(57)【要約】高レベル抗体産生細胞を選択する方法であって、細胞表面にプロテインＡまたはプロテインＧを接着させ、分泌された可溶性抗体を捕捉する工程を含む方法。慣用的な方法およびその後のＦＡＣＳ分析により、捕捉された抗体を蛍光染色すると、低存在度で高生産の単一の細胞を選択することができる。
2005526950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の抗体を分泌する細胞を選択する方法であって、
ａ）細胞の細胞表面にアビジンを連結させる工程、
ｂ）少なくとも一の機能性抗体結合ドメインを含むビオチン化ポリペプチドと前記細胞をインキュベートする工程、
ｃ）蛍光標識され、かつ前記第一の抗体上のエピトープを認識し結合する第二の抗体もしくは抗原と前記細胞をインキュベートする工程、
ｄ）ある量の第二の抗体を結合した蛍光標識された細胞を、好ましくは蛍光分析フローサイトメトリーにより選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ビオチン化ポリペプチドが、プロテインＧまたはプロテインＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共有結合による前記細胞表面のビオチン化が行われた後、好ましくは１０℃未満の温度でビオチン化が行われた後、前記アビジンを前記細胞表面に結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチン化ポリペプチドとインキュベートする間または遅くともインキュベート後に、増粘剤を含む培地で前記細胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一の抗体を分泌する細胞を選択する方法であって、
１）好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡに由来する、少なくとも一の機能性抗体結合ドメインを含むポリペプチドに接合したアビジンを、細胞の細胞表面に連結させる工程、
２）蛍光標識され、かつ前記第一の抗体上のエピトープを認識し結合する第二の抗体または抗原と前記細胞をインキュベートする工程、
３）ある量の第二の抗体を結合した蛍光標識された細胞を、好ましくは蛍光分析フローサイトメトリーにより選択する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーによる生産の分野に関する。本発明の目的は、抗体産生細胞を選択し、細胞系の安定性を評価する方法を考案することである。
【背景技術】
【０００２】
抗体産生細胞を非産生細胞に対して選択すること、とりわけ高産生細胞系を選択することは、任意のバイオプロセスの開発において重要な第一歩である。このような選択された細胞系は、動物細胞からタンパク質を産生するため、従来、限界希釈クローニングを繰り返し、その後産物を分析することにより単離されていた。この従来法は、時間とコストがかかる。クローン性（clonality）を達成する理論上の信頼度を高めるためには２回のクローニングの繰り返しが必要である。クローン性は、高産生細胞（high producer）より通常増殖速度が速い低生産性変異体による高産生細胞の過剰増殖を避けるために重要である。従来法は、完了するのにトータルで８ヶ月以上かかり得る。更に、現実的に考慮すべき問題は、実際にスクリーニングされる細胞の数を制限し、その結果、低存在度の高産生細胞クローンの検出を単なる機会の問題にしてしまうことである。
【０００３】
発達プロセスの間に細胞系の安定性を評価するには、分析クローニングが更に必要であり、これには６〜７週間かかり得る。また、分析クローニングは、フローサイトメトリーで可能な何千もの分析に対して、200〜300のクローンを評価するものであり、このため分析クローニングは、非産生細胞集団のサイズに関してより詳細かつ正確な描写が可能である。以前に報告された分泌分析は、別個のサブ集団を解析し定量するのに充分な感度を有していなかった。
【０００４】
フローサイトメトリー（ＦＣ）により、非常に多数の細胞の生産性をモニターし、適切な単一の細胞を単離することが可能になった。ＦＣは、蛍光体（fluorophor）による細胞の標識を必要とし、この蛍光はＦＣで定量され、所望の特性と互いに関連しているべきである。しかし、細胞系の表面に膜結合して提示された抗体の量は、可溶性抗体の分泌速度とあまり関連していない（Meilhoc et al., Application of flow cytometric measurement of surface IgG in kinetic analysis of monoclonal antibody synthesis and secretion by minute hybridoma cell-line in low serum and serum-free media, Hybridoma 9， 67-175）。従って、提示された抗体を検出抗体を用いて単に染色することは、高産生クローンを単離するのに有効でないことが判った。この問題を解決し、分泌抗体の高産生細胞を直接選択するために、二つの基本的に異なるアプローチが選出された。
【０００５】
第一の方法では、単一の細胞および共存する分泌抗体を、ゲル小滴の中にカプセル化する。その後、全ての小滴を標識し、ＦＣを用いて選別する。このアプローチは、ゲル小滴が単一の細胞のみを確実に占有するようにするため、作成されたゲル小滴の約５％しか細胞を含まず、分析されたゲル小滴の約９５％が細胞を含んでいないという、使用者に不都合な欠点を有する。その上、カプセル化/脱カプセル化が、組換えタンパク質の発現に一般に使用される細胞タイプ、最も著名には骨髄腫ＮＳＯ細胞の生存を低下させ得る。
【０００６】
第二のアプローチでは、分泌された抗体の量を引き続きＦＣにより評価するために、分泌された抗体を、人工的に作成された親和性部位または細胞表面のレセプターによって保持する。Holmes et al.（J. of Immunol. methods, 230 (1999), 141-147）は、室温での血漿（plasma）膜タンパク質のビオチン化を伴うアッセイを記載している。ビオチンは、第一にアビジン、第二にビオチン化捕捉抗体の更なる結合を促進する。捕捉抗体は、ＮＳＯ細胞系から分泌された抗体を認識し、それを細胞表面に固着する。その後、捕捉された分泌抗体を有する細胞を、第三の蛍光標識検出抗体とインキュベートすることにより、ＦＣにより、低存在度の高産生細胞クローンの蛍光検出および細胞選別が行われる。インキュベーション培地にゼラチン等の増粘剤を添加すると、個々のクローンの間の混線（cross-talk）、（即ち、産生細胞から非産生細胞または低産生細胞への分泌抗体の拡散および結合）が防止される。
【０００７】
公開されたこの方法の主な欠点は、高レベル産生細胞および低レベル産生細胞を識別し、低存在度の高産生細胞を正確に選別することに関して、比較的低い感度しか提供しないということである。公開されたこの方法を用いて、所定の細胞系から細胞表面への捕捉抗体を介した分泌キメラ抗体の結合を検出することはできなかった。更に、捕捉抗体は、必ず哺乳類細胞培養物に由来し、これは、胎児血清を含み、しばしば商業的抗体調製物としてのウシ血清アルブミンで安定化される。従って、捕捉抗体の使用は、クローン細胞培養物のウイルスまたはＢＳＥコンタミネーションを必然的に伴う。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、細胞クローンのプールから、適切な抗体を発現する単一の細胞を効率よく検出し選択する別の方法を考案することである。この目的は、独立請求項１に記載の方法により達成される。
本発明の可能な態様は、図面に示される。
【０００９】
第一の抗体を分泌する細胞を選択する本発明の方法は、
ａ）細胞の細胞表面にアビジンを連結させる工程、
ｂ）プロテインＧまたはプロテインＡ由来の少なくとも一の機能性抗体結合ドメインを含むビオチン化ポリペプチドと前記細胞をインキュベートする工程、
ｃ）蛍光標識され、かつ前記第一の抗体上のエピトープを認識し結合する第二の抗体と前記細胞をインキュベートし、インキュベート後に未結合の第二の抗体を洗浄する工程、
ｄ）ある量の第二の抗体を結合した蛍光標識された細胞を、便宜的かつ好ましくは蛍光分析フローサイトメトリー（ＦＣ）により選択する工程
を含む。ＦＣにより、蛍光標識された細胞の同時選別が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
抗体を分泌する産生細胞は、抗体を分泌するために使用する任意の細胞であり得、例えば、ハイブリドーマ、骨髄腫またはＣＨＯ細胞が挙げられる。より好ましくは、産生細胞は、骨髄腫細胞系であり、最も好ましくはＮＳＯ細胞系である。
【００１１】
従って、抗体は、天然に存在するかもしくは操作された任意の抗体、または抗体フラグメントであり得、例えばキメラ抗体または一価もしくは二価特異抗体などであり、ごく近年知られるようになったラクダおよびラマの単一重鎖抗体を含む（Trends Biochem. Scien. (2001), 26, 230）。好ましくは、本発明においてこのような抗体は、種々のクラス（IgG, IgA, IgE, IgM）の免疫グロブリン（Ｉｇ）の天然に存在するＦｃ部分に含まれるような、細菌プロテインＧまたはプロテインＡを高い親和性で結合するための結合部位を必ず含む。好ましくは、本発明において抗体は、ＩｇＧのＦｃ部分を含む。最も好ましくは、本発明において抗体は、ＩｇＧであるか、あるいはＩｇＧの少なくとも一の重鎖を含む。
【００１２】
本発明においてアビジンは、慣用的な鳥類のアビジン（約67kD）、または任意の他の機能的相同体、即ちビオチン結合相同体、例えばストレプトミセス属の種に由来するストレプトアビジン（60kD）、またはこのような天然に存在するアビジン類を化学的もしくは遺伝学的に操作した任意の変異体である。このような操作された変異体の例は、ニュートラビジン（Neutravidin）（Pierce, Rockford/IL）であり、これは、炭水化物を欠く脱グリコシル化アビジンであり、ｐＩ６〜７を有し、細胞表面レセプターへの非特異的結合を媒介し得るストレプトアビジンに含まれるトリペプチドＲＹＤドメインを含まないように更に操作されている。好ましくは、本発明においてアビジンは、鳥類のアビジン、脱グリコシル化された鳥類アビジン、またはニュートラビジンである。最も好ましくは、本発明においてアビジンはニュートラビジンである。このようなニュートラビジンは、およそ１４μｇ/ｍｇタンパク質のレンジ（range）のビオチン結合最大能力を示す。
【００１３】
アビジンは、例えば架橋により細胞表面に連結させることができる。当該技術分野で周知である慣用的な二官能性架橋試薬として、オキシラン、アルデヒド、スクシンイミド等の反応性基を含むもの、またはＮ-[Ｎ-４-アジド-テトラフルオロベンゾイル]ビオシチニルオキシ]スクシンイミド、ＳＡＮＤ(スルホスクシンイミジル２-[ｍ-アジド-ｏ-ニトロベンズアミド]-エチル-１，３-ジチオプロピネート)等の光反応性化合物を使用することができる。架橋が、脂質の反応性基（例えばホスファチジルセリンのヒドロキシ基）、またはより好ましくは膜タンパク質の表面に提示された反応性基と実際に起こることは言うまでもない。
【００１４】
好ましい態様では、ビオチンラベルを有する一官能性架橋試薬を用いて、細胞表面にビオチン部分を共有結合で連結した後、アビジンを、当該細胞表面に非共有結合で接着させる。アビジンは、細胞表面でビオチン部分を認識しそれに結合する。より好ましくは、かかるビオチン化は、10℃以下、最も好ましくは約４℃以下で行われる。この温度で、ビオチン化の効率は、時間とともに増大する。好適には、細胞表面をビオチン化するための反応時間は、30〜60分の範囲である。
【００１５】
アビジンを、細胞表面上のビオチンラベルを用いて細胞表面に捕捉したい場合、少なくとも50μｇ/ｍＬアビジン、より好ましくは少なくとも100μｇ/ｍＬアビジンを含む溶液中で細胞をインキュベートすることが好ましい。ここで「アビジン」という用語は、本発明におけるアビジンを指す。アビジン分子は、通常約４つのビオチン結合部位を有する。ビオチンラベルを、細胞表面をコーティングするために使用し、その後アビジンを、細胞表面に共有結合で連結したビオチンラベルより多い量でインキュベートすると、一つのビオチンラベルは、一つのアビジン分子に結合し、該アビジン分子の他の約３つのビオチンラベル結合部位はオープンのまま残る。
【００１６】
細胞表面に共有結合で連結し、かつ細胞表面に非共有結合でアビジンを固着するために機能するビオチン部分は、少なくとも10Å、より好ましくは少なくとも20Å、最も好ましくは少なくとも30Å延出するスペーサー部分（例えば直鎖アルキル鎖）により細胞表面に連結されることが更に好ましい。
【００１７】
本発明の方法の次の工程において、少なくとも一の抗体結合ドメインを包含するビオチン化ポリペプチドを、アビジン標識された細胞とインキュベートし、既に細胞表面に連結しているアビジンに結合する。本発明において抗体結合ドメインは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメントの抗原結合部分または相補性決定部分に由来しない。抗体結合ドメインは、免疫グロブリンに由来しない抗体結合ポリペプチドである。該ポリペプチドは、例えばプロテインＡ（Surolia, A. et al., 1982, Protein A: Nature’s universal antibody, TIBS 7, 74-76; Langone, J., 1982, Protein A of staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors, Adv. in Immunology, 32: p.156-241）、プロテインＧまたはプロテインＬであり得る。プロテインＬは、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）種に由来し、抗体の抗原結合部位に支障をきたすことなくカッパ（kappa）軽鎖相互作用を介して結合する独特の能力を有し（Kastern, W. et al., 1992, Structure of protein L and identification of a repeated immunoglobulin light-chain binding domain, J. Biol. chem. 267, 12820-12825）、これにより、Ｉｇの全てのクラス並びに一本鎖可変フラグメント（ScFv）およびFabフラグメントに結合する。
【００１８】
本発明に従って、かかる抗体結合ドメインを含むポリペプチドを使用することにより、本発明の分泌アッセイにおける感度は増大し、高産生細胞クローンを低産生細胞もしくは非産生細胞と充分に識別することができる。また、本発明の分泌アッセイは、細胞系の安定性を簡便かつ迅速に評価することができる。細胞系の発達プロセスの間に細胞系の安定性を評価するには、従来少なくとも200〜300クローンの分析クローニングが必要であり、これには６〜７週間を要していた。フローサイトメトリーと関連して、本願の主題であるアッセイは、低産生もしくは非産生サブ集団の何千の細胞を分析し定量するのに充分な感度を有し、これによりたった５時間で細胞系の安定性についての情報を提供する。
【００１９】
好ましくは、抗体結合ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＧに由来する。スタフィロコッカス（Staphylococcus）種のプロテインＡおよびストレプトコッカス（Streptococcus）種のプロテインＧは、抗体のＦｃ部分に特異的に結合する周知のタンパク質である（Boyle, M., Bacterial Immunoglobulin-Binding proteins, Academic Press, Sand Diego 1990）。これらは、ほとんど任意の動物種またはサブクラスのＩｇＧをアフィニティー精製するためバイオテクノロジーにおいて広く適用されている。スタフィロコッカス（Staphylococcus）のプロテインＡは、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対して、ストレプトコッカス（Streptococcus）のプロテインＧが結合するのと同様の部位に結合し、これは、両ケースとも例えばヒトＩｇＧ−Ｆｃ残基252-254、433-435および311と関連しており、Deisenhofer et al. (1981, Biochemistry 20; 2361-2370)およびSauer-Eriksson et al. (1995, Structure 3, 265-278)に示される。
【００２０】
更に、WO 00/7428は、ＩｇＧのFabフラグメントを結合するがＩｇＧのＦｃフラグメントを結合しない、細菌プロテインＧの抗体結合Ｂ１ドメインポリペプチド単離物について記載している。このＢ１ドメインの使用は、本発明の別の好ましい態様である。
【００２１】
一般的に、本発明において抗体ドメインは、単離されたドメインとして使用してもよいし、他のポリペプチド部分との融合タンパク質として使用してもよい。また、例えばプロテインＡ、Ｇ、Ｌ、またはそのアミノ酸を置換、欠失もしくは挿入により人為的に操作した機能的変異体の幾つかの抗体結合ドメインを融合することもできる。また、欠失を有するかまたは先端を切断された例えばプロテインＡ、Ｇ、Ｌ等の変異体をを使用することもできる。
【００２２】
好ましくは、該ポリペプチドは、グリコシル化の部位を含まないか、または１〜２部位しか含まず、より好ましくは炭水化物を欠いている。
【００２３】
好ましくは、少なくとも４つの抗体結合部位を含むポリペプチド、最も好ましくは分子量約４２ｋＤの完全なプロテインＡが本発明で使用される。このような完全なプロテインＡは、ＩｇＧのＦｃ部位に対して高親和性の結合部位を４〜５個有する。このことは、ビオチン部分に対するアビジンの多価性（multivalency）と関連して、分泌された抗体の結合量をかなり増大させ、これによりシグナルは増幅する。
【００２４】
ポリペプチドのビオチン化は、細胞表面をビオチン化する上記方法の何れかにより達成され得る。その上、好適にはビオチン部分をチラミンに接合することも可能であり、そのポリペプチドへの共有結合は、過酸化水素の存在下で水素ペルオキシダーゼにより生成した酸素フリーラジカルにより触媒される。
【００２５】
ポリペプチドがプロテインＡまたはプロテインＧの少なくとも一の抗体結合ドメインを有する、ポリペプチド−アビジン接合体を直接使用することもでき、これは本発明の更なる目的である。ポリペプチドとタンパク質部分との架橋は、それぞれ生化学の分野で周知であり、多くの試薬を用いて達成され得る（Fasold et al., bifunctional reagents for the crosslinking of proteins, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1971), 10: 795-801）。例えば、Ｎ−ヒドロキスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルによるアミノ酸リジンのアミノ基への結合は、当該分野で周知である。本発明の好ましい態様および定義が、同様にこの目的に適用される。
【００２６】
好ましくは、ビオチン部分はスペーサー部分によりポリペプチドに連結され、スペーサーアームは、少なくとも１５Å、より好ましくは少なくとも２２Å、最も好ましくは少なくとも３０Åの長さを有する。適切なスペーサーアームは、例えば直鎖アルキル部分であり得る。このような延出したスペーサーアームは、一のアビジン複合体に幾つかのビオチン化分子を結合すると立体障害が低減する。
【００２７】
本発明において抗体結合ドメインを含むポリペプチドは、該ポリペプチドまたはタンパク質に共有結合した少なくとも３つのビオチン部分、より好ましくは少なくとも６つのビオチン部分、最も好ましくはポリペプチドまたはタンパク質あたりそれぞれ６〜１０のビオチン分子を有する。ポリペプチドのビオチン化の程度は、ポリペプチドにおける反応性基（例えばリジンのアミノ基、システインのスルフヒドリル基）の数およびビオチン化の際のポリペプチドに対するビオチン化試薬の比率によって支配されやすい。
【００２８】
本発明において第二の検出抗体は、本発明の方法に従って細胞クローンによる発現がモニターされる第一の分泌抗体に特異的に結合する、任意の慣用的な蛍光標識抗体または抗体フラグメントであり得る。また本発明の範囲において、「分泌抗体」は、例えばELISA技術等の関連技術で慣用的に使用されるような、第一および第二の検出抗体の任意の適切な組み合わせを含むように解釈されてもよく、ここでは第二の検出抗体のみが蛍光標識される。同様に、第一の分泌抗体により認識される蛍光標識抗原を、検出のために使用してもよい。好適には、本発明の工程ｂとｃの間に、細胞培地での短いインキュベーション期間を挟むことにより、人為的に作成した細胞表面上の抗体結合部位を、分泌された抗体により飽和させることができる。
【００２９】
好ましくは、本発明の方法においてビオチン化ポリペプチドと細胞をインキュベートする間または遅くともインキュベートの後に、増粘剤を含む培地で細胞を培養する。この処置が、培地の粘度を人為的に増大させることにより細胞間のクロスフィーディング（cross-feeding）を妨害する。増粘剤は、例えばメチルセルロース、ＰＥＧ、デンプン、藻類、細菌もしくは植物由来のポリサッカリド、またはゼラチンであり得る。好ましい態様において、少なくとも１０％(w/w)の濃度のゼラチンが使用される。
【００３０】
とりわけ好ましい更なる態様において、本発明の方法においてビオチン化ポリペプチドと細胞をインキュベートする間または遅くともインキュベートの後であって、蛍光標識抗体または抗原で細胞を標識する前に、非ビオチン化プロテインＡまたは別の非捕捉・競合抗体結合ドメインを含むポリペプチドを、少なくとも0.5μｇ/ｍＬ、より好ましくは少なくとも４μｇ/ｍＬ、最も好ましくは少なくとも８μｇ/ｍＬの濃度で含む培地で細胞を培養する。好適には、かかる非捕捉・競合プロテインＡ等は、細胞間のクロスフィーディングを妨害するため、上述の増粘剤と組み合わせて使用される。
【００３１】
好ましくは、本発明の方法において蛍光標識抗体または抗原で細胞を標識する前であって、細胞表面に固相化されたビオチン化ポリペプチドに、分泌された抗体を結合させた後、第三のブロッキング抗体を例えば少なくとも0.5〜５ｍｇ/ｍＬの濃度で細胞に添加する。かかる第三のブロッキング抗体は、ビオチン化ポリペプチドの残りの抗体結合部位に結合することができるが、検出のために使用される第二の蛍光標識抗原または抗体により認識されず結合されない。この処置は、更に、遅い時期のクローン間のクロスフィーディングを除去することに寄与し、これにより、本発明のアッセイの感度および識別力を高めることに寄与する。アッセイの識別力および感度を相乗して高めるために、かかる処置が、他の提案される処置、例えば増粘剤および/または非ビオチン化競合プロテインＡ等と組合せ可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００３２】
すべての実験において、細胞は、標準的な染色細胞計数技術により評価した生存率が９５％以上であるバッチ培養の対数増殖期から採取した。
【００３３】
１．比較実験
ＮＳＯ骨髄腫細胞系に由来する細胞系6A1(100)3（Lonza Biologicsから入手）を使用した。それは、胸部腫瘍抗原TAG73に特異的なヒトキメラＩｇＧ抗体cB72.3を分泌するＧＳ−トランスフェクト細胞系である（Bebbington, C. et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine sunthetase (GS) gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10: 169-175）。この細胞をHolmes et al.（同上）に記載されるとおり正確に処理した。分泌細胞と未処理ネガティブコントロール細胞系（ＮＳＯ細胞系ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．85110503）との間に再現可能な有意な蛍光の差異は観察されず、結果は期待はずれであった。非産生ＧＳトランスフェクト骨髄腫細胞系を用いて、該細胞に外部からヒトＩｇＧを添加して実験を繰り返したが、これもまた、平均蛍光に感知できるほどの差異はなかった。
【００３４】
２．分泌アッセイ
２．１  分泌された抗体の捕捉
分泌された抗体の捕捉および検出の原理は、図１に概略的に図示される。キメラ抗体cB72.3を分泌する細胞系6A1(100)3を実験モデルとして再度選択した。分泌マトリクスは、以下のとおり構築した。107の6A1(100)3細胞を、25ｍＬのｐＨ８ ＰＢＳで洗浄し、１ｍｇ/ｍＬ  ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（カタログＮｏ．21336、スクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエイト；Pierce, Rockford, IL/USA）を含有する１ｍＬの生理学的標準ＰＢＳ（ｐＨ８）に再懸濁した。４℃で４０分インキュベートした後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７）で２回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７）に再懸濁した。128μＬの１ｍｇ/ｍＬニュートラビジンTM（Pierce, UK）溶液を添加し、細胞を室温で１５分間インキュベートし、その後５０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７）で更に洗浄した。１ｍＬのｐＨ７ ＰＢＳに再懸濁した後、非ビオチン化プロテインＡを、最終濃度１μｇ/ｍＬまで添加し、その混合物を室温で５分間インキュベートした。次いで、５２μＬの１ｍｇ/ｍＬビオチン化プロテインＡ（Pierce, Rockford, IL/U.S.A.；タンパク質あたり６〜１０のビオチンラベルを有する）溶液を添加し、室温で更に１５分間インキュベートした。インキュベーションのために用いたビオチン化プロテインＡの濃度は、まだ飽和ではなかった。独立した実験により、120μｇ/ｍＬの濃度のビオチン化プロテインＡでさえ、結合は飽和に近づかないことが確認された（データ示さず）。
【００３５】
その後、ポジティブコントロールとして使用されるサンプルに、6.6μｇ/ｍＬの濃度になるように適切な体積の精製cB72.3 ＩｇＧを投与した。
【００３６】
ネガティブコントロールとして使用されるサンプルは、ビオチン/アビジン/捕捉プロテインＡアフィニティーマトリクスを欠損する細胞から成っていた。これらサンプルに、他のすべてのサンプルと同様、分泌培地でのインキュベーションで開始する処理を行った。
【００３７】
完全な分泌アッセイで使用されるサンプルすべてに、以下の処理を行った：細胞を１０ｍＬの分泌培地（Holmes, P. et al., Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors, J. of Immunological methods, 230 (1999), 141-147 for culture of NSO 6A1(100)-3 cell line enriched with 10% gelatineに記載される細胞培地）に再懸濁した。この培地は、産生細胞から離れて拡散する抗体を捕捉し、抗体が非産生細胞に結合することを妨害するために、８μｇ/ｍＬの非ビオチン化プロテインＡ（Sigma, UK）を更に含有していた。細胞は、この分泌培地で４℃で１５分間インキュベートした。
【００３８】
２．２  蛍光標識
マウス抗ヒトカッパ軽鎖ＦＩＴＣ接合体（Sigma, UK）を最終希釈１/500で用いて、結合した分泌抗体を検出した。
【００３９】
２．１の欄に記載したとおり処理した細胞を、２５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７）で１回洗浄し、320μＬの１ｍｇ/ｍＬマウスＩｇＧブロッキング抗体（Sigma, UK）を添加し、細胞ペレットと混合し、５分間インキュベートした。その後、細胞を２５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７）で２度目の洗浄をし、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。５μＬのマウス抗ヒトカッパ軽鎖ＦＩＴＣ検出抗体（Sigma, UK）を添加し、細胞を１５分間インキュベートした。２５ｍＬのＰＢＳで更に洗浄した後、細胞をフローサイトメトリーによる分析のために１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
【００４０】
２．３  フローサイトメトリー
先のセクションで記載したとおり標識した後、細胞を、Coulter Epics Elite flow Flow Cytometerを用いて、488ｎｍの励起波長、515ｎｍの検出波長で分析した。ゲートで制御された（gated）生存集団を同定するために、前方散乱に対する側方散乱のログを使用し、蛍光レベル（および結合した抗体の量）をこの集団について測定した。（Ａ）ネガティブコントロール（即ち、アフィニティーマトリクスなし）、（Ｂ）アフィニティーマトリクスにより捕捉された分泌抗体を備えた細胞、（Ｃ）アフィニティーマトリクスにより捕捉された精製ＩｇＧを外部から添加してインキュベートしたポジティブコントロール細胞の分布を、蛍光強度に対する細胞数としてすべて図２に示す。分泌細胞Ｂは、１９．３の平均蛍光を示し、ネガティブコントロールＡと比べて平均蛍光は５０倍増大した。ポジティブコントロールＣは、平均５９．５を示し、ネガティブコントロールに対して125倍の増加を示した。図２に記載の平均蛍光の数値を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
３．比較例
細胞表面に分泌抗体を結合するビオチン化捕捉抗体の有効性を、ビオチン化プロテインＡの有効性と比較した。比較実験では、全サンプルについて、分泌培地の代わりに増粘剤を含まないＰＢＳをインキュベーションに使用したことを除いて、分泌アッセイはセクション２に記載のとおり行った。先のセクションで記載した標準的なネガティブコントロール（Ａ）、ポジティブコントロール（Ｃ）およびcB72.3分泌細胞（Ｄ）とは別に、ビオチン化プロテインＡを、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的捕捉抗体（Sigma, UK）と置き換えることにより追加のサンプル（Ｂ）を調製した。ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的捕捉抗体は、50μｇ/ｍＬの濃度（飽和に近く、先の実験で使用したプロテインＡの量に匹敵する濃度）で15分間インキュベートすることにより細胞表面に固相化された。その後、サンプル（Ｂ）にヒトＩｇＧを外部から添加してインキュベートし、上記ポジティブコントロールについて記載したとおり更に処理した。全サンプルの分布を、図２と同様、フローサイトメトリー蛍光分析後の蛍光強度に対する細胞数として図３に示す（図３：Ａ：ネガティブコントロール、Ｂ：捕捉抗体、Ｃ：ポジティブコントロール、プロテインＡ、Ｄ：分泌されたcB72.3、プロテインＡ）。図３に示される分布に記載の平均蛍光の数値を表２に示す。捕捉抗体をヒトＩｇＧモデル生成物と使用すること（サンプルＢ）により、ネガティブコントロール細胞と比較して平均蛍光は５倍増大した。しかし、プロテインＡを使用すると（サンプルＣ）、平均蛍光は８０倍増大し、このことは、プロテインＡが捕捉抗体より有効であることを実証している。また、当該技術を、分泌されたcB72.3を捕捉し検出するために用いたとき、プロテインＡは非常に有効であり、ネガティブコントロールと比較して平均蛍光は約５５倍増加した。
【００４３】
Holmes et al.（同上）に記載のとおり調製したサンプルは、ネガティブコントロールに対して何ら増加を示さなかった（データ示さず）。
【００４４】
【表２】
2005526950.tif 000004
【００４５】
実験Ｂのデータを実験Ｃ、Ｄのデータと比較すると、捕捉抗体をプロテインＡに置き換えることにより、検出感度および結合能力がそれぞれ劇的に改善されることは明らかである。理論的には、プロテインＡは、捕捉抗体と比較して、余分の２つの結合部位（全部で４つ）を有するため、分泌された抗体の結合量を２倍にすることが可能であると思われる。高親和性結合抗体は、プロテインＡの結合親和性をおよそ一桁上回ることができるため、この予測は、理論的な最大値を構成するであろう。対照的に、捕捉抗体と比べてプロテインＡにより実際に観察された約１５〜２０倍の強度の増大は、驚くべきことに未知の理由により、理論的に予測される値をはるかに超える。
【００４６】
図１ｂは、外部から添加したＩｇＧのＦｃ部分を結合するプロテインＡの結合能力に対する、かかる外来ＩｇＧのＦｃ部分を結合する捕捉抗体の結合能力との比較を示す。インキュベーションのために使用する捕捉抗体とプロテインＡの量を、結合を飽和にするためにそれぞれ２倍にしたことを除いて、本質的にこのセクションのこのパートで記載したとおりサンプルを調製した。インキュベーションの間、予め正確に決められた外来ＩｇＧの濃度を保証するために、規定体積の細胞ペレットに精製ＩｇＧを添加した。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】分泌された抗体を分析するための捕捉および検出原理を示す該略図。
【図１ｂ】捕捉抗体およびプロテインＡの結合能力の比較。
【図２】本発明の分泌アッセイに由来するサンプルの蛍光サイトメトリー（ＦＣ）分析。
【図３】プロテインＡの効果を、分泌された抗体を捕捉するための抗ヒトＩｇＧ抗体と比較した、分泌アッセイに由来するサンプルの蛍光サイトメトリー（ＦＣ）分析。
【図１ａ】
2005526950.tif 000005
【図１ｂ】
2005526950.tif 000006
【図２】
2005526950.tif 000007
【図３】
2005526950.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月2日(2004.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の抗体を分泌する細胞を選択する方法であって、
ａ）細胞の細胞表面にアビジンを連結させる工程、
ｂ）プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたはその機能的変異体の少なくとも一の機能性抗体結合ドメインを含むビオチン化ポリペプチドと前記細胞をインキュベートする工程、
ｃ）蛍光標識され、かつ前記第一の抗体上のエピトープを認識し結合する第二の抗体または抗原と前記細胞をインキュベートする工程、
ｄ）ある量の第二の抗体を結合した蛍光標識された細胞を、好ましくは蛍光分析フローサイトメトリーにより選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ビオチン化ポリペプチドが、プロテインＧまたはプロテインＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
共有結合による前記細胞表面のビオチン化が行われた後、好ましくは１０℃未満の温度でビオチン化が行われた後、前記アビジンを前記細胞表面に結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチン化ポリペプチドとインキュベートする間または遅くともインキュベート後に、増粘剤を含む培地で前記細胞を培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一の抗体を分泌する細胞を選択する方法であって、
１）好ましくはプロテインＧまたはプロテインＡに由来する、少なくとも一の機能性抗体結合ドメインを含むポリペプチドに接合したアビジンを、細胞の細胞表面に連結させる工程、
２）蛍光標識され、かつ前記第一の抗体上のエピトープを認識し結合する第二の抗体または抗原と前記細胞をインキュベートする工程、
３）ある量の第二の抗体を結合した蛍光標識された細胞を、好ましくは蛍光分析フローサイトメトリーにより選択する工程
を含む方法。
【国際調査報告】
2005526950.tif 000009
2005526950.tif 000010
2005526950.tif 000011