(57)【要約】本発明は、自己の継代した線維芽細胞を含み、場合により、自己の継代した筋細胞、生分解性無細胞マトリックス成分、及び／又は生分解性無細胞充填剤を含んでもよい組成物を提供する。本発明はまた、上記組成物の製造方法、並びに尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流などの症状を治療するために上記組成物を投与する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するための組成物であって、自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を含み、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない、前記組成物。
【請求項２】
前記疾患、障害又は欠陥が、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記自己の線維芽細胞が、前記被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記自己の筋細胞が横紋筋細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記横紋筋細胞が、前記被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記自己の筋細胞が平滑筋細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、生分解性無細胞マトリックスをさらに含み、前記線維芽細胞及び筋細胞が、前記マトリックス内及びマトリックス上に組み込まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記マトリックスが、前記線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト及び無機骨からなる群より選択される１又は複数の物質を含んでいる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記１又は複数の物質が、グルタルアルデヒドで架橋されたコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１又は複数の物質がコラーゲンである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記コラーゲンがＩ型ブタコラーゲン又はＩＩＩ型ブタコラーゲンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１又は複数の物質が、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨及びヒドロキシアパタイトからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
前記１又は複数の物質が、ゼラチン、ポリグリコール酸及び腸線からなる群より選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
十分な線維芽細胞及び筋細胞が前記マトリックス上及びマトリックス内に組み込まれ、細胞が利用可能な前記マトリックス上及びマトリックス内の空間を実質的に充填している、請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するための組成物を製造する方法であって、
（ａ）前記被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、
（ｂ）自己線維芽細胞を前記生検試料から分離するステップ、
（ｃ）前記自己線維芽細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己線維芽細胞を産生する条件下で培養するステップ、
（ｄ）前記培養自己線維芽細胞を、前記線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、
（ｅ）前記被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、
（ｆ）前記筋組織から単離した自己筋細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で培養するステップ、
（ｇ）前記培養自己筋細胞を、前記筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、及び
（ｈ）前記線維芽細胞を前記筋細胞と組み合わせるステップ、
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記疾患、障害又は欠陥が、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記線維芽細胞含有組織が、歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄及び脂肪組織からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
筋組織が、舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋及び胸鎖乳突筋からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を前記培養するステップが、（１）０．１％〜約２０％のヒト又は非ヒト血清を含む培養培地中でのインキュベーション、その後の（２）無血清培養培地中でのインキュベーションを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、無血清培養培地中でのインキュベーションを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、マイコプラズマの増殖を防止する１又は複数の試薬を含む培地中で行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記１又は複数の試薬がチロシンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１又は複数の試薬が、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン及びテトラサイクリンからなる群より選択される１又は複数の化合物をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞の懸濁液を生じる前記条件が、タンパク質分解酵素を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するための組成物を製造する方法であって、
（ａ）自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を用意するステップ、
（ｂ）生分解性無細胞マトリックスを用意するステップ、及び
（ｃ）前記線維芽細胞及び筋細胞を、前記線維芽細胞及び筋細胞が前記生分解性無細胞マトリックス上及びその内部に組み込まれるように、前記生分解性無細胞マトリックスと共にインキュベートするステップ、
を含み、前記インキュベーションにより組織を修復するための組成物が生じ、前記インキュベーションの条件が、前記組成物が培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようにするものである、前記方法。
【請求項２７】
前記疾患、障害又は欠陥が、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を用意するステップが、
（ａ）前記被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、
（ｂ）前記生検試料から自己線維芽細胞を分離するステップ、
（ｃ）前記線維芽細胞を培養するステップ、
（ｄ）前記線維芽細胞を懸濁するステップ、
（ｅ）前記被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、
（ｆ）前記筋組織から筋細胞を単離するステップ、
（ｇ）前記筋細胞を培養するステップ、及び
（ｈ）前記筋細胞を懸濁するステップ、
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記線維芽細胞含有組織が、歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄及び脂肪組織からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記筋組織が、舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋及び胸鎖乳突筋からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞を培養するステップが、マイコプラズマの増殖を防止する試薬を含む培地中で行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記試薬がチロシンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試薬が、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン及びテトラサイクリンからなる群より選択される１又は複数の化合物をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生分解性無細胞マトリックスが、前記線維芽細胞及び前記筋細胞の懸濁液と組み合わせる前に、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト及び無機骨からなる群より選択される１又は複数の物質を含んでいる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記１又は複数の物質が、グルタルアルデヒドで架橋されたコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記１又は複数の物質が、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨及びヒドロキシアパタイトからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記１又は複数の物質が、ゼラチン、ポリグリコール酸及び腸線からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１又は複数の物質がコラーゲンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記コラーゲンがＩ型ブタコラーゲン又はＩＩＩ型ブタコラーゲンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞が前記インキュベーションの前に組み合わせられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞が別々に前記インキュベーションに加えられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記インキュベーションステップが、（１）０．１％〜約２０％のヒト又は非ヒト血清を含む培養培地中で培養するステップ、その後の（２）無血清培養培地中で培養するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記インキュベーションステップが、無血清培養培地中で培養するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
十分な線維芽細胞及び筋細胞が前記生分解性無細胞マトリックス内に組み込まれ、細胞が利用可能な前記生分解性無細胞マトリックス上及びその内部の空間を実質的に充填する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
被験体において組織を修復する方法であって、
（ａ）請求項７に記載の組成物を用意するステップ、
（ｂ）前記被験体における組織欠陥又は組織変性の部位を特定するステップ、及び
（ｃ）前記組織欠陥又は変性が修復されるように前記組成物を前記部位に配置するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記組織欠陥又は組織変性が、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流を生じる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記自己線維芽細胞が、前記被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記自己筋細胞が、前記被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
被験体において組織欠陥を修復する方法であって、
（ａ）（１）自己の継代した線維芽細胞、（２）自己の継代した筋細胞、及び（３）これらの薬学的に許容し得る担体、を含有する医薬組成物であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない上記医薬組成物を用意するステップ、
（ｂ）尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流からなる群より選択される疾患に関連する組織欠陥又は組織変性部位を、前記被験体において特定すうｒステップ、
（ｃ）治療上有効な量の前記医薬組成物を前記組織欠陥又は変性部位に隣接して注射するステップ、
を含み、前記注射により前記組織欠陥又は変性の修復がもたらされるものである、前記方法。
【請求項５１】
医薬組成物を用意するステップが、
（ａ）前記被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、
（ｂ）前記生検試料から線維芽細胞を分離し、細胞外マトリックス及び非線維芽細胞を実質的に含まない線維芽細胞を得るステップ、
（ｃ）前記線維芽細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞を生成する条件下で培養するステップ、
（ｄ）前記継代した線維芽細胞を、前記線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、
（ｅ）前記被験体からの筋組織生検試料を用意するステップ、
（ｆ）前記筋組織から筋細胞を単離するステップ、
（ｇ）前記筋細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で培養するステップ、
（ｈ）前記筋細胞を、前記筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、及び
（ｉ）前記線維芽細胞懸濁液を、前記筋細胞懸濁液及び薬学的に許容し得る担体と組み合わせ、前記医薬組成物を形成するステップ、
を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記線維芽細胞含有組織が、歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄及び脂肪組織からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記筋組織が、舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋及び胸鎖乳突筋からなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、（１）０．１％〜約２０％のヒト又は非ヒト血清を含む培養培地中で培養するステップ、その後の（２）無血清培地中で培養するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、無血清培地中で培養するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記線維芽細胞又は筋細胞の懸濁液を生じる前記条件が、タンパク質分解酵素を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記注射するステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に、尿道内腔が圧迫されるように注射することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記注射するステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の尿管口に隣接する組織に、前記尿管口が圧迫されるように注射することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記注射するステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に、食道が圧迫されるように注射することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
被験体における、該被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するための注射用組成物であって、
（ａ）自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞及び前記筋細胞、並びに
（ｂ）注射用の生分解性無細胞充填剤、
を含む、注射用組成物。
【請求項６１】
前記自己の線維芽細胞が、前記被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものである、請求項６０に記載の注射用組成物。
【請求項６２】
前記自己の筋細胞が、前記被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものである、請求項６０に記載の注射用組成物。
【請求項６３】
前記注射用の生分解性無細胞充填剤が、前記線維芽細胞及び前記筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートからなる群より選択される１又は複数の物質を含む、請求項６０に記載の注射用組成物。
【請求項６４】
前記１又は複数の物質が自己コラーゲン線維の注射用分散液を含む、請求項６３に記載の注射用組成物。
【請求項６５】
前記注射用分散液中の前記自己コラーゲン線維の濃度が少なくとも２４ｍｇ／ｍｌである、請求項６４に記載の注射用組成物。
【請求項６６】
前記１又は複数の物質がコラーゲンを含む、請求項６３に記載の注射用組成物。
【請求項６７】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項６６に記載の注射用組成物。
【請求項６８】
前記コラーゲンが、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維を含む、請求項６６に記載の注射用組成物。
【請求項６９】
前記１又は複数の物質が、可溶化ゼラチン、可溶化ポリグリコール酸、及び可溶化腸線からなる群より選択される、請求項６３に記載の注射用組成物。
【請求項７０】
前記１又は複数の物質が、塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに前記被験体由来の血漿のアリコートを含む、請求項６３に記載の注射用組成物。
【請求項７１】
前記塩化ナトリウム溶液と前記血清のアリコートとの比率が体積で１：１である、請求項７０に記載の注射用組成物。
【請求項７２】
前記塩化ナトリウム溶液が、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含む、請求項７１に記載の注射用組成物。
【請求項７３】
被験体において、該記被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するための注射用組成物を製造する方法であって、
（ａ）自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない前記線維芽細胞及び前記筋細胞を用意するステップ、
（ｂ）生分解性無細胞充填剤を用意するステップ、並びに
（ｃ）前記自己の継代した線維芽細胞、前記自己の継代した筋細胞、及び前記生分解性無細胞充填剤を組み合わせるステップ、
を含む方法。
【請求項７４】
前記疾患、障害又は欠陥が、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患、障害又は欠陥が、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜の外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈うっ滞、皮膚の瘢痕、又は皮膚の皺に関連するものである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を用意するステップが、
（ａ）前記被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、
（ｂ）前記生検試料から自己線維芽細胞を分離するステップ、
（ｃ）前記自己線維芽細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞を生成する条件下で培養するステップ、
（ｄ）前記インキュベートした自己線維芽細胞を、前記線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、
（ｅ）前記被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、
（ｆ）前記筋組織生検試料から筋細胞を単離するステップ、
（ｇ）前記筋細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で培養するステップ、及び
（ｈ）前記筋細胞を、前記筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、
を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記線維芽細胞含有組織が、前記被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄及び脂肪組織からなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記筋組織が、舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋からの生検試料を用意することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、（１）０．１％から約２０％のヒト又は非ヒト血清を含有する培地中で培養するステップ、その後の（２）無血清培地中で培養するステップを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、無血清培地中で培養するステップを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞を培養するステップが、マイコプラズマの増殖を防止する試薬を含む培地で行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記試薬がチロシンを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記試薬が、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン及びテトラサイクリンからなる群より選択される１又は複数の化合物をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記線維芽細胞又は前記筋細胞の懸濁液を生じる前記条件が、タンパク質分解酵素を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
前記生分解性無細胞充填剤が、前記線維芽細胞及び前記筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに前記被験体由来の血漿のアリコート、からなる群より選択される１又は複数の物質を含んでいる、請求項７３に記載の方法。
【請求項８６】
前記１又は複数の物質が、自己コラーゲン線維の注射用分散液を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記注射用分散液中の前記自己コラーゲン線維の濃度が少なくとも２４ｍｇ／ｍｌである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記１又は複数の物質がコラーゲンを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記コラーゲンが、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記１又は複数の物質が、可溶化ゼラチン、可溶化ポリグリコール酸及び可溶化腸線からなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項９２】
前記１又は複数の物質が、塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに前記被験体由来の血漿のアリコートを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９３】
前記塩化ナトリウム溶液と血清のアリコートとの比率が体積で１：１である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記塩化ナトリウム溶液が、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復する方法であって、有効量の請求項６０に記載の組成物を、前記組織が修復されるように、前記被験体の変性部位に注射するステップを含む、前記方法。
【請求項９６】
前記注射ステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に、尿道内腔が圧迫されるように注射することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記注射ステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の尿管口に隣接する組織に、前記尿管口が圧迫されるように注射することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記注射ステップが、ある量の前記医薬組成物を、前記被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に、食道が圧迫されるように注射することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記注射用の生分解性無細胞充填剤が、前記線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに前記被験体由来の血漿のアリコート、からなる群より選択される１又は複数の物質を含んでいる、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記１又は複数の物質がコラーゲンを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復する方法であって、
（ａ）自己の継代した線維芽細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを、前記被験体の組織変性の部位に注射するステップ、
（ｂ）自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを、前記被験体中の組織欠陥又は所望の組織増加の部位に注射するステップ、及び
（ｃ）生分解性無細胞充填剤であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを前記部位に注射するステップ、
を含む方法。
【請求項１０３】
前記注射ステップ（ａ）〜（ｃ）のそれぞれが、前記被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に、尿道内腔が圧迫されるように注射することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記注射ステップ（ａ）〜（ｃ）のそれぞれが、前記被験体の尿管口に隣接する組織に、前記尿管口が圧迫されるように注射することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記注射ステップ（ａ）〜（ｃ）のそれぞれが、前記被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に、食道が圧迫されるように注射することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記疾患、障害又は欠陥が、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜の外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈うっ滞、皮膚の瘢痕又は皮膚の皺を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記自己の線維芽細胞が、前記被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記自己の筋細胞が、前記被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞が同時に注射される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１０】
前記線維芽細胞、前記筋細胞及び前記生分解性無細胞充填剤が同時に注射される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１１】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞が別々に注射される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１２】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞が、前記生分解性無細胞充填剤とは別に注射される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１３】
前記線維芽細胞及び前記筋細胞を前記被験体へ注射するステップと、前記生分解性無細胞充填剤を前記被験体へ注射するステップとの間の期間が約２週間である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
生分解性無細胞充填剤が、前記線維芽細胞及び前記筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに前記被験体由来の血漿のアリコート、からなる群より選択される１又は複数の物質を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記１又は複数の物質が、自己コラーゲン線維の注射用分散液を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記注射用分散液中の前記自己コラーゲン線維の濃度が少なくとも２４ｍｇ／ｍｌである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記１又は複数の物質がコラーゲンを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記コラーゲンがウシコラーゲンである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記コラーゲンが、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記１又は複数の物質が、可溶化ゼラチン、可溶化ポリグリコール酸、及び可溶化腸線からなる群より選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
前記１又は複数の物質が、塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記塩化ナトリウム溶液と前記血清のアリコートとの比率が体積で１：１である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記塩化ナトリウム溶液が、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含む、請求項１２２に記載の注射用の方法。
【請求項１２４】
自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞の、生分解性無細胞充填剤に対する比率が、体積で約１：１である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１２５】
被験体において、該被験体における疾患、障害又は欠陥の結果として変性した組織を修復するデバイスであって、
（ａ）シリンジチャンバ、その中に配置されたピストン、及び前記チャンバに通じる開口を有する皮下注射用シリンジ、並びに
（ｂ）自己の継代した線維芽細胞、自己の継代した筋細胞、及び薬学的に許容し得る担体を含有する懸濁液
を含み、前記懸濁液が、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まず、前記チャンバ内に配置されている、前記デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿失禁は、全米中で極めてよく見られる症状である。米国健康福祉省は、１９９６年、同国内の１３００万人が尿失禁に苦しんでいると報告した。この症状は、女性の方が男性よりはるかに多い。１５〜６４歳の一般人口において、罹患しているのは女性１０〜３０％に対し、男性１．５〜５％である。老人ホーム入居者の少なくとも５０％が罹患しており、このうち７０％が女性である。
【０００３】
尿失禁は、解剖学的、生理学的又は病理学的因子が原因となる可能性がある。急性及び一過性の失禁は、一般に、出産、制限された移動（limited mobility）、薬剤の副作用、及び尿路感染症が原因となる。慢性の失禁は、一般に先天異常、膀胱の筋力低下、尿道閉塞（例えば、良性の前立腺肥大又は腫瘍による）、脳又は脊髄の損傷、神経疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、二分脊椎又は多発性硬化症などの先天性及び後天性の筋神経支配の疾患）、及び骨盤底の筋力低下が原因となる。
【０００４】
尿失禁にはいくつかのタイプがある。緊張性尿失禁は、腹圧を上昇させる身体活動（例えば、咳、くしゃみ、又は笑い）の最中の尿の漏れを指す。急迫性尿失禁は、切迫した放尿の要求と、不随意的な膀胱収縮による尿の漏れをもたらす。混合性尿失禁は、緊張性及び急迫性尿失禁の両方を含む。溢流性尿失禁は、絶え間ない尿の滴下を含むが、膀胱は決して完全には空にならない。これらのタイプの尿失禁のうち、緊急性、急迫性及び混合性尿失禁が、症例の９０％以上を占める。溢流性尿失禁は、脊髄の上部に由来する神経支配を冒す疾患を有する者、及び良性前立腺肥大症を有する年配男性でより多く見られる。
【０００５】
尿失禁の問題は、概して尿道に発生し、膀胱頚の尿道括約筋機構の不全によることが多い。かかる不全により尿の流出に対する抵抗性が低下し、不随意的な尿の漏れが生じるようになる。
【０００６】
膀胱尿管逆流現象は、尿の流出に対する不十分な抵抗性をも含む付随症状である。この疾患は膀胱から尿管への尿の不適切な逆流を含むものであり、腎内逆流を含む可能性があるため、逆流性腎症を併発することもある。
【０００７】
胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）は、同様のメカニズムによって生じる症状であり、胃内容物が食道内に逆流する。胃内容物は、通常下部食道括約筋の作用で胃内に留まっており、この括約筋は嚥下の最中を除き緊張性に収縮したままとなっている。ＧＥＲＤは、この括約筋が機能不全を起こしているか、間欠的に弛緩しているか、又は妨害されている場合に起こる。膀胱からの不適切な尿の流出及び食道への食物の不適当な逆流を効果的に制御する方法は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象、及びＧＥＲＤを有する患者を治療するのに有用である。
【０００８】
米国特許第５，８５８，３９０号、第５，６６５，３７２号、第５，６６０，８５０号及び第５，５９１，４４４号、ならびに、同時係属中の米国出願第０９／６７８，０４７号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、組織学的に適合した、自己の継代した線維芽細胞及び筋細胞の懸濁液を注射することによる、尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び食道逆流などの症状を治療する方法を提供する。本発明は、線維芽細胞及び筋細胞が、培養培地に存在する免疫原性タンパク質を実質的に含まないようにする方法を提供する。本発明はまた、自己線維芽細胞及び筋細胞を含有する組成物を提供する。本発明の組成物はまた、増量剤（bulking agent）及び／又は生分解性無細胞マトリックス成分を含有することもできる。本組成物は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は食道逆流などの症状を治療するために被験体に注射することができる。本発明は、さらに、かかる組成物を注射するためのデバイスを提供する。
【００１０】
組織学的に適合した、自己の継代した線維芽細胞及び筋細胞の懸濁液を、尿道周囲注射又は経尿道注射により投与することで、尿道への圧を上昇させ、尿道内腔を圧迫し、尿の流れに対する尿道の抵抗性を高めることにより、尿失禁を軽減することができる。同様に、かかる細胞の懸濁液を尿管口の隣接組織への注射により投与することで、膀胱内尿管の逆流に対する支持を向上させ、尿の逆流に対する抵抗性をもたらすことにより、膀胱尿管逆流現象を軽減することができる。ＧＥＲＤは、細胞の懸濁液を下部食道括約筋の隣接組織中に注射することにより治療することができる。注射された線維芽細胞は、通常は被験体から採取した生検検体の培養物に由来する線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）である。筋細胞（例えば、横紋筋由来の細胞）もまた、被験体から得ることができる。細胞を入念に洗浄することにより、細胞懸濁液の被験体への投与の際に免疫原性となり得る血清由来のタンパク質は本質的に全て除去される。
【００１１】
本発明は、自己細胞が、尿失禁及び膀胱尿管逆流現象などの症状を治療するための増量剤として用いるのに理想的であり、かかる細胞の豊富な供給が、治療の数週間前に被験体から採取した生検検体を培養することにより可能であるとの発見に基づく。本発明はさらに、被験体における有害な免疫応答（例えば、炎症性の免疫応答）が、免疫原性タンパク質を、自己の培養細胞から、被験体へのこれらの投与の前に除去することにより回避することができるとの発見に基づく。
【００１２】
一態様において、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥により変性した、被験体の組織を修復するための組成物に関する。本組成物は、自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を含有することができ、培養培地の血清に由来するタンパク質を実質的に含まないことができる。疾患、障害又は欠陥は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものでありうる。自己線維芽細胞は、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものであることができる。自己筋細胞は、横紋筋細胞（例えば、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来の横紋筋細胞）であることができる。自己筋細胞はまた、平滑筋細胞であることができる。
【００１３】
本組成物は、生分解性無細胞マトリックスをさらに含有することができ、線維芽細胞及び筋細胞は、マトリックス内及びマトリックス上に組み込まれる。マトリックスは、線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト及び無機骨（anorganic bone）からなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。コラーゲンは、例えば、ウシコラーゲン、ブタＩ型コラーゲン又はブタＩＩＩ型コラーゲンであることができる。線維芽細胞及び筋細胞は、マトリックス上及びマトリックス内の、細胞に利用可能な空間を実質的に充填するようにして、マトリックス上及びマトリックス内に組み込まれる。
【００１４】
別の態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復する組成物を製造する方法に関する。本方法は、（ａ）被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、（ｂ）生検試料から自己線維芽細胞を分離するステップ、（ｃ）培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない自己線維芽細胞を生成する条件下で、自己線維芽細胞を培養するステップ、（ｄ）培養した自己線維芽細胞を、線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、（ｅ）被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、（ｆ）培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で、筋組織から単離した自己筋細胞を培養するステップ、（ｇ）培養した自己筋細胞を、筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、及び（ｈ）線維芽細胞を筋細胞と組み合わせること、を含むことができる。疾患、障害又は欠陥は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連していることができる。
【００１５】
線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップは、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織からの生検試料を用意することを含みうる。筋組織の生検試料を用意するステップは、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋からの生検試料を用意することを含みうる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、（１）０．１％から約２０％のヒト又は非ヒト血清を含有する培養培地中でのインキュベーション、その後の（２）無血清培養培地中でのインキュベーションを含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、無血清培地でのインキュベーションを含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、マイコプラズマの増殖を防止する１又は複数の試薬（例えば、チロシン、プラズモシン（plasmocin）、マイコプラズマ除去剤、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン、又はテトラサイクリン）を含有する培地中で行うことができる。線維芽細胞又は筋細胞の懸濁液を生じる条件は、タンパク質分解酵素を含んでもよい。
【００１６】
別の態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復する組成物を製造する方法を提供する。本方法は、（ａ）自己の継代した線維芽細胞と、自己の継代した筋細胞とを用意するステップ、（ｂ）生分解性無細胞マトリックスを用意するステップ、及び（ｃ）線維芽細胞と筋細胞とを、生分解性無細胞マトリックスの上及び内部に組み込まれるように、生分解性無細胞マトリックスと共に培養するステップを含むことができ、ここで、インキュベーションによって組織を修復するための組成物がもたらされ、そして、培養の条件は、組成物が培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようにするものである。疾患、障害又は欠陥は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流に関連するものとすることができる。
【００１７】
生分解性無細胞マトリックスは、線維芽細胞及び筋細胞の懸濁液を組み合わせる前に、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、ヒドロキシアパタイト及び無機骨からなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。コラーゲンは、ウシコラーゲン、ブタＩ型コラーゲン、又はブタＩＩＩ型コラーゲンであることができる。線維芽細胞及び筋細胞は、インキュベーション前に組み合わせることができる。線維芽細胞及び筋細胞は、別々にインキュベーションに添加してもよい。あるいは、インキュベーションステップは、（１）０．１％から約２０％のヒト又は非ヒト血清を含有する培養培地中での培養、その後の（２）無血清培養培地中での培養を含むことができる。インキュベーションステップは、無血清培地での培養を含むことができる。線維芽細胞及び筋細胞は、生分解性無細胞マトリックスの上及び内部の、細胞に利用可能な空間を実質的に充填するようにして、生分解性無細胞マトリックス内に組み込まれる。
【００１８】
自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を用意するステップは、（ａ）被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、（ｂ）生検試料から自己線維芽細胞を分離するステップ、（ｃ）線維芽細胞を培養するステップ、（ｄ）線維芽細胞を懸濁するステップ、（ｅ）被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、（ｆ）筋組織から筋細胞を単離するステップ、（ｇ）筋細胞を培養するステップ、及び（ｈ）筋細胞を懸濁するステップ、を含むことができる。線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップは、被験体の歯茎、口蓋又は皮膚からの生検試料を用意することを含むことができる。筋組織の生検試料を用意するステップは、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋、又は胸鎖乳突筋からの生検試料を用意することを含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、マイコプラズマの増殖を防止する試薬（例えば、チロシン、マイコプラズマ除去剤、プラズモシン、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン、又はテトラサイクリン）を含有する培地中で行うことができる。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、被験体の組織を修復する方法を提供する。本方法は、（ａ）本発明の組成物を用意するステップ、（ｂ）被験体における組織欠陥部位又は組織変性部位を特定するステップ、及び（ｃ）組織欠陥又は組織変性を修復するために、前記組成物を前記部位に配置するステップ、を含むことができる。組織欠陥又は組織変性は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流を生じる可能性がある。自己線維芽細胞は、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものであることができる。自己筋組織は、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものであることができる。
【００２０】
別の態様では、本発明は、被験体の組織欠陥を修復する方法を提供する。本方法は、（ａ）（１）自己の継代した線維芽細胞、（２）自己の継代した筋細胞、及び（３）これらの薬学的に許容し得る担体、を含有する医薬組成物であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない該医薬組成物がを提供するステップ、（ｂ）尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流からなる群より選択される疾患に関連する、被験体における組織欠陥又は組織変性部位を特定するステップ、（ｃ）ある量の前記医薬組成物を組織欠陥又は変性部位に隣接して注射するステップ、を含むことができ、注射により組織欠陥又は変性が修復される。
【００２１】
注射ステップは、ある量の医薬組成物を、被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に、尿道内腔が圧迫されるように注射することを含むことができる。注射ステップは、ある量の医薬組成物を、被験体の尿管口に隣接する組織に、尿管口が圧迫されるように注射することを含むことができる。注射ステップは、ある量の医薬組成物を、被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に、食道が圧迫されるように注射することを含むことができる。
【００２２】
医薬組成物を提供するステップは、（ａ）被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、（ｂ）生検試料から線維芽細胞を分離し、細胞外マトリックス及び非線維芽細胞を実質的に含まない、線維芽細胞を得るステップ、（ｃ）線維芽細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞を生成する条件下で培養するステップ、（ｄ）継代した線維芽細胞を、線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、（ｅ）被験体からの筋組織生検試料を用意するステップ、（ｆ）筋組織から筋細胞を単離するステップ、（ｇ）筋細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で培養するステップ、（ｇ）筋細胞を、筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、（ｈ）線維芽細胞懸濁液を、筋細胞懸濁液及び薬学的に許容し得る担体と混合し、医薬組成物を形成するステップ、を含むことができる。
【００２３】
線維芽細胞含有組織の生検試料は、被験体の歯茎、口蓋又は皮膚から採取することができる。筋組織生検試料は、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋から採取することができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、（１）０．１％から約２０％のヒト又は非ヒト血清を含有する培養培地中での培養、その後の（２）無血清培養培地中での培養を含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、無血清培地での培養を含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の懸濁液を生じる条件は、タンパク質分解酵素を含みうる。
【００２４】
本発明はまた、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復するための注射用組成物に関する。この注射用組成物は、（ａ）自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない前記線維芽細胞及び筋細胞、並びに（ｂ）注射用の生分解性無細胞充填剤、を含むことができる。自己の線維芽細胞は、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものであることができる。自己の筋細胞は、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものであることができる。注射用の生分解性無細胞充填剤は、線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートからなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。注射用分散液における自己コラーゲン線維の濃度は、少なくとも２４ｍｇ／ｍｌであることができる。コラーゲンはウシコラーゲン（例えば、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維）であることができる。塩化ナトリウム溶液と血清のアリコートとの比率は、体積で１：１であることができる。塩化ナトリウム溶液は、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含有することができる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復するための注射用組成物を製造する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）  自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞及び筋細胞を用意するステップ、（ｂ）生分解性無細胞充填剤を用意するステップ、及び（ｃ）自己の継代した線維芽細胞、自己の継代した筋細胞、及び生分解性無細胞充填剤を組み合わせるステップ、を含むことができる。疾患、障害又は欠陥は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象、胃食道逆流、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜の外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈うっ滞、皮膚の瘢痕又は皮膚の皺に関連するものであることができる。
【００２６】
自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞を用意するステップは、（ａ）被験体からの線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップ、（ｂ）生検試料から自己線維芽細胞を分離するステップ、（ｃ）自己線維芽細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない線維芽細胞を生成する条件下で培養するステップ、（ｄ）継代した自己線維芽細胞を、線維芽細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、（ｅ）被験体からの筋組織の生検試料を用意するステップ、（ｆ）筋組織生検試料から筋細胞を単離するステップ、（ｇ）筋細胞を、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない筋細胞を生成する条件下で培養するステップ、及び（ｈ）筋細胞を、筋細胞の懸濁液を生じる条件に曝露するステップ、を含むことができる。
【００２７】
線維芽細胞含有組織の生検試料を用意するステップは、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄、又は脂肪組織から生検試料を用意することを含むことができる。筋組織の生検試料を用意するステップは、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋、又は胸鎖乳突筋からの生検試料を用意することを含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、（１）０．１％から約２０％のヒト又は非ヒト血清を含有する培養培地中での培養、その後の（２）無血清培地中での培養を含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、無血清培地での培養を含むことができる。線維芽細胞又は筋細胞の培養ステップは、マイコプラズマの増殖を防止する試薬（例えば、チロシン、プラズモシン、マイコプラズマ除去剤、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン及びテトラサイクリン）を含有する培地中で行うことができる。線維芽細胞又は筋細胞の懸濁液を生じる条件は、タンパク質分解酵素を含みうる。
【００２８】
生分解性無細胞充填剤は、線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートからなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。注射用分散液における自己コラーゲン線維の濃度は、少なくとも２４ｍｇ／ｍｌであることができる。コラーゲンはウシコラーゲン（例えば、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維）であることができる。塩化ナトリウム溶液と血清のアリコートとの比率は、体積で１：１であることができる。塩化ナトリウム溶液は、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含有することができる。
【００２９】
別の態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復する方法を特徴とする。本方法は、有効量の本発明の組成物を、組織が修復されるように、被験体の変性部位に注射するステップを含むことができる。注射ステップは、ある量の組成物を、被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に、尿道内腔が圧迫されるように注射することを含むことができる。注射ステップは、ある量の医薬組成物を、被験体の尿管口に隣接する組織に、尿管口が圧迫されるように注射することを含むことができる。注射ステップは、ある量の医薬組成物を、被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に、食道が圧迫されるように注射することを含むことができる。
【００３０】
注射用の生分解性無細胞充填剤は、線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートからなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。コラーゲンはウシコラーゲンであることができる。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復する方法を特徴とする。本方法は、（ａ）自己の継代した線維芽細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを、被験体の組織変性の部位に注射するステップ、（ｂ）自己の継代した筋細胞であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを、被験体中の組織欠陥又は所望の組織増加の部位に注射するステップ、及び（ｃ）生分解性無細胞充填剤であって、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないものを該部位に注射するステップ、を含むことができる。各々の注射ステップ（ａ）〜（ｃ）は、被験体の尿道又は尿道に隣接する組織に注射することを含むことができ、本方法により尿道内腔が圧迫される。各々の注射ステップ（ａ）〜（ｃ）は、被験体の尿管口に隣接する組織に注射することを含むことができ、本方法により尿管口が圧迫される。各々の注射ステップ（ａ）〜（ｃ）は、被験体の下部食道括約筋に隣接する組織に注射することを含むことができ、本方法により食道が圧迫される。疾患、障害又は欠陥は、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜の外傷、歯周病、糖尿病、皮膚潰瘍、静脈うっ滞、皮膚の瘢痕、又は皮膚の皺に関連するものであることができる。
【００３２】
自己の線維芽細胞は、被験体の歯茎、口蓋、皮膚、粘膜固有層、結合組織、骨髄又は脂肪組織由来のものであることができる。自己の筋細胞は、被験体の舌、口蓋舌筋、側頭筋、ヒラメ筋、腓腹筋又は胸鎖乳突筋由来のものであることができる。線維芽細胞及び筋細胞は、同時に注射することができる。線維芽細胞、筋細胞及び生分解性無細胞充填剤は、同時に注射することができる。線維芽細胞及び筋細胞は、別々に注射することができる。線維芽細胞及び筋細胞は、生分解性無細胞充填剤とは別に注射することができる。線維芽細胞及び筋細胞の被験体への注射と、生分解性無細胞充填剤の被験体への注射との間の期間は、約２週間であることができる。
【００３３】
生分解性無細胞充填剤は、線維芽細胞及び筋細胞と組み合わせる前に、（ａ）自己コラーゲン線維の注射用分散液、（ｂ）コラーゲン、（ｃ）可溶化ゼラチン、（ｄ）可溶化ポリグリコール酸、（ｅ）可溶化腸線、並びに（ｆ）塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末及びアミノカプロン酸、並びに被験体由来の血漿のアリコートからなる群より選択される１又は複数の物質を含有することができる。注射用分散液における自己コラーゲン線維の濃度は、少なくとも２４ｍｇ／ｍｌであることができる。コラーゲンはウシコラーゲン（例えば、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維）であることができる。塩化ナトリウム溶液の血清のアリコートに対する比率は、体積で１：１であることができる。塩化ナトリウム溶液は、体積で０．９％の塩化ナトリウムを含有することができる。自己の継代した線維芽細胞及び自己の継代した筋細胞の、生分解性無細胞充填剤に対する比率は、体積で約１：１であることができる。
【００３４】
別な態様では、本発明は、被験体の疾患、障害又は欠陥の結果として変性した被験体の組織を修復するデバイスを特徴とする。本デバイスは、（ａ）シリンジチャンバ（syringe chamber）、その中に配置されたピストン、及びチャンバに通じる開口を有する皮下注射用シリンジ、並びに（ｂ）自己の継代した線維芽細胞、自己の継代した筋細胞、及び薬学的に許容し得る担体を含有する懸濁液、を含有することができ、ここで、懸濁液は、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まず、懸濁液はチャンバ内に配置されている。
【００３５】
他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術の当業者により通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたのと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実施に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書中で言及したすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。一致しない場合は、定義を含む本明細書で統制することになる。さらに、材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図していない。
【００３６】
本発明の１又は複数の実施形態の詳細は、添付図面と、以下の説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流などの症状を治療する方法を提供する。これらの方法は、被験体に、組織学的に適合する、自己の継代した線維芽細胞を含有する組成物を投与することを含む。本組成物はまた、筋細胞（例えば、組織適合性の又は自己の筋細胞）を含有することもでき、生分解性無細胞マトリックス成分及び／又は増量剤（例えば、生分解性無細胞充填剤）を含有することができる。本発明は、注射する細胞が、培養培地中に存在し得る免疫原性タンパク質を実質的に含まないようにする方法を提供する。本発明はまた、自己線維芽細胞を、筋細胞、生分解性無細胞マトリックス成分、及び／又は増量剤と共に及びなしに含有する、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流などの症状を有する被験体に投与するための組成物を提供する。本発明はさらに、かかる組成物の製造方法、及びかかる組成物を注射するためのデバイスを提供する。
【００３８】
１．自己線維芽細胞を含有する組成物
本発明は、尿失禁、膀胱尿管逆流現象及び胃食道逆流などの症状を治療するのに有用な組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫原性タンパク質（例えば、培養培地血清由来のタンパク質）を実質的に含まない、自己の継代した線維芽細胞を含有する。本明細書で用いる場合、用語「自己」は、ドナーから取り出され、レシピエントに投与される細胞であって、ドナーとレシピエントが同一個体であるものをいう。本明細書で用いる場合、「培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない」細胞（例えば、自己の継代した線維芽細胞）とは、細胞が組み込まれている細胞を取り囲む液体が、０．１％未満（例えば、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、又は０．００１％未満）の、細胞が培養された組織培養培地中に含有される異種又は同種の血清を含む細胞のことをいう。同様に、「培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない」組成物とは、組成物中の細胞を取り囲む液体が、０．１％未満（例えば、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、又は０．００１％未満）の、細胞が培養された組織培養培地中に含有される異種又は同種の血清を含む組成物のことをいう。
【００３９】
線維芽細胞は、任意の哺乳動物種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又はスナネズミ）からのものであることができるが、ただし、細胞は自己のものである。自己ヒト線維芽細胞が特に有用である。動物が同系交配され、したがって同系である場合（例えば、同一の実験室系統の、ラット及びマウスなどの動物）、「自己の」とは同一種の別の個体に由来するものを意味することができる。
【００４０】
組成物は、培養中で拡大することができる任意の未分化間葉系細胞を含有することができる。皮膚組織から単離された線維芽細胞が特に有用であるが、これは、これらを容易に得、そして拡大することができるからであり、また、これらが、尿道括約筋、尿管口、及び下部食道括約筋に隣接する組織に通常存在する細胞種だからである。自己真皮線維芽細胞は、例えば、被験体の歯茎、口蓋、又は皮膚の生検試料から得ることができる。真皮は、表皮のすぐ下に位置しており、一般的に０．５〜３ｍｍの範囲の厚さを有する。真皮の主要な細胞性構成要素は、線維芽細胞及びマクロファージだが、脂肪細胞及び筋線維も存在することがある。真皮に加え、線維芽細胞は、限定されることなく、筋膜、粘膜固有層、毛包の球状部、骨髄、又は任意の結合組織源から得ることができる。さらに、線維芽細胞は、未分化間葉系細胞に由来することができる。未分化間葉系細胞を培養し、分化させる任意の好適な方法を用いることができ、これには当該技術分野で公知の方法が含まれる。
【００４１】
同種移植拒絶現象により、培養線維芽細胞がレシピエントに組織適合性であることが重要であることは、移植外科医及び免疫学者によく知られている。組織適合性は、治療する被験体から生検試料を得ることにより保証することができる。しかしながら、かかる細胞は、被験体の一卵性の兄弟、又は被験体と主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）が同一の個体から得ることもできる。生検検体からの線維芽細胞は、得られる細胞が培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないように培養することができ、これはまた、細胞が、被験体内で有害な免疫応答を活性化する能力を減少させることもできる。本発明の組成物を生成するため、線維芽細胞の培養は、例えば、組織変性（例えば、尿失禁、膀胱尿管逆流現象、又はＧＥＲＤ）を患う被験体の歯茎、口外、又は皮膚の全層（例えば、１〜５ｍｍ、又は十分な組織が得られる場合には５ｍｍ以上）真皮生検検体から開始することができる。かかる生検検体は、例えば、パンチ生検手順を用いて得ることができる。真皮又は粘膜固有層の生検もまた、自己線維芽細胞を得るのに特に有用である。皮膚生検試料は、皮膚、例えば耳の裏から採取することができる。
【００４２】
培養を開始する前に、生検試料を、抗生物質及び抗真菌剤で繰り返し洗浄することができる。好適な「洗浄培地」は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの組織培養培地及び以下の試薬のいくつか又は全てを含有することができる：ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ（ファンギゾン（登録商標））、マイコプラズマ除去剤（ＭＲＡ、大日本製薬株式会社、日本）、プラズモシン、及びチロシン（例えば、Serva, Heidelberg, Germanyから入手可能）。ゲンタマイシンは、１０〜１００μｇ／ｍｌ（例えば、２５〜７５μｇ／ｍｌ、又は約５０μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。アンホテリシンＢは、０．５〜１２．５μｇ／ｍｌ（例えば、１．０〜１０．０μｇ／ｍｌ、又は約２．５μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。ＭＲＡは、０．１〜１．５μｇ／ｍｌ（例えば、０．２５〜１．０μｇ／ｍｌ、又は約０．５μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。プラズモシンは、１〜５０μｇ／ｍｌ（例えば、１０〜４０μｇ／ｍｌ、又は約２５μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。チロシンは、０．０１２〜１．２ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．０６〜０．６ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。
【００４３】
所望であれば、無菌顕微解剖を、角化組織含有表皮及び皮下脂肪細胞含有皮下組織からの生検試料において、真皮組織を分離するのに用いることができる。生検検体は、その後、例えばメス又は鋏を用いて組織を細かくきざみ、小片に分離することができる。いくつかの実施形態では、組織の小片をプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、又はキモパパイン）で消化する。２００〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＩ型コラゲナーゼでの３０分〜２４時間の消化が特に有用である。酵素的消化を用いた場合、細胞は遠心分離により回収し、組織培養フラスコに播種することができる。
【００４４】
組織を酵素的消化に供しない場合は、きざんだ組織片を組織培養フラスコの乾燥表面に個別に配置し、約２〜約１０分間かけて付着させる。付着した組織断片を移動させないように、少量の培地をゆっくりと添加することができる。消化された細胞の場合には、細胞を培養培地で懸濁し、１又は複数のフラスコに配置することができる。約４８〜７２時間のインキュベーション後、フラスコに追加の培地を供給することができる。培養を開始するのにＴ−２５フラスコを用いた場合、培地の初期量は、一般的に約１．５〜２．０ｍｌである。生検検体からの細胞株の確立は、約２〜３週間かかることがあり、その時点で細胞を初期培養容器から取り出し、拡大することができる。
【００４５】
培養の早い段階において、組織断片は、培養容器の底に付着したままであることが望ましい。剥離した断片は、新しい容器に再移植することができる。線維芽細胞は、標準的な技術に従い、ＥＤＴＡ−トリプシンへの短い曝露により、増殖するよう刺激することができる。このようなトリプシンへの曝露は、線維芽細胞を、培養容器壁への付着状態から解放するには十分に簡便である。培養が確立され、コンフルエントに近づいたらすぐに、線維芽細胞のサンプルを、例えば、液体窒素中での凍結保存用に処理することができる。細胞を凍結するための任意の好適な方法を用いることができ、これは細胞を後に使用するために好ましく凍結する、当該技術分野で知られた多数の方法を包含する。正常ヒト線維芽細胞の細胞培養における継代の回数は制限されているため、早期の継代の線維芽細胞を凍結し貯蔵することは、遅い継代のものよりも好ましい。
【００４６】
線維芽細胞は、線維芽細胞を保存するのに好適な任意の凍結培地（例えば、任意の市販の凍結培地）中で凍結させることができる。約７０％（ｖ／ｖ）の増殖培地、約２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び約１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる培地が特に有用である。ＤＭＳＯはまた、例えば、グリセロールと置き換えることができる。解凍細胞は、同一の被験体で後に使用するための追加の懸濁液を調製するための二次培養を開始するのに用いることができ、こうして第二の検体を得る不都合が回避される。
【００４７】
皮膚線維芽細胞を生検検体から増殖させるのに好適な任意の組織培養技術を、細胞を拡大するのに用いることができる。有用な技術は、例えば、R. I. Freshney編, Animal Cell Culture: A Practical Approach, (IRL Press, Oxford, England, 1986)及びR. I. Freshney編, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, (Alan R. Liss & Co., New York, 1987)に見出すことができる。
【００４８】
細胞培養培地は、線維芽細胞の初代培養の増殖に適した任意の培地であることができる。培地には、線維芽細胞の増殖を促進するために、ヒト又は非ヒト血清（例えば、自己ヒト血清、非自己ヒトＡ／Ｂ血清、ウマ血清、又はウシ胎児血清（ＦＢＳ））を加えることができる。培地に含まれる場合、血清は、一般的には、約０．１％〜約２０％ｖ／ｖ（例えば、０．５％〜１９％、１％〜１５％、又は５％〜１２％）の量である。線維芽細胞のより早い増殖を促すために、より高い濃度の血清を用いることもできる。特に有用な培地は、約２ｍＭのグルタミン、約１０ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリウム、約１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、及び抗生物質を添加したグルコースＤＭＥＭを含有し（しばしば「完全培地」と呼ばれる）、ここでグルコースの濃度は、約１，０００ｍｇ／ｌ〜約４，５００ｍｇ／ｌの範囲である。線維芽細胞は、無血清培地中で拡大することもできる。このやり方では、線維芽細胞は決して異種又は同種異系の血清タンパク質にさらされることはなく、線維芽細胞を非自己血清を含有する培地中で拡大した場合に行なわれる、無血清培地でのさらなる培養を必要としない。
【００４９】
線維芽細胞を培養するのに用いる増殖培地には、例えば、細菌、真菌、酵母、及びマイコプラズマなどによる培養物の汚染を防止するために抗生物質を添加することができる。マイコプラズマによる汚染は頻繁であり、組織培養では特にわずらわしい問題である。マイコプラズマによる汚染を防止するか、又は最小限にするため、チロシンなどの試薬を培養増殖培地に加えることができる。培地には、１又は複数の抗生物質／抗真菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、アラトロフロキサシン、アジスロマイシン、ＭＲＡ、プラズモシン、及びテトラサイクリン）をさらに添加することができる。チロシンは、０．００６〜０．６ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０６ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。ゲンタマイシンは、０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．０３〜０．０８ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。シプロフロキサシンは、０．００２〜０．０５ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．００５〜０．０３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。アラトロフロキサシンは、０．２〜５．０μｇ／ｍｌ（例えば、０．５〜３．０μｇ／ｍｌ、又は約１．０μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。アジスロマイシンは、０．００２〜０．０５ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．００５〜０．０３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。ＭＲＡは、０．１〜１．５μｇ／ｍｌ（例えば、０．２〜１．０μｇ／ｍｌ、又は約０．７５μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。プラズモシンは、１〜５０μｇ／ｍｌ（例えば、１０〜４０μｇ／ｍｌ、又は約２５μｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。テトラサイクリンは、０．００４〜０．１ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．００８〜０．０５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いることができる。抗生物質は、培養の全期間、又は培養期間の一部分において存在することができる。
【００５０】
マイコプラズマによる汚染は、例えば、bioMerieux（Marcy l'Etoile, France）から入手可能な、又は機関内で調製することができるマイコプラズマ寒天培地などの系を用いた寒天培養法、及びＰＣＲによりアッセイすることができる。American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）も、ＰＣＲ「マイコプラズマ検出キット」を市販している。チロシン（０．０６ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、アラトロフロキサシン（１．０μｇ／ｍｌ）、アジスロマイシン（０．０１ｍｇ／ｍｌ）、及びテトラサイクリン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を含有する培養培地が、マイコプラズマによる汚染を防止するのに特に有用である。マイコプラズマによる汚染を防止するのに有用な別の試薬は、４−オキソ−キノリン−３−カルボン酸（ＯＱＣＡ）の誘導体であり、「マイコプラズマ除去剤」として、例えば、ICN Pharmaceuticals, Inc.（Costa Mesa, CA）より商業的に入手可能である。この試薬は、一般的には、０．１〜２．５ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．２〜２．０ｍｇ／ｍｌ、又は０．５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で用いられる。抗生物質混合物又はその他の試薬は、開始後の最初の２週間、線維芽細胞培養物中に存在することができる。２週間の培養後、抗生物質含有培地は、一般的には、抗生剤非含有培地に交換する。培養物中に一度十分な数の細胞が存在するようになったら（例えば、細胞が７０％〜９０％のコンフルエントになったとき）、これらをマイコプラズマ、細菌及び真菌による汚染について試験することができる。検出できる汚染がない細胞のみが、本発明の方法に有用である。
【００５１】
自己線維芽細胞は、トリプシン処理により新しいフラスコに継代できる。拡大のために、個々のフラスコを、例えば、１：３〜１：５の比率で分割することができる。４５０ｃｍ２の総培養面積を有する三重底のＴ−１５０フラスコは、線維芽細胞を拡大するのに好適である。三重底のＴ−１５０フラスコに、細胞の大きさに依存して、例えば、約１×１０６〜約３×１０６個の細胞を播くことができる。かかるフラスコは、一般的には、約８×１０６〜約１．０×１０７個の細胞を産生する容量がある。フラスコの容量に達するのには約５〜７日の培養を要するだろうが、このとき、増殖培地を無血清培地に交換することができる。細胞は、一般的には、約３０℃〜約３７．５℃で、少なくとも４時間（例えば、一晩又は約１８時間）インキュベートする。無血清培地中での細胞のインキュベーションにより、培養培地に加えられた非自己血清（例えば、ＦＢＳ）に由来するタンパク質を実質的に除去することができる。これらのタンパク質は、被験体に注射する組成物中に存在すると望ましくない免疫応答を惹起し得る。無血清培地は、例えば、２ｍＭのグルタミンを添加した、約１１０ｍｇ／ｌのピルビン酸ナトリウムを含む又は含まないグルコースＤＭＥＭを含有することができ、ここで、グルコースの濃度は、およそ１，０００ｍｇ／ｌ〜約４，５００ｍｇ／ｌの範囲であることができる。およそ４，５００ｍｇ／ｌのグルコース濃度が特に有用である。無血清培地は、上記の抗生物質を１又は複数含有することもできる。
【００５２】
無血清培地でのインキュベーションの最後に、細胞を、例えばトリプシン−ＥＤＴＡを用いて、組織培養フラスコから取り出すことができる。被験体への投与の前に、線維芽細胞は、一般的には、血清及びフェノールレッドを含まない培地で、又は生理食塩水で２〜４回洗浄する。細胞は、遠心分離と再懸濁によって洗浄することができ、その後、適切な生理的浸透圧を有し、実質的に発熱物質及び外来タンパク質を含まない、同量の注射用の等張溶液中に、注射のために再懸濁する。等張生理食塩水は、特に有用な等張溶液である。容量まで増殖した、５個の三重底Ｔ−１５０フラスコにより、約３．５×１０７〜約７×１０７個の細胞を得ることができ、これは、約１．２ｍｌ〜約１．４ｍｌの懸濁液を作製するのに十分である。その後、薬学的に許容し得る担体を、継代した自己の線維芽細胞に加え、医薬組成物を形成することができる。熟語「薬学的に許容し得る」は、細胞に有害でなく、生理学的に耐容され、そして、ヒトに投与した場合、一般的に胃の不調、めまいなどのアレルギー性又は類似の有害な反応を惹起しない化合物及び組成物をいう。かかる組成物は、種々のバッファー成分（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度を有する生理学的に許容し得る溶媒を包含する。
【００５３】
投与の前に、線維芽細胞は、活性化化合物、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸パルミテート、リノール酸、Ｃ−Ｍｅｄ１００（登録商標）（Optigene-X LLC, Shrewsbrury, NJ）、コエンザイムＱ−１０、グリコール酸、Ｌ−ヒドロキシ酸、Ｌ−リポ酸、カルシウム一リン酸、又は増殖因子などの他の刺激性添加剤などとインキュベートすることができる。かかる化合物とのインキュベーションは、線維芽細胞を刺激し、そのコラーゲン産生を増強することができる。１又は複数の活性化化合物を、自己の継代した線維芽細胞を含有する組成物と共に、被験体に投与することもできる。あるいは、継代した線維芽細胞なしでの活性化化合物の投与は、線維芽細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するのに用いることができる。
【００５４】
線維芽細胞を直ちに投与しない場合、これらは、氷上約４℃で、２４〜４８時間までインキュベートすることができる。細胞は、適切な浸透圧を有し、発熱物質及び内毒素のレベルを試験した生理的溶液中に懸濁することができる。かかる溶液は、一般的には、ｐＨ指示薬であるフェノールレッド、及びいずれの血清も含まないが、ＦＢＳ又はその他の異種血清よりは被験体の血清が好ましい。線維芽細胞は、例えば、５％のデキストロースを含むクレブス−リンゲル液中、又はその他の任意の生理的溶液（例えば、生理食塩水）中に懸濁することができる。細胞は吸引し、インキュベーション培地中に懸濁して被験体に投与することができる。細胞を懸濁する生理食塩水又はインキュベーション培地の容量は、一般的には、注射する線維芽細胞の数、及び組織変性又は欠陥による損傷の程度などの因子に関係する。
【００５５】
その他の任意の適切な方法を、自己の継代した線維芽細胞を含有する組成物を調製するのに用いることもできる。例えば、米国特許第５，８５８，３９０号、第５，６６５，３７２号、第５，６６０，８５０号、及び第５，５９１，４４４号、ならびにＷＯ９９／６０９５１を参照。これらの全ては、その全体が参照により組み込まれる。
【００５６】
２．線維芽細胞及び筋細胞を含有する組成物
本発明の組成物は、自己の継代した線維芽細胞を、継代した筋細胞と共に含有することができる。筋細胞は自己又は非自己（例えば、別の被験体からのもの、又は細胞株からのもの）であることができるが、自己筋細胞が特に有用である。筋細胞は、横紋筋細胞又は平滑筋細胞であることができる。自己横紋筋細胞は、例えば、頭部（例えば、舌、口蓋舌筋又は側頭筋）、頸部、体幹（例えば、胸鎖乳突筋）、又は四肢（例えば、ヒラメ筋又は腓腹筋）からの筋組織の生検検体から単離することができる。自己筋生検試料は、一般的には、容易に到達できるが、美容の観点から高度に視認できない部位から得る。平滑筋細胞は、一般的には非自己であり、例えば、臓器（例えば、心臓）移植ドナーからの大動脈生検試料から分離することができる。非自己筋細胞は、筋細胞株由来のものであることもできる。かかる細胞は、例えば、ATCC及びClonetics Corp.（San Diego, CA）から商業的に入手可能である。あるいは、筋細胞は、例えば皮膚生検試料から単離した幹細胞に由来することができる。幹細胞を培養し、そして分化させる任意の好適な方法を用いることができ、これには、当該技術分野で公知の方法が包含される。
【００５７】
継代した筋細胞の懸濁液を調製するため、自己又は非自己筋組織を筋生検試料から得ることができる。試料は、一般的には大きさが約０．５〜１．０ｃｍ３、質量が約０．５〜１ｇである。組織は、例えば、自己線維芽細胞培養物を生成するための生検試料の処理について記載されたのと同じ抗生物質を含有する培養培地中での穏やかな攪拌によって分離することができる。すべての明らかな結合組織又は脂肪組織は、鉗子で除去することができる。残りの組織試料は、より小さな小片（例えば、１ｍｍ３未満の小片）にきざむことができる。トリプシン中でのカミソリ刃によるきざみ処理が特に有用である。すりつぶした懸濁液は、細胞を分離するためにトリプシン／ＥＤＴＡ中で穏やかに攪拌することができ、その後、残りの組織片が後に残るように、未使用のフラスコにデカントすることができる。トリプシンを中和するために、ＦＢＳを加えることができる。トリプシン処理は、最大３回、又はピンク色の組織片が残らなくなるまで繰り返すことができ、そして筋細胞を遠心分離により回収することができる。筋細胞及び／又は筋組織（例えば、生検サンプル）は、培養線維芽細胞について上記したように、抗生物質及び抗真菌剤を含有した培地中で、十分に洗浄することができる。
【００５８】
筋細胞は、任意の好適な培地中で培養することができる。ヒト筋増殖培地：馴化培地の１：１の混合物（ＨｕＧＭ／ＣＭ）が特に有用である。ＨｕＧＭは、一般的には、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０、１０％ＦＢＳ、５％ＦＢＳ（規定されており、鉄が添加されている；Hyclone, Logan, UT）、０．５％ニワトリ胚抽出物（Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する。ＣＭはＭＲＣ−５線維芽細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能）とのインキュベーションにより馴化されたＨｕＧＭである。異種血清タンパク質を含有しない他の有用な培地（例えば、無血清培地）は、自己線維芽細胞について上記したものである。培養培地は、自己線維芽細胞について上記したのと同じ抗生物質を含有することもできる。
【００５９】
筋細胞は、任意の好適な大きさの組織培養プレート又はフラスコ（例えば、９６穴プレート、２４穴プレート、１２穴プレート、又は３５ｍｍ、６０ｍｍ若しくは１００ｍｍディッシュ、又はＴ−２５、Ｔ−７５、Ｔ−１５０、若しくはＴ−５００フラスコ）に播種し、約４０％のコンフルエントに達したときに、新鮮な培地（例えば、１：１のＨｕＧＭ／ＣＭ）を供給することができる。その後、細胞には２〜３日ごとに増殖培地（例えば、ＨｕＧＭ）を供給することができる。筋細胞が７０〜８０％のコンフルエントに達したとき、これらをトリプシン処理し、未使用の組織培養ディッシュ（例えば、１００ｍｍディッシュ）に、ディッシュあたり約５×１０５〜１０×１０５個で播くことができる。ディッシュは、一般的には、継代培養後、約２０％のコンフルエントである。細胞は、好適な数を得るまで、拡大し、継代培養することができる。細胞は、上述のとおり細菌、真菌、酵母、又はマイコプラズマによる汚染についてモニターすることができる。一度好適な数の筋細胞が得られたら、これらを無血清培地中で２〜１８時間インキュベートし、免疫原性タンパク質を除去すること（すなわち、細胞が、培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まないようにすること）ができる。被験体への投与の前に、筋細胞は、一般的には、無血清培地中又はＰＢＳ中で２〜４回洗浄する。Ｃａ＋２又はＭｇ＋２を含有しないＰＢＳが特に有用である。細胞は、一般的には遠心分離と再懸濁によって洗浄し、その後、適切な生理的浸透圧を有し、実質的に発熱物質及び外来タンパク質を含まない、同量の注射用の等張溶液中に、注射のために再懸濁する。等張生理食塩水は、特に有用な等張溶液である。
【００６０】
筋細胞に、薬学的に許容し得る担体を、被験体に投与する前に加えることができる。あるいは、細胞を直ちに投与しない場合、これらは、氷上約４℃で、２４〜４８時間までインキュベートすることができる。かかるインキュベーションのために、細胞は、適切な浸透圧を有し、発熱物質及び内毒素のレベルについて試験した生理的溶液中に懸濁することができる。かかる溶液は、一般的には、ｐＨ指示薬であるフェノールレッド、及びいずれの血清も含まないが、ＦＢＳ又はその他の異種血清よりは被験体の血清が好ましい。筋細胞は、例えば、５％のデキストロースを含むクレブス−リンゲル液中、又はその他の任意の生理的溶液中に懸濁することができる。細胞は吸引し、インキュベーション培地中に懸濁して被験体に投与することができる。筋細胞を懸濁する生理食塩水又はインキュベーション培地の容量は、一般的には、注射する細胞の数、及び組織変性又は欠陥による損傷の程度などの因子に関係する。
【００６１】
筋細胞は、将来の使用のために凍結することができる。細胞は、トリプシン処理し、任意の好適な凍結培地（上記参照；例えば、９０％仔ウシ血清及び１０％ＤＭＳＯを含有する培地）中に再懸濁することができる。筋細胞懸濁液は、その後、低温凍結バイアルに分注し、液体窒素に移す前に約−７０℃〜約−８６℃で凍結させることができ、又は、これらは液体窒素低温保存ユニットで凍結することができる。細胞は解凍し、同一の被験体で後に使用するための追加の懸濁液を調製するための二次培養を開始するのに用いることができ、こうして第二の検体を得る不都合が回避される。
【００６２】
本発明は、被験体における組織欠陥を修復するか、又は増強する組成物を製造する方法を提供する。これらの方法は、一般的には、皮膚生検試料を得、免疫原性タンパク質（例えば、培養培地血清由来のタンパク質）を実質的に含まない自己の継代した線維芽細胞の懸濁液を調製すること、筋生検試料を得、これも免疫原性タンパク質を含まない、自己の継代した筋細胞の懸濁液を調製すること、及び線維芽細胞と筋細胞を混合し、例えば、尿失禁、膀胱尿管逆流現象又は胃食道逆流などの症状を治療するのに用いる組成物を生成すること、を含む。あるいは、非自己筋細胞の懸濁液を調製し、線維芽細胞と混合する。
【００６３】
３．生分解性無細胞マトリックス成分を含有する組成物
継代した筋細胞と共に又はそれなしに、自己の継代した線維芽細胞を含有する本発明の組成物は、生分解性無細胞マトリックス成分を含むこともできる。かかる組成物は、被験体中に注射又は移植し、変性した組織を修復するのに好適である。用語「生分解性」は、本明細書中で用いる場合、生物学的に有害ではなく、天然の作用因子（例えば、天候、土壌細菌、植物、動物）により化学的に劣化又は分解することができる組成物をいう。本発明で用いることができるマトリックスの例は、限定されることなく、自己及び非自己タンパク質を含む無細胞マトリックス、及び生分解性ポリマーを含む無細胞マトリックスを包含する。
【００６４】
非自己タンパク質を含有する多数の生分解性マトリックスのいずれも、本明細書で提供される組成物に用いることができる。生分解性無細胞マトリックスの例は、任意の型のコラーゲン、又は例えばグルタルアルデヒドでグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と架橋された任意の型のコラーゲンを含有するマトリックスを包含する。有用な生分解性無細胞マトリックスを作製することができる他の物質は、ヒアルロン、ヒアルロン酸、レスタリン（restalyn）、及びパーレーン（parleane）を包含することができる。コラーゲンを含有するマトリックスは、限定されることなく、吸収性コラーゲンスポンジ、コラーゲン膜、及び海綿骨を包含する。有用な型のコラーゲンは、例えば、ウシコラーゲン（例えば、McGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CAから商業的に入手可能なZyderm（登録商標）及びZyplast（登録商標））、ブタコラーゲン、ヒト死体コラーゲン（例えば、Fascian（商標）（Fascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA）、Cymetra（LifeCell Corp., Branchburg, NJ）、又は以前はCollagenesis Corp.が製造していたDermalogen（商標））、及び自己ヒトコラーゲン（Autologen（登録商標）、以下参照）を包含する。Fascian（商標）は特に有用である。この製品は、５種の粒径で入手可能であり、そのいずれをも本明細書に記載の組成物及び方法に用いることができる。０．２５ｍｍ大の粒子が特に有用である。
【００６５】
吸収性コラーゲンスポンジは、例えば、Sulzer Calcitek, Inc.（Carlsbad, CA）から購入できる。CollaTape（登録商標）、CollaCote（登録商標）、及びCollaPlug（登録商標）の名称で販売されているこれらのコラーゲンスポンジガーゼは、ウシ深屈筋（アキレス）腱から抽出した架橋コラーゲンと、ＧＡＧとで作られている。これらの製品は、柔軟で、曲げやすく、脆くなく、そして非発熱性である。９０％を超えるコラーゲンスポンジは、一般的に開孔で構成される。
【００６６】
生分解性無細胞マトリックスは、例えば、薄膜に形成されたコラーゲン（例えば、ウシ又はブタＩ型コラーゲン）を含有することができる。このような膜の１つは、Sulzer Calcitekにより製造されており、BioMend（商標）として市販されている。別のこのような膜状マトリックスは、Bio-Gide（登録商標）としてGeistlich Soehne AG（Wolhusen, Switzerland）により市販されており、ブタＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンでできている。Bio-Gide（登録商標）は２層構造を有しており、１つの面は多孔質で、細胞の内部増殖を可能にし、そして第２の面は密であり、線維組織の内部増殖を防止する。
【００６７】
生分解性無細胞マトリックスは、顆粒又は塊に形成された海綿骨で構成することもできる。この材料は、実質的にすべての有機材料（例えば、タンパク質、脂質、核酸、炭水化物、及びビタミンや非タンパク質ホルモンなどの小有機分子）が除去された、動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギ）の骨からなる。このタイプのマトリックスを、本明細書では「非有機マトリックス」と呼ぶ。このようなマトリックスの１つで、Bio-Oss（登録商標）海綿顆粒及びBio-Oss（登録商標）塊として市販されているものは、Geistlich Soehne AGにより製造される。この会社は、無機骨及びさらに約１０重量％のコラーゲン線維を含有する、塊状マトリックス（Bio-Oss（登録商標）コラーゲン）も製造している。
【００６８】
他の有用な生分解性無細胞マトリックスは、ゼラチン、ポリグリコール酸、腸線、脱灰骨、無機骨、若しくはヒドロキシアパタイト、又はこれらの物質の混合物を含有することができる。脱灰したヒトの骨でできたマトリックスは、例えば、小塊に形成されたものが、DynaGraft（登録商標）として、GenSci Regeneration Laboratories, Inc.（Toronto, Ontario）により市販されている。脱灰骨は、例えば、コラーゲンと混合し、スポンジ、塊、又は膜の形態のマトリックスを作製することができる。１又は複数のモノマーから作製した合成ポリマーも、本明細書中で有用な生分解性無細胞マトリックスを作製するのに用いることができる。マトリックスは、１又は複数のこのような合成ポリマーで構成することができる。合成ポリマーは、上述の任意の物質と混合し、マトリックスを形成することもできる。単一のマトリックスを形成する異なるポリマーは、別個の区画又は層にあることができる。例えば、W. L. Gore&Associates, Inc.（Flagstaff, AZは、多孔質の生分解性無細胞マトリックス（再生材料GORE RESOLUT XT）を製造した。このマトリックスは、細胞の内部増殖を許容しない、グリコリド及びラクチドの合成生分解性コポリマーで構成される閉鎖膜に付着した、細胞が遊走することができる、グリコリド及びトリメチレンカーボネートの生分解性の合成コポリマー線維で構成されている。
【００６９】
生分解性無細胞マトリックスを選択した後、継代した筋細胞を有する又は有しない、自己の継代した線維芽細胞の濃縮懸濁液を、マトリックスの表面に均一に分配することができる。マトリックスの、液体懸濁液を吸収する能力を超過するのを避けるため、一般的には濃縮懸濁液を用いる。例えば、GORE RESOLUT XTマトリックスに提供される細胞懸濁液は、通常は、約９４μｌ〜約１２５μｌの容量を有し、マトリックスの平方センチあたり約２．０×１０６個〜約４．０×１０６個の細胞を含有することができる。細胞は、さらなる培地の添加なしに、マトリックスに付着させることができる。マトリックスと細胞とのインキュベーションは、例えば、約３７℃で約１〜２時間行うことができる。細胞は、一般的に、約６０分のインキュベーションの後に、マトリックス材料に付着し、その全体に均一に分配される。この時点で、細胞を添加したマトリックスを含有する培養容器に追加の増殖培地を添加することができ、細胞は、マトリックス中で約３〜４日間培養することができる。細胞は、マトリックス内の空間を実質的に充填するように、高濃度でマトリックスに加えるため、培養期間の３〜４日目に、増殖はわずかに起こるか又は起こらない。実際、分裂している線維芽細胞は、マトリックスを劣化又は部分的に劣化させる可能性のある酵素（例えば、コラゲナーゼ）を分泌することができるため、有意な細胞増殖は、一般的にこの期間中は望ましくない。
【００７０】
被験体に投与したときに免疫応答を惹起する可能性のある免疫原性タンパク質（例えば、マトリックス播種ステップのために非自己血清含有培地を用いた場合には、培養培地血清由来のタンパク質）を実質的に除去するために、細胞を有するマトリックスは、一般的には、例えば、生理食塩水又は血清及びフェノールレッドを含まない培地で洗浄する（例えば、各１０分間の洗浄を少なくとも３回）。新鮮なＰＢＳを、各洗浄に用いることができる。マトリックスは、その後、使用前に新鮮なＰＢＳ中でインキュベート（例えば、２時間のインキュベーション）することができる。インキュベーション後、継代した筋細胞と共に又はそれなしに、自己の継代した線維芽細胞を含有するマトリックスを、組織変性又は欠陥部位に設置することができる。
【００７１】
コラーゲンスポンジマトリックス（例えば、CollaCote（登録商標））については、およそ１．５ｍｌの増殖培地中の、およそ１．５×１０７〜２．０×１０７個の細胞を、２ｃｍ×４ｃｍの薄い（およそ２．５〜３．０ｍｍの厚さの）スポンジ上に播くことができる。スポンジは、その後３７℃で約１〜２時間、さらなる培地の添加なしにインキュベートし、実質的にすべての線維芽細胞がマトリックス材料に接着するのを可能にすることができる。細胞の接着後、追加の増殖培地をマトリックス及び細胞組成物に加えることができ、その後、これを３７℃で３〜４日、毎日培地を交換しながらインキュベートすることができる。細胞播種ステップのために非自己血清含有培地を用いた場合、組成物からかかる血清を含有する増殖培地を除去し、ＰＢＳで繰り返し（例えば、３回以上）洗浄することができる。毎回ＰＢＳを加えた後は、マトリックスは、ＰＢＳを捨てる前に、１０〜２０分間インキュベートすることができる。最終洗浄の後、組成物は、被験体に直ちに投与するか、又は、生理的溶液（例えば、クレブス−リンゲル液）を含有する出荷用バイアルに移し、約４℃で、約２４〜４８時間までインキュベートすることができる。
【００７２】
膜状マトリックス（例えば、BioMend（商標））については、約１００μｌの増殖培地中の、およそ３×１０６〜８×１０６個の細胞を、１５ｍｍ×２０ｍｍの薄い（およそ０．５〜１．０ｍｍの厚さの）膜上に播くことができる。膜は、その後３７℃で約３０〜６０分間、さらなる培地の添加なしにインキュベートし、実質的にすべての線維芽細胞がマトリックス材料に接着するのを可能にすることができる。細胞の接着後、追加の増殖培地をマトリックス及び細胞組成物に加えることができ、その後、これを３７℃で２〜３日、毎日培地を交換しながらインキュベートすることができる。細胞は、一般的に、細胞に利用可能なマトリックス内の空間を実質的に充填するように、マトリックスに高濃度で加える（上記参照）。組成物の洗浄、及び、即時の使用又はインキュベーションは、スポンジマトリックスについて上記したとおりに行うことができる。
【００７３】
上記の非有機マトリックス（例えば、Bio-Oss（登録商標）塊）などの塊状マトリックス、又は脱灰骨マトリックス（例えば、Dynagraft（商標）マトリックス）の場合、およそ１００〜１５０μｌの増殖培地中の、およそ１．２×１０７〜２．０×１０７個の細胞を、１ｃｍ×１ｃｍ×２ｃｍのマトリックス材料の立方塊に播くことができる。細胞は、一般的に、塊面の１つの面上にゆっくり播種する。一度培地及び細胞が塊に吸収されたら、塊の別の面に同様に播種することができる。この手順は、塊のすべての面に播種がなされ、そして塊が完全に培地で飽和されるまで繰り返すことができる。培地を過剰に加え、それにより塊からの培地及び細胞の漏出を起こすことを回避するよう、注意する必要がある。組成物は、その後３７℃で約６０〜１２０分間、さらなる培地の添加なしにインキュベートし、実質的にすべての線維芽細胞がマトリックス材料に接着するのを可能にすることができる。細胞の接着後、追加の増殖培地をマトリックス及び細胞組成物に加えることができ、その後、これを３７℃で２〜３日、毎日培地を交換しながらインキュベートすることができる。細胞は、一般的に、細胞に利用可能なマトリックス内の空間を実質的に充填するように、マトリックスに高濃度で加え（上記参照）、上記と同じ結果となる。組成物の洗浄、及び、即時の使用又はインキュベーションは、スポンジマトリックスについて上記したとおりである。
【００７４】
自己の継代した線維芽細胞と、生分解性マトリックスの粒子（例えば、Fascian（商標）、Cymetra（商標）、又はDermalogen（商標））とを含有する組成物は、前記成分を、例えば、これらを、ルアーロックを介して接続した２本のシリンジの間で行き来させることにより混合することによって調製することができる。Fascian（商標）は、例えば、一般的には、シリンジ（例えば、３ｃｃシリンジ）中、８０ｍｇ／シリンジで入手可能である。Fascian（商標）は、洗浄バッファー（例えば、等張生理食塩水又はデキストロースを含有するクレブス・リンゲル液）を少量（例えば、１．５ｍｌ）シリンジに取り、第１のシリンジを第２のシリンジにルアーロックを介して接続し、そして粒子と洗浄液とを、２本のシリンジ間で数回行き来させることにより、使用前にシリンジ中で直接洗浄することができる。粒子を洗浄液から分離するために、混合物を無菌チューブに移し、そしてFascian（商標）粒子を沈降させることができる。液を除去（例えば、デカント又は吸引）することができ、そして粒子を未使用シリンジに（例えば、１８ゲージ又は２０ゲージ針を通して）取り込むことにより、洗浄過程を所望の回数で繰り返すことができる。
【００７５】
充填剤粒子を適切に洗浄したら、これらを線維芽細胞と、及び、任意により筋細胞を、洗浄と同じ手順を用いて混合することができる。細胞（例えば、１×１０７〜３×１０７個）を、溶液（例えば、５％デキストロースを含む１．５ｍｌのクレブス・リンゲル液）に懸濁し、そしてシリンジに取り込むことができる。細胞を含有するシリンジを、充填剤粒子を含有するシリンジにルアーロックを介して接続することができ、２つの成分を、シリンジ間で行き来させることにより混合することができる。その後、混合物をＴ−２５組織培養フラスコ又は組織培養ディッシュ又はチューブに移すことができ、これにより細胞は充填剤粒子に付着することができる。あるいは、混合物を付着が起こるまでシリンジ中に保持することができるが、これは細胞に対してより有害であるかもしれない。混合物は一晩インキュベートし、そしてその後、医師に送付するための容器（例えば、バイアル又はチューブ）に移すことができ、又は被験体に投与するためにシリンジに移すことができる。医師に送付される容器は、配送中氷上に保つことができる。かかる粒子の無細胞性生分解性マトリックスを用いる場合、細胞含有粒子の懸濁液は、組織変性又は欠陥の部位に、移植するのではなく、任意に注射することができる。
【００７６】
培養筋細胞が、線維芽細胞及び生分解性無細胞マトリックスを含有する組成物に含まれている場合、これらは、マトリックスに播種する前に、線維芽細胞と混合することができる。あるいは、これらは、線維芽細胞の播種の前又は後に、マトリックスに播種することができる。筋細胞が、線維芽細胞の前又は後に播種されている場合、第２の播種は、第１の播種の直後に行うことができ、又は第１の播種の細胞が、マトリックス材料に実質的に付着した後に行うことができる。
【００７７】
本発明はまた、自己の継代した線維芽細胞を、マトリックス成分と共に含有する組成物を製造する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、免疫原性タンパク質（例えば、培養培地血清由来のタンパク質）を実質的に含まない、自己の継代した線維芽細胞の懸濁液を用意するステップ、生分解性無細胞マトリックスを用意するステップ、生分解性無細胞マトリックスを線維芽細胞懸濁液と共にインキュベートして、線維芽細胞がマトリックス上及びマトリックス内に組み込まれるようにし、こうして組織を修復又は増加するための組成物を形成するステップ、を含む。これらの方法はまた、継代した筋細胞（例えば、自己の継代した筋細胞）の懸濁液を、線維芽細胞と一緒に、又は別個にマトリックスに加えるステップを含むことができる。
【００７８】
４．増量剤を含有する組成物
本発明の組成物は、自己の継代した線維芽細胞を、１又は複数の注射用の生分解性無細胞充填材料（すなわち、増量剤）と共に含有することができる。本組成物は、変性した組織を修復するために被験体に注射するのに適している。線維芽細胞及び充填剤に加えて、本組成物はまた、継代した筋細胞（一般的には、自己筋細胞、上記参照）を含有することができる。自己の継代した線維芽細胞を、筋細胞と共に又はそれなしに、生分解性の無細胞充填剤と共に含有する注射用組成物において、細胞は、一般的には、充填剤とおよそ１：１の体積比で混合される。
【００７９】
多くのタイプの、生分解性の注射用の無細胞充填剤を、本発明の組成物に加えることができる。充填剤は、被験体から得た任意の型のコラーゲンを包含する、自己タンパク質からなることができる。かかる充填剤の例は、以前Collagenesis Corp.（Beverly, MA）が製造していたAutologen（登録商標）である。Autologen（登録商標）は、被験体からの自己真皮コラーゲン線維の分散液であり、したがって、筋細胞及び／又は線維芽細胞と共に被験体に再投与された場合でも、免疫応答を惹起しない。Autologen（登録商標）を得るには、被験体から組織（例えば、真皮、胎盤、又は臍帯）の標本を得、そしてCollagenesis Corp.に送るが、それはそこでコラーゲン多量の分散液に加工される。およそ１．５平方インチの真皮組織により、１立方センチ（ｃｃ）のAutologen（登録商標）を得ることができる。Autologen（登録商標）の濃度は、被験体内で、欠陥を修正し、又は組織を増加させるのに要求される量に応じて調節することができる。分散液中のAutologen（登録商標）の濃度は、例えば、少なくとも約２５ｍｇ／ｌ（例えば、少なくとも３０ｍｇ／ｌ、少なくとも４０ｍｇ／ｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｌ、又は少なくとも１００ｍｇ／ｌ）であることができる。
【００８０】
注射用の無細胞充填材料はまた、任意の型のコラーゲンを包含する、非自己タンパク質を含有することができる。多数のコラーゲン製品が商業的に入手可能であり、本発明の組成物に用いることができる。ヒトコラーゲン製品もまた、商業的に入手可能である。商業的に入手可能なコラーゲンは、限定されることなく、グルタルアルデヒドで架橋された再構成ウシコラーゲン線維を含有し、０．３％リドカインを含むリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁された、Zyderm（登録商標）及びZyplast（登録商標）などの再構成ウシコラーゲン製品を包含する。これらの製品は、Santa Barbara, CA.のMcGhan Medical Corporationが製造している。ブタコラーゲン製品もまた、商業的に入手可能である。
【００８１】
有用な充填材料のその他の例としては、限定されることなく、可溶化ゼラチン、ポリグリコール酸、又は腸線縫合糸が挙げられる。具体的には、ゼラチンマトリックス・インプラントは、例えば、Fibril（登録商標）の標章で販売されている。この充填剤は、（１）０．９（体積）％塩化ナトリウム溶液に分散されたブタゼラチン粉末とｏ−アミノカプロン酸との混合物、及び（２）被験体由来の血漿のアリコートを等量含有する。充填剤として有用なその他の物質としては、ヒアルロン、ヒアルロン酸、レスタリン、及びパーレーンが挙げられる。
【００８２】
本発明はまた、自己の継代した線維芽細胞と生分解性無細胞充填剤とを、継代した筋細胞と共に又はそれなしに含有する組成物を製造するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に、免疫原性タンパク質（例えば、培養培地血清由来のタンパク質）を実質的に含まない、自己の継代した線維芽細胞、及び任意に筋細胞の懸濁液を用意するステップ、１又は複数の生分解性無細胞充填材料を用意するステップ、及び充填剤を線維芽細胞及び筋細胞懸濁液と組み合わせるステップ、を含む。あるいは、２つの細胞種の別々の懸濁液を充填剤と組み合わせることができる。
【００８３】
５．本発明の組成物を投与するためのデバイス
本発明はまた、自己の継代した細胞を含有する組成物を、組織変性又は欠陥の部位（例えば、尿道、尿管口、又は下部食道括約筋）に近接した箇所に送達するためのデバイスを提供する。かかるデバイスは、シリンジチャンバを有する皮下注射用無菌シリンジ、その中に配置されたピストン、チャンバに通じる開口、及び自己の継代した線維芽細胞を含有する医薬組成物から構成されることができ、医薬組成物は、チャンバ内に配置されている。医薬組成物は、自己の継代した線維芽細胞、及び以下の１又は複数を含有することができる：継代した筋細胞（例えば、自己の継代した筋細胞）、薬学的に許容し得る担体、生分解性無細胞充填剤、及び生分解性無細胞マトリックス成分。皮下注射用シリンジは、任意の好適なサイズの容量（例えば、１ｃｃ、３ｃｃ、１０ｃｃ、又は１０ｃｃを超える）を有することができる。シリンジはまた、適切なサイズ（例えば、１４ゲージ、１６ゲージ、１８ゲージ、２０ゲージ、２３ゲージ、２５ゲージ、２７ゲージ、又は３０ゲージ）と長さ（例えば、２０ｃｍ未満、２０ｃｍ、２５ｃｍ、３０ｃｍ、３５ｃｍ、又は４０ｃｍ、又は４０ｃｍを超える）の針に接続していることができる。
【００８４】
６．組織を修復又は増加する方法
本発明の方法を用いて、本発明の組成物の有効量を被験体に投与し、被験体内の組織を修復又は増加することができる。本明細書で用いる場合、用語「有効量」は、好適な嵩（bulk）を提供し、被験体における組織欠陥を修正することができる、又は被験体における変性した組織の組織再生を促進することができる、医薬組成物の量をいう。本発明の方法は、例えば、尿失禁、膀胱尿管逆流現象、又はＧＥＲＤなどの疾患に関連した組織変性又は欠陥を治療するために本医薬組成物を投与するのに有用である。
【００８５】
本発明の方法は、一般的に、本発明の１又は複数の組成物を、例えば、注射又は移植により被験体に投与することを含む。自己の継代した線維芽細胞、継代した筋細胞（例えば、自己の継代した筋細胞）、及び充填剤の組合せを被験体に投与する場合、前記成分は同時に又は別個に投与することができる。例えば、自己の継代した線維芽細胞を１つの注射として被験体に投与することができ、自己の継代した筋細胞を別の注射として投与することができ、そして充填材料を、さらに別の注射として投与することができる。注射は、任意の好適な長さの時間（例えば、５分、３０分、１日、３日、１週間、２週間又は２週間より長い）あけることができる。あるいは、前記成分は、注射の前に組み合わせることができる。例えば、自己の継代した線維芽細胞、継代した筋細胞、及び充填剤を含有する組成物を、単一の注射で投与することができる。あるいは、自己の継代した線維芽細胞及び継代した筋細胞の混合物を１つの注射として投与することができ、そして充填剤を別の注射で投与することができる。
【００８６】
本発明の方法は、任意の哺乳類種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又はスナネズミ）を治療するのに用いることができる。本発明の方法は、ヒトを治療するのに特に有用である。
【００８７】
本発明の方法は、尿道、尿管、及び食道を取り囲む組織（例えば、括約筋構造）を改善又は修復し、それにより異常に広く、弛緩した内腔の大きさを減少させることにより、尿失禁及び／又は膀胱尿管逆流現象を治療するのに用いることができる。これらの方法は、本発明の組成物を、尿道、尿管若しくは食道を取り囲む領域に、又は修復若しくは増加すべき領域に設けたポケット中に直接、配置（例えば、注射又は移植）することを含む。
【００８８】
雄性尿道は、前立腺部、隔膜部、及び陰茎部に分けられる。隔膜部は、尿道で最も厚い部分であり、泌尿生殖器隔膜中を通っている。隔膜部尿道の骨格筋層は、尿道の周囲にほぼ完全な環を形成する、外部（又は随意）尿道括約筋を含む。本発明の方法は、尿失禁を有する被験体に、損傷した又は不良な隔膜部尿道の機能を改善するために、自己線維芽細胞を含有する組成物を投与（例えば、尿道壁への注射又は移植による）するのに用いることができる。
【００８９】
雌性尿道は極めて短く、約４ｃｍの長さの拡張可能な管状構造物である。尿道は、膀胱出口に始まり、会陰膜を通過して延び、恥骨結合の後ろを通り、会陰の外尿道口に終わる。雌性尿道は、膀胱に対する全体的な括約機構である。その内部は粘膜層で被覆され、その中心部は３層の主筋層で構成される強力な筋肉壁である。中層は、環を形成する密な横紋筋線維を含む。失禁は、これらの筋線維が部分的に欠損していることにより起こり得る。尿道機能は、尿道又は膣及び膀胱などの隣接臓器の解剖学的な問題により変化又は損傷し得る。損傷した又は欠損した隔膜部尿道の機能は、自己線維芽細胞及び、任意により筋細胞（例えば、自己筋細胞）を含有する組成物を投与（例えば、尿道壁への注射又は移植により）する、本発明の方法を用いることにより改善することができる。かかる組成物は、希釈剤（例えば、生理食塩水）中の、生分解性充填材料を含有する懸濁液中の、又は生分解性無細胞マトリックスに播種された細胞を含有することができる。
【００９０】
尿管は、腎臓から膀胱への尿の輸送の最中、伸展反射に応答して収縮する筋肉性の導管である。膀胱内の尿管の遠位開口は尿管口（ureteral meatus）として知られており、膀胱壁の後態様の、下層の筋肉及び膀胱三角と呼ばれる三角構造の両側に位置する。尿管の筋層は尿管口を通り、膀胱底（floor of the bladder）に扇状に広がっているため、尿管の筋組織と膀胱三角とは連続している。膀胱内尿管、及び膀胱三角表面（superficial trigone）に入る粘膜下尿管の固有縦走筋層の長さが、遠位尿管の正常な機能にとって重要である。これらの要因は、尿管口の形状にとって重要であり、尿管口の形状が変化すると、尿管口の位置が悪くなり、膀胱内尿管の部分が短くなり、その結果として逆流が起こる傾向が増大する。
【００９１】
尿道括約筋又は尿管筋組織の機能を向上するための手順は、任意に、局所又は全身麻酔下に行うことができる。尿管組織への注射のために、膀胱鏡検査を、一般的には外来患者として、又は外来診療中にさえ行うことができる。膀胱鏡は、拡張した異常な尿道／尿管内腔から正しい視距離にその先端が位置するように、尿道内に導入することができる。注射は、尿道周囲に、又は経尿道的に行うことができる。
【００９２】
尿失禁を有する雄を治療するために、任意の好適なゲージ及び長さの針（例えば、２０ゲージ×３５ｃｍ針）を、膀胱鏡の処置チャンネルを介して導入し、膨張した内腔から外部へと、尿道周囲組織に導き、組織内を前進させることができる。自己線維芽細胞を、筋細胞（例えば自己筋細胞）と共に又はそれなしに、及び、任意に、生分解性無細胞充填剤又はマトリックスを含有する本発明の組成物は、所望の内腔の狭窄が達成されるまで、尿道周囲組織中に注射することができる。
【００９３】
尿失禁を有する雌を治療するために、任意の好適なゲージ及び長さの針（例えば、２０ゲージ×３０ｃｍ針）を、針の配置方向を膀胱鏡の軸でガイドしながら、下向きの斜角で、かつ膀胱頚を前進するように、尿道周囲に挿入することができる。周囲粘膜組織への針の理想的な配置の観察は、針に接続したシリンジに詰めた細胞製剤を注射する前に、膀胱鏡の視野から観察される針の緩やかな動きによって得ることができる。注射は、「３時及び／又は９時の位置」に行うことができる。内腔の狭窄は、注射が完了するまで膀胱鏡により連続的にモニターすることができる。
【００９４】
膀胱尿管逆流現象を治療するために、被験体を仰臥位又は改変砕石位にすることができ、膀胱鏡を挿入し、尿管が視覚化できるまで前進させることができる。長さ約２５〜４０ｃｍ（例えば、長さ２５ｃｍ、３０ｃｍ、３５ｃｍ、又は４０ｃｍ）の針（１８ゲージ針、２０ゲージ針、２３ゲージ針、２５ゲージ針、又は２７ゲージ針）を、処置チャンネルを通して前進させることができる。ニードルチップは、尿管口からおよそ４〜６ｍｍ遠位の、尿管下領域（subureteral space）の「６時の位置」に、直視下、膀胱粘膜に挿入することができる。針の適切な配置は、尿管にフレンチカテーテルを設置することで容易になるだろう。その後、針を近位に前進させることができる。自己線維芽細胞を、筋細胞（例えば、自己筋細胞）と共に又はそれなしに、及び任意に生分解性無細胞充填剤又はマトリックスと共に含有する組成物を、隆起が尿管口をほぼ閉鎖するまで、ゆっくりと注射することができる。溢出を防ぐために、一般的に、単回の正確な注射を行ない、針は、引き抜く前に２〜３分その位置に保持することができる。
【００９５】
食道は、長さ約８インチの筋肉性の管であり、咽頭から胃まで伸びている。食道の上端及び下端は、両方とも括約構造を有しており、嚥下の最中を除き閉じたままとなっている。下部食道括約筋（ＬＥＳ）の欠陥は、胃内容物を食道に逆流させる可能性があり、こうしてＧＥＲＤが起こる。
【００９６】
ＬＥＳの機能を改善し、ＧＥＲＤの症候を軽減するために、本発明の組成物を、食道のＬＥＳ又はその近傍に設置する（例えば、注射又は移植する）ことができる。内視鏡を用いてＬＥＳを視覚化することができ、任意の好適なサイズ及び長さの針（例えば、２３ゲージ×２５ｃｍ針、又はカテーテルに接続した２３ゲージ×１．５ｃｍ針）を、内視鏡の処置チャンネルを通して挿入することができる。次に、針を、食道内腔に対して内側に向いた斜角で、ＬＥＳの若干近位の食道粘膜に挿入することができる。本発明の組成物は、粘膜の所望の膨化が達成されるまで、食道壁の数箇所（例えば、３時、６時、９時及び１２時の位置）に注射することができる。
【００９７】
本発明はまた、本発明の組成物を、皮膚、皮下、及び筋膜組織の増加及び／又は修復のために投与する方法を提供する。自己の継代した線維芽細胞を、継代した筋細胞、マトリックス成分、及び／又は充填剤と共に又はそれなしに含有する組成物は、例えば、瘢痕、セルライト、皮膚弛緩（skin laxness）又は皮膚菲薄（skin thinning）、しわ、創傷（例えば、急性、慢性、部分的又は全層の創傷、火傷、褥瘡及び潰瘍）、乳房欠損、歯周疾患、口腔粘膜の欠陥、口腔粘膜の外傷、糖尿病、静脈うっ滞、ヘルニア、関節の靭帯、腱及び筋肉の損傷、及び脱毛などを治療するために被験体に注射又は移植することができる。これらの症状を治療する方法は、例えば、欠損又は欠陥の部位へ、自己の継代した線維芽細胞及び継代した筋細胞（例えば、自己の継代した筋細胞）を含有する組成物を注射することを含むことができ、ここで、細胞は培養培地血清由来のタンパク質を実質的に含まない。
【実施例】
【００９８】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【００９９】
実施例１：注射用の線維芽細胞懸濁液を得る方法
皮膚線維芽細胞培養物は、皮膚の１〜５ｍｍの全層生検標本、又は組織が入手可能な場合はより厚い標本から開始した。同種移植片拒絶現象のため、培養線維芽細胞が、宿主と組織適合性であることが重要であった。組織適合性は、治療対象の被験者から生検試料を得、そしてこの標本由来の線維芽細胞を培養することによって確保した。
【０１００】
培養を開始する前に、生検試料は、抗生物質及び抗真菌剤で繰り返し洗浄した（上記参照）。上皮及び皮下脂肪細胞含有組織を取り出し、得られる培養物が実質的に非線維芽細胞を含まないようにした。皮膚の残りの標本は、メス又は鋏により細かく分割した。個々の組織片は、鉗子でＴ−２５組織培養フラスコの乾燥表面上に置き、２〜５分間かけて、又は組織及び実験室内の温度及び培養フードに応じて必要なだけの間にわたり付着させた。少量の培地（通常１．５〜２ｍｌ）を、付着した組織断片を動かさないように、ゆっくりと慎重に加えた。４８〜７２時間のインキュベーションの後、フラスコに標準的な抗生物質を含有する追加の培地を供給した。細胞は、抗生物質を含む培地中で１４日間維持し、この時点から、細胞を、ゲンタマイシンを含有する抗生物質不含培地中でインキュベートした。
【０１０１】
培養の早期の段階では、組織断片が、培養フラスコの底に付着したままであることが望ましく、剥離した断片は新しいフラスコに再移植した。線維芽細胞の増殖をトリプシン／ＥＤＴＡへの短い曝露により刺激した。この曝露は、細胞を付着から解放しない程度に短いものであった。この過程によって、細胞のフラスコ表面へのより均一な分配が可能となり、コンフルエントへのより迅速な増殖を促した。培養物が確立し、コンフルエントに近づいた後すぐに、線維芽細胞のサンプルを凍結貯蔵のために取り出した。ヒト線維芽細胞の継代回数は一般的に限られているため、継代回数の少ない線維芽細胞の貯蔵が好ましい。凍結培地は、一般的に７〜１０％のＤＭＳＯ及び２０％の自己血清又はＦＢＳを含有するが、細胞はまた、グリセロール又は９０％の血清中で凍結することもできる。
【０１０２】
一度細胞がコンフルエントになったら、これらをトリプシン処理により新たなフラスコに継代した。拡大のために、個々のフラスコを、４５０ｃｍ２の総培養面積を有する三重底Ｔ−１５０フラスコに１：３分割した。これらのフラスコには、約６×１０６個の細胞を播種し、約１．８×１０７個の細胞を得た。フラスコの容量に達したとき（一般的には、７〜１０日の培養後）、増殖培地を、無血清完全培地に交換した。その後、細胞を３７℃で少なくとも２時間（一般的には１２時間超）タンパク質不含培地でインキュベートした。無血清培地中でのインキュベーションにより、それが存在した場合に、被験体に免疫原性となり得、アレルギー反応を惹起し得る、ウシ胎仔血清に由来するタンパク質を、細胞から実質的に除去した。
【０１０３】
無血清培地でのインキュベーションの終わりに、細胞を組織培養フラスコからトリプシン／ＥＤＴＡで取り出し、遠心分離及び再懸濁により入念に洗浄し、注射のために等量の注射用の等張生理食塩水に懸濁した。容量まで増殖させた５〜１０個の三重底Ｔ−１５０フラスコは、約３×１０７〜１×１０８個の細胞をもたらし、これは約１〜３ｍｌの懸濁液を作製するのに十分であった。
【０１０４】
あるいは、細胞は、懸濁液が作製されたときから１８時間以内に注射されるのであれば、４℃で輸送することができる。細胞を、等量の完全培地（ただしフェノールレッドｐＨ指示薬を含まず、ＦＢＳが被験体の血清で置き換えられたもの）に懸濁した。細胞を吸引し、輸送培地に注入した。細胞を懸濁する生理食塩水又は輸送培地の容量は重要ではなかった。
【０１０５】
実施例２：粘性懸濁液中の注射用の細胞集団を得る方法
大容量の増量剤（bulk-enhancing material）が必要な場合には、注射用の細胞懸濁液を調製する別の方法を用いた。この方法は、約１０６個の細胞の集団が得られるまでは、実施例１に記載した方法と同一である。その後、１ｍｌの被験体血漿及び５０〜１００μｌの３００ｍＭ  ＣａＣｌ２を加えることにより、６０ｍｍ又は１００ｍｍ組織培養ディッシュの底に、血漿凝塊を形成させた。培養皮膚線維芽細胞（２〜１０ｍｌ中に１０６個）を凝塊の表面に播種し、完全培地中でさらに７日間培養した。７日後に、完全培地を無血清培地に交換した。最初の培地交換から１時間後、再度培地を取り除き、新鮮な無血清培地と交換した。細胞をさらに１４〜１８時間インキュベートした。その後、凝塊をシリンジに吸引し必要なだけ注射した。
【０１０６】
実施例３：筋細胞の注射用組成物を得る方法
筋の生検を行ない、大きさが約０．５〜１．０ｃｍ３の試料を回収し、質量が約０．５〜１ｇの組織を得た。組織は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地中での穏やかな攪拌によって分離し、すべての明らかな結合組織又は脂肪組織は、鉗子で除去した。残りの組織試料は、１００ｍｍディッシュ中の５ｍｌのトリプシンに移し、無菌カミソリ刃により組織を１ｍｍ３以下の小片にきざんだ。すりつぶした懸濁液は、その後、攪拌棒を備えた無菌フラスコに移し、トリプシン／ＥＤＴＡを加え、最終容量を２０〜２５ｍｌとした。懸濁液は、３７℃で２０分間、極めて穏やかに攪拌した。一度組織片がフラスコの底に沈殿したら、上清を、氷上のプラスチック製５０ｍｌ遠心チューブにデカントした。トリプシンを中和するために、ＦＢＳを最終濃度１０％まで加えた。トリプシン処理ステップを、最大３回、又はピンク色の組織片が残らなくなるまで繰り返した。上清を、８００〜９００ｇで５分間遠心分離した。
【０１０７】
細胞ペレットを、１０ｍｌの１：１ヒト筋増殖培地／馴化培地（ＨｕＧＭ／ＣＭ）中にプールした。ＨｕＧＭは、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０、１０％ＦＢＳ、５％仔ウシ血清（規定されており、鉄が添加されている；Hyclone, Logan, UT）、０．５％ニワトリ胚抽出物（Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する。ＣＭはＭＲＣ−５線維芽細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）での一晩のインキュベーションにより馴化し、その後０．４５μｍフィルターを通して濾過したＨｕＧＭである。０．１ｇの組織により、概してそれぞれ５×１０３個の細胞を得た。
【０１０８】
細胞は、任意の好適な大きさ（例えば、３５ｍｍ、６０ｍｍ又は１００ｍｍ）の組織培養プレートに播種し、第１又は第２日に、細胞が３０〜４０％のコンフルエントに達した場合に１：１のＨｕＧＭ／ＣＭを供給した。さもなければ、第４若しくは５日、又は細胞が４０％のコンフルエントに達したとき（いずれか早い方）に、細胞に１：１のＨｕＧＭ／ＣＭを供給した。その後、細胞が４０％未満のコンフルエントにならない限り、２〜３日ごとにＨｕＧＭを供給し、４０％未満のコンフルエントの場合は、１：１のＨｕＧＭ／ＣＭを供給した。細胞が７０〜８０％のコンフルエントに達したとき、これらをトリプシン処理し、ＨｕＧＭに分散させ、未使用１００ｍｍディッシュに、ディッシュあたり１０ｍｌのＨｕＧＭ中に５〜１０×１０５個の細胞を播種した。ディッシュは、一般的に、継代培養後、約２０％のコンフルエントであった。好適な数が得られるまで、細胞を拡大し、継代培養した。
【０１０９】
筋細胞を、将来の使用のために凍結した。細胞をトリプシン処理し、１５ｍｌチューブに回収した。細胞数を血球計算機で決定し、細胞を８００〜９００ｇで２分間遠心分離した。培地を吸引し、細胞を凍結培地（９０％の仔ウシ血清、１０％のジメチルスルホキシド）に再懸濁し、およそ２×１０６細胞／ｍｌとした。細胞懸濁液を２ｍｌ低温凍結バイアルに０．５ｍｌずつ分注（アリコート）し、液体窒素に移す前に、バイアルを発泡材で充填された箱の中で−７０℃で凍結した。
【０１１０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明に付随して説明したが、前記記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図するものであって、制限することを意図するものでないことを理解すべきである。他の態様、利点、及び改変は、特許請求の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
2005532090.tif 000002
2005532090.tif 000003