(57)【要約】本発明は、細胞外マトリックスの組成、形成または分解に関連するそれらの遺伝子または遺伝子産物に影響することによってウロテンシンII受容体の活性を変更する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックスの構造、形成または分解に関与する遺伝子または遺伝子産物の活性または量に影響を与えるよう、ウロテンシンII受容体の活性を変更する化合物を同定する方法であって、
ａ）ウロテンシンII受容体が形成される細胞を準備し、
ｂ）化学的化合物を準備し、
ｃ）ａ）からの細胞をｂ）からの化学的化合物と接触させ、
ｄ）その後、ｃ）からの細胞由来の細胞外マトリックスの構造、形成または分解に関与する遺伝子またはその遺伝子産物の活性または量を定量し、
ｅ）ｄ）からの活性または量を、ｂ）からの化合物と接触したことがない相当する対照細胞からの同じ遺伝子または遺伝子産物の活性または量と比較する、
ことからなる上記方法。
【請求項２】
準備する細胞が哺乳動物の細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
準備する細胞がヒト細胞である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
準備する細胞が心臓細胞または線維芽細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
準備する化合物が分子量100〜50000kDaを有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
分子量が100〜5000kDaである請求項５記載の方法。
【請求項７】
化合物が天然の生成物、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖含有化合物または脂肪含有化合物である請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
化合物がウロテンシンIIである請求項７記載の方法。
【請求項９】
Col 1、MMP2、TGFβ1およびCTGFの群からの少なくとも１種の遺伝子がｄ）において選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｄ）またはｅ）における定量が定量的PCRによって行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｄ）またはｅ）における定量が酵素のターンオーバーによって行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｄ）またはｅ）における定量が抗体を用いて行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を処方するために必要とされる他の物質からなる、冠状循環の疾患を処置するための医薬。
【請求項１４】
化合物の分子量が100〜50000kDaである請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
分子量が100〜5000kDaである請求項１４記載の医薬。
【請求項１６】
化合物が天然の生成物、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖含有化合物または脂肪含有化合物である請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１７】
化合物がウロテンシンIIである請求項１６記載の医薬。
【請求項１８】
冠状循環の疾患を処置するための医薬を製造する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項１９】
化合物の分子量が100〜50000kDaである請求項１６記載の化合物の使用。
【請求項２０】
化合物の分子量が100〜5000kDaである請求項１６または１７記載の化合物の使用。
【請求項２１】
化合物が天然の生成物、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖含有化合物または脂肪含有化合物である請求項１７または１８に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
化合物がウロテンシンIIである請求項１９記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウロテンシンII受容体の活性を変更し、それにより冠状循環系における老化作用に影響を与える化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウロテンシンII（UII）は、血管に作用するペプチドである。それは、血管のタイプおよび考慮する種に依存して、血管拡張もしくは血管収縮作用を生じる。多くの点で、その活性はアンギオテンシンII（AII）の活性に匹敵する。ウロテンシンIIならびにその受容体GPR14は、ヒト冠状循環系、たとえば内皮細胞、冠状動脈の平滑筋細胞、心筋もしくは冠状アテロームにおいて発現する。したがって、細胞レベルで心脈管系の組織における、および結果として病態生理学的過程における重要な役割は、当該両因子に帰せられる。ウロテンシンIIはGPR14の天然のリガンドとして知られている。GPR14はGPCR（Ｇ−蛋白結合受容体）グループのメンバーである。
【０００３】
麻酔したサルに行った実験におけるウロテンシンIIの使用は、血液動態のパラメーターに劇的な変化を招来した。末梢抵抗の増大は、心収縮力の脆弱化および心拍出量の低下とともに、冠状循環系の虚脱を招来した。これに匹敵する事象がヒトでも生じる。
【０００４】
Ｇ−蛋白結合受容体（GPCR）は、きわめて多様な生理学的過程において中心的な役割を果たしている。ヒトゲノムにおける約1000の遺伝子がこのファミリーの受容体をコードしていると推定されている。現在利用されている医薬のおよそ40〜50％は、処方で得られるものに限っても、GPCRのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。これは、薬理学的研究を実施している業界にとっての、このクラスの受容体の重要な役割を強調するものである。このタンパク質ファミリーのサイズおよび重要性から、また多くのGPCRに対する生理学的リガンドがまだ知られていない（オーファンGPCR）という事実に鑑み、このクラスの受容体が将来、新規な医薬の研究をする場合に適切な標的タンパク質に関する最も重要な貯蔵庫の一つになると考えられるはずである。
【０００５】
GPCRは細胞の表面上に位置する内在性膜タンパク質のファミリーを構成する。それらは細胞外シグナリング物質（たとえば、ホルモン、神経伝達物質、ペプチドおよびリピド）からのシグナルを受け、これらのシグナルを、Ｇ蛋白と命名されたグアニンヌクレオチド−結合タンパク質のファミリーによって細胞の内部に伝達する。そうすることでそれらは、受容体の特異性、活性化されるＧ蛋白および細胞のタイプに依存して様々なシグナル伝達経路を活性化する。
【０００６】
すべてのGPCRのポリペプチド鎖は細胞膜のリン脂質二重層をまたぐ７つのαヘリックスに折りたたまれる。膜の７回の転移が細胞外および細胞内のループを発生させ、これが細胞外へのリガンドの結合および細胞内におけるＧ蛋白に対するカップリングを可能にする。この理由によりGPCRは７回膜貫通受容体とも呼ばれる。
【０００７】
すべてのＧ蛋白結合受容体は共通の基本的なパターンによって機能する。すなわち、細胞外リガンドの結合は受容体タンパク質のコンフォーメーションにおける変化を招来し、その際に後者がＧ蛋白と接触することを可能にする。細胞内におけるＧ蛋白仲介シグナル伝達カスケードが最終的に、細胞に、生物学的応答を産生させる。
【０００８】
Ｇ蛋白はヘテロトリマーのタンパク質であり、サブユニットα、βおよびγから構成される。リピドアンカーにより、細胞膜の内側に配置される。Ｇ蛋白への活性化されたGPCRのカップリングはGαサブユニット上でのGDP／GTP交換、およびヘテロダイマーのαサブユニットおよびβγサブユニットへの解離をもたらす。活性化されたαサブユニットおよびβγ複合体はいずれも細胞内のエフェクタータンパク質に影響することができる。
【０００９】
膜に存在するアデニル酸シクラーゼ（AC）の、Gαs型Ｇ蛋白による活性化は、たとえばcAMPの細胞内レベルの上昇を招来するが、一方Gαi型のＧ蛋白による活性化はこのレベルに低下をもたらす。Cq型のＧ蛋白はホスホリパーゼC（PLC）を活性化し、これはイノシトール1,4,5−トリホスフェート（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）の形成を触媒する。これらの分子は続いて細胞内貯蔵部からのCa2+の放出またはプロテインキナーゼＣ（PKC）の活性化および、いずれの場合も更なる効果を招来する。上述のＧ蛋白型（Gαi/s, Gq）に加えて、なお更なるタイプが存在し、これらのタイプはG16、G12／13等と命名されている。これらのＧ蛋白の多重性はGPCRの有するきわめて多様な多くの機能を反映する。
【００１０】
マウスのウロテンシンII受容体はWO 00/75 168に開示されている。GPR14に対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法は同様にたとえばWO 99/40 192に開示されている。
【００１１】
スクリーニング方法に関する先行技術において、ウロテンシンII受容体が細胞外マトリックスの合成、構造または分解に関与する遺伝子または遺伝子産物である化合物を見出すために特異的に使用できるという事実を考慮したことはこれまでにまだなかった。その結果、結合組織における増加を伴う疾患に抵抗する物質を、医薬的な観点から十分効果的に研究することは不可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、細胞外マトリックスの構造、形成または分解に関与する遺伝子または遺伝子産物の活性または量に影響を与えるよう、ウロテンシンII受容体の活性を変更する化合物を、
ａ）ウロテンシンII受容体が形成される細胞を利用し、
ｂ）化学的化合物を利用し、
ｃ）ａ）からの細胞をｂ）からの化学的化合物と接触させ、
ｄ）ｃ）からの細胞由来の遺伝子またはその遺伝子産物（この遺伝子または遺伝子産物は細胞外マトリックスの構造、形成または分解に関与する）の活性または量を定量し、
ｅ）ｄ）からの活性または量を、ｂ）からの化合物と接触したことがない相当する対照細胞からの同じ遺伝子または遺伝子産物の活性または量と比較すること、
により同定する方法に関する。
【００１３】
利用でき、およびその中でウロテンシンIIが形成される細胞は好ましくは哺乳動物細胞たとえばマウス、ラット、モルモットまたはハムスターの細胞である。利用できるとくに好ましい細胞はヒト細胞である。とくに好ましい実施態様においては、この細胞は心臓の細胞である。
【００１４】
この方法に利用される化学的化合物は、好ましくは分子量100〜50000kDa、とくに好ましくは100〜5000kDaである。
この方法に利用されるこの性質の化学的化合物は、好ましくは天然産物、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖含有化合物または脂肪含有化合物である。さらにこの化合物はウロテンシンIIであることが好ましい。
【００１５】
その活性または量が測定される本発明の方法における遺伝子またはその相当する遺伝子産物は、好ましくはCol 1（コラーゲン１型）、MMP2（メタロプロテイナーゼ２型）、TGFβ（トランスフォーミング増殖因子β）またはCTGF（結合組織増殖因子）に関する遺伝子または遺伝子産物である。
【００１６】
本発明による方法の遺伝子または遺伝子産物の活性または量は、好ましくは、酵素的ターンオーバーによりまたは抗体を使用して、定量的PCRで測定される。
【００１７】
また本発明は、前述の本発明の方法によって同定された化合物からなる医薬に関する。この医薬はさらに医薬を処方するために要求される物質を含む。この医薬は冠状循環系の疾患を処置するために使用される。
【００１８】
好ましい実施態様においては、この医薬の化合物は100〜50000kDaの分子量を有する。この化合物の分子量は、とくに好ましくは、100〜5000kDaの範囲である。この化合物は、好ましくは天然の産物、タンパク質、ポリヌクレオチド、糖含有化合物または油脂含有化合物である。この化合物は、さらに好ましくは、ウロテンシンIIである。
【００１９】
本発明はさらに、冠状循環系の疾患を処置する医薬を製造するために、前述のような本発明の方法によって同定された化合物の使用に関する。この関連で、冠状循環系の疾患はたとえば、心筋梗塞、冠状血管疾患、血管における病的変化たとえば動脈硬化、または狭心症である。細胞外マトリックスの形成に関連する冠状循環系の疾患には、この形成が病的に変化する可能性がある場合とくに包含される。
【００２０】
この化合物を使用する好ましい実施態様では、化合物は、分子量100〜50000kDaであり、とくに好ましい実施態様においては分子量100〜5000kDaを有する。
【００２１】
ウロテンシンII受容体の活性の変更は、この受容体によって仲介されるシグナル伝達が誘導、増大、中断または弱められることを意味する。ウロテンシンII受容体の活性はとくに、ウロテンシンIIのアゴニストまたはアンタゴニストにより変更される。しかしながら、ウロテンシンII受容体の変更はアロステリックモデュレーターと呼ばれる物質によっても行われる。ウロテンシンIIのアゴニストは、特定の細胞に自然に起こるウロテンシンIIの作用を支持、維持または増大させる化合物であるが、一方、アンタゴニストはこの作用を、弱めるかまたは消失させる。ウロテンシンII受容体のアロステリックモデュレーターは、それ自体、受容体に対し低い親和性を有するのみであるが、アゴニストまたはアンタゴニストの作用を増強または阻害する化合物である。遺伝子または遺伝子産物の活性または量は、特定の細胞に関連する遺伝子または遺伝子産物の活性または量が対照に比べて増大または低減する場合に影響される。対照はしたがって、この活性または量に対する影響を招来する測定に付されない同等の細胞から構成される。これに関連して、測定はとくに、細胞と化合物の接触をもたらすものと理解される。上述の意味における細胞は脊椎動物の臓器または組織の１またはそれ以上の細胞を意味する。このような細胞は、脳、肺、筋肉、脂肪組織、結合組織もしくは心臓、または他の臓器に由来する。細胞は単離された状態で、またはまだ組織の形態で存在することができる。これらの細胞にはまた、とくに細胞培養液からの細胞も包含される。脊椎動物の例には、ラット、マウス、ハムスター、モルモットおよびヒトも包含される。
【００２２】
ウロテンシンIIはポリペプチドである。ヒトにおいては11個のアミノ酸からなる。ウロテンシンIIはきわめて有効な血管収縮ホルモンとして作用する。霊長類においては全身性の血管収縮、心筋の収縮性機能不全および総循環虚脱がもたらされる。ウロテンシンIIの効果はGPC受容体GPR14によって仲介される。GPR14についての配列が開示されている。たとえば国際特許出願WO 00/75 168にはマウスGPR14の配列が開示されている。ヒト組換えウロテンシンII受容体はたとえば「Euroscreen」から市販されている。
【００２３】
細胞外マトリックス（ECM）は組織の構造的同一性の維持に中心的な役割を果たしている。ECMは組織構造または個体細胞を取り囲んでいる。ECMはコラーゲン、非コラーゲン性糖タンパク質およびプロテオグリカンから構成される。その組成は様々な組織で変動する。ECMは高度に特異化された、複雑でダイナミックなネットワークを形成する。その支持機能に加えて、それはとくにシグナル伝達、細胞の分化、接着、再生および遊走に関与する。さらに、ECMは組織の線維化に重要な役割を果たしていて、これは結合組織への浸潤の増大を意味するものとして理解すべきである。これはたとえば、心筋梗塞後の心臓における傷害に続く瘢痕に関連して、または肺の線維性変化、または有機溶媒もしくは過剰な持続性アルコール摂取による肝臓の中毒後における線維性変化に関連して起こる。また、臓器はとくに、老化作用の進行として、一時的事象の結果または過剰なストレスの結果として、この線維化により冒される。細胞外マトリックスの形成における欠陥である機能はとくに線維化に重要な役割を果たす。線維化は、創傷の治癒過程に生じる極度に強力な瘢痕形成を伴う。心臓、腎臓、肝臓、肺、眼または皮膚のような臓器が冒される。線維化はコラーゲンの形成の増大および冒された臓器における機能の喪失を特徴とする。
【００２４】
コラーゲン、たとえばＩ型コラーゲンもしくはIV型コラーゲン、ラミニン、および他のタンパク質がECMの合成に関与する。メタロプロテイナーゼグループ、セリンプロテイナーゼグループまたはシステインプロテイナーゼグループに属するとして考慮されるべきプロテイナーゼがECMの分解に役割を果たしている。
【００２５】
メタロプロテイナーゼは特徴的な機能性ドメインを有する。シグナル配列、プロドメイン、触媒ドメインおよびＣ−末端ヘモペキシン様ドメインは、様々なファミリーのメンバーで保存されている。MMP2およびMMP9は付加的なフィブロネクチン様ドメインを含有する。MMP2はまた、ゼラチナーゼＡとしても知られている。コラーゲンＩ、II、IV、Ｖ、VII、Ｘ、XIおよびXIV、エラスチン、フィブロネクチン、ゼラチンおよびラミニンはMMP2の基質である。TGFβシグナル経路およびCTGFの活性化は、細胞外マトリックスタンパク質たとえばＩ型コラーゲンの遺伝子を活性化する鍵となる過程である。したがってCTGFは線維形成誘導性サイトカインとも呼ばれる。
【００２６】
細胞の準備はその調製、培養および更なる処理からなる。準備は、たとえば臓器もしくは組織からの適当な細胞材料の調製または適当な細胞系もしくは微生物の増殖によって行われる。様々な栄養培地が培養のために使用できる。細胞はその生物に至適な温度に維持される。適宜、防腐剤、抗生物質、pH指示薬、血液血清構成成分、血清、補助物質または他の物質が、使用される特定の増殖培地に添加される。調製、培養および更なる処理の方法は標準的な研究に記載されている（たとえば、Basic Cell Culture; Ed. J. M. Davis; IRL Press, 1994）。
【００２７】
適当な細胞である哺乳動物の細胞が優先して使用される。これらの細胞は、一次細胞または細胞系とすることができる。このような細胞の例には、哺乳動物臓器（たとえば、脳、筋肉、脂肪組織、結合組織、心臓、肺、肝臓、腎臓、血管、ホルモン腺等）由来の一次細胞である。細胞には神経細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、白血球、肺細胞、肝臓細胞、腎臓細胞または他のタイプの細胞とすることができる。適当な細胞系は、好ましくは、CHO、HEK 293、COS、マウス3T3もしくはhera細胞または他のタイプの細胞である。酵母細胞を使用できる可能性もある。
【００２８】
化学的化合物はとくに、化学合成または生物学的な材料からの化学的物質の単離により利用される。生物学的材料には生存または非生存細胞が含有されるか、またはこれらの細胞から構成される。
【００２９】
化学的な化合物の合成、または生物学的細胞から物質の単離のためには、当業者は定常的な方法によることができる。当業者はこれらの方法をたとえば“Organic Synthesis Workbook”, 1995, John Wiley & Sons, ISBN 3-527-30187-9、“The Organic Chemistry of Drug Synthesis”, 1998, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-24510-0 または“Bioactive Compounds from Natural Sources”, 2000, Taylor & Francis, ISBN 07-7484-0890-8のような参考書から利用できる。合成または単離によって得られた化合物は適当な溶媒中に溶液とすることができる。適当な溶媒には水、緩衝物質（たとえば、Tris, Hepes, Mops等）、１価および／または２価イオン（たとえば、Ｋ+、Na+、Mg2+、Ca2+等）、酸（たとえば、塩酸、硫酸、ギ酸、酢酸等）、苛性アルカリ（たとえば、NaOH等）、アルコール（たとえば、メタノール、エタノールおよびグリセロール）、界面活性剤（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム等）、有機溶媒（たとえば、ホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド等）および他の構成成分とくに可溶化または安定化のための成分が包含される。本発明の方法による化学的化合物はGPCRのリガンドとしての使用に適当でなければならない。
【００３０】
この性質の化合物はとくに、脊椎動物の組織または臓器たとえば内皮細胞組織、心臓組織、脳組織、血液、血清または血漿から得られる。
【００３１】
化学的化合物を上記細胞系と接触させるためには、当業者により、実験室からの定常的な方法が使用される。接触させるためには、たとえばエルレンマイヤーフラスコ、試験管もしくはエッペンドルフ管中またはマイクロタイタープレート上で行われる。接触には、一定の温度たとえば30℃または37℃、および均一なCO2条件または大気の湿度条件にセットできる恒温インキュベーターを使用することができる。接触はとくに、この目的のために設計された装置、実験室ロボットで行われる。接触は数秒から数分、数時間まで延長されて様々な期間、行うことが可能である。それぞれの場合に選択される条件は、受容体、細胞系および化学的化合物に依存する。
【００３２】
遺伝子またはその遺伝子産物の活性または量は、そのプロモーターを考慮した遺伝子の活性、形成されるRNAおよびmRNAの量、ならびにその遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性または量を意味する。
【００３３】
細胞中のmRNAの量を決定するためには、様々な方法、たとえばPCRまたはハイブリダイゼーション法が使用できる。当業者によって利用されるPCR法は、様々な供給業者から市販されているリアルタイムPCRシステムがある。これらの供給業者の例には、Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Cortett Research, Roche Molecular BiochemicalsおよびStratageneがある。リアルタイムPCRシステムは当業者に常用されるツールに属する。RNAの量を決定するための適当なハイブリダイゼーション法の例はドットブロットハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションである。いずれの方法も、一方の鎖は支持体表面に固定され、他方は比較的容易に検出できる放射性または他の性質の標識を有する可動性の鎖である２つの別個の１本鎖から、塩基対形成によりもたらされる二本鎖核酸分子の形成を使用する。当業者は、ハイブリダイゼーション技術に精通し、それらを標準的なマニュアルたとえば、とくに「Current Protocols in Molecular Biology」 Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Keven Struhl編, John Wiley & Sons, Inc, New York, 2001に見出すことができる。
【００３４】
タンパク質の活性または量はその酵素活性により、または特異的な抗体を使用して決定することができる。酵素活性の場合は、その基質に関する特定の酵素のターンオーバーが定量される。これには、pH、補因子、イオン環境、温度および基質濃度に関する酵素の至適活性条件を確認するアッセイのセットアップが包含され、ターンオーバーに比例する範囲内での測定が可能になる。基質ターンオーバーは、たとえば高分子に放射標識された前駆体を組み込むか、または放射標識された高分子を分解生成物に分解し、ついで分解生成物を分離し、そしてそれぞれの放射能の量を測定することにより決定することができる。タンパク質量の決定に抗体を使用する場合には、当業者によりサザンハイブリダイゼーション、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（固相酵素免疫測定法）等の方法が使用される。当業者はまた、これらの検出法を実施するための、詳細な実際的説明を、前述の「Current Protocols in Molecular Biology」に見出すことができる。
【００３５】
医薬においては、化合物は好ましくは耐容性のある賦形剤と医薬組成物を形成して存在させる。賦形剤はもちろん、それが組成物中の他の構成成分と適合性を示し、患者の健康に有害ではないという意味で十分な耐容性を有さなければならない。賦形剤は固体もしくは液体またはそれらの両者でもよく、好ましくは化合物と単一用量として、0.05〜95重量％の活性化合物を含むことができる、たとえば錠剤として処方される。
【００３６】
本発明による医薬組成物は任意の既知の、主として構成成分を医薬的に耐容性のある担体物質および／または補助物質と混合することからなる医薬製造方法により製造することができる。本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、局所、口内（たとえば舌下）および非経口的（皮下、筋肉内、経皮または静脈内）投与に適した組成物である。
【００３７】
所望の生物学的効果を達成するために要求される化合物の量は、多くの因子、たとえば選択された特定の化合物、意図される使用、投与形式および患者の臨床状態に依存する。以下に記載される量的なデータはリガンドに関するものである。
【００３８】
一般に１日用量は、0.3mg〜100mg（通常、３mg〜50mg）／日および／kg、たとえば３〜10mg／kg／日である。静脈注射の用量は、たとえば0.3mg〜1.0mg／kgの範囲であり、この用量は10ng〜100ng／kg／分の輸液として適切に投与することができる。これらの目的のための適当な輸液溶液は、たとえば0.1ng〜10mg、通常は１ng〜10mg／mLを含有することができる。単一用量はたとえば、活性化合物１mg〜10ｇを含有することができる。したがって、注射用アンプルはたとえば１mg〜100mgを含有し、一方経口的に投与される単一用量処方は、たとえば錠剤またはカプセルとして、たとえば1.0〜1000mg、通常は10〜600mgを含有することができる。
【００３９】
略号
ＡＩＩ          アンギオテンシンII
Ｃｏｌｌ        コラーゲナーゼＩ
Ｃｏｎ          対照
ＭＭＰ２        マトリックスメタロプロテイナーゼII
ＵＩＩ          ウロテンシンII
【実施例１】
【００４０】
ヒト心臓からの線維芽細胞の単離および培養
線維芽細胞をCell and Tissue Research 286, 145-153 (1996) に記載のようにヒト心臓から単離した。得られた細胞培養物の96〜98％は線維芽細胞からなる。
この操作を実施する目的では、心臓組織を小片に切断し、３回、コラーゲナーゼ２mg／mLおよびジスパーゼ２mg／mLを含有するKHB（Krebs Henseleit緩衝液）中37℃で20分間インキュベートした。ホモジネートを混合し、ついで遠心分離した。沈殿を10mLのKHBに採取した。コーティングしていないプラスチック容器に、各場合２〜３mLに分けて細胞を添加した。4.5mgのグルコース／Ｌおよび10％FCS（ウシ胎児血清）を含有するDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）で10mLとした。37℃で１時間インキュベートしたのち、細胞をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、ついで37℃および５％CO2で、90％コンフルエンスに達するまで、約４〜８週間培養した。各場合４週間、さらに２回継代した。本実験に使用した細胞は第二の継代後に、70〜90％コンフルエンスで使用した（単離後約３ヶ月）。
【実施例２】
【００４１】
ヒト心臓からの線維芽細胞のアンギオテンシンIIおよびウロテンシンIIによる刺激
細胞培養法を実行するための試薬はGibco BRL Life Technologiesから入手した。細胞はまず、4000mg／Ｌのグルコース、２mMのＬ−グルタミン、100μg／0.1mgのペニシリン／ストレプトマイシン／mLおよび0.1％のBSA（ウシ血清アルブミン）を含有する無血清のDMEM中37℃に維持したのち、アンギオテンシンIIまたはウロテンシンIIを加え、各場合最終濃度を0.1μMとした。ついでRNAを６時間後にその細胞から調製した。
【実施例３】
【００４２】
特異的RNAを定量するためのリアルタイムPCRの使用
塩化グアニジウムを用いる標準方法によりRNAを単離した。
逆転写酵素（10単位／ng RNA）を用いて各サンプルからのRNA500ngをDNAに転写した。DNAを分解するためには、約８〜10μgのRNAを含有する全容量をDAアーゼＩとインキュベートした。RNAはRoche Molecular Biochemicalsにより供給されるLightCyclerおよびFast Start SYBR Green RT−PCRキットを用いて定量した。他の会社の相当するキットたとえばApplied Biosystems, Bio−RadまたはStratageneも同じ目的に適当である。配列番号１および２に相当するプライマーはColＩのプライマーとして使用され、一方、配列番号３および４に相当するプライマーはMMP2のプライマーとして使用され、配列番号５および６に相当するプライマーは対照としてのGAPDHのプライマーとして使用され、配列番号７および８に相当するプライマーはTGFβのプライマーとして使用され、配列番号９および10に相当するプライマーはCTGFのプライマーとして使用された。反応はまず10分間95℃で一定に保持した。ついで、各サイクルは95℃に10秒、60℃に５秒および72℃に12秒のインキュベーションからなる40サイクルに付した。融解曲線は反応の特異性を確認するために使用した。定量は対照としてGAPDH mRNAを用いて補正した。
【実施例４】
【００４３】
心臓線維芽細胞における基底膜の合成に関与する遺伝子の誘導
線維芽細胞は３例のヒト心臓から単離され、最初の継代に使用された。細胞を約80％のコンフルエンスまで培養し、さらに24時間血清なしで保持し、１μMのウロテンシンII, １μMのアンギオテンシンIIまたは対照としての緩衝物質で６時間刺激し、各場合二重にアッセイした。mRNA（コラーゲン１、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、TGFβ1およびCTGF）は、LightCycler（登録商標）を用いるリアルタイムPCRによって定量した。GAPDH（グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）mRNAを標準対照として使用した。リアルタイムPCR（リアルタイムでのポリメラーゼ連鎖反応）は定量的な特異的核酸の測定を可能にした。この技術は、逆転写RNAのポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた蛍光染料の使用に基づくものである。アッセイキットには現在、様々な供給者がある。たとえばこのシステムは、Applied Biosystems, Bio-Rad, Cepheid, Carbett Research, Roche Molecular BiochemicalsまたはStratageneからの市販品を入手できる。
【００４４】
ウロテンシンIIによる刺激はコラーゲンＩ、MMP2、TGFβ1およびCTGFのmRNAの有意な上昇を招いた。
2005500042.tif 000002
【００４５】
これらのRNAの形成は、マトリックス合成ならびに血管および心臓における組織リモデリングのためのウロテンシンIIおよびその受容体のきわめて大きな重要性を証明するものである。したがって、相当するアゴニストおよびアンタゴニストは、心臓、とくに心臓発作後の冒された領域における再構築に関し、心臓組織の瘢痕形成を回避、予防または修正する目的で、そしてまたとくに高血圧またはうつ血性肺疾患に関連して、大きな医薬的価値がある。アンギオテンシンIIはレニン−アンギオテンシン系における主要なエフェクター分子である。このペプチドホルモンは様々な生理学的効果をもたらす。すなわちアンギオテンシンIIは末梢抵抗性における変化に関与する。それは腎臓機能に対して効果を発揮し、とくにナトリウムの再吸収を調節する。これに加えて、それは増殖因子として作用する。
【実施例５】
【００４６】
ヒト心臓線維芽細胞においてコラーゲン合成を誘導するためのウロテンシンの使用
ヒト心臓線維芽細胞は、拡張型心筋症による心不全の末期段階における７例の外植片ヒト心臓から単離した。また、４例の細胞プレパレーションは、健康なドナーから入手した。線維芽細胞は滅菌した10cmのペトリ皿に単離し、前述のように培養した。約12週間培養し、細胞はコンフルエンス約80％の第二継代に到達した。このステージで血清を48時間除き、この細胞をその後、UII、Ang II、TNFα、TGFβ、UII＋TNFα（各場合10-7mol／L）または緩衝液（対照）により様々な間隔（６〜24時間）で刺激した。定量は二重または三重に実施した。刺激後、細胞を洗浄し、ペトリ皿から１mLのPBSで除去し、エッペンドルフ管中で遠心分離した（100 rpm, ５分, ４℃）。上清は捨てた。100μLの分解緩衝液（Nonidet P40, 0.5％, SDS 0.5％）を約50μLの細胞に加え、混合物を氷上でさらに20分間インキュベートした。分解物をもう一度遠心分離し（20分, 1400rpm, ４℃）、上清を以後の実験に使用した。タンパク質をBCA（ビシンコニン酸）アッセイによって定量した。ホモジネートをタンパク質濃度２μg／μLに希釈した。すべての心臓からの線維芽細胞中のプロコラーゲンＩ型Ｃ−ペプチドを、市販品を入手できる固相ELISAアッセイ（TaKaRa Biomedicals, Shuzo Co, Ltd）を用いて96−ウエルマイクロタイタープレート上で定量した。アッセイは製造業者の指示に従って実施した。これを実施した場合、ヒトフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩ型またはコラーゲンIII型との交叉反応性は観察されなかった。プロコラーゲンＩ型Ｃ−ペプチドに対する値は、10〜640ng／mLの標準曲線を用いて定量した。標準は製造業者によって与えられた。対照（緩衝液）で得られた刺激についての吸収値を100％にセットした。刺激した細胞の吸収値は同じ心臓で得られた対照の値と関連づけた。各場合、二重または三重の定量からの平均値を計算に使用した。対照細胞および心不全細胞における刺激応答の比較を統計的に評価するために、両側の対応のないｔ検定を用いた。
【００４７】
心不全に冒されている心臓からの外植片心臓線維芽細胞においては、UII（対照の173＋/−42％）、AngII（205＋/−67％）およびTGFβ（202＋/−52％）による刺激後、プロコラーゲンＩタンパク質は増加し、程度は低いがTNFαでも（139＋/−26％）の上昇がみられる（表１)。この増加は時間依存性であったが、６時間後には既に観察された。これに反し同じペプチド：UII（対照の98％）、AngII（88％）、TGFβ（97％）およびTNFα（86％）で刺激されたドナーの心臓線維芽細胞では、コラーゲンタンパク質の量は変化しなかった。
【００４８】
対照の心臓における細胞と心不全に冒されている心臓からの細胞の間にみられる差は、UIIおよびTNFαで刺激後統計的に有意であった。同様の傾向がAngIIおよびTGFβを用いた場合にも観察された。
【００４９】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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