(57)【要約】植物害虫を駆除するための組成物及び方法が開示される。具体的には、コーン・ルートワームに対する毒性が高められた修飾Cry3A毒素をコードする新規の核酸配列が提供される。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位、例えばカテプシンGを、Cry3A毒素の少なくとも1つの位置に挿入することによって、特にウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する毒性が有意に高められた修飾Cry3A毒素が構成される。さらに、修飾Cry3A毒素を形成する方法、及び、例えば昆虫駆除のために微生物中で、又は昆虫による損害に対する保護のためにトランスジェニック植物中で、修飾Cry3A核酸配列を使用する方法、及び、修飾Cry3A毒素及び修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法であって、例えば、修飾Cry3A毒素又は組成物又は配合物を、昆虫が蔓延する領域に使用する方法、或いは、昆虫に対して鋭敏な領域又は植物を予防的に処理することにより害虫に対して保護するために、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置；
b)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置；及び、
c)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワーム(western corn rootworm)の消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に配置されている、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記付加的なプロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項９に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項１６に記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１９】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項１８に記載の単離された核酸分子。
【請求項２０】
前記Cry3A毒素がウェスタン・コーン・ルートワームに最大30%の死亡率をもたらすのに対して、前記修飾Cry3A毒素が該ウェスタン・コーン・ルートワームに最小50%の死亡率をもたらす、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２３】
前記修飾Cry3A毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項２４】
キメラ構造体であって、請求項１に記載の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列を含むことを特徴とする、キメラ構造体。
【請求項２５】
組換えベクターであって、請求項２４に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項２６】
トランスジェニック非ヒト宿主細胞であって、請求項２４に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト宿主細胞。
【請求項２７】
細菌細胞である、請求項２６に記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項２８】
植物細胞である、請求項２６に記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項２９】
トランスジェニック植物であって、請求項２８に記載のトランスジェニック植物細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項３０】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項２９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３１】
トランスジェニック種子であって、請求項２９に記載のトランスジェニック植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項３２】
トランスジェニック種子であって、請求項３０に記載のトウモロコシ植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項３３】
単離された毒素であって、請求項１に記載の核酸分子の発現によって生成されることを特徴とする、単離された毒素。
【請求項３４】
前記毒素が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む核酸分子の発現によって生成される、請求項３３に記載の単離された毒素。
【請求項３５】
前記毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項３３に記載の単離された毒素。
【請求項３６】
前記毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の単離された毒素。
【請求項３７】
組成物であって、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるのに効果的な量の請求項３３に記載の毒素を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３８】
修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置；
b)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置；及び、
c)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして前記トランスジェニック植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるレベルで、根組織内に前記修飾Cry3A毒素を発現させることを特徴とする、トランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項３９】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４０】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４１】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４２】
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４３】
前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:19に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４４】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに100%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４５】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに90%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４６】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに80%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４７】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに70%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４８】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに60%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項４９】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに50%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５０】
前記根組織が、ウェスタン・コーン・ルートワームに40%の死亡率をもたらす、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５１】
前記トランスジェニック・トウモロコシ植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームが該トランスジェニック植物の根を大幅に取り除くのを防止するのに十分なレベルで、前記修飾Cry3A毒素を発現させる、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５２】
前記トランスジェニック・トウモロコシ植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームの摂食損害により該植物が倒伏するのを防止するのに十分なレベルで、前記修飾Cry3A毒素を発現させる、請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５３】
同系繁殖植物である、請求項３８から５２までのいずれか１項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５４】
雑種植物である、請求項３８から５２までのいずれか１項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項５５】
トランスジェニック種子であって、請求項５３に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項５６】
トランスジェニック種子であって、請求項５４に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項５７】
非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含む修飾Cry3A毒素であって、前記プロテアーゼ認識部位がCry3A毒素を修飾し、そして、
a)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置；
b)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置；及び、
c)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置
から成る群から選択された位置に配置されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、修飾Cry3A毒素。
【請求項５８】
前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項５９】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６０】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６１】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に配置されている、請求項６０に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６２】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６３】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に配置されている、請求項６２に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６４】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６５】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６６】
前記付加的なプロテアーゼ部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項６５に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６７】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６８】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項６７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項６９】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７０】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７１】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項７０に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７２】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７３】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に配置されている、請求項７２に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７４】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111とに対応するアミノ酸の間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541とに対応するアミノ酸の間に配置されている、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７５】
前記プロテアーゼ認識部位が、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間、及び、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に配置されている、請求項７４に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７６】
前記Cry3A毒素がウェスタン・コーン・ルートワームに最大30%の死亡率をもたらすのに対して、前記修飾Cry3A毒素が該ウェスタン・コーン・ルートワームに最小50%の死亡率をもたらす、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７７】
SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818によってコードされる、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７８】
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項７９】
ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項５７に記載の修飾Cry3A毒素。
【請求項８０】
ウェスタン・コーン・ルートワームがトウモロコシ植物にはびこるのを抑止する方法であって、
(a)  請求項３８に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物を準備し；そして
(b)  該植物に前記ウェスタン・コーン・ルートワームを接触させる
ことを含むことを特徴とする、ウェスタン・コーン・ルートワームがトウモロコシ植物にはびこるのを抑止する方法。
【請求項８１】
修飾Cry3A毒素の生成方法であって：
(a)  請求項２７に記載のトランスジェニック宿主細胞を獲得し；
(b)  該修飾Cry3A毒素の発現を可能にする条件下でトランスジェニック宿主細胞を培養し；そして
(c)  発現された修飾Cry3A毒素を回収する
ことを含むことを特徴とする、修飾Cry3A毒素の生成方法。
【請求項８２】
昆虫抵抗性植物の生成方法であって：
(a)  植物細胞のゲノム中に、請求項１に記載の核酸分子を安定的に組込み；そして
(b)  前記形質転換植物細胞から、安定的に形質転換された植物を再生し、前記安定的に形質転換された植物が有効量の修飾Cry3A毒素を発現させ、これにより前記形質転換植物が少なくともウェスタン・コーン・ルートワームに対して抵抗性を有するようにする
ことを含むことを特徴とする、昆虫抵抗性植物の生成方法。
【請求項８３】
少なくともウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する方法であって、請求項３３に記載の有効量の毒素をウェスタン・コーン・ルートワームに経口送達することを含むことを特徴とする、少なくともウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する方法。
【請求項８４】
修飾Cry3A毒素の形成方法であって：
(a)  Cry3A毒素をコードするCry3A遺伝子を獲得し；
(b)  ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼを同定し；
(c)  前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し；
(d)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間の位置、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸の間及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸の間の位置で、前記認識部位が前記Cry3A毒素中に配置されるように、前記ヌクレオチド配列を前記Cry3A遺伝子中に挿入し、これにより修飾Cry3A遺伝子を作成し；
(e)  前記修飾Cry3A遺伝子を発現カセット中に挿入し；そして
(f)  前記発現カセットを、修飾Cry3A毒素を生成する非ヒト宿主細胞中に形質転換する
ことを含むことを特徴とする、修飾Cry3A毒素の形成方法。
【請求項８５】
修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記修飾Cry3A遺伝子が前記プロテアーゼ認識部位をコードするコーディング配列を含み、前記コーティング配列がCry3A遺伝子を修飾し、そして、
a)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置；
b)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置；及び、
c)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間、及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置
から成る群から選択された位置に挿入されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして人工食餌バイオアッセイで、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされるウェスタン・コーン・ルートワームの死亡率よりも高い死亡率をウェスタン・コーン・ルートワームにもたらすことを特徴とする、修飾Cry3A遺伝子。
【請求項８６】
前記消化管プロテアーゼがカテプシンGである、請求項８５に記載の修飾Cry3A遺伝子。
【請求項８７】
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む、請求項８５に記載の修飾Cry3A遺伝子。
【請求項８８】
前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む、請求項８５に記載の修飾Cry3A遺伝子。
【請求項８９】
前記修飾Cry3A毒素が、ノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である、請求項８５に記載の修飾Cry3A遺伝子。
【請求項９０】
キメラ構造体であって、請求項８５に記載の修飾Cry3A遺伝子に作用連関された異種プロモーター配列を含むことを特徴とする、キメラ構造体。
【請求項９１】
組換えベクターであって、請求項９０に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項９２】
トランスジェニック非ヒト宿主細胞であって、請求項９０に記載のキメラ構造体を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト宿主細胞。
【請求項９３】
細菌細胞である、請求項９２に記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項９４】
植物細胞である、請求項９２に記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項９５】
トランスジェニック植物であって、請求項９４に記載のトランスジェニック植物細胞を含むことを特徴とする、トランスジェニック植物。
【請求項９６】
前記植物がトウモロコシ植物である、請求項９５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項９７】
トランスジェニック種子であって、請求項９５に記載のトランスジェニック植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項９８】
トランスジェニック種子であって、請求項９６に記載のトウモロコシ植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項９９】
修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物であって、該修飾Cry3A毒素が、非天然発生型プロテアーゼ認識部位を含み、前記修飾Cry3A遺伝子が前記プロテアーゼ認識部位をコードするコーディング配列を含み、前記コーティング配列がCry3A遺伝子を修飾し、そして、
a)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置；
b)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置；及び、
c)  SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間；及びSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542とに対応するアミノ酸をコードするコドンの間の位置
から成る群から選択された位置に挿入されており、
前記プロテアーゼ認識部位が、ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管プロテアーゼによって認識可能であり、そして前記トランスジェニック植物が、ウェスタン・コーン・ルートワームを死亡させるレベルで、根組織内に前記修飾Cry3A毒素を発現させることを特徴とする、トランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項１００】
前記ヌクレオチド配列が、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791を含む、請求項９９に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項１０１】
前記修飾Cry3A毒素が、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、又はSEQ ID NO:19に示されたアミノ酸配列を含む、請求項９９に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項１０２】
同系繁殖植物である、請求項９９から１０１までのいずれか１項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項１０３】
雑種植物である、請求項９９から１０１までのいずれか１項に記載のトランスジェニック・トウモロコシ植物。
【請求項１０４】
トランスジェニック種子であって、請求項１０２に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【請求項１０５】
トランスジェニック種子であって、請求項１０３に記載の植物に由来することを特徴とする、トランスジェニック種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質工学、植物分子生物学及び害虫駆除の分野に関する。より具体的には、本発明は新規の修飾Cry3A毒素、及び、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす核酸配列に関し、また、修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列の形成方法、及び、昆虫を駆除するために修飾Cry3A毒素及び対応する核酸配列を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーン・ルートワーム(corn rootworm)種は、最も破壊的なトウモロコシ害虫であると考えられている。米国内で、3つの重要な種は、Diabrotica virgifera virgifera(ウェスタン・コーン・ルートワーム)、D. longicornis barberi(ノーザン・コーン・ルートワーム)及びD. undecimpunctata howardi(サザン・コーン・ルートワーム)である。米国トウモロコシ地帯において一次害虫と考えられるのは、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームだけである。コーン・ルートワームの幼虫はほとんど専らトウモロコシの根を食べることにより、最も大きな植物損害を引き起こす。このような損傷は、植物の倒伏量を増大させ、穀物収穫高及び植物収穫高を低減し、また、穀物の栄養含有率を変化させる。幼虫による摂食はまた、根腐れ病及び茎腐れ病を招く細菌及び真菌感染のために根を通して道を開くことによって、トウモロコシに間接的な影響を与える。成熟したコーン・ルートワームは晩夏にトウモロコシ畑で活動し、穂、毛及び花粉を食べ、正常な受粉を妨げる。
【０００３】
コーン・ルートワームは主に化学農薬の集中的な使用により駆除される。化学農薬は、昆虫の成長の阻害、昆虫の摂食又は繁殖の予防を通して活性であるか、又は昆虫を死に至らしめる。従ってコーン・ルートワームを良好に駆除することはできるが、しかしこれらの化学物質は他の有益な有機体に影響を与えることもある。化学農薬を広く使用することに起因する別の問題は、耐性の昆虫品種の出現である。さらに別の問題は、コーン・ルートワームの幼虫が地中で摂食し、従って殺虫剤の救援処理を適用することが難しくなるという事実による。従って殆どの殺虫剤は、植え付け時に予防的に使用される。このような方法は結果として環境の大きな負荷となる。このような負荷は種々の農場管理方法によって部分的に緩和されてはいるが、しかし代わりとなる害虫駆除メカニズムがますます必要になっている。
【０００４】
生物学的な害虫駆除剤、例えばδ-エンドトキシンのような殺虫性毒素を発現させるBacillus thuringiensis(Bt)菌株も作物に使用されており、主に鱗翅目の害虫に対して申し分のない結果をもたらしている。δ-エンドトキシンは、或る特定の昆虫による摂取時に殺虫活性を有することが知られている、結晶マトリックス内に保持されたタンパク質である。種々のδ-エンドトキシンは、活性スペクトル及び配列相同性に応じて分類されている。1990年以前には、主要なクラスは、これらの活性スペクトルによって、鱗翅目(蛾及び蝶)に対して活性のCry1タンパク質、鱗翅目及び双翅目(蝿及び蚊)の両方に対して活性のCry2タンパク質、鞘翅目(甲虫)に対して活性のCry3タンパク質、及び双翅目に対して活性のCry4タンパク質と定義された(Hofte及びWhitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255)。最近は、昆虫の標的特異性ではなくアミノ酸配列相同性に基づいて、Cryタンパク質を系統的に分類する新しい命名法が開発された(Crickmore他、1998、Microbiol. Molec. Biol. Rev.62:807-813)。
【０００５】
Btに由来する個々のδ-エンドトキシンの殺虫活性スペクトルは極めて狭く、所与のδ-エンドトキシンは所定の系列内の数種に対してしか活性ではない。例えば、Cry3Aタンパク質は、コロラドハムシ(Lapinotarsa decemlineata)に対して極めて毒性であるが、しかしDiabrotica属における関連甲虫に対する毒性はきわめて低いか又は全くない(Johnson他、1993、J. Econ. Entomol. 86:330-333)。Slaney他(1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18)によれば、Cry3Aタンパク質のサザン・コーン・ルートワームに対する毒性は、コロラドハムシに対する毒性の2000分の1以下である。Cry3Aのウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性はほとんど又は全くないことも知られている。
【０００６】
δ-エンドトキシンの特異性は、活性毒素タンパク質を生成するのに関与する種々のステップ、及び、昆虫の中腸内の上皮細胞とのその後の相互作用の効率の結果である。殺虫活性を発揮するために、殆どの既知のδ-エンドトキシンは先ず昆虫によって摂取され、そして活性毒素を形成するためにタンパク質分解により活性化されなければならない。殺虫性結晶タンパク質の活性化は、多段プロセスである。摂取後、結晶は昆虫消化管内でまず可溶化されなければならない。可溶化されると、δ-エンドトキシンは特異的なタンパク質分解によって活性化される。昆虫消化管内のプロテアーゼは、δ-エンドトキシンがどこでプロセッシングされるかを決定することにより、特異性の役割を果たすことができる。δ-エンドトキシンは可溶化されプロセッシングされると、昆虫の中腸上皮の表面上の特異的な受容体に結合し、続いて刷子縁膜の脂質二重層内に組込まれる。次いでイオンチャネルが形成され、中腸の正常な機能を乱し、最終的には昆虫を死に至らしめる。
【０００７】
鱗翅目において、消化管プロテアーゼはδ-エンドトキシンをプロセッシングして、130-140kDaのプロトキシンをほぼ60-70kDaの毒性タンパク質にする。プロトキシンから毒素へのプロセッシングは、N末端アミノ酸及びC末端アミノ酸の双方を除去することにより進められることが報告されている。この場合正確なプロセッシング位置は、関与する特異的な昆虫消化管液に依存する(Ogiwara他、1992、J.Invert. Pathol. 60:121-126)。δ-エンドトキシンのタンパク質分解活性化は、その特異性を決定する上で有意な役割を演じることができる。例えばIC1と呼ばれる、Bt var. aizawaに由来するδ-エンドトキシンは、他の既知のCry1 Abタンパク質との配列相同性に基づいて、Cry1Abタンパク質として分類されている。Cry1 Abタンパク質は典型的には鱗翅目の昆虫に対して活性である。しかし、IC1タンパク質は、これがどのようにプロセッシングされるか如何では鱗翅目及び双翅目の昆虫の双方に対して活性を有する(Haider他、1986、Euro. J. Biochem. 156:531-540)。双翅目の消化管においては、53kDaの活性IC1毒素が得られるのに対して、鱗翅目の消化管においては、55kDaの活性1C1毒素が得られる。1C1は、4つのアミノ酸によってだけしか、正基準標本HD-1 Cry1Abタンパク質とは異ならないので、受容体結合部位の全体的な変化が活性の差異の原因になるとは考えられない。2つの異なる昆虫消化管におけるタンパク質分解の差異は、活性化された分子が異なる状態に折り畳まれ、ひいては異なる受容体と結合可能な異なる領域を暴露することを可能にすると考えられる。従って特異性は、異なる昆虫の消化管プロテアーゼと共に存在すると考えられる。
【０００８】
鞘翅目昆虫は、中性寄りの酸性である消化管を有しており、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンは、活性化された鱗翅目特異的毒素のサイズと類似している。従って、鞘翅目特異的δ-エンドトキシンのプロセッシングは、かつては毒性には不要と考えられていた。しかし、最近のデータが示唆するところによれば、鞘翅目活性δ-エンドトキシンは可溶化されタンパク質分解されて、より小さな毒性ポリペプチドにされる。B. thuringiensis var. tenebrionisによって生成される73kDaのCry3Aδ-エンドトキシンタンパク質は、N-末端において細菌中で容易にプロセッシングされ、結晶形成中又は結晶形成後に49-57残基を失い、これにより一般には単離された67kDa形を生成する(Carroll他、1989, Biochem. J. 261:99-105)。またMcPherson他、1988(Biotechnology 6:61-66)によって実証されたように、天然型Cry3A遺伝子は、2つの機能性翻訳開始コドンを同じリーディング・フレーム内に含有し、その一方は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2参照)のMet-1で始まる73kDaタンパク質をコードし、他方は、Met-48で始まる67kDaタンパク質をコードする。この場合、両タンパク質は天然発生型全長Cry3Aタンパク質と考えることができる。可溶性の67kDA Cry3Aタンパク質をトリプシン又は昆虫消化管抽出物で処理すると、演繹アミノ酸配列のAsn-159をN末端に有する55kDaの開裂生成物が得られる。このポリペプチドは、天然型67kDA Cry3A毒素と同じ毒性を、鋭敏な鞘翅目昆虫に対して有することが見出された(Carroll他、同書)。従って、天然型Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間には天然型トリプシン認識部位が存在する。Cry3Aはキモトリプシンによって開裂することもでき、その結果49、11及び6kDaの3つのポリペプチドが生じる。49kDa成分及び6kDa成分のN末端分析は、最初のアミノ酸残基がそれぞれSer-162及びTyr-588であることを示した(Carroll他、1997、J. Invert. Biol. 70:41-49)。従って、天然型キモトリプシン認識部位は、演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間、及びTyr-587とTyr-588との間でCry3A中に存在する。49kDaキモトリプシン生成物は、天然型67kDAタンパク質又は55kDaトリプシン生成物よりも中性pHでより高い可溶性を有すると考えられ、Cry3Aに対して鋭敏な昆虫、コロラドハムシ及びマスタード・ビートル(Phaedon cochleariae)に対する完全な殺虫活性を維持する。昆虫消化管プロテアーゼは典型的には、昆虫が食餌性タンパク質から必須アミノ酸を得るのを助ける機能を果たす。最も良く理解される昆虫消化プロテアーゼは、特に鱗翅目種において最も一般的と考えられるセリン・プロテアーゼである(Englemann及びGeraerts, 1980, J. Insect Physiol. 261:703-710)。鞘翅目の幼虫及び成虫の大部分、例えばコロラドハムシは、弱酸性の中腸を有しており、システイン・プロテアーゼが主要な蛋白質分解作用を提供する(Wolfson及びMudock, 1990, J.Chem.Ecol.16:1089-1102)。より正確には、Thie及びHouseman(1990, Insect Biochem. 20:313-318)が、コロラドハムシにおいてシステイン・プロテアーゼ、カテプシンB及びH、並びにアスパルチル・プロテアーゼ、カテプシンDを同定して特徴付けした。Gillikin他(1992, Arch. Insect Biochem. Physiol. 19:285-298)はウェスタン・コーン・ルートワーム幼虫の消化管内のタンパク質分解作用を特徴付けし、そして15個の、主としてシステイン・プロテアーゼを見出した。本発明において開示されるまで、セリン・プロテ���ーゼ、カテプシンGがウェスタン・コーン・ルートワーム中に存在することを示す報告はなかった。昆虫消化管プロテアーゼの多様性及び種々異なる活性レベルは、特にBt毒素に対する昆虫の感受性に影響を与えると云える。
【０００９】
線虫に対して活性の菌株(欧州特許出願公開第0517367号明細書)を含む、改善された又は新規の生体活性を有する新たな及び新規のBt菌株及びδ-エンドトキシンが数多く過去5年間にわたって発表されている。しかしこれらの菌株及び毒性のうち、鞘翅目の昆虫に対して活性を有するものは相対的に少ない。さらに、現在既知の鞘翅目活性δ-エンドトキシン、例えばCry3A、Cry3B、Cry3C、Cry7A、Cry8A、Cry8B及びCry8Cには、例えば微生物又はトランスジェニック植物を通して送達された場合に、適切な畑管理を可能にするのに十分な、コーン・ルートワームに対する経口毒性を有するものはない。従って、コーン・ルートワームに対して活性の新規毒性を生成するための他のアプローチを究明する必要がある。
【００１０】
δ-エンドトキシンがどのように機能するかに関する知識が増えるのに伴って、新しい活性を有するようにδ-エンドトキシンを遺伝子工学的に改変しようという試みが多くなっている。1991年にCry3Aの三次元構造が解明されたことにより(Li他、1991, Nature 353:815-821)、δ-エンドトキシンの改変は一層可能になった。タンパク質は3つの構造ドメインを有している。すなわち、残基1-290から成るN末端ドメインIは、7つのα螺旋から形成され、残基291-500から成るドメインIIは、3つのβシートを含有し、残基501-644から成るC末端ドメインIIIはβサンドイッチである。このような構造に基づき、δ-エンドトキシンの構造と機能との関係に関して、仮説が成り立っている。ドメインIは主に昆虫消化管膜内の孔形成に寄与し(Gazit及びShai, 1993, Appl. Environ. Microbiol. 57:2816-2820)、ドメインIIは主に消化管受容体との相互作用に寄与し(Ge他、1991、J. Biol. Chem. 32:3429-3436)、及びドメインIIIは、おそらくタンパク質安定性(Li他、1991、前掲書)と関連し、またイオンチャネル活性に対して調節上の影響を与える(Chen他、1993, PNAS 90:9041-9045)と、一般には考えられている。
【００１１】
特異的活性を改善しようという目的、或いは、殺虫活性スペクトルを広げようという目的で、鱗翅目活性δ-エンドトキシンが遺伝子工学的に作成されている。例えば、Cry1Aaに由来するコイコガ(Bombyx mori)特異性ドメインをCry1Acに移し、こうして、結果として生じたキメラタンパク質に新しい殺虫活性を付与した(Ge他、1989、PNAS 86:4037-4041)。また、1998年にBosch他(米国特許第5,736,131号)は、Cry1EのドメインIIIをCry1CのドメインIIIと置換し、こうしてより広い鱗翅目活性スペクトルを有するCry1E-Cry1Cハイブリッド毒素を生成することにより、新しい鱗翅目活性毒素を作成した。
【００１２】
鞘翅目活性δ-エンドトキシンを遺伝子工学的に作成しようという幾つかの試みが報告されている。Van Rie他,1997(米国特許第5,659,123号明細書)は、溶媒接触可能性において重要であると考えられるドメインII内のアミノ酸をアミノ酸アラニンとランダムに置換することにより、Cry3Aを作成した。受容体結合ドメインIIに限定されたこれらのランダム置換のうちのいくつかは、報告によれば、ウェスタン・コーン・ルートワーム毒性の増大に関与する。しかし、その他の報告では、Cry3AのドメインIIにおける幾つかのアラニン置換が、受容体結合の分裂又は構造的な不安定性を招くことが示されている(Wu及びDean, 1996, J. Mol. Biol. 255:628-640)。English他が1999年に(国際公開第99/31248号パンフレット)報告したCry3Bb中のアミノ酸置換は、サザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対する毒性を増大させる。しかし、報告された35種のCry3Bb突然変異体のうち、主としてドメインII及びドメインII-ドメインI界面における3つの突然変異体しか、ウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性ではなかった。さらに、同じアッセイにおけるウェスタン・コーン・ルートワームに対する野生型Cry3Bbの毒性の差異は、突然変異型Cry3Bb毒素と野生型Cry3Bb毒素との間の差異のうちのいずれよりも大きい。従ってCry3Bb突然変異体の毒性の改善形は、主としてサザン・コーン・ルートワームに限定されると考えられる。
【００１３】
農業従事者に経済的な利益を提供し、環境的に許容可能である新しく効果的な害虫駆除剤を構成することが依然として必要である。具体的に必要なのは、既存の昆虫駆除剤に対して耐性の、又は耐性と成り得る米国内の主要な害虫であるウェスタン・コーン・ルートワームを駆除する修飾Cry3A毒素である。さらに、使用しても環境に負荷を最小限にしか加えない、トランスジェニック植物を介して使用されるような作用物質が望ましい。
【発明の開示】
【００１４】
これらの必要性から、本発明の目的は、コーン・ルートワームに対する毒性が高められた修飾Cry3A毒素をコードする新規の核酸配列を提供することである。本発明により、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を、Cry3A毒素の1つ以上の位置に挿入することにより、具体的にはサザン・コーン・ルートワーム及びウェスタン・コーン・ルートワームに対して有意に毒性が高められた修飾Cry3A毒素が構成される。本発明はさらに、核酸配列の発現から生じる新規の修飾Cry3A毒素、及び、修飾Cry3A毒素を含有する組成物及び配合物に関し、これらの修飾Cry3A毒素は、害虫の生存、成長及び繁殖の能力を阻害するか、或いは、作物に対する昆虫関連の損害又は損失を制限することができる。本発明はさらに、修飾Cry3A毒性の形成方法、及び、昆虫駆除のために微生物中で、又は昆虫による損害からの保護のためにトランスジェニック植物中で、修飾Cry3A核酸配列を使用する方法、そして、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法であって、例えば修飾Cry3A毒素又は組成物及び配合物を、昆虫が蔓延する領域に使用する方法、或いは、昆虫に対して鋭敏な領域又は植物を予防的に処理することにより害虫に対して保護するために、修飾Cry3A毒素、並びに修飾Cry3A毒素を含む組成物及び配合物を使用する方法に関する。
【００１５】
本明細書中に記載された新規の修飾Cry3A毒素は、昆虫に対して高活性である。例えば、本発明の修飾Cry3A毒素は、重要な害虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム(Diabrotica virgifera virgifera)、ノーザン・コーン・ルートワーム(D. longicornis barberi)を経済的に駆除するために使用することができる。修飾Cry3A毒素は、単独で、又は他の昆虫駆除戦略との組み合わせで使用することにより、環境に対して最小限にしか影響を及ぼさずに、最大の害虫駆除効率を与えることができる。
【００１６】
1つの観点によれば、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該修飾Cry3A毒素が、Cry3A毒素中に天然には発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率しかもたらさないのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【００１７】
この観点の1実施態様の場合、標的昆虫の消化管プロテアーゼは、セリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼから成る群から選択される。この実施態様による好ましいセリン・プロテアーゼは、カテプシンG、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼ、最も好ましくはカテプシンGを含む。
【００１８】
この観点の別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。
【００１９】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。
【００２０】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。
【００２１】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【００２２】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【００２３】
さらに別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【００２４】
1実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、修飾されていないCry3A毒素のドメインI及びドメインIIIに挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIに挿入され、天然発生型プロテアーゼ認識部位内の位置、該認識部位と置き換わる位置、又は該認識部位に隣接する位置で、ドメインIIIに挿入される。
【００２５】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【００２６】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。
【００２７】
別の実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。
【００２８】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む。
【００２９】
別の好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする。
本発明の1実施態様によれば、単離された核酸分子は、鞘翅目昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素をコードする。好ましくは、修飾Cry3A毒素は、ウェスタン・コーン・ルートワームに対する活性を有する。
【００３０】
本発明は、本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列を含むキメラ遺伝子を提供する。本発明はまた、このようなキメラ遺伝子を含む組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、このようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト宿主細胞を提供する。本発明のこの観点によるトランスジェニック宿主細胞は細菌細胞又は植物細胞、好ましくは植物細胞であってよい。本発明はさらに、このような植物細胞を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明のこのような観点によるトランスジェニック植物は、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、又はトウモロコシ、好ましくはトウモロコシであってよい。本発明はまた、サトウモロコシ、小麦、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、アブラナ属植物、綿、稲、大豆、甜菜、サトウキビ、タバコ、大麦、脂肪種子ナタネ、及びトウモロコシから成るトランスジェニック植物の群から選択された種子を提供する。特に好ましい実施態様の場合、種子はトランスジェニック・トウモロコシ植物に由来する。
【００３１】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子の発現により生成された毒素を提供する。好ましい実施態様において、毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1818、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1791を含む核酸分子の発現によって生成される。
【００３２】
別の実施態様の場合、本発明の毒素は、鞘翅目昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームに対して活性である。
【００３３】
1実施態様の場合、本発明の毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の毒素を含む組成物を提供する。
別の観点において、本発明は、昆虫に対して活性の毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し；そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の毒素を生じさせる、ことを含む方法を提供する。
【００３５】
さらに別の観点において、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を提供する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。
【００３６】
さらに別の観点において、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の毒素を昆虫に送達することを含む方法を提供する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワームである。好ましくは、毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【００３７】
本発明によりさらに提供されるのは、修飾Cry3A毒素の形成方法であって：(a)  Cry3A毒素をコードするCry3A遺伝子を獲得し；(b)  標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し；(c)  前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し；(d)  ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し；(e)  前記修飾Cry3A遺伝子を発現カセット中に挿入し；(f)  前記修飾Cry3A遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ；そして(g)  標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法である。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大約30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【００３８】
本発明はさらに昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物が、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を提供する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫性タンパク質(Vegetative Insecticidal Protein) 毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質殺虫成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【００３９】
本発明のさらに別の観点は、開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメント個体群にされた核酸分子に、本発明に基づいて突然変異を誘発する方法であって：(a)  二本鎖ランダム・フラグメントの個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、これのオリゴヌクレオチドはそれぞれ二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み；(b)  結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし；(c)  結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し；(d)  2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおいて結果として得られた混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、方法を提供することである。
【００４０】
本発明の他の観点及び利点は、本発明の以下の説明、及び本発明を限定しない実施例を検討することにより、当業者に明らかになる。
SEQ ID NO:1は、天然型Cry3Aコーディング領域である。
SEQ ID NO:2は、天然型Cry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:3は、天然型Cry3Aコーティング領域のヌクレオチド144で始まる、トウモロコシに対して最適化されたCry3Aコーティング領域である。
SEQ ID NO:4は、トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子によってコードされたCry3A毒素のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:5は、pCIB6850のヌクレオチド配列である。
SEQ ID NO:6は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A054コーディング配列である。
SEQ ID NO:7は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:8は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A055コーディング配列である。
SEQ ID NO:9は、SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:10は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A085コーディング配列である。
【００４１】
SEQ ID NO:11は、SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:12は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A082コーディング配列である。
SEQ ID NO:13は、SEQ ID NO:12のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:14は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A058コーディング配列である。
SEQ ID NO:15は、SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:16は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A057コーディング配列である。
SEQ ID NO:17は、SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:18は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A056コーディング配列である。
SEQ ID NO:19は、SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:20は、トウモロコシに対して最適化された修飾Cry3A083コーディング配列である。
【００４２】
SEQ ID NO:21は、SEQ ID NO:20のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:22-34は、本発明において有用なPCRプライマーである。
SEQ ID NO:35は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:36は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:37は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:38は、カテプシンG認識部位を含むアミノ酸配列である。
【００４３】
本明細書中に使用される特定の用語を明確にするために下記のように定義して示す：
本発明の修飾Cry3A毒素の「活性」は、修飾Cry3A毒素が経口活性の昆虫駆除剤として機能するか、毒性効果を有するか、又は昆虫の摂食を妨害又は抑制することができることを意味し、このことは昆虫の死を招いても招かなくてもよい。本発明の修飾Cry3A毒素が昆虫に送達されると、結果として昆虫は死に至らしめられるのが典型的であり、或いは、昆虫は、修飾Cry3A毒素を昆虫に利用可能にする源を食べなくなる。
【００４４】
「隣接する」という用語に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位の4つの残基以内、好ましくは3つの残基以内、より好ましくは2つの残基以内、及び最も好ましくは1つの残基以内にある場合、この付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位に「隣接」しているという。例えば、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のPro-154とArg-158との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)の演繹アミノ酸配列のArg-158とAsn-159との間に位置する天然発生型トリプシン認識部位に「隣接」している。
【００４５】
本明細書において使用される「ほぼ同じ位置」という言い方は、天然発生型プロテアーゼ認識部位に関連して、付加的なプロテアーゼ認識部位が挿入されるCry3A毒素中の場所を記述するのに使用され、この場所が天然発生型プロテアーゼ認識部位から多くても残基4つ分だけ隔たっていることを意味する。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基3又は2つ分だけ隔たっていてもよい。この場所は、天然発生型プロテアーゼ認識部位から残基1つ分だけ隔たっていてもよい。「ほぼ同じ位置」という言い方はまた、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然発生型プロテアーゼ認識部位内に挿入されることを意味することもできる。
【００４６】
「関連/作用連関」という用語は、物理的又は機能的に関係する2つの核酸配列を意味する。例えば、プロモーター又は調節DNA配列と、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列とが作用連関しているならば、或いは、調節DNA配列がコーディングDNA配列又は構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置しているならば、プロモーター又は調節DNA配列は、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列と「関連」していると云われる。
【００４７】
「キメラ遺伝子」又は「キメラ構造」は組換え核酸配列であって、この配列において、プロモーター又は調節核酸配列が、mRNAをコードするか又はタンパク質として発現される核酸配列と作用連関又は関連し、これにより、調節核酸配列が関連核酸コーディング配列の転写又は発現を調節することができる。キメラ遺伝子の調節核酸配列は、天然に見出されるような関連核酸配列に通常は作用連関されていない。
【００４８】
「コーディング配列」は、RNA、例えばmRNA、rRNA、tRNA、snRNA、センスRNA又はアンチセンスRNAに転写される核酸配列である。好ましくはRNAは次いで生物内で翻訳され、これによりタンパク質が生成される。
【００４９】
昆虫を「駆除」することは、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限することを意味する。昆虫を「駆除」することは、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【００５０】
本発明との関連において、「対応する」は、変異体Cry3Aδ-エンドトキシンのアミノ酸配列が互いに整列させられる場合、本発明において列挙した所定の位置に「対応する」アミノ酸が、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)におけるこれらの位置と整合するアミノ酸であることを意味するが、しかし、これらのアミノ酸は、本発明の特定のCry3Aアミノ酸に関してこれらの正確な数値的な位置に必ずしもあるわけではない。例えば、本発明のトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:3)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)をコードし、このCry3A毒素(SEQ ID NO:4)は、Cry3A毒素(SEQ ID NO:2)のMet-48で始まり、このCry3A毒素(SEQ ID NO:2)は天然型Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:1)によってコードされる。従って本発明によれば、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号107-115(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154-163及びその間の全ての番号に対応し、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号536-541(その間の全ての番号を含む)は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号583-588及びその間の全ての番号に対応する。
【００５１】
本明細書中に使用される「Cry3A毒素」は、73kDaのBacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)(Bt)鞘翅目活性タンパク質(Sekar他、1987、Proc. Nalt. Acad. Sci. 84:7036-7040)、例えばSEQ ID NO:2、並びに、Cry3A毒素、例えばSEQ ID NO:4から誘導可能で、Cry3A毒素とほぼ同じ毒性を維持する、先端切除された任意の低分子量変異体を意味する。低分子量変異形は、Cry3A毒素の天然発生型プロテアーゼ認識部位のプロテアーゼ開裂によって、又は、73kDaのCry3A毒素をコードする翻訳開始コドンと同じフレーム内の第2の翻訳開始コドンによって得ることができる。Cry3A毒素及びその低分子量変異形のアミノ酸配列は、Btにおいて天然発生する毒素に見出すことができる。Cry3A毒素は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Bt遺伝子、又は、SEQ ID NO:3におけるような合成コーディング配列によってコードすることができる。「Cry3A毒素」は、Cry3A毒素中に天然発生するプロテアーゼ認識部位以上の付加的なプロテアーゼ認識部位を有することはない。Cry3A毒素は異種系において分離、精製、又は発現することができる。
【００５２】
本明細書に使用された「Cry3A遺伝子」は、SEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を意味する。Cry3A遺伝子(Sekar他、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7036-7040)は、Bacillus thuringiensis var. tenebrionis(Kreig他、1983、Z. Angew. Entomol. 96:500-508)に見出されるような天然発生型、又は合成型であってよく、Cry3A毒素をコードする。本発明のCry3A遺伝子は、SEQ ID NO:1におけるような天然型Cry3A遺伝子、又はSEQ ID NO:3におけるようなトウモロコシ最適化Cry3A遺伝子と呼ぶことができる。
【００５３】
毒素を「送達する」ことは、毒素が昆虫と接触し、その結果毒性効果をもたらし、昆虫を駆除することを意味する。毒素は、認識された多くの方法、例えば昆虫による経口摂取、又はトランスジェニック植物の発現、調製されたタンパク質組成物、噴霧可能なタンパク質組成物、ベイト・マトリックス、又は当業者に認識されているその他の毒素送達システムを介して昆虫と接触させることにより、送達することができる。
【００５４】
「効果的な昆虫駆除量」は、害虫の生存、成長、摂食及び/又は繁殖の能力を毒性効果を通して阻害するか、或いは、作物の昆虫に関係する損害又は損失を制限する毒素の濃度を意味する。「効果的な昆虫駆除量」は、昆虫を殺すことを意味する場合と意味しない場合とがあるが、好ましくは、昆虫を殺すことを意味する。
【００５５】
本明細書中に使用される「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞中に特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる核酸配列を意味する。発現カセットは、当該ヌクレオチド配列に作用連関されたプロモーターを含み、当該ヌクレオチド配列は終止シグナルに作用連関されている。発現カセットはまた典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列を含む。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであってよく、すなわちこれは、その成分の少なくとも1つがその他の成分のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然発生型ではあるが、しかし異種発現に有用な組換え形として獲得されているカセットであってもよい。しかし典型的には、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中に天然発生することはなく、宿主細胞又は宿主細胞の原種中に、形質転換事象によって導入されていなければならない。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成性プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下で行われてよい。このプロモーターは、宿主細胞が或る特定の外部刺激に暴露されたときにのみ転写を開始する。多細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターは特定の組織又は器官、或いは発育段階に対して特異的であってもよい。
【００５６】
「遺伝子」は、ゲノム内に位置する定義済領域であって、上述のコーディング核酸配列以外に、コーディング部分の発現の制御、つまり転写及び翻訳に寄与する他の一次調節核酸配列を含む領域である。遺伝子はその他の5'及び3'未翻訳配列及び終止配列を含んでもよい。存在し得る更なる要素は例えばイントロンである。
【００５７】
「当該遺伝子」とは、植物に導入されたときに、その植物に所望の特性、例えば抗生物質抵抗性、ウィルス抵抗性、昆虫抵抗性、疾患抵抗性又は他の害虫に対する抵抗性、除草剤耐性、改善された栄養価、産業プロセスにおける生産能力向上、又は改変された繁殖能力を付与する任意の遺伝子を意味する。「当該遺伝子」とは、植物中で商業的に高価値の酵素又は代謝産物を生成するために、植物に導入された遺伝子であってもよい。
【００５８】
「消化管プロテアーゼ」は、昆虫の消化管内に天然に見出されるプロテアーゼである。このプロテアーゼは通常、摂取されたタンパク質の消化に関与する。
「異種」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然では関連しない核酸配列であり、天然発生型核酸配列の非天然発生型多コピーを含む。
「相同」核酸配列は、これが導入される宿主細胞と天然で関連する核酸配列である。
「相同組換え」は、相同核酸分子間の核酸フラグメントの相互交換である。
「殺虫」は、昆虫を好ましくは殺すことによって駆除することができる毒性生体活性として定義される。
核酸配列が、基準核酸配列によってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、その核酸配列は、基準核酸配列と「等コード性」である。
【００５９】
「単離された」核酸分子又は単離された毒素は、人手によってその天然環境から離されて存在する核酸分子又は毒素であり、従って天然の生成物ではない。単離された核酸分子又は毒素は、精製された形で存在してよく、或いは、非天然環境、例えば組換え宿主細胞中に存在してもよい。
本発明の「修飾Cry3A毒素」は、付加的なプロテアーゼ認識部位を少なくとも1つ有するCry3A誘導型毒素を意味し、この付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識され、Cry3A毒素中で天然には発生しない。修飾Cry3A毒素は天然発生せず、Bacillus thuringiensis中に見出される天然発生型毒素とは同一ではないアミノ酸配列を人手によって含む。修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い死亡率を、同じ標的昆虫にもたらす。
【００６０】
本発明による「修飾Cry3A遺伝子」は、未修飾Cry3A遺伝子中には天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位のコーディング配列を含むCry3A誘導型遺伝子を意味する。修飾Cry3A遺伝子は、天然型Cry3A遺伝子又は合成型Cry3A遺伝子から誘導することができる。
「天然発生型プロテアーゼ認識部位」は、昆虫以外のものに由来するプロテアーゼ、又は、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫種に由来するプロテアーゼ又は消化管抽出物によって開裂されるCry3A毒素内の位置である。例えば、Cry3A毒素に対して鋭敏な昆虫の消化管抽出物中に見出されるトリプシン及びプロテアーゼによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に存在する。キモトリプシンによって認識される天然発生型プロテアーゼ認識部位は、演繹Cry3A毒素アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のHis-161とSer-162との間並びにTys-587とTyr-588との間に存在する。
「核酸分子」又は「核酸配列」は、任意の源から分離することができる一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAの線状セグメントである。本発明との関連において、核酸分子はDNAセグメントであることが好ましい。
【００６１】
「植物」は、任意の発育段階にある任意の植物、具体的には種子植物である。
「植物細胞」は、植物の構造的且つ生理学的な単位であり、プロトプラストと細胞壁とを含む。植物細胞は、単離された単一細胞又は培養された細胞の形で、又は、より高度に組織された単位、例えば植物組織、植物器官、又は植物全体の一部であってよい。
「植物細胞培養」とは、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織内の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び種々の発育段階の胚の培養を意味する。
「植物材料」とは、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断部、細胞又は組織培養、又は植物のその他の任意の部分又は生成物を意味する。
本明細書中に使用される「植物組織」とは、構造的及び機能的な単位に組織化された植物細胞の群を意味する。in planta又は培養における任意の植物組織が含まれる。この用語の一例としては、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養及び、構造的単位及び/又は機能的単位に組織化された植物細胞の任意の群が含まれる。上述の又はこの定義によってそれ以外に包含される任意の特定のタイプの植物細胞との関連においてこの用語を使用するとしても、又はこのような植物細胞の存在なしにこの用語を使用するとしても、他のタイプの植物組織を排除するものではない。
【００６２】
「プロモーター」はRNAポリメラーゼ結合部位を含有し、DNAの転写を開始するコーティング領域の上流の未翻訳DNA配列である。プロモーター領域は、遺伝子発現のレギュレーターとして作用するその他の要素を含んでもよい。
「プロトプラスト」は、細胞壁を有さないか又は細胞壁の一部しか有さない、単離された植物細胞である。
「調節要素」とは、ヌクレオチド配列の発現の制御に関与する配列を意味する。調節要素は、当該ヌクレオチド配列に作用連関されるプロモーターと終止シグナルとを含む。調節要素は典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要な配列をも包含する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」ことに関して、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位は、付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入が天然発生型プロテアーゼ認識部位を排除する場合に、天然発生型プロテアーゼ認識部位を「置き換える」と云う。例えば、Arg-158残基とAsn-159残基とを排除する、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のPro-154とPro-160との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のArg-158とAsn-159との間に配置された天然発生型トリプシン認識部位と置き換わる。
【００６３】
「セリン・プロテアーゼ」は、セリンによる標的ペプチド結合の求核攻撃に基づいたメカニズムを用いて、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素から成る同一群を表す。セリン・プロテアーゼは、配列に対して特異的である。すなわち、それぞれのセリン・プロテアーゼは、酵素認識が発生するタンパク質内の特異的サブ配列を認識する。
「標的昆虫」は、Cry3A毒素に対する感受性を殆ど又は全く有していない害虫種であり、本発明の技術を用いて駆除するための候補として同定される。このような駆除は、幾つかの手段を介して達成することができるが、しかし、最も好ましくは、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を発現させることによって達成することができる。
【００６４】
「標的昆虫消化管プロテアーゼ」は、標的昆虫の消化管内に見出されるプロテアーゼであって、その認識部位をCry3A毒素中に挿入して、本発明の修飾Cry3A毒素を形成することができるプロテアーゼである。
「形質転換」は、宿主細胞又は生物中に異種核酸を導入するプロセスである。具体的には、「形質転換」は、当該生物のゲノム中にDNA分子を安定的に組込むことを意味する。
「形質転換された/トランスジェニック/組換え」は、異種核酸分子が導入された宿主生物、例えば細菌又は植物を意味する。核酸分子は宿主のゲノム中に安定的に組込むことができ、或いは、核酸分子は染色体外分子として存在していてもよい。このような染色体外分子は自己複製性である。形質転換された細胞、組織又は植物が、形質転換プロセスの最終生成物だけでなく、そのトランスジェニック子孫をも包含することは明らかである。「非形質転換」、「非トランスジェニック」又は「非組換え」ホストは野生型生物、例えば細菌又は植物であって、異種核酸分子を含有しないものを意味する。
天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」に関しては、本発明によれば、付加的なプロテアーゼ認識部位が天然型プロテアーゼ認識部位の前に来るアミノ酸残基と、天然型プロテアーゼ認識部位の後に来るアミノ酸残基との間にある場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は天然発生型プロテアーゼ認識部位「内」にあると云う。例えば、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に挿入された付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素の演繹アミノ酸配列(SEQ ID NO:2)のTyr-587とTyr-588との間に配置された天然発生型キモトリプシン認識部位「内」にある。天然発生型プロテアーゼ認識部位内の付加的なプロテアーゼ認識部位の挿入は、プロテアーゼによる天然発生型プロテアーゼ認識部位の認識を変化させても変化させなくてもよい。
【００６５】
ヌクレオチドは、下記の標準省略形によってこれらの塩基で示される：アデニン(A)、シトシン(C)、チミン(T)及びグアニン(G)。アミノ酸は同様に下記の標準省略形によって示される：アラニン(Ala;A)、アルギニン(Arg;R)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、システイン(Cys;C)、グルタミン(Gln;Q)、グルタミン酸(Glu;E)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;l)、ロイシン(Leu;L)、リシン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)及びバリン(Val;V)。
【００６６】
本発明は、発現により修飾Cry3A毒素をもたらす修飾Cry3A核酸配列に関し、また、害虫を駆除するための修飾Cry3A毒素の形成及び使用に関する。修飾Cry3A核酸配列を発現させることにより、修飾Cry3A毒素がもたらされ、この修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫、例えばウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームを駆除するのに使用することができる。本発明の修飾Cry3A毒素は、Cry3A毒素中で天然発生しない少なくとも1つの付加的なプロテアーゼ認識部位を含む。標的昆虫の消化管プロテアーゼによって認識されるこの付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位とほぼ同じ位置に挿入される。修飾Cry3A毒素が標的昆虫にもたらす死亡率は、Cry3A毒素が同じ標的昆虫にもたらす死亡率よりも高い。好ましくは、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【００６７】
好ましい1実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、標的昆虫の消化管プロテアーゼ、カテプシンGによって認識される。カテプシンG活性は、実施例2において説明するように、標的昆虫ウェスタン・コーン・ルートワームの消化管内に存在することが見極められる。好ましくは、カテプシンG活性の存在を見極めるのに使用される基質アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)が、本発明に従ってCry3A毒素中に挿入される。その他のカテプシンG認識部位、例えばAAPM(SEQ ID NO:36)、AVPF(SEQ ID NO:37)、PFLF(SEQ ID NO:38)、又はTanaka他、1985の方法(Biochemistry 24:2040-2047)によって見極められるようなその他のカテプシンG認識部位を、本発明に従って使用することもできる。上記文献の内容を参考のため本明細書中に引用する。標的昆虫の消化管中で同定されるその他のプロテアーゼのプロテアーゼ認識部位、例えば、その他のセリン・プロテアーゼ、システイン・プロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識部位を使用することができる。この実施態様によって包含される好ましいセリン・プロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ及びエラスターゼを含む。
【００６８】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素のドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、未修飾Cry3A毒素中の天然発生型プロテアーゼ認識部位と置き換わる位置、該認識部位に隣接する位置、又は該認識部位内の位置で、ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に挿入されるカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A毒素をコードする核酸分子である。
【００６９】
修飾Cry3A毒素をコードする修飾Cry3A核酸分子を形成する方法の具体的な教示例は、実施例3に見出すことができる。当業者には明らかなように、本発明に従ってCry3A毒素中に付加的なプロテアーゼ認識部位を挿入するために、当業者に知られているその他の方法を用いることもできる。
【００７０】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と162との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と115との間に挿入される。好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A054 (SEQ ID NO:6)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接する。SEQ ID NO:6の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:6に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７１】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む、修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)をコードするCry3A055(SEQ ID NO:8)と呼ばれる核酸分子、及び、修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)をコードするCry3A085(SEQ ID NO:10)と呼ばれる核酸分子である。SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７２】
好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と589との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と542との間に挿入される。
【００７３】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A082 (SEQ ID NO:12)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:12の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:12に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７４】
別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間、又はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:14)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位は、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:14の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことはSEQ ID NO:14に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７５】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は修飾Cry3A毒素をコードする単離された核酸分子を包含し、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と160との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A057 (SEQ ID NO:16)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と113との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:16の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:16に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７６】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号587と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A056 (SEQ ID NO:18)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号540と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。SEQ ID NO:18の核酸分子は異種宿主中に発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:18に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７７】
さらに別の好ましい実施態様の場合、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158とに対応するアミノ酸の間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588とに対応するアミノ酸の間に挿入される。好ましくは、付加的なプロテアーゼ認識部位は、ドメインIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号154と158との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:2のアミノ酸番号583と588との間に挿入されるか、或いは、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入される。この実施態様において具体的に例示されるのは、Cry3A058 (SEQ ID NO:20)と呼ばれる核酸分子であって、ドメインIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号107と111との間に挿入され、ドメインIIIにおいてSEQ ID NO:4のアミノ酸番号536と541との間に挿入されたカテプシンG認識部位を含む修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)をコードする核酸分子である。カテプシンG認識部位はドメインIにおいて、天然発生型トリプシン認識部位及び天然発生型キモトリプシン部位に隣接し、またドメインIIIにおいて、天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。SEQ ID NO:20の核酸分子は異種宿主において発現されると、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対する昆虫駆除活性を生じさせ、このことは、SEQ ID NO:20に示される核酸配列が、このような昆虫駆除活性にとって十分であることを示す。
【００７８】
好ましい実施態様の場合、本発明の単離された核酸分子は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む。
【００７９】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む修飾Cry3A毒素をコードする、単離された核酸分子を包含する。
本発明はまた、本発明の核酸配列を含む組換えベクターを包含する。このようなベクターにおいて、核酸配列は好ましくは、ヌクレオチド配列を発現させることができる宿主細胞中にヌクレオチド配列を発現させるための調節要素を含む発現カセット内に含まれる。このような調節要素は普通、プロモーター及び終止シグナルを含み、また好ましくは、本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの効率的な翻訳を可能にする要素をも含む。核酸配列を含むベクターは普通、特定の宿主細胞中で、好ましくは染色体外分子として複製することができ、従って、宿主細胞内で本発明の核酸配列を増幅するのに使用される。1実施態様の場合、このようなベクターのための宿主細胞は、微生物、例えば細菌、具体的にはBacillus thuringiensis又はE.coliである。別の実施態様の場合、このような組換えベクターのための宿主細胞は、内生植物又は着生植物である。このようなベクターの好ましい宿主細胞は、真核細胞、例えば植物細胞である。植物細胞、例えばトウモロコシ細胞が最も好ましい宿主細胞である。別の好ましい実施態様の場合、このようなベクターはウィルス・ベクターであり、特定の宿主細胞、例えば昆虫細胞又は植物細胞中のヌクレオチド配列の複製のために使用される。宿主細胞中に本発明のヌクレオチド配列を形質転換するために、組換えベクターも使用される。これにより、ヌクレオチド配列は、このような宿主細胞のDNA中に安定的に組込まれる。1実施態様の場合、このような宿主細胞は原核細胞である。好ましい実施態様の場合、このような宿主細胞は真核細胞、例えば植物細胞である。最も好ましい実施態様の場合、宿主細胞は植物細胞、例えばトウモロコシ細胞である。
【００８０】
別の観点において、本発明は、本発明の核酸分子を発現させることにより生成された修飾Cry3A毒素を包含する。
【００８１】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:6のヌクレオチド1-1791、SEQ ID NO:8のヌクレオチド1-1806、SEQ ID NO:10のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:12のヌクレオチド1-1794、SEQ ID NO:14のヌクレオチド1-1818、SEQ ID NO:16のヌクレオチド1-1812、SEQ ID NO:18のヌクレオチド1-1791、又はSEQ ID NO:20のヌクレオチド1-1818を含む核酸分子を発現させることによって生成される。
【００８２】
好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19又はSEQ ID NO:21に示されたアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本発明の修飾Cry3A毒素は、バイオアッセイで害虫に対して試験した場合に、昆虫駆除活性を有する。別の好ましい実施態様の場合、本発明の修飾Cry3A毒素は、鞘翅目昆虫に対して、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに対して活性である。本発明の修飾Cry3A毒素の昆虫駆除特性は、さらに実施例4及び6において示す。
【００８４】
本発明はまた、本発明による効果的な昆虫駆除量の修飾Cry3A毒素を含む組成物を包含する。
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して活性の修飾Cry3A毒素を生成する方法であって、(a)本発明の核酸分子に作用連関された異種プロモーター配列をそれ自体が含むキメラ遺伝子を含む宿主細胞を獲得し；そして(b)トランスジェニック宿主細胞内に核酸分子を発現させることにより、昆虫に対して活性の1種以上の修飾Cry3A毒素を生じさせる、ことを含む方法を包含する。
【００８５】
別の好ましい実施態様の場合、本発明は、昆虫に対して抵抗性のトランスジェニック植物を生成する方法であって、トランスジェニック植物中に本発明の核酸分子を導入することを含み、この核酸分子が昆虫駆除に有効な量でトランスジェニック植物において発現可能である、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、これらの昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。
【００８６】
さらに別の好ましい実施態様の場合、本発明は昆虫駆除の方法であって、本発明の有効量の修飾Cry3A毒素を昆虫に送達することを含む方法を包含する。1実施態様によれば、昆虫は鞘翅目の昆虫、好ましくはウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームである。好ましくは、修飾Cry3A毒素は昆虫に経口送達される。好ましい1実施態様の場合、毒素は、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる核酸配列を含むトランスジェニック植物を通して経口送達される。
【００８７】
本発明はまた、修飾Cry3A毒素の形成方法であって：(a)  Cry3A毒素をコードするCry3A毒素遺伝子を獲得し；(b)  標的昆虫の消化管プロテアーゼを同定し；(c)  前記消化管プロテアーゼのための認識部位をコードするヌクレオチド配列を獲得し；(d)  ドメインI又はドメインIII、或いは、ドメインI及びドメインIIIの両方に、Cry3A毒素遺伝子内の天然発生型プロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列と置き換わる位置、該ヌクレオチド配列内の位置、又は該ヌクレオチド配列に隣接する位置で前記(c)のヌクレオチド配列を挿入し、こうして修飾Cry3A毒素遺伝子を作成し；(e)  前記修飾Cry3A毒素遺伝子を発現カセット中に挿入し；(f)  前記修飾Cry3A毒素遺伝子を非ヒト宿主細胞中に発現させることにより、修飾Cry3A毒素を生成する宿主細胞を生じさせ；そして(g)  標的昆虫に対して修飾Cry3A毒素をバイオアッセイし、これにより、前記修飾Cry3A毒素が前記Cry3A毒素によってもたらされる標的昆虫の死亡率よりも高い死亡率を標的昆虫にもたらすことを含む、方法を包含する。好ましい実施態様の場合、Cry3A毒素が標的昆虫に最大30%の死亡率をもたらすのに対して、修飾Cry3A毒素は最小約50%の死亡率をもたらす。
【００８８】
本発明はさらに、昆虫駆除の方法であって、トランスジェニック植物がさらに、第2の殺虫成分をコードする第2の核酸配列又は核酸配列群を含む方法を包含する。特に好ましい第2の核酸配列は、δ-エンドトキシンをコードする核酸配列、米国特許第5,849,870号明細書及び同第5,877,012号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示された栄養殺虫剤タンパク質毒素をコードする核酸配列、又は非タンパク質成分を生成するための経路をコードする核酸配列である。
【００８９】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列はさらに、in vitroでの組換え又はDNAシャッフリングとして知られている技術で、ランダムな突然変異を組込むことにより修飾することができる。この技術はStemmer他、Nature 370:389-391(1994)及び米国特許第5,605,793号明細書に記載されている。これらの文献を参考のため本明細書中に引用する。本発明の元のヌクレオチド配列に基づいて、ヌクレオチド配列の数百万の突然変異体コピーが生成され、改善された特性、例えば増大した殺虫活性、向上した安定性、又は標的昆虫の異なる特異性又は範囲を有する変異形が回収される。この方法は、本発明のヌクレオチド配列を含む鋳型二本鎖ポリヌクレオチドから、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを包含し、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは開裂によって所望のサイズの二本鎖ランダム・フラグメントにされている。そしてこの方法は、結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメント個体群に、1又は2種以上の一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチドを添加し、前記オリゴヌクレオチドは二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに対して同一性領域及び異種性領域を含み；結果として生じた二本鎖ランダム・フラグメントとオリゴヌクレオチドとの混合物を変性して一本鎖フラグメントにし；結果として生じた単鎖フラグメント個体群を、同一性領域で前記単鎖フラグメントをアニーリングすることになる条件下で、ポリメラーゼと一緒にインキュベートすることにより、アニールされたフラグメント対を形成し、同一性領域は、対の一方の員が他方の員の複製をプライムするのに十分であり、これにより、突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成し；2回以上の更なるサイクルにわたって第2ステップ及び第3ステップを反復し、更なるサイクルの第2ステップにおける混合物が、前のサイクルの第3ステップから得られた突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを含み、そして、前記更なるサイクルは、更なる突然変異誘発型二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、ステップを含む。好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメント個体群における二本鎖ランダム・フラグメントの単一種の濃度は、総DNAの1重量%未満である。別の好ましい実施態様の場合、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドは、約100種以上のポリヌクレオチドを含む。別の好ましい実施態様の場合、二本鎖ランダム・フラグメントのサイズは、約5bp-5kbである。別の好ましい実施態様の場合、この方法の第4ステップは、10サイクル以上にわたって第2ステップ及び第3ステップを反復することを含む。
【００９０】
異種微生物宿主におけるヌクレオチド配列の発現
生物学的な昆虫駆除剤として、殺虫性修飾Cry3A毒素は、ヌクレオチド配列を発現させることができる異種宿主中にヌクレオチド配列を発現させることにより生成される。第1の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列の修飾形を含むB. thuringiensis細胞が形成される。このような修飾形は、既存の調節要素を突然変異させるか又は抹消し、こうしてヌクレオチド配列の発現を変化させるか、又はヌクレオチド配列の発現を制御する新しい調節要素を組込むことを包含する。別の実施態様の場合、ヌクレオチド配列のうちの1又は2つ以上の付加的なコピーが、染色体中に挿入することにより、又は、これらのヌクレオチド配列を含有する染色体外複製分子を導入することにより、Bacillus thuringiensis細胞に添加される。
【００９１】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、プロモーター及び終止シグナルを含む適切な発現カセット内に挿入される。ヌクレオチド配列の発現は構成的であるか、或いは、転写を開始するための種々のタイプの刺激に応答する誘導性プロモーターが使用される。好ましい実施態様の場合、毒素が発現される細胞は微生物、例えばウィルス、細菌又は菌類である。好ましい実施態様の場合、ウィルス、例えばバキュロウィルスは、そのゲノム中に本発明のヌクレオチド配列を含有し、ウィルス複製及びヌクレオチド配列の発現に適した真核細胞の感染後に、対応する多量の殺虫性毒素を発現させる。こうして生成された殺虫性毒素は、殺虫剤として使用される。或いは、ヌクレオチド配列を含むように遺伝子工学的に作り出されたバキュロウィルスを使用することにより、in vivoで昆虫を感染させ、そして、殺虫性毒素を発現させるか、又はウィルス感染と殺虫性毒素の発現とを組み合わせることにより、これらの昆虫を殺す。
【００９２】
細菌細胞は、本発明のヌクレオチド配列を発現させるための宿主でもある。好ましい実施態様の場合、植物細胞内で生存し複製することができる非病原性共生細菌、いわゆる内生植物、又は、葉圏又は根圏をコロニー化することができる非病原性共生細菌、いわゆる着生植物が使用される。このような細菌は、Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces及びXanthomonasの属から成る細菌を含む。共生菌類、例えばTrichoderma及びGliocladiumも、同じ目的で本発明のヌクレオチド配列を発現させるのに考えられ得る宿主である。
【００９３】
これらの遺伝子操作の技術は、利用可能な種々異なる宿主に対して特異的であり、当業者に知られている。例えば、発現ベクターpKK223-3及びpKK223-2を使用することにより、tac及びtrcプロモーターの後ろで、転写融合又は翻訳融合の際にE.coli中に異種遺伝子を発現させることができる。複数のORFをコードするオペロンを発現させるために、最も簡単な手順は、転写融合の際にpKK223-3のようなベクター内にオペロンを挿入し、異種遺伝子の同系リボソーム結合部位の使用を可能にすることである。グラム陽性種、例えばBacillusにおける過剰発現技術も当業者に知られており、本発明の関連において使用することができる(Quax他、「Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics」 Baltz他編、American Society for Microbiology, Washington (1993))。過剰発現の代替系は、例えば酵母ベクターに依存し、Pichia, Saccharomyces 及びKluyveromycesの使用を含む(Sreekrishna 「Industrial Microorganisms: basic and applied molecular genetics」 Baltz, Hegeman及びSkatrud編、American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173-177(1994); van den Berg他、Biotechnology 8:135-139(1990))。
【００９４】
植物の形質転換
特に好ましい実施態様の場合、本発明の殺虫性修飾Cry3A毒素の少なくとも1種が、より高等な生物、例えば植物において発現される。この場合、有効量の修飾Cry3A毒素を発現させるトランスジェニック植物は、害虫から自らを守る。昆虫がこのようなトランスジェニック植物を食べはじめると、その昆虫は、発現された修飾Cry3A毒素をも摂取することになる。このことは、昆虫がこれ以上植物組織に食い付くことを阻止することになり、或いは、昆虫に危害を加えるか又は殺しさえすることができる。本発明のヌクレオチド配列は発現カセット内に挿入され、この発現カセットは次いで好ましくは前記植物のゲノム中に安定的に組込まれる。別の好ましい実施態様の場合、ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウィルス中に含まれる。本発明に従って形質転換される植物は、単子葉植物又は双子葉植物であってよく、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、エンドウ豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、蕪、大根、ほうれん草、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、胡椒、セロリ、スカッシュ、カボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、桃、ネクタリン、アンズ、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、大豆、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、甜菜、ヒマワリ、菜種、クローバー、タバコ、ニンジン、綿、アルファルファ、稲、ジャガイモ、茄子、キュウリ、アラビドプシス、及び樹木植物、例えば針葉樹及び落葉樹を含む。所望のヌクレオチド配列が特定の植物種内に形質転換されると、このヌクレオチド配列は伝統的な繁殖技術を用いて、その種内で増殖するか、又は、具体的には実用品種を含む同一種の他の亜種に移動することができる。本発明のヌクレオチド配列は好ましくはトランスジェニック植物中で発現され、こうしてトランスジェニック植物中で、対応する修飾Cry3A毒素を生合成させる。このようにして、昆虫に対して抵抗性が増強されたトランスジェニック植物が生成される。トランスジェニック植物中の発現のために、本発明のヌクレオチド配列は、他の修飾及び最適化を必要とすることがある。多くの場合、微生物に由来する遺伝子は植物中に修飾なしに高レベルで発現させることができるものの、植物において好ましくないコドンを有する微生物ヌクレオチド配列からは、トランスジェニック植物における発現率が低くなることがある。全ての生物がコドン使用頻度に対して特異的な優先傾向を有していることが当業者に知られており、本発明において記載されたヌクレオチド配列のコドンを変更することにより、植物の優先傾向と一致させる一方、これによりコードされたアミノ酸を維持することができる。さらに、GC含有率が約35%以上、好ましくは45%超、より好ましくは約50%超、最も好ましくは約60%超のコーディング配列から、植物中の高発現率が最良に達成される。GC含有率が低い微生物ヌクレオチド配列は、メッセージを不安定化させるATTTAモチーフ、及び、不適切なポリアデニル化を引き起こすAATAAAモチーフの存在に起因して植物中の発現率を悪くするおそれがある。好ましい遺伝子配列は、単子葉植物種及び双子葉植物種の両方において十分に発現させることができるものの、単子葉植物及び双子葉植物の特異的なコドン優先傾向及びGC含有率優先傾向に寄与するように配列を修飾することができる。それというのも、これらの優先傾向は互いに異なることが判っているからである(Murray他、Nucl. Acids Res. 17:477-498(1989))。加えてヌクレオチド配列は、メッセージを切断するおそれのある非正統的なスプライス部位の存在に関してスクリーニングされる。上述のような、ヌクレオチド配列内で行われる必要のある全ての変更は、特定部位の突然変異誘発、PCR、及び、欧州特許出願公開第0385962号明細書(Monsanto)、同第0359472号明細書(Lubrizol)及び国際公開第93/07278号パンフレット(Ciba-Geigy)に記載された方法による合成遺伝子構成の良く知られた技術を用いて実施される。
【００９５】
本発明の1実施態様の場合、Cry3A遺伝子は、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成される。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンが使用される。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導されてよい。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列はSEQ ID NO:3に示される。
このようにして、ヌクレオチド配列は任意の植物における発現のために最適化することができる。すなわち、合成最適化配列又は部分最適化配列を使用することもできる。
効率的な翻訳開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を必要する場合がある。例えばこれらの配列は、植物において効果的であることが知られている配列を含むことにより修飾することができる。Joshiは、植物のための適切なコンセンサスを示唆しており(NAR 15:6643-6653(1987))、そしてClonetechは、更なるコンセンサス翻訳イニシエーター(1993/1994カタログ、第210頁)を示唆する。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列と共に使用するのに適している。これらの配列は、ATGまでの(ATGを含む)ヌクレオチド配列(第2アミノ酸は未修飾のままにする)、或いは、ATGに続くGTCまでの(GTCを含む) ヌクレオチド配列(導入遺伝子の第2アミノ酸を修飾することが可能である)を含む構造中に組込まれる。
【００９６】
トランスジェニック植物におけるヌクレオチド配列の発現は、植物中で機能するプロモーターによって推進される。プロモーターは、発現に必要な時間的及び空間的な要件に応じて、また標的種に応じて選択される。従って、葉、軸及び茎、穂、花部(例えば下穂、円錐花序、穂軸)、根、及び/又は苗中に、本発明のヌクレオチド配列が発現されることが好ましい。しかし多くの場合、2つ以上のタイプの害虫に対する保護が求められ、ひいては複数の組織における発現が望ましい。双子葉植物に由来する多くのプロモーターが単子葉植物において作用可能であり、その逆も云えることが判っているが、理想的には、双子葉植物における発現のためには双子葉植物プロモーターが選択され、単子葉植物における発現のためには単子葉植物プロモーターが選択される。しかし、選択されるプロモーターの起源に対する制限はなく、これらが所望の細胞におけるヌクレオチド配列の発現を推進する上で作用可能であれば十分である。
【００９７】
構成的に発現される好ましいプロモーターは、アクチン又はユビキチンをコードする遺伝子に由来するプロモーターと、CaMV 35S及び19Sプロモーターを含む。本発明のヌクレオチド配列は、化学的に調節されるプロモーターによって調節されながら発現させることもできる。このことは、作物が誘導性化学物質で処理されるときにだけ、殺虫性修飾Cry3A毒素が合成されることを可能にする。遺伝子発現の化学的誘導のための好ましい技術に関しては、欧州特許出願公開第0332104号明細書(Ciba-Geigy)及び米国特許第5,614,395号明細書に詳細に記載されている。化学的誘導のための好ましいプロモーターは、タバコPR-1aプロモーターである。
【００９８】
プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導性のプロモーターである。傷部位で、また植物病原体感染部位でも発現される多くプロモーターが記述されている。理想的には、このようなプロモーターは感染部位で局所的にのみ活性であることが望ましく、このようになっていれば、殺虫性修飾Cry3A毒素は、侵入する害虫を殺すために殺虫性修飾Cry3A毒素を合成するのを必要とする細胞にだけ蓄積する。このような種類の好ましいプロモーターは、Stanford他、Mol.Gen. Genet. 215:200-208(1989), Xu他、Plant Molec. Biol. 22:573-588(1993), Logemann他、Plant Cell 1:151-158(1989), Rormeier及びLehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792(1993), Firek他、Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993)及びWarner他、Plant J.3:191-201(1993)によって記載されたプロモータを含む。植物、具体的にはトウモロコシにおいて修飾Cry3A毒素遺伝子を発現させるのに有用な組織特異的又は組織優先的なプロモーターは、根、髄、葉又は花粉、特に根において発現を導くプロモーターである。このようなプロモーターは、例えば米国特許第5,625,136号明細書に開示されたPEPC又はtrpA、又は、米国特許第5,466,785号明細書に開示されたMTLから単離されたプロモーターである。上記両米国特許明細書全体を参考のため本明細書中に引用する。
【００９９】
別の好ましい実施態様は、傷誘導式又は病原体感染誘導式に、ヌクレオチド配列を発現させるトランスジェニック植物である。
プロモーターに加えて、本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を使用したキメラ遺伝子構造において、種々の転写ターミネーターを使用することもできる。転写ターミネーターは、導入遺伝子を超えた転写の終結、及びその正確なポリアデニル化に寄与する。適切な転写ターミネーター及び植物において機能することが知られているターミネーターは、CaMV 35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリン・シンターゼ・ターミネーター、pea rbcS E9ターミネーター及び当業者に知られたその他のターミネーターを含む。これらは、単子葉植物及び双子葉植物の両方において使用することができる。植物中で機能することが知られている任意の利用可能なターミネーターを、本発明の関連において使用することができる。
【０１００】
本発明において記載された発現カセット内に、その他の多くの配列を組込むことができる。これらの配列は、発現を増強することが判っている配列、例えばイントロン配列(例えばAdhl及びbronzel由来)及びウィルス・リーダー配列(例えばTMV, MCMV及びAMV由来)を含む。
【０１０１】
植物中の種々異なる細胞部位を標的として本発明のヌクレオチド配列を発現させることが好ましい。幾つかの場合には、細胞質ゾルにおける局在化が望ましいのに対して、他の場合には、何らかの亜細胞小器官における局在化が望ましい。導入遺伝子によってコードされた酵素の亜細胞局在化が、当業者に良く知られた技術によって行われる。典型的には、小器官を標的とした既知の遺伝子生成物に由来する標的ペプチドをコードするDNAが操作され、ヌクレオチド配列の上流で融合される。多くのこのような標的配列が葉緑体に関して知られており、異種構造においてこれらの配列が機能することが判っている。本発明のヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞の小胞体又は液胞を標的とする。これを達成するための技術は当業者に良く知られている。
【０１０２】
植物の形質転換に適したベクターは、本明細書の別の箇所に記載されている。アグロバクテリウム媒介性形質転換の場合、二元ベクター、又は少なくとも1つのT-DNAボーダー配列を担持する二元ベクターが好適であり、これに対して、直接的な遺伝子導入の場合には、いかなるベクターも好適であり、当該構造だけを含有する線状DNAが好ましい。直接的な遺伝子導入の場合、単一DNA種による形質転換又は同時形質転換を用いることができる(Schocher他、Biotechnology 4:1093-1096(1986))。直接的な遺伝子導入の場合にも、アグロバクテリウム媒介性導入の場合にも、形質転換は普通(必ずというわけではない)、選択マーカーを用いて行われる。この選択マーカーは抗生物質(カナマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキサート)又は除草剤(バスタ)に対する耐性を提供することができる。本発明の修飾Cry3A毒素遺伝子を含む植物形質転換ベクターは、米国特許第5,767,378号明細書及び同第5,994,629号明細書(これらを参考のため本明細書中に引用する)に開示されているような、トランスジェニック植物をポジティブに選択することを可能にする遺伝子(例えばホスホマンノース・イソメラーゼ；PMI)を含んでもよい。しかし選択マーカーの選択肢は、本発明にとってさほど重要ではない。
【０１０３】
別の実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド・ゲノム中に直接的に形質転換される。プラスチド形質転換の主な利点は、プラスチドが一般に、コドンが実質的に最適化されていない細菌遺伝子を発現させることができること、及び、プラスチドが単一プロモーターの制御下で複数のオープン・リーディング・フレームを発現させることができること、である。プラスチド形質転換技術は、米国特許第5,451,513号明細書、同第5,545,817号明細書及び同第5,545,818号明細書、国際公開第95/16783号パンフレット、及びMcBride他(1994)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305に広範囲にわたって記載されている。葉緑体形質転換のための基本技術は、バイオリスティクス又はプロトプラスト形質転換(例えば塩化カルシウム又はPEGを媒介とする形質転換)を用いて、選択マーカーを側面に有するクローニングされたプラスチドDNAの領域を、当該遺伝子と一緒に好適な標的組織中に導入することを伴う。ターゲティング配列と呼ばれる1-1.5kbの側面領域は、プラスチド・ゲノムとの相同組換えを容易にし、ひいては、プラストムの特定領域の置換又は修飾を可能にする。先ず、スペクチノマイシン及び/又はストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体16S rRNA及びrps12の遺伝子中の点突然変異体が、形質転換のための選択マーカーとして利用される(Svab,Z., Hajdukiewicz, P.及びMaliga, P.(1990)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J.M.及びMaliga, P.(1992)Plant Cell 4, 39-45)。その結果、標的となる葉に対する衝撃100回当たりほぼ1回の頻度で、安定的な同種形成性の形質転換体が得られる。これらのマーカーの間にクローニング部位が存在することにより、外来遺伝子を導入するためのプラスチド標的ベクターの形成が可能になった(Staub, J.M及びMaliga, P.(1993)EMBO J.12,601-606)。劣性rRNA又はr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子を、主要な選択マーカー、スペクチノマイシン解毒酵素、アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌aadA遺伝子と置換することにより、形質転換頻度が実質的に増大する(Svab,Z及びMaliga, P.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。既に、このマーカーは、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチド・ゲノムの高頻度形質転換に使用することに成功している(Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)。プラスチド形質転換に有用な他の選択マーカーが当業者に知られており、これらは本発明の範囲に含まれる。典型的には、同種形成性の状態に達するには、形質転換に続いてほぼ15-20回の細胞分裂サイクルが必要となる。それぞれの植物細胞内に存在する環状プラスチドゲノムの数千個のコピーの全てに、相同組換えにより遺伝子が挿入されるプラスチド発現は、コピー数が莫大であるという、核発現遺伝子を凌ぐ利点を利用することにより、可溶性植物タンパク質全体の10%を容易に上回ることができる発現レベルを可能にする。好ましい実施態様の場合、本発明のヌクレオチド配列は、プラスチド標的ベクター中に挿入され、所望の植物宿主のプラスチド・ゲノム中に形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含有するプラスチド・ゲノムに対して同種形成性の植物が得られ、これらの植物は、このヌクレオチド配列を優先的に高発現させることができる。
【０１０４】
昆虫駆除成分の組み合わせ
本発明の修飾Cry3A毒素をBtδ-エンドトキシン又はその他の殺虫性成分と組み合わせて使用することにより、害虫の標的範囲を広くすることができる。さらに、Btδ-エンドトキシン又は明確な性質を有するその他の殺虫性成分と組み合わせて、本発明の修飾Cry3A毒素を使用することは、昆虫における抵抗性の予防及び/又は管理に特に有用である。
他の殺虫性成分は例えば、レクチン、α-アミラーゼ、ペルオキシダーゼ及びコレステロール・オキシダーゼを含む。栄養殺虫性タンパク質遺伝子、例えば米国特許第5,889,174号明細書に開示されたVip1A(a)及びvip2A(a)も本発明において有用である。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。
必要な遺伝子全てを含有し発現させるように植物を遺伝子工学的に作り出すことにより、同じトランスジェニック植物中に2つ以上の殺虫性成分を同時発現させることができる。或いは、本発明の遺伝子を発現させるために、植物「親1」を遺伝子工学的に作成することができる。補足的な昆虫駆除成分を発現させるために、第2の植物「親2」を遺伝子工学的に作成することができる。親1と親2とを交配することにより、親1と親2とに導入された遺伝子全てを発現させる子孫植物が得られる。本発明のトランスジェニック種子は、米国特許第5,849,320号明細書及び同第5,876,739号明細書に記載されているような殺虫性種子コーティングで処理することもできる。上記明細書を参考のため本明細書中に引用する。殺虫性種子コーティングと本発明のトランスジェニック種子との双方が同じ標的昆虫に対して活性である場合、その組み合わせは、(i)標的昆虫に対する本発明の修飾Cry3A毒素の活性を増強する方法、及び(ii)標的昆虫に対する第2の作用メカニズムを提供することにより、本発明の修飾Cry3A毒素に対する抵抗性の発生を予防する方法、において有用である。従って本発明は、標的昆虫、例えばコーン・ルートワームに対する活性を増強するか、又は該標的昆虫における抵抗性の発生を予防する方法であって、本発明の1又は2種以上の修飾Cry3A毒素を含むトランスジェニック種子に殺虫性種子コーティングを塗布することを含む、方法を提供する。
【０１０５】
殺虫性種子コーティングが異なる昆虫に対して活性である場合にも、例えば、鞘翅目昆虫に対して活性を有する本発明のトランスジェニック種子に、鱗翅目昆虫に対して活性を有する殺虫性種子コーティングを添加することにより、殺虫性種子コーティングは昆虫駆除範囲を広げるのに有用である。生成されたコーティング済トランスジェニック種子は、鱗翅目及び鞘翅目双方の害虫を駆除する。
【０１０６】
実施例
下記に詳述する実施例を参照することにより、本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としてのみ提供され、特に断りのない限り、本発明を限定するものではない。これらの実施例において使用した標準的な組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に良く知られており、J. Sambrook他著、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版、Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001);T.J.Silhavy, M.L. Berman及びL.W.Enquist著、Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY: (1984)及びAusubel, F.M.他著、Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter他著、Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press(1992)及びSchultz他著、Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers(1998)によって記述されている。
【０１０７】
実施例1:トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子の構成
トウモロコシに対して最適化されたCry3A遺伝子を、米国特許第5,625,136号明細書に開示された手順に従って形成する。この手順において、トウモロコシ優先コドン、すなわちトウモロコシ中のそのアミノ酸を最も頻繁にコードする単一コドンを使用する。特定のアミノ酸に対応するトウモロコシ優先コドンは、例えばトウモロコシに由来する既知の遺伝子配列から誘導する。トウモロコシ植物に由来する28個の遺伝子に対応するトウモロコシ・コドン使用頻度が、Murray他、Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)に見出される。トウモロコシ最適化コドンで形成された合成配列をSEQ ID NO:3に示す。
【０１０８】
実施例2: ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG酵素活性の同定
ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管におけるカテプシンG様(セリン・プロテアーゼ)及びカテプシンB様(システイン・プロテアーゼ)酵素活性を、比色分析基質を使用して測定する。それぞれ1mlの反応物は、第3齢のウェスタン・コーン・ルートワームの5つの均質化中腸と、反応緩衝液(10mM Tris, 5mM NaCl, 0.01 M DTT, pH7.5)中に溶解された基質1mgとを含有する。試験されるカテプシンG基質は、Ala-Ala-Pro-Phe(SEQ ID NO:35)-pNAであり、カテプシンB基質はArg-Arg-pNAである。反応物を1時間にわたって28℃でインキュベートする。プロテアーゼが適切な基質を認識する効率を示す、黄色形成強度を処理物と対照とで比較する。色が検出されない場合、又は僅かなバックグラウンド色が検出される場合には、反応物には負(-)のスコアを与える。バックグラウンドを25%、50%、75%又は100%上回る反応物には、それぞれ+, ++, +++又は++++のスコアを与える。酵素アッセイの結果を下記表に示す。
【０１０９】
【表１】
2005500849.tif 000002
セリン・プロテアーゼ、カテプシンGの活性がウェスタン・コーン・ルートワーム消化管中で同定されたのはこれが初めてである。ウェスタン・コーン・ルートワーム消化管は明らかに、カテプシンB(システイン・プロテアーゼ)活性よりも強いカテプシンG(セリン・プロテアーゼ)活性を有している。本発明の修飾Cry3A毒素を形成するためのカテプシンGプロテアーゼ認識部位として、AAPF配列(SEQ ID NO:35)を選択する。
【０１１０】
実施例3:修飾Cry3A遺伝子の構築
ドメインI又はドメインIII、或いはドメインI及びドメインIIIの両方においてカテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を含む修飾Cry3A遺伝子を、オーバーラップPCRを用いて形成する。プラスミドpCIB6850(SEQ ID NO:5)に含まれる、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子(SEQ ID NO:2)を、開始鋳型として使用する。修飾Cry3A毒素をコードする8つの修飾Cry3A遺伝子構造、すなわち、ドメインI内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A054, Cry3A055, Cry3A085; ドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A058, Cry3A082; ドメインI及びドメインIII内にカテプシンG認識部位コーティング配列を含むCry3A056, Cry3A057, Cry3A083を形成する。これら8つの修飾Cry3A遺伝子及びこれらがコードする修飾Cry3A毒素を以下に説明する：
【０１１１】
pCMS054に含まれるCry3A054
Cry3A054(SEQ ID NO:6)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する：
1.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3'              (SEQ ID NO:23)
2.  TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3'           (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
3.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
【０１１２】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A054遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれ、Cry3A054遺伝子(SEQ ID NO:6)を含む。
【０１１３】
pCMS054に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A054毒素(SEQ ID NO:7)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接している。
【０１１４】
pCMS055に含まれるCry3A055
Cry3A055(SEQ ID NO:8)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する：
1.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3'              (SEQ ID NO:23)
2.  AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3'          (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
3.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
【０１１５】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれ、Cry3A055遺伝子(SEQ ID NO:8)を含む。
pCMS055に含まれる修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A055毒素(SEQ ID NO:9)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接している。
【０１１６】
pCMS058に含まれるCry3A058
Cry3A058(SEQ ID NO:14)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する：
1.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                  (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3'          (SEQ ID NO:28)
2.  AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3'      (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                    (SEQ ID NO:30)
3.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                  (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                    (SEQ ID NO:30)
【０１１７】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を次いで等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A058遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS058と呼ばれ、Cry3A058遺伝子(SEQ ID NO:14)を含む。
【０１１８】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A058毒素(SEQ ID NO:15)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位内にある。
【０１１９】
Cry3A082を含むpCMS082
Cry3A082(SEQ ID NO:12)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。QuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対を使用して、未修飾のトウモロコシ最適化Cry3A中に、カテプシンG認識部位をコードするヌクレオチド配列を挿入する：
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3'       (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3'       (SEQ ID NO:32)
【０１２０】
プライマー対が固有のPCR生成物を発生させる。この生成物をクローニングして元のpCIB6850鋳型に戻す。修飾Cry3A082遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS082と呼ばれ、Cry3A082遺伝子(SEQ ID NO:12)を含む。
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A082毒素(SEQ ID NO:13)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、天然型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【０１２１】
pCMS056に含まれるCry3A056
Cry3A056(SEQ ID NO:18)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する：
1.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3'              (SEQ ID NO:23)
2.  AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3'          (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
3.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
4.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                       (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3'               (SEQ ID NO:28)
5.  AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3'           (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                         (SEQ ID NO:30)
6.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                       (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                         (SEQ ID NO:30)
【０１２２】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3A055遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS056と呼ばれ、Cry3A056遺伝子(SEQ ID NO:18)を含む。
【０１２３】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A056毒素(SEQ ID NO:19)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【０１２４】
pCMS057に含まれるCry3A057
Cry3A057(SEQ ID NO:16)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。6つのオーバーラップPCRプライマー対を使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する：
1.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3'              (SEQ ID NO:23)
2.  TAIL5mod-5'-GCTGCACCGTTCCCCCACAGCCAGGGCCG-3'           (SEQ ID NO:24)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
3.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
4.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                       (SEQ ID NO:27)
AAPF-Y2-5'-GAACGGTGCAGCGTATTGGTTGAAGGGGGC-3'               (SEQ ID NO:28)
5.  AAPF-Y1-5'-GCTGCACCGTTCTACTTCGACAAGACCATC-3'           (SEQ ID NO:29)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                         (SEQ ID NO:30)
6.  SalExt-5'-GAGCGTCGACTTCTTCAAC-3'                       (SEQ ID NO:27)
SacExt-5'-GAGCTCAGATCTAGTTCACGG-3'                         (SEQ ID NO:30)
【０１２５】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS054と呼ばれる。プライマー対4及びプライマー対5が別の固有のフラグメント・セットを発生させる。これらのフラグメントをプライマー対6で別のPCRによって接合する。このフラグメントを、pCMS054内に含まれる修飾Cry3A054遺伝子のドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS057と呼ばれ、Cry3A057遺伝子(SEQ ID NO:16)を含む。
【０１２６】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A057毒素(SEQ ID NO:17)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と113との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸540と541との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン認識部位と置き換わり、且つ天然発生型キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位内にある。
【０１２７】
pCMS083に含まれるCry3A083
Cry3A083(SEQ ID NO:20)は、修飾Cry3A毒素をコードするヌクレオチド配列を含む。3つのオーバーラップPCRプライマー対と1つのQuikChange Site Directed Mutagenesis PCRプライマー対とを使用して、未修飾Cry3A中に、2つのカテプシンG認識部位を挿入する：
1.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
AAPFtail3-5'-GAACGGTGCAGCGGGGTTCTTCTGCCAGC-3'              (SEQ ID NO:23)
2.  AAPFtail4-5'-GCTGCACCGTTCCGCAACCCCCACAGCCA-3'          (SEQ ID NO:26)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
3.  BamExt1-5'-GGATCCACCATGACGGCCGAC-3'                    (SEQ ID NO:22)
XbaIExt2-5'-TCTAGACCCACGTTGTACCAC-3'                       (SEQ ID NO:25)
BBmod1-5'-CGGGGCCCCCGCTGCACCGTTCTACTTCGACA-3'              (SEQ ID NO:31)
BBmod2-5'-TGTCGAAGTAGAACGGTGCAGCGGGGGCCCCG-3'              (SEQ ID NO:32)
【０１２８】
プライマー対1及びプライマー対2が2つの固有のPCR生成物を発生させる。これらの生成物を等しい部分で組み合わせ、プライマー対3を使用することにより生成物を接合して1つのPCRフラグメントを生成する。このフラグメントをクローニングして元のpCIB6850プラスミドに戻す。修飾Cry3A055遺伝子を次いでpBluescript(Stratagene)に移す。その結果生じたプラスミドはpCMS055と呼ばれる。プライマー対4が別の固有のフラグメントを発生させる。このフラグメントを、pCMS055内に含まれる修飾Cry3AのドメインIII中にクローニングする。その結果生じたプラスミドはpCMS083と呼ばれ、Cry3A083遺伝子(SEQ ID NO:20)を含む。
【０１２９】
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A083毒素(SEQ ID NO:21)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111との間に挿入されており、ドメインIIIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸539と542との間に挿入されている。カテプシンG認識部位は、ドメインIにおいては天然発生型トリプシン・キモトリプシン認識部位に隣接し、ドメインIIIにおいては天然発生型キモトリプシン認識部位と置き換わる。
【０１３０】
pCMS085に含まれるCry3A085
Cry3A085(SEQ ID NO:10)は、上述のCry3A055遺伝子内の位置と同じ位置にカテプシンGコーディング配列を含む。Cry3A085遺伝子は、SEQ ID NO:2に示された演繹アミノ酸配列のアミノ酸41-47をコードする、5'末端に挿入された付加的な24個のヌクレオチド、並びに、付加的なメチオニンを有している。付加的なヌクレオチドは、下記PCRプライマー対を使用して、Cry3A055遺伝子の5'末端に挿入される：
mo3Aext-5'-GGATCCACCATGAACTACAAGGAGTTCCTCCGC-
ATGACCGCCGACAAC-3'                                        (SEQ ID NO:33)
CMS16-5'-CCTCCACCTGCTCCATGAAG-3'                          (SEQ ID NO:34)
修飾Cry3A遺伝子によってコードされる修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)は、アミノ酸配列AAPF(SEQ ID NO:35)を含むカテプシンG認識部位を有し、このカテプシンG認識部位はドメインIにおいて未修飾Cry3A毒素(SEQ ID NO:4)のアミノ酸107と111とに対応するアミノ酸の間に挿入されている。修飾Cry3A085毒素(SEQ ID NO:11)はまた、N末端に8つの付加的なアミノ酸残基を有している。これらの残基のうちの第2残基は、SEQ ID NO:2に示されたアミノ酸配列のアミノ酸番号41に対応する。
【０１３１】
実施例4:修飾Cry3A毒素の殺虫活性
ウェスタン・コーン・ルートワーム、ノーザン・コーン・ルートワーム及びサザン・コーン・ルートワームに対する殺虫活性に関して、昆虫バイオアッセイにおいて、修飾Cry3A毒素を試験する。食餌取込み法を用いてバイオアッセイを実施する。本発明の修飾Cry3A毒素のうちの1つを発現させるE.coliクローンを一晩にわたって成長させる。一晩経過後の培養500μlを超音波処理し、次いで、500μlの溶融人工食餌(Marrone他、(1985)J. of Economic Entomology 78:290-293)と混合する。食餌が凝固したら、これをペトリ皿に小分けし、20匹の新生コーン・ルートワームを食餌上に置く。これらのペトリ皿を30℃で保持する。6日後の死亡率を記録する。修飾Cry3A毒素の全ては、ウェスタン・コーン・ルートワーム及びノーザン・コーン・ルートワームに50%-100%の死亡率をもたらすのに対し、未修飾Cry3A毒素は0%-30%の死亡率をもたらす。サザン・コーン・ルートワームに対する活性を有する修飾Cry3A毒素はない。
【０１３２】
実施例5:修飾Cry3Aコーディング配列を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物の形成
3つの修飾Cry3A遺伝子、すなわち、ドメインIの修飾形の代表であるCry3A055と、ドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A058と、ドメインI及びドメインIIIの修飾形の代表であるCry3A056とを、トウモロコシ植物中への形質転換のために選択する。修飾Cry3Aコーディング配列を含む発現カセットを、アグロバクテリウム媒介性トウモロコシ形質転換に適したベクターに導入する。例えば、発現カセットは、修飾Cry3A遺伝子に加えて、MTLプロモーター(米国特許第5,466,785号明細書)及び当業者に知られたnosターミネーターを含む。
【０１３３】
未熟なトウモロコシ胚の形質転換を、事実上、Negrotto他、2000、Plant Cell Reports 19:798-803に記載されたように実施する。この例の場合、全ての培地構成成分は、Negrotto他、前掲書に記載されている通りである。しかしその代わりに、当業者に知られた種々の培地を使用することができる。
形質転換に使用される遺伝子を、トウモロコシ形質転換に適したベクター中にクローニングする。この例で使用されるベクターは、トランスジェニック系統を選択するためのホスホマンノース・イソメラーゼ(PMI)遺伝子を含有する(Negrotto他、(2000)、Plant Cell Reports 19:798-803)。
【０１３４】
植物形質転換プラスミドを含有するAgrobacterium菌株LBA4404(pSB1)を、YEP(酵母抽出物(5g/L)、ペプトン(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l寒天、pH6.8)固形培地上で、2-4日にわたって28℃で成長させる。100μMのAsが補足されたLS-inf培地中に約0.8 x 109個のAgrobacteriumを懸濁する。30-60分にわたってこの培地中で細菌を前誘発する。
A188又は他の好適な遺伝子型に由来する未熟胚を日齢8-12日の穂から摘出し、液体LS-inf + 100μM As中に入れる。新鮮な感染培地で胚を一度濯ぐ。次いでAgrobacterium溶液を添加し、胚を30秒間にわたって渦流処理し、5分間にわたって細菌と共に鎮静させておく。次いで、胚を、胚盤側を上にしてLSA培地に移し、2-3日間にわたって暗所内で培養する。続いて、セフォタキシム(250mg/l)及び硝化銀(1.6mg/l)が補足されたLSD培地に、ペトリ板1つ当たり20-25個の胚を移し、28℃で10日間にわたって暗所内で培養する。
【０１３５】
胚生成カルスを生成する未熟胚をLSD1M0.5S培地に移す。3週目の継代培養ステップを含む6週間にわたって、この培地上で培養を淘汰する。
マンノースが補足されたReg1培地に、生き残ったカルスを移す。明所(16時間明/8時間暗の編成)における培養に続いて、未熟な組織を成長レギュレーターを有さないReg2培地に移し、そして1-2週間にわたってインキュベートする。小植物を、Reg3培地を含有するMagenta GA-7ボックス(Magenta Corp, Chicago I11)に移し、明所で成長させる。2-3週間後、PMI遺伝子及び修飾Cry3A遺伝子の存在に関してPCRによって植物を試験する。PCRアッセイで陽性であった植物を温室に移し、コーン・ルートワームに対する抵抗性を試験する。
【０１３６】
実施例6:トランスジェニック・トウモロコシ植物の分析
コーン・ルートワームに対する効果
根摘出バイオアッセイ
Magenta GA-7ボックスから土壌中に植物を移植するのに伴い、これらの植物をサンプリングする。これにより、土壌条件に対して十分に滅菌性の環境から根をサンプリングすることが可能になる。サンプリングは、根の小片(約2-4cm長)を切断して、小型ペトリ皿内の富化されたフィトアガー(phytagar)(フィトアガー12g、スクロース9g、MS塩3ml、MSビタミン3ml、ナイスタチン(25mg/ml)3ml、セフォタキシミン(50mg/ml)7ml、オーレオマイシン(50mg/ml)7ml、ストレプトマイシン(50mg/ml)7ml、dH2O 600ml)上にこれを載せることから成る。負の対照は、同じ試験から生じた修飾Cry3A遺伝子に対してPCR陰性のトランスジェニック植物であるか、又は、フィトトロン中で成長中の非トランスジェニック植物(試験植物と同様のサイズ)に由来する。土壌から対照の根をサンプリングする場合、根試料を水で洗浄し、土壌残留物を除去し、ナイスタチン溶液(5mg/ml)中に浸漬し、浸漬液から取り出し、ペーパータオルで拭き取って乾かし、そしてファイトアガール皿に入れる。
【０１３７】
それぞれのフィトアガー皿の蓋の内面に10匹の第1齢の幼虫を置くことにより、根試料にウェスタン・コーン・ルートワームを接種し、次いで蓋を密に再シールする。幼虫は、細い先端の絵筆で取り扱う。全ての皿での接種後、皿のトレイをデータ収集まで室温で暗所に置く。
接種から3-4日後に、データを捕集する。幼虫の死亡百分率を、根の視覚的な損害評価と共に計算する。摂食損害を高、中、低又は無しと格付けし、これにそれぞれ数値3,2,1又は0を与える。40%以上の死亡率をもたらし、且つ2以下の損害格付けを有する根試料を陽性と考える。
下記表の結果が示すように、修飾Cry3A毒素を発現する植物は、ウェスタン・コーン・ルートワームに40-100%の死亡率をもたらし、これに対して対照植物は0-30%の死亡率をもたらす。また、修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、対照植物よりも有意に低い摂食損害を維持する。
【０１３８】
【表２】
2005500849.tif 000003
【０１３９】
植物全体のバイオアッセイ
上述の根摘出バイオアッセイを用いて同定されたいくつかの陽性植物を、植物全体のバイオアッセイを用いて、ウェスタン・コーン・ルートワーム抵抗性に関して評価する。根摘出アッセイを完了してから概ね3日以内に、植物にウェスタン・コーン・ルートワームをはびこらせる。
ウェスタン・コーン・ルートワームの卵を予めインキュベートし、植物の接種から2-3日後に孵化が発生するようにする。卵は0.2%寒天中に懸濁し、卵約200個/植物で試験植物の周りの土壌に塗布する。
卵の孵化から2週間後に、ウェスタン・コーン・ルートワームの幼虫による損害に関して植物を評価する。植物がウェスタン・コーン・ルートワームの摂食損害に対して抵抗性を有するか否かを見極めるのに用いられる基準は、達成された植物の高さ、倒伏、及び根塊である。評価時点では、対照植物は典型的には、修飾Cry3A植物よりも小さい。また、非トランスジェニック対照植物、及び、トウモロコシ最適化Cry3A遺伝子によってコードされた未修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、根のほとんどが重度に取り除かれる結果、根塊の蓄積がなくなることにより、この時間中に倒伏した。評価時点で、本発明の修飾Cry3A毒素を発現させる植物は、修飾Cry3A毒素の殺虫活性により、対照植物よりも背が高く、倒伏せず、大きな無傷の根塊を有する。
【０１４０】
ELISAアッセイ
トランスジェニック植物中の修飾Cry3Aタンパク質及び未修飾Cry3Aタンパク質のレベルを定量するために、米国特許第5,625,136号明細書に開示された方法に基づくELISA分析を用いる。
【０１４１】
【表３】
2005500849.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2005500849.tif 000005
2005500849.tif 000006
2005500849.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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