(57)【要約】本発明は次のアミノ酸配列を含む新規α−コノトキシン様ペプチドに関する：Ｘａａ１ＣＣＳＸａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＣＸａａ５Ｘａａ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｃ−ＮＨ２（式中、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ３はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ２ないしＸａａ８およびＸａａ１１のそれぞれは独立して任意のアミノ酸であり；Ｘａａ９はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ１０はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｘａａ１１は所望により存在しなくてもよく；Ｃ末端は所望によりアミド化されていてもよい。ただし、ペプチドはα−コノトキシンＥｐ１またはα−コノトキシンＩｍ１でないとする）。該ペプチドは疼痛の治療または予防、神経損傷からの回復、および発作などの痛みのある神経病状態の治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：
Ｘａａ１ＣＣＳＸａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＣＸａａ５Ｘａａ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｃ−ＮＨ２      （配列番号１１）
［式中、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ３はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ２ないしＸａａ８およびＸａａ１１のそれぞれは独立して任意のアミノ酸であり；Ｘａａ９はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ１０はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｘａａ１１は存在しなくてもよく；Ｃ末端はアミド化されていてもよい］
を含む単離されたα−コノトキシン様ペプチド：ただし、当該ペプチドはα−コノトキシンＥｐ１またはα−コノトキシンＩｍ１以外のペプチドである。
【請求項２】
Ｘａａ２がＤ、ＨまたはＮであり；Ｘａａ４がＡ、ＰまたはＲであり；Ｘａａ５がＮ、ＡまたはＹであり；Ｘａａ６がＡ、Ｙ、Ｈ、ＭまたはＶであり；Ｘａａ７がＮまたはＤであり；Ｘａａ８がＨまたはＮであり；Ｘａａ１１はＩまたはＹである請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
次のアミノ酸配列：
Ｘａａ１ＣＣＳＸａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＣＸａａ５Ｘａａ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｃ−ＮＨ２      （配列番号１０）
［式中、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ２はＤ、ＨまたはＮであり；Ｘａａ３はＰまたは４−Ｈｙｐであり；Ｘａａ４はＡ、ＰまたはＲであり；Ｘａａ５はＮ、ＡまたはＹであり；Ｘａａ６はＡ、Ｙ、Ｈ、ＭまたはＶであり；Ｘａａ７はＮまたはＤであり；Ｘａａ８はＨまたはＮであり；Ｘａａ９はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ１０はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｘａａ１１はＩまたはＹであり；Ｃ末端がアミド化されている］
を含む、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘａａ１がＧまたはＤであり；Ｘａａ３がＲであり；Ｘａａ４がＮであり；Ｘａａ５がＹであり；Ｘａａ６がＤであり；Ｘａａ７がＨであり；Ｘａａ１０がＩである請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
次のアミノ酸配列：
ＧＣＣＳＤＸａａ１ＲＣＮＹＤＨＸａａ２Ｘａａ３ＩＣ      （配列番号１）
［式中、Ｘａａ１はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ２はプロリンまたはヒドロキシプロリンであり；Ｘａａ３はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｃ末端はアミド化されていてもよい］
を含む、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項６】
１またはそれ以上の以下の能力を有する請求項１ないし５のいずれか一つに記載のペプチド：
（ａ）ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲ）を阻害する能力、
（ｂ）哺乳動物において鎮痛薬として作用する能力、または
（ｃ）神経損傷からの回復を促進する能力。
【請求項７】
ラットにおいて筋肉型ニコチン性応答に影響を及ぼさない請求項６記載のペプチド。
【請求項８】
ＧＣＣＳＤＰＲＣＮＹＤＨＰＥＩＣ−ＮＨ２（配列番号２）
ＧＣＣＳＤ４−ＨｙｐＲＣＮＹＤＨＰガンマカルボキシ−ＧｌｕＩＣ−ＮＨ２（配列番号７）
ＤＣＣＳＮＰＰＣＡＨＮＮＰＤＣ−ＮＨ２（配列番号８）；および
ＧＣＣＳＨＰＡＣＹＡＮＮＱＤＹＣ−ＮＨ２（配列番号９）
（それぞれにおいてＣ末端システインはアミド化されている）
のいずれかの配列を含む請求項１ないし４のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号２に示す配列を有する請求項８記載のペプチド。
【請求項１０】
ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターの活性を阻害する能力および／または痛みを阻害する能力、および／または神経損傷からの回復速度を促進する能力を保持する請求項８または９記載のペプチドの付加、置換、欠失またはペプチド模倣変異体。
【請求項１１】
ペプチドがＣＣ−（Ｘ）４−Ｃ−（Ｘ）７−（Ｃ）フレームワークにおいて４つのシステイン残基を有する請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１２】
翻訳後修飾を受ける請求項１ないし１１のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１３】
Ｃ末端がアミド化されている請求項１ないし３および５ないし７のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項１４】
翻訳後修飾が、プロリンのヒドロキシル化またはグルタメートのγ−カルボキシル化である請求項１２記載のペプチド。
【請求項１５】
（ａ）請求項１ないし１０のいずれか一つに記載のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）において定義されたものと相補性のヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）のいずれかにおいて定義された配列とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸分子；
を含む単離または合成核酸分子。
【請求項１６】
（ｃ）において核酸分子がストリンジェントな条件下で（ａ）の分子とハイブリッド形成できる請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１７】
（ｄ）において核酸分子が（ａ）の分子と少なくとも約７５％の配列同一性を有する請求項１５記載の核酸分子。
【請求項１８】
少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で配列番号５または配列番号６に示す配列とハイブリッド形成する請求項１５ないし１７のいずれか一つに記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号３に示す配列を有する請求項１５ないし１７のいずれか一つに記載の核酸分子。
【請求項２０】
ベクター部分と請求項１５ないし１９のいずれか一つに記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
【請求項２１】
請求項１ないし１４のいずれか一つに記載のペプチドを生理学的に許容される担体とともに含む組成物。
【請求項２２】
ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターにより媒介される状態の治療法であって、請求項１ないし１４のいずれか一つに記載の有効量のペプチドをかかる治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項２３】
状態がニューロンｎＡＣｈＲにより媒介される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
状態が、発作、疼痛、てんかん、ニコチン中毒、統合失調症、パーキンソン病、小細胞肺癌およびアルツハイマー病からなる群から選択される請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２５】
状態が、神経性または神経障害性疼痛に付随する状態から生じる疼痛である請求項２２ないし２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２６】
疼痛を治療または予防する方法であって、有効量の本発明のペプチドをかかる治療を必要とする哺乳動物に投与する処置を含む方法。
【請求項２７】
疼痛が、癌性疼痛、術後痛、口腔または歯痛、関連三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、幻想肢痛、線維筋痛、および反射性交感神経性ジストロフィーからなる群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
疼痛が、炎症状態、関節リウマチおよび他の炎症性関節炎、または変形性関節炎に付随する請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
神経損傷からの回復を促進する方法であって、有効量の本発明のペプチドをかかる治療を必要とする哺乳動物に投与する処置を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファコノトキシン（α−コノトキシン）クラスの新規ペプチドおよび疼痛の治療または予防、神経損傷からの回復および疼痛性神経病状態、たとえば発作の治療におけるその使用に関する。本発明はさらに、これらのペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明のペプチドは、ニコチン性アセチルコリンレセプター生理学および薬理学の研究用試薬としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において記載する特許または特許出願を含む全ての引例は出典明示により本発明の一部とする。いずれの引例も従来技術を構成しない。引例の議論は、その著者が主張し得ることを記載し、本出願者らは記載された書類の正確さおよび適切さを調べる権利を留保する。多くの従来技術の刊行物を本明細書において記載するが、この引例はこれらの書類が当該分野、オーストラリアまたは他の国における一般常識の一部を形成することを認めない。
コーヌス（Ｃｏｎｕｓ）属の捕食性海洋性巻貝（イモガイ）は、毒物注入により獲物を捕獲する非常に多様な海洋性軟体動物である（Ｓｃｒｅｅｎｉｖａｓａｎ、２００２）。典型的なイモガイの毒は、約１００の異なるペプチドを含む複雑な混合物であり、異なるイオンチャンネルおよびレセプターを標的とし、その機能を妨害し、その結果、獲物を動けなくする（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９０；ＯｌｉｖｅｒａおよびＣｒｕｚ、２００１）。
【０００３】
存在するペプチドの混合物は、イモガイの種類および餌にする獲物によって変わり、個々の軟体動物においてさえも時間によって変化し得る（Ｌｅｗｉｓら、１９９４；Ｊｏｎｅｓら、１９９６；Ｂｉｎｇｈａｍら、１９９６）。コーヌス毒においてみられるペプチドの種類は、α−、αＡ−およびΨ−コノトキシン（ニコチン性アセチルコリンレセプターでの拮抗物質）、μ−、μＯ−コノトキシン（電圧ゲート制御ナトリウムイオンチャンネルでの拮抗物質）、δ−コノトキシン（電位感受性ナトリウムチャンネルでの不活化を阻害する作用物質）、ω−コノトキシン（電位感受性カルシウムチャンネルでの拮抗物質）、κ−およびκΑ−コノトキシン（カリウムチャンネルでの拮抗物質）、σ−コノトキシン（５ＨＴレセプターの阻害物質）、χ−コノトキシン（ノルアドレナリン吸収の阻害物質）、コナントキンおよびコノダイン（ＮＭＤＡレセプターでの拮抗物質）、ρ−コノトキシン（α１−アドレナリン受容体の阻害物質）、コノルファミド（Ｍａｉｌｌｏら、２００１）、およびコンツラキン（神経伸張レセプターの阻害物質）を包含する。論評については、ＪｏｎｅｓおよびＢｕｌａｊ、２０００；ＭｃＩｎｔｏｓｈおよびＪｏｎｅｓ、２００１参照）。
α−コノトキシンは典型的には、魚または海洋性巻貝または海洋性蠕虫を捕食するイモガイにおいて見いだされる。これらは典型的には１２〜１９アミノ酸長であり、２のジスルフィド結合を形成する４のシステイン残基を有し、２−ループ構造を形成する（ＭｃＩｎｔｏｓｈら、１９９９）。これらは、ニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲ）を阻害する能力により特徴づけられる。ｎＡＣｈＲはカチオン伝導孔の周りに配置された５のサブユニットからなるリガンドゲート制御イオンチャンネルである（Ｓａｒｇｅｎｔ  １９９３；Ｌｕｋａｓら、１９９９；Ｋａｒｌｉｎ、２００２）。
【０００４】
ｎＡＣｈＲには２つの主な種類：
ニューロン型；および
筋肉型
がある。
ニューロン型ｎＡＣｈＲは、中枢および末梢神経系においてシナプス前およびシナプス後の両方に存在するが、筋肉型ｎＡＣｈＲは骨格神経筋接合でシナプス後に見いだされる（Ｗｏｎｎａｃｏｔｔ、１９９７）。これらのレセプター間の主な違いは、そのサブユニット組成である。ニューロン型レセプターはαおよびβサブユニットの組み合わせまたはαサブユニット単独から形成されるが、筋肉型レセプターは、α、β、γおよびε（またはδ）サブユニットからなる。機能的レセプターは異なる組み合わせのサブユニットを有し（Ｋａｒｌｉｎ、２００２参照）、一連の薬理学的特性を有する（論評についてはＡｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅら、１９９７；Ｌｕｋａｓら、１９９９参照）。特異的α−コノトキシンは、筋肉およびニューロンｎＡＣｈＲおよびそのサブタイプに対して異なる親和性および選択性を示す。
【０００５】
α−コノトキシンクラスの化合物は、ニューロンｎＡＣｈＲを含む障害の治療において有用であり得る。ニューロンｎＡＣｈＲはアルツハイマー病（Ｇｕａｎら、２０００）、パーキンソン病（Ａｕｂｅｒｔら、１９９２）、精神分裂病（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、１９９４）、小細胞肺癌（Ｃｏｄｉｇｎｏｌａ、１９９６）、ニコチン中毒（米国特許第５７８０４３３号および米国特許第５８６６６８２号）、疼痛（Ｍａｒｕｂｉｏら、１９９９）、および神経筋ブロッキング剤、たとえば筋弛緩薬（米国特許第６２６８４７３号、第６２７７８２５号）およびある種の形態のてんかん（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら、１９９５）の病態生理学に関与する。
もう一つ別の種類のコノトキシン、ω−コノトキシンクラスは、発作および疼痛の基礎化合物を提供してきた（Ｎｅｕｒｅｘ  ＳＮＸ−１１１、Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  ＣＩ−１００９、またはＥｌａｎのジコノチド）およびω−コノトキシンＣＶＩＤ（ＡＭＲＡＤ  ＡＭ３３６）は現在、発作（Ｚｈａｏら、１９９４；Ｈｅａｄｉｎｇ、１９９９；Ｓｈｅｎら、２０００；ＪｏｎｅｓおよびＢｕｌａｊ、２０００）および慢性疼痛（Ｂｏｗｅｒｓｏｘら、１９９６；１９９７；Ｊａｉｎ、２０００；ＪｏｎｅｓおよびＢｕｌａｊ、２０００）の徴候の治療に関して臨床試験を受けている。これらの化合物は、神経におけるＮ−タイプカルシウムチャンネルを標的とする。しかしながら、ω−コノトキシンクラスのメンバーは数人の患者においては望ましくない副作用を有し（ＰｅｎｎおよびＰａｉｃｅ、２０００）、米国食品医薬品局は、癌性疼痛の治療についてジコノチド（ＥｌａｎによりＰｒｉａｌｔと改名）について繰り返し第ＩＩＩ期臨床試験を行うことを要請している。
【０００６】
さらにもう一つの種類のコノペプチドであるコナントキンは、１０〜３０アミノ酸を有し、好ましくは２以上のγ−カルボキシグルタミン酸残基を有するが、疼痛を含む神経および精神障害の治療用に、たとえば、鎮痛薬として開発された（米国特許第６２７７８２５号）。加えて、その標的レセプターがさらに限定されるコノペプチドの新規種類（ＭｃＩｎｔｏｓｈら、２０００）はマウスにおいて鎮痛活性を有することが証明されている。
本発明者らは最近α−コノトキシンＰｎＩＢの１０位の特定のアミノ酸（Ｌｅｕ１０）がニューロン型ニコチン性応答の有効性賦与の原因であることを見いだした（Ｂｒｏｘｔｏｎら、２０００）。本発明者らはさらに、Ｃｏｎｕｓ  ｐｅｎｎａｃｅｕｓから得られるα−コノトキシンＰｎＩＡおよびＰｎＩＢのスプライス変異体はｎＡＣｈＲのα７サブユニットに対して向上された選択性を示すことも見いだした（米国特許出願番号０９／６３９５６５；Ｈｏｇｇら、１９９９；Ｂｒｏｘｔｏｎら、２０００も参照）。
本発明者らは、従来調査されていないＣｏｎｕｓ種、Ｃｏｎｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｉａｅ（オーストラリアの北西海岸に沿って見られる）が予想外に強力な鎮痛活性を有する新規α−コノトキシンを有することを見いだした。驚くべきことに、あるα−コノトキシン（Ｖｃ１．１）の感覚神経機能を阻害する能力、および結果としてその鎮痛活性は、Ｃｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓから得られるω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（ジコノチド、Ｐｒｉａｌｔ）よりもさらに高い。加えて、本発明者らは、このペプチドの翻訳後修飾は鎮痛活性が不足しているが、親化合物の神経損傷からの回復を促進する能力を保持することを見いだした。本発明者らはさらに、２つの他の新規α−コノトキシン、Ｃｏｎｕｓ  ａｎｅｍｏｎｅから得られるコノトキシンＡｎ１．１およびＣｏｎｕｓ  ｖｉｒｇｏから得られるコノトキシンＶｇ１．１（Ｖｃ１．１と類似した配列を有し、類似した薬理学的作用を有する
）を同定した。
【０００７】
第一の態様において、本発明は次のアミノ酸配列を含む単離されたα−コノトキシンペプチドを提供する：
Ｘａａ１ＣＣＳＸａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＣＸａａ５Ｘａａ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｃ−ＮＨ２
（配列番号１１）（式中、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ３はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ２ないしＸａａ８およびＸａａ１１のそれぞれは独立して任意のアミノ酸であり；Ｘａａ９はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ１０はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｘａａ１１は所望により存在しなくてもよく；Ｃ末端は所望によりアミド化されていてもよい。ただし、ペプチドはα−コノトキシンＥｐｉまたはα−コノトキシンＩｍ１でないとする）。
好ましくは、Ｘａａ２はＤ、ＨまたはＮであり；Ｘａａ４はＡ、ＰまたはＲであり；Ｘａａ５はＮ、ＡまたはＹであり；Ｘａａ６はＡ、Ｙ、Ｈ、ＭまたはＶであり；Ｘａａ７はＮまたはＤであり；Ｘａａ８はＨまたはＮであり；Ｘａａ１１はＩまたはＹである。
【０００８】
さらに好ましくは、ペプチドは、次のアミノ酸配列を含む：
Ｘａａ１ＣＣＳＸａａ２Ｘａａ３Ｘａａ４ＣＸａａ５Ｘａａ６Ｘａａ７Ｘａａ８Ｘａａ９Ｘａａ１０Ｘａａ１１Ｃ−ＮＨ２
（配列番号１０）（式中、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ２はＤ、ＨまたはＮであり；Ｘａａ３はＰまたは４−Ｈｙｐであり；Ｘａａ４はＡ、ＰまたはＲであり；Ｘａａ５はＮ、ＡまたはＹであり；Ｘａａ６はＡ、Ｙ、Ｈ、ＭまたはＶであり；Ｘａａ７はＮまたはＤであり；Ｘａａ８はＨまたはＮであり；Ｘａａ９はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ１０はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｘａａ１１はＩまたはＹであり；Ｃ末端はアミド化されている。
なお一層好ましくは、Ｘａａ１はＧまたはＤであり；Ｘａａ３はＲであり；Ｘａａ４はＮであり；Ｘａａ５はＹであり；Ｘａａ６はＤであり；Ｘａａ７はＨであり；Ｘａａ１０はＩである。
最も好ましくは、ペプチドは次のアミノ酸配列：
ＧＣＣＳＤＸａａ１ＲＣＮＹＤＨＸａａ２Ｘａａ３ＩＣ    ［配列番号１］
（式中、Ｘａａ１はプロリン、ヒドロキシプロリンまたはグルタミンであり；Ｘａａ２はプロリンまたはヒドロキシプロリンであり；Ｘａａ３はアスパルテート、グルタメートまたはγ−カルボキシグルタメートであり；Ｃ末端は所望によりアミド化されていてもよい）を含む。さらに好ましくは、Ｘａａ１はプロリンであり；Ｘａａ２はプロリンであり；Ｘａａ３はグルタメートである。Ｃ−末端はアミド化されているか、または遊離カルボン酸基を含んでもよい。好ましくはＣ−末端はアミド化されている。
【０００９】
本発明のペプチドは、好ましくは１以上の次の能力を有する：
（ａ）ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプター（ｎＡＣｈＲ）を阻害する能力、または
（ｂ）哺乳動物において鎮痛薬として作用する能力、または
（ｃ）神経損傷からの回復を促進する能力。
好ましくは、ペプチドはラットにおいて筋肉型のニコチン性応答に影響をおよぼさない。
特に好ましい具体例において、ペプチドは、
ＧＣＣＳＤＰＲＣＮＹＤＨＰＥＩＣ−ＮＨ２（配列番号２）
ＧＣＣＳＤ４−ＨｙｐＲＣＮＹＤＨＰガンマカルボキシ−ＧｌｕＩＣ−ＮＨ２（配列番号７）
ＤＣＣＳＮＰＰＣＡＨＮＮＰＤＣ−ＮＨ２（配列番号８）；および
ＧＣＣＳＨＰＡＣＹＡＮＮＱＤＹＣ−ＮＨ２（配列番号９）
（それぞれにおいてＣ末端システインはアミド化されている）
のいずれかの配列を含む。
ペプチドはコーヌス属の軟体動物から単離することもできるし、あるいは合成または組み換え体であってもよいと理解される。天然に存在する配列において存在する１以上のＬ−アミノ酸はその対応するＤ−アミノ酸により置換することができる。
【００１０】
好ましくは、ペプチドは合成品であり、当該分野において公知の方法により、たとえば、ＢＯＣまたはｆＭＯＣ法を用いた公知固相ペプチド合成により調製することができる。ペプチドがコーヌス属の軟体動物から単離される場合、このコーヌスは好ましくはＣｏｎｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｉａｅ、Ｃｏｎｕｓ  ａｎｅｍｏｎｅまたはＣｏｎｕｓ  ｖｉｒｇｏである。
全てのジスルフィド結合形（Ｐｒｉｃｅ−Ｃａｒｔｅｒら、２００２参照）を包含するペプチドの全ての異性体は、本発明の範囲内に含まれると理解される。
ペプチドにおける４のシステインは酸化されて、２つの分子内ジスルフィド結合を提供する。この反応は自発的に進行するので、還元された形態は活性形態の供給源である。ジスルフィド結合によるシステイン残基のこの結合は、３通りの方法により起こり得る：第一と第二、第二と第三、または第三と第四システイン、続いて各場合において２つの残りのシステインを結合させる（Ｇｅｈｒｍａｎｎら、１９９８参照）。他の可能なスルフィドリル結合は、Ｃｏｎｕｓ  ａｕｌｉｃｕｓから得られるα−コノトキシンＡｕＩＢにおける４：６結合（Ｌｕｏら、１９９８）、またはＣｏｎｕｓ  ｉｍｐｅｒｉａｌｉｓから得られるα−コノトキシンＩｍ１においてみられる４：３ループ（ＭｃＩｎｔｏｓｈら、１９９４）などのニューロンニコチンレセプターでの活性ペプチドを産生することが知られているものである。
【００１１】
好ましくは、ペプチドは、ＣＣ−（Ｘ）４−Ｃ−（Ｘ）７−（Ｃ）（またはいわゆる４：７ループ）フレームワークにおいて４のシステイン残基を有し、ここにおいてジスルフィド結合によるシステイン残基の結合は第一と第三および第二と第四システインについて起こる。アミノ酸の欠失はより小さなループを生じさせ、これはさらに、活性なペプチド、たとえば、Ｃｏｎｕｓ  ａｕｌｉｃｕｓから得られる４：６ループα−コノトキシンＡｕＩＢを提供する。
主な配列のペプチド結合は、通常、トランス構造であるが、１以上のペプチド結合はシス構造をとり得る。さらに、ジスルフィド結合はそれ自体キラルであり、各ジスルフィド結合がとる特定の構造は、この異性の供給源の結果として４までの形態を許容する（Ｌｉｎら、１９９９）。これらの形態の全ては本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
さまざまな異性体間の相互交換は生理学的条件下で実行可能であり、したがって任意の異性体が活性形態の供給源であり得；本発明は、その範囲内に前記の異性のタイプにより包含されるすべての完全に還元された形態、全ての部分的に酸化された形態および全ての酸化された形態を含む。
本発明は、アミノ酸置換、付加、欠失または側鎖修飾のうちの１以上を受ける配列を含む本明細書において開示されている特定の配列のアミノ酸配列変異体も包含する（ただし、ペプチドはｎＡＣｈＲ、好ましくはニューロンｎＡＣｈＲの活性を阻害する能力、疼痛を予防する能力、および／または神経損傷からの回復を促進する能力を保持するものとする）。かかる置換は活性に対して異なる影響を及ぼし得る。たとえば、本発明者らは、グルタメートのγ−カルボキシル化の結果、鎮痛活性が著しく減少するが、ペプチドの神経損傷からの回復を促進する能力に影響を及ぼさないことを見いだした。
【００１３】
本発明に含まれる他の誘導体は、完全にグルコシル化されていない分子から修飾されたグルコシル化分子までおよぶグルコシル化変異体を包含する。変更されたグルコシル化パターンは、異なる宿主細胞における組み換え分子の発現の結果生じる。好ましい一具体例において、前駆体ペプチド（図１参照）のＣ−末端グリシンが除去され、合成されたペプチドにおけるＣ−末端システインのアミド化により置換され、公知活性α−コノトキシンのＣ−末端を模倣する。他の特異性翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、プロリンのヒドロキシル化（たとえば、Ｖｃ１．１ｐｔｍにおいて４−ヒドロキシプロリンをもたらす）およびグルタメートのγ−カルボキシル化（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、２００２参照）を包含し、両方とも本発明者らがＶｃ１．１ｐｔｍ：
ＧＣＣＳＤ４−ＨｙｐＲＣＮＹＤＨＰガンマカルボキシ−ＧｌｕＩＣ−ＮＨ２
（配列番号７）（ここにおいて、Ｃ−末端システインはアミド化されている）で処理した。
【００１４】
コノペプチドにおいて公知のさらに他のＰＴＭは、トリプトファンについて５−ブロモトリプトファン、チロシンについてＯ−硫酸化チロシン、Ｎ−末端でのグルタメートについてピログルタメート（κΑ−コノトキシンＳＩＶＡおよびμ−コノトキシンＰＩＩＩＡにおけるのと同様）、トレオニンについてトレオニン−Ｏ−ｇａｌ（Ｎａｃ）−ＧａｌおよびトリプトファンについてＤ−トリプトファン、ならびに国際特許出願番号ＷＯ００／４４７６９に記載されているものを包含する。
好ましい具体例において、α−コノトキシンペプチドは次の配列：
ＧＣＣＳＤＰＲＣＮＹＤＨＰＥＩＣ−ＮＨ２［配列番号２］
を有する。
【００１５】
この好ましいペプチドは、Ｖｃ１．１と称する。
本発明のペプチドは、天然に存在するコノペプチドであってもよいし、またはかかる天然に存在するペプチドの誘導体であってもよい。天然に存在するコノペプチドの誘導体は、以下に記載するように、天然に存在する対応物とアミノ酸置換、欠失または付加のうちの１以上により異なる。
置換は、異なる天然に存在するかまたは通常でないアミノ酸残基でアミノ酸が置換されているアミノ酸変更を包含する。このような置換は、「保存的」と分類され、この場合において、ペプチドに含まれるアミノ酸残基は、類似した特徴を有するもう一つ別の天然に存在するアミノ酸、たとえば、Ａｌａに対してＧｌｙ、Ｇｌｕに対してＡｓｐ、Ｇｌｎに対してＡｓｎまたはＴｙｒに対してＴｒｐで置換されている。可能な別のアミノ酸は、セリンまたはトレオニン、アスパルテートまたはグルタメートまたはγ−カルボキシグルタメート、プロリンまたはヒドロキシプロリン、アルギニンまたはリシン、アスパラギンまたはヒスチジン、ヒスチジンまたはアスパラギン、チロシンまたはフェニルアラニンまたはトリプトファン、アスパルテートまたはグルタメート、イソロイシンまたはロイシンまたはバリンを包含する。
【００１６】
いくつかの通常でないアミノ酸は天然に存在するアミノ酸の適当な置換であってもよいと理解される。本発明に含まれる置換は、「非保存的」であり、ここにおいて、ポリペプチドにおいて存在するアミノ酸残基は、異なる性質を有するアミノ酸、たとえば、異なる群からの天然に存在するアミノ酸で置換されるか（たとえば、荷電または親水性または疎水性アミノ酸をアラニンで置換する）、または別法として、天然に存在するアミノ酸が通常でないアミノ酸で置換されている。付加は、１以上の天然に存在するかまたは通常でないアミノ酸残基の付加を包含する。欠失は、１以上のアミノ酸残基の欠失を包含する。
本発明の範囲を制限することを意図しないが、システイン残基および３〜４のコンセンサスアミノ酸は分子の生物学的活性に必須であるらしく、従って、以下にさらに議論するように、これらの点での置換の範囲は制限されると現在のところ考えられている。
本発明はさらに、これらに限定されないが、次のものを包含するペプチド類似体も包含すると理解される：
１．１以上のアミノ酸がその対応するＤ−アミノ酸で置換されている化合物。当業者らは、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏアミノ酸配列が標準的方法により合成できることに気づくであろう；たとえば、ＣｈｏｒｅｖおよびＧｏｏｄｍａｎ、１９９３参照；
２．ペプチド結合が代謝分解に対してより耐性である構造により置換されているペプチド模倣化合物。たとえば、Ｏｌｓｏｎら、１９９３参照；および
３．その電荷を修飾するために修飾された末端あるいはアルキル、アシルまたはアミン置換を有しているかどうかにかかわらず、個々のアミン酸が類似構造、たとえば、ｇｅｍ−ジアミノアルキル基またはアルキルマロニル基により置換されている化合物。
【００１７】
このような別の構造は生理学的条件下での分解に対してより耐性であるので、その使用は体内において著しく長い半減期をもたらし得る。
ペプチド類似体の組み合わせ合成法ならびにペプチドおよびペプチドのスクリーニング法は当該分野において周知である（たとえば、Ｇａｌｌｏｐら、１９９４；Ｈｏｇａｎ、１９９７参照）。
本発明のペプチドまたはペプチド模倣物は、標準的固相技術、たとえば、ＦｍｏｃまたはＢＯＣ化学反応を用い、続いて酸化的ジスルフィド結合形成により合成することができる。コノトキシンを合成する方法は当該分野において公知であり；たとえば、Ｌｏｕｇｈｎａｎら（１９９８）、Ｇｒｏｅｂｅら（１９９７）、Ｆａｖｒｅａｕら（１９９９）、ＭｉｒａｎｄａおよびＡｌｅｗｏｏｄ、１９９９参照。脱保護および固体支持体からの開裂に続いて、当該分野において公知の方法、たとえば分取クロマトグラフィーを用いて還元されたペプチドを精製することができる。
本発明のペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することもできる。ペプチド配列をエンコードするヌクレオチド配列を適当なベクターおよび適当な発現系において発現されたタンパク質中に挿入することができる。いくつかの例において、発現されたペプチドをさらにＣ−末端アミド化など、化学的に修飾することが適当である。ある状況下で、ペプチド発現後の化学工程として発現されたペプチドの酸化的結合形成を行うのが望ましい。この前に、還元的処置をおこなって、フォールドされていないペプチドを得ることができる。当業者らはペプチドの還元および酸化のための適当な条件を容易に決定することができる。
【００１８】
従って、第二の態様において、本発明はさらに、配列番号３および図１に示すヌクレオチド配列：
ATGGGCATGCGGATGATGTTCACCGTGTTTCTGTTGGTTGTCTTGGCAACCACTGTCGTT
TCCTCCACTTCAGGTCGTCGTGAATTTCGTGGCAGGAATGCCGCAGCCAAAGCGTCTGAC
CTGGTCAGTTTGACCGACAAGAAGCGAGGATGCTGTAGTGATCCTCGCTGTAACTATGAT
CATCCAGAAATTTGTGGTTGAAGACGCTGATGCTCCACGACCCTCTGAACCACGACACGC
CGCCCTCTGCCTGACCTGCTTCACTTTCCG
（ｂ）（ａ）において定義されたものと相補的なヌクレオチド配列；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかにおいて定義された配列と少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）と少なくとも７５％配列同一性を有する核酸分子
を含む単離または合成核酸分子を提供する。
【００１９】
さらに詳細には、（ｃ）において、核酸分子はストリンジェントな条件下で（ａ）の分子とハイブリッド形成できる。さらに好ましくは、（ｄ）において、核酸分子は（ａ）の分子と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。
核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングについての「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために、たとえば５０℃で０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの低イオン強度および高温を用いるか、または
（２）ハイブリダイゼーション中、変性剤、たとえばホルムアミド、たとえば５０％（体積／体積）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム（４２℃）を用いるものである。もう一つの例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、音波処理された鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン（４２℃）と、４２℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を用いる。
好ましくは、核酸はペプチドＶｃ１．１をエンコードする。
【００２０】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。核酸分子がＤＮＡである場合、これはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。核酸分子がＲＮＡである場合、これは一般にｍＲＮＡである。本発明の核酸分子は、他の遺伝子分子、たとえば、ベクター、特に発現ベクター中に組み入れられるか、または結紮されるか、さもなければ融合または結合されていてもよい。ベクターおよび発現ベクターは一般に複製でき、該当する場合、原核細胞または真核細胞の一方または両方における発現が可能である。好ましい原核細胞は、イー・コリ、バチルス種およびシュードモナス種を包含する。好ましい真核細胞は、酵母、真菌、植物、哺乳動物および昆虫細胞を包含する。前記のペプチドを特に必要とする好ましい細菌発現系（Ｂａｎｅｙｘ、１９９９により検討）は、
（１）フォールディングを助けるために、ＤｎａＫ−ＤｎａＬまたはＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロン（Ｎｉｃｈｉｈａｒａら１９９８；Ｃａｓｔａｎｉｅら１９９７；ＴｈｏｍａｓおよびＢａｎｅｙｘ、１９９６）を同時発現するエシェリキア・コリの菌株；
（２）ジスルフィド結合形成を助けるためにジスルフィドイソメラーゼおよびジスルフィドオキシドレダクターゼを発現する菌株（Ｑｉｕら、１９９８）；および
（３）プロリル残基のトランスからシス異性化を触媒するために、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（Ｈｏｔｔｅｎｒｏｔｔら１９９７、Ｓｔｏｌｌｅｒら１９９５）を発現する菌株
を包含する。
【００２１】
第三の態様において、本発明は、配列番号３に示す配列からの少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含むＶｃ１．１をエンコードする核酸を検出するためのプローブを提供する。好ましくは、プローブは配列番号５または配列番号６に示す配列を有する。
第四の態様において、本発明は、ベクター部分および本発明のペプチドをエンコードする核酸を含む遺伝子構造を提供する。好ましくは、核酸はベクター上のプロモーターと操作可能に連結され、従ってプロモーターは適当な細胞において核酸を発現できる。
第五の態様において、本発明は、本発明のペプチドを、生理学的に許容される担体とともに含む組成物を提供する。好ましい一具体例において、担体は医薬的に許容される担体であり、組成物は哺乳動物対象に投与するのに適当である。第二の好ましい具体例において、担体は組織培養またはニコチン性アセチルコリンレセプター機能の実験における使用に適している。
本発明のペプチドは、医薬的用途とニコチン性アセチルコリンレセプター機能および他の生理学的パラメータの評価における調査試薬としての両方に適している。特に、これらのレセプターの役割を調査するための疼痛伝導経路における第一次ニューロンの代表であるペプチドは感覚ニューロンの特定のサブセット（小無髄Ｃ繊維）の調節において有用である。
【００２２】
第六の態様において、本発明はｎＡＣｈＲにより媒介される状態の治療法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物に有効量の本発明のペプチドを投与することを含む方法を提供する。
好ましくは、状態は、ニューロンｎＡＣｈＲにより媒介される。より好ましくは、状態は、発作、疼痛、てんかん、ニコチン中毒、統合失調症、パーキンソン病、小細胞肺癌およびアルツハイマー病からなる群から選択される。かかる状態の広範囲のリストは米国特許第６２６５５４１号に記載されている。
最も好ましくは、状態は疼痛であり、これは癌性疼痛、手術後疼痛、口腔または歯痛、関連三叉神経痛、帯状疱疹後神経痛、幻想肢痛、線維筋痛、反射性交感神経性ジストロフィーならびに関節リウマチおよび他の炎症性関節炎などの炎症性状態；または変形性関節炎、たとえば骨関節炎を包含する神経原性神経原性疼痛状態を包含するが、これらに限定されない神経原性または神経病性疼痛と関連する任意の状態の結果である。
好ましい具体例において、本発明はさらに、疼痛を治療または予防する方法であって、有効量の本発明のペプチドをかかる治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
【００２３】
第七の態様において、本発明は神経損傷からの機能的回復を促進する方法であって、有効量の本発明のペプチドをかかる治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法を提供する。
「機能的回復」なる用語は、機能を正常に戻すことを意味すると理解される。本発明者らは、Ｖｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍがこのプロセスが起こる速度を向上（または「加速」）すること、すなわち、機能的回復が別の場合よりも早く回復することを見いだし、食塩対照またはＭＶＩＩＡについてよりも早い回復が観察される。
哺乳動物はヒトであってもよいし、あるいは家畜または愛玩動物であってもよい。本発明の化合物はヒトの医学的治療における使用に適していると特に考えられるが、これらはイヌおよびネコなどのコンパニオン動物、およびウマ、ウシおよびヒツジなどの家畜、またはネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄動物などの動物園の動物を含む獣医学的治療にも適用可能である。
【００２４】
本発明の化合物および組成物は任意の好適な経路により投与することができ、当業者は治療される状態について最も好適な経路および投与量を容易に決定することができる。投与量は、診察する医師または獣医師により決定され、治療される症状の性質および状態、治療される対象の年齢および一般的健康状態、投与経路、およびすでに施された治療に依存する。
担体または希釈剤、および他の賦形剤は投与経路に依存し、ここでも当業者はそれぞれの具体的な場合についての最も好適な処方を容易に決定することができる。
医薬組成物を調製するための方法および医薬担体は当該分野において周知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡなどのテキストに記載されている。
ペプチドは、経口投与；皮下、静脈内、動脈内、くも膜下、大脳内、筋肉内のいずれかの注射；またはマイクロカプセル化（たとえば、米国特許第４３５２８８３号；第４３５３８８８号；第５０８４３５０号参照）；マクロカプセル化（たとえば、米国特許第５２８４７６１号；第５１５８８８１号；第４９７６８５９号参照）；局所ローションあるいはベクターまたは浸透圧ポンプによる送達を含む任意の適当な送達手段を用いるか、あるいはイオン泳動または電気泳動手段により送達することができる。
【００２５】
本発明者らは、ペプチドＶｃ１．１がニューロンｎＡＣｈＲを阻害し、鎮痛活性を有することを証明した。本発明のペプチドの活性がペプチドの標的レセプターとの実際の結合により媒介されるかどうか、あるいはさもなければレセプター活性を妨害するかどうかはまだわからない。しかしながら、本発明者らは、ペプチドのインビトロ作用はニコチン作用物質についての作用の競合的様式と一致し、電圧活性化イオンチャンネルにより媒介されないことを示した。さらに、ペプチドは筋肉型ニコチン性アセチルコリン反応を阻害しなかった。たとえば、Ｖｃ１．１は、５６ｍＭＫ＋により刺激された場合に、培養物においてウシクロム親和性細胞からのノルアドレナリンまたはアドレナリンの放出を阻害しなかった（図３参照）。化合物の感覚神経活性に対する影響を調査するためにラットモデルを用いて得られた本発明者らの結果は、炎症血管応答の減少により示されるように感覚神経活性の阻害においてＭＶＩＩＡよりも有効であり、これは感覚神経からの感覚ペプチド放出に依存することを示す（図９ａおよびｂ参照）。神経病性疼痛のラットモデルを用いて得られたさらなる結果は、本発明のペプチドがＭＶＩＩＡおよびすでに知られているコノペプチドよりも優れた、長期間持続する活性を有し、非経口投与に適していることを示す（図６および７参照）。さらに、今までのところ有害な副作用は観察されず、実験において用いられたラットは治療完了後１０ヶ月で生存していた。ペプチドはラットにおいて安静時全身血圧に影響を及ぼさなかった（図１５参照）。
本発明の目的に関して、「含んでいる」なる用語は、「含んでいるが、これに限定されない」ことを意味し、「含む」なる用語は、対応した意味を有する。
【００２６】
（図面の簡単な記載）
図１は、ペプチドＶｃ１．１のコノペプチド前駆体のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。活性トキシン領域に下線を施し、プライマー配列は太字で示す。トキシン領域は長さが１６アミノ酸であり、ＣＣ−Ｘ（４）−Ｃ−Ｘ（７）配列において４システイン残基を含む。星印は停止コドンを示し；Ｃ−末端のグリシンは典型的にはＣ−末端アミド化Ｖｃ１．１ペプチドの形成において失われる。
図２ａおよびｂは、ウシクロム親和性細胞からのニコチン刺激カテコールアミン放出に関するＶｃ１．１の作用についての濃度−反応曲線を示す。４〜５日令のクロム親和性細胞培養物を０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭおよび１０μＭのＶｃ１．１とともにニコチンでの刺激前に５分間プレインキュベートした。図２ａは、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭのＶｃ１．１、および４μＭのニコチンでの刺激を用いた実験の結果を示す。図２ｂは、１μＭ、５μＭおよび１０μＭのＶｃ１．１、および１μＭのニコチンでの刺激を用いた実験の結果を示す。図２ｃは、Ｖｃ１．１ｐｔｍをＶｃ１．１の代わりに用いる以外は図２ｂについてと同様におこなった実験の結果を示す。結果は、平均±標準偏差（ｎ＝４）として表す。アドレナリンおよびノルアドレナリン放出についてのＩＣ５０は約１〜３μＭである。
【００２７】
図３は、クロム親和性細胞からのＫＣｌ−刺激カテコールアミン放出に対するＶｃ１．１の作用についての濃度−反応曲線を示す。４〜５日令のクロム親和性細胞培養物を０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭのＶｃ１．１とともにＫＣｌ（５６ｍＭ）での刺激前に５分間プレインキュベートした。
図４は、Ｖｃ１．１（１μＭ）によるウシ副腎クロム親和性細胞からのカテコールアミン（ノルアドレナリンおよびアドレナリン）のニコチン誘発放出の阻害の競合的性質を示す。結果は、機能的ニコチン性レセプターでの作用についてＶｃ１．１がニコチンと競合することを示す。高濃度（＞２０μＭ）のニコチンはＶｃ１．１による阻害を克服できる。
図５は、標識されたニコチン性レセプター作用物質、３Ｈ−エピバチジンの結合についてＶｃ１．１は競合することを示す。競合結合曲線の二相性は、２つの別個のレセプター成分、高親和性成分と低親和性成分、およびＶｃ１．１（１μＭ）によるウシ副腎クロム親和性細胞からのカテコールアミンのニコチン誘発放出の阻害の競合的性質を示す。結果は、機能的ニコチン性レセプターでの作用についてＶｃ１．１はニコチンと競合することを示す。
【００２８】
図６ａは、食塩水、０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたは０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の筋肉内注射の、慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に関する短期的影響を示す。機械的疼痛閾値は、ベースラインデータのパーセンテージとして表す。それぞれのデータポイントは各群において６匹のラットの平均±ＳＥＭを表す。星印は、注射後１時間および２４時間で、α−コノトキシンＶｃ１．１を受けた群についての閾値が食塩水対照群についてのものと著しく異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５）。
図６ｂは、損傷ニューロンの足蹠受容野中への食塩水、０．５３μｇ／２．５μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたは０．３６μｇ／２．５μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の皮下注射の、慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する短期効果を示す。機械的疼痛閾値は、ベースラインデータのパーセンテージとして表す。それぞれのデータポイントは各群において６匹のラットの平均±ＳＥＭを表す。星印は、注射後１時間および２４時間で、α−コノトキシンＶｃ１．１を受けた群についての閾値が食塩水対照群についてのものと著しく異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５）。
【００２９】
図７ａは、食塩水または０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡおよび０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１を毎日筋肉内注射することの慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する効果を示す。機械的疼痛閾値は、ベースラインデータのパーセンテージとして表す。それぞれのデータポイントは各群において６匹のラットの平均±ＳＥＭを表す。星印は、１１日、１２日、１３日および１４日に、α−コノトキシンＶｃ１．１を受けた治療群についての閾値が食塩水対照群についてのものと著しく異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５）。
図７ｂは、食塩水または０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡおよび０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の筋肉内注射の慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する効果を示す。筋肉内注射は２週間後に終了した。機械的疼痛閾値は、ベースラインデータのパーセンテージとして表す。それぞれのデータポイントは各群において６匹のラットの平均±ＳＥＭを表す。星印は、α−コノトキシンＶｃ１．１を受けた群についての閾値が対照群についてのものと著しく異なっていたことを示す（ｐ＜０．０５）。
【００３０】
図８は、ラット皮膚における微小血管血流に対するコノトキシンの影響を示す。
（ａ）血管は感覚神経の電気的刺激に対して反応する。バーは、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６〜８）を表す。星印は、対照群と比較した有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。
（ｂ）α−コノトキシンＶｃ１．１の、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、直接作用性平滑筋血管拡張薬の血管効果に対する影響。
図９ａは、感覚神経活性に関するＶｃ１．１の用量応答効果を示す。実験は図８ａにおけるのと同様におこなったが、１μＭのＶｃ１．１に加えて、各種濃度のＶｃ１．１を比較した。結果は、Ｖｃ１．１が感覚神経活性化に対する血管応答の阻害において有効であることを示し、０．１μＭの濃度が最も有効であった。
図９ｂは、感覚神経活性の阻害におけるＶｃ１．１とＭＶＩＩＡの有効性を比較する（両方とも０．１μＭペプチドの濃度）。Ｖｃ１．１はこの低濃度ではＭＶＩＩＡよりも有効であるのに対して、１μＭペプチドでは（図８ａ）ＭＶＩＩＡがより有効であった。
【００３１】
図１０ａは、Ｖｃ１．１およびＶＣ１．１ｐｔｍについてそれぞれ０．３６μｇ／２００μｌおよび０．３７μｇ／２００μｌで静脈内投与された場合の神経病性疼痛の阻害におけるＶｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの長期有効性を比較する。バーは平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６〜８）を表す。星印は、食塩水対照群と比較しての有意な差を示す（ｐ＜０．０５）。結果は、Ｖｃ１．１が注射後５週間まで神経病性疼痛の阻害に有効であったが、Ｖｃ１．１ｐｔｍは有効でなかったことを示す。
図１０ｂは、炎症性血管応答を起こす能力により評価される損傷神経の機能的回復の促進における筋肉内（ｉｍ）投与されたＶｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの有効性を比較する。
図１１は感覚神経活性の阻害におけるＶｃ１．１ｐｔｍとＶｃ１．１の有効性を比較する。図１１ａは、ペプチドまたは食塩水を３０分灌流した直後に試験した場合に、Ｖｃ１．１ｐｔｍがＶｃ１．１よりも感覚神経活性の阻害に有効でないことを示す。
図１１ｂは、ペプチドまたは食塩水を３０分灌流した２４時間後までＶｃ１．１ｐｔｍはＶｃ１．１よりも感覚神経活性の阻害に有効でないことを示す。濃度は、Ｖｃ１．１については０．３６μｇ／２００μｌ、Ｖｃ１．１ｐｔｍについては０．３７μｇ／２００μｌであった。
【００３２】
図１２は、次の期間にわたって神経病性疼痛の阻害（ＣＣＩモデル）におけるＶｃ１．１、Ａｎ１．１、Ｖｇ１．１、ＭＩＶＶＡ、およびＶｃ１．１ｐｔｍの有効性を示す：ａ）短期（０〜２４時間）、（ｂ）７〜１４日、および（ｃ）長期（２〜８週間）。図１２（ｄ）は、炎症性血管応答を起こす能力により評価される、損傷神経の機能的回復をもたらすためのＶｃ１．１、Ａｎ１．１、ＭＶＩＩＡ、およびＶｃ１．１ｐｔｍの有効性を比較する。
図１３ａは、Ａｎ１．１による培養されたＢＣＣｓにおけるニューロンニコチン性応答の阻害を示し、これはＶｃ１．１（図２と比較）、またはＶｇ１．１（図１４ａ参照）の阻害にとうてい及ばなかった。
図１３ｂは、Ａｎ１．１がＢＣＣにおける機能的ニコチン性レセプター応答の競合的阻害剤でもあり、高濃度のニコチンにより引き起こされるニコチン性レセプター脱感作に対して保護することを示す。
図１４（ａ）は、ＢＣＣからのカテコールアミン（ノルアドレナリンおよびアドレナリン）のニコチン（１μＭ）誘発放出に対するペプチドα−コノトキシＶｇ１．１の影響を示す。
図１４（ｂ）は、ラットにおける刺激誘発血管応答に対するＶｇ１．１およびＶｃ１．１（両方とも１．０μＭ）の効果の比較である（図８ａとも比較）。図１４（ｃ）は、（ｂ）と同じであるが、０．１μＭの低用量であり、Ｖｃ１．１はＶｇ１．１よりも有効である（図９ｂとも比較）。
図１５は、全身血圧に対してＶｃ１．１（２００μｌ中１μＭ  ｉｍ）は影響を及ぼさなかった、すなわち、Ｖｃ１．１は全身循環効果を有さないことを示す。
【００３３】
（発明の詳細な記載）
本明細書の目的に関して、「ペプチドおよびペプチド類似体」なる用語は、１，２、１，３、１，４またはさらに長い置換パターンにより隔てられたアミノおよびカルボキシ末端を有する単位で構成される化合物を包含する。これは、２０の天然に存在するか、または「一般的な」α−アミノ酸（ＬまたはＤ構造のいずれか）、生合成により入手可能またはタンパク質において通常見いだされない「一般的でない」アミノ酸、たとえば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、シトルリンおよびオルンチン；合成により誘導されるα−アミノ酸、たとえば、α−メチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、Ｃα−およびＮ−アルキル化アミノ酸、ホモシステイン、およびホモセリン；および当該分野において公知の他の多くのものを包含する。
この用語は、たとえばβ−アラニン、γ−アミノ酪酸、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒラクタム（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、１９８２）、二環式ジペプチド（ＢＴＤ）（Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、１９８２；ＮａｇａｉおよびＳａｔｏ、１９８５）、アミノ−メチル安息香酸（Ｓｍｙｔｈｅおよびｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ、１９９４）、および当該分野において周知の他のものなどの１，３またはさらに長い置換パターンにおいて隔てられたアミンおよびカルボキシ官能基を有する化合物も包含する。スタチン様同配体、ヒドロキシエチレン同配体、還元アミド結合同配体、チオアミド同配体、尿素同配体、カーバメート同配体、チオエーテル同配体、ビニル同配体および当該分野においてい公知の他のアミド結合同配体も本発明の目的に関して有用である。
【００３４】
「一般的な」アミノ酸は、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパルテート、アスパラギン、グルタメート、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リシン、プロリン、セリン、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸である。これらは、本明細書においてその通常の３文字または１文字記号により記載される。
「一般的でない」アミノ酸は、これらに限定されないが、Ｄ−アミノ酸、ホモアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン以外）、オルト−、メタ−またはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロイシン、γ−グルタミン酸、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびα，α−二置換アミノ酸からなる群から選択されるものを包含する。
【００３５】
前記のように、本発明は１以上のアミノ酸が側鎖修飾を受けるペプチドを包含する。本発明により意図される側鎖修飾の例は、アルデヒドと反応させ、続いてＮａＢＨ４で還元することによる還元的アルキル化などのアミノ基の修飾；メチルアセトイミデートでのアミジン化；無水酢酸でのアシル化；アミノ基のシアネートでのカルバモイル化；アミノ基の２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）での修飾；およびアミノ基の無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸でのアシル化を包含する。カルボキシ基は、Ｏ−アシルイソウレア形成によりカルボジイミドを活性化し、続いてたとえば対応するアミドに誘導化することにより修飾することができる。スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドでのカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；４−クロロ水銀ベンゾエート、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀クロリド、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールおよび他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアネートでのカルバモイル化などの方法により修飾することができる。システイン残基の任意の修飾は、ペプチドの必要なジスルフィド結合を形成する能力に影響を及ぼしてはならない。しかしながら、システインのスルフィドリル基をセレニウム等価物、セレノドリル基と置換して、ペプチドが１以上のジスルフィド結合の代わりにジセレニウム結合を形成することが可能である。
トリプトファン残基は、たとえば、Ｎ−ブロモスクシンイミドでの酸化またはインドール環の２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはスルフェニルハライドでのアルキル化により修飾することができる。チロシン残基は硫酸化またはリン酸化された形態であってもよい。修飾された側鎖を有するアミノ酸および他の修飾されたアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸の非網羅的リストを表１に示す。
【００３６】
表１
2005500017.tif 000002
2005500017.tif 000003
2005500017.tif 000004
2005500017.tif 000005
【００３７】
これらの種類の修飾は、対象への投与後にペプチドを安定化させるために有用である。他の修飾は、安定化させるため、または他の性質、たとえば膜透過性および溶解性を向上させるためにペプチドに対して行うことができる。かかる修飾は、１以上のアミノ酸の側鎖を他の種類の基、たとえば１以上の親油性基を結合させるために修飾することを含む。かかる結合は、ペプチドの活性を妨害しないように他の基をペプチドから隔てるためにデザインされた結合基によりなされる。修飾されたペプチドがｎＡＣｈＲの活性を阻害し、疼痛を予防し、および／または神経損傷からの回復速度を促進する能力を保持するならば、このような修飾された形態のペプチドは全て本発明の範囲内に含まれる。当業者らは、本発明のペプチドをどのように修飾するか、また必要な活性を有する修飾されたペプチドをどのように同定するかを容易に決定できる。
【００３８】
経口投与に関して、活性成分は投与前に保護する必要がある。たとえば、ペプチドは同化性、可食性担体と共に処方できるか、またはペプチドはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入するか、または圧縮して錠剤にするか、または食事の食物と直接混合できる。経口治療的投与に関して、活性化合物は、賦形剤と混合することができ、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート剤などの形態において用いられる。かかる組成物および製剤は好ましくは少なくとも１重量％の活性化合物を含む。組成物および製剤のパーセンテージはもちろんさまざまであり、単位の重量の約５〜約８０％の間であるのが都合良い。かかる治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適当な用量が得られるようなものである。錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなども以下に列挙するような成分を含むことができる：バインダー、たとえばゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、たとえば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、たとえばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム；および甘味料、たとえば、シュークロース、ラクトースまたはサッカリン、または矯味矯臭剤、たとえばペパーミント、冬緑油、またはチェリーフレーバーを添加することができる。投与単位形態がカプセルである場合、これは前記種類の物質に加えて、液体担体を含むことができる。様々な他の物質がコーティングとして、または別の方法では投与単位の物理的形態を修飾するために存在しても良い。たとえば、錠剤、丸薬、またはカプセルはシェラック、糖または両方でコートすることができる。シロップまたはエリキシルは活性化合物、甘味料としてシュークロース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、染料および矯味矯臭剤、たとえば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含んでもよい。加えて、活性化合物は持続性放出製剤および処方中に組み入れることができる。
【００３９】
注射可能な用途に好適な医薬形態は、滅菌注射可能な溶液または分散液、および滅菌注射溶液の即席製剤用の滅菌粉末を含む。注射溶液または分散液用の溶媒または分散液媒体は、ペプチド活性物質の通常の溶媒または担体系を含んでもよく、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、および植物油を含んでもよい。たとえば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により、適当な流動性を維持できる。必要な場合に様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを配合することにより微生物の作用を防止することができる。多くの場合において、浸透圧を調節するための薬剤、たとえば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物において吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することにより達成できる。注射可能な用途に好適な医薬形態は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、大脳内、くも膜下、硬膜外注射または注入を含む任意の適当な経路により送達することができる。
本発明はまた、たとえば局所投与などの投与に好適な任意の他の形態、たとえば、クリーム、ローションおよびゲル、または吸入または鼻内送達に好適な組成物、たとえば溶液または乾燥粉末にも及ぶ。
【００４０】
静脈内、くも膜下、大脳内、筋肉内、腹腔内、皮下または硬膜外送達に好適なものを含む非経口投与形態が好ましい。投与を容易にし、投与量を均一にするための投与単位の非経口組成物を処方することが特に有利である。本発明において用いられる投与単位形態とは、治療される哺乳動物対象用の単位投与として適した物理的に独立した単位を意味し；各単位は、所望の治療効果を生じるために計算されたあらかじめ決められた量の活性物質を必要な医薬担体と共に含む。単位投与形態は、たとえば、０．２５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量の主な活性化合物を含むことができる。割合で表現すると、活性化合物は一般に担体の約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌで存在する。追加の活性成分を含む組成物の場合において、投与量は前記成分の通常の投与量および投与方法を参考にして決定される。
ペプチドＶｃ１．１は、次の分子生物学的技術を適用することによりＣｏｎｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｉａｅと同定された。ｃＤＮＡライブラリーを毒管組織から単離されたｍＲＮＡから作成した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてα−コノトキシン前駆体を増幅するためにオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。ＰＣＲ産物を適当なプラスミドベクター中にクローンし、個々のクローンを配列化した。ｃＤＮＡによりエンコードされたアミノ酸を次に解明した。これは実施例１においてさらに詳細に記載する。
【００４１】
ペプチドＶｃ１．１はニューロンｎＡＣｈＲを阻害する。これは、ウシクロム親和性細胞ニューロンｎＡＣｈＲ分析システムを用いて決定した。ウシクロム親和性細胞はニューロンｎＡＣｈＲを発現することが知られている（Ｃａｍｐｏｓ−Ｃａｒｏら、１９９７）。ニコチンで刺激すると、カテコールアミンノルアドレナリンおよびアドレナリンが放出される。クロム親和性細胞をウシ副腎髄質から単離し（Ｌｉｖｅｔｔら、１９８７ａ）、ペプチドＶｃ１．１の存在下でニコチンで刺激した。クロム親和性細胞により放出されたカテコールアミンを、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離し、電気化学的検出法を用いて定量化した（Ｌｉｖｅｔｔら、１９８７ｂ）。ペプチドＶｃ１．１はニコチンにより引き起こされるカテコールアミン放出を阻害することが見いだされた。これは実施例２において記載する。
【００４２】
ペプチドＶｃ１．１は鎮痛活性も有する。ラットにおいて機械的に誘発された痛覚過敏症を阻害するＶｃ１．１の能力を試験するために、ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ（１９８７）の慢性狭窄型傷害モデル（ＣＣＩ）を用いた。ラットを麻酔し、右坐骨神経を露出させ、４本のクロミックガット結紮糸で縛った。この方法により、ラットの足に痛覚過敏症が起こる。次にラットの大腿部の中間部分に食塩水またはＶｃ１．１を含む食塩水のいずれかを筋肉内注射した。ラットの足に圧力を加えるために、一定率で増大する力を加えるＢａｓｉｌｅ  Ａｎａｌｇｅｓｙ−Ｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を用いた。ラットが足を引っ込める前に加えられた力を測定した。Ｖｃ１．１の筋肉内投与後、神経誘発性機械的痛覚過敏症は、短期（１〜２４時間）および長期（１〜２１日）のいずれにおいても著しく緩和されることが見出された。Ｖｃ１．１の機械的に誘発された痛覚過敏症を軽減する能力を、モルヒネよりも１０００倍以上有効であると報告されているコノトキシンであるω−ＭＶＩＩＡと比較した。Ｖｃ１．１は機械的に誘発された痛覚過敏の緩和にω−ＭＶＩＩＡよりも約３倍以上有効であることが見いだされた。これは実施例３に記載する。
【００４３】
ペプチドＶｃ１．１はまた、神経刺激に対する血管応答を測定することにより決定される感覚神経機能の阻害に有効である。−４０ｋＰａの吸引圧を用いて麻酔されたラットの後足蹠上に生じた水疱の基部からレーザードップラーフローメトリーを用いて皮膚において微小血管血流を測定した。血管機能の感覚神経調節を、坐骨神経調製物に関して行った逆行性神経刺激を用い、感覚神経ペプチドを水疱基部上に灌流させることにより評価した。これを実施例４に記載する。
ペプチドＶｃ１．１およびその翻訳後に修飾された形態（配列番号３）も、神経損傷からの回復速度の加速において有効であった。これを実施例５において議論する。
本発明を以下の非制限的実施例および図面のみを参考にして詳細に説明する。
【００４４】
実施例
【実施例１】
【００４５】
ペプチドＶｃ１．１の単離
（ａ）ｍＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
イモガイＣｏｎｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｉａｅの標本をＢｒｏｏｍｅ（西オーストラリア）から集めた。イモガイは営利的漁師の合法的な捕獲物の一部であり、約２０匹のイモガイを用いた。液体窒素中で急速冷凍する前にイモガイの毒管および球を切開により除去した。製造業者の仕様書に従ってダイナビーズｍＲＮＡダイレクトキットを用いてｐｏｌｙ−ＡｍＲＮＡを抽出した。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キットを用いて単離されたｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ合成プライマーおよびＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血球ウイルス逆転写酵素を用いて第一鎖ＤＮＡを構築した。イー・コリＤＮＡポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡリガーゼおよびイー・コリＲＮａｓｅＨを用いて第二鎖ＤＮＡ合成をおこなった。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端の二本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００４６】
（ｂ）Ｖｃ１．１をエンコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅
５’プレ領域
５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号５）および３’未翻訳領域
５’−ＣＧＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６）
とアニールするために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＶｃ１．１をエンコードするＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲは５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）；５μｌの１０×反応緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）；４００μｇのプライマー；２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ；および適当な量のｃＤＮＡを総体積５０μｌのｍｉｌｌｉＱ水中に含んでいた。ＰＣＲ反応の条件は次の通りであった：９４℃で２分間；続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒のアニーリング工程、７２℃で４５秒間を３０サイクル；最後に７２℃で５分間の最終工程。
【００４７】
（ｃ）Ｖｃ１．１ＤＮＡのクローニング
５０ｎｇのＰＣＲ産物を２：１のモル比でｐＣＲ２．１ベクター（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡクローニングキット）中に結紮した。反応混合物を１４℃で一夜最終体積１０μｌの６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭＡＴＰ、２ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン中、４ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。ｐＣＲ２．１プラスミドをコンピテントＩＮＶαＦ’イー・コリ細胞中に製造業者の仕様書に従って形質転換した（Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡクローニングキット）。細胞を次いでアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢプレート上に広げた。組み換えコロニーを選択し、一夜３７℃で、ＬＢブロス中でインキュベートし、製造業者のプロトコルに従ってウルトラクリーンミニプラスミドプレップキット（ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＭｉｎｉＰｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いてスクリーンした。
【００４８】
（ｄ）Ｖｃ１．１をエンコードするＤＮＡフラグメントのシーケンシング
興味のある挿入物を含むクローンを、アガロースゲル電気泳動により同定し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてジデオキシ連鎖停止法により配列決定した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を熱サイクルに用いた。各シーケンシング反応を、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で４分間の２５サイクルに付した。配列をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ３７７シーケンサーを用いて分析した。
Ｖｃ１．１をエンコードするクローンのヌクレオチド配列（配列番号３）およびＶｃ１．１前駆体タンパク質について推定されるアミン酸配列（停止コドンまで）（配列番号６）を図１に示す。推定される成熟ペプチドのもとになるヌクレオチド配列に下線を施し、停止コドンＴＧＡは下線をひいた配列の直後にくる。この配列は次の特徴を有する：
（ａ）コーディング配列は、配列番号３の停止コドン以下の最初の２０１塩基対である。
（ｂ）コーディング配列は６６アミノ酸残基：
【００４９】
2005500017.tif 000006
（成熟トキシン領域に下線を施す）を翻訳する。
【００５０】
（ｃ）合成された１６アミノ酸残基ペプチドＶｃ１．１配列番号２は停止コドンの前の１７アミノ酸残基から誘導され、Ｃ−末端グリシン残基は通常除去され、結果として得られるＣ−末端システインのアミド化により置換され、ニューロンｎＡＣｈＲ拮抗物質として活性な公知α−コノトキシンのＣ−末端と一致する。
（ｄ）合成ペプチドはＣＣ−（Ｘ）４−Ｃ−（Ｘ）７−Ｃフレームワーク中に４のシステイン残基を有する。
【実施例２】
【００５１】
ペプチドＶｃ１．１はニコチン誘発性カテコールアミン放出を阻害する
Ｌｉｖｅｔｔら（１９８７ａ）により記載されているようにして成体ウシ副腎から副腎クロム親和性細胞を単離した。単離された細胞をコラーゲンコートされた２４−ウェルプレート上に２．８×１０５細胞／ｃｍ２の密度でプレートアウトした。
３〜４日令の培養されたクロム親和性細胞を室温に５分間平衡化させた。２回連続してＬｏｃｋｅの緩衝液（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６ｍＭ  ＫＣｌ、２．１５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．８５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１．１８ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中で５分間洗浄することによりインキュベーションメディアを除去した。細胞を次いで様々な濃度（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）のペプチドＶｃ１．１と５分間インキュベートした後、４μＭニコチンまたは５６ｍＭ  ＫＣｌのいずれかでさらに５分間刺激した。インキュベーション混合物を細胞から分離し、２Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）で酸性化して、最終濃度を０．４Ｍ  ＰＣＡにした。細胞を０．０１Ｍ  ＰＣＡで溶解させることによりクロム親和性細胞中に残存するカテコールアミンを放出させ、次いで等体積の０．８Ｍ  ＰＣＡを添加することにより酸性化した。沈殿したタンパク質を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより除去した。カテコールアミンの基礎放出を測定するために、ニコチン、ＫＣｌまたはＶｃ１．１を含まない対照を用いた。カテコールアミンの最大放出を測定するために、第二の対照を４μＭニコチンまたは５６ｍＭ
【００５２】
ＫＣｌでＶｃ１．１の非存在下で刺激した。
各サンプル中に存在するカテコールアミンを、Ｃ１８カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ粒径）および移動相（７０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｍＭ  ＮａＥＤＴＡ、０．２％ヘプタンスルホン酸）において１０％メタノールでの定組成溶離を用いて逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離した。カラムから溶出するカテコールアミンをその保持時間により同定し、電気化学的検出（６５０ｍＶ  ＢＡＳ  ＬＣ−３Ａ型）により定量化した。各サンプル中のカテコールアミンの量を計算するために既知のアドレナリンおよびノルアドレナリン標準を用い、これらを全細胞含量のパーセンテージとして表した。結果を図２に示す。
Ａ−系統超科の構成員と一致して、この新規α−コノトキシンはニューロン型ニコチン性レセプターのインビボ細胞ベースの機能分析におけるニコチン性応答の有効な阻害剤であるが、５６ｍＭ  Ｋ＋による応答を阻害せず、このことはジコノチドなどのω−コノトキシンの標的であるＮ−タイプ電圧ゲート制御Ｃａ＋＋イオンチャンネルなどの電圧活性化イオンチャンネルが含まれにくいことを示す。
したがって、Ｖｃ１．１はニコチンにより誘発されるカテコールアミン放出を阻害することが見いだされた。１０μＭの濃度で、Ｖｃ１．１はノルアドレナリン放出を８６％阻害し、アドレナリン放出を９７％阻害した。Ｖｃ１．１のＩＣ５０は１から３μＭであると計算された。図３に示すように、カテコールアミン放出がＫＣｌにより誘発される場合に、Ｖｃ１．１は阻害作用を有さなかった。これは、Ｖｃ１．１が電圧ゲート制御イオンチャンネルを標的としないことを示し、これがニコチン性アセチルコリンレセプターを標的とすることが確認された。
【実施例３】
【００５３】
Ｖｃ１．１はそのｎＡＣｈＲ上の結合部位から３Ｈ−エピバチジン（ニコチン性レセプター作用物質）を置換する。
地元の屠殺場から入手したウシ副腎を切開し、髄質を取り出し、氷冷１０％ｗ／ｖ０．３２Ｍシュークロース緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．０１％ナトリウムアジドで補足）中に入れた。ポリトロンホモジナイザーを用いて髄質を均質化し、ホモジネートを１００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。結果として得られる上清をデンカントし（Ｓ１）、ペレットを氷冷シュークロース緩衝液（５ｍｌ／ｇの本来の骨髄重量）中に再懸濁した。この再懸濁されたペレットを１００ｇで１０分間４℃で遠心分離し、上清Ｓ１およびＳ２を組み合わせ、１２０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。結果として得られたペレットを、０．０１％ナトリウムアジド、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１ｍＭウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液（４０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）中に再懸濁し、１２０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。この工程を繰り返し、洗浄したペレットを５０ｍＭリン酸塩緩衝液中に再懸濁し、−７０℃で貯蔵した。ウシ血清アルブミンを基準として用いて、タンパク質濃度を測定するためにＢｒａｄｆｏｒｄ分析を行った。
【００５４】
この研究は、ウシ副腎髄質膜上で発現されたｎＡＣｈＲの薬理学的キャラクタライゼーションの結合研究において３Ｈ−エピバチジン（３Ｈ−ｅｐｉ）および他のリガンドを用いた。エピバチジンはニューロンｎＡＣｈＲ、特にα３を含むものについて高親和性を有するが、α７ｎＡＣｈＲに対しては低親和性を有する（Ｇｅｒｚａｎｉｃｈら、１９９５）。貯蔵した副腎髄質膜を解凍し、３７℃で２時間、１ｎＭ  ３Ｈ−エピバチジンおよび試験リガンド（濃度範囲１ｎＭ〜１ｍＭ）の存在下でインキュベートした（３００〜５００μｇタンパク質／試験管）。３Ｈ−エピバチジンは広範囲のｎＡＣｈＲサブタイプ親和性を有するので最適の放射リガンドであった。インキュベーション期間後、各試験管を濾過し、Ｂｒａｎｄｅｌｌ濾過システムにおいてリン酸塩緩衝塩溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した。濾過工程において用いられるガラス繊維フィルターは、あらかじめ一夜、５％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むリン酸塩緩衝塩溶液中に浸漬した。膜上に残存する結合放射活性を液体シンチレーションにより定量化した。非特異的結合は２ｍＭニコチンで置換した後に膜上に残存するものであった。全結合は、置換試験リガンドをｍｉｌｌｉＱ水で置換することにより得た。全結合から非特異的結合を差し引くことにより、特異的結合を求めた。飽和結合実験（ｎ＝３）は、非線形回帰分析を用いてＫｄ値を求めた（Ｐｒｉｓｍ，ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。置換実験から、非線形回帰分析を用いてＨｉｌｌ係数およびＫｉ値を求めた。Ｋｉ値は、Ｃｈｅｎ−Ｐｒｕｓｏｆｆ則（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［３Ｈ−エピバチジン］）／３Ｈ−エピバチジンのＫｄ）を用いて求めた。
【００５５】
本発明者らの結果は、ウシ副腎髄質膜と結合する３Ｈ−エピバチジンはＨｉｌｌ係数が１．０８で単一の親和性モデルと適合することを示す。Ｖｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍを、３Ｈ−エピバチジンを置換する能力について調べた。原形質膜はニューロンα−ｎＡＣｈＲを含むことが知られている。
図５に示すように、α−コノトキシンＶｃ０１は３Ｈ−エピバチジン結合を置換し、一方Ｖｃ１．１ｐｔｍは置換しなかった。コノトキシンＶｃ１．１は非選択的ニコチン性レセプターリガンド３Ｈ−エピバチジンの結合を濃度に依存する方法で置換し、高親和性および低親和性両方の二成分結合特性を示す。Ｖｃ１．１ｐｔｍは第一成分を置換するが、結合の第二成分は顕著には置換せず、このことは、２つの異なる結合部位がＶｃ１．１のこれらの膜に対する結合に関与することを示唆する。このＶｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの異なる作用は、図７においても明らかであり、図中、Ｖｃ１．１は疼痛性刺激を阻害するが、Ｖｃ１．１ｐｔｍは効果がない。
他の研究において、本発明者らは、シトシン、１，１−ジメチル−４−フェニルピペラジニウムヨージド（ＤＭＰＰ）、カルバコール、およびニコチンは３Ｈ−エピバチジン結合を置換するが、α７選択的リガンド、α−コノトキシンＩｍＩ（ＳＩＧＭＡまたはＡＵＳｐｅｐから商業的に購入）およびα−ブンガロトキシンは置換しないことを見出した。これらをあわせると、これらの研究は、Ｖｃ０１はおそらくはα３α４またはα３α５α４サブタイプのレセプターと結合するが、３Ｈ−ｅｐｉにより標識されていないレセプター集団は、α７サブタイプをおそらくは他のサブユニットとの組み合わせにおいて含むことを示す。
【実施例４】
【００５６】
Ｖｃ１．１は鎮痛活性を有する
（ａ）慢性狭窄型傷害モデル
ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ（１９８７）の慢性狭窄型傷害（ＣＣＩ）法により、片側末梢神経障害を引き起こした。ラット（ｎ＝４〜８／群）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。閉鎖性切開により大腿部の中央の位置で大腿二頭筋を貫いて右坐骨神経を露出させた。坐骨三分岐の近くに、約７ｍｍの神経を付着組織からはずし、４本の結紮糸（４．０ｇクロミックガット）をこの周りに緩く約１ｍｍの間隔で縛った。皮膚切開を外科用クリップを用いて閉じた。対照ラット群は偽処置を受け、右坐骨神経を単離したが、結紮しなかった。
【００５７】
（ｂ）機械的疼痛閾値の測定
ω−コノトキシンＭＶＩＩＡの合成形態（ＳＮＸ−１１１；Ｂｏｗｅｒｓｏｘら、１９９６）をＡｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，．から購入した。動物を１週間回復させた後、大腿部中間領域に食塩水、あるいは０．２ｍｌの食塩水中に溶解させたＶｃ１．１または合成ω−コノトキシンＭＶＩＩＡのいずれかを筋肉内注射した。機械的疼痛閾値を、Ｂａｓｉｌｅ  Ａｎａｌｇｅｓｙ−Ｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を用いてＲａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｉｔｔｏ法（ＲａｎｄａｌｌおよびＳｅｌｉｔｔｏ、１９５７）を若干変更した方法で測定した。この装置は、ラットの足に力を加え、これは一定割合で増大する（１秒あたり数グラム）。動物をキャップ付ハンドの間で優しく拘束し、ラットが後ろ足を引っ込めるまで増大する圧力を測定した。薬剤を注射する前、注射後１、３および２４時間、その後毎日７日間にわたって機械的疼痛閾値を測定した。７日の薬剤治療後、筋肉内注射をやめ、疼痛閾値を１週間に２回測定した。
【００５８】
（ｃ）機械的に誘発された痛覚過敏に対するＶｃ１．１の効果
Ｖｃ１．１は機械的に誘発された痛覚過敏を１時間、３時間、および２４時間後に、食塩水で処置された対照と比較して、それぞれ８９％、６４％、および１１６％軽減した。これらの結果を図６ａおよびｂに示す。毎日Ｖｃ１．１を筋肉内注射することも神経損傷により誘発される機械的痛覚過敏に対して著しい効果を有し、図７ａに示すように、１１日、１２日、１３日、および１４日にそれぞれ１４０％、１８６％、１５６％および１７２％に相当した。Ｖｃ１．１は図９ｂに示すように、この時間にわたって機械的に誘発される痛覚過敏の緩和に合成ω−コノトキシンＭＶＩＩＡよりも約３倍以上有効であった。加えて、Ｖｃ１．１は図７ｂに示すように、毎日の筋肉内注射をやめた後数週間機械的に誘発される痛覚過敏を軽減した。
【実施例５】
【００５９】
Ｖｃ１．１は感覚神経機能を阻害する。
この研究は、５Ｈｚで１分間、２０Ｖ、２ｍｓで低周波数電気刺激（ＬＦＥＳ）を用いた無髄鞘一次求心性感覚神経の活性化（逆刺激）により媒介される血管反応に関して、３つの合成コノトキシン、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、ω−コノトキシンＧＶＩＡおよびα−コノトキシンＶｃ１．１を比較する。−４０ｋＰａの吸引圧を用いてコノトキシンペプチドを麻酔したラットの足蹠上に生じた水疱の基部上に灌流した。足蹠は坐骨神経の末端により神経支配され、これらは潅流された化合物の影響を受けやすい。水疱の基部からレーザードップラーフローメトリーを用いて皮膚において微小血管血流における変化を測定した。坐骨神経を電気刺激する３０分前、１分間の電気刺激期間中、および刺激後２０分間、３つのコノペプチドを灌流した。図８ａに示す結果は、Ｖｃ１．１（１μＭ）が感覚神経の低周波数電気刺激に対する血管反応を著しく阻害することを示す。微小血管血流における変化を刺激後２０分間測定された反応曲線の下の面積（ｃｍ２）として表す。試験した３つのコノトキシンは全て、対照と比較すると、ＬＦＥＳに応じて血管反応を著しく阻害した。３つのコノトキシン治療群の任意のものの間には有意な差はなかった。阻害の程度は、ω−コノトキシンＧＶＩＡおよびω−コノトキシンＭＶＩＩＡにより生じるものに匹敵した。感覚神経の電気刺激に応答して測定される血管反応は、これらの神経が神経伝達物質を放出して血管拡張を引き起こす能力だけでなく、平滑筋細胞を広げる能力も反映するので、本発明者らは平滑筋反応性における変化の内部標識としてニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）を使用した。ＳＮＰは直接平滑筋細胞拡張剤であり、感覚神経とは無関係に作用する。試験したコノトキシンの作用が平滑筋反応性に対する作用に依存するかまたは無関係であるかどうかを調べるために、コノトキシンの存在下または不在下で、水疱基部上にＳＮＰを１０分間灌流した。ＳＮＰ（１００μＭ、リンゲル液中に溶解）を水疱基部上に１０分間還流し、続いて血流がベースラインに戻るまでリンゲル液で１０分間すすいだ。Ｖｃ１．１の不在下での結果（２４．５±１．４）は、Ｖｃ１．１の存在下での結果（２３．０±１．６）と著しく異ならなかった（ｎ＝２２）。図８ｂに示す結果は、Ｖｃ１．１の灌流はＳＮＰに対する応答を変更せず、このことは、感覚神経刺激に対する血管反応に関するＶｃ１．１の阻害効果は、平滑筋反応性における変化と無関係の作用により媒介されることを示す。最も適当な説明としては、Ｖｃ１．１は刺激された感覚神経からの感覚神経伝達物質の放出を阻害するということである。
【００６０】
本発明者らは、前記結果に基づいて、Ｖｃ１．１の作用の最も有望なメカニズムは、感覚神経に関するニューロン型のニコチン性アセチルコリンレセプターをブロックすることを含むものであることを提唱する。これは、他のメカニズム（たとえば、可能性のあるＮ−タイプＣａ＋＋チャンネルのブロッキング）を除外するものではなく、特定のシナプス前ｎＡＣｈＲおよび電圧ゲート制御カルシウムチャンネルの機能的関連性が証明されているので（Ｋｕｌａｋら、２００１）、実際に可能性があるように思われる。
【実施例６】
【００６１】
Ｖｃ１．１は神経損傷からの回復速度を加速する。
本発明者らの以前の研究（Ｋｈａｌｉｌら、１９９９）は、慢性狭窄型神経傷害からの回復は、損傷された神経により神経支配されている領域における痛覚過敏症の軽減および末梢血管反応の常態への復帰により決定することができることを示した。血管反応は血管拡張薬（サブスタンスＰ、死の前に起こるメカニズムにより作用する）を損傷された神経により神経支配されている領域上に生じた水疱の基部上に灌流することにより調べることができる。図１０ｂおよび１２ｂは、８週後、１μＭでのサブスタンスＰの灌流に対する血管反応を示す。対照と比較して、Ｖｃ１．１処置群は８３％、Ｖｃ１．１ｐｔｍ処置群は８５％の回復を示した。食塩水（４７％）およびＭＶＩＩＡ（５４％）処置群の両方における血管反応は、対照と著しく異なったままであり、このことは機能的回復が不完全であることを示す。坐骨神経は、感覚神経、交感神経および運動神経を含むが；サブスタンスＰが感覚神経に依存したメカニズムにより血管拡張効果を誘発するので、この特定の血管試験は神経の感覚成分の機能を特異的に反映する。従って、この血管反応の常態への復帰は、炎症性血管反応を起こす能力により示される感覚神経の機能的回復を反映する。結果は、Ｖｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの両方が８週間後に血管反応を常態へ回復させるのに有効であったことを示す。
【実施例７】
【００６２】
ペプチドＶｇ１．１の単離
Ｃｏｎｕｓ  ｖｉｃｔｏｒｉａｅからのＶｃ１．１の単離について記載したのと同じ分子法（前記実施例１参照）により、Ｃｏｎｕｓ  ｖｉｒｇｏ（Ｌｉｚａｒｄ島（Ｎｏｒｔｈ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）で集めた）の毒管からペプチドＶｇ１．１を単離した。クローンを選択し、Ｖｇ１．１をエンコードするクローンのヌクレオチド配列を、ＲＴＰＣＲ／ＲＡＣＥ技術を用いて増幅した。Ｖｇ１．１のアミノ酸配列を推定し、固相ペプチド合成法により商業的に（ＡｕｓＰｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）合成し、空気酸化によりジスルフィド結合を形成させた。推定されるペプチドＶｇ１．１は構造：
ＤＣＣＳＮＰＰＣＡＨＮＮＰＤＣ−ＮＨ２（配列番号８）
（ここにおいて、Ｃ−末端システインはアミド化されている）を有する。
【００６３】
合成されたペプチドをＶｃ１．１について記載されてようにして、
（１）培養物におけるウシ副腎髄質クロム親和性細胞におけるニューロン型ニコチン性アセチルコリンレセプター反応を阻害する能力、
（２）クロム親和性細胞のニコチン性反応について機能的に競合する（アドレナリンおよびノルアドレナリンを放出する）能力、および
（３）ラットにおける坐骨神経の電気刺激に対する血管反応を阻害し、ラットにおいて神経病性疼痛のＣＣＩモデルにおいて疼痛を防止する能力
について試験した。
結果を図１２および１３に示す。
【実施例８】
【００６４】
ペプチドＡｎ１．１の単離
ペプチドの供給源がＥｄｉｔｈｂｕｒｇｈ（Ｓｔ  Ｖｉｎｃｅｎｔ湾、南オーストラリア）から集めたＣｏｎｕｓ  ａｎｅｍｏｎｅの毒管である以外は、Ｖｇ１．１についてすでに記載したようにしてペプチドＡｎ１．１を単離した。ペプチドＡｎ１．１について推定される構造は次の通りである：
ＧＣＣＳＨＰＡＣＹＡＮＮＱＤＹ−ＮＨ２（配列番号９）
（ここにおいてＣ−末端システインはアミド化されている）。
推定される配列は商業的に合成し（ＡｕｓＰｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）、空気酸化した。合成ペプチドをＶｃ１．１について記載したようにして、インビトロおよびインビボにおいて試験した。結果を図１２および１４に示す。
【００６５】
高い程度の同一性を示すために、Ｖｃ１．１、Ｖｃ１．１ｐｔｍ、Ａｎ１．１およびＶｇ１．１の配列を以下のように整列させることができる：
ＧＣＣＳＤＰＲＣＮＹＤＨＰＥＩ  Ｃ−ＮＨ２  Ｖｃ１．１
ＧＣＣＳＤＯＲＣＮＹＤＨＰγＩ  Ｃ−ＮＨ２  Ｖｃ１．１ｐｔｍ
ＧＣＣＳＨＰＡＣＹＡＮＮＱＤＹ  Ｃ−ＮＨ２  Ａｎ１．１
ＤＣＣＳＮＰＰＣＡＨＮＮＰＤ    Ｃ−ＮＨ２  Ｖｇ１．１
γ＝γ−カルボキシグルタメート
Ｏ＝４−Ｈｙｐ
【実施例９】
【００６６】
Ｖｃ１．１は血圧に影響を及ぼさない。
新規α−コノトキシンが有害な全身性副作用を有するかどうかを確認するための予備実験において、Ｖｃ１．１（２００μｌ中１μＭ、ｉｍ）のラットにおける安静時収縮期血圧に対する影響を測定した。図１５はＶｃ１．１が全身血圧に影響を及ぼさないこと、すなわち、Ｖｃ１．１が全身性循環効果を有さないことを示す。
【００６７】
考察
ニコチン性レセプター機能の疼痛との関連性は比較的新しい。初期の研究は、強力なニコチン性作用物質は鎮痛薬であることを確立したが、真実はあまり明らかではないかまたはニコチン性拮抗物質についてよく確立されている。脳において特定のニコチン性レセプターサブユニットが欠けているマウスは疼痛反応が減少した（Ｍａｒｕｂｉｏら、１９９９）。
ｎＡＣｈＲが培養された感覚後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン体上でも発現される良好な証拠があり（Ｇｅｎｚｅｎら、２００１）、ｎＡＣｈＲはＤＧＲ求心性部分の末端上でも発現される可能性がある。脊髄は、後角における一次求心性部分の末端にシナプス前接触をさせる抑制コリン作用性介在ニューロンの副次手段を含む（Ｇｅｎｚｅｎら、２００１により論評）。脊髄におけるアセチルコリンはしたがってＤＲＧ求心性部分の中心末端上で発現されるｎＡＣｈＲを活性化する。末梢神経末端上でｎＡＣｈＲを活性化できるアセチルコリンの供給源は同定されていないが、多くの非ニューロン細胞がアセチルコリンを含むかまたは製造できる証拠はある（Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９９）。加えて、Ｃｈａｎｇｅｕｘと同僚らは、最近、４０％までのニューロンｎＡＣｈＲは本質的に活性であり、活性化にＡＣｈを必要としないことを証明した（ＣｈａｎｇｅｕｘおよびＥｄｅｌｓｔｅｉｎ、２００１）。ニコチン性拮抗物質は、活性の本質的なレベルを低下させるのに有効である。この本質的に活性なレセプターの集団は、末梢神経損傷後の神経腫において差別的に多数発現され得る。加えて、ニコチン性レセプター脱感作は、エピバチジンおよびＡＢＴ−５９４などの強力なニコチン性作用物質の鎮痛効果の原因であるが、ニコチン性レセプター活性化に必要とされるよりもずっと低い作用物質濃度で存在し（Ｇｅｎｚｅｎら、２００１参照）、感覚活性の調節において重要な役割を果たし得る。他の者は、このような作用物質を鎮痛用量以下で投与した場合の刺激性および自発性応答または痛覚過敏を報告している（Ｍａｓｎｅｒ、１９７２；Ｋｈａｎら、１９９４）。
【００６８】
ニコチン性作用物質の末梢適用は前記のような刺激性効果を引き起こし得るが、行動実験により、ニコチン性作用物質は鎮痛性も有することが証明された。興味深いことに、エピバチジンはニコチンと類似点がある。エピバチジンの類似構造に注意し、ただしヒトに使用するには毒性が高すぎることを承知して、Ｄａｌｙと同僚はＡｂｂｏｔｔ研究所と共同して、鎮痛薬として有効であることを願ってニコチン様化学物質を調製することを始めた（論評に関してはＰｌｏｔｋｉｎ、２０００参照）。発明し、試験された数百の分子のうちのひとつ：ＡＢＴ−５９４が突出していた。エピバチジンの毒性がないだけでなく、同等の鎮静薬が比較的有効でない神経損傷により引き起こされる疼痛を含む数種の疼痛に対して有効であることが証明された。鎮静薬と違って、ＡＢＴ−５９４は常習性がなく、鎮静作用を引き起こすよりも覚醒を向上させ、呼吸器系に対する影響が比較的少ない。これは便秘や常習などのモルヒネの主な副作用がないが、まだ規制許可を受けていない。
エピバチジンと同様、ＡＢＴ−５９４はモルヒネよりも高い鎮痛効力を有するニコチン性作用物質であり、全身的、皮内または痛覚消失の調節システムの低下に関与する部位である大縫線核において中心に投与された場合に痛覚消失を生じることができる。
ニコチン性作用物質の刺激性効果は主にｎＡＣｈＲ活性化とＮａ＋およびＣａ２＋チャンネル活性化につながるその後のニューロン脱分極によるが、本発明者らは、エピバチジンおよびその誘導体、たとえばＡＢＴ−５９４のような強力なニコチン性作用物質の阻害効果は、レセプター脱感作およびＮａ＋およびＣａ２＋チャンネル閉鎖のためであることを提唱する。これは、以前には示唆されておらず、ニコチン性拮抗物質、たとえば、α−コノトキシンが疼痛に対する臨床的使用について鎮痛薬として有用であることを示す。
【００６９】
明確にし、理解する目的で本発明をある程度詳細に記載したが、本明細書に記載した具体例および方法に対して様々な修正および変更を本明細書に開示した本発明の概念の範囲を逸脱すること行うことができることは、当業者らには明らかであろう。
本明細書において記載した引例を次に列挙し、出典明示により本発明の一部として参照される。
【００７０】
参考文献
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【００７１】
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【００７２】
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Ｂｏｗｅｒｓｏｘ  Ｓ、Ｍａｎｄｅｍａ  Ｊ、Ｔａｒｃｚｙ−Ｈｏｒｎｏｃｈ  Ｋ、Ｍｉｌｊａｎｉｃｈ  Ｇ、Ｌｕｔｈｅｒ  ＲＲ（１９９７）ＳＮＸ−１１１の薬物動力学、ラットおよびカニクイザルにおける選択的Ｎ−タイプカルシウムチャンネルブロッカー（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ＳＮＸ−１１１，ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｎ−ｔｙｐｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ，ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ．）  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．２５，３７９−８３
【００７３】
Ｂｏｗｅｒｓｏｘ  ＳＳ、Ｓｉｎｇｈ  Ｔ、Ｌｕｔｈｅｒ  ＲＲ（１９９６）選択的Ｎ−タイプニューロン電位感受性カルシウムチャンネルブロッカー、ＳＮＸ−１１１は急性、持続性および神経病性疼痛のラットモデルにおいて脊髄非侵害受容を生じる。（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｎ−ｔｙｐｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ，ＳＮＸ−１１１，ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｓｐｉｎａｌ  ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ，ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２７９、１２４３−１２４９
Ｂｒｏｘｔｏｎ  Ｎ、Ｍｉｒａｎｄａ  Ｌ、Ｇｅｈｒｍａｎｎ  Ｊ、Ｄｏｗｎ  Ｊ、Ａｌｅｗｏｏｄ  Ｐ、およびＬｉｖｅｔｔ  Ｂ（２０００）α−コノトキシンＰｎＩＢのＬｅｕ１０はウシクロム親和性細胞におけるニューロンニコチン性応答について有効性を付与する。（Ｌｅｕ１０  ｏｆ  α−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＰｎＩＢ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  ｃｅｌｌｓ．）Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３９０：２２９−２３６
【００７４】
Ｃａｍｐｏｓ−Ｃａｒｏ  Ａ、Ｓｍｉｌｌｉｅ  ＦＩ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ  ｄｅｌ  Ｔｏｒｏ  Ｅ、Ｒｏｖｉｒａ  ＪＣ、Ｖｉｃｅｎｔｅ−Ａｇｕｌｌｏ  Ｆ、Ｃｈａｐｕｌｉ  Ｊ、Ｊｕｉｚ  ＪＭ、Ｓａｌａ  Ｓ、Ｓａｌａ  Ｆ、Ｂａｌｌｅｓｔａ  ＪＪ、Ｃｒｉａｄｏ  Ｍ（１９９７）ウシクロム親和性細胞上のニューロンニコチン性アセチルコリンレセプター：レセプターサブユニットのクローニング、発現およびゲノム機構（Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  ｃｅｌｌｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｅｐｔｏｔｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８、４８８−４９７
Ｃａｓｔａｎｉｅ  ＭＰ、Ｂｅｒｇｅｓ  Ｈ、Ｏｒｅｇｌｉａ  Ｊ、Ｐｒｅｒｅ  ＭＦ、Ｆａｙｅｔ  Ｏ（１９９７）シャペロンの試験を可能にする１組のｐＢＲ３２２適合性プラスミドはエシェリキア・コリにおいて過剰発現されたタンパク質のフォールディングを助けた。（Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐＢＲ３２２−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈａｐｅｒｏｎ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２５４：１５０−１５２
【００７５】
Ｃｈａｎｇｅｕｘ  Ｊ、Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ  ＳＪ（２００１）正常および病的なニコチン性アセチルコリンレセプターにおけるアロステリックなメカニズム（Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１：３６９−７７［ＲＥＶＩＥＷ］
Ｃｈｏｒｅｖ  ＭおよびＧｏｏｄｍａｎ  Ｍ（１９９３）レトロインベルソペプチド模倣物の１２年（Ａ  ｄｏｚｅｎ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ．）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６  ２６６−２７３
Ｃｏｄｉｇｎｏｌａ  Ａ、ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ、Ｃａｔｔａｎｅｏ  ＭＧ、Ｖｉｃｅｎｔｉｎｉ  ＬＭ、Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｆ、Ｓｈｅｒ Ｅ（１９９６）アルファ−コノトキシンインペリアリンスＩはヒト神経内分泌癌細胞におけるニコチン誘発性ホルモン放出および細胞増殖を阻害する。（ａｌｆａ−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ｉｍｐｅｒｉａｌｉｓ  Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｅｖｏｋｅｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２０６：５３−５６
Ｄｅｃｋｅｒ、ＭＷ、Ｍｅｙｅｒ、ＭＤ、Ｓｕｌｌｉｖａｎ、ＪＰ（２００１）疼痛制御についてのニコチン性アセチルコリンレセプター作用物質の治療的可能性（Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ．）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００１  １０月；１０（１０）：１８１９−３０  Ｒｅｖｉｅｗ
【００７６】
Ｆａｖｒｅａｕ  Ｐ、Ｋｒｉｍｍ  Ｉ、Ｌｅ  Ｇａｌｌ  Ｆ、Ｂｏｂｅｎｒｉｅｔｈ  ＭＪ、Ｌａｍｔｈａｎｈ  Ｈ、Ｂｏｕｅｔ  Ｆ、Ｓｅｒｖｅｎｔ  Ｄ、Ｍｏｌｇｏ  Ｊ、Ｍｅｎｅｚ  Ａ、Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｘ  Ｙ、Ｌａｎｃｅｌｉｎ  ＪＭ（１９９９）Ｃｏｎｕｓ  ｃｏｎｓｏｒｓの毒から単離された新規アルファ−コノトキシンの生化学的キャラクタライゼーションおよび核磁気共鳴構造（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ａｌｐｈａ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ｃｏｎｕｓ  ｃｏｎｓｏｒｓ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（１９）６３１７−２６
Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＲＭ、Ｐｅｒｌｏｗ  ＤＳ、Ｖｅｂｅｒ  ＤＦ（１９８２）ペプチドにおける構造的制約として用いられる保護されたラクタム架橋ジペプチド（Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｌａｃｔａｍ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７、１０４−１０９
Ｇａｌｌｏｐ  ＭＡ、Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ、Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ、Ｆｏｄｏｒ  ＳＰ、Ｇｏｒｄｏｎ  ＥＭ（１９９４）薬物デリバリーに対する組み合わせ技術の適用。１．背景およびペプチドコンビナトリアルライブラリー（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｒｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．１．Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９４  ３７、１２３３−１２５１［Ｒｅｖｉｅｗ］
【００７７】
Ｇｅｚｅｎ、Ｊ．Ｒ．、Ｃｌｅｖｅ、Ｗ．Ｖ．およびＭｃＧｈｅｈｅｅ、Ｄ．Ｓ．（２００１）後根神経節ニューロンは複数のニコチン性アセチルコリンレセプターサブタイプを発現する。（Ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ．）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．８６：１７７３−１７８２
Ｇｅｒｚａｎｉｃｈ  Ｖ、Ｐｅｎｇ  Ｘ、Ｗａｎｇ  Ｆ、Ｗｅｌｌｓ  Ｇ、Ａｎａｎｄ  Ｒ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  Ｓ、およびＬｉｎｄｓｔｒｏｍ  Ｊ．（１９９５）エピバチジンの比較薬理学：ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターの有効な作用物質（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎｅ：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８：７７４−７８２
Ｇｕａｎ  ＺＺ、Ｚｈａｎｇ  Ｘ、Ｒａｖｉｄ  Ｒ、Ｎｏｒｄｂｅｒｇ  Ａ（２０００）アルツハイマー病の患者の海馬および外皮質におけるニコチン性レセプターサブユニットの減少したタンパク質レベル（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７４、２３７−２４３
【００７８】
Ｇｒｏｅｂｅ  ＤＲ、Ｇｒａｙ  ＷＲ、Ａｂｒａｍｓｏｎ  ＳＮ（１９９７）ニコチン性アセチルコリンレセプターの筋肉サブタイプについてのアルファ−コノトキシンＧＩおよびＳＩの親和性に関与する決定因子（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｃｏｎｏｔｏｋｉｓ  ＧＩ  ａｎｄ  ＳＩ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６、６４６９−６４７４
Ｈｅａｄｉｎｇ  Ｃ（１９９９）“ジコノチド、ニューレックス・コープ”ＣＰＮＳ治験薬における現在の見解（“Ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ，Ｎｅｕｒｅｘ  Ｃｏｒｐ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ＣＰＮＳ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ）１、１５３−１６６［Ｒｅｖｉｅｗ］
Ｈｏｔｔｅｎｒｏｔｔ  Ｓ、Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｔ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｇ、Ｒａｈｆｅｌｄ  Ｊ−Ｕ（１９９７）エシェリキア・コリＳｌｙＤは金属イオン−調節ペプチジル−プロリルシス／トランスイソメラーゼである。（Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳｌｙＤ  ｉｓ  ａ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７２：１５６９７−１５７０１
Ｈｏｇａｎ  ＪＣ（１９９７）薬物発見におけるコンビナトリアル化学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５  ３２８−３３０
【００７９】
Ｊａｉｎ、ＫＫ（２０００）慢性疼痛を治療するための鞘内ジコノチドの評価（Ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｉｎ．）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．９、２４０３−１０［Ｒｅｖｉｅｗ］
Ｈｏｇｇ  ＲＣ、Ｍｉｒａｎｄａ  ＬＰ、Ｃｒａｉｋ  ＤＪ、Ｌｅｗｉｓ  ＲＪ、Ａｌｅｗｏｏｄ  ＰＦおよびＡｄａｍｓ  ＤＪ（１９９９）哺乳動物ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターのサブタイプについてのアルファ−コノトキシンＰｎＩＡシフト選択性における単一のアミノ酸置換（Ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｌｐｈａ−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＰｎＩＡ  ｓｈｉｆｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６５５９−３６５６４
Ｊｏｎｅｓ  Ａ、Ｂｉｎｇｈａｍ  ＪＰ、Ｇｅｈｒｍａｎｎ  Ｊ、Ｂｏｎｄ  Ｔ、Ｌｏｕｇｈｎａｎ  Ｍ、Ａｔｋｉｎｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  ＲＪおよびＡｌｅｗｏｏｄ  ＰＦ（１９９６）質量分析およびタンデム質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィーによるコノペプチドの単離およびキャラクタライゼーション（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１０、１３８−１４３
Ｊｏｎｅｓ  ＲＭ、Ｂｕｌａｊ  Ｇ（２０００）コノトキシン−ペプチド療法の新規分野（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ  −  ｎｅｗ  ｖｉｓｔａｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．６、１２４９−８５［Ｒｅｖｉｅｗ］
【００８０】
Ｋａｒｌｉｎ、Ａ．（２００２）ニコチン性アセチルコリンレセプターの新しい構造（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：１０２−１１４［Ｒｅｖｉｅｗ］
Ｋｈａｌｉｌ、Ｚ．、Ｌｉｕ、Ｔ．およびＨｅｌｍｅ、Ｒ．Ｄ．（１９９９）フリーラジカルは慢性狭窄型障害のラットにおける神経性血管反応の軽減および熱痛覚過敏の維持に寄与する。（Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｇｎｅｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ．）Ｐａｉｎ：７９：３１−３７
Ｋｈａｎ  ＩＭ、Ｔａｙｌｏｒ  ＰおよびＹａｋｓｈ  ＴＬ（１９９４）鞘内投与されたニコチン型薬剤の刺激経路および作用部位（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｙｗａｙｓ  ａｎｄ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ．）Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７１：１５５０−１５５７
Ｋｕｌａｋ  ＪＭ、ＭｃＩｎｔｏｓｈ、ＪＭ、Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ  Ｄ、およびＯｌｉｖｅｒａ  ＢＭ（２００１）シナプトソームにおけるニコチン誘発性伝達物質放出：特異的シナプス前アセチルコリンレセプターと電圧ゲート制御カルシウムチャンネルの機能的関連（Ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｅｖｏｋｅｄ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍｅｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：２５８１−８９
【００８１】
Ｌｅｗｉｓ  ＲＪ、Ｂｉｎｇｈａｍ  ＪＰ、Ｊｏｎｅｓ  Ａ、Ａｌｅｗｏｏｄ  ＰＦ、Ａｎｄｒｅｗｓ  ＰＲ（１９９４）海洋性イモガイのペプチド毒から得られる薬剤（Ｄｒｕｇｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖｅｎｏｍｓ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  ｃｏｎｅ  ｓｈｅｌｌｓ．）Ａｕｓｔｒａｌｉａ’ｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、２９８−３００［Ｒｅｖｉｅｗ］
Ｌｉｎ、Ｓ−Ｒ、Ｃｈａｎｇ  ＬＳ、Ｃｈａｎｇ、ＣＣ（１９９９）キングコブラ毒から得られるα−ニューロトキシンのジスルフィド異性体（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒｓ  ｏｆ  α−ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｋｉｎｇ  Ｃｏｂｒａ（Ｏｐｈｉｏｐｈａｇｕｓ  ｈａｎｎａｈ）Ｖｅｎｏｍ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５４、１０４−１０８
Ｌｉｖｅｔｔ  ＢＧ、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ  ＫＩ、Ｄｅａｎ  ＤＭ（１９８７ａ）副腎クロム親和性細胞−その単離および培養。（Ａｄｒｅｎａｌ  ｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  ｃｅｌｌｓ−ｔｈｅｉｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．）Ｉｎ  Ｐｏｉｓｎｅｒ  ＡＭ、Ｔｒｉｆａｒｏ  ＪＭ（編）Ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ、第３巻。Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１７１−１７５
Ｌｉｖｅｔｔ  ＢＧ、Ｍａｒｌｅｙ  ＰＤ、Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ  ＫＩ、Ｗａｎ  ＤＣ、Ｗｈｉｔｅ  ＴＤ（１９８７ｂ）副腎クロム親和性細胞分泌の評価：４種の技術の提示（Ａｓｓｅｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｒｅｎａｌ  ｃｈｒｏｍａａｆｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ：Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．）Ｉｎ  Ｐｏｉｓｎｅｒ  ＡＭ  ａｎｄ  Ｔｒｉｆａｒｏ  ＪＭ（編）Ｔｈｅ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ、第３巻、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１７７−２０４
【００８２】
Ｌｏｕｇｈｎａｎ  Ｍ、Ｂｏｎｄ  Ｔ、Ａｔｋｉｎｓ  Ａ、Ｃｕｅｖａｓ  Ｊ、Ａｄａｍｓ  ＤＪ、Ｂｒｏｘｔｏｎ  ＮＭ、Ｌｉｖｅｔｔ  ＢＧ、Ｄｏｗｎ  ＪＧ、Ｊｏｎｅｓ  Ａ、Ａｌｅｗｏｏｄ  ＰＦ、Ｌｅｗｉｓ  ＲＪ（１９９８）アルファ−コノトキシンＥｐＩ、ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターを選択的に標的にするＣｏｎｕｓ  ｅｐｉｓｃｏｐａｔｕｓから得られる新規硫酸化ペプチド（ａｌｐｈａ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＥｐＩ，a  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｎｕｓ  ｅｐｉｓｃｏｐａｔｕｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３、１５６６７−１５６７４
Ｌｕｋａｓ  ＲＪ、Ｃｈａｎｇｅｕｘ  ＪＰ、Ｌｅ  Ｎｏｖｅｒｅ  Ｎ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ  ＥＸ、Ｂａｌｆｏｕｒ  ＤＪ、Ｂｅｒｇ  ＤＫ、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｄ、Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ  ＶＡ、Ｃｌａｒｋｅ  ＰＢ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＡＣ、Ｄａｎｉ  ＪＡ、Ｇｒａｄｙ  ＳＲ、Ｋｅｌｌａｒ  ＫＪ、Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ＪＭ、Ｍａｒｋｓ  ＭＪ、Ｑｕｉｋ  Ｍ、Ｔａｙｌｏｒ  ＰＷ、Ｗｏｎｎａｃｏｔｔ  Ｓ．（１９９９）薬理学国際連盟（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）ＸＸ  ニコチン性アセチルコリンレセプターおよびそのサブユニットの命名の現状。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５１、３９７−４０１［Ｒｅｖｉｅｗ］
【００８３】
Ｌｕｏ  Ｓ、Ｋｕｌａｋ  ＪＭ、Ｃａｒｔｉｅｒ  ＧＥ、Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＲＢ、Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ  Ｄ、Ｏｌｉｖｅｒａ  ＢＭおよびＭｃＩｎｔｏｘｈ  ＪＭ（１９９８）アルファ−コノトキシンＡｕＩＢはアルファ３ベータ４ニコチン性アセチルコリンレセプターおよびニコチン誘発性ノルエピネフリン放出を選択的にブロックする。（ａｌｐｈａ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＡｕＩＢ  ｓｅｌｅｔｉｖｅｌｙ  ｂｌｏｃｋｓ  ａｌｐｈａ３ｂｅｔａ４  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｅｖｏｋｅｄ  ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：８５７１−８５７９
Ｍａｉｌｌｏ、Ｍ．、Ｍ．Ｂ．Ａｇｕｉｌａｒ、Ｅ．Ｌｏｐｅｚ−Ｖｅｒａ、Ａ．Ｇ．Ｃｒａｉｇ、Ｇ．Ｂｕｌａｊ、Ｂ．Ｍ．、ＯｌｉｖｅｒａおよびＥ．Ｐ．Ｈｅｉｍｅｒ  ｄｅ  ｌａ  Ｃｏｒｔｅｒａ（２００１）コノルファミド、神経ペプチドのＲＦアミド科に属するコーヌス毒ペプチド（Ｃｏｎｏｒｆａｍｉｄｅ，ａ  Ｃｏｎｕｓ  ｖｅｎｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＲＦａｍｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．）Ｔｏｘｉｃｏｎ、４０：４０１−４０７
Ｍａｒｕｂｉｏ  ＬＭ、Ａｒｒｏｙｏ−Ｊｉｍｅｎｅｚ  ＭＤＭ、Ｃｏｒｄｅｒｏ−Ｅｒａｕｓｑｕｉｎ  Ｍ、Ｌｅｎａ  Ｃ、ＬｅＮｏｖｅｒｅ  Ｎ、ＤＥｘａｅｒｄｅ  ＡＫ、Ｈｕｃｋｅｔ  Ｍ、Ｄａｍａｊ  ＭＩおよびＣｈａｎｇｅｕｘ  ＪＰ（１９９９）ニューロンニコチン性レセプターサブユニットが欠けたマウスにおける軽減された抗侵害受容。（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８、８０５−８１０
Ｍａｓｎｅｒ  Ｒ（１９７２）マウスにおけるニコチンおよびその脳レベルの主要な効果間の関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｏｍｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｒａｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．）Ａｎｎ．Ｍｅｄ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｆｅｎｎｉａｅ  ５０；２０５−２１２
【００８４】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ、Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ  Ｄ、Ｍａｈｅ  Ｅ、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＤＢ、Ｒｉｖｉｅｒ  ＪＥ、Ｇｒａｙ  ＷＲ、Ｏｌｉｖｅｒａ  ＢＭ（１９９４）独自の特異性を有するニコチン性アセチルコリンレセプターリガンド、アルファ−コノトキシンＩｍｌ（Ａ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｌｐｈａ−ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  Ｉｍｌ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６７３３−１６７３９
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭおよびＪｏｎｅｓ  ＲＭ（２００１）イモガイ毒−偶発的に刺されることから故意の注射まで（Ｃｏｎｅ  ｖｅｎｏｍ−ｆｒｏｍ  ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ  ｓｔｉｎｇｓ  ｔｏ  ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．）Ｔｏｘｉｃｏｎ３９：１４４７−１４５１
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ、Ｓａｎｔｏｓ  ＡＤ、Ｏｌｉｖｅｒａ  ＢＭ（１９９９）コーヌスペプチドは特定のニコチン性アセチルコリンレセプターサブタイプを標的とした。（Ｃｏｎｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８、５９−８８
ＭｃＩｎｔｏｓｈ  ＪＭ、Ｃｏｒｐｕｚ  ＧＯ、Ｌａｙｅｒ  ＲＴ、Ｇａｒｒｅｔｔ  ＪＥ、Ｗａｇｓｔａｆｆ  ＪＤ、Ｂｕｌａｊ  Ｇ、Ｖｙａｚｏｖｋｉｎａ  Ａ、Ｙｏｓｈｉｋａｍｉ  Ｄ、Ｃｒｕｚ  ＬＪ、Ｏｌｉｖｅｒａ  ＢＭ（２０００）見掛けの抗侵害受容活性を有する新規コーヌスペプチドの単離およびキャラクタライゼーション（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  １０月  ２０；２７５（４２）：３２３９１−７
【００８５】
Ｍｅｒｈｉ、Ｍ．、Ｄｕｓｔｉｎｇ、Ｇ．Ｊ．およびＫｈａｌｉｌ、Ｚ．（１９９８）ニューロン起源のＣＧＲＰおよび酸化窒素はラット皮膚微小血管において神経性血管拡張を媒介する。（ＣＧＲＰ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｖａｓｏｄｉｌａｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｉｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２３：８６３−８６８
Ｍｉｒａｎｄａ、ＬＰおよびＡｌｅｗｏｏｄ、ＰＦ．（１９９９）ペプチドおよび小タンパク質の促進された化学合成（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１１８１−１１８６
Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  Ｓ、Ｍａｈａｄｉｋ  ＳＰ、Ｋｏｒｅｎｏｖｓｋｙ  Ａ、ＬａｅｖＨ、Ｓｃｈｎｕｒ  ＤＢ、Ｒｅｄｄｙ  Ｒ（１９９４）精神分裂病患者におけるニコチン性アセチルコリンレセプターに対する血清抗体（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．）Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、１３１−１３６
Ｎａｇａｉ  Ｕ、Ｓａｔｏ  Ｋ（１９８５）β−ターン中心部の形状を有する二環式ジペプチドの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  β−ｔｕｒｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐａｒｔ．）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６、６４７−６５０
【００８６】
Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｋ、Ｋａｎｅｍｏｒｉ  Ｍ、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｍ、Ｙａｎａｇａ  Ｈ、Ｙｕｒａ  Ｔ（１９９８）シャペロン同時発現プラスミド：エシェリキア・コリにおける杉花粉、Ｃｒｙｊ２のアレルゲンのフォールディングの援助におけるＤｎａＫＤｎａＪ−ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳの差次的および相乗的役割（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＤｎａＫＤｎａＪ−ＧｒｐＥ  ａｎｄ  ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ  ｉｎ  ａｓｓｉｓｔｉｎｇ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｃｅｄａｒ  ｐｏｌｌｅｎ，Ｃｒｙｊ２，ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６４：１６９４−１６９９
Ｏｌｉｖｅｒａ  ＢＭ、Ｒｉｖｉｅｒ  Ｊ、Ｃｌａｒｋ  Ｃ、Ｒｅｍｉｌｏ  ＣＡ、Ｃｏｒｐｕｚ  ＧＰ、Ａｂｏｇａｄｉｅ  ＦＣ、Ｍｅｎａ  ＥＥ、Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ＳＲ、Ｈｉｌｌｙａｒｄ  ＤＲ、Ｃｒｕｚ  ＬＪ（１９９０）コーヌス神経ペプチドの多様性（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｕｓ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、２５７−２６３
Ｏｌｉｖｅｒａ、Ｂ．Ｍ．およびＬ．Ｊ．Ｃｒｕｚ（２００１）コノトキシン（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎｓ）ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔ．  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：７−１４
Ｏｌｓｏｎ  ＧＬ、Ｂｏｌｉｎ  ＤＲ、Ｂｏｎｎｅｒ  ＭＰ、Ｂｏｓ  Ｍ、Ｃｏｏｋ  ＣＭ、Ｆｒｙ  ＤＣ、Ｇｒａｖｅｓ  ＢＪ、Ｈａｔａｄａ  Ｍ、Ｈｉｌｌ  ＤＥ、Ｋａｈｎ  Ｍ．ら（１９９３）ペプチド模倣物の開発における概念および進歩（Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）［Ｒｅｖｉｅｗ］Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．、３６  ３０３９−３０４９
【００８７】
Ｐｅｎｎ  ＲＤ、Ｐａｉｃｅ  ＪＡ（２０００）ジコノチドの鞘内投与に関連する有害な効果（Ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ．）Ｐａｉｎ．８５（１−２）：２９１−２９６
Ｐｌｏｔｋｉｎ、ＭＪ（２０００）「医薬調査」第１章（Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ“Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｑｕｅｓｔ”）  ｂｙ  Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｖｉｋｉｎｇ−Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｇｒｏｕｐ．
Ｐｒｉｃｅ−Ｃａｒｔｅｒ  Ｍ、Ｂｕａｊ  Ｇ、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＰ（２００２）オメガ−コノトキシンのフォールディングにおける初期ジスルフィド形成工程（Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｅｐｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｏｍｅｇａ−Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ．）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３５０７−３５１９
Ｑｉｕ  Ｊ、Ｓｗａｒｔｚ  ＪＲ、Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  Ｇ（１９９８）エシェリキア・コリにおける活性ヒト組織タイププラスミノーゲンアクチベーターの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９８、６４：４８９１−４８９６
Ｒａｎｄａｌｌ  Ａ、およびＳｅｌｉｔｔｏ  ＪＪ（１９５７）刺激された組織に対する鎮痛活性の測定法（Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎａｌｇｅｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ．）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．１１１：４０９−４１９
【００８８】
Ｓａｒｇｅｎｔ  ＰＢ（１９９３）ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターの多様性（Ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｓｅｐｔｏｒｓ．）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６、４０３−４４３
Ｓｃｒｅｎｉｖａｓａｎ、Ａ（２００２）イモガイに遅れずに：進化論生物学者および薬理学研究者らにより追求され、熱帯性軟体動物は「カタツムリのようなペース」を再定義する（Ｋｅｅｐｉｎｇ  ｕｐ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｎｅｓ：ｃｈａｓｅｄ  ｂｙ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ，  ａ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｍｏｌｌｕｓｋ  ｒｅｄｅｆｉｎｅｓ“ａ  ｓｎａｉｌ’ｓ  ｐａｃｅ”．）Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ、１１１、４０−４８［Ｒｅｖｉｅｗ］
Ｓｈｅｎ  ＧＳ、Ｌａｙｅｒ  ＲＴ，ＭｃＣａｂｅ  ＲＴ（２０００）コノペプチド：猛毒から新規治療薬まで（Ｃｏｎｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｆｏｒｍ  ｄｅａｄｌｙ  ｖｅｎｏｍｓ  ｔｏ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５、９８−１０６
Ｓｍｙｔｈｅ  ＭＬ、ｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ  Ｍ（１９９４）抗体−抗原結晶構造に基づく生物学的に活性な抗体模倣物の設計および合成（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｉｃ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６、２７２５−２７３３
【００８９】
Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ  ＯＫ、Ｍｕｌｌｅｙ  ＪＣ、Ｐｒｏｐｐｉｎｇ  Ｐ、Ｗａｌｌａｃｅ  ＲＨ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＨＡ、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＧＲ、Ｓｃｈｅｆｆｅｒ  ＩＥ、Ｂｅｒｋｏｖｉｃ  ＳＦ（１９９５）ニューロンニコチン性アセチルコリンレセプターアルファサブユニットにおけるミスセンス突然変異は常染色体優性夜間前頭葉てんかんと関連する。（Ａ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｏｃｔｕｒｎａｌ  ｆｒｏｎｔａｌ  ｌｏｂｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ．）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１、２０１−２０３
Ｓｔｏｌｌｅｒ  Ｇ、Ｒｕｃｋｎａｇｅｌ  ＫＰ、Ｎｉｅｒｈａｕｓ  ＫＨ、Ｓｃｈｍｉｄ  ＦＸ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｇ、Ｒａｈｆｅｌｄ  Ｊ−Ｕ（１９９５）誘因因子として関連するリボソーム関連ペプチジル−プロリル  シス／トランスイソメラーゼ（Ａ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｓ  ｔｈｅ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ．）ＥＭＢＯ  Ｊ、１４：４９３９−４９４８
Ｔｈｏｍａｓ  ＪＧ、Ｂａｎｅｙｘ  Ｆ（１９９６）熱ショックタンパク質を過剰産生する組み換えエシェリキア・コリ細胞におけるタンパク質ミスフォールディングおよび封入体形成。（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１：１１１４１−１１１４７
Ｗｅｓｓｌｅｒ、Ｉ．、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ、Ｃ．Ｊ．およびＲａｃｋｅ、Ｋ．（１９９９）コリン作用性「落とし穴」：アセチルコリン、ヒトを含む生物学的システムにおける普遍的な細胞分子（Ｔｈｅ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ‘ｐｉｔｆａｌｌ’：ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎｓ．）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６：１９８−２０５［Ｒｅｖｉｅｗ］
【００９０】
Ｗｏｎｎａｃｏｔｔ  Ｓ（１９９７）シナプス前ニコチン性Ａｃｈレセプター（Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ＡＣｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２０，９２−９８
Ｚｈａｏ  Ｑ、Ｓｍｉｔｈ  ＭＬ、Ｓｉｅｓｊｏ  ＢＫ（１９９４）オメガ−コノペプチドＳＮＸ−１１１、Ｎ−タイプカルシウムチャンネルブロッカーは一過性焦点性虚血による脳損傷をめざましく改善する。（Ｔｈｅ  ｏｍｅｇａ−ｃｏｎｏｐｅｐｔｉｄｅ  ＳＮＸ−１１１，ａｎ  Ｎ−ｔｙｐｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ，ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｂｒａｉｎ  ｄａｍａｇｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｆｏｃａｌ  Ｉｓｃｈａｅｍｉａ．）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ．１５０、４５９−６１
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、ペプチドＶｃ１．１のコノペプチド前駆体のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図２】図２ａおよびｂは、ウシクロム親和性細胞からのニコチン刺激カテコールアミン放出に関するＶｃ１．１の作用についての濃度−反応曲線を示す。図２ｃは、Ｖｃ１．１ｐｔｍをＶｃ１．１の代わりに用いる以外は図２ｂについてと同様におこなった実験の結果を示す。
【図３】図３は、クロム親和性細胞からのＫＣｌ−刺激カテコールアミン放出に対するＶｃ１．１の作用についての濃度−反応曲線を示す。
【図４】図４は、Ｖｃ１．１（１μＭ）によるウシ副腎クロム親和性細胞からのカテコールアミン（ノルアドレナリンおよびアドレナリン）のニコチン誘発放出の阻害の競合的性質を示す。
【図５】図５は、標識されたニコチン性レセプター作用物質、３Ｈ−エピバチジンの結合についてＶｃ１．１は競合することを示す。
【図６】図６ａは、食塩水、０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたは０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の筋肉内注射の、慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に関する短期的影響を示す。図６ｂは、損傷ニューロンの足蹠受容野中への食塩水、０．５３μｇ／２．５μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたは０．３６μｇ／２．５μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の皮下注射の、慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する短期効果を示す。
【図７】図７ａは、食塩水または０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡおよび０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１を毎日筋肉内注射することの慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する効果を示す。図７ｂは、食塩水または０．５３μｇ／２００μＬのω−コノトキシンＭＶＩＩＡおよび０．３６μｇ／２００μＬのα−コノトキシンＶｃ１．１の筋肉内注射の慢性狭窄型傷害のラットにおける機械的疼痛閾値に対する効果を示す。
【図８】図８は、ラット皮膚における微小血管血流に対するコノトキシンの影響を示す。
【図９】図９ａは、感覚神経活性に関するＶｃ１．１の用量応答効果を示す。図９ｂは、感覚神経活性の阻害におけるＶｃ１．１とＭＶＩＩＡの有効性を比較する（両方とも０．１μＭペプチドの濃度）。
【図１０】図１０ａは、Ｖｃ１．１およびＶＣ１．１ｐｔｍについてそれぞれ０．３６μｇ／２００μｌおよび０．３７μｇ／２００μｌで静脈内投与された場合の神経病性疼痛の阻害におけるＶｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの長期有効性を比較する。図１０ｂは、炎症性血管応答を起こす能力により評価される損傷神経の機能的回復の促進における筋肉内（ｉｍ）投与されたＶｃ１．１およびＶｃ１．１ｐｔｍの有効性を比較する。
【図１１】図１１は感覚神経活性の阻害におけるＶｃ１．１ｐｔｍとＶｃ１．１の有効性を比較する。
【図１２】図１２は、次の期間にわたって神経病性疼痛の阻害（ＣＣＩモデル）におけるＶｃ１．１、Ａｎ１．１、Ｖｇ１．１、ＭＩＶＶＡ、およびＶｃ１．１ｐｔｍの有効性を示す：ａ）短期（０〜２４時間）、（ｂ）７〜１４日、および（ｃ）長期（２〜８週間）。
【図１３】図１３ａは、Ａｎ１．１による培養されたＢＣＣｓにおけるニューロンニコチン性応答の阻害を示す。図１３ｂは、Ａｎ１．１がＢＣＣにおける機能的ニコチン性レセプター応答の競合的阻害剤でもあり、高濃度のニコチンにより引き起こされるニコチン性レセプター脱感作に対して保護することを示す。
【図１４】図１４（ａ）は、ＢＣＣからのカテコールアミン（ノルアドレナリンおよびアドレナリン）のニコチン（１μＭ）誘発放出に対するペプチドα−コノトキシＶｇ１．１の影響を示す。図１４（ｂ）は、ラットにおける刺激誘発血管応答に対するＶｇ１．１およびＶｃ１．１（両方とも１．０μＭ）の効果の比較である（図８ａとも比較）。図１４（ｃ）は、（ｂ）と同じであるが、０．１μＭの低用量であり、Ｖｃ１．１はＶｇ１．１よりも有効である（図９ｂとも比較）。
【図１５】図１５は、全身血圧に対してＶｃ１．１（２００μｌ中１μＭ  ｉｍ）は影響を及ぼさなかった、すなわち、Ｖｃ１．１は全身循環効果を有さないことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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