(57)【要約】本発明は様々な実施例によって、ヒト構造および細胞骨格結合タンパク質(SCAP)およびSCAPを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、SCAPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）乃至（g）からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-25（配列番号１乃至25）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO：１−5、SEQ ID NO：7-13、SEQ ID NO：15-16、SEQ ID NO：18-19およびSEQ ID NO：21-25を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（ｃ）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:14のアミノ酸配列と少なくとも９8％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（e ）SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO:20からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９4％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｇ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の（ａ）乃至（ｇ）からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:26-50を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:26-41およびSEQ ID NO:43-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（d）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（e）（b）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（f）（c）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（g）（ａ）〜（f）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在・不存在を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程からなり、 前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたは断片の間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、前記プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的なSCAPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的なSCAPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとして有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能的SCAPの過剰発現に関連する疾患や病状の治療方法であって、そのような治療を要する患者への、請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）適切な条件下で請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させるステップと、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項５の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程、とを含む方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項12のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のSCAP の発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記抗体を前記ポリペプチドと混合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した条件下で、前記生物学的サンプルを請求項11に記載の抗体と結合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関する方法。
【請求項３１】
請求項11の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2 断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のSCAP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のSCAP の発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリをスクリーニングすることにより産出されることを特徴とする請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:１-25からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドがサンプル中に存在することを示唆することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-25 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、或るサンプルと共に請求項11に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）サンプルのポリヌクレオチドを標識するステップと、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量するステップとを含むサンプルの発現プロファイルを作製する方法。
【請求項４８】
或る固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を有し、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有する或るヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを更に有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが前記のヌクレオチド分子の少なくとも１つと前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な核酸、これらの核酸によってコードされる構造および細胞骨格結合タンパク質に関する。またこれらの核酸およびタンパク質の、細胞増殖異常、ウイルス感染および神経疾患の診断、治療および予防における利用に関する。本発明はまた、核酸と構造および細胞骨格結合タンパク質の発現における外因性化合物の作用の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞骨格は、細胞形状、構造及び運動を媒介するタンパク質線維の細胞質内ネットワークである。この細胞骨格は細胞膜を支え、細胞小器官や他の要素が細胞質内で移動するトラックを形成する。細胞骨格は動的な構造をしており、それによって細胞が種々の形状をとり有向性移動が行えるようになっている。主要細胞骨格線維には微小管、ミクロフィラメント、および中間径フィラメントが含まれる。ミオシン、ダイニン及びキネシンを含むモータータンパク質は、線維の移動または線維に沿った移動を駆動する。モータータンパク質であるダイニンは、膜小胞の形成を駆動する。補助タンパク質または関連タンパク質は線維の構造または活性を変更し、細胞骨格の膜アンカーは線維を細胞膜に結合する。
【０００３】
微小管および関連タンパク質
チューブリン
直径約24nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で複数の役割を果たしている。束になった微小管は繊毛や鞭毛を形成し、両者は細胞膜の鞭状の伸長であり、繊毛は上皮上の物質を一掃するのに必要で、鞭毛は精子の遊泳に必要である。赤血球や血小板の微小管の辺縁領域は、これらの細胞の柔軟性の維持に重要である。細胞小器官、膜小胞及びタンパク質は、微小管のトラックに沿って細胞内で輸送される。例えば、微小管は神経細胞軸索の中を通っており、細胞体と神経末端の間で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。神経末端にこれらの小胞を供給できないと、神経のシグナル伝達が妨げられる。微小管はまた、細胞分裂中の染色体運動にとっても重要である。安定な微小管集団と短命な微小管集団の両方が細胞内に存在する。
【０００４】
微小管は、GTPを結合するチューブリンタンパク質サブユニットからなる重合体である。各々のサブユニットは、α-チューブリンおよびβ-チューブリンのヘテロ二量体であり、各々には複数のイソ型が存在する。GTPの加水分解は、微小管の末端へのチューブリンサブユニットの付加に関連する。サブユニットはヘッドとテイルどうしが相互作用してプロトフィラメントを形成し、プロトフィラメントは側面どうしが相互作用して微小管を形成する。微小管は極性があり、一端はαチューブリン、他端はβチューブリンで環状になっており、両端でアセンブリの速度が異なる。１１または１５のプロトフィラメントの微小管も見られるが、一般に各微小管は１３のプロトフィラメントから構成される。繊毛と鞭毛はダブレット微小管を含んでいる。微小管は、中心体または微小管形成中心(MTOC)として知られている特殊構造体から成長する。微小管形成中心は一つまたは二つの中心小体を含んでおり、三つ組の微小管の風車配列になっている。基底小体は繊毛または鞭毛の基部に位置する形成中心であり、1つの中心小体を含む。MTOCに存在するγチューブリンは、αとβのチューブリンへテロ二量体の重合の核形成に重要であるが、微小管には重合しない。ペリセントリン（pericentrin）タンパク質はMTOCに見られ、微小管のアセンブリに関与している。
【０００５】
微小管結合タンパク質
微小管結合タンパク質(MAP)は微小管のアセンブリと安定化に関与している。微小管結合タンパク質の主要ファミリーの一つである、アセンブリMAPは神経細胞および非神経細胞においても同定される。アセンブリMAPはサイトゾル内の微小管の架橋をも担っている。これらのMAPは、塩基性微小管結合ドメインと酸性プロジェクションドメインの二つのドメインから構成されている。プロジェクションドメインは、膜、中間径フィラメントまたは他の微小管の結合部位である。配列解析に基づいて、アセンブリMAPをタイプIとタイプIIの2つの種類にグループ分け出来る。タイプI MAPにはMAP1AとMAP1Bがあり、微小管で同時精製される大型の線維状分子であり、脳や精巣に多く発現する。タイプI MAPは正に帯電したアミノ酸配列モチーフのいくつかのリピートを含むが、このモチーフは負に帯電したチューブリンを中和して微小管の安定化をもたらす。MAP1AおよびMAP1Bの各々は一つの前駆体ポリペプチドから由来しており、その前駆体ポリペプチドはタンパク分解処理されて、一つの重鎖と一つの軽鎖を形成する。
【０００６】
別の軽鎖であるLC3は、16.4 kDaの分子であり、MAP1A、MAP1Bおよび微小管と結合する。LC3はMAP1AまたはMAP1B転写物以外の源泉から合成されこと、またLC3の発現は細胞増殖時のMAP1AおよびMAP1Bの微小管結合活性の調節に重要であり得ることが示唆されている（Mann, S. S. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:11492-11497）。
【０００７】
MAP2a、MAP2b、MAP2c、MAP4 および Tauを含むタイプ II MAPは、微小管結合ドメインに3コピーないし4コピーの18残基配列を有することが特徴である。MAP2a、MAP2b、およびMAP2cは樹状突起のみに見られ、MAP4は 非神経細胞性細胞に見られ、Tauは神経細胞の軸索と樹状突起に見られる。TauのmRNAの選択的スプライシングによってTauタンパク質の複数のアイソフォームが存在するようになる。アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、および17番染色体に連鎖する家族性前頭側頭部痴呆症とパーキンソン病のような神経変性疾患ではTauのリン酸化が変更されている。Tauリン酸化が変更されることによって微小管網が破壊され、神経細胞内Tau凝集の形成が生じる(Spillantini, M.G. および Goedert, M. (1998) Trends Neurosci. 21:428-433)。
【０００８】
STOP（stable tubule only polypeptide）は、別の微小管結合タンパク質で、安定性を調節するカルモジュリン制御タンパク質である（Denarier, E. 他 (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 24:791-796）。神経細胞は長距離にわたって伝導性の接続を維持するために、軸索樹状突起の伸長に依存しており、その軸索樹状突起の伸長は微小管によって支持されている。STOPタンパク質は微小管ネットワークを安定化する機能をもつ。STOPタンパク質は軸索微小管と結合し、また神経内にも豊富にある（Guillaud, L. 他 (1998) J. Cell Biol. 142:167-179）。STOPタンパク質は正常の神経突起の形成に必要であり、in vitro、低温でカルシウム、または薬剤によって起こされ得る解離に対し微小管を安定させることが観察されている（Margolis, R.L. 他 (1990) EMBO 9:4095-502）。
【０００９】
ミクロフィラメントおよび関連タンパク質
アクチン
直径約７〜９nmの細胞骨格フィラメントであるミクロフィラメントは、細胞移動、細胞形状、細胞接着、細胞分裂及び筋収縮に重要である。ミクロフィラメントの集合と解離によって、細胞はその形態を変えることが可能になる。ミクロフィラメントは、真核細胞で最も豊富な細胞内タンパク質であるアクチンが重合したものである。ヒト細胞は、アクチンの６つのアイソフォームを有する。三つのαアクチンが異なった種類の筋肉にあり、非筋肉性βアクチンおよび非筋肉性γアクチンは非筋肉細胞にあり、また他のγアクチンは腸の平滑筋細胞にある。単量体形のアクチンであるG-アクチンは、ATPからADPへの加水分解を伴って、極性をもつ螺旋形のF-アクチンフィラメントに重合する。アクチンフィラメントは、会合して束及びネットワークを形成し、原形質膜を支持して細胞形状を決定するようなフレームワークを提供する。これらの束及びネットワークは、細胞膜に接続している。筋肉細胞では、収縮する時にアクチンを含む細いフィラメントが、モータータンパク質ミオシンを含む太いフィラメントに対し滑る。アクチン細胞骨格の一部ではなく、むしろ微小管やダイニンに会合する一群のアクチン関連タンパク質が存在する。
【００１０】
アクチン結合タンパク質
アクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの架橋、切断および安定化、またアクチン単量体の隔離に関与している。アクチン結合タンパク質のいくつかは複数の機能を有している。アクチンフィラメントの束やネットワークはアクチン架橋タンパク質によって保持されている。これらのタンパク質は各フィラメントに一個づつの合計2つのアクチン結合部位を有する。短い架橋タンパク質は束形成を促進し、他方、長くてより柔軟性のある架橋タンパク質はネットワーク形成を促進する。アクチン相互作用タンパク質（AIP）は、アクチンフィラメント組織の調節に関与する。新規なF-アクチン結合タンパク質であるTARAのような、他のアクチン結合タンパク質は、アクチン細胞骨格組織を調節することによって同様の能力で機能する。アクチン架橋タンパク質のカルモジュリン様カルシウム結合ドメインによって架橋のカルシウム調節が可能となる。グループ I の架橋タンパク質は独特のアクチン結合ドメインを持ち、30 kD タンパク質、EF-1a、ファシン(fascin)やスクルイン(scruin)等が含まれる。グループ II の架橋タンパク質は、7,000-MW アクチン結合ドメインを有し、ビリン(villin)やデマチン(dematin)等が含まれる。グループ III の架橋タンパク質は、１対の26,000MWのアクチン結合ドメインを有し、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィン、ABP120、及びフィラミンがある。
【００１１】
切断タンパク質は、アクチンフィラメントを短い断片に切るか、またはその端をブロックすることによって、アクチンフィラメントの長さを調節する。切断タンパク質には、gCAP39、セベリン（severin）(フラグミン（fragmin）)、ゲルゾリンおよびビリンが含まれる。キャッピングタンパク質は、アクチンフィラメントの端にキャップを形成し得るが、フィラメントを切断することはできない。キャッピングタンパク質には、CapZ及びトロポモジュリンがある。タンパク質のチモシンとプロフィリンはサイトゾル内でアクチン単量体を隔離し、重合しないアクチンのプールの存在を可能にする。アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニンおよびカルデスモンは筋肉収縮をカルシウムに応答して調節する。
【００１２】
微小管とアクチンフィラメントのネットワークは、小胞と細胞小器官の輸送、分裂溝の配置、有向性の細胞遊走、紡錘体の回転、および核の移動などのプロセスで協調する。微小管とアクチンは、小胞、細胞小器官、および細胞運命の決定因子の輸送を協同ですることがあり、または輸送には皮層（cortical）アクチン部位に微小管の端を向かわせることとその部位での微小管の捕捉を含み得る。これらの細胞骨格系は、ミオシン-キネシン複合体、ミオシン-CLIP170複合体、フォルミン相同体（FH）タンパク質、ダイニン、ダイナクチン複合体、Kar9p、コロニン（Coronin）、ERMタンパク質、およびKelchリピート含有タンパク質によって架橋され得る（Goode, B.L. 他 (2000) Curr. Opin. Cell Biol. 12:63-71の概説を参照）。Kelchリピートは、Ring Canalと呼ばれる細胞質内架橋の形成に関与するKelchタンパク質で最初に観察されたモチーフである。種々の哺乳類Kelchファミリータンパク質と他のKelchファミリータンパク質が同定されているKelchリピートドメインは、アクチンとの相互作用を仲介していると考えられている（Robinson, D.N. および L. Cooley (1997) J. Cell Biol. 138:799-810）。
【００１３】
ADF/コフィリンは保存された15〜18kDaのアクチン結合タンパク質のファミリーであり、これらのタンパク質は、細胞分裂、エンドサイトーシス、および胚組織の発生で役割を果たすと共に、組織再生、および虚血、酸化的ストレス、または浸透的ストレスのような病状でも役割を果たす。LIMキナーゼ１はADFを下方調節する（Carlier, M.F. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:33827-33830）。
【００１４】
LIMは、そのモチーフが最初に同定された、Lin-11、lsl-1、およびMec-3の３つの転写因子の頭字語である。LIMドメインは２つのZnフィンガーのモチーフであり、転写因子、シグナル伝達タンパク質、および細胞骨格結合タンパク質のタンパク質-タンパク質相互作用を仲介する（Roof, D.J. 他 (1997) J. Cell Biol. 138:575-588）。これらのタンパク質は核、細胞質、または両方に分布している（Brown, S. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:27083-27091）。最近、ALP（アクチン結合LIMタンパク質）がαアクチニン-２に結合することが示された（Bouju, S. 他 (1999) Neuromuscul. Disord. 9:3-10）。
【００１５】
Frabinタンパク質は、アクチンフィラメント結合タンパク質の別の例である（Obaishi, H. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:18697-18700）。Frabin（FGD1関連F-アクチン結合タンパク質）は1つのアクチンフィラメント結合（FAB）ドメイン、１つのDbl相同（DH）ドメイン、２つのプレックストリン相同（PH）ドメイン、および１つのシステインリッチFYVE（Fab1p、YOTB、Vac1p、およびEEA1（初期エンドソーム抗原１））ドメインをもつ。FrabinはCdc42低分子量Gタンパク質（Cdc42）のGDP/GTP交換活性を示し、無傷の細胞でRac低分子量Gタンパク質（Rac）の活性を間接的に誘導する。Cdc42とRacの活性化によって、Frabinは糸状偽足様のプロセスと葉状偽足様のプロセスの形成を誘導できる（Ono, Y. 他 (2000) Oncogene 19:3050-3058）。
【００１６】
Rhoファミリーの低分子量GTP結合タンパク質は、細胞形態変化、接着、および運動を含むアクチン依存性の機能の重要な調節因子である。Rhoファミリーは、Cdc42、Rac、Rhoの３つの主要なサブファミリーから成る。Rhoファミリーメンバーは、GDP/GTP交換因子（GEF）によってGDP結合の非活性型とGTP結合の活性型の間を循環する（Umikawa, M. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:25197-25200）。RhoGEFファミリーはミクロフィラメント組織で重要である。
【００１７】
中間径フィラメントおよび関連タンパク質
中間径フィラメント(IF)は直径約10nmの細胞骨格線維であり、ミクロフィラメントと微小管の直径の中間の大きさである。IFは細胞の構造的役割を果たしており、細胞を強化し、組織化する。IFは特に上皮細胞および神経細胞に豊富である。IFは極めて安定であり、ミクロフィラメントや微小管とは異なり、細胞運動には関与しない。
【００１８】
哺乳動物では、５つのタイプのIFタンパク質が知られている。I型及びII型のタンパク質は、各々酸性ケラチン及び塩基性ケラチンである。酸性ケラチン及び塩基性ケラチンのヘテロ二量体は、ケラチンIFの構成単位である。ケラチンは、皮膚や角膜などの軟らかい上皮内、爪や髪などの硬い上皮内、及び身体内腔に沿って並ぶ上皮内に豊富にある。ケラチン遺伝子の突然変異は、単純型表皮水疱症、水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症（表皮溶解性角質増殖）、非表皮溶解性及び表皮溶解性掌蹠角皮症、シーメンスの水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、及び白色海綿母斑を含む上皮の疾病の原因となる。これらの疾病には、重症の皮膚水疱形成の原因となるものもある（Wawersik, M. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:32557-32565、Corden, L.D. および W.H. McLean (1996) Exp. Dermatol. 5:297-307等を参照）。
【００１９】
III型のIFタンパク質には、デスミン、グリア線維酸性タンパク質、ビメンチン、およびペリフェリンが含まれる。筋細胞中のデスミンフィラメントは筋線維を束に連結し、収縮中の筋肉中のサルコメアを安定化させる。グリア線維性酸性タンパク質フィラメントは、神経と星状膠細胞を囲むグリア細胞に見られる。ビメンチンフィラメントは血管内皮細胞、ある種の上皮細胞、および線維芽細胞のような間葉細胞に見つけられ、一般に微小管と結合している。ビメンチンフィラメントは、細胞内で核や他の細胞小器官を所定の位置に留める役割を持っている可能性がある。IV型のIFにはニューロフィラメントとネスチンが含まれる。ニューロフィラメントはNF-L、NF-M、およびNF-Hの３つのポリペプチドから構成され、しばしば軸索中の微小管に結合している。ニューロフィラメントは軸索の放射状成長とその直径に関与し、最終的には神経インパルス伝達の速度にも関係する。ニューロフィラメントのリン酸化と代謝の変化は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む神経変性疾患で観察されている（Julien, J.P. および W.E. Mushynski (1998) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 61:1-23）。V型のIFであるラミンは核内で見つかっており、そこで核膜の支持をしている。
【００２０】
IF群は、複数の短い非螺旋状リンカーのセグメントが割り込んでいる、中心部のα螺旋棒状領域を有する。この棒状領域はたいてい、非螺旋状のヘッドドメインとテイルドメインに挟まれている。中間径フィラメントタンパク質の棒状領域は、会合してコイルドコイル二量体を形成する。極めて規則正しい集合過程によって、二量体からIFを生じる。ミクロフィラメントや微小管の集合とは異なり、IF集合にはATPまたはGTPのどちらも必要でない。
【００２１】
IF結合タンパク質(IFAP)はIF間の相互作用および他の細胞構造との相互作用を媒介する。IFAPは束状またはネットワークにIFを架橋するか、あるいは原形質膜に架橋する。またIFをミクロフィラメントや微小管細胞骨格に架橋する場合がある。微小管とIFは特に密接に会合している。IFAPには、BPAG1、プラコグロビン、デスモプラキン1、デスモプラキンII、プレクチン(plectin)、アンキリン、フィラグリン (filaggrin)、およびラミンB受容体が含まれる。
【００２２】
細胞骨格膜アンカー
細胞骨格線維は特異的タンパク質によって原形質膜に付着している。これらの付着は細胞の形状維持や筋肉収縮にとって重要である。赤血球において、スペクトリン-アクチン細胞骨格は三つのタンパク質、即ちバンド4.1、アンキリンおよびアデュシン(adducing)によって細胞膜に付着される。この付着に欠陥があると、異常な形状の細胞になり、それらの細胞は脾臓によってより急速に分解され、貧血を起こさせる。血小板においては、スペクトリン-アクチン細胞骨格はまた、アンキリンによって膜に結合されており、二番目のアクチンネットワークがフィラミンによって膜に付着されている。筋肉細胞において、タンパク質ジストロフィンはアクチンフィラメントを原形質膜に結合しており、ジストロフィン遺伝子の突然変異によってデュセンヌ型筋ジストロフィーが生じる。
【００２３】
接着斑
接着斑は、細胞外マトリックス(ECM)のような基質への細胞の接着に関与する原形質膜の特殊化した構造である。細胞斑は細胞外基質と細胞骨格との間の接続を形成し、細胞形態、細胞運動性、および細胞増殖性のような機能に影響を与える。膜貫通のインテグリン分子が接着斑の基礎を形成する。インテグリンはリガンドに結合すると、原形質膜の面でクラスターを形成する。αアクチニン、タリン、テンシン、ビンキュリン、パキシリン、およびフィラミンのアクチン結合タンパク質のような細胞骨格連結タンパク質がそのクラスター部位に集められる。Rhoファミリータンパク質、Rasファミリータンパク質、接着斑キナーゼ、およびSrcファミリーメンバーのような重要な調節タンパク質もまた動員される。これによって、アクチンフィラメントが再構成され、ストレスファイバーが形成される。これらの細胞内再構成によって、さらに、インテグリン-細胞外マトリックスの相互作用とインテグリンのクラスター化が促進される。このようにして、インテグリンは原形質膜の細胞質内側と細胞外側の両方においてタンパク質複合体の凝集を媒介し、接着斑の形成に至らせる。多くのシグナル伝達応答は、Src、FAK、パキシリン、およびテンシンを含む、種々の接着複合体タンパク質によって仲介される（Yamada, K.M. および B. Geiger, (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9:76-85の概説を参照）。
【００２４】
IFはまた細胞骨格膜アンカーによって膜に付着される。核ラミナはラミンB受容体によって核膜の内部表面に付着されている。ビメンチンIFはアンキリンとプレクチンによって原形質膜に付着されている。デスモソームおよびヘミデスモソームの膜接合部によって、臓器と皮膚の上皮細胞が結合されている。これらの膜接合部によって剪断変形力が上皮細胞層全体に分布され、したがって、上皮細胞に強度と硬性が与えられる。上皮細胞のIFはプラコグロビンとデスモプラキンによってデスモソームに付着している。IFをヘミデスモソームに結合するタンパク質はわかっていない。デスミンIFは筋肉においてサルコメアを包囲しており、パラネミン（paranemin）、シネミン(synemin)およびアンキリンによって原形質膜に結合している。
【００２５】
モータータンパク質
ミオシン関連モータータンパク質
ミオシンは、ATPの加水分解を運動に共役させるアクチン活性ATP分解酵素であり、真核細胞中に見られる。ミオシンは、筋収縮のモーター機能、および食作用や有糸細胞分裂（細胞質分裂）中に行われる細胞内容物の再配列などの細胞内運動のためのモーター機能を提供する。サルコメアと称される骨格筋の収縮単位は、アクチンを含む細いフィラメント及びミオシンを含む太いフィラメントの高度に規則正しい配列から構成される。太いフィラメントと細いフィラメントの間に架橋が形成され、太いフィラメント内のミオシンヘッドのATP依存性の運動が細いフィラメントを引っ張り、筋節を短縮し、それによって筋線維を短縮する。
【００２６】
ミオシンは、１または２つの重鎖及びそれに会合する軽鎖を有する。ミオシン重鎖は、アミノ末端モータードメイン即ちヘッドドメインと、軽鎖結合の部位である頚部と、カルボキシル末端テイルドメインとを有する。テイルドメインどうしが、会合してα螺旋コイルドコイルを形成し得る。例えば筋肉組織などに見られるような従来のミオシンは、２つのミオシン重鎖サブユニットを有し、各々が２つの軽鎖サブユニットに会合しており、軽鎖サブユニットは重鎖の頚部領域に結合し調節の役割を果たしている。細胞内運動において機能すると信じられている非従来型のミオシンは、１または２つの重鎖及びそれに会合する軽鎖を含んでいる可能性がある。脊椎動物の約２５ミオシン重鎖遺伝子について半分以上が非従来型であるという証拠がある。
【００２７】
ダイニン関連モータータンパク質
ダイニンは微小管上で作用する(-)末端方向性モータータンパク質である。細胞質型と軸糸型の2種のダイニンが同定されている。細胞質型ダイニンは細胞質内の微小管に沿って物質の移行を担い、例えば、神経末端から細胞体への輸送やエンドサイトーシス小胞のリソソームへの輸送などに関与する。さらに、ウイルスはしばしば、細胞質型ダイニンを利用して核内に入り込み感染を成功させる（Sodeik, B. 他 (1997) J. Cell Biol. 136:1007-1021）。例えば、単純ヘルペスウイルス１のビリオンタンパク質は細胞質型ダイニンの中鎖と相互作用する（Ye, G.J. 他 (2000) J. Virol. 74:1355-1363）。細胞質内ダイニンはまた、有子分裂にも関与していることが報告されている。軸糸型ダイニンは鞭毛や繊毛の鞭打ち運動に関与する。一つの微小管ダブレット上のダイニンは、隣接する微小管ダブレットに沿って歩く。この滑る力によって、鞭毛または繊毛の鞭打ち運動を起こす屈曲が生じる。ダイニンは1000から2000キロダルトンの間の天然質量を有し、ATPの加水分解によって駆動される力を生じるヘッドが２個ないし３個ある。このヘッドは柄（ストーク）を介して基部ドメインに連結しており、この基部ドメインは極めて異なった数からなる付属の中鎖や軽鎖から構成されている。細胞質型ダイニンはモータータンパク質中で最大で最も複雑である。
【００２８】
ネブリン関連タンパク質
ネブリンは骨格筋のアクチンフィラメントと相互作用する大きい筋節タンパク質である(Wang, K. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4304-4314).。ネブリンはコンセンサス配列および予測されたα螺旋構造を持つ35残基モジュールのコピーを185以上含んでいる。35残基モジュールにはアクチン結合ドメインが含まれている。ネブリンの中心部分では、35残基モジュールが7個のモジュールのスーパリピートパターンを示している。このスーパーリピートパターンはネブリンのC末端100キロダルトン領域には存在しない。ネブリンのN末端領域には8個のリンカーモジュールと8キロダルトンの酸性ドメインが１個含まれている。このC末端領域は固有であり、１個のSH3ドメインを含む。筋節内でネブリンは、C末端がZラインに位置し、またN末端がアクトミオシン重複部分の細いフィラメントの先の尖った（pointed）低成長型末端に位置するように向いている。
【００２９】
ネブリンは異なったアイソフォームとして存在し、これらは大きさの範囲が600から900キロダルトンにわたる。(Kruger, M. 他 (1991) J. Cell. Biol. 115:97-107)。ネブリンの大きさは組織および種特異的であり、発生的に制御される。アイソフォームの大きさが骨格筋における細いフィラメントの長さと相関するという観察に基づくと、ネブリンは細いフィラメントの長さを調節する分子的定規（molecular ruler）としてある役割を果たすと提案されている。各々のネブリン35残基モジュールは一つのアクチン単量体と会合し得る、したがって、異なった数のモジュールを持つアイソフォームによって細いフィラメントの長さが決定される得る。ネブリンのN末端領域はトロポモジュリンと相互作用し、トロポモジュリンはこの機能で補助している可能性がある (McElhinny, A.S. 他 (2001) J. Biol. Chem. 276:583-592)。トロポモジュリンは細いフィラメントの先のとがった末端でアクチンをキャップ（cap）して、アクチン単量体の解離または付加を防ぐことによってフィラメントの長さを維持する。
【００３０】
ネブリンは心筋には存在しないが、ネブリン様モジュールを有する関連するタンパク質によって類似の機能が果たされ得る。例えば、nebuletteは心臓に特異的に発現され、23個の35残基ネブリン様モジュールを含むC末端領域を有する(Moncman, C.L. 及び Wang, K. (2000) J Muscle Res. Cell Motil. 21:153-169; Millevoi, S. 他 (1998) J. Mol. Biol. 282:111-123)。nebulette のドメイン構造はネブリンに類似している、けれど、ほんの107キロダルトンのネブリンより小さいタンパク質である。これは１つの酸性N末端ドメインを有し、このドメインはネブリン様モジュール、リンカードメインおよびSH3ドメインを含むリピートドメインである。nebulette のリピートドメインはネブリンのリピートドメインの約10分の１の大きさである。nebulette の35残基モジュールはコンセンサスモチーフを有しており、モジュール15-22のサブファミリは保存されたモチーフを共有する。ネブリンとは異なり、nebulette モジュールはスーパーリピートパターンを示さない。Nebulette はアクチンおよびその他の筋節タンパク質(ミオシン、カルモジュリン、トロポミオシン、トロポニンおよびα-アクチニン)に結合する(Moncman, C.L. 及び Wang, K. (1999) Cell Motil. Cytoskeleton 44:1-22)。筋節におけるnebulette の方向は、ZラインにC末端およびIバンドにN末端を有するネブリンの方向に類似している。
【００３１】
ネブリンに関連する固着(anchoring)タンパク質(N-RAP)は心筋および骨格筋に発現される(Luo, G. 他(1997) Cell Motil. Cytoskeleton 38:75-90)。これは筋腱接合部および介在板で、筋原線維の末端に存在する133キロダルタンのタンパク質である。N-RAPのC末端領域には35残基ネブリン様モジュールのコピーが27個ある。17のモジュールはスーパーリピートパターンで組織化されている。N末端領域にはシステインリッチLIMドメインが含まれる。LIMドメインは二つの隣接する亜鉛フィンガー様構造にて２つの亜鉛イオンを結合し、タンパク質間相互作用を媒介することがわかっている。N-RAPは筋原線維のアクチンフィラメントと他の筋節タンパク質との間の相互作用を媒介するN-RAP はアクチン、タリンおよびビンキュリンに結合する(Luo, G. 他(1999) Biochemistry 38:6135-6143)。N-RAP はそのスーパリピート領域によってアクチンおよびビンキュリンと相互作用し、そのLIMドメインによって  タリンと相互作用する。タリンおよびビンキュリンもまた、筋腱接合部に存在し、N-RAPとともに筋原線維のアクチンフィラメントと筋節の間で連結し、張力を筋原線維から細胞外マトリックスに伝達する。
【００３２】
筋節タンパク質の突然変異は筋肉の弱化と疾患に関連している(Laing, N.G. (1999) Curr. Opin. Neurol. 12:513-518)。いくつかの症例のおける常染色体劣性ネマリンミオパシーはネブリン欠損によって生じる(Pelin, K. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96:2305-2310)。この疾患は筋線維におけるネマリン体（nemaline bodies）が存在することを特徴とする。ネマリン体には通常Zディスクおよび細いフィラメントと会合したタンパク質が含まれている。ネブリンにおける欠損は明らかに筋節タンパク質間の相互作用を乱させ、その結果ネマリン体におけるタンパク質の病理的凝集を生じる。
【００３３】
キネシン関連モータータンパク質
キネシンは、微小管で作用する(+)末端方向性モータータンパク質である。基本型のキネシン分子は、膜結合小胞及び細胞小器官の輸送に関与している。この機能は、ニューロンにおける軸索輸送に特に重要である。キネシンはまた、全ての細胞タイプにおいてゴルジ体から小胞体への小胞の輸送にも重要である。この役割は、これら分泌性オルガネラの同一性及び機能性の維持にとって重大な意味を持つ。
【００３４】
キネシンは偏在性で保存されたファミリーの50以上のタンパク質を定義し、１次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度および細胞機能に基づいた少なくとも8つのサブファミリに分類される。(概説は、Moore, J.D. および S.A. Endow (1996) Bioessays 18:207-219; および Hoyt, A.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:63-68を参照)。原型のキネシン分子は、2個のポリペプチド重鎖(KHC) と2個のポリペプチド軽鎖(KLC)からなるヘテロ四量体である。KHCサブユニットは通常「キネシン」と呼ばれる。KHCは長さが約１０００アミノ酸であり、KLCは長さが約５５０アミノ酸である。２つのKHCは二量体化して、３つの異なる２次構造領域を有する棒状分子を形成する。キネシン分子の一端は、ATP加水分解及び微小管結合において機能する球状のモータードメインである。キネシンモータードメインは高度に保存され、７０％を超える一致率を共有する。モータドメインの先には二量体化を媒介するα螺旋状コイルドコイル領域がある。キネシン分子の他端は、積荷分子に会合する扇形テイルである。テイルは、KHCのＣ末端と２つのKLCの相互作用により形成される。
【００３５】
キネシンのさらに分岐したサブファミリのメンバーはキネシン関連タンパク質(KRP)と呼ばれ、これらの多くは真核生物の有糸分裂の際に機能する(Hoyt、 前出)。いくつかのKRPは、有糸分裂紡錘体の集合に必要である。in vivo およびin vitro 分析ではこれらのKRPは紡錘体を構成する微小管上で力を出し、紡錘体極の分離を生じることが示唆されている。この活性のためには、KRPのリン酸化が必要である。紡錘体が集合できないと、有糸分裂が不成功に終わり染色体異数性が生じる。染色体異数性は癌細胞の特徴である。さらに、あるユニークなKRPであるセントロメアタンパク質Eではヒト有糸分裂染色体の動原体に局在化し、動原体の紡錘体の両極への分離に関与している可能性がある。
【００３６】
ダイナミン関連モータータンパク質
ダイナミンは、「分子ピンチ酵素（molecular pinchase）」として機能する大型のGTP分解酵素モータータンパク質で、膜を切断するために使われるメカノケミカル的力を発生する。この活性は、エンドサイトーシスで被覆ピットからクラスリン被覆小胞を形成するのに、また神経細胞のシナプス小胞の生成に重要である。ダイナミンが膜に結合すると、ダイナミンの螺旋状への自己集合をもたらし、その螺旋が平らな膜表面を締め付けてチューブ状にするように作用する。GTPの加水分解はダイナミンポリマーのコンフォメーション変化を誘導し、それが膜チューブを締め付けてその膜チューブの切断と膜小胞の形成をもたらす。GDPと無機リン酸の放出がダイナミンの解離をもたらす。ダイナミンは解離の後、膜から離れるか、または小胞に会合したままで細胞の他の領域に輸送され得る。いくつかのダイナミン関連タンパク質と共に、３つの相同なダイナミン遺伝子が発見されている。保存されたダイナミン領域は、N末端のGTP結合ドメイン、膜に結合する、中心のプレックストリン相同性ドメイン、ダイナミンのGTP分解酵素活性を活性化する可能性のある中心のコイルドコイル領域、および他のタンパク質のSH3ドメインに結合するいくつかのモチーフを含むC末端のプロリンリッチドメインである。いくつかのダイナミン関連タンパク質は、プレックストリン相同性ドメインやプロリンリッチドメインを含まない（McNiven, M.A. (1998) Cell 94:151-154; Scaife, R.M. および R.L. Margolis (1997) Cell. Signal. 9:395-401を参照）。
【００３７】
細胞骨格については、Lodish, H. 他 (1995) Molecular Cell Biology Scientific American Books, New York NYで概説されてある。
【００３８】
サイクリックヌクレオチドシグナル伝達
サイクリックヌクレオチド（cAMP及びcGMP）は、ホルモン、光及び神経伝達物質等のさまざまな細胞外信号を伝達する細胞内セカンドメッセンジャーとして機能する特に、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）は、さまざまなホルモン誘発性の細胞応答を含む殆どの哺乳動物細胞におけるcAMPの全効果の原因であると考えられている。目の中の視覚神経の興奮及び光信号の伝達はサイクリックGMPに調節されるCa2+特異性チャネルによって制御されている。これらさまざまな応答の仲介に関してサイクリックヌクレオチドの細胞内レベルが重要であるため、サイクリックヌクレオチドの合成と分解の調節は重要なことである。例えば、アドレナリンがβアドレナリン作動性受容体に結合することにより、AMPからcAMPを合成するアデニリルシクラーゼが活性化されて、筋肉内のcAMPレベルが増加する一方で、光受容体におけるcGMPレベルが増加し、グアニル酸シクラーゼが活性化され、これによってCa2+特異的チャネルの再開と目の中の暗状態が回復する。哺乳類アデニルシクラーゼには９つの膜貫通型アイソフォームと精巣内で優先的に発現される１つの可溶性の型が知られている。可溶性アデニリルシクラーゼは１つのPループ或いはヌクレオチド結合ドメインを有し、男性不妊に関与している可能性がある（Buck, J. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:79-84）。これと対照的に、cAMPとｃGMP特異的ホスホジエステラーゼ（PDE）によるサイクリックヌクレオチドの加水分解は、サイクリックヌクレオチドレベルの増加に仲介されるこれらおよびその他の効果の反対の効果をもたらす。PDEファミリーの多様性を考慮すると、このタンパク質はサイクリックヌクレオチドの調節に特に重要であるようだ。基質の特異性と親和性、補助因子への感受性、および抑制性薬剤への感受性に基づいて、少なくとも７つのファミリーの哺乳類PDE（PDE１〜７）が同定されている（Beavo, J.A. (1995) Physiol. Rev. 75:725-748）。PDEインヒビターは、様々な臨床的疾患を治療するのに特に有用であることがわかっている。PDE4インヒビターであるロリプラムは、抑鬱症の治療に用いられ、類似のインヒビターは抗炎症薬として評価が行われている。テオフィリンは、気管支喘息およびその他の呼吸器疾患の治療に用いられる非特異的PDEインヒビターである（Banner, K.H. および Page, C.P. (1995) Eur. Respir. J. 8:996-1000）。
【００３９】
発現プロファイル作成
マイクロアレイはバイオアナリシスに使われる分析ツールである。マイクロアレイは複数の分子を有し。それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび/または抗体のマイクロアレイが開発されており、遺伝子配列決定、遺伝子発現のモニタリング、遺伝子マッピング、細菌の同定、薬物発見およびコンビナトリアル化学のような種々の応用において利用されている。
【００４０】
特にマイクロアレイが利用できる一つの領域は遺伝子発現解析である。  アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００４１】
細胞骨格結合タンパク質に関する疾患
アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、老人斑と、神経原線維変化との形成である。これらは、アミロイドβペプチドを含む。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。アルツハイマー病の早期に、生理学的変化が帯状皮質に見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。進行したアルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。
【００４２】
180,000例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(K. Gish (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率はきわめて高い(97％)。これに対して、疾患のステージが進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロフィールを開発する努力がなされている。このプロフィールを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752）。
【００４３】
乳癌は乳房上皮細胞における突然変異によって通常生じる遺伝疾患である。  ２種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が、女性の乳癌の大きな素因であることが知られており、これらの変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし、このタイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約５％〜９％であり、大多数の乳癌の原因は乳房上皮細胞で生じる非遺伝性突然変異である。
【００４４】
乳癌に関連する特定の遺伝子の発現についてはかなりのことがすでにわかっている。例えば、上皮細胞成長因子(EGF)とその受容体（EGFR）と、ヒト乳癌との関係は特によく研究されている。(この領域の概説については前出のKhazaie 他およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。)EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方調節と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇することから、EGFRは腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それは、EGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリ（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu, HER-3およびHER-4）およびそれらのリガンドが乳癌において豊富に存在するということは乳癌の病原におけるそれらの機能的重要性を示唆しており、したがって乳癌治療の標的となり得る(Bacus, S. S. 他 (1994) Am J Clin Pathol 102:S13-S24)。その他の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzled タンパク質の mRNA（乳房腫瘤では下方調節される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現される)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸癌、乳癌、前立腺腫瘍で低下する)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方調節）、およびCaN19（S100蛋白ファミリのメンバーであり、このファミリは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方調節される）がある(Zhou, Z. 他 (1998) Int J Cancer 78:95-99; Chen, L 他 (1990) Oncogene 5:1391-1395; Ulrix W 他(1999) FEBS Lett 455:23-26; Sager, R 他(1996) Curr Top Microbiol Immunol 213:51-64; 及び Lee, S.W. 他 (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:2504-2508)。
【００４５】
種々の病期のヒト乳癌乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスの研究に有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を、長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他 (1998) Clin Cancer. Res 4:2931-2938).このようなモデルが特に有用なのは、悪性転換の種々の段階におけるヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、比較する場合である。
【００４６】
肺癌は米国における癌死亡の主要原因となっており、毎年男性100,000 人、女性50,000 人以上が影響を受けている。肺癌と診断された患者のほとんど90%が喫煙者である。タバコの煙には暴露された気管支上皮において発癌物質代謝酵素および共有結合性DNA付加体形成を誘発する有害物質がたくさん含まれている。肺癌と診断された患者のほとんど80%においてすでに転移が生じている。大部分の一般的肺癌は胸膜、脳、骨、心膜、および肝臓に転移する。手術、放射線療法、または化学療法で治療するかの決定は腫瘍組織学、成長因子またはホルモンへの応答および阻害剤あるいは薬物に対する感受性に基づいて行われる。現在の治療では大部分の患者が診断の一年以内に死亡する。肺癌の早期診断、および同定、病期および治療に対する系統的アプローチは患者への結果をポジティブなものにし得る。
【００４７】
肺癌は、過形成から侵襲性癌への一連の形態学的に固有の段階を通して進行する。悪性の肺癌は四つの組織病理学的なクラスからなる２つのグループに分かれる。Non Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC) (非小細胞肺癌)群は扁平上皮細胞癌、腺癌および大細胞癌を含み、すべての肺癌症例の約70%を占める。腺癌は通常、末梢気道に生じ、ムチン分泌腺を形成する。扁平上皮細胞癌は一般に、近位気道に発症する。扁平上皮細胞癌の組織形成は慢性炎症と、気管支上皮の損傷に関連し、扁平〔上皮〕化生につながる。Small Cell Lung Carcinoma (SCLC) 群は肺癌症例の約20%を占める。SCLCは一般的に近位の気道に発症し、副腎皮質刺激ホルモンおよび抗利尿ホルモンの不適切な産生などの多くの腫瘍随伴症候群を示す。
【００４８】
肺癌細胞は多くの遺伝的病変を蓄積し、その多くは、細胞学的に明らかな染色体異常を伴う。肺癌に随伴する染色体欠失の頻度が高いことはこの疾患の病因において複数の癌抑制遺伝子座の関与を示し得る。染色体３の短腕の欠失は症例の90%以上に見られ、肺癌につながる最も早期の遺伝子病変の一つを示す。染色体腕９pおよび17pにおける欠失もまた一般的である。その他のしばしば見られる遺伝的病変にはテロメラーゼの過剰発現、K-ras やc-mycなどの発癌遺伝子の活性化、またRB、 p53 および CDKN2のような癌抑制遺伝子の不活性化がある。
【００４９】
肺癌において差次的に制御される遺伝子が種々の方法によって同定されている。
【００５０】
mRNAディファレンシャルディスプレイ技術を用いて、Manda, R.他 (1999; Genomics 51:5-14) は正常気管支上皮細胞に比べて肺癌細胞系に差次的に発現される５つの遺伝子を同定した。既知の遺伝子の間で、肺胞界面活性物質のアポプロテインAおよびアルファ２マクログロブリンは下方制御され、他方、nm23H1は上方制御される。Petersen, S. 他(2000; Int J. Cancer, 86:512-517) はサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて、肺腫瘍由来細胞系に差次的に発現された552のクローンを同定した。その中の205は既知の遺伝子を示した。既知の遺伝子の間で、トロンボスポンジン1、フィブロネクチン、細胞内接着分子1およびサイトケラチン6と18は肺癌において差次的に発現されることが以前に観察されていた。Wang, T. 他(2000; Oncogene 19:1519-1528) はマイクロアレイ解析とサブトラクティブハイブリダイゼーションを併用して正常肺上皮と比べて扁平細胞癌に差次的に過剰発現された17の遺伝子を同定した。彼らが同定した既知の遺伝子の間でケラチンアイソフォーム6、KOC、SPRC、IGFb2, コネキシン 26、 plakofillin 1 およびサイトケラチン 13であった。
【００５１】
細胞増殖異常、ウイルス感染および神経疾患の診断、予防および治療のための核酸およびタンパク質を含む新規の組成物のため技術上必要性がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００５２】
本発明の様々な実施例において、総称して「SCAP」、個別にはそれぞれ「SCAP-1」、「SCAP-2」、「SCAP-3」、「SCAP-4」、「SCAP-5」、「SCAP-6」、「SCAP-7」、「SCAP-8」、「SCAP-9」、「SCAP-10」、「SCAP-11」、「SCAP-12」、「SCAP-13」、「SCAP-14」、「SCAP-15」、「SCAP-16」、「SCAP-17」、「SCAP-18」、「SCAP-19」、「SCAP-20」、「SCAP-21」、「SCAP-22」、「SCAP-23」、「SCAP-24」及び「SCAP-25」と呼ぶ構造および細胞骨格結合タンパク質である精製されたポリペプチドを提供し、これらのタンパク質およびこれらのコードするポリヌクレオチドを疾患および医学上の状態の検出、診断および治療に利用する方法を提供する。実施例はまた、効力、用量の決定、毒性および薬理などの薬物開発過程の促進に精製された構造および細胞骨格結合タンパク質および/またはそれらのコードするポリヌクレオチドを利用するための方法を提供する。関連する実施例によって、疾患および医療上状態の調査および病原性を調べるために精製された構造および細胞骨格結合タンパク質またはそれらのコードするポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
【００５３】
或る態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一態様では、SEQ ID NO:1-25のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００５４】
なお、他の実施例は（ａ）SEQ ID NO:1-25（配列番号1乃至２5）を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片を含むポリペプチドをコードするような単離されたポリヌクレオチドを提供する 一実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-25を有する群から選択したポリペプチドをコードする。 別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:26-50（配列番号26乃至50）を有する群から選択される。
【００５５】
更に、他の実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に結合したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。 一実施態様では、組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。なお、他の実施例によって、組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物体を提供する。
【００５６】
他の実施例では、（ａ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｂ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一である、または少なくともほぼ90%同一である、或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、（ｃ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、（ａ）或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００５７】
なお、他の実施例は、(a)SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一である、または少なくと主ほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００５８】
更になお、他の実施例は、（ａ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である。或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。その他の実施例において、ポリヌクレオチドは少なくともほぼ 20、30、40、60、80または 100の連続するヌクレオチドを有し得る。
【００５９】
なお、他の実施例は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、前記標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である、或る天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。関連する実施例において、この方法にハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含め得る。更に、その他の実施例において、プローブは少なくともほぼ 20、30、40、60、80または 100の連続するヌクレオチドを有し得る。
【００６０】
更になお、他の実施例は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。 ここで、前記標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である、或る天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。この検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。関連する実施例において、この方法に増幅された標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量を検出することを含め得る。
【００６１】
他の実施例は、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む成分を提供する。 有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列、（ｂ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、またはほぼ90%同一である、或る天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-25を有する群から選択したアミノ酸配列の免疫抗原性断片からなる群れから選択される。一実施例では、組成物はSEQ ID NO:1−25からなる群から選択されたアミノ酸配列を含み得る。 他の実施例は、機能的SCAPの発現の低下または異常発現に関連する疾患や症状の治療方法を提供し、そのような治療の必要な患者にこの組成物を投与することを含む。
【００６２】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程とを含む。他の実施例は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更に他の実施例は、機能的SCAPの発現の低下に関連した疾患や症状の治療方法を提供し、また、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００６３】
なお、他の実施例は更に、（ａ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列の生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1−25からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択されたポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを有するサンプルを化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。他の実施例は、この方法で同定されたアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更に他の実施例は、機能的SCAPの過剰発現に関連した疾患や症状の治療方法を提供し、また、そのような治療を必要とする患者にこの組成物を投与することが含まれる。
【００６４】
他の実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-25からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００６５】
更に、他の実施例は、（ａ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1−25を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。 スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドの活性が許容された条件下で、ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合させる過程と、（ｂ）ポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性と、試験化合物の不存在下でのポリペプチドの活性とを比較する過程とを含み、試験化合物の存在下でのポリペプチドの活性の変化は、ポリペプチドの活性を調節する化合物であることを意味する。
【００６６】
更になお、他の実施例は、SEQ ID NO:26−50からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を変化させるのに効果的な化合物をスクリーニングする方法を提供し、その方法には、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の変化を検出する過程と、（c）可変量の化合物の存在下と化合物の非存在下で標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程が含まれる。
【００６７】
他の実施例は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。（ａ）核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。（ｂ）処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。（i）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である天然のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:26-50からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である、または少なくともほぼ90%同一である天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチドの断片を持つことができる。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸及び方法について説明する前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明の実施例が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００６９】
補足請求および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００７０】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明の種々の実施例で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００７１】
（定義）
用語「SCAP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などからの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得た、実質的に精製されたSCAPのアミノ酸配列を指す。
【００７２】
用語「アゴニスト」は、SCAPの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。このアゴニストは、SCAP に直接相互作用するか、或いはSCAP が関与する生物学的経路の成分と作用して、SCAP の活性を調節するタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【００７３】
「対立遺伝子変異体／変異配列」は、SCAPをコードする、別の形態の遺伝子である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変容したmRNAまたはポリペプチドを作製し得る。その構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独或いは他の変化と共に所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【００７４】
SCAP をコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、SCAP と同じポリペプチド、或いはSCAP の機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、SCAPをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体の遺伝子座ではない位置での対立遺伝子変異配列との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーション、並びにSCAPをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なSCAPとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にSCAP の活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００７５】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【００７６】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅は当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術か、あるいは他の核酸増幅技術を用いて行う。
【００７７】
用語「アンタゴニスト」は、SCAPの生物学的活性を阻害或いは減弱する分子である。アンタゴニストとしては、抗体などのタンパク質、anticalin、核酸、糖質、小分子またはその他の任意の化合物や組成物を挙げることができるが、これらはSCAP  と直接相互作用することによって、或いはSCAP が関与する生物学的経路の構成エレメントに作用することによって、SCAPの活性を調節する。
【００７８】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFaｂ、F(ab')2 及びFv断片を指す。SCAP ポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、そのままのポリペプチド、または関心のある小ペプチドを含む断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラット、ウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、所望によりキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合その結合ペプチドは、動物を免疫化するために用いる。
【００７９】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体への結合において無損傷抗原（即ち免疫応答を誘発するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００８０】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模な組み合わせライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド構成要素は修飾された糖基(例えば、リボヌクレオチドの2'-OH 基が2'-F または 2'-NH2で置換されている)を有することが可能で、これらの糖基は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性あるいは血中でのより長い寿命など、望む性質を改善しうる。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Brody, E.N. および L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【００８１】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系は、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現させるために使われている（Blind, M.他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【００８２】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチドを含むアプタマーは、右旋性のヌクレオチドを含む基質に通常作用する天然の酵素による分解に耐性がある。
【００８３】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾されたバックボーン連結たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表現は、或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【００８４】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え体、または合成のSCAPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００８５】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'-AGT-3'」は、相補配列「3'-TCA-5'」と対合する。
【００８６】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。SCAP 若しくはSCAP の断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成要素（例えばデンハート液、粉乳、サケの精子のDNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００８７】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（GCG, Madison, WI）か、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００８８】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
【００８９】
2005500830.tif 000002
【００９０】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやαヘリックス構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分が保持される。
【００９１】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００９２】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって誘導起源のポリペプチドの、少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって修飾されたポリペプチドである。
【００９３】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【００９４】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００９５】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定したサブストラクチャー群の新たな組み合わせによって、新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００９６】
用語「断片」は、SCAP またはSCAP をコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列と同一であるがその配列より長さが短いものを指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、ほぼ５〜ほぼ１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００９７】
SEQ ID NO:26−50の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:26−50を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。例えば、、ハイブリダイゼーション、増幅技術および、関連するポリヌクレオチドからSEQ ID NO:26-50 を区別するような類似の方法等のように、発明の方法の実施態様の一つ以上にSEQ ID NO:26-50 の断片を利用することができる。SEQ ID NO:26-50の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:26-50の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００９８】
SEQ ID NO:1−25のある断片は、SEQ ID NO:26−50のある断片によってコードされる。SEQ ID NO:1−25のある断片は、SEQ ID NO:1−25を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO:1−25のある断片は、SEQ ID NO:1−25を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用いられ得る。SEQ ID NO:1−25のある断片の正確な長さ及びその断片に相当するSEQ ID NO:1−25の領域は、本明細書に記載する複数の解析的方法、あるいは、当業者の公知の方法を用いて、その断片に対する意図した目的に基づき決定することが可能である。
【００９９】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１００】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１０１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「一致％」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１０２】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)は当業者に公知の、または本明細書に記載した一つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用いて決定され得る。例えば、一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G. 及び P.M. Sharp (1989) CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリヌクレオチド配列対間の「percent similarity(類似率)」として一致率を報告する。
【０１０３】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして対話形式で利用することが可能である。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及び他のパラメータをデフォルト設定に設定して用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１０４】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１０５】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１０６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１０７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「一致性％」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。
【０１０８】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズでアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドのアラインメントと同様に、アラインメントされたポリペプチド配列の対の一致率は、CLUSTAL Vによって「percent similarity（類似性パーセント）」として報告される。
【０１０９】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年４月２１日)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１０】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１１１】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１１２】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１１３】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１１４】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに対する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。許容条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更することができる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１１５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの下で、完全に一致するプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１１６】
本発明の、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対する高ストリンジェンシー条件には、約０.２×SSC及び約１％のSDS存在下で約６８℃において１時間の洗浄条件が含まれる。或いは、約６５℃、６０℃、５５℃または４２℃の温度で行ってもよい。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションに有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１１７】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析など）。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１１８】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはポリヌクレオチド配列の変化を指す。
【０１１９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１２０】
「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物などの生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、SCAPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片である。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用なSCAPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を含む。
【０１２１】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
【０１２２】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０１２３】
用語「調節」は、SCAPの活性の変化を指す。例えば、調節によって、SCAPのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起こる。
【０１２４】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１２５】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１２６】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１２７】
SCAPの「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他の当分野で既知の修飾を含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、SCAPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１２８】
「プローブ」とは、同一、或いは対立遺伝子核酸、関連する核酸の検出に用いる、SCAPやそれらの相補物またはそれらの断片をコードする核酸のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸の増幅（および同定）に用い得る。
【０１２９】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１３０】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J.他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻、Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M.他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１３１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために当技術分野でよく知られているソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各１００ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって３２キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有であって保存されたオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片の同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１３２】
「組換え核酸」は、天然の核酸ではなく、配列の２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列を有する核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、核酸の一部が単に付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１３３】
あるいはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１３４】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１３５】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１３６】
DNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１３７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。SCAP、SCAPをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１３８】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識するものが存在するか否かに依存している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
【０１３９】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０１４０】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１４１】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１４２】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１４３】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１４４】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の生物であり、限定するものではないが動植物を含み、生物の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することにより、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスの感染によって行う。他の実施例において、核酸はレンチウイルスベクターのような組換えウイルスベクターを用いた感染によって導入することができる(Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989)等の参考文献に記載されている。
【０１４５】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40％の配列同一性を有する核酸配列であると定義する。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子とかなりの相同性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互にかなりのアミノ酸相同性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間で特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が異なる。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１４６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１４７】
（発明）
本発明の種々の実施態様には、新規のヒト構造および細胞骨格結合タンパク質（SCAP）の発見、SCAPをコードするポリヌクレオチド、および、細胞増殖異常、ウイルス感染、および神経系疾患の診断、治療、ならびに予防に対するこれらの組成の使用に基づいている。
【０１４８】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの具体例の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１４９】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO :）と最も近いPROTEOME データベース相同体のPROTEOME データベース識別番号 (PROTEOME ID NO:) を示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１５０】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列７は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１５１】
表２及び表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それらの特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが構造および細胞骨格結合タンパク質であることを確立している。例えば、SEQ ID NO:6は、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で決定されるようにラットneurabin II(GenBank ID g2853592) とM1残基からT817残基まで95％同一である（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:6はまた、膜貫通受容体のリガンドに結合するPDZドメインをも含む。 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFSおよび BLAST 解析からのデータは、SEQ ID NO:6 がアクチン細胞骨格の原形質膜への連結において重要な役割を果たすニューラビン（neurabin）/spinophilinタンパク質である、さらに実証的証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:9はM1残基からC766残基まで、ラットアクチンフィラメント結合タンパク質Frabin (GenBank ID g3342246) と83％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:9はまた、FYVE亜鉛フィンガー、PHおよびRhoGEF ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:9が細胞骨格結合タンパク質であることを示す更に確証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:11はヒトのサイトケラチン18 (GenBank ID g34037) )とT8残基からE414残基まで88％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.7e-158であり、これは偶然に観測されたポリペプチド配列を得る確率を示す。SEQ ID NO:11はまた、中間径フィラメントドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:11 が中間体フィラメントタンパク質リガーゼである、さらに実証的な証拠を提供する。別の実施例において、SEQ ID NO:13 がヒトアクチン結合二重亜鉛フィンガータンパク質(GenBank ID g2337952)にP44残基からD525残基まで57%、またK584残基からF648残基まで70%同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって決定された(表２参照)。BLAST確率スコアは4.6e-172であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:13はまた、LIMおよびビリンドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。MOTIFからのデータ、およびPRODOMとDOMOのデータベースのPROFILE解析とBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:13が細胞骨格結合タンパク質である、さらに確証的な証拠を提供する。別の例において、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)��よって決定されるようにSEQ ID NO:16 はA68残基からV529残基までヒトのプラコグロビン(GenBank ID g10334699) に23%同一である(表2参照)。BLAST確率スコアは1.3e-13であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:16はまた、プラコグロビンにも見られる、アルマジロ/ベータカテニン様リピートを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。DOMOデータベースを用いるBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:16がプラコグロビン様タンパク質であることをさらに確証する証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:20はM1残基からS201残基まで、塩基性へリックス・ループ・へリックス転写因子 (GenBank ID g998899) と93％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.5e-99であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:20はまた、へリックス・ループ・へリックスDNA結合ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFS及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:20 が細胞骨格結合タンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:1-5、SEQ ID NO:7-8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14-15およびSEQ ID NO:17-19 およびSEQ ID NO:21-25は同様にして解析し、注釈付けをされた。SEQ ID NO:1-25の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１５２】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチドの具体例は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに使われたｃDNA配列および／またはゲノム配列のヌクレオチド開始位置（5'）と停止位置（3'）、およびSEQ ID NO:26-50 を同定するか、またはSEQ ID NO:26-50と、関連するポリヌクレオチド配列とを区別する技術(例えば、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術)に有用なポリヌクレオチドの断片のヌクレオチド開始位置(5')と終了位置(3')を示す。
【０１５３】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は、具体的にはたとえば組織特異的なｃDNAライブラリまたはプールされたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合がある。或いは列２に記載したポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１５４】
あるいは、接頭コードは手作業で編集されたか、ゲノムDNA配列から予測されたか、または配列解析方法の組み合わせから由来している構成配列を同定する。次の表は構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する同じ配列の分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2005500830.tif 000003
【０１５５】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１５６】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記のポリヌクレオチドをアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１５７】
本発明はまた、SCAP の変異体も含む。好適なSCAP の変異体は、SCAP アミノ酸配列に対して、少なくとも約80％、あるいは少なくとも約90％、さらには少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有し、SCAP の機能的または構造的特徴を少なくとも1つ含む変異体である。
【０１５８】
種々の実施態様もまた、SCAPをコードするポリヌクレオチドをも含む。特定の実施例において、本発明は、SCAPをコードするSEQ ID NO:26−20からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:26-50のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１５９】
本発明はまた、SCAPをコードするポリヌクレオチドの変異体を含む。特に、このような変異体ポリヌクレオチドは、SCAPをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約70%または、少なくとも約85％、あるいは、少なくとも約95%ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:26-50からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するようなSEQ ID NO:26-50からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、SCAPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１６０】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体はSCAPをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異配列である。スプライス変異体は、SCAPをコードするポリヌクレオチド配列と有意な配列同一性をもつ部分を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって生じるブロックの配列の追加または欠失のため、その変異体は通常、より多くまたはより少数のヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、SCAPをコードするポリヌクレオチドに対して、その全長の７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、SCAPをコードするポリヌクレオチド配列の各部に対して少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有する。例えば、SEQ ID NO:49の配列を含むポリヌクレオチドはSEQ ID NO:32の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:50の配列を含むポリヌクレオチドはSEQ ID NO:38の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異配列は何れも、SCAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１６１】
遺伝暗号の縮重により、SCAPをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され得、中には、いかなる既知の自然発生する遺伝子のポリヌクレオチド配列とも最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組み合わせは、天然のSCAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されているとみなす。
【０１６２】
SCAPとその変異配列群とをコードするポリヌクレオチド群は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然SCAPをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能であるが、非天然コドンを含むなど実質的に異なるコドン使用を有する、SCAPあるいはその誘導体をコードするポリヌクレオチド群を産生することは有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択し得る。コードされたアミノ酸配列を変えないで、SCAP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する他の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１６３】
本発明はまた、SCAP及びその誘導体をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出す過程も含む。作製後にこの合成ポリヌクレオチドを、当分野で公知の試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、SCAPまたはその任意の断片をコードするポリヌクレオチドの中に突然変異を導入することも可能である。
【０１６４】
更に本発明の実施態様は、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:26-50及びそれらの断片群に示された配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１６５】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１６６】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、SCAPをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(例えば、 Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318--322を参照)。別の方法にインバースPCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(例えば、Triglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している。（Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic 1:111-119等を参照）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１６７】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、しばしば遺伝子の５'領域を有する配列を含み、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１６８】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで活性化されるフルオロフォア（蛍光色素）と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１６９】
本発明の別の実施態様では、SCAP をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、SCAP 、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号に固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリヌクレオチドをコードする別のポリヌクレオチドが作られ、これらの配列をSCAPの発現に利用可能である。
【０１７０】
種々の目的で、SCAPをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１７１】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリングシャッフリング技術を用いてシャッフリングして、生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのSCAPの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所与の遺伝子を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝多様性を、示された方法及び制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１７２】
別の実施例によれば、SCAPをコードするポリヌクレオチドは、当分野で公知の複数の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser.225-232を参照）。あるいは、SCAP自体またはその断片を当分野で既知の化学的方法を用いて合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY,  55-60ページ、Roberge, J.Y. 他 (1995) Science 269:202-204等を参照）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にSCAPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または他のタンパク質の配列または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１７３】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る（例えばChiez, R.M.およびF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421を参照）。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認できる。（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０１７４】
生物学的に活性なSCAPを発現させるために、SCAPをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。 この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコード配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びSCAPをコードするポリヌクレオチドにおけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、SCAPをコードするポリヌクレオチドのより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。SCAP をコードするポリヌクレオチド配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162を参照)。
【０１７５】
当業者に周知の方法を用いて、SCAP をコードするポリヌクレオチド、好適な転写及び翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換え技術がある(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章、8章及び１6-17章、Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,9章、13章及び16章等を参照)。
【０１７６】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、SCAPをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある。（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G. 及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、Engelhard、E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J. 他T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815、McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０１７７】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、SCAPをコードするポリヌクレオチド群の使用目的に応じて選択できる。例えば、SCAP をコードするポリヌクレオチドの日常的なクローニング、サブクローニングおよび増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。SCAP をコードするポリヌクレオチドをこのベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(例えば、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509を参照)。抗体の産生などのために多量のSCAPが必要な場合は、SCAPの発現を高レベルで誘導するベクターが使用し得る。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを含むベクターが使用できる。
【０１７８】
SCAPの産生に酵母発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か、または細胞内での保持かのどちらかを誘導するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(例えば、Ausubel, 1995,前出、Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-544、及びScorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 121−181-184.を参照)。
【０１７９】
植物系を使用してSCAPを発現することも可能である。SCAPをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えば、Coruzzi, G. 他 (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. 他 (1984) Science 224: 838-843; および Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17 : 85-105を参照）。これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０１８０】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、SCAPをコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの非必須のE1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞内でSCAPを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J. および T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１８１】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNAの断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている（例えばHarrington, J.J.他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照）。
【０１８２】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるSCAP+の安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、SCAPをコードするポリヌクレオチドを株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素や、同じベクター上に或いは別のベクター上に選択マーカー遺伝子を含み得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０１８３】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他. (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他. (1980) Cell 22:817-823等を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える( Wigler, M. 他 (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F. 他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14 等を参照。)この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDが、文献に記載されている(Hartman, S.C及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０１８４】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、SCAPをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、SCAPをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定できる。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がSCAPをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１８５】
一般に、SCAPをコードするポリヌクレオチドを含み且つSECPを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNAハイブリダイゼーション或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０１８６】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いる、SCAPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で既知である。このような技法には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などがある。SCAP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ等を参照）。
【０１８７】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。SCAPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、SCAPをコードするポリヌクレオチド群、またはその任意の断片群を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングできる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１８８】
SCAPをコードするポリヌクレオチド群で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。SCAP をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過してのSCAP の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１８９】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞装置および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０１９０】
本発明の別の実施例では、SCAP をコードする天然のポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチド、または組換えのポリヌクレオチドを上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラSCAP タンパク質が、SCAP 活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質が、SCAP をコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を持つように遺伝子操作すると、精製後にSCAP が異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１９１】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したSCAP の合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１９２】
本発明のSCAPまたはその断片を用いて、SCAPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。SCAPに対する特異的結合について、一つ以上の試験化合物をスクリーンすることができる。種々の実施例において、SCAPに対する特異結合について、1、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 50、 100 または 200 の試験化合物をスクリーンすることができる。試験化合物の例として、抗体、アンティカリン(anticalins)、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０１９３】
関連する実施例において、SCAP、SCAPの変異体、あるいはSCAPおよび／または１つ以上のSCAP変異体とのある組み合わせへの試験化合物（抗体等）の結合/をスクリーニングするために、SCAP変異体を用いることができる。ある実施例においては、SEQ ID NO:1-25の配列の正確な配列を有するSCAPではなく、SCAPの変異体に結合する化合物のスクリーニングにSCAP の変異体を用いることができる。このようなスクリーニングを行うために使うSCAP変異体はSCAPに約50%から約99%の範囲で配列同一性を有し得る。また、種々の実施例で60%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%,および 95%の配列同一性を有することができる。
【０１９４】
ある実施例では、SCAPへの特異結合の試験において同定された化合物は、SCAPの天然のリガンド（例えば、リガンドやその断片、天然の基質、構造的または機能的な擬態物質、または自然結合パートナー）に密接に関連し得る。  （Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。別の実施態様では、こうして同定した化合物は、受容体SCAPの天然リガンドであり得る。(例えばHoward, A.D. 他(2001) Trends Pharmacol. Sci.22:132-140; Wise, A.他 (2002) Drug Discovery Today 7:235-246.)
別の実施態様で該化合物は、SCAPへの特異結合に対するスクリーニングにおいて同定された化合物は、SCAPが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に密接に関連し得る。例えば、この化合物はシグナルを伝播できるSCAP の或る受容体、あるいは、シグナルを伝播できないSCAP の或るデコイ受容体であり得る(Ashkenazi, A. 及びV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol. 11:255-260; Mantovani, A. 他 (2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Immunex Corp., Seattle WA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは或る操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体二量体であり、ヒトIgG1のFc部分に連結されている。
【０１９５】
一実施例においては、類似または異なる特異性を有する2つ以上の抗体のSCAP、SCAPの断片、またはSCAPの変異体への特異的結合についてスクリーニングし得る。このようにしてスクリーニングされた抗体の結合特異性は、その特異的結合によって、SCAPの特定の断片または変異体を同定することができる。一実施例において、抗体の結合特異性によって、SCAPの特定の断片または変異体の選択的同定が可能となるように抗体を選択することができる。他の実施例において、或る抗体を、その結合特異性によってSCAPの産生の増加、減少または異常な特定の疾患または病状の選択的診断が可能となるように選択することができる。
【０１９６】
ある実施例において、アンティカリン(anticalin)のSCAP、SCAPの断片、あるいはSCAPの変異体に対する特異的結合をスクリーニングし得る。アンティカリンはリポカリン足場(scaffold )に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184; Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリンのタンパク質構造には、その開放末端に４つのループを支持する８つの逆平行ベータ鎖を持つベータバレルが含まれ得る。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０１９７】
一実施態様では、SCAP に特異的に結合、刺激、あるいは阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でSCAP を発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。SCAP を発現する細胞、またはSCAP を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、結合や、SCAP または該化合物の何れかの、刺激または活性の阻害を分析する。
【０１９８】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたSCAPと混合させるステップと、SCAPとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出および測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１９９】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(例えばMatthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30を参照)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(例えばCunningham, B.C. および J.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988.)。
【０２００】
SCAPまたはその断片、あるいはSCAPの変異体を用いて、SCAPの活性を変調する化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。ある実施態様では、SCAP の活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をSCAP と混合し、試験化合物の存在下でSCAP の活性を試験化合物不在下でのSCAP の活性と比較する。試験化合物の存在下でのSCAPの活性の変化は、SCAPの活性を変調する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をSCAP の活性に適した条件下でSCAP を含むin vitroすなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、SCAP の活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２０１】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、SCAPまたはその哺乳類相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換される。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０２０２】
SCAPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他 (1998) Science 282:1145-1147）。
【０２０３】
SCAP をコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、SCAP をコードするポリヌクレオチドのある領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別の実施例として、例えばSCAPを乳汁内に分泌するなどSCAPを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２０４】
（治療）
SCAP の領域と構造および細胞骨格結合タンパク質の領域との間に、例えば配列及びモチーフの内容における化学的及び構造的類似性が存在する。また、SCAP を発現する組織の例は、表６を見られたい。また、実施例11をも見られたい。このように、SCAP は、細胞増殖異常、ウイルス感染症および神経疾患において或る役割を果たすと考えられる。SCAP の発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、SCAP の発現または活性を低下させることが望ましい。また、SCAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、SCAP の発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２０５】
従って、一実施態様では、SCAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にSCAP またはその断片や誘導体が投与され得る。限定するものではないが、このような疾患には、たとえば細胞増殖異常としては日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌等の癌があり、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、ウイルス感染症としては、アデノウイルス（急性呼吸疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎）、ブニャウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（ヘルペス単純ウイルス、水痘・帯状ウイルス、エプスタイン バーウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、乳頭腫ウイルス（癌）、パラミクソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、およびトガウイルス（脳炎、風疹）によって起こされる感染症が含まれ；  神経の疾患としては、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神薄弱およびその他の中枢神経系性発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、およびトゥーレット病が含まれる。
【０２０６】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、SCAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SCAP またはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２０７】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSCAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたSCAP を含む組成物を好適な医薬用担体と共に被験者に投与することも可能である。
【０２０８】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、SCAP の発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SCAP の活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２０９】
更なる実施態様では、SCAP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にSCAP のアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、ウイルス感染症、および神経系疾患が含まれる。一実施態様では、SCAPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはSCAPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的化機構、或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２１０】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むSCAP の発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、SCAP をコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０２１１】
他の実施態様において、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補的配列、またはベクタは他の適切な治療剤と併用して投与し得る。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２１２】
SCAP のアンタゴニストは、当分野で一般に既知の方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたSCAP を用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、SCAP と特異結合するものを同定し得る。SCAP への抗体も、当分野で周知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において利点を持つようであり、免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発においても利点を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２１３】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、SCAP または任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２１４】
SCAP に対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましい。SCAP アミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２１５】
SCAP に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D.他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２１６】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発された技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452-454を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、SCAP特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２１７】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G. 他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２１８】
SCAP に対する特異的な結合部位を含む抗体も得ることができる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる（Huse, W.D. 他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照）。
【０２１９】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、SCAP とその特異性抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性SCAP エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２２０】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、SCAPに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表す。Kaの定義は、平衡状態下の、SCAP抗体複合体のモル濃度を、遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なSCAP エピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したＫａは、SCAP に対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のSCAP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、SCAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７liter／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、SCAPが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. および Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０２２１】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質および適性を決定することができる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、SCAP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan 他の文献等を参照）。
【０２２２】
本発明の別の実施例では、SCAPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、SCAPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片を、SCAPをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(例えばAgrawal, S., ed. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJを参照。)
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（Slater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475 及び Scanlon, K.J. 他 (1995)9(13):1288-1296等を参照）。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51(1):217-225、Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他 (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736.等を参照）。
【０２２３】
本発明の別の実施例では、SCAP をコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他 (1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G.他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, 35  R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. and Somia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E.他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生菌、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原生動物寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。SCAP の発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からSCAP を発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２２４】
本発明の更なる実施態様では、SCAP の欠損による疾患や障害を、SCAP をコードする哺乳類発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってSCAP 欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、および（v）DNAトランスポゾンの使用がある（Morgan, R.A. および W.F. Anderson（1993）Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.（1997）Cell 91:501-510; Boulay, J-L. およびH. Recipon（1998）Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）。
【０２２５】
SCAP の発現に効果的である発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、 PRCCMV2、PREP、 PVAX, PCR2-TOPOTA ベクター (Invitrogen, Carlsbad CA)、 PCMV-SCRIPT、 PCMV-TAG、PEGSH/PERV (Stratagene, La Jolla CA)およびPTET-OFF、PTET-ON、 PTRE2、 PTRE2-LUC、 PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。SCAP は、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えばサイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）またはβアクチン遺伝子）、(ii)誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. and H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. ら (1995) Science 268:1766-1769、Rossi, F.M.V. and H.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456）、市販のInvitrogen社のT-REXプラスミドに含まれる）、エクジソン誘導性プロモーター（Invitrogen社のプラスミドPVGRXR及びPINDから得られる）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーターまたはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（前出のRossi, F.M.V. and H.M. Blau）、または（iii）正常個体由来の、SCAP をコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いて、発現させることができる。
【０２２６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPERFECT LIPID TRANSFECTION KIT）を用いれば、当業者は経験にそれほど頼らないでもポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に導入することが可能になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２２７】
本発明の別の実施例では、SCAP の発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でSCAP をコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。 上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株群を得る方法が開示されており、引用を以て本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２２８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、SCAP の発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞にSCAP をコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他 (1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544 及び Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２２９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、SCAP の発現に関して１以上の遺伝子異常を持つ標的細胞に、SCAP をコードするポリヌクレオチド類を送達する。単純ヘルペスウイルス（HSV）系ベクター類の使用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にSCAP を導入する場合に、特に有用である。ヘルペス系ベクターの作製及びパッケージングは、当業者に公知である。 複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターは、レポーター遺伝子を霊長類の眼に送達するために用いられてきた（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。 米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532 及び Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なったセグメント群を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２３０】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてSCAP をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、SCAPのコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のSCAPをコードするRNAが産生され、高いレベルでSCAPが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群において持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他 (1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にSCAP を導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２３１】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するため有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E.他 (1994) in: Huber、B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するように設計することができる。
【０２３２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、SCAPをコードするRNA分子の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒し得る。
【０２３３】
任意のRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対して標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２３４】
相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成のために当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、RNA分子は、SCAPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によって産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２３５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするために、RNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を加える。
【０２３６】
本発明の更なる実施例は、SCAPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現の改変に効果的な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、SCAP の発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、SCAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、SCAP の発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、SCAP をコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２３７】
或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、少なくとも１個、または複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変えるのに有効であるとされている化合物の化学的修飾、天然または非天然の化合物の既存の、市販または私的なライブラリからの選択、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインすること、および組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリからの選択がある。SCAP をコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。SCAP をコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、SCAP をコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異的ポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物のスクリーニングは、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行うことができる。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性を調べるためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド等）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関する（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２３８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照）。
【０２３９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２４０】
本発明の或る更なる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、SCAP、SCAPの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはSCAPのインヒビターなどからなる。
【０２４１】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２４２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリンなどの薬物を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２４３】
本発明の使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は当業者の能力の範囲内で行う。
【０２４４】
SCAP またはその断片を含む高分子を直接細胞内に送達するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、SCAP またはその断片をHIV Tat-1タンパク質の陽イオン性N末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２４５】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる活性成分の量、たとえばSCAP またはその断片、SCAP の抗体、SCAP のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量の比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２４６】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、患者の全身健康状態、被験者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、薬剤の併用、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮する。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって３〜４日毎に１度、１週間に１度、或いは２週間に１度の間隔で投与し得る。
【０２４７】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２４８】
（診断）
別の実施例では、SCAP に特異的に結合する抗体が、SCAP の発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはSCAP やSCAP のアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。SCAP の診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからSCAP を検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものも、されていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２４９】
ELISA、RIAおよびFACSなどのSCAPを測定するための種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した、或いは異常なレベルのSCAP発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なSCAP の発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とSCAP に対する抗体とを混合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照、および、生検組織からの疾患サンプルでの、SCAP 発現の量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２５０】
本発明の別の実施態様では、SCAP をコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用い得る。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、SCAP の発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、SCAP の存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のSCAP レベルの調節を監視し得る。
【０２５１】
或る態様では、SCAP または近縁の分子をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを用いて、SCAP をコードする核酸配列を同定することができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られているか、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、そのプローブがSCAPをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２５２】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、SCAP をコードする任意の配列と少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:26−50の配列、或いはSCAP 遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２５３】
SCAP をコードするポリヌクレオチドに特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法としては、SCAP またはSCAP 誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブ作製用ベクターにクローニングする方法を含む。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２５４】
SCAP をコードするポリヌクレオチド配列を、SCAP の発現に関係する疾患の診断に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には、たとえば細胞増殖異常としては日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌等の癌があり、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、ウイルス感染症としては、アデノウイルス（急性呼吸疾患、肺炎）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎）、ブニャウイルス（ハンタウイルス）、コロナウイルス（肺炎、慢性気管支炎）、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（ヘルペス単純ウイルス、水痘・帯状ウイルス、エプスタイン バーウイルス、サイトメガロウイルス）、フラビウイルス（黄熱）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、乳頭腫ウイルス（癌）、パラミクソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（痘瘡）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、ヒトT細胞ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）、およびトガウイルス（脳炎、風疹）によって起こされる感染症が含まれ、神経の疾患としては、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神薄弱およびその他の中枢神経系性発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄障害、筋ジストロフィー及びその他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性の筋疾患、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神病（気分性、不安性の障害、分裂病性疾患）、季節性障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、およびトゥーレット病が含まれる。SCAP をコードするポリヌクレオチド配列は、変容したSCAP 発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術や、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２５５】
或る特定の態様では、SCAP をコードするポリヌクレオチドは、関連する疾患、特に前記したこれらを検出するアッセイにおいて有用であり得る。SCAP をコードする配列に相補的なポリヌクレオチドは、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化している場合は、該サンプル内の、SCAP をコードするポリヌクレオチドのレベル変化の存在が、関連する疾患の存在を示す。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２５６】
SCAPの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、SCAPをコードする配列或いはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２５７】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２５８】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２５９】
SCAP をコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはSCAPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはSCAPをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２６０】
特定態様においては、SCAP をコードするポリヌクレオチド配列群に由来するオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入および欠失である。限定するものではないがＳＮＰの検出方法には、ＳＳＣＰ（single-stranded conformation polymorphism）及び蛍光ＳＳＣＰ（ｆＳＳＣＰ）がある。SSCPでは、SSCPをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰによって、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異が生じる。この差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。ｆＳＣＣＰでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、ＤＮＡの実験室での調製に、また統計モデル及びＤＮＡ配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２６１】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば、少なくとも16の一般的ＳＮＰが非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫性疾病等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンでの変異体（MBL2）は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することがわかっている。ＳＮＰはまた、生命を脅かす毒性等の薬剤への患者の反応に影響する遺伝変異体の同定という薬理ゲノミックスにおいても有用性がある。例えば、N-アセチルトランスフェラーゼにおける変異は抗結核剤、イソニアジドに応答した末梢神経障害の発生率が高くなるが、ALOX5 遺伝子のコアプロモータの変異は５-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息薬での治療に対する臨床的反応を減少する。異なった集団でのSNPの分布についての分析は遺伝的浮動、突然変異、組み換えおよび選択の研究に有用であると共に、集団の起源と移動の調査にも有用である(Taylor, J.G他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P.他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２６２】
SCAP の発現を定量するためにも用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、 Melby, P.C. 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C. 他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２６３】
更に別の実施例では、本明細書に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。大多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０２６４】
別の実施例では、SCAP、SCAPの断片、SCAPに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２６５】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２６６】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２６７】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価と併せて使用し得る。全ての化合物は、作用機序及び毒性メカニズムを示す、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S. 及び N.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒性シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば２０００年２月２９日に米国国立環境衛生科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２６８】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、未処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２６９】
別の実施態様は、本明細書に開示するポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施例では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出のSteiner および Anderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、目的のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２７０】
プロテオームのプロファイルは、SCAP に特異的な抗体を用いてSCAP 発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochern. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２７１】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０２７２】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２７３】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２７４】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他の (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他の (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他の (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。
【０２７５】
本発明の別の実施例ではまた、SCAP をコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる（例えばHarrington, J.J. 他（1997）Nat. Genet. 15:345-355、Price, C.M.（1993）Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J.（1991）Trends Genet. 7:149-154を参照）。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(例えば、 Lander, E.S. 及び D. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０２７６】
蛍光in situハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（例えばHeinz-Ulrich,他 (1995) in Meyers, 前出 965-968ページを参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のSCAP をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患の素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０２７７】
確定した染色体マーカーを用いた連鎖分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニング、またはその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他 (1988) Nature 336:577-580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２７８】
本発明の別の実施例では、SCAP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。SCAP と、検査する薬剤との結合による複合体の形成を、測定しうる。
【０２７９】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、SCAP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したSCAP を検出する。精製したSCAP はまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２８０】
別の実施例では、SCAP と特異結合可能な中和抗体が、SCAP との結合を試験化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、SCAPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在をも、抗体を使って検出できる。
【０２８１】
別の実施例では、SCAP をコードするヌクレオチド配列を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存する新技術に用い得る。
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２８２】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/296.865号、第60/298.664号、第60/300.149号、第60/302.340号、第60/303.481、第60/305.059、第60/343.557号およびNo.60/296.878 は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０２８３】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０２８４】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮA分解酵素でＲＮＡを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２８５】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ選択（３００〜１０００bp）は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションされた。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen Carlsbad CA）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE (Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含むコンピテントな大腸菌細胞に形質転換した。
【０２８６】
２  cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０２８７】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合ＰＣＲ法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN２蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２８８】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences 社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離には、また、標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルと塩基対呼び出しソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて同定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２８９】
Incyte cDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基対をマスクすることによって有効性を確認した。 その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するようにアセンブリした。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング、 South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列間の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって指定されるデフォルトパラメータを用いて作製する。
【０２９０】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献は全体を引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０２９１】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:26-50のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも利用した。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０２９２】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の構造および細胞骨格結合タンパク質は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C及びS. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C及びS. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶアセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が構造および細胞骨格結合タンパク質をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて構造および細胞骨格結合タンパク質について問合せて分析した。潜在的な構造および細胞骨格結合タンパク質はまた、構造および細胞骨格結合タンパク質として注釈が付けられていたIncyte cDNA配列への相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブリプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０２９３】
5   cDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ以上のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、１つのｃＤＮＡと２つのゲノム配列上に或る区間が存在する場合、この３つの区間は全て等しいと考えられた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間間の連鎖（ｃＤＮＡ−ｃＤＮＡまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（ｃＤＮＡ−ゲノム配列）に優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０２９４】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載したようにアセンブリされた部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０２９５】
６  SCAPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:26-50をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:26-50 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした(表７)。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２９６】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。 もっとも、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットによって広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap’99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など一般個人が入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０２９７】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合されている膜への標識ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している。（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０２９８】
BLASTを適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLifeSeq（Incyte Genomics）等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２９９】
【数１】
2005500830.tif 000004
【０３００】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３０１】
或いは、SCAP をコードするポリヌクレオチドは、由来する組織源に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる（実施例３を参照）。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、SCAPをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３０２】
８  SCAP をコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチドもまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。 ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの伸長は全て回避した。
【０３０３】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３０４】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と２−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマー対、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃, 15 秒、ステップ 3: 60℃, 1 分、ステップ 4: 68℃, 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。  ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、15 秒、ステップ 3: 57℃、 1 分、ステップ 4: 68℃、2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を20回反復する。  ステップ6: 68℃, 5 分、ステップ7:  4℃で保存する。
【０３０５】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３０６】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０.６〜０.８％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハング部分を満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384穴プレートに３７℃で一晩培養した。
【０３０７】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1: 94℃, 3分、 ステップ 2: 94℃、 15 秒、ステップ 3: 60℃、 1 分、ステップ 4: 72℃、 2 分、 ステップ 5: ステップ2、3および 4を29回反復する。  ステップ6: 72℃、5 分、ステップ7:  4℃で保存する。上記のようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシング反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３０８】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３０９】
９  SCAP をコードするポリヌクレオチドのSNP(一塩基多型)の同定
一塩基多型性（SNP）として知られる一般的なＤＮＡ配列変異体は、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:26-50において同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列を共にクラスターにしてアセンブリし、これによって遺伝子内のすべての配列変異体の同定ができた。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３１０】
異なる4つのヒト集団のＳＮＰ部位における対立遺伝子頻度を分析するために、高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いる質量分析によって、更なる特徴付けのためにいくつかのＳＮＰが選択された。白人母集団は、ユタ州の83人、フランス人4人、ベネズエラ３人およびアーミッシュ派２人を含む92人(男性46人、女性46人)で構成された。アフリカ人母集団はすべてアフリカ系アメリカ人である194人( 男性97人、 女性97人)からなる。ヒスパニック母集団はすべてメキシコ系ヒスパニックの324人( 男性162人、 女性162人)からなる。アジア人母集団は126人(男性64人、女性62人)からなり、親の内訳は中国人43%、日本人31%、コリアン13%、ベトナム人5%およびその他のアジア人8%と報告されている。対立形質の発生頻度は最初に白人母集団において分析し、いくつかの例において、この母集団で対立形質分散を示さなかったSNPは他の三つの母集団においてさらに検査しなかった。
【０３１１】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:26-50から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸 （Amersham Biosciences）２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN, Boston MA）を混合することにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３１２】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、４０℃で１６時間行う。 非特異的シグナルを除去するため、例えば０.１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０.５％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３１３】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweilerなどを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一且つ、無孔の表面を持つ固体とするべきである（Schena (1999) 前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０３１４】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーは、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３１５】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルは、MMLV逆転写酵素、０.０５pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1X 第１鎖バッファ、０.０３unit/μlのRNアーゼ阻害剤、５００μMのdATP、５００μMのdGTP、５００μMのdTTP、４０μMのdCTP、４０μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、２００ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積２５ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で２時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、２.５mlの０.５M水酸化ナトリウムで処理し、８５℃で２０分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。 混合した後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、１４μlの５×SSC／０.２％SDS中で再懸濁する。
【０３１６】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化ｃＤＮＡインサートを持つベクター含有細菌細胞から増幅する。ＰＣＲ増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。３０サイクルのPCRで１〜２ngの初期量から５μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３１７】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、０.１％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、９５％エタノール中で０.０５％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、１１０℃のオーブンで硬化させる。
【０３１８】
米国特許第5,807,522号に記載されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。 この特許に引用することを以って本明細書の一部とする。平均濃度が１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速機械装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを加える。マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の０.２％カゼイン中において６０℃で３０分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３１９】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、６５℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して１.８cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、１４０μlの５×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,０.１％SDS）において４５℃で１０分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（０.１×SSC）において４５℃で１０分間ずつ３回洗浄し、乾燥させる。
【０３２０】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３２１】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルターを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３２２】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を、ハイブリダイズする種の重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、較正するcDNAのサンプルを２つの蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３２３】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３２４】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。発現の変化が少なくともほぼ２倍、シグナルとバックグラウンドの割合が少なくとも2.5、および少なくとも40%のエレメントのスポットサイズを示すアレイエレメントは、差次的発現されるものとGEMTOOLS プログラム (Incyte Genomics)を用いて同定された。
【０３２５】
発現
マイクロアレイ分析はヒト細胞系C3Cの初期のコンフルエント培養にて行ったが、C3Cは、肝腫瘍(15才の男子)から単離されたHep G2 肝細胞腫細胞系のクローン誘導体で、その強度な接触成長阻止によって選択された。クローン集団を使用すると、測定結果の再現性が向上する。規則的にモニターされるマスターバンクを保持し、細胞の継代培養の制限によって、長期的研究用細胞系のローバスト性が非常に向上する。これらの細胞を用いてステロイド化合物に応答するSCAPの発現を評価した。更なるマイクロアレイ実験を行って、非悪性ヒト乳房初代上皮細胞における遺伝子発現と、腫瘍進行の異なる段階にある種々の癌腫細胞株の遺伝子発現とを比較した。相互比較プロトコールは、MCF7 (69才女性の胸水から単離された非悪性乳房腺癌細胞株)、Sk-BR-3 (43才女性の悪性の胸水から単離された乳房腺癌細胞株), MDA-mb-231 (51才女性の胸水から単離された乳房腫瘍細胞系) およびMDA-mb-435S (転移性管腺癌(ductal adenocarcinoma)の31才女性の胸水から1976年に単離された親株細胞(435)から進化した紡錘状株) 細胞に対し、ヒトHMEC細胞(健常ドナーから単離された初代の非腫瘍形成乳房上皮細胞系）における差次的発現プロファイルを評価した。この細胞は、供給業者の推奨する培養液中で70〜80%のコンフルエンスまでに増殖させて、RNAを収集した。細胞はTrizol 中で溶解し、製造会社のプロトコルに従って全RNA分画を回収した。Poly(A) mRNA は標準のオリゴdT 選択法を用いて精製した。Cy3 およびCy5 プローブはIncyteのマイクロアレイ施設にて開発した標準の操作手順に従って調製した。
【０３２６】
ステロイドに対する応答:
SEQ ID NO:33 はステロイドを用いた処理に応答した差次的な発現を示したが、これはマイクロアレイ分析によって確認された。1μM 、10μM および100 μMのベクロメタゾンによる1時間、3時間および6時間の処理に応答してSEQ ID NO:33 の発現は、早期コンフルエントのヒトC3C細胞において少なくとも2倍減少した。ベクロメタゾンは、ステロイド性喘息の治療、アレルギー性または非アレルギー性(血管運動)鼻炎に伴う症状の軽減、外科切除後の再発鼻ポリープの予防に使われる合成グルココルチコイドである。  グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬用量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。
【０３２７】
腫瘍細胞と正常細胞の応答
別の実施例において、SEQ ID NO:34 は、正常乳房上皮細胞系（HMEC）と比べていくつかの腫瘍細胞系において差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析によって確認された。SEQ ID NO:34 の発現は、種々の段階にある乳癌患者ドナーから収集した四つの異なる乳房腫瘍細胞系において少なくとも2倍減少した。
【０３２８】
別の実施例において、健常乳房組織に比べて乳房腫瘍組織におけるSEQ ID NO:37の発現が少なくとも２倍減少することがマイクロアレイ分析によって確認された。乳房腫瘍組織は浸潤性小葉癌と診断された43才女性ドナーから収集された。この腫瘍はよく分化しており、転移性であった。正常乳房組織は同じドナーの肉眼的に罹患していない乳房組織から採取した。したがって、SEQ ID NO:37 は乳癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３２９】
他の例において、SEQ ID NO:37 の発現は、正常前立腺上皮細胞に比べて前立腺癌細胞株で少なくとも２倍減少した。前立腺癌細胞株は広領域転移性前立腺癌の69才男性の脳の転移部位から単離され、また、前立腺上皮細胞は正常ドナーから単離された。したがって、SEQ ID NO:37 は前立腺癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３３０】
別の例でSEQ ID NO:41 はアルツハイマー病患者の脳帯状回と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SCAP-16 の発現は、アルツハイマー病の帯状組織において少なくとも2倍増加した。したがってSEQ ID NO:41は、アルツハイマー病を含む神経疾患の診断アッセイに有用である。
【０３３１】
別の例でSEQ ID NO:42 は癌患者の乳房組織と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SCAP-17 の発現は癌性乳房組織において少なくとも2倍減少した。SEQ ID NO:42 もまた、乳癌細胞株（MCF7, BT-20, T-47D, Sk-BR-3, MDA-mb-231）に比べてヒト乳腺細胞系MCF-10A において差次的発現を示した。MCF-10A 細胞は線維嚢胞性疾患の36才の女性に由来する。SCAP-17 の発現は乳癌細胞において少なくとも2倍減少した。さらに、SEQ ID NO:42 は乳癌T-47D 細胞に比べてヒト乳房上皮HEMC 細胞において差次的発現を示した。SCAP-17 の発現は乳癌細胞において少なくとも2倍減少した。したがって、SEQ ID NO:42 は乳癌を含む細胞増殖異常の診断アッセイにおいて有用である。
【０３３２】
別の例でSEQ ID NO:43 は癌患者の肺組織と、同じドナーのマッチした微視的正常組織とで差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。SCAP-18 の発現は癌性肺組織において少なくとも2倍減少した。したがって、SEQ ID NO:43 は肺癌を含む細胞増殖異常の診断アッセイにおいて有用である。
【０３３３】
１２  相補的ポリヌクレオチド
SCAPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、天然のSCAPの発現を検出、低下、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）と、SCAPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、SCAPをコードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐ。
【０３３４】
１3  SCAPの発現
SCAP の発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて成される。細菌内でSCAP を発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNAの転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターに、cDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとSCAP を発現する。真核細胞でのSCAP の発現は、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、SCAP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.等を参照）。
【０３３５】
殆どの発現系では、SCAP が、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製後、GST部分を、特異的に操作した諸部位において、SCAP からタンパク分解的に切断できる。FLAGは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したSCAP を直接用いて以下の実施例１7および１8のアッセイを行うことができる。
【０３３６】
１４  機能的アッセイ
SCAP 機能は、哺乳類細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのSCAP をコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳類発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORT（Invitrogen, Carlsbad  CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen,）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３３７】
遺伝子発現に与えるSCAP の影響は、SCAP をコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率よく分離できる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、これら細胞から、当業者に周知の方法で精製できる。SCAP と目的の他の遺伝子群とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３３８】
15  SCAP に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495等を参照)または他の精製技術で実質的に精製されたSCAP を用いて、標準的なプロトコルで動物（ウサギ、マウス等）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３３９】
あるいは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてSCAP アミノ酸配列を解析して、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者に周知の方法で抗体を生成する。Ｃ末端付近あるいは親水性領域などの、適切なエピトープの選択方法については、当分野に記述が多い（前出のAusubel, 1995, 11章などを参照）。
【０３４０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995 等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗SCAP 活性を検査するには例えば、、ペプチドまたはSCAP を基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３４１】
16  特異的抗体を用いる天然SCAP の精製
天然SCAP 或いは組換えSCAP は、SCAP に特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィによって実質的に精製される。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンとSCAP 抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３４２】
SCAP を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、SCAP を優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とSCAP との結合を切るような条件で（例えば、或るpH２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させ、SCAP を回収する。
【０３４３】
17  SCAPと相互作用する分子の同定
SCAPまたはその生物学的に活性な断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する。(例えばBolton A.E.およびW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補分子を、標識したSCAPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したSCAP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なSCAP  濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したSCAP の数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３４４】
別法では、SCAP と相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３４５】
SCAP はまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２つの大きなライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３４６】
18  SCAP 活性の実証
SCAP の微小管運動性アッセイによって運動(motor)タンパク質活性を測定できる。このアッセイにおいて、組換えSCAP をガラススライドまたは同様の基板に固定する。ATPおよび細胞質抽出物を含む溶液に入れた、タキソールで安定化されたウシ脳の微小管(市販されている)をスライド面に漑流する。SCAP のモーター活性によって駆動される微小管の運動は、ビデオ光学顕微鏡および画像解析技術を用いて視覚化および定量化できる。SCAP の活性は微小管運動の頻度や速度に直接比例する。
【０３４７】
或いは、SCAPのアッセイでin vitroでタンパク質フィラメントの形成を測定できる。ポリマー集合の「臨界濃度」より高い濃度のSCAP 溶液を、カーボンでコートされたグリッドに置く。溶液中に好適な核形成部位を供給し得る。グリッドは、０.７％(w/v) の水溶性ウラニルアセテートでネガティブ染色し、電子顕微鏡検査により検査する。約25nm(微小管)、約8nm(アクチン)、または約10nm(中間径フィラメント)のフィラメントが現れると、SCAP 活性があることが証明される。
【０３４８】
別法では、SCAP の活性は、SCAP のタンパク質フィラメントへの結合によって測定される。35S-メチオニンで標識されたSCAP サンプルが好適なフィラメントタンパク質（アクチン、チューブリン、または中間径フィラメントタンパク質）とインキュベーションされ、そのフィラメントタンパク質に対する抗体を用いる免疫沈降によって複合体タンパク質が回収される。その免疫沈降物は、その後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で走らせ、結合したSCAP の量が測定される。
【０３４９】
或いは、SCAP のGTP結合活性は、SCAP の[α-32P]標識化GTPへの結合を測定するアッセイで決定する。精製したSCAP はまず、フィルター上にブロットされ、次に好適なバッファーでリンスされる。そのフィルターを、次に放射能標識された[α-32P]-GTPを含むバッファー中でインキュベーションする。フィルターはバッファーで洗って非結合GTPを除き、ラジオアイソトープカウンターでカウントする。非特異的結合は、無標識GTPを100倍過剰に含めたアッセイで決定される。特異的結合の量は、SCAP活性に比例する。
【０３５０】
別法では、SCAP 活性は、in vitroでの結合アッセイでSCAP がその関連するLMW GTP加水分解酵素と相互作用する能力として実証され得る候補となるLMW GTP加水分解酵素はグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現され、グルタチオン-Sepharose上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。100 mM NaCl、2 mM EDTA、5 mM MgCl2、0.2 mM DTT、100μM AMP-PNP、および10μMGDPを含む20ｍM Trisバッファーで30℃で20分間インキュベーションして、GDPでLMW GTP加水分解酵素を負荷する。SCAP はバキュロウイルス系でFLAG融合タンパク質として発現される。SCAP-FLAG融合タンパク質を含むこれらのバキュロウイルス細胞の抽出物は、GSTビーズで前もって取り除き、次にGST-GTP分解酵素融合タンパク質とインキュベーションする。形成された複合体は、グルタチオン-Sepharoseによって沈殿させ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にブロットされ、市販の抗FLAG抗体で探査される。SCAP 活性は、複合体中に検出されるSCAP -FLAG融合タンパク質の量に比例する。
【０３５１】
或いは、SCAP 活性を、その、レポーター遺伝子の転写を刺激する能力によって測定する（Liu, H. Y. 他 (1997) EMBO J. 16 : 5289-5298）。このアッセイは、十分に特徴付けられたレポーター遺伝子作成物であるLexAop-LacZを用いる。このLexAop-LacZは、大腸菌LacZ酵素をコードする配列に融合されたLexA DNA転写調節エレメント（LexAop）からなる。融合遺伝子の作成及び発現、細胞への融合遺伝子の導入、及び、LacZ酵素活性の測定方法は、当業者に周知である。SCAP をコードする配列を、LexA転写因子に由来するDNA結合ドメインとSCAP とからなる融合タンパク質、LexA-SCAP の合成を誘導するプラスミドにクローニングする。得られたLexA-SCAP 融合タンパク質をコードするプラスミドを、LexAop-LacZレポーター遺伝子を含むプラスミドと共に酵母細胞内に導入する。対照細胞と比較してLexA-SCAP 形質移入細胞に関連するLacZ酵素活性の量が、SCAP によって刺激された転写の量に比例する。
【０３５２】
あるいはSCAP の活性は、亜鉛に結合する能力により測定される。5〜10 ミクロモルのサンプル溶液（2.5 mMの酢酸アンモニウム溶液中(pH 7.4)）を0.05 Mの硫酸亜鉛溶液 (Aldrich, Milwaukee WI)と、100ミクロモルのジチオスレイトール（10%メタノールを添加）の存在下で混合する。サンプルと硫酸亜鉛溶液とのインキュベートを20分間おこなう。反応溶液をVydac カラム（約300オングストロームのボアサイズ（bore size）、5μMの粒径）に通して、亜鉛-サンプル複合体を溶液から単離し、次に質量分析計(PE Sciex, Ontario, Canada)にかける。サンプルに結合した亜鉛の定量には、機能的原子量である63.5 Daを用いる（この原子量を観測したのはWhittal, R. M. 他(2000) Biochemistry 39:8406-8417である）。
【０３５３】
当業者には、本発明の要旨および精神から逸脱しない範囲での、本発明の記載した組成物、方法およびシステムの種々の修正および変更の手段は自明であろう。本発明が新規であり、有用なタンパク質およびそのコードするポリヌクレオチドを提供することは高く評価されるであろう。また、これらは薬物発見および疾患および症状の検出、診断および治療にこれらの組成物を使用する方法に用いられ得る。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。また、本発明をこのような実施態様の説明によって、開示した形態だけに網羅されるか、あるいは、制限されるものと見なされるべきでもない。さらに、一実施態様の要素は他の実施態様の一つ以上の要素と容易に組み合わされ得る。このような組合わせによって本発明の範囲内で多数の実施態様が形成され得る。本発明の範囲は下記の請求項およびそれに相当するものによって定義することを意図するものである。
【０３５４】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド及びポリペプチド実施例の命名の概略である。
【０３５５】
表２は、本発明のポリペプチド実施例のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。各ポリペプチドとそのGenBank相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３５６】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、本発明のポリヌクレオチド実施例の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いる方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０３５７】
表４は、ポリヌクレオチド実施例をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０３５８】
表５はポリヌクレオチド実施例の代表的ｃDNAライブラリを示す。
【０３５９】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３６０】
表７は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３６１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005500830.tif 000298
2005500830.tif 000299