(57)【要約】本発明は、ヘリコバクターピロリ菌からのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明は、オリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質を合成するためのフコシルトランスフェラーゼの使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコシル化糖タンパク質の製造方法であって、以下の：
フコシルトランスフェラーゼがドナー基質から糖タンパク質上のアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する条件下で、組換えフコシルトランスフェラーゼをフコース残基を含むドナー基質および糖タンパク質上のアクセプター基質を含む混合物と接触させ、それによりフコシル化糖タンパク質を産生する
ことを包含する方法であって、
組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質が配列番号２、４、６および８からなる群から選択されるアミノ酸配列と90％より大きい同一性を有するポリペプチドを含む方法。
【請求項２】
ポリペプチドが配列番号２、４、６および８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号２を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドがさらにアミノ酸タグを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
フコシル化糖タンパク質を精製する過程をさらに包含する請求項１記載の方法。
【請求項６】
アクセプター基質がグルコース残基であり、組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質が配列番号６と90％より大きい同一性を有するポリペプチドを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
アクセプター基質がＮ−アセチルグルコサミン残基であり、組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質が配列番号２、４および８からなる群から選択されるアミノ酸配列と90％より大きい同一性を有するポリペプチドを含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
糖タンパク質上のアクセプター基質がＧａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ、３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１、３／４ＧｌｃＮＡｃ−Ｏｒを含み、Ｒが少なくとも1つの炭素原子を有するアミノ酸、糖、オリゴ糖またはアグリコン基である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第60/398,156号（2002年7月23日提出）および米国特許仮出願第60/424,894号（2002年11月8日提出）（これらの記載内容はともに、全ての目的のために参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
本発明の分野
【０００２】
本発明は、ヘリコバクターピロリ菌からのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明は、オリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質を合成するためのフコシルトランスフェラーゼの使用方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
近年、炭水化物化学において有意の進歩がなされてきたが、しかし糖複合体の化学合成と、特に哺乳類オリゴ糖中に見出される遍在性β−１，２−シス−マンノシド結合と関連した実質的難しさが依然として存在する。さらに位置−および立体化学的障害が、炭水化物のde novo合成の各過程で解決されなければならない。
【０００４】
糖複合体の化学合成に関連した難しさを考慮して、所望の糖部分を有する糖タンパク質および糖脂質を酵素的に合成するためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、このような糖複合体を調製するための有望なアプローチである。酵素ベースの合成は位置選択性および立体選択性の利点を有し、そして非保護化基質を用いて実施され得る。さらにグリコシルトランスフェラーゼはオリゴ糖部分を酵素的に修飾するために用いられており、良好な立体化学的および位置化学的制御を伴う特定の生成物を製造するために非常に有効であることが示されている。当該グリコシルトランスフェラーゼとしては、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが挙げられる。全般的再検討のためには、Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998)およびArsequell, et al., Tetrahedon: Assymetry 10: 2839 (1997)を参照されたい。
【０００５】
多数の糖タンパク質および糖脂質は、特定の生物学的活性を示すために、特定の糖形態の存在または特定の糖形態の不存在を要する。例えば多数の糖タンパク質および糖脂質は、生物学的活性を示すために、特定のフコシル化構造の存在を要する。細胞間認識メカニズムはしばしば、フコシル化オリゴ糖を要する。例えば細胞接着分子として機能する多数の糖タンパク質、例えばＰ−セレクチン、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、特定の細胞表面フコシル化炭水化物構造、例えばシアリルルイス−ｘおよびシアリルルイス−ａ構造を結合する。さらにＡＢＯ血液型系を形成する特定の炭水化物構造はフコシル化される。3つの群の各々における炭水化物構造は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１−二糖単位を共有する。血液型Ｏ構造では、この二糖は末端構造である。一方、血液型Ａ構造は、二糖に末端ＧａｌＮＡｃ残基を付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼにより形成される。そして血液型Ｂ構造は、末端ガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼにより形成される。
【０００６】
ルイス血液型構造もフコシル化される。例えばルイス−ｘおよびルイス−ａ構造は、それぞれＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これらの構造はともにさらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）されて、対応するシアリル化構造を形成し得る。その他の当該ルイス血液型構造は、ルイス−ｙおよびルイス−ｂ構造であり、これらはそれぞれＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲである。ＡＢＯおよびルイス血液型構造ならびにそれらの合成に関与する酵素の構造の説明に関しては、Essentials of Glycobiology, Varki et al. eds., Chapter 16 （Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999）を参照されたい。
【０００７】
特にフコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプターの特定のヒドロキシルにフコース残基を転移する合成経路に用いられてきた。種々のドナー基質およびアクセプター基質が既知である（Guo et al., Applied Biochem. And Biotech. 68: 1-20 (1997)参照）。例えばIchikawaは、クローン化フコシルトランスフェラーゼによるシアリル化ラクトサミンのフコシル化を包含する方法によりシアリルルイス−ｘを調製した（Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)）。Loweは、細胞中で非ネイティブフコシル化活性を発現し、それにより細胞表面にフコシル化糖タンパク質を産生するための方法等を記載している（米国特許第5,955,347号）。
【０００８】
したがって多数の商業的に重要な組換え的および遺伝子導入的に産生された糖タンパク質および糖脂質の生物学的活性は特定の糖形態の存在または特定の糖形態の不存在によっているため、所望のフコシル化オリゴ糖部分を有する糖複合体を酵素的に合成するための効率的方法が必要とされている。さらにフコシル化オリゴ糖の効率的製造の必要性も存在する。本発明は、これらのおよびその他の必要を満たす。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の要約
本発明は、ヘリコバクターピロリ菌からのα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質および核酸を提供する。α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する。一実施形態において、本発明は、配列番号１、３または７から選択されるヌクレオチド配列と90％より大きい同一性を有する、そしてＧｌｃＮＡｃ残基にフコースを転移するα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードするα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ核酸を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号５と90％より大きい同一性を有する、そしてグルコース残基にフコースを転移するα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードするα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ核酸を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ核酸は配列番号１、３、５または７から選択される。本発明は、配列番号２、４、６または８を含めたα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードし、そしてＮ−アセチルグルコサミン残基への、またはグルコース残基へのフコースの転移を触媒する核酸配列も提供する。一態様において、コード化α−１，３／４フコシルトランスフェラーゼはアミノ酸タグも含む。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１１を含み、そしてドナー基質からグルコース残基へのフコース残基の転移を触媒する単離核酸を提供する。別の態様では、本発明は配列番号１２をコードする核酸を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、上記のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ核酸、発現ベクターを含む宿主細胞、ならびにα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の発現に適した条件下で培養された宿主細胞を用いてα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質を産生するための方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２、４または８と90％より大きい同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質を提供するが、この場合、フコシルトランスフェラーゼはドナー残基からＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの転移を触媒する。別の実施形態では、本発明は、配列番号６と90％より大きい同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質を提供するが、この場合、フコシルトランスフェラーゼはドナー残基からグルコースへのフコースの転移を触媒する。一態様では、フコシルトランスフェラーゼタンパク質は配列番号２、４、６または８を含む。別の態様では、フコシルトランスフェラーゼタンパク質はアミノ酸タグも含む。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１２を含み、そしてドナー基質からグルコースへのフコース残基の転移を触媒する組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質を提供する。別の態様では、フコシルトランスフェラーゼタンパク質はアミノ酸タグも含む。
【００１５】
本発明は、上記のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質を用いてフコシル化オリゴ糖を産生するための方法も提供する。フコシル化オリゴ糖は、さらに精製され得る。アクセプター基質は、使用者の要求によって、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコースであり得る。一実施形態では、アクセプター基質はラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（ＬＮｎＴ）であり、そしてフコシル化産物はラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＥＰ  ＩＩＩ）である。α−１，３／４フコシルトランスフェラーゼは、他のグリコシルトランスフェラーゼと組合せて用いられて、フコシル化オリゴ糖を産生し得る。例えば出発物質としてラクトースを用いて、ＬＮＥＰは、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにフコースを転移するα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの作用により産生され得る。β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは細菌酵素であり得るし、好ましい実施形態ではナイセリア・ゴノコッカス菌（Neisseria gonococcus）からのものである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、フコシル化糖脂質を産生するために用いられ得る。アクセプター基質は、使用者の要求によってＮ−アセチルグルコサミンまたはグルコースであり得る。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載されたα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを、フコシル化糖タンパク質を産生するのに適した条件下で適切なアクセプター基質を含む糖タンパク質と組合せることにより、フコシル化糖タンパク質を産生するための方法を提供する。アクセプター基質は、Ｇａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−Ｏｒ（ここで、Ｒは少なくとも1つの炭素原子を有するアミノ酸、糖、オリゴ糖またはアグリコン基である）から選択され得る。アクセプター基質は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはグルコース残基であり得る。α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼは、アミノ酸タグも含み得る。
【００１８】
定義
別記しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は一般に、本発明が属する当該技術分野の当業者に一般に理解されているのと同一の意味を有する。一般に本明細書中で用いられる命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝子学、有機化学および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションにおける実験室手法は、当業者に周知のものである。核酸およびペプチド合成に関しては、標準技法が用いられる。一般に、酵素反応および精製過程は、メーカーの使用説明書に従って実施される。技法および手法は一般に、本文書により提供される当該技術分野および種々の一般的参考文献における慣用的方法に従って実施される（一般に、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed. (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.参照）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。本明細書中で用いられる命名法、ならびに下記の分析化学および有機合成化学における実験室手法は、当業者に周知でそして当該技術分野で一般に用いられるものである。標準技法またはその変法は、化学合成および化学分析のために用いられる。
【００１９】
「α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ」あるいは「α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼまたはフコシルトランスフェラーゼ」をコードする核酸という用語は、（１）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１３から選択される核酸によりコードされるポリペプチドと、；あるいは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１４のアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000またはそれ以上のアミノ酸の領域に亘って、約60％より大きいアミノ酸配列同一性を、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％またはそれより大きいアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し；（２）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生される抗体、例えばポリクローナル抗体；その免疫原性断片およびその保存的修飾変異体と特異的に結合し；（３）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１４をコードする核酸、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１３の核酸配列、またはその相補体およびその保存的修飾変異体と、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（４）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１３；あるいはその相補体と、好ましくは少なくとも約25、50、100、200、500、1000またはそれ以上のヌクレオチドの領域に亘って、約90％より大きい、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％またはそれより大きいヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する核酸ならびにポリペプチド多型性変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間相同体を指す。本発明の核酸およびタンパク質は、天然または組換え分子の両方を含む。
【００２０】
本発明のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ酵素は、フコシルトランスフェラーゼタンパク質の一ファミリーである、グリコシルトランスフェラーゼファミリー１０に見出される高度保存触媒ドメインの存在によっても認識され得る（例えばｇｎｌ｜ＣＤＤ｜１９８３６  ｐｆａｍ００８５２、Ｇｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｓｆ＿１０参照）。１１８２ｆｕｔＢ、１１１１ｆｕｔＡ、１２１８ｆｕｔＢおよび１９Ｃ２ｆｕｔＢの保存触媒ドメインとグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０成員の触媒ドメインからのコンセンサス配列との間のアラインメントは、図８〜１１に示されている。
【００２１】
本明細書中に記載されたような生物学的活性フコシルトランスフェラーゼは、α−１，３／４−結合中のアクセプター分子へのドナー基質からのフコース、例えばＧＤＰ−フコースの転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼである。アクセプター分子は、Ｎ−アセチルグルコシルアミン（ＧｌｕｃＮＡｃ）またはグルコースであり得る。例えば以下のヘリコバクターピロリ菌株からのフコシルトランスフェラーゼは、Ｇｌｃ−ＮＡｃにフコースを転移する：菌株９１５ＦｕｔＡ、菌株１１１１ＦｕｔＡ、菌株１９Ｃ２ＦｕｔＢおよび菌株１１８２ＦｕｔＢ。ヘリコバクターピロリ菌株１９Ｃ２ＦｕａからのＦｕｔＡ遺伝子産物は、ヘリコバクターピロリ菌株１２１８からのＦｕｔＢ遺伝子産物、ならびに新規の２６６９５ＦｕｔＡタンパク質の場合と同様に、ＬＮｎＴアクセプターの還元グルコースにフコースを転移する。好ましい実施形態では、フコシルトランスフェラーゼはもっぱらＧｌｃＮＡｃに、またはもっぱらグルコースにフコースを転移する。アクセプター分子は、炭水化物、オリゴ糖、糖脂質または糖タンパク質であり得る。
【００２２】
本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、ドナー基質からアクセプター基質に糖を転移するために有用である。付加は一般に、生体分子上のオリゴ糖または炭水化物の非還元末端で起こる。しかしながらいくつかの実施形態では、フコース残基は還元グルコース残基に付加される。本明細書中で定義されるような生体分子としては、生物学的に有意の分子、例えば炭水化物、オリゴ糖、タンパク質（例えば糖タンパク質）および脂質（例えば糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
以下の略号が本明細書中で用いられる：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトシルアミノ；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコシルアミノ；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；
ＦＴまたはＦｕｔ＝フコシルトランスフェラーゼ*
ＳＴ＝シアリルトランスフェラーゼ*
ＧａｌＴ＝ガラクトシルトランスフェラーゼ*
【００２４】
オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であるか否かにかかわらず、還元および非還元末端を有すると考えられる。許容される命名法に従って、オリゴ糖は、本明細書中では非還元末端は左にそして還元末端は右に表わされる。
【００２５】
本明細書中に記載されたオリゴ糖は全て、非還元糖に関する名称または略号（例えばＧａｌ）と、その後にグルコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合、結合に関与する還元糖の環位置、そして次に還元糖の名称または略号（例えばＧｌｃＮＡｃ）で記載される。2つの糖間の結合は、例えば２，３、２→３または（２，３）として表され得る。各糖は、ピラノースまたはフラノースである。
【００２６】
「シアル酸」という用語は、9炭素カルボキシル化糖の一ファミリーの任意の成員を指す。シアル酸ファミリーの最も一般的な成員は、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オニン酸）（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡとして省略される）である。ファミリーの第二の成員は、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であって、この場合、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化される。第三のシアル酸ファミリー成員は、２−ケト−３−デオキシ−nonulosonic酸（ＫＤＮ）である（Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)）。９−置換シアル酸、例えば９−Ｏ−Ｃ1〜Ｃ6アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、例えば９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃも含まれる。シアル酸ファミリーの再検討のためには、例えばVarki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))を参照されたい。シアリル化手法におけるシアル酸化合物の合成および使用は、国際出願WO 92/16640（1992年10月1日公開）に開示されている。
【００２７】
グリコシルトランスフェラーゼに関する「アクセプター基質」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして作用し得るオリゴ糖部分である。アクセプター基質が対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖基質ならびにその他の必要な反応混合物構成成分と接触され、そして反応混合物が十分な時間インキュベートされると、グリコシルトランスフェラーゼは糖ドナー基質からアクセプター基質に糖残基を転移する。アクセプター基質はしばしば、特定のグリコシルトランスフェラーゼの異なる型に関して異なる。
【００２８】
ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼに関する「アクセプター基質」は、ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして作用し得るオリゴ糖部分である。アクセプター基質がヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼおよび糖基質（例えばＧＤＰ−フコース）ならびにその他の必要な反応混合物構成成分と接触され、そして反応混合物が十分な時間インキュベートされると、ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼはＧＤＰ−フコースからアクセプター基質にフコース残基を転移する。アクセプター基質はしばしば、特定のフコシルトランスフェラーゼの異なる型に関して異なる。例えば哺乳類ガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対するアクセプター基質は、オリゴ糖の非還元末端にＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを含む。このフコシルトランスフェラーゼは、α１，２結合を介してフコース残基をＧａｌに結合する。末端Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化類似体は、それぞれα１，３およびα１，４−フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質である。しかしながらこれらの酵素は、フコース残基をアクセプター基質のＧｌｃＮＡｃ残基に結合する。したがって「アクセプター基質」という用語は、特定の用途のための当該特定グリコシルトランスフェラーゼとの関係で取り上げられる。本明細書中に記載されたヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼは、フコースをシアリル化または非シアリル化アクセプター基質に転移する。本明細書中に記載されたいくつかのヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼは、フコースをグルコース残基に転移する。
【００２９】
グリコシルトランスフェラーゼに関する「ドナー基質」は、活性化ヌクレオチド糖である。このような活性化糖は一般に、糖のウリジン、グアノシンおよびシチジン一リン酸塩誘導体（それぞれＵＭＰ、ＧＭＰおよびＣＭＰ）あるいは糖の二リン酸塩誘導体（それぞれＵＤＰ、ＧＤＰおよびＣＤＰ）から成り、この場合、ヌクレオシド一リン酸塩または二リン酸塩は脱離基として役立つ。例えばフコシルトランスフェラーゼに関するドナー基質はＧＤＰ−フコースである。例えばシアリルトランスフェラーゼに関するドナー基質は、望ましいシアル酸を含む活性化糖ヌクレオチドである。例えばＮｅｕＡｃの場合、活性化糖はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃである。
【００３０】
「実質的に均一な糖形態」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、糖タンパク質種に言及する場合、当該グリコシルトランスフェラーゼ（例えばフコシルトランスフェラーゼ）によりグリコシル化されるアクセプター基質のパーセンテージを指す。例えば上記のα１，３またはα１，４フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的に均一なフコシル化パターンは、実質的に全ての（下記のように）Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化または非シアリル化類似体が当該糖タンパク質を含む組成物中でフコシル化される場合に存在する。出発物質はグリコシル化アクセプター基質（例えばフコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ基質）を含有し得る、と当業者により理解される。したがって算定量のグリコシル化は、本発明の方法によりグリコシル化されるアクセプター基質、ならびに出発物質においてすでにグリコシル化されたアクセプター基質を含む。
【００３１】
「実質的に均一」の上記定義における「実質的に」という用語は一般に、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターの少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上、好ましくは少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％がグリコシル化される（例えばフコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ基質）ことを意味する。
【００３２】
「実質的に同一のフコシル化パターン」という用語は、既知の糖タンパク質のフコシル化と少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約90％、さらに好ましくは少なくとも約91％、92％、93％、94％または95％、そしてさらに好ましくは少なくとも約96％、97％、98％または99％同一である本発明の方法により産生される糖タンパク質のグリコシル化パターンを指す。「既知のフコシル化パターン」とは、任意の既知レベルのフコシル化を有する任意の供給源からの既知の糖タンパク質のフコシル化パターンを指す。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造、即ち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合されるα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、しかし天然アミノ酸と同一の基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、しかし天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００３４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」は、単量体がアミノ酸であり、そしてアミド結合により一緒に連結されるか、あるいはポリペプチドとして言及されるポリマーを指す。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体が用いられ得る。さらに非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸も本発明で用いられ得る。さらに反応性基を含むよう修飾されたアミノ酸も、本発明に用いられ得る。本発明で用いられるアミノ酸は全て、Ｄ−またはＬ−異性体であり得る。Ｌ−異性体が一般に好ましい。さらにその他のペプチド模倣物も本発明において有用である。一般的再検討のためには、Spatola, A.F., in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p.267 (1983)を参照されたい。
【００３５】
「組換え体」という用語は、細胞に関して用いられる場合、細胞が異種核酸を複製し、または異種核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現する、ということを示す。組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を含有し得る。組換え細胞は、ネイティブ形態の細胞中に見出される遺伝子も含有し得るが、この場合、遺伝子は人工的手段により修飾され、細胞中に再導入される。本用語は、細胞からの核酸の除去を伴わずに修飾された細胞に対して内因性である核酸を含有する細胞も包含する。このような修飾としては、遺伝子置換、部位特異的突然変異および関連技法により得られるものが挙げられる。「組換えタンパク質」は、組換え細胞により産生されたものである。
【００３６】
「融合タンパク質」とは、オリジナルまたはネイティブ全長タンパク質をコードするアミノ酸配列またはそのサブ配列に加えた、その代わりの、それより少ないおよび／またはそれとは異なるアミノ酸配列を含むヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質を指す。
【００３７】
融合タンパク質の構成成分としては、「付属酵素」および／または「精製またはアミノ酸タグ」が挙げられる。本明細書中で言及されるような「付属酵素」は、例えばフコシルトランスフェラーゼに対する基質を生成する反応を触媒するのに関与する酵素である。付属酵素は、例えばフコシルトランスフェラーゼによりドナー部分として用いられるヌクレオチド糖、例えばＧＤＰ−フコースを触媒し得る。付属酵素は、ヌクレオチド糖の生成に必要とされるヌクレオチド三リン酸塩の生成に、またはヌクレオチド糖に組み入れられる糖、例えばフコースの生成に用いられるものでもあり得る。本発明の組換え融合タンパク質は、タンパク質の精製を促す一末端に分子「精製タグ」を有する融合タンパク質として構築され、発現され得る。このようなタグは、グリコシル化反応中のタンパク質の固定化のためにも用いられ得る。適切なタグとしては、抗体により特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」が挙げられる。エピトープタグは一般に、融合タンパク質を明白に検出するかまたは単離するための容易に利用可能な抗体の使用を可能にするために融合タンパク質中に組入れられる。「ＦＬＡＧタグ」は、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓまたはその実質的に同一の変異体から成る、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体により特異的に認識される一般的に用いられるエピトープタグである。その他の適切なタグは当業者に既知であり、例としては、例えばアフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンペプチドが挙げられ、これは金属イオン、例えばニッケルまたはコバルトイオンと結合する。精製タグは、マルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に既知である。デンプン結合ドメインは、WO 99/15636（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導樹脂を用いたデンプン結合ドメインを含む融合タンパク質のアフィニティー精製は、USSN 60/468,374（2003年5月5日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００３８】
「機能性ドメイン」という用語は、グリコシルトランスフェラーゼに関しては、酵素の活性、例えばアクセプター基質特異性、触媒活性、結合親和性、あるいはその他の生物学的または生化学的活性を付与するかまたは調整するグリコシルトランスフェラーゼのドメインを指す。グリコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインの例としては触媒ドメインが挙げられるが、これに限定されない。
【００３９】
「発現レベル」または「発現のレベル」という用語は、タンパク質に関しては、細胞により産生されるタンパク質の量を指す。細胞により産生されるタンパク質の量は、本明細書中に記載されたまたは当業者に既知の検定および活性単位により測定され得る。それぞれ種々の検定および単位を用いて細胞により産生されるタンパク質の量を測定し、記載する方法を、当業者は既知である。したがってタンパク質、例えばヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼの発現のレベルの定量および定量的記載が検定されて、タンパク質の活性または量を記載するために用いられる酵素活性または単位を測定し得る。細胞により産生されるタンパク質の量は、標準的既知検定により、例えばBradford (1976)によるタンパク質検定、Pierce (Rockford, Illinois)からのビシンコニン酸タンパク質検定キットにより、あるいは米国特許第5,641,668号に記載されているように確定され得る。
【００４０】
「酵素活性」という用語は酵素の活性を指し、そして本明細書中に記載された、あるいは当業者に既知の検定および単位により測定され得る。
【００４１】
「特異的活性」という用語は、本明細書中で用いる場合、酵素の、例えば本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質の触媒活性を指し、活性単位で表され得る。本明細書中で用いる場合、1活性単位は所定の温度（例えば37℃）およびｐＨ値（例えばｐＨ7.5）で1 μmolの生成物／分の生成を触媒する。したがって例えば37℃の温度で、例えば7.5のｐＨ値で1分で10 μmolの基質が10 μmolの生成物に転化される場合、10単位の酵素がその酵素の触媒量である。
【００４２】
「触媒ドメイン」とは、酵素により実施される酵素反応を触媒するタンパク質ドメインまたはそのサブ配列を指す。例えばフコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインは、ドナーからアクセプター糖にフコース残基を転移するのに十分なフコシルトランスフェラーゼのサブ配列を含む。触媒ドメインは、全酵素、そのサブ配列を含み得るし、あるいは現実に見出されるような酵素またはそのサブ配列に結合されない付加的アミノ酸配列を含み得る。本発明のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ酵素は、フコシルトランスフェラーゼタンパク質の一ファミリーである、グリコシルトランスフェラーゼファミリー１０に見出される高度保存触媒ドメインの存在によっても認識され得る（例えばｇｎｌ｜ＣＤＤ｜１９８３６  ｐｆａｍ００８５２、Ｇｌｙｃｏ＿ｔｒａｎｓｆ＿１０参照）。１１８２ｆｕｔＢ、１１１１ｆｕｔＡ、１２１８ｆｕｔＢおよび１９Ｃ２ｆｕｔＢの保存触媒ドメインとグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０成員の触媒ドメインからのコンセンサス配列との間のアラインメントは、図８〜１１に示されている。１１８２ｆｕｔＢ、１１１１ｆｕｔＡ、１２１８ｆｕｔＢおよび１９Ｃ２ｆｕｔＢの保存触媒ドメインとグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０成員の触媒ドメインからのコンセンサス配列との間のアラインメントは、図８〜１１に示されている。ほぼアミノ酸１１で開始し、アミノ酸３０１で終了するグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０触媒ドメインコンセンサス配列の領域と類似の高度保存領域は、上記のヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ酵素の各々に見出され（例えば１１８２ｆｕｔＢ、アミノ酸２３〜３０５；１１１１ｆｕｔＡ、アミノ酸２７〜３０４；１２１８ｆｕｔＢ、アミノ酸２３〜３０５；および１９Ｃ２ｆｕｔＢ、アミノ酸２２〜２７７）、酵素の触媒ドメインであると考えられる。したがって上記のフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むポリペプチドは、本発明の方法に、例えば糖タンパク質のフコシル化に用いられ得る。上記のフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインをコードする核酸は、本発明の方法に、例えば糖タンパク質をフコシル化するためのフコシルトランスフェラーゼタンパク質の産生にも用いられ得る。
【００４３】
「サブ配列」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸のより長い配列（例えばタンパク質）の一部を含む核酸またはアミノ酸の配列を指す。
【００４４】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖継代のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別記しない限り、天然ヌクレオチドと同様に核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を包含する。別記しない限り、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。
【００４５】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」とは、このような配列に適合性である宿主中での構造遺伝子の発現に作用し得る核酸素子を用いて組換え的または合成的に生成される核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターを、そして任意に転写終結シグナルを含む。典型的には組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば所望のポリペプチドをコードする核酸）、ならびにプロモーターを含む。発現を実行するのに必要なまたは役立つ付加的因子も、本明細書中に記載されているように用いられ得る。例えば発現カセットは、宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を指図するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列も含み得る。転写終結シグナル、エンハンサーおよび遺伝子発現に影響を及ぼすその他の核酸配列も、発現カセット中に含まれ得る。
【００４６】
「異種配列」または「異種核酸」とは。本明細書中で用いる場合、特定の宿主細胞に対して異質の供給源から生じるものであり、あるいは同一供給源からの場合には、そのオリジナル形態から修飾されるものである。したがって真核生物宿主細胞中の異種糖タンパク質遺伝子は、修飾された特定の宿主細胞に対して内因性である糖タンパク質コード遺伝子を含む。異種配列の修飾は、例えば制限酵素でＤＮＡを処理して、プロモーターと操作可能的に連結され得るＤＮＡ断片を生成することにより生じ得る。部位特異的突然変異誘発のような技法は、異種配列を修飾するためにも有用である。
【００４７】
「単離された」という用語は、酵素の活性を妨害する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。本発明の糖、タンパク質または核酸に関しては、「単離された」という用語は、そのネイティブ状態で見出されるような物質に通常は随伴する構成成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。典型的には本発明の単離された糖、タンパク質または核酸は、銀染色ゲル上の帯域強度により、または純度を確定するためのその他の方法により測定した場合、少なくとも約80％の純度、通常は少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約95％の純度である。純度または均質性は、当業界で周知の多数の手段により示され得る。例えば試料中のタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解され、次にタンパク質または核酸は染色により可視化され得る。ある種の目的のためには、タンパク質または核酸の高度分解が望ましく、例えばＨＰＬＣまたは精製のための同様の手段が利用され得る。
【００４８】
「操作可能的に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、シグナル配列または転写因子結合部位のアレイ）と二次核酸配列との間の機能性連結を指すが、この場合、発現制御配列は二次配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に作用する。
【００４９】
「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、2つまたはそれ以上の核酸またはタンパク質配列の情況では、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを用いてまたは視覚的検査により測定されるように、最大一致に関して比較しおよび整列された場合に、同一であるか、あるいは同一である特定パーセンテージアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。
【００５０】
「実質的に同一の」という語句は、2つの核酸またはタンパク質の情況では、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを用いてまたは視覚的検査により測定されるように、最大一致に関して比較しおよび整列された場合に、約60％より大きい核酸またはアミノ酸配列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、好ましくは91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する2つまたはそれより多い配列またはサブ配列を指す。好ましくは実質的同一性は、少なくとも約50残基長である配列の領域に亘って、さらに好ましくは少なくとも約100残基の領域に亘って存在し、最も好ましくは配列は、少なくとも約150残基に亘って実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列はコード領域の全長に亘って実質的に同一である。
【００５１】
配列比較のためには、典型的には一配列が参照配列として作用し、これと試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いて、試験および参照配列はコンピューターに入力されると、サブ配列座標が指示され、必要な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指示される。次に配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した場合の試験配列（単数または複数）に関する配列同一性パーセントを算定する。
【００５２】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性方法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化履行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP, BESTFIT, FASTAおよびTFASTA)により、あるいは視覚的検査（一般的にはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement)(Ausubel)参照）により、実行され得る。
【００５３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを確定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)により公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一長の語と整列された場合に、いくつかの正値閾値スコアＴに匹敵するかまたはそれを満たす検索配列中の長さＷの短い語を先ず同定する。Ｔは、隣接語スコア閾値として言及される（Altschul et al、上記）。これらの最初の隣接語ヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次に語彙ヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿った両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（一対のマッチング残基に関する報酬スコア；常に＞0）およびＮ（ミスマッチング残基に関するペナルティースコア；常に＜0）を用いて算定される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算定するためにはスコアリングマトリックスが用いられる。各方向における語彙ヒットの拡張は、以下の場合、停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する；１つまたは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のため、累積スコアがゼロまたはそれ以下になる；あるいはいずれかの配列の末端が到達される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感受性および速度を確定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして語長（Ｗ）11、期待値（Ｅ）10、Ｍ＝5、Ｎ＝4、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして語長（Ｗ）3、期待値（Ｅ）10、ならびにＢＬＯＳＵＭ62スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)参照）。
【００５４】
配列同一性パーセントを算定するほかに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一測定値は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【００５５】
2つの核酸配列またはタンパク質が実質的に同一であるというさらなる指標は、下記のように、一次核酸によりコードされるタンパク質が二次核酸によりコードされるタンパク質と免疫学的に交差反応するというものである。したがって例えば2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、一タンパク質は典型的には二次タンパク質と実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、下記のように、2つの分子が緊縮条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００５６】
「〜と（に）特異的にハイブリダイズする」という語句は、その配列が複合混合物（例えば総細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、緊縮条件下で特定のヌクレオチド配列とのみ分子が結合するか、二重鎖を形成するかまたはハイブリダイズすることを指す。
【００５７】
「ストリンジェント（緊縮）条件」という用語は、プローブがその標的亜配列とハイブリダイズするが、しかし他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。長い配列ほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に緊縮条件は、限定イオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する融点（Ｔｍ）より約15℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的であるプローブの50％が平衡状態（標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの50％は平衡状態で存在する）で標的配列とハイブリダイズする温度（限定イオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）である。典型的には緊縮条件は、塩濃度が、7.0〜8.3のｐＨで、約1.0 M未満のＮａイオン典型的には約0.01〜1.0 MのＮａイオン濃度（または他の塩）であるものであり、温度は短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃であり、そして長いプローブ（例えば50ヌクレオチドより大きい）に関しては少なくとも約60℃である。緊縮条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の付加によっても達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、正のシグナルは典型的には、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。緊縮ハイブリダイゼーション条件の例としては、以下のものが挙げられる：50％ホルムアミド、5×ＳＳＣおよび1％ＳＤＳ、42℃でインキュベートまたは5×ＳＳＣ、1％ＳＤＳ、65℃でインキュベート、0.2×ＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中で65℃で洗浄。ＰＣＲのためには、約36℃の温度が低緊縮性増幅に関しては典型的であるが、しかしアニーリング温度は、プライマー長によって約32〜48℃の間で変わり得る。高緊縮性ＰＣＲ増幅のためには、約62℃の温度が典型的であるが、しかし高緊縮性アニーリング温度は、プライマー長および特異性によって、約50℃〜約65℃の範囲であり得る。高および低緊縮性増幅の両方に関する典型的周期条件としては、90〜95℃で30〜120秒の変性期および30〜120秒のアニーリング期、ならびに約72℃で1〜2分間の伸長期が挙げられる。低および高緊縮性増幅反応に関するプロトコールおよびガイドラインは、例えばInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y.において入手可能である。
【００５８】
「タンパク質と特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性である」という語句は、抗体に言及する場合、タンパク質およびその他の生物製剤の不均一集団の存在下でタンパク質の存在に決定力を有する結合反応を指す。したがって指示イムノアッセイ条件下では、特異的抗体は特定のタンパク質と優先的に結合し、試料中に存在するその他のタンパク質と有意量で結合しない。このような条件下でのタンパク質との特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性に関して選択される抗体を要する。種々のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するためにルーチンに用いられる。特異的免疫反応性を確定するために用いられ得るイムノアッセイフォーマットお酔い条件の説明に関しては、Harlow and Lane (1988) Antiodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Publications, New Yorkを参照されたい。
【００５９】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的修飾変異体」とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指すか、あるいはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に等しい配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えばコドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。したがってアルギニンがコドンにより特定される全ての位置で、コドンは、コード化タンパク質を変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、これは「保存的修飾変異」の一種である。タンパク質をコードする本明細書中に記載された全てのポリヌクレオチド配列も、別記しない限り、全ての考え得るサイレント変異を説明する。核酸中の各コドン（普通はメチオニンに関する唯一のコドンであるＡＵＧ、ならびに普通はトリプトファンに関する唯一のコドンであるＵＧＧは除く）は、標準的技法により帰納的に同一の分子を産生するよう修飾され得る、と当業者は認識する。したがってタンパク質をコードする核酸の各「サイレント変異」は、各々の記載された配列中に潜在する。
【００６０】
さらに、コード配列中の単一アミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸（典型的には5％未満、さらに典型的には1％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は「保存的修飾変異」であり、この場合、変更は化学的に類似のアミノ酸による一アミノ酸の置換を生じる、と当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提示する保存的置換表は、当該技術分野で周知である。
【００６１】
融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸の多数の保存的変更は本質的に同一の生成物を産生する、と当業者は理解する。例えば遺伝暗号の縮重のため、「サイレント置換」（即ちコードタンパク質における変更を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列の暗示的特徴である。本明細書中に記載されているように、配列は好ましくは、キメラグリコシルトランスフェラーゼを産生するために用いられる特定の宿主細胞（例えば酵母、ヒト等）における発現のために最適化される。同様に、アミノ酸配列中の1個または2〜3個のアミノ酸における「保存的アミノ酸置換」は、高類似特性を有する異なるアミノ酸で置換され（定義の節（上記）参照）、さらにまた特定のアミノ酸配列に、またはアミノ酸をコードする特定の核酸配列に非常に類似しているとして容易に同定される。任意の特定の配列のこのような保存的置換変異は、本発明の一特徴である（Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyも参照）。さらにコード配列中の単一アミノ酸または少パーセンテージのアミノ酸を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加も「保存的修飾変異」である。
【００６２】
本発明の実行は、トランスフェクト化宿主細胞中での組換え核酸の構築および遺伝子の発現を包含し得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターのような組換え核酸の構築に適した広範な種々のクローニングおよびin vitro増幅法が当業者に周知である。これらの技法の例ならびに多数のクローニング実習により当業者を指導するのに十分な使用説明書は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)；ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1999 Supplement)(Ausubel)に見出される。組換えヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼの発現のための適切な宿主細胞は当業者に既知であり、例としては例えば細菌細胞、例えば大腸菌が挙げられる。真核生物細胞、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞および酵母または真菌細胞（例えば黒コウジカビAspergillus nigerまたは酵母）も、本発明に用いられ得る。
【００６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅およびその他のＲＮＡポリペプチド媒介性技法を含めたin vitro増幅方法により当業者を指導するのに十分なプロトコールの例は、Berger、SambrookおよびAusubelならびにMullis等（1987）米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C & EN 36-47；The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94；(Kwoh et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874； Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826； Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080； Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294； Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560；およびBarriger et al. (1990) Gene 89: 117に見出される。増幅核酸のin vitroでのクローニング方法の改善は、米国特許第5,426,039号（Wallace等）に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明の詳細な説明
【００６５】
本発明は、ドナー基質から糖タンパク質上のアクセプター糖にフコースを転移する最初の最近α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ、即ちヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼを提供する。さらにフコシルトランスフェラーゼは、フコシル化オリゴ糖および糖脂質を産生するために有用である。
【００６６】
特に以下のヘリコバクターピロリ菌株からのα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼがクローン化され、分析された：９１５Ａ２、１１１１Ａ２、１９Ｃ２Ｂ１、１１８２Ｂ３、１９Ｃ２Ａ５、２６６９５および１２１８。以下のヘリコバクターピロリ菌株：９１５Ａ２、１１１１Ａ２、１９Ｃ２ＦｕｔＢおよび１１８２Ｂ３からのフコシルトランスフェラーゼは、Ｇｌｃ−ＮＡｃにフコースを転移した。ヘリコバクターピロリ菌株１９Ｃ２Ａ５からのＦｕｔＡ遺伝子産物は、ヘリコバクターピロリ菌株１２１８からのＦｕｔＢ遺伝子産物の場合と同様に、ＬＮｎＴアクセプターの還元グルコースにフコースを転移した。グルコースにフコースを転移するヘリコバクターピロリ菌株２６６９５からのＦｕｔＡ遺伝子産物の能力が確証された。
【００６７】
哺乳類α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを上回るヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの主な利点は、ヘリコバクターピロリ菌酵素がアクセプターのシアリル化状態により影響を及ぼされないと思われる点である。さらにヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼのいくつかは、グルコースおよびｇｌｃＮＡｃ残基の両方を含有するアクセプター糖中のＮ−アセチルグルコサミン（ｇｌｃＮＡｃ）残基にもっぱらフコースを付加する。それに対比して、哺乳類α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼはアクセプターのシアリル化度に感受性であり、そしていくつかの哺乳類酵素は同一アクセプター中のグルコースおよびｇｌｃＮＡｃ残基の両方に付加する。さらに細菌発現酵素は、Ｓｆ９またはＣＨＯ系中での哺乳類遺伝子産物の発現に比して、大きな経費節約を提供する。
【００６８】
Ａ．ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質のクローニング
【００６９】
グリコシルトランスフェラーゼ、例えばヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸およびこのような核酸の生成方法は、当業者に既知である。適切な核酸（例えばｃＤＮＡ、ゲノムまたはサブ配列（プローブ））は、in vitro方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）または自立配列複製系（ＳＳＲ）によりクローン化されまたは増幅され得る。広範な種々のクローニングおよびin vitro増幅方法は、当業者に周知である。これらの技法の例および多数のクローニング実習により当業者を指導するのに十分な使用説明書は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)；Sambrook et al.(1989) Molecular cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook et al.)；Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1994 Supplement)(Ausubel)；米国特許第5,017,478号（Cashion等）ならびに欧州特許第0,246,864号（Carr）に見出される。
【００７０】
ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはそのサブ配列は、上記の任意の適切な方法により、例えばクローニングおよび制限酵素を用いた適切な配列の制限により調製され得る。好ましい一実施形態では、ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、ルーチンのクローニング方法により単離される。例えばGenBankまたはその他の配列データベースで提供されるようなヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列（上記参照）を用いて、ゲノムＤＮＡ試料中のヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子と、または総ＲＮＡ試料中の（例えばサザンまたはノーザンブロットにおける）ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブを提供し得る。一旦、ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする標的核酸が同定されれば、それは当業者に既知の標準方法に従って単離され得る（例えばSambrook et al.(1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory；Berger and Kimmel(1987) Methods in Enzymology Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques , San Diego: Academic Press, Inc.；またはAusubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York参照）。さらに単離核酸は制限酵素で切断されて、全長ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を、または、例えばヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインの少なくとも一サブ配列をコードするサブ配列を含有するそのサブ配列を生成し得る。ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼまたはそのサブ配列をコードするこれらの制限酵素断片は次に、例えばヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を生成するために結繋され得る。
【００７１】
ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸またはそのサブ配列は、発現産物に関して検定することにより特性化され得る。発現タンパク質の物理的、化学的または免疫学的特性の検出に基づいた検定が用いられ得る。例えば、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する核酸によりコードされるタンパク質の能力により、クローン化ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを同定することができる。一方法では、キャピラリー電気泳動を用いて反応産物を検出する。この高感受性検定は、Wakarchuk et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (45): 28271-276に記載されているようにフルオレセインにより標識される糖類または二糖類アミノフェニル誘導体の使用を包含する。例えばナイセリア菌ｌｇｔＣ酵素に関して検定するためには、ＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＬａｃまたはＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−Ｇａｌが用いられ、一方、ナイセリア菌ｌｇｔＢ酵素に関しては、適切な試薬はＦＣＨＡＳＥ−ＡＰ−ＧｌｃＮＡｃである（同上）。フコシル化反応産物の検出のための他の方法としては、薄層クロマトグラフィーおよびＧＣ／ＭＳが挙げられる。
【００７２】
さらにまた、ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸またはそのサブ配列は、化学的に合成され得る。適切な方法としては、Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetra. Lettl.のジエチルホスホルアミダイト法；ならびに米国特許第4,458,066号の固体支持体法が挙げられる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションにより、あるいは鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼによる重合により、二本鎖ＤＮＡに転化され得る。ＤＮＡの化学合成はしばしば約100塩基の配列に限定されるが、一方、より短い配列の結繋によりより長い配列が生成され得る、と当業者は認識する。
【００７３】
ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸またはそのサブ配列は、ＤＮＡ増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてクローン化され得る。したがって例えば核酸配列またはサブ配列は、1つの制限酵素部位（例えばＮｄｅＩ）を含有するセンスプライマーおよび別の制限酵素部位（例えばＨｉｎｄＩＩＩ）を含有するアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅される。これは、所望のヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼまたはサブ配列をコードし、そして末端制限酵素部位を有する核酸を生じる。適切なＰＣＲプライマーは、GenBankまたはその他の供給源で提供される配列情報を用いて、当業者により確定され得る。適切な制限酵素部位はさらにまた、部位特異的突然変異誘発によりヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質またはタンパク質サブ配列をコードする核酸に付加され得る。ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼコードヌクレオチド配列またはサブ配列を含有するプラスミドは適切な制限エンドヌクレアーゼにより切断され、次に標準方法に従って増幅および／または発現のために適切なベクターに結繋される。in vitro増幅法により当業者を指導するのに十分な技法の例は、Berger、SambrookおよびAusubelならびにMullis等（1987）米国特許第4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C & EN 36-47；The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94；(Kwoh et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874； Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826； Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080； Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294； Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560；およびBarriger et al. (1990) Gene 89: 117に見出される。
【００７４】
特定の核酸から発現されるクローン化ヘリコバクターピロリ菌α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼのその他の物理的特性は、既知のヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの特性と比較されて、アクセプター基質特異性および／または触媒活性の決定因子であるヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの適切な配列またはドメインの別の同定方法を提供し得る。あるいは推定ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子または組換えヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が突然変異化され、そして非突然変異化天然または対照α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼにより普通は産生される炭水化物の構造における変異を検出することにより、α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼとしてのその役割、あるいは特定の配列またはドメインの役割が確定され得る。
【００７５】
クローン化ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインは、ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを突然変異化するかまたは修飾するための標準方法を用いて、本明細書中に記載されたようなアクセプター基質活性および／または触媒活性のような活性に関して修飾化または突然変異化タンパク質を試験することにより、同定され得る。種々のヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインを用いて、１つまたは複数のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの機能性ドメインを含むα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸を構築し得る。これらの融合タンパク質は次に、所望のアクセプター基質または触媒活性に関して試験され得る。
【００７６】
α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸をクローニングするための例示的一アプローチでは、クローン化グリコシルトランスフェラーゼの既知の核酸またはアミノ酸配列が整列され、比較されて、種々のグリコシルトランスフェラーゼ間の配列同一性の量を確定する。この情報を用いて、グリコシルトランスフェラーゼ活性、例えば当該グリコシルトランスフェラーゼ間の配列同一性の量に基づいたアクセプター基質活性および／または触媒活性を付与するかまたは調整するタンパク質ドメインを同定し、選択し得る。例えば当該フコシルトランスフェラーゼ間の配列同一性を有し、そして既知の活性に関連したドメインを用いて、そのドメインを含有し、そのドメインに関連した活性（例えばアクセプター基質特異性および／または触媒活性）を有するフコシルトランスフェラーゼタンパク質を構築し得る。
【００７７】
Ｂ．ヌクレオチド糖生成に関与する付属酵素を含む融合タンパク質
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（単数または複数）および／またはその他の機能性ドメインのほかに、付属酵素からの少なくとも1つの触媒ドメインを含む。付属酵素としては、例えばヌクレオチド糖の生成に関与する酵素が挙げられる。付属酵素は、例えば糖とヌクレオチドとの結合に関与し得るし、あるいは糖またはヌクレオチドの製造に関与し得る。ヌクレオチド糖は一般に、特定の融合ポリペプチドのグリコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインにより糖ドナーとして利用されるものである。α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼは、糖ドナーとしてＧＤＰ−フコースを利用する。グリコシルトランスフェラーゼおよび付属酵素からの機能性ドメインを含む融合タンパク質の例、ならびにこのような融合物の製造方法は、例えばPCT/CA98/01180、USSN 09/211,691（1998年12月14日提出）に見出される（これらの記載内容は、全ての目的に関して参照により本明細書中で援用される）。
【００７９】
ヌクレオチド糖の合成に関与する付属酵素は、当業者に周知である。細菌多糖合成および遺伝子名称の再検討に関しては、例えばReeves et al., Trends Microbiol. 4: 495-503 (1996)を参照されたい。グリコシルトランスフェラーゼコード核酸を生成するための上記の方法は、ヌクレオチド糖の生成に関与する酵素をコードする核酸を生成するためにも適用可能である。例えば、そのいくつかが以下に列挙されている当該技術分野で既知の核酸のうちの1つを、直接的にまたは他の当該生物からの対応する核酸を単離するためのプローブとして使用し得る。
【００８０】
本発明により提供される融合ポリペプチドの一例は、フコシル化可溶性オリゴヌクレオチドを生成するために用いられる。フコシルトランスフェラーゼに関するドナーヌクレオチド糖はＧＤＰ−フコースであり、これは製造するのが相対的に高価である。フコシル化オリゴ糖の製造経費を低減するために、本発明は、相対的に安価なＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに転化し、次にアクセプター糖へのフコースの転移を触媒し得る融合ポリペプチドを提供する。これらの融合ポリペプチドは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース３，５−エピメラーゼまたはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｌ−グルコース４−レダクターゼのうちの少なくとも1つからの触媒ドメインを含む。これらの酵素活性の各々が提供されると、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに転化し得る。
【００８１】
ＧＤＰ−フコース−合成酵素をコードする大腸菌遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、Stevenson et al. (1996) J. Bacteriol. 178: 4885-4893により記載されている（GenBank寄託番号U38473）。この遺伝子クラスターは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼに関するオープンリーディングフレームを含むことが報告されていた（ヌクレオチド8633〜9754；Stevenson et al.、上記）。この遺伝子クラスターは、３，５エピマー化および４−レダクターゼ活性の両方を有し（本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第6,500,661号（2002年12月31日発行）を参照）、したがってＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ反応の生成物（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）をＧＤＰ−フコースに転化し得る酵素をコードするオープンリーディングフレームも含有する、ということが近年発見された。ＹＥＦ  Ｂと呼ばれるこのＯＲＦは、ヌクレオチド9757〜10722間に見出される。ＹＥＦ  Ｂが2つの活性を有する酵素をコードするというこの発見の前には、1つまたは2つの酵素がＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転化に必要であるか否かは未知であった。ヒトＦｘ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBank寄託番号U58766で見出される。
【００８２】
マンノシルトランスフェラーゼ触媒ドメインおよびＭａｎ−１−ＰをＧＤＰ−Ｍａｎに転化するＧＤＰ−Ｍａｎピロホスホリラーゼ（EC 2.7.7.22）の触媒ドメインを含む融合ポリペプチドも提供される。適切な遺伝子は多数の生物体から既知であり、例としては、大腸菌：GenBankU13629、AB010294、D43637、D13231（Bastin et al., Gene 164: 17-23 (1995), Sugiyama et al., J. Bacteriol. 180: 2775-2778 (1998), Sugiyama et al., Microbiology 140 (Pt 1): 59-71 (1994), Kido et al., J. Bacteriol. 177: 2178-2187 (1995)）；肺炎クレブシエラ菌：GenBank AB010295（Sugiyama et al., J. Bacteriol. 180: 2775-2778 (1998)）；サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）：GenBank X56793 M29713（Stevenson et al., J. Bacteriol. 178: 4885-4893 (1996)）が挙げられる。
【００８３】
糖アクセプターをフコシル化するための本発明の融合ポリペプチドは、ＧＤＰ−フコース生成のための小または「捕捉」経路を提供する酵素も利用する。この経路では、遊離フコースはフコキナーゼによりリン酸化されて、フコース１−リン酸塩を生成し、これは、グアノシン５’−三リン酸塩（ＧＴＰ）と一緒に、ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼにより用いられて、ＧＤＰ−フコースを生成する（Ginsburg et al., J. Biol. Chem., 236: 2389-2393 (1961)およびReitman, J. Biol. Chem., 255: 9900-9906 (1980)）。したがってフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、適切な核酸が同時係属中の本発明の譲渡人に譲渡された米国特許出願第08/826,964号（1997年4月9日提出）に記載されているＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼからの触媒ドメインに連結され得る。フコキナーゼコード核酸は、例えばインフルエンザ菌（Fleischmann et al. (1995) Science 269: 496-512）および大腸菌（Lu and Lin (1989) Nucleic Acids Res. 17: 4883-4884）に関して記載されている。
【００８４】
触媒ドメインを得ることができる付加的付属酵素は、グリコシルトランスフェラーゼサイクルにおいて消費される反応体の生成に関与するものである。例えばいくつかのリン酸塩キナーゼのいずれかが付属酵素として有用である。例えばポリリン酸塩キナーゼ（EC 2.7.4.1）は、ＡＴＰの生成を触媒する；ヌクレオチドリン酸塩キナーゼ（EC2.7.4.4）は、それぞれのヌクレオシド二リン酸塩を生成し得る；クレアチンリン酸塩キナーゼ（EC2.7.3.2）；ミオキナーゼ（EC2.7.4.3）；Ｎ−アセチルグルコサミンアセチルキナーゼ（EC2.7.1.59）；アセチルリン酸塩キナーゼ；およびピルビン酸塩キナーゼ（EC2.7.1.40）。
【００８５】
Ｃ．組換えヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質を発現するための発現カセットおよび宿主細胞
【００８６】
本発明の融合タンパク質は、種々の宿主細胞中で、例えば大腸菌、その他の細菌宿主および酵母中で発現され得る。宿主細胞は、好ましくは微生物、例えば酵母細胞、細菌細胞または糸状真菌細胞である。適切な宿主細胞の例としては、アゾトバクター属（例えばアゾトバクタービネランディーA. vinelandii）、シュードモナス属、リゾビウム属、エルウィニア属、エスケリキア属（例えば大腸菌）、バシラス、シュードモナス、プロテウス、サルモネラ、セラチア、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ、パラコッカスおよびクレブシエラ属等が挙げられる。細胞は、いくつかの属のいずれかのものであり、例としては、サッカロミセス（例えばビール酵母菌）、カンジダ（例えばカンジダ属酵母C. utilis、カンジダパラプシロス、カンジダクルセイ、カンジダベルサチリス、カンジダリポリチカ、カンジダゼイラノイデス、カンジダグイリエルモンジイ、カンジダアルビカンスおよびカンジダフミコラ）、ピチア（例えばファリノサおよびピチアオーメリ）、トルロプシス（例えばトルロプシスカンジダ、トルロプシススフェリカ、トルロプシスキシリヌス、トルロプシスファマタおよびトルロプシスベルサチリス）、デバリオミセス（例えばデバリオミセスサブグロボズス、デバリオミセスカンタレリイ、デバリオミセスグロボズス、デバリオミセスハンセニイおよびデバリオミセスヤポニクス）、チゴサッカロミセス（例えばチゴサッカロミセスロウキシイおよびチゴサッカロミセスバリイ）、クルイベロミセス（例えばクルイベロミセスマルキシア）、ハンセヌラ（例えばハンセヌラアノマラおよびハンセヌラヤジニイ）およびブレッタノミセス（例えばブレッタノミセスラムビクスおよびブレッタノミセスアノマルス）が挙げられる。有用な細菌の例としては、エスケリキア、エンテロバクター、アゾトバクター、エルウィニア、クレブシエラが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
典型的にはα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、望ましい宿主細胞中で機能性であるプロモーターの制御下に置かれる。非常に広範な種々のプロモーターが周知であり、特定の用途によって、本発明の発現ベクター中で用いられ得る。普通は、選択されるプロモーターは、プロモーターが活性であるべき細胞によっている。その他の発現制御配列、例えばリボソーム結合部位、転写終結部位等も任意に含まれる。１つまたは複数のこれらの制御配列を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。したがって本発明は、融合タンパク質をコードする核酸が望ましい宿主細胞中での高レベルの発現のために組入れられる発現カセットを提供する。
【００８８】
特定の宿主細胞中で用いるのに適した発現制御配列はしばしば、その細胞中で発現される遺伝子をクローニングすることにより得られる。リボソーム結合部位配列と一緒に転写開始のためのプロモーターを任意にオペレーターを伴って含むことを本明細書中で定義されている一般的に用いられる原核生物制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Change et al., Nature (1977) 198: 1056）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057）、ｔａｃプロモーター（DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80: 21-25）およびλ−誘導ＰLプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake et al., Nature (1981) 292: 128）のような一般的に用いられるプロモーターを含む。特定のプロモーター系は本発明には重要でなく、原核生物中で機能する任意の利用可能なプロモーターが用いられ得る。
【００８９】
大腸菌以外の原核生物細胞中でのα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の発現のためには、特定の原核生物種中で機能するプロモーターが必要とされる。このようなプロモーターは、その種からクローン化された遺伝子から得られるか、あるいは異種プロモーターが使用され得る。例えばハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターは、大腸菌のほかにバシラス中で機能する。
【００９０】
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、本発明の発現カセット中に便利に含まれる。例えば大腸菌中のＲＢＳは、開始コドンの3〜11ヌクレオチド上流に位置する3〜9ヌクレオチド長のヌクレオチド配列から成る（Shine and Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, In Biological regulation and development: Gene expression (ed. R.F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NY）。
【００９１】
酵母におけるα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の発現のために、便利なプロモーターはＧＡＬ１−１０（Johnson and Davies (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 1440-1448）、ＡＤＨ２（Russel et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 2674-2682）、ＰＨＯ５（EMBO J. (1982) 6: 675-680）およびＭＦα（Herskowitz and Oshima (1982) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (eds. Strathern, Johes, and Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor N.Y., pp. 181-209）を含む。酵母に用いるための別の適切なプロモーターは、Cousens et al., Gene 61: 265-275 (1987)に記載されたようなＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。糸状真菌、例えば真菌アスペルギルス属の菌株（米国特許第4,935,349号（McKnight等））に関しては、有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニデュランス解糖遺伝子由来のもの、例えばＡＤＨ３プロモーター（McKnight et al., EMBO J. 4: 2093-2099 (1985)）およびｔｐｉプロモーターを含む。適切なターミネーターの例はＡＤＨ３ターミネーターである（McKnight et al.）。
【００９２】
構成または調節プロモーターが、本発明において用いられ得る。調節プロモーターは、融合タンパク質の発現が誘導される前に宿主細胞が高密度に増殖され得るため、有益であり得る。異種タンパク質の高レベル発現は、いくつかの情況において細胞増殖を遅くする。誘導プロモーターは、環境または発生因子、例えば温度、ｐＨ、嫌気性または好気性条件、光、転写因子および化学物質により発現のレベルが変えられる場合、遺伝子の発現を指図する。このようなプロモーターは本明細書中では「誘導」プロモーターと呼ばれるが、これは、繰りトラまたはヌクレオチド糖合成に関与する酵素の発現の時機を制御するのを可能にする。大腸菌およびその他の細菌宿主細胞に関しては、誘導プロモーターは当業者に既知である。これらの例としては、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージλＰLプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 80: 21）およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.; Tabor et al. (1985) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 82: 1074-8）が挙げられる。これらのプロモーターおよびそれらの使用は、Sambrook et al.（上記）で考察されている。原核生物における発現のための特に好ましい誘導プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする単数または複数の遺伝子から得られるプロモーター構成成分（例えばＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）からのプロモーター）に連結されたｔａｃプロモーター構成成分を含む二重プロモーターである。二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターは、ＰＣＴ特許出願公開WO98/20111に記載されている。
【００９３】
適切な宿主細胞中に置かれた場合に、ポリヌクレオチドの発現を駆動する遺伝子発現制御シグナルに操作可能的に連結された当該ポリヌクレオチドを含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。本発明の融合タンパク質をコードする発現カセットはしばしば、宿主細胞中への導入のために発現ベクター中に入れられる。ベクターは典型的には、発現カセットのほかに、１つまたは複数の宿主細胞中で独立してベクターを複製させる核酸配列を含む。一般にこの配列は、宿主染色体ＤＮＡから独立してベクターを複製させるものであり、複製の起点または自律的複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌に関して周知である。例えばプラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適している。あるいはベクターは、宿主細胞ゲノム相補体中に組み込まれるようになり、そして細胞がＤＮＡ複製を経ると複製されることにより複製され得る。酵素の発現のための好ましい発現ベクターは、細菌細胞においてはｐＴＧＫであり、これは二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、そしてＰＣＴ特許出願公開WO98/20111に記載されている。
【００９４】
ポリヌクレオチド構築物の構築は一般に、細菌中で複製し得るベクターの使用を要する。細菌からのプラスミドの生成のために、きわめて多数のキットが市販されている（例えばEasyPrepJ、FlexiPrepJ（ともにPharmacia Biotech）；StrataCleanJ（Stratagene）；ならびにQIAexpress Expression System（Qiagen）参照）。単離および精製プラスミドは次にさらに操作されて他のプラスミドを産生し、細胞をトランスフェクトするために用いられ得る。ストレプトミセスまたはバシラスにおけるクローニングも可能である。
【００９５】
選択マーカーがしばしば、本発明のポリヌクレオチドを発現するために用いられる発現ベクター中に組入れられる。これらの遺伝子は、選択培地中で増殖される形質転換化宿主細胞の生存または増殖に必要な遺伝子産物、例えばタンパク質をコードし得る。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しない。典型的選択遺伝子は、抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。あるいは選択マーカーは、栄養要求性欠損を補足するかまたは複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えばバシラスに関してはその遺伝子はＤ−アラニンラセマーゼをコードする。しばしばベクターは、例えば宿主細胞中に導入される前にベクターが複製される大腸菌またはその他の細胞中で機能性である一選択マーカーを有する。多数の選択マーカーが当業者に既知であり、例えばSambrook et al.（上記）に記載されている。
【００９６】
１つまたは複数の上記の構成成分を含有する適切なベクターの構築は、上記の参考文献に記載されているような標準結繋技法を用いる。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、合わせられ、所望される形態で再結繋されて、必要とされるプラスミドを生成する。構築されたプラスミド中の正しい配列を確証するために、標準技法により、例えば既知の方法に従った制限エンドヌクレアーゼ消化および／またはシーケンシングにより、プラスミドは分析され得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技法は、当該技術分野で既知である。組換え核酸の構築に適した広範な種々のクローニングおよびin vitro増幅法は、当業者に周知である。これらの技法の例ならびに多数のクローニング実習により当業者を指導するのに十分な使用説明書は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)；ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement)(Ausubel)に見出される。
【００９７】
本発明の発現ベクターを構築するための出発物質として用いるのに適した種々の一般的ベクターは、当該技術分野で周知である。細菌におけるクローニングに関しては、一般的ベクターとしてはｐＢＲ３２２由来ベクター、例えばｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴTM、ならびにλファージ由来ベクターが挙げられる。酵母においては、ベクターとしては酵母組込みプラスミド（例えばＹＩｐ５）および酵母複製プラスミド（ＹＲｐシリーズプラスミド）ならびにｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳類細胞中での発現は、種々の一般的に利用可能なプラスミド、例えばｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩおよびｐ９１０２３、ならびに溶菌性ウイルスベクター（例えばワクチンウイルス、アデノウイルスおよびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えばウシパピローマウイルス）およびレトロウイルスベクター（例えばネズミレトロウイルス）を用いて達成され得る。
【００９８】
選択宿主細胞中への発現ベクターの導入方法は特に重要ではなく、このような方法は当業者に既知である。例えば発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換により原核生物細胞、例えば大腸菌中に、そしてリン酸カルシウム処理または電気穿孔により真核生物細胞中に導入され得る。その他の形質転換方法も適している。
【００９９】
発現を増強するために、翻訳カップリングが用いられ得る。本戦略は、翻訳系に固有の高度発現遺伝子由来の短い上流オープンリーディングフレームを用いるが、これはプロモーターおよびリボソーム結合部位の下流に置かれ、2〜3つのアミノ酸コドンの後に終結コドンが従う。終結コドンの直前は二次リボソーム結合部位であり、終結コドン後は翻訳の開始のための出発コドンである。本系はＲＮＡ中の二次構造を解明し、翻訳の効率的開始を可能にする（Squires, et al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 16297-16302参照）。
【０１００】
α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、細胞内で発現され、あるいは細胞から分泌され得る。細胞内発現はしばしば、高収率を生じる。必要な場合、可溶性活性融合タンパク質の量は、再フォールディング手法を実施することにより増大され得る(例えばSambrook et al.（上記）；Marston et al., Bio/Technology (1984) 2: 800；Schoner et al., Bio/Technology (1985) 3: 151参照)。α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質が細胞から周縁細胞質にまたは細胞外液中に分泌される実施形態では、ＤＮＡ配列は切断シグナルペプチド配列に連結される。シグナル配列は、細胞膜を介しての融合タンパク質の転位を指図する。プロモーター−シグナル配列単位を含有する大腸菌中で用いるための適切なベクターの一例はｐＴＡ１５２９であり、これは大腸菌ｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配列を有する（例えばSambrook et al.（上記）；Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 7212；Talmadge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 3988；Takahara et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2670参照）。別の実施形態では、融合タンパク質は、精製、分泌または安定性を促進するために、例えばプロテインＡまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のサブ配列と融合される。
【０１０１】
本発明のα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質はまた、他の細菌タンパク質にさらに連結され得る。正常原核生物制御配列が転写および翻訳を指図するため、このアプローチはしばしば高収率を生じる。大腸菌では、ｌａｃＺ融合はしばしば異種タンパク質を発現するために用いられる。適切なベクター、例えばｐＵＲ、ｐＥＸおよびｐＭＲ１００シリーズは、容易に入手可能である（例えばSambrook et al.（上記）参照）。ある種の用途に関しては、精製後に融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼおよび／または付属酵素アミノ酸を切断するのが望ましい。これは、当該技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかにより、例えば臭化シアン、プロテアーゼによる、または因子Ｘaによる切断により達成され得る（例えばSambrook et al.（上記）；Itakura et al., Science (1977) 198: 1056；Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 106；Nagai et al., Nature (1984) 309: 810；Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 561参照）。切断部位は、所望の切断点で融合タンパク質に関する遺伝子に工学処理され得る。
【０１０２】
単一発現ベクター中に多転写化セットを入れることにより、またはクローニング戦略において用いられる発現ベクターの各々に対して異なる選択マーカーを利用することにより、1つより多い組換えタンパク質が単一宿主細胞中で発現され得る。
【０１０３】
それらのＮ末端の完全性を保持する大腸菌からの組換えタンパク質を得るための適切な系は、Miller et al. Biotechnology 7: 698-704 (1989)により記載されている。この系では、当該遺伝子は、ペプチターゼ切断部位を含有する酵母ユビキチン遺伝子の最初76残基へのＣ末端融合物として生成される。2つの部分の接合部での切断は、無傷真正Ｎ末端残基を有するタンパク質の産生を生じる。
【０１０４】
Ｄ．α−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製
【０１０５】
本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、細胞内タンパク質として、または細胞から分泌されるタンパク質として発現され、そしてこの形態で、本発明の方法に用いられ得る。例えば発現細胞内または分泌ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質を含有する粗製細胞抽出物は，本発明の方法に用いられ得る。
【０１０６】
あるいはヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、当該技術分野の標準手法、例えば硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等に従って精製され得る(一般的にはR. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)参照)。少なくとも約70〜90％の均質性の実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。精製タンパク質は、例えば抗体産生のための免疫原としても用いられ得る。
【０１０７】
本発明のヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の精製を促すために、融合タンパク質をコードする核酸は、アフィニティー結合試薬が入手可能なエピトープまたは「タグ」，即ち精製タグに関するコード配列も含み得る。適切なエピトープの例としては、ｍｙｃおよびＶ−５レポーター遺伝子が挙げられる；これらのエピトープを有する融合タンパク質の組換え的産生に有用な発現ベクターは、市販されている（例えばInvitrogen（Carlsbad CA）ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓは哺乳類細胞中での発現に適している）。本発明のヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質にタグを取り付けるのに適している付加的発現ベクターおよび対応する検出系は当業者に既知であり、そしていくつかは市販されている（例えば“ＦＬＡＧ”（Kodak, Rochester NY））。適切なタグの別の例はポリヒスチジン配列であり、これは金属キレートアフィニティーリガンドへの結合を可能にする。典型的には6個の隣接ヒスチジンが用いられるが、しかし6個より多いかまたは少ないものを使用し得る。ポリヒスチジンタグのための結合部分として役立ち得る適切な金属キレートアフィニティーリガンドとしては、ニトリロ−トリ−酢酸（ＮＴＡ）が挙げられる（”Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents” In Genetic Engineering: Principles and Methods, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY；Qiagen (Santa Clarita, CA)から市販）。
【０１０８】
精製タグは、マルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に既知である。デンプン結合ドメインは、WO 99/15636に記載されている（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導樹脂を用いたデンプン結合ドメインを含む融合タンパク質のアフィニティー精製は、USSN 60/468,374（2003年5月5日提出）に記載されている（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）。
【０１０９】
タグとして用いるのに適したその他のハプテンは当業者に既知であり、例えばHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR)に記載されている。例えばジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン、バルビツレート（例えば米国特許第5,414,085号参照）およびいくつかの種類の蛍光体は、これらの化合物の誘導体の場合と同様に、ハプテンとして有用である。キットは、ハプテンおよびその他の部分をタンパク質およびその他の分子に連結するために市販されている。例えばハプテンがチオールを含む場合、ヘテロ二機能性リンカー、例えばＳＭＣＣを用いて、捕獲試薬上に存在するリシン残基にタグを結合し得る。
【０１１０】
修飾は、それらの生物学的活性を減少させることなくα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ触媒または機能性ドメインに対してなされ得る、と当業者は認識する。いくつかの修飾は、クローニング、発現または融合タンパク質中への触媒ドメインの組入れを促すためになされ得る。このような修飾は当業者に周知であり、例としては例えば開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニンを、あるいは便利に配置された制限酵素部位または末端コドンまたは精製配列を作製するためにいずれかの末端上に置かれた付加的アミノ酸(例えばポリＨｉｓ)を提供するための触媒ドメインをコードするポリヌクレオチドのいずれかの末端でのコドンの付加が挙げられる。
【０１１１】
Ｅ．ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質の使用
【０１１２】
本発明は、ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質、ならびに糖タンパク質、糖脂質およびオリゴ糖部分を酵素的に合成するためのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の使用方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ、アクセプター基質およびドナー基質、ならびに典型的には可溶性二価金属陽イオンを含む反応培地中で起こる。いくつかの実施形態では、付属酵素および付属酵素触媒部分のための基質も、付属酵素がヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼに対するドナー基質を合成し得るよう、存在する。
【０１１３】
所望のオリゴ糖を有する糖タンパク質および糖脂質を合成するためのグリコシルトランスフェラーゼの多数の使用方法が既知である。例示的方法は、例えばWO 96/32491、Ito et al. (1993) Pure Appl. Chem. 65: 753、ならびに米国特許第5,352,670号、第5,374,541号および第5,545,553号に記載されている。
【０１１４】
本明細書中に記載されたように調製されるヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質は、付加的グリコシルトランスフェラーゼと組合せて用いられ得る。例えば組換えシアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質と組換えヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの組合せを用い得る。単一容器中で次から次に2つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を実行することにより、全体的収率は、中間産物種が単離される手法を上回って改良される。さらに余分の溶媒および副産物の一掃および廃棄は低減される。同様に組換えグリコシルトランスフェラーゼは組換え付属酵素とともに用いられ、これらは融合タンパク質として存在することもしないこともあり得る。他の実施形態では、ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼおよび付加的グリコシルトランスフェラーゼまたは付属酵素は同一細胞中で産生され、所望の目的生成物を合成するために用いられる。
【０１１５】
上記の方法により産生される生成物は、精製せずに用いられ得る。しかしながら標準的な周知の技法、例えば薄層または厚層クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは膜濾過が、グリコシル化糖の回収のために用いられ得る。さらにまた、本発明の譲渡人に譲渡されたＡＵ特許第735695号に記載されているような例えばナノ濾過または逆浸透膜を利用する膜濾過が用いられ得る。さらなる例として、膜が約1000〜約10,000ダルトンの分子量カットオフを有する膜濾過を用いて、タンパク質を除去し得る。別の例として、ナノ濾過または逆浸透圧は次に、塩を除去するために用いられ得る。ナノ濾過膜は、用いられる膜によって、一価塩を通すが、しかし多価塩ならびに約200〜約1000ダルトンより大きい非荷電溶質を保持する逆浸透膜の一種である。したがって例えば本発明の組成物および方法により産生されるオリゴ糖は膜中に保持され、そして夾雑塩は通り抜ける。
【０１１６】
Ｆ．ドナー基質およびアクセプター基質
【０１１７】
本発明の方法においてヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質およびその他のグリコシルトランスフェラーゼにより用いられる適切なドナー基質としては、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡおよびＣＭＰ−シアル酸が挙げられるが、これらに限定されない（Guo et al., Applied Biochem. And Biotech. 68: 1-20 (1997)）。
【０１１８】
本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法により用いられる適切なアクセプター基質としては、多糖、オリゴ糖、脂質および糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。例えばオリゴ糖ＬＮｎＴは、ＬＮＦＩＩＩを生成するためにフコシル化され得る。本明細書中に記載されたフコシルトランスフェラーゼは、多酵素系にも用いられて、便利な出発物質から望ましい生成物を生成し得る。例えばＬＮＦＩＩＩは、本明細書中に記載された菌株１１８２からのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを、ナイセリアゴノコッカス菌のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）およびナイセリアゴノコッカスβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）と組合せて用いて、マルチグラムスケールで調製された。
【０１１９】
本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法により用いられる適切なアクセプター基質としては、タンパク質、脂質、ガングリオシドおよび本発明の方法により修飾され得るその他の生物学的構造物（例えば全細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法により修飾され得る例示的構造物としては、表１に記述されたような当業者に既知の細胞上の任意の多数の糖脂質、糖タンパク質および炭水化物構造物が挙げられる。
【０１２０】
【表１】
2005533525.tif 000002
【０１２１】
フコシルトランスフェラーゼ触媒反応に用いられる適切なアクセプター基質の例、ならびにシアリルトランスフェラーゼ触媒反応に用いられる適切なアクセプター基質の例は、Guo et al., Applied Biochem. And Biotech. 68: 1-20 (1997)に記載されているが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明は、望ましいオリゴ糖部分を有する糖タンパク質および糖脂質を産生するそれらの能力に関して選択されるヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質(例えばフコシルトランスフェラーゼ)を提供する。同様に、存在する場合、所望の活性化糖基質にまたは生成物オリゴ糖上に見出される糖に基づいて、付属酵素が選択される。
【０１２３】
種々の量の当該ヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質（例えば0.01〜100 mU/mgタンパク質）を当該融合タンパク質によるグリコシル化のための潜在的アクセプター部位を有するオリゴ糖に連結される糖タンパク質（例えば1〜10 mg/mlで）と反応させることにより、適切なヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質を容易に同定し得る。所望のアクセプター部位に糖残基を付加する本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質の能力が比較され、そして所望の特性（例えばアクセプター基質特異性または触媒活性）を有するヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質が選択される。
【０１２４】
概して、所望のオリゴ糖部分を有する糖タンパク質および糖脂質の酵素的合成の効率は、本発明の組換え的に産生されたヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の使用により増強され得る。組換え技法は、大規模糖タンパク質および糖脂質修飾に必要とされる大量の組換えヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼタンパク質の産生を可能にする。
【０１２５】
本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法により用いるための適切な糖タンパク質および糖脂質は、グリコシル化反応中に固体支持体上に固定される糖タンパク質および糖脂質であり得る。「固体支持体」という用語は、半固体支持体も包含する。好ましくは標的糖タンパク質または糖脂質は、グリコシル化反応が完了された後にそれぞれの糖タンパク質または糖脂質が放出され得るよう、可逆的に固定される。多数の適切なマトリックスが当業者に既知である。例えばイオン交換は、グリコシル化反応が進行する間、適切な樹脂上に糖タンパク質または糖脂質を一時的に固定するために用いられ得る。当該糖タンパク質または糖脂質と特異的に結合するリガンドも、親和性ベースの固定のために用いられ得る。例えば糖タンパク質と特異的に結合する抗体が適している。さらにまた当該糖タンパク質がそれ自体抗体であるかまたはその断片を含有する場合、親和性樹脂としてプロテインＡまたはＧを用い得る。当該糖タンパク質または糖脂質と特異的に結合する染料およびその他の分子も適している。
【０１２６】
本発明の組換え融合タンパク質は、タンパク質の精製を促す分子「タグ」、即ち精製タグを一端に有する融合タンパク質として構築され、発現され得る。このようなタグは、グリコシル化反応中の当該タンパク質の固定化のためにも用いられ得る。適切なタグとしては、抗体により特異的に認識されるタンパク質配列である「エピトープタグ」が挙げられる。エピトープタグは一般に、融合タンパク質を明白に検出するかまたは単離するための容易に利用可能な抗体の使用を可能にするために、融合タンパク質中に組入れられる。「ＦＬＡＧタグ」は、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓまたはその実質的に同一の変異体から成る、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体により特異的に認識される一般的に用いられるエピトープタグである。ｍｃｙタグは、もうひとつの一般的に用いられるエピトープタグである。その他の適切なタグは当業者に既知であり、例としては、例えばアフィニティータグ、例えばヘキサヒスチジンペプチドが挙げられ、これは金属イオン、例えばニッケルまたはコバルトイオンと結合する。精製タグは、マルトース結合ドメインおよびデンプン結合ドメインも含む。マルトース結合ドメインタンパク質の精製は、当業者に既知である。デンプン結合ドメインは、WO 99/15636（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。βシクロデキストリン（ＢＣＤ）誘導樹脂を用いたデンプン結合ドメインを含む融合タンパク質のアフィニティー精製は、USSN 60/468,374（2003年5月5日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１２７】
好ましくは、糖タンパク質が全長糖タンパク質の切頭化バージョンである場合、それは好ましくは全長糖タンパク質の生物学的に活性なサブ配列を含む。例示的生物学的活性サブ配列としては、酵素活性部位、受容体結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域および抗原の抗原性領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法を用いて、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖タンパク質または糖脂質を酵素的に合成する。糖タンパク質および糖脂質は、糖形態変化が望ましいタンパク質、糖タンパク質、質または糖脂質に結合される単糖またはオリゴ糖を含む。単糖またはオリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプター基質として機能し得る構造を含む。アクセプター基質がグリコシル化されると、所望のオリゴ糖部分が形成される。所望のオリゴ糖部分は、それが結合される糖タンパク質または糖脂質に所望の生物学的活性を付与するものである。本発明の組成物において、予め選択された糖残基は、当該潜在的アクセプター部位の少なくとも約30％と連結される。さらに好ましくは予備選択糖残基は、当該潜在的アクセプター部位の少なくとも約50％と連結され、さらに好ましくは当該潜在的アクセプター部位の少なくとも約70％と連結される。出発糖タンパク質または糖脂質が当該オリゴ糖部分において異質性を示す（例えば出発糖タンパク質または糖脂質上のオリゴ糖のいくつかが当該アクセプター基質に結合された前選択糖残基をすでに有する）状況では、列挙されたパーセンテージはこのような前結合糖残基を含む。
【０１２９】
「変更された」という用語は、本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法の適用後に、最初に生成されたように糖タンパク質上に観察されたものとは異なるグリコシル化パターンを有する当該糖タンパク質または糖脂質を指す。このような糖複合体の一例は、糖タンパク質の糖形態が、糖タンパク質が固有のものである生物体の細胞により産生される場合、糖タンパク質上に見出されるものと異なる糖タンパク質である。ネイティブ糖複合体が産生される細胞と同一のまたは異なる種のものであり得る宿主細胞により最初に産生されたような糖複合体のグリコシル化パターンと比較して、これらの糖複合体のグリコシル化パターンが修飾される糖タンパク質および糖脂質を酵素的に合成するためにこのような融合タンパク質を使用するヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法も提供される。
【０１３０】
糖タンパク質および糖脂質の構造分析によるだけでなく、糖複合体の１つまたは複数の生物学的活性の比較によっても、グリコシル化パターンの差を査定し得る。例えば「糖形態変更」を示す糖タンパク質としては、非修飾化糖タンパク質と比較して、グリコシル化反応後に糖タンパク質の1つより多い生物学的活性の改善を示すものが挙げられる。例えば変更糖複合体としては、本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼおよび方法の適用後に、当該リガンドまたは受容体に対するより大きい結合親和性、より大きい治療半減期、抗原性低減および特定組織に対するターゲッティングを示すものが挙げられる。観察された改善の量は好ましくは統計学的に有意であり、さらに好ましくは少なくとも約25％改善であり、さらに好ましくは少なくとも約50％、60％、70％であり、さらに好ましくは少なくとも80％である。
【０１３１】
Ｇ．フコシルトランスフェラーゼ反応
ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質、アクセプター基質、ドナー基質およびその他の反応混合物成分、例えばその他のグリコシルトランスフェラーゼおよび付属酵素は、水性反応媒質中での混和により併合される。媒質は一般に、約5〜約8.5のｐＨ値を有する。媒質の選択は、所望レベルにｐＨ値を保持する媒質の能力に基づいている。したがっていくつかの実施形態では、媒質は約7.5のｐＨ値に緩衝される。緩衝剤が用いられない場合、媒質のｐＨは、用いられる特定のグリコシルトランスフェラーゼによって、約5〜8.5に保持される必要がある。フコシルトランスフェラーゼに関しては、ｐＨ範囲は好ましくは約6.0〜8.0に保持される。シアリルトランスフェラーゼに関しては、その範囲は好ましくは約5.5〜7.5である。
【０１３２】
酵素の量または濃度は、触媒作用の初期速度の測定値である活性単位で表される。1活性単位は、所定の温度（典型的には37℃）およびｐＨ値（典型的には7.5）で1 μmolの生成物／分の生成を触媒する。したがって37℃の温度で、7.5のｐＨ値で1分で10 μmolの基質が10 μmolの生成物に転化される場合、10単位の酵素がその酵素の触媒量である。
【０１３３】
反応混合物は、二価金属陽イオン（Ｍｇ2+、Ｍｎ2+）を含み得る。反応媒質は、必要な場合、可溶化洗剤（例えばトリトンまたはＳＤＳ）、ならびに有機溶媒、例えばメタノールまたはエタノールも含み得る。酵素は溶液中に遊離して利用され得るか、あるいはポリマーのような支持体に結合され得る。したがって反応混合物は初めは実質的に均質であるが、しかし反応中に多少の沈殿が生じ得る。
【０１３４】
上記方法が実行される温度は、凍結直前からほとんどの感受性酵素が変性する温度までの範囲であり得る。その温度範囲は、好ましくは約0℃〜約45℃、さらに好ましくは約20℃〜約37℃である。
【０１３５】
そのように生成された反応混合物は、所望のオリゴ糖生成物、例えばグリコシル化される糖タンパク質に結合されたオリゴ糖基上に存在する決定因子の所望の高収量を得るのに十分な時間の間保持される。大規模製造のためには、反応はしばしば、約0.5〜240時間、さらに典型的には約1〜18時間続行される。
【０１３６】
オリゴ糖産物を得るために1つより多いグリコシルトランスフェラーゼが用いられる実施形態では、二次グリコシルトランスフェラーゼ反応のための酵素および試薬は、一旦一次グリコシルトランスフェラーゼ反応がほぼ完了した時点で、反応媒質に付加され得る。酵素のいくつかの組合せに関しては、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する基質は単一初期反応混合物中で組合され得る。このような同時反応物における酵素は好ましくは、他の酵素のためのアクセプターとして役立ち得ない生成物を生じない。単一容器中で2つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を次から次に実行することにより、中間産物種が単離される手法を上回って全体的収率が改良される。さらに余分の溶媒および副産物の一掃および廃棄は低減される。さらにいくつかの実施形態では、フコシルトランスフェラーゼおよびさらにグリコシルトランスフェラーゼまたは付属酵素は同一宿主細胞中で発現され、そして所望の生成物が宿主細胞内で合成される。
【０１３７】
１つまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実行され得る。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および説明は、記載されている。多数のグリコシルトランスフェラーゼサイクル(例えばシアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクルおよびフコシルトランスフェラーゼサイクル)が米国特許第5,374,541号およびWO 9425615Aに記載されている。その他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ichikawa et al. J. Am. Chem. Soc. 114: 9283 (1992)、Wong et al. J. Org. Chem. 57: 4343 (1992)、DeLuca, et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 5869-5870 (1995)およびIchikawa et al. In Carbohydrates and Carbohydrate Polymers. Yaltami, ed. (ATL Press, 1993)に記載されている。
【０１３８】
その他のグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼに関して詳述されたように、類似のトランスフェラーゼサイクルに置き換えられ得る。特にグリコシルトランスフェラーゼは、例えばグルコシルトランスフェラーゼ、例えばＡｌｇ８（Stagljov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5977 (1994)）またはＡｌｇ５（Heesen et al. Eur. J. Biochem. 224: 71 (1994)）、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、例えばα（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Nagata et al. J. Biol. Chem. 267: 12082-12089 (1992)およびSmith et al. J. Biol Chem. 269: 15162 (1994) and (1993)）ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（HJBC）でもあり得る。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（2.4.1.101, Hull et al.,  BBRC 176: 608 (1991)）、ＧｎＴＩＩ（Ihara et al. J. Biochem. 113: 692 (1993)）、ＧｎＴＶ（Shoreiban et al. J. Biol. Chem. 268: 15381 (1993)）、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Bierhuizen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9326 (1992)）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Rajput et al. Biochem J. 285: 985 (1992)）ならびにヒアルロナンシンターゼが挙げられる。適切なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０１３９】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関しては、当該工程に用いられる種々の反応体の濃度または量は、多数の因子、例えば反応条件、例えば温度およびｐＨ値、ならびにグリコシル化されるアクセプター糖の選択および量によっている。グリコシル化工程が活性化ヌクレオチドの再生、活性化ドナー糖、ならびに触媒量の酵素の存在下での産生ＰＰｉの掃去を可能にするため、当該工程は上記の化学量論的基質の濃度または量により限定される。本発明の方法に従って用いられ得る反応体の濃度に関する上限は、このような反応体の溶解度により確定される。
【０１４０】
好ましくは活性化ヌクレオチド、リン酸塩ドナー、ドナー糖および酵素の濃度は、アクセプターが消費されるまでグリコシル化が続行するよう選択される。
【０１４１】
酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度によって、ならびに反応条件、例えば温度、時間およびｐＨ値によって変わる。予備選定基質濃度および反応条件下で所定の酵素に関する触媒量を確定するための手段は、当業者に周知である。
【０１４２】
フコシルトランスフェラーゼ反応は、アクセプター分子としてオリゴ糖または多糖を用いて実行され得る。本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法により用いられる適切なアクセプター基質としては、多糖、オリゴ糖、脂質および糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。例えばオリゴ糖ＬＮｎＴはフコシル化されて、ＬＮＦＩＩＩを生成する。本明細書中に記載されたフコシルトランスフェラーゼは、便利な出発物質から所望の生成物を生成するために多酵素系でも用いられ得る。例えばＬＮＦＩＩＩは、本明細書中に記載された菌株１１８２からのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを、ナイセリアゴノコッカス菌のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）およびナイセリアゴノコッカスβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）と組合せて用いて、マルチグラムスケールで調製された。
【０１４３】
本発明の方法に用いられる組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質は、当該フコシルトランスフェラーゼアクセプター基質をフコシルかするその能力に基づいて選択される。好ましくはフコシルトランスフェラーゼは、可溶性単糖またはオリゴ糖に結合されるフコシルトランスフェラーゼアクセプター基質を用いて、適合性に関して検定される。フコシルトランスフェラーゼ活性を確定するための検定における可溶性単糖またはオリゴ糖アクセプター基質の使用は、所望のオリゴ糖産物を生成するフコシルトランスフェラーゼの選択を可能にする。
【０１４４】
フコシルトランスフェラーゼ反応は、アクセプター分子として脂質または糖脂質を用いて実行され得る。多数の糖は、生物学的活性を示すために、特定のフコシル化構造物の存在を要する。細胞間認識メカニズムはしばしば、フコシル化オリゴ糖を要する。例えば細胞接着分子として機能する多数のタンパク質、例えばＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチンは、特定の細胞表面フコシル化炭水化物構造、例えばシアリルルイスｘおよびシアリルルイス−ａ構造を結合する。さらにＡＢＯ血液型系を形成する特定の炭水化物構造はフコシル化される。3つの群の各々における炭水化物構造は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１−二糖単位を共有する。血液型Ｏ構造では、この二糖は末端構造である。血液型Ａ構造は、二糖に末端ＧａｌＮＡｃ残基を付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼにより形成される。血液型Ｂ構造は、末端ガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼにより形成される。
ルイス血液型構造もフコシル化される。例えばルイスｘおよびルイスａ構造は、それぞれＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これらの構造はともにさらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）されて、対応するシアリル化構造を形成し得る。その他の当該ルイス血液型構造は、ルイスｙおよびルイスｂ構造であり、これらはそれぞれＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲである。ＡＢＯおよびルイス血液型構造ならびにそれらの合成に関与する酵素の構造の説明に関しては、Essentials of Glycobiology, Varki et al. eds., Chapter 16 （Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999）を参照されたい。
【０１４５】
本発明の方法に用いられる組換えフコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、当該フコシルトランスフェラーゼアクセプター基質をフコシル化するその能力に基づいて選択される。好ましくはフコシルトランスフェラーゼは、脂質または糖脂質に結合されるフコシルトランスフェラーゼアクセプター基質を用いて、適合性に関して検定される。フコシルトランスフェラーゼ活性を確定するための検定における可溶性オリゴ糖の一部であるアクセプター基質というよりむしろ、糖脂質結合アクセプター基質の使用は、糖脂質上に選定フコシル化パターンを生成するフコシルトランスフェラーゼの選択を可能にする。
【０１４６】
フコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプターの特定のヒドロキシルにフコース残基を転移する合成経路に用いられてきた。例えばIchikawaは、クローン化フコシルトランスフェラーゼによるシアリル化ラクトサミンのフコシル化を包含する方法によりシアリルルイス−Ｘを調製した（Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992)）。Loweは、細胞中で非ネイティブフコシル化活性を発現し、それにより細胞表面にフコシル化糖タンパク質を産生するための方法等を記載している（米国特許第5,955,347号）。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の方法は、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を有する基質を、フコースドナー部分、フコシルトランスフェラーゼならびにフコシルトランスフェラーゼ活性に必要とされるその他の試薬を含む反応混合物と接触させることにより実行される。基質は、フコースドナー部分からフコシルトランスフェラーゼアクセプター部分にフコースを転移するために十分な時間および適切な条件下で反応混合物中でインキュベートされる。好ましい実施形態では、フコシルトランスフェラーゼは、組成物中のフコシルトランスフェラーゼのそれぞれのアクセプター部分の少なくとも60％のフコシル化を触媒する。
【０１４８】
選択基質に対する特異性は、好ましいフコシルトランスフェラーゼが満たす必要がある第一判定基準に過ぎない。本発明の方法に用いられるフコシルトランスフェラーゼは、好ましくは種々の基質を効率的にフコシル化し、そして少なくとも約500 mgの基質のフコシル化を可能にするために反応の増大を支持することもできる。さらに好ましくはフコシルトランスフェラーゼは、相対的に低い経費および基本的施設要件で、少なくとも約1 kgの、さらに好ましくは少なくとも10 kgの基質の合成を可能にするためのフコシル化反応の規模を支持する。
【０１４９】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼ触媒性結合のための適切なアクセプター部分としては、ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ（ここで、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸、単糖、オリゴ糖またはアグリコン基である）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒは基質に結合されるかまたは基質の一部である。特定の反応のための適切なフコシルトランスフェラーゼは、望ましいフコース結合の型（例えばα２、α３またはα４）、特定の当該アクセプター、ならびにフコシル化の所望の高収率を達成するフコシルトランスフェラーゼの能力に基づいて選択される。適切なフコシルトランスフェラーゼおよびそれらの特性は上記されている。
【０１５０】
組成物中の十分な割合の基質結合オリゴ糖がフコシルトランスフェラーゼアクセプター部分を含まない場合、適切なアクセプターを合成し得る。例えばフコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターを合成するための好ましい一方法は、基質結合オリゴ糖上に存在するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプター部分にＧｌｃＮＡｃ残基を結合するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を包含する。好ましい実施形態では、潜在的当該アクセプター部分の大部分をグリコシル化する能力を有するトランスフェラーゼが選択される。その結果生じるＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲは次に、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして用いられ得る。
【０１５１】
その結果生じるＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分は、フコシルトランスフェラーゼ反応の前にガラクトシル化されて、例えばＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基を生じ得る。いくつかの実施形態では、ガラクトシル化およびフコシル化過程は同時に実行され得る。ガラクトシル化アクセプターを要するフコシルトランスフェラーゼを選択することにより、所望の生成物のみが生成される。したがってこの方法は、以下の過程を包含する：
（ａ）化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを生成するのに十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物をガラクトシル化し、そして
（ｂ）以下の：
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃｌβ−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃｌβ−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ１、α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ
から選択される化合物を生成するのに十分な条件下で、ＧＤＰ−フコースの存在下で、フコシルトランスフェラーゼを用いて（ａ）で生成された化合物をフコシル化する。
【０１５２】
所望の活性を有する付加的フコシルトランスフェラーゼを含むことにより、上記の構造物に付加的フコース残基を付加し得る。例えば本方法は、オリゴ糖決定因子、例えばＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを生成し得る。したがって別の好ましい実施形態では、本方法は、少なくとも2つのフコシルトランスフェラーゼの使用を包含する。多数のフコシルトランスフェラーゼが、同時的にまたは逐次的に用いられる。フコシルトランスフェラーゼが逐次的に用いられる場合、多フコシル化過程間で糖タンパク質が精製されないのが、一般的に好ましい。多数のフコシルトランスフェラーゼが同時的に用いられる場合、酵素活性は2つの別個の酵素に、あるいは1つより多いフコシルトランスフェラーゼ活性を有する単一酵素に由来する。
【０１５３】
フコシルトランスフェラーゼ反応は、本発明の組換えフコシルトランスフェラーゼタンパク質を、例えばその大多数が好ましくはフコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質を含む１つまたは複数の結合オリゴ糖を有する糖タンパク質種の多重コピー；フコースドナー基質；ならびにフコシルトランスフェラーゼ活性に必要とされるその他の試薬を含む混合物と接触させることにより実行され得る。糖タンパク質は、ドナー基質からフコシルトランスフェラーゼアクセプター基質にフコースを転移するのに十分な時間、適切な条件下で反応混合物中でインキュベートされる。
【０１５４】
本発明の方法に用いられる組換えフコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、当該フコシルトランスフェラーゼアクセプター基質をフコシル化するその能力に基づいて選択される。好ましくはフコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質に結合されるフコシルトランスフェラーゼアクセプター基質を用いて適合性に関して検定される。フコシルトランスフェラーゼ活性を確定するための検定における可溶性オリゴ糖の一部であるアクセプター基質というよりむしろ、糖タンパク質結合アクセプター基質の使用は、糖タンパク質上に選定フコシル化パターンを生成するフコシルトランスフェラーゼの選択を可能にする。
【０１５５】
好ましい実施形態では、本発明の組換えフコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質は、細胞中での高レベルの発現および／または高酵素活性（例えば選択基質に対する高徳異性および／または高触媒活性）を有する。別の好ましい実施形態では、フコシルトランスフェラーゼは商業的に重要な組換えまたはトランスジェニック糖タンパク質をフコシル化するための方法において有用である。本発明の方法に用いられるフコシルトランスフェラーゼはさらにまた、好ましくは種々の糖タンパク質を効率的にフコシル化し、そして少なくとも約500 mgの糖タンパク質のフコシル化を可能にするための反応の増大を支持し得る。さらに好ましくはフコシルトランスフェラーゼは、相対的に低い経費および基本的施設要件で、少なくとも約1 kgの、さらに好ましくは少なくとも10 kgの組換え糖タンパク質の合成を可能にするためのフコシル化反応の規模を支持する。
【０１５６】
例示的一実施形態では、本発明の方法は、選択のための少なくとも１つのリガンドの糖タンパク質に関する生成を生じる。リガンドの生成の確証は、セレクチンと相互作用する糖タンパク質の能力を立証することにより、操作的に検定される。糖タンパク質と特定のセレクチンとの間の相互作用は、当業者に周知の方法により測定される（例えばJutila et al., J. Immunol. 153: 3917-28 (1994); Edwards et al., Cytometry 43(3): 211-6 (2001); Stahn et al., Glycobiology 8: 311-319 (1998); Luo et al., J. Cell Biochem. 80(4): 522-31 (2001); Dong et al., J. Biomech. 33(1): 35-43 (2000); Jung et al., J. Immunol. 162(11): 6755-62 (1999); Keramidaris et al., J. Allergy Clin. Immunol. 107(4): 734-8 (2001); Fieger et al., Biochim. Biophys. Acta 1524(1): 75-85 (2001); Breuhl et al., J. Biol. Chem. 275(42): 32642-8 (2000); Tangemann et al., J. Exp. Med. 190(7): 935-42 (1999); Scalia et al., Circ. Res. 84(1): 93-102 (1999); Alon et al., J. Cell Biol. 138(5): 1169-80 (1997); Steegmaier et al., Eur. J. Immunol. 27(6): 1339-45 (1997); Stewart et al., J. Med. Chem. 44(6): 988-1002 (2001); Schurmann et al., Gut 36(3): 411-8 (1995); Burrows et al., J. Clin. Pathol. 47(10): 939-44 (1994)参照）。
【０１５７】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼ触媒性結合のための適切なアクセプター基質としては、ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ（ここで、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸、単糖、オリゴ糖またはアグリコン基である）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒは糖タンパク質に結合されるかまたはその一部である。特定の反応のための適切なフコシルトランスフェラーゼは、望ましいフコース結合の型（例えばα２、α３またはα４）、特定の当該アクセプター、ならびにフコシル化の所望の高収率を達成するフコシルトランスフェラーゼの能力に基づいて選択される。適切なフコシルトランスフェラーゼおよびそれらの特性は上記されている。
【０１５８】
組成物中の十分な割合の糖タンパク質結合オリゴ糖がフコシルトランスフェラーゼアクセプター基質を含まない場合、適切なアクセプターを合成し得る。例えばフコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターを合成するための好ましい一方法は、糖タンパク質結合オリゴ糖上に存在するＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプター部分にＧｌｃＮＡｃ残基を結合するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を包含する。好ましい実施形態では、潜在的当該アクセプター基質の大部分をグリコシル化する能力を有するトランスフェラーゼが選択される。その結果生じるＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲは次に、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして用いられ得る。
【０１５９】
その結果生じるＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分は、フコシルトランスフェラーゼ反応の前にガラクトシル化されて、例えばＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基を生じ得る。いくつかの実施形態では、ガラクトシル化およびフコシル化過程は同時に実行され得る。したがってこの方法は、以下の過程を包含する：
（ａ）化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを生成するのに十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物をガラクトシル化し、そして
（ｂ）以下の：
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃｌβ−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃｌβ−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ１、α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ
から選択される化合物を生成するのに十分な条件下で、ＧＤＰ−フコースの存在下で、フコシルトランスフェラーゼを用いて（ａ）で生成された化合物をフコシル化する。
【０１６０】
所望の活性を有するフコシルトランスフェラーゼでフコシル化ペプチドを処理することにより、フコシル化糖タンパク質に付加的フコース残基を付加し得る。例えば本方法は、オリゴ糖決定因子、例えばＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを生成し得る。したがって別の好ましい実施形態では、本方法は、少なくとも2つのフコシルトランスフェラーゼの使用を包含する。多数のフコシルトランスフェラーゼが、同時的にまたは逐次的に用いられる。フコシルトランスフェラーゼが逐次的に用いられる場合、多フコシル化過程間で糖タンパク質が精製されないのが、一般的に好ましい。多数のフコシルトランスフェラーゼが同時的に用いられる場合、酵素活性は2つの別個の酵素に、あるいは1つより多いフコシルトランスフェラーゼ活性を有する単一酵素に由来する。
【０１６１】
Ｈ．多酵素オリゴ糖合成
上記のように、いくつかの実施形態では、2つまたはそれ以上の酵素を用いて糖タンパク質または糖脂質上に所望のオリゴ糖またはオリゴ糖決定因子を生成し得る。例えば特定のオリゴ糖決定因子は、所望の活性を示すために、ガラクトース、シアル酸およびフコースの付加を要し得る。したがって本発明は、2つまたはそれ以上の酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ、トランスシアリダーゼまたはスルホトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖決定因子の高収量合成を得る方法を提供する。
【０１６２】
好ましい一実施形態では、ＬＮＦＩＩＩは、本明細書中に記載された菌株１１８２からのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを、ナイセリアゴノコッカス菌のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）およびナイセリアゴノコッカスβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）と組合せて用いて、ラクトースから調製された。その他のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は本発明のこの実施形態に用いられ得る、と当業者は認識する。
【０１６３】
いくつかの場合、糖タンパク質−または糖脂質結合オリゴ糖は、糖タンパク質または糖脂質のin vivo生合成時に特定の当該グリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質を含む。このような糖タンパク質または糖脂質は、それぞれとタンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンの従来の修飾を伴わずに、本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法を用いてグリコシルかされ得る。しかしながら他の場合には、当該糖タンパク質または糖脂質は、適切なアクセプター基質を欠く。このような場合、本発明の方法を用いて、糖タンパク質−または糖脂質結合オリゴ糖がその場合に所望のオリゴ糖部分を生成するために予め選択された当該糖単位のグリコシルトランスフェラーゼ触媒性結合のためのアクセプター基質を含むよう糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化パターンを変更し得る。
【０１６４】
糖タンパク質−または糖脂質結合オリゴ糖は任意に、全部または一部分、先ず「トリミング」されて、グリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質あるいは適切なアクセプター基質を得るために１つまたは複数の適切な残基が付加され得る部分を曝露し得る。酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼは、結合およびトリミング反応に有用である。例えば「高マンノース」型オリゴ糖を示す糖タンパク質は、１つまたは複数の予備選択糖単位の結合時に、所望のオリゴ糖決定因子を生成するアクセプター基質を得るためにマンノシダーゼによりトリミングに付され得る。
【０１６５】
本方法は、そのネイティブ形態ではグリコシル化されないタンパク質または脂質上の所望のオリゴ糖部分を合成するためにも有用である。対応するグリコシルトランスフェラーゼのための適切なアクセプター基質は、本発明の方法を用いてグリコシル化前にこのようなタンパク質または脂質に結合され得る。グリコシル化のための適切なアクセプターを有するポリペプチドを得るための方法に関しては、米国特許第5,272,066号を参照されたい。
【０１６６】
したがっていくつかの実施形態において、本発明は、糖複合体上に存在する糖基のin vitroシアリル化のための方法であって、適切なアクセプターを作製するために糖複合体を修飾することを先ず包含する方法を提供する。所望のオリゴ糖部分の多酵素合成の好ましい方法の例を以下に示す。
【０１６７】
フコシル化およびシアリル化オリゴ糖部分
糖タンパク質に所望の生物学的活性を付与するオリゴ糖決定因子はしばしば、フコシル化されるほかに、シアリルかされる。したがって本発明は、糖タンパク質結合オリゴ糖が高収量でシアリル化され、フコシル化される方法を提供する。
【０１６８】
シアリル化は、特定の部分がα２，６−結合シアル酸を要する場合（この場合、シアリルトランスフェラーゼが用いられる）を除いて、トランス−シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを用いて成し遂げられ得る。各々の種類の酵素の適切な例は、上記されている。これらの方法は、適切なドナー基質の存在下でアクセプターと適切な酵素を接触させることにより、シアリルトランスフェラーゼまたはトランスシアリダーゼに対するアクセプターをシアリル化することを包含する。シアリルトランスフェラーゼに関しては、ＣＭＰ−シアル酸が好ましいドナー基質である。しかしながらトランス−シアリダーゼは好ましくは、トランス−シアリダーゼがシアル酸を付加し得ない脱離基を含むドナー基質を用いる。
【０１６９】
当該アクセプター基質としては、例えばＧａｌβ−ＯＲが挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ−ＯＲまたはＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ−ＯＲ（式中、Ｒは、少なくとも1この炭素原子を有するアミノ酸、単糖、オリゴ糖またはアグリコン基である）を生成するためにシアル酸がアクセプター基質の非還元末端に転移される条件下で、ＣＭＰ−シアル酸の存在下で、アクセプター基質はシアリルトランスフェラーゼと接触させられる。Ｒは、糖タンパク質に結合されるかまたはその一部である。第二のまたは多数のシアル酸残基を上記構造物に結合するために、α２，８−シアリルトランスフェラーゼも用いられ得る。
【０１７０】
シアリル化されそしてフコシル化されるオリゴ糖部分を得るために、シアリル化アクセプターは、上記のようにフコシルトランスフェラーゼと接触される。ほとんどのシアリルトランスフェラーゼはフコシル化アクセプター上で活性でないため、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ反応は一般に逐次的に実行される。しかしながらＦＴＶＩＩはシアリル化アクセプター基質上でのみ作用する。したがってＦＴＶＩＩは、シアリルトランスフェラーゼとの同時反応に用いられ得る。
【０１７１】
トランス−シアリダーゼを用いてシアリル化を成し遂げる場合、フコシル化およびシアリル化反応は、同時的に、あるいはいずれかの順に逐次的に実行され得る。修飾されるタンパク質は、適量のトランス−シアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３またはα１，４結合を作製し得る）および適切なフコシルドナー基質（例えばＧＤＰ−フコース）を含有する反応混合物とともにインキュベートされる。
【０１７２】
ガラクトシル化、フコシル化およびシアリル化オリゴ糖決定因子
本発明は、ガラクトシルかされ、フコシル化され、そしてシアリルかされるオリゴ糖部分を酵素的に合成するための方法も提供する。いずれかのシアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼ(α２，３−結合シアル酸のみに関して)がこれらの方法に用いられ得る。
【０１７３】
トランス−シアリダーゼ反応は、修飾されるタンパク質を、適量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えばＵＤＰ−ガラクトース）、トランスシアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３またはα１，４結合を作製し得る）、適切なフコシルドナー基質（例えばＧＤＰ−フコース）および二価金属イオンを含有する反応混合物とともにインキュベートすることを包含する。これらの反応は、逐次的にまたは同時的に実行され得る。
【０１７４】
シアリルトランスフェラーゼが用いられる場合、本方法は、修飾されるタンパク質を、適量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えばＵＤＰ−ガラクトース）、シリアルトランスフェラーゼ（α２，３またはα２，６）および適切なシアル酸ドナー基質（例えばＣＭＰシアル酸）を含有する反応混合物とともにインキュベートすることを包含する。反応は、実質的に完了するまで続行され、次にフコシルトランスフェラーゼ(アルファ１，３またはα１，４結合を作製し得る)および適切なフコシルドナー基質（例えばＧＤＰ−フコース）を用いる。シアリル化基質（例えばＦＴＶＩＩ）を要するフコシルトランスフェラーゼが用いられる場合、反応は同時的に実行され得る。
【０１７５】
シアリルトランスフェラーゼ反応
【０１７６】
上記のように、いくつかの実施形態において、本発明は、糖タンパク質のシアリル化後に糖タンパク質をフコシル化するためのヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および方法は、実質的に均一なシアリル化パターンを有する糖タンパク質を合成する。シアリル化糖タンパク質は次にフコシル化され、それにより成員が実質的に均一なフコシル化パターンを有するフコシル化糖タンパク質の一集団を産生する。
【０１７７】
糖タンパク質は、シアル酸ドナー基質から糖基にシアル酸を転移するのに十分な時間および適した反応条件かでシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナー基質と接触され得る。シアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質ＣＭＰ−シアル酸からアクセプターオリゴ糖基質にシアル酸を転移するグリコシルトランスフェラーゼの一ファミリーを含む。好ましい実施形態では、シアリルトランスフェラーゼは組換えシアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質である。適切なシアリルトランスフェラーゼ反応は、米国特許仮出願第60/035,710号（1997年1月16日提出）および米国特許出願第09/007,741号（1998年1月15日提出）に記載されている。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質により変更されたシアリル化パターンを有する糖タンパク質上の糖部分は、非変更糖タンパク質より大きいパーセンテージのシアリル化された末端ガラクトース残基を有する。好ましくは糖タンパク質結合オリゴ糖上に存在する約80％より多い末端ガラクトース残基が、本方法の使用後にシアリル化される。さらに好ましくは本発明のヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼタンパク質および方法の使用は、約90％より多い末端ガラクトース残基のシアリル化を、さらに好ましくは約95％より多いシアリル化を生じる。最も好ましくは組成物中の糖タンパク質上に存在する本質的に100％の末端ガラクトース残基が、本発明の方法を用いた修飾後にシアリルかされる。本発明の融合タンパク質および方法は典型的には、約48時間で、さらに好ましくは約24時間またはそれ以下で所望レベルのシアリル化を達成し得る。
【０１７９】
今日までに少なくとも15の異なる哺乳類シアリルトランスフェラーゼが実証されており、これらのうちの13のｃＤＮＡがクローン化されている（本明細書中で用いられる系統的命名法に関しては、Tsuji et al. (1996) Glycobiology 6: v-xiv参照）。これらのｃＤＮＡは、本発明の組換えシアリルトランスフェラーゼ融合タンパク質を製造するために用いられ得る。
【０１８０】
好ましくは糖タンパク質のＮ−結合および／またはＯ−結合炭水化物に関しては、シアリルトランスフェラーゼは末端配列Ｇａｌβ１，４−ＯＲまたはＧａｌＮＡｃ−ＯＲにシアル酸を転移する（この場合、Ｒは、少なくとも1個の炭素原子を有するアミノ酸、単糖、オリゴ糖またはアグリコン基であり、そして糖タンパク質に結合されるかまたはその一部である）。Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃは、全シアリル化炭水化物構造物上の末端シアル酸の基礎を成す最も一般的な最後から2番目の配列である。少なくとも3つのクローン化哺乳類シアリルトランスフェラーゼがこのアクセプター特異性要件を満たし、そしてこれらの各々は糖タンパク質のＮ−結合およびＯ−結合炭水化物基にシアル酸を転移することが実証されている。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明のシアリル化法は、ネイティブ細菌細胞中で組換え的に産生されるかまたは産生される細菌シアリルトランスフェラーゼの使用により、商業的実用性を増大した。2つの細菌シアリルトランスフェラーゼ：即ち発光細菌フォトバクテリウム・ダムセラからのＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ（Yamamoto et al. (1996) J. Biochem. 120: 104-110）およびナイセリア・メニンギティジスからのＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ（Gilbert et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 28271-28276）が近年報告されている。2つの近年記載された細菌酵素は、オリゴ糖基質上のＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列にシアル酸を転移する。
【０１８２】
近年報告されたウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼも、本発明のシアリル化方法を試験するのにそして考え得る使用に適している（Sujino et al. (2000) Glycobiology B10: 313-320）。この酵素ｖ−ＳＴ３ＧａｌＩは粘液腫ウイルス感染細胞から得られ、そしてそれぞれのアミノ酸配列の比較により示されるように、明らかに哺乳類ＳＴ３ＧａｌＩＶに関連がある。ｖ−ＳＴ３ＧａｌＩは、Ｉ型（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、ＩＩ型（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−β１−Ｒ）およびＩＩＩ型（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ）アクセプターのシアリル化を触媒する。酵素はフコシル化アクセプター基質(例えばルイス−ｘおよびルイス−ａ)にもシアル酸を転移し得る。
【０１８３】
特許請求された方法において有用であるシアリルトランスフェラーゼの一例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩであり、これはα（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（EC 2.4.99.6）とも呼ばれる。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の移動を触媒する（例えばWen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 21011; Van den Eijnden et al. (1991) J. Biol. Chem. 256: 3159参照）。シアル酸は、2つの糖間のα−連結の形成を伴ってＧａｌに結合される。糖間の結合の（連結）は、ＮｅｕＡｃの2位置とＧａｌの3位置との間である。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離され得る（Weinstein et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 13845）；ヒトｃＤＮＡ（Sasaki et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269: 1394-1401）およびゲノム（Kitagawa et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 931-938）ＤＮＡ配列が既知であり、組換え発現によりこの酵素の産生を促す。好ましい実施形態では、特許請求されたシアリル化法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０１８４】
その他のシアリルトランスフェラーゼ（上記のものを含む）も、商業的に重要な糖タンパク質のシアリル化のための経済的および効率的大規模製法において有用である。上記のように、これらのその他の酵素の有用性を見出すための簡単な試験は、種々の量の各酵素（1〜100 mU/mgタンパク質）を容易に入手可能な糖タンパク質、例えばアシアロ−α1−ＡＧＰ（1〜10 mg/mlで）と反応させて、糖タンパク質をシアリルかする当該シアリルトランスフェラーゼの能力を比較することである。結果は、所望される特定のシアル酸結合によって、例えばＳＴ６ＧａｌＩまたはＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（例えばウシまたはヒト酵素）のいずれかまたは両方と比較され得る。あるいはその他の糖タンパク質、あるいはペプチド主鎖から酵素的に放出される糖タンパク質あるいはＮ−またはＯ−結合オリゴ糖が、この評価に関してアシアロ−α1ＡＧＰの代わりに用いられ得るし、あるいは他の方法により産生されるかまたはミルクのような天然産物から精製される糖類を用い得る。しかしながら好ましくはシアリルトランスフェラーゼは、糖タンパク質に結合されるオリゴ糖を用いて検定される。例えばＳＴ６ＧａｌＩより効率的に糖タンパク質のＮ−結合またはＯ−結合オリゴ糖をシアリルかする能力を示すシアリルトランスフェラーゼは、糖タンパク質シアリル化のための実際的大規模製法において有用である。
【０１８５】
本発明は、ともにヒト血漿糖タンパク質のＮ−結合オリゴ糖上に見出されるα２，６Ｇａｌ結合、ならびにα２，３Ｇａｌ結合において、シアル酸を付加することによるフコシル化の前に、糖タンパク質のシアリル化パターンを変更する方法も提供する。この実施形態では、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩおよびＳＴ６ＧａｌＩシアリルトランスフェラーゼはともに反応物中に存在し、再シアリル化反応において形成される再現可能比の2つの結合を有するタンパク質を提供する。したがって2つの酵素の混合物は、両結合が最終生成物中で所望される場合には、価値を有し得る。
【０１８６】
シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプター基質は、本明細書中に記載されたシアリル化方法により修飾される糖タンパク質上に存在する。適切なアクセプターとしては、例えばガラクトシル化アクセプター、例えばＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｔｈｒおよび当業者に既知のその他のアクセプターが挙げられる（例えばPaulson et al. (1978) J. Biol. Chem. 253: 5617-5624参照）。典型的には、アクセプターは、タンパク質中に存在するアスパラギン、セリンまたはトレオニン残基に結合されるオリゴ糖鎖中に含まれる。
【実施例】
【０１８７】
実施例
【０１８８】
特許請求された本発明を例証するために以下の実施例を提供するが、しかしこれらに限定されない。
実施例１：ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼのクローニング
ヘリコバクターピロリ菌の以下の菌株からの推定フコシルトランスフェラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅し、大腸菌：菌株９１５ＦｕｔＡ、菌株１１１１ＦｕｔＡ、菌株１９Ｃ２ＦｕｔＢ、菌株１１８２ＦｕｔＢ、菌株１９２Ｃ２ＦｕｔＡ、菌株２６６９５ＦｕｔＡおよび菌株１２１８ＦｕｔＢ中での発現のためにベクター中でクローン化した。核酸およびアミノ酸配列を図１〜７に提示する。アミノ酸配列アラインメントを図１２に提示する。核酸配列アラインメントを図１３に提示する。
【０１８９】
ＬＮｎＴおよびＧＤＰ−フコース基質を用いて、α１，３／４−フコシルトランスフェラーゼ活性に関して推定フコシルトランスフェラーゼタンパク質をスクリーニングした。ＬＮｎＴおよび一産物ＬＮＦＰＩＩＩのオリゴ構造を、図１４に示す。
【０１９０】
ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼで形質転換した大腸菌の100 ml培養を0.8のＯＤ600に増殖させ、ＩＰＴＧで誘導して、収穫した。フレンチプレスを用いて、細胞溶解物を作製した。基質ＬＮｎＴを用いて、酵素活性およびアクセプター特異性に関してフコシルトランスフェラーゼ酵素を試験した。反応物は、3 mMのＧＤＰ−フコース、3 mMのＬＮｎＴ、50 mMのトリス、ｐＨ7.5、20 mMのＭｎＣｌ2および15％細菌溶解物を含有した。37℃で24時間、反応物をインキュベートした。
【０１９１】
以下のＴＬＣ緩衝液系を用いて、反応生成物を分離した：7ＩＰＡ：2Ｈ2Ｏ：1酢酸。試料をメチル化し、加水分解して、ホウ重水素化ナトリウムで還元し、アセチル化して、ＧＣ／ＭＳによりＬＮｎＴおよびＬＮＦ３の試料とともに分析した。結果を図１５に示す。1に近いＧｌｃ対Ｇｌｃ−ＮＡｃ値はＧｌｃ−ＮＡｃのフコシル化を促す。0に近いＧｌｃ対Ｇｌｃ−ＮＡｃ値はＧｌｃのフコシル化を促す。以下のヘリコバクターピロリ菌株：菌株９１５ＦｕｔＡ、菌株１１１１ＦｕｔＡ、菌株１９Ｃ２ＦｕｔＢおよび菌株１１８２ＦｕｔＢからのフコシルトランスフェラーゼは、フコースをＧｌｃ−ＮＡｃに転移した。ヘリコバクターピロリ菌株１９Ｃ２ＡからのＦｕｔＡ遺伝子産物は、ヘリコバクターピロリ菌株１２１８ＦｕｔＢからのＦｕｔＢ遺伝子産物の場合と同様に、ＬＮｎＴアクセプターの還元グルコースにフコースを転移した。ヘリコバクターピロリ菌株２６６９５からの新規のＦｕｔＡ遺伝子産物も、グルコースへのフコースの転移を触媒した。
【０１９２】
実施例２：ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼを用いたオリゴ糖の産生
ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌の1 L培養を増殖させ、誘導し、収穫した。溶解物を用いて、ＬＮｎＴからＬＮＦＩＩＩを合成した。2つの異なるイオン交換樹脂を、ＬＮＦＩＩＩの精製に関して試験した。反応混合物を5,000 RPMで30分間遠心分離した。次に10 kDの分子量カットオフを有する中空繊維限外濾過膜を用いて、限外濾過により試料を処理した。ＭＲ３  ＮＨ4ＨＣＯ3カラム1 ml樹脂／1 ml合成（70％）またはＤｏｗｅｘ１／Ｄｏｗｅｘ５０カラム2 ml樹脂／1 ml合成（82％）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーを実行した。次に試料をＰ２サイズ排除カラム上で移動させて、次に凍結乾燥した。結果を図１６に示す。Ｄｏｗｅｘ樹脂を用いた収率は50％に近づいたが、一方、ＭＲ３  ＮＨ4ＨＣＯ3カラムからの収率は70％に近づいた。
【０１９３】
本明細書中に記載された菌株１１８２からのヘリコバクターピロリα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを発現する大腸菌からの溶解物を、ナイセリアゴノコッカス菌のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＡ）およびナイセリアゴノコッカスβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｌｇｔＢ）と組合せて用いて、マルチグラムスケールでＬＮＦＩＩＩを調製された。その他のβ−１，３Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素は本発明のこの実施形態において用いられ得る、と当業者は認識する。
【０１９４】
実施例３：ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼを用いた糖タンパク質の製造
糖タンパク質上のアクセプター分子にフコースを付加するヘリコバクターピロリ菌株１１８２Ｂからのフコシルトランスフェラーゼの能力を、基質としてアシアリルトランスフェリンを用いて試験した。上記のように大腸菌細胞中で１１８２Ｂフコシルトランスフェラーゼを産生した。50 mMのトリス、ｐＨ7.5、20 mMのＭｎＣｌ2、200 μgアシアリルトランスフェリンおよび5 mMのＧＤＰ−フコースを含有する緩衝液中で、反応を実行した。15％v/vの細菌溶解物を付加することにより、反応を開始した。反応物を37℃で一晩インキュベートした。ＧＣ／ＭＳを用いて試料を分析した。結果を図１７に示す。
【０１９５】
本明細書中に記載された実施例および実施形態は例証のためであるに過ぎず、その点を考慮した種々の修正または変更は当業者に示唆され、そして本出願の本質および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきものである、と理解される。本明細書中で引用された出版物、特許および特許出願は全て、これらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、ヘリコバクターピロリ菌株１１８２Ｂからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図２】図２は、ヘリコバクターピロリ菌株１１１１Ａからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図３】図３は、ヘリコバクターピロリ菌株１２１８Ｂからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図４】図４は、ヘリコバクターピロリ菌株１９Ｃ２Ｂからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図５】図５は、ヘリコバクターピロリ菌株９１５Ａからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図６】図６は、ヘリコバクターピロリ菌株２６６９５Ａからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図７】図７は、ヘリコバクターピロリ菌株１９Ｃ２Ａからのフコシルトランスフェラーゼの核酸およびアミノ酸配列を提示する。
【図８】図８は、１１８２ｆｕｔＢアミノ酸配列とグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０、即ちフコシルトランスフェラーゼファミリーからのコンセンサス配列との間のアラインメントを提示する。１１８２ｆｕｔＢのアミノ酸23〜305は上段線に示され、タンパク質のほとんどの保存領域、即ちフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを表す。
【図９】図９は、１１１１ｆｕｔＡアミノ酸配列とグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０、即ちフコシルトランスフェラーゼファミリーからのコンセンサス配列との間のアラインメントを提示する。１１８２ｆｕｔＢのアミノ酸27〜417は上段線に示され、タンパク質のほとんどの保存領域、即ちフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを表す。
【図１０】図１０は、１２１８ｆｕｔＢアミノ酸配列とグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０、即ちフコシルトランスフェラーゼファミリーからのコンセンサス配列との間のアラインメントを提示する。１１８２ｆｕｔＢのアミノ酸23〜399は上段線に示され、タンパク質のほとんどの保存領域、即ちフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを表す。
【図１１】図１１は、１９Ｃ２ｆｕｔＢアミノ酸配列とグリコシルトランスフェラーゼファミリー１０、即ちフコシルトランスフェラーゼファミリーからのコンセンサス配列との間のアラインメントを提示する。１１８２ｆｕｔＢのアミノ酸23〜377は上段線に示され、開示されたタンパク質のほとんどの保存領域、即ちフコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを表す。
【図１２】図１２は、ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡのアミノ酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−１】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−２】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−３】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−４】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−５】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１３−６】ヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢ、１１１１ＦｕｔＡ、１２１８ＦｕｔＢ、１９Ｃ２ＦｕｔＢ、９１５ＦｕｔＡ、１９Ｃ２ＦｕｔＡおよび２６６９５ＦｕｔＡの核酸配列間のアラインメントを提示する。下段配列はコンセンサス配列である。
【図１４】図１４は、ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼの基質であるラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（ＬＮｎＴ）、ならびにヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼの産物であるラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰＩＩＩまたはＬＮＦＩＩＩ）のオリゴ糖構造を提示する。
【図１５】図１５は、ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター特異性の分析の結果を示す。
【図１６】図１６は、ヘリコバクターピロリ菌フコシルトランスフェラーゼを用いたＬＮＦＩＩＩ合成の収量を示す。2つのイオン交換樹脂を試験した:ＭＲ３  ＮＨ4ＨＣＯ3およびＤＯｗｅｘ１／ＤＯｗｅｘ５０樹脂。
【図１７】図１７は、糖タンパク質アシアリルトランスフェリンにフコースを転移するためのヘリコバクターピロリ菌株１１８２からのＦｕｔＢα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼの使用を実証する。上パネルは、シアリル化トランスフェリンのＧＣ／ＭＳ分析を示す。下パネルは、酵素的にアシアリル化され、次にヘリコバクターピロリ菌株１１８２ＦｕｔＢα−１，３／４−フコシルトランスフェラーゼを用いてフコシル化されたシアリル化トランスフェリンのＧＣ／ＭＳ分析を示す。糖構造の手掛かり：中黒四角形−ＧｌｃＮＡｃ;中白丸形−マンノース;中黒菱形−ガラクトース;三角形−フコース;星形−シアル酸。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月23日(2005.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１，３，５、及び７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列に９０％超の同一性を有する核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、ここで、当該ヌクレオチド配列が、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記核酸配列が、配列番号１，３，５、及び７から成る群から選ばれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記フコシルトランスフェラーゼが、Ｎ−アセチルグルコサミン残基へのフコースの転移を触媒し、かつ、前記核酸配列が、配列番号１，３、及び７から成る群から選ばれるヌクレオチド配列に９０％超の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記フコシルトランスフェラーゼが、グルコース残基へのフコースの転移を触媒し、かつ、前記核酸配列が配列番号５に９０％超の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒するフコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、ここで、当該フコシルトランスフェラーゼが、配列番号２，４，６、及び８から成る群から選ばれるアミノ酸を含む、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記フコシルトランスフェラーゼが、アミノ酸タグを含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１又は５に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
フコシルトランスフェラーゼの製造方法であって、当該フコシルトランスフェラーゼ・タンパク質の発現に好適な条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養するステップを含む前記製造方法。
【請求項１０】
配列番号１１のヌクレオチド配列から成る核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、ここで、当該ヌクレオチド配列が、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する生物学的に活性なフコシルトランスフェラーゼをコードする、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記フコシルトランスフェラーゼが、グルコース残基へのフコースの転移を触媒する、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸配列が、生物学的に活性なフコシルトランスフェラーゼをコードする単離ポリヌクレオチドであって、ここで、当該フコシルトランスフェラーゼが、配列番号１２から成るアミノ酸を含む、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１０又は１２に記載の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
フコシルトランスフェラーゼ・タンパク質の製造方法であって、当該フコシルトランスフェラーゼ・タンパク質の発現に好適な条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、前記製造方法。
【請求項１６】
配列番号２，４，６、及び８から成る群から選ばれる、アミノ酸配列に９０％超の同一性を有するポリペプチドを含む組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質であって、ここで、当該フコシルトランスフェラーゼが、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する、前記組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質。
【請求項１７】
アミノ酸タグをさらに含む、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号２，４，６、及び８から成る群から選ばれる、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１９】
前記フコシルトランスフェラーゼが、Ｎ−アセチルグルコサミンへのフコースの転移を触媒し、かつ、前記ポリペプチドが、配列番号２，４、及び８から成る群から選ばれるアミノ酸配列に９０％超の同一性を有する、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２０】
前記フコシルトランスフェラーゼが、グルコース残基へのフコースの転移を触媒し、そして前記ポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列に９０％超の同一性を有する、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２１】
配列番号１２から成るポリペプチドを含む組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質であって、当該フコシルトランスフェラーゼは、ドナー基質からアクセプター基質へのフコース残基の転移を触媒する、前記組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質。
【請求項２２】
前記フコシルトランスフェラーゼが、グルコースへのフコースの転移を触媒する、請求項２１に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２３】
フコシル化オリゴ糖の製造方法であって、当該方法は、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼを、フコース残基を含むドナー基質と、糖又はオリゴ糖を含むアクセプター基質とを含む混合物と、当該ドナー基質から当該アクセプター基質へのフコース残基の転移を当該融合タンパク質が触媒する条件下で、接触させ、それにより、フコシル化オリゴ糖を製造する、前記製造方法。
【請求項２４】
前記方法が、フコシル化オリゴ糖を精製するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ドナー基質がＧＤＰ−フコースである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記フコシルトランスフェラーゼが、アミノ酸タグを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記アクセプター基質が、Ｎ−アセチルグルコサミン及びグルコースから選ばれるメンバーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記アクセプターが、ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏ−Ｔｅｔｒａｏｓｅ（ＬＮｎＴ））である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記フコシル化オリゴ糖が、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−Ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ  III（ＬＮＦＰ  III））である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記混合物が、ラクトース、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、バクテリアの酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、ナイセリア・ゴノコッカス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）由来である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、バクテリアの酵素である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、ナイセリア・ゴノコッカス由来である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記フコシル化オリゴ糖が、ラクト−Ｎ−フコペンタオースIII（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−Ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ  III（ＬＮＦＰ  III））である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
フコシル化糖脂質の製造方法であって、当該方法は、請求項１６に記載の組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質を、フコース残基を含むドナー基質と糖脂質上のアクセプター基質とを含む混合物と、当該ドナー基質から当該糖脂質上の当該アクセプター基質への当該フコース残基の転移を当該フコシルトランスフェラーゼが触媒する条件下で、接触させて、それによりフコシル化糖脂質を製造するステップを含む前記製造方法。
【請求項３７】
フコシル化糖タンパクの製造方法であって、当該方法は、組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質を、フコース残基を含むドナー基質と糖タンパク質上のアクセプター基質とを含む混合物と、当該ドナー基質から当該糖タンパク質上の当該アクセプター基質への当該フコース残基の転移を当該フコシルトランスフェラーゼが触媒する条件下で、接触させ、それによりフコシル化糖タンパクを製造するステップを含み、ここで、上記組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質は、配列番号２，４，６、及び８から成る群から選ばれるアミノ酸配列に９０％超の同一性を有するポリペプチドを含む、前記製造方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号２，４，６、及び８から成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、アミノ酸タグをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記方法が、前記フコシル化糖タンパクを精製するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記アクセプター基質が、グルコース残基であり、かつ、前記組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列に９０％超の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記アクセプター基質が、Ｎ−アセチルグルコサミン残基であり、かつ、前記組換えフコシルトランスフェラーゼ・タンパク質が、配列番号２，４、及び８から成る群から選ばれるアミノ酸配列に９０％超の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記糖タンパク上のアクセプター基質が、Ｇａｌｂ１−ＯＲ，Ｇａｌｂ，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ，ＮｅｕＡｃａ２，３Ｇａｌｂ１，３／４ＮＡｃ−ＯＲを含み、ここでＲは、アミノ酸、糖、オリゴ糖、又は少なくとも１の炭素原子をもつアグリコン基である、請求項３７に記載の方法。
【国際調査報告】
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