(57)【要約】【課題】  本発明は、Ｇタンパク質共役オーファン受容体ＧＰＲ４３に関し、また短鎖脂肪酸がこの受容体の天然リガンドとして同定されたことに関する。本発明はさらに、ＧＰＲ４３のリガンド結合およびシグナル伝達活性を調節する物質を同定するためのアッセイ、ならびに単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸から本質的に構成される組成物に関する。本発明はまた、ＧＰＲ４３と短鎖脂肪酸の新規相互作用を利用する診断方法およびキットに関する。
2005533483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：
（ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補調節因子の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補調節因子存在下の結合が、候補調節因子不存在下の結合と比較して減少すれば、該候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項２】
試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：
（ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、試料存在下の結合が、試料不存在下の結合と比較して減少すれば、該試料中にＧＰＲ４３の機能を調節する物質が存在することが示される工程；
含む方法。
【請求項３】
ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：
（ａ）候補調節因子の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節因子存在下の活性が、候補調節因子不存在下の活性と比較して変化すれば、該候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項４】
ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：
（ａ）ＧＰＲ４３ポリペプチドを候補調節因子と接触させる工程；
（ｂ）候補調節因子存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
（ｃ）候補調節因子存在下で測定される活性を、ＧＰＲ４３ポリペプチドがＥＣ５０の濃度の短鎖脂肪酸と接触している試料中で測定される活性と比較する工程であって、候補調節因子存在下で測定される活性量が、ＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸によって誘導される量の少なくとも２０％であれば、該候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項５】
試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：
（ａ）試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
（ｃ）試料不存在下でＧＰＲ４３および短鎖脂肪酸を含有する反応において測定される活性量を、ＧＰＲ４３、短鎖脂肪酸および試料を含有する反応において測定される活性量と比較する工程であって、試料存在下の活性が、試料不存在下の活性と比較して変化すれば、該試料中にＧＰＲ４３の機能を調節する物質が存在することが示される工程；
を含む方法。
【請求項６】
試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：
（ａ）ＧＰＲ４３ポリペプチドを試料と接触させる工程；
（ｂ）試料存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
（ｃ）試料存在下で測定される活性を、ＧＰＲ４３ポリペプチドがＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸と接触している反応中で測定される活性と比較する工程であって、試料存在下で測定される活性量が、ＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸によって誘導される量の少なくとも２０％であれば、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質が検出される工程；
を含む方法。
【請求項７】
短鎖脂肪酸が検出可能に標識されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
短鎖脂肪酸が、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、およびアフィニティータグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
接触がＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞内またはその表面で行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
接触が合成リポソーム内またはその表面で行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
接触がＧＰＲ４３ポリペプチドを含有するウイルス誘導性出芽膜内またはその表面で行われる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
接触がＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の膜画分を用いて行われる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
測定が、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項１、２および７から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
物質が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程がセカンドメッセンジャーのレベル変化を検出することを含む、請求項３から１２および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項３から１２および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
シグナル伝達活性の測定がエクオリンに基づくアッセイの使用を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞内のＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する方法であって：
ＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する物質を細胞に供給する工程であって、ＧＰＲ４３の活性が調節される工程；
を含む方法。
【請求項１９】
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：
（ａ）組織試料から核酸を単離する工程；
（ｂ）核酸を鋳型として用いてＧＰＲ４３ポリヌクレオチドを増幅する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で生産される増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの量を標準と比較する工程であって、標準と比較して増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの量に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；
を含む方法。
【請求項２０】
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：
（ａ）組織試料から核酸を単離する工程；
（ｂ）核酸を鋳型として用いてＧＰＲ４３ポリヌクレオチドを増幅する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で生産される増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの配列を標準と比較する工程であって、標準と比較して配列に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；
を含む方法。
【請求項２１】
標準が配列番号１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在を検出する方法であって：
（ａ）組織試料をＧＰＲ４３に特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）組織試料に対する抗体の結合を検出する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で検出される結合を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在が示される工程；
を含む方法。
【請求項２３】
ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在を検出する方法であって：
（ａ）ＰＭＮ細胞の膜に存在するＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で検出される結合を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在が示される工程；
を含む方法。
【請求項２４】
ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在を検出する方法であって：
（ａ）ＰＭＮ細胞の膜に存在するＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で検出されるシグナル伝達活性を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在が示される工程；
を含む方法。
【請求項２５】
単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸またはその塩を含む組成物。
【請求項２６】
単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸またはその塩を含むキット。
【請求項２７】
短鎖脂肪酸またはその塩が線状である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
短鎖脂肪酸またはその塩が分岐状である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
単一の短鎖脂肪酸またはその塩および、ＧＰＲ４３ポリペプチドを含む細胞膜画分を含むキット。
【請求項３２】
短鎖脂肪酸またはその塩が線状である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
短鎖脂肪酸またはその塩が分岐状である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
ＧＰＲ４３の活性を調節する物質をスクリーニングするためのキットであって、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドおよび単一の短鎖脂肪酸塩を含むキット。
【請求項３７】
短鎖脂肪酸塩が線状短鎖脂肪酸塩である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
短鎖脂肪酸塩が分岐状短鎖脂肪酸塩である、請求項３６に記載のキット。
【請求項３９】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項４０】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
ＧＰＲ４３の活性を調節する物質をスクリーニングするためのキットであって、単一の短鎖脂肪酸塩および、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞を含むキット。
【請求項４２】
短鎖脂肪酸塩が線状短鎖脂肪酸塩である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
短鎖脂肪酸塩が分岐状短鎖脂肪酸塩である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項４１に記載のキット。
【請求項４５】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断するためのキットであって、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチド、標準およびそれらのためのパッケージ材料を含むキット。
【請求項４７】
単一の短鎖脂肪酸塩をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
短鎖脂肪酸塩が線状短鎖脂肪酸塩である、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
短鎖脂肪酸塩が分岐状短鎖脂肪酸塩である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項４７に記載のキット。
【請求項５２】
標準がＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害を有しない個体から採取される臨床試料を含む、請求項４６から５１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５３】
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断するためのキットであって、ＧＰＲ４３ポリペプチドを含む細胞膜画分、標準およびそれらのためのパッケージ材料を含むキット。
【請求項５４】
単一の短鎖脂肪酸塩をさらに含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
短鎖脂肪酸塩が線状短鎖脂肪酸塩である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
短鎖脂肪酸塩が分岐状短鎖脂肪酸塩である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５７】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項５４に記載のキット。
【請求項５８】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項５４に記載のキット。
【請求項５９】
標準がその疾患または障害を患わない個体由来の試料を含む、請求項５３から５８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６０】
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断するためのキットであって、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞、標準およびそれらのためのパッケージ材料を含むキット。
【請求項６１】
単一の短鎖脂肪酸塩をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
短鎖脂肪酸塩が線状短鎖脂肪酸塩である、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
短鎖脂肪酸塩が分岐状短鎖脂肪酸塩である、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
短鎖脂肪酸の１つまたはそれ以上の炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項６１に記載のキット。
【請求項６５】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６６】
標準がその疾患または障害を患わない個体由来の試料を含む、請求項６０から６５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６７】
哺乳類のＰＭＮ走化性を調節する方法であって、ＧＰＲ４３を保持しているＰＭＮ細胞を、ＰＭＮ走化性を調節するのに十分なＧＰＲ４３シグナル伝達活性の調節因子と接触させることを含む方法。
【請求項６８】
ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の阻害剤と接触させることによってＰＭＮ走化性を減少させる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の作用薬と接触させることによってＰＭＮ走化性を増大させる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の拮抗薬と接触させることによってＰＭＮ走化性を減少させる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
ＰＭＮ走化性を調節する物質を同定する方法であって：
（ａ）候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補物質存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、候補物質不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項７２】
ＰＭＮ走化性を調節する物質を同定する方法であって：
（ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補物質存在下の結合が、候補物質不存在下の結合と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項７３】
試料中で、ＰＭＮ走化性を調節する物質の存在を検出する方法であって：
（ａ）試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、試料存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、試料不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、この候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項７４】
試料中で、ＰＭＮ走化性を調節する物質の存在を検出する方法であって：
（ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、試料存在下の結合が、試料不存在下の結合と比較して増大または減少すれば、この候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項７５】
ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質を同定する方法であって：
（ａ）候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補物質存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、候補物質不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質として同定される工程；
を含む方法。
【請求項７６】
ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質を同定する方法であって：
（ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；および
（ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補物質存在下の結合が、候補物質不存在下の結合と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性関連疾患処置用に同定される工程；
を含む方法。
【請求項７７】
ＧＰＲ４３受容体がＰＭＮ細胞の細胞膜に存在する、請求項７１から７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
短鎖脂肪酸が検出可能に標識されている、請求項７１から７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
短鎖脂肪酸が、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、およびアフィニティータグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項１から１７のいずれか1項に記載の方法によって、同定されるか、あるいは試料中で検出される、ＧＰＲ４３活性を調節する物質。
【請求項８１】
請求項７１から７９のいずれか1項に記載の方法によって、同定されるか、あるいは試料中で検出される、ＰＭＮ走化性を調節する物質。
【請求項８２】
ＧＰＲ４３活性を調節するための、請求項８０に記載の物質の使用。
【請求項８３】
ＰＭＮ走化性を調節するための、請求項８１に記載の物質の使用。
【請求項８４】
ＧＰＲ４３関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＧＰＲ４３活性調節用のキットを製造するための、請求項８０に記載の物質の使用。
【請求項８５】
ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＰＭＮ走化性調節用のキットを製造するための、請求項８１に記載の物質の使用。
【請求項８６】
適当な製薬的担体または希釈剤および必要量の請求項８０または８１に記載の物質を含む医薬組成物。
【請求項８７】
ベシクルまたは、投与対象の患者の免疫応答を調節可能なアジュバントをさらに含む、請求項８６に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
ＧＰＲ４３関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＧＰＣＲ４３調節用のキットを製造するための、請求項８６または８７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項８９】
ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＰＭＮ走化性調節用のキットを製造するための、請求項８６または８７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９０】
インビボおよび／またはインビトロのＧＰＲ４３活性を調節するための短鎖脂肪酸の使用。
【請求項９１】
インビボおよび／またはインビトロのＰＭＮ走化性を調節するための短鎖脂肪酸の使用。
【請求項９２】
ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドの部分欠失または全欠失を含む非ヒト哺乳類を検証する際の短鎖脂肪酸の使用。
【請求項９３】
ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドを過剰発現している非ヒト哺乳類を検証する際の短鎖脂肪酸の使用。
【請求項９４】
短鎖脂肪酸またはその塩が線状である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法、キット、使用。
【請求項９５】
短鎖脂肪酸またはその塩が分岐状である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法、キット、使用。
【請求項９６】
短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素が非炭素含有置換基で置換されている、前記請求項のいずれか１項に記載の方法、キット、使用。
【請求項９７】
短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法、キット、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーファンＧタンパク質共役受容体に対する天然リガンドおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は細胞内シグナル伝達を担うタンパク質である。ＧＰＣＲは通常、７種の膜貫通ドメインを有する。リガンドがＧＰＣＲの細胞外部分または断片と結合すると、細胞内にシグナルが伝達され、細胞の生物学的または生理学的性質または動態に変化が生じる。Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャネル）と共役するＧＰＣＲは、細胞内セカンドメッセンジャーの状態を細胞外入力と関連させるモジュール式シグナル伝達系の構成要素である。
【０００３】
ＧＰＣＲ遺伝子および遺伝子産物は種々の生理的プロセスを調節可能であり、疾患の潜在的な原因物質である。ＧＰＣＲは中枢神経系および末梢生理学的プロセスの両者に対して非常に重要であると考えられる。
【０００４】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは５つのファミリーに分けられる：ファミリー I，ロドプシンおよびベータ２−アドレナリン作動性受容体によって分類され、現在２００を超える固有のメンバーを含む；ファミリーII，副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体ファミリー；ファミリーIII，代謝調節型グルタミン酸受容体ファミリー；ファミリーIV，ＣＡＭＰ受容体ファミリー、細胞性粘菌（D.discoideum）の走化性および成育に重要；およびファミリーV、ＳＴＥ２のような真菌の接合フェロモン受容体。
【０００５】
Ｇタンパク質とは、グアニンヌクレオチドと結合した、α、βおよびγサブユニットから構成されるヘテロ三量体タンパク質のファミリーを表わす。これらのタンパク質は通常はシグナル伝達用の細胞表面受容体（７つの膜貫通ドメインを含有する受容体）と連結されている。実際、ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、コンフォメーション変化がＧタンパク質に伝達され、このことがαサブユニットが結合ＧＤＰ分子をＧＴＰ分子と交換させ、βγ−サブユニットから解離させる。
【０００６】
α、β、およびγ−サブユニットのＧＴＰ結合型は典型的にエフェクター調節部分として機能し、セカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ（例えばアデニルシクラーゼの活性化により）、ジアシルグリセロールまたはイノシトールリン酸の生成につながる。
【０００７】
ヒトでは、２０を超える種々の型のα−サブユニットが既知である。これらのサブユニットは小プールのβおよびγサブユニットと結合する。哺乳類のＧタンパク質の例には、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｑ、ＧｓおよびＧｔが含まれる。Ｇタンパク質は、Lodish et al. Molecular Cell Biology (1995) Scientific American Books Inc., New York, N. Y.（非特許文献１）およびDownes and Gautam (1999) The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552.（非特許文献２）に詳細に記載されている。これら両文献の開示内容は引用により本明細書中に包含される。
【０００８】
既知の特徴付けされていないＧＰＣＲは現在、薬物作用および開発に関する主要な標的となっている。潜在的な予防および治療特性を有し得る新規作用薬および拮抗薬についてのスクリーニングに使用可能な新規Ｇタンパク質共役受容体を同定する取り組みが継続中である。
【０００９】
嗅覚受容体ファミリーを除いて、３００以上のＧＰＣＲが今日までにクローニングされている。機構的には、すべての臨床的に重要な薬物の約５０−６０％が種々のＧＰＣＲの機能を調節することによって作用する（Cudermann et al.(1995)J.Mol.Med.,73:51-63.（非特許文献３））。
【００１０】
ＧＰＲ４３はロドプシン様受容体ファミリーのメンバーであり、１９９７年にクローニングされた。これは別のオーファンＧＰＣＲであるＧＰＲ４１と３８％相同性を示し、マウスＰＡＲ１受容体の膜貫通ドメインと２７％相同性を示す。ＧＰＲ４３をコードする遺伝子はヒト染色体１９ｑ３１に位置する（Sawzdargo et al (1997) Biochem Biophys Res Commun. 239(2): 543-7.（非特許文献４））。ＧＰＲ４３はマウスサイトカイン依存性Ｔヘルパー細胞株および骨髄由来の初代肥満細胞中でＩＬ−９により誘導される遺伝子として記載されている。さらに、ＧＰＲ４３のｍＲＮＡ転写はＩＬ−９過剰発現トランスジェニックマウスの肺、腸および胃で刺激される。ＧＰＲ４３のｍＲＮＡはまた、脾細胞においてマイトジェン、例えばコンカナバリンＡによって誘導され、この誘導はアミノステロール化合物によって阻害される（WO99/15656（特許文献１）を参照のこと）。ＧＰＲ４３ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は米国特許第5,910,430号（特許文献２）、米国特許第6,180,365B1号（特許文献３）、WO00/28083（特許文献４）、WO98/40483（特許文献５）、WO99/15656（特許文献６）およびWO00/22129（特許文献７）に開示されている。これらはそれぞれ引用により本明細書中に包含される。
【００１１】
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）には、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩および吉草酸塩が含まれるがこれらに限定されない。ＳＣＦＡは後腸内の微生物発酵によって相当量が生産される。後腸内容物のほとんどのアニオンがＳＣＦＡであり、主に酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩である。ＳＣＦＡは急速に吸収され、末梢血のトータルＳＣＦＡ濃度は７９μＭに達する（Cummings J. H. et al (1987) Gut28: 1221-7.（非特許文献５））。種々のＳＣＦＡのうち、酢酸塩は主要なアニオンであり、生化学合成により種々の組織内で生産され得る（Bergman E. (1990) Physiol. Rev. 70, 567-590.（非特許文献６））。酢酸塩は濃度５９から８５μＭで血漿内に存在し、エタノール投与後にはこの濃度は２０倍まで増大し得る（Lundquist F. (1960) Acta Physiol. Scand.175, 97.（非特許文献７））。ほとんどの血漿酢酸塩は内臓神経床（splanchnic  bed）由来であり、これが他の組織で用いられると考えられる。このような組織で、酢酸塩は基本エネルギー消費の約７％を担い得る。酪酸塩は結腸内腔で食物繊維を微生物発酵することによって生産され、酪酸塩はインビトロ実験において大腸癌細胞の増殖に劇的に影響する。種々の歯周および根管の病原体、例えばバクテロイド種は、大量の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を生産可能である。短鎖脂肪酸はまた、胃腸管の成育および分化の生理学的調節因子でもあり、さらに抗菌性物質として作用し得る。ＳＣＦＡ代謝が大腸炎潰瘍、憩室症および結腸直腸癌の進行に関与するいくつかの証拠がある。結腸細胞の細胞増殖、分化およびアポトーシスに対するＳＣＦＡの作用にはインビボおよびインビトロで差異があり、これはＳＣＦＡの直接の作用に加えて、全身性の作用、例えば神経性および体液性因子もまた非常に重要であることを示す。正常な結腸細胞および大腸癌細胞の、増殖およびアポトーシスに対してＳＣＦＡが反対に作用することから、結腸疾患の予防および／または治療に関する可能性が示される。
【特許文献１】WO99/15656
【特許文献２】米国特許第5,910,430号
【特許文献３】米国特許第6,180,365B1号
【特許文献４】WO00/28083
【特許文献５】WO98/40483
【特許文献６】WO99/15656
【特許文献７】WO00/22129
【非特許文献１】Lodish et al. Molecular Cell Biology (1995) Scientific American BooksI nc., New York, N. Y.
【非特許文献２】Downes and Gautam(1999)The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552.
【非特許文献３】Cudermann et al. (1995) J.Mol.Med.,73: 51-63.
【非特許文献４】Sawzdargo et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 239(2):543-7.
【非特許文献５】Cummings J.H. et al. (1987) Gut 28:1221-7.
【非特許文献６】Bergman E. (1990) Physiol. Rev. 70, 567-590.
【非特許文献７】Lundquist F. (1960) Acta Physiol. Scand. 175, 97.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）がオーファン受容体ＧＰＲ４３の天然産のリガンドであることを発見したことに基づくものである。したがって本発明は、ＳＣＦＡリガンド／受容体（以後配列番号２と特定する）ペアに関し、さらにＳＣＦＡリガンドとの組み合わせとして、ＳＣＦＡを結合するこの受容体の機能的相同体および、この受容体をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を含むベクターによって形質転換された細胞に関する。本発明はまた、単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一のＳＣＦＡから本質的に構成される組成物、ならびにＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する物質を同定する方法に関する。この方法は、新規薬物の開発に有用な作用薬、逆作用薬または拮抗薬化合物の同定に有用である。またＧＰＲ４３とＳＣＦＡの相互作用はＧＰＲ４３活性に関連する疾患の診断法の開発に有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補調節因子の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補調節因子存在下の結合が、候補調節因子不存在下の結合と比較して減少すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；を含む方法を包含する。
【００１４】
本発明はさらに、試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、試料存在下の結合が、試料不存在下の結合と比較して減少すれば、該試料中にＧＰＲ４３の機能を調節する物質が存在することが示される工程；を含む方法を包含する。
【００１５】
前記いずれかの方法の一態様では、測定が、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる。
【００１６】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：ａ）候補調節因子の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節因子存在下の活性が、候補調節因子不存在下の活性と比較して変化すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；を含む方法を包含する。
【００１７】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質を同定する方法であって：ａ）ＧＰＲ４３ポリペプチドを候補調節因子と接触させる工程；ｂ）候補調節因子存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；およびｃ）候補調節因子存在下で測定される活性を、ＧＰＲ４３ポリペプチドがＥＣ５０の濃度の短鎖脂肪酸と接触している試料中で測定される活性とを比較する工程であって、候補調節因子存在下で測定される活性量が、ＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸によって誘導される量の少なくとも２０％であれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３の機能を調節する物質として同定される工程；を含む方法を包含する。
【００１８】
本発明はさらに、試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：ａ）試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；およびｃ）試料不存在下でＧＰＲ４３および短鎖脂肪酸を含有する反応において測定される活性量を、ＧＰＲ４３、短鎖脂肪酸および試料を含有する反応において測定される活性量と比較する工程であって、試料存在下の活性が、試料不存在下の活性と比較して変化すれば、この試料中にＧＰＲ４３の機能を調節する物質が存在することが示される工程；を含む方法を包含する。
【００１９】
本発明はさらに、試料中で、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質の存在を検出する方法であって：ａ）ＧＰＲ４３ポリペプチドを試料と接触させる工程；ｂ）試料存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；およびｃ）試料存在下で測定される活性を、ＧＰＲ４３ポリペプチドがＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸と接触している反応中で測定される活性と比較する工程であって、試料存在下で測定される活性量が、ＥＣ５０の濃度で存在する短鎖脂肪酸によって誘導される量の少なくとも２０％であれば、ＧＰＲ４３の機能を調節する物質が検出される工程；を含む方法を包含する。
【００２０】
前記各方法の一態様では、短鎖脂肪酸は検出可能に標識されている。好ましい態様では、短鎖脂肪酸は、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、およびアフィニティータグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている。
【００２１】
前記各方法の一態様では、接触はＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞内またはその表面で行われる。
【００２２】
前記各方法の一態様では、接触は合成リポソーム内またはその表面で行われる。
【００２３】
前記各方法の一態様では、接触はＧＰＲ４３ポリペプチドを含有するウイルス誘導性出芽膜（virus-induced budding membranes）内またはその表面で行われる。
【００２４】
前記各方法の一態様では、接触はＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の膜画分を用いて行われる。
【００２５】
前記各方法の一態様では、測定は、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光からなる群から選択される方法を用いて行われる。
【００２６】
前記各方法の一態様では、物質は、天然または合成ペプチドまたはポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子からなる群から選択される。
【００２７】
シグナル伝達活性が測定される方法の一態様では、ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程がセカンドメッセンジャーのレベル変化を検出することを含む。
【００２８】
シグナル伝達活性が測定される方法の別の態様では、シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ、プロテインキナーゼＣ活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、クモ膜酸（arachinoid acid）、ＭＡＰキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む。
【００２９】
一態様では、シグナル伝達活性を測定する工程がエクオリンに基づくアッセイの使用を含む。
【００３０】
本発明はさらに、細胞内のＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する方法であって、ＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する物質を細胞に供給（derivering）し、これによりＧＰＲ４３の活性が調節される工程を含む方法を包含する。
【００３１】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：ａ）組織試料をＧＰＲ４３ポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；ｂ）組織試料に対する抗体の結合を検出する工程；およびｃ）工程（ｂ）で検出される結合を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；を含む方法を包含する。
【００３２】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：ａ）組織試料から核酸を単離する工程；ｂ）核酸を鋳型として用いてＧＰＲ４３ポリヌクレオチドを増幅する工程；およびｃ）工程（ｂ）で生産される増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの量を標準と比較する工程であって、標準と比較して増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの量に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；を含む方法を包含する。
【００３３】
本発明はまた、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：ａ）組織試料から核酸を単離する工程；ｂ）核酸を鋳型として用いてＧＰＲ４３ポリヌクレオチドを増幅する工程；およびｃ）工程（ｂ）で生産される増幅ＧＰＲ４３ポリヌクレオチドの配列を標準と比較する工程であって、標準と比較して配列に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；を含む方法を包含する。一態様では、増幅工程はＲＴ／ＰＣＲを含む。別の態様では、標準は配列番号１である。別の態様では、配列を比較する工程はミニシーケンシングを含む。別の態様では、量を比較する工程はマイクロアレイを用いて行われる。
【００３４】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在を検出する方法であって：ａ）ＰＭＮ細胞の膜に存在するＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程；およびｃ）工程（ｂ）で検出される結合を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在が示される工程；を含む方法を包含する。
【００３５】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在を検出する方法であって：ａ）ＰＭＮ細胞の膜に存在するＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；ｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程；およびｃ）工程（ｂ）で検出されるシグナル伝達活性を標準と比較する工程であって、標準と比較して結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患の存在が示される工程；を含む方法を包含する。
【００３６】
本発明はさらに、単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸を含むか、あるいはこれらから本質的に構成される組成物を包含する。単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸はいっしょになって複合体を形成し、この複合体はその相互作用を調節する物質の同定、ＧＰＲ４３ポリペプチドの活性を調節する物質の同定、およびＧＰＲ４３によって媒介されるか、あるいはＧＰＲ４３が関与する疾患または障害を患う個体の同定に有用である。したがって、複合体または複合体でない（すなわち結合または未結合の）単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸は本発明のアッセイおよび方法の必須要素または基礎である。単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸「から本質的に構成される」組成物は追加の成分を含むことができるが、このような追加の成分は発明が基礎とする新規相互作用に必須ではないものである。単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸「から本質的に構成される」組成物は、例えば細胞内、組織内、または細胞もしくは組織抽出物内に存在する、ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸間の天然に存在する複合体から区別され、これらを除外する。本発明の組成物はまた、組換えコンストラクトから発現されるＧＰＲ４３ポリペプチドと天然短鎖脂肪酸間の複合体から区別され、これを除外する。
【００３７】
本発明はさらに、単一のＧＰＲ４３ポリペプチドおよび単一の短鎖脂肪酸またはその塩を含むキットを包含する。一態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は線状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は分岐状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素は非炭素含有置換基で置換されている。別の態様では、短鎖脂肪酸塩は、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００３８】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドおよび単一の短鎖脂肪酸塩を含むキットを包含する。一態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は線状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は分岐状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素は非炭素含有置換基で置換されている。別の態様では、短鎖脂肪酸塩は、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００３９】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞および単一の短鎖脂肪酸またはその塩を含むキットを包含する。一態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は線状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は分岐状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素は非炭素含有置換基で置換されている。別の態様では、短鎖脂肪酸塩は、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００４０】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３ポリペプチドを含む細胞膜画分およびパッケージ材料を含むキットを包含する。一態様では、キットは単一の短鎖脂肪酸またはその塩をさらに含む。一態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は線状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩は分岐状である。別の態様では、短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素は非炭素含有置換基で置換されている。別の態様では、短鎖脂肪酸塩は、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のキットは、例えばＧＰＲ４３の活性を調節する物質のスクリーニング、試料中のＧＰＲ４３を調節する物質の存在の同定、またはＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に有用である。本発明のキットはさらに、そのようなキットに必要なパッケージ材料を含むことができる。本発明のキットはさらに、標準を含むことができる。一態様では、標準は、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害を患わない個体由来の試料である。
【００４２】
本明細書中で用いる用語「ＧＰＲ４３ポリペプチド」とは、以下２つの必須の性質を有するポリペプチドを意味する：１）ＧＰＲ４３ポリペプチドは配列番号：２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、１００％同一性まで、および１００％同一性を含むアミノ酸同一性を有する；および２）ＧＰＲ４３ポリペプチドは、ＧＰＲ４３リガンド結合活性（本明細書中では、酢酸塩またはプロピオン酸塩結合と少なくとも等価な親和性を有するＳＣＦＡリガンドが結合）または本明細書中で定義されるＧＰＲ４３シグナル伝達活性のいずれか、あるいは両者を含むＧＰＲ４３活性を有する。
【００４３】
本明細書中で用いる用語「ＧＰＲ４３活性」とは、本明細書中で定義されるＧＰＲ４３ポリペプチドに対するＳＣＦＡ結合またはこのＧＰＲ４３ポリペプチドによるシグナル伝達を意味する。「ＧＰＲ４３活性」を有するポリペプチドは、ギ酸塩の親和性より少なくとも１００倍高い親和性で酢酸塩およびプロピオン酸塩と結合する。
【００４４】
相同配列（別の哺乳類種または特定群のヒト集団に存在し得る）の相同性は配列同一性を示し、これは、完全ヒトヌクレオチド配列または配列番号２のアミノ酸配列と高い配列同一性（８０％、８５％、９０％、９５％より大きなまたは９８％より大きな配列同一性）を示す配列を意味する。機能的相同体は、本明細書中で定義される短鎖脂肪酸リガンドとの結合能またはリガンド結合に応答するシグナルの開始能または伝達能、あるいはその両者を特徴とする。機能的相同体は野生型（ｗｔ）ＧＰＲ４３の天然リガンドを以下のような親和性で結合する：プロピオン酸塩＝酢酸塩＞酪酸塩＞ギ酸塩、プロピオン酸塩および酢酸塩はギ酸塩より少なくとも１００倍高い親和性で結合する。
【００４５】
本発明の配列の相同配列は、別の動物種（ラット、マウス、ネコ、イヌ、等）または特定ヒト集団群に存在する類似の受容体であって、同一の生化学経路に関与する受容体のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００４６】
このような相同配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの付加、欠失または置換を含んでいてもよく、これらは本発明の受容体の機能的特徴を実質的に改変しない。すなわち相同体は、ｗｔ完全長ヒトＧＰＲ４３の少なくとも９０％の活性を有し、ギ酸塩と比較して少なくとも１００倍高い親和性で酢酸塩およびプロピオン酸塩と結合する。
【００４７】
このような相同配列はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、SAMBROOK et al. Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratorypress, NewYork.（非特許文献８）に記載される条件）下、完全ヒトＧＰＲ４３配列とハイブリダイズ可能な４００、６００、８００または１０００ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列であってよい。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例は以下のものである：50%ホルムアミド、5XSSC、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5Xデンハーツ液（Denhardt’s  solution）、50μg/ml超音波処理サーモン精子DNA、0.1%SDSおよび10%デキストラン硫酸中42℃でハイブリダイズ；および0.2XSSCおよび0.1%SDS中42℃（またはそれ以上、例えばプローブ配列の完全相補物のＴｍより２℃下まで）で洗浄。
【００４８】
本明細書中で用いる用語「ＧＰＲ４３シグナル伝達活性」とは、ＧＰＲ４３ポリペプチドによるシグナルの開始または伝達を意味する。ＧＰＲ４３シグナル伝達活性は、１つまたはそれ以上の以下のものを分析し、シグナル伝達経路の検出可能な工程を測定することによってモニターされる：Ｇタンパク質上のＧＤＰとＧＴＰの交換の刺激；アデニル酸シクラーゼ活性の変化；プロテインキナーゼＣ調節；ホスファチジルイノシトール分解（セカンドメッセンジャー、ジアシルグリセロール、およびイノシトール三リン酸を生産する）；細胞内カルシウム流動；ＭＡＰキナーゼの活性化；チロシンキナーゼの調節；または遺伝子またはレポーター遺伝子活性の調節。本明細書中以下に記載される任意のＧＰＲ４３活性アッセイに関して、測定可能な活性が、ＳＣＦＡの実質的不存在下で確立される基準の上または下に１０％またはそれ以上変化した場合には、シグナル伝達経路の検出可能な工程が開始または媒介されたとみなされる。測定可能な活性は、例えばｃＡＭＰまたはジアシルグリセロールレベルの測定と同様に直接測定することができる。あるいは、測定可能な活性は、例えばレポーター遺伝子アッセイと同様に間接的に測定してもよい。
【００４９】
本明細書中で用いる用語「短鎖脂肪酸」および「短鎖脂肪族カルボン酸」とは、一般式：ＣｘＨ（２ｘ＋１）−ＣＯＯで示される分子であって、一般式中のｘは０から５である、またはＯＨ、ＮＨ３、ＰＯ４、Ｏおよびハロゲンを含む非炭素含有置換基がカルボニル鎖上で分岐している関連分子を意味する。本発明のＳＣＦＡは線状または分岐状で、飽和または不飽和であってよい。本発明のＳＣＦＡは、酢酸塩またはプロピオン酸塩と少なくとも等価、ギ酸塩より少なくとも１００倍強い親和性で、本明細書中で定義されているＧＰＲ４３ポリペプチドと結合する。本発明のＳＣＦＡはさらに、ＧＰＲ４３シグナル伝達活性を刺激し得る。ＳＣＦＡの例には、酢酸塩（acetate）、プロピオン酸塩（propionate）、ｎ−酪酸塩（n-butyrate）、ｎ−ペンタン酸塩（吉草酸塩）（n-pentanoate（valerate））およびギ酸塩（formate）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＳＣＦＡの例およびＧＰＲ４３に対するその相対活性を図１２に示す。
【００５０】
本明細書中で用いる用語「検出可能な工程」とは、直接的に、例えば、セカンドメッセンジャーの測定、または修飾（例えばリン酸化）タンパク質の検出によってか、あるいは間接的に、例えば、この工程の下流作用のモニタリングによって測定することができる工程を意味する。例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化はｃＡＭＰの生産をもたらす。アデニル酸シクラーゼの活性は直接的に、例えばｃＡＭＰ生産をモニターするアッセイによってか、あるいは間接的に、ｃＡＭＰの実際のレベルを測定することによって測定できる。
【００５１】
本発明の組換え細胞は、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクター、好ましくはバキュロウイルス、アデノウイルス、またはセムリキ森林熱ウイルスによって形質転換された組換え細胞であるのが好ましく、細胞は細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい態様では、細胞はCOS-7細胞、CHO細胞、LM (TK-)細胞、NIH-3T3細胞、HEK-293細胞、K-562細胞または1321N1星細胞腫細胞からなる群から選択される。しかし他の形質転換可能なセルラインもまた有用である。ベクターは、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド配列と作動可能に連結され、その発現を可能にする調節因子を含むのが好ましい。
【００５３】
本発明の別の側面は、配列の特定活性部分の使用に関する。本明細書中で用いる「活性部分」とは、正常または正常に近い薬理作用（例えば、受容体活性（本明細書中で定義されているもの）、活性化剤または阻害剤に対する応答、またはリガンド結合が、野生型受容体によって示される活性、応答、または結合のレベルの少なくとも９０％であること）を示すのに十分な大きさである配列の部分を意味する。「部分」とは、受容体をコードする配列に対して意味するのと同様に、１００％より少ない配列（すなわち、９９、９０、８０、７０、６０、５０％等）を意味する。活性部分は、完全ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分欠失を含むが、特定リガンド、好ましくは酢酸塩およびプロピオン酸塩の結合およびその相互作用に必要な活性部位（群）およびタンパク質ドメイン（群）を依然保持している受容体であり得る。
【００５４】
前記いずれかの方法の別の態様では、接触がＧＰＲ４３ポリペプチドを含有する合成リポソーム（Mirzabekov et al. (2000) Nature Biotechnology 18, 649-654.またはウイルス誘導性出芽膜の内または表面で行われる。（例えば引用により本明細書中に包含されるWO0102551（Virus-like particles, their Preparation and their Use preferably in Pharmaceutical Screening and Functional Genomics (2001)）を参照のこと）。
【００５５】
本明細書中で用いる「リガンド」とは、受容体と会合または結合可能な部分を意味する。本発明の方法では、リガンドおよび受容体は、受容体に対するリガンド結合の検出に適当なアッセイ方法（例えば、受容体に対するリガンド結合に応答するセカンドメッセンジャー生産の増大または減少を検出するセカンドメッセンジャーアッセイ、タンパク質−リガンド結合を測定する結合アッセイ、または抗体−抗原相互作用を測定する免疫アッセイ）によって結合の検出が可能であるほど十分に強い結合定数を有する。本発明のリガンドには、受容体と結合する既知の分子（例えば、プロピオン酸塩はＧＰＲ４３のリガンドである）が含まれ、あるいはリガンドは、任意の、受容体と結合可能なヌクレオチド、抗体、抗原、酵素、ペプチド、ポリペプチドまたは核酸であってよい。リガンドは短鎖カルボン酸であるのが好ましいが、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸配列を含むこともできる。本発明の方法では、リガンドおよび受容体は互いに特異的に結合する（例えば、共有結合または水素結合を介して、または例えばタンパク質とリガンド、抗体と抗原またはタンパク質サブユニット間の相互作用を介して）。
【００５６】
本発明の別の側面は、本発明の受容体の候補調節因子をスクリーニング、検出および回収するための方法であって：酢酸塩またはプロピオン酸塩とＧＰＲ４３の結合を許容する条件下、候補調節因子存在下で、ＧＰＲ４３発現細胞をＳＣＦＡと接触させる工程、セカンドメッセンジャーアッセイを行う工程、および候補調節因子の存在および不存在下で得られるセカンドメッセンジャーアッセイの結果を比較する工程を含む方法に関する。
【００５７】
本発明の別の側面は、本発明の受容体候補調節因子のスクリーニング、検出および可能な回収を行うための方法であって：酢酸塩またはプロピオン酸塩とＧＰＲ４３の結合を許容する条件下、ＧＰＲ４３発現細胞膜をＳＣＦＡと接触させる工程、セカンドメッセンジャーアッセイを行う工程、および候補調節因子の存在および不存在下で得られるセカンドメッセンジャーアッセイの結果を比較する工程を含む方法に関する。
【００５８】
別の態様では、ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程は、セカンドメッセンジャーレベルの変化を検出することを含む。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、本発明の方法によって同定され、ならびに／あるいは回収される未知の作用薬および／または拮抗薬化合物、ならびにこの（未知の）化合物を含むか、あるいは適当な製薬的担体および必要量のこの（未知の）化合物を含む医薬組成物（ワクチンを含む）を含む診断キットに関する。
【００６０】
本発明の拮抗薬化合物は、本発明の受容体と結合可能で、天然化合物（プロピオン酸塩または酢酸塩または関連する短鎖カルボン酸）の結合をブ阻害することができる分子または分子群を意味する。
【００６１】
本発明は、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：ａ）組織試料をＧＰＲ４３ポリペプチドに特異的な抗体およびＧＰＲ４３リガンドに特異的な抗体と接触させる工程；ｂ）抗体と組織試料の結合を検出する工程；およびｃ）工程（ｂ）で検出される結合を標準と比較する工程であって、標準と比較して抗体のいずれかまたは両者の結合に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；を含む方法を包含する。
【００６２】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害を診断する方法であって：ａ）組織試料を単離する工程；ｂ）ＳＣＦＡ濃度を測定する工程；およびｃ）工程（ｂ）で測定されるＳＣＦＡ量を標準と比較する工程であって、標準と比較してＳＣＦＡ量に差異があれば、ＧＰＲ４３の調節不全を特徴とする疾患または障害が診断される工程；を含む方法を包含する。
【００６３】
本発明のさらなる側面は、本発明のＧＰＲ４３受容体をコードするポリヌクレオチド配列のホモ接合性無発現変異（ホモ接合性「ノックアウト」）を含む非ヒト哺乳類、またはＧＰＲ４３ポリペプチドを天然の発現レベルを超えて過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類に関する。本明細書中で用いる「天然の発現レベルを超えて」とは、正常天然状態での内因性受容体の発現レベルと比較して少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、ならびに最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍、等）のレベルを意味する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳類は、少なくとも１つの組織または細胞タイプで導入遺伝子を発現するが、すべての組織および細胞でＧＰＲ４３導入遺伝子を発現してもよい。トランスジェニック非ヒト哺乳類は、例えばWO98/20112に記載されるように、胚性幹細胞のトランスフェクションに基づく典型的な技術を用いる当業者に周知の方法により、好ましくはCarmeliet et al. (1996) Nature, Vol.380, p.435-439.に記載の方法にしたがって得ることができる。
【００６４】
「遺伝子ターゲッティング」とは、ゲノムＤＮＡ断片が哺乳類細胞に導入された場合に生じるタイプの相同組換えであり、この断片が内因性相同配列の位置を突き止め、組換える。これは米国特許第5,464,764号および米国特許第5,777,195号に典型的に示され、これらの開示内容はその全体が引用により本明細書中に包含される。本明細書中で用いる用語「トランスジェニック動物」とは、１つまたはそれ以上の、好ましくは本質的にすべての細胞が、人為的介入、例えば当技術分野に既知のトランスジェニック技術によって導入された導入遺伝子を含有する非ヒト動物を意味する。導入遺伝子は、細胞の前駆体への導入によって、慎重な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクションによって、または組換えウイルスを用いる感染によって、直接または間接的に細胞に導入することができる。
【００６５】
本発明のＧＰＲ４３受容体をコードするポリヌクレオチドを過剰発現するトランスジェニック非ヒト哺乳類は、受容体の過剰発現を可能にする誘導性プロモーターおよび、場合により、組織および細胞特異的な調節因子を伴ってＤＮＡコンストラクトに組み込まれたポリヌクレオチドを含むのが好ましい。
【００６６】
一態様では、本発明のキットは、ＧＰＲ４３ポリペプチドに対する短鎖脂肪酸の結合を測定するための試薬を含む。別の態様では、キットはＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定するための試薬を含む。
【００６７】
一態様では、本発明のスクリーニングキットまたは診断キットは、ＧＰＲ４３受容体ポリペプチドまたはＧＰＲ４３ポリペプチドを含む細胞膜調製物、および１つまたはそれ以上のＳＣＦＡを別々の容器内に含む。このようなキットはさらに、本発明のＧＰＲ４３受容体に対する（例えばプロピオン酸塩の）特異的結合の検出を行うために必要なすべての手段および媒体を含むことができる。結合活性またはシグナル伝達活性は、本明細書中以下に記載される疾患の１つまたはそれ以上の症状をモニタリングする方法と相関させることができる。
【００６８】
したがって診断キットはさらに、特定の診断測定、または、例えば、当業者に既知のハイスループットスクリーニング技術、例えばWO 00/02045に記載される技術を用いる結合化合物の測定に必要な要素を含むことができる。このようなキットを用いて、例えば処置のために用いられるＧＰＲ４３調節物質の用量および有効性をモニターすることができる。ハイスループットスクリーニング診断用量およびモニタリングは種々の固形支持体、例えば当業者によって選択されるマイクロタイタープレートまたはバイオチップを用いて行うことができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物中、適当な製薬的担体は固形、液状またはガス状担体であり、当業者が、投与の型およびＧＰＲ４３活性を調節するために投与される化合物の副作用の可能性に応じて選択可能である。本発明の有用な製薬的担体には組織培養培地または他の血清含有培地は含まれない。製薬的担体と特定化合物間の割合は、当業者が、処置対象の患者、投与方法および化合物の副作用の可能性、ならびに処置または予防目的の対象である疾患障害のタイプに応じて選択可能である。
【００７０】
医薬組成物は、種々の疾患または障害の処置および／または予防の分野での適用に有益であり、このような疾患または障害は以下からなる群から選択されるのが好ましい：前立腺（ostatic）肥大、偏頭痛、嘔吐、精神病性および神経学的障害、例えば不安、統合失調症、躁鬱病、欝病、譫妄、痴呆症および深刻な精神遅滞、変性疾患、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病、および運動障害（dyskinasias）、例えばハンチントン病またはギレス・デ・ラ・トゥーレット症候群（Gilles de la Tourett's syndrome）および他の関連疾患、例えば血栓症および他の心血管疾患、自己免疫および炎症性疾患。
【００７１】
上記疾患のうち好ましい適用は、機能不全または疾患を予防し、改善し、あるいは治すのに機能を果たすことが可能な７TM受容体を標的とする治療物質に関するものであり、このような機能不全および疾患には以下のものが含まれる：受胎能、胎児発生、感染、例えば細菌、真菌、原虫およびウイルス感染、特にＨＩＶ１およびＨＩＶ２によって引き起こされる感染、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性の前立腺肥大症、精神病性および神経学的障害、例えば不安、欝病、偏頭痛、嘔吐、脳卒中、統合失調症、躁鬱病、譫妄、痴呆症、深刻な精神遅滞および運動障害、例えばハンチントン病またはギレス・デ・ラ・トゥーレット症候群、血栓症、他の心血管疾患、自己免疫および炎症性疾患、ただしこれらに限定されない。
【００７２】
本発明はまた、細胞表面受容体ＧＰＲ４３を保持しているＰＭＮ細胞を、ＰＭＮ走化性を調節するのに十分なＧＰＲ４３シグナル伝達活性の調節因子と接触させることを含む、哺乳類において該ＰＭＮ走化性を調節する方法を提供する。
【００７３】
一態様では、本発明は、患者にＧＰＲ４３シグナル伝達活性の阻害剤を投与することを含む、それを必要としている患者においてＰＭＮ走化性を調節する方法を提供する。
【００７４】
一態様では、ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の阻害剤と接触させることによって前記ＰＭＮ走化性を減少させる。
【００７５】
一態様では、ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の拮抗薬と接触させることによって前記ＰＭＮ走化性を減少させる。
【００７６】
さらなる態様では、ＰＭＮ細胞をＧＰＲ４３シグナル伝達活性の作用薬と接触させることによって前記ＰＭＮ走化性を増大させる。
【００７７】
本発明はまた、ＰＭＮ走化性を調節する物質を同定する方法であって：短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補物質存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、候補物質不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；を含む方法を包含する。
【００７８】
本発明はまた、ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質を同定する方法であって：短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補物質存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、候補物質不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質として同定される工程；を含む方法を提供する。
【００７９】
本発明はまた、ＰＭＮ走化性を調節する物質を同定する方法であって：短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補物質存在下の結合が、候補物質不存在下の結合と比較して減少すれば、該候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；を含む方法を提供する。
【００８０】
本発明はまた、試料中で、ＰＭＮ走化性を調節する物質の存在を検出する方法であって：ａ）試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、試料存在下のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が、試料不存在下のシグナル伝達活性と比較して増大または減少すれば、候候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；を含む方法を提供する。
【００８１】
本発明はまた、試料中で、ＰＭＮ走化性を調節する物質の存在を検出する方法であって：ａ）短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で試料の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびｂ）ＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、試料存在下の結合が、試料不存在下の結合と比較して増大または減少すれば、候候補物質がＰＭＮ走化性を調節する物質として同定される工程；を含む方法を提供する。
【００８２】
本発明はさらに、ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質を同定する方法であって：短鎖脂肪酸とＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補物質の存在および不存在下でＧＰＲ４３ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程；およびＧＰＲ４３ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補物質存在下の結合が、候補物質不存在下の結合と比較して減少すれば、候候補物質がＰＭＮ走化性関連疾患処置用の物質として同定される工程；を含む方法を提供する。
【００８３】
一態様では、ＧＰＲ４３受容体はＰＭＮ細胞の細胞膜中に存在する。
【００８４】
一態様では、短鎖脂肪酸は検出可能に標識されている。
【００８５】
さらなる態様では、短鎖脂肪酸は、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、およびアフィニティータグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている。
【００８６】
本発明はさらに、上記のような方法によって同定されるか、あるいは上記のように試料中で検出されるＧＰＲ４３活性を調節する物質を包含する。
【００８７】
本発明はさらに、上記のような方法によって同定されるか、あるいは上記のように試料中で検出されるＰＭＮ走化性を調節する物質を包含する。
【００８８】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３活性を調節するための前記物質の使用を包含する。
【００８９】
本発明はさらに、ＰＭＮ走化性を調節するための前記物質の使用を包含する。
【００９０】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３関連疾患処置用の医薬品を製造するための前記物質の使用またはＧＰＲ４３活性調節用のキットを製造するための前記物質の使用を包含する。
【００９１】
本発明はさらに、ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の医薬品を製造するための前記物質の使用またはＰＭＮ走化性調節用のキットを製造するための前記物質の使用を包含する。
【００９２】
本発明はさらに、適当な製薬的担体または希釈剤および必要量の前記物質を含む医薬組成物を包含する。
【００９３】
本発明はさらに、小胞または、投与対象の患者の免疫応答を調節可能なアジュバントをさらに含む、上記医薬組成物を包含する。
【００９４】
本発明はさらに、ＧＰＲ４３関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＧＰＣＲ４３調節用のキットを製造するための上記医薬組成物の使用を包含する。
【００９５】
本発明はさらに、ＰＭＮ走化性関連疾患処置用の医薬品を製造するための、またはＰＭＮ走化性調節用のキットを製造するための上記医薬組成物の使用を包含する。
【００９６】
本発明はまた、インビボおよび／またはインビトロのＧＰＲ４３活性を調節するための短鎖脂肪酸の使用に関する。
【００９７】
本発明はまた、インビボおよび／またはインビトロのＰＭＮ走化性を調節するための短鎖脂肪酸の使用に関する。
【００９８】
本発明はまた、ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドの部分欠失または全欠失を含む非ヒト哺乳類を確認する際の短鎖脂肪酸の使用に関する。
【００９９】
本発明はまた、ＧＰＲ４３をコードするポリヌクレオチドを過剰発現している非ヒト哺乳類を確認する際の短鎖脂肪酸の使用に関する。
【０１００】
本発明はまた、前記短鎖脂肪酸またはその塩が線状である、上記のような方法、キット、使用を包含する。
【０１０１】
本発明はまた、前記短鎖脂肪酸またはその塩が分岐状である、上記のような方法、キット、使用を包含する。
【０１０２】
本発明はさらに、前記短鎖脂肪酸またはその塩の１つまたはそれ以上の非カルボニル炭素が非炭素含有置換基で置換されている、上記のような方法、キット、使用を包含する。
【０１０３】
本発明はまた、前記短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、上記のような方法、キット、使用を包含する。
【０１０４】
本明細書中で用いる用語「多形核細胞」または「ＰＭＮ」とは、直径１０−１４μｍ範囲の顆粒球系列の白血球を意味する。本発明の「ＰＭＮ」は、２つまたはそれ以上の葉またはセグメントを有する、粗集合性の深染色性クロマチンを伴う核を有する（一方、未成熟ＰＭＮ細胞は、葉を持たない帯状核を有し得る）。本発明の「ＰＭＮ」はまた、小さくて弱染色性の、または大きくて強染色性の好塩基性顆粒、または大きい（０．５−１μｍ）好酸性顆粒を含有する顆粒性細胞質を有する。本発明のＰＭＮ細胞の形態学は当業者に周知である。
【０１０５】
本明細書中で用いる「ＰＭＮ走化性」とは、走化性因子に応答する、走化性因子の方向または逆方向へのＰＭＮ細胞の定方向運動を意味する。走化性因子には、細菌因子（Ｎ−ホルミル化ペプチド、例えばｆＭＬＰ、これは細菌タンパク質の初期化に特有の因子である）、血漿タンパク質（例えば、Ｃ５ａ、補体活性化の典型的経路または代替経路の活性化産物の１つ、およびロイコトリエン）および細胞（例えば、ＴＧＦ−ベータおよび他のサイトカイン、リンパ球、肥満細胞、および好塩基球から放出されるポリペプチド、Ｇｃ−グロブリン、オプソニン）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＭＮ走化性は、本発明にしたがい、1962年にS.Boydenによって最初に開発された手法によって測定することができる（S. Boyden (1962) The Chemotactic Effect of Mixtures of Antibody and Antigen on Polymorphonuclear Leucocytes, J. Exp. Med. 115: pp.453-466.を参照のこと）。簡単には、この手法では、ＰＭＮ細胞懸濁液および化学物質を２つの別々の区画に設置する。これらの区画はポリカーボネートフィルターで分離されている。ＰＭＮは例えば、哺乳類の末梢血から調製することができる。あらかじめ決められた時間の後、フィルターを取り除き、細胞懸濁液含有区画側フィルター表面の細胞を注意して取り除く。次いでフィルター上の残留細胞を固定し、染色する。ハイパワーの顕微鏡を用いてフィルターを検査し、フィルターの下面（すなわち化学物質含有区画側フィルター面）に現れた細胞の数を手動で計測する。正の走化性応答は、細胞がフィルターを通って化学物質含有区画側へ遊走または「クロール（crawl）」したことによって示される。時間がかかるので、典型的にはフィルター全体が検査されることはない。そのかわり、代表試料領域が検査され、計測される。本発明では、走化性因子が存在しない場合と比較して、走化性因子が区画内に存在する場合に、走化性因子含有区画に接したフィルター表面に少なくとも１０％以上のＰＭＮ細胞が存在すれば「ＰＭＮ走化性」が生じたとされる。
【０１０６】
本明細書中で用いる「拮抗薬」とは、受容体に対し、作用薬と同一部位で競合的に結合するが、活性型受容体により開始される細胞内応答を活性化しないリガンドである。これにより拮抗薬は、作用薬、例えばプロピオン酸によって誘導される細胞内応答を、作用薬の存在下かつ拮抗薬の不存在下での細胞内応答と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５−２０％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％阻害する。
【０１０７】
本明細書中で用いる「作用薬」とは、細胞内応答を誘導するプロピオン酸濃度と等しいか、あるいはより低い濃度で受容体と結合した場合に、細胞内応答を活性化するリガンドを意味する。本発明の作用薬は、受容体によって媒介される細胞内応答を、作用薬不存在下の細胞内応答と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等…）増大させることが可能である。本発明の作用薬は細胞表面受容体の内在化を低下させ、受容体の細胞表面発現を、作用薬不存在下の細胞表面に存在する細胞表面受容体数と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等…）増大させることが可能である。本発明の別の態様では、作用薬は細胞表面受容体を安定化し、受容体の細胞表面発現を、作用薬不存在下の細胞表面に存在する細胞表面受容体数と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等…）増大させる。
【０１０８】
本明細書中で用いる「逆作用薬」とは、受容体と結合した場合に細胞表面受容体の常時活性を減少させるリガンドを意味する。本発明の逆作用薬は、受容体によって媒介される常時細胞内応答を、逆作用薬不存在下の細胞内応答と比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍、そして最も好ましくは１００倍またはそれ以上（すなわち、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍等…）減少させることができる。
【０１０９】
本発明の「阻害剤」化合物とは、受容体に対する分子または受容体の天然産のリガンドに対する分子であり、酢酸塩またはプロピオン酸塩存在下のリガンドと受容体の結合を、酢酸塩またはプロピオン酸塩存在下で、かつ阻害剤不存在下の結合と比較して、少なくとも１０％、好ましくは１５−２５％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％減少させる。本発明の「阻害剤」化合物は、作用薬、例えば酢酸塩またはプロピオン酸塩によって誘導される細胞内応答を、少なくとも１０％、好ましくは１５−２５％、より好ましくは２５−５０％、そして最も好ましくは５０−１００％減少させることが可能である。また「阻害剤」とは、本発明の阻害剤化合物をコードするヌクレオチド配列をも意味する。本発明の有用な阻害剤には、ＧＰＲ４３の、少なくともＧＰＲ４３を介するシグナル伝達に必要とされる部分（例えばリガンド結合部位）に特異的に結合する抗体、またはＧＰＲ４３受容体と共役するシグナル伝達経路をブロックするか、あるいは（例えば少なくとも１０％）減少させることが可能な化合物が含まれるが、これらに限定されない。このような阻害剤には、致死下の用量の百日咳毒素、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；Sigma）、ジブチリルｃＡＭＰ（Boehringer Mannheim, Corp.）、およびＨ−８９（Ｎ−[２−((ｐ−ブロモシンナミル)アミノ)エチル]−５−イソキノリンスルホンアミド−ＨＣＬ；Calbiochem）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本明細書中で用いる「天然リガンド」とは、酢酸塩またはプロピオン酸塩と少なくとも等価の様式で（すなわちギ酸塩の親和性より大きい受容体に対する親和性で（酢酸塩＝プロピオン酸塩＞ギ酸塩））、受容体と結合する、天然に発見される、天然に存在するリガンドを意味する。「天然リガンド」は、天然には発見されず、受容体と結合するように操作されている改変リガンドを意味するのではない。改変リガンドはもともと、操作後の結合と程度または種類が異なっていて受容体と結合しなかったものである。このような改変リガンドはもはや天然に存在するのではなく、「非天然」であり、天然に存在する分子に由来する。
【０１１１】
本明細書中で用いる「調節因子」とは、本発明の受容体の細胞表面発現を増大または減少させる化合物、リガンドと本発明の受容体の結合を増大または減少させる化合物、または作用薬の存在または不存在下で、かつ受容体のリガンド、例えば酢酸塩またはプロピオン酸塩の存在下で本発明の活性型受容体によって開始される細胞内応答を増大または減少させる任意化合物を意味する。調節因子には、本明細書中で定義される、作用薬、拮抗薬、阻害剤または逆作用薬が含まれる。調節因子は、例えばポリペプチド、ペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子であり得る。候補調節因子は天然または合成の化合物であってよく、これには、例えば合成小分子、動物、植物、細菌または真菌細胞の抽出物ならびにそのような細胞由来のならし培地に含まれる化合物が含まれる。
【０１１２】
本明細書中で用いる「増大」および「減少」とは、ＧＰＲ４３受容体に対するリガンド結合および／またはＧＰＲ４３を介する細胞シグナル伝達の少なくとも１０％の変化を意味する。結合またはシグナル伝達における「増大」または「減少」は、候補調節因子の存在下でＧＰＲ４３をリガンドと接触させることに応答して測定するのが好ましく、この測定では、結合またはシグナル伝達の変化は候補調節因子不存在下の結合またはシグナル伝達と比較される。
【０１１３】
本明細書中で用いる用語「小分子」とは、３０００ダルトンより小さい、好ましくは２０００または１５００ダルトンより小さい、さらにより好ましくは１０００ダルトンより小さい、そして最も好ましくは６００ダルトンより小さい分子量を有する化合物を意味する。「有機小分子」は炭素を含む小分子である。
【０１１４】
本明細書中で用いる用語「変化」、「差異」、「増大」または「減少」は、例えば結合またはシグナル伝達活性、またはある物質の量に適用され、結合、シグナル伝達活性、または例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドまたはリガンドのレベルが、特定のアッセイの標準と比較して少なくとも１０％増大または減少することを意味する。
【０１１５】
本明細書中で用いる用語「調節不全」とは、以下のような試料中のＧＰＲ４３のシグナル伝達活性を意味する：
ａ）特定アッセイの測定で、１つまたはそれ以上のＧＰＲ４３ポリペプチド、リガンドまたはｍＲＮＡレベルの量が、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少している試料または；
ｂ）ＧＰＲ４３コード配列中、配列番号１と比較して、少なくとも一組の塩基対変化が検出され、パラグラフａ）、ｃ）またはｄ）で定義されるＧＰＲ４３リガンド結合またはシグナル伝達活性の変化を生じる試料または；
ｃ）特定アッセイの測定で、ＧＰＲ４３リガンド結合活性の量が、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少している試料または；
ｄ）特定アッセイの測定で、本明細書中で定義されるセカンドメッセンジャーが、本明細書中で定義される標準と比較して１０％またはそれ以上増大または減少している試料。
【０１１６】
本明細書中で用いる用語「ＳＣＦＡとＧＰＲ４３ポリペプチドの結合を許容する条件」とは、ＳＣＦＡ（例えば酢酸塩またはプロピオン酸塩）がＧＰＲ４３と結合する際の温度、塩濃度、ｐＨおよびタンパク質濃度等の条件を意味する。正確な結合条件は、アッセイが生細胞を用いるのか、または細胞の膜画分のみを用いるのか等のアッセイの性質に応じて変化し得る。しかしＧＰＲ４３は細胞表面タンパク質であるから、好ましい条件は一般に、生理的塩（９０ｍＭ）および生理的ｐＨ（約７．０から８．０）を含むだろう。結合温度は１５℃から３７℃まで変化させることができるが、好ましくは室温から約３０℃の温度であろう。結合反応中のＳＣＦＡの濃度もまた変化させることができるが、好ましくは約１μＭ（例えば放射性標識されたトレーサＳＣＦＡ、例えばプロピオン酸塩を用いる反応中、一般に、ＳＣＦＡ濃度がＫｄより低い）から１０ｍＭ（例えば競合因子としてのプロピオン酸塩）である。
【０１１７】
本明細書中で用いる用語「試料」とは、ＧＰＲ４３ポリペプチドに対する結合またはＧＰＲ４３ポリペプチドのシグナル伝達活性を調節する物質または調節因子化合物の存在に関する試験の対象である分子のソースを意味する。試料は、環境試料、動物、植物、酵母または細菌細胞または組織の天然抽出物、臨床試料、合成試料、または組換え細胞または発酵プロセス由来の条件培地であってもよい。用語「組織試料」とは、ＧＰＲ４３ポリペプチド、ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードする核酸、ＧＰＲ４３リガンドまたはＧＰＲ４３ポリペプチドのリガンド結合または活性を修飾する物質または化合物の存在、量、質または活性に関して試験を受ける組織を意味する。
【０１１８】
本明細書中で用いる「組織」は、器官内で特定機能を行う細胞の集合体である。本明細書中で用いる用語「組織」とは、特定の生理的領域由来の細胞性物質を意味する。特定組織の細胞はいくつかの異なる細胞タイプを含み得る。この非限定的な例としては、脳組織が挙げられよう。脳組織は、毛細内皮細胞および血球細胞、特定の組織セクションまたは試料中に含まれるすべてのものに加えて、さらにニューロンおよびグリア細胞を含む。また固形組織に加えて、用語「組織」は非固形組織、例えば血液を含むものとする。
【０１１９】
本明細書中で用いる用語「膜画分」とは、ＧＰＲ４３ポリペプチドを含む細胞性脂質膜の調製物を意味する。本明細書中で用いられるように、「膜画分」は細胞性ホモジネートと区別され、非膜結合細胞性成分が少なくとも部分的に（すなわち少なくとも１０％、好ましくはそれ以上）除去されている。用語「膜結合」とは、脂質膜に組み込まれているか、あるいは脂質膜に組み込まれている成分と物理的に結合している細胞性成分を意味する。
【０１２０】
本明細書中で用いる「セカンドメッセンジャーアッセイ」は、以下を測定する工程を含むのが好ましい：グアニンヌクレオチドの結合または交換、アデニル酸シクラーゼ、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度、ＭＡＰキナーゼ（群）またはチロシンキナーゼ（群）、プロテインキナーゼＣ活性、またはレポーター遺伝子発現またはエクオリンに基づくアッセイ。この測定は当技術分野に既知で、かつ本明細書中で定義される方法にしたがう。
【０１２１】
本明細書中で用いる用語「セカンドメッセンジャー」とは、Ｇタンパク質共役受容体の活性化によって生産されるか、または濃度の変化が引き起こされ、このＧＰＣＲ由来のシグナル伝達に関与する分子を意味する。セカンドメッセンジャーの非限定的な例には、ｃＡＭＰ，ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出、イノシトール三リン酸および細胞内カルシウムが含まれる。用語「セカンドメッセンジャーのレベルの変化」とは、候補調節因子の不存在下で行われるアッセイで検出される量と比較して、特定セカンドメッセンジャーの検出レベルが少なくとも１０％増大または減少することを意味する。
【０１２２】
本明細書中で用いる用語「エクオリンに基づくアッセイ」とは、活性化ＧＰＣＲによって誘導される細胞内カルシウム流動を測定する、ＧＰＣＲ活性についてのアッセイを意味し、このアッセイでは、細胞内で発現されるエクオリンの発光によって細胞内カルシウム流動が測定される。
【０１２３】
本明細書中で用いる用語「結合」とは、リガンド（例えばプロピオン酸塩のようなＳＣＦＡまたは抗体）と受容体（例えばＧＰＲ４３）の物理的会合を意味する。本明細書中で用いられるように、結合が１ｍＭより小さい、一般に１ｍＭから１０ｎＭの範囲のＥＣ５０またはＫｄで生じる場合、この結合は「特異的」である。例えばＥＣ５０またはＫｄが１ｍＭ、５００μＭ、１００μＭ、１０μＭ、９．５μＭ、９μＭ、８．５μＭ、８μＭ、７．５μＭ、７μＭ、６．５μＭ、６μＭ、５．５μＭ、５μＭ、４．５μＭ、４μＭ、３．５μＭ、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭまたは１００ｎＭまたはそれ以下である場合、結合は特異的である。
【０１２４】
本明細書中で用いる用語「ＥＣ５０」とは、プロピオン酸塩または他のリガンドの結合およびＧＰＲ４３ポリペプチドの機能的活性を含む特定の活性が、化合物不存在下で同一アッセイを用いて測定可能なＧＰＲ４３活性に関する最大値の５０％である化合物の濃度を意味する。言い換えれば、「ＥＣ５０」とは、１００％活性化が、さらに作用薬を添加しても増大しない活性量で設定される場合には、５０％活性化を示す化合物の濃度である。例えばプロピオン酸塩アナログの「ＥＣ５０」は、アッセイで用いられるアナログの独自性に応じて変化し得ることに注意すべきである。例えばプロピオン酸塩アナログはプロピオン酸塩より高いか、より低いか、あるいは同一のＥＣ５０値を有し得る。したがって、プロピオン酸塩アナログがプロピオン酸塩と異なっている場合には、当業者は従来の方法にしたがってそのアナログに関するＥＣ５０を決定することができる。特定のＳＣＦＡのＥＣ５０は、少なくともＧＰＲ４３応答が飽和するか、あるいは最大まで増大させるＳＣＦＡ用量の存在下で、固定量のＧＰＲ４３ポリペプチドの活性に関するアッセイを実行し、次いで測定されたＧＰＲ４３活性をＳＣＦＡ濃度に対してプロットすることによって測定される。
【０１２５】
本明細書中で用いる用語「飽和」とは、リガンド濃度をさらに増加してもリガンドの結合またはＧＰＲ４３特異的シグナル伝達活性が増大しないプロピオン酸塩または他のリガンドの濃度を意味する。
【０１２６】
本明細書中で用いる用語「ＩＣ５０」は、ＧＰＲ４３受容体の最大活性を５０％減少させる拮抗薬または逆作用薬の濃度である。
【０１２７】
本明細書中で用いる用語「ＬＤ５０」とは、投与対象の５０％を死滅させるのに必要な個々の物質の用量を意味する。
【０１２８】
本明細書中で用いる用語「結合の減少」とは、既知または推定のＧＰＲ４３調節因子を用いる特定のアッセイで検出されるリガンド結合量が、その既知または推定のＧＰＲ４３調節因子を欠いているアッセイで検出される結合と比較して少なくとも１０％減少することを意味する。
【０１２９】
本明細書中で用いる用語「供給する（derivering）」とは、薬物または物質に関して用いられる場合、アッセイ混合物または培養細胞に薬物または物質を添加することを意味する。この用語はまた、動物への薬物または物質の投与を意味する。このような投与は、例えば（例えば滅菌食塩水または水中での適当な担体）注射または吸入、または経口、経皮、直腸内、膣内、または他の一般的薬物投与経路によって行うことができる。
【０１３０】
本明細書中で用いる用語「標準」とは、ＧＰＲ４３活性の調節不全を特徴とする疾患または障害を患わない個体から採取される試料を意味する。「標準」は、ＧＰＲ４３ｍＲＮＡまたはポリペプチドレベルおよび性質（すなわち突然変異型対野生型）の比較、ならびにＧＰＲ４３活性の比較に関する基準として用いられる。「標準」はまた、参照配列、例えば配列番号１または配列番号２を包含する。核酸配列またはそれがコードするポリペプチドがこれらの配列と比較される。
【０１３１】
本明細書中で用いる用語「増幅」とは、核酸配列に適用される場合、鋳型の核酸から１つまたはそれ以上のコピーの核酸配列が生産されるプロセスを意味する。好ましい「増幅」方法はＰＣＲまたはＲＴ／ＰＣＲである。
【０１３２】
本明細書中で用いる用語「Ｇタンパク質共役受容体」または「ＧＰＣＲ」とは、７つのアルファらせん状膜貫通ドメインを有する膜結合ポリペプチドを意味する。機能的ＧＰＣＲはリガンドまたは作用薬と会合し、さらにＧタンパク質と会合して、これを活性化する。ＧＰＲ４３はＧＰＣＲである。
【０１３３】
本明細書中で用いる用語「抗体」は、通常の免疫グロブリン分子、ならびに対象ポリペプチドの１つと特異的に反応するその断片である。抗体は従来の技術を用いて断片化することができる。当該断片は、完全長抗体に関して本明細書中以下に記載される方法と同様の方法で、その有用性に関してスクリーニング可能である。例えば、抗体をペプシンで処理してＦ(ａｂ)２断片を作成することができる。得られたＦ(ａｂ)２断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ断片を作成できる。本発明の抗体はさらに、二重特異性、単一鎖、およびキメラおよびヒト化分子であって、この抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与される、ポリペプチドに対する親和性を有する分子を含むものとする。好ましい態様では、抗体はさらに、自身に結合している検出可能な標識を含む（例えば標識は放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、または酵素補因子であってよい）。抗体、モノクローナルまたはポリクローナルおよびその超可変部分（ＦＡＢ、ＦＡＢ"、等）、ならびに抗体産生ハイブリドーマ細胞は本発明のさらなる側面である。該側面は、好ましくは本明細書中以下に記載されるような、特定の疾患の診断およびモニタリング分野で具体的な産業的適用を見出すものである。
【０１３４】
本発明の阻害剤には、標識モノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその抗体の超可変部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本明細書中で用いる用語「トランスジェニック動物」とは、１つまたはそれ以上の細胞が人為的介入、例えば当技術分野に周知のトランスジェニック技術によって導入された異種の核酸を含有する、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類、魚類または両生類を意味する。前記核酸は、直接または間接的に、細胞前駆体への導入によって、慎重な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクションによって、または組換えウイルスを用いる感染によって細胞内に導入される。用語「遺伝子操作」には、典型的な交雑育種またはインビトロ受精は含まれず、組換えＤＮＡ分子の導入を指す。この分子は染色体内に組み込ませることができ、あるいは染色体外複製ＤＮＡとすることもできる。本明細書中に記載の典型的なトランスジェニック動物では、導入遺伝子により細胞は１対象ポリペプチドの組換え型、例えば作用薬型または拮抗薬型を発現する。しかし、例えば以下に記載のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性コンストラクトのように、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物もまた考慮される。さらにまた、「トランスジェニック動物」には、人為的介入、例えば組換え技術およびアンチセンス技術の両者によって、１つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子破壊が生じている組換え動物が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３６】
本発明は、短鎖脂肪酸がオーファンＧタンパク質共役受容体ＧＰＲ４３の天然リガンドであるという発見および薬物スクリーニング方法において受容体に対するこのリガンドの結合を用いる方法に基づくものである。既知のリガンドおよびその受容体ＧＰＲ４３との相互作用はまた、受容体活性の調節不全が関与する症状の診断を提供する。本発明はまた、ＧＰＲ４３および相同配列、その対応するポリヌクレオチドおよび／またはこのポリヌクレオチドを発現する組換え細胞を含むキットであって、この受容体ポリペプチドおよび／またはその対応するポリヌクレオチドの作用薬、拮抗薬および逆作用薬化合物を同定するためのキットに関する。このようなキットは、ＧＰＲ４３活性に関連する疾患および障害の診断、予防および／または処置に有用である。
【０１３７】
本発明はまた、本発明の方法にしたがって同定される、この受容体ポリペプチドおよびその対応するポリヌクレオチドの新規作用薬、拮抗薬および逆作用薬化合物に関する。
【０１３８】
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される。
【０１３９】
配列
本発明は、ＧＰＲ４３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）に関する（図１に示す）。本発明はまた、ＧＰＲ４３をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と相同な配列に関する。
【０１４０】
ＧＰＲ４３組織分布
ＧＰＲ４３は主に好中球で発現され、より低い程度には、単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、ならびに脾臓および骨髄で発現されている。そのｍＲＮＡはまた、好酸球および肥満細胞で弱く検出される。その発現は、サイトカインおよびＬＰＳ刺激によって高められ、これにより白血球分化および活性化に役割を果たす可能性が示唆される（Senga et al.,2002）。
【０１４１】
配列相同性の計算
本明細書中に記載の任意の配列に関する配列同一性は、いずれか１つまたはそれ以上の配列を別の配列とシンプルに「肉眼」比較（すなわち厳密に比較）し、この別の配列がこの配列（群）に対して、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有するか否かを確かめることによって決定可能である。
【０１４２】
相対的配列同一性はまた、任意の適当な同一性測定用アルゴリズムを、例えばデフォルトパラメータを用いて使用し、２つまたはそれ以上の配列間の％同一性を算出可能な市販のコンピュータプログラムによって決定することができる。このようなコンピュータプログラムの典型的な例はCLUSTALである。２配列間の同一性および類似性を測定する他のコンピュータプログラム方法には、GCGプログラムパッケージ（Devereux et al(1984) NucleicAcids Research 12: 387）およびFASTA（Atschul et al(1990)J Molec Biol 403-410）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
％相同性は近接する配列にわたって計算することができる。すなわち、１配列が他の配列とアライメントされ、１配列内の各アミノ酸が他の配列内の対応するアミノ酸と１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップのない」アライメントと称される。典型的にギャップのないアライメントは比較的少数の残基にわたってのみ行われる。
【０１４４】
この方法は非常にシンプルで一貫性のある方法であるが、この方法では、例えば別の同一対の配列において、１挿入または欠失があれば、それ以降のアミノ酸残基がアライメントから排除されるため、広範囲のアライメントが行われる場合には％相同性が大きく減少する可能性があることを考慮していない。したがって、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に不利にすることなく、挿入および欠失の可能性を考慮する最適なアライメントを実行するように設計されている。これは局所相同性を最大にするように、配列アライメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１４５】
一方、これらのより複雑な方法では、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、同数の同一アミノ酸に関して、可能な限り少ないギャップしか含まない配列アライメント−これは２比較配列間のより高い関連性を反映する−が多数のギャップを含むアライメントより高いスコアを達成する。ギャップの存在に対して相対的に高いコストを課し、このギャップ内の以後の各残基に対しては比較的低いペナルティを課する「アフィンギャップコスト（Affinegapcosts）」が典型的に用いられる。これが最も一般的に用いられるギャップスコア系である。高いギャップペナルティーは当然、より少ないギャップしか有さない最適化されたアライメントを生じさせる。ほとんどのアライメントプログラムはギャップペナルティーの修正を可能にしている。しかし、このようなソフトウェアを配列比較のために用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、GCGWisconsinBestfitパッケージを用いる場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、各延長残基に対して−４である。
【０１４６】
したがって最大％相同性の計算は、第一に、ギャップペナルティーを考慮する最適アライメントの作成を必要とする。このようなアライメントを実行するのに適当なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U. S. A.; Devereuxら (1984)Nucleic Acids Research 12: 387）である。配列比較を実行可能な他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ（Ausubel et al (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons）、FASTA（Atschul et al (1990) J. Mol. Biol., 403-410）およびGENEWORKS比較ツールパッケージが含まれるが、これらに限定されない。BLASTおよびFASTAはオフラインおよびオンライン検索によって入手可能である（Ausubel et al (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, ページ7−58から7−60）。
【０１４７】
最終％相同性は同一性の観点から測定することができるが、アライメントプロセスそのものは典型的に全か無かの対比較に基づくものではない。その代わりに、化学類似性または進化距離に基づく各対ごとの比較にスコアを割り当てる、スケール化された類似性スコアマトリクスが一般に用いられる。このような一般に用いられるマトリクスの例は、BLOSUM62マトリクス（BLASTプログラムパッケージのデフォルトマトリクス）である。GCGWisconsinプログラムは一般に、公開されているデフォルト値または、提供されていれば、カスタムのシンボル比較テーブルを用いる。GCGパッケージについては公開されているデフォルト値、または他のソフトウェアではデフォルトマトリクス、例えばBLOSUM62を使用するのが好ましい。
【０１４８】
BLASTアルゴリズムはパラメータをデフォルト値に設定して用いるのが有益である。BLASTアルゴリズムはhttp://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlに詳細に記載され、これは引用により本明細書中に包含される。検索パラメータは以下のように定義されており、これらは規定のデフォルトパラメータに設定するのが有益である。
【０１４９】
「実質的同一性」とは、BLASTによって評価される場合、少なくとも約７、好ましくは９、そして最も好ましくは１０またはそれ以上のEXPECT値と一致する配列と同じである。BLAST検索のEXPECTに関するデフォルトの閾値は通常１０である。
【０１５０】
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、 blastn、 blastx, tblastn、およびtblastxによって用いられる発見的検索アルゴリズムである。これらのプログラムはその有意性をKarlinおよびAltschulの統計的方法（KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68;  KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlを参照）を２、３強化して用いる調査結果に帰する。BLASTプログラムは配列類似性検索用に、例えばクエリー配列に対する相同体を同定するように調整されている。配列データベースの類似性検索における基本的問題の議論に関しては、Altschulら (1994) Nature Genetics 6: 119-129を参照のこと。
【０１５１】
http://www.ncbi.nlm.nih.govで入手可能な５つのBLASTプログラムは以下のタスクを実行する：blastp−アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する；blastn−ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；blastx−ヌクレオチドクエリー配列（両鎖）の６フレーム概念翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する；tblastn−タンパク質クエリー配列を、全６リーディングフレーム（両鎖）で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する；tblastx−ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳物をヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳物と比較する。
【０１５２】
BLASTは以下の検索パラメータを用いる：
HISTOGRAM−各検索スコアに関するヒストグラムを表示する；デフォルトはイエスである（BLASTマニュアルのパラメータＨを参照のこと）。
【０１５３】
DESCRIPTIONS−一致配列について報告される簡単な記述（description）の数を特定数に制限する；デフォルト制限値は１００記述（description）である。（マニュアルページのパラメータＶを参照のこと）。
【０１５４】
EXPECT−データベース配列との一致の報告に関する統計的有意さの閾値；デフォルト値は１０であり、KarlinおよびAltschul (1990)の確率論的モデルにしたがえば、１０一致はただ偶然にのみ観察されると予想される。一致の統計的有意さがEXPECT閾値より大きい場合、一致は報告されない。EXPECT閾値が低いほど、よりストリンジェントであり、一致が報告される機会がより少なくなる。分数値も許容される。（BLASTマニュアルのパラメータＥを参照のこと）。
【０１５５】
CUTOFF−高スコア断片対の報告に関するカットオフスコア。デフォルト値は EXPECT値から算出される（上記を参照のこと）。HSPがデータベース配列に関して報告されるのは、その統計的有意さが、CUTOFF値と等しいスコアを有する単一のHSPの有意さと少なくとも等しい高さである場合にのみである。CUTOFF値が高いほど、よりストリンジェントであり、一致が報告される機会がより少なくなる。（BLASTマニュアルのパラメータＳを参照のこと）。典型的には、有意さの閾値はEXPECTを用いて比較的感覚的に管理される。
【０１５６】
ALIGNMENTS−高スコア断片対（HSP）報告の対象であるデータベース配列を特定数に制限する；デフォルト制限値は５０である。この値より多数のデータベース配列が報告に関する統計的有意さの閾値を満たす場合（本明細書中のEXPECTおよびCUTOFFを参照のこと）、高い統計的有意さを示す一致のみが報告される。（BLASTマニュアルのパラメータＢを参照のこと）。
【０１５７】
MATRIX−BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXに関して代替のスコアリングマトリクスを特定する。デフォルトマトリクスはBLOSUM62である（Henikoff & Henikoff,1992）。有効な代替の選択には、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが含まれる。BLASTNについては利用可能な代替のスコアリングマトリクスがない；BLASTNリクエストにMATRIXコマンドを特定すると、エラー応答が返される。
【０１５８】
STRAND−TBLASTN検索をデータベース配列のトップ鎖またはボトム鎖のみに制限する；またはBLASTN, BLASTXまたはTBLASTX検索をクエリー配列のトップ鎖またはボトム鎖のリーディングフレームのみに制限する。
【０１５９】
FILTER−Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163のSEGプログラムによって測定される、組成の複雑さが低いクエリー配列の断片、またはClaverie & States (1993) Computers and Chemistry 17: 191- 201のXNUプログラム、または、BLAST用には、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと）によって測定される、短周期の内部反復からなる断片  を隠す。フィルタリングは統計的に有意であるが、生物学的に関心のない報告（例えば通常の酸性残基、塩基性残基またはプロリンリッチ領域に対するヒット）をblast出力から排除し、データベース配列との具体的な照合に利用可能な、クエリー配列の生物学的により関心のある領域を残すことができる。
【０１６０】
フィルタープログラムによって発見される複雑さが低い配列は、ヌクレオチド配列中では、文字「N」を用いて置換され（例えば「NNNNNNNNNNNNN」）、タンパク質配列中では、文字「X」を用いて置換される（例えば「XXXXXXXXX」）。
【０１６１】
フィルタリングはクエリー配列（またはその翻訳産物）に適用されるのみであり、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTNに関してはDUSTであり、他のプログラムに関してはSEGである。
【０１６２】
SWISS-PROTで配列に適用された場合、SEG, XNU、または両者によって何も隠されていないのは異常ではなく、つまりフィルタリングは常に効果を生じると予測するべきでない。さらに、配列全体が隠されていることもあり、これはフィルターされていないクエリー配列に対して報告される任意の一致についての統計的有意さが疑われるべきであることを示す。
【０１６３】
NCBI-gi−受入(accession)および／または遺伝子座名に加えて、NCBI gi識別子を出力に表示させる。
【０１６４】
配列比較は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTで提供されているシンプルBLAST検索アルゴリズムを用いて行われるのが最も好ましい。本発明のいくつかの態様では、配列同一性の測定時にギャップペナルティーを用いない。
【０１６５】
細胞
本発明の有用な細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
【０１６６】
本発明の有用な細胞は、本発明の受容体をコードする核酸配列が導入可能で、この受容体が、本明細書中で定義される、天然レベルで、あるいは天然レベル以上に発現可能な任意の細胞であり得る。細胞内で発現される本発明の受容体は、本明細書中で定義される、正常の、または正常に近い薬理作用を示すのが好ましい。最も好ましくは、細胞内で発現される本発明の受容体は、図１に示されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、または図１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。細胞内で発現される本発明の受容体は、ＩＤＰおよびＵＤＰに関する親和性より少なくとも１００倍、好ましくは５００倍、そして最も好ましくは１０００倍高い親和性でプロピオン酸塩と結合するのが好ましい。
【０１６７】
本発明の好ましい態様では、細胞は、COS-7細胞、CHO細胞、LM (TK-)細胞、NIH-3T3細胞、HEK-293細胞、K-562細胞または1321N1星細胞腫細胞、または他のトランスフェクション可能な細胞株からなる群から選択される。
【０１６８】
アッセイ
I．ＧＰＲ４３の活性を調節する物質の同定に関するアッセイ
ＧＰＲ４３の活性を調節する物質は、新規に発見された、当該受容体とＳＣＦＡ、例えば酢酸塩またはプロピオン酸塩の相互作用を利用する多数の方法によって同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上またはインビボでのＧＰＲ４３／プロピオン酸塩結合再構成能は、この結合を分裂させる物質の同定に関する標的を提供する。結合の分裂に基づくアッセイは、物質、例えば有機小分子をそのような分子のライブラリまたはコレクションから同定できる。別法では、このようなアッセイは、天然ソース（起源）由来の試料または抽出物中、例えば、植物、真菌または細菌抽出物中、またはヒト組織試料（例えば腫瘍組織）中でさえ、物質を同定できる。一側面では、抽出物は変異型核酸、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリを発現している細胞から作成できる。その後、ＧＰＲ４３／ＳＣＦＡ結合の調節因子は、結合アッセイまたは、当該受容体を介する下流のシグナル伝達を測定する機能アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１６９】
ＧＰＲ４３機能を調節する物質をより直接的に同定するためにＧＰＲ４３／ＳＣＦＡ相互作用を使用する別のアプローチでは、候補物質または候補調節因子によって誘導されるＧＰＲ４３下流シグナル伝達の変化を測定する。これらの機能アッセイは単離された細胞膜画分中または当該受容体を表面に発現している細胞上で行うことができる。
【０１７０】
ＳＣＦＡ、例えば酢酸塩およびプロピオン酸塩がＧＰＲ４３受容体のリガンドであることが発見されたことにより、受容体活性の作用薬、拮抗薬および逆作用薬を同定するためのスクリーニングアッセイが可能になる。該スクリーニングアッセイは、以下に詳細に説明する、２つの一般的アプローチを有する。この段落では、プロピオン酸塩を典型的なＳＣＦＡとして用いる。しかし、本明細書中で定義される任意のＳＣＦＡが記載されるアッセイで使用可能であることが理解されよう。
【０１７１】
１）リガンド結合アッセイ
このアッセイでは、ＧＰＲ４３発現細胞、このような細胞由来の膜抽出物、またはＧＰＲ４３を含む固定化脂質膜が標識物質および候補化合物に曝露される。インキュベート後、反応混合物は、ＧＰＲ４３受容体に対する標識物質の特異的結合を測定される。標識物質の結合を妨げるか、あるいはこれを置換する化合物は、ＧＰＲ４３活性の作用薬、拮抗薬または逆作用薬となり得る。以後の機能分析は陽性化合物に対して行い、この化合物がこれらいずれの部類に属するか決定することができる。
【０１７２】
２）機能アッセイ、このアッセイではＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が測定される。
ａ）作用薬のスクリーニングでは、ＧＰＲ４３発現細胞またはこの細胞から調製される膜が候補化合物とインキュベートされ、ＧＰＲ４３のシグナル伝達活性が測定される。受容体活性を調節する化合物によって誘導される活性は、天然リガンド、酢酸塩またはプロピオン酸塩によって誘導される活性と比較される。作用薬または部分作用薬は、１ｍＭ以下の作用薬または部分作用薬が存在する場合に、プロピオン酸の最大活性の少なくとも１０％に相当する最大の生物学的活性を有するだろう。これらは酢酸塩またはプロピオン酸塩と少なくとも等しい効力を有するのが好ましい。
【０１７３】
ｂ）拮抗薬または逆作用薬のスクリーニングでは、ＧＰＲ４３発現細胞またはこの細胞から単離される膜を、プロピオン酸塩存在下で、候補化合物の存在または不存在下でシグナル伝達活性に関してアッセイする。拮抗薬は、プロピオン酸塩が刺激する受容体活性のレベルを、プロピオン酸存在下の拮抗薬を欠いている反応と比較して少なくとも１０％減少させるだろう。逆作用薬は、この受容体の構成性活性を、逆作用薬を欠いている反応と比較して少なくとも１０％減少させるだろう。
【０１７４】
ｃ）逆作用薬のスクリーニングでは、常時ＧＰＲ４３活性を発現している細胞またはこの細胞から単離される膜が、この受容体の活性を候補化合物の存在下で測定する機能アッセイに用いられる。逆作用薬は、この受容体の常時活性を少なくとも１０％減少させる化合物である。ＧＰＲ４３の過剰発現により常時の活性化を生じさせることができる。ＧＰＲ４３は強力な常時性プロモーター、例えばＣＭＶ早期プロモーターの制御下に配置することによって過剰発現させることができる。また、保存ＧＰＣＲアミノ酸またはアミノ酸ドメインの特定変異により常時活性を生じさせることも多い。例えば以下を参照のこと：Kjelsberg et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 1430; Mc Whinney et al (2000) J. Biol. Chem. 275: 2087; Ren et al (1993) J. Biol. Chem. 268: 16483; Samama et al (1993)J.Biol.Chem 268:4625; Parma et al (1993) Nature 365: 649;Parma et al (1998) J. Pharmacol. Exp. Ther. 286: 85; およびParent et al (1996) J. Biol. Chem. 271: 7949。
【０１７５】
リガンド結合および置換アッセイ：
上記（１）に記載されるように、細胞上で発現されているＧＰＲ４３ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離された膜を、プロピオン酸塩とともに用いて、プロピオン酸塩とＧＰＲ４３の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。この段落では、プロピオン酸塩を典型的なＳＣＦＡとして用いる。しかし、本明細書中で定義される任意のＳＣＦＡが記載されるアッセイで使用可能であることが理解されよう。
【０１７６】
置換実験では、ＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞（通常２５，０００細胞／アッセイ、または膜抽出物１から１００μｇ）は、結合バッファー中、増加濃度の候補調節因子の存在または不存在下で、標識プロピオン酸塩とインキュベートされる。アッセイを有効にし、較正するために、増加濃度の標識されていないプロピオン酸塩を用いるコントロール競合反応を行うことができる。インキュベート後、細胞は何度も洗浄され、結合した標識プロピオン酸塩が特定の標識に応じて適切に（例えばシンチレーション計測、蛍光、等）測定される。候補調節因子の存在下で、結合した標識プロピオン酸塩量の少なくとも１０％が減少すれば、候補調節因子によって結合が置換されたことが示される。候補調節因子が、このアッセイまたは本明細書中に記載の他のアッセイで特異的に結合するとみなされるのは、１ｍＭ以下の濃度で、標識プロピオン酸塩（飽和以下プロピオン酸塩用量）の５０％を置換する場合である。
【０１７７】
別法では、結合または結合の置換は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によりモニターできる。表面プラスモン共鳴アッセイは、固定センサーに近接する質量の変化によって２分子間の結合を測定する定量的方法として用いることができ、この質量の変化は、水相由来プロピオン酸塩とセンサー上の膜内に固定されたＧＰＲ４３ポリペプチドの結合または結合の喪失によって生じる。この質量の変化は、プロピオン酸塩または候補調節因子の注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Biacore Biosensor（BiacoreAB）を用いて測定される。ＧＰＲ４３は、Salamonらによって示される方法にしたがって、薄膜脂質膜中のセンサーチップ（例えば研究等級ＣＭ５チップ；BiacoreAB）に固定することができる（Salamon et al (1996) Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al (2001) Biophys. J. 80 : 1557-1567; Salamon et al (1999) Trends Biochem. Sci. 24: 213-219、これらはそれぞれ引用により本明細書中に包含される）。Sarrioらは、ＳＰＲを用いて、チップ上の脂質層に固定されているＧＰＣＲＡ(１)アデノシン受容体に対するリガンド結合を検出できることを示した（Sarrioら(2000) Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174、これは引用により本明細書中に包含される）。ＳＰＲアッセイにおけるＧＰＲ４３に対するプロピオン酸結合の条件は、当業者がSarrioらによって報告されている条件を出発点として用いて微調整可能である。
【０１７８】
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で、結合の調節因子に関してアッセイすることができる。第一に、プロピオン酸塩は、固定されたＧＰＲ４３ポリペプチドにあらかじめ結合させておくことができ、次いで、０．１ｎＭから１μＭの範囲の候補調節因子が注入される。結合プロピオン酸塩の置換は定量可能であり、調節因子結合の検出が可能になる。別法では、膜結合ＧＰＲ４３ポリペプチドは、候補調節因子とプレインキュベート可能であり、これがプロピオン酸塩で惹起される。調節因子にあらかじめ曝露されていないチップ上のＧＰＲ４３と比較して、調節因子に曝露されたＧＰＲ４３に対するプロピオン酸塩の結合に差異があれば、調節因子の存在下でのプロピオン酸塩の結合または置換が示されることになる。いずれのアッセイでも、候補調節因子存在下の結合プロピオン酸塩の量が、候補調節因子不存在下の結合プロピオン酸塩の量と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、該候補調節因子がＧＰＲ４３およびプロピオン酸塩の相互作用を阻害することが示される。
【０１７９】
ＧＰＲ４３に対するプロピオン酸塩の結合の阻害を検出する別の方法では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が用いられる。ＦＲＥＴは、互いに近接している（通常、＜１００Ａの分離）蛍光ドナー（Ｄ）および蛍光アクセプター（Ａ）間で、Ｄの発光スペクトルがＡの励起スペクトルと重複する場合に生じる量子力学的現象である。試験対象分子、例えばプロピオン酸およびＧＰＲ４３ポリペプチドは、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの相補対で標識されている。ＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用によって密接に結合した状態で、ドナーフルオロフォアが励起されて発光する蛍光は、プロピオン酸塩およびＧＰＲ４３ポリペプチドが結合していない場合の励起波長に応答して発光する蛍光と異なる波長を有し、したがって各波長の発光強度を測定することにより結合分子対未結合分子が定量される。ＧＰＲ４３ポリペプチドを標識するためのドナーフルオロフォアは当技術分野に周知である。特に興味深いのは、Cyan FP（ＣＦＰ、ドナー（Ｄ））およびYellow FP（ＹＦＰ、アクセプター（Ａ））として既知のＡ．VictoriaＧＦＰの変異体である。例として、ＧＰＲ４３との融合タンパク質としてＹＦＰ変異体を作成できる。融合物としてのＧＦＰ変異体を発現するベクター（Clontech）およびフルオロフォア標識されたプロピオン酸塩化合物（Molecular Probes）は当技術分野で既知である。標識プロピオン酸塩およびＹＦＰ−ＧＰＲ４３タンパク質の混合物に候補調節因子を加えると、例えば、候補調節因子を含まない試料と比較してＹＦＰ蛍光が減少し、エネルギー転移の阻害が生じたことが証明されるだろう。ＧＰＲ４３：プロピオン酸相互作用検出のためにＦＲＥＴを用いるアッセイでは、候補調節因子含有試料中のアクセプター波長での蛍光発光強度が、候補調節因子を含まない試料と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用を阻害することが示される。
【０１８０】
ＦＲＥＴのバリエーションでは、蛍光消光を用いて分子の相互作用をモニターする。相互作用ペアの一方の分子をフルオロフォアで標識し、他方は、フルオロフォアと密接付着に至るとその蛍光を消光する分子で標識することができる。励起時の蛍光変化は、フルオロフォア：消光剤ペアで標識された分子の会合の変化を示す。一般に、標識ＧＰＲ４３ポリペプチドの蛍光が増大すれば、消光剤を保持するプロピオン酸塩分子が置換されたことを示す。消光アッセイでは、候補調節因子含有試料中の蛍光発光強度が、候補調節因子を含まない試料と比較して１０％またはそれ以上増大すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用を阻害することが示される。
【０１８１】
表面プラスモン共鳴およびＦＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定が結合の定量に有用である。蛍光標識された分子に関する蛍光偏光値は回転相関時間または反転速度に依存する。複合体、例えば蛍光標識プロピオン酸塩と会合したＧＰＲ４３によって形成される複合体は、複合体でない標識プロピオン酸塩より高い偏光値を有する。ＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用の候補阻害剤を含むことにより、候補阻害剤を含まない混合物と比較して蛍光偏光が減少するのは、該候補阻害剤がＧＰＲ４３とプロピオン酸塩の相互作用を分裂させるか、あるいは阻害する場合である。蛍光偏光は、受容体：リガンド複合体の形成を乱す小分子の同定に非常に適している。候補調節因子含有試料中の蛍光偏光が、候補調節因子を欠いている試料中の蛍光偏光と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用を阻害することが示される。
【０１８２】
ＧＰＲ４３：プロピオン酸塩相互作用をモニターするもう１つの代替の方法では、バイオセンサーアッセイが用いられる。ＩＣＳバイオセンサーは当技術分野の文献に記載されている（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；  ｗｗｗ．ａｍｂｒｉ．ｃｏｍ．ａｕ／；  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｂ，Ｂｒａａｃｈ−Ｍａｋｓｖｙｔｉｓ  Ｖ，Ｋｉｎｇ  Ｌ，Ｏｓｍａｎ  Ｐ，Ｒａｇｕｓｅ  Ｂ，Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ  ＬおよびＰａｃｅ  Ｒ．“Ａ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｔｈａｔ  ｕｓｅｓ  ｉｏｎ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８７，５８０）。この技術では、ＧＰＲ４３およびそのリガンドの会合を、懸濁膜二重層中のグラミシジン（gramacidin）促進性イオンチャネルの閉塞と、すなわちバイオセンサーアドミタンス（インピーデンスと類似）の測定可能な変化と共役させる。このアプローチは６桁の振幅のアドミタンス変化にわたって線形であり、小分子の組み合わせライブラリの大規模なハイスループットスクリーニングに理想的に適している。候補調節因子含有試料中のアドミタンスが、候補調節因子を欠いている試料のアドミタンスと比較して１０またはそれ％以上変化（増大または減少）すれば、該候補調節因子がＧＰＲ４３およびプロピオン酸塩の相互作用を阻害することが示される。ＧＰＲ４３とプロピオン酸塩の相互作用を試験するアッセイでは、相互作用の調節因子が、プロピオン酸塩と物理的に相互作用しているタンパク質のドメイン（群）と必ずしも直接相互作用することを要しないことに注意することが重要である。また調節因子は、相互作用部位から離れた位置で相互作用し、例えばＧＰＲ４３ポリペプチドのコンフォメーション変化を生じさせることが可能である。それでもなお、この様式で作用する調節因子（阻害剤または作用薬）は、ＧＰＲ４３の活性を調節する物質として興味深い。
【０１８３】
本明細書中に記載の任意の結合アッセイが、ＧＰＲ４３の非プロピオン酸塩リガンド（例えば、作用薬、拮抗薬、等）を用いて実行可能であることが理解されよう。これは例えば、本明細書中に記載のように同定される小分子またはプロピオン酸塩アナログ、例えば非限定的に、任意のプロピオン酸塩アナログ、天然産のまたは合成ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、および有機小分子である。
【０１８４】
本明細書中に記載される任意の結合アッセイを用いて、試料、例えば組織試料中の、ＧＰＲ４３受容体分子と結合する物質、またはプロピオン酸塩と該受容体の結合に影響する物質の存在を決定することができる。この場合、ＧＰＲ４３ポリペプチドを、試料の存在または不存在下でプロピオン酸塩または別のリガンドと反応させ、プロピオン酸塩またはリガンドの結合を、使用される結合アッセイに応じて適切に測定する。プロピオン酸塩または他のリガンドの結合が１０％またはそれ以上減少すれば、該試料が、受容体ポリペプチドに対するプロピオン酸塩またはリガンドの結合を調節する物質を含有することが示される。
【０１８５】
受容体活性の機能アッセイ
【０１８６】
i．ＧＴＰアーゼ／ＧＴＰ結合アッセイ：
ＧＰＣＲ、例えばＧＰＲ４３に関して、受容体活性の基準は受容体含有細胞膜によるＧＴＰの結合である。引用により本明細書中に包含されるTraynorおよびNahorski (1995) Mol. Pharmacol. 47: 848-854に記載される方法では、標識ＧＴＰの結合を検出することによって、膜と共役したＧタンパク質が本質的に測定される。ＧＴＰ結合アッセイでは、この受容体を発現する細胞から単離された膜が、以下を含有するバッファー中でインキュベートされる：20mMHEPES、pH7.4、100mMNaCl、および10mMMgCl2、80pM 35S-GTPγSおよび3μMGDP。このアッセイ混合物は３０℃で６０分間インキュベートされ、その後、未結合の標識ＧＴＰがＧＦ／Ｂフィルターでろ過され、除去される。結合した標識ＧＴＰが液体シンチレーション計測によって測定される。プロピオン酸塩誘導性ＧＰＲ４３活性の調節をアッセイするために、ＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞から調製された膜が、プロピオン酸塩と混合され、ＧＰＲ４３活性の候補調節因子の存在および不存在下でＧＴＰ結合アッセイが行われる。候補調節因子を含有するこの種のアッセイでのシンチレーション計測によって測定される標識ＧＴＰの結合が、この調節因子を含まないアッセイと比較して１０％またはそれ以上増大すれば、この候補調節因子がＧＰＲ４３活性を阻害することが示される。プロピオン酸塩を用いずに同様のＧＴＰ結合アッセイを行い、作用薬として作用する化合物を同定することができる。この場合、プロピオン酸塩刺激性ＧＴＰ結合は標準として用いられる。化合物が作用薬とみなされるのは、１μＭまたはそれ以下で存在する場合に、プロピオン酸塩によって誘導されるＧＴＰ結合レベルの少なくとも５０％を誘導する場合であり、プロピオン酸塩によって誘導されるレベルと等しいか、あるいはより高いレベルを誘導するのが好ましい。ＧＴＰアーゼ活性は、ＧＰＲ４３ポリペプチド含有膜をγ３２Ｐ−ＧＴＰとインキュベートすることによって測定される。活性ＧＴＰアーゼはこの標識を無機リン酸塩として放出し、この無機リン酸塩が、２０ｍＭＨ３ＰＯ４中の５％活性炭懸濁液中の遊離の無機リン酸塩の分離、その後のシンチレーション計測によって検出される。コントロールは、ＧＰＲ４３を発現していない（偽トランスフェクト）細胞から単離された膜を用いるアッセイを含み、候補化合物の非特異的作用の可能性が排除される。
【０１８７】
ＧＰＲ４３調節性ＧＴＰアーゼ活性に対する候補調節因子の作用をアッセイするためには、膜試料がこの調節因子の存在および不存在下でプロピオン酸塩とインキュベートされた後、ＧＴＰアーゼアッセイが行われる。ＧＴＰ結合またはＧＴＰアーゼ活性のレベルが、調節因子を含まない試料と比較して１０％またはそれ以上変化（増大または減少）すれば、候補調節因子によるＧＰＲ４３の調節が示される。
【０１８８】
ii．下流経路活性化アッセイ：
【０１８９】
ａ．カルシウム流動−エクオリンに基づくアッセイ：
エクオリンアッセイは、ＧＰＣＲの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアアポエクオリンの反応性を利用するものである（Stables et al (1997) Anal. Biochem. 252: 115-126; Detheux et al (2000) J. Exp. Med., 1921501-1508; これらは共に引用により本明細書中に包含される）。簡単には、ＧＰＲ４３発現クローンがトランスフェクトされ、ミトコンドリアアポエクオリンおよびＧα１６が同時発現される。細胞は５μＭコエレンテラジンＨ（Coelenterazine H）（Molecular Probes）と室温で４時間インキュベートされ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培養培地で洗浄され、濃度０．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁される。次いで細胞は試験作用薬分子と混合され、エクオリンによる光放出が照度計で３０秒間記録される。結果は相対光単位（Relative Light Units（ＲＬＵ））として記載される。コントロールは、ＧＰＲ４３を発現していない（偽トランスフェクト）細胞から単離された膜を用いるアッセイを含み、候補化合物の非特異的作用の可能性が排除される。
【０１９０】
エクオリン活性または細胞内カルシウムレベルが「変化する」のは、ＧＰＲ４３ポリペプチドを発現し、かつ候補調節因子で処理された細胞の試料中の光強度が、ＧＰＲ４３ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト細胞）が、候補調節因子で処理された細胞の試料と比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０１９１】
プロピオン酸塩不存在下で行われる場合は、前記アッセイを用いて、ＧＰＲ４３活性の作用薬を同定することができる。前記アッセイがプロピオン酸塩の存在下で行われる場合は、これを用いて、拮抗薬についてアッセイすることができる。
【０１９２】
ｂ．アデニル酸シクラーゼアッセイ：
アデニル酸シクラーゼ活性に関するアッセイは、Kenimer & Nirenberg (1981) Mol. Pharmacol. 20: 585-591に記載され、これは引用により本明細書中に包含される。このアッセイは、引用により本明細書中に包含されるSolomon et al (1974) Anal. Biochem. 58: 541-548）に教示されているアッセイの修飾法である。簡単には、１００μＬ反応物は50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、20mMクレアチンリン酸（２ナトリウム塩）、１０ユニット（タンパク質７１μｇ）のクレアチンホスホキナーゼ、1mMα-32P-ATP(テトラナトリウム塩、2μCi)、0.5mM環状AMP、G−３H−標識環状AMP（約10,000cpm)、0.5mMRo20-1724、0.25%エタノール、および試験対象のタンパク質ホモジネート（すなわち、候補調節因子の存在または不存在下、プロピオン酸塩で処理されているか、または処理されていない、ＧＰＲ４３ポリペプチドを発現しているか、または発現していない細胞由来のホモジネート）50-200μgを含有する。反応混合物は一般に、３７℃で６０分間インキュベートされる。インキュベート後、反応混合物は冷６％トリクロロ酢酸０．９ｍｌの添加により除タンパクされる。試験管は１８００ｘｇで２０分間遠心分離され、各上澄溶液がDowex AG50W-X4カラムに添加される。カラム由来のｃＡＭＰ画分は０．１ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）４ｍＬを用いて計測バイアル中へ溶出される。アッセイは３回行われるべきである。またコントロール反応は、ＧＰＲ４３ポリペプチドを発現していない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて行われるべきである。
【０１９３】
本発明で、アデニル酸シクラーゼ活性が「変化する」のは、ＧＰＲ４３活性の候補調節因子で処理された細胞由来の試料中で、候補調節因子で処理されていない細胞の同様の試料またはＧＰＲ４３ポリペプチドを発現していない（偽トランスフェクト細胞）が、候補調節因子で処理された細胞の試料と比較して１０％またはそれ以上増大または減少した場合である。
【０１９４】
ｃ．ｃＡＭＰアッセイ：
細胞内または細胞外ｃＡＭＰは、当技術分野に広く既知の方法にしたがい、ｃＡＭＰ放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）またはｃＡＭＰ結合タンパク質を用いて測定される。例えば、引用により本明細書中に包含されるHorton & Baxendale (1995) Methods Mol. Biol. 41: 91-105はｃＡＭＰに関するＲＩＡを記載している。
【０１９５】
ｃＡＭＰ測定用の多数のキットが市販されている。例えば、LJL BiosystemsおよびNEN Life Science Productsにより市販されているHigh Efficiency Fluorescence Polarization-based homogeneous assayがある。コントロール反応は偽トランスフェクト細胞の抽出物を用いて行い、これにより候補調節因子の非特異的作用の可能性が排除される。
【０１９６】
ｃＡＭＰのレベルが「変化する」のは、Horton & Baxendale (1995)上記のＲＩＡに基づくアッセイを用いて、ＧＰＲ４３ポリペプチドを発現し、ＧＰＲ４３活性の候補調節因子で処理された細胞（またはそのような細胞の抽出物）中で検出されるｃＡＭＰのレベルが、候補調節因子で処理されていない同様の細胞中のｃＡＭＰレベルと比較して少なくとも１０％増大または減少した場合である。
【０１９７】
ｄ．リン脂質分解、ＤＡＧ生産およびイノシトール三リン酸レベル：
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、およびその結果のセカンドメッセンジャーＤＡＧおよび／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）生産をモニターすることによって、ＧＰＲ４３の既知または推定の調節因子の活性を原因とする変化に関してモニターできる。これらそれぞれの検出方法は、IanM. Bard. Totowa, NJ, Humana Press (1998)編集のPhospholipid Signalling Protocolsに記載され、これは引用により本明細書中に包含される。また引用により本明細書中に包含されるRudolph et al(1999)J.Biol.Chem.274:11824-11831を参照のこと、これはホスファチジルイノシトール分解に関するアッセイを記載している。アッセイは、候補調節因子の存在または不存在下、プロピオン酸塩で処理されたか、または処理されていないＧＰＲ４３発現細胞または細胞抽出物を用いて行われるべきである。コントロール反応は、偽トランスフェクト細胞またはそれ由来の抽出物を用いて行い、これにより候補調節因子の非特異的作用の可能性が排除される。
【０１９８】
本発明で、ホスファチジルイノシトール分解、およびジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸レベルが「変化する」のは、候補調節因子で処理されたＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の試料中で、候補調節因子で処理されていないＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の試料中で観察されるレベルと比較して少なくとも１０％増大または減少した場合である。
【０１９９】
ｅ．ＰＫＣ活性化アッセイ：
成長因子受容体チロシンキナーゼはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化が関与する経路を介してシグナルを伝達できる。ＰＫＣはリン脂質−およびカルシウム−活性化プロテインキナーゼのファミリーである。ＰＫＣ活性化は最終的に、一連の原癌遺伝子転写因子をコードする遺伝子、例えばc-fos、c-myc、およびc-jun、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、例えばＩ型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲン活性化剤阻害剤、および接着分子、例えば細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭＩ）の転写を生じさせる。アッセイは、ＰＫＣによって誘導される遺伝子産物の増大を検出するように設計されており、これを用いて、ＰＫＣ活性化、すなわち受容体活性をモニターできる。さらに、ＰＫＣを介してシグナル伝達する受容体の活性は、ＰＫＣ活性化によって活性化される遺伝子の調節配列により駆動されるレポーター遺伝子コンストラクトの使用を介してモニターできる。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイは以下により詳細に議論されている。
【０２００】
ＰＫＣのより直接的な測定では、引用により本明細書中に包含されるKikkawa et al (1982) J. Biol. Chem. 257: 13341の方法を用いることができる。このアッセイはＰＫＣ基質ペプチドのリン酸化を測定する。当該リン酸化ペプチドは次いでホスホセルロースペーパーとの結合により分離される。このＰＫＣアッセイ系を用いて、精製キナーゼの活性または粗製の細胞抽出物中の活性を測定できる。プロテインキナーゼＣ試料はアッセイの直前に20mMHEPES/2mMDTT中で希釈することができる。
【０２０１】
前記アッセイの基質はミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質タンパク質（MARCKS）から誘導されたペプチドAc-FKKSFKL-NH2（配列番号３）である。該ペプチドに対する酵素のＫｍは約５０μＭである。また、当技術分野に既知の他の塩基性プロテインキナーゼＣ選択的ペプチドをそれぞれのＫｍの少なくとも２−３倍の濃度で用いることができる。アッセイに必要とされる補因子には、カルシウム、マグネシウム、ＡＴＰ、ホスファチジルセリンおよびジアシルグリセロールが含まれる。使用者の所望により、アッセイを行ってＰＫＣ存在量（活性化用条件）または活性ＰＫＣ存在量（非活性化用条件）を測定できる。ほとんどの本発明目的のためには、非活性化用条件が用いられ、活性化可能なＰＫＣの測定ではなく、単離時の試料中で活性なＰＫＣが測定される。非活性化用条件では、ＥＧＴＡによりカルシウムはアッセイから除去される。
【０２０２】
前記アッセイは以下を含有する混合物中で行われる：20 mM HEPES、pH 7.4、1-2 mM DTT, 5 mM MgCl2、100μMATP、〜1μCiγ-32P-ATP、100μg/mlペプチド基質(〜100μM)、140μM/3.8μM ホスファチジルセリン/ジアシルグリセロール膜,および100μMカルシウム(または500μMEGTA)。試料４８μｌは20mM HEPES、pH7.4、2mM DTT 中で希釈され、最終反応容量８０μlで用いられる。反応は３０℃で５−１０分間行われ、その後100mMATP、100mM EDTA、pH8.0溶液２５μｌの添加により反応が停止される。
【０２０３】
反応の停止後、各反応物の一部（８５μｌ）がWhatman P81リン酸セルロースフィルターにスポットされ、次いで０．４％ リン酸 ５００ｍｌ中で４回洗浄され（５−１０分／洗浄）、９５％エタノール５００ｍｌ中で２−５分間最終洗浄される。シンチレーション計測により結合放射能が測定される。標識ＡＴＰの特異的活性（cpm／nmol）は、反応物の試料をP81ペーパーにスポットし、洗浄せずに計測することによって測定される。転移されたリン酸nmol／分として定義されるＰＫＣ活性のユニットは以下のように算出される：
活性ユニット（nmol／分）は：
＝（ペーパー上cpm）×（トータル１０５μｌ／スポットされた８５μｌ）
／（アッセイ時間、分）（ＡＴＰの特異的活性 cpm/nmol）。
【０２０４】
別のアッセイはPanVeraより販売されているプロテインキナーゼＣアッセイキット（Protein Kinase C Assay Kit（Cat.#P2747））を用いて行うことができる。
【０２０５】
アッセイは、候補調節因子の存在または不存在下で、プロピオン酸で処理されたか、あるいは処理されていないＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の抽出物に対して行われる。コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはその抽出物を用いて行われ、候補調節因子の非特異的作用の可能性が排除される。
【０２０６】
本発明で、候補調節因子によりＰＫＣ活性が「変化する」のは、上記いずれかのアッセイにより測定されるＰＫＣのユニットが、候補調節因子で処理されたＧＰＲ４３発現細胞由来の抽出物中で、候補調節因子で処理されていない細胞由来の同様の試料に対して行われる反応と比較して少なくとも１０％増大または減少する場合である。
【０２０７】
ｆ．キナーゼアッセイ：
ＭＡＰキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキットのいずれかを用いてアッセイすることができる。このようなキットは例えば、New England Biolabsにより販売されているp38MAPキナーゼアッセイキット（Cat#9820）またはPerkin-Elmer Life Sciencesにより販売されているFlash PlateTM MAPキナーゼアッセイである。
【０２０８】
ＭＡＰキナーゼ活性が「変化する」のは、候補調節因子で処理されたＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の試料中の活性のレベルが、候補調節因子で処理されていない同様の細胞由来の試料中のＭＡＰキナーゼ活性と比較して１０％またはそれ以上増大または減少する場合である。
【０２０９】
既知の合成または天然チロシンキナーゼ基質および標識リン酸を用いるチロシンキナーゼ活性の直接アッセイは、他の型のキナーゼ（例えば、セリン／スレオニンキナーゼ）に関する同様のアッセイのように周知である。キナーゼアッセイは、候補調節因子の存在または不存在下で、プロピオン酸塩で処理されたか、あるいは処理されていないＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来の精製キナーゼおよび粗製の抽出物の両者を用いて行うことができる。コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはその抽出物を用いて行い、これにより候補調節因子の非特異的作用の可能性が排除される。基質は完全長タンパク質または該基質を代替する合成ペプチドであってよい。Pinna & Ruzzene (1996) Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225（これは引用により本明細書中に包含される）はキナーゼ活性の検出に有用な多数のリン酸化基質部位をリストしている。多数のキナーゼ基質ペプチドが市販されている。特に有用なものは、「Src関連ペプチド」、RRLIEDAEYAARG（配列番号４；Sigmaより入手可能#A7433）であり、これは多数の受容体および非受容体チロシンキナーゼの基質である。以下に記載のアッセイは、フィルターに対するペプチド基質の結合を必要とするため、このペプチド基質は結合を促す正味の正電荷を有するべきである。一般に、ペプチド基質は少なくとも２つの塩基性残基および遊離のアミノ末端を有するべきである。一般に反応は０．７−１．５ｍＭのペプチド濃度を用いる。
【０２１０】
アッセイは一般に、以下を含む２５μｌ容量中で行われる：5×キナーゼバッファー5μl（5 mg/mｌ BSA、150mMTris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2; アッセイ対象のキナーゼに的確に応じてMgCl2の代わりに、あるいはそれに加えて、MnCl2を用いることができる）、5μlの1.0mMATP(0.2mM最終濃度)、γ-32P-ATP (100-500 cpm/pmol) 3μｌの10mMペプチド基質(1.2mM 最終濃度)、試験対象のキナーゼを含有する細胞抽出物（キナーゼアッセイに使用される細胞抽出物はホスファターゼ阻害剤（例えば0.1-1mMオルトバナジウム酸ナトリウム）を含有すべきである）、および25μｌまでの水。反応は３０℃で行い、細胞抽出物の添加によって開始される。
【０２１１】
キナーゼ反応は３０秒から約３０分間行われ、その後、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４５μlが添加される。試料を微量遠心機中で２分間回転させ、上清３５μｌがWhatman P81リン酸セルロースフィルターサークルへスポットされる。このフィルターは冷０．５％リン酸５００ｍlで３回洗浄され、その後、室温で５分間、アセトン２００ｍｌで１回洗浄される。フィルターが乾燥され、取り込まれた３２Ｐがシンチレーション計測によって測定される。キナーゼ反応物中のＡＴＰの（例えばcpm/pmol単位の）特異的活性は、反応の小試料（２−５μｌ）をＰ81フィルターサークル上へスポットし、洗浄せずに直接計測することによって決定される。次いで、このキナーゼ反応で得られるカウント／分（ブランクを除く（minus blank））が特異的活性で除算されることにより、反応中の転移されたリン酸のモル数が測定される。
【０２１２】
チロシンキナーゼ活性が「変化する」のは、候補調節因子で処理されたＧＰＲ４３ポリペプチド発現細胞由来試料中のキナーゼ活性のレベルが、候補調節因子で処理されていない同様の細胞由来試料中のキナーゼ活性と比較して１０％またはそれ以上増大または減少する場合である。
【０２１３】
ｇ．下流経路活性化に関する転写レポーター：
受容体、例えばＧＰＲ４３に対する作用薬の結合によって開始される細胞内シグナルは細胞内イベントのカスケードを開始し、最終的に１つまたはそれ以上の遺伝子の転写または翻訳の急速かつ検出可能な変化を生じさせる。したがって受容体の活性は、ＧＰＲ４３活性化に応答する調節配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターできる。
【０２１４】
本明細書中で用いる「プロモーター」とは、遺伝子発現の受容体媒介性調節に必要な転写調節エレメントを意味し、これには基本的プロモーターだけでなく、受容体によって制御される発現に必要な任意のエンハンサーまたは転写因子結合部位が含まれる。作用薬結合の結果である細胞内シグナルに応答するプロモーターを選択し、該選択プロモーターを、転写、翻訳または最終的活性が容易に検出可能で測定可能なレポーター遺伝子と作動可能に連結することによって、転写に基づくレポーターアッセイは、特定の受容体が活性化されているか否かの迅速な指標を提供する。
【０２１５】
ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、β−ラクタマーゼまたはβ−ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子は、当該産物の検出に関するアッセイとともに当技術分野に周知である。
【０２１６】
受容体活性のモニタリングに特によく適している遺伝子は、「即時早期（immediate early）」遺伝子であり、これは通常、受容体とエフェクタータンパク質またはリガンドの接触後数分以内に迅速に誘導される。即時早期遺伝子転写の誘導は新たな調節タンパク質の合成を必要としない。リガンド結合に対する迅速な反応性に加えて、レポーターコンストラクトの作成に有用な好ましい遺伝子の性質には以下が含まれる：静止状態細胞での、低いか、あるいは検出不能な発現；一過性で、かつ新たなタンパク質合成に非依存である誘導；続いて起こる転写遮断が新たなタンパク質合成を必要とすること；およびこれらの遺伝子から転写されるｍＲＮＡが短期の半減期を有すること。転写調節エレメントが有用であるためにはこれらすべての性質を有するのが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。
【０２１７】
多数の種々の刺激に応答する遺伝子の例はc-fos原癌遺伝子である。c-fos遺伝子は、成長因子、ホルモン、分化に特異的な物質、ストレス、および他の既知細胞表面タンパク質の誘導物質によって、タンパク質合成と無関係な様式で活性化される。c-fos発現の誘導は非常に迅速で、受容体刺激後数分以内に生じることが多い。この性質により、受容体活性化のレポーターとしての使用に関してc-fos調節領域は特に魅力的である。
【０２１８】
c-fos調節エレメントには以下が含まれる（Verma et al (1987) Cell 51: 513-514 を参照のこと）：転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックス；基本転写用の２つの上流エレメント、およびエンハンサー、これは二回対称のエレメントであり、ＴＰＡ、血清、ＥＧＦ、およびＰＭＡによる誘導に必要とされる。
【０２１９】
c-fos ｍＲＮＡキャップ部位から上流の−３１７および−２９８ｂｐ間に位置する２０ｂｐのc-fos転写エンハンサーエレメントは、血清飢餓ＮＩＨ ３Ｔ３細胞内の血清誘導に関して必須である。２つの上流エレメントの一方は−６３から−５７に位置し、これはｃＡＭＰ調節に関する保存配列に類似する。
【０２２０】
転写因子ＣＲＥＢ（環状ＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質）は、その名称が示すように、細胞内ｃＡＭＰのレベルに応答する。したがってｃＡＭＰレベルの調節を介してシグナルを伝達する受容体の活性化は、転写因子の結合を検出するか、あるいはＣＲＥＢ結合エレメント（ＣＲＥまたはｃＡＭＰ応答エレメント（cAMP response element）と称される）と連結されたレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターできる。ＣＲＥのＤＮＡ配列は、TGACGTCAである。ＣＲＥＢ結合活性に応答するレポーターコンストラクトは米国特許第5,919,649号に記載されている。
【０２２１】
c-fosエレメントおよびＣＲＥＢ応答性コンストラクトに加えて、他のプロモーターおよび転写調節エレメントには、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Fink et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6662-6666）；ソマトスタチン遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Montminy et al (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 8. 3: 6682-6686）；プロエンケファリンプロモーター（ｃＡＭＰ、ニコチン作用薬、およびホルボールエステル応答性；Comb et al (1986) Nature323:353-356）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）遺伝子プロモーター（ｃＡＭＰ応答性；Short et al(1986) J. Biol. Chem. 261: 9721-9726）が含まれる。
【０２２２】
ＧＰＣＲ活性の変化に応答する転写調節エレメントのさらなる例には、ＡＰ−１転写因子に応答するエレメントおよびＮＦ−κB活性に応答するエレメントが含まれるが、これらに限定されない。共通ＡＰ−１結合部位はパリンドローム：TGA(C/G)TCAである(Leeら (1987) Nature325: 368-372; Lee et al (1987) Cell 49: 741-752)。前記ＡＰ−１部位はまた、腫瘍プロモーター、例えばホルボールエステル１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−□−アセテート（ＴＰＡ）による誘導の媒介を担い、したがってＴＰＡ応答エレメントとしてＴＲＥと称されることもある。ＡＰ−１は、成長刺激に対する細胞の早期応答に関与する多数の遺伝子を活性化する。ＡＰ−１応答性遺伝子の例には、FosおよびJun（これらのタンパク質はそれ自身ＡＰ−１活性を構成する）に関する遺伝子、Fos関連抗原（Fra）１および２、ＩκＢα、オルニチンデカルボキシラーゼおよびアネキシンＩおよびＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
ＮＦ−κＢ結合エレメントは共通配列：GGGGACTTTCC（配列番号５）を有する。多数の遺伝子がＮＦ−κＢ応答性として同定されており、それらの調節エレメントをレポーター遺伝子に連結して、ＧＰＣＲ活性をモニターすることができる。ＮＦ−κＢ応答性の遺伝子の小試料には、IL-1β(Hiscott et al (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 6231-6240),TNF-α(Shakhov et al (1990) J. Exp. Med. 171:35-47)、CCR5 (Liu et al (1998) AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 1509-1519)、P-セレクチン(Pan & Mc Ever (1995) J. Biol. Chem. 270: 23077-23083)、Fas リガンド(Matsui et al (1998) J. Immunol. 161: 3469-3473)、GM-CSF (Schreck & Baeuerle (1990) Mol. Cell. Biol.10: 1281-1286)およびIκBα(Haskill et al(1991)Cell 65:1281-1289)をコードする遺伝子が含まれる。これらの各参考文献は引用により本明細書中に包含される。ＮＦ−κＢ応答性レポーターをコードするベクターもまた当技術分野に既知であり、あるいは当業者であれば、例えば合成ＮＦ−κＢエレメントおよび最小プロモーターを用いるか、またはＮＦ−κＢ調節の対象であることが既知の遺伝子のＮＦ−κＢ応答性配列を用いて容易に作成可能である。さらにＮＦ−κＢ応答性レポーターコンストラクトは、例えばCLONTECHから市販されている。
【０２２４】
このようなプロモーターコンストラクトは、該コンストラクトをトランスフェクトされたＧＰＲ４３発現細胞をプロピオン酸塩に曝露することによって試験されるべきである。プロピオン酸に応答するレポーター発現が少なくとも２倍増大すれば、このレポーターがＧＰＲ４３活性の指標であることが示される。
【０２２５】
転写レポーターコンストラクトを用いてＧＰＲ４３活性をアッセイするため、ＧＰＲ４３ポリペプチドを安定発現する細胞はレポーターコンストラクトで安定にトランスフェクトされる。作用薬に関するスクリーニングでは、細胞は未処理のままか、候補調節因子に曝露されるか、あるいはプロピオン酸塩に曝露され、レポーターの発現が測定される。プロピオン酸塩処理された培養は、既知の作用薬によって誘導される転写レベルの標準となる。候補調節因子の存在下でレポーター発現が少なくとも５０％増大すれば、この候補はＧＰＲ４３活性の調節因子であることが示される。作用薬はプロピオン酸塩単独と少なくとも同等、好ましくは同一量またはそれ以上のレポーター発現を誘導する。またこのアプローチを用いて、逆作用薬に関するスクリーニングを行うことができる。この場合、細胞は、プロピオン酸塩または別の作用薬の不存在下でレポーターの高い基本活性が存在するようなレベルでＧＰＲ４３ポリペプチドを発現している。候補調節因子存在下のレポーター活性が、その不存在下と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この化合物は逆作用薬であることが示される。
【０２２６】
拮抗薬に関するスクリーニングでは、ＧＰＲ４３を発現し、レポーターコンストラクトを保持している細胞が、候補調節因子の存在および不存在下でプロピオン酸塩（または別の作用薬）に曝露される。候補調節因子存在下のレポーター発現が、候補調節因子の不存在下と比較して１０％またはそれ以上減少すれば、この候補はＧＰＲ４３活性の調節因子であることが示される。
【０２２７】
転写アッセイに関するコントロールはＧＰＲ４３を発現していないが、レポーターコンストラクトを保持している細胞、ならびにプロモーターを欠いているレポーターコンストラクトを含む細胞を含む。ＧＰＲ４３調節性転写の調節因子として同定される化合物は、これが他の調節配列および他の受容体によって駆動される転写に影響するか否かを測定する分析に付され、その活性の特異性およびスペクトルが決定される。
【０２２８】
転写レポーターアッセイ、およびほとんどの細胞に基づくアッセイは、ＧＰＲ４３活性を調節するタンパク質に関する発現ライブラリのスクリーニングに良く適している。ライブラリは、例えば、天然起源、例えば植物、動物、細菌、等由来のｃＤＮＡライブラリであってよく、あるいは１つまたはそれ以上のポリペプチドのランダムまたは体系的変異体を発現するライブラリであってよい。またウイルスベクター中のゲノムライブラリを用いて、ＧＰＲ４３のスクリーニングに用いられる種々のライブラリ中の１細胞または組織のｍＲＮＡ内容物を発現させることができる。
【０２２９】
ｈ．イノシトールリン酸（ＩＰ）測定：
本発明の細胞、例えばCHO-K1細胞は、5% FCS、抗生物質、アンフォテリシン、ピルビン酸ナトリウムおよび400μg/ml G418を含有するイノシトールを含まないDMEM中、10μCi/ml[3H]イノシトールで２４時間標識される。細胞は以下の組成のクレブスリンガーHepes(KRH)バッファー中で２時間インキュベートされる（124mMNaCl、5mMKCI、1.25 mM MgSO4、1.45 mM CaCl2、1.25 mM KH2PO4、25mMHepes(pH:7.4)および 8 mMグルコース）。次いでこの細胞は種々のＳＣＦＡで３０分間惹起される。インキュベートは氷冷３％過塩素酸溶液の添加により停止される。ＩＰは、以前（Communi,D. et al (1995) Circ. Res., 76, 191-198）に記載されているように、Dowexカラムで抽出分離される。
【０２３０】
ＧＰＲ４３アッセイ
本発明は、試料中の本発明の受容体活性を検出するためのアッセイを提供する。例えばＧＰＲ４３活性は、ＧＰＲ４３を発現している細胞または細胞膜を含む試料中で測定できる。上記のように、この段落ではプロピオン酸塩が例として用いられる。本明細書中で定義されている任意のＳＣＦＡがこれらのアッセイで使用可能であることが理解されよう。当該アッセイは、ＳＣＦＡの存在または不存在下で試料をインキュベートし、上記のようなセカンドメッセンジャーアッセイを実行することによって行われる。ＳＣＦＡの存在または不存在下で行われたセカンドメッセンジャーアッセイの結果が比較され、ＧＰＲ４３受容体が活性であるか否か決定される。本明細書中で定義される特定セカンドメッセンジャーの検出レベルが、ＳＣＦＡの存在下で、ＳＣＦＡの不存在下で行われたアッセイの検出量と比較して１０％またはそれ以上増大すれば、ＧＰＲ４３活性が示される。
【０２３１】
これらに限定されないが、ＧＴＰ結合、ＧＴＰアーゼ、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ、リン脂質分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、アラキドン酸放出（以下を参照のこと）、ＰＫＣ、キナーゼおよび転写レポーターアッセイを含む、受容体活性の任意のアッセイを用いて、試料、例えば組織試料中のＧＰＲ４３受容体分子の活性に影響する物質の存在が決定できる。この場合、ＧＰＲ４３ポリペプチドは、試料または試料の抽出物の存在および不存在下で活性に関してアッセイされる。試料または抽出物存在下のＧＰＲ４３活性が、該試料の不存在下と比較して増大すれば、該試料は受容体活性の作用薬を含有することが示される。プロピオン酸塩または別の作用薬および試料の存在下の受容体活性が、プロピオン酸塩が単独で存在する条件下での受容体活性と比較して減少すれば、該試料はＧＰＲ４３活性の拮抗薬を含有することが示される。所望であれば、その後試料を分画し、さらに試験して、作用薬または拮抗薬を単離または精製することができる。試料が調節因子を含有することを示すために必要とされる測定活性の増大または減少の量は、用いるアッセイのタイプに依存する。一般に、試料の不存在下で行われたアッセイと比較して１０％またはそれ以上の変化（増大または減少）があれば、試料中の調節因子の存在が示される。例外の１つは転写レポーターアッセイであり、このアッセイでは、試料が調節因子を含有することを示すために、シグナルの少なくとも２倍の増大または１０％の減少が必要である。作用薬は、プロピオン酸塩単独を用いる場合と比較して少なくとも５０％、好ましくは７５％または１００％またはそれ以上、例えば２倍、５倍、１０倍またはそれ以上の受容体活性化を刺激することが好ましい。
【０２３２】
他の機能アッセイには、例えば微視的生理計測（microphysiometer）またはバイオセンサーアッセイが含まれる（引用により本明細書中に包含されるHafner (2000) Biosens. Bioelectron. 15: 149-158を参照のこと）。またアラキドン酸の細胞内レベルは、Gijon et al (2000) J. Biol.Chem., 275: 20146-20156に記載されるように測定できる。
【０２３３】
II．ＧＰＲ４３およびプロピオン酸塩の相互作用に基づく診断アッセイ：
ＧＰＣＲを介するシグナル伝達は多数の疾患および障害の病状に関与する。リンパ球系列、血小板、脾臓、胃、肺ならびに白血病性細胞の細胞内で発現されているＧＰＲ４３は、免疫プロセス、癌、血栓症および関連障害または疾患において役割を担っている可能性がある。
【０２３４】
ＧＰＣＲによって一般に媒介される障害に関するＧＰＲ４３の発現パターンおよび知識によれば、ＧＰＲ４３が以下の障害に関与し得ることが示される：細胞遊走、癌、腫瘍の進行および腫瘍転移、炎症性および腫瘍性プロセス、創傷および骨治癒および調節性成長機能の機能不全、糖尿病、肥満、摂食障害、過食症、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、血栓症および他の心血管疾患、自己免疫性および炎症性疾患、過剰平滑筋細胞増殖を特徴とする疾患、動脈瘤、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患、脳卒中、虚血、潰瘍、アレルギー、良性の前立腺肥大症、偏頭痛、嘔吐、精神病性および神経疾患、例えば不安症、統合失調症、躁鬱病、欝病、幻覚症状、痴呆および深刻な精神遅滞、変性疾患、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病、および運動障害、例えばハンチントン病、ギレス・デ・ラ・トゥーレット症候群および他の関連疾患、例えば血栓症および他の心血管疾患、自己免疫性および炎症性疾患。
【０２３５】
ＧＰＲ４３とプロピオン酸塩の相互作用は、ＧＰＲ４３シグナル伝達が関与する疾患、障害またはプロセスの診断またはモニタリングのためのアッセイの基準として用いることができる。ＧＰＲ４３関連疾患または障害に関する診断アッセイはいくつかの諸形式を有し得る。第一に、診断アッセイは、組織試料中のＧＰＲ４３ポリペプチド、ｍＲＮＡまたはリガンドの量を測定することができる。ＧＰＲ４３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を測定するアッセイもこの範疇に収まる。第二に、アッセイは、受容体またはリガンドの性質を評価することができる。例えば個体が突然変異型または変異型のＧＰＲ４３を発現しているか否かを決定するアッセイが診断に使用可能である。第三に、ＧＰＲ４３ポリペプチドの１つまたはそれ以上の活性を測定するアッセイが診断に使用可能である。
【０２３６】
Ａ．ＧＰＲ４３ポリペプチドの量を測定するアッセイ
ＧＰＲ４３レベルを測定し、標準と比較して、試料中に異常レベルの受容体またはそのリガンドが存在するか否かを決定することができる。これらの存在はいずれもＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全の可能性を示すものである。ポリペプチドレベルは、例えば該ポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫組織化学により測定される。ＧＰＲ４３活性を特徴とする疾患または障害を患っていることが疑われる個体から単離された試料を、ＧＰＲ４３ポリペプチドに対する抗体と接触させ、当技術分野に既知のように（例えば二次抗体共役型酵素の活性を測定することにより）抗体結合が測定される。
【０２３７】
ＧＰＲ４３レベルを測定する別のアプローチは、罹患組織由来の細胞のフローサイトメトリー分析を用いる。ＧＰＲ４３に特異的な抗体を蛍光標識することを含むフローサイトメトリーの方法は、当技術分野に周知である。他のアプローチには、放射性免疫アッセイまたはELISAが含まれる。これらの各方法もまた当技術分野に周知である。
【０２３８】
検出される結合の量は、健康な個体由来、または罹患個体の罹患していない部位由来の同様組織試料中の結合と比較される。標準と比較して１０％またはそれ以上の増大があれば、ＧＰＲ４３調節不全を特徴とする疾患または障害と診断される。
【０２３９】
ＧＰＲ４３発現はまた、組織試料中のこのポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を決定することにより測定可能である。ｍＲＮＡのレベルは定量PCRまたは半定量ＰＣＲによって測定可能である。「定量的な（quantitative）」増幅の方法は当業者に周知であり、ＧＰＲ４３核酸増幅用のプライマー配列は本明細書中で開示されている。定量ＰＣＲの一般的方法は、同一プライマーを用いる、既知量のコントロール配列の同時増幅を伴う。これはＰＣＲ反応を較正するのに使用可能な内部基準を提供する。定量ＰＣＲに関する詳細なプロトコルは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al、Academic Press, Inc.N.Y., (1990)により提供され、これは引用により本明細書中に包含される。試料中のＧＰＲ４３をコードするｍＲＮＡの量が、健康な個体由来の同様組織の試料中、または罹患個体の罹患していない場所由来の組織試料中で発現される量と比較して１０％またはそれ以上増大すれば、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害と診断される。
【０２４０】
B．定性的アッセイ
ＧＰＲ４３ポリペプチドまたはそれをコードするｍＲＮＡが野生型であるか否かを評価するアッセイは診断に使用可能である。ＧＰＲ４３調節不全を特徴とする疾患または障害をこの様式で診断するため、試料から単離されたＲＮＡを、ＧＰＲ４３のＰＣＲ増幅用の鋳型として用いる。増幅された配列は次いで、標準的方法を用いて直接配列決定されるか、あるいはまずベクター中にクローニングされた後に配列決定される。野生型ＧＰＲ４３の配列と比較して１つまたはそれ以上のエンコードアミノ酸を変化させる配列内の差異があれば、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害と診断することができる。コード配列の変化が試料内で同定される場合に、当該変異型受容体またはリガンドを発現し、その活性を野生型ＧＰＲ４３の活性と比較することが有用であり得る。他の利点には、このアプローチが、常時活性型および無発現変異体を含む新規突然変異体を提供できることがある。
【０２４１】
標準的配列決定方法に加えて、増幅された配列は、例えば、野生型と変異型配列を識別する分子標識（molecular beacons）のハイブリダイゼーションを用いて、特定の突然変異の存在に関してアッセイできる。１ヌクレオチド単位の変化を基準に識別するハイブリダイゼーションアッセイは当技術分野に周知である。別法では、米国特許第5,888,819号、第6,004,744号および第6,013,431号（これらは引用により本明細書中に包含される）に記載される方法を含む、任意の回数の「ミニシーケンシング（minisequencing）」アッセイを行うことができる。これらのアッセイおよび当技術分野に既知の他のアッセイは、特定試料中で、既知の多型性を有する核酸の存在を決定することができる。
【０２４２】
所望により、アレイまたはマイクロアレイに基づく方法を用いて、ＧＰＲ４３配列中の突然変異の発現または存在を分析することができる。ミニシーケンシングおよび核酸発現の定量のためのアレイに基づく方法は当技術分野に周知である。
【０２４３】
Ｃ．機能アッセイ
ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断は機能アッセイを用いて行うことができる。この場合、組織試料から調製された細胞膜または細胞抽出物が、本明細書中に記載されるＧＰＲ４３活性のアッセイにおいて用いられる（このようなアッセイは例えば、リガンド結合アッセイ、ＧＴＰ結合アッセイ、ＧＴＰアーゼ活性、アデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰアッセイ、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロールまたはイノシトール三リン酸アッセイ、ＰＫＣ活性化アッセイ、またはキナーゼアッセイである）。検出される活性は、健康な個体由来または罹患した個体の罹患していない部位由来の標準試料中の活性と比較される。別法として、試料または試料の抽出物をＧＰＲ４３発現細胞に適用し、その後ＧＰＲ４３シグナル伝達活性を標準試料と比較して測定することができる。これらのいずれかのアッセイで測定される活性に関し、標準の活性と比較して１０％またはそれ以上の差異があれば、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害と診断される。
【０２４４】
本発明による細胞内ＧＰＲ４３活性の調節
プロピオン酸塩がＧＰＲ４３のリガンドとして発見されたことにより、細胞内のＧＰＲ４３ポリペプチド活性を調節する方法が提供される。細胞内のＧＰＲ４３活性は、この細胞に対してＧＰＲ４３ポリペプチドの機能を調節する物質を供給することによって調節される。この調節は、別の調節物質を同定するためのアッセイの部分として、培養細胞内で、または、例えばヒトを含む動物内で行うことができる。物質には、プロピオン酸塩および本明細書中で定義される他のＳＣＦＡならびに、本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて同定される別の調節因子、例えば任意のプロピオン酸塩アナログが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
物質は培養培地に添加することによって細胞に供給することができる。供給する量は、物質の性質に応じて、および供給の目的に応じて変化する。例えば、ＧＰＲ４３活性の拮抗薬を同定する培養アッセイでは、この受容体を最大半減的に活性化する量（例えばおよそのＥＣ５０）で、好ましくは受容体飽和に必要とされる用量を越えない量の物質、例えばプロピオン酸塩を加えるのが好ましい。この用量の決定は、プロピオン酸塩の量を滴定し、プロピオン酸塩をさらに添加してもＧＰＲ４３活性に対してさらに影響することのないポイントを決定することにより行うことができる。
【０２４６】
ＧＰＲ４３活性の調節因子が疾患または障害の処置のために動物に投与される場合、当業者は所望の効果に基づいて投与量を調節できる。処置の成功が達成されるのは、病状の１つまたはそれ以上の測定可能な症状（例えば腫瘍細胞増殖、炎症性細胞の蓄積）が、処置前の該症状の値と比較して少なくとも１０％変化した場合である。
【０２４７】
本発明の有用な候補調節因子
本発明は、本発明の受容体の調節因子である化合物を提供する。
候補調節因子は短鎖脂肪酸またはカルボン酸であるのが好ましい。
【０２４８】
候補化合物は合成化合物、または化合物の混合物であってよく、あるいは天然産物（例えば植物抽出物または培養上澄液）であってもよい。本発明の候補化合物には、合成可能な小分子、天然抽出物、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、抗体またはその抗原結合断片、核酸、および有機小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４９】
合成または天然化合物の多数のライブラリ由来の候補調節因子化合物は、スクリーニングすることできる。現在多数の方法が、糖類、ペプチド、および核酸に基づく化合物のランダムまたは定方向合成に使用されている。合成化合物ライブラリは多数の企業、例えばMaybridge Chemical Co.(Trevillet, Cornwall, UK)、Comgenex (Princeton, NJ)、Brandon Associates (Merrimack, NH)、 およびMicrosource (New Milord, CT)から市販されている。希少な化学物質ライブラリはAldrich (Milwaukee, WI)から入手可能である。組み合わせライブラリが入手可能であり、調製可能である。また、細菌、真菌、植物および動物抽出物形態の天然化合物ライブラリは、例えばPan Laboratories (Bothell, WA)またはMyco Search (NC)から入手可能であり、あるいは当技術分野に周知の方法によって容易に作成可能である。さらに、天然産の、および合成により作成されたライブラリおよび化合物は、通常の化学、物理、および生化学的方法を用いて容易に修飾することができる。
【０２５０】
有用な化合物は多数の化学物質類中に見出すことができる。有用な化合物は有機化合物または小有機化合物であってよい。小有機化合物は５０ダルトンより大きいが、約２，５００ダルトンより小さい、好ましくは約７５０ダルトンより小さい、より好ましくは約３５０ダルトンより小さい分子量を有する。典型的な化合物類には、複素環類、ペプチド類、糖類、ステロイド類、等が含まれる。該化合物は、修飾により、有効性、安定性、医薬品適合性、等を高めることができる。物質の構造上の特性を用いて、別の物質を同定、作成、またはスクリーニングすることができる。例えば、ペプチド物質が同定された場合、これらは、その安定性を高める種々の方法で修飾することができる。このような修飾には、例えば非天然のアミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、特にＤ−アラニンを用いる修飾、アミノ末端またはカルボキシル末端を官能化、例えばアミノ基に関しては、アシル化またはアルキル化、およびカルボキシル基に関しては、エステル化またはアミディフィケーション（amidification）することによる修飾、等がある。
【０２５１】
最初のスクリーニングでは、本発明の候補化合物の有用な濃度は約１０μＭから約１００μＭまたはそれ以上（すなわち１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、または１M）であるが、これは１ｎＭおよびそれ以上、１ｐＭおよびそれ以上、または１ｆＭおよびそれ以上であってもよい。最初のスクリーニング濃度は上限として用いられ、これに９つの追加濃度が付随する。この場合、二次スクリーニング用に、あるいは濃度曲線の作成用に、最初のスクリーニング濃度を（例えば９つの追加濃度に関して）半対数間隔で減少させ、追加濃度が決定される。
【０２５２】
本発明の有用な抗体
本発明はＧＰＲ４３に対する抗体を提供する。抗体は当技術分野に既知の標準的プロトコルを用いて作成できる（例えばAntibodies: A Laboratory Manual,HarlowおよびLane編集(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照のこと）。哺乳類、例えばマウス、ハムスター、またはウサギをこのペプチドの免疫原性型（例えば、ＧＰＲ４３ポリペプチドまたは抗体応答を誘導する抗原性断片、または本明細書中上記の融合タンパク質）で免疫することができる。抗体を生じさせるための免疫原は、このポリペプチド（例えば単離された組換えポリペプチドまたは合成ペプチド）をアジュバントと混合することによって調製される。別法では、ＧＰＲ４３ポリペプチドまたはペプチドは、より大きな免疫原性タンパク質に対する融合タンパク質として作成される。またポリペプチドは、他のより大きな免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと共有結合により連結可能である。別法では、引用により本明細書中に包含されるCostagliola et al (2000) J. Clin. Invest. 105: 803-811に記載されるように、ＧＰＲ４３ポリペプチドまたはこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、動物内でポリペプチドを発現させ、免疫応答を引き起こすことができる。抗体を生じさせるため、免疫原は典型的に、実験動物、例えばウサギ、ヒツジ、およびマウスに皮内、皮下、または筋肉内投与される。上に議論されている抗体に加えて、遺伝子改変された抗体の誘導体、例えば単一鎖抗体を作成できる。
【０２５３】
免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによってモニターできる。標準的ELISA、フローサイトメトリーまたは他の免疫アッセイを行い、免疫原を抗原として用いて抗体のレベルを評価することもできる。抗体調製物は単に免疫化動物由来の血清であってよく、または所望であれば、例えば固定された免疫原を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、この血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【０２５４】
モノクローナル抗体を生産するため、抗体産生脾細胞を免疫化動物から採取し、不死化細胞、例えば骨髄腫細胞を伴う標準的体細胞融合前駆体と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作成する。このような技術は当技術分野に周知であり、これには例えば、ハイブリドーマ技術（これはKohlerおよびMilstein (1975) Nature, 256: 495-497によって最初に開発されたものである）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar et al (1983) Immunology Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、ＧＰＲ４３ポリペプチドと特異的に反応する抗体およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養培地から単離されるモノクローナル抗体の産生に関して免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【０２５５】
ハイスループットスクリーニングキット
本発明の高処理量スクリーニングキットは、好ましくは１μＭから１ｍＭ濃度範囲のプロピオン酸の存在下、本発明の受容体に対する調節因子化合物、例えば作用薬、拮抗薬、逆作用薬または阻害剤を検出するために必要なすべての手段および媒体を含む。このキットは以下の連続工程を行うための材料を含む。ＧＰＲ４３受容体をコードするヌクレオチド配列を含み、発現している本発明の組換え細胞の培養は、固形支持体、例えばマイクロプレート、より好ましくは９６ウェルマイクロタイタープレート上で、当業者に周知の方法、特にWO00/02045に記載される方法にしたがって行われる。本発明の調節因子化合物は、約１μＭから１ｍＭまたはそれ以上の濃度で、適当な濃度（好ましくは１μＭから１μＭの範囲）のプロピオン酸が存在する特定のウェルの培養培地に加えられる。
【０２５６】
本発明のキットはまた、これらに限定されないがｃＡＭＰの細胞内レベル、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキドン酸濃度またはＭＡＰキナーゼまたはチロシンキナーゼ活性の測定（上記参照）を含むハイスループットスクリーニングアッセイを担うセカンドメッセンジャーアッセイに必要な材料を含むことができる。例えば、環状ＡＭＰアッセイで測定されるＧＰＲ４３活性は、以前（Brooker,G. et al (1979) Adv. Cyclic Nucleotide Res. 10, 1-33.）に記載される放射性免疫アッセイによって定量される。結果は、プロピオン酸の存在下かつ添加調節因子化合物の不存在下で本発明の組換え細胞から得られるベースラインレベルのＧＰＲ４３活性と比較される。調節因子不存在下の活性のレベルと比較して、少なくとも２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍さらに最も好ましくは１００倍またはそれ以上のＧＰＲ４３活性増大または減少を示すウェルが次の分析用に選択される。
【０２５７】
本発明の有用な他のキット
本発明はＧＰＲ４３活性の調節因子に関するスクリーニングに有用なキット、ならびにＧＰＲ４３シグナル伝達の調節不全と特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットを提供する。本発明の有用なキットには、単一のＧＰＲ４３ポリペプチド（例えば単離された膜上、ＧＰＲ４３発現細胞上、またはＳＰＲチップ上の、膜または細胞結合型ＧＰＲ４３ポリペプチドを含む）を含ませることができる。キットはＧＰＲ４３に特異的な抗体を含むこともできる。これとは別に、あるいはこれに加えて、キットはＧＰＲ４３ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞を含有することができる。さらなる態様では、本発明のキットはＧＰＲ４３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することができる。さらに別の態様では、本発明のキットは以下に記載されるＧＰＲ４３の増幅に有用な特異的プライマーを含んでもよい。本発明のすべてのキットは特定の品目または品目組み合わせ、およびそれらのためのパッケージ材料を含む。キットはまた、使用に関する指示書を含むことができる。
【０２５８】
トランスジェニック動物
トランスジェニックマウスは遺伝学および発生生物学的研究のため、および新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。通常のトランスジェネシスの方法では、追加コピーの正常または修飾遺伝子が接合体の雄性前核に注入され、これが受容マウスのゲノムＤＮＡに組み込まれることになる。確立したトランスジェニック系統内では導入遺伝子はメンデル様式で遺伝する。トランスジェニック動物の作成に有用なコンストラクトは、正常プロモーターまたは誘導性プロモーター調節下の遺伝子、組織発現および調節パターンに関する分析対象であるプロモーター調節下のレポーター遺伝子、ならびに優性突然変異、変異プロモーター、および特異的発生効果に関して調査される人工融合遺伝子を含有するコンストラクトを含む。典型的には、１０キロベースまたはそれ以下のオーダーのＤＮＡ断片がトランスジェニック動物の構築に用いられる（Reeves (1998) New. Anat., 253: 19）。トランスジェニック動物は、本発明の１つまたはそれ以上の多型性を含有する候補遺伝子を含むコンストラクトを用いて作成可能である。別法では、単一の多型性を含有する候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、異なる多型性を含有する候補遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交雑することができ、２つの多型性の混合効果を子孫の動物で研究することができる。
【０２５９】
他のトランスジェニック動物
本発明は、これらに限定されないがトランスジェニックのマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、等を含むトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニックブタの作成プロトコルはWhiteおよびYannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp.88-94; 米国特許第5,523,226号;米国特許第5,573,933号:PCT出願WO93/25071;およびPCT出願WO95/04744中に見出せる。トランスジェニックマウスの作成プロトコルは米国特許第5,530,177号中に見出せる。トランスジェニックラットの作成プロトコルはBaderおよびGanten (1996) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3: S81-S87中に見出せる。トランスジェニックウシの作成プロトコルはTransgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Carl A. Pinkert編, Academic Press, Inc.中に見出せる。トランスジェニックウサギの作成プロトコルはHammerら (1985) Nature 315: 680-683およびTaylorおよびFan (1997) Frontiers in Bioscience 2: d298- 308中に見出せる。
【０２６０】
ノックアウト動物
i．標準
ノックアウト動物は相同組換えにより遺伝子欠失を作成する方法によって作成できる。この技術は、胚性幹（ＥＳ）細胞の開発に基づくものである。このＥＳ細胞は胚由来であり、培養中に維持され、宿主胚盤胞に導入された場合にマウスのすべての組織発生に関与する能力を有するものである。ノックアウト動物の作成は、ＥＳ細胞内の特定の標的遺伝子に対する相同組換えを導き、これによりこの遺伝子の無効対立遺伝子を作成することによって行われる。（ヘテロ接合性またはホモ接合性子孫において）当該無効対立遺伝子の潜在的表現型の結果を分析することができる（Reeves,上記）。
【０２６１】
ii．Cre-loxを用いるマウスのインビボ組織特異的ノックアウト
標的化された相同組換えの方法は、バクテリオファージＰ１部位特異的リコンビナーゼCreに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良された。バクテリオファージＰ１由来のCre-loxP部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼはトランスジェニックマウスアッセイにおいて用いられ、規定の組織または発生段階に制限された遺伝子ノックアウトが作成される。広範囲の遺伝子ノックアウトと対照的に、領域制限された遺伝子の欠失は、表現型を特定の細胞／組織に起因させることができる点で有益である（Marth (1996) Clin. Invest. 97: 1999）。Cre-loxP系では、一方のトランスジェニックマウス系統は、loxP部位が目的の遺伝子の１つまたはそれ以上のエキソンに隣接するように操作される。これに関するホモ接合体、いわゆる「floxed遺伝子」は、細胞／組織型転写プロモーターの調節下でCre遺伝子を発現する第二のトランスジェニックマウスと交雑される。その後Creタンパク質はloxP認識配列間のＤＮＡを切除し、標的遺伝子機能を効果的に除去する（Sauer (1998) Methods, 14: 381）。現在、この方法の多数のインビボ実施例が存在し、これには哺乳類組織特異的遺伝子の誘導性不活化（Wagnerら (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4323）が含まれる。
【０２６２】
iii．ノックアウト表現型のBac救出
改変されたタンパク質のインビボ機能が特定の遺伝的多型性／突然変異に帰することを証明するために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することにより、改変されたタンパク質機能を「救出」することができる。トランスジェニックマウスで発現された細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを用いるインビボ補完はこれらの目的のために使用可能である。この方法はマウス概日時計遺伝子の同定に使用された（Antoch et al (1997) Cell 89: 655）。
【０２６３】
材料
トリプシンはFlow Laboratories (Bioggio, Switzerland)製品である。培養培地、G４１８、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、制限酵素、プラチナ（Platinum）PfxおよびTaqDNAポリメラーゼはLife Technologies, Inc. (Merelbeke, Belgium)から購入した。放射能製品ミオ-D-[2-3H]イノシトール(17.7Ci/mmol)はAmersham(Ghent,Belgium)製品である。Dowex AG1X8(ギ酸塩型)はBio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.)製品である。ATP、プロピオン酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、ベータ−ヒドロキシ酪酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩および他のカルボン酸はSigma Chemical Co.(St. Louis, MO)から得た。フォルスコリンはCalbiochem (Bierges, Belgium)から購入した。ロリプラムはLaboratories Jacques Logeais (Trappes,France)から得た。pEFIN5はEuroscreen (Brussels, Belgium)により開発された発現ベクターである。二重リン酸化（Thr202およびTyr204）型Erk1およびErk2に特異的なモノクローナル抗体はNew England Biolabs (Beverly, MA)から得た。
【０２６４】
投与の用量および様式
典型的に患者は、ＧＰＲ４３の調節因子（例えば、本発明のＧＰＲ４３作用薬、拮抗薬または阻害剤）を投与することによって以下のように処置することができる。本発明のＧＰＲ４３の調節因子は、摂取、注射、吸入または他の多数の方法により、好ましくは生物学的適合性溶液または製薬的に許容されるデリバリーベヒクル中で患者に投与することができる。投与用量は患者に応じて変化する；「治療的有効量」は、例えば機能を高めるレベル（例えば本明細書中に記載のセカンドメッセンジャーアッセイで決定されるレベル）によって決定することができる。プロピオン酸塩結合のモニタリングにより、当業者は投与用量を選択および調節可能である。本発明のＧＰＲ４３調節因子の用量は、毎日、毎週、毎月、毎年、または担当医師が適当と考えるところにしたがってくり返し投与される。
【０２６５】
一態様では、致死量以下の用量の、ＧＰＲ４３シグナル伝達活性を阻害または促進する物質を投与して患者を処置し、ＧＰＲ４３受容体のシグナル伝達活性を調節することができる。本発明の致死量以下の用量とは、ＧＰＲ４３シグナル伝達活性を阻害または刺激するための物質の用量であって、この特定物質に関するＬＤ５０であるか、あるいはそれ以下である用量を意味する。一態様では、ＧＰＲ４３のシグナル伝達活性を阻害する物質の用量は１ａＭから１Ｍの範囲、好ましくは１ｆＭから１ｍＭの範囲、より好ましくは１ｎＭから１μＭの範囲である。一態様では、ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節に有用な物質は、ＧＰＲ４３のリガンド結合部位に特異的に結合する抗体であってよい。ＧＰＲ４３シグナル伝達の調節に有用な用量を達成するのに要する抗ＧＰＲ４３抗体の量は、ＧＰＲ４３の発現レベル、受容体発現の局在、および患者自身の免疫系の全般的状態に依存し得るが、一般には、抗ＧＰＲ４３抗体またはその結合性タンパク質０．０００５から５．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／用量がより一般的に用いられる用量である。
【０２６６】
医薬組成物
本発明は、生理適合性担体と混合された本発明のＧＰＲ４３調節因子を含む組成物を提供する。本明細書中で用いる用語「生理適合性担体」とは、生理的に許容される希釈剤、例えば水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水を意味し、さらにアジュバントを含むことができる。アジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンは当技術分野に周知の材料である。
【０２６７】
また本発明は医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬的に使用可能な適当な製薬的に許容される担体調製物を含んでもよい。
【０２６８】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野に既知の製薬的に許容される担体を用いて経口投与に適した製剤に製剤化できる。このような担体により、医薬組成物は、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液状剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として患者の摂取用に製剤化することができる。
【０２６９】
経口使用のための医薬調製物は次のように得ることができる：活性化合物を固形賦形剤と混合し、場合により、得られた混合物を研磨し、所望であれば補助剤を加えた後、顆粒の混合物を加工し、錠剤または糖衣錠コアを得る。適当な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；およびアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンである。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてもよい。
【０２７０】
糖衣錠コアは濃糖類溶液のような適当なコーティングを施される。コーティングは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。製品の同定のため、または活性化合物の量、すなわち用量を示すために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または顔料を加えても良い。
【０２７１】
経口により使用可能な医薬調製物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル剤、ならびにゼラチン製の軟密閉カプセル剤およびコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールが含まれる。押し込み型カプセル剤は、充填剤または結合剤、例えばラクトースまたはデンプン、潤滑剤例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および、場合により、安定化剤と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセル剤では、活性化合物は、安定化剤を含むか、あるいは含まない適当な液状物、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液状ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁されていてよい。
【０２７２】
非経口投与用の医薬製剤には活性化合物の水溶液が含まれる。注射用には、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理適合性バッファー、例えばハンクス液、リンガー液、または生理緩衝食塩水中で製剤化することができる。注射用の水性懸濁液は、この懸濁液の粘性を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有してもよい。さらに、活性溶媒またはベヒクルの懸濁液には、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。場合により懸濁液には、適当な安定化剤または、この化合物の可溶性を増大させ、高濃度溶液の調製を可能にする物質を含ませることができる。
【０２７３】
鼻腔投与用には、通過すべき特定の障壁に適当な浸透剤を製剤化に用いる。このような浸透剤は当技術分野で一般に知られている。
【０２７４】
本発明の医薬組成物は、当技術分野に既知の様式、例えば通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣作成、浮揚（levitating）、乳化、カプセル化、包括（entrapping）または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。
【０２７５】
医薬組成物は塩として提供することができ、このような塩は、これらに限定されないが塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、等を含む多数の酸と形成可能である。塩は水性または他のプロトン性溶媒中でより可溶性である性質を有し、その対応する遊離塩基型で存在する。別の場合では、好ましい調製物は、１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１−２％スクロース、２％−７％マンニトール、ｐＨ範囲４．５から５．５中の凍結乾燥粉末であってよく、これは使用前にバッファーと混合される。
【０２７６】
許容される担体中で製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を調製した後、これらを適当な容器内に入れ、特定症状処置用のラベルを付することができる。前記ラベルは、投与の量、頻度および方法を含む情報を含んでいる。
【０２７７】
走化性の調節
本発明は、ＰＭＮおよび関連細胞を本発明の短鎖脂肪酸分子と接触させることにより、インビトロまたはインビボでこれらの細胞の走化性を調節する方法を提供する。免疫細胞の感染部位（または抗原提示部位）への遊走は、種々の疾患状態で生じる一般的なプロセスである。本発明は部分的に、ＧＰＲ４３が短鎖脂肪酸、例えば酢酸塩およびプロピオン酸塩に関する受容体として機能すること、およびこのようなＳＣＦＡに応答してＰＭＮ走化性の媒介を担うことの発見に基づくものである。したがって本発明は、共通の作用機構として、ＰＭＮ細胞の遊走現象を共有する疾患状態の調節および／または処置のための機構を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の望ましくない遊走を特徴とする疾患状態、例えば自己免疫疾患を、そのような疾患の患者に、ＧＰＲ４３のシグナル伝達活性を阻害するか、あるいはこの受容体の活性化をブロックする物質（例えばＧＰＲ４３受容体に特異的に結合する抗体）を投与することによって調節および／または処置することができることを提供する。また本発明は、不十分な免疫細胞遊走を特徴とする疾患状態または、免疫応答の刺激によって排除されなければならない病原体によって引き起こされる疾患を、その調節または処置を必要としている患者に、これらに限定されないが酢酸塩および／またはプロピオン酸塩を含む、ＧＰＲ４３受容体の作用薬を投与することによって調節または処置することができることを提供する。本発明の方法によって調節および／または処置することができる具体的な疾患は以下に示すものである。しかし本発明はこれらの特定疾患に制限されず、異常、または不十分な免疫細胞遊走を特徴とする他の疾患状態の処置に有用であり得る。したがって本明細書中で用いる「ＰＭＮ走化性関連疾患」とは、可溶性走化性因子の方向または逆方向へのＰＭＮ細胞の遊走を一要素として含む疾患を意味する。「ＰＭＮ走化性関連疾患」は、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）、肝硬変、歯周病、および当業者に既知の、少なくとも部分的にＰＭＮ細胞の可溶性走化性因子方向または逆方向への遊走によって媒介される他の疾患であり得る。また「ＰＭＮ走化性関連疾患」とは、病原体の感染から生じるか、または個体内の内因性病原体が異常増殖することによる病理学的状態を意味し得る。
【０２７８】
腸関連障害：
共生植物相の生成物は、粘膜障壁障害または粘膜損傷の存在下で炎症を促進することがあり（Chadwick & Anderson, 1990）、これにより炎症性腸疾患（ＩＢＤ）における粘膜免疫系の活性化が生じる（Chadwick et al.,2002）。ＩＢＤは小腸および大腸のいずれかまたは両者に影響し得る。クローン病および潰瘍性大腸炎は最もよく知られている型のＩＢＤである。ＩＢＤの主な病理組織学的特徴は、罹患した腸における急性および慢性炎症性細胞の浸潤である。これらの免疫細胞は腸細胞を認識し、破壊することができ、これにより典型的な免疫機構がＩＢＤ病因に関与する（Perlmann & Broberger, 1963）。さらに、免疫細胞は形態学的、臨床的および内視鏡的に明確な炎症の証拠を伴わずに腸に広く浸潤することができる（Fiocchi, 1998）。また単球細胞はすべての段階のＩＢＤに関与すると考えられ、ＩＢＤ病態生理学におけるその重要性が強調されている（Fiocchi, 1998）。さらに、活性化Ｔリンパ球は器官培養中で粘膜損傷を誘導し（MacDonald & Spencer, 1988）、ＰＭＮは炎症および組織損傷の増幅に重要な役割を果たし（Fiocchi,1998）、ＩＢＤ患者の炎症性結腸粘膜には顕著な好中球浸潤が伴う。全身性循環から粘膜間質腔へ遊走した後、好中球は活性化を受け、活性酸素中間体およびさらなるケモカインを生産し、炎症性応答の保持ならびに最終的な粘膜損傷を引き起こすことができる。好中球浸潤はＩＢＤを伴う深刻な炎症性の腸に不可分の要因であるため、好中球遊走および活性化を阻害する治療戦略の開発は非常に望まれる目標である。実際、好中球遊走応答の阻害剤であるシクロスポリンＡを用いる処置では、好中球およびＴリンパ球が原因の炎症を減少させることによってＩＢＤ患者の炎症が改善された（Ina et al.,2002）。正常植物相が何らかの形で生理学的炎症の調節因子として機能するという概念は、Duchmannらの観察結果により強化された（Duchmann et al.,1995 & 1996）。彼らは、ＩＢＤ患者由来の粘膜性であるが末梢血性でない単核細胞が、自己の腸内細菌に対して曝露されると増殖することを示した。結腸環境での因子の生産はＰＭＮによる反応性酸素種の生産を著しく増大させる。これらの因子のうち、ＳＣＦＡは腸内の複合炭水化物の嫌気的発酵によって生産され（Pouteauら(1996)Topping & Clifton, 2001-Eftimiadi et al.(1987)）、主に以下の配分の酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩である：酢酸塩（６０％）、プロピオン酸塩（２５％）および酪酸塩（１５％）。結腸管腔のトータル濃度は約７０−１００ｍＭである（Sellin, 1999）。酪酸塩を除く、プロピオン酸塩および酢酸塩は好中球機能の強力な調節因子であり（Nakao et al.,1992）、我々は酢酸塩およびプロピオン酸塩がＧＰＲ４３に対して作用薬として作用し、好中球活性を調節することを示した。したがってＧＰＲ４３の拮抗薬は好中球活性化およびＩＢDにおける炎症を減少させ得る。
【０２７９】
ＩＢＤにおける粘膜免疫系の活性化に関し、好中球遊走および活性化が重要な役割を担うことから、本発明による、ＧＰＲ４３受容体シグナル伝達の拮抗薬である化合物は、好中球活性化およびＩＢＤにおける炎症を減少させるのに有用であり得る。
【０２８０】
宿主防御、炎症、先天性免疫の調節および造血障害
ＧＰＲ４３は白血球上で発現されている。ＧＰＲ４３のリガンドである、プロピオン酸塩および酢酸塩は、多形核細胞ならびにTリンパ球および単球を調節している（Eftimiadi et al.,1991; Nakao et al.,1992;Curi et al.,1993）。しかし、百日咳毒素およびプロテインキナーゼＣの活性化剤／阻害剤を用いる実験によってＧＰＣＲ機構が示唆されたかもしれないが、これらの作用はいずれも特定のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の刺激と結び付けられていなかった。Brunkhorst et al.(1992)は、少なくともプロピオン酸塩および酢酸塩に関して、一連のＰＭＮ活性化イベント、例えば細胞骨格Ｆ−アクチン改変、ＰＭＮ極性化（polarization）、Ｆ−アクチン局在化、細胞質ｐＨの周期的変動、細胞形態に対する作用のＧＰＣＲ機構を提案した。本発明は、ＧＰＲ４３のリガンドが、これらに限定されないが炎症性疾患、病原体感染、リンパ腫および白血病を含む、種々の病状において白血球活性を調節するために使用可能であることを提供する。
【０２８１】
歯周病
歯周病は、歯肉溝への複合グラム陰性菌感染の結果であり、これは好中球応答の欠損と関連する。見込みのある治療アプローチの１つは好中球応答を高める生物学的応答の調節因子を使用することである。種々の歯周および根管の病原体、例えばバクテロイド種は大量の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を生産することができる。したがって、本発明が提供するＧＰＲ４３リガンドは、好中球応答を調節し、歯周病の症状を減少させるのに有用であり得る。
【０２８２】
アルコール症
ほとんどのエタノールは、主にアルコール脱水素酵素（alcohol deshydrogenase, ADH）およびアルデヒド脱水素酵素（aldehy dedeshydrogenase, ALDH）によって触媒されるアルデヒドおよび酢酸塩への酸化によって排除される。アルコールは、肝代謝により、まずアセトアルデヒドに、次いで酢酸塩に、そして最終的に二酸化炭素および水になり、ほとんど完全に身体から排除される。当該代謝はミカエリス・メンテン動態学によって最もうまく説明可能な経時的除去にしたがうものである。（Fujimiya et al (2000) Alcohol ClinExp Res 24: 16S-20S; LiおよびBosron (1986) Ann Emerg Med 15:997-1004を参照のこと）。エタノール用量の約６０％−７５％が酢酸塩に変換される（Siler SQ, Neese RA,Hellerstein MK(1999) Am J Clin Nutr 70 (5): 928-36）。酢酸塩はヘッドスペース・ガス・クロマトグラフィーによりヒト血液中および尿中で評価でき（Tsukamoto et al.,Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi 19983: 200-9）、アルコール摂取、大量飲酒、代謝耐性、乱用、慢性アルコール症およびアルコール禁断の重篤性に関するマーカーを示す（Pronko et al(1997) Alcohol 32: 761-8; Korri et al (1985) Alcohol Clin Exp Res 9: 468-71; Nuutinen et al (1985) Alcohol 2: 623-6）。 エタノール摂取後、酢酸塩は５７ｍｇ／ｍＬに増大する（Lundquist (1962) Nature N°4815, p579）。
【０２８３】
慢性中度アルコール使用、および急性中度アルコール使用でさえ、細菌およびウイルス病原体によって引き起こされる感染の宿主感受性を増大させ得る（すなわち肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）（Shellito et al (2001) 25: 872-81）；および緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の肺排除（Greensberg et al (1999) Alcohol Clin Exp Res 23: 735-44）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aurecus）および表皮ブドウ球菌（Staphylococcusepidermidis）の食作用（Jareo et al (1995) Alcohol 30: 311-8; Corberand et al (1989) Alcohol Clin Exp Res 13: 542-6）。アルコール曝露後の障害のある宿主防御は、炎症応答の減少、サイトカイン生産の変化および異常な反応性酸素中間体生成および好中球機能の組み合わせと関連付けられるようだ（Szabo, 1999）。１％エタノールを摂取した２時間後の健康なボランティアから得られる好中球においてシグナル伝達カスケードのイノシトールリン酸（ＩＰ）／Ｃａ２＋応答の感受性は変化する（Gann et al (1999) Psychiatry Res 89: 189-99）。エタノールによるＰＭＮ機能の損傷は好中球顆粒の超微形態構造変化から構成され、さらに自己貪食空胞の減少、再分布および異常な蓄積（Todorovic (1999) Indian J Med Res 109: 105-14; Todorovic et al (1994) J Stud Alcohol 55: 239-48）、および好中球エラスターゼ活性の変化（Sachs et al(1990) Am Rev Respir Dis 141: 1249-55）を含む。これらの現象は結果的に細菌に対する好中球の殺菌活性の欠損を促進し得る。さらに、慢性のエタノール摂取はf-met-leu-phe（ｆＭＬＰ）誘導性の走化活性および好中球によるスーパーオキシド生産を調節する（Bautista et al(1992) 16: 788-94）。
【０２８４】
また肝臓内の白血球浸潤はアルコール性肝疾患の最も重要な特徴の１つである。アルコール性肝炎では、ＰＭＮは肝臓へ選択的に遊走する（Bautista (2002) Alcohol 27: 17-21; Siratoriら(1992) J Hepatol 15: 266-8）。循環および組織内のケモカインの上方制御は肝臓における好中球浸潤の増加と関連する（Bautista (2002) Alcohol 27: 17-21）。肝硬変のアルコール依存症患者では、走化性、食作用および殺菌活性がすべて有意に減少した（Laharrague et al (1985) Ann Med Interne (Paris) 136: 210-2）。
【０２８５】
エタノール摂取後、酢酸塩は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の減少を引き起こし得る。これはエタノールが健康なボランティアに対して循環ＦＦＡを低下させ得ることに基づく。したがってエタノール摂取後の血中酢酸の増大は、アシドーシスを伴わない場合でさえＦＦＡの減少を十分に説明するものであり、酢酸塩はアルカリ化剤として知られている（Crouse JR, Gerson CD, De Carli LM, Lieber CS. (1968) J Lipid Res 9 (4): 509-12）。
【０２８６】
結論として、上記内容は、好中球機能が慢性アルコール依存者で損なわれ得ることを示す。このような場合、本発明により、ＧＰＲ４３のリガンドは好中球機能を回復させるのに有用であり得る。
【０２８７】
走化性測定
ＰＭＮ走化性は、本発明にしたがって、S. Boydenによって1962年に最初に開発された手法によってインビトロ測定することができる（S.Boyden (1962) J. Exp. Med. 115: pp.453-466を参照のこと）。簡単には、この手法ではＰＭＮ細胞懸濁液および化学物質を２つの別々の区画に配置する。これらの区画はポリカーボネートフィルターで分離されている。ＰＭＮは例えば哺乳類の末梢血から調製することができる。あらかじめ決められた時間の後、フィルターを取り除き、細胞懸濁液含有区画側のフィルター表面の細胞を注意して取り除く。次いでフィルター上の残留細胞を固定し、染色する。ハイパワーの顕微鏡を用いてフィルターを検査し、フィルターの下面（すなわちフィルターの化学物質含有区画側）に現れた細胞の数を手動で計測する。正の走化性応答は、フィルターを通って化学物質含有区画側へ遊走または「クロール」した細胞によって示される。時間がかかるので、典型的にはフィルター全体が検査されることはない。そのかわり、代表試料領域が検査され、計測される。本発明では、走化性因子が存在しない場合と比較して、走化性因子が区画内に存在する場合に、走化性因子含有区画に接したフィルター表面に少なくとも１０％多数のＰＭＮ細胞が存在すれば、「ＰＭＮ走化性」が生じたとされる。
【０２８８】
またＰＭＮ走化性は、特定部位または特定試料中のＰＭＮ細胞数を異なる二時点で比較することにより、哺乳類においてインビボで評価することもできる。適当な刺激下で、ＰＭＮ細胞は末梢血循環から結合組織、および周囲構造内へ遊走する。走化性が、例えばＧＰＲ４３シグナル伝達活性の調節因子のような候補物質に応答して調節されたか否かを決定するため、哺乳類から結合組織試料を採取し、これを当業者に周知の組織学的技術を用いて検査し、末梢組織（例えば結合組織またはリンパ器官）に存在するＰＭＮ細胞の数を測定することができる。存在するＰＭＮ細胞の数は、次いで、後の時点（例えば１−５時間、１−５日、または１−５週間後）で存在する数と比較することができる。一態様では、哺乳類の組織内に存在するＰＭＮ細胞の数が候補物質の投与後に存在する数と比較され、末梢組織内に存在するＰＭＮ細胞の数が候補物質の投与後に増大または減少すれば、該物質はＰＭＮ走化性の調節物質として同定される。
【実施例】
【０２８９】
以下、非限定的な実施例を挙げ、本発明を説明する。この実施例では、以下の材料および方法が用いられる。本明細書中以下に引用される各参考文献の全開示内容は、引用により本明細書中に包含される。
【０２９０】
実施例１
クローニング、配列決定およびアライメント
特異的オリゴヌクレオチドプライマーをＧＰＲ４３ヒト受容体の配列に基づいて合成した：センスプライマー5'-GCGGAATTCACCATGCTGCCGGACTGGAAGAG-3'（配列番号６）およびアンチセンスプライマー5'-CTAGTCTAGACTGCTACTCTGTAGTGAAGTC-3'（配列番号７）。３つの異なる脾臓ｃＤＮＡに対し、プラチナPfxＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。増幅条件は以下であった：９４℃、１５秒；５０℃、３０秒；６８℃、２分で３５サイクル。増幅により、ＧＰＲ４３遺伝子の完全コード配列を含有する１キロベースの断片を得た。次いでこのコード配列をｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）発現ベクターのEcoRIおよびXbaI部位間にサブクローニングし、BigDyeターミネーターサイクル配列決定キット（BigDyeTerminatorcyclesequencingkit, Applied Biosystems, Warrington, Great Britain）を用い、３つのｃＤＮＡのそれぞれに関して両鎖に対する配列決定を行った。
【０２９１】
また、この９９０塩基対（ｂｐ）−オープンリーディングフレームは最近、Sawzdargoらによって同定され（GenBankアクセション AF024690）、ＧＰＲ４３と称されるオーファンＧタンパク質共役受容体をコードすることが報告された。Sawzdargoらに公開されているこのコード配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。これらを脾臓ｃＤＮＡから開始するＰＣＲに使用した。ＧＰＲ４３コード配列とサイズが適合するＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３発現ベクターに挿入し、両鎖に関して配列決定した（図１）。推定の膜貫通ドメインには下線を引き、ＩからＶＩＩの番号を付している。カゼインキナーゼ（caseine kinase）による推定のリン酸化部位は太字で示す。
【０２９２】
ＰＡＲ１および他のＰＡＲ関連配列とＧＰＲ４３のアミノ酸配列のアライメント（図２）は、ClustalXアルゴリズムを用いて行った。次いで、TreeViewアルゴリズムを用いて図２の樹状図を構築した。この図はＧＰＲ４３とプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−１、−２、−３、および−４、血小板活性化因子受容体（ＰＡＦ）、およびＧタンパク質共役受容体４２（ＧＰＲ４２）の関係を示す。ＧＰＲ４２は常にオーファン受容体である。
【０２９３】
実施例２
ＧＰＲ４３ヒト受容体の組織分布
いくつかのヒト組織中のＧＰＲ４３ ｍＲＮＡをＲＴ-ＰＣＲによって増幅した（図３）。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）実験はポリＡ＋ ＲＮＡのパネル（Clontech）を用いて行った。ＧＰＲ４３プライマーは以下のものであった：ＧＰＲ４３センスプライマー（5'-ACTGGAAGAGCTCCTTGATC-3'；配列番号８）およびＧＰＲ４３アンチセンスプライマー（5'-CAAGTATTGAACGATGATC-3'；配列番号９）。増幅ＤＮＡバンドの予想サイズは４３９ｂｐであった。アルドラーゼコード配列に基づく２つの合成プライマーをコントロールとして用いて、予想サイズ４４３ｂｐの生成物を製造した：アルドラーゼセンスプライマー5'-GGCAAGGGCATCCTGGCTGC-3'（配列番号１０）およびアルドラーゼアンチセンスリバース5'-TAACGGGCCAGAACATTGGCATT-3'（配列番号１１）。SuperscriptII（LifeTechnologies,Inc.,Merelbeke, Belgium）を用いてポリA＋ＲＮＡ約７５ｎｇを逆転写し、これをＰＣＲ用に用いた。ＰＣＲはTaqポリメラーゼを用いて以下の条件下で行った：９４℃で３分変性し、９４℃で１分、５８℃で２分および７２℃で２分で３８サイクル。ＰＣＲ反応物の一定量（１０μＬ）を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０２９４】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）中には４３９ｂｐバンドがはっきりと検出された。アルドラーゼコード配列断片の増幅はコントロールとして用いた。
【０２９５】
さらに半定量的ＰＣＲを用いて、特定の末梢血細胞および他の細胞型中のＧＰＲ４３分布を調査した（図１３）。半定量的ＲＴ-ＰＣＲ（TaqMan）実験は、トータルおよびポリＡ＋ＲＮＡのパネル（Clontech, Ambion, Biochain）を用い、１２の選択ヒト組織範囲にわたって行った。血液細胞および細胞系統由来のトータルＲＮＡは（Tripure Isolation Reagent,Boehringer Mannheim）を用いて調製した。
【０２９６】
半定量的ＲＴ-ＰＣＲ実験は、ヒトＧＰＲ４３受容体の遺伝子特異的プライマーを用いて行った。ＧＰＲ４３受容体プライマーは、フォワード5'-GGCTTTCCCCGTGCAGTAC-3'（配列番号１２）、Taqmanプローブ5'-AGCTCTCCCGCCGGCCTCTG-3'（配列番号１３）およびリバース5'-CCAGAGCTGCAATCACTCCA-3'（配列番号１４）。
【０２９７】
ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ用プライマー フォワード 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（配列番号１５）、 Taqmanプローブ5'-AGCTCTCCCGCCGGCCTCTG-3'（配列番号１６）およびリバース  5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（配列番号１７）を用いて参照ｍＲＮＡプロファイルを作成した。
【０２９８】
強いレベルのＧＰＲ４３発現は多形核好中球（ＰＭＮ）で見られた。またＴリンパ球および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では、より低いレベルでＧＰＲ４３が検出された（図１３）。顆粒球での発現レベルと比較して、ＣＮＳおよび他の末梢組織では有意な発現は検出できなかった（データは示していない）。
【０２９９】
実施例３
ＧＰＲ４３リガンドに関するスクリーニング
１０％胎児ウシ血清、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補った栄養混合ハムＦ１２培地（Nutrient Mixture HAM's F12 medium）でＣＨＯ-Ｋ１細胞（ATCCCRL-9618（Bethesda, MD, USA））を培養した。Fugene6（RocheDiagnostics, Mannheim,Germany）を用いてヒトＧＰＲ４３をコードするバイシストロン性プラスミドをＣＨＯ-Ｋ１細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、２５０μｇ／ｍlゼオシン（zeocin）を用いて個々のクローンを選択し、ＧＰＲ４３ポジティブクローンをノーザンブロッティングによって確認した。Ｇタンパク質共役受容体の天然リガンド２５０個を濃度１−１００μＭで含有する参照小分子ライブラリを用いるスクリーニングにポジティブクローンを用いた。酢酸塩を用いて特異的活性を取得し、用量応答曲線によって確認した。同一細胞を用いてさらに関連化合物を試験した。
【０３００】
ヒトＧＰＲ４３をコードしないバイシストロン性プラスミドでトランスフェクトされたＣＨＯ-Ｋ１細胞はコントロール細胞（偽トランスフェクト）として用いた。
【０３０１】
実施例４
ｈＧＰＲ４３発現ＣＨＯ-Ｋ１細胞に対するＳＣＦＡの活性
炭素数１から４の範囲のＳＣＦＡを、ヒトＧＰＲ４３を安定発現するＣＨＯ-Ｋ１細胞において、フォルスコリンで刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性の阻害能に関して試験した。
【０３０２】
効力の序列は以下のようであった：Ｃ２（酢酸塩）＞Ｃ３（プロピオン酸塩）＞Ｃ４（酪酸塩）＞＞Ｃ１（ギ酸塩）。酢酸塩は最も強力に酵素活性を阻害した。これらすべての化合物はフォルスコリン刺激性アデニル酸シクラーゼ活性を７５％減少させた（図４）。
【０３０３】
観察された酢酸塩の効果は、受容体とＧαｉ/ｏサブユニット間の共役を乱す百日咳毒素（ＰＴＸ）と一晩プレインキュベートすることにより完全に消失した（図５）。したがってヒトＧＰＲ４３の共役経路はＣＨＯ-Ｋ１中では選択的にＧｉである。
【０３０４】
観察された脂肪酸の効果はＧＰＲ４３発現細胞に制限され、他の組換えＧＰＣＲを発現しているか、あるいは発現していないコントロール細胞はいずれも上記活性化剤による活性を示さなかった（データは示していない）。
【０３０５】
上記結果はｐＨと無関係である。つまり試験濃度では、反応バッファーのｐＨは７−７．４の範囲であった。さらに、活性ＳＣＦＡの種々の塩、例えばアンモニウム（ＮＨ３＋）、カリウム（Ｋ＋）およびナトリウム（Ｎａ＋）塩を用いて、等しい効力の活性が観察された（酢酸アンモニウムを用いて得られた結果に関しては図７を参照のこと）。
【０３０６】
実施例５
膜に基づく機能アッセイにおけるＳＣＦＡ活性の分析
膜に基づく機能試験において酢酸の活性を試験した。このアッセイでは、ヒトＧＰＲ４３を発現するＣＨＯ-Ｋ１細胞由来の膜調製物でＧＴＰγ[３５Ｓ]結合の蓄積をモニターした（図６）。酢酸塩の効力は、ｃＡＭＰレベルをモニターする細胞に基づく機能アッセイで観察された効力と匹敵した。この膜に基づくアッセイを用いて試験されたＳＣＦＡの効力の序列は保存されていた。すなわち、このアッセイはＣ２＞Ｃ３＞Ｃ４＞＞Ｃ１を示した。Ｃ４およびＣ１はヒト受容体を部分的に活性化し、その最大応答は酢酸塩およびプロピオン酸塩を用いて観察された最大応答と比較して最も低かった（データは示していない）。
【０３０７】
酢酸塩、プロピオン酸塩および関連化合物の活性はＧＰＲ４３に制限され、これらの酸は、非関連ヒトＧタンパク質共役受容体、例えばアデノシンＡ１受容体、アドレナリン作動性２Ｃ受容体、コルチコトロピン放出因子１受容体、ケモカインＣＣＲ３受容体、ロイコトリエンＬＴＢ４受容体、ムスカリンＭ４受容体、ニューロペプチドFF2S受容体、オピオイド３受容体、セロトニン５-ＨＴ１Ａ受容体、およびソマトスタチンsst5受容体を発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞の１０個の異なる膜調製物ではいずれの結合も刺激できなかった。これらすべてのＧｉ共役受容体は同一の実験において、それぞれ自身の参照リガンドによって刺激された（データは示していない）。
【０３０８】
任意の直接対イオン効果を除外するために塩の影響を評価した。特にナトリウムカチオンは、Ｇタンパク質共役受容体を、リガンドの存在または不存在下でポジティブまたはネガティブに調節することが既知である。ナトリウム塩またはアンモニウム塩として試験された酢酸塩は、１２０ｍＭナトリウムまたはカリウムを含有するアッセイバッファーに懸濁された膜上のＧＴＰγ[３５Ｓ]結合の活性化において等しい効力を示した（図７）。
【０３０９】
他のＳＣＦＡおよび関連化合物（アルコール、アルデヒド、アセトン（cetone）、二価酸…）の活性を、膜−細胞に基づくアッセイにおいてそれぞれ単一濃度で用いて評価した。作用薬効力の序列は、酢酸塩＝プロピオン酸塩＞ｎ−酪酸塩＝イソ酪酸塩＝ｎ−吉草酸塩＝カプロン酸塩＞＞ギ酸塩＞＞ピルビン酸塩＝アセトアセテートである。不活性化合物には：Ｃ２−エタノール、アセトアルデヒドおよびシュウ酸塩；Ｃ３−マロン酸塩およびアセトン；Ｃ４−ＤＬ−β−ヒドロキシ酪酸塩、ＧＡＢＡ、Ｌ−グルタミン酸塩、コハク酸塩；およびＣ６−クエン酸塩が含まれる（図８）。
【０３１０】
実施例６
セカンドメッセンジャー蓄積によって測定されるＧＰＲ４３の活性に対するＳＣＦＡの作用
ＳＣＦＡはヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞においてイノシトールリン酸の生産を刺激することが可能であった（図９）。使用するＳＣＦＡに関わらず、刺激前にＰＴＸ前処理することによってこの活性化はわずかに影響を受けた。したがってヒトＧＰＲ４３の共役は二重であり、これには上記Ｇｉ共役に加えてＧｑタンパク質の活性化が関与する（図１０）。
【０３１１】
ヒトＧＰＲ４３のｃＤＮＡを、キメラＧｑｉタンパク質の同時発現を伴うか、あるいは伴わずに、ＣＯＳ-７、ＣＨＯおよびＨＥＫ細胞に一過性トランスフェクションすると、脂肪酸が、ホスホリパーゼＣの活性化を反映するイノシトールリン酸塩の蓄積を刺激した（図１１）。Ｇｑｉのみまたは他のＧＰＣＲ、例えばモチリンまたはヒスタミンＨ１受容体のｃＤＮＡでトランスフェクトされたコントロール細胞は、酢酸塩および他のＳＣＦＡによって活性化されなかった（データは示していない）。イノシトールリン酸塩の蓄積は、ＧｑｉおよびヒトＧＰＲ４３ｃＤＮＡでトランスフェクトされた未ＳＣＦＡ処理細胞で増大し、これは反応時点で添加リガンド不存在下の当該受容体が常時（構成性に）活性化していることの証拠を提供する（図１１）。
【０３１２】
実施例７
ＧＰＲ４３に対して活性なＳＣＦＡの化学式および活性
活性化合物の化学式は図１２に示す。活性化合物の構造活性相関（ＳＲＡ）は、構造上密に関連する化合物（ケトン、アルコールおよびアルデヒト）が不活性であることを考慮すると、カルボン酸部分が活性に必要とされることを示した。この部分は、線状または非線状の、２−３Ｃに関して最適活性を有する１−６炭素原子を含む炭素鎖の先端で分岐されている部分である。第二のカルボン酸部分は炭素鎖の長さに関わらすシグナルを消失させることが、シュウ酸塩（Ｃ２）、マロン酸塩（Ｃ３）、コハク酸塩（Ｃ４）、アスパラギン酸塩（Ｃ４）、グルタミン酸塩（Ｃ５）または３カルボン酸部分を有するクエン酸塩で観察された。
【０３１３】
他の官能基で置換すると、ヒトＧＰＲ４３に対する化合物の活性が種々に調節された。例えば、−ＯＨ置換基は対応する活性化合物の活性を消失させ（ｎ−酪酸塩は活性であり、β−ヒドロキシ酪酸塩は活性でない）、−ＮＨ３＋は活性を減少させたが消失させはしなかった（酢酸塩＞＞グリシン）。セリン（Ｃ３）のような−ＯＨおよびの−ＮＨ３＋官能基の組み合わせもまた活性を消失させた。またケトン置換化合物、例えばピルビン酸塩およびアセトアセテートは、対応する活性な非置換化合物（それぞれ酢酸塩およびｎ−酪酸塩）と比較して減少するが一貫した活性を示した。
【０３１４】
実施例８
プロピオン酸塩および酢酸塩はヒト好中球の細胞内カルシウム流動（mobilization）を誘導できる。
以下の実験を行い、酢酸塩およびプロピオン酸塩を用いてヒト多形核（ＰＭＮ）白血球を活性化できるか否かを試験した。これはＰＭＮを主に含有する末梢血細胞中でこの受容体が強力に発現されていることに基づくものである。活性化は、細胞膜受容体を酢酸およびプロピオン酸塩で刺激した後に内部プールから結集される細胞内カルシウムを定量することによって測定した。
【０３１５】
ＰＭＮは健康なボランティアの静脈血から精製した。細胞は、確立された方法にしたがって単離した。細胞内カルシウム測定では、室温で３０分間Fura-2AM（Molecular Probes）を細胞に取り込ませた。LSB50B分光蛍光光度計（PerkinElmer）によってカルシウム流量をモニターした。簡単には、好中球懸濁液（１×１０７細胞／ｍlを２μＭFura-2/AMと３７℃で３０分間インキュベートした。次いでこの細胞を洗浄して細胞外プローブを除き、５×１０６細胞／ｍl再懸濁し、３７℃で１０分間放置して再平衡化した。次いで細胞を蛍光光度計の温度自動調節のキュベット区画（３７℃）に移し、蛍光をモニターした（励起および発光波長はそれぞれ３４０および５１０ｎｍ）。
【０３１６】
プロピオン酸塩または酢酸塩をＰＭＮに注入すると、基本条件下と比較して細胞内カルシウムの増大が生じた。図１４は、プロピオン酸ナトリウム濃度の変化に対するこの増大の動態プロットを示す。細胞内カルシウムの増加は「基本蛍光」を超える「刺激性蛍光」の割合の増大によってモニターする。
【０３１７】
増加濃度のプロピオン酸塩（図１５）または酢酸塩（図１６）を注入すると、濃度依存性の細胞内カルシウム増大が生じる。プロピオン酸塩および酢酸塩は等しい効力である（プロピオン酸塩および酢酸塩に関して、それぞれＥＣ５０＝５４０μＭおよび５３７μＭ）。
【０３１８】
この結果はプロピオン酸塩および酢酸塩が、ヒト好中球における細胞内カルシウム流動の誘導能を有することを示す。我々の以前の結果は、ＧＰＲ４３が短鎖脂肪酸、例えばプロピオン酸塩および酢酸塩の細胞表面標的として薬理学的に完全に特徴付けられることを説明するものであるが、我々はこれにしたがって、観察されたカルシウム流動に対する作用は目的の受容体の刺激を介して媒介されるものであることを結論する。Naccache et al（J Cell Physiol (1988) Jul; 136 (1): 118-24）、Fonteriz et al（Biochem Biophys Acta (1991) Jun7; 1093(1):1-6）およびNakao et al（Infect Immun (1992) Dec; 60 (12): 5307-11）は、酢酸塩およびプロピオン酸塩がＰＭＮ中、ミリモル濃度のＥＣ５０で細胞質カルシウム流動を刺激することを記載している。しかし、百日咳毒素およびプロテインキナーゼＣの活性化剤／阻害剤を用いる実験がＧＰＣＲ機構を示唆したかもしれないが、これらはいずれも観察された応答を特定のＧタンパク質共役受容体の刺激と結び付けていない。Brunkhorst et al（Infection and Immunity July(1992),vol60, 7: 2957-2968）は、少なくともプロピオン酸塩および酢酸塩について、一連のＰＭＮ活性化事象、例えば細胞骨格Ｆ−アクチン改変、ＰＭＮ極性化、Ｆ−アクチン局在化、細胞質ｐＨの周期的変動、細胞形態に対する作用のＧＰＣＲ機構を示唆した。
【０３１９】
我々は、酢酸塩およびプロピオン酸塩が、組換え系で発現された組換えｈＧＰＲ４３の活性化剤として等しい効力であることを示した。
【０３２０】
したがって我々は、我々のデータによって初めて、ヒト好中球でのカルシウム流動に対する酢酸塩およびプロピオン酸塩の作用がＧＰＲ４３単独の活性化を介して媒介されることが示されることを結論する。
【０３２１】
実施例９
ＳＣＦＡによって誘導される走化性：好中球に対するカルシウムおよび走化性アッセイ
以前に記載されるように、健康なボランティアの軟膜から末梢血単核細胞を精製した（Struyf S, De Meester I, Scharpe S,Lenaerts JP, Menten P, Wang JM, Proost P, Van Damme J. ,Eur J Immunol (1998) Apr; 28 (4):1262-71）。細胞内カルシウム測定では、室温で３０分間Fura-2AM（Molecular Probes）を細胞に取り込ませた。LS50B分光蛍光光度計（Perkin Elmer）によってカルシウム流量をモニターした。これは１２５μＭプロベネシドを含有するバッファー中最終細胞濃度１０６細胞／ｍｌで、記載（Grynkiewicz G,Poenie M,TsienRY.,J Biol Chem (1985) Mar 25; 260(6): 3440-50）にしたがって行った。４８ウェル容器中、３μｍ（メッシュサイズ）のポリカーボネートフィルター膜（Neuroprobes,Inc.）を用いて走化性を評価した。この結果を走化性指数として表わす（図１７）。
【０３２２】
ＳＣＦＡに対する好中性顆粒球の走化性応答：
健康なドナーから新たに単離した末梢血好中球を、酢酸ナトリウムおよびプロピオン酸ナトリウムに対するその走化性応答に関して試験した。両ＳＣＦＡは典型的な鐘形用量応答曲線を示し、最適濃度は１０−３Ｍであった（図１７）。我々は、ＳＣＦＡが好中球に対して走化性を誘導することを結論する。好中球走化性におけるＳＣＦＡの効力は、ｆＭＬＰの効力より低く、ｆＭＬＰは１０−８Ｍで依然完全に活性であった。さらにまた、ｆＭＬＰの効力はＳＣＦＡの効力より高く、ｆＭＬＰの最大走化性指数が平均で少なくとも３倍高かった（データは示していない）。
【０３２３】
他の態様
前記実施例は、本発明の作成および実行の際に発明者らにより行われ、考慮された実験を示している。これらの実施例は、発明の実施について当技術分野に公開し、ならびにその有用性を示す両目的を果たす技術の開示を含むものと考える。当業者であれば、本明細書中に開示されている技術および態様は好ましい態様のみであり、多数の同等な一般的方法および技術を用いて同一の結果を得ることができることを理解するだろう。
【０３２４】
本明細書中上記特定の、特許および特許出願を含む、すべての参考文献は、その文献が、本発明の１つまたはそれ以上の態様を実施するために重要であり得る組成物および／または方法を記載し、説明し、その基礎を提供し、あるいはそれを可能にしている範囲まで、引用により明示的に本明細書中に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】ヒトＧＰＲ４３受容体のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】ＧＰＲ４３受容体と関連受容体の構造的関連を示す樹状図である。ＧＰＲ４３のアミノ酸配列と、ＰＡＲ１および他のＰＡＲ関連配列のアライメントは、ClustalXアルゴリズムを用いて行った。次いで、TreeViewアルゴリズムを用いて樹状図を構築した。プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−１、−２、−３、−４；血小板活性化因子受容体（ＰＡＦ）；Ｇタンパク質共役受容体４３（ＧＰＲ４３）；Ｇタンパク質共役受容体４２（ＧＰＲ４２）。ＧＰＲ４２は常にオーファン受容体である。
【図３】ヒトＧＰＲ４３受容体の組織分布を示す。
【図４】ヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞における、フォルスコリン刺激性アデニル酸シクラーゼ活性に対するＳＣＦＡの阻害活性を示す。
【図５】ヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞における、フォルスコリン刺激性アデニル酸シクラーゼ活性の酢酸による阻害のＰＴＸ感受性を示す。
【図６】ヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞由来の膜調製物と結合したＧＴＰγ[３５Ｓ]の蓄積に対する、酢酸の活性を示す。
【図７】ヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞由来の膜調製物と結合したＧＴＰγ[３５Ｓ]の蓄積に対する、酢酸塩の種々の塩の等しい効力の活性を示す。
【図８】ヒトＧＰＲ４３を安定発現するＣＨＯ-Ｋ１細胞由来の膜調製物と結合したＧＴＰγ[３５Ｓ]の蓄積に対する、ＳＣＦＡおよび関連分子の活性を示す。
【図９】ｈＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞中のトータルイノシトールリン酸の蓄積に対する、酢酸塩の活性を示す。
【図１０】ヒトＧＰＲ４３を安定発現しているＣＨＯ-Ｋ１細胞中のトータルイノシトールリン酸代謝産物の蓄積に対する、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４−線状カルボン酸の非ＰＴＸ感受性活性を示す。
【図１１】ヒトＧＰＲ４３および／またはキメラＧαタンパク質を一過性発現しているＣＯＳ−７細胞中のトータルイノシトールリン酸代謝産物の蓄積に対する、酢酸塩の活性を示す。
【図１２】試験対象のＳＣＦＡおよび関連化合物の名称および化学式、およびヒトＧＰＲ４３活性に対するそれらの効果を示す。
【図１３】半定量ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan）方法論を用いる、１２の選択ヒト組織の範囲にわたるヒトＧＰＲ４３転写物の組織分布を示す。データは、各組織に関するポリＡ＋ＲＮＡ２．５ｎｇ由来またはトータルＲＮＡ２５ｎｇ由来の平均ｍＲＮＡコピーの割合Ｚとして示す。パネルＡは、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の検出ｍＲＮＡの平均（＋／−Ｓ.Ｄ.）ｍＲＮＡコピー／ポリＡ＋ＲＮＡ２．５ｎｇまたはトータルＲＮＡ２５ｎｇ由来を示す（Ｙ軸）。パネルＢは、ＧＰＲ４３の平均（＋／−Ｓ.Ｄ.）ｍＲＮＡコピーを示す。Ｙ軸＝遺伝子の検出ｍＲＮＡコピー／ポリＡ＋ＲＮＡ２．５ｎｇまたはトータルＲＮＡ２５ｎｇ由来。パネルＣは、各組織に関するＧＰＣＲ／ＧＡＰＤＨ平均ｍＲＮＡコピーの割合（Ｚ）を示す（Ｙ軸）。
【図１４】プロピオン酸ナトリウムの濃度変化に対する、ＰＭＮの細胞内カルシウム増大の動態学プロットである。
【図１５】プロピオン酸ナトリウムの濃度増加によって誘導されるＰＭＮ細胞の細胞内カルシウムレベル増大の刺激に関する用量応答曲線を示す。
【図１６】酢酸ナトリウムの濃度増加によって誘導されるＰＭＮ細胞の細胞内カルシウムレベル増大の刺激に関する用量応答曲線を示す。
【図１７】遊走指数として報告される、ＳＣＦＡ（酢酸塩およびプロピオン酸塩）濃度増加に応答する好中球遊走を示す。走化性データは５つの独立した実験の平均およびＳＥＭを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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