素酸による処理は，共溶媒（例えばＤＭＳＯ）の存在下で行う。
【００１６】
１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を合成し，脱保護し，そして精製する方法を特徴とし，この方法は以下の工程を含む：（ａ）脱トリチル化，活性化，カップリング，キャッピング，および酸化またはこれらの同等物を任意の順番で含む工程により，固相，溶液相，および／またはハイブリッド相で（例えば，ホスホルアミダイト系またはＨ−ホスホネート系）オリゴヌクレオチドを合成し，次に，（ｂ）１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有する核酸分子を，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，約５−約２４０分間，約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチルであり，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチルであり，例えばトリエチルアミンである）と接触させ，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で，約５−約２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，次に，水性酢酸ナトリウム，炭酸水素アンモニウム，および／または炭酸水素トリエチルアンモニウムまたはこれらの同等物，好ましくは５０ｍＭ水性酢酸ナトリウムを用いて脱保護反応を停止させることにより脱保護し，次に（ｃ）脱保護生成物を，水，または約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む負荷緩衝液中で，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む緩衝液で平衡化した，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む媒体に負荷し，溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に，適当な手法により画分を分析し，純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜を含む膜を用いて接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩し，次に濃縮した物質を凍結乾燥することにより，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を精製する。
【００１７】
１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチドおよび１またはそれ以上の化学的修飾を含む核酸分子を合成し，脱保護し，そして精製するプロセスを特徴とし，この方法は以下の工程を含む：（ａ）脱トリチル化，活性化，カップリング，キャッピング，および酸化の工程またはこれらの同等物を任意の適当な順番で含む，固相，溶液相，および／またはハイブリッド相（例えば，ホスホルアミダイト系またはＨ−ホスホネート系）でオリゴヌクレオチドを合成し，次に，（ｂ）核酸分子を，核酸分子の部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチルであり，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチルであり，例えばトリエチルアミンである）と，約５−約２４０分間，約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間接触させ，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，そして，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で約５−約２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，次に水性酢酸ナトリウム，炭酸水素アンモニウム，および／または炭酸水素トリエチルアンモニウムまたはその同等物，好ましくは５０ｍＭ水性酢酸ナトリウムを用いて脱保護反応を停止させることにより脱保護し，そして（ｃ）脱保護生成物を，水，または約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む負荷緩衝液中で，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む緩衝液で平衡化した，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５ａｎｄＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む媒体に負荷し，溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に適当な手法により画分を分析し，純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜を含む膜を用いて接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩し，次に濃縮した物質を凍結乾燥することにより核酸分子を精製する。別の態様においては，化学的修飾は同じであっても異なっていてもよく，独立して，糖修飾，例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキ��，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシドを含む。別の態様においては，核酸分子中の化学的修飾は，同じであっても異なっていてもよく，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては，核酸分子の化学的修飾は，同じであっても異なっていてもよく，１またはそれ以上の無塩基成分で末端の位置を修飾することを含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，オリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ成分を含む。
【００１８】
別の態様においては，本発明にしたがって合成され，脱保護され，および／または精製される核酸分子は，糖，リン酸骨格，塩基，および／または末端修飾の組み合わせを含む。
【００１９】
１つの態様においては，本発明は，保護基を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有する核酸分子を脱保護し，続いて精製する方法を特徴とする。この方法は，以下の工程を含む：（ａ）核酸分子を，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えばトリエチルアミンである）と，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃で，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，約５−約２４０分間，または約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間接触させ，部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で約５−約２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，次に水性酢酸ナトリウム，炭酸水素アンモニウム，および／または炭酸水素トリエチルアンモニウムまたはこれらの同等物，好ましくは５０ｍＭ水性酢酸ナトリウムを用いて脱保護反応を停止させることにより脱保護し，次に（ｂ）脱保護生成物を，水，または約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む負荷緩衝液中で，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む緩衝液で平衡化した，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む媒体に負荷し，溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に画分を適当な手法により分析し，純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜を含む膜を用いて接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩し，次に濃縮した物質を凍結乾燥することにより，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を精製する。
【００２０】
１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチド，１またはそれ以上の化学的修飾，および保護基を有する核酸分子を脱保護し，続いて精製する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を含む：（ａ）核酸分子を，核酸分子の部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，約５−約２４０分間，または約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間，水性アルキルアミン（ここで，アルキルは，エチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルは，メチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えばトリエチルアミンである）と接触させることにより脱保護し，部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下でトリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で，約５−約２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，次に，水性酢酸ナトリウム，炭酸水素アンモニウム，および／または炭酸水素トリエチルアンモニウムまたはこれらの同等物，好ましくは５０ｍＭ水性酢酸ナトリウムを用いて脱保護反応を停止し，そして（ｂ）脱保護生成物を，水，または２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に含む負荷緩衝液中で，２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に含む緩衝液で平衡化した，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５を含む媒体およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷに負荷し，溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に適当な手法により画分を分析して純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択されるような膜を含む膜を用いて接線流濾過または同等の方法により脱塩し，次に濃縮した物質を凍結乾燥することにより，核酸分子を精製する。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，独立して，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキル，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシドを含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上の無塩基成分を含む。別の態様におい��は，化学的に修飾された核酸分子は，オリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ成分を含む。
【００２１】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，保護基を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有する核酸分子の１ポット脱保護の方法を特徴とする。この方法は，以下の工程を含む：（ａ）核酸分子を，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチルであり，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチルであり，例えばトリエチルアミンである）と，約１０−１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，約５−約２４０分間，または約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間接触させ，そして（ｂ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下でトリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約５−２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。
【００２２】
さらに別の好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上のリボヌクレオチド，１またはそれ以上の化学的修飾および保護基を有する核酸分子の１ポット脱保護の方法を特徴とする。この方法は以下の工程を含む：（ａ）核酸分子を，核酸分子の部分的脱保護に適した条件下で，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチルであり，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここでアルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチルであり，例えばトリエチルアミンである）と，約１０−１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，Ｎ−フタロイル保護基を含む分子については好ましくは約３５℃または約６５℃で，約５−約２４０分間，または約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間接触させ，そして（ｂ）部分的に脱保護された分子を溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下でトリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約５−２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，独立して，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキル，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシドを含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上の無塩基成分を含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，オリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ成分を含む。
【００２３】
好ましい態様においては，本発明は，核酸分子を精製する方法を特徴とし，この方法は以下の工程を含む：（ａ）粗脱保護分子を，水，または約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む負荷緩衝液中で，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む緩衝液で平衡化した，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む媒体に負荷し，そして（ｂ）溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に，適当な手法により画分を分析して純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜を含む膜を用いて接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩する。
【００２４】
好ましい態様においては，本発明は，化学的に修飾された核酸分子を精製する方法を特徴とし，この方法は以下の工程を含む：（ａ）粗脱保護分子を，水，または約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノール，またはアセトニトリルのいずれかを含む負荷緩衝液中で，２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に含む緩衝液で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑ媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む媒体に負荷し，そして（ｂ）溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用し，次に，適当な手法により画分を分析し，純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜を含む膜を用いて接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩する。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，独立して，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキル，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシドを含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，１またはそれ以上の無塩基成分を含む。別の態様においては，化学的に修飾された核酸分子は，オリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ成分を含む。
【００２５】
さらに別の好ましい態様においては，核酸分子または化学的に修飾された核酸分子は精製後に凍結乾燥する。
【００２６】
好ましい態様においては，脱保護反応は，水性酢酸ナトリウム，炭酸水素アンモニウム，および／または炭酸水素トリエチルアンモニウムまたはこれらの同等物，好ましくは５０ｍＭ水性酢酸ナトリウムを用いて停止することができる。
【００２７】
別の好ましい態様においては，本発明は，２’−Ｎ−フタロイルおよび２’−Ｏ−シリル保護を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸分子を脱保護する方法を特徴とし，該方法は，以下の工程を含む：（ａ）核酸分子を，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃またはＮ−フタロイル保護基を含む分子については約６５℃で，約５−約２４０分間，または約２０−約１００分間，好ましくは約６０分間，水性アルキルアミン（ここで，アルキルは，エチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチルであり，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルは，メチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチルであり，例えばトリエチルアミンである）と接触させ，そして（ｂ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約５−２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。核酸分子は，さらに化学的修飾，例えば，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキル，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシド；１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合；１またはそれ以上の無塩基成分；またはオリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方に末端キャップ成分を含んでいてもよい。
【００２８】
好ましい態様においては，部分的に脱保護された分子は，焼結ガラス等の適当な濾過媒体を用いて濾過し，ＴＥＡ・３ＨＦ試薬で処理する前に極性溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，および／またはＮ−メチルピロリジノン）で洗浄する。さらに別の態様においては，ＴＥＡ・３ＨＦ試薬で処理する前に，濾液を好ましくは約０℃から−７８℃に冷却する。
【００２９】
別の観点においては，本発明は，脱保護反応を水性メチルアミン溶液を用いて，約０℃−１２０℃の範囲の温度で，約５００分間−約５分間行う，オリゴヌクレオチドを脱保護する方法を特徴とする。
【００３０】
１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを脱保護する方法を特徴とし，この方法は，オリゴヌクレオチドを約２５℃−約４５℃で水性メチルアミンの溶液（例えば４０％水性メチルアミン）と約３０分間接触させることを含む。別の態様においては，オリゴヌクレオチドを約３５℃で約３０分間水性メチルアミンの溶液と接触させる。
【００３１】
１つの態様においては，本発明は，１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを脱保護する方法を提供し，この方法は以下の工程を含む：（ａ）オリゴヌクレオチドを，約２５℃−約４５℃約３０分間，水性メチルアミン（例えば４０％水性メチルアミン）の溶液と接触させ，そして（ｂ）（ａ）の部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，さらに５−６０分間，好ましくは約１５分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。別の態様においては，（ａ）において，オリゴヌクレオチドと水性メチルアミンの溶液と約３５℃で約３０分間接触させる。
【００３２】
１つの態様においては，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を脱保護する本発明のプロセスは，カラムフォーマットを用いて合成されたオリゴヌクレオチドを脱保護するために用いられる。
【００３３】
１つの態様においては，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を脱保護する本発明のプロセスは，Ｕｓｍａｎら，米国特許５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；および／またはＶａｒｇｅｅｓｅら，米国特許出願１０／１９０，３５９（これらはすべて図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）に記載される方法にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドを脱保護するために用いられる。
【００３４】
１つの態様においては，本発明は以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは３５℃または６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約３０−約６０分間，水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここでアルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えばトリエチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，そして約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で約１５−２４０分間，好ましくは約３０−約６０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。
【００３５】
１つの態様においては，本発明は以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約３５℃−約６５℃で，約１５−約２４０分間（例えば，約３０−約６０分間），水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えばｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。
【００３６】
１つの態様においては，本発明は以下の工程を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは３５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約３０分間，水性アルキルアミン（ここで，アルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えばトリエチルアミンである）と接触させ，そして，（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約１５−約３０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えばｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。
【００３７】
１つの態様においては，本発明は以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃で，約１５−約２４０分間（例えば，約３０−約６０分間），水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下でトリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約１５−約３０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えばｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えばトリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。
【００３８】
１つの態様においては，本発明は以下の工程を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチ分子ドを合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは３５℃または６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約３０−約６０分間，水性アルキルアミン（ここで，アルキルは，エチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここで，アルキルは，メチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えば，トリエチルアミンである）と接触させ，（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約３０−約６０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えばｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，そして（ｄ）オリゴヌクレオチドを単離するのに適した条件下で脱保護されたオリゴヌクレオチドを精製する。
【００３９】
１つの態様においては，本発明は以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約３５℃−約６５℃で約１５−約２４０分間，（例えば，約３０−約６０分間），水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約６０分間加熱して２’−ヒドロキシル保護基（例えばｔ−ブチルジメチルシリル）を除去し，そして（ｄ）オリゴヌクレオチドを単離するのに適した条件下で脱保護されたオリゴヌクレオチドを精製する。
【００４０】
１つの態様においては，本発明は，以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約１０−約１００℃，または約２０℃−約８０℃，または約３０℃−約６５℃，好ましくは３５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約３０分間，水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである），および／またはトリアルキルアミン（ここでアルキルはメチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはエチル，例えばトリエチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−約１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約１５−約３０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。そして（ｄ）オリゴヌクレオチドを単離するのに適した条件下で脱保護されたオリゴヌクレオチドを精製する。
【００４１】
１つの態様においては，本発明は，以下を含む方法を特徴とする：（ａ）１またはそれ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび１またはそれ以上のリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド分子を合成し，（ｂ）オリゴヌクレオチドを，オリゴヌクレオチドの部分的脱保護に適した条件下で，約３０℃−約６５℃，好ましくは約３５℃で，約１５−約２４０分間，（例えば，約３０−約６０分間），水性アルキルアミン（ここでアルキルはエチル，プロピルまたはブチルであることができ，好ましくはメチル，例えばメチルアミン，例えば４０％水性メチルアミンである）と接触させ，そして（ｃ）部分的に脱保護された分子を，溶媒（例えば，ＤＭＳＯ，ＤＭＦ，ＨＭＰＡ，エタノール，メタノール，イソプロパノール，Ｎ−メチルピロリジノンおよび他のもの）の存在下で，トリエチルアミン・３フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）と接触させ，約１０−１００℃，好ましくは約６５℃で，約１５−２４０分間，好ましくは約１５−約３０分間加熱して，２’−ヒドロキシル保護基（例えば，ｔ−ブチルジメチルシリル）を除去する。さらに別の態様においては，分子の完全な脱保護に適した条件下で，他のアルキルアミン・ＨＦ複合体（例えば，トリメチルアミン３フッ化水素酸および／またはジイソプロピルエチルアミン３フッ化水素酸）を用いてもよい。そして，（ｄ）オリゴヌクレオチドを単離するのに適した条件下で脱保護されたオリゴヌクレオチドを精製する。
【００４２】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，化学的に修飾されている。化学的修飾の非限定的例としては，２’−デオキシ−２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｃ−アルキル，２’−デオキシ，２’−デオキシ−２’−アミノまたはＬＮＡ（ロック核酸）ヌクレオシド；ホスホロチオエートヌクレオチド間結合；無塩基成分；またはオリゴヌクレオチドの３’末端，５’末端，または３’末端および５’末端の両方の末端キャップ成分が挙げられる。化学的に修飾されたｓｉＲＮＡまたはｓｉＮＡ分子の非限定的例は，本明細書の表ＩＩＩおよびＢｅｉｇｅｌｍａｎら，米国特許出願１０／４４４，８５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【００４３】
“カラムフォーマット”とは，固体支持体（例えば，ＣＰＧ，ポリスチレン）がカラム，カートリッジまたはその同等物等の保持装置中に充填されている固相合成を意味し，固体支持体は，ポリマー性分子，例えばオリゴヌクレオチドおよびその誘導体の合成に適した試薬に順番に曝露することができる。
【００４４】
さらに別の好ましい態様においては，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を脱保護する本発明のプロセスは，マルチウエルプレートのフォーマットを用いて合成された分子を脱保護するために用いられる。詳細には，本発明は，マルチウエルプレートのフォーマット（例えば，９６ウエルプレートまたは２５６ウエルプレート）におけるオリゴヌクレオチドのハイスループットの脱保護を提供する。より詳細には，高い生物学的活性を有する酵素的核酸分子をマイクログラムより多い量で迅速に脱保護することを特徴とする。酵素的に活性な核酸分子の高い収率および質での回収は，その脱保護の間に用いられる若干の重要な工程に依存することが判明した。
【００４５】
さらに別の態様においては，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子を脱保護する本発明のプロセスは，トリチルオンおよびトリチルオフ様式の両方で合成された分子を脱保護するために用いられる。
【００４６】
“トリチルオン”とは，５’末端ジメトキシトリチル保護基または同等の保護基をそのまま残すように合成される分子，例えばオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４７】
“トリチルオフ”とは，５’末端ジメトキシトリチル保護基または同等の保護基を除去するように合成される分子，例えばオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４８】
“固相”とは，ポリマー性分子，例えばオリゴヌクレオチドの合成においてサブユニットを順番に付加するための足場として用いられる固体支持体（例えば，ポリスチレンまたは制御孔ガラス）を含む合成を意味する。固体支持体は，溶液中の試薬に順番に曝露することができ，このことにより，合成の間に精製と単離の工程を繰り返す必要性を回避することができる。固体支持体と成長ししつあるポリマーとの間のインターフェースとしてリンカー分子を使用することができる。固相合成は，ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法のオリゴヌクレオチド合成の両方に用いることができる。
【００４９】
“溶液相”とは，溶液，例えば，均一な混合物を与える溶媒中で，反応物と試薬とを組み合わせることを含む合成を意味する。溶液相合成は，低いコスト，より効率のよい試薬の反応性，および工業的因子を考慮して，大量の分子を合成するのに好ましい方法でありうる。
【００５０】
“ハイブリッド相”とは，固相および溶液相の合成要素の両方を含む合成を意味する。
【００５１】
本発明はまた，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の大規模脱保護方法（例えば，３ｍｍｏｌ合成スケールまたはそれ以上）を特徴とする。より詳細には，数グラムまたはキログラムの量より多い，高い生物学的活性を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む分子の迅速な脱保護を特徴とする。当業者は，時間および温度パラメータに関する改変を用いて，異なるスケールおよび／または異なる組成の分子の反応について脱保護条件を最適化しうることを理解するであろう。したがって，様々な分子成分および／または異なる反応スケールの適用について種々の時間および温度パラメータを用いることは，本発明の範囲内である。
【００５２】
好ましい態様においては，本発明は，本発明の核酸分子を精製する方法を特徴とする。詳細には，本発明は，エタノールまたはアセトニトリル（エタノールが好ましい）を，イオン交換クロマトグラフィーを用いるオリゴヌクレオチドの精製において有機改質剤として使用することを特徴とする。さらに別の観点においては，本発明は，オリゴヌクレオチド分子，例えば，限定されないが，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），酵素的核酸，アンチセンス核酸，および／またはアプタマーの精製において用いられる有機改質剤としてエタノールを使用することを特徴とする。別の態様においては，大規模精製の間では，有機溶媒の使用を回避するために有機改質剤を使用せず，その代わりに約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌの溶液を使用する。
【００５３】
さらに別の態様においては，本発明の核酸分子の精製に用いられる媒体は，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑタイプの媒体，またはこれらの同等物，例えば，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  ＰＯＲＯＳＨＱ，ＴＯＳＯＨＡＡＳＱ−５ＰＷ−ＨＲ，Ｑ−５ＰＷ，またはスーパーＱ−５ＰＷを含む。別の態様においては，精製媒体は，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液で平衡化する。さらに別の態様においては，精製媒体は，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む緩衝液で平衡化する。
【００５４】
１つの態様においては，本発明は，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む，オリゴヌクレオチド精製用の負荷緩衝液を特徴とする。別の態様においては，本発明は，約２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび約０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に２０％エタノールまたはアセトニトリルのいずれかを含む，オリゴヌクレオチド精製用の負荷緩衝液を特徴とする。１つの観点においては，本発明は，本発明の核酸分子の精製のための溶出緩衝液として約１．０Ｍ  ＮａＣｌの適当な勾配を適用することに関する。別の態様においては，本発明は，本明細書に記載される精製プロセスから得られる画分を適当な手法（例えば，ＵＶ，ＨＰＬＣ，および／またはＣＧＥ）により分析し，純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜からなる群より選択される膜等の膜を用いて，接線流濾過またはこれらの同等物により脱塩することを特徴とする。さらに別の好ましい態様においては，本発明は，精製した物質を濃縮するための手段として凍結乾燥を用いることを特徴とする。
【００５５】
１つの態様においては，本発明のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの精製の方法はさらに，２つの精製したオリゴヌクレオチド鎖を一緒にハイブリダイズされてｓｉＲＮＡデュープレックスを形成する工程を含む。
【００５６】
"ＲＮＡ"とは，少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。"リボヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボ−フラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，単離されたＲＮＡ，例えば，部分的に精製されたＲＮＡ，本質的に純粋なＲＮＡ，合成ＲＮＡ，組換え的に製造したＲＮＡ，ならびに１またはそれ以上のヌクレオチドの付加，欠失，置換および／または変更により天然に生ずるＲＮＡとは異なる変更されているＲＮＡを含む。そのような変更は，非ヌクレオチド物質をｓｉＮＡの末端または内部，例えばＲＮＡの１またはそれ以上のヌクレオチドに付加することを含んでいてもよい。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた，標準的ではないヌクレオチド，例えば，天然に生じないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの変更されたＲＮＡは，類似体または天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。ＲＮＡは，ｓｉＲＮＡ，酵素的核酸，アンチセンス核酸，デコイＲＮＡ，アプタマーＲＮＡ，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，キメラＲＮＡ，２−５Ａアンチセンスキメラ，アゴニストＲＮＡ，アンタゴニストＲＮＡ，または他の任意のＲＮＡ種でありうる。ＲＮＡは，限定されないが，治療剤，診断試薬，および研究試薬として使用することを目的として用いることができる。
【００５７】
本明細書において用いる場合，“核酸”，"核酸分子"または“オリゴヌクレオチド”とは，２またはそれ以上のヌクレオチドを有する分子を意味する。核酸は，一本鎖，二本鎖，または多重鎖であることができ，修飾または未修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド，またはこれらの種々の混合物および組み合わせを含むことができる。
【００５８】
１つの態様においては，本発明の方法は，酵素的核酸分子，好ましくはハンマーヘッド，ＡＨリボザイム，ＮＣＨ（イノザイム），Ｇ切断剤，アンバーザイム，および／またはチンザイムのモチーフのものを合成，脱保護，および精製するために用いられる。
【００５９】
１つの態様においては，本発明の方法は，ｓｉＲＮＡ分子を合成，脱保護，および精製するために用いられる。
【００６０】
１つの態様においては，１またはそれ以上の化学的修飾を含んでいてもよい本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の合成は，（ａ）ｓｉＲＮＡ分子の２つの相補鎖を合成し；（ｂ）二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を得るのに適した条件下で２つの相補鎖を一緒にアニーリングさせることを含む。別の態様においては，ｓｉＲＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は固相オリゴヌクレオチド合成により行う。さらに別の態様においては，ｓｉＲＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は固相タンデムオリゴヌクレオチド合成により行う。
【００６１】
１つの態様においては，本発明は，二本鎖ｓｉＲＮＡデュープレックス分子を合成する方法を特徴とし，該方法は，（ａ）ｓｉＲＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，第１のオリゴヌクレオチド配列鎖は，ｓｉＲＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成の足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を含み；（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖の足場上でｓｉＲＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，第２のオリゴヌクレオチド配列鎖はさらに，ｓｉＲＮＡデュープレックスを精製するために用いることができる化学成分を含み；（ｃ）２つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュープレックスを形成するのに適した条件下で（ａ）のリンカー分子を切断し；そして（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用してｓｉＲＮＡデュープレックスを精製する，ことを含む。１つの態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断はオリゴヌクレオチドの脱保護の間に，例えばアルキルアミン塩基，例えばメチルアミンを用いて加水分解条件下で行う。１つの態様においては，合成の方法は，固体支持体，例えば制御孔ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン上での固相合成を含み，ここで，（ａ）の第１の配列は，固体支持体を足場として用いて，切断可能なリンカー，例えばスクシニルリンカー上で合成する。（ａ）において第２の鎖の合成の足場として用いる切断可能なリンカーは，固体支持体誘導化リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断が同時に生ずるように，固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性を有することができる。別の態様においては，結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる（ｂ）の化学成分は，本明細書に記載されるトリチルオン合成戦略において利用することができるトリチル基，例えばジメトキシトリチル基を含む。さらに別の態様においては，化学成分，例えばジメトキシトリチル基は，精製の間に，例えば酸性条件を用いて除去する。
【００６２】
さらに別の態様においては，二本鎖ｓｉＲＮＡ合成の方法は，第１の配列に結合した，第２の配列の合成の足場として作用する切断可能なリンカーを用いて，ｓｉＲＮＡデュープレックスの両方の鎖をタンデムで合成する，溶液相合成またはハイブリッド相合成である。別々のｓｉＲＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適した条件下でリンカーを切断することにより，二本鎖ｓｉＲＮＡ分子が形成される。
【００６３】
別の態様においては，本発明は，二本鎖ｓｉＲＮＡデュープレックス分子を合成する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）ｓｉＲＮＡ分子の１つのオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し，ここで，配列は別のオリゴヌクレオチド配列の合成のための足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を含み；（ｂ）第１の配列鎖に対して相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を（ａ）の足場上で合成し，ここで，第２の配列は，二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の他方の鎖を含み，第２の配列は，結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる化学成分をさらに含み；（ｃ）切断可能なリンカーにより連結された両方のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む全長配列を単離するのに適した条件下で，かつ２つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定なデュープレックスを形成するのに適した条件下で，第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用して（ｂ）の生成物を精製する，ことを含む。１つの態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護の間に行い，例えば，加水分解条件下で行う。別の態様においては，上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は，オリゴヌクレオチドの脱保護の後に行う。別の態様においては，合成の方法は固体支持体，例えば制御孔ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン上での固相合成を含み，ここで，（ａ）の第１の配列は切断可能なリンカー，例えばスクシニルリンカー上で，固体支持体を足場として用いて合成する。（ａ）において第２の鎖を合成するための足場として用いる切断可能なリンカーは，固体支持体誘導化リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断を同時にまたは順番に行うように，固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性を有していてもよく，異なる反応性を有していてもよい。１つの態様においては，結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる（ｂ）の化学成分は，トリチル基，例えばジメトキシトリチル基を含む。
【００６４】
別の態様においては，本発明は，単一の合成プロセスにおいて二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を作製する方法を特徴とし，この方法は，（ａ）第１の配列および第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し，ここで，第１の配列は第２の配列に相補的であり，第１のオリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第２の配列に連結されており，かつ第２の配列を有するオリゴヌクレオチドには末端５’−保護基，例えば５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）が残っており；（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し，このことにより脱保護によって２つのオリゴヌクレオチド配列を連結するリンカーが切断され；そして（ｃ）二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を単離するのに適した条件下で，例えば，本明細書に記載されるトリチルオン合成戦略で，（ｂ）の生成物を精製する，ことを含む。
【００６５】
本明細書において用いる場合，"短干渉核酸"，"ｓｉＮＡ"，"短干渉ＲＮＡ"，"ｓｉＲＮＡ"，"短干渉核酸分子"，"短干渉オリゴヌクレオチド分子"，または"化学的に修飾された短干渉核酸分子"との用語は，例えば，配列特異的様式でＲＮＡ干渉（"ＲＮＡｉ"）または遺伝子サイレンシングを媒介することにより，遺伝子発現またはウイルス複製をダウンレギュレートしうる任意の核酸分子を表す（例えば，Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ００／０１８４６；Ｍｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，国際公開ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際公開ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ００／４４９１４；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的例は，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願１０／４４４，８５３（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に示される。例えば，ｓｉＮＡは，自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ，ここで一方の鎖はセンス鎖であり，他方はアンチセンス鎖であり，アンチセンス鎖およびセンス鎖は自己相補的であり（すなわち，各鎖は，他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，例えば，アンチセンス鎖とセンス鎖とがデュープレックスまたは二本鎖構造を形成し，例えば，二本鎖領域は約１９塩基対である）；アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス鎖は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは，ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく，ここで，ｓｉＮＡの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は，核酸系または非核酸系のリンカー��より連結されている。ｓｉＮＡは，自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は別の標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は，標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２またはそれ以上のループ構造および自己相補的センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく，ここで，アンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み，センス領域は標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し，環状ポリヌクレオチドは，インビボまたはインビトロでプロセシングされて，ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた，標的核酸分子またはその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば，そのようなｓｉＮＡ分子がｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合），ここで，一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基，例えば５’−リン酸（例えば，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照），または５’，３’−二リン酸を含んでいてもよい。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含んでいてもよく，ここで，センス領域およびアンチセンス領域は，当該技術分野において知られるヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合により結合しているか，あるいは，イオン相互作用，水素結合，ファンデルワールス相互作用，疎水的相互作用，および／またはスタッキング相互作用により非共有結合的に結合している。ある態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，本発明のｓｉＮＡ分子は，標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように，標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく，化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては，本発明の短干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は，ある態様において，ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短干渉核酸を記載する。すなわち，本発明の短干渉核酸分子は，任意にリボヌクレオチド（例えば，２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし，ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は，２’−ＯＨ基を有する１またはそれ以上のヌクレオチドを含む，結合したリンカーまたは他の結合しているかまたは会合し���いる基，成分，または鎖を有することができる。任意に，ｓｉＮＡ分子は，ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０，または５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短干渉核酸分子はまた，短干渉修飾オリゴヌクレオチド"ｓｉＭＯＮ"と称される。本明細書において用いる場合，ｓｉＮＡとの用語は，配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語，例えば，短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），短干渉オリゴヌクレオチド，短干渉核酸，短干渉修飾オリゴヌクレオチド，化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ，転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ），および他のものと同等であることを意味する。さらに，本明細書において用いる場合，ＲＮＡｉとの用語は，配列特異的ＲＮＡ干渉を記述する他の用語，例えば転写後遺伝子サイレンシング，翻訳阻害または後成遺伝学と同等であることを意味する。例えば，本発明のｓｉＮＡ分子を用いて，転写後レベルまたは転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定的例においては，本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的制御は，クロマチン構造のｓｉＮＡ媒介性修飾により生じて遺伝子発現を変化させることができる（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。
【００６６】
本明細書において用いる場合，“非対称ヘアピン”とは，アンチセンス領域，ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含んでいてもよいループ部分，およびセンス領域がアンチセンス領域と塩基対形成してループを有するデュープレックスを形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度にアンチセンス領域より少ない数のヌクレオチドを含むセンス領域を含む直線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば，本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は，細胞またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば，約１９−約２２（例えば，約１９，２０，２１，または２２ヌクレオチド）），および約４−約８ヌクレオチドを含むループ領域，およびアンチセンス領域に相補的な約３−約１８（例えば，約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，または１８）ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はまた，化学的に修飾されていてもよい５’末端リン酸基を含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は，本明細書に記載されるヌクレオチド，非ヌクレオチド，リンカー分子，またはコンジュゲート分子を含むことができる。
【００６７】
本明細書において用いる場合，“非対称デュープレックス”とは，センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別々の鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し，ここでセンス領域は，センス領域がアンチセンス領域と塩基対形成してデュープレックスを形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する程度に，アンチセンス領域より少ない数のヌクレオチドを含む。例えば，本発明の非対称デュープレックスｓｉＮＡ分子は，細胞またはインビトロ系でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さを有するアンチセンス領域（例えば，約１９−約２２ヌクレオチド），およびアンチセンス領域に相補的な約３−約１８ヌクレオチドを有するセンス領域を含むことができる。
【００６８】
"酵素的核酸分子"とは，特定の遺伝子標的の基質結合領域において相補性を有し，かつ標的ＲＮＡを特異的に切断する作用をする酵素的活性を有する核酸分子を意味する。すなわち，酵素的核酸分子は，分子間でＲＮＡを切断し，このことにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。このような相補的領域は，酵素的核酸分子が標的ＲＮＡに十分にハイブリダイズし，したがって切断が起こることを可能にする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性もまた本発明において有用である。核酸は塩基，糖および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム，制御可能リボザイム，触媒的オリゴヌクレオチド，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムまたはＤＮＡ酵素のような句と相互交換的に使用される。これらすべての用語は酵素的活性を有する核酸分子を記述する。本出願に記載されている特定の酵素的核酸分子は本発明において限定的なものではない。当業者は，本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，１またはそれ以上の標的核酸領域に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつ分子に核酸切断活性を与えるヌクレオチド配列を基質結合部位内または周辺に有することであることを認識するであろう（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１，Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＪＡＭＡ）。
【００６９】
"アンチセンス核酸"とは，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｌ  ａｌ．，１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，５６６）相互作用により標的核酸に結合して，標的核酸の活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（概説については，Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１００４を参照）。典型的には，アンチセンス分子は，アンチセンス分子の１つの連続する配列に沿って標的配列に相補的である。しかし，ある態様においては，アンチセンス分子は，基質分子がループを形成するように基質に結合することができ，および／またはアンチセンス分子はアンチセンス分子がループを形成するように結合することができる。すなわち，アンチセンス分子が２つ（またはそれ以上）の非連続的基質配列に相補的であってもよく，またはアンチセンス分子の２つ（またはそれ以上）の非連続的配列部分が標的配列に相補的であってもよく，その両方でもよい。
【００７０】
“ＡＨリボザイム”モチーフとは，Ｋｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１８），４１１６−４１２０に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。
【００７１】
"ＮＣＨ"または"イノザイム"モチーフとは，Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願．０９／４０６，６４３（１９９９年９月２７日出願，表題"ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＲＮＡ  ＣＬＥＡＶＩＮＧ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ"），および国際公開ＷＯ９８／５８０５８およびＷＯ９８／５８０５７（いずれも図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。
【００７２】
"Ｇ−切断剤"モチーフとは，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開Ｎｏ．ＷＯ９９／１６８７１（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含む酵素的核酸分子を意味する。
【００７３】
"チンザイム"モチーフは，例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開Ｎｏ．ＷＯ９９／５５８５７（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるようなモチーフを含むクラスＩＩ酵素的核酸分子である。チンザイムは，活性のためにはそれ自身の核酸配列中にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例である。
【００７４】
"アンバーザイム"モチーフとは，例えば，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開Ｎｏ．ＷＯ９９／５５８５７（図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されるモチーフを含むクラスＩ酵素的核酸分子を意味する。アンバーザイムは，活性のためにはそれ自身の核酸配列中にリボヌクレオチド（２’−ＯＨ）基を必要としない酵素的核酸分子の非限定的例である。
【００７５】
"２−５Ａアンチセンスキメラ"とは，５’リン酸化２’−５’結合アデニレート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合し，細胞性２−５Ａ依存性リボヌクレアーゼを活性化し，それは次に標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１３００）。
【００７６】
"トリプレックス形成オリゴヌクレオチド"とは，二本鎖ＤＮＡに配列特異的様式で結合して，三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような三重らせん構造の形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｃｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５０４）。
【００７７】
"デコイＲＮＡ"とは，天然のリガンド結合ドメインを模倣するＲＮＡ分子を意味する。したがって，デコイＲＮＡは特定のリガンドの結合について天然の結合標的と競合する。例えば，ＨＩＶトランス活性化応答（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現が"デコイ"として作用して，ＨＩＶ  ｔａｔ蛋白質に有効に結合し，このことによりこれがＨＩＶ  ＲＮＡ中にコードされるＴＡＲ配列に結合することを妨害することが示されている（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ，６３，６０１−６０８）。これは特定の例にすぎず，当業者は，当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成しうることを理解するであろう。
【００７８】
"アゴニストＲＮＡ"とは，高い親和性をもって蛋白質レセプターと結合して，特定の細胞経路の刺激を引き起こすことができるＲＮＡ分子を意味する。
【００７９】
"アンタゴニストＲＮＡ"とは，細胞蛋白質と結合して，これがその正常な生物学的機能を行うことを防止することができるＲＮＡ分子を意味する（例えば，Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，８８６４−８８６８を参照）。
【００８０】
本明細書において用いる場合，"アプタマー"または"核酸アプタマー"とは，標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し，ここで，核酸分子は，その自然の設定において標的分子により認識される配列とは異なる配列を有する。あるいは，アプタマーは標的分子と結合する核酸分子であってもよく，ここで，標的分子は自然には核酸に結合しない。標的分子は興味のある任意の分子でありうる。例えば，アプタマーを用いて蛋白質のリガンド結合ドメインと結合させ，このことにより，天然に生ずるリガンドと蛋白質との相互作用を防止することができる。これは非限定的例であり，当業者は，当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成しうることを理解するであろう（例えば，Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｅ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。
【００８１】
"・・を含む"とは，"・・を含む"の単語の前にあるものを含むがそれには限定されないことを意味する。すなわち，"・・を含む"との用語の使用は，挙げられる要素が必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，存在しても存在しなくてもよいことを示す。"・・からなる"とは，"・・からなる"の語句の前にあるものをすべて含みかつそれに限定されることを意味する。すなわち，"・・からなる"との語句は，挙げられる要素が必要または強制的なものであり，他の要素は存在しないことを示す。"本質的に・・からなる"とは，この語句の前に挙げられるすべての要素を含み，挙げられる要素についての開示において特定される活性または作用を妨害せずまたはそれに貢献する他の要素に限定されることを意味する。すなわち，"本質的に・・からなる"との語句は，挙げられる要素は必要または強制的なものであるが，他の要素は任意であり，それらが挙げられる要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かによって，存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００８２】
本発明の他の特徴および利点は，以下の本発明の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８３】
好ましい態様の説明
まず図面を簡単に説明する。
図面：
図１はホスホルアミダイト法を用いて合成された１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む核酸分子の１ポット脱保護の概略図である。
【００８４】
図２は不完全Ｎ−フタロイル脱保護生成物の概略図である。化合物Ａは無傷のＮ−フタロイル保護を表し，化合物Ｂは部分的に切断されたＮ−フタロイル保護を表し，化合物ＣはＮ−フタロイル保護を完全に切断した後の遊離２’−アミノ基を表す。
【００８５】
図３は，エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）データに基づく種々の１ポット脱保護方法の比較を示す。図３Ａは，リボヌクレオチド官能基（ＴＢＤＭＳ保護）および２つの２’−アミノ官能基（Ｎ−フタロイル保護）を含む精製された全長オリゴヌクレオチドの，無水メチルアミン／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ・３ＨＦを用いた脱保護方法の後のＥＳＭＳクロマトグラムを示す。図３Ｂは，リボヌクレオチド官能基（ＴＢＤＭＳ保護）および２つの２’−アミノ官能基（Ｎ−フタロイル保護）を含む精製された全長オリゴヌクレオチドの，水性メチルアミン／ＤＭＳＯ／ＴＥＡ・３ＨＦを用いた脱保護方法の後のＥＳＭＳクロマトグラムを示す。図３Ａに見られる３つのピークは，完全に脱保護されたオリゴ，１つの部分的に脱保護されたフタロイル基が残っている脱保護されたオリゴ，および２つの部分的に脱保護されたフタロイル基が残っている脱保護されたオリゴの質量を表す。図３Ｂに示される単一のピークは，完全に脱保護されたオリゴのみの質量を表す。
【００８６】
図４は，キャピラリーゲル電気泳動データに基づく種々の１ポット脱保護方法の比較を示す。図４Ａは，図３Ａに示される精製された全長オリゴヌクレオチドのＣＥクロマトグラムを示す。部分的に切断されたフタロイル基混入物による広いピークが得られた。図４Ｂは，図３Ｂに示される精製された全長オリゴヌクレオチドのＣＥクロマトグラムを示す。均一なオリゴヌクレオチド種と一致する単一の狭いピークが得られた。
【００８７】
図５は，二本鎖ｓｉＮＡ分子の合成のスキームの非限定的例を示す。相補的ｓｉＮＡ配列鎖，すなわち鎖１および鎖２は，タンデムで合成し，切断可能な結合，例えばヌクレオチドスクシネートまたは無塩基スクシネートにより連結されており，これは固体支持体上の固相合成に用いられた切断可能なリンカーと同じであっても異なっていてもよい。合成は，固相または溶液相のいずれで行ってもよく，示される例においては合成は固相合成である。合成は，タンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上に保護基，例えばジメトキシトリチル基が無傷で残るようにして行った。オリゴヌクレオチドを切断および脱保護すると，２つのｓｉＮＡ鎖は自発的にハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスを形成するため，末端保護基の性質を利用することにより，例えば末端保護基を有するデュープレックス／オリゴヌクレオチドのみが単離されるトリチルオン精製方法を適用することにより，デュープレックスを精製することができる。
【００８８】
図６は，本発明の方法により合成された精製二本鎖ｓｉＮＡデュープレックスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。示される２つのピークは，別々のｓｉＮＡ配列鎖の予測される質量に対応する。この結果は，タンデム合成により生成したｓｉＮＡデュープレックスを単純なトリチルオン精製方法論を用いて単一の物質として精製することができることを示す。
【００８９】
図７は，例えば本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる種々の安定化化学（１−１０）の非限定的例を示す：（１）［３−３’］−反転デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド。図に示される修飾および未修飾骨格化学に加えて，これらの化学を本明細書に記載される別の骨格修飾，例えば式Ｉを有する骨格修飾と組み合わせてもよい。さらに，示されている末端修飾の５’側に示される２’−デオキシヌクレオチドは，別の修飾または未修飾ヌクレオチドであってもよく，非ヌクレオチドであってもよい。
【００９０】
ＲＮＡ緩衝（ＲＮＡｉ）を媒介する核酸分子：
ＲＮＡ干渉とは，動物において短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを表す（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応するプロセスは一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと称され，真菌においてはクエリングとも称される。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは，外来遺伝子の発現を防止するために用いられる進化的に保存された細胞防御メカニズムであると考えられており，異なる叢および門が共通して有している（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。そのような外来遺伝子発現からの防御は，ウイルス感染または宿主ゲノム中へのトランスポゾン要素のランダムインテグレーションから生ずる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して，相同的一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答により進化してきたのであろう。細胞におけるｄｓＲＮＡの存在は，まだ完全には特性決定されていないメカニズムにより，ＲＮＡｉ応答を引き起こす。このメカニズムは，蛋白質キナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介性活性化の結果，リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断が生ずるインターフェロン応答とは異なるようである。
【００９１】
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると，ダイサーと称されるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは，ｄｓＲＮＡをプロセシングして短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短い断片のｄｓＲＮＡとすることに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサー活性から生ずる短干渉ＲＮＡは，典型的には約２１−２３ヌクレオチドの長さであり，約１９塩基対のデュープレックスを含む。ダイサーはまた，翻訳制御における関与が示唆されている保存された構造の前駆体ＲＮＡから２１および２２ヌクレオチドの小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を切り出すことに関与することが示唆されている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答はまた，一般にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される，ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とし，これはｓｉＲＮＡと相同な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は，ｓｉＲＮＡデュープレックスのガイド配列に相補的な領域の中央部で生ずる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。さらに，ＲＮＡ干渉には，小さいＲＮＡ（例えば，マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは，クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり，このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される（例えば，Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。このように，本発明のｓｉＮＡ分子は，ＲＮＡ転写産物との相互作用を介して，あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により，遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ，そのような相互作用により転写レベルまたは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。
【００９２】
ＲＮＡｉは種々の系で研究されてきた。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は，Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初にＲＮＡｉを観察した。ＷｉａｎｎｙおよびＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０）は，マウス胚においてｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉを記載する。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は２，ｄｓＲＮＡでトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉを記載する。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は，培養哺乳動物細胞，例えばヒト胚性腎臓細胞およびＨｅＬａ細胞において，合成の２１ヌクレオチドＲＮＡのデュープレックスを導入することにより誘導されるＲＮＡｉを記載する。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は，効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ，構造，化学組成，および配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は，２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡデュープレックスは２つの２ヌクレオチド３’末端ヌクレオチドオーバーハングを含む場合に最も活性であることを示した。さらに，一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが，３’末端ｓｉＲＮＡヌクレオチドをデオキシヌクレオチドで置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡデュープレックスの中心におけるミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに，これらの研究はまた，標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は，ｓｉＲＮＡデュープレックスの標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり，ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。しかし，５’−リン酸を欠失したｓｉＲＮＡ分子は，外的に導入したときに活性であり，このことは，インビボでｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が生じているかもしれないことを示唆する。短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）との用語は短干渉核酸（ｓｉＮＡ），二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），マイクロ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ），および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）との用語と互換的に用いられ，これらはすべて，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる分子である。
【００９３】
酵素的核酸分子：
酵素的ＲＮＡ分子とは，１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む核酸分子である。酵素的ＲＮＡ分子は，分子内でまたは分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができ，このことにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化することができる。基質結合領域において特定の遺伝子標的と相補性を有する酵素的ＲＮＡ分子は，その標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的活性をも有するこの相補性は酵素的ＲＮＡ分子の標的ＲＮＡまたはＤＮＡに対する十分なハイブリダイゼーションを可能とするよう機能し，切断が生ずることを可能とする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性も本発明においては有用であろう。核酸は，塩基，糖，および／またはリン酸基で修飾されていてもよい。
【００９４】
酵素的ＲＮＡとの用語は，リボザイム，酵素的核酸，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，ヌクレオザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイムなどの句と互換的に用いられる。
【００９５】
"相補性"とは，核酸が，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプ（例えば，フーグスティーンタイプ）のいずれかにより，別のＲＮＡ配列と水素結合を形成することができることを意味する。
【００９６】
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有するＲＮＡ分子は，ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。適切な設計および構造を有するそのような酵素的ＲＮＡ分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９  １９８６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７８８，１９８７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４  Ｎａｔｕｒｅ  ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７１，１９８９）。
【００９７】
その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾患の治療剤として有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｒ，１９９５  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性にし，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連する蛋白質の合成を選択的に阻害することができる。
【００９８】
現在，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られている。それぞれは，生理学的条件下で，ＲＮＡのホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。一般に，酵素的ＲＮＡは，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ  １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６２；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ  ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｖａｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ３６，６４９５（これらはすべて本明細書の一部としてここに引用する）。それぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。
【００９９】
リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度がより低い等の著しい利点を有する。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力を反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，その阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。
【０１００】
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９  １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，５９６；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，８４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４  Ｎａｔｕｒｅ  ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０  ＪＡＭＡ  ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１７  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３７１，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（上掲）））。
【０１０１】
その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾患の治療剤として有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｒ，１９９５  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性にし，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾患状態に関連する蛋白質の合成が選択的に阻害される（Ｗａｒａｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．６，２３７−２５０）。
【０１０２】
１つの観点においては,酵素的核酸分子はハンマーヘッドまたはヘアピンのモチーフで形成されるが，デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ），グループＩイントロン，ＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列を伴う），またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡのモチーフで形成してもよい。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は，Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８，１８３，Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１，５２７により；ヘアピンモチーフの例は，Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＰ０３６０２５７，Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ，１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，４９２９，Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２９９，Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９により；デルタ肝炎ウイルスモチーフの例は，Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ，１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ３１，１６，Ｂｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７により；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は，Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３  Ｃｅｌｌ  ３５，８４９；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，７８３により；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフの例は，Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９０  Ｃｅｌｌ  ６１，６８５−６９６；Ｓａｖｉｌｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９１  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８，８８２６−８８３０；Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１４，３６８）により；グループＩイントロンの例は，Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９，Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許４，９８７，０７１により，それぞれ記載されている。これらの特定のモチーフは本発明において限定的なものではなく，当業者は，エンドヌクレアーゼ活性を有する本発明の酵素的核酸分子において重要なことは，それが標的遺伝子のＲＮＡの１またはそれ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し，かつその基質結合部位の中または周辺に，分子にＲＮＡ切断活性を付与するヌクレオチド配列を有することのみであることを認識するであろう。結合部位の長さは，異なるリボザイムモチーフについて様々であり，当業者は，最適なリボザイム活性を達成するためには，結合アームの長さが標的核酸配列と安定な相互作用を形成するのに十分な長さでなければならないことを理解するであろう。
【０１０３】
本発明において記載されるリボザイムの触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）に記載されるように最適化することができる。ここでは詳細は繰り返さないが，リボザイム結合アームの長さを変化させること，または血清リボヌクレアーゼによる分解を防止し，および／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有するリボザイムを化学的に合成することが含まれる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；およびＲｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて，酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖成分に行うことができる種々の化学的修飾を記載する）。細胞におけるその有効性を増強する修飾，およびステムループ構造から塩基を除去してＲＮＡ合成時間を短くし，化学物の必要性を減少させることが望ましい（これらの刊行物はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１０４】
アプタマー：
目的とする特定のリガンドと特異的に結合する核酸アプタマーを選択することができる（例えば，Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，５６７，５８８および米国特許５，４７５，０９６，Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３；ＢｒｏｄｙａｎｄＧｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００；Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０；およびＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。例えば，インビトロセレクションを使用して，ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１，ｇｐ１２０またはウイルスの融合誘導活性を破壊するＨＩＶの他の任意の部分に対して結合特異性を有する核酸アプタマーを進化させることができる。核酸アプタマーは，本明細書に記載される化学的修飾およびリンカーを含むことができる。本発明の核酸アプタマーは二本鎖でも一本鎖でもよく，１つの独特の核酸配列または互いに複合体を形成している２以上の核酸配列を含むことができる。ＨＩＶエンベロープ糖蛋白質，例えばｇｐ４１に結合する本発明のアプタマー分子は，ＨＩＶの融合誘導活性を調節することができ，したがって，ウイルスの細胞への侵入および感染能力を調節することができる。
【０１０５】
アンチセンス：
アンチセンス分子は，修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ，ＤＮＡ，または混合ポリマーのオリゴヌクレオチドであることができ，主として，マッチする配列に特異的に結合することにより機能し，ペプチド合成を阻害する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ  １９９４，Ｂｉｏ  Ｐｈａｒｍ，２０−３３）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，標的ＲＮＡにワトソンクリック塩基対形成により結合し，立体的障害によりまたはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化することにより結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害する。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸送を妨害することにより蛋白質合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ  ７，１５１−１９０）。
【０１０６】
さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスがヌクレアーゼ分解される（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲），Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））。これまでのところ，ＲＮａｓｅＨの基質として作用する，主鎖を化学的に修飾したＤＮＡは，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートおよびボロントリフルオリデートのみである。最近，２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴもまたＲＮａｓｅＨ活性を活性化することが報告された。
【０１０７】
化学的に修飾されたヌクレオチドの新規なコンフィギュレーション，二次構造，および／またはＲＮａｓｅＨ基質ドメインを利用する多数のアンチセンス分子が記載されている（Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，９８９，９１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４（１９９８年４月２０日出願）；Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願６０／１０１，１７４（１９９８年９月２１日出願）（これらはその全体を本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１０８】
アンチセンスＤＮＡを用いて，ＤＮＡ−ＲＮＡ相互作用によりＲＮＡを標的化して，このことによりデュープレックス中の標的ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＨを活性化することができる。アンチセンスＤＮＡは，化学的に合成することができ，または一本鎖ＤＮＡの細胞内発現ベクターまたはその同等物を用いて発現させることができる。
【０１０９】
血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有する，化学的に合成された核酸分子は，その抗力が高まるであろう（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）を参照。上述の参考文献はすべて，本明細書に記載される核酸分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学的修飾を記載する（これらのすべての刊行物は本明細書の一部としてここに引用する）。細胞中におけるその抗力を増強する修飾，およびオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
【０１１０】
当該技術分野には，そのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，核酸分子中に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば，オリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  ＴＩＴＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，７１６，８２４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，６２７，０５３；Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願６０／０８２，４０４，１９９８年４月２０日出願；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；およびＢｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。これらの刊行物は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載する。このような教示の観点から，本明細書に記載されるものと同様の修飾を用いて，本発明の核酸分子を修飾することができる。
【０１１１】
ホスホロチオエート，ホスホロチオエート，および／または５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学的修飾は安定性を改良するが，これらの修飾が多すぎるとある種の毒性を引き起こしうる。したがって，核酸分子を設計する場合，これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度を減少させると，毒性が低下し，これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
【０１１２】
活性を維持するかまたは増強させる化学的修飾を有する核酸分子が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，細胞中でおよび／またはインビボで，活性は顕著に低下しないはずである。外的にデリバリーされた治療用核酸分子は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は，疾病状態に依存して数時間から数日まで様々であろう。明らかに，核酸分子は，有効な細胞内治療剤として機能するためには，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する））により，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより，核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
【０１１３】
本発明の核酸に基づく分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のアンチセンスまたは酵素的核酸分子，既知の小分子阻害剤とカップリングさせた核酸分子，または分子（異なるモチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。
【０１１４】
外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば，酵素的核酸分子およびアンチセンス核酸分子）は，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は，疾病状態に依存して数時間から数日まで様々であろう。明らかに，核酸分子は，有効な細胞内治療剤として機能するためには，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。本発明および当該技術分野において記載される核酸分子の化学合成の改良により，上述したように，ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより，核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
【０１１５】
"増強された酵素的活性"とは，細胞および／またはインビボで測定される活性を含むことを意味し，ここで，活性はリボザイムの触媒活性および安定性の両方が反映されたものである。本発明においては，全ＲＮＡリボザイムまたは全ＤＮＡ酵素と比較して，これらの特性の積をインビボで増加させることができる。
【０１１６】
さらに別の好ましい態様においては，酵素的活性を維持するかまたは増強させる化学修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって，細胞中でおよび／またはインビボで，核酸の活性は顕著に低下しないであろう。本明細書に例示されるように，そのような核酸分子は，全体の活性が１０倍低下したとしても，細胞内でおよび／またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのような核酸は，本明細書において，全ＲＮＡ核酸分子，例えばリボザイムまたはｓｉＲＮＡの酵素的活性を"維持する"と称される。
【０１１７】
別の観点においては，核酸分子は５’および／または３’−キャップ構造を含む。
【０１１８】
"キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば，Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９７／２６２７０を参照，本明細書の一部としてここに引用する）。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，輸送および／または細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは，５’−末端（５’−キャップ）または３’−末端（３’−キャップ）のいずれに存在していてもよく，両末端に存在していてもよい。非限定的例においては，５’−キャップは，反転無塩基残基（成分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３’−３’反転ヌクレオチド成分；３’−３’−反転無塩基成分；３’−２’−反転ヌクレオチド成分；３’−２’−反転無塩基成分；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照，本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１１９】
さらに別の好ましい態様においては，３’−キャップは，４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−反転ヌクレオチド成分；５’−５’−反転無塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト成分からなる群より選択される（詳細については，Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）。
【０１２０】
本明細書において用いる場合，"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ，糖および／またはリン酸置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基または化合物を意味する。基または化合物は，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えば，アデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まない場合，無塩基である。
【０１２１】
"アルキル"基とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖，および環状アルキル基が含まれる。好ましくは，アルキル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨである。この用語は，また，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素原子，より好ましくは１−４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ3）2，アミノ，またはＳＨから選択される。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖，および環状基でありうる。好ましくは，アルキニル基は１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ2またはＮ（ＣＨ3）2，アミノまたはＳＨから選択される。
【０１２２】
そのようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，複素環アリール，アミドおよびエステル基を含むことができる。"アリール"基とは，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し，炭素環式アリール，複素環アリールおよび二アリール基が含まれる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシル，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基は，アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は，芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。複素環アリール基は，芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には，酸素，イオウ，および窒素が含まれ，例えば，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が挙げられる。これらはすべて任意に置換されていてもよい。"アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。
【０１２３】
本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"とは，当該技術分野において認識されているように，天然の塩基（標準的な），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に，ヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは，一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において，修飾されていても修飾されていなくてもよい（ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準的ヌクレオチドおよび他のものとして互換的に称される。例えば，Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲）を参照，すべて本明細書の一部としてここに引用する）。修飾核酸塩基のいくつかの例が当該技術分野において知られるており，Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸分子中に導入することができる塩基修飾の非限定的例には，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば，６−メチルウリジン），プロピン，および他のものが含まれる（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，（上掲））。この観点において"修飾塩基"とは，１’位におけるアデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基またはその同等物を意味する。このような塩基は，任意の位置で，例えば酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
【０１２４】
好ましい態様においては，本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾リボザイムを特徴とし，これは１またはそれ以上のホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，メチルホスホネート，モルホリノ，アミデート，カルバメート，カルボキシメチル，アセトアミデート，ポリアミド，スルホネート，スルホンアミド，スルファメート，ホルムアセタール，チオホルムアセタール，および／またはアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，およびＭｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照。これらの参考文献は本明細書の一部としてここに引用する。
【０１２５】
"無塩基"とは，１’位置において塩基を欠失しているか，または塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を意味する（詳細については，Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９７／２６２７０を参照）。
【０１２６】
"修飾ヌクレオシド"または“化学的に修飾された”とは，未修飾または天然に生ずるヌクレオチド塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチドを意味する。
【０１２７】
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して，"アミノ"とは，２’−ＮＨ2または２’−Ｏ−ＮＨ2を意味し，これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は，例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許５，６７２，６９５およびＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９８／２８３１７（いずれも本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【０１２８】
核酸（例えば，アンチセンスおよびリボザイム）構造に対する種々の修飾を作成して，これらの分子の有用性を高めることができる。このような修飾は，製品寿命，インビトロの半減期，安定性，およびそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め，例えば，細胞膜の透過性を高め，標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
【０１２９】
これらの分子の使用は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム，既知の小分子阻害剤とカップリングさせたリボザイム，またはリボザイム（異なるリボザイムモチーフを含む）および／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。核酸分子を用いる患者の治療にはまた，異なる種類の核酸分子の組み合わせが含まれる。１またはそれ以上の標的に対するリボザイム（異なるリボザイムモチーフを含む），アンチセンスおよび／または２−５Ａキメラ分子の混合物を含む療法を案出して，疾病の症状を軽減することができる。
【０１３０】
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの合成および精製
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，好ましくは，小さい核酸モチーフ（"小さい"とは，１００ヌクレオチド以下の長さ，好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ，最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ，例えば，個別のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列またはタンデムで合成されたｓｉＮＡ配列等を表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸が蛋白質および／またはＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが，他の分子も同様に合成することができる。
【０１３１】
オリゴヌクレオチド（例えば，ある種の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを欠失したオリゴヌクレオチドの一部は，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開９９／５４４５９，Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６，００１，３１１に記載されるような，当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する（これらの文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する）。オリゴヌクレオチドの合成には，一般の核酸保護基およびカップリング基，例えば５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で，０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで，２’−Ｏメチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程，および２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ  ヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で，小規模の合成を行う。表Ｉは，合成サイクルで用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトおよび１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイトおよび７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ  Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍ��ｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，ボーケージ試薬（３Ｈ１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０１３２】
ＤＮＡ系のオリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し，４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去する。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得る。
【０１３３】
本発明のある種のｓｉＮＡ分子等のＲＮＡについて用いられる合成方法は，Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９；に記載の方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５’末端にジメトキシトリチル，および３’末端にホスホルアミダイトを用いる。非限定的例においては，小規模の合成は，３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を，２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表Ｉは，合成サイクルにおいて用いる試薬の量および接触時間の概要を示す。あるいは，０．２μｍｏｌスケールでの合成は，９６ウエルプレート合成機，例えば，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で，サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイトおよび１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，典型的には９７．５−９９％である。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ(ＡＢＩ）であり；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は，１６．９ｍＭ  Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは，ホスホロチオエート結合の導入のために，ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド，アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０１３４】
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの脱保護は，本発明にしたがって行う。オリゴヌクレオチドは，本発明にしたがって精製するか，および／または一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ国際公開ＷＯ９５／２３２２５を参照，その全内容を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。トリチルオンオリゴマーの精製のためには，クエンチしたＮＨ４ＨＣＯ３溶液を，アセトニトリル，続いて５０ｍＭＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８を含有するカートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後，０．５％ＴＦＡで１３分間ＲＮＡを脱トリチル化する。次にカートリッジを再び水で洗浄し，１Ｍ  ＮａＣｌで塩交換し，再び水で洗浄する。次に３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
【０１３５】
平均段階カップリング収率は，典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は，合成のスケールは，上述の例より大きくまたは小さく，例えば，限定されないが，９６ウエルのフォーマットに適合させることができることを認識するであろう。
【０１３６】
あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成して，合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４），または合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションにより，一緒につなげてもよい。
【０１３７】
本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）はまた，タンデム合成法により合成することができる。この方法では，両方のｓｉＮＡ鎖を，切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成し，次にこれを切断して別々のｓｉＮＡフラグメントまたは鎖を生成し，これはハイブリダイズしてｓｉＮＡデュープレックスの精製を可能とする（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願１０／４４４，８５３，２００３年５月２３日出願）を参照）。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成は，マルチウエル／マルチプレート合成プラットフォーム，例えば９６ウエルまたは同様のより大きなマルチウエルプラットフォームのいずれにも容易に適合させることができる。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成はまた，バッチリアクター，合成カラムなどを用いる大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。
【０１３８】
核酸分子（例えばｓｉＮＡ分子）はまた，一方のフラグメントがＲＮＡ分子のセンス領域を含み第２のフラグメントがＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む２つの別々の核酸鎖またはフラグメントから組み立てることができる。
【０１３９】
本発明の核酸分子は，広範囲に修飾して，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２’−アミノ，２’−Ｃ−アリル，２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｈによる修飾により安定性を高める（概説としてはＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ１７，３４；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは，一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）を参照，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）により精製し，水に再懸濁する。
【０１４０】
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの脱保護
オリゴリボヌクレオチドの大規模かつハイスループットの化学合成のためには，オリゴリボヌクレオチドの脱保護に含まれる２つの主要な工程（すなわち，アミノ保護基およびリン酸保護基を除去するための塩基処理および２’−ＯＨアルキルシリル保護基，例えばｔ−ブチルジメチルシリル基を除去するためのフッ素処理）を圧縮することが重要である。
【０１４１】
Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（上掲）は，無水メチルアミンおよびトリエチルアミン三フッ化水素酸に基づく時間効率のよい（約２時間）ワンポット脱保護プロトコルを記載する。フッ素処理の間の水の混入が脱シリル化反応の効率に不利益であることが報告されて以来（Ｈｏｇｒｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，４７３９−４７４１），かつ水性メチルアミンをＴＥＡ・３ＨＦと組み合わせて使用するとリボヌクレオチドが分解すること（実施例３を参照）が報告されて以来，従来は，塩基の無水溶液，例えば純粋エタノール中の３３％メチルアミンを使用し，次にトリエチルアミン３フッ化水素酸で適切に処理してオリゴリボヌクレオチドをワンポット様式で効率的に脱保護することが必要であると考えられてきた。しかし，これらの条件は，不完全な脱保護生成物が生ずるため，２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシド含有核酸分子の２’−アミノ官能基を保護するために用いられる２’−Ｎ−フタロイル保護基の完全な脱保護には不十分であることが証明された（図２，化合物Ｂを参照）。フタロイル基を完全に除去するために無水脱保護反応条件をより長い時間および／またはより高い温度で行う試みの結果，リボヌクレオチド種が顕著に分解された。したがって，本出願人は，オリゴヌクレオチド脱保護の１ポット方法として水性メチルアミンをＴＥＡ・３ＨＦおよびＤＭＳＯとともに使用することを研究した。驚くべきことに，この方法は，ＤＭＳＯの存在下で用いると，予測されたリボヌクレオチド結合のアルカリ加水分解を引き起こさない。この方法をＤＭＳＯなしで適用すると，全長核酸の収率が低くなり，これはおそらく，リボヌクレオチド結合のアルカリ加水分解によるものであろう（実施例３を参照）。本明細書に記載される１ポット水性方法は，現存する２ポット水性方法および１ポット無水方法と比較してオリゴヌクレオチド脱保護を有意により短い時間で行い，物質をより高い収率および純度で得る方法を提供する。
【実施例】
【０１４２】
以下はオリゴヌクレオチドの脱保護を示す非限定的例である。
【０１４３】
実施例１：ワンポット無水脱保護方法を用いる２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／Ｎ−フタロイル保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの小規模脱保護
２つのＮ−フタロイル保護２’−アミノヌクレオシドを含むリボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにしてＰｈａｒｍａｃｉａ  ＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上に合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥した。約２０ｍｇの支持体を５ｍｌねじ蓋付きバイアルに移した。３３％メチルアミン／エタノール（８００μｌ）と乾燥ＤＭＳＯ（８００μｌ）との１：１混合物を支持体に加え，混合物を加熱ブロックを用いて６５℃で１５分間加熱した。溶液を室温に冷却し，次に０．５ミクロンフィルターを通して濾過し，別の５ｍｌねじ蓋付きバイアルに入れた。ＴＥＡ・３ＨＦ（６００μｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１５分間加熱した。次に混合物を冷却し，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（２ｍｌ）でクエンチした。対応する脱保護し精製した全長オリゴヌクレオチドは，キャピラリーゲル電気泳動およびＥＳ質量分析により分析した。質量分析は，完全に脱保護されたオリゴヌクレオチド，１つの部分的に切断されたフタロイル基が残っているオリゴヌクレオチド，および２つの部分的に切断されたフタロイル基が残っているオリゴヌクレオチドに対応する質量の３つのピークを示した（図３Ａ）。ＣＧＥクロマトグラフは，１つの広いピークを示した（図４Ａ）。同様の方法を用いて，他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンス，およびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。
【０１４４】
実施例２：ワンポット水性脱保護方法を用いる２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／Ｎ−フタロイル保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの小規模脱保護
リボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにしてＰｈａｒｍａｃｉａ  ＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上で合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥した。約２０ｍｇの支持体を５ｍｌねじ蓋付きバイアルに移し，次に支持体を水性メチルアミン（１ｍｌ）とともに加熱ブロックを用いて６５℃で１５分間加熱した。溶液を室温に冷却し，次に，０．５ミクロンフィルターを通して濾過して，別の５ｍｌねじ蓋付きバイアルに入れた。ＤＭＳＯ（１．６ｍｌ）およびＴＥＡ・３ＨＦ（６００μｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１５分間加熱した。次に混合物を５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（２ｍｌ）で冷却しクエンチした。対応する脱保護して精製した全長オリゴヌクレオチドは，キャピラリーゲル電気泳動およびＥＳ質量分析により分析した。質量分析は，完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドに対応する質量の１つのピークを示した（図３Ｂ）。ＣＧＥクロマトグラフは，１つの狭いピークを示した（図４Ｂ）。同様の方法を用いて，リボヌクレオチドを含むか，および／または化学的修飾を有する他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。さらに，脱保護条件は，オリゴヌクレオチドコンストラクトの可能な最大の収率および純度を与えるよう改変することができる。例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることが認められた。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを約３５℃で３０分間用いて脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロを含有するオリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液をさらに１５分間約６５℃に維持することができる。
【０１４５】
実施例３：ＤＭＳＯなしでワンポット水性脱保護方法を用いる，２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／Ｎ−フタロイル保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの小規模脱保護
リボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにＰｈａｒｍａｃｉａＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上で合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥した。約２０ｍｇの支持体を５ｍｌのねじ蓋バイアルに移し，支持体を水性メチルアミン（１ｍｌ）とともに加熱ブロックを用いて６５℃で１５分間加熱した。溶液を室温に冷却し，次に０．５ミクロンのフィルターを通して濾過し，別の５ｍｌねじ蓋バイアルに入れた。ＴＥＡ・３ＨＦ（６００μｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１５分間加熱した。次に混合物を冷却し，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（２ｍｌ）でクエンチした。対応する脱保護し精製した全長オリゴヌクレオチドは，イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ痕跡は，脱保護においてＤＭＳＯを用いた実施例２からの物質と比較して，オリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチド結合の切断に対応する有意な分解を示した。同様の方法を用いて，リボヌクレオチドを含むか，および／または化学的修飾を有する他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。さらに，脱保護条件は，オリゴヌクレオチドコンストラクトの可能な最大の収率および純度を与えるよう改変することができる。例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることが認められた。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。
【０１４６】
実施例４：ワンポット無水脱保護方法を用いる２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの大規模脱保護
リボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにして，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上で合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥し，５００ｍｌのスコット瓶に移した。３３％メチルアミン／エタノール（７５ｍｌ）と乾燥ＤＭＳＯ（７５ｍｌ）との１：１混合物を支持体に加え，混合物を保温振盪器で３５℃で４時間加熱した。溶液を室温に冷却し（１５分間），次に焼結ガラス漏斗を通して濾過した。支持体をＤＭＳＯ（４ｘ１５ｍｌ）で洗浄し，合わせた濾液を氷浴中で３０分間冷却した。ＴＥＡ・３ＨＦ（３０ｍｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１時間加熱した。次に混合物を−７８℃で３０分間冷却し，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（２００ｍｌ）でクエンチした。同様の方法を用いて，他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンス，およびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。
【０１４７】
実施例５：ワンポット水性脱保護方法を用いる２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの大規模脱保護
リボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにＰｈａｒｍａｃｉａ  ＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上で合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥し，２５０ｍｌスコット瓶に移した。４０％水性メチルアミン（７５ｍｌ）を支持体に加え，混合物を３５℃で保温振盪器で１時間加熱した。溶液を室温に冷却し（１５分間），次に焼結ガラス漏斗を通して濾過した。支持体をＤＭＳＯ（４ｘ１８．７５ｍｌ）で洗浄し，合わせた濾液を氷浴中で３０分間冷却した。ＴＥＡ・３ＨＦ（４５ｍｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１時間加熱した。次に混合物を−７８℃で３０分間冷却し，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（１９５ｍｌ）でクエンチした。同様の方法を用いて，リボヌクレオチドを含むか，および／または化学的修飾を有する他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。さらに，脱保護条件は，オリゴヌクレオチドコンストラクトの可能な最大の収率および純度を与えるように改変することができる。例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることが認められた。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロを含有するオリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液を約６５℃でさらに１５分間維持する。
【０１４８】
実施例６：ワンポット水性脱保護方法を用いる２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ／Ｎ−フタロイル保護を有する１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの大規模脱保護
リボザイム配列（表ＩＩ）（２００μｍｏｌｅ）を本明細書に記載されるようにしてＰｈａｒｍａｃｉａ  ＯＰＩＩ合成機によりＣＰＧ支持体上で合成した。合成後，支持体を１５−３０分間乾燥し，２５０ｍｌのスコット（Ｓｃｈｏｔｔ）瓶に移した。４０％水性メチルアミン（７５ｍｌ）を支持体に加え，混合物を保温振盪器で６５℃で１時間加熱した。溶液を室温に冷却し（１５分間），次に焼結ガラス漏斗を通して濾過した。支持体をＤＭＳＯ（４ｘ１８．７５ｍｌ）で洗浄し，合わせた濾液を−７８℃で３０分間冷却した。ＴＥＡ・３ＨＦ（４５ｍｌ）を反応混合物に加え，次に６５℃で１時間加熱した。次に混合物を氷浴で３０分間冷却し，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（１９５ｍｌ）で反応を停止した。同様の方法を用いて，リボヌクレオチドを含むか，および／または化学的修飾を有する他のオリゴヌクレオチド，例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンスおよびアプタマーオリゴヌクレオチドを脱保護することができる。さらに，脱保護条件は，オリゴヌクレオチドコンストラクトの可能な最大の収率および純度を与えるように改変することができる。例えば，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることが認められた。そのようなオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロを含有しリボヌクレオチドをも含むオリゴヌクレオチドは，水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後に，ＴＥＡ−ＨＦを加え，反応液を約６５℃でさらに１５分間保持する。
【０１４９】
実施例７：１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの大規模イオン交換精製
１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（例えば，ｓｉＲＮＡ，アンチセンス，またはアプタマーオリゴヌクレオチド）は，脱保護の後にイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。イオン交換精製プロセスは，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑ１５およびＢｉｏｒａｄ  Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ２５Ｑタイプのいずれの媒体を用いて行ってもよい。精製媒体を平衡化するために用いる緩衝液は，２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌ中の，０−２０％エタノール（２００プルーフ，ＵＳＰ等級）またはアセトニトリルのいずれかである。同じ緩衝液を核酸分子を精製媒体に負荷するために用いてもよく，あるいは水を用いてもよい。粗オリゴヌクレオチド材料は１０ｍｇ／ｍＬまでの濃度でカラムに負荷する。溶出緩衝液の適当な勾配，例えば１．０Ｍ  ＮａＣｌを適用して画分を単離することができる。精製後，適当な方法（例えば，ＵＶ，ＨＰＬＣおよび／またはＣＧＥ）により画分を純度について分析する。純粋な画分をプールし，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＰａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ  ＰＥＳ１Ｋ膜等の膜を用いて接線流濾過により脱塩する。次に濃縮した材料を凍結乾燥する。同様の方法を用いて，本発明のｓｉＲＮＡコンストラクト，例えば，一本鎖，ヘアピン，およびデュープレックスｓｉＲＮＡを精製することができる。デュープレックスｓｉＲＮＡについては，各鎖を合成し，別々に脱保護し，精製し，次に，デュープレックス形成に適した条件下でハイブリダイズさせた。非限定的例においては，ｓｉＲＮＡ鎖を１００ｍＭ酢酸カリウム，３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ酢酸マグネシウム中で２０μＭの各鎖でアニーリングする。アニーリング混合物をまず９０℃で１分間加熱し，次に３７℃に移して６０分間置く。アニーリングは非変性ＰＡＧＥにより確認する。あるいは，デュープレックスｓｉＲＮＡは，以下の実施例８に記載されるように，タンデム合成方法を用いて合成することができる。
【０１５０】
実施例８：ｓｉＮＡコンストラクトのタンデム合成
本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は，切断可能なリンカー，例えば，スクシニル系リンカーを用いて，タンデムで合成する。本明細書に記載されるタンデム合成の後に，１段階精製プロセスを行って，ＲＮＡｉ分子を高収率で得る。この方法はハイスループットＲＮＡｉスクリーニングを支えるｓｉＮＡ合成に非常に適しており，マルチカラムまたはマルチウエルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。
【０１５１】
５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残るｓｉＮＡオリゴおよびその相補鎖のタンデム合成（トリチルオン合成）が完了した後，オリゴヌクレオチドを上述のようにして，例えば実施例２に記載されるようにして脱保護する。脱保護の後，ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションにより，一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し，相補鎖が末端５’−ヒドロキシルを含むデュープレックスが得られる。新たに形成されたデュープレックスは，１つの分子のみがジメトキシトリチル基を有するにもかかわらず，日常的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間，単一の分子として振る舞う。これらの鎖は安定なデュープレックスを形成するため，オリゴの対を例えばＣ１８カートリッジを用いて精製するためには，このジメトキシトリチル基（または同等の基，例えば他のトリチル基または他の疎水性成分）のみが必要である。
【０１５２】
タンデムリンカー，例えば反転デオキシ無塩基スクシネートまたはグリセリルスクシネートリンカー（図５を参照）または同等の切断可能なリンカーを導入する時点までは，標準的なホスホルアミダイト合成化学を用いる。用いることができるリンカー結合条件の非限定的例には，活性化剤，例えばブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒＯＰ）の存在下で，妨害塩基，例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）および／またはＤＭＡＰを使用することが含まれる。リンカーを結合させた後，標準的な合成化学を用いて第２の配列の合成を完了し，末端の５’−Ｏ−ＤＭＴはそのまま残す。合成後，得られたオリゴヌクレオチドを本明細書に記載される方法にしたがって脱保護し，適当な緩衝液，例えば，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃまたは１．５Ｍ  ＮＨ4Ｈ2ＣＯ3で反応を停止させる。
【０１５３】
ｓｉＮＡデュープレックスの精製は，固相抽出，例えば，１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル，２ＣＶのＨ2Ｏ，および２ＣＶの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃで調整したＷａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＳｅｐＰａｋ  ｌｇカートリッジを用いて，容易に行うことができる。サンプルを負荷し，１ＣＶのＨ2Ｏまたは５０ｍＭ  ＮａＯＡｃで洗浄する。失敗配列は１ＣＶの１４％ＡＣＮ（水性；５０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）で溶出する。次にカラムを１ＣＶのＨ2Ｏ等で洗浄し，例えば，１ＣＶの１％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をカラムに通し，次にさらに１ＣＶの１％水性ＴＦＡをカラムに加えて約１０分間放置することにより，カラム上で脱トリチル化を行う。残りのＴＦＡ溶液を除去し，カラムをＨ2Ｏで，次に１ＣＶの１Ｍ  ＮａＣｌおよび再度のＨ2Ｏで洗浄する。次に，ｓｉＮＡデュープレックス生成物を，例えば，１ＣＶの２０％水性ＣＡＮを用いて溶出する。
【０１５４】
図６は，精製したｓｉＮＡコンストラクトのＭＡＬＤＩ−ＴＯＶ質量分析の例を示し，ここで，各ピークはｓｉＮＡデュープレックスの個々のｓｉＮＡ鎖の計算質量に対応する。同じ精製ｓｉＮＡは，キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）で分析したときに３つのピークを与える。１つのピークはおそらくはデュープレックスｓｉＮＡに対応し，２つのピークはおそらく個々のｓｉＮＡ配列鎖に対応する。同じｓｉＮＡコンストラクトのイオン交換ＨＰＬＣ分析では単一のピークしか示されない。以下に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる精製ｓｉＮＡコンストラクトの試験は，別々に合成したオリゴヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡコンストラクトと比較して，ＲＮＡｉ活性が同じであることを示した。
【０１５５】
他の用途
本発明の核酸分子（例えばリボザイム）は，広範な範囲の疾病および病気を治療するための治療剤として用いることができる。リボザイムは，他の別個のＲＮＡ分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で繰り返し切断することができる酵素的活性を有するＲＮＡ分子である。そのような酵素的ＲＮＡ分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的として，インビトロで効率的な切断を達成することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．ｏｆ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８７８８，Ｈａｚｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｎａｔｕｒｅ，２３４，５８５，Ｃｅｃｈ，１９８８，ＪＡＭＡ，２６０，３０３０，およびＪｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７．１３７１）。リボザイムはまず，標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断するよう作用するＲＮＡの酵素的部分と近接して保持された，リボザイムの標的ＲＮＡ結合部分により生ずる。すなわち，リボザイムはまず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。リボザイムは，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。
【０１５６】
本発明の核酸分子を診断手段として使用し，疾病に罹患した細胞内の遺伝的浮動および変異を検査するか，または細胞において特定のＲＮＡの存在を検出することができる。例えば，リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子のいずれの領域においても，標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるリボザイムを複数使用することにより，インビトロならびに細胞および組織におけるＲＮＡの構造および機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの切断を使用して，遺伝子の発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割を（本質的に）明らかにすることができる。このようにして，他の遺伝子標的を疾病の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は，組み合わせ療法の可能性を提供することにより，疾病の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば，異なる遺伝子を標的とする多数のリボザイム，既知の小分子阻害剤とカップリングさせたリボザイム，またはリボザイムおよび／または他の化学的または生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。本発明のリボザイムの他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており，これには，ＲＮＡに関連する状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは，標準的な方法論を使用してリボザイムで処理した後，切断産物の存在を判定することにより検出する。
【０１５７】
特定の例においては，標的ＲＮＡの野生型または変異型のみしか切断できないリボザイムをアッセイに使用する。第１のリボザイムを用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し，第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として野生型および変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のリボザイムで切断し，反応におけるリボザイムの相対効率および“非標的”ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は，試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。従ってそれぞれの分析は２つのリボザイム，２つの基質，および１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在をＲＮａｓｅ保護アッセイを使用して確認し，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現および所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るためには，必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば，ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり，初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても，より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【０１５８】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用されるすべての参考文献は，それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０１５９】
当業者は，本発明が，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載される方法および組成物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途をなすであろう。
【０１６０】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち，そのような追加の態様は，本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０１６１】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１６２】
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０１６３】
すなわち，追加の態様は本発明の範囲内であり，以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１６４】
他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
【表２】
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【０１６７】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１はホスホルアミダイト法を用いて合成された１またはそれ以上のリボヌクレオチドを含む核酸分子の１ポット脱保護の概略図である。
【図２】図２は不完全Ｎ−フタロイル脱保護生成物の概略図である。
【図３】図３は，エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）データに基づく種々の１ポット脱保護方法の比較を示す。
【図４】図４は，キャピラリーゲル電気泳動データに基づく種々の１ポット脱保護方法の比較を示す。
【図５】図５は，二本鎖ｓｉＮＡ分子の合成のスキームの非限定的例を示す。
【図６】図６は，本発明の方法により合成された精製二本鎖ｓｉＮＡデュープレックスのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【図７】図７は，本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる種々の安定化化学の非限定的例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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