(57)【要約】【課題】Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐおよび前記ペプチドを含む骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤を提供する。【解決手段】Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩である。骨芽細胞の分化を促進し、骨形成を促進するため、骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤として使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤。
【請求項３】
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規トリペプチド、骨芽細胞の分化促進剤および骨形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、細胞内で−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−（式中、ＸおよびＹはそれぞれ同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の繰り返し構造を有するポリペプチド鎖として合成され、３本のポリペプチド鎖が三重螺旋構造を形成して細胞外へと分泌される。細胞内で合成された各ポリペプチド鎖は、翻訳後修飾によってＸやＹがプロリンである場合にその一部が３Ｈｙｐ（３−ヒドロキシプロリン）や４Ｈｙｐ（４−ヒドロキシプロリン）などのヒドロキシプロリンへと水酸化される。したがって、コラーゲンには、プロリン、３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐが混在している。なお、４Ｈｙｐがコラーゲン三重螺旋構造の安定化に機能していることはよく知られている。
【０００３】
皮膚や骨に存在するＩ型コラーゲンの場合、３Ｈｙｐの存在量は１，０００アミノ酸残基当たり１残基に満たない程度であり、同約１００残基存在する４Ｈｙｐと比較して非常に少ない。また、腱のＩ型コラーゲンにおける３Ｈｙｐの含有量は２残基程度、ＩＶ型コラーゲンでは同１０残基程度である。
【０００４】
近年、測定技術の発達により微量な３Ｈｙｐの分析が可能となったことなどから、３Ｈｙｐに関する研究が盛んとなっている。例えば、３Ｈｙｐの生理的、病理的役割として、コラーゲン線維形成への寄与（非特許文献１）、骨形成不全症（非特許文献２）や強度近視（非特許文献３）などの疾患との関連、幼若期の腱Ｉ型コラーゲンでの３Ｈｙｐの顕著な増加（非特許文献４）などの報告がある。また、抗体を用いた測定により、ＩＶ型コラーゲンに由来する３Ｈｙｐ含有ペプチドがガン患者の尿中で減少しているとの報告もあり(非特許文献５、特許文献１)、３Ｈｙｐ含有ペプチドが生体内で何らかの機能を発揮することが示唆される。
【０００５】
近年、コラーゲン加水分解物を経口摂取することにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐに代表されるコラーゲン由来オリゴペプチドが血中に非常に高濃度で検出されることが報告され、それらペプチドの効果効能に注目が集まっている。その中で、コラーゲン加水分解物摂取による骨代謝改善（特許文献２）、コラーゲン加水分解物による骨分化促進効果（非特許文献６、非特許文献７）、さらにＰｒｏ−Ｈｙｐによる骨分化促進効果などが報告されている（非特許文献８）。
【０００６】
更に、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−ＧｌｙやＧｌｕ−Ｈｙｐなどを含有する、前駆軟骨細胞または骨芽細胞の増殖促進剤もある（特許文献３）。これらのペプチドは、ゼラチンにエンド型プロテアーゼおよびエキソ型プロテアーゼの２種以上を組み合わせて加水分解したペプチド混合物自体やこれを部分精製した混合物に含まれるという。ペプチド固相合成法で調製したこれらのペプチドを、マウス正常前駆軟骨細胞ＡＴＤＣ５に添加して細胞増殖率を測定したところ、高い前駆軟骨細胞の増殖促進作用が示され、マウス正常骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に添加してアルカリホスファターゼ活性（以下、ＡＬＰ活性と称する。）を測定したところ、高い骨芽細胞の分化促進作用が示され、およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に添加して細胞増殖率を測定したところ、高い骨芽細胞の増殖促進作用が示されたという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６-１７７８１１号公報
【特許文献２】特開２０１３−１２４２２１号公報
【特許文献３】特開２０１５−５９０８７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Weis MA, et al., "Location of 3-hydroxyproline residues in collagen types I, II, III, and V/XI implies a role in fibril supramolecular assembly", J. Biol. Chem., (2010), 285(4):2580-2590.
【非特許文献２】Cabral WA, et al.,"Prolyl 3-hydroxylase 1 deficiency causes a recessive metabolic bone disorder resembling lethal/severe osteogenesis imperfecta", Nat. Genet., (2007) 39(3):359-365.
【非特許文献３】Hudson DM, et al., "Post-translationally Abnormal Collagens of Prolyl 3-Hydroxylase-2 Null Mice Offer a Pathobiological Mechanism for the High Myopia Linked to Human LEPREL1 Mutations", J. Biol. Chem., (2015) 290(13):8613-8622.
【非特許文献４】Taga Y, et al., "Developmental stage-dependent regulation of prolyl 3-hydroxylation in tendon type I collagen", J. Biol. Chem., (2016) 291(2):837-847.
【非特許文献５】Saito J, et al., "ELISA measurement for urinary 3-hydroxyproline-containing peptides and its preliminary application to healthy persons and cancer patients", Anticancer Res., (2010) 30(3):1007-1014.
【非特許文献６】Guillerminet F, et al., "Hydrolyzed collagen improves bone metabolism and biomechanical parameters in ovariectomized mice: an in vitro and in vivo study", Bone, (2010) 46(3):827-834.
【非特許文献７】Liu J, et al., "Bovine collagen peptides compounds promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts", PLoS One, (2014) 9(6):e99920.
【非特許文献８】Kimira Y, et al., "Collagen-derived dipeptide prolyl-hydroxyproline promotes differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells", Biochem. Biophys. Res. Commun., (2014) 453(3):498-501.
【非特許文献９】Hudson DM., et al., "Collagen prolyl 3-hydroxylation: a major role for a minor post-translational modification?", Connect Tissue Res. 2013;54(4-5):245-51.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のように、コラーゲンタンパク質における３Ｈｙｐの機能に関する報告はあるが、３Ｈｙｐを含有するオリゴペプチドの機能や効果効能についての研究はほとんど行われていない。上記非特許文献５、特許文献１で測定されている３Ｈｙｐ含有ペプチドもアミノ酸数１０のポリペプチドである。配列が特定された３Ｈｙｐ含有オリゴペプチドが存在すれば、３Ｈｙｐを含有するペプチドの効果をより正確に評価することができる。
【００１０】
一方、非特許文献８では、Ｐｒｏ−Ｈｙｐにより前駆骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化が促進され、特許文献３ではＧｌｕ−Ｈｙｐ−ＧｌｙやＧｌｕ−ＨｙｐなどによりＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分化、増殖促進作用が示されたというが、より分化能や骨形成促進作用に優れるペプチドの開発が望まれる。
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、３Ｈｙｐ含有ペプチドとして、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを含む骨芽細胞の分化促進剤を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを含む骨形成促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は、３Ｈｙｐ含有ペプチドについて詳細に検討したところ、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐが骨芽細胞の分化を促進することを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち本発明は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩を提供するものである。
【００１６】
また本発明は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨芽細胞の分化促進剤を提供するものである。
【００１７】
更に本発明は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩を含有する、骨形成促進剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐ、およびＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを含む骨分化促進剤等が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の第一は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐまたはその医学的に許容可能な塩である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
（１）Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐ
３本のポリペプチド鎖からなる三重螺旋構造を構成するコラーゲンは、細胞内でポリペプチド鎖として合成された後、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−で示される繰り返し構造において、Ｙに位置するプロリンのほぼ全てが、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ(prolyl ４-hydroxylase)によって水酸化され４Ｈｙｐとなる。それに対し、Ｘに位置するプロリンは、Ｙが４Ｈｙｐの場合に、その一部がプロリル−３−ヒドロキシラーゼ(prolyl 3-hydroxylase)によって水酸化され３Ｈｙｐとなる(非特許文献９)。ただし、コラーゲンを構成する一次アミノ酸配列−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−のごく一部が−Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐ−に変換されるに過ぎない。例えば、ウシＩ型コラーゲンα１鎖には、１，０００アミノ酸残基当たり約４０の−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−配列が含まれるが、−Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐ−に由来する３Ｈｙｐの含有量は、後記する実施例に示すように、ウシ皮膚由来Ｉ型コラーゲンの場合０．１％程度である。しかも、配列の存在が推定されても、トリペプチドＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐが単離されたことはなく、その作用も解明されていない。
【００２１】
本発明で使用するＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの製造方法は、特に限定はない。例えば、魚類、肉類その他のコラーゲン含有材料にコラーゲンをＧｌｙ−Ｘ−Ｙ単位で分解するコラゲナーゼを作用させ、生成したＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを液体クロマトグラフィーその他の方法で精製して調製することができる。コラーゲンを構成するプロリンは、細胞内で翻訳後に水酸化されるため、ＤＮＡ配列やアミノ酸配列からＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの存在や含有量を知ることはできない。しかしながら、後記する実施例に示すように、同じ一次アミノ酸配列を持つアキレス腱Ｉ型コラーゲンと皮膚Ｉ型コラーゲンまたは水晶体嚢ＩＶ型コラーゲンを原料として比較したところ、コラーゲン含有組織やコラーゲン型によってＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの含有量が相違することが確認された。組織やコラーゲン型を適宜選択することで、コラーゲン含有組織からＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを製造することができる。
【００２２】
また、「固相合成法」や「液相合成法」などの公知のペプチド合成法によって製造することもできる。固相合成法としては、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法の何れであってもよい。例えば、表面をアミノ基で修飾した樹脂ビーズを固相として用い、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用いる。トリペプチドのＣ−末端にあたる４ＨｙｐのＮ−末端をＦｍｏｃ基で保護し、上記樹脂ビーズのアミノ基とペプチド結合させる。固相を溶媒で洗浄し、その後固相に結合している４ＨｙｐのＦｍｏｃ基の脱保護を行う。溶媒で樹脂ビーズを洗浄後、Ｆｍｏｃ−３Ｈｙｐ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ反応溶液に加える。反応後、樹脂ビーズを溶媒で洗浄し、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基を脱保護し、溶媒で樹脂ビーズを洗浄後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＤＩＣおよびＨＯＢｔをそれぞれ加え、固相上でペプチドを合成する。その後、Ｎ−末端のＦｍｏｃ基を除去し、減圧乾燥した後に得られた乾燥樹脂ビーズをＴＦＡで処理し、樹脂ビーズからＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐ粗生成物をＴＦＡに溶出させる。得られた粗生成物を精製水に溶解し、液体クロマトグラフィー等で精製し、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを単離する。
【００２３】
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐは、塩を形成するものであってもよい。塩は、医学的に許容可能な塩であることが好ましい。「医学的に許容可能な塩」とは、薬理学的に許容可能であり、投与された対象に対して略無毒である塩形態をいう。例えば、無毒の有機酸塩または無機酸塩がある。無機酸としては、塩化水素酸、硫酸、またはリン酸などがある。有機酸としては、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸があり、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシブチル酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、フマル酸、琥珀酸、アジピン酸、酒石酸、クエン酸、グルタル酸、２−または３−グリセロリン酸、ならびに当業者には周知の他の鉱物の酸がある。また、無機塩基や有機塩基との塩であってもよい。無機塩基としては、アルカリまたはアルカリ土類金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、またはマグネシウム）水酸化物、アンモニア、アンモニウム水酸化物などがある。また、有機塩基としては、アルキルアミン、ヒドロキシアルキルアミン、Ｎ−メチルグルカミン、ベンジルアミン、ピペリジン、ピロリジンなどがある。
【００２４】
（２）骨芽細胞の分化促進剤
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進剤として使用することができる。
骨組織が形成されることを骨化といい、膜内骨化と軟骨内骨化とに大別される。膜内骨化は頭蓋骨等で観察され、間葉系細胞が直接、骨芽細胞に分化して骨基質を産生する骨形成様式をいう。一方、軟骨内骨化とは、未分化間葉系細胞が軟骨細胞に分化して軟骨原基を形成し、軟骨細胞が肥大軟骨細胞に分化し、周囲の軟骨膜に含まれる細胞が骨芽細胞に分化し、これらによって石灰化した軟骨組織を骨組織に置換する骨形成様式をいう。何れの骨形成過程でも骨芽細胞が関与する点で共通する。
【００２５】
マウス頭蓋冠由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、胎児マウスの頭蓋骨より樹立された前駆骨芽細胞株である。骨芽細胞へと分化誘導されるとアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を発現するため、骨芽細胞の分化の指標としてＡＬＰ活性が用いられている。よって、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞培養時にサンプルを添加し、未処置対照に対するサンプル添加時のＡＬＰ活性を求めると、骨芽細胞への分化に対する作用を調べることができる。骨芽細胞の分化誘導は、生体を構成する種々の骨形成にポジティブに寄与して、骨形成が促進されると考えられる。ただし、ＡＬＰ活性の上昇と細胞増殖とは同義ではない。一般の細胞分化の過程では増殖が止まってから分化が起こり、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞も同様である。後記する実施例に示すように、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐは、骨芽細胞の分化を促進し、骨芽細胞の分化促進剤として使用することができる。
【００２６】
（３）骨形成促進剤
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐやその医学的に許容可能な塩は、骨形成促進剤として使用することができる。上記したように、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐやその医学的に許容可能な塩は、骨芽細胞の分化促進作用があり、この分化促進作用によって骨形成を促進することができる。しかも、後記する実施例に示すように、骨芽細胞による石灰化（リン酸カルシウムの一種であるハイドロキシアパタイトの沈着）を促進する作用を有する。
【００２７】
（４）剤型等
骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤は、経口的、または非経口的に投与することができる。経口投与の場合は、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐやその医学的に許容可能な塩をそのまま散剤、顆粒剤、丸剤としてもよく、表面に糖衣その他で加工したコーティング剤や、カプセルに充填したカプセル剤、適当な溶媒に溶解した経口液剤や懸濁剤、乳化剤によって乳化してなる乳剤などの何れであってもよい。非経口投与の場合は、ローション剤、軟膏剤、貼付剤（パップ剤）、注射剤、坐剤、点鼻剤等がある。
【００２８】
上記骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤には、剤型に応じて賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、保存料、抗酸化剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、増粘剤、無機充填剤、結合剤、希釈剤、着色料、香料、紫外線吸収剤などを添加してもよい。なお、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐとして、コラーゲン含有材料を分解して精製したものに限定されず、精製を行わずＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを含有するタンパク質加水分解物を使用してもよい。
【００２９】
上記ペプチドの投与量は、対象の状態や体重、剤型、投与経路等によって異なるが、成人１日当たり、経口投与の場合は、１〜５０００ｍｇ、好ましくは２〜２０００ｍｇ、より好ましくは５〜５００ｍｇである。患部に直接投与する場合は、０．１〜５００ｍｇ、好ましくは０．２〜２００ｍｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇである。製剤は、１日１〜数回に分けて投与してもよく、または１〜数日に１回投与してもよい。
【００３０】
上記骨芽細胞の分化促進剤や骨形成促進剤は、飲食物に添加してもよい。このような飲食物として、野菜やフルーツ、乳酸菌などを含むジュースその他の飲料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、アイスクリームなどの半流動性食品などがあり、また他の食材に混練して固形食品に調製してもよい。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３２】
（実施例１）
以下の方法により、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを調製した。
ウシ皮膚由来Ｉ型コラーゲン、ウシアキレス腱由来Ｉ型コラーゲン、およびウシ水晶体嚢由来ＩＶ型コラーゲンを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように、５ｍＭのＣａＣｌ２を含む０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液で希釈し、これを６０℃で３０分間加熱した。この溶液にグリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼ（和光純薬工業社製）を、コラーゲンに対して質量換算で１／２０倍量加え、３７℃で１６時間反応させた。得られたペプチド溶液を下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で分析し、各組織由来コラーゲン１ｇあたりのＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの生成量を定量した。結果を表１に示す。
【００３３】
（１）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム：Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜７．５分：Ａ液１００％、
７．５〜１５分：Ａ液１００〜１０％；Ｂ液０〜９０％、
１５〜２０分：Ａ液１０％；Ｂ液９０％、
２０〜２５分：Ａ液１００％、
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ、
（２）質量分析条件：
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：７００℃
【００３４】
（結果）
同じ一次アミノ酸配列を持つウシアキレス腱Ｉ型コラーゲンとウシ皮膚Ｉ型コラーゲンで比較すると、ウシアキレス腱Ｉ型コラーゲンから約３倍のＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを生成することができ、ウシ水晶体嚢ＩＶ型コラーゲンからはウシ皮膚Ｉ型コラーゲンの約５倍のＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを生成することができた。コラーゲン型や由来組織を選択すれば、効率的にＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを製造し得ることが判明した。
【００３５】
（実施例２）
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの骨芽細胞分化促進効果について評価を行った。
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、１０％ウシ胎児血清含有アルファＭＥＭ中に５×１０４細胞／ウェルの条件で２４−ウェル細胞培養プレート中に準備した。翌日、細胞がコンフルエントになっていることを確認後、培地を分化培地（１０％透析済みウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１０ｍＭグリセロール２−リン酸二ナトリウム含有アルファＭＥＭ）で置換し、Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスによりＦｍｏｃ−３Ｈｙｐ（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を用いて化学合成したＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように添加した。対照には、蒸留水を添加した。２日おきに分化培地を交換し、終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬのＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを添加した。６日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドにて固定した。
【００３６】
ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＮＭ溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２）で洗浄後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（１８．７５ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド、９．４ｍｇ／ｍＬ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩を６７％メチルスルホキシド（ｖ／ｖ）に溶解した液）をＴＮＭ溶液で５０倍希釈し、各ウェルに３００μＬずつ添加してＡＬＰ染色を行った。Ｉｍａｇｅ  Ｊにてウェル中でＡＬＰ陽性を示す面積を数値化した。
【００３７】
Ｎ＝３で独立して２回くりかえし、計６サンプルの平均値および標準誤差を、対照を１とした相対評価で示した。ｔ検定にて、対照に対してｐ＜０．０５で統計的有意差ありと設定した。結果を表２に示す。
【００３８】
（比較例１）
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐに代えてＰｒｏ−Ｈｙｐ（Ｂａｃｈｅｍ社製）を使用した以外は実施例２と同様に操作し、ＡＬＰ活性を算出した。結果を表２に示す。
【００３９】
（結果）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞にＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４ＨｙｐおよびＰｒｏ−Ｈｙｐを添加すると、それぞれＡＬＰ活性が上昇した。ただし、ＡＬＰ活性の上昇はＰｒｏ−Ｈｙｐでは対照に対して１．４倍で統計的有意差が認められなかったのに対し、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐは対照に対し１．９倍で統計的有意差が検出された。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、骨芽細胞へと分化誘導されるとＡＬＰを発現するため、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐは、対照と比較して約２倍の骨芽細胞の分化誘導作用を有すると考えられる。
【００４０】
（実施例３）
マウス頭蓋冠由来骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を用いて、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの骨芽細胞石灰化促進効果について評価を行った。
実施例２と同様に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０％ウシ胎児血清含有アルファＭＥＭ中に５×１０４細胞／ウェルの条件で２４−ウェル細胞培養プレート中に準備した。翌日、細胞がコンフルエントになっていることを確認した後、培地を分化培地（１０％透析済みウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１０ｍＭグリセロール２−リン酸二ナトリウム含有アルファＭＥＭ）で置換し、Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスによりＦｍｏｃ−３Ｈｙｐ（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を用いて化学合成したＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬになるように添加した。対照には、蒸留水を添加した。２日おきに分化培地を交換し、終濃度２００ｎｍｏｌ／ｍＬのＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐを添加した。７日間培養後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて１０分間固定した。
【００４１】
水でウェルを洗浄後に水分を除去し、アリザリンレッド溶液（コスモバイオ社製）を各ウェルに５００μＬずつ添加してアリザリンレッドにより石灰化した骨結節を染色した。３０分後、水でウェルを６回洗浄後に水分を除去し、５％ギ酸を各ウェルに５００μＬずつ添加して、１０分間揺らしながら細胞に染色されたアリザリンレッド溶液を溶出した。その後、溶出された溶液１００μＬを９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ−６（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社製）にて４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４２】
Ｎ＝３で独立して２回くりかえし、計６サンプルの平均値および標準誤差を、対照を１とした相対評価で示した。ｔ検定にて、対照に対してｐ＜０．０５で統計的有意ありと設定した。結果を表３に示す。
【００４３】
（結果）
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞にＧｌｙ−３Ｈｙｐ−４ＨｙｐおよびＰｒｏ−Ｈｙｐを添加すると、沈着したカルシウム量の増加が観察された。Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐは対照に対し１．９倍で統計的有意差が検出された。一方、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは対照に対し１．７倍の増加が観察されたが統計的有意差は検出されなかった。
【００４４】
Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐの添加によって対照よりも石灰化能が増加していることから、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐによって対照よりも分化誘導が促進され、結果的に骨芽細胞による石灰化が促進されたと考えられる。すなわち、骨芽細胞はリン酸カルシウムの一種であるハイドロキシアパタイトを沈着させる石灰化能を有するため、実施例３の結果は実施例２と同様、Ｇｌｙ−３Ｈｙｐ−４Ｈｙｐが対照と比較して約２倍の骨芽細胞の分化誘導作用を有することを示す結果と考えられる。
【００４５】
【表１】
2018058827.tif 000002
【００４６】
【表２】
2018058827.tif 000003
【００４７】
【表３】
2018058827.tif 000004