(57)【要約】試料中に存在するｍＲＮＡ種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法は、（ｉ）ヒール化５’−増幅プライマー（ＦＡＰ−ＲＡＮＤ）およびヒール化３’−増幅プライマー（ＴＡＰ−ＲＴ）を用いるｍＲＮＡ種の逆転写（ここに、各プライマー配列は特有であり、いずれかのヒール配列または両方のヒール配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含み、ＦＡＰは可変配列を含む）により、該ＲＮＡを逆転写して二本鎖ｃＤＮＡを生産し、したがって、該可変配列に応じて複数のｃＤＮＡを生産する工程；および（ｉｉ）ＦＡＰ−ＲＡＮＤおよびＴＡＰ−ＲＴ内のプライマー、すなわち、ＦＡＰおよびＴＡＰに対して十分に相補的なプライマーを用いて該ｃＤＮＡを増幅する工程を含む。一の具体例において、該方法はさらに、（ｉｉｉ）アンプリコンのいずれかの末端からＲＮＡラン・オフを生ずるためのイン・ビトロ転写工程を含む。
2005532074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在するｍＲＮＡ種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法であって、
（ｉ）ヒール化５’−増幅プライマー（ＦＡＰ−ＲＡＮＤ）およびヒール化３’−増幅プライマー（ＴＡＰ−ＲＴ）を用いるｍＲＮＡ種の逆転写（ここに、各プライマー配列は特有であり、いずれかのヒール配列または両方のヒール配列はＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含み、ＦＡＰは可変配列を含む）により、該ＲＮＡを逆転写して二本鎖ｃＤＮＡを生産し、したがって、該可変配列に応じて複数のｃＤＮＡを生産する工程；および
（ｉｉ）ＦＡＰ−ＲＡＮＤおよびＴＡＰ−ＲＴ内のプライマー、すなわち、ＦＡＰおよびＴＡＰに対して十分に相補的なプライマーを用いて該ｃＤＮＡを増幅する工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、（ｉｉｉ）アンプリコンのいずれかの末端からＲＮＡラン・オフを生ずるためのイン・ビトロ転写工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
各ヒール配列が異なるＲＮＡポリメラーゼ部位を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
鎖特異的ライブラリーを作成するための請求項３記載の方法。
【請求項５】
２つの細胞集団からサブトラクションライブラリーを作成するための上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチド産物をクローニングし、それらをアレイに固定することを含む上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
試料がレーザー捕獲顕微解剖由来である上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
試料がパッチクランプ採取由来である上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
第１および／または第２のヒール配列が切断部位のヌクレオチド配列を含む上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
切断部位がそのヒール配列の３’末端に位置する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第１および第２のヒール化プライマーが同一の切断部位を有する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
第１および第２のヒール化プライマーが異なる切断部位を有する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
切断部位で切断する物質でポリヌクレオチドを処理する付加的な工程を含む請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
増幅が５０サイクルまでの増幅サイクルからなる上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
各増幅サイクルが：
（ｉ）８５℃〜９７℃で一本鎖ＤＮＡ分子を得る工程；
（ｉｉ）４５℃〜６５℃で一本鎖ＤＮＡ分子をアニールする工程；および
（ｉｉｉ）７０℃〜７５℃でアニールしたＤＮＡ分子を伸長する工程
を含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第１のヒール化プライマー集団が、５’末端から３’末端へ
（ｉ）試料中に初めに存在するｍＲＮＡ分子に対して非相補的な１５〜２２個のヌクレオチドからなるヒール配列；および
（ｉｉ）１５〜２５個のヌクレオチドからなるオリゴｄＴ配列
を含む核酸の集団からなり、ここに、実質的に全ての可能な可変配列の組み合わせが該第１のヒール化プライマー集団において見られる、上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
さらに、増幅後の反応混合物中に含有される少なくとも１つの核酸配列の存在を確認することを含む上記請求項のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
確認が、
（ｉ）特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる目的配列の検出；
（ｉｉ）特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いる目的配列の増幅；および
（ｉｉｉ）複製および／または発現ベクター中に得られるＤＮＡ分子のクローニング
のいずれか１つを含む請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は核酸増幅法に関する。
【０００２】
発明の背景
ＷＯ０１／０６００４は、試料中に存在するｍＲＮＡ種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法を開示する。該方法は、３工程、すなわち、第１のｃＤＮＡ鎖を提供するための、第１のヒール化（heeled）プライマー集団を用いるｍＲＮＡ種の逆転写；第２のヒール化プライマー集団を用いる、第１のｃＤＮＡ鎖からの第２のｃＤＮＡ鎖の合成；および第１および第２のｃＤＮＡ鎖の増幅からなる。第１および／または第２工程において使用されるプライマーのヒール（heel）配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有する。増幅に使用されるプライマーは、少なくとも、第１のヒール配列の一部および第２のヒール配列の一部を含む。該ヒール配列のいずれか、または各々は、好ましくは、低頻度制限酵素切断部位のヌクレオチド配列を含み；生産されるポリヌクレオチドはコンカテマーを含みうるが、所望のアンプリコン（amplicon）に影響を及ぼすことなく、該切断部位で切断する物質で処理することができる。
【０００３】
発明の概要
本発明は、ＷＯ０１／０６００４において開示された手法を簡略化できることを見出したことに基づく。本発明によると、試料中に存在するｍＲＮＡ種に対応する配列を含有するポリヌクレオチドの数を増加する方法は、
（ｉ）ヒール化５’−増幅プライマー（ＦＡＰ−ＲＡＮＤ）およびヒール化３’−増幅プライマー（ＴＡＰ−ＲＴ）を用いるｍＲＮＡ種の逆転写（ここに、各プライマー配列は特有であって、関連するゲノムに存在せず、各ヒール配列はＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含み、ＦＡＰ−ＲＡＮＤは可変配列を含む）により、該ＲＮＡを逆転写して二本鎖ｃＤＮＡを生産し、したがって、該可変配列に応じて複数のｃＤＮＡを生産する工程；および
（ｉｉ）ＦＡＰ−ＲＡＮＤおよびＴＡＰ−ＲＴ内のプライマー、すなわち、ＦＡＰおよびＴＡＰに対して十分に相補的なプライマーを用いて該ｃＤＮＡを増幅する工程を含む。
【０００４】
本発明において、逆転写および複数のｃＤＮＡの生産が一工程で行われることは明らかであろう。本発明は、様々なＦＡＰ−ＲＡＮＤ配列の適当な集団の使用により複数のｃＤＮＡを得るために、よりランダムな配列を使用するという点で既知の手法と共通するが、この新規な手法はより単純である。逆転写は、より効率良く進行し、必要とされる増幅サイクルは、より少ない。
【０００５】
さらに、既知の手法と比べて、低頻度制限部位の必要性が回避される。もう一つ別の利益は、一部、研究されているゲノムに存在しないＦＡＰおよびＴＡＰ中の特有配列の使用のため、複合体生成物の生産が最少化されることである。さらに、既知の手法は、ＲＴおよび第２鎖合成後の生成物の増幅に単一プライマーを用いるが、本発明は、特有配列からなる２つの別個のプライマーを用いるという有意な利点を提供する。
【０００６】
本発明は、より多くの増幅を提供するだけでなく、使用時のより大きな柔軟性を提供する。例えば、サブトラクション標準化濃縮ｃＤＮＡライブラリーを作成するための、特異的制限部位の包含が容易に可能である。また、単一細胞ライブラリーを作成するための、ラムダクローニングのための特異的制限部位の包含も可能である。また、マイクロアレイおよびフィルター上でプローブとして使用するために、断片化のために、特異的制限部位を含ませることができる。該手法は、例えば、Fendら、Am. J. Pathol. (1999) 154(1): 61-6によって記載されるように、レーザー捕獲顕微解剖のためのプロトコールに容易に関連付けることができる。
【０００７】
本発明の具体例は、第３工程、すなわち、（ｉｉｉ）アンプリコンのいずれかの末端からＲＮＡラン・オフを生ずるための、例えば、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いる、イン・ビトロ転写を含む。これは特に、最初のＲＮＡの量が少ないか、または入手可能な細胞数が少ないときの使用に適当である。
【０００８】
好ましい具体例の記載
本発明（本明細書において「ＭＥＸ」と記載される）は、少数の細胞（単一細胞レベルであってもよい）における遺伝子発現の分子分析のための技術である。ＭＥＸ産物は、単一細胞ＰＣＲ、サブトラクション発現ライブラリーの構築およびスクリーニング、マイクロアレイ分析および標的バリデーションを包含する多くのダウンストリーム分子技術と直接、一体化され、適合するように設計されている。
【０００９】
理論に捉われることは望ましくないが、ＭＥＸ増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）工程、次いで、必要ならば、ＩＶＴ（イン・ビトロ転写）工程の２段階において起こる。ＭＥＸの基礎をなす機構の概要を図１に示す。簡単に言うと、該図は、逆転写（ＲＴ）特異的配列が細胞性ｃＤＮＡ集団の５’および３’両末端に組み込まれる第１段階を示す。これらの配列は、ＭＥＸ−ＰＣＲプライマーのプライミング部位（各々、図１の菱形および斑点模様のボックスとして示される）として、段階１増幅において使用される。次いで、ＭＥＸ−ＲＴプライマー内に含有されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（各々、図１のストライプおよび網目模様のボックスとして示される）が、段階２のＭＥＸ産物の生産のために使用される。これらは、複数のダウンストリーム分子応用において使用できる鎖特異的ＲＮＡ種である。
【００１０】
ＭＥＸ段階１において、細胞集団のｃＤＮＡ相補体の５’および３’両末端に、例えば、特許を有するプライマー配列をタグ付加する。これらのタグ付加産物を次いで、限られたサイクル数のＰＣＲを用いて増幅する。これは、１０００個ほどのわずかな細胞（１０−１００ｎｇ全ＲＮＡ）からのダウンストリーム分析に十分な材料を提供し；これらは、本明細書において、ＭＥＸ段階１生産物と称する。
ＭＥＸ段階１生産物は、ｃＤＮＡプール内のＭＥＸ−ＲＴプライミング部位の組み込みに依存し、ＭＥＸ前の初めのＲＮＡ集団における転写産物と類似のサイズを有する。これは、ＭＥＸにおいて、全長ｃＤＮＡが生産され、増幅されることを説明する。さらに、クローン化されたＭＥＸ産物のバイオインフォマティック分析は、１００％の生産物が、転写産物（ｎ＝４３）中の適当な部位にＭＥＸ−ＲＴプライマーを含有することを示した。すなわち、３’ＭＥＸプライマーは、転写産物の３’ポリＡ部位に正確にプライムし、５’プライマーは転写産物の５’末端に含有される。
【００１１】
特定の具体例において、３’ヒール化プライマー（ＴＡＰ−ＲＴ）は、該プライマーの３’末端に含有される（Ｔ）２０配列がｍＲＮＡ集団におけるポリＡ尾部へ結合することによって、逆転写および第１ラウンドｃＤＮＡ合成を開始する。該プライマーは、その後に続くＰＣＲ増幅のためのヒール配列およびその後に続くイン・ビトロ転写反応のためのネスティッド(nested）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ用）を含有する。第２のプライマー（ＦＡＰ−ＲＡＮＤ）もまた、ＲＴ反応に含まれ；これは、該プライマーの３’末端に組み込まれた（Ｎ）１５配列を介して第１鎖ｃＤＮＡから半無作為的にプライミングすることによって、第２ラウンドｃＤＮＡ合成を開始する。該プライマーもまた、その後に続くＰＣＲ増幅のためのヒール配列（注意：該ヒール配列は３’−プライマーのヒール配列と異なる）およびその後に続くイン・ビトロ転写反応のためのネスティッドＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位（Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ用）を含有する。該ヒール配列は、現行のゲノムデータベースに存在しないことによって明らかにされるような特有の配列である。
【００１２】
このように、ｍＲＮＡの集団は、その３’末端でＴＡＰに、５’末端でＦＡＰに固定される２本鎖ｃＤＮＡに変換される。したがって、該ｃＤＮＡ集団は、下記の種類のＭＥＸフラグメント（ここに、遺伝子Ｘは逆転写されたいずれかの遺伝子を示す）を含有する：
ＦＡＰ配列−Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ配列−（Ｎ）１５−遺伝子Ｘ−（Ｔ）２０−Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ−ＴＡＰ配列
【００１３】
例えば、出発試料中の入手可能なＲＮＡの限定的な性質のために、さらなる増幅を必要とする場合、段階１ＭＥＸ生産物においてＩＶＴ反応を行って、該技術の感度を拡張することができる。これは、特許を有するＭＥＸ−ＲＴ ｃＤＮＡ合成プライマー内のＲＮＡポリメラーゼ部位の組み込みによって達成され、単一細胞レベル（〜１０−１００ｐｇ全ＲＮＡ）まで検出範囲を拡張する。該技術はまた、Ｔ３部位を有する５’プライマーおよびＴ７部位を有する３’プライマーの差別的なタグ付加によって、ＭＥＸアンプリコンプールからの鎖特異的プローブ（センスおよびアンチセンスの両方）の生産を可能にする。
ＭＥＸの力は、確実に、簡単に、再現可能に、かつ、典型的な方法で、少量のｍＲＮＡを増幅できるその能力に由来する。それにもかかわらず、該技術の真の潜在能力は、それを一連のアップストリームおよびダウンストリーム応用に結びつけることによって、最もよく理解されうる。これらは、レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）およびパッチクランプ採取（Patch Clamp Harvesting；ＰＣＨ）などのアップストリーム細胞採取技術、および出発点としてＭＥＸ生産物を使用するダウンストリーム分子応用を包含する。
【００１４】
かくして、多くの組織における病的細胞の散在した位置、および従来技術によってこれらの細胞を均質に精製することの困難性がＬＣＭの開発をもたらしたことが知られている。現在、該アプローチを用いると、中程度の数の目的細胞を高い精度で視覚的に同定し、採取することが可能である。これらの細胞を処理してＲＮＡを単離することができ、これをＭＥＸを用いて増幅する。
さらに、ＭＥＸ産物は、一連のハイスループット分子技術と適合するように設計されうる。ＭＥＸプライマーにおける設計特徴は、ＰＣＲサブトラクションライブラリーの構築のためのベクター−適合性制限部位の組み込み、ならびにマイクロアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップをスクリーニングするための鎖特異的プローブを生産する能力を包含する。
【００１５】
下記により詳細に示すように、ＭＥＸは、サブトラクションＰＣＲライブラリーを作成するために首尾よく使用された。これらは、従来法で作成されたライブラリーと比較され、組成が非常に類似することが示された。このように、２つの小さな細胞集団からＲＮＡ内容物を増幅すること、他の集団から１の集団を引き算すること、および差別的に発現した遺伝子について高度に濃縮されたパラダイム−特異的ライブラリーを作成することが可能である。
ＭＥＸ−サブトラクションライブラリー内または未処理のＭＥＸアンプリコンプール内に含有される生産物の集団をスクリーニングするための有効な方法は、これらの生産物をクローニングし、次いで、例えば、それらをプローブとしてガラスマイクロアレイに結合させることによって、それらを基体上に固定することによるものである。さらに、同時に、未処理のアンプリコンおよびライブラリーを標識された標的として使用して、これらおよび他のマイクロアレイをスクリーニングすることができる。
【００１６】
いずれの増幅技術も、重要な一面は、増幅後のＲＮＡ種のレプリゼンテーション（representation）が非増幅材料におけるそれを反映しなければならないことである。これにより、試料間の比較分析の実施が可能になる。ＭＥＸは、増幅後に、初めのＲＮＡ出発集団のレプリゼンテーションを維持する。これは、出発試料が類似していようが、相違していようが変わらず、初めの増幅前試料中におけるレプリゼンテーションと全く同等である。同様に、出発材料が低濃度であっても、レプリゼンテーションは維持される。
【００１７】
本発明とＷＯ０１／０６００４に開示される方法との間の基本的な相違を配慮しながらも、後者の文献の開示は、多くの点において関連し、出典明示によって本明細書の一部とされる。例えば、該文献は、ある特定の関連する材料および処理条件を開示し、それは、当業者によって、本発明の目的に容易に適用できる。
【００１８】
下記の実施例は本発明を説明するものである。上記するように、「ＦＡＰ」および「ＴＡＰ」は、各々、５’−および３’−増幅プライマーの省略形として使用される。
【実施例】
【００１９】
実施例１  ＭＥＸ ＲＴ反応
該工程において、ＰＣＲ増幅に特異的なプライミング部位をｃＤＮＡ集団の適当な末端に導入した。
水に溶解した１０μｌの全ＲＮＡ（細胞／組織／レーザー捕獲顕微鏡細胞採取物から標準的な分子生物学プロトコールによって、または直接的パッチクランプ採取から調製された）を、各々１０μＭのＦＡＰ−ＲａｎｄｏｍｅｒおよびＴＡＰ−ＲＴ １μｌに加えた。ＦＡＰ−Ｒａｎｄｏｍｅｒは、ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＴＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＴＡ ＡＴＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＧＴＡＣ（Ｎ）１５であり、その塩基１−２５がプライマーを構成し、塩基２６−４６がＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを構成し、塩基４８−５１（ＧＡＴＣ）がＳａｕ３Ａ制限部位を構成し、塩基５２−５５（ＧＴＡＣ）がＲｓａ１制限部位を構成する。ＴＡＰ−ＲＴ配列は、ＣＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＣＴ ＧＴＡ ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＣＧＴ ＡＣ（Ｔ）２０であり、その塩基１−２２がプライマーを構成し、塩基２２−４５がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを構成し、塩基４６−５３が同じ制限部位を構成する。これを７０℃に５分間加熱した後、氷上で２分間、ｓｎａｐ−冷却した。
【００２０】
４μｌの５ｘ逆転写バッファー（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキット、Invitrogen）、２μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキット、Invitrogen）、１μｌのｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの混合物）および１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Invitrogen）を加え、反応物を４２℃で１時間インキュベートした。
【００２１】
ＭＥＸ増幅反応
該工程において、逆転写されたＭＥＸ−ＲＴ産物を、ダウンストリーム分子応用のためにＰＣＲによって増幅した。
５μｌのＲＴ反応物を１００μｌ ＰＣＲにおいて、下記の試薬：１０μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＩＩ ＰＣＲバッファー（Clontech）、１μｌのｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの混合物）、１０μＭの ＦＡＰ １μｌ、すなわち、上記のＦＡｐ−Ｒａｎｄｏｍｅｒの塩基１−２５、および１０μＭのＴＡＰ １μｌ、すなわち、上記のＴＡＰ−ＲＴの塩基１−２２、および７７μｌの滅菌水の添加によって増幅した。
サイクリング・パラメーターは下記の通りであった：９５℃で１分間を１サイクル、次いで、９５℃で１５秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で６分間を２４サイクルまで。
【００２２】
実施例２  対照ＲＮＡ由来のＭＥＸ
約１００ｎｇの全脳ＲＮＡを実施例１のＭＥＸ ＲＴ／増幅プロトコールにしたがって逆転写した。これを連続希釈し、９サイクルまたは１５サイクルのＭＥＸ増幅に付した。さらに、増幅を行わなかった対照も含まれた。ＰＣＲを行って、ｃＤＮＡおよびＭＥＸ増幅プール中におけるアクチンｍＲＮＡ転写産物の増幅度を決定した。
アクチン転写産物は、全ＲＮＡ相当量５０ｎｇの濃度でのみ、非増幅ｃＤＮＡ中で検出できた。転写産物は、５ｐｇ未満のｃＤＮＡ濃度では検出できなかった。対照的に、アクチンは、９サイクルのＭＥＸ増幅後、０．５ｐｇおよび１５サイクルのＭＥＸ増幅後、５０ｆｇという低濃度にて、同じｃＤＮＡ試料中で検出できた。
該実験は、ｃＤＮＡのＭＥＸ増幅が、従来のＲＴ ＰＣＲのみによって検出可能な範囲を越えて検出範囲を拡張することを明らかにする。
【００２３】
実施例３  レーザー捕獲細胞由来のＭＥＸ
Ｇ−１培養細胞をガラス顕微鏡スライド上で生育させ、レーザー捕獲顕微解剖（ＬＣＭ）のために処理した。確定数の細胞を採取し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｍｉｃｏ−ＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡ抽出した。ＭＥＸ ＲＴプライマーを用いて該ＲＮＡを逆転写し、次いで、１５または２１サイクルのＭＥＸ増幅に付した。また、ｃＤＮＡの一部をＭＥＸ増幅を用いない分析のために保持した。ＭＥＸ増幅の有効性の最終的なアッセイとして、アクチンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
アクチン配列は、１５サイクルのＭＥＸ増幅後、わずか５０個の細胞において、および２１サイクルのＭＥＸ増幅後、わずか１０個の細胞において検出された。対照的に、アクチン配列は、ＭＥＸプレ増幅に付されなかった試料中において検出されなかった。これは、分子技術をＬＣＭに結びつけるためにＭＥＸを使用できることを明らかにする。
【００２４】
実施例４  イン・ビトロ転写と連結したＭＥＸ
約１００ｎｇの全ＲＮＡをＭＥＸプライマーを用いて逆転写し、連続希釈し、次いで、ＭＥＸ増幅を３、６または９サイクル行った。これらの生産物をＭｅｇａｓｃｒｉｂｅキット（Ambion）を用いてイン・ビトロ転写（ＩＶＴ）し、従来の（ｄＴ)１８プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓ ＩＩ（Invitrogen）を用いて二度目の逆転写を行った。相対的増幅効率を測定するために、これらの生産物において、アクチン配列について遺伝子特異的なＰＣＲを３０サイクル行った。ＩＶＴと共に用いた場合、３サイクルのＭＥＸの組み合わせが、５ｐｇの全ＲＮＡにおいてアクチン転写物の同定を可能にするのに十分であった。ＩＶＴ前に付加的な３サイクルのＭＥＸを適用することにより、該検出領域を５０ｆｇの全ＲＮＡまで拡張できた。ちなみに、ＩＶＴを用いないで５０ｆｇのＲＮＡにおいてアクチンの検出を可能にするには、１５サイクルのＭＥＸが必要とされた。
結論として、ＭＥＸをＩＶＴと共に用いると、検出感度を拡張すると共に、サイクル数を最少にすることができる。これは、アンプリコンプールにおけるレプリゼンテーションの線形性を維持しながら、ＭＥＸ由来のアンプリコン収量を増加させるのに重要であるかもしれない。さらに、ＭＥＸ産物からＲＮＡラン・オフが生じることにより、これらの生産物のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘおよび他のマイクロアレイ上でのプローブとしての使用が可能になる。
【００２５】
実施例５  標的同定において使用されるＭＥＸ
ＭＥＸの有用性を明らかにするために、ＬＣＭを用いて、ｃ線維をイン・ビトロ疼痛モデルから採取した。該モデルは、神経生長因子（ＮＧＦ）などのプロ侵害受容物質で処理したラット三叉神経節細胞の初代培養を基礎とした。
５０個のニューロンを三叉神経節培養物から採取し、ＲＮＡ抽出し、２４サイクルのＭＥＸを用いて増幅した。遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを用いて、これらの細胞由来のいくつかのハウスキーパーおよび疼痛関連遺伝子を同定した。より詳細には、侵害受容との関連が知られた遺伝子に対するプライマーを用いて、アンプリコンプールをアッセイした。ＭＥＸ増幅の前後にアンプリコンプールをアッセイしたとき、明確な差異を観察することができた。アクチンおよびシクロフィリン（ａｃｔおよびｃｙｃ）などの対照遺伝子はプレ−ＭＥＸプールにおいて検出することができたが、他のあまり豊富ではない、生物学的により重要な侵害受容応答に関する遺伝子、すなわち、ＴｒｋＢ受容体、ＰＮ３、ナトリウムチャネルＢｅｔａ３サブユニット、カルシトニン遺伝子関連タンパク質、脈管腸管ペプチド、ニューロペプチドＹ、ガラニンおよびチロシンヒドロキシラーゼ（ＰＮ３、β３、ＣＧＲＰ、ＶＩＰ、ＮＰＹ、Ｇａｌ、およびＴＨ）は欠如していた。これは、多数のこれらのプロ−侵害受容遺伝子を容易に検出できたＭＥＸ増幅後のアンプリコンプールとは対照的であった。また、これにより、イン・ビトロ疼痛モデルが確認された。
したがって、ＭＥＸは、少数の病理学的に関連する細胞における目的遺伝子の検出に有用である。これらの遺伝子は、治療的介入のための標的として使用されうる。
【００２６】
実施例６  ライブラリー構築において使用されるＭＥＸ
ＭＥＸプライマーは、多くのダウンストリーム応用に適合するように設計された。これらは、サブトラクションＰＣＲライブラリーの作成における使用を包含する。
少数の細胞（１００ｎｇ全ＲＮＡ相当量）由来のＭＥＸ産物を、神経生長因子で処理した、または非処理の三叉神経節初代培養物から増幅し、精製して、サブトラクションライブラリーの作成のための出発材料を得た。これらをサイズで選別して、小さい生産物およびプライマー配列（＜５０塩基対）を除去した。サブトラクションを容易にするために、リンカー分子をこれらの生産物にライゲートし（これらは、リンカー−ベース／遺伝子−ベースのＰＣＲプライマーの組み合わせを用いることによって品質管理された）、２ラウンドの抑制ＰＣＲサブトラクションをＭＥＸアンプリコンに適用した。これにより、最終的な順方向および逆方向のサブトラクションライブラリー対を作成した。該ライブラリーは、両サブトラクションプールに共通する「ハウスキーパー」遺伝子がサブトラクション過程の間に確実に除去されるように品質管理された。これは、サブトラクションライブラリーからのアクチン転写産物の除去によって明らかにされた。これらのライブラリーの内容物の最終的なチェックとして、生産物をクローン化し、サイズを測定した。これらのクローンのいくつかを配列決定し、差別的な発現を同定した。
したがって、ＭＥＸを用いて、少数の細胞中での遺伝子発現を分析でき、２以上の細胞型または異なる表現型を有する細胞型間で差別的に発現される遺伝子を同定することができる。
【００２７】
実施例７
ＭＥＸを用いて、ＭＥＸ逆転写された全ＲＮＡ（２ｎｇ−２μｇ）由来の連続希釈ｃＤＮＡを、１５〜２５サイクルのＰＣＲサイクル範囲を用いて増幅した。同時に、同じ濃度の従来法で逆転写したＲＮＡを同様に増幅した。ＰＣＲアンプリコンは、ＭＥＸ増幅後にのみ見られた。ＭＥＸ増幅は、２５サイクルのＰＣＲと組み合わせたとき、２０ｎｇというわずかな全ＲＮＡから好結果が得られた（アガロースゲル上で可視生産物の存在によって決定される場合）。
さらに、１００ｎｇの全ＲＮＡのＭＥＸ増幅後アンプリコンと１０μｇの非増幅全ＲＮＡとを比較すると、ＭＥＸ増幅後の生産物のサイズ範囲は非増幅対照試料のそれと類似する。さらに、ＭＥＸ試料中の生産物の量は、対照試料の１％から開始したにもかかわらず、増幅原料中よりも多い。
【００２８】
実施例８
ＲＮＡの希釈物を段階１ＭＥＸまで増幅し、これらのＭＥＸ産物のアリコートを鋳型として、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いるＩＶＴ反応において用いた。該アプローチを用いて、ＭＥＸの感度を、〜１０ｎｇ ｔＲＮＡから２．５ｐｇほどのわずかなＲＮＡへ、３桁拡張することができる。鎖特異的プローブは、該技術を用いて作成することができる。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いてセンス鎖ＲＮＡを作成することができ、一方、Ｔ７を用いてアンチセンス転写物を合成することができる。
これらのＩＶＴ産物の配向は、鎖特異的プローブを含有するマイクロアレイをスクリーニングすることによって、すなわち、ガラススライドに異なるコーディネートで別々に結合させたセンスおよびアンチセンスプローブを用いて分析された。同じ段階１反応由来のアリコートをこれらのセンスおよびアンチセンス反応のための鋳型として用いたことから、予測通り、信頼できるセンスおよびアンチセンスプローブが生産されたならば、２つの標的調製物のハイブリダイゼーションパターンにおいて明らかな差異が予想されたであろう。
より詳細には、Ｔ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかを用いて、段階１ＭＥＸ産物をイン・ビトロで転写し、ＲＮＡ逆転写し、ｃｙ３（Ｔ７）またはｃｙ５（Ｔ３）で標識した後、鎖特異的マイクロアレイにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションシグナルは、もっぱら、「緑色」（ｃｙ３）のみ、または「赤色」（ｃｙ５）のみであり、「黄色」スポットはあったとしてもわずかであり、それは混合したセンス／アンチセンス転写物の不適当な転写を示す。
鎖特異的転写産物が段階１ＭＥＸ産物から生産されたことを説明するために、Ｔ３およびＴ７ ＩＶＴラン・オフ標的を生産し、各々、ｃｙ３およびｃｙ５で標識した。これらを一緒に（Ｔ３ ｃｙ３ ｖ Ｔ３ ｃｙ５およびＴ７ ｃｙ３ ｖ Ｔ７ｃｙ５）、鎖特異的プローブからなるマイクロアレイにハイブリダイズした。両センスおよびアンチセンスプローブのチューブリンに対するハイブリダイゼーション強度を各マイクロアレイにわたって比較した。結果は、Ｔ３標的がセンス鎖プローブにハイブリダイズしたことを示し、それは、アンチセンスプローブと比較したとき、より高い蛍光シグナルを示した。これは、Ｔ７標的を用いたとき逆転した。これは、鎖特異的ハイブリダイゼーションが起こっていることを明らかにする。Ｔ３実験におけるチューブリンに対するセンスおよびアンチセンスプローブ間の強度の差は、１０３倍であり、Ｔ７実験においては１０４倍であった。
【００２９】
実施例９
ＭＥＸの間に達成された増幅レベルを定量するために、典型的なＭＥＸ反応から生産されたＲＮＡの量を測定した。〜４５μｇのポリＡ ＲＮＡが＜５ｎｇの投入した全ＲＮＡ（〜５０ｐｇポリＡ ＲＮＡ）から合成された。したがって、約１００，０００培の増幅が達成された。これは、可能な増幅レベルの粗測定値を与えるが、増幅過程の間に基本的な反応成分が枯渇するために、これは推定値未満になるようである。同時に、アンプリコンプール内の遺伝子の相対的な濃度は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認された。
より詳細には、リアルタイムＰＣＲを、２つの遺伝子、アクチンおよび高アフィニティーＮＧＦ受容体ｔｒｋＡについて、ＭＥＸ前、段階１ＭＥＸ後、および段階２ＭＥＸ後の２つのバランスのとれたｃＤＮＡ試料において行った。図２の２つのグラフは、Ｓｙｂｒグリーンアッセイによって決定されたＰＣＲ開始点を示す。２つの試料は、増幅過程を通じてこれら２つの転写産物の相対レベルを維持するが、これらが出現する相対的サイクル数は左にシフトし、これは、ｃＤＮＡプールの増幅が起こったことを示し、結果として、転写産物のより早い検出をもたらす。
【００３０】
実施例１０
サブトラクションＭＥＸ産物および従来法で作成したライブラリーをクローン化し、社内で構築したマイクロアレイ上でプローブとして用いるために増幅した。該マイクロアレイを、対になったＭＥＸにより作成されたサブトラクションライブラリーを用いてスクリーンした。実質的に直線的な関係が、ハイブリダイゼーションシグナルのグラフ解釈において見られた（ここに、各プローブは、ｙ軸上に示されるｃｙ３蛍光強度およびｘ軸上のｃｙ５蛍光強度を用いて、単一データポイントとして示される）。
【００３１】
実施例１１
同じＲＮＡ供給源由来の２つの独立して逆転写されたＲＮＡをＭＥＸによって増幅し、独立して、ｃｙ３またはｃｙ５で標識した。これらの試料を混合し、マイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後の全プローブの「黄色」の性質は、各チャネルにおけるシグナルが等しかったことを示す。これは、各プローブがｃｙ３（ｙ軸）およびｃｙ５（ｘ軸）チャネルにおけるそのシグナルにしたがってプロットされたときに示され；該グラフの直線性は、同一ＲＮＡ試料が別々のＭＥＸ反応において全く同じに増幅されることの証明である。これは、各反応／チャネルにおいて増幅／標識される出発材料が同一であった場合の予測された結果である。これは、ＭＥＸが増幅の間中、試料ＲＮＡレプリゼンテーションを維持することを明らかにする。
【００３２】
実施例１２
２つの別々の供給源（脳ｃｙ３および精巣ｃｙ５）由来の２つの独立して逆転写されたＲＮＡを、ＭＥＸ増幅後または増幅前に比較した。これらの試料を比較したとき、ハイブリダイゼーションパターンはほとんど同一であり、よって、増幅しても、増幅しなくても、ＭＥＸが２つのＲＮＡ供給源間のレプリゼンテーションのバランスを維持したことが明らかにされた。
【００３３】
実施例１３
同じＲＮＡ供給源の独立した逆転写由来のＲＮＡ量１μｇ〜１ｎｇを、ＭＥＸおよびＩＶＴ増幅によって増幅し、ｃｙ３またはｃｙ５のいずれかで標識した。量は下記の通りである。
１＝１μｇ出発全脳ＲＮＡ ＲＴ    ２５０ｎｇＭＥＸ  ２５ｎｇＭＥＸ／ＩＶＴ
２＝１０ｎｇ出発全脳ＲＮＡ ＲＴ  ２．５ｎｇＭＥＸ  ２５０ｐｇＭＥＸ／ＩＶＴ
３＝１ｎｇ出発全脳ＲＮＡ ＲＴ    ２５０ｐｇＭＥＸ  ２５ｐｇＭＥＸ／ＩＶＴ
これらの量は、個々の実験に使用される当初の試料の量に関係する（すなわち、ＲＴの１／４がＭＥＸ反応に用いられ、ＭＥＸ反応の１／１０がＩＶＴに用いられた）。試料間の直線的な関係は、投入ＲＮＡが非常に低濃度であってもレプリゼンテーションが維持されたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
（原文に記載なし）
【配列表】
2005532074.tif 000003
【図１】
2005532074.tif 000004
【図２】
2005532074.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532074000001.app
【国際調査報告】
2005532074.tif 000006
2005532074.tif 000007