(57)【要約】【課題】  【解決手段】  レトロウイルスは、増殖性感染を実行するためにそれらのゲノムのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を宿主ゲノムへ挿入する必要のある、ＲＮＡウイルスである。レトロウイルスｃＤＮＡ組込みに対抗して防御する１つの宿主細胞性経路は、宿主ＤＮＡ修復経路の高度に保存されたタンパク質を含む。これらのタンパク質は抗レトロウイルス薬剤に対する新規標的を表している。ここで示される発明は、とりわけ、ＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくは宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定する方法、それによって同定された化合物、そのような化合物の使用、ＤＮＡ修復経路を誘導する、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する、及びレトロウイルス感染を阻害する化合物を同定し、その能率を検定するキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のＤＮＡ修復経路を誘導する化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
ｂ）前記テスト化合物非存在下でＤＮＡ修復経路の前記少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
ｃ）前記テスト化合物非存在下のレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が前記テスト化合物存在下で増加したかどうかを決定する工程と、
を有する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
テスト化合物と接触した前記成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドをコード化している核酸分子である。
【請求項３】
請求項２の方法において、
前記核酸分子はＸＰＢ若しくはＸＰＤをコード化しているものである。
【請求項４】
請求項３の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項５】
請求項３の方法において、
ＸＰＢをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：１のヌクレオチド配列を有しており、
ＸＰＤをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：３のヌクレオチド配列を有しているものである。
【請求項６】
請求項１の方法において、
テスト化合物と接触した前記成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドである。
【請求項７】
請求項６の方法において、
前記ポリペプチドはＸＰＢ若しくはＸＰＤである。
【請求項８】
請求項７の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項９】
請求項１の方法において、
前記テスト化合物非存在下での前記ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分は、前記成分の野生型生物活性と比較して減少した生物活性を示すものである。
【請求項１０】
請求項９の方法において、
減少した生物活性を示している前記成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドをコード化する核酸分子である。
【請求項１１】
請求項１０の方法において、
前記核酸分子はＸＰＢ若しくはＸＰＤをコード化するものである。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項１３】
請求項１１の方法において、
ＸＰＢをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：１のヌクレオチド配列を有しており、
ＸＰＤをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：３のヌクレオチド配列を有しているものである。
【請求項１４】
請求項９の方法において、
減少した生物活性を示している前記成分はＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドである。
【請求項１５】
請求項１４の方法において、
前記ポリペプチドはＸＰＢ若しくはＸＰＤである。
【請求項１６】
請求項１５の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項１７】
請求項１の方法において、
前記テスト化合物はＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分の発現を直接的に若しくは間接的に上方制御するものである。
【請求項１８】
請求項１７の方法において、
ＤＮＡ修復経路の前記上方制御された成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドをコード化する核酸分子である。
【請求項１９】
請求項１８の方法において、
前記核酸分子はＸＰＢ若しくはＸＰＤをコード化するものである。
【請求項２０】
請求項１９の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項２１】
請求項１９の方法において、
ＸＰＢをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：１のヌクレオチド配列を有しており、
ＸＰＤをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：３のヌクレオチド配列を有しているものである。
【請求項２２】
請求項１の方法において、
前記テスト化合物はＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分の生物活性を直接的に若しくは間接的に上方制御するものである。
【請求項２３】
請求項２２の方法において、
ＤＮＡ修復経路の前記上方制御された成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドである。
【請求項２４】
請求項２２の方法において、
前記ポリペプチドはＸＰＢ若しくはＸＰＤである。
【請求項２５】
請求項２４の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項２６】
請求項１の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを有するものであり、
前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上の前記プロモーターから発現されるものである。
【請求項２７】
請求項２６の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルの増加によって検出されるものである。
【請求項２８】
請求項２６の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルの増加によって検出されるものである。
【請求項２９】
請求項２７の方法において、
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコード化しているものである。
【請求項３０】
請求項２６の方法において、
前記プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、パルボウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＳＨ２プロモーター、若しくは哺乳動物ゲノムＤＮＡプロモーターである。
【請求項３１】
請求項２６の方法において、
前記プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター、若しくはメタロチオニンプロモーターである。
【請求項３２】
請求項１の方法において、
工程（ａ）及び（ｂ）は細胞中若しくは細胞抽出物中で生じるものである。
【請求項３３】
請求項３２の方法において、
前記細胞は哺乳動物細胞若しくは酵母細胞である。
【請求項３４】
請求項１の方法において、
前記化合物は細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害するものである。
【請求項３５】
請求項３４の方法において、
前記化合物はレトロウイルス感染を予防するものである。
【請求項３６】
請求項１の方法によって同定された、細胞のＤＮＡ修復経路を誘導する化合物。
【請求項３７】
レトロウイルス感染を治療するための薬剤組成物であって、
前記薬剤組成物は、治療的に有効な量で請求項１の方法によって同定された少なくとも１つの化合物若しくはそれらの薬剤的に許容可能な塩類と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを有するものである。
【請求項３８】
細胞のＤＮＡ修復経路を誘導する方法であって、
前記方法は、請求項１の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記細胞へ投与する工程を有するものである。
【請求項３９】
請求項３８の方法において、
前記化合物は、前記細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害するものである。
【請求項４０】
患者のレトロウイルス感染を治療するための方法であって、
前記方法は請求項１の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記患者へ投与する工程を有するものである。
【請求項４１】
請求項４０の方法において、前記患者は哺乳動物である。
【請求項４２】
請求項４１の方法において、
前記哺乳動物は、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、若しくはヒトである。
【請求項４３】
請求項４２の方法において、前記哺乳動物はヒトである。
【請求項４４】
請求項４０の方法において、
前記レトロウイルス感染は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）感染、癌、ヒト成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、Ｉ型糖尿病、及び多発性硬化症から成る群から選択された少なくとも１つの状態に関連するものである。
【請求項４５】
請求項４４の方法において、
前記レトロウイルス感染はＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳである。
【請求項４６】
ＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するためのキットであって、
前記キットは、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化上で発現されたマーカー遺伝子を持つレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを有するものである。
【請求項４７】
請求項４６のキットであって、
前記キットはさらに少なくとも１つの従来のキット構成成分を有するものである。
【請求項４８】
レトロウイルス感染を治療するための薬剤組成物の製造における請求項１の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項４９】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下で第１の細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）前記テスト化合物非存在下で第２の細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程であって、前記第１及び前記第２の細胞若しくは細胞抽出物が同じ細胞の種類である、接触させる工程と、
（ｃ）前記テスト化合物非存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、前記テスト化合物存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が増加されているかどうかを決定する工程と、
を有する方法。
【請求項５０】
請求項４９の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを有しており、
前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のプロモーターから発現されるものである。
【請求項５１】
請求項５０の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルの増加によって決定されるものである。
【請求項５２】
請求項５０の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルの増加によって検出されるものである。
【請求項５３】
請求項５０の方法において、
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコード化しているものである。
【請求項５４】
請求項５０の方法において、
前記プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、パルボウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＳＨ２プロモーター、若しくは哺乳動物ゲノムＤＮＡプロモーターである。
【請求項５５】
請求項５０の方法において、
前記プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター、若しくはメタロチオニンプロモーターである。
【請求項５６】
請求項４９の方法において、
前記細胞種類は哺乳動物若しくは酵母である。
【請求項５７】
請求項４９の方法によって同定された宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物。
【請求項５８】
レトロウイルス感染を治療するための薬剤組成物であって、
前記薬剤組成物は、治療的に有効な量の請求項４９の方法によって同定された少なくとも１つの化合物若しくはそれらの薬剤的に許容可能な塩類と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを有するものである。
【請求項５９】
請求項４９の方法によって同定された化合物を前記細胞に投与することによる、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する方法。
【請求項６０】
患者のレトロウイルス感染を治療する方法であって、
前記方法は、請求項４９の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記患者に投与する工程を有するものである。
【請求項６１】
請求項６０の方法において、前記患者は哺乳動物である。
【請求項６２】
請求項６１の方法において、
前記哺乳動物は、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、若しくはヒトである。
【請求項６３】
請求項６２の方法において、前記哺乳動物はヒトである。
【請求項６４】
請求項６０の方法において、
前記レトロウイルス感染は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）感染、癌、ヒト成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、Ｉ型糖尿病、及び多発性硬化症から成る群から選択された少なくとも１つの状態に関連するものである。
【請求項６５】
請求項６４の方法において、
前記レトロウイルス感染はＨＩＶ感染若しくはＡＩＤＳである。
【請求項６６】
レトロウイルス感染を治療するための薬剤組成物の製造における請求項４９の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項６７】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定するためのキットであって、
前記キットは、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化上で発現されたマーカー遺伝子を持つレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを有するものである。
【請求項６８】
請求項６７のキットであって、
前記キットはさらに少なくとも１つの従来のキット構成成分を有するものである。
【請求項６９】
レトロウイルスベクターであって、
前記レトロウイルスベクターは、前記核酸分子の環状化上で発現されたプロモーター及びマーカー遺伝子を持つ核酸分子を有するものである。
【請求項７０】
請求項６９のレトロウイルスベクターにおいて、
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコード化しているものである。
【請求項７１】
請求項６９のレトロウイルスベクターにおいて、
前記プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、パルボウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＳＨ２プロモーター、若しくは哺乳動物ゲノムＤＮＡプロモーターである。
【請求項７２】
請求項６９のレトロウイルスベクターにおいて、
前記プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター、若しくはメタロチオニンプロモーターである。
【請求項７３】
請求項６９のレトロウイルスベクターであって、
前記ベクターは、配列ＩＤ：５若しくは配列ＩＤ：６のヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項７４】
細胞のＤＮＡ修復経路を誘導する化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、
（ａ）テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量を決定する工程とを有するものである。
【請求項７５】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下で細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量を決定する工程とを有するものである。
【請求項７６】
細胞のＤＮＡ修復経路を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）前記テスト化合物非存在下で前記ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｃ）前記テスト化合物非存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、前記テスト化合物存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が減少されているかどうかを決定する工程と
を有する方法。
【請求項７７】
請求項７６の方法において、
テスト化合物と接触した前記成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドをコード化している核酸分子である。
【請求項７８】
請求項７７の方法において、
前記核酸分子はＸＰＢ若しくはＸＰＤをコード化しているものである。
【請求項７９】
請求項７８の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項８０】
請求項７８の方法において、
ＸＰＢをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：１のヌクレオチド配列を有しており、
ＸＰＤをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：３のヌクレオチド配列を有しているものである。
【請求項８１】
請求項７６の方法において、
テスト化合物と接触した前記成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドである。
【請求項８２】
請求項８１の方法において、前記ポリペプチドはＸＰＢ若しくはＸＰＤである。
【請求項８３】
請求項８２の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項８４】
請求項７６の方法において、
前記テスト化合物は、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分の発現を直接的に若しくは間接的に下方制御するものである。
【請求項８５】
請求項８４の方法において、
ＤＮＡ修復経路の前記下方制御された成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドをコード化する核酸分子である。
【請求項８６】
請求項８５の方法において、
前記核酸分子はＸＰＢ若しくはＸＰＤをコード化しているものである。
【請求項８７】
請求項８６の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項８８】
請求項８６の方法において、
ＸＰＢをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：１のヌクレオチド配列を有しており、
ＸＰＤをコード化している前記核酸分子は配列ＩＤ：３のヌクレオチド配列を有しているものである。
【請求項８９】
請求項７６の方法において、
前記テスト化合物はＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分の生物活性を直接的に若しくは間接的に下方制御するものである。
【請求項９０】
請求項８９の方法において、
ＤＮＡ修復経路の前記下方制御された成分は、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの相同体から成る群から選択されたポリペプチドである。
【請求項９１】
請求項８９の方法において、前記ポリペプチドはＸＰＢ若しくはＸＰＤである。
【請求項９２】
請求項９１の方法において、
前記ＸＰＢは配列ＩＤ：２のアミノ酸配列を有しており、
前記ＸＰＤは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有しているものである。
【請求項９３】
請求項７６の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを有しており、
前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のプロモーターから発現されるものである。
【請求項９４】
請求項９３の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルの減少によって決定されるものである。
【請求項９５】
請求項９３の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルの減少によって検出されるものである。
【請求項９６】
請求項９３の方法において、
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコード化しているものである。
【請求項９７】
請求項９３の方法において、
前記プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、パルボウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＳＨ２プロモーター、若しくは哺乳動物ゲノムＤＮＡプロモーターである。
【請求項９８】
請求項９３の方法において、
前記プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター、若しくはメタロチオニンプロモーターである。
【請求項９９】
請求項７６の方法において、
工程（ａ）及び（ｂ）は細胞中若しくは細胞抽出物中で生じるものである。
【請求項１００】
請求項９９の方法において、
前記細胞は哺乳動物細胞若しくは酵母細胞である。
【請求項１０１】
請求項７６の方法において、
前記化合物は細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加するものである。
【請求項１０２】
請求項７６の方法によって同定された細胞のＤＮＡ修復経路を阻害する化合物。
【請求項１０３】
遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を増加するための薬剤組成物であって、
前記薬剤組成物は、治療的に有効な量の請求項７６の方法によって同定された少なくとも１つの化合物若しくはそれらの薬剤的に許容可能な塩類と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを有するものである。
【請求項１０４】
細胞のＤＮＡ修復経路を阻害する方法であって、
前記方法は、請求項７６の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記細胞に投与する工程を有するものである。
【請求項１０５】
請求項１０４の方法において、
前記化合物は前記細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加するものである。
【請求項１０６】
患者の遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を改善する方法であって、
前記方法は、請求項７６の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記患者へ投与する工程を有するものである。
【請求項１０７】
請求項１０６の方法において、前記患者は哺乳動物である。
【請求項１０８】
請求項１０７の方法において、
前記哺乳動物は、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、若しくはヒトである。
【請求項１０９】
請求項１０８の方法において、前記哺乳動物はヒトである。
【請求項１１０】
ＤＮＡ修復経路を阻害する化合物を同定するためのキットであって、
前記キットは、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化上で発現されたマーカー遺伝子を持つレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを有するものである。
【請求項１１１】
請求項１１０のキットであって、
前記キットはさらに少なくとも１つの従来のキット構成成分を有するものである。
【請求項１１２】
遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を増加するための薬剤組成物の製造における請求項７６の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項１１３】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を同定する方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下で第１の細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）前記テスト化合物非存在下で第２の細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程であって、前記第１及び前記第２の細胞若しくは細胞抽出物が同じ細胞の種類である、接触させる工程と、
（ｃ）前記テスト化合物非存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、前記テスト化合物存在下でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が増加されているかどうかを決定する工程と
を有する方法。
【請求項１１４】
請求項１１３の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを有しており、
前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のプロモーターから発現されるものである。
【請求項１１５】
請求項１１３の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子の発現レベルの減少によって決定されるものである。
【請求項１１６】
請求項１１４の方法において、
前記レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少は、前記テスト化合物非存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルと比較して、前記テスト化合物存在下での前記マーカー遺伝子から発現されたポリペプチドの活性レベルの減少によって検出されるものである。
【請求項１１７】
請求項１１４の方法において、
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコード化しているものである。
【請求項１１８】
請求項１１４の方法において、
前記プロモーターは、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、パルボウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＳＨ２プロモーター、若しくは哺乳動物ゲノムＤＮＡプロモーターである。
【請求項１１９】
請求項１１４の方法において、
前記プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター、若しくはメタロチオニンプロモーターである。
【請求項１２０】
請求項１１３の方法において、
前記細胞種類は哺乳動物若しくは酵母である。
【請求項１２１】
請求項１１３の方法によって同定された、宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物。
【請求項１２２】
遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を増加するための薬剤組成物であって、
前記薬剤組成物は、治療的に有効な量の請求項１１３の方法によって同定された少なくとも１つの化合物若しくはそれらの薬剤的に許容可能な塩類と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを有するものである。
【請求項１２３】
請求項１１３の方法によって同定された化合物を前記細胞へ投与することによって宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する方法。
【請求項１２４】
患者の遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を改善する方法であって、
前記方法は、請求項１１３の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を前記患者へ投与する工程を有するものである。
【請求項１２５】
請求項１２４の方法において、前記患者は哺乳動物である。
【請求項１２６】
請求項１２５の方法において、
前記哺乳動物は、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、若しくはヒトである。
【請求項１２７】
請求項１２６の方法において、前記哺乳動物はヒトである。
【請求項１２８】
遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を増加するための薬剤組成物の製造における請求項１１３の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項１２９】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を同定するためのキットであって、
前記キットは、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化上で発現されたマーカー遺伝子を持つレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを有するものである。
【請求項１３０】
請求項１２９のキットであって、
前記キットはさらに少なくとも１つの従来のキット構成成分を有するものである。
【請求項１３１】
細胞のＤＮＡ修復経路を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量を決定する工程とを有するものである。
【請求項１３０】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を同定する方法であって、
（ａ）テスト化合物存在下で細胞若しくは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、
（ｂ）レトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量を決定する工程と
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許  
本明細書は２００２年４月５日に出願された米国特許仮出願第６０／３７０，３７６号に対して優先権を主張しており、その全体で開示されている内容はこの参照により組み込まれる。
【０００２】
連邦政府後援の研究に関する記述  
この発明はアメリカ国立予防衛生研究所（ＮＩＨ）からの研究助成金（グラント許可番号ＧＭ６２５５６）によって一部補助されたものである。米国政府は本発明の一部の権利を有している。
【０００３】
本発明は１つには、ＤＮＡ修復経路を誘導するための方法と、ＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくはレトロウイルス感染を阻害する化合物を同定する方法と、レトロウイルス感染によって引き起こされた症状をＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくは宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物によって治療する方法と、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する方法と、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくはレトロウイルス感染を増加する化合物の同定のための方法と、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を有する遺伝子運搬の改良による状態の治療方法と、に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
レトロウイルスは、増殖性感染を行うために宿主染色体へそれらのゲノムのＤＮＡコピー（レトロウイルスｃＤＮＡ）を挿入する必要があるＲＮＡウイルスである。レトロウイルス組込みはｃＤＮＡ挿入部位での遺伝子の変異原性不活性化、若しくは隣接する宿主遺伝子の異常発現をもたらし、それら両方は宿主生物に有害な結果を導くことができる。さらに、レトロウイルスは、限定されるものではないが、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ−１が原因である）、様々な動物癌、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びヒト成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などの疾患を引き起こすという事実からも明らかなように、レトロウイルスはヒト及び動物の健康に著しいリスクを与える。レトロウイルスは他の一般的な障害は、例えばこれに限定されるものではないが、Ｉ型糖尿病及び多発性硬化症などにも関連していた。
【０００５】
そのようなレトロウイルス感染性疾患に対抗するための最近の努力は、感染に関連するレトロウイルスタンパク質のインヒビター（阻害剤）の同定に焦点が当てられてきた。２つのメカニズムはレトロウイルスの感染機序、すなわち逆転写及び組換え（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ．ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳＥＳ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を特徴付ける。２つの過程はレトロウイルスが細胞へ増殖性感染するために重要である（Ｔｉｓｄａｌｅ，Ｍ．，Ｔ．Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｂ．Ａ．Ｌａｒｄｅｒ，ａｎｄ  Ｋ．Ｍｏｅｌｌｉｎｇ.  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  1  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ａｂｏｌｉｓｈ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２：５９〜６６，１９９１；ＬａＦｅｍｉｎａ，Ｒ．Ｌ．，Ｃ．Ｌ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｏ．Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｋ．ＬｅＧｒｏｗ，Ｅ．Ｒｏｔｈ，Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｌｅｉｆ，ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｅ．Ｅｍｉｎｉ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６：７４１４〜７４１９，１９９２；Ｓａｋａｉ，Ｈ．，Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｊ．Ｓａｋｕｒａｇｉ，Ｓ．Ｓａｋｕｒｇａｉ．，Ｒ．Ｓｈｉｂａｔａ，Ａ，Ｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．Ｏｎｏ，Ｓ．Ｕｅｄａ，ａｎｄ  Ａ．Ａｄａｃｈｉ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：１１６９〜１１７４，１９９３；Ｅｎｇｌｕｎｄ，Ｇ．，Ｔ．Ｓ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｅ．Ｏ．Ｆｒｅｅｄ，Ａ．Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ‐ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６９：３２１６〜３２１９，１９９５）。今まで、多くの薬剤開発プログラムは、レトロウイルス逆転写酵素及びプロテアーゼを含むウイルス性コード化産物の阻害に焦点が当てられてきた。しかしながら、レトロウイルスの短い生活環及びそれら固有の高確率の遺伝的変化或いは変異を考えると、そのような戦略はウイルス性コード化標的分子の変化を通じた薬剤耐性ウイルス誘導体の発生に終わる。従って、ウイルス性コード化タンパク質を干渉する多くの抗レトロウイルス薬剤は、仮にあるとすれば限定��間のみに対して有効である。レトロウイルスタンパク質を標的にしている薬剤の別の制限は、これらの多くは幅広い適用性を有していないこと、及び特定のウイルス或いは特定のウイルスのある系統に対して高特異性であることである。
【０００６】
レトロウイルスタンパク質を標的とする現在のレトロウイルス治療の制限の一例として、ＨＩＶレトロウイルスによって引き起こされるＡＩＤＳに対する現在の治療は、ＨＡＡＲＴ（ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉ-ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ：高活性抗レトロウイルス剤療法）（Ａｕｔｒａｎ，Ｂ．，Ｇ．Ｃａｒｃｅｌａｉｎ，Ｔ．Ｓ．Ｌｉ，Ｃ．Ｂｌａｎｃ，Ｄ．Ｍａｔｈｅｚ，Ｒ．Ｔｕｂｉａｎａ，Ｃ．Ｋａｔｌａｍａ，Ｐ．Ｄｅｂｒｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｌｅｉｂｏｗｉｔｃｈ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＩＶ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１１２〜１１６，１９９７）と呼ばれる３若しくは４つの抗レトロウイルス薬剤のカクテル（反応混液）から成る。前記レトロウイルス逆転写酵素は、ＨＡＡＲＴ薬剤成分であるヌクレオチド類似体及び非ヌクレオチドインヒビター、の２つのファミリーによって阻害される。ＨＡＡＲＴ中で用いられている残りの薬剤はレトロウイルスプロテアーゼインヒビターであり、別のＨＩＶ酵素を標的にしている。しかしながら、７８％の新規ＨＩＶ感染は少なくとも１つのＨＡＡＲＴ薬剤成分に対して耐性を示し、効果的なＨＩＶワクチンは開発されていない（Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，２００１；Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｄｅｂａｔｅ  ｂｅｇｉｎｓ  ｏｖｅｒ  ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉａｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：１９７３，２００１）。さらに、ＨＩＶの前記レトロウイルス組込み酵素（インテグラーゼ）を阻害する多くの既知薬剤は、特異性の欠如若しくは低い生物学的利用能が原因でヒトへの試行は不成功であった（Ｃｒａｉｇｉｅ，Ｒ．ＨＩＶ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，ａ  ｂｒｉｅｆ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：２３２１３〜２３２１６，２００１；Ｈａｚｕｄａ，Ｄ．Ｊ．，Ｐ．Ｆｅｌｏｃｋ，Ｍ．Ｗｉｔｍｅｒ，Ａ．Ｗｏｌｆｅ，Ｋ．Ｓｔｉｌｌｍｏｃｋ，Ｊ．Ａ．Ｇｒｏｂｌｅｒ，Ａ．Ｅｓｐｅｓｅｔｈ，Ｌ．Ｇａｂｒｙｅｌｓｋｉ，Ｗ．Ｓｃｈｌｅｉｆ，Ｃ．Ｂｌａｕ，ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＨＩＶ‐１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：６４６〜６５０，２０００）。従って、新規ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳの薬物療法の開発は重大である。さらに効果的なＨＩＶワクチンの開発も非常に重要である。
【０００７】
レトロウイルスは遺伝子運搬にも用いられ、遺伝子治療においてますます重要な役割を演じると思われる。従って、宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加し、このため遺伝子運搬を増加する方法及び化合物が非常に重要となる。
【０００８】
従って、レトロウイルス機能がどのようなものか、それらがどのように制御され得るかを理解することは非常に商業的で医学的に重要である。そのような理解はレトロウイルス感染を治療するための、及び遺伝子治療方法論での遺伝子運搬を改善するための新規戦略の開発を可能にする。
【０００９】
本発明は、レトロウイルス感染に関与するＤＮＡ修復経路とその成分を提供することによって解明し、とりわけ（ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ）、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する及び／若しくはＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するための方法及びアッセイ（検定法）システム、ＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害するための方法、ＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくは宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物によってレトロウイルス感染を治療する方法、ＤＮＡ修復経路を阻害するための及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加するための方法、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくはレトロウイルス感染を増加する化合物を同定するための方法、及びＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくは宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を有する遺伝子運搬を改良することによって状態を治療する方法を提供することによってなされる。
【００１０】
ここに示されたような内因性宿主防御メカニズムの刺激は、ＨＩＶ、若しくは他のあらゆるレトロウイルス感染の治療に対して有益な相加作用である。第１に、レトロウイルスが薬剤作用を回避するような方法で変異することは困難である若しくは不可能である。宿主細胞要因は、レトロウイルス薬剤耐性の発生の基礎である高変異原性ウイルス複製過程の影響は受けない。第２に、組込みは全てのレトロウイルスが感染性であるために必須条件であるので、１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環の形成を誘導する薬剤は広範囲のレトロウイルスの種対に対して有効的である。さらに、これは刺激された内因性システム（すなわち宿主細胞要因）であるので、この治療形態には毒性がほとんどない。ここに示されたレトロウイルス感染に対する治療は他の現在利用可能な抗ウイルス薬剤との組合わせで、例えばＨＡＡＲＴの一部として使用されると期待される。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１１】
本発明の１実施形態において、テスト化合物存在下で細胞若しくは細胞抽出物と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させること；テスト化合物非存在下で同じ種類の細胞若しくは細胞抽出物と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させること；及び前記テスト化合物非存在下で生じるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化のレベルと比較して、前記テスト化合物存在下でレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が増加するかどうか決定することによって、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定するための方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の１実施形態において、テスト化合物存在下で細胞若しくは細胞抽出物と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させること、及びレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量を決定することによって、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定するための方法が提供される。
【００１３】
本発明の１態様では、テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させること；テスト化合物非存在下でＤＮＡ修復経路の成分と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させること；及び前記テスト化合物非存在下で生じるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、前記テスト化合物存在下でレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が増加するかどうか決定することによって、細胞中のＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するための方法を提供する。本発明の前記方法は細胞中若しくは細胞抽出物中で行われる。本発明の方法で使用される細胞若しくはそれらから由来する細胞抽出物は、例えばヒト、鳥などを含む哺乳動物、酵母、及び植物細胞などが含まれる。直接的若しくは間接的に前記テスト化合物によって接触する或いは上方制御されるＤＮＡ修復経路の成分は、限定されるものではないが、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５０と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーとをコード化する核酸分子の少なくとも１つと、それらによってコード化されるポリペプチドと、それらの相同体とを含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分は、前記テスト化合物非存在下での成分の野生型生物活性と比較して、前記テスト化合物非存在下で減少した生物活性を示す。減少した生物活性を示す前記成分は、限定されるものではないが、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５０と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーとをコード化する核酸分子の少なくとも１つと、それらによってコード化されるポリペプチドと、それらの相同体とを含む。
【００１５】
本発明のいくつかの態様において。前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを有しており、前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上の前記プロモーターから発現される。本発明の前記方法でのレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加は、前記テスト化合物非存在下のそれらと比較して、前記マーカー遺伝子の発現レベルの増加、若しくは前記化合物存在下の前記マーカー遺伝子によってコード化されたポリペプチドの活性レベルの増加によって検出される。本発明の前記方法で用いられるマーカー遺伝子の例として、これに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）などをコード化している遺伝子が含まれる。本発明の前記方法で用いられるプロモーターの例として、これに限定されるものではないが、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、或いは哺乳動物ゲノムＤＮＡから由来したプロモーターと、ＭＳＨ２プロモーターと、３−ホスホグリセリン酸キナーゼや他の様々な解糖系酵素遺伝子プロモーターを含む構成プロモーターと、若しくはアルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター或いはメタロチオニンプロモーターを含む誘導性プロモーターとを含む。
【００１６】
ここではプロモーターと核酸分子の環状化上で発現されるマーカー遺伝子とを含む核酸分子を有するレトロウイルスベクターも提供される。本発明のいくつかの実施形態において、前記レトロウイルスベクターは配列ＩＤ番号：５若しくは配列ＩＤ番号：６の核酸配列を有する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路を誘導する及び／若しくは宿主細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、前記宿主細胞のレトロウイルス感染を阻止する化合物が提供される。本発明の別の態様において、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの態様は、本発明の化合物の薬剤組成物に関するものである。本発明の薬剤組成物は、例えばレトロウイルス感染の治療のためであり、本発明の方法に従って同定された治療的に有効な量の少なくとも１つの化合物若しくは薬剤的に許容可能なそれらの塩類、及び薬剤的に許容可能な賦形剤を含む。
【００１９】
本発明の付加的な実施形態は、本発明の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を細胞に投与することによって細胞のＤＮＡ修復経路を誘導する方法に関するものである。本発明のいくつかの態様において、前記化合物は前記細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態は、本発明の前記方法によって同定された少なくとも１つの化合物、若しくはそれらの薬剤組成物を患者へ投与することによって患者のレトロウイルス感染を治療する方法を提供する。前記患者は植物若しくは、これに限定されるものではないが、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトを含む哺乳動物である。本発明の前記方法に従って治療されるレトロウイルス感染の例としては、これに限定されるものではないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）感染、癌、ヒト成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、ＦＩＶ、Ｉ型糖尿病、及び多発性硬化症の少なくとも１つの状態に関連したレトロウイルス感染を含む。
【００２１】
本発明の１態様は、テスト化合物存在下でＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させる；前記テスト化合物非存在下で前記ＤＮＡ修復経路の成分と非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを接触させる；及び前記テスト化合物非存在下で生じるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量と比較して、前記テスト化合物存在下で生じるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量が増加するかどうか決定することによって、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物を同定するための方法を提供する。本発明の前記方法は細胞中若しくは細胞抽出物中で行われる。本発明の方法で使用される細胞若しくはそれらから由来する細胞抽出物は、例えばヒト、鳥などを含む哺乳動物、酵母、及び植物細胞などが含まれる。直接的または間接的に前記テスト化合物によって接触される或いは上方制御されるＤＮＡ修復経路の化合物は、限定されるものではないが、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５０と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマーとをコード化する核酸分子の少なくとも１つと、それらによってコード化されるポリペプチドと、それらの相同体とを含む。
【００２２】
本発明のいくつかの態様において、前記レトロウイルスｃＤＮＡは少なくとも１つのマーカー遺伝子と少なくとも１つのプロモーターとを含み、前記マーカー遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上の前記プロモーターから発現される。本発明の前記方法におけるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少は、前記テスト化合物非存在下でのそれらと比較した、前記マーカー遺伝子の発現レベルの減少若しくは前記化合物存在下の前記マーカー遺伝子によってコード化されたポリペプチドの活性レベルの減少によって検出される。本発明の前記方法で用いられるマーカー遺伝子の例として、これに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）などをコード化している遺伝子が含まれる。本発明の前記方法で用いられるプロモーターの例として、これに限定されるものではないが、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、或いは哺乳動物ゲノムＤＮＡから由来したプロモーターと、ＭＳＨ２プロモーターと、３−ホスホグリセリン酸キナーゼや他の様々な解糖系酵素遺伝子プロモーターを含む構成プロモーターと、若しくはアルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター或いはメタロチオニンプロモーターを含む誘導性プロモーターとを含む。
【００２３】
本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくは宿主細胞のゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物が提供される。本発明のいくつかの実施形態において、前記方法に従って同定された化合物が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの態様は本発明の化合物の薬剤組成物に関するものである。本発明の薬剤組成物は、例えば遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を改善するためであり、本発明の方法に従って同定された治療的に有効な量の少なくとも１つの化合物若しくは薬剤的に許容可能なそれらの塩類、及び薬剤的に許容可能な賦形剤を含む。
【００２５】
本発明の付加的な実施形態は、本発明の方法によって同定された少なくとも１つの化合物を細胞に投与することによってＤＮＡ修復経路を阻害する及び／若しくは細胞のレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する方法に関するものである。
【００２６】
本発明の付加的な実施形態は、本発明の化合物を投与することによって遺伝子治療における遺伝子運搬の効率を増加するための方法を提供する。前記患者は植物若しくは、これに限定されるものではないが、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトを含む哺乳動物である。
【００２７】
本発明の付加的な態様はＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するためのアッセイシステムを提供する。本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分と、レトロウイルスｃＤＮＡ環状化上で発現されるマーカー遺伝子を有する非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと、ゲノムＤＮＡとを含んでいる、ＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するための無細胞系が提供される。ここにおいてマーカー遺伝子を有するレトロウイルスと、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を有する細胞とを含む、ＤＮＡ修復経路を誘導する化合物を同定するための細胞ベースシステムも提供される。前記アッセイシステムのいくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ修復経路の成分は、前記成分の野生型生物活性と比較して減少した生物活性を示す。本発明のいくつかの実施形態において、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定するための、細胞と環状化マーカー遺伝子を含むレトロウイルスとを有する細胞ベースアッセイシステムが提供され、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を同定するための、宿主ゲノムＤＮＡと環状化マーカー遺伝子を有する非環状化レトロウイルスｃＤＮＡとを有する無細胞系アッセイシステムも本発明の範囲内に含まれている。
【００２８】
本発明の別の態様は、本発明のレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを含むキットである。そのようなキットは、限定されるものではないが、容器、ラベル及び説明書を含む従来のキット構成成分を含む。
【００２９】
本発明の他の態様は、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分をテスト化合物にさらし；ＤＮＡ修復を誘導し；レトロウイルスｃＤＮＡ環状化（ここにおいて前記環状化はプロモーターをマーカー遺伝子の隣りに並べる、レトロウイルスｃＤＮＡの物理的組換えである）の量の１つを測定し；マーカー遺伝子の発現を定量化し；宿主細胞ゲノムへの前記レトロウイルスｃＤＮＡの組込みを阻害し；前記化合物を同定することによって、レトロウイルス感染力を阻害する化合物をスクリーニングするための方法を含む。ＤＮＡ修復経路の成分をテスト化合物にさらし；ＤＮＡ修復を誘導し；レトロウイルスｃＤＮＡ環状化（ここにおいて前記環状化はプロモーターをマーカー遺伝子の隣りに並べる、レトロウイルスｃＤＮＡの物理的組換えである）の量の１つを測定し；環状化の増加を意味するマーカー遺伝子の発現量を測定し；宿主細胞ゲノムへの前記レトロウイルスｃＤＮＡの組込みを阻害し；前記化合物を同定することによって、レトロウイルス感染力を阻害する化合物をスクリーニングするための方法も提供される。前記ＤＮＡ修復経路の前記成分は、ＸＰＢ若しくはＸＰＤの少なくとも１つであるが、前記ＤＮＡ修復経路の前記ＸＰＢ若しくはＸＰＤメンバーに限定されるものではない。前記ＤＮＡ修復経路の前記成分はＤＮＡ修復経路の遺伝子であり、ＤＮＡ修復を誘導する前記化合物は前記遺伝子を上方制御し、その結果ＤＮＡ修復が誘導されレトロウイルス組込みは阻害される。前記ＤＮＡ修復経路の前記成分は前記ＤＮＡ修復経路のタンパク質でもあり、ＤＮＡ修復を誘導する前記化合物は前記タンパク質の活性若しくは機能を誘導し、その結果ＤＮＡ修復が誘導されレトロウイルス組込みは阻害される。本発明の付加的な実施形態は、同定された化合物を細胞に投与し、前記細胞のゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害することによって細胞中のレトロウイルス感染力を阻害する方法を含む。スクリーニング方法によって同定された化合物と薬剤的に許容可能な賦形剤とから成る薬剤組成物も提供される。レトロウイルス組込みを阻害する化合物はここに開示された前記方法に従って同定された。レトロウイルス組込みを阻害する化合物は本発明の方法に従って同定され、ここにおいて前記化合物は宿主細胞ゲノムへのレトロウイルス組込みの阻害を引き起こす薬剤のさらなる開発のためのリード化合物となる。
【００３０】
同定された前記テスト化合物を対象へ投与し、前記対象のゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害することによって対象内のレトロウイルス感染力を阻害する方法が付加的に提供される。別の実施形態において、細胞内でＤＮＡ修復を誘導する（ここにおいてＤＮＡ修復の誘導は宿主細胞ゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害する）化合物を、ＤＮＡ修復経路の成分をテスト化合物にさらし；（相同性組換え若しくは非相同性末端結合を介する）レトロウイルスｃＤＮＡ環形成の量の１つをマーカー遺伝子の発現と、レトロウイルスｃＤＮＡの物理的組換えとを定量化することによって測定し；前記宿主細胞ゲノムへの前記レトロウイルスｃＤＮＡの組込みを阻害し；前記化合物を同定することによって、スクリーニングする方法が提供される。前記ＤＮＡ修復経路の前記成分は、ＸＰＢ若しくはＸＰＤの少なくとも１つであるが、前記ＤＮＡ修復経路の前記ＸＰＢ若しくはＸＰＤメンバーに限定されるものではない。細胞内のＤＮＡ修復を誘導する方法も本発明によって含まれ、ここにおいてＤＮＡ修復の誘導は、本発明の方法で同定されたテスト化合物を細胞へ投与し；ＤＮＡ修復を誘導し；前記細胞のゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害することによって、前記細胞のゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害する。本発明の別の態様は、本発明の方法に従って同定されたＤＮＡ修復を誘導する化合物（ここにおいてＤＮＡ修復の誘導は宿主細胞ゲノムレトロウイルス組込みを阻害する）と、前記化合物の薬剤的組成物と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを含む。本発明の１実施形態は、対象に対して同定されたテスト化合物を投与し；ＤＮＡ修復を誘導し；対象のゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害することによって、対象内のＤＮＡ修復を誘導する方法を含む。前記化合物はＤＮＡ修復経路の遺伝子を上方制御することによってＤＮＡ修復を誘導し、それによりＤＮＡ修復が誘導されレトロウイルス組込みは阻害される。
【００３１】
対象に対して本発明の方法で同定されたテスト化合物を投与し、ＤＮＡ修復を誘導することによって、対象内のＤＮＡ修復を誘導する方法も本発明によって提供される。本発明の方法に従って同定されたＤＮＡ修復を誘導する化合物は宿主細胞ゲノムへのレトロウイルス組込みの阻害を引き起こす薬剤のさらなる開発のためのリード化合物となる。
【００３２】
本発明の別の態様は、ＤＮＡ修復経路の成分をテスト化合物にさらし；ＤＮＡ修復を誘導し；（相同性組換え若しくは非相同性末端結合を介する）レトロウイルスｃＤＮＡ環形成の量の１つをマーカー遺伝子の発現と、レトロウイルスｃＤＮＡの物理的組換えとを定量化することによって測定し；前記化合物を同定することによって、細胞内でＤＮＡ修復（ここにおいてＤＮＡ修復の誘導は宿主細胞ゲノムへのレトロウイルス組込みを阻害する）を誘導する化合物をスクリーニングするための方法を含む。
【００３３】
ここに提供された物質、方法、及び実施例は説明のためのものであり、これに限定されることを意図したものではない。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明及び請求項から明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
ここに参照されている参考資料、特許、特許明細書、及び科学文献は当業者の知識を確立するために参照され、それぞれがこの参照により組み込まれると明確に、個別に開示されたものと同程度に、それらの全体の内容はこの参照により組み込まれる。ここに引用されたあらゆる文献と本明細書の特定の教示の間の全ての不一致は、後者を支持して解決されるものである。同様に、単語や語句の本発明分野で理解されている定義と本明細書中で特に指示された単語や語句の定義の間の全ての不一致は、後者を支持して解決されるものである。
【００３５】
組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を説明している標準的な参考資料は当業者に知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）。
【００３６】
本発明は増殖性感染を実行するためにレトロウイルスがその遺伝物質を真核生物宿主細胞のゲノムに挿入する過程に関連するものである。より具体的には、本発明は効果的なレトロウイルスｃＤＮＡ組込みに必要とされる前記宿主細胞の高度に保存されたタンパク質に関連するものである。これらのタンパク質は抗レトロウイルス薬剤に対する、及びレトロウイルスによる改善された遺伝子運搬のための薬剤に対する新規標的を示す。とりわけ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同様なレトロウイルスアッセイ及び薬剤を比較しテストすると共に、抗レトロウイルス化合物及びレトロウイルス遺伝子運搬を増加する化合物をスクリーニングするために用いることができる方法及びアッセイシステムがここにおいて提供される。
【００３７】
ここで用いられる"ＤＮＡ修復経路"という語句は、これに限定されるものではないが、相同性組換え及び非相同性末端結合を含む前記宿主ＤＮＡの修復を容易にする宿主細胞のあらゆる経路を意味している。"ＤＮＡ修復経路の成分"は、限定するものではないが、宿主細胞のＤＮＡ修復経路に関与する核酸分子及びポリペプチドを含むあらゆる分子を意味している。ＤＮＡ修復経路の成分の例として、これに限定されるものではないが、ＸＰＡと、ＸＰＢと、ＸＰＣと、ＸＰＤと、ＸＰＥと、ＸＰＦと、ＸＰＧと、ＲＡＤ５０と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９と、ＭＳＨ２と、ＣＤＣ９と、ｈＲＡＤ５０と、ｈＲＡＤ５１と、ｈＲＡＤ５１Ｂと、ｈＲＡＤ５１Ｃと、ｈＲＡＤ５１Ｄと、ｈＸＲＣＣ２と、ｈＸＲＣＣ３と、ＸＲＣＣ４と、リガーゼＩＶと、ｈＭＲＥ１１と、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）と、ＤＮＡ−ＰＫと、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、及びそれらの同等な相同体とを含む。
【００３８】
ここで用いられたように、"接触させる"という用語は直接的若しくは間接的に化合物を目的の分子の物理的に近くへ一緒に運ぶことを意味している。接触させることは、例えば、あらゆるバッファー、塩類、溶液中で、若しくは細胞或いは細胞抽出物中で生じる。
【００３９】
ここで用いられたように、"抗体"という用語は、完全で無傷な抗体、及びＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、及びそれらの他の断片を言及することを意味している。完全で無傷な抗体はマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体などのモノクローナル抗体を含む。
【００４０】
ここで用いられたように、"結合"という用語は２つのタンパク質或いは化合物、関連するタンパク質或いは化合物、若しくはそれらの組み合わせの間の物理的な若しくは化学的な相互作用を意味している。結合はイオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス、疎水結合などを含む。前記物理的な相互作用、結合は直接的若しくは間接的であり、間接的とは別のタンパク質若しくは化合物の影響を介する若しくはそれらに起因することである。直接的結合とは、別のタンパク質若しくは化合物の影響を介して若しくは起因して行われないことではなく、他の実質的な化学中間体なしでの相互作用を意味する。結合は多くの異なる方法で検出される。限定されない例として、２つの分子間の前記物理的結合相互作用は標識化合物を用いて検出され得る。結合を検出する他の方法は当業者にはよく知られたものである。
【００４１】
ここで用いられたように、"相補的な"という用語は核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン−クリック塩基対形成を意味している。
【００４２】
ここで用いられたように、"緊縮性ハイブリダイゼーション状態"若しくは"緊縮性状態"という用語は、その状態下でオリゴヌクレオチドがその標的配列と特異的にハイブリダイゼーションするであろう状態を意味している。緊縮性状態は配列依存性であり、異なる環境では異なるであろう。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイゼーションする。一般的に、緊縮性状態は定義されたイオン強度及びｐＨで、前記特異的配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低い。前記Ｔｍは（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度条件下で）前記標的配列に対して相補的な前記オリゴヌクレオチドの５０％が平衡状態で前記標的配列とハイブリダイゼーションする温度である。前記標的配列は一般的に過度に存在するので、Ｔｍでは５０％の前記ハイブリダイゼーションしているオリゴヌクレオチドが平衡状態で占めている。一般的に緊縮性状態においては、それらの塩濃度が約０．１Ｍナトリウムイオン以下であり、通常はｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（若しくは他の塩類）であり、温度は短いオリゴヌクレオチド（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、より長いオリゴヌクレオチドに対しては少なくとも約６０℃である。緊縮性状態は例えばホルムアミドなどの不安定化因子の添加によっても達成される。
【００４３】
"マーカー遺伝子"若しくは"レポーター遺伝子"という用語は、発現した時、形質転換された細胞に物理的、形態学的、若しくは生物化学的レベルで表現型を与える産物をコード化している遺伝子を意味し、これは標準的な技術を用いて直接的若しくは間接的に、容易に同定可能であり、これに限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼをコード化している）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、若しくはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）などが含まれる。本発明の実行に関係する標準的な手順の多くと同様に、当業者はマーカー若しくはレポーターの機能に貢献できる付加的な配列を認識するであろう。従って、このリストはただ単に何が使用されるかの例を示すことを意味しているものに過ぎず、本発明の限定を意味したものではない。ここで用いられているような"普遍的マーカー"若しくは"普遍的マーカー遺伝子"という用語は、宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡの組込み若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の場合でも発現しているレトロウイルスｃＤＮＡの遺伝子を意味しており、従って宿主細胞核へのレトロウイルスｃＤＮＡ移入に対するポジティブコントロールとして働く。"環状化マーカー遺伝子"若しくは"環状化マーカー"という用語は、レトロウイルスｃＤＮＡの環状化の場合にのみ発現されるレトロウイルスｃＤＮＡの遺伝子を意味している。
【００４４】
ここで用いられるように、"プロモーター"という用語は、目的の核酸分子の発現を制御し、調節し、促進する制御要素を意味しており、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、サイトメガロウイルス、或いは哺乳動物ゲノムＤＮＡから由来したものであり得る。哺乳動物に対して適したプロモーターの例として、これに限定されるものではないが、ＣＭＶ及びＭＳＨ２プロモーターが含まれる。酵母での使用に適したプロモーターは、これに限定されるものではないが、３−ホスホグリセリン酸キナーゼや他の様々な解糖系酵素遺伝子プロモーターを含む構成プロモーターと、若しくはアルコールデヒドロゲナーゼ−２プロモーター或いはメタロチオニンプロモーターを含む誘導性プロモーターである。さらに、本発明の実行に関連した標準的な手段の多くと同様に、当業者はマーカー若しくはレポーターの発現を指示する機能に貢献する付加的なプロモーターを認識するであろう。従って、前記リストはただ単に何が使用されるかの例を示すことを意味しているものに過ぎず、本発明の限定を意味したものではない。
【００４５】
"ポリペプチド"、"ペプチド"及び"タンパク質"という用語はここにおいては同語的に用いられている。
【００４６】
ここで用いられているように、"アミノ酸"という用語はアミノ基及びカルボキシル基の両方を含む分子を意味している。いくつかの好ましい実施形態において、前記アミノ酸はα−、β−、γ−、若しくはδ−アミノ酸であり、それらの立体異性体及びラセミ体を含む。ここで用いられているように、"Ｌ−アミノ酸"という用語はα−炭素の周りにＬ立体配置を有しているα−アミノ酸を意味しており、このα−アミノ酸はＬ−立体配置を有する、通常ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）式のカルボキシル酸である。"Ｄ−アミノ酸"という用語は同様にα−炭素の周りにＤ−立体配置を有している通常ＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＮＨ２）−（側鎖）式のカルボキシル酸を意味している。Ｌ−アミノ酸の側鎖は天然由来部分及び非天然由来部分を含む。非天然由来（不自然）アミノ酸側鎖は例えばアミノ酸類似体中で天然由来アミノ酸側鎖の代わりに用いられる部分である。アミノ酸置換基はそれらのカルボニル基を通じて、その酸素若しくはカルボニル炭素を通じて、若しくはそれらのアミノ基を通じて、若しくはそれらの側鎖部分に存在する官能基を通じて付加される。
【００４７】
ここで用いられるように"ポリヌクレオチド"は核酸分子を意味し、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びそれらと同等のものを含む。
【００４８】
ここで用いられるように、"アンチセンスオリゴヌクレオチド"は少なくとも目的の標的ヌクレオチド配列の１部分と相補的であり、生理的条件下で前記標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイゼーションする核酸分子を意味している。ここで用いられているように"二本鎖ＲＮＡ"若しくは"ｄｓＲＮＡ"という用語はＲＮＡ干渉する能力がある二本鎖ＲＮＡ分子を意味しており、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（例として、Ｂａｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８〜４２９（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４〜４９８（２００１）を参照のこと）を含む。
【００４９】
ここで用いられるように"合成された"とは、酵素的に対立するものとして、純粋化学方法によって産生されたポリヌクレオチドを意味している。"完全に"合成されたＤＮＡ配列はその結果化学的手段によって完全に産生されたものであり、"部分的に"合成されたＤＮＡは、結果生じるＤＮＡの１部分のみが化学的手段によって産生されたＤＮＡを含む。
【００５０】
"レトロウイルスｃＤＮＡ環状化"は環形成を意味し、例えばレトロウイルスｃＤＮＡの１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環形成である。
【００５１】
ここで用いられるように"レトロウイルスｃＤＮＡ組込み"は宿主細胞ゲノムＤＮＡへのレトロウイルスｃＤＮＡの組み込みを意味している。
【００５２】
ここで用いられるように"レトロウイルス感染"はレトロウイルスが宿主細胞内で増殖する過程を意味しており、レトロウイルスｃＤＮＡに対するレトロウイルスＲＮＡの逆転写、及び宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡの組み込みの工程を含む。ここで用いられるように"非環状化レトロウイルスｃＤＮＡ"若しくは"直線状レトロウイルスｃＤＮＡ"は、例えば１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環などへ環状化されていないレトロウイルスｃＤＮＡを意味している。"環状化レトロウイルスｃＤＮＡ"は宿主細胞ゲノムへの組込みの能力がなく、例えば１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環などの環の形状であるレトロウイルスｃＤＮＡを意味している。
【００５３】
ここで用いられるように、"調節する"若しくは"修飾する"という用語は、特異的活性若しくはタンパク質の量、質、若しくは効果における増加若しくは減少を意味している。
【００５４】
"阻害因子（インヒビター）"、"活性化因子（アクチベーター）"及び"修飾因子（モジュレーター）"は、例えばアゴニスト（作用物質）、アンタゴニスト（拮抗物質）、及びそれらの相同体に対するｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて同定されたあらゆる阻害性若しくは活性分子を意味しており、ここに定義されたように前記分子と実質的に同じ生物活性を示す断片、変異体、擬態を含む。"阻害因子（インヒビター）"は減少する、阻止する、阻害する、活性を遅らせる、不活性化する、脱感作する、若しくは前記生物活性或いは分子の発現や目的の経路を下方制御する化合物であり、例えばアンタゴニストである。"誘導因子"若しくは"活性化因子"は増加する、誘導する、刺激する、開く、活性化する、容易にする、活性を増強する、感作する、若しくは目的の分子或いは経路を上方制御する化合物であり、例えばアゴニストである。本発明のいくつかの実施形態において、分子の発現或いは生物活性、若しくは目的の経路の阻害若しくは上方制御のレベルは、約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％以上の減少（阻害若しくは下方制御）若しくは増加（上方制御）を意味している。前記阻害若しくは上方制御は、直接的すなわち目的の分子若しくは経路自身に作用する、若しくは間接的すなわち目的の分子若しくは経路に影響を及ぼす目的の分子若しくは経路に作用するものである。
【００５５】
ここで用いられる"約"は基準値の＋／−１０％を意味している。
【００５６】
ここで用いられるように、"相同性ヌクレオチド配列"若しくは"相同性アミノ酸配列"若しくはそれらの変異は、ヌクレオチドレベル若しくはアミノ酸レベルで、参照配列に対して、少なくとも約６０％であり、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも９０％か９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の相同性によって特徴付けられた配列と、若しくは機能ドメインをコード化する或いは有しているそれらの部分か断片とを意味しており、これに限定されるものではないが、例えば配列ＩＤ：１若しくは配列ＩＤ：３の前記ヌクレオチド配列、若しくはエンコード化されたポリペプチド（配列ＩＤ：２若しくは配列ＩＤ：４）、配列ＩＤ：２或いは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能ドメインをコード化している配列ＩＤ：１若しくは配列ＩＤ：３の部分、或いは完全長ポリペプチドの機能ドメインを有しているそれらの断片である。相同性ヌクレオチド配列は、例えばアイソフォームと、種変異体と、対立遺伝子変異体と、目的のタンパク質の断片とを含む相同体をコード化しているそれらの配列を含む。アイソフォームは例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織で発現され得る。代わりに、アイソフォームは異なった遺伝子によってコード化され得る。相同性ヌクレオチド配列はタンパク質の特異的変異体をコード化しているヌクレオチド配列を含む。相同性ヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、天然由来対立遺伝子の変異体と、ここに説明された前記ヌクレオチド配列の変異体とを含む。相同性アミノ酸配列は、本発明の方法に従って同定されたポリペプチド中と同様に、配列ＩＤ：２若しくは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列を有するポリペプチド中の保存性アミノ酸置換をコード化するそれらのアミノ酸配列を含む。パーセント相同性は好ましくは、例えばＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２〜４８９，１９８１）によるアルゴリズムを使用する初期設定を用いるＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）によって決定される。本発明の核酸断片は前記参照ヌクレオチド配列の少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、若しくは少なくとも約１００ヌクレオチドを有する。好ましくは本発明の前記核酸断片は、完全長核酸配列によってコード化されているポリペプチドの生物特性と実質的に同じである、少なくとも１つの生物特性若しくは機能を有しているポリペプチドをコード化する。
【００５７】
本分野ではよく知られているように、遺伝暗号の縮重が原因で、目的のヌクレオチド配列によってコード化されているポリペプチドの同じポリペプチドをコード化できる多数のＤＮＡとＲＮＡ分子が存在する。従って本発明は、発現中、目的の核酸分子によってコード化されているポリペプチドをコード化するそれらの他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子を意図する。ここに特に開示されたＤＮＡ及びＲＮＡ分子以外の、特異的アミノ酸に対するコドン中の変化によって単純に特徴付けられているＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、本発明の範囲内である。
【００５８】
本発明は相同的で、少なくとも１つの生物特性若しくは機能を有するタンパク質を含み、これは参照ポリペプチドの生物特性と実質的に同じであるものであることが理解される。好ましくは、前記生物特性の生物活性の範囲は、前記参照ポリペプチドの前記細胞特性の活性の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは１００％である。そのようなタンパク質は変異体とも呼ばれている。この定義は断片、アイソマー、天然対立遺伝子変異体、及びスプライシング変異体を含むことを意図されている。これらの変異体形態は例えば選択性スプライシング若しくは同種の生物の異なる組織中の差異（ディファレンシャル）発現に起因する。前記変異体形態は例えばアミノ酸挿入、欠損、若しくは置換によって特徴付けられる。この結合において、前記参照配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも７０％配列相同性、少なくとも８０％配列相同性、好ましくは約９０％配列相同性、より好ましくは９５％配列相同性及び最も好ましくは９８％配列相同性を有するアミノ酸配列を有する変異体形態が本発明に含まれる。好ましい相同性ポリペプチドは前記参照ポリペプチドと比較して少なくとも１つの保存性アミノ酸置換を有している。アミノ酸"挿入""置換"若しくは"欠損"はアミノ酸配列への変化若しくはアミノ酸配列内にある。特異的なアミノ酸配列中で認められた変異は合成的なペプチドの産生によって、若しくは組換えＤＮＡ技術を用いた核酸配列中にヌクレオチドの挿入、欠損、若しくは置換を系統的に作ることによって実験的に決定される。本発明のポリペプチド断片は、前記参照ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、若しくは４０連続アミノ酸を有する。好ましくはポリペプチド断片は、前記参照ポリペプチド及びその対立遺伝子、種相同性に独特の若しくは特異的な抗原性特性を示す。目的の生物学的及び免疫学的特性を有する本発明の断片はよく知られ、本分野で日常的に実行されているあらゆる方法によって準備され得る。
【００５９】
前記天然由来アミノ酸配列の変化はあらゆる多くの既知の技術によって達成され得る。例えば、変異はオリゴヌクレオチド定方向変異原性などの当業者によく知られた手順によって特異的な位置でポリペプチドをコード化している前記ポリヌクレオチドへ誘導され、これは米国特許番号第４，５１８，５８４号、及び第４，７３７，４６２号に記載されている。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリペプチド相同体は天然由来参照ポリペプチドの実質的な生物活性を示す。"天然由来ポリペプチドの実質的な生物活性を示す"ことによって、本発明の範囲内の変異体は保存的に置換された配列を有することができること、つまりポリペプチドの１若しくはそれ以上のアミノ酸残基は異なる残基に置き換えられ、前記ポリペプチドの２次及び／若しくは３次構造は変わらないことを意味している。そのような置換は例えば１つの脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、もしくはＡｌａ）の別の残基への置換、若しくは塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ間、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ間、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ間、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ間、若しくは芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒ間の置換などの、同様な物理化学的な特性を有する残基によるアミノ酸の置換を含む。表現型的サイレントアミノ酸交換を作ることに関するさらなる情報は本技術で知られている（Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６〜１３１０，１９９０）。前記参照ポリペプチドの前記生物活性を実質的に保存する他のポリペプチド相同体は、アミノ酸置換が本発明の機能領域外の領域で作られる相同体である。
【００６１】
本発明で用いられた核酸分子若しくはポリペプチドの、若しくは本発明のスクリーニング方法によって同定された化合物のヌクレオチド及び／若しくはアミノ酸配列は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列データバンクで類似度の領域をＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ et al.,Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９，１９９７）を用いて検索するために使用される。簡潔には、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表す前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列類似性の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０，１９９０）。ソフトウェア若しくは実行ＢＬＡＳＴ解析は全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムはまずクエリー配列中の長さＷの短い単語を同定することによる、高スコア配列対（ＨＳＰｓ）を同定することを含み、このクエリー配列はデータベース配列中の同じ長さの単語と一直線になったいくつかの正値の閾値（ｐｏｓｉｔｉｖｅ‐ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）スコアに一致しているか若しくは満たしているかのどちらかである。Ｔは隣接単語スコア閾値として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０，１９９０）。これらの開始隣接単語ヒットは、それらを含むＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するためのシーズとして働く。前記単語ヒットは、各配列に沿って累積アラインメントスコアが増加され得る範囲において両方向へ広げられる。各方向での前記単語ヒットの延長は以下の：１）前記累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘへ落ちた、２）前記累積アライメントスコアが、１若しくはそれ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積が原因でゼロ若しくはそれ以下になった、若しくは３）どちらかの配列の末端に到達する時、中止される。前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、Ｘは前記アライメントの感度とスピードを決定する。前記ＢＬＡＳＴプログラムは初期値として単語の長さ（Ｗ）は１１と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリンクマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５〜１０９１９，１９９２）と、アライメント（Ｂ）は５０と、期待値（Ｅ）は１０と、Ｍ＝５と、Ｎ＝４と、及び両鎖の比較とを用いる。前記ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３〜５７８７，１９９３）とＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは２つの配列間の類似性の動的解析を行う。前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供された類似性の１つの測定は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間のマッチが偶然起こることによって前記確率の目安を提供する。例えば、テスト核酸と前期参照核酸配列との比較において前記最小合計確率が約１以下、好ましくは０．１以下、より好ましくは０．０１以下、最も好ましくは０．００１以下である時、核酸は遺伝子若しくはｃＤＮＡと同じであると考えられる。
【００６２】
ここで用いられるように"生物活性"は生物システム中の目的の分子若しくは経路の特異的な機能（例えば酵素活性）のレベルを意味している。"野生型生物活性"は目的の分子若しくは経路の機能の通常レベルを意味している。"減少した生物活性"は、その分子若しくは経路の生物活性の参照レベルと比較して、目的の分子若しくは経路の機能の減少したレベルを意味している。例えば、減少した生物活性は目的の分子若しくは経路の前記野生型生物活性と比較した生物活性の減少したレベルを意味している。"増加した生物活性"は、その分子若しくは経路の生物活性の参照レベルに対して、目的の分子若しくは経路の機能の増加したレベルを意味している。例えば、増加した生物活性は目的の分子若しくは経路の前記野生型生物活性に対する生物活性の増加したレベルを言及する。
【００６３】
ここで用いられるように、"単離された"核酸分子という用語はその自然の環境から取り除かれた核酸分子（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を意味する。単離された核酸分子の例として、これに限定されるものではないが、ベクター内に含まれた組換えＤＮＡ分子、異種性宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、部分的に若しくは実質的に精製された核酸分子、及び合成ＤＮＡ或いはＲＮＡ分子を含む。
【００６４】
ここで用いられるように、"擬態"という用語は宿主ＤＮＡ修復経路の誘導因子として同定された化合物と立体的に同じ化合物であり、従って前記分子は生物活性、すなわち宿主ＤＮＡ修復経路の誘導を保持する。擬態は本発明によって同定されたＤＮＡ修復経路を誘導する化合物と構造的に及び機能的に等価物である。
【００６５】
"患者"及び"対象"という用語はここにおいて同語的に用いられており、これに限定されるものではないが、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトを含む。"宿主細胞"は例えば哺乳動物細胞、酵母細胞、若しくは植物細胞を含む。本発明の哺乳動物細胞は、これに限定されるものではないが、ヒト及びトリ細胞（例えばＤＴ４０細胞）が含まれる。
【００６６】
ここで用いられるように"治療"という用語はレトロウイルス感染の予防、治療、回復の成功のあらゆる徴候、若しくは遺伝子治療の遺伝子運搬の有効性の改良の成功の徴候を意味する。レトロウイルス感染の治療はあらゆる対象若しくは対象パラメーター、これに限定されるものではないが例えば患者内のレトロウイルス粒子数の寛解・緩解・減少、症状若しくは副作用の数若しくは重症度の減少、感染に対する患者の耐性の増加、患者の変性若しくは減退の割合の緩徐化など、を含む。レトロウイルス感染の治療は、レトロウイルスの増加したリスクにさらされているが、まだその症状を経験若しくは現れていない患者の症状の発症の予防も含む。
【００６７】
"遺伝子治療の遺伝子運搬の有効性の改善"は、宿主細胞ゲノムへレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターの遺伝子の組み込みを増加することに成功したあらゆる徴候を意味している。"遺伝子治療"は、治療効果のために患者へ遺伝子を導入するあらゆる治療方法を意味しており、例えばこれに限定されるものではないが内因性核酸若しくはポリペプチドの上方制御若しくは下方制御などである。
【００６８】
レトロウイルスｃＤＮＡ組込み
ここにおいて開示された本発明のいくつかの実施形態は、保存された細胞性宿主防御メカニズムであるＤＮＡ修復を刺激することによってレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する。本発明の他の実施形態は、保存された細胞性宿主防御メカニズムを阻害することによってレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを刺激する。逆転写に続き、前記レトロウイルスはそのゲノムのｃＤＮＡコピーを前期宿主染色体へ組み込まなくてはならない（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｓ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ．ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳＥＳ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７；ＬａＦｅｍｉｎａ，Ｒ．Ｌ．，Ｃ．Ｌ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．Ｌ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｏ．Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｋ．ＬｅＧｒｏｗ，Ｅ．Ｒｏｔｈ，Ｗ．Ａ．Ｓｃｈｌｅｉｆ，ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｅ．Ｅｍｉｎｉ．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６：７４１４〜７４１９，１９９２；Ｓａｋａｉ，Ｈ．，Ｍ．Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｊ．Ｓａｋｕｒａｇｉ，Ｓ．Ｓａｋｕｒｇａｉ，Ｒ．Ｓｈｉｂａｔａ，Ａ．Ｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．Ｏｎｏ，Ｓ．Ｕｅｄａ，ａｎｄ  Ａ．Ａｄａｃｈｉ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：１１６９〜１１７４，１９９３；Ｅｎｇｌｕｎｄ，Ｇ．，Ｔ．Ｓ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ，Ｅ．Ｏ．Ｆｒｅｅｄ，Ａ．Ｅｎｇｌｅｍａｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６９：３２１６〜３２１９，１９９５）。組込まれた時、前記ウイルスはプロウイルスと呼ばれる。ウイルスが組込みプロウイルスの形を完了できなかった場合、感染を続けることができない。レトロウイルスｃＤＮＡ組込みの過程、組込み前複合体（ｐｒｅ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ：ＰＩＣ）を介した、は図１Ａに図示されている。前記感染反応に影響すると示されている宿主因子は、これに限定されるものではないが、高移動度タンパク質ファミリー（ＨＭＧＩ（Ｙ））、自己組込み因子バリアー（ＢＡＦ）、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、Ｋｕ７０／８０へテロダイマー、ＸＲＣＣ４、及びリガーゼＩＶを含む（Ｆａｒｎｅｔ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｂｕｓｈｍａｎ．ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＭＧ  Ｉ(Ｙ)  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ，８８：４８３〜４９２，１９９７；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｒ．Ｃｒａｉｇｉｅ．Ａ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｈｏｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９５：１５２８〜１５３３，１９９８；Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．，Ｒ．Ａ．Ｋａｔｚ，Ａ．Ｍ．Ｓｋａｌｋａ．Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ−ＰＫ  ｉｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１９９９；Ｌｉ，Ｌ．，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｖｅｒａ，Ｋ．Ｅ．Ｙｏｄｅｒ，Ｒ．Ｓ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｓ．Ｌ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．Ｌｉｅｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｂｕｓｈｍａｎ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０：３２７２〜３２８１，２００１)。ＨＭＧＩ(Ｙ)及びＢＡＦの両方は、ＨＩＶレトロウイルスｃＤＮＡ組込みをｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激することが示されていた。ＸＲＣＣ４、 Ｋｕ７０／８０へテロダイマー、及びリガーゼＩＶタンパク質は非相同性末端結合(ＮＨＥＪ)を触媒し、直線型のレトロウイルスｃＤＮＡを末端反復配列（ＬＴＲ）で結合した環状分子（２−ＬＴＲ）へ変換することができる （図１Ｂ）(Ｌｉ，Ｌ．，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｖｅｒａ，Ｋ．Ｅ．Ｙｏｄｅｒ，Ｒ．Ｓ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｓ．Ｌ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．Ｌｉｅｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｂｕｓｈｍａｎ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０：３２７２〜３２８１，２００１）。レトロウイルスｃＤＮＡのこの２−ＬＴＲ環状形成は宿主細胞ゲノムへの組込みを不可能にする（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．，Ｂ．Ｂｏｗｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｂｉｓｈｏｐ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，ａｎｄ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ＩＮ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８６：２５２５〜２５２９，１９８９；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ａ．，Ｇ．Ｅｎｇｌｕｎｄ，Ｊ．Ｍ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｒ．Ｃｒａｉｇｉｅ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｏｎ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６９：２７２９〜２７３６，１９９５）。直線型レトロウイルスｃＤＮＡの選択性運命は、前記ＬＴＲ間の相同性組換えによって形成された１−ＬＴＲ環の形成である（図１Ｂ）。
【００６９】
ここに示された結果は、前記レトロウイルスｃＤＮＡの１−ＬＴＲ及び２−ＬＴＲ環の形成の刺激、例えば宿主細胞のＤＮＡ修復経路の誘導によってなど、は前記宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込み、及び従ってレトロウイルス感染力を阻害することを示している。代わりに、レトロウイルスｃＤＮＡの１−ＬＴＲ及び／若しくは２−ＬＴＲ環形成の阻害、例えばＤＮＡ修復経路の阻害などによる、は宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込み、及び従ってレトロウイルス感染力を増加する。
【００７０】
ＤＮＡ修復遺伝子は組込みの効率を制御する
レトロウイルス感染の間、ほぼ全ての前記直線型ウイルスｃＤＮＡは宿主へゲノムへ組込みする若しくは１−ＬＴＲ或いは２−ＬＴＲ環になる（Ｚｅｎｎｏｕ，Ｖ．，Ｃ．Ｐｅｔｉｔ，Ｄ．Ｇｕｅｔａｒｄ，Ｕ．Ｎｅｒｈｂａｓｓ，Ｌ．Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ，ａｎｄ Ｐ．Ｃｈａｒｎｅａｕ．ＨＩＶ−１  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ＤＮＡ  ｆｌａｐ．Ｃｅｌｌ，１０１：１７３〜１８５，２０００；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｍ．Ｓ．Ｔ．Ｈａｎｓｅｎ，ａｎｄ  Ｆ．Ｄ．Ｂｕｓｈｍａｎ．Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７：６３１〜６３４，２００１）。１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環形成を仲介する宿主因子の誘導は１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環の数を増加し、それによって組込み現象の数の減少にを生じる。逆に、１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環形成を仲介する宿主因子の阻害若しくはノックアウトは、レトロウイルスｃＤＮＡ環状かを減少し、それによって組込み現象の数の増加が生じる（表１）。ここに示された本発明は、組込みに対して形質転換受容性（コンピテント）な直線型レトロウイルスｃＤＮＡ分子が１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環形成の選択性デッドエンド（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）経路へ向けられる戦略を記載する。本発明は１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環形成を阻害することによってレトロウイルスｃＤＮＡ組込み現象の数を増加するための戦略も記載する。酵母研究は、組込みを制御するこのシステムの能力は非常に高いことを示唆する。
【００７１】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）はレトロウイルス様要素ファミリーＴｙ（レトロトランスポゾンと呼ばれる）を含むことが示されていた。前記Ｔｙレトロトランスポゾンファイリーは、レトロウイルスを示しているｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む。前記ｇａｇ遺伝子はウイルス様粒子に関連する構造タンパク質の全てをコード化している。前記ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼを含む。ポリプロテインは前記ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子から翻訳され、次にプロテアーゼによって機能タンパク質へとプロセッシングされる。Ｔｙは外被（ｅｎｖ）遺伝子を欠いている。ｅｎｖ遺伝子なしではＴｙ粒子は酵母細胞から出芽することはできず、それ故細胞外には存在しない。従って、ＴｙゲノムＤＮＡは転写されウイルス様粒子として細胞質中にパッケージされ、次に脱外被され、逆転写され、前記酵母ゲノムへ組み込まれる。生活環の細胞外段階の欠如は、Ｔｙをトランスポゾンとして定義する。
【００７２】
酵母中のＴｙトランスポゾンの研究はいくつかの酵母細胞性ＤＮＡ修復遺伝子はレトロウイルスｃＤＮＡ組込みの効率を制御することを示していた。これらの修復遺伝子は、これに限定されるものではないが、ｒａｄ２５、ｒａｄ３、ｒａｄ５０、ｒａｄ５１、ｒａｄ５２、ｒａｄ５４、ｒａｄ５７を含む（例えば表１参照のこと：Ｌｅｅ，Ｂ．−Ｓ．，Ｃ．Ｐ．Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｆａｉｏｌａ，Ｌ．Ａ．Ｒｉｎｃｋｅｌ，Ｗ．Ｗｙｓｏｃｋ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｃｉｏ，ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙ１  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＦＩＩＨ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  Ｓｓｌ２ｐ  ａｎｄ  Ｒａｄ３ｐ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８：１７４３〜１７６１，１９９８；Ｒａｔｔｒａｙ，Ａ．Ｊ．，Ｂ．Ｋ．Ｓｈａｆｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ．Ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＡＤ５２  ｅｐｉｓｔａｓｉｓ  ｇｒｏｕｐ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔｙ１  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５４：５４３〜５５６，２０００）。これらの遺伝子の変異は組込み効率の大きな増加を導く。逆に、野生型ＤＮＡ修復遺伝子／タンパク質の存在は前記組込み反応を大きく減少させる若しくは阻害する。
【００７３】
相同性組換えの３タイプは真核生物中で同定されており、それらは組換えを誘導する配列相同性の量によって区別されている：マイクロ相同性組換え（関与している親ＤＮＡ分子間の１〜５塩基対の相同性配列を必要とする）、短配列組換え（関与している親ＤＮＡ分子間の２０〜３００塩基対の相同性配列を必要とする）、及び相同性組換え（関与している親ＤＮＡ分子間の３００塩基対以上の相同性配列を必要とする）。マイクロ相同性組換えはＲａｄ５０ｐ、ＭＲＥ１１ｐ、ＸＲＳ２（ＮＢＳ１）ｐ、及びＤＮＡリガーゼ（ＸＲＣＣ４／Ｌｉｇ４ｐ）を必要とするように見える。短配列及び相同性組換えは、これに限定されるものではないが、ＲＡＤ５１と、ＲＡＤ５２と、ＲＡＤ５４と、ＲＡＤ５５と、ＲＡＤ５７と、ＲＡＤ５９を含むｒａｄ５２経路遺伝子を必要とするように見える。加えて、ｒａｄ３及びｒａｄ２５遺伝子は短配列相同性組換え経路の一部になることが発見されていた。これら組換え経路遺伝子の全てはヒト相同体を有しており、前記経路のタイプの全てはヒト細胞中に保存されている。
【００７４】
実は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＴｙレトロトランスポゾン組込みを阻害する若しくは阻止する同じ宿主防御メカニズムは、ヒトを含む哺乳動物細胞中にも保存されている。例えば、酵母遺伝子ｒａｄ２５、ｒａｄ３、ｒａｄ１、ｒａｄ２、ｒａｄ１４、ｒａｄ５０、ｒａｄ５１、ｒａｄ５２、ｒａｄ５４、ｒａｄ５７、ｍｓｈ２、及びｃｄｃ９のヒト相同体はそれぞれＸＰＢ、ＸＰＤ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ｈＲＡＤ５０、ｈＲＡＤ５１、ｈＲＡＤ５２、ｈＲＡＤ５４、ｈＲＡＤ５７、ｈＭＳＨ２及びリガーゼＩである。多くのヒト遺伝子、これに限定されるものではないが、ＸＰＢ、ＸＰＤ、ｈＲＡＤ５１、ｈＭＳＨ２、ｈＲＡＤ５１Ｂ、ｈＲＡＤ５１Ｃ、ｈＲＡＤ５１Ｄ、ｈＸＲＣＣ２、ｈＸＲＣＣ３を含む、は相同性組換えに関連するヒトＤＮＡ修復経路の化合物として同定されていた。Ｒａｄ２５ｐとＲａｄ３ｐ、ＸＰＢとＸＰＤの各前記ヒト相同体は外因性ＤＮＡの組換えを阻害する（図２）。ＸＰＢとＸＰＤは、タンパク質の２つの大きな複合体：転写複合体ＴＦＩＩＨ及びヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）複合体、に関与するヘリカーゼになると示されていた。ヒトにおいて、７つのＮＥＲ遺伝子（ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＥ、ＸＰＦ、及びＸＰＧ）の少なくとも１つでの変異は、欠損ＮＥＲに関連する遺伝病であるｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ（ＸＰ）を引き起こす。ＮＥＲ因子は共に働き、障害性ＤＮＡ上に多タンパク質複合体を形成する（Ｒｉｏｕ，Ｌ．，Ｌ．Ｚｅｎｇ，Ｏ．Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ‐Ｌａｇｅｎｔｅ，Ａ．Ｓｔａｒｙ，Ｏ．Ｎｉｋａｉｄｏ，Ａ．Ｔａｉｅｂ，Ｇ．Ｗｅｅｄａ，Ｍ．Ｍｅｚｚｉｎａ，ａｎｄ  Ａ．Ｓａｒａｓｉｎ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＸＰＢ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ／Ｃｏｃｋａｙｎｅ'ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｒ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１１２５〜１１３３，１９９９）。
【００７５】
本発明は、前記ＤＮＡヘリカーゼＸＰＢ及びＸＰＤは、レトロウイルスｃＤＮＡを環状化、例えば１−ＬＴＲ環などに、するための前記直線型レトロウイルスｃＤＮＡの形質転換に関与することを示す。１−ＬＴＲ環の形成は、レトロウイルスｃＤＮＡの直接反復ＬＴＲ間の相同性組換えによって制御される。レトロウイルスｃＤＮＡ組換え阻害のレベルは逆にｉｎ  ｖｉｖｏのＸＰＢ修復活性のレベルに比例している（図２）。
【００７６】
第２の宿主細胞性ＤＮＡ修復メカニズムである非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）は、２−末端反復配列（２−ＬＴＲ）環を形成するために前記レトロウイルスｃＤＮＡの末端にっ連結する。前記タンパク質ＤＮＡ−ＰＫ、Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、ＸＲＣＣ４、リガーゼＩＶ、ｈＭＲＥ１１、ｈＲＡＤ５０、及びＸＲＳ２（ＮＢＳ１）はＮＨＥＪに関与している。Ｋｕ７０／８０ヘテロダイマー、リガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４を含む前記ＮＨＥＪ経路のメンバーは、前記直線型レトロウイルスｃＤＮＡを、前記末端反復（ＬＴＲ）配列に結合した環状分子（２−ＬＴＲ）へ変換すると示されていた（図１Ｂ）。
【００７７】
ＤＮＡ修復経路及び抗レトロウイルス作用
ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物の阻害はレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する。ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物の刺激はレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを減少する。
【００７８】
本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路内の遺伝子及び／若しくはタンパク質は誘導され、ＤＮＡ修復はレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害するために刺激される。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復経路中の遺伝子の発現は上方制御され、それによってＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物の産生が増加する。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復に関与するタンパク質の生物活性若しくは機能は、ＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物と直接的に若しくは間接的に相互作用する化合物によって誘導される。
【００７９】
本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路内の遺伝子及び／若しくはタンパク質はレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加するために阻害される。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復経路中の遺伝子の発現は下方制御され、それによってＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物の産生が減少する。本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡ修復経路に関与するタンパク質の生物活性若しくは機能はＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの化合物と直接的に若しくは間接的に相互作用する化合物によって減少される。
【００８０】
化合物のスクリーニング
本発明は宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを調節する化合物を同定する方法を提供する。本発明のいくつかの態様において、ＤＮＡ修復経路の成分は、ＤＮＡ修復経路の成分を特異的に誘導する或いは阻害する分子、若しくはそれらの活性を増強する或いは減少するためにＤＮＡ修復経路の成分と結合する分子を検出するためのスクリーニング方法で用いられていた。１実施形態において、そのようなアッセイは抗レトロウイルス薬剤、もしくは薬剤開発用のリード化合物として有用である分子のスクリーニングのために実行される。
【００８１】
宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを調節する化合物のスクリーニング方法は、テスト化合物存在下で細胞或いは細胞抽出物を非環状化レトロウイルスｃＤＮＡと接触させる工程と、生じたレトロウイルスｃＤＮＡ環状化を測定する工程とを含む。テスト化合物存在下で生じたレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の量は、前記テスト化合物で処理していない比較可能な反応培地中で生じるレトロウイルスｃＤＮＡ環状化と比較される。レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する化合物は、前記テスト化合物非存在下の対照と比較してレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の減少を生じる。レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを減少する化合物は、前記テスト化合物の非存在下の対照と比較してレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の増加を生じる。
【００８２】
ＤＮＡ修復を誘導する化合物をスクリーニングする方法は、１若しくはそれ以上のテスト化合物を、目的の生物（この生物はこれに限定されるものではないが、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトを含む多くの異なる種の１つであり得る）のＤＮＡ修復経路の１若しくはそれ以上の成分と、適切な反応培地中で接触させる工程と、化合物／成分相互作用を例えばＤＮＡ修復経路の活性、若しくはその成分を評価することによって検定する工程と、この活性を前記テスト化合物で処理していない比較可能な反応培地中の活性と比較する工程とを含む。処理されたサンプルと未処理のサンプル間の活性の違いは、関連するテスト化合物の調節効果の指標である。ＤＮＡ修復に影響を及ぼす若しくは調節する実際の能力をスクリーニングされる前に、テスト化合物はＤＮＡ修復経路の成分と物理的に相互作用する能力をスクリーニングされる。これは、例えば化合物による生物活性を調節する実際の能力を検定する前の粗いスクリーニングとして用いられる。
【００８３】
前記スクリーニングアッセイ中で用いられたＤＮＡ修復経路の前記成分は、前記テスト化合物にさらされるために細胞中に提供される。代わりに前記アッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＮＡ修復システムにおいて実行され、これは無傷ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、化学薬品、放射線、若しくは組換えレトロウイルスと処理することによって作られたＤＮＡ鎖切断を連結する精度及び効率を測定する。
【００８４】
ＤＮＡ修復経路の活性化は分解からの宿主ＤＮＡの保護、従ってレトロウイルスｃＤＮＡ組込みからの保護を導く。ＤＮＡ修復経路の活性化はＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢｓ）によって、ＤＮＡ二重らせん中の一本鎖ギャップによって、若しくはＤＮＡ二重らせんの他の破壊によって引き起こされる。これらの構造はレトロウイルスｃＤＮＡの末端に存在し、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みの過程の中間体として生じる。ＤＮＡ修復、レトロウイルス或いはレトロウイルスｃＤＮＡ、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みでの中間体、若しくはこれらの全てを擬態するＤＮＡの合成標品に対するアッセイが提供される。
【００８５】
本発明の方法は、レトロウイルスｃＤＮＡ環（１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ）形成を調節するそれらの能力によってＤＮＡ修復及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを調節する化合物を同定する。前記テスト化合物によるＤＮＡ修復の誘導若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みの阻害は、レトロウイルスｃＤＮＡ環形成の増加によって変えられる。前記テスト化合物によるＤＮＡ修復の阻害若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みの刺激は、レトロウイルスｃＤＮＡ環形成の減少によって変えられる。レトロウイルスｃＤＮＡ環形成は標準遺伝的、生物化学的、細胞性、若しくは組織学的技術を用いてスコア化される。本発明を制限する意味ではないが、例えばレトロウイルスベクターは、１−ＬＴＲ環の形成を導く前記短配列相同性組換え、若しくは２−ＬＴＲ環の形成を導く非相同性末端結合の結果、プロモーターとこれに限定されるものではないが例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの環状化マーカー遺伝子とが近位になるように設計される。前記マーカー遺伝子に対する前記プロモーターの近接は、ＧＦＰなどの前記マーカー遺伝子の発現に起因し、それにより細胞性若しくは生物化学的技術によって発現したマーカー遺伝子を直接測定することが可能になる。本発明はＤＮＡ修復経路の成分の生物活性に影響を与えるテスト化合物の能力を検定することも考慮している。従って、例えば化合物はＤＮＡ−ＰＫリン酸化などに影響を与えるそれらの能力を検定される。
【００８６】
ＤＮＡ修復経路の発現した組換えタンパク質成分を有する有機若しくはペプチドライブラリーのスクリーニングは、ＤＮＡ修復経路の活性を調節する薬剤的分子の同定に有用である。１実施形態においてスクリーニングは、１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ形成の誘導によって決定されるような、ＤＮＡ修復を刺激する化合物を選択するために実行される。別の実施形態においてスクリーニングは、１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ形成の阻害によって決定されるような、ＤＮＡ修復を阻害する化合物を選択するために行われる。
【００８７】
ランダム若しくは組合わせペプチドライブラリー若しくは非ペプチドライブラリーなどの多様性ライブラリーは、ＤＮＡ修復を特異的に刺激する若しくは阻害する分子に対しても検定される。多くのライブラリーは本分野で知られており、限定するものではないが、例えば化学的合成ライブラリー、組換え（例えばファージディスプレイライブラリーなど）及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ベースライブラリーなどが用いられ得る。非ペプチドライブラリーの１例として、ベンゾジアゼピンライブラリーが用いられる。ペプチドライブラリーも用いられる。用いられるライブラリーの別の例として、ペプチド中のアミド官能性は化学的に形質転換組み合わせライブラリーを作成するためにパーメチル化された。これらの方法は当業者にはよく知られており、標準分子技術参考文献中に見つけることができる。
【００８８】
ライブラリーをスクリーニングすることは一般に知られた方法のあらゆる多様性によって達成され得る。
【００８９】
テストシステム
本発明の方法のための宿主細胞は好ましくは真核細胞である。酵母の操作の容易さを考えると、本発明に従ったアッセイはテスト化合物を酵母システムに適用する工程を含む。これに限定されるものではないが、ヒト細胞及びトリ細胞（例えばＤＴ４０細胞など）を含む哺乳動物細胞、及び植物細胞も本発明の方法で用いられる。
【００９０】
治療目的のために、ＤＮＡ修復経路、若しくはその１若しくはそれ以上の成分（若しくはサブユニット）は前記アッセイで用いられる。前記ＤＮＡ修復経路、若しくはその成分は、これに限定されるものではないが例えば鳥、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトである。異なる真核生物中のＤＮＡ修復成分間の高保存を考えると、哺乳動物例えばヒトのシステム中で前記化合物を用いて同様な結果が得られる。言い換えると、酵母中でＤＮＡ修復を誘導できると同定された化合物は他の真核生物中でＤＮＡ修復を誘導できる。更なるアプローチは、別の真核生物例えばヒトなどのＤＮＡ修復経路の１若しくはそれ以上の成分若しくはサブユニットを発現する酵母細胞を作成するために、標準組換え技術を用いることである。植物ＤＮＡ修復経路、若しくはその１若しくはそれ以上の成分或いは前記成分を有する細胞も、植物中のレトロトランスポゾン若しくはレトロエレメント活性を調節するのに有用である化合物を検定するための、本発明に従ったアッセイで用いられる。
【００９１】
代わりに、本発明の方法における化合物をスクリーニングするシステムは無細胞系、例えば細胞抽出物中である。
【００９２】
前記スクリーニング方法によって同定された化合物
本発明に従ったアッセイで検定しポジティブであった化合物、すなわちレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する及び／若しくはＤＮＡ修復を刺激すると見出された化合物、若しくは代わりにＤＮＡ修復を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加すると見出された化合物、は天然でペプチド若しくは非ペプチドである。ここで用いられるように、"化合物"という用語はあらゆる同定可能な化学薬品若しくは分子を意味しており、これに限定されるものではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、或いは核酸、及び天然の若しくは合成されたそのような化合物を含む。そのような化合物は例えば抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び小分子を含む。本発明のスクリーニング方法によって同定された"化合物"は、ＤＮＡ修復及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みに同じ機能的効果を有するその相同体及び擬態に加えてそのように同定された化合物を含む。
【００９３】
アンチセンス及びｓｉＲＮＡ
本発明の方法に従って同定されたＤＮＡ修復を阻害する化合物は、ＤＮＡ修復経路の成分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を含む。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ修復経路の少なくとも１つの成分を破壊するために細胞若しくは細胞抽出物へ投与される。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ修復経路の成分をコード化するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。完全長及びポリヌクレオチド断片の両方はアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用に適している。本発明の"アンチセンスオリゴヌクレオチド断片"はこれに限定されるものではないが、ＤＮＡ修復経路の成分をコード化する（他の既知ポリペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドに対する、ＤＮＡ修復経路の成分をコード化するオリゴヌクレオチドの配列比較によって決定されたような）ＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例として、これに限定するものではないが、配列ＩＤ：１若しくは配列ＩＤ：３とハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。ＤＮＡ修復成分コード化オリゴヌクレオチドに対して実質的に独特である配列の同定はあらゆる公共に利用可能な配列データベースの解析によって、及び／若しくはあらゆる商業的に利用可能な配列比較プログラムで確認され得る。アンチセンス分子は、これに限定されるものではないが、化学合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応中の発現、アンチセンス分子を産生するように転写されたベクターを有する形質転換細胞中の発現、制限消化及び単離、ポリメラーゼチチェーンリアクション（ＰＣＲ）およびそれらと同等なものを含むあらゆる手段によって作成される。
【００９５】
当業者は、ＤＮＡ修復経路の成分の発現及び／若しくは生物活性を阻害する前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ修復経路の成分をコード化するあらゆる遺伝子を用いることを予想していることに気が付く。特に、アンチセンス核酸分子は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２５０若しくは５００ヌクレオチドに対して相補的な配列、若しくは完全ＤＮＡ修復遺伝子配列を有する。好ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはＤＮＡ修復成分コード化配列の有意鎖の約１５連続ヌクレオチドに相補的な配列を有する。
【００９６】
１実施形態において、アンチセンス核酸分子はＤＮＡ修復経路成分タンパク質をコード化しているヌクレオチド配列の有意鎖の"コード領域"に対してアンチセンスである。前記有意鎖はＤＮＡ修復経路成分配列の制御領域も含む。"有意鎖"という用語はアミノ酸残基へ翻訳されるコドンを有するヌクレオチド配列の領域を意味している。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子はＤＮＡ修復タンパク質をコード化しているヌクレオチド配列の有意鎖の"非コード領域"に対するアンチセンスである。"非コード領域"という用語は、アミノ酸へ翻訳されない前記コード領域に隣接する５’及び３’配列を意味している（すなわち５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）としても言及されている）。
【００９７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ修復タンパク質をコード化しているヌクレオチド配列、若しくはそれに対応するｍＲＮＡの制御領域を意味しており、これに限定するものでないが、開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列、及びそれと同等のものを含む。ここに提供された前記有意鎖配列を考えると、本発明のアンチセンス核酸はＷａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｉｃｋ若しくはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対のルールに従って設計され得る。前記アンチセンス核酸分子はＤＮＡ修復成分ｍＲＮＡの完全コード領域に対して相補的であるだけでなく、前記ｍＲＮＡのコード領域若しくは非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの翻訳開始部位の周りの領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０ヌクレオチドであり得る。
【００９８】
本発明に従ったＤＮＡ修復経路成分の活性を阻害するための別の手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してである（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４〜４９８(２００１)；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５：１８８〜２００(２００１)を参照のこと）。ＲＮＡｉは配列特異的、転写後遺伝子サイレンシングの過程であって、サイレンス遺伝子に対する配列中の相同体（例えばＤＮＡ修復経路成分の配列に対する配列中の相同体であり、これに限定されるものではないが例えば配列ＩＤ：１若しくは配列ＩＤ：３に説明されたような配列である。）である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。ｓｉＲＮＡ仲介サイレンシングは転写後に及び／若しくは転写性に起こると考えられている。例えばｓｉＲＮＡ二本鎖は、ｍＲＮＡ認識及び標的切断を導くｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体（ｓｉＲＮＰｓ）の再構成によって転写後遺伝子サイレンシングを仲介する。
【００９９】
従って、本発明のＤＮＡ修復経路阻害化合物の別の形態は、ＤＮＡ修復経路成分コード配列に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡ二本鎖（例えば長さ１０〜２５、好ましくは２０、２１、２２、２３、２４、若しくは２５残基である）であり、これらは相同性の配列、若しくは配列ＩＤ：１として説明されているＸＰＢ配列と；配列ＩＤ：３のＸＰＤ配列の断片と同一である配列を有しており、対照的な２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有している。前記２−ヌクレオチド３’オーバーハングは好ましくは（２’デオキシ）チミジンから成り、なぜならそれはＲＮＡ合成のコストを減らし、細胞培養培地中及び形質移入された細胞内のｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性を増強するからである。３’オーバーハング中のチミジンによるウリジンの置換は哺乳動物細胞中で許容され、前記オーバーハングの配列は標的認識に貢献しないように見える。
【０１００】
抗体
本発明により、抗体（例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二重特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体など）も含まれ、この抗体はＤＮＡ修復経路の成分若しくはその断片に特異的である。本発明の好ましい抗体はヒト抗体であり、これは１９９３年６月２０日に公開された国際特許第ＷＯ９３／１１２３６号に記載された方法に従って作成され同定される。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖを含む抗体断片も本発明によって提供される。本発明の抗体を描写するために用いられる際"特異的である"という用語は、本発明の抗体の可変領域はＤＮＡ修復経路の成分を独占的に認識し結合することを意味している（すなわち、同一性、相同性若しくは類似性局在配列が存在する可能性があるのにも関わらず、結合親和性における測定可能な違いの特性によって他の既知分子から前記成分を区別できる）。特異的抗体は他のタンパク質（例えばＥＬＩＳＡ技術におけるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ若しくは他の抗体）と、特に前記分子の定常部中の前記抗体の可変領域の外の配列との相互作用を介して、相互作用することが理解される。本発明の抗体の結合特異性を決定するためののスクリーニングアッセイはよく知られており、本分野では日常的に実験されている。そのようなアッセイの包括的な議論は、Ｈａｒｌｏｗら（編集),ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ(１９８８)，第６章を参照のこと。本発明のＤＮＡ修復経路の成分の断片を認識し結合する抗体は、前記抗体がＤＮＡ修復経路の成分に特異的であることも検討され、提供される。本発明の抗体はよく知られており本分野では日常的に行われているあらゆる方法を用いて作成され得る。
【０１０１】
本発明はＤＮＡ修復経路の成分若しくはそのエピトープに特異的である抗体を提供する。本発明の抗体の例としてこれに限定されるものではないが、配列ＩＤ：２若しくは配列ＩＤ：４のアミノ酸配列、若しくはそのエピトープに対する抗体を含む。抗体特異性は以下に詳細に記載されている。交差（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）抗体はＤＮＡ修復経路の成分に"特異的"な抗体ではない。抗体が特異的か若しくは他の分子との交差（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）かの決定は、本分野でよく知られているいくつかのアッセイ、例えばウエスタンブロッティングアッセイなどを用いてなされる。
【０１０２】
好ましい１応用において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。そのような抗体を産生するハイブリドーマも本発明の態様として意図される。別の応用において、本発明はヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体はｉｎ  ｖｉｖｏ治療指標に有用である。
【０１０３】
別の応用において、本発明はポリクローナル光来を有する無細胞組成物を提供し、そこにおいて前記抗体の少なくとも１つはＤＮＡ修復経路の成分に特異的である本発明の抗体である。動物から単離された抗血清は例示的な組成物であり、水に若しくは別の希釈液、賦形剤、若しくは担体中に懸濁された抗血清の抗体フラクションを有する組成物である。
【０１０４】
更なる関連実施形態において、本発明はＤＮＡ修復経路の成分に特異的な抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。
抗体は化学的に若しくは組換え技術によって単離され得る比較的小さな抗原結合ドメインを含むことが知られている。そのようなドメインはＤＮＡ修復経路成分結合分子それ自身に有用であり、ヒト抗体へ再導入される若しくは毒若しくは他のポリペプチドと融合される。従って更なる別の実施形態において、本発明はＤＮＡ修復経路成分特異的抗体の断片を有するポリペプチドを提供し、そこにおいては前記断片及び前記ポリペプチドはＤＮＡ修復経路の成分に結合する。限定されない例において、本発明は一本鎖抗体及びＣＤＲ（相補性決定領域）−移植抗体であるポリペプチドを提供する。
【０１０５】
非ヒト抗体は本分野は知られたあらゆる方法によってヒト化される。１つの方法において、前記非ヒトＣＤＲｓはヒト抗体若しくはコンセンサス抗体フレームワーク配列へ挿入される。さらに、次には親和性若しくは免疫原性を調節するために抗体フレームワークへ変化が導入される。
【０１０６】
本発明の抗体は例えば治療目的（ＤＮＡ修復経路の成分の活性を調節することによって）に有用である。
【０１０７】
擬態
ここで同定された成分の擬態若しくは模倣（構造の重要な部分を模倣するように処方された立体的に同じ化合物）は薬剤的使用に対して設計される。擬態は、ＤＮＡ修復を刺激しそのため機能的に等価物でもある本発明によって同定された化合物と同じ方法で用いられる。構造的−機能的等価物の産生は当業者に知られたモデリング及び化学設計の技術によって達成される。全てのそのような立体的に同じ構成は本発明の範囲内に収まることは理解されるだろう。
【０１０８】
既知の薬剤的活性化合物に対する擬態の設計は、"リード"化合物に基づく医薬品開発のための既知のアプローチである。活性化合物は合成が困難で高価である、若しくは投与の特定の方法に適していない、例えばペプチドは消化性管中のプロテアーゼによって素早く消化される傾向があるため、経口組成物に対する活性因子には適していないため、これが望ましい。ＤＮＡ修復を誘導する化合物からの擬態の設計で共通して行われるいくつかの過程がある。まず、そのＤＮＡ修復誘導特性を決定する上で重大及び／若しくは重要である前記化合物の特異的部分が決定される。ポリペプチドの場合、これは前記ペプチド中の前記アミノ酸残基を系統的に変化することによって、例えば各残基を順番に置換することによってなどで、行われ得る。ペプチドのアラニン走査（スキャン）はそのようなペプチドモチーフを精製するために共通的に用いられる。
【０１０９】
一度前記化合物の前記活性領域が同定されたら、その構造は例えば立体化学、結合、大きさ及び／若しくは電荷などのその物理的特性に従って、これに限定されるものではないが、分光学技術、Ｘ線回折データ、及びＮＭＲなどのソースの範囲からのデータを用いてモデル化される。当業者には知られているコンピュータ的解析、類似度マッピング（原子間の結合よりは電荷及び／若しくは前記活性領域の量をモデル化する）、及び他の技術はこのモデル化過程において用いられ得る。
【０１１０】
このアプローチの応用において、ＤＮＡ修復を誘導する前記化合物の３次元構造とＤＮＡ修復経路の標的成分の活性領域とはモデル化される。これら化合物のどちらか若しくは両方は結合における高次構造を変化するのでこれは特に有用である。
【０１１１】
次に、ＤＮＡ修復を誘導する化合物を擬態する化学基が移植される化学基に鋳型分子が選択される。その中に移植された前記鋳型分子及びその化学基は都合よく選択され、前記擬態の合成が容易になり、薬剤的に許容可能になり、前記リード化合物の生物活性を残したままｉｎ  ｖｉｖｏで分解されない。あるいは、前記擬態がペプチドベースの状態で、さらに安定性は前記ペプチドの開環によって達成され、それによってその硬性が増加する。従って前記擬態若しくはこのアプローチによって発見された擬態は次に本発明の方法によってスクリーニングすることによって、それらがＤＮＡ修復を誘導する能力を有しているかどうかが検討される。さらに次にｉｎ  ｖｉｖｏ若しくは臨床テスト用の１若しくはそれ以上の最終擬態に到達するように最適化若しくは修飾が実行される。
【０１１２】
薬剤組成物
ＤＮＡ修復を誘導する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する、若しくは代わりにＤＮＡ修復を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを刺激する化合物の同定に従って、前記化合物は製造される及び／若しくは薬剤組成物の調製で用いられる。これらはこれに限定されるものではないが、鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトを含む患者に投与される。
【０１１３】
従って本発明は様々な態様、すなわちここに開示された方法に従って同定された化合物だけでなく、薬剤組成物、薬剤、若しくはそのような化合物を有する他の組成物と；例えばレトロウイルス疾患の治療のため（予防的治療を含む）若しくは遺伝子治療の遺伝子運搬の効率を改善するためのそのような組成物の患者への投与方法と；患者へ投与するための組成物の製造におけるそのような化合物の使用と；そのような化合物と、薬剤的に許容可能な賦形剤、媒体若しくは担体と、任意に他の成分との混合物を有する組成物を作成する方法へと拡張する。
【０１１４】
本発明の前記薬剤組成物は、ここに開示された方法に従って同定された化合物、若しくはその薬剤的に許容可能な塩類の治療的に有効な量と、薬剤的に許容可能な担体若しくは賦形剤とを有する。
【０１１５】
本発明の前記化合物は中性若しくは塩形態として処方され得る。薬剤的に許容可能な塩類は、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから由来した塩類などの遊離アミノ基と共に処方された塩類と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから由来した塩類などの遊離カルボキシル基と共に処方された塩類とを含む。
【０１１６】
薬剤的に許容可能な担体は、これに限定されるものではないが、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、及びその組合せを含む。前記担体及び組成物は無菌である。前記調製は投与形態に適しているべきである。
【０１１７】
もし望まれれば前記組成物は、少量の湿潤剤或いは乳化剤、若しくはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。前記組成物は液体、懸濁液、乳剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性処方、若しくは粉末であり得る。前記組成物は、従来の結合剤とトリグリセリドなどの担体とを有する坐薬として処方され得る。経口処方は例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアリン酸、セルロース、マグネシウム炭酸塩、などの標準的な担体を含む。
【０１１８】
１実施形態において、前記組成物は、対象への経口（例えば錠剤、顆粒、シロップ）若しくは非経口（例えば軟膏、注射）投与に適応した薬剤組成物として通常の手順に従って処方される。様々な運搬システムが知られており、ＤＮＡ修復を誘導する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物を投与するために、例えばリポソーム中への封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、レセプター仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部として治療的核酸の構成などが用いられる。導入の方法はこれに限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、局所的、及び経口経路を含む。
【０１１９】
本発明の前記化合物は、例えば注入若しくは大量瞬時投与や、上皮若しくは粘膜皮膚内面（例えば口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜など）を介した吸収などによるあらゆる便利な経路によって投与され、例えばＨＡＡＲＴ治療などで他の生物的活性因子と共に投与される。投与は全身的若しくは局所的である。加えて本発明の薬剤組成物は、脳室内及びくも膜下腔内注射を含むあらゆる適した経路によって、中枢神経系にも導入されることが望ましい；前記脳室内注射は例えばＯｍｍａｙａ貯蔵所などの貯蔵所に付属している脳室カテーテルによって容易になる。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明の前記薬剤組成物は治療が必要な領域に局所的に投与されることが望ましく、これはこれに限定されるものではないが例えば手術中の局所的注射、局所的な適用（例えば手術後の創傷包帯剤と併せる）、注射、カテーテル手段、坐薬手段、若しくは移植手段によって達成され、前記移植は多孔性、非多孔性、若しくはｓｉａｌａｓｔｉｃ膜若しくは線維などの膜を含むゼラチン質物質である。
【０１２１】
前記組成物はユニット用量形態で投与され、薬剤分野ではよく知られたあらゆる方法、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載されたような方法によって調製される。ＤＮＡ修復を誘導する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する、若しくは代わりにＤＮＡ修復を阻害する及び／若しくはレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する、特異的障害若しくは状態の治療に効果的である本発明の前記化合物の量は、これに限定されるものではないが、用いる化合物の化学的特性、投与の経路、年齢、体重、及び患者の症状、障害若しくは状態の本質を含む要因に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。一般的な治療は前記化合物の低レベルから開始され、望ましい治療効果が達成されるまで増加される。加えて、最適な用量範囲の決定を助けるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが任意に用いられる。静脈内投与に適した用量範囲は一般的に２０〜５００マイクログラム活性化合物／キログラム体重である。鼻腔内投与に適した用量範囲は一般的に０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。坐薬は一般的に活性成分を体重の０．５％〜１０％の範囲で含み、経口処方は好ましくは１０％〜９５％の活性成分を含む。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくは動物モデル検定システムに由来する用量−反応曲線から推定される。
【０１２２】
一般的に、静脈内投与に対する組成物は無菌等張水溶緩衝液の溶液である。必要であれば、前記組成物は可溶化因子、及び注射部位の痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所的麻酔も含む。従来、前記成分は例えば活性因子の量を指示するアンプル若しくはｓａｃｈｅｔｔｅなどの密閉シールド容器中の凍結乾燥粉末若しくは無水濃縮物などとしてのユニット用量形態で、別々に若しくは共に混合されて適用される。前記組成物が注入によって投与される場合、無菌薬剤等級水若しくは生理食塩水を含む注入ボトルに調剤される。
【０１２３】
前記組成物が注射によって投与される場合、注射用の無菌水のアンプル若しくは生理食塩水は前記成分が投与前に混合されるように提供される。
【０１２４】
治療方法
本発明は、ＤＮＡ修復を誘導する及び／若しくは宿主ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みを阻害する化合物の効果的な量を対象若しくは患者に投与することによってレトロウイルス感染を治療する方法を提供する。本発明のいくつかの態様において、本発明の前記化合物若しくは薬剤組成物はレトロウイルス感染の増加したリスクにさらされている、若しくは感染している患者へ投与される。前記患者は例えば鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトである。前記レトロウイルス感染は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）感染、癌、ヒト成人Ｔ細胞白血病、リンパ腫、ＦＩＶ、Ｉ型糖尿病、及び多発性硬化症の少なくとも１つに関連する。
【０１２５】
本発明は、例えば遺伝子運搬を改良することによる、レトロウイルスｃＤＮＡ組込みを増加する及び／若しくはＤＮＡ修復を阻害する化合物の効果的な量を患者若しくは対象に投与することによる、治療方法も提供する。前記患者は例えば鳥、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類、サル、及びヒトである。
【０１２６】
環状化マーカー遺伝子を有するレトロウイルスのキット
本発明のキットは、厳重な管理下にある、例えばバイアル、チューブ、及びそれと同等なものなどの１若しくはそれ以上の容器媒体を局限して受けるために区分化された担体手段を有し、各前記容器媒体は本発明の方法において用いられる要素を有している。例えば、容器手段の１つは、環状化マーカー遺伝子を持つ本発明のレトロウイルス若しくはレトロウイルスベクターを有している。前記キットは１若しくはそれ以上の従来のキット構成成分、例えばこれに限定されるものではないが、説明書、テストチューブ、エッペンドルフ（登録商標）チューブ、ラベル、マーカー遺伝子発現の定量化に役立つ試薬などを含む。
【０１２７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは宿主細胞のレトロウイルス感染の例を説明している。図１Ａは細胞のＨＩＶ感染は宿主細胞膜タンパク質ＣＤ４、及びＣＣＲ５或いはＣＸＣＲ４に、ＨＩＶ外被タンパク質ｇｐ１２０が結合することで始まることを図示している。この結合現象は、第２ＨＩＶ外被タンパク質ｇｐ４１によって仲介され、レトロウイルス及び細胞膜の融合を誘発する。膜融合に続き、レトロウイルスキャプシドコアは前記宿主細胞へ侵入し、細胞質で分解される。ＨＩＶ逆転写酵素はレトロウイルスゲノムＲＮＡをｃＤＮＡ分子へ複写する。前記レトロウイルスｃＤＮＡは組込み前複合体（ＰＩＣ）の一部であり、宿主タンパク質ＨＭＧＩ（Ｙ）と同様に、少なくとも前記レトロウイルスタンパク質インテグラーゼ（組込み酵素）、逆転写酵素、マトリックス、キャプシド、及びｖｐｒを含む。タンパク質のこの複合体及び核酸は前記宿主細胞核へ侵入する。レトロウイルスインテグラーゼは前記レトロウイルスｃＤＮＡの３’末端と宿主ゲノムＤＮＡとの結合を触媒する。前記レトロウイルスｃＤＮＡは宿主配列の５塩基ギャップとＨＩＶ配列の５’ジヌクレオチドフラップに隣接される。宿主ＤＮＡ修復酵素は前記隣接ギャップと５’フラップの修復によって組込み反応を完了し、プロウイルスを産生する。組込みが完了した後、レトロウイルス及び宿主転写因子はレトロウイルスｍＲＮＡ及びゲノムＲＮＡの転写を促進する。前記レトロウイルスｍＲＮＡは細胞質中へ翻訳されレトロウイルスポリタンパク質を産生する。これらポリタンパク質はレトロウイルスゲノムＲＮＡを有して細胞形質膜に集合する。未成熟レトロウイルス粒子は前記細胞から出芽する。出芽後、前記レトロウイルス酵素プロテアーゼは前記レトロウイルスポリタンパク質を切断し成熟な感染ウイルス粒子（ビリオン）を産生する。図１Ｂは前記ＰＩＣが宿主細胞核に侵入した後、レトロウイルスｃＤＮＡの組込みが前記細胞の増殖性感染を引き起こすことを説明している。一方、少なくとも２つのメカニズムの１つによる前記レトロウイルスｃＤＮＡの環状化は、増殖性でなく、レトロウイルス感染の完了を阻害するものである。相同性組換えの宿主細胞性ＤＮＡ修復メカニズムは１−末端反復配列（１−ＬＴＲ）環を産生する。前記レトロウイルスｃＤＮＡの両末端は相同性ヌクレオチド配列、すなわち末端反復配列（ＬＴＲｓ）を有している。宿主ＤＮＡ修復機構は、１−ＬＴＲ環を産生するための組換え反応において前記相同性ＬＴＲ末端を使用する。第２宿主細胞性ＤＮＡ修復メカニズムである非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）は前記レトロウイルスｃＤＮＡの末端を連結し、２−末端反復配列（２−ＬＴＲ）環を産生する。１−ＬＴＲ環でも２−ＬＴＲ環でもないものは次にレトロウイルスｃＤＮＡ組込み産物に変換される。
【図２】図２はＨＩＶｃＤＮＡ組込みは宿主細胞ＤＮＡ修復によって調節されることを図示している。ＨＩＶベースベクター粒子は、ＤＮＡ修復機能を変えられた細胞株における相対性レトロウイルスｃＤＮＡ組込み効率を決定するために使用される。レトロウイルスｃＤＮＡ組込み現象の成功は前記ＨＩＶベクター粒子によってコード化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現によって表される。細胞株はＸＰＢ遺伝子の変異を持つ２人の患者から由来したものである（Ｒｉｏｕ，Ｌ．，Ｌ．Ｚｅｎｇ，Ｏ．Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ‐Ｌａｇｅｎｔｅ，Ａ．Ｓｔａｒｙ，Ｏ．Ｎｉｋａｉｄｏ，Ａ．Ｔａｉｅｂ，Ｇ．Ｗｅｅｄａ，Ｍ．Ｍｅｚｚｉｎａ，ａｎｄ  Ａ．Ｓａｒａｓｉｎ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＸＰＢ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｘｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ／Ｃｏｃｋａｙｎｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｒ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１１２５〜１１３３，１９９９）。３つの前記細胞株はＸＰＢ導入遺伝子の付加によって救出された。５つの細胞株はＸＰＢを必要とするＤＮＡ修復のレベルの変化を示す。ＸＰＢ機能のレベルは三角形によって表される。前記細胞株は、２９３Ｔヒト線維芽細胞の形質導入によって決定されたような、相対的な感染効率（ＭＯＩ）０、０．５、及び２で、ＨＩＶベースベクター粒子によって形質導入された。形質導入に続き、前記細胞は固定され、ＧＦＰ発現に対するフローサイトメトリーによって検討された。ベクター粒子が加えられなかった（０ＭＯＩ）細胞はＧＦＰを発現しなかった。０．５ＭＯＩ及び２ＭＯＩ両方においては、ＧＦＰを発現している細胞のパーセンテージ（ＧＦＰ＋細胞）はＸＰＢ機能のレベルに対して逆に比例していた。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは本発明の範囲内に含まれたレトロウイルスｃＤＮＡ環状形成に対するスクリーンの１実施例を説明している。図３Ａは、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター若しくはＭＳＨ２プロモーター）によって促進される、普遍的マーカー遺伝子（例えばＤｓＲｅｄ）を含むように構成された組換えレトロウイルスベクターを示している。赤色蛍光の検出はレトロウイルスｃＤＮＡが前記宿主細胞核に侵入することを示すためのポジティブコントロールとして使用される。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは本発明の範囲内に含まれたレトロウイルスｃＤＮＡ環状形成に対するスクリーンの１実施例を説明している。図３Ｂは１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ環の効率的な形成は、５’スプライシングドナーと３’スプライシング受容部位によって隣接された介在性ＬＴＲ（１−ＬＴＲ若しくは２−ＬＴＲ）を有して、第２のプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター若しくはＭＳＨ２プロモーター）と環状化マーカー遺伝子（例えばＧＦＰ）を並べる。この第２プロモーターからの転写は前記介在性ＬＴＲ（ｓ）が除去されたスプライシングｍＲＮＡを生じ、環状化マーカー遺伝子（例えばＧＦＰ）を発現するようになり、従って（ＧＦＰの場合、緑色蛍光として）検出される。ＧＦＰはレトロウイルスｃＤＮＡ環状化の場合にのみ発現するので、緑色蛍光のレベルはレトロウイルスｃＤＮＡ環形成対宿主細胞ゲノムへのレトロウイルスｃＤＮＡ組込みの能率を意味している。
【図４Ａ】図４Ａ及び４ＢはヒトＸＰＢ遺伝子（配列ＩＤ：１）のヌクレオチド配列及びそれによってコード化されているＸＰＢポリペプチドのアミノ酸配列（配列ＩＤ：２）のそれぞれを説明している（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０００１２２）。図４Ｃ及び４ＤはヒトＸＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：３）及びそれによってコード化されているＸＰＤポリペプチドのアミノ酸配列（配列ＩＤ：４）のそれぞれを提供している（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＮＭ＿０００４００）。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４ＢはヒトＸＰＢ遺伝子（配列ＩＤ：１）のヌクレオチド配列及びそれによってコード化されているＸＰＢポリペプチドのアミノ酸配列（配列ＩＤ：２）のそれぞれを説明している（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号．ＮＭ＿０００１２２）。
【図４Ｃ】図４Ｃ及び４ＤはヒトＸＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：３）及びそれによってコード化されているＸＰＤポリペプチドのアミノ酸配列（配列ＩＤ：４）のそれぞれを提供している（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号．ＮＭ＿０００４００）。
【図４Ｄ】図４Ｃ及び４ＤはヒトＸＰＤ遺伝子のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：３）及びそれによってコード化されているＸＰＤポリペプチドのアミノ酸配列（配列ＩＤ：４）のそれぞれを提供している（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号．ＮＭ＿０００４００）。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの１実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：５）を説明しており、前記普遍的マーカー遺伝子はＤｓＲｅｄであり、その発現はＣＭＶプロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの１実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：５）を説明しており、前記普遍的マーカー遺伝子はＤｓＲｅｄであり、その発現はＣＭＶプロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの１実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：５）を説明しており、前記普遍的マーカー遺伝子はＤｓＲｅｄであり、その発現はＣＭＶプロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの１実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：５）を説明しており、前記普遍的マーカー遺伝子はＤｓＲｅｄであり、その発現はＣＭＶプロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの別の実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：６）を説明しており、前記普遍的マーカーはＤｓＲｅｄであり、その発現はＭＳＨ２プロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの別の実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：６）を説明しており、前記普遍的マーカーはＤｓＲｅｄであり、その発現はＭＳＨ２プロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの別の実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：６）を説明しており、前記普遍的マーカーはＤｓＲｅｄであり、その発現はＭＳＨ２プロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、図３に示されている前記レトロウイルスベクターの別の実施例のヌクレオチド配列（配列ＩＤ：６）を説明しており、前記普遍的マーカーはＤｓＲｅｄであり、その発現はＭＳＨ２プロモーターによって調節されており、環状化マーカー遺伝子はＧＦＰであり、その発現はレトロウイルスｃＤＮＡ環状化上のＣＭＶプロモーターによって促進される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際調査報告】
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