(57)【要約】本発明は、ＭＣＨ−２ＲよりもＭＣＨ−１Ｒで選択的に活性な切断ｈＭＣＨアナログに関する。ｈＭＣＨで示されるアミノ酸ナンバリングを用いると、本発明のアナログはＤ−アミノ酸、５−グアニジノプロピオン酸、またはその低級もしくは高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であるＸ６；及びアスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、リシン、セリン、スレオニンまたはメチオニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であるＸ１０を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式：
【化１】
2005527491.tif 000034
［式中、
Ｘ１は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ２は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ３は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ４は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはノルロイシンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ５は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ６はＤ−アミノ酸、５−グアニジノプロピオン酸、またはその低級または高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ７はリシン、システイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ８はメチオニン、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ９はロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１０はアスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、リシン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはシトルリンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１１はアルギニン、リシン、シトルリン、ヒスチジン、ホモアルギニン、ノルアルギニンまたはニトロアルギニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１２はバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはメチオニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１３はフェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、トリプトファン、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、またはＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒからなる群から独立して選択される少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルアラニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１４はアルギニン、リシン、ヒスチジン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、ニトロアルギニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１５はプロリン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、サルコシンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１６は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはシステイン、ホモシステイン、システアミン、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１７は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｚ１は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＮ−末端アミノ基に共有結合しており；
Ｚ２は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＣ−末端カルボキシ基に共有結合しており；
ただし、Ｘ１６が存在する場合には、Ｘ１６はＸ７と一緒になってジスルフィド結合またはアミド結合により結合されてなる３２〜３６原子の環状基を形成し、Ｘ７がシステイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはペニシラミンのいずれかのときにはＸ１６はシステイン、ホモシステイン、システアミンまたはペニシラミンのいずれかであり、Ｘ７が２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６はアスパラギン酸またはその高級ホモログであり、Ｘ７がアスパラギン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６は２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログであり；
ただし、Ｘ１６が存在しない場合には、Ｘ１７は存在せず、Ｚ２は存在せず、Ｘ７はリシンであり、Ｘ１５はＸ７と一緒になってＸ７Ｌｙｓ  ε−アミノ基及びＸ１５カルボキシル基により結合されてなる環状基を形成する］
を有する場合により置換されたペプチド、前記ペプチドの標識誘導体、或いは前記ペプチドまたは前記標識誘導体の医薬的に許容され得る塩。
【請求項２】
Ｘ６がＤ−アルギニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−α−アミノ酪酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−リシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−（２’）−ナフチルアラニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｄ−ニトロアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｄ−シトルリン及び５−グアニジノプロピオン酸からなる群から選択される請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ１０がアスパラギンまたはグルタミンのいずれかである請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ１６及びＸ１７が存在しない請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１６が存在する請求項３に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５が存在せず、Ｘ１７がチロシンまたはトリプトファンのいずれかである請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ１７が存在しない請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｚ１が存在しないかまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｚ２は存在しないかまたは−ＮＨ２である請求項６に記載のペプチド。
【請求項９】
Ｚ１が存在しないかまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｚ２は存在しないかまたは−ＮＨ２である請求項７に記載のペプチド。
【請求項１０】
Ｘ８がメチオニン、ノルロイシンまたはＮ−メチルノルロイシンのいずれかであり、Ｘ９がロイシンであり、Ｘ１１がアルギニンであり、Ｘ１２がバリンであり、Ｘ１３がフェラルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、ｐ−フルオロ−フェニルアラニン、チロシンまたはシクロヘキシルアラニンであり、Ｘ１４がアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１５はプロリンまたはサルコシンのいずれかであり、Ｘ１６はシステイン、Ｄ−システイン、アスパラギン酸またはジアミノプロピオン酸のいずれかである請求項７に記載のペプチド。
【請求項１１】
Ｘ６がＤ−アルギニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リシンまたはＤ−シトルリンのいずれかである請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
Ｘ７が２，３−ジアミノプロピオン酸であり且つＸ１６がアスパラギン酸であるか、またはＸ７がアスパラギン酸であり且つＸ１６が２，３−ジアミノプロピオン酸である請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｚ１が−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｚ２が−ＮＨ２である請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
Ｘ７がシステインであり、Ｘ１６がシステインまたはＤ−システインである請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１５】
Ｚ１が−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｚ２が−ＮＨ２である請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
Ｘ１０がグルタミンである請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
ペプチドが配列番号２９、３０、３１、３２、３３及び３４からなる群から選択される配列からなる請求項１に記載のペプチド。
【請求項１８】
ペプチドが配列番号３０からなる請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドのＭＣＨ−１Ｒに対する結合に影響を及ぼす化合物の能力を測定するステップを含む、ＭＣＨ−１Ｒに結合し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項２０】
ペプチドが放射標識されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドをＭＣＨ−１Ｒを機能的に発現する細胞に提供するステップを含む、ＭＣＨ−１Ｒ活性を選択的に生じさせる方法。
【請求項２２】
ＭＣＨ−１Ｒが配列番号３５のアミノ酸配列を有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）ＭＣＨ−１Ｒまたはその機能的誘導体、試験化合物及び請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドを混合するステップ、及びｂ）前記試験化合物のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストとして作用する能力の指標として試験化合物のＭＣＨ−１Ｒ活性を阻害する能力を測定するステップを含む、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項２４】
機能的ＭＣＨ−１Ｒが哺乳動物ＭＣＨ−１Ｒである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
機能的ＭＣＨ−１ＲがヒトＭＣＨ−１Ｒである請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＣＨ−１Ｒを有する被験体に対して請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドを有効量投与するステップを含む、前記被験体の体重増加方法。
【請求項２７】
ＭＣＨ−１Ｒを有する被験体に対して請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドを有効量投与するステップを含む、前記被験体の食欲増進方法。
【請求項２８】
ａ）ＭＣＨ−１Ｒを有する被験体に対して請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドを有効量投与して体重を増加させるか食欲を増進させるステップ、ｂ）前記被験体に対して化合物を投与するステップ、及びｃ）前記被験体の体重及び食欲の変化を測定するステップを含む、前記被験体において体重または食欲を減少させる化合物の能力の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本願は、本明細書中に参考として援用される、２００２年１月９日に出願した米国仮出願第６０／３４７，１９１号の優先権を主張する。
【０００２】
視床下部中に存在する神経ペプチドは体重コントロールの媒介において重要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら，Ｃｅｌｌ，９２：４３７−４４０（１９９８））。哺乳動物で産生されるメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は、視床下部において大型プレ−プロホルモン前駆体の一部として合成される環状１９アミノ酸神経ペプチドであり、神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードする（Ｎａｈｏｎら，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４：６３２−６３７（１９９０）；Ｖａｕｇｈａｎらの米国特許第５，０４９，６５５号明細書；Ｖａｕｇｈａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５：１６６０−１６６５（１９８９））。ヒトＭＣＨ（ｈＭＣＨ）は以下の構造（配列番号１）を有する。
【０００３】
【化１】
2005527491.tif 000002
【０００４】
ＭＣＨは初めサケ下垂体で同定され、魚ではＭＣＨはメラニン凝集に影響を及ぼし、よって皮膚色素沈着に影響を及ぼす。マスやウナギでは、ＭＣＨがストレス誘導またはＣＲＦ刺激性ＡＣＴＨ放出に関与することも判明している（Ｋａｗａｕｃｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：３２１−３２３（１９８３））。
【０００５】
ヒトでは、脳で発現するｈＭＣＨをコードする２つの遺伝子が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１８：２９７−３１０（１９９３））。哺乳動物では、ＭＣＨは主に外側視床下部及び不確帯の神経細胞形質を含めた視床下部のニューロン細胞体に局在しており、前記細胞体は食物摂取のコントロールに関与している（Ｋｎｉｇｇｅら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１７：１０６３−１０７３（１９９６））。
【０００６】
薬理学的及び遺伝的証拠から、ＭＣＨ作用の主モードは栄養補給を促進することである（食欲促進）。ＭＣＨ  ｍＲＮＡは絶食マウス及びラット、ｏｂ／ｏｂマウス及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）に関する遺伝子が標的破壊されているマウスではアップレギュレートされている（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９９６）；及びＥｒｉｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３８１：４１５−４１８（１９９６））。ＭＣＨを中枢に（ＩＣＶ）注射すると、食物摂取が刺激され、ＭＣＨはα−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）で見られる食欲低下効果と拮抗する（Ｑｕら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：２４３−２４７（１９９６））。ＭＣＨ欠乏マウスは痩せて食欲低下性であり、高い代謝率を有する（Ｓｈｉｍａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３９６：６７０−６７３（１９９８））。ＭＣＨの投与は摂食、食欲、体重増加または維持を促進するために有用であることが判明している（Ｍａｒａｔｏｓ−Ｆｌｉｅｒの米国特許第５，８４９，７０８号明細書）。
【０００７】
ＭＣＨ作用は、視床下部−下垂体−軸に対する影響が報告されているように摂食の調節に限定されない（Ｎａｈｏｎ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８：２２１−２６２（１９９４））。ＭＣＨはＣＲＦの視床下部からのストレス誘導放出及びＡＣＴＨの下垂体からのストレス誘導放出を調節し得るので、ＭＣＨはストレスに対する身体応答に関与し得る。更に、ＭＣＨニューロン系は生殖または母性機能に関与し得る。
【０００８】
ヒトＭＣＨは少なくとも２つの異なる受容体、すなわちＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒに結合し得る（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６１−２６５（１９９９）；Ｓａｉｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ，４００：２６５−２６９（１９９９）；Ｂａｃｈｎｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５７：５２２−５２４（１９９９）；Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６１：６２２−６２６（１９９９）；Ｓａｉｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：７５６４−７５６９（２００１））。ＭＣＨ−１ＲとＭＣＨ−２Ｒ間のアミノ酸同一性は約３８％である（Ｓａｉｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９８：７５６４−７５６９（２００１））。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、ＭＣＨ−２ＲよりもＭＣＨ−１Ｒで選択的に活性な切断ｈＭＣＨアナログに関する。ｈＭＣＨで示されるアミノ酸ナンバリングを用いると、本発明のアナログは、Ｄ−アミノ酸、５−グアニジノプロピオン酸、またはその低級もしくは高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であるＸ６；及びアスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、リシン、セリン、スレオニンまたはメチオニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であるＸ１０を含む。
【００１０】
ＭＣＨ−１Ｒに対して選択的なヒトＭＣＨアナログはＭＣＨ−２ＲでよりもＭＣＨ−１Ｒでより高い活性を示す。ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２ＲでのＭＣＨ活性には受容体結合及び受容体活性化が含まれる。ＭＣＨ−１Ｒで選択的に活性なＭＣＨアナログはＭＣＨ−１Ｒで高い結合及び／または高い活性を有し得る。好ましいＭＣＨアナログはＭＣＨ−１Ｒで高い結合及び高い活性を有する。別の実施態様では、ＭＣＨ−２Ｒに比したＭＣＨ−１Ｒでの活性レベルの差は少なくとも２、５、１０または２０倍である。
【００１１】
従って、本発明の１態様は、構造式：
【００１２】
【化２】
2005527491.tif 000003
を有する場合により置換されたペプチド、前記ペプチドの標識誘導体、或いは前記ペプチドまたは前記標識誘導体の医薬的に許容され得る塩に関し、上記式中、
Ｘ１は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ２は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ３は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ４は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはノルロイシンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ５は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ６はＤ−アミノ酸、５−グアニジノプロピオン酸、またはその低級または高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ７はリシン、システイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ８はメチオニン、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ９はロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１０はアスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、リシン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはシトルリンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１１はアルギニン、リシン、シトルリン、ヒスチジン、ホモアルギニン、ノルアルギニンまたはニトロアルギニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１２はバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはメチオニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１３はフェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、トリプトファン、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、またはＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒからなる群から独立して選択される少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルアラニンのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１４はアルギニン、リシン、ヒスチジン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、ニトロアルギニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１５はプロリン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、サルコシンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１６は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはシステイン、ホモシステイン、システアミン、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｘ１７は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体であり；
Ｚ１は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＮ−末端アミノ基に共有結合しており；
Ｚ２は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＣ−末端カルボキシ基に共有結合しており；
ただし、Ｘ１６が存在する場合には、Ｘ１６はＸ７と一緒になってジスルフィド結合またはアミド結合により結合されてなる環状基を形成し、Ｘ７がシステイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはペニシラミンのいずれかのときにはＸ１６はシステイン、ホモシステイン、システアミンまたはペニシラミンのいずれかであり、Ｘ７が２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６はアスパラギン酸またはその高級ホモログであり、Ｘ７がアスパラギン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６は２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログであり；
ただし、Ｘ１６が存在しない場合には、Ｘ１７は存在せず、Ｚ２は存在せず、Ｘ７はリシンであり、Ｘ１５はＸ７と一緒になってＸ７Ｌｙｓ  ε−アミノ基及びＸ１５カルボキシル基により結合されてなる環状基を形成する。
【００１３】
特記しない限り、キラル中心を有するアミノ酸はＬ−エナンチオマーの形態である。「その誘導体」は対応のＤ−アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、β−アミノ酸及びω−アミノ酸を指す。
【００１４】
本発明の別の態様は、ＭＣＨ−１Ｒに結合し得る化合物のスクリーニング方法に関する。この方法はｈＭＣＨアナログのＭＣＨ−１Ｒへの結合に影響を及ぼす化合物の能力を測定するステップを含む。
【００１５】
本発明の別の態様は、ｈＭＣＨアナログをＭＣＨ−１Ｒを機能的に発現する細胞に提供するステップを含むＭＣＨ−１Ｒ活性を選択的に生じさせる方法に関する。この方法はＭＣＨ−１Ｒを発現する培養細胞または哺乳動物を用いて実施され得る。
【００１６】
本発明の別の態様は、ＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。この方法は、ａ）ＭＣＨ−１Ｒまたはその機能的誘導体、試験化合物及び選択的に活性なＭＣＨ−１Ｒアゴニストを混合するステップ、及びｂ）前記試験化合物のＭＣＨ−１Ｒアンタゴニストとして作用する能力の指標として試験化合物のＭＣＨ−１Ｒ活性を阻害する能力を測定するステップを含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、被験体の体重または食欲を増加させる方法に関する。この方法は前記被験体に対してＭＣＨ−１Ｒを活性化するｈＭＣＨアナログを有効量投与して体重を増加させるステップを含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、被験体において体重または食欲を低下させる化合物の能力を測定する方法に関する。この方法は前記被験体に対して体重または食欲を増加させるであろうｈＭＣＨアナログを有効量投与し、化合物の体重または食欲に対する影響を調べることを含む。
【００１９】
本発明の他の特徴及び作用効果は複数の実施例を含めた本明細書の追加記載から明らかである。本明細書に提示した実施例は本発明を実施するのに有用な各種成分及び方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定しない。本明細書に開示に基づいて、当業者は本発明を実施するのに有用な他の成分及び方法を同定し、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
切断ｈＭＣＨの６位及び１０位に特定のアミノ酸を含むＭＣＨ−１Ｒ選択的アナログが同定された。同定されたアミノ酸に基づいて、異なるサイズのＭＣＨアナログが提供され得る。好ましいＭＣＨアナログはＡＣ−ｈＭＣＨ６−１６−ＮＨ２（配列番号２）に基づくより短いアナログである。ＡＣ−ｈＭＣＨ６−１６−ＮＨ２はＭＣＨ−１Ｒ活性を促進するコア領域を与える。より短いペプチドは大きいペプチドに比して合成が容易である及び／または生理的緩衝液中の溶解度が高いなどの利点を有する。
【００２１】
好ましいｈＭＣＨアナログはＭＣＨ−１Ｒで有意な活性を有する。ＭＣＨ−１Ｒでの有意な活性はｈＭＣＨを用いて得られる活性に比して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％の活性である。ＭＣＨ−１Ｒでの活性は下記実施例に記載されているような結合またはＧタンパク質活性を測定する技術を用いてアッセイされ得る。
【００２２】
ｈＭＣＨアナログの使用には研究ツール及び治療用途が含まれる。研究ツール用途では、通常ＭＣＨアナログ及びＭＣＨ−１Ｒの使用を含む。ＭＣＨ−１Ｒは哺乳動物被験体、全細胞及び膜断片のようなさまざまな環境中に存在し得る。ＭＣＨアナログの研究ツール用途の例には、ＭＣＨ−１Ｒで活性な化合物のスクリーニング、ＭＣＨ−１Ｒがサンプルまたは調製物中に存在するかどうかの測定、ＭＣＨ及びＭＣＨ−１Ｒ活性化の役割または影響の試験、及びＭＣＨアンタゴニストの役割または影響の試験が含まれる。
【００２３】
ＭＣＨ−１Ｒで選択的に活性なヒトＭＣＨアナログは選択的活性に関連した追加用途を有する。追加用途の例には、ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒ間の差異を調査したり、ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒの存在を区別するために使用することが含まれる。
【００２４】
ヒトＭＣＨアナログはＭＣＨアゴニスト及びＭＣＨアンタゴニストの両方をスクリーニングするために使用され得る。ＭＣＨアゴニストのスクリーニングは、例えば試験化合物との競合実験でＭＣＨアナログを用いることにより実施され得る。ＭＣＨアンタゴニストのスクリーニングは、例えばＭＣＨ−１Ｒ活性を生ずるようにＭＣＨアナログを用い、その後試験化合物の前記活性を変化させる能力を測定することにより実施され得る。
【００２５】
ｈＭＣＨアナログの治療用途はＭＣＨ−１Ｒを含む被験体への投与を含む。ＭＣＨ−１Ｒを有する被験体にはヒト、マウス、ラット、イヌ、フェレット及びアカゲザルが含まれる。
【００２６】
被験体を指すとき必ずしも疾患または障害が存在していることを意味しない。被験体という用語には、例えば病気または障害の緩和を助けるべく治療されるヒト及び病気または障害の発症を遅らしたり予防するために予防的に治療されるヒトが含まれる。
【００２７】
ＭＣＨアゴニストは被験体において有利な効果を達成させるために使用され得る。例えば、ＭＣＨアゴニストは体重増加、体重の維持及び／または食欲増進を促進するために使用され得る。前記した効果は体重低下を伴う病気または疾患を患っていたりそのような治療を受けている患者に対して特に有用である。体重低下を伴う病気または疾患の例には不眠症、ＡＩＤＳ、るいそう、悪液質及び虚弱な高齢者が含まれる。体重低下を伴う治療の例には化学療法、放射線治療及び透析が含まれる。
【００２８】
ＭＣＨアンタゴニストは患者において有利な効果を達成させるためにも使用され得る。例えば、ＭＣＨアンタゴニストは体重減少、食欲低下、体重維持、癌（例えば、結腸癌または乳癌）治療、疼痛緩和、ストレス緩和及び／または性機能不全の治療を促進するために使用され得る。
【００２９】
ＭＣＨ−１Ｒ選択的に活性なアナログ
選択的に活性なｈＭＣＨアナログは、ｈＭＣＨの６位及び１０位の特定基の重要性に関する本明細書の開示に基づいて設計され得る。ＭＣＨアナログ中の残りのアミノ酸は天然ＭＣＨ中に存在するアミノ酸に対応していても天然アミノ酸とは異なっていてもよい。
【００３０】
ＭＣＨ−１Ｒ活性を与えるための各種ＭＣＨアミノ酸の重要性は文献、例えばＢｅｄｎａｒｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：９３７９−９３８６（２００１）；Ｂｅｄｎａｒｅｋの国際特許出願公開第ＷＯ０１／５７０７０号パンフレット；及びＡｕｄｉｎｏｔら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：１３５５４−１３５６２（２００１）に評価されている。前記文献に記載されている方法は更にＭＣＨアナログに対するアミノ酸変更を評価するために使用され得る。
【００３１】
本発明のヒトＭＣＨ−１Ｒアナログは、構造式：
【００３２】
【化３】
2005527491.tif 000004
を有する場合により修飾されたペプチド、前記ペプチドの標識誘導体、或いは前記ペプチドまたは前記標識誘導体の医薬的に許容され得る塩であり、上記式中、
Ｘ１は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１は存在する場合アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、より好ましくはＸ１は存在する場合アスパラギン酸であり、より好ましくはＸ１は存在しない。
【００３３】
Ｘ２は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ２は存在する場合フェニルアラニンまたはチロシンであり、より好ましくはＸ２は存在する場合フェニルアラニンであり、より好ましくはＸ２は存在しない。
【００３４】
Ｘ３は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ３は存在する場合アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、より好ましくはＸ３は存在する場合アスパラギン酸であり、より好ましくはＸ３は存在しない。
【００３５】
Ｘ４は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはノルロイシンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ４は存在する場合メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンまたはノルロイシンであり、より好ましくはＸ４は存在する場合メチオニンであり、より好ましくはＸ４は存在しない。
【００３６】
Ｘ５は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ５は存在する場合ロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリンまたはアラニンであり、より好ましくはＸ５は存在する場合ロイシンであり、より好ましくはＸ５は存在しない。
【００３７】
Ｘ６はＤ−アミノ酸、５−グアニジノプロピオン酸、またはその低級または高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ６はＤ−アルギニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−α−アミノ酪酸、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−メチオニン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−リシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−（２’）−ナフチルアラニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−ホモアルギニン、Ｄ−ニトロアルギニン、Ｄ−ノルアルギニン、Ｄ−シトルリン又は５−グアニジノプロピオン酸のいずれかである。より好ましくはＸ６はＤ−アルギニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−プロリン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リシンまたはＤ−シトルリンである。
【００３８】
Ｘ７はリシン、システイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ７はシステイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、アスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体である。より好ましくはＸ７はシステイン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはアスパラギン酸である。
【００３９】
Ｘ８はメチオニン、ノルロイシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ８はメチオニン、ノルロイシンまたはＮ−メチルノルロイシンである。
【００４０】
Ｘ９はロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ９はロイシンである。
【００４１】
Ｘ１０はアスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、リシン、セリン、スレオニン、メチオニンまたはシトルリンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１０はアスパラギンまたはグルタミンのいずれかである。
【００４２】
Ｘ１１はアルギニン、リシン、シトルリン、ヒスチジン、ホモアルギニン、ノルアルギニンまたはニトロアルギニンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１１はアルギニンである。
【００４３】
Ｘ１２はバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニンまたはメチオニンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１２はバリンである。
【００４４】
Ｘ１３はフェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、トリプトファン、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、またはＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒからなる群から独立して選択される少なくとも１個の置換基で置換されたフェニルアラニンのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１３はフェニルアラニン、（２’）−ナフチルアラニン、ｐ−フルオロ−フェニルアラニン、チロシンまたはシクロヘキシルアラニンである。
【００４５】
Ｘ１４はアルギニン、リシン、ヒスチジン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、ニトロアルギニンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１４はアルギニンである。
【００４６】
Ｘ１５はプロリン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、サルコシンまたは５−アミノペンタン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１５はプロリンまたはサルコシンである。
【００４７】
Ｘ１６は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはシステイン、ホモシステイン、システアミン、ペニシラミン、２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはアスパラギン酸またはその高級ホモログのいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１６は存在し、より好ましくはＸ１６はシステイン、Ｄ−システイン、アスパラギン酸またはジアミノブロピオン酸であり、より好ましくはＸ１６はシステインまたはＤ−システインである。
【００４８】
Ｘ１７は場合により存在するアミノ酸であり、存在する場合にはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸のいずれかであるか、或いはその誘導体である。好ましくはＸ１７は存在する場合チロシンまたはトリプトファンであり、より好ましくはＸ１７は存在しない。
【００４９】
Ｚ１は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＮ−末端アミノ基に共有結合している。
【００５０】
Ｚ２は場合により存在する保護基であり、存在する場合にはＣ−末端カルボキシ基に共有結合している。
【００５１】
ただし、Ｘ１６が存在する場合には、Ｘ１６はＸ７と一緒になってジスルフィド結合またはアミド結合により結合されてなる環状基を形成し、Ｘ７がシステイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸またはその高級ホモログ、またはペニシラミンのいずれかのときにはＸ１６はシステイン、ホモシステイン、システアミンまたはペニシラミンのいずれかであり、Ｘ７が２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６はアスパラギン酸またはその高級ホモログであり、Ｘ７がアスパラギン酸またはその高級ホモログのときにはＸ１６は２，３−ジアミノプロピオン酸またはその高級ホモログである。好ましくは、前記環状基は３２〜３６原子、好ましくは３２原子を有する。更に、Ｘ１６が存在しない場合には、Ｘ１７は存在せず、Ｚ２は存在せず、Ｘ７はリシンであり、Ｘ１５はＸ７と一緒になってＸ７Ｌｙｓ  ε−アミノ基及びＸ１５カルボキシル基により結合されてなる環状基を形成する。
【００５２】
本発明はジアステレンマー、そのラセミ形態及び分割されたエナンチオマー的に純粋な形態を含む。ｈＭＣＨアナログはＤ−アミノ酸及び／またはＬ−アミノ酸を含み得る。
【００５３】
別の実施態様で、ｈＭＣＨアナログは１つの位置または異なる複数の位置に好ましい（または、より好ましい）基を含む。より好ましい実施態様は複数の異なる位置に好ましい（または、より好ましい）基を含む。
【００５４】
保護基をＮ−末端アミノ基に共有結合させることによりインビボ条件下でアミノ末端の反応性が低下する。アミノ保護基には、場合により置換されていてもよい−Ｃ１−１０アルキル、場合により置換されていてもよい−Ｃ２−１０アルケニル、場合により置換されていてもよいアリール、−Ｃ１−６アルキルで場合により置換されていてもよいアリール、−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１−６−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−で場合により置換されていてもよいアリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−で場合により置換されていてもよいアリールが含まれる。アミノ末端保護基としてはアセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルが好ましい。
【００５５】
保護基をＣ−末端カルボキシ基に共有結合させると、インビボ条件でカルボキシ末端の反応性が低下する。カルボキシ末端保護基を最後のアミノ酸のα−カルボニル基に結合させることが好ましい。カルボキシ末端保護基にはアミド、メチルアミド及びエチルアミドが含まれる。
【００５６】
保護基をＮ−末端アミノ基に共有結合させると、インビボ条件でアミノ末端の反応性が低下する。アミノ保護基には、場合により置換されていてもよい−Ｃ１−１０アルキル、場合により置換されていてもよい−Ｃ２−１０アルケニル、場合により置換されていてもよいアリール、−Ｃ１−６アルキルで場合により置換されていてもよいアリール、−（ＣＯ）−（ＣＨ２）１−６−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−で場合により置換されていてもよいアリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−で場合により置換されていてもよいアリールが含まれる。アミノ末端保護基としてはアセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニルが好ましい。
【００５７】
保護基をＣ−末端カルボキシ基に共有結合させると、インビボ条件でカルボキシ末端の反応性が低下する。カルボキシ末端保護基を最後のアミノ酸のα−カルボニル基に結合させることが好ましい。カルボキシ末端保護基にはアミド、メチルアミド及びエチルアミドが含まれる。
【００５８】
「アルキル」は、場合により置換されていてもよい炭化水素、または炭素−炭素一重結合により結合した場合により置換されていてもよい炭化水素を指す。アルキル炭化水素基は直鎖であってもよく、または１個以上の分枝または環状基を含んでいてもよい。好ましくは、アルキル基は１〜４個の炭素長である。アルキルの例にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル及びｔ−ブチルが含まれる。アルキル基は、ハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１〜６個のハロゲン（好ましくは−Ｆまたは−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３または−ＯＣＦ３からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい。別の実施態様では、アルキルは未置換であるかまたは１個の置換基を有する。
【００５９】
「アルケニル」は、１個以上の炭素−炭素二重結合を含む場合により置換されていてもよい炭化水素基を指す。アルケニル炭化水素基は直鎖であってもよく、または１個以上の分枝または環状基を含んでいてもよい。好ましくは、アルケニル基は２〜４個の炭素長である。アルケニル基は、ハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１〜５個のハロゲン（好ましくは−Ｆまたは−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３または−ＯＣＦ３からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい。別の実施態様では、アルケニルは未置換であるかまたは１個の置換基を有する。
【００６０】
「アリール」は、最高２個の共役または融合環系を含み、少なくとも１つの環が共役π−電子系を有する場合により置換されていてもよい芳香族基を指す。アリールには炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール及びビアリール基が含まれる。アリールは５〜６員環が好ましく、ベンジルがより好ましい。アリール基は、−Ｃ１−４アルキル、−Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン（好ましくは、−Ｆまたは−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１〜５個のハロゲン（好ましくは−Ｆまたは−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、または−ＯＣＦ３からなる群から選択される１個以上の置換基で置換されていてもよい。別の実施態様では、アリール基は０〜３個の置換基を有する。
【００６１】
標識誘導体は検出可能な標識の存在を示す。検出可能な標識の例にはルミネッセンス、酵素標識及び放射標識が含まれる。好ましい放射標識は１２５Ｉである。標識の種類及び標識の位置がＭＣＨ活性に影響を与え得る。標識はＭＣＨ−１ＲでＭＣＨアナログの活性に実質的に影響を及ぼさないように選択されるべきである。特定標識のＭＣＨ活性に対する影響はＭＣＨ活性及び／または結合を測定するアッセイを用いて測定することができる。
【００６２】
好ましい実施態様において、Ｘ１６は存在し、Ｘ１７は場合により存在する。場合により修飾されたペプチドは構造式：
【００６３】
【化４】
2005527491.tif 000005
（式中、各種基及び好ましい基は上記した通りである）
を有する。より好ましい実施態様は好ましい基及び／またはより好ましい基の各種組合せ及び数を有して製造され得る。
【００６４】
ヒトＭＣＨアナログの製造
ヒトＭＣＨアナログは当業界で公知の方法を用いて製造され得る。例えば、ＭＣＨアナログのポリペプチド領域は化学的または生化学的に合成され得、所望によりブロックされたＮ末端及び／またはブロックされたＣ末端を生ずるように修飾され得る。ポリペプチドの化学合成方法は当業界で公知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，「ペプチド及びタンパク質薬物デリバリー(Peptide and Protein Drug Delivery)」，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＤｅｋｋｅｒ（１９９０年）発行参照）。核酸を細胞に導入し、核酸を発現させることを含む生化学的合成方法の例はＡｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のブロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行及びＳａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング，実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に挙げられている。
【００６５】
ＭＣＨ−１Ｒ
ＭＣＨ−１ＲはｈＭＣＨに応答するＧタンパク質結合受容体である。機能性ＭＣＨ−１Ｒ活性は天然ヒトＭＣＨ−１Ｒ及びその機能的誘導体を用いることにより生じさせ得る。天然ＭＣＨ−１Ｒ及びその機能的誘導体はｈＭＣＨにより活性化され、配列番号３５のヒトＭＣＨ−１Ｒ中に存在するような少なくとも１２連続アミノ酸の存在により同定され得る。
【００６６】
配列番号３５中に存在する少なくとも１２連続アミノ酸はＭＣＨ−１Ｒ機能的誘導体に対するタグを与える。別の実施態様では、機能的誘導体は配列番号３５中に存在する少なくとも約３０連続アミノ酸を含み、或いは配列番号３５を含むか配列番号３５から構成される。
【００６７】
本発明の実施態様では、ＭＣＨ−１Ｒは哺乳動物ＭＣＨ−１Ｒである。哺乳動物ＭＣＨ−１Ｒの例にはヒト、フェレット、マウス、ラット、イヌ及びアカゲザル中に存在するＭＣＨ−１Ｒが含まれる。
【００６８】
ＭＣＨ−１Ｒ誘導体は、例えばヒトＭＣＨ−１Ｒを出発物質として製造され得る。ＭＣＨ−１Ｒの機能的誘導体は、例えばアミノ酸置換、付加及び欠失を導入することにより製造され得る。ポリペプチドがＭＣＨ−１Ｒ活性を有するかどうかはＧタンパク質活性を測定するような方法を用いて確認することができる。
【００６９】
天然アミノ酸の違いは異なるＲ基による。Ｒ基はアミノ酸の各種特性、例えば物理的サイズ、電荷及び疎水性に影響を及ぼす。アミノ酸は、中性で疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）；中性で極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン）；及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）の複数のグループに分類され得る。
【００７０】
一般的に、アミノ酸を置換する場合、類似の特性を有するアミノ酸同士を交換することが好ましい。特定グループ内のアミノ酸を置換すること、例えばロイシンをバリン、リシンをアルギニン及びグルタミンをアスパラギンで置換することはポリペプチド機能に変化を生じさせない良好な候補である。
【００７１】
グループ外でアミノ酸を変化させてもよい。前記変化はポリペプチド中の置換しようとするアミノ酸の位置を考慮してなされることが好ましい。例えば、アルギニンは脂肪族側鎖が長いので、ポリペプチドの内部の非極性アミノ酸をアルギニンはグルタメートよりもより自由に置換し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，補遺３３，付録１Ｃ参照）。
【００７２】
ＭＣＨ受容体結合アッセイ
ＭＣＨ−１Ｒに結合する化合物の能力を測定するアッセイはｈＭＣＨ結合部位を含むＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを用いる。ＭＣＨ−１Ｒポリペプチドには完全長ヒトＭＣＨ−１Ｒ及びその機能的誘導体、ＭＣＨ結合部位を含むＭＣＨ−１Ｒ断片、及び前記ＭＣＨ−１Ｒ断片を含むキメラポリペプチドが含まれる。ｈＭＣＨに結合するＭＣＨ−１Ｒ断片を含むキメラポリペプチドは天然ＭＣＨ−１Ｒ中に存在しない１つ以上のポリペプチド領域をも含む。好ましくは、ＭＣＨ結合を測定するアッセイは配列番号３５の完全長ＭＣＨ−１Ｒを用いる。
【００７３】
ｈＭＣＨ結合に関与するＭＣＨ−１Ｒアミノ酸配列は、標識ｈＭＣＨまたはｈＭＣＨアナログ及び異なる受容体断片を用いて同定され得る。結合領域を狭めるかを試験しようとする断片を選択するために別の戦略を使用し得る。前記戦略の例にはＮ末端から数えて約１５アミノ酸の長さの連続断片の試験、及びより長い断片の試験が含まれる。より長い断片を試験する場合、ｈＭＣＨに結合する断片はｈＭＣＨ結合領域を更に位置づけるために再分割または変異され得る。結合研究のために用いられる断片は組換え核酸方法を用いて作成され得る。
【００７４】
結合アッセイは各化合物または各種化合物を含む調製物を用いて実施され得る。ＭＣＨ−１Ｒに結合する能力を有する各種化合物を含む調製物は、受容体に結合する化合物を同定するために試験され得る小さな化合物の群に分けられ得る。本発明の実施態様では、少なくとも１０化合物を含む試験調製物が結合アッセイにおいて用いられる。
【００７５】
結合アッセイは各種環境中に存在する組換え産生したＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを用いて実施され得る。前記環境には、例えば組換え核酸または天然核酸から発現させたＭＣＨ−１Ｒポリペプチドを含む細胞抽出物及び精製細胞抽出物が含まれ、例えば組換え手段によるかまたは別の環境に導入される天然核酸から産生される精製ＭＣＨ−１Ｒの使用も含まれる。
【００７６】
ＭＣＨ−１Ｒ活性化合物のスクリーニング
ＭＣＨ−１Ｒ活性化合物のスクリーニングは、ＭＣＨ−１Ｒ活性を有するポリペプチドを発現する組換え核酸を用いて促進される。組換え発現受容体により、受容体活性化合物をスクリーニングする際に幾つかの作用効果、例えば受容体活性化合物の応答性が他の受容体に対する応答から容易に区別され得るように規定細胞系において受容体を発現する能力が得られる。例えば、ＭＣＨ−１Ｒは発現ベクターを用いてＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ  ７及びＣＨＯのような細胞株において発現され得、発現ベクターを含まない同一細胞株はコントロールとして機能し得る。
【００７７】
組換え「核酸」は２つ以上のヌクレオチド配列領域の人工的組合せを指す。前記した人工的組合せは天然に存在しない。組換え核酸には第１コード領域と調節要素または第１コード領域に元々関連しない第２コード領域とを有する核酸が含まれる。好ましい組換えヌクレオチド配列は、コード領域が外因性プロモーターの制御下にあり、第２コード領域が選択マーカーであるものである。組換えヌクレオチド配列は細胞ゲノム中に存在していても、発現ベクターの一部であってもよい。
【００７８】
好ましくは、発現は発現ベクターを用いて宿主細胞において達成される。発現ベクターは適切な転写及びプロセシングのために調節要素と共にポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。存在し得る調節要素には組換え核酸に元々関連する調節要素及び組換え核酸に元々関連しない外因性調節要素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素は特定宿主において組換え核酸を発現させるために有用であり得る。
【００７９】
ＭＣＨ−１Ｒ活性化合物のスクリーニングは、アッセイにおいてｈＭＣＨアナログを使用することにより促進される。ＭＣＨアナログはＭＣＨ−１Ｒ活性を与える。前記活性に対する試験化合物の影響は例えばアロステリックモジュレーター及びアンタゴニストを同定するために測定され得る。更に、前記アッセイはアゴニストを同定するためにも使用され得る。
【００８０】
ＭＣＨ受容体活性
ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２ＲはＧタンパク質結合受容体である。ＭＣＨ−１ＲはＧｉ及びＧｑの両方にカップリングするのに対して、ＭＣＨ−２ＲはＧｑにカップリングする。Ｇｉにカップリングするとアデニレートシクラーゼが阻害され、その後ｃＡＭＰレベルが低下する。ＧｑにカップリングするとホスホリパーゼＣが活性化され、その後細胞内Ｃａ２＋が上昇する。
【００８１】
各種Ｇタンパク質活性、例えばＧｉ、Ｇｓ及びＧｑの測定方法は当業界で公知である。Ｇｉ及びＧｓ活性はメラニン保有細胞(melonaphore)アッセイ、ｃＡＭＰ産生を測定するアッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の抑制を調べるアッセイや３５Ｓ−ＧＴＰの結合を調べるアッセイのような方法を用いて測定され得る。ｃＡＭＰはラジオイムノアッセイのような各種方法を用いて、ｃＡＭＰ応答遺伝子リポータータンパク質により間接的に測定され得る。
【００８２】
Ｇｑ活性は細胞内Ｃａ２＋を測定するような方法を用いて測定され得る。Ｃａ２＋を測定するために使用され得る当業界で公知の方法の例には色素（例えば、Ｆｕｒａ−２）の使用及びＣａ２＋−バイオルミネッセンス感受性リポータータンパク質（例えば、エクオリン）の使用が含まれる。Ｇタンパク質活性を測定するためにエクオリンを用いる細胞株の例はＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７（いずれも援用により本明細書に含まれるとするＢｕｔｔｏｎら，Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ，１４：６６３−６７１（１９９３）；及びＦｅｉｇｈｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：２１８４−２１８８（１９９９））である。
【００８３】
Ｇタンパク質に機能的にカップリングしたｈＭＣＨ結合領域を含むキメラ受容体もＭＣＨ受容体活性を測定するために使用され得る。キメラＭＣＨ受容体はＮ末端細胞外ドメイン；膜貫通領域、細胞外ループ領域及び細胞内ループ領域からなる膜貫通ドメイン；及び細胞内カルボキシ末端を含む。キメラ受容体を作成し、Ｇタンパク質結合応答を測定するための方法は、例えば国際特許出願公開第９７／０５２５２号パンフレット及び米国特許第５，２６４，５６５号明細書に記載されている。
【００８４】
体重又は食欲の変化
ヒトＭＣＨアナログは被験体において体重及び／または食欲を増加または維持するための方法において使用され得る。前記方法は、例えば被験体において有利な効果を達成させるため、またはＭＣＨの生理学的効果を更に調べるためにＭＣＨアンタゴニストの効果を調べる実験プロトコルの一部として使用され得る。
【００８５】
ＭＣＨアンタゴニストの効果を調べる実験プロトコルは、例えば被験体において体重または食欲を増加させるのに十分な量のｈＭＣＨアナログを用い、その後試験化合物の効果を調べることにより実施され得る。体重及び食欲の変化は当業界で公知の方法を用いて測定され得る。
【００８６】
体重及び食欲の増加は、過少体重被験体、体重または食欲に影響を及ぼす疾患を有しているかまたはそのような治療を受けている患者において体重を維持、体重を増加または食欲を増進させるために有用であり得る。加えて、例えばＭＣＨ−１Ｒを有する家畜は体重を増加させるべく処置され得る。
【００８７】
過少体重の被験体は正常な体重範囲すなわちボディーマス指数（ＢＭＩ）の下限よりも約１０％以下、２０％以下または３０％以下の体重を有する者が含まれる。「正常」体重範囲は当業界で公知であり、患者の年齢、身長及び体型のような要因が考慮される。
【００８８】
ＢＭＩは身長／体重の比である。ＢＭＩは体重（ｋｇ）を身長の二乗（ｍ）で割ることにより算出される。ＢＭＩの「正常」範囲は１９〜２２である。
【００８９】
投与
ヒトＭＣＨアナログは当業界で公知の方法に従って本明細書に記載のガイダンスを用いて被験体に対して処方、投与され得る。好ましい投与ルートにより有効量の化合物が確実に標的に到達する。医薬投与のガイドラインは、例えばいずれも援用により本明細書に含まれるとするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅs，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０年）発行；及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９０年）発行に包括的に記載されている。
【００９０】
ヒトＭＣＨアナログは酸性塩または塩基性塩として製造され得る。医薬的に許容され得る塩（水に溶解性または分散性の物質または油に溶解性または分散性の物質の形態）には、例えば無機酸、無機塩基、有機酸または有機塩基から形成されるような慣用されている非毒性塩または４級アンモニウム塩が含まれる。前記塩の例には酸付加塩（例えば、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルフェート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート及びウンデカン酸塩）；塩基性塩（アンモニウム塩、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩）；有機塩基との塩（例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）；アミノ酸（例えば、アルギニン及びリシン）との塩が含まれる。
【００９１】
ヒトＭＣＨアナログは注射を含めた各種ルートを用いて投与され得る。注射により投与する場合、注射用溶液または懸濁液は適当な非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒（例えば、リンゲル液または等張性塩化ナトリウム溶液）、適当な分散または湿潤／懸濁剤（例えば、合成モノ−及びジ−グリセリドを含めた滅菌無刺激性固定油、及びオレイン酸を含めた脂肪酸）を用いて処方され得る。
【００９２】
適当な投薬レジメは、好ましくは投与対象の被験体のタイプ；前記被験体の年齢、体重、性別及び医学的状態；投与ルート；前記被験体の腎及び肝機能；所望効果；及び使用する特定化合物を含めた当業界で公知の要因を考慮して決定される。
【００９３】
毒性なしに効果を得る範囲内の薬物の濃度を達成する際の最適精度には、標的部位への薬物のアベイラビリティーの動態学に基づくレジメが必要である。これには、薬物の分布、平衡及び排泄を考慮する。被験体に対する１日用量は０．０１〜１０００ｍｇ／被験体であると予想される。
【００９４】
ヒトＭＣＨアナログはキットの形態で提供され得る。前記キットは通常投与剤形中に活性化合物を含む。投与剤形は、被験体に対して１日以上定期的に（例えば、１〜６回／日）投与したときに体重または食欲を増加できるように十分量の活性化合物を含む。好ましくは、キットは体重または食欲増加のための剤形の使用及び特定期間中服用しなければならない薬物の量を指示する指示書を含む。
【００９５】
本発明の各種特徴を更に説明するために下記実施例を提示する。これらの実施例は本発明を実施するための有用な方法をも例示する。これらの実施例は本発明を限定しない。
【実施例１】
【００９６】
ＭＣＨ受容体配列
ヒトＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒアミノ酸及びコード化ｃＤＮＡ配列を以下に示す。
【００９７】
【化５】
2005527491.tif 000006
2005527491.tif 000007
2005527491.tif 000008
【実施例２】
【００９８】
ヒトＭＣＨアナログの合成
ヒトＭＣＨアナログを下記手順を用い、アミノ酸基の段階的付加を変更して製造した。ペプチドを作成及び修飾するための他の方法は当業界で公知である。
【００９９】
４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂（０．６５ｍｅｑ／ｇ−置換）でのペプチド鎖の延長は４３１Ａ  ＡＢＩペプチド合成装置を用いて実施した。製造業者から供給されたプロトコルをＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中でアミノ酸のヒドロキシベンゾトリアゾールエステルをカップリングするために用いた。α−アミノ基を半永久保護するためにフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を用い、側鎖に関してアスパラギン酸及びチロシン残基に対してｔｅｒｔ−ブチル、アルギニンに対して２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、システインに対してトリチルを用いて保護した。
【０１００】
５％  アニソールを含むＴＦＡを用いてペプチドを樹脂から開裂させた。室温で２時間後、ペプチジル樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄し、合わせた濾液を真空下で蒸発乾固させた。残渣をエーテルと磨砕し、形成された沈殿を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥した。粗ペプチドを水中５％  酢酸中に溶解し、溶液のｐＨを希水酸化アンモニウムを用いて約８．２に調整した。反応混合物を激しく攪拌しながら、０．０５％フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）水溶液を溶液が約５分間黄色を保つように滴下した。更に２０分後、約１ｍｌの酢酸で酸化を停止し、反応混合物を凍結乾燥した。
【０１０１】
凍結乾燥した粗ペプチドを、自動Ｗｉｓｐ  ７１２インジェクター及び９９１  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙデテクタを設けたＷａｔｅｒｓ  ６００Ｅシステムに取り付けたＣ１８  Ｖｙｄａｃカラムを用いて分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）により分析した。分析のために、３０分間で０％から１００％  緩衝液Ｂの標準勾配系を用いた。緩衝液Ａは水中０．１％  トリフルオロ酢酸であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％  トリフルオロ酢酸であった。ＨＰＬＣプロフィールを２１０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。分取分離は半分取Ｃ１８  ＲＰ  Ｗａｔｅｒｓカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ４０００システムを用いて実施した。分離のために、６０分間で０％から７０％  緩衝液Ｂの勾配とする水とアセトニトリルの上記溶媒系を用いた。クロマトグラフィー的に均質な生成物（純度＞９７％）をエレクトロスプレー質量分析法により分析した。
【実施例３】
【０１０２】
放射性リガンド結合アッセイ
膜結合アッセイを、プラスミドベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（ウィスコンシン州マディソンに所在のＰｒｏｍｅｇａ）由来のヒトＭＣＨ−２Ｒを発現する一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、プラスミドベクターｐＥＦ１／Ｖ５−ＨｉｓＢ（カリフォルニア州カールズバードに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＭＣＨ−２Ｒを安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、またはｐｃＤＮＡ３．１由来のヒトＭＣＨ−１Ｒを安定的に発現するＣＨＯ細胞で実施した。一時的発現のために、ＣＯＳ−７細胞を１０％  熱不活化ウシ胎仔血清を含むダルベッコ修飾イーグル培地（メリーランド州ロックビルに所在のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において培養した。
【０１０３】
７×１０６個のＣＯＳ−７細胞の懸濁液にｐＣＩ−ｎｅｏ／ＭＣＨ−２Ｒプラスミド（２０μｇ）をエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、６０〜７２時間後細胞を収集した。膜は一時的な安定トランスフェクタントから低張性溶解により作成し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
【０１０４】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９］−ｈＭＣＨの特異的結合を測定するために開発された（Ｂｅｄｎａｒｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：９３７９−９３８６（２００１））。ＳＰＡは９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅｓ（コネティカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）において小麦胚芽凝集素−ポリビニルトルエンビーズ（イリノイ州アーリントンハイツに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．）を用いて実施した。各ウェルにはＳＰＡビーズ（０．２５ｍｇ）、膜タンパク質（１〜１０μｇ）、及び結合緩衝液（５０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１２％  グリセロール，０．１％  ＢＳＡ）（２００μｌ）を含めた。結合緩衝液は５０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２％  グリセロール、０．１％  ＢＳＡ（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ）、及びプロテアーゼ阻害剤［４μｇ／ｍｌのロイペプチン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ），４０μｇ／ｍｌのバシトラシン（ミズーリ州セントルイスに所在のＳｉｇｍａ），５μｇ／ｍｌのアプロチニン（イリノイ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、０．０５Ｍ  ＡＥＢＳＦ（イリノイ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）及び５ｍＭ  ホスホラミドン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］を含んでいた。アッセイは膜調製物に対して最適化した。ＣＨＯ／ＭＣＨ−１Ｒ膜の場合には１μｇ／ウェルの膜が＞６×の特異的結合ウィンドーを生じた。ＣＯＳまたはＣＨＯ／ＭＣＨ−２Ｒの場合には８μｇの膜タンパク質が約３×のウィンドーを生じた。
【０１０５】
特異的結合は、総結合と５００ｎＭ  非標識ｈＭＣＨの存在下で実施した非特異的結合との差として定義される。ビーズを膜で２０分間被覆し、９６ウェルに分配し、ウェルにＤＭＳＯ中の各種濃度の試験化合物（最終ＤＯＳＭ濃度は１〜２％）を添加した後、２５ｎＣｉの［１２５Ｉ］−［Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ１９］−ｈＭＣＨ（〜２０００Ｃｉ／ミリモル；マサチューセッツ州ボストンに所在のＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。室温で３時間平衡とした後、プレートをＴｏｐＣｏｕｎｔ（コネティカット州メリデンに所在のＰａｃｋａｒｄ）で読んだ。ＩＣ５０はＰｒｉｓｍ  ３．０（カリフォルニア州サンディエゴに所在のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて計算した。ＩＣ５０値は３回の別々の実験で測定した。
【実施例４】
【０１０６】
エクオリンバイオルミネッセンス機能アッセイ
エクオリンバイオルミネッセンスアッセイは、Ｇｑ及びＧ１１から構成されるＧタンパク質サブユニットファミリーを介してカップリングするＧタンパク質結合受容体を同定するための信頼できる試験である。Ｇｑ及びＧ１１のカップリングにより、ホスホリパーゼＣが活性化され、細胞内カルシウムが可動化し、タンパク質キナーゼＣが活性化する。
【０１０７】
ＭＣＨ−１ＲまたはＭＣＨ−２Ｒのいずれか及びエクオリンリポータータンパク質を発現する安定細胞株を用いた。上記アッセイは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣ  ６１００に書き込んだカスタムソフトウェアによりコントロールされるＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  ＲＴルミノメーター（メリーランド州ゲーザーズバーグに所在のＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて実施した。２９３ＡＥＱ１７／ＭＣＨ−１Ｒ（または、ＭＣＨ−２Ｒ）細胞を７２時間培養し、細胞中のアポエクオリンにＥＣＢ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４），５ｍＭ  グルコース，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）中還元条件（３００Ｍ  還元グルタチオン）下でセレンテラジン（１０μＭ）を１時間充填した。
【０１０８】
細胞を収集し、ＥＣＢ培地で１回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌまで再懸濁した。次いで、細胞懸濁液（１００μｌ，５×１０４細胞に対応）をｈＭＣＨペプチドを収容している試験プレートに注入し、集積発光を０．５−ｓ単位で３０秒間にわたり記録した。次いで、溶解緩衝液（０．１％  最終トリトンＸ−１００濃度）（２０μｌ）を注入し、集積発光を０．５−ｓ単位で１０秒間にわたり記録した。各ウェル毎の「機能的応答」値を、トリトンＸ−１００溶解応答を含めた総集積ルミネッセンスに対する最初の誘発に対する集積応答の比を取ることにより計算した。
【実施例５】
【０１０９】
６位修飾
６位を修飾したヒトＭＣＨアナログは実施例１〜４に記載した方法を用いて固相合成により製造し、評価した。６位を修飾したＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２のアナログの結合及び機能データーを表１及び２に示す。
【０１１０】
【表１】
2005527491.tif 000009
【０１１１】
【表２】
2005527491.tif 000010
【０１１２】
Ａｃ及びＡｒｇ６のアミノ基を省くと、例えば６位に５−グアニジノ−吉草酸（脱−アミノ−アルギニン）を導入すると、配列番号３の化合物が生じた。配列番号３はｈＭＣＨ−１Ｒでは完全に有効なアゴニストでなかったが（１０μＭ濃度で４９％活性化）、ｈＭＣＨ−２Ｒで親化合物と同等の効力を有する完全アゴニストであった。対照的に、Ａｃ基を欠き、６位にＤ−Ａｒｇを含む配列番号４アナログはｈＭＣＨ−１ＲでＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２と同等の効力を示したが、ｈＭＣＨ−２Ｒでは１０倍以上弱かった。
【０１１３】
配列番号６〜１３の化合物は、ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２の６位が疎水性アミノ酸のＡｌａ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ及びＰｈｅ、親水性アミノ酸のＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ及びＬｙｓのＤ−エナンチオマーを与えた。これらのペプチドはｈＭＣＨ−１Ｒに対する有効な結合剤であったが、同一受容体での信号伝達効率はＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２よりも１０倍以上低かった。しかしながら、上記化合物はｈＭＣＨ−２Ｒに弱くしか結合せず、活性化しなかった。このことから、これらの化合物がｈＭＣＨ−１Ｒに対してより選択的であったことが分かる。
【０１１４】
Ａｒｇ６を別の親水性アミノ酸のシトルリンのＤ−エナンチオマーで置換すると、配列番号１４の化合物が生じた。配列番号１４はｈＭＣＨ−１Ｒに対してＤ−Ａｒｇ６化合物よりも約３０倍低い結合アフィニティーを有していた。両受容体で、６位にウレア側鎖を有する配列番号１４のアゴニスト効力はＬ−Ａｒｇ６化合物よりも低かった。
【０１１５】
配列番号１５のアナログでは、Ａｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２のＡｃ−Ａｒｇ６が除去されており、Ｃｙｓの代わりに３−チオ−プロピオン酸（脱−アミノ−システイン）を使用すると、ジスルフィド環が形成された。配列番号１５はｈＭＣＨ−１ＲでＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２よりも約５倍低い結合アフィニティー及び３０倍低い活性を示した。６位を修飾した他のペプチドと同様に、配列番号１５はｈＭＣＨ−２Ｒに対して非常に弱いリガンドであった（ＩＣ５０及びＥＣ５０  ＞３０００ｎＭ）。
【実施例６】
【０１１６】
１０位修飾
１０位を修飾したヒトＭＣＨアナログは実施例１〜４に記載した方法を用いて固相合成により製造し、評価した。Ａｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２のジスルフィド環は１０位にＧｌｙを含む。拘束側鎖の非存在下でＧｌｙがかなり立体的に自由であると、新しいペプチド配座異性体（逆回転）がしばしば容易に形成される。生物学的意義のある低エネルギーコンフォメーションの幾つかを安定化させるために、しばしばＧｌｙが立体的に拘束するアミノ酸（例えば、α−アミノ酸）で置換される。１０位を修飾したＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２のアナログの結合及び機能データーを表３及び４に示す。
【０１１７】
【表３】
2005527491.tif 000011
2005527491.tif 000012
【０１１８】
【表４】
2005527491.tif 000013
【０１１９】
Ｇｌｙ１０を長い側鎖、分枝側鎖または芳香族側鎖を有する疎水性Ｌ−アミノ酸で置換すると、配列番号１６〜２１の化合物が生じた。これらのアナログは親化合物とほぼ同じ効率でｈＭＣＨ−１Ｒに結合した。１０位にＬｅｕ、Ｃｈａ及びＮａｌ（２’）を有するｈＭＣＨ−２Ｒペプチド（配列番号１７、１９及び２１）は１０〜７０倍弱い結合剤であった。ｈＭＣＨ−１Ｒで、配列番号１６〜１８、２０及び２１の化合物の信号伝達効率はＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２と同等であったのに対して、ｈＭＣＨ−２Ｒではこれらの化合物は５〜１０倍弱かった。１０位に嵩高い分枝側鎖を有するＣｈａ１０アナログ（配列番号１９）は両受容体を弱くしか活性化しなかった。Ｇｌｙ１０の代わりに立体的に拘束するＰｒｏを導入すると、ｈＭＣＨ受容体でのアゴニズムを欠いていた。Ｐｒｏ１０アナログ（配列番号２２）はミクロモル濃度で実際不活性であった。
【０１２０】
配列番号２３〜２７の化合物では、親水性残基が１０位に導入された。１０位にＡｓｎ、Ｓｅｒ、Ｃｉｔ及びＬｙｓを有するペプチドはｈＭＣＨ−１Ｒに対する高いアフィニティー結合剤であったが、ｈＭＣＨ−２Ｒに対するそのアフィニティーはＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２よりも３０〜７００倍低かった。また、Ａｓｎ１０、Ｓｅｒ１０及びＣｉｔ１０ペプチドは両ｈＭＣＨ受容体で親化合物よりも３〜５０倍弱いアゴニストであったが、Ｌｙｓ１０アナログは３００倍弱かった。１０位に酸性残基を有する配列番号２８アナログ、すなわちＧｌｕ１０ペプチドは実際ｈＭＣＨ−１Ｒ及びｈＭＣＨ−２Ｒで不活性であった。
【実施例７】
【０１２１】
複修飾
少なくとも６位及び１０位を修飾したヒトＭＣＨアナログは実施例１〜４に記載した方法を用いて固相合成により製造し、評価した。少なくとも６位及び１０位を修飾したＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２のアナログの結合及び機能的データを表５及び６に示す。
【０１２２】
【表５】
2005527491.tif 000014
【０１２３】
【表６】
2005527491.tif 000015
【０１２４】
配列番号２９〜３４は、Ａｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２の構造にｈＭＣＨ−１Ｒ選択性にとって好ましい変化を加えるように設計した。Ｄ−Ａｒｇ６，Ａｓｎ１０及びＤ−Ａｒｇ６，Ｇｌｎ１０アナログの配列番号２９及び３０はＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２とほぼ同じ効率でｈＭＣＨ−１Ｒを活性化した。これらはｈＭＣＨ−２ＲよりもｈＭＣＨ−１Ｒに対するアゴニストとして約１５０倍以上選択的であった。配列番号３１及び３２では、Ｍｅｔ８が立体的等価のＮｌｅで置換されていた。これらのアナログは強力で選択的なｈＭＣＨ−１Ｒアゴニストであった。
【０１２５】
ＡｒｇをＡｌａで置換することによりＡｃ−ｈＭＣＨ（６−１６）−ＮＨ２の１４位のグアニジノ基を省くと、配列番号３３の化合物が生じた。配列番号３３の化合物はｈＭＣＨ−１Ｒ受容体で親化合物よりも５倍弱いアゴニストであったが、ｈＭＣＨ−２Ｒ受容体に対しては約５０倍以上選択的であった。
【０１２６】
他の実施態様は請求の範囲内である。幾つかの実施態様を例示、説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種変更を加え得る。
【配列表】
2005527491.tif 000016
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【国際調査報告】
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