(57)【要約】新規のＧＡＶＥ３ポリペプチド、タンパク質および核酸分子を提供する。単離された完全長ＧＡＶＥ３タンパク質に加えて、単離されたＧＡＶＥ３融合タンパク質、抗原性ペプチドおよび抗ＧＡＶＥ３抗体が教示される。またＧＡＶＥ３、組換え発現ベクター、発現ベクターが導入された宿主細胞、および、ＧＡＶＥ３遺伝子が導入または破壊された非ヒトトランスジェニック動物が教示される。本発明の組成物を利用する診断、スクリーニングおよび治療方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＶＥ３のヌクレオチド配列（配列番号１）またはＧＡＶＥ３の変異体を含む単離核酸。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列でＧＡＶＥ３ポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項３】
核酸が、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ＧＡＶＥ３のヌクレオチド配列（配列番号１）の対立遺伝子変異体を含む単離核酸。
【請求項５】
変異体が、付加、欠失または置換による変異をコードする、請求項１に記載の単離核酸。
【請求項６】
置換による変異をコードし、該変異により配列内に少なくとも１つの機能的に同等なアミノ酸残基が提供される、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１に相補的なハイブリダイゼーションプローブ、または、配列番号２をコードする核酸に相補的なハイブリダイゼーションプローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸であって、該プローブは、配列番号１または配列番号２をコードする核酸の断片を含む、上記核酸。
【請求項８】
アミノ酸配列が配列番号１と少なくとも６０％同一であるポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項９】
アミノ酸配列が配列番号２を含む精製ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に記載の第三の細胞内ループを含む精製ポリペプチド。
【請求項１１】
発現調節因子に操作可能に連結した請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
発現調節因子が、構成的配列、細胞特異的配列および誘導調節配列からなる群より選択される、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１４】
発現調節因子に操作可能に連結した請求項１に記載の核酸を含む培養細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載のベクターを含む核酸によりコードされたポリペプチドを発現する、該ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された培養細胞、またはその細胞の後代。
【請求項１６】
細胞が、真核細胞および原核細胞からなる群より選択される、請求項１３に記載の培養細胞。
【請求項１７】
ベクターを含む核酸によりコードされたポリペプチドが発現可能な条件下で請求項１３に記載の細胞を培養することを含む、タンパク質の生産方法。
【請求項１８】
ＧＡＶＥ３に特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
ＧＡＶＥ３のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを治療が必要な患者に投与することを含む、ＧＡＶＥ３シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節するための治療方法。
【請求項２１】
可能性のあるアゴニストとＧＡＶＥ３発現細胞とを接触させること、および、該可能性のあるアゴニストの存在下で、該可能性のあるアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ３活性に比べてＧＡＶＥ３シグナル伝達活性が増加しているかどうかを決定すること、を含む、ＧＡＶＥ３のアゴニストを同定する方法。
【請求項２２】
可能性のあるインバースアゴニストとＧＡＶＥ３発現細胞とを接触させること、および、該可能性のあるインバースアゴニストの存在下で、該可能性のあるインバースアゴニストの非存在下でのＧＡＶＥ３活性に比べてＧＡＶＥ３活性が減少しているかどうか、および内在性リガンドまたはアゴニストの存在下で減少しているかどうかを決定することを含む、ＧＡＶＥ３のインバースアゴニストを同定する方法。
【請求項２３】
可能性のあるアンタゴニストとＧＡＶＥ３発現細胞とを接触させること、および該可能性のあるアンタゴニストの存在下で、内在性リガンドまたはアゴニストの存在下でのＧＡＶＥ３活性に比べてＧＡＶＥ３シグナル伝達活性が減少するかどうかを決定すること、を含む、ＧＡＶＥ３のアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２４】
ＧＡＶＥ３シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節することができるＧＡＶＥ３のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを含む治療組成物。
【請求項２５】
ＧＡＶＥ３シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節することができるＧＡＶＥ３のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストを含む治療組成物を治療が必要な患者に投与することを含む、病気の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞シグナル伝達に関与する内在性膜タンパク質の大規模なファミリーである。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光などの様々な細胞外シグナルに応答し、シグナル伝達を可能にし、細胞内で第２メッセンジャー応答を開始させる。多くの治療用薬物は、ＧＰＣＲを標的とするが、これは、それらの受容体が、炎症、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌および蠕動などの多種多様な生理学的応答を仲介するためである。
【０００２】
ＧＰＣＲは、細胞外ドメイン、７回膜貫通ドメイン、および、細胞内ドメインを特徴とする。受容体が行う機能のいくつか、例えばリガンド結合やＧタンパク質との相互作用は、重要な位置にある特定のアミノ酸の存在に関連する。例えば、様々な研究によれば、ＧＰＣＲのアミノ酸配列における差は、天然のリガンドまたは低分子物質アゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかに対する親和性における差の原因となることが示されている。言い換えれば、配列における小さな差は、結合親和性や活性の差の原因となる可能性がある。（例えば、Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（５０）：３２０１６−２０；Ｂｕｒｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（５１）：３４４８８−９５；および、Ｈｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９９）７２（Ｉ）：４１３−２１を参照）。特に、第三の細胞内ドメインにおけるアミノ酸配列の差が異なる活性の原因になり得ることが研究で示されている。Ｍｙｂｕｒｇｈ等は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体の細胞内ループ３のアラニン２６１が、Ｇタンパク質共役と、受容体内在化とに極めて重要であることを見出した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９８）３３１（Ｐａｒｔ３）：８９３−６）。Ｗｏｎｅｒｏｗ等は、チロトロピン受容体を研究し、第三の細胞内ループにおける欠失が構成的な受容体活性の原因になることを実証した（Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（１４）：７９００−５）。
【０００３】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）のような病気は、一般的に、Ｔヘルパー細胞、単核細胞−マクロファージおよび好酸球に関する炎症性の病因を有すると考えられている。現在のコルチコステロイドを用いる抗炎症性の療法は、喘息には有効であるが、代謝や内分泌の副作用を伴う。おそらく同様のことが、肺または鼻の粘膜を介して吸収することができる吸入用製剤に関しても当てはまる。現在、ＲＡまたはＣＯＰＤのための満足できる経口療法はない。
【０００４】
好酸球は、アレルギーや喘息における気道の機能障害のほとんどを仲介する。インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、好酸球成長およびサイトカイン活性化に関する。ＩＬ−５が、気道過敏性に陥る組織好酸球増加症や好酸球介在の組織ダメージに必要であることが研究により示された（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）９８（５ｐｔ１）：９２２−９３１、および、Ｄｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ（２０００）１６１（１）：２００−２０６）。ＩＬ−５は、アトピー性喘息において、アレルゲン（例えばイエダニ抗原）曝露の後にＴヘルパー２細胞（Ｔｈ２）により生産される。
【０００５】
ＲＡは、罹患した滑膜における活性化マクロファージの蓄積が原因であると信じられている。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、多数のプロ炎症性特性を有するＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞誘導性サイトカインである。これは、最も有力なマクロファージ活性化サイトカインであり、樹状細胞様の表現型をもたらすＭＨＣクラスＩＩ遺伝子転写を誘導する。
【０００６】
リポ多糖体（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細胞壁の成分であり、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）放出などの炎症性反応を引き起こす。ＲＡにおける静脈内抗ＴＮＦα療法の効能が病院で実証されている。ＣＯＰＤはまた、肺でのマクロファージ蓄積に起因するとも考えられている。マクロファージは好中球化学誘引物質を生産する（例えばＩＬ−８：ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２０００）１９０（５）：６１９−６２６）。マクロファージと好中球はいずれも肺胞壁分解を引き起こすカテプシンを放出する。肺上皮は、炎症性細胞の化学誘引物質、および、その他の炎症性細胞活性化因子の重要な源であり得ることが信じられている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４（１８）：８４２５−８４３３；Ｌａｍｋｈｉｏｕｅｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ（２０００）１６２（２Ｐｔ．１）：７２３−７３２；および、Ｓｅｋｉｙａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６５（４）：２２０５−２２１３を参照）。
【０００７】
プロ炎症性物質が走化性シグナルや他のシグナルに対する免疫細胞応答を開始させるメカニズムは、完全には理解されていない。ヒト単核細胞からのＨＭ７４の分子クローニングにより、ＨＭ７４がケモカイン受容体であると推測された（Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９３）５（１０）：１２３９−１２４９）。ＨＭ７４のｍＲＮＡは、一次ヒト好酸球のＩＬ−５処理、ならびにヒトマクロファージのＩＦＮγおよびＬＰＳ治療により、再現可能に、かつ顕著にアップレギュレートされる。従って、ＨＭ７４阻害は炎症性細胞の走化性を阻害し得ると仮定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
病気においてＧＰＣＲが有する役割、および、ＧＰＣＲ活性を調節することによる病気を治療する能力を前提として、これまで未知のＧＰＣＲの同定および特徴付けにより、ＧＰＣＲ活性を伴う病状を治療するための新規の組成物および方法の発展を提供することができる。本発明は、新規のＧＰＣＲ、ＧＡＶＥ３の発現を同定、特徴付けし、関連疾患の同定および治療にその発見を適用するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規に同定されたＧタンパク質共役受容体（本明細書においてＧＡＶＥ３と称される）に関する。一実施形態において、ＧＡＶＥ３は、配列番号２に記載の約３４６個のアミノ酸をコードするイントロン非含有構造遺伝子から得られる。関連する局面において、配列番号１に記載のポリヌクレオチドは、約１０４１個の塩基対（ｂｐ）を含む核酸に相当すると考えられる。
【００１０】
他の局面において、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸の脊椎動物タンパク質をコードする単離核酸、ＧＡＶＥ３活性を保持するそれらの変異体、突然変異体および断片、および、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸、ＧＡＶＥ３活性を有するポリペプチドをコードするそれらの変異体、突然変異体および断片からなる群より選択された単離核酸に関する。例えば、構成的な活性を有するＧＡＶＥ３は、該分子の特定部分を改変することによって製造することができる。さらに、本発明は、配列番号１に結合する核酸ハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片に関する。さらに、本発明は、配列番号１と約５５％〜約９９％の同一性を有する核酸、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする単離核酸と約５５％〜約９９％の同一性を有する核酸、に関する。関連する局面において、該オリゴヌクレオチドは少なくとも８個のヌクレオチドを含み、ハイブリダイズ方法は、相補体と核酸とのハイブリダイゼーションが可能な条件下で、該相補オリゴヌクレオチドと、配列番号１に記載のヌクレオチドを含む核酸とを接触させる工程、または、それと実質的に同等な工程を含むと考えられる。さらに、相補断片は、インビボおよびインビトロでＧＡＶＥ３発現を抑制する方法のための、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしても提供することができる。このような方法は、配列番号１に記載のヌクレオチドの相補体からなるオリゴヌクレオチド配列を提供する工程、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを含むヒト細胞を提供する工程、および、該オリゴヌクレオチドを該細胞に導入する工程を含んでもよく、該方法において、翻訳、トリプルヘリックス形成および／または細胞中でのｍＲＮＡ分解をもたらすヌクレアーゼ活性化の阻害などのメカニズムによりＧＡＶＥ３発現が阻害される。
【００１１】
本発明はまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列の精製ポリペプチド、それらの変異体、突然変異体および断片、ならびにＧＡＶＥ３の機能的特性を提供する付加的なアミノ酸残基を有する精製ポリペプチドからなる群より選択された単離ポリペプチドに関する。
【００１２】
さらに本発明は、発現調節因子に操作可能に連結した核酸、例えば単離核酸を含むベクターに関する。さらに本発明は、本発明の核酸が含まれるようにトランスフェクトまたは形質転換された培養細胞、ならびにポリペプチド生産方法に関し、該ポリペプチド生産方法は、本発明の核酸を含む形質転換細胞を成長させる工程、発現調節因子のもとで発現させる工程、および、細胞または細胞を培養した培地からポリペプチドを精製する工程を含む。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、本発明のポリペプチドに結合する単離された抗体を含み、該抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。さらに、関連する局面において、抗体生産方法、および、ＧＡＶＥ３に結合する抗体を用いたＧＡＶＥ３関連疾患の治療方法を開示する。該抗体はまた、リガンド結合を伴わずにＧＡＶＥ３を活性化する分子を同定するのに用いることができる。
【００１４】
本発明の追加の局面は、診断目的で、生物学的サンプルおよび／または組織サンプルにおけるＧＡＶＥ３の存在または非存在を確認するための方法を含む。本発明の他の局面において、ＧＡＶＥ３シグナル伝達を調節するための治療方法を開示し、該方法は、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストおよび／または抗体を、それが必要な患者に投与することを含む。
【００１５】
本発明の他の局面において、ＧＡＶＥ３の調節因子を同定する方法を開示し、該方法は、化学成分を提供する工程、ＧＡＶＥ３発現細胞を提供する工程、および、該化学成分がＧＡＶＥ３シグナル伝達活性を調節しているかどうか、例えばこのような調節が内在性リガンドの存在または非存在下で起こるのかどうかを決定する工程を含む。関連する局面において、化学成分としては、これらに限定されないが、ペプチド、抗体、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストが挙げられる。
【００１６】
本発明の他の局面は、治療組成物を含み、このような組成物は、核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストを含む。さらに、本発明の方法はまた、このような治療組成物をそれが必要な患者に投与することにより、病状を治療する方法、および、ＧＡＶＥ３シグナル伝達活性を調節する方法を含む。
【００１７】
本発明の上記局面およびその他の局面は、以下の詳細な説明と添付の図面を参照することにより明白となる。加えて、より詳細に特定の方法または組成物を説明する様々な参考文献は、後述する。従って、各参考文献は、それぞれ個々に加入について言及されたのと同様に参照により本明細書に加入される。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は、ｈＧＡＶＥ３に関するＤＮＡ配列である（配列番号１）。
図２は、ｈＧＡＶＥ３に関するアミノ酸配列である（配列番号２）。
図３ａは、ｈ−β−アクチンで基準化された選択された脳組織におけるｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである。
図３ｂは、ｈ−β−アクチンで基準化された選択された末梢ヒト組織におけるｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである；ＳＫは骨格のことである。
図４ａは、選択されたヒト免疫細胞（すなわちＴ細胞（活性化およびコントロール）、好中球（１１ａ，ｂおよびｃは異なる患者から）、および、好酸球（１２ａおよび１２ｂは異なる患者から））における、ｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである；ならびに、
図４ｂは、選択されたヒト免疫細胞（すなわち、イエダニ抗原（ＨＡＤ）の存在および非存在下における、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＡ５４９（肺上皮細胞））の、ｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである。ＰＨＡはフィトヘマグルチニンであり；ＰＭＡはホルボール１２−ミリスレート（ｍｙｒｉｓｌａｔｅ）１３アセテートであり；および、ＢＥＧＭは、気管支の上皮増殖培地（コントロール）である。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであるヒトＧＡＶＥ３をコードするcＤＮＡ分子の発見に基づく。
ヒトＧＡＶＥ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号１）。ＧＡＶＥ３タンパク質のアミノ酸配列を図２に示す（配列番号２）。
図１のＧＡＶＥ３ｃＤＮＡ（配列番号１）は、非翻訳領域を含む約１０４１個のヌクレオチド長を有し、分子量約３９.３ｋＤの、約３４６個のアミノ酸の長さを有するイントロン非含有タンパク質をコードする。
【００２０】
ノーザンブロット分析を用いたところ、約２.２ｋｂのＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ転写物が特定の組織において発現される。例えば、ＧＡＶＥ３は、脳の全部分では発現しないが、実質的に脾臓および肺では発現される。組織パネル上のＴａｑＭａｎの結果は、ＧＡＶＥ３が脾臓、腎臓および肺で発現されることを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＧＡＶＥ３発現は、実質的に免疫系細胞由来の細胞系においてなされることが示された。免疫細胞パネル上のＴａｑＭａｎの結果は、ＧＡＶＥ３がＴｈ１およびＴｈ２のようなＴ細胞、好中球ならびに好酸球で発現されることを示す。ＴａｑＭａｎ研究はまた、ＧＡＶＥ３発現レベルは、イエダニ抗原で刺激された肺上皮細胞系（Ａ５４９）で２種の因子により調節されることを示した。
【００２１】
ヒトＧＡＶＥ３は、ＨＭ７４受容体ファミリーの分子に関する可能性がある。用語「ファミリー」は、本発明のタンパク質および核酸分子に言及される場合、本明細書で示されるように、表面上共通の構造ドメインを有し、十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を有する２またはそれ以上のタンパク質または核酸分子を意味するものとする。このようなファミリーメンバーは、天然に存在してもよいし、同じ種または異なる種のいずれからも構成され得る。例えば、ファミリーは、ヒト由来の第一のタンパク質、および、マウス由来の該第一のタンパク質の相同体、同様に、ヒト由来の別個の第二のタンパク質、および、該第二のタンパク質のマウス相同体を含み得る。ファミリーメンバーはまた、共通の機能的特徴を有し得る。
【００２２】
一実施形態において、ＧＡＶＥ３タンパク質は第三の細胞内ループドメインを含み、該第三の細胞内ループドメインは、ＧＡＶＥ３活性を有する配列番号２の第三の細胞内ループドメインに対して、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは約８５％、９５％、９８％または１００％アミノ酸配列同一性を有する。
【００２３】
本明細書における用語「同等なアミノ酸残基」は、２またはそれ以上の配列を分析のために並べた場合、タンパク質配列内において実質的に同じ位置を占めるアミノ酸を意味する。本発明の好ましいＧＡＶＥ３ポリペプチドは、配列番号２の第三の細胞内ループドメインアミノ酸配列と十分に同一なアミノ酸配列を有する。用語「十分に同一」とは、第一および第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、十分な数の、または、最小限の数の、同一または同等な（例えば類似の側鎖を有する）アミノ酸残基またはヌクレオチドを含む、第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。例えば、約５５％の同一性、好ましくは６５％の同一性、より好ましくは７５％、８５％、９５％または９８％の同一性を有する共通のＧＡＶＥ３活性を有する構造ドメインを有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書において十分に同一と定義される。
【００２４】
対象となる他のドメインとしては、これらに限定されないが、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（配列番号２において、ＴＭ１はアミノ酸残基約１７〜約４１；ＴＭ２はアミノ酸残基約５２〜約７０；ＴＭ３はアミノ酸残基約８５〜約１１１；ＴＭ４はアミノ酸残基約１２７〜約１５４；ＴＭ５はアミノ酸残基約１７９〜約２０１；ＴＭ６は約２２０〜約２４８；および、ＴＭ７はアミノ酸残基約２５８〜約２８１）、細胞質（細胞内）（ＩＣ）ドメイン（配列番号２において、ＩＣ１はアミノ酸残基約４２〜約５１；１Ｃ２はアミノ酸残基約１１２〜約１２６；および、ＩＣ３はアミノ酸残基約２０２〜約２１９）、および、細胞外（ＥＣ）ドメイン（配列番号２において、ＥＣ１はアミノ酸残基約１〜約１６；ＥＣ２はアミノ酸残基約７１〜約８４；ＥＣ３はアミノ酸約１５５〜約１７８；および、ＥＣ４はアミノ酸残基約２４９〜約２５７）が挙げられる。関連する局面において、対象となるドメインはまた、これらに限定されないが、コンセンサス糖付加部位、脂質結合部位およびリン酸化部位が挙げられる。
【００２５】
本明細書において交換可能に用いられる「ＧＡＶＥ３活性」、「ＧＡＶＥ３の生物学的活性」または「ＧＡＶＥ３の機能的活性」は、標準的な技術によりインビボまたはインビトロで測定された、ＧＡＶＥ３応答細胞における、ＧＡＶＥ３タンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子により発揮される活性を意味する。ＧＡＶＥ３活性は、第二のタンパク質との連合もしくは酵素活性のような直接的活性、または、ＧＡＶＥ３タンパク質と第二のタンパク質との相互作用が介在する細胞のシグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ３活性としては、少なくとも１またはそれ以上の以下の活性、（ｉ）ＧＡＶＥ３シグナル伝達経路においてタンパク質と相互作用する能力；（ii）ＧＡＶＥ３リガンドと相互作用する能力；および（iii）細胞内の標的タンパク質と相互作用する能力が挙げられる。
従って、本発明の他の実施形態は、ＧＡＶＥ３活性を有する単離されたＧＡＶＥ３タンパク質およびポリペプチドを特徴とする。
本発明の様々な局面を以下の章でより詳細に説明する。
【００２６】
単離核酸分子
本発明の一つの局面は、ＧＡＶＥ３タンパク質、または、生物学的に活性なそれらの部分をコードする単離核酸分子に関し、同様に、ＧＡＶＥ３をコードする核酸（例えばＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして十分に用いられる核酸分子、および、ＧＡＶＥ３核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられる断片、に関する。本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、および、ヌクレオチド類似体を用いて生産されたＤＮＡまたはＲＮＡ類似体を含むものとする。該核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００２７】
「単離された」核酸分子とは、天然の核酸源に存在する他の核酸分子から分離したものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸を得る生物のゲノムＤＮＡ中の、ＧＡＶＥ３をコードする核酸の側に天然に存在する配列（すなわち核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、ＧＡＶＥ３がヒト第１２染色体に位置するため（すなわち１４３メガ塩基）、様々な実施形態において、単離されたＧＡＶＥ３核酸分子は、核酸を得る細胞のゲノムＤＮＡ中の、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂまたは０.１ｋｂ未満の、核酸分子の側に天然に存在するヌクレオチド配列を含み得る。その上、「単離された」核酸分子（例えばｃＤＮＡ分子）は、組換え技術で生産した場合、他の細胞材料または培地が実質的に含まれないか、または、化学的に合成した場合、前駆化学物質または他の化学物質が実質的に含まれない。
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列もしくは断片を有する核酸分子、またはこれらヌクレオチド配列のいずれかの相補体であり、標準的な分子生物学技術や本発明で提供された配列情報を用いて単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列の全部または部分を用いて、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２nd  ｅｄ.，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に説明された）を用いてＧＡＶＥ３核酸分子を単離することができる。
【００２９】
本発明の核酸分子は、標準的なＰＣＲ増幅技術により、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅が可能である。例えば、このようなプライマーとしては、これらに限定されないが、５’−ＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＣ−３’（配列番号３）、および、５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧ−３’（配列番号４）が挙げられる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。その上、ＧＡＶＥ３ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて調製することができる。
【００３０】
その他の好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列の相補体、または、それらのＧＡＶＥ３特異的部分である核酸分子を含む。所定のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、所定のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることにより単離可能または検出可能な二本鎖を形成する所定のヌクレオチド配列に対して、十分に相補的であるものである。
【００３１】
その上、本発明の核酸分子は、ＧＡＶＥ３をコードする核酸配列の部分（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いることができる断片、または、ＧＡＶＥ３の生物学的に活性な部分をコードする断片）のみを含んでもよい。例えば、このような断片は、これらに限定されないが、配列番号２に記載の配列ＷＳＬＲＲＲＱＱＬＡＲＱＡＲＭＫＫＡＴＲを有する約２０２〜約２１９のアミノ酸残基をコードする領域を含み得る。ヒトＧＡＶＥ３遺伝子のクローニングにより決定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型におけるＧＡＶＥ３相同体、例えば他の組織由来のＧＡＶＥ３相同体、同様に他の哺乳動物由来のＧＡＶＥ３相同体を同定および／またはクローニングするためのプローブおよびプライマーを製造することができる。該プローブ／プライマーは、一般的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。該オリゴヌクレオチドは、一般的に、配列番号１のセンスもしくはアンチセンス配列、または、配列番号１の天然に存在する突然変異体の、少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。ヒトＧＡＶＥ３ヌクレオチド配列に基づくプローブは、類似のまたは同一なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するのに用いることができる。該プローブは、それらに結合した標識基を含んでもよく、例えば、放射線同位体、蛍光化合物、酵素または酵素コファクターである。このようなプローブは、診断試験キットの部分として用いることができ、該キットは、被験対象からの細胞サンプルにおいてＧＡＶＥ３をコードする核酸レベルを測定すること（例えばＧＡＶＥ３ｍＲＮＡレベルを検出すること）によりＧＡＶＥ３タンパク質を適切に発現していない細胞または組織を同定したり、または、ゲノムＧＡＶＥ３遺伝子が変異しているか、それとも欠失しているかを決定したりするために用いられる。
【００３２】
「ＧＡＶＥ３の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、ＧＡＶＥ３生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離し、ＧＡＶＥ３タンパク質のコードされた部分を発現し（例えばインビトロでの組換え発現により）、ＧＡＶＥ３のコードされた部分の活性を評価することにより、調製することができる。例えば、ＧＡＶＥ３の生物学的に活性な部分をコードする核酸断片としては、第三の細胞内ループドメイン、例えば、配列番号２に記載の約２０２〜約２１９のアミノ酸残基が挙げられる。本発明は、遺伝子コードの縮重のために配列番号１のヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によりコードされるのと同じＧＡＶＥ３タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【００３３】
配列番号１に記載のヒトＧＡＶＥ３ヌクレオチド配列に加えて、ＧＡＶＥ３アミノ酸配列において変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団（例えばヒト集団）中に存在し得ることは、当業者には明白である。ＧＡＶＥ３遺伝子におけるこのような遺伝子多型は、自然の対立遺伝子変異により集団内の個体間に存在し得る。対立遺伝子とは、所定の遺伝子座において二者択一的に発生する遺伝子群の一つである。本明細書で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＧＡＶＥ３タンパク質、好ましくは哺乳動物ＧＡＶＥ３タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。本明細書で用いられる句「対立遺伝子変異体」は、ＧＡＶＥ３遺伝子座で生じるヌクレオチド配列、または、該ヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドを意味する。二者択一的な対立遺伝子は、多数の異なる個体で対象となる遺伝子を配列解析することによって同定することができる。これは、ハイブリダイゼーションプローブを用いて容易に実施することができ、様々な個体において同じ遺伝子座を同定することができる。このようなヌクレオチド変異のいずれかおよび全部、ならびに、その結果生じたＧＡＶＥ３におけるアミノ酸多型または変異（これらは自然の対立遺伝子変異の結果であってＧＡＶＥ３の機能的活性を改変しない）は、本発明の範囲内であることとする。
【００３４】
その上、ヒトＧＡＶＥ３とは異なるヌクレオチド配列を有する他の種からのＧＡＶＥ３タンパク質をコードする核酸分子（ＧＡＶＥ３相同体）は、本発明の範囲内であることとする。本発明のＧＡＶＥ３のｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、本発明で開示されたヒトＧＡＶＥ３核酸との同一性に基づき、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはそれらの部分を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術に従って単離することができる。
【００３５】
従って、他の実施形態において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００または１１００個の長さのヌクレオチドであり、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはコーディング配列またはそれらの相補体を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を説明するものであって、その条件下で、互いに少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％またはそれ以上の相補性を有するヌクレオチド配列が通常はハイブリダイズしたままである。このようなストリンジェントな条件は当業者既知であり、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、続いて、５０〜６５℃での０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄である。
【００３７】
好ましくは、配列番号１の配列またはそれらの相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で用いられる「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列（例えば天然のタンパク質をコードする配列）を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。熟練した技術者は配列特異的な変数（例えば、長さ、ＧＣリッチ度など）に照らし条件を変更してもよいことを理解できる。
【００３８】
本発明は、類似の特性を有するＧＡＶＥ３様分子を診断するＧＡＶＥ３核酸断片を含むことが考慮されている。この診断断片は、フランキング配列を含むＧＡＶＥ３遺伝子のどの部分からでも得ることができる。該断片は、既知方法を実施するライブラリーのプローブとして用いることができる。該断片は、既知方法で作製することができる。
【００３９】
集団中に存在し得るＧＡＶＥ３配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、配列番号１のヌクレオチド配列への変異により変化が導入され、熟練した技術者はそれによりＧＡＶＥ３タンパク質の生物学的活性を実質的に変えることなくコードされたＧＡＶＥ３タンパク質のアミノ酸配列において変化がもたらされることは理解できる。例えば、ヌクレオチド置換を行い、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＧＡＶＥ３の野生型配列（例えば配列番号２の配列）を生物学的活性を実質的に変えずに改変できる残基である。「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に実質的に必要なアミノ酸残基である。例えば、様々な種のＧＡＶＥ３間で保存されていない、または、少ししか保存されていないアミノ酸残基は、活性に関して非必須の可能性があり、従って改変の標的となり得る。あるいは、様々な種のＧＡＶＥ３タンパク質間で保存されたアミノ酸残基は、活性に必須の可能性があり、従って改変の標的とはならない可能性がある。
【００４０】
従って、本発明の他の局面は、活性に非必須のアミノ酸残基における変化を含むＧＡＶＥ３タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＧＡＶＥ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２とは異なるが、生物学的活性を保持する。一実施形態において、単離核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約５５％の同一性、６５％、７５％、８５％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
配列番号２の配列とは異なる配列を有するＧＡＶＥ３タンパク質をコードする単離核酸分子は、１またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入されるように配列番号１のヌクレオチド配列に１またはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより製造することができる。
【００４２】
突然変異は、部位特異的変異誘発や、ＰＣＲによる変異誘発のような標準的な技術により導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１またはそれ以上の推定非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。該ファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびシステイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリンおよびイソロイシン）、および、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）が挙げられる。従って、ＧＡＶＥ３における推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー内の他のアミノ酸残基で置換される。あるいは、ＧＡＶＥ３コーディング配列の全部または部分にわたりランダムに、例えば飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）変異誘発により突然変異を導入することができ、ＧＡＶＥ３生物学的活性に関して生じた突然変異体をスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換えにより発現させることができ、そのタンパク質活性を測定することができる。
【００４３】
好ましい実施形態において、突然変異型ＧＡＶＥ３タンパク質は、（１）ＧＡＶＥ３シグナル伝達経路におけるタンパク質と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（２）ＧＡＶＥ３リガンドと結合する能力；または、（３）細胞内標的タンパク質と結合する能力、に関して分析することができる。さらにその他の好ましい実施形態において、突然変異型ＧＡＶＥ３は、細胞増殖または細胞分化を調節する能力に関して分析することができる。
【００４４】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な分子、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的な分子、または、ｍＲＮＡ配列に相補的な分子を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。該アンチセンス核酸は、ＧＡＶＥ３コーディング鎖全体またはそれらの部分のみ、例えば、タンパク質コーディング領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または部分に相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ３をコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対するアンチセンスであり得る。該非コーディング領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コーディング領域の側に存在しアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
【００４５】
本明細書で開示されたＧＡＶＥ３をコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１）を前提として、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基ペアリングの規則に従って設計することができる。該アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡコーディング領域全体に相補的であってもよいが、より好ましくはＧＡＶＥ３ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周りの領域に対して相補的であり得る。例えば、配列５’−ＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の長さのヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当業界既知の方法による化学合成や酵素によるライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを用いて、または、分子の生物学的安定性を増すために、もしくはアンチセンスとセンス核酸とで形成された二本鎖の物理的安定性を増すために設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体、ホスホネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。
【００４６】
アンチセンス核酸を作製するために用いることができる改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および、２,６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、該アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡが対象となる標的核酸に対してアンチセンス方向となり得る）発現ベクターを用いて生物学的に生産することができる。
【００４７】
一般的に、本発明のアンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ３タンパク質をコードする細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合するように被験対象に投与されるか、または、インサイチュで生産されるが、それにより、例えば転写および／または翻訳を抑制することによりタンパク質発現を阻害することができる。ハイブリダイゼーションは、通常のヌクレオチド相補性により安定な二本鎖を形成することにより、または例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、ダブルヘリックスの主溝で特異的相互作用を起こすことにより、もしくはＧＡＶＥ３の調節領域に結合することによりできる。
【００４８】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、選択された細胞を標的にするようにアンチセンス核酸分子を改変し、全身投与することもできる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子を、選択された細胞表面上で発現された受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができ、これは、例えば、アンチセンス核酸分子と細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体とを連結させることによりなされる。該アンチセンス核酸分子はまた、本明細書で説明されたベクターを用いて細胞に運搬することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が好ましい。
【００４９】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は、鎖が互いに平行な相補ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６６２５−６６４１）。またアンチセンス核酸分子として、メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ.，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９８７）２１５：３２７−３３０）も挙げられる。
【００５０】
本発明はまた、リボザイムを含む。リボザイムとは、触媒性のＲＮＡ分子であって、リボザイムがハイブリダイズする一本鎖核酸（例えばｍＲＮＡ）を開裂させることができるリボヌクレアーゼ活性を有する。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３４：５８５−５９１）に説明されている）は、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂させるのに用いることができ、それによりＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ翻訳を阻害することができる。ＧＡＶＥ３をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本発明で開示されたＧＡＶＥ３のｃＤＮＡヌクレオチド配列（例えば配列番号１）に基づき設計することができる。例えば、テトラヒメナＬ−１９ＩＶＳのＲＮＡの誘導体を構築することができ、それにおいて、活性部位のヌクレオチド配列は、ＧＡＶＥ３をコードするｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に相補的である。例えば米国特許第４,９８７,０７１号および５,１１６,７４２号を参照。あるいは、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子プールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性のＲＮＡを選択するのに用いることができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４１１−１４１８を参照。
【００５１】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を含む。例えば、ＧＡＶＥ３遺伝子発現は、ＧＡＶＥ３の調節領域（例えばＧＡＶＥ３プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とし、標的細胞におけるＧＡＶＥ３遺伝子転写を防ぐ三重らせん構造を形成することによって阻害することができる。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９１）６（６）：５６９；Ｈｅｌｅｎｅ  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６０：２７；および、Ｍａｈｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ（１９９２）１４（１２）：８０７を参照。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、塩基成分、糖成分またはリン酸主鎖で改変され、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善することができる。例えば、核酸のデオキシリボース−リン酸主鎖を改変し、ペプチド核酸を得ることができる（Ｈｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）４：５を参照）。本明細書で用いられる用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸模擬体を意味し、例えば、デオキシリボース−リン酸主鎖がプソイドペプチド主鎖で置換され４種の天然の核酸塩基のみが保持されているＤＮＡ模擬体である。中性のＰＮＡ主鎖は、低いイオン強度条件下でＤＮＡおよびＲＮＡと特異的にハイブリダイズできることが示されている。ＰＮＡオリゴマー合成は、上述のＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：１４６７０で説明されたような標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施することができる。
【００５３】
ＧＡＶＥ３のＰＮＡは、治療用途および診断用途に用いることができる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の阻止を誘導したり複製を抑制したりすることによる遺伝子発現の配列特異的調節に関するアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として用いることができる。ＧＡＶＥ３のＰＮＡはまた、例えば、例えばＰＮＡに向けられたＰＣＲクランピングにより遺伝子における単一の塩基対突然変異を分析することにおいて、他の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて用いる場合人工の制限酵素として（上述のＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６））、または、ＤＮＡ配列やハイブリダイゼーション用のプローブもしくはプライマーとして（上述のＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）；上述のＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６））、用いることもできる。
【００５４】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ３のＰＮＡを改変して、親油性基またはその他の補助基をＰＮＡに付着させることによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ形成によって、または、当業界既知のリポゾームまたはその他のドラッグデリバリー技術の使用によって、例えば安定性、特異性、または細胞の吸収を増強することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述のＨｙｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９６）２４（１７）：３３５７−６３，Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：５９７３；および、Ｐｅｔｅｒｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９７５）５：１１１９で説明されたように実施することができる。
【００５５】
単離されたＧＡＶＥ３タンパク質および抗ＧＡＶＥ３抗体
本発明の一つの局面は、単離されたＧＡＶＥ３タンパク質、および、生物学的に活性なそれらの部分、同様に、抗ＧＡＶＥ３抗体を発生させる免疫原として使用するのに適切なポリペプチド断片に関する。一実施形態において、天然ＧＡＶＥ３タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって細胞または組織源から単離することができる。他の実施形態において、ＧＡＶＥ３タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生産される。組換え発現の代わりに、ＧＡＶＥ３タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
【００５６】
「単離された」または「精製」タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分は、ＧＡＶＥ３タンパク質を得た細胞もしくは組織源の細胞成分もしくはその他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成された場合は前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない。句「細胞成分を実質的に含まない」は、タンパク質は、タンパク質が単離された細胞または組換えにより生産された細胞の細胞成分から分離されたＧＡＶＥ３タンパク質の標品であることを意味する。従って、細胞成分を実質的に含まないＧＡＶＥ３タンパク質とは、非ＧＡＶＥ３タンパク質（また本発明では「混入タンパク質」ともいう）が、約３０％、２０％、１０％または５％またはそれ未満（乾燥重量で）未満であるＧＡＶＥ３タンパク質の標品のことである。また、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分が組換えにより生産される場合、培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地は、タンパク質標品の容量の約２０％、１０％または５％未満またはそれ未満であることが好ましい。ＧＡＶＥ３タンパク質が化学合成される場合、前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク質合成に関与する前駆化学物質または他の化学物質から分離されることが好ましい。従って、このようなＧＡＶＥ３タンパク質標品において、前駆化学物質または非ＧＡＶＥ３化学物質は、約３０％、２０％、１０％または５％未満またはそれ未満（乾燥重量で）ある。
【００５７】
ＧＡＶＥ３タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＧＡＶＥ３タンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列）と十分に同一な、または、それから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、該ペプチドは、全長ＧＡＶＥ３タンパク質より少ないアミノ酸を含み、少なくとも１つのＧＡＶＥ３タンパク質活性を示す。一般的に、生物学的に活性な部分は、少なくとも１つのＧＡＶＥ３タンパク質活性を有するドメインまたはモチーフを含む。生物学的に活性なＧＡＶＥ３タンパク質の部分は、例えば１０、２５、５０、１００個またはそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドであり得る。好ましい生物学的に活性なポリペプチドは、１またはそれ以上の同定されたＧＡＶＥ３構造ドメイン、例えば、第三の細胞内ループドメイン（例えば配列番号２）を含む。
【００５８】
その上、他の生物学的に活性な部分（それにおいてタンパク質の他の領域が欠失している）は、組換え技術で調製することができ、天然ＧＡＶＥ３タンパク質の１またはそれ以上の機能的活性に関して評価することができる。
【００５９】
好ましいＧＡＶＥ３タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。他の有用なＧＡＶＥ３タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持しているが、自然の対立遺伝子変異または変異誘発によりアミノ酸配列において異なる。例えば、このようなＧＡＶＥ３タンパク質およびポリペプチドは、本明細書で説明された少なくとも１つの生物学的活性を有する。
【００６０】
従って、有用なＧＡＶＥ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％の同一性を有し、かつ配列番号２のＧＡＶＥ３の機能的活性タンパク質を保持するアミノ酸配列を含むタンパク質である。他の例において、該ＧＡＶＥ３タンパク質は、ＧＡＶＥ３の第三の細胞内ループドメイン（配列番号２）と、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ３タンパク質は、配列番号２のＧＡＶＥ３タンパク質の機能的活性を保持する。
【００６１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、配列を並べて最適に比較することができる（例えば、第二のアミノ配列または核酸配列との最適なアライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入する）。次に、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。次に、第一配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていた場合、該分子は、その位置において同一とみなされる。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一な位置の数／位置の総数（例えばオーバーラップする位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。
【００６２】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的なアルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ等のアルゴリズム（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４）、Ｋａｒｉｉｎ等のアルゴリズムの改変（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３−５８７７）である。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ（１９９０）２１５：４０３）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（例えばスコア＝１００、語長＝１２）で実施することができ、本発明のＧＡＶＥ３核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、語長＝３）で実施することができ、本発明のＧＡＶＥ３タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較するためのギャップ入りアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９で説明されているようにギャップ入りＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を実施するのに用いることができる。上述のＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）を参照。ＢＬＡＳＴ、ギャップ入りＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。
【００６３】
配列比較に用いられる数学的なアルゴリズムの他の好ましい非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ等のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１−１７）である。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの部分を構成するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組み入れられる。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮプログラム、ＰＡＭ１２０重量残量表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）を利用する場合、１２個のギャップ長ペナルティーおよび４個のギャップペナルティーを用いることができる。
【００６４】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを使用して、または使用しないで上述と類似の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算する際、正確なマッチングだけがカウントされる。
【００６５】
本発明はまた、ＧＡＶＥ３キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書で用いられるＧＡＶＥ３「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非ＧＡＶＥ３ポリペプチドに操作可能に連結したＧＡＶＥ３ポリペプチドのことである。「ＧＡＶＥ３ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ３に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、一方で「非ＧＡＶＥ３ポリペプチド」は、ＧＡＶＥ３タンパク質と実質的に同一ではないタンパク質（例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質とは異なるタンパク質であって、同じまたは異なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ＧＡＶＥ３融合タンパク質において、ＧＡＶＥ３ポリペプチドは、ＧＡＶＥ３タンパク質の全部または部分、好ましくはＧＡＶＥ３タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分に対応し得る。該融合タンパク質において、用語「操作可能に連結した」は、ＧＡＶＥ３ポリペプチドおよび非ＧＡＶＥ３ポリペプチドがフレーム内で互いに融合することを示すこととする。非ＧＡＶＥ３ポリペプチドは、ＧＡＶＥ３ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００６６】
一つの有用な融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＧＡＶＥ３であり、これにおいて、ＧＡＶＥ３配列はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端と融合する。このような融合タンパク質は、組換えＧＡＶＥ３精製を容易にすることができる。好ましい実施形態において、本発明の第三の細胞内ループ（ＩＬ３）（すなわち、配列番号２に記載の約２０２〜約２１９のアミノ酸）は、ＩＬ３のＰＣＲ増幅によりＧＳＴと融合し、その産物をｐＧＥＸ−２Ｔのようなベクターにサブクローニングする。得られた構築物は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することができ、前記構築物からの発現は、適切な低分子物質（例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で誘導し、その後精製することができる（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９９６）２７１（１９）：１１２７２−１１２７９を参照）。
【００６７】
特定の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、ＧＡＶＥ３の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用により増加させることができる。例えば、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のｇｐ６分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ.，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２）。真核性の異種シグナル配列の他の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の分泌配列が挙げられる。さらに他の例において、有用な原核性の異種シグナル配列としては、ｐｈｏＡ分泌シグナル（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等）、および、タンパク質Ａ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。
【００６８】
さらに他の実施形態において、該融合タンパク質は、ＧＡＶＥ３−免疫グロブリン融合タンパク質であり、それにおいて、ＧＡＶＥ３の全部または部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーから得られた配列に融合する。本発明のＧＡＶＥ３−免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に取り込ませて、被験対象に投与することにより、細胞表面上でのＧＡＶＥ３リガンドとＧＡＶＥ３タンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでＧＡＶＥ３介在シグナル伝達を抑制することができる。ＧＡＶＥ３−免疫グロブリン融合タンパク質は、ＧＡＶＥ３と同系のリガンドの生物学的利用能に影響を与えるのに使用することができる。ＧＡＶＥ３リガンド−ＧＡＶＥ３相互作用の阻害は、血管増殖性の疾患や分化に関する疾患を治療すること、および、細胞の生存を調節すること（例えば促進または抑制すること）の双方に関して、治療上有用であり得る。その上、本発明のＧＡＶＥ３−免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として、被験対象中で抗ＧＡＶＥ３抗体を生産し、ＧＡＶＥ３リガンドを精製し、スクリーニング分析ではＧＡＶＥ３とＧＡＶＥ３リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するのに用いることができる。
【００６９】
好ましくは、本発明のＧＡＶＥ３キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により生産される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、通常の技術に従ってフレーム内で共にライゲーションされるが、例えば、適切な末端を提供するためにライゲーションのための平滑末端または互い違いの末端、制限酵素消化を用いること、望ましくない結合や酵素によるライゲーションを防ぐために適切なアルカリホスファターゼ処理で付着端を埋めることによりなされる。他の実施形態において、該融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーなどの通常の技術で合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行うことができ、この場合、２つの連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングが生じるアンカープライマーを用いることができ、続けてアニーリングおよび再増幅することによりキメラ遺伝子配列を生産することができる（例えば、上述のＡｕｓｕｂｅｌ等を参照）。さらに、多くの発現ベクターは、融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした市販品である。ＧＡＶＥ３をコードする核酸は、融合成分がＧＡＶＥ３タンパク質にフレーム内で連結されるような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００７０】
本発明はまた、ＧＡＶＥ３タンパク質変異体（すなわち、ＧＡＶＥ３アミノ酸配列のとは異なる配列を有するタンパク質）に関する。このような変異体は、ＧＡＶＥ３アゴニスト（模擬体）またはＧＡＶＥ３アンタゴニストのいずれかとして機能し得る。ＧＡＶＥ３タンパク質の変異体は、変異誘発、例えばＧＡＶＥ３タンパク質の個別の点変異または短縮により得ることができる。ＧＡＶＥ３タンパク質のアゴニストは、天然に存在するＧＡＶＥ３タンパク質と同じ生物学的活性またはサブセットを実質的に保持可能である。ＧＡＶＥ３タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在するＧＡＶＥ３タンパク質形態の１またはそれ以上の活性を、例えばＧＡＶＥ３タンパク質を含む細胞のシグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することによって阻害することができる。従って、特定の生物学的作用は、限定された機能の変異体での治療により引き出すことができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体を用いた被験対象の治療は、被験対象における副作用を、ＧＡＶＥ３タンパク質天然に存在する形態での治療に比べて少なくすることができる。
【００７１】
ＧＡＶＥ３アゴニスト（模擬体）またはＧＡＶＥ３アンタゴニストのいずれかとして機能するＧＡＶＥ３タンパク質の変異体は、ＧＡＶＥ３タンパク質の突然変異体（例えばＧＡＶＥ３タンパク質の短縮突然変異体）のコンビナトリアルライブラリーを、ＧＡＶＥ３アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態において、ＧＡＶＥ３変異体の多様なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により得られ、多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＧＡＶＥ３変異体の多様なライブラリーの製造は、例えば、可能性のあるＧＡＶＥ３配列のディジェネレートセットが、個々のポリペプチドとして、またあるいは、ＧＡＶＥ３配列のセットを含むより大規模の融合タンパク質のセット（例えばファージディスプレイ用）として発現されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることによりなされる。ディジェネレートオリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＧＡＶＥ３変異体のライブラリーを作製するのに用いることができる様々な方法が存在する。ディジェネレート遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーにより実施することができ、続いてその合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結される。遺伝子のディジェネレートセットの使用により、１つの混合物において、可能性のあるＧＡＶＥ３配列の望ましいセットをコードする全ての配列の供給が可能になる。ディジェネレートオリゴヌクレオチドの合成方法は、当業界既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３）３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４）５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）１９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８３）１１：４７７を参照）。
【００７２】
加えて、ＧＡＶＥ３タンパク質コーディング配列断片のライブラリーは、スクリーニングおよびそれに続くＧＡＶＥ３タンパク質変異体の選択のための、ＧＡＶＥ３断片の多様な集団を製造するのに用いることができる。一実施形態において、コーディング配列断片のライブラリーの製造は、ＧＡＶＥ３コーディング配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、１分子あたり約１つ程度のニック導入（ｎｉｃｋｉｎｇ）が生じる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、そのＤＮＡを再生して異なるニック入り産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再生した二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることによりなされる。この方法により、様々な大きさのＧＡＶＥ３タンパク質のＮ末端と内部断片とをコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【００７３】
点変異または短縮により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および、選択された特性を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための数々の技術が当業界既知である。このような技術は、ＧＡＶＥ３タンパク質のコンビナトリアル変異誘発により製造された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応できる。大規模遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析を施すことができる最も広く用いられている技術は、一般的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換すること、および、望ましい活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にするような条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現すること、を含む。反復的集団変異誘発（ＲＥＭ）、ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を強化する技術を、ＧＡＶＥ３変異体を同定するためのスクリーニング分析と組み合わせて用いることができる（Ａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３）６（３）：３２７−３３１）。
【００７４】
単離されたＧＡＶＥ３タンパク質もしくは部分またはそれらの断片を免疫原として用いて、標準的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製技術によりＧＡＶＥ３に結合する抗体を発生させることができる。完全長ＧＡＶＥ３タンパク質を用いることができ、またあるいは、本発明は、免疫原として使用するためのＧＡＶＥ３の抗原性ペプチド断片を提供する。ＧＡＶＥ３の抗原性ペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の少なくとも８個（好ましくは１０、１５、２０、３０個またはそれ以上）のアミノ酸残基を含み、そして、該ペプチドに対して生じた抗体がＧＡＶＥ３との特異的な免疫複合体を形成するようなＧＡＶＥ３のエピトープを含む。
【００７５】
関連する局面において、抗原性ペプチドに含まれるエピトープは、タンパク質表面（例えば親水性領域）に存在するＧＡＶＥ３領域である。ヒトＧＡＶＥ３タンパク質配列の疎水性分析により、配列番号２のアミノ酸約１〜約１６、アミノ酸約７１〜約８４、アミノ酸約１５５〜約１７８、および、アミノ酸約２４９〜約２５７の領域が、特に親水性であることが示され、従って、抗体産生を標的化するのに有用な表面残基をコードする可能性がある。
【００７６】
一般的に、ＧＡＶＥ３免疫原は、適切な被験対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するのに用いられる。適切な免疫原性標品は、例えば、組換え発現されたＧＡＶＥ３タンパク質、または、化学合成されたＧＡＶＥ３ポリペプチドを含み得る。該標品は、フロイント完全もしくは不完全アジュバント、または、類似の免疫促進剤のようなアジュバントをさらに含み得る。免疫原性のＧＡＶＥ３標品での適切な被験対象の免疫化は、ポリクローナル抗ＧＡＶＥ３抗体応答を誘導する。
【００７７】
従って、本発明の他の局面は、抗ＧＡＶＥ３抗体に関する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意味し、すなわち、ＧＡＶＥ３のような抗原に特異的に結合する抗原−結合部位を含む分子を意味する。ＧＡＶＥ３に特異的に結合する分子は、ＧＡＶＥ３に結合するが、天然にＧＡＶＥ３を含むサンプル（例えば生物学的サンプル）中で他の分子と実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で処理することにより得ることができるＦ(ab)およびＦ(ab')2断片が挙げられる。本発明は、ＧＡＶＥ３に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、特定のＧＡＶＥ３のエピトープと免疫反応が可能な抗原−結合部位を１種だけ含む抗体分子の集団を意味する。従って、モノクローナル抗体組成物は、一般的に、特定のＧＡＶＥ３タンパク質エピトープに関する一つの結合親和性を提示する。
【００７８】
ポリクローナル抗ＧＡＶＥ３抗体は、上述のように、適切な被験対象をＧＡＶＥ３免疫原で免疫化することにより調製することができる。免疫化被験対象における抗ＧＡＶＥ３抗体タイターは、標準的な技術、例えば固定化ＧＡＶＥ３を用いた酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）による技術により長期にわたりモニターすることができる。必要に応じて、ＧＡＶＥ３に対して向けられた抗体分子は、哺乳動物から（例えば血液から）単離することができ、さらにプロテインＡクロマトグラフィーのような周知の技術により精製することができ、それによりＩｇＧ分画を得ることができる。免疫化後の適切な時間に、例えば抗ＧＡＶＥ３抗体タイターが最高であるときに、被験対象から抗体生産細胞を得ることができ、標準的な技術によりモノクローナル抗体を調製するのに用いられ、例えば、もともとはＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７で説明されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９８５），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ.，ｐｐ．７７−９６）、または、トリオーマ技術が挙げられる。ハイブリドーマ作製技術は周知である（一般的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ.，ｅｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ.，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照）。簡単に言えば、不死の細胞系（一般的に骨髄腫）を、上述のようにＧＡＶＥ３免疫原で免疫化した哺乳動物からのリンパ球（一般的に脾細胞）に融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＧＡＶＥ３に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
【００７９】
リンパ球と不死の細胞系とを融合させるのに用いられる多くの周知のプロトコールのいずれも、抗ＧＡＶＥ３モノクローナル抗体を得る目的に適用することができる（例えば、上述のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６：５５０−５５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ.，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）；および、Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９８１）５４：３８７−４０２を参照）。その上、有用となり得るこのような方法の多くの改変法があることは、通常の熟練者には明白である。
【００８０】
一般的に、不死の細胞系（例えば骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳動物種から得られる。例えば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原性標品で免疫化したマウスからのリンパ球で、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性の不死のマウス細胞系（例えば骨髄腫細胞系）を融合することにより製造することができる。多数の骨髄腫細胞系のいずれも、標準的な技術に従って融合パートナーとして用いることができ、例えば、Ｐ３−ＮＳ１／ｌ−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇｌ４骨髄腫系である。骨髄腫系は、ＡＴＣＣから入手できる。一般的に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞と融合する。次に、融合で得られたハイブリドーマ細胞を、未融合していない非生産的に融合した骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選択する（融合していない脾細胞は、形質転換されないため数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いて、ハイブリドーマ培養上清をＧＡＶＥ３を結合させる抗体に関してスクリーニングすることにより検出される。
【００８１】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、モノクローナル抗ＧＡＶＥ３抗体を同定し、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をＧＡＶＥ３を用いてスクリーニングすることによって単離することができ、それによりＧＡＶＥ３を結合させる免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；および、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｒｆＺＡＰ（Ｒ）ファージディスプレイキット，カタログ番号２４０６１２）。
【００８２】
加えて、特に抗体ディスプレイライブラリーを製造しスクリーニングするのに使用することができる方法と試薬の例は、以下に見出すことができる：例えば、米国特許第５,２２３,４０９号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５６７９；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ.，Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２）３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５−１２８１；および、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９３）２５（１２）：７２５−７３４。
【００８３】
加えて、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗ＧＡＶＥ３抗体は、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含み、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当業界既知の組換えＤＮＡ技術、例えば以下で説明される方法を用いて製造することができる：ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４,１８７号；欧州特許出願第１７１,４９６号；欧州特許出願第１７３,４９４号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４,８１６,５６７号；欧州特許出願第１２５,０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ（１９８７）４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（１９８８）８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４；および、Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）１４１：４０５３−４０６０。
【００８４】
完全ヒト抗体は、特にヒト患者の治療処理に望ましい。このような抗体は、内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないがヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて製造することができる。該トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えばＧＡＶＥ３の全部または部分を用いた通常の方法で免疫化される。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスに含まれるヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の際に再編成され、その後クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、このようなエピトープを用いて、例えば、ＧＡＶＥ３活性を阻害する抗体が同定される。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖をクローニングして、ファージディスプレイＦab断片を作製するのに用いられる。例えば、重鎖遺伝子は、重鎖を細菌から分泌させることができるようにプラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖遺伝子は、ファージ表面で軽鎖を発現できるようにファージ被覆タンパク質遺伝子にクローニングすることができる。ファージに融合したヒト軽鎖のレパートリー（ランダム収集）を用いて、非ヒト重鎖を発現する細菌に感染させる。得られた後代のファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選択された抗原をパンニングスクリーニングで用いて、選択された抗原と結合するファージを選択することができる。このようなファージを同定するのに数回の選択が必要な場合がある。
【００８５】
選択された抗原と結合する選択されたファージから、ヒト軽鎖遺伝子を単離する。次に、選択されたヒト軽鎖遺伝子を用いて、ヒト重鎖遺伝子の選択を以下のように行う。選択されたヒト軽鎖遺伝子を細菌により発現ベクターに挿入する。選択されたヒト軽鎖を発現する細菌をファージに融合したヒト重鎖のレパートリーで感染させる。得られた後代のファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。
【００８６】
次に、選択された抗原をパンニングスクリーニングに用いて、選択された抗原と結合するファージを選択する。選択されたファージは、もとの選択された非ヒトモノクローナル抗体で認識されるのと同じエピトープを認識する完全ヒト抗体を提示する。重鎖および軽鎖両方をコードする遺伝子を単離し、さらにヒト抗体を生産するために操作することができる。その技術は、Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：８９９−９０３）により説明されている。
【００８７】
抗ＧＡＶＥ３抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によりＧＡＶＥ３を単離するのに用いることができる。抗ＧＡＶＥ３抗体は、天然ＧＡＶＥ３の細胞からの精製、および、宿主細胞で発現された組換えにより生産されたＧＡＶＥ３の精製を容易にすることができる。その上、抗ＧＡＶＥ３抗体を用いて、ＧＡＶＥ３タンパク質を検出し（例えば、細胞溶解産物または細胞上清中で）、ＧＡＶＥ３タンパク質発現の存在度とパターンを評価することができる。抗ＧＡＶＥ３抗体を診断的に用いて、臨床試験方法の一部として組織でのタンパク質レベルをモニターすることができ、例えば、所定の治療方式の効能を測定することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることにより簡易化できる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および、放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、および、アビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例は、ルミノールである。生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および、エクオリンが挙げられる。適切な放射性材料の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【００８８】
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の他の局面は、ＧＡＶＥ３（またはそれらの部分）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それに連結した他の核酸を輸送させることができる核酸分子を意味する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントがライゲーション可能な環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーション可能である。特定のベクターは、宿主細胞（例えば、細菌  複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）で自己複製が可能である。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに統合され、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。その上、特定のベクター、発現ベクターは、それに操作可能に連結した遺伝子の発現を指揮することができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしば、プラスミド（ベクター）形態である。しかしながら、本発明は、その他の形態の発現ベクター、例えば同等な機能を与えるウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものとする。
【００８９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸発現に適切な形態で本発明の核酸を含む。これは、該組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択された、発現しようとする核酸に操作可能に連結した１またはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「操作可能に連結した」とは、対象となるヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳システムで、または、ベクターが宿主細胞に導入されている場合には宿主細胞中で）ヌクレオチド配列発現を可能にさせる方法で調節配列に連結していることを意味するものとする。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）で説明されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指揮する調節配列（例えば、組織特異的な調節配列）が挙げられる。発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択のような要素、所望のタンパク質発現レベルなどに応じて設計することができることは、当業者には明白である。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書で説明された核酸でコードされたタンパク質またはペプチド（例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質、ＧＡＶＥ３の変異形態、融合タンパク質など）を生産することができる。
【００９０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核または真核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞または哺乳動物細胞におけるＧＡＶＥ３発現に関して設計することができる。適切な宿主細胞は、上述のＧｏｅｄｄｅｌにおいてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロで、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳することができる。
【００９１】
原核生物におけるタンパク質発現は、殆どの場合、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指揮する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは、そこでコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、一般的に、以下の３つの目的：１）組換えタンパク質発現を増すこと；２）組換えタンパク質の溶解性を増すこと；および、３）親和性精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質精製を補助すること、を提供する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合成分と組換えタンパク質との連結部分にタンパク分解の開裂部位を導入し、組換えタンパク質の融合成分からの分離、それに続く融合タンパク質精製を可能にする。このような酵素および同種の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。一般的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらはいずれも、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合させる。
【００９２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８８）６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写による。
【００９３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化する一つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解により開裂させる能力を損なわせた宿主でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：１１９−１２８）。他の方法は、発現ベクターに挿入しようとする核酸の核酸配列を、各アミノ酸に関する個々のコドンが優先的にＥ．ｃｏｌｉで利用されるコドンになるように改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９２）２０：２１１１−２１１８）。このような本発明の核酸配列の改変は、標準的なＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【００９４】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ３発現ベクターは、酵母発現ベクターである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母で発現するためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【００９５】
あるいは、ＧＡＶＥ３は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現することができる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質発現で利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ.，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１−３９）が挙げられる。
【００９６】
さらに他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で用いる場合、発現ベクターのコントロール機能はしばしば、ウイルスの調節因子で提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０由来である。原核および真核細胞両方のためのその他の適切な発現系に関しては、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等の１６および１７章を参照。
【００９７】
他の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、優先的に特定の細胞型における核酸発現を指揮することができる（例えば、核酸を発現させるのに組織特異的調節因子が用いられる）。組織特異的調節因子が当業界既知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８７）１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ.，ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８９）８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号および欧州特許出願第２６４，１６６号）が挙げられる。発生調節プロモーターも含まれ、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８９）３：５３７−５４６）が挙げられる。
【００９８】
さらに本発明は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、該ＤＮＡ分子は、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にさせるような方法で調節配列に操作可能に連結する。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に操作可能に連結した調節配列は、様々な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指揮するもの、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーであり、を選択することができ、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的発現を指揮する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であってもよく、それにおいて、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で生産され、その活性は、ベクターが導入された細胞型により測定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照。
【００９９】
本発明の他の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において交換可能に用いられる。このような用語が、特定の被験対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または可能性のある後代も意味するということが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかにより次世代で特定の変性が生じる可能性があることから、このような後代は、実際に親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で用いられる用語の範囲内に含まれる。
【０１００】
宿主細胞は、原核または真核細胞のいずれでもよい。例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞またはＣＯＳ細胞）で発現することができる。その他の適切な宿主細胞が当業者既知である。ベクターＤＮＡは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞へ導入する様々な業界で認識された技術を意味するものとし、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、形質導入、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。
【０１０１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術によっては、ほんのわずかな細胞しか外来ＤＮＡをゲノムに統合させることができないことが知られている。統合成分を同定し選択するために、一般的に、選択マーカー（例えば抗生物質耐性に関する）をコードする遺伝子が対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーとしては、薬物耐性を与えるものであり、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートである。選択マーカーをコードする核酸は、ＧＡＶＥ３をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入してもよいし、または、別のベクターで導入してもよい。導入された核酸で安定してトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）。
【０１０２】
本発明の宿主細胞、例えば培養中の原核または真核性の宿主細胞は、ＧＡＶＥ３タンパク質を生産（すなわち発現）させるのに用いることができる。従って、さらに本発明は、本発明の宿主細胞を用いたＧＡＶＥ３タンパク質の生産方法を提供する。一実施形態において、該方法は、本発明の宿主細胞（ＧＡＶＥ３をコードする組換え発現ベクターが導入された）を、ＧＡＶＥ３タンパク質が生産されるような適切な培地中で培養することを含む。他の実施形態において、該方法は、ＧＡＶＥ３を培地または宿主細胞から単離することさらに含む。
【０１０３】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を生産するのに用いることができる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ３コーディング配列が導入された受精した卵母細胞または胚幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用いて、外因性ＧＡＶＥ３配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または、内在性ＧＡＶＥ３配列が改変された相同組換え動物を製造することができる。このような動物は、ＧＡＶＥ３の機能および／または活性を研究すること、および、ＧＡＶＥ３活性の調節因子を同定および／または評価することに有用である。本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、それにおいて、１またはそれ以上の動物細胞は導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物のその他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。
【０１０４】
導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、これを細胞のゲノムに統合し、それからトランスジェニック動物を発生させ、成熟動物のゲノムに保持され、それにより、トランスジェニック動物の１またはそれ以上の細胞型または組織で、コードされた遺伝子産物の発現が指揮される。本明細書で用いられる「相同組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、それにおいて、内在性ＧＡＶＥ３遺伝子は、動物の発生の前に、動物細胞（例えば動物の胚細胞）に導入された内在性遺伝子と外因性ＤＮＡ分子との相同組換えにより改変されている。
【０１０５】
本発明のトランスジェニック動物は、ＧＡＶＥ３をコードする核酸を受精した卵母細胞の雄の前核に導入すること（例えばマイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染により）、および、卵母細胞を偽妊娠雌フォスター動物で発生させることにより、製造することができる。ＧＡＶＥ３のｃＤＮＡ配列（例えば配列番号１）は、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ヒトＧＡＶＥ３遺伝子の非ヒト相同体、例えばマウスＧＡＶＥ３遺伝子は、ヒトＧＡＶＥ３のｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づき単離することができ、導入遺伝子として用いることができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、導入遺伝子の発現効率を増すために、導入遺伝子に含ませることができる。組織特異的調節配列は、ＧＡＶＥ３導入遺伝子に操作可能に連結することができ、特定の細胞でＧＡＶＥ３タンパク質の発現を指揮することができる。特にマウスのような動物の、胚操作およびマイクロインジェクションによるトランスジェニック動物製造方法は、当業界で一般的であり、例えば、以下で説明される：米国特許第４,７３６,８６６号および第４,８７０,００９号、米国特許第４,８７３,１９１号、ならびに、Ｈｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ.，１９８６）。ゲノムにおける導入遺伝子を用いたその他のトランスジェニック動物の製造、および／または、動物の組織または細胞におけるＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ発現に関する類似の方法が用いられる。次に、トランスジェニックを設定した動物を用いて、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させることができる。その上、ＧＡＶＥ３をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、他のトランス遺伝子を有する他のトランスジェニック動物をさらに増殖させることができる。
【０１０６】
相同組換え動物を製造するために、少なくともＧＡＶＥ３遺伝子の部分（例えば、ＧＡＶＥ３遺伝子のヒトまたは非ヒト相同体、例えばマウスのＧＡＶＥ３遺伝子）を含み、そこに欠失、付加または置換が導入されたベクターを調製し、それによりＧＡＶＥ３遺伝子を改変することができ、例えばＧＡＶＥ３遺伝子を機能的に破壊することができる。好ましい実施形態において、該ベクターは、相同組換えの際に内在性ＧＡＶＥ３遺伝子を機能的に破壊するように設計される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；または「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。
【０１０７】
あるいは、該ベクターは、相同組換えの際に、内在性ＧＡＶＥ３遺伝子が変異されるか、あるいは改変されるが、それでもなお機能的タンパク質をコードするように設計することができる（例えば、上流の調節領域が改変され、それにより内在性ＧＡＶＥ３タンパク質発現が改変され得る）。
【０１０８】
相同組換えベクターにおいて、ＧＡＶＥ３遺伝子の改変部分は、５’および３’末端で、ＧＡＶＥ３遺伝子の付加核酸でフランキングされており、それにより、胚幹細胞において、ベクターにより含まれる外因性ＧＡＶＥ３遺伝子と内在性ＧＡＶＥ３遺伝子との間で相同組換えを起こすことを可能にする。付加的なフランキングＧＡＶＥ３核酸は、内在性遺伝子との良好な相同組換えに十分な長さを有する。一般的に、数キロ塩基のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端との両方において）がベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明に関するＴｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３を参照）。
【０１０９】
該ベクターは、胚幹細胞系に（例えばエレクトロポレーションにより）導入され、導入されたＧＡＶＥ３遺伝子が内在性ＧＡＶＥ３遺伝子と相同組換えを起こした細胞が選択される（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：９１５を参照）。次に、選択された細胞は、動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入され、キメラ集合体を形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ.，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照）。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠雌フォスター動物に移植し、続いて胚を発生させることができる。生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを有する後代を用いて、動物を繁殖させることができ、それにおいて、全ての動物細胞は、生殖細胞系列により導入遺伝子が伝播されるため相同組換えＤＮＡを含む。
【０１１０】
相同組換えベクターおよび相同組換え動物の構築方法は、以下でさらに説明される：Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）２：８２３−８２９、および、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０１１４０、ＷＯ９２／０９６８およびＷＯ９３／０４１６９。
【０１１１】
他の実施形態において、調節された導入遺伝子発現を可能にするために選択されたシステムを含むトランスジェニック非ヒト動物が製造可能である。このようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの説明に関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：６２３２−６２３６を参照。組換えシステムの他の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰ組換えシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが導入遺伝子発現の調節に用いられる場合、ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードするトランス遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供することができ、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方は、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することにより提供することができる。
【０１１２】
本明細書で説明された非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５：８１０−８１３、ならびに、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９で説明された方法に従って製造することもできる。簡単に言えば、トランスジェニック動物からの細胞（例えば体細胞）を単離して、成長サイクルを脱出させてＧ0期に入るように誘導することができる。次に、休止細胞を、例えば電気パルスの使用により、同種の動物からの除核卵母細胞に融合することができ、それから休止細胞を単離する。次に、構築された卵母細胞を桑実胚または未分化胚芽細胞を発生させるように培養し、次に、偽妊娠雌フォスター動物にトランスファーする。生まれた雌フォスター動物の子孫は、動物のクローンの可能性があり、それから、細胞（例えば体細胞）を単離する。
【０１１３】
医薬組成物
本発明のＧＡＶＥ３核酸分子、ＧＡＶＥ３タンパク質および抗ＧＡＶＥ３抗体（また本明細書においては「活性化合物」とも呼ばれる）は、投与に適切な医薬組成物に取り込ませることができる。このような組成物は、一般的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および製薬上許容できる担体を含む。本明細書で用いられる用語「製薬上許容できる担体」は、医薬投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などのいずれかまたは全てを含むものとする。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体および剤の使用は、当業界で周知である。従来の媒体または剤のいずれかが活性化合物と適合しない場合を除いては、それらの該組成物における使用が考えられる。補足の活性化合物もまた該組成物に取り込ませることができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように配合される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、口（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜および直腸内投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラオキシ安息香酸エステル類；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート、および、張度を調節する剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、ＨＣｌまたはＮａＯＨのような酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨ての注射器または複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１１５】
注射用に適切な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または、分散物、および、滅菌注射用溶液の即時調製または分散のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に関して、適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（Ｒ）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。
【０１１６】
全ての場合において、該組成物は、滅菌されなければならず、容易な注射器で利用できる程度の流体であるべきである。該組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や菌類のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒が可能である。適切な流動度は、例えば、コーティング（例えばレシチン）の使用、分散物の場合必要な粒度の維持、および、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤により達成することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどである。多くの場合において、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅らせる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物に含ませることにより得ることができる。
【０１１７】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中、上記で列挙された成分の一つまたは組み合わせと共に、活性化合物（例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質または抗ＧＡＶＥ３抗体）を必要量取り込ませ、必要に応じて、その後にフィルター滅菌を行うことによって調製することができる。一般的に、分散物は、基本的な分散媒と、上記で列挙されたものからの必要なその他の成分とを含む滅菌賦形剤に活性化合物を取り込ませることにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分と追加の望ましい成分のいずれかとの粉末を、予め滅菌ろ過したそれらの溶液から得られる。
【０１１８】
経口用組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または食べられる担体を含む。該組成物は、ゼラチンカプセルに包んでもよいし、または、錠剤に圧縮してもよい。経口治療での投与目的に関して、活性化合物は、賦形剤と共に取り込ませることができ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いることができる。経口用組成物はまた、うがい薬として使用するための液状担体を用いて調製することができ、この場合、液状担体中の化合物は、経口に適用し、口内を循環させ、吐き出すか、または、飲み込む。
【０１１９】
医薬的に適合可能な結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、類似の性質を有する以下の成分または化合物のいずれかを含み得る：結合剤、例えば微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン；賦形剤、例えばスターチまたはラクトース：崩壊剤、例えばアルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；または、着香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ着香剤。吸入による投与に関しては、該化合物は、適切な噴射剤（例えば二酸化炭素のようなガス）を含む加圧コンテナもしくはディスペンサーまたは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で運搬される。
【０１２０】
全身投与もまた、経粘膜または経皮手段によりなされ得る。経粘膜または経皮投与に関して、透過を遮蔽するのに適切な浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤は一般的に当業界既知であり、例えば、経粘膜投与用に、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤の使用を介して達成することができる。経皮投与に関して、活性化合物は、一般的に当業界既知の軟膏、ソルベ、ゲルまたはクリームに配合される。
【０１２１】
該化合物はまた、直腸運搬のための坐剤（例えば、カカオバターやその他のグリセリドのような通常の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製することができる。
【０１２２】
一実施形態において、活性化合物は、体からの迅速な排除に対して化合物を保護し得る担体（例えば調節放出製剤）を用いて調製することができ、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化された運搬システムである。
【０１２３】
生分解性の、生体適合性ポリマーを用いることができ、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸である。
【０１２４】
このような製剤の調製方法は、当業者に明白である。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎやＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販のものを入手してもよい。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体で感染させた細胞を標的としたリポゾームを含む）も製薬上許容できる担体として用いることができる。これらは、当業者既知の方法、例えば米国特許第４,５２２,８１１号で説明された方法に従って調製することができる。
【０１２５】
投与の容易さと投与量均一性のために、投与量単位形態で経口または非経経口用組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で用いられる投与量単位形態は、治療される被験対象に対して単一用量として適した物理的に個別のユニットを意味し、各ユニットは、望ましい治療効果が得られるように計算された予め決められた量の活性化合物を必要な製薬担体と共に含む。病気のタイプと重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０.１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者へ投与するための初期の候補用量であり、例えば、１またはそれ以上の別々の投与または連続注入のいずれかによりなされる。一般的な１日投与量は、上記要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日またはそれ以上にわたる反復投与のために、状態に応じて、病気の症状の望ましい抑制が起こるまで治療が継続される。しかしながら、その他の投与量方式も有用であり得る。療法の経過は通常の技術や分析により簡単にモニターされる。代表的な投薬方式はＷＯ９４／０４１８８に開示される。本発明の投与量単位形態に関する詳細は、活性化合物の独特の特徴、および、達成するべき特定の治療効果、および、個体を治療するためのこのような活性化合物の調合に関する当業界固有の限定に規定され、かつ直接的に依存する。
【０１２６】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５,３２８,４７０号）または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３０５４−３０５７を参照）により被験対象に運搬することができる。遺伝子治療ベクターの医薬配合物は、遺伝子治療ベクターを許容できる希釈剤中に含ませることができ、または、徐放性基質を含み、そこに遺伝子デリバリー賦形剤が埋め込むことができる。あるいは、完全遺伝子デリバリーベクターが組換え細胞から無傷で製造できる場合（例えば、レトロウイルスのベクター）、該医薬配合物に、遺伝子デリバリーシステムを形成する１またはそれ以上の細胞を含めることができる。
該医薬組成物は、投与指示書と共に、コンテナ、パックまたはディスペンサー中に含ませることができる。
【０１２７】
本発明の使用および方法
本明細書で説明された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体および抗体は、以下の１またはそれ以上の方法で用いることができる：ａ）スクリーニング分析；ｂ）検出分析（例えば、染色体マッピング、組織のタイプ分け、法生物学）；ｃ）予防薬（例えば、診断分析、予後分析、臨床試験のモニタリングおよび薬理ゲノム学）；および、ｄ）治療方法（例えば、治療剤および予防剤）。ＧＡＶＥ３タンパク質とその他の細胞性タンパク質との相互作用、で用いることができ、従って、（ｉ）細胞増殖調節；（ii）細胞分化調節；および（iii）細胞生存の調節に関して用いることができる。本発明の単離核酸分子は、それにより、ＧＡＶＥ３タンパク質（例えば、遺伝子治療用途において、宿主細胞中での組換え発現ベクターを介して）の発現、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ（例えば生物学的サンプル中で）またはＧＡＶＥ３遺伝子における遺伝的な損傷の検出、ＧＡＶＥ３活性の調節に用いることができる。加えて、ＧＡＶＥ３タンパク質は、ＧＡＶＥ３活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニング、ならびに、ＧＡＶＥ３タンパク質の不十分な生産もしくは過剰生産、または、ＧＡＶＥ３野生型タンパク質に比べて活性が減少した、もしくは、活性が異常なＧＡＶＥ３タンパク質形態の生産を特徴とする疾患の治療に用いることができる。加えて、本発明の抗ＧＡＶＥ３抗体を用いて、ＧＡＶＥ３タンパク質を検出および単離し、ＧＡＶＥ３活性を調節することができる。本発明はさらに、本明細書で説明された治療のための、上述のスクリーニング分析で同定された新規の薬剤およびそれらの使用に関する。
【０１２８】
Ａ．スクリーニング分析
本発明は、調節因子を同定するための方法（または本明細書においては「スクリーニング分析」とも称される）、すなわち、ＧＡＶＥ３タンパク質に結合するか、または、例えばＧＡＶＥ３発現またはＧＡＶＥ３活性に刺激または阻害効果を有する候補または試験化合物または物質（例えば、ペプチド、ペプチド模擬体、低分子物質またはその他の薬物）を同定するための方法を提供する。
【０１２９】
一実施形態において、本発明は、ＧＡＶＥ３タンパク質、ポリペプチドまたは生物学的に活性なそれらの部分に結合する、またはそれらの膜結合型の活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングする分析を提供する。本発明の試験化合物は、当業界既知のコンビナトリアルライブラリー方法で多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、例えば：生物学的ライブラリー；立体的に指定可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ、１−化合物」ライブラリー法；および、アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチがペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子物質ライブラリーに利用可能である（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９７）１２：１４５）。
【０１３０】
分子ライブラリーの合成方法の例を、当業界で見出すことができ、例えば：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０６１；および、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：１２３３である。
【０１３１】
化合物ライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ（１９９２）１３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５,２２３,４０９号）、胞子（米国特許第５,５７１,６９８号；５,４０３,４８４号；および、５,２２３,４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：１８６５−１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｉａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６３７８−６３８２；および、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９１）２２２：３０１−３１０）に存在し得る。
【０１３２】
一実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であり、それにおいて、細胞表面上でＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞が、試験化合物と接触し、ＧＡＶＥ３タンパク質と結合する試験化合物の能力が測定される。該細胞は、例えば、酵母細胞または哺乳動物由来の細胞が可能である。ＧＡＶＥ３タンパク質に結合する試験化合物の能力の測定は、例えば、複合体における試験化合物とＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分との結合を標識化合物を検出することによって測定することができるように試験化合物と放射線同位体または酵素標識とをカップリングすることにより達成することができる。例えば、試験化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで直接的または間接的に標識することができ、放射線同位体は、放射線放出の直接的なカウントまたはシンチレーションカウントにより検出できる。あるいは、試験化合物は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換を測定することによって検出することができる。好ましい実施形態において、分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞を、細胞表面で、ＧＡＶＥ３と結合する既知の化合物と接触させて分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定すること、を含み、ここで、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定することは、既知化合物よりもＧＡＶＥ３または生物学的に活性なそれらの部分に優先的に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。
【０１３３】
他の実施形態において、分析は、細胞に基づく分析であり、該分析は、細胞表面上でＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の膜結合型を発現する細胞と、試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定すること、を含む。ＧＡＶＥ３活性または生物学的に活性なそれらの部分を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＧＡＶＥ３標的分子に結合または相互作用するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を測定することにより達成することができる。本明細書で用いられる「標的分子」は、ＧＡＶＥ３タンパク質が本質的に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境における分子、細胞膜の内部表面に結合する分子または細胞質分子が挙げられる。ＧＡＶＥ３標的分子は、非ＧＡＶＥ３分子またはＧＡＶＥ３タンパク質または本発明のポリペプチドであり得る。一実施形態において、ＧＡＶＥ３標的分子は、細胞膜を介する細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合型ＧＡＶＥ３分子に結合することによって生じるシグナル）の細胞への導入を容易にするシグナル伝達経路の成分である。該標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または、下流のシグナル伝達分子とＧＡＶＥ３との結合を容易にするタンパク質であり得る。
【０１３４】
ＧＡＶＥ３標的分子に結合または相互作用するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を測定することは、直接的な結合を測定することに関して上記で説明された方法の一つにより達成することができる。好ましい実施形態において、ＧＡＶＥ３標的分子に結合または相互作用するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を決定することは、標的分子の活性測定により達成することができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞の第２メッセンジャー（例えば、細胞内のＣａ2+，ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質で標的の触媒性の／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（例えば、検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）をコードする核酸に操作可能に連結したＧＡＶＥ３応答調節因子）の誘導を検出すること、または、細胞の応答、例えば細胞分化または細胞増殖を検出することにより決定することができる。
【０１３５】
さらに他の実施形態において、本発明の分析は、細胞を用いない分析であり、該分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する試験化合物の能力を決定することを含む。試験化合物のＧＡＶＥ３タンパク質への結合は、上述のように直接的または間接的のいずれかで決定することができる。好ましい実施形態において、該分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ３と結合する既知の化合物とを接触させ分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここで、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することは、ＧＡＶＥ３または生物学的に活性なそれらの部分と既知化合物に比べて優先的に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。
【０１３６】
他の実施形態において、分析は、細胞を用いない分析であり、該分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定することを含む。ＧＡＶＥ３活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば、直接的な結合を決定することに関する上述の方法の一つによりＧＡＶＥ３標的分子に結合するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を測定することにより達成することができる。
【０１３７】
その代わりの実施形態において、ＧＡＶＥ３活性を調節する試験化合物の能力を測定することは、ＧＡＶＥ３標的分子をさらに調節するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質上での標的分子の触媒性の／酵素活性は、前述したように決定することができる。
【０１３８】
さらに他の実施形態において、細胞を用いない分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質または生物学的に活性なそれらの部分とＧＡＶＥ３と結合する既知の化合物とを接触させ分析混合物を形成すること、分析混合物と試験化合物とを接触させること、および、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することを含み、ここで、ＧＡＶＥ３タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定することは、優先的にＧＡＶＥ３標的分子に結合する、または、その活性を調節するＧＡＶＥ３タンパク質の能力を決定することを含む。
【０１３９】
受容体は、必ずしもリガンド結合を阻害しないが、受容体における構造変化を引き起こし、Ｇタンパク質結合、またおそらくは活性化を引き起こす受容体凝集、二量体化もしくは集積化を可能にさせる非リガンド分子により活性化することができる。
【０１４０】
従って、抗体は、細胞表面で晒されるＧＡＶＥ３の様々な部分に対して発生させることができる。標準的な分析（例えばｃＡＭＰレベルまたは細胞内のＣａ+2レベルのモニタリング）により測定されるＧタンパク質カスケードにより細胞を活性化する抗体が選択可能である。
【０１４１】
該抗体は、既知技術を用いて製造できる。分子マッピング、特にエピトープマッピングが含まれるため、モノクローナル抗体が好ましいと思われる。モノクローナル抗体は、細胞表面で発現されるインタクト受容体および細胞表面で形成されることがわかっているペプチドの両方に対して発生させることができる。Ｇｅｙｓｅｎ等の米国特許第５,９９８,５７７号の方法を実施して、複数の関連ペプチドを得ることができる。
【０１４２】
ＧＡＶＥ３を活性化することが見出された抗体を改変して、ＧＡＶＥ３活性化と無関係の活性（例えば補体固定）を最小化することができる。従って、抗体分子を短縮化または変異し、ＧＡＶＥ３活性化以外の活性を最小化または除去することができる。例えば、特定の抗体に関して、抗原結合部分だけが必要である。従って、抗体のＦc部分を除去することができる。
【０１４３】
ＧＡＶＥ３発現細胞は、抗体に晒され、ＧＡＶＥ３を活性化する。次に、より高い活性化レベルまたはより低い活性化レベルのいずれかに受容体活性を変更するものを同定する目的で、活性化細胞を様々な分子に晒す。次に、その目的を達成する分子を抗体を用いずにＧＡＶＥ３発現細胞に関して試験して、非活性化細胞に関する効果を観察することができる。次に、既知技術を用いて、標的分子を試験し、変更されたＧＡＶＥ３代謝に関する疾患を治療するための候補薬物として改変することができる。
【０１４４】
本発明の細胞を用いない分析は、ＧＡＶＥ３の可溶化形態および膜結合型の両方の使用を可能にする。ＧＡＶＥ３の膜結合型を含む細胞を用いない分析の場合、ＧＡＶＥ３の膜結合型が溶液中で維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい。可溶化剤の例としては、非イオン性界面活性剤、例えばｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ(R)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが挙げられる。
【０１４５】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ３は、宿主細胞で発現される場合に常に活性状態であるように改変される。ＧＡＶＥ３の改変により、リガンドに結合しなくても受容体を活性にすることができる。活性化受容体を達成する一つの方法は、ＧＡＶＥ３がリガンド結合なしでＧタンパク質と相互作用するように改変することである。該改変は、受容体を細胞内のＧタンパク質に結合させ得るようなリガンド結合における受容体のコンフォメーション変化を模擬する。このようなアプローチの一つは、ＷＯ００／２２１２９で提供される。
【０１４６】
ＷＯ００／２２１２９は、構成的な活性を生じるＴＭ６およびＩＣ３領域における特定のアミノ酸を示す。特定のアミノ酸をＧＡＶＥ３に取り込ませる方法は、当業界既知であり、例えば、部位特異的変異誘発、サブクローニングなどである。次に、改変されたＧＡＶＥ３分子は、宿主細胞中で発現され、構成的に活性なＧＡＶＥ３を生じる。
【０１４７】
次に、活性化細胞は、ＧＡＶＥ３アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト等であると推測される分子、ＧＡＶＥ３活性を改変する分子に晒される。Ｇタンパク質活性を改変する分子は、医薬開発において既知の方法を用いて、改変されたＧＡＶＥ３代謝に関連する疾患を治療するために標的化される。
【０１４８】
本発明の上記分析方法の一以上の実施形態において、ＧＡＶＥ３またはそれらの標的分子のいずれかを固定することが望ましく、それにより、タンパク質の一つまたは両方の複合化していない形態から複合化形態を分離することを容易にすることができ、同様に、分析の自動操作に便宜をはかることができる。試験化合物のＧＡＶＥ３への結合、または、候補化合物の存在および非存在でのＧＡＶＥ３と標的分子との相互作用は、反応物を収容するのに適切な容器のいずれかのなかで達成することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心管が挙げられる。一実施形態において、タンパク質の一つまたは両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ３融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロース(R)ビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、次にそれらを試験化合物と、または、試験化合物および未吸着標的タンパク質もしくはＧＡＶＥ３タンパク質のいずれかと併せ、その混合物を複合体形成を助長する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的な条件）でインキュベートする。インキュベートの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、未結合成分を全て除去し、例えば上述したように複合体形成を直接的または間接的に測定する。あるいは、該複合体は、マトリックスから解離させることができ、ＧＡＶＥ３結合レベルまたは活性を標準的な技術を用いて測定することができる。
【０１４９】
タンパク質をマトリックスに固定するその他の技術もまた、本発明のスクリーニング分析で用いることができる。例えば、ＧＡＶＥ３またはそれらの標的分子のいずれかは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチン化ＧＡＶＥ３または標的分子は、当業界周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製することができ、ストレプトアビジン被覆９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定することができる。あるいは、ＧＡＶＥ３または標的分子と反応性はあるがＧＡＶＥ３タンパク質の標的分子への結合に干渉しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合標的またはＧＡＶＥ３を抗体結合によりウェルに捉えることができる。このような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ固定化複合体に関して上述したものに加えて、ＧＡＶＥ３または標的分子と反応性のある抗体を用いた複合体の免疫検出、同様に、ＧＡＶＥ３または標的分子と結合した酵素活性を検出することによる酵素結合分析が挙げられる。
【０１５０】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ３発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中のＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が測定される方法において同定される。候補化合物の存在下でのＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次に、候補化合物は、比較に基づいてＧＡＶＥ３発現調節因子を同定することができる。例えば、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それらの非存在における発現より大きい（統計学的に有意に大きい）場合、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質またはアゴニストとして候補化合物が同定される。あるいは、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、それらの非存在における発現より小さい（統計学的に有意に小さい）場合、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤またはアンタゴニストとして候補化合物が同定される。リガンドまたはアゴニストの存在下で、または、構成的ＧＡＶＥ３においてＧＡＶＥ３活性が基準未満に減少する場合、インバースアゴニストとして候補化合物が同定される。細胞中でのＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルは、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書で説明された方法により決定することができる。
【０１５１】
さらなる本発明の他の局面において、ＧＡＶＥ３タンパク質は、２−ハイブリッド分析または３−ハイブリッド分析での「ベイトタンパク質」として用いることができ（例えば、米国特許第５,２８３,３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１６９３−１６９６；および、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１０３００を参照）、ＧＡＶＥ３と結合または相互作用するその他のタンパク質（「ＧＡＶＥ３結合タンパク質」または「ＧＡＶＥ３−ｂｐ」）を同定し、ＧＡＶＥ３活性を調節することができる。このようなＧＡＶＥ３結合タンパク質はまた、ＧＡＶＥ３タンパク質によるシグナル（例えばＧＡＶＥ３経路の上流または下流の因子）の伝達に関与する可能性がある。
【０１５２】
大量の純粋なＧＡＶＥ３を製造することができたので、合理的なドラッグデザインのための機能する可能性のある領域のコンフォメーションの物理的な特徴を解明することができる。例えば、分子のＩＣ３領域およびＥＣドメインは、特に対象となる領域である。一度領域の形状やイオン配位が識別されれば、その領域と相互作用すべき候補薬物を構築することができ、次に、インタクト細胞、動物および患者で試験することができる。このような３Ｄ構造情報を引き出すことが可能な方法としては、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ分光学、分子モデリングなどが挙げられる。３Ｄ構造はまた、その部位で作用する既知薬物が存在する場合、他の既知タンパク質における類似のコンフォメーション部位の同定をもたらすことができる。これら薬物、またはその誘導体について、ＧＡＶＥ３との用途が見出される可能性がある。
【０１５３】
さらに本発明は、本明細書で説明された治療のための、上述のスクリーニング分析によって同定された新規の物質、および、その使用に関する。
【０１５４】
Ｂ．検出分析
本発明において同定されたｃＤＮＡ配列の部分または断片（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多数の方法で用いることができる。例えば、該配列は、（ｉ）染色体上の各遺伝子をマッピングし、遺伝病に関する遺伝子領域の位置を確認すること；（ii）わずかな生物学的サンプルから個体を同定すること（組織タイプ分け）；および（iii）生物学的サンプルの法医同定を補助することに用いることができる。該用途を以下の章で説明する。
【０１５５】
１．染色体マッピング
一度遺伝子配列（または配列の部分）が単離されれば、第１２染色体上のＧＡＶＥ３遺伝子の位置をマッピングするのに配列を用いることができる。従って、本明細書で説明されたＧＡＶＥ３核酸分子またはそれらの断片は、第１２染色体上のＧＡＶＥ３の位置をマッピングするのに用いることができる。第１２染色体へのＧＡＶＥ３配列のマッピングは、配列と病気に関する遺伝子とを互いに関係付けることにおける重要な第一段階である。
【０１５６】
簡単に言えば、ＧＡＶＥ３遺伝子は、ＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を用いてＧＡＶＥ３配列から調製することによって第１２染色体にマッピングすることができる。該プライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。ＧＡＶＥ３配列に対応するヒト遺伝子を含むこれらハイブリッドのみが増幅断片を発生させる。
【０１５７】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物体細胞（例えばヒトおよびマウス細胞）を融合することによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドは成長し、分裂するので、一般的にヒト染色体は、ばらばらに失われるが、マウス染色体は保持される。マウス細胞は成長できないが（特定の酵素が欠乏しているため）ヒトの細胞は成長できる培地を用いることによって、必要な酵素をコードする遺伝子を含む一つのヒト染色体が保持され得る。様々な培地を用いることによって、ハイブリッド細胞系のパネルが確率される。パネル中の各細胞系は、一つのヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および、マウス染色体一式を含み、特定のヒト染色体に対する個々の遺伝子の簡単なマッピングが可能である。（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体断片のみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を含むヒト染色体を用いて生産することもできる。
【０１５８】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対して特定するための迅速な方法である。シングルサーモサイクラーを用いれば、１日当り３またはそれ以上の配列を特定することができる。ＧＡＶＥ３配列をオリゴヌクレオチドプライマーの設計に用いることによって、第１２染色体の断片のパネルまたは第１２染色体に関与する転座でサブローカライゼーションを達成する。ＧＡＶＥ３配列を第１２染色体に対してマッピングするのに同様に用いることができるその他のマッピング方法としては、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６２２３−２７で説明される）、標識したフロー選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、および、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。
【０１５９】
分裂中期染色体の展開に対する、ＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）はさらに、一段階で正確な染色体の位置を提供するのに用いることができる。染色体展開は細胞を用いてなされ、ここで、化学物質で、例えば有糸分裂の紡錐体を破壊するコルセミドで、分裂は分裂中期においてブロックされる。染色体は、トリプシンで簡単に処理し、次に、ギームザで染色することができる。明暗バンドのパターンが、染色体を個々に同定することができるように各染色体で得られる。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基もの短いＤＮＡ配列で用いることができる。しかしながら、１,０００塩基を超過するクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、唯一の染色体位置へ結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、より好ましくは２,０００塩基が、ほどよい時間で良好な結果を得るのに十分である。技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａ等（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８））を参照。染色体マッピングは、インシリコで、統計学的な考察（例えばロッドスコアまたは単なる近似）を用いて推測することができる。例えば、暫定的にＧＡＶＥ３は、インシリコマッピングで１２ｑ２４．２３にマッピングされる。
【０１６０】
染色体マッピング用試薬は、第１２染色体もしくは第１２染色体上の単一部位をマークするのに個別に用いることができ、または、試薬のパネルは、複数の部位および／または複数の染色体をマークするのに用いることができる。実際には、ＧＡＶＥ３遺伝子のフランキング領域に対応する試薬がマッピングの目的に好ましい。コーディング配列は、遺伝子ファミリー内で保存されているする可能性が高く、従って、染色体マッピングの際にクロスハイブリダイゼーションの機会が増加する。
【０１６１】
一度配列が正確な染色体の位置にマッピングされれば、染色体上の配列の物理的な位置は、遺伝子マップデータと関係付けることができる。（このようなデータは、例えばＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎで見出すことができ、Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで利用できる）。次に、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））により同定することができ、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：７８３−７８７で説明されている。
【０１６２】
その上、ＧＡＶＥ３に関連する病気に罹患した個体と罹患していない個体との間のＤＮＡ配列の差を決定することができる。突然変異が罹患した個体のいくつかまたは全てで観察されるが、罹患していない個体では全く観察されない場合、突然変異が特定の病気を引き起こす因子の可能性がある。罹患した個体と罹患していない個体との比較は、一般的に、初めに、染色体における構造的変化、例えば、染色体分布から見てわかるかまたはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座を検索することを含む。最終的には、数々の個体からの遺伝子の完全な配列解析を実施し、突然変異の存在を確認し、突然変異と多型とを区別することができる。
【０１６３】
２．組織タイプ分け
本発明のＧＡＶＥ３配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体をを同定するのに用いることもできる。米国軍は、例えば、隊員の同定に制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を用いることを考慮している。この技術において、個体のゲノムＤＮＡを１またはそれ以上の制限酵素で消化し、サザンブロットで調べて同定のための独特のバンドを得ることができる。該方法は、現在使われている、失われたり変換されたり盗まれたりする可能性があり、肯定的な同定を困難にする「ドッグタグ（Ｄｏｇ  Ｔａｇ）」の制限を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰのための追加のＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５,２７２,０５７号で説明される）。
【０１６４】
その上、本発明の配列は、個体のゲノムの選択された部分の実際の１塩基ごとのＤＮＡ配列を決定するその代わりの技術を提供するのに用いることができる。従って、本明細書で説明されたＧＡＶＥ３配列は、配列の５’および３’末端から２種のＰＣＲプライマーを調製するのに用いることができる。次に、プライマーは、個体のＤＮＡを増幅するのに用いることができ、その後、それらの配列を提供することができる。
【０１６５】
その方法で調製された個体からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が対立遺伝子の差によるこのようなＤＮＡ配列の特有のセットを有することから、特有の個体同定を提供することができる。本発明の配列は、個体および組織からこのような同定配列を得るのに用いることができる。本発明のＧＡＶＥ３配列は、ヒトゲノムの部分に特有に存在する。対立遺伝子変異は、ある程度は配列のコーディング領域に発生し、非コーディング領域にはより高い頻度で発生する。個々のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基あたり約１回の頻度で発生することが推測される。本明細書で説明されたそれぞれの配列は、ある程度は標準として用いることができ、それに対して、個体からのＤＮＡは、同定目的で比較することができる。より多数の多型が非コーディング領域で発生することから、個体を区別するのに必要な配列はより少ない。配列番号１の非コーディング配列は、それぞれ１００塩基の非コーディング増幅配列を生じる約１０〜１,０００プライマーのパネルを用いて、陽性の個体同定を提供することができる。推定のコーディング配列、例えば配列番号１のコーディング配列を用いる場合、陽性の個体同定により適切な数のプライマーは、５００〜２,０００であり得る。
【０１６６】
個体に関して特有の同定データベースを得るために本明細書で説明されたＧＡＶＥ３配列からの試薬パネルを用いる場合、後々、この同じ試薬がその個体からの組織を同定するのに用いることができる。特有の同定データベースを用いて、陽性の個体同定は、生きていても死んでいても、極端に小さい組織サンプルから実施することができる。
【０１６７】
３．法医生物学における部分的なＧＡＶＥ３配列の使用
ＤＮＡに基づく同定技術はまた、法医生物学で用いることもできる。法医生物学は、科学の一分野であって、例えば犯人を陽性と同定するための手段として、犯罪現場で発見された生物学的な証拠の遺伝的なタイプ分けが用いられる。このような同定を行うため、ＰＣＲ技術を用いて、非常に小さい生物学的サンプル、例えば犯罪現場で発見された組織（例えば毛髪や皮膚）、または体液（例えば血液、唾液や精液）から得られたＤＮＡ配列を増幅することができる。次に、増幅された配列を標準と比較し、それにより、生物学的サンプルの素性を同定することができる。
【０１６８】
本発明の配列を用いて、ポリヌクレオチド試薬、例えばヒトゲノムにおいて特異的な遺伝子座を標的にしたＰＣＲプライマーを提供することができ、それにより、例えば他の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に特有な他のＤＮＡ配列）を提供することによりＤＮＡに基づく法医同定の確実性を高めることができる。上述したように、実際の塩基配列情報は、制限酵素により得られた断片で形成されるパターンの代わりに、正確であるかを同定するのに用いることができる。配列番号１の非コーディング領域を標的とした配列は、より多くの数の多型が非コーディング領域に発生するため、その使用に対して特に適切であり、その技術を用いて個体を区別するための識別を強化する。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＧＡＶＥ３配列またはそれらの部分；例えば、少なくとも２０または３０塩基の長さの配列番号１の非コーディング領域から誘導された断片が挙げられる。
【０１６９】
本明細書で説明されたＧＡＶＥ３配列はさらに、ポリヌクレオチド試薬、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術で用いることができる標識プローブまたは標識可能なプローブを提供するのに用いることができ、特定の組織（例えば脳組織）を同定できる。これは、法医病理学者が、起源が不明の組織を提示した場合に非常に有用である。このようなＧＡＶＥ３プローブパネルは、種および／または器官のタイプにより組織を同定するのに用いることができる。
【０１７０】
類似の方法で、試薬、例えば、ＧＡＶＥ３プライマーまたはプローブは、混在に関して組織培養物をスクリーニングする（すなわち、培養物中で、異なるタイプの細胞の混合物の存在をスクリーニングする）のに用いることができる。
【０１７１】
Ｃ．予防薬
本発明はまた、予防薬の分野に関し、該分野おいて、診断分析、予後分析、薬理ゲノム学的、および、臨床試験のモニタリングが、予防的に個体を治療する予後（予測）目的で用いられる。従って、本発明の一つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、尿、糞、痰、血清、細胞および組織）において、ＧＡＶＥ３タンパク質および／または核酸発現、同様にＧＡＶＥ３活性を決定するための診断分析に関し、それにより、個体が、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する病気または疾患に苦しんでいるかどうか、または、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する疾患を発症させる危険があるかどうかを決定することができる。
【０１７２】
例えば、喘息の患者におけるイエダニアレルゲンへの露出と、これらアレルゲンへの感作の罹患率との関係が、多くの研究で確認されている（例えば、Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１０５（１Ｐｔ１）：７５−８２を参照）。喘息の被験対象において、チリダニ抗原への露出は、気道上皮の脱落を誘導する可能性があり、これは、このような露出の際の上皮ダメージがダニ主要抗原のタンパク分解活性による可能性を示唆している（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ（１９９８）２８（５）：５６１−５６７を参照）。喘息による抗原の回避は、気管支洗浄における上皮細胞と痰サンプルの量を減少させることが示された（すなわち上皮ダメージの低減、上述のＰｉａｃｅｎｔｉｎｉ等（１９９８）を参照）。
【０１７３】
ダニ数の増加は、湿度で調節される。湿度を低くし効果的な機械的な換気／吸引によりアレルゲンレベルを除去することにより、ダニアレルゲンをコントロールし、症状を軽減することができる（上述のＷａｒｎｅｒ等（２０００））。しかしながら、洗浄または気管支生検におけるＥＧ２+細胞または好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）のカウントによるダニ抗原の露出の決定は、時間と労力を要する（Ａａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｅｕｒ  ＲｅｓｐｉｒＪ（１９９３）６（６）：８４０−８４７；上述のＰｉａｃｅｎｔｉｎｉ等（１９９８）、および、Ａａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ（１９９３）１４７（１）：７６−８１を参照）。
【０１７４】
イエダニ抗原に露出した肺上皮細胞（Ａ５４９細胞、業界で認識されたモデルシステム；例えば、Ｗｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ（１９９８）２８（１０）：１２７３−１２８５  ａｎｄ  Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０００）１３１（３）：４６５−４７２を参照）において、ＧＡＶＥ３発現が２倍誘導されたことを実証した。
【０１７５】
従って、一実施形態において、ＧＡＶＥ３をコードする核酸から誘導されたプライマーを用いた、痰、洗浄および／または気管支生検サンプルのＴａｑＭａｎは、喘息の被験対象のイエダニ抗原（ＨＡＤ）への露出を決定する診断方法を含む。関連する局面において、ノーザンブロット、ＲＮアーゼ保護分析（ＲＰＡ）およびその他のＲＮＡ発現分析（例えばＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＧＡＶＥ３発現誘導をＨＡＤ露出の機能として定性的および／または定量的に決定することができる。他の実施形態において、タンパク質に対する抗体を診断方法（例えば、酵素結合免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ））に用いて、ＨＡＤ露出への応答におけるＧＡＶＥ３誘導を決定することができる。このような診断は、これらに限定されないが、ダニ感受性の喘息の被験対象の家における、機械的な換気および高効率の吸引の有効性のチリダニ数に関する評価に用いることができ、症状のいかなる軽減効果をも評価することができる。
【０１７６】
本発明はまた、個体において、ＧＡＶＥ３タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患を発症させる危険があるかどうかを決定するための予後（または予測）分析を提供する。例えば、ＧＡＶＥ３遺伝子の突然変異は、生物学的サンプルで分析することができる。このような分析は、予後または予測目的に用いることができ、それにより、ＧＡＶＥ３タンパク質、核酸発現または活性で特徴付けられるか、またはそれに関する疾患が発病する前に、個体を予防的に治療することができる。
【０１７７】
本発明の他の局面は、個体におけるＧＡＶＥ３タンパク質、核酸発現またはＧＡＶＥ３活性を決定する方法を提供し、それにより、その個体に適した治療剤または予防剤（本明細書においては「薬理ゲノム学的なゲノム」と称される）を選択することができる。薬理ゲノム学的なゲノムは、個体の遺伝子型（例えば、特定の物質に応答する個体の能力決定を試験した個体の遺伝子型）に基づいて個体を治療処置または予防処置するための物質（例えば薬物）の選択を可能にさせる。
【０１７８】
本発明のさらなる他の局面は、臨床試験においてＧＡＶＥ３の発現または活性に関して物質（例えば、薬物またはその他の化合物）の影響をモニターすることに関する。
【０１７９】
これらおよびその他の物質を以下の章でより詳細に説明する。
【０１８０】
１．診断分析
生物学的サンプル中でＧＡＶＥ３の存在または非存在を検出する代表的な方法は、試験被験対象からの生物学的サンプルを得ること、および、ＧＡＶＥ３の存在が生物学的サンプルで検出されるようなＧＡＶＥ３タンパク質またはＧＡＶＥ３タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物または物質と、生物学的サンプルを接触させること、を含む。ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい物質は、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズ可能な標識核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、配列番号１の核酸またはそれらの部分のような完全長ＧＡＶＥ３核酸が可能であり、これは、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００個またはそれ以上の長さのヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下でＧＡＶＥ３ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドである。本発明の診断分析で用いるためのその他の適切なプローブは本明細書で説明される。
【０１８１】
ＧＡＶＥ３タンパク質を検出するのに好ましい物質は、ＧＡＶＥ３タンパク質に結合することができる抗体であり、好ましくは検出可能なラベルを有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、より好ましくはモノクローナルであり得る。インタクト抗体またはそれらの断片（例えば、ＦabまたはＦ(ab')2）を用いることができる。用語「標識した」とは、プローブまたは抗体に関しては、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングすること（すなわち物理的に連結させること）によりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、同様に、直接的に標識される他の試薬との反応によりプローブまたは抗体を間接的に標識すること、を含むものとする。間接的な標識の例としては、蛍光標識した二次抗体を用い、蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるようにビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することにより一次抗体を検出することが挙げられる。
【０１８２】
用語「生物学的サンプル」は、被験対象から単離された組織、細胞および生物学的な流体、同様に、被験対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ、同様にインビボで、生物学的サンプル中で、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するのに用いることができる。例えば、ＧＡＶＥ３ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＧＡＶＥ３タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降反応および免疫蛍光法が挙げられる。ＧＡＶＥ３ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。その上、ＧＡＶＥ３タンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験対象に標識抗ＧＡＶＥ３抗体を導入することが挙げられる。例えば、該抗体は、放射性のマーカー標識することができ、その存在と位置は、被験対象において標準的なイメージング技術により検出することができる。
【０１８３】
一実施形態において、生物学的サンプルは、試験被験対象からのタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験対象からのｍＲＮＡ分子、または、試験被験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、通常の手段で被験対象から単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０１８４】
従って、キャリアまたは罹患者のための、病気との関連、および、核酸またはタンパク質多型診断の同定は、予後または診断分析の開発に有益であり得る。例えば、シェーグレン病、統合失調症などの予後または診断分析を行うのに有益であり得る。従って、ＧＡＶＥ３代謝に関する障害は、シェーグレン病の診断になり得る。その上、シェーグレン病の分子メカニズムは、例えば組織サンプル（例えば血液サンプル）において検出可能な診断ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、発現レベルの変動性、機能の変動性などを、検出できる可能性がある。
【０１８５】
他の実施形態において、該方法は、コントロール被験対象から生物学的サンプルを得ること、ＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量が生物学的サンプル中で検出されるようなＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または物質と、コントロールサンプルを接触させること、および、コントロールサンプル中のＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ存在および量と、試験サンプル中のＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量とを比較すること、をさらに含む。
【０１８６】
本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中でＧＡＶＥ３の存在を検出するためのキットを含む。このようなキットは、被験対象が、異常なＧＡＶＥ３発現に関する疾患（例えば免疫疾患）に罹っているか、または、その発症の危険を増加させているかどうかを決定するのに用いることができる。例えば、該キットは、生物学的サンプル中でＧＡＶＥ３タンパク質またはｍＲＮＡを検出することができる標識化合物または物質、および、サンプル中でＧＡＶＥ３の量を決定する手段（例えば、ＧＡＶＥ３をコードするＤＮＡ（例えば配列番号１）に結合する抗ＧＡＶＥ３抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）を含み得る。また、キットを用いて、ＧＡＶＥ３タンパク質またはｍＲＮＡの量が通常レベルの上か下かの場合、試験被験対象が、異常なＧＡＶＥ３発現に関する疾患に罹っているか、またはそれを発症する危険があるかどうかを示す結果が得られる。
【０１８７】
抗体に基づくキットに関して、該キットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ３タンパク質に結合する第一の抗体（例えば、固体支持体に付着した）；および、場合によっては、（２）ＧＡＶＥ３タンパク質または第一抗体に結合し、検出可能な物質と結合する第二の異なる抗体、を含み得る。第二の抗体が存在しない場合、第一抗体に結合し標識できる他の分子を用いるか、または、第一抗体を標識するかのいずれかである。いずれの現象においても、当業界既知の検出可能なレポーター分子として作用する標識結合成分が含まれる。
【０１８８】
オリゴヌクレオチドに基づくキットに関して、該キットは、例えば：（１）オリゴヌクレオチド、例えば、ＧＡＶＥ３核酸配列にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、または、（２）ＧＡＶＥ３核酸分子の増幅に有用なプライマー対、を含み得る。
【０１８９】
該キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、または、タンパク質安定剤を含み得る。該キットはまた、検出可能な物質（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含み得る。該キットはまた、試験サンプルを分析し比較することができるコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを含み得る。該キットの各成分は、通常、個々のコンテナ内に封入され、様々なコンテナの全ては、試験被験対象が異常なＧＡＶＥ３発現に関する疾患に罹っているか、または、それを発症する危険があるかどうかを観察するための説明書と共に一つのパッケージ内に含まれる。
【０１９０】
２．予後分析
その上、本明細書で説明された方法は、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する病気または疾患に罹った被験対象またはそれを発症する危険がある被験対象を同定するための診断または予後分析として利用することができる。例えば、本明細書で説明された分析、例えば上述の診断分析または以下の分析は、ＧＡＶＥ３タンパク質、核酸発現または活性に関する疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎に関する新しい炎症）を有する、またはそれを発症させる危険がある被験対象を同定するのに利用することができる。あるいは、該予後分析は、このような病気または疾患を発症する危険を有する、またはその危険状態にある被験対象を同定するのに利用することができる。
【０１９１】
従って、本発明は、被験対象から試験サンプルを得て、ＧＡＶＥ３タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供し、該方法において、ＧＡＶＥ３タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する病気または疾患に罹った被験対象またはそれを発症する危険を有する被験対象の診断となる。本明細書で用いられる「試験サンプル」は、対象となる被験対象から得られた生物学的サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、体液（例えば血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
【０１９２】
その上、本明細書で説明された予後分析は、被験対象に、物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）を、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する病気または疾患を治療するために投与できるかどうかを決定する用いることができる。例えば、このような方法は、特定の物質または物質のクラス（例えばＧＡＶＥ３活性を減少させるタイプの物質）で効果的に被験対象を治療できるかどうかを決定するのに用いることができる。従って、本発明は、被験対象が、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関連した疾患のための薬剤で効果的に治療され得るかどうかを決定するための、試験サンプルを得てＧＡＶＥ３タンパク質または核酸を検出する方法（例えば、ＧＡＶＥ３タンパク質または核酸の存在が、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する疾患を治療するために物質を投与され得る被験対象の診断となるかどうかを決定する方法）を提供する。
【０１９３】
また、本発明の方法を用いて、ＧＡＶＥ３遺伝子の遺伝的な損傷または突然変異を検出し、それにより、損傷した遺伝子を有する被験対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする疾患に関する危険を有するかどうかを決定することができる。好ましい実施形態において、該方法は、被験対象からの細胞サンプルにおいて、ＧＡＶＥ３タンパク質をコードする遺伝子の完全性またはＧＡＶＥ３遺伝子のミス発現に影響を与える改変の少なくとも１つにより特徴付けられる遺伝的な損傷または突然変異の存在または非存在を検出することを含む。例えば、このような遺伝的な損傷または突然変異は：１）ＧＡＶＥ３遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）１またはそれ以上のヌクレオチドのＧＡＶＥ３遺伝子への付加；３）ＧＡＶＥ３遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）ＧＡＶＥ３遺伝子を含む染色体の配列換え；５）ＧＡＶＥ３遺伝子のメッセンジャー  ＲＮＡ転写レベルの改変；６）ＧＡＶＥ３遺伝子の、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンにおける異常な改変；７）ＧＡＶＥ３タンパク質の非野生型レベル；８）ＧＡＶＥ３遺伝子の対立遺伝子の消失；および、９）ＧＡＶＥ３タンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在を確認することによって検出することができる。本明細書で説明したように、ＧＡＶＥ３遺伝子における損傷を検出することに用いることができる当業界既知の多数の分析技術がある。好ましい生物学的サンプルは、通常の手段で被験対象から単離された末梢血液白血球サンプルである。
【０１９４】
特定の実施形態において、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用（例えば、米国特許第４,６８３,１９５号および４,６８３,２０２号を参照）、またあるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：１０７７−１０８０；および、Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３６０−３６４を参照）を含み、そのうち後者は、ＧＡＶＥ３遺伝子における点変異を検出するのに特に有用であり得る（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９５）２３：６７５−６８２を参照）。該方法は、患者からの細胞サンプルを収集すること、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、ＧＡＶＥ３遺伝子（存在する場合は）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＧＡＶＥ３遺伝子に特異的にハイブリダイズする１またはそれ以上のプライマーと、核酸サンプルを接触させる工程、および、増幅産物の存在または非存在を検出する工程、または、増幅産物のサイズを検出する工程、および、コントロールサンプルと長さを比較する工程、を含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書で説明された突然変異を検出するのに用いられる技術のいずれかと共に、予備的な増幅工程として用いるのに望ましいことが予想される。
【０１９５】
その代わりの増幅方法としては：自律的な配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１９７）、または、他のいかなる核酸増幅方法が挙げられ、続いて、当業者周知の技術を用いて増幅分子を検出できる。このような分子が非常にわずかしか存在しない場合、この検出スキームは、核酸分子の検出に特に有用である。
【０１９６】
その代わりの実施形態において、サンプル細胞からのＧＡＶＥ３遺伝子の突然変異は、制限酵素開裂パターンにおける改変により同定することができる。例えば、サンプルとコントロールＤＮＡとを単離し、増幅し（場合によって）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片長さサイズをゲル電気泳動で決定して比較する。サンプルとコントロールＤＮＡとの断片長さサイズにおける差は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。その上、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５,４９８,５３１号を参照）は、リボザイム開裂部位の開発または消失により特異的な突然変異の存在に関するスコアとして用いることができる。
【０１９７】
他の実施形態において、ＧＡＶＥ３における遺伝子突然変異は、サンプルおよびコントロール核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９６）７：２４４−２５５，Ｋｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：７５３−７５９）。例えば、ＧＡＶＥ３における遺伝子突然変異は、上述のＣｒｏｎｉｎ等で説明された光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイで同定することができる。簡単に言えば、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロール中のＤＮＡの長い伸長をスキャンし、配列間の塩基変化を連続してオーバーラップしたプローブのリニアアレイを得ることにより同定することができる。この工程により、点変異を同定することができる。該工程に続き、第二のハイブリダイゼーションアレイが可能であり、これにより、検出される全ての変異または突然変異に相補的なより小さい特殊化したプローブアレイを用いて、特定の突然変異を特徴付けすることができる。各突然変異アレイは、パラレルプローブセットから成り、その一つは野生型遺伝子に相補的であり、他方は、突然変異遺伝子に相補的である。
【０１９８】
さらに他の実施形態において、当業界既知の様々な配列解析反応のいずれかを用いて、ＧＡＶＥ３遺伝子を直接的に配列解析し、サンプルＧＡＶＥ３の配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することにより突然変異を検出することができる。配列解析反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）により開発された技術に基づくものが挙げられる。診断分析を実施する際に様々な自動配列解析方法のいずれかを利用することも考えられ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）、例えばマススペクトロメトリーによる配列解析（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ（１９９６）３６：１２７−１６２；および、Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３）３８：１４７−１５９を参照）である。
【０１９９】
ＧＡＶＥ３遺伝子における突然変異を検出するその他の方法としては、開裂剤から保護をＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖においてミスマッチした塩基を検出するのに用いる方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ開裂」の技術において、野生型ＧＡＶＥ３配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織サンプルから得られた可能性のある突然変異ＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズすることにより形成されたヘテロ二本鎖を提供することが必要である。二本鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチにより発生するような二本鎖中の一本鎖領域を開裂させる剤で処理される。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮアーゼ処理することによって、ミスマッチ領域を消化することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼ処理することによって、ミスマッチ領域を消化することができる。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかを、ヒドロキシルアミンまたはオスミウム四酸化物およびピペリジンで処理し、ミスマッチ領域を消化することができる。次に、ミスマッチ領域の消化の後、得られた材料を、変性ポリアクリルアミドゲルでサイズにより分離し、突然変異の部位を決定することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９２）２１７：２８６−２９５を参照。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識することができる。
【０２００】
さらに他の実施形態において、ミスマッチ開裂反応は、定義されたシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡにおいてミスマッチ塩基対を認識する１またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチリペア」酵素）を用いることができ、それにより、細胞サンプルから得られたＧＡＶＥ３のｃＤＮＡにおける点変異を検出し、マッピングすることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおいてＡを開裂させ、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにおいてＴを開裂させる（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ.，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９４）１５：１６５７−１６６２）。代表的な実施形態によれば、ＧＡＶＥ３配列（例えば野生型ＧＡＶＥ３配列）に基づくプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。二本鎖は、ＤＮＡミスマッチリペア酵素で処理され、開裂産物は、必要に応じて、電気泳動法などで検出することができる（例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照）。
【０２０１】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化を、ＧＡＶＥ３遺伝子の突然変異の同定に利用することができる。例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いて、突然変異体と野生型核酸との間の電気泳動移動度における差を検出することができる（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：２７６６；また、Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（１９９３）２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ（１９９２）９：７３−７９も参照）。サンプルとコントロールＧＡＶＥ３核酸との一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、再生させることができる。一本鎖核酸の２次構造は、配列に従って変化し、電気泳動移動度において生じた変化は、たった一つの塩基の変化でも検出可能にする。ＤＮＡ断片は、標識されるか、または標識プローブで検出され得る。分析の感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を用いて増強することができ、それにおいて、２次構造は、配列における変化に対してより高感度になる。好ましい実施形態において、該方法は、ヘテロ二本鎖分析を利用して、電気泳動の移動度に基づきヘテロ二本鎖分子を分離することができる（Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ（１９９１）７：５）。
【０２０２】
さらに他の実施形態において、変性剤による勾配があるポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型断片の移動は、変性剤濃度勾配電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５）を用いて分析される。ＤＧＧＥを分析方法として用いた場合、例えば約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲにより付加することによって、ＤＮＡが完全には変性しないことを確実にするようにＤＮＡを改変することができる。さらなる実施形態において、変性勾配の代わりに温度勾配を用いて、コントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡとの移動度の差を同定することができる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ（１９８７）２６５：１２７５３）。
【０２０３】
点変異を検出するためのその他の技術の例としては、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長法が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができ、それにおいて、既知の突然変異が中心に置かれ、続いて完全なマッチングが見出された場合にのみハイブリダイゼーションが起こるような条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズする（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドをハイブリダイズメンブレンに付着させた場合に、ＰＣＲで増幅した標的ＤＮＡまたは多数の異なる突然変異にハイブリダイズし、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする。
【０２０４】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と併せて用いることができる。特異的な増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に（増幅が、差別的なハイブリダイゼーションに依存するように）対象となる突然変異を含んでもよいし（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ.，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：２４３７−２４４８）または、一方のプライマーの３’末端の先端に対象となる突然変異を含んでもよく、この場合、適切な条件下で、ミスマッチによりポリメラーゼ伸長が防御または減少され得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，Ｔｉｂｔｅｃｈ（１９９３）１１：２３８）。加えて、突然変異の領域に新規の制限部位を導入することが望ましい場合もあり、それにより開裂に基づく検出を実施することができる（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ.，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）６：１）。特定の実施形態において、増幅用のＴａｑリガーゼを用いて増幅を実施することもできる、と考えられる（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：１８９）。このような場合において、５’配列の３’末端において完全なマッチングが存在する場合においてのみライゲーションが起こり、増幅の存在または非存在を探すことによって、特異的な部位における既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
【０２０５】
本明細書で説明された方法は、例えば、本明細書で説明された少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予めパッケージされた診断キットを利用することによって実施することができ、このようなキットは、例えば症状を示す患者またはＧＡＶＥ３遺伝子に関する病気の家族の履歴を診断するための臨床条件において便利に用いることができる。
【０２０６】
その上、ＧＡＶＥ３が発現されるいかなる細胞型または組織でも本明細書で説明された予後分析に利用することができる。
【０２０７】
３．薬理ゲノム学
本明細書で説明されたスクリーニング分析によって同定された、ＧＡＶＥ３活性（例えばＧＡＶＥ３遺伝子発現）に対する刺激または阻害効果を有する物質または調節因子を、個体に投与し、ＧＡＶＥ３活性に関する疾患（例えば、喘息に関する炎症、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎）を（予防的または治療的に）治療することができる。このような治療と共に、個体の薬理ゲノム学（すなわち、外来化合物または薬物に対する個体の遺伝子型とその個体の応答との間の関係研究）を考慮することができる。治療の代謝における差は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との関係を変えることにより、深刻な毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考察に基づく予防または治療処置のための有効な物質（例えば薬物）を選択することができる。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投与量および治療方式を決定するのに用いることができる。従って、個体におけるＧＡＶＥ３活性タンパク質、ＧＡＶＥ３発現核酸またはＧＡＶＥ３遺伝子の突然変異内容を決定することができ、それにより、個体に適した治療剤または予防治療剤を選択することができる。
【０２０８】
薬理ゲノム学は、改変された薬物動態や罹患したヒトにおける異常な作用による薬物応答における臨床的に重要な遺伝的変異を扱う。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９７）４３（２）：２５４−２６６を参照。一般的に、２種の遺伝薬理学的な条件を区別することができる。身体で薬物が作用する方法を改変する一つの因子として伝えられる遺伝的な状態は、「改変された薬物作用」と呼ばれる。薬物に対して体が作用する方法を改変する一つの因子として伝えられる遺伝的な状態は、「改変された薬物代謝」と呼ばれる。遺伝薬理学的な状態は、まれな欠陥または多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）の欠陥は、一般的な遺伝性酵素病であり、それにおいて、主要な臨床上の合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤またはニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂取の後の溶血である。
【０２０９】
説明のための実施形態として、薬物を代謝する酵素活性は、薬物作用の強度および持続時間両方の主要な決定因子である。薬物を代謝する酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２ＣＩ９）の遺伝子多型の発見により、なぜ一部の患者が期待される薬物効果が得られないのか、または、標準的で安全な薬物用量を摂取した後に不自然な薬物応答や深刻な毒性を示すのかについての説明が与えられている。多型は、集団における２つの表現型、代謝能が高い群（ＥＭ）および代謝能が低い群（ＰＭ）において発現される。ＰＭ罹患率は、異なる集団では異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は多数の多型を有し、ＰＭで数々の突然変異が同定されており、その全てにより、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の非存在がもたらされる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２ＣＩ９の代謝能が低い群は、標準的な用量を摂取した際に、かなりの頻度で誇張された薬物応答および副作用を起こす。代謝産物が活性な治療成分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６により形成される代謝産物、モルヒネが介在するコデインの鎮痛効果に関して実証されたように、治療的応答を示さない可能性がある。その他の極端なものは、標準用量では応答しない、いわゆる代謝能が著しく高い群である。近年、著しく迅速な代謝分子機構が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると同定されている。
【０２１０】
従って、ＧＡＶＥ３活性タンパク質、個体におけるＧＡＶＥ３発現核酸またはＧＡＶＥ３遺伝子の突然変異内容を決定することができ、それにより、個体に適した治療剤または予防治療剤を選択することができる。加えて、遺伝薬理学的な研究を用いて、個体の薬物反応性の表現型を同定するために薬物代謝酵素をコードする多型の対立遺伝子の遺伝子型の特定を適用することができる。その知識は、投薬または薬物選択に適用すれば、ＧＡＶＥ３調節因子（例えば、本明細書で説明された代表的なスクリーニング分析の一つにより同定された調節因子）を有する被験対象を治療する際に、反対の反応または治療の失敗を防ぎ、それにより治療または予防効率を高めることができる。
【０２１１】
４．臨床試験の際の効果のモニタリング
ＧＡＶＥ３の発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に関する物質（例えば薬物または化合物）の影響のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、本明細書で説明したスクリーニング分析によってＧＡＶＥ３遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を増加させることが決定された物質の有効性は、低いＧＡＶＥ３遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を示す被験対象の臨床試験においてモニターすることができる。あるいは、スクリーニング分析でＧＡＶＥ３遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることが決定された物質の有効性は、高いＧＡＶＥ３遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を示す被験対象の臨床試験においてモニターすることができる。このような臨床試験において、ＧＡＶＥ３発現または活性、および、好ましくは、例えば細胞の増殖に関する欠陥に関与するその他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の免疫反応性のマーカーとして用いることができる。
【０２１２】
例えば、これらに限定されないが、ＧＡＶＥ３活性（例えば、本明細書で説明されたスクリーニング分析で同定されたような）を調節する物質（例えば、化合物、薬物または低分子物質）での治療により細胞において調節される、ＧＡＶＥ３を含む遺伝子を同定することができる。従って、細胞の増殖に関する欠陥における物質の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞を単離することができ、ＧＡＶＥ３および該疾患に関与するその他の遺伝子の発現レベルに関して、ＲＮＡを調製、分析することができる。遺伝子発現レベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書で説明したようにノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲ、またあるいは、本明細書で説明された方法の一つで生産されたタンパク質量を測定すること、もしくは、ＧＡＶＥ３またはその他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。その方法において、遺伝子発現パターンは、細胞の物質に対する生理学的応答を示すマーカーとして作用し得る。従って、応答状態は、物質を用いた個体の治療の前、およびその最中の様々なポイントで測定することができる。
【０２１３】
好ましい実施形態において、本発明は、物質（例えば、本明細書で説明されたスクリーニング分析により同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬体、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子物質またはその他の薬物候補）で被験対象を治療することの有効性をモニターする方法を提供し、該方法は、（ｉ）物質の投与前の被験対象から投与前のサンプルを得る工程；（ii）投与前のサンプルにおけるＧＡＶＥ３発現タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルを検出する工程；（iii）被験対象から１またはそれ以上の投与後のサンプルを得る工程；（iv）投与後のサンプルにおけるＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与前のサンプルにおけるＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと、投与後のサンプルにおけるＧＡＶＥ３タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとを比較する工程；および（vi）それに従って被験対象への物質の投与を改変する工程、を含む。例えば、物質の投与量を増すことにより、ＧＡＶＥ３の発現または活性を検出されたものより高いレベルに高めること、すなわち物質の有効性を高めることが望ましい。あるいは、物質の投与量を減らすことにより、ＧＡＶＥ３の発現または活性を検出されたものより低いレベルに低めること、すなわち物質の有効性を低めることが望ましい。
【０２１４】
Ｄ．治療方法
本発明は、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する疾患の危険を有する（または過敏な）被験対象、または、異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する疾患を有する被験対象を処置する、予防方法および治療方法の両方を提供する。このような疾患としては、これらに限定されないが、例えば、炎症性疾患、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患およびリウマチ様関節炎が挙げられる。
【０２１５】
１．予防方法
一つの局面において、本発明は、ＧＡＶＥ３発現または少なくとも１つのＧＡＶＥ３活性を調節する物質を被験対象に投与することにより異常なＧＡＶＥ３発現または活性に関する病気または状態を被験対象において予防する方法を提供する。異常なＧＡＶＥ３発現または活性により発症する、またはそれに起因する病気の危険を有する被験対象は、例えば本明細書で説明された診断または予後分析のいずれかまたはその組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、病気または疾患を予防する、またあるいは、進行を遅らせるようにＧＡＶＥ３異常の症状の特徴が発症する前に行うことができる。ＧＡＶＥ３異常のタイプに応じて、例えば、ＧＡＶＥ３アゴニストまたはＧＡＶＥ３アンタゴニスト剤が、被験対象の治療に用いることができる。適切な物質は、本明細書で説明されたスクリーニング分析に基づき決定することができる。
【０２１６】
２．治療方法
本発明の他の局面は、治療目的でＧＡＶＥ３発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞と、細胞に関するＧＡＶＥ３タンパク質活性の１またはそれ以上の活性を調節する物質とを接触させることを含む。ＧＡＶＥ３タンパク質活性を調節する物質は、本明細書で説明した物質、例えば核酸またはタンパク質、ＧＡＶＥ３タンパク質の天然に存在する同種のリガンド、ペプチド、ＧＡＶＥ３ペプチド模擬体またはその他の低分子物質であり得る。一実施形態において、該物質は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ３タンパク質の生物学的活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性ＧＡＶＥ３タンパク質、および、細胞に導入されたＧＡＶＥ３をコードする核酸分子が挙げられる。他の実施形態において、該物質は、１またはそれ以上のＧＡＶＥ３タンパク質の生物学的活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＧＡＶＥ３核酸分子および抗ＧＡＶＥ３抗体が挙げられる。該調節方法は、インビトロで（例えば、該物質と共に細胞を培養することにより）またあるいは、インビボで（例えば、該物質を被験対象に投与することにより）実施することができる。このようにして、本発明は、ＧＡＶＥ３タンパク質または核酸分子異常な発現または活性を特徴とする病気または疾患に苦しむ個体を治療する方法を提供する。一実施形態において、該方法は、物質（例えば、本明細書で説明されたスクリーニング分析で同定された物質）またはＧＡＶＥ３発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）物質の組み合わせを投与することを含む。他の実施形態において、該方法は、減少したまたは異常なＧＡＶＥ３発現または活性を償うための療法として、ＧＡＶＥ３タンパク質または核酸分子を投与することに関する。
【０２１７】
ＧＡＶＥ３活性の刺激は、ＧＡＶＥ３が異常にダウンレギュレートされた場合において、および／または、増加したＧＡＶＥ３活性が有益な効果を有する可能性がある場合において望ましい。逆にいえば、ＧＡＶＥ３活性の阻害は、ＧＡＶＥ３が異常にアップレギュレートされた場合において、および／または、減少したＧＡＶＥ３活性が有益な効果を有する可能性がある場合において、望ましい。
【０２１８】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、該実施例を限定と解釈するべきではない。本明細書を通して引用された全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容を、参照により加入させる。
【実施例１】
【０２１９】
ｈＧＡＶＥ３のクローニング
ＰＣＲスクリーニングは、脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号７１２５−１）および／または胎盤ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号７４１１−１）でなされる。ＰＣＲ用のプライマーは、第１２染色体クローンＲＰ１１−５０７Ｎ２０からのＡＣ０２６３３１を用いて設計され、以下の配列を有する。
【０２２０】
フォワード：５’−ＡＴＧＴＡＣＡＡＣＧＧＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号６）
ネステッドフォワード：５’−ＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＧ−３’（配列番号７）。
【０２２１】
ネステッドフォワードプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、続いてＫｏｚａｋ配列を含む。ネステッドリバースプライマーは、ＸｈｏＩ制限酵素部位を含む。ＰＣＲは、ＢｉｏｍｅｔｒａのＴｒｉｏ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋサーモサイクラーで、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、これをＰＣＲ反応液に添加し、続いてテンプレートｃＤＮＡ、プライマー、Ｐｆｕ緩衝液およびｄＮＴＰを添加することによってなされる。５０μｌの反応液は：５μｌの１０×ＰｆｕＤＮＡ緩衝液、２μｌ（２５００ユニット／ｍｌ）のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、１.０μｌのＮＴＰ混合物（１０ｍＭの各ヌクレオチドを含む）；２.０μｌのフォワードプライマー（１０ｍＭ）；２.０μｌのリバースプライマー（１０ｍＭ）；５μｌのｃＤＮＡテンプレート、および、３３μｌの滅菌水を含む。サーモサイクラーについては以下のサイクルを用いた：９４℃で２分間、続いて９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、７２℃で３分間、７２℃で１０分間を３０サイクル；および、４℃でクールダウン。
【０２２２】
ＰＣＲの後、３μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ヌクレオチド）Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４０４−ｉ、および、１μｌ（５ユニット）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号２０１２２３）をＰＣＲ産物に加え、その混合物を７２℃で１０分間インキュベートする。次に、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで泳動させる。所望の断片を含む約１キロ塩基のバンドを、ゲルから切り出し、製造元により提供されたプロトコールに従いＱｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号２８７０４）を用いて精製する。次に、精製ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｋ２０００−０１／４０／Ｊ１０およびＫ２０３０−０１／４０／Ｊ１０）にサブクローニングする。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングするために、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡクローニングベクターキットを用いてライゲーション反応液を準備する。ライゲーション反応液は、：５μｌの滅菌水；１μｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２×ライゲーション緩衝液；２μｌのｐＣＲ２．１ベクター（２５ｎｇ／μｌ）；４μｌのＰＣＲ産物ＤＮＡ（１０ｎｇ）；４μｌ（５×）希釈緩衝液；および、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５ユニット）を含む。この反応液を１４℃で１８時間インキュベートする。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をライゲーション反応液で以下のようにして形質転換する：２μｌのライゲーション反応混合物と２００μｌのＩＮＶαＦ’コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｃ６５８−００）とを混合し、氷上で３０分間インキュベートし、３７℃で４５秒間ヒートショックを行い、氷上で２分間インキュベートし、続いて８００μｌのＬＢを添加する。次にその細胞を、細菌振盪器／インキュベーター（空気は再循環させる）で撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートする。一晩インキュベートした後、２００μｌの形質転換反応混合物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。
【０２２３】
インキュベートの後、コロニーを選別し、それぞれ個々のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５００μｌのＬＢを含む別々のチューブで、振盪器／インキュベーターでで一晩培養する。ＰＣＲでコロニーをスクリーニングするために、以下の反応液を用いる：ＬＢ中の４１.５μｌのコロニー；５μｌのＴａｑ緩衝液（１０×）；１.０μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ヌクレオチド）；１.０μｌのフォワードプライマー（１０ｍＭ）；１.０μｌのリバースプライマー（１０ｍＭ）；および、０.５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット／μｌ）。
【０２２４】
その反応液を、サーモサイクラーで、以下のサイクルを用いてインキュベートする：９４℃で２分間。９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間および７２℃で１０分間、続いて４℃でクールダウン。
【０２２５】
ＰＣＲ反応の結果をチェックするため、５μｌのＰＣＲ反応液を１％ＴＡＢアガロースゲルで泳動させる。陽性クローンは、約１ｋｂのインサートを示した。陽性クローンを、細菌振盪器／インキュベーターで、５ｍｌのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中で３７℃で一晩で培養する。製造元のプロトコールの指示通りにＱｉａｇｅｎのＤＮＡ精製カラムを用いてプラスミドを精製する（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号１２１４３）。次に、Ｔ７フォワードプライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）（配列番号８）およびＭＩ３リバースプライマー（５’−ＣＡＧＵＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴ−３’）（配列番号９）を用いて陽性クローンを配列解析する。ＤＮＡ配列解析により、図１で示すＤＮＡ配列（配列番号１）を有するｃＤＮＡ、および、図２で示すアミノ酸配列（配列番号２）の単離が同定された。
【実施例２】
【０２２６】
ｈＧＡＶＥ３を過剰発現する哺乳動物細胞の製造
さらなる実験のために相当量のｈＧＡＶＥ３を提供するために、ｈＧＡＶＥ３をコードするｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、哺乳動物細胞（例えば２９３細胞）にトランスフェクトさせる。
【０２２７】
ｈＧＡＶＥ３を過剰発現する哺乳動物細胞を製造するために、哺乳動物細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１６００−０４４）の存在下で、２ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）を含む６−ウェルの３５ｍｍ組織培養プレート（ウェルあたり３×１０5哺乳動物細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＣＲＬ−１５７３））に置く。
【０２２８】
次にその細胞を、ＣＯ2インキュベーターで３７℃で、細胞が５０〜８０％の密度になるまでインキュベートする。上述の方法を用いて、ｈＧＡＶＥ３のクローン化ｃＤＮＡ核酸配列をｐｃＤＮＡ３．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｖ７９０−２０）に挿入する。２μｇのＤＮＡを１００μｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地に希釈する。それとは別に、２５μｌのリポフェクトアミン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８３２４−０２０）を１００μｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地に希釈する。次に、ＤＮＡ溶液とリポフェクトアミン溶液を穏やかに混合し、室温で４５分間インキュベートし、ＤＮＡ−脂質複合体を形成させる。
【０２２９】
細胞を２ｍｌの無血清Ｆ１２ＨＡＭ培地で１回リンスする。各トランスフェクション（６−ウェルプレート中、６つのトランスフェクション）に対して、０.８ｍｌの血清非含有Ｆ１２ＨＡＭ培地をＤＮＡ−脂質複合体を含む溶液に加え（総容量０.２ｍｌ）、穏やかに混合する。次に、得られた混合物（以降、「トランスフェクション混合物」）（０.８ｍｌ＋０.２ｍｌ）をリンスした細胞の上にのせる。抗菌試薬は加えない。次に、その細胞を、脂質−ＤＮＡ複合体と共に、ＣＯ2インキュベーターで３７℃で１６時間インキュベートし、トランスフェクションさせる。
【０２３０】
インキュベート時間が完了した後、１ｍｌの１０％ウシ胎仔血清を含むＦＩ２ＨＡＭ培地を、最初はトランスフェクション混合物を取り除かないで、細胞の上にのせる。トランスフェクションして１８時間後、細胞の上にのせた培地を吸引する。次に、細胞をＰＢＳ（ｐＨ２〜４）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１００１０−０２３）で洗浄し、ＰＢＳを５％血清を含むＦ１２ＨＡＭ培地（「選択培地」）で置き換える。トランスフェクションして７２時間後、細胞を、抗菌剤ｇｅｎｅｔｅｃｉｎ４００μｇ／ｍｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１８１１）を含む選択的培地に１０倍希釈する。
【実施例３】
【０２３１】
アゴニスト分析
ヒトＧＡＶＥ３のアゴニストをスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ３を、Ｇqメカニズムに人工的に共役させる。Ｇqメカニズム活性化は、細胞内で筋小胞体からのＣａ2+の放出を刺激する。Ｃａ2+は、細胞質に放出され、この場合、Ｃａ2+キレート染料を用いて検出することができる。蛍光イメージングプレートリーダーまたはＦＬＩＰＲ（Ｒ）装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、生じたいかなる蛍光変化をもモニターすることができる。アゴニスト活性は、蛍光のいかなる増加により反映される。
【０２３２】
ｈＧＡＶＥ３を発現するＣＨＯ−ＫＩ細胞は、無差別形態のＧqタンパク質（Ｇα16）を発現するように予め改変される。このような細胞を調製するために、Ｇα16共役ＣＨＯ細胞が、市販されており（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅｓのＬＩＶＥＷＡＲＥ（ＴＭ）細胞，カタログ番号ＲＤ−ＨＧＡＩ６）、続いて、実施例２のプロトコールを行い、該細胞におけるｈＧＡＶＥ３発現を容易にする。
【０２３３】
細胞を、３７℃および５％ＣＯ2で、Ｆ１２ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）中で、対数増殖期に維持し、ここで該Ｆ１２ＨＡＭ培地は、１０％ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１０１３１−０３５）および２００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含む。分析の１日前に、１２,５００細胞／ウェルのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、９６／３８４マルチドロップ装置（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，タイプ８３２）を用いて、ウェル容量が５０μｌの３８４−ウェルの底が透明な分析プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ，カタログ番号Ｎ５８１０２）の上に置く。細胞を、加湿した５％ＣＯ2インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＣＯ2ウォータージャケット付きインキュベーターモデル３１１０）で、３７℃でインキュベートする。
【０２３４】
以下のストック溶液を調製する：Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５６３０−０８０）の、１Ｍストック溶液；１ＮのＮａＯＨで作製されたプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８７６１）の、２５０ｍＭストック溶液；および、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ２６５０）で作製されたＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｆｌ４２０２）の、１ｍＭストック溶液。反応緩衝液を、１０００ｍｌのハンクス液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＭＴ２１０２３）、２０ｍｌの１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液および１０ｍｌの２５０ｍＭプロベニシドストック溶液で調製する。ローディング緩衝を調製するために、１.６ｍｌの１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅストック溶液を、０.３２ｍｌのプルロニックアシッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｐ６８６６）と混合し、次に、４００ｍｌの上記反応緩衝液および４ｍｌのウシ胎仔血清と混合する。
【０２３５】
分析の前１時間に、５０μｌの新しく調製したローディング緩衝を、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて３８４−ウェルプレートの各ウェルに加える。染料の取り込みを極大化するために、細胞を、加湿したインキュベーターで、３７℃でインキュベートする。分析の直前に、細胞を、プレート下部の上少なくとも１０ｍｍに吸引ヘッドセットを備える３８４ＥＭＢＬＡ細胞洗浄器（Ｓｋａｔｒｏｎ；モデル番号１２３８６）を用いて、９０μｌの反応緩衝液で２回洗浄し、ウェルあたり４５μｌの緩衝液を残す。
【０２３６】
ＦＬＩＰＲ(R)ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）器具のＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は、ｆ−ｓｔｏｐ２．０および露出０.４秒間の設定である。カメラを用いて、染料ローディングの精度に関して細胞プレートをモニターすることができる。
【０２３７】
可能性のあるアゴニストを含む化合物ライブラリーを、生理学的な塩緩衝液中の濃度１０μＭで試験する。化合物添加の前の１０秒間、蛍光の変化を測定する。化合物の添加後、初めの１分間は毎秒で蛍光を測定し、続いて総実験分析時間３分間の間は６秒ごとに露出を行う。１０回目のスキャンの後、１００μＭストック化合物の５μｌのアリコートを加え、細胞の最終化合物濃度を１０μＭにする。最初の８０回のスキャンに関する最大蛍光変化がアゴニスト活性の測定値として記録され、１０μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ，Ａ９０６２）で誘導された最大蛍光変化と比較する。
【実施例４】
【０２３８】
アンタゴニスト分析
ヒトＧＡＶＥ３のアンタゴニストをスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ３を、人工的にＧqメカニズムに共役させる。実施例３でのように、ＦＬＩＰＲ(R)装置を用いて、生じたいかなる蛍光の変化もモニターする。アンタゴニスト活性は、蛍光のいかなる減少により反映される。
【０２３９】
ｈＧＡＶＥ３を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞は、実施例３で説明したように、無差別形態のＧqタンパク質（Ｇα16）を発現するように予め改変される。細胞を、３７℃および５％ＣＯ2で、Ｆ１２ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１１７６５−０５４）中で、対数増殖期に維持し、ここで該Ｆ１２ＨＡＭ培地は、１０％ウシ胎仔血清，１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５１４０−１４８）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、４００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１０１３１−０３５）および２００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｒ２５０−０５）を含む。分析の１日前に、１２,５００細胞／ウェルのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて、ウェル容量が５０μｌの３８４−ウェルの底が黒／透明な分析プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ，カタログ番号Ｎ５８１０２）の上に置く。細胞を、加湿した５％ＣＯ2で、３７℃でインキュベートすることができる。
【０２４０】
以下のストック溶液を調製する：Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７.５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，カタログ番号１５６３０−０８０）の、１Ｍストック溶液；１ＮのＮａＯＨで作製されたプロベニシド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８７６１）の、２５０ｍＭストック溶液；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ２６５０）で作製されたＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｆ１４２０２）の、１ｍＭストック溶液；および、リガンドまたはアンタゴニストのストック溶液。反応緩衝液を、１０００ｍｌのハンクス液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，カタログ番号ＭＴ２１０２３）、２０ｍｌの１ＭのＨｅｐｅｓストック溶液、１０ｍｌの２５０ｍＭプロベニシドストック溶液および１ｍＭのＣａＣｌ２で調製する。ローディング緩衝を調製するために、８０μｌの１ｍＭのＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅストック溶液を、１６μｌのプルロニックアシッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，カタログ番号Ｐ６８６６）と混合し、次に、２０ｍｌの上記反応緩衝液および０.２ｍｌのウシ胎仔血清と混合する。
【０２４１】
分析の前の３０分に、３０μｌの新しく調製したローディング緩衝を、９６／３８４マルチドロップ装置を用いて３８４−ウェルプレートの各ウェルに加える。染料の取り込みを極大化するために、細胞を、加湿したＣＯ2インキュベーターで３７℃でインキュベートする。分析の直前に、プレート下部の上少なくとも４０ｍｍに吸引ヘッドセットを備える３８４ＥＭＢＬＡ細胞洗浄器を用いて、細胞を１００μｌの反応緩衝液で３回洗浄し、ウェルあたり４５μｌの緩衝液を残した。
【０２４２】
５μｌの１００μＭストックアンタゴニスト化合物を、Ｐｌａｔｅｍａｔｅ−３８４ピペッター（Ｍａｔｒｉｘ）を用いて、細胞に加える。インキュベート工程中の化合物濃度は、約１０μＭである。細胞をＦＬＩＰＲ(R)ＩＩに置き、プレート蛍光を初めの１分間は毎秒で測定し、続いて、総実験分析時間３分の間は６秒ごとに露出を行う。
【０２４３】
１０回目のスキャンの後に、アンタゴニストまたはリガンド（１０μＭ）を加える。それぞれを添加した後、３８４チップを２０μｌの０.０１％ＤＭＳＯ水溶液で１０回洗浄する。
【実施例５】
【０２４４】
受容体結合分析
ｈＧＡＶＥ３受容体を含むメンブレン分画を調製するために、ｈＧＡＶＥ３を過剰発現するＣＨＯ細胞系を、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）でインキュベートすることによって回収した。細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（１０ｍｌ）でさらに３回洗浄し、その後、５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.８）（ＳｉｇｍａＴ６７９１）、５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｍ８２６６）および１ｍＭのＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ，０３９６）で再懸濁する。
【０２４５】
次に、細胞を組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ，Ｋｉｎｅｍｅｔｉｃａ，モデルＰＴ１０／３５）で１分間破壊する。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＲＣ３Ｂ冷蔵遠心分離機を用いて、４９,０００×ｇで４℃で２０分間、得られたホモジネートを遠心分離する。得られたペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａで再懸濁し、遠心分離工程を３回繰り返す。最後の遠心分離の後、再度、ペレットを５ｍｌの緩衝液Ａで再懸濁し、等分し、−７０℃で保存する。
【０２４６】
メンブレン分画と、トレーサーとして放射標識したリガンドまたはアゴニストとを用いて受容体結合分析を行う。９６−ウェルプレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析を行う。結合反応液は、０.１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号３４２８７）を含む緩衝液Ａ（最終容量０.２ｍｌ）中の、放射性のリガンドまたはアゴニスト（０.０１ｎＭ〜２５ｎＭ）のの存在下での１８μｇのＣＨＯ細胞調製物からなる（Ｉｍ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５（１９）：１４２８１−１４２８６を参照）。反応液を室温で１時間インキュベートする。０.３％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ３１４３）および０.１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間前処理されたマルチチャンネルハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ）上で、ＷｈａｔｍａｎのＧＦ／Ｃフィルターでろ過して反応を止める。混合物をフィルターに塗布し、１時間インキュベートする。フィルターを１ｍｌの氷冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）で６回洗浄する。放射測定により、各トレーサー濃度に対する総結合と非特異的結合（バックグラウンド）との差に基づき、特異的結合を計算する。８〜１６の濃度データポイントが得られ、それにより、リガンドと受容体との平衡状態において達成されるリガンドの受容体への結合（平衡結合パラメーター）、および、放射性のリガンドまたはアゴニストの受容体への結合に関して比較するのに必要な非放射性リガンドまたはアゴニストの量（競合結合値）を決定することができる。阻害曲線を作製して、結合の５０％阻害を達成するのに必要な濃度（ＩＣ50）を決定することができる。
【実施例６】
【０２４７】
ノーザンブロット分析
数々のヒト組織サンプルから得られたトータルＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡでノーザンブロット分析を行い、組織がｈＧＡＶＥ３を発現するかどうかを決定することができる。用いられたプローブは、Ｐ32標識ｈＧＡＶＥ３のｃＤＮＡまたはそれらの部分である。
【０２４８】
プローブの調製
Ｐ32標識ｈＧＡＶＥ３のｃＤＮＡを以下のように調製する。２５ｎｇの上述のように調製されたｈＧＡＶＥ３のｃＤＮＡを、超遠心チューブ中で４５μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）；１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁し、９５℃で５分間加熱する。次に、チューブをさらに５分間氷上で冷却する。冷却後、上述のように、チューブに含まれた混合物を４５μｌのＧＡＶＥ３のｃＤＮＡおよび緩衝液で再懸濁し、ＲＴＳ  Ｒａｄのプライムミックス（ＲＴＳ  ＲａｄのプライムＤＮＡラベリングシステムが提供されている）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１０３８７−０１７）と混合する。５μｌのＰ32標識α−ｄＣＴＰ、特異的活性３０００Ｃｉ／ｍＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＡＡ０００５）を穏やかに、かつ徹底的に混合しながら加える。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベートする。インキュベートを、５μｌの０.２ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）を添加することによって止める。放射性α−ｄＣＴＰのｈＧＡＶＥ３のｃＤＮＡへの取り込みは、５μｌの混合物アリコートを分取し、放射能を測定することによって評価される。
【０２４９】
ＲＮＡ抽出
１ｍｌのトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１５５９６）を添加することによって、対象となる細胞を培養皿中で直接溶解する。次に、細胞溶解産物を数回ピペットを通過させ、溶解産物をホモジナイズする（その後、細胞溶解産物をチューブに移す）。ホモジナイズ後、溶解産物を３０℃で５分間インキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解離させる。
【０２５０】
インキュベート後、１ｍｌのトリゾール試薬に対して０.２ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｃ５３  １２）を溶解産物に加え、チューブを１５秒間強く振盪する。次に、溶解産物を、３０℃で３分間インキュベートする。インキュベート後、溶解産物を１２,０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離する。得られた水相を新しいチューブに移し、１ｍｌのトリゾール試薬に対し０.５ｍｌのイソプロピルアルコールを加える。次に、水相サンプルを３０℃で１０分間インキュベートし、１２,０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、残存したＲＮＡペレットを７０％エタノールでリンスする。次に、リンスしたサンプルを７５００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、得られた上清を捨てる。次に、残存したＲＮＡペレットを乾燥し、ＲＮアーゼ非含有の水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１０９７７−０１５）で再懸濁する。トータルＲＮＡ（例えば末梢組織からのサンプル）、または、ポリＡ+ＲＮＡ（例えば様々な脳領域のサンプル）のいずれかをノーザンまたはＴａｑｍａｎ（上述した）実験に用いる。既知の標準（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのヒト脳アクチン）を購入することができる。
【０２５１】
ゲル電気泳動
アガロースゲルは、２ｇのアガロース（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ａ０１６９）を水、５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液（説明は以下を参照）および２.２Ｍホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ８２０３１）に溶かして調製される。
【０２５２】
ゲル電気泳動用サンプルを以下のように調製した：
ＲＮＡ                                  ４.５μｌ（トータルで５μｇ）
５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液      ２.０μｌ
ホルムアルデヒド                        ３.５μｌ
ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｆ９０３７）  １０.０μｌ
ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液（５×）は、０.１Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７.０）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｍ５１６２）；４０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｓ７６７０）；および、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｅ７８８９）である。
【０２５３】
サンプルを６５℃で１５分間インキュベートし、次に、氷上で冷却する。冷却後、サンプルを５秒間遠心分離する。次に、２μｌのホルムアルデヒドゲルローディング緩衝液；５０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｇ５５１６）；１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）；０.２５％ブロモフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号１８０４６）；０.２５％キシレンシアノールＦＦ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号３３５９４０）をサンプルに加える。
【０２５４】
表１は、一部の実験で用いられた一部のＲＮＡの源を列挙する。
【表１】
2005500036.tif 000002
【０２５５】
ゲルを５分間、５Ｖ／ｃｍでプレランする。プレラン後、サンプルをゲルにローディングする。次に、ゲルを１×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液に浸しながら４Ｖ／ｃｍで泳動する。２時間の泳動後に緩衝液を交換する。
【０２５６】
ゲルからニトロセルロースへのＲＮＡのトランスファー
ゲルをエチジウムブロマイド（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号ＥＩ３８５）（０.５μｇ／ｍｌの０.１Ｍ酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号０９６８９）溶液）で３０分間染色し、ＲＮＡが分解していないことを確認する。次に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編集（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ．７．４６−７．５１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に説明されたプロトコールを用いて、ＲＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ.，カタログ番号７４３３０−０２６）へトランスファーする。
【０２５７】
Ｐ32標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号８０１５−１）を６８℃で２時間インキュベートする。インキュベート後、１５ｍｌの温めたハイブリダイゼーション溶液を複数の組織サンプルのノーザン（ＭＴＮ）メンブレンに注ぐ。ＭＴＮメンブレンを６８℃でハイブリダイゼーション溶液に撹拌しながら浸したままにする。１時間経過した後、ｈＧＡＶＥ３のｃＤＮＡプローブを９５℃で５分間煮沸することにより予め変性させ、これを濃度１０6カウント／ｍｌで加える。次に、６８℃でゲルを浸すハイブリダイゼーション溶液を、撹拌しながら２時間インキュベートし続ける。
【０２５８】
次に、ＭＴＮメンブレンをＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  ハイブリダイゼーション溶液から取り出し、メンブレンを１５ｍｌの溶液に室温で４０分間撹拌しながら浸すことにより（それぞれ溶液を４０分ごとに交換しながら）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの洗浄溶液１（２×ＳＳＣ；０.０５％ＳＤＳ）で３回連続して洗浄する。次に、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの洗浄溶液２（０.１×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ）を５５℃で１時間温める。次に、メンブレンを、メンブレンを１５ｍｌの溶液に５５℃で６０分間撹拌しながら浸すことにより、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ洗浄溶液２（０.１×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ）で３回連続して洗浄する。洗浄溶液は１５分間ごとに交換する。
【０２５９】
現像
メンブレンをＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（Ｋｏｄａｋ，カタログ番号１６５  １５７９）フィルムに一晩−７０℃でに晒し、標準的な方法で現像する。多数の異なる組織がスクリーニングされ、選択された組織、例えば脾臓および肺で約２.３ｋｂの特有なｍＲＮＡが見出された。
【実施例７】
【０２６０】
ＰＣＲ分析
ＴａｑＭａｎ(R)またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、サンプル中でメッセンジャーＲＮＡを検出する。分析は、ＰＣＲ中にＴａｑＭａｎ(R)プローブを開裂させるＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ(R)ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。ＴａｑＭａｎ(R)プローブは、レポーター染料（例えばプローブの５’末端における６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン））、および、消光染料（例えばプローブの３’末端におけるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルローダミン）を含む。ＴａｑＭａｎ(R)プローブは、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位との間の対象となる標的ｃＤＮＡにハイブリダイズするように特異的に設計される。プローブが無傷（ｉｎｔａｃｔ）の場合、３’末端消光染料は、５’末端レポーター染料の蛍光を抑制する。ＰＣＲの際、５’から３’へのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ(R)ＤＮＡポリメラーゼ活性により、５’末端  レポーター染料と３’末端  消光染料との間のプローブの開裂が起こり、それにより、レポーター染料の置き換えが生じる。一度置き換えられれば、レポーター染料の蛍光はもはや消光染料により抑制されない。従って、標的化されたｃＤＮＡテンプレートから生じるＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター染料の蛍光における増加をモニターすることによって検出される。
【０２６１】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩプリズム配列検出システム（モデル番号ＡＢ１７７００）を用いて、ＰＣＲ中のレポーター蛍光の増加をモニターする。レポーターシグナルは、受動的リファレンス（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）の放出に対して基準化される。
【０２６２】
ｃＤＮＡテンプレートの調製
数々の組織からのトータルＲＮＡおよびポリＡ+ＲＮＡは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから購入できる（上記表１および下記の表２を参照）。
【表２】
2005500036.tif 000003
【０２６３】
５μｇのトータルＲＮＡを、２μｌ（５０ｎｇ／μｌ）のランダム６量体プライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８０９０）と混合する（総反応容量７μｌ）。得られた混合物を７０℃で１０分間加熱し、急速に氷上で冷却する。次に、それを、４μｌの５×ファーストストランド緩衝液、２μｌの０.１ｍＭのＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰおよび１μｌの水の混合物に加える。混合物を穏やかに混合し、３７℃で２分間インキュベートする。インキュベート後、５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１８０９０）を加える。次に、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。反応を、１μｌの２.５ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって止める。次に、混合物を６５℃で１０分間インキュベートする。
【０２６４】
ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ(R)分析
９６−ウェルプレートのＭｉｃｒｏＡｍｐ光学チューブ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号Ｎ８０１−０９３３）でＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ(R)分析を行う。２５μｌのＴａｑＭａｎ(R)ＰＣＲ混合物（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号Ｎ８０８−０２３０）、１μｌのフォワードプライマー（５’−ＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＣ−３１）（配列番号１０）、１μｌのリバースプライマー（５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧ−３１）（配列番号１１）、１μｌのＴａｑＭａｎ(R)プローブ（５’−ＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＣＣＴＣＴＧＴ−３’）（配列番号１２）、１μｌのｃＤＮＡおよび２１μｌの水を含む反応混合物を各ウェル上に置く。ＴａｑＭａｎ(R)サンプルを、ｃＤＮＡテンプレート濃度５、２、１、０.５、０.２５、０.１２５、０.０６２５ｎｇ／μｌ（テンプレートｃＤＮＡ濃度は、最終濃度である）で二連で各組織サンプルに対して作製する。次に、プレートをＭｉｃｒｏＡｍｐ  光学８−ストリップキャップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔａｌｏｇ，Ｎｏ．Ｎ８０１−０９３５）で密封する。
【０２６５】
ヒトβアクチン遺伝子（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号４０１８４６）を二重に用いて標準曲線を作製する。標準曲線の各ｃＤＮＡテンプレート濃度に関して、多数の増幅分子が得られた。既知遺伝子の標準曲線増幅を得ることにより、各既知標的遺伝子に関して増幅されたｃＤＮＡ分子の定量、および、内部コントロールを用いた標準化が可能になる。
【０２６６】
上記ＴａｑＭａｎ(R)反応の結果は、掛け算で調節して任意選択の組織に比例させて表されている（例えば、心臓におけるＧＡＶＥ３発現値は、脳におけるＧＡＶＥ３発現値で割った）。あるいは、既知の反応性を有する異なる組織を参照のフレームとして用いることができ、例えばβアクチンである。
【０２６７】
高レベルのＧＡＶＥｍＲＮＡが腎臓、心臓、肺、脾臓および胸腺で観察された。中枢神経系において、ＧＡＶＥ３が視床で発現されたが、小脳、尾状核、小脳および脳梁ではあまり発現されなかった。
【０２６８】
免疫細胞において、ＧＡＶＥ３のメッセージが活性化Ｔ細胞、好中球および好酸球で検出される。いくつかの個々の変異が観察された。Ａ５４９細胞ＧＡＶＥ３レベルは、Ａ５４９細胞をチリダニ抗原に露出した後に２倍になった。
【０２６９】
上記実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、本発明の本質から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。本明細書で言及された全ての引用された特許および出版物は、その全体を参照により加入させる。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】ｈＧＡＶＥ３に関するＤＮＡ配列である（配列番号１）。
【図２】ｈＧＡＶＥ３に関するアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図３】３ａは、ｈ−β−アクチンに基準を合わせた選択された脳組織におけるｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである。３ｂは、ｈ−β−アクチンに基準を合わせた選択された末梢ヒト組織におけるｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである。
【図４】４ａは、選択されたヒト免疫細胞（すなわちＴ−細胞（活性化およびコントロール）、好中球（１１ａ，ｂおよびｃは異なる患者から）、および、好酸球（１２ａおよび１２ｂは異なる患者から））における、ｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである；および、４ｂは、選択されたヒト免疫細胞（すなわち、イエダニ抗原（ＨＡＤ）の存在および非存在下における、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＡ５４９（肺上皮細胞））の、ｈＧＡＶＥ３のＴａｑＭａｎ発現プロフィールである。
【図１】
2005500036.tif 000004
【図２】
2005500036.tif 000005
【図３】
2005500036.tif 000006
【図４】
2005500036.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2005500036.tif 000008
2005500036.tif 000009
2005500036.tif 000010
2005500036.tif 000011
2005500036.tif 000012
2005500036.tif 000013
2005500036.tif 000014
2005500036.tif 000015
2005500036.tif 000016
2005500036.tif 000017
2005500036.tif 000018
2005500036.tif 000019
2005500036.tif 000020
2005500036.tif 000021
2005500036.tif 000022
2005500036.tif 000023
2005500036.tif 000024
2005500036.tif 000025
2005500036.tif 000026
2005500036.tif 000027
2005500036.tif 000028
2005500036.tif 000029
2005500036.tif 000030
2005500036.tif 000031
2005500036.tif 000032
2005500036.tif 000033
2005500036.tif 000034
2005500036.tif 000035
2005500036.tif 000036
2005500036.tif 000037
2005500036.tif 000038
2005500036.tif 000039
2005500036.tif 000040
2005500036.tif 000041
2005500036.tif 000042
2005500036.tif 000043
2005500036.tif 000044
2005500036.tif 000045
2005500036.tif 000046
2005500036.tif 000047
2005500036.tif 000048
2005500036.tif 000049
2005500036.tif 000050
2005500036.tif 000051
2005500036.tif 000052
2005500036.tif 000053
2005500036.tif 000054
2005500036.tif 000055
2005500036.tif 000056
2005500036.tif 000057
2005500036.tif 000058
2005500036.tif 000059
2005500036.tif 000060
2005500036.tif 000061
2005500036.tif 000062
2005500036.tif 000063
2005500036.tif 000064
2005500036.tif 000065
2005500036.tif 000066
2005500036.tif 000067
2005500036.tif 000068
2005500036.tif 000069
2005500036.tif 000070
2005500036.tif 000071
2005500036.tif 000072
2005500036.tif 000073
2005500036.tif 000074
2005500036.tif 000075
2005500036.tif 000076
2005500036.tif 000077
2005500036.tif 000078
2005500036.tif 000079
2005500036.tif 000080
2005500036.tif 000081
2005500036.tif 000082
2005500036.tif 000083
2005500036.tif 000084
2005500036.tif 000085
2005500036.tif 000086
2005500036.tif 000087
2005500036.tif 000088
2005500036.tif 000089
2005500036.tif 000090
2005500036.tif 000091
2005500036.tif 000092
2005500036.tif 000093
2005500036.tif 000094
2005500036.tif 000095
2005500036.tif 000096
2005500036.tif 000097
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500036.tif 000098
【国際調査報告】
2005500036.tif 000099
2005500036.tif 000100