(57)【要約】薬物スクリーニング戦略は、関心対象の遺伝子以外は同質遺伝子性である細胞を基にしている。各細胞は、細胞増殖をモニタリングするために、示差的に検出することができる異なる蛍光タンパク質をコードするベクターでトランスフェクションすることができる。両細胞の共培養により、関心対象の遺伝子に対して選択的毒性を有する化合物についてのスクリーニングを促進することができる。本薬物スクリーニングは、癌発生を担う特定の遺伝子変化に対して標的化された治療薬の探索に広く適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の細胞および第二の細胞を含む細胞対であり、
ここで、第一の細胞および第二の細胞は、関心対象の遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子について以外は、同質遺伝子性であり；
ここで、第一の細胞は、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み；
ここで、第二の細胞は、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み；かつ、
ここで、第一および第二の吸収スペクトルは同一でないか；ならびに／または
第一および第二の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである、細胞対。
【請求項２】
第一および第二の吸収スペクトルが同一でなく、第一および第二の発光スペクトルが同一でない、請求項1記載の細胞対。
【請求項３】
細胞が区分けされていない同じ容器内に含まれる、請求項1記載の細胞対。
【請求項４】
第一の細胞が関心対象の遺伝子についてホモ接合性野生型であり、第二の細胞が関心対象の遺伝子についてホモ接合性変異体である、請求項1記載の細胞対。
【請求項５】
第二の細胞の関心対象の遺伝子がホモ接合的に欠失されている、請求項1記載の細胞対。
【請求項６】
第一の細胞が関心対象の遺伝子の2つの野生型アレルを含み、第二の細胞が関心対象の遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルを含み、変異型アレルが優性である、請求項1記載の細胞対。
【請求項７】
関心対象の遺伝子が癌遺伝子であり、第一の細胞が癌遺伝子の変異型アレルについてホモ接合性であり、第二の細胞が変異癌遺伝子のホモ接合性欠失を含む、請求項1記載の細胞対。
【請求項８】
第一の細胞が関心対象の遺伝子を発現し、第二の細胞が関心対象の遺伝子を発現しない、請求項1記載の細胞対。
【請求項９】
第一の細胞が関心対象の遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルを含み、第二の細胞が関心対象の遺伝子の野生型アレルについてヘミ接合性である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１０】
第一の細胞が関心対象の遺伝子によりコードされたタンパク質を発現し、第二の細胞が関心対象の遺伝子によりコードされたタンパク質を発現しない、請求項1記載の細胞対。
【請求項１１】
第一および第二の細胞が哺乳類細胞である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１２】
第一および第二の細胞がヒト細胞である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１３】
細胞が癌細胞である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１４】
癌細胞が結腸癌細胞および乳癌細胞からなる群より選択される、請求項13記載の細胞対。
【請求項１５】
細胞がHCT116細胞である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１６】
細胞がDLD-1細胞である、請求項1記載の細胞対。
【請求項１７】
第一および第二の蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、およびシアン蛍光タンパク質かからなる群より選択される、請求項1記載の細胞対。
【請求項１８】
関心対象の遺伝子がRasであり、第一の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/変異型であり、第二の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/ヌルである、請求項1記載の細胞対。
【請求項１９】
以下のものを含む細胞対：
Ras遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/変異型であり、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子を含む、第一の細胞；ならびに
Ras遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/ヌルであり、第一の吸収スペクトルと同一でない第二の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルと同一でない第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする第二の遺伝子を含む、第二の細胞、
ここで、第一および第二の細胞は、Ras遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子について以外は同質遺伝子性である。
【請求項２０】
第一の蛍光タンパク質が青色蛍光タンパク質であり、第二の蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質である、請求項19記載の細胞対。
【請求項２１】
以下の工程を含む、細胞対を作成する方法：
第一の細胞を遺伝子改変し、単独の関心対象の遺伝子について以外は第一の細胞と同質遺伝子性である第二の細胞を得る工程；
第一の細胞を、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子でトランスフェクションする工程；ならびに
第二の細胞を、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする第二の遺伝子でトランスフェクションする工程、
ここで、第一および第二の吸収スペクトルは同一でないか、ならびに／または第一および第二の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである。
【請求項２２】
第一および第二の吸収スペクトルが同一でなく、第一および第二の発光スペクトルが同一でない、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
第一および第二の細胞が哺乳類細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
第一および第二の細胞がヒト細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
ヒト細胞がヒト癌細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ヒト癌細胞が、結腸癌細胞および乳癌細胞からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
第一および第二の細胞がHCT116細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
第一および第二の細胞がDLD-1細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
第一の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/変異型であり、第二の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/ヌルである、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
以下の工程を含む、被験化合物を関心対象の遺伝子もしくはその発現産物またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとして同定する方法：
第一および第二の細胞を培養する工程であって、ここで第一および第二の細胞は、関心対象の遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子について以外は同質遺伝子性であり、ここで第一の細胞は、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子を含み、ここで第二の細胞は、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする第二の遺伝子を含み、ここで第一および第二の吸収スペクトルは同一でないか、ならびに／または、第一および第二の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである、工程；
第一および第二の細胞を被験化合物と接触する工程；ならびに
第一の細胞の増殖速度が、第二の細胞の増殖速度に関して変化した場合に、被験化合物を、関心対象の遺伝子もしくはその発現産物またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとして同定する工程。
【請求項３１】
第一および第二の細胞が共培養される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
同数の第一および第二の細胞が培養される、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
第一および第二の吸収スペクトルが同一でなく、第一および第二の発光スペクトルが同一でない、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
蛍光タンパク質が、増殖速度を評価するために蛍光顕微鏡を用いて検出される、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
蛍光タンパク質が、増殖速度を評価するためにハイスループット蛍光光度計を用いて検出される、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
第一の細胞が関心対象の遺伝子についてホモ接合性野生型であり、第二の細胞が関心対象の遺伝子についてホモ接合性変異体である、請求項30記載の方法。
【請求項３７】
第二の細胞の関心対象の遺伝子がホモ接合的に欠失されている、請求項30記載の方法。
【請求項３８】
第一の細胞が関心対象の遺伝子の2つの野生型アレルを含み、第二の細胞の関心対象の遺伝子が関心対象の遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルを含み、ここで変異型アレルが優性である、請求項30記載の方法。
【請求項３９】
第一の細胞が変異癌遺伝子についてホモ接合性であり、第二の細胞が変異癌遺伝子のホモ接合性欠失を含む、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
第一の細胞が関心対象の遺伝子を発現し、第二の細胞が関心対象の遺伝子を発現しない、請求項30記載の方法。
【請求項４１】
第一の細胞が関心対象の遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルを含み、第二の細胞が関心対象の遺伝子の野生型アレルについてヘミ接合性である、請求項30記載の方法。
【請求項４２】
第一の細胞が関心対象の遺伝子によりコードされた変異体タンパク質を発現し、第二の細胞が関心対象の遺伝子によりコードされたタンパク質を発現しない、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
第一および第二の細胞が哺乳類細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項４４】
第一および第二の細胞がヒト細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項４５】
細胞が癌細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項４６】
癌細胞が、結腸癌細胞および乳癌細胞からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
第一および第二の細胞がHCT116細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項４８】
第一および第二の細胞がDLD-1細胞である、請求項30記載の方法。
【請求項４９】
第一および第二の蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、およびシアン蛍光タンパク質からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項５０】
以下の工程を含む、被験化合物を、細胞のRas遺伝子、Rasタンパク質、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質へ選択的に影響を及ぼすものとして同定する方法：
被験化合物を、Ras遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子について以外は同質遺伝子性である、本質的に同数の第一および第二の細胞の共培養物と接触する工程であり、ここで第一の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/変異型であり、第一の細胞は第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子を含み、ならびにここで第二の細胞のRas遺伝子型がc-Ki-Ras野生型/mullであり、第二の細胞は第一の吸収スペクトルと同一でない第二の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルと同一でない第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする第二の遺伝子を含む、工程；ならびに
第一の細胞の増殖速度が、第二の細胞の増殖速度に関して変化した場合に、被験化合物を、Ras遺伝子、Rasタンパク質、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質へ選択的に影響を及ぼすものとして同定する工程。
【請求項５１】
第一の蛍光タンパク質が青色蛍光タンパク質であり、第二の蛍光タンパク質が黄色蛍光タンパク質である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
以下のものからなる群より選択される式を有する化合物を少なくとも90％含む、組成物：
2005511025.tif 000008
ならびに
2005511025.tif 000009
および
2005511025.tif 000010
の混合物。
【請求項５３】
以下のものからなる群より選択される式を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、および薬学的に適切な担体を含む、薬学的組成物：
2005511025.tif 000011
ならびに
2005511025.tif 000012
および
2005511025.tif 000013
の混合物。
【請求項５４】
以下の式を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ；および薬学的に適切な担体を含む、細胞毒性組成物：
2005511025.tif 000014
【請求項５５】
以下のものからなる群より選択される式を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの治療的有効量、および薬学的に適切な担体を、それを必要とする患者へ投与する工程を含む、癌を治療する方法：
2005511025.tif 000015
ならびに
2005511025.tif 000016
および
2005511025.tif 000017
の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国立衛生研究所(NIH)の助成金(CA43460、CA09243、およびCA62924)を用いて行われた。従って米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、治療薬のためのハイスループットスクリーニングアッセイの分野に関する。より詳細に述べると、本発明は、癌の創薬に関するスクリーニングアッセイの分野に関する。更には本発明は、癌を治療する化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去15年間にわたり、ヒトの癌の遺伝子的基礎に関する知識が爆発的に増加した。これにより、体内の腫瘍細胞と全ての正常細胞との間に存在する遺伝子的差異を標的とすることを目的とした新規治療法の開発に関する膨大な可能性が出てきた。しかし依然、この可能性は、例えば、STI571、c-abl/c-kitチロシンキナーゼインヒビター(Drukerら、N. Engl. J. Med.、344:1038-42(2001))、およびトラスツズマブ(trastuzumab)(Herceptin)、ヒト上皮増殖因子受容体-2(HER-2/neu)を阻害するヒト化されたモノクローナル抗体(Pegramら、Cancer Treat. Res.、103:57-75(2000))などの、過剰発現されたまたは調節不全とされた細胞性癌遺伝子を伴うごくわずかな腫瘍型において実現されているにすぎない。理想的な改善された治療法を実現するためには、これらのような遺伝子的変化を標的化する新規戦略が、どうしても必要である。
【０００４】
抗癌剤に関する組織培養細胞ベースのスクリーニングが、数十年使用されている。しかし、このような細胞ベースのスクリーニングに伴う根深い問題点は、対照細胞の性質にある。多くの化合物が、癌細胞に対し毒性があるが、しかしほとんどは全ての増殖している細胞に対しても毒性がある。一般的な腫瘍に代表される細胞型に対応する正常細胞は、通常、利用できないまたは腫瘍の場合と同等の増殖特性を示さない。これらおよび他の理由のために、薬物が腫瘍特異分子を標的化するかどうかを決定することは困難である。この問題点を克服するために多くの戦略が利用されている。例えば、米国国立癌研究所(NCI)は、独自の薬物感受性を特定の遺伝子変化と相関させる試みにおいて、60種の癌細胞株のパネルを使用し、「In Vitro Cell Line Screening Project」(IVCLSP)を創出した。しかしこの意欲的で有用な方法により達成された結果の解釈は、異なる個体に由来する癌の間の、数多くの大部分が特徴付けられていない体細胞性で遺伝性の遺伝子的差異により制限される。別の場合において、様々な癌遺伝子を高レベルで過剰発現する形質転換された細胞を使用する薬物スクリーンが使用される(Jenkinsら、Br. J. Cancer、68:856-61(1993)；Corbleyら、Int. J. Cancer、66:753-59(1996))。しかしこのような過剰発現は、形質転換された細胞の非生理学的特性に関連し得、かつ同じ遺伝子の内因性突然変異を伴うヒト腫瘍において発生する事象を必ずしも反映しない。形質転換された細胞株の復帰サブクローンを使用するスクリーンについてもこの後者の批判がある(Stratowaら、Anticancer Drug Des.、14:393-402(1999))。
【０００５】
当技術分野において、特定の遺伝子の規定された内因性の変化を伴う細胞を利用し、任意の遺伝子変化に対する選択性を有する被験化合物のハイスループットで費用対効果の良いスクリーニングを提供する薬物スクリーニング戦略が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明の1つの態様は、関心対象の遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外は同質遺伝子性である細胞対である。第一の細胞は、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第二の細胞は、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第一および第二の蛍光タンパク質の吸収スペクトルは同一でないか、ならびに／または第一および第二の蛍光タンパク質の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである。
【０００７】
本発明の第二の態様は、細胞のRas遺伝子型および蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外は同質遺伝子性である細胞対である。第一の細胞のRas遺伝子型は、c-Ki-Ras野生型/変異型であり、第一の吸収および第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第二の細胞のRas遺伝子型は、c-Ki-Ras野生型/ヌルであり、第二の吸収および第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第一および第二の吸収および発光スペクトルは同一でない。
【０００８】
別の本発明の態様は、単独の関心対象の遺伝子以外は同質遺伝子性である第二の細胞を得るために、第一の細胞を遺伝子改変することによる、細胞対を作成する方法である。次に第一の細胞は、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子でトランスフェクションされる。第二の細胞は、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクションされる。第一および第二の蛍光タンパク質の吸収スペクトルは同一でないか、ならびに／または第一および第二の蛍光タンパク質の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである。
【０００９】
更に別の本発明の態様は、関心対象の遺伝子、その発現産物、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとしての被験化合物を同定する方法である。この方法は、関心対象の遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外は同質遺伝子性である第一の細胞および第二の細胞を培養する工程を含む。第一の細胞は、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第二の細胞は、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。第一および第二の蛍光タンパク質の吸収スペクトルは同一でないか、ならびに／または第一および第二の蛍光タンパク質の発光スペクトルは同一でないかのいずれかである。第一および第二の細胞は、被験化合物と接触され、この被験化合物は、第一の細胞の増殖速度が第二の細胞に関して変化した場合、関心対象の遺伝子、その発現産物、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとして同定される。
【００１０】
本発明の更なる態様は、Ras遺伝子、Rasタンパク質、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとして被験化合物を同定する方法である。それらのRas遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子以外は同質遺伝子性である第一および第二の細胞は、被験化合物と接触される。第一の細胞のRas遺伝子型は、c-Ki-Ras野生型/変異型であり、第一の細胞は更に、第一の吸収スペクトルおよび第一の発光スペクトルを有する第一の蛍光タンパク質をコードする第一の遺伝子を含む。第二の細胞のRas遺伝子型は、c-Ki-Ras野生型/ヌルであり、第二の細胞は更に、第二の吸収スペクトルおよび第二の発光スペクトルを有する第二の蛍光タンパク質をコードする第二の遺伝子を含む。被験化合物は、第一の細胞の増殖速度が第二の細胞の増殖速度に関して変化した場合、Ras遺伝子、Rasタンパク質、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に選択的に影響を及ぼすものとして同定される。
【００１１】
別の本発明の態様は、下記式を有するシチジンアナログ：
2005511025.tif 000002
もしくは
2005511025.tif 000003
またはそれらの混合物を少なくとも90％含む、組成物である。
【００１２】
更に別の本発明の態様は、下記式を有する化合物：
2005511025.tif 000004
もしくは
2005511025.tif 000005
またはそれらの混合物、および薬学的に適切な担体を含む、薬学的組成物である。
【００１３】
より別の本発明の態様は、トリフェニルテトラゾリウム(TPT)および薬学的に適切な担体を含む細胞毒性組成物である。
【００１４】
更に別の本発明の態様は、下記式を有する化合物：
2005511025.tif 000006
もしくは
2005511025.tif 000007
またはそれらの混合物の治療的有効量、および薬学的に適切な担体を、それらを必要とする患者へ投与する工程を含む、癌を治療する方法である。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の態様は、当技術分野に、創薬のための治療的化合物のハイスループットスクリーニングのためのツールおよび方法を提供する。加えて、本発明の態様は、当技術分野に、癌治療のための化合物を提供する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の発見は、関心対象の遺伝子以外は同質遺伝子性である細胞は、その遺伝子、その発現産物、またはその経路の下流の遺伝子もしくはタンパク質に特異的に影響を及ぼす化合物の同定に特に有用であることである。特定の遺伝子型を特異的に標的とする物質の開発は、より有効でより毒性の少ない治療薬へとつながりうる。
【００１７】
本発明は、特定の遺伝子の規定された内因性変化を有するヒト癌細胞を活用する薬物スクリーンを提供する。このような細胞において1つの遺伝子を変化させることにより、その親とはこの単独の遺伝子のみが異なる同質遺伝子性クローンを作出することができる。このように、任意の遺伝子変化に対する選択的毒性をもつ化合物を直接スクリーンすることができる。本発明はまた、親細胞および標的化された細胞の共培養を含み、従って各薬物アッセイの正確な内部校正および迅速なスループット(約12,000化合物／週)を可能にする、スクリーニング戦略も提供する。
【００１８】
本発明の戦略は、2つの構成要素を含む(図1参照)。第一の構成要素は、2つの細胞の一方において変化された単独の遺伝子が異なる、対にした細胞の使用である。第二の構成要素は、これらの細胞の各々において異なる蛍光タンパク質をコードし、従って示差的検出ができるように細胞を個別に印付けしている、遺伝子を含む。その後これらの細胞を共培養または個別に培養し、それらの増殖速度を蛍光分光法を用いて追跡する。
【００１９】
本発明は、通常使用されている薬物スクリーニング技術に勝るいくつかの重要な利点を提供する。比較される2つの細胞は、共培養され同時にアッセイされるので、個別のコンパートメントにおいて維持されている細胞対をスクリーニングする場合に遭遇する様々な誤りが排除される。第二に、細胞増殖パターンを経時的に追跡することができ、早い時点を各ウェルについての内部対照として利用し、試料横断的な細胞数の変動に加え、ある薬物の固有の蛍光について、標準化することができる。最後に、操作した蛍光タンパク質を含むアッセイは、ルシフェラーゼのような追加試薬またはピペッティング工程が増殖の分析に必要ないため、費用効果が高い(Kain、Drug Discov. Today、4:304-12(1999))。
【００２０】
特定の遺伝子の規定された内因性変化をもつヒト癌細胞を活用する薬物スクリーニング戦略は、多くの利点を有する。単独の突然変異遺伝子がその親とは異なる同質遺伝子性クローンを利用し、任意の遺伝子変化に対して選択的毒性をもつ化合物を直接スクリーニングすることができる。本明細書に説明されたスクリーニング手法は、基本的機構的研究を超えて体細胞性ノックアウトの有用性を広げ、特定の遺伝子に対して標的化されたリード化合物およびそれらが制御する経路を理論的に発見する手段を提供するであろう。
【００２１】
本明細書において使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、特に文脈において明確に指摘されない限り、複数の意味を含むという点について、注意されなければならない。従って、例えば、「細胞（a cell）」との言及は、複数のそのような細胞を含む。
【００２２】
関心対象の単独の遺伝子が異なる同質遺伝子性細胞
本明細書において使用される用語「同質遺伝子性」は、細胞自身の内因性ゲノムを意味する。培養において維持され得るあらゆる種類の哺乳類細胞は、トランスフェクションされ、特定の遺伝子変化を伴う細胞を作出するために使用されうる。これらの細胞は、初代細胞、例えば線維芽細胞、筋芽細胞、白血球、肝細胞、内皮細胞、および樹状細胞などに加え、細胞株(例えば、NCI-BL2126、Hs578Bst、HCC1954 BL、Hs 574.Sk、Hs888Lu、これらはアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209から入手可能)を含むが、これらに限定されるものではない。確立された腫瘍細胞株、例えば、HT29、SW480、HCT116、DLD1、MCF-7、HL-60、HeLa細胞S3、K562、MOLT-4、バーキットリンパ腫Raji、A549、G361、M12、M24、M101、SK-MEL、U-87 MG、U-118 MG、CCF-STTG1、またはSW1088を使用することができる。好ましい細胞は、ヒト細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞、より好ましくはヒト結腸癌細胞およびヒト乳癌細胞を含む。
【００２３】
本発明の目的のためには、遺伝子の正常な全数を持つ細胞は、「野生型」である。少なくとも1個の内因性遺伝子の任意の変化は、変異体と考えられる。特定の遺伝子の規定された内因性変化を使用することができる。網羅型のリストではないが、遺伝子産物中の単独のアミノ酸の置換、遺伝子産物中の少なくとも1個のアミノ酸の欠失、遺伝子発現のレベルは、低下もしくは増加されるか、または遺伝子は全く発現されないことがあるので、関心対象の遺伝子は2つの細胞の間で変動しうる。好ましくは、この遺伝子変化は、マウスのモデルシステムにおいて細胞に腫瘍原性を与えるものである。好ましくは、本発明の方法で使用される野生型細胞および変異型細胞の対は、同じ細胞型である(すなわち、同じ型の組織および臓器を起源とする)。より好ましくは、これらの2つの細胞は、関心対象の単独の遺伝子以外は、同質遺伝子性である。
【００２４】
特定の遺伝子の規定された変化を伴う細胞を作出するための、当技術分野において公知の任意の手段を使用することができる。例えば、相同的組換えを用い、その親細胞と単独の突然変異遺伝子のみが異なる同質遺伝子性クローンを作成することができる(Capecchi、Science、244:1288-92(1989))。
【００２５】
細胞対は、細胞培養皿またはフラスコ、マルチウェル細胞培養プレート、液体窒素容器、冷凍保存箱、冷凍庫、冷蔵庫、組織培養用クリーンベンチ、または分析装置を含むが、これらに限定されるものではないような、単独の容器、または区分けされた容器内に存在させることができる。
【００２６】
蛍光タンパク質を含む細胞
前述の同質遺伝子性細胞は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。蛍光技術で検出することが可能である全てのタンパク質が企図され、タンパク質の吸光および発光スペクトルを変化するように改変されている緑色蛍光タンパク質の変異体のような公知の蛍光タンパク質のバリアントを含む (例えば、Prasherら、Gene、111:229-33(1992)；Chalfie、Photochem. Photobiol.、62:651-6(1995)；MiteliおよびSpector、Nature Biotechnol、15:961(1997)；Heimら、Nature、373:663-4(1995)；Cubittら、Trends Biochem.、20:448-55(1995)参照のこと)。適当な蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質(吸収395nm／発光509nm)、黄色蛍光タンパク質(吸収530nm／発光590nm)、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質(吸収433nm／発光475nm)および青色蛍光タンパク質(吸収390nm／発光510nm)を含む(Clonetech Living Colors(登録商標)、ユーザーマニュアル、2000年8月)。
【００２７】
遺伝子は、ゲノム、またはより好ましくは発現ベクターに組込むことができる。蛍光分光法による検出が可能なタンパク質をコードするいずれかの発現ベクターが企図される。有用な蛍光タンパク質ベクターは、pGFPtpz-cmvおよびpGFPsph-cmv(Packard Instrument社)に加え、pGFP、pEGFP、pEBFP、pEYFP、pECFPおよびpd2EGFP(Clonetech Laboratories社)を含むが、これらに限定されるものではない。発現ベクターは更に、抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを含むように改変することができる。好ましくは、単独のトランスフェクションの後代が、均一な蛍光タンパク質発現を示す。
【００２８】
適当な発現ベクターは、所定の細胞型において、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む。当業者に周知の方法を用い、蛍光タンパク質をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築することができる。このような技術は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、1989、およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、NY、1989に記されている。
【００２９】
利用されるベクターシステムおよび宿主に応じて、構成および誘導プロモーターを含む、任意の数の適当な転写および翻訳要素を使用することができる。哺乳類細胞システムにおいて、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。多くのウイルスベースの発現システムを使用し、蛍光タンパク質を哺乳類宿主細胞において発現することができる。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、蛍光タンパク質をコードする配列は、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列を含む、アデノウイルス転写／翻訳複合体に連結することができる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域の挿入を用い、感染細胞において蛍光タンパク質を発現することが可能である生存可能なウイルスを得ることができる(LoganおよびShenk、Proc. Natl. Acad. Sci.、81:3655-3659(1984))。望ましいならば、Rous肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを使用し、哺乳類細胞における発現を増強することができる。
【００３０】
当技術分野において公知の、細胞を発現ベクターでトランスフェクションする任意の手段を使用することができる。これらの方法は、トランスフェリン-ポリカチオン媒介型DNA導入、裸のまたは被膜に包まれた核酸による導入、リポソーム媒介型細胞融合、DNA被覆したラテックスビーズの細胞内取込み、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、およびリン酸カルシウム媒介型トランスフェクションを含むが、これらに限定されるものではない。蛍光タンパク質をコードするDNA配列の宿主細胞DNAへの組込みは、宿主細胞DNAと相同な、従ってこれと組換わるようなこれらのDNA配列の3'または5'末端にヌクレオチドを提供することにより促進することができる。各DNA配列の1種または複数のコピーは、望ましいように、細胞のゲノムに組込むことができる。
【００３１】
当技術分野において公知の蛍光タンパク質を検出する任意の方法が企図されている。この検出法は、定量的であることは必要とはされていないが、定量的であってよい。蛍光タンパク質は、フローサイトメトリーおよび蛍光定量アッセイにより検出することができる。好ましくは、蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡またはハイスループット蛍光分光法を用いて検出される。より好ましくは、細胞の相対増殖は、蛍光分光法を用い実時間で追跡される。
【００３２】
細胞培養
細胞は、共培養するかまたは個別に培養することができる。細胞が共培養される場合、各細胞は、異なる蛍光タンパク質を含むことが好ましい。検出を促進するために、蛍光タンパク質は、選択された検出法においてタンパク質が識別可能であるようにする吸収および／または発光スペクトルを有さなければならない。蛍光タンパク質を選択的に励起するか、または蛍光タンパク質の発光を選択的に検出するかのいずれかが可能でなければならない。蛍光タンパク質は、同一でない吸収スペクトルもしくは同一でない発光スペクトルのいずれかまたはその両方を有さなければならない。好ましくは、蛍光タンパク質は、重複しない吸収または発光スペクトルのいずれかを有する。より好ましくは、蛍光タンパク質は、重複しない吸収および発光スペクトルを有する。
【００３３】
被験化合物スクリーニング法
関心対象の遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子について以外は同質遺伝子性である細胞は、被験化合物の関心対象の遺伝子に特異的に影響を及ぼす能力に関するスクリーニングに使用することができる。これらの細胞は、被験化合物に接触され、これらの細胞の増殖速度が、被験化合物との接触前および被験化合物との接触後の両方で、モニタリングされる。第二の細胞に対して第一の細胞の増殖速度を変化させる被験化合物は、関心対象の遺伝子に選択的に影響を及ぼすものとして同定される。
【００３４】
被験化合物は、当技術分野において既に公知である薬理学的物質であることができ、あるいはいずれの薬理学的活性も有することがこれまで不明の化合物であることができる。これらの化合物は、天然に生じるかまたは実験室でデザインされることができる。これらは、微生物、動物、または植物から単離されることができ、組換えにより作出されるか、または当技術分野において公知の化学的方法により合成され得る。望ましいならば、被験化合物は、当技術分野において公知の多くのコンビナトリアルライブラリー法のいずれかを用いて得ることができ、これは生物学的ライブラリー、空間的にアドレス付け可能なパラレル固相または液相ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「1ビーズ 1化合物」ライブラリー法、ならびにアフィニティークロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含むが、これらに限定されるものではない。生物学的ライブラリー手法は、典型的にはポリペプチドライブラリーに使用されるが、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーへのその他の4種の手法が適用可能である。Lam、Anticancer Drug Des.、12:145(1997)参照のこと。
【００３５】
被験化合物は、癌原性突然変異を含む、規定された公知の遺伝子変化を有する細胞の増殖を遅延する能力についてスクリーニングすることができる。より詳細に述べると、関心対象の遺伝子以外は同質遺伝子性である細胞は、被験化合物と接触することができ、細胞の相対的増殖速度が決定される。関心対象の遺伝子の発現に選択的に影響を及ぼすものとして被験化合物を同定するために、細胞対を、適当な細胞増殖培地および適当な増殖容器を用い、個別に培養または単独の容器で共培養することができる。好ましくは、細胞は、各薬物アッセイの正確な内部校正を可能にする、個別のプレートにおいて維持される細胞対をスクリーニングする場合に遭遇する誤差を排除するために、共培養される。「本質的に同数」とは、文字通りに等しい(すなわち、第一および第二の細胞の各々が10)ことと、ほぼ等しい(すなわち、第一の細胞が1および第二が10、第一の細胞が1および第二が5、第一の細胞が1および第二が2、もしくは第一の細胞が1および第二が1.5)こととを意味し、試料中に存在する第一および第二の細胞数の差異が10倍未満またはこれと等しいように制約されることと定義される。細胞の相対増殖速度が決定され得るように、各種類の細胞の相対量を知ることが必要である。
【００３６】
同質遺伝子性細胞は、細胞を被験化合物に接触する前に、ベースライン増殖速度を得るための期間、増殖させてモニタリングすることができる。細胞の増殖速度は、定性的または定量的に決定することができる。細胞増殖は、当技術分野において公知のいずれかの手段によりモニタリングすることができる。好ましくは、細胞は、蛍光分光的技術を用いモニタリングされる。より好ましくは、細胞は共培養され、示差的に検出されうる蛍光タンパク質は、細胞増殖データを得るために、同時にモニタリングされる。細胞増殖曲線を作成する任意の手段が企図される。
【００３７】
前述のように、増殖は、当技術分野において公知である蛍光技術のいずれかを用い、モニタリングすることができる。被験化合物は、適当な担体または溶媒中において供給され、当技術分野において公知のいずれかの手段により、細胞培養物に添加することができる。適当な溶媒は、水性溶媒およびDMSOを含むが、これらに限定されるものではない。次に細胞対の各細胞の増殖速度が、被験化合物の存在下でモニタリングされる。使用される被験化合物の濃度は、化合物およびアッセイ条件に応じて広範に変動するであろう。
【００３８】
関心対象の遺伝子型を有する第一の細胞の増殖速度が、関心対象の遺伝子型を有さない第二の細胞に対して減少する場合に、被験化合物を、関心対象の遺伝子型を有する細胞に選択的に影響を及ぼすものとして同定することができる。好ましくは、被験化合物は、少なくとも25、50、75、85、90、95、または100％の、第一および第二の細胞の間の増殖速度の示差的変化を生じる。より好ましくは、被験化合物は、反応がNCIにより確立された将来性のあるリード化合物についての標準の判定基準を上回るように、癌原性突然変異を有する細胞において、細胞増殖を阻害することが可能である(Geranら、Cancer Chemother. Rep.、3:1-103(1972))。
【００３９】
多数の被験化合物を迅速にスクリーニングすることができるように、ハイスループットスクリーニングを用いて、多くの個別の被験化合物をパラレルに試験することができる。最も広範に確立された技術は、96ウェルマイクロタイタープレートを使用する。マイクロタイタープレートのウェルは、典型的には、50〜500μlの範囲のアッセイ容量が必要である。これらのプレートに加え、多くの装置、材料、ピペッター、ロボット方式、プレート洗浄機、およびプレートリーダーが、96ウェルフォーマットに合わせて市販されている。他のフォーマットを、都合良く使用することができる。
【００４０】
薬学的組成物
本発明は更に、薬学的組成物を提供する。1つは、Aldrich Chemical社(ミルウォーキー、WI)から購入することができるトリフェニルテトラゾリウム(TPT)(図2a)である。もう1つは、不飽和糖鎖部分を有するシチジン誘導体である(またはスルフィニルシチジン誘導体「SC-D」)(図2b)。SC-Dは、当技術分野において企図され実施例3に説明されたいずれかの方法により合成することができる。図2に示されたTPTおよびSC-D化合物には、それらの立体異性体、その薬学的に許容される塩、それらの互変異性体、およびそれらのプロドラッグが含まれる。
【００４１】
化合物の立体異性体は、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ混合物およびそれらの組合わせを含むことができるが、これらに限定されるものではない。このような立体異性体は、通常の技術を用い、エナンチオマー出発材料を反応するか、または本発明の化合物の異性体を分離するかのいずれかにより、調製および分離することができる。異性体は、幾何異性体を含んでも良い。幾何異性体の例は、二重結合を挟むトランス異性体またはシス異性体を含むが、これらに限定されるものではない。別の異性体が、本発明の化合物に企図される。これらの異性体は、説明された化合物の純粋な形または他の異性体との混合型のいずれかで使用することができる。
【００４２】
本発明の化合物の薬学的に許容できる塩は、アルカリ金属塩を形成するまたは遊離酸もしくは遊離塩基の付加塩を形成するために通常使用される塩を含む。この塩の性質は、薬学的に許容できる限りは、重要ではない。
【００４３】
経口用途のための薬学的製剤は、活性化合物の、固形賦形剤との組合わせを通じて得ることができ、選択的に、得られた混合物を粉砕し、顆粒状混合物を加工し、望ましいならば、適当な佐剤の添加後、錠剤または糖衣錠コアを得る。適当な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖質；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの、セルロース；アラビアガムおよびトラガカントガムを含む、ガム類；ならびに、ゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質がある。望ましいならば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩、例としてアルギン酸ナトリウムなどの、崩壊剤または可溶化剤を添加することができる。
【００４４】
糖衣錠コアは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー液、および適当な有機溶媒もしくは溶媒混合物も含有しうる濃縮糖溶液のような、適当なコーティングと共に使用することができる。染料または色素を、製品識別または活性化合物の量、すなわち用量の特徴付けのために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
【００４５】
経口使用することができる薬学的製剤は、ゼラチンで製造されたプッシュフィット型カプセル剤に加え、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングで製造した密封軟カプセル剤を含む。プッシュフィット型カプセル剤は、乳糖またはデンプンのような充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、および選択的に安定剤と混合された、活性成分を含むことができる。軟カプセル剤において、活性化合物は、安定剤を伴いまたは伴わずに、油脂、液体、または液体ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁することができる。
【００４６】
非経口投与に適した薬学的製剤は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理的に緩衝された生理食塩水のような、生理的に適合可能な緩衝液中に処方することができる。水性注射用懸濁剤は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁剤として調製することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような油脂、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーも送達に使用することができる。選択的に、この懸濁剤は、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、適当な安定剤または化合物の溶解度を上昇する物質を含有することもできる。局所的または鼻腔内投与のためには、透過すべき特定の障壁に適した浸透剤を、製剤中に使用することができる。このような浸透剤は、一般に当技術分野において公知である。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、懸濁化、乳化、カプセル封入、捕捉、または凍結乾燥プロセスによるような、当技術分野において公知の手法で、製造することができる。この薬学的組成物は、塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されるものではない多くの酸と共に形成することができる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒中で、対応する遊離塩基型よりも、より可溶性となる傾向がある。
【００４８】
処方および投与の技術に関する更なる詳細は、例えば、Hoover, John E.、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing社、イーストン、PA、1975；Libermanら編集、「Pharmaceutical Dosage Forms」、Marcel Decker社、ニューヨーク、NY、1980；および、Kibbeら編集、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(第3版)、American Pharmaceutical Association社、ワシントン、1999；「U.S. Pharamacopeia」(第21版-USP XXI)National Formulary(16版-XVI)、United States Pharmacopeial Convention社、ロックビル、MD、1985、およびその改訂版；ならびに、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第16版、Arthur Osol、Editor and Chairman of the Editorial Board、Mack Publishing社、イーストン、PA、1980、およびその改訂版において考察されている。
【００４９】
本発明のSC-D化合物は、癌を治療するために使用することができ、いずれか適当な経路により、意図された治療にとって治療有効量で投与しうる。例えば活性化合物および組成物は、経口、舌下、鼻腔内、経肺、経粘膜、非経口、血管内、腹腔内、皮下、筋肉内または局所的に投与することができる。治療有効量の決定は、十分当業者の能力内である。治療有効量は、症状を軽減、腫瘍サイズを縮小、細胞増殖速度を低下、または転移を防止するのに十分な量である。
【００５０】
いずれの化合物に関しても、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイ、または通常マウス、ウサギ、イヌもしくはブタである、動物モデルのいずれかで推定することができる。この動物モデルは、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することもできる。このような情報は、その後ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用される。
【００５１】
治療効力および毒性、例えば、ED50(集団の50％の治療有効量)およびLD50(集団の50％の致死量)を、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手法により決定することができる。毒性作用の治療作用に対する用量比は治療指数であり、これは比LD50／ED50で表わすことができる。
【００５２】
大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒト用途のための用量範囲を処方する際に使用される。このような組成物に含有される用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないED50を含む循環血濃度の範囲内である。この用量は、使用される用量形態、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【００５３】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連した要因を考慮し、臨床技術者により決定されるであろう。用量および投与は、活性成分の十分なレベルを提供するか、または望ましい作用を維持するように調節される。考慮されうる要因は、病態の重症度、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、併用薬、反応感受性、ならびに治療への耐性／反応性を含む。特定の用量および送達法の指針は、文献において提供されており、当技術分野の臨床技術者に一般的に利用可能である。
【００５４】
前述の態様のいずれかにおいて、本発明の薬学的組成物はいずれも、他の適当な治療薬と併用して投与することができる。併用療法において使用するための適当な物質の選択は、通常の薬学的原理に従い、当業者により行うことができる。
【００５５】
前述の治療法のいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、のような哺乳類、および最も好ましくはヒトを含む、そのような治療を必要とする任意の対象へ適用することができる。
【００５６】
TPTは、癌の治療に使用することができ、意図された治療についていずれか適当な経路および治療有効量で投与することができる。活性化合物および組成物は、SC-Dに関して前述したいずれかの手段により投与することができる。治療有効量の決定はまた、SC-Dについて考察されたように実現することができる。治療有効量は、症状を軽減、腫瘍サイズを縮小、癌細胞増殖速度を低下、または転移を予防するのに十分な量である。
【００５７】
本発明は、本発明の実行において現時点で好ましい様式を含む具体例に関して説明されているが、当業者は、特許請求の範囲において言及されたような本発明の精神および範囲内である、前述のシステムおよび技術の多くの変形および互換があることを理解するであろう。
【００５８】
実施例1−DLD-1およびKO結腸癌細胞株における薬物スクリーニング
本発明の薬物スクリーニング戦略は、変異体c-Ki-Rasアレルが、標的化された相同的組込みにより欠失されたDLD-1細胞を用いて実行された(Shirasawaら、Science、260:85-8(1993))。緑色蛍光タンパク質プラスミドベクター、pGFPtpz-cmv(黄色蛍光タンパク質、YFP)およびpGFPsph-cmv(青色蛍光タンパク質、BFP)は、Packard Instrument社(メリディアン、CT)から購入した。これらのベクターは更に、プラスミドpCMVzeo(Invitrogen社、カールスパッド、CA)から得たゼオシン遺伝子を挿入することにより、哺乳類細胞における薬物選択のために改変した。同質遺伝子性細胞株DLD-1(Ki-Ras野生型/K-RasG12D Mut)およびDKS-8(Ki-Ras野生型/Null)は、豊富にS. Shirasawa、T. Sasaukiおよびその同僚により提供された(Shirasawaら、Science、260:85-8(1993))。DLD-1中のBFPベクターおよびDKS-8(本明細書においてKOと称する)中のYFPベクターの安定した発現を有するクローンを、ゼオシン選択(0.5mg/ml)下で限定希釈することにより単離した。各細胞株の単独のクローンを、明るく均一な蛍光タンパク質発現を基にした薬物スクリーニングのために選択した。
【００５９】
29,440種の多様な小分子のコレクションを、Chembridge社(DiverSetライブラリー)(サンディエゴ、CA)またはNational Cancer Institutes Developmental Therapeutic Program(ベセスタ、MD)のいずれかから得た。全てのライブラリーは、細胞を容易に導入するために、96ウェルプレート中にフォーマットされたDMSO溶液として提供された。p38ストレスキナーゼインヒビターSB203580は、Promega社(マジソン、WI)から得た。トリフェニルテトラゾリウム(TPT)は、Aldrich Chemical社(ミルウォーキー、WI)から購入した。SC-Dは、実施例3に説明されたように合成した。
【００６０】
蛍光細胞株は、トリプシン処理により収集し、10％FCS(Hyclone、ローガン、UT)を補充したDMEM培地中に22,000細胞/ml(DLD-1)および18,000細胞/ml(KO)を含有する混合物として共に再懸濁した。合計200μl中のおよそ8000個の細胞を、薬物スクリーニングのための96ウェルプレートの各ウェル中に分注した。列1の各ウェルには、バックグラウンド蛍光を計算するための対照として細胞を含まない増殖培地200mlを含ませた。プレートは、加湿したインキュベーター内で、37℃、5％CO2で一晩インキュベーションした。翌日、薬物を含有する培地50μlを、列2〜11の各ウェルに添加した。列12の各ウェルを非薬物対照とし、列1と共に、薬物＋DMSOを伴わない培地50μlを入れた。従って、1枚のプレートにおいて合計80種の薬物を試験した。最終薬物濃度は、Chembridgeライブラリーについて2μg/ml、およびNCIから得た化合物について2μMであった。薬物添加後と、6日間それぞれ翌日とに、プレートを蛍光定量に供し、各細胞株に関する増殖曲線を決定した。DLD-1およびKO細胞は、それらの各蛍光タンパク質の重複しない吸収および発光の特徴により、独立して識別することができた(BFP：吸収390nm／発光510nm；YFP：吸収530nm／発光590nm)。各日の読み値からの蛍光データは、特注したプログラム(Drugmobile)に転送し、96ウェルプレートの各ウェルにおける各細胞株の増殖曲線をプロットした。非薬物対照の平均と比較して標準偏差が＜2であったDLD-1増殖曲線を有するウェルを、「ヒット」としてスコア化した。この様式でヒットをスコア化することは、DLD-1細胞に対して選択的毒性を有する化合物に加え、DLD-1およびKO両細胞を阻害したものも含んだ。
【００６１】
1回目のスクリーンのヒットについて、2回目のスクリーンを、典型的には30ng/ml〜4μg/mlに及ぶ薬物濃度範囲を使用した以外は、前述のように行った。2回目のスクリーンにおいてDLD-1細胞対KO細胞について少なくとも2倍の選択性が認められた化合物は、次に、これら2つの細胞型の他のクローンについて、更には蛍光タンパク質を発現しないクローンに対して、再試験した。GFP改変しなかった細胞株を用いるアッセイは、共培養したものではなく個別に播種した細胞を用いて行った。プレートは、MTTアッセイを用いるかまたはDNA結合色素PicoGreen(Molecular Probes社、ユージーン、OR)を用いるかのいずれかにより、細胞数を評価するために、各日収集した。MTTアッセイは、製造業者の指示に従い実施した(Trevigen社、ゲティスバーグ、MD)。PicoGreenアッセイは、96ウェルプレート中の細胞を200μl H2O中に溶解し、粉砕し、その後10μlアリコートを各ウェルから、TrisEDTA(TE)緩衝液中に0.5容量％に希釈した190mlのPigoGreen溶液(# P-7581)へ移すことにより行った。
【００６２】
このスクリーンを実行するために、等しい数のDLD-1およびKO細胞を混合し、96ウェルプレートに低希釈で分配した。2つの細胞型の増殖は、蛍光顕微鏡(図3)またはハイスループット蛍光分光法(図4aおよび4b)により容易に識別された。添加薬物が存在しない場合、両方の細胞型は、指数関数的かつ同等に増殖した(図4aおよび4b)。細胞は、播種後約7日間追跡することができ、この時点で培養物は集密となった。合計29,440種の多様な化学化合物の小分子ライブラリーを、このスクリーンにおいて用いた。各化合物は、1回目のスクリーンにおいて濃度2μg/ml(Chembridgeライブラリー)または2μM(NCIライブラリー)で試験した。この濃度でのほとんどの化合物(27,757)は、いずれの細胞型の増殖にも影響を及ぼさなかった(代表的プレートは、図4a参照)。1,683種の化合物(5.7％)は、増殖阻害活性を示した。例えばウェル#R6C4(図4b)のような、いくつかの候補は、DLD-1細胞対KO細胞について選択的毒性を示した。しかし、例えばウェル#R7C4(図4b)のように、ほとんどの化合物はこの単独の薬物濃度では、両方の細胞株について同等に毒性である。低用量で選択的に活性となりうる更なる化合物を同定するために、全ての1683種の化合物を、薬物濃度範囲を用いる2回目のスクリーンに採用した。
【００６３】
183種の化合物は、1回目および2回目のスクリーンから、2倍またはそれよりも大きい選択性を有することが示された。これらの候補には、数回の追加スクリーンを施した。最初に各化合物を再試験し、最初の結果を確認した。第二に、再現性のある陽性化合物を、異なる濃度で試験し、2つの株について示差的毒性が観察される最適濃度を決定した。第三に、これらの化合物を、これら2つの細胞型の他のクローン、更には蛍光タンパク質を発現しないクローンについて試験し、示差的毒性が、クローンの可変性または最初のスクリーンにおいて試験されたクローンに導入された蛍光タンパク質もしくは薬物耐性遺伝子の混乱を引き起こす作用の結果でないことを確認した。
【００６４】
このスクリーニング手法を使用し、本発明者らは、興味深い4種の化合物を同定した。これらの2つは、ウォルトマニンアナログ(デメトキシビリジン)およびミスラマイシンであり、これらは先にRAS経路の下流の構成要素を阻害することが示されており(Cardenasら、Trends Biotechnol.、16:427-31(1998)；Campbellら、Am. J. Med. Sci.、307:167-72(1994))、これによりスクリーニング法を確認した。2つの更なる化合物、TPTおよびSC-D(図2参照)は、新規抗増殖活性を有し、更に評価した。
【００６５】
図4の蛍光顕微鏡像は、これら2種の化合物による変異体c-Ki-Rasを含むDLD-1細胞の増殖の阻害を図示している。このアッセイにおいて使用した薬物濃度では、変異体c-Ki-Ras遺伝子が破壊されているDLD-1由来物において、増殖阻害は観察されなかった(図3)。詳細な濃度および時間経過の実験により、TPTのDLD-1およびKOに対するIC50は、各々、約2μg/mlおよび約12μg/mlであるのに対し、SC-DのDLD-1およびKO細胞に対するIC50は、各々、125ng/mlおよび約750ng/mlであることが示された(図5)。結果的に、両化合物は、変異体c-Ki-RAS細胞株(DLD-1)の増殖阻害に関しておよそ6倍の選択性を示した。
【００６６】
TPTに関する抗増殖活性は、これまで示されていない。TPTのようなテトラゾール化合物は、通常、生存細胞において細胞のデヒドロゲナーゼにより還元されて色の付いたホルマザン色素となる組織学的試薬として使用される(Adegboyegaら、Arch. Pathol. Lab. Med.、121:1063-68(1997)、Oteroら、Cytotechnology、6:137-42(1991))。しかし、本アッセイにおいて使用された濃度のTPTを用いては、細胞の明らかな染色は認められなかった。興味深いことに、いくつかの他のトリフェニル化合物が、構造相同性検索において本発明者らのライブラリーにおいて認められたが、いずれも変異体RAS含有株に対する選択性は示さなかった(図6)。先に同定されたp38マイトジェン活性化キナーゼインヒビター(SB203580)(Cuendaら、FEBS Lett.、364:229-33(1995)、Livertonら、J. Med. Chem.、42:2180-90(1999))も、TPTとの構造類似性が注目された(図6)。しかしSB203580も、変異体RAS細胞株に対する選択性を示さず(図6)、TPTは、インビトロキナーゼアッセイを使用し、p38またはSB203580により阻害されることが知られている他のキナーゼ(c-Raf-1およびc-Junキナーゼ)の再現的阻害はほとんどまたは全く示さなかった(データ示さず)。従って、キナーゼがTPTの細胞標的を示すかどうかは不明である。
【００６７】
SC-DおよびTPTの選択的毒性の基礎となる機構は不明である。これまで、抗新生物性化合物の実際の標的を決定することは困難であり、癌に対するそれらの選択性の理由は、非常に曖昧である(Gibbs、Science、287:1969-73(2000))。薬物特異性の現在のモデルは、細胞周期パラメータ、アポトーシスの受け易さ、およびチェックポイント制御における差異に頼っている。本発明者らは、これらの薬物が変異体c-Ki-Ras遺伝子により引き金を引かれる何らかの下流の事象を標的とすると考えるので、本発明者らのスクリーンのデザインにより今後の機構研究が可能になったと考える。
【００６８】
実施例2−マウスモデルにおけるSC-Dのインビボ投与
多様な種類の正常細胞に対する毒性を腫瘍のそれと比較することが可能であるため、SC-Dのインビボ投与を行い、癌に関する特異性を試験した。両方ともc-Ki-Ras遺伝子において単独のG13D点突然変異を有している、2種類の結腸癌細胞株HCT116およびDLD-1を、SC-Dインビボ活性を試験するためにヌードマウスにおいて異種移植片として増殖させた(図7)。雌のヌードマウスで年齢4〜6週のものに、DLD-1またはHCT-116結腸癌細胞(5x106細胞)を用い、異種移植片を皮下移植した。明らかな腫瘍が細胞を注射後3〜6日間で確立し、その時点で、薬物治療を開始した。薬物は、総容量400μl(リン酸緩衝生理食塩水)で腹腔内注射により毎日投与した。異種移植片は、キャリパーを用いて2日毎に測定し(長軸および短軸)、腫瘍容積を下記式により算出した：長さx幅2x0.5。腫瘍容積は、対照群および治療群について、各データ点の平均腫瘍容積(T)を平均開始時腫瘍容積(S)で除算し、プロットした。DLD-1腫瘍は、20日間SC-Dで腹腔内治療したマウスにおいて、対照未治療マウスよりも、およそ45％小さかった。HCT-116腫瘍増殖は、同期間SC-Dで治療した動物において、およそ65％阻害された(スチューデントt-検定；P＜0.05)。これらの反応は、NCIにより確立された将来性のあるリード化合物の標準の判定基準を超えている(Geranら、Cancer Chemother. Rep.、3:1-103(1972))。
【００６９】
実施例3−SC-D合成
SC-Dは、下記のように合成した：5'-ジメトキシトリチルシチジン(2.72g, 5mM)を、真空下で24時間乾燥し、無水テトロヒドロフラン(THF)(100ml)に溶解し、100℃に冷却した。無水THF(10ml)中の新たに蒸留した塩化チオニル(365ml, 5mM)を、30分間かけて攪拌しながら滴下した。この反応混合物を、室温に温め、室温で更に24時間攪拌した。分離した固形物を濾過し、無水THF(4x25ml)で十分に洗浄した。この固形物を、真空下で24時間乾燥し、粗生成物を、溶離液としてクロロホルムおよびメタノール(9:1)を用い、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけた。親化合物スルフィニルシチジンは、非常に不安定であることがわかり、従って極少量で存在した。主要な分解産物を含有する画分(Rf＝0.47、クロロホルムおよびメタノール(75:25)現像システムを用いたシリカTLCプレート上)を合わせ、真空下で濃縮した。こうして得た生成物を、水で2回結晶化し、真空下で24時間乾燥し、SC-Dを得た。質量分析を基に、SC-Dは、不飽和糖鎖部分を有するデオキシシチジンアナログを示した(図2b)。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】分光学的に識別される緑色蛍光タンパク質(GFP)バリアントで改変された共培養された同質遺伝子性細胞を使用する、薬物スクリーニング形式の概略である。変異体c-Ki-RASアレル＋野生型(wt)c-Ki-RASアレルを収容するDLD-1細胞は、530nm(YFP)で励起されるGFPバリアントを安定して発現するように改変した。変異体c-Ki-RASアレルのみを欠失している同質遺伝子性クローン(KO)(Adegboyegaら、Arch. Pathol. Lab. Med.、121:1063-68(1997))を、390nm(BFP)で励起されるGFPバリアントを発現するように改変した。これらの細胞を混合し、96ウェルプレートに低密度で播種した。一晩インキュベーションし細胞を接着させた後、被験化合物を、培養培地50μlに、最終濃度2μg/mlとなるように添加した。プレートは、蛍光プレートリーダーを用い、6日間毎日アッセイし、プレートのウェル毎における、各細胞株の増殖曲線を得た。
【図２】SC-D(a)およびTPT(b)の構造である。
【図３】2種の被験化合物による、KO細胞と共培養されたDLD-1細胞の選択的増殖阻害を示す、蛍光顕微鏡像である。左側パネル＝青色光を用いて励起したDLD-1細胞(NikonフィルターUV-2A)；右側パネル＝黄色光を用いて励起したKO細胞(Omega OpticalフィルターXF104)。上側パネルは、細胞播種後6日目の、未処理の対照を示す。下側パネルは、薬物存在下で播種後6日目の細胞を示す。
【図４ａ】DLD-1/KO薬物スクリーンからの一次データを示す代表的96ウェルプレートである。列1＝培養培地のバックグラウンド蛍光を減算するための細胞なし対照；列12＝薬物なし対照(青色線＝DLD-1；赤色線＝KO)。合計80の化合物／プレートを、列2〜11で試験した。増殖阻害を引き起こした化合物の視覚化を促進するために、薬物なし対照(列12)の平均を、96ウェルプレートの各ウインドウにプロットした。各グラフのx軸は、薬物添加後の時間(0〜150時間)を示す。△=KO細胞、薬物なし；▲=KO細胞+薬物；◇=DLD-1細胞、薬物なし；◆=DLD-1細胞+薬物。
【図４ｂ】ウェル#R6C4(図4aの行6、列4)は、DLD-1への選択的毒性を有する化合物を示す。ウェル#R7C4は、DLD-1およびKO細胞両方への毒性作用を有する化合物を示す。大部分のウェル、例えばR6C5およびR7C5は、細胞増殖に対して、対照と比べ、識別し得る作用を持たない化合物を含む。各グラフのx軸は、薬物添加後の時間(0〜150時間)を示す。△=KO細胞、薬物なし；▲=KO細胞+薬物；◇=DLD-1細胞、薬物なし；◆=DLD-1細胞+薬物。
【図５】漸増濃度の被験化合物SC-DおよびTPTに曝露された共培養したDLD-1およびKO細胞の増殖曲線を示す。増殖曲線は、390ex／508em(DLD-1)および530ex／590em(KO)での蛍光から得た。各グラフのx軸は、薬物添加後の日数を示す。
【図６】TPTに対して構造相同性を有する化合物の構造／活性比(SAR)である。増殖阻害アッセイは、親(非GFP改変)細胞株を用いて行った。細胞は、96ウェルプレートへ低密度で個別に播種し、5日間、被験薬物濃度範囲に曝露した。その後細胞をH2O中で溶解し、溶解液を、dsDNA結合色素(PicoGreen)を用い、相対細胞数についてアッセイした。
【図７】SC-Dの腫瘍異種移植片への作用を示す。図7Aは、SC-D(300mg/kg)で処置した、結腸癌HCT116を示す。図7Bは、SC-D(150mg/kg)で処置した、結腸癌DLD-1を示す。相対腫瘍容積＝平均腫瘍容積(T)／平均開始時腫瘍容積(S)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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