(57)【要約】本発明は、レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＧＦＰ変異体を開示している。レニラ・レニフォルミスＧＦＰおよびその変異体はヒト細胞での発現のために最適化されており、さらに、ペプチドのインビボ表示およびペプチドライブラリー用の足場として用いられる。
2005532071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、ヒト化ｈｒＧＦＰをコードする前記第１の核酸配列に内部挿入されている第２の非相同性核酸配列とを含み、足場ＧＦＰをコードしている組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記足場ＧＦＰが蛍光性である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
ｈｒＧＦＰをコードする前記第１の核酸配列が配列番号１である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記第２の非相同性核酸配列が、ｈｒＧＦＰをコードする前記第１の核酸配列のヌクレオチド５１９とヌクレオチド５２０の間に挿入されている、請求項２に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記第２の非相同性核酸配列が多重クローニング部位配列を含む、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記第２の非相同性核酸配列が配列番号２の多重クローニング部位配列である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記多重クローニング部位に内部挿入されている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列がランダム核酸配列を含む、請求項４または５に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第３の核酸配列が、前記ｈｒＧＦＰコード配列とインフレームのペプチドをコードする、請求項６に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記第３の核酸配列が、２〜５０アミノ酸のペプチドをコードする、請求項６に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記第３の核酸配列が、１０〜２０アミノ酸のポリペプチドをコードする、請求項６に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項１１】
レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、前記ＧＦＰに内部融合されている非相同性ペプチドとを含む、組換えポリペプチド。
【請求項１２】
前記非相同性ペプチドが、前記ＧＦＰのアミノ酸残基１７３と１７４の間に配置されている、請求項７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
前記第２の非相同性アミノ酸配列がランダムペプチド配列である、請求項７に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される、請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１１に記載の組換えベクターを含む細胞。
【請求項１７】
複数の組換えポリヌクレオチドを含む組換えベクターのライブラリーであって、前記組換えポリヌクレオチドが、ヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、ｈｒＧＦＰをコードしている前記第１の核酸配列に内部挿入されている第２の非相同性核酸配列とを含み、該ライブラリーの構成ベクターが、複数の異なる前記第２の非相同性核酸配列を含む、前記ライブラリー。
【請求項１８】
前記複数の異なる前記第２の非相同性核酸配列が、複数のランダム化核酸配列を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項１９】
目的の表現型を付与するペプチドを同定する方法であって、
ａ）複数の細胞を提供し、ここで各細胞が、レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）と非相同性ランダムペプチドとを含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む組換えベクターを含有し、前記非相同性ランダムペプチドが、前記組換えポリペプチドが発現する条件下で、前記ｈｒＧＦＰへ内部融合されるステップと、
ｂ）前記表現型について前記細胞をアッセイするステップとを含む
方法。
【請求項２０】
目的のタンパク質と相互作用するペプチドを同定する方法であって、
ａ）組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む組換えベクターのライブラリーを複数の宿主細胞へ導入し、かつ前記組換えポリペプチドが発現する条件下で前記細胞を維持し、
前記組換えポリペプチドが、転写活性化ドメインと融合したレニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）と、前記ｈｒＧＦＰへ内部融合されている非相同性ランダム化ペプチドとを含み、
前記宿主細胞が、ＤＮＡ結合ドメインと融合した目的のタンパク質をコードする遺伝子と、前記ＤＮＡ結合ドメインを結びつけるＤＮＡ配列と機能的に連結したレポーター遺伝子とを含有しており、前記レポーター遺伝子の発現が前記転写活性化ドメインにより制御されているステップと；
ｂ）目的のタンパク質と相互作用するペプチドとして、前記非相同性ランダムペプチドを同定する、前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップとを含む
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００２年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／３９４７３７号の優先権を主張するものであり、図面を含むその全内容を引用により本明細書に援用するものとする。
（発明の分野）
本発明は、ヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）と、機能ペプチドを表示するための足場タンパク質としてのその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ、オワンクラゲ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、酵母および哺乳動物の両細胞において、ペプチドのインビボ表示およびペプチドライブラリーの足場として用いられてきている（Ｋａｍｂら、（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：７５０８〜７５１３）。このランダムなペプチドの表示に関する足場タンパク質としてのＧＦＰを用いて、ペプチドライブラリーの特性を明らかにすることができる。例えば、Ａｂｅｄｉら（１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６：６２３〜３００）は、エクオレア・ビクトリアＧＦＰの溶媒曝露ループ領域にペプチドを挿入し、酵母および大腸菌でＧＦＰ分子が発現された場合、それらの自己蛍光を維持することを明らかにしている。さらにＡｂｅｄｉらは、ＧＦＰ足場の蛍光を用いて、ペプチド多様性、ならびに所与の細胞中のペプチドの存在または発現をモニターすることができることを示している。しかし、ＧＦＰ足場分子の平均蛍光は、野生型（ｗｔ）ＧＦＰと比較すると相対的に弱い。ＫａｍｂおよびＡｂｅｄｉ（米国特許第６０２５４８５号）は、蛍光強度を高めるために、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）でＧＦＰ足場ライブラリーを調製している。さらに最近、Ｐｅｅｌｌｅら（２００１、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏ．、８：５２１〜５３４）は、哺乳動物細胞の異なる構造バイアスをもつＥＧＦＰ足場ペプチドライブラリーを試験している。さらにＡｎｄｅｒｓｏｎらは、テトラグリシンリンカーを有しているＧＦＰループにペプチドを挿入することによって蛍光強度を改良している（米国特許出願第２００１／０００３６５０号）。しかし当技術分野では、最適蛍光を示すだけでなく、細胞内において高発現し得るＧＦＰ足場が求められている。ＧＦＰの間には、自己蛍光は維持しているが、表示に関する許容度に差がある。従って、ＧＦＰ自己蛍光を維持しながら、高発現し、かつ挿入を許容し得るＧＦＰも当技術分野で求められている。
【０００３】
（本発明の概要）
本発明は、ヒト細胞での発現に対して最適化されており、かつペプチドのインビボ表示およびペプチドライブラリーの足場として有用なレニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＧＦＰ変異体を開示する。
【０００４】
本発明は、ヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、前記のヒト化ｈｒＧＦＰをコードする第１の核酸配列に内部挿入されている第２の非相同性核酸配列とを含む、組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０００５】
一実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）で同定される配列を含む。
【０００６】
別の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ｈｒＧＦＰをコードする核酸配列のヌクレオチド５１９とヌクレオチド５２０の間に挿入されている非相同性核酸配列を含む。
【０００７】
さらに本発明は、非相同性核酸配列が多重クローニング部位配列である、組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０００８】
一実施形態では、多重クローニング部位を含む組換えポリヌクレオチドは配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）で同定される配列である。
【０００９】
さらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、多重クローニング部位に内部挿入されている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列はランダム核酸配列である。
【００１０】
一実施形態では、第３の核酸配列は、ｈｒＧＦＰを含むインフレームのペプチドをコードする。
【００１１】
別の実施形態では、第３の核酸配列は、２〜５０個のアミノ酸のペプチドをコードする。好ましい実施形態では、第３の核酸配列は、約１０〜約２０個のアミノ酸のペプチドをコードする。
【００１２】
本発明はまた、レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、前記ＧＦＰへ内部融合されている非相同性ペプチドとを含む組換えポリペプチドを包含する。
【００１３】
一実施形態では、組換えポリペプチドは、レニラ・レニフォルミスＧＦＰのアミノ酸残基１７３と１７４の間に配置されている非相同性ペプチドを含む。
【００１４】
別の実施形態では、組換えポリペプチドは非相同性ランダムペプチド配列を含む。
【００１５】
さらに本発明は、上述の組換えポリヌクレオチドを含む組換えベクターを包含する。
【００１６】
一実施形態では、組換えベクターはプラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選択される。
【００１７】
さらに本発明は、ヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、前記のヒト化ｈｒＧＦＰをコードする第１の核酸配列に内部挿入されている第２の非相同性核酸配列とを含む組換えポリヌクレオチドを含んでいる組換えベクターを含む細胞を包含する。
【００１８】
本発明はさらに、組換えポリヌクレオチドを含有し、組換えポリヌクレオチドが、レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードする第１の核酸配列と、ｈｒＧＦＰをコードする第１の核酸配列に内部挿入されている第２の非相同性ランダム核酸配列とを含む、組換えベクターのライブラリーを包含する。該ライブラリーは、ランダム核酸によって配列が異なる複数の組換えベクターを含む。
【００１９】
本発明は、目的の表現型を付与するペプチドを同定する方法を提供する。本方法は、ｉ）レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）の組換えポリペプチドと、ｈｒＧＦＰに内部融合されている非相同性ランダムペプチドをコードする組換えベクターを含有する複数の細胞を提供するステップと、ｉ）前記表現型について細胞をアッセイするステップとを含む。
【００２０】
さらに本発明は、目的のタンパク質と相互作用するペプチドを同定する方法を提供する。本方法は、転写活性化ドメインに融合されているレニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）の組換えポリペプチドと、ｈｒＧＦＰに内部融合されているランダム非相同性ペプチドをコードする組換えベクターのライブラリーを宿主細胞中に導入することを含む。この方法では、宿主細胞は、ＤＮＡ結合ドメインに融合されている目的のタンパク質をコードする遺伝子と、そのＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質の近くに結合しているＤＮＡ配列に機能的に連結されているレポーター遺伝子とを含有している。レポーター遺伝子の発現は、転写活性化ドメイン融合タンパク質により制御され、従って、レポーター遺伝子発現の検出は、ペプチドが目的のタンパク質と相互作用することを示す。
【００２１】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な記載と添付の図面を参照することにより深く理解することができる。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、ヒト細胞における発現で最適化されており、かつペプチドのインビボ表示およびペプチドライブラリーの足場として有用なレニラ・レニフォルミス由来のＧＦＰおよび変異体に関する。
【００２３】
さらに本発明は、ヒト化レニラ・レニフォルミスＧＦＰペプチドライブラリーを用いて、薬剤の発見または細胞内ノックアウト試薬に用いることができるペプチドを同定する方法を開示する。
【００２４】
定義
以下の定義は、下記の記載で用いられている特定の用語について提供するものである。
【００２５】
本明細書で用いる「ヒト化Ｒ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質」または「Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ」という用語は、配列番号３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のポリペプチド、またはその蛍光性変異体を意味する。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ変異体は、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはコード配列内のいずれかにおいて、１種または複数のアミノ酸の挿入または欠失を含む、１種または複数の変異を有する配列番号４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のポリペプチドを包含する。本発明によるＲ・レニフォルミスＧＦＰの変異体は、特定の部分のスペクトル内の光により励起された場合に光を放出する能力を保持しており、野生型Ｒ・レニフォルミスにより励起または放出されるスペクトル部分と検出可能に異なるスペクトル部分の光により、励起され得るか、あるいはかかる光を放出し得る。異なる励起または発光スペクトルを示す変異体に加えて、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ変異体には、野生型レニラ・レニフォルミスＧＦＰと比べて蛍光強度の増加を示す変異体が含まれる。
【００２６】
「ヒト化」Ｒ・レニフォルミスポリヌクレオチドコード配列に関して用いられる場合の「その変異体」という用語は、配列が、配列番号５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の野生型Ｒ・レニフォルミスコード配列の配列に対して１種または複数のヌクレオチド差異を有することを意味する。Ｒ・レニフォルミスポリヌクレオチド配列の変異体は、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドまたはその変異体をコードする。変異体ポリヌクレオチドは、非ヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリヌクレオチド配列の等質量の、または等数のコピーから発現された量に少なくとも等しいか、またはそれより多い量の蛍光ポリペプチドの発現を指令する。本明細書では、変異体ポリヌクレオチドは「ヒト化ポリヌクレオチド」である。
【００２７】
「ヒト化ポリヌクレオチド」または「ヒト化配列」という用語は、１または複数の、つまり５あるいはそれ以上、１０あるいはそれ以上、２０あるいはそれ以上、５０あるいはそれ以上、７５あるいはそれ以上、１００あるいはそれ以上、１２５あるいはそれ以上、１５０あるいはそれ以上、２００あるいはそれ以上、またはさらにはすべてを含む非ヒトポリペプチド（すなわち、自然にはヒトでは発現されていないポリペプチド）のポリヌクレオチドコード配列のコドンが、ヒト細胞における発現でより好ましいコドン配列に変化している、ポリヌクレオチドコード配列を意味する。３コドン群では４個のＤＮＡヌクレオチドの６４個の可能な組合せが存在するので、遺伝子コードは２０個のアミノ酸の多くで重複している。特定のアミノ酸の異なる各コドンは、そのアミノ酸のポリペプチドへの取込みをコードしている。しかし、特定の種間では、特定のアミノ酸をコードするために、ある重複コドンに対する優先性が存在する傾向がある。Ｒ・レニフォルミスの「コドン優先性」は、ヒトのコドン優先性とは異なる（このコドン優先性は、通常、対応するアンチコドン配列を含有するｔＲＮＡの発現レベルの差異に基づいている）。ヒト細胞で高発現する非ヒト遺伝子産物を得るには、１種または複数の好ましくないコドンを、ヒト細胞での好ましいコドン配列に変えることが有利である。表１は、ヒト遺伝子発現において好ましいコドンを示す。コドン配列が、表の所与のコドン配列の左に存在する場合、ヒト発現において好ましい。最適には、必ずしもではないが、非ヒトポリヌクレオチドコード配列中のあまり好ましくないコドンは、それらをヒト遺伝子発現におけるアミノ酸に最も好ましいコドンに変えることによりヒト化される。ヒト細胞で本発明によるヒト化ＧＦＰポリヌクレオチド配列から発現される蛍光ポリペプチドの量は、１細胞当たりの質量または蛍光強度いずれかに関して、等しいコピー量または等しいコピー数の非ヒト化ＧＦＰポリヌクレオチドから発現される量に対して少なくとも２倍である。
【００２８】
本明細書では、「ヒト化コドン」という用語は、非ヒト生物（これから非ヒトポリペプチドが得られる）によりコードされているコドンに比べて、ヒト細胞での発現にさらに好ましいコドン配列に変えられた、非ヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列内のコドン配列を意味する。「好ましい」コドンは、好ましくないコドンに比べて、発現中に使用されるｔＲＮＡ分子の大きなプールを有している。例えば、ｔＲＮＡ分子は特定のポリペプチドの発現に限定されるものではない。種特異的コドン優先性は、一部には、適切なアンチコドン配列を有するｔＲＮＡ分子の発現における差異から生じる。すなわち、種特異的コドン優先性における１つの因子は、コドンと、発現される対応するアンチコドンｔＲＮＡの量の間の関係である。
【００２９】
本明細書では、「野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ」という用語は、配列番号５の核酸を意味する。
【００３０】
本明細書では、「蛍光強度の増加した」または「輝度の増加した」という用語は、特定の一連の条件下で、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰにより示されるものより高い蛍光強度または輝度を意味する。一般に、蛍光強度または輝度の増加は、変異体の蛍光が、特定の一連の条件下で、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰに比べて、少なくとも５％またはそれ以上、好ましくは１０％、２０％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上、さらには５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍、またはそれ以上の強度または輝度であることを意味する。
【００３１】
本明細書では、「組換えポリヌクレオチド」とは、「ヒト化」レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）またはその変異体をコードするように連結されている２種またはそれ以上の異なる核酸配列のＤＮＡ配列を意味し、これはｈｒＧＦＰに内部挿入されている非相同性アミノ酸配列を有している。その結果、ｈｒＧＦＰは「非相同性」ペプチドを表示する足場として役立つ。本明細書では、「非相同性」核酸配列またはアミノ酸配列とは、ｈｒＧＦＰに通常存在しない付加的なアミノ酸配列または核酸配列を意味する。「非相同性ペプチド」配列は、２アミノ酸（５０アミノ酸まで）のように小さくてよい。「非相同性」配列は少なくとも１種の、好ましくは１種よりも多くの制限酵素開裂部位または制限部位を含有し、従って「クローニング部位」または「多重クローニング部位」が生じる、核酸配列であってよい。「多重クローニング部位」は、制限酵素開裂部位または認識部位を含有しているが、ここで、付加的な「非相同性核酸配列」は、その配列がインフレームで存在するようにｈｒＧＦＰコード配列に挿入され得る。また、「非相同性」配列は、リンカーによってインフレームでｈｒＧＦＰと融合され得る。「非相同性」核酸配列またはアミノ酸配列は、目的の周知の配列またはランダム配列であってよい。
【００３２】
本明細書では、「ランダムペプチド」および「ランダム核酸」とは、それぞれ、ランダムアミノ酸またはランダムヌクレオチドからなる配列を意味する。ランダムペプチドまたはランダム核酸分子は、周知の配列の鋳型を用いては合成されない。すなわち、ランダム核酸は、配列の全体にわたる任意の位置に任意のヌクレオチドを組込むことにより合成することができる。従って、ランダムヌクレオチド配列は、ペプチドの全体にわたってランダムに配置されているアミノ酸を含有するランダムペプチドをコードし得る。「ランダム化ペプチドライブラリー」は、合成過程で、核酸の全体にわたる、すべての、または大部分の可能なヌクレオチド位置の組合せを形成させることによって作製することができる。例えば、２４ヌクレオチドのランダムオリゴヌクレオチドは、１００億８個を越えるアミノ酸ペプチドをコードする。ライブラリーは、サイズとしては、一般には１０３〜１０９の異なる種の範囲に及んでおり、従って、ライブラリーのサブセットを作ってもよい。本明細書では、「ランダムペプチドライブラリー」もまたバイアスライブラリーを含んでいる。「バイアス」ライブラリーでは、例えば、特定のアミノ酸残基はペプチド配列内に固定されているが、他の残基はランダムに変わる。残基は構造バイアスがあるように固定されていてもよい。例えば、システインが存在するとジスルフィド結合が可能となり、プロリンは、ＳＨ３ドメイン、二量体化配列、またはリン酸化してタンパク質間相互作用部位を生成し得るアミノ酸を作ることができる。好適なバイアスのいくつかの例が米国特許出願第２００１／０００３６５０号に記載される。なお、この出願は引用により本明細書に援用するものとする。
【００３３】
ランダム非相同性ヌクレオチド配列、バイアス非相同性ヌクレオチド配列、または周知の非相同性ヌクレオチド配列は、種々の方法で調製することができる。かかる配列は、例えば、オリゴヌクレオチド合成によって、または、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡなどの天然核酸配列からのＰＣＲ増幅によって、調製することができる。本明細書では、「組換えペプチドのライブラリー」は、少なくとも１０３、好ましくは、１０７、１０８、または１０９またはそれ以上の個々の種の範囲に及ぶ多様なランダム化発現産物を有する。「組換えベクターのライブラリー」は、少なくとも１０３、好ましくは、１０７、１０８、または１０９またはそれ以上の個々の種の範囲に及ぶランダム化発現産物をコードする多様なランダム化組換えポリヌクレオチドｈｒＧＦＰコード配列を有している。
【００３４】
本明細書では、「ベクター」とは、一定の宿主細胞中で自己複製することができるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。「組換えベクター」とは、挿入された外来核酸配列を含有するベクターである。ベクターは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染などをはじめとする、当業者に周知の種々の手段によって宿主細胞へ導入することができる。「組換えベクター」が宿主細胞へ導入される場合、それは一時的にまたは安定的にその外来核酸を発現することができる。
【００３５】
本明細書では、「宿主細胞」は、ベクターを導入することができる真核生物、原核生物、または古細菌起源の細胞を意味する。宿主細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、ドロソフィラ・メランガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ）細胞および他の昆虫細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の真菌細胞、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および他の細菌細胞、ならびに不死化細胞系とヒトの組織および癌から単離された細胞を含む、哺乳動物細胞が挙げられる。「宿主細胞」は、ｈｒＧＦＰをコードしている組換えポリヌクレオチドを発現する組換えベクターによって提供されるもの以外の外因性核酸を含有するようにさらに遺伝子操作することができる。
【００３６】
本明細書では、「複数の細胞」とは好ましくは細胞の群であるが、必ずしも同じタイプまたは株である必要はない。本明細書では、「複数の細胞」（一般に約１０３〜１０９個の細胞）にライブラリーを導入することができ、その結果、各形質導入細胞は組換えｈｒＧＦＰポリペプチドをコードする組換えベクターを含有する。レトロウイルス感染を用いて組換えポリペプチドライブラリーを導入する場合、各感染細胞は個々の種の組換えｈｒＧＦＰポリペプチドを含有する。別の導入方法を用いる場合、所与の細胞内の組換えポリペプチド種の数は広く変えることができる。
【００３７】
本明細書では、ペプチドライブラリーは、「目的の表現型」を付与するペプチドを同定するためにスクリーニングされる。「目的の表現型」とは、野生型または周知の出発表現型に比べて検出可能に改変された表現型であって、この場合、その改変は、前記野生型または出発表現型で所望の変化を示す。「検出可能に改変された」とは、測定される表現型特性における少なくとも１０％の変化を意味する。
【００３８】
「目的の表現型」としては、これらに限定されるものではないが、膜ひだなどの形態学的変化、細胞増殖、細胞生存率、細胞接着または細胞密度における変化、ならびに細胞内または細胞外の分子の細胞輸送における変化、および膜電位の変化が挙げられる。「目的の表現型」は、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、ホルモン、シグナル伝達分子、サイトカイン、および他の分子の発現、半減期、位置、または比活性における変化であってよい。また「目的の表現型」には、病原体（ウイルス、細菌、真菌の病原体であるか、または任意の別の病原体であるかは問わない）による感染に対する細胞の罹病性における変化も含まれている。一実施形態では、「目的の表現型」は、標的分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質とペプチドとの相互作用である。例えば、本明細書に記載されているペプチドライブラリーは、酵母または哺乳動物のツーハイブリッドおよびスリーハイブリッドシステムでスクリーニングすることができるが、この場合、「目的の表現型」は、ペプチド相互作用を示すレポーター分子の発現における変化である。
【００３９】
「目的の表現型」は、当技術分野で知られている任意の手段によって検出することができ、そのアッセイは、測定される表現型によって決まる。例えば、膜電位は、パッチクランプ技術、顕微鏡分析による形態学的変化、ウェスタン、ノーザン、サザンによる発現における変化、ＰＣＲ、免疫組織化学、またはＦＡＣＳ分析などによってモニターすることができる。細胞の病原体に対する罹病性は、細胞生存率測定、シンシチウムアッセイ（ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ａｓｓａｙ）、または当技術分野で用いられるすべての他の標準アッセイによってモニターされ得る。レポーター分子、ベクターおよび系を用いて、特定の表現型について分析することができる。さらに、レポーター細胞を用いることができ、例えば、第２の細胞は、目的の表現型を表示する第１の細胞によって提供されるシグナルに応答し得る。
【００４０】
本明細書では、「内部挿入されている」または「内部融合されている」とは、非相同性ＤＮＡ配列が、「ヒト化」レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）をコードするＤＮＡ配列内に配置されていることを意味し、該非相同性配列はインフレームでｈｒＧＦＰをコードするヌクレオチドと連結され、ｈｒＧＦＰをコードするヌクレオチドに挟まれる。「内部挿入されている」非相同性ペプチドをコードしている非相同性ＤＮＡ配列は、完全長ＤＮＡが発現される場合に非相同性ペプチドを足場とする組換えｈｒＧＦＰが作製されるように、ｈｒＧＦＰをコードするＤＮＡに連結されている。非相同性ペプチドはｈｒＧＦＰ中に「内部融合されている」。非相同性ペプチドは、ｈｒＧＦＰがそれ自身の自己蛍光を維持し、かつｈｒＧＦＰ組換えポリペプチドが、野生型の蛍光の少なくとも１％、好ましくは野生型の蛍光の１０％、さらに好ましくは５０〜６０％、最も好ましくは、野生型の蛍光の９５〜１００％を有するように、「内部融合されて」いる。また、組換えｈｒＧＦＰポリペプチドは、野生型に対して増強されている蛍光強度を有し得る（例えば、１００％、１２０％など）。
【００４１】
本明細書では、「組換えポリペプチド」は、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体にインフレームで融合されている２またはそれ以上のアミノ酸の非相同性アミノ酸配列を意味する。非相同性ドメインに融合されているものは、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチド、またはその変異体に内部挿入されているか、あるいはそのＮ末端またはＣ末端に連結されている。追加の、融合非相同性ドメインは、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドまたはその変異体に内部挿入されるか、あるいはそのＮ末端またはＣ末端に連結され得る。
【００４２】
本明細書では、「アミノ末端に融合されている」という用語は、別のポリペプチドのアミノ末端へのポリペプチド配列の連結を意味する。該連結は、直接であってもよく、あるいは短い（例えば、約２〜２０個のアミノ酸）リンカーペプチドを介してであってもよい。有用なリンカーペプチドの例としては、これに限定されるものではないが、グリシンセリンポリマーおよびグリシンアラニンポリマーを含む、グリシンポリマー（（Ｇ）ｎ）が挙げられる。本明細書で用いられているアミノ末端とは、存在しているポリペプチドのアミノ末端アミノ酸を意味し、アミノ酸が野生型のアミノ末端アミノ酸であるか、あるいは特定のポリペプチドの変異形態（例えば、アミノ末端切断型形態）であるかは問わないことを理解されたい。
【００４３】
本明細書では、「カルボキシ末端に融合されている」という用語は、別のポリペプチドのカルボキシル末端へのポリペプチド配列の連結を意味する。連結は、直接であってもよく、あるいはリンカーペプチドを介してであってもよい。アミノ末端への融合と同様に、カルボキシ末端への融合は、存在しているポリペプチドのカルボキシ末端への連結を意味する。
【００４４】
本明細書では、「リンカー配列」という用語は、結合される２種類のポリペプチドのどちらの配列の一部でもないアミノ酸の短い（例えば、約１〜２０個のアミノ酸）配列を意味する。リンカー配列は、そのアミノ末端上で一方のポリペプチドまたはポリペプチドドメインに結合され、そのカルボキシ末端上でもう一方のポリペプチドまたはポリペプチドドメインに結合される。
【００４５】
本明細書では、「励起スペクトル」という用語は、本発明の蛍光ポリペプチド分子により吸収された場合に、その分子による蛍光発光を引き起こす光の波長を意味する。
【００４６】
本明細書では、「発光スペクトル」という用語は、蛍光ポリペプチドにより発光される波長を意味する。
【００４７】
本明細書では、「操作可能に連結されている」という用語は、コード配列の転写が制御配列によって生じかつ制御されるように、一定のコード配列が一定の転写制御配列に結合されていることを意味する。本明細書では、目的のペプチドを含有しているＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質が目的のペプチドの表示を可能にするＤＮＡ配列に結合するように、レポーター遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質のＤＮＡ配列に「機能的に連結されて」いる。「機能的に連結されている」ために、レポーター遺伝子の発現は、転写活性化ドメイン融合タンパク質により制御することができる。この場合、転写活性化ドメイン融合タンパク質は、目的の表示されたペプチドとの相互作用時に、レポーター遺伝子の転写を活性化させる、ランダムペプチド配列または非ランダムペプチド配列を含有している。
【００４８】
本明細書では、「レポーター構築物」という用語は、検出可能なレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチド構築物を意味し、該構築物は検出可能な分子をコードするポリヌクレオチドに制御性転写を付与する転写制御配列に連結されている。
【００４９】
本明細書では、「転写活性化タンパク質」または「転写活性化ドメイン」という用語は、活性のある転写活性化タンパク質またはドメインの非存在下で、転写に関連する機能的転写複合体を形成するように、遺伝子のプロモーターで集合している、酵素および因子との相互作用を介して遺伝子の転写を高め得るタンパク質またはタンパク質のドメインを意味する。転写活性化タンパク質または転写活性化ドメインは活性型で存在し、転写での向上をもたらす、あるいは転写の向上をもたらす前の活性化を必要とする不活性形態での向上をもたらすことができる。このタイプの転写活性化タンパク質または転写活性化ドメインは、本明細書では「条件付きで活性な」ものとして意味する。転写活性化タンパク質または転写活性化ドメインは、そのタンパク質またはタンパク質ドメインとの融合物として発現された場合、あるいは、そのタンパク質またはタンパク質ドメインに結合された場合に、別のタンパク質またはタンパク質ドメインに転写活性化特性を付与することができるものと理解されたい。本発明で用いられる転写活性化ドメインは、配列特異的ＤＮＡ結合能力は有していない。
【００５０】
本明細書では、「条件付きで活性な」という用語は、活性のある機能形態または不活性形態で存在し得るタンパク質またはタンパク質のドメインを意味する。この条件付きの活性は、例えば、リン酸化、構造変化、または別のタンパク質との複合体形成によって制御することができる。条件付きで活性な機能的ドメインは、そのタンパク質またはタンパク質ドメインとの融合物として発現された場合に、別のタンパク質またはタンパク質ドメインに条件付きの機能特性を付与することができることは理解されよう。
【００５１】
Ｉ．本発明によるヒト化組換えＲ・レニフォルミスＧＦＰポリヌクレオチドおよびポリペプチドの調製方法。
【００５２】
本明細書に記載されている本発明を提供するには、分子学的、細胞学的および生化学的手法を含む多くの手法が有用である。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰをコードするポリヌクレオチドは、直接的化学合成、ライブラリースクリーニングおよびＰＣＲ増幅を含む、いくつかの異なる方法のいずれかにより得ることができる。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドは、適切な生物における組換えポリヌクレオチド配列からの発現により得られる。ヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドおよびその変異体は、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰをコードするポリヌクレオチド配列への変異の導入後に同様の方法で得られる。本発明のＲ・レニフォルミスＧＦＰポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびその変異体を作製および使用するのに必要な方法を以下に詳細に記載する。
【００５３】
Ａ．Ｒ・レニフォルミスＧＦＰをコード化するポリヌクレオチド配列の単離
１．Ｒ・レニフォルミスｃＤＮＡライブラリー調製
真核細胞を感染し得る、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、およびウイルスを含む、多数の異なるベクターでのライブラリーの構築方法が当分野では周知である。発現遺伝子の大きな完全長クローンが得られる、任意の周知のライブラリー調製法を使用して、Ｒ・レニフォルミス由来のＧＦＰコードポリヌクレオチドを単離するための鋳型を得ることができる。
【００５４】
本明細書に記載されているＧＦＰコードポリヌクレオチドを単離するのに使用したライブラリーには、以下の方法を用いた。ポリ（Ａ）ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６〜１５９頁）に記載されているようにして、Ｒ・レニフォルミス生物から調製した。ｃＤＮＡは、製造業者の推奨するプロトコルに従ってＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン製造番号２００４００）を用いて調製し、ベクターλＺＡＰＩＩのＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入した。得られたライブラリーは５×１０６の個々の一次クローンを含んでおり、挿入断片サイズの範囲は０．５〜３．０ｋｂ、平均挿入断片サイズは１．２ｋｂであった。ライブラリーは、ＰＣＲ反応の鋳型として、使用前に１回増幅した。
【００５５】
２．ＰＣＲによるＲ・レニフォルミスＧＦＰコード配列の単離
Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコード配列は、本明細書に記載されているｃＤＮＡライブラリー内由来の配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により単離した。多くのＰＣＲ法が当業者には周知である。熱サイクルＰＣＲ（ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５〜３５０頁；また、ＰＣＲ法の総説については、ＰＣＲプロトコル、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴを参照）は、熱安定性のＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される複数サイクルのＤＮＡ複製を使用して、目的の標的配列を増幅する。簡単に説明すると、オリゴヌクレオチドプライマーは、それらが、増幅する配列の一方の側と逆の鎖をアニーリングするように選択する。プライマーをアニーリングし、鋳型依存的熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して伸長し、その後、熱変性し、プライマーを、両方の最初の鋳型配列および新規に伸長した鋳型配列にアニーリングし、その後、プライマーを伸長する。かかるサイクルの反復により、２つのプライマー間で配列が指数関数的に増幅する。
【００５６】
熱サイクルＰＣＲに加えて、Ｒ・レニフォルミスｃＤＮＡライブラリーから本発明によるＧＦＰコードポリペプチドを増幅および単離するのに使用し得る、多くの他の核酸配列増幅法がある。これらには、例えば、等温３ＳＲ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ３ＳＲ）（Ｇｉｎｇｅｒａｓら、１９９０、Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ、４８（７）：４９８〜５０１頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７４頁）、およびＤＮＡリガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）が挙げられ、これにより、数種の細菌ＤＮＡリガーゼのいずれか１種の活性をとおして、特異的な短い配列の指数関数的な増加が可能となる（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４：５６０頁）。これらの両方の文献の内容のその全体を、引用により本明細書に援用するものとする。
【００５７】
Ｒ・レニフォルミスｃＤＮＡライブラリーからＲ・レニフォルミスＧＦＰをコードする配列を増幅するために、以下の方法を採用した。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコード配列を、５’プライマー、５’−ＡＡＴＴＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））と３’プライマー、５’−ＡＴＡＡＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＣＣＣＡＴＴＣＧＴＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣ−３（配列番号７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））を用いて増幅させた。５’プライマーは、増幅断片の次のクローニングを容易にするＥｃｏＲＩ認識部位、続いて、Ｋｏｚａｋコンセンサス翻訳開始配列ＡＣＣＡＴＧＧを含んでいる。３’プライマーは、増幅断片のクローニングを容易にするＸｈｏＩ認識部位を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、任意の多くの業者（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）から購入することができる。別法として、オリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、ホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．ら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０頁；および米国特許第４３５６２７０号）、ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９頁）およびホスホルアミジト（Ｂｅａｕｃａｇｅ、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：３３頁）法を含む、当技術分野で周知の方法を用いて合成することができる。これらの各文献のその全体は、引用により本明細書に援用するものとする。
【００５８】
ＰＣＲは、１×ＴａｑＰｌｕｓプレシジョン緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各ＰＣＲプライマー、２．５ＵのＴａｑＰｌｕｓプレシジョン酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および、上述の増幅ｃＤＮＡライブラリー由来の約３×１０７のλファージ粒子を含有する５０μｌの反応容量中で実施した。反応は、以下のようにして、ロボサイクラー勾配４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で実施した：９５℃で１分間（１サイクル）、９５℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で１分間（４０サイクル）、および７２℃で１分間（１サイクル）。反応産物を１％アガロースゲル上で分離し、約７００ｂｐのバンドを切り出し、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＤＮＡゲル抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して精製した。増幅核酸断片を単離および精製する他の方法は当業者には周知である。ＰＣＲ断片は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いて消化して完了することによりサブクローニングし、レトロウイルス発現ベクターｐＦＢ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入してベクターｐＦＢ−ｒＧＦＰを作製した。クローン化ＧＦＰ断片の両鎖を完全にシークエンスした。コードポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ図１および図２に示す。Ｒ・レニフォルミスおよびＲ・ムレリ（Ｒ．ｍｕｌｌｅｒｉ）ＧＦＰコード配列は８３％の相同性であり、それらのタンパク質は８８％の同一アミノ酸配列を共有している。
【００５９】
３．ライブラリースクリーニングによるＲ・レニフォルミスＧＦＰコードポリヌクレオチドの単離
本発明によるＧＦＰコードポリヌクレオチドを単離する別法は、ＧＦＰの励起スペクトル内の光で照射した場合に、ＧＦＰの発光スペクトル内の蛍光を示すクローンについての、例えばλファージ発現ライブラリーなどの発現ライブラリーのスクリーニングを含んでいる。このように、クローンは、大きなプール内から直接同定され得る。λファージ発現ライブラリーを播種し、挿入断片によりコードされているポリペプチドの発現を誘導する標準的な方法は、当技術分野で十分に確立されている。蛍光励起および発光によるスクリーニングは、分光蛍光計またはさらには蛍光している斑の可視的同定を用いて、以下の本明細書に記載されているようにして実施する。いずれの方法でも、蛍光している斑を拾い上げ、１回または複数回新しい培養液を再感染させ、純粋な培養物を提供し、これからＧＦＰ挿入断片配列を決定およびサブクローニングし得る。
【００６０】
別の代替法として、得たいと思うポリヌクレオチドに関して配列が入手可能な場合、そのポリヌクレオチドは、当業者により化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドプライマー（上述）の調製に用いたのと同じ合成法を使用して、本発明のＧＦＰの遺伝子コード配列を合成することができる。一般に、これは、数個の短い配列（約１００ｎｔまたはそれ以下）を合成し、その後、アニーリングし、ライゲートすることによって実施し、完全長コード配列を得ることができる。
【００６１】
Ｂ．ヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコードポリヌクレオチド配列の作製
本発明では、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰの核酸配列を改変して、哺乳動物細胞またはヒト細胞内でのその発現を増強する。Ｒ・レニフォルミスのコドン利用は、Ｒ・レニフォルミス内での発現において最適であるが、哺乳動物系またはヒト系での発現には最適ではない。従って、ウミシイタケ（ｓｅａ  ｐａｎｓｙ）から単離された配列をより高等な真核生物で発現するように適応させるには、哺乳動物系またはヒト系では望ましくない特異的なコドンを、これらの系でより一般的に用いられているコドンに改変することが必要である。このいわゆる「ヒト化」は、本明細書に記載されているようにして、あるいは本技術分野において周知であるようにして、望ましくないコドンを部位特異的突然変異させることにより達成される。Ａ．ビクトリア（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰコード配列の同様の改変は、米国特許第５８７４３０４号に記載されている。ヒト遺伝子発現に好ましいコドンを表１に列挙している。表中のコドンを、左から右へヒト遺伝子において相対的に使用される順に並べている。ヒト遺伝子において望ましいコドンに対して野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰのコドン（例えば、配列番号５）を検討することにより、当業者は、ヒト細胞または哺乳動物細胞中でより有効な発現を達成するＲ・レニフォルミスＧＦＰ遺伝子に改変するためのコドンを特定することができる。特に、表中に下線を引いたコドンは、周知のヒト遺伝子において１０００コドン当たり１０コドン未満で用いられ、従って、Ｒ・レニフォルミス配列で発見された場合には、哺乳動物細胞またはヒト細胞中での発現能力を増強するために改変させるべき最も重要なコドンを表している。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
左側のコドンはヒト遺伝子の利用で最も好ましいコドンを表し、右に向かってヒトでの利用は減少する。下線を引いたコドンは、ヒト遺伝子において用いられる１０００コドン当たり１０コドン未満で用いられる。
【００６４】
Ｒ・レニフォルミスＧＦＰのヒト化バージョンは作製されており、配列番号１で表される。
【００６５】
Ｃ．本発明によるヒト化レニラ・レニフォルミスＧＦＰの変異体
本発明では、ヒト化レニラ・レニフォルミスＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）核酸は、ｈｒＧＦＰのコード配列へ相同性核酸配列を挿入することにより改変される。非相同性配列は、ランダム配列または特異的配列、例えば、周知の多重クローニング部位配列であり得る。本発明では、多重クローニング部位配列は、当技術分野で周知の方法を用いて、ｈｒＧＦＰ（配列番号２）のヌクレオチド５１９と５２０の間に挿入されている（実施例１を参照）。組換えポリヌクレオチドは、その自己蛍光を維持する組換えポリペプチドをコードしている。従って、配列番号２の組換えポリヌクレオチドはヌクレオチド配列の一例であり、この場合、追加の核酸非相同配列は、ｈｒＧＦＰを含んでいるインフレームに挿入することができる。また本発明は、ヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰの他の領域内の挿入をも包含することを理解されたい。例えば、当業者は、かかるタンパク質（例えば、すなわちλファージ）を発現させ、ｈｒＧＦＰの励起スペクトル中の光でそれらを発現するタンパク質または細胞に照射し、発光された蛍光を測定することによって、非相同性のインフレーム挿入物を含むｈｒＧＦＰが自己蛍光を維持するかどうかを容易に検出することができる。
【００６６】
非相同性配列を挿入するための別の部位を同定する１つの方法は、３ヌクレオチドのインフレーム挿入での本明細書に記載されている多重クローニング配列（または別の多重クローニング配列）、またはそれらの多重物を核酸配列内へ挿入することである。例えば、多重クローニング部位は、アミノ酸コードヌクレオチドの３および４、６および７、９および１０、１２および１３の間など、例えば、アミノ酸コードヌクレオチドの７５および７６、９０および９１、１２０および１２１、１５０および１５１、１７３および１７４、１８０および１８１の間などの配列番号１へインフレームで挿入することができる。かかるクローンの蛍光の測定は、ｈｒＧＦＰタンパク質が挿入部位を許容しているかで検出される。挿入変異体により維持されている蛍光は、野生型ｈｒＧＦＰの蛍光の少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上（１００％またはそれ以上を含む）であるべきである。かかる挿入は、ｈｒＧＦＰポリペプチドの励起または発光スペクトルを変化させ得るが、様々な励起エネルギーで特定のポリペプチドを走査し、かつ様々な発光スペクトルを検出することは、当業者の１つの能力の範囲内であることは理解されよう。
【００６７】
あるいは、特異的部位は、例えば結晶学、ＮＭＲまたはＣＤによってｈｒＧＦＰポリペプチドの特性に基づいて挿入を選択することができる。前記手法は、蛍光を維持しながら、かかる挿入を許容する可能性がありそうなポリペプチドの溶媒曝露領域を同定する。
【００６８】
ｈｒＧＦＰのコード配列内に多重クローニング部位を含有するｈｒＧＦＰベクターの使用は望ましく、それは、ｈｒＧＦＰが足場であるランダムペプチドライブラリー作製用のランダム核酸配列を効果的に連結させるからである。
【００６９】
ランダム非相同性配列の作製
一実施形態では、ランダムペプチドＧＦＰ足場ライブラリーを作製する。好ましい実施形態では、ｈｒＧＦＰベクターは、ｈｒＧＦＰのコード配列内に多重クローニング部位を含有している。この多重クローニング部位を用いて、ｈｒＧＦＰを含んでいるインフレームに少なくとも１種のランダム化核酸配列を挿入する。ランダム化配列は、コードされているランダムペプチドがＧＦＰタンパク質の溶媒曝露領域で表示されるように挿入される。ランダムペプチドライブラリーは、ランダム化核酸配列にわたるすべての、または本質的にすべての、可能性のあるヌクレオチド位置の組合せを形成させる、当技術分野で周知の合成法によって作製することができる。ライブラリーを作製することができる１つの方法は、人工オリゴヌクレオチド合成によるものである。あるいはライブラリーは、天然起源のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡから作製することができ、この場合、ペプチド配列のインフレーム連結を容易にするため、適当な制限部位を増幅中ＰＣＲにより付加される。作製されたＤＮＡライブラリー配列は、分子生物学の標準的技術により適当なｈｒＧＦＰ発現ベクターに挿入される。種々の好適な発現ベクターは本明細書に記載されている。
【００７０】
本発明では、ランダム化ペプチドライブラリーにはバイアスライブラリーも含まれている。例えば、個々のアミノ酸残基はランダム化ペプチド配列内で固定される。残基は、構造的バイアスがあるように固定化することができる。他のランダム化配列内に固定することができる残基としては、例えば、ジスルフィド結合を可能とするシスチン、ＳＨ３ドメイン、二量体化配列、あるいはリン酸化してタンパク質間相互作用部位を作製し得るアミノ酸を作るプロリンを挙げることができる。いくつかの好適なバイアスの例は、米国特許出願第２００１／０００３６５０号に記載されており、この出願は引用により本明細書に援用するものとする。
【００７１】
本発明による有用な組換えベクターのライブラリーは、少なくとも１０３から、好ましくは１０７、１０８、１０９またはそれ以上の個々の種の範囲に及ぶランダム化発現産物をコードする、多様なランダム化組換えポリヌクレオチドｈｒＧＦＰコード配列を有しているべきである。
【００７２】
さらに本発明は、リンカー配列を用いた、ｈｒＧＦＰへのペプチドの挿入を提供する。連結は、短い（例えば、約２〜２０個のアミノ酸）リンカーペプチドによって介され得る。有用なリンカーペプチドの例としては、これに限定されるものではないが、グリシンセリンポリマーおよびグリシンアラニンポリマーを含む、グリシンポリマー（（Ｇ）ｎ）が挙げられる。リンカーは、ペプチド配列をｈｒＧＦＰへ本質的に結合し、挿入されたペプチド配列がより一層曝露され、あるいはより順応性のある表示が可能となる。好適なリンカー配列は当業者に明らかである。
【００７３】
光度が増強された変異体
野生型レニラ・レニフォルミスＧＦＰに対して光度が増強されたヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ変異体、および他の改変体もまた対象である。例えば、励起または発光スペクトルのいずれかまたはその両方を示す変異体は、簡単な蛍光測定を介して、同一細胞内の１種を越えるポリペプチドの位置またはレベルをモニタリングすることができるので有用である。さらに、例えば別のＧＦＰの発光スペクトルと重なる励起スペクトルを有するＧＦＰ変異体は、ＦＲＥＴベースのアッセイに有用となり得る。あるいは、そのスペクトル特性がｐＨまたは酸化／還元状態などの環境上の変化に反応するか、リン酸化状態の変化に反応するＧＦＰ変異体は、かかる細胞内の変化または細胞外の変化に関する研究において有用である。
【００７４】
ａ．本発明による有用な突然変異誘発方法
Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコード配列への改変は、ランダムであっても、あるいは標的指向されてもよい。いずれの場合も、選択には、所望の改変特性、すなわち、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰに対して増強された蛍光、スペクトルシフト、または他の変化について個体クローンをモニターすることが含まれる。
【００７５】
多数のランダム突然変異誘発法および部位特異的変異誘発方法が当技術分野で周知であり、配列番号１のＲ・レニフォルミスＧＦＰコード配列への改変が生じるそれらの方法のいずれも、本発明による有用な変異体ＧＦＰを得るのに適し得る。ランダム突然変異誘発法と部位特異的変異誘発の両方法に関するいくつかの例を下記に記載する。
【００７６】
ランダム突然変異誘発法
例えば、Ｍｅｙｅｒら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：２４２頁に記載されているようにして、亜硝酸、過マンガン酸またはギ酸を使用する化学的突然変異誘発を用いて、ランダム突然変異を本質的に得ることができ、この文献の全内容は、引用により本明細書に援用するものとする。Ｍｅｙｅｒらの方法に従った場合、一本鎖Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ遺伝子断片の突然変異群が得られ、次いで、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰの増幅用の、本明細書の上述で用いられているＰＣＲプライマーを用いて増幅させる。ランダム突然変異を有する増幅産物を適当なベクター内にクローニングし、細菌に形質転換する。コロニーは、同じ細菌株の同じベクターから発現または精製された野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰに比べて変化した蛍光特性についてスクリーニングする。
【００７７】
ランダム突然変異体の作製に関する化学的突然変異誘発の代替法は、突然変異誘発細菌株（例えば、ＸＬ１−Ｒｅｄ大腸菌株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の使用であり、該細菌株は、ＤＮＡポリメラーゼプルーフリーディング活性およびＤＮＡ修復機構が欠損している。この細菌株または類似の細菌株に導入されたプラスミドは、細胞分裂中に突然変異を受けるようになる。ＸＬ１−Ｒｅｄなどの突然変異誘発細菌株を使用した場合、突然変異を誘発するＧＦＰ配列（すなわち配列番号１）を含有するプラスミドを突然変異誘発細菌に形質転換し、約２日間（所望の突然変異の誘発程度に応じて、より短期間または長期間）増殖させる。ランダムに突然変異誘発したプラスミドは、標準的な方法を使用して培養液から単離し、非突然変異誘発細菌（例えば、大腸菌株ＤＨ５α、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に再度形質転換し、これを播種して個々のコロニーを得る。その後、同じ細菌株中の同じプラスミドに由来する野生型Ｒ・レニフォルミス発現コロニーと比較して、所望の改変した蛍光特性に関し，該コロニーをスクリーニングする。
【００７８】
ランダム突然変異誘発法の別の例は、いわゆる「変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ法」である。名前が示す通り、この方法は、所与の配列を、ＤＮＡポリメラーゼが高い正確性での取込みを支持しない条件下で増幅する。この変異性取込みを推奨する条件は異なるＤＮＡポリメラーゼに対して変わるが、当業者は、特定の酵素についてのかかる条件は決定することができる。増幅の正確性における多くのＤＮＡポリメラーゼの重要な可変性因子は、例えば、緩衝液中の二価金属イオンの型および濃度である。従って、マンガンイオンの使用および／またはマグネシウムまたはマンガンイオン濃度の変化を適用して、ポリメラーゼのエラー率に影響を及ぼすことができる。他の方法と同様に、突然変異誘発した配列を適切なベクターに挿入し、細菌へ形質転換し、所望の特性についてスクリーニングする。
【００７９】
部位特異的または標的指向突然変異誘発法
特定の部位または領域を直接的な方法で突然変異させることができる、当技術分野で公知の部位特異的突然変異誘発法が数多くある。これらの方法には、慣用的方法およびＰＣＲがベースの方法の両方法をはじめとする、部位特異的突然変異誘発法を実施するための市販されている多くのキットが含まれる。例としては、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＥＸＳＩＴＥ（登録商標）ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５０２；ＰＣＲをベースとする）、および、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５１８；ＰＣＲをベースとする）、およびこれもＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５０９）が挙げられる。
【００８０】
当技術分野で周知の古い部位特異的突然変異誘発法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能とする、Ｍ１３バクテリオファージベクターなどの変異させる配列のベクターへのサブクローニングに依拠している。これらの方法では、変異原性プライマー（すなわち、変異させる部位にアニーリング可能であるが、変異させる部位での１種または複数のミスマッチヌクレオチドを有するプライマー）を一本鎖鋳型にアニーリングし、その後、変異原性プライマーの３’末端から出発して鋳型の相補体を重合する。次いで、得られた二本鎖を宿主細菌に形質転換し、斑を所望の変異についてスクリーニングした。
【００８１】
さらに最近では、部位特異的突然変異誘発法では、一本鎖鋳型を必要としないという利点を有する、ＰＣＲ方法が使用されてきている。さらに、サブクローニングを必要としない方法も開発されている。ＰＣＲをベースとした部位特異的突然変異誘発を実施する場合、いくつかの問題を考慮しなければならない。第１に、これらの方法では、ポリメラーゼにより導入された好ましくない突然変異の増大を防ぐために、ＰＣＲサイクルの回数を減らすことが望ましい。第２に、反応中に残存する非突然変異親分子の数を減らすために、選択を採用しなければならない。第３に、１組のＰＣＲプライマーセットが使用可能となるように、広域（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｌｅｎｇｔｈ）ＰＣＲ法が好ましい。第４に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存的末端伸長活性のために、ＰＣＲで得られた突然変異産物の平滑末端ライゲーション前に、手順に末端ポリッシング段階を組み入れることが必要であることが多い。
【００８２】
下記のプロトコルは、以下のステップによってこれらの考察に対応する。第１に、使用される鋳型濃度は、慣用のＰＣＲ反応に使用されている濃度の約１０００倍高く、これによって、産物の収率を大幅に低下させることなく、サイクル回数を２５〜３０回から５〜１０回まで低下させることができる。第２に、最も一般的な大腸菌株Ｄａｍは、配列５’−ＧＡＴＣ−３’でそのＤＮＡをメチル化することから、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、ここで、Ａ残基はメチル化されている）を使用して、親ＤＮＡに対して選択する。第３に、長い（すなわち全長プラスミド）ＰＣＲ産物の比率を高めるために、Ｔａｑ連鎖伸長剤をＰＣＲ混液で使用する。最後に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーション前にＰＣＲ産物の末端を平滑化する。この方法は、以下に詳述されている。
【００８３】
ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発法
プラスミド鋳型ＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌｅ）を、１×突然変異誘発緩衝液（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、８ｍＭのＭｇＣｌ２、４０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）、１２〜２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（当業者は、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング特性に影響を及ぼす、塩基組成、プライマー長および目的の緩衝液塩濃度などの因子を考慮して、必要に応じて突然変異誘発プライマーを設計することができる；１つのプライマーは、所望の突然変異を含まなければならず、１つ（同じまたは他方）のプライマーは、後のライゲーションを容易にするために５’リン酸を含まなければならない）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および２．５ＵのＴａｑ連鎖伸長剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入：Ｎｉｅｌｓｏｎら（１９９４）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、７：２７頁、および米国特許第５５５６７７２号を参照）を含む、ＰＣＲカクテルに加える。ＰＣＲサイクリングは以下のように実施する：９４℃で４分間、５０℃で２分間、７２℃で２分間を１サイクル；その後、９４℃で１分間、５４℃で２分間、７２℃で１分間を５〜１０サイクル。親鋳型ＤＮＡ、および変異原性プライマーを組み込んだ線状のＰＣＲ作製ＤＮＡを、ＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これにより、インビボでメチル化した親鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩ消化と、線状ＰＣＲ産物上の非鋳型特異的ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基（群）のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる除去が行われる。反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、さらに３０分間７２℃まで移行する。０．５ｍＭのＡＴＰを含有する突然変異誘発緩衝液（１１５μｌの１×）をＤｐｎＩで消化したＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ平滑化済みＰＣＲ産物に添加する。この溶液を混合し、１０μｌを新しいマイクロヒュージチューブに取り出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を加える。ライゲーションは、３７℃で６０分間以上インキュベートする。最後に、処理した溶液を、標準的な方法に従って、コンピテント大腸菌に形質転換する。
【００８４】
限定ランダム突然変異誘発法
部位特異的突然変異誘発のサブカテゴリーは、ランダム突然変異を所与の配列の限定された領域に導入するための、ランダム化オリゴヌクレオチドの使用を含む（これは、「限定ランダム突然変異誘発」と称する）。これは、例えばヘキサペプチドをコードする領域内のあらゆる塩基を突然変異させたい場合に特に有用である。一般に、この種類の方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、変異する配列に対応するランダム化オリゴヌクレオチド配列または部分的ランダム化オリゴヌクレオチド配列により連結されている、変異する領域の一方の側の領域に正確に相補的であり、かつ変異する領域に隣接する、一続きの定常ヌクレオチド配列を有する。突然変異誘発領域に隣接する定常領域の１つは、突然変異誘発後に野生型配列を突然変異誘発配列で置換するのを容易にするための制限部位を有するべきである。理想的には、かかる制限部位は、天然には変異させる領域に隣接して存在するが、当業者は、コード配列を変更させることなく、サイレント突然変異により制限部位を導入することもできる（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）カタログ付録中の、特に、１９９８／１９９９ＮＥＢカタログ、２８２〜２８３頁の、サイレント突然変異誘発により導入され得る制限部位のリストを参照）。
【００８５】
限定ランダム突然変異誘発法では、上述のような突然変異誘発オリゴヌクレオチドを、選択した対プライマー、および野生型、またはさらには以前に突然変異させた組換えＲ・レニフォルミスＧＦＰ構築物鋳型（野生型、あるいは、以前に変異させたもの）と共に使用し、所望の部位においてすべてランダムにまたは半ランダムに突然変異させた断片プールをＰＣＲ増幅する。対プライマーは、ヌクレオチドの突然変異誘発させた１本の５’または３’であるように選択し、野生型を突然変異配列で置換できるように、ＧＦＰコード配列を変化させない、天然制限部位または遺伝子操作制限部位を有するべきである。対プライマーは、ＧＦＰコード配列の５’または３’間近のベクター配列に結合し得るのが都合よい。突然変異断片の増幅プールを突然変異誘発プライマーおよび対プライマーのそれぞれの部位を認識する制限酵素で切断し、そのプールを、突然変異誘発段階中には増幅しないＧＦＰコード配列（突然変異誘発部位の５’または３’のいずれか）を含む、同様に切断した組換えベクターに連結し、選択したヌクレオチド配列上のみでランダムに、または半ランダムに突然変異を受けた完全長ＧＦＰコード配列のプールを調製する。
【００８６】
限定ランダム突然変異誘発法における突然変異は、突然変異誘発配列が必ずしも完全にランダムである必要はないことから、「ランダムまたは半ランダム」と称する。当業者は、コードされたペプチド配列に対する可能な変化の範囲である限り、無変化（多くの場合、第３ヌクレオチドまたは「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」ヌクレオチドで可能である）から限定変化（中間ヌクレオチドおよび／または第３ヌクレオチドのみに影響を及ぼす変化）から、完全なランダム変化（コドンの３個のヌクレオチドすべてに影響を及ぼす変化）の異なる結果をもって、例えば、コドンの１個、２個、または３個すべてのヌクレオチドを変化させることができると理解されよう。従って、突然変異誘発領域内で不変である一部のヌクレオチドを保持し、他のヌクレオチドを変化させ得ることにより（すべての４つの可能なヌクレオチドまたは１つ以上のそれらのサブセット上で）、突然変異誘発領域の特性を調節することができる。かようにして突然変異誘発された配列は、「半ランダム的に」突然変異誘発されている。限定ランダム突然変異誘発法を用いてレニラ・レニフォルミスＧＦＰベクターの突然変異プールまたはそれと同等の物をクローニングした後、突然変異プールを細菌に形質転換し、発現を誘導し、クローンを所望の特性の変化についてスクリーニングする。
【００８７】
ｂ．Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体の精製
必要であれば、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰは、ＷａｒｄおよびＣｏｒｍｉｅｒ（１９７９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４：７８１〜７８８頁）およびＭａｔｔｈｅｗｓら（１９７７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６：８５〜９１頁）により述べられているようにして、Ｒ・レニフォルミス生物から精製し、なお、この両文献の内容は引用により本明細書に援用するものとする。当業者は、凍結解凍溶解と、１４，０００×ｇでの遠心分離による清澄化溶解液の調製後に、同じ方法を細菌発現Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体に適用することができる。簡単に説明すると、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、ならびにＷａｒｄおよびＣｏｒｍｉｅｒにより使用されている方法は、ＤＥＡＥ−セルロース、セファデックスＧ−１００、およびＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））セファロースカラムでの連続クロマトグラフィー、ならびに１ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡに対する透析を含んでいる。次いで、ＧＦＰを含有する透析画分（蛍光により識別）を酸処理して不純物を沈澱させ、その後、上清を中和し、それを凍結乾燥する。低塩（最初１０ｍＭから１ｍＭ）および７．５から８．５のｐＨ範囲が凍結乾燥時の活性を維持するのに重要である。凍結乾燥試料を水に再懸濁し、直ちに遠心分離して溶解性の低い不純物を除去し、セファデックスＧ−７５カラムにかける。ＧＦＰを、１．０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡで溶出する。試料を部分的な凍結乾燥により濃縮し、５ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に対して透析し、その後、同じ透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥバイオゲルＡカラムのクロマトグラフィーにかける。ＧＦＰを、同じ酢酸／イミダゾール緩衝液中、ｐＨ６．０から４．９の連続的な酸勾配で溶出する。ＧＦＰ含有画分を、１．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に対して透析した後、試料を部分的に凍結乾燥して濃縮し、セファデックスＧ−７５（Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）カラムにかける。次いで、ＧＦＰ含有画分を、ｐＨ８．０のトリス／ＥＤＴＡ緩衝液中のＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラムに装填し、その後、２０ｍＭグリシン、５ｍＭトリスＨＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡで形成されているｐＨ８．５から１０．５の連続的アルカリ勾配中で溶出する。ＧＦＰ含有画分は、実質的に均質なＲ・レニフォルミスＧＦＰを含んでいる。
【００８８】
純度の低いＧＦＰ調製物を必要とするスクリーニングの適用では、組換えＲ・レニフォルミスまたはその変異体を以下のようにして細菌から精製することができる。本発明の組換えＧＦＰコードベクターで形質転換した細菌を、適当な選択抗生物質（例えば、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン）を含むルリア−べルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地中で増殖させる。ベクターにより可能であれば、組換えポリペプチド発現は、適当な誘導物質（例えば１ｍＭのＩＰＴＧ）の添加により誘導する。細菌は遠心分離により収集し、細胞ペレットの凍結解凍により溶解させる。細片を１４，０００×ｇの遠心分離により除去し、上清を１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）で平衡化した、セファデックスＧ−７５（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）カラムにかける。ＧＦＰ含有画分を、５００ｎｍの光により励起する場合には５０６ｎｍでの蛍光放出により、あるいは、スペクトル特性の変化したＧＦＰ変異体を精製する場合には、一連のスペクトルでの励起および発光により同定する。
【００８９】
ｃ．本発明による有用なヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰへの改変
Ｒ・レニフォルミス色素体の中心は、配列ＦＱＹＧＮＲ（配列番号８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８））を有する、野生型ポリペプチドのアミノ酸６４〜６９からなる。例えば、標準的な部位特異的ランダム突然変異誘発法または限定ランダム突然変異誘発法またはそれらと同等の方法を使用した、１つまたは複数の位置におけるアミノ酸配列の突然変異により、蛍光強度の増強またはスペクトル特性のシフトを示すＲ・レニフォルミス変異体を得ることができる。色素体の中心の外の部位における変化も、ポリペプチドの蛍光特性に影響を及ぼし得る。例えば、Ｒ・レニフォルミスは３７℃よりかなり下の温度で生存するので、３７℃で折り畳まれた蛍光形態のポリペプチドを安定化させる変異は、そのために、ヒトもしくは哺乳動物の細胞培養液、または細菌培養液中のポリペプチドの蛍光を増強し得る。さらに、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ色素体の化学的性質は、Ａ．ビクトリアＧＦＰ色素体の化学的性質とほぼ同じであるが（Ｗａｒｄら、１９８０、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３１：６１１〜６１５頁）、強度およびスペクトルをはじめとする蛍光特性は全く異なっている。これは、色素体中心の外の改変が、蛍光特性に対する影響を及ぼしていることを示している。
【００９０】
Ｄ．変化した蛍光特性または変化した形質を有するＲ・レニフォルミスＧＦＰ突然変異体についてのスクリーニング
変化した蛍光特性についてスクリーニングする１つの方法は、突然変異ＧＦＰ配列で形質転換した１つの細菌コロニーを、プレートから孔径０．４５μｍのニトロセルロース膜（ニューハンプシャー州Ｋｅｅｎｅ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ製）などの支持体に拾い上げ、膜を新しい寒天／培地プレート（例えば、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコード領域の上流にａｍｐｒおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子、ならびにｌａｃオペレーターを含有するベクターについて、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天）に、細菌側を上にして置き、コロニーをメンブラン上で増殖させることを含む。次いで、その膜を、コロニーの蛍光特性について走査する。走査は、例えば所望の励起波長に適した干渉フィルター（例えば、ニューメキシコ州Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＣＶＩ  Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｒｐ．から購入できるフィルター）を通して、１５０Ｗのキセノンランプ（マサチューセッツ州Ｗｏｂｕｒｎ、Ｘｅｎｏｎ  Ｃｏｒｐ．）の光を通過させることにより得られる、単色輻射光での照射下で実施することができる。照射したコロニーからの発光は、例えば、５００ｎｍの波長をカットオフする、Ｓｃｈｏｔｔ  ＫＶ５００フィルターを通して観察することができる。変化した蛍光特性について変異体をスクリーニングする同様の方法は、変異誘発法がランダム変異誘発法または標的指向変異誘発法に関係なく適用可能である。
【００９１】
別の蛍光走査装置は、走査型多色光源（ドイツ国ミュンヘン、Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓの高速モノクロメーター）、および集積ＲＧＢ色カメラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｃｏｏｌ  Ｖｉｅｗなど）が含まれる。多波長励起走査後、集積色カメラにより取り込んだ画像を画像解析にかけ、Ｓｐｅｃ  Ｒ４（米国バージニア州Ｖｉｅｎｎａ、Ｓｉｇｎａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）などのソフトウェアを使用して放出光の実際の色を決定することができる。
【００９２】
スクリーニングすべき変化した特徴が多くあるので（例えば、蛍光強度、熱安定性またはスペクトル特徴）、突然変異形態を発現する細菌または真核（例えば酵母または哺乳動物）細胞を、最初に、野生型を発現している対照細胞と比較してスクリーニングし、その後、必要に応じて、細胞選抜により選択したコロニーから、清澄化溶解液または精製ポリペプチドを特徴づけることができる。変化した他の特徴（例えばｐＨ感受性または蛍光のリン酸化依存的変化）に関し、精製ポリペプチドまたは少なくとも清澄化した細菌または真核細胞溶解液がスクリーニングに必要であり得る。必要であれば、清澄化した溶解液調製物および／または精製は、本明細書に記載の、または当分野で周知の方法に従って行う。最終的には、精製突然変異ＧＦＰポリペプチドまたは変化ＧＦＰポリペプチドを、改変させたい特徴に関して、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ（天然または組換え）と比較できる。本発明に従って変化した蛍光強度または輝度をもつＲ・レニフォルミスＧＦＰの変異体についてスクリーニングする場合、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰ（レニラ・レニフォルミスから単離または本発明の組換えベクター構築物から発現）の蛍光の少なくとも２倍の強度または輝度、そして、野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰの同じモル量の、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍またはさらには１００倍以上の強度または輝度である蛍光を探す。
【００９３】
変化したスペクトル特徴をもつＲ・レニフォルミスＧＦＰ変異体をスクリーニングする場合、野生型ＧＦＰポリペプチドのスペクトルから識別可能または検出可能に明確である、励起または発光スペクトルを示すＧＦＰポリペプチドを探す。識別可能または検出可能に明確とは、標準的なフィルターセットにより、他の形態を励起することなく、おのおの１つの形の励起が可能となり、または同様に、標準的なフィルターセットにより、ある形の発光と別の形の発光を識別できることを意味する。一般に、識別可能な励起または発光スペクトルは、１ｎｍより大きく、好ましくは２、３、４、５、１０ｎｍ、またはそれより大きく変化したピークを有する。識別可能なスペクトルのピークも好ましくは狭く、約５ｎｍまたはそれ以下、７ｎｍまたはそれ以下、１０ｎｍまたはそれ以下、１５ｎｍまたはそれ以下、２０ｎｍまたはそれ以下、５０ｎｍまたはそれ以下、または１００ｎｍまたはそれ以下の範囲に及んでいる。識別可能であると考えられるピークの最大の許容可能な幅は、ピーク最大が、識別するピークの最大からどれ位変化したかに直接関連する。言い換えれば、２つの蛍光ポリペプチドのピーク波長の間の変動が大きければ大きいほど、ピークはより幅広くなり、さらになお識別可能である。逆に、ピークの中心間の変動がより少なくなればなるほど、識別可能であるためにはピークはより狭くなければならない。
【００９４】
特に好ましいスペクトルシフトは、励起スペクトルの識別可能なシフトを伴わない、発光スペクトルのシフトである。かかるシフトにより、同じ波長の光（または同じ範囲の励起波長）を有する２つ以上の異なるＧＦＰの励起が可能となり、さらになお異なる発光波長に基づいた２つ以上のＧＦＰの蛍光の識別が可能となる。
【００９５】
他の好ましいスペクトルシフトは、ドナーまたはアクセプター蛍光タンパク質のようにＦＲＥＴできるＲ・レニフォルミスＧＦＰを提供するものを含む。例えば、第１蛍光ポリペプチドの発光スペクトルを、それが第２蛍光ポリペプチドの発光スペクトルと重複するように変化させた、スペクトル変化は、ＦＲＥＴの一対の蛍光ポリペプチドを規定する。第１および第２蛍光ポリペプチドの両方がＧＦＰポリペプチドであることが好ましいが、必ずしも必要ではなく、非ＧＦＰ蛍光ポリペプチドがＦＲＥＴのドナーまたはアクセプターの場合、その蛍光ポリペプチドのポリヌクレオチド配列は周知であることが好ましい。
【００９６】
ＦＲＥＴ対の両方の蛍光ポリペプチドがＲ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドである場合、一方または両方のポリペプチドは変化し得る。すなわち、一方は野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰであり得、他方は変化し得、あるいはＦＲＥＴ対の両方のＧＦＰが変化し得る。野生型Ｒ・レニフォルミスＧＦＰが対のメンバーである場合、それは対のドナーまたはアクセプターメンバーいずれかであり得る。
【００９７】
本発明のＲ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドの有用性を増強し得る、変化した別の特徴は、インビボでのポリペプチドの安定性の変化である。上述のように、ポリペプチドの蛍光プローブ（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）中心の折り畳まれた安定性を変化させる改変は、ポリペプチドの蛍光強度を変化させ得る。しかし、全ＧＦＰポリペプチドのインビボまたはインビトロでの半減期を増加または減少する改変、すなわち、ポリペプチドのターンオーバーまたは分解に影響を及ぼす改変も有用である。例えば、安定性の増加は、より大量の定常状態のＧＦＰプールが、特定の発現速度で蓄積できることにより、改変Ｒ・レニフォルミスＧＦＰの検出を高めることができる。重要なことには、インビボまたはインビトロでの安定性の低下したＲ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチド変異体にも有用である。例えば、転写のレポーターアッセイの応答性は、より短い半減期をもつレポーター分子により増強する。一般に、レポーター分子の生物学的半減期が短くなればなるほど、転写速度が増加または減少する場合に、新しい定常状態は速く達成され、アッセイの感度が高まる。
【００９８】
Ｅ．ヒト化Ｒ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドおよびその変異体の産生
本発明のＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター由来のＲ・レニフォルミスＧＦＰポリペプチドおよびその変異体の産生は、当業者に周知の多くの方法で達成され得る。例えば、当業者にとって周知の多くの方法のいずれかにより、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルスを原核細胞または真核細胞に導入することができる。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを原核細胞または真核細胞に導入した後、発現されたＧＦＰポリペプチドを本技術分野において周知の方法、あるいは本明細書に記載されている方法を用いて単離することができる。有用なベクター、細胞、細胞にベクターを導入する方法、およびＧＦＰポリペプチドとその変異体の検出や単離方法も下記の本明細書に記載されている。
【００９９】
１．本発明による有用なベクター
本発明によるＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の発現に有用であって、当技術分野で周知であり、かつ入手可能な多種多様なベクターが存在する。特定のベクターの選択は、ＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の目的とする使用によって明らかに決まる。例えば、選択したベクターは、細胞型が原核であれ真核であれ、所望の細胞型でポリペプチドの発現を作動できなければならない。多くのベクターは、原核ベクター複製、および、操作可能に連結された遺伝子配列の真核発現の両方を可能とする配列を含む。
【０１００】
本発明による有用なベクターは自発的に複製し得、すなわち、ベクター、例えばプラスミドは、染色体外に存在し、その複製は、必ずしも宿主細胞のゲノムに複製に直接連関していない。あるいは、ベクターの複製は、宿主染色体ＤＮＡの複製に連関し得、例えば、ベクターは、レトロウイルスベクターにより達成されるように、宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。
【０１０１】
本発明による有用なベクターは、好ましくは、ＧＦＰ配列の転写および翻訳の可能な、ＧＦＰコード配列に操作可能に連結されている配列を含む。連結ＧＦＰ配列の転写を可能とする配列にはプロモーターが含まれ、状況に応じて、連結配列の高発現を可能とするエンハンサーエレメントまたはエレメント群も含まれる。「転写制御配列」という用語は、プロモーターと、操作可能に連結されている核酸配列に所望の発現特性（例えば、高発現、誘導性発現、組織または細胞型特異的発現）を付与する任意の付加的な配列の組合せを意味する。
【０１０２】
選択したプロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、また宿主細胞で正常に発現される遺伝子、または他の細胞または生物で正常に発現される遺伝子から得てもよい。プロモーターの例は、以下に限定されるものではないが、Ａ）原核プロモーター−大腸菌ｌａｃ、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーター、λファージＰＲまたはＰＬプロモーター、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、Ｓｐ６プロモーター、枯草菌アルカリプロテアーゼプロモーター、およびＢ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成プロモーター等；Ｂ）真核プロモーター−酵母プロモーター、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ４および他の解糖遺伝子プロモーター（例えば、Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３〜１２０８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：４１９〜４３４）、ＬＥＵ２プロモーター（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｇａｒｃｉａら、１９８９、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、２１７：４６４〜４７０）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｙｏｕｎｇら、１９８２、化学物質用の微生物の遺伝子工学、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、またはＴＰＩ１プロモーター（米国特許第４５９９３１１号）；昆虫プロモーター、例えばポリヘドリンプロモーター（米国特許第４７４５０５１号；Ｖａｓｕｖｅｄａｎら、１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３１１：７〜１１）、Ｐ１０プロモーター（Ｖｌａｋら、１９８８、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：７６５〜７７６）、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａポリヘドローシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター（ＥＰ第３９７４８５号）、バキュロウイルス最初期遺伝子プロモーター遺伝子１プロモーター（米国特許第５１５５０３７号および第５１６２２２２号）、バキュロウイルス３９Ｋ遅延初期遺伝子プロモーター（米国特許第５１５５０３７号および第５１６２２２２号）、およびＯｐＭＮＰＶ最初期プロモーター２；哺乳動物プロモーター−ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、１９８１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１：８５４〜８６４）、メタロチオネインプロモーター（ＭＴ−１；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２：８０９〜８１４）、アデノウイルス２主要後期プロモーター（Ｙｕら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２：９３０９〜２１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）または他のウイルスプロモーター（Ｔｏｎｇら、１９９８、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１８：７１９〜７２５）、あるいはさらには、特定細胞型における目的の遺伝子の内因性プロモーターが挙げられる。
【０１０３】
選択したプロモーターはまた、それを誘導性または組織特異的とする配列に連結することができる。例えば、選択したプロモーターの上流へ組織特異的エンハンサーエレメントを付加すると、プロモーターは特定の組織または細胞型でより活発となり得る。あるいは、またさらには、誘導性発現は、例えば熱的変化（温度感受性）、化学処理（例えば、金属イオンもしくはＩＰＴＧ誘導性）、または抗生誘導物質の添加（例えばテトラサイクリン）による誘導の可能な、多くのいずれかの配列エレメントに、プロモーターを連結することにより達成することができる。
【０１０４】
制御可能な発現は、例えば、薬物誘導性（例えばテトラサイクリン、ラパマイシンまたはホルモン誘導性）である発現系を使用して達成される。特に哺乳動物細胞での使用に好適な薬物制御プロモーターとしては、テトラサイクリン制御プロモーター、およびグルココルチコイドステロイド−、性ホルモンステロイド−、エクジソン−、リポ多糖（ＬＰＳ）−、およびイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−制御プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で使用するための制御可能な発現系は、必ずしもではないが、理想的には、制御物質に応答して非哺乳動物ＤＮＡモチーフに結合する（または結合しない）転写制御因子、およびこの転写制御因子のみに応答性のある制御配列を含むべきである。
【０１０５】
本発明のＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の制御発現に好適な、１つの誘導発現系は、テトラサイクリン制御発現系であり、これは、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンの効率に基づいている。テトラサイクリンとｔｅｔリプレッサーの間の結合定数は高いが、哺乳動物細胞に対するテトラサイクリンの毒性は低く、これにより、細胞増殖速度または形態に影響を及ぼさない、真核細胞培養物中、または、哺乳動物内のテトラサイクリン濃度によるこの系の制御が可能となる。ｔｅｔリプレッサーのオペレーターへの結合は高い特異性で生じる。
【０１０６】
テトラサイクリンによる遺伝子発現の正または負の制御の可能な、ｔｅｔ制御系の変形が存在する。テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体の非存在下では、野生型細菌ｔｅｔリプレッサータンパク質は、ｔｅｔオペレーター配列からのリプレッサー結合エレメントを含むプロモーターにより作動される遺伝子の負の制御を起こす。ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９頁；また国際特許出願第ＷＯ９６／０１３１３号）は、テトラサイクリンによるこの正の制御を活用した、ｔｅｔ制御発現系を記載している。この系では、テトラサイクリンは、ｔｅｔリプレッサー融合タンパク質、ｒｔＴＡに結合し、ｔｅｔオペレーターＤＮＡ配列にそれが結合するのを防ぎ、従って、薬剤の存在下でのみ連結遺伝子の転写および発現が可能となる。
【０１０７】
この正のテトラサイクリン制御系は、本発明のＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の一過性の緊縮性制御（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の１つの手段を提供する（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９５、上掲）。ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔ  Ｏ）配列は、現在当業者に周知である。総説については、読者は、タンパク質−核酸相互作用、「分子および構造生物学におけるトピックス」、ＳａｅｎｇｅｒおよびＨｅｉｎｅｍａｎｎ編（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、ロンドン）、第１０巻、１４３〜１６２頁を参照されたい。典型的には、ＧＦＰポリペプチドをコードする核酸配列は、複数のｔｅｔ  Ｏ配列の下流に配置されている。一般に、５個から１０個のかかるｔｅｔ  Ｏ配列を直接反復で使用する。
【０１０８】
テトラサイクリン制御系に加えて、本発明によるＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の制御または誘導性発現に関する多くの他の選択肢が存在する。例えば、大腸菌ｌａｃプロモーターは、ｌａｃオペレーター配列で結合しているｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）ＤＮＡに応答性である。オペレーター系のエレメントは、異種内容で機能性であり、ＩＰＴＧによるｌａｃＩのｌａｃオペレーターへの結合阻害は、原核細胞系、最近では真核細胞系の両方における誘導性発現の提供に広く使用されている。さらに、Ｒｉｖｅｒａら（１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２：１０２８〜１０３２）により記載されているラパマイシン調節転写アクチベーター系は、ラパマイシンに依存的な転写活性化を提供する。この系は、低いベースラインの発現および高い誘導比を有する。
【０１０９】
ＧＦＰポリペプチドまたはその変異体の制御または誘導発現に関する別の選択肢には、熱応答性プロモーターの使用が含まれる。活性化は、投与前に許容可能な温度で、温度感受性転写活性化因子により制御されるＧＦＰ構築物でトランスフェクトした、細胞のインキュベートにより誘導される。例えば、３７℃でのみ活性な同時トランスフェクトした温度感受性転写因子により制御される転写を、細胞を最初に、例えば３２℃で増殖し、次いで、３７℃に切り替えて発現を誘導する場合に使用し得る。
【０１１０】
組織特異的プロモーターも、本発明のＧＦＰコード構築物で有利に使用することができる。多種多様の組織特異的プロモーターが周知である。本明細書では、「組織特異的」という用語は、特定のプロモーターが、生物の全細胞または全組織に満たないなかで、転写的に活性である（すなわち、プロモーターのポリペプチド産物の検出を可能とするのに十分な連結配列の発現を指令する）ことを意味する。組織特異的プロモーターは、好ましくは、ただ１つの細胞型で活性であるが、例えば、細胞型の特有のクラスまたは系統で活性であり得る（例えば造血細胞）。本発明による有用な組織特異的プロモーターは、天然のプロモーターに連結した遺伝子の発現の様式またはパターンに実質的に同じである様式またはパターンで、操作可能に連結されている核酸配列の発現に必要かつ十分である配列を含んでいる。以下は、組織特異的プロモーターの非排他的な一覧、およびそのそれぞれの組織におけるかかるプロモーターに特徴的な発現を達成するのに必要な配列を含んでいる参考文献である。なお、これらの各参考文献の全内容は引用により本発明に援用するものとする。本発明のＲ・レニフォルミスＧＦＰに有用な組織特異的プロモーターの例は、以下の通りである：Ｂｏｗｍａｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１２１１５〜１２１１９は、脳特異的トランスフェリンプロモーターを記載し；シナプシンＩプロモーターは神経特異的であり（Ｓｃｈｏｃｈら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、３３１７〜３３２３）；ネクジンプロモーターは有糸分裂後神経特異的であり（Ｕｅｔｓｕｋｉら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、９１８〜９２４）；神経フィラメント光プロモーターは神経特異的であり（Ｃｈａｒｒｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３０６０４〜３０６１０）；アセチルコリン受容体プロモーターは神経特異的であり（Ｗｏｏｄら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３０９３３〜３０９４０）；カリウムチャネルプロモーターは高頻度発火神経特異的であり（Ｇａｎら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、５８５９〜５８６５）、クロモグラニンＡプロモーターは神経内分泌細胞特異的であり（Ｗｕら、１９９５、Ａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９６、５６８〜５７８）、フォンウィルブラント（Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子プロモーターは脳内皮特異的であり（Ａｉｒｄら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、４５６７〜４５７１）、ｆｌｔ−１プロモーターは内皮特異的であり（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、２７９４８〜２７９５３）、プレプロエンドセリン−１プロモーターは、内皮、上皮および筋肉特異的であり（Ｈａｒａｔｓら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９５、１３３５〜１３４４）；ＧＬＵＴ４プロモーターは骨格筋特異的であり（ＯｌｓｏｎおよびＰｅｓｓｉｎ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、２３４９１〜２３４９５）；遅効性／速効性トロポニンプロモーターは遅収縮／即収縮筋原線維特異的であり（Ｃｏｒｉｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎ���ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６１８５〜６１８９）；アクチンプロモーターは、平滑筋特異的であり（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、７６３１〜７６４３）；ミオシン重鎖プロモーターは平滑筋特異的であり（Ｋａｌｌｍｅｉｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３０９４９〜３０９５７）；Ｅ−カドヘリンプロモーターは上皮特異的であり（Ｈｅｎｎｉｎｇら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、５９５〜６０２）；サイトケラチンプロモーターはケラチノサイト特異的であり（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９５、Ｂ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４、９９４〜９９９）；トランスグルタミナーゼ３プロモーターはケラチノサイト特異的であり（Ｊ．Ｌｅｅら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、４５６１〜４５６８）；水疱類天疱瘡抗原プロモーターは基底ケラチノサイト特異的であり（Ｔａｍａｉら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、７６０９〜７６１４）；ケラチン６プロモーターは増殖表皮特異的であり（Ｒａｍｉｒｅｚら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、４７８３〜４７８７）；コラーゲン１プロモーターは肝臓星細胞および皮膚／腱線維芽細胞特異的であり（Ｈｏｕｇｌｕｍら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９６、２２６９〜２２７６）；Ｘ型コラーゲンプロモーターは肥大性軟骨細胞特異的であり（ＬｏｎｇおよびＬｉｎｓｅｎｍａｙｅｒ、１９９５、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６、４１９〜４２８）；第ＶＩＩ因子プロモーターは肝特異的であり（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、１２３４７〜１２３５）；脂肪酸シンターゼプロモーターは肝臓および脂肪組織特異的であり（Ｓｏｎｃｉｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３０３３９〜３０３４）、カルバモイルリン酸シンテターゼＩプロモーターは門脈肝細胞および小腸特異的であり（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｌｓら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、２４９３２〜２４９４０）；Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ輸送プロモーターは腎臓（ヘンレ係蹄）特異的であり（Ｉｇａｒａｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、９６６６〜９６７４）；スカベンジャー受容体Ａプロモーターはマクロファージおよび気泡細胞特異的であり（Ｈｏｒｖａｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、５３９１〜５３９５）；糖タンパク質ＩＩｂプロモーターは巨核球および血小板特異的であり（ＢｌｏｃｋおよびＰｏｎｃｚ、１９９５、幹細胞、１３、１３５〜１４５）；ｙｃ鎖プロモーターは造血細胞特異的であり（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、１４８４９〜１４８５５）；ＣＤ１１ｂプロモーターは成熟骨髄細胞特異的である（Ｄｚｉｅｎｎｉｓら、１９９５、Ｂｌｏｏｄ、８５、３１９〜３２９）。
【０１１１】
当分野で周知の任意の組織特異的転写制御配列を使用して、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体をコードするベクターを活用することができる。
【０１１２】
プロモーター／エンハンサーエレメントに加えて、本発明に従い有用なベクターは、さらに適切なターミネーターを含み得る。かかるターミネーターとしては、例えば、ヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、１９８３、上掲）、または、酵母または真菌宿主では、ＴＰＩ１（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、１９８２、上掲）、またはＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８５、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：２０９３〜２０９９）が挙げられる。
【０１１３】
本発明による有用なベクターはまた、ポリアデニル化配列（例えばＳＶ４０またはＡｄ５Ｅ１ｂポリ（Ａ）配列）、および転写エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡ由来のもの）を含んでいてもよい。さらに、本発明による有用なベクターは、特定の細胞区画に組換えポリペプチドを指令するシグナル配列をコードし得るか、あるいは、組換えポリペプチドの分泌を指令するシグナルをコードし得る。
【０１１４】
組換えベクター中の同じプロモーターからの異なる遺伝子の協調的発現は、ｐＳＢＣ−１由来のポリオウイルス１型の内部リボソーム侵入部位などの、ＩＲＥＳエレメントを使用して達成することができる（Ｄｉｒｋｓら、１９９３、Ｇｅｎｅ、１２８：２４７〜９）。内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、多重遺伝子性またはポリシストロン性メッセージを創造する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存的翻訳のリボソーム走査機序を回避し、内部部位で翻訳を開始できる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：３２０〜３２５）。ピカノウイルスファミリーの２つのメンバー由来のＩＲＥＳエレメント（ポリオおよび脳心筋炎）は記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８、上掲）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも記載されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：９０〜９４）。本発明に従って、前記のいずれかをレニラ・レニフォルミスＧＦＰベクターに用いることができる。
【０１１５】
ＩＲＥＳエレメントは非相同性オープンリーディングフレームに連結できる。ＩＲＥＳにより各々分離され、ポリシストロン性メッセージをつくる、複数のオープンリーディングフレームが共に転写され得る。ＩＲＥＳエレメントに基づいて、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに近接可能である。このように、複数の遺伝子（その１つはＲ・レニフォルミスＧＦＰ遺伝子である）は、１つのプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写することができる。任意の非相同性オープンリーディングフレームを、ＩＲＥＳエレメントに連結することができる。本発明の状況では、これは、発現させたい任意の選択タンパク質および任意の第２のレポーター遺伝子（または選択マーカー遺伝子）を意味する。このように、複数のタンパク質の発現は、例えば、ＧＦＰ産生を通じて同時にモニタリングしながら達成できる。
【０１１６】
本発明による有用なベクターはまた、ＧＦＰコード遺伝子構築物の機能的コピーを受けた、細胞の同定を可能とする選択マーカーを含み得る。その最も単純な形態では、細胞または細胞溶解液を適切な波長の光で照射し、期待される波長で放出された蛍光を測定することにより、ＧＦＰ構築物を発現する細胞を検出できる点で、選択プロモーターに連結されているＧＦＰ配列自体が選択マーカーと考えられ得る。他の形態では、選択マーカーは、ネオマイシン、ブレオマイシン、ゼオシン、またはフレオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を含み得るか、または、それは、その産物が宿主細胞で欠陥を補足する遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、または、例えば、酵母ではＬｅｕ２遺伝子を含み得る。あるいは、選択マーカーは、いくつかの場合には、ルシフェラーゼ遺伝子または色素生産性基質変換酵素遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であってよい。
【０１１７】
本発明によるＧＦＰコード配列は、遊離ポリペプチドとして、または多くの場合には、他のポリペプチドとの融合体としてのいずれにも発現し得る。当業者は、本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列（例えば配列番号１）があれば、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその蛍光性変異体をコードする配列を含む遺伝子、および目的の１種または複数のポリペプチドまたはポリペプチドドメインを含む配列を容易に構築できると推定される。ＧＦＰコード配列と目的のポリペプチドをコードする配列の融合は、関与するすべてのポリペプチド配列のリーディングフレームを維持すると考えられる。本明細書では、「目的のポリペプチド」または「目的のドメイン」という用語は、本発明のＧＦＰ分子に融合を行いたい、任意のポリペプチドまたはポリペプチドドメインを意味する。本発明のＧＦＰポリペプチドと目的のポリペプチドの融合体、すなわち転写活性化ドメインは、融合対のＮ末端またはＣ末端のいずれかへのＧＦＰ配列の連結を通してであり得る。本発明のＧＦＰポリペプチドを含む融合体は、ＧＦＰに加えて、ただ１つのポリペプチドまたはドメインを含む必要はない。むしろ、ＧＦＰコード領域がそのリーディングフレームを保持し、コードポリペプチドが少なくとも一連の条件下で蛍光活性を保持している限り、任意の数の目的ドメインを任意の方法で連結することができる。かかる条件のこれに限定されない例としては、生理的塩濃度（すなわち約９０ｍＭ）、中性に近いｐＨ、および３７℃が挙げられる。
【０１１８】
ａ．プラスミドベクター
選択した宿主細胞型において、本発明のＧＦＰコード配列を発現し得る任意のプラスミドベクターが本発明による使用に好ましい。本発明で有用なプラスミドベクターは、本発明によって有用な任意またはすべての上記のベクターの特徴を有し得る。本発明によって有用なプラスミドベクターとしては、これらに限定されるものではないが、以下の例、すなわち、細菌−ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、真核−ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。しかし、宿主で複製可能かつ生存可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１１９】
ｂ．バクテリオファージベクター
本発明による有用な周知のバクテリオファージ由来ベクターが数多くある。これらの中で最も重要なのは、挿入断片によりコードされるポリペプチドの誘導性発現が可能な、λベースのベクター、例えばλＺａｐＩＩまたはλ−Ｚａｐエクスプレスベクター（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）である。他には、Ｍ１３ベースのベクターファミリーなどの、糸状バクテリオファージが挙げられる。
【０１２０】
ｃ．ウイルスベクター
多くの異なるウイルスベクターが本発明で有用であり、細胞においてＲ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体をコードする配列の導入および発現が可能な任意のウイルスベクターが本発明の方法での使用に好ましい。外来核酸を細胞に送達するのに使用可能なウイルスベクターは、これらに限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（αウイルス）ベクターが挙げられる。欠陥レトロウイルスは、遺伝子導入に使用するために十分特徴づけられている（総説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ、７６：２７１を参照）。組換えレトロウイルスを作製し、インビトロまたはインビボで細胞をかかるウイルスで感染させるプロトコルは、分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）、９．１０〜９．１４章、および他の標準的な実験マニュアルで確認できる。また、本発明の方法に使用するレトロウイルスの作製および宿主細胞形質導入の詳細は以下の実施例１にも示している。
【０１２１】
レトロウイルスベクターに加えて、アデノウイルスは、それが、目的の遺伝子産物をコードし発現するが、正常な溶菌ウイルスライフサイクルでの複製する能力に関して不活性化されるように操作することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５を参照）。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から得られた好適なアデノウイルスベクターは当業者に周知である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを、効率的複製および生産的ライフサイクルのためにヘルパーウイルスとして必要とする、天然の欠陥ウイルスである（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：９７〜１２９を参照）。Ｔｒａｓｃｈｉｎら（１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３２５１〜３２６０）に記載されているようなＡＡＶベクターを使用して、核酸を細胞に導入することができる。多様な核酸を、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入することができる（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６〜６４７０；およびＴｒａｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４：２０７２〜２０８１を参照）。
【０１２２】
最後に、高度の発現が得られ、培養条件は哺乳動物細胞培養液に比べて単純であり、昆虫細胞によりなされた翻訳後修飾は哺乳動物細胞によりなされたものと非常に似ているので、外来遺伝子の導入および発現は昆虫細胞が望ましいことが多い。外来ＤＮＡの昆虫細胞（ショウジョウバエＳ２細胞など）への導入には、バキュロウイルスベクターによる感染が広く使用されている。他の昆虫ベクター系としては、例えば、発現プラスミドｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）および他のタグおよび選択マーカーをコードするｐＩＺ／Ｖ５ベクターの他の変種が挙げられる。昆虫細胞は、リポフェクション試薬を使用して容易にトランスフェクトすることができ、昆虫細胞のトランスフェクションに特に最適化された脂質をベースとしたトランスフェクション製品（例えばＰａｎＶｅｒａ製）が存在する。
【０１２３】
２．本発明による有用な宿主細胞
Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体を保持する組換えベクターを導入し得る任意の細胞（この場合、ベクターは、ＧＦＰまたはＧＦＰ変異体配列の発現を作動することができる）が本発明により有用である。すなわち、本発明のＧＦＰ分子に関する多種多様の用途から、本発明のＧＦＰ分子を発現し得、好ましくは検出し得る任意の細胞が好適な宿主である。種々の異なる生物、つまり原核生物および真核生物由来の宿主細胞へのＧＦＰコード配列の導入に適したベクターは本明細書で上述しているか、または、当業者には周知である。
【０１２４】
宿主細胞は、多くのいずれかの細菌株などの原核細胞であるか、または、酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫もしくは両生類細胞、または、例えばげっ歯類、サルまたはヒト細胞をはじめとする哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。本発明のＧＦＰを発現する細胞は、初代培養細胞、例えば初代ヒト線維芽細胞またはケラチノサイトであるか、または、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３ＴまたはＣＨＯ細胞などの確立されている細胞系であってもよい。さらに、本発明のＧＦＰの発現に有用な哺乳動物細胞は、表現型的に正常であるか、または発癌的に形質転換され得る。当業者は、培養において選択した宿主細胞型を容易に確立および維持できると考えられる。
【０１２５】
３．ＧＦＰコードベクターの宿主細胞への導入
ＧＦＰコードベクターは、当業者に周知の多くの適切な方法のいずれかにより、選択した宿主細胞に導入することができる。例えば、ＧＦＰ構築物は、λまたはＭ１３などの大腸菌バクテリオファージベクター粒子の場合には、感染により、あるいは、プラスミドベクターまたはバクテリオファージＤＮＡに関する多くの形質転換法のいずれかにより、適切な細菌細胞に導入し得る。例えば、標準的な塩化カルシウム改変細菌形質転換は、今なお、裸ＤＮＡを細菌に導入するのに一般的に使用されているが（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）、電気穿孔法も使用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上掲）。
【０１２６】
酵母または他の真菌細胞へのＧＦＰコード構築物の導入では、化学的形質転換法を一般的に使用する（例えば、Ｒｏｓｅら、１９９０、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。例えば、サッカロマイセス・セレビシエの形質転換では、細胞を酢酸リチウムで処理し、ＤＮＡ１μｇ当たり、約１０４個のコロニー形成単位（形質転換細胞）の形質転換効率を達成する。次いで、形質転換細胞を、使用する選択マーカーに適した選択培地上で単離する。あるいは、またはさらに、プレートまたはプレートから取り上げたフィルターをＧＦＰ蛍光についてスキャンし、形質転換したクローンを同定することができる。
【０１２７】
Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコードベクターの哺乳動物細胞への導入では、使用する方法はベクターの形態によって決まる。プラスミドベクターでは、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはその変異体をコードするＤＮＡを、例えば、脂質によるトランスフェクション（「リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）」）、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、電気穿孔法またはリン酸カルシウム沈降法をはじめとする、多くのトランスフェクション法のいずれかにより導入することができる。これらの方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、上掲に詳述されている。
【０１２８】
多種多様の形質転換および非形質転換または初代細胞の一過的トランスフェクションに適したリポフェクション試薬および方法は、広く入手可能であり、これにより、リポフェクションは、構築物を、真核細胞、特に哺乳動物細胞培養物に導入する絶好の方法になる。例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または；ＬｉｐｏＴａｘｉ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）キットを購入することができる。リポフェクション用の試薬および方法を提供している他の会社としては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＬＯＮＴＨＣＨ、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓａｅａｒｃｈ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＰａｎＶｅｒａ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡが挙げられる。
【０１２９】
また、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰコードベクターを、ショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞（Ｓ２）細胞、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞に導入するために、トランスフェクションをリポフェクションにより実施する。
【０１３０】
本発明のＲ・レニフォルミスＧＦＰコードベクターでトランスフェクトした後、首尾よく構築物を（染色体の内または外に）取込んでいる真核細胞（好ましくは哺乳動物細胞であるが、必ずしもそうではない）は、上述のように、トランスフェクトした細胞集団を、耐性遺伝子がベクターによりコードされる抗生物質などの選択物質で処理することにより、または、例えば細胞集団のＦＡＣＳまたは付着培養物の蛍光走査を使用した直接的なスクリーニングにより選択することができる。多くの場合、両タイプのスクリーニングを使用することができるが、この場合、陰性選択を使用して、構築物およびＦＡＣＳを取込んだ細胞について強化するか、または、蛍光走査を使用して、それぞれ、ＧＦＰ発現細胞をさらに強化するか、または、細胞の特定のクローンを同定する。例えば、ネオマイシン類似体Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いた陰性選択を使用して、ベクターを受けた細胞を同定し、蛍光走査を使用して、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰまたはＧＦＰ変異体をより多く発現した細胞または細胞のクローンを同定することができる。
【０１３１】
ＩＩ．本発明によるＲ・レニフォルミスＧＦＰおよびその変異体の使用法。
本発明によるＲ・レニフォルミスＧＦＰおよびその変異体は、多くの異なる方法において有用である。Ｒ・レニフォルミスＧＦＰは他のＧＦＰに比べて優れたスペクトル特性および蛍光強度を有しており、従って、Ｒ・レニフォルミスＧＦＰはまた、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）、レニラ・ムレリ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ）、プチロサルカス・ガルネイ（Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ  ｇｕｒｎｅｙ）などの他のＧＦＰを用いて以前実施されてきていたものよりも、方法およびアッセイにおいて有用である。
【０１３２】
Ａ．ペプチドライブラリーのインビボ表示のためのＲ・レニフォルミスＧＦＰの使用
本発明によるＲ・レニフォルミスＧＦＰおよびその変異体は、タンパク質−タンパク質の相互作用またはタンパク質と核酸の相互作用を確認し、目的の表現型を付与するペプチドを同定するためのペプチドライブラリーのインビボ表示に特に有用である。特定の表現型を示すペプチドの同定は、所与の表現型の「ノックアウト」または改変に使用可能な治療用化合物および生物学的試薬の開発に役立つ。特定の疾患状態を阻害する薬剤または化合物を同定するように設計されている確立された多数のスクリーニングアッセイがあり、それらは当技術分野において周知である。治療薬の同定に好適なスクリーニングアッセイが存在する疾患状態のいくつかの例は、すでに米国特許出願第２００１／０００３６５０号に記載されている。なお、これは引用により本明細書に援用する。本質的には、当技術分野で周知である、所与の表現型についての確立されたスクリーニングアッセイはいずれも本発明に有用である。さらに、タンパク質−タンパク質の相互作用およびタンパク質と核酸の相互作用を同定するインビボペプチドライブラリーを用いる、当技術分野で開発されているすべてのアッセイも本明細書に用いることができる。
【０１３３】
１．ツーハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）
タンパク質−タンパク質の相互作用を同定するために、種々の生化学的手法が開発されてきている。１つの手法は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するインビボの遺伝学的手法である、酵母ツーハイブリッドシステムであり、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇによって初めて記載されている（Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２４５〜２４６頁、１９８９）。古典的なツーハイブリッドシステムは、２種類のタンパク質間の相互作用を検出するか（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９、前掲）、あるいは特定の「ｂａｉｔ（餌）」を用いて、ライブラリー（「ｐｒｅｙ（餌食）」）から相互作用するタンパク質を単離させるために適用することができる（Ｃｈｉｅｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８２頁）。さらに、ｂａｉｔまたはｐｒｅｙいずれかとしての全ゲノムへのツーハイブリッドシステムの適用は、生物の完全プロテオームの相互作用のネットワークのカタログを作るタンパク質連鎖地図を生成するために用いられている（Ｂａｒｔｅｌら、１９９６、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：７２〜７７頁）。
【０１３４】
次の用語、すなわちツーハイブリッド、スリーハイブリッド、トリ−ハイブリッドおよびトリブリッド（ｔｒｉｂｒｉｄ）、およびリバースツーハイブリッドによって知られている、タンパク質−タンパク質相互作用の分野で現在用いられているいくつかの系がある。これらの各系は、本発明のｈｒＧＦＰが有用であり得る系である。また、これらの各系の変法が存在する。本明細書では、「ツーハイブリッド」という用語は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇの古典的なｂａｉｔおよびｐｒｅｙの組合せ、ならびに本明細書に記載されているライブラリースクリーニングを記載するために用いている。
【０１３５】
酵母ツーハイブリッドシステムは、転写活性化因子、例えば、酵母のサッカロマイセス・セレビジエ中のＧＡＬ４などの活性の再構築を介してインビボのタンパク質−タンパク質相互作用を検出にする、遺伝学的な手法である。ツーハイブリッドシステムの重要な点は、部位特異的転写因子が多くの場合モジュールであり、特定のプロモーター配列に結合する、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）および  ＤＮＡ結合部位の下流遺伝子を転写するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体に指令する活性化ドメイン（ＡＤ）からなっているという知見による。この現象は、個々の結合ドメインおよび活性化ドメインを１ペアの相互作用タンパク質、ＸおよびＹと融合し、ツーハイブリッドタンパク質、ＢＤ−ＸおよびＡＤ−Ｙをつくりだすことで発揮する。従って、一般に、任意のペアのＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを用いることができる。さらに、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有している任意の部位特異的転写因子も用いることができる。酵母細胞中のこれらのツーハイブリッドの共発現により、同系統のＢＤ結合部位を含有しているレポーター遺伝子の発現が得られる。またこの手法を用いて、ＡＤ−Ｙライブラリーから目的のタンパク質のパートナーをコードするｃＤＮＡを単離することができる。
【０１３６】
ツーハイブリッドシステムは、多くの理由で、他の生化学的方法以上に有利である。ツーハイブリッドシステムによって、相互作用するタンパク質のインビボ同定が可能となる。従って、酵母細胞中の標的タンパク質の構造は、恐らく、入手可能な大部分のインビトロ条件より天然形態に近く、それ故、生理学上重要なタンパク質が得られる可能性があると考えられる。これは、標識タンパク質による発現ライブラリーの探索または共免疫沈降（並列比較に基づくもの）などの他の多くの方法に比べてタンパク質−タンパク質相互作用の検出に感度が高いと思われる（Ｌｉら、１９９３年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、７：９５７〜９６３頁）。この感度によって、弱い、あるいは一時的な相互作用タンパク質の単離が可能となる。このツーハイブリッドシステムの使用により、細胞周期因子、シグナル伝達因子、およびアポトーシスとＤＮＡ修復に関与するタンパク質をはじめとする、多数のタンパク質相互作用が首尾よく検出されている。
【０１３７】
酵母ツーハイブリッドシステムは、酵母中の２種類のタンパク質間の二分子相互作用を検出するために開発された。この手法の限界の１つは、数種類の成分によって仲介されている相互作用、あるいは酵母中で用いられない特異的翻訳後修飾に依存している相互作用を再構築できないことであった。いくつかのアッセイでは、この問題を克服することが記載されており、例えば、リンタンパク質間の相互作用をアッセイする修飾酵素としてのタンパク質チロシンキナーゼの共発現（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９９５、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：１４７４〜１４７８頁）、複合三成分相互作用をアッセイするアダプターまたはリガンド架橋の導入（ＬｉｃｉｔｒａおよびＬｉｕ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９３：１２８１７〜１２８２１頁；ＺｈａｎｇおよびＬａｕｔｅｒ、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４２：６８〜７２頁）、およびＲＮＡタンパク質相互作用のアッセイ（Ｐｕｔｚら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：４８３８〜４８４０頁；Ｓｅｎ  Ｇｕｐｔａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９３：８４９６〜８５０１頁）が挙げられる。これらの研究はすべて、変性剤または安定剤としての第３のタンパク質の存在下における単一のｂａｉｔタンパク質および相互作用に焦点を合わせている。
【０１３８】
酵母ツーハイブリッドシステムは、酵母フェロモン応答を阻害するペプチドを同定するために都合よく用いられてきた（Ｃａｐｏｎｉｇｒｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９５：７５０８〜７５１３頁）。さらに、米国特許第５９２８８６８号および同第６３０３３１０号には複数のタンパク質相互作用を検出する方法が記載されている。
【０１３９】
タンパク質複合体を不活性化する分子を同定する、リバースツーハイブリッドシステムも確立されている（Ｖｉｄａｌ  Ｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９６、９３：１０３１５〜１０３２０頁）。
【０１４０】
哺乳動物ツーハイブリッドシステムは、本発明において同様に有用である。通常、酵母中に存在しない翻訳後修飾などを哺乳動物細胞で用いることができ（Ｄａｎｇ，Ｃ．Ｖ．ら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：９５４〜９６２頁）、生物学的に重要な相互作用が得られる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、オリジナルの相互作用トラップ（ｔｒａｐ）系（Ｇｙｒｕｓら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７５：７９１〜８０３頁）に基づいて酵母ツーハイブリッドシステムを用いる。相互作用トラップ系では、目的のタンパク質が、選択可能な標識遺伝子ＬＥＵ２の上流のＬｅｘＡ結合部位を含有している酵母株のＬｅｘＡ融合物として発現する。転写活性化ドメインと融合したタンパク質をコードするＤＮＡライブラリーを酵母株へ導入する。周知のタンパク質と相互作用するライブラリーペプチド含有細胞は、相互作用がＬＥＵ２の転写活性化を可能とするので、ロイシン欠乏培地で増殖する。また、酵母株はＬｅｘＡオペレーター−ｌａｃＺレポーターを含有しており、産生されるβ‐ガラクトシダーゼ活性の量は相互作用の強度の基準である。Ｃｏｌａｓら（Ｎａｔｕｒｅ、１１：５４８〜５５０頁、１９９６）は、ペプチドアプタマー（アミノ末端とカルボキシ末端にて骨格作られ、固定されるペプチド）の遺伝子選択にこの系を都合よく用いてきた。タンパク質ライブラリーは、オリジナルの相互作用トラップ酵母ツーハイブリッドシステム由来の改変された１セットのタンパク質成分に融合されている大腸菌チオレドキシンベースの足場により表示されていた（ＬａＶａｌｌｉｅら、１９９３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１８７〜１９３頁；Ｃｏｌａｓら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、１１：５４８〜５５０頁；Ｆａｂｒｉｚｉｏら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８：４３５７〜４３６３頁）。
【０１４２】
本明細書に記載されているハイブリッドシステムを用いるには、標準の分子生物学技術を用いて、転写活性化ドメインをｈｒＧＦＰのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合させ、ランダム化ペプチドがｈｒＧＦＰへ内部的に融合され得る発現カセットベクターを得る。一実施形態では、用いられる転写活性化タンパク質には、ＳＶ４０核局在化シグナル、Ｂ１１２転写活性化ドメイン、および赤血球凝集素エピトープタグ（Ｃｏｌａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１１：５４８〜５５０、１９９６頁）が含まれている。結果として得られたｈｒＧＦＰの転写活性に対する能力は、上述の相互作用トラップ酵母ツーハイブリッドシステム（Ｃｏｌａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１１：５４８〜５５０頁、１９９６）、および２種類の周知の相互作用タンパク質パートナーを用いて試験することができる。
【０１４３】
また、ハイブリッドアッセイで用いられる活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、単離可能な結合ドメインと転写活性化ドメインを有している多種多様の転写活性化因子タンパク質由来のものであってよい。例としては、これらに限定されるものではないが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ４タンパク質、Ｓ．セレビシエのＧＣＮ４タンパク質（ＨｏｐｅおよびＳｔｒｕｈｌ、１９８６、Ｃｅｌｌ、４６：８８５〜８９４頁）、Ｓ．セレビシエのＡＲＤ１タンパク質（Ｔｈｕｋｒａｌら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：２３６０〜２３６９頁）、およびヒトエストロゲン受容体（Ｋｕｍａｒら、１９８７、Ｃｅｌｌ、５１：９４１〜９５１）が挙げられる。融合タンパク質へ組み込まれるＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、同じ転写活性化因子由来のものである必要はない。ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化因子ドメインは、核局在化シグナルを有するのが好ましい（Ｙｌｉｋｏｍｉら、１９９２、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１：３６８１〜３６９４頁；ＤｉｎｇｗａｌｌおよびＬａｓｋｅｙ、１９９１、ＴＩＢＳ、１６：４７９〜４８１頁を参照）。
【０１４４】
アッセイで用いられるレポーター遺伝子には、検出可能または選択可能なマーカーをコードする配列、つまり発現が転写活性化因子によって制御されている配列を含有する。本明細書では、「によって制御されている」という用語は、レポーター遺伝子の発現が少なくとも１０％まで高められ、その発現が転写活性化因子の活性に応じて変化することを意味する。検出可能または選択可能なマーカーは、特定の相互作用の存在に応じて、細胞中で作動のオンまたはオフがなされる。好ましくは、該アッセイは、転写活性化因子の背景強度のない状態で（例えば、突然変異体である細胞中、または転写活性化因子に欠損がある細胞中で）実施する。一実施形態では、２種以上のレポーター遺伝子を用いて、転写活性化、例えばＬａｃＺ、ＬＥＵ２を検出する。検出可能なマーカーは、検出可能なシグナル、例えば抗体、酵素アッセイまたは蛍光によって検出可能なシグナルを生じさせることが可能な任意の分子であってよい。好適な選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーのない状態で、細胞の増殖をサポートしない条件下で細胞に増殖能力を付与する任意のタンパク質分子である。例えば、選択可能なマーカーは、必須栄養素を提供する酵素であってよい。該レポーター遺伝子は、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を含有するプロモーターに操作可能に連結させる。該レポーター遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質に対する結合部位を必然的に含有している在来のプロモーターの調節下、または非相同性プロモーターもしくは合成プロモーターの調節下いずれであってもよい。
【０１４５】
相互作用アッセイを行う宿主細胞は、任意の細胞、つまり原核生物またはこれに限定されるものではないが、哺乳動物、細菌、昆虫細胞および酵母菌を含む真核細胞でもよい。該細胞は、レポーター遺伝子の転写を支援し、その検出を可能にしなければならない。使用する宿主細胞は、ＤＮＡ結合ドメイン融合物群によって認識されるもＤＮＡ部位と同じＤＮＡ部位へ結合する内因性転写因子を発現してはならない。また宿主細胞は、アッセイで用いられるレポーター遺伝子の内因性で機能的形態を欠損している突然変異体であり得る。好適な酵母宿主株は当技術分野では周知であり、本明細書に記載されている方法で用いることができる（例えば、Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、「Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｈａｒｔｌｅｙ，  Ｄ．Ａ．編集、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｘｖｉｉｉ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＰｒｅｓｓのＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１５３〜１７９頁；ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ、１９９４、ＴＩＧ、１０：２８６〜２９２頁を参照）。
【０１４６】
ハイブリッドシステムにおいて、ペプチドのインビボ表示のＧＦＰ足場としてＲ・レニフォルミスを使用することは、ＧＦＰ自己蛍光をモニタリングすることによってライブラリーの多様性が容易に推定でき、表示されたペプチドの発現を１個の細胞ベースにつきモニターすることができるという特別な利点を有する。
【０１４７】
２．トランス優性（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）タンパク質−タンパク質相互作用
本発明によるペプチド表示ライブラリーは、阻害性のある「ノックアウト」タンパク質分子を同定するトランス優性遺伝学実験にも有用である。優性阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）タンパク質を同定するのに用いられる当技術分野で周知の任意のアッセイを本発明に用いることができる（アッセイは、例えば、Ｄａｎｇ，Ｃ．Ｖ．ら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：９５４〜９６２頁；Ｈｏｌｚｍａｙｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、２０：７１１〜７１７頁；Ｗｈｉｔｅｗａｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９４１０〜９４１４頁；Ｇｕｄｋｏｖ，Ａ．Ｖ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３７４４〜３７４８頁；Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｉ．、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、３２９：２１９〜２２２頁；Ｒａｍｅｒ，Ｓ．Ｗ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１１５８９〜１１５９３頁；Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｍ．Ｃ．ら、１９９７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４７：１０６３〜１０７６頁、ならびに米国特許第５９５５２７５号および同第６０２５４８５号に記載されている）。基本的には、ｈｒＧＦＰ足場ペプチドライブラリーは、宿主細胞に導入され、改変表現型に対する特定の選択基準が実施される。次いで、選択した改変表現型を示す細胞を用いて、例えばＰＣＲにより、目的のペプチドに対するコード配列を単離する。次いでさらに、ペプチドとそれらの標的を明らかにし、特定の生化学的経路内のどの段階でペプチドが作用するのかを決定することができる。例えば、特定の標的分子は、酵母ツーハイブリッド分析によって確認することができる。
【０１４８】
レポーター遺伝子構築物は、レポーターとして特定の表現型に用いることができる。レポーター構築物は、関連する表現型をできるだけ厳密に表すように注意深く選択する。例えば、レポーター遺伝子は、関連する状態の間にのみ活性であるプロモーターの調節下に置くことができる。レポーター遺伝子は、定量的に検出し、改変表現型を示す細胞を速やかに選択させることができるようなレベルで発現する。本発明に好適なレポーター遺伝子は、これらに限定されるものではないが、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含み、細胞表面上で発現されるタンパク質に対する遺伝子も含みえる。
【０１４９】
また目的の表現型は、当技術分野で周知の他の方法によっても検出することができ、そのアッセイは、測定すべき表現型によって決まる。例えば、膜電位の変化は、パッチクランプ技術、顕微分析による形態学的変化、ウェスタン、ノーザン、サザンによる分子発現の変化、ＰＣＲ、免疫組織化学、またはＦＡＣＳ分析などによってモニターすることができる。病原体への細胞の罹病性は、細胞生存率測定、シンシチウムアッセイ、または病原性への感染をモニターするために用いられている他の標準アッセイによってモニターすることができる。加えて、レポーター細胞を用いてもよい。例えば、第２の細胞は、目的の表現型を示す第１の細胞によって提供されるシグナルに応答してもよい。生化学的経路を不活性化するペプチドを同定するペプチドライブラリーの使用法は、国際公開第９８／３９４８３Ａ１に記載されており、この公報は引用により本明細書に援用するものとする。さらに、サイトカイン、ホルモン、増殖因子シグナル伝達経路アゴニストおよびアンタゴニストの同定に用いられている、当技術分野で周知のアッセイの例がいくつかある（例えば、それらのアッセイは、米国特許第６３１２９４１号、同第６２３２０８１号、同第６２１０９１３号で確認される。なお、これらもまた引用により本明細書に援用するものとする）。
【０１５０】
ひとたび表示ペプチドが一定の表現型の応答を改変することが分かると、そのペプチドの配列を用いて、例えば、本明細書に記載されている突然変異誘発アッセイの使用により、同じ機能を有する追加の候補ペプチドを得ることができる。また同定されたペプチドは、酵母または哺乳動物のツーハイブリッドシステムで「ｂａｉｔ」としてそのペプチドを用いることによって、あるいは免疫共沈降などによって標的分子を引き抜くために用いることができる。あるいは、分子生物学的技術を用いて、同定されたペプチドをプローブとして使用することにより発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０１５１】
３．病原性疾患の治療用ペプチドの同定
病原性疾患を阻止する化合物または薬剤の多種多様のスクリーニング法はすでに確立されており、当業者に周知である。多くの場合、スクリーニング法は、活性なシグナル伝達経路、アポトーシス、特定のタンパク質−タンパク質相互作用、サイトカイン産生、病原性感染、または特定のタンパク質改変を構成的に遮断する薬剤を同定する。
【０１５２】
例えば、ｈｒＧＦＰ足場化ペプチドライブラリーを用いて、腫瘍細胞の増殖を阻害するペプチドをスクリーニングすることができる。ライブラリーを主要腫瘍細胞または不死化腫瘍細胞いずれかへ導入し、細胞増殖を阻害し、かつ／またはアポトーシスを誘導するペプチドを同定することができる。あるいは、周知の腫瘍遺伝子を用いて、癌でない正常細胞を形質転換することができる。本発明によるライブラリーの導入に際して、形質転換された状態を逆にするようにペプチドを同定することができる。形質転換された状態およびそれらの阻害を検出する多くのアッセイが当技術分野で周知である（例えば、軟寒天アッセイおよび細胞膜ラッフリングアッセイ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｕｆｆｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ））。
【０１５３】
ｈｒＧＦＰ足場化ペプチドは、腫瘍形成および転移に関与するシグナル形質導入経路を遮断するそれらの能力についてさらにスクリーニングすることができる。例えば、ｈｒＧＦＰ足場化ペプチドは、血小板由来増殖因子または表皮増殖因子シグナル伝達を遮断するペプチドについてスクリーニングすることができる。転移の場合には、浸潤に関与する分子、例えばＲＡＳ、ｖ−ｍｏｓ、ｖ−ｒａｆ、ｖ−ｓｒｃ、およびｖ−ＦＥＳを遮断するペプチドは、特定の目的のペプチドである。
【０１５４】
また本明細書に記載されているｈｒＧＦＰ足場化ペプチドライブラリーは、感染因子の複製、または感染因子による初感染を阻害するペプチドについてスクリーニングするために用いることができる。いくつかのアッセイが当技術分野でよく知られている。例えば、シンシチウム形成アッセイおよびレポーター遺伝子アッセイを含む、ＨＩＶの侵入を阻止する化合物または薬剤を同定するアッセイが開発されている。さらに、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害する薬剤を同定するスクリーニング法（米国特許第６３２６１５１号）ならびに抗真菌剤を同定するためのスクリーニング法（米国特許第６２７７５６４号および同第６１１７６４１号）も確立されている。
【０１５５】
実施例
さらにこれより以下の実施例を参照して本発明を説明する。以下のものは例示することのみを目的とするものであり、また、本発明の範囲以内にある限り、詳細な記述に変更がなされ得ることは理解されよう。
実施例１．Ｒ・レニフォルミスｈｒＧＦＰ挿入突然変異体の構築
細胞内プロセスのペプチド阻害剤の単離は、薬剤設計、研究標的の同定、およびマイクロアレイ検出の検証にとって重要である。化学試薬とは異なり、ペプチドは、インビボ発現および細胞内環境内での標的スクリーニングについての可能性を表示する。しかし、ペプチドはタンパク分解に反応しやすく、水溶液中に非常に多くの構造で存在する。安定したタンパク質への融合物としてのペプチドの発現は、ペプチドが分解される可能性を低下させ、ペプチド構造を安定させ、かつ有望な結合標的へのペプチドの親和性を高める。多数のタンパク質足場が記載されているが、緑色蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡法または蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）により容易にモニターされるという利点がある。
【０１５６】
ヒト化Ｒ・レニフォルミス（ｈｒＧＦＰ）由来の緑色蛍光タンパク質は、ペプチドの挿入に許容性を持つ。具体的には、ｈｒＧＦＰヌクレオチドの５１９と５２０の間に１８塩基対の多重クローニング部位配列を挿入した。この配列は、野生型ｈｒＧＦＰのアミノ酸１７３と１７４の間に６アミノ酸挿入断片を有するｈｒＧＦＰタンパク質をコードしている。蛍光顕微鏡法によって評価した場合、ｈｒＧＦＰ−１７３は、ｈｒＧＦＰ−１７３遺伝子のトランスフェクション後２４時間以内、２９３細胞で蛍光を発する（図６Ａ）。ｈｒＧＦＰ−１７３挿入突然変異体は、ｈｒＧＦＰ−１７４およびｈｒＧＦＰ１７５よりも、野生型ｈｒＧＦＰとの比較において多量の蛍光を定性的に産生する（図７）。
【０１５７】
ｈｒＧＦＰ−１７３の構築
ｈｒＧＦＰ−１７３遺伝子の構築は、２つの別々のＰＣＲ反応で２セットのプライマーを用いてＰＣＲにより実施した：
セット１：
Ｎ−ＧＦＰ５’Ｋｏｚａｋ：５’−ＡＴＴＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））
ＧＦＰ−５’−１７３：５’−ＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０））
セット２：
ＧＦＰ３’−１７３：５’−ＡＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＴＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１））
Ｘ−ＧＦＰ３’：５’−ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＧ−３’（配列番号１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））
セット１のＰＣＲ反応の産物は、ＮｏｔＩ制限部位による５’末端とＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位による３’末端で挟まれているｈｒＧＦＰの第１の５１９塩基対からなる５５８塩基対の断片であった。セット２のＰＣＲ反応の産物は、ＥｃｏＲＩ部位およびＡａｔＩＩ部位による５’末端とＸｈｏＩ部位による３’末端で挟まれているｈｒＧＦＰ最後の２０１塩基対（停止コドンを含む）からなる２３７塩基対の断片であった。
【０１５８】
この２種類の断片をＥｃｏＲＩで消化し、連結した。連結産物を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｎ−ＧＦＰ５’プライマーおよびＸ−ＧＦＰ３’プライマーによりＰＣＲ反応で増幅した。結果得られた産物は約７６５塩基対であり、塩基５１９と塩基５２０の間の１８塩基対挿入断片を有し、ＮｏｔＩ（５’）部位およびＸｈｏＩ（３’）部位に挟まれているｈｒＧＦＰ遺伝子からなっている。１８塩基対挿入断片は、５’−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩ−３’からなっていた。ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩでこの産物を消化し、この２種類の同じ酵素で切断された、ｐｈｒＧＦＰ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ連結した。結果得られたプラスミドはｐｈｒＧＦＰ−１７３と称する。ｐｈｒＧＦＰ−１７３を配列決定し、予想された挿入断片を含有することを示した。ｈｒＧＦＰ−１７３配列の核酸配列およびポリペプチド配列を図２および図４にそれぞれ示す。
【０１５９】
蛍光顕微鏡法：
発現に際して、ｈｒＧＦＰ−１７３は、Ｓ１７３とＧ１７４の間の６アミノ酸挿入断片（Ｒ−Ｓ−Ｅ−Ｆ−Ｄ−Ｖ）を含有するタンパク質を産生することが予測される（図４を参照）。この６アミノ酸挿入断片が、タンパク質が細胞内で折り重なり蛍光を発させ得るかどうか決定するため、ｐｈｒＧＦＰ−１７３を２９３の細胞に形質転換し、２４時間および７２時間で、蛍光顕微鏡（Ｂ２Ａフィルターを装着）により蛍光を調べた。２４時間後に弱い蛍光が認められ（図６ａ）、７０時間後に有意な蛍光が認められた（図６ｂ）。比較では、アミノ酸１７４／１７５または１７５／１７６の間の１８塩基対挿入断片を含有する突然変異体は、７０時間後、蛍光が有意に低下するか、蛍光は認められなかった（図６ｂ、図７）。Ｎ−ＧＦＰ５’Ｋｏｚａｋ／Ｘ−ＧＦＰ３’プライマーを用いたＰＣＲにより構築された、プラスミドｐｈｒＧＦＰ−Ｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および野生型ｈｒＧＦＰから発現された野生型ｈｒＧＦＰは、２４時間後に強い蛍光を示した。アミノ酸４１、１５７、１７２〜１７５、１７７、１７８および１９２の後の挿入断片を含む、合計９種類の異なる挿入部位をｈｒＧＦＰ−１７３と共に試験した（上記で説明した方法と同様の方法により構築し、分析した）。ｈｒＧＦＰ−１７３は、試験したすべての突然変異体で最も強い蛍光を生じた。これらのデータは本質的に定性的であることに注意されたい。定量的データは、顕微鏡使用データまたはＦＡＣＳ分析のコンピューターによる調整が必要である。
【０１６０】
結果から、ｈｒＧＦＰは、アミノ酸Ｓｅｒ−１７３およびＧｌｙ−１７４の間の挿入断片に許容性があることが明らかである。ｈｒＧＦＰ−１７３突然変異体の蛍光は野生型ｈｒＧＦＰと比べると減少しているが、蛍光はトランスフェクションの２４〜７０時間後に容易に認められる。従って、この部位は、ｈｒＧＦＰ不溶性と蛍光の減少を最小限にしながら、ランダムペプチドライブラリーの挿入に用いることができる。足場として使用するためには、ｈｒＧＦＰ−１７３は、可溶性形態でペプチドを表示し、挿入ペプチドの構造を安定化し、多種多様の特有のペプチド配列に許容性を有していなければならない。ｈｒＧＦＰ−１７３の蛍光活性は、ペプチド足場の発現および溶解性のモニタリング、ならびにペプチドライブラリー各物質のスクリーニングの促進を可能にするものでなければならない。
【０１６１】
前述の実施例は、本発明を達成し実施するために、本発明者らによって行い検討した実験をあきらかにしている。これらの実施例には、本発明の実際の技術を伝え、かつその有用性を説明するのに用いられる技術の開示が含まれていると考えている。本明細書に記載されている技術および実施形態は、同じ結果を達成するために用いることができる一般的な多くの同じような方法および技術の中の好ましい実施形態のみであることは、当業者には理解されよう。
【０１６２】
本明細書中に引用されているすべての特許、特許出願、および刊行の文献は、その全文を引用により本明細書に援用するものとする。また、本発明は、その好ましい実施形態について具体的に示し、記載しているが、形態および詳細の種々の変更は、添付の特許請求の範囲によって包含されている本発明の範囲から逸脱することなくその中で行われ得ることは当業者には理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ヒト化レニラ・レニフォルミスＧＦＰ（ｈｒＧＦＰ）の核酸配列である。
【図２】ｈｒＧＦＰ、ｈｒｐＧＦＰ−１７３のヌクレオチド５１９と５２０の間に挿入されている１８ヌクレオチド塩基を有するヒト化レニラ・レニフォルミスＧＦＰの核酸配列である。挿入物には、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＡａｔＩＩ制限酵素認識配列を含む。１８ヌクレオチド挿入物には下線を引いており、野生型ｈｒＧＦＰのアミノ酸１７３とアミノ酸１７４の間の６アミノ酸挿入物をコードしている。
【図３】レニラ・レニフォルミスＧＦＰのアミノ酸配列である。
【図４】ｈｒＧＦＰ−１７３のアミノ酸配列である。野生型ｈｒＧＦＰのアミノ酸１７３とアミノ酸１７４の間の６アミノ酸挿入物には下線を引いている。
【図５】野生型レニラ・レニフォルミスＧＦＰの核酸配列を示す。
【図６】ｈｒＧＦＰ−１７３挿入突然変異体が２９３細胞で蛍光を発することを示す。図６ａは、トランスフェクションの２４時間後の蛍光を示す。図６ｂ（上部左側の図がｈｒＧＦＰ−１７３）は、トランスフェクションの約７０時間後の蛍光を示す。
【図７】ＧＦＰ−１７３挿入突然変異体（上部左側の図）が、野生型ｈｒＧＦＰ（下部右側の図）との比較において、ｈｒＧＦＰ−１７４（上部右側の図）およびｈｒＧＦＰ  １７５（下部左側の図）よりも強い蛍光を定性的に産生することを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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