(57)【要約】本発明は、支持体上において、認識分子と標識が付された標的分子の間で、または標的分子と標識が付された検出分子の間のいずれかで、少なくとも1つの生物学の反応を読み取るか、検出するか、定量する方法に関する。本発明方法は、基本的には、認識分子と標識が付された標的分子の分離または標的分子と標識が付された検出分子の分離のいずれか;ならびに、異なる分子間の特定と非特異的な結合を測定するために使用できる前記処理の前およびその処理の後における画像生成を可能とする物理化学的な条件下に支持体を処理することからなる。本発明はまた、発明方法において使用できるバイオチップおよび複合体ならびにそれを含み前記方法を実施するために用いられるバイオチップに関する。本発明は、特に診断の分野で使用するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって
支持体(1)を、互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これらの同一の認識分子(2)を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
官能化された支持体を、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
標識された標的分子をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各標的分子をそれらが特異的に結合している認識分子(2)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、認識分子(2)と特異的に結合していない標識された標的分子(7)を検出するステップと、
認識分子(2)と標的分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項２】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップと、
場合によっては少なくとも1種類の標的分子と複合していてもよい少なくとも同一の生物学的認識分子(2)のグループを含む少なくとも2種類の第1および第2の液体試料の混合物に支持体(1)を接触させ、このもしくはこれらの認識分子(2)または複合体を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
標識された標的分子をこのように結合させた後に前記支持体(1)に第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各標的分子をそれらが特異的に結合している認識分子(2)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、認識分子(2)と特異的に結合していない標識された標的分子(7)を検出するステップと、
認識分子(2)と標的分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項３】
さらに、以下の追加的な後ステップ:
官能化され処理された支持体を、特異的分離後に第2の液体試料または他の液体試料に接触させ、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を再び
それもしくはそれらが分離された生物学的認識分子(2)、および/または
同じ認識ゾーンに由来する他の何らかの認識分子(2)
に結合させるステップと、
標的分子をこのように新たに結合させた後に前記支持体(1)の第3の画像(12)を生成するステップと、
認識分子と標的分子との間の特異的結合を確認するために2つの最初の画像の前の分析結果に関して第3の画像を分析するステップと
を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
支持体(1)を、互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これらの同一の認識分子(2)を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
官能化された支持体を、少なくとも1つの標的生物学的分子(3)を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子(3)を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
官能化され処理された支持体を、少なくとも1つの標識が付された検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子(4)を、認識分子(2)と結合した前記標的分子(3)に結合させるステップと、
標識が付された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項５】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの生物学的標的分子(3)を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子(3)を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
場合によっては少なくとも1種類の標的分子と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子(2)のグループを含む少なくとも2種類の第1および第2の液体試料の混合物に支持体(1)を接触させ、このもしくはこれらの認識分子(2)および/または複合体を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
官能化され処理された支持体を、少なくとも1つの標識が付された検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子(4)を、認識分子(2)と結合した前記標的分子(3)に結合させるステップと、
標識された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項６】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの生物学的標的分子(3)を含む少なくとも第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子(3)を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
2つの第1および第2の液体試料の混合物を、少なくとも1つの標識が付された検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子(4)を、認識分子(2)と結合した前記標的分子(3)に結合させるステップと、
場合によっては少なくとも1種類の標的分子(3)(それ自体(3)、少なくとも1つの検出分子(4)と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子(2)のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子(2)または複合体を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
標識された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項７】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
少なくとも1つの生物学的標的分子(3)を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子(3)を検出分子(4)に結合させるステップと、
少なくとも1つの互いに同一の認識分子(2)のグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料に、2種類の第2および第3の液体試料の混合物を接触させ、このもしくはこれらの認識分子(2)を前記標的分子(3)に結合させ、場合によっては前記検出分子(4)に結合させるステップと、
場合によっては少なくとも1種類の標的分子(3)(それ自体(3)、少なくとも1つの検出分子(4)と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子(2)のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体(1)を接触させ、このもしくはこれらの認識分子(2)または複合体を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
標識された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項８】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
支持体(1)を、互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これら同一の認識分子(2)を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
少なくとも1つの生物学的標的分子(3)を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子(3)を検出分子(4)に結合させるステップと、
少なくとも1つの場合によっては複合していてもよい標的分子(3)を含む少なくとも2種類の第2および第3の液体試料の混合物を検出分子(4)に接触させ、このもしくはこれらの標的分子(3)を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
標識された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項９】
支持体(1)上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
少なくとも1つの生物学的標的分子(3)を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子(4)を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子(3)を検出分子(4)に結合させるステップと、
互いに同一である生物学的認識分子(2)の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの場合によっては検出分子(4)と複合していてもよい標的分子(3)を含む少なくとも2種類の第2および第3の液体試料の混合物に接触させ、このもしくはこれらの標的分子(3)を前記認識分子(2)に結合させるステップと、
場合によっては少なくとも1種類の標的分子(3)(それ自体(3)、少なくとも1つの検出分子(4)と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの互いに同一の生物学的認識分子(2)のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体(1)を接触させ、これらの同一の認識分子(2)を支持体(1)に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップと、
標識された検出分子(4および/または9)をこのように結合させた後に前記支持体(1)の第1の画像(10)を生成するステップと、
支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子(4)をそれ(4)が特異的に結合している標的分子(3)から分離させるステップと、
この分離後に前記支持体(1)の第2の画像(11)を生成し、標的分子(3)と特異的に結合していない標識された検出分子(9)を検出するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップと
からなる方法。
【請求項１０】
さらに以下の追加的な後ステップ:
官能化され処理された支持体を、特異的分離後に第3の液体試料または他の液体試料に接触させ、標識が付された少なくとも1つの検出分子(4)を再び
それもしくはそれらが分離された後の標的分子(3)、および/または
同じ認識ゾーンに由来する1つまたは複数の認識分子(2)に結合する他の何らかの標的分子(3)
に結合させるステップと、
検出分子(4および/または9)をこのように新たに結合させた後に前記支持体(1)の第3の画像(12)を生成するステップと、
標的分子と検出分子との間の特異的結合を確認するために2つの最初の画像の前の分析結果に関して第3の画像を分析するステップと
を含むことを特徴とする請求項4から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
以下の結合ステップ:
場合によっては標識が付された標的分子および/または標識が付けられていない標的分子(3)に結合していてもよい認識分子(2)(ここで、標的分子(3)は検出分子(4)に結合していてもよい)の支持体(1)への結合ステップ、および/または
標識が付された標的分子および/または標識が付けられていない標的分子(3)の認識分子(2)(ここで認識分子それ自体(2)は、予め支持体(1)に結合しており、標的分子(3)は検出分子(4)に結合していてもよい)への結合ステップ、および/または
標識が付されていない標的分子(3)への検出分子(4)の結合ステップ(ここで、標的分子(3)は認識分子(2)に結合し、認識分子(2)自身は支持体(1)に結合している)。
後に少なくとも1回の洗浄ステップを行うことを特徴とする請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
支持体(1)は磁気粒子からなり、方法は、前記磁気粒子(それらは好ましくは適所に置かれる)を磁化するステップを
請求項1から10のいずれかに記載の物理化学的な処理および/または画像生成のいずれかのステップにおいて、および/または
請求項11に記載のいずれかの洗浄ステップの前
において含むことを特徴とする請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
支持体(1)を少なくとも2種類の異なる第1の液体試料(場合によって事前に混合してもよい)に接触させることにより、少なくとも2つの別個の認識ゾーンでの前記支持体(1)への少なくとも2つの異なる認識分子(2)の結合を可能とすることを特徴とする請求項1から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
検出分子(4)は、ナノ粒子などの画像(10、11および/または12)生成を可能にする少なくとも1つのマーカーと直接または間接的に結合した分子からなり、これによって、他の近隣の検出分子(4および/または9)などの存在にもかかわらず個々の視覚化を可能とすることを特徴とする、少なくとも2種の場合によっては異なる標的分子(3)の定量のための、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
標識が付された標的分子の認識分子(2)からの、または検出分子(4)の標的分子(3)からの分離を可能にする物理化学的条件は、融点まで加熱することにより得ることができることを特徴とする請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
標識が付された標的分子、認識分子(2)または標的分子(3)は核酸からなり、または、検出分子(4)は核酸を含むことを特徴とする請求項1から15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標識が付された標的分子、認識分子(2)または標的分子(3)は抗体および/または抗原からなり、または、検出分子(4)は抗体および/または抗原を含むことを特徴とする請求項1から15のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
標的分子または検出分子(4)の標識付与が、
従来の光学顕微鏡、蛍光顕微鏡使用、暗視野顕微鏡または原子力顕微鏡によって視覚化することができる粒子、
原子力顕微鏡使用によって視覚化することができる分子、
例えば、蛍光、ルミネセンスによって検出できる信号を生じる沈殿生成物を伴う酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはグルコース-6-リン酸塩脱水素酵素)、
蛍光性または発光化合物などの発色団、
電子顕微鏡使用によって検出することができる電子的マーカー、
熱レンズ顕微鏡によって可視化できる吸収性分子
によって行われることを特徴とする請求項1から17のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
特異的分離後に官能化され処理された支持体に第2または第3の液体試料のいずれかに代わって接触される別の液体試料は、前記第2または第3の液体試料に含まれるものとは異なるマーカーを含むことを特徴とする、請求項3と6の組合せに記載の方法または請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
請求項4から19のいずれかに記載の方法の実施の際に得られ、認識分子(2)によって支持体(1)に結合され、それ自体は検出分子(4)に結合した標的分子(3)に結合した認識分子(2)からなるハイブリッドまたは複合体であって、検出分子(4)と標的分子(3)の間の結合は、適当な物理化学的条件下、
前記標的分子(3)と認識分子(2)の間の結合、および、
前記認識分子(2)と支持体(1)の間の結合
より解離しやすいことを特徴とするハイブリッドまたは複合体。
【請求項２１】
認識分子(2)、標的分子(3)および検出分子(4)が核酸に基づく場合は、検出分子(4)と標的分子(3)の間の対は、標的分子(3)と認識分子(2)の間よりも対塩基数の合計が少ないか、および/またはより少数のグアニン-シトシン塩基対を含むことを特徴とする請求項20に記載のハイブリッドまたは複合体。
【請求項２２】
少なくとも1つの支持体(1)に請求項20または21に記載の多数のハイブリッドもしくは複合体を結合させてなるバイオチップ(5)。
【請求項２３】
構造的に同一のハイブリッドまたは複合体が一まとめにされて認識ゾーンを形成している請求項22に記載のバイオチップ(5)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体(支持体はペトリ皿、マイクロタイタープレート、バイオチップなどからなるものでもよい)上で実行される化学的または生物学的の反応を読み取る方法、検出する方法および定量する方法に関する。本発明はまた、複数の、すなわち少なくとも2個の分子認識ゾーンを含み、各認識ゾーンが少なくとも1個の認識分子を含む支持体に関する。認識ゾーン当たり少なくとも2個の認識分子がある場合、認識分子は構造上すべて同一である。本発明は、最後に、そのような支持体で使用され得るハイブリッドまたは複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発現バイオチップは、認識特性を有する分子が賦与された多数の認識ゾーン(すなわち、少なくとも100個の認識ゾーン)をその表面に有するチップを意味すると理解される。本願の残りの部分では、用語の誤用によって、チップが化学的または生物学的分析を目的とすることとは無関係にバイオチップという用語を使用する。バイオチップ、より正確にはDNAチップの概念は、1990年代初頭に登場した。最近では、タンパク質チップが開発されているため、この概念は拡張されたものとなっている。バイオチップは、マイクロエレクトロニクス、核酸化学、イメージ分析および計算を組み込んだ学際的技術に基づく。操作原理は分子生物学基礎:ハイブリダイゼーション現象(すなわち、2種のDNAおよび/またはRNA配列塩基相補性による対形成)に基づく。
【０００３】
バイオチップ法は、基本的にはプローブ(遺伝子の一部を表すDNA配列またはオリゴヌクレオチド)を固体の支持体に取り付けて用い、蛍光色素で直接または間接に標識した核酸試料をその上に作用させるものである。
【０００４】
しかし、ペトリ皿、多数の個別ウェルを含むマイクロタイタープレートなど、より慣用的な支持体を用いることも十分に可能である。発現支持体は少数の認識ゾーン、一般には多くても100個の認識ゾーンを含む、分析用表面を意味すると理解される。各認識ゾーンは、認識特性を有する少なくとも1個の分子を含む。
【０００５】
いずれにせよ、プローブ(認識分子とも呼ぶ)を支持体またはチップ上に特異的に配置することで、それぞれのハイブリダイゼーションによってそれが表す各遺伝子についての情報が得られる。この情報は累積的であり、調べようとする組織における遺伝子の有無およびその発現レベルの定量が可能になる。ハイブリダイゼーション後、支持体またはチップを洗浄し、スキャナーで読み込んで蛍光分析をコンピュータによって処理する。
【０００６】
プローブを取り付けるための支持体またはチップは、一般に、以下のような材料から構成された平面または多孔質からなる:
・ガラス(廉価かつ不活性で、機械的に安定した材料);表面は、親水性と疎水性ゾーンを画するテフロン（登録商標）スクリーンで被覆してもよい。
・ポリマー
・シリコン、および
・金属、特に金およびプラチナ。
【０００７】
しかし、本出願人のうち1名による特許出願WO-A-97/34909、WO-A-97/45202、WO-A-98/47000およびWO-A-99/35500に記載されているように、粒子(例えば、磁気粒子)を使用することも可能である。
【０００８】
プローブ(または認識分子)を取り付けるためには、3つの主要なタイプの製造方法が識別可能である。
【０００９】
まず、第1の技術としては、予め合成したプローブを付着させる方法がある。プローブの付着は、直接移行による、マイクロピペット、マイクロチップによる、またはインクジェット方式の装置によって行う。この方法では、少数の塩基(5〜10)から比較的大きな60塩基(インプリンティング)から数百塩基(マイクロデポジッション)のサイズまでの範囲のプローブの付着が可能である。
・インプリンティングはインクジェットプリンターによって使用される方法の応用である。これは、基本的には流体を非常に小さな球体(体積<1nl)とし4000滴/秒のリズムで噴射する。インプリンティングでは、流体を放出するシステムと、流体が付着する表面との間での接触が起こらない。
・マイクロデポジッションは、数十から数百の塩基長のプローブをスライドガラスの表面に付着させることからなる。これらのプローブは、一般にデータベースから抽出され、増幅および精製された製品の形で存在する。この技術によれば、4cm2よりわずかに狭い表面の上に約1万のDNAスポット(認識ゾーンと呼ばれる)を担持したマイクロアレイと呼ばれるチップの製造が可能である。しかし、増幅(一般にはPCRによる)された産物を、直径0.5〜1mm、25スポット/cm2の最大密度で担持する「マイクロアレイ」と呼ばれるナイロン薄膜の使用も忘れてはならない。この高度に柔軟な技術は多くの研究所で使用されている。本発明では、後者の技術はバイオチップの一部をなすものと見なされる。もっとも、本出願人のうち1名による1999年5月20日および1999年12月6日の優先権主張を伴う特許出願WO-A-00/71750および2000年11月17日のFR00/14896の場合のように、マイクロタイタープレートの底部においてある体積の試料を各ウェルに入れることも可能であるし、あるいは、この同一の出願人による2000年11月15日の別の特許出願FR00/14691に従って、同じペトリ皿の底部にある数の液滴を互いに離して置くことも可能である。
【００１０】
支持体またはチップにプローブを付着させるための第2の技術は、インサイチュ合成と呼ばれる。この技術によれば、チップの表面で短いプローブが直接に生産される。これはEdwin Southernによって発明されたオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成に基づき、また、オリゴヌクレオチドシンセサイザー法に基づく。これは、ガラス表面に沿って反応チャンバー(そこでオリゴヌクレオチド伸張反応が起こっている)を移動させることからなる。
【００１１】
最後に、第3の技術はフォトリソグラフィと呼ばれ、Affymetrixによって開発されたバイオチップの起源に当たる方法である。これはまた、インサイチュ合成を含んでいる。フォトリソグラフィはマイクロプロセッサー技術に由来する。チップ表面は、光によって活性化され得る感光性化学基を付着させることによって修飾する。照射を行うと、これらの基は、3'オリゴヌクレオチド末端と反応可能となる。所定形状のマスクでこの表面を保護することによって、4種のヌクレオチドのどれかを取り付けるべきチップ上の領域を選択的に照射ししたがって活性化することができる。異なるマスクを連続的に使用することで、保護/反応サイクルを交互に行い、これにより約数十平方マイクロメートル(μm2)のスポット上にオリゴヌクレオチドプローブを生産することが可能になる。この手法によれば、数平方センチメートル(cm2)の表面の何十万ものスポットを作成することが可能になる。フォトリソグラフィは、平行して大量に実行できるという利点があり、4×NサイクルだけでNマー(mer)のチップを作成することが可能になる。
【００１２】
これらの技術はすべてもちろん本発明と共に使用することができる。
【００１３】
そのような支持体またはバイオチップを使用する方法は基本的に以下の目的のために使用することができる。
・病原体の有無を探索すること(例えば、肉の中の細菌の存在)
・変異の有無を探索すること。遺伝子の分子構造がわかれば、この遺伝子の全体または相補的な部分を表すオリゴヌクレオチドが製造される。生物学的試料の存在下で、前記遺伝子の全体または部分(一般に標識が、例えば蛍光によって付される)とオリゴヌクレオチドとのの間にハイブリダイゼーションが生じ、蛍光により得られたイメージによって、変異が存在するかどうか、また、それがどこに位置しているかを知ることができる。この応用例では、DNAチップの使用は、変異の診断のために配列決定するのと同じであり、速度の点で非常に有利である。
・組織中での遺伝子の発現レベルを測定すること。チップネットワークは、研究対象とする種のすべての遺伝子に相当する非常に多くのプローブを含んでいる。試料、例えば、予め増幅されたmRNA(これは組織で活発な遺伝子を表す)をハイブリダイズする。蛍光分析から、各遺伝子の発現レベルを知ることができる。
【００１４】
このような支持体およびバイオチップの能力を、酵母などのよくわかっている(細胞周期、呼吸代謝、発酵など)生物学的システムを用いて試験した。チップによって得られた結果を以前に他のアプローチによって得られた結果と比較したところ、これらの生物学的システムでの発現が既によく知られている遺伝子との一致を示した。このように、上記作業から、本発明のバイオチップ技術が上に言及した従来の支持体と対比して有効であることが確認できた。
【００１５】
さらに、複数の企業が、ゲノム分析を平行して実行できる新規方法に携わっている。したがって、マイクロビーズ技術は、個別「タグ」またはマーク、より正確には遺伝子情報を担持するミクロスフェアにプローブを取り付けることを可能にする。反応後に、このマークを読み取れば、マイクロビーズを、したがってその表面に存在するプローブを間違いなく識別することができる。ミクロスフェアを、1種または複数以上の蛍光色素で標識が付けられた試験試料と接触させる。次いで、一方ではその「タグ」によって各ビーズを識別し、他方では、有効なハイブリダイゼーション反応を示す蛍光を測定するフローサイトメトリーによって混合物を分析する。
【００１６】
DNAチップは、分子生物学において様々な段階について分析を小型化した形で組み込むことができる新規な手段への道を開いた。この点については、本出願人のうち1名による1999年6月22日付の優先権主張を伴う特許出願WO-A-00/78452および2000年8月28日に出願されたFR00/10978参照。さらに、既に上に示したように、最近、プロテオミクス(ポストゲノムの鍵となる研究分野)によってもたらされた非常に大きな関心事は、タンパク質チップの概念の出現を伴っている。これらはまた、本発明による支持体の一部を形成する。
【００１７】
認識分子は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗体またはペプチドなどのタンパク質、レクチンまたは他のリガンド-レセプタータイプのシステムとすることができる。認識分子は特にDNAまたはRNAの断片を含んでもよい。
【００１８】
分析しようとする試料と支持体を接触させる場合、認識分子は、例えば、核酸が関わる場合はハイブリダイゼーションによる相互作用によって、また、抗原と抗体が関わる場合は複合体の形成によって、液体生物学的試料中の標的分子と相互作用し得るものである。
【００１９】
したがって、バイオチップに、それぞれ標的分子に対して特異的な様々な分子を含む多数の認識ゾーンを設けることにより、試料に含まれている多数の分子を検出し、さらには定量することが可能になる。また、各認識ゾーンが互いに等しい1種類のみの認識分子を含み得ることはもちろん明らかである。
【００２０】
支持体-認識分子の結合体は検出分子によって検出できる。支持体-認識分子-標的分子-検出分子からなる結合体は、サンドイッチフォーマットでの試験を構成する。サンドイッチフォーマットでの試験は、診断において広く使用され、分子診断、例えば、ELOSA試験(酵素結合オリゴ-吸着剤分析)試験、または、例えば、免疫学的診断、例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着剤分析)で広く用いられている。一般に、それらは核酸プローブまたは抗原(抗原サンドイッチの場合)もしくは抗体(抗体サンドイッチの場合)を含み、これらは標的(これはそれぞれ核酸プローブまたは抗体もしくは抗原からなる)を捕捉する働きをする。この認識分子は当業者に知られていた方法で固体の支持体に付着させる。例えば、
・吸着によるか、
・または、直接結合によって、
・または、例えば、アビジンやタンパク質Aなどの仲介タンパク質によって、
・または、ポリマーを介して。
【００２１】
次いで、認識分子および標的分子の結合体を検出分子(これはそれぞれ核酸プローブまたは抗体もしくは抗原からなる)によって検出する。この検出分子はマーカーを担持しているか、この後に結合させてもよい。このマーカーは検出および/または定量を可能にするために必要である。検出分子は、マーカーとまだ結合した状態でも結合していなくとも検出分子と呼ぶことにする。
【００２２】
以下の説明では、「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸が別の核酸に結合することをいい、「複合体形成」という用語は、抗原が抗体に結合することをいう。また、「結合」という用語は、広義におけるものであり、以下のものに同時に関係し得る:
・核酸の別の核酸への核酸の結合
・または、抗体の抗原への核酸の結合
・生物学的分子の支持体への結合。
【００２３】
現在利用可能な試験は、本出願人のうちの1名が開発した免疫学的分析のための試験やAffymetrix社が開発した医療診断用のためのDNAチップなどの試験である(「Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays」、M.Shee et al.、Science、274、610-614、「Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis」、A.Caviani Pease et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1994、91、5022-5026)。この技術では、捕捉用プローブは、一般に20個程度の小さなヌクレオチドである。
【００２４】
ELOSAの分野、つまり核酸検出の分野では、この点に関しては本出願人のうちの特許出願WO-A-91/19812を参照されたい。同様に捕捉用オリゴヌクレオチド(認識分子)、DNAまたはRNAのいずれかである標的核酸(標的分子)および検出オリゴヌクレオチド(検出分子)が定義される。捕捉用オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドは標的の一部に相補的であるが、捕捉用オリゴヌクレオチドと検出オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイゼーションすることがないように、それぞれ構造上および物理的に異なる標的の領域のレベルで相補的である。
【００２５】
分子診断または免疫学的アッセイでは、検出要素がマーカーを有していて、これにより標的の検出および/または定量が可能である。発現標識は、直接または間接的に検出できる信号を生成できるマーカーの付着を意味すると理解される。感度を改善するという永遠の目的のために様々なマーカーが開発されている。それらは、放射性のものでもよいし、酵素や、蛍光性、あるいは最近文献に記載されているように、ナノ粒子の形をしていてもよい。これらのナノ粒子は、特に1ミクロンを遥かに下回るというその大きさにおいてマイクロ粒子とは異なる。それらは、それほど重要でないわけではないので、後により詳細に説明することにする。
・単一のマーカーでイメージイングを実行し得るこれらのマーカーのリスト(ただし、それらに限定されない)については、後述する。
【００２６】
例えば、抗リガンドと反応し得るリガンドなどの間接的システムも使用できる。リガンド/抗リガンド対は、当業者にはよく知られており、例えば以下の対が挙げられる:
・ビオチン/ストレプトアビジン
・ハプテン/抗体
・抗原/抗体
・ペプチド/抗体
・糖/レクチン
・ポリヌクレオチド/そのポリヌクレオチドに相補的なもの
・「タグ」と呼ばれる連続的なヒスチジン配列と金属(例えばニッケル)。
【００２７】
この場合、結合剤を有するのはリガンドである。抗リガンドは、上に記載したマーカーによって直接検出することもできるし、リガンド/抗リガンドによってそれ自体検出できる。
【００２８】
これらの間接的検出システムは、ある条件下では信号増幅をもたらすことができる。この信号増幅技術は当業者にはよく知られており、本出願人のうちの1名による前記特許出願FR98/10084またはWO-A-95/08000あるいは、J.Histochem.Cytochem.45:481-491、1997が言及され得る。
【００２９】
さらに、本出願人は、信号の増幅技術について1999年12月2日付優先権主張(フランス)を伴って特許出願PCT/FR00/03359を共同出願した。もっとも、後者は、マーカーの結合サイトのレベルにおいてマーカーの数を増加させる先行技術文献となるものではなく、支持体の表面で、窒化ケイ素、炭化ケイ素、チタン酸化物、酸化アルミニウム、ZrO2、ZrO4Ti、HfO2、Y2O3、ダイヤモンド、MgO、酸窒化物(SixOyNZ)、フッ素処理された材料、YF3、MgF2から選択される物質に基づく特定の薄層コーティングを使用するものである。これらの2つの技術は併用することもできる。
【００３０】
上述のように、マーカーはナノ粒子の形態を持つものでもよい。ナノ粒子との複合体を用いた最初の実験は1980年に遡る。それらは、放射能の使用や酵素標識の使用(時間だけでなく有毒試薬の使用も必要とする)を回避する超高感度な標識技術を探索することに動機づけられるものであった。それらはそれ以来、広く開発、使用されており、また、マイクロ粒子、ラテックスのナノ粒子またはコロイド金粒子、あるいは蛍光性粒子など、多くのタイプの粒子が開発されている。以下の説明では、「粒子」という用語を、マイクロ粒子またはナノ粒子またはサイズの異なる他の粒子との区別なしで使用する。多くの粒子が現在市販されている(Bangs、Milteny、Molecular Probes、Polyscience、Immunicon)。
【００３１】
ナノ粒子を使用して、標識を付ける実験はJ.H.W.Leuvering,P.J.H.M.Thal,M.Van der Waart and A.H.W.M.Schuurs、Sol Particle Immunoassay(SPIA)、Journal of Immunoassay 1(1):77-91、1980によって免疫学的アッセイの分野で始められた。
【００３２】
ナノ粒子の使用により、免疫学的アッセイの結果を読み取るために原子力顕微鏡の使用などの他の技術へのアクセスを可能にした。この技術によれば、TSH検出モデルにおいて、金ナノ粒子に結合した抗TSH検出抗体複合体を使用してシリコン支持体上にマウントさせたサンドイッチシステムで、1pM程度の感度を得ることが可能になった。この点については、以下の2つの刊行物に言及することができるであろう。
・Agnes Perrin,Alain Theretz,and Bernard Mandrand、Thyroid stimulating hormone assays based on the detection of gold conjugates by scanning force microscopy、Analytical biochemistry 256:200-206、1998、および
・Agnes Perrin,Alain Theretz,Veronique Lanet,S.Vialle,and Bernard Mandrand、Immunomagnetic concentration of antigens and detection based on a scanning force microscopic immunoassay、Journal of immunological methods 8313、1999
【００３３】
核酸の検出のためにナノ粒子を使用する例は、ごく最近になってから見られるものである。これは免疫学の分野で行われてきた仕事を、核酸の分野でその等価物としたものであり、標識付与方法や検出方法に基本的な革新はない。ELISAプレートはもはや存在しないので、それは実際には平板支持体に置き換えられる。次いで、顕微鏡を使用して、「バイオセンサー」技術と呼ばれる表面プラズモン共鳴の増幅によって、またはAFMを使用した測定によってナノ粒子を検出する。全体として、生物学的モデルは単純なモデルのままである。
【００３４】
「Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes」に関するTaton,T.A.,Mirkin C.A.and Letsinger R.L.による論文Science 2000 Sep.8;289(5485):1757-60は、12塩基のプローブに捕捉された27塩基の標的の検出のために15塩基の検出オリゴヌクレオチドに連結した金のナノ粒子の使用を示す。検出信号は銀で標識を付けることによって増幅する。10ナノモル(nM)程度の高濃度では、目視によるピンク色の透過の観察によって粒子の検出を実行する。例えば最低濃度100ピコモル(pM)では、検出には、スキャナを使用する必要がある。達成感度は約50フェムトモル(fM)程度である。著者は、加熱により表面からナノ粒子を解離することができており、これはこの標識の特異性を示しているようである。しかし、出願人の実験によれば、また、検出オリゴヌクレオチド(15塩基)の、標的オリゴヌクレオチド(27塩基)および捕捉用オリゴヌクレオチド(12塩基)のそれぞれのサイズのために、前記ナノ粒子と検出オリゴヌクレオチドの間には解離が必ずあるはずである。この論文は、さらにいくつかの刊行物(1996;1997;1997;2000)ならびにWO-A-98/04740などの特許出願および特許の主題とされた一連の実験に基づく。
【００３５】
これらの研究者は、標的とのミスマッチのない検出分子と結合したナノ粒子と前記標的とのミスマッチのある検出分子と結合したナノ粒子を区別しないナノ粒子の解離を行っている。以下の説明では、「解離」という表現は、特に認識分子と標的分子の分離、および/または標的分子と検出分子の分離を意味すると理解される。この解離が熱によるものである場合、関与する物理的な特性は、DNAまたはRNA分子が変性する温度域に対応する融点(Tm)からなる。より正確には、この温度は、同一のオリゴヌクレオチドの集団が同一量の相補的オリゴヌクレオチドの存在下で、50%が2本鎖構造の形(つまり、対になっている)を取り、50%が1本鎖構造の形を取っている状態に相当する。
【００３６】
ナノ粒子による標識では良好な感度を得ることができるが、一方、特異的信号の増加と非特異的信号の減少の間で妥協しならなければならない。非特異的信号は、もちろん方法の感度およびダイナミクスの改善を限定する。著者らは実験条件の最適化によりこれらの問題を解決する。目安として、何人かの著者(Okano et al.;Anal.Biochem.202:120-125;1992)は、一方で粒子当たり検出オリゴヌクレオチドの濃度を、他方で溶液中の粒子濃度を最適化した。彼らはまた、BSA(ウシ血清アルブミン)を加えることにより非特異性を低減することに成功した。
【００３７】
バイオセンサーで得られた信号を増幅するためのナノ粒子の使用については、Lin He,Michael D.Musick,Scheila R.Nicewaener,Franck G.Salinas,Stephen J.Benkovic,Michael J.Natan,and Christine D.Keating、Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA hybridization.J.Am.Chem.Soc.122:9071-9077、2000の論文が言及される。コロイド金ナノ粒子で結合した検出オリゴヌクレオチド(12塩基)を使用して、小サイズの核酸標的(24mers)の検出を表面プラズモン共鳴によって増幅する。彼らは10pMの感度、つまり、8.108分子/cm2の表面密度を得ており、これは信号強度で100000倍の改善になっている。彼らは、加熱するか制限部位がハイブリダイズされた配列上に存在する場合には制限酵素で消化することにより、表面からナノ粒子を解離させることにより、ハイブリダイゼーション特異性を確認した。この場合、標識付与は信号増幅のために使用され、解離は、標識付与が特異的ハイブリダイゼーションに起因することを示す役目をする。
【００３８】
それはハイブリダイゼーションの立証である。ナノ粒子は加熱により分離されるか(このケースについては、Taton(2000)が記載したシナリオが存在し、マーカーの除去に特異性はない)、制限酵素によって分離される(この場合、ナノ粒子は例えば洗浄により除去されるが、検出分子および/またはハイブリッドの全部または一部は結合したままである)。この分離には配向特性があるが、2本鎖の解離はないか、部分的な解離があるだけである。
【００３９】
ナノ粒子を使用する最先端技術の方法において、Kubitschko S.,Spinke J.,Bruckner T.,Pohl S.and Oranth N.「Sensitivity enhancement of optical immunosensors with nanoparticles.」Anal.Biochem.253(1):112-122は、免疫学的診断において、抗原に関して抗体複合体の解離を喚起する。この解離は、ギ酸によって達成され、マイクロコンポーネントを再生する役目を果たす(このマイクロコンポーネントは、後でマイクロコンポーネントを用いるために抗体を依然として含んでいる)。
【００４０】
それはむしろマイクロコンポーネントの精製方法でもある。その結果、抗原(それはナノ粒子と結合していてもよい)から抗体複合体の解離が起こる場合、事実上の区別はされない。
【００４１】
米国特許第6,093,370号は、DNAチップ上に捕捉されたDNAを回収する目的を有する別の方法を提供する。これは1053ナノメーター(nm)の赤外線(IR)レーザで行う光熱的(photothermal)な解離であり、10と100mWの間の出力で、DNAの回収が望まれるチップ領域を照射するものである。溶液で再解離されたDNAは、PCRによって増幅される。著者らは彼らが169nm2当たり少なくとも1個のDNA分子(つまり10-17mol/1000μm2である)を抽出できることを示している。
【００４２】
しかし、彼らは、他のハイブリダイゼーションから特異的(真に陽性)であるゆえに真のハイブリダイゼーションを測定するために物理化学的な解離を使用していない。
【００４３】
最先端技術では、上に言及した解離技術、すなわち、熱変性(加熱)によるもの、光熱的な変性(IRレーザ)によるもの、消化(制限酵素)によるもの、化学物質(ギ酸)によるものの他にも、核酸を分離する他の方法が存在する。
【００４４】
したがって、標的から検出オリゴヌクレオチドを解離させるためにハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度を変更することができる。実際、オリゴヌクレオチドの融点は、バッファーのイオン強度によって変わる。バッファーのイオン強度が低ければ低いほど、オリゴヌクレオチドは不安定になる。バッファー条件と温度の効果を組み合わせることも可能である。
【００４５】
核酸を捕捉するための従来技術で使用されているPNA(ペプチド核酸)または他の分子も使用可能である。PNA/オリゴヌクレオチドハイブリッドは、イオン強度にかかわらず等しい熱安定性を持っている(つまり、ハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度によってその融点が変わることがない)。捕捉用プローブがPNAで、検出プローブがオリゴヌクレオチドである場合、低イオン強度を使用すると、標的が捕捉用プローブ(PNA)とハイブリダイズしたままの状態で検出プローブが標的から解離してくる。
【００４６】
ある条件下では、DNAの解離を行うために検出プローブを化学的に修飾することが可能である。この解離方法は、ナノ粒子と支持体の表面特性を介して表面と相互作用する粒子には当てはまらない。
【００４７】
また、例えばドライヤーら(Dreyer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.、82:968-972;1985))が記載しているように、オリゴヌクレオチド塩基を修飾することも可能である。EDTAグループをチミジンに結合する。DTT、Fe(II)およびO2存在下で、EDTAを担持するチミジンのレベルでDNAの開裂が生じる。
【００４８】
後でアビジンを結合させるため、検出オリゴヌクレオチドにビオチンを結合することが可能なように、ある条件下で開裂させ得る付加的な化学官能基(例えば、光開裂基あるいはDTTによって還元される基)を含むホモ2官能性またはヘテロ2官能性タイプ(オリゴヌクレオチドおよび支持体への結合に必要な化学的官能基)である化学基を連結することは可能である。光開裂基の場合には、与えられた波長にオリゴヌクレオチドを曝露することで官能基を開裂させ、その支持体からオリゴヌクレオチドを解離させる。
【００４９】
また、別の方法としては、「タグ」と呼ばれる小サイズの知られた配列(これはナノ粒子上に存在するキレート形成基と金属イオンを介してキレート化合物を形成する特性を有する)を加えることもできる。タグはヒスチジンタグまたは従来技術に記載されている他の分子でもよい。キレート形成基はNTA(ニトリロ三酢酸)または従来技術に記載されている他の基でもよい。解離は、タグ-金属キレート形成基相互作用(例えば、EDTAを使用する)の解離について従来技術によって記載されている方法を使用して行う。
【００５０】
ナノ粒子上で、同一の配列を有するオリゴヌクレオチドによって検出プローブを置換することにより解離を行うこともできる。これらのオリゴヌクレオチドは標的に相補的な付加的配列より短い配列または同じ配列のいずれを有するものでもよい。また、競争によって、この置換のために核酸アナログ、例えばPNA(ペプチド核酸)または中性骨格という利点を有する他のアナログを使用することが可能である。
【００５１】
抗原および/または抗体などのタンパク質分子の解離については、抗原と抗体間の相互作用の分離について従来技術に記載された方法(親和性クロマトグラフィーの分野で知られている多数の技術)のうちのいずれを適用することも可能である。したがって、例として挙げれば、酸性pHでグリシンバッファーのような酸性溶液または5M LiCl(Kubitschko et al.、Anal.Biochem.253(1):112-122;1997)のような高イオン強度を有する溶液を用いることにより解離を実行することが可能である。塩化グアニジウム、尿素、あるいは界面活性剤を含む溶液などの変性剤を使用するか;または、抗原または抗体に特異的なまたは抗原または抗体には非特異的なプロテアーゼもしくはエンドプロテアーゼを用いてタンパク質を消化する方法を使用することも可能である。
【００５２】
2重標識付与の場合、第2の標識の付与を可能にするためには、解離は、タンパク質を変性させず有向的なものでなければならない。これは、例えば、合成ペプチド(その配列はモノクローナル抗体のエピトープ配列に相当するがより高い親和性を有する)を使用した置換によって行うことができる。
【００５３】
また、ある条件下での解離を実行するために化学的にまたは遺伝子工学技術により、抗原および抗体によって修飾することも可能である。しかし、これらの方法は、非特異的に表面と直接相互作用するタンパク質分子には当てはまらない。もっとも、こうした修飾は、例えば、遺伝子工学によって、エンドプロテアーゼによる開裂のための配列を挿入することにより、タンパク質(抗原または抗体)のうちの1つに適用できるようになる。酵素の存在下で検出されるタンパク質の開裂がある。第2標識の付与は、残りのタンパク質配列に特異的なもう1つのモノクローナル抗体を使用して行う。修飾は、例えば遺伝子工学によってタグを加えることによりタンパク質末端に適用できる。このタグはモノクローナル抗体によって認識することができ、次いで、競合ペプチドまたは抗体を使用して置換することによって解離を行う。参考のために言えば、加えるタグは「ポリヒスチジン」配列でもよいが、エンドプロテアーゼによって開裂させるための配列中に存在しない配列を含むものであればよく、次いで、酵素的開裂によって解離を行う。タンパク質「継手」配列のような他の配列をタンパク質に組み込んでもよい。開裂は、例えば、DTTの存在下で行う。
【００５４】
最後に、検出タンパク質に核酸配列を加えることも可能である。これにより、上記のように、それ自体がナノ粒子に結合した核酸プローブによって認識可能なタグを得る。次いで、核酸について述べた技術のうちの1つによって、解離を、有向的な場合もそうでない場合も(ただし、有向的な解離の場合は、タンパク質結合体が変性されない限りにおいて)行うことができる。競争法はこの点から見て有利である。
【００５５】
上に述べたこれらの要素はすべて、本発明の実行を改善するために本発明に組み入れることができる。
【００５６】
出願人のうち1名による特許出願WO-A-99/65926によれば、核酸の場合に固有な検出分子を省くことも可能である。各標的は化学的に酵素的にまたは物理的に開裂することができ、同時に標識を付与してもよいしそうでなくてもよい。この場合、標識が標的分子に付けられるので、検出分子はもはや存在しなくてもよい(特に特許出願PCT/FR99/03192参照)。
【００５７】
標識が付されたまたは付与されていない分子(それはチップの認識ゾーン内に存在し得る)を読むための装置が存在する。
【００５８】
認識ゾーンの読み取りは、実際には、マーカー(従来技術で既に知られているような技術)の存在なし行うことができる。出願人は、実際にそのような読み取り技術(これは光熱的な方法を使用する)について1999年9月30日(フランス)の優先権主張を伴う特許出願PCT/FR00/02703として共同出願した。
【００５９】
ハイブリダイゼーションの検出のための直接法の中では、特に質量における変化、厚さにおける変化、およびインデックスにおける変化の検出を識別することが可能である。光熱的な方法は、化学分析:分析およびその応用についてのモノグラフシリーズの「化学分析のための光熱的分光分析法」と題する刊行物(S.E.Bialkowski、vol.137、「Photothermal spectrocopy methods for chemical analysis」、Wiley)にも記載されて知られている。最後に、米国特許第4,299,494号は、光熱的な偏差(photothermal deflection)についての技術について記載する。
【００６０】
したがって、本発明は、生物学的分析および化学分析の分野に利用できる。
【００６１】
一般に、上に述べた分子的および免疫学的診断の読み取りの主な欠点は、擬陽性(つまり、ハイブリダイゼーションまたは複合体形成をしてはならない場合にハイブリッドまたは複合体が形成される)および/または擬陰性(つまり、ハイブリダイゼーションまたは複合体形成をすべき場合にハイブリッドまたは複合体が形成されない)によって制限されているという点である。この擬陽性または擬陰性の存在は別の欠点(それは上に言及した第1の欠点の結果である)を引き起こす。すなわち、分子的または免疫学的診断が感度(試験される生物学的試料中に探そうとしているハイブリッドまたは複合体が少量しか存在しない場合にハイブリッドまたは複合体を識別する能力)および/または特異性(試験される生物学的試料中が他のハイブリッドまたは複合体を含んでいる場合に探そうとしているハイブリッドまたは複合体を検出する能力)を欠くという点である。これは、患者、医療関係者およびそのような試験を行う会社にとって許容できない診断の誤りを引き起こすおそれがある。
【特許文献１】
WO-A-97/34909
【特許文献２】
WO-A-97/45202
【特許文献３】
WO-A-98/47000
【特許文献４】
WO-A-99/35500
【特許文献５】
WO-A-00/71750
【特許文献６】
FR00/14896
【特許文献７】
FR00/14691
【特許文献８】
WO-A-00/78452
【特許文献９】
FR00/10978
【非特許文献１】
「Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays」、M.Shee et al.、Science、274、610-614、
【非特許文献２】
「Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA sequence analysis」、A.Caviani Pease et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1994、91、5022-5026
【特許文献１０】
FR98/10084
【特許文献１１】
WO-A-95/08000、J.Histochem.Cytochem.45:481-491、1997
【特許文献１２】
PCT/FR00/03359
【非特許文献３】
J.H.W.Leuvering,P.J.H.M.Thal,M.Van der Waart and A.H.W.M.Schuurs、Sol Particle Immunoassay(SPIA)、Journal of Immunoassay 1(1):77-91、1980
【非特許文献４】
Agnes Perrin,Alain Theretz,and Bernard Mandrand:Thyroid stimulating hormone assays based on the detection of gold conjugates by scanning force microscopy、Analytical biochemistry 256:200-206、1998
【非特許文献５】
Agnes Perrin,Alain Theretz,Veronique Lanet,S.Vialle,and Bernard Mandrand:Immunomagnetic concentration of antigens and detection based on a scanning force microscopic immunoassay、Journal of immunological methods 8313、1999
【非特許文献６】
Taton,T.A.,Mirkin C.A.and Letsinger R.L.:「Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes」Science 2000 Sep.8;289(5485):1757-60
【特許文献１３】
WO-A-98/04740
【非特許文献７】
Okano et al.;Anal.Biochem.202:120-125;1992
【非特許文献８】
Lin He,Michael D.Musick,Scheila R.Nicewaener,Franck G.Salinas,Stephen J.Benkovic,Michael J.Natan,and Christine D.Keating、Colloidal Au-enhanced surface plasmon resonance for ultrasensitive detection of DNA hybridization.J.Am.Chem.Soc.122:9071-9077、2000
【非特許文献９】
Kubitschko S.,Spinke J.,Bruckner T.,Pohl S.and Oranth N.「Sensitivity enhancement of optical immunosensors with nanoparticles.」Anal.Biochem.253(1):112-122、1997
【特許文献１４】
米国特許第6,093,370号
【非特許文献１０】
Dreyer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.、82:968-972;1985
【特許文献１５】
WO-A-99/65926
【特許文献１６】
PCT/FR99/03192
【特許文献１７】
PCT/FR00/02703
【非特許文献１１】
S.E.Bialkowski、vol.137、「Photothermal spectrocopy methods for chemical analysis」、Wiley
【特許文献１８】
米国特許第4,299,494号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００６２】
本発明は、擬陽性の存在によって影響を受けず、したがって、診断の試験の感度および特異性を非常に著しく改善する読み取り方法の提供により上に言及した先行技術の問題点をすべて解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００６３】
このため、本発明は、その第1の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・支持体を、互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これらの認識分子を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・官能化された支持体を、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・標識された標的分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各標的分子をそれらが特異的に結合する認識分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・認識分子と標的分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００６４】
本発明は、その第2の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・場合によっては少なくとも1種類の標的分子と複合していてもよい少なくとも生物学的認識分子のグループを含む少なくとも2種類の第1および第2の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子または複合体を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・標識された標的分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各標的分子をそれらが特異的に結合する認識分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・認識分子と標的分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００６５】
これら2つのケースでは、方法はさらに以下の追加的な後ステップを含んでもよい。すなわち、
・官能化され処理された支持体を、特異的分離後に第2の液体試料または他の液体試料に接触させ、標識が付された少なくとも1つの標的生物学的分子を再び
■それもしくはそれらが分離された後の生物学的認識分子、および/または
■同じ認識ゾーンに由来する他の何らかの認識分子、
に結合させるステップ、
・標的分子をこのように新たに結合させた後に前記支持体の第3の画像を生成するステップ、
・認識分子と標的分子との間の特異的結合を確認するために2つの最初の画像の前の分析結果に関して第3の画像を分析するステップ。
【００６６】
本発明は、その第3の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・支持体を、互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これらの同一の認識分子を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・官能化された支持体を、少なくとも1つの標的生物学的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・官能化され処理された支持体を、少なくとも1つの標識が付された検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子を、認識分子と結合した前記標的分子に結合させるステップ、
・標識が付された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれらが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００６７】
本発明は、その第4の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの生物学的標的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・場合によっては少なくとも1種類の標的分子と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子のグループを含む少なくとも2種類の第1および第2の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子および/または複合体を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・官能化され処理された支持体を、少なくとも1つの標識が付された検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子を、認識分子と結合した前記標的分子に結合させるステップ、
・標識された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００６８】
本発明は、その第5の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの生物学的標的分子を含む少なくとも第2の液体試料と接触させて、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・2つの第1および第2の液体試料を、少なくとも1つの標識が付された検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの検出分子を、認識分子と結合した前記標的分子に結合させるステップ、
・場合によっては少なくとも1種類の標的分子(それ自体、少なくとも1つの検出分子と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子または複合体を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・標識された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００６９】
本発明は、その第6の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・少なくとも1つの生物学的標的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子を検出分子に結合させるステップ、
・少なくとも1つの互いに同一の認識分子のグループを含む少なくとも2種類の第2および第3の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子を前記標的分子に結合させ、場合によっては前記検出分子に結合させるステップ、
・場合によっては少なくとも1種類の標的分子(それ自体、少なくとも1つの検出分子と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体を接触させ、このもしくはこれらの認識分子または複合体を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・標識された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００７０】
本発明は、その第7の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・支持体を、互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料と接触させて、これら同一の認識分子を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・少なくとも1つの生物学的標的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子を検出分子に結合させるステップ、
・少なくとも1つの場合によっては複合していてもよい標的分子を含む少なくとも2種類の第2および第3の液体試料の混合物を検出分子に接触させ、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・標識された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００７１】
本発明は、その第8の実施形態によれば、支持体上の少なくとも1つの生物学的反応を読み取る方法であって、
・少なくとも1つの生物学的標的分子を含む少なくとも1つの第2の液体試料を、少なくとも1つの生物学的検出分子を含む少なくとも1つの第3の液体試料と接触させ、このもしくはこれらの標的分子を検出分子に結合させるステップ、
・互いに同一である生物学的認識分子の少なくとも1つのグループを含む少なくとも1つの第1の液体試料を、少なくとも1つの場合によっては検出分子と複合していてもよい標的分子を含む少なくとも2種類の第2および第3の液体試料の混合物に接触させ、このもしくはこれらの標的分子を前記認識分子に結合させるステップ、
・場合によっては少なくとも1種類の標的分子(それ自体、少なくとも1つの検出分子と複合していてもよい)と複合していてもよい少なくとも1つの同一の生物学的認識分子のグループを含む少なくとも3種類の第1、第2および第3の液体試料の混合物に支持体を接触させ、これらの同一の認識分子を支持体に、好ましくは、認識ゾーンのレベルで結合させるステップ、
・標識された検出分子をこのように結合させた後に前記支持体の第1の画像を生成するステップ、
・支持体を物理化学的な条件下に処理して、各検出分子をそれが特異的に結合する標的分子から分離させるステップ、
・この分離後に前記支持体の第2の画像を生成するステップ、および
・標的分子と検出分子との間の特異的結合を測定するために2つの画像を分析するステップ
からなる方法に関する。
【００７２】
これら5つのケースでは、方法はさらに以下の追加的な後ステップを含んでもよい。すなわち、
・官能化され処理された支持体を、特異的分離後に第3の液体試料または他の液体試料に接触させ、標識が付された少なくとも1つの検出分子を再び
■それもしくはそれらが分離された後の標的分子、および/または
■同じ認識ゾーンに由来する1つまたは複数の認識分子(2)に結合する他の何らかの標的分子(3)、
に結合させるステップ、
・検出分子をこのように新たに結合させた後に前記支持体の第3の画像を生成するステップ、
・検出分子と検出分子との間の特異的結合を確認するために2つの最初の画像の前の分析結果に関して第3の画像を分析するステップ。
【００７３】
本発明の第1の変形実施形態によれば、以下の結合ステップ後に少なくとも1回の洗浄ステップを行う。
・場合によっては標識が付された標的分子および/または標識が付けられていない標的分子に結合していてもよい認識分子(ここで、標的分子は検出分子に結合していてもよい)の支持体への結合ステップ、
・標識が付された標的分子および/または標識が付けられていない標的分子の認識分子(ここで認識分子それ自体は、予め支持体に結合しており、標的分子は検出分子に結合していてもよい)への結合ステップ、および/または
・標識が付されていない標的分子への検出分子の結合ステップ(ここで、標的分子は認識分子に結合し、認識分子自身は支持体に結合している)。
【００７４】
本発明の第2の変形実施形態によれば、支持体は磁気粒子からなり、方法は、前記磁気粒子(それらは好ましくは適所に置かれる)を磁化するステップを以下の時点で含む。
・上記の物理化学的な処理および/または画像生成のいずれかのステップにおいて、および/または
・上記のいずれかの洗浄ステップの前。
【００７５】
本発明の第3の変形実施形態によれば、支持体を少なくとも2種類の異なる第1の液体試料(場合によって事前に混合してもよい)に接触させることにより、少なくとも2つの別個の認識ゾーンでの前記支持体への少なくとも2つの異なる認識分子の結合が可能になる。
【００７６】
上記変形にかかわらず、少なくとも2種の場合によっては異なる標的分子の定量が望まれる場合、検出分子は、ナノ粒子などの画像生成を可能にする少なくとも1つのマーカーと直接または間接的に結合した分子からなり、これによって、他の近隣の検出分子などの存在にもかかわらず個々の視覚化が可能になる。
【００７７】
すべての場合に、標識が付された標的分子の認識分子からの、または検出分子の標的分子からの分離を可能にする物理化学的条件は、融点まで加熱することにより得ることができる。
【００７８】
好ましい実施形態によれば、標識が付された標的分子、認識分子または標的分子は核酸からなり、または、検出分子は核酸を含む。
【００７９】
別の好ましい実施形態によれば、標識が付された標的分子、認識分子または標的分子は抗体および/または抗原からなり、または、検出分子は抗体および/または抗原を含む。
【００８０】
いずれにしても、標的分子または検出分子の標識付与は次のものによって行うことができる。
・従来の光学顕微鏡、蛍光顕微鏡使用、暗視野顕微鏡または原子力顕微鏡によって視覚化することができる粒子、
・原子力顕微鏡使用によって視覚化することができる分子、
・例えば、蛍光、ルミネセンスによって検出できる信号を生じる沈殿生成物を伴う酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはグルコース-6-リン酸塩脱水素酵素)、
・蛍光性または発光化合物などの発色団、
・電子顕微鏡使用によって検出することができる電子的マーカー、
・熱レンズ顕微鏡によって可視化できる吸収性分子。
【００８１】
支持体の3つの連続する画像を生成する場合、特異的分離後に官能化され処理された支持体に第2または第3の液体試料のいずれかに代わって接触される別の液体試料は、前記第2または第3の液体試料に含まれるものとは異なるマーカーを含む。
【００８２】
本発明はまた、上に開示した方法の実施の際に得られ、認識分子によって支持体に結合され、それ自体は検出分子に結合した標的分子に結合した認識分子からなるハイブリッドまたは複合体に関する。この場合、検出分子と標的分子の間の結合は、適当な物理化学的条件下、前記標的分子と認識分子の間の結合より解離しやすく、かつ、標的分子と認識分子の間の結合は、適当な物理化学的条件下、前記認識分子と支持体の間の結合より解離しやすい。
【００８３】
この場合、認識分子、標的分子および検出分子が核酸に基づくときは、検出分子と標的分子の間の対は、標的分子と認識分子の間よりも対塩基数の合計が少ないか、および/またはより少数のグアニン-シトシン塩基対を含む。好ましくは、検出分子と標的分子の間の対塩基数の合計は、5と50の間、好ましくは10と25の間、さらに好ましくは12と20の間であり、標的分子と認識分子の間の対塩基数の合計は、10と100の間、好ましくは15と50の間、より好ましくは20と30の間である。さらに、検出分子と標的分子の間の結合に関与するグアニン-シトシン塩基対の割合は、50%以下、好ましくは45%以下であり、標的分子と認識分子の間の結合に関与するグアニン-シトシン塩基対の割合は、50%以上、好ましくは55%以上である。
【００８４】
本発明は最後に、上記のような少なくとも1つの支持体に結合した、上記のような複数のハイブリッドまたは複合体からなるバイオチップに関する。
【００８５】
このバイオチップ上では、構造上同一のハイブリッドまたは複合体が一まとめにされて認識ゾーンを形成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
添付図面および以下の説明は例示として挙げるものであって、本発明を限定するものではない。それらによって、本発明をより理解することが可能になるであろう。
【００８７】
以下の例により、さらに本発明を理解することが可能になるであろう。
【実施例１】
【００８８】
磁気ナノ粒子と結合した検出分子の標的分子からの特異的解離
このモデルは、HIV配列に選択され、以下のものからなる。
・認識分子2、支持体1に結合するように5'でビオチン化された配列番号1:
5'-TCACTATTAT CTTGTATTAC TACTGCCCCT TCACCTTTCC AGAGGAGCTT
TGCTGGTCCT TTCCAAAGTG-3'
(長さ:70ヌクレオチド)に対応するもの、
・標的分子3、配列番号2:
【００８９】
【化１】
2005502366.tif 000002
【００９０】
(長さ:514ヌクレオチド)に対応するもの、および
・検出分子4、3'端でビオチン化された配列番号3:5'-TTCTGAACTT ATTCTT-3'(長さ:16ヌクレオチド)に対応するもの、およびマーカー。
【００９１】
配列番号2では、配列の一部を太字および下線で強調してあるが、この部分は認識分子2の配列番号1に相補的な配列に相当する。配列の別の部分は下線だけで強調してあるが、この部分は、検出分子4の配列番号3に相補的な配列に相当する。
【００９２】
第1ステップ:支持体上への認識分子の固定
使用した支持体1は、1%AMPMES(アミノ-プロピル-ジメチル-エトキシシラン)で前もってシラン化した、18mm×18mmフォーマットのコーニングスライドガラス(参照番号0211)である。
【００９３】
この支持体1上に、ニュートラビジン(Neutravidinビオチン結合タンパク質、Pierce参照番号31000AH)を、PBS(リン酸塩バッファー食塩水)中1mg/mlの濃度でPDC(フェニレンジイソシアネート)によって2μ1(直径にして2mm)で堆積物の形でグラフト化する。この予備ステップは図には示していないが、これにより、前記認識分子2のビオチン化末端を前記支持体1上の存在するニュートラビジンに固定することによって、後に認識分子2を支持体1に結合することができる。
【００９４】
1%アンモニア水、1M NaCl、1%BSA(ウシ血清アルブミン)の溶液で洗浄し、この同じバッファー中で10分間インキュベートした後に、支持体1を、水で、次いでTEバッファー(10mMトリス、pH8、1mM EDTA)、1M NaClで洗浄して、結合していないニュートラビジンを除去する。
【００９５】
次いで、ニュートラビジンを結合させた支持体1を、TEの1M NaClの溶液(濃度5μM)中、認識分子2の存在下、室温で20分間インキュベートする。支持体1を、1%アンモニア水、1M NaCl、1%BSA溶液中10分間インキュベートすることにより洗浄する。次いで、この支持体1をこの同じ溶液に20分間浸漬して認識ゾーン全体を飽和させ、水で、次いでTEで洗浄して、ニュートラビジン未結合の認識分子2の除去を促進する。
【００９６】
図1によれば、支持体1は標的分子3を受け取るために既に官能化されているので、ビオチン化された5'端による支持体1への認識分子2の結合ステップは図中に表していない。
【００９７】
第2ステップ:認識分子への標的分子のハイブリダイゼーション
認識分子2の固定後、支持体をTE 1M NaCl、0.05%トライトンX100中35℃で一夜インキュベート(それは図1に相当する)することにより、分子2の標的分子3とのハイブリダイゼーションを行う。この場合、70の相補的な塩基対がハイブリダイズされる。
【００９８】
次いで、支持体1を取り出し、図2に示すようにして室温で15分間この同じバッファーの中で洗浄する。これにより、ハイブリダイズされない標的分子6を除去できる。
【００９９】
本発明の1つの変形によれば、認識分子2を予め標的分子3とハイブリダイズしておき、次いで混合物を支持体1と直接に接触させてもよいことに注意すべきである。
【０１００】
第3ステップ:検出分子を合成するためにオリゴヌクレオチドにナノ粒子で標識を付与すること
認識分子2でハイブリダイズされた標識分子3を検出するために、標識は、検出分子4を予め磁気ナノ粒子Immunicon(ハンティンドンヴァリー(アメリカ)参照番号:F3106)で標識しておく。これらのナノ粒子は145nmの直径を有し、ストレプトアビジンで官能化する。一般に6000〜20000個のストレプトアビジン分子を1個のナノ粒子に結合させる。1個のストレプトアビジンには4個のビオチンの結合が可能である。これらのナノ粒子を109粒子/mlの濃度で、4℃で1M NaCl、0.14mg/m1サケDNA、0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、一夜インキュベートする。オリゴヌクレオチドは、検出分子4の基礎を形成し、その一端でビオチン化され、次いで、ナノ粒子当たり1000個の検出オリゴヌクレオチドの割合で、ナノ粒子溶液に加え、35℃で30分間インキュベートする。ナノ粒子と結合した各検出オリゴヌクレオチドは検出分子4を構成する。
【０１０１】
第4ステップ:標的分子による検出分子の第1ハイブリダイゼーション
図3に表す各ステップは、認識分子2とハイブリダイズされた標的分子3を検出分子4に接触させるものである。このために、支持体1(その上には認識分子2とハイブリダイズした標的分子3が結合されている)を、室温で1時間109ナノ粒子/mlの割合で前記ステップによって調製した検出分子4の1ml溶液と共にインキュベートする。ハイブリダイゼーションは16個の相補的な塩基対上で実行する。
【０１０２】
次いで、支持体1を、1M NaCl、0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、室温で15分間洗浄し、図4に示すように、標的分子3でハイブリダイズされない検出分子の除去を促進する。
【０１０３】
本発明の1つの変形によれば、検出分子4を標的分子3で予めハイブリダイズし、次いで混合物を、認識分子2が結合された支持体1に直接接触させてもよく有利である。
【０１０４】
第5ステップ:第1の画像の生成
第1の画像10を、非蛍光性の小サイズナノ粒子を可視化できる暗視野顕微鏡(暗視野レンズによる。倍率20倍)を使用して生成する(これは図5に相当する)。
【０１０５】
第6のステップ:標的分子および検出分子の熱による解離
この解離ステップは図6に示す。検出分子4は、51℃の融点を有し、認識分子2は、90.5℃の融点(測定値)を有した。60℃の温度は、検出分子4の融点より高く標的分子3の融点より低いため、検出分子4と認識分子2間の解離が可能となる。したがって、検出分子4の解離は、60℃で0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、支持体1を1時間処理することにより行える。いくつかの検出分子4は表面に残るが、これらの残ったものは表面に特異的に吸着されない検出分子に相当する。
【０１０６】
この解離も1mM EDTA、0.05%トライトンX100を含む濃度100mMのリン酸ナトリウムバッファー(pH5.5)中で支持体1を60℃、1時間インキュベートすることにより得られる。解離は、ハイブリダイゼーションに用いるバッファー(100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH5.5)、1M NaCl、1mM EDTA、0.05%トライトンX100、または100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH5.5)、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.05%トライトンX100)の性質によらない。必要な条件は、低イオン強度の使用であり、無塩バッファー中でも60℃、1時間の加熱である。
【０１０７】
第7ステップ:第2画像の生成
暗視野顕微鏡使用によって第2画像11を生成する。これによれば、標的分子と予めハイブリダイズ検出分子4(これは真陽性を構成する)の大半が消失したことが観察できる。それは図7で表されるものである。
【０１０８】
この第2画像11は、表面で吸着されただけか、適切に(つまり、ミスマッチなしに)標的分子3にハイブリダイズされなかった検出分子4(それらは擬陽性を構成する)を検出することをこのように可能にする。
【０１０９】
したがって、第2画像11からの第1画像10上で存在する検出スポットを差し引くことによって、真の陽性と擬陽性の存在を識別することが可能である。
【０１１０】
第8ステップ:検出分子の標的分子との第2のハイブリダイゼーション
これまでに述べてきたステップによる結果をさらに洗練するため、上記第4ステップに記載した第1のハイブリダイゼーションと同一の条件下、支持体1を検出分子4と共に再度インキュベートし、既に認識分子2、検出分子4とハイブリダイズしている標的分子3の標識付与を再構成する。それは図8の中で実際に表されるものである。
【０１１１】
次いで、支持体1を、1M NaCl、0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、15分室温で洗浄する(これは図9に相当する)。
【０１１２】
第9ステップ:第3画像の生成
この第3の画像12によれば、第7ステップで行った真の陽性と擬陽性の間の区別を洗練できる。さらに、検出分子4は標的分子3に特異的なので、図10中に表されるように、この第3の画像12によれば、前記標的分子3が前記認識分子2上でまだ存在するかを確認できる(第1の画像と同じ検出信号の強度が得られるため)。したがって、標的分子3は、60℃でトライトンX100を含むTEによる処理において認識分子2から解離されず、解離は有向的になる。
【０１１３】
また、図11に対応する最終ステップを行うことが可能である。ここでは、コンピュータ手段が認識分子2-標的分子3ハイブリッドとハイブリダイズした検出分子4に実際に対応する検出スポット18を正確に定義するために得られた3つの画像10、11および12を処理することができる。
【実施例２】
【０１１４】
蛍光性のナノ粒子と結合した検出分子の標的分子からの有向的解離
この例は、実施例1に記載した生物学的モデルを使用する。
【０１１５】
実施例1に記載した最初の2ステップ(それは、支持体1上に認識分子2を固定することおよび認識分子2への標的分子3のハイブリダイゼーションにそれぞれ対応する)を、この例におけるのと同様の方法で実行する。
【０１１６】
一方、第3のステップ(これは検出分子への標識付与に相当する)は、実施例1では検出分子4に標識を付けるためにナノ粒子を使用したが、これとは異なり、ニュートラビジンで既に官能化された直径100nmの分子プローブ(Eugene OR US;参照番号T8860)として供給される蛍光性のナノ粒子である。したがって、得られた検出分子4は、Microcon YM30(Amicon MILLIPORE;参照番号42409)で精製する。
【０１１７】
実施例1の第4ステップに記載するように、検出分子4の標的分子との第1のハイブリダイゼーションを実行する。
【０１１８】
検出スポットの計数は図5による蛍光顕微鏡使用によって得られる第1の画像10によって行われる。
【０１１９】
図7に示すように、解離ステップは60℃で1時間0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中で行い、上記実施例1の第6のステップに述べたとおりである。
【０１２０】
第2画像11は蛍光顕微鏡使用によって生成される。第1の画像中で得られた蛍光強度を第2の画像で得られた蛍光強度から差し引くことによって、擬陽性の存在により蛍光強度をそこから推定することが可能である。実施例1に記載する同様な方法では、検出分子4の標的分子3との第2のハイブリダイゼーションの後に第3の画像12を得ることによって、第1の画像10に検出されたそれに匹敵する蛍光強度が実際に得られるかをチェックして解離が実際に有向的であることを再度実証できる。
【０１２１】
したがって、解離は異なる性質のナノ粒子で標識が付された検出分子4を用いて行うことができる。
【実施例３】
【０１２２】
ナノ粒子と結合した2つのオリゴヌクレオチド間でハイブリダイズした標的分子の有向的解離
この実施例で使用する認識分子2、標的分子3および検出分子4の配列は、実施例lに記載するものと同一である。
【０１２３】
この実施例において、本発明は、以下のものと標的分子3を組み合わせる2重ハイブリッドで使用する。
・認識分子2(それ自体2は磁気粒子と結合している)、
・蛍光性ナノ粒子で標識が付された検出分子4。
【０１２４】
磁気粒子の使用(それはここではマーカーとして機能しない)は、単なる磁化によって単純な精製プロトコルを使用でき、また、蛍光性の粒子を使用すれば、生成したハイブリッドを検出し計数する敏感な方法として蛍光を使用できる。
【０１２５】
したがって、検出分子4を、蛍光性のナノ粒子(分子プローブニュートラビジン;直径100nm;濃度109p/ml)と組み合わせる一方、認識分子2を、磁気粒子(Immuniconストレプトアビジン;Huntingdon Valley(アメリカ);整理番号F3106;直径145nm;濃度109p/m1)と組み合わせる。
【０１２６】
第1段階では、標的分子3を蛍光性の検出分子4とハイブリダイズする。標的分子3(濃度:106p/μl)を1M NaClおよび0.05%トライトン(最終ボリューム:20μ1)を含むTEバッファー中、検出分子4(濃度:1nM)と室温で4時間インキュベートする。
【０１２７】
第2段階では、検出分子4とハイブリダイズした標的分子3を、磁気粒子と結合した認識分子2と室温で1時間インキュベートする。したがって、標的分子3は、磁化可能な認識分子2と蛍光性の検出分子4の間にサンドイッチされる。
【０１２８】
第3段階では、2重ハイブリッドを、エピフルオレッセンス(epifluorescence)照明または暗視野照明を備えた顕微鏡で観察する。顕微鏡のプレートの下に永久磁石を備えた装置は、300ガウスの磁界を適用できる。この磁界の作用の下では、磁気粒子が棒状に集まり、その中には蛍光性の粒子が含まれているかもしれない。しかし、試験のこの段階では、これらの複合体が標的分子を組み込んだものか否かは結論できない。
【０１２９】
第4段階では、有向解離段階でこの不確実性が除去される。このために、粒子を懸濁させるためのバッファーを、磁場制限下、0.05%トライトンX100を含む低イオン強度TEバッファーと取り替え、粒子を70℃で30分間加熱する。
【０１３０】
その直後、磁気洗浄を行う。得られた懸濁液を、依然として300ガウスの磁界の下、顕微鏡で検討する。したがって、イオン強度および温度の組合せで、標的分子3の検出分子4からの分離を可能にした。解離レベルは、2つのタイプのナノ粒子の官能基の正確な性質、およびDNA分子の長さおよび配列、ならびにバッファーの組成に依存する。
【０１３１】
蛍光性の粒子と磁気粒子間、より正確に言えば、標的分子3と検出分子4の間の有向的解離を適用するこの態様は、他のタイプの非磁性または非蛍光性粒子とも、あるいは官能基が異なる粒子や異なるサイズの粒子とも行うことができる。
【実施例４】
【０１３２】
標識が付された標的分子の認識分子からの有向的解離
この実施例の主要な特徴は、認識分子と標的分子の間のハイブリダイゼーションの検出を検出分子に頼らずに、標識が付された標的分子を直接使用することである。モデルは次のものからなる。
・認識分子(その配列は実施例1に記載したものと同一である)、
・標的分子(その配列は実施例1に記載したものと同一であり、特許出願PCT/FR99/03192に記載されたプロトコルによって予め断片化され標識化されている)。
【０１３３】
この方法を使用すると、3'端で蛍光性マーカーによって標識を付された約50個のヌクレオチドの断片が得られる。これらの断片のうちの1つ(検出断片と呼ぶ)は、実施例1に記載するのと同様のプロトコルにより認識分子と相補性によってハイブリダイゼーションすることができる。
【０１３４】
したがって、支持体上への認識分子の固定化は実施例1の第1段階に記載するようにして行う。認識分子の固定後、1M NaClを含むTE中で支持体をインキュベートすることにより認識分子の標識が付された標的分子とのハイブリダイゼーションを実行する。
【０１３５】
次いで、支持体1を取り出し、室温で15分間この同じバッファーの中で洗浄する。この方法によって得られる断片(それはハイブリダイズされない検出断片である)、および認識分子に相補的な領域を有しない断片を除去できるので、この洗浄ステップは非常に重要である。
【０１３６】
実施例2に記載するようにして、第1の画像を蛍光顕微鏡を使用して生成する。これにより真の陽性の存在により蛍光のレベルを得ることが可能になるが、擬陽性の存在による蛍光レベルも得られる。
【０１３７】
次いで、0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、95℃で1時間、支持体をインキュベートすることにより、認識分子で標識された標的分子の解離を行う。
【０１３８】
次いで、第2画像を生成する。これにより表面に吸着しただけで、適切に認識分子とハイブリダイズしなかった検出断片(それは擬陽性を構成する)を検出できる。実施例1に記載するように、第2画像の検出スポットからの第1画像上に存在する検出スポットを差し引くことによって、真の陽性および擬陽性の存在を識別することが可能である。
【０１３９】
前段階で得られた結果をさらにチェックする目的で、上記の第1の認識分子-標的分子ハイブリダイゼーションと同一の条件下で、認識分子を結合させた支持体を標的分子と再度インキュベートし、支持体を1M NaClおよび0.05%トライトンX100を含むTEバッファー中、室温で15分間洗浄する。
【０１４０】
第3の画像により、真の陽性および擬陽性の区別を確認できる。さらに、この第3の画像により、第1の画像と同じ強度の検出信号が得られるので、認識分子が支持体上に依然として存在するのか否かが確認できる。したがって、認識分子を支持体から分離する必要がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】その一部として認識分子を担持するバイオチップ中に標的分子を含む第2の液体試料を導入する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図２】ハイブリダイズまたは複合化しなかった、つまりバイオチップ中に結合しなかった標識分子を除去するために洗浄する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図３】認識分子と標的分子の両方を担持するバイオチップ中に検出分子を含む第3の液体試料を導入する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図４】ハイブリダイズまたは複合化しなかった、つまりバイオチップ中に結合しなかった検出分子を除去するために洗浄する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図５】上記図1〜図4に示すステップの後にバイオチップ上で検出されたハイブリッドまたは複合体を表す第1の画像を生成する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図６】標的分子と検出分子の間の解離を可能にする有向的開裂からなる、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図７】上記図6に示すステップの後にバイオチップ上で検出されたハイブリッドまたは複合体を表す第2の画像を生成する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図８】認識分子と標的分子の両方を担持するバイオチップ中に検出分子を含む第3の液体試料を再導入する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図９】バイオチップ中に結合しなかった検出分子を除去するために洗浄する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図１０】上記図8および9に示すステップの後にバイオチップ上で検出されたハイブリッドまたは複合体を表す第3の画像を生成する、読み取り方法の1ステップを表す模式図である。
【図１１】ステップは真にバイオチップ上で検出されたハイブリッドまたは複合体を表す第4の画像を生成するために、第2および第3の画像の同時の分析する本発明の読み取り方法の最終ステップを表す模式図である。
【符号の説明】
【０１４２】
1  支持体
2  認識分子
3  標的分子
4  検出分子
5  バイオチップ
6  ハイブリダイズされない標的分子
7  認識分子と結合していない標識した標的分子
9  標的分子と結合していない標識した検出分子
10  第1の画像
11  第2の画像
18  検出分子に対応する検出スポット
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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