(57)【要約】本発明の抗体は、ヒトＤＲ５またはヒトＤＲ４と相互作用して、細胞の増殖およびアポトーシスの阻害を含む、レセプター下流のアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用をもたらす。必要に応じて種々の治療剤と組み合わせられるこの抗体のための方法および使用（アポトーシス関連疾患の処置および無調節な差異棒増殖の処置を含む）が詳述される。本発明によって、ＤＲ５を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、該方法は、以下：（ａ）標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程；および（ｂ）該標的細胞を、１種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、を包含する、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ５を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程；および
（ｂ）該標的細胞を、１種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの接触させる工程が、インビボで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの接触させる工程が、インビトロで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記化学療法剤が、以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記化学治療剤または薬剤が、以下：レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、６−チオグアニニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｉｎｅ）、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｏｓｉｄｅ）、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン  リン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コランブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）  リン酸ナトリウム、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、方法。
【請求項８】
リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記治療剤が抗生物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療剤がサイトカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療剤がケモカインである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記治療剤が増殖因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載の方法であって、前記治療剤が、以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、方法。
【請求項３２】
前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性化免疫細胞が活性化リンパ球である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的細胞が好中球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的細胞を照射する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
ＤＲ５を発現する標的細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は以下：
（ａ）標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程；および
（ｂ）該標的細胞を、１種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
少なくとも１つの接触させる工程が、インビボで実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの接触させる工程が、インビトロで実施される、請求項３９載の方法。
【請求項４２】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記化学療法剤が、以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法であって、前記化学治療剤または薬剤が、以下：ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、６−チオグアニニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｉｎｅ）、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｏｓｉｄｅ）、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン  リン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コランブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）  リン酸ナトリウム、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、方法。
【請求項４６】
リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記治療剤が抗生物質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
前記治療剤がサイトカインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項６３】
前記治療剤がケモカインである、請求項３９に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療剤が増殖因子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項６６】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項３９に記載の方法であって、前記治療剤が、以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、方法。
【請求項７０】
前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７１】
前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７３】
前記活性化免疫細胞が活性化リンパ球である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７４】
前記標的細胞が好中球である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７５】
前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項７６】
前記標的細胞を照射する工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項７７】
炎症疾患または自己免疫疾患を有する被験体を処置する方法であって、以下：
（ａ）標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体の治療量と接触させる工程であって、ここで、該後退は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、工程；および
（ｂ）該標的細胞を、１種以上の治療剤の治療量と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記治療剤が化学療法剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記化学療法剤が以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド、６−  チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記化学療法剤が、以下：ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、６−チオグアニニン、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン、コランブシル、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
請求項７８に記載の方法であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、方法。
【請求項８２】
リタキシマブを投与する工程をさらに包含する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９１】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９３】
前記治療剤が抗生物質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９５】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
前記治療剤がサイトカインである、請求項７７に記載の方法。
【請求項９９】
前記治療剤がケモカインである、請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
前記治療剤が増殖因子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記治療剤が、化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０６】
前記炎症性疾患または自己免疫疾患は、以下：エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、シェーグレン病、悪性貧血、アディソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、生殖不能、重症筋無力症、多発性硬化症、バーゼドー病、血栓性血小板減少（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｐｅｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒａ）、インスリン依存性糖尿病、アレルギー；ぜん息、アトピー疾患；動脈硬化症；心筋炎；心筋症；糸球体腎炎；低形成貧血からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０７】
放射線治療を被験体に受けさせる工程をさらに包含する、請求項７７に記載の方法。
【請求項１０８】
組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体であって、ここで該抗体は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞中にインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導する活性を有する、抗体、および
（ｂ）１種以上の治療剤、
を含有する、組成物。
【請求項１０９】
前記治療剤が以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、疾患修飾抗リウマチ薬、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、請求項１０８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（承認）
本願は、米国仮出願番号６０／３９１，４７８（２００２年６月２４日出願）および米国仮出願番号６０／３４６，４０２（２００１年１１月１日出願）の利益を主張し、そして現在係属中である、ＰＣＴ／ＵＳ０１／１４１５１（２００１年５月出願）に対する優先権を主張する。ＰＣＴ／ＵＳ０１／１４１５１は、米国仮出願番号６０／２０１，３４４（２０００年５月２日出願）の利益を主張する。本願が利益を主張する出願は、本明細書中で、それらの全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、国立ガン協会から授与された助成金ＮＣＩ  Ｐ５０  ＣＡ８９０１９−０１および国立関節炎ならびに筋骨格疾患および皮膚疾患協会から授与されたＮＩＨ  Ｒ０３−ＡＲ４４９８２下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、１つの型の腫瘍壊死因子（本明細書中で以後「ＴＮＦ」と呼ばれる）関連アポトーシス誘導リガンド（本明細書中で以後「ＴＲＡＩＬ」と呼ばれる）レセプターに特異的に結合することが可能な抗体、より詳細には、その１つの型のレセプターを発現する細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体、ならびにそれに基づく治療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦファミリータンパク質のメンバーであり、それはまた、ＴＮＦ−αおよびＦａｓリガンドも含む（１）。これらのタンパク質は、アポトーシスの強力な誘導因子である。現在まで、ＴＲＡＩＬに対する５つのレセプターが同定されており、それらのうちの２つである、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）（２〜７）は、アポトーシスシグナルを伝達することが可能である。一方、他の３つ、ＤｃＲ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）およびオステオプレテゲリン（ＯＰＧ）は、アポトーシスシグナルを伝達しない（８〜１２）。ＴＲＡＩＬに対する５つすべてのレセプターは、それらの細胞外リガンド結合ドメイン内で有意な相同性を共有する。ＦａｓおよびＴＮＦレセプターＩ（本明細書中で以後「ＴＮＦＲＩ」と呼ばれる）と同様に、ＤＲ４およびＤＲ５の両方の細胞内セグメントは、デス（ｄｅａｔｈ）ドメインを含み、そしてＦａｓ関連デスドメインタンパク質（本明細書中で以後「ＦＡＤＤ」と呼ばれる）およびカスパーゼ８に関連する経路を通ってアポトーシスシグナルを伝達する（６、７）。アポトーシスシグナルの伝達に加えて、ＤＲ４レセプターおよびＤＲ５レセプターはまた、ＮＦκｂの関与する経路を活性化し得る（６、７）。
【０００５】
実証されているＴＲＡＩＬの生物学的機能は、形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導するＴＲＡＩＬの能力を含む（１３〜１５）。正常細胞は、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに比較的耐性である。この選択性は、Ｆａｓリガンドとは対照的に、ＴＲＡＩＬの投与が、有意な毒性を誘導することなく動物モデルにおいてＴＲＡＩＬの全身投与によって実証されたように、毒性が非常に低いレベルであることに関連することが示される（１３）。このように、ＴＲＡＩＬは、ガンおよび異常な細胞増殖に関連する他の疾患の処置に対して適した治療薬であり得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。ＴＲＡＩＬはまた、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置に対して適し得る強力なアポトーシス誘導薬剤として提案される。ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスが、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死に関連し、それによってＦａｓリガンドに代替メカニズムとして働くことが実証されている（１６、１７）。ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスはまた、Ｔ細胞および他の炎症性細胞のアポトーシスの誘導において機能し得（１８）、そしてＮＫ細胞の死滅活性（１９〜２１）および樹状細胞の免疫調節機能（２２、２３）の役割を果たす。このように、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスはまた、免疫沈降および免疫学的調査において機能し得る。
【０００６】
ＴＲＡＩＬレセプターシステムは、複雑であり、そして少なくとも２つのデスレセプター（ＤＲ４およびＤＲ５）および少なくとも２つの非アポトーシスレセプター（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）を含む。これらのレセプターすべては、高いアミノ酸配列の相同性を共有するだけでなく、ＴＲＡＩＬに対する同様の結合親和性を示す（２〜１２）。アポトーシスを誘導せずにＴＲＡＩＬの結合に対して競合するようなＤｃＲ１レセプターおよびＤｃＲ２レセプターの能力は、それらが、ＴＲＡＩＬリガンドの活性をブロックまたは調節するデコイレセプターとして作用し得ることを示す。さらに、非形質転換細胞が、形質転換細胞が発現するよりも高いレベルのデコイレセプターを発現することが報告されている。このように、デスレセプターおよびデコイレセプターの発現の差次的な調節が、レセプター特異的抗体の欠如に起因するＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性を決定する主要な調節メカニズムを示し得ることが提案される（２）。ＤＲ４およびＤＲ５の発現および機能が、広範に研究されていたにも拘らず、レセプター特異的モノクローナル抗体の欠如によって、その進展が妨害されていた。ＤＲ５の細胞表面発現は、実証されていない。インビトロでの黒色腫細胞のアポトーシスを誘導することが可能である一群の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体が生成されたが、それは、抗体が固定された場合においてのみ架橋を促進し、いくつかの場合では、その細胞がアクチノマイシンＤでの培養を必要とすることが報告されている（２４）。いくつかの抗ＤＲ５抗体が、生成されている（２４）。しかし、以前に生成されたこれらの抗ＤＲ５モノクローナル抗体は、インビトロにおいて、架橋状態下でさえ、低いアポトーシス誘導活性を有する。インビボでの活性は報告されていない。これらの抗体は、ＴＲＡＩＬレセプターの細胞表面発現を試験するために使用される（２４）。このように、細胞表面レセプターに結合することができるだけでなく、インビボおよびインビトロの両方において架橋または固定を必要とせずに、腫瘍細胞を含む種々の型の異常細胞のアポトーシスを強く誘導することができる、各特異的ＴＲＡＩＬレセプターに対して選択的なモノクローナル抗体が必要である。そのような抗体は、潜在的な治療薬を提供するだけでなく、ＴＲＡＩＬレセプターの機能的分析に対する診断的ツールを提供する。死誘導レセプターＤＲ４およびＤＲ５の各々に対する抗体特異的な薬剤が特に必要である。
【０００７】
多くの疾患の発症または進行において、細胞は欠失されないことがしばしばある。多くの自己免疫疾患および炎症性状態において、生存する活性化細胞は、正常組織または正常細胞を攻撃する。さらに、腫瘍形成の進行およびリウマチ様関節炎の増殖性ｐａｎｕｓ形成は、細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる。このように、不十分なアポトーシスは、疾患の発症を導き、そしてアポトーシス誘導リガンドまたはアポトーシスを増強するアゴニスト性モノクローナル抗体の使用は、それら望まれない細胞を排除するための潜在的な治療ストラテジーとして考慮される。
【０００８】
例えば、リウマチ様関節炎（本明細書中で以後「ＲＡ」と呼ばれる）は、一般的なヒト自己免疫疾患である。ＲＡの病理生理の現在の理解は、自己免疫Ｔ細胞およびＢ細胞が、関節において炎症性の応答を開始し、それが滑膜細胞の過剰増殖を駆動するというものである。滑膜細胞の過剰増殖の結果として、メタロプロテイナーゼ（本明細書中で以後「ＭＭＰ」と呼ばれる）は、過剰産生され、それによって、さらにＲＡに特徴的である軟骨および骨のびらん性破壊がさらに導かれる（２５）。従って、炎症性滑膜細胞の過剰増殖の制御は、ＲＡの処置において重要な工程である。滑膜細胞の過剰増殖を導く分子メカニズムは、なお未知である。過剰増殖した滑膜細胞が、悪性でなくかつ形質転換していないにも拘らず、多くの研究において、それらは、形質転換細胞と共通のいくつかの特徴を共有することが示唆されている（４６）。これらの細胞は、いわゆる「形質転換しているように見える滑膜細胞」であり、密集した粗面小胞体、無数の不揃いの核および通常は紡錘体形状の細胞骨格の変化によって特徴付けられる。オンコジーンおよびウイルス由来遺伝子の組み込みは、ＲＡ滑膜細胞の形質転換した外観に対する最初の誘発であり得ることが提唱されている（４６）。
【０００９】
ＲＡの少なくとも２つの局面において、調節されていないアポトーシスは、疾患の進行に寄与し得ること、そしてアポトーシスの治療的な誘発は、効果的な処置であり得ることが、示唆される：活性化Ｔ細胞の欠失の失敗は、これらＴ細胞の不完全活性化誘導性細胞死が存在することを示唆し、この細胞死は、Ｆａｓ媒介性アポトーシスおよびＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスを含むプロセスである。そして、ＲＡ滑膜細胞の過剰増殖性質は、ＲＡ病理生理学の後の段階で寄与する因子である。実際、抗Ｆａｓ抗体の炎症性関節への投与が、ヒトＲＡに対する動物モデルであるｔａｘトランスジェニックマウスにおいて慢性関節炎の発症を阻害することが示されている（２６）。さらに、アデノウイルスベクターによるｆａｓリガンド遺伝子での局所的な形質導入は、コラーゲン誘導関節炎の予防に効果的である（２７）。Ｆａｓ媒介性アポトーシスの増強による炎症性滑膜細胞の増殖の阻害は、両方の場合に観察される。Ｆａｓリガンドが、ＲＡ滑膜細胞における強力なアポトーシス誘発因子であるにも拘らず、ヒトに対する治療としてのＦａｓリガンド媒介性アポトーシスの適用は、致死的な肝臓毒性によって制限されている。したがって、ＴＲＡＩＬレセプター誘導アポトーシスは、ＲＡの処置に対して、Ｆａｓリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。ＴＲＡＩＬレセプター誘導アポトーシスはまた、ガンの処置に対して、Ｆａｓリガンド誘導アポトーシスより安全かつ効果的な治療を示す。ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスは、正常細胞に影響を及ぼさずに形質転換腫瘍細胞のアポトーシスを特異的に誘導することが知られている。三量体形成した可溶性ＴＲＡＩＬの全身投与は、実験動物にて毒性を引き起こさないがなお、移植した腫瘍の退化を誘導することが可能であることが示されている（１３、２８）。従来の処置のための付属的な治療としてのその能力は、ＤＲ５の発現および乳ガン細胞のＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する感受性が、照射によって増大されるこという最近の研究結果によって理解された。このことは、照射と組み合わせると、ＴＲＡＩＬの効力は、ガン治療において増大することが示唆する（２９）。
【００１０】
さらに、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５をコードする遺伝子は、いくつかのガン細胞において高頻度の変異を有する座である染色体８ｐ２１−２２にマッッピングされている（３０）。少なくとも２種類の腫瘍細胞、小肺ガン（３１）、頭頚部ガン（３２）が、ＤＲ５遺伝子のデスドメインにおいて変異を示すことが報告されている。したがって、ガンの発症および進行に対する、レセプターエピトープのバリエーションの効果を決定するためのガン研究において抗ＤＲ５抗体が必要である。さらに、ガンの早期検出において他の生物マーカーとともに使用される場合、および腫瘍進行性の予知因子として使用される場合、ＴＲＡＩＬレセプター変異の機能性は、有利な臨床的診断ツールを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を認識し、インビボまたはインビトロでＤＲ５を発現する細胞においてアポトーシスを誘導する抗体に関する。さらに、ＤＲ５を認識するがＤＲ４も、ＤｃＲ１もＤｃＲ２も認識しない抗体が、開示される。ハイブリドーマによって生成されるＤＲ５に対するモノクローナル抗体が、具体的に詳述される。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ４を認識し、インビボまたはインビトロでＤＲ４を発現する細胞にてアポトーシスを誘導する抗体に関する。さらに、ＤＲ４を認識するがＤＲ５も、ＤｃＲ１もＤｃＲ２も認識しない抗体が、開示される。ハイブリドーマによって生成されるＤＲ４に対するモノクローナル抗体が、具体的に詳述される。
【００１３】
提供される方法は、ＤＲ５またはＤＲ４に結合することが可能な治療量の抗体と細胞とを接触することによる、標的細胞におけるアポトーシスの誘導および標的細胞増殖の阻害である。この方法の種々の実施形態において、標的細胞を、他のデスレセプターに対する抗体と接触させることによって、アポトーシスが誘導され得るか、または細胞増殖が阻害され得る。
【００１４】
ＤＲ５に対して活性な治療量のモノクローナル抗体、薬剤的に受容可能なキャリア、ならびに必要に応じてその抗体およびキャリアを収容する容器を含む、薬理学的組成物もまた、開示される。さらに、異常細胞または調節不全細胞の選択的アポトーシスに対する治療剤を調製するための、ＤＲ５を認識する抗体またはＤＲ４を認識する抗体の使用が、本発明によって提供される。
【００１５】
本発明の抗体は、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｒＲ１、ＤｒＲ２およびＯＰＧのような腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドレセプターと相互作用し、そのようなレセプターを発現する細胞にてアポトーシスを誘導する。アゴニスト性またはアンタゴニスト性の腫瘍壊死因子リガンドレセプターエピトープを選択的に結合することが可能な本発明の抗体が、開示される。
【００１６】
本発明は、単独でかまたは他のアポトーシス誘導抗体および／または他の治療薬もしくは処置と組み合わせて、疾患を有する標的組織を治療量の本発明の抗体に接触すること、を含む方法による、アポトーシス関連疾患、ガン、炎症性疾患または自己免疫疾患に対する処置を提供する。
【００１７】
さらに、被験体内で免疫反応を誘発することが可能な免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントに連結された、少なくとも１０塩基を有する抗原性ＴＲＡＩＬレセプターアミノ酸配列を含む融合タンパク質が、開示される。
【００１８】
本発明は、標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプター核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトし、その結果、そのＴＲＡＩＬレセプターが標的細胞で発現される、遺伝子治療方法を提供する。次いで、この標的細胞は、そのＴＲＡＩＬレセプターを選択的に結合する抗体に曝される。
【００１９】
ＤＲ５に対して選択的な抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列およびアミノ酸配列が、提供される。配列もまた、ＤＲ４に選択的に結合する抗体について提供される。本発明の核酸配列を含むベクターおよび本発明のベクターで形質転換された宿主細胞もまた、詳述される。
【００２０】
本発明は、ヒト化ＤＲ５抗体（例えば、ＴＲＡ−８）およびヒト化ＤＲ４（例えば、２Ｅ１２）、ならびにそのヒト化ＤＲ５抗体を生成するトランスフェクト細胞およびヒト化ＤＲ４抗体を生成するトランスフェクト細胞を提供する。
【００２１】
ヒト化ＤＲ５抗体またはヒト化ＤＲ４抗体を生成するための方法が、記載され、この方法において、宿主が、ヒト化免疫グロブリン軽鎖およびヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列で形質転換され、その後、形質転換された宿主は、所定の期間、インキュベートされる。
【００２２】
また、標的細胞においてアポトーシスを誘導するかまたは細胞増殖を阻害するためのプロセスが、記載され、そのプロセスは、他の治療薬および処置の存在下または非存在下で、薬学的に有効な量のヒト化ＤＲ５抗体、ヒト化ＤＲ４抗体、またはＤＲ５抗体と別のデスレセプターに対する抗体（例えば、ＤＲ４に対する抗体）との組み合わせと、標的細胞を接触することを含む。
【００２３】
アポトーシスを誘導するための市販のキットが、提供され、このキットは、適した容器内に包まれた、ＤＲ５に対して選択的なヒト化ＴＲＡ−８抗体またはＤＲ４に対するヒト化抗体（例えば、ヒト化２Ｅ１２）、および必要に応じて使用のための指示書を備える。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
細胞除去の失敗は、アポトーシス誘導系の欠陥に起因し、それは例証的にリガンド、レセプター、または細胞内調節因子およびエフェクター分子の発現または機能を含む欠陥に関連する。本発明は、不完全なアポトーシス誘導系を補正する方法および所定の不完全なアポトーシス誘導系に備わる特定の欠陥を解明する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、ＤＲ５、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２を含む特異的ＴＲＡＩＬレセプターに対する選択的なインビボおよびインビトロでのアポトーシス誘導活性を有するモノクローナル抗体の新しいクラスに関する。従って、本発明の抗体は、ＴＲＡＩＬレセプターの１つに特異的に結合する。「選択的な結合」または「特異的な認識」とは、伝統的なウェスタンブロット解析の使用によって、抗体がただ１つのＴＲＡＩＬレセプターに結合し、そして他の型のＴＲＡＩＬレセプターにほとんど結合しないかまたは全く結合しないことを意味する。本発明のＤＲ５抗体は、ＤＲ５に選択的に結合し、そしてＤＲ４、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２に対して約１．５倍のバックグランドを上回る結合を示さない。同様に、本発明のＤＲ４抗体は、選択的にＤＲ４に結合し、ＤＲ５、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２の約１．５倍のバックグラウンドを上回る結合を示さない。本発明は、アポトーシスシグナル伝達の研究のための試薬としての有用性、およびＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞に対して有効な治療薬としての有用性を有する。ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞としては、例証的に、癌細胞の広範なクラス、アポトーシス系の脱調節を示す細胞、活性化リンパ球または他の活性化免疫細胞（例えば、リンパ球および骨髄性細胞）、ウイルス感染細胞、および自己免疫疾患の異常増殖する滑膜細胞（例えば、炎症性滑膜細胞、滑膜における活性化リンパおよび骨髄性細胞、マクロファージ様滑膜細胞、ならびに線維芽細胞様滑膜細胞を含む、慢性関節リウマチ滑膜細胞）が挙げられる。本発明による抗体は、ＴＲＡＩＬレセプター間のホモロジーにもかかわらず、このレセプターの特定の型との結合において特異的である。この発明の抗体は、標的ＴＲＡＩＬレセプターを発現する細胞、あるいは標的レセプターを発現する細胞のＴＲＡＩＬアポトーシスをブロックする細胞のみを標的とするアポトーシスを提供する。
【００２６】
本発明のＤＲ５モノクローナル抗体またはＤＲ４モノクローナル抗体は、インビトロで、それぞれＤＲ５またはＤＲ４を発現する細胞におけるアポトーシスの強力な誘導因子として、およびインビボで、アポトーシスの強力な誘導因子として働く。ヒト化抗体骨格と本発明の融合タンパク質ＤＲ５抗体または融合タンパク質ＤＲ４抗体とにおいて合体された、ヒト化した断片的ＣＤＲ配列は、類似のアポトーシス様特性を示す。
【００２７】
今日まで、細胞表面ＤＲ５に結合するモノクローナル抗体、およびたとえ低濃度であっても、架橋剤なしで、インビトロおよびインビボの両方において、ＤＲ５を発現する細胞のアポトーシスを誘導するモノクローナル抗体は、入手可能ではない。本発明は、種々の疾患の処置における治療剤として作用するＤＲ５抗体を含む。可溶性のＴＲＡＩＬが、インビボにおいて、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導に効果的であることが示されているが、殺傷活性は非常に低いようであり、多くの反復した投薬がしばしば必要とされる（１３）。本発明は、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を結合する精製された抗体を提供し、ここで、この抗体は、低濃度におけるその可溶性形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロでのアポトーシス誘導活性を有する。好ましい実施形態において、この精製された抗体は、抗体の架橋の非存在下で、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に結合する。好ましくは、この抗体は、正常な線維芽細胞の有意なアポトーシスを誘導しない。好ましくは、このアポトーシス誘導活性は、約０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ未満あるいはそれらの間における任意の濃度の抗体濃度での、標的細胞の６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満あるいはそれらの間における任意の％の生存度によって特徴付けられる。この精製された抗体は、慣用的なウェスタンブロット解析下で、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５と特異的に結合し、そしてＴＲＡＩＬレセプターＤＲ４、ＤｃＲ１またはＤｃＲ２とは結合しない。好ましい実施形態において、この抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１４２８を有する、マウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８と同じエピト−プ特異性を有する。
【００２８】
本発明に従って、ＤＲ５抗体の系列うちの１つであるＴＲＡ−８は、ヒトＤＲ５トランスジーンを保有する動物において薬学的に有効であり、そしてまた、ＤＲ５およびＴＲＡＩＬの役割の研究のためのモデルを確立する際に有用性を有する。
【００２９】
本発明の種々の実施形態は、架橋の存在または非存在下で、アポトーシスを誘導する抗体を提供する。例えば、ＤＲ５抗体（例えば、ＴＲＡ−８）の好ましい実施形態は、架橋の非存在下でアポトーシスを誘導する。「架橋」は、例えば、二次抗体による架橋を含む。他の実施形態は、架橋の存在下でアポトーシスを誘導する抗体を提供し、例えば、ＤＲ４抗体（２Ｅ１２）の好ましい実施形態を含む。
【００３０】
従って、本発明は、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ４に特異的に結合する精製された抗体を提供し、ここで、この抗体は、その可溶性形態で、ＤＲ４を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する。１実施形態として、この抗体は、Ｔｈｅ  ＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを代表して、呼称名「ヒトＤＲ４に対する２Ｅ１２ハイブリドーマクローン」を有し、２００１年１０月２４日に寄託された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９７８を有するハイブリドーマ２Ｅ１２と、同じエピト−プ特異性を有するモノクローナル抗体である。本発明のＤＲ４抗体の系列のうちの１つである２Ｅ１２は、ＤＲ４を発現する癌を有する動物においてインビボで、未処置のコントロール動物と比較されるか、または処置前の腫瘍のサイズと比較されるように、腫瘍のサイズを減少させることにおいて薬学的に活性である。
【００３１】
ＤＲ５に対する抗体の両方は、低用量の可溶性形態で有効であり、低用量とは、インビトロで約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ未満、そしてインビボで約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ未満の用量または濃度を意味する。本発明の抗体の好ましい特徴は、この抗体が、正常で活性化されておらず形質転換されていない肝細胞、線維芽細胞、滑膜細胞などにおいて、アポトーシスを誘導することなく、ＤＲ５レセプターを発現する細胞に対して選択的に、アポトーシスを誘導することである。ＴＲＡＩＬレセプターに対して惹起された本発明に従う抗体は、本発明に従って実験動物から採集されるが、当該分野において公知の抗体産生または合成の任意の方法によって作製され得る。レセプター結合活性を維持するが、ヒト被験体内で減少する免疫応答および治療的に寛容な免疫応答を誘起させるように、本発明に従う抗体をヒト化することによって、本発明に従うヒト化抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体が、所定のＴＲＡＩＬレセプターに対する治療的なアゴニストまたはアンタゴニストとして使用される。本発明は、抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体の二次架橋以後、インビボ治療薬として作用するが、必要に応じて、必要とされない。
【００３２】
本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストのアポトーシス効果を有する１つの抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を越えて広がる。むしろ２つ以上の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体が、強化した処置を生み出すために、インビトロで細胞培養物またはインビボで被験体身体組織と接触される。「強化した処置」とは、任意の相加的、相乗的または増強的な効果を意味する。例えば、神経膠腫細胞株Ｕ８７および造血細胞株Ｕ９３７およびＭｏｌｔ−４は、アゴニストの抗ＤＲ４抗体および抗ＤＲ５抗体への相乗的曝露のための曝露に反応性であり、一方、アゴニストのＤＲ５抗体単独への曝露は、アポトーシスの誘導において制限された成功しか示さない。
【００３３】
さらに、アンタゴニストの抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、この抗体がデコイレセプターＤｃＲ１、ＤｃＲ２またはＯＰＧの１つに特異的に結合する場合、本発明において特に有用である。本発明に従う抗体でのデコイレセプターの選択的なブロッキングは、デコイレセプターを発現する細胞型において、アポトーシスシグナルを伝達することが可能なＴＲＡＩＬレセプターに、ＴＲＡＩＬ結合平衡をシフトする効果を有する。従って、本発明に従う別の組み合わせ治療において、デコイレセプター結合抗体が、発現細胞を、アゴニストのアポトーシスシグナル伝達ＴＲＡＩＬレセプター結合に対して感受性にする。
【００３４】
別の実施形態においては、本発明は、所定のＴＲＡＩＬレセプターのアゴニストのエピトープおよびアンタゴニストのエピトープを解明する方法を提供する。さらに、本発明に従って、各々が異なる可変領域またはＣＤＲ領域を有するモノクローナル抗体のパネルの使用を介して、所定のＴＲＡＩＬレセプターと関連した個体間の多型現象が解明される。特徴付けされたモノクローナル抗体のパネルは、アゴニストのエピト−プおよびアンタゴニストのエピトープならびに多型現象を規定する能力を提供する。従って、本発明に従うモノクローナル抗体のパネルは、薬物発見および／または疾患傾向のための物質スクリーニングにおける有用性を有する。
【００３５】
本発明のなお別の実施形態は、免疫グロブリンタンパク質、ポリペプチドまたはこれらのフラグメントと結合されたＴＲＡＩＬレセプターの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を包含する。ＴＲＡＩＬレセプターフラグメントは、被験体細胞表面で発現されるネイティブなＴＲＡＩＬレセプターに対する免疫原性応答を惹起するために十分な数の塩基を含むとして定義される。ＴＲＡＩＬレセプター融合フラグメントは、少なくとも１０アミノ酸を含む。免疫グロブリン融合タンパク質またはこのフラグメントは、ネイティブタンパク質または合成タンパク質、あるいは被験体内で免疫原性カスケード応答を活性化させるために十分な数のアミノ酸残基を有するポリペプチド区画を含むことが、本明細書中で定義される。免疫グロブリンフラグメントとカップリングされたＴＲＡＩＬレセプターフラグメントの融合を含む、本発明の免疫原は、被験体内でインサイチュで抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体を惹起させるためのインビボでの治療薬として有用性を有する。
【００３６】
またさらなる実施形態において、本発明は遺伝子治療剤として効力を有する。従って、本発明は、標的細胞内で選択的にアポトーシスを誘導する方法を提供し、この方法は、発現可能なＴＲＡＩＬレセプター核酸配列を含むベクターで標的細胞をトランスフェクトする工程；当該細胞上で、当該ＴＲＡＩＬレセプター核酸配列によりコードされるＴＲＡＩＬレセプターを発現する工程；および当該ＴＲＡＩＬレセプターと結合するのに選択的なアポトーシス誘導性の抗体と、当該細胞とを接触させる工程を包含する。本発明の遺伝子治療の局面においては、標的細胞は、ＴＲＡＩＬレセプターに対応する発現可能な配列を有するベクターでトランスフェクトされ、このベクターは通常のものであり、そして標的される細胞のベクターへの感受性に基づいて選択される。遺伝子治療ベクターとしては、例証的にアデノウイルス、ｐＡｄＣＭＶ５が挙げられる。トランスフェクトしたＴＲＡＩＬレセプターを発現する標的される細胞または組織において、これら細胞または組織は、トランスフェクトされたＴＲＡＩＬレセプターへの結合に特異的な、本発明に従う抗体に曝露される。抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、所望される治療結果に一致して、アゴニスト的かまたはアンタゴニスト的のいずれかであることが理解される。
【００３７】
本発明の抗体は、増感物質と併用してまた効力を有する。本明細書中で使用される増感物質は、アポトーシスを誘導する任意の刺激因子を含むと定義され、紫外線、有機分子（特に、ビスインドールマレイミドのクラスを含む）、重金属、および遊離基種が挙げられる。
【００３８】
癌治療の状況において、ＴＲＡ−８は、二次的な架橋の非在下で、カスパーゼ依存様式でほとんどのＴＲＡＩＬ感受性の腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。ＴＲＡ−８および２Ｅ１２は、単独でも、他の抗体との組み合わせでも、インビボで強い殺腫瘍性活性を示す。大部分のＴＲＡＩＬ感受性細胞のアポトーシスを誘導するＴＲＡ−８または２Ｅ１２の能力は、ＤＲ５かＤＲ４のいずれかが単独でアポトーシスの誘発に十分であることを確認する。本明細書中で詳述されている大多数の腫瘍細胞は、細胞表面ＤＲ５を発現しており、そしてこれらのＴＲＡ−８誘導細胞死に対する感受性は、これらのＴＲＡＩＬに対する感受性に匹敵し、そのことはＤＲ５が、大部分の腫瘍細胞において、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスについての主要なデスレセプターであることを示す。類似の結果が、ＤＲ４に対して特異的な抗体（例えば、２Ｅ１２）で得られた。従って、正常細胞および癌細胞によるＤＲ５またはＤＲ４の差次的発現は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの選択性において機能的である。ＴＲＡ−８は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを誘導するために、デコイレセプターを迂回する。しかし、ほんの少数のＴＲＡＩＬ抵抗性腫瘍細胞だけがＴＲＡ−８に感受性であり、このことは、デコイレセプターが、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗性において、主な役割を担っていないようであることを示す。
【００３９】
以前の研究で、動物における可溶型のＴＲＡＩＬの全身投与が、毒性を引き起こすことなく腫瘍退縮を誘導し３、４、２２、ヒトＴＲＡＩＬの膜結合型は、本明細書中で記載されるように、マウスにおいて肝臓損傷を誘導することが示された。ところが、ＴＲＡＩＬの肝毒性は、Ｆａｓリガンドと比較して、ＴＲＡＩＬ誘導性傷害に対する正常肝細胞の感受性がより低いこと、およびインビボではＴＲＡＩＬの致死性を欠くことによって説明されるように、Ｆａｓリガンドほどずっと強力でない。従って、ＴＲＡＩＬの力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）は、癌の治療において有用性を有する。
【００４０】
本明細書中で記載されるように、正常な肝細胞による有意なレベルのＤＲ５タンパク質の発現の不在が示され、そしてこれは、ＴＲＡ−８誘導性のアポトーシスに対する肝細胞の抵抗性と関連する。ＤＲ５のモノクローナル抗体との架橋は、アポトーシスを誘発することが可能な死レセプターのホモポリマー形態を統合するために十分ではない。マーモセットにおける実験は、ＴＲＡ−８投与の肝性の毒性の証拠を示さない。従って、アゴニスト的なモノクローナルＤＲ５抗体は、治療薬剤として、可溶型ＴＲＡＩＬよりも、選択的かつ安全である可能性がある。同様に、ＤＲ４は、形質転換されたまたは活性化されたか、細胞によって発現され、そして正常細胞（例えば、線維芽細胞）では認知可能な量またはほんのずっと少量でも発現されない。それらの本発明のＤＲ４は、線維芽細胞などのような非標的細胞において認知可能な細胞死を生じずに、特定の標的細胞のアポトーシスを誘導する。本明細書中で使用される場合、効果の不在または認知可能なまたは有意な効果の欠損とは、その効果の完全な不在、あるいはバックグラウンドまたはコントロールレベルより低いか、もしくは等しく、かつバックグラウンドおよびコントロールのレベルが、そのバックグラウンドまたはコントロールレベルの１．５倍より大きくは超過しない効果をいい、そして含む。
【００４１】
スクリーニングアッセイまたは画像ツールとして、本発明は、正常な細胞形態学をなお示し得るＤＲ４細胞またはＤＲ５細胞の小クラスターを検出するためによく適合される。例えば、本発明に従う標識抗体でヒト癌細胞（肺癌、前立腺癌および肝臓癌を含む）のインサイチュ細胞切片染色は、容易に癌性細胞を同定する。本発明の抗体はまた、他の疾患の症状発現（例えば、慢性関節リウマチのような、様々な炎症性疾患および自己免疫疾患を含む）のスクリーニングにおいて有益である。このようなスクリーニングは、他の臨床的な兆候の発症前であっても有益であり得、そして疾患の危険性を有する被験体をスクリーニングするために用いられ得るから、予防的な処置が、他の兆候または症状の発現以前に開始され得る。特に、癌細胞は、同じ型の正常な細胞と比較して、非常に高いレベルのＤＲ５を発現することが観察されている。従って、本発明は、少なくとも肺、前立腺、結腸、血液、頚、胸、および肝臓を含む組織内における、早期ステージの悪性疾患のための高感度なスクリーニング方法として有用性を有する。治療プロセスは、疾患に関連した異常な細胞増殖（例証的に、とりわけ悪性癌およびリンパ性白血病）の阻害について本明細書中で詳述される。
【００４２】
本発明は、ＴＲＡ−８と命名された、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有する抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体について特に本明細書中に詳述される。アゴニストの抗ヒトＤＲ５モノクローナル抗体ＴＲＡ−８に関して詳述された技術および結果は、アンタゴニストのＤＲ５抗体、並びにアゴニスト様式とアンタゴニスト様式の両方で作用する、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対して惹起された抗体に対し全体的に拡張可能かつ適用可能であることが認められている。従って、本発明は、本明細書中で、ヒトＤＲ４に特異的なアポトーシス誘導抗体に関して詳述されている。一つの実施形態において、抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭｄでＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎのために受託番号を獲得するため、２００１年１０月２４日に寄託されたハイブリドーマ２Ｅ１２と同じエピトープ特異性を有する。寄託された材料の説明は、株名２Ｅ１２および参考事件整理番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／１４１５１を伴う、「２Ｅ１２  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｌｏｎｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  ＤＲ４」であった。Ｆａｓのようなアポトーシスレセプターの発現レベルは、アポトーシスに対する細胞の感受性と必ずしも相関しない。ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに関して、ＴＲＡＩＬのデコイレセプターの発現は、細胞の感受性に影響を与えることが示唆されている。さらに、ＦＡＤＤおよびカスパーゼ−８経路を介したアポトーシスシグナルの効果的な伝達のため、ＤＲ５はＤＲ４と会合されなければならないことが示唆されている。アゴニストの抗ＤＲ５モノクローナル抗体の入手可能性は、ＤＲ５シグナル伝達の調節およびＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスにおけるその関連する役割の評価を可能にした。ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性とＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する細胞の感受性との比較は、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスにおけるＤＲ５の役割および感受性に影響を与え得る機構に関する見識を提供する。同様の利点がＤＲ４抗体により提供される。
【００４３】
この利点は、一般的に、本発明のヒト化ＤＲ５抗体およびヒト化ＤＲ４抗体に拡張される。例えば、ＤＲ５に対する抗体の分子クローンは、以下の実施例について詳述されるような既知の技術により調製される。組換えＤＮＡ方法論（３３）は、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築するため、本明細書において有効である。
【００４４】
本発明は、ヒト抗マウス抗体（本明細書中以下に「ＨＡＭＡ」と称される）応答を誘導する見込みがなく（３４）、一方で効果的な抗体エフェクター機能をまだ有しているヒト化ＴＲＡＩＬレセプター抗体の構築を可能にする。完全なヒト抗体は、完全なヒト抗体を作成することができるマウス（例えば、ヒト抗体を産生するよう遺伝的に改変されたマウス）を免疫し、ＤＲ５またはＤＲ４に結合しアポトーシスを誘導し、そしてＴＲＡ−８または２Ｅ１２エピトープと競合するクローンをスクリーニングすることによっても作成され得る。例えば、完全なヒト抗体生成の方法についてその全体が本明細書に参考として援用される、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５）Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３を参照のこと。本明細書で使用される場合、抗体に関連した用語「ヒト」および「ヒト化」は、ヒト被験体において治療上許容可能な弱い免疫原性応答を誘発すると予想される任意の抗体に関する。
【００４５】
本発明は、ＤＲ５抗体、ヒト化抗ＤＲ５抗体、ＴＲＡ−８重鎖免疫グロブリンおよびＴＲＡ−８軽鎖免疫グロブリンならびにヒト化重鎖免疫グロブリンおよびヒト化軽鎖免疫グロブリンを提供する。本発明はまた、ＤＲ４抗体、ヒト化ＤＲ４抗体、ＤＲ４抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンならびにヒト化重鎖免疫グロブリンおよびヒト化軽鎖免疫グロブリン、抗体ならびに重鎖および軽鎖をコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、ならびにこれらのベクターを含む細胞を提供する。これらのタンパク質または遺伝子の特定の短縮は、完全配列のタンパク質または完全配列の遺伝子の調節機能または酵素的機能を実行する。例えば、これらをコードする核酸配列は、置換、付加、欠失あるいは機能的に等価なタンパク質または遺伝子を提供する多量体発現により変えられ得る。核酸コード配列の縮重のために、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の配列が、本発明の実施において使用され得る。これらは、上記のポリペプチドをコードする核酸配列の全てまたは一部を含む核酸配列を含むが、これに限定されない。この核酸配列は、配列内の機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変えられ、従ってサイレント変化を生じる。本発明に従う免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、標準方法（「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１２７〜１４９、１９９８、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）により計算される場合、このような改変体がＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を認識する作動的な抗体を形成する限り、２５％までの配列相同性バリエーションを許容することが認められている。例えば、ポリペプチド配列内の一つ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸配列により置換され得、サイレント変化を生じる。配列内のアミノ酸置換は、そのアミノ酸が所属するクラスの他のメンバーから選択され得る（すなわち保存的置換）。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本発明の範囲内にまた含まれるものは、翻訳の間または後に例えばグリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドとの結合などによって差動的に修飾された、タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体である。加えて、本発明の抗体の核酸配列をコードする組換えベクターは、ベクターのプロセシングまたは発現を改変するために操作され得る。他の改変は、抗体におけるアポトー��ス活性の減少なしにまたは実質的な減少なしに、核酸配列またはアミノ酸配列のどちらかにおいて行われ得る。そのような改変は、当該分野において慣用的な技術を使用して、ＣＤＲ領域または非ＣＤＲ領域で起こり得る。例えば、ＣＤＲウォーキング変異誘発の方法に関して、その全体が本明細書により参考として援用される、Ｙａｎｇら（１９９５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２〜４０３を参照のこと。
【００４６】
加えて、インヒビターをコードする核酸配列は、インビトロまたはインビボにおいて、翻訳開始および／または終結配列を作製および／または破壊するために、あるいはコード領域においてバリエーションを作製するために、そして／あるいは新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するためもしくは既存の部位を破壊して、インビトロの改変をさらに促進するために、変異され得る。当該分野で公知の変異誘発の任意の技術（インビトロの部位特異的突然変異誘発（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、Ｔａｂリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用などを含むがこれに限定されない）が使用され得る。
【００４７】
Ｘ線結晶学データは、抗体免疫グロブリンの折りたたみが、一般的にそれぞれが三つまたは四つのβ鎖から成る二層の逆平行βシートを含む長円柱状構造を形成することを示している。可変領域において、Ｈ鎖およびＬ鎖の各Ｖドメイン由来の三つのループが一緒にクラスターを形成して、抗原結合部位を形成する。これらの各ループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される。ＣＤＲは、抗体のアミノ酸配列において最も高い可変性を有する。ＣＤＲの一部ではない可変領域の一部は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」領域）と呼ばれ、一般的にＣＤＲ構造の維持において役割を果たす。好ましくは、所定の抗体由来の全てのＣＤＲが、ＴＲＡＩＬレセプターエピトープ領域に対する結合領域を保存するために、アクセプター抗体に移植される。ＣＤＲ総量の一部をドナーに移植することは、本明細書において有効であることが認識されている。移植は一般的に、一つのアミノ酸または領域の残基から残基への、別の残基での置換を伴うことが理解される。しかしながら、時々、特に領域の転移に関して、一つ以上の残基が所望される場合に付加または除外または置換され得、そしてそのような欠失および挿入、ならびに適切な置換および転位は、当業者の範囲内である。
【００４８】
本発明の抗体は、例えば抗ＴＲＡＩＬレセプターモノクローナル抗体のＬ鎖サブユニットおよびＨ鎖サブユニットの各ＣＤＲをヒト抗体の対応するＣＤＲ領域に移植し、それによってＴＲＡＩＬレセプターに対して有効なマウスモノクローナル抗体をヒト化することにより得られる。
【００４９】
分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントもまた、公知の技術を用いて本明細書中において生成されるかつ有効である。例えば、そのようなフラグメントとしては、例示的に、抗体分子のペプシン消化により生成され得る抗ＴＲＡＩＬレセプター（ＡＢ’）２フラグメント、ＴＲＡＩＬレセプター（ＡＢ’）２フラグメントのジスルフィド結合の還元により生成されたＴＲＡＩＬレセプター抗体ＡＢ’フラグメント、ならびにパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することにより生成される抗体フラグメントが挙げられる。
【００５０】
本発明の抗体は、当該分野で公知の多くの技術を使用して生成され得る。一例として、抗ＤＲ５モノクローナル抗体ＴＲＡ−８は、ヒトＤＲ５でマウスを免疫し、マウス由来の脾臓細胞またはリンパ節細胞とマウスミエローマ細胞とを引き続いて融合させることにより次々に得られ得る、ハイブリドーマを培養することで得られ得る。
【００５１】
モノクローナル抗体の調製は、以下の工程を例示的に包含する：
ａ）抗原として用いる生体高分子の精製；
ｂ）最初に抗原の注射を使用して動物を免疫し、動物から血を抜き、脾臓を取り出す時点を決定するため、抗体力価をアッセイした後の抗体生成細胞の調製；
ｃ）ミエローマ細胞の調製；
ｄ）抗体産生細胞およびミエローマ細胞を融合する工程；
ｅ）望ましい抗体を生成するハイブリドーマを選択する工程；
ｆ）単一細胞クローンを調製する工程（クローニング）；
ｇ）必要に応じて、ハイブリドーマ細胞を培養するか、またはモノクローナル抗体の大規模調製のため、ハイブリドーマ細胞を移植した動物を育てる工程；ならびに
ｈ）このようにして調製したモノクローナル抗体の生物学的活性および特異性を試験するか、あるいはマーカー因子特性をのアッセイする工程。
【００５２】
モノクローナル抗体の調製の手順は、上記の工程を参照して以下に詳述される。本発明の抗体を調製する方法は、調製の方法を例示することを意図しているだけであり、これに限定されることは意図されない。他の公知の手順が先行し得るか、あるいは下記の方法が、例えば、脾臓細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマの使用によって改変され得る。
（（ａ）抗原の調製）
抗原として有効な組換えタンパク質（本明細書以下に「組換えヒトＤＲ５」または「組換えヒトＤＲ４」として言及される）は、ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ  ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）を使用し、ＱＢＩ−２９３Ａ細胞をヒトＤＲ５またはヒトＤＲ４の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１抗体（本明細書以下に「ＩｇＧ」として言及される）のＦｃ領域、（ＰＴＡ−１４２８を参照のこと）を含む融合タンパク質の発現ベクターｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧでトランスフェクトして、このタンパク質を発現させ、そして発現産物を収集し、部分的に精製することによって、得られる。プラスミドｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧは、ヒトＤＲ５またはヒトＤＲ４およびヒトＩｇＧ融合タンパク質をコードするＤＮＡを、動物細胞の発現ベクターであるｐＡｄＣＭＶ５に挿入することで構築される。他の材料、例えばＤＲ５またはＤＲ４をコードするＤＮＡ、ベクターおよび宿主は、本明細書中で有効である。
【００５３】
ベクターｐＡｄＤＲ５−ＩｇＧでトランスフェクトされたＱＢＩ−２９３Ａ細胞の培養物上清において生成されるヒトＤＲ５またはヒトＤＲ４およびＩｇＧ融合タンパク質は、プロテインＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインＧ−セファロースアフィニティークロマトグラフィー、あるいはＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（商標名；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するイオン交換クロマトグラフィーにより部分的に精製され得る。
【００５４】
あるいは、ヒト細胞株の細胞膜から得た精製ＤＲ５または精製ＤＲ４は、抗原として使用される。さらに、ＤＲ４およびＤＲ５の一次構造が既知なので（ＰＴＡ−１４２８を参照のこと）、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）１のアミノ酸配列を含むペプチドは、公知の方法（例えばサンガー法）により化学的に合成され得、抗原として使用され得る。
（（ｂ）抗体産生細胞の調製）
マウスを、以下の工程において生成された免疫原で免疫する；
（ａ）アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン）と混合する。他の適した実験動物としては、例示的に、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ、ウマ、ブタ、ウシおよびヒツジが挙げられる。
【００５５】
実験動物を免疫するために適した投与経路としては、皮下注射経路、腹腔内注射経路、静脈内注射経路、皮内注射経路、および筋肉注射経路が挙げられ、皮下注射および腹腔内注射が好まれる。
【００５６】
免疫は、単回用量により、または適切な間隔（好ましくは１〜５週間）で数回の反復用量により必要に応じて行われる。免疫された動物は、血清内の抗体力価についてモニターされ、十分に高い抗体力価を有する動物は、抗体産生細胞供給源として選択される。高い力価を有する動物の選択は、続きの工程をより効果的にする。後の融合のための細胞は、最後の免疫の３〜５日後の動物から一般的に収集される。
【００５７】
抗体力価をアッセイする方法は、様々な周知の技術（例えば、放射免疫アッセイ（本明細書以下に、「ＲＩＡ」として言及される）、固相酵素免疫アッセイ（本明細書以下に、「ＥＬＩＳＡ」として言及される）、蛍光抗体アッセイおよび受動的血球凝集反応アッセイが含まれ、検出感度、速度、精度および自動化の可能性の理由でＲＩＡおよびＥＬＩＳＡが好まれる。
【００５８】
抗体力価の決定は、例えばＥＬＩＳＡにより、以下のとおりに行われ得る。最初に、精製または一部精製したＤＲ５またはＤＲ４が、例えば９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのような固相の表面上に吸着され、その後にＤＲ５またはＤＲ４が結合していない任意の残存表面を、抗原に関係ないタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））でブロッキングすることが続く。洗浄後、ウェル表面に、サンプル内のＤＲ５抗体またはＤＲ４抗体の抗原に対する結合を可能にするため、マウス血清の連続希釈サンプルを接触させる。二次抗体として標識された抗マウス抗体が、マウス抗体に結合させるため添加される。その標識としては、酵素標識、蛍光標識または当該分野で公知の他の標識が挙げられ得る。洗浄後、酵素基質が添加され、基質などの変化により生じた発色に起因する吸光度変化の測定により、抗体力価が推定される。
【００５９】
（（ｃ）ミエローマ細胞の調製）
確立されたマウス細胞株（例えば、８−アザグアニン耐性マウスを含む）由来の細胞は、ＢＡＬＢ／ｃミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）（３５）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）（３６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（３７）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（３８）およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（３９）由来のミエローマ細胞の供給源として働く。選択された細胞株は、例えば８−アザグアニン培地のような適切な培地に連続的に移される。８−アザグアニン培地は、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（本明細書以下に、「ＩＭＤＭ」として言及される）またはＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（本明細書以下に、「ＤＭＥＭ」として言及される）を含む。ＲＰＭＩ−１６４０培地は、グルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（本明細書以下に、「ＦＣＳ」として言及される）、および８−アザグアニンで補充されている。次に、細胞は、少なくとも２×１０７細胞が融合の日に有効となることを確実にするため、融合３〜４日前に、例えば１０％ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．）のような通常培地に移される。
【００６０】
（(ｄ）細胞融合）
動物の任意の適した部分から得られるリンパ球および形質細胞は、抗体を産生するための前駆細胞である。リンパ球または形質細胞の供給源としては、例えば脾臓、リンパ節、末梢血またはそれらの任意の適切な組みが挙げられ、脾臓細胞が最も一般的な供給源である。
【００６１】
最後の追加免疫注射の後、抗体産生細胞が存在する組織は、あらかじめ決定された抗体力価を有するマウスから取り出される。工程ｃ）において調製される骨髄腫細胞と脾臓細胞との融合についての現在好ましい技術は、ポリエチレングリコールを用いる。
【００６２】
融合技術は、脾臓細胞と骨髄腫細胞との数の割合が、約５：１と１０：１との間になるよう、無血清培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０）またはリン酸緩衝化生理食塩水（本明細書以後、「ＰＢＳ」としていう）で脾臓細胞および骨髄腫細胞を洗浄し、次に遠心分離することを含む。上清が廃棄され、そしてペレット化細胞が、十分にほぐされた後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（分子量１，０００〜４，０００）を含む無血清培地１ｍｌは、混合しながら懸濁液に滴下される。次に、１０ｍｌの無血清培地が、ゆっくり添加され、そして次に遠心分離される。上清は、再び廃棄され、そしてペレット化細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（本明細書以後、「ＨＡＴ」という）ならびにマウスインターロイキン−２（本明細書以後、「ＩＬ−２」という）の溶液を含む適切量のＨＡＴ培地中に懸濁される。懸濁液は次に、培養プレート（本明細書以後、単に「プレート」という）のウェルに分配され、そして３７℃で、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２の存在下で、約２週間インキュベートされる（適切なように、補足的にＨＡＴ培地を追加しながら）。
【００６３】
（（ｅ）ハイブリドーマの選択）
使用される骨髄腫株が、８−アザグアニンに抵抗性である（すなわち、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）酵素が欠損している）場合、あらゆる非融合骨髄腫細胞およびあらゆる骨髄腫−骨髄腫融合体は、ＨＡＴ培地中では生存不可能である。一方、お互いが抗体産生細胞である融合体、ならびに抗体産生細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、生き残り得、前者のみが限定された寿命を有する。従って、ＨＡＴ培地中でインキュベートを継続すると、所望のハイブリドーマのみが選択される。
【００６４】
生じたハイブリドーマは増殖してコロニーとなり、これは次にアミノプテリンを欠いたＨＡＴ培地（ＨＴ培地）に移される。その後、培養上清のアリコートは、例えば、ＥＬＩＳＡにより抗Ｆａｓ抗体力価を決定するために取り出される。上述の融合タンパク質が、ＥＬＩＳＡ抗原として使用される場合、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に特異的に結合する抗体を産生するクローンを取り除くこともまた必要である。このようなクローンの存在または非存在は、例えば、Ｆａｓ−ＩｇＧ１またはＩｇＧ１を抗原として用いるＥＬＩＳＡによって確認され得る。
【００６５】
（（ｆ）クローニング）
次に、抗体力価を決定するための工程ｂ）に述べられた方法と同様の方法を用いて、特異的抗体を産生することが示されたハイブリドーマは、クローニングのために別のプレートに移される。適したクローニング方法は、以下を含む：プレートの１ウェルあたり１細胞を含むようにハイブリドーマが希釈され、次いで培養される限界希釈法；軟寒天培地における培養の後にコロニーが回収される軟寒天法；培養のために単一細胞に分けるためにマイクロマニピュレーターを使用する方法；およびセルソータにより単一細胞が、分けられる「クローン選別（ｓｏｒｔ−ａ−ｃｌｏｎｅ）」。
【００６６】
例えば、限界希釈法によるクローニング手順は、抗体力価を表す各ウェルについて２〜４回繰り返され、そして安定な抗体力価を有するクローンが、抗ＤＲ５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択される。抗マウスＤＲ５抗体を生産するハイブリドーマは、抗ＤＲ５モノクローナル抗体産生細胞株を得るために同様の方法によって選択される。
【００６７】
本発明の抗体について基本であるマウス―マウスハイブリドーマＴＲＡ−８は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｉｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２０００年３月１日に寄託され、そして受託番号ＰＴＡ−１４２８を有する。２Ｅ１２ハイブリドーマは、上記のように、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｉｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに２００１年１０月２４日に寄託され、そして受託番号ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７９８を有する。従って、マウス―マウスハイブリドーマＴＲＡ−８または任意の他の確立されたハイブリドーマを使用して抗体を準備する場合、調製は、工程（ａ）〜工程（ｆ）を除外した以下の工程（ｇ）から始まる以下の手順により行われ得る。
【００６８】
（（ｇ）モノクローナル抗体の調製のためのハイブリドーマの培養）
クローニングによって得られたハイブリドーマは、次にＨＴ培地でない通常培地において培養される。大規模培養は、大きな培養ボトルを使用したローラーボトル培養またはスピナー培養によって行わる。次に、大規模培養からの上清は、本発明の抗体についての基本であるＤＲ５またはＤＲ４モノクローナル抗体を得るために、当業者に周知のゲル濾過のような適切な方法によって収集され、そして精製される。ハイブリドーマはまた、大容量のＤＲ５またはＤＲ４モノクローナル抗体を含む腹水を得るために、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはｎｕ／ｎｕマウスのような同系マウスにおいて、腹腔内で増殖され得る。市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧＩＩ  Ｋｉｔ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、収集され抗体の精製に簡便に用いられている。
【００６９】
上で調製されたモノクローナル抗体は、それぞれヒトＤＲ５またはＤＲ４について高い特異性を有する。
【００７０】
（（ｈ）モノクローナル抗体のアッセイ）
モノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの適切な同定方法としては、オークターロニー方法、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡが挙げられる。好ましくは、同定には、Ｍｏｕｓｅ  Ｔｙｐｅｒ  Ｋｉｔ（商標；ＢｉｏＲａｄ）のような市販のキットを使用する。
【００７１】
タンパク質の定量は、Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法または２８０ｎｍ（１．４（ＯＤ２８０）＝免疫グロブリン  １  ｍｇ／ｍｌ）の吸光度を基にした計算によって、行われ得る。
【００７２】
モノクローナル抗体が認識するエピトープの同定は、以下のように行われる。第１に、モノクローナル抗体が認識する分子の種々の部分構造が、調製される。この部分構造は、この方法によって調製され、ここで、分子の種々の部分ペプチドは、既知のオリゴペプチド合成技術によって合成的に調製される方法、または所望の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡが、適切な発現プラスミド中に組み込まれ、そしてＥ．ｃｏｌｉのような適切な宿主中で発現されて、このペプチドが産生される方法によって調製される。一般に、両方法は、上記の目的のために頻繁に組み合わせて使用される。例えば、抗原タンパク質のＣ末端またはＮ末端からはじめて、適切に減少した長さを有する一連のポリペプチドは、確立された遺伝子工学技術によって調製され得る。抗体と反応するフラグメントを確立することによって、エピトープ部位のおおよその見当が得られる。
【００７３】
エピトープは、抗ＤＲ５モノクローナル抗体に対するこのペプチドの結合特性を決定するために確立されたオリゴペプチド合成技術を用いて、このペプチドかまた、その変異体に対応する種々のより小さなオリゴペプチドを合成することによってより綿密に同定される。例えば、エピトープは、本発明の抗体の調製およびモノクローナル抗体を用いた抗原に対するペプチドの競合的結合阻害について基礎となる。ＳＰＯＴｓ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびマルチピン（ｍｕｌｔｉｐｉｎ）合成法を基礎とする一連のマルチピンペプチド合成キット（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）のような市販のペプチド合成キットは、多種類のオリゴペプチドを得るために簡便に使用され得る。
【００７４】
本発明の抗体は、以下に示されるａ）〜ｆ）の種々の機能的特性を有し、例えば、これらは各々は、本明細書の以下に記載される方法によって確認される。
【００７５】
（ａ）ヒトＤＲ５発現細胞に対するＴＲＡ−８の特異的結合）
本発明の特有の特性は、細胞表面のＤＲ５に結合する能力である。これは、ＤＲ５発現細胞のフローサイトメトリー解析によって示される。第１に、ＤＲ５の特異的細胞表面結合は、ヒトＤＲ５をコードする全長ｃＤＮＡがトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞によって確認される。詳細には、ＴＲＡ−８は、ＤＲ５がトランスフェクトされたＣＯＳ−７のみを認識し、空のコントロールベクターまたはＤＲ４をコードするベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ−７は認識しない。第２に、３つの異なる起源（ヒト悪性腫瘍細胞の造血癌、グリオーマおよび前立腺癌）が試験される。発現レベルは大きく変化するが、これらのトランスフォームした腫瘍細胞の大部分は、有意なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現した。第３に、ＲＡ患者およびＯＡ患者から得たヒト初代滑膜線維芽細胞の２つのパネルが、調査される。全てのＲＡ滑膜細胞は、ＯＡ細胞と比較して有意に高いレベルのＤＲ５を発現した。
【００７６】
（ｂ）架橋のないインビトロにおいてのヒト悪性腫瘍細胞のアポトーシスの誘導）
本発明に従って惹起された抗体が、ＴＲＡＩＬレセプターを認識する能力、および悪性ヒト腫瘍細胞のアポトーシスを直接的に誘導する能力は、インビトロで種々の濃度の抗体（特に、ＴＲＡ−８）とともに細胞を培養する間、細胞生存率アッセイ（ＡＴＰＬｉｔｅ）により決定される。大部分の腫瘍細胞は、ＴＲＡ−８の誘導するアポトーシスに対して感受性である。いくらかの細胞にとって、ＴＲＡ−８は、強力なアポトーシス誘導活性を示した（例えば、ＴＲＡ−８は、ｐｇ／ｍｌレベル内でヒトＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導し得る）。重要なことには、ＴＲＡ−８の誘導するアポトーシスは、架橋を必要とせず、そしてほとんどの細胞において、ＴＲＡ−８は、エンハンサーの存在下で、組み換え可溶性ＴＲＡＩＬよりも強力なアポトーシス誘導活性を示した。
【００７７】
（ｃ）インビボにおけるＴＲＡ−８の腫瘍殺傷活性）
ＴＲＡ−８の腫瘍殺傷活性は、２つのＳＣＩＤ／ヒト腫瘍細胞モデルにおいて評価される。第１に、ＳＣＩＤマウスは、ヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞を静脈内に接種され、ＴＲＡ−８の１用量（１００μｇ）で処置される。この結果は、大部分の移植Ｊｕｒｋａｔ細胞が、ＴＲＡ−８で処置することにより末梢血および脾臓から取り除かれることを示す（Ｊｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析およびインサイチュ免疫組織化学染色によって決定された）。第２に、ヒト星状細胞腫細胞１３２１Ｎ１はＳＣＩＤマウスに皮下接種され、そして腫瘍保有マウスは、ＴＲＡ−８の１用量で処置される。移植された１３２１Ｎ１細胞の増殖は、ＴＲＡ−８処置マウスにおいて有意に阻害される（腫瘍の大きさ、および組織学的解析によって決定された）。
【００７８】
（ｄ）ＴＲＡ−８によるＲＡ滑膜細胞の同定）
８人のＲＡ患者および４人のＯＡ患者から単離された初代滑膜細胞は、ＤＲ５の細胞表面発現について試験される。ＴＲＡ−８は、全てのＲＡ細胞をポジティブに染色し得ないが、全てのＯＡ細胞はネガティブに染色し得る。従って、ＲＡは、ＴＲＡ−８によって検出されるようなＤＲ５の表面発現によってＯＡから識別される。
【００７９】
（ｅ）ＲＡ滑膜線維芽細胞におけるＴＲＡ−８によるアポトーシスの誘導）
ＴＲＡ−８がＲＡ滑膜細胞のアポトーシスを誘導する能力は、種々の濃度のＴＲＡ−８の存在するインビトロ培養の間、細胞生存率アッセイによって決定される。全てのＲＡ細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８に対しての高レベル〜中間レベルまでの感受性を示した。対照的に、全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡ−８の誘導するアポトーシスに対して本質的に耐性がある。重要なことに、ＴＲＡ−８は、エンハンサーを用いた可溶性ＴＲＡＩＬよりもＲＡ滑膜細胞に対して、より良好なアポトーシス誘導活性を示した。さらに、抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）と比較して、ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞に対してより良好な選択性を示した。
【００８０】
（ｆ）ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞においてＭＭＰの産生を誘導しない）
ＴＲＡ−８は、ＴＮＦ−ａとしてＲＡ滑膜細胞において、ＮＦ−ｋｂ活性化を誘導し得るので、滑膜細胞のＭＭＰ１およびＭＭＰ３の産生に対するＴＲＡ−８の影響が、決定される。ＴＮＦ−ａは、ＭＭＰの用量依存性増加を誘導した一方、ＴＲＡ−８は、ＭＭＰの任意の産生を誘導することができず、そしてある濃度において、ＴＲＡ−８は、ＲＡ滑膜細胞において、ＭＭＰの産生をわずかに減少させた。
【００８１】
（ｇ）ＴＲＡ−８は、多様なカスパーゼ活性化を誘導する）
カスパーゼは、アポトーシスの誘導に重要な役割を果たすので、ＴＲＡ−８がカスパーゼの活性化を誘導する能力は、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞において決定される。Ｊｕｒｋａｔ細胞が、低用量（５０ｎｇ／ｍｌ）のＴＲＡ−８とともにインキュベートされた場合、カスパーゼ８、カスパーゼ９およびカスパーゼ３の活性化は、ウエスタンブロット分析およびカスパーゼ切断分析によって示されるようにインキュベーション後１５分という早さで観察される。カスパーゼの活性化の時期、数および強さの観点から、例示の抗体ＴＲＡ−８を含め、本発明の抗体は、抗ヒトＦａｓ抗体（ＣＨ−１１）のようなあらゆる他の既知のアポトーシス誘導抗体よりもさらに良い活性を示した。
【００８２】
２Ｅ１２抗体は、その可溶性形態において、特異的にＤＲ４を結合し、ＤＲ４を発現する標的細胞（例えば、癌細胞、慢性関節リウマチ滑膜細胞、活性化リンパ球のような活性化免疫細胞およびウイルス感染細胞などが挙げられる）において、インビボおよびインビトロのアポトーシス誘導活性を有し、インビボで腫瘍殺傷活性を有する（好ましくは、非腫瘍細胞に対して毒性の無い）。好ましくは、本発明のＤＲ４抗体は、３０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、０.３μｇ／ｍｌまたは０.０３μｇ／ｍｌ未満の抗体濃度で、約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満の標的細胞生存率で特徴付けられるアポトーシス誘導活性を有し、また腫瘍の大きさにおいて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の縮小により特徴付けられる腫瘍殺傷活性を有する。従って、本発明の抗体は、効果（ａ）および（ｇ）に示すような病原性細胞において、選択的にアポトーシスを誘導する特性を有する物質である。従って、それは、細胞の不適切な生存または細胞の不適切な増殖に関連する疾患（Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系を含むアポトーシス系の調節不全に起因し得る疾患）について、予防剤および治療剤として有用である。
【００８３】
本発明の抗体がアポトーシスを誘導する能力は、ヒト白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ番号ＴＩＢ−１５２）および星状細胞株１３２１Ｎ１のような細胞を試験サンプルが加えた培地中で培養すること、そして例えば、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって生存率を決定により確かめられる。
【００８４】
本発明の抗体（特にヒト抗体のものとほとんど同じヒトへの免疫原性を有するＤＲ５およびＤＲ４抗体）は、不適切な細胞の生存または増殖に関連する、疾患の予防剤または処置剤として用いられ、この疾患としては、炎症および自己免疫の疾患におけるアポトーシス系の調節不全に起因し得るものが挙げられ、この炎症および自己免疫の疾患としては、例として、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、宿主移植片病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫溶血性貧血、生殖不能症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドー病、血栓不足紫斑病、インスリン依存糖尿病、アレルギー；喘息、アトピー疾患；動脈硬化症；心筋炎；心筋症；糸球腎炎；再生不良性貧血；臓器移植後の拒絶反応ならびに肺、前立腺、肝臓、卵巣、結腸、頸、リンパ組織および胸組織の多数の悪性腫瘍が挙げられる。本発明の抗体を用いて、活性化された免疫細胞を標的化し、アポトーシスを選択的に誘導し得、これらの標的化された細胞が、特異的なＴＲＡＩＬレセプター（すなわち、ＤＲ４またはＤＲ５）を発現させ、または発現させ得る限り、この細胞としては、活性化されたリンパ球、リンパ性細胞、脊髄細胞、およびリウマチ様滑液細胞（炎症性滑液細胞、マクロファージ様滑液細胞、繊維芽細胞様滑液細胞を含む）、およびウイルス性感染細胞（例えば、ＨＩＶに感染したものを含む）が挙げられる。
【００８５】
このような予防剤または治療剤は、種々の形態で投与され得る。適切な投与の様式は、錠剤、カプセル剤、粒剤、粉末剤およびシロップ剤の様な経口投与または注射もしくは坐剤のような非経口投与を含む。
【００８６】
この抗体または治療剤が、経口で、直腸で、槽内で、心室内（脳室内）で、頭蓋内で、骨髄腔内で、関節内に、膣内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、または皮下に）、局部的に（粉末剤、軟膏、または滴剤）、腹膜内注射により、経皮的に、吸入により、または口内もしくは鼻腔スプレ−として、投与され得る。必要とされる抗体の正確な量または治療剤の正確な量は、被験体により変わり、これは、被験体の年齢、体重および一般的条件、処置される疾患の重篤度、腫瘍の位置および大きさ、使用される特定の化合物、投与の様式などに依存する。適切な量は、本明細書中の教示と慣用的な実験のみを用いて、当該者によって決定され得る。代表的な抗体の１回分の投薬量は、０．１μｇ〜１０，０００μｇの範囲にわたり、好ましくは、１μｇと１００μｇとの間の範囲にわたる。代表的なキャリア内の抗体濃度は、送達される１ｍｌ当たり、０．２ｎｇ〜２０００ｎｇの範囲にわたる。関節への注射について、抗体およびキャリアの体積は、その関節に依存するが、しかしおよそ０．５ｍｌ〜１０ｍｌ、好ましくは１ｍｌ〜５ｍｌが、ヒトの膝関節に注射され、およそ０．１ｍｌ〜５ｍｌそして好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌがヒトの足関節に注射される。
【００８７】
投与の意図された様式に依存して、抗体または治療剤は、固体、半固体、または液体調剤の形態において、薬学的組成物であり得、その形態は例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、液剤、または懸濁液剤、好ましくは、正確な投薬量の一回の投与に適切な投薬形態である。この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせで有効量の選択された基質を含み、さらに、他の医薬、薬学的薬剤、キャリア、または希釈液を含み得る。「薬学的に受容可能」とは、生物学的またはそれ以外で所望されないことはない物質を意味し、この物質は、重大な所望されない生物学的効果を引き起こすことも、この物質が含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な様式において相互作用することもなしに、選択された基質と一緒に個体へ投与され得る。
【００８８】
非経口的注射に適切な組成物は、生理学的に受容可能な減菌した水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、および減菌された注射可能溶液または分散液への再構成のための減菌された粉末を含み得る。適切な水性、および非水性キャリア、希釈液、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノ−ル、ポリオ−ル（プロピレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ル、グリセロ−ルなど）、これらの適切な混合物、植物油（オリ−ブオイルのような）およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機物のエステルが挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコ−ティングの使用により、分散剤の場合必要とされる粒子の大きさの保持により、および界面活性剤の使用により、保持され得る。
【００８９】
これらの組成物はまた、保護剤、湿潤剤、乳化剤、分配剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の活動を妨げることは、例えば、パラベン、クロロブタノ−ル、フェノ−ル、ソルビン酸などの、種々の抗菌剤および抗真菌剤により、確実にされ得る。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等浸透圧剤を含むこともまた、所望され得る。注射可能な薬学的形態の延長された吸収が、吸収を遅らせる薬、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することで、もたらされ得る。
【００９０】
経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉末剤、および粒剤が挙げられる。このような固体投薬形態において、活性な化合物は、少なくとも一つの不活性な慣習的な賦形剤（またはキャリア）と混ぜられ、ここで賦形剤としては、クエン酸ナトリウムもしくはジカルシウムホスフェ−トまたは（ａ）フィラ−もしくは増量剤、例えば、スタ−チ、ラクト−ス、スクロ−ス、グルコ−ス、マンニト−ル、および珪酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロ−ス、アルギネ−ト（ａｌｉｇｎａｔｅ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロ−ス、およびアカシア、（ｃ）湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、例えば、グリセロ−ル、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、カルシウムカ−ボネ−ト、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の珪酸塩複合体、およびナトリウムカ−ボネ−ト、（ｅ）溶液抑制剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば、セチルアルコ−ル、およびモノステアリン酸グリセロ−ル、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコ−ル、ラウリル硫酸ナトリウム、またはその混合物である。カプセル剤、錠剤、および丸薬の場合、投薬形態はまた、緩衝剤を含み得る。
【００９１】
同様な型の固体組成物はまた、ラクト−スまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコ−ルなどの様な賦形剤を用いる、ソフト充填カプセル剤およびハ−ド充填カプセル剤においてフィラ−として利用され得る。
【００９２】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸薬、および粒剤のような固体投薬形態が、当該分野で周知の腸溶性コ−ティングおよび他のものといった、コ−ティングおよび殻を用いて調製され得る。これらは不透明化剤を含み得、また、これらが、遅延された様式で腸管のある部分で活性な化合物を放出するような組成物であり得る。使用され得る組成物を埋め込む実施例は、ポリマ−性物質およびワックスである。活性な化合物はまた、適切な場合、１つ以上の上記の賦形剤を有する、マイクロカプセル化形態であり得る。
【００９３】
経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に受容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。活性な化合物に加えて、液体投薬形態は、当該分野で一般的に使用される、不活性な希釈液、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコ−ル、イソプロピルアルコ−ル、エチルカ−ボネ−ト、エチルアセテ−ト、ベンジルアルコ−ル、ベンジルベンゾエ−ト、プロピレングリコ−ル、１，３−ブチレングリコ−ル、ジメチルホルムアミド、油、詳細には、綿実油、アメリカホドイモ油、トウモロコシ胚油、オリ−ブ油、ひまし油およびゴマ油、グリセロ−ル、テトラヒドロフルフリルアルコ−ル、ポリエチレングリコ−ルならびにソルビタンの脂肪酸エステルまたはこれらの物質の混合物などを含み得る。
【００９４】
このような不活性な希釈液に加えて、組成物もまたアジュバント（湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、調味料、ならびに香料）を含み得る。
【００９５】
懸濁液は、活性な化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化されたイソステアリルアルコ−ル、ポリオキシエチレンソルビト−ルおよびソルビタンエステル、微小結晶セルロ−ス、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天ならびにトラガカント、またはこれらの物質の混合物、など、を含み得る。
【００９６】
直腸投与についての組成物は、好ましくは坐剤であり、これは本発明の化合物と適切な非刺激賦形剤またはキャリア（例えば、ココアバタ−、ポリエチレングリコ−ルまたは坐剤ワックス（これらは常温で固体だが体温で液体であり、従って、直腸または膣腔において溶融し、活性成分を放出する））と本発明の化合物を混合することによって調製され得る。
【００９７】
本発明の化合物の局所的投与のための投薬形態としては、軟膏、粉末薬、スプレ−、および吸入薬が挙げられる。活性成分は、減菌された条件下で生理学的に受容可能なキャリアおよび予防剤、緩衝液、または推進体と必要な場合に混合される。眼用の処方物、軟膏、粉末薬、および溶液もまた本発明の範囲内にあるものとして、企図される。
【００９８】
本明細書中で使用される用語「薬学的に受容可能な塩、エステル、アミド、およびプロドラッグ」は、本発明の化合物のカルボキシレ−ト塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミドおよびプロドラッグをいい、これらは、正常な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギ−反応などを有さないで患者の組織に接触して使用することに適切で、合理的な利益／危険率にふさわしく、意図された使用に有効であり、そして、可能な場合、本発明の化合物の多価イオン形能である。用語「塩」は、本発明の化合物の比較的無毒で、無機および有機酸の付加塩をいう。これらの塩は、この化合物の最後の単離および精製の間にインサイチュで調製され得るか、または遊離の塩基形態において精製された化合物を適切な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、このように形成された塩を単離することにより調製され得る。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロクロリド、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシレ−ト、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネ−ト、メタンスルホン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。これらは、アルカリ金属およびアルカリ土類金属（ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、など）ならびに無毒のアンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これらに限定されない）に基づくカチオンを含む。（例えば、本明細書中に参考として援用されるＳ．Ｍ．Ｂａｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６：１−１９を参照のこと）。
【００９９】
用語「プロドラッグ」は、インビボで急速に変化し、例えば、血液中での加水分解により、上記式の親化合物を生じる化合物をいう。Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ＳｅｒｉｅｓのＴ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｖｏｌ．１４、ならびにＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７において詳細な考察が提供されている。
【０１００】
標的細胞は、動物の細胞であり、例示的には、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、キヌザル、ケナガイタチが挙げられる。
【０１０１】
加えて、本発明の抗体または治療剤は、非溶媒和形態、ならびに水、エタノ−ルなどの様な薬学的に受容可能な溶媒を用いる溶媒和形態において存在し得る。一般的には、溶媒和形態は、本発明の目的のために非溶媒和形態と同等と考えられる。
【０１０２】
抗体分子は、公知の技術により精製され、この技術には、例示的には、アミノ吸収クロマトグラフィ−もしくはアミノ親和クロマトグラフィ−、高圧液体クロマトグラフィ−の様なクロマトグラフィ−技術、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０３】
本発明の別の局面は、生物学的に活性な抗ＴＲＡＩＬレセプタ−抗体またはヒト化抗ＴＲＡＩＬレセプタ−抗体の脊椎動物への送達における使用のための薬学的産物を含む。薬学的産物は、薬学的有効量の抗ＴＲＡＩＬレセプタ−抗体またはそのフラグメント、薬学的に受容可能なキャリア、ならびに減菌様式でキャリアおよび抗体を封入する容器を含む。
【０１０４】
本発明の好ましい実施形態において、薬学的有効量の本発明の抗体は、標的細胞との接触により細胞の増殖を妨げるか、またはアポト−シスを誘導する。薬学的有効量またはある量の抗体（ＤＲ５もしくはＤＲ４のいずれかを認識する）またはヒト化抗体（ＤＲ５もしくはＤＲ４のいずれかを認識する）は、所望される効果を引き起こすのに十分な、個体に投与される量である。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的有効量」および「治療の量」は、同義である。ＤＲ５またはＤＲ４を認識する抗体の薬学的有効量の投与の所望される効果としては、１つ以上の標的細胞の死、１つ以上の標的細胞の増殖抑制、ＤＲ５またはＤＲ４各々への刺激、ＤＲ５またはＤＲ４各々への結合、および標的細胞における増大したＮＦｋＢレベルまたはＮＦｋＢ活性が挙げられる。標的細胞は、ＤＲ５またはＤＲ４を発現する細胞であり、例示的に、異常に増殖した細胞および腫瘍細胞（乳頭腫およびいぼ；乳癌、結腸癌、肝癌、白血病、肺癌、メラノ−マ、骨髄腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、頭または首の癌、甲状腺癌、子宮癌、星状細胞腫のような脳の腫瘍）、活性化免疫細胞（例えば、活性化リンパ球、リンパ系細胞および骨髄細胞）、炎症性の細胞、慢性関節リウマチ滑液細胞、およびウイルス感染細胞が挙げられる。インビボにおいて、標的細胞は病理学的状態を有する個体の細胞であり、この状態としては、細胞の増殖が、異常または調節不全（例えば、悪性の癌または良性の癌および慢性関節リウマチ）である状態である。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、標的細胞をまた、治療剤と接触させる。従って、本発明の抗体および組成物は、単独かまたは１以上の治療剤と組み合わせて投与され得る。治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＮＦファミリ−の他のメンバ−、化学療法剤、抗体、抗ウイルス剤、ステロイド抗炎症剤および非ステロイド抗炎症剤、従来の免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、ならびに／または増殖因子。併用剤（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、付随して（例えば、混合物として）か、別々であるが同時に（例えば、別々の静脈内ラインを介して同じ被験体に）か、または連続的に（例えば、化合物または薬剤のうちの一方を最初に与えて、次いで第２の化合物または薬剤を与える）かのいずれでも投与され得る。従って、用語「併用（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」または「組み合わせた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）」は、２つ以上の薬剤の不随投与、同時投与、または連続的投与のいずれかをいうために使用される。
【０１０６】
一実施形態において、併用治療は、ＴＮＦファミリ−のメンバ−の投与を包含する。本発明の抗体と共に投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合体ヘテロトリマ−ＬＴ−α２−βで見出される）ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（ＷＯ９６／１４３２８）、ＴＲＡＩＬ、ＡＩＭ−ＩＩ（ＷＯ  ９７／３４９１１）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−９０）、エンドカイン−α（Ｗ０９８／０７８８０）、ＴＲ６（ＷＯ  ９８／３０６９４）、ＯＰＧおよび神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびにＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢの可溶性形態、ＴＲ２（ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（Ｗ０９７／３３９０４）、ＤＲ４（ＷＯ  ９８／３２８５６）、ＴＲ５（ＷＯ  ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲＩＯ（ＷＯ  ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（ＷＯ  ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびにＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３の可溶性形態。
【０１０７】
別の実施形態において、本発明の抗体は、天然に存在する、合成または操作したＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と組み合わせて投与され、これらとしては、例えば、以下が挙げられるＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲＥＮＤ）、ＣＤ４０Ｌの生物学的に活性なフラグメント、改変体または誘導体、ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、および／あるいはＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、以下の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上と組み合わせて投与される：タクロリムス（Ｆｕｊｉｓａｗａ）、サリドマイド（例えば、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｔａｃ（Ｆｖ）−ＰＥ４０（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、ＭＡＫ−１９５Ｆ（Ｋｎｏｌｌ）、ＡＳＭ−９８１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インタ−ロイキン−１レセプタ−（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、インタ−ロイキン−４レセプタ−（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ）、ＩＣＭ３（ＩＣＯＳ）、ＢＭＳ−１８８６６７（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、抗−ＴＮＦ  Ａｂ（例えば、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＣＧ−１０８８（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、抗Ｂ７モノクロ−ナル抗体（例えば、Ｉｎｎｏｇｅｔｉｃｓ）、ＭＥＤＩ−５０７（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ）、およびＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ）。
【０１０９】
本発明によれば、本発明の抗体を、Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）、またはＦａｓに結合してアポト−シスを引き起こす生物学的シグナルを伝達するＦａｓ抗体と共に投与し得る。好ましくは、本方法に従って使用するＦａｓ抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、および／またはプロテア−ゼインヒビタ−を組み合わせて投与される。本発明の抗体と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）（ジドブジン／ＡＺＴ）（Ｇａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）、ＶＩＤＥＸ（登録商標）（ジダノシン／ｄｄＩ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＨＩＶＩＤ（登録商標）（ザルシタビン／ｄｄＣ）（Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ＺＥＲＩＴ（登録商標）（スタブジン）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。本発明の抗体と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）（ネビラピン）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ／Ｒｏｘａｎｎｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）（デラビルジン）（Ｐｈａｎｎａｃｉａ  ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、およびＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）（エファビレンツ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）。
【０１１１】
本発明の抗体と組み合わせて投与され得るプロテア−ゼインヒビタ−としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）（硫酸インジナビル）（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）（リトナビル）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）（サキナビル）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）（ネルフィナビル）（Ａｇｏｕｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）。特定の実施形態において、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビタ−、および／またはプロテア−ゼインヒビタ−は、ＡＩＤＳを処置するためおよび／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の組成物との任意の組み合わせにおいて使用され得る。
【０１１２】
他の実施形態において、本発明の抗体は、抗日和見感染剤と組み合わせて投与され得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トリメトプリム−ペンタミジン、スルファメトキサゾ−ル、ＤＡＰＳＯＮＥ（登録商標）（Ｊａｃｏｂｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（登録商標）（ＣＩＢＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｕｍｍｉｔ、ＮＪ）、ＲＩＦＡＤＩＮ（登録商標）（リファンピン）（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｍａｒｒｉｏｎ−Ｒｏｕｓｓｅｌ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（登録商標）（Ｌｅｄｅｌｒｌｅ、Ｐｅａｒｌ  Ｒｉｖｅｒ、ＮＹ）、ＢＩＡＸＩＮ（登録商標）（クラリスロマイシン）（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（登録商標）（Ｌｅｄｅｌｒｌｅ、Ｐｅａｒｌ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＹ）、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（登録商標）（Ａｓｔｒａ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（登録商標）（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（登録商標）（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）、ＦＡＭＩＣＩＣＯＬＣＩＲ（登録商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、ピリメタミン、ロイコボリン、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスチム／ＧＭ−ＣＳＦ）（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、およびＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）（サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｉｍｍｕｎｅｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）。
【０１１３】
特定の実施形態において、本発明の抗体を、トリメトプリム−スルファメトキサゾ−ル
および／またはＡｔｏｖａｑｕｏｎｅ、Ｄａｐｓｏｎｅ、Ｐｅｎｔａｍｉｄｉｎｅとの任意の組み合わせで使用して、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置するか、および／または予防する。
【０１１４】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、イソニアジド、ＲＩＦＡＤＩＮ（登録商標）（Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）、ピラジンアミド、および／またはエタンブトールとの任意の組み合わせで、日和見性のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、リファブチン、クラリスロマイシン、および／またはアジスロマイシンとの任意の組み合わせで、日和見性のヒト型結核菌感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ガンシクロビル、ホスカネット、および／またはシドフォビル（Ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）との任意の組み合わせで、日和見性のサイトメガロウイルス感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、フルコナゾール、トラコナゾール（Ｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）、および／またはケトコナゾールとの任意の組み合わせで、日和見性の真菌感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、アシクロビルおよび／またはファムシクロビルとの任意の組み合わせで、日和見性の単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型の感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ピリメタミンおよび／またはロイコボリンとの任意の組み合わせで、日和見性のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ロイコボリンおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）との任意の組み合わせで、日和見性の細菌感染を予防的に処置し、そして／または予防するために使用される。
【０１１５】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。投与され得る抗ウイルス剤としては、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、抗菌剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗菌剤としては、アモキシリン、アミノ配糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、ベータラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルロキノロン（ｆｌｕｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、マクロライド、メトロニダゾル、ペニシリン、キノロン、リファンピン（ｒｉｔａｍｐｉｎ）、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明の抗体と組み合わせて投与され得る、従来の非特異的な免疫抑制薬剤としては、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６（Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、１５デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答性免疫細胞（例えば、Ｔ細胞が挙げられる）の機能を直接的（例えば、免疫細胞に作用することによって）または間接的に（他の媒介細胞に作用することによって）抑制することによって働く他の免疫抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る免疫抑制剤調製物としては、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（登録商標）（ＯＫＴ３）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ＯＲＡＬ（シクロスポリン）（Ｓａｎｄｏｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ））（Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（ミコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、アザチオプリン、グルココルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））（Ｗｙｅｔｈ，Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ，ＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗体と組み合わせた免疫抑制剤は、器官または骨髄の移植の拒絶を予防するために使用され得る。
【０１１９】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、単独でか、または１種以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の抗体とともに投与され得る、静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲＥ（登録商標）（Ｃｅｎｔｅｏｎ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，ＩＬ）、ＩＶＥＥＧＡＭ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ−ＵＳ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＩ）、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＦＮ（登録商標）（Ｓａｎｄｏｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｌｅｎｄａｌｅ，ＣＡ）、およびＧＡＭＩＭＵＮＥ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、移植治療（例えば、骨髄移植）において、静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０１２０】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、単独でか、または抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗炎症剤としては、グルココルチコイドおよび非ステロイド系抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニネスリド（ｎｉｎｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフォキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、ステロイド治療と組み合わせて投与される。組み合わせて投与され得るステロイドとしては、メチルプレドニゾロン（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、プレドニゾンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、プレドニゾンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。投与され得る免疫抑制剤およびプレドニゾンは、本明細書中に記載されるものであり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、メチルプレドニゾロンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。メチルプレドニゾロンと共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載されるものであり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
なお別の実施形態において、本発明の抗体は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投与される。必要に応じて、本発明の抗体は、以下の薬物のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、またはそれより多くと組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅｔｈａｉｄ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣＮ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）二ナトリウム（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、アトレロイトン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、バルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテナク（Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）、カムパス（ｃａｍｐａｔｈ）、ＡＧＭ−１４７０（Ｔａｋｅｄａ，Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ，ＩＬ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＢ−２４３１（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）、ＣＢＦ、ＢＳ２（ＫＳ  Ｂｉｏｍｅｄｉｘ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）、ＩＬ−Ｉｒａ遺伝子療法（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、パクリタキセル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ  Ｗｈａ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）、ダルブフェロン（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ）メシレート（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（シナージェン（ｓｙｎｅｒｇｅｎ）；Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＩＰＲ  ６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロケード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、ＥＦ５（Ｓｃｏｔｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，ＣＴ）、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，ＣＴ）、ＬＥＵＫＯＶＡＸ（登録商標）（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）、ＳＴ−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、およびブチキソコート（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ）プロピオネート（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ）。
【０１２４】
なお別の実施形態において、本発明の抗体は、１種以上のＤＭＡＲＤと組み合わせて投与される。従って、以下の薬物のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くが使用され得る：メトトレキサート、レフルノミド、エダトレキサート、エピロプリム、イオメトレキソール（ｉｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、ピリトレキシム（ｐｙｒｉｔｒｅｘｉｍ）、トリメトレキサート、ブロジモプリム、ＭＸ−６８、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［ｄ］−ピリミジン−５−イル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［［５−［２−（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキシピリリド［２．３−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル］−２−チエニル］カルボニル］−Ｌ−グルタミン酸、（Ｒ）Ｎ−［［５−［２−（２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル］−２−チエニル］−カルボニル］Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（（２，４−ジアミノ−３，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル）エチル）−２−チエニルカルボニル−Ｌ−グルタミン酸、（Ｓ）−２−［［［４−カルボキシ−４−［［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］アミノ］ブチル］アミノ］カルボニル］安息香酸、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−１−Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸、２，４−ジアミノ−６−（Ｎ−（４−（フェニルスルホニル）ベンジル）メチルアミノ）キナゾリン、２，４−ジアミノ−５−［４−［３−（４−アミノフェニル−４−スルホニルフェニルアミノ）プロポキシ］−３，５−ジメトキシベンジル］ピリミジン、Ｎ−［４−４−（２，４−ジアミノ−５−ピリミジニル）ブチル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［３−（２，４−ジアミノ−５−ピリミジニル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）エチル］−ベンゾイル］−４−メチレン−ＤＬ−グルタミン酸およびＮ−（１−メチルエチル）−Ｎ’［３−（２，４，５−トリクロロフェノキシ）プロポキシ］イミドジカルボンイミジックジアミド塩酸塩（ＰＳ１５）、スルファサラジン、アウロチオマレイン酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリン、ペニシルアミン、アザチオプリン、抗マラリア薬物（例えば、本明細書中に記載されるような）、シクロホスファミド、クロラムブシル、金、Ｅｎｂｒｅｌ（エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ））（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬、メトトレキサート、抗ＴＮＦ、Ｅｎｂｒｅｌおよび／またはスルファサラジンと組み合わせて投与される。
【０１２５】
１つの実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサートおよび抗ＴＮＦ抗体または抗Ｆａｓ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、スルファサラジンと組み合わせて投与される。
【０１２６】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、メトトレキサート、抗ＴＮＦ抗体、抗Ｆａｓ抗体およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｅｎｂｒｅｌと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｅｎｂｒｅｌおよびメトトレキサートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｅｎｂｒｅｌ、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、エトロリコキシブ（ｅｔｒｏｒｉｃｏｘｉｂ）、ミソプロストール／ジクロフェナクナトリウム、バルデコキシブ、チラコキシブ（ｔｉｒａｃｏｘｉｂ）、ロフェコキシブ（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ガランタミン、ダルブフェロンメシレート、アセクロフェナク、ＭＬ−３０００、アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）、ヒアルロン酸ナトリウム（ｈｖａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、ニメスリド、ミコフェノレートモフェチル（ｍｖｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ）、ジアセレイン、シベレストスト（ｓｉｖｅｌｅｓｔｓｔ）ナトリウム、デフラザコート（ｄｅｆｌａｚａｃｏｒｔ）、ナルメフェン塩酸塩、サマリウム−１５３レキシドロナム（ｌｅｘｉｄｒｏｎａｍ）五ナトリウム、ペントスタチン、Ｔ−６１４、アミプリロース塩酸塩、ロセパファント（ｒｏｃｅｐａｆａｎｔ）、アンピロキシカム、ファルネシル酸プレドニゾロン、メロキシカム、ジクロフェナクナトリウム、ロモキシカム（ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）、サラゾスルファピリジン、エトドラク、フルピルチン、マレエート、エブセレン、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）水和物、ナブメトン、クロプレドノール、ピロキシカムシンナメート、プロカゾン、リメキソロン、フェンレチニド、イミダゾールヒドロキシベンゾエート、ドロキシカム、フェンチアザク、アルファカルシドール、ハロプレドンジアセテート、グスペリムス（ｇｕｓｐｅｒｉｍｕｓ）塩酸塩、イノシンプラノベクス、アクタリト、インドメタシンファルネシル、ミゾリビン、トルフェナム酸、ジフルニサル、ピロキシカム、オキサプロジン、ヒアルロン酸ナトリウム、ブシラミン、シクロスポリン、フロクタフェニン、テノキシカム、デキサメタゾンパルミテート、アムフェナクナトリウム、アセメタシン、オーラノフィン、ロベンザリット二ナトリウム、またはこれらの任意の組み合わせと組み合わせて投与される。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｅｎｂｒｅｌ、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において、１つ以上の抗マラリア薬が、上記組み合わせの１つと組み合わせられる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、Ｅｎｂｒｅｌ、メトトレキサートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗ＴＮＦ抗体、およびメトトレキサートと組み合わせて投与される。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インターフェロンα−２Ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害性因子（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コラムブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンナトリウムホスフェート）；および他のもの（例えば、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタント（ｍｉｔｏｔａｎｔ）、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。他の化学療法剤としては、例えば、ＣＰＴ−１１、デフルノミド（ｄｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、シクロヘキシミド、およびマイトマイシンが挙げられる。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）またはＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと組み合わせて、投与される。別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共に、投与される。
【０１３０】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得るサイトカインとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−Ｉβ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦβが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明の抗体は、造血増殖因子と組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）（サルグラモスチム（ｓａｒｇａｍｏｓｔｉｍ））およびＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（フィルグラスト（ｆｉｌｇｒａｓｔ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、１種以上の他の治療レジメンまたは予防レジメン（例えば、放射線療法など）と組み合わせて投与される。
【０１３２】
全体にわたって使用される場合、「治療剤」とは、病理学的状態を軽減する際に有効な、化合物または組成物である。治療剤の代表的な例としては、抗癌化合物、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見性剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、疾患改変抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および標的細胞のアポトーシスを促進する二次抗体が挙げられる。
【０１３３】
抗癌化合物または抗癌化学療法剤は、異常に増殖する細胞の増殖を、抑制するまたは止めるのに有効な化合物または組成物である。従って、このような薬剤は、癌および異常な細胞増殖によって特徴付けられる他の疾患を処置するために、治療的に使用され得る。薬学的に有効な量の抗癌化合物は、個体に投与されて、異常に増殖する細胞の増殖を抑制または止めるのに十分な量である。抗癌化合物の例示的な例としては、以下が挙げられる：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポサイド、６−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチン。抗癌化合物および治療剤のさらなる例は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第１５版、Ｂｅｒｋｏｗら編、１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．およびＳｌａｄｅｋらＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９８７，Ｐｏｗｉｓら編、ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に見出される。
【０１３４】
本発明の抗体は、悪性腫瘍の処置において他の治療（例えば、化学治療および／または放射性治療）とさらに組み合わされ得、そして治療効力は、アポトーシス誘導化合物（例えば、ビスインドリルマルイミドＶＩＩＩ（Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ）またはＳＮ−５０もしくはＬＹ２９４００２のような他の感作剤）によって高められ得る。従って、１つの実施形態において、本発明の抗体は、Ｂｉｓ  ＶＩＩＩまたは他の感作剤および化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、エトポシド、トポテカン、タキソテレ（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、またはパクリタキセル）と組み合わされ得る。別の実施形態においては、本発明の抗体は、非ステロイド抗炎症性薬物（例えば、スリンダクスルフィドまたは他のＣＯＸ−１インヒビターもしくは他のＣＯＸ−２インヒビター）、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、エトポシド、トポテカン、タキソテレ、またはパクリタキセル）と組み合わされ得る。他の疾患（例えば、自己免疫疾患および炎症性疾患）の処置において、処置の組み合せもまた、使用され得る。例えば、抗体は、抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ、化学治療剤、メトトレキサート、ビスインドリルマルイミドＶＩＩＩまたは他の感作剤などのような、他の治療剤と組み合わせて投与され得る。放射性治療もまた、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置において他の治療剤と組み合わされ得る。当業者は、特定の炎症性疾患または自己免疫疾患に対して放射性治療の形態を適合する（例えば、関節炎の処置における放射線骨膜切除）。
【０１３５】
本発明の抗体を使用する治療はまた、本発明の別の抗体を使用する治療とも組み合され得る。例えば、ＤＲ５に対する抗体は、ＤＲ４、ＴＮＦ、Ｂ７、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０、ＣＤ２０  （例えば、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、Ｆａｓ、またはこれらの組み合わせに対する抗体の投与とともに、投与より先に、または投与の後に、それを必要とする被験体に投与され得る。このような併用抗体治療は、１つ以上の治療剤（例えば、化学療法剤、ドキソルビシン、および／またはメトトレキサート）、放射性治療、または両方の投与とさらに組み合され得る。
【０１３６】
従って、本発明は、ＤＲ５を発現する標的細胞のアポトーシスを選択的に誘導するか、またはこの細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）標的細胞を、ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５を特異的に結合する治療的量の抗体と接触させる工程であって、この抗体は、その可溶性形態において、ＤＲ５を発現する標的細胞において、インビボおよびインビトロのアポトーシス誘導活性を有する、工程；ならびに（ｂ）標的細胞を、治療的な量の１つ以上の治療剤と接触させる工程。１つの実施形態において、接触させる工程の一方または両方が、必要に応じてインビボで実施される。別の実施形態において、一方または両方の接触させる工程が、インビトロで実施される。標的細胞は、アポトーシス系の非調節を示す細胞、好中球、活性化リンパ球または他の活性化免疫細胞（例えば、リンパ系細胞および骨髄性細胞）、ウイルス感染した細胞、および自己免疫疾患の異常に増殖する滑膜細胞（例えば、慢性関節リウマチ滑膜細胞（炎症生活膜細胞、滑膜における活性化リンパ系細胞および活性化骨髄性細胞、マクロファージ様滑膜細胞、ならびに線維芽細胞様滑膜細胞が挙げられる））から選択され得る。以前公開された抗ＤＲ５抗体（２４）と比較すると、本発明の指示的なＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導活性は、非常に強力であり、そしてインビトロでｐｇ／ｍｌレベルにてＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導し得、そして以前報告された可溶性ＴＲＡＩＬと比較して優れた殺腫瘍性の活性をインビボで示す。ＴＲＡ−８の単一用量の静脈内投与は、固形腫瘍細胞および造血性腫瘍細胞の両方の増殖を阻害するのに十分であるが、可溶性のＴＲＡＩＬを用いてインビボで腫瘍後退を誘導するには、かなり高用量（１日毎に５００μｇを１０日間）を必要とする。本発明の抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体は、例示的な抗体ＴＲＡ−８が、非形質転換線維芽細胞のアポトーシスを誘導しないので、可溶性のＴＲＡＩＬと同様に安全であるように見える。類似する結果が、ＤＲ４抗体について観察された。
【０１３７】
本発明のベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動可能に連結された、ＤＲ５抗体またはＤＲ４抗体の重鎖免疫グロブリンもしくは軽鎖免疫グロブリンをコードする核酸配列を含む。「作動可能に連結される」とは、その通常の機能を実施するように構成されたヌクレオチド配列の配置を言う。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントは、ポリペプチドの転写、複製および／または翻訳を指示可能である。単一ベクターが、ＤＲ５抗体またはＤＲ４抗体の重鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンについてのコード配列を必要に応じて含むことは、当業者によって認識される。１つの実施形態において、ベクターは、ヒト化軽鎖免疫グロブリンまたはヒト化重鎖免疫グロブリンをコードする。
【０１３８】
本発明による方法および結果を示すため、次の実施例を以下に示す。これらの実施例は、本発明の全ての局面を包括するものであることを意図しないが、むしろ代表的な方法および結果を示すことを意図する。これらの実施例は、当業者にとって明らかである本発明の等価物および変化形を除外することを意図しない。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１．ＤＲ５抗原の調製）
（１．１  ＤＲ５  ｃＤＮＡのクローニング）
ヒトＤＲ５タンパク質をコードするＤＮＡを、以下を使用する次のＲＴ−ＰＣＲ法によってクローン化する。
【０１４０】
（ａ）テンプレート）
ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用することによって抽出する。Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、このキットに備え付けられた指示マニュアルに従って使用することによって得られるｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応についてのテンプレートとして使用する。
【０１４１】
（ｂ）ＰＣＲプライマー）
次のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
５’−ｇａｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｃｔａｃｔｔｔａａｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ１：配列番号１）；
５’−ｃｃａｃｔｇｇｇｔｇａｔｇｔｔｇｇａｔｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ２：配列番号２）。
【０１４２】
別のように特定されなければ、これらの実施例中の全てのオリゴヌクレオチドを、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、蒸留水に溶かした後、−２０℃で保存する。
【０１４３】
（ｃ）ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応溶液の組成：
テンプレートｃＤＮＡ、全３３μｌ反応物中の５μｌ
プライマーＤＲ５ｐ１、１０ｐｍｏｌ；
プライマーＤＲ５ｐ２、１０ｐｍｏｌ；
１０×濃縮ＰＣＲ緩衝液（キットに備え付けられている）、１０μｌ；
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、４μｌ；および
Ｔａｑポリメラ−ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５単位。
【０１４４】
滅菌した蒸留水を、全容積１００μｌになるまでこの溶液に加える。別のように特定されなければ、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各２．５ｍＭ）の等モル混合物である。
【０１４５】
ＰＣＲ反応を、次のように行う。溶液を最初に９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間そして７２℃で３分間加熱するサイクルを、４０回繰り返す。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１０分間加熱する。
【０１４６】
このようにして得られた、増幅されたＤＮＡフラグメントを、０．２５μｇ／ｍｌエチジウムブロミドを含む１％アガロースゲル上で分離する。所望のＤＮＡフラグメントを含むように決定されたバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、次いで、そのＤＮＡをＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキット（ＢＩＯ１０１）を使用して回収する。そのＤＮＡフラグメントを、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用してクローン化する。これを、次のように実施する。
【０１４７】
ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  キットに備え付けられているｐＣＲ２．１ベクター５０ｎｇとともに、このＰＣＲ反応溶液から回収されたＤＮＡフラグメントを、１μｌの１０×リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ塩化ナトリウム、７ｍＭβーメルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジン、および０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と混ぜ合わせ、これに４単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）を加えた。混合物の全容積を、滅菌脱イオン水を用いて１０μｌに調整し、そして得られたリガーゼ溶液を、１４℃で１５時間インキュベートする。その後、２μｌのリガーゼ反応溶液を、５０μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’株（これは、ＴＡクローニングキットに備え付けられており、指示マニュアルに従ってコンピテントにする）に加え、そして２μｌの０．５Ｍβ−メルカプトエタノールを、これに加える。そして得られた混合物を、３０分間氷上で保ち、次いで４２℃で３０秒間、そして再び氷上で５分間保つ。次に、２％ｖ／ｖトリプトンを含む５００μｌの培地、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．０５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、および２０ｍＭグルコース（本明細書中以後「ＳＯＣ」培地と呼ぶ）を、培養物に加え、そして混合物を、振り混ぜながら３７℃で１時間インキュベートする。その後、培養物を、１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス寒天プレート（１％ｖ／ｖトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム、０．１％ｗ／ｖグルコース、および０．６％ｗ／ｖバクト寒天（Ｄｉｆｃｏ））上にスプレッディングする。プレート上で現れるアンピシリン耐性コロニーを選択し、そして白金製移動ループを用いて削り取り、そして２００ｒ．ｐ．ｍ．で振り混ぜながら、一晩中３７℃で、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス培地中で培養する。インキュベーションの後、細胞を、遠心分離法によって収集し、それからプラスミドＤＮＡをアルカリ法によって調製する。このようにして得られたプラスミド由来のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＲ５  ｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｅｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）にサブクローン化する。ｐｃＤＮＡ３におけるＤＲ５遺伝子の全長を、配列決定し、そして公開された配列と適合させる。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＤＲ５と名付ける。
【０１４８】
（１．２  ＤＲ５−ＩｇＧ発現ベクターの構築）
膜貫通ドメインを欠くヒトＤＲ５の可溶性形態を得るため、発現プラスミドベクターを構築する。このベクターを、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤＮＡ（４１）に融合されたヒトＤＲ５の細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするように設計する。膜貫通ドメインを欠くヒトＤＲ５をコードするＤＮＡを、次のＰＣＲ反応によって得る。
【０１４９】
（ａ）テンプレート）
ＰＣＲ反応のためのテンプレートは、ｐｃＤＮＡ３−ＤＲ５を使用する。
【０１５０】
（ｂ）ＰＣＲプライマー）
次のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲのために合成する：
５’−ｇａｃｇａｔｇｃｃｃｇａｔｃｔａｃｔｔｔａａｇｇｇ−３’（ＤＲ５ｐ１：配列番号１）；
５’−ｇｇａｔｃｃｇｔｇｇａｃａｃａｔｔｃｇａｔｇｔｃ−３’（ＤＲ５ｐ３：配列番号３）；
別のように特定されなければ、これらの実施例中の全てのオリゴヌクレオチドを、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成する。全てのオリゴヌクレオチドを、蒸留水中で溶かした後、−２０℃で保存する。
【０１５１】
（ｃ）ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応を行い、そして増幅されたＤＮＡを実施例１．１（ｃ）によって単離する。
【０１５２】
このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐＣＲ−ΔＤＲ５として表す。ｐｍＦａｓ−ｈＩｇＧ１Ｆｃから回収されるヒトＦｃフラグメントにコードされたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩマルチクローニング部位およびＥｃｏＲＩマルチクローニング部位にサブクローン化する。このようにして得られたプラスミドを、ｐｃＤＮＡＦｃとして表す。さらに、ｐＣＲ−ΔＤＲ５から回収されるヒト可溶性ＤＲ５領域をコードするＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡＦｃのＢａｍＨＩ部位にサブクローン化する。このようにして得られたプラスミドを、プラスミドｐｃＤＮＡΔＤＲ５−Ｆｃとして表す。ｐｃＤＮＡΔＤＲ５−Ｆｃプラスミドから回収されるヒト可溶性ＤＲ５−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域をコードするＥｃｏＲＩフラグメントを、ＤＮＡポリメラ−ゼＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用することによって平滑末端化する。次いでＢａｍＨＩによって切断した後に平滑末端化されているシャトルベクタ−ｐＡｄＣＭＶ５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｃａｎａｄａ）に、そのフラグメントをサブクローン化する。このようにして得られたプラスミドを、ｐＡｄΔＤＲ５−Ｆｃとして表す。
【０１５３】
（１．３  ヒトＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の発現および精製）
ＱＢＩ−２９３Ａ細胞（ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ  Ｋｉｔに備えられている）を、指示マニュアルに従ってＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ  Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｃａｎａｄａ）を使用してｐＡｄΔＤＲ５−ＦｃおよびＱＢＩ−ウイルスＤＮＡ（ＡＤＥＮＯ−Ｑｕｅｓｔ  Ｋｉｔに備えられている）を用いて共トランスフェクトする。組換えウイルスプラークを培養し、上清のＥＬＩＳＡ分析によってＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質の発現についてスクリーニングする。ポジティブプラークを、ＱＢＩ−２９３Ａ細胞中で増幅し、そしてウイルスストックとして−８０℃で保存する。５０枚のＱＢＩ−２９３Ａ細胞ディッシュ（１５０ｍｍ）を、１０ｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）でｐＡｄΔＤＲ５−Ｆｃ組換えウイルスを用いてトランスフェクトする。培養培地を、４８時間トランスフェクションした後、収集する。
【０１５４】
ＤＲ５−ＩｇＧ遺伝子を有するトランスフェクトされた細胞を、３７℃にて５％ｖ／ｖ  ＣＯ２雰囲気下で、１０％ｖ／ｖ  ＦＣＳを含む５００ｍｌのＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地中で２日間インキュベーションすることによって、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度にする。次いで、培養物を遠心分離（１，０００ｒ．ｐ．ｍ．、５分）し、そして上清を、収集する。上清からのＤＲ５−ＩｇＧの精製を、次の条件下でＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂアフィニティクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて成し遂げる：
カラム：ＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（カラムサイズ２ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；
溶出緩衝液：０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．４）、０．１５ＭＮａＣｌ；
中和緩衝液：１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）。
【０１５５】
全ての上清を、カラムに適用した後、これを、２０ｍｌ  ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１ｍｌ溶出緩衝液を、１０回加える。各溶出画分（１ｍｌ）の光学密度を測る。２番目の画分から５番目の画分まで（ＯＤ２８０≧０．１）を収集し、そして、１００μｌ中和緩衝液を加えた後、溶出液を、透析チューブの中に別々に置き、そして溶出液を、４℃で１ｌのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対し透析する。透析緩衝液を２回換える。
【０１５６】
次いで、溶出液を、ＥＬＩＳＡによってＤＲ５−ＩｇＧ遺伝子生成物の発現についてアッセイする。まず、各画分１００μｌを、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに別々に置き、そして３７℃で１時間インキュベートする。その後、ウェル中の溶液を除去し、そしてプレートを、０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０（本明細書中以後、「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ」と呼ぶ）を含む１００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて３回洗浄する。洗浄後、２％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（本明細書中以後、「ＢＳＡ」と呼ぶ）を含むＰＢＳを、１００μｌ／ウェルの量で加える。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。その後、ウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いてさらに３回洗浄し、その後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０００倍希釈された抗ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の１００μｌ／ウェル溶液を、各ウェルに加える。そしてプレートを、再び３７℃で１時間１回インキュベートする。次いで、ウェルを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄する。次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（本明細書中以後、「ＴＭＢ」と呼ばれる）液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェル量で加え、そしてプレートを、室温で５分間静置させ、次いで、１００μｌ／ウェルの０．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を止める。各ウェルの吸光度を、コントロール読取り値として６５０ｎｍでの吸光度を使用して、結合抗体の濃度を推定するために４５０ｎｍで読み取る。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定する。ＤＲ５−ＩｇＧ１の生成を、このＥＬＩＳＡ法を使用して確認する。発現ＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の分子量を、ウエスタンブロッティング分析を使用して決定する。この分析において、抗ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）を、ゲル上でこの抗体を検出するのに使用する。発現ＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質の分子量は、約５０ｋＤａの分子量を有する。成し遂げられる純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分析およびクーマシーブルー染色法によるタンパク質の検出によって評価される場合、９０％を超える。
【０１５７】
（実施例２．ヒトＤＲ５に対するモノクローナル抗体の産生）
（２．１  免疫）
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、アフィニティー精製されたヒトＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質で免疫する。初期肉趾免疫について、融合タンパク質（５０μｇ）を、フロイントの完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中に乳化する。次いで、マウスを、５０μｇの融合タンパク質の４回の注射でブーストした（アジュバントを有さずに１日置きに投与される）。最後の注射の３日後、局所的リンパ節由来のリンパ球を、ＮＳ−１骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを、１０％ウシ胎仔血清を補充したＦ１０４培地中で培養する。陽性のハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡによって選択し、このＥＬＩＳＡにおいて、プレートは、１μｇ／ｍｌ  ＤＲ５／ｈＩｇＧ１またはコントロールとして等量のＦａｓ／ｈＩｇＧ１でコーティングされる。ハイブリドーマのアイソタイプを、マウスＩｇアイソタイプ特異的ヤギ抗体のパネル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用するＥＬＩＳＡによって決定する。モノクローナル抗体を、固定された抗マウスＩｇＧ１またはプロテインＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【０１５８】
（２．２  細胞融合）
ブースト注射の３日後において、局所的リンパ節を、マウスから除去し、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および３００μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン酸を含有する１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中に置き、器官をスパチュラを使用してメッシュ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｆａｌｃｏｎ）を通過させることによって破壊した。得られた細胞懸濁物を、遠心分離し、局所的リンパ節細胞をペレットにし、次いで、無血清ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した。次いで、この洗浄した細胞を、無血清ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、計数する。
【０１５９】
その間に、骨髄腫ＮＳ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＴＩＢ−１８）は、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む、ＡＳＦ１０４培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ，Ｋ．Ｋ．（「血清を含むＡＳＦ培地」）中、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２下３７℃で、１×１０８細胞／ｍｌを超えない細胞濃度まで増殖し、そしてこれらを同様に粉砕し、洗浄し、再懸濁し、そして計数する。
【０１６０】
３×１０７細胞を含むと計算されたある量のＮＳ１細胞懸濁物を、３×１０８細胞を含むと計算されたある量の脾細胞懸濁物と混合する。得られた混合物を、遠心分離し、上清を捨てる。以下の工程の細胞融合を実施する一方、ペレットを含むプラスチック管を、常に温水ビーカー中３７℃に保つ。
【０１６１】
次いで、１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を、管にゆっくりと添加し、その間ずっと、ピペットのチップを使用してペレットを攪拌する。続いて、前もって３７℃まで暖められた１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地を、２部でゆっくりと添加し、続いて、さらに７ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地を添加する。次いで、得られた混合物を、遠心分離し、上清を捨て、ピペットのチップでゆっくりと攪拌しながら、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有する１０ｍｌのＨＡＴ培地を添加する。１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有するＨＡＴ培地をさらに２０ｍｌ添加し、懸濁物を、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養マイクロプレートに分配し、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２雰囲気下で３７℃でインキュベートする。７日または８日後、１００μｌ／ウェルの新鮮なＨＡＴ培地を使用し、黄色の色相を示すウェルの全てにおいて培地を入れ換える。これらのウェルからの融合細胞を、以下に示すような限界希釈によってクローン化する。
【０１６２】
（２．３  限界希釈によるクローニング）
４〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｐａｎ  ＳＬＣ，Ｉｎｃ．製）から胸腺を取り出し、上記のようにメッシュ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ；Ｆａｌｃｏｎ）上で破壊し、粉砕された細胞を、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有するＨＴ培地で２回洗浄した。１匹のマウスからの胸腺に対応するある量の胸腺細胞を、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有する３０ｍｌのＨＴ培地中に懸濁し、供給用細胞懸濁物を生成する。上記実施例２．２において得られた融合細胞調製物を、この供給用細胞懸濁物で１０〜１００倍に希釈し、さらに供給用細胞懸濁物で連続的に希釈し、５細胞／ｍｌ、１細胞／ｍｌおよび０．５細胞／ｍｌの融合細胞濃度を有する懸濁物を作製する。このように調製したサンプルを、９６ウェル細胞培養マイクロプレートのウェルに１００μｌ／ウェルで分配し、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２下で、３７℃で５日間インキュベートする。
【０１６３】
（２．４  スクリーニング）
増殖するハイブリドーマからの培養上清を、１μｇ／ｍｌ  ＤＲ５／ｈＩｇＧ１またはコントロールとして同量のＦａｓ／ｈＩｇＧ１（４１）のいずれかでコーティングされたプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。結合した抗体を、基質としてＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗マウス免疫グロブリン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用して検出する。１μｇ／ｍｌの濃度の精製ＤＲ５−ＩｇＧ１または同量のＦａｓ−ｈＩｇＧ１を、９６ウェルのＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ  ＳＴＲＩＰ  ＰＬＡＴＥ（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ）のウェルに導入する。プレートを、４℃で一晩静置しておき、ウェル表面上にタンパク質を吸着させる。この時間の後、ウェル中の溶液を捨て、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。次いで、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（Ａ３８０３；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．）を含有する１００μｌのＰＢＳを、各ウェルに添加し、プレートを、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄し、次いで、増殖するハイブリドーマからの５０μｌの各培養上清を、各ウェルに添加する。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで再度４回洗浄する。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍に希釈された、１ウェル当たり５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を添加し、プレートを、再度３７℃で１時間インキュベートし、その後、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄する。次いで、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジリデン（ＴＭＢ）液体基質系（Ｓｉｇｍａ）を、１００μｌ／ウェルの量で添加し、プレートを、室温で５分間静置し、次いで、反応を、１００μｌ／ウェルの０．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止した。各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（コントロール  ６５０ｎｍ）を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定し、融合細胞を、融合細胞上清が添加されなかったサンプル（ＯＤ値；約０．０３）より明らかに高い吸光度（４５０ｎｍ−６５０ｎｍ，ＯＤ値；＞０．５）を有したサンプルから選択する。さらに、増殖するハイブリドーマからの培養上清をまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用してアポトーシス誘導活性を測定することによって、機能的にスクリーニングする。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ウェル当たり１０００細胞）および５μＭのビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ，Ａｌｅｘｉｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有する５０μｌのＲＰＭＩ培地を、５０μｌの増殖するハイブリドーマからの培養上清の存在下で、９６ウェルプレートに添加する。細胞を、加湿培養器中で３７℃で一晩培養する。アポトーシスを、ＡＴＰＬｉｔｅキットを製造業者（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって指示されるように使用して細胞生存性によって決定し、サンプルを、ＴｏｐＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して計数する。
【０１６４】
（２．５  ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８のレセプターへのＥＬＩＳＡ結合）
ＥＬＩＳＡプレートを、２μｇ／ｍｌのＤＲ４−Ｉｇ融合タンパク質またはＤＲ５−Ｉｇ融合タンパク質で一晩コーティングする。３％  ＢＳＡでのブロッキングの後、可溶性ＴＲＡＩＬ−ＦＬＡＧまたはＴＲＡ−８を、指示された濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートする。ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の結合を、それぞれ、ＨＲＰ−結合体化抗Ｆｌａｇ抗体（Ａｌｅｘｉｓ）またはＨＲＰ−結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出する。反応を、ＴＭＢ基質緩衝液によって開始し、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定する。Ｋｄ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する非線形回帰の一部位結合モデルによって推定する。競合的ＥＬＩＳＡのために、１００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ−ＦＬＡＧを添加し、種々の濃度のＴＲＡ−８の存在下でインキュベートする。ＴＲＡＩＬの結合を上記のように決定する。
【０１６５】
（２．６  クローニング）
上記実施例２．３および２．４に記載される工程を、２．４において選択される細胞について５回繰り返し、それによって、いくつかのハイブリドーマクローンの選択を可能にする。これらの各々は、ＤＲ５−ＩｇＧを結合するが、Ｆａｓ−ＩｇＧを結合しない単一の抗体を産生した。この選択手順の結果として、ＴＲＡ−８と命名され、ＤＲ５−ＩｇＧに結合するが、Ｆａｓ−ＩｇＧに結合しない抗体を産生する、マウス−マウスハイブリドーマを得る。このハイブリドーマ（ＴＲＡ−８）は、２０００年３月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号ＰＴＡ−１４２８を割り当てられた。
【０１６６】
マウス−マウスハイブリドーマＴＲＡ−８（本明細書中以後、単に「ＴＲＡ−８」という）によって産生される抗体のサブクラスは、モノクローナル抗体アイソタイプ決定キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した後、ＩｇＧ１、κであるとして示される。
【０１６７】
本出願人らのヒトＤＲ５−ＩｇＧ１融合タンパク質を免疫原として使用して、７つのハイブリドーマクローンを、初期ＥＬＩＳＡスクリーニングによって得る。これらの全ては、ＤＲ５−ＩｇＧに対して強い陽性であるが、Ｆａｓ−ＩｇＧ融合タンパク質に対してはそうではなく、このことは、得られたハイブリドーマが、ＤＲ５の細胞外部分を認識するが、ＩｇＧ１のＦｃ部分は認識しない抗体を産生することを示す（データは、示さず）。
【０１６８】
（２．７  ウェスタンブロット分析）
正常ヒト組織ホモジネートおよび癌組織ホモジネートのウェスタンブロット分析用のフィルターを、Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入する。各レーンに、抗βアクチン抗体によって決定される等量のタンパク質でローディングする。ブロットを、１μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８で一晩プローブし、続いて、ＨＲＰ−結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温で１時間プローブし、化学発光によって発色させる。
【０１６９】
（２．８  インサイチュ免疫組織化学）
ヒト組織を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ＵＡＢから得る。凍結切片を、７０％エタノール中に固定し、ＰＢＳ中の１０％ウシ血清でブロックし、次いで、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ＴＲＡ−８と共に室温で６０分間インキュベートする。比色基質としてジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いる抗マウスＩｇＧ  ＡＢＣキットを、反応性を可視化するために使用する。
【０１７０】
（２．９  カスパーゼ活性化の分析）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０６／ｍｌ）を、５００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８と共にインキュベートする。細胞溶解物のアリコート（３０μｇのタンパク質）を、１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、ナイロン膜上にブロットし、そしてこのブロットを、抗カスパーゼ８抗体、抗カスパーゼ９抗体、および抗カスパーゼ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でプローブし、続いて、ＨＲＰ結合体化二次抗体でプローブし、切断産物の化学発光可視化を行う。カスパーゼインヒビターセットを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入する。各カスパーゼインヒビターを、示した濃度で培養液に添加する。
【０１７１】
（実施例３．ＴＲＡ−８モノクローナル抗体の精製）
マウス−マウスハイブリドーマ（ＴＲＡ−８）を、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有する５００ｍｌのＡＳＦ培地中、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２下で、３７℃で５日間インキュベーションすることによって、１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖する。次いで、培養物を遠心分離（１，０００ｒ．ｐ．ｍ．、５分間）し、上清を収集する。上清からのＴＲＡ−８の精製を、以下の条件下で、ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して達成する：
カラム：ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（カラムサイズ  ２ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；
溶出緩衝液：０．１Ｍ  グリシン（ｐＨ２．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；
中和緩衝液：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）。
【０１７２】
上清の全てをカラムにアプライした後、２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、次いで、溶出緩衝液を、１ｍｌの容量で１０回添加する。各溶出画分（１ｍｌ）の光学密度を測定する。第２番目〜第５番目の画分（＞ＯＤ２８０＝０．１）を、別々に収集する。
【０１７３】
１００μｌの中和緩衝液の添加後、溶出液を、別々に透析チューブに配置し、溶出液を、４℃で１リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して透析する。透析緩衝液を、２回交換する。このサンプルを、上記の技術を使用して上で調製されたヒトＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡによって抗ＤＲ５抗体活性についてアッセイする。
【０１７４】
（実施例４．ＤＲ４抗原、ＤＲ４−ＩｇＧ発現ベクターおよび抗ＤＲ４モノクローナル抗体の調製）
実施例１〜３の手順を、実施例１に詳述されるものの代わりにＤＲ４テンプレートｃＤＮＡおよびプライマーを用いて繰り返し、ＤＲ４抗原を得る。このＤＲ４抗原は、ＤＲ４に対して特異的なモノクローナル抗体を得るために実施例１．２〜３に従って使用される。
【０１７５】
（実施例５．ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対するモノクローナル抗体）
実施例１に従ってそれぞれの抗原を作製するように対応するｃＤＮＡおよびプライマーを置換することによって、デコイレセプターＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対してモノクローナル抗体を惹起する。免疫グロブリンＧとのＤｃＲ１融合体またはＤｃＲ２融合体に対する発現ベクターおよび得られた精製モノクローナル抗体を、実施例２および３に従って作製する。
【０１７６】
（実施例６．モノクローナル抗体の特異性）
ＴＲＡＩＬのレセプターの全て、およびＴＮＦＲファミリーの他のタンパク質は、有意な相同性を共有するので、ＤＲ５に対する例示的な抗体ＴＲＡ−８の特異性を、２つの異なるヒトＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質および可溶性組換え形態の他の関連するタンパク質を使用するウェスタンブロット分析によって決定する。第一のＤＲ５−Ｉｇ融合タンパク質を、ＤＲ５の細胞外部分の残基１〜１８０由来のｃＤＮＡと、ヒトＩｇＧ１の定常領域をコードするｃＤＮＡとを融合させることによって、構築する。この融合ｃＤＮＡを、組換えアデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）にクローニングする。発現されるＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質（これは、５０ｋＤａの相対分子量を有した）を、抗ヒトＩｇＧアフィニティーカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して精製する。特異性のウェスタンブロット分析のために、第二の組換えヒトＤＲ５／ＩｇＧ１融合タンパク質（アミノ酸５２〜２１２）ならびにＴＲＡＩＬ−Ｒ１融合タンパク質、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３融合タンパク質およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４融合タンパク質を、Ａｌｅｘｉｓから購入する。ヒトＦａｓおよびＴＮＦＲ１の可溶性形態は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡのＣａｒｌ  Ｅｄｗａｒｄｓ博士によって親切にも提供された。使用する可溶性組換えヒトＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＴＮＦＲ１、Ｒ４、およびＦａｓ分子は、ヒトＩｇＧ１融合タンパク質である。０．５μｇの各タンパク質を、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてニトロセルロース膜上にブロットする。これらのブロットを、ＰＢＳ中５％乾燥ミルクで、室温で１時間ブロックし、そして１μｇ／ｍｌの精製モノクローナル抗ＤＲ５抗体（クローン：ＴＲＡ−８）または０．１μｇ／ｍｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧで、４℃で一晩プローブする。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧを、二次抗体として使用して、結合したＴＲＡ−８を検出する。これらのブロットを、化学発光によって発色させる。
【０１７７】
全長ＤＲ５またはＤＲ４を含むｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、あるいは空のベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞を、フローサイトメトリー分析のために使用する。ヒトＴＲＡＩＬまたはマウスＦａｓリガンドをコードする全長ｃＤＮＡを、テトラサイクリン制御可能プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の下流にｐＴＲＥベクターにクローニングする。ｐＴＲＥ−ｈＴＲＡＩＬまたはｐＴＲＥ−ｍＦａｓＬのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、アデノウイルスシャトルベクターｐＡｄＢＮ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）内にさらにクローニングする。２９３宿主細胞を、線状化したｐＡｄ−ＴＲＥ−ｈＴＲＡＩＬまたはｐＡｄ−ＴＲＥ−ｍＦａｓＬおよびアデノウイルスのラージフラグメントＤＮＡで同時トランスフェクトする。組換えウイルスプラークからの機能的ヒトＴＲＡＩＬまたはマウスＦａｓリガンドの発現を、Ｊｕｒｋａｔを標的として用いる５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、スクリーニングする。
【０１７８】
ＴＲＡ−８は、図１ａ、ＤＲ５、＃１において示されるように、ＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質（約５０ｋＤａ）（これは、免疫のために使用される）と強く反応し、そして図１ａ、ＤＲ５、＃２において示されるように、第二のＤＲ５−ＩｇＧ融合タンパク質（約６０ｋＤａ）と弱く反応した。ＴＲＡ−８の、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、Ｆａｓ（ＣＤ９５）またはＴＮＦＲＩに対する有意な結合は、存在しない。これらの結果は、ＴＲＡ−８が、ＤＲ５に特異的であるがそのファミリーの他のメンバーによって共有されないエピトープを認識することを示す。
【０１７９】
ＴＲＡ−８は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの他のメンバー（例えば、Ｆａｓ（ＣＤ９５）およびＴＮＦレセプターＩ）と反応せず、そして４５０ｎｍおよび６５０ｎｍについての光学吸光度比によって示されるように（下のパネルの番号１〜７（図１ａ、下のパネルの欄８））、ＴＲＡ−８は、ＤＲ５のマウスホモログと交差反応もしない。可溶性のＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８は、固定されたＤＲ５に同程度に結合した（図１ｂ、左のパネル）。対照的に、ＴＲＡＩＬは、ＤＲ４に結合するが、ＴＲＡ−８は、ＤＲ４に対していかなる結合活性も示さなかった（図１ｂ、中央のパネル）。ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８の、ＤＲ５に対する結合についてのＫｄ値は、それぞれ５９ｎＭおよび３ｎＭと推定される。重要なことには、競合ＥＬＩＳＡ（図１ｂ、右のパネル）に示されるように、ＴＲＡ−８は、ＤＲ５への結合についてＴＲＡＩＬと効率的に競合するが、ＤＲ４に対する結合については競合しない。これらの結果は、ヒトＤＲ５に対するＴＲＡ−８の特異性を確立する。
【０１８０】
ＴＲＡ−８は、ＤＲ５の細胞表面発現を検出し得、フローサイトメトリー分析は、全長ヒトＤＲ５でトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の細胞表面への特異的結合を示すが、ＤＲ４または空のベクターでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞については示さない（図１ｃ）。同様に、ＴＲＡ−８を用いるインサイチュ免疫組織化学は、全長ＤＲ５  ＤＮＡでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞との反応性を実証したが、コントロールベクターでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞との反応性を示さなかった（図１ｄ）。ＴＲＡ−８は、トランスフェクトされていないＣｏｓ−７細胞のアポトーシスを誘導せず、そしてヒトＤＲ５をコードする対合プライマーを使用する、Ｃｏｓ−７細胞由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、特異的ＰＣＲ産物を示さなかった。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を標的として用いるさらなる機能的分析は、架橋の非存在下では、ＴＲＡ−８は、細胞死を「強力に」誘導することを示した。これは、ＡＴＰＬｉｔｅ、ＭＴＴおよびＰＩ排除を含む、細胞生存性についての３つの異なるアッセイによって実証された（図１ｅ）。ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって示されるように、５０％より多くのＪｕｒｋａｔ細胞が、ナノグラムレベルのＴＲＡ−８によって殺傷される。ＴＲＡ−８の殺傷活性は、ＤＲ５に対して特異的である。なぜなら、これは、ＤＲ５−Ｉｇ融合タンパク質によってブロックされ得るが、ＤＲ４−Ｉｇ融合タンパク質によってはブロックされないからである（データは示さない）。カスパーゼ８、９、および３の切断は、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＲＡ−８処理の３０分後程度の早さで、ウェスタンブロット分析によって検出され得（図１ｆ）、そしてＪｕｒｋａｔ細胞の細胞死は、一般的なカスパーゼインヒビター（Ｚ−ＶＡＤ）によって完全に阻害される（図１ｇ）。カスパーゼ８、３、９、および１０についての個々のカスパーゼインヒビターは、細胞死を部分的に阻害し、このことはさらに、ＴＲＡ−８によって媒介される細胞死が、主として、カスパーゼ依存性のアポトーシス機構を介することを示す。
【０１８１】
（実施例７．細胞表面ＤＲ５の発現のフローサイトメトリー分析：多くの腫瘍細胞に対する主要なデスレセプターであるが正常細胞についてはそうではない）
次いで、ＴＲＡ−８が、細胞表面において発現されるＤＲ５に結合する能力、およびこの反応の特異性を、全長ヒトＤＲ５  ｃＤＮＡもしくは全長ヒトＤＲ４  ｃＤＮＡを含む発現ベクター、またはコントロールとして空のベクターでトランスフェクトされた、ＣＯＳ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ番号ＣＲＬ−１６５１）細胞を使用して評価する。フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、二次抗体として使用して、結合ＴＲＡ−８を検出する。１×１０４細胞の蛍光を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ）を使用して、以下の条件下で測定する：
励起波長：４８８ｎｍ；
検出波長：６００ｎｍ。
【０１８２】
フローサイトメトリー分析は、図１ｃの黒塗りヒストグラムにおいて示されるように、ＴＲＡ−８が、ＤＲ５ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の約３０％を染色したことを示した。この百分率は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用するトランスフェクションの分析によって決定される場合のトランスフェクション効率（データは示さない）と類似する。ＴＲＡ−８は、ＤＲ４（白抜きのヒストグラム）またはコントロールベクター（点線のヒストグラム）のいずれでトランスフェクトされた細胞も有意には染色しなかった。このことは、ＴＲＡ−８が、細胞表面ＤＲ５に特異的であることを示す。
【０１８３】
腫瘍細胞におけるＤＲ５発現は、ｍＲＮＡレベルで広範に研究されているが（参考文献挿入）、ＤＲ５の表面発現は、文献で示されていない。従って、モノクローナル抗ＤＲ５抗体の利用可能性は、本発明者らがＤＲ５の表面レベルを試験し、そしてこの発現を、ＴＲＡＩＬにより媒介されるアポトーシスに対する細胞の感受性と相関付けるのを可能にする。以下の細胞（１×１０６）のパネルを、１０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したＴＲＡ−８と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、ＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でさらに３０分間染色する。１０，０００個の生存細胞を、ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅフローサイトメーターを使用して、以下の条件下で分析する：
励起波長：４８８ｎｍ；
検出波長：６００ｎｍ。
【０１８４】
試験した５種類の造血細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＥＭ−６細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、Ｈ−９細胞、およびＵ９３７細胞である。図２ａおよび２ａ’に示されるように、ＤＲ５発現は、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＥＭ−６細胞、Ｈ−９細胞、およびＵ９３７細胞の表面において検出可能であるが、Ｍｏｌｔ−４細胞においてはほとんど検出不可能である。高レベルのＤＲ５  ＲＮＡ発現が、以前に記載されたが（４３）、ＦＡＣｓ分析は、これらの細胞が、高レベルの表面ＤＲ５を発現しないことを示した。これらの結果は、ＤＲ５の細胞表面発現が、ＤＲ５の転写発現に相関しないことを示し、このことは、このようなレセプターについては予測されない。ＤＲ５の細胞表面発現のレベルは、細胞系統に特異的であり得る。なぜなら、造血起源の細胞の大部分は、低レベルのＤＲ５を発現したが、大部分の神経膠腫細胞および前立腺細胞は、高レベルのＤＲ５を発現したからである。
【０１８５】
ＴＲＡ−８モノクローナル抗体を使用して、その細胞表面発現を異なる型のヒト腫瘍細胞のパネルの間でＴＲＡＩＬによって媒介されるアポトーシスの誘導におけるＤＲ５の役割を、ならびに、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対するこれらの細胞の感受性を試験することによって、決定する。初代末梢血Ｔ細胞は、有意なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現せず、そしてＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスおよびＴＲＡ−８媒介アポトーシスの両方に耐性である（図２ａ、２ａ’、および３ａ’）。試験されたヒトＴ白血病細胞株の５つ全てが、検出可能ではあるが比較的低レベルの細胞表面ＤＲ５を発現したが、これらのうちの２つ（ＪｒｕｋａｔおよびＣＥＭ−６）は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して非常に感受性である。このことは、ＤＲ５は単独で、これらの細胞のアポトーシスを誘導するために十分であることを示す。Ｍｏｌｔ−４細胞およびＵ９３７細胞は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに部分的に感受性であるが、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスには比較的耐性であり、このことは、他のＴＲＡＩＬレセプターが、アポトーシスシグナルの伝達に関与し得ることを示唆する。Ｈ−９細胞は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に耐性であり、このことは、細胞内抗アポトーシス経路によって媒介されるブロックを示す。
【０１８６】
細胞のパネルは、以下を含んだ：ヒト悪性神経膠腫細胞株、Ｈｓ６８３、Ｕ２５１ＭＧ、Ｄ３７ＭＧ、Ｄ５４ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、ＣＨ２３５ＭＧ、Ｕ８７および正常ヒト星状細胞（これらは、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｌａｂａｍａのＹａｎｃｅｙ  Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ博士によって提供された）。ヒト前立腺癌細胞株、Ｄｕ１５４、ＰＣ３およびＬｎＣａｐは、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＰａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｌａｂａｍａのＷｉｌｌｉａｍ  Ｇｒｉｚｚｌｅ博士（彼は、これらの細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した）により提供された。ヒト白血病Ｔ細胞株、Ｂ細胞リンパ腫、ＨｅｐＧ２  Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＴＩＢ−１５２）およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ  ＣＥＭ−６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＣＬ−１１９）；単球細胞株、Ｕ９３７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＲＬ−２３６７）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。上記細胞株の全てを、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。ヒト星状細胞株（１３２１Ｎ１）は、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＰｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＡｌａｂａｍａのＲｉｃｈａｒｄ  Ｊｏｐｅ博士から親切にも提供され、そして５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１８７】
可溶性組換えヒトＴＲＡＩＬ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した）は、Ｎ末端でＦＬＡＦタグに融合したヒトＴＲＡＩＬの細胞外ドメイン（アミノ酸残基９５〜２８１）および８アミノ酸のリンカーペプチドから構成される融合タンパク質である。以前に報告されたＨｉｓタグＴＲＡＩＬとは異なり、ＴＲＡＩＬ単独のこの調製物は、Ｊｕｒｋａｔ細胞において強力なアポトーシス応答を誘導せず、そしてアポトーシスを増強するために、架橋剤として抗ＦＬＡＧ抗体を必要とする。抗ＦＬＡＧ抗体もまた、Ａｌｅｘｉｓから購入した。
【０１８８】
試験した１０のヒト悪性神経膠腫細胞の全てが、検出可能なレベルのＤＲ５を細胞表面において発現した。大部分が、図２ｂに示されるように、中間レベルから高レベルのＤＲ５を発現した。３つの株（Ｄ−５４ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧおよびＣＨ−２３５ＭＧ）は、高レベルのＤＲ５を発現し、一方で６つの株（Ｈｓ−６８３、Ｕ２５１−ＭＧ、Ｄ３７−ＭＧ、Ｕ８７、ＳＭＫ１および１３２１Ｎ１）は、中間レベルのＤＲ５を発現した。１つの細胞株（Ｈ−４６５）のみが、低レベルのＤＲ５を発現した。３つ全ての前立腺癌細胞株は、図２ｃに示されるように、高レベルのＤＲ５を発現した。
【０１８９】
正常初代Ｔ細胞と同様に、初代Ｂ細胞は、有意なレベルのＤＲ５を発現せず、そしてＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれかで処理した後にも、アポトーシスを起こさなかった（図２ｄ）。試験した４つのＢリンパ腫細胞株のうちの３つ（ＳＫＷ６．４、ＥＢ−３、およびＲａｊｉ）は、比較的高レベルのＤＲ５を発現した。そしてこれらは、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスとＴＲＡ−８媒介アポトーシスとの両方に対して、非常に感受性である。第四の細胞株（Ｄａｕｄｉ）は、非常に低レベルのＤＲ５を発現した。そしてこれらは、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスまたはＴＲＡ−８媒介アポトーシスのいずれに対しても、非常に感受性が低い。初代星状細胞は、検出可能なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現しなかったが（図２ｂ’）、試験した４つ全ての神経膠腫細胞株は、高レベルのＤＲ５を発現した。Ｔ細胞およびＢ細胞においてより高レベルの、神経膠腫細胞上でのＤＲ５の発現は、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスおよびＤＲ５媒介アポトーシスに対する有意により大きい感受性を伴わず、このことは、ＤＲ５の細胞表面発現のレベルが、必ずしも腫瘍細胞のアポトーシスのレベルに相関しないことを示唆する。ＤＲ４、ＤＲ５およびＤＣＲ２のメッセージレベルを決定するために実施したＲＴ−ＰＣＲは、試験した細胞すべてにおいてメッセージを検出した（表１）。しかし、一般に、初代正常細胞は、形質転換された腫瘍細胞と比較して、比較的低レベルのＤＲ５を発現した。
【０１９０】
【表１】
2005519871.tif 000002
【０１９１】
＊総ＲＮＡを、細胞から単離し、そして方法に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を、３％アガロースゲルにおいて分離し、そしてＦｌｕｏｒ−Ｓ  ＭＡＸ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）によって分析した。これらの値は、β−アクチンに対する比として与えられる。
【０１９２】
（実施例８．悪性細胞におけるインビトロでのアポトーシスの誘導）
ＴＲＡ−８が、インビトロで形質転換された細胞におけるアポトーシスを誘導するか否かを決定するために、ＤＲ５ポジティブ腫瘍細胞の全てを、ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬのいずれかによって誘導されるアポトーシスに対するそれらの感受性について試験する。
【０１９３】
標的細胞（１×１０３個／ウェル）を、指定濃度の可溶性ＴＲＡＩＬ＋架橋剤（Ａｌｅｘｉｓ）またはＴＲＡ−８の存在下で、９６ウェルプレート中、３７℃にて一晩培養する。細胞生存度を、以下の（１）〜（３）を使用して決定する：（１）製造業者の指示書に従うＡＴＰＬｉｔｅキット（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）；（２）ＭＴＴ細胞増殖／生存度キット（Ｓｉｇｍａ）；または（３）死細胞のＰＩ染色およびフローサイトメトリによる分析。培養の最後に、細胞を、１０μｇ／ｍｌのＰＩで染色し、そしてＰＩネガティブ細胞を、生存細胞として追出す（ｇａｔｅ）。肝細胞の凝縮核の分析のために、細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３５２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、そしてフローサイトメトリによって分析する。
【０１９４】
ＴＲＡ−８抗体は、多数の悪性ヒト神経膠腫細胞株（９／１０）において、３個の前立腺癌細胞株のうち２個の前立腺癌細胞株において、および４個のＤＲ５ポジティブ造血細胞株のうち２個の造血細胞株において、アポトーシスを誘導する能力を有する。ＴＲＡ−８抗体は、Ｍｏｌｔ−４細胞株（この細胞株は、ほとんど検出不可能な細胞表面レベルのＤＲ５を発現した）においてアポトーシスを誘導しなかった。しかし、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対するこの細胞の感受性レベルは、細胞株の間でかなり変動した。
【０１９５】
ＴＲＡ−８抗体誘導性アポトーシスに対するこの細胞の感受性の変動は、ＤＲ５の最小レベルの細胞表面発現が必要とされるが、このＤＲ５の細胞表面発現レベルは、必ずしも感受性の主要な決定因子ではなく他の因子がこのプロセスに影響を及ぼすことを示唆する。全ての神経膠腫細胞は、一般的に、造血細胞が発現するよりも有意に高レベルの表面ＤＲ５を発現したが、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対する神経膠腫細胞の感受性は、造血細胞と比較して、比例的に増加しない。ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する５種の神経膠腫細胞株（Ｄ−３７ＭＧ、Ｄ５４−ＭＧ、Ｕ３７３−ＭＧ、ＣＨ２３５−ＭＧおよび１３２１Ｎ１）の感受性は高く、かつ図３ｂに示されるように、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するそれらの感受性に等しい。これらの神経膠腫細胞株のうちの２種（Ｈ−４５６およびＳＭＫ１）は、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対してほとんど感受性ではない。Ｈ−４５６細胞の場合、ＤＲ５の表面発現は低いが、ＳＭＫ１上でのＤＲ５の表面発現は、より感受性の細胞株と類似している。このことは、他の機構が、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対する感受性を決定する際に役割を果たし得ることを示唆する。３種全ての前立腺癌細胞が、高レベルのＤＲ５を発現したが、図３ｃに示されるように、Ｄｕ１４５細胞は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して最も感受性であり、ＰＣ３細胞は、部分的に感受性であり、一方、ＬｎＣＡＰ細胞は、完全に耐性である。造血細胞の間で、図２ａに示されるように、ＪｕｒｋａｔおよびＣＥＭ−６は、ＴＲＡ−８アポトーシスに対して非常に感受性であることが見出されているが、これらの細胞株の両方が、低レベルのＤＲ５を発現することが見出されている。ＤＲ５は、Ｕ９３７細胞上で検出可能であるが、これらの細胞は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して耐性である。同様に、Ｈ−９細胞は、検出可能なレベルのＤＲ５を発現した。しかし、Ｈ−９細胞は、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対して耐性である。これらの結果は、ＤＲ５媒介アポトーシスに影響を及ぼす調節性機構の存在に関係している。
【０１９６】
さらなる表面結合抗ＤＲ５抗体を、実施例１〜３の手順によって生成する。２つのさらなる抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−１およびＴＲＡ−１０と命名する）を、ＴＲＡ−８とともに研究して、アポトーシスを誘導し、それによってアゴニストとして作用する相対的能力、または逆にＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスをブロックし、それによってアンタゴニストとして作用する相対的能力を決定する。ヒトＪｕｒｋａｔ細胞を標的として使用して、３種の抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−１、ＴＲＡ−８およびＴＲＡ−１０と表わす）のアゴニスト活性および／またはアンタゴニスト活性を決定する。図４に示されるように、２．５μｇ／ｍｌで一晩インキュベーションした際のＴＲＡ−１０、ＴＲＡ−１およびＴＲＡ−８のそれぞれについて、細胞生存度は、約９０％、７０％および２０％である。ＴＲＡ−８は、用量依存性様式で強いアポトーシス応答を誘導したが、ＴＲＡ−１は、中程度のアポトーシス応答のみを誘導し、そしてＴＲＡ−１０は、弱いアポトーシス応答のみを誘導した。従って、ＴＲＡ−８は、アゴニスト抗ＤＲ５抗体として分類される。図４において、ヒトＪｕｒｋａｔ細胞の生存度は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの用量依存性様式として示される。ＴＲＡ−１０は、低用量のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシス研究において、有意な程度までヒトＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスをブロックした。従って、ＴＲＡ−１０は、アンタゴニスト抗ＤＲ５抗体として分類される。
【０１９７】
ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する５種の神経膠腫細胞株（Ｄ−３７ＭＧ、Ｄ５４−ＭＧ、Ｕ３７３−ＭＧ、ＣＨ２３５−ＭＧおよび１３２１Ｎ１）の感受性は、図３ｂに示されるように、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対するそれらの感受性と等しい。このことは、これらの細胞におけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスが、主にＤＲ５を通して媒介されることを示している。さらに、２種の神経膠腫細胞株（Ｈｓ６８３およびＵ２５１−ＭＧ）は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して耐性であるが、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対しては部分的に感受性である。このことは、これらの細胞においてデコイレセプターが機能し、かつこのＴＲＡ−８誘導性抗体の使用がこの調節性機構を回避したことを示している。前立腺癌細胞株において、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対する感受性が変動するにもかかわらず、この感受性の変動は、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに対するこの細胞の感受性に類似している。このことはさらに、ＤＲ５が、前立腺細胞癌におけるＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの主要な役割を果たすことを示唆している。造血細胞の間で、ＪｕｒｋａｔおよびＣＥＭ−６は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスとＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの両方に対して非常に感受性であることが見出されている。ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスのレベルは、図２ａおよび図３ａ’に示されるように、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスのレベルに匹敵する。神経膠腫細胞株のうちの１種（Ｕ８７）および造血細胞株のうち２種（Ｕ９３７およびＭｏｌｔ−４）のみが、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対する感受性を示した。しかし、これらは、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してそれほど感受性でも耐性でもない。１種の細胞株（Ｈ−９細胞株）は、検出可能なレベルのＤＲ５を発現した。しかし、これは、ＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対してもＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに対しても耐性である。最小レベルのＤＲ５発現が、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスのために必要とされるが、このＤＲ５の発現レベルは、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対するこの細胞の感受性を必ずしも予測しない；デコイレセプターは、数種の細胞におけるＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを調節する際に役割を果たすが、今日まで試験した細胞のほとんどにおいて主要な役割を果たすというわけではないようであり；予測されるように、ＴＲＡ−８抗体は、このデコイレセプターの影響を回避し；ＤＲ５レセプターの機能的変異は、形質転換された細胞において生じ得；そして、最終的に、細胞内調節性機構が、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスおよびＤＲ５媒介アポトーシスに対するこれらの細胞の感受性を規定する際に、このデコイレセプターと同程度に重要になり得るか、またはより重要であり得る。
【０１９８】
以前の研究は、ＤＲ５に対するｍＲＮＡが、正常組織において広範に分布されていることを示している７。タンパク質レベルでのＤＲ５の発現を評価するために、正常ヒト組織ホモジネートのパネル（Ｇｅｎｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、ウエスタンブロット分析において、ＴＲＡ−８抗体を用いてプローブする。９種の正常ヒト組織の間で、脳組織は、弱い陽性である（図５ａ、レーン２）。ＤＲ５タンパク質は、肝臓（レーン１）、肺（レーン３）、腎臓（レーン４）、脾臓（レーン５）、精巣（レーン６）、卵巣（レーン７）、心臓（レーン８）または膵臓（レーン９）におけるＴＲＡ−８反応によって検出することができない。対照的に、１３種全てのヒト癌組織（（卵巣癌（レーン１）、肺癌（レーン２）、肝臓癌（レーン３）、直腸癌（レーン４）、頸部癌（レーン５）、皮膚癌（レーン６）、精巣癌（レーン７）、甲状腺癌（レーン８）、子宮癌（レーン１０）、胃癌（レーン１１）、咽頭喉頭部癌（レーン１２）、および膵臓癌（レーン１３）を含む）を、ＴＲＡ−８でポジティブに染色した（図５ｂ）。さらに、ＴＲＡ−８での正常組織および癌組織のインサイチュ免疫組織化学は、脾臓においてわずかに散乱するポジティブ細胞を除いて、正常胸部組織、正常肺組織および正常脾臓組織におけるＤＲ５発現は、検出することができないことを証明した（図５ｃ）。対応する癌組織（胸部浸潤性腺管癌（ｂｒｅａｓｔ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、小細胞肺癌、およびリンパ腫を含む）は、ＴＲＡ−８とポジティブに反応した（図５ｄ）。試験した総数２２種の癌組織の間で、６個の胸部癌のうち５個の胸部癌、２個の頸部癌のうち２個の頸部癌、５個の肝臓癌のうち４個の肝臓癌、８個のリンパ腫のうち５個のリンパ腫、２個の肺癌のうち２個の肺癌、および２個の前立腺癌のうち２個の前立腺癌が、ＴＲＡ−８とポジティブに反応した。これらの結果は、フローサイトメトリ分析の結果と一致しており、このことは、癌性組織が、正常組織が発現するよりも高レベルのＤＲ５タンパク質を発現することを示している。
【０１９９】
（実施例９．インビボでのＴＲＡ−８の殺腫瘍性活性）
種々の理由により、インビトロ研究で見込みを示す多数の薬剤は、インビボで有効性を示さない。従って、インビボ動物モデルにおけるＴＲＡ−８の有効性を試験することが、重要である。このことを達成するために、ＴＲＡ−８抗ヒトＤＲ５抗体を、ヒトＤＲ５分子を発現するヒト異種移植片保有マウスに投与する。使用したマウスは、６〜８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）であり、このマウスに、ヒト星状細胞腫１３２１Ｎ１細胞（ｌ×１０７個）を皮下接種するか、またはヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞（１×１０６個）を静脈内接種する。腫瘍の接種から２日後、マウスにＴＲＡ−８（１００μｇ）を静脈内接種する。ＴＲＡ−８での処置から５日後、１３２１Ｎ１腫瘍増殖を、その腫瘍塊の大きさおよび重量によって決定する。Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖を、脾臓の重量、および接種した動物の脾臓におけるヒトＣＤ３ポジティブＪｕｒｋａｔ細胞の割合によって決定する。腫瘍組織の生検を採取し、そして組織学的に試験する。
【０２００】
腫瘍接種から１日後における、１００μｇのＴＲＡ−８の単回静脈内用量での初期処置は、１３２１Ｎ１細胞が、（図６ａ）の固形腫瘍を形成するのを完全に阻害した。腫瘍接種から１週間後における、１００μｇのＴＲＡ−８の３回用量での後期の処置は、腫瘍重量を４倍以上減少させた（図６ｂ）。腫瘍形成は、初期の時点では、ＴＲＡ−８で処置した動物において可視ではない（図６ｃ、上パネル）。組織学的分析は、ＴＲＡ−８で処置した動物における腫瘍組織の劇的な縮退を示した（図６ｃ、下パネル）。同様に、ＴＲＡ−８処置は、脾臓におけるＣＤ３ポジティブＪｕｒｋａｔ細胞の欠乏によって示されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞による脾臓の集合を阻害した（図６ｄ、図６ｅ）。移植された腫瘍の組織学的分析は、わずかな腫瘍細胞が、ＴＲＡ−８で処置された動物の軟組織において散乱されたことを示す。しかし、コントロールは、図６ｃに示されるような固形腫瘍の形成を示した。Ｊｕｒｋａｔ細胞モデルにおいて、ＴＲＡ−８で処置された動物の脾臓におけるＪｕｒｋａｔ細胞の数は、図６ａに示されるようなフローサイトメトリ分析および図６ｃのインサイチュＣＤ３染色によって示されるコントロール動物の脾臓でのほぼ１０％と比較して、２％未満である。
【０２０１】
これらの結果は、架橋した組換えＴＲＡＩＬの全身性投与がインビボでの腫瘍増殖を阻害するという近年の実証を確証している（１３）。これらの結果は、ＴＲＡ−８の単回用量が、インビボでの腫瘍細胞の除去においてかなり効果的であることを示している。
【０２０２】
抗ヒト抗体をマウスモデルにおいて使用する場合、ＴＲＡ−８処置の毒性を評価することができなかった。しかし、インビボでのＴＲＡＩＬの投与の研究は、有意な毒性がこの処置に関連しないことを示している（１３）。
【０２０３】
（実施例１０．ＲＡ滑膜細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して感受性である）
ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスの先行技術研究のほとんどは、悪性細胞に焦点を当てていた。本発明に従うＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスはまた、自己免疫状態および炎症性状態（例えば、ＲＡ）の治療法である。
【０２０４】
（１０．１．ＲＡ滑膜細胞における細胞表面ＤＲ５の発現のフローサイトメトリ分析）
ＲＡを有する患者由来の８種の初代培養滑膜細胞のパネル上でのＤＲ５の発現を、変形性関節症（本明細書中以後「ＯＡ」と呼ぶ）を有する患者由来の８種の初代培養滑膜細胞上でのＤＲ５の発現と比較する。これら８種のヒト初代ＲＡ滑膜細胞培養物（ＲＡ−１０１４、ＲＡ−１０１６、ＲＡ−１０２１、ＲＡ−５１２、ＲＡ−７０７、ＲＡ−８１１、ＲＡ−７１６、およびＲＡ−９２９）は、Ｄｒ．Ｍ．Ｏｈｔｓｕｋｉ（Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって快適に提供されており、１０％  ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養される。これら７種のＯＡ滑膜細胞の初代細胞培養物を、標準的なコラゲナーゼ方法によってＯＡ患者の滑膜組織から単離し、そして同じ条件下で培養する。全ての初代細胞の継代数は、１０より下である。ＤＲ５の発現を、実施例５に記載されるようなＦＡＣＳ分析によって決定する。
【０２０５】
ＲＡ細胞の初代培養物の全てが、高レベルの表面ＤＲ５を発現し、図７ａに示されるように、異なる患者から単離されたこれらの滑膜細胞の間では、発現レベルがほとんど変化しない。対照的に、ＯＡ患者から単離された滑膜細胞表面上での表面ＤＲ５の発現は、図７ｂのとおり、非常に低いかまたは検出することができない。ＳＶ４０形質転換滑膜細胞は、ＲＡ細胞によって示されるＤＲ５の発現レベルに匹敵する、高レベルのＤＲ５を発現することが見出されている。対照的に、非形質転換繊維芽細胞は、図７ｂにおいてＯＡ細胞によって示されるＤＲ５のレベルに匹敵する、低レベルのＤＲ５を発現した。
【０２０６】
（１０．２．ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬによって媒介されるアポトーシスに対するＲＡ滑膜細胞の感受性）
一般に、図８ａ、図８ｂのとおり、ＲＡ患者から単離された全ての滑膜細胞は、ＴＲＡＩＬ抗体および抗ＤＲ５抗体によって誘導されるアポトーシスに対して感受性であり、かつ全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡＩＬ抗体および抗ＤＲ５抗体によって誘導されるアポトーシスに対して耐性である。これらの研究は、ＴＲＡ−８抗体が、正常細胞に優先して変更された細胞を標的することを示している。さらに、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに対する感受性または耐性のパターンは、抗ＤＲ５抗体によって誘導されるアポトーシスに対する感受性または耐性のパターンと相関する。このことは、滑膜細胞がＤＲ５を主に利用して、ＴＲＡＩＬアポトーシスを誘発することを示している。
【０２０７】
悪性細胞に関して記載されるように、ＴＲＡＩＬ抗体または抗ＤＲ５抗体によって誘導されるアポトーシスに対する感受性は、ＲＡ滑膜細胞の間で変更された。しかし、ＤＲ５．ＲＡ−５１２とＲＡ−７０７との類似の発現レベルは、２０ｎｇ／ｍｌより低いＴＲＡＩＬ濃度またはＴＲＡ−８濃度によって、８０％を超える細胞が殺傷される場合に、最も感受性である。ＲＡ−１０１４、ＲＡ−８１１、ＲＡ−７１６、およびＲＡ９２９は、これらの間で、ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８に対して中間の感受性を有し、ほぼ１００％の細胞死が、高濃度（＞５０ｎｇ／ｍｌ）のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下で起こる。ＲＡ−１０１６細胞およびＲＡ１０２１細胞において、多数の（６０％を超える）細胞が、低用量のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８によって殺傷される。しかし、細胞の一部は、高濃度のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下で生存した。このことは、細胞の亜集団が、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスに対して耐性であることを示している。対照的に、全てのＯＡ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してほとんど感受性ではない。６０％ほどの細胞が、高濃度のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８の存在下でさえも、ＯＡ５２ＦおよびＯＡ６９Ｆにおいて殺傷される。ＯＡ７２Ｍ細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対してもＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対しても完全に耐性である。ＳＶ４０形質転換滑膜細胞もまた、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスおよびＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して感受性である（データは示さず）。対照的に、非形質転換繊維芽細胞は、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８に対して耐性であるようである。
【０２０８】
ＤＲ５は、ＦＡＤＤ／カスパーゼ８依存性経路を使用して、アポトーシスを誘発することがこれまでに示されている（４４）。ＲＡ滑膜細胞におけるＤＲ５媒介アポトーシスのカスパーゼ依存性を決定するために、ＲＡ細胞を、ＴＲＡＩＬ抗体または抗ＤＲ５抗体とともに、特定のカスパーゼインヒビターの存在下で培養する。試験した８種のカスパーゼインヒビターの間で、カスパーゼ６インヒビター、カスパーゼ８インヒビターおよびカスパーゼ１０インヒビターが、図９に示されるように、ＴＲＡＩＬとＤＲ５との両方によって誘導されるＲＡ滑膜細胞のアポトーシスを阻害し得る。このことは、これら３種のカスパーゼが、ＤＲ５媒介アポトーシスに関与することを示している。
【０２０９】
（１０．３  ＴＲＡ−８またはＴＲＡＩＬは、ＭＭＰの放出の増加を伴うことなしにＲＡ滑膜細胞におけるＮＦ−κｂ活性化を誘導する）
アポトーシスのシグナル伝達と増殖のシグナル伝達との間に緊密な関連が存在するという概念を支持する、多くの証拠が存在する（４５）。ＤＲ５が、アポトーシスシグナル伝達に加え、ＮＦ−κｂ経路を活性化し得、そして、ＮＦ−κｂ活性化によって、抗アポトーシスシグナルが伝達され得ることを確立した。従って、ゲルシフトアッセイが行われる。指定された時間の間で、１ｍｇ／ｍｌエンハンサーの存在下で、５０ｎｇ／ｍｌの組換え可溶型ＴＲＡＩＬであるＦａｓリガンドで、または５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８で、細胞を刺激する。この核抽出物を、調製し、二重染色［３２Ｐ］標識オリゴＤＮＡプローブとともにインキュベートした。これらの結果を、サイクロンホスファイメージャー（ｃｙｃｌｏｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａ−ｉｍａｇｅｒ）（ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＣＴ）を使用して分析する。ＲＡ滑膜細胞を、ＴＮＦ−αまたはＴＲＡＩＬとインキュベートした後に、ＮＦ−κｂを、時間依存的様式で活性化させた。このＴＲＡ−８抗体は、ＮＦ−κｂを強力に活性化し得る。対照的に、Ｆａｓリガンドは、図１０ａが示すように、ＮＦ−κｂ活性化を誘導し得ない。
【０２１０】
従って、ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８抗体は、ＲＡ滑膜細胞において強力なアポトーシス応答を誘導するが、これらはまた、ＮＦ−κｂを活性化し、そして、ＮＦ−κｂ活性化は、ＲＡにおけるＴＮＦ−αの炎症前の役割に寄与していると考えられている。従って、ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ−αのように、炎症前のサイトカインとしての役割を担い得る可能性がある。ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦ−αによって誘導されるＮＦ−κｂ活性化の類似の生物学的な結果が存在するか否かを決定するために、ＭＭＰの産生を、ＥＬＩＳＡによって決定する。滑膜細胞を、培地単独の中で、あるいは、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキンｌｂ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬ、または５０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８とともに、一晩培養する。培養物上清中のＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３のレベルを、ＥＬＩＳＡキットによって決定付ける。
【０２１１】
ＲＡ滑膜細胞を、炎症前サイトカイン、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１ｂとともにインキュベートすると、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３の産生が図１０ｂ、図１０ｃにおいて示されるように、培地コントロールと比較して増加される。対照的に、ＴＲＡＩＬまたは抗ＤＲ５抗体を用いた処理は、これらのＭＭＰの増加した放出と関連していない。
【０２１２】
（実施例１１Ａ  肝細胞毒性を誘導し得ない）
２４時間の細胞生存アッセイの間で、９６ウェルプレートにおける新たな正常ヒト肝細胞を、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から購入した。これらの肝細胞を、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（可溶性のＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれかの１μｇ／ｍｌを含む）中で培養する。６時間の生存アッセイの間に、正常肝細胞または肝細胞癌細胞を、ＵＡＢ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒから収集した新鮮な外科生検材料から単離する。ヒト肝臓の単離のための全ての試薬（肝細胞灌流緩衝液、消化培地、洗浄培地、および付着培地）を、Ｇｉｂｃｏから購入した。これらの組織スライドを、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ中で３７℃にて、振とう（５０ｒｐｍ）しながら、１時間、消化した。これらの単離した肝細胞を、低速遠心分離（５０ｇ，３分間）によって回収し、そして、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍで６回、洗浄した。肝細胞の単一の細胞懸濁物を、９６ウェルＭａｔｒｉｇｅｌプレート（ＢＤ）中のＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ＦＣＳを含む）の中で、６時間培養した。接着していない肝細胞は、予め温めた接着培地（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いて２回洗浄することによって、取り除いた。接着した肝細胞をさらに、６時間に亘って、架橋剤、またはＴＲＡ−８もしくはＣＨ１１の存在下で、種々の濃度のＴＲＡＩＬまたはＦａｓＬとともにインキュベートする。
【０２１３】
ＴＲＡＩＬは、アポトーシスを誘導し得る少なくとも２つのレセプター（ＤＲ４およびＤＲ５）を有する。ＤＲ５単独の架橋が、正常な肝細胞のアポトーシスを誘導するのに十分であるか否かを決定するために、ＴＲＡ−８を使用する。タンパク質レベルでのＤＲ５発現を、ＴＲＡ−８を使用するインサイチュ免疫組織化学法によって５つの正常なヒト肝臓組織、および５つの肝臓癌組織において最初に調べる。正常な肝臓組織に由来する切片は、ＤＲ５について、ＴＲＡ−８との陽性反応性の非存在（図１ｌａ，左下パネル）下で、Ｈ＆Ｅ染色（図１ｌａ，左上パネル）において正常な構造および細胞形態学的状態を示した。対照的に、ヒト肝細胞癌組織は、癌細胞におけるＤＲ５の細胞膜での存在および細胞質での存在の両方と一致するパターンで、ＴＲＡ−８と陽性反応した。ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２は、また、ＤＲ５に関して陽性である。これらの結果は、５個の正常な肝臓組織の間で一貫したものであり、そして、５つの肝臓癌組織に由来するもののうち唯ひとつ（肝腺癌）が、ＤＲ５−陰性であった。これらの結果は、図５ａにおいて示される、ウェスタンブロットと一致し、他の組織を用いたときのように、正常ヒト肝臓組織は、有意なレベルのＤＲ５タンパク質を発現しない。さらに、ＴＲＡ−８でプローブした、単離した正常なヒト肝臓細胞のウェスタンブロット分析によって、検出可能なレベルのＤＲ５は示されない。
【０２１４】
フローサイトメトリー分析による、ヒト肝細胞におけるＤＲ５の細胞表面発現は、新たに調製された正常な肝細胞は検出可能なレベルの細胞表面ＤＲ５を発現しなかったことを実証した（図１１ｂ，左上パネル）。これは、凍結保存された正常ヒト肝細胞においても短期間培養された正常ヒト肝細胞においても、検出されない。対照的に、新たに単離された肝細胞性癌腫細胞ならびにＨｅｐＧ２細胞は、細胞表面ＤＲ５を発現する。比較としてＦａｓを使用すると、正常肝細胞、肝細胞癌腫細胞、およびＨｅｐＧ２細胞の全ては、等しいレベルのＦａｓを発現していた（図１ｌｂ，下パネル）。これらの結果は、インサイチュ免疫組織化学法およびウェスタンブロットを使用して得られた結果と一致しており、これは、細胞表面ＤＲ５が、癌腫細胞において高度に発現されるが、正常な肝細胞においては発現されないことを示している。ＲＴ−ＰＣＲ２３によって実証されるように、ヒト肝細胞におけるＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に関するｍＲＮＡレベルの存在によって、ヒト肝細胞が、ＴＲＡ−８による検出のための閾値未満の非常に低いレベルのＤＲ５タンパク質を発現し得ることが示唆される。
【０２１５】
ＴＲＡ−８が肝細胞毒性を誘導するか否かを決定するために、ＴＲＡ−８によってかまたは、可溶性ＴＲＡＩＬ＋架橋剤によって誘導されるアポトーシスに対する正常ヒト肝細胞の感受性を調べる。正常な肝細胞を高濃度のＴＲＡＩＬの存在下で培養し、細胞生存度の経時的減少が、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイ（図１２ａ）およびＭＴＴアッセイによって観察される。正常肝細胞のＴＲＡＩＬ媒介性細胞死は、ＴＲＡＩＬ添加後４時間程度の速さで、観察され得る。２４時間培養の終わりに、そのうち８０％を超える肝細胞が、ＴＲＡＩＬによって殺傷される。対照的に、同じ培養期間の間に、ＴＲＡ−８は、正常肝細胞において有意な細胞死を誘導しなかった。Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された凝集した核（これはアポトーシスの特徴である）は、ＴＲＡＩＬ処理肝細胞においては増大するが、ＴＲＡ−８処理肝細胞においては増大しない（図１２ｂ）。アポトーシス性肝細胞の数は、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定付けられるように、細胞生存度の減少に十分に相関し、このことは、肝細胞のＴＲＡＩＬ誘導性細胞死がアポトーシスによって媒介されていることを示唆している。これは、肝細胞におけるＴＲＡＩＬ媒介性毒性を阻害するＺ−ＶＡＤの能力によって確認される。シクロヘキシミドは、強力なアポトーシスエンハンサーであるので、ＴＲＡＩＬ処理肝細胞およびＴＲＡ−８処理肝細胞における、その化合物の効果を調べる。４時間培養の間に、シクロヘキシミドは、ＴＲＡＩＬによって誘導される肝細胞の細胞死を有意に増強し、その結果、７０％を超える肝細胞が、シクロヘキシミドの存在下で、ＴＲＡＩＬによって殺傷される（図１２ｃ）。しかし、シクロヘキシミド処理は、肝細胞におけるＴＲＡ８媒介性細胞死を増強し得ない。肝細胞中のＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスの特徴と、肝細胞中のＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスの特徴とを比較するために、正常肝細胞ならびに癌細胞を、架橋剤またはＴＲＡ−８と共に種々の濃度の可溶性ＴＲＡＩＬとインキュベートする。６時間の培養期間にわたって、ＴＲＡＩＬは、正常肝細胞において中程度のアポトーシス応答を誘導した。２０％を超える肝細胞が、５００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬの存在下で、殺傷される（図１２ｄ，上左）。正常肝細胞のＴＲＡ−８処置は、同一時間に亘たる有意な細胞死を誘導しなかった。正常な肝細胞とは対照的に、初代の肝細胞癌腫細胞（図１２ｄ，上中）およびＨｅｐＧ２細胞（図１２ｄ，上右）は、ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８のいずれかによって媒介されるアポトーシスに対して高感受性である。８０％を超える肝細胞癌腫細胞および殆ど１００％のＨｅｐＧ２細胞は、８時間の培養期間の間で殺傷される。これらの結果は、正常肝細胞は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対して完全に耐性であり、肝癌細胞よりも、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対してずっと低感受性であることを示す。Ｆａｓリガンドおよび抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）を使用すると、正常な肝細胞、肝細胞癌細胞、およびＨｅｐＧ２細胞の間で、Ｆａｓ媒介性アポトーシスに対する感受性の有意な差異は存在しない（図１２ｄ，下のパネル）。
【０２１６】
（比較実施例１１Ｂ．  インビボ肝炎におけるヒト膜結合ＴＲＡＩＬ誘導）
８〜１０週齢の雌性Ｂ６マウスに、１０９ｐｆｕのＡｄ／ｈＴＲＡＩＬと、同じ数のＡｄ／Ｔｅｔ−ｏｎとを、静脈内注射する。マウスに、アデノウイルスベクターの接種の後すぐに、飲料水中に様々な濃度のテトラサイクリンを供給する。肝臓の損傷は、ＡＳＴ診断キット（Ｓｉｇｍａ）を使用してＡＳＴの血清レベルによって決定する。ＴＲＡＩＬの発現を、ノーザンブロット分析によって決定する。
【０２１７】
膜結合形態のＴＲＡＩＬがインビボでの肝臓損傷を誘導するか否かということを決定するために、全長ヒトＴＲＡＩＬ（Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬ）をコードする組換えアデノウイルスベクターを、構築し、これらの発現を、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下におく。Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬをＢ６マウスに静脈内で接種した２４時間後に、ヒトＴＲＡＩＬのテトラサイクリン誘導性発現が、ノーザンブロット分析によって実証されるように用量依存様式で肝臓において観測される（図１３ａ）。ＴＲＡＩＬの発現レベルは、トランスアミナーゼの血清レベルにおけるテトラサイクリン依存性増加、重ねて、用量依存的様式（図１３ｂ）の増加によって示されるように、肝臓損傷と十分に相関した。アデノウイルスベクター自体を用いた接種によって、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する肝細胞の感受性を増大し得るので、Ａｄ／ＴＲＡＩＬを接種したマウスに由来する肝細胞を、単離して、そして、ＴＲＡＩＬ媒介性細胞死について試験する。コントロールマウスに由来する肝細胞と比較して、Ａｄ／ＴＲＡＩＬに感染した肝細胞の細胞死の有意な増加は存在しない（図１３ｃ，左パネル）。さらに、Ａｄ／ＴＲＡＩＬ接種したマウスは、可溶性ヒトＴＲＡＩＬの静脈内注射の後の肝臓損傷の増加を提示しなかった。従って、Ａｄ／ＴＲＡＩＬによって誘導される肝炎は、その膜形態の、高レベルのＴＲＡＩＬ発現によって媒介されるということである。肝臓切片の組織学的分析によって、肝細胞に対する損傷は、ベクター接種後２４時間ほどの早さで明らかとなり（図１３ｄ）、少なくとも７日間持続することが明らかとなった（図１３ｅ）。肝臓におけるこれらの病理学的変化はまた、テトラサイクリン依存的であって、用量依存的様式で発生する。ＴＲＡＩＬ誘導性肝臓損傷の、初期（すなわち、処置の２４時間以内）は、壊死の病巣によって特徴付けられる。炎症細胞の浸潤は、この段階では観察されないが、出血は生じていた。接種後の第７日目までに、散在性の肝臓損傷が、明らかであり、顕著な小葉の配置の乱れ（ｌｏｂｕｌａｒ  ｄｉｓａｒｒａｙ）、不規則な集塊となる細胞質および大きな明確な間隙を伴う肝細胞の重篤な変性ならびに顕著なアポトーシスおよび壊死を伴う。単核細胞の広範な浸潤は、この段階で特徴な特性である。これらの結果は、膜結合形態におけるヒトＴＲＡＩＬがインビボにおいて肝臓損傷を誘導し得ることを示している。マウスにおいて、重篤な肝炎を引き起こすヒトＴＲＡＩｌの傾向に関わらず、これは、致死性の応答を誘導しなかった。対照的に、Ｆａｓリガンドをコードする類似のテトラサイクリン制御ベクターを接種されたマウスが、接種の７２時間以内において、テトラサイクリン用量依存性様式の、重篤な出血および死亡を付随する肝細胞における多量のアポトーシスおよび壊死を伴う劇症性の肝臓炎を発症した。３ｍｇ／ｍｌ以上のテトラサイクリンを受けたこれらのサブグループにおいては、致死率は４８時間以内で１００％に達した。対照的に、Ａｄ／ｈＴＲＡＩＬを受けたマウスの全ては、テトラサイクリンの用量に関わらず、接種後４週間でも生存する。従って、インビボで、膜結合形態のＴＲＡＩＬは、Ｆａｓリガンドよりも強力でない、肝細胞損傷���誘導因子といえる。これらは、ＴＲＡＩＬが、Ｆａｓリガンド毒性に潜む機構とは異なる機構を介して肝臓損傷を誘導し得ることをさらに、示唆する。
【０２１８】
（実施例１２  活性化されたヒトＴ細胞およびＢ細胞は、増大したレベルのＤＲ５を発現する）
ＤＲ５が、活性化したＴ細胞およびＢ細胞のＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスにおける役割を担うか否かを決定するために、休止したＴ細胞およびＢ細胞ならびに活性化したＴ細胞およびＢ細胞におけるＤＲ５の表面での発現を、ＴＲＡ−８を使用して調べた。ＰＢＭＣにおけるこの刺激を受けないヒトＴ細胞は、顕著なレベルのＤＲ５を発現しなかった（図１４）。抗ＣＤ３またはＣｏｎ−Ａ刺激のいずれかの４８時間後で、細胞表面ＤＲ５発現が、有意に増加する。同様に、刺激を受けていないＢ細胞は、非常に低いレベルのＤＲ５を発現した。ＬＰＳでなく抗μの刺激によって、ＤＲ５の増大した細胞表面発現を生じた。これらの結果は、活性化したＴ細胞およびＢ細胞の両方が、高レベルの細胞表面ＤＲ５を発現することを示す。細胞を、２０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８およびＰＥ抗マウスＩｇＧ１で染色する。
【０２１９】
（実施例１３．活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに感受性となる）
活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞がＴＲＡ−８媒介アポトーシスに感受性であるか否かを決定するために、ヒトＰＢＭＣのＴ細胞およびＢ細胞を、それぞれ、抗ＣＤ３または抗μを用いて、インビトロで４８時間刺激する。生存細胞および増殖芽細胞を勾配遠心分離によって回収し、そして種々の濃度のＴＲＡ−８と共にインキュベートする。未刺激のＴ細胞よびＢ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに感受性でない（図１５）。総刺激Ｔ細胞およびＢ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対する中程度増加した感受性を示し、２０％の細胞が、一晩の培養後にＴＲＡ−８によって殺傷された。高度に増殖性の芽Ｔ細胞は、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスに対してより感受性でありさえする。７０％より多くの芽Ｔ細胞が、一晩の培養後にＴＲＡ−８によって殺傷され得る。芽Ｂ細胞はまた、他と比較して、ＴＲＡ−８媒介アポトーシスにより感受性である。これらの結果は、活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞が、ＤＲ５媒介アポトーシスに感受性であることを示す。
【０２２０】
（実施例１４．ＴＲＡ−８は、ヒト／ＳＣＩＤマウスにおいて活性化Ｔ細胞を枯渇させる）
ＴＲＡ−８のインビボ抗Ｔ細胞効果を決定するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、１×１０８ヒトＰＢＭＣを静脈内注射する。通常は、ＳＣＩＤマウスにおいて、ヒトＴ細胞は、異種刺激に応答してすばやく活性化される。ヒトＰＢＭＣ／ＳＣＩＤマウスに、移植の日から１００μｇのＴＲＡ−８またはコントロールＩｇＧ１を腹腔内注射し、３日間毎日繰り返す。移植の５日後、単核細胞を脾臓から単離し、そして抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、そしてリンパ球集団を、フローサイトメトリーにかけ、そしてＣＤ３ポジティブのヒトＴ細胞を分析する。コントロール処理マウスにおける抗ヒトＣＤ３染色によって決定されるように、脾臓リンパ球の約３０％はヒトＴ細胞である。しかし、わずかなヒトＴ細胞のみ（３％未満）が、ＴＲＡ−８処理マウス中の脾臓リンパ球から得られる（図１６）。インサイチュ組織学的研究は、コントロールマウスの脾臓において、ヒトＴ細胞は、脾臓で再増殖され、わずかなアポトーシス細胞が、ＴＵＮＥＬ染色によって実証されるように観察されるのみであることを明らかにした。対照的に、生存ヒトＴ細胞との再増殖は、ＴＲＡ−８処理マウスの脾臓において観察されず、むしろ、多くのアポトーシス細胞が観察される（図１７）。これらの結果は、ＴＲＡ−８が、インビボで抗Ｔ細胞活性を有することを実証しており、ＧＶＨ疾患の処置についての本発明の抗体の有用性を示している。
【０２２１】
（実施例１５．ＴＲＡ−８の抗癌治療活性）
（１５．１  ヒト癌組織およびヒト癌細胞株におけるＤＲ５の発現および機能）
ｉ）ＴＲＡ−８でのインサイチュ染色によるヒト癌組織におけるＤＲ５発現。
【０２２２】
癌細胞および癌組織が、より高いレベルのＤＲ５を差次的に発現するか否かを決定するために、２０個を超える乳癌、６個の卵巣癌、５個の結腸癌および５個の前立腺癌を含むヒト癌組織のパネルを、免疫組織化学のためにＴＲＡ−８で染色する。これらの癌組織の大部分は、検出可能なＤＲ５を発現した。これらの癌組織におけるＤＲ５の発現レベルは、変化した。一般的に、癌組織は、無関係の組織よりも高いレベルのＤＲ５を発現した。さらに、ＤＲ５発現は、ｐ５３の変異と明らかに相関しない。
【０２２３】
ｉｉ）ヒト癌細胞株におけるＤＲ５の発現および機能（表２）
９個のヒト乳癌細胞株、３個の卵巣癌株、３個の結腸癌株および３個の前立腺癌株を、ＤＲ５の細胞表面発現およびインビトロでのＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する感受性について試験する。９個のうち７個の乳癌株、３個のうち３個の卵巣癌株、３個のうち３個の結腸癌株および３個のうち３個の前立腺癌株が、可変レベルの細胞表面ＤＲ５を発現した。９個の乳癌細胞株のうち３個が、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対して非常に感受性であり、３個が中程度に感受性であり、そして３個が耐性である。３個全ての卵巣癌株は、非常に感受性である。３個の結腸癌株のうち１個が、非常に感受性であり、一方、２個は、中程度の感受性を有する。３個の前立腺癌株のうち２個が、中程度の感受性を有し、そして１個が、耐性である。
【０２２４】
（表２．ヒト癌細胞におけるＤＲ５の発現および機能）
【０２２５】
【表２−１】
2005519871.tif 000003
【０２２６】
【表２−２】
2005519871.tif 000004
【０２２７】
注釈：１  フローサイトメトリーにより決定され、細胞を、２０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８で染色し、そしてコントロール抗体と比較する。２  ＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定した。＋＋＋＋：８０％を超える死滅、＋＋＋：６０〜８０％の死滅：＋＋：４０〜６０％の死滅、＋：２０〜４０％の死滅、−：死滅なし。
【０２２８】
ｉｉｉ）アドリアマイシンとのＴＲＡ−８の組合せた細胞傷害性
いくつかの乳癌株において、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するアドリアマイシンの効果を試験する。高用量のアドリアマイシンは、付加的な効果を示した。しかし、ＴＲＡ−８耐性株のいくつかにおいて、低用量のアドリアマイシンは、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスを相乗的に増加した。
【０２２９】
ｉｖ）ヒト癌細胞に対するＴＲＡ−８のインビトロおよびインビボの結合活性
放射性同位体で標識したＴＲＡ−８を使用する。乳癌株に対するＴＲＡ−８の結合活性を、腫瘍を移植されたＳＣＩＤマウスにおいて、インビトロおよびインビボで試験する。癌細胞に対するインビトロ結合活性を、３ｎＭのＫｄ値として推定し、この値は、ＥＬＩＳＡを使用した以前の推定と一致し、そして可溶性ＴＲＡＩＬよりも少なくとも５０倍大きい。インビボにおいて、ＴＲＡ−８は、移植された腫瘍組織に局在した。
【０２３０】
（１５．２  ＴＲＡ−８を用いるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける慢性リンパ性白血病の治療）
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂ細胞悪性腫瘍の一般的な形態である。ＣＬＬにおけるほとんどの悪性Ｂ細胞が、成熟表現型を有し、そして多くのアポトーシス刺激に対して耐性である。ＣＬＬを有する５人の患者のＢ細胞におけるＤＲ５の発現および機能を試験する。全ての患者は、ＰＢＭＣにおいて、９５％より多いＣＤ１９＋Ｂ細胞により示されるように、多くの末梢Ｂ細胞を有していた。正常な一次Ｂ細胞と比較して、全ての患者のＣＬＬ  Ｂ細胞は、より高いレベルの細胞表面ＤＲ５を有し、インビトロにおけるＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してより感受性である。興味深いことに、このＣＬＬ  Ｂ細胞はまた、ビスインドールマレイミドＶＩＩＩ（Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ）誘導性細胞傷害性に対して感受性である。ＴＲＡ−８およびＢｉｓＶＩＩＩでの併用処置の後に、ＣＬＬ  Ｂ細胞の５０％近くが死滅し、一方、正常なＢ細胞は、非応答性のままである（図１８）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのＣＬＬ  Ｂ細胞の移植により、移植の５日後におけるレシピエントマウスの脾臓においてＣＤ１９＋Ｂ細胞の約２５％〜３０％の再増殖が生じた。しかし、３用量の１００μｇのＴＲＡ−８処置は、レシピエントＳＣＩＤマウスの脾臓における５の患者（ｐａｔｉｅｎｔ）のうち４のＣＬＬ  Ｂ細胞を完全に排除した。従って、ＴＲＡ−８は、単独はでまたは他の基質と一緒になって、慢性リンパ性白血病の治療剤として活性である。
【０２３１】
（実施例１６．ｃＤＮＡクローニング）
（１）ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列の決定
ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを得るために、ＴＲＡ−８遺伝子およびクローン化されたＴＲＡ−８遺伝子の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を、公知の技術によって決定する。
【０２３２】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８を含有する溶液（１０μｇ）を、１２％  ｗ／ｖのゲル濃度、１００Ｖの一定電圧を使用するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）に、１２０分間供する。電気泳動の後、このゲルを、移動緩衝液である、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２０％メタノール、０．０２％  ｖ／ｖ  ＳＤＳ中に、５分間浸す。この時間の後、ゲルのタンパク質含有物を、ポリビニリデンジフルオリド膜（「ＰＶＤＦ膜」；孔径０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｊａｐａｎ）に移す（このポリビニリデンジフルオリド膜は、１０Ｖの一定電圧、４℃で１４時間の条件下で、ブロッティング装置（ＫＳ−８４５１；Ｍａｒｙｓｏｌ）を使用して、転写緩衝液に予浸する）。
【０２３３】
この時間の後、ＰＶＤＦ膜を、洗浄緩衝液である、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次いで染色溶液（５０％  ｖ／ｖメタノール、２０％  ｖ／ｖ酢酸および０．０５％  ｗ／ｖクーマシーブリリアントブルー）中で５分間染色して、タンパク質バンドを位置決める。次いで、このＰＶＤＦ膜を、９０％  ｖ／ｖの水性メタノールで脱染色し、そして重鎖（ＰＤＶＦ膜上に以前に位置決めしたより低移動度を有する）および軽鎖（高い移動度を有する）に対応するバンドを切り出し、そして脱イオン水で洗浄する。
【０２３４】
重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列を、Ｅｄｍａｎ自動化方法（Ｅｄｍａｎ，Ｐ．ら（１９６７），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１，８０）によって、気相タンパク質シーケンサー（ＰＰＳＱ−１０；Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｅｉｓａｋｕｓｙｏ，Ｋ．Ｋ．）を使用して決定する。
【０２３５】
重鎖に対応するバンドのＮ末端アミノ酸配列を、以下であると決定する：
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号４）。
【０２３６】
軽鎖に対応するバンドのＮ末端アミノ酸配列を、以下であると決定する：
Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（配列表の配列番号５）。
【０２３７】
これらのアミノ酸配列と、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  Ｖｏｌ．ＩＩ」Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）により作製された抗体のアミノ酸配列のデータベースとの比較により、ＴＲＡ−８の重鎖（γ１鎖）および軽鎖（ｋ鎖）は、それぞれ、サブタイプ３ｄおよびサブタイプ１に属することが明らかになった。
【０２３８】
（２）ｃＤＮＡクローニング
上記の知見に基づいて、これらのマウスサブタイプに属する遺伝子の、５’非翻訳領域の部分および３’翻訳領域の最末端にハイブリダイズすることが予測されるオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。次いで、ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡを、逆転写およびＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の以下の組合せによってクローニングする。
【０２３９】
ａ）テンプレート
ＴＲＡ−８ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１４２８）の総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を使用することによって抽出する。ＰＣＲ反応のためのテンプレートは、キットに備えられる指示マニュアルに従って、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用することによって得られるｃＤＮＡを使用した。
【０２４０】
ｂ）ＰＣＲプライマー
以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲのために合成する：
５’−ｃａｇｃａｃｔｇａａ  ｃａｃｇｇａｃｃｃｃ−３’（Ｈ５ＮＣＳ１：配列表の配列番号６）；
５’−ａａａｇｇｔａａｔｔ  ｔａｔｔｇａｇａａｇ−３’（Ｈ５ＮＣＳ２：配列表の配列番号７）；
５’−ｃｃｔｃａｃｃａｔｇ  ａａｃｔｔｃｇｇｇｃ−３’（Ｈ５ＳＳ１：配列表の配列番号８）；
５’−ｃｔｇｔｔｇｔａｔｇ  ｃａｃａｔｇａｇａｃ−３’（Ｈ５ＳＳ２：配列表の配列番号９）；
５’−ｇａａｇｔｇａｔｇｃ  ｔｇｇｔｇｇａｇｔｃ−３’（Ｈ５ＣＳ１：配列表の配列番号１０）；
５’−ａｇｔｇｔｇａａｇｔ  ｇａｔｇｃｔｇｇｔｇ−３’（Ｈ５ＣＳ２：配列表の配列番号１１）；
５’−ｔｔｔａｃｃａｇｇａ  ｇａｇｔｇｇｇａｇａｇ−３’（Ｈ３ＣＲ：配列表の配列番号１２）；
５’−ｔｇｃａｇａｇａｃａ  ｇｔｇａｃｃａｇａｇ−３’（Ｈ３ＶＲ：配列表の配列番号１３）；
５’−ｔｇｔｔｃａｇｇａｃ  ｃａｇｃａｔｇｇｇｃ−３’（Ｌ５ＮＣＳ１：配列表の配列番号１４）；
５’−ａａｇａｃａｔｔｔｔ  ｇｇａｔｔｃｔａａｃ−３’（Ｌ５ＮＣＳ２：配列表の配列番号１５）；
５’−ｔａｔｃａｔｇａａｇ  ｔｃｔｔｔｇｔａｔｇ−３’（Ｌ５ＳＳ１：配列表の配列番号１６）；
５’−ｇａｔｇｇａｇａｃａ  ｃａｔｔｃｔｃａｇｇ−３’（Ｌ５ＳＳ２：配列表の配列番号１７）；
５’−ｇａｃａｔｔｇｔｇａ  ｔｇａｃｃｃａｇｔｃ−３’（Ｌ５ＣＳ：配列表の配列番号１８）；
５’−ｔｔａａｃａｃｔｃａ  ｔｔｃｃｔｇｔｔｇａ−３’（Ｌ３ＣＲ：配列表の配列番号１９）；および
５’−ｇａｃｔｇｇｇｔｃａ  ｔｃａｃａａｔｇｔｃ−３’（ＬＣＳＲ：配列表の配列番号２０）。
【０２４１】
特に他の規定がない限り、これらの実施例における全てのオリゴヌクレオチドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈにより合成される。全てのオリゴヌクレオチドを、蒸留水に溶解した後、−２０℃で貯蔵する。
【０２４２】
ｃ）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応溶液の組成：
テンプレートｃＤＮＡ、合計３３μｌの反応物のうち５μｌ；
プライマーＤＲ５ｐｌ、１０ｐｍｏｌ；
プライマーＤＲ５ｐ２、１０ｐｍｏｌ；
１０×濃ＰＣＲ緩衝液（キットに提供される）、１０μｌ；
ｄＮＴＰ（各々、２．５ｍＭ）、４μｌ；および
Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５単位。
【０２４３】
滅菌蒸留水を、この溶液に、１００μｌの総容量まで添加する。特に他の規定がない限り、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（各々、２．５ｍＭ）の等モル混合物である。
【０２４４】
ＰＣＲ反応を、以下のように行う。この溶液を、初めに、９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で３０秒、５２℃で１分および７２℃で３分の加熱サイクルを、４０回繰り返す。この手順が完了した後、この反応溶液を、７２℃で１０分間加熱する。
【０２４５】
このようにして得られた増幅ＤＮＡフラグメントを、０．２５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含有する１％のアガロースゲルで分離する。所望のＤＮＡフラグメントを含むことが決定されたバンドを、カミソリの刃を使用して切り取り、そして、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキット（ＢＩＯ１０１）を使用して、ＤＮＡをこれから回収する。このＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、クローニングする。これを、以下のようにして行う。
【０２４６】
このＰＣＲ反応溶液から回収したＤＮＡフラグメントを、５０ｎｇのｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（キットに備えられる）と共に、４単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）を添加した１μｌの１０×リガーゼ反応緩衝液（６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  塩化ナトリウム、７ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  スペルミジンおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）と混合する。この混合物の総容量を、滅菌脱イオン水を用いて１０μｌに調整し、そして得られたリガーゼ溶液を、１４℃で１５時間インキュベートする。この時間の後、２μｌのリガーゼ反応溶液を、５０μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（このキットに備えられており、指示マニュアルに従って、コンピテンスにされている）（これには、２μｌの０．５Ｍ  β−メルカプトエタノールが添加されている）に添加し、そして得られた混合物を、氷上で３０分間維持し、次いで、４２℃で３０秒間維持し、そして再び、氷上で５分間維持する。次いで、５００μｌの培地（２％  ｖ／ｖ  トリプトン、０．５％  ｗ／ｖ  酵母抽出物、０．０５％  ｗ／ｖ  塩化ナトリウム、２．５ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、および２０ｍＭグルコースを含む）（本明細書中以下で、「ＳＯＣ」培地と呼ぶ）を、この培養物に添加し、そしてこの混合物を、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。この時間の後、この培養物を、１００μｇ／ｍｌを含有するＬブロス寒天プレート（１％  ｖ／ｖ  トリプトン、０．５％  ｗ／ｖ  酵母抽出物、０．５％  ｗ／ｖ  塩化ナトリウム、０．１％  ｗ／ｖ  グルコースおよび０．６％  細菌寒天（ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）（Ｄｉｆｃｏ））の上にひろげる。このプレート上に現れるアンピシリン耐性コロニーを選択し、そして白金移動ループで切り取り、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬブロス培地中で、３７℃で一晩、２００ｒ．ｐ．ｍ．で振盪しながら培養する。インキュベーションの後、これらの細胞を、遠心分離により回収し、これらの細胞から、プラスミドＤＮＡを、アルカリ方法によって調製する。この得られたプラスミドを、ＴＲＡ−８の重鎖について、プラスミドｐＨ６２、またはＴＲＡ−８の軽鎖について、ｐＬ２８と命名する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨ６２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＬ２８と命名された、これらのプラスミドを有する形質転換体Ｅ  ｃｏｌｉ株を、微生物の寄託に関するブタペスト条約に従って、国際特許生物寄託当局である、産業技術総合研究所（日本国、３０５−５４６６、茨城県つくば市、東１丁目１−１に、２００１年４月２０日に寄託し、これらのプラスミドは、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６０およびＦＥＲＭ  ＭＰ−７５６１を与えられた。ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、ジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ��ｐａｎ）を使用して確認する。
【０２４７】
ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列表の配列番号２１および配列番号２２として示される。ＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号２３および配列番号２４として示される。上記で確立されたＴＲＡ−８の重鎖および軽鎖のＮ末端アミノ酸配列は、完全に一致していた。さらに、この重鎖および軽鎖のアミノ酸配列が抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較される場合、重鎖について、配列番号２１のヌクレオチド番号５８〜４１４が可変領域を構成していたが、配列番号２１のヌクレオチド番号４１５〜１３９２が、定常領域を構成したことが確立される。軽鎖については、配列番号２２のヌクレオチド番号６４〜３８７が、可変領域を構成していたが、配列番号２２のヌクレオチド番号３８８〜７０２が定常領域を構成していた。ＣＤＲの位置および配列はまた、データベースを用いて相同性を比較することにより明らかにされる。ＴＲＡ−８の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６、および２７に示される。ＴＲＡ−８の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８、２９、および３０に示される。
【０２４８】
（実施例１７．ＴＲＡ−８抗体のヒト化バージョンの設計）
（１）ＴＲＡ−８の可変領域の分子モデリング
ＴＲＡ−８の可変領域の分子モデリングを、相同性モデリングとして一般的に知られる方法により行う（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２８，２３５−２４２（２０００））（Ｘ線結晶学に由来する３次元構造が利用可能である）に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の一次配列を、上で決定されたＴＲＡ−８のフレームワーク領域と比較する。結果として、１ＮＣＤおよび１ＨＩＬを、それぞれＴＲＡ−８の軽鎖および重鎖についてのフレームワーク領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択する。フレームワーク領域の３次元構造を、ＴＲＡ−８の軽鎖および重鎖に対応する１ＮＣＤおよび１ＨＩＬの座標を組み合わせることにより生成して、「フレームワークモデル」を得る。Ｃｈｏｔｈｉａらにより定義された分類を使用して、ＴＲＡ−８のＣＤＲを、以下のように分類する：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２は、基準クラス２、１、１、３にそれぞれ属し、一方ＣＤＲＬ３は、基準クラスのいずれにも属さない。このＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２のＣＤＲループは、それらのそれぞれの基準クラスに固有のコンホメーションに固定され、そしてフレームワークモデルに組み込まれる。ＣＤＲＬ３は、Ｔｈｏｒｎｔｏｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，（１９９６））の分類に従って、クラスター８Ａのコンホメーションに帰属され、そしてＣＤＲＨ３は、Ｈ３則（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ  ４５５，１８８−１９７（１９９９））を使用してｋ（８）Ｃに分類される。次いで、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３の代表的なコンホメーションを、フレームワークモデルに組み込む。
【０２４９】
最後に、エネルギーに関してＴＲＡ−８の可変領域の可能な分子モデルを得るために、エネルギー計算を行って望ましくない原子間接触を排除する。上記の手順は、市販の一般的な分子モデリングシステムＡＢＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｉｎｃ．）を使用して実行する。得られた分子モデルについて、構造の正確さを、ソフトウエア（ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（１９９３），２６，２８３−２９１）を使用してさらに評価する。
【０２５０】
（２）ヒト化ＴＲＡ−８のアミノ酸配列の設計
ヒト化ＴＲＡ−８抗体の構築は、ＣＤＲグラフト化として一般的に知られる方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））により実行する。このアクセプター抗体を、フレームワーク領域におけるアミノ酸相同性に基づいて選択する。ＴＲＡ−８におけるフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））における全てのヒトフレームワーク配列と比較する。結果として、ｍＡＢ５８’ＣＬ抗体を、フレームワーク領域について最も高い８０％の配列相同性に起因してアクセプターとして選択する。ｍＡｂ５８’ＣＬについてのフレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、ＴＲＡ−８のフレームワーク領域におけるアミノ酸残基と整列し、そして異なるアミノ酸が使用される位置を同定する。これらの残基の配置を、上で構築されたＴＲＡ−８の３次元モデルを使用して解析し、そしてアクセプターにグラフト化されるべきドナー残基を、Ｑｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））により与えられる規準により選択する。ヒト化ＴＲＡ−８配列を、いくつかのドナー残基をアクセプター抗体であるｍＡｂ５８’ＣＬに移行することにより以下の実施例において記載されるように構築する。
【０２５１】
（実施例１８．ヒト化抗体の重鎖についての発現ベクターの構築）
（１）ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを保有するプラスミドの構築
ヒト化ＴＲＡ−８の活性を決定するために、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖を保有するプラスミドを、以下のように構築する。しかし、ＴＲＡ−８のヒト化は、これらの実施例に限定されないことが理解される。
【０２５２】
配列表の配列番号３１に示されるとおり、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のヒト化は、結果として１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、４０番目のアミノ酸（スレオニン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン酸）、４４番目のアミノ酸（アルギニン）、８４番目のアミノ酸（セリン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれグルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシンおよびバリンとの置換をもたらした。
【０２５３】
ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域（配列表の配列番号３１）をコードするＤＮＡを保有するプラスミドを以下のように構築する。
【０２５４】
ＰＣＲを使用して、以下のＤＮＡ配列を構築し、それらに含まれる各配列が、上に記載される：
以下の１２のオリゴヌクレオチドを合成する：
【０２５５】
【化１】
2005519871.tif 000005
【０２５６】
以下の２つのＰＣＲプライマーを上記のように合成する：
【０２５７】
【化２】
2005519871.tif 000006
【０２５８】
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端における８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＤＮＡの合成を、それぞれＰＣＲの組み合わせを使用して実行する。
【０２５９】
ＤＮＡフラグメントを以下のように調製する。
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰ混合物、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容積５０μｌになるまでの再蒸留水。
【０２６０】
ＰＣＲ反応を、以下のように実行する。この溶液を、まず９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で１分間の加熱サイクルを、７回繰り返す。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０２６１】
等容積のフェノール−クロロホルム（５０％ｖ／ｖの水で飽和したフェノール、４８％ｖ／ｖのクロロホルム、２％ｖ／ｖのイソアミルアルコール）を、２００μｌのＰＣＲ産物の各々に添加し、そして１分間激しく混合する。この時間の後、この混合物を、１０，０００×ｇで遠心分離し、そして水層を回収し、等容積のクロロホルム−イソアミルアルコール（９６％ｖ／ｖのクロロホルム、および４％ｖ／ｖのイソアミルアルコール）と混合し、これを再度１０，０００×ｇにかけ、そして水層を回収した。この段落に記載される一連の工程を、本明細書中以下において「フェノール抽出」と呼ぶ。
【０２６２】
次いで、エタノール沈殿を、この回収された水層に対して行う。本明細書中で使用される場合および言及される場合、「エタノール沈殿」は、混合しながら、３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の１０分の１容積および１００％エタノールの２．５容積を、処理されるべき溶液に添加し、そしてドライアイスを使用してこの混合物を凍結する工程からなる。次いで、得られた混合物を、１０，０００×ｇで遠心分離して、ＤＮＡを沈殿物として回収する。
【０２６３】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られたＤＮＡ沈殿物を真空乾燥し、最少量の再蒸留水に溶解し、そして３％アガロースゲル電気泳動により分離する。電気泳動後に、このゲルを１μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液で染色してＵＶ光の下でのＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＴＲＡ−８ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してこのゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いでこの溶出されたＤＮＡを、７，５００×ｇにおける遠心分離で濃縮し、次いでエタノール沈殿を行い、そして最終的に５μｌの蒸留水に溶解する。
【０２６４】
得られたそれぞれ抽出されたＤＮＡを、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して以下のようにクローン化する：
ＰＣＲ反応から回収されたＤＮＡフラグメント、５μｌ；
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１μｌ；
ｄＮＴＰ混合物、１μｌ；
Ｔａｑポリメラーゼ（５単位／ｍｌ）、１μｌ；および
最終容積１０μｌになるまでの再蒸留水。
【０２６５】
上記の各溶液を７０℃で３０分間反応させた後、各ＤＮＡ溶液およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターを、製造者のプロトコルを使用してＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して結合する。
【０２６６】
１５℃における４時間のインキュベーションの後、２μｌのインキュベーションした反応溶液を、１〜２×１０９細胞／ｍｌの細胞密度で１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）と混合し、そしてこの混合物を氷上に３０分間維持し、次いで、４２℃で３０秒間、そして再び氷上に１分間維持する。次いで、５００μｌのＳＯＣ培地（２％ｖ／ｖのトリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、０．５％ｗ／ｖの酵母抽出物、０．０５％ｗ／ｖの塩化ナトリウム、２．５ｍＭｗ／ｖの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび２０ｍＭのグルコース）をこの混合物に添加し、これを振盪しながらさらに１時間インキュベートする。次いで、形質転換体株を単離し、そしてプラスミドＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に記載されるとおりに、この株から調製する。ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら，（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）により確認する。
【０２６７】
得られたプラスミドを、ｐＨＢ１４と名付ける（ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）。これらのプラスミドを保有する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＢ１４と名付けられる）を、国際特許生物寄託当局である産業技術総合研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（日本国、３０５−５４６６茨城県つくば市東１−１−１）に、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って２００１年４月２０日に寄託し、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５５６の受託番号を与えられた。
【０２６８】
（２）ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを有する発現プラスミドの構築
動物細胞用の組換え発現ベクターを、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするＤＮＡ（上でクローン化された）を以下のように挿入することにより構築する。
【０２６９】
ヒト化抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを有するプラスミドｐＳＲＨＨＨ３（欧州特許出願ＥＰ０−９０９−８１６−Ａ１）（哺乳動物細胞用の発現ベクター）の１μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして３％アガロースゲル電気泳動により分離する。電気泳動後、このゲルを臭化エチジウムの１μｇ／ｍｌ水溶液で染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域を含まずヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを含有するベクターＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してこのゲルから溶出する。フェノール抽出の後、次いで、溶出されたＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離により濃縮し、次いでエタノール沈殿を行い、そして最後に５μｌの蒸留水に溶解し、次いでＣＩＰを使用して脱リン酸する。得られた消化されて脱リン酸されたプラスミド（１００ｎｇ）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むｐＨＢ１４ＤＮＡフラグメント（これも、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩを用いて消化されている）の１μｇと結合する。次いで、この結合混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングする。
【０２７０】
この方法により得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地２ｍｌ中で３７℃にて一晩培養し、そしてプラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法により得られた培養物から連続的に抽出する。
【０２７１】
抽出されたプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして３％ｗ／ｖアガロースゲル電気泳動にかけて、ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの挿入物の存在または不在を確認する。このベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＤＮＡ配列決定することにより確認する。ヒト化ＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを有する得られた発現プラスミドを、ｐＨＢ１４−１と名付ける。
【０２７２】
（実施例１９．ヒト化抗体軽鎖についての発現ベクターの構築）
（（１）ＴＲＡ−８抗体のヒト化バージョンの軽鎖に対するベクターの構築物）
配列表の配列番号４６に示されるように、マウス抗−ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列のヒト化において、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ−末端から第８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、第９番目のアミノ酸（リジン）、第１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、第１１番目のアミノ酸（メチオニン）、第１３番目のアミノ酸（スレオニン）、第２０番目のアミノ酸（セリン）、第４２番目のアミノ酸（グルタミン）、第４３番目のアミノ酸（セリン）、第６０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、第６３番目のアミノ酸（スレオニン）、第７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、第７８番目のアミノ酸（バリン）、第８０番目のアミノ酸（セリン）、第８３番目のアミノ酸（ロイシン）、第８５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、第８７番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、第９９番目のアミノ酸（グリシン）、第１０３番目のアミノ酸（ロイシン）、第１０８番目のアミノ酸（アラニン）を、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換する。得られた配列を、ＬＭ２と命名する。
【０２７３】
抗−ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８のこの型のヒト化軽鎖アミノ酸配列を保有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０２７４】
（１）ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ２ポリペプチド鎖（配列表の配列番号４６）をコードするＤＮＡ（この各々は、ヒト化抗−ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域の融合である）を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを使用することによって、合成する。
【０２７５】
７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ（配列番号４８）に加えて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲのために合成する：
５’−ｇｔｃｃｃｃｃａｃａ  ｇａｔｇｃａｇａｃａ  ａａｇａａｃｔｔｇｇ  ａｇａｔｔｇｇｇｔｃ  ａｔｃａｃａａｔｇｔｃａｃｃａｇｔｇｇａ−３’（ＨＫＳＰＲ１１；配列番号４９）；
５’−ｃｃａａｇｔｔｃｔｔ  ｔｇｔｃｔｇｃａｔｃ  ａｇｔａｇｇａｇａｃ  ａｇｇｇｔｃａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｃ−３’（ＨＫＣＤＦ１１；配列番号５０）
；５’−ａｇｔｇｔｇｃｃｇｇｇｔｇｇａｔｇｃｃｃ  ａｇｔａａａｔｃａｇ  ｔａｇｔｔｔａｇｇａｇｃｔｔｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔｃｔｇ−３’（ＨＫＣＤＲ１２；配列番号５１）；
５’−ｔｇｇｇｃａｔｃｃａ  ｃｃｃｇｇｃａｃａｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃａ  ａｇｃａｇｇｔｔｔａｇｔｇｇｃａｇｔ−３’（ＨＫＣＤＦ２２；配列番号５２）；
５’−ａｔａａｃｔａｃｔａｔａｔｔｇｃｔｇａｃ  ａｇｔａａｔａｇｇｔｔｇｃａａａａｔｃｃｔｃｃｇｇｃｔｇｃａ  ｇａｃｔａｇａｇａｔ  ｇｇｔ−３’（ＨＫＣＤＲ２２；配列番号５３）；および
５’−ｃａｇｃａａｔａｔａ  ｇｃａｇｃｔａｔｃｇ  ｇａｃｇｔｔｃｇｇｔ  ｃａａｇｇｃａｃｃａ  ａｇｇｔｇｇａａａｔ  ｃａａａｃｇｇａｃｔ  ｇｔｇ−３’（ＨＫＣＦ１２；配列番号５４）。
【０２７６】
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／Ｍ２−１の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖のクローニング））
配列表の配列番号４６に規定されるようなアミノ酸配列をコードする同じ配列表の配列番号５５において規定されるＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施することによって調製し、プラスミドベクター中に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローン化する。
【０２７７】
（ａ）第１工程ＰＣＲ）
分泌シグナル配列および５’末端に付加されたＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を有するＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミド（ｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＰＤＨＨ）を、欧州特許出願ＥＰ０９０９８１６Ａ１中の記載に従うことによって得る。
【０２７８】
反応溶液の組成：
プラスミド  ｐＨＳＧＨＭ１７  ＤＮＡ（欧州特許出願  ＥＰ０９０９８１６Ａ１）、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー  ７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＳＰＲ１１、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、２．５単位。
【０２７９】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容量まで調整し、ＰＣＲにおいて使用する。
【０２８０】
ＰＣＲ熱条件：９４℃２分間の加熱、その後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の熱サイクル（３０回反復）、続いての７２℃１０分間の加熱。
【０２８１】
ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、およびＣＤＲＬ２の一部をコードするＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２８２】
反応溶液の組成：
プラスミド  ｐＬ２８  ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＣＤＦ１１、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＣＤＲ１２、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０２８３】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容量まで調整し、ＰＣＲにおいて使用する。
【０２８４】
ＰＣＲ熱条件：９４℃２分間の加熱、その後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の熱サイクル（３０回反復）、続いての７２℃１０分間の加熱。
【０２８５】
ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＣＤＲＬ３（部分）をコードするＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２８６】
反応溶液の組成：
プラスミド  ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願  ＥＰ０９０９８１６Ａ１）、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＣＤＦ２２、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＣＤＲ２２、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０２８７】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容量まで調整し、ＰＣＲにおいて使用する。
【０２８８】
ＰＣＲ熱条件：９４℃２分間の加熱、その後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の熱サイクル（３０回反復）、続いての７２℃１０分間の加熱。
【０２８９】
ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および３’末端に付加されたＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を有する定常領域コードするＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０２９０】
反応溶液の組成：
プラスミド  ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー  ＨＫＣＦ１２、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー  ７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０２９１】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容量まで調整し、ＰＣＲにおいて使用する。
【０２９２】
ＰＣＲ熱条件：９４℃２分間の加熱、その後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の熱サイクル（３０回反復）、続いての７２℃１０分間の加熱。
【０２９３】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光下で生成されたＤＮＡを検出する。それに従って、それぞれのＤＮＡバンドを、カミソリで切除する。
（ｂ）第２工程ＰＣＲ）
上記ＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡフラグメント、およびＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを融合するＬＭ２−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
【０２９４】
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ２−Ｆ１−ＤＮＡのゲルフラグメント
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ２−Ｆ２−ＤＮＡのゲルフラグメント
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ２−Ｆ３−ＤＮＡのゲルフラグメント
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ２−Ｆ４−ＤＮＡのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー  ７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー  ７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０２９５】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容量まで調整し、ＰＣＲにおいて使用する。
【０２９６】
ＰＣＲ熱条件：９４℃２分間の加熱、その後、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃２分間の熱サイクル（３０回反復）、続いての７２℃１０分間の加熱。
【０２９７】
このように調製されたＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを、製造業者のプロトコールに従って、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、キット中に含まれるコンピテントなＥ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’に導入する。ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０２９８】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／Ｍ２−１と命名する（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）。
【０２９９】
ＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを含む得られたプラスミドｐＣＲ３．１／Ｍ２−１を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化する。
【０３００】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡおよびＬＭ２−ＤＮＡフラグメント（制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化される）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、連結ＤＮＡを用いて形質転換し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％  Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）を含有するＬＢ寒天培地上に広げる。得られた白い形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する液体ＬＢ培地中で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って得られた培養物から抽出する。抽出されたプラスミドＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いで、ＬＭ２−ＤＮＡフラグメントを保持するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。
【０３０１】
上記手順の結果として、ヒト化ＬＭ２  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４を得る。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４と命名された、これらのプラスミドを含む形質転換体Ｅｃｏｌｉ株を、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １  ｃｈｏｍｅＴｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６３を与えられた。
【０３０２】
（３）プラスミドｐＳＲ／Ｍ２−１（ヒト化ＬＭ２  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
ヒト化ＬＭ２  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化する。
【０３０３】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ０９０９８１６Ａ１）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡおよびｐＨＳＧ／Ｍ２−１−４から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、連結ＤＮＡを用いて形質転換し、ＬＢ寒天上に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する液体ＬＢ培地中で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って得られた培養物から抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入物および方向を、遺伝子配列分析器（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＤＮＡ配列決定により確認する。
【０３０４】
ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを保有する得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／Ｍ２−１と命名する。
【０３０５】
（実施例２０．ヒト化抗体の産生）
ＣＯＳ−７細胞（すなわち、サル腎臓に由来する細胞株）の、上記で得られたヒト化ＴＲＡ−８重鎖およびヒト化ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミドでのトランスフェクションを、キットと共に提供される指示書に従って、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）によって実施する。
【０３０６】
ＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）を、１０％ウシ胎仔血清（本明細書中以後「ＦＣＳ」と略される；Ｍｏｒｅｇａｔｅ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（本明細書中以後「Ｄ−ＭＥＤ」といわれる；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む培養皿（培養面積：５７ｃｍ２；Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）中で半コンフルエント（３×１０６細胞／皿）まで増殖する。
【０３０７】
その間に、１０μｇ／皿（全５皿）のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ１５−１）ならびにアルカリ−ＳＤＳ法および塩化セシウム密度勾配遠心分離によって調製された１０μｇ／皿（全５皿）のヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ１５−１）を混合し、次いで、エタノールで沈殿し、その後、５μｌ／皿のｄＨ２Ｏ中に懸濁する。
【０３０８】
１５μｌ／皿のＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を、ＦＣＳを含まない１８０μｌ／皿のＤ−ＭＥＭと混合した後、このＦＵＧＥＮＥ溶液（１８５μｌ／皿）を、１０μｇ／皿のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡおよび１０μｇ／皿のヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡを含有する５μｌ／皿  ＤＮＡ溶液と混合する。室温での１５分間のインキュベーションの後、得られたプラスミド懸濁物（２００μｌ）を、前に調製したＣＯＳ−７プレートに添加する。５％ＣＯ２中で３７℃で２４時間のインキュベートの後、培養培地を、ＦＣＳを含まないＤ−ＭＥＭと交換する。５％ＣＯ２中で３７℃で７２時間のインキュベートの後、培養上清を回収し、上清流体中の発現産物を精製する。上記される方法によって、ＣＯＳ−７細胞を、以下のプラスミドの各々の組み合わせでトランスフェクトする：
（Ａ）：プラスミドＤＮＡなし
（Ｂ）：ｐＨＢ１４−１およびｐＳＲ／Ｍ２−１の共トランスフェクション。
【０３０９】
次いで、培養物を遠心分離（１，０００  ｒ．ｐ．ｍ．、５分間）し、上清を回収する。上清を、再度遠心分離（９，８００  ｒ．ｐ．ｍ．、１５分間）し、そして０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＯＹＯ  ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ，Ｃａｔ＃  ２５ＣＳ０４５  ＡＳ）を用いて濾過する。濾液からのＩｇＧの精製を、以下の条件下で、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ＰＯＲＯＳアフィニティークロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して達成する：
ＨＰＬＣ：ＢｉｏＣＡＤ  ７００Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ＩＤセンサーカートリッジ（カラムサイズ：２．１ｍｍＩＤ×３０ｍｍ  ＬＤ、ベッド容量：０．１ｍｌ；Ｃａｔ＃  ２−１００２−００，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
溶出緩衝液：０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）
中和緩衝液：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
検出：２８０ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
フラクションサイズ：０．５ｍｌ／０．５分
フラクションチューブ：１．５ｍｌポリプロピレンマイクロチューブ
温度：４Ｃ。
【０３１０】
全ての濾過物をカラムにアプライした後、３０ｍｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃  １０００−３）を使用してカラムを洗浄する。溶出緩衝液をアプライした後、フラクションコレクターを始動する。各フラクションマイクロチューブは、予めＰＢＳ中に、５５μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１１０μｌの中和緩衝液および７４μｌの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃  Ａ−７０３０）を含んだ。８番目〜１０番目の画分を回収し、Ｓｌｉｄｅ−Ａライザーを使用して、１リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．５）に対して、４℃で１日間透析した。透析緩衝液を２回交換する。
【０３１１】
調製された培養上清流体中の、ヒト化抗体の発現の確認および発現産物の定量的アッセイを、抗−ヒトＩｇＧに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡによって実施する。
【０３１２】
９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）の各ウェルに、吸着緩衝液（０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中に０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で溶解した１００μｌのヤギ抗−ヒトＩｇＧ特異的ポリクローナル抗体（Ｋａｐｐｅｌ）を添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートし、抗体の吸着を引き起こした。次いで、プレートを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＢｉｏＲａｄ）を含有する３５０μｌのＰＢＳ（−）（本明細書中、移行では「ＰＢＳ−Ｔ」と称する）を用いて、５回洗浄する。洗浄後のウェルに、１０％  ＦＣＳを含有するＤ−ＭＥＭで希釈された培養上清を添加し、３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔでの再度の洗浄の後、ＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈された１００μｌのアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的モノクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．）を、各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−Ｔでの再度の洗浄の後、アルカリホスファターゼ基質キット（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）から得られたｐ−ニトロフェニルリン酸の基質溶液を、キットと共に提供される指示書に従って添加する。３７℃で０．５〜１時間のインキュベーションの後、４０５ｎｍでの吸光度を測定する。本実験において、Ｄ−ＭＥＭ含有１０％ＦＣＳで特定の濃度に希釈されたヒト血漿免疫グロブリンＧサブクラス１（ＩｇＧ１）（Ｂｉｏｐｕｒｅ  ＡＧ）を、培養上清流体中に含まれるヒト化ＤＲ５抗体の濃度参照サンプルとして使用する。
【０３１３】
結果として、培養上清中の発現産物および精製産物を、抗−ヒトＩｇＧ抗体で特異的に検出する。ヒトＩｇＧ抗体の量は、８．９６μｇ（８００μｌ）である。
【０３１４】
（実施例２１．ヒト化抗体のアポトーシス誘導活性）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−１５２）を使用して、精製したヒト化ＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導活性を試験した。
【０３１５】
１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で、３７℃で３日間、５％ＣＯ２の存在下で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウェルマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに分配する（５０μｌ／ウェル）。実施例２０で調製したヒト化ＴＲＡ−８を、実施例２０に記載される方法に従って液体中のそれらの濃度を推定することによって、１００ｎｇ／ｍｌの目的の最終産物の濃度を有するよう、１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で調節する。このようにして１００ｎｇ／ｍｌに調節された発現産物の溶液の各々を使用して、１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０での連続２倍希釈を繰り返すことによって、連続希釈物を作製する。希釈した各ヒト化ＴＲＡ−８溶液を、５０μｌ／ウェルで各ウェルに添加する。３７℃で１２時間反応させた後、１ｍｇ／ｍｌ  ＸＴＴ（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド内部塩；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含有する５０μｌの２５μＭ  ＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を添加する（終濃度２５０μｇ／ｍｌ（ＸＴＴ）および５μＭ（ＰＭＳ））。３時間インキュベートした後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定して、指標としてミトコンドリアの還元能力を使用して、細胞生存度を算出する。
【０３１６】
各ウェルにおける細胞の生存度を、以下の式に従って算出する：
生存度（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
（ここで、「ａ」は試験ウェルの測定値であり、「ｂ」は細胞のないウェルの測定値であり、そして「ｃ」は抗体を添加しないウェルの測定値である）。
【０３１７】
結果として、実施例２０で調製した発現産物（ヒト化ＴＲＡ−８）は、ヒトＤＲ５抗原を発現するＴリンパ腫細胞株の細胞においてアポトーシスを誘導することが実証される。
【０３１８】
（実施例２２．種々のＤＲ５分子に対するＴＲＡ−８の反応性）
種々のＤＲ５分子に対するＴＲＡ−８の反応性を決定するために、ＴＲＡ−８の反応性を、以下の通り、活性化リンパ球を用いて試験する。
【０３１９】
第１に、末梢血サンプルをヒト（３０ｍｌ）、マーモセット（３ｍｌ）、およびカニクイザル（２０ｍｌ）から採取する。これらの血サンプルに１ｍｌのヘパリン（Ｎｏｖｏｈｅｐａｒｉｎ；Ｎｏｖｏ）を添加し、次いでサンプルを、等量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）上にゆっくりと重層し（カニクイザルを除く全て比重１．０７７、カニクイザルは比重１．０７２）、１，７００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心分離して、末梢血単核細胞の画分を得る。この単核細胞フラクションを、ハンクス平衡塩溶液で２度洗浄し、次いで、１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁して細胞密度を１×１０６細胞／ｍｌにする。フィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏ．）を得られた懸濁物に添加して終濃度を５μｇ／ｍｌにし、そしてサンプルを、３７℃、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２下で２４時間インキュベートする。この後、細胞を遠心分離により回収し、洗浄し、そして１０％  ｖ／ｖ  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁する。次いで、回収した細胞を活性化するために、インターロイキン−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）を、終濃度１０ユニット／ｍｌになるように懸濁物に添加し、これを、３７℃、５％  ｖ／ｖ  ＣＯ２下で７２時間インキュベートする。
【０３２０】
１×１０６個の活性化リンパ球細胞を含むと算出された活性化調製物の量を、試験管に入れ、そして０．５、１、５、１０μｇ／ｍｌのＴＲＡ−８を含有するＰＢＳ５０μｌまたはＰＢＳのみ５０μｌのいずれかに懸濁する。得られた懸濁物を氷上に１時間静置し、その後、細胞を、５００μｌのＰＢＳのアリコートで３回洗浄し、次いで、５０μｌの２０μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ）を含有するＰＢＳ中に懸濁する。コントロールとして５００μｌのＰＢＳ中に懸濁した細胞を用いて、蛍光強度を、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定する。
【０３２１】
蛍光強度により細胞数の分布を得、そして総細胞数に対する染色細胞数の比を算出する。さらに、各Ｋｄ値を、ＴＲＡ−８の濃度および総細胞数に対する染色細胞数の比を用いて算出する。ヒト、マーモセット、およびカニクイザルの活性化リンパ球に対する反応性の各頻度はほぼ同じである。従って、ＴＲＡ−８は、ＴＲＡ−８が最初に調製されたヒトを含む、広範囲の霊長類ＤＲ５に結合し得る。
【０３２２】
（実施例２３．マーモセットにおけるＴＲＡ−８の漸増用量研究）
ＴＲＡ−８の漸増用量予備的毒性研究を、オス１匹およびメス１匹のマーモセットを用いて実施する。３セットの単回静脈内投与（７日間の中断期間により分離される）を実施する。ＴＲＡ−８の用量を、５０μｇ／匹、２５０μｇ／匹および１２５０μｇ／匹に設定する。各々の処理の４８時間後、血液を大腿静脈から回収し、血漿を調製する。血漿アスパルテートアミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの活性を、分析器（ＦＵＪＩ  ＤＲＩ−ＣＨＥＭ：Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて測定する。全ての血液を、いかなる麻酔も行わずに採取する。結果として、各々の処理の後に、血漿生化学試験において、肝損傷を示す証拠は見られない。
【０３２３】
（実施例２４．癌細胞に対するＴＲＡ−８のインビトロおよびインビボ薬理学的研究）
ＴＲＡ−８が抗癌治療において治療効力を有するか否かを決定するために、種々の癌細胞株を用いてＴＲＡ−８のインビトロ殺傷活性を、以下の通りに試験する。
【０３２４】
１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含有するＧｉｂｃｏ  ＢＲＬから入手したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊｕｒｋａｔ）、ＤＭＥＭ培地（ＨＣＴ−１１６）、ＭＥＭ−Ｒ（ＷｉＤｒ）、またはＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＣＯＬ２−Ｊｃｋ）中、３７℃、５％  ＣＯ２の存在下で培養した種々の癌細胞（２〜８×１０３細胞／５０μｌ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェルに分配する。ＴＲＡ−８を、１００ｎｇ／ｍｌの目的の最終産物の濃度を有するよう、１０％  ＦＣＳを含有する培地で調節する。ＴＲＡ−８溶液（１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して、１０％  ＦＣＳを含有する培地での連続２倍希釈を繰り返すことによって、連続希釈物を作製する。希釈した各ＴＲＡ−８溶液を、５０μｌ／ウェルで各ウェルに添加し、３７℃でインキュベートする。３７℃で７２時間反応させた後、１ｍｇ／ｍｌ  ＸＴＴを含有する５０μｌの２５μＭ  ＰＭＳ（フェナジンメトスルフェート；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を添加する（終濃度２５０μｇ／ｍｌ（ＸＴＴ）および５μＭ（ＰＭＳ））。３時間インキュベートした後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定して、指標としてミトコンドリアの還元能力を使用して、細胞生存度を算出する。
【０３２５】
各ウェルにおける細胞の生存度を、以下の式に従って算出する：
生存度（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
（ここで、「ａ」は試験ウェルの測定値であり、「ｂ」は細胞のないウェルの測定値であり、そして「ｃ」は抗体を添加しないウェルの測定値である）。
【０３２６】
この結果を、以下の表３に示す。
【０３２７】
【表３】
2005519871.tif 000007
【０３２８】
種々の癌細胞株は、インビトロ条件下で、ＴＲＡ−８によって強くアポトーシスが誘導される。
【０３２９】
さらに、ＴＲＡ−８は、マウスＤＲ５と交差反応でないので、ＷｉＤｒ細胞を移植したヌードマウスにおけるインビボのＴＲＡ−８の抗腫瘍効果を決定する。
【０３３０】
ＴＲＡ−８抗ヒトＤＲ５抗体を、ヒトＤＲ５分子を発現するヒト異種移植片を保有するヌードマウスに投与する。使用したマウスは、ヒト結腸癌細胞株ＷｉＤｒ（５ｍｍ３）を移植された６週齢のＢＡＬｂ／ｃ  ヌード／ヌードマウス（メス、Ｃｌｅａ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．）であった。腫瘍移植の１日後に、これらの移植マウスを１４回のＴＲＡ−８（５μｇ／匹）の関節内注射によって毎日処理する。ＷｉＤｒ腫瘍の増殖を、腫瘍塊の大きさによって毎日決定する。この結果を、以下の表４に示す。
【０３３１】
【表４】
2005519871.tif 000008
【０３３２】
このモデルにおいて、全ての未処理動物は、目に見える腫瘍増殖を示すが、ＴＲＡ−８処理動物における腫瘍増殖は、腫瘍の大きさによって実証されるように、阻害される。この結果は、ＴＲＡ−８が、インビボでの腫瘍細胞の排除において有効であることを示した。
【０３３３】
（実施例２５．ＴＲＡ−８の組み合わせ研究）
ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、そして１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）；１％Ｌ−グルタミン−２００ｍＭ（２５０３０−１４９、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．５％ペニシリンストレプトマイシン溶液（Ｐ−７５３９、Ｓｉｇｍａ）を含有するＦ−１２Ｋ栄養混合物（２１１２７−０２２、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で維持する。１０％  ＦＢＳおよび０．５％ペニシリンストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＥＤ−００８、ＩＷＡＫＩ）を、以下の実験に使用する。指数関数的に増殖するＰＣ−３細胞をトリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）により回収し、そして新鮮な培地で２度洗浄する。次いで、この細胞を計数し、新鮮な培地に５×１０４細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、そして実験開始の１日前に総量１００μｌ／ウェルで、平底９６ウェルプレート（３５９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔｅｒ）に三連に分配する。ジメチルスルホキシドに溶解させた代表的な抗癌薬であるパクリタキセル（１６９−１８６１１、Ｗａｋｏ）（１０ｍｇ／ｍｌ）を新鮮な培地中で希釈し、次いで、５０μｌ／ウェルの細胞を含む９６ウェルプレートに添加する。ジメチルスルホキシドの終濃度は、０．１％未満である。３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気中で２４時間インキュベートした後、新鮮な培地に希釈したＴＲＡ−８をこれらのウェルに添加する。さらに２４時間インキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴおよび２５ｍＭのＰＭＳを含有する５０μｌの最小必須培地（１１０９５−０９８、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）をこれらのウェルに添加し、そしてこのプレートを６時間インキュベートする。次いで、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によってＯＤ４５０を測定し、細胞生存度を以下に従い算出する。
【０３３４】
細胞生存度（％）＝（タキソールおよび／またはＴＲＡ−８（薬剤）で処理した細胞を含むウェルのＯＤ４５０）−（細胞も薬剤も含まないウェルのＯＤ４５０）×１００／（薬剤を含まない細胞を含むウェルのＯＤ４５０−細胞も薬剤も含まないウェルのＯＤ４５０）。
【０３３５】
代表的な抗癌薬であるパクリタキセルと組み合わせたＴＲＡ−８についての上記アッセイの結果は、以下の通りである。パクリタキセルは、ＰＣ−３細胞の生存度を減少させるが、４０％よりも大きなシグナル（癌細胞の生存を示す）がなお、２００ｎＭまでの濃度で残存していた。注目すべきは、０．１ｎｇ／ｍｌのＴＲＡ−８の添加により、１０％まで癌細胞の生存度が大きく減少したことである（細胞生存度の減少はこの濃度のＴＲＡ−８の単回適用後に見られないにもかかわらず）。この結果は、ＴＲＡ−８が、他の抗癌薬と組み合わせた場合に、相乗的に抗癌活性を示すことをはっきりと示している。
【０３３６】
（実施例２６．ＴＲＡ−８の他の型のヒト化抗体の分析）
（１）ヒト化抗体の設計
ＣＤＲグラフトとして一般的に知られている方法によって、ＴＲＡ−８のヒト化版の構築を実施する。ｍＡＢ５８’ＣＬ抗体を、参照実施例２に記載されるようにアクセプターとして使用し、そしてＴＲＡ−８抗体のＣＤＲ領域を、このアクセプターにグラフトする。フレームワーク領域において、いくつかのアミノ酸を、Ｑｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３，（１９８９））によって提供された基準によって、ＴＲＡ−８またはヒトコンセンサス配列のいずれかからアクセプターにグラフトし、そしてヒト化ＴＲＡ−８配列を、本明細書中以降に記載されるようにして構築する。
【０３３７】
（２）他の型のヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを保有するプラスミドの構築
配列表の配列番号５６に示されるように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のＨ１型ヒト化は、３番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、４０番目のアミノ酸（スレオニン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン酸）、４４番目のアミノ酸（アルギニン）、８４番目のアミノ酸（セリン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アスパラギン、アラニン、バリン、ロイシン、およびバリンとの置換を伴った。
【０３３８】
配列表の配列番号５９に示されるように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の重鎖のアミノ酸配列のＨ３型ヒト化は、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、４０番目のアミノ酸（スレオニン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン酸）、４４番目のアミノ酸（アルギニン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、アルギニン、アラニン、グリシン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびバリンでの置換を伴った。
【０３３９】
配列表の配列番号６０に示されているように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８重鎖のアミノ酸配列のＨ４型のヒト化は、１３番目のアミノ酸（リジン）、１９番目のアミノ酸（リジン）、８８番目のアミノ酸（セリン）、９３番目のアミノ酸（メチオニン）、１１４番目のアミノ酸（スレオニン）、１１５番目のアミノ酸（ロイシン）の、それぞれ、グルタミン、アルギニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびバリンでの置換を伴った。
【０３４０】
配列表の配列番号６１に示されるように、キメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域ＤＮＡを保有するプラスミドを、「Ｍ型」と命名した。さらに、実施例１７および１８に記載されるヒト化ＴＲＡ−８を「Ｈ２型」と命名した。
【０３４１】
ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを保有するプラスミドを、以下のようにして構築する。
【０３４２】
ＰＣＲを使用して、以下のＤＮＡ配列を構築する。これらの各々は、上記を含んだ。
【０３４３】
以下の２４個のオリゴヌクレオチドを合成する：
【０３４４】
【化４−１】
2005519871.tif 000009
【０３４５】
【化４−２】
2005519871.tif 000010
【０３４６】
【化４−３】
2005519871.tif 000011
【０３４７】
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端の８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＨ１型ＤＮＡの合成を、それぞれのＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３４８】
Ｈ１型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３４９】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容量５０μｌまでの再蒸留水。
【０３５０】
ＰＣＲ反応を、以下のように実施する。溶液を、最初に９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の加熱サイクルを、７回反復する。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０３５１】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られたＤＮＡ沈殿物を減圧乾燥し、最少量の再蒸留水に溶解させ、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液によって染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能とする。Ｈ１型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ  １０１，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離によって濃縮し、その後エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解する。
【０３５２】
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端の８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＨ３型ＤＮＡの合成を、それぞれのＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３５３】
Ｈ３型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３５４】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容量５０μｌまでの再蒸留水。
【０３５５】
ＰＣＲ反応を、以下のように実施する。溶液を、最初に９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の加熱サイクルを、７回反復する。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０３５６】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られたＤＮＡ沈殿物を減圧乾燥し、最少量の再蒸留水に溶解させ、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液によって染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能とする。Ｈ３型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離によって濃縮し、その後エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解する。
【０３５７】
分泌シグナル配列、ヒト化ＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端の８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＨ４型ＤＮＡの合成を、それぞれのＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３５８】
Ｈ４型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３５９】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容量５０μｌまでの再蒸留水。
【０３６０】
ＰＣＲ反応を、以下のように実施する。溶液を、最初に９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の加熱サイクルを、７回反復する。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０３６１】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られたＤＮＡ沈殿物を減圧乾燥し、最少量の再蒸留水に溶解させ、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液によって染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能とする。Ｈ４型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離によって濃縮し、その後エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解する。
【０３６２】
分泌シグナル配列、キメラＴＲＡ−８重鎖の可変領域およびＩｇＧ−ＣＨ１領域のＮ末端の８アミノ酸残基を含むポリペプチド鎖をコードするＭ型ＤＮＡの合成を、それぞれのＰＣＲの組み合わせを使用して実施する。
【０３６３】
Ｍ型ＤＮＡフラグメントを、以下のように調製する。
【０３６４】
ＰＣＲ反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドＡ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＢ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＣ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＤ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＥ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＦ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＧ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＨ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＩ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＪ、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＫ３、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドＬ２、１０ｐｍｏｌ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、２μＭ；
オリゴヌクレオチドプライマーＰ２、２μＭ；
１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ緩衝液ＩＩ、１０μｌ；
ｄＮＴＰミックス、８μｌ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌ；および
最終容量５０μｌまでの再蒸留水。
【０３６５】
ＰＣＲ反応を、以下のように実施する。溶液を、最初に９４℃で５分間加熱し、その後、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の加熱サイクルを、７回反復する。この手順の完了後、反応溶液を７２℃で１５分間加熱する。
【０３６６】
フェノール抽出およびエタノール沈殿の後、得られたＤＮＡ沈殿物を減圧乾燥し、最少量の再蒸留水に溶解させ、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液によって染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能とする。Ｍ型ＤＮＡに対応するＤＮＡバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離によって濃縮し、その後エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解する。
【０３６７】
得られた、各抽出されたＤＮＡ（Ｈ１型、Ｈ３型、Ｈ４型およびＭ型）を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、以下のようにクローニングする：
ＰＣＲ反応から回収したＤＮＡフラグメント（Ｈ１、Ｈ３、Ｈ４またはＭ）、５μｌ；
１０×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、１μｌ；
ｄＮＴＰ混合物、１μｌ；
Ｔａｑポリメラーゼ（５単位／ｍｌ）、１μｌ；および
１０μｌの最終容量までの再蒸留水。
【０３６８】
上記の各溶液を、７０℃で３０分間反応させた後、各ＤＮＡ溶液およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、製造者のプロトコルを用いて、結合する。
【０３６９】
１５℃での４時間のインキュベーション後、２μｌのインキュベートした反応溶液を、１００μｌのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９と、１〜２×１０９細胞／ｍｌの密度で混合し（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、そしてこの混合物を、３０分間氷上で維持し、次いで、４２℃で３０秒間おき、そして再度氷上に１分間おく。次いで、５００μｌのＳＯＣ培地（２％  ｖ／ｖトリプトン、０．５％  ｗ／ｖ酵母抽出物、０．０５％  ｗ／ｖ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ  ｗ／ｖ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび２０ｍＭグルコース）をこの混合物に添加し、これを攪拌しながらさらに１時間インキュベートする。次いで、形質転換体株を単離し、そしてプラスミドＤＮＡを、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に記載されるように、この株から調製する。ヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の重鎖をコードするこのＤＮＡのヌクレオチド配列を、それぞれ、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら（１９７７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０３７０】
得られたプラスミドを、ｐＨＡ１５（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ１型重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）、ｐＨＣ１０（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ３型重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）、ｐＨＤ２１（ヒト化ＴＲＡ−８のＨ４型重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）およびｐＭ１１（キメラＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを保有するプラスミド）と称する。これらのプラスミドを保有する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＡ１５、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＣ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＨＤ２１およびＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＭ１１と称する）を、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１−１、Ｈｉｇａｓｈｉ  １  ｃｈｏｍｅ  Ｔｈｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎに、２００１年４月２０日付けで寄託し、そしてそれぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５５５、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５５７、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５５８およびＦＥＲＭ  ＢＰ−７５５９とされた。
【０３７１】
（（３）いくつかの型のヒト化ＴＲＡ−８またはマウスＴＲＡ−８の、重鎖可変領域ＤＮＡを保有する発現プラスミドの構築）
動物細胞についての組換え発現ベクターを、Ｈ１型、Ｈ３型およびＨ４型のヒト化ＴＲＡ−８の重鎖またはＭ型のキメラＴＲＡ−８（上記でクローニングした）の重鎖をコードするＤＮＡを挿入することによって、以下のように構築する。
【０３７２】
ヒト化抗Ｆａｓモノクローナル抗体ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを保有するプラスミドｐＳＲＨＨＨ３（欧州特許出願ＥＰ０  ９０９  ８１６  Ａ１）（哺乳動物細胞についての発現ベクター）１μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして３％アガロースゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後、ゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド水溶液で染色して、ＵＶ光下でのＤＮＡの検出を可能にする。ヒト化ＨＦＥ７Ａの重鎖可変領域を含まずにヒトＩｇＧ１定常領域ゲノムＤＮＡを含むベクターＤＮＡのバンドを、カミソリの刃を使用して切り出し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔを使用してゲルから溶出する。フェノール抽出後、次いで、溶出したＤＮＡを、７，５００×ｇでの遠心分離によって濃縮し、その後エタノール沈殿し、そして最後に５μｌの蒸留水中に溶解し、次いで、ＣＩＰを使用して脱リン酸化する。得られた消化された脱リン酸化プラスミド（１００ｎｇ）を、ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、ｐＨＡ１５、ｐＨＣ１０、ｐＨＤ２１またはｐＭ１１のＤＮＡフラグメント（これらもまた、ＨｉｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化されている）１μｇと、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用して、連結する。次いで、ライゲーション混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、次いで、これを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレートする。
【０３７３】
この方法により得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ｍｌの液体ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養し、続けて、アルカリＳＤＳ法により、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。
【０３７４】
抽出されたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化し、３％  ｗ／ｖ  アガロースゲル電気泳動に供し、ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの挿入片が存在するか否かを確認する。ベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析機（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＤＮＡ配列決定することにより確認する。ヒト化ＴＲＡ−８またはキメラＴＲＡ−８の重鎖をコードするｃＤＮＡを有する得られた発現プラスミドを、それぞれ、ｐＨＡ１５−１、ｐＨＣ１０−３、ｐＨＤ２１−１、およびｐＭ１１−１と称した。
【０３７５】
（（４）ヒト化軽鎖のためのベクターの構築）
（（４．１）ヒト化抗体（ＬＭ１型）の軽鎖のための発現ベクターの構築）
配列表の配列番号７２に示されるように、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端からの３番目のアミノ酸（バリン）、８番目のアミノ酸（ヒスチジン）、９番目のアミノ酸（リジン）、１０番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、１１番目のアミノ酸（メチオニン）、１３番目のアミノ酸（トレオニン）、２０番目のアミノ酸（セリン）、４２番目のアミノ酸（グルタミン）、４３番目のアミノ酸（セリン）、６０番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、６３番目のアミノ酸（トレオニン）、７７番目のアミノ酸（アスパラギン）、７８番目のアミノ酸（バリン）、８０番目のアミノ酸（セリン）、８３番目のアミノ酸（ロイシン）、８５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）、８７番目のアミノ酸（フェニルアラニン）、および９９番目のアミノ酸（グリシン）、１０３番目のアミノ酸（ロイシン）および１０８番目のアミノ酸（アラニン）の置換を伴ったマウス抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８の軽鎖のアミノ酸配列の他のヒト化（ＬＭ１型）は、それぞれ、グルタミン、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、トレオニン、リジン、アラニン、セリン、セリン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、チロシン、グルタミン、バリン、およびトレオニンと置換される。得られた配列は、ＬＭ１と称する。
【０３７６】
この型の抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８のヒト化軽鎖アミノ酸配列（ＬＭ１型、配列表の配列番号７２）を有する発現プラスミドを、以下のように構築する。
【０３７７】
（１）ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１型）の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ１ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７２）をコードするＤＮＡ（その各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖（ＬＭ１型）の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合物である）は、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを用いることにより合成される。
【０３７８】
７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）、７ＡＬＣＮ（配列番号４８）、ＨＫＣＤＦ１１（配列番号５０）、ＨＫＣＤＲ１２（配列番号５１）、ＨＫＣＤＦ２２（配列番号５２）、ＨＫＣＤＲ２２（配列番号５３）、およびＨＫＣＦ１２（配列番号５４）に加えて。
【０３７９】
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０３８０】
【化５】
2005519871.tif 000012
【０３８１】
２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ１型のクローニング）
配列番号７２で定義されるものと同じアミノ酸配列をコードするＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施し、プラスミドベクター内に挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉにクローニングすることによって調製する。
【０３８２】
ａ）第１工程ＰＣＲ
分泌シグナル配列および５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加されたＦＲＬ１領域の一部をコードするＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを以下の条件下で調製する。テンプレートプラスミドｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＰＤＨＨを、欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１の記載に従って得る。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７  ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＳＰＲ１２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ，ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ），２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０３８３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０３８４】
ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２の一部をコードするＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調整する。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＬ２８  ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＦ１１，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＲ１２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０３８５】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０３８６】
ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＣＤＲＬ３の一部をコードするＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ，２５，ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＦ２２，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＤＲ２２，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５  μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５  μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０３８７】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０３８８】
ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４および３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加された定常領域をコードするＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ，２５ｎｇ，
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＣＦ１２，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５  μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０３８９】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０３９０】
ＰＣＲの後、増幅したＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。電気泳動の後、ゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光下で生じたＤＮＡを検出する。次いで、各ＤＮＡバンドを剃刀で切り出す。
【０３９１】
ｂ）第２工程ＰＣＲ
上述のＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡフラグメントを融合するＬＭ１−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ１−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ２−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ３−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ１−Ｆ４−ＤＮＡのゲルフラグメント
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０３９２】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０３９３】
次いで、調製したＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、キットに含まれるコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０Ｆ’に導入する。ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１型）の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７）により確認する。
【０３９４】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２（ヒト化ＴＲＡ−８（ＬＭ１型）の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域コードするｃＤＮＡを有するプラスミド）と名付ける。
【０３９５】
得られたＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ１−２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０３９６】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した、得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡおよびＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％  Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に広げる。得られた白色形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＬＭ１−ＤＮＡフラグメントを有するクローンを１％寒天ゲル電気泳動によって選択する。
【０３９７】
上記の手順の結果、ヒト化ＬＭ１  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２が得られる。これらのプラスミドを有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍｌ−２−２と名付け、微生物寄託のためのブダペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １  ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎ）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６２と一致する）。
【０３９８】
３）  プラスミドｐＳＲ／ＬＭ１−２（ヒト化ＬＭ１  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築
得られた、ヒト化ＬＭ１  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０３９９】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡおよび、ｐＨＳＧ／Ｍ１−２−２から得られるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ寒天上に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および位置を、遺伝子配列分析装置を使用して、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０４００】
得られた、ヒト化ＬＭ１  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを有する発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ１−２と名付ける。
【０４０１】
（４．２）ヒト化抗体（ＬＭ３型）の軽鎖についての発現ベクターの構築
配列表の配列番号７３に示すように、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端からの第８番アミノ酸（ヒスチジン）、第９番アミノ酸（リジン）、第１０番アミノ酸（フェニルアラニン）、第１１番アミノ酸（メチオニン）、第１３番アミノ酸（スレオニン）、第２０番アミノ酸（セリン）、第４２番アミノ酸（グルタミン）、第４３番アミノ酸（セリン）、第７７番アミノ酸（アスパラギン）、第７８番アミノ酸（バリン）、第８０番アミノ酸（セリン）、第８３番アミノ酸（ロイシン）、第８５番アミノ酸（アスパラギン酸）、第８７番アミノ酸（フェニルアラニン）、第９９番アミノ酸，（グリシン）、１０３番アミノ酸（ロイシン）および第１０８番アミノ酸（アラニン）を置換する、ＴＲＡ−８末端マウス抗ヒトＤＲ５抗体軽鎖のアミノ酸配列の、他のヒト化体（ＬＭ３型）は、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、チロシン、グルタミン、バリンおよびスレオニンで置換する。得られる配列をＬＭ３と名付ける。
【０４０２】
この型の抗ヒトＤＲ５抗体のヒト化軽鎖アミノ酸配列、ＴＲＡ−８（ＬＭ３型、配列表の配列番号７３）を有する発現プラスミドを、以下のようにして構築する。
【０４０３】
１）ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成
各々が、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域の融合である、ＬＭ３ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号７３）を、ＰＣＲの組み合わせを使用してそれぞれ合成する。
【０４０４】
さらに、７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ（配列番号４８）について、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０４０５】
【化１３５】
2005519871.tif 000013
【０４０６】
２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ３型のクローニング）
配列番号７３で定義されるものと同じアミノ酸配列をコードするＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施して調製し、プラスミドベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングする。
【０４０７】
ａ）第１工程ＰＣＲ
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列領域コードするＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡフラグメント、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４ならびに定常領域の一部を以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤＩＦ１，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤＩＲ１，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４０８】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４０９】
３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加された定常領域の一部をコードするＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０４１０】
欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１の説明に従って、テンプレートプラスミドｐＳＲＰＤＨＨを得る。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ，２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７，５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４１１】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４１２】
ＰＣＲの後、増幅したＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。電気泳動の後、ゲルを１ｐｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光下で生じたＤＮＡを検出する。次いで、各ＤＮＡバンドを剃刀で切り出す。
【０４１３】
ｂ）第２工程ＰＣＲ
上述のＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを融合するＬＭ３−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ３−Ｆ３１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ３−Ｆ３１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４１４】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４１５】
このように調製したＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、キットに含まれるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ，ＴＯＰ  １０Ｆ’に導入する。ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７）により確認する。
【０４１６】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４（ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域コードするｃＤＮＡを有するプラスミド）と名付ける。
【０４１７】
得られたＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ３−３−４４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４１８】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％  Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢ寒天培地上に広げる。得られた白色形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＬＭ３−ＤＮＡフラグメントを有するクローンを１％寒天ゲル電気泳動によって選択する。
【０４１９】
上記の手順の結果、ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２が得られる。これらのプラスミドを有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２と名付け、微生物寄託のためのブダペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １  ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎ）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６４が与えられた）。
【０４２０】
３）  プラスミドｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０（ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築
得られた、ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４２１】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡおよび、ｐＨＳＧ／Ｍ３−３−２２から得られるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢアガー上に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および位置を、遺伝子配列分析装置（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０４２２】
得られた、ヒト化ＬＭ３  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを有する発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０と名付ける。
【０４２３】
（４．３）ヒト化抗体（ＬＭ４型）の軽鎖についての発現ベクターの構築
配列表の配列番号７４に示すように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＴＲＡ−８と称される）の軽鎖のアミノ酸配列の、他のヒト化体（ＬＭ４型）は、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端からの第８番アミノ酸（ヒスチジン）、第９番アミノ酸（リジン）、第１０番アミノ酸（フェニルアラニン）、第１１番アミノ酸（メチオニン）、第１３番アミノ酸（スレオニン）、第２０番アミノ酸（セリン）、第４２番アミノ酸（グルタミン）、第４３番アミノ酸（セリン）、第７７番アミノ酸（アスパラギン）、第７８番アミノ酸（バリン）、第８０番アミノ酸（セリン）、第８３番アミノ酸（ロイシン）、第８５番アミノ酸（アスパラギン酸）、第９９番アミノ酸（グリシン）、第１０３番アミノ酸（ロイシン）および第１０８番アミノ酸（アラニン）を、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン、バリンおよびスレオニンと置換する。得られる配列をＬＭ４と名付ける。
【０４２４】
この型の抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ４型）のヒト化軽鎖アミノ酸配列（配列表の配列番号７４）を有する発現プラスミドを、以下のようにして構築する。
【０４２５】
１）ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成
各々が、ヒト化抗ＤＲ５  抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域の融合である、ＬＭ４ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ（配列表の配列番号７４）を、ＰＣＲの組み合わせを使用してそれぞれ合成する。
【０４２６】
【数１４１】
2005519871.tif 000014
【０４２７】
。
【０４２８】
２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ４型のクローニング）
配列番号７４で定義されるものと同じアミノ酸配列をコードするＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施して調製し、プラスミドベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングする。
【０４２９】
ａ）第１工程ＰＣＲ
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列領域をコードするＬＭ４−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡフラグメント、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２およびＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４ならびに定常領域の一部を以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ１，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ１，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６２，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７，５ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４３０】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４３１】
３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加された定常領域の一部をコードするＬＭ４−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０４３２】
欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１の説明に従って、テンプレートプラスミドｐＳＲＰＤＨＨを得る。
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ，２５ｎｇ，
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４３３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４３４】
ＰＣＲの後、増幅したＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。電気泳動の後、ゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ光下で生じたＤＮＡを検出する。次いで、各ＤＮＡバンドを剃刀で切り出す。
【０４３５】
ｂ）第２工程ＰＣＲ
上述のＬＭ３−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ３−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを融合するＬＭ４−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ４−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント，
第１工程ＰＣＲで調製されたＬＭ４−Ｆ４１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ，５０ｐｍｏｌ，
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ，５０ｐｍｏｌ，
ｄＮＴＰカクテル，５．０μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液，５．０μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，２．５単位
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって５０μｌの最終容積に調整し、ＰＣＲに使用する。
【０４３６】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱し、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間の温度サイクルを３０回繰り返し、続いて７２℃で１０分間加熱する。
【０４３７】
このように調製したＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってプラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡに挿入し、キットに含まれるコンピテントＥ．ｃｏｌｉ，ＴＯＰ  １０Ｆ’に導入する。ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら、（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７）により確認する。
【０４３８】
得られたプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３（ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域およびヒトＩｇ軽鎖定常領域コードするｃＤＮＡを有するプラスミド）と名付ける。
【０４３９】
得られたＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ４−５−３を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４４０】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０．１％  Ｘ−Ｇａｌおよび５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（最終濃度）を含むＬＢアガー培地上に広げる。得られた白色形質転換体を５０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＬＭ４−ＤＮＡフラグメントを有するクローンを１％寒天ゲル電気泳動によって選択する。
【０４４１】
上記の手順の結果、ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１が得られる。これらのプラスミドを有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１と名付け、微生物寄託のためのブダペスト条約に従って、２００１年４月２０日に、産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １  ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−５４６６，Ｊａｐａｎ）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６５が与えられた）。
【０４４２】
３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３（ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築
得られた、ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇκ鎖の定常領域の融合フラグメントを有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ４−５−３−１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。
【０４４３】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願番号ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで、ＣＩＰで脱リン酸化する。得られた脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡおよび、ｐＨＳＧ／Ｍ５−４−３−１から得られるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。次いで、連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢアガー上に広げる。得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、アルカリＳＤＳ法に従って、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中の所望のＤＮＡフラグメントの挿入および位置を、遺伝子配列分析装置（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＮＡ配列決定により確認する。
【０４４４】
得られた、ヒト化ＬＭ４  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを有する発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３と名付ける。
【０４４５】
（４．４）ヒト化抗体（ＬＭ５型）の軽鎖についての発現ベクターの構築
配列表の配列番号７５に示すように、マウス抗ヒトＤＲ５抗体（ＴＲＡ−８と称される）軽鎖のアミノ酸配列の、他のヒト化体（ＬＭ５型）は、ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列のＮ末端からの第８番アミノ酸（ヒスチジン）、第９番アミノ酸（リジン）、第１０番アミノ酸（フェニルアラニン）、第１１番アミノ酸（メチオニン）、第１３番アミノ酸（スレオニン）、第２０番アミノ酸（セリン）、第４２番アミノ酸（グルタミン）、第４３番アミノ酸（セリン）、第７７番アミノ酸（アスパラギン）、第７８番アミノ酸（バリン）、第８０番アミノ酸（セリン）、第８３番アミノ酸（ロイシン）、第１０３番アミノ酸（ロイシン）および第１０８番アミノ酸（アラニン）を、それぞれ、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、アラニン、スレオニン、リジン、アラニン、セリン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、バリンおよびスレオニンと置換する。得られる配列をＬＭ５と名付ける。
【０４４６】
この型の抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ５型）のヒト化軽鎖アミノ酸配列（配列表の配列番号７５）を有する発現プラスミドを、以下のようにして構築する。
【０４４７】
（１）ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するためのプライマーの合成）
ＬＭ５ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７５）をコードするＤＮＡ（その各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域およびヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域の融合である）を、それぞれ、ＰＣＲの組み合わせを用いて合成する。
【０４４８】
７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）、７ＡＬＣＮ（配列番号４８）、ＭＯＤ１Ｆ１（配列番号７８）、ＭＯＤ１Ｒ１（配列番号７９）、ＭＯＤ１Ｆ２２（配列番号８０）、ＭＯＤ１Ｒ２２（配列番号８１）、ＭＯＤ１Ｆ３（配列番号８２）、ＭＯＤ１Ｒ３（配列番号８３）、ＭＯＤ１Ｆ４２（配列番号８４）、ＭＯＤ１Ｒ４（配列番号８５）、ＭＯＤ１Ｒ５２（配列番号８７）、ＭＯＤ１Ｆ７（配列番号９０）およびＬＲ１７（配列番号１０１）に加えて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲのために合成する：
【０４４９】
【化６】
2005519871.tif 000015
【０４５０】
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖タイプＬＭ５のクローニング））
配列表の配列番号７５に規定されたようなアミノ酸配列をコードするＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施することにより調製し、プラスミドベクター中に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングする。
【０４５１】
ａ）第一のＰＣＲ工程
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加した分泌シグナル配列領域、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４、および定常領域の一部、をコードするＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０４５２】
反応溶液の組成：
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ１、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ２２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ４２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ４、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ５２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ６３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ６３、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｒ７２、５ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマーＬＲ１７、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０４５３】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより５０μｌの最終容量に調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４５４】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間、３０回反復、その後、７２℃で１０分間加熱。
【０４５５】
３’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を付加した定常領域の一部をコードするＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。鋳型プラスミドｐＳＲＰＤＨＨを、欧州特許出願ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１の記載に従うことにより得る。
【０４５６】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ、２５ｎｇ
オリゴヌクレオチドプライマーＭＯＤ１Ｆ７、５０ｐｍｏｌ
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ、５０ｐｍｏｌ
ｄＮＴＰカクテル、５μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液、５μｌ
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、２．５単位。
【０４５７】
上記組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することにより５０μｌの最終容量に調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４５８】
ＰＣＲ温度条件：９４℃で２分間加熱、その後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間、３０回反復、その後、７２℃で１０分間加熱。
【０４５９】
ＰＣＲ後に増幅されたＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。電気泳動後のゲルを１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、生成されたＤＮＡをＵＶ光下で検出する。このように検出されたそれぞれのＤＮＡバンドをカミソリで切り出す。
【０４６０】
（（ｂ）第２工程ＰＣＲ）
上記ＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡフラグメントとＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡフラグメントとが融合されている、ＬＭ５−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
【０４６１】
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ５−Ｆ５１Ｂ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ５−Ｆ５１Ｃ−ＤＮＡのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ（５０ｐｍｏｌ）、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ（５０ｐｍｏｌ）、
ｄＮＴＰカクテル（５．０μｌ）、
１０×ＰＣＲ緩衝液（５．０μｌ）、
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。
【０４６２】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容量５０μｌへと調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４６３】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間の加熱、その後、９４℃にて１分間と、５５℃にて１分間と、７２℃にて２分間との熱サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４６４】
そのように調製したＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡ中に、製造業者のプロトコルに従ってＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して挿入し、そしてそのキット中に含まれるコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’中に導入する。ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、デオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．Ｓ．ら（１９７７）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７）によって確認する。
【０４６５】
生じるプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２（ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８の軽鎖可変領域とヒトＩｇ軽鎖定常領域とをコードするｃＤＮＡを保有する、プラスミド）と名付ける。
【０４６６】
ＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ５−３−４２を、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化する。
【０４６７】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＣＩＰを用いて脱リン酸化する。生じる脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡと、ＬＭ５−ＤＮＡフラグメントと（これらは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化されている）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡで形質転換する。そしてそのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧと、０．１％  Ｘ−Ｇａｌと、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）とを含む、ＬＢ寒天培地上にスプレッディングする。得られる白色形質転換体を、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養する。プラスミドＤＮＡを、得られる培養物から、アルカリ−ＳＤＳ法に従って抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化し、その後、ＬＭ５−ＤＮＡフラグメントを保有するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。
【０４６８】
上記の手順の結果として、ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７を、得る。
【０４６９】
（（３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１（ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築））
ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する、得られたプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７を、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化する。
【０４７０】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡ（欧州特許出願ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１）を、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化し、その後、ＣＩＰを用いて脱リン酸化する。得られる脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡと、ｐＨＳＧ／Ｍ５−３−２７から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ）を使用して連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡで形質転換する。そしてそのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、ＬＢ寒天培地上にスプレッディングする。得られる形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養する。プラスミドＤＮＡを、得られる培養物から、アルカリ−ＳＤＳ法に従って抽出する。ｐＳＲＰＤＨＨベクター中での望ましいＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析機（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０４７１】
ヒト化ＬＭ５  ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするｃＤＮＡを保有する、得られた発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１と名付ける。
【０４７２】
（（４．５）ヒト化抗体（キメラ型）の軽鎖についての発現ベクターの構築）
配列表の配列番号７６に示される配列（キメラ型ＴＲＡ−８軽鎖のアミノ酸配列）を、ＬＭ６と名付ける。
【０４７３】
抗ヒトＤＲ５抗体ＴＲＡ−８（ＬＭ６型）のこの型のヒト軽鎖アミノ酸配列（配列表の配列番号７５）を保有する発現プラスミドを以下のように構築する。
【０４７４】
（１）ヒト化ＬＭ６  ＴＲＡ−８の軽鎖の可変領域および定常領域を調製するための、プライマーの合成）
ＬＭ６ポリペプチド鎖（配列表の配列番号７５）（その各々は、ヒト化抗ＤＲ５抗体ＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇ軽鎖（κ鎖）の定常領域との融合物である）をコードするＤＮＡを、ＰＣＲの組み合わせを使用することによって、それぞれ合成する。
【０４７５】
７ＡＬ１Ｐ（配列番号４７）および７ＡＬＣＮ（配列番号４８）に加えて、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲのために合成する：
【０４７６】
【化１５１】
2005519871.tif 000016
【０４７７】
【化１５２】
2005519871.tif 000017
【０４７８】
（２）プラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６の構築（ヒト化ＴＲＡ−８軽鎖ＬＭ６型のクローニング）
配列表の配列番号７５に規定されるようなアミノ酸配列をコードするＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを、２工程ＰＣＲを実施することによって調製し、プラスミドベクター中に挿入し、そしてＥ．ｃｏｌｉ中にクローン化する。
【０４７９】
（ａ）第１工程ＰＣＲ）
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列およびＦＲＬ１領域とをコードする、ＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。鋳型プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７およびｐＳＲＲＰＤＨＨを、欧州特許出願ＥＰ  ０  ９０９  ８１６  Ａ１の記載に従うことにより得る。
【０４８０】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＨＳＧＨＭ１７  ＤＮＡ（２５ｎｇ）
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ（５０ｐｍｏｌ）、
オリゴヌクレオチドプライマーＨＫＳＰＲ１３（５０ｐｍｏｌ）、
ｄＮＴＰカクテル（５μｌ）、
１０×ＰＣＲ緩衝液（５μｌ）、
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。
【０４８１】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容量５０μｌへと調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４８２】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間の加熱、その後、９４℃にて１分間と、５５℃にて１分間と、７２℃にて２分間との熱サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４８３】
ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、ＦＲＬ４の一部、および定常領域の一部をコードするＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０４８４】
その反応溶液の組成：
プラスミドｐＬ２８  ＤＮＡ（２５ｎｇ）、
オリゴヌクレオチドプライマーＭＶＦ１１（５０ｐｍｏｌ）、
オリゴヌクレオチドプライマーＭＶＦ１２（５０ｐｍｏｌ）、
ｄＮＴＰカクテル（５μｌ）、
１０×ＰＣＲ緩衝液（５μｌ）、
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。
【０４８５】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容量５０μｌへと調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４８６】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間の加熱、その後、９４℃にて１分間と、５５℃にて１分間と、７２℃にて２分間との熱サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４８７】
３’末端にＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位を付加された分泌シグナル配列およびＦＲＬ４とをコードする、ＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントを、以下の条件下で調製する。
【０４８８】
反応溶液の組成：
プラスミドｐＳＥＰＤＨＨ  ＤＮＡ（２５ｎｇ）
オリゴヌクレオチドプライマーＭＣＦ１１（５０ｐｍｏｌ）、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ（５０ｐｍｏｌ）、
ｄＮＴＰカクテル（５μｌ）、
１０×ＰＣＲ緩衝液（５μｌ）、
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。
【０４８９】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容量５０μｌへと調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４９０】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間の加熱、その後、９４℃にて１分間と、５５℃にて１分間と、７２℃にて２分間との熱サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４９１】
ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡフラグメントを、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。電気泳動後のゲルを、１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを用いて染色して、生じたＤＮＡをＵＶ光の下で検出する。そのようにして検出される個々のＤＮＡバンドを、かみそりの刃を用いて切り出す。
【０４９２】
（ｂ）第２工程ＰＣＲ）
上記ＬＭ６−Ｆ４１Ｂ−ＤＮＡフラグメントとＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡフラグメント、ＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡフラグメントおよびＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡフラグメントとが融合されている、ＬＭ６−ＤＮＡを、以下の条件下で調製する。
【０４９３】
反応溶液の組成：
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ６−Ｆ１−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ６−Ｆ２−ＤＮＡのゲルフラグメント、
第１工程ＰＣＲにおいて調製されたＬＭ６−Ｆ３−ＤＮＡのゲルフラグメント、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬ１Ｐ（５０ｐｍｏｌ）、
オリゴヌクレオチドプライマー７ＡＬＣＮ（５０ｐｍｏｌ）、
ｄＮＴＰカクテル（５．０μｌ）、
１０×ＰＣＲ緩衝液（５．０μｌ）、
ａｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）。
【０４９４】
上記の組成を有する反応溶液を、再蒸留水を添加することによって最終容量５０μｌへと調整し、そしてＰＣＲにおいて使用する。
【０４９５】
ＰＣＲ温度条件：９４℃にて２分間の加熱、その後、９４℃にて１分間と、５５℃にて１分間と、７２℃にて２分間との熱サイクルを３０回反復し、その後、７２℃にて１０分間加熱する。
【０４９６】
そのように調製したＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＣＲ３．１ＤＮＡ中に、製造業者のプロトコルに従ってＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して挿入し、そしてそのキット中に含まれるコンピテントＥ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’中に導入する。ヒト化ＴＲＡ−８の軽鎖をコードするこれらのＤＮＡのヌクレオチド配列を、ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、デオキシ法によって確認する。
【０４９７】
生じるプラスミドを、ｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６（マウスＴＲＡ−８とヒトＩｇ軽鎖定常領域とをコードするｃＤＮＡを保有する、プラスミド）と名付ける。
【０４９８】
ＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを含む、得られたプラスミドｐＣＲ３．１／ＬＭ６−１−１６を、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化する。
【０４９９】
１μｇのクローニングプラスミドｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、ＣＩＰを用いて脱リン酸化する。生じる脱リン酸化ｐＨＳＧ３９９  ＤＮＡと、ＬＭ６−ＤＮＡフラグメントと（これらは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化されている）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｔａｋａｒａ  Ｓｙｕｚｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して連結する。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、この連結したＤＮＡで形質転換する。そしてそのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧと、０．１％  Ｘ−Ｇａｌと、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（最終濃度）とを含む、ＬＢ寒天培地上にスプレッディングする。得られる白色形質転換体を、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地中で培養する。プラスミドＤＮＡを、得られる培養物から、アルカリ−ＳＤＳ法に従って抽出する。抽出したプラスミドＤＮＡを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉを用いて消化し、その後、ＬＭ６−ＤＮＡフラグメントを保有するクローンを、１％アガロースゲル電気泳動によって選択する。
【０５００】
上記の手順の結果、マウスＴＲＡ−８軽鎖の可変領域とヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有するプラスミドｐＨＳＧ／Ｍ６−１−４−１が得られる。これらのプラスミドを保有する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α／ｐＨＳＧ／Ｍ６−１−４−１と称される）を、日本国、３０５−５４６６、茨城県つくば市東１丁目１−１の産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに２００１年４月２０日に、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って寄託し、そして受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５６６が付与された。
【０５０１】
（３）プラスミドｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６（キメラ型ＬＭ６  ＴＲＡ−８軽鎖についての発現プラスミド）の構築）
マウスＴＲＡ−８軽鎖の可変領域と、ヒトＩｇκ鎖の定常領域との融合フラグメントを保有する得られたプラスミドｐＨＳＧ／ＬＭ６−１−４−１を、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化する。
【０５０２】
１μｇのクローニングプラスミドｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、次いでＣＩＰで脱リン酸化する。得られる脱リン酸化ｐＳＲＰＤＨＨ  ＤＮＡフラグメントおよびｐＨＳＧ／ＬＭ６−１−４−１から得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（宝酒造株式会社）を用いて連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、この連結されたＤＮＡで形質転換し、そしてＬＢ寒天に広げる。得られる形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む液体ＬＢ培地中で培養し、そしてプラスミドＤＮＡを、アルカリ−ＳＤＳ法に従って、得られる培養物から抽出する。このベクター中での所望のＤＮＡフラグメントの挿入および方向を、遺伝子配列分析機を用いたＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０５０３】
ＴＲＡ−８の軽鎖（キメラ型）をコードするｃＤＮＡを保有する、得られる発現プラスミドを、ｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６と称する。
【０５０４】
（（５）いくつかの型のヒト化ＴＲＡ−８抗体またはキメラＴＲＡ−８抗体の産生）
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションを、ＦＵＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ）によって、このキットに提供される指示マニュアルに従って行う。
【０５０５】
ＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）を、半コンフルエント（３×１０６細胞／ディッシュ）にまで、１０％ウシ胎仔血清（本明細書中以後、「ＦＣＳ」と略す；Ｍｏｒｅｇａｔｅ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（本明細書中以後、「Ｄ−ＭＥＤ」という；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む培養ディッシュ（培養面積：５７ｃｍ２；住友ベークライト）中で増殖させる。
【０５０６】
その間に、アルカリ−ＳＤＳ法および塩化セシウム密度勾配遠心分離によって調製した、１０μｇ／ディッシュ（合計５ディッシュ）のヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ１５−１）および１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡを混合し、次いでエタノールで沈澱させ、続いて５μｌ／ディッシュのｄＨ２Ｏに懸濁させる。
【０５０７】
１５μｌ／ディッシュのＦＵＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬を１８０μｌ／ディッシュのＤ−ＭＥＭ（ＦＣＳを含まず）と混合した後、このＦＵＧＥＮＥ溶液（１８５μｌ／ディッシュ）を、５μｌ／ディッシュのＤＮＡ溶液（１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５重鎖発現プラスミドＤＮＡおよび１０μｇ／ディッシュのヒト化ＤＲ５軽鎖発現プラスミドＤＮＡを含む）と混合する。室温での１５分間のインキュベーション後、得られるプラスミド懸濁物（２００μｌ）を、予め調製したＣＯＳ−７プレートに添加する。５％  ＣＯ２中で３７℃にて２４時間インキュベートした後、培養培地を、Ｄ−ＭＥＭ（ＦＣＳを含まない）に交換する。５％  ＣＯ２中で３７℃にて７２時間インキュベートした後、培養上清を取り出して、上清液中の発現産物を精製する。上記の通りの方法によって、ＣＯＳ−７細胞を、以下のプラスミドの組み合わせの各々でトランスフェクトする：
（Ａ）：ｐＨＡ１５−１およびｐＳＲ／ＬＭ１−２（Ｈ１Ｌ１）の共トランスフェクション
（Ｂ）：ｐＨＢ１４−１およびｐＳＲ／Ｍ２−１（Ｈ２Ｌ２）の共トランスフェクション
（Ｃ）：ｐＨＢ１４−１およびｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０（Ｈ２Ｌ３）の共トランスフェクション
（Ｄ）：ｐＨＢ１４−１およびｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３（Ｈ２Ｌ４）の共トランスフェクション
（Ｅ）：ｐＨＣ１０−３およびｐＳＲ／Ｍ２−１（Ｈ３Ｌ２）の共トランスフェクション
（Ｆ）：ｐＨＣ１０−３およびｐＳＲ／ＬＭ３−３−４４−１０（Ｈ３Ｌ３）の共トランスフェクション
（Ｇ）：ｐＨＣ１０−３およびｐＳＲ／ＬＭ４−５−３−３（Ｈ３Ｌ４）の共トランスフェクション
（Ｈ）：ｐＨＤ２１−１およびｐＳＲ／ＬＭ５−３−２７−１（Ｈ４Ｌ５）の共トランスフェクション
（Ｉ）：ｐＭ１１−１およびｐＳＲ／ＬＭ６−１−４−６（キメラ）の共トランスフェクション。
【０５０８】
次いで、培養物を遠心分離（３，５００ｒ．ｐ．ｍ．、１５分間）し、そして上清を収集する。この上清を、０．４５μｍフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＯＹＯ  ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ、カタログ番号２５ＣＳ０４５  ＡＳ）を用いて濾過する。この濾液からのＩｇＧの精製を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ＰＯＲＯＳアフィニティークロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を以下：
ＨＰＬＣ系：ＢｉｏＣＡＤ  ７００Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
カラム：ＰｒｏｔｅｉｎＧ−ＩＤセンサーカートリッジ
（カラムサイズ：２．１ｍｍＩＤ×３０ｍｍＬＤ、ベッド容積：０．１ｍｌ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
溶出緩衝液：０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）
中和緩衝液：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
検出：２８０ｎｍ
流速：１ｍｌ／分
画分サイズ：０．５ｍｌ／０．５分
画分チューブ：１．５ｍｌポリプロピレンマイクロチューブ
温度：４℃
の条件下で用いて達成する。
【０５０９】
全ての濾液をカラムに適用した後、５０ｍｌのＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０００−３）を用いてカラムを洗浄する。この溶出緩衝液を適用したときに、フラクションコレクターを始動させる。各画分マイクロチューブは、５５μｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、１１０μｌの中和緩衝液、および７４μｌの２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−７０３０）をＰＢＳ中に予め含んでいた。７番目〜８番目の画分を収集する。
【０５１０】
ヒト化抗体の発現確認および調製した培養上清流体中の発現産物の定量アッセイを、抗ヒトＩｇＧに対する抗体を用いるＥＬＩＳＡによって行う。
【０５１１】
９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）の各ウェルに、吸着緩衝液（０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中に０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で溶解された１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｋａｐｐｅｌ）を添加し、そしてプレートを、３７℃で２時間インキュベートし、抗体を吸着させた。次いで、プレートを３５０μｌのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。洗浄後のウェルに、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで希釈した培養上清を添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで再び洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで１０，０００倍に希釈した１００μｌのアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．）を、各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。再びＰＢＳ−Ｔで洗浄後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）から得たリン酸ｐ−ニトロフェニルの基質溶液を、キットに提供される指示マニュアルに従って、添加する。３７℃で０．５〜１時間インキュベーション後、４０５ｎｍにおける吸収を測定する。本実施例において、特定の濃度まで、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭで希釈されたヒト血漿免疫グロブリンＧサブクラス１（ＩｇＧ１）（Ｂｉｏｐｕｒｅ  ＡＧ）を培養上清流体に含まれるヒト化ＤＲ５抗体の濃度参照サンプルとして使用する。
【０５１２】
結果として、培養上清中の発現および精製産物は、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて特異的に検出される。ヒトＩｇＧ抗体の最終濃度は、それぞれ、４４．０３μｇ／ｍｌ（Ｈ１Ｌ１）、３９．８μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ２）、２６．７μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ３）、４１．０μｇ／ｍｌ（Ｈ２Ｌ４）、３９．３μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ２）、２４．７μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ３）、２１．５μｇ／ｍｌ（Ｈ３Ｌ４）、１６．７μｇ／ｍｌ（Ｈ４Ｌ５）および１８．３μｇ／ｍｌ（キメラ）である。
【０５１３】
（（６）いくつかの型のヒト化抗体またはキメラ抗体のアポトーシス誘導活性）
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）を使用して、精製ヒト化ＴＲＡ−８抗体のアポトーシス誘導活性を調べた。
【０５１４】
５％ＣＯ２の存在下で、３日間、３７℃で１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とともにＲＰＭＩ１６４０培地中で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウェルマイクロプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）の各ウェル中に、ウェル当たり５０μｌで分配した。この実施例２６において調製されたヒト化ＴＲＡ−８を、実施例２６に記載される方法に従って、流体中のそれらの濃度を推定することによって、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、１００ｎｇ／ｍｌの目的の最終産物の濃度を有するように調節する。このように、１００ｎｇ／ｍｌに調節された発現産物の溶液のそれぞれを使用して、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いて連続的な２倍希釈を繰り返すことによって、連続希釈物を作製する。希釈されたヒト化ＴＲＡ−８溶液（Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４またはＨ４Ｌ５）の各々を、５０μｌ／ウェルで各ウェルに添加した。３７℃で１２時間反応させた後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴを含む５０μｌの２５μＭ  ＰＭＳを添加する（ＸＴＴについて２５０μｇ／ｍｌおよびＰＭＳについて５μＭの最終濃度）。３時間インキュベーション後、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を、指数としてミトンコンドリアの還元能力を使用することによって、細胞の生存能力を計算するために測定する。
【０５１５】
各ウェル中の細胞の生存能力を、以下の一般式に従って計算する：
生存能力（％）＝１００×（ａ−ｂ）／（ｃ−ｂ）
ここで、「ａ」は、試験ウェルの測定値であり、「ｂ」は、細胞の無いウェルの測定値であり、そして「ｃ」は、抗体を添加しないウェルの測定値である。
【０５１６】
結果として、試験されたヒト化抗体は、ヒトＤＲ５抗原を発現するＴリンパ腫細胞株の細胞中のアポトーシスを誘導することが実証される。
【０５１７】
さらに、ＰＣ−３に対するヒト化ＴＲＡ−８のアポトーシス誘導活性は、実施例２５に記載される方法に従って、タキソールを添加することによって試験される。
【０５１８】
ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得、そして１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％Ｌ−グルタミン−２００ｍＭ（２５０３０−１４９、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および０．５％ペニシリンストレプトマイシン溶液（Ｐ−７５３９、Ｓｉｇｍａ）を含むＦ−１２Ｋ栄養混合物（２１１２７−０２２、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で維持する。１０％ＦＢＳおよび０．５％ペニシリンストレプトマイシン溶液を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＥＤ−００８、ＩＷＡＫＩ）を、以下の実験において使用する。指数関数的に増殖するＰＣ−３細胞を、トリプシン処理によって収集し、そして新鮮な培地を用いて２回洗浄する。次いで、細胞を計数し、新鮮な培地に５×１０４細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、そして実験の開始の前の日に、１００μｌ／ウェルの合計容積で、平底９６ウェルプレート（３５９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔｅｒ）中に３連で分配する。代表的な抗癌剤（ジメチルスルホキシドに溶解したパクリタキセル（１６９−１８６１１、Ｗａｋｏ）（１０ｍｇ／ｍｌ））を新鮮な培地に希釈し、次いで、５０μｌ／ウェルで細胞を含む９６ウェルプレートに添加する。ジメチルスルホキシドの最終濃度は、０．１％未満である。３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で、２４時間のインキュベーション後、新鮮な培地に希釈したヒト化ＴＲＡ−８抗体（Ｈ１Ｌ１、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４またはＨ４Ｌ５）をウェルに添加する。さらに２４時間のインキュベーション後、１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴおよび２５ｍＭのＰＭＳを含む５０μｌの最小必須培地（１１０９５−０９８、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を、ウェルに添加し、そしてプレートを６時間インキュベートする。次いで、ＯＤ４５０を、ＡＲＶＯ  ＨＴＳ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）によって測定し、細胞生存能力を以下のように計算する。
【０５１９】
細胞生存能力（％）＝（タキソールおよびヒト化ＴＲＡ−８（薬剤）で処理された細胞を含むウェルについてのＯＤ４５０）−細胞も薬剤も含まないウェルについてのＯＤ４５０）×１００／（薬剤を含まない細胞を含むウェルについてのＯＤ４５０−細胞も薬剤も含まないウェルについてのＯＤ４５０）
結果として、試験されたヒト化抗体は、ヒトＤＲ５抗原を発現するヒト前立腺癌細胞におけるアポトーシスを誘導することが実証される。
【０５２０】
（実施例２７．ＤＲ４抗体の産生）
ヒトＤＲ４の細胞外ドメイン（ａ．ａ．１〜２３６）およびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む融合タンパク質を、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞において発現させた。融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティーカラムによって精製する。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、上記精製融合タンパク質で免疫した。１つのハイブリドーマクローン（２Ｅ１２（ＩｇＧ１，κ））（ＤＲ４に対する特異的結合およびＲａｍｏｓヒトＢリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する）を３回、サブクローン化した。２Ｅ１２の結合特異性は、コントロール抗原としてヒトＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２およびＩｇＧ１融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析によって決定した。細胞表面ＤＲ４に対する２Ｅ１２の結合を、ヒトＤＲ４をコードする全長ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞のフローサイトメトリー分析によって決定した。アポトーシス誘導活性を、ヤギ抗マウスＩｇＧ１の存在下で、１μｇ／ｍｌ  ２Ｅ１２とともにＲａｍｏｓ細胞をインキュベートすることによって決定した。細胞生存能力を、上記のＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【０５２１】
（実施例２８．ＤＲ４抗体の特徴付け）
ＤＲ４モノクローナル抗体（２Ｅ１２）は、ＥＬＩＳＡにおいて他のＴＲＡＩＬレセプター（例えば、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）に結合しなかった（図１９ａ）ので、ヒトＤＲ４に特異的である。２Ｅ１２は、ＤＲ４トランスフェクトＣｏｓ−７細胞のフローサイトメトリー分析によって実証されるように、細胞表面ＤＲ４を認識した（図１９ｂ）。２Ｅ１２は、用量依存性様式で架橋する二次抗体の存在下で、Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞のアポトーシスを誘導し得る（図１９ｃ）。２Ｅ１２でのＲａｍｏｓ細胞のインビトロ処理は、カスパーゼ８、９および３の時間依存性活性化、ならびにＰＡＲＰの切断を生じた（図１９ｄ）。これらの結果は、２Ｅ１２が、アゴニスト性抗ＤＲ４抗体であることを示し、これは、カスパーゼ依存性様式でアポトーシスを誘導する。
【０５２２】
抗ＤＲ４（２Ｅ１２）、続いて、ＰＥ結合化ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体およびフローサイトメトリーを使用して、ＤＲ４抗体は、線維肉腫細胞株（Ｈｓ９１３Ｔ）およびいくつかの乳癌細胞株（２ＬＭＰ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１、およびＭＤＡ−ＭＢ  ４５３）の細胞に結合することが示されるが、正常なヒト皮膚線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ−３）に結合しないことはほとんど示されなかった。
【０５２３】
（実施例２９．ＤＲ４抗体の殺腫瘍活性）
２Ｅ１２の殺腫瘍活性を、乳癌腫瘍モデルを使用して試験した。ヌードマウスに、ｓ．ｃ．で、ヒト乳癌細胞株（２ＬＭＰ）を接種した。２００μｇの２Ｅ１２のｉ．ｐ．用量での処置を、腫瘍細胞注射の７日後、１０日後、１４日後、１７日後、２１日後、および２４日後に行った。動物に、８日目、１２日目、および１６日目に、ｉ．ｖ．アドリアマイシン（ドキソルビシン）（６ｍｇ／ｋｇ）を、受容させた。２Ｅ１２およびアドリアマイシンでの処置（図２０）は、２Ｅ１２単独またはアドリアマイシン単独のいずれよりも大きな腫瘍増殖阻害を生成した。
【０５２４】
２Ｅ１２と組み合わせたＴＲＡ−８の殺腫瘍活性を、同じ乳癌腫瘍モデルを使用して試験した。２００μｇのＴＲＡ−８および２Ｅ１２のｉ．ｐ．用量での処置を、腫瘍細胞注射の７日後、１０日後、１４日後、１７日後、２１日後、および２４日後に行った。動物に、８日目、１２日目、および１６日目に、ｉ．ｖ．アドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）を、受容させた。ＴＲＡ−８および２Ｅ１２、またはＴＲＡ−８および２Ｅ１２およびアドリアマイシンでの処置は、それぞれ、８８％の腫瘍退縮および１００％の完全腫瘍退縮を生じた（図２１）。
【０５２５】
（実施例３０．他の治療と組み合わせたＤＲ４／ＤＲ５抗体の殺腫瘍活性）
（（１）細胞株および試薬）
ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の２ＬＭＰサブクローン、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５のＬＣＣ６サブクローン、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１のＤＹ３６Ｔ２サブクローンを、Ｄｒ．Ｍａｒｃ  Ｌｉｐｍａｎｎ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）から得、そして１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充した改善ＭＥＭにおいて維持した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３、およびＺＲ−７５−１のヒト乳癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、ＭＥＭビタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。ＢＴ−４７４細胞を、１０μｇ／１ｍｌのインシュリン、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１５％ＦＢＳを有するＭｃＣｏｙの培地で増殖させた。ＺＲ−７５−１細胞を、２０％ＦＢＳを有するＨａｍのＦ１２Ｋ培地で増殖させた。全ての細胞株を、抗生物質を含まない培地において、３７℃で５％のＣＯ２雰囲気下で維持し、そしてマイコプラズマ混入について慣用的にスクリーニングした。
【０５２６】
精製されたＴＲＡ−８（ＩｇＧ１）ｍＡｂを、ＵＡＢにおいて作製し、そしてまた、Ｓａｎｋｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって提供した。フィコエリトリン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１およびアイソタイプ特異的ＩｇＧ１コントロール抗体を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得た。アドリアマイシンおよびパクリタキセルを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そしてそれぞれ、蒸留したＨ２ＯまたはＤＭＳＯ中の１０ｍＭストック溶液として調製した。動物の研究について、パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の臨床処方物を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から得た。この調製物を、使用の直前に、ＰＢＳ中で１：５に希釈した。
【０５２７】
（（２）ＤＲ５発現の免疫蛍光抗体分析およびフローサイトメトリー分析）
対数増殖期中の細胞を、いったんＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋欠乏）で洗浄し、そして３７℃で４ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．５％  ＫＣｌで収集した。細胞を、１，０００ｒｐｍで４℃で５分間の遠心分離によって収集し、いったん洗浄し、そして４℃で１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含むＰＢＳ中に再懸濁した。細胞を、４℃で６０分間１０μｇ／ｍｌの精製ＴＲＡ−８またはアイソタイプ特異的ＩｇＧ１コントロール抗体と共にインキュベートし、いったん緩衝液で洗浄し、次いで４℃で２０分間１０μｇ／ｍｌのＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。抗体染色後、細胞を、いったんＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして氷上で１５分間１％パラホルムアルデヒド中で固定した。サンプルを、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）上で分析し、そしてデータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【０５２８】
（（３）ＡＴＰＬｉｔｅを使用する細胞生存能力アッセイ）
細胞を、トリプシン処理し、そして完全な培養媒地中に再懸濁した。ウェル当り１，０００細胞を、光学的なに透明な９６ウェル黒プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３９０４、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中でプレートし、そして処置を開始する前に３７℃で一晩インキュベートした。薬物および抗体を、使用する直前に培養媒地中で希釈し、そしてＤＭＳＯの最終濃度を、常に０．００１％以下にした。細胞生存能力を、ＴＲＡ−８単純に対し２４時間暴露した後評価した。細胞傷害性薬物を用いる組み合わせ処置のため、細胞を、抗体を加える前に２４時間薬物で前処置し、そしてさらに２４時間インキュベートし、ＡＴＰＬｉｔｅ発光ベースのアッセイ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を使用して細胞ＡＴＰレベルの測定によって細胞生存能力を評価した。製造業者の推奨プロトコールに、全ての反応容量（培養媒地および試薬）を半分まで減少した以外は従った。全てのサンプルを、三連でアッセイし、そして３つの独立した実験の最小から平均±ＳＥとして報告した。
【０５２９】
（（４）無胸腺症ヌードマウス支持面胸癌異種移植片におけるＴＲＡ−８のみの治療研究または化学療法もしくは放射線との組み合わせ）
無胸腺症ヌードマウスに、３×１０７  ２ＬＭＰ細胞を皮下注入した。腫瘍細胞注入後７日で、２００または６００μｇ（１０または３０ｍｇ／ｋｇ）ＴＲＡ−８を、腹腔内に投与し、続いて１０日、１４日、１７日、２１日、および２４日に５回のさらなる注射をした。腫瘍の増殖を、経時的にモニターした。次の研究において、２ＬＭＰ皮下腫瘍を有する動物に、７日、１０日、１４日、１７日、２１日および２４日に単独で、２００μｇのＴＲＡ−８をｉ．ｐ．注射するか、またはアドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ静脈内、８日、１２日および１６日）もしくはパクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内、８日、１２日、１６日、２０日、および２４日）と組み合わせを用いて腹腔内に注射した。腫瘍サイズおよび後退速度を、決定した。さらに、研究を、９日および１７日に２ＬＭＰ異種移植片の３Ｇｙ６０Ｃｏ照射と組み合わせて、上記される同じレジメンを使用してＴＲＡ−８およびアドリアマイシンを用いて実施した。
【０５３０】
（（５）異種移植片におけるアポトーシスの分析）
０日で３×１０７  ２ＬＭＰ細胞を皮下注射された無胸腺症ヌードマウスは、７日および１０日に腹腔内に１００μｇＴＲＡ−８を受容した。２匹のマウスの群は、８日および１１日にアドリアマイシン（３ｍｇ／ｋｇ）、８日および１１日にパクリタキセル（１０ｍｇ／ｋｇ）、または同じ用量およびスケジュールでＴＲＡ−８とアドリアマイシンもしくはパクリタキセルの組み合せを受容した。マウスの一つの群を、処置しなかった。異種移植片を、腫瘍細胞注入後、１４日でアポトーシスの研究のために解剖した。本発明者らの標準処置プロトコールと比較しての、処置強度における実質的な減少についての理由は、１４日目に適合腫瘍組織を分析させることであった。腫瘍異種移植片におけるアポローシスに対するチュネル（ｔｕｎｅｌ）アッセイを、以下のように実施した。組織の５ミクロンパラフィン切片を、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓスライド上にマウントし、そして５８℃で１時間加熱した。組織切片を、キシレンの３つの変化で脱パラフィン化し、そして無水エタノール、９５％エタノール、および７０％エタノール（各５分増分で）の一つの変化で再水和した。次いで、切片を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０００２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．６）中に配置した。アポトーシス核を、Ａｐｏｐ  Ｔａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅキット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ＮＹ）を使用して検出した。タンパク分解酵素Ｋ（蒸留脱イオン水中で２０μｇ／ｍｌ）を、組織試料に加え、そして１５分間室温でインキュベートした。内因性ペルオキシダーゼを、５分間３％過酸化水素の水溶液でクエンチした。切片を、３０分間平衡緩衝液で処理し、次いでパラフィルムカバーを使用して、３７℃で１時間、ＴｄＴ／酵素（標識反応混合液中で希釈された）を用いてインキュベートした。このインキュベーションの間、ＴｄＴ酵素は、ＤＮＡ断片の３’−ＯＨ末端に結合し、そしてジゴキシゲニン標識デオキシヌクレオチドおよび非標識デオキシヌクレオチドの付加を触媒する。ネガティブコントロールを、ＴｄＴ酵素の代わりに蒸留Ｈ２Ｏ（標識反応混合液中で希釈された）を用いてインキュベートした。停止緩衝液を、標識反応を終了させるため室温で１０分間加えた。抗ジゴキシゲニン結合体を、３０分間、各スライドに加えた。クロマゲン３，３’ＤＡＢを、ＤＮＡ断片の標識３’ＯＨ末端を可視化するために使用した。次いで、スライドを、脱イオン水中でリンスし、ヘマトキシリンですばやく対比染色し、等級のアルコールおよびキシレンを使用して脱水された、そしてＰｅｒｍｏｕｎｔを使用してカバースリップした。約１０のランダム領域を、染色されたＴｕｎｅｌのパーセンテージおよび組織の全体にわたって激しく染色されたアポトーシス体のパーセンテージについて評価した。
【０５３１】
（（６）統計分析）
（Ａ）インビトロでの薬物細胞傷害性とのＴＲＡ−８相互作用の分析
細胞傷害性データを、混合細胞傷害性効果の組み合わせが、相加的、相加的より少ない（アンタゴニスト）、または相加的より多い（相乗作用）であるかを判定するために評価した。薬剤だけおよびその組み合せについての用量応答関係を、Ｇｅｎｎｉｎｇｓ（Ｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ／Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ、ｐｐ．４５７−４６８、２０００）によって推薦されるような、９細胞株（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ｄ．Ｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ、２００１）の各々について１次項、２次項および相互作用項を使用して２次応答表面モデルを使用してモデル化した。有意な相互作用項を、相互作用項が、相加的細胞傷害性より多くネガティブであるか、または相加的細胞傷害性未満でポジティブであるかに依存する相乗作用またはアンタゴニストのいずれかとして分類した。相互作用項が有意でない場合、ＴＲＡ−８とアドリアマイシンとの間、またはＴＲＡ−８とパクリタキセルとの間の関係を、相加的と見るし、相加的期間が、有意であった。
【０５３２】
（（Ｂ）個々の動物実験のＴＲＡ−８、化学療法、放射治療およびその組み合せ治療の分析）
６つの独立実験からのデータを、個々の実験によって分析した。処置の組み合せを、インビボ抗腫瘍効力（すなわち、腫瘍増殖の阻害）に関して比較し、そして３つの終点；腫瘍２倍化時間の延長、腫瘍後退のパーセンテージ、および時間にわたっての増殖比率として測定した。腫瘍細胞注入の７回後のベース株に対する腫瘍が表面積（２つの直径の産物）中で倍加する実際の日数が、倍加時間分析において使用された。パラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を、処置の間のメジアン腫瘍倍加時間の比較のために使用した。Ｆｉｓｈｅｒの正確な試験を、処置群にわたる腫瘍後退および無再発後退の比率を比較するために使用した。任意の組み合せ治療が、腫瘍増殖の有意な相乗作用阻害（すなわち、相加的より大きい）を生じるか否かを決定するために、連続面積測定からの増殖曲線を、治療を開始した後の最初の３週間にわたって線型混合モデルアプローチを使用して比較した（Ｌｉｎｄｓｅｙ、Ｊ．Ｋ．Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ、ｐｐ．１００−１４２、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９３）。組み合せ治療の相乗作用効果についての試験のため、相互作用期間を、モデル中に含めた。相互作用項が、有意であり、そして効果が、相加的より大きい速度での増殖の阻害であった場合、相互作用を、相乗作用とみなした。
【０５３３】
（（Ｃ）治療効果の凝集分析）
１６６動物の合計、１０処置群、および６独立実験を、凝集分析中に含んだ。処置の組み合せを、インビボ抗腫瘍効力に関して比較した。メジアン腫瘍倍加時間を、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を使用して分析し、そしてＦｉｓｈｅｒの正確な試験を、処置群の全体にわたって腫瘍後退および無再発後退の比率を比較するために使用した。
【０５３４】
すべての統計分析を、ＳＡＳ（登録商標）を使用して実施した（Ｓａｓ／Ｓｔａｔ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、ＳＡＳ  ＯｎｌｉｎｅＤｏｃ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８、Ｃａｒｙ  ＮＣ：ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．、１９９９）。
【０５３５】
（（６）乳癌細胞株に関するＤＲ５発現およびＴＲＡ−８誘導性細胞傷害性）
図２２Ａに証明されるように、全ての９乳癌細胞株は、強力なポジティブ（ＬＣＣ６およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３）から弱いポジティブ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＳＫ−ＢＲ−３）までの発現の程度の変化を有するＤＲ５ポジティブであった。図２２Ｂは、９細胞株のＴＲＡ−８誘導細胞傷害性を示す。４細胞株は、１７〜２９９ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０濃度を有するＴＲＡ−８誘導細胞傷害性に対して感受性があり（ＬＣＣ６、２ＬＭＰ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、一方他は、かなりの耐性があった（ＤＹ３６Ｔ２、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８によって示されるように、ＤＲ５発現とＴＲＡ−８誘導性細胞傷害性の程度には良好な相関は存在しなかった。
【０５３６】
次いで、化学療法誘導性細胞傷害性におけるＴＲＡ−８の効力を、アドリアマイシン（図２３Ａ）およびパクリタキセル（図２３Ｂ）を用いて試験した。抗体効果と薬物効果との間の相互作用について試験するための分析を、表５にまとめる。ＴＲＡ−８とパクリタキセルとの間には有意な相乗作用的な相互作用は存在せず、相互作用のほとんどが相加的であった。９細胞株のうち４細胞株が、ＴＲＡ−８とアドリアマイシンとの間の相乗作用的な相互作用についての基準を満たした。細胞株２ＬＭＰは、ＴＲＡ−８に対する良好な感受性、およびアドリアマイシンまたはパクリタキセルのいずれかに対する良好な感受性を実証した。この細胞株を、抗体および／または薬物のインビボでの効力を調査するために選択した。
【０５３７】
【表５−１】
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【０５３８】
ａ  ｐ値は、相乗作用的な相互作用項の有意性をいう。ＴＲＡ−８および薬物の効果の両方が有意であり、かつ相互作用項が有意であった場合、併用効果を相乗作用的であるとみなした。相互作用のｐ値が０．０５よりも少なくない場合、併用効果を相加的であるとみなした。
ｂ  ＴＲＡ−８の効果が有意でなかったが、アドリアマイシン／パクリタキセルの効果が有意であったので決定しなかった。
ｃ  どちらの薬剤についても有意な用量応答は存在しなかった。
【０５３９】
（（７）ＴＲＡ−８単独あるいは化学療法および／または放射線との併用のインビボ抗腫瘍効果）
２００μｇおよび６００μｇの用量で、週２回、６回投与のＴＲＡ−８は、十分に確立した２ＬＭＰ皮下腫瘍に対する腫瘍増殖の類似した阻害を生じた（図２４）。さらなる３つの独立した実験において、２００μｇ用量／スケジュールは、未処置コントロールと比べて統計学的に有意な腫瘍増殖の阻害（ｐ＜０．００４、腫瘍倍化時間に関するクラスカルワリス検定）を生じ、この用量およびスケジュールをさらなる研究のために選択した。図２５は、抗腫瘍効力に対するＴＲＡ−８、アドリアマイシンまたはＴＲＡ−８とアドリアマイシンの併用の効果を示す。未処置のコントロールと比較した場合、ＴＲＡ−８単独またはＴＲＡ−８＋アドリアマイシンを用いた治療は、腫瘍増殖の有意な阻害を生じた（ｐ＝０．００２  クラスカルワリス検定）が、一方、アドリアマイシンは、コントロールと差異はなかった。ＴＲＡ−８＋アドリアマイシンの併用は、どちらかの薬剤単独よりもより大きな増殖阻害を生じ（ｐ＝０．００２）、そしてどちらかの薬剤単独（完全な後退は見とめられなかった）よりも腫瘍（４つ）のより完全な、有意な後退を生じた（ｐ＜０．００１、フィッシャーの直接確率検定）。インビボでのＴＲＡ−８およびアドリアマイシンの相乗作用を、初期増殖曲線分析を用いて評価した。相互作用項は有意であり、（ｐ＜０．００１）、かつ相乗作用的であった。この相乗作用的な相互作用を、第二の独立した実験において確認した。
【０５４０】
ＴＲＡ−８およびパクリタキセルの効果を、類似の観察を有するこの同一モデルにおいて研究した（図２６）。未処置のコントロールと比較した場合、ＴＲＡ−８およびＴＲＡ−８＋パクリタキセルは、腫瘍増殖の有意な阻害を生じた（ｐ＜０．００１、クラスカルワリス検定）。ＴＲＡ−８＋パクリタキセルで処置した動物における腫瘍増殖は、パクリタキセル単独よりも有意な差であり（ｐ＝０．００８）、そしてどちらの薬剤単独もない場合と比べて、３／８が完全な後退を生じた。初期腫瘍増殖曲線の分析は、相乗効果がほぼ有意である（ｐ＝０．０６３）が、相加的効果が有意であった（ｐ＜０．００１）ことを実証した。
【０５４１】
最終的に、ＴＲＡ−８、アドリアマイシンおよび６０Ｃｏ照射の効果を、図２７に示されるように、単独の薬剤および種々の組み合わせとして分析した。腫瘍倍化時間について全体として有意差（ｐ＜０．００１）が存在し、そして多様な比較は、ＴＲＡ−８、アドリアマイシン、および６０Ｃｏを用いた三重の治療が、他の処置群全てより有意差のある腫瘍増殖阻害を生じたが、２重治療群（アドリアマイシン＋ＴＲＡ−８、または６０Ｃｏ＋ＴＲＡ−８）の両方は、どちらの単独薬剤群とも異なる（ｐ＜０．００１）ことを示した。放射線単独で処置した６０Ｃｏ動物は、未処置コントロールと差がなかった（ｐ＝０．９２６）。２方法の処置の組み合わせの全ては、有意な相乗作用的効果を有した（ｐ＜０．００１）。完全な後退は、３重の治療を受けた６／８の動物に見られ、そして４匹の動物は１８０日の追跡の間、腫瘍の再発を有さなかった。
【０５４２】
（（８）治療効果の集計的分析）
インビボ抗腫瘍研究には１６６匹の動物を含め、そして各処置群における全ての動物について腫瘍倍化時間および完全腫瘍後退の頻度を分析した（表６）。平均腫瘍倍化時間についてのＡＮＯＶＡ分析により、多数の比較で処置群間の有意な差異（ｐ＜０．００１）を示し、これは、ＴＲＡ−８＋パクリタキセル、ＴＲＡ−８＋アドリアマイシンおよびＴＲＡ−８＋アドリアマイシン＋６０Ｃｏが、ＴＲＡ−８を欠く全ての処置群よりも有意に長い平均腫瘍倍化時間を有することが明らかとなった。すべての処置形式に対するＴＲＡ−８の添加は、単独形式よりもより長い腫瘍倍化時間を生じた。同様に、腫瘍倍化についての時間の中央値に関するクラスカルワリス検定により、中央値が、全体で有意に異なった（ｐ＜０．００１）ことが明らかになった。ウィルコクスンサインランク検定（Ｗｉｌｃｏｘｉｎ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を用いたペアワイズ比較は、ＡＮＯＶＡ多数比較としての腫瘍倍化時間についての時間中央値に対して類似のパターンを生じた。この分析は、実験の終わりまでに腫瘍の倍化を達成しなかった群は、実験最終日を割り当てたという点で、最も有効な処置によって生じる増殖阻害を過小評価する。表６はまた、腫瘍の完全な後退の頻度および実験終了までのその後退持続性頻度を提供する。化学療法レジメンあるいは放射線のいずれかで処置した動物において、認められる腫瘍の完全な後退は存在せず、十分に確立した腫瘍増殖および腫瘍攻撃性を証明した。フィッシャーの直接確率検定から、処置群間の腫瘍の完全な後退の頻度における有意な差は存在しなかった（ｐ＜０．００１）。１６６匹の動物のうち３０匹は完全な後退を達成し、そしてこれらのうちの２８匹にＴＲＡ−８単独または他の形式との併用を与えた。１／４２のコントロール動物：化学療法、放射線もしくは併用を受けた１／５４の動物；そしてＴＲＡ−８単独もしくはＴＲＡ−８併用レジメンの２８／６８において完全な後退が生じた。ＴＲＡ−８処置群は、完全な後退の有意に大きな頻度（ｐ＜０．００１）を有した。同様に、ＴＲＡ−８もしくはＴＲＡ−８の併用を受けた１４／６８の動物は、１／４２のコントロールならびに化学療法および／または放射線を用いて処置した０／５２の動物と比べて腫瘍の再増殖を有さなかった。再発のない後退は、９９〜１７１日（１４６±２４日）の観察期間を有した。
【０５４３】
【表６−１】
2005519871.tif 000019
【０５４４】
【表６−２】
2005519871.tif 000020
【０５４５】
ａ  括弧内の数字は、検定されていない動物の数である。
【０５４６】
（（９）処置した腫瘍におけるアポトーシス）
ＴＲＡ−８、アドリアマイシン、パクリタキセル、ＴＲＡ−８＋アドリアマイシン、およびＴＲＡ−８＋パクリタキセルを用いて処置した後、ＴＵＮＥＬ技術を用いて、２ＬＭＰ異種移植片におけるアポトーシスの誘導を評価した。未処置の動物では、腫瘍は４％の染色細胞（１％、強）を有し、一方アドリアマイシンもしくはパクリタキセルで処置した動物では、８％の染色細胞（６％、強）および７％の染色細胞（２％、強）を有した。ＴＲＡ−８単独で処置した動物は、２５％の染色細胞（１５％、強）の著しいアポトーシスを有した。ＴＲＡ−８＋アドリアマイシンは、２８％の染色細胞（２２％、強）を有し、そしてＴＲＡ−８＋パクリタキセルは、２６％の染色細胞（１２％、強）を有した。
【０５４７】
本明細書中に記載される全ての特許もしくは刊行物は、本発明が関する分野における当業者のレベルを示している。これらの特許および刊行物は、その各々の刊行物が参考として援用されるように詳細にかつ個別に示されるのと同程度に本明細書中に参考として援用される。
【０５４８】
本発明は、上に参照した寄託または本発明のいくつかの局面の説明として意図される実施例において開示される実施形態よって範囲を制限されず、そして機能的に等価なすべての実施形態は本発明の範囲内である。本明細書中に示されそして記載される本発明に加えて、本発明の種々の改変は、当業者に明らかであり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
（参考文献）
【０５４９】
【表７−１】
2005519871.tif 000021
【０５５０】
【表７−２】
2005519871.tif 000022
【０５５１】
【表７−３】
2005519871.tif 000023
【０５５２】
【表７−４】
2005519871.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【０５５３】
【図１Ａ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ａ．）ＴＲＡ−８の結合特異性：ウェスタンブロット解析（上パネル）：ＴＲＡ−８または抗ヒトＩｇＧで標識したＴＮＦＲファミリーの組換え融合タンパク質。レーン１：ＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質（免疫原）；レーン２：ＤＲ４／ｈＩｇＧ１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）；レーン３：ＤＲ５／ｈＩｇＧ１；レーン４：ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤｃＲ−１）／ｈＩｇＧ１；レーン５：ＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤｃＲ−２）／ｈＩｇＧ１；レーン６：ＣＤ９５／ｈＩｇＧ１；レーン７：可溶性ＴＮＦＲＩ。ＥＬＩＳＡ解析（下パネル）：ウェル番号は、マウスＤＲ５／ｈＩｇＧ１融合タンパク質であるウェル８を除いて、ウェスタンブロットのウェル番号と一致する。
【図１Ｂ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｂ．）ＤＲ５およびＤＲ４への可溶性ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡ−８の結合活性：ＥＬＩＳＡプレートを、ＤＲ５／ｈＩｇＧ１（左パネル）またはＤＲ４／ｈＩｇＧ１（中央パネル）でコーティングし、次いでＴＲＡＩＬまたはＴＲＡ−８と共にインキュベートした。
【図１Ｃ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｃ．）ＤＲ５の表面発現のフローサイトメトリー分析。完全長ＤＲ５  ｃＤＮＡ（実線のヒストグラム）、ＤＲ４  ｃＤＮＡ（白抜きヒストグラム、実線）または空のベクター（白抜きヒストグラム、破線）を含むｐｃＤＮＡ３発現ベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞。形質転換の４８時間後、細胞をＴＲＡ−８、次いでＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ１で染色した。
【図１Ｄ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｄ．）ＤＲ５に対するインサイチュ免疫組織化学反応性：ＤＲ５発現ベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされたＣｏｓ−７のサイトスピンスライドを、形質転換の４８時間後にＴＲＡ−８で染色した。
【図１Ｅ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｅ．）ＴＲＡ−８の死滅活性：Ｊｕｒｋａｔ細胞を、示された濃度のＴＲＡ−８と共にインキュベートした。細胞生存度を、一晩培養後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイ、ＭＴＴアッセイおよびＰＩ排除アッセイによって決定した。ＡＴＰＬｉｔｅアッセイおよびＭＴＴアッセイの結果は、培地コントロールに対する割合として表され、そしてＰＩアッセイは、ＰＩネガティブ細胞に対する割合として表される。
【図１Ｆ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｆ．）カスパーゼ活性のウェスタンブロット分析：Ｊｕｒｋａｔ細胞を、示した時間、５００ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡ−８と共にインキュベートした。細胞溶解物を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ブロットし、そして抗カスパーゼ抗体で標識した。矢印は、各カスパーゼの切断されたサブユニットを示す。
【図１Ｇ】ＴＲＡ−８の特徴付け。（ｇ．）カスパーゼ阻害アッセイ：Ｊｕｒｋａｔ細胞を、指示された種々の濃度のカスパーゼ阻害剤の存在下において５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡ−８と共に一晩インキュベートした。細胞生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ａ】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ１】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ２】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ３】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ４】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｂ５】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｃ】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｄ１】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｄ２】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｄ３】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｄ４】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図２Ｄ５】ＤＲ５の細胞表面発現およびＤＲ５媒介アポトーシスに対する感受性。末梢血液から新たに単離した正常なＴ細胞およびＢ細胞、Ｔ細胞（ａおよびａ’）細胞株、神経膠腫（ｂおよびｂ’）細胞株、前立腺癌細胞（ｃ）細胞株およびＢ細胞（ｄ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートし、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。白抜きのヒストグラムはアイソタイプ抗体コントロールを表し、一方、黒のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を表す。ａ、ｂ’およびｄに見られるように、アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩インキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図３Ａ】Ｔ細胞株Ｕ９３７を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩のインキュベートの後に、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図３Ｂ１】神経膠腫（ｂ）細胞株および前立腺癌（ｃ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩のインキュベートの後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図３Ｂ２】神経膠腫（ｂ）細胞株および前立腺癌（ｃ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩のインキュベートの後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図３Ｂ３】神経膠腫（ｂ）細胞株および前立腺癌（ｃ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩のインキュベートの後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図３Ｃ】神経膠腫（ｂ）細胞株および前立腺癌（ｃ）細胞株を、ＴＲＡ−８またはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とともにインキュベートした。アポトーシスを、可溶性ＴＲＡＩＬ（白抜き丸）またはＴＲＡ−８（黒丸）との一晩のインキュベートの後、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図４Ａ】図４は、図４Ａに示される一定濃度の本発明抗体株の存在下で、指示濃度の（Ａ）抗体株ＴＲＡ−１、ＴＲＡ−８およびＴＲＡ−１０、ならびに（Ｂ）ＴＲＡＩＬへの曝露後のヒトＪｕｒｋａｔ細胞についての細胞生存度を示す一連のグラフである。
【図４Ｂ】図４は、図４Ａに示される一定濃度の本発明抗体株の存在下で、指示濃度の（Ａ）抗体株ＴＲＡ−１、ＴＲＡ−８およびＴＲＡ−１０、ならびに（Ｂ）ＴＲＡＩＬへの曝露後のヒトＪｕｒｋａｔ細胞についての細胞生存度を示す一連のグラフである。
【図５】正常組織および癌組織におけるＤＲ５の発現：正常組織および癌組織のホモジネイトをＴＲＡ−８で探索し、化学発光によって発色した。（ａ．）正常組織におけるＤＲ５タンパク質のウェスタンブロット分析：レーン１：肝臓、レーン２：脳、レーン３：肺、レーン４：腎臓、レーン５：脾臓、レーン６：精巣、レーン７：卵巣、レーン８：心臓、レーン９：膵臓。ｂ．癌組織におけるＤＲ５タンパク質のウェスタンブロット分析。以下に由来する癌を含む癌組織ブロットを検索した：卵巣（レーン１）、肺（レーン２）、肝臓（レーン３）、直腸（レーン４）、頚部（レーン５）、皮膚（レーン６）、精巣（レーン７）、甲状腺（レーン８）、子宮（レーン１０）、胃（レーン１１）、咽喉頭（レーン１２）および膵臓（レーン１３）。正常ヒト組織（ｃ．）および癌組織（ｄ．）のインサイチュ免疫組織化学。凍結切片をＴＲＡ−８を用いて免疫染色した。
【図６−１】ＴＲＡ−８の殺腫瘍性活性。ＳＣＩＤマウスに１３２１Ｎ１細胞を皮下接種した。腫瘍接種の２日後、マウスに１００μｇ  ＴＲＡ−８を単回投与で静脈内注入した（ａ．）か、または腫瘍接種後の最初の７日間に、１００μｇ  ＴＲＡ−８を３回投与で静脈内注入した（ｂ）。腫瘍増殖は、重量によって決定し、組織学的にＨ＆Ｅ染色で検査した。写真は、コントロールのマウスにおける生存可能な腫瘍増殖を示すが、ＴＲＡ−８処置マウスでは生存可能な腫瘍増殖を示さず（ｃ．上段パネル）、そして腫瘍のＨ＆Ｅ染色（ｃ．下段パネル）を示す。ＳＣＩＤマウスに、１０６個のＪｕｒｋａｔ細胞を静脈内注入し、注入の２日後、ＴＲＡ−８の単回投与で処置した。７日後、脾細胞を収集し、抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析するか（ｄ．）、または免疫組織化学により分析した（ｅ．）。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７Ａ】図７Ａは、ＲＡ（Ａ）滑膜細胞におけるＤＲ５の細胞表面発現を示す。１×１０６個の初代培養滑膜細胞を、アフィニティー精製ＴＲＡ−８を用いて染色し、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体を続けた。１０，０００個の生存可能な細胞をＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅにより分析した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＯＡ（Ｂ）滑膜細胞におけるＤＲ５の細胞表面発現を示す。１×１０６個の初代培養滑膜細胞を、アフィニティー精製ＴＲＡ−８を用いて染色し、その後にＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体を続けた。１０，０００個の生存可能な細胞をＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅにより分析した。
【図８Ａ】図８Ａは、種々の濃度の組換え可溶化ＴＲＡＩＬ（白丸）またはアフィニティー精製ＴＲＡ−８（黒丸）とともに、ＲＡ（Ａ）滑膜細胞の代表的な株のアポトーシスを誘導する、ＴＲＡＩＬ濃度およびＴＲＡ−８濃度の関数としての細胞生存度を示す一連のグラフである。細胞生存度は、処理細胞のｃｐｍ  対  未処理細胞のｃｐｍの割合である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、種々の濃度の組換え可溶化ＴＲＡＩＬ（白丸）またはアフィニティー精製ＴＲＡ−８（黒丸）とともに、ＯＡ（Ｂ）滑膜細胞の代表的な株のアポトーシスを誘導する、ＴＲＡＩＬ濃度およびＴＲＡ−８濃度の関数としての細胞生存度を示す一連のグラフである。細胞生存度は、処理細胞のｃｐｍ  対  未処理細胞のｃｐｍの割合である。
【図９−１】図９−１は、ＲＡ滑膜細胞のＤＲ５媒介アポトーシスのカスパーゼ依存性を示す一連のグラフである。ＲＡ滑膜細胞（ＲＡ５１２）を、可変濃度のカスパーゼインヒビターの存在下で、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性Ｆａｓリガンド（白四角）、抗Ｆａｓ抗体（ＣＨ−１１）（黒四角）、可溶性ＴＲＡＩＬ（白丸）、または抗ＤＲ５抗体（ＴＲＡ−８）（黒丸）とともにインキュベートした。一晩の培養の後、細胞生存度をＡＴＰＬｉｔｅによって決定した。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０−１】図１０Ａは、ＮＦｋｂ活性化を示す電気泳動ゲルシフトアッセイである。ＲＡ１０１６細胞を、電気泳動法にかける前に、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−ａ、５０ｎｇ／ｍｌ可溶性ＴＲＡＩＬまたは５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＲＡ−８とともに示した時点にわたってインキュベートした。
【図１０−２】図１０ＢおよびＣは、ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の産生を示すグラフである。１×１０６／ｍｌの指定したＲＡ滑膜細胞を、示した濃度のＴＮＦ−ａ（白丸）、ＴＲＡＩＬ（白三角）、またはＴＲＡ−８（黒丸）とともにインキュベートする。一晩の培養の後、培養上清を収集する。培養上清中のＭＭＰレベルをＥＬＩＳＡによって決定する。
【図１１Ａ】ＴＲＡ−８は、肝細胞性毒性を誘導しない。（ａ.）正常肝臓組織は、ＤＲ５を発現しない。２つの正常肝臓組織、１つの肝細胞癌腫組織、およびＨｅｐＧ２細胞のサイトスピン調製物のパラフィン切片をＨ＆Ｅ染色のために調製し、対応する凍結切片をＴＲＡ−８で染色した。
【図１１Ｂ】（ｂ．）ＤＲ５の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。２つの正常肝臓組織から単離した肝細胞および、肝細胞癌腫組織の症例から単離した肝細胞、ならびに、ＨｅｐＧ２細胞をＴＲＡ−８、抗Ｆａｓ抗体（ＤＸ２）またはアイソタイプコントロール抗体を用いて染色した。黒のヒストグラムは、ＴＲＡ−８染色またはＤＸ２染色を示し、白抜きのヒストグラムは、それらの対応するアイソタイプコントロールを示す。
【図１２−１】ＴＲＡＩＬは肝細胞性毒性を誘導するが、ＴＲＡ−８は肝細胞性毒性を誘導しない。新鮮な正常ヒト肝細胞を、肝細胞培養培地中で維持した。（ａ．）肝細胞のアポトーシスを、１μｇ／ｍｌの可溶性ＴＲＡＩＬ＋架橋剤、またはＴＲＡ−８を用いて、示した時点にわたって誘導した。細胞生存度はＡＴＰＬｉｔｅにより決定した。結果は、培地コントロールと比べて生存可能な細胞の割合として表す。斜線のバーは、ＴＲＡＩＬを示し、黒いバーはＴＲＡ−８を示す。（ｂ．）肝細胞の濃縮された核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３５２で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。（ｃ．）肝細胞のアポトーシスに対するシクロヘキシミドの効果。肝細胞を、コントロール培地中で、または１μｇ／ｍｌ  ＴＲＡＩＬもしくはＴＲＡ−８とともに、１μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下（黒いバー）または非存在下（白いバー）で８時間培養した。細胞生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅにより決定する。結果を、２つの実験の３連の培養物の平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。ｄ．ＤＲ５に対する正常肝細胞の感受性とＦａｓ媒介アポトーシスとの比較。新たに単離した肝細胞を、指定した濃度の可溶性ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡ−８、可溶性ＦａｓＬまたは抗Ｆａｓ  ｍＡｂ  ＣＨ１１とともに６時間インキュベートした。細胞生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定した。結果を、培地コントロールと比べて生存可能な細胞の割合として表す。正常な肝細胞について、４人の正常な個体の平均±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１人の患者由来の肝細胞癌腫細胞およびＨｅｐＧ２細胞の結果を、３連の培養物の平均として示す。
【図１２−２】図１２−１の続き。
【図１３−１】ＴＲＡＩＬは肝炎を誘導する。Ｂ６マウスに、「Ｔｅｔ−オン」転写エレメントの制御下で、全長のヒトＴＲＡＩＬをコードする、１０９ｐｆｕのアデノウイルスベクターを静脈内接種した。ＴＲＡＩＬ発現を、指定した用量のテトラサイクリンで誘導した。（ａ．）肝臓におけるヒトＴＲＡＩＬ発現のノーザンブロット分析。ベクターの接種およびテトラサイクリンの導入から２４時間後、総ＲＮＡを肝臓から単離し、ヒトＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡまたはβ−アクチンで探索した。（ｂ．）ＡＳＴの血清レベル。ＴＲＡＩＬのトランスフェクションから２４時間後、ＡＳＴの血清レベルを決定した。（ｃ．）アデノウイルスベクター感染肝細胞のＴＲＡＩＬ媒介細胞死：Ｂ６マウスに、テトラサイクリン誘導性アデノウイルスベクターを静脈内接種した。接種の４８時間後、接種したマウス由来の肝細胞、および接種していないコントロールマウス由来の肝細胞を単離し、指定した濃度のＴＲＡＩＬとともに８時間インキュベートした（左パネル）。肝細胞の細胞生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定した。上述のアデノウイルスベクターを接種したマウスに、４８時間後に１０μｇの可溶性ヒトＴＲＡＩＬを静脈内注入した。ＴＲＡＩＬの注入から２４時間後に、ＡＳＴの血清レベルを測定した（右パネル）。（ｄ．およびｅ．）ＴＲＡＩＬにより誘導された肝損傷の組織学的分析。肝臓を、ＴＲＡＩＬのトランスフェクションから２４時間後（ｄ．）または７日後（ｅ．）に収集した。パラフィン切片をＨ＆Ｅ染色し、１００倍（上部パネル）および４００倍（下部パネル）で撮影した。
【図１３−２】図１３−１の続き。
【図１４】図１４は、ヒトＰＢＭＣから精製した活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞が、休止細胞（白抜き）および活性化細胞（斜線）についてフローサイトメトリーにより決定した場合の、増大したレベルのＤＲ５を発現することを示す一連のグラフである。
【図１５】図１５は、図１４に示す精製したＴ細胞およびＢ細胞に対するＴＲＡ−８濃度の関数としての生存度のグラフである。この精製したＴ細胞およびＢ細胞は、異なる密度のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅにより収集した、活性化された芽細胞とともに、抗ＣＤ３、または抗μで４８時間刺激した。生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定する。
【図１６】図１６は、ヒトＰＢＭＣおよびＴＲＡ−８またはＩｇＧ（コントロール）を注射した、ＮＫ細胞が枯渇したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対するゲーテッド（ｇａｔｅｄ）リンパ球集団におけるＣＤ３発現を示す、ヒストグラムおよびフローサイトメトリープロットである。
【図１７】図１７は、実施例１３で詳細に述べる、マウス脾組織についてのＣＤ３染色およびＴＵＮＥＬ染色の細胞顕微鏡写真を示す。
【図１８】図１８は、ＴＲＡ−８、ＢＩＳＶＩＩＩおよびこれらの組み合せの存在下での慢性リンパ性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＣＣＬ）および正常ヒトＢ細胞についての細胞傷害性プロットを示す。
【図１９Ａ】図１９ａは、２Ｅ１２のＤＲ４への特異的な結合を示す。ＥＬＩＳＡプレートを、示されるように可溶性形態のヒトＴＲＡＩＬレセプター−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質でコートし、指定した濃度のｍＡｂ  ２Ｅ１２とともにインキュベートし、その後にＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇＧ１を続けた。反応をＴＭＢ基質緩衝液で発色させ、そしてＯＤ値を４５０／４６０ｎＭで測定した。
【図１９Ｂ】図１９ｂは、細胞表面ＤＲ４に結合する２Ｅ１２を示す。Ｃｏｓ−７細胞を、ＤＲ４についての全長ｃＤＮＡを含むベクターを使用して（黒いヒストグラム）、またはコントロールベクターを使用して（白抜きヒストグラム）トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０μｇ／ｍｌ  ２Ｅ１２およびＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧ１で染色した。細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。
【図１９Ｃ】図１９ｃは、２Ｅ１２のアポトーシス誘導活性を示す。ヒトＲａｍｏｓＢリンパ球を、２μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧ１の存在下で、指定した濃度の２Ｅ１２とともに一晩インキュベートした。細胞生存度を、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイにより決定した。
【図１９Ｄ】図１９ｄは、２Ｅ１２によって誘導されるカスパーゼ活性を示す。Ｒａｍｏｓ細胞を、指定した時点にわたって２Ｅ１２および抗マウスＩｇＧ１抗体で処理した。カスパーゼ活性化およびＰＡＲＰ切断を、特異的な抗カスパーゼ抗体またはＰＡＲＰ抗体を使用するウェスタンブロット分析により決定した。
【図２０】図２０は、胸部癌異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスにおける２Ｅ１２およびアドリアマイシンの効果を示す。０日目に、胸腺欠損ヌードマウスに２ＬＭＰ細胞（３×１０７個）を皮下注入した。７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目および２４日目に、２群のマウスに、２００μｇの２Ｅ１２を腹腔内注入した。８日目、１２日目および１６日目に、２群のマウスに、アドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入を与えた。１群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズの平均変化（ｎ＝８マウス／群）として示す。
【図２１】図２１は、胸部癌異種移植片を有する胸腺欠損ヌードマウスにおけるＴＲＡ−８、２Ｅ１２およびアドリアマイシンの効果を示す。０日目に、胸腺欠損ヌードマウスに２ＬＭＰ細胞（３×１０７個）を皮下注入した。７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目および２４日目に、２群のマウスに、２００μｇのＴＲＡ−８および２Ｅ１２を腹腔内注入した。８日目、１２日目および１６日目に、２群のマウスに、アドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入を与えた。１群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズの平均変化（ｎ＝８マウス／群）として示す。
【図２２Ａ】図面の簡単な説明なし。
【図２２Ｂ】図面の簡単な説明なし。
【図２３Ａ】図面の簡単な説明なし。
【図２３Ｂ−１】図面の簡単な説明なし。
【図２３Ｂ−２】図面の簡単な説明なし。
【図２３Ｂ−３】図面の簡単な説明なし。
【図２４】図面の簡単な説明なし。
【図２５】図面の簡単な説明なし。
【図２６】図面の簡単な説明なし。
【図２７】図面の簡単な説明なし。
【配列表】
2005519871.tif 000025
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【図１Ａ】
2005519871.tif 000060
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2005519871.tif 000062
【図１Ｄ】
2005519871.tif 000063
【図１Ｅ】
2005519871.tif 000064
【図１Ｆ】
2005519871.tif 000065
【図１Ｇ】
2005519871.tif 000066
【図２Ａ】
2005519871.tif 000067
【図２Ｂ】
2005519871.tif 000068
【図２Ｂ１】
2005519871.tif 000069
【図２Ｂ２】
2005519871.tif 000070
【図２Ｂ３】
2005519871.tif 000071
【図２Ｂ４】
2005519871.tif 000072
【図２Ｂ５】
2005519871.tif 000073
【図２Ｃ】
2005519871.tif 000074
【図２Ｄ１】
2005519871.tif 000075
【図２Ｄ２】
2005519871.tif 000076
【図２Ｄ３】
2005519871.tif 000077
【図２Ｄ４】
2005519871.tif 000078
【図２Ｄ５】
2005519871.tif 000079
【図３Ａ】
2005519871.tif 000080
【図３Ｂ１】
2005519871.tif 000081
【図３Ｂ２】
2005519871.tif 000082
【図３Ｂ３】
2005519871.tif 000083
【図３Ｃ】
2005519871.tif 000084
【図４Ａ】
2005519871.tif 000085
【図４Ｂ】
2005519871.tif 000086
【図５】
2005519871.tif 000087
【図６−１】
2005519871.tif 000088
【図６−２】
2005519871.tif 000089
【図７Ａ】
2005519871.tif 000090
【図７Ｂ】
2005519871.tif 000091
【図８Ａ】
2005519871.tif 000092
【図８Ｂ】
2005519871.tif 000093
【図９−１】
2005519871.tif 000094
【図９−２】
2005519871.tif 000095
【図１０−１】
2005519871.tif 000096
【図１０−２】
2005519871.tif 000097
【図１１Ａ】
2005519871.tif 000098
【図１１Ｂ】
2005519871.tif 000099
【図１２−１】
2005519871.tif 000100
【図１２−２】
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【図１３−１】
2005519871.tif 000102
【図１３−２】
2005519871.tif 000103
【図１４】
2005519871.tif 000104
【図１５】
2005519871.tif 000105
【図１６】
2005519871.tif 000106
【図１７】
2005519871.tif 000107
【図１８】
2005519871.tif 000108
【図１９Ａ】
2005519871.tif 000109
【図１９Ｂ】
2005519871.tif 000110
【図１９Ｃ】
2005519871.tif 000111
【図１９Ｄ】
2005519871.tif 000112
【図２０】
2005519871.tif 000113
【図２１】
2005519871.tif 000114
【図２２Ａ】
2005519871.tif 000115
【図２２Ｂ】
2005519871.tif 000116
【図２３Ａ】
2005519871.tif 000117
【図２３Ｂ−１】
2005519871.tif 000118
【図２３Ｂ−２】
2005519871.tif 000119
【図２３Ｂ−３】
2005519871.tif 000120
【図２４】
2005519871.tif 000121
【図２５】
2005519871.tif 000122
【図２６】
2005519871.tif 000123
【図２７】
2005519871.tif 000124
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月30日(2004.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ５を発現する標的細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下：
（ａ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する治療量の抗体であって、ここで、該抗体は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、治療量の抗体；および
（ｂ）治療量の１種以上の治療剤、
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記標的細胞が、インビボで前記（ａ）または（ｂ）のうち少なくとも１つと接触される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記標的細胞が、インビトロで前記（ａ）または（ｂ）のうち少なくとも１つと接触される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化学療法剤が、以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化学治療剤が、以下：レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、６−チオグアニニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｉｎｅ）、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｏｓｉｄｅ）、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン  リン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コランブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）リン酸ナトリウム、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項７】
請求項４に記載の薬学的組成物であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、薬学的組成物。
【請求項８】
リタキシマブをさらに含有する、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記抗炎症剤が抗ステロイド性の抗炎症剤である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記治療剤が抗生物質である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記治療剤が疾患修飾抗リウマチ薬である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記治療剤がサイトカインである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記治療剤がケモカインである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記治療剤が増殖因子である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の薬学的組成物であって、前記治療剤が、以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項３２】
前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記活性化免疫細胞が活性化リンパ球である、請求項３４に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記標的細胞が好中球である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記標的細胞が照射された細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
ＤＲ５を発現する標的細胞の増殖を阻害ための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下：
（ａ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する治療量の抗体であって、ここで、該抗体は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、抗体；および
（ｂ）治療量の１種以上の治療剤
を含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
前記標的細胞が、インビボで前記（ａ）または（ｂ）のうち少なくとも１つと接触される、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記標的細胞が、インビトロで前記（ａ）または（ｂ）のうち少なくとも１つと接触される、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
請求項４２に記載の薬学的組成物であって、前記化学療法剤が、以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、６−チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載の薬学的組成物であって、前記化学治療剤または薬剤が、以下：ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、メルカプトプリン、６−チオグアニニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｉｎｅ）、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｏｓｉｄｅ）、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン  リン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、コランブシル（ｃｈｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾン（ｂｅｔｈａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）  リン酸ナトリウム、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項４２に記載の薬学的組成物であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、薬学的組成物。
【請求項４６】
リタキシマブをさらに包含する、請求項４５に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項５０に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項５１に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項５０に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
前記治療剤が抗生物質である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
前記治療剤が抗慢性関節リウマチ剤である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
前記治療剤がサイトカインである、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
前記治療剤がケモカインである、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
前記治療剤が増殖因子である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項６７に記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
請求項３９に記載の薬学的組成物であって、前記治療剤が、以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項７０】
前記標的細胞が異常に増殖する滑膜細胞である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７１】
前記滑膜細胞が慢性関節リウマチ滑膜細胞である、請求項７０に記載の薬学的組成物。
【請求項７２】
前記標的細胞が活性化免疫細胞である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
前記標的細胞が活性化リンパ球である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
前記標的細胞が好中球である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
前記標的細胞がウイルスに感染した細胞である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
前記標的細胞が照射された標的細胞である、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
炎症疾患または自己免疫疾患を有する被験体を処置するための薬学的組成物であって、以下：
（ａ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する治療量の抗体であって、ここで、該抗体は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞においてインビボおよびインビトロでアポトーシス誘導活性を有する、抗体；および
（ｂ）治療量の治療剤、
を含む、薬学的組成物。
【請求項７８】
前記治療剤が化学療法剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
前記化学療法剤が以下：ブレオマイシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、メルファラン、メトトレキサート、マイトマイシン、６−メルカプトプリン、テニポシド、６−  チオグアニン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンからなる群から選択される、請求項７８に記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
前記化学療法剤が、以下：ダクチノマイシン、タモキシフェン、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、６−チオグアニニン、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラボシド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ブスルファン、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン  リン酸ナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール  二リン酸、クロロトリアニセン、テストラクトン、メファレン、コランブシル、メクロレタミン、チオテパ、ベタメタゾンリン酸ナトリウム、ジカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトーテン、硫酸ビンクリスチン、および硫酸ビンブラスチンからなる群から選択される、請求項７８に記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
請求項７８に記載の薬学的組成物であって、前記化学治療剤が、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジゾン（ｐｒｅｄｉｓｏｎｅ）またはこれらのサブセットである、薬学的組成物。
【請求項８２】
リタキシマブをさらに含む、請求項８１に記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
前記治療剤が、ＴＮＦファミリーのメンバーである、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＣＤ４０リガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーがＦａｓリガンド、またはこのフラグメントもしくは誘導体である、請求項８３に記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
前記治療剤が抗炎症剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
前記抗炎症剤が非ステロイド性の抗炎症剤である、請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
非ステロイド性の抗炎症剤がＣＯＸ−１インヒビターまたはＣＯＸ−２インヒビターである、請求項８７に記載の薬学的組成物。
【請求項８９】
前記抗炎症剤が、ステロイド性抗炎症剤である、請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項９０】
前記治療剤が抗ウイルス剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９１】
前記治療剤が抗レトロウイルス剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９２】
前記治療剤が抗日和見剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９３】
前記治療剤が抗生物質である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９４】
前記治療剤が免疫抑制剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９５】
前記治療剤が免疫グロブリン調製物である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９６】
前記治療剤が抗マラリア剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９７】
前記治療剤が抗慢性関節リウマチ剤である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９８】
前記治療剤がサイトカインである、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項９９】
前記治療剤がケモカインである、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１００】
前記治療剤が増殖因子である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０１】
前記治療剤が前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０２】
前記二次抗体が、ＤＲ４抗体、ＴＮＦ抗体、Ｂ７抗体、ＣＤ４０リガンド抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ２０抗体、およびＦａｓ抗体からなる群から選択される、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０３】
前記治療剤がアポトーシス誘導化合物である、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０４】
前記アポトーシス誘導化合物が、ビシンドイルマレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ）ＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ）、ＳＮ−５０またはＬＹ２９４００２である、請求項１０３に記載の薬学的組成物。
【請求項１０５】
前記治療剤が、化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０６】
前記炎症性疾患または自己免疫疾患は、以下：エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、シェーグレン病、悪性貧血、アディソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、生殖不能、重症筋無力症、多発性硬化症、バーゼドー病、血栓性血小板減少（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｐｅｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒａ）、インスリン依存性糖尿病、アレルギー；ぜん息、アトピー疾患；動脈硬化症；心筋炎；心筋症；糸球体腎炎；低形成貧血からなる群から選択される、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０７】
前記被験体が放射線治療を受ける、請求項７７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０８】
キットであって、該キットは、以下：
（ａ）ＴＲＡＩＬレセプターＤＲ５に特異的に結合する抗体であって、ここで該抗体は、その可溶形態で、ＤＲ５を発現する標的細胞中にインビボおよびインビトロでアポトーシスを誘導する活性を有する、抗体
（ｂ）１種以上の治療剤、および
（ｃ）該キットを使用するための指示書
を備える、キット。
【請求項１０９】
前記治療剤が、以下：化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗日和見剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、疾患修飾抗リウマチ薬、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、および前記標的細胞のアポトーシスを促進するかまたは増殖をブロックする二次抗体からなる群から選択される、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１０８に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月1日(2004.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ａ】  図２２Ａは、ヒト乳癌細胞株のパネルにおけるＤＲ５細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。乳癌細胞をＥＤＴＡを用いて採取し、１０μｇ／ｍｌ  ＴＲＡ−８  ｍＡｂを用いて４℃にて１時間、続いて、ＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ１を用いて４℃にて１時間染色し、次いでＦＡＣＳｃａｎおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。太線のヒストグラムはＴＲＡ−８染色を示し、細線のヒストグラムはマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体とのインキュベーションを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ｂ】  図２２Ｂは、ＴＲＡ−８のヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害性を示す。細胞をトリプシン処理し、９６ウェルプレート中に、１，０００細胞／ウェルの密度で再度プレートした。細胞をプレートした後にＴＲＡ−８抗体を添加し、３７℃にて２４時間インキュベートした。ＴＲＡ−８を添加して２４時間後、ＡＴＰＬｉｔｅを使用して細胞生存度を評価した。ＡＴＰレベルを、２〜３回の独立した実験（各々三連で行った）からの平均およびＳＥとして、未処理コントロール細胞と比較して報告する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ａ】  図２３Ａは、ＴＲＡ−８およびアドリアマイシン併用処理の、ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害性を示す。細胞（１，０００／ウェル）を、細胞をプレートした後２４時間目に開始して、種々のアドリアマイシン濃度に３７℃にて２４時間曝した。アドリアマイシンを添加した後、ＴＲＡ−８を２４時間添加し、ＡＴＰレベルを２４時間後に決定した。値は、２〜４回の独立した実験（各々三連で行った）からの３つの測定の平均およびＳＥを示し、未処理コントロール細胞と比較して報告する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２３Ｂ−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ｂ−１】  図２３Ｂ−１は、ＴＲＡ−８およびパクリタキセル併用処理の、ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害性を示す。細胞（１，０００／ウェル）を、細胞をプレートした後２４時間目に開始して、種々のパクリタキセル濃度に３７℃にて２４時間曝した。パクリタキセルを添加して２４時間後、ＴＲＡ−８を添加し、ＡＴＰレベルを２４時間後に決定した。値は、２〜４回の独立した実験（各々三連で行った）からの３つの測定の平均およびＳＥを示し、未処理コントロール細胞と比較して報告する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２３Ｂ−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ｂ−２】  図２３Ｂ−２は、ＴＲＡ−８およびパクリタキセル併用処理の、ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害性を示す。細胞（１，０００／ウェル）を、細胞をプレートした後２４時間目に開始して、種々のパクリタキセル濃度に３７℃にて２４時間曝した。パクリタキセルを添加して２４時間後、ＴＲＡ−８を添加し、ＡＴＰレベルを２４時間後に決定した。値は、２〜４回の独立した実験（各々三連で行った）からの３つの測定の平均およびＳＥを示し、未処理コントロール細胞と比較して報告する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２３Ｂ−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３Ｂ−３】  図２３Ｂ−３は、ＴＲＡ−８およびパクリタキセル併用処理の、ヒト乳癌細胞株に対する細胞傷害性を示す。細胞（１，０００／ウェル）を、細胞をプレートした後２４時間目に開始して、種々のパクリタキセル濃度に３７℃にて２４時間曝した。パクリタキセルを添加して２４時間後、ＴＲＡ−８を添加し、ＡＴＰレベルを２４時間後に決定した。値は、２〜４回の独立した実験（各々三連で行った）からの３つの測定の平均およびＳＥを示し、未処理コントロール細胞と比較して報告する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】  図２４は、確立された２ＬＭＰヒト乳癌異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍増殖に対する、ＴＲＡ−８の効果を示す。２ＬＭＰ細胞（３×１０７）を、０日目にｓ．ｃ．注射した。２つの群のマウスに、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、および２４日目に２００μｇまたは６００μｇのＴＲＡ−８をｉ．ｐ．注射した。１つの群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズ（２つの直径の積）の平均変化として表す（ｎ＝８匹マウス／群）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】  図２５は、乳癌異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍増殖に対する、ＴＲＡ−８およびアドリアマイシンの効果を示す。無胸腺ヌードマウスに２ＬＭＰ細胞（３×１０７）を、０日目にｓ．ｃ．注射した。２つの群のマウスに、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、および２４日目に２００μｇのＴＲＡ−８をｉ．ｐ．注射した。２つの群のマウスに、８日目、１２日目、および１６日目にアドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で与えた。１つの群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズ（２つの直径の積）の平均変化として表す（ｎ＝６〜８匹マウス／群）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２６】  図２６は、乳癌異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスにおけるＴＲＡ−８およびパクリタキセルの効果を示す。無胸腺ヌードマウスに２ＬＭＰ細胞（３×１０７）を、０日目にｓ．ｃ．注射した。２つの群のマウスに、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、および２４日目に２００μｇのＴＲＡ−８をｉ．ｐ．注射した。２つの群のマウスに、８日目、１２日目、１６日目、２０日目および２４日目にパクリタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で与えた。１つの群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズ（２つの直径の積）の平均変化として表す（ｎ＝８匹マウス／群）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７】  図２７は、乳癌異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍増殖に対する、ＴＲＡ−８、アドリアマイシン、および６０Ｃｏ照射の効果を示す。無胸腺ヌードマウスに２ＬＭＰ細胞（３×１０７）を、０日目にｓ．ｃ．注射した。３つの群のマウスに、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目、および２４日目に２００μｇのＴＲＡ−８をｉ．ｐ．注射した。２つの群のマウスに、８日目、１２日目、および１６日目にアドリアマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で与えた。４つの群のマウスに、９日目および１７日目に３Ｇｙの６０Ｃｏ照射を与えた。１つの群のマウスには、抗体を与えなかった。データを、７日目のサイズと比較した腫瘍サイズ（２つの直径の積）の平均変化として表す（ｎ＝８匹マウス／群）。


【国際調査報告】
2005519871.tif 000125
2005519871.tif 000126