(57)【要約】本発明は、重篤かつ早発型クローン病（ＣＤ）に関与している遺伝標識形質を用いて、炎症性腸疾患を診断する方法を提供する。また本発明は、有機陽イオンカルニチンの輸送能力を有意に減じる、ＯＣＴＮ１遺伝子におけるコード配列変異を提供する。また本発明は、ＯＣＴＮ２遺伝子のプロモーター領域における変異（基本転写、及びヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導される転写のいずれをもダウンレギュレートする変異）も提供する。この転写の差は、どうやらヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）結合部位の破壊に原因があるらしい。これら２つの変異を組み合わせたハプロタイプは、クローン病（ＣＤ）患者に見出される。また、これら変異は、炎症組織における代謝ストレスに対する細胞の応答能力を減じるが、さらに細胞からの毒性物質の排除にも関与しているものと考えられる。本発明は、炎症性腸疾患及び炎症全般の治療に役立つことを意図した治療化合物の開発のために、これらポリヌクレオチド及びコードされたポリペプチド配列を同定し、かつそれらを標的として使用することを考慮したものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７；配列番号７の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有し、配列番号７のＬ５０３Ｆ残基に相当する配列を含む；配列番号９；配列番号１０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号３９；及び配列番号４０から成る群より選択される１つの配列を含むヌクレオチド配列を有する単離ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチドが組み込まれているポリヌクレオチドベクターをさらに含む請求項１記載のＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチドと相同であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＯＣＴＮ１ポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、前記ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチドが、配列番号１；配列番号１の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有する；配列番号３６；配列番号３６の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有する；配列番号３７；配列番号３７の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有する；配列番号７；配列番号７の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有し、配列番号７のＬ５０３Ｆ残基に相当する配列を含む；配列番号９；配列番号１０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号３９；及び配列番号４０から成る群より選択される１つの配列を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、並びに
（ｂ）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断における前記ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用に関する取り扱い説明書一式、
を含む製品。
【請求項４】
配列番号８；配列番号８の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有し、配列番号８のＧ−２０７Ｃ残基に相当する配列を含む；配列番号５；配列番号６；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；及び配列番号３５から成る群より選択される１つの配列を含むヌクレオチド配列を有する単離ＯＣＴＮ２ポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドが組み込まれているポリヌクレオチドベクターをさらに含む請求項５記載のＯＣＴＮ２ポリヌクレオチド。
【請求項６】
（ａ）ＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドと相同であり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、前記ＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドが、配列番号３；配列番号３の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有する；配列番号２３；配列番号２３の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有する；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７、配列番号２８；配列番号８；配列番号８の断片、ただし前記断片は少なくとも２０ヌクレオチド分の長さを有し、配列番号８のＧ−２０７Ｃ残基に相当する配列を含む；配列番号５；配列番号６；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１３；配列番号１４；配列番号１５；配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；及び配列番号３５から成る群より選択される１つの配列を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、並びに
（ｂ）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断における前記ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの使用に関する取り扱い説明書一式、
を含む製品。
【請求項７】
哺乳動物の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を決定する方法であって、
（ａ）哺乳動物から生物学的試料を得ること、
（ｂ）前記生物学的試料を、ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド又はＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドと選択的に結合するポリヌクレオチドプローブと接触させること、及び
（ｃ）哺乳動物の炎症性腸疾患に対する感受性の尺度として、ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド又はＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドの発現量を測定すること、
を含む方法。
【請求項８】
生物学的試料におけるＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド又はＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドの発現量が、炎症性腸疾患に対して非感受性である哺乳動物に比べ、炎症性腸疾患に対して感受性を有する哺乳動物において減少している請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が胃腸管組織及び免疫系組織からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的試料が炎症組織から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物がヒトである請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性腸疾患が、クローン病（ＣＤ）、病因不明大腸炎（ＩＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）からなる群より選択される請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記発現量の測定がノーザン解析法によるものである請求項７記載の方法。
【請求項１４】
前記発現量の測定がポリメラーゼ連鎖反応によるものである請求項７記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的試料においてＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド及びＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドの両ポリヌクレオチドの発現を測定する請求項７記載の方法。
【請求項１６】
ＯＣＴＮ２遺伝子の基本転写がダウンレギュレートされる請求項７記載の方法。
【請求項１７】
ヒートショック又はアラキドン酸のいずれかに誘導されるＯＣＴＮ２遺伝子の転写がダウンレギュレートされる請求項７記載の方法。
【請求項１８】
ＯＣＴＮ２遺伝子の基本転写とヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導されるＯＣＴＮ２遺伝子の転写との双方がダウンレギュレートされる請求項７記載の方法。
【請求項１９】
ヒトの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を測定する方法であって、
（ａ）ヒトのＯＣＴＮ１遺伝子又はＯＣＴＮ２遺伝子のポリヌクレオチド配列を決定すること、及び
（ｂ）ヒトのＯＣＴＮ１遺伝子又はＯＣＴＮ２遺伝子のポリヌクレオチド配列が、ヒトにおいてＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の発現を低減する多型を含んでいることを判定すること、
を含む方法。
【請求項２０】
ヒトのＯＣＴＮ１遺伝子及びＯＣＴＮ２遺伝子の両遺伝子のポリヌクレオチド配列を測定する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ＯＣＴＮ１遺伝子のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つのＬ５０３Ｆ多型を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記ＯＣＴＮ１遺伝子のポリヌクレオチド配列が、コードされたＯＣＴＮ１ポリペプチドのカルニチン輸送能力を有意に低下させる請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記ＯＣＴＮ２遺伝子のポリヌクレオチド配列が、Ｇ−２０７Ｃ、４１０及びＴＡから成る群より選択される少なくとも１つの多型を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記ＯＣＴＮ２遺伝子のポリヌクレオチド配列が、ＯＣＴＮ２プロモーター領域に少なくとも１つの多型を含んでいる請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記多型が、ＯＣＴＮ２プロモーターへのヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）の結合を変化させる請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記ＯＣＴＮ２遺伝子の多型が基本転写をダウンレギュレートする請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
前記ＯＣＴＮ２遺伝子の多型が、ヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導される転写をダウンレギュレートする請求項１９記載の方法。
【請求項２８】
ＯＣＴＮ２遺伝子の多型が、基本転写と、ヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導される転写との双方をダウンレギュレートする請求項１９記載の方法。
【請求項２９】
抗炎症薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）タンパク質と、ＯＣＴＮ２プロモーター領域を含むポリヌクレオチドとの複合体を形成すること、
（ｂ）前記複合体を、それを解離するのではないかと思われる薬剤と接触させること、及び
（ｃ）前記複合体の解離を検出すること、ここで前記複合体の解離によって、前記薬剤は抗炎症剤であると同定される、
を含む方法。
【請求項３０】
炎症性腸疾患と関連がある哺乳動物のＯＣＴＮ１遺伝子又は哺乳動物のＯＣＴＮ２遺伝子にヌクレオチド多型を検出する方法であって、炎症性腸疾患である又は炎症性腸疾患の疑いがあると診断された哺乳動物から取り出した、遺伝子をコードするＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の配列に変化を検出することを含む方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物がヒトである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＯＣＴＮ１遺伝子の発現が、哺乳動物の炎症組織において有意にダウンレギュレートされる請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
ＯＣＴＮ２遺伝子の発現が、哺乳動物の炎症組織において有意にダウンレギュレートされる請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
炎症性腸疾患治療用化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物を、カルニチン輸送活性を測定するためのシステムと接触させること、ここで前記システムは、ＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２ポリペプチド又はＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２ポリペプチドの機能性断片と、前記システムによってカルニチン輸送活性を測定するための基質とを含む、及び
（ｂ）前記試験化合物非存在下でのカルニチン輸送活性と比べた場合の、前記試験化合物存在下でのカルニチン輸送活性の増加を検出すること、
を含む方法。
【請求項３５】
前記試験化合物が小分子である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記試験化合物がＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドに結合する細胞内因子である請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記試験化合物がＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドに結合する細胞外因子である請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記カルニチン輸送活性を測定するための基質が、カルニチン、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、及びＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２輸送体によって輸送されるその他の化合物から成る群より選択される請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記ＯＣＴＮ１ポリペプチドが、配列番号７及び配列番号７のＬ５０３Ｆ残基に相当する配列を含む配列番号７の機能性断片から成る群より選択される配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記ＯＣＴＮ２ポリペプチドが、配列番号８及び配列番号８のＧ−２０７残基に相当する配列を含む配列番号８の機能性断片から成る群より選択される配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
カルニチン輸送を調節するための化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験化合物を、カルニチン輸送活性を測定するためのシステムと接触させること、ここで前記システムは、ＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２ポリペプチド又はＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２ポリペプチドの機能性断片と、前記システムによってカルニチン輸送活性を測定するための基質とを含む、及び
（ｂ）前記試験化合物非存在下でのカルニチン輸送活性と比べた場合の、前記試験化合物存在下でのカルニチン輸送活性のモジュレーションを検出すること、
を含む方法。
【請求項４２】
前記化合物がＯＣＴＮ１の輸送体としての機能を増大させる請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物がＯＣＴＮ１の輸送体としての機能を低下させる又は阻止する請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物がＯＣＴＮ２の輸送体としての機能を増大させる請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物がＯＣＴＮ２の輸送体としての機能を低下させる又は阻止する請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
炎症性腸疾患治療用化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＯＣＴＮ１遺伝子又はＯＣＴＮ２遺伝子にヌクレオチド多型を有する、トランスジェニック哺乳動物又は突然変異哺乳動物を得ること、ここでＯＣＴＮ１遺伝子又はＯＣＴＮ２遺伝子における多型は、ＯＣＴＮ１遺伝子又はＯＣＴＮ２遺伝子の組織発現を低下させる、
（ｂ）前記哺乳動物と試験化合物を接触させること、及び
（ｃ）試験化合物に応答して哺乳動物の状態に生じる改善を検出すること、ここで状態とは炎症性腸疾患の症状である、
を含む方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がＯＣＴＮ１遺伝子及びＯＣＴＮ２遺伝子の双方に変異を有する請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
炎症性腸疾患が、クローン病（ＣＤ）、病因不明大腸炎（ＩＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）から成る群より選択される請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは生物学的試料の分析に関する。特に、胃腸管の炎症性疾患に関連するマーカーの診断的分析、及び炎症性疾患の新規治療法の開発に前記分析を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
クローン病（ＣＤ）は、慢性かつ再燃性の腸管炎症を特徴とし、成人期初期に発病することが多い特発性の病気であり、クローン病、病因不明大腸炎（ＩＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含めた炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の一群を含む。
【０００３】
北米では、全人口中これら病気の罹患者数は比較的大きな割合を占めており、その推定有病率はおよそ３００，０００人にのぼるとされる。炎症性腸疾患は、経済にも影響を与えており、そのコストは数十億ドルに達している。
【０００４】
遺伝学的研究によって、炎症性腸疾患を起こしやすくするいくつかの遺伝子座が存在することが分かっているが、それら遺伝子座のうちその存在が繰り返し言われる遺伝子座は、染色体１６（ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の突然変異によって生じる）、１２、１６及び１４上にある。早発型クローン病（発病年齢１６以内）を起しやすい、ＩＢＤ５と呼ばれる染色体５ｑ３１における遺伝子座については、Ｒｉｏｕｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２９、２２３−２２８（２００１）に記載されている。この遺伝子座は、およそ２５０−ｋｂの領域にわたる、１１の一塩基多型（ＳＮＰｓ）のリスクハプロタイプによって区分される。この領域には、有機陽イオン輸送体遺伝子（ＯＣＴＩＮ１／ＳＬＣ２２Ａ４及びＯＣＴＮ２／ＳＬＣ２２Ａ５）、ＬＩＭドメイン含有タンパク遺伝子（ＲＩＬ／ＰＤＬＩＭ３）、プロライン−４−ヒドロキシラーゼのα２サブユニット遺伝子（Ｐ４ＨＡ２）、及び未知の機能をする遺伝子（ＮＣＢＩ  ＵｎｉＧｅｎｅ識別番号Ｈｓ．７０９３２）を含めて複数の候補遺伝子が含まれている。この領域においては連鎖不平衡（ＬＤ）が強いため、これまでＳＮＰマップをさらに精密化することも単一の感受性遺伝子をはっきり同定することもできなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、医療技術分野においては、クローン病の遺伝標識形質及びこれら標識遺伝子の利用が、引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、重篤かつ早発型クローン病（ＣＤ）に関与している遺伝標識形質を用いて、炎症性腸疾患を診断する方法を提供する。また本発明は、有機陽イオンカルニチンの輸送能力を大幅に減じる、ＯＣＴＮ１遺伝子（「ホモサピエンス溶質担体ファミリー２２（有機陽イオン輸送体）、メンバ４（ＳＬＣ２２Ａ４）」としても知られる、ヒトＯＣＴＮ１遺伝子）におけるコード配列変異を提供する。また本発明は、基本転写、及びヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導される転写のいずれをもダウンレギュレーションする、（「ホモサピエンス溶質担体ファミリー２２（有機陽イオン輸送体）、メンバ５（ＳＬＣ２２Ａ５）」としても知られる、ヒトＯＣＴＮ２遺伝子）ＯＣＴＮ２のプロモーター領域における変異も提供する。この転写の差は、どうやらヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）結合部位の破壊によるらしい。本発明はさらに、これら２つの変異遺伝子を組み合わせたハプロタイプを提供する。２つの遺伝子ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２は、クローン病炎症組織において著しいダウンレギュレーションを示す。
【０００７】
同定されたＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２配列変異は、診断上及び薬理遺伝学上有用であり、それらによって治療的介入の標的とし得る疾患に関与する分子経路が明らかになる。ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２遺伝子は、ＣＤ患者の炎症及び非炎症結腸組織において異なる発現をする。両遺伝子とも疾患に関連するＤＮＡ配列変化（多型）を含んでいる。したがって、同定されたポリヌクレオチド多型は、ある個体における炎症性腸疾患にかかりやすさを記述する診断及び予後推定試験の根拠となる。また本発明は、炎症性腸疾患及び炎症全般の治療に役立つことを意図した治療化合物の開発のために、これらポリヌクレオチド及びコードされたポリペプチド配列を同定すること、並びにそれらを標的として使用することを考慮したものである。
【０００８】
また本発明は、これら２つの変異の影響が合わさって、特に炎症に反応してカルニチンの輸送が全体として悪くなるような、クローン病のモデルを提供する。カルニチンは、引き続くβ酸化のために、長鎖脂肪酸をミトコンドリアの中に取り込むときに必要とされる補因子であるため、この突然変異ハプロタイプの影響は代謝ストレスを起こすことになり、このストレスが一因となってクローン病患者の胃腸管に炎症性損傷が生じる。さらに本発明は、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２両遺伝子と一般的な炎症反応とが関連しているという証拠を提供する。このモデルによって、炎症性腸疾患の治療法の基礎が得られることになる。また本発明は、ＯＣＴＮ１における突然変異体の影響によって細胞からの分子の流出が全体として悪くなるような、クローン病のモデルを提供する。これら分子には毒性代謝物、菌体内毒素、生体異物、炎症治療に使用される医薬品化合物又はフリーラジカル種などが含まれると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
概要  Ｒｉｏｕｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２９、２２３−２２８（２００１）に記載されている染色体５ｑ３１の２５０ｋｂ領域において、候補遺伝子の機能解析及び徹底した変異スクリーニングを行った。また、炎症性腸疾患患者から採取した炎症性及び非炎症性胃腸（ＧＩ）管組織において、前記領域における遺伝子の発現レベルの差を検討した。２つの遺伝子、ＯＣＴＮ１（配列番号１）及びＯＣＴＮ２（配列番号３）は、クローン病の炎症組織において有意なダウンレギュレーションを示した。ＯＣＴＮ１遺伝子において、有機陽イオンカルニチン及び基本的な有機陽イオン基質テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の輸送能を著しく低下させるコード配列変異を検出した。また、ＯＣＴＮ２のプロモーター領域における１つの変異が、基礎転写、及びヒートショック又はアラキドン酸のいずれかによって誘導される転写のいずれもダウンレギュレーションすることが判明した。この転写の差は、どうやらヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）の結合部位の破壊が原因となっているらしい。
【００１０】
変異検出  変異検出及び解析のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅したＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２遺伝子のエクソンの二方向塩基配列決定を、ＡＢＩ３７７又は３７００シークエンサーによって行った。検出変異を、順方向及び逆方向エレクトロフェログラムを視覚検査することによって確認した。ゲノムＤＮＡのＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋが公表しているヒトＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２のゲノム配列（染色体５ｑ上の遺伝子座ＡＣ００８５９９及びＡＣ００４６２８）に基づいて設計した。プライマーは各エクソンの上流及び下流約６０ｂｐとし、スプライス供与配列及びスプライス受容配列の塩基配列決定、並びに投げ網枝分かれ部位の塩基配列決定を可能とした。ＯＣＴＮ２プロモーター領域の場合、ＰＣＲプライマー、すなわち２つのプライマー、具体的にはＯＣＴＮ２プロモーター順方向（Ｏ２ＰＦ）：５’−ＣＴＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号５）及びＯＣＴＮ２プロモーター逆方向（Ｏ２ＰＲ）：５’−ＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号６）を用いた１．３ｋｂの断片のＰＣＲ増幅を行った。この領域のＧＣ富化を克服するためにＰＣＲｘエンハンサー溶液を最終濃度が１倍となるように添加し、さらにＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を備えた、ＰＣＲｘエンハンサーシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲプロトコルは、９４℃（４０秒間）、５４℃（１分間）及び７２℃（２分間）の３０サイクル、並びに第１回目のサイクルにおける９８℃で５分間の伸長反応と最終サイクルの７２℃で１０分間の伸長反応を含む。
【００１１】
ＳＮＰリスクハプロタイプを、前記したＲｉｏｕｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２９、２２３−２２８（２００１）に記載のＳＮＰデータから決定し、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２の変異データを、家系の視覚検査によって、ＳＮＰハプロタイプに照らし合わせた。群間の対立遺伝子頻度差の有意なレベル（下表１参照）を、２×２カイ二乗分割表を用いて算出した。相対的危険率計算値（正式には、オッズ比率）を、Ｂｌａｎｄ  ＪＭ  ＆  Ａｌｔｍａｎ  ＤＧ、ＢＭＪ３２０：１４６８（２０００）に記載の方法で算出した。
【００１２】
初めに、５ｑ３１におけるクローン病ＳＮＰリスクハプロタイプがヘテロ接合性又はホモ接合性のいずれかである１６人の互いに血縁関係のない患者のパネルから得た、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２遺伝子のエクソン、スプライス部位及びプロモーター領域を塩基配列決定することによって、変異を検出した。
【００１３】
ＳＮＰリスクハプロタイプと共分離する２つの変異を同定した。すなわち、５０３番のロイシン残基をフェニルアラニンに変える（Ｌ５０３Ｆ；配列番号７）ＯＣＴＮ１の第９エクソンにおけるＣからＴへの変化、及びＯＣＴＮ２の開始コドンから２０７ｂｐ分５’側におけるＧからＣへの変化（Ｇ−２０７；配列番号８）を同定した。Ｇ−２０７Ｃ変異によって、コンセンサスヒートショック転写因子１（ＨＳＦ１）結合部位が変わる。この領域において他の候補遺伝子の塩基配列決定を行っても、リスクハプロタイプバックグラウンドには何ら安定した変異は見られなかった。
【００１４】
次いで、先のＳＮＰ解析で使用した４６家族からの個体におけるＯＣＴＮ１の第９エクソン及びＯＣＴＮ２のプロモーター領域の塩基配列決定を行った。Ｒｉｏｕｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２９、２２３−２２８（２００１）。これら家族のうち４１家族がＳＮＰハプロタイプの少なくとも１コピーを分離し、５家族はこのハプロタイプのコピーをまったく分離しない。これら家族からの互いに血縁関係のない子供においてＳＮＰハプロタイプを調べた結果、先に定義したＳＮＰリスクハプロタイプは、常にＬ５０３Ｆのフェニルアラニン変異体及びＧ−２０７ＣのＣ対立遺伝子の両者を有していることが分かった。
【００１５】
次いで、健常なコントロールのパネルと、ＳＮＰリスクハプロタイプのコピーをまったく保有していないことが分かっている患者のパネルにおいてこれら２つの変異の遺伝子型を決定した。Ｌ５０３Ｆ（配列番号７）及びＧ−２０７Ｃ（配列番号８）の変異対立遺伝子は、健常なコントロールに比べて、これら家族からの互いに血縁関係のない患者において有意に共通しており、非リスクハプロタイプがホモ接合性である（２５人の患者（５０の染色体）においてただ１つのＬ５０３Ｆ対立遺伝子及び１６人の患者（３２の染色体）において１つのＧ−２０７Ｃ対立遺伝子）患者においてはまったく見出されなかった。コントロール群における対立遺伝子頻度は、ハーディ−ワインベルグの平衡から逸脱していなかった。対立遺伝子頻度を表１に示す。
【００１６】
【表１】
2005526491.tif 000003
【００１７】
各対立遺伝子の染色体の数を示し、２つのクローン病患者群については、健常なコントロールとの差の有意レベルを示す。
【００１８】
クローン病感受性に関するオッズ比率を表２に示す。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
ノーザンブロット解析  潰瘍性大腸炎患者及びクローン病患者の胃腸管組織から取り出したＲＮＡをノーザンブロット解析した結果、非炎症組織に比べ、活動性炎症組織においてはＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２両遺伝子を有意にダウンレギュレーションすることが分かった。固体間における発現レベルの多様性を調整するために、同一患者から取り出した試料数が同数の炎症及び非炎症組織の対についても検討した。その結果、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２両遺伝子とも炎症組織において有意にダウンレギュレーションすることが分かった。図１参照。
【００２１】
クローン病又は潰瘍性大腸炎の外科的組織試料を、予定した外科的切除を受けた患者から得た。試料収集に先立って倫理上の承認及びインフォームドコンセントを得た。試料は、ＲＮＡ抽出前にＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で保存した。隣接部の組織を標準的病理検査に使用して、胃腸管領域の診断（クローン病、潰瘍性大腸炎）及び組織の状態（炎症、非炎症）を確認した。非罹患個体から取り出したコントロール結腸ＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ＴＲＩＺＯＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使って、組織からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料（１５μｇ／レーン）を、１％アガロース−３．７％ホルムアルデヒド変性ゲル中で分離し、ＭＳＩナイロン転写膜（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上に転写し、紫外線照射によって架橋させる。
【００２２】
膜をＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２の３２Ｐ−標識相補的プローブを用いてハイブリッド形成した。ＯＣＴＮ１転写産物を、ヒトＯＣＴＮ１遺伝子のコード領域５’部分を含むＯＣＴＮ１（ＲｅｓＧｅｎ）の０．８−ｋｂＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片で検出した。ＯＣＴＮ２転写産物は、ヒトＯＣＴＮ１遺伝子のコード領域３’部分を含むＯＣＴＮ１（ＲｅｓＧｅｎ）の２．２ｋｂＮｏｔＩ／ＳａｌＩ断片で検出した。プローブをランダムプライマー法（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰで放射線標識した。組み込まれなかった放射線標識ヌクレオチドを、ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で除去した。ヒト組織から取り出した全ＲＮＡを含むノーザンブロットを、６８℃のＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中で２時間ハイブリッド形成した。次いで、ブロットを、室温の０．１％ＳＤＳ含有２倍ＳＳＣ中で１５分間ずつ２回洗浄し、さらに６０℃の０．１％ＳＤＳ含有０．１倍ＳＳＣ中で３０分間の洗浄を１回行った。
【００２３】
Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｏｎ社）を用いてノーザンブロットのデンシトメトリーを行い、Ｇ３ＰＤＨに合わせて標準化し、相対的光学密度単位として表した。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて解析した。
【００２４】
組織発現解析  発現解析のために、多重組織発現パネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＲＴ−ＰＣＲを、メーカーの説明書に従って実施した。いくつかのハウスキーピング遺伝子に対して標準化をおこなった、ヒト胃腸（ＧＩ）管及びヒト免疫系からの第一鎖ｃＤＮＡ調製品を使用して、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２ｍＲＮＡの組織特異性並びに相対的存在量を評価した。各ｃＤＮＡ５μｌ（０．２ｎｇ／μｌ）を、遺伝子特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲの鋳型として使用した。
【００２５】
ＯＣＴＮ１に関しては、順方向プライマーを５’−ＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号９）とし、逆方向プライマーを５’−ＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＡ−３’（配列番号１０）とした。
【００２６】
ＯＣＴＮ２に関しては、順方向プライマーを５’−ＣＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号１１）とし、逆方向プライマーを５’−ＡＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号１２）とした。
【００２７】
３２サイクル繰り返した後、各ＰＣＲ産物の５μｌ試料を２％アガロース／エチジウムブロマイドゲル上に流した。Ｇ３ＰＤＨＰＣＲプライマー及びコントロールｃＤＮＡを正のコントロールとして用いた。
【００２８】
健常なコントロール個体の胃腸（ＧＩ）管及び免疫系から取り出した多重組織発現パネルのＲＴ−ＰＣＲ発現解析によって、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２が広範にわたり低レベルで発現しており、ＯＣＴＮ１の発現は上行結腸及び胎児の肝臓において最も高く、ＯＣＴＮ２の発現は結腸及び胎盤で最も高かった。ＲＴ−ＰＣＲの結果を表３に示す。
【００２９】
【表３】
2005526491.tif 000005
【００３０】
ＯＣＴＮ１の一過性発現（輸送体アッセイ）及びＯＣＴ２の一過性発現（ルシフェラーゼプロモーターアッセイ）  野生型又は変異（Ｌ５０３Ｆ；配列番号７）の一過性発現に関しては、ＨｅＬａ細胞を、１００−ｍｍプラスチック培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）に密度１．５×１０６〜１０５細胞／皿でプレーティングし、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）でメーカーの推奨通りトランスフェクションの２４時間前に、カルニチン欠損ヒト繊維芽細胞（ＧＭ１０６６５）を６穴プラスチック培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）に密度２．５×１０５細胞／皿でプレーティングした。
【００３１】
ＨｅＬａ細胞培養に関しては、ヒトＨｅＬａ細胞を、１０％牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足したＤ−ＭＥＭ中で増殖した。カルニチン欠損ヒト繊維芽細胞の培養では、Ｓｃａｇｌｉａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．１、３４−３９（１９９８）に記載（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログの患者ＧＭ１０６６５の記述を参照）の原発性カルニチン欠損の患者から取り出したカルニチン欠損ヒト繊維芽細胞を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  ｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から取得した。繊維芽細胞を、１５％牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、並びに１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び１倍濃度非必須アミノ酸で補足したＤ−ＭＥＭ中で増殖した。細胞を、ＣＯ２５％及び空気９５％の混合物で満たした３７℃加湿インキュベーター内で培養した。
【００３２】
トランスフェクションの４８時間後、培地を取り除き、Ｄ−グルコース（５．５ｍＭ）を含有するアールの平衡塩類液と取り替え、０．５％ＢＳＡで補足した。
【００３３】
ＯＣＴＮ１輸送体アッセイに関しては、Ｌ−［３Ｈ］カルニチン（比活性８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を基質として用い、室温にてカルニチン輸送アッセイを行った。輸送緩衝液は、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び５ｍＭグルコースで補足した２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、で構成した。放射線標識カルニチンを含有する輸送培地を３７℃で前培養し、次いで細胞に添加した。３７℃で３０分間培養した後、緩衝液を吸い出して輸送を停止し、氷冷輸送緩衝液で４回洗浄した。次いで、細胞を、１倍細胞培養溶菌試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、関連する放射能を液体シンチレーションカウンターで定量した。細胞タンパク含有量を、Ｓｍｉｔｈ  Ｐｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６−８５（１９８５）に記載のビシンコニン酸法に従い、ＢＣＡ標準タンパクアッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。トランスフェクション効率を標準化するために、２０分の１のホタルルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ３−Ｐベクターを、細胞にコトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、手動発光測定器（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０１、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した。同様の条件下で空ベクターをトランスフェクトした細胞をコントロールとして使った。全アッセイを三連ずつ行った。
【００３４】
ＯＣＴＮ２ルシフェラーゼプロモーターアッセイに関しては、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＯＣＴＮ２プロモーター領域の変異の影響を調べた。ＯＣＴＮ２プロモータールシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を、Ｇ対立遺伝子がホモ接合である患者のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた約２．７ｋｂ  ＯＣＴＮ２プロモーター断片のＰＣＲ増幅、及びＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓから取り出したルシフェラーゼをレポーターとして使用するプロモーターを含まないルシフェラーゼベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ／ＭｌｕＩへの連結反応によって生成した。ＰＣＲプライマーとして、２つのプライマー、すなわちＯＣＴＮ２−ＢｇｌＩＩ：５’−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１３）及びＯＣＴＮ２−ＭｕｌＩ：５’−ＣＧＡＣＧＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＣＧＡＣＣＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号１４）を用いた。ＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液を最終濃度１倍となるように添加し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴａｑＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を添加したＰＣＲｘ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を用いて、９４℃（４０秒間）、６１℃（１分間）及び７２℃（３分間）を３０サイクルと、さらに第１回目のサイクルにおける９８℃で５分間の伸長反応と最終サイクルの７２℃で１０分間の伸長反応とを含む標準的なプロトコルに従って、ＰＣＲを行った。
【００３５】
次いで、２０７番を包含する６００ｂｐの断片を、ＥｃｏＮＩ／ＮｄｅＩで消化し、Ｃ対立遺伝子がホモ接合である患者のＤＮＡから増幅した対応する断片を連結して置き換え、Ｃ変異構築物を作製した。
【００３６】
構築物の塩基配列を完全に決定し、ＰＣＲにより生じる誤差の可能性を排除した。
【００３７】
実験のレポーター遺伝子の活性を標準化するために、各構築物を、内部コントロールＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）である２０分の１のホタルルシフェラーゼプラスミドｐＧＬ３−Ｐベクターを、メーカーのプロトコル通りにＨｅｌａ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、アラキドン酸処理を施すことになっているＨｅｌａ細胞を、無血清培地で６時間飢餓させた。飢餓させた後、細胞を、３７℃の温度にて３０分間２０μＭのアラキドネートで処理し、ＰＢＳで２回洗浄した。コントロールの細胞は、同等の濃度のエタノールで処理した。その後、細胞をインキュベーターの完全培地にさらに１８時間置いた。トランスフェクションの２４時間後にヒートショックを施した細胞は、４２℃の温度にて２時間培養した。次いで、細胞を３７℃のインキュベーターに戻しさらに１８時間培養した。Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ反応（「実験の」レポーターａ：）からの発光を、ホタルルシフェラーゼ（「コントロール」レポーター）の活性と共に測定した。使用した機器は手動発光測定器（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０１、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）であった。同様の条件下で空ベクターをトランスフェクトした細胞をコントロールとして使用した。全アッセイを３重に行った。
【００３８】
ＯＣＴＮ２プロモーターの２．７ｋｂ断片におけるＧ−２０７Ｃ変異のＣ対立遺伝子を含むルシフェラーゼ構築物をＨｅｌａ細胞内へトランスフェクトすることによる、基本発現の減少量は、野生型（Ｇ）対立遺伝子の場合と比べると平均して２．８倍であった。４２℃におけるヒートショック後のトランスフェクションでは、ヒートショックによって誘導される発現が３．１倍減少した。３７℃における２０μＭのアラキドン酸処理後のトランスフェクションによっても、アラキドネートによって誘導される発現量と比べると、３．３倍減少した。結果を図２に示す。
【００３９】
ＯＣＴＮ２ゲルシフトアッセイに関しては、ヒトＨｅｌａ細胞を、Ｔ−７５組織培養フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）内にて、３７℃の温度で、１０％牛胎児血清、２ｍｍＬ−グルタミン酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補足したＤ−ＭＥＭ中で増殖した。ヒートショックを施した細胞を、前記フラスコを組織培養インキュベーター内、４２℃で３時間培養して調製した。アラキドン酸実験に関しては、実験日前日に、Ｈｅｌａ細胞を、血清を含有しないＤ−ＭＥＭで一晩飢餓させた。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を３７℃の温度で、３０分間２０ｍＭアラキドネートで処理した。実際使用する濃度溶液を、アラキドン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で調製し、１００ｍＭ原液として冷無水エタノール中で保管した。コントロールとしての細胞は、等価濃度のエタノールで処理した。核抽出物は、ＮＰ−４０系分別によって調製した。この方法は、Ｂａｌｅｒ  Ｒ、Ｄａｈｌ  Ｇ  ａｎｄ  Ｖｏｅｌｌｍｙ  Ｒ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２４８６−２４９６（１９９３）に記載の方法に一部変更を加えたものである。つまり、２．５×１０６個の細胞をペレットにし、１倍ＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有する低塩緩衝液（Ａ）１ｍｌに再懸濁させた。核を、４℃、７０００×ｇで１０分間遠心してペレットにした。上清を取り除き、ペレット（未精製核）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２０％グリセロール、３００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する高塩緩衝液（Ｂ）５０μｌに懸濁させた。４℃で１５分間培養後、試料を５秒間音波処理し、２００００×ｇで１０分間遠心した。得られた抽出物は核分画である。核抽出物を−８０℃で保管した。抽出物のタンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。
【００４０】
ゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に関しては、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール中に、核抽出物１０μｇ、３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブ０．５ｎｇ、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）１μｇ及びＢＳＡ１０μｇを含有する２０μｌの反応溶液において、氷上で２時間、結合反応を実施した。ＨＳＦ１及びＨＳＦ２抗体（ＴｒａｎｓＣｒｕｚＴＭ  Ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）２μｌを培養し、標識プローブを添加して、抗体スーパーシフト実験を実施した。競合実験に関しては、１００倍モル過剰の非標識オリゴヌクレオチドを各反応液に添加した。ポジティブコントロールとして使用した競合オリゴヌクレオチドは以下の通りである。ＷＴ−ＯＣＴＮ２（Ｐ）アンチセンス：５’−ＣＡＧＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴ−３’（配列番号１５）；ＷＴ−ＯＣＴＮ２（Ｐ）センス：５’−ＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＴＣＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号１６）；変異ＯＣＴＮ２（Ｐ）アンチセンス：５’−ＣＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴ−３’（配列番号１７）；及び変異ＯＣＴＮ２（Ｐ）センス：５’−ＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴＴＧＣＧＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号１８）。
【００４１】
ヒトＨＳＰ７０の典型的なＨＳＥとして設計したオリゴヌクレオチドは以下の通りである。センス：５’−ＴＣＧＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡ−３’（配列番号１９）；アンチセンス：５’−ＴＣＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＧＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＡＧＣＣＧＡ−３’（配列番号２０）。
【００４２】
反応生成物を、２００Ｖで３時間、４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させて分離し、乾燥してＸ線フィルムに露出した後、オートラジオグラフィーで検出した。
【００４３】
ＯＣＴＮ２Ｇ−２０７Ｃプロモーター変異を取り囲む領域をゲルシフトアッセイすることによって、核因子と、野生型Ｇ対立遺伝子を取り囲む領域を含むオリゴヌクレオチドとの間に、特異的な相互作用があることが証明された。このオリゴヌクレオチドには、過剰野生型オリゴヌクレオチドは競合的に結合するが、変異Ｃ対立遺伝子を含むオリゴヌクレオチド及びＯＣＴＮ２プロモーターとは無関係な無作為に選択されたオリゴヌクレオチドのいずれも競合的に結合しないという点で、特異的であった。この因子の結合は、４２℃での培養及びアラキドン酸処理の後には誘導されたが、３７℃での培養後には誘導されず、ＨＳＰ７０遺伝子のヒートストレスエレメントに相当するオリゴヌクレオチドに結合する因子と、移動度が一致した。ＯＣＴＮ２プロモーターのＧ対立遺伝子にも、過剰ＨＳＰ７０ＨＳＥオリゴヌクレオチドは競合的に結合したが、このことは、この因子がヒートショック転写因子であることを示唆するものである。Ｇ−２０７Ｃ変異によってコンセンサスＨＳＦ１結合部位が変化することから、本発明者等は、この因子がＨＳＦ１であるとの仮説を立てた。抗ＨＳＦ１抗体によって複合体はスーパーシフトしたが、抗ＨＳＦ２抗体ではシフトしなかったことから、未知の因子がＨＳＦ１であることがはっきり確認された。ＯＣＴＮ２プロモーターへのＨＳＦ１の結合は、いずれの試験条件下においても、Ｃ対立遺伝子の存在によって完全に消失した。
【００４４】
ＯＣＴＮ１輸送体アッセイ  ＯＣＴＮ１輸送体アッセイに関しては、完全長ゲノスコープクローンＩＤ  ＣＳ０ＤＪ  ００３ＹＢ０３（ＲｅｓＧｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）である完全長ＯＣＴＮ１ｃＤＮＡ（２．２４ｋｂ）を得た。前記ｃＤＮＡクローンを、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。構築物について完全に塩基配列決定すると、５０３番（Ｌ５０３）にロイシン対立遺伝子を含んでいることが判明した。この構築物をＰＣＲに基づく部位指定突然変異導入法（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）の鋳型として用い、フェニルアラニン対立遺伝子（Ｌ５０３Ｆ）を作製した。親ＤＮＡ鎖をＤｐｎＩ消化によって取り除き、ニックを入れた環状ＤＮＡを使ってＸＬ−１０  Ｇｏｌｄスーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を形質転換した。
【００４５】
Ｌ５０３Ｆ変異の調製に使用した突然変異誘導プライマーは以下の通りである。５’−ＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡ−３’（順方向）（配列番号２１）及び５’−ＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＣＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣ−３’（逆方向）（配列番号２２）。
【００４６】
Ｈｅｌａ細胞内へ一過性トランスフェクションした後の放射線標識カルニチンの取り込み量は、ベクターのみをトランスフェクトした場合を基準とすると、Ｌ５０３Ｆ変異のフェニルアラニン対立遺伝子によって、その基準方向への減少がロイシン対立遺伝子を含む同一の構築物に比べて３．６倍となった。ＯＣＴＮ２の発現が欠損している固体から取り出した細胞系では、放射線標識カルニチンの取り込み量は、ＯＣＴＮ１Ｌ５０３Ｆ変異によってベクター基準方向への減少が、ロイシン対立遺伝子を含む同一の構築物に比べて５．２倍となった（図３）。
【００４７】
ＴＥＡ流出アッセイ  放射線標識したＴＥＡの流出を測定することにより、ロイシン変異体（Ｌ５０３）の場合と比べ、ＣＤが関与するＯＣＴＮ１のフェニルアラニン（Ｌ５０３Ｆ）変異体によって流出が有意に減少することが証明された。図４参照。
【００４８】
トランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘマウス線維芽細胞に３７℃で３０分間１４Ｃ標識ＴＥＡをローディングし、冷輸送緩衝液で２回洗浄した後、輸送培地に再懸濁させた。３７℃で流出を開始し、開始から０、４、８、１２及び３０分の各時間において測定した。測定は、冷輸送緩衝液で２回洗浄し、１倍細胞培養溶菌試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解し、１５０μＬ中の１４Ｃ貯留を定量化して行われた。細胞のタンパク質含量はＢＣＡ法に従って測定した。ナトリウムを使用しない実験に関しては、ナトリウムをＮ−メチル−Ｄ−グルカミンで等張的に取り換えた培地に細胞を懸濁させた。
【００４９】
考察  本明細書に記載の２つの変異は、先に記載されているＳＮＰハプロタイプと共分離し、非リスクハプロタイプには見出されず、クローン病に対するほぼ同程度の遺伝的感受性の一因となっている（表２）。Ｒｉｏｕｘ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２９：２２３−２２８（２００１）の記載では、明らかに、遺伝的リスク（すなわち、１つのＳＮＰハプロタイプに対して２倍のゲノム相対リスク、２つのＳＮＰハプロタイプに対して６倍のゲノム相対リスク）は低く見積られている。その理由はおそらく、リスクハプロタイプの対立遺伝子頻度が、これまでは非伝達性の親の染色体から評価されており、本発明者等が本発明において行ったように、独立したコントロールのセットから評価されていなかったためであろう。
【００５０】
対立遺伝子頻度又は機能に関するデータはいずれもこれまで入手できなかったにせよ、従来、ＯＣＴＮ１にＬ５０３Ｆの変化を引き起こす変異は、機能が未知のＳＮＰ（ｄｂＳＮＰ識別番号ｒｓ１０５０１５２）であるとされてきた。Ｌ５０３Ｆ変異は一般集団に見られる変異である。このことがおそらく、フェニルアラニン変異体（本明細書において、本発明者等は、クローン病感受性に関与している変異体であることを実証する）は野生型の輸送体である、と最初に報告された理由であろう。Ｔａｍａｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１９、１０７−１１１（１９９７）。従来、ＯＣＴＮ１輸送体の機能アッセイは、本明細書に示すようなこの位置における他の変異体についての検討をせずに、フェニルアラニン変異体を使って行われてきた。
【００５１】
野生型変異体の場合、ＯＣＴＮ１の５０３番目に対応するアミノ酸は、マウス、ラット又はヒトのその他知られている全有機陽イオン輸送体におけるロイシン、イソロイシン、メチオニン又はバリンのいずれかである。Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ  Ｇ  ＆  Ｗｏｌｆｆ  ＮＡ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏ．２７８、Ｆ８５８−Ｆ８６６（２０００）。かさの大きいフェニルアラニン残基に変化が起こると、タンパク質に構造上の影響を及ぼすことが考えられる。この残基は、カルニチン輸送に関与しているとすでに証明されている領域の、ＯＣＴＮ１のトランスメンブランドメイン１１に位置している。本発明者等による輸送体アッセイの結果によれば、ＯＣＴＮ１のロイシン変異体では、フェニルアラニン変異体に比べてカルニチンの輸送が有意に良好である。この結果は、フェニルアラニン変異体を使って行った（Ｔａｍａｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１９、１０７−１１１（１９９７））ＯＣＴＮ１に関する従来の機能アッセイ、しかもＯＣＴＮ１のｉｎ  ｖｉｖｏ機能は単に多重特異的な陽イオン輸送体としての機能ではなく、実際にはカルニチン輸送体としての機能であろうとする従来の機能アッセイの結果と相違する。
【００５２】
ＯＣＴＮ２に関しては、これらのデータから、基本転写がＧ−２０７ＣのＣ対立遺伝子によってダウンレギュレートされること、また、この対立遺伝子は、ＨＳＦ１結合の損傷及び引き続く転写活性化の結果として、ヒートショック又はアラキドン酸に応答してアップレギュレートされるＯＣＴＮ２の能力を破壊することなどが分かる。
【００５３】
これら有機陽イオン輸送体がクローン病という病変の一因となるメカニズムは、カルニチンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける代謝の重要性と関係している。カルニチンは、引き続くβ酸化のために、ミトコンドリア内膜を通過する長鎖脂肪酸の輸送を促進する物質であり、また細胞のＣｏＡレベルの維持においても重要な物質である。リンパ球内へのカルニチンの取り込みは、それに対応する血漿レベルの低下とともに、炎症に対する生理学的な応答である。関連の病気である潰瘍性大腸炎の症状も、ミトコンドリアへの長鎖脂肪酸の輸送が減じることによってミトコンドリアの機能が悪化することに派生する、結腸上皮におけるエネルギー欠乏が原因であろうとされている。Ｒｏｅｄｉｇｅｒ  ＷＥ、Ｌａｎｃｅｔ  ２、７１２−７１５（１９８０））。本発明により提供されるクローン病における突然変異のハプロタイプは、損傷を受けたＯＣＴＮ１輸送体の機能を、ＯＣＴＮ２遺伝子による心臓又は炎症性ストレスのダウンレギュレーション又は応答不能性と組み合わせることによって、炎症組織における細胞代謝レベルに影響を及ぼす可能性がある。
【００５４】
ヒートショックタンパク質及びアラキドン酸は、敗血症、代謝ストレス及び虚血を含めた種々の細胞ストレスの応答に関与している。ヒートショック応答は、ＮＦ−ｋＢ活性化をモジュレーションすることによって炎症をモジュレーションする。従来、ＯＣＴＮ２はヒートストレス誘発性タンパク質であるとは言われていなかったが、本発明の結果によれば、ＯＣＴＮ２はヒートストレス誘発性タンパク質である。したがって、通常ＯＣＴＮ２遺伝子は、そのプロモーターへのＨＳＦ１タンパクの結合を介して炎症に応答する際にアップレギュレートされる。これによって、次にカルニチンが動員され、炎症組織における代謝を活発にする。ＯＣＴＮ１カルニチン輸送体活性の弱体化及びＯＣＴＮ２発現レベルの低下は代謝低下の原因となり、また、炎症領域における細胞のストレス誘発又はその悪化を誘発する。
【００５５】
したがって、クローン病の炎症病理学においては、２つのＯＣＴＮ輸送体が機能しているものと考えられる。興味深いことに、結腸にプロピオニル−Ｌ−カルニチン（ＰＬＣ）を局所潅注することで、潰瘍性大腸炎のいくつかの症状を改善することができるという報告があり（Ｇｉａｎｃａｔｅｒｉｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．９６、２２７５−２２７６（２００１））、また、ＰＬＣによって、げっ歯類動物の種々の血管炎症モデルにおける炎症が抑制されている。Ｃａｒｕｓｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３１、６７−７２（１９９５）及びＡｍｉｃｏ−Ｒｏｘａｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．１９、２１３−２１７（１９９３）。ＯＣＴＮ１は多重特異的陽イオン輸送体であって、ＣＤの治療に使用される医薬品の腸からの取り込みにおいて役割を担っている可能性がある。したがって、Ｌ５０３Ｆなどの変異は、治療化合物の生体利用率を低下させることによって、又はフリーラジカル、毒性代謝物質若しくは細菌毒素などの毒性化合物を流出によって除去する細胞の能力を低下させることによって病気を悪化させている可能性がある。
【００５６】
ＯＣＴＮ２遺伝子の変異及び炎症診断におけるその利用  前述したように、ＯＣＴＮ２は、ナトリウムに依存してカルニチンを輸送する能力を備えた輸送体タンパク質である。有機陽イオン輸送体ＯＣＴＮ２におけるミスセンス変異及びナンセンス変異は、従来、原発性全身性カルニチン欠損症（ＳＣＤ；（ＯＭＩＭ２１２  １４０））の患者、すなわち進行性心筋症、骨格筋ミオパシー、低血糖症及び過アンモニア血症を特徴とする常染色体劣性疾患の患者で確認されていた。それに対し、本発明は、エクソン１の開始コドンより上流側のＯＣＴＮ２遺伝子にあるポリヌクレオチド多型（図６参照）を提供し、また、それらの多型が炎症性腸疾患（ＩＢＤｓ）、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に関与していることは本明細書で明らかにする。先に記載したＯＣＴＮ２のＧ−２０７Ｃ変異は、確かに基本転写レベルを低下させるものであるが、ヒートストレス又は炎症によって誘発される転写と最も関係がある。同時に起こるＯＣＴＮ１変異と相まって、これら変異のハプロタイプはクローン病感受性の原因となっている。
【００５７】
本発明は下記の配列番号２３で示されるようなポリヌクレオチド多型を提供する。
【化１】
2005526491.tif 000006
【００５８】
本発明は、下記の配列番号２３での断片である配列を有する他のポリヌクレオチドも提供する。例えば、前記断片は、２０塩基長（又はその倍数）の配列を有することができる。
【００５９】
さらに、本発明は、４１０変異（例えば、ｔａａｇｃｃｇａ（ｃ／ｇ）ｃｃｃｇｇｇｃｔａ、配列番号２４）を含むポリヌクレオチドの利用を可能にする。また、本発明は、Ｇ−２０７Ｃ変異（例えば、ｃｃａｇｇｃｃｃｇ（ｃ／ｇ）ａａｃｃｔｔｃｃｃ、配列番号２５）を含むポリヌクレオチドの利用を可能にする。本発明が提供するその他のポリヌクレオチドには、ｃｇｇｃｇｇｔｇｔｃａｇｃｔｃ（ｔ／ｇ）ｃｇａｇｃｃｔａｃｃｃｔｃｃｇｃ（配列番号２６）、ｇｇａｃｇｇｔｃｔｔｇｇｇｔｃ（ｔ／ｇ）ｃｃｔｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃｔｔｇ（配列番号２７）及びｃｃｔｇｇｔｃｇｇｃｇｇ（ｃｇ／ｔａ）ｇｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｃｇｃａｃｇｃ（「ＴＡ」、配列番号２８）が含まれる。その他のポリヌクレオチドは図６を観察することによって決定することができる。
【００６０】
ＯＣＴＮ２プロモーター領域  表２に、ＯＣＴＮ２Ｇ−２０７Ｃプロモーター領域変異の対立遺伝子頻度を示す。これまで、Ｇ−２０７Ｃ多型対立遺伝子頻度に関するデータは、いかなる集団（健常者集団又は罹患者集団）においても得られていなかった。
【００６１】
各対立遺伝子を、番号（１又は２）とその位置に存在するＤＮＡヌクレオチド（Ｃ又はＧ）とによって表４に示す。各対立遺伝子を有する染色体の数を、互いに親族でない健常人のコントロール（「健常」の段）及び先に記載の染色体５遺伝子座によって付与された遺伝性リスクを有する家系からのクローン病患者（「ＣＤ」の段）について示す。各対立遺伝子の頻度を、それらを有する染色体が占めるパーセンテージで表して（）内に示し、染色体の総数（「ｎ」）を格段の下部に示す。２×２分割表カイ二乗検定の結果を表４の下部に示し、同時に「健常」と「ＣＤ」各群間の対立遺伝子頻度の有意差を示す（カイ二乗統計値：１０．２６４０、自由度１のｐ値：０．００１４）。
【００６２】
【表４】
2005526491.tif 000007
【００６３】
表５は、ＯＣＴＩＮ２遺伝子の３つの多型（すなわち、４１０、Ｇ−２０７Ｃ及び「ＴＡ」の多型）に関する対立遺伝子頻度のデータを示す。対立遺伝子頻度を、特定の対立遺伝子を有する染色体の数、次いでその対立遺伝子を有する全染色体（「ｎ」）が占めるパーセンテージで表す（例えば、健常人のコントロールにおけるＧ−２０７Ｃ変異の場合、１１０個の染色体のうち５２個（すなわち４７％）が「Ｃ」対立遺伝子を有している）。調査した集団は以下の通りである。健常人のコントロール（「健常」）：ＩＢＤの病歴のない個体の静脈血から取ったＤＮＡ試料、ＲＡ同胞（「ＲＡ」）：慢性関節リュウマチに罹患しているがＩＢＤの病歴のない患者の健常な同胞の静脈血から取ったＤＮＡ試料、ウェジナー肉芽腫症（「ＷＧ」）：ウェジナー肉芽腫症を罹患しているがＩＢＤの病歴のない患者の静脈血から取ったＤＮＡ試料、外科手術癌／ポリープ（「癌」）：結腸癌又は結腸ポリープの外科手術を受けているがＩＢＤの病歴のない患者の静脈血から取ったＤＮＡ試料、染色体（５）患者の両親：染色体５に連鎖が示される家系からのＣＤ患者の両親の静脈血又は培養白血球から取ったＤＮＡ試料、親族でない染色体（５）クローン病（ＣＤ）患者（「染色体（５）ＣＤ」）：染色体５に連鎖が示される家系からの互いに親族でない患者の静脈血又は培養白血球から取ったＤＮＡ試料、外科手術ＣＤ：ＣＤであるために腸組織を外科的に切除した患者の静脈血から取ったＤＮＡ試料、及び外科手術ＵＣ：潰瘍性大腸炎（ＵＣ）であるために腸組織を外科的に切除した患者の静脈血から取ったＤＮＡ試料。
【００６４】
【表５】
2005526491.tif 000008
【００６５】
表６は、表５に記載の集団における対立遺伝子頻度のカイ二乗統計解析を示す。これら集団に存在する対立遺伝子数は、表５に示す通りである。各検定に関して、４１０、Ｇ−２０７Ｃ及び「ＴＡ」の各多型の結果を示す。比較する集団を各２×２分割表の上部に（例えば、「健常」、「染色体（５）患者」）、個々の対立遺伝子を分割表の左側に、各多型について数えた対立遺伝子の総数を分割表の下に示す（例えば、第１番目の分割表におけるＧ−２０７Ｃの多型については、対立遺伝子の総数は１１０）。各分割表の右側（「統計」の段）には、カイ二乗値（上方）、及び自由度１の片側カイ二乗分布に基づいた関連するｐ値（例えば、第１番目の分割表の場合のカイ二乗は９．７８０６、関連するｐ値は０．００１８）。この解析では、いくつかの集団は一群にまとめてある。また、下記の用語以外は、表５で使用した用語にならった。すなわち、「全ＣＤ」とは「染色体（５）ＣＤと外科手術ＣＤの組合せ」を意味し、「全ＩＢＤ」とは「染色体（５）ＣＤ、外科手術ＣＤ及び外科手術ＵＣの組合せ」を意味する。
【００６６】
【表６】
2005526491.tif 000009
【００６７】
クローン病患者においては、同定した変異体（突然変異体）の内、最もよく見られるＯＣＴＮ２のＤＮＡ配列の頻度が著しく増加している。この観察結果は統計学的に高度に有意である（ｐ＝０．００１４）。リスク対立遺伝子は、これら患者の一塩基多型（ＳＮＰ）リスクハプロタイプのバックグラウンドにほぼ必ずといっていいほど見出され、この領域におけるクローン病感受性に関する本発明者等の遺伝学的モデルと合致する。
【００６８】
さらに、本発明者等は、ＯＣＴＮ２遺伝子と全身的な炎症反応との間の関連を検出した。本発明者等は、ＯＣＴＮ２遺伝子における変異と、ＯＣＴＮ２遺伝子のプロモーター領域に結合する特異的タンパク質（ＨＳＦ１；ヒートショック転写因子１、ＮＣＢＩ  ＵｎｉＧｅｎｅ識別番号Ｈｓ．１４９９）と、ＨＳＦ１の炎症への関与との間の関連性を示すゲルシフトアッセイを行った。Ｈｓｆ１タンパク質とＯＣＴＮ２プロモーター領域間の特異的相互作用は、Ｇ−２０７Ｃの「Ｃ」対立遺伝子の存在によって消失する。
【００６９】
核の非存在下では、野生型又は変異オリゴヌクレオチド（ＯＣＴＮ２プロモーター領域がＧ−２０７Ｃの「Ｃ」対立遺伝子の存在によって消失している）との複合体は、まったく検出されなかった（３２Ｐ標識プローブを用いたハイブリッド形成による）。野生型オリゴヌクレオチドとヒートショック処理をしていない細胞からの核抽出物の間には複合体はまったく形成されなかった。野生型オリゴヌクレオチドは、ヒートショック処理した細胞からの核抽出物とは複合体を形成した。この複合体形成では、コールド（５０倍過剰３２Ｐ標識テストオリゴヌクレオチド）野生型オリゴヌクレオチドと既知のヒートショックエンハンサー（ＨＳＥ）を含むコールドオリゴヌクレオチドとが特異的に競合する。この複合体形成では、コールド変異オリゴヌクレオチド又は配列に関連のないコールドオリゴヌクレオチドは競合しなかった。この複合体は、既知のＨＳＥを含む標識オリゴヌクレオチドと核抽出物との複合体と、ゲル移動度がまったく同じであった。この複合体は、抗ＨＳＦ１抗体と高次の複合体を形成するとスーパーシフトする、すなわち、移動度がさらに減少する。このことは、複合体に結合する核抽出物のタンパク質成分がＨｓｆ１であることを示唆するものである。標識変異オリゴヌクレオチドと核抽出物との間には、競合オリゴヌクレオチド又は抗Ｈｓｆ１抗体の存在にかかわらず、複合体は見出されない。
【００７０】
つまり、ＯＣＴＮ２のＧ−２０７Ｃ変異は、ＨＳＦ１タンパク質と特異的複合体を形成し、ＨＳＦ１の結合は、Ｇ−２０７Ｃ変異（「Ｃ」）対立遺伝子の存在によって完全に消失する。
【００７１】
このように、本発明は、抗炎症剤を同定する方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒートショック因子１（ＨＳＦ１）タンパク質とＯＣＴＮ２プロモーター領域に変異を含むポリヌクレオチドとの複合体を形成する。前記変異は、例えば、ＯＣＴＮ２プロモーター領域のＧ−２０７Ｃ変異とすることができる。前記複合体を、その複合体を解離するのではないかと思われる医薬品などの薬剤と接触させる。前記複合体の解離を検出することによって、前記薬剤を抗炎症剤であると同定する。
【００７２】
ＯＣＴＮ２遺伝子のＰＣＲ増幅部分に役立つプライマーの例としては、ＯＣＴＮ２  ２．４：ｇｃｃａｇｇｔｔａｇｇｔｔｃｃｃｔｔｔｃ（配列番号２９）、ＯＣＴＮ２  ２．２：ａｇｃａｇｃｃｃａａａｔｔｃｔｔａａａｇｇ（配列番号３０）、Ｏ２Ｘ１ｖ３：ｇａａｔｃａｃｃｔｃｇｃｔｇｃｔｔｔｔｔ（配列番号３１）、Ｏ２Ｘ１ｖ４：ａａａｔｇｔｇｇａａａｇｇｇｃａｔｃｔ（配列番号３２）、Ｏ２Ｘ１６００ｕｐ：ａｔｔａｇｇｃｇｇｔｇｔｃａａｇａｇｃａ（配列番号３３）、Ｏ２Ｘ１Ｆ：ｇｇｔｃｇｔｇｃｇｃｃａｔａｔｇｔａａｇ（配列番号３４）、及びＯ２Ｘ１Ｒ１：ｇａｇａｇｇａｇｃｔｃｇｇｇｔｔｃａａｇ（配列番号３５）が含まれる。
【００７３】
ＯＣＴＮ１遺伝子の変異及び炎症診断における利用  前述のように、ＯＣＴＮ１は、ナトリウムに依存してカルニチンを輸送する能力を備えた輸送体タンパク質である。ＯＣＴＮ１は、マウス及びヒト胎児肝臓でクローニングされそれぞれ５５３個のアミノ酸及び５５１個のアミノ酸で特徴づけられているが、ヌクレオチド結合部位モチーフを有している。ＯＣＴＮ１は、成人の腎臓、気管、骨髄、胎児肝臓、及びいくつかの腫瘍細胞で強く発現されるが、ヒト成人肝臓では発現されない。ＯＣＴＮ１は、ｐＨに依存してＴＥＡの取り込みを仲介する。
【００７４】
図８は、第９エクソンの一塩基多型を含めた、ＯＣＴＮ１遺伝子のヌクレオチド配列を示している。この多型は、ｄｂＳＮＰデータベースではｒｓ１０５０１５２で表される。このＳＮＰの対立遺伝子頻度は、どの集団（コントロール又は疾患関与集団）においても決定されたことがなかった。第９エクソンのヌクレオチド配列は、以下の通りである。ｇｔｇｃｔｔａｃａａｃａｇａａｔｇｃｔｇｃｃｃｔａｃａｔｃｇｔｃａｔｇｇｇｔａｇｔｃｔｇａｃｔｇｔｃｃｔｇａｔｔｇｇａａｔｃＹｔｃａｃｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｃｃｔｇａａａｇｔｔｔｇｇｇａａｔｇａｃｔｃｔｔｃｃａｇａａａｃｃｔｔａｇａｇｃａｇａｔｇｃａｇａａａｇｔｇａａｔｇ（配列番号３６）。
【００７５】
スプライシングしたエクソンのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【化２】
2005526491.tif 000010
【００７６】
図９は、ＯＣＴＮ１遺伝子から推定したアミノ酸配列を、ＯＣＴＮ１の第９エクソン変異によって生じたアミノ酸変化を含めて示す（配列番号３８）。ＯＣＴＮ１の第９エクソン変異部位を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの例としては、Ｏ１Ｘ９Ｆ：ｇｔｇｃｃｃａｇａｇａｇｔｃｃｔｃｃｔａ（配列番号３９）及びＯ１Ｘ９Ｒ：ｔｔｃｔｃｃｃｔａａｇｇｃａｔｔｔｔｇｇｔ（配列番号４０）が含まれる。
【００７７】
表７は、ＯＣＴＮ１の第９エクソン変異の対立遺伝子頻度を示す（図８及び図９参照）。対立遺伝子を、数字（１又は２）、その位置に存在するＤＮＡヌクレオチド（Ｃ又はＴ）、及びそのヌクレオチドを含むコドンによってコードされるアミノ酸（フェニルアラニンを表すＰｈｅ又はロイシンを表すＬｅｕ）によって記載する。各対立遺伝子を有する染色体の数を、互いに親族でない健常人のコントロール（「健常」の段）、及び前記した染色体５の遺伝子座によって授かった遺伝的リスクを有する家系からのクローン病患者（「ＣＤ」の段）の両方について示す。パーセンテージで表した各対立遺伝子の頻度を括弧内に示し、染色体の総数（「ｎ」）を各段の下部に示す。２×２分割表カイ二乗検定の結果を表の下部に示し、同時に「健常」と「ＣＤ」各群間の対立遺伝子頻度の有意差を示す（カイ二乗統計値：１３．１４２２、自由度１のｐ値：０．０００３）。
【００７８】
【表７】
2005526491.tif 000011
【００７９】
また本発明は、配列番号３７又は配列番号３８の断片を配列として有するその他のポリヌクレオチドを提供する。例えば、前記断片は２０塩基長（又はその倍数の長さ）の配列を有していてよい。
【００８０】
また、ＯＣＴＮ１遺伝子と全身的な炎症反応との間に関連があることも考えられる。特異的タンパク質（ＨＳＦ１）がＯＣＴＮ１遺伝子のプロモーター領域に結合することも考えられる。したがって、炎症疾患全般も本発明の範囲内である。
【００８１】
したがって、本発明は、抗炎症剤を特定する方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒートショック因子１（ＨＳＦ１）タンパク質とＯＣＴＮ１プロモーター領域に変異を含むポリヌクレオチドとの複合体を形成する。その複合体を解離することができると思われる医薬品などの薬剤との複合体。前記複合体の解離を検出することによって、前記薬剤を抗炎症剤であると同定する。
【００８２】
ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２ポリヌクレオチド  本発明は、ＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２の多型を提供する。「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ並びにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡ（例えば、化学的に合成したＤＮＡ）を含めたＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖である場合、ポリヌクレオチドはセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドを形成する材料となる。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチドは、炎症性大腸炎の診断に役に立つ医薬品開発の基礎として使用することができる。本発明のポリヌクレオチドによって提供される構造上の情報に加え、遺伝子解析によって関連する情報が提供される。本発明のポリヌクレオチドを、複合的な遺伝的形質のさらなる遺伝子分析と組み合わせて使用する方法は、当技術分野では知られている（Ｌａｎｄｅｒ  Ｅ．＆  Ｋｒｕｇｌｙａｋ  Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１１：２４１−２４７（１９９５）、Ｏｔｔ，Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：７７２−７７３（１９９６）を参照）。また、同定された遺伝子座がヘテロ接合性、ホモ接合性又は複合ヘテロ接合性の個体に関して、クローン病の相対的危険率を評価する方法も知られている（例えば、Ｈｕｇｏｔ  Ｊ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：（２００１）、ＩＢＤ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６８：１１６５−１１７１（２００１）を参照）。
【００８４】
「単離ポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノム内では直接連続している双方のコード配列（一方は５’末端側、他方は３’末端側）と直接連続していないＤＮＡを意味する。したがって、組換えポリヌクレオチドは、コード配列と直接連続している非５’コード（例えばプロモーター）配列の一部又はすべてを含み得る。したがって、「単離ポリヌクレオチド」は、例えば、ベクターに組み込まれているか、自律複製するプラスミド若しくはレトロウィルスなどのウィルスに組み込まれているか、又は原核細胞若しくは真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている組換えＤＮＡ、又は他の配列とは関係ない個々の分子（例えば、ＰＣＲ若しくは制限酵素処理によって増幅されるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。また、新たに付加されるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００８５】
「実質的に同一である」とは、基準アミノ酸の配列又はポリヌクレオチド配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上が同一であるような配列を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドの場合、一般に、基準ポリペプチド配列の長さは少なくともアミノ酸１６個分、好ましくは少なくともアミノ酸２０個分、より好ましくは少なくともアミノ酸２５個分、最も好ましくはアミノ酸３５分である。ポリヌクレオチドの場合、一般に、基準ポリヌクレオチド配列の長さは少なくともヌクレオチド５０個分、好ましくは少なくともヌクレオチド６０個分、より好ましくは少なくともヌクレオチド７５個分、最も好ましくは少なくともヌクレオチド１１０個分である。
【００８６】
２つのポリヌクレオチドのパーセント同一性を決定するために、最善の比較を行うことを目的として、それらの配列のアライメントをとる（例えば、２番目のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列と最善の並びかたをするように、１番目のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。１番目の配列の１つの位置が、２番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められていれば、それらの分子は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、それら配列に共通する同一な位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／総位置数（例えば、重複する位置）×１００）。２つの配列は同じ長さを有していることが好ましい。
【００８７】
２つの配列間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使って行うことができる。２つの配列の比較に使われる数学的アルゴリズムの好ましい一例としては、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８３７−５８７７（１９９３）において一部修正した、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）に記載の両者によるアルゴリズムが挙げられる。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。このような数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のプログラム、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラムを使って、スコア＝１００、語長＝１２で行うことにより、本発明のＯＣＴＮ２ポリヌクレオチド分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラムを使って、スコア＝５０、語長＝３で行うことにより、本発明のＯＣＴＮ２タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ付きアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載しているように、Ｇａｐｐｅｄ  Ｂｌａｓｔを利用することができる。またＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使うことで、分子間の遺伝学的距離関係を検出する反復検索を行うことができる。（同上）。Ｂｌａｓｔ、Ｇａｐｐｅｄ  Ｂｌａｓｔ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔの各プログラムを利用する場合には、各プログラムの省略時パラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用することができる。＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞を参照のこと。配列の比較に使われる数学的アルゴリズムの別の好ましい一例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、（１９９８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７に記載のアルゴリズムが挙げられる。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるプログラムＡＬＩＧＮ（２．０バージョン）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合には、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーを使うことができる。
【００８８】
前記手法と類似の手法を使い、ギャップを導入し又は導入せずに、２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を計算する際には、完全にマッチしているものだけを数える。
【００８９】
本発明は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件の例としては、１）Ｃｈｕｒｃｈ緩衝液（７％ＳＤＳ、０．５％ＮａＨＰＯ４、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ）中、５０℃でハイブリダイズし、５０℃の２倍ＳＳＣ中で洗浄する条件、及び２）６倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、５０〜６５℃の０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する条件が挙げられる。その他のストリンジェンシーな条件については、当業者には明らかであろうし、また、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．１９８９）、６．３．１〜６．３．６から知ることもできる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、２０、３０、５０又は７０塩基長であることが好ましい。また、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、ＯＣＴＮ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部の配列と、９５％又は９８％同一性であることが好ましい。前記した種類のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、クローニング用プローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、又は診断用プローブとして使用することができる。好ましいハイブリダイズするポリヌクレオチドは、天然に存在するＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２が有する生物学的活性の一部又は全部を有しているポリペプチドをコードするものである。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子のうちの１つによってコードされるスプライス変異体であってもよい。したがって、ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の種々の型に比べて短い又は長いタンパク質をコードすることができよう。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２と関連するタンパク質（例えば、本明細書に記載のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子と比較的高度に同一性であるタンパク質を含む遺伝子によってコードされるタンパク質）をコードすることもできよう。
【００９０】
本発明はまた、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の一部をコードする単離ポリヌクレオチド配列を特徴づける。したがって、ＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２の一部又はその一部の一部（例えば１つ又はそれ以上のドメイン）が、配列が無関係なタンパク質又はポリペプチド（すなわち、融合パートナー）に融合して融合タンパク質を作っているような、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。検出可能マーカーの例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホォトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β−ガラクトシダーゼ、及びキサンチングアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。
【００９１】
本発明のポリペプチドとしては、それらに限定されないが、組換えポリペプチド、本明細書に開示の多型を有する本発明のポリペプチドから作製される天然のポリペプチド、及び合成ポリペプチド、並びにプレタンパク質又はプロタンパク質であるポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドは、例えばマーカーポリペプチド又は融合パートナーなどの別のポリペプチドに融合させて発現させることができる。例えば、本発明のポリペプチドをヘキサヒスチジンタグに融合させて、細菌によって発現させたタンパク質の精製を容易にする、又はヘマグルチニンタグに融合させて真核細胞中に発現させたタンパク質の精製を容易にすることもできる。
【００９２】
本発明は、本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチドを有する形質転換細胞を特徴とする。また、本発明は、発現のための適切な位置に置かれている本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも特徴とする。前記ベクターは、例えば、発現ベクターであってよく、１つ又はそれ以上の調節エレメントを含んでいてよい。組織特異的発現を導く調節エレメントなどの、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼしうる調節エレメントについては、当業者ならば周知であろう。調節エレメントの例としては、サイトメガロウィルスｈＣＭＶ即時初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子、ＳＶ４０アデノウィルスの初期プロモーター、ＳＶ４０アデノウィルスの後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λファージのオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター、酸ホスフォターゼのプロモーター、並びに酵母α接合因子などが挙げられる。ベクターは、プラスミド、又はレトロウィルスなどのウィルスとすることができる。
【００９３】
「形質転換細胞」とは、遺伝子組換えによって、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドを（本明細書で言うように）コードするＤＮＡ分子が、その中に（又はその祖先に）導入されている細胞を意味する。
【００９４】
「発現のための位置に置かれている」とは、選択されたＤＮＡ分子が、その配列の転写及び／又は翻訳を指令する１つ又はそれ以上の配列エレメントに隣接した位置に置かれており、その配列とは、配列エレメントが前記選択されたＤＮＡの転写及び／又は翻訳を調節することができるような（すなわち、選択されたＤＮＡが配列エレメントと作動可能に結合されている）配列であることを意味する。このように作動可能に結合されているエレメントは、ＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドの生成を促進することができる。
【００９５】
本発明はまた、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２のアンタゴニスト及びアゴニストを特徴とする。アンタゴニストは、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の機能の１つ又はそれ以上を阻害することができる。好適なアンタゴニストには、大分子又は小分子（例えば、有機分子）、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の抗体、及び本来型のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２と競合するＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドを含めることができる。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２のアゴニストは、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の機能の１つ又はそれ以上を高めるか又は促進する。好適なアゴニストには、例えば、大分子又は小分子（例えば、有機分子）及びＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の抗体を含めることができる。例えばアンチセンス分子及びリボザイムなどの、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の発現に干渉するのに使用することができるポリヌクレオチド分子も本発明の範囲に含まれる。
【００９６】
本発明はまた、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む細胞、及びＯＣＴＮ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。
【００９７】
また、本発明は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドを含む医薬品化合物を特徴とする。
【００９８】
方法  本発明は、炎症性腸疾患を検出する方法を特徴とする。前記方法は、（ａ）生物学的試料を得ること、（ｂ）前記試料を、ＯＣＴＮ１ポリヌクレオチド又はＯＣＴＮ２ポリヌクレオチドと選択的に結合するプローブと接触させること、及び（ｃ）前記生物学的試料に選択的に結合したプローブの量を、ｖの発現レベルの尺度として測定することを含む。この発現レベルは、炎症性腸疾患患者の疾患活性及び／又は進行の生物学的マーカーとして使うことができる。したがって、本発明は、炎症性腸疾患における発現レベルの変化を追跡又はモニターする方法を、診断又は予後推定のツールとして提供する。
【００９９】
通常、本発明によるＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２タンパク質及び融合タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを使い、好適な発現ビヒクルに導入したＯＣＴＮ１をコードする又はＯＣＴＮ２をコードするＤＮＡ断片（例えば、本明細書に記載のｃＤＮＡ）のすべて又は一部で、宿主細胞を形質転換（トランスフェクション、形質導入又は感染）することによって合成される。好適な発現ビヒクルとしては、プラスミド、ウィルス粒子及びファージが含まれる。昆虫細胞の場合、バキュロウィルス発現ベクターが適する。発現ビヒクルの全体又は一部を、宿主細胞ゲノムと組み込むことができる。ある種の環境においては、誘導的発現ベクター、例えば、ＬＡＣＳＷＩＴＣＨ（商標）誘導的発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を使用することが望ましい。
【０１００】
分子生物学分野の当業者には、多種多様な発現系を使って組換えタンパク質を提供できることが理解されよう。使用する宿主細胞が何であるかは、本発明にとって重要なことではない。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２タンパク質は、原核宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ若しくはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は真核宿主（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ若しくはＰｉｃｈｉａ；ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３若しくはＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞；又は昆虫細胞）内で産生することができる。
【０１０１】
植物細胞もまた、タンパク質及びポリペプチドを産生できる。植物の場合、ウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス及びタバコモザイクウィルス）並びにプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）が好適である。このような細胞は、広範な供給元（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４）も参照のこと）から入手可能である。形質転換又はトランスフェクションの方法及び発現ビヒクルの選択は、選択される宿主系によって決まる。形質転換及びトランスフェクションの方法については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４）に記載されており、発現ビヒクルについては、例えばＰ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８５、Ｓｕｐｐ．１９８７）に記載されているビヒクルの中から選択できる。
【０１０２】
発現ビヒクルを保有する宿主細胞は、選択された遺伝子の活性化、選択された遺伝子の抑制、形質転換体の選択又は選択された遺伝子の増幅に必要とされる形態に適合させた、従来の栄養培地で培養することができる。
【０１０３】
ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチドは、融合タンパク質として産生することができる。例えば、発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１、１９８３）を用いてｌａｃＺ融合タンパク質を産生することができる。ベクターｐＧＥＸを用いて、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）で外来のポリペプチドを融合タンパク質として発現させることができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズに吸着させ、次いでフリーグルタチオンの存在下で溶出することによって、溶菌した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビン又は因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１０４】
昆虫細胞発現系では、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖するＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いる。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２コード配列は、前記ウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター、例えば、ポリヘドリンプロモーターの制御下におくことができる。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子をうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が不活化され、閉鎖されていない組換えウィルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質のコートを欠いたウィルス）が産生される。次いで、これらの組換えウィルスを用いて、挿入遺伝子が発現しているＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６．５８４、１９８３）及びＳｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
【０１０５】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウィルス発現系を利用することができる。アデノウィルスを発現ベクターとして用いる場合には、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ポリヌクレオチド配列を、アデノウィルス転写／翻訳調節複合体、例えば、後期プロモーター及び三層リーダー配列にライゲートすることができる。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによってアデノウィルスゲノムに挿入することができる。前記ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）に挿入することによって、感染宿主内で生存可能かつＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子産物を発現可能な組換えウィルスが生じる。例えば、Ｌｏｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３６５５（１９８４）を参照されたい。
【０１０６】
挿入されたポリヌクレオチドが効率的に翻訳されるためには、特異的開始シグナルも必要であろう。これらシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びそれに隣接する配列が含まれる。本来型のＯＣＴＮ１若しくはＯＣＴＮ２遺伝子又はｃＤＮＡの、開始コドン及びそれに隣接する配列を含めた全体が適切な発現ベクターに挿入される場合には、新たな翻訳調節シグナルが必要ないこともある。その他の場合には、おそらくはＡＴＧ開始コドンを含めて、外因性翻訳調節シグナルを供給しなければならない。さらに、開始コドンは、所望のコード配列の読み枠が合うようにして、挿入された配列全体の翻訳を確実なものにしなければならない。これら外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンの由来は、天然及び合成のものを含めて多様である。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結信号を含むことによって高められる。Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６（１９８７）。
【０１０７】
また、宿主細胞としては、挿入された配列の発現をモジュレーションするか、又は遺伝子産物を修飾しかつプロセッシングする宿主細胞が、特異的かつ所望の方法で選択されよう。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセッシング（例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞はそれぞれ、タンパク質及び遺伝子産物の転写後プロセッシング及び修飾の特徴的かつ特異的なメカニズムを有している。適切な細胞系又は宿主系を選択することで、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確実なものとすることができる。このため、転写一次産物のプロセッシング、グリコシル化、遺伝子産物のリン酸化を適正に行う細胞機械装置を有する真核宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞の例としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、特に脈絡叢細菌系を挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０８】
当業界で知られているいずれの手法を使っても、ＯＣＴＮ２トランスジーンを動物に導入して、トランスジェニック動物の始原細胞系を作製することができる。このような手法の例としては、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖細胞系へのレトロウィルス仲介遺伝子トランスファー（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８２：６１４８（１９８５）、ＥＳ細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３（１９８９））、及び胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３、１９８３）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
本発明は、全細胞中にＯＣＴＮ２トランスジーンを有するトランスジェニック動物、及び全細胞中ではなく、一部の細胞中にトランスジーンを有する動物、すなわちモザイク動物を考慮したものである。トランスジーンは、１個のトランスジーンとして、又は頭−頭若しくは頭−尻尾タンデムなどのコンカテマーの状態で組み込むことができる。またトランスジーンは、ある特定の細胞種に選択的に導入しそこで活性化することもできる。Ｌａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８９：６２３２（１９９２）。このような細胞種特異的活性に必要とされる調節配列は、問題の細胞種によって決まるものであり、当業者には明らかであろう。
【０１１０】
ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２トランスジーンを、内在性ＯＣＴＮ２遺伝子の染色体部位に組み込むことを所望する場合には、遺伝子ターゲッティングが好ましい。つまり、このような手法を用いようとする場合には、内在性のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子と相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターを、染色体配列との相同性に基づく組換えを介して、内在性遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込みこと及びその機能を破壊することを目的として設計する。トランスジーンを特定の細胞種に選択的に導入して、その細胞種においてのみ内在性のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子を不活化することもできる。Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３（１９８４）。このような細胞種特異的不活化に要求される調節配列は、問題とする細胞種によって決まるが、このことは当業者には明らかであろう。
【０１１１】
トランスジェニック動物を作製したら、組換えＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子の発現を、標準的な手法を用いてアッセイすることができる。最初のスクリーニングをサザンブロット解析又はＰＣＲ技術によって行い、動物の組織を解析して、トランスジーンの組み込みが起こっているかどうかをアッセイする。トランスジェニック動物の組織中におけるトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルも、各種手法によって評価することができよう。それら手法の例としては、動物から得た組織試料のノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析及びＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子が発現している組織の試料を、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２トランスジーン産物に特異的な抗体を使って、免疫細胞化学的に評価することもできる。
【０１１２】
アンチセンスポリヌクレオチド  アンチセンス法は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を設計することを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ転写産物に結合し、翻訳を妨害する。絶対相補性であることが好ましいが、必ずしも絶対相補性である必要はない。本明細書で言う、１つのＲＮＡの一部分に「相補的な」配列とは、そのＲＮＡとハイブリダイズできるのに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成するような配列を意味する。二重鎖アンチセンスポリヌクレオチドの場合には、二重鎖ＤＮＡの一本の鎖をテストするか、又は三重鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及びアンチセンスポリヌクレオチドの長さの両者によって決まる。一般に、ハイブリダイズするポリヌクレオチドが長ければ長いほど、含まれるＲＮＡとの不適正塩基対合が多くなるが、それでもやはり安定な二重鎖（場合によっては、三重鎖）を形成することができる。当業者ならば、許容できる不適正塩基対合の程度を標準的な技法を用いて確認し、ハイブリダイズした複合体の融点を測定することができよう。
【０１１３】
例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’−非翻訳配列とＡＵＧ開始コドンとを含むメッセンジャーＲＮＡの５’末端と相補的であるオリゴヌクレオチドは、翻訳阻害において最も効率良く作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’−非翻訳配列と相補的である配列が、ｍＲＮＡの翻訳阻害において同様に有効であることが最近明らかにされている。Ｗａｇｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３（１９８４）。したがって、例えば図８及び図６に示すヒト遺伝子などの、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子の５’−又は３’−非翻訳すなわち非コード領域を、アンチセンス法において使用して内在性のＯＣＴＮ２ｍＲＮＡの翻訳を阻害できる可能性がある。ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域と相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補的な配列を含んでいるほうがよい。
【０１１４】
ｍＲＮＡコード領域と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳阻害効率はあまり高くないが、本発明にしたがって使用可能である。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡの５’−、３’−又はコード領域とハイブリダイズするように設計されていようといまいと、アンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチド分の長さを有していなければならず、前記オリゴヌクレオチドの長さは、ヌクレオチド６個から５０個分であることが好ましい。特定の態様においては、オリゴヌクレオチドの長さは少なくともヌクレオチド１０個分、少なくともヌクレオチド１７個分、少なくともヌクレオチド２５個分、又は少なくともヌクレオチド５０個分である。
【０１１５】
標的配列の選択の如何にかかわらず、先ずｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究を行ってアンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害能を定量化することが好ましい。これらの研究では、アンチセンスによる遺伝子発現阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物学的影響とを区別するコントロールを使用することが好ましい。また、これらの調査では、標的ＲＮＡ又はタンパク質のレベルと、内部コントロ−ルＲＮＡ又はタンパク質のレベルとを比較することが好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使って得られた結果を、コントロールオリゴヌクレオチドを使って得られた結果と比較することも考慮しておく。コントロールオリゴヌクレオチドは、テストオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さを有していることが好ましく、また、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに必要な程度にアンチセンス配列と異なっていることが好ましい。
【０１１６】
前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、又はＲＮＡ、又はそれらのキメラ混合物若しくは誘導体若しくは修飾体とすることができ、一本鎖又は二本鎖とすることができる。前記オリゴヌクレオチドは、その塩基部分、糖部分又はリン酸塩バックボーンを修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を向上させることができる。前記オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的宿主細胞受容体）などのその他の付加されている基、又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３（１９８９）、Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８（１９８７）、ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０に記載）若しくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４を参照）を通過する輸送を促進する薬剤、又はハイブリダイゼーション誘発性切断薬（Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８（１９８８）参照）、又は挿入剤（Ｚｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９（１９８８））などを含んでいてよい。このため、オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤又はハイブリダイゼーション誘発性切断薬などの他の分子とコンジュゲートさせることができる。
【０１１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−テオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、２−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでいてよい。ただし、本発明における修飾塩基部分はこれらに限定されない。
【０１１８】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を有していてよい。ただし、本発明はこれらに限定されない。
【０１１９】
別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル及びホルムアセタルから成る群より選択される少なくとも１つの修飾ホスフェートバックボーン、又はそれらバックボーンのいずれか１つのアナログを含む。
【０１２０】
別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のβ−ユニットとは反対に２本の鎖が互いに平行である相補的ＲＮＡと、特異的二重鎖ハイブリッドを形成する。Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５（１９８７）。前記オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６１３１（１９８７））、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７（１９８７））である。
【０１２１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業界で知られている標準的な方法、例えば自動ＤＮＡ合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から購入できる合成機など）を使って合成することができる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８）に記載の方法によって合成することができ、また、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された多孔ガラスポリマー支持体を使って調製できる。Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４４８（１９８８）。
【０１２２】
ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２コード領域配列と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使うことができるが、転写非翻訳領域と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが最も好ましい。
【０１２３】
このようなアンチセンス分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２を発現する細胞、例えば、胃腸管及び免疫系の細胞に送達することができる。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に送達する多くの方法が開発されている。例えば、アンチセンス分子を組織部位に直接注射することもできるし、所望の細胞を標的にするよう設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面で発現された受容体又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体に結合しているアンチセンス）を全身投与して、内因性ｍＲＮＡの翻訳を十分抑制できるような細胞内濃度を達成することもできる。このような方法については、当業界では知られている。
【０１２４】
リボザイム  ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ転写産物を触媒作用によって切断するように設計されたリボザイム分子を使って、ＯＣＴＮ２ｍＲＮＡの翻訳及びＯＣＴＮ２の発現を阻止することもできる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３６４、Ｓａｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２（１９９０））。部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断する種々のリボザイムを使って、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムを使うことが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域の影響を受ける位置において、ｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下のような２塩基配列、５’−ＵＧ−３’、を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び作製については、当業界ではよく知られている。Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、３３４：５８５（１９８８）。
【０１２５】
本発明のリボザイムはまた、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中で天然に存在するエンドリボヌクレアーゼ（ＩＶＳ又はＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）などの、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本明細書では以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」と言う）も含む。このエンドリボヌクレアーゼについてはＣｅｃｈ及び共同研究者達が詳細に記載している。Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５７４（１９８４）、Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：５７４（１９８４）；Ｚａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：４７０（１９８６））；Ｚｕｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：４２９（１９８６）；ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  ４７：２０７（１９８６）。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８塩基対配列を有し、ハイブリダイゼーションの後には標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明には、ＯＣＴＮ２に存在する８塩基対活性部位配列を標的とするＣｅｃｈ型リボザイムも含まれる。
【０１２６】
ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２発現のモジュレーション法  内在性ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子の発現は、それら遺伝子を不活化する若しくは「ノックアウトする」ことによって、又はそのプロモーターを標的相同的組換えを使って不活化する若しくは「ノックアウトする」（米国特許第５，４６４，７６４号参照）ことによって減じることができる。例えば、内在性ＯＣＴＮ２（ＯＣＴＮ２遺伝子のコード領域又は調節領域のいずれか）と相同なＤＮＡが隣接している非機能性変異ＯＣＴＮ２（又は配列にまったく関連のないＤＮＡ配列）を、選択可能マーカー及び／若しくは負の選択性マーカーと共に、又はそれらを用いずに使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＯＣＴＮ２を発現する細胞をトランスフェクトすることができる。標的相同的組換えによりＤＮＡ構築物の挿入を行うと、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２遺伝子は不活化される。このような手法は、農業分野での利用に特に好適であって、同分野では、ＥＳ（胚幹）細胞の修飾を利用して不活性なＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２を有する動物の子孫を作製することができる。しかし、適切なウィルスベクター、例えば弓状核又は脈絡叢などの脳組織への送達のためのヘルペスウィルスベクターを使って、ｉｎ  ｖｉｖｏの必要な部位に、組換えＤＮＡ構築物が直接投与又はターゲティングされるならば、この手法はヒトへの利用に適合させることもできる。
【０１２７】
また別の実施形態においては、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２発現のモジュレーションは、細胞を候補化合物と接触させ、その細胞中のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を測定する方法で同定される。候補化合物存在下でのＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを、候補化合物非存在下でのＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較する。この比較に基づいて、候補化合物は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２発現のモジュレーション物質であると同定される。例えば、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量が、候補化合物非存在下に比べてその存在下で多い（統計学的に有意に多い）場合、その候補化合物は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激物質であると同定される。また、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量が、候補化合物非存在下に比べてその存在下で少ない（統計学的に有意に少ない）場合、その候補化合物は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害物質であると同定される。細胞中でのＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載の、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡ又はタンパク質検出法によって測定することができる。
【０１２８】
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ９０：６９０９（１９９３）；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ９１：１１４２２（１９９４）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８（１９９４）；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３）；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９（１９９４）；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１（１９９４）；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３（１９９４）などの技術に見ることができる。
【０１２９】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、又はビーズ（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号及び同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２）若しくはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；及びＦｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１）に載せて提供することができる。
【０１３０】
診断への応用  本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の機能にとって重要なタンパク質を含む哺乳動物の細胞の区画を同定するのに有用である。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２に特異的な抗体は、前述のように産生することができる。次いでタンパク質の正常な位置を、ｉｎ  ｓｉｔｕで又は分別した細胞を用いて、標準的な免疫学的又は免疫組織化学的手法のいずれかによって決定する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、１９８２）を参照のこと）。
【０１３１】
また、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の発現は、標準的なノーザンブロット解析法でアッセイすることができるし、又はＰＣＲを併用してそのアッセイを行うこともできる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前掲；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｅｄ．、Ｈ．Ａ．Ｅｈｒｌｉｃｈ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．））。実際の例については、前述した例を参照のこと。所望又は必要であれば、解析を行いＯＣＴＮ２配列における点変異を検出することもできる（例えば、よく知られているポリヌクレオチドミスマッチ検出法を用いて）。前記した手法はすべて、本明細書に記載のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２配列によって可能となる。
【０１３２】
したがって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び抗体は、患者がＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の異常な発現に関連する疾患を有しているか否かを判定する方法において使用することができる。この方法は、患者から得た生物学的試料のＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の発現レベルを定量化することによって実施することができる。コントロールとして、健常な被験者から得た生物学的試料を使って定量化を行うこともできる。
【０１３３】
ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の発現は、例えば、生物学的試料中でのＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２ｍＲＮＡの発現を定量化することによって遺伝子の発現レベルで評価することができ、また、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２タンパク質の発現を定量化することによってタンパク質の発現レベルで評価することもできる。定量化は前記手法を用いて実施することができるが、それらの手法は当業者であれば十分実施可能な範囲のものである。
【０１３４】
仮に、患者がＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の異常な発現又は活性に関連した障害を有していると判定されたら、その患者には、その発現又は活性をモジュレーションする化合物を投与することができる。例えば、患者には、ＯＣＴＮ２の発現を阻害する、小分子、アンチセンスポリヌクレオチド分子又はリボザイムなどの化合物を投与することができる。また患者には、ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２の活性を阻害する化合物を投与することもできる。ＯＣＴＮ１又はＯＣＴＮ２と特異的に結合する抗体もこのような目的で使用することができる。他の選択としては、患者に、ＯＣＴＮ２の発現又は活性を高めるような化合物を投与することもできる。ＯＣＴＮ２の発現又は活性を阻害する又は高めるような化合物には、合成分子が含まれる。これらの治療方法を用いて、炎症性腸疾患、及び細胞増殖が関与している、炎症性腸疾患に関連する諸疾患を治療することができる。
【０１３５】
本発明の実施形態の１つ又はそれ以上についての詳細は、上記の添付の説明で述べてある。本明細書に記載の方法及び物質に類似又は等価の方法及び物質を、本発明の実施又は試験において使用することもできる。しかし、好ましい方法及び物質は、本明細書にこれまで記載した通りである。本発明のその他の特徴、目的及び利点については、本明細書の記載及び添付の請求の範囲から明らかであろう。本明細書及び添付の請求の範囲において、文脈から単数であることが疑いようのない場合を除き、単数形には複数のものが含まれる。特に明示しないかぎり、本明細書で使用するすべての科学的及び技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているような意味を有するものとする。本明細書で引用したすべての特許文献及び刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
これまでの記載内容は単に例示を目的としたものであり、本発明を、開示されている形態そのものに限定しようとするものではない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】炎症組織におけるＯＣＴＮ１及びＯＣＴＮ２の発現量の差を示す一連のノーザンブロット図である。ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２又はＧＡＰＤＨでプローブしたノーザンブロットを図１の左側に示す。ＯＣＴＮ１の発現（右上）又はＯＣＴＮ２の発現（右下）に対応する相対的吸光度（ＧＡＰＤＨに合わせて標準化）の棒グラフを、グラフ上に吸光度±ＳＥＭ値を表示して、図１の右側に示す。有意とするｐ値は、炎症組織に対応する棒グラフの上方に示してある。ＨＣ：正常なヒト結腸。Ｊ：ジャーカットヒト白血病性Ｔ細胞。ＵＣ−Ｎ：潰瘍性大腸炎患者の非炎症組織。ＵＣ−Ｉ：瘍性大腸炎患者の炎症組織。ＣＤ−Ｎ：クローン病患者の非炎症組織。ＣＤ−Ｉ：クローン病患者の炎症組織。
【図２】ＯＣＴＮ２遺伝子のプロモーター領域のヒートショックエンハンサー（ＨＳＥ）におけるＧ−２０７Ｃ変異によって、ヒートショック及びアラキドン酸処理下で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のダウンレギュレーションが起こることを示す一連の棒グラフである。野生型（Ｇ−２０７）又は変異（Ｇ−２０７Ｃ）対立遺伝子についてＯＣＴＮ２プロモーターの２．７−ｋｂ領域に融合したルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する構築物を、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＯＣＴＮ２プロモーター構築物の相対的発光を、未処理コントロール細胞（３７℃）、標準的ヒートショック（４２℃）及び２０μＭアラキドン酸（アラキドン酸処理）に暴露した細胞において測定した。各値は、３つの独立して行った実験の結果を平均したものである。誤差を表す線はＳＥＭである。Ｇ：ＯＣＴＮ２プロモーターの−２０７番の非リスク対立遺伝子。Ｃ：リスク対立遺伝子。
【図３】Ｌ５０３又はＬｌ５０３対立遺伝子のＯＣＴＮ１ｃＤＮＡをトランスフェクトしたヒトＨｅＬａ細胞（図３Ａ）及びヒトＯＣＴＮ２欠損細胞系（図３Ｂ）によるカルニチン輸送を示す一連の棒グラフである。ｐｃＤＮＡ３ベクターのみをトランスフェクトした細胞をコントロールとした。ＮａＣｌを含有する培地において、ｐＨ７．５で［３Ｈ］−カルニチン（２０ｎＭ）の取り込みを測定した。カルニチンの取り込みをｃｐｍ／ｍｇタンパク／分で算出し、値をトランスフェクション効率として補正し、取り込みを空トランスフェクトした細胞の値に関して標準化した。点数は、３つ（図３Ａ）又は２つ（図３Ｂ）の独立した実験における、３個（図３Ａ）から６個（図３Ｂ）の測定値の平均±ＳＥ値である。
【図４】ＯＣＴＮ１の突然変異５０３Ｆ及び野生型５０３Ｌ両変異体によるＴＥＡ流出を示す棒グラフである。放射線標識ＴＥＡの細胞内貯留を、０時間に保持されていた最大量に対するパーセンテージで示す。ＯＣＴＮ１−Ｆ：ＯＣＴＮ１のＬ５０３Ｆ変異体。ＯＣＴＮ１−Ｌ：ＯＣＴＮ１の野生型５０３Ｌ変異体。点数は３つの測定値の平均±ＳＥ値である。
【図５】２．７ｋｂのＯＣＴＮ２プロモーター領域を含むｐＲＬヌルベクターのルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図６】ＯＣＴＮ２遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列を示す図である。エクソンの位置を黄色でハイライトしてある。使用されるプライマー配列の位置は緑色でハイライトしてある（図に示すようにＯ２Ｘ１Ｆプライマーはエクソン１内に位置し、Ｏ２Ｘ１Ｒは逆向きの相補配列である）。コード配列の開始コドン及び終止コドンは赤色でハイライトしてある。ＯＣＴＮ２遺伝子の５’領域内の変異をハイライトし、多型性塩基の標準ＤＮＡ命名法で示す。すなわち、「Ｋ」はＧ又はＴを、「Ｙ」はＣ又はＴを、「Ｒ」はＡ又はＧを、「Ｓ」はＣ又はＧを意味する。
【図７】オートラジオグラフによるＯＣＴＮ２遺伝子からのシグナルを、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の場合と比較して相対的光学密度（「ＲＯＤ」）として表した、ＯＣＴＮ２遺伝子の発現レベルを示すグラフ図である。青い棒は、外科的に切除した炎症を起こしていないＧＩ管組織から抽出されるＲＮＡの発現レベルを表し、赤い棒は、外科的に切除した炎症ＧＩ管組織から抽出されるＲＮＡ用いた発現レベルを表す。個々のＲＮＡ試料は、各棒の下方に記したそれぞれ独自の識別番号（例えば７４０３）及び患者の診断（「ＵＣ」は潰瘍性大腸炎、「ＣＤ」はクローン病を表す）によって識別される。コントロールとしての非罹患資料は、「ＨＣ男性」及び「ＨＣ女性」と表示されるが、それらは炎症性腸疾患を罹患していない個体からの資料である。図７Ａから図７Ｄはそれぞれ、一回の「ノーザンブロット」（すなわち、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成実験）で得られたデータを表し、個々の試料の結果を上段のパネル、炎症性及び非炎症性試料について、それらの結果の平均を下段のパネルに示してある。下段のパネルには、各棒にその平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表示してある。統計的ｐ値も下段のパネルに表示する。図７Ｅは、同一の個体から取り出した炎症及び非炎症組織の対に関して、個々の試料の結果を示す。個々の識別番号、診断名、値及び標準誤差を図５Ａから５Ｆのように示し、すべての罹患及び非罹患サンプルについての結果を平均したものを示す。個々の識別番号、診断名、値及び標準誤差を、図７Ａから図７Ｄの様に示す。
【図８】ＯＣＴＩＮ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列を示す図である。エクソンの位置は黄色でハイライトしてある。使用したオリゴヌクレオチドプライマー配列の位置は緑色でハイライトしてある（図に示すようにＯ１Ｘ９Ｒプライマーは逆の相補的配列である）。コード配列の開始及び停止コドンは赤でハイライトしてある。遺伝子の第９エクソン内の変異をハイライトし、多型塩基の標準的ＤＮＡ命名法、すなわち「Ｙ」はＣ又はＴを意味する、で示す。
【図９】ＯＣＴＩＮ１の既知のｍＲＮＡ配列から決定されるような、アミノ酸配列を示す図である。各文字は、標準的命名法によって定義される１つのアミノ酸を表している。ＯＣＴＮ１の第９エクソン変異によって引き起こされるアミノ酸の変化の位置を「Ｌ／Ｆ」で示すが、これは、ゲノムＤＮＡ中に「Ｃ」対立遺伝子が存在する場合は、ロイシン（「Ｌ」）がＯＣＴＮ１タンパク質中の相当するアミノ酸であり、ゲノムＤＮＡ中に「Ｔ」対立遺伝子が存在する場合は、フェニルアラニン（「Ｆ」）がＯＣＴＮ１タンパク質中の相当するアミノ酸であることを示している。
【図１０】オートラジオグラフィーによるＯＣＴＮ１遺伝子からのシグナルを、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の場合と比較して相対的光学密度（「ＲＯＤ」）として表した、ＯＣＴＮ１遺伝子の発現レベルを示すグラフ図である。青い棒は、外科的に切除した炎症を起こしていないＧＩ管組織から抽出されるＲＮＡの発現レベルを表し、赤い棒は、外科的に切除した炎症ＧＩ管組織から抽出されるＲＮＡの発現レベルを表す。個々のＲＮＡ試料は、各棒の下方に記したそれぞれ独自の識別番号（例えば７４０３）及び患者の診断（「ＵＣ」は潰瘍性大腸炎、「ＣＤ」はクローン病を表す）によって識別される。コントロールとしての非罹患試料は、「ＨＣ男性」及び「ＨＣ女性」と表示されるが、それらは炎症性腸疾患を罹患していない個体からの試料である。図１０Ａから図１０Ｃはそれぞれ、一回の「ノーザンブロット」で得られたデータ（すなわち、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド形成結果）を表し、各ブロットについて、個々の試料の結果を上段のパネル、炎症及び非炎症試料について、それらの結果の平均を下段のパネルに示してある。下段のパネルには、各棒にその平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表示してある。統計的ｐ値も下段のパネルに表示してある。図１０Ｄは、同一の個体から取り出した炎症及び非炎症組織の対に関して、個々の試料の結果を示す。個々の識別番号及び診断名を、図１０Ａから図１０Ｃの様に示す。図１０Ｅは、罹患及び非罹患試料の結果の平均値を示す。個々の識別番号、診断名、値及び標準誤差を、図１０Ａから図１０Ｃの様に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【国際調査報告】
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