(57)【要約】特異的で効力の高い２−オキソ−アミドをベースにしたホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性阻害剤を提供する。脊髄の介在する炎症過程におけるＰＬＡ２活性の役割を立証し、ＰＬＡ２活性に関係する痛覚過敏及びその他の炎症状態を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物、
【化１】
2005519134.tif 000048
その幾何異性体、鏡像異性形態、薬理学的又は免疫学的に許容できる塩：
［式中、
Ｒ１は、カルボキシル、ホスフェート、ホスフィネート、サルフェート、スルホネート、又はテトラゾリル基などの任意の酸性基であり、
Ｒ２、Ｒ３は、任意の芳香族、複素環、又は炭素環基、或いは直鎖状又は分枝鎖状の飽和若しくは不飽和のアルキル、アルケニル、又はアルキニル鎖であり、
ｎは０、ｍが０、ｋが０である］。
【請求項２】
ｋ＞０であり、かつ、ｍ及びｎの１つが＞０である、式（Ｉ）の化合物。
【請求項３】
ｋが２〜２２である、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３がメチルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
ｍが０及び３であり、かつ、ｎが１〜１２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
ｍが３であり、Ｒ２がＣＨ３である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
ｎが３である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１がＣＯ２Ｈである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
（４Ｓ）−４−［（２−オキソドデカノイル）アミノ］オクタン酸及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１０】
４−［（２−オキソヘキサデカノイル）アミノ］ブタン酸及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
４−［（２−オキソオクタノイル）アミノ］ブタン酸、及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
（４Ｒ）−４−［（２−オキソドデカノイル）アミノ］オクタン酸及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として許容できる担体を更に含む、請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
式（ＩＩ）の化合物
【化２】
2005519134.tif 000049
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）の化合物
【化３】
2005519134.tif 000050
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１６】
式（ＩＶ）の化合物
【化４】
2005519134.tif 000051
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１７】
式（Ｖ）の化合物
【化５】
2005519134.tif 000052
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１８】
式（ＩＶ）の化合物
【化６】
2005519134.tif 000053
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項１９】
式（ＶＩＩ）の化合物
【化７】
2005519134.tif 000054
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項２０】
式（ＶＩＩＩ）の化合物
【化８】
2005519134.tif 000055
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項２１】
式（ＩＸ）の化合物
【化９】
2005519134.tif 000056
及び薬剤として許容できる担体を含む、細胞又は生物体内のホスホリパーゼＡ２の酵素活性を阻害するのに使用するための医薬組成物。
【請求項２２】
ホスホリパーゼＡ２を阻害するに有効な量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物の１種又は複数を投与することを含む、哺乳動物における炎症過程の影響を調節するための方法。
【請求項２３】
調節される前記炎症過程の影響の１つが中枢神経系炎症である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
調節される脊髄介在炎症過程の影響の１つがプロスタグランジンＥ２産生であって、該プロスタグランジンＥ２産生を、治療に応答して、治療前の哺乳動物におけるプロスタグランジンＥ２産生レベルよりも低下させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
調節される脊髄介在炎症過程の影響の１つが疼痛であって、哺乳動物が感じる該疼痛を、治療に応答して、治療前に感じる疼痛レベルよりも低下させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
調節される炎症過程に脊髄が介在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
調節される脊髄介在炎症過程の１つが痛覚過敏である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物が治療前に身体のある部位で炎症を体験しており、治療の前及び後に哺乳動物が感じる疼痛が身体の他の部位である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
治療の前及び後に哺乳動物が感じる疼痛が中枢神経系の部位である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物に対し有効阻害量の１種又は複数のホスホリパーゼＡ２阻害剤を投与することを含む、哺乳動物の中枢神経系における脊髄仲介炎症過程の影響を調節するための方法。
【請求項３１】
調節される脊髄介在炎症過程の影響の１つが疼痛であって、哺乳動物の感じる疼痛を、ホスホリパーゼＡ２活性を阻害することによって、治療前に感じる疼痛のレベルよりも低下させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
調節される脊髄介在炎症過程の影響の１つが痛覚過敏であって、哺乳動物の経験する炎症を、ホスホリパーゼＡ２活性を阻害することによって、治療前に経験する炎症のレベルよりも低下させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物に対するホスホリパーゼＡ２阻害剤の脳脊髄幹投与を含む、請求項２２又は３０に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物に対し１種又は複数のＰＬＡ２相同体阻害剤を投与することを更に含む請求項２２又は３０に記載の方法。
【請求項３５】
グループＩＶＢ  ＰＬＡ２、グループＩＶＣ  ＰＬＡ２、グループＶＩＡ  ＰＬＡ２、グループＶＩＢ  ＰＬＡ２、ニューロパシー標的エステラーゼ、ホスホリパーゼＢ、パタチン、及びシュードモナスアエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのＥｘｏＵからなる相同体などの群から選択されるＰＬＡ２相同体阻害剤を投与することを更に含む、請求項２２又は３０に記載の方法。
【請求項３６】
合成スキーム１〜８のいずれか１つによって該化合物を合成することを含む、２−オキソ−アミド化合物の調製方法。
【請求項３７】
Ｒ２にα−、β−、γ−、δ−、又はε−型のアミノ酸から選択されるアミノ酸側鎖を有する化合物を作るためにスキーム１を修正することを更に含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
請求項３６によって作られる化合物を含む、哺乳動物におけるホスホリパーゼＡ２介在炎症を治療するのに使用するための化合物。
【請求項３９】
請求項３７によって作られる化合物を含む、哺乳動物におけるホスホリパーゼＡ２介在炎症を治療するのに使用するための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年３月７日出願の米国仮特許出願第６０／３６２，７０１号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般にホスホリパーゼＡ２酵素を阻害するための非ステロイド性抗炎症剤の分野、及び炎症を制御する上での該薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
身体の一部が傷害されると、疼痛刺激に対する過敏症が生じることも多い。近年、この現象は、これまで考えられていたように、末梢炎症部位から脊髄を介する脳への神経インパルスの伝達によってのみ起こるのではないことが発見された。Ｓａｍａｄらは、むしろ、痛覚過敏は脳及び脊髄内部における疼痛処理シグナルの促通に由来すると考えている。Ｓａｍａｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４１０巻、４７１〜４７５頁（２００１年）。
【０００４】
このようなシグナル伝達がどのようにして起こるかについての１つの理論は、脳脊髄内インターロイキン−１β濃度の増加が、中枢神経系に身体に対する傷害が発生したことを伝達すると仮定している。Ｅｃｋらは、インターロイキン−１βが血液脳関門で細胞と相互作用してシクロオキシゲナーゼ−２及びプロスタグランジンシンターゼの発現を刺激するのであろうと提案している。Ｅｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ、４１０巻、４３０〜４３１頁（２００１年）。
【０００５】
ホスホリパーゼＡ２によるリン脂質からのアラキドン酸の加水分解に続いて、シクロオキシゲナーゼ−２がアラキドン酸をプロスタグランジンＨ２に変換する。すると、プロスタグランジンＥシンターゼがプロスタグランジンＨ２を強力な炎症メディエーターであるプロスタグランジンＥ２に変換する。また、プロスタグランジンＥ２は、ミクログリアによるインターロイキン−１βの合成を活性化する（脳脊髄液中に後者が存在することの理由かもしれない）。詳細な機序が何であれ、中枢シクロオキシゲナーゼシグナル伝達カスケードの最終結果は疼痛及び炎症の増強である。
【０００６】
今まで、痛覚過敏を治療するためのシクロオキシゲナーゼシグナル伝達カスケードを標的とする治療計画は、シクロオキシゲナーゼ−２活性を阻害することに焦点を当ててきた。例えば、先に挙げたＳａｍａｄ他及びＥｃｋの論文を参考にしながら、Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．、Ｎａｔｕｒｅ、４１０巻、４２５〜４２７頁（２００１年）を参照されたい。しかしながら、この目的に対して一般に採用される現行の治療法及び抗炎症剤は、潜在的に習慣性のあるアヘン製剤であるか、或いはシクロオキシゲナーゼ酵素を標的にして設計された非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（例えばアスピリン、イブプロフェン、ケトロラック、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））、及びビオックス（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））である。また、シクロオキシゲナーゼ−２は、ほとんどの解熱剤（発熱低下）の標的でもある。
【０００７】
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、シクロオキシゲナーゼシグナル伝達カスケードにおける治療標的としては余り注目されて来なかった。逆に、動物モデルにおいて、脊髄又は脳内でのＰＬＡ２活性が末梢傷害（ラット足浮腫）に応答して増加することはないことが報告されている。例えば、最近、同４７１頁で「中枢（神経系）ＰＧＥ２誘発で重要なのはＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）だけである」と結論づけているＳａｍａｄらの論文４７１及び４７３頁、図２を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）に対する強力な阻害剤、及び該阻害化合物の使用方法を提供する。後者に関して、ＰＬＡ２は脊髄中に存在し、かつ脊髄中で活性であることが発見された。特に、このことは脊髄の介在する炎症過程に原因として関係しており、炎症、疼痛、痛覚過敏（刺激に対する過敏症を介して経験される疼痛）及び炎症に原因として関係したその他の状態（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与える炎症に由来する神経学的障害）を治療するための新しい方法を示唆している。本発明の阻害化合物はこれらの状態を治療する上で特に有用であり、シクロオキシゲナーゼ酵素よりはむしろＰＬＡ２酵素に作用する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のＰＬＡ２阻害剤は、２−オキソアミド化合物であり、その一方又は双方が多くの異なる細胞型中に存在している、分子の細胞質（ｃＰＬＡ２）及びカルシウム非依存性（ｉＰＬＡ２）アイソフォームなど、ＰＬＡ２の特定アイソフォームに対する高度の特異性を示す化合物が含まれる。ＰＬＡ２阻害剤は、細胞を傷害する濃度よりはるかに低い投与量でプロスタグランジンの産生（実験モデルにおいてＬＰＳによって誘発される）を完全に排除することができる。したがって、本発明のＰＬＡ２阻害剤は、炎症、疼痛及び痛覚過敏を治療する上で特に有用な薬剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ａ．中枢神経系でのＰＬＡ２活性
本発明は、強力なＰＬＡ２阻害剤、及び該阻害化合物の使用方法を提供する。後者に関して、ＰＬＡ２に関わるｍＲＮＡ及びタンパク質濃度は炎症シグナルに応答して検知可能なほどには上向き調節されないが、それでもＰＬＡ２は脊髄中で活性であり、痛覚過敏に原因として関係していることが発見された。したがって、ＰＬＡ２を標的にすることによって、一般的な炎症及び疼痛、並びに痛覚過敏（刺激に対する過敏症を介して経験される疼痛）を治療するための新規な方法が得られる。
【００１１】
ＰＬＡ２とは、グリセロリン脂質のｓｎ−２位からアシル基を加水分解し、遊離脂肪酸及びリゾリン脂質を生成させる脂質分解酵素の類に対する名称である。ホスホリパーゼＡ２酵素スーパーファミリーは、二つの大きな分科、ヒスチジン及びセリンＰＬＡ２分科から構成される。ヒスチジン分科は、同じように小型で、活性部位Ｃａ２＋、アスパルテート、及び特に触媒性ヒスチジンによって活性化される求核性水分子を利用する分泌性Ｃａ２＋依存性酵素である（グループＩ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＩＸ〜ＸＩＶ）。スパーファミリーの他の分科は、求核性セリンを利用するより大型で典型的な細胞質酵素からなる（グループＩＶ及びＶＩ〜ＶＩＩＩ）。
【００１２】
細胞質ＰＬＡ２（ｃＰＬＡ２）はリン脂質のｓｎ−２位のアラキドン酸に対して強い選択性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されるこの選択性が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアラキドン酸の放出及びプロスタグランジンの産生において生理学的に重要であることが判った。対照的に、カルシウム非依存性ＰＬＡ２（ｉＰＬＡ２）にはそれほど脂肪酸特異性がなく、アラキドン酸放出及びロイコトリエン合成の双方で役割があるとも考えられるが、その主な機能は、膜の再構成にあると考えられる。
【００１３】
ＰＬＡ２はシクロオキシゲナーゼ酵素（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）に対しｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＯＸ酵素作用に必要な基質であるアラキドン酸を供給する。ｃＰＬＡ２は、それぞれ血小板活性化因子（ＰＡＦ）及びエイコサノイドの前駆体である遊離のリゾリン脂質及びアラキドン酸の主要供給者である。ｃＰＬＡ２で刺激されたアラキドン酸の産生により、リポポリ多糖（ＬＰＳ）の介在するプロスタグランジン産生のための細胞内中間体が準備される。特に、アラキドン酸は、直接的にＰＧＥ２にすることが可能であり、或いは炎症及び疼痛のメディエーターとして働くプロスタグランジン（ＰＧＥ２など）を産生するのに利用できるＰＬＡ２の濃度を転写的に上向き調節するのに使用できる。
【００１４】
ＣＯＸ−経路に基質を供給することに加え、ＰＬＡ２によって遊離されたアラキドン酸は、侵害受容を増加させる上で更なる役割を演じることがあることがわかっている。例えば、アラキドン酸は、ＮＭＤＡ受容体の部位に結合することによって、或いは受容体の脂質環境を改変することによってＮＭＤＡ受容体流れを増強し、それに伴ってグルタメートの介在する細胞内カルシウム濃度の増加を増幅する。更に、ＣＯＸに依存しない方式でのアラキドン酸の過酸化によって、エイコサノイドの新規な部類であるイソプロスタンが、主として形成される。イソプロスタンはラットの感覚ニューロンを鋭敏にするように作用し、その結果、機械的及び熱的逃避閾値を減少させる。
【００１５】
Ｂ．ＣＮＳの介在する炎症過程におけるＰＬＡ２の役割
当技術分野での現在の考え方とは対照的に、脊髄でのＰＬＡ２発現は、脊髄が介在する炎症、疼痛、及び痛覚過敏において重要な役割を演じる。更に、ＣＮＳ中でのＰＬＡ２活性を阻害すると、動物における痛覚過敏応答が有意に減少し（ラット足浮腫モデル）、ＰＧＥ２の産生を排除することができる。
【００１６】
６種のＰＬＡ２酵素、すなわちグループＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＣ、ＩＶＡ、Ｖ及びＶＩの発現が脊髄で生じる（実施例５のＱ−ＰＣＲによって確認されるように）。グループＩＶＡ及びＶＩ（本明細書ではそれぞれｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２と呼ぶ）は、最も高度に発現され、分泌性ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）に較べ１６倍を超える発現差を示す。ｓＰＬＡ２の中で、グループＶはＩＢ、ＩＩＡ、又はＩＩＣよりも２００分の１のメッセージ、ＩＶＡ又はＶＩより少なくとも４桁少ないメッセージを有する最も少ない発現を示す（データは示していない）。
【００１７】
ｍＲＮＡ及びタンパク質発現のどちらも局部炎症に応答して上向き調節されているとは思われず（実施例５）、したがって、ｃＰＬＡ２活性の主な調節は、タンパク質発現の変化を介してよりも、細胞内カルシウム濃度の変化に続くサイトゾルから膜への酵素のトランスロケーションを介してであると考えられる。トランスロケーションを介する活性化に加え、ｃＰＬＡ２活性は、リン酸化単独ではアラキドン酸放出に十分ではないが、ＭＡＰＫタンパク質によるリン酸化に続いて若干増加することもわかった。
【００１８】
ある特定の細胞又は状況におけるＰＬＡ２活性化の機序がなんであれ、ＰＬＡ２阻害剤の髄腔内投与に続く痛覚過敏の低下に伴って脚浮腫の減少は観察されなかったので、本発明に関して観察されるＰＬＡ２阻害に対する生物学的応答は、末梢での抗炎症作用よりも脊髄促通の減少によるものであると考えられる。更に、髄腔内的に与えたと同量のＰＬＡ２を腹腔内投与してもカラゲナン誘発熱痛覚過敏に対して影響はなかった。
【００１９】
実施例６及び７に示し表１に要約したように、ＰＬＡ２阻害剤によってラット脊髄中でのｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２活性を低下させることができる。ｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２阻害剤メチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）及びアラキドニルトリフルオロメチルケトン（ＡＡＴＦＭＫ）を髄腔内投与すると、後足へのカラゲナン注入によって誘発される熱痛覚過敏、及びフォルマリンで誘発されるフリンチング（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）を投与量依存的に防止し、通常の運動機能に影響しない（実施例２及び３も参照のこと）。
【００２０】
【表１】
2005519134.tif 000002
ａ．食塩水、賦形剤又はＰＬＡ２阻害剤をＩＴ注入した後、６０分間の自発運動。運動は足にホルマリンを注入しないで自動フリンチング計数装置を使用して定量化した。動物を装置に馴れさせ、賦形剤又は薬物をＩＴ投与して１０分後に測定を開始した。
ｂ．グループＶＩ特異的ｉＰＬＡ２阻害剤ブロモエノールラクトン（ＢＥＬ）の髄腔内注入により、ホルマリンで誘発されるフリンチングは低下したが、自発運動も抑制された。多分、鎮静／運動機能不全によるのものであろう。
【００２１】
対照的に、ＣＯＸ酵素はプロスタグランジンの合成に対して極めて重要であり、傷害に先立ってこの酵素を阻害すると痛覚過敏が低下することがわかっているが、痛覚過敏が始まった後にＣＯＸ阻害剤をＩＴ投与しても痛覚過敏行動を救出できない（炎症の開始に続くＡＡＴＦＭＫのＩＴ投与により痛覚過敏の部分的緩和は可能であるが）。したがって、観察される阻害効果は、脊髄ホモジネート中でＰＬＡ２活性を明らかに低減することが実証された阻害剤の能力（実施例６及び７）と結びついており、ＰＬＡ２活性の調節と密接に関連している。
【００２２】
Ｃ．ＣＮＳ中でのＰＬＡ２の阻害方法
１．既存ＰＬＡ２阻害剤の活性
上に示したように、既知ＰＬＡ２阻害剤（例えばＡＡＴＦＭＫ及びＭＡＦＰ）はＣＮＳ中で活性を有する。他のＰＬＡ２阻害剤（例えば、脂肪酸トリカルボニル及びトリフルオロメチルケトン、並びに大分子ピロリジンをベースにした阻害剤）が各種哺乳動物細胞中で活性であることが知られており、脊髄細胞でも活性かも知れない。しかしながら、このような阻害剤の多くはその効果が可逆的ではないし、ＰＬＡ２に対して完全に特異的でもない。したがって、これらの阻害剤は脊髄が介在するＰＬＡ２活性を阻害できるかもしれないが、より優れた結果は特異的で可逆的な本発明のＰＬＡ２阻害剤を用いて得られるであろう。
【００２３】
２．新規２−オキソアミドＰＬＡ２阻害剤：活性と構造
新規な種類の強力なヒトＰＬＡ２阻害剤を開発した。これらの阻害剤は、２−オキソアミド官能性を含み、式Ｉ
【化１】
2005519134.tif 000003
で記述される。但し、式中、
Ｒ１は、カルボキシル、ホスフェート、ホスフィネート、サルフェート、スルフォネート、又はテトラゾリル基などの任意の酸性基であり、
Ｒ２、Ｒ３は任意の芳香族、複素環、又は炭素環基、或いは直鎖状又は分枝鎖状の飽和又は不飽和のアルキル、アルケニル、若しくはアルキニル鎖であり、
ｎ≧０、ｍ≧０、ｋ≧０である。
【００２４】
以下の表２〜５にデータを要約した阻害活性研究に依れば、好ましいＰＬＡ２阻害剤は、それに限定するものではないが、以下の１項又は複数を含む特徴を有する阻害剤である。
（１）すべてが、本開示の以下の節に記載された一般合成スキーム（１）に従って作られる疎水性２−オキソアミドであり、
（２）Ｒ２側鎖置換基が、α−、β−、γ−、δ及びε−アミノ酸であってよく、
（３）Ｒ３が、３個を超える、好ましくは６個を超える、最も好ましくは１０個を超える炭素長を有し、
（４）好ましくは遊離カルボキシ部分が残され（しかし、下記の（８）を参照）、
（５）エーテル側鎖の長さが約１１個の炭素を超えるまでには決して増加せず、
（６）ノルロイシン化合物中のカルボキシ基からδ−又はγ−ノルロイシンの距離に比較できる、カルボキシ部分とオキソアミド側鎖の間の距離を有する阻害剤が好ましく、δ−及びγ−ノルロイシン変形体が特に好ましく、
（７）Ｒ３側鎖にメチレンが加えられてもよく、
（８）本発明阻害剤の遊離カルボキシ部分の代わりに極性置換基が置換されてもよく、
（９）特にｃＰＬＡ２の阻害のためには、分子が負に帯電していてもよい。
【００２５】
試験した化合物の中で、Ｌ−γ−ノルロイシンを含む長鎖２−オキソアミドは最も有力な阻害剤の１つであって、０．００９のモル分率でｃＰＬＡ２活性を５０％低下させた（化合物「ＯＡ４」表２及び３、並びに実施例２及び７を参照のこと）。上のデータのすべては、酵素を５０％阻害するのに必要な全基質界面中の阻害剤のモル分率であるＸ１（５０）として示す。阻害剤は、通常、ＰＬＡ２の活性部位に結合するのに役立つ疎水的性質を有しているので、ＰＬＡ２に対する阻害剤のほとんどすべては、リン脂質表面に分配される。これらの阻害剤が表面に分配される場合、表面希釈と呼ばれる重要な物理的効果が働く。この場合、ＰＬＡ２と阻害剤の相互作用の強さは、阻害剤の容積濃度（モル単位）ではなく阻害剤の表面濃度（モル分率単位）によって決まる。
【００２６】
合成、評価したいくつかの化合物の活性を以下の表に要約し、本発明化合物が強力なＰＬＡ２阻害剤であることを明らかにする。図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、提示された阻害効果は、完全に可逆であり、本発明の阻害化合物を治療的応用で使用する上で特に魅力的な候補にしている。
【００２７】
表２．識別番号、化学構造、及び各種２−オキソ−アミド化合物のｉＰＬＡ２に対する阻害効力。Ｎ．Ｄはその化合物が弱い阻害剤であるためＸ１（５０）値を決定できないことを示す。Ｎ／Ａはその化合物に対してＸ１（５０）値が与えられていることを示す。
【表２−１】
2005519134.tif 000004
【表２−２】
2005519134.tif 000005
【００２８】
表３．識別番号、化学構造、及び各種２−オキソ−アミド化合物のｉＰＬＡ２に対する阻害効力。Ｎ．Ｄはその化合物が弱い阻害剤であるか、或いは原液濃度の関係で完全な投与依存分析ができないために、Ｘ１（５０）値を決定できないことを示す。Ｎ／Ａはその化合物に対してＸ１（５０）値が与えられていることを示す。
【表３】
2005519134.tif 000006
【００２９】
表４．識別番号、化学構造、並びに各種２−オキソ−アミド化合物のｉＰＬＡ２及びｃＰＬＡ２の双方に対する阻害効力。Ｎ．Ｄはその化合物が弱い阻害剤であるためＸ１（５０）値を決定できないことを示す。Ｎ／Ａはその化合物に対してＸ１（５０）値が与えられていることを示す。
【表４】
2005519134.tif 000007
【００３０】
表５．ｃＰＬＡ２又はｉＰＬＡ２のいずれにも阻害を示さない２−オキソ−アミド化合物の識別番号及び化学構造。
【表５】
2005519134.tif 000008
【００３１】
これらのデータは、本発明のＰＬＡ２阻害剤に必須な及び望ましい特徴を示している。例えば、Ｒ３置換基の長さが重要である。ロイシン及びフェニルアラニン変形体を用いて２−オキソ酸部分からの飽和鎖（Ｒ３位、式Ｉ参照）の長さ（１３個の炭素）の役割を調べてみた。その長さを炭素６個又は炭素１０個に短くすると、効力はそれぞれ４分の１及び２分の１に低下した。より短いＲ３置換基の付いたγ−カーバメート、ＯＡ２９は、ｃＰＬＡ２を阻害しなかったが（表５）、一方、Ｒ３位の鎖がより長いものは中程度のレベルの阻害を示した（表２のＯＡ１５）。ＯＡ２８とＯＡ１の活性比較においても同様の効果が見受けられた（それぞれ表５及び表２）。
【００３２】
本発明はその作用機序によって限定されるものではないが、脂質ミセルに対する分配は、鎖の短い疎水性の弱いアシル鎖によって影響され、或いは多分、ｃＰＬＡ２の深部疎水性活性部位とのより弱い相互作用によって起こるのかもしれない。このことは、４個又は３個のメチレン基で２−オキソアミドに結合したＲ３フェニル置換基をもつ化合物はｃＰＬＡ２を阻害しないことによって示唆される（表５のＯＡ３５及びＯＡ３６）。これらの化合物はよりかさばってもいるより短い置換基をもち、このことがこれら化合物の活性に影響を与えているのかもしれない。予想されるように、これら二つの化合物のカルボキシメチルエステル変換物（それぞれ、表３のＯＡ２０及び表５のＯＡ３４）もｃＰＬＡ２を阻害しない。
【００３３】
更に、活性は遊離カルボキシ基の存在によってある程度左右されると思われる（表２を参照してＯＡ１及びＯＡ８に対するデータを比較されたい）。他の選択肢として、分子に比較的極性のある置換基を付加することによって阻害効力はある程度強化される。この現象はカルボキシとγ−側鎖の代わりにラクトンを有し、したがって帯電していないＯＡ２５（表５）によって説明できる。予想されるように、ＯＡ２５はｃＰＬＡ２に関してまったく弱い阻害剤であるが、０．０９１モル分率で若干の阻害活性を有している。対照的に、カルボキシメチルエステルであるＯＡ１９（表３）は阻害活性を示さない。この現象の更なる例は、遊離カルボキシを含有するカーバメートＯＡ３０（表５）のカルボキシメチル変形体であるＯＡ２６（表５）が提供している。ＯＡ３０はｃＰＬＡ２を阻害しないのに、ＯＡ２６はその中に遊離カルボキシ部分が存在しないにもかかわらず阻害する。ＯＡ２６の活性は、多分、カーバメート及びカルボキシメチルエステルの極性はより良好に適合しているのに、カーバメート側鎖及び遊離カルボキシ基の極性のいずれかとｃＰＬＡ２活性部位は不適合であるためであろう。
【００３４】
したがって、ｃＰＬＡ２活性部位の構成を考慮すると、阻害活性の程度を維持しながら本発明阻害剤の遊離カルボキシ部分を極性置換基で置換することが可能である。よって、これらの極性置換分子は本発明の範囲内である。それでも一般には遊離カルボキシ部分を持つ阻害剤分子が好ましい。
【００３５】
また、ｃＰＬＡ２阻害剤の活性は、遊離カルボキシの代わりにカルボキシメチルエステルを含むＯＡ１の変形体（表３、ＯＡ１９）が阻害性を示さないことによって示唆されるように、阻害剤中に負電荷を存在させることによっても強化される。ＯＡ１９は、０．０９１モル分率でｃＰＬＡ２に対して測定可能な阻害性を有しない。
【００３６】
効力はまた、オキソアミド基とカルボキシ基の間の相対距離の増加によっても強化される（表２、ＯＡ４のα−、β−、γ−、δ−及びε−アミノ酸変形体（それぞれＯＡ２、ＯＡ３、ＯＡ４、ＯＡ５、及びＯＡ６）の活性比較）。特に、カルボキシ部分がノルロイシン側鎖からより遠ざかるにつれて阻害効力が増加する。例えば、α−アミノ酸変形体であるＯＡ２は、比較的弱い阻害剤である（ＯＡ４の約７分の１の効力）。β−ノルロイシンはより良好な阻害活性、すなわちＯＡ４の約３分の１の効力を示す。δ−ノルロイシンの阻害活性は、ＯＡ４の阻害活性と本質的に同等である。しかしながら、δ−ノルロイシンからγ−ノルロイシンで阻害能力が横這いになるのに合せて、ε−アミノ酸変形体であるＯＡ６はＯＡ４の約２分の１の効力であった（表２）。このように、カルボキシ部分とオキソアミド部分の間にカルボキシ基からδ−又はγ−ノルロイシンの距離に相当する距離を有する阻害剤が好ましく、δ−及びγ−ノルロイシン変形体が特に好ましい。
【００３７】
δ−又はγ−ノルロイシン変形体の使用に加え、疎水度を増加させるために１個又は複数のメチレンを附加するなど、当業者が同一と認めるその他の修正によって本発明の阻害剤に距離と疎水性を具備させてもよい。例えば、Ｒ３置換基（式Ｉ参照）は、ＯＡ２、ＯＡ４、及びＯＡ６のメチレン９個からＯＡ３及びＯＡ５のメチレン１２個まで変化する。置換基Ｒ３が長くなると阻害効力に有利に働くと思われるので、Ｒ３位にメチレン１２個を持つγ−ノルロイシンはメチレン９個のγ−ノルロイシン（ＯＡ４）よりも、或いはメチレン１２個のδ−ノルロイシン（ＯＡ５）さえよりも有効であると期待しても不合理ではない。
【００３８】
しかしながら、データは阻害化合物の構造を変形することの限界を示してもいる。特に、エーテル側鎖の長さが全体としてかなり増大すると、ｃＰＬＡ２活性部位が受け入れない。Ｌ−γ−ノルロイシン−２−オキソアミド（ＯＡ４）はｃＰＬＡ２の活性に対してかなり有効であるが、ノルロイシン側鎖をより長い（炭素１１個）エーテルを含む側鎖で置換すると、その阻害効力は両方の立体異性体で５分の１に減少する（図１３）。データの形が直線（対数的に）であることは、約０．０４５モル分率でのエナンチオマー双方に対するＸ１（５０）によって確認される阻害性が弱いことを示し、ｃＰＬＡ２活性部位がこの位置のより極性のヘテロ原子に対して若干の不寛容性を持っていることを示唆している。この仮説は、更に、側鎖がカーバメート（例えば、表２及び４の、ＯＡ１６、ＯＡ３０及びＯＡ３２）又はアミド（例えば表４のＯＡ３１及びＯＡ２９）を含むことによって阻害性が欠如することによって支持される。これらのものにはｃＰＬＡ２に関して測定可能なほどの阻害性はなかった。
【００３９】
３．新２−オキソアミドＰＬＡ２阻害剤の合成
先の表に記載された化合物に対する一般構造及び合成スキームを以下に示す。いくつかの単純で代表的な第一級及び第二級２−オキソアミド、並びに遊離カルボキシル基を含む４つの誘導体の合成を示す。具体的で代表的な阻害化合物であるＯＡ４の合成を実施例８で詳しく述べる。
【００４０】
カルボキシル基を含む２−オキソ−アミドを合成するための一般的スキーム
【化２】
2005519134.tif 000009
【００４１】
本発明阻害剤の合成は、上記スキーム１に概略を示し、後記のスキーム２でも繰り返す第１及び第２ステップから開始して達成できる。両スキームで、Ｎ−保護アミノアルコール１は、対応する天然又は非天然アミノ酸から混成無水物−ＮａＢＨ４法又はフッ化アシル−ＮａＢＨ４法によって調製される。アルコール１を、触媒量の４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−ニルオキシフリーラジカル（ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ）の存在下でＮａＯＣｌによって対応するアルデヒドに酸化し、そのアルデヒド２をいかなる精製もしないで直接的に次のステップに使用する。
【００４２】
スキーム１で、ステップ（ｉ）は、スキーム２に記したような選択肢、ステップ３、４及び／又は５、並びにそれと同等なステップを包括的に表す。ステップ（ｉｉ）は、スキーム２に記したような選択肢、ステップ６、７及び／又は８、並びにそれと同等なステップを包括的に表す。ステップ（ｉｉｉ）は、スキーム２に示すような選択肢、ステップ９並びにそれと同等なステップを包括的に表し、ステップ（ｉｖ）は、スキーム３〜９に示す代替合成ルートに対するステップをひとまとめにして表示したものである。
【００４３】
γ−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤の合成には、使用するイリド及びＮ−保護基に応じて３つのルートがある（スキーム２）。Ｂｏｃ保護アミノアルデヒドのベンジル又はメチル（トリフェニルホスホランイリド）アセテートとのウィティッヒ反応によりα，β−不飽和エステル３及び４が得られる。Ｂｏｃ基を除去し、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の存在下に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣＩ）を用いて、アミノ部分を２−ヒドロキシ酸と結合させる。７の場合にはケン化と組み合わせた６及び７の接触水素化、次いでＰＤＣ又はＮＡＯＣｌ／ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯを用いる酸化により、目的化合物９が得られる。Ｚ−保護アミノアルデヒドをｔｅｒｔ−ブチルトリフェニルホスホランイリデン）アセテートで処理して化合物５を得る。接触水素化の後、ＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法によりアミノ部分を２−ヒドロキシ酸と結合させる。８を酸化し、続いてＣＦ３ＣＯＯＨでｔｅｒｔ−ブチル基を除去すると化合物９が生じる。
【００４４】
スキーム２。γ−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤を合成するための３ルート
【化３】
2005519134.tif 000010
【００４５】
試薬及び条件：（ａ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃；（ｂ）Ｐｈ３Ｐ＝ＣＨＣＯ２Ｙ、ＴＨＦ、還流；（ｃ）４Ｎ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ；（ｄ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｅ）Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ；（ｆ）１Ｎ  ＮａＯＨ、ジオキサン／Ｈ２Ｏ  ９：１；（ｇ）５０％ＣＦ３ＣＯ２Ｈ／ＣＨ２Ｃｌ２。
【００４６】
ε−アミノ酸をベースにした阻害剤の場合は、アルコール１をアルデヒドに変換し、トリエチルホスホノクロトネートと反応させる（スキーム３）。化合物１０の接触水素化、保護基の除去、２−ヒドロキシ酸との結合により化合物１１を得る。ケン化、それに続く酸化により化合物１２が生じる。
【００４７】
反応スキーム３。ε−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤の合成。
【化４】
2005519134.tif 000011
【００４８】
試薬及び条件：（ａ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃；（ｂ）（ＥｔＯ）２Ｐ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｅｔ、ＬｉＯＨ、ＴＨＦ；（ｃ）Ｈ２  １０％Ｐｄ／Ｃ；（ｄ）４Ｎ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ；（ｅ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｆ）１Ｎ  ＮａＯＨ、ジオキサン／Ｈ２Ｏ  ９：１。
【００４９】
α−アミノ酸をベースにした阻害剤の場合には、α−アミノ酸のメチルエステル１３を２−ヒドロキシ酸と結合させる（スキーム４）。１４をケン化し、続いて酸化すると化合物１５が生じる。
【００５０】
スキーム４。α−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤の合成。
【化５】
2005519134.tif 000012
【００５１】
試薬及び条件：（ａ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｂ）１Ｎ  ＮａＯＨ、ジオキサン／Ｈ２Ｏ  ９：１；（ｃ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃。
【００５２】
同様に、α−アミノ酸をベースにした阻害剤に対してスキーム４で示したルートに従って、β−アミノ酸エステルからβ−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤を調製できる。β−アミノ酸をベースにした阻害剤の場合、別法としては出発原料としてＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−フェニルアラニノール１６を使用してもよい。化合物１６を酸化し、アルキリデンホスホランと処理して化合物１７を生成させる（スキーム５）。保護基を除去し、２−ヒドロキシ酸と結合させると化合物１８が生じ、これを水素化する。ＭｅＣＮ、ＥｔＯＡｃ、Ｈ２Ｏ（１：１：８）中でＮａＩＯ４、ＲｕＣｌ３で酸化してフェニル基をカルボン酸に変換する。
【００５３】
スキーム５。β−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤の合成。
【化６】
2005519134.tif 000013
【００５４】
試薬及び条件：（ａ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃；（ｂ）ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＨ２Ｐ＋Ｐｈ３Ｂｒ−、ＫＨＭＤＳ、トルエン、−７８℃；（ｃ）Ｈ２  １０％Ｐｄ／Ｃ；（ｄ）４Ｎ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ；（ｅ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｆ）ＮａＩＯ４、ＲｕＣｌ３、ＭｅＣＮ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  １：１：８。
【００５５】
δ−アミノ酸をベースにした阻害剤の場合には、Ｂｏｃ−保護アミノアルコール１を酸化し、Ｂｒ−Ｐｈ３Ｐ＋ＣＨ２ＣＨ２Ｃ６Ｈ５から生成させたイリドと反応させる（スキーム６）。２０の保護基を除去し、２−ヒドロキシ酸と結合させると化合物２１が生じた。接触水素化の後、フェニル基のカルボン酸への酸化的変換により化合物２２が生じた。
【００５６】
スキーム６。δ−アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤の合成。
【化７】
2005519134.tif 000014
【００５７】
試薬及び条件：（ａ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃；（ｂ）ＰｈＣＨ２ＣＨ２Ｐ＋Ｐｈ３Ｂｒ−、ＫＨＭＤＳ、トルエン、−７８℃；（ｃ）４Ｎ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ；（ｄ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｅ）Ｈ２  １０％Ｐｄ／Ｃ；（ｆ）ＮａＩＯ４、ＲｕＣｌ３、ＭｅＣＮ／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  １：１：８。
【００５８】
同族アミノ酸をベースにした阻害剤の合成は、スキーム７に記したように行ってもよい。１から作製したＢｏｃ−保護アミノアルデヒドをＩ−Ｐｈ３Ｐ＋ＣＨ２（ＣＨ２）ｎＯＴｒから生成させたイリドと反応させる。２３の保護基を除去し、２−ヒドロキシ酸と結合させると化合物２４が生じる。接触水素化し、相間移動触媒の存在下にＮａＯＣｌ／ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯで酸化すると化合物２５が生じる。
【００５９】
スキーム７。同族アミノ酸をベースにした２−オキソアミド阻害剤のための合成ルート。
【化８】
2005519134.tif 000015
【００６０】
試薬及び条件：（ａ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃；（ｂ）ＴｒＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ２Ｐ＋Ｐｈ３Ｉ−、ＫＨＭＤＳ、トルエン、−７８℃；（ｃ）４Ｎ  ＨＣｌ／Ｅｔ２Ｏ；（ｄ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｅ）Ｈ２  １０％Ｐｄ／Ｃ；（ｆ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、Ｂｕ４Ｎ＋ＨＳＯ４−、ＮａＢｒ，ＮａＨＣＯ３、ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ、０℃。
【００６１】
グルタミン酸をベースにした２−オキソアミドはスキーム８及び９に記したようにして調製できる。γ−メチルｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルグルタメート２６をＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法によってアミンと結合させる。保護基を除去し、２−ヒドロキシ酸と結合させると化合物２８が生じた。２８のケン化及びＮａＯＣｌ／ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯを用いる酸化により化合物２９が生成した。アルキルイソシアネートで処理してアルコール３０をカーバメート３１に変換した。保護基を除去し、２−ヒドロキシ酸と結合させると化合物３２が生じた。３２のケン化及びＮａＯＣｌ／ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯを用いる酸化により化合物３３が生成した。
【００６２】
【化９】
2005519134.tif 000016
スキーム８。グルタミン酸をベースにした２−オキソアミド。
【００６３】
試薬及び条件：（ａ）ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＮＨ２、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｂ）４Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ；（ｃ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｄ）１Ｎ  ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ；（ｅ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、５℃。
【００６４】
【化１０】
2005519134.tif 000017
スキーム９。グルタミノールをベースにした２−オキソアミド。
【００６５】
試薬及び条件：（ａ）ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＮＣＯ、ＤＭＡＰ；（ｂ）４Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ；（ｃ）Ｒ２（ＣＨ２）ｍＣＨＯＨＣＯ２Ｈ、ＷＳＣＩ、ＨＯＢｔ；（ｄ）１Ｎ  ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ；（ｅ）ＮａＯＣｌ、ＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ、ＮａＢｒ、ＮａＨＣＯ３、トルエン／ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏ  ３：３：０．５、−５℃。
【００６６】
各阻害化合物に対する分析データ
【００６７】
（４Ｒ）−５−（デシルオキシ）−４−［（２−オキソドデカノイル）アミノ］ペンタン酸（ＯＡ１１）
2005519134.tif 000018
【００６８】
（３Ｓ）−（２−オキソ−ペンタデカノイルアミノ）−ヘプタン酸（ＯＡ３）
2005519134.tif 000019
【００６９】
（５Ｓ）−５−（２−オキソペンタデカノイルアミノ）−ノナン酸（ＯＡ５）
2005519134.tif 000020
【００７０】
（４Ｓ）−４−（２−オキソペンタデカノイルアミノ）−ヘプタン酸（ＯＡ１４）
2005519134.tif 000021
【００７１】
（４Ｒ）−６−メチル−４−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ヘプタン酸（ＯＡ１３）
2005519134.tif 000022
【００７２】
（６Ｓ）−６−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−デカン酸（ＯＡ６）
2005519134.tif 000023
【００７３】
（４Ｒ）−４−（２−オキソ−ペンタデカノイルアミノ）−５−フェニル−ペンタン酸（ＯＡ９）
2005519134.tif 000024
【００７４】
（２Ｓ）−２−（２−オキソ−ペンタデカノイルアミノ）−ヘキサン酸（ＯＡ２）
2005519134.tif 000025
【００７５】
（４Ｒ）−４−（２−オキソ−オクタノイルアミノ）−５−フェニル−ペンタン酸（ＯＡ１７）
2005519134.tif 000026
【００７６】
（４Ｒ）−６−メチル−４−（２−オキソ−ペンタデカノイルアミノ）−ヘプタン酸（ＯＡ１２）
2005519134.tif 000027
【００７７】
３−［１−（２−オキソ−ペンタデカノイル）−ピロリジン−２−イル］プロピオン酸（ＯＡ１８）
2005519134.tif 000028
【００７８】
３−［１−（２−オキソ−ドデカノイル）−ピロリジン−２−イル］プロピオン酸（ＯＡ３７）
2005519134.tif 000029
【００７９】
５−オクチルカルバモイルオキシ−４−（Ｓ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ペンタン酸（ＯＡ１６）
2005519134.tif 000030
【００８０】
５−エチルカルバモイルオキシ−４−（Ｓ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ペンタン酸（ＯＡ３０）
2005519134.tif 000031
【００８１】
５−エチルカルバモイルオキシ−４−（Ｒ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ペンタン酸（ＯＡ３２）
2005519134.tif 000032
【００８２】
４−エチルカルバモイル−４−（Ｓ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ２９）
2005519134.tif 000033
【００８３】
４−エチルカルバモイル−４−（Ｒ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ３１）
2005519134.tif 000034
【００８４】
４−デシルカルバモイル−４−（Ｓ）−（２−オキソ−ヘキサデカノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ１５）
2005519134.tif 000035
【００８５】
２−（Ｓ）−（２−オキソ−ドデカノイルアミノ）−ペンタンジオン酸（ＯＡ３３）
2005519134.tif 000036
【００８６】
４−（２−オキソ−６−フェニル−ヘキサノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ３５）
2005519134.tif 000037
【００８７】
４−（２−オキソ−５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ３６）
2005519134.tif 000038
【００８８】
４−［（２−オキソオクタノイル）アミノ］ブタン酸（ＯＡ２８）
2005519134.tif 000039
【００８９】
４−［（２−オキソヘキサデカノイル）アミノ］ブタン酸（ＯＡ１）
2005519134.tif 000040
【００９０】
（４Ｓ）−４−［（２−オキソドデカノイル）アミノ］オクタン酸（ＯＡ４）
2005519134.tif 000041
【００９１】
（４Ｒ）−４−［２−（オキソドデカノイル）アミノ］オクタン酸（「ＯＡ７」）
分光データは（Ｓ）−エナンチオマーで得られたものと同じであった。
【００９２】
Ｄ．ＰＬＡ２阻害医薬組成物及びその使用
治療的応用（例えば、疼痛、炎症、又は痛覚過敏の治療）での使用に関して、送達されるべきＰＬＡ２阻害剤の個々の量は、達成されるべき効果、該組成物が送達される生物体種、送達経路、投与計画、並びに生物体の年齢、健康、及び性を含む多くの要因によって決まる。よって、個々の投与量は当業者の判断に委ねられる。
【００９３】
治療組成物の処方及びそれに続く投与は当業者の技術に属すると考えられる。投与は治療する病態の重篤度及び応答度によって決まり、治療の過程は数日から数カ月、或いは治癒が実現されるまで、又は病態の縮小が達成されるまで継続される。最適投与スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定から計算できる。当業者は、最適な投与量、投与方法及び繰返し速度を容易に決定できる。最適投与量は、個々の阻害剤の相対的用量効力に応じて変動してもよく、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで通常有効であることが見出されたＸ１（５０）に基づいて予測できる（例えば、実施例７を参照）。一般に、投与量は体重ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、必要なら、毎日、毎週、若しくは毎年に１回又は複数回与えることができる。
【００９４】
毒性は、本発明のＰＬＡ２阻害剤の臨床的に有効な投与量で、低いか、或いはないものと予想される。実施例に示したデータは、ｅｘ  ｖｉｖｏ処置細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏ処置動物で細胞毒性の兆候なしで得られた。更に、グループＩＶＡ  ＰＬＡ２がすべて欠損した遺伝子ターゲッティングマウスでは、疾病、ストレス、及び物理的傷害に対して炎症の病理学的反応をほとんど示さない傾向があり、これによってマウスはその細胞及び全身障害から本質的に保護される。これらの動物は、他のすべての点でまったく正常であり、ｃＰＬＡ２の活性を相当阻害しても、特に比較的短期間の治療では有害効果を与えないに違いないことを示唆している。実際、本発明のＰＬＡ２阻害剤及び方法を使用して各種の炎症状態を治療すれば、現在の治療法及び処置の多くの副作用及び欠点を回避できるはずである。
【００９５】
本発明のＰＬＡ２阻害剤は、薬剤として許容できる塩、エステル、又は該エステルの塩、或いはヒトを含む動物に投与すると生物学的に活性な代謝産物又はその残留物を（直接的又は間接的に）提供できる任意の他の化合物を含む任意の形態で投与できる。用語「薬剤として許容できる塩」とは、本発明化合物の生理学的及び薬剤として許容できる塩、すなわち、所望する親化合物の生物学的活性を保持し、かつ、それに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を意味する。
【００９６】
更に、本発明は、ＰＬＡ２阻害剤のプロドラッグ形、すなわち、体内又は細胞内で内在酵素又はその他の化学物質及び／又は条件の作用によりその活性形（薬物）に変換される不活性形の状態で調製されたものを投与することを包含する。したがって、本発明は、本発明のＰＬＡ２阻害剤のプロドラッグ及び薬剤として許容できる塩を包含する。
【００９７】
薬剤として許容できる塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンなどの金属又はアミンを用いて形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。薬剤学上有用なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅらの論文、「薬剤学的塩（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ）」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、６６巻、１〜１９頁（１９７７年）を参照のこと）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸型を十分な量の望む塩基と接触させ、通常の方式で塩を生成させることによって調製される。遊離酸型は、塩型を酸と接触させ、通常の方式で遊離酸を単離することにより再生できる。遊離酸型は、そのそれぞれの塩型とは極性溶媒中での溶解度など、ある種の物理的性質を若干異にするが、その他の点で、塩は、本発明の目的に対してそのそれぞれの遊離酸と同等である。
【００９８】
経口投与も適用可能であり、その他の適用（例えば、末梢の炎症及び疼痛）では経口投与が好ましいが、ある種の適用（例えば痛覚過敏）には脳脊髄幹、例えば髄腔内又は脳室内投与経路が好ましいかもしれない。髄腔内又は脳室内投与用の組成物及び処方には、滅菌した水溶液、エマルジョン、及びリポソームをベースにした処方が含まれ、その処方には、緩衝液、希釈剤、及びそれに限定はされないが浸透強化剤、担体化合物及びその他の薬剤として許容できる担体又は賦形剤など、その他の適当な添加剤を含めることもできる。
【００９９】
本発明の組成物には、溶液、エマルジョン、懸濁液、及び使用に適した任意の他の剤形のための有用で非毒性の薬剤として許容できる担体を含めることができる。使用できる担体には、グルコース、ラクトース、マンノース、アラビアゴム、ゼラチン、マニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、馬鈴薯デンプン、尿素、中間鎖長トリグリセリド、デキストラン、及びその他製剤を製造するのに適した固体、半固体、又は液状の担体が含まれる。更なる補足として、安定、増粘及び着色剤、並びに香料も使用できる。
【０１００】
ｃＰＬＡ２に相同でその機能があまりよく知られていないＧ  ＶＩ  ＰＬＡ２、Ｇ  ＩＶＢ及びＧ  ＩＶＣなど、多くの酵素及びタンパク質がある。これら酵素の共通触媒機序及び分岐配列相同性により、これらの酵素はＰＬＡ２と同様魅力的な共通標的となる。例えば、Ｓｅｒ−Ａｓｐ活性部位をｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２と共有するＰＬＡ２相同体に対して有効な阻害剤を、本発明のＰＬＡ２阻害剤と一緒に投与してもよい。したがって、具体的な阻害の標的には、グループＩＶＢ  ＰＬＡ２、グループＩＶＣ  ＰＬＡ２、グループＶＩＡ  ＰＬＡ２、グループＶＩＢ  ＰＬＡ２、ニューロパシー標的エステラーゼ、真菌からのホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）、植物のパタチン（ｐａｔａｔｉｎ）及びシュードモナスアエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からのＥｘｏＵなどの各種バクテリア同族体が含まれる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｓｉｘ，Ｄ．Ａ．、Ｄｅｎｎｉｓ，Ｅ．Ａ．、及びＧｈｏｓｈ，Ｐ．、調製原稿）。ＰＬＢはカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）などの真菌の病原性に不可欠であることが見出されており、ＥｘｏＵがの日和見感染性シュードモナスアウルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ）の大部分の細胞毒性に不可欠であることも見出されている。
【０１０１】
このような相同体は、リン脂質からリゾリン脂質、その他のエステル含有化合物に及ぶ各種の基質を有する。しかしながら、すべてはｃＰＬＡ２に関係し、互いにその同じ触媒残部及び触媒機序に関係している。したがって、本発明は更にＰＬＡ２相同体の阻害剤を一緒に投与すること、又はその阻害剤で同時に治療することを包含する。
【０１０２】
本発明の方法及び組成物の最大効力を示すデータを以下の実施例で提供する。実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義される。時間に対する「ｈ」など、実施例で使用する省略はその通常の意味を有するものとする。
【０１０３】
本発明を十分に説明してきたので、本明細書に記載した方法及び応用に、本発明の範囲又はその任意の実施形態から逸脱することなしに本明細書に記載された方法及び応用にその他の修正及び調整を成し得ることは当業者にとって極めて明白であろう。したがって、以下の実施例は例示の目的でのみ添えるものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
【実施例１】
【０１０４】
ＥＸ  ＶＩＶＯ実験で利用する一般的方法
動物：実験は、カルフォルニア大学（サンディエゴ）動物管理機構委員会（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された実験計画に従って実施した。Ｈｏｌｔｚｍａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット（２５０〜３５０ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）をケージ内に二匹一組で収容し、食料と水をいつでも自由に取れるようにして１２時間の明／暗サイクルで飼育した。
【０１０５】
髄腔内カテーテル埋込み：髄腔内薬物送達のために、長期腰椎カテーテルをＹａｋｓｈが発表した方法（Ｙａｋｓｈ及びＲｕｄｙ、１９７６年）の改良法に従ってイソフルラン麻酔のもとでラットに埋め込んだ。環椎後頭膜の切開口を通してポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０）を挿入し、尾部から腰膨大の吻側末端に進めた。長期ＩＴカテーテルを付けたラットに関する研究は埋込みの後５日間実施し、ラットは埋込み後に上に記載したと同じ条件下で個々に収容した。除外基準はｉ）何らかの神経学的結果の存在ｉｉ）埋込み後２０％の重量減少又はｉｉｉ）カテーテル閉塞、である。
【０１０６】
炎症の誘発及び痛覚過敏の評価：局部炎症の状態を誘発するために、２ｍｇのカラゲナン（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州、セントルイス、２０％（ｗ／ｖ）生理的食塩水溶液１００μｌ）を左後足の足底表面に皮下的に注入した。熱で誘発される足逃避反応を評価するのには、ガラス面から構成される市販の装置を使用し、ラットをそのガラス面（２５℃に維持）の上でプレキシグラス製のキュービクル（９×２２×２５ｃｍ）の中に１匹づつ入れた。熱侵害受容刺激はガラス面下に設置し焦点を合わせたプロジェクターランプから発生させる。この刺激は、刺激源に取り付けたアングルミラーの助けで各試験対象のどちらかの後足に別々に加えられる。タイマーを光源と共に作動させ、潜時は、ホトダイオード移動センサーによって検知されるような、タイマーを止め刺激を終わらせる活発な逃避を示すに要する時間として定義される。
【０１０７】
時間（Ｔ）＝−１５分で基礎的足逃避潜時（ＰＷＬ）を評価した。Ｔ＝−１０分に動物に髄腔内賦形剤又は薬物を与え、Ｔ＝０でカラゲナンをＩＰＬＴ注入した。次いで、Ｔ＋３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、及び２４０分に逃避潜時を評価し、各時点における左及び右足の平均ＰＷＬとして潜時を表した。また、データを痛覚過敏指数（ＨＩ）でも示した。痛覚過敏指数は、それぞれのモデルに対して各時点に渡って平均したベースラインからのパーセンテージ変化である。これらの値は積み上げられ［すなわち（ベースライン−ポスト薬物潜時）／ベースラインの合計を測定数で割ったもの］、したがって、値が増加すると痛覚過敏が増大することを示す。
【０１０８】
ホルマリン誘発フリンチング。フリンチングは自動検知装置で評価した。この装置を使用するには、試験される動物の後足に柔らかい金属バンド（幅１０ｍｍ、長さ２７ｍｍ、Ｃ字型、重量〜０．５ｇ）を嵌める。Ｃ字の腕を徐々に圧迫して足の周りにブレスレットを形作り、Ｃ字の開いた部分を足の頂部に配置する。動物は１匹用のプレキシグラスチャンバー中で１時間馴化させてから試験チャンバーに移動する。試験チャンバーに動物を入れる直前に動物を一時的に布タオルの中に拘束し、バンドを嵌めた足の背面に５％ホルマリン（容積５０μｌの生理学的食塩水溶液で）を注射する。データの集積は、動物を試験チャンバーに入れた後から開始する。
【０１０９】
疼痛行動は、注射した足の自発的フリンチング又は震えの発生を計数することによって定量化した。フリンチングは６０分間、１分刻みで計数した。ホルマリン注入後、注入した足の自発的フリンチングには２つの相が観察され、これを相１（０〜９分）及び相２（１０〜６０分）と定義する。６０分間の観察が完了したら、ラットをペントバルビタールナトリウムフェニトインナトリウム溶液で屠殺した。
【０１１０】
薬物及び送達。カラゲナンで誘発される痛覚過敏及びフリンチング行動に対する薬物の効果を調べるために、ラットに薬物の髄腔内又は腹腔内注入を行う。髄腔内注入は長期髄腔内カテーテルを前以て埋め込んだラット（前記参照）に、容積１０μｌの薬物、それに続く１０μｌの賦形剤による潅流を用いて行った。腹腔内薬物は、容積０．５ｍｌ／ｋｇで送達した。ＡＡＴＦＭＫ、ＭＡＦＰ及びＢＥＬ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）はＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ社）に溶解した。予備的な投与量範囲の検討の中で副作用の観点から最高可溶投与量の試験をした。賦形剤は、それ自体で約１０秒間継続する引っ掻き及び発声の類の初期注入反応を起こした。薬物はその最高可溶投与量までよく許容された。ＢＥＬの場合を除き通常行動に対する影響は観察されなかった。
【０１１１】
組織調製：屠殺の前にラットに深く麻酔をかけ、断頭後、食塩水を満たしたシリンジで脊柱から脊髄を取り出した。脊髄の腰椎部をドライアイスで凍結し−７０℃で保存した。ドライアイスで事前冷却したＢｉｏＰｕｌｖｅｒｉｚｅｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を使用して凍結脊髄を微紛化した。次いで微紛化組織をミクロ遠心管に移し溶菌用緩衝液７５０μＬ、すなわち１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３４Ｍスクロースと混合した。２０μＬの哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）を直ちに添加した。サンプルを均一になるまで渦撹拌及び音波処理し、１６，０００×ｇ、４℃で４０分間遠心分離した。上清液を新鮮なエッペンドルフ管に移しペレットを廃棄した。
【０１１２】
ウェスタンブロット：上清液のタンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを使用するＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。３０μｇのタンパク質をＮｕＰＡＧＥ４＋１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ社）にかけ、次いでニトロセルロースに転写した。抗ヒトｉＰＬＡ２抗体（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの提供品）を用いてタンパク質を検出した。
【０１１３】
ｃＤＮＡ調製：ＴＲＩｚｏｌ法（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を使用して上清液からｍＲＮＡを抽出し、製造業者の説明書に従ったＤＮＡ−フリー処理（Ａｍｂｉｏｎ）によって汚染ＤＮＡを除去した。得られた無ＤＮＡ−ＲＮＡの濃度を分光光度法で測定した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）及びプライマーとしてオリゴｄＴを使用してｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡの調製に続き、サンプルを３７℃で２０分間ＲＮアーゼと共にインキュベートしてＲＮＡを除去した。
【０１１４】
ＰＬＡ２遺伝子フラグメントのクローニング：下表に挙げたプライマーを使用するＰＣＲによってＰＬＡ２遺伝子フラグメントを生成させた。得られたフラグメントをアガロースゲルで精製し、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にクローン化した。各ベクターを配列して挿入の同一性を確認し、分光光度法でベクター濃度を測定した。
【０１１５】
Ｑ−ＰＣＲ：遺伝子特異的プライマーはＰｒｉｍｅｒ３プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ／）又はＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。ＦＡＭプローブが必要なＰＬＡ２グループＩＩＡ及びＶを除くすべての試験遺伝子に対し、単一アンプリコンを生成させるためにＳＹＢＲグリーンを使用して蛍光を生成させた。プライマー濃度及びＰＣＲ条件は、以下に挙げるようにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｅｒ  ｂｕｌｌｅｔｉｎに記載されたと同様にして最適化した。熱サイクルは標準的な条件、すなわち、５０℃ＵＮＧ活性化（ｔａｑｍａｎケミストリー用）２分、ポリメラーゼ活性化には９５℃で１０分、９５℃で１５秒及び６０℃で１分４０サイクル。標準曲線を生成させるのに未処置ラット脊髄を使用する標準曲線法によってＱ−ＰＣＲ結果を分析した。絶対定量の場合には、ＰＬＡ２遺伝子フラグメント挿入を含むＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ）を使用して標準曲線を生成させた。
【０１１６】
各ラットサンプルについて１０ｎｇの総ｃＤＮＡを分析した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用し、負荷対照として作用させる。各Ｑ−ＰＣＲの実施に続いて解離曲線を生成させ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが推奨するように単一アンプリコンの増幅を確認した。プローブを使用するＩＩＡ及びＶの場合には、アガロースゲルでＰＣＲ産生物を分析して単一アンプリコンの産生を確認した。ＰＣＲ産生物をゲルで精製し、配列してその同一性を確認した。プライマー、プローブ及びＰＣＲ条件を下表に記載する。記載されたプライマー及びプローブ濃度はアッセイでの最終濃度である。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
ＰＬＡ２活性アッセイ：ホモジナイズ化及び遠心分離に続いて、本発明者らの研究室で開発したグループ特異的アッセイ法（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９巻、２７８〜２８８頁、１９９９年）を使用して、脊髄上清液のｃＰＬＡ２又はｉＰＬＡ２活性をアッセイした。ｃＰＬＡ２アッセイ条件を要約すれば、４００μＭトリトンＸ−１００混合ミセル、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、０．０８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及び２ｍＭ  ＤＴＴ中１％１４Ｃラベル化ＰＡＰＣでドーピングした１００μＭ脂質ＰＡＰＣ／ＰＩＰ２（９７／３）である。ｉＰＬＡ２アッセイ条件は、４００μＭトリトンＸ−１００混合ミセル、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５，５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ  ＡＴＰ中１％１４Ｃラベル化ＤＰＰＣでドーピングした１００μＭ  ＤＰＰＣである。各アッセイでの全容積は５００μＬであり、脂質が２００μＬ、アッセイ緩衝液が２５０μＬ、サンプルが５０μＬである。どの場合も、添加したカルシウム又はＥＤＴＡの量は溶菌用緩衝液へのＥＤＴＡの添加を考慮して調節し、上に示した最終濃度とした。
【０１１９】
脂質調製：脂質はＮ２下で乾燥し、少なくとも１時間凍結乾燥して痕跡量のクロロホルムを除去した。次いで脂質を１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及びトリトンＸ−１００中に再懸濁し、溶液が澄明になるまで渦撹拌と温水中での加熱を繰り返してミセルを生じさせた。サンプルを基質と共に４０℃で１時間インキュベートした。次いでアッセイを終了し、修正Ｄｏｌｅアッセイによって脂肪酸を抽出した。アッセイ中に放出された放射性脂肪酸の量をシンチレーション計数によって測定した。分析に続いて、ｃＰＬＡ２アッセイのデータをＹａｎｇらが発表していると同様にして（Ｙａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９巻、２７８〜２８８頁（１９９９年））混入しているｉＰＬＡ２活性に対する調整を行った。
【０１２０】
阻害剤の検討においては、４μＭ又は０．８モル％の阻害剤を添加して上と同じリン脂質及び緩衝液条件を使用した。市販の阻害剤はすべてＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から購入し、脊髄ホモジェネート中での阻害効果をアッセイする前に、ｉＰＬＡ２活性を含むことが知られている純粋なＧＩＶＡ又は細胞溶解生成物を使用してその有効性を確認した。ＡＡＦＴＭＫはアッセイに先立ってホモジェネートと共に４時間インキュベートした。ＭＡＦＰ及びＢＥＬはアッセイの開始直前に脂質基質中に等分した。
【０１２１】
統計：ホルマリン及びカラゲナン痛覚過敏測定には、各グループに６〜８匹のラットを含めた。各時点及び棒は平均±ＳＥＭ（平均標準誤差）を表す。グループ間の差異をＳｔａｔｖｉｅｗ統計ソフトウェアを使用し１元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）で比較した。それぞれの活性アッセイ及びＰＣＲ実験には、３匹のラットを含めた。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄオンライン計算機を使用して阻害剤活性におけるＰ値を求めた。
【実施例２】
【０１２２】
髄腔内ＰＬＡ２阻害剤で防止されるカラゲナン誘発熱痛覚過敏
カラゲナンは特徴的な炎症及びそれに伴う熱痛覚過敏を誘発する。カラゲナンを注入する前にすべての動物に対してベースライン潜時を評価し、応答までの平均時間は左後足（投与側足）に対して１１．１±０．４秒、右後足（非投与側足）に対して１０．６±０．７秒であった。左後足の足底側にカラゲナンを注入した後、足逃避までの時間の短縮が認められた。カラゲナン注入後１２０分で、逃避潜時は３．２±０．７秒に減少した（図１Ａ）。ＩＴ食塩水又はＩＴ賦形剤を与えられた２つの対照群のいずれにおいても逃避時間は変化しなかった（データは示していない）。ＩＴ  ＡＡＴＦＭＫ又はＩＴ  ＭＡＦＰのどちらかで前処理すると、カラゲナン誘発熱痛覚過敏が投与量に強く依存して防止された（図１Ａ及びＣ）。
【０１２３】
重要なことであるが、どちらかの薬剤の最高投与量でも炎症を起こしていない足の応答潜時は変化しなかった。２００μｇのＩＴ  ＡＡＦＴＭＫ投与（２６±１３）又は３００／μｇのＩＴ  ＭＡＦＰ投与（２５±１１）で、賦形剤対照を与えられたラット（７７±４）と比較して、統計的に有意な痛覚過敏指数の低下が起こった（図１Ｂ及びＤ）。溶解度の制約により、髄腔内で与えられた最高投与量は２つの化合物間で異なる。
【０１２４】
賦形剤又はＰＬＡ２阻害剤の注入に続き、短時間、約１０秒間の発声及びスクラッチングがあった。自発運動の試験により、これらの化合物は通常の運動機能に対して外見上の影響を与えないことがわかったが（表１）、３番目のｉＰＬＡ２特異的阻害剤（ブロモエノールラクトン）は実施例４で考察するようにこのような影響を与える。髄腔内に送達したＰＬＡ２阻害剤の抗痛覚過敏効果が、脊髄から末梢部位への再分布に続く末梢作用ではなく脊髄作用によるものであることを確認するために、髄腔内に与えたと同量のＡＡＴＦＭＫ（２００μｇ）を腹腔内（ＩＰ）に与えた。図２Ａに示したように、ＡＡＦＴＭＫ２００μｇのＩＰ投与後に、カラゲナン誘発熱痛覚過敏に対する効果はＩＰ賦形剤を与えた対照群と較べて認められなかった。
【０１２５】
更に、カラゲナンで誘発される足浮腫に対するＡＡＴＦＭＫ髄腔内注入の影響を、足の高さを測定することによって評価した。投与側足の高さは実験の過程でかなり増加した。足の高さは６時間でピークに達し（図２Ｂ）７２時間後にベースラインに戻った（データは示していない）。非投与側足は高さ増加の兆候をまったく示さず、ＰＬＡ２阻害剤で治療しても、カラゲナンを注入した足の高さに対して統計的に有意な影響を与えなかった（図２Ｂ）。
【０１２６】
熱痛覚過敏が既に確立している状態に対するＰＬＡ２阻害剤の効果を調べるために、足にカラゲナンを注入してから１８０分後にＡＡＦＴＭＫを髄腔内で投与した。この研究では、事前処置が熱痛覚過敏の開始を完全に阻止するのと対照的に、事後処置は痛覚過敏をほんの部分的にしか抑えないことは注目される（図３）。
【０１２７】
２−オキソアミド阻害剤の抗炎症活性を評価するために、急性炎症のモデルとしてカラゲナンで誘発されたラットの足浮腫アッセイを利用した（対照薬はインドメタシン、０．０１１ミリモル／ｋｇで４７％抑制）。実験は、体重が２００〜２６０ｇのメスのＦｉｓｈｅｒ３４４ラットで実施した。右足肉趾に皮内的にカラゲナン（Ｋ１００、市販品）２％滅菌食塩水溶液０．１ｍＬを注入することによって誘発される、ラットの足のカラゲナン誘発浮腫の縮小によって抗急性炎症活性を３．５時間後に測定した。同時に試験化合物を腹腔内（ｉｐ）に投与した。対照動物には賦形剤のみを与えた。
【０１２８】
酢酸ライジング（ｗｒｉｔｈｉｎｇ）試験を用いてラットにおける鎮痛活性を評価した（対照薬アセチルサリチル酸ナトリウム、１ミリモル／ｋｇで９３．４％抑制）。阻害剤をｉｐで与え、３０分後に１ｍＬ／体重１００ｇの０．６％酢酸をｉｐで与えた。５分後、３０分間の間５分ごとに伸展の数を計数した。群の各動物が示すライジングの総数を記録し賦形剤で処置した対照群の数値と比較した。
【０１２９】
４−（２−オキソヘキサデカノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ１）及び（４Ｓ）−４−（２−オキソドデカノイルアミノ）−オクタン酸（ＯＡ４）に対するＥＤ５０値は、それぞれ０．０１ミリモル／ｋｇ及び０．１ミリモル／ｋｇであった。カラゲナン足浮腫試験のＥＤ５０投与量に対応する０．０１ミリモル／ｋｇの投与量で、４−（２−オキソヘキサデカノイルアミノ）−ブタン酸（ＯＡ１）は９２．７％の鎮痛活性を示した。カラゲナン足浮腫試験のＥＤ５０投与量に対応する０．１ミリモル／ｋｇの投与量で、（４Ｓ）−４−（２−オキソドデカノイルアミノ）−オクタン酸（ＯＡ４）は６３％の鎮痛活性を示した。
【実施例３】
【０１３０】
ＰＬＡ２阻害剤のＩＴ投与で抑制されるホルマリン誘発フリンチング
右後足の背面側にホルマリンを注入すると初めに導入注入物の破裂が起こり、低レベルの持続的な排出が続く。このモデルにより、後角広活動域ニューロン活性の２相的増加（Ｈａｌｅｙら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、５１８巻、２１８〜２２６頁（１９９０年））、及び並行するフリンチングの２相的発生（図４）が予想される（Ｙａｋｓｈら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９０巻、２３８６〜２４０２頁（２００１年））。ＡＡＦＴＭＫ及びＭＡＦＰで事前処置すると投与量に依存するホルマリン誘発フリンチングの低下が生じる（図４Ａ、Ｂ及びＣ）。相１は薬物によってそれほど影響されないが、相２（図４Ｄ）ではＩＴ賦形剤を与えた群と比較して統計的に有意な低下が認められた。
【実施例４】
【０１３１】
ＡＡＴＦＭＫ及びＭＡＦＰではなくＢＥＬの髄腔内注入で低下する自発運動
髄腔内で投与したＰＬＡ２阻害剤の自発運動に対する影響を調べるために、ラットを足にホルマリン注入することなしにフリンチング計数装置に載せた。統計的に有意ではないが賦形剤はカウント数を低下させる傾向を示した（先の表１）。ＡＡＴＦＭＫ又はＭＡＰＦのＩＴを注入後、１０分から始まり６０分に渡って発生したカウントの総数は、賦形剤で処置した群と比較して統計的に有意な差異を示さなかった。しかしながら、ＢＥＬをＩＴ注入すると、自発運動の測定可能な低下が生じた（賦形剤注入後のカウント３０６±３６に対して２１２±３２）（先の表１）。
【０１３２】
足をホルマリンで処置する１０分前にＢＥＬをＩＴ注入すると、ホルマリン誘発フリンチングの抑制が生じる（データは示していない）が、自発運動の低下のためこの効果が抗痛覚過敏効果によるものなのか、或いは鎮静／運動機能障害によるものなのかは判定できない。髄腔内ＢＥＬの痛覚過敏状態に対する効果はこれ以上検討しなかった。
【実施例５】
【０１３３】
ＰＬＡ２グループＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＣ、ＩＶＡ、Ｖ及びＶＩに対するＲＮＡメッセージは脊髄中に存在するが、傷害に続いて上向き調節はされない
脊髄におけるＰＬＡ２メッセージの存否を判定するために、配列特異的プライマーを選択し、公開データベース中で利用できる各ラットＰＬＡ２遺伝子に対するスプライス部位を囲み、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。次いで、得られたフラグメントを精製し、配列してその同一性を確認した。公開データベースで利用できる配列を持ったすべてのＰＬＡ２が１つ（グループＸ）を例外として脊髄中に存在することが見出された。
【０１３４】
カラゲナンへの暴露に続いて起こる可能性のあるＰＬＡ２メッセージのアップレギュレーションを試験するため、上で使用したプライマーを利用して定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を実施した。非処置ラットから、或いは足にカラゲナンを注入した後２時間又は４時間のラットからｍＲＮＡを抽出した。次いで、抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。遺伝子発現レベルの変化は標準曲線法を使用するＱ−ＰＣＲによって決定した。標準曲線は、対照ラットの１つからのｃＤＮＡを用いて描いた。ＧＡＰＤＨ濃度は、内部対照に使用したと同様の方法で決定した。
【０１３５】
絶対定量による分析（以下で考察）により、対照と処置動物の間でＧＡＰＤＨレベルの有意な変化はないことが判った。増幅に続いて、解離曲線を生成し、或いはサンプル毎にアガロースゲルを行い単一アンプリコンの特異的増殖を確実にした。分析により、対照ラットと比較してカラゲナン注入に続くいかなるＰＬＡ２遺伝子のアップレグレーションも起こっていないことが判った（図５）。
【０１３６】
ウェスタンブロットによる分析により、対照対処置動物でｉＰＬＡ２の安定なレベルが維持させることが判った（図６）。ｉＰＬＡ２はＳＤＳ−ＰＡＧＥで６０−６５ｋＤＡに移動することが報告されている。ＩＰＬＡ２はそのアンキリンリピートを介してオリゴマーを形成することが知られているので、図６で観察される大きなバンドは多分二量化酵素であろう。
【０１３７】
６個のＰＬＡ２遺伝子の相対的発現レベルは、Ｑ−ＰＣＲの絶対定量法を用いて判定した。ＰＣＲによって生成した遺伝子フラグメントをＴＯＰＯベクター中にクローン化した。次いで、得られた環状ＤＮＡを分光光度法で定量し、コピー数を判定した。次いで、これらのベクターを段階的に希釈して１０，０００〜１０個のコピーを得て、これらのベクターを使用して対照ラットサンプルについてＱ−ＰＣＲを再び実施して標準曲線を生成した。この手法を用いて、ＰＬＡ２グループＩＶＡ及びＶＩがラット脊髄中に見出される支配的なＰＬＡ２であることが確認された。
【実施例６】
【０１３８】
ｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２の両方とも脊髄中で活性である
ＰＬＡ２メッセージ及びタンパク質の形跡を見出したので、次に脊髄のＰＬＡ２活性を試験した。非処置ラット又は後足への注入後２時間又は４時間のガラゲナン処置ラットについて再び分析を行った。ｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２の両方とも脊髄ホモジネート中でかなりの活性を示し、カラゲナン処置に続く活性の有意な増加は観察されなかった（図７）。
【実施例７】
【０１３９】
マクロファージ中でのｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２活性のＥｘ  ｖｉｖｏ阻害
ｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２はマクロファージ細胞中で発現する。したがって、本発明のＰＬＡ２阻害剤がマクロファージ中のｃＰＬＡ２及びｉＰＬＡ２の一方又は両方に作用するか否かを判定することは興味あることであった。この目的のために、加湿した１０％ＣＯ２雰囲気中に３７℃でＰ３８８Ｄ１ネズミマクロファージを維持した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂ、Ｐｒｏｖｏ、ユタ州）、１００ユニット／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）と共にＩｓｃｏｖｅの改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で成長させた。細胞は、細胞が集密７５〜８０％に到達する２〜３日毎に普通に継代した。刺激用に使用される細胞は標準１２ウェル組織培養プレート中でウェル当たり１０６個の細胞密度で培養した。
【０１４０】
マクロファージはＰ３３８Ｄ１をリポ多糖（ＬＰＳ）単独又は血小板活性化因子（ＰＡＦ）と組み合わせたＬＰＳで処理することによって刺激した。要約すれば、細胞を飢餓培地（０．２％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ）で２回洗浄し、次いで１ｍＬの飢餓培地で１時間インキュベートした。次に細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳに１８時間か、或いは２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳに１時間暴露する。次いで、２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで処理した細胞を１００ｎＭのＰＡＦに１５分間暴露した。刺激の終末点で、細胞から培地を除去し、細胞破片を遠心分離により除去し、酵素結合イムノアッセイ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）によってプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）濃度を分析した。
【０１４１】
阻害剤化合物をＤＭＳＯに溶解し、細胞に添加する前に飢餓培地に希釈し、ＤＭＳＯ濃度をすべての実験で０．５ｖ／ｖ％未満に保持した。すべての阻害剤を刺激の３０分前に添加した。
【０１４２】
ＯＡ１及びＯＡ４の両方をＬＰＳ／ＰＡＦ刺激条件で試験した（図１４）。これらの阻害剤の両方とも、細胞からのＰＧＥ２放出について本質的に同一の阻害を示した。阻害は、試験した最大投与量（５０μＭ）で６０％近くまで到達した。したがって、図１４に示したデータは化合物ＯＡ１及びＯＡ４がＬＰＳ／ＰＡＦ刺激条件下でＰ３８８Ｄ１ｃＰＬＡ２を阻害し、ＰＧＥ２放出の部分的停止が起こる。
【０１４３】
化合物ＯＡ１及びＯＡ４を長期ＬＰＳ刺激条件でも試験した。図１５に示すように、ＯＡ１は両方とも５０μＭの阻害剤の添加でＰＧＥ２の放出を完全に阻止できた。更に、データは対数関数に正確に適合し、これらの適合から導かれる２つの阻害剤に対するＩＣ５０はＯＡ１で７．８μＭ、ＯＡ４で５．８μＭであった。
【実施例８】
【０１４４】
合成スキームの阻害化合物ＯＡ４の製造への適用
本発明の阻害化合物に対して合成スキームをどの様に適用できるかの代表例として、化合物ＯＡ４を以下のように合成した。
【０１４５】
ベンジル（Ｅ，４Ｓ）−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］オクト−２−エノエート。２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ヘキサノール（０．２２ｇ、１．０ミリモル）のＥｔＯＡｃ／トルエン１：１混合溶媒（６ｍＬ）溶液に、ＮａＢｒ（０．１２ｇ、１．１ミリモル）水溶液（水０．５ｍＬ）及び続いてＡｃＮＨ−ＴＥＭＰＯ（２ｍｇ、０．０１ミリモル）を−１０℃で添加した。得られた二相系にＮａＯＣｌ（０．０８ｇ、１．１ミリモル）及びＮａＨＣＯ３（０．０８ｇ、１．０ミリモル）の水溶液（水０．７ｍＬ）を、激しい撹拌下に−１５℃で１５分間で滴加した。−１０℃で１０分間撹拌した後、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）を添加した。有機相を、ＫＩ（０．５ｇ）、１０％Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１０ｍＬ）、食塩水を含む１％クエン酸水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られたアルデヒドはいかなる精製もしないで直接次のステップに使用した。
【０１４６】
アルデヒド（０．２１ｇ、１．０ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｐｈ３＝ＣＨＣＯＯＢｎ（０．４５ｇ、１．１ミリモル）を添加し、反応混合物を１時間還流した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィーで精製した（石油エーテル４０〜６０℃／ＥｔＯＡｃ  ９／１）。
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【０１４７】
（Ｅ，４Ｓ）−１−（ベンジルオキシ）−１−オキソオクト−２−エン−４−アミニウムクロリド。ベンジル（Ｅ，４Ｓ）−４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］オクト−２−エノエート（０．３５ｇ、１．０ミリモル）を４Ｎの  ＨＣｌ−Ｅｔ２Ｏ溶液（８ｍＬ）で、室温のもと１時間処理した。溶媒及び過剰の酸を減圧下で蒸発させ、残渣にＥｔ２Ｏによる再蒸発操作を２回加えた。
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【０１４８】
ベンジル（Ｅ，４Ｓ）−４−［（２−ヒドロキシドデカノイル）アミノ］オクト−２−エノエート。２−ヒドロキシヘキサデカン酸（０．５４ｇ、２．０ミリモル）及び（Ｅ，４Ｓ）−１−（ベンジルオキシ）−１−オキソオクト−２−エン−４−アミニウムクロリド（０．２８ｇ、１．０ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）撹拌溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．３ｍＬ）、続いてＷＳＣＩ（０．５７ｇ、３．０ミリモル）及びＨＯＢｔ（０．３２ｇ、２．０ミリモル）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で１時間、室温で１日間撹拌した。有機相を食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  ９８／２）で精製した。
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【０１４９】
（４Ｓ）−４−［（２−ヒドロキシドデカノイル）アミノ］オクタン酸。ベンジル（Ｅ，４Ｓ）−４−［（２−ヒドロキシドデカノイル）アミノ］オクト−２−エノエート（０．４４５ｇ、１ミリモル）のＥｔＯＨ（２．５ｍＬ）溶液に、５分間Ｎ２を通し、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒（０．０４２ｇ）を添加した。反応混合物をＨ２下に室温で５時間撹拌した。触媒をセライトのパッドを通過させる濾過によって取り除き、濾液を減圧下で蒸発させた。生成物はカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ  ９／１）で精製した。
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【０１５０】
（４Ｓ）−４−［（２−オキソドデカノイル）アミノ］オクタン酸（ＯＡ４）。（４Ｓ）−４−［（２−ヒドロキシドデカノイル）アミノ］オクタン酸（０．３６ｇ、１．０ミリモル）の氷酢酸（４ｍＬ）溶液に、ＰＤＣ（１．１３ｇ、３．０ミリモル）を添加した。室温で２時間撹拌した後、混合物を５％ＮａＨＣＯ３水溶液で中和し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３回）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル４０〜６０℃／ＥｔＯＡｃ  ５／５）で精製した。
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【０１５１】
その他の実施形態は特許請求の範囲に含まれる。更に、本発明の構成又は態様をマーカッシュグループの表現で記載する場合には、それによって本発明がマーカッシュグループの個々の構成要素又は構成要素のサブグループの表現でも記載されることを当業者は認識するであろう。
【０１５２】
本明細書中で言及又は引用した論文、特許、特許出願、及びその他すべての文献、並びに電子的に入手できる情報の内容を、あたかも、各個々の刊行物が参照により組み込まれることを具体的かつ個別的に示す如く、その同じ範囲まで全体として参照により本明細書に組み込む。本発明者らは、本出願中にこのような論文、特許、特許出願、又はその他の文献からの任意の及びすべての資料及び情報を物理的に組み込む権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】髄腔内（ＩＴ）ＰＬＡ２阻害剤で事前処置（−１０ｍｍ）したラットにおいて、左後足底表面へカラゲナンを注入した後の経過時間に対して熱逃避潜時をプロットした図である。Ａ：アラキドノイルトリフルオロメチルケトン（ＡＡＴＦＭＫ）（黒塗り菱形は２００μｇ、及び白塗り三角は１００μｇ）及びＣ：メチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）（黒塗り円は３００μｇ、及び白塗り三角は１００μｇ）。対照群には足カラゲナン及びＩＴ賦形剤を与えた。炎症を起こした足（同側、黒塗り四角）、及び起こしていない足（反対側、白塗り四角）での足逃避潜時（ＰＷＬ）を示した。Ｂ：ＡＴＦＭＫ及びＤ：ＭＡＦＰの様々なＩＴ投与量で、投与後Ｔ＝０からＴ＝１８０分に渡って計算した痛覚過敏指数を示す図である。各時点及び棒は４〜６匹のラットに対する平均値及びＳＥＭ（平均標準誤差）を表し、（＊）は賦形剤で処置したカラゲナン注入群（投与側足の値）に対しＰ＜０．０５であることを示す。
【図２】Ａ）腹腔内ＡＡＴＦＭＫ（２００μｇ／０．５ｍｌ、白塗り三角は非投与側足、白塗り円は投与側足、）又は賦形剤（黒塗り菱形は非投与側足、黒塗り四角は投与側足、）で事前処置（−１０分）したラットにおいて、左後足底表面へカラゲナンを注入した後の経過時間に対して熱逃避潜時（ＰＷＬ）をプロットした図である。Ｂ）カラゲナンを注入した後足（投与側）及び非処置の後足（非投与側）の足の高さを異なる時点で測定した図である。カラゲナン注入の１０分前に、対照群にはＩＴ賦形剤を、他の群にはＩＴ  ＡＡＴＦＭＫ（２００μｇ）を与えた。各時点及び棒は４〜６匹のラットに対する平均値及びＳＥＭを表す。
【図３】左後足底面にカラゲナンを注入し、ＩＴ  ＡＡＴＦＭＫ（２００μｇ）で後処置（＋１８０分）したラットにおいて、カラゲナン注入後の経過時間に対して熱逃避潜時（ＰＷＬ）をプロットした図である（白塗り四角は非投与側足、黒塗り円は投与側足）。各時点は４〜６匹に対する平均値及びＳＥＭを表す。
【図４】ＩＴ賦形剤（白塗り四角）、又はＡ：ＩＴ  ＡＡＴＦＭＫ（２００μｇ、黒塗り菱形）、又はＣ：ＩＴ  ＭＡＦＰ（３００μｇ、黒塗り円）で前処置（−１０ｍｍ）したラットの右後足背面にホルマリンを注入した後の経過時間に対してフリンチング行動をプロットした図である。Ｂ：ＩＴ  ＡＡＴＦＭＫ及びＤ：ＩＴ  ＭＡＦＰの様々な投与量での投与後に観察される、段階２での累積フリンチング回数（１０〜６０分、総数）を表す図である。各時点及び棒は４〜６匹のラットに対する平均値及びＳＥＭであり、（＊）は賦形剤で処置されたホルマリン注入群に対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図５】Ｑ−ＰＣＲ分析。Ａ）発現レベルは標準曲線法によって測定した。各遺伝子について対照ラット脊髄中での発現を、後足にカラゲナンを注入処置したラットの脊髄における注入２時間後又は４時間後の発現と比較した図である。
【図６】ｉＰＬＡ２タンパク質は腰部脊髄で発現する。上図は抗ヒトｉＰＬＡ２抗体を、下図はβ−ｄｉｎ負荷対照を表す図である。レーン（１）はラダー、（２〜４）は対照ラット、（５〜７）はカラゲナン注入２時間後、（８〜１０）はカラゲナン注入後４時間。対照（０分）と比較し、後足にカラゲナンを注入した後１２０分又は２４０分で活性の増加はほとんど観察されなかった。それぞれの値は、まったく同一にアッセイされた３匹のラットの平均である。
【図７】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの脊髄ｉＰＬＡ２活性の阻害を表す図である。ラット腰部脊髄ホモジネートをＡではｃＰＬＡ２について、ＢではｉＰＬＡ２について０．８モル％阻害剤の存在下に１時間アッセイした。それぞれの値は、まったく同一にアッセイされた３匹のラットの平均である。＊Ｐ値はすべて０．００９未満である。
【図８】ＴＸ−１００（４００μＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（９７μＭ、１００，０００ｃｐｍ）及びＰＩＰ２（３μＭ、０．６モル％）を含む混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。混合ミセルの各種阻害剤の表面濃度をＯＡ１（▲）、ＯＡ４（■）、及びＯＡ７（□）に対して示したように増加させた。ＯＡ１及びＯＡ４に対するデータは単純な対数関数に適合した（ＯＡ１は連続線、及びＯＡ４は破線）。この適合によって決定されたＸ１（５０）は、ＯＡ１に対して０．０１７±０．００９、ＯＡ４に対して０．００９±０．００４であった。ＯＡ７に対するデータは直線関数に適合した。この適合によって決定されたＯＡ７に対するＸ１（５０）は０．０６８±０．００５であった。
【図９】ＴＸ−１００（３ｍＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（１ｍＭ、２００，０００ｃｐｍ）を含みＰＩＰ２の存在しない混合ミセルでのｃＰＬＡ２の相対活性を試験した図である。ＯＡ１の表面濃度は、０モル分率（左棒）及び０．０１モル分率（４０μｇ、右棒）であった。両方の棒に対するデータは対照（左棒）に対して正規化している。
【図１０】ＴＸ−１００（３ｍＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（１ｍＭ、２００，０００ｃｐｍ）を含みＰＩＰ２の存在しない混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。ＯＡ４の表面濃度を示したように増加させた。曲線は単純な対数関数へのデータの当てはめである。曲線の値から０．００２７±０．００１２のＸ１（５０）が得られる。
【図１１】ＴＸ−１００（４００μＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（９７μＭ、１００，０００ｃｐｍ）及びＰＩＰ２の（３μＭ、０．６モル％）を含む混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。ミセルには最終濃度で０．００５モル分率のＯＡ１（２０μＭ）も含めた。ｃＰＬＡ２を先ずＯＡ１と共に指定の時間予備インキュベートし（２００μＭで）、次いで、基質含有溶液で酵素及び阻害剤を１０倍希釈した。
【図１２】Ａ）ＴＸ−１００（４００μＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（９７μＭ、１００，０００ｃｐｍ）及びＰＩＰ２の（３μＭ、０．６モル％）を含む混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。ミセルには最終濃度で０．００５モル分率のＯＡ４（２０μＭ）も含めた。ｃＰＬＡ２を先ずＯＡ４（２０μＭ）と共に０又は４時間予備インキュベートし、次いで同様にＯＡ４（２０μＭ）を含む基質含有溶液へ添加した。Ｂ）ＴＸ−１００（４００μＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（９７μＭ、１００，０００ｃｐｍ）及びＰＩＰ２の（３μＭ、０．６モル％）を含む混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。ミセルには最終濃度で０．００５モル分率のＯＡ４（２０μＭ）も含めた。ｃＰＬＡ２を先ずＯＡ４（２０μＭ）と共に０又は４時間予備インキュベートし、次いで追加のＯＡ４を含まない基質含有溶液へ添加した。これによりＯＡ４の最終濃度は０．０００５モル分率（２μＭ）になった。
【図１３】ＴＸ−１００（４００μＭ）、１−パルミトイル−２−（１−［１４Ｃ］−アラキドノイルＰＣ（９７μＭ、１００，０００ｃｐｍ）及びＰＩＰ２の（３μＭ、０．６モル％）を含む混合ミセルでのｃＰＬＡ２の活性を試験した図である。ＯＡ１０（■）及びＯＡ１１（□）の表面濃度を示したように別々に増加させた。データを直線最小自乗関数に適合した（ＯＡ１０は破線、ＯＡ１１は実線）。直線からＯＡ１１に対して０．０４７±０．００６のＸ１（５０）値が、ＯＡ１０に対して０．０４５±０．００７のＸ１（５０）値が得られる。
【図１４】刺激の３０分前にＰ３８８Ｄ１細胞に異なる濃度でＯＡ１（▲）又はＯＡ４（■）を添加した図である。次いで、細胞を説明したようにＬＰＳで１時間、ＰＡＦで１５分間刺激した。刺激後、培地を採取し、説明したように培地中のＰＧＥ２濃度を定量した。データは、％阻害として見えるように対照のＤＭＳＯ処理ＬＰＳ／ＰＡＦ刺激細胞に対して正規化した。視覚化を容易にするため、データ点を破線（ＯＡ１）及び実線（ＯＡ４）で連結している。
【図１５】刺激の３０分前にＰ３８８Ｄ１細胞に異なる濃度でＯＡ１（▲）又はＯＡ４（■）を添加した図である。次いで、細胞を説明したようにＬＰＳで１８時間刺激した。刺激後、培地を採取し、説明したように培地中のＰＧＥ２濃度を定量した。データは、％阻害として見えるように対照のＤＭＳＯ処理ＬＰＳ刺激細胞に対して正規化した。曲線はデータが対数関数へ適合した非線形最小自乗に一致する（ＯＡ１は実線曲線、ＯＡ４は破線曲線）。次いで、これらの関数を用いてＯＡ１（７．８μＭ）及びＯＡ４（５．８μＭ）に対するＩＣ５０を計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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