(57)【要約】マイクロアレイ上の核酸試料の、非特異的および特異的ハイブリダイゼーションをブロックするための方法が提供される。本発明の方法は、ブロッキング剤をマイクロアレイに加えることを含み、そこで上記ブロッキング剤が、改変ヌクレオチド塩基、好ましくはＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）：２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環式単量体ユニット）を含む。さらなる実施形態においては、本方法には、ａ）標的試料のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ薬剤、および捕獲配列を持つｃＤＮＡ、ｂ）検出可能なシグナルを放射するための標識、および捕獲配列に相補的な第２ヌクレオチド配列をもつデンドリマー、およびｃ）ＬＮＡを含むブロッキング剤を含む混合物を、マイクロアレイに加えることが含まれ、上記標識から検出可能なシグナルが産出され、それによってハイブリダイゼーションパターンがマイクロアレイ上に生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１核酸配列と第２核酸配列の間の非特異的結合を減少させるために、ブロッキング剤を使用することであって、前記ブロッキング剤に、少なくとも１つの改変ヌクレオチドが含まれる、方法。
【請求項２】
前記ブロッキング剤が前記第１核酸配列に結合し、そこで該ブロッキング剤が核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１核酸に結合した前記ブロッキング剤が、該第１核酸に結合した第２薬剤よりも高い融解温度（Ｔｍ）を持ち、該第２薬剤が、同一の核酸配列であるが、前記改変ヌクレオチドの代わりに該改変ヌクレオチドと同様の塩基を持つ標準ヌクレオチドを有している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記改変ヌクレオチドがＬＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記改変ヌクレオチドがペプチド骨格を持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ブロッキング剤がポリ−Ａ核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキング剤がポリ−Ｔ核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１）多数の特徴を含むマイクロアレイを使用することであって、その特徴のそれぞれが、第１ヌクレオチド配列を含む分子の第１の組を含む、
２）該マイクロアレイに試料を加えることであって、該試料が相補的である該マイクロアレイ上で、任意の該第１ヌクレオチド配列に結合するために、第２ヌクレオチド配列を含む分子の第２の組を含む、
３）該第１ヌクレオチド配列と該第２ヌクレオチド配列間の非特異的結合を減少させるために、ブロッキング剤を使用することであって、該ブロッキング剤が、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む核酸の配列を含む、
を含む方法。
【請求項９】
前記ブロッキング剤が、相補的標準ヌクレオチド塩基の配列に結合したときに、同一の核酸配列を持つが、前記改変ヌクレオチドの代わりに該改変ヌクレオチドと同一の塩基を持つ標準ヌクレオチドを有している薬剤の融解温度よりも高い融解温度（Ｔｍ）を持つ、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分子の第２の組がさらに、検出可能なシグナルを生じるための標識を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記分子の第２の組がさらにデンドリマーを含み、該デンドリマーが検出可能なシグナルを生じるための標識を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
マイクロアレイを、少なくとも１つのＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）−２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環式単量体ユニット）の残基を含むオリゴヌクレオチドを含む混合物と接触させることであって、該マイクロアレイが多数の特徴を含み、該特徴がヌクレオチド配列の第１の組を含む工程を含む、方法。
【請求項１３】
さらに、前記マイクロアレイを検出可能なシグナルを生じるための標識化標的分子と接触させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＤＮＡ分子を、前記マイクロアレイに加え、該マイクロアレイにハイブリダイズしなかった該ｃＤＮＡ分子を除去するために該マイクロアレイを洗浄し、続いて標識化デンドリマーを、該マイクロアレイへの該ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの後に、該ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために該マイクロアレイに加える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＬＮＡを含む前記オリゴヌクレオチドを前記マイクロアレイに対してハイブリダイズさせ、標識化標的分子を該マイクロアレイに加え、ＬＮＡを含む前記オリゴヌクレオチドを、該標識化標的分子を加える前に、該マイクロアレイにハイブリダイズさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合物が標的分子を含み、前記マイクロアレイを該混合物と接触させる前に、該標的分子をＬＮＡを含む前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
１）マイクロアレイを使用することであって、該マイクロアレイは多数の特徴を含み、該特徴にはプローブヌクレオチド配列が含まれ、
２）試料を該マイクロアレイに加えることであって、該試料は、前記標的分子に相補的な該マイクロアレイ上の任意の該プローブヌクレオチド配列に結合するための標的分子を含み、
３）該標的とプローブ分子間の非特異的結合を減少させるために、ブロッキング剤として、ＬＮＡ薬剤を使用することであって、前記ＬＮＡ薬剤は少なくとも１つのロックド核酸の残基を含むオリゴヌクレオチドであり、該ロックド核酸残基は、２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環式単量体ユニットである、
を含む方法。
【請求項１８】
標的分子が、検出可能なシグナルを生じるための標識を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分子が、ｃＤＮＡ分子であり、さらに以下の順番で以下の工程
ａ）該ｃＤＮＡ分子を前記マイクロアレイに加えること、
ｂ）該マイクロアレイにハイブリダイズしなかった該ｃＤＮＡ分子を取り除くために、該マイクロアレイを洗浄すること、
ｃ）前記プローブヌクレオチド配列にハイブリダイズした該ｃＤＮＡ分子に対するハイブリダイゼーションのために、デンドリマー分子を該マイクロアレイに加えること、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記マイクロアレイに前記標的分子を加える前に、前記ＬＮＡ薬剤を該マイクロアレイにハイブリダイズさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的分子を、前記ＬＮＡ薬剤にハイブリダイズさせ、続いて該ＬＮＡ薬剤にハイブリダイズした該標的分子を、前記マイクロアレイに加える、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
１）マイクロアレイを使用することであって、該マイクロアレイは多数の特徴を含み、該特徴にはプローブヌクレオチド配列が含まれ、
２）ａ）標的試料のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ薬剤を含む第１成分であって、該ｃＤＮＡは捕獲配列を含む、
ｂ）検出可能なシグナルを生じるための標識を含む少なくとも１つの第１のアーム、および該捕獲配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくとも１つの第２のアームを持つデンドリマーを含む第２成分、および
ｃ）該マイクロアレイ上のブロッキング剤としての使用のための、ＬＮＡ（ロックド核酸：２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環式単量体ユニット）残基を含む合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む第３成分、
を含む混合液と、該マイクロアレイを接触させること
の工程を含む方法。
【請求項２３】
さらに、前記第１成分が前記第２成分に結合することを可能にするのに十分な温度および時間で、該第１成分および該第２成分を混合する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１ヌクレオチド配列を前記第１成分に結合することを可能にするために、前記混合物を前記マイクロアレイとともにインキュベートする工程をさらに含み、そこでそのような結合が結果として、前記検出可能なシグナルの放射を生じる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｃＤＮＡ薬剤中で、前記ｍＲＮＡの逆転写を開始するのに十分な条件下で、多量の捕獲配列を持つＲＴプライマー、逆転写酵素およびヌクレオチドと、該標的試料ｍＲＮＡを接触させることによって、該ｃＤＮＡ薬剤を含む第１成分を形成する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物のインキュベーション前に、前記第１成分より、過剰なハイブリダイズしていないＲＴプライマーを取り除く工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記浄化工程がさらに、前記第１成分を、スピンカラム培地を通す工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロアレイを、前記標識からのシグナルを検出するためにスキャンすることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロアレイと前記混合物のインキュベーションの後に、該マイクロアレイに結合していないデンドリマーを取り除くために、該マイクロアレイを洗浄する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
マイクロアレイ上での検出およびアッセイのための方法であって、
１）ａ）標的試料のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ薬剤を含む第１成分であって、該ｃＤＮＡは捕獲配列を持つ、および
ｂ）検出可能なシグナルを生じるための標識を含む少なくとも１つの第１のアームおよび前記捕獲配列に相補的な第２ヌクレオチド配列を持つ少なくとも１つの第２のアームを持つデンドリマーを含む第２成分、
を含む混合物をインキュベートすることであって、
該第１成分が前記第２成分に結合し、予めハイブリダイズさせたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を形成するように誘導するために十分な第１温度、時間にて該混合物をインキュベートすること、
２）マイクロアレイを該混合物と接触させることであって、該マイクロアレイは多数の特徴を含み、該特徴には、ヌクレオチド配列の第１の組が含まれること、および
３）該ｃＤＮＡ薬剤の任意の配列に相補的である第１ヌクレオチド配列の前記組のいずれかに結合するように、該予めハイブリダイズさせたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体を誘導するのに十分な第２温度および時間で、該マイクロアレイと該予めハイブリダイズさせたｃＤＮＡ−デンドリマー複合体をインキュベートすることであって、そのような結合によりハイブリダイゼーションパターンが該マイクロアレイ上に生じるように、前記検出可能なシグナル放射する該特徴となる、
工程を含む方法。
【請求項３１】
キットを含む装置であり、該キットはデンドリマーおよびブロッキング剤を含み、該ブロッキング剤は改変ヌクレオチドを含む、装置。
【請求項３２】
前記キットがさらにＲＴプライマーを含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記キットがさらにＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３４】
前記ブロッキング剤がＬＮＡを含む、請求項３１に記載の装置。
【請求項３５】
前記キットがマイクロアレイでの使用のために提供される、請求項３１に記載の装置。
【請求項３６】
前記キットがさらにＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、請求項３２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明明細書は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている、２００１年８月３１日に出願された、米国仮出願明細書番号第６０／３１６，１１６号の優先権を請求する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ、さらに詳細には、マイクロアレイに対する核酸配列試料のハイブリダイゼーションの間の、非特異的相互作用をブロックするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子発現パターンまたはＤＮＡ配列の変化は、生物学的機能に大きな影響を与えることができる。遺伝子発現におけるそのようなバリエーションは、生理学的および病理学的プロセスを変化させる場合がある。ＤＮＡ技術の開発により、大規模なレベルでの、遺伝子発現および遺伝子のバリエーションを同定するための、迅速かつ費用効果の高い方法が提供されつつある。
【０００４】
ＤＮＡ分析のために有用な１つの高速技術は、ガラス、シリコンまたはナイロン膜のプレートのような、実質的に平面の基質、安定して間隔を空けて配置された多数の異なるＤＮＡまたは遺伝子プローブ（すなわちポリヌクレオチド）を含むＤＮＡマイクロアレイである。そのようなマイクロアレイが開発されており、遺伝子のバリエーションまたは変異の存在に関して（例えば、遺伝子型分析）、または遺伝子発現のパターンに関して、試料を分析することのような一定の範囲の適用で使用されてきており、そして、数百の同等の個別の「試験チューブ（ｔｅｓｔ−ｔｕｂｅ）」実験の実施が、短期間に実施される。
【０００５】
全てのマイクロアレイは、同様の原理に基づいて操作される。カバーガラススライドのような基本的に平面の基質を、直径にして約２０〜１００ミクロンのきわめて小さなスポットの格子によってコートする。それぞれのスポット（すなわち、特徴）には、数百万の、ＤＮＡまたはヌクレオチドの短い配列のコピーが含まれる。コンピュータが、予め決定した特徴にて、各配列のトラックを保持する。分析を行うために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が細胞試料から抽出される。酵素を用いて、数百のｍＲＮＡ分子のコピーが複製される。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のコピーは、逆転写によってｍＲＮＡから生成される。ｃＤＮＡコピーは、蛍光マーカーのようなマーカーまたは標識でタグ化され、短い断片に分割される。タグ化断片はマイクロアレイ上で洗浄され、一晩放置され、タグ化断片は、マイクロアレイに結合しているＤＮＡとハイブリダイズさせられる。
【０００６】
ハイブリダイゼーションの後、蛍光ｃＤＮＡと対合したマイクロアレイ上の特徴は、顕微鏡で見ることができるか、またはコンピュータによって検出可能である蛍光シグナルを放射する。この様式において、マイクロアレイ上のどの配列が、試験試料のｃＤＮＡにマッチするかを知ることが出来る。時折ミスマッチが存在するが、各スポットまたは特徴において、数百万のプローブを使用することで、相補的ｃＤＮＡが存在する場合にのみ蛍光が検出されることが保証される。蛍光シグナルの強度がより高ければ高いほど（すなわちスポットが明るければ明るいほど）、マッチしているｃＤＮＡが細胞中により多く存在していることになる。
【０００７】
マイクロアレイが有用である１つの領域は、遺伝子発現分析である。マイクロアレイを利用する遺伝子発現分析においては、「プローブ」オリゴヌクレオチドのアレイは、対象の核酸試料、すなわち特定の組織型から抽出されたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡのような、標的と接触させられる。接触は、ハイブリダイゼーション条件下で実施され、次いで結合しなかった核酸が除去される。得られたハイブリダイズした核酸のパターンは、試験した試料の遺伝的プロファイルに関連する情報を提供する。遺伝的プロファイルとは、試料中に存在する核酸の型に関連した情報（例えば、相補的である遺伝子の型、ならびに、試料中の各特定の核酸のコピー数）を含むように意図される。遺伝子発現分析は、例えば遺伝子の新規発現の同定、特定の表現系への遺伝子発現の相関、疾患傾向に関するスクリーニング、および例えば、毒性試験において細胞の遺伝子発現に対する特定の薬剤の作用を同定することを含む種々の適用で使用することができる。
【０００８】
公知の方法を使用して、多数の遺伝子プローブが、例えば、ロボットまたはレーザーリソグラフィック処理によって、マイクロアレイの表面に固定または印刷される。標識化標的分子が、続いて、これらのプローブに加えられ、アレイが洗浄されて、ハイブリダイズしなかった標的分子が除去される。
【０００９】
例えば、マイクロアレイ上での使用のための試料は、細胞試料から抽出された、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または全ＲＮＡを用いて調製することができる。鋳型として使用するｍＲＮＡは、逆転写され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）標的分子を生じる。蛍光のような１つまたはそれ以上の標識またはマーカーは、逆転写プロセスの間に、ｃＤＮＡのコピーに直接組み込まれる（標識化は、その蛍光シグナルに関してスキャンすることによって、これらのｃＤＮＡ分子の続く検出を可能にするように行われる）。ｃＤＮＡの標識化コピーは短い断片に分離され、マイクロアレイ上で洗浄される。適切なハイブリダイゼーション条件下で、標識化断片は、その検出の準備のために、マイクロアレイの特徴に結合させられた相補的な核酸配列（すなわち遺伝子プローブ）とハイブリダイズまたは結合させられる。この標識化方法は、「直接組み込み（ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」と一般に呼ばれる。
【００１０】
（図１で示されるような）他の方法では、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、多量のヌクレオチド塩基（デオキシヌクレオチド三リン酸、ＤＮＴＰ）、およびそれに結合させられた捕獲配列部分を持つ酵素および逆転写酵素（ＲＴ）プライマーオリゴヌクレオチドとともに、全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）+  ＲＮＡを含むｍＲＮＡ試料から調製される。あるいは、リボ核酸（ＲＮＡ）から相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を合成するための他のプロセスもまた使用することができ、これには、米国特許第５，７１６，７８７号および第５，８９１，６３６号にて開示された、Ｖｏｎ  Ｇｅｌｄｅｒ、Ｖｏｎ  Ｚａｓｔｒｏｗ、Ｂａｒｃｈａｓ  ａｎｄ  Ｅｂｅｒｗｉｎｅの方法が含まれるが、これに限定されない。
【００１１】
新規に形成されたｃＤＮＡは、次いで、ｍＲＮＡ試料から単離され、エタノールで沈殿させられる。次いで、ｃＤＮＡを相補的な遺伝子プローブとともにマイクロアレイにハイブリダイズさせるために、ｃＤＮＡはｃＤＮＡハイブリダイゼーションバッファ中に懸濁させられ、一晩インキュベートされる。調製されたマイクロアレイへのｃＤＮＡのハイブリダイゼーション後に、マイクロアレイが洗浄されて、任意の過剰なＲＴプライマーオリゴヌクレオチドが除去される。ｃＤＮＡは、標識、および捕獲配列に相補的な配列の両方を持つ分子（例えばデンドリマー）を用いて標識化される。
【００１２】
マイクロアレイへのｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの際に、ｃＤＮＡが、直接の組み込みまたは捕獲配列を用いてされるかどうかにはかかわらず、検出可能なシグナル（例えば、蛍光）は、それに結合させられた相補的遺伝子プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡ断片を含むそれぞれの特徴からのポジティブ出力について、放射される。検出可能なシグナルは、適切なセンサー装置または顕微鏡で見ることができ、次いでハイブリダイゼーションパターンを作製するために、コンピュータまたはユーザーによって検出されうる。それぞれの特徴での核酸配列は知られているので、特定の特徴における任意のポジティブ出力（すなわちシグナル産出）は、試料細胞中に相補的ｃＤＮＡ配列が存在することを示している。時折ミスマッチが存在するが、各スポットまたは特徴に数百万の遺伝子プローブを結合させることにより、検出可能なシグナルが、試験試料の相補的ｃＤＮＡが存在する場合にのみ、強く放射されることが保証される。
【００１３】
本発明に関連して、（あらゆる型の標識化分子を、本明細書で開示される本発明で使用することができるが）樹状核酸分子が、その検出能力のために特に好ましい。樹状核酸分子またはデンドリマーは、複雑で多く分岐した分子であり、多数の互いに連結された二本鎖ＤＮＡの天然または合成の単量体サブユニットから構成される。デンドリマーは、Ｎｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１８７，２７３−２８４（１９９７）、Ｓｔｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  Ｎｏｖｅｌ，  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３：９３−９９（２０００）、および米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号、第５，４８７，９７３号、第６，０７２，０４３号、第６，１１０，６８７号および第６，１１７，６３１号のような種々の米国特許に、より詳細に記述されている。これらの全ての刊行物は、参照することにより本明細書に組み込まれている。
【００１４】
デンドリマーは、２つの鍵となる機能を添えるために使用される、表面上に、２つの型の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム（ａｒｍ）」を含む。単一のデンドリマー分子は、表面上に少なくとも百のそれぞれの型のアームを持つことができる。一方のアームの型は、標的特異性を確立するために、特定の標的化分子の結合に使用され、他方は標識またはマーカーの結合に使用される。標的およびデンドリマーの標識特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートいずれかとして結合される。単純なＤＮＡ標識化、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション反応を用いて、デンドリマー分子は、高度に標識化された、標的特異的プローブとして働くように構成されうる。
【００１５】
調製された混合物は、適切なバッファの存在下で作られ、１つの型の「アーム」に結合された蛍光標識、およびＲＴプライマーが結合するｃＤＮＡ断片の捕獲配列に相補的な、他方の型の「アーム」に結合されたオリゴサッカライドとの、デンドリマーを含むデンドリマーハイブリダイゼーション混合物を生じる。ｃＤＮＡまたはデンドリマーの、アレイ表面上にスポットされた核酸への非特異的相互作用をブロックするために設計されたオリゴヌクレオチドもまたこの時点で加えられる。多数の同じ核酸塩基を含むブロッキングオリゴヌクレオチドが、マイクロアレイ表面上でのＲＮＡ試料および核酸プローブに由来するｃＤＮＡ上で見られる、同一の相補的塩基の長い鎖をブロッキングするために使用される。本発明においては、以下に記述されるように、融解温度（Ｔｍ）を変化させる改変ヌクレオチドを持つブロッキングオリゴヌクレオチドが、先行技術のブロッキング分子よりも優れていることが見出された。
【００１６】
デンドリマー分子を含むデンドリマーハイブリダイゼーション混合物が、次いで、マイクロアレイに加えられ、一晩インキュベートされて、ハイブリダイゼーションパターンが作製される。ｃＤＮＡのデンドリマーへのハイブリダイゼーション後、マイクロアレイが洗浄され、過剰なハイブリダイズしていないデンドリマーが洗い流される。マイクロアレイがスキャンされ、標識によって生じたシグナルが検出され、ハイブリダイゼーションパターンの遺伝子発現分析が可能となる。本方法を用いる１つの欠点として、試料を調製するため、およびハイブリダイゼーションおよび洗浄工程を含むアッセイを実施するために長い時間および過度の労力が必要であることが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
感度、低バックグラウンド「ノイズ」、および最小「偽陽性」のような所望の特性を犠牲にすることなく、試料の調製およびアッセイの実施に費やす時間および労力の量を有意に減少させることが、非常に望まれている。さらに、遺伝子試料の調製および遺伝子発現分析のためのアッセイに必要な複雑さおよび工程を有意に減少させ、そして従来の実験用試薬、実験器具および技術を用いて実施可能である方法を提供することは、遺伝子発現検出マイクロアレイの分野での有意な進展である。従って、アレイ上での非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする方法を用いてそのような目的を達成することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
本発明は、概して、核酸配列間の非特異的および特異的ハイブリダイゼーションをブロックするための方法に関する。本発明にしたがうと、核酸分子のハイブリダイゼーションの間の非特異的相互作用を最小化または減少させるために、ブロッキング剤を使用する工程を含む１つの方法が提供される。ここでは、上記ブロッキング剤は、その中に、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを持つ。この改変ヌクレオチドは、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの改変型であるヌクレオチドであり、それでもなお、ワトソン−クリック塩基対合規則に従う。従って、改変ヌクレオチドは、相補的標準ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドに対して親和性を持つが、その親和性は、それらの相補物に関する、標準的なＤＮＡヌクレオチドのものとは異なる。結果として、それらを含む核酸配列は、その中に標準的なＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドを含むだけの標準的な二本鎖配列よりも、より高いかまたは低い融解温度（Ｔｍ）を持つ。例えば、改変ヌクレオチドであるアデニン塩基（Ａ’）は、標準的なチミジン塩基（Ｔ）に対して、標準的なアデニン塩基（Ａ）の同一の標準的なチミジン塩基（Ｔ）に対する親和性よりも大きな親和性を持つように提供され得るなどである。結果として、そして本発明のさらなる利点として、ブロッキング剤は、適用したストリンジェンシーをかけること、すなわち、物理的パラメータを変化させることによって、特異的結合相互作用と非特異的結合相互作用との識別する能力を与える。
【００１９】
本発明の方法は、種々の適用で使用可能であり、マイクロアレイとの併用に特に有用である。例えば、本発明は、マイクロアレイ表面上の相補的プローブに対する非特異的ハイブリダイゼーション、ならびにｃＤＮＡおよび他の核酸試料のハイブリダイゼーションにより得られるシグナルの量の有意な減少を提供するために使用することができる。従って、優れた感度および低いバックグラウンド「ノイズ」および最小「偽陽性」を持つ、マイクロアレイアッセイが得られる。アッセイのパラメータは、反応温度またはブロッキング剤中の改変ヌクレオチドの数のような、反応条件の物理的パラメータを調整することによって、アレイ上のプローブ分子に対する標識化標的分子の所望のハイブリダイゼーションに関して、所望の程度の効率および特異性を生じるように調整することができる。
【００２０】
ブロッキング剤それ自身は、核酸配列に結合して、別の核酸がそれに結合すること、特に、非特異的に結合することを妨げる分子である。その全体が核酸配列である分子が好ましいが、あるいはその中に核酸配列が組み込まれている分子であってもよい。
【００２１】
当業者は、非特異的結合を生じる可能性がある適用において、予想されるヌクレオチド配列に基づいてブロッキング剤の配列を設計するかまたは選択することができ、同様に、予想される条件に基づいて、どの型の改変核酸を使用するかを選択することができる。
【００２２】
マイクロアレイの場合は、例えば、ブロッキング剤は、標識化標的分子による非特異的結合を引き起こすことが知られているプローブ配列に結合させるために使用され、特定のそのようなプローブ配列は、当該分野でよく知られている。例えば、アレイを作製するために一般に使用される手順により、アレイ上にポリ−Ａ鎖を持つ各スポットにおけるヌクレオチド配列ができる。通常、標識化ｃＤＮＡ標的分子のポリ−Ｔテールは、アレイ上のプローブ分子の任意の相補的遺伝子に対してｃＤＮＡ配列がハイブリダイゼーションする代わりに、そのようなポリ−Ａ配列にハイブリダイズして非特異的シグナルを生じる可能性がある。結果として、この場合に非特異的シグナルを消去するために、その中に改変ヌクレオチドが組み込まれているポリ−Ａオリゴヌクレオチドの形態のブロッキング剤を使用することによって、ポリ−Ｔ配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションをブロックする薬剤が設計される。これらのポリ−Ａオリゴヌクレオチドは、強くポリ−Ｔ配列に結合して、非特異的シグナルを生じるアレイへのｃＤＮＡポリＴ配列の結合を妨げる。同様の様式で、アレイ上のポリ−Ｔの鎖は、ポリ−Ａブロッキング剤を用いることにより、標的ＲＮＡ分子のポリ−Ａへの結合をブロックすることができる。従って、本発明のもっとも一般的な適用においては、ブロッキング剤は、ポリ−Ｔまたはポリ−Ａ配列からなる。しかしながら、ポリ−Ａおよびポリ−Ｔのハイブリダイゼーションは、非特異的結合のもっとも一般的な形態であり、本発明は、これらの配列の使用に限定されない。むしろ、結果として望ましくない非特異的結合相互作用を生じ得る任意のプローブまたは標的配列に対する相補的な配列を有しているブロッキング剤を提供することができる。
【００２３】
好ましい実施形態においては、ブロッキング剤の改変ヌクレオチド（単数または複数）は、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）ヌクレオチド（「ＬＮＡ」−２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環単量ユニット）である。そのようなＬＮＡヌクレオチドは、ブロッキング剤のハイブリダイゼーションが、結果として、従来型の二本鎖ＤＮＡ配列よりも高い融解温度を持つ構造となるように、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドよりもプローブヌクレオチドに対して強い親和性を持つ。あるいは、またはさらに、ブロッキング剤は、その中にペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（「ＰＮＡ」））を含む（すなわち、ペプチド骨格を持つ、改変ヌクレオチド塩基）。しかしながら、他の改変ヌクレオチドを、同様に本発明と矛盾なく使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な記述および好ましい実施形態
同様の参照文字が同様の部分を示す以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、本明細書の構成部分である特許請求の範囲によって意図されるような本発明の限定とは解釈されるべきでない。
【００２５】
本発明をさらに記述する前に、本発明は、本明細書で記述した本発明の特定の実施形態に限定されるものではなく、特定の実施形態の変法を行うこともでき、それらもなお、本発明または付随する請求項の範囲内であることが理解されるべきである。さらに、使用される技術は、特定の実施形態を記述する目的のためであり、制限する意図はないことが理解されるべきである。
【００２６】
本発明は、概して、非特異的シグナルの有意な減少を提供する様式で、マイクロアレイ上での検出およびアッセイのための方法に関する。当該分野で公知であるように、非特異的シグナルは、試料（対象）の同定に関する有用であるかまたは関係する情報を提供しない、アレイ表面上での分子への試料の結合に関連する。例えば、標的分子がポリ−Ａテールを持つｍＲＮＡを含む試料から調製されたｃＤＮＡである場合は、ポリ−ＴテールがｃＤＮＡの作製の結果として存在し、これはｃＤＮＡが由来するｍＲＮＡの配列に関する、有用であるかまたは関連する情報を提供しない、標的のプローブに対する結合を生じ得る。
【００２７】
本発明の方法は、実験室および臨床的な用途に必要な、低いバックグラウンド「ノイズ」、最小限の「偽陽性」の利点を提供する。それから核酸配列試料が調製され、それにより本発明の方法を、従来の実験室技術、実験器具および試薬を使用して実施することができる、費用効果が高くかつ十分な様式により、それらは研究および臨床的用途にとくに適切である。
【００２８】
これらの目的を達成するために、本発明は、核酸分子の他の核酸配列への非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるブロッキング剤を利用する。これらのブロッキング剤は、その中に改変ヌクレオチドを持つ核酸配列薬剤を有している薬剤である。本発明の好ましい実施形態においては、ブロッキング剤は、核酸配列中の改変ヌクレオチド（単数または複数）として、１つまたはそれ以上のＬＮＡ（ロックド核酸）残基を持つ。別の実施形態においては、１つまたはそれ以上のＰＮＡ残基または他の改変ヌクレオチドを使用することができる。
【００２９】
ＬＮＡ分子は、ワトソン−クリック塩基対合規則にしたがう新規のＤＮＡ類似体であり、高い熱安定性を有しているＤＮＡまたはＲＮＡ−ヘテロ二本鎖を形成する。ＬＮＡ分子は、これまでに、例えば、単一ヌクレオチド多型検出（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）における、マッチ標的配列またはミスマッチ標的配列間を識別する優れた能力を有していることが示されている。
【００３０】
図４に示されるように、フラノース環の通常の立体配座の自由度は、２’−Ｏ位を４’−Ｃ位に連結するメチレンリンカーを用いて、これらの分子内で制限されている。好ましくはＬＮＡ分子は、Ｐｒｏｌｉｇｏ、ＬＬＣ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ（ｗｗｗ．ｐｒｏｌｉｇｏ．ｃｏｍ）から、またはエキシクオンＡ／Ｓ（Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ）、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ（ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ）より得られる。あるいは、これらは、ＤＮＡ合成装置を使用して、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成することができる（また、Ｓａｎｊａｙ  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，「ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．」）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＧＢ，Ｎｏ．４，Ｆｅｂ．２１，１９９８も参考のこと、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている）。図４に示される構造以外に、２’−酸素原子が窒素または硫黄にて置換された、他の類似体も使用することができる。さらに別の実施形態においては、ＬＮＡのａ−Ｌ−リボジアステレオ異性体形態を使用することもできる。
【００３１】
ＰＮＡに関して、ＰＮＡモノマーは、４つの塩基（アデニン、グアニン、チミジンまたはシステイン）の１つに、メチレンカルボニル結合によって連結された２−アミノエチルグリシンである。標準的なヌクレオチドとは違い、ＰＮＡは、ペントース糖リン酸基を欠く。ＰＮＡの一般的構造は図５に示されている。
【００３２】
アミノ酸と同様に、ＰＮＡモノマーは、アミノ末端およびカルボキシ末端を持つ。ＰＮＡモノマーは、ペプチド結合によって、一本鎖オリゴマーに連結される。慣例により、ＰＮＡオリゴマーは、第１位にそのＮ−末端を持つペプチドとして記述される（図２）。この末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の３’末端に相当し、相補的一本鎖ＤＮＡの５’末端にハイブリダイズするＰＮＡのＮ末端を含む。従って、核酸配列を記載する際の５’から３’への慣例とは違い、ＰＮＡ配列は通常、３’から５’へ記述される。これらに関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている、Ｂ．Ｈｙｒｕｐ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．  Ｎｉｅｌｓｅｎ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  （ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」ｖｏｌ．４、ｎｏ．１、ｐｐ．５−２３（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ，１９９６）にて提供される。
【００３３】
ＰＮＡモノマーが本発明と矛盾なく使用できる一方で、ＰＮＡモノマーは、現在、２０塩基ほどの長さのオリゴマーにしか合成できないという事実のような要因のために、いくつかの適用においては特定の欠点がある。同様に、その融解温度は、ある最大レベルにて最高に達する傾向があり、制限が存在しないＬＮＡとは対照的である。結果として、ＬＮＡは一般的に、本発明のブロッカーについての改変ヌクレオチドの選択肢として好ましい。
【００３４】
本発明の方法においては、本質的に平面な基質の表面に固定されたか、または安定に結合されたＤＮＡまたは遺伝子プローブのアレイは、相補的プローブ／標的複合体のハイブリダイゼーションパターンを生じるために十分なハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸の試料と接触させられる。使用することができる種々の異なるマイクロアレイは、当該分野で公知である。ハイブリダイズした核酸の試料は次いで、標識化プローブによって標的化され、ハイブリダイズされて、特定のハイブリダイゼーションパターンに相当する検出可能なシグナルを生じる。標的核酸にハイブリダイズした個々の標識化プローブは全て、公知の強度の同一のシグナルを生じることができる。従って、マイクロアレイ中の個々のポジティブシグナルは、標的核酸試料の遺伝的プロファイルに関する定量的情報を得るために「計数（ｃｏｕｎｔｅｄ）」することができる。
【００３５】
標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションが可能であるマイクロアレイのＤＮＡまたは遺伝子プローブは、ポリヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーション類似体またはミメティックでありうる。それらの例として、ホスホジエステル結合が、ホリホロチオエート、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、グアニジンなどの別の結合基によって置換された核酸、リボースサブユニットが、例えばヘキソースホスホジエステルによって置換された核酸、ペプチド核酸などをあげることができるが、これらに限定はされない。プローブの長さは、一般的に１０〜１０００ヌクレオチドである。本発明のいくつかの実施形態においては、プローブは、１５〜１５０ヌクレオチド、より一般的には１５〜１００ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドでありえる。他の実施形態においては、プローブは、より長く、通常長さにして１５０〜１０００ヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドプローブは、一本鎖または二本鎖、通常は一本鎖であり得、ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片であり得る。基質の表面上のＤＮＡまたは遺伝子プローブは、好ましくは、分析される生理学的源の公知の遺伝子に対応し、ポジティブなハイブリダイゼーション事象が、標的核酸試料が由来する生理学的源の特定の遺伝子の発現に関連しうるように、既知の位置にてマイクロアレイ上に配置されうる。標的核酸試料が産出される様式により、以下に示されるように、遺伝子プローブのマイクロアレイは一般的に、それらが対応する遺伝子の非鋳型鎖に相補的である配列を持つ。
【００３６】
遺伝子プローブが安定に結合させられる基質は、プラスチック、セラミック、金属、ゲル、膜、ガラスなどを含む種々の材料から加工されうる。マイクロアレイは、遺伝子プローブを先に形成させ、次いでこれらを支持体の表面に安定に結合させるか、遺伝子プローブを直接支持体上で成長させるような、任意の便利な従来の方法に従って産出することができる。多くの異なるマイクロアレイ構造およびその製法が、当業者に公知であり、そのうちの１つは、その内容が、参照することにより本明細書に組み込まれている、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，８３，１９９９に記載されている。
【００３７】
本明細書で使用する語句「標識」は、直接、またはシグナル産出システムの１つまたはそれ以上のさらなるメンバーとの相互作用を介して、検出可能なシグナルを提供することができる薬剤を意味する。直接検出可能であり、本発明での使用が見出されうる標識には、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素、蛍光色素ホスホルアミダイトなどの蛍光標識、および32Ｓ、32Ｐ、3Ｈなどの放射性同位元素などが含まれる。シグナル産出系の１つまたはそれ以上の追加メンバーとの相互作用を介して、検出可能なシグナルを提供する標識の例には、相補的結合対メンバーに特異的に結合する捕獲部位が含まれ、相補的結合対メンバーには、上記の蛍光部位などの直接検出することができる標識部分が含まれる。標識は、好ましくは、可変シグナルを提供しないが、代わりに、一定の時間に渡り、一定または再生可能なシグナルを提供する標識である。
【００３８】
本発明の方法に従って、それに安定に結合させられたプローブ核酸配列を有している望ましいマイクロアレイが提供される。さらに、研究の対象の標的分子を有している試料が、提供される。標的分子は、任意の望ましい方法により、以下にさらに詳細に議論されるような、標識分子の直接組み込み、またはデンドリマーのような、適切な標識分子への標的のハイブリダイゼーションのような他の方法のいずれかによって標識される。標的分子は、アレイへの標識の添加の前または後に標識することができるが、標識化の前が一般的に好ましい。
【００３９】
従って、１つの好ましい実施形態においては、任意の適切な順番で、以下の複数の工程を含む方法が提供される。多数の特徴を含むマイクロアレイを使用することであって、ここで、各特徴はプローブヌクレオチド配列を持つこと。マイクロアレイに標識を適用することであって、ここで試料は、標的分子に相補的であるマイクロアレイ上の任意のプローブヌクレオチド配列への結合のための標識分子を含むこと。および標識とプローブ分子との間での非特異的結合を減少させるために、ブロッキング剤を使用することであって、上記ブロッキング剤には、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む核酸の配列が含まれ、上記改変ヌクレオチドはペプチド骨格を持たず、上記改変ヌクレオチドを含むブロッキング剤は、同一の配列の核酸を持つが、改変ヌクレオチドの代わりに標準的なヌクレオチド塩基を持つ薬剤と比べてより高い融解温度（Ｔｍ）を持つこと。
【００４０】
さらに好ましい実施形態においては、任意の適切な順番で、以下の複数の工程を含む方法が提供される。その上に多数の特徴を持ち、各特徴がプローブヌクレオチド配列を持つ、マイクロアレイを使用すること。試料を上記マイクロアレイに加えることであって、ここで、上記試料は、マイクロアレイ上の任意の相補的なプローブ配列に結合するために、その中に標的分子を持つこと。および標的およびプローブ分子間の非特異的結合を減少させるために、ブロッキング剤として、ＬＮＡ薬剤を使用することであって、ここでＬＮＡ薬剤は、ロックド核酸の残基を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、上記ロックド核酸残基は、２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を持つ改変二環式単量体ユニットであること。
【００４１】
さらに好ましい実施形態においては、標的分子は、その中に直接または間接的に標識またはタグが組み込まれている。さらに好ましい実施形態においては、標的分子は、標的試料のｍＲＮＡから得たｃＤＮＡ薬剤を含むが、あらゆる標的分子を本発明と矛盾なく使用することができる。
【００４２】
従って、ブロッキング剤は、標的分子とプローブ分子間の非特異的結合を生じる核酸配列に結合するために使用される。通常、ブロッキング剤は、プローブの核酸配列に結合させるために、マイクロアレイに加えられ、プローブ配列が標的に結合することを「ブロックする（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」。しかしながら、別の実施形態においては、ブロッキング剤は、標的の核酸配列をブロックするために試料に加えることもできる。いずれの実施形態でも、本発明と矛盾なく、ブロッキング剤をアレイへの試料の適用の前に、またはそれと同時に加えることができる。
【００４３】
本発明のさらに適切な実施形態においては、樹状核酸分子またはデンドリマーが、標識として使用される。デンドリマーは複雑で多く分岐している分子であり、多数の互いに結合している二本鎖ＤＮＡの天然または合成の単量体サブユニットから構成されている。デンドリマーは、参照することにより本明細書に全内容が組み込まれている、Ｎｉｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１８７，２７３−２８４（１９９７）に記載されている。デンドリマーの構造および産出に関するさらなる情報は、それぞれの内容が参照することにより本明細書に組み込まれている、米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号および第５，４８７，９７３号にて開示されている。
【００４４】
デンドリマーは、２つの鍵となる機能を結合するために使用される、２つの型の一本鎖ハイブリダイゼーション「アーム（ａｒｍｓ）」を表面上に含む。一つのデンドリマー分子は、少なくとも１００のそれぞれの型のアームを持つことができる。一方の型のアームは、標的特異性を確立するための標的化分子（例えば捕獲配列）への結合に使用され、他方は、標識またはマーカーへの結合に使用される。デンドリマーの標的および標識特異性を決定する分子は、オリゴヌクレオチドとして、またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートとしてのいずれかで結合させられる。単純ＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーション、およびライゲーション反応を用いて、デンドリマープローブを、高度に標識化された、標的特異的薬剤として作用するように構成することができる。
【００４５】
蛍光標識デンドリマーを調製するために、Ｃｙ３（Ｒ）ＲＴプライマーおよびＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー上の捕獲配列に相補的な配列が、以前に記述された方法（Ｎｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記、および米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号および第５，４８７，９７３号、上記を参照のこと）によって調製されるように、精製した樹状コア物質に別々に連結される。次いで、５’Ｃｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）を有している四層デンドリマーの外部アームに相補的な３０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが合成される。（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）。次いで、Ｃｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）オリゴヌクレオチドを、それぞれ、対応するデンドリマーの外部表面にハイブリダイズさせられるか、またはそれと共有架橋を形成させられる。次いで、過剰な捕獲および蛍光標識化オリゴヌクレオチドが、サイズ排除クロマトグラフィーのような技術によって除去される。
【００４６】
デンドリマーの濃度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計上で、２６０ｎｍにて、精製された物質の光学密度を測定することによって決定される。蛍光は、蛍光計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ、ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて、最適シグナル／ノイズ波長で測定される。Ｃｙ３は、５４２ｎｍにて励起され、放射は５７０ｎｍにて測定される。Ｃｙ５は６４１ｎｍにて励起され、６７６ｎｍにて放射が測定される。
【００４７】
先の発明においては、デンドリマープローブの使用は、デンドリマーの優れたシグナル増幅能力による感度の増大の一方で、アッセイの実施に必要な試料ＲＮＡの量を有意に減少させる。アッセイに必要なＲＮＡの量の減少によって、ＲＴプライマーの量も同様に、以下で議論されるように、シグナル発生改善のために減少させられうる。ＲＴプライマー量の減少はまた、アッセイの準備に必要な洗浄の回数を減少させる。
【００４８】
アッセイそのものに関して、望まれる場合には、逆転写されたｃＤＮＡが、ＬＮＡブロッカーの存在下で、またはその使用の後に、一晩アレイにハイブリダイズさせられる、連続ハイブリダイゼーション工程を使用する方法を使用することができる（「二工程法（ｔｗｏ  ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ）」）。ｃＤＮＡ分子の標的固定プローブへのハイブリダイゼーションの直後、結合していないｃＤＮＡおよびＬＮＡブロッカーをアレイから除去する洗浄手順が続く。蛍光標識デンドリマー分子（またはｃＤＮＡ内に組み込まれる捕獲配列に結合することができる他の分子）が、洗浄されたアレイに加えられ、この第２のハイブリダイゼーションの間に、適切な標的ｃＤＮＡに結合した捕獲配列にハイブリダイズさせられる。一般的には１５〜１８０分間実施される。過剰なデンドリマーが、第２の洗浄手順の間に洗い流され、アレイが先に議論されるようにスキャンされる。
【００４９】
あるいは、感度の増大および使用の簡便性のため、ならびに処理時間を大きく短縮させるために、本発明に従って、ハイブリダイゼーションプロセスを、単一工程「一工程（ａ  ｏｎｅ  ｓｔｅｐ）」プロセス）に減らすことができる。ハイブリダイゼーション速度および効率は、マイクロアレイへのｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの前に、ｃＤＮＡをデンドリマープライマーに最初にハイブリダイズさせることによって大きく増大させられる。この単一工程ハイブリダイゼーションプロセスはまた、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションバッファ（５０％  ホルムアミド、１０％  硫酸デキストラン、１×デンハルト溶液、０．２％  Ｎ−ラウロイルサルコシン、２５０マイクログラム／マイクロリットル  サケ精子ＤＮＡ、２×ＳＳＣ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、および二重蒸留水）の使用を省くことによって、ハイブリダイゼーションバッファの数を１つに減らすことができる。２工程および１工程プロセスに関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている、２００１年３月８日に出願された、ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０７４７７号にて提供されている。
【００５０】
望ましい場合には、好ましい実施形態においては、温度循環を使用して、標的核酸とマイクロアレイとの間でのハイブリダイゼーション、捕獲薬剤とマイクロアレイとの間のハイブリダイゼーション（好ましくは、それぞれ、ｃＤＮＡ−マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡ−デンドリマーハイブリダイゼーション）を選択的に制御することができる。そのような循環を使用することによって、ｃＤＮＡがまずマイクロアレイにのみハイブリダイズし、続いてｃＤＮＡがデンドリマーにハイブリダイズするように、ハイブリダイゼーションを注意深く制御することができる。この手順を用いて、２つの成分のそれぞれのハイブリダイゼーションの速度論、すなわち標的核酸のプローブへの、および捕獲薬剤の標的核酸へのハイブリダイゼーションの速度論を改善することができる。そのような温度サイクルの使用に関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている、２００１年１月１３日に出願された、米国仮出願明細書第６０／２６１，２３１号、ならびに本発明者らによる、およびＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙによって公開されているプロトコールにて提供される。
【００５１】
標的核酸は一般的に、天然に存在する供給源から誘導されたＲＮＡから逆転写されたＤＮＡであり、上記ＲＮＡは、全ＲＮＡ、ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡ、増幅されたＲＮＡなどからなる群より選択されうる。最初のｍＲＮＡ供給源は、種々の異なる試料中に存在する。試料は、典型的には、生理学的供給源に由来する。生理学的供給源は、種々の真核生物供給源より導かれ、対象の生理学的供給源は、酵母のような単細胞生物、および植物および動物、とりわけ哺乳動物を含む、多細胞生物由来の供給源である場合もあり、多細胞生物由来の上記生理学的供給源は、とりわけ多細胞生物の器官または組織から、あるいはそれらから導かれた単離細胞に由来してもよい。生理学的供給源から、分析すべき試料ＲＮＡを得る際には、生理学的供給源を、多数の異なる処理工程に適用してよく、そのような公知の処理工程には、組織均質化、細胞の単離および細胞質抽出、核酸の抽出などが含まれうる。細胞、組織、器官または生物体全体からＲＮＡを単離する方法は、当業者に公知であり、例えば、各内容が参照することにより本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２nd  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に記載されている。
【００５２】
試料ｍＲＮＡは、ハイブリダイズしたプライマーの酵素による伸張に十分である条件下で、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはＲＴプライマーをｍＲＮＡにハイブリダイズさせることによって、ｃＤＮＡの形態で標的核酸に逆転写させられる。プライマーは、ｍＲＮＡテールに対する十分なハイブリダイゼーションを提供するのに十分な長さであり、この領域は、典型的には長さにして１０〜２５ヌクレオチド、通常は、１０〜２０ヌクレオチド、より一般的には１２〜１８ヌクレオチドである。
【００５３】
適用には典型的には、配列特異的プライマーの使用が必要であるとの認識により、本発明において使用される標準的なプライマーにはさらに、「捕獲配列」ヌクレオチド部分が含まれる。本明細書で言及される好ましい捕獲配列は、Ｃｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー捕獲配列（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）、またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー捕獲配列（Ｏｌｉｇｏｓ  ｅｔｃ．Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）であり、以下に記載される。
Ｃｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー捕獲配列：
５’−ｇｇＣ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ｇＣｇ  ＣｇＴ  ＣＴＴ  Ｃｔｇ  ＴＣＣ  ＣｇＣ  Ｃ−３’、および
ＣＹ５（Ｒ）ＲＴプライマー捕獲配列：
５’−ＣＣＴ  ｇＴＴ  ｇＣＴ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ｇＴｇ  Ｃｃｇ  ＣＴＣ  Ｃｇｇ  Ｔ−３’
カスタムプライマーに関しては、上記捕獲配列が、対応するカスタムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端に結合されるべきである。この様式においては、カスタムプライマーは、標準的なＲＴプライマーと置き換わる。本発明が、標準ＲＴプライマーとの使用のために考案されているので、カスタムプライマーを使用する場合は、一部改変が必要である。そのような改変は、当業者に公知であり、使用されるＲＮＡの量および型に基づいて、プライマーの量および混合を調節することが含まれうる。プライマーは、上記のような、特定の配列のヌクレオチドからなる捕獲配列を有している。捕獲配列は、少なくとも１つの標識をさらに有している、デンドリマープローブのアームに結合させられたオリゴヌクレオチドに相補的である。そのような相補的オリゴヌクレオチドは、任意の外部ベクターから獲得することができ、また標識された部分として獲得することもできる。標識は、当該分野で公知であるように、直接、または結合基を介してのいずれかで、デンドリマープローブのアームに結合させられた、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドに結合させることができるる。好ましい実施形態においては、Ｃｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）標識化オリゴヌクレオチドを、デンドリマーアームにハイブリダイズさせ、架橋させることによって、デンドリマープローブが標識される。Ｃｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）標識化オリゴヌクレオチドは、それぞれＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー捕獲配列に対して相補的である。
【００５４】
標的核酸試料を作製する場合には、第１鎖のｃＤＮＡ合成を誘導するために十分な条件下で、逆転写酵素、およびプライマー伸張に必要な他の試薬の存在下で、プライマーをｍＲＮＡと接触させる。ここでは、追加の試薬として、ｄＮＴＰｓ、Ｔｒｉｓ．Ｃｌのようなバッファ剤、一価および二価両方、例えばＫＣｌ、ＭｇＣｌ2のような、陽イオン供給源、例えばジチオスレイトールのようなＲＮＡａｓｅ阻害剤およびスルフヒドリル試薬などが挙げられる。逆転写酵素活性を持つ種々の酵素、通常は、ＤＮＡポリメラーゼを、第１鎖のｃＤＮＡ合成工程に使用することができる。適切なＤＮＡポリメラーゼの例には、好熱性細菌および古細菌、レトロウイルス、酵母、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｓ）、霊長類および齧歯類からなる群より選択される生物体に由来するＤＮＡポリメラーゼが含まれる。逆転写酵素活性を有している適切なＤＮＡポリメラーゼは、生物体から単離可能であり、市販により得る、または当業者に公知の方法によって、クローニングされたポリメラーゼをコードしている高レベルで遺伝子を発現している細胞より得ることができる。ここで、ポリメラーゼを得るための特定の様式は、主に、利便性、コスト、有用性などのような要因に基づいて選択されうる。試薬を混合する順番は、望ましいように変更することができる。
【００５５】
１つの好ましい実施形態においては、ｃＤＮＡ合成プロトコールには、約０．２５〜１マイクログラムの全ＲＮＡから、または約１２．５〜５０ナノグラムのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡから、約０．２ピコモルのＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）およびＲＮａｓｅを含まない水を、最終容量約１０マイクロリットルで混合し、ＲＮＡ−ＲＴプライマーミックスを得ることが含まれる。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物は、次いで混合され、微量遠心分離し、微量遠心分離管の底に内容物を集めた。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液は、次いで、８０℃で１０分間加熱されし、すぐに氷に移された。氷上の別の微量遠心分離管中で、約４マイクロリットルの５×ＲＴバッファ、１マイクロリットルｄＮＴＰミックス、４マイクロリットルＲＮａｓｅを含まない水および１マイクロリットルの２００ユニットの逆転写酵素が一緒に混合される。穏やかに混合され、軽く微量遠心分離し、微量遠心分離管の底に内容物が集められて、反応混合液が得られる。ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液が反応混合液と混合され、次いで、第１鎖のｃＤＮＡプライマー伸張産物が形成されるのに十分な時間、通常は約２時間、約４２℃でインキュベートされる。
【００５６】
形成に続いて、ｃＤＮＡまたは標的核酸を含む混合物はさらに、精製されて、逆転写処理の完了後にまだ残っている過剰なＲＴプライマーが除去される。過剰のＲＴプライマーは、デンドリマープローブに結合して、シグナル強度および強さが減少し、従ってアッセイ感度が低下する可能性がある。この工程は任意であるが、ｃＤＮＡ混合物の精製は、マイクロアレイにおけるシグナル強度を改善する傾向にあり、結果として、ハイブリダイゼーションパターンのシグナル産出を改善する。ＲＴプライマーの量は、過剰なＲＴプライマーが、シグナル強度および解像度を低下させるので、アッセイの精度に影響を与える。過剰なＲＴプライマーは、スピンカラムアセンブリ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Ｒ）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）などの使用を含む、任意の適切な手段によって、ｃＤＮＡ混合液から除去されうる。スピンカラムアセンブリは、遠心分離法により、混合液から１つまたはそれ以上の成分を分離するために使用される、公知の機器である。
【００５７】
好ましくは、過剰なＲＴプライマーは、従来のスピンカラムアセンブリにより除去されうる。スピンカラム媒体は、その中全体に分布させられている多数の樹脂孔を含む、サイズ排除樹脂コアからなる。樹脂孔は、過剰なＲＴプライマーを捕獲するために十分大きく、ｃＤＮＡが空いているボリューム内へと通過すること可能にする。過剰なＲＴプライマーを除去するために、ｃＤＮＡを含有している混合液は、スピンカラムの一方の末端で保持したチューブ内に入れられ、そこでスピンカラムおよび混合液に、一定の時間間隔で高い遠心力が加えられる。混合液は、カラム全体に拡散させられ、逆側の末端で回収容器内に入れられる。容器内に回収された得られた溶出液には、精製されたｃＤＮＡプローブが含まれる。
【００５８】
本発明の方法の実施の際には、多量の標識化デンドリマープローブが、デンドリマープローブと標的ｃＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションを誘導する温度条件下で、ハイブリダイゼーションバッファとともに精製されたｃＤＮＡプローブ溶出液に加えられる。詳細には、本混合液は、第１のプレハイブリダイゼーション温度にて、デンドリマープローブがｃＤＮＡに結合するのに十分な時間、インキュベートされる。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーションバッファが使用される、第１プレハイブリダイゼーション温度の好ましい範囲は、約４５〜６０℃であり、好ましくは５５℃である。ホルムアミドを含有しているハイブリダイゼーションバッファが使用される場合は、好ましいプレハイブリダイゼーション温度の範囲は、ホルムアミドのパーセント含有量に依存し、温度は標準的なホルムアミドを含まないバッファの温度範囲より、存在する各２％ホルムアミドあたり１℃低くなる。混合液は、好ましく約１５〜２０分間、ｃＤＮＡがデンドリマープローブとハイブリダイズし、プレハイブリダイゼーション混合物が得られるようにインキュベートされる。
【００５９】
ブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドは、好ましくは、処理工程の間、またはデンドリマー−ｃＤＮＡ混合物のマイクロアレイへの添加の直前に、混合液に加えられる。あるいは、ＬＮＡブロッカーは、アレイにプレハイブリダイズさせることができ、すなわち標的分子のアレイへの添加の前に、アレイに直接添加することができる。ブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドの機能的融点（Ｔｍ）を上昇させる（１００℃以上のＴｍ融点が可能である）、正常および改変ＬＮＡ塩基残基（ＬＮＡ＝ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を含む、改変二環式単量体ユニット）の両方を含む。これは、ブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドが、優先的および不可逆的に、マイクロアレイ上の相補的配列にハイブリダイズすることを可能にし、これらの繰り返し配列を介してハイブリダイズしたＲＴ産出ｃＤＮＡ試料と競合するか、置き換わる。（あるいは、ＬＮＡブロッカーは、好ましくはアレイへの標的の添加前に、標的の相補的配列へのハイブリダイズのために使用することができる）。
【００６０】
典型的には、２０〜５０のポリ−Ｔまたはポリ−Ａの通常の塩基、および２〜２０のＬＮＡポリ−Ｔまたはポリ−Ａ塩基を含むブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドが、融点および機能的な特徴に基づいて選択される。オリゴヌクレオチド配列内でのＬＮＡ残基の位置づけが、分子の機能を変化させる可能性があり、従って、正確なオリゴヌクレオチドの設計が、ブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドの適切な機能のための最重要事項である。有用で好ましい配列設計は、以下のようなものを含む。
名前：Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３
配列：５’−ＴＴｔ  ｔＴｔ  ｔＴＴ  ｔｔｔ  Ｔｔｔ  ｔＴＴ  ｔｔＴ  ｔｔＴ  Ｔｔｔ  ｔＴｔ  ｔｔＴ  ｔｔｔ−３’
式中、Ｔ＝ＬＮＡ残基およびｔ＝通常のＤＮＡ塩基
名前：Ｏｌｉｇｏ  ｄＡ３０−ＬＮＡ７
配列：５’−ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａａ  ａａＡ  ａＡａ  ＡａＡ  ａＡａ  ＡａＡ−
式中、Ａ＝ＬＮＡ残基およびａ＝通常のＤＮＡ塩基
これらのブロッキングオリゴ類は、ｍＲＮＡ、およびマイクロアレイ試験に一般的に使用される他の配列に典型的に見られる、ポリ−Ｔおよびポリ−Ａ配列の長い伸張物の結合をブロックするように設計される。これらの配列は、ハイブリダイゼーションがこれらの配列とマイクロアレイの表面上で見られる相補的配列との間で起こる場合に、典型的に、偽陽性の結果および非特異的シグナルを引き起こす。典型的には、ＰＣＲ反応により生じたｃＤＮＡがスポットされたマイクロアレイは、おそらく、上記の逆転写反応の間に産出されるｃＤＮＡにハイブリダイズすることができる長ポリ−Ａおよびポリ−Ｔ配列をよく含む。（知られていないことであるが、オリゴヌクレオチドをプローブとして含むマイクロアレイは、単量体塩基の長い鎖を含むことはまれである。）
しかしながら、望ましいブロッキングＬＮＡオリゴマーは、同様に、ゲノム（ヒトまたはそれ以外）の全体に分布している繰り返し配列を含むがこれに限定されない非特異的結合相互作用を引き起こしうる任意の他の配列をブロックするために使用することができる。例えば、タンデムな繰り返しＤＮＡまたは断続的な繰り返しＤＮＡ、例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（「ＳＩＮＥＳ」）、Ｌｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（「ＬＩＮＥＳ」）などをブロックするために使用することができる。従って、１つの実施形態においては、ブロッカーは、Ａｌｕ配列、または現在公知であるか、または後に発見される任意の他の配列をブロックするために使用することができる。一般的には、結果として標識化標的分子への非特異的結合を生じ得る任意の１つまたはそれ以上の塩基配列は、プローブまたは標的ヌクレオチド内で同定される。次いで、それに結合し、それによって望まない非特異的プローブ−標識結合相互作用を最小化するかまたは排除するために、それらの塩基配列に相補的な配列を持つＬＮＡブロッキング剤が、提供されうる。
【００６１】
次いで、プレハイブリダイゼーション混合物がマイクロアレイに加えられ、第２のハイブリダイゼーション温度にて、ｃＤＮＡがマイクロアレイに結合するのに十分な時間、インキュベートされる。ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーションバッファが使用される場合、第２のハイブリダイゼーション温度に関する好ましい範囲は、約４２〜６０℃である。ホルムアミドを含むハイブリダイゼーションバッファが使用される場合は、プレハイブリダイゼーション温度の好ましい範囲は、ホルムアミドのパーセント含有量に依存し、標準的なホルムアミドを含まないバッファ温度範囲より、存在する各２％ホルムアミドあたり１℃低下する。好ましくは、プレハイブリダイゼーション混合液およびマイクロアレイは、第２の温度にて、加湿チャンバー内で、一晩インキュベートされる。
【００６２】
このような初期条件下で、ｃＤＮＡの捕獲配列は、ｃＤＮＡがマイクロアレイの遺伝子プローブに結合する前に、デンドリマープローブに結合させられた相補体とプレハイブリダイズできる。デンドリマープローブに結合させられた標的ｃＤＮＡは次いで、標的ｃＤＮＡをマイクロアレイ上のＤＮＡまたは遺伝子プローブへハイブリダイゼーションさせるのに十分な条件下で、マイクロアレイと接触させられる。得られた混合物は、完全なハイブリダイゼーションのために一晩インキュベートされる。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に十分に知られており、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（上記）に概説されている。そこでは、条件は、ハイブリダイゼーションにおける所望の特異性を達成するように調節されうる。任意の適切なハイブリダイゼーションバッファを、本発明で使用することができること注目される。１つの好ましい形態においては、ハイブリダイゼーションバッファの組成には、０．２５Ｍ  ＮａＰＯ4、４．５％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１×ＳＳＣが含まれうる。別の好ましい形態において、ハイブリダイゼーションバッファの組成には、４０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳが含まれうる。
【００６３】
ハイブリダイゼーション工程に続いて、ハイブリダイズしていないデンドリマープローブ−ｃＤＮＡ複合体が、検出工程の間にシグナルを放射することが可能である場合には、ハイブリダイズしていない複合体がマイクロアレイから取り除かれる洗浄工程が行われ、これにより、マイクロアレイに結合したハイブリダイズしたｃＤＮＡ−デンドリマープローブの可視的、分離パターンが残される。種々の洗浄溶液およびその使用のためのプロトコールが当業者に公知であり、使用することができる。使用される特定の洗浄条件は、必然的に、使用されるシグナル産出系の特定の性質に依存し、使用される特定のシグナル産出系に精通している当業者には公知であり得る。
【００６４】
得られた、標識化ｃＤＮＡ断片のハイブリダイゼーションパターンは、種々の方法で可視化または検出することができ、特定の検出様式は、ｃＤＮＡの特定の標識に依存して選択される。代表的な検出法には、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、光励起測定などが含まれる。
【００６５】
上記のハイブリダイゼーションおよび任意の洗浄工程（単数または複数）および／またはその後の処理に続いて、得られたハイブリダイゼーションパターンが検出される。ハイブリダイゼーションパターンが検出または可視化される際には、標識の強度またはシグナル値は、ただ検出されるだけでなく、定量される。ここでは、それぞれのハイブリダイゼーションのスポットからのシグナルが測定されることを意味する。
【００６６】
検出または可視化に続いて、ハイブリダイゼーションパターンが使用され、ハイブリダイゼーションパターンを生じるようにマイクロアレイと接触させられた標識化標的核酸試料の遺伝的プロファイルに関する、ならびに、標識化標的核酸試料が由来する生理学的供給源に関する、定量的および定性的情報を決定することができる。このデータより、また、生理学的供給源である組織または細胞中で発現される遺伝子の型、ならびに各遺伝子の発現レベル、とりわけ定量的観点からのもののような、標的核酸試料が由来する生理学的供給源に関する情報を導くこともできる。２つまたはそれ以上の生理学的供給源に由来する標的核酸を比較する本方法が使用される場合は、ハイブリダイゼーションパターンは、パターン間の違いを同定するために比較されうる。それぞれの異なるプローブが既知の遺伝子に対応しているマイクロアレイが使用される場合は、全ての不一致は、比較される生理学的供給源中特定の遺伝子の発現の差に関連しうる。従って、本方法を、罹患組織と正常組織、例えば新生物組織と正常組織、異なる組織型または亜組織型などの、ディファレンシャル発現アッセイにて使用できるので、本方法が、ディファレンシャル遺伝子発現アッセイに使用できることが分かる。
【００６７】
上記の手順の多くの他のバリエーションを、本発明と矛盾なく使用することができる。例えば、ハイブリダイゼーション前に、ｃＤＮＡに変換される試料から抽出されたＲＮＡを使用する代わりに、本発明では、ＲＮＡ試料を直接使用することができる。１つのそのような実施形態においては、適切な捕獲配列を、例えば、酵素的手段によってＲＮＡをスプライシングする公知の方法を使用して、ＲＮＡに連結することができる。または、ＲＮＡが、捕獲配列として有用である特定のオリゴヌクレオチドを含む場合は、相補的オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ分子を標識するために、デンドリマーに結合させられ得る。逆転写の必要のないＲＮＡを直接使用する方法に関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれている、２００１年７月１９日に出願された、ＰＣＴ明細書第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２２８１８号にて提供される。
【００６８】
本発明の実施形態のさらなる例は以下のように提供される。
【実施例１】
【００６９】
図２に関して、マイクロアレイ上での検出およびアッセイを以下に記述する。
【００７０】
マイクロアレイの調製
マイクロアレイを、製造業者によって、または日常的に行われている手順プロトコールによって指示されているように調製した。ＤＮＡまたは遺伝子プローブを含む核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応にて公知の技術を用いて増幅し、次いでガラススライド上にスポットし、従来の手順に従って処理した。
【００７１】
標的核酸配列試料またはｃＤＮＡの調製および濃縮
標的核酸配列、またはｃＤＮＡを、細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）+ＲＮＡより調製した。ｃＤＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを実施するのに十分濃縮されているので、約１０〜２０マイクログラムの全ＲＮＡ、または５００〜１０００ナノグラムのポリ（Ａ）+ＲＮＡを含む試料に関しては、エタノール沈殿は必要なく、省略してよい。微量遠心分離管中に、０．２５〜５マイクログラムの全ＲＮＡまたは１２．５〜５００ナノグラムのポリ（Ａ）+ＲＮＡを、３マイクロリットルのＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌ）とともに加え、ＲＮａｓｅを含まない水で総容量１０ＦＬとし、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物を得た。得られた混合物を混合し、軽く遠心分離して、微量遠心分離管の底に内容物を集めた。次いで回収した内容物を、約１０分間、８０ＥＣまで熱し、すぐに氷に移した。氷上の別の微量遠心分離管中で、４マイクロリットルの５×ＲＴバッファ、１マイクロリットルのｄＮＴＰミックス、４マイクロリットルのＲＮａｓｅを含まない水、および１マイクロリットルの逆転写酵素（２００ユニット）を混合し、反応混合液を得た。この反応混合液を穏やかに混合し、軽く微量遠心分離し、微量遠心分離管の底に内容物を集めた。１０マイクロリットルのＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物と１０マイクロリットルの反応混合物とを、軽く混合し、４２ＥＣで２時間インキュベートした。この反応を、３．５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡを混合液に加えることにより終了させた。この混合液を、６５℃にて１０分間インキュベートし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させ、反応液を、５マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５で中和した。次いで、３８．５マイクロリットルの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを中和した反応混合液に加えた。（上記工程は、デュアルチャンネル発現アッセイを調製するためには、３マイクロリットルのＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）を、３マイクロリットルのＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（０．２ｐｍｏｌｅ）で置き換えて繰り返すことができ、それによって調製したＣｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）ｃＤＮＡ混合物を、１０マイクロリットルの１０  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡとともに混合して、次の工程での処理のために反応混合液を得た。）
２マイクロリットルの担体核酸（１０ｍｇ／ｍＬ  直鎖アクリルアミド）を、エタノール沈殿のために中和した反応混合液に加えた。１７５マイクロリットルの３Ｍ  酢酸アンモニアをこの混合液に加え、次いで混合した。次いで、６２５マイクロリットルの１００％エタノールを得られた混合液に加えた。得られた混合液を、−２０ＥＣにて３０分間インキュベートした。試料を１５分間、１０，０００ｇ以上の加速度で遠心分離した。上清を吸引し、次いで３３０マイクロリットルの７０％エタノールを上清、またはｃＤＮＡペレットに加えた。次いでｃＤＮＡペレットを、５分間、１０，０００ｇ以上の加速度にて遠心分離し、次いで除去した。ｃＤＮＡペレットを乾燥させた（すなわち、６５℃にて２０〜３０分間）。
【００７２】
ｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合物のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、１０分間６５℃まで熱することによって、融解させ、再懸濁させた。ハイブリダイゼーションバッファは４０％ホルムアミドを含まれていた。バッファを、反転させて混合し、確実に成分が均一になるように再懸濁させた。全ての物質が再懸濁するまで、加熱および混合を繰り返した。競合ＤＮＡを必要な量だけ加えることもできる（例えば、ＣＯＴ−１−ＤＮＡ、およびｐｏｌｙｄＡ）。ｃＤＮＡを、５．０マイクロリットルの滅菌水中に再懸濁させた。
【００７３】
第１の実施形態である単一チャネル分析においては、２．５マイクロリットルの１つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ）（Ｃｙ３またはＣｙ５）を、１２．５マイクロリットルの（４０％ホルムアミドを含む）ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、懸濁させたｃＤＮＡに加えた。
【００７４】
デュアルチャネル分析に関する別の実施形態においては、２．５マイクロリットルの２つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３およびＣｙ５特異的標識化デンドリマーを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。（３つまたはそれ以上のチャネルでの）多チャネル分析のさらなる実施形態においては、２．５マイクロリットルの３またはそれ以上の型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３、Ｃｙ５および１つまたはそれ以上の他の標識部位を使用して調製したものを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。
【００７５】
より多量のハイブリダイゼーションバッファに関して、さらなる量のＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、必要な最終容量まで加えた。３５マイクロリットル以上のハイブリダイゼーションバッファ容量では、さらに多量の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬が必要である場合があることに留意する。
【００７６】
ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファ混合物を、ｃＤＮＡを３ＤＮＡ（Ｒ）試薬にプレハイブリダイゼーションさせるために、約１５〜２０分間、約５０℃にてインキュベートした。次いで、プレハイブリダイゼーション混合液をマイクロアレイに加え、５５℃にて一晩インキュベートした。この工程で、ｃＤＮＡを遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。
【００７７】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
マイクロアレイを軽く洗浄して、任意の過剰なデンドリマープローブを除去した。最初に、マイクロアレイを５５℃で１０分間、２×ＳＳＣバッファ、０．２％  ＳＤＳで洗浄した。次いで、マイクロアレイを室温で１０分間、２×ＳＳＣバッファで洗浄した。最後に、マイクロアレイを室温で１０分間、０．２×ＳＳＣバッファで洗浄した。
【００７８】
シグナル検出
次いでマイクロアレイを、ハイブリダイゼーションパターンの検出、分析およびアッセイのために、スキャナーの製造業者によって指示されているようにスキャンした。
【実施例２】
【００７９】
図３に関して、マイクロアレイ上の検出およびアッセイのための方法を以下に記述する。本方法には、プロトコール時間および工程数を減少させるため、さらにはシグナル強度を増大させるために、スピンカラムアセンブリの使用が含まれる。
【００８０】
マイクロアレイの調製
マイクロアレイを、製造者によるか、または日常的に行われているプロトコール手順によって指示されているように調製した。ＤＮＡまたは遺伝子プローブを含む核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で公知の技術を用いて増幅し、次いでガラススライド上にスポットし、従来の手順に従って処理した。
【００８１】
標的核酸配列またはｃＤＮＡの調製および濃縮
標的核酸配列またはｃＤＮＡを、細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）+ＲＮＡから調製した。微量遠心分離管中に、０．２５〜５マイクログラムの全ＲＮＡまたは１２．５〜５００ｎｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを、１マイクロリットルのＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）、および１０マイクロリットルの総容量にするためのＲＮａｓｅを含まない水とともに加えて、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を得た。得られた混合液を混合し、軽く微量遠心分離し、微量遠心分離管の底に内容物を回収した。回収した内容物を次いで、約１０分間、８０℃まで熱し、すぐに氷に移した。氷上の別の微量遠心分離管中で、４マイクロリットルの５×ＲＴバッファ、１マイクロリットルのｄＮＴＰミックス、４マイクロリットルのＲＮａｓｅを含まない水、および１マイクロリットルの逆転写酵素（２００ユニット）を混合して、反応混合液を得た。この反応混合液を緩やかに混合し、軽く微量遠心分離して、微量遠心分離管の底に内容物を回収した。１０マイクロリットルのＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物と１０マイクロリットルの反応混合物とを一緒に混合し、２時間４２ＥＣにてインキュベートした。反応を、３．５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることにより終了させた。この混合液を、１０分間６５℃にてインキュベートし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させた。反応を、５マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を混合液に加えることによって中和した。７１マイクロリットルの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを、この中和した反応混合液に加えた。（以上の工程は、デュアルチャンネル発現アッセイを調製するためには、１マイクロリットルのＣｙ３（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌ）を、１マイクロリットルのＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌ）と置換してよく、それによって調製したＣｙ３（Ｒ）およびＣｙ５（Ｒ）ｃＤＮＡ混合物を、４２マイクロリットルの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡと一緒に混合して、以下の工程での処理のための反応混合物を得た。）
ｃＤＮＡの精製：ＳＣスピンカラムアセンブリによる過剰なＲＴプライマーの除去
スピンカラムを数回反転させて、培地を再懸濁させ、カラム内に均一なスラリーを作製した。上部および底キャップをスピンカラムから外した。微量遠心分離管を得、微量遠心分離管の底の先端を切り取るか、または先端に穴を開けた。スピンカラムの１つの末端を、穴を開けた微量遠心分離管内に入れ、次いで穴を開けたマイクロチューブを、第２の、何もしていないマイクロチューブ、または回収チューブに入れた。次いで組み立てたスピンカラムを、微量遠心分離管の末端を持つ１５ｍＬ遠心分離管内にまず入れた。スピンカラムを、完全な加速に達した後、約３．５分間、約１０００ｇで遠心分離した。スピンカラムを、遠心分離の後カラムから完全に水が切れたこと、およびスピンカラムの末端が、回収チューブの液体線より上であったことを確かめるために確認した。回収チューブは、スピンカラムから放出された約２〜２．５ｍＬの透明なバッファを含んだ。樹脂は、カラムバレル中でほとんど乾燥しているように見え、ひずみまたは傷は無くうまく納まっていた。スピンカラムの末端が、液体部分に浸かっていた場合は、スピンカラムを捨て、上記の工程を、新しいスピンカラムを用いて繰り返した。この時点で、中和した反応混合液中の過剰なＲＴプライマーを除去するためのスピンカラムが準備できた。
【００８２】
水を切ったスピンカラムを除去し、新しい１．０ｍＬの回収チューブを、１５ｍＬの遠心分離管中にすでにあるバッファ回収チューブの先においた。放出されたバッファを捨てた。水を切ったスピンカラムを新しい回収チューブ内に入れた。１００マイクロリットルの、ｃＤＮＡを含む中和した反応混合液を、スピンカラム培地の中央に直接のせた。スピンカラムアセンブリを、完全な加速に達してから約２．５分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。次に、新しい回収チューブに回収した溶出液を戻した。もともとの反応混合液の約１０パーセントが回収された。溶出液にはｃＤＮＡプローブが含まれた。
【００８３】
２マイクロリットルの担体核酸（１０ｍｇ／ｍＬ  直鎖アシルアミド）を加えて、エタノール沈殿のために溶出した。２５０マイクロリットルの３Ｍ酢酸アンモニウムをこの混合液に加え、混合した。次いで、８７５マイクロリットルの１００％  エタノールを混合液に加えた。得られた混合液を、３０分間、−２０ＥＣにてインキュベートした。試料を、１０，０００×ｇより大きな加速度にて、１５分間遠心分離した。上清を吸引し、３００マイクロリットルの７０％エタノールをこの上清、またはｃＤＮＡペレットに加えた。次いでｃＤＮＡペレットを、１０，０００×ｇより大きな加速度で、５分間遠心分離した。次いで上清を除去した。ｃＤＮＡペレットを乾燥させた（すなわち６５℃にて２０〜３０分間）。
【００８４】
ｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合液のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、６５℃まで加熱し、１０分間６５℃で維持することによって、融解させ、再懸濁させた。ハイブリダイゼーションバッファには４０％ホルムアミドが含まれていた。バッファを、反転させて混合し、確実に成分が均一になるように再懸濁させた。全ての物質が再懸濁するまで、加熱および混合を繰り返した。競合ＤＮＡを必要な量だけ加えることもできる（例えば、ＣＯＴ−１−ＤＮＡ、およびｐｏｌｙｄＡ）。ｃＤＮＡを、５．０マイクロリットルの滅菌水中に再懸濁させた。
【００８５】
第１の実施形態である単一チャネル分析においては、２．５マイクロリットルの１つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ）（Ｃｙ３またはＣｙ５）を、１２．５マイクロリットルの（４０％ホルムアミドを含む）ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、懸濁させたｃＤＮＡに加えた。デュアルチャネル分析に関する別の実施形態においては、２．５マイクロリットルの２つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３およびＣｙ５特異的標識化デンドリマーを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。（３つまたはそれ以上のチャネルでの）多チャネル分析のさらなる実施形態においては、２．５マイクロリットルの３またはそれ以上の型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３、Ｃｙ５および１つまたはそれ以上の他の標識部位を使用して調製したものを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。
【００８６】
より多量のハイブリダイゼーションバッファに関しては、さらなる量のＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、必要な最終容量まで加えた。３５マイクロリットル以上のハイブリダイゼーションバッファ容量では、さらに多量の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬が必要である場合があることに留意する。ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファ混合物を、ｃＤＮＡが３ＤＮＡ（Ｒ）試薬またはデンドリマープローブにプレハイブリダイゼーションするように、約１５〜２０分間、約５０℃にてインキュベートした。この工程で、３ＤＮＡ（Ｒ）試薬のデンドリマープローブが、ｃＤＮＡ上の捕獲配列とハイブリダイズした。２０分後、次いでＤＮＡハイブリダイゼーションバッファをマイクロアレイに加えた。マイクロアレイおよびＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを覆い、約５５℃の温度にて、加湿チャンバー内で一晩インキュベートした。この工程で、ｃＤＮＡを遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。
【００８７】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
マイクロアレイを軽く洗浄して、任意の過剰なデンドリマープローブを除去した。最初に、マイクロアレイを５５℃で１０分間、０．２％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣバッファで洗浄した。次いで、マイクロアレイを室温で１０分間、２×ＳＳＣバッファで洗浄した。最後に、マイクロアレイを室温で１０分間、０．２×ＳＳＣバッファで洗浄した。
【００８８】
シグナル検出
次いでマイクロアレイを、ハイブリダイゼーションパターンの検出、分析およびアッセイのために、スキャナーの製造業者によって指示されているようにスキャンした。
【実施例３】
【００８９】
マイクロアレイ上での検出およびアッセイのための別の方法
マイクロアレイの調製
マイクロアレイを、製造者によるか、または日常的に行われているプロトコール手順によって指示されているように調製した。ＤＮＡまたは遺伝子プローブを含む核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応で公知の技術を用いて増幅し、次いでガラススライド上にスポットし、従来の手順に従って処理した。
【００９０】
標的核酸配列またはｃＤＮＡの調製および濃縮
標的核酸配列またはｃＤＮＡを、細胞の試料から抽出した全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）+ＲＮＡから調製した。微量遠心分離管中に、０．２５〜１０マイクログラムの全ＲＮＡまたは２５０〜５００ｎｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを、１マイクロリットルのＣｙ３（Ｒ）またはＣｙ５（Ｒ）ＲＴプライマー（５ｐｍｏｌｅ）、および１０マイクロリットルの総容量にするためのＲＮａｓｅを含まない水とともに加え、ＲＮＡ−ＲＴプライマー混合液を得た。得られた混合液を混合し、軽く微量遠心分離し、微量遠心分離管の底に内容物を回収した。回収した内容物を次いで、約１０分間、８０℃まで熱し、すぐに氷に移した。氷上の別の微量遠心分離管中で、４マイクロリットルの５×ＲＴバッファ、１マイクロリットルのｄＮＴＰ混合液、４マイクロリットルのＲＮａｓｅを含まない水、および１マイクロリットルの逆転写酵素（２００ユニット）を混合して、反応混合液を得た。この反応混合液を緩やかに混合し、軽く微量遠心分離して、微量遠心分離管の底に内容物を回収した。１０マイクロリットルのＲＮＡ−ＲＴプライマー混合物と１０マイクロリットルの反応混合物とを一緒に混合し、４２℃で２時間インキュベートした。反応を、３．５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることにより終了させた。混合液を、１０分間６５℃にてインキュベートし、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させた。反応を、５マイクロリットルの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を混合液に加えることによって中和した。７１マイクロリットルの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡを、この中和した反応混合液に加えた。
【００９１】
ｃＤＮＡの精製：ＳＣスピンカラムアセンブリによる過剰なＲＴプライマーの除去
スピンカラムを数回反転させて、培地を再懸濁させ、カラム内に均一なスラリーを作製した。上部および底キャップをスピンカラムから外した。微量遠心分離管を得、微量遠心分離管の底の先端を切り取るか、または先端に穴を開けた。スピンカラムの１つの末端を、穴を開けた微量遠心分離管内に入れ、次いで穴を開けたマイクロチューブを、第２の、何もしていないマイクロチューブ、または回収チューブに入れた。次いで組み立てたスピンカラムを、微量遠心分離管の末端を持つ１５ｍＬ遠心分離管内にまず入れた。スピンカラムを、完全な加速に達した後、約３．５分間、約１０００ｇで遠心分離した。スピンカラムを、遠心分離の後カラムから完全に水が切れたこと、およびスピンカラムの末端が、回収チューブの液体線より上であったことを確かめるために確認した。回収チューブは、スピンカラムから放出された約２〜２．５ｍＬの透明なバッファを含んだ。樹脂は、カラムバレル中でほとんど乾燥しているように見え、ひずみまたは傷は無くうまく納まっていた。スピンカラムの末端が、液体部分に浸かっていた場合は、スピンカラムをすて、上記の工程を、新しいスピンカラムを用いて繰り返した。この時点で、中和した反応混合液中の過剰なＲＴプライマーを除去するためのスピンカラムが準備できた。
【００９２】
水を切ったスピンカラムを除去し、新しい１．０ｍＬの回収チューブを、１５ｍＬの遠心分離管中にすでにあるバッファ回収チューブの先においた。放出されたバッファを捨てた。水を切ったスピンカラムを新しい回収チューブ内に入れた。１００マイクロリットルの、ｃＤＮＡを含む中和した反応混合液を、スピンカラム培地の中央に直接のせた。スピンカラムアセンブリを、完全加速に達してから約２．５分間、１０，０００×ｇで遠心分離した。次に、新しい回収チューブに回収した溶出液を戻した。もともとの反応混合液の約１０パーセントが回収された。溶出液にはｃＤＮＡプローブが含まれた。
【００９３】
ｃＤＮＡ／デンドリマープローブ混合液の、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、６５ＥＣまで加熱し、６５℃で１０分間維持することによって、融解させ、再懸濁させた。ハイブリダイゼーションバッファには４０％ホルムアミドを含んだ。バッファを、反転させて混合し、確実に成分が均一に再懸濁するようにした。加熱および混合を、全ての物質が再懸濁するまで繰り返した。競合ＤＮＡを必要な量だけ加えることもできる（例えば、ＣＯＴ−１−ＤＮＡ、およびｐｏｌｙｄＡ）。ｃＤＮＡを、５．０マイクロリットルの滅菌水中に再懸濁させた。第１の実施形態である単一チャネル分析においては、２．５マイクロリットルの１つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ）（Ｃｙ３またはＣｙ５）を、１２．５マイクロリットルの（４０％ホルムアミドを含む）ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、懸濁させたｃＤＮＡに加えた。デュアルチャネル分析に関する別の実施形態においては、２．５マイクロリットルの２つの型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３およびＣｙ５特異的標識化デンドリマーを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。（３つまたはそれ以上のチャネルでの）多チャネル分析のさらなる実施形態においては、２．５マイクロリットルの３またはそれ以上の型の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬、Ｃｙ３、Ｃｙ５および１つまたはそれ以上の他の標識部位を使用して調製したものを、１０マイクロリットルのＤＮＡハイブリダイゼーションバッファおよび１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチドＯｌｉｇｏ  ｄＴ３６−ＬＮＡ１３とともに、再懸濁させたｃＤＮＡに加えた。
【００９４】
より多量のハイブリダイゼーションバッファに関して、さらなる量のＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを、必要な最終容量まで加えた。３５マイクロリットル以上のハイブリダイゼーションバッファ容量では、さらに多量の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬が必要である場合があることに留意する。ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファ混合物を、ｃＤＮＡの３ＤＮＡ（Ｒ）試薬またはデンドリマープローブにプレハイブリダイゼーションさせるように、約１５〜２０分間、約５０℃にてインキュベートした。この工程で、３ＤＮＡ（Ｒ）試薬のデンドリマープローブが、ｃＤＮＡ上の捕獲配列とハイブリダイズする。２０分後、次いでＤＮＡハイブリダイゼーションバッファをマイクロアレイに加えた。マイクロアレイおよびＤＮＡハイブリダイゼーションバッファを覆い、約５５℃の温度にて、加湿チャンバー内で一晩インキュベートした。この工程で、ｃＤＮＡを遺伝子プローブにハイブリダイズさせた。
【００９５】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
マイクロアレイを軽く洗浄して、任意の過剰なデンドリマープローブを除去した。最初に、マイクロアレイを５５℃で１０分間、０．２％  ＳＤＳを含む２×ＳＳＣバッファで洗浄した。次いで、マイクロアレイを室温で１０分間、２×ＳＳＣバッファで洗浄した。最後に、マイクロアレイを室温で１０分間、０．２×ＳＳＣバッファで洗浄した。
【００９６】
シグナル検出
次いでマイクロアレイを、ハイブリダイゼーションパターンの検出、分析およびアッセイのために、スキャナーの製造業者によって指示されているようにスキャンした。
【実施例４】
【００９７】
ｃＤＮＡアレイのための検出キットを用いたマイクロアレイ上での検出およびアッセイの方法
キットの内容
バイアル１  Ｃｙ３（Ｒ）３ＤＮＡ（Ｒ）試薬（Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ）２０μｌのアッセイあたり２．５μｌを使用。
バイアル２  ハイブリダイゼーションバッファ−０．２５ＭのＮａＰＯ4、４．５％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１×ＳＳＣ（−２０℃、暗所にて保存）
バイアル３  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ３６ＬＮＡ−１３ブロッキング剤、７５〜１２５ｎｇ／μＬ
マイクロアレイの調製
製造業者により指示された手法、または日常的に行われているプロトコール手順によりマイクロアレイを調製した。ポリメラ−ゼ連鎖反応法において公知の技術を用いて、ＤＮＡまたは遺伝子プロ−ブを含む核酸配列を増幅させ、次いでスライドガラス上にスポットし、従来の手順に従って処理した。
【００９８】
３ＤＮＡ（Ｒ）ハイブリダイゼーション
バイアル２のハイブリダイゼーションバッファを、１０分間６５℃まで熱して溶かし、再懸濁させた。確実に組成物が十分再懸濁されるように、バッファを反転させて混合した。必要であれば、全ての成分が再懸濁されるまで加熱および混合を繰り返した。バイアル１の３ＤＮＡ（Ｒ）試薬２．５マイクロリットルを１７．５マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファに加え、ハイブリダイゼーション混合物を得た。１マイクロリットルのブロッキングＬＮＡオリゴヌクレオチド、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ３６ＬＮＡ−１３もまた混合物に加えた。ハイブリダイゼーション混合液をマイクロアレイに加えた。マイクロアレイを覆い、加湿チャンバー中にて、３７〜４２℃で約６時間〜一晩インキュベートした。
【００９９】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
マイクロアレイを４２℃にて１０分間、０．２％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣバッファで洗浄した。次いでマイクロアレイを室温にて１０分間、２×ＳＣＣバッファで洗浄した。次いで室温にて１０分間、０．２×ＳＳＣバッファで洗浄した。
【０１００】
シグナル検出
次に、マイクロアレイを、ハイブリダイゼーションパターンの検出、分析、およびアッセイについてスキャナーの製造業者に指示されているようにスキャンした。
【実施例５】
【０１０１】
ＬＮＡブロッカーおよび標識の直接の取り込みを用いたマイクロアレイ上での検出およびアッセイの方法
微量遠心分離管中で５００ｎｇのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマ−を、１．５ｍｌの微量遠心分離管中で２０μｇの全ＲＮＡ（マウスの脳またはマウスの肝臓）とあわせた。ヌクレアーゼを含まない水で容量を２１μｌに調整した。試料を７５〜８０℃にて１０分間インキュベ−トし、次いで速やかに氷上に１〜２分おいた。逆転写反応成分を全ＲＮＡおよびプライマ−に下記のように加え、反応物の総容量を４０μｌにした。
【０１０２】
８μｌの５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、酵素と一緒に供給）
４μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、酵素と一緒に供給）
２μｌのｄＮＴＰミックス（１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および２ｍＭのｄＣＴＰ）
２μｌのＣｙ３またはＣｙ５改変ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
１μｌのＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ）
２μｌのス−パ−スクリプトＩＩ  ＲＴ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
チューブを穏やかに混合し、微量遠心分離して内容物をチューブの底にスピンダウンさせた。反応物を４２℃にて９０分インキュベートした。７μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応を止め、試料を６５℃にて１０分間インキュベ−トした。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを１０マイクロリットル加えて反応物を中和した。得られたｃＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを製造業者によって指示されているように精製し、エタノール沈殿により凝集させた。乾燥させたｃＤＮＡペレットを、１９．５μｌの水に再懸濁させた。２マイクロリットルのＬＮＡＴＭｄＴブロッカー（２５ｎｇ／ｕｌ）、１μｌのヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ（１μｇ／μｌ）、および２２．５μｌの２×ＳＤＳを主成分とするハイブリダイゼーションバッファを加え、総容量を４５μｌとした。試料を入念に混合し、８０℃にて１５分間、時々混合しながらインキュベートした。試料をあらかじめ暖めておいたマイクロアレイ上にピペットで移し、表面に２４×６０ｍｍのカバーガラスをのせた。アレイを加湿ハイブリダイゼーションチャンバ−中で、６５℃にて一晩インキュベ−トした。
【０１０３】
ハイブリダイゼーションチャンバーからアレイを取り出し、２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中に浸してアレイの表面からカバーガラスを浮かばせて取り外した。アレイを下記のようにバッファからバッファへ移して洗浄した。
【０１０４】
２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ  ６５℃にて１５分間
２×ＳＳＣ、室温にて１０分間
０．２×ＳＳＣ  室温にて１０分間
アレイを乾燥させた５０ｍＬの遠心管に移し、８００〜１０００ＲＰＭにて２分間遠心分離にかけ、スライドを乾燥させた。遠心分離管からアレイを取り出してスキャンし、デ−タを得た。
【０１０５】
本明細書ではいくつかの好ましい実施形態について記載しているが、さらに別の実施形態も本発明に完全に一致させて用いることができる。例えば、上記した本発明の様々な実施形態について述べたように、ＬＮＡは、マイクロアレイへの適用において、デンドリマーと併用して、または併用せずに一般的なブロッキング剤として用いることができる。さらに別の実施形態では、ＬＮＡを、マイクロアレイを用いない適用においてもブロッキング剤として用いることもできる。言い換えれば、本発明に一致して、ＬＮＡ試薬は、ｃＤＮＡおよびその他の核酸の相補的なプローブへのハイブリダイゼーションの間に生じる、非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるような任意の望ましい適用に用いることができる。
【０１０６】
さらに、好ましい実施形態においてはロックド核酸ヌクレオチドは、Ｔｍで定量化される温度安定性をより高くし、それによってブロッカーとしての試薬の有用性をより高める目的で、オリゴヌクレオチドに組み込まれている。典型的には、それぞれのＬＮＡヌクレオチドの付加により、オリゴヌクレオチドのＴｍは、置換されたヌクレオチドまたは置換配置に依存して、約３〜５℃上昇する。さらに、ＬＮＡはＴｍを上昇させるためのヌクレオチドの選択肢として使用されることが望ましいが、他のヌクレオチドを用いて同様の効果が得られるようにオリゴヌクレオチド中で置換することもできることを理解されたい。例えば、標準的なヌクレオチド構造が改変されているヌクレオチド（すなわち改変ヌクレオチド）も利用することができる。選択されたその他の任意のそのような代替ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドが、「改変されていないヌクレオチド」（すなわち、標準的なＤＮＡまたはＲＮＡ塩基を持つ）と同じ核酸配列と同様にオリゴヌクレオチドのＴｍを上昇させるヌクレオチドであることが好ましく、Ｔｍは好ましくは少なくとも３〜５℃上昇する。当業者が容易に入手できる任意のヌクレオチドに加え、そのようなヌクレオチドも将来有機化学合成品として入手できるであろう。本明細書で用いたＬＮＡについてのそれらのヌクレオチドの置換も、同様の有益なブロック作用について本発明に一致して使用可能である。
【０１０７】
以上の議論は、本発明の単なる例証および好ましい実施形態の開示および説明である。当業者は、上記、および添付の図面、特許請求の範囲、および実施例から、下記の特許請求の範囲で定義する本発明の目的および範囲様々な変更、改変および変化を加えてよいことを十分に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】核酸配列試料の検出およびアッセイのためのマイクロアレイを調製するための、先行技術の方法の１つの模式図である。
【図２】本発明の１つの実施形態における、核酸配列試料の検出およびアッセイのためのマイクロアレイを調製するための方法の模式図である。
【図３】本発明の他の実施形態における、核酸配列試料の検出およびアッセイのためのマイクロアレイを調製するための方法の模式図である。
【図４】ＤＮＡおよびＲＮＡと比較してＬＮＡの構造を示す。
【図５】ＤＮＡおよびＲＮＡと比較してＰＮＡの構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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