(57)【要約】本発明は、プロスタグランジン  Ｅシンターゼ（ＰＧＥＳ）、またはそのアナログもしくは改変体（例えば、その一部分）の精製された調整物、およびこれらを含む融合ポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらの精製調製物を得るための方法を提供し、この方法は、以下：ＰＧＥＳのモジュレーター（例えば、ＰＧＥＳの活性を阻害または刺激する低分子）を同定するための方法；およびプロスタグランジンを調製するための方法である。本発明のＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２を含むプロスタグランジン  Ｅシンターゼ（ＰＧＥＳ）、またはそのアナログもしくは改変体の実質的に純粋な調製物。
【請求項２】
前記ＰＧＥＳまたはそのアナログもしくは改変体が、異種ポリペプチドに融合され、それによって融合ポリペプチドを形成する、請求項１に記載の調製物。
【請求項３】
約１０％未満の夾雑細胞物質を有する、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
約５％未満の夾雑細胞物質を有する、請求項３に記載の調製物。
【請求項５】
約１％未満の夾雑細胞物質を有する、請求項４に記載の調製物。
【請求項６】
約０．１％未満の夾雑細胞物質を有する、請求項５に記載の調製物。
【請求項７】
実質的に他の細胞性タンパク質を含まない、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項８】
約１０％未満の夾雑タンパク質を有する、請求項７に記載の調製物。
【請求項９】
約５％未満の夾雑タンパク質を有する、請求項８に記載の調製物。
【請求項１０】
約１％未満の夾雑タンパク質を有する、請求項９に記載の調製物。
【請求項１１】
約０．１％未満の夾雑タンパク質を有する、請求項１０に記載の調製物。
【請求項１２】
前記ＰＧＥＳポリペプチド、またはそのアナログもしくは改変体が、ＰＧＨのＰＧＥへの転換を触媒し得る、請求項１に記載の調製物。
【請求項１３】
前記ＰＧＥＳポリペプチド、またはそのアナログもしくは改変体が、その活性が３７℃で測定される場合、少なくとも約１００μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する、請求項１２に記載の調製物。
【請求項１４】
前記ＰＧＥＳポリペプチド、またはそのアナログもしくは改変体が、その活性が０℃で測定される場合、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する、請求項１２に記載の調製物。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、ＰＧＨのＰＧＥへの転換を触媒し得る、請求項２に記載の調製物。
【請求項１６】
前記融合ポリペプチドが、その活性が３７℃で測定される場合、少なくとも約１００μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する、請求項１５に記載の調製物。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、その活性が０℃で測定される場合、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する、請求項１５に記載の調製物。
【請求項１８】
前記異種ポリペプチドが、アフィニティーマトリクスへの前記融合ポリペプチドの結合を媒介する、請求項２に記載の調製物。
【請求項１９】
前記アフィニティーマトリクスが、金属イオンアフィニティーマトリクスである、請求項１８に記載の調製物。
【請求項２０】
前記金属イオンアフィニティーマトリクスが、Ｎｉ２＋キレートアフィニティーマトリクスである、請求項１９に記載の調製物。
【請求項２１】
前記異種ポリペプチドが、１〜１２連続したヒスチジンを含む、請求項２０に記載の調製物。
【請求項２２】
前記融合ポリペプチドが、配列番号４を含む、請求項２１に記載の調製物。
【請求項２３】
約１０％のグリセロールを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項２４】
約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項２５】
約１０％のグリセロールおよび約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項２６】
凍結物である、請求項２５に記載の調製物。
【請求項２７】
ＰＧＥＳ融合ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を得るための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）金属イオンアフィニティークロマトグラフィーに結合し得る異種ポリペプチドへと融合した、ＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログまたはフラグメントを含むＰＧＥＳ融合ポリペプチドを含む溶解物を提供する工程；
（ｉｉ）（ｉ）の溶解物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーに供する工程；
（ｉｉｉ）該ＨＡクロマトグラフィー由来の未結合画分を得る工程；
（ｉｖ）該ＨＡクロマトグラフィー由来の未結合画分を、該融合ポリペプチドが金属イオンに結合するのに適切な条件下で、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーに供する工程；および
（ｖ）該金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを溶出して、それによってＰＧＥＳ融合ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記溶解物が、細胞全体の溶解物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶解物が、細胞の可溶化した膜画分である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶解物が、原核生物細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記原核生物細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＡクロマトグラフィーが、約１０％のグリセロールおよび／または約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンの存在下で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記金属イオンクロマトグラフィーが、約１０％のグリセロールおよび／または約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンの存在下で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法の各工程が、約１０％のグリセロールおよび／または約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンを含む溶液中で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記金属イオンが、Ｎｉ２＋である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記異種ポリペプチドが、少なくとも６連続したヒスチジンを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合ポリペプチドがさらに、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、前記異種ポリペプチドとの間にプロテアーゼ認識部位を含み、そして前記方法がさらに、該異種ポリペプチドが、該ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントから切断されるように、前記金属イオンアフィニティークロマトグラフィーの後にプロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼに融合タンパク質を供する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７に記載の方法によって調製される、精製されたＰＧＥＳ融合ポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法によって調製される、精製されたＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント。
【請求項４０】
請求項１に記載の調製物を含む薬学的組成物。
【請求項４１】
ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、ＰＧＥＳ結合パートナーとの間の相互作用を調節する薬剤を同定するための方法であって、該方法は、実質的に純粋なＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；ＰＧＥＳ結合パートナー；および試験薬剤を、該試験薬剤が存在しなければ、該ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、該ＰＧＥＳ結合パートナーとが相互作用する条件下で接触させる工程を包含し、ここで、該ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、該ＰＧＥＳ結合パートナーとの間での相互作用の相違が、該試験薬剤が、それらの相互作用を調節することを示す、方法。
【請求項４２】
前記ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントが、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを結合して融合ポリペプチドを形成する異種ポリペプチドへと融合される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合ポリペプチドが、請求項２７に記載の方法によって調製される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＧＥ２をインビトロで調製するための方法であって、該方法は、ＰＧＨ２分子と、請求項１に記載のＰＧＥＳまたはそのアナログもしくはフラグメントまたは請求項２に記載の融合ポリペプチドの実質的に純粋な調製物と、還元型グルタチオンとを、ＰＧＥＳによるＰＧＨのＰＧＥへの転換の触媒に適切な条件下で接触する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
ＰＧＥＳまたはプロスタグランジンの活性を調節する必要がある被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体が処置されるように、ＰＧＥＳのモジュレーターの薬学的有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
プロスタグランジンを必要とする被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体が処置されるように、請求項４３に記載の方法によって調製されたプロスタグランジンの薬学的有効量を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
プロスタグランジン産生を阻害する必要のある被験体を処置するための方法であって、該方法は、請求項１または２に記載の調製物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントが、天然に存在するＰＧＥＳのドミナントネガティブ改変体である、方法。
【請求項４８】
プロスタグランジン産生を阻害する必要のある被験体を処置するための方法であって、該方法は、請求項４１に記載の方法によって同定される化合物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントの三次元構造を決定するための方法であって、該方法は、請求項１に記載の調製物を結晶化する工程；該結晶構造の座標を決定する工程；および該座標をコンピュータプログラムに導入して、座標から三次元構造の決定を可能にする工程を包含する、方法。
【請求項５０】
天然に存在するＰＧＥＳポリペプチドの触媒活性を調節する薬物を同定するための方法であって、該方法は、請求項４７に記載の方法によってＰＧＥＳポリペプチドの三次元構造を決定する工程、および該三次元構造と相互作用する薬物を選択する工程を包含する、方法。
【請求項５１】
ヒトＰＧＥＳポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むか、または１〜約２０アミノ酸において配列が異なり、ここで、ＰＧＥＳポリペプチドはＨｉｓ６タグへと融合されている、単離された核酸。
【請求項５２】
前記ＰＧＥＳポリペプチドが配列番号２からなる、請求項５１に記載の単離された核酸。
【請求項５３】
請求項５１に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項５４】
図２に記載される配列に対して、少なくとも約９５％同一であるヌクレオチド配列を有する、請求項５３に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項５１の核酸を含む、単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）、そのアナログおよび改変体の純粋な調製物、ならびに精製されたＰＧＥＳを調製するための新規方法に関する。本発明はまた、ＰＧＥＳのモジュレーターを同定するためのスクリーング方法ならびにプロスタグランジンおよびそのアナログを調製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プロスタグランジン（これは、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２および他の関連化合物を包含する）は、脂肪酸の代謝に由来する、多様な群のオートクラインホルモンおよびパラクリンホルモンを表す。これらは、細胞中にそれ自体は保存されず、アラキドン酸（細胞膜リン脂質の分解に由来する２０炭素脂肪酸）から必要なときに生合成される、天然に存在するエイコサノイド（プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエン）のファミリーに属する。通常の条件下では、これらのエイコサノイドは、低レベルで産生されて、異なる細胞型において非常に異なり得る、多くの多様な細胞機能の重要なメディエーターとして役立つ。しかし、これらのプロスタグランジンはまた、病態生理学において重要な役割を果たす。特に、炎症は、少なくとも部分的に、損傷細胞におけるプロスタグランジンの過剰産生によって開始および維持の両方が行われる。プロスタグランジンが炎症において果たす中心的役割は、多くの病理的炎症状態の治療において最も有効であるアスピリン様非ステロイド抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤＳ）が全て、プロスタグランジン合成を阻害することによって作用するという事実によって強調されている。
【０００３】
ＭＡＰＥＧ（エイコサノイドおよびグルタチオン代謝における膜会合タンパク質）と称される広範なスーパーファミリーは、酵素活性、配列モチーフおよび構造特性に従って定義されている（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，８，６８９，１９９９およびＪａｋｏｂｓｓｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６１，Ｓ２０，２０００）。このファミリーは、以下を含む６つのヒトタンパク質からなる：５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質（ＦＬＡＰ）、ＬＴＣ４シンターゼ、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＭＧＳＴ）１、ＭＧＳＴ２（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２２０３，１９９６およびＳｃｏｇｇａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１０１８２，１９９７）、ＭＧＳＴ３（Ｊａｋｏｂｓｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２９３４，１９９７）およびＭＧＳＴ１様１（現在、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅシンターゼと同定されている）（Ｊａｋｏｂｓｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６  （１３），７２２０，１９９９）。
【０００４】
図１は、ＭＡＰＥＧメンバーに関連するアラキドン酸の代謝経路（すなわち、５−リポキシゲナーゼ経路およびシクロオキシゲナーゼ経路）を例示する。ＦＬＡＰの存在下で、５−リポキシゲナーゼは、不安定なエポキシドロイコトリエン（ＬＴ）Ａ４の形成を触媒する（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０，５６８，１９８３）。この反応は、中間体５−ヒドロペルオキシ−エイコサテトラエン酸（５−ＨｐＥＴＥ）を介して進行する。過剰な５−ＨｐＥＴＥ産生では、ＭＧＳＴ２および／またはＭＧＳＴ３は、この産物を還元によって、対応するアルコール５−ＨＥＴＥに代謝し得る（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２９３４，１９９７）。ＬＴＡ４の１つの重要な代謝経路は、還元グルタチオンとの結合であり、ＬＴＣ４の形成をもたらす。この反応を触媒し得る３つの既知の酵素（すなわち、ＬＴＣ４シンターゼ、ＭＧＳＴ２またはＭＧＳＴ３）が存在する（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２２０３，１９９６；Ｓｃｏｇｇａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１０１８２，１９９７；およびＪａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２９３４，１９９７）。産物であるＬＴＣ４ならびにその代謝産物であるＬＴＤ４およびＬＴＥ４は、ヒトの気管支の強力な収縮因子であり、昨年の間に、ＳｉｎｇｕｌａｉｒＴＭ（ＣｙｓＬＴ１レセプターアンタゴニスト）が、種々の型の喘息を罹患する患者の処置のために導入されている。本質的に、ＭＧＳＴ２およびＭＧＳＴ３は両方とも、ミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよびペルオキシダーゼを構成すると特徴付けられている（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２２２０３，１９９６およびＪａｋｏｂｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２２９３４，１９９７）。ＬＴＣ４の産生についてのこれらの重要性は、当業者によって現在調査されている。ＭＧＳＴ２およびＭＧＳＴ３は、ＬＴＣ４シンターゼと比べて、より広い基質特異性ならびにさらなる触媒特性（ペルオキシダーゼ活性）を保有するので、これらの酵素はまた、種々の生体異物の無毒化に関与し得る。生理学におけるそれらの役割は、さらに調査されている。
【０００５】
プロスタグランジンエンドペルオキシドＨ２（ＰＧＨ２）は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−１またはシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２の作用によって、アラキドン酸から形成される（図１）。ＣＯＸ−１は、多くの細胞および組織において構成的に発現され、一方、ＣＯＸ−２タンパク質は、炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（例えば、インターロイキン−１β）によって、炎症部位にて誘導され得る。このシクロオキシゲナーゼの下流では、産物ＰＧＨ２が、種々の生理学的に重要なエイコサノイド（例えば、ＰＧＦ２α、ＰＧＥ２、ＰＧＤ２、ＰＧＩ２（プロスタサイクリン）およびトロンボキサン（ＴＸ）Ａ２へとさらに代謝され得る（Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６３，Ｆ１８１，１９９２）。炎症に関して、プロスタグランジンＥ２は、最も重要なプロスタグランジンメディエーターであると考えられる。この事実は、近年、ＰＧＥレセプターのうちの１つ（ＥＰ３）を欠いたノックアウトマウスを用いた実験によって支持されている。これらのマウスは、インターロイキン−１βおよびリポ多糖によって誘発された熱に応答することが完全にできない（Ｕｓｈｉｋｕｂｉら，Ｎａｔｕｒｅ，３９５，２８１，１９９８）。さらに、ＰＧＥ２は、炎症の疼痛において重要な役割を果たすようである。なぜなら、選択的抗ＰＧＥ２抗体が、インドメタシン（ＮＳＡＩＤの１種）と同等に強力に、マウスにおけるフェニルベンゾキノン誘発性のねじれ、ならびにラットにおけるカラゲナン誘発性の足の水腫および痛覚過敏を阻害することが示されたからである（Ｍｎｉｃｈら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５（９），４４３７，１９９５およびＰｏｒｔａｎｏｖａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４（３），８８３，１９９６）。
【０００６】
ＰＧＥ２感受性レセプターは、４つのサブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４）に細分されており、そしてこれらのレセプターは、種々の組織において広範な分布を有する。ＥＰ１レセプターおよびＥＰ３レセプターに関連する影響は、興奮性とみなされ得、そしてホスファチジルイノシトールの代謝回転の刺激またはアデニルシクラーゼ活性の阻害によって媒介され、サイクリックＡＭＰの細胞内レベルの低下となると考えられる。対照的に、ＥＰ２レセプターおよびＥＰ４レセプターに関連する影響は、阻害的であるとみなされ得、そしてアデニルシクラーゼの刺激および細胞内サイクリックＡＭＰのレベルの上昇と関連すると考えられる。特に、ＥＰ４レセプターは、平滑筋弛緩、抗炎症活性もしくは炎症促進活性、リンパ球分化、抗アレルギー活性、メサンギウム細胞の弛緩もしくは増殖、胃もしくは腸の粘液分泌などと関連するとみなされ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、プロスタグランジンの産生および活性を制御するための方法および組成物を有すること、ならびにプロスタグランジンをインビトロで調製し得ることが望ましい。しかし、ＰＧＥシンターゼを精製および特徴付けする多くの試みにもかかわらず、この酵素は、これらの使用を許容するに充分には精製されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記を含め、本出願全体を通して引用されるような文献の参考文献、発行された特許、公開特許出願を含め、全ての引用文献の内容は、その全体が、本明細書中に参考として明らかに援用される。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、プロスタグランジンＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）の実質的に純粋な調製物、およびこれらの純粋な調製物を得る方法を提供する。ＰＧＥＳは、異種ポリペプチドに対して融合され得る。好ましい実施形態では、このＰＧＥＳは、（例えば、配列番号２を有する）ヒトＰＧＥＳまたはそのアナログもしくは改変体（例えば、ＰＧＥＳの一部分）である。本発明はまた、ＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１０】
精製されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、好ましくは、約１０％未満の夾雑細胞物質；さらにより好ましくは約５％未満の夾雑細胞物質；約１％未満、およびさらにより好ましくは約０．１％未満の夾雑細胞物質を有する。精製されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、好ましくは、他の細胞タンパク質を実質的に含まず、そして例えば、約１０％未満の夾雑タンパク質；好ましくは約５％未満の夾雑タンパク質；そしてさらにより好ましくは約１％または０．１％未満の夾雑タンパク質を有する。
【００１１】
精製されたＰＧＥＳポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはそれらのアナログもしくは改変体は、好ましくは、サイクリックエンドペルオキシド基質の、９−ケト，１１αヒドロキシ形態の基質への転換（例えば、ＰＧＨ１の、ＰＧＥ１への転換；ＰＧＨ２の、ＰＧＥ２への転換およびＰＧＨ３の、ＰＧＥ３への転換）を触媒し得る。精製されたポリペプチドは、好ましくは、この活性が約３７℃にて測定された場合、少なくとも約１００μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有するか、またはこの活性が約０℃にて測定された場合、少なくとも約１０μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する。
【００１２】
好ましい実施形態では、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくは改変体は、１以上の異種ポリペプチドに対してインフレームで融合され、これは、アフィニティーマトリクス（例えば、金属イオンアフィニティーマトリクス（例えば、Ｎｉ２＋キレートアフィニティーマトリクス））に対する融合ポリペプチドの結合を媒介する。異種ポリペプチドは、例えば、１〜１２個連続したヒスチジン残基（好ましくは６ヒスチジン残基）を含むかまたはこれらの残基からなるポリペプチドであり得る。好ましい融合ポリペプチドは、配列番号４に示され、そして図２Ａに示されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
ＰＧＥＳもしくは融合ポリペプチドまたはそれらのアナログもしくは改変体の調製物は、約１０％のグリセロールおよび／または約１〜５ｍＭの還元型グルタチオンを含み得る。調製物は、液体または凍結物の形態であり得る。
【００１４】
本発明はさらに、ＰＧＥＳ融合ポリペプチドまたはそれらのアナログもしくは改変体の実質的に純粋な調製物を得るための方法を提供し、この方法は、例えば、以下を包含する：（ｉ）金属イオンアフィニティークロマトグラフィーに結合し得る異種ポリペプチドへと融合した、ＰＧＥＳポリペプチド、またはそのアナログもしくはフラグメントを含む、ＰＧＥＳ融合ポリペプチドを含む溶解物を提供する工程；（ｉｉ）（ｉ）の溶解物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーに供する工程；（ｉｉｉ）このＨＡクロマトグラフィーから未結合画分を得る工程；（ｉｖ）このＨＡクロマトグラフィー由来の未結合画分を、この融合ポリペプチドが金属イオンに結合するに適切な条件で、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーに供する工程；および（ｖ）この金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを溶出して、それによって、ＰＧＥＳ融合ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を得る工程。この溶解物は、細胞全体の溶解物または細胞の可溶化した膜画分であり得る。この溶解物は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌）由来または真核生物細胞であり得る。
【００１５】
この方法のうちの１以上の工程（例えば、ＨＡクロマトグラフィーまたは金属アフィニティークロマトグラフィー）は、約１０％グリセロールおよび／または約１〜５ｍＭ還元型グルタチオンの存在下で実施され得る。好ましい実施形態では、この方法の各工程は、約１０％グリセロールおよび／または約１〜５ｍＭ還元型グルタチオンを含む溶液中で実施される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、この金属アフィニティークロマトグラフィーは、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーであり、そしてＰＧＥＳポリペプチドは、１〜６個連続したヒスチジン残基を含むタグに対して融合される。
【００１７】
融合ポリペプチドは必要に応じて、このＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくは改変体と、この異種ポリペプチドとの間にプロテアーゼ認識部位を含み、そしてこの方法はさらに、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー後に、この融合ポリペプチドを、このプロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼに供し、その結果、この異種ポリペプチドが、このＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントから切断される工程を含む。
【００１８】
本発明の方法によって調製される、精製されたＰＧＥＳ融合ポリペプチドまたは精製されたＰＧＥＳポリペプチドまたはそれらのアナログもしくはフラグメントもまた、本発明の範囲内である。上記のＰＧＥＳ調製物を含む薬学的組成物もまた、本発明によって提供される。
【００１９】
本発明はさらに、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、ＰＧＥＳ結合パートナーとの間の相互作用を調節する薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、実質的に純粋なＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント；ＰＧＥＳ結合パートナー；および試験薬剤を、この試験薬剤が存在しなければこのＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、このＰＧＥＳ結合パートナーとが相互作用する条件下で接触させる工程を包含し、ここで、このＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントと、このＰＧＥＳ結合パートナーとの間での相互作用の相違が、この試験薬剤が、それらの相互作用を調節することを示す。ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントは、金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを結合して融合ポリペプチドを形成する１以上の異種ポリペプチドへと融合され得る。
【００２０】
本発明によってまた、プロスタグランジンまたはそのアナログをインビトロで調製するための方法が提供される。本発明は、環式エンドペルオキシドを有する任意の分子を、９−ケト，１１−α−ヒドロキシを有する分子へと転換するための方法を提供する。例えば、ＰＧＨ１、ＰＧＨ２およびＰＧＨ３ならびにそれらのアナログは、それぞれ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２およびＰＧＥ３ならびにそれらのアナログへと転換され得る。この方法は、ＰＧＨ分子と、ＰＧＥＳまたはそのアナログもしくはフラグメントあるいは融合ポリペプチドの実質的に純粋な調製物と、還元型グルタチオンとを、ＰＧＥＳによるＰＧＨのＰＧＥへの転換の触媒に適切な条件下で接触させる工程を包含し得る。
【００２１】
ＰＧＥもしくは精製されたＰＧＥＳまたはそれらのモジュレーターは、プロスタグランジンの影響を調節する必要がある被験体を処置するために用いられ得る。例えば、本発明の精製された調製物（例えば、ＰＧＥもしくは精製されたＰＧＥＳまたはそれらのモジュレーター）を用いて、例えば、炎症疾患、疼痛、血圧、子宮収縮活性、および骨吸収を含め、ＰＧＥ関連疾患またはＰＧＥ関連疾患を処置し得る。ＰＧＥＳのアンタゴニストは、天然に存在するＰＧＥＳの例えば、ドミナントネガティブ変異体であり得る。
【００２２】
本発明によってなおまた提供されるのは、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントの三次元構造を決定するための方法であり、この方法は、精製されたＰＧＥＳまたは融合ポリペプチドの調製物を結晶化する工程；結晶構造の座標を決定する工程；およびこの座標をコンピュータプログラムに導入して、座標からの三次元構造の決定を可能にする工程を包含する。ＰＧＥＳの三次元構造の知識は、ＰＧＥＳと相互作用する薬物の選択を可能にする。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも、高度に純粋なＰＧＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）の調製を可能にする方法の発見に基づく。本発明をさらに記載することを支援するいくつかの図面が提供される。当業者は、図２Ｃから、組換えＰＧＥＳが、タンパク質の損失なくして細菌メンブレンから効率的に抽出され、そして上記に記載の緩衝液組成物中で可溶化され得ること；図３から、可溶化の間／後のＰＧＥＳ酵素活性の保存がＧＳＨおよびグリセロールの存在により改善されること；図４から、可溶化されたＰＧＥＳの活性が、ＧＳＨおよびグリセロールの存在により延長された時間保存されること（ＧＳＨとグリセロールの非存在下では、すべての検出可能な活性は、２〜３時間以内に失われる）；図５から、組換えＰＧＥＳは、実施例３中に記載される方法により、可溶化された膜フラクションから見かけ上均一まで生成され得ること；図６から、粗製フラクション中のＰＧＥＳの量が、精製されたタンパク質を標準として用い、定量ウェスタンブロットで決定され得ること；図７から、溶液中の精製されたＰＧＥＳの酵素活性が、可溶化されていない膜中で決定された活性に等しく、タンパク質が、実際の方法を用いて機能的状態で可溶化かつ精製され得ることを示し、しかもこの精製され、可溶化されたＰＧＥＳが、酵素活性の損失なくして凍結−融解に対して耐性であり、それ故、実際の緩衝液／界面活性剤組成物中でこのタンパク質の長期間貯蔵を可能にすること；図８から、組換えＰＧＥＳがまた、膜フラクションを最初に単離することなく細菌総細胞溶解物から見かけ上均一まで精製され得ること；図９から、組換えＰＧＥＳが、実施例８に記載のような対応するより大きなカラム、しかも精製されたＰＧＥＳの回収率を用いて、大量の物質から見かけ上均一まで精製され得ること；図１２から、ＰＧＥＳの発現が、ＣＯＸ−２のアップレギュレーションに従ってＩＬ−１βにより誘導されること；図１３から、ＩＬ−１βとのインキュベーションに際し、ミクロソームＰＧＥＳ酵素活性の増加が、タンパク質発現の誘導に比例することを認識する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語は、当該分野でそれらの通常の意味を有しているが、なおさらに本発明を明瞭にするために、便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項で採用される特定の用語および語句の意味は、以下に提供される。
【００２５】
「ＰＧＥＳ」または「ＰＥＧシンターゼ」は、環状エンドペルオキシド基質の９−ケト、１１αヒドロキシ形態への変換を触媒する酵素である、プロスタグリンＥシンターゼをいう。ＰＧＥＳは、前駆体分子のＰＧＥ１、ＰＧＥ２およびＰＧＥ３ならびにそれらのアナログ（例えば、合成アナログ）への変換を触媒する。例えば、ＰＧＥＳは、ＰＧＨ２のＰＧＥ２への変換を触媒する。
【００２６】
「ＰＧＥＳ基質」は、環状エンドペルオキシド構造を有する任意の分子であり、これは、ＰＧＥＳにより９−ケト、１１αヒドロキシ形態に変換され得る。例示のＰＧＥＳ基質は、以下を含む；ＰＧＨ１、これは、ＰＧＥＳによりＰＧＥ１に変換される；ＰＧＨ２、これは、ＰＧＥＳによりＰＧＥ２に変換される；ＰＧＨ３、これは、ＰＧＥＳによりＰＧＥ３に変換される；ＰＧＧ１、これは、ＰＧＥＳにより、１５（Ｓ）ヒドロキシペルオキシＰＧＥ１に変換される；ＰＧＧ２、これは、ＰＧＥＳにより、１５（Ｓ）ヒドロキシペルオキシＰＧＥ２に変換される；およびＰＧＧ３、これは、ＰＧＥＳにより、１５（Ｓ）ヒドロキシペルオキシＰＧＥ３に変換される（ＷＯ  ００／２８０２２を参照のこと）。
【００２７】
「ＰＧＥＳ核酸」は、本明細書で規定されるような、ＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸である。
【００２８】
「ＰＧＥＳアゴニスト」は、ＰＧＥＳ生体活性を模倣する試薬をいう。
【００２９】
「ＰＧＥＳアンタゴニスト」は、野生型ＰＧＥＳと競争することによるような、ＰＧＥＳ生体活性を阻害する試薬をいう。
【００３０】
「野生型ＰＧＥＳ」は、この遺伝子の最も一般的な形態（すなわち、対立遺伝子）である天然に存在するＰＧＥＳ遺伝子（またはそれによってコードされるポリペプチド）をいう。
【００３１】
「ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログまたはフラグメント」は、ＰＧＥＳポリペプチド、ＰＧＥＳポリペプチドのアナログ；ＰＧＥＳポリペプチドのフラグメントおよびＰＧＥＳアナログのフラグメントを含むことが意図される。
【００３２】
本明細書の目的のために交換可能に用いられる「生物学的活性」または「生体活性」または「活性」または「生物学的機能」は、ＰＧＥＳポリペプチドによって実施されるエフェクター機能、例えば、ＰＧＨ２からＰＧＥ２の形成を触媒する能力を意味する。
【００３３】
「ＰＧＥＳポリペプチドの生体活性フラグメント」は、完全長ＰＧＥＳポリペプチドのフラグメントをいい、ここでこのフラグメントは、野生型ＰＧＥＳポリペプチドの活性を特異的に模倣するか、またはそれに拮抗する。
【００３４】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では交換可能に用いられる用語である。このような用語は、特定の目的細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的な子孫を意味することが理解される。特定の変異は、変異または環境の影響のいずれかに起因して引き続く世代で特定の改変が生じ得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でないかもしれないが、なお本明細書で用いられる用語の範囲内に包含される。細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞を包含する。好適な細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌である。
【００３５】
「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントをコードする第１のアミノ酸配列と、ＰＧＥＳポリペプチドとは異なり（すなわち異質）、そして本明細書では、「異質（異種）ポリペプチド」または「外来ポリペプチド」という第２のアミノ酸配列との融合物である。このＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントは、例えば、異質ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合して位置され得る。この異質ポリペプチドはまた、ＰＧＥＳポリペプチドの内部に存在し得る。融合ポリペプチドは、これもまた（異なるポリペプチドであるが）第１のポリペプチドを発現する生物中で見出される外来ドメインを提示し得るか、それは、異なる種類の生物により発現されるポリペプチド構造の「種間」、「属間」などの融合であり得る。好適な実施形態では、融合ポリペプチドは、一般式、Ｘ−目的ポリペプチド−Ｙによって表すことができ、ここで、目的ポリペプチドは、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントを表し、そしてＸおよびＹは、ＰＧＥＳ配列とは有意に関連しない、独立して存在するか、または存在しないアミノ酸配列である。
【００３６】
「薬剤」は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドもしくは脂質）、または細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）細胞もしくは組織のような生物学的材料から作製される抽出物をいう。薬剤は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイおよび同定方法に含められることにより、例えば、ＰＧＥＳのモジュレーターとしての潜在的な活性について評価される。
【００３７】
「天然に存在する」とは、対象が天然に見出され得るという事実をいう。例えば、自然の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）中に存在し、そして実験室でヒトにより意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３８】
以下の用語：「参照配列」、「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性％」、および「実質的に同一」は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために用いられる。「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いられる規定された配列であり；参照配列は、例えば、完全長ｃＤＮＡのセグメントもしくは配列番号１のポリヌクレオチド配列のような配列表に与えられる遺伝子配列としてのより大きな配列のサブセットであり得るか、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含み得る。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチド、頻繁には長さが少なくとも２５ヌクレオチド、そしてしばしば長さが５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部分）を含み、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列をさらに含み得、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、代表的には、「比較窓」内の２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行い、複数の局所領域を同定し、かつその配列類似性を比較する。本明細書で用いる「比較窓」は、少なくとも２０の連続ヌクレオチド位置の認識セグメントをいい、ここで、ポリヌクレオチドセグメントは、少なくとも２０の連続ヌクレオチドの参照配列と比較され得、そしてここで、比較窓中のポリヌクレオチド配列の一部分は、２つの配列の最適アラインメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較窓をアラインするための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ）８５：２４４４の類似性サーチ法により、これらアルゴリズムのコンピューター化された履行（Ｗｉｓｃｏｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または視察により、実施され得、そして種々の方法により生成される最良のアラインメント（すなわち、比較窓内の最高％の相同性を生じる）が選択される。用語「配列同一性」は、比較の窓内の２つのポリヌクレオチド配列が同一（すなわち、ヌクレオチド毎を基礎にして）であることを意味する。用語「配列同一性％」は、比較窓内で２つの最適にアラインされた配列を比較することにより、両方の配列で一致した位置の数を得るために同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定すること、一致した位置の数を比較の窓内の位置の総数（すなわち窓のサイズ）で除すること、および配列同一性％を得るためにこの結果に１００を乗じることにより算出される。本明細書で用いられる用語「実質的に同一」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、このポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較窓、頻繁に少なくとも２５〜５０ヌクレオチドの比較窓内の参照配列と比較したとき、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より普通には少なくとも９９％配列同一性をもち、ここで、配列同一性％は、参照配列を、比較の窓内の参照配列の合計２０％を超えない欠失または負荷を含み得るポリヌクレオチドに対して比較することにより算出される。参照配列は、例えば、配列番号１に示される完全長ヒトＰＧＥＳポリヌクレオチド配列もしくは完全長マウスもしくはウシＰＧＥＳ  ｃＤＮＡ配列のセグメントとしての、より大きな配列のサブセットであり得る。「非関連」または「非相同」配列は、本発明のＰＧＥＳ配列の１つと、好ましくは２５％より小さい同一性であるけれども、４０％より小さい同一性を共有する。
【００３９】
ポリペプチドに適用されるとき、用語「実質的に同一」は、２つのポリペプチド配列が、例えば、デフォールトのギャップ重さを用いるプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適にアラインされたとき、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％のまたはそれより多い（例えば、９９％配列同一性）を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびトレオニンであり；アミドを含む側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００４０】
本明細書で用いられる「ＰＧＥＳフラグメント」は、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残存アミノ酸配列が、例えば、配列番号２であるＰＧＥＳ配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドをいう。ＰＧＥＳフラグメントは、代表的には、少なくとも１４アミノ酸長さ、好ましくは少なくとも２０アミノ酸長さ、通常少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０アミノ酸長さであるか、またはそれより長い。
【００４１】
ＰＧＥＳポリペプチドの「ＰＧＥＳアナログ」または「ＰＧＥＳ改変体」は、ＰＧＥＳポリペプチドに対する特定の相同性、例えば、アミノ酸配列相同性または構造的相同性を有する天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在しないポリペプチドをいう。いくつかのＰＧＥＳアナログは、生物学的活性を欠き得るが、なお種々の使用に採用され得、例えば、ＰＧＥＳエピトープ抗体を惹起するため、アフィニティクロマトグラフィーによりＰＧＥＳ抗体を検出するため、および／またはそれを精製するための免疫学的試薬として、またはネイティブＰＧＥＳタンパク質機能の競合的もしくは非競合的アゴニスト、アンタゴニスト、または部分的アゴニストなどである。
【００４２】
ＰＧＥＳポリペプチドおよびそのアナログ、ならびにＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログのフラグメントは、「ＰＧＥＳ型ポリペプチド」と称される。
【００４３】
「ＰＧＥＳポリペプチド」は、配列番号２、その天然に存在する対立遺伝子（ＡＦ０１０３１６で提示される配列を含む）を有するヒトポリペプチド、パラログ、およびＰＧＥＳのオルトログである任意の天然に存在する非ヒトポリペプチド（例えば、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジまたはウシ）またはパラログをいう。文脈に依存して、「ＰＧＥＳポリペプチド」はまた、ＰＧＥＳポリペプチドまたはＰＧＥＳポリペプチドの調製物のみを本質的に含む組成物をいう。
【００４４】
本明細書で用いる「コグネート（ｃｏｇｎａｔｅ）」または「オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」は、種間で進化的および機能的に関連している遺伝子配列またはそれによってコードされるタンパク質をいう。例えば、制限されずに、ヒトゲノムにおいて、ヒトＣＤ４遺伝子は、ヒトＣＤ４遺伝子は、マウスＣＤ４遺伝子に対するコグネート遺伝子である。なぜなら、これら２つの遺伝子の配列および構造は、それらが高度に相同的であり、そして両方の遺伝子がＭＨＣクラスＩＩに限定される抗原認識を通じてシグナル伝達Ｔ細胞活性化において機能するタンパク質をコードすることを示すからである。従って、ヒトＰＧＥＳ遺伝子に対するコグネートマウス遺伝子は、ヒトＰＧＥＳタンパク質に対して最も大きな程度の配列同一性を有し、かつヒトＰＧＥＳの発現パターン（例えば、Ｔ系統細胞で発現される）と類似の発現パターンを示す発現されたタンパク質をコードするマウス遺伝子である。好適なコグネートＰＧＥＳ遺伝子は：ラットＰＧＥＳ、ウサギＰＧＥＳ、イヌＰＧＥＳ、非ヒト霊長類ＰＧＥＳ、ブタＰＧＥＳ、ウシＰＧＥＳ、およびハムスターＰＧＥＳである。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「標識」または「標識された」は、例えば、放射線標識アミノ酸もしくは放射線標識ヌクレオチドの取り込み、または印をつけたアビジン（例えば、蛍光マーカーまたは光学的もしくは比色法により検出され得る酵素活性を含むストレプトアビジン）への付着による検出マーカーの取り込みをいう。ポリペプチド、核酸、および糖タンパク質を標識する種々の方法が当該分野で公知であり、そして用いられ得る。ポリペプチドの標識の例は、制限されずに以下を含む：放射線同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、ビオチン基、二次的レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識には、可能な立体妨害を低減するためのスペーサーアームが付着される。
【００４６】
「試薬（ａｇｅｎｔ）の薬学的組成物」は、試薬および適切なキャリア、希釈剤またはビヒクルを含む。
【００４７】
「プロスタグランジン」および「ＰＧ」は、一般に、プロスタン酸（１）のアナログおよび誘導体である化合物のクラスを記載するために用いられる。ＰＧは、例えば、それらの５員環構造に従って、文字指定を用いてさらに分類され得る；Ａ〜ＪのＰＧが知られている。ＰＧはさらに、側鎖上の不飽和結合の数を基に分類され得る。例えば、ＰＧ１ｓ（１３，１４−不飽和）、ＰＧ２（１３，１４−および５，６−不飽和）およびＰＧ３’ｓ（１３，１４−、５，６−および１７，１８−不飽和）である。米国特許第５，６３１，２８７号を参照のこと。
【００４８】
「ＰＧＥ」は、プロスタグランジンＥ、例えば、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＥ３およびそれらのアナログをいう。ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＰＧＥ３はまた、ＰＧＥ−１、ＰＧＥ−２、ＰＧＥ−３とも称される。
【００４９】
「ＰＧＨ」は、プロスタグランジンＨ、例えば、ＰＧＨ１、ＰＧＨ２、ＰＧＨ３およびそれらのアナログをいう。
【００５０】
「実質的に純粋」は、目的種が存在する優勢種であり（すなわち、それは、モルを基礎に、組成物中の任意の他の種より豊富である）、そして、好ましくは、実質的に精製されたフラクションは、目的種がすべての存在する高分子種の（モルを基礎に）少なくとも約５０％を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、この組成物中に存在するすべての高分子種の約８０〜９０％より多くを含む。最も好ましくは、目的種は、本質的に均一まで精製され（従来の検出方法によってはこの組成物中で狹雑種を検出できない）、ここで、この組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【００５１】
ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関して本明細書で用いられる「単離された」は、高分子の天然の供給源中に存在する、その他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子をいう。例えば、目的ＰＧＥＳポリペプチドの１つをコードする単離された核酸は、（プロモーターを含む）完全遺伝子を超えない、ゲノムＤＮＡ中のＰＧＥＳ遺伝子に天然に直接隣接する通常１０キロベース（ｋｂ）を超えない、好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の５ｋｂを超えない、そしてより好ましくはこのような天然に存在する隣接配列の１．５ｋｂより少ない核酸配列を含む。本明細書で用いられるこの用語「単離された」はまた、組換えＤＮＡ技法により生成されるとき、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地を、化学的に合成されるとき、化学的前駆体またはその他の化学的化合物を、実質的に含まない核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在せず、そして天然の状態で見出されない核酸フラグメントを包含することが意図される。本明細書で用いられる用語「単離された」はまた、その他の細胞タンパク質から単離されるポリペプチドをいい、そして精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することが意図される。
【００５２】
「非ヒト動物」は、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ニトワトリ、両生類、爬虫類などを包含する。
【００５３】
核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、等価物として、ヌクレオチドアナログから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、および、記載されている実施形態に適用可能であるとして、一本鎖ポリヌクレオチド（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含することが理解されるべきである。
【００５４】
「プロモーター」は、このプロモーターに作動可能に連結される選択されたＤＮＡ配列の発現を調節し、そして細胞内でこの選択されたＤＮＡ配列の発現を行うＤＮＡ配列を意味する。この用語は、構成的プロモーターおよび誘導性（すなわち、発現レベルが制御され得る）プロモーターを包含する。
【００５５】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物をいう場合、交換可能に用いられる。
【００５６】
「組換えタンパク質」は、組換えＤＮＡ技法により産生されるポリペプチドをいい、ここでは、一般的に、タンパク質、例えば、ＰＧＥＳポリペプチドをコードするＤＮＡは、次に宿主細胞を形質転換してこのタンパク質を産生するために用いられる適切な発現ベクター中に挿入される。
【００５７】
本明細書で用いられる「小分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、約５ｋＤより小さい、そして最も好ましくは約４ｋＤより少ない分子量を有する組成物をいうことが意図される。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質またはその他の（炭素含有）有機分子または無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的混合物および生物学的混合物、しばしば真菌、細菌または藻類抽出物の広範なライブラリーを有し、これらは、例えば、ＰＧＥＳ活性を調整する化合物を同定するために、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングされ得る。
【００５８】
「転写調節配列」は、それらに作動可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターのようなＤＮＡ配列をいうために、本明細書を通じて用いられる一般用語である。好適な実施形態では、目的遺伝子の１つの転写は、その中で発現が意図される細胞型中の組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（またはその他の転写調節配列）の制御下にある。組換え遺伝子はまた、天然に存在する遺伝子の転写を制御するような配列と同一または異なる転写調節配列の制御下に存在し得る。
【００５９】
用語「目的ポリペプチド」または「目的タンパク質」または「目的ペプチド」は、野生型ＰＧＥＳポリペプチドのモジュレーター、例えば、アゴニストまたはアゴニストである、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントをいう。目的ポリペプチドは、融合ポリペプチドであり得る。
【００６０】
用語「目的核酸」または「目的遺伝子」はそれぞれ、目的のＰＥＧＳポリペプチドをコードする核酸または遺伝子をいう。
【００６１】
本明細書で用いられる「処置すること」は、少なくとも１つの病状または疾患の兆候を防ぎ、治癒し、または軽減することを包含することが意図される。
【００６２】
ヒトＰＥＧＳをコードする核酸は、Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：７２２０中、およびＪａｋｏｂｓｓｏｎらによる公開されたＰＣＴ出願ＷＯ００／２８０２２中に記載されている。（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら上述中およびＷＯ００／２８０２２中に記載されるような）完全長ヒトＰＥＧＳをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１として提示され、そしてヒトＰＥＧＳのアミノ酸配列は、配列番号２として提示される。ヒトＰＥＧＳをコードするヌクレオチド配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｒ７６４９２中に含められ、これは、発現された配列タグクローン１４３７３５のヌクレオチド配列である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２７７４０は、ヒトＰＥＧＳのコード配列を含むＲ７６４９２の配列の一部分（これは、ＡＦ０２７７４０のヌクレオチド１９〜４７７に対応する）からなる。この配列は、コードされるタンパク質をミクロソームグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ１様１（ＭＧＳＴ１−Ｌ１）と称する。ヒトＰＥＧＳポリペプチドは、１５２アミノ酸（配列番号２）からなり、そして４５６ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列（配列番号１）によりコードされる。
【００６３】
配列番号２とは１つのアミノ酸が異なるヒトタンパク質（すなわち、アミノ酸５３と５４との間にグリシンの付加）をコードする核酸が、公開されたＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎらによるＰＣＴ出願ＷＯ９９／１４３５６、Ｐｏｌｙａｋら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００中、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１０３１６中に記載され、これらすべてはこのタンパク質をｐ５３誘導ＰＩＧ１２と称している。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎらに記載されたタンパク質は、ヒトＰＥＧＳの対立遺伝子または変異体形態であり得るか、または配列決定の誤りからであり得、そしてこのようなポリペプチドもまた、ＰＥＧＳの定義内に含まれ、そして本発明に従って用いられ得る。
【００６４】
ウシＰＥＧＳは、Ｆｉｌｉｏｎら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、原稿Ｍ１０３７０９２００中に記載されている。ラットおよびマウスＰＥＧＳポリペプチドは、Ｍｕｒａｋａｍｉら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３２７８３；Ｍａｎｃｉｎｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（印刷中）；およびＳａｔｏｈら（２０００）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８３：２２１中に記載されている。ウシポリペプチドは、ヒト（配列番号２）、マウス（Ｍｕｒａｋａｍｉら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３２７８３）およびラット（Ｍｕｒａｋａｍｉら、上述；Ｍａｎｃｉｎｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（印刷中）；およびＳａｔｏｈら、（２０００）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８３：２２１）に対し、７７％以上同一である。
【００６５】
ＰＥＧＳの活性部位は、約残基３０と約残基１３０との間に位置するようである。実際、ＰＧＥシンターゼタンパク質の対応する触媒領域は、ＭＧＳＴ１およびＬＴＣ４シンターゼとのアナログ性を基礎に、配列番号２の中央セグメント中にあると予期される。アミノ酸１〜４１は、機能の喪失なくしてＭＧＳＴ１から除去され得る（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２０４：２９８）。Ｃ−末端フラグメントは、ＬＴＣ４シンターゼとＦＬＡｐとの間でタンパク質機能の改変なくして交換され得る（Ｌａｍら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３９２３）。
【００６６】
さらに、Ｍｕｒａｋａｉｍら（上述）は、ヒトＰＧＥＳ中のＡｒｇ１１０が、触媒機能に重要であることを示した。ヒト、マウス、ラットおよびウシのＰＧＥＳの配列のアラインメント（Ｆｉｌｏｎら、上述）は、このアルギニンがすべての４種中で保存されていることを示し、触媒活性におけるその役割をさらに示唆する。また、ウシタンパク質の２つの内部領域Ａｒｇ３９〜Ａｌａ５１およびＡｓｐ６３〜Ｐｒｏ９７（すなわち、それぞれ、配列番号２のＡｒｇ３８〜Ａｌａ５０およびＡｓｐ６２〜Ｐｒｏ９６）は、これら４つのタンパク質を通じて１００％同一性を示し、そしてそれ故、重要な構造／調節ドメインを含み得る。ウシタンパク質のＮ−末端領域（Ｍｅｔ１〜Ｌｅｕ１４）およびカルボキシ末端領域（Ｌｙｓ１２１〜Ｌｅｕ１５３）（すなわち、それぞれ、配列番号２のＭｅｔ１〜Ｌｅｕ１３およびＬｙｓ１２０〜Ｌｅｕ１５２）は、ウシＰＧＥＳを対応するげっ歯類酵素と比較したとき、それぞれ、平均５９〜６１％同一性で、より少なく保存されているようである（Ｆｉｌｉｏｎら、上述を参照のこと）。
【００６７】
ヒトＰＧＥＳは、それぞれ、配列番号２の約アミノ酸３６〜７８および１１９〜３０に位置する、２つの親水性ループを含む。これらのループは、この酵素の活性部位の一部分である可能性が最も高い。２つのループ間の領域、すなわち、アミノ酸７９〜１１８は、疎水性領域を含み、そしてまたこの酵素の機能的エレメントを含み得る。
【００６８】
本発明は、ＰＧＥＳポリペプチドもしくはそのアナログ、または、例えば、異種ポリペプチドに融合した（本明細書では「目的融合ポリペプチド」または「ＰＧＥＳ融合ポリペプチド」と称する）フラグメントを含む精製されたポリペプチドを提供する。好適な実施形態では、このＰＧＥＳポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、他の細胞物質、例えば、タンパク質を実質的に含まない。用語「ＰＧＥＳポリペプチドの実質的に純粋または精製された調製物」は、約２０％より少ない（乾燥重量）狹雑細胞物質（例えば、核酸、タンパク質、および脂質）を有し、そして好ましくは、約５％より少ない狹雑細胞物質を有するＰＧＥＳポリペプチドの調製物をいう。目的融合ポリペプチドの好適な調製物は、約２％の狹雑細胞物質；なおより好ましくは、約１％の狹雑細胞物質、そして最も好ましくは、約０．５；０．２；０．１；０．０１；０．００１％の狹雑細胞物質を有する。
【００６９】
「他の細胞性タンパク質（「夾雑タンパク質」とも本明細書中でよばれる）を実質的に含まない」ポリペプチド調製物は、約２０（乾燥重量）％未満の夾雑タンパク質、そして好ましくは、約５％未満の夾雑タンパク質を有するポリペプチドの調製物をいう。本発明のポリペプチドの好ましい調製物は、約２％未満の夾雑タンパク質、そしてさらにより好ましくは、約１％未満の夾雑タンパク質、そして最も好ましくは、約０．５％未満；約０．２％未満；約０．１％未満；約０．０１％未満；約０．００１％未満の夾雑タンパク質を有する。
【００７０】
当業者は、本発明のポリペプチド調製物の純度が、種々の方法により決定され得ることを理解する。ポリペプチド調製物中の夾雑タンパク質の量を決定するための好ましい方法は、ポリペプチド調製物を、特定の量の分子マーカーの存在下で、ゲル電気泳動（例えば、ポリアクリルアミド電気泳動）に供する工程、および電気泳動後に、タンパク質色素（染料）を用いてゲルを染色する工程を包含する。分子マーカーとの本発明のポリペプチドのバンドの強度の比較は、本発明のポリペプチド調製物の純度を示す。夾雑タンパク質の量を決定するための他の方法としては、当該分野で公知の方法に従う、質量分析、ゲルろ過およびペプチド配列決定が挙げられる。
【００７１】
ポリペプチド調製物中の夾雑細胞物質の量を決定するための好ましい方法は、ゲル電気泳動およびこのゲルの銀染色を包含する。
【００７２】
ポリペプチド調製物の純度を決定するための他の方法としては、当該分野で公知の方法に従う質量分析が挙げられる。ポリペプチド調製物の純度のさらに他の測定としては、本明細書中にさらに記載されるような、ポリペプチドの活性の尺度が挙げられる。
【００７３】
タンパク質濃度は、以下の方法に従って決定され得る：Ｌｏｗｒｙ−Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ試薬；２８０ｎｍ（芳香族バンド）または２０５〜２２０ｎｍ（ペプチドバンド）でのＵＶ吸収；色素結合（例えば、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０）；またはビス−シンコニン酸（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））試薬。これらの方法の全てが、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、およびその中で引用される参考文献に記載される。簡単には、周知のＬｏｗｒｙ法は、０．１ｍｇ／ｍｌ以下のタンパク質で、良好な色を与える、比較的敏感な方法である。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０を用いる方法は、非常に敏感で、速く、そして、少なくとも、Ｌｏｗｒｙ法と同じ程度に精確である。この手順は、ポリペプチドサンプルを試薬と混合すること、および５９５ｎｍでの青色の測定からなる。
【００７４】
当業者は、正確なタンパク質量を決定するために好ましい方法は、乾燥重量測定によるものであることを理解する。なぜならば、これは、タンパク質量に適切に正確な測定値を提供するからである。従って、本発明の精製したポリペプチドの量を決定するために好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物の乾燥重量が決定され、次いで、この調製物は、本発明のポリペプチドの他の調製物のタンパク質濃度を決定するための標準として用いられる。
【００７５】
当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドの調製物の回収百分率および純度の程度は、精製後に回収されるタンパク質の総量、ならびに目的のポリペプチドの量および／または活性から計算され得る。
【００７６】
本発明の融合ポリペプチドは、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント、およびそれらに対して異種であるポリペプチドを含む。
【００７７】
本明細書中で用いられる場合、ＰＧＥＳポリペプチドは、配列番号２を有するヒトポリペプチド、その天然に存在する対立遺伝子、およびＰＧＥＳのオルソログである任意の非ヒト（例えば、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジまたはウシ）の天然に存在するポリペプチドをいう。ＰＧＥＳポリペプチドのアナログまたは改変体は、ＰＧＥＳポリペプチドに対して特定の相同性（例えば、アミノ酸配列相同性または構造的相同性）を有する、天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在しないポリペプチドをいう。簡単には、ＰＧＥＳポリペプチドおよびそのアナログ、ならびにＰＧＥＳポリペプチドのフラグメントまたはそのアナログのフラグメントは、「ＰＧＥＳ型ポリペプチド」といわれる。従って、好ましい実施形態では、本発明は、ＰＧＥＳ型ポリペプチド、およびそれに対して異種であるポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。
【００７８】
本発明の好ましいＰＧＥＳ型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一または相同であるアミノ酸配列を有する。さらにより好ましいＰＧＥＳ型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約９７％、９８％、または９９％同一または相同であるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
例えば、ＰＧＥＳ型ポリペプチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列と、少なくとも８５％相同、およびより好ましくは９０％相同、および最も好ましくは９５％相同である核酸によりコードされ得る。配列番号１に対して少なくとも約９８〜９９％相同である核酸によりコードされるポリペプチドもまた、本発明の範囲内にある。
【００８０】
本発明の別の局面は、配列番号１の相補体により表される核酸に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドを提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件（例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで、５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄）は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出され得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃にて約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃にて約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度および塩の両方を、変化させ得るか、または温度もしくは塩濃度は、他方の変数を変化させる間、一定に保たれ得る。好ましい実施形態では、ＰＧＥＳ型ポリペプチドをコードする核酸は、中程度にストリンジェントな条件下（例えば、約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃）で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする。特に好ましい実施形態では、ＰＧＥＳ型ポリペプチドをコードする核酸は、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６５℃で５×ＳＳＣ、次いで、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄）で、配列番号１の相補体にハイブリダイズする。
【００８１】
本発明の融合ポリペプチドにおいて用いられ得る他のＰＧＥＳ型ポリペプチドとしては、配列番号２を有するヒトＰＧＥＳポリペプチドに進化的に関係したＰＧＥＳ型ポリペプチドが挙げられる。用語「進化的に関係した」は、ＰＧＥＳポリペプチドのアミノ酸配列に関して、天然に存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことをいい、そしてまた、例えば、コンビナトリアル変異誘発により誘導されるヒトＰＧＥＳポリペプチドの変異改変体のこともいう。
【００８２】
好ましい実施形態では、ＰＧＥＳ型ポリペプチドは、脊椎動物ＰＧＥＳ型ポリペプチド（例えば、哺乳動物ＰＧＥＳ型ポリペプチド、例えば、ヒトＰＧＥＳ型ポリペプチド、非ヒトＰＧＥＳ型ポリペプチド、霊長類ＰＧＥＳ型ポリペプチド、げっ歯類（マウスまたはラット）ＰＧＥＳ型ポリペプチド、ネコＰＧＥＳ型ポリペプチド、ウシＰＧＥＳ型ポリペプチド、またはヒツジＰＧＥＳ型ポリペプチド）である。特に好ましい実施形態では、ＰＧＥＳ型ポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、ＰＧＥＳポリペプチド（例えば、ヒトＰＧＥＳポリペプチド）である。ウシＰＧＥＳは、Ｆｉｌｉｏｎら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，原稿Ｍ１０３７０９２００に記載されている。ラットおよびマウスのＰＧＥＳポリペプチドは、Ｍｕｒａｋａｍｉら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３２７８３；Ｍａｎｃｉｎｉら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（印刷中）；およびＳａｔｏｈら（２０００）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８３：２２１に記載されている。
【００８３】
ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログのフラグメントであるＰＧＥＳ型ポリペプチドを含む融合ポリペプチドもまた本発明の範囲内である。このフラグメントは、１つ以上の特定のモチーフおよび／もしくはドメイン、または任意のサイズ（例えば、少なくとも約５、１０、２５、５０、７５、１００および１２５）のアミノ酸長に対応し得る。好ましいフラグメントは、ＰＧＥＳポリペプチドの触媒部位を含むか、またはそのアナログの部分に対応する、生物学的に活性なフラグメント（例えば、フラグメント）である。従って、配列番号２またはそのオルソログを有するＰＧＥＳポリペプチドの例示的フラグメントは、約アミノ酸１〜約アミノ酸１３０；約アミノ酸３０〜１５２；約アミノ酸３０〜１３０；約アミノ酸５０〜１００；約アミノ酸３８〜５０；および約アミノ酸６２〜９６を含む。ポリペプチドの生物学的活性は、本明細書中に記載される方法（例えば、ポリペプチドの、ＰＧＨからＰＧＥへの転換を触媒する能力を決定するためのアッセイ）に従って決定され得る。
【００８４】
他の好ましいＰＧＥＳ型ポリペプチドは、１つ以上の親水性ループ（例えば、配列番号２の約アミノ酸３６〜約アミノ酸７８、および約アミノ酸１１９から約アミノ酸１３０）を含む。好ましいＰＧＥＳ型ポリペプチドとしては、活性部位またはその部分（例えば、１つまたは２つの親水性ループ、および、必要に応じて、この２つのループの間の配列）を含むものが挙げられる。
【００８５】
ＰＧＥＳ型ポリペプチドは、好ましくは、ＰＧＥＳ型ポリペプチド（例えば、配列番号２を有するヒトＰＧＥＳ）の少なくとも１つの生物学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかの役割の１つで機能し得る。従って、ＰＧＥＳ型ポリペプチドは、例えば、還元型グルタチオンの存在下で、ＰＧＨまたはそのアナログの、ＰＧＥまたはそのアナログへの転換（例えば、ＰＧＨ２のＰＧＥ２への転換）を触媒し得る酵素であり得る。ＰＧＥＳ型ポリペプチドはまた、ＰＧＨのＰＧＥへの転換を阻害するポリペプチドであり得る。ＰＧＥＳポリペプチドの生物学的活性を測定するためのアッセイは、本明細書中にさらに記載される。
【００８６】
野生型ＰＧＥＳポリペプチドの好ましいアゴニストは、ＰＧＨ２のＰＧＥ２へのグルタチオン依存転換について、０℃か、室温か、３７℃かのいずれかで測定される、約１〜約５００μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する。好ましいアゴニストは、約１０〜約２５０μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する。この単位は、産生されたＰＧＥ２のμモル／１分間の反応時間／ＰＧＥＳポリペプチドのミリグラムをいう。本明細書中に記載される精製された例示的ＰＧＥＳポリペプチドは、０℃で測定された、１５μｍｏｌ／分／ｍｇの活性、および３７℃で測定された１６７μｍｏｌ／分／ｍｇの活性を有する。好ましいアゴニストは、少なくとも約１０、２０、５０、１００、２００、３００μｍｏｌ／分／ｍｇの比活性を有する。ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントの比活性は、当該分野で周知でもある、本実施例に記載される方法により決定され得る。
【００８７】
野生型ＰＧＥＳポリペプチドの好ましいアゴニストは、ＰＧＨ２のＰＧＥ２へのグルタチオン依存転換について、０℃か、室温か、３７℃かのいずれかで測定された、約１〜約５００μＭのＰＧＨ２に関するＭｉｃｈａｅｌｉｓ定数（Ｋｍ）を有する。好ましいアゴニストは、約１０〜約２００μＭのＫｍを有する。さらにより好ましいアゴニストは、１００μＭ、１０μＭ、５μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ未満のＫｍを有する。本明細書中に記載されるように精製された例示的ＰＧＥＳポリペプチドは、０℃で約５０のＫｍおよび３７℃で約１６３のＫｍを有する。
【００８８】
野生型ＰＧＥＳポリペプチドの好ましいアゴニストは、ＰＧＨ２のＰＧＥ２へのグルタチオン依存転換について、０℃か、室温か、３７℃かのいずれかで測定された、約０．０１〜約１０μＭ／秒の最大反応速度（Ｖｍａｘ）を有する。好ましいアゴニストは、約０．１〜約５μＭ／秒のＶｍａｘを有する。さらにより好ましいアゴニストは、少なくとも約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、または５μＭ／秒のＶｍａｘを有する。
【００８９】
好ましいＰＧＥＳアゴニスト調製物およびＰＧＥＳアンタゴニスト調製物は、少なくとも約０．１〜約２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ、そして好ましくは、少なくとも約０．１、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
【００９０】
ＰＧＥＳポリペプチドの改変体およびフラグメント（例えば、アゴニストおよびアンタゴニストのようなモジュレーター）は、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットのみを促進または阻害するために有用である。従って、特定の生物学的効果は、特定の機能のホモログを用い、そしてホモログ機能が全ての生物学的活性に対して指向される、モジュレーター（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）を用いる処理と比較して、おそらくより少ない副作用を有する、処理により誘導され得る。
【００９１】
当業者により理解されるように、本発明のＰＧＥＳタンパク質の改変体は、従来の技術（例えば、別々の点変異を作製することを含む変異誘発、または短縮化による）を用いて作製され得る。例えば、変異は、それが由来したＰＧＥＳポリペプチドの生物学的活性と実質的に同じ生物学的活性、または単なるサブセットを保持する改変体を生じ得る。あるいは、タンパク質のアンタゴニスト形態が作製されて、これは、例えば、ＰＧＥＳの基質に対して競合的に結合することにより、このタンパク質の天然に存在する形態の機能を阻害し得る。
【００９２】
本発明のＰＧＥＳポリペプチドの改変体はまた、野生型ＰＧＥＳポリペプチド（例えば、（例えば、このポリペプチドと関連したユビキチン結合または他の酵素的標的化を変化させる変異に起因して）タンパク質分解切断に対して耐性であるポリペプチドのバージョン）のホモログを含む。このような部位は、当該分野で公知である。
【００９３】
ＰＧＥＳポリペプチドはまた、化学的に修飾されて、他の化学部分（例えば、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基など）との共有結合体または凝集結合体を形成することによって、ＰＧＥＳ誘導体を作製し得る。ＰＧＥＳポリペプチドの共有結合誘導体は、化学部分を、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基、またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に連結することにより調製され得る。
【００９４】
本発明のＰＧＥＳポリペプチドの構造の修飾は、治療的または予防的な効力、安定性（例えば、エキソビボでの保存期間およびタンパク質分解に対する耐性）、または翻訳後の修飾（例えば、タンパク質のリン酸化パターンを変化させるため）の増強ような目的のためのものであり得る。このような修飾されたペプチドは、例えば、タンパク質の天然に存在する形態の少なくとも１つの活性を維持するか、またはその特異的なアンタゴニストを作製するように設計される場合、ＰＧＥＳポリペプチドの機能的等価物とみなされる。このような修飾されたペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加により作製され得る。置換改変体は、置換された保存的アミノ酸であってもよいし、置換された非保存的アミノ酸であってもよい。
【００９５】
例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる孤立置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による孤立置換、スレオニンのセリンによる孤立置換、あるいは、あるアミノ酸の構造的に関連した（すなわち、等配電子変異体および／または等電点変異体）アミノ酸による類似の置換が、得られる分子の生物学的活性に対して主要な影響を有しないことを予想することは合理的である。保存的置換は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、４つのファミリーに分けられ得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電の極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。類似の様式で、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン（セリンとスレオニンは、必要に応じて、脂肪族−ヒドロキシルとして別にグループ化される）；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに（６）イオウ含有＝システインおよびメチオニンとしてグループ化され得る。（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ編、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：１９８１を参照のこと）。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、機能的ＰＧＥＳホモログ（例えば、得られるポリペプチドが野生型形態を模倣するかまたはアンタゴナイズするという意味において機能的な）を生じるか否かは、改変体ペプチドがＰＧＥＳの生物学的活性をもたらす（例えば、野生型タンパク質に類似する様式で、ＰＧＨのＰＧＥへの転換を触媒するか、またはこのような生物学的活性を競合的に阻害する）能力を評価することにより容易に決定され得る。１を超える置換が生じるポリペプチドは、同じ様式で容易に試験され得る。
【００９６】
本発明はさらに、本発明のＰＧＥＳポリペプチドのコンビナトリアル変異体および短縮型変異体のセットを作製する方法を提供し、そして潜在的な改変体配列（例えば、ホモログ）を同定するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、モジュレーターとして機能し得るおよび／または同時に新規の活性を有し得る、新規のＰＧＥＳホモログを作製することである。従って、コンビナトリアル的に誘導されるホモログは、タンパク質の天然に存在する形態に対して増加した能力を有するように作製され得る。
【００９７】
１つの実施形態では、ＰＧＥＳ改変体の雑多なライブラリーが、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により作製され、そして雑多な遺伝子ライブラリーによりコードされる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、遺伝子配列へと酵素的に連結され得、その結果、潜在的なＰＧＥＳ配列の縮重セットが、個別のポリペプチドとしてか、あるいは、その中にＰＧＥＳ配列のセットを含むより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能である。
【００９８】
潜在的なＰＧＥＳホモログのこのようなライブラリーが、縮重オリゴヌクレオチド配列から作製され得る多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成器により実行され得、次いで、合成遺伝子は、適切な発現ベクターへと連結され得る。縮重セットの遺伝子の目的は、１つの混合物において、所望のセットの潜在的ＰＧＥＳ配列をコードする全ての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ  第３回Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ２７３−２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。このような技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化において用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ  ８７：６３７８−６３８２；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【００９９】
同様に、コード配列フラグメントのライブラリーは、スクリーニングのためのＰＧＥＳフラグメントの雑多な集団の作製、次いで、生理活性フラグメントの選択のために、ＰＧＥＳクローンについて提供され得る。種々の技術が、化学合成を含む、このようなライブラリーを作製するために当該分野で公知である。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、（ｉ）ニック化が１分子あたり約１回のみ生じる条件下で、ヌクレアーゼを用いて、ＰＧＥＳコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること；（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡを変性させること；（ｉｉｉ）このＤＮＡを再生して、異なるニック化産物からセンス／アンチセンスの対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること；（ｉｖ）Ｓ１ヌクレアーゼを用いる処理により再生した二重鎖から一本鎖部分を除去すること；および（ｖ）得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターへと連結することにより作製され得る。この例示的方法により、種々のサイズの、Ｎ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメント、および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが誘導され得る。
【０１００】
広範な技術が、点変異または短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、当該分野で公知である。このような技術は、ＰＧＥＳホモログのコンビナトリアル変異誘発により作製される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに一般的に適合可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために用いられる最も広範な技術は、代表的には、遺伝子ライブラリーを、複製可能な発現ベクターへとクローニングすること、得られたベクターのライブラリーを用いて、適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現することを包含する。以下に記載される例示的アッセイの各々は、コンビナトリアル変異誘発技術により作製される、多数の縮重ＰＧＥＳ配列をスクリーニングするために、必要に応じて、ハイスループット分析に受け入れられる。
【０１０１】
コンビナトリアル変異誘発は、変異タンパク質の非常に大きなライブラリー（例えば、１０２６分子のオーダー）を作製する潜在能力を有する。このサイズのコンビナトリアルライブラリーは、例えば、回帰的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）によって、スクリーニングされ得、これは、ランダムなライブラリーにおける非常に高い割合の非機能的なタンパク質を避け、そして機能的タンパク質の頻度を単に増大させ、従って、配列空間の有用なサンプリングを達成するために必要とされる複雑度を低下させるのを可能にする。ＲＥＭは、適切な選択法またはスクリーニング法を用いる場合に、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大するアルゴリズムである（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ、１９９２、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｙｏｕｒｖａｎら、１９９２、Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍ  Ｓｏｌｖｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｕｒｅ，２．，ＭａｅｎｎｅｒおよびＭａｎｄｅｒｉｃｋ編、Ｅｌｓｅｖｉｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，４０１−４１０頁；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１０２】
ＰＧＥＳポリペプチドに融合される異種ポリペプチド、そのアナログまたはフラグメントは、本発明の融合ポリペプチドにおいて、それらの付着したポリペプチドのアフィニティー精製を可能にする任意のポリペプチドであり得る。
【０１０３】
異種ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。あるいは、特定の実施形態では、異種ポリペプチドのコンフォメーションがアフィニティーマトリクスへの結合を可能にし、そして好ましくは、所望の生物学的活性（例えば、ＰＧＨのＰＧＥへの（例えば、ＰＧＨ２からＰＧＥ２への）転換を触媒する能力）に影響しないのであれば、ＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログまたはフラグメント内に異種ポリペプチドを含むことが適切であり得る。小スケールの精製試験は、融合タンパク質の精製が、異種ポリペプチドが、ＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログまたはフラグメントのＮ末端またはＣ末端に位置する場合、より有効であるか否かを決定するために行われ得る。
【０１０４】
好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、１つ以上のヒスチジン残基を含み、融合ポリペプチドが、金属（例えば、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、およびＡｌ）へ結合することを可能にする。好ましい異種ポリペプチドは、Ｎｉ２＋金属樹脂に結合する。この異種ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のヒスチジン残基を含み得る。さらにより好ましい実施形態では、異種ポリペプチドは、６個のヒスチジン残基（「Ｈｉｓ６タグ」）を含む。６または１０個のヒスチジンをコードする配列を含む特定の発現ベクターが市販されており、そして、通常は、このヒスチジンをコードする配列に対してＣ末端側またはＮ末端側に１つ以上の制限部位を含み、その結果、目的のポリペプチドをコードする核酸は、それらにインフレームで融合され得、そして融合ポリペプチドが発現される。このようなベクターは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）（例えば、ｐＱＥ−ＴｒｉＳｙｓｔｅｍ  Ｖｅｃｔｏｒ）、およびＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）（ｐＥＴベクター）から入手可能である。もちろん、任意の他のベクターが、当該分野で周知の方法を用いて、または本明細書中にさらに記載されるように、６個のヒスチジンをコードする配列を含むように改変され得る。
【０１０５】
Ｈｉｓ６ポリペプチドタグは、生理学的ｐＨで荷電していない。さらに、これらは、タンパク質の免疫原性を殆ど変化させず、これにも寄与せず、そしてタンパク質構造にも、タンパク質機能にも、殆ど影響を与えず、そしてタンパク質分泌にも影響を与えない（Ｓｉｓｋら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：７６６）。
【０１０６】
本発明の好ましい融合ポリペプチドは、６個のヒスチジン残基からなるポリペプチドに対して、そのＮ末端で融合された全長ヒトＰＧＥＳからなる（実施例を参照のこと）。このアミノ酸配列は、配列番号４に示され、そしてこのポリペプチドをコードする例示的な核酸は、配列番号３に示される。
【０１０７】
別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位配列またはエンテロキナーゼ切断部位配列が、ＰＧＥＳ型ポリペプチドをコードする配列と異種ポリペプチドをコードする配列との間に挿入され得る。次いで、精製リーダー配列は、プロテアーゼまたはエンテロキナーゼでの処理により引き続いて除去されて、精製されたタンパク質を提供し得る（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ８８：８９７２を参照のこと）。例示的なプロテアーゼ認識部位は、第Ｘａ因子プロテアーゼ認識部位である。６個のヒスチジンのストレッチをコードする配列およびプロテアーゼに感受性の部位を含むベクターは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）（第Ｘａ因子プロテアーゼ認識部位を含むｐＱＥ−３０  Ｘａ  Ｖｅｃｔｏｒ）から入手可能である。
【０１０８】
用いられ得る別の異種ポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の少なくとも一部を含む。ＧＳＴ融合タンパク質は、例えば、グルタチオン由来マトリクスの使用により、融合タンパク質の精製に寄与し得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１）を参照のこと）。アフィニティー精製に用いられ得るさらに他の異種ポリペプチドは、マルトース結合タンパク質およびプロテインＡである。これらの異種ポリペプチドを用いる場合、アフィニティー精製後の異種ポリペプチドの除去を可能にするプロテアーゼ部位を含むことが好適であり得る。なぜならば、これらの異種ポリペプチドは、Ｈｉｓ６タグよりも大きいからである。
【０１０９】
ＰＧＥＳ型ポリペプチドおよびそれらに対して異種のポリペプチドに加えて、本発明の融合ポリペプチドはまた、他のポリペプチド（例えば、ポリペプチドに増大した安定性および／または可溶性を提供するポリペプチド）を含み得る。例えば、免疫グロブリンの一部分は、本発明の融合ポリペプチドに付加され得る。ＰＧＥＳ−Ｉｇ融合タンパク質は、例えば、米国特許第５，４３４，１３１号に記載されるように調製され得る。
【０１１０】
融合ポリペプチドに加えられ得る、さらに他のポリペプチド成分としては、ポリペプチドの検出を可能にするタグが挙げられる。頻繁に用いられるタグとしては、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基の配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７を参照のこと）、ｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＥＺＺ−プロテインＡ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａヘマグルチニンタンパク質の１６アミノ酸部分が挙げられる。さらに、任意のポリペプチドは、試薬（例えば、タグポリペプチドと特異的に相互作用する抗体）が利用可能であるか、または調製もしくは同定され得る限り、タグとして用いられ得る。
【０１１１】
別の実施形態において、シグナルペプチド配列が、この構築物に付加され、その結果、この融合ポリペプチドは、細胞から分泌される。このようなシグナルペプチドは、当該分野で周知である。
【０１１２】
以下に記載される実施例で示されるように、ヒトＰＧＥＳポリペプチドコード核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅方法によって、ＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸（例えば、発現された配列タグクローン１４７３５）から得られ得る。あるいは、ＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸は、多数の原核細胞生物のいずれか（例えば、Ａ５４９細胞およびＨｅＬａ細胞）に存在するｍＲＮＡから得られ得る（Ｊａｋｏｂｓｓｅｎら、（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：７２２０を参照のこと）。この方法は、ｍＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成すること、次いで、ＰＧＥＳ核酸にハイブリダイズする２つのプライマーを使用してＰＣＲ増幅すること、およびこの増幅された産物を単離することを包含し得る。
【０１１３】
本発明のＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸はまた、任意の適切な供給源から（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから）クローニングされ得る。ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡは、細胞（例えば、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞）から総ｍＲＮＡを単離することによって、得られ得る。二本鎖ｃＤＮＡが、次いで、この総ｍＲＮＡから調製され得、続いて、多数の公知の技術のうちの任意のものを使用して、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入され得る。
【０１１４】
非ヒトＰＧＥＳをコードする核酸は、例えば、配列番号１の全てまたは一部を構成する核酸との低いストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって、または増幅（例えば、１つ以上の縮重プライマーを使用するＰＣＲ増幅）によって、得られ得る。マウスＰＧＥＳおよびラットＰＧＥＳをコードする核酸配列は、それぞれ、登録番号ＮＰ ０７１８６０およびＮＰ ０６７５９４としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。ＰＧＥＳポリオペプチドの改変体およびフラグメントをコードする核酸は、変異誘発またはＰＣＲ法（この両方は当該分野で周知である）によって調製され得る。
【０１１５】
本発明で使用するための、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントをコードする核酸は、遺伝コードの縮重に起因して、例えば、配列番号１で示される野生型ヌクレオチド配列またはその相補体とは異なり得る。このような核酸は、機能的に等価なポリペプチドをコードする。例えば、多数のアミノ酸が、１つより多いトリプレットにより表される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣの各々はヒスチジンをコードする）は、ＰＧＥＳポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」な変異を生じ得る。
【０１１６】
ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸はまた、対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１の配列遺伝子改変体）であり得る。このような対立遺伝子改変体は、配列番号２で示されるポリペプチド、またはこのポリペプチドとは１つ以上のアミノ酸が異なるポリペプチドをコードし得る。
【０１１７】
ＰＧＥＳ型ポリペプチドをコードする核酸の好ましい改変体は、特定のコドンがこのポリペプチドの発現のために使用される特定の発現系において高度に使用されるコドン（「コドンバイアス」）に変更された核酸である。このような置換は、特定の系におけるポリペプチドの発現を改善することが知られている。
【０１１８】
ＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログもしくはフラグメントの精製を可能にする異種ポリペプチドをコードする核酸は、ＰＧＥＳ核酸と類似の様式で得られ得る。融合ポリペプチドに含まれ得る他のポリペプチド（例えば、検出のためのタグ）をコードする核酸はまた、当該分野で公知の方法に従って作製され得る。これらの核酸のいくつかは短いので、これらはまた、オリゴヌクレオチドとして都合良く合成され得る。この場合、互いに相補的な２つのオリゴヌクレオチドが合成され、その後、これらは、一緒にハイブリダイズされ、そして目的のポリペプチドをコードする核酸に連結される。特定の実施形態において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、連結される前に、最初に制限消化に供される。
【０１１９】
融合遺伝子を作製するための技術は、当業者に公知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの連結は、ライゲーションのための平滑末端終結または付着末端終結、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合に付着末端を埋めること（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望でない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを使用して、従来の技術に従って実施される。別の実施形態において、融合遺伝子は、従来の技術（自動化ＤＮＡ合成機を含む）によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して実施され得、このアンカープライマーは、２つの連続した遺伝子フラグメントの間に相補的突出部を生じ、これは次いで、アニーリングされて、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
【０１２０】
本発明の融合ポリペプチドは、細胞または溶解物（例えば、細胞から調製された溶解物）中で作製され得る。本明細書中で宿主細胞と呼ばれるこれらの細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。好ましい実施形態において、この融合ポリペプチドをコードする核酸は、転写制御配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー）に作動可能に連結される。一般に、このような核酸はまた、プラスミドまたは発現ベクターに組み込まれ、これは次いで、宿主細胞に導入されて、融合ポリペプチドの発現を可能にする。使用される転写制御配列のタイプは、使用される特定の発現系（例えば、この系が原核生物（例えば、細菌）であるか真核生物（例えば、酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）であるか）に依存する。例えば、転写調節配列における哺乳動物転写制御エレメントは、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。発現系および適切な転写制御配列は、以下にさらに記載される。
【０１２１】
原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＧＥＳ型ポリペプチドの発現のための適切なベクターとしては、以下の型のプラスミドが挙げられる：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミド。
【０１２２】
一実施形態において、強力なファージＴ５プロモーター（これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）が、ｌａｃオペレーター抑制モジュールと共に使用されて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、厳密に調節された高レベルの発現または組換えタンパク質が提供される。この系において、タンパク質の発現は、高レベルのｌａｃレプレッサの存在下でブロックされる。このようなベクターは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｑＱＥ  ベクター）から市販されている。
【０１２３】
別の実施形態において、ＰＧＥＳポリペプチド融合ポリペプチドをコードする核酸は、細菌プロモーター（例えば、嫌気性Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター、ＮｉｒＢプロモーター、もしくはＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質ｌｌｐプロモーター（例えば、Ｉｎｏｕｙｅら、（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１に記載される）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｇＣプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒら、前出）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｅｎｔプロモーター（ＳｃｈｍｉｔｔおよびＰａｙｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：８１６（１９９１）、Ｔｎ１０上のｔｅｔプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒら、前出）、またはＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｏｒａのｃｔｘプロモーター）に作動可能に連結される。任意の他のプロモーターが、本発明で使用され得る。細菌プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。好ましい誘導性プロモーターは、鉄または鉄制限条件で誘導可能なプロモーターである。実際、いくつかの細菌（例えば、細胞内生物）は、宿主細胞質中の鉄制限条件に遭遇すると考えられる。ＦｅｑＡおよびＴｏｎＢの鉄制御プロモーターの例は、当該分野で公知であり、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｈｅａｄｌｅｙ，Ｖ．ら（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：８１８；Ｏｃｈｓｎｅｒ，Ｕ．Ａ．ら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：７１９４；Ｈｕｎｔ，Ｍ．Ｄ．ら（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７６：３９４４；Ｓｖｉｎａｒｉｃｈ，Ｄ．Ｍ．およびＳ．Ｐａｌｃｈａｕｄｈｕｒｉ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：１３９；Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｗ．ら（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：２８２３；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｂ．ら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：６８６３；ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｖ．ら（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：２６２４；およびＨａｎｔｋｅ，Ｋ．（１９８１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８２：２８８。
【０１２４】
ＰＧＥＳ融合ポリペプチドをコードする核酸およびこの核酸が作動可能に連結される細菌プロモーターは、好ましくは、ベクターまたはプラスミド中にある。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、これが作動可能に連結される別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製し得る核酸である。好ましいベクターは、その中に含まれる核酸の自律的複製および／または発現を可能にし得るベクターである。ベクターが作動可能に連結される遺伝子の発現を方向付けし得るベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、用語「プラスミド」とは、一般に染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡループをいう。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、このプラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターであるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を果たし、かつその後当該分野で公知になったような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１２５】
本発明を実施するためのプラスミドは、好ましくは、細菌中の核酸の適切な転写に必要な配列（例えば、転写終結シグナル）を含む。ベクターは、さらに、目的の核酸を含む細菌の選択を可能にする因子をコードする配列（例えば、抗生物質に対する耐性を提供するタンパク質をコードする遺伝子）、核酸の増幅に必要な配列（例えば、細菌複製起点）を含み得る。
【０１２６】
好ましい実施形態において、ＤＮＡは、第１のプロモーターに作動可能に連結され、そしてこの細菌は、この第１のプロモーターからの転写を媒介し得る第１のポリメラーゼをコードする第２のＤＮＡをさらに含み、ここで、この第１のポリメラーゼをコードするＤＮＡは、第２のプロモーターに作動可能に連結される。好ましい実施形態において、この第２のプロモーターは、細菌プロモーター（例えば、上記のプロモーター）である。さらにより好ましい実施形態において、このポリメラーゼは、バクテリオファージポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼ）であり、そして第１のプロモーターは、バクテリオファージプロモーター（例えば、それぞれ、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＴ７プロモーター）である。バクテリオファージプロモーターを含むプラスミドおよびバクテリオファージポリメラーゼをコードするプラスミドは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販され得るか、または標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を使用してバクテリオファージから直接得られ得る。バクテリオファージポリメラーゼおよびプロモーターは、例えば、以下の参考文献にさらに記載される：Ｓａｇａｗａ，Ｈ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅ  １６８：３７；Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ら（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：４０３４；Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．およびＦ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１９：４５；Ｂｕｊａｒｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．およびＰ．Ｋａｅｓｂｅｒｇ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３３７；ならびにＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：６０）。このようなプラスミドは、本発明の特定の実施形態に従って、さらに改変され得る。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、細菌は、第２のプロモーターからの転写を媒介し得る第２のポリメラーゼをコードするＤＮＡをさらに含み、ここでこの第２のポリメラーゼをコードするＤＮＡは、第３のプロモーターに作動可能に連結される。好ましい実施形態において、この第３のプロモーターは、細菌プロモーターである。しかし、２つより多い異なるポリメラーゼおよびプロモーターが、高レベルの転写を得るために細菌中に導入され得る。細菌における転写を媒介するために１つ以上のポリメラーゼを使用することは、ＤＮＡが直接的に細菌プロモーターの制御下にある細菌と比較して、細菌中のＰＧＥＳポリペプチドの量の有意な増加を提供し得る。採用するための系の選択は、本発明の特定の用途（例えば、生成を望むＲＮＡの量）に依存して変化する。
【０１２８】
一般に、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、トランスフェクションによって、宿主細胞に導入され、そしてこの宿主細胞は、この融合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。核酸を原核生物細胞および真核生物細胞に導入する方法は、当該分野で周知である。哺乳動物宿主細胞および原核生物宿主細胞の培養に適切な培地は、当該分野で周知である。一般に、目的の融合ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターの制御下にあり、この誘導性プロモーターは、一旦核酸を含む宿主が特定の回数分裂すると、誘導される。例えば、核酸がβガラクトースオペレータおよびレプレッサーの制御下にある場合、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、細菌宿主細胞がＯＤ６００約０．４５〜０．６０の密度に達した場合に、培養物に加えられる。次いで、この培養物は、宿主細胞にポリペプチドを合成する時間を与えるようにさらにしばらくの間増殖される。次いで、培養物は、代表的に、冷凍され、そして、このポリペプチドの単離および精製の前にしばらくの間冷凍貯蔵され得る。
【０１２９】
原核生物宿主細胞を使用する場合、この宿主細胞は、例えば、プラスミドｐＬｙｓＳＬから発現される、内部Ｔ７リゾチームを発現するプラスミドを含み得る（実施例を参照のこと）。このような宿主細胞の溶解は、リゾチームを遊離させ、このリゾチームは、次いで、細菌膜を分解する。
【０１３０】
細菌または他の原核生物細胞における発現のためにベクターに含まれ得る他の配列としては、合成リボソーム結合部位；転写を通じて読み取りを防止し、発現されるポリペプチドの安定性を確実にするための強力な転写ターミネーター（例えば、ファージλ由来のｔ０およびＥ．ｃｏｌｉにおけるｒｒｎＢオペロン由来のｔ４）；複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）；およびアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。
【０１３１】
他の宿主細胞としては、原核生物宿主細胞が挙げられる。なおより好ましい宿主細胞は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。使用され得る他の細菌としては、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、およびＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐｐが挙げられる。これらの細菌の大部分は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から得られ得る。
【０１３２】
好ましい実施形態において、融合ポリペプチド（例えば、Ｈｉｓ６−ＰＧＥＳ（例えば、配列番号４を有する））は、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３））において発現される。このＥ．ｃｏｌｉ株は、必要に応じて、プラスミドｐＬｙｓＳＬを含む。Ｈｉｓ６−ＰＧＥＳ（配列番号４を有する）をコードするヌクレオチド配列を含む例示的プラスミドは、図２Ｂに示される。
【０１３３】
酵母における組換えタンパク質発現のために、多くのベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに遺伝子構築物を導入する際に有用なクローニングビヒクルおよび発現ビヒクルである（例えば、Ｂｒｏａｃｈら（１９８３）  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８３（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。これらのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはｐＢＲ３２２  ｏｒｉの存在に起因して複製し得、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては酵母２ミクロンプラスミドの複製決定基に起因して複製し得る。さらに、薬物耐性マーカー（例えば、アンピシリン）が使用され得る。
【０１３４】
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列、および真核生物細胞において発現される１以上の真核生物転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇに由来するベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのうちのいくつかは、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）由来の配列で改変されて、真核生物細胞および原核生物細胞の両方で複製および薬物耐性選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体は、真核生物細胞におけるタンパク質の一過性発現のために使用され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適した他の発現系について、ならびに一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１３５】
いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系の使用によって本発明の融合ポリペプチドを発現することは望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷＩ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０１３６】
融合ポリペプチドはまた、インビトロ系（例えば、インビトロ翻訳系（例えば、細胞溶解物（例えば、網状赤血球溶解物）））において生成され得る。用語「インビトロ翻訳系」（これは、本明細書中で用語「無細胞翻訳系」と交換可能に使用される）とは、ＲＮＡ分子をタンパク質へ翻訳するために必要な少なくとも最小のエレメントを含む無細胞抽出物である翻訳系をいう。インビトロ翻訳系は、代表的には、少なくともリボソーム、ｔＲＮＡ、開始メチオニル−ｔＲＮＡＭｅｔ、翻訳に関与するタンパク質または複合体（例えば、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、ｃａｐ結合（ＣＢ）複合体（ｃａｐ結合タンパク質（ＣＢＰ）および真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）を含む））を含む。種々のインビトロ翻訳系が当該分野で周知であり、市販のキットを含む。インビトロ翻訳系の例としては、真核生物溶解物（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物、ウサギ卵母細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、昆虫細胞溶解物およびコムギ胚芽抽出物が挙げられる。溶解物は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．；およびＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．のような製造業者から市販される。インビトロ翻訳系は、代表的には、高分子（例えば、酵素、翻訳因子、開始因子、および伸長因子、化学的試薬、およびリボソーム）を含む。
【０１３７】
植物発現ベクターが使用される場合において、本発明のポリペプチドの発現は、任意の多くのプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５１１−５１４）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３０７−３１１）が使用され得る；あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉら，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅら，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：８３８−８４３）；または熱ショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９−５６５）が使用され得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター;直接ＤＮＡ形質転換;マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して植物細胞に導入され得る。このような技術の総説については、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第ＶＩＩＩ節，ｐｐ．４２１−４６３；ならびにＧｒｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，第７章〜第９章を参照のこと。
【０１３８】
本発明のポリペプチドを発現するために使用され得る代替的発現系は、昆虫系である。１つのこのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。ＰＧＨＳ−２配列は、ウイルスの非本質的領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローニングされ得、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。コード配列の首尾よい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠くウイルス）の生成を生じる。次いで、これらの組換えウイルスを、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させるために使用し、この細胞において、挿入された遺伝子が発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈら，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４，Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと）。
【０１３９】
昆虫系の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ポリヘドリンプロモーターの下流にあるｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ組換え移入ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）にクローニングされ、Ｓｆ９昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ卵巣細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から市販される）に由来する）にトランスフェクトされて、組換えウイルスを生成する。組換えウイルスのプラーク精製の後に、高力価のウイルスストックが調製され、次に、これは、Ｓｆ９またはＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞ホモジネートに由来するＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から市販される）昆虫細胞に感染させて、大量の適切に翻訳後修飾された本発明のポリペプチドを生成するために使用される。これらの細胞自体が、薬物アッセイのために直接的に有用であり得ることはあり得るが、本発明の方法によって調製される本発明のポリペプチドは、インビトロアッセイのために使用され得る。
【０１４０】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、トランスジェニック動物において調製され、その結果、特定の実施形態において、そのポリペプチドは、例えば、雌性動物の乳汁中に分泌される。
【０１４１】
本発明の融合ポリペプチド（これは、例えば、上記の発現系において発現される）は、細胞培養培地もしくは宿主細胞またはその両方から単離される。例えば、宿主細胞が原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）である場合、その宿主細胞において発現される組換えポリペプチドは、そのタンパク質が分泌される場合は培養培地から単離され得るか、またはそのタンパク質が分泌されない場合はＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞またはその特定の区画から単離され得る。組換えタンパク質が細菌膜に結合される場合は、細菌膜を最初に単離することによって精製され得る。あるいは、そのタンパク質は、全細胞溶解物から単離され得る。
【０１４２】
膜から組換えポリペプチドを単離するための本発明の好ましい方法は、最初に、膜溶解物を調製する工程を包含する。このために、細菌細胞は、凍結融解され得；膜がリゾチームで溶解され；ＤＮＡおよびＲＮＡが分解され得る。次いで、その溶解物は、氷上での超音波処理によってホモジナイズされ得る。細片および破壊されなかった細胞は、低速遠心分離により除去され得る。次いで、膜画分は、超遠心分離によりペレット化され得、続いて、そのペレットは、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液）中に懸濁される。膜画分は、この時点で凍結され得る。膜画分中に存在する組換えポリペプチドは、膜タンパク質を、０〜約１０℃で変化する温度にて（好ましくは、氷上でまたは４℃にて）、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む緩衝液中で可溶化することにより単離され得る。不溶性物質は、超遠心分離により分離され得る。次いで、この可溶化した溶解物は、フィルターを通して濾過され得、以下に記載のようにタンパク質がさらに精製され得る。これらの手順に関するさらなる詳細は、実施例に提供される。
【０１４３】
全細胞の原核生物抽出物から、すなわち、予め膜を分離することなく、本発明の融合ポリペプチドを精製することは、以下のように行われ得る。細菌細胞は、リン酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁され得る。次いで、この細胞は、例えば、リゾチームで溶解され得、粘性の細胞溶解物は、均質な混合物を得るまで、超音波処理され得る。次いで、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は、可溶化を補助するために添加され得、超遠心分離は、不溶性物質を除去するために使用され得る。次いで、この可溶化した溶解物は、以下に記載のさらなる精製にすぐに使用することができる。これらの手順に関するさらなる詳細は、実施例に提供される。
【０１４４】
タンパク質を精製するための多くの手順は、当該分野で周知であり、任意の適切な技術が、使用され得る。これらの技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製が挙げられる。
【０１４５】
本発明のポリペプチドの精製の好ましい方法としては、第１精製工程の前のアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー）が挙げられる。好ましい実施形態において、精製の第１工程は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである。ＧＰＥＳ融合ポリペプチドを含む可溶化した溶解物をアフィニティークロマトグラフィーに通過させることは、有意な量の不純物を除去するには不十分であり、アフィニティー精製前のさらなる精製工程（例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）は、例えば、結晶学的研究において使用され得る、均質に精製されるＰＧＥＳの調製物を得るために必要であることが、本明細書中で実証された。
【０１４６】
概して、任意の無機吸着物は、第１のクロマトグラフィー工程のために使用され得る。タンパク質吸着のために使用され得る無機物質としては、酸化物、不溶性水酸化物、およびリン酸塩が挙げられる。タンパク質精製のために使用されている無機物質の例としては、アルミナゲルＣγ（ゲルおよび結晶）、ベントナイト（シリカ性粉末（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ  ｐｏｗｄｅｒ））、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、水酸化亜鉛ゲル、およびＡｇｅｄ  ｇｅｌの形態のリン酸カルシウム、ブルッシャイトまたはヒドロキシアパタイトが挙げられる。無機物質は、工業的適用に特に有用である。なぜなら、無機物質は、一般に、他の型のクロマトグラフィー材料より安価であるからである。
【０１４７】
ポリペプチドは、少なくとも静電相互作用を通じて無機物質に結合する。相互作用はまた、極性の双極子−双極子結合であり得る。
【０１４８】
好ましい実施形態において、無機物質は、リン酸水素カルシウムであり、結晶形態にあるリン酸水素カルシウムは、ヒドロキシアパタイトとして公知である。バッチ吸着は、ヒドロキシアパタイトのゼラチン性形態であるリン酸カルシウムゲルを用いて行われ得る。別の実施形態において、ポリペプチドは、ヒドロキシアパタイト精製の前または後のいずれかに、別の無機物質を使用して精製される。例えば、本発明のポリペプチドを含む調製物は、ヒドロキシアパタイトとともにインキュベートされ、そのポリペプチドは、非結合溶液から回収され、次いで、これは、別の無機物質（例えば、ベントナイト）とともにインキュベートされる。
【０１４９】
ヒドロキシアパタイトは、いくつかの会社（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から商業的に入手され得る。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、例えば、ＣａＣｌ２およびＮａ２ＨＰＯ４の０．５Ｍ溶液を、１Ｍ  ＮａＣｌとゆっくり混合する（これは、ブルッシャイト、ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏの生成を生じる）ことによって調製され得る。ブルッシャイトをＮａＯＨとともに沸騰させることによって、ブルッシャイトは、ヒドロキシアパタイト、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２に変換される（Ｂｅｒｎａｒｄｉら、（１９７１）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２：３２５）。
【０１５０】
ポリペプチド溶液から望ましくない材料を除去するための無機材料は、バッチ型システムまたはカラム型システムの形態であり得る。好ましい実施形態において、ポリペプチド溶液（または調製物）は、バッチ型システムにおいて無機溶媒とともにインキュベートされる。短いインキュベーション（好ましくは、氷上で）の後に、無機物質に結合しない分子を、溶液から無機物質を分離して除くことのよって回収する。これは、例えば、無機物質をペレット化するための遠心分離によってなされ得る。他の実施形態において、目的のポリペプチドはまた、特定の条件下で無機物質に吸収され得、そしてより高い塩濃度で無機物質のインキュベーションによって回収され得る。
【０１５１】
好ましい実施形態において、吸着は、およそｐＨ６〜９のｐＨ範囲で、なおより好ましくは、ｐＨ８で実施される。吸着は、好ましくは、より低い塩濃度で実施されるが、十分な緩衝化は、吸着剤表面の高度に極性の環境における望ましくない局所的なｐＨ変化を避けるために存在すべきである。吸着の間に使用するための好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液である。ヒドロキシアパタイトを使用して本発明のポリペプチドを精製するための好ましい方法は、実施例４に記載される。実施例４に記載されるＨｉｓ６ｈＰＧＥＳに対して全体的な電荷の類似の局所的な分布を有するポリペプチドが、実施例４に記載の条件と類似の条件でヒドロキシアパタイトに結合せず、そして非結合画分に回収され得ることが期待される。
【０１５２】
無機物質を伴うポリペプチド溶液のインキュベーションによって、種々の望ましくないポリペプチド、他の高分子、ならびに低分子量化合物（無機物質上に吸着される）の除去が可能になり、一方、目的のポリペプチドは、吸着されない。無機物質を使用するポリペプチドの精製に関するさらなる情報は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３に提供される。
【０１５３】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの精製の第２工程は、金属アフィニティークロマトグラフィー（例えば、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ））である。このクロマトグラフィーは、カラム上に固定された金属イオンとタンパク質上の塩基性基（主にヒスチジン残基）との間の弱い配位結合の形成に依存する。吸着剤は、マトリクスに、適切なスペーサーアームおよび単純な金属キレーター（通常、イミノジアセテート構造に基づく（例えば、ＥＤＴＡの形態で））を、結合することによって形成され得る（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、上記を参照のこと）。イミノジアセテート（ＩＤＳ）およびトリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）が使用され得る。これらのキレートリガンドは、金属イオン、特に、遷移金属Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、およびＺｎの２価イオンに密接に結合するが、３価金属イオン（ＦｅおよびＡｌ）にも結合する。
【０１５４】
タンパク質上のヒスチジン残基が固定化金属に最も引きつけられるが、他の潜在的な電子供与側鎖は、トリプトファンおよびシステイン（中性ｐＨにおいて）を含む。アフィニティーカラムへの結合は、これらのアミノ酸がポリペプチドの表面上に配置され、そして相互作用の強度が、ポリペプチドのサイズに対するこのような結合の数に依存する。
【０１５５】
金属キレート吸着剤は、一般的に、金属無しで提供される。従って、第１工程において、カラムは、金属を充填される。１つの実施形態において、例えば、５０ｍＭの金属塩（例えば、ＣｕＳＯ４、酢酸亜鉛またはＮｉＣｌ２）を含む溶液は、金属で飽和されるまでカラムを通過する。次いで、過剰な金属イオンが洗浄される。これに続いて、好ましくは、弱い錯化剤（例えば、１〜１０ｍＭイミダゾールまたは０．５Ｍグリシン）で洗浄される。なおさらに好ましい実施形態において、カラムは、弱い錯化剤のより濃い濃度の溶液（例えば、約１０〜約１００ｍＭイミダゾール、好ましくは、約２０〜約８０ｍＭイミダゾール、さらにより好ましくは、約６０ｍＭイミダゾール）でさらに洗浄される。最終調製物への金属イオンの浸出を避けるために、カラムから目的のポリペプチドを溶出するために使用される溶液でカラムを洗浄することがまた望ましくあり得る。
【０１５６】
ＩＭＡＣは、一般的に、例えば、イオン交換効果を避けるために、高いイオン強度（例えば、１００ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）で実施される。適用緩衝液は、一般的に、錯化剤を含まない、ｐＨ６〜８である。ポリペプチド溶液は、カラムを一般的に４℃で、例えば、約１ｍｌ／分の流速でゆっくり通過する。次いで、カラムは、全ての未結合タンパク質が溶出されるまで、開始緩衝液で洗浄される。目的のポリペプチドの溶出は、２つの方法のいずれかによって達成される。１つの方法に従って、ポリペプチドは、より強力な錯化剤（例えば、イミダゾールまたはＥＤＴＡ）によって示される。他の方法において、ポリペプチドは、例えば、ポリペプチド上のヒスチジンがプロトン化され、そして金属イオンと配位し得ないように、緩衝液のｐＨを低下させることによって、溶出される。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドを金属アフィニティーマトリクスから溶出するために、方法の組合せが使用される。
【０１５７】
従って、好ましい実施形態において、６ヒスチジンに融合したＰＧＥＳポリペプチド、またはそのアナログもしくはフラグメントを含む融合ポリペプチドを含む可溶化溶解産物は、ヒドロキシアパタイトと混合される。この溶液はまた、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含み得る。短いインキュベーション（好ましくは、氷上で）の後、ヒドロキシアパタイトは、例えば、遠心分離によってペレット化され、そして未結合画分が除去され、そして遠心分離および濾過によってさらに清浄にされ得る。次いで、この組成物は、ＮｉＣｌ２を充填したキレーティングセファロースカラム上に充填され得る。充填の後に、カラムは、未結合タンパク質を除去するために洗浄される。６０ｍＭイミダゾールを含む別の洗浄物は、非特異的結合タンパク質を洗浄して除くためになされ得る。次いで、ヒスチジンタグ化ポリペプチドは、約２００〜約４００ｍＭイミダゾール、好ましくは、約３００〜３５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出され得る。好ましい量のイミダゾールは、精製される特定の融合ポリペプチドに依存し得る。例えば、６ヒスチジンに対してＮ末端で融合した全長ヒトＰＧＥＳからなる融合ポリペプチドは、３５０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから効果的に溶出される。
【０１５８】
次いで、イミダゾールは、透析によって、または脱塩カラム上を通過させることによって、組換えタンパク質を含む溶液から除去され得る（実施例を参照のこと）。組換えタンパク質の調製は、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーを繰り返すことによってさらに精製され得る。この第２のＮｉアフィニティークロマトグラフィーは、第１のものとして実施され得る。なおさらなる回の精製がなされ得る。
【０１５９】
一般的に、リン酸ナトリウム緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液で置換され得る。他の可能な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む。
【０１６０】
アフィニティータグの無いＰＧＥＳは、ヒドロキシアパタイト、続くイオン交換クロマトグラフィーによって精製され得る。
【０１６１】
クロマトグラフィーカラムから溶出されるタンパク質の量は、例えば、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の指示に従うクーマシータンパク質アッセイによって決定され得る。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態において、ＰＧＥＳポリペプチドを含むタンパク質（例えば、細胞膜または細胞溶解物全体）の可溶化、またはＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログおよびフラグメントの精製は、グリセロールおよび／または還元グルタチオンの存在下で実施される。実施例に記載されるように、グリセロールおよび還元グルタチオン（ＧＳＨ）は、可溶化されたＰＧＥＳポリペプチドの活性を保存する。従って、ＰＧＥＳを含む任意の溶液において、０．５〜１０ｍＭの還元グルタチオンを含むことが好ましく；約１〜約５ｍＭの還元グルタチオンを含むことがより好ましく；そして約１〜約２．５ｍＭの還元グルタチオンを含むことが最も好ましい。ＰＧＥＳを含む任意の溶液において、約１〜約３０％のグリセロールを含むことも好ましく；約５〜約１５％のグリセロールを含むことがより好ましく；そして約１０％のグリセロールを含むことが最も好ましい。
【０１６３】
従って、グリセロールおよび／または還元グルタチオンは、好ましくは、ＰＧＥＳ、そのアナログまたはフラグメントを含む任意の溶液中に含まれ、このとき、酵素の生物学的活性を保存することが望ましい。しかし、グリセロールまたはＧＳＨの存在が使用される方法の特定の工程を妨害する場合、それはそのままにされ、工程が実施された直後に添加され得る。
【０１６４】
サンプル中のタンパク質の量は、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の指示に従って、クーマシータンパク質アッセイによって決定され得る。タンパク質の量および純度は、タンパク質混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、必要に応じて、ウェスタンブロット分析を行うことによって決定され得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、例えば、ポリペプチドを可視化するために、銀またはクーマシーブルー染色によって染色され得る。ウェスタンブロットはまた、問題のポリペプチド（例えば、抗体）に特異的に結合する試薬とともにインキュベートされ得る。既知の量の参照タンパク質の含有は、比較によって、ウェスタンブロット上で特定のタンパク質の量を推定することを可能にする。ウェスタンブロット分析のプロトコルは、実施例およびＪａｋｏｂｓｓｅｎら、上記に提供される。
【０１６５】
精製ポリペプチドのＰＧＥシンターゼ活性（すなわち、ＰＧＥＳの基質の９−ケト，１１−α−ヒドロキシ形態への変換（例えば、ＰＧＨ２のＰＧＥ２への変換）は、以下のように、決定され得る。１つの実施形態において、アッセイは、ＰＧＥ２の前駆体、還元剤、好ましくは、還元グルタチオンおよびＰＧＥシンターゼを一緒にインキュベートすることからなる。ＰＧＥＳ活性を有すると推測されるポリペプチドは、緩衝液（例えば、約１〜５ｍＭ、好ましくは、２．５ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）の存在においてリン酸ナトリウム緩衝液）中でインキュベートされる。反応は、約５〜２０μＭ、好ましくは１０μＭでのＰＧＨ２の添加によって開始し、次いで、反応混合物は、３７℃、室温または好ましくは、０℃のいずれかで、約１〜１０分間、好ましくは、約１分間インキュベートされる。反応は、ｐＨを約３または３．２に減少させる溶液の添加によって終結され得る。これは、アセトニトリル／ＨＣｌ（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、（１９９９）ＰＮＡＳ  ９６：７２２０に記載される）の添加によって、またはＦｅＣｌ２、クエン酸、および／または１１−βＰＧＥ２の添加（実施例に記載される）によって、達成され得る。ＰＧＦ２α、ＰＧＥ２およびＰＧＤ２は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＵＶ検出（１９５ｎｍ）によって決定され得る。タンパク質をＨＰＬＣに供するために、反応混合物は、固相抽出（例えば、Ｃ１８カラムを使用する）に供され得る；サンプルは、アセトンで溶出され、乾燥され、そしてアセトニトリル中に溶解され得る。次いで、サンプルは、ＨＰＬＣのために準備される。これらの方法のさらなる詳細は、実施例およびＪａｋｏｂｓｓｏｎら、上記、およびＪａｋｏｂｓｓｏｎらによる公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ００／２８０２２に提供される。
【０１６６】
融合ポリペプチドがプロテアーゼまたはエンテロキナーゼによって認識される部位を、例えば、ＰＧＥＳポリペプチドから異種ポリペプチドを切断するために含む実施形態において、プロテアーゼまたはエンテロキナーゼを用いる処理は、ペプチドの精製の任意の段階でなされ得る。さらなる工程がプロテアーゼまたはエンテロキナーゼを除去するために必要であるので、好ましくは、この処理は、最後の段階の前になされる
特定のアッセイにおいて、形成されるＰＧＥが標識の存在によって（例えば、オンラインβ−ＲＡＭ検出器（Ｉｎｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔａｍｐａ、ＦＬ）を使用して）、検出され得るように、標識前駆体（例えば、３Ｈ  ＰＧＨ）を含むことが望ましくあり得る。
【０１６７】
対象の融合ポリペプチドが原核生物において産生されない場合、対象の融合ポリペプチドを精製するための方法は、本明細書の説明に基づく任意の適切な方法から適合され得る。一般的に、溶解物は、対象の融合ポリペプチドを発現する宿主細胞から調製され、そしていくらかの予備的精製工程（例えば、遠心分離）の後に、溶解物は、本明細書中に記載されるように、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに供され、次いで、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー）に供される。同様に、対象の融合ポリペプチドが、溶解物（例えば、網状赤血球溶解物）において発現する場合、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるように精製され得る。
【０１６８】
１つの実施形態において、精製ＰＧＥＳまたはそのアナログまたはそのフラグメントは、その合成がＰＧＥＳによる異性化を含む大量の任意の分子をインビトロで作製するために使用される。ＰＧＥＳは、環状エンドペルオキシダーゼ基質の９−ケト，１１−α−ヒドロキシ形態の基質への変換を触媒する。ＰＧＥＳは、多くのプロスタグランジンＥ分子（例えば、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２およびＰＧＥ３）によって共有されるコア９−ケト，１１−α−ヒドロキシプロスタグランジン構造の立体特異的形成を触媒する。従って、本発明は、コア９−ケト，１１−α−ヒドロキシ基を含むＰＧＥ分子およびそのアナログを合成するための方法を提供する。
【０１６９】
プロスタグランジンＥ分子（例えば、ＰＧＥ２）は、例えば、ＰＧＨ２のＰＧＥ２への変換を触媒する、ＰＧＥＳポリペプチドの能力を試験するために上記のアッセイのスケールアップバージョンによって調製され得る。ＰＧＥの多くの前駆体（例えば、ＰＧＨ２）および還元グルタチオンは、例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）およびＢｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から商業的に入手され得る。あるいは、ＰＧＨ２基質は、シクロオキシゲナーゼおよびアラキドン酸のインキュベーションによって提供され得る。次いで、産生されるプロスタグランジンＥは、１９０〜２１０ｎｍでの検出を用いるＳＰ−ＨＰＬＣ上での分離、または放射性トレーサーをマーカーとして使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分離を含む、当該分野で公知の方法に従って精製され得る。
【０１７０】
本発明は、高純度のＰＧＥＳポリペプチド、そのアナログおよびフラグメント（これは、融合ポリペプチドの形態であってもなくてもよい（例えば、異種ポリペプチドが切断された場合））を提供する。これらのポリペプチドは、それらに結合する分子を同定するため、および／またはポリペプチドとその基質（例えば、ＰＧＨ２）との間の相互作用を調節するためにインビトロで使用され得る。これらの分子は、ＰＧＥＳ活性のインヒビターまたは刺激因子として作用し得る。このような薬剤は、本明細書中にさらに記載されるように、治療目的で使用され得る。
【０１７１】
従って、本発明は、天然に存在するＰＧＥＳポリペプチドのアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供し、この方法は、ＰＧＥＳポリペプチドまたはＰＧＥＳポリペプチドと相互作用する分子（例えば、ＰＧＥＳポリペプチドの基質）と相互作用し得る化合物を選択し、そして／またはＰＧＥＳポリペプチドと別の分子との相互作用を調節し得る化合物（例えば、基質ペプチド）を選択する工程を包含する。ＰＧＥＳポリペプチドと相互作用し得る分子は、本明細書中において、「ＰＧＥＳ結合パートナー」と呼ばれ、そして標的ポリペプチドのアナログまたは一部がＰＧＥＳポリペプチドに結合し得る限り、基質（例えば、ＰＧＨ１、ＰＧＨ２、ＰＧＨ３またはそのアナログもしくはその一部）であり得る。ＰＧＥＳ結合パートナーはまた、基質でなく、そして例えば、触媒部位以外の部位でＰＧＥＳポリペプチドと相互作用し得る、ポリペプチドであり得る。
【０１７２】
本発明の化合物は、所望である化合物の型およびその化合物の活性に依存して種々のアッセイを使用して同定され得る。ＰＧＥＳ治療剤（すなわち、天然に存在するＰＧＥＳポリペプチドの活性に影響する分子）同定するために使用され得る少なくともいくつかのアッセイが以下に記載される。ＰＧＥＳ治療剤を同定するためのさらなるアッセイを設計することは、当該分野の技術の範囲内である。
【０１７３】
好ましい実施形態において、ＰＧＥＳ治療剤を同定するための無細胞アッセイは、本質的に、対象ポリペプチド（例えば、必要に応じて異種ポリペプチドに融合された、ＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント）および試験化合物または試験化合物のライブラリーを含む、結合パートナーの存在下または非存在下での反応混合物からなる。好ましい結合パートナーは、ＰＧＨ２、またはＰＧＥＳと相互作用するために十分なその部分である。試験化合物は、例えば、ＰＧＥＳ結合パートナーの誘導体（例えば、生物学的に不活性な基質、または低分子）であり得る。
【０１７４】
従って、本発明の１つの例示的なスクリーニングアッセイは、対象ポリペプチドもしくはその機能的フラグメント、またはＰＧＥＳ結合パートナーを、試験化合物または試験化合物のライブラリーと接触させる工程、ならびに複合体の形成を検出する工程を包含する。検出の目的で、分子は、特異的マーカーで標識され得、そして試験化合物または試験化合物のライブラリーは、異なるマーカーで標識され得る。次いで、試験化合物と対象ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはＰＧＥＳ結合パートナーとの相互作用が、インキュベーション工程および洗浄工程の後のこれら２つの標識のレベルを決定することによって、検出され得る。洗浄工程後の２つの標識の存在は、相互作用の指標である。
【０１７５】
分子間の相互作用もまた、表面プラスモン応答（ＳＰＲ）（光学事象）を検出するリアルタイムＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を使用することによって、同定され得る。検出は、生体特異的界面における高分子の質量濃度の変化に依存し、そして相互作用のいずれの標識も必要としない。１つの実施形態において、試験化合物のライブラリーは、センサ表面（例えば、これは、マイクロフローセルの１つの壁を形成する）に固定され得る。次いで、対象ポリペプチドまたはＰＧＥＳ結合パートナーを含有する溶液が、センサ表面にわたって連続的に流される。信号記録において示されるような共鳴角の変化は、相互作用が起こったことを示す。この技術は、例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａによるＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋにさらに記載されている。
【０１７６】
本発明の別の例示的なスクリーニングアッセイは、以下の工程を包含する：（ａ）以下を含有する反応混合物を形成する工程：（ｉ）対象ポリペプチド、（ｉｉ）ＰＧＥＳ結合パートナー（例えば、ＰＧＨ２）、および（ｉｉｉ）試験化合物；ならびに（ｂ）対象ポリペプチドとＰＧＥＳ結合タンパク質との相互作用を検出する工程。試験化合物の非存在下での相互作用に対する、試験化合物の存在下での対象ポリペプチド、そのアナログもしくはフラグメントと、ＰＧＥＳ結合タンパク質との相互作用における統計学的に有意な変化（例えば、相乗または阻害）は、その試験化合物がＰＧＥＳ活性の潜在的な調節因子（例えば、アゴニスト（模倣物もしくは増強剤）またはアンタゴニスト（インヒビター））であることを示す。「統計学的に有意な変化」とは、親和性定数の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも２倍の増減、なおより好ましくは少なくとも５倍の増減、そしてなおより好ましくは少なくとも１０倍の増減の差をいう。
【０１７７】
化合物の任意の適切な接触が、本発明の方法において使用され得、例えば、このアッセイの化合物は、同時に接触され得る。あるいは、対象ポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントが、まず試験化合物と十分な量の時間最初に接触され得、その後、ＰＧＥＳ結合パートナーが、その反応混合物に添加される。この化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を使用して得られるデータから、用量応答曲線を作成することによって、評価され得る。さらに、コントロールアッセイもまた実施されて、比較のためのベースラインを提供し得る。コントロールアッセイにおいて、単離および精製された対象ポリペプチドまたは結合パートナーが、ＰＧＥＳ結合パートナーまたは対象ポリペプチドを含有する組成物に添加され、そして複合体の形成が、試験化合物の非存在下で定量される。
【０１７８】
対象ポリペプチドとＰＧＥＳ結合パートナーとの間での複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。複合体の形成の調節は、例えば、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識された対象ポリペプチドまたはＰＧＥＳ結合パートナーのような、検出可能に標識されたタンパク質を使用して、イムノアッセイ、またはクロマトグラフィー検出によって、定量され得る。
【０１７９】
代表的に、対象ポリペプチドまたはその結合パートナーのいずれかを、一方または両方のタンパク質の未複合体形成形態からの、複合体の分離を容易にするため、およびアッセイの自動化に適応するために固定することが望ましい。対象ポリペプチドのＰＧＥＳ結合パートナーへの結合は、反応剤を含むために適切な任意の容器内で達成され得る。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、対象ポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントは、タンパク質がマトリックスに結合することを可能にするドメインを含む、融合タンパク質である。例えば、Ｈｉｓ６−ＰＧＥＳポリペプチドまたはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＧＥＳ（ＧＳＴ／ＰＧＥＳ）の融合タンパク質は、Ｎｉビーズもしくはグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートにそれぞれ吸着され得、次いでこれらは、ＰＧＥＳ結合パートナー（例えば、３５Ｓ標識ＰＧＥＳ結合パートナー）および試験化合物と混合され、そしてこの混合物が、複合体形成を誘導する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件であるが、わずかによりストリンジェントな条件が望ましくあり得る）でインキュベートされる。インキュベーション後、これらのビーズが洗浄されて任意の未結合標識が除去され、そして複合体が引き続いて解離した後に、固定および放射性標識されたマトリックスが直接（例えば、シンチレーション器（ｓｃｉｎｔｉｌａｎｔ）に入れられたビーズ）、または上清中で決定される。あるいは、複合体は、マトリックスから解離され得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得、そしてビーズ画分において見出される対象ポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメントあるいはＰＧＥＳ結合パートナーのレベルが、添付の実施例に記載されるような標準的な電気泳動技術を使用して、ゲルから定量され得る。
【０１８０】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術はまた、本発明のアッセイにおいて使用するために利用可能である。例えば、対象またはその同種の結合パートナーのいずれかが、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定され得る。例えば、ビオチン化対象分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から、当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、調製され得、そしてストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、対象ポリペプチドと反応性の抗体は、プレートのウェルに誘導体化され、そして対象ポリペプチドは、固体結合体化によってウェルにトラップされる。上記のように、ＰＧＥＳ結合タンパク質および試験化合物の調製物は、プレートの対象ポリペプチドを提示するウェル中でインキュベートされ、そしてこのウェルにトラップされた複合体の量が定量され得る。このような複合体を、ＧＳＴ固定された複合体について上記された複合体に加えて検出するための例示的な方法としては、ＰＧＥＳ結合パートナーと反応性の抗体、または対象ポリペプチドと反応性でありかつ結合パートナーと競合する抗体を使用する複合体の免疫検出；ならびに結合パートナーに関連する酵素活性（内因性活性または外因性活性のいずれか）を検出することに依存する酵素結合アッセイが挙げられる。後者の例においては、酵素は、ＰＧＥＳ結合パートナーと化学的に結合体化され得るか、またはＰＧＥＳ結合パートナーとの融合タンパク質として提供され得る。説明のために、ＰＧＥＳ結合パートナーは、ホースラディッシュペルオキシダーゼと化学的に架橋されるかまたは遺伝的に融合され得、そして複合体にトラップされたポリペプチドの量は、酵素の色素形成基質（例えば、３，３’−ジアミノベンジジン（ｂｅｎｚａｄｉｎｅ）四塩酸塩または４−クロロ−１−ナフトール）で評価され得る。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼからなる融合タンパク質が提供され得、そして複合体形成が、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを使用してＧＳＴ活性を検出することによって、定量され得る（Ｈａｂｉｇら（１９７４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４９：７１３０）。
【０１８１】
複合体にトラップされたタンパク質の１つを定量するための免疫検出に依存するプロセスのために、そのタンパク質に対する抗体（例えば、ＰＧＥＳ抗体）が使用され得る。あるいは、複合体中の検出されるべきタンパク質は、対象配列に加えて、抗体が（例えば市販の供給源から）容易に入手可能な第二のポリペプチドを含む、融合タンパク質の形態で「エピトープタグ化」され得る。例えば、上記ＧＳＴ融合タンパク質もまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を使用する結合の定量のために使用され得る。他の有用なエピトープタグとしては、ｍｙｃエピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６６：２１１５０−２１１５７を参照のこと）（これは、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含む）、およびｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、またはｐＥＺＺ−プロテインＡ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）が挙げられる。
【０１８２】
無細胞アッセイはまた、対象ポリペプチドと相互作用し、そしてその対象ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するために使用され得る。従って、１つの実施形態において、対象ポリペプチドは、試験化合物に接触され、そしてその対象ポリペプチドの触媒活性がモニタリングされる。１つの実施形態において、対象ポリペプチドがＰＧＨに結合し、そして／またはＰＧＥへのＰＧＨの転換を触媒する能力が決定される。基質に対する対象ポリペプチドの結合親和性は、当該分野において公知の方法に従って決定され得る。対象ポリペプチドの酵素活性の決定は、本明細書にさらに記載されるように実施され得る。
【０１８３】
好ましい実施形態において、本発明は、スクリーニング方法を提供し、この方法は、対象ポリペプチドが試験化合物の非存在下で標的ペプチドを切断するために十分な条件下で、対象ポリペプチドおよび基質を反応混合物中の試験化合物と混合する工程を包含する。この方法は、基質、転換生成物の存在をモニタリングする工程をさらに包含し、その結果、試験化合物を含まない反応混合物に対する、試験化合物と共にインキュベートされた反応混合物中の基質または転換生成物のうちの少なくとも一方の量の差が、その化合物がＰＧＥＳ治療剤であることを示す。本発明のなおより好ましい実施形態において、基質または転換生成物の存在および／または量は、反応混合物またはその一部の分光学測定分析によって決定される。
【０１８４】
別の実施形態において、本発明は、アッセイを提供し、このアッセイは、本発明の精製されたＰＧＥＳを、酵素の環状エンドペルオキシド基質の存在下で、ＰＧＥＳが、この基質の生成物である９−ケト，１１−α−ヒドロキシ形態へのこの環状エンドペルオキシド基質の転換を触媒する条件下で、試験化合物とともにインキュベートする工程；およびこの生成物の生成を決定する工程を包含する。アッセイの非存在下でなされる反応に対する、試験化合物の存在下でのＰＧＥＳによる転換の量の差は、この試験化合物が、ＰＧＥＳ活性のモジュレーター（例えば、インヒビターまたは刺激因子）であることを示す。生成物の決定は、ＨＰＬＣ、ＵＶ分光法、放射活性検出、またはＲＩＡ（ＰＧＥについて市販されている）を使用し得る。生成物の形成は、ガスクロマトグラフィーまたは質量分析または放射活性走査を用いるＴＬＣによって分析され得る。
【０１８５】
エイコサノイドおよびグルタチオンの代謝に関与するタンパク質のファミリー（例えば、ＭＡＰＧファミリー）の他のメンバーと相互作用し、そして必要に応じて、その産生または転換を阻害する化合物を同定するためのアッセイがまた、開発され得る。これは、各工程が本明細書中に記載されるように実施され得る２工程スクリーニングアッセイによってなされ得る。
【０１８６】
純粋なＰＧＥＳポリペプチドまたはそのアナログもしくはフラグメント（融合ポリペプチドを含む）（例えば、天然に存在するヒトＰＧＥＳ）が、野生型タンパク質の結晶化および野生型タンパク質の結晶構造の決定のために使用され得る。次いで、結晶構造を規定する座標が、コンピュータ読み取り可能な媒体およびコンピュータにロードされ得、これによって、そのポリペプチドの三次元構造を表示し得る。従って、好ましい実施形態において、本発明は、ＰＧＥＳポリペプチドの三次元構造を可視化するための方法を提供し、この方法は、ＰＧＥＳポリペプチドの結晶を得る工程、この結晶をＸ線回折に供してそのポリペプチドの三次元構造を規定する座標セットを得る工程；およびこの座標を、この座標に基づく三次元構造を表示する能力を有するコンピュータにロードする工程を包含する。コンピュータでの三次元構造の表示はまた、ＰＧＥＳポリペプチドを阻害または刺激し得る薬物の合理的な設計において、使用され得る。次いで、これらの薬物は、以下にさらに記載される、治療処置または予防処置のために使用され得る。
【０１８７】
純粋なＰＧＥＳポリペプチドはまた、基質と共晶化され得る。このような複合体の三次元画像は、ＰＧＥＳと基質との間の相互作用を調節する薬物を設計するために有用である。
【０１８８】
これらの座標はまた、ＰＧＥＳポリペプチドに関連するポリペプチドの三次元構造を得ることを補助し得る。
【０１８９】
当業者は、本発明の精製されたＰＧＥＳ型ポリペプチドまたは融合ポリペプチドが、診断目的で使用され得ることを理解する。例えば、これらのポリペプチドは、被験体由来のサンプル中のＰＧＥＳポリペプチドを検出および定量するために使用され得る。
【０１９０】
本発明のポリペプチドはまた、サンプル中のＰＧＥＳの量を決定するためのアッセイにおける標準として、使用され得る。従って、これらのポリペプチドは、サンプル中（例えば、被験体中）のＰＧＥＳの量を決定するためのキットの一部であり得る。
【０１９１】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、抗体（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか）を産生するために使用される。このような抗体は、例えば、サンプル中のＰＧＥＳポリペプチドの量を決定するために使用され得る。
【０１９２】
本発明は、ＰＧＥＳおよび／またはＰＧＥの活性の調節を必要とする患者において、疾患または状態を処置するための方法を提供する。１つの実施形態において、患者は、ＰＧＥＳまたはＰＧＥの活性のモジュレーターを患者に投与することによって、処置される。１つの実施形態において、ＰＧＥ活性の増加により利益を得ることが可能な疾患または状態を有する被験体は、この被験体に、薬学的に有効な量のＰＧＥ（例えば、本明細書中に記載されるように、精製されたＰＧＥシンターゼを使用してインビトロで調製されたＰＧＥ２）を投与することによって、または精製されたＰＧＥシンターゼを投与することによって、処置される。別の実施形態において、ＰＧＥ活性の減少により利益を得ることが可能な疾患または状態を有する被験体は、この被験体に、本発明によって提供される方法に従って同定された、薬学的有効量のＰＧＥシンターゼのインヒビターを投与することによって、処置される。これらの組成物は、動物宿主（ヒト患者が挙げら得る）に、任意の適切な様式で（例えば、単独で、または適切なキャリアもしくは賦形剤と混合される場合には薬学的組成物中で）、種々の障害（過剰または不十分なＰＧＥ活性またはＰＧＥＳ活性によって特徴付けられるものが挙げられる）を処置または軽減するために治療的に有効な容量で投与され得る。治療有効量とは、さらに、このような障害に関連する症状の軽減を生じるために十分な化合物の量をいう。本願の化合物の処方および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，最新版に見出され得る。
【０１９３】
プロスタグランジンは、免疫反応を調節し、血圧を調節し、血小板凝集を調節し、サイクリックＡＭＰレベルを調節し、胃分泌を阻害し、気管支を拡張し、脂肪分解を阻害し、バソプレッシン誘導性抗下痢（ｄｉａｒｒｈｅｓｉｓ）に拮抗し、瞳孔を収縮させ、皮質骨形成および海綿質骨形成を誘導し、眼内圧を上昇および減少し、そして子宮収縮を引き起こす（Ｇａｎｏｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｆ．，Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，第７版（１９７５），２２６頁（本明細書中以下「Ｇａｎｏｎｇ」））。天然に存在するプロスタグランジンは全て、脈管平滑筋収縮および他の平滑筋収縮の制御に影響をし得るように見える。中枢神経系において、プロスタグランジンは、特定のシナプス伝達物質に対する応答を改変することが公知である。このプロスタグランジンは、いくつかのホルモンの作用を模倣し、そして特定の他のホルモンの作用を阻害することが報告されている（Ｇａｎｏｎｇ，２２６頁）。従って、ＰＧＥ２は、種々の活性（例えば、疼痛誘導活性、炎症活性、子宮収縮活性、消化蠕動に対する促進効果、覚醒活性、胃酸分泌に対する抑制効果、低血圧性活性、血小板阻害活性、骨再吸収活性、脈管形成活性など）を有する。
【０１９４】
本発明の化合物および組成物は、炎症および疼痛（例えば、関節および筋肉（例えば、慢性関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、若年性関節炎など）、炎症性皮膚状態（例えば、日焼け、熱傷、湿疹、皮膚炎など）、炎症性眼状態（例えば、結膜炎など）、炎症が関連する肺障害（例えば、ぜん息、気管支炎、鳩愛好家の疾患、農夫肺など）、炎症に関連する胃腸管の状態（例えば、アフタ性潰瘍、クローン病、萎縮性胃炎、胃粘膜仮痘、潰瘍性大腸炎、腹腔疾患、限局性腸炎、過敏性腸症候群など）、歯肉炎、および手術または外傷後の腫脹、発熱、ならびに哺乳動物（好ましくは、ヒト）における以下に関連する他の状態；炎症、アレルギー性疾患、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、腱炎、滑液包炎、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、シェーグレン症候群、ベーチェット病、甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、糖尿病性合併症（糖尿病性細小血管症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症など）、ネフローゼ症候群、再生不良性貧血、重症筋無力症、ブドウ膜炎接触皮膚炎、乾癬、川崎病、サルコイドーシス、ホジキン病、アルツハイマー病、腎機能障害（腎炎、腎炎症候群など）、肝機能障害（肝炎、肝硬変など）、胃腸機能障害（下痢、炎症性腸疾患など）ショック、異常な骨代謝（例えば、骨粗鬆症（特に、閉経後骨粗鬆症））によって特徴付けられる骨疾患、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、パジェット骨病、骨溶解、骨転移を有するかまたは有さない高カルシウム血症の悪性腫瘍、慢性関節リウマチ、歯周炎、変形性関節症、骨痛、骨減少症、癌悪液質、結石症（ｃａｌｃｕｌｏｓｉｓ）、結石症（ｌｉｔｈｉａｓｉｓ）（特に、尿石症）、および細胞増殖異常（例えば、癌（例えば、固形腫瘍）、など）を処置するために有用である。
【０１９５】
当業者が理解するように、特定の生物学的活性は、特定のＰＧＥ２レセプターによって優先的に媒介される。ＰＧＥ２選択性レセプターは、４つのサブタイプ（ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、およびＥＰ４）に細分され、これらのレセプターは、種々の組織において広い分布を有する。ＥＰ１レセプターおよびＥＰ３レセプターに関連する効果は、興奮性であるとして考えられ得、そしてこの効果は、サイクリックＡＭＰの細胞内レベルの減少に伴う、ホスファチジルイノシトール回転の刺激またはアデニルシクラーゼ活性の阻害によって媒介されると考えられる。対照的に、ＥＰ２レセプターおよびＥＰ４レセプターに関連する効果は、阻害的であると考えられ得、アデニルシクラーゼの刺激および細胞内サイクリックＡＭＰのレベルの増加に関連すると考えられる。特に、ＥＰ４レセプターは、平滑筋弛緩、抗炎症性活性または前炎症性活性、リンパ球分化、抗アレルギー活性、血管間膜細胞弛緩または増殖、胃粘膜分泌または腸粘膜分泌などに関連すると考えられ得る。
【０１９６】
炎症および疼痛に加えて、多くの障害は、不十分または過剰のＰＧＥ（例えば、ＰＧＥ２活性）によって特徴付けられる。さらに、時々望ましくないものであり得るいくつかの生理学的状態はまた、ＰＧＥ２活性に関連する。例としてであるが限定ではなく、本発明の化合物およびポリペプチドで処置され得るこのような障害および生理学的状態は、アルツハイマー病、発作、および急性頭部損傷のような神経学的障害；結腸直腸腫瘍；排卵；早産分娩；子宮内膜症；移植；ならびに肺線維症が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９７】
例えば、産科学において、プロスタグランジンは、頚管熟化、分娩誘導および産褥出血の制御のために使用される（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｅ，Ｖａｌｅｒｉａｎ  Ａ．およびＧａｒｙ  Ａｉｓｅｎｂｒｅｙ，Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ＯＢ／ＧＹＮ（１９８７年、１０月），２９頁）。頚管熟化について、ＰＧＥ２は、静脈的、経口的および膣的に投与されるが、好ましい経路は、頸管内的である。ＰＧＥ２ゲルは、ここで、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａで市販されており、そして別のＰＧＥ２ゲルは、Ｏｂ／Ｇｙｎ適用について、米国で調査されている。ＰＧＥ２ゲルはまた、分娩誘導のために使用され得る（２０ｍｇの坐剤を６０ｍＬの潤滑ゲルとブレンドすることによって調製され、その混合物の９〜１５ｍＬを使用して、３〜５ｍｇのＰＧＥ２が、膣に配置される）。（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｅ，３２頁）。プロスタグランジンはまた、産褥出血を制御するために使用されてきた。
【０１９８】
プロスタグランジンは、婦人科学における妊娠末期に対して使用される。プロスタグランジン坐剤で子宮頚部を下処理することは、子宮頚部裂傷および重大な出血の発生率を減少することが見出された。（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｅ，２２頁）。プロスタグランジンＰＧＥ２の合成アナログ（例えば、１６−１６ジメチルＰＧＥ２および９−メチレンＰＧＥ２）は、最初のトリメスター流産の誘導について有用であることが証明された。このような手順は、代表的には、２０ｍｇのＰＧＥ２を含む膣坐剤を羊膜に使用する。「ジノプロストン（ｄｙｎｏｐｒｏｓｔｏｎｅ）」または「ＰｒｅｐｉｄｉｌＲＴＭ」の「プロスチンＥ２」ブランドとしても公知であるプロスタグランジンＥ２はまた、膣坐剤の形態でＵｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能である。Ｕｐｊｏｈｎによって報告された指示書および用法は、（ｉ）妊娠１２週〜２０週の妊娠の終了、（ｉｉ）失敗した流産または妊娠２８週までの子宮内胎児死の管理における子宮含有物の瀉出、および（ｉｉｉ）非転移性在胎栄養膜疾患（良性胞状奇胎）の管理における子宮含有物の瀉出である。（Ｔｈｅ  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ．，Ｐｒｏｓｔｉｎ  Ｅ２  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ８１０  ９９４  ００９，１９９０年１０月）。Ｆｏｒｅｓｔ  Ｌａｂｓは、同様の目的のためにＰＥＥ２に対してＣｅｒｖｉｄｉｌＲＴＭを提供する。
【０１９９】
実験的証拠は、プロスタサイクリンおよびＰＧＥがエンドトキシンによる損傷（例えば、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）と呼ばれる臨床的症候群において生じるような損傷）から肺を保護し得る。（Ｂｒｉｇｈａｍら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｅｅｐ  ｌｕｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６４：２５６８（１９８８））。プロスタサイクリンは、肺において血管を拡張し、一次肺高血圧の処置における治療試行において使用され、現時点において、この疾患に対する受容される処置は存在しない。Ｒｏｂｉｎ，Ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｃｉｒｃ．Ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｗｉｌｌ，Ｄａｖｉｓｏｎ，Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｕｅｂｒｉｅｒ編  Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．４９１頁〜４９８頁（１９８７）。プロスタノイドはまた、気道平滑筋を拡張し（気管支拡張薬）、従って、喘息において治療に役立ち得る。
【０２００】
ＰＧＥはまた、インポテンツの処理のために投与され得る。米国特許第５，９８１，５９３号は、インポテンツの処理のためにプロスタグランジンＰＧＥ２の投与を記載する。
【０２０１】
さらに、ＰＧＥはまた、高血圧を処置するために投与され得る。例えば、ＰＧＥ２は、血管を拡張する（すなわち、血管拡張薬として作用する）ことが示された。ＰＧＨ２が血管収縮薬であるので、ＰＧＥシンターゼを高血圧に罹患する被験体に投与することは、同時に、血管拡張薬の量を増加し、そして血管収縮薬の量を減少する。
【０２０２】
野生型ＰＧＥＳ（例えば、アンタゴニストであるＰＧＥＳのアナログ（例えば、ドミナントネガティブ変異型））のインヒビター、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイまたは合理的薬物設計によって同定された低分子または他の化合物の投与から利益を受け得る疾患および状態は、以下に示される。例えば、プロスタグランジン産生の阻害は、被験体における疼痛の低減または免疫反応の低下において有益である。
【０２０３】
プロスタグランジン産生のインヒビターから利益を受け得る別の疾患は、神経炎アミロイド斑によって特徴付けられるアルツハイマー病（ＡＤ）、神経細線維もつれ、ニューロン細胞損失、シナプスの損失、および高度グリオーシスである。最近の発見は、グリオーシスに関連する「炎症プロセス」が疾患における治療介入に関する潜在的な標的であることが示唆される。特に、Ｊｏｅ  Ｒｏｇｅｒｓおよび同僚は、非ステロイド性抗炎症剤がＡＤの進行を有意に遅らせ得る遡及的証拠および有望な証拠の両方を示す（ＭｃＧｅｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４２：４４７−４４９；Ｒｏｇｅｒｓら、１９９３，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４３：１６０９−１６１１）。実際、これらの結果は、ＡＤに対する抗炎症性治療試験の開始を促進する。
【０２０４】
ＡＤにおけるグリオーシスに対する「炎症性成分」についての証拠は、炎症前サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα（Ｇｒｉｆｆｉｎら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７６１１−７６１５；Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９９３，Ｇｌｉａ，７：７５−８３；ＬａｐｃｈａｋおよびＡｒａｕｊｏ，１９９３，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓｔｒ．，１９：１９１））の発現の増加および活性化された補体成分の存在（ＭｃＧｅｅｒら、１９８９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．，１０７：３４１−３４６；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１３：６４１−６４８；ＷａｌｋｅｒおよびＭｃＧｅｅｒ，１９９２  Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，１４：１０９−１１６）を含む。グリオーシスおよび炎症前サイトカインの存在は、ＡＤに限定されないことが留意されるべきである。むしろ、これらは、中枢神経系に対する多くの傷害および中枢神経系の疾患の特徴であり、これには、急性頭部損傷、発作、脊髄損傷、多発性硬化症、脳のＨＩＶ感染および他のウイルス性脳障害、ならびにほとんどの神経変性障害（例えば、ハンティングトン病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２０５】
結腸直腸癌は、西洋化諸国における主要な死因である。プロスタグランジンは、一般的には発癌に関連し、より詳細には、結腸直腸癌に関連する（Ｍａｒｎｅｔｔ，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：５５７５−５５８９）。いくつかの臨床試験において、アスピリンの使用は、減少した結腸腫瘍増殖および結腸腫瘍死と関連した。Ｔｈｕｎら、１９９１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２５：１５９３−６；Ｋｕｎｅら、１９８８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８：４３９−４０４。従って、ＰＧＥＳのインヒビターの投与は、癌（例えば、結腸直腸癌）の処置を補助し得る。
【０２０６】
排卵は、広い意味を有し、月経周期の間、ＬＨサージ（ｓｕｒｇｅ）によって開始される炎症プロセスとして見られ得る。Ｅｓｐｅｙ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ，２２：７３−１０６。ＮＳＡＩＤは、多くのモデル系における排卵を阻害することが示された。Ｅｓｐｅｙ，１９８２，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，２３：３２９−３３５。プロスタグランジン処方を阻害することおよび炎症性応答を中断することによって排卵は、停止される。従って、ＰＧＥＳポリペプチドのインヒビターは、排卵をブロックするため。および例えば避妊薬としての使用のために使用され得る。
【０２０７】
上記されるように、プロスタグランジンは、例えば、早産分娩において所望されない場合、分娩を誘導し、このことは、重大な臨床的問題である。Ｋｅｌｌｙ，１９９４，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１５（５）：６８４−７０６。プロスタグランジンは、正常分娩の子宮筋層収縮に非常によく関連する。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｇａｎｔ，Ｌｅｖｅｎｏ，およびＧｉｌｓｔｒａｐ（編）Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  第１９版。ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ  Ｃｏｎｎ．，１９９３。従って、ＰＧＥＳのインヒビターは、早産分娩およびそれから生じる合併症を予防するために使用され得る。
【０２０８】
月経困難および子宮内膜症は、通常、女性に関する困難な問題のある状態である。ＮＳＡＩＤがプロスタグランジン産生を阻害することによって、月経困難および子宮内膜症を処置する場合、極端に有効であることは周知である。従って、ＰＧＥＳのインヒビターは、プロスタグランジンの産生を阻害し、これらの状態を軽減する。
【０２０９】
上記されるように、ＰＧＥ２は、血管拡張薬である。従って、ＰＧＥインヒビターの局所的適用は、血管の拡張およびそれに由来する結果を予防し得る。
【０２１０】
本発明はまた、糖尿病、他の自己免疫状態、および機能不全的アポトーシスプロセスに関する状態を処置する方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、細胞死機構および事象の調節に基づく治療法を提供する。特定の実施形態において、癌の危険にさらされる個人または自己免疫疾患を発生する個人は、化学因子（ＴＮＦ−αおよびＦＡＳリガンドが挙げられるがこれらに限定されない）によって細胞を刺激する際に、細胞死に対するプロスタグランジン関連耐性を示す。例えば、ＰＧＥＳ活性のインヒビターの投与によるこのプロセスにおける介入によって、細胞死事象の完了を容易にし、生物学的環境から不適切な細胞を除去することを可能にする。この方法において、自己免疫Ｔ細胞は、適切な化学的シグナルによる刺激、または疾患関連標的抗原（例えば、インシュリンまたはＧＡＤ）での免疫の際のアポトーシス機構によって、除去され得る。同様に、癌細胞はまた、適切な細胞死に進行し、それによって、腫瘍および／または他の不適切な細胞増殖を減少もしくは阻害する。従って、本発明のさらに特定の実施形態は、ＰＧＥＳのインヒビターの投与に関するか、またはその生物学的活性に関し、これは、プログラムされた細胞死の調節をし、その結果、自己破壊性Ｔ細胞および／または癌細胞が除去され、自己免疫状態または癌状態を処置する。
【０２１１】
本発明の化合物は、例えば、特定の部位（例えば、炎症部位）に対してこれらの部位（例えば、関節炎の場合、関節）に直接注射することによって標的化され得る。中枢神経系における使用のために設計された化合物は、血液脳関門を越ええるべきであるか、または局所的注射による投与に適しているべきである。同様に、膀胱に対して特異的な化合物は、その中に直接注射される。化合物はまた、結腸直腸癌のような障害に対する使用のための胃腸管での制限について設計され得る。さらに、脈管系内に残存する本発明の化合物は、動脈硬化症、バルーン血管形成、カテーテル法、心筋梗塞、脈管閉塞、および脈管手術の結果として生じる脈管炎症の処置において有用であり得る。血流内に残存するこのような化合物は、ＭｃＩｎｔｉｒｅ，１９９４，Ａｎｎａｌｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２２：２−１３により完全に記載される方法を含む当該分野で周知の方法によって調製され得る。
【０２１２】
本発明における使用に適切な薬学的組成物は、活性成分が意図される目的を達成するのに十分な量で含まれる組成物を包含する。より具体的には、治療有効利用とは、処置される被験体の現在の症状の進行を処置するかまたは現在の症状を緩和するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示の観点から、十分当業者の能力内である。
【０２１３】
本発明の方法において使用される任意の化合物について、例えば、低分子またはポリペプチド）、患者の適切な処置を生じる治療有効用量は、細胞培養アッセイからから最初に見積られ得る。例えば、用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（５０％の細胞が所望の効果を示す用量）を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定し得る。
【０２１４】
治療有効用量とは、患者中で、症状の処置または生存の長期化を生じる化合物の量をいう。当業者が認識するように、投薬量は使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。正確な処方物、投薬経路および投薬量は、患者の状態の観点から、個々の医者によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌｅら、１９７５、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｃｈ．１  ｐ１を参照のこと）。投薬量および間隔は、個々に調整されて、所望の効果を維持するのに十分である活性部分の血漿レベルを提供し得る。
【０２１５】
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関係し得ない。
【０２１６】
投与される組成物量は、勿論、処置される被験体、被験体の体重、苦痛の重篤度、投与様式および前出の医者の判断に依存する。
【０２１７】
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の、混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）プロセス、乳化プロセス、カプセル充填プロセス、包括プロセスまたは凍結乾燥プロセスにより、適切な様式で製造され得る。
【０２１８】
従って、本発明に従う使用のための薬学的組成物は、薬学的に使用され得る化合物の調製物への処理を容易にする、賦形剤および補助剤を含む、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用する任意の従来の様式で、処方され得る。適切な処方物は、選択される投与経路に依存する。
【０２１９】
注射のために、本発明の薬剤は水溶液中に、処方され得る、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス液、リンガー溶液または生理食塩水）中に処方され得る。粘膜経由の投与のために、障壁を透過するのに適切な透過剤が、処方物中に使用される。このような透過剤は、一般に、当該分野で公知である。
【０２２０】
経口投与のために、化合物は、当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと化合物を混ぜ合わせることにより容易に処方され得る。このようなキャリアは、本発明の化合物を、処置される患者による経口摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方することを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤より得られ得、錠剤または糖衣錠コアを得るために、必要に応じて、得られた混合物を磨砕し、そして所望される場合、適切な補助剤の添加後に混合物の顆粒を処理する。適切な賦形剤は特に、以下のような充填剤である：糖類（ラクトース、スクロース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールが挙げられる）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ポテトデンプン、ゼラチン、ガム、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。所望の場合、不活性化剤（例えば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムのようなその塩）が添加され得る。
【０２２１】
糖衣錠コアは、適切なコーティングが施される。この目的のため、濃縮糖溶液を使用し、これは必要に応じて、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料（ｄｙｅｓｔｕｆｆ）および色素（ｐｉｇｍｅｎｔ）は、同じ配合であるかまたは異なる配合の化合物用量を特徴とする、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０２２２】
経口に使用され得る薬学的調製物は、ゼラチンから作製される押し込み成型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤ｌ（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製される軟封入カプセルが挙げられる。この押し込み成型カプセルは、活性成分と合わせて、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、スターチ）、および／または滑沢剤（例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム）、必要に応じて安定化剤を含み得る。軟カプセルにおいて、化合物は適切な溶液（例えば、油脂、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁される。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与のための全ての処方物は、このような投与に適切な投薬量であるべきである。
【０２２３】
吸引による投薬のために、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用した、加圧パックからのエアロゾルスプレー押し出しまたはネブライザーの形態で、便利に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位はメーター表示量（ｍｅｔｅｒｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）または粉末吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合および適切な粉末ベース（例えば、ラクトースまたはスターチ）を含んで処方され得る。
【０２２４】
化合物は、注射による非経口投与（例えば、ボーラス注射または連続的な注入）のために処方され得る。注射のための処方物は、保存剤を添加して、単位投薬量形態（例えば、アンプルまたは複数用量のコンテナ）で保存され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中での懸濁物、溶液、または乳液のような形態をとり得、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。
【０２２５】
非経口投与のための薬学的処方物は、水溶性形態で化合物の水溶液を含む。さらに、化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製され得る。適切な脂質溶媒または脂質ビヒクルとしては、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル（例えば、エチルオレイン酸もしくはトリグリセリド、またはリポソーム）のような油脂が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の濁度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、適切な安定化剤または、化合物の溶解度を増大させて高濃縮溶液の調製を可能とする薬剤を、含み得る。
【０２２６】
あるいは、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌の発熱性物質のない水）を用いた構成物のための、粉末形態であり得る。
【０２２７】
化合物はまた、座薬または停留浣腸のような直腸組成物（例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような便利な座薬ベースを含む）に処方され得る。
【０２２８】
これまでに記載された処方物に加えて、化合物はまた、徐放性調製物（ｄｅｐｏｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）として調製され得る。このような長期作用する処方物は、移植片によって（例えば、皮下または筋肉内に）か、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー性材料または疎水性材料（例えば、需要可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂、または難溶性（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ）誘導体（例えば、難溶性の塩）で処方され得る。
【０２２９】
本発明の疎水性化合物のための薬物キャリアは、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和有機ポリマーおよび水相を含む、共溶媒系（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）である。本質的に、共溶媒系の比率は、その溶解特性を損なわずにかなり変化され得る。さらに、共溶媒成分の同一性が変化され得る。
【０２３０】
あるいは、疎水性薬学的組成物のために他の送達方法が使用され得る。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬物の送達ビヒクルまたは送達キャリアの周知の例である。リポソームは、リポースの外表面を改変することによって（例えば、標的細胞の表面上の抗原を認識する抗体を連結することによって）、体内の特定部位に標的化され得る。特定の有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）もまた使用され得る。さらに、化合物は、持続性放出系（例えば、治療剤を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクス）を使用して送達され得る。種々の持続性放出材料が確立されており、そして当業者に周知である。持続性放出カプセルは、その化学的性質に依存して、数週間から１００日以上までの間、薬物を放出し得る。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性の依存して、タンパク質安定化のためのさらなるストラテジーが使用され得る。
【０２３１】
薬学的組成物はまた、適切な固相もしくはゲル相、または賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３２】
プロスタグランジンを含む組成物は、好ましくは、組成物中にプロスタグランジンの溶解または分散を支援するために、少なくとも１つの界面活性剤を含む。界面活性剤はまた、容器の壁へのプロスタグランジンの接着を阻害または防止する。界面活性剤は、任意の薬学的に受容可能な界面活性剤（例えば、薬学的に受容可能な、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤）であり得る。適切な界面活性剤の例としては、ポリエトキシル化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ−２〜ＰＥＧ−２００ヒマシ油に分類されるもの、ならびにＰＥＧ−５〜ＰＥＧ−２００の水素化ヒマシ油に分類されるもの）が挙げられる。このようなポリエトシキル化ヒマシ油としては、ＡｌｋａｍｕｌｓＴＭのブランドでＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，Ｎ．Ｊ．）によって製造されるもの、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭブランドでＢＡＳＦ（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）によって製造されるもの、そしてＮｉｋｋｏｌブランドでＮｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって製造されるものが挙げられる。好ましいポリエトリキシル化ヒマシ油は、ＰＥＧ−１５〜ＰＥＧ−５０ヒマシ油、そしてさらに好ましくは、ＰＥＧ−３０〜ＰＥＧ−３５ヒマシ油そして分類されるものである。ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭ  ＥＬおよびＡｌｋａｍｕｌｓＴＭ  ＥＬ−６２０として知られるポリエトリキシル化ヒマシ油を使用することが最も好ましい。好ましいポリエトリキシル化水素化ヒマシ油は、ＰＥＧ−２５〜ＰＥＧ−５５水素化ヒマシ油として分類される。最も好ましいポリエトリキシル化水素化ヒマシ油は、ＰＥＧ−４０水素化ヒマシ油（例えば、Ｎｉｋｋｏｌ  ＨＣＯ−４０）である。
【０２３３】
本発明の多くの化合物は、薬学的に適合性の対イオンを有する塩として提供され得る。薬学的に適合性の塩は、多くに酸（塩酸、硫酸、酢酸、酪酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されない）と共に形成され得る。塩は、水性溶媒または他のプロトン性溶媒により溶解性である傾向があり、塩は対応する遊離塩基形態になる。
【０２３４】
投与の適切な経路としては、例えば、局所的投与、経口投与、直腸投与、粘膜経由の投与、経皮投与、または腸管投与；非経口送達（筋肉内注射、皮内注射、骨髄内注射ならびにくも膜下腔内注射、直接の脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射または眼内注射を含む）が挙げられる。
【０２３５】
あるいは、全身的な様式よりも局所的様式で、例えば、患部への直接の化合物の注射を介して、しばしば、徐放性または持続性の放出処方物中で、化合物が投与され得る。
【０２３６】
さらに、標的化薬物送達システム、例えば、罹患した細胞に特異的な抗体でコーティングされたリポソーム中で、薬物が投与され得る。このリポソームは、細胞に標的化されるかまたは細胞によって選択的に取り込まれる。
【０２３７】
組成物は、所望される場合、活性成分を含む１単位以上の投薬量形態を含み得る、包材デバイスまたは容器デバイス中に供給され得る。この包材は、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含み得る（例えば、ブリスターパック）。包材デバイスまたは容器デバイスは、投与のための指示書を伴い得る。適合性の薬物キャリア中に処方された本発明の化合物を含む組成物はまた、適切なコンテナ中に入れられ、そして表示される状態の処置のためにラベルが付けられて、調製され得る。ラベルに表示される適切な状態としては、不十分なＰＧＥＳ活性またはＰＧＥ２、異常なＰＧＥＳ活性またはＰＧＥ２、あるいは過剰なＰＧＥＳ活性またはＰＧＥ２によって特徴付けられる疾患のような疾患の処置が挙げられる。
【０２３８】
本発明は、ＰＧＥＳポリペプチドのインビトロ調製のためのキットを提供し、これはＰＧＥＳポリペプチドをコードする核酸、この核酸を発現するための細菌、ＰＧＥＳポリペプチドを精製するためのクロマトグラフィー材料、および／またはコントロールＰＧＥＳポリペプチドを含み得る。他のキットは、プロスタグランジンをインビトロで調製するための１つ以上の成分を含み得る。このようなキットは、ＰＧＥＳポリペプチドの精製調製物、またはそのアナログもしくはフラグメント、およびＰＧＨ、ならびに必要に応じて緩衝液を含み得る。
【０２３９】
本発明はさらに、診断目的または治療目的のためのキットを含む。治療キットは、本発明の方法によって同定された化合物、または治療量の本発明のポリペプチド、および、例えば、投与のための局所型または他の型の薬学的ベクターを、含み得る。他のキットは、本発明の方法に従って合成されたＰＧＥを含む、１つ以上の薬学的組成物を含み得る。診断用キットは、サンプル中のＰＧＥＳに対する抗体量を測定するために、本発明の精製ポリペプチドを含み得る。
【０２４０】
他のキットは、ＰＧＥＳポリペプチド（例えば、被験体の細胞のポリペプチド）の活性を試験するためのアッセイにおいて、標準品（またはポジティブコントロールもしくはネガティブコントロール）として役立つように、本発明の精製ポリペプチドを含み得る。同様に、精製ポリペプチドは、サンプル中に存在するＰＧＥＳポリペプチドの存在および／または量を決定するための標準品として役立ち得る。従って、例示的なキットは、例えばグリセロールおよび／または還元グルタチオンを含む緩衝液中に、本発明の精製ＰＧＥＳポリペプチドの溶液を含み得る。このキットは、異なる濃度または異なる活性の異なる溶液を含み得る。このキットは、いくつかのサンプルを含み得、これは凍結または４℃で保存され得る。
【０２４１】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。これらの実施例は、多少なりとも限定的であると解釈されるべきではない。本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術（これらは、当該分野の技術範囲内である）を使用する。このような技術は、文献中で完全に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【実施例】
【０２４２】
（実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるヒスチジンタグ付ヒトプロスタグランジンＥシンターゼ（Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ）のクローニング、発現および精製）
配列番号１を有するヒトＰＧＥＳ（ｈＰＧＥＳ）のコードヌクレオチド配列を、発現配列タグクローン１４３７３５からＰＣＲによって増幅し、そして発現ベクターｐＳＰ１９Ｔ７ＬＴ（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、（１９９９）  ＰＮＡＳ  ９６：７２２０）に挿入した。６個のヒスチジン残基の配列を、ＮｄｅＩ部位でベクターに導入し、ここにｈＰＧＥＳのＮ末端をコードする末端を挿入した。この融合ポリペプチドをコードする核酸配列を、配列番号３に示し、そしてコードするポリペプチドを、配列番号４に示す（これらの両方は、図２Ａにおいても示される）。組換えＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（これは、プラスミドｐＬｙｓＳＬ（Ｓｔｕｄｉｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７）を収容する）中で以下のように発現させた。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢブロス中のＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の一晩培養物を、アンピシリンおよびクロラムフェニコール（各々、１００μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）を含む１〜２Ｌのテリフィックブロス（ｒｏｔｈ）培地中に１：１００希釈した。この培養物を、ＯＤ６００が、０．４５〜０．６０になるまで、テリフィックブロス培地中で３７℃で増殖させ、その時点で、ｈＰＧＥＳの発現を、３ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。その後、この培養物を３７℃でさらに３時間増殖させ、続いて、遠心分離により回収し、そしてさらなる処理まで、−２０℃で保存した。
【０２４３】
凍結ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞ペレットを、氷上で融解し、そして１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５Ｍ  スクロース、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＧＳＨを含む溶液（１Ｌの培養物のペレットに対して２０ｍｌ）中に懸濁した。この細胞を、凍結融解において、ｐＬｙｓＳＬプラスミド（Ｓｔｕｄｉｅｒら、前出）から発現した、内在性のＴ７リソザイムの排出によって溶解した。１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．４μｇ／ｍｌ  Ｄｎａｓｅを添加し、そして氷上で３０分間インキュベートすることによって、ＮＡを加水分解した。その後、この溶解物を、ＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０ソニケーター（ＭＳＥ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）からの、６回の３０秒間の超音波処理パルス（６０％出力）によって超音波処理した。非破壊の細胞および破片を、１０分間の低速の遠心分離（５，０００ｇ）によって分離した。膜画分を、２５０，０００ｇでの１時間の超遠心分離法によってペレット化し、そして、１０〜２０ｍｇ／ｍｌ膜タンパク質濃度で、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。この膜画分を、−７０℃で保存した。１ｌの発現培養物から、６０〜１００ｍｇの総膜タンパク質を得た。
【０２４４】
組換えＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む凍結Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）膜画分を融解し、そして膜タンパク質を、１０ｍＭまたは５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、氷上で撹拌しつつ３０分間可溶化した。不溶性の物質を、１００，０００ｇでの３０分間の超遠心分離法によって分離した。清澄な上清を、０．４５μｍフィルターに通して濾過した。
【０２４５】
タンパク質を、ウェスタンブロット分析によって可視化した。１μｇまたは１０μｇのタンパク質サンプル（図２Ｂにおいて示されるように）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてＰＶＤＦ膜へ電気泳動的にトランスファーした。膜上の非特異的部位を、ＴＢＳＴ中５％無脂肪乾燥乳でブロッキングした。この膜を、ポリクローナルＰＧＥＳペプチド抗血清（Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、前出）で、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体化ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でプローブした。バンドを、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した。この手順は、Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら（前出）において記載される。
【０２４６】
これらの結果（図２Ｂに示す）は、本発明の方法がＰＧＥＳの効果的な抽出および可溶化を提供することを例示する。これにより、ｈＰＧＥＳを、４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により、酵素活性を維持して可溶化抽出物中に完全に抽出した（下記を参照のこと）。
【０２４７】
（実施例２：可溶化およびＰＧＥＳ活性）
膜画分を、その後に続く精製実験のために、活性化状態でのｈＰＧＥＳの可溶化に適切な条件を研究するために、異なる緩衝液組成物において、上記のように可溶化した。以下の４つの異なる培地を試験した：
１．５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
２．５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１０％  グリセロール
３．５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１ｍＭ  還元グルタチオン
４．５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００＋１ｍＭ  還元グルタチオン＋１０％  グリセロール
ＰＧＥＳ活性を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、２．５ｍＭ  還元グルタチオン（ＧＳＨ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から入手した）および０ｍｇ／ｍｌ；０．２ｍｇ／ｍｌ；０．４ｍｇ／ｍｌまたは０．６ｍｇ／ｍｌのいずれかの精製ｈＰＧＥＳの存在下でアッセイした。この反応を、１０μＭ  ＰＧＨ２の添加により開始し、そしてこのサンプルを、０℃で１分間インキュベートし、次いで、２０ｍＭ  ＦｅＣｌ２、４０ｍＭクエン酸および２．１μＭ  １１−β  ＰＧＥ２でｐＨを３に下げることによって終結させた。ＰＧＨ２を、本質的にＨａｍｂｅｒｇら、（１９７４）ＰＮＡＳ  ７１：３４５またはＨｅｃｋｅｒら、（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：８５１に記載されるように、ヒツジ精嚢腺のホモジネートのミクロソーム画分の懸濁液とともにアラキドン酸を短時間インキュベートすることによって調製した。Ｌ−トリプトファン（５ｍＭ）を、電子供与体として使用した。０．００２％酢酸を含む２．５％  ２−プロパノール−ヘキサンの溶媒系を使用した順相（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｐｈａｓｅ）ＨＰＬＣによって精製を達成した。Ｃ１８Ｃｈｒｏｍａｂｏｎｄカラムを使用した固相抽出を、即座に実施した。このサンプルをアセトンで抽出し、乾燥させ、そしてアセトニトリル（Ｈ２Ｏ中１／３容量）に溶解し、そしてＰＧＥ２の形成を、Ｃ１８（３．９×１５０ｍｍ、４μＭ粒径）カラムにおける逆相ＨＰＬＣおよび１９５ｎｍでのＵＶ検出によって分析した。
【０２４８】
これらの結果（図３に示す）は、可溶化培地中にＧＳＨおよびグリセロールを含有することが、可溶化ｈＰＧＥＳの活性を維持するために好都合であることを示す。
【０２４９】
（実施例３：グリセロールおよびＧＳＨの存在下での、可溶化膜におけるＰＧＥＳ活性の安定性）
この実施例は、ＰＧＥＳの活性を維持するための条件を記載する。
【０２５０】
膜画分を、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  グリセロールおよび１ｍＭ  ＧＳＨで可溶化し、そして４℃で保存した。４℃で０、３、６、２４および２４０時間（１０日）後、サンプルを、ＰＧＥＳ活性について上記のようにアッセイした。
【０２５１】
これらの結果（図４に示す）は、可溶化組換えｈＰＧＥＳの活性が、グリセロールおよびＧＳＨの存在下で長時間維持されることを実証する。４℃で２４時間後、７０％の変換が残り、そして１０日のような長時間の後でさえ、最初の活性の４０％が残る。対照的に、グリセロールおよびＧＳＨの非存在下では、ＢＬ２１（ＤＥ３）膜中のＰＧＥＳ活性は、２４時間以内に急速に衰退する。
【０２５２】
（実施例４：ｈＰＧＥＳの精製）
この実施例は、本発明の組換えｈＰＧＥＳが、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、それに続く固定化金属イオンクロマトグラフィーの２工程の組合せによって、単離された膜画分から精製され得ることを実証する。
【０２５３】
組換えＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む凍結Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）膜画分を融解し、そして１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１ｍＭ  還元グルタチオン（ＧＳＨ）中の４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で上記のように可溶化した。ホスフェート濃度を１０ｍＭに低くし、以下の工程におけるヒドロキシアパタイトへのタンパク質の結合を促進した。この特定の実施形態において、２４０ｍｇの総膜タンパク質を含む画分を使用した。
【０２５４】
この可溶化膜タンパク質混合物を、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＧＳＨ、１０％  グリセロール、１０ｍＭ  イミダゾール、０．２％還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｘ−１００  ＲＳ）で平衡化したヒドロキシアパタイト、（ＨＡ）、（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ、ＨＴＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｇ／１００ｍｇ膜タンパク質と混合した。還元Ｔｒｉｔｏｎを、緩衝液のＵＶ吸光度を最少にして、溶出されたタンパク質の検出を容易にするために使用した。氷上での１０分間のインキュベーション後、ＨＡを短い遠心分離パルスによりペレット化し、そして大部分のＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む非結合画分（フロースルー）を、遠心分離（１５００ｇ、３分間）および濾過（０．４５ｍｍ）により除去および清澄化した。
【０２５５】
ＨＡからの清澄化された非結合分画を、ＮｉＣｌ２をチャージされ、そして１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、１ｍＭ  ＧＳＨ、１０％グリセロール、０．２％還元Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（出発緩衝液）で平衡化された１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（１ｍｌのカラムを、３００ｍｇまでの膜タンパク質（出発材料として）について使用した）に１ｍｌ／分の流速で即座にローディングした。ローディング後、このカラムを、全ての非結合タンパク質が溶出されるまで、出発緩衝液で洗浄した。その後、６０ｍＭのイミダゾールを添加して、非特異的に結合されたタンパク質を洗い出した。最後に、このアフィニティーカラムに結合しているヒスチジンタグ付タンパク質を、３００ｍＭまたは３５０ｍＭのイミダゾールの添加によって溶出した。この溶出プロフィールを、図５Ａに示す。溶出したピークをＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において、８ｍｌ／分の流速で、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１ｍＭ  ＧＳＨおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に即座に脱塩した。
【０２５６】
純度を改善するために、この脱塩したタンパク質ピークを、Ｎｉカラムに再度ローディングし、そして第二ラウンドの精製を行った。その後に続く、ＰＤ１０脱塩カラムで行う脱塩を除いて、全ての工程を上記と同様に実施した。
【０２５７】
第２のＮｉカラム後の回収は、７ｍｌ中に０．０７ｍｇ／ｍｌで分布する０．４９ｍｇ（出発材料の総量の０．２％）純粋Ｈｉｓ６ＰＧＥＳであった。第１のＮｉアフィニティーカラム後、０．５７ｍｇを、３ｍｌ中に回収した（０．１９ｍｇ／ｍｌ）。従って、１４％（０．０８ｍｇ）のみが、第２のＮｉカラムで失われ、そしてその部分は、おそらく不純物（例えば、非特異的に結合された他のタンパク質）であった。精製したタンパク質を、ウェスタンブロットおよびＰＧＥＳ活性決定（下記を参照のこと）によってさらに分析し、両方の実験から陽性の結果を得た。
【０２５８】
このカラムから溶出したタンパク質の量および同一性を、溶出物画分のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）およびそのゲルの銀染色に供することによって可視化した。ゲルの写真を、図５に示す。明らかに均一にまで精製された１７．５ｋＤａタンパク質を得た。収量は、単離した膜画分からの０．２〜１ｍｇの精製タンパク質、そして全細胞溶解物（下記を参照のこと）から精製した場合、１ＬのＢＬ２１（ＤＥ３）発現培養物あたり１．０〜３．５ｍｇであった。ＰＧＥＳに対して惹起されたウサギポリクローナルペプチド抗血清を使用したイムノブロット分析およびＰＧＥＳ活性決定（下記を参照のこと）によって、このタンパク質を、ＰＧＥＳとして同定した。精製タンパク質の分子量は、１７．５ｋＤａに対する標準（これは、ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの理論的分子量（１７．９ｋＤａ）と一致する）と比較した、その電気泳動的移動度から算出した。同一の結果を、染色した（ｓｔｓａｉｎｅｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットから算出した場合に得た。
【０２５９】
ｈＰＧＥＳの主要部分は、ＨＡに結合せず、従ってフロースルー画分において回収され得、そしてその後Ｎｉカラムにおいて良好に精製され得た。しかし、ＨＡ工程は必要である。なぜなら、いくつかのタンパク質（そうしないとＮｉアフィニティークロマトグラフィーにおいて干渉する）は、特異的に結合され、従ってＨＡによって除去されることが明らかであるからである。Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーによる１工程精製は、多くの非特異的に結合したタンパク質がＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳと同時に溶出され、そしてこれらの選択的な排除を達成し得ないので、失敗であった。
【０２６０】
別の金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ製のＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）を、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの精製について試験した。しかし、このＮｉ−ＮＴＡ樹脂が、ｈｉｓ−タグ付きｈＰＧＥＳに対して、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅより低いアフィニティーを有することを見出し、そして現在、全ての精製実験を、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して実施している。別のアフィニティー樹脂の試験についての主な理由は、主には還元剤に対するＮｉ−ＮＴＡアガロースの証明されたより強い耐性（ＧＳＨが、全ての緩衝液中に含まれねばならない場合、ＰＧＥＳの機能性を維持するために重要である）である。しかし、１ｍＭ  ＧＳＨを含む緩衝液が、樹脂に対する明らかな、いずれの損傷も伴わずに、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムと共に使用され得ることが見出された。しかし、効率的でない場合でさえ、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．）製の樹脂はまた、ＰＧＥＳを精製するために、本発明の方法に従って使用され得る。
【０２６１】
（実施例５）
（膜分画中のｈＰＧＥＳ含有量）
精製ＰＧＥＳタンパク質は、現在入手可能であるので、細菌膜内で発現される組換えタンパク質の量を決定するための標準として精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを使用する定量的ウェスタンブロットがなされ得る。従って、定量的ウェスタンブロットは、ＢＬ２１ＤＥ３細胞中で発現される組換Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ量の決定するために実施した。ウェスタンブロットは、上記（図２）のように実施した。バンドの強度は、デンシトメトリーによって決定した。
【０２６２】
図６に、ウェスタンブロットの写真を示す。応答は、２０ｎｇまで線形であった。ＰＧＥＳの含有量は、異なる膜バッチにおいて、総膜タンパクの０．５％〜２％の間で変化した。このことはまた、本発明によって提供される精製方法が、有効であることを例証する。
【０２６３】
（実施例６）
（精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの活性および安定性）
精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの活性を、タンパク質サンプルについてアッセイした。残るタンパク質を、２つのパートに分割し、１つを４℃で５日間保存し、そしてもう一方を凍結し、−２０℃で、同じ時間保存した。これら３つのサンプルにおけるＰＧＥＳ活性を、可溶化なしで、膜分画中でのＰＧＥＳ活性と比較した。ＰＧＥＳ活性を、上記のように、様々な量のタンパク質について決定した。このサンプルを、反応を停止する前に、氷上で１分間または３７℃で１分間インキュベートした。精製タンパク質の活性を、可溶化なしで、ＢＬ２１（ＤＥ３）膜中での活性と比較した。
【０２６４】
この結果を、表７に示した。組換えヒスチジン−タグ化酵素のＰＧＥＳ活性は、安定であり、そして可溶化または凍結融解による影響は見られなかった。従って、ＰＧＥＳタンパク質は、調製され、精製され、そして活性の有意な損失なしに保存され得る。より大量のＰＧＥＳがまた、生成され、そしてより長い期間保存され得る。−２０℃で、少なくとも２ヶ月までの保存では、そのバッチ内での活性の損失は、全く見られない。４℃で５日間保存した後の活性は、新たに調製して４℃で３４日間保存したあとの酵素と比較して変化せず、元の活性を約５０％を残していた。長期保存を意図したサンプルを、酸化によるタンパク質の損傷を妨げるため、窒素下で保存した。不溶化膜分画中のＰＧＥＳ（ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ含有量は、定量的免疫ブロットにより決定されている）は、可溶化した精製酵素と同様の活性を示した。
【０２６５】
精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ比活性は、ＰＧＨ２からＰＧＥ２へのグルタチオン依存的転換について、３７℃で１５μｍｏｌ／分／ｍｇおよび１６７μｍｏｌ／分／ｍｇと算出された。この比活性を、最近同定された細胞質ゾルＰＧＥＳ（２４℃で０．１９μｍｏｌ／分／ｍｇ）（Ｔａｎｉｏｋａら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２７５：３２７７５）の公表されたＶｍａｘと比較する（約１，０００倍低い）。
【０２６６】
従って、ＰＧＨ２からＰＧＥ２への転換に対するこの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの比活性は、これまでＰＧ−シンターゼについて報告されているところでは最高の活性である（表３）。ＰＧＨ２（０．１６ｍＭ）に対するＫＭは、他の報告されているＰＧ−シンターゼと匹敵するが、転換率および触媒的有効性（ｋｃａｔ／ＫＭ）が高い（表３）。
【０２６７】
（実施例７）
（膜で分離されていない全細胞溶解物であるＢＬ２１ＤＥ３からの精製）
膜分画からのポリペプチドの単離は、通常、全細胞溶解物からの単離よりも時間がかかるので、全細胞溶解物であるＢＬ２１（ＤＥ３）から直接的に組換えＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを抽出し、精製することが可能か否かを調べた。このことは、精製プロセスのための全時間をかなり短縮し、そして損失を最小限にすることを可能にする。
【０２６８】
以下の方法を用いて、全細胞溶解物からＰＧＥＳを単離した。組換えＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、上記のようにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中で発現させた。１リットルのＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳ発現培地からの凍結細胞ペレットを融解し、そして２０ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＧＳＨ中に再懸濁した。これらの細胞を、ｐＬｙｓＳＬベクターによって発現した細胞内Ｔ７リソゾーム押出しによって、凍結融解で自己溶解させた。粘性細胞溶解物全体を、上述の道具により、均質化し、当量の１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＧＳＨおよび８％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加ならびに３０分間の氷上での穏やかな攪拌によって可溶化するまで、１５秒のパルスで氷水浴中で超音波処理した。膜分画のために記載したように、超遠心および濾過によって、この可溶化溶解物から不溶性物質を除いた。その後、膜分画から可溶化したタンパク質について記載したように、ヒドロキシアパタイトおよびＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーによって、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを可溶化溶解物から精製した。
【０２６９】
溶出タンパク質のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供し、ゲルを銀染色した。このゲルの写真は、図８のように示される。この結果は、最初に膜分離することなく細胞溶解物全体の可溶化開始することが、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの精製のための膜分画を用いる場合と同等に働いたことを表す。実際に、収量はさらにより高く、３．４ｍｇの純粋Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳが２つのピーク（３００ｍＭ（大きい、０．３５ｍｇ／ｍｌ、レーン６、図８）および５００ｍＭ（小さい、０．０４ｍｇ／ｍｌ、レーン７、図８））（イミダゾールピーク）中に溶出される。後の実施例において、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの溶出に用いたイミダゾールの濃度を、３５０ｍＭまで上げた結果、全てのタンパク質が、１つのピーク中に溶出した。ＰＧＥＳ活性が決定され、両方のピークにおいて膜分画から精製したＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳにより決定される活性と同じであった。
【０２７０】
従って、この手順により多くの時間が節約され、比較的高速（例えば、４時間）の小規模培養物からの多量のタンパク質を発現させ、精製することを可能にする。
【０２７１】
（実施例８）
（精製規模の拡大）
精製プロセスをスケールアップして、精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの量および濃度を上げるために、５１の発現培地からの凍結細胞ペレットを用いて始める実験を行った。全ての容量およびカラムのサイズが５倍大きい全細胞溶解物からの精製のために、全ての可溶化工程およびクロマトグラフィー工程を、実質的に上記のように実施した。
【０２７２】
５倍のスケールアップした精製プロセスから、５倍の純粋タンパク質は得られなかった。１回目のＮｉカラム（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（５ｍｌ））からの溶出ピークには、まだ多くの不純物が含まれていたので、このピークをタンパク質の純度および濃度を上げるための１ｍｌカラムに再充填した。１回目のピークからのＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳの一部のみを２回目のＮｉカラムに実際に結合させたが、最終的に４回のＮｉアフィニティーカラムへの再充填が成された。これらの全てから純粋Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの一部の溶出液が得られたが、濃度は所望したほど上げられなかった。精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの全収量は、４．９ｍｇ（０．５７ｍｇ／ｍｌで５．５ｍｌ（２回目のＮｉカラム）、０．２１ｍｇ／ｍｌで５．５ｍｌ（３回目のＮｉカラム）および０．１４ｍｇ／ｍｌで４ｍｌ（４回目のＮｉカラム）に分散）であった。
【０２７３】
種々のピークからのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供し、次いでこのゲルを銀染色（図９）するか、またはウェスタンブロット分析に供した（図１０）。図９（レーン６）およびウェスタンブロット（図１０、レーン７）に見られるように、Ｎｉカラムを４回通した後でさえ、フロースルー分画中に結合しなかったＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳがまだ多量に存在する。この理由は、明らかでないが、おそらく小さな１ｍｌカラムは、より多くのタンパク質と結合する能力を有さず、従ってオーバーロードとなると解釈し得る。ウェスタンブロット（図１０、レーン９）に見られるように、１回目のアフィニティークロマトグラフィー工程において、全てのＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、よりおおきな５ｍｌＮｉカラムで保持した。
【０２７４】
（実施例９）
（ＰＧＨ２に対するＫＭおよびＶｍａｘの決定）
精製したＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で、０℃で１ｍｇ／ｍｌ、３７℃で０．５ｍｇ／ｍｌ）（上記のように２．５ｍＭ  ＧＳＨおよび様々なＰＧＨ２濃度を有する）を用いて、活性をアッセイした。全ての点で、３回行った。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数ＫＭおよびＶｍａｘ（最大速度）を、コンピュータプログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア３．０または３．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた双曲線回帰によって得た。
【０２７５】
このグラフを、図１１に示した。ＰＧＨ２に対するＫＭは、０℃で５０±８．９μＭおよび３７℃で１６３±４２μＭであった。Ｖｍａｘは、０℃で０．２５±０．０１３μＭ／ｓおよび３７℃で１．３９±０．１６μＭ／ｓであった。
【０２７６】
ＧＨＳが、他のスルフヒドリル化合物（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレイトールまたは２−メルカプトエタノール）で置換されている場合、または精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを１００℃で１０分間加熱した場合、ＰＧＥＳ活性は検出不能であった。ＧＳＨを欠いた５ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドでの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの１分間のプレインキュベーションは、ＰＧＥＳ活性をほぼ１００％下げた。
【０２７７】
（実施例１０）
（ｈＰＧＥＳの基質特異性）
精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの活性を、ＰＧＨ２、ＬＴＡ４、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）、ＰＧＧ２および５−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）を用いてアッセイした。
【０２７８】
ＬＴＣ４シンターゼ活性を、上記（Ｊａｋｏｂｏｓｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２７１：２２２０３）のように３０μＭ  ＬＴＡ４および１０ｍＭ  ＧＳＨ（ｐＨ７．４）とともにインキュベートした１００μｇ／ｍｌまでの精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを用いてアッセイした。上記バックグラウンドの活性は、１００μｇ／ｍｌ（通常のＰＧＥＳ活性のアッセイに用いられるより１００倍多いタンパク質）までの精製酵素で、検出不能であった（表Ｉ参照のこと）。
【０２７９】
グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性（グルタチオン結合体）を、ＧＳＴに対する古典的なモデル基質であるｐ−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を用いてアッセイした。精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の５ｍＭ  ＧＳＨ（グルタチオン，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１ｍＭ  ＣＤＮＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、３０℃でインキュベートした。生成物の形成を、３４０ｎｍ（生成物ＧＳ−ＤＮＢに対するモル吸収率は、９．６ｍＭ−１ｃｍ−１）で検出した。
【０２８０】
この結果は、精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳが、小さいながら有意なＧＳＨ−ＣＤＮＢ結合体活性を有する（表Ｉを参照のこと）ことを示した。ＣＤＢＮについてのＫｍは、決定不可能であった。なぜなら、ＧＳＴ活性が、２ｍＭ  ＣＤＮＢまで直線だったからである。精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、ＧＳＨの存在しない５ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドとともに１分間プレインキュベートした場合、酵素活性は５０％減少した。。精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、ＬＴＡ４とともにインキュベートするか、または１００℃で１０分間加熱した場合、ＧＳＴ活性は検出不能であった。
【０２８１】
ＭＡＰＥＧスーパーファミリーに関する他の活性を試験した。ＭＧＳＴ２およびＭＧＳＴ３は、両方ともグルタチオン依存的な５−ＨＰＥＴＥの５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（５−ＨＥＴＥ）への還元を触媒する（Ｊａｋｏｂｓｓｅｎら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９３４）。従って、ＰＧＥＳのペルオキシダーゼ活性を測定するために、５−ＨＰＥＴＥ（１０μＭ）（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を、１００μｌの反応混合物（０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）；５ｍＭ  グルタチオン；０．００５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０２５〜０．１ｍｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む）中でアッセイした。この反応混合物を、３７℃で３分間インキュベートした。この反応を、０．２％の酢酸を含む２００μｌのアセトニトリルを添加するによって停止した。次いで、１００μｌの水を添加し、そして１４，０００ｇ、１分間の遠心分離によってタンパク質を除去した。次いで、アリコート（２００μｌ）を、Ｎｏｖａ−Ｐａｋ  Ｃ１８（３．９×１５０ｍｍ，４μｍ  粒子サイズ）を備えたＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、水から得た。この移動相は水、アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸（４０：６０：０．００７、容積による）であった。流速は、１．０ｍｌ／分であり、生成物を、既知の量の注入５−ＨＰＥＴＥおよび５−ＨＥＴＥから、ピーク面積（２３６ｎｍ）に基いて定量した。この結果は、ＰＧＥＳは、低い活性を有するが、有意なグルタチオンペルオキシダーゼ活性を有する（表Ｉ）ことを示す。精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを１００℃で１０分間加熱した場合、このグルタチオン依存的ペルオキシダーゼ活性は、消失した。
【０２８２】
Ｈｉｓ６−ＰＧＥＳはまた、ＧＳＨ存在下で１５−ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２の還元を触媒したが、速度は、１５−ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２の生成よりも低かった。さらに、精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳは、クメンヒドロペルオキシド（０．１７μｍｏｌ／分  ｍｇ）に対するＧＳＨ依存的ペルオキシダーゼ活性を触媒した。コントロールとして、酵素を１０分間煮沸し、全ての活性を消失させた。基質としてのクメンヒドロペルオキシドに対するペルオキシダーゼ活性を、０．０５ｍｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳ、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．５ｍＭ  クメンヒドロペルオキシド（アルコール中に溶解）および過剰量のグルタチオンレダクターゼを用いる結合アッセイによって、３４０ｎｍのＮＡＤＰＨ吸収の直線的な減少として決定した（Ｗｅｎｄｅｌ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７７：３２５））。
【０２８３】
次いで、精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳが、ＰＧＧ２の１５−ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２への異性化（ｓｉｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を触媒するか否かを調べた。１００μｌの反応混合物（０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）；２．５ｍＭ  還元グルタチオン；１０〜８００μＭ  ＰＧＧ２および０．２〜２．０μｇ／ｍｌの精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む）中のＰＧＥＳの基質として、ＰＧＧ２をアッセイした。ＰＧＧ２を、ＰＧＥ２と同様に（上記に記載）調製した（Ｌ−トリプトファンを抜く）。この反応を、６μｌ  ＨＣｌ（１Ｍ）を添加してｐＨを３まで低くすることによって停止した。次いで、４５μｌのアセトニトリルを添加し、そして１４，０００ｇで１分間遠心分離して、タンパク質を除去した。停止溶液は、ＦｅＣｌ２を含まない。なぜなら、全てのペルオキシダーゼ（１５−ヒドロペルオキシＰＧＥ２を含む）を分解するからである。ＰＧＥ２および１５−ヒドロキシＰＧＥ２の形成を決定するために、アリコート（１００μｌ）を、１９５ｎｍのＵＶ検出を備えたＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。生成物を、注入した既知の量のプロスタグランジンのピーク面積に基いて定量した。
【０２８４】
この結果は、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳが、還元グルタチオンの存在下でのＰＧＧ２の１５−ヒドロペルオキシＰＧＥ２（１５−ＨＰ  ＰＧＥ２）への特異的な転換を触媒することを示す。このことは、３０秒間のインキュベーション後、緩衝液コントロール（図１２Ｃ）と比較した場合に典型的なクロマトグラム（図１２Ｂ）に示される。Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳとの１０分間のインキュベーション後、約半分の１５−ヒドロペルオキシＰＧＥ２が、ＰＧＥ２に転換した（図１２Ｄ）が、一方、緩衝液コントロールは、３：１のＰＧＥ２：ＰＧＤ２比を有する典型的な比酵素プロフィールを示した（図１２Ｅ）（Ｎｕｇｔｅｒｅｎら（１９８０）ｄｖ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ  Ｒｅｓ．６，Ｂ．Ｓａｍｅｌｓｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．Ｒａｍｗｅｌｌ，およびＲ．Ｐａｏｌｅｔｔｉ（編）Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：ＮＹ，１２９−１３７）。Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、還元グルタチオンの非存在下でＰＧＧ２と共にインキュベートした場合、１５−ヒドロペルオキシＰＧＥ２の還元は起こらなかった（図１２Ｆ）。煮沸酵素は、いかなる活性も含まなかった。Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳをまた、１５−ＨＰ  ＰＧＥ２と共に（０．１ｍｇ／ｍｌの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳおよび０．１６ｍＭの１５  ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２を用いて３７℃で、ＰＧＧ２について記載されたとおりに）インキュベートしたが、この化合物に対するペルオキシダーゼ活性は検出されなかった。
【０２８５】
ＰＧＧ２についてのＫＭおよびｋｃａｔを表１に示し、そしてＶｍａｘでの比活性を表２に示す。さらに、ｈｉｓ６−ＰＧＥＳは、１５−ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２の還元を触媒したが、ＰＧＧ２の１５−ヒドロペルオキシ−ＰＧＥ２への高効率の異性化と比較して非常に低い速度であった。ＰＧＧ２およびＰＧＨ２の疎水特性に起因して、ＫＭ値を見かけのＫＭ値として得た。
【０２８６】
従って、精製Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳは、ＰＧＧ２の１５−ＨＰ  ＰＧＥ２への転換を触媒し得、次いで、１５−ＨＰ  ＰＧＥ２を、ＧＳＨの存在下で、より遅い工程でＰＧＥ２に非酵素学的に還元した。当業者は、１５−ＨＰ  ＰＧＥ２は、重要であり得、なお未知の生物学的機能を有する非常に短命の中間体であり得ることを理解する。水溶液および不適切な停止溶液中のＰＧＧ２の不安定性に起因して、ＰＧＧ２を用いて受容可能なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ飽和曲線は、得ることができなかった。しかし、最も高い測定された比活性は、表２に示される。
【０２８７】
【表１】
2005526483.tif 000002
【０２８８】
【表２】
2005526483.tif 000003
従って、これまでに試験された基質から、当業者は、ｈＰＧＥＳが、ＰＧＨ２について高い比活性を有すること、およびＰＧＥＳもまた、ＣＤＮＢ、５−ＨＰＥＴＥおよびＰＧＧ２の転換を触媒し得ることを理解する。
【０２８９】
比較の目的のために、表３は、ＰＧＥシンターゼ活性を有する酵素の特徴を列挙する。
【０２９０】
【表３】
2005526483.tif 000004
（実施例１１：電子線結晶学）
１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、界面活性剤含量を減少させる前にリン脂質を加えることによって、２−Ｄ結晶化試験にかけた（Ｈｅｂｅｒｔ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｄ．，およびＨａｒｉｓ，Ｐ．（編）），ｐｐ８８−１１０，ＩＯＳ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓｅｒ（２００１）Ｍｉｃｒｏｎ  ３２：５１７）。透過型電子顕微鏡および光回折によってネガティブに染色されたサンプル分析から判断されるように、結晶性を示す試料を、安定化剤として１％のタンニン溶液を使用して戻し注入法（ｂａｃｋ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）による調製に供した。この試料を、−１７５℃で凍結させ、そしてデータ収集の間、Ｇａｔａｎ  ６２６凍結ホルダー中でほぼこの温度で維持した（Ｗａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１７：６９１およびＨｉｒａｉら（１９９９）Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃ．４８：６５３）。電子顕微鏡写真を、１２０ｋＶで操作したフィリップスＣＭ１２０電子顕微鏡を用いて、Ｋｏｄａｋ  ＳＯ−１６３フィルムに記録した。選択された領域を、試料レベル上で１．４Åに対応する７μｍピクセルサイズでＺｅｉｓｓ  Ｓｃａｉスキャナでデジタル化した。このデータをＭＲＣソフトウエアパッケージからのプログラムを使用して、基本的には記載されたとおりに、画像処理のいくつかの工程に供した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（１９８６）Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １９：１４７およびＣｏｗｔｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１６：９）。
【０２９１】
ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの二次元結晶は、単位胞パラメータ：ａ＝９７．０、ｂ＝９８．０Å、γ＝９０．０°を有した。このデータは、１０Åの解像度に対する対称性関連回折点間の２５．７°の全位相残差を有する割り当て投射対称ｐｇｇ（ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｐｇｇ）と一致する（表４）。この結晶のａ−軸およびｂ−軸に平行なグライドライン（ｇｌｉｄｅ  ｌｉｎｅ）は、図１２に示されるように、上向き方向および下向き方向に変化させて対称性関連タンパク質単位の横の列および縦の列を生じる。この投射マップは、１８の結晶性領域からのデータを合わせることによって得た。
【０２９２】
【表４】
2005526483.tif 000005
＊  投射対称ｐｇｇにおける位相関係：ｈ＋ｋ＝２ｎの場合α（ｈ，ｋ）＝α（ｈ，−ｋ）そしてｈ＋ｋ＝２ｎ＋１の場合α（ｈ，ｋ）＝α（ｈ，−ｋ）＋１８０
単位胞サイズ（ｉｓｚｅ）に関連するｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳタンパク質の分子量は、２−Ｄマップ（図１３中で丸で印される）中の各タンパク質単位が、膜の平面に垂直な方向に沿った３つのモノマーの投射に対応することを示唆する。得られたパッキング密度は、２２．７Ｄ／Å２であり、これは、他の多くの小さい内在性膜タンパク質の２−Ｄ結晶に匹敵する。従って、ＰＧＥＳは、膜中で三量体を構築する。
【０２９３】
（実施例１２：ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の分子量）
精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳに結合するＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の程度を、一連の実験において決定した。この沈降係数、偏比容、およびストークス半径を、セファクリルＳ−３００ＨＲでのスクロース勾配およびゲル濾過を使用することによって決定した。タンパク質−界面活性剤複合体の分子量を、Ｓｖｅｄｂｅｒｇの式：
【０２９４】
【数１】
2005526483.tif 000006
から算出し得る。Ｍは分子量、η２０，ｗは２０℃での水の粘度、Ｓ２０，ｗは沈降係数、ａはスークス半径、Ｎはアボガドロ数、νは偏比容、およびＱ２０，ｗは２０℃での水の密度である。
【０２９５】
ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の沈降係数を、５〜２０％のスクロース、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＧＳＨ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１０ｍｌの線形勾配に加えて、総用量（ｔｏｔｌａ  ｖｏｌｕｍｅ）４５０μｌの０．５ｍｇのシトクロムｃおよび１０ｍｇのウシ血清アルブミンと共に、１００μｇの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを加えることによって決定した。シトクロムｃおよびウシ血清アルブミンを、それぞれ１．７Ｓおよび４．６Ｓの沈降係数を有する標準として使用した。遠心分離を、４℃にて４５時間、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０Ｔｉローターで、１６００００×ｇａｖで実施した。次いで、画分をポンプを用いてシリンジでチューブの底から回収し、０．４ｍｌアリコートを活性アッセイおよびタンパク質（ｐｒｏｔｅｎｉ）を決定するために取っておいた。これらの画分を本明細書中に記載したとおりにＰＧＥＳ活性についてアッセイし、そして屈折率を決定した。シトクロムｃを、４０５ｎｍでの吸収およびタンパク質を測定することによって局在化されたウシ血清アルブミンから決定した（Ｐａｎｄｅら（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２０：４２４）。
【０２９６】
ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の偏比容を、平衡密度勾配遠心分離によって決定した。３０μｇの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、３０〜６０％のスクロース、１０  ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＧＳＨ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する３．８ｍｌの勾配に加えた。このチューブを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ６０Ｔｉローターで７２時間および９６時間、４℃にて２４６０００ｇａｖで遠心分離し、確実に平衡に到達させた。０．１６ｍｌの画分を回収し、上記のとおりに分析した。
【０２９７】
ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体のストークス半径を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲのカラム（１．６×６０ｃｍ）でゲル排除クロマトグラフィーによって決定した。３０〜５０μｇの精製ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳを、１．０ｍｌの溶出緩衝液中のマーカー酵素と共にカラムに充填した。溶出を、５０  ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．５％グリセロールを用いて１０℃にて実施した。１．０ｍｌの画分を回収し、そして上記のとおりに分析した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のＨＭＷゲル濾過較正キットを使用した。使用したマーカー酵素は、アルブミン、カタラーゼ、フェリチンおよびサイログロブリンであった。いずれのマーカーも、有意な量の界面活性剤との結合を示さなかった。ストークス半径を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製のゲル濾過キット説明書に従って推定した。
【０２９８】
ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の沈降係数は、３．４±０．２Ｓ（ｎ＝２）（図１４Ａ）であることが見出され、そして偏比容は、０．８７９±０．００６ｃｍ３／ｇ（ｎ＝５）である（これは、図１０Ｂに見られるように１．１４ｇ／ｍｌ（３３％スクロース）の密度に対応する）ことが見出された。ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体は、ほとんど、セファクリルＳ−３００  ＨＲカラムで、カタラーゼと共に同時クロマトグラフ（ｃｏ−ｃｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）される。−ｌｏｇＫＡＶ値の平方根をマーカー酵素の既知のストークス半径に対してプロットし、そしてＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体のストークス半径が５．２±０．１ｎｍ（ｎ＝２）であることを示した。このゲル濾過を０．５％の還元ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて繰り返し、ＰＧＥＳ−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００複合体のストークス半径において有意な差異がないことを見出した（図１４Ｃ）。ゲル濾過をまた、マーカー酵素のみを用いて実施し、これらは、および溶出緩衝液中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって影響を受けなかったと考えられた。
【０２９９】
これらのデータを、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ式に代入して、ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の分子量が１６４０００であることを見出した。この複合体がどれくらいの量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００からなっているかを決定するために、ＰＧＥＳおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００両方の偏比容を知ることが必要である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、０．９３９ｃｍ３／ｇの偏比容を有し、そしてＰＧＥＳの偏比容は、その既知のアミノ酸配列から算出される（０．７５ｃｍ３／ｇ）。Ｔｒｉｔｏｎは、６２５の平均分子量を有し、引き続く計算によって、２．１５  ｇ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００結合／ｇ  ＰＧＥＳの値を得た。これは、３つのポリペプチド鎖および複合体あたり１８５の界面活性剤分子に対応する。
【０３００】
（実施例１３：Ａ５４９細胞中のＰＧＥシンターゼおよびシクロオキシゲナーゼ−２の誘導）
この実施例は、ＩＬ−１βによる活性ＰＧＥＳポリペプチドのＡ５４９へ細胞の誘導およびそのＣＯＸ−２の誘導との比較を記載する。
【０３０１】
ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）と共にまたはＩＬ−１βを伴わずに培養したＡ５４９細胞のミクロソーム画分を、０時間、１２時間、２４時間、３６時間または７２時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に供した。ポジティブコントロールとして、ヒトＰＧＥシンターゼを発現する細菌からの膜画分を含んだ。ゲルの全てのレーンにおいて、ヒトＰＧＥシンターゼを除く１０μｇの総タンパク質が分析され、ここで、２μｇが充填された。次いで、ウエスタンブロットをＰＧＥシンターゼに対する抗ペプチド抗血清と共にインキュベートした。次いで、このブロットをストリッピングし、そしてＣＯＸ−２に対する抗血清と共にインキュベートした。
【０３０２】
図１５Ａは、ＩＬ−１βのＡ５４９細胞への付加後の時間の画分としてミクロソームＰＧＥシンターゼタンパク質の誘導を示す。図１５Ｂは、シクロオキシゲナーゼ−２の対応発現プロフィールを示す。
【０３０３】
ウエスタンブロットからの結果とＰＧＥシンターゼ活性との間の可能性のある関係を研究するために、対応するミクロソームを、ＰＧＨ２および還元グルタチオンの存在下で上記のようにインキュベートした。簡単に言うと、ミクロソーム（０．０３ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＧＨ２（１１μＭ）と共に０℃にて３０秒間インキュベートし、その後抽出してＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。図１６において、ＩＬ−１βで処理されたＡ５４９細胞からのミクロソーム中のＰＧＥシンターゼ活性は、未処理の細胞（コントロール）と比較して、ある時間の間に増加を示した。さらに、いかなる対応する活性もサイトゾル画分中で検出されなかった。
【０３０４】
従って、当業者は、この結果が、ＣＯＸ−２およびＰＧＥシンターゼタンパク質のタンデムなアップレギュレーションを示すこと、およびミクロソームＰＧＥシンターゼ活性がＰＧＥシンターゼタンパク質の誘導に関連することを認識する。
【０３０５】
（等価物）
当業者は、ただ慣習的な実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するかまたは確認し得る。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】図１は、ＭＡＰＥＧメンバー（太字）およびエイコサノイド（ｅｉｃｏｓｉｎｏｉｄ）代謝におけるそれらの役割を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例において用いたＨｉｓ６−ＰＧＥＳのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列からなる、ＰＧＥＳのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの好ましい実施形態を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ（シート１〜４）は、Ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳをコードする図２Ｂのヌクレオチド配列を含む、ベクターｈ６ｐＳＰ１９Ｔ７ＬＴｈＰＧＥＳのヌクレオチド配列からなる本発明のヌクレオチド配列を含むベクターの好ましい実施形態を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に懸濁され、そして４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で可溶化した、組換えＰＧＥＳを発現する細菌由来の膜調製物のウェスタンブロットを表す。この膜懸濁物を氷上で３０分間可溶化し、そして不溶性粒子を超遠心分離によって除去した。サンプルを、この図に示した量で、ゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングに供した。非可溶化サンプルを、示したように、不溶性物質の除去の前および後に、ＰＧＥＳの抽出の程度を評価するために、可溶化サンプルと比較した。
【図３】図３は、異なる緩衝液組成物中で可溶化した組換えＰＧＥＳを発現する細菌膜画分におけるＰＧＥＳ活性を、この反応に含まれる膜タンパク質の量と比較して示すグラフである。膜を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（黒丸）、緩衝液＋１０％グリセロール（白丸）、緩衝液＋１ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（黒三角）および緩衝液＋１ｍＭ  ＧＳＨ＋１０％グリセロール（白三角）からなる緩衝液中で、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって可溶化した。
【図４】図４は、１ｍＭ  ＧＳＨおよび１０％グリセロールの存在下で４℃で保存した、可溶化細菌膜中のＰＧＥＳ活性の経時的安定性を示す。組換えＰＧＥＳを発現する細菌由来の膜画分を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＧＳＨ、１０％グリセロール中で４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって可溶化し、そして４℃で保存した。サンプルを示した時点で取り出し、そしてＰＧＥＳ活性を、この反応物中の０．２５ｍｇ／ｍｌの膜タンパク質を用いてアッセイした。
【図５Ａ】図５Ａは、ｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳのＮｉアフィニティー精製物からのクロマトグラムである。Ｎｉアフィニティー精製物を、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出させた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、可溶化した細菌膜抽出物由来のＰＧＥＳの精製物を用いた実験由来のタンパク質サンプルを用いて銀染色した１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。組換えヒスチジンタグ化ＰＧＥＳを発現する細菌由来の膜画分を可溶化し、そしてＰＧＥＳを上記の実施例３に記載の通りに精製した。レーン１：分子量マーカー（下から：９．０、１６．２、２１．８、２７．７、３９．８、５２．８および６４．９ｋＤａ）、レーン２：ポジティブコントロールである、先の実験からの、精製されたＰＧＥＳ（０．１２５μｇ）、レーン３：第一のＮｉ−カラムから６０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（１０μｌ）、レーン４：第一のＮｉ−カラムから３００ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．１９μｇ）、レーン５：第二のＮｉ−カラムから３００ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．１３μｇ）、レーン６：第二のＮｉ−カラムから３００ｍＭイミダゾールを用いて溶出され、ＰＤ１０カラムにて脱塩されたタンパク質ピーク（０．１４μｇ）。
【図６】図６は、定量的ウェスタンブロットを示す。ここで、示した量の精製ＰＧＥＳを、細菌膜中のＰＧＥＳ含量の定量のための標準曲線としてブロットした。バンド強度を、デンシトメトリーによって決定し、そしてその増加は、２０ｎｇの精製ＰＧＥＳまで線形であった。
【図７】図７は、精製ＰＧＥＳの酵素活性および異なる条件下での保存の影響を示す。この実験の目的は、精製ＰＧＥＳの安定性および保存可能性を調査することであった。示した濃度における精製ＰＧＥＳを、１０μＭ  ＰＧＨ２および２．５ｍＭ  ＧＳＨと共に０℃にてインキュベートし、そしてＰＧＥ２の酵素形成を上記の実施例２に記載の通りに分析した。新鮮に精製したＰＧＥＳ（白三角）、４℃にて５日間保存したタンパク質（黒丸）、−２０℃で凍結保存し、そして実験前に融解した（白丸）、および対応する量の非可溶化ＰＧＥＳ（黒三角）（定量的ウェスタンブロットによって決定したところ、０．５６％の組換えＰＧＥＳを含む細菌膜画分）を用いて反応を実施した。
【図８】図８は、細菌の細胞全体の溶解物からの、ＰＧＥＳの精製物を用いた実験由来のタンパク質サンプルを用いた、銀染色した１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。細胞全体溶解物を、組換えヒスチジンタグ化ＰＧＥＳを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌から調製した。この溶解物を可溶化し、そしてＰＧＥＳを上記の実施例７に記載の通りに精製した。レーン１：分子量マーカー（下から：９．０、１６．２、２１．８、２７．７、３９．８、５２．８および６４．９ｋＤａ）。レーン２：可溶化した細胞全体抽出物（０．１μｌ）、レーン３：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程由来の未結合画分（０．１μｌ）、レーン４：Ｎｉ−カラム由来の素通り画分（０．２μｌ）、レーン５：Ｎｉ−カラムから６０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．２μｌ）、レーン６：Ｎｉ−カラムから３００ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．１６μｇ）、レーン７：Ｎｉ−カラムから５００ｍＭイミダゾールを用いてタンパク質ピーク（０．２μｇ）、レーン８：ポジティブコントロールである、先の実験からの、精製されたＰＧＥＳ（０．１２５μｇ）。
【図９】図９は、細菌の細胞全体溶解物からの精製スケールアップ試験からのタンパク質サンプルを用いて銀染色された１５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。実施例７および図８において記載されたよりも５倍多い材料からなる細胞全体溶解物を、組換えヒスチジンタグ化ＰＧＥＳを発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌（５ｌ培養物）から調製した。この溶解物を可溶化し、そしてＰＧＥＳを、上記の実施例８に記載した通りに、５倍大きなカラムサイズを用いて精製した。レーン１：分子量マーカー（下から：９．３、１３．１、１９．２、２４．７、３６．４、４９．０および６１．３ｋＤａ）。レーン２：ポジティブコントロールである、先の実験から精製されたＰＧＥＳ（０．１２５μｇ）、レーン３：第一の、より大きな（５ｍｌ）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．４μｇ）、レーン４：第二の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．２μｇ）、レーン５：第三の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（０．２１μｇ）、レーン６：第四の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムからの素通り画分（０．１μｌ）、レーン７：第四のＮｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出したタンパク質ピーク（０．２μｇ）。
【図１０】図１０は、実施例８に記載される精製スケールアップ試験からのタンパク質ピークの、そして図９に示す通りに銀染色されたウェスタンブロットである。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、そしてＰＧＥＳを実施例１に記載の通りに免疫検出した。レーン１：分子量マーカー（下から：１３．１、１９．２、２４．７、３６．４、４９．０および６１．３ｋＤａ）。レーン２：ポジティブコントロールである、先の実験からの、精製されたＰＧＥＳ（５０ｎｇ）、レーン３：可溶化した細胞全体の溶解物（１０μｇ）、レーン４：第一の、より大きな（５ｍｌの）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（５０ｎｇ）、レーン５：第二の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（５０ｎｇ）、レーン６：第三の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（５０ｎｇ）、レーン７：第四の（１ｍｌサイズの）Ｎｉ−カラムからの素通り画分（０．０５μｌ）、レーン８：第四のＮｉ−カラムから、３５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出されたタンパク質ピーク（５０ｎｇ）、レーン９：第一のＮｉ−カラムからの素通り画分（０．１μｌ）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、０℃にて、２．５ｍＭ  ＧＳＨおよび種々のＰＧＨ２濃度の存在下で、１μｇ／ｍｌの精製したＰＧＥＳを用いて決定したＶ対［ｓ］曲線を示す。ＰＧＨ２についてのＫｍは、５０±８．９μＭであると決定され、Ｖｍａｘは０．２５±０．０１３μＭ  ｓ−１であった。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、３７℃にて、２．５ｍＭ  ＧＳＨおよび種々のＰＧＨ２濃度の存在下で、１μｇ／ｍｌの精製したＰＧＥＳを用いて決定されたＶ対［ｓ］曲線を示す。ＰＧＨ２についてのＫｍは、３７℃にて１６３±４２μＭであると決定され、そしてＶｍａｘは３７℃にて１．３９±０．１６μＭ  ｓ−１であった。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、３７℃にて、２．５ｍＭ  ＧＳＨおよび種々のＰＧＧ２濃度の存在下で、１μｇ／ｍｌの精製したＰＧＥＳを用いて決定したＶ対［ｓ］曲線を示す。
【図１２】図１２は、３７℃での２．５ｍＭ  ＧＳＨの存在下での、１０μＭ  ＰＧＧ２とのインキュベーション後の、精製したＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳ（２０ｎｇ）および緩衝液コントロールによる、１９５ｎｍでの１５−ＨＰ  ＰＧＥ２シンターゼ活性のクロマトグラムを示す。図１２Ａは、既知のプロスタグランジンをコントロールとして含む例示的なクロマトグラムを示す。図１２Ｂは、３０秒間のインキュベーション後の、精製されたＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む反応混合物の産物を示す。図１２Ｃは、３０秒間のインキュベーション後の緩衝液コントロールを含む反応混合物の産物を示す。図１２Ｄは、１０分間のインキュベーション後の、精製されたＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む反応混合物の産物を示す。図１２Ｅは、１０分間のインキュベーション後の緩衝液コントロールを含む反応混合物の産物を示す。図１２Ｆは、１０μＭ  ＰＧＧ２の存在下であるが、ＧＳＨの不存在下での、３０秒間のインキュベーション後のＨｉｓ６−ｈＰＧＥＳを含む反応混合物の産物を示す。
【図１３】図１３は、１８個の未染色結晶領域から合わされたデータセットから算出されたｈｉｓ６−ｈＰＧＥＳの射影図を示す。見出された単位格子の１つについて、ａ軸およびｂ軸に沿ったすべり線およびｐｇｇ突出対称の２倍の回転が示された。膜平面に対して反対方向にあるこのタンパク質の２つのトリマーに対応する２つのタンパク質単位が取り囲まれている。
【図１４Ａ】図１４Ａは、スクロース勾配遠心分離（５〜２０％スクロース）によるＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ複合体の沈降係数の決定を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体の平衡密度勾配遠心分離を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｘ−３００  ＨＲからのＰＧＥＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００複合体およびマーカー酵素の溶出を表す。１ｍｌの画分を、ＰＧＥＳ活性についてアッセイした。２８０ｎｍでの吸光度を、平坦な線によって実証されるように、連続的にモニタリングした。
【図１５】図１５は、上記の実施例１３に記載のように、ＩＬ−１βなしまたはＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、示した時間にわたって培養したＡ５４９細胞のミクロソーム画分におけるＰＧＥＳ（図１２Ａ）およびＣＯＸ−２（図１２Ｂ）の発現のウェスタンブロット分析である。
【図１６】図１６は、ＰＧＥＳ酵素活性の好ましい実施形態を示す。図１６は、ＩＬ−１βなしまたはＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、示した時間にわたって培養したＡ５４９細胞から単離したミクロソームにおけるＰＧＥＳ酵素活性の時間経過である。黒いバーは、組換えＰＧＥＳを発現する細菌由来の膜において測定された対応するＰＧＥ２形成を示す。灰色のバーは、この緩衝液における非酵素的ＰＧＥ２形成を示す。詳細を実施例１３に記載する。
【配列表】
2005526483.tif 000007
2005526483.tif 000008
2005526483.tif 000009
【図１】
2005526483.tif 000010
【図２Ａ】
2005526483.tif 000011
【図２Ｂ（１）】
2005526483.tif 000012
【図２Ｂ（２）】
2005526483.tif 000013
【図２Ｂ（３）】
2005526483.tif 000014
【図２Ｂ（４）】
2005526483.tif 000015
【図２Ｃ】
2005526483.tif 000016
【図３】
2005526483.tif 000017
【図４】
2005526483.tif 000018
【図５Ａ】
2005526483.tif 000019
【図５Ｂ】
2005526483.tif 000020
【図６】
2005526483.tif 000021
【図７】
2005526483.tif 000022
【図８】
2005526483.tif 000023
【図９】
2005526483.tif 000024
【図１０】
2005526483.tif 000025
【図１１】
2005526483.tif 000026
2005526483.tif 000027
【図１１Ｃ】
2005526483.tif 000028
【図１２】
2005526483.tif 000029
【図１３】
2005526483.tif 000030
【図１４】
2005526483.tif 000031
【図１５】
2005526483.tif 000032
【図１６】
2005526483.tif 000033
【国際調査報告】
2005526483.tif 000034
2005526483.tif 000035