(57)【要約】本発明は、霊長類、好ましくはヒトにおける、発作または一過性脳虚血発作の処置のためのインターフェロンβ類似ポリペプチドの使用に関する。さらに詳細には、インターフェロンβ様ポリペプチドは、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは、少なくとも１つのグリコシル化部位、好ましくは、少なくとも１つのインビボのＮ−グリコシル化部位が導入されるという点で異なる。必要に応じて、インターフェロンβ様ポリペプチドは、ＰＥＧ化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類における発作または脳血管障害（ＣＶＡ）の処置のための医薬の製造のための、インターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体の使用であって、該改変体は、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入された野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項２】
前記発作が、虚血性発作である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記虚血性発作が、塞栓性発作、心原性脳塞栓症発作、血栓性発作、大血管血栓症、ラクナ梗塞、動脈−動脈発作および原因不明の発作である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記発作が、出血性発作である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記出血性発作が、実質内発作、硬膜下発作、硬膜外発作およびクモ膜下発作からなる群から選ばれる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
霊長類における一過性脳虚血発作の処置のための医薬の製造のためのインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体の使用であって、該改変体は、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入された野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項７】
前記霊長類がヒトである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記グリコシル化部位がインビボのＮ−グリコシル化部位である、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記ＩＦＮＢ改変体がアシアロ−グリコシル化される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記改変体の前記アミノ酸配列が、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列と、１〜１５のアミノ酸残基が異なる、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのグリコシル化部位が、
【化１】
2005519946.tif 000045
からなる群から選択される置換により導入される、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記置換が、Ｓ２Ｎ＋Ｎ４Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｒ１１Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ、Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記置換が、Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ、Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記置換が、Ｑ４９Ｗ＋Ｑ５１ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記改変体が、
【化２】
2005519946.tif 000046
からなる群から選択される置換を含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記改変体が、置換Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔを含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ヒト野生型ＩＦＮＢ（配列番号２）の位置１７に位置するシステイン残基が取り除かれた、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記システイン残基が置換Ｃ１７Ｓにより取り除かれた、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記改変体が、
【化３】
2005519946.tif 000047
からなる群から選択される置換を含む、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記改変体が、置換Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔを含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記改変体が、位置１１０における置換を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記置換が、Ｄ１１０Ｆ、Ｄ１１０Ｖ、Ｄ１１０ＷおよびＤ１１０Ｙからなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記置換が、Ｄ１１０Ｆである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記改変体が、
【化４】
2005519946.tif 000048
からなる群から選択される置換を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記改変体が、置換Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔを含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記改変体が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
ポリマー分子が、改変体のアミノ酸配列に共有結合的に結合し、前記アミノ酸残基がポリマー分子に対する結合基を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
前記ポリマーが、ＰＥＧポリマーである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記結合基が、リジン残基のε−アミノ基またはＮ末端アミノ基である、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
少なくとも１つのリジン残基が取り除かれた、請求項２７〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
前記リジン残基が、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ５２、Ｋ９９、Ｋ１０５、Ｋ１０８、Ｋ１１５、Ｋ１２３、Ｋ１３４、およびＫ１３６からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記リジン残基が、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５またはＫ１２３からなる群から選択される、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記リジン残基が、アルギニン残基またはグルタミン残基による該リジン残基の置換により取り除かれた、請求項３０〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
前記置換が、
【化５】
2005519946.tif 000049
からなる群から選択される、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記置換が、Ｋ１９Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｋ１２３Ｒ、Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ１２３Ｒ，Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５ＲおよびＫ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｋ１２３Ｒからなる群から選択される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記置換が、Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒからなる群から選択される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記改変体が、
【化６】
2005519946.tif 000050
からなる群から選択される置換を含む、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記改変体が、置換Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ＋Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒを含む、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
霊長類における発作または脳血管障害（ＣＶＡ）を処置するまたは予防するための方法で、前記方法が、有効量のインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体の、それを必要とする霊長類への投与を含み、該インターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体が、野生型ヒトＩＦＮＢのアミノ酸配列（配列番号２）とは異なる、少なくとも１つのグリコシル化部位を導入したアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４０】
前記発作が虚血性発作である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記虚血性発作が、塞栓症発作、心臓塞栓症発作、血栓症発作、大血管血栓症、ラクナ梗塞、動脈−動脈発作および原因不明の発作からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記発作が、出血性発作である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記出血性発作が、実質内発作、硬膜下発作、硬膜外発作およびクモ膜下発作からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
霊長類における一過性脳虚血発作を処置するまたは予防するための方法であって、該方法が、有効量のインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体の、それを必要とする霊長類への投与を含み、該インターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド改変体が、野生型ヒトＩＦＮＢのアミノ酸配列（配列番号２）とは異なる、少なくとも１つのグリコシル化部位を導入したアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４５】
前記霊長類がヒトである、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記ＩＦＮＢ改変体が、請求項８〜３８のいずれかにより規定された、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、霊長類、好ましくはヒトにおける、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または一過性脳虚血発作（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｔｔａｃｋ）の処置のためのインターフェロンβ類似ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターフェロンは、抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性により特徴付けられる重要なサイトカインである。これらの活性は、肝炎、様々な癌および多種の硬化症を含む多くの疾患で観察される臨床的利益に対する基礎を形成する。インターフェロンは、Ｉ型クラスおよびＩＩ型クラスに分けられる。インターフェロンβ（インターフェロンベータ、ＩＦＢＮまたは、ＩＦＮ−βとも表される）はＩ型インターフェロンのクラスに属し、それはまた、インターフェロンα、τおよびωを含む。一方、インターフェロンγのみが、異なったＩＩ型クラスの公知のメンバーである。
【０００３】
野生型ヒトＩＦＢＮは、１６６のアミノ酸残基からなる、２２ｋＤａの分子量を有する調節ポリペプチドである。それは、ウイルス感染または他の生物製剤への曝露に応じて、体内のほとんどの細胞（特に線維芽細胞）により、生成され得る。それは、マルチマー性細胞表面レセプターに結合し、増殖性レセプター結合が、抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節性として分類され得る効果をここで生じるＩＦＮＢ誘導性遺伝子の発現につながる細胞内事象のカスケイドを生じる。
【０００４】
野生型ヒトＩＦＮＢのアミノ酸配列はＴａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｇｅｎｅ  第１０巻：１１〜１５、１９８０および欧州特許第０，０８３，０６９号、同第０，０４１，３１３号および米国特許第４，６８６，１９１号により報告された。
【０００５】
ヒトおよびマウスのＩＦＮＢの結晶構造はそれぞれ報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９４巻：１１８１３〜１１８１８、１９９７；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  第２５３巻：１８７〜２０７、１９９５および、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ  第５４巻：１２０３〜１２０６、１９９８に総説された。）。
【０００６】
比較的少ないタンパク質操作されたＩＦＢＮ改変体が報告されてきた（ＷＯ  ９５／２５１７０号；ＷＯ９８／４８０１８号；米国特許第５，５４５，７２３号；米国特許第４，９１４，０３３号；欧州特許０，２６０，３５０号；米国特許第４，５８８，５８５号；米国特許第４，７６９，２３３号；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＤＮＡ６巻２号（１９８７）ｐ．１１９〜ｐ．１２８およびＲｕｎｋｅｌら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  第２７３巻  第１４号ｐ．８００３〜８００８）。
【０００７】
ＣＨＯ細胞におけるＩＦＮＢの発現が報告されている（米国特許第４，９６６，８４３号；米国特許５，３７６，５６７号および米国特許５，７９５，７７９号）。
【０００８】
Ｒｅｄｌｉｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８巻  ｐｐ．４０４０〜４０４４、１９９１は、Ｃ１７Ｓ変異を含む組換えヒトＩＦＮＢのペプチドストレッチに対応する合成したペプチドに対する抗体の免疫反応性を記載している。
【０００９】
特定のグリコシル化パターンを含むＩＦＮＢ分子およびそれらの調製方法が報告されている（欧州特許第０，２８７，０７５号および欧州特許第０，５２９，３００号）。
【００１０】
様々な参考文献が、ポリマー結合またはグリコシル化によるポリペプチドの改変を開示する。ネイティブのＩＦＮＢのポリマー改変またはそのＣ１７Ｓ変異体が報告されてきた（欧州特許第０，２２９，１０８号；米国特許第５，３８２，６５７号；欧州特許第０，５９３，８６８号；米国特許４，９１７，８８８号およびＷＯ９９／５５３７７号）。
【００１１】
米国特許第４，９０４，５８４号は、少なくとも１つのリジン残基が欠損されるか、または任意の他のアミノ酸残基が置換されたＰＥＧ化したリジン枯渇ポリペプチドを開示する。ＷＯ９９／６７２９１号は、タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失し、タンパク質への結合を達成するのに十分な条件下で、そのタンパク質をＰＥＧと接触させることによるタンパク質をＰＥＧと結合する過程を開示する。ＷＯ９９／０３８８７号は、ポリペプチドの特定領域に位置するシステイン残基を非必須アミノ酸残基に置換した、成長ホルモンスーパーファミリーに属する、ＰＥＧ化した、ポリペプチドの変異体を開示する。ＩＦＮＢは、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの１つの例として言及されている。ＷＯ００／２３１１４号はグリコシル化したＩＦＮＢおよびＰＥＧ化したＩＦＮＢを開示している。ＩＦＮＢ融合タンパク質は、ＷＯ００／２３４７２号に開示されている。
【００１２】
ＩＦＮＢの商業的調製物は、商標名Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（インターフェロンβ１ｂとも呼ばれるが、これはグリコシル化されておらず、組換え細菌細胞を使用して作製され、Ｃ１７Ｓ突然変異を含み、Ｎ末端メチオニン残基に欠損を有する）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｆ（登録商標）（インターフェロンβ１ａとも呼ばれるが、これは、グリコシル化され、組換え哺乳類細胞を用いて作製される）の下で販売されている。これらの調製物は、多発性硬化症患者の処置のために使用され、悪化速度を減少するのに効果的であることが示され、そして、より多くの患者が、プラシーボ処置した患者と比較して、悪化のない期間が延長していた。さらに、障害の蓄積速度が減少していた（Ｎｅｕｒｏｌ．５１巻：６８２〜６８９、１９９８）。
【００１３】
構造および機能についてのインターフェロンβ１ａおよびインターフェロンβ１ｂの比較が、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．１５巻：６４１〜６４９、１９９８に示されている。
【００１４】
ＩＦＮＢは、多発性硬化症の進行を遅延し、その後、中枢神経系の進行性炎症変性疾患を再発させることを示した最初の治療的発明である。しかしながら、その作用のメカニズムは、大部分明らかにはなっていないままである。ＩＦＮＢは、白血球の増殖および抗原提示に対して阻害効果を有するようである。さらに、ＩＦＮＢは、抗炎症表現型に対するサイトカイン生成の性質を調節し得る。最終的に、ＩＦＮＢは、Ｔ細胞マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することにより、Ｔ細胞移動を減少し得る。これらの活性は、協同して作用し、多発性硬化症におけるＩＦＮＢのメカニズムの説明となっているようである（Ｎｅｕｒｏｌ．  ５１巻：６８２〜６８９、１９９８）。
【００１５】
さらに、ＩＦＮＢは、骨肉腫、基底細胞癌、子宮頸部形成異常、神経膠腫、急性骨髄白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、乳癌、黒色腫およびウイルス性感染（例えば、パピローマウイルス、ウイルス性肝炎、陰部ヘルペス、帯状疱疹、ヘルペス性角膜炎、単純ヘルペス、ウイルス性脳炎、サイトメガロウイルス肺炎、およびライノウイルス）の処置のために使用され得る。現在のＩＦＮＢの調製物の使用には、注入部位の反応、発熱、悪寒、筋肉痛、関節痛および他のインフルエンザに似た症状を含む様々な副作用が関連している（Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１９巻：８８３〜８９３、１９９７）。
【００１６】
ＷＯ０１／１５７３６号は、非ポリペプチドの一部（例えば、ＰＥＧ）およびグリコシル化部位の導入および／または欠失により改変されたＩＦＮＢポリペプチドに結合した非ポリペプチド部分を含む、新規のＩＦＮＢ結合体を開示する。その分子は、特性（例えば、半減期の改良および／または現在のＩＦＮＢ生成物に対して惹起された中和抗体に対する反応性の減少）を改良した。
【００１７】
最近、ＩＦＮＢは、発作および関連する障害の処置に対する医薬として示唆されている（ＷＯ０１／４１７８２号；ＷＯ０２／０８９８２８号、ＷＯ０２／０８０９５３号およびＶｅｌｄｈｕｉｓら、Ｓｔｒｏｋｅ、２００２年１月、３４６頁）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の簡潔な開示）
本発明は、発作および関連する障害の処置に、インターフェロンβ１ａ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｆ（登録商標））およびインターフェロンβ１ｂ（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））より効果があるＩＦＮＢ類似ポリペプチドを提供する。
【００１９】
従って、第１の局面において、本発明は、霊長類における発作または脳血管障害（ＣＶＡ）の処置のための医薬の製造のための、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入された、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド変異体の使用に関する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、霊長類における発作または脳血管障害（ＣＶＡ）を処置するかまたは予防するための方法に関し、この方法は、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なる、少なくとも1つのグリコシル化部位を導入したアミノ酸配列を含む、効果的な量のインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド変異体の、それを必要とする霊長類への投与する工程を包含する。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、霊長類における一過性虚血性発作の処置のための医薬を製造するためのインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ペプチド変異体の使用に関し、このインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ペプチド変異体は、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なる、少なくとも１つのグリコシル化部位が導入されたアミノ酸配列を含む。
【００２２】
なおさらなる局面において、本発明は、霊長類における一過性虚血性発作を処置するかまたは予防するための方法に関し、この方法は、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なる、少なくとも1つのグリコシル化部位を導入したアミノ酸配列を含む、有効量のインターフェロンβ（ＩＦＮＢ）ポリペプチド変異体の、それを必要とする霊長類への投与する工程を包含する。
【００２３】
他の局面は以下の開示より明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な開示）
（定義）
本願の文脈では、次の定義を適用する：
「結合体」という用語（または「結合体ポリペプチド」と交換できる）は、１つ以上のポリペプチドの、１つ以上の非ポリペプチド部分への共有結合により形成した異質性の（複合性のまたはキメラのという意味の）分子を示すことを意図している。共有結合という用語は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が、互いに直接共有結合しているか、あるいは、介在性の部分（例えば、架橋、スペーサー、ポリペプチドに存在する結合基を用いた結合部分）を介して、互いに間接的に共有結合していることを意味する。好ましくは、結合体は、適切な濃度および適切な条件で溶解し得る。すなわち、生理学的流体（例えば、血液）に溶解し得る。本発明における使用のための結合体化ポリペプチドの例としては、グリコシル化したポリペプチドおよび／またはＰＥＧ化したポリペプチドが挙げられる。「非結合体化ポリペプチド」という用語は、結合体のポリペプチド部分について使用し得る。
【００２５】
「非ポリペプチド部分」という用語は、本発明における使用のためのポリペプチドの結合基に結合し得る分子を示すことを意図している。そのような分子の好ましい例としては、ポリマー分子、糖部分、リン脂質化合物または有機誘導体化薬剤が挙げられる。結合体を、本明細書に記載された文脈で使用する場合、非ポリペプチド部分は、ポリペプチドの結合基を介して結合体のポリペプチド部分に結合していることが理解される。
【００２６】
「ポリマー分子」という用語は、２つ以上のモノマーの共有結合によって形成された分子であって、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な血漿タンパク質である場合を除いて、そのモノマーのいずれもがアミノ酸残基ではない分子として定義される。「ポリマー」という用語は、「ポリマー分子」という用語と交換可能に使用され得る。好ましいポリマー分子の例としては、ＰＥＧおよびｍＰＥＧが挙げられる。「ポリマー分子」という用語もまた、インビトロのグリコシル化により結合した（すなわち、必要に応じて架橋剤を使用して、通常炭水化物分子のポリペプチドの結合基への共有結合を含む合成的なグリコシル化をインビトロで行う）炭水化物分子を対象とすることも意図する。
【００２７】
インビボでグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化または、Ｏ−グリコシル化（さらに、以下に記載））することにより結合した炭水化物分子は、本明細書では「糖部分」をいう。通常、インビボのグリコシル化部位はＮ−グリコシル化部位であるが、Ｏ−グリコシル化部位もまた、本発明に適切であるとして検討される。グリコシル化ＩＦＮＢ変異体もＩＦＮＢ結合体（結合体のポリペプチド部分に結合した糖部分である非ポリペプチド部分を含む）と呼ばれ得ることを理解すべきである。
【００２８】
非ポリペプチド部分（例えば、結合体中のポリマー分子または糖部分）の数が明白に示されている場合を除いて、結合体中に含まれるかさもなければ本明細書で使用される「非ポリペプチド部分」への全ての言及は、この結合体中の１つ以上の非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子または糖部分）をいうべきである。
【００２９】
「結合基」という用語は、適切な非ポリペプチド部分に結合し得るポリペプチドのアミノ酸残基を示すことを意図する。例えば、ポリマー（特にＰＥＧ）としては、結合基は、リジンのε−アミノ基またはＮ末端アミノ基が頻繁に使用される。他のポリマー結合基は、遊離カルボン酸基（例えば、Ｃ末端アミノ酸残基の遊離カルボン酸基あるいはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基またはグルタミン酸残基の遊離カルボン酸基）、適切に活性化したカルボニル基、メルカプト基（例えば、システイン残基のメルカプト基）、芳香族酸残基（例えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）、水酸基（例えば、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＯＨ−Ｌｙｓの水酸基）グアニジン（例えば、Ａｒｇ）イミダゾール（例えば、Ｈｉｓ）および酸化炭水化物部分を含む。
【００３０】
インビボのＮ−グリコシル化では、「結合基」という用語は、非習慣的な方法で使用され、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ’−Ｓ／Ｔ／Ｃ−Ｘ’’、ここでＸ’はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｘ’’はＸ’と同一であるかまたは同一ではない任意のアミノ酸残基であって、好ましくはプロリンとは異なり、Ｎはアスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、スレオニン、もしくはシステインのいずれかであって、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最も好ましくはスレオニンである）を構成するアミノ酸残基を示す。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン酸残基は、グリコシル化の間、糖部分が結合されるアスパラギン酸残基であるが、このような結合は、Ｎ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しなければ、達成され得ない。従って、非ポリペプチド部分がＮ結合糖部分である場合、親ポリペプチドのアミノ酸配列の改変に関して使用される「非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、Ｎ−グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基が、例えば、機能的なＮ−グリコシル化部位をアミノ酸配列に導入する方法により改変されることを理解すべきである。「Ｏ−グリコシル化部位」については、結合基がセリンまたはスレオニン残基のＯＨ基である。
【００３１】
「側鎖の少なくとも２５％（または５０％）を溶媒に曝露する」という用語をインビボのＮ−グリコシル化部位の導入に関して使用する場合、この用語は、糖部分が実際に結合している位置のアミノ酸側鎖の表面への接触可能性をいう。多くの場合、糖部分が実際に結合しているアスパラギン酸残基と相対的に＋２の位置に、セリン残基またはスレオニン残基を導入することが必要である。そしてこれらの位置は、セリンまたはスレオニン残基が導入される場合、埋もれる（すなわち、それらの側鎖の２５％（または５０％）未満が、溶媒に曝露される）。
【００３２】
グリコシル化部位に結合した糖部分は、代表的にシアル酸付加される。しかしながら、アシアロ−グリコシル化ＩＦＮＢポリペプチドを生成するために、シアル酸は、例えばノイラミニダーゼによる酵素切断により除去され得る（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．（１９９４）１７巻、５１０〜５１９および米国特許第５，５４９，８９２号）。別の実施形態において、糖部分はマンノースのみを含むように、さらに改変される。これは、ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる連続処理によりなされ得る（Ｂｒａｄｙら、Ｊ．Ｉｎｈｅｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．（１９９４）１７巻、５１０〜５１９および米国特許第５，５４９，８９２号）。
【００３３】
「非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基」という用語は、アミノ酸残基が、非ポリペプチド部分が結合する（導入したアミノ酸残基の場合）、または結合した（除去したアミノ酸残基の場合）アミノ酸残基を示すことを意図している。
【００３４】
特定の改変（例えば置換）に関して使用される「１つの相違」または「とは異なる」という用語は、特定のアミノ酸の相違とは別に存在する付加的な相違を認めることを意図している。例えば、非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基の除去および／または導入に加えて、ＩＦＮＢポリペプチドは、そのようなアミノ酸残基の導入および／または除去とは関連のない、他の置換を含み得る。これらは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基によるＣ末端の切断、１つ以上のアミノ酸残基によるＮ末端の切断および／または「保存的アミノ酸置換」、すなわち、類似の性質を持つアミノ酸の群内で行われる置換（例えば、小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸）を含み得る。本発明における保存的置換の例は、下表に記載した群から特に選択され得る。
【００３５】
【化７】
2005519946.tif 000002
非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換などについて用いられる「少なくとも１つ」という用語は、１つ以上を意味することを意図する。
【００３６】
本願では、アミノ酸の名称および原子の名称（例えば、ＣＡ、ＣＢ、ＣＤ、ＣＧ、ＳＧ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ，Ｃなど）は、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（残基名、原子名など）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３８巻、９〜３７（１９８４）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２巻、１（１９８５）におけるこれらの補正）に基づいたＰｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）（ｗｗｗ.ｐｄｂ．ｏｒｇ）により定義されるものとして使用される。ＣＡは、Ｃαをいうこともあり、ＣＢはＣβをいうこともある。「アミノ酸残基」という用語は、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基からなる群に含まれるアミノ酸残基を示すことを意図する。アミノ酸位置／置換を同定するために使用される専門用語は、以下に示される：
アミノ酸位置／置換を同定するために使用される専門用語は、以下に示される：Ｃ１７は、位置１７が配列番号２に示されるアミノ酸配列におけるシステイン残基により占められることを示す。Ｃ１７Ｓは、位置１７のＣｙｓ残基がＳｅｒ残基で置き換えられたことを示す。複数の置換は「＋」により示される。例えば、Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３Ｔ／Ｓは、位置７１におけるＡｒｇ残基のＡｓｎ残基による置換および位置７３におけるＡｓｐ残基のＴｈｒまたはＳｅｒ残基、好ましくはＴｈｒ残基による置換を含むアミノ酸配列を意味する。本明細書の所定の置換について使用されたＴ／Ｓは、Ｔ残基またはＳ残基のどちらか、好ましくはＴ残基を意味する。欠失は、アステリスクにより示される。例えば、Ｍ１＊は、位置１におけるＭｅｔ残基が欠失していることを示している。挿入は、次の方法で示される：位置１７に位置するＣｙｓ残基の後へのさらなるＰｈｅ残基の挿入は、Ｃ１７ＣＦとして示す。組み合わせた置換および挿入は、次の方法により示される：位置１７におけるＣｙｓ残基のＳｅｒ残基による置換および位置１７アミノ酸残基の後へのＰｈｅ残基の挿入はＣ１７ＳＦとして示す。
【００３７】
「ヌクレオチド配列」という用語は、２以上のヌクレオチド分子の連続的なストレッチを示すことを意図する。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成の、合成起点のまたはそのいずれかの組み合わせのヌクレオチド配列であり得る。
【００３８】
「ＩＦＮＢタンパク質配列ファミリー」という用語は、その慣習的な意味で使用される。すなわち、配列の整列を可能にする（例えばＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを使用して）アミノ酸配列と十分に相同なポリペプチドの群を示すために使用される。ＩＦＮＢ配列ファミリーは、例えばＰＦＡＭファミリーから入手可能であり、４．０版、または、適したコンピュータープログラム（例えば、デフォルトパラメーターを使用したＣＬＵＳＴＡＬＷ  １．７４版）の使用により調製され得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：配列の重要性、位置特異的ギャップペナルティおよび重量マトリックスの選択による連続的な複合的配列アラインメントの感受性の改善、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２：４６７３〜４６８０）。
【００３９】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、本明細書中で相互互換に使用され、そしてそのような用語は全て、細胞の成長または培養から生じる子孫を含むことを理解されるべきである。
【００４０】
「形質転換」および「トランスフェクション」は、ＤＮＡを細胞に導入するプロセスをいうために、相互互換に使用される。
【００４１】
「作動可能に連結した」とは、配列の正常な機能が実行され得るように、互いに相対的な配置で酵素的なライゲーションの手段または他の方法による、２つ以上のヌクレオチド配列の共有結合をいう。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現した場合、ポリペプチドのヌクレオチド配列に作動可能に連結する：プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結する。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するために位置される場合、コード配列に作動可能に連結する。一般に、「作動可能に連結した」とは、結合されるヌクレオチド配列が隣接し、分泌リーダーの場合、隣接し、そして読み取り位相（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。連結は、簡便な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、次いで標準の組換えＤＮＡ方法と共に、合成ヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００４２】
用語「導入する」とは、主に、存在するアミノ酸残基の置換を意味することを意図されるが、さらなるアミノ酸残基の挿入もまた意味し得る。
【００４３】
用語「除去する」とは、主に、別のアミノ酸残基により除去されるアミノ酸残基の置換を意味することが意図されるが、除去されるアミノ酸残基の欠失（置換を含まない）もまた意味し得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「改変」とは、置換、挿入および欠失を網羅する。
【００４５】
用語「変異」および「置換」とは、本明細書で相互互換に使用される。
【００４６】
所定の物質に関して使用される場合、用語「免疫原性」とは、免疫システムからの応答を誘導する物質の能力を示すことが意図される。免疫応答は、細胞または抗体に媒介される応答であり得る（免疫原性のさらなる定義のために、例えば、Ｒｏｉｔｔ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）を参照のこと）。免疫原性は、当該分野で公知の任意の適切な方法の使用（例えば、インビボまたはインビトロで、例えば、以下の材料および方法の節に記載される、インビトロ免疫原性テストを使用して）により決定され得る。
【００４７】
所定のポリペプチドまたは結合体について使用される場合、用語「低下した免疫原性」とは、結合体またはポリペプチドが、参照分子（例えば、野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）またはＡｖｏｎｅｘ（登録商標））あるいは野生型ヒトＩＦＮＢの改変体（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）））（これらは、比較可能な条件下で決定される）よりも測定可能に低い免疫応答を生じることを示すことが意図される。市販のＩＦＮＢ産物（すなわち、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｆ（登録商標））に対する参照が本明細書でなされる場合（適切な場合）、処方された生成物または生成物のＩＦＮＢポリペプチド部分のいずれかを意味することが理解されるべきである。通常、抗体反応性の低下（例えば、商業的なＩＦＮＢ生成物で処置した患者からの血清に存在する抗体に対する反応性）は、低下した免疫原性の指標である。
【００４８】
用語「インビボでの機能性半減期」とは、通常の意味で使用される（すなわち、ポリペプチドまたは結合体の所定の機能の５０％が保持される時間（例えば、ポリペプチドまたは結合体の生物学的活性の５０％がなお身体／標的器官に存在する時間、またはポリペプチドまたは結合体の活性が初期値の５０％である時間である））。
【００４９】
インビボでの機能性半減期を決定する代替として、「血清半減期」（すなわち、５０％のポリペプチド分子または結合体分子が、消失される（ｃｌｅａｒ）前に血漿または血流中を循環する時間を決定し得る。血清半減期の決定は、しばしば、インビボでの機能性半減期の決定より簡単であり、そして、血清半減期の長さは、通常インビボでの機能性半減期の長さの良い指標である。血清半減期に対する代替用語としては、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿排除」および「クリアランス半減期」を含む。保持される機能は、通常、抗ウイルス活性、抗増殖活性、免疫調節性活性またはレセプター結合活性から選択される。インビボでの機能性半減期および血清半減期は、本明細書以下の材料および方法の節でさらに議論されるような当該分野で公知の任意の適切な方法により決定され得る。
【００５０】
ポリペプチドまたは結合体は、通常、１つ以上の網内系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓または肝臓の作用によって、あるいは、特定のまたは非特定のタンパク質分解によって排除される。腎臓で生じるクリアランスはまた、「腎クリアランス」と言われ得、そして、例えば、糸球体ろ過、尿細管排泄（ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）または尿細管排泄（ｔｕｂｕｌａｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）により達成される。通常は、クリアランスは、ポリペプチドまたは結合体の物質的特長（分子量、大きさ（直径）（糸球体ろ過の排除に対する）、電荷、対称性、形状／剛性、結合した炭水化物鎖およびタンパク質の細胞レセプターの存在を含む）に依存する。約６７ｋＤａの分子量は、腎クリアランスの重要な排除値であると考えられる。
【００５１】
腎クリアランスの減少は、任意の適切なアッセイ（例えば、確立されたインビボアッセイ）により確立され得る。代表的には、腎クリアランスは、標識した（例えば、放射標識した、または蛍光標識した）ポリペプチドまたはポリペプチド結合体の患者への投与および患者から回収した尿における標識活性の測定により決定される。腎クリアランスの減少は、比較可能な条件下で、対応する非結合体化ポリペプチドまたは対応する非結合体化野生型ポリペプチドあるいは商業的なＩＦＮＢ産物と比較して決定される。
【００５２】
インビボでの機能性半減期または血清半減期について使用される場合、用語「増加した」とは、結合体またはポリペプチドの適切な半減期が、比較可能な条件下で決定される場合、参照分子（例えば、非結合体化野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））または、非結合体化ヒトＩＦＮＢ改変体（例えば、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）））の半減期と比較して統計的に有意に増加されることを示すために使用される。
【００５３】
用語「低下した免疫原性および／または増加したインビボでの機能性半減期および／または増加した血清半減期」とは、これらの特性の任意の１つ、２つまたは全てを網羅するように理解すべきである。興味深い実施形態では、本明細書に記載される結合体またはポリペプチドは、これらの特徴の少なくとも２つ（すなわち、低下した免疫原性および増加したインビボでの機能性半減期、低下した免疫原性および増加した血清半減期、あるいは増加したインビボでの機能性半減期および増加した血清半減期）を有する。
【００５４】
本発明および参照分子に使用される分子の（絶対的というよりはむしろ）相対的な性質の測定について使用される場合、用語「比較可能な条件下」とは、同じアッセイ（すなわち、アッセイは、同じ内部標準を含む同じ条件下で行う）、および適切な場合、同じ型の動物を使用して２つの分子の適切な性質をアッセイすることを示すことが意図される。
【００５５】
用語「ＩＦＮＢ活性を示す」とは、ポリペプチドまたは結合体がネイティブなＩＦＮＢ（特に、グリコシル化された宿主細胞において必要に応じて発現された、配列番号２（配列番号２は、成熟配列である）に示されるアミノ酸配列を有するヒト野生型ＩＦＮＢまたは任意の市販のＩＦＮＢ産物である）の１つ以上の機能を有することを示すことが意図される。そのような機能としては、ＩＦＮＢに結合し得、レセプター（特に、レセプターサブユニットＩＦＮＡＲ−２およびＩＦＮＡＲ−１（Ｄｏｍａｎｓｋｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３巻６号  ｐｐ．３１４４〜３１４７、１９９８、Ｍｏｇｅｎｓｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９：１０６９〜１０９８、１９９９）により構成される１型インターフェロンレセプター）からの細胞内シグナル伝達を開始し得るインターフェロンレセプターに結合する能力および抗ウイルス活性、抗増殖活性、または免疫調節性活性（これらは、当該分野で公知のアッセイ（例えば、以下の開示に述べられるアッセイ）を使用して決定され得る）が挙げられる。ＩＦＮＢ活性は、本明細書以下の材料および方法の節において例示されるような当該分野で公知の方法によりアッセイされ得る。
【００５６】
ＩＦＮＢ活性を「示す」または「有する」ポリペプチドまたは結合体は、測定可能な機能（例えば、測定可能なレセプター結合活性およびレセプター刺激活性）（例えば、材料および方法の節において記載される第１または第２のアッセイにより決定される）を提示する場合、このような活性を有すると考えられる。ＩＦＮＢ活性を示すポリペプチドはまた、本明細書では、「ＩＦＮＢ分子」、「ＩＦＮＢ改変体ポリペプチド」または「ＩＦＮＢポリペプチド」と呼ばれ得る。用語「ＩＦＮＢポリペプチド」「ＩＦＮＢ改変体」および「改変体ポリペプチド」とは、本明細書では主に、本発明における使用のための改変されたポリペプチドについて使用される。
【００５７】
用語「親ＩＦＮＢ」とは、本発明に従った使用のために改良される開始分子を示すことが意図される。好ましくは、親ＩＦＮＢは、ＩＦＮＢ配列ファミリーに属する。親ＩＦＮＢはいずれの起源のもの（脊椎動物起源または哺乳動物起源（例えばＷＯ００／２３４７２に定義される起源のいずれか））でもあり得るが、親ＩＦＮＢは、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその改変体を有する野生型ヒトＩＦＮＢが好ましい。
【００５８】
親ＩＦＮＢポリペプチドの文脈において、「改変体」は、親ＩＦＮＢポリペプチド（例えば、野生型ヒトＩＦＮＢ）由来の１つ以上のアミノ酸残基が異なるポリペプチドである。代表的には、改変体は、親ＩＦＮＢポリペプチド（例えば野生型ヒトＩＦＮＢ）とは、１〜１５アミノ酸残基、１〜１０アミノ酸残基、１〜８アミノ酸残基、２〜８アミノ酸残基、１〜５アミノ酸残基または２〜５アミノ酸残基が異なる。従って、代表的には、改変体は、親ＩＦＮＢポリペプチド（例えば、野生型ヒトＩＦＮＢ）とは1、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基が異なる。野生型ヒトＩＦＮＢポリペプチドの例としては、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標）のポリペプチドの一部が挙げられる。親ＩＦＮＢ改変体の例は、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）である。あるいは、親ＩＦＮＢポリペプチドは、ＩＦＮＢと別の相同なポリペプチド（例えば、ハイブリッド分子に導入された１つ以上の付加的置換を必要に応じて含むインターフェロンα）とのハイブリッド分子であるアミノ酸配列を含み得る。このようなハイブリッド分子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは、１０より多いアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み得る。親ポリペプチドとして有用であるために、ハイブリッド分子はＩＦＮＢ活性を示す（例えば、本明細書中の材料および方法の節に記載される第２のアッセイにより決定される）。本発明にて親ＩＦＮＢ分子として役に立ち得る野生型ヒトＩＦＮＢの改変体の他の例は、非ポリペプチド部分に対する結合基を含む、導入されたおよび／または除去されたアミノ酸残基を有するＷＯ０１／１５７３６に記載された改変体またはＷＯ００／２３１１４、ＷＯ００／２３４７２、ＷＯ９９／３８８７または当該分野で利用可能な他に記載されたＩＦＮＢ分子のいずれかである。
【００５９】
本発明における使用のためのポリペプチドまたは結合体について使用される場合、用語「機能性部位」とは、ＩＦＮＢの機能または性能に必須であるか、またはＩＦＮＢの機能または性能に関与する他のものであり、従って、機能性部位「に位置する」１つ以上のアミノ酸残基を示すことが意図される。機能性部位は、例えば、レセプター結合部位であり、そして、当該分野で公知の方法によって、好ましくは、ＩＦＮＡＲ−１およびＩＦＮＡＲ−２により構成されるＩ型インターフェロンレセプターのような適切なレセプターに複合体化したポリペプチドの構造の分析によって決定され得る。
【００６０】
本文脈における、用語「増加したグリコシル化」とは、通常、グリコシル化部位の増加した利用（またはより良い利用）の結果として得られた、結合した炭水化物分子の量の増加を示すことが意図される。増加したグリコシル化は、結合した炭水化物の構造を分析するための、当該分野で公知の任意の適切な方法により決定され得る。結合した炭水化物の構造を決定するための１つの簡便なアッセイは、本明細書中の実施例７および８に記載した方法である。
【００６１】
グリコシル化部位「に密接に位置される」アミノ酸残基は、通常、糖部分が結合されるグリコシル化部位のアミノ酸残基に関して、−４位、−３位、−２位、−１位、＋１位、＋２位、＋３位または＋４位、特に−２位、−１位、＋１位または＋２位（例えば−１位または＋１位、特に−１位）に位置される。これらの位置は、部位におけるグリコシル化を増加するために、改変され得る。改変は、通常、置換であり、その置換は、親ＩＦＮＢポリペプチドのグリコシル化と比較して、ＩＦＮＢ改変体のグリコシル化の増加を引き起こす任意の他のアミノ酸残基を用いてなされる。このような他のアミノ酸残基は、試行錯誤型実験によって（すなわち、他の任意のアミノ酸残基に対して適切な位置のアミノ酸残基の置換および得られた改変体の得られたグリコシル化の決定によって）決定され得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「天然のグリコシル化部位」とは、Ｎ８０およびＴ８２により定義されるＮ−グリコシル化部位を意味することが意図される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「発作」とは、血流の不足および脳への不十分な酸素から生じる脳組織の死から生じる状態を意味することが意図される。用語「発作」および「脳血管障害」（すなわち「ＣＶＡ」）は、本明細書中で相互互換に使用される。上で説明されるように、発作は、虚血性または出血性であり得る。虚血性発作の特定の例は、塞栓性発作、心臓塞栓性発作、血栓性発作、大血管血栓症、ラクナ型梗塞、動脈−動脈発作および原因不明の発作を含む。出血性発作の特定の例は、硬膜下発作、実質内発作、硬膜外発作およびクモ膜下発作を含む。
【００６４】
本文脈において、用語「一過性虚血性発作」とは、脳の血液供給における一時的な欠乏症から生じる脳機能の障害を網羅することが意図される。
【００６５】
（本発明における使用のための改変体）
本発明の好ましい実施形態においては、ＩＦＮＢポリペプチドは、野生型ヒトＩＦＮＢの改変体であり、ここで前記改変体はインビボで導入された（さらなる）少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。インビボで導入されたグリコシル化部位は、Ｏ−グリコシル化部位であり得るが、Ｎ−グリコシル化部位が好ましい。糖部分がグリコシル化部位に結合されることを保証するために、このようなグリコシル化改変体は、グリコシル化し得る宿主細胞内で生成されなければならないことが理解される。
【００６６】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、霊長類（好ましくはヒト）における発作または一過性の虚血性発作の処置のための薬品の製造のために、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位が導入されている点が、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸配列を含むＩＦＮＢポリペプチド改変体の使用に関する。
【００６７】
より具体的には、インビボのＮ−グリコシル化部位は、分子の表面に露出したアミノ酸残基によって占められる親ＩＦＮＢ分子の位置に導入され、好ましくは、側鎖の２５％より多くが、溶媒にさらされ、５０％より多くが溶媒にさらされているのが特に好ましい（これらの位置は本明細書中の方法の節で同定される）。インビボのＮ−グリコシル化部位は、前記部位のＮ−残基が該位置に位置される方法により導入される。同様に、Ｏ−グリコシル化部位は、このような部位をなすＳ残基またはＴ残基が前記位置に位置されるように、導入される。さらに、十分なグリコシル化を保証するために、インビボのグリコシル化部位（特にＮ−グリコシル化部位のＮ残基またはＯ−グリコシル化部位のＳ残基またはＴ残基）がＩＦＮＢポリペプチドの最初の１４１アミノ酸残基内に、より好ましくは、最初の１１６アミノ酸残基内に位置されることが好ましい。
【００６８】
親ＩＦＮＢ分子の表面に露出し、溶媒にさらした２５％より多い側鎖を有するアミノ酸残基に占められる位置で、インビボのさらなるＮ−グリコシル化部位の導入を導く置換は、以下：
【００６９】
【化８】
2005519946.tif 000003
からなる群から選択される置換を含む。
【００７０】
溶媒にさらした５０％の側鎖より多くを有する親ＩＦＮＢ分子の表面に露出した位置でさらなるインビボのＮ−グリコシル化部位の導入を導く置換は、以下：
【００７１】
【化９】
2005519946.tif 000004
からなる群から選択される置換を含む。
【００７２】
上のリストで述べた置換の中で、１４１Ｎ末端アミノ酸残基（特に１１６Ｎ末端アミノ酸残基）の中に、導入されたＮ残基を有する置換が好ましい。
【００７３】
ここで、最も好ましい置換は、
【００７４】
【化１０】
2005519946.tif 000005
からなる群から選択された置換を含む変異体を含み、より好ましくは、Ｓ２Ｎ＋Ｎ４Ｔ、Ｌ９Ｎ＋Ｒ１１Ｔ、Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ、Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択し、さらにより好ましくは、Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ、Ｒ７１Ｎ＋Ｄ７３ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択し、特に、Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１ＴおよびＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔからなる群から選択する。
【００７５】
好ましいＩＦＮＢ変異体の特定の実施形態は、
【００７６】
【化１１】
2005519946.tif 000006
からなる群から選択された置換を含む。
【００７７】
最も好ましくは、ＩＦＮＢ変異体は、置換Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ（２つのさらなるインビボＮ−グリコシル化部位を導入する）を含む。
【００７８】
インビボの機能性Ｎ−グリコシル化部位を導入するために、Ｎ残基とＳ／Ｔ残基との間にあるアミノ酸残基は、プロリン残基とは異なることを理解すべきである。通常は、間にあるアミノ酸残基は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の適切な位置を占める。例えば、置換Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔを含むポリペプチドでは、位置５０は間にある位置である。
【００７９】
ＩＦＮＢ変異体はインビボの１つのグリコシル化部位を含み得る（例えば、自然に生じるＮ８０におけるインビボのＮ−グリコシル化部位）。しかしながら、親ポリペプチドの表面に存在するエピトープの効果的な遮蔽物を得るために、ポリペプチドが１つ以上のインビボのグリコシル化部位、特に、２〜７個または２〜５個のグリコシル化部位、例えば、２、３、４、５、６、または７個のインビボのグリコシル化部位を含むことが、特に好ましいことが多い。従って、ＩＦＮＢポリペプチドは１つの付加的なグリコシル化部位（自然に生じる、位置Ｎ８０に既に存在するインビボのＮ−グリコシル化部位に加えて）を含み得、また、１〜６個または１〜４個のインビボのグリコシル化部位付加（導入した）（例えば、インビボのグリコシル化部位への１、２、３、４、５または６個の付加（導入した））を含み得る。好ましくは、前記インビボのグリコシル化部位は、インビボのＮ−グリコシル化部位である。従って、ＩＦＮＢ変異体は１つの糖部分（例えば、Ｎ８０に存在する自然に生じる糖部分）を含み得る。しかし、ＩＦＮＢ変異体が１つ以上の糖部分を含むことが好ましく、特に、２〜７個または２〜５個の糖部分、例えば２、３、４、５、６または７個の糖部分を含むことが好ましい。
【００８０】
非常に好ましい実施形態では、ＩＦＮＢポリペプチドは、３つのインビボＮグリコシル化部位（すなわち、２つの付加的な（導入された）インビボＮ−グリコシル化部位（天然に存在するＮ８０  Ｎグリコシル化部位に加えて））を含む。すなわち、ＩＦＮＢ変異体は、３個のインビボのＮ−グリコシル化部位および３個の糖部分を含む。特に好ましい実施形態では、３個のインビボのＮ−グリコシル化部位が位置４９、８０および１１１に位置している。
【００８１】
（さらなる改変）
上に開示した任意のグリコシル化変異体は、さらに改変し得る。
【００８２】
例えば、ＩＦＮＢポリペプチドがシステイン残基（例えば、配列番号２の位置１７に位置するシステイン残基）を含まないことが、ここでは好ましい。好ましくは、システイン残基は、置換Ｃ１７Ｓにより除去される。
【００８３】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、霊長類、好ましくはヒトにおける発作または一過性虚血性発作の処置のための薬品の製造のために、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位が導入され、その中の位置１７に位置するシステイン残基が除去されている点が、野生型ヒトＩＦＮＢ（配列番号２）のアミノ酸配列とは異なっているアミノ酸配列を含むＩＦＮＢポリペプチド異性体の使用に関する。好ましくは、前記システイン残基は、置換Ｃ１７Ｓにより除去される。
【００８４】
特に好ましいＩＦＮＢ変異体の特定の実施形態は、
【００８５】
【化１２】
2005519946.tif 000007
からなる群から選択された置換を含む変異体を含む。
【００８６】
最も好ましくは、ＩＦＮＢ変異体は、置換Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ（位置４９および１１１のインビボのＮ−グリコシル化部位における２つの付加の導入および位置１７のシステイン残基の除去につながる）を含む。
【００８７】
さらに好ましい実施形態では、その部位でのグリコシル化を最適化または増加するために、ＩＦＮＢ変異体はさらに、グリコシル化部位に近接して位置する１つ以上の置換を含む。特定の実施形態は、ＷＯ０２／０７４８０６号のｐ１４〜２３の「Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ」と題された節に記載されている。
【００８８】
本発明の興味深い実施形態では、特に、変異体が、位置４９に導入されたインビボＮ−グリコシル化部位を含む場合、ＩＦＮＢ変異体は、位置４８にアミノ酸置換を含む。好ましくは、位置４９に位置するグルタミン残基は、疎水性アミノ酸残基（例えば、Ｑ４８Ｆ、Ｑ４８Ｖ、Ｑ４８ＷまたはＱ４８Ｙ）により置換される。
【００８９】
本発明の非常に好ましい実施形態では、特に、変異体が、位置１１１に導入されたインビボＮ−グリコシル化部位を含む場合、ＩＦＮＢ変異体は、位置１１０にアミノ酸置換を含む。好ましくは、位置１１０に位置するアスパラギン酸残基は、疎水性アミノ酸残基（例えば、Ｄ１１０Ｆ、Ｄ１１０Ｖ、Ｄ１１０ＷまたはＤ１１０Ｙ）により置換される。特に好ましい実施形態では、変異体は、置換Ｄ１１０Ｆを含み、好ましくは、置換Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ／Ｓと組み合わせた、特にＦ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔと組み合わせた置換Ｄ１１０Ｆを含む。
【００９０】
従って、特に好ましいＩＦＮＢ変異体の特定の実施形態は、
【００９１】
【化１３】
2005519946.tif 000008
からなる群から選択された置換を含む変異体を含む。
【００９２】
さらにより好ましくは、ＩＦＮＢ変異体は、
【００９３】
【化１４】
2005519946.tif 000009
からなる群から選択された置換を含む。
【００９４】
最も好ましくは、ＩＦＮＢ変異体は、置換Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ（配列番号３）を含む。
【００９５】
（結合）
上で開示したグリコシル化された変異体は、糖部分とは異なる非ポリペプチド部分にさらに結合し得る。特定の実施形態は、ＷＯ０１／１５７３６号の、「非ポリペプチド部分が、結合基としてリジンを有する分子である発明の結合物」（ｐ．１７〜２２）、「非ポリペプチド部分が、システイン残基に結合した発明の結合物」（ｐ．２２〜２３）および「非ポリペプチド部分が、酸基に結合した発明の結合物」（ｐ．２３〜２５）と題された節において開示される。
【００９６】
非ポリペプチド部分に対する結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することにより、選択した非ポリペプチド部分へより結合しやすい、結合型を最適化しやすい（例えば、ＩＦＮＢ分子の表面に存在する非ポリペプチド部分の最適な分布を保証する、そしてそれによって、例えば、それらの機能を顕著に弱めることなく、効果的にエピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を遮蔽する）分子を生成するように、ポリペプチドを特に適合させ得る。例えば、結合基の導入によって、ＩＦＮＢポリペプチドは、適切な非ポリペプチド部分が結合し、それにより、より効果的な、特異的なかつ／または広範囲の結合を達成する特定のアミノ酸残基の含有量を増加するか、そうでなければ変更する。一つ以上の結合基の除去により、そのような結合が、不利になる（例えば、アミノ酸残基がポリペプチドの機能性部位に、または近接して位置するために（そのような部位における結合は、弱められたレセプター認識のために生じた結合のＩＦＮＢ活性の不活性化または減少という結果をもたらし得る））ポリペプチドの一部における非ポリペプチド部分への結合を避けることが可能になる。さらに、そのような官能基に対する異種結合を避けるために他の結合基に近接して位置する結合基を除去することが好都合となり得る。
【００９７】
非ポリペプチド部分に対する結合基を含む（除去されるかまたは導入された）アミノ酸残基が、非ポリペプチド部分の性質に基づいて、多くの例では、使用した結合方法に基づいて選択されることを理解すべきである。例えば、非ポリペプチド部分がポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキシド由来分子）である場合、結合基としての機能を持ち得るアミノ酸残基は、リジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアルギニンからなる群から選択され得る。非ポリペプチド部分が糖部分である時、結合基はインビボグリコシル化部位であり、好ましくはＮ−グリコシル化部位である。非ポリペプチド部分に対する結合基がＩＦＮＢポリペプチドに導入されるかまたはＩＦＮＢポリペプチドから除去される場合は常に、改変されたＩＦＮＢポリペプチドの位置は、以下から都合よく選択される：
位置は好ましくは、ＩＦＮＢポリペプチドの表面に位置し、さらに好ましくは、溶媒にさらした側鎖の２５％より多くを有するアミノ酸残基により占められ、好ましくは、溶媒にさらした側鎖の５０％より多くを有するアミノ酸残基により占められる。そのような位置は、本明細書の方法の節に記載した野生型ヒトＩＦＮＢ分子の立体構造の分析に基づいて同定した。
【００９８】
とりわけ、インビボの機能性半減期は、結合物の分子量および半減期の増加を提供するために必要な結合基の数に依存し、従って、当該非ポリペプチド部分の分子量に依存する。１つの実施形態では、本発明に使用する結合物は、少なくとも６７ｋＤａの分子量を有し、特に、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７巻（１９７０）、ｐ６８０〜８５に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した場合、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する。ＩＦＮＢは、約２０ｋＤａの分子量を有し、そしてそれゆえに、所望の効果を得るために、さらに約５０ｋＤａが必要である。このことは、例えば、５、１０、１２または２０ｋＤａのＰＥＧ分子または、本明細書に記載された他のものにより提供され得る。
【００９９】
さらなる実施形態では、本発明に使用するための結合物は、１つ以上の、以下の改良された（比較できる条件下で決定される）特徴を持つ。
【０１００】
野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標）またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）と比較して免疫原性の減少は、例えば、少なくとも２５％の減少であり、より好ましくは少なくとも５０％であり、さらにより好ましくは少なくとも７５％である。
【０１０１】
野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）と比較して、インビボの機能性半減期は増加し、そして／または血清半減期は増加した。
【０１０２】
野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）またはＡｖｏｎｅｘ（登録商標））またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）で処置した患者からの中和抗体との反応は減少するかまたはなくなった（例えば、野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）またはＡｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）と比較して、少なくとも２５％の中和の減少、例えば、少なくとも５０％の減少、および好ましくは少なくとも７５％の減少であった）。
【０１０３】
本発明において使用する結合物の抗ウイルス活性の大きさは、決定的ではなく、従って、比較し得る条件下で決定した場合、減少する（例えば、７５％まで）かまたは増加する（例えば、５％まで）かまたは野生型ヒトＩＦＮＢ（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））の抗ウイルス活性と、またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）と同等である。
【０１０４】
さらに、本発明において使用する結合物の抗増殖活性と比較した抗菌活性の程度は、異なり得、従って野生型ヒトＩＦＮＢの抗菌活性より高いか、低いか、または同等であり得る。
【０１０５】
非ポリペプチド部分は好ましくは、ポリマー分子（例えば、ＰＥＧ）であり、ポリマーは、変異体のアミノ酸残基に共有結合していて、該アミノ酸残基は、ポリマー分子に対する結合基を含む。そのような結合基の例は、ＷＯ０３／００２１５２号の７〜８ページにある表に示される。好ましい結合基は、リジン残基のＮ末端アミノ基、ε−アミノ基およびシステイン残基の−Ｓ−Ｈ基を含み、特に、リジン残基のＮ末端アミノ基およびε−アミノ基である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、親ポリペプチドの少なくとも1つのリジン残基が、例えば、「非ポリペプチド部分が、結合基としてリジンを有する分子である発明の結合物」（ＷＯ０１／１５７３６号のｐ．１７〜２２）と題された節に記載された任意の置換により除去される。
【０１０７】
従って、本発明のこの局面の1つの実施形態においては、ＩＦＮＢ変異体のアミノ酸配列は、ヒト野生型ＩＦＮＢのアミノ酸配列とは、少なくとも1つのリジン残基が除去されている点で異なっている。代表的には、１〜５のリジン残基が除去され、特に１〜４または１〜３のリジン残基が除去される。好ましくは、置換により除去されるリジン残基は、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５、Ｋ５２、Ｋ９９、Ｋ１０５、Ｋ１０８、Ｋ１１５、Ｋ１２３、Ｋ１３４およびＫ１３６からなる群から選択され、好ましくは、Ｋ１９、Ｋ３３、Ｋ４５およびＫ１２３から選択される。リジン残基は、任意の他のアミノ酸残基により置き換えることができる。しかし、少なくとも構造的な違いを引き起こすために、アルギニン残基またはグルタミン残基により置き換えるのが好ましい。
【０１０８】
従って、本明細書で開示するＩＦＮＢ変異体は、さらに
【０１０９】
【化１５】
2005519946.tif 000010
からなる群から選択された置換を含み得る。
【０１１０】
従って、少なくとも１つの非ポリペプチド部分（例えば、ポリマー分子、特にＰＥＧ）への好ましいＩＦＮＢ結合物の特定の例は、
【０１１１】
【化１６】
2005519946.tif 000011
からなる群から選択された置換を含むＩＦＮＢ改変体を含む、改変体のアミノ酸残基の結合基に共有結合している。
【０１１２】
ＩＦＮＢ改変体がＰＥＧ化されている場合、それは、通常１〜５個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む。さらなる実施形態では、ＩＦＮＢ分子は１〜５個のＰＥＧ分子を含む（例えば、１〜３個のＰＥＧ分子、例えば、１、２または３個のＰＥＧ分子）。さらなる実施形態では、各ＰＥＧ分子は約５ｋＤａ（キロダルトン）〜１００ｋＤａの分子量を有する（例えば、約１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、例えば、約１２ｋＤａまたは約２０ｋＤａの分子量）。本発明の特に好ましい実施形態では、ＩＦＮＢ改変体は、約２０ｋＤａの分子量を有する１ＰＥＧ分子を含む。
【０１１３】
本明細書中で、ポリマー分子について使用される場合、用語「約」は、近似平均分子量を示し、通常、所定のポリマー調製における特定の分子量分布があるという事実を反映する。
【０１１４】
適切なＰＥＧ分子は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＩｎｃおよびＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃから入手でき、ＳＳ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、アルデヒド−ＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ｍＰＥＧ−ＢＴＣ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレイト化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ｍＰＥＧ（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ  ｍＰＥＧ）（米国特許第５，８８０，２５５号）または、オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド−ＰＥＧ（米国特許第５，１２２，６１４号）から選択され得る。
【０１１５】
（結合体の調製方法）
本明細書中に開示された、非ポリペプチド部分（特にＰＥＧポリマー）のＩＦＮＢ改変体への結合に関する特定の詳細は、ＷＯ０１／１５７３６のｐｐ．３２〜４０の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ」と題された節に示される。
【０１１６】
（糖部分への結合）
本明細書中に記載されるようなＩＦＮＢポリペプチドのインビボでのグリコシル化を達成するために、ＩＦＮＢ改変体をコードするヌクレオチド配列は、グリコシル化している真核発現宿主（例えば、ＣＨＯ細胞）に挿入されなければならない。適切な発現宿主細胞は、ＷＯ０１／１５７３６のｐ．３６の「ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｓｕｇａｒ  ｍｏｉｅｔｙ」と題された節に記載される。
【０１１７】
（ＩＦＮＢポリペプチド改変体を調製する方法）
本発明において使用するためのＩＦＮＢ改変体は（必要に応じて、グリコシル化した形態において）、当業者に公知の適切な任意の方法により産生され得る。このような方法は、ポリペプチド改変体をコードするヌクレオチド配列を構築することおよび形質転換またはトランスフェクトされた宿主に適切な配列を発現することを含む。しかし、本発明に使用するポリペプチドは、あまり効率的ではないにもかかわらず、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成および組換えＤＮＡ技術の組み合わせにより産生され得る。
【０１１８】
本発明に使用するためのＩＦＮＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ＩＦＮＢをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する）の単離、または合成により構築され得、次いで、ヌクレオチド配列を改変して関連するアミノ酸残基の導入（すなわち、挿入または置換）または関連するアミノ酸残基の除去（すなわち欠失または置換）をもたらす。
【０１１９】
ヌクレオチド配列は、好都合なことに、周知の方法に従う部位特異的な突然変異形成により改変される（例えば、Ｍａｒｋら、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、ｐｐ．５６６２〜６６（１９８４）；および米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと）。
【０１２０】
その代わりに、ヌクレオチド配列は、化学合成、例えば、オリゴヌクレオチド合成機を使用することにより調製される。ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、そして好ましくは、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞に都合の良いコドンを選択する。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ、連結反応または連結連鎖反応（ＬＣＲ）により合成され、アセンブルされ得る。個々のオリゴヌクレオチドは、代表的には、相補的なアセンブリに対する５’または３’のオーバーハングを含む。
【０１２１】
一旦合成、部位特異的突然変異形成または他の方法によりアセンブルされると、ＩＦＮＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えベクターに挿入され、所望の形質転換された宿主細胞におけるＩＦＮＢ改変体の発現に必要なコントロール配列に、作動可能に結合する。
【０１２２】
適切な発現ベクター、コントロール配列、宿主細胞、産生培地、精製技術などを含む、本明細書中に開示されるＩＦＮＢ改変体の産生の詳細な記述は、ＷＯ０１／１５７３６のｐｐ．４３〜５１の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  β  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ」と題された節に見出され得る。
【０１２３】
ＩＦＮＢポリペプチドの生物学的活性は、当業者に公知の任意の適した方法により、アッセイされ得る。このようなアッセイとしては、ＥＰ  ０  ４１  ３１３  Ｂ１に記載されるような、抗ウイルス活性の抗体中和、プロテインキナーゼ、オリゴアデニレート２，５−Ａシンセターゼまたはホスホジエステラーゼ活性の誘導が挙げられる。このようなアッセイとしてはまた、免疫調節アッセイ（例えば、米国特許第４，７５３，７９５号を参照のこと）、増殖阻害アッセイおよびインターフェロンレセプターを発現する細胞への結合の測定も挙げられる。
【０１２４】
本発明において使用するポリペプチドまたは結合体の生物学的活性を決定するための特定のアッセイは、本明細書中の材料および方法の節に開示する。
【０１２５】
（薬学的組成物）
ＩＦＮＢ分子は、「そのままで」および／またはそれを形成する塩において使用され得る。適した塩としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムおよびマグネシウム）との塩および例えば亜鉛塩が挙げられるが、これらに限定されない。これらの塩または錯体は、結晶構造および／またはアモルファス構造として存在し得る。
【０１２６】
ＩＦＮＢ分子は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む組成中で投与される。「薬学的に受容可能な」は、それを投与された患者に、いかなる有害な効果も誘導しないキャリアまたは賦形剤を意味する。このような薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤は、当該分野で周知である。
【０１２７】
ＩＦＮＢ分子は、周知の方法により、薬学的組成物に処方され得る。適した処方物は、米国特許第５，１８３，７４６号、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓ．ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＬ．Ｈｏｖｇａａｒｄ編、ＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ［２０００］；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ａ．Ｋｉｂｂｅ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］に記載されている。
【０１２８】
ＩＦＮＢ分子は、液体、ゲル、凍結乾燥物、肺の分散剤または他の任意の適した形態（例えば、圧縮した固体）を含む多様な形態で、薬理学的組成物に処方され得る。好ましい形態は、処置されている特定の徴候に依存し、これは、当業者には明らかである。
【０１２９】
薬学的組成物は、非経口的投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与）、経口的投与、脳内投与、皮内投与、鼻腔内投与、肺内投与、吸入により投与され得るか、または他の任意の受容可能な様式（例えば、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ技術またはＰｒｏＬｅａｓｅ技術を使用して）において投与され得る。投与の好ましい様式は、処置されている特定の徴候に依存し、これは、当業者には明らかである。
【０１３０】
適した薬学的組成物の詳細な記載は、ＷＯ０１／１５７３６のｐｐ．５２〜６１「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ」と題された節に与えられる。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態では、薬学的組成物は、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体（例えば、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（Ｃｙｄｅｘ社製、Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、Ｋａｎｓａｓ  ６６２１３、ＵＳ）を含む。本明細書で開示されたＩＦＮＢ改変体およびスルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体を含む、薬学的組成物に関する詳細は、ＷＯ０３／００２１５２のｐｐ．３７〜４９「Ｔｈｅ  ｓｕｌｆｏａｌｋｙｌ  ｅｔｈｅｒ  ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ」と題された節に見出され得る。
【０１３２】
（治療用途）
本明細書で開示された改変体および結合体は、主に神経性症状または精神医学的症状、眼性疾患、心臓血管疾患、心肺疾患、呼吸器系疾患、腎臓疾患、尿疾患および生殖性疾患、消化管疾患および内分泌腺異常および代謝異常を有する中枢神経系または末梢神経系のヒト疾患の治療的処置または予防的処置のために有用である。特に、このような状態および疾患としては、炎症（例えば、興奮性組織（例えば中枢神経系組織、末梢神経系組織、心臓組織または網膜組織（例えば、脳、心臓、または網膜／眼）における興奮性組織）に有害な影響を与える神経炎症性過程）が挙げられる。
【０１３３】
従って、本明細書で開示される改変体は、多様な条件下および環境下において炎症過程から生じる興奮性組織の損傷を処置または予防するために使用され得る。このような条件および環境の非限定的な例は、以下の表１に提供される。
【０１３４】
本発明に従って処置し得る神経組織病態の保護の例においては、このような病態は、ニューロン組織の酸化の減少から生じる病態を含む。ニューロン組織への酸素の利用可能性を減少し、ストレス、損傷および最終的には、神経細胞死を生じるいかなる状態も、本発明の方法により処置され得る。
【０１３５】
一般に、低酸素症および／または虚血と称される場合、これらの状態は、発作、血管閉塞、出生前の酸素欠乏または出生後の酸素欠乏、窒息（ｓｕｆｆｏｃａｔｉｏｎ）、窒息（ｃｈｏｋｉｎｇ）、近似溺死（ｎｅａｒ  ｄｒｏｗｎｉｎｇ）、一酸化炭素中毒、煙草吸入、外傷（外科治療および放射線治療を包めて、仮死、癲癇、低血糖症、慢性閉塞性肺疾患、気腫、成人呼吸窮泊症候群、低血圧性ショック、敗血性ショック、アナフィラキシーショック、インスリンショック、鎌状赤血球発症、心停止、律動異常、窒素性ナルコーシス、および心肺バイパス手順により誘発される神経性欠損から生じるか、またはそれらが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
１つの実施形態では、本明細書で開示されるＩＦＮＢ改変体は、例えば、腫瘍切除または動脈瘤修復などの外科的手順の間、傷害または組織損傷のリスクから生じる傷害または組織損傷を防止するために投与され得る。本明細書に記載される方法により処置され得る、低血糖症により誘発されるかまたは低血糖症から生じる他の病態としては、インスリン過剰摂取（医原性の高インスリン血症ともいう）、膵島細胞腺腫、成長ホルモン欠損症、低コルチゾール症（ｈｙｐｏｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ）、薬物過剰摂取およびある種の腫瘍が挙げられる。
【０１３７】
興奮性ニューロン組織損傷から生じる他の病態としては、発作障害（例えば、癲癇、痙攣または慢性発作障害）が挙げられる。他の処置し得る状態および疾患としては、例えば、発作、低血圧、心停止、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳性麻痺、脳または脊髄の外傷、エイズ痴呆、加齢性認知性機能喪失、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、発作障害、アルコール中毒、網膜虚血、緑内症から生じる視神経損傷、およびニューロン損失のような疾患が挙げられる。
【０１３８】
本明細書で開示されるＩＦＮＢ改変体は、網膜組織の状態および網膜組織に対する損傷を処置するために使用され得る。このような疾患としては、網膜虚血、黄斑変性、色素性網膜炎、網膜色素変性症、動脈硬化性網膜症、高血圧性網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、低血圧および糖尿病性網膜症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明の方法原理は、興奮性組織に対する放射線損傷から生じる傷害を防護または処置するために使用され得る。本発明の方法のさらなる有用性は、神経毒性中毒（例えば、ドモイックアシッド貝中毒（ｄｏｍｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）、神経ラチリスムおよびグアム病（Ｇｕａｍ  ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病）の処置に存在する。
【０１４０】
上に記載したように、本発明はまた、上に記載したようなインターフェロンβ改変体の末梢投与により、霊長類における興奮性組織機能を増強する方法に関する。種々の疾患および状態は、この方法を使用した処置に対して影響を受けやすく、そしてさらに、この方法は、任意の状態および疾患の非存在下で認識機能を増強するために有用である。本発明のこれらの用途は、以下にさらに詳細に記載され、そして、ヒトおよび非ヒト霊長類の両方における学習および訓練の促進にかかわる。
【０１４１】
本発明のこの局面の方法により処置し得る中枢神経系に関する状態および疾患としては、気分障害、不安障害、鬱病、自閉症、注意欠陥過活動性障害および認識機能不全が挙げられるがこれらに限定されない。これらの状態は、ニューロン機能の増強から利益を受ける。本発明の教示に従って処置し得る他の障害は、睡眠妨害（例えば、睡眠時無呼吸および旅行関連性障害）；クモ膜下出血および動脈瘤出血（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ  ｂｌｅｅｄ）、低血圧ショック、震盪性傷害、敗血性ショック、アマフィラキシーショックおよび種々の脳炎および髄膜炎の後遺症、例えば、結合組織疾患関連脳炎（例えば、狼蒼）を含む。他の使用としては、神経毒（例えば、ドモイックアシッド貝中毒、神経ラチリスムおよびグアム病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病）による中毒の予防または防護；塞栓性損傷または虚血性損傷に対する手術後の処置；全脳放射線照射；鎌状赤血球発症および子癇が挙げられる。
【０１４２】
興奮性組織損傷が起源であると考えられる種々の神経心理学的な障害は、本明細書中に開示された方法により処置され得る。炎症過程そしてそれ故にニューロン損傷が関与し、そして本発明により提供される処置の対象である慢性的な障害としては、中枢神経系および／または末梢神経系に関連する障害が挙げられ、これらとしては、以下が挙げられる：加齢性認識機能障害および老人性痴呆症、慢性発作性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆症、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、結節硬化症、ウィルソン病大脳および進行性核上性麻痺、グアム病、レーヴィ小体痴呆、プリオン病（例えば、海綿状脳障害、例えば、クロイツフェルトヤコブ病）、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、フレイドリッヒ（Ｆｒｅｉｄｒｉｃｈ）運動失調および他の運動失調ならびにジル・ド・ラ・ツレット症候群、発作性障害（例えば、癲癇性発作性障害および慢性発作性障害）、発作、脳外傷または脊髄外傷、エイズ痴呆、アルコール中毒、自閉症、網膜虚血症、緑内症、高血圧および睡眠障害のような自立神経性機能障害、ならびに神経精神医学的な障害（精神分裂病、分裂感性情障害、注意欠陥障害、気分変調障害、大鬱病性障害、そう病、強迫性障害、精神活性物質使用障害、不安、パニック障害、ならびに単極性（ｕｎｉｐｏｌａｒ）情動障害および双極性（ｂｉｐｏｌａｒ）情動障害）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる神経精神医学的障害および神経変性障害としては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ’ｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ）に列挙されるものが挙げられ、その最新版は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０１４３】
以下の表は、前述のインターフェロンβ改変体による処置に対して影響を受けやすい種々の状態および疾患についてのさらなる例示的な非限定的な徴候を列挙する。
【０１４４】
【表１−１】
2005519946.tif 000012
【０１４５】
【表１−２】
2005519946.tif 000013
【０１４６】
【表１−３】
2005519946.tif 000014
【０１４７】
【表１−４】
2005519946.tif 000015
【０１４８】
【表１−５】
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【０１４９】
【表１−６】
2005519946.tif 000017
【０１５０】
【表１−７】
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【０１５１】
【表１−８】
2005519946.tif 000019
上で述べたように、これらの疾患、障害または状態は、本明細書で開示されたＩＦＮＢ改変体により提供される利点の範囲の単なる例示である。従って、本発明は、一般に機構的外傷の結果の治療的処置または予防的処置を提供する。疾患、障害またはＣＮＳおよび／もしくは末梢神経系の状態に対する治療的処置または予防的処置が好ましい。
【０１５２】
非常に好ましい本発明の実施形態においては、処置すべき疾患は、発作（例えば、虚血性発作または出血性発作）である。虚血性発作においては、アテローム性動脈硬化症または血餅のいずれかが血管をブロックするので、脳の一部への血液供給が遮断される。出血性発作においては、血管が破裂することにより、正常な血流の阻止および脳の領域への血液の漏れおよびその破壊が生じる。
【０１５３】
虚血性発作を伴い、封鎖は、脳への動脈経路に沿うどこにおいても生じ得る。例えば、大きな脂肪物質の沈着物（アテローム）は、頸動脈に発生し、その血流を減少し、少量流れるようにし得る。この状態は、深刻である。なぜなら、通常各動脈が脳の血液供給の大きなパーセンテージを供給するからである。脂肪物質は、頸動脈の壁からも、ちぎり取れ得、血流と共に移動し、そしてより小さい動脈内にくっつき、それを完全にブロックする。頸動脈および椎骨動脈ならびにその分枝は、他の方法によりブロックされ得る。例えば、心臓においてまたはその弁の１つにおいて形成された血餅は、遊離し（塞栓になり）、動脈を介して脳まで移動し、そこでひっかかる。その結果は、塞栓性発作である。このような発作は、最近心臓外科手術を受けた人々および欠陥のある心臓弁または異常なリズム（特に心房性細動）を有する人々においては、最も一般的である。
【０１５４】
大部分の発作は、突然始まり、急速に発達し、数分以内に脳損傷を引き起こす。よりまれには、発作は、脳死が安定して拡大し続ける間、数時間から１日または２日悪化し続ける。
【０１５５】
潜在的発作を示す症状は、即時の医療的注意を必要とし；医師は、時折、損傷を減じ得、急速な作用によるさらなる損傷を防止し得る。発作の多くの効果は、特に最初の数時間、医療を必要とする。最初に、医師は、通常酸素を投与し、静脈内に線を挿入し、患者が流体および食物を受け取っていることを確実にする。発作の過程においては、抗凝血剤（例えば、ヘパリン）を投与し得る。
【０１５６】
発作および関連疾患の処置において、本明細書に記載されたＩＦＮＢ改変体の効果は、当業者に公知の種々の動物モデルを使用して評価され得る。本明細書に記載された改変体が、発作および関連疾患（主に、脳虚血および脊髄虚血）に利益的効果を有するか否かを決定するために、多数の試験が実施され得る。参照は、以下の関連する試験のためになされるが、他の試験も適していることを証明し得る。
【０１５７】
ｉ）血栓塞栓症発作モデル（Ｌａｐｃｈａｋら、Ｓｔｒｏｋｅ  ２００２；３３巻：１６６５〜１６７０またはＬａｐｃｈａｋら、Ｓｔｒｏｋｅ  ２００２；３３巻：１４１１〜１４１５を参照のこと）、
ｉｉ）光血栓症（Ｚｈａｏら、Ｓｔｒｏｋｅ  ２００２；３２巻：２１５７〜２１６３を参照のこと）
ｉｉｉ）クモ膜下出血（Ｇｒａｓｓｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ２００２；９６巻：５６５〜５７０を参照のこと）
ｉｖ）動脈瘤クリップによる一過性中大脳動脈閉塞（Ｙｅｎａｒｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００１；２３巻：７２〜７８を参照のこと）
ｖ）一過性脊髄虚血（動脈瘤クリップ、バロン）（Ｍｕｒａｋａｗｉら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００１；２９巻：８１４〜８１８；Ｌｉｐｓら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．２０００；９３巻：１３０３〜１３１１；Ｌｉｐｓら．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．２００２；１４巻：３５〜４２；Ｌａｐｃｈａｋら、Ｓｔｒｏｋｅ  ２００１；３３巻：１２２０〜１２２５またはＳｕｋａｒａｉら、Ｓｔｒｏｋｅ  ２０００；３１巻：２００〜２０７を参照のこと）および
（材料および方法）
（材料）
ＨｅＬａ細胞−（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能）
ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＵＳＡ）
ｐＣＤＮＡ  ３．１／ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＵＳＡ）
ｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）
ヒトゲノムＤＮＡ（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ、ＵＳＡ）
ＤＭＥＭ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能）
（アッセイ）
（インターフェロンアッセイの概略）
ＩＦＮＢが、ＨｅＬａ細胞においてＩ型インターフェロンレセプターと相互作用し、そしてそれを活性化するということは、以前に発表されている。その結果、転写は、インターフェロン刺激反応因子（ＩＳＲＥ）を含むプロモーターにおいて活性化される。従って、ＨｅＬａ細胞に配置したＩＳＲＥ結合型ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）の使用によって、インターフェロンレセプターのアゴニストをスクリーニングすることが可能である。
【０１５８】
（第１アッセイ）
ＨｅＬａ細胞をＩＳＲＥ−ＬｕｃおよびｐＣＤＮＡ  ３．１／ｈｙｇｒｏを用いて共トランスフェクトし、そして、病巣（細胞クローン）をハイグロマイシンＢを含むＤＭＥＭ培地における選択により作り出した。細胞クローンを、ＩＦＮＢ存在下または非存在下においてルシフェラーゼ活性についてスクリーニングした。刺激されないルシフェラーゼ活性に対しての刺激されたルシフェラーゼ活性の最高の比率を示すそれらのクローンは、さらなるアッセイにおいて使用された。
【０１５９】
ムテインをスクリーニングするために、１５，０００細胞／ウェルを９６ウェル培養プレートに播種し、ＤＭＥＭ培地において一晩インキュベートした。次の日、ムテインならびに公知の標準を種々の濃度で細胞に添加する。プレートを、５％ＣＯ２空気雰囲気下で３７℃で６時間インキュベートする。引き続き、ＬｕｃＬｉｔｅ基質（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。プレートを密閉し、ＳＰＣ（単光子計数法）モードのＴｏｐＣｏｕｎｔルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）により発光を測定する。各個々のプレートは、ＩＦＮＢを刺激コントロールとして用いてインキュベートしたウェルおよび非刺激コントロールとして通常の培地を含む他のウェルを含む。刺激ルシフェラーゼ活性と非刺激ルシフェラーゼ活性との間の比は、ムテイン活性および実験−実験間のバリエーションの両方の内部標準として働く。
【０１６０】
（第２アッセイ）
現在、１８の非対立遺伝子インターフェロンα遺伝子および１つのＩＦＮＢ遺伝子がある。これらのタンパク質は、重複する活性を示し、従って、ムテインがＩＦＮＢの選択性および特異性を保持することを保証するために、重要である。
【０１６１】
β−Ｒ１遺伝子は、ＩＦＮＢにより活性化されるが、他のインターフェロンによっては活性化されない。従って、β−Ｒ１の転写は、ＩＦＮＢ活性化の第２のマーカーとして働き、ムテインがＩＦＮＢ活性を保持していることを保証するために使用される。インターフェロン感受性転写を駆動することが示されている（Ｒａｎｉ．Ｍ．Ｒ．ら（１９９６）ＪＢＣ  ２７１巻２２８７８〜２２８８４）β−Ｒ１の３００ｂｐのプロモーターフラグメントを、ＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡから単離し、ｐＧＬ３基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。得られたβ−Ｒ１：ルシフェラーゼ遺伝子は、上記の第１のアッセイに類似したアッセイにおいて使用される。神経膠星状細胞腫においては、得られたβ−Ｒ１：ルシフェラーゼ遺伝子は、インターフェロンαより２５０倍高いＩＦＮＢに対する感受性を示すことが記載されている（Ｒａｎｉら、ｏｐ  ｃｉｔ）。
【０１６２】
（ＥＬＩＳＡ  アッセイ）
ＩＦＮＢの濃度は、市販のサンドイッチ免疫測定法（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）の使用により定量化される。キットは、試験サンプルにおいてＩＦＮＢを捕捉および検出するためのマウスモノクローナル抗ＩＦＮＢ抗体を用いるＥＬＩＳＡに基づいている。検出抗体は、ビオチンに結合される。
【０１６３】
試験サンプルおよび組換えヒトＩＦＮＢ標準は、１０〜０．２５ｎｇ／ｍＬの濃度でマイクロタイタープレートに０．１ｍＬ添加され、捕捉抗体によりプレコートされる。プレートは、室温で１時間インキュベートされる。試料および標準はキットの希釈緩衝液に希釈される。
【０１６４】
プレートを、キットの緩衝液中で洗浄し、０．１ｍＬのビオチン化した検出抗体とともに、室温で１時間インキュベートする。もう１回の洗浄後、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体を０．１ｍＬ中に添加し、室温で１時間インキュベートする。
【０１６５】
反応を０．１ｍＬテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質色原体の添加により視覚化する。プレートを室温で暗黒下で１５分間インキュベートし、停止液の添加により反応を停止する。ＥＬＩＳＡ読み取り装置を使用して４５０ｎｍにおける吸光度を読み取る。
【０１６６】
（レセプター結合アッセイ）
本発明に使用するためのポリペプチドまたは結合体のレセプター結合能力は、「レセプター結合に対するＩＦＮＢ（Ｐｈｅ１０１）の分析」（これは、ＤａｕｄｉまたはＡ５４９細胞に基づいている）と題されたＷＯ９５／２５１７０号に記載されたアッセイを使用して決定し得る。ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２の可溶性ドメインは、本質的にＡｒｄｕｉｎｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、８巻、１８６７〜１８７７または本明細書の実施例９に記載されるように入手し得る。
【０１６７】
あるいは、レセプター結合能力は、架橋剤（例えば、以下のとおりに、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ  ＵＳＡから入手可能である二スクシニミジル基質（ＤＳＳ））を使用して決定される。
【０１６８】
ポリペプチドまたは結合体を製造者の指示書に従ってＤＳＳの存在下または非存在下で可溶性ＩＦＮＡＲ−２レセプターとともにインキュベートする。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗ＩＦＮＢ抗体またはＩＦＮＡＲ２抗体を使用するウエスタンブロットを行う。機能的ＩＦＮＢポリペプチド／結合体：レセプターの相互作用の存在は、ＤＳＳの存在下におけるレセプターおよびＩＦＮＢの分子サイズにおける増加により明らかである。
【０１６９】
さらに、本発明において使用するためのポリペプチドまたは結合体および両レセプターサブユニット（ＩＦＮＡＲ−１およびＩＦＮＡＲ−２）を使用した架橋アッセイにより、インターフェロンレセプター１結合能力を確立し得る。これに関して、ＩＦＮＡＲ−１は、インターフェロンβ：ＩＦＮＡＲ−２複合体が形成された後のみ結合することが発表されている（Ｍｏｇｅｎｓｅｎら、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅｒｃｈ、１９巻：１０６９〜１０９８、１９９９）。
【０１７０】
（インビトロ免疫原性試験）
本発明において使用するための結合体またはポリペプチドの免疫原性の減少は、参照分子または調製物と比較して、結合体またはポリペプチドの免疫反応性を測定するＥＬＩＳＡ法の使用により決定される。参照分子または調製物は、通常組換えＩＦＮＢ調製物（例えば、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）またはこれらの生成物がつくられた方法と同等の方法により生じた、別の組換えＩＦＮＢ調製物）である。ＥＬＩＳＡ法は、これらの組換えＩＦＮＢ調製物の１つを用いて処置した患者からの抗体に基づいている。本発明の結合体またはポリペプチドが、本アッセイにおいて参照分子または調製物より統計的に有意に低い応答を有する場合、免疫原性は、減少すると考えられる。
【０１７１】
免疫原性を決定する別の方法は、Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５巻、１９７４〜７８、１９９５に記載された方法と類似の方法によりＩＦＮＢ（すなわち、任意の市販のＩＦＮＢ製品）を用いて処置した患者からの血清の使用による。抗ウイルス中和バイオアッセイにおいては、免疫原性の減少は、野生型ＩＦＮＢ参照分子と比較して、本発明における使用のための患者の血清による結合体の阻害の減少を生じる。さらに、生物化学的なＩＦＮ結合アッセイにおいては、参照ＩＦＮＢ分子より少ない免疫原性結合体がより小さい範囲で患者のＩｇＧに結合すると予想される。
【０１７２】
中和アッセイについては、抗ウイルス中和バイオアッセイにおいて約８０％のウイルス防御を生じる濃度に参照分子および改変体分子を添加する。ＩＦＮＢタンパク質を、種々の希釈（１：２０において開始する）で患者の血清と混合する。
【０１７３】
（抗ウイルス活性）
Ａ５４９細胞（ＣＣＬ１８５、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）および脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルス（ＶＲ−１２９Ｂ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を使用して抗ウイルスバイオアッセイを行う。
【０１７４】
細胞を９６ウェル組織培養プレートに、１０，０００細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃で５％ＣＯ２空気雰囲気でインキュベートする。本発明における使用のためのポリペプチドまたは結合体を１００〜０．０００１ＩＵ／ｍＬの濃度で、ウシ胎仔血清および抗生物質を含む全量１００μｌのＤＭＥＭ培地に添加する。
【０１７５】
２４時間後、培地を除去し、ＥＭＣウイルスを含む０．１ｍＬの新たな培地を各ウェルに添加する。ＩＦＮＢが含まれない細胞培養において、２４時間後、１００％の細胞死を引き起こす濃度でＥＭＣウイルスを添加する。
【０１７６】
さらに２４時間後、ＷＳＴ−１アッセイを使用して、ポリペプチドまたは結合体の抗ウイルス効果を測定する。０．０１ｍＬのＷＳＴ−１（ＷＳＴ−１細胞増殖剤、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を０．１ｍＬ培地に添加し、５％のＣＯ２空気雰囲気下で、３７℃で１／２〜２時間インキュベートする。生存可能な細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるＷＳＴ−１テトラゾリウム塩の切断は、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって定量化されるホルマザンの形成を生じる。
【０１７７】
（インターフェロン刺激応答性成分（ＩＳＲＥ）アッセイにおける活性の中和）
抗ＩＦＮＢ血清のＩＦＮＢ中和効果をＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ活性アッセイを使用して分析する。
【０１７８】
ＩＦＮＢ処置した患者からの血清または免疫化した動物からの血清を使用する。血清は、一定濃度（希釈  １：２０〜１：５００（患者血清）または２０〜６００ｎｇ／ｍＬ（動物血清））あるいは１／２０ｎｇ／ｍＬ（患者血清）または６００ｎｇ／ｍＬ（動物血清）で開始する５倍の連続した血清の希釈のいずれかで添加される。ＩＦＮＢは、２５．０００ＩＵ／ｍＬで開始する５倍希釈または一定濃度（０．１〜１０ＩＵ／ｍＬ）のいずれかで、１０％のＦＣＳを添加した全量８０μｌのＤＭＥＭ培地に添加される。血清をＩＦＮＢとともに３７℃で１時間インキュベートする
サンプルは次いで、ＤＭＥＭ培地で２４時間の前培養（１５，０００細胞／ウェル）から増殖したＩＳＲＥ−Ｌｕｃを用いてトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を含む９６ウェル組織培養プレートに移す。培地を５％ＣＯ２空気雰囲気下で３７℃で６時間インキュベートする。引き続き、ＬｕｃＬｉｔｅ基質（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を各ウェルに添加する。プレートを密封し、ＳＰＣ（単光子計数法）モードのＴｏｐＣｏｕｎｔルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）により発光を測定する。
【０１７９】
ＩＦＮＢサンプルを一定量の血清の存在下で滴定する場合、中和効果を、ＥＣ５０（血清あり）／ＥＣ５０（血清なし）として定量した倍阻害（ＦＩ）として定義した。ＩＦＮＢ改変体タンパク質の抗体中和化の減少は、
【０１８０】
【数１】
2005519946.tif 000020
と定義される。
【０１８１】
（生物学的半減期測定）
生物学的半減期の測定は、文献に記載された多数の方法により行われ得る。１つの方法は、Ｍｕｎａｆｏら  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９８、５巻２号、１８７〜１９３に記載され、著者らは、ＩＦＮＢの皮下投与および筋肉内投与後にＩＦＮＢの血清レベルを検出するＥＬＩＳＡ法を使用している。
【０１８２】
静脈内投与後のＩＦＮＢ血清濃度の急速な減少は、ＩＦＮＢ処置に対する生物学的な応答を評価することを重要にする。しかし、本発明に使用する改変体または結合体は、血清の半減期を延長すること、そして、また静脈内投与後、例えばＥＬＩＳＡ法による測定または一次スクリーニングアッセイによる測定を可能にすることが企図される。
【０１８３】
種々の薬理学的なマーカー（例えば、血清ニュープテリン（ｓｅｒｕｍ  ｎｅｕｐｔｅｒｉｎ）およびβ２マイクログロブリン）も研究されてきた（Ｃｌｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９９）１８（１）：２７〜３４）。これらは、延長された生物学的効果を評価するために等しく良好に使用され得る。これらの実験は、適切な動物種（例えば、ラット）においてもまた、行われ得る。
【０１８４】
ＩＦＮＢの生物学的効果（例えば、抗ウイルス効果、抗増殖性効果および免疫調節性効果（例えば、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９５  第３７巻１号７〜１５に記載される）を評価するアッセイは、本明細書に記載された、野生型ＩＦＮＢと比較して結合体の生物学的効力を評価するための第１スクリーニングアッセイおよび第２スクリーニングアッセイとともに使用され得る。
【０１８５】
（接近可能表面領域（ＡＳＡ））
構造における個々の原子の接近可能表面領域（ＡＳＡ）を算定するために、コンピュータプログラムアクセス（Ｂ．ＬｅｅおよびＦ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９〜４００（１９７１）２版（著作権（ｃ）１９８３  Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用する。この方法は、代表的には１．４Åのプローブサイズを使用し、そしてプローブの中心により形成された領域として接近可能表面領域（ＡＳＡ）を定義する。この計算の前に、全水分子および全水素原子を座標セットから除去し、同様に、直接タンパク質に関係しない他の原子も座標セットから除去する。代替プログラム（例えば、プログラムＷｈａｔＩｆ  Ｇ．Ｖｒｉｅｎｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．（１９９０）８、５２〜５６）が、ＡＳＡを算出するために利用し得、接近可能分子表面を計算するために、選択肢「接近可能性（Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」を使用して、ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｓｅｒｖｅｒｓ２／（Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、ＣＡＢＩＯＳ（１９９８）１４、５２３〜５２８）にてインターフェースで電子的に利用し得る。
【０１８６】
（側鎖の部分ＡＳＡ）
側鎖中の原子のＡＳＡの合計を、伸張したＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチド中のその残基型の側鎖原子のＡＳＡを示す値で除算することにより、側鎖原子の部分ＡＳＡを算出する。Ｈｕｂｂａｒｄ、ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２０、５０７〜５３０を参照のこと。この例では、ＣＡ原子はグリシン残基の側鎖の一部としてみなされるが、残りの残基について、そうはみなされない。以下の表は、側鎖についての１００％ＡＳＡ基準を示す。
【０１８７】
【数２】
2005519946.tif 000021
（表面に露出されたアミノ酸残基の決定）
２．２Å分解能のヒトインターフェロンβの３次元結晶構造（Ｋａｒｐｕｓａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：１１８１３〜１１８１８）が、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手可能（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７７）１１２．ｐｐ．５３５）であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ／におけるＴｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＰＤＢを介して、登録番号１ＡＵ１に基づいて電子的に入手可能である。この結晶構造は、Ａ分子が使用されるこの実施例においてヒトインターフェロンβの２つの独立した分子を含む。
【０１８８】
（表面露出）
上に記載されたＷｈａｔＩｆプログラムを使用して、以下の残基が、それらの側鎖原子に対する０表面接近可能性を有することを見出した（ＧｌｙについてＣＡ原子の接近可能性を使用する）：Ｇ７、Ｎ１４、Ｃ１７、Ｌ２１、Ｉ４４、Ａ５５、Ａ５６、Ｔ５８、Ｉ５９、Ｍ６２、Ｌ６３、Ｌ９８、Ｌ１２２、Ｙ１２５、Ｉ１２９、Ｌ１３３、Ａ１４２、Ｗ１４３、Ｖ１４６、Ｉ１５０、Ｎ１５３、Ｉ１５７、Ｌ１６０、Ｔ１６１およびＬ１６４。
【０１８９】
（部分表面露出）
さらなる分析のために、立体構造の衝突に起因して、Ｒ７１，Ｒ１１３、Ｋ１１５、Ｌ１１６、Ｍ１１７残基の側鎖を再モデル化することが必要であった。再モデル化をＭＳＩ  ＩＮＣのＭｏｄｅｌｅｒ９８を使用して行った。再モデル化インターフェロンβ分子（アミノ酸残基を含み、Ｎ結合型糖部分を除く）に関してＡｃｃｅｓｓコンピュータープログラムを使用して部分的ＡＳＡの計算を行うことにより、結果として側鎖のうちの２５％より多くが表面に露出された側鎖を有する以下の残基が生じた。
【０１９０】
【化１７】
2005519946.tif 000022
【実施例】
【０１９１】
（実施例１）
（哺乳動物細胞および昆虫細胞におけるＩＦＮＢの発現のための発現カセットの設計）
その天然のシグナルペプチドを含むヒトＩＦＮＢをコードする全長ｃＤＮＡを含むＤＮＡ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｍ２８６２２（配列番号１に示される））を、哺乳動物細胞における高発現を容易にするために改変した。まず、ＡＴＧ開始コドンの前後をＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７  ８月２０日；１９６（４）：９４７〜５０）に従って、ＡＴＧ開始コドンの上流のコンセンサス配列に完全一致が存在するように改変した。第２に、非常に発現するヒト遺伝子において頻繁に使用されるコドンへとコドン使用に偏りを作成することによって、天然ヒトＩＦＮＢのコドンを改変した。引き続き、配列中の特定のヌクレオチドを、ＤＮＡ制限酵素のための認識部位を導入する（これは、以後のＤＮＡ配列のより容易な改変を可能にする）ために、他の配列により置換した。プライマーを、その遺伝子が合成され得るように設計した：
【０１９２】
【化１８】
2005519946.tif 000023
プラチナＰｆｘポリメラーゼキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および標準的３段階ＰＣＲサイクルパラメーターを使用した一段階ＰＣＲによって、これらのプライマーを集めて合成遺伝子にした。構築した遺伝子を、同条件を使用したＰＣＲにより増幅した。
【０１９３】
精製ＴＡＧをＩＦＮＢ分子に組み込むために、プライマーＣＢＰｒｏＦｐｒ１および−１４置換した以下：
【０１９４】
【化１９】
2005519946.tif 000024
プライマーの使用を除いて上記と同じＰＣＲ条件を使用して、ヒトＩＦＮＢのＮ末端伸張形態をコードするｃＤＮＡを合成した。
【０１９５】
合成された遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）中の５’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’のＢａｍＨＩ部位の間にクローニングし、ｐＣＢＰｒｏＦ１およびｐＣＢＰｒｏＦ２を得た。
【０１９６】
上記標準的ＰＣＲ条件および以下：
【０１９７】
【化２０】
2005519946.tif 000025
のプライマーを使用することにより、ｐＣＩ−Ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来の合成イントロンを増幅し、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した３３２ｂｐ  ＰＣＲ断片を得、プラスミドｐＣＢＰｒｏＦ１およびプラスミドｐＣＢＰｒｏＦ２の５’ＵＴＲに挿入し、ｐＣＢＰｒｏＦ４およびｐＣＢＰｒｏＦ５を得た。
【０１９８】
個々のアミノ酸についてコドンを、ＰＣＲが導入した配列中の改変を古典的クローニング技術により発現プラスミドに導入し得るように、ＰＣＲにより、コード領域の適切な領域を増幅することにより改変した。例えば、ｐＣＢＰｒｏＦ１中の位置１０５５〜位置１２４３の領域にまたがるＰＣＲ断片に、Ｋ４５Ｒ置換を導入するために、プライマー：
【０１９９】
【化２１】
2005519946.tif 000026
を使用した。ＰＣＲ断片およびｐＣＢＰｒｏＦ１の両方を、ＮａｒＩおよびＢｓｉＷＩ（両方とも１つしか存在しない）を用いて切断した。ＰＣＲ断片およびｐＣＢＰｒｏＦ１のベクター骨格を精製し、ライゲーションし、ｐＣＢＰｒｏＦ１中のＡｒｇコドンＣＧＣを用いてＬｙｓ４５コドンＡＡＧを置換した。
【０２００】
さらに、ＳＯＥ（配列突出伸張）ＰＣＲを、アミノ酸置換の導入のために使用した。ＳＯＥ−ＰＣＲにおいて、ＩＦＮＢ分子のＮ末端部分およびＣ末端部分を、個別一次ＰＣＲにおいて最初に増幅した。
【０２０１】
これらの一次ＰＣＲのために、置換すべきアミノ酸についてのコドンを所望のコドンに改変するように、中心相補的プライマーを合成した。末端プライマーは、ＩＦＮＢ分子のＮ末端およびＣ末端をそれぞれ定義する標準プライマーであった。さらに、末端プライマーは、全長ＰＣＲ産物のその後のクローニングを可能にする制限酵素部位を提供した。従って、一次ＰＣＲの１つにおいてＩＦＮＢコード領域のＮ末端領域を増幅するために、中央（ナンセンス）プライマーおよびＮ末端（センス）プライマーを使用し、Ｃ末端部分についても同等に使用した。一旦増幅するとＮ末端部分およびＣ末端部分を２次ＰＣＲにおける全長産物へと構築し、上記のようにｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏの改変版にクローニングした。例えば、置換Ｆ１１１Ｎおよび置換Ｒ１１３Ｔについての変異を導入するために、以下のプライマー：
【０２０２】
【化２２】
2005519946.tif 000027
を使用した。
【０２０３】
さらに、導入された変異が、発現プラスミドにおいて唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位に十分に接近した場合、１ＰＣＲ段階を含む構築手順および引き続くクローニングを使用して、改変体遺伝子を構築した。例えば、置換Ｋ１９Ｒを、以下のＰＣＲプライマー：
【０２０４】
【化２３】
2005519946.tif 000028
の使用によって導入した。
【０２０５】
引き続き、制限エンドヌクレアーゼ部位ＢｓｉＷＩおよびＢｓｔＢＩを使用して、ＰＣＲ産物をクローニングした。
【０２０６】
（実施例２）
（１１１位に導入された１つのグリコシル化部位を有するＩＦＮＢ改変体の構築および発現）
ヒトＩＦＮＢの１１１位において余分なＮ結合型グリコシル化部位を挿入するために、ヒトＩＦＮＢ（実施例１に記載した）をコードする合成遺伝子（ｈｉｎｆ−β）を、部位特異的ＰＣＲ変異誘発により改変した。ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＵＫ）およびプラスミドＰＦ０５０［ｈｉｎｆ-β／ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ／Ｉｎｔｒｏｎ（ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）から入手したキメライントロンが、ベクターのＭＣＳ内のＢａｍＨＩ部位とＮｈｅＩ部位との間に挿入されたｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の誘導体）］をテンプレートとして使用して、２つの重複するプライマーセット：
【０２０７】
【化２４】
2005519946.tif 000029
を用いて２つのＰＣＲ反応を行い、それぞれ４４６ｂｐおよび１８４ｂｐの２つの断片を得た。これら２つの断片を、隣接プライマーＣＢ４１およびＣＢ４２を用いた第３ＰＣＲにおいて構築した。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ／Ｉｎｔｒｏｎ中に挿入し、ＤＮＡ配列決定により、ヒトＩＦＮＢ中に置換Ｆ１１１Ｎおよび置換Ｒ１１３Ｔを生じる正確な塩基変化を有することを確認した（ＰＦ０８５と名付けられたプラスミド）。
【０２０８】
［Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の活性を試験するために、トランスフェクト薬剤としてのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）の使用によって、ＰＦ０８５をＣＨＯ  Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）中にトランスフェクトした。２４時間後、培養培地を回収し、ＩＦＮＢ活性／濃度をアッセイした。
【０２０９】
活性：  ５６０４６ＩＵ／ｍｌ［第一アッセイ］
ＥＬＩＳＡ：  ８０ｎｇ／ｍｌ
比活性：７×１０８ＩＵ／ｍｇ
観察され得るように、［Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体は、野生型ヒトＩＦＮＢの比活性の約２倍の非常に高い比活性を有する。
【０２１０】
（実施例３）
（４９位に１つのグリコシル化部位を導入したＩＦＮＢ改変体の構築および発現）
ＷＯ０１／１５７３６号の実施例５に記載されたものと同様に、置換Ｑ４９Ｎおよび置換Ｑ５１Ｔにより付加的なＮ結合型グリコシル化部位を４９位に導入した。ＰＦ０４３（ｈｉｎｆ−β／ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ））をテンプレートとして使用して、２つの重複するプライマーセット：
【０２１１】
【化２５】
2005519946.tif 000030
を用いて、２つのＰＣＲ反応を行い、それぞれ２２８塩基対および３６９塩基対の２つの断片を得た。これら２つの断片を隣接するプライマーＰＢＲ７およびＰＢＲ８を用いた第３ＰＣＲにおいて構築した。得られた遺伝子を哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ハイグロ／イントロン中に挿入し、ＤＮＡ配列決定により、［Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢを生じる正確な塩基変換を有することを確認した（ＰＦ１０４と名付けられたプラスミド）。
【０２１２】
［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の活性を試験するために、トランスフェクト薬剤としてのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）の使用によって、ＰＦ１０４をＣＨＯ  Ｋ１細胞株中にトランスフェクトした。２４時間後、培養培地を回収し、ＩＦＮＢ活性／濃度をアッセイした。
【０２１３】
活性：  １７６３９ＩＵ／ｍｌ［第一アッセイ］
ＥＬＩＳＡ：  １０ｎｇ／ｍｌ
比活性：１．７×１０９ＩＵ／ｍｇ
［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体は、高い比活性を有する。これは、ＥＬＩＳＡに使用したモノクローナル抗体の１つによる、低い認識力のためであり得る。
【０２１４】
（実施例４）
（２つの導入されたグリコシル化部位を有するＩＦＮＢ改変体の構築および発現）
ＷＯ０１／１５７３６号の実施例５および６に記載されたさらなるグリコシル化部位を置換Ｑ４９Ｎ、置換Ｑ５１Ｔ、置換Ｆ１１１Ｎおよび置換Ｒ１１３Ｔの方法によって、ヒトＩＦＮＢに導入した。
【０２１５】
ＰＦ０８５（ＷＯ０１／１５７３６号の実施例５に記載された）をテンプレートとして使用することにより、２つの重複するプライマーセット［ＰＢＲ８９（５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＴＧ）／ＰＢＲ７８およびＰＢＲ８／ＰＢＲ７７］を用いて２つのＰＣＲ反応を行い、それぞれ２２８塩基対および３６９塩基対の２つの断片を得た。
【０２１６】
これら２つの断片をフランキングプライマーＰＢＲ８９およびＰＢＲ８を用いた第３ＰＣＲにおいて構築した。得られた遺伝子を哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）ハイグロ／イントロン中に挿入し、配列決定により、［Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ、Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢを生じる正確な塩基変換を有することを確認した（ＰＦ１２３と名付けられたプラスミド）。
【０２１７】
トランスフェクト薬剤としてのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）の使用によって、ＰＦ１２３をＣＨＯ  Ｋ１細胞にトランスフェクトした。２４時間後、培養培地を回収し、ＩＦＮＢ活性／濃度をアッセイした。
【０２１８】
活性：  ２９４０１ＩＵ／ｍｌ［第一アッセイ］
ＥＬＩＳＡ：  １４ｎｇ／ｍｌ
比活性：２．１×１０９ＩＵ／ｍｌ
明らかに、［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体も高い比活性を有する。
【０２１９】
試料および方法の節中に記載したレセプター結合アッセイ（それは架橋剤ＤＳＳの使用に基づいている）において、改変体がレセプター結合活性を有することを見出した。
【０２２０】
（実施例５）
（ローラーボトル中での［Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ、Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢグリコシル化改変体の生成）
［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］グリコシル化改変体を生じるＣＨＯＫ１サブクローン（５／Ｇ−１０）を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充した２００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号３１３３０）中のそれぞれ拡張した１７００ｃｍ２の表面を有する（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）２つのローラーボトル中に播種した。２日後、培地を交換した。さらに２日後、２つのローラーボトルは、ほぼ１００％コンフルエントであり、培地を１／５００ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；カタログ番号８１１２９Ｎ）およびＰ／Ｓを補充した３００ｍｌの無血清ＵｌｔｒａＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ；カタログ番号１２−７２４）に移動した。この培地中で細胞を成長させることは、高い細胞集団を促進し、血清を含む培地において達成され得る細胞集団より高く促進する。２日後、培地を更新した。さらに２日後、培地を生産培地：１／１００  ＩＴＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号５１３００−０４４）［ＩＴＳＡはＩｎｓｕｌｉｎ（１．０ｇ／Ｌ）−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（０．５５ｇ／Ｌ）−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ（０．６７ｍｇ／Ｌ）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓを表す］、１／５００ＥＣ−ＣＹＴＥおよびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２１０４１）に移した。ＩＦＮＢ活性決定のために、培地サンプルを取り出す前に、２つのローラーボトルから回収した培地をプールした。
【０２２１】
（実施例６）
（［Ｋ１９Ｒ、Ｋ４５Ｒ、Ｋ１２３Ｒ］ヒトＩＦＮＢの生成、精製およびＰＥＧ化）
最後には、ＩＦＮＢ改変体Ｋ１９Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｋ１２３Ｒを含み、１００ｍｌの無血清培地にするために、３Ｔ−１７５フラスコの１０％ＦＢＳに加えてグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２１９６９−０３５）中にＣＯＳ−７細胞を播種した。トランスフェクト（ほぼ１００％のコンフルーエンシー）の日に、トランスフェクトの４〜５時間前に、３０ｍｌの新鮮な培地により培地を更新した。トランスフェクトを調製するために、サプリメントを含まない１８９０μｌのＤＭＥＭ培地を１４ｍｌのポリプロピレンチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にアリコートした。２１０μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を培地に直接添加し、室温で５分間インキュベートした。その間の時間、１６８μｇのプラスミドＤＮＡ（［Ｋ１９Ｒ、Ｋ４５Ｒ、Ｋ１２３Ｒ］ＩＮＦ−β／ｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ；ＰＦ番号１６１）を別の１４ｍｌのポリプロピレンチューブにアリコートした。５分のインキュベート後、Ｆｕｇｅｎｅ６混合物を直接ＤＮＡ溶液に添加し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベート後、約７００μｌを３つの細胞培地のそれぞれに滴下法により添加した。
【０２２２】
次の日、トランスフェクト培地を血清を含まない３５ｍｌの生産培地で置換した。血清を含まない培地は、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ＩＴＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号５１３００−０４４）および０．２％Ｅｘ−Ｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；カタログ番号８１−１２９）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号３１０５３−０２８）に基づいている。生産培地を添加する前に、細胞層を添加物を含まないＤＭＥＭ培地中で２回洗浄した。
【０２２３】
トランスフェクト３日後に、１００ｍｌの血清を含まない培地をＩＦＮＢ改変体の精製およびＰＥＧ化のために回収した。
【０２２４】
ｐＨは６．８に調整し、伝導率は、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水を用いて＜１０ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、ブロスを緩衝液Ａ（２０ｍＭ  リン酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）で前平衡化した１ｍｌのＳＰ５５０カチオン交換樹脂（ＴｏｓｏＨａａｓ）にバッチ吸収した。２時間の回転させながらの循環後、樹脂を沈殿させ、カラムに移した。樹脂を５カラム体積分の緩衝液Ａで洗浄し、２ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  リン酸、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）で溶出した。溶出物を５％エチレングリコール添加後、ＶｉｖａＳｐｉｎ（１０ｋＤａカットオフ）にて５００μｌに濃縮した。濃縮物を２ｍｌの最終体積中において、５０ｍＭ  リン酸、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０％エチレングリコール、ｐＨ８に調整し、さらに０．５ｍｌに濃縮した。
【０２２５】
最終濃縮物を以下のようにＰＥＧ化した：１００μｌの最終濃縮物に、リン酸緩衝液（ｐＨ８）中に新たに調製した２５μｌの活性化ｍＰＥＧ−ＳＰＡ（５０００ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ）を添加し、０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたは５０ｍｇ／ｍｌの活性化ＰＥＧの最終濃度を作製した。反応を、室温で３０分間進行させ、次いで５０ｍＭグリシン緩衝液を添加することによりクエンチした。サンプルを−８０℃でただちに凍結し、生物活性を記載されるとおりに測定した（第１アッセイ）。ＰＥＧ化サンプル中に存在する未反応のＩＦＮＢ改変体の量を評価するために、各サンプルのウエスタンブロットを行った。
【０２２６】
結果は、ウエスタンブロットにより、２５ｍｇ／ｍｌの活性化ＰＥＧにおいて、非ＰＥＧ化ＩＦＮＢ改変体が存在しないと判断されたこと、および改変体は、コントロールサンプル（０ｍｇ／ｍｌの活性化ＰＥＧを用いる以外は、同じく処理した）と比較してその生物活性の５０％を保持していることを示している。
【０２２７】
（実施例７）
（４９位に結合した、増加した炭水化物を有する改変体）
ＷＯ  ０１／１５７３６号の実施例６に記載された、ＩＦＮＢ改変体内の位置４９に挿入したＮ−結合型グリコシル化部位（Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ）は、約６０％しか使用されない。結合した炭水化物の量を増加させるために、部位特異的ＰＣＲ変異形成により、４８位においてグルタミン残基を、フェニルアラニン（Ｑ４８Ｆ）、バリン（Ｑ４８Ｖ）およびトリプトファン（Ｑ４８Ｗ）で交換した。ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＵＫ）およびＰＦ１８５（ＰＦ１８５は、Ｋｏｚａｋ配列を開始ＡＴＧの前に挿入したという事実にもかかわらず、ＰＦ１０４と同じｃＤＮＡ配列（実施例６において記載した）を含有する）をテンプレートとして使用して、以下の重複するプライマーセット：
【０２２８】
【化２６】
2005519946.tif 000031
を使用してＰＣＲ反応を行った。
【０２２９】
断片を隣接するプライマーＰＢＲ８９およびＰＢＲ８を用いたＰＣＲ反応において組み立てた。生じた遺伝子を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ／Ｉｎｔｒｏｎに挿入し、それぞれ［Ｑ４８Ｆ、Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ３０５と名付けられたプラスミド）［Ｑ４８Ｖ、Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ３０６と名付けられたプラスミド）および［Ｑ４８Ｗ、Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ３０７と名付けられたプラスミド）を生じる正確な塩基交換を有することを配列決定により確認した。
【０２３０】
トランスフェクト剤としてＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）の使用により、ＰＦ３０５、ＰＦ３０６、ＰＦ３０７およびＰＦ１８５（［Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ］ヒトＩＦＮＢをコードする）をＣＨＯ  Ｋ１細胞にトランスフェクト（ａｎｓｆｅｃｔ）させた。２４時間後、培養培地を回収し、ＩＦＮＢ活性をアッセイした。
【０２３１】
ＰＦ１８５  １３４７１３  ＩＵ／ｍｌ
ＰＦ３０５    ５３１２２  ＩＵ／ｍｌ
ＰＦ３０６    ６５９４９  ＩＵ／ｍｌ
ＰＦ３０７    ４５０７６  ＩＵ／ｍｌ
これらのグリコシル化改変体中の結合した炭水化物の量を評価するために、各レーンにおいて等量の活性を有するウエスタンブロットを行った。導入したグリコシル化部位（Ｑ４９Ｎ、Ｑ５１Ｔ）の前部にアミノ酸交換（Ｑ４８Ｆ、Ｑ４８Ｖ、Ｑ４８Ｗ）が観察されたので、全て十分にグリコシル化した材料の増量を生じる。
【０２３２】
別の実験においては、４８位中の特にチロシンの挿入が、４９位中に挿入されたＮ結合型グリコシル化部位に結合される炭水化物の増量を生じることが観察された。
【０２３３】
（実施例８）
（１１１位に増加した炭水化物結合を有する改変体）
ＷＯ  ０１／１５７３６号の実施例５に記載されたＩＦＮＢ改変体［Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］中の１１１位に挿入されたＮ−結合型グリコシル化部位は、約５０％しか使用されない。結合型炭水化物の量を増加させるために、１１０位のアスパラギン酸残基を、部位特異的ＰＣＲ変異形成により、フェニルアラニン（Ｄ１１０Ｆ）およびバリン（Ｄ１１０Ｖ）で交換した。ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＵＫ）およびＰＦ０８５（ＷＯ  ０１／１５７３６号の実施例５に記載された）をテンプレートとして使用して、重複するプライマーセット：
【０２３４】
【化２７】
2005519946.tif 000032
を使用してＰＣＲ反応を行った。
【０２３５】
断片を隣接するプライマーＰＢＲ８９およびＰＢＲ８を用いたＰＣＲ反応において組み立てた。生じた遺伝子を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）Ｈｙｇｒｏ／Ｉｎｔｒｏｎに挿入し、それぞれ［Ｄ１１０Ｆ、Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ３０８と名付けられたプラスミド）および［Ｄ１１０Ｖ、Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ３０９と名付けられたプラスミド）を生じる正確な塩基交換を有することを配列決定により確認した。
【０２３６】
トランスフェクト剤としてＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）の使用により、ＰＦ３０８、ＰＦ３０９およびＰＦ０８５（［Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢをコードする）を、ＣＨＯ  Ｋ１細胞にトランスフェクトさせた。２４時間後、培養培地を回収し、ＩＦＮＢ活性をアッセイした。
【０２３７】
ＰＦ０８５  ５８６１５  ＩＵ／ｍｌ
ＰＦ３０８  ５０９００  ＩＵ／ｍｌ
ＰＦ３０９  １５０６３  ＩＵ／ｍｌ
これらのグリコシル化改変体中の結合した炭水化物の量を評価するために、各レーンにおいて等量の活性を有するウエスタンブロットを行った。導入したグリコシル化部位（Ｆ１１１Ｎ、Ｒ１１３Ｔ）の前部にアミノ酸交換（Ｄ１１０ＦおよびＤ１１０Ｖ）が観察されたので、両方とも顕著に増量した十分にグリコシル化した材料を生じる。
【０２３８】
別の実験においては、１１０位中の特にチロシンの挿入が、１１１位中に挿入されたＮ結合型グリコシル化部位に結合される炭水化物の増量を生じることが観察された。
【０２３９】
（実施例９）
（糖型ＩＦＮＢポリペプチドの分離）
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、糖型ＩＦＮＢの分離（例えば、十分にグリコシル化部位を利用した糖型を得る）に対して、効果的な方法である。この方法を本発明の実施例において例証する。
【０２４０】
ＷＯ  ０１／１５７３６号の実施例８に記載されたように生成されたＩＦＮＢ改変体［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］を３工程手順で精製した。
【０２４１】
ローラーボトルから回収した培地を遠心分離し、０．２２μｍフィルター（ＰＶＤＦ）を介してろ過した。ろ過した培地を、ｃｕｔ  ｏｆｆ  １００００を有するポリエーテルスルホン膜を備えたＶｉｖａｆｌｏｗ２００系でダイアフィルトレーションを行い、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５によって平衡化したＳ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。カラムに結合したＩＦＮＢ改変体を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５によって抽出した。Ｓ−セファロースカラムから溶出した塩化ナトリウムの濃度を１．０Ｍに調整し、サンプルを５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１．０Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５によって平衡化したフェニル−セファロース高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。適用に続いて、カラムをＭｉｌｌｉ  Ｑ水を用いて洗浄した。ＩＦＮＢ改変体を、３０カラム分の体積のＭｉｌｌｉ  Ｑ水〜６０％エチレングリコール、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の勾配を用いて溶出した。十分にグリコシル化したＩＦＮＢ改変体を含む画分を収集し、溶出物中の緩衝液を１５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換した。サンプルを１５ｍＭ  リン酸ナトリウムにより平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（ＣＨＴ  ＩＩ、セラミックヒドロキシアパタイト、ＩＩ型、Ｂｉｏｒａｄ）に適用した。使用される1つの付加的な部位を有する過少グリコシル化形態がカラムに結合するのに対して、十分にグリコシル化した形態は、カラムを通過し、２０カラム分の体積の１５ｍＭ〜２００ｍＭの直線的リン酸ナトリウム勾配を用いて溶出した。
【０２４２】
十分にグリコシル化した［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ＩＦＮＢの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて９５％より高いと判断した。
【０２４３】
（実施例１０）
（グリコシル化部位に導入したＩＦＮＢ改変体のＰＥＧ化）
各実験の前に、ＳＣＭ−ＰＥＧの新鮮なストック溶液（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ由来のカルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル、５ｋＤａまたは１２ｋＤａ）をメタノール中に調製した。
【０２４４】
５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中のグリコ改変体［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢの０．３ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌを、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわちリジンおよびＮ末端）に対して、２倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有する５ｋＤａまたは１２ｋＤａのＳＣＭ−ＰＥＧを用いてＰＥＧ化した。室温でのインキュベート３０分後、５μｌの２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。この段階では、反応混合物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非改変タンパク質と判断されたものの微量部分を含んだ。第１スクリーニングアッセイを使用したインビトロの試験によって、１２ｋＤａのＰＥＧの１〜３群が結合したＰＥＧ化物質は、４０％の活性を保持したことが示された。５ｋＤａのＰＥＧの１〜３群が結合したＰＥＧ化物質が保持した生物活性は２５％であった。
【０２４５】
別の実験においては、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する、５０μｌの精製した［Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ＋Ｋ１９Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｋ１２３Ｒ］ヒトＩＦＮＢを、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわち、リジンおよびＮ末端）に対して２０倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有するＳＣＭ−ＰＥＧ、５ｋＤａを含む５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ８．０中でＰＥＧ化した。室温でインキュベート３０分後、５μｌの２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。この段階では、反応混合物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非改変タンパク質と判断されたものの微量部分を含んだ。
【０２４６】
第１スクリーニングアッセイを使用したインビトロの試験によって、５ｋＤａのＰＥＧの１〜３群が結合したＰＥＧ化物質は、４５％の活性を保持したことが示された。１つまたはいくつかのリジンが他のアミノ酸残基で置換された改変体をＰＥＧ化するためには、より高いモル濃度過剰のＰＥＧが必要である。
【０２４７】
サイズ排除クロマトグラフィーか、またはカチオン交換クロマトグラフィーか、もしくは両方の組み合わせのいずれかを使用して、ＰＥＧ化物質を、非ＰＥＧ化物質および過剰のＰＥＧから分離した。ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．２で平衡化した、Ｐｈａｒｍａｃｉａ由来のＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。カチオン交換クロマトグラフィーを、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ２．７で平衡化したＳＰ−セファロースＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。ＳＰ−セファロースＨＰカラムからの溶出を、塩（例えば、塩化ナトリウム）の濃度を増加することによるかまたは緩衝液（例えば、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム）のｐＨを増加させることによるかのいずれかにより行った。
【０２４８】
（実施例１１）
（Ｃ１７Ｓの置換を行うことによるグリコシル化ＩＦＮＢ改変体の安定化）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、２つの高グリコシル化ＩＦＮＢ改変体：［Ｓ２Ｎ、Ｎ４Ｔ、Ｑ５１Ｎ、Ｅ５３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ２７６）および［Ｓ２Ｎ、Ｎ４Ｔ、Ｃ１７Ｓ、Ｑ５１Ｎ、Ｅ５３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ（ＰＦ２７９）をコードするプラスミドをトランスフェクトさせた。コンフルエントで安定な一次トランスフェクションプールを４つのＴ１７５フラスコ内でそれぞれ増殖させた。コンフルーエンシーにおいては、血清を含む培地から、１／１００  ＩＴＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号５１３００−０４４）および１／１０００Ｅｘ−Ｃｙｔｅ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．番号８１−１２９）を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号２１０４５−０２５）に基づいた、血清を含まない培地に、フラスコを移した。１５日間毎日、各改変体の１２０ｍｌを回収し、−８０℃で凍結した。
【０２４９】
毎日の回収物からの上清を収集し、０．２２μｍフィルター（ＰＶＤＦベース）を通してろ過した。ｃｕｔ−ｏｆｆ  １００００を有するポリエーテルスルホン膜を備えたＶｉｖａｆｌｏｗ  ２００システムにより上清を約１５倍濃縮し、そして、濃縮サンプルを、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５で平衡化したＳ−セファロースカラムに適用した。ＩＦＮＢ改変体を５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を用いた１段階で溶出した。
【０２５０】
Ｓ−セファロースカラムからの溶出物における塩化ナトリウムの濃度を１．０Ｍに調整し、サンプルを５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１．０Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５で平衡化したフェニル−セファロースカラムに適用した。ＩＦＮＢ改変体を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中の６０％エチレングリコールで溶出する前に、平衡化緩衝液を用いた広範な洗浄を行った。
【０２５１】
精製後の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、［Ｓ２Ｎ、Ｎ４Ｔ、Ｑ５１Ｎ、Ｅ５３Ｔ］ヒトＩＦＮＢを有する二量体の形成を明らかに示し、他方で、［Ｓ２Ｎ、Ｎ４Ｔ、Ｃ１７Ｓ、Ｑ５１Ｎ、Ｅ５３Ｔ］ヒトＩＦＮＢを有する二量体は、存在しないことを示した。
【０２５２】
（実施例１２）
（［Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の産生、精製、およびＰＥＧ化）
［Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢグリコシル化改変体を産生するＣＨＯＫ１サブクローン（５／Ｇ−１０）を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充した２００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号３１３３０）中のそれぞれ拡張した１７００ｃｍ２の表面を有する（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）６つのローラーボトル中に播種した。２日後、培地を交換した。さらに２日後、２つのローラーボトルは、ほぼ１００％コンフルエントであり、培地を１／５００ＥＸ−ＣＹＴＥ（血清学的タンパク質；カタログ番号８１１２９Ｎ）およびＰ／Ｓを補充した３００ｍｌの血清が含まれないＵｌｔｒａＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ；カタログ番号１２−７２４）に移した。この培地中で細胞を増殖させることは、より高い細胞質量を促進し、血清を含む培地において達成され得る細胞質量より高く促進する。２日後、培地を更新した。さらに２日後、培地を産生培地：１／１００  ＩＴＳＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号５１３００−０４４）［ＩＴＳＡは、付着培養のためのインスリン（１．０ｇ／Ｌ）−トランスフェリン（０．５５ｇ／Ｌ）−セレニウム（０．６７ｍｇ／Ｌ）の補充を意味する］、１／５００ＥＣ−ＣＹＴＥおよびＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２１０４１）に移した。ＩＦＮＢ活性決定のために、培地サンプルを取り出す前に、ローラーボトルから回収した培地をプールした。２１日間毎日、１．８ｌの培地を回収し、−８０℃で凍結した。
【０２５３】
ローラーボトルから回収した培地を遠心し、０．２２μｍのフィルター（ＰＶＤＦ）を通してろ過した。ろ過した培地を、ｃｕｔ  ｏｆｆ  １００００を有するポリエーテルスルホン膜を備えたＶｉｖａｆｌｏｗ２００システムでダイアフィルトレーションを行い、Ｓ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。
【０２５４】
Ｓ−セファロースカラムを、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５によって平衡化し、インターフェロン改変体を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、０．５Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて溶出した。溶出液中の塩化ナトリウムの濃度を１．０Ｍに調整した。
【０２５５】
Ｓ−セファロースカラム由来の溶出液を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１．０Ｍ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５で平衡化したフェニル−セファロース高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。適用に続いて、カラムを５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて洗浄した。ＩＦＮＢ改変体を、３０カラム分の体積の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５〜６０％エチレングリコール、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の勾配を用いて溶出した。十分にグリコシル化したＩＦＮＢ改変体を含む画分を収集し、プールした。
【０２５６】
溶出物を５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、５０ｍＭ  塩酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化したＳ−セファロースカラムを通すことにより、フェニル−セファロース由来の溶出物中のエチレングリコールを除去した。インターフェロン改変体はカラムに結合したが、流出物中にエチレングリコールは存在した。適用に続いて、カラムを２０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて洗浄し、インターフェロン改変体を、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を用いて溶出した。
【０２５７】
溶出物中のリン酸塩の濃度を１５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２に調整し、１５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２を用いて平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（ＣＨＴ  Ｉ、セラミック  ヒドロキシアパタイト、１型、Ｂｉｏｒａｄ）に適用した。使用される１つの付加的な部位を有する非グリコシル化形態はカラムに結合したが、十分にグリコシル化した形態は、カラムを通過し、２０カラム分の体積のｐＨ６．８の１５ｍＭ〜２００ｍＭのリン酸ナトリウムの直線的勾配を用いて溶出した。
【０２５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、十分にグリコシル化した［Ｃ１７Ｓ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の純度を、９５％より高いと判断した。
【０２５９】
精製後、改変体をＰＥＧ化した。１０ｍｇ／ｍｌ  ＳＣＭ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ由来のカルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジル  エステル、１２Ｋまたは２０Ｋ）の新鮮なストック溶液を、各実験の前に９６％エタノール中で調製した。
【０２６０】
２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中の０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわちリジンおよびＮ末端）に対して、０．７５倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有するＳＣＭ−ＰＥＧ、２０Ｋを用いてＰＥＧ化した。室温でインキュベート３０分後、過剰の２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。反応混合物は、モノ−ＰＥＧ化物質、ジ−ＰＥＧ化物質および非ＰＥＧ化物質の混合物を含んだ。カチオン交換クロマトグラフィーか、またはサイズ排除クロマトグラフィーか、もしくは両方の組み合わせのいずれかの使用により、モノ−ＰＥＧ化物質を他の種から分離した。ＰＥＧ化溶液において、ｐＨは、ｐＨ２．７に調整し、サンプルを、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７で平衡化したＳＰ−セファロース  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。ＰＥＧ化したタンパク質を、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いてカラムから溶出し、そして、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化した、サイズ排除カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（（１６／６０）Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。モノＰＥＧ化物質を含む分画をプールし、さらに特徴付けた。
【０２６１】
別の実験においては、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の０．１６ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわちリジンおよびＮ末端）に対して、２倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有するＳＣＭ−ＰＥＧ、１２Ｋを用いてＰＥＧ化した。室温でインキュベート３０分後、過剰の２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。反応混合物は、非誘導体化物質とともに、モノ−ＰＥＧ化物質、ジ−ＰＥＧ化物質、トリ−ＰＥＧ化物質の混合物を含んだ。カチオン交換クロマトグラフィーか、またはサイズ排除クロマトグラフィーか、もしくは両方の組み合わせのいずれかの使用により、非改変タンパク質からＰＥＧ化物質を分離した。ＰＥＧ化溶液において、ｐＨは、ｐＨ２．７に調整し、サンプルを、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７で平衡化したＳＰ−セファロース  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。ＰＥＧ化したタンパク質を、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いてカラムから溶出し、そして、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化した、サイズ排除カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（（１６／６０）Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。モノ−ＰＥＧ化タンパク質、ジ−ＰＥＧ化タンパク質およびトリ−ＰＥＧ化タンパク質の混合物を含む分画をプールし、さらに特徴付けた。
【０２６２】
（実施例１３）
（ローラーボトル中の［Ｃ１７Ｓ＋Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の産生、精製、およびＰＥＧ化）
実施例１２中に記載したように、６個のローラーボトル中で、［Ｃ１７Ｓ＋Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢグリコシル化改変体を産生するＣＨＯＫ１サブクローン（５／Ｇ−１０）を産生し、実施例１２において使用したプロトコルに従って精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、十分にグリコシル化した［Ｃ１７Ｓ＋Ｋ１９Ｒ＋Ｋ３３Ｒ＋Ｋ４５Ｒ＋Ｑ４９Ｎ＋Ｑ５１Ｔ＋Ｄ１１０Ｆ＋Ｆ１１１Ｎ＋Ｒ１１３Ｔ］ヒトＩＦＮＢ改変体の純度を９５％より高いと判断した。
【０２６３】
精製に続いて、改変体をＰＥＧ化した。各実験の前に、ＳＣＭ−ＰＥＧの新鮮なストック溶液（Ｓｈｅｒｗａｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ由来のカルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル、１２ｋＤａまたは２０ｋＤａ）を、エタノール中で調製した。
【０２６４】
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわちリジンおよびＮ末端）に対して、３倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有するＳＣＭ−ＰＥＧ、２０Ｋを用いてＰＥＧ化した。室温でのインキュベート３０分後、過剰の２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。反応混合物は、モノ−ＰＥＧ化物質、ジ−ＰＥＧ化物質および非ＰＥＧ化物質の混合物を含んだ。カチオン交換クロマトグラフィーか、またはサイズ排除クロマトグラフィーか、もしくは両方の組み合わせのいずれかの使用により、他種からモノ−ＰＥＧ化物質を分離した。ＰＥＧ化溶液において、ｐＨは、ｐＨ２．７に調整し、サンプルを、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７で平衡化したＳＰ−セファロース  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。ＰＥＧ化したタンパク質を、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いてカラムから溶出し、そして、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化した、サイズ排除カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（（１６／６０）Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。モノ−ＰＥＧ化物質を含む分画をプールし、さらに特徴付けた。
【０２６５】
別の実験においては、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中の０．１６ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、潜在的ＰＥＧ化部位（すなわちリジンおよびＮ末端）に対して、５倍モル濃度の過剰のＰＥＧを有するＳＣＭ−ＰＥＧ、１２Ｋを用いてＰＥＧ化した。室温でインキュベート３０分後、過剰の２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ８．０の添加により反応をクエンチした。反応混合物は、非誘導体化物質とともに、モノ−ＰＥＧ化物質、ジ−ＰＥＧ化物質、トリ−ＰＥＧ化物質の混合物を含んだ。カチオン交換クロマトグラフィーか、またはサイズ排除クロマトグラフィーか、もしくは両方の組み合わせのいずれかの使用により、非改変タンパク質からＰＥＧ化物質を分離した。ＰＥＧ化溶液において、ｐＨは、ｐＨ２．７に調整し、サンプルを、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ２．７で平衡化したＳＰ−セファロース  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに適用した。ＰＥＧ化したタンパク質を、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いてカラムから抽出し、そして、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．５を用いて平衡化した、サイズ排除カラム、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（（１６／６０）Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。モノ−ＰＥＧ化タンパク質、ジ−ＰＥＧ化タンパク質およびトリ−ＰＥＧ化タンパク質の混合物を含む分画をプールし、さらに特徴付けた。
【配列表】
2005519946.tif 000033
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2005519946.tif 000043
2005519946.tif 000044
【国際調査報告】
2005519946.tif 000051
2005519946.tif 000052
2005519946.tif 000053
2005519946.tif 000054
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