(57)【要約】シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物、組織および／またはそれら由来の細胞であって、その結果少なくともいくつかの細胞のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）発現が枯渇または除去されている。本発明はまた、このような動物の産生方法ならびに特に製品の開発、動態および／または毒性研究および／または合理化された製品デザインまたは製品発見に使用するためのインビボおよびインビトロの両方でのその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
製品開発、動態および／または毒性研究および／または合理化された製品デザインまたは製品発見における、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項２】
シトクロムｐ４５０が役割を果たす病態、妊娠、胎児の発生、および／またはホルモン機能および／またはホルモンレベルの調整およびまたは他の内因性経路および／または基質代謝の研究における、シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項３】
前記ホルモン／基質が、ステロイド、エストロゲン、アンドロゲン、プロスタサイクリン、コレステロール、糖質コルチコイド、アラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トロンボキサン、プロスタグランジン、ビタミンＤ３、神経ステロイド、カテコール、胆汁酸、脂肪酸、またはレチノイン酸からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記病態が、胆汁鬱滞、アテローム発生、ホルモンのアンバランス、神経疾患、変性疾患、皮膚疾患（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、心血管疾患、癌、または緑内障からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
循環コレステロールレベルを減少させる製品の同定におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項６】
前記動物が、胚、新生児、幼若、若年、および／または成獣である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
製品の発見、開発、および／または動態／毒性研究および／または合理化された薬物デザインにおけるインビトロスクリーニングとしてのシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた動物細胞の使用。
【請求項８】
シトクロムｐ４５０が役割を果たす病態、妊娠、胎児の発生、および／またはホルモン機能および／またはホルモンレベルの調整および／または他の内因性経路および基質代謝の研究におけるインビトロスクリーニングとしてのシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた動物細胞の使用。
【請求項９】
製品開発／発見および／または動態／毒性研究および／または合理化した薬物デザイン、シトクロムｐ４５０が役割を果たす病態、妊娠、または胎児の発生、および／またはホルモン機能および／またはホルモンレベルの調整およびまたは他の内因性経路および基質代謝の研究におけるインビトロスクリーニングとしてのフロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子座を有する動物細胞の使用。
【請求項１０】
前記細胞が組織の形態である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記動物または動物細胞が、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、ラット、またはマウスからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記動物がマウスであり、および／または動物細胞がマウスである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
シトクロムＰ４５０レダクターゼを条件付きで欠失させた動物細胞または前記細胞を含む動物が、胚幹細胞をシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ターゲティング構築物によりトランスフェクトするステップと、フロックス化ＣＰＲ遺伝子座（ＣＰＲlox/lox）に関してホモ接合性の動物を選択するステップと、前記動物をＣｒｅ発現が調節された株と交配するステップとを含む方法によって産生されるか、またはその方法によって産生された動物の特徴を有する、前記請求項のいずれか記載の使用。
【請求項１４】
Ｃｒｅ発現の調節を組織または細胞特異的プロモーターによって行うか、前記発現が構成性であるか、外因性薬剤の投与によって誘導可能／調節可能である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
Ｃｒｅ発現が、タモキシフェンまたはテトラサイクリンの投与によって誘導可能である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記プロモーターが、ラットアルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、腸脂肪酸結合タンパク質プロモーター、またはウシケラチンＶＩプロモーター、または条件反応によって組織特異的様式で活性化される任意の他のプロモーターからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記組織または細胞特異的プロモーターが、シトクロムＰ４５０プロモーター、別の薬物代謝酵素のプロモーター、または転写因子プロモーターからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記シトクロムＰ４５０プロモーターが、ＣＹＰｌＡｌ、ＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ４Ａ、ＣＹＰ２Ｂ１、またはＣＹＰ２Ｂ６である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記転写因子プロモーターが、ＰＸＲまたはＮｒｆ２である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＣＰＲターゲティング構築物がＣＰＲ遺伝子のエクソンを含み、前記構築物のエクソンが３〜１６個である、請求項１３〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記構築物が１２ｋｂのＳａｌＩフラグメントを含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記構築物が同一方向のｌｏｘＰ部位に隣接し、プロモーターを含むカセット中に含まれ、任意選択的に選択マーカーをさらに含む、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記マーカーがネオマイシンである、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記プロモーターが、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）プロモーターである、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記カセットがイントロン４に挿入される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた動物細胞の産生における、請求項２０〜２５のいずれか１項に定義の構築物の使用。
【請求項２７】
シトクロムＰ４５０レダクターゼを条件付きで欠失させた動物細胞または前記細胞を含む動物が、胚幹細胞を、Ｆｌｐ／ｆｔｒ、Ｃ３１／ａｔｔＢ、ａｔｔＰを含む群から選択される適切に修飾されたシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子に関して部位特異的組換え系標的または遺伝子トラップベクターリコンビナーゼ系によってトランスフェクトするステップと、前記欠失に関してホモ接合性の動物を選択するステップとを含む方法によって得られた動物またはその方法により産生された動物の特徴を有する、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を欠失または除去するか、その発現産物を減少／防止する方法が、遺伝子産物を特異的にターゲティングするｓｉＲＮＡテクノロジーを含み、それによってヌルまたは低形質表現型を得る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
任意の１つまたは複数の以下のパラメーター：
（ｉ）製品の動態または任意の他の有機低分子の動態におけるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの役割、
（ｉｉ）製品動態経路、
（ｉｉｉ）第ＩＩ相薬物動態経路および／または親製品の毒性、
（ｉｖ）薬物取り込みにおける薬物輸送の役割、
（ｖ）化学的毒性経路におけるシトクロムＰ４５０またはＰ４５０レダクターゼの役割、
（ｖｉ）正常な代謝プロセス、ホメオスタシス、疾患モデル、または薬物／製品標的におけるＰ４５０の役割、または
（ｖｉｉ）病因または病原におけるＰ４５０系の役割
を決定するためのインビボスクリーニングとしての、シトクロムＰ４５０レダクターゼヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物の使用。
【請求項３０】
任意の１つまたは複数の以下のパラメーター：
（ｉ）最初に代謝される薬剤の薬理学的有効性、
（ｉｉ）肝外代謝の発生および速度、
（ｉｉｉ）製品の分布および薬物動態学の決定因子としての代謝クリアランス速度、
（ｉｖ）インビボ代謝パラメーターに基づくリード製品選択の評価、
（ｖ）薬理学的活性および治療結果に対する代謝効果を確立するための薬物発見モデルとの交配、
（ｖｉ）薬理学的に活性な代謝製品の妥当性および発生の評価、
（ｖｉｉ）代謝活性化または他の機構に起因する毒性の区別、
（ｖｉｉｉ）薬物／製品動態における律速段階としてのＰ４５０またはＰ４０レダクターゼの役割の確立、
（ｉｘ）製品解毒に対する胆汁流の役割、または
（ｘ）Ｐ４５０または薬物輸送効果のいずれかに起因する薬物／薬物相互作用の研究
を決定するためのインビボスクリーニングとしての、シトクロムＰ４５０レダクターゼヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物の使用。
【請求項３１】
任意の１つまたは複数の以下の使用：
（ｉ）薬理学的／毒物学的効果における代謝の役割を確立するための疾患モデルへとの交配、
（ｉｉ）化合物の生物学的利用能研究におけるＰ４５０およびＭｄｒの二重の役割を評価するための多剤応答タンパク質（Ｍｄｒ１およびＭｄｒ２）ヌルマウスとの交配、
（ｉｉｉ）応答におけるＰ４５０系またはＰ４５０レダクターゼの役割を確立するための毒物学的応答、製品誘導および／または薬理学的応答を研究するためのレポーター動物との交配、
（ｉｖ）Ｐ４５０レダクターゼ活性の無い細胞株の作製、または
（ｖ）化学的変異誘発におけるＰ４５０／Ｐ４５０レダクターゼの役割を評価するための新規のインビボ変異試験の作製、
におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物の使用。
【請求項３２】
前記動物が、肝臓レダクターゼヌルまたは肝臓レダクターゼヌルヘテロ接合体である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
任意の１つまたは複数の以下の事象／パラメーター：
（ｉ）化合物の取り込みおよび流出における輸送体の役割、
（ｉｉ）シトクロムＰ４５０系によって産生された化合物の代謝製品の同定、
（ｉｉｉ）Ｐ４５０基質としての候補化合物の評価、
（ｉｖ）Ｐ４５０効果に起因する薬物／薬物相互作用の評価、
（ｖ）薬物の生物学的利用能におけるＰ４５０およびＭｄｒの二重の役割を評価するための多剤耐性（Ｍｄｒ）ヌル動物との交配、
（ｖｉ）潜在的なＰ４５０が介在する製品の変異原性を決定するためのエームス試験におけるＳ９画分の使用、
（ｖｉｉ）肝毒性／発癌性におけるシトクロムＰ４５０系の関与の確立、
（ｖｉｉｉ）肝臓の製品代謝または他の器官に対する毒性に関与する任意の他のＰ４５０含有細胞の代謝のいずれであるかを確立すること、
（ｉｘ）化合物の代謝の肝臓または任意の他の細胞産生（すなわち、プロドラッグ活性化）が所与の候補製品の薬理学的活性／毒性に重要であるかどうかの確立、
（ｘ）親製品またはそのＰ４５０産生代謝製品が薬物代謝酵素、肝臓成長、または他の表現型効果の誘導を介在するかどうかの確立、
（ｘｉ）ペルオキシソーム増殖におけるＰ４５０系の役割の調査、
（ｘｉｉ）製品の動態、毒性、または代謝活性化におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼの役割の調査、または
（ｘｉｉｉ）Ｐ４５０が介在する製品代謝に起因する任意の細胞型における毒性の非存在下における毒性の二次部位の存在の調査、
の研究のためのインビトロアッセイとしてシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた動物組織および／または細胞の使用。
【請求項３４】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞、組織および／または前記組織由来の細胞、またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させるために産生された動物細胞、ヒトＤＮＡシトクロムＰ４５０または薬物代謝に関与する別のタンパク質をコードするＤＮＡを含むか発現させるために修飾した動物細胞を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３５】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させたヒト細胞を含む動物。
【請求項３６】
ヒトＰ４５０が介在する代謝を調査するためにシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む免疫欠乏性のトランスジェニック動物に導入されたヒト細胞の使用。
【請求項３７】
前記ヒト細胞が肝細胞である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記免疫欠乏性トランスジェニック動物が、シトクロムＰ４５０レダクターゼヌルマウスと交配したＳＣＩＤマウスである、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
内因性活性Ｐ４５０発現に欠陥がある単数または複数の動物細胞にヒトシトクロムＰ４５０レダクターゼを導入する方法であって、ヒトＰ４５０レダクターゼ単独またはＰ４５０レダクターゼ融合タンパク質として導入するステップを含み、前記導入されたＰ４５０レダクターゼが特異的Ｐ４５０と結合していることを特徴とする、方法。
【請求項４０】
前記ヒトシトクロムＰ４５０レダクターゼが、ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ２Ｄ４のいずれかと融合している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｐ４５０発現を駆動するためのターゲティング配列をさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ターゲティング配列が、組織特異的プロモーター、Ｐ４５０プロモーター、または転写因子プロモーターである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）発現が枯渇または除去された非ヒトトランスジェニック動物、この動物由来の組織および／または細胞の使用、ならびに特に治療薬のインビボおよびインビトロ両方でのスクリーニング、薬物開発、薬物代謝／動態研究に使用するための（しかし、これらに限定されない）このような動物、組織、および／または細胞の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスジェニック動物は、その遺伝情報に組み込まれた外因性または非天然のＤＮＡの存在によって特徴付けられる。動物は、場合によって外来ＤＮＡによってコードされた遺伝子の特徴を発現するか発現しない。
【０００３】
肝臓シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系は、哺乳動物の有害な環境化学物質に対する防御で中心的な役割を果たし、これはまた、治療薬の半減期および薬理学的性質の重要な決定因子であり、一定の場合、その最終的な毒性種に対する薬物、毒素、および発癌性物質の活性化を介在する。肝臓のＰ４５０に対するいくつかの他の機能（コレステロールおよびステロイドホルモンの代謝ならびに胆汁酸の生合成の調節が含まれる）が説明されている。しかし、一定のこれらの経路について、正常なホメオスタシスにおけるＰ４５０の正確な役割は知られていない。
【０００４】
これらの酵素の機能、遺伝子、および調節ならびに最近ではその構造の理解は非常に有利であった。しかし、正常なホメオスタシスおよび代謝ならびに薬物および化学的毒素の活性におけるこれらの酵素の役割についての多くの基本的疑問には未回答のままである。Ｐ４５０多遺伝子ファミリーのサイズおよび多様性により、特に外来化合物代謝に関与するこれらの酵素の多くの基質特異性が重複するので、各々の肝臓Ｐ４５０の機能の分析は非常に困難である。この酵素系の機能を理解するために、非常に多数のシトクロムＰ４５０を同時に不活性化するアプローチが必要である。
【０００５】
小胞体中に存在する全てのシトクロムＰ４５０は、１つのドナー（シトクロムＰ４５０レダクターゼ）（ＣＰＲ；ＮＡＤＰＨ：フェリヘモタンパク質レダクターゼ、ＥＣ１．６．２．４）から電子を供与される；したがって、このタンパク質の条件付き欠失により任意の特定の細胞型において小胞体中に存在する全てのＰ４５０を不活化することができる。発生中のＰ４５０発現は生命維持に必要であることが先行技術から知られている。最近の研究では、ＣＰＲを完全に欠失したにもかかわらず、胚に致死的であることが示された（１，２）。
【０００６】
分子および細胞レベルでのシトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系および薬物／毒素の代謝および／または動態における全てのその関連する相互作用を研究するためのモデルとして使用することができるトランスジェニック非ヒト動物および／またはこれら由来の組織および／または細胞により、一般に、当該分野、薬学、農芸化学、化学、および食品産業に直接利点が付与され、多くの生化学的機構もさらに理解される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、製品の開発、動態および／または毒性研究および／または合理化された薬物デザインにおけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物の使用を提供する。
【０００８】
本明細書中で言及される、「製品」は、薬学、治療、薬物、毒素、農薬、化学物質、食品、または化粧品の薬剤／分子／部分／化合物／複合体または本発明の動物もしくは方法を使用して調査することができる任意の他の天然もしくは合成化合物を含むことが意図される。
【０００９】
本明細書中では、文脈中で必要でない限り、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、それぞれ「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」を意味する。すなわち、本発明が特定の特徴を含むと記載または定義する場合、本発明の種々の実施形態はさらなる特徴も含み得る。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、シトクロムｐ４５０が役割を果たす病態、ホルモン機能およびホルモンレベルの調整ならびに他の内因性経路および基質代謝の研究におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物の使用を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる態様によれば、製品の開発および／または動態毒性研究におけるインビトロスクリーニングとしてのシトクロムＰ４５０遺伝子を条件付きで欠失させた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物由来の組織およびまたは細胞の使用を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトＤＮＡシトクロムＰ４５０または製品の代謝、化学的毒性、もしくは他の代謝経路に関与する別のタンパク質をコードするＤＮＡを含むか発現するように修飾されたトランスジェニック動物、これに由来する組織および／または細胞を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ４５０が介在する製品代謝および／または毒性またはＰ４５０系が関与する他の機能へのヒト細胞の寄与を調査するための本発明の免疫欠乏性（ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｐｒｉｖｅｄ）動物に導入されたヒト細胞の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の実施に適切な動物は、一般に、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、およびマウスなどの非ヒト動物である。げっ歯類が好ましく、マウスが最も好ましい種である。全発生段階（胚、新生児、幼若、若年、および成獣）の動物が本明細書中に含まれる。
【００１５】
本明細書中で言及される、「シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）の欠失」は、部分的または完全な除去、肝臓ヌルまたはレダクターゼヌル、「ノックアウト」、またはＣＰＲの発現不能、欠失することができる（ＣＰＲ遺伝子の全部または一部の除去を含み得る）内因性ＣＰＲ遺伝子を有する動物を含むことが意図される。レダクターゼヌル動物はまた、例えばＣＰＲｍＲＮＡプロセシングの阻害によってレダクターゼ発現が防止された動物が含まれ得る。
【００１６】
用語「条件付き欠失」は、特定の刺激を条件とする特定の遺伝子（この場合、ＣＰＲ遺伝子）の「オン」または「オフ」の切換えをいう。
【００１７】
前に考察するように、肝臓シトクロムＰ４５０は、外来化合物の代謝および正常なホメオスタシスで重要な役割を果たす。タンパク質のこの多遺伝子ファミリーの機能を調査するために、本発明者らは、マウス肝臓シトクロムＰ４５０レダクターゼの条件付き欠失を行った。本発明の実験アプローチは有効であることが証明され、肝臓Ｐ４５０活性のほとんどが完全に除去され、いくつかの予想されない表現型が得られた。本発明のマウスは本質的に胆汁酸を産生せず、肝臓へのコレステロールおよびトリグリセリドの蓄積を示し、直感に反し、同時に循環コレステロールおよびトリグリセリドが６０〜７０％減少する。
【００１８】
マウスは薬物代謝能力の著しい低下を示し、Ｐ４５０系によって活性化された毒素に対して耐性を示すようになることも認められた。これらの著しい変化にもかかわらず、本発明者らは、本発明の動物が正常に生存して生殖することができるので、先行技術の教示と対照的に肝臓Ｐ４５０が介在するホルモン代謝は生存または生殖に不可欠でないことが証明されることを予想外に見出した。したがって、本発明の動物モデルにより、この酵素系に関する多くの未解決の基本的問題に取り組み、答えることが可能である。
【００１９】
Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ部位間の分子内および分子間の部位特異的組換えを介在するＰ１バクテリオファージ由来の３８ｋＤａのリコンビナーゼタンパク質である。ｌｏｘＰ部位は、８ｂｐの非対称スペーサー領域によって分離された１３ｂｐの逆方向反復からなる。逆方向反復あたり１つのＣｒｅ分子が結合するか、２つのＣｒｅ分子が１つのｌｏｘＰ部位に並んでいる。非対称領域で組換えが起こる。これらの８ｂｐはまた、部位の方向性を担う。互いに反対方向の２つのｌｏｘＰ配列はＤＮＡの介在片を逆転し、正方向の２つの部位により部位間の介在ＤＮＡが切り出され、１ｌｏｘＰ部位後ろが遊離してＤＮＡが正確に除去されることが予想される。
【００２０】
本発明の動物を、好ましくは、ＣＰＲターゲティング構築物で胚幹細胞をトランスフェクトするステップと、フロックス化ＣＰＲ遺伝子座に関してホモ接合性（ＣＰＲlox/lox）の動物を選択するステップと、前記動物をＣｒｅ発現が調節された株と交配するステップとを含む方法によって産生することができる。
【００２１】
本明細書中で言及される、「Ｃｒｅ発現の調節」は、内因性または外因性の薬剤または刺激のいずれかによる構成性および誘導性の調節を含むことが意図される。
【００２２】
好ましくは、Ｃｒｅ発現は、プロモーター（例えば、ラットアルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、またはＣＹＰ１Ａ１プロモーター）によって調節される。
【００２３】
使用例において、アルブミンプロモーターとしてのラットアルブミンプロモーターによって新生児のＣＰＲ発現が活性になり、活性は６〜８週齢の範囲に減少し、ＣＰＲに対応する免疫反応性バンドが存在しないことが認識される。この様式では、ＣＰＲ発現は、加齢によって条件付きで欠失し、アルブミンプロモーターの連続的活性の結果として欠失されたままである。
【００２４】
例えば、Ｆｌｐ／ｆｔｒを使用したｃｒｅリコンビナーゼ以外の部位特異的リコンビナーゼ法もまた本発明の動物の産生方法に利用可能であることも認識される。Ｆｌｐリコンビナーゼは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２Ｍｍプラスミドによってコードされる４５ｋＤタンパク質である。Ｃ３１／ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、または遺伝子トラップベクターを使用することも可能である。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、３〜１６個のＣＰＲ遺伝子のエクソンを対象とするＣＰＲターゲティング構築物を提供する。
【００２６】
好ましくは、構築物は、１２ｋｂのＳａｌＩフラグメントを含む。
【００２７】
好ましくは、構築物は、同方向のｌｏｘＰ部位に隣接し、任意選択的に選択マーカー（例えば、ネオマシン）を含むカセット中に含まれる。
【００２８】
好ましくは、カセットはまた、プロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）プロモーター）を含む。
【００２９】
好ましくは、カセットは、イントロン４に挿入される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の動物の産生における本発明の構築物の使用を提供する。
【００３１】
本発明者らは、一例としてＣｒｅ／ｌｏｘＰ系を使用して出生後に任意の組織中のＣＰＲが欠失されたマウスを作製することができていた（３）。以後、酵素系の肝臓欠失によって認められる興味深い表現型を記載する。
【００３２】
本発明の方法を使用して他のＣＰＲの欠失もしくは除去またはその発現の減少／防止方法を適用することもできることが認識される。例えば、このような方法には、ｓｉＲＮＡテクノロジー（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＲＮＡテクノロジー）が含まれる。ｓｉＲＮＡは、遺伝子産物を特異的にターゲティングしてヌル又はヘテロ接合性表現型が得られる相同二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入をいう。
【００３３】
本発明の１つの態様では、本発明の肝臓ヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物を任意の１つまたは複数の以下のパラメーターを決定するためのインビボスクリーニングとして使用することができることが認識される。
（ｉ）低分子量の有機小分子（好ましくは、１０００Ｄａ未満）の動態におけるシトクロムＰ４５０またはシトクロムＰ４５０レダクターゼの役割。試験すべき化合物の経口投与、食事投与、または静脈内投与および胆汁、尿、もしくは排泄物内での排泄速度の評価、あるいは化合物の循環レベルの測定によってこれらの研究を行うことができる。さらに、インビボでの薬物／化合物の代謝レベルまたは動態を、異なる組織で検出された異なる時点での薬物／化合物濃度の測定（例えば、放射性標識化合物およびその後の全身オートラジオグラフィの使用または例えば質量分析などの分析方法を使用した特定の組織中の薬物／化合物レベルの分析）によって決定することができる。
（ｉｉ）薬物／製品の動態経路。肝外細胞中のＰ４５０レダクターゼの欠失により、薬物動態経路によって薬物取り込みおよび細胞内薬物濃度代謝の役割が決定される。コントロールまたはＰ４５０肝臓レダクターゼヌル動物で産生された代謝製品の比較により、肝臓シトクロムＰ４５０系の活性の直接的結果として代謝製品が産生されることを確立することが可能である。
（ｉｉｉ）親化合物の第ＩＩ相薬物／製品動態経路。肝臓シトクロムＰ４５０活性の非存在下では、他の酵素が親化合物の動態に関与するかどうかを確立することが可能である。これは、Ｐ４５０が介在する反応によって状況が複雑であるコントロール動物で速やかに明らかにできない。
（ｉｖ）例えば、腸管および肝臓を介した薬物取り込みにおける薬物輸送の役割。肝臓または胃腸管などの組織におけるシトクロムＰ４５０発現の非存在下で、薬物の生物学的利用能の決定における他の酵素またはタンパク質の役割、特に薬物輸送の役割の評価を容易にする。現在のところ、薬物輸送体のほとんどのインヒビターはまた、シトクロムＰ４５０系のインヒビターである。このような化合物の薬物の生物学的利用能または代謝に対するその効果を研究するためのインビボでの使用により、ある経路と別の経路を区別するための調査物（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｒ）は得られない。しかし、Ｐ４５０活性の非存在下では、インヒビターが薬物輸送体に特異的であり、それにより本発明の動物を使用して生物学的利用能の決定における薬物輸送体の役割についての研究が容易になることがより確かになる。
（ｖ）化学的毒性経路におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼの役割。シトクロムＰ４５０系は、代謝によって薬物および外来化合物（例えば、多数の抗癌薬の場合）を解毒することができ、化学反応性を示し、且つ有毒である製品への多数の化合物の変換を触媒することもできる。本発明の条件付きレダクターゼヌルモデルを使用して、これらの反応におけるＰ４５０系の役割を評価することができる。これらの反応におけるＰ４５０の役割の同定により、このような反応がヒトに関連し、これらの副作用を回避するための分子の再設計も容易にするかを評価するために有利に研究することが可能である。
（ｖｉ）正常な代謝プロセス／ホメオスタシスにおけるＰ４５０の役割。薬物動態におけるその役割に加えて、シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系は、非常に多数の重要な代謝機能を果たし、これらの反応の結果のいくつかは未知である。本発明のＰ４５０レダクターゼ動物モデルを有利に使用して、正常なホメオスタシスにおける特定のＰ４５０経路の役割を確立するための組織または細胞に特異的な様式でシトクロムＰ４５０機能を欠失することができる。これにより、これらの特定の経路（例えば、皮膚におけるレチノイン酸代謝または脳内の神経ステロイドの生合成が含まれるが、これらに限定されない）により、新規の薬物開発のための新規の標的が得られるかどうかを評価することが可能である。さらに、シトクロムＰ４５０活性の潜在的な除去により、新規の疾患モデルを作製することが可能である（例えば、肝臓および腎臓中のビタミンＤ１，２５−ヒドロキシラーゼ活性の欠失によりビタミンＤ欠損マウスが作製されること、副腎におけるステロイドホルモン生合成の欠失により、ステロイドホルモン欠損マウスが作製されることが含まれるが、これらに限定されない）。したがって、本発明の１つの実施形態では、Ｐ４５０レダクターゼヌル動物を使用して、認められた表現型に対して治療効果を示し得る新規の薬物の潜在的試験のための疾患モデルを作製することができる。
（ｖｉｉ）病因におけるＰ４５０系の役割。正常なホメオスタシスにおけるシトクロムＰ４５０系の役割のために、Ｐ４５０レダクターゼヌルマウスモデルを使用して、疾患の原因および進行におけるＰ４５０系の役割を評価することができる。これは、特に、シトクロムＰ４５０系が変性過程を強化し得る化学的に活性酸素種を作製する能力を有することが知られている変性疾患で利用される。
【００３４】
本発明の１つの態様では、本発明の肝臓ヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物を任意の１つまたは複数の以下の事象またはパラメーターを調査するためのインビボスクリーニングとして使用することもできることが認識される。
（ｉ）最初に代謝される（すなわち、そうでなければ代謝されている）薬剤の薬理学的有効性。開発における薬物の使用により、高速の最初に通過したシトクロムＰ４５０が介在する代謝により薬理学的効果を測定するのに十分な濃度を得ることができないので、インビボでの薬理学的活性を確立することは可能でない。これにより、有益且つ強力な化合物を開発することができない。しかし、本発明の肝臓レダクターゼヌルマウスでは、このような化合物のために高い薬物レベルを得ることができ、その薬理学的効力を評価することができる。化合物がインビボ効力を証明する事象では、その後、高速でＰ４５０代謝を循環させるように化合物を修飾することができる。
（ｉｉ）例えば、腎臓、脳、胃腸管、皮膚、および／または副腎など（これらに限定されない）の組織における過剰な肝臓代謝の発生および速度。肝臓以外の組織で３０％までの薬物を代謝することができ、これは関与する特定の薬物によって変化し得ると評価された。肝外薬物代謝速度は、薬物動態／毒性ならびに薬物−薬物相互作用などの事象に対する感受性の変化における重要なパラメーターであり得る。したがって、本発明の肝臓Ｐ４５０レダクターゼヌルマウスを使用して、任意の特定の薬物または化学物質が肝外組織で代謝されるかどうかおよび代謝速度を確立することができる。肝外代謝はまた、特定の細胞型で治療活性を発揮するプロドラッグの活性化の重要なパラメーターであり得るので、本発明の動物はプロドラッグ活性化研究で適用することができる。
（ｉｉｉ）プロドラッグ／薬物分布および薬物動態学における決定因子としての肝臓代謝クリアランス速度。代謝クリアランス速度の確立は、治療薬および外来化学物質の生体半減期および活性を決定する重要な薬物動態パラメーターである。Ｐ４５０代謝の非存在下では、代謝クリアランスにおけるこれらの酵素の役割を明確に確立することができ、且つどのようにして潜在的な薬物または化合物をヒトが取り扱うことができるのかということをより深く理解することが可能である。
（ｉｖ）インビボ代謝パラメーターに基づくリード製品／化合物選択の促進。代謝パラメーターに基づいて、本発明の肝臓Ｐ４５０レダクターゼヌルマウスを、ヒトで使用するための最適な薬物動態学パラメーターを有することを確立するための非常に多数の化学物質の迅速なスクリーニングにおけるツールとして使用することができる。これにより、その薬物動態学的性質を至適化するために化学修飾が必要な化合物も同定される。
（ｖ）薬理学的活性および治療結果に対する代謝効果を確立するための薬物発見マウスモデルとの交配。前臨床薬物開発、毒物学、および薬物発見目的のために開発されたトランスジェニックレポーターマウス数が増加していることが先行技術から知られている。本発明の１つの実施形態では、肝臓レダクターゼヌルモデルを、これらのレポーターマウス系の１つと有利に交配させ、それにより、調査中の化合物の薬理学的効果または毒物学的効果に対する代謝の役割をより明確に評価することができる。
（ｖｉ）薬理学的に活性な代謝製品の妥当性および発生の評価。多数の製品／薬物は、最初に、薬理学的に活性な製品を作製するために、シトクロムＰ４５０系による代謝が必要である。潜在的な薬物または製品の代謝によって活性化されるかどうかまたは製品が薬理学的性質または毒物学的性質を保持するかさらに増強されるかどうかを評価するのにも重要である。Ｐ４５０代謝を含むまたはＰ４５０代謝を含まない動物における薬理学的効果の比較により、プロドラッグまたは化学物質の活性化を評価することが可能である。
（ｖｉｉ）製品代謝活性化または他の機構に起因する毒性の区別。多数の化学物質は、シトクロムＰ４５０系による反応性代謝製品への変換の結果として有毒である。開発において薬物または製品がインビボで固有の毒性を示す事象では、本発明の１つの実施形態で条件付きＰ４５０レダクターゼヌルマウスを使用して、シトクロムＰ４５０系による代謝活性化が関与するかどうかを評価することができる。この場合、有毒代謝製品の性質を確立することができ、このような潜在的に有毒な事象を回避するように分子を再設計することができる。
（ｖｉｉｉ）薬物／化合物動態における律速段階としてのＰ４５０またはＰ４０レダクターゼの役割の確立。特定の細胞型におけるレダクターゼの条件付き欠失の使用に加えて、Ｐ４５０レダクターゼ発現にヘテロ接合性のマウスで実験を行うことができる（すなわち、１つのＰ４５０レダクターゼヌル対立遺伝子および機能的Ｐ４５０レダクターゼ対立遺伝子を含むマウスを交配させる）。これらの環境下では、Ｐ４５０酵素への電子流の速度が制限される結果としてＰ４５０活性が減少すると予想される。これが真であることの証拠は既に得られているので、本発明のこの特定のモデルを使用して、上記パラメーターにおけるＰ４５０系の役割を確立することができる。Ｐ４５０レダクターゼヘテロ接合性マウスで薬物代謝が変化しない事象では、これは、Ｐ４５０系への電子伝達が薬物動態速度における重要な決定要因ではないことを示す。
（ｉｘ）薬物消失に対する胆汁流の役割。本発明の肝臓Ｐ４５０レダクターゼヌルマウスは、胆汁酸産生に欠陥があることを示した。したがって、本発明の動物を使用して、薬物動態の速度および経路に対する胆汁流の効果を確立することができる。このような研究は、特に、胆汁鬱滞を発症する化合物に有利であり得る；または
（ｘ）Ｐ４５０または薬物輸送効果のいずれかに起因する薬物／薬物相互作用の研究。上記のように、肝臓Ｐ４５０活性が存在しない場合、このような効果がシトクロムＰ４５０系または薬物の取り込みおよび動態の他の経路（薬物輸送体など）との相互作用に起因するかどうかを評価するための薬物−薬物相互作用研究を行うことが可能である。このような情報は、薬物調節目的およびクリニックでの薬物使用の潜在的困難さの同定の両方に重要である。
【００３５】
本発明の１つの態様では、本発明の肝臓ヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物を任意の１つまたは複数のさらなる以下の状況で使用することもできることが認識される。
（ｉ）製品の薬理学的／毒物学的効果における化合物代謝の役割を確立するための疾患モデルとの交配、
（ｉｉ）製品の生物学的利用能研究におけるＰ４５０およびＭｄｒの二重の役割を評価するための多剤応答タンパク質（Ｍｄｒ１およびＭｄｒ２）ヌルマウスとの交配。
（ｉｉｉ）変性疾患研究のためのレポーター動物（例えば、酸化ストレス感受性レポーターが含まれるが、これに限定されない）との交配。本発明の条件付きレダクターゼヌルと特定の疾患のレポーターを保有するマウスとの交配により、この疾患の原因および進行におけるＰ４５０系の役割を評価することが可能である。化学物質の代謝活性化および毒作用機構におけるＰ４５０系の役割をより容易に確立することができるように、レダクターゼヌルマウスを、例えば、特定の細胞ストレス応答型を反映するレポーターマウスと交配させることもできる。さらに、多数の薬物および外来化合物は、シトクロムＰ４５０系を誘導または抑制する能力を有する。多くの場合、この効果が親化合物またはその代謝製品の１つに起因するかどうかは知られていない。これは、特に、例えば、化学予防薬の場合である。本発明のこの実施形態の１つの例では、例えば、遺伝子のプロモーターがＬａｃＺなどのレポーターに連結される場合、あるいは、ＣＹＰ１Ａ１−ＬａｃＺ系の場合のように化学物質によってプロモーターを活性化することができる毒物学スクリーニングにおいてレポーター系を使用することができる。
（ｉｖ）Ｐ４５０レダクターゼ活性が無いか（例えば、線維芽細胞）任意の細胞株のための不死化遺伝子（例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原）の移入による本発明の動物由来の細胞株の作製。インビボ実験に加えて、上記の全実験をインビトロで行うことができる。例えば、線維芽細胞株の使用または細胞への不死化遺伝子の導入（レダクターゼマウスとＳＶ４０ラージＴ抗原などの不死化遺伝子を保有するマウスとの交配または培養物中の初代細胞への不死化遺伝子の導入のいずれか）によって、条件付き肝臓レダクターゼヌルマウスまたはこれら由来の細胞株由来の初代細胞のいずれかを使用してこれらを行うことができる。
（ｖ）化学的変異誘発におけるＰ４５０／Ｐ４５０レダクターゼの役割を評価するための新規のインビボ変異試験の作製。化学物質および薬物開発の重要な態様は、化学物質が有毒であるか特定の変異誘発能力を有するかどうかを確立することである。インビボでは、化学的変異原性におけるＰ４５０系の役割を確立するために、Ｐ４５０レダクターゼヌルマウスをビッグブルーマウスなどの変異誘発事象をレポートするマウスと交配することができる。あるいは、例えば、エームス試験においてＳ９画分を使用して任意の変異効果におけるＰ４５０代謝の役割を確立するために、コントロールまたはレダクターゼヌル動物由来の肝細胞成分分画を使用して、インビトロ研究を行うことができる。
【００３６】
シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼ系は全身に分布し、組織および細胞特異的様式で異なる酵素が発現する。本発明の１つの実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ系は、これらの細胞中の特定の酵素を特異的に欠失することができるように条件付き方法で特定の細胞型を特異的にターゲティングする。好ましくは、これらの酵素を含む細胞に発現を指示するためにシトクロムＰ４５０遺伝子のプロモーターまたはＣｒｅリコンビナーゼを駆動するための酵素を代謝する他の薬物のプロモーターの使用によってこれを行うことができる。さらに、好ましくは、シトクロムＰ４５０遺伝子の調節を介在する転写因子のプロモーターを、特定のＰ４５０酵素が発現される細胞にＣｒｅを特異的に送達させる機構として使用することができる。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、Ｃｒｅリコンビナーゼ系および組織または細胞特異的様式でＣｒｅリコンビナーゼ発現を駆動するためのプロモーターを含み、前記プロモーターが、シトクロムＰ４５０プロモーター、別の薬物代謝酵素のプロモーター、または転写因子プロモーターを含む群から選択される、動物または動物細胞を提供する。
【００３８】
シトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１Ａ１は、その発現がプロモーター内に含まれる生体異物応答エレメントの存在によって決定される高度に調節可能な遺伝子である。本発明者らは、以前に、このプロモーターにより、外因性化学物質に応答した遺伝子発現の調節のための非常に強力なオン／オフスイッチが得られる（すなわち、構成性レベルのシトクロムＰ４５０１Ａ１は非常に低いが、一定範囲の特定の化学物質への動物または細胞の曝露に対して高い誘導性を示す）ことを証明した。ＣＹＰ１Ａ１は、シトクロムＰ４５０系を発現する事実上全ての細胞型で調節可能であり、従って、本発明の１つの実施形態では、外因性薬剤の投与により、事実上全ての関連する動物細胞でＰ４５０系が欠失される。従って、Ｐ４５０レダクターゼがフロックス化されたマウスとＣＹＰ１Ａ１  Ｃｒｅマウスとの交配により、多数の細胞型でＣｒｅが条件付きで調節される。本発明の他の実施形態では、プレグナンｘ受容体（ＰＸＲ）プロモーターなどの転写因子プロモーターを使用して、組織特異的な条件付き欠失を行う。この受容体は、主に肝臓、腸、および腎臓で発現するので、Ｃｒｅリコンビナーゼを駆動するためにこれを使用したプロモーターにより、これらの組織中でＰ４５０系が特異的に欠失される。さらなる選択肢は、化学予防薬（クマリン、エトキシキン、およびブチル化ヒドロキシアニソールが含まれる）のような異なる化合物クラスによって再度調節される転写因子（Ｎｒｆ２）のプロモーターである。さらなる例は、肺胞２型細胞および肺のクララ細胞で構成性発現が得られ、一定範囲の化合物（バルビツール酸系薬物が含まれる）によって肝臓で特異的に調節可能な発現が得られるシトクロムＰ４５０ＣＹＰ２Ｂ１またはＣＹ２Ｂ６プロモーターである。さらに、シトクロムＰ４５０ＣＹＰ３ＡまたはＣＹＰ４Ａプロモーターの使用により、デキサメタゾンまたはクロフィブリン酸などのそれぞれの化合物によって肝臓または腸のＣｒｅが調節される。したがって、本発明のこれらの特定の実施形態では、（上記のもののような）プロモーターを、特定の組織／細胞がＣＰＲ遺伝子欠失を含むように構成性または誘導様式での組織／細胞特異的Ｃｒｅ発現に使用する。
【００３９】
本発明のある実施形態では、本発明のレダクターゼヌル動物を有利に使用して、組織または細胞特異的様式でＰ４５０系を欠失することができる。このような動物を、製品／薬物の代謝、解毒、通常のホメオスタシス、または病因におけるＰ４５０系の役割を研究する上記適用に使用することができる。この実施形態により、代謝の非存在下においてこれらの組織または細胞で研究すべき薬物輸送体が介在する効果などの他の効果も得られると予想される。
【００４０】
好ましくは、ＣＰＲフロックス化マウスとＣｒｅリコンビナーゼが組織または細胞特異的プロモーター（例えば、胃腸管特異的欠失を得るための腸脂肪酸結合タンパク質のプロモーターまたは他の例では皮膚上皮細胞欠失を得るためのウシケラチンＶＩのプロモーター）がオフにされたマウスとの交配によって組織特異的欠失を実施する。
【００４１】
前に記載のように、Ｃｒｅ調節は、構成性または誘導性でもよい。本発明の別の実施形態では、ｃｒｅの調節は条件付きでもよい（すなわち、その発現を、外因性の薬剤の投与（例えば、タモキシフェンスイッチ系またはテトラサイクリン誘導性発現系の使用が含まれるが、これらに限定されない）によって調節することができる）。１つのこのような例は、ｃｒｅが、非常に多数の外因性外来化合物によって調節されるＣＹＰ１Ａ１プロモーターがオフになる場合である。Ｃｒｅリコンビナーゼ活性は、外因性誘導薬が適用されるまでサイレントである（すなわち、これが行われるまで表現型が認められない）。したがって、インビボ実験では、これにより同一の動物を試験およびコントロールの両方として有利に使用することが可能であると予想される。ＣＹＰ１Ａ１系を使用して、主に肝臓で欠失するかＣＹＰ１Ａ１プロモーターが活性な成体または胎児組織で欠失することができる。組織／細胞特異的またはｐａｎ欠失（ｐａｎ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を、前記の製品／薬物の開発、動態、および毒性の研究で使用することができる。
【００４２】
シトクロムＰ４５０系は、薬物および外来化合物の代謝におけるその役割に加えて、種々の異なる組織中の一定範囲のホルモンおよびシグナル伝達分子の生合成および代謝において重要な役割を果たす。例えば、生殖腺および副腎におけるステロイドホルモン生合成（エストロゲン、プロスタサイクリン、アンドロゲン、糖質コルチコイド）、腎臓におけるアラキドン酸代謝、血小板におけるトロンボキサン、肺および前立腺におけるプロスタグランジン代謝、肝臓および腎臓におけるビタミンＤ３代謝、脳および海馬における神経ステロイドの生合成／代謝、副腎、胎児肝臓、および視床下部におけるカテコールエストロゲン生合成、肝臓における胆汁酸生合成、肝臓および肺における脂肪酸代謝、ならびに胎児、肝臓、および皮膚におけるレチノイン酸代謝。さらに、Ｐ４５０は、妊娠および胎児の発生において重要な役割を果たすので、本発明は、これらの条件におけるその役割を研究するためのツールを提供する。
【００４３】
したがって、本発明のさらなる態様では、製品／薬物発見のための疾患モデルまたはＰ４５０系の機能を検証または評価するためのモデルを作製するために、本発明の動物を使用して、任意の上記の細胞型における関連ホルモンの機能およびレベルを調整することができる。
【００４４】
本発明者らは、肝臓Ｐ４５０レダクターゼの欠失により胆汁酸産生（主なコレステロール動態経路）がほとんど完全に除去され、これがコレステロールの有意な肝臓蓄積に付随することを認めた。しかし、驚いたことに、予想に反して、循環コレステロールレベルの減少も付随するので、これまで同定されなかった肝臓および循環コレステロールレベルの両方を調節するＰ４５０系の役割が同定された。これらの所見を考慮して、本発明のさらなる態様では、病態における胆汁酸の役割の評価および薬物動態研究における胆汁鬱滞の研究ならびにアテローム発生および他の病態におけるコレステロールの役割の評価のためのモデルとしての本発明の動物の使用を提供する。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ４５０系を阻害し、循環コレステロールレベルの減少にも使用することができる新規の薬物の同定における本発明の動物の使用を提供する。
【００４６】
本発明のさらなる態様によれば、任意の１つまたは複数の以下の事象／パラメーター：
（ｉ）製品の取り込みおよび流出における輸送体の役割、
（ｉｉ）シトクロムＰ４５０系によって産生された製品の代謝製品の同定、
（ｉｉｉ）候補製品がＰ４５０基質であるかどうかの評価、
（ｉｖ）Ｐ４５０効果に起因する薬物／薬物相互作用の評価、
（ｖ）Ｐ４５０およびＭｄｒの二重の役割を評価するためのＭｄｒ１および／またはＭｄｒ２ヌルマウスとの交配、または
（ｖｉ）潜在的なＰ４５０が介在する化学的変異原性を決定するためのエームス試験におけるヌルマウス由来のＳ９画分の使用の研究のためのインビトロアッセイとしての本発明の動物組織および／またはそれら由来の細胞の使用を提供する。
【００４７】
本明細書中で言及される、「動物組織および／またはそれら由来の細胞」は、初代肝細胞、肝細胞株、肝臓ミクロソーム画分、肝臓スライス、および／または他の組織（例えば、腎臓、肺、または脳組織が含まれるが、これらに限定されない）および／または通常の条件下でシトクロムＰ４５０および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼが発現され、そして／またはこれらへまたはこれらから輸送される細胞（例えば、ケラチノサイトまたは軟骨細胞が含まれるが、これらに限定されない）が含まれることが意図される。本発明の組織および／または細胞は、本発明の動物に由来するかインビトロまたはエキソビボで産生され、その全てが本発明の範囲内に含まれる。
【００４８】
本発明の１つの態様では、本発明の肝臓ヌルまたはレダクターゼヌルヘテロ接合性動物由来の組織および／または細胞を、任意の１つまたは複数の以下の事象またはパラメーター：
（ｉ）肝臓毒性／発癌性におけるシトクロムＰ４５０系の関与の確立、
（ｉｉ）肝臓での製品の代謝が他の器官への毒性に関与するかどうかの確立、
（ｉｉｉ）製品代謝製品（すなわち、プロドラッグ活性化）の肝臓産生が所与の候補化合物の薬理学的作用／毒性に重要であるかの確立、
（ｉｖ）親製品またはそのＰ４５０作製代謝製品が薬物代謝酵素、肝臓成長、または他の表現型効果の誘導を介在するかどうかの確立、
（ｖ）ペルオキシソーム増殖におけるＰ４５０系の役割の調査、
（ｖｉ）製品の動態、毒性、または代謝活性化におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼの役割の調査、または
（ｖｉｉ）Ｐ４５０が介在する化合物の代謝に起因する毒性の非存在下での毒性の二次部位の存在の調査
を調査するためのツール／スクリーニングとして使用することもできることが認識される。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、ヒトシトクロムＰ４５０  ＤＮＡをコードするＤＮＡを含むか発現するように修飾された前記のトランスジェニック動物、これら由来の組織、および／または細胞を提供する。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、外来または外因性化合物の代謝、毒性、または正常なホメオスタシスにおけるヒトＰ４５０の役割を確立するために、ヒトＤＮＡシトクロムＰ４５０をコードするＤＮＡを含むか発現するように修飾されたトランスジェニック動物、それら由来の組織および／または細胞の使用を提供する。
【００５１】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ４５０が介在する製品の代謝および／または毒性におけるヒト細胞または肝細胞の分布を調査するための本発明の免疫欠乏性レダクターゼヌル動物に導入されたヒト細胞、詳細には肝細胞の使用を提供する。
【００５２】
本発明のこの実施形態では、ヒト細胞または肝細胞は、例えば、ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスの肝臓または脾臓で成長することができる。ＳＣＩＤマウスは、Ｐｒｋｄｃscid変異にホモ接合性であり、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによる欠失のためにＴ細胞およびＢ細胞の両方を欠く。したがって、これらのマウスは、外来組織移植片（ヒト腫瘍が含まれる）を容易に受け入れ、新規の癌治療試験用のモデルおよびヒト免疫系組織（すなわち、ＳＣＩＤ−ｈｕ）の宿主として有効となる。
【００５３】
したがって、本発明のこの実施形態では、ヒト細胞または肝細胞のみが細胞または肝細胞が介在するＰ４５０代謝に寄与するので、バックグラウンドマウス代謝の非存在下でのヒト代謝モデルとして有利に使用することができる。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態によれば、ヒトＰ４５０のみまたは組み合わせ（例えば、導入したＰ４５０レダクターゼが動物細胞中の特定のＰ４５０に強固に結合したＰ４５０レダクターゼ融合タンパク質）を移入するステップを含む、レダクターゼ欠失のために内因性Ｐ４５０に欠陥のある動物細胞にヒトシトクロムＰ４５０を移入する方法を提供する。
【００５５】
ＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ２Ｄ４のＰ４５０レダクターゼへの融合により、機能的Ｐ４５０酵素が作製される。従って、適切な遺伝子プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーターまたは組織もしくは特異的プロモーター（ラットアルブミンまたはＣＹＰＩＡなど））をオフにし、トランスジェニックマウスに移入したこのような融合により、構成性または条件付き様式で融合タンパク質が発現される。
【００５６】
方法のある実施形態では、マウスＰ４５０への融合におけるＰ４５０レダクターゼ（または個別のヒトＰ４５０およびＰ４５０レダクターゼポリペプチドを使用する）からのトランス電子伝達を回避するために、例えば、融合タンパク質を、マウスＰ４５０が発現されない特定の細胞区画（すなわち、脾臓などの別の細胞型または肝細胞の細胞質もしくは原形質膜などの全く異なる細胞区画）にターゲティングすることができる。
【００５７】
好ましくは、Ｐ４５０発現を駆動するために、ターゲティング配列を融合タンパク質または組織特異的プロモーターに付加する。
【００５８】
本発明のさらなる態様によれば、Ｐ４５０が含まれない代謝環境におけるタンパク質の役割を確立するためのヒトＤＮＡタンパク質をコードするＤＮＡを含み且つ発現するように修飾された前記トランスジェニック動物、これら由来の組織および／または細胞の使用を提供する。
【００５９】
本発明のこの特定の実施形態では、目的の他のヒトタンパク質（例えば、薬物輸送体が含まれるが、これに限定されない）を、本発明の動物または動物細胞のＭｄｒ／レダクターゼヌルバックグラウンドに導入することができ、それにより、Ｐ４５０が含まれない代謝製品またはマウスＭｄｒヌルバックグラウンドに対するヒトＭｄｒタンパク質の機能を有利に研究することが可能である。
【００６０】
本発明は、胆汁鬱滞、アテローム発生、ホルモンのアンバランス、神経疾患、変性疾患、皮膚疾患（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、心血管疾患、癌、または緑内障ならびにＰ４５０が役割を果たす任意の他の疾患などの病態の調査のためのツールを提供することが認識される。
【００６１】
本発明を、ここに、例示のみを目的とした以下の図面を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
（図面の詳細な説明）
図１：マウスＣＰＲ遺伝子のターゲティング。ａ．野生型、フロックス化、および破壊ＣＰＲ対立遺伝子のマップ。マウスＣＰＲ遺伝子のエクソン３〜１６を含む１２ｋｂのＳａｌＩフラグメントをクローン化し、遺伝子ターゲティングに使用した。エクソン１（非翻訳）およびエクソン２は約３０ｋｂ上流に存在し、情報のみのために示す。ＬｏｘＰ部位を三角で示し、選択マーカー（ｈｓｖ−ｔｋ−ｎｅｏ）をイントロン４中の斜線のボックスによって示す。
ｂ．ＣＰＲ+/+マウス、ＣＰＲ+/-マウス、ＣＰＲlox/+マウス、ＣＰＲlox/-マウス、およびＣＰＲlox/loxマウス由来のテールＤＮＡのサザン分析。ａ．に示すように、ゲノムＤＮＡを、ＫｐｎＩで消化し、１．５ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとハイブリッド形成させた。野生型対立遺伝子（ＣＰＲ+）は８ｋｂのフラグメントであり、ターゲティング対立遺伝子（ＣＰＲlox、選択マーカーカセットも含む）は約９．２ｋｂのフラグメントであり、欠失対立遺伝子（ＣＰＲ-）は３．２ｋｂのフラグメントサイズで示す。レーン１、５＝ＣＰＲlox/+；レーン３、４＝ＣＰＲlox/-；レーン２＝ＣＰＲ+/+；レーン６＝ＣＰＲ+/-；レーン７、８＝ＣＰＲlox/lox。
【００６３】
図２：肝臓ＣＰＲヌルマウスにおけるＣＰＲの肝臓特異的欠失。ａ．以下のマウスの肝臓および腎臓におけるＣＰＲタンパク質レベルを示す代表的免疫ブロット：レーン１、６＝ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB雄、雌；レーン２、７＝ＣＰＲlox/-雄、雌；レーン３、８＝ＣＰＲlox/+＋ＣｒｅALB雄、雌；レーン４、９＝ＣＰＲlox/+雄、雌；レーン５、１０＝ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB雄、雌；Ｓ＝ＣＰＲ標準。
ｂ．雄（白色バー）および雌（灰色バー）野生型（ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB）および肝臓ＣＰＲヌルマウス（ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB）（ｎ＝３）における肝臓および腎臓ＣＰＲ活性。値を、還元されたシトクロムｃ（ｎｍｏｌ）／分／ｍｇミクロソームタンパク質±ＳＥＭで示す。独立ｔ検定を使用して、*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００１。
ｃ．野生型（ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB）および肝臓ＣＰＲヌルマウス（ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB）由来の肝臓、腎臓、および肺切片の抗ＣＰＲ抗血清での免疫染色。示したデータは、各群の代表である（ｎ＝３）。
【００６４】
図３：肝臓ＣＰＲヌル表現型の特徴づけ。ａ．写真は、肝臓ＣＰＲヌルマウス（右）および野生型マウス（左）の典型的に拡大したサイズおよび血色の無い外観を示す。
ｂ．ヘマトキシリンおよびエオシン（ｉ、ｉｉｉ、ｖ、ｖｉｉ）またはＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（ｉｉ、ｉｖ、ｖｉ、ｖｉｉｉ）で染色した雄（左）および雌（右）ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB（上）（コントロール）およびＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBＣＤＲヌル（下）マウスの肝臓由来の代表的切片。
ｃ．成体肝臓ＣＰＲヌルおよび野生型マウス（ｎ＝４〜１２）における肝臓／体重比、血清トリグリセリド、およびコレステロール。値は、平均±ＳＥＭで示す。レーン１＝ＣＰＲ+/+；２＝ＣＰＲlox/+；３＝ＣＰＲ+/-；４＝ＣＰＲlox/-；５＝ＣＰＲlox/lox。独立ｔ検定を使用して、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００５、***ｐ＜０．００１。
【００６５】
図４：肝臓ＣＰＲヌルマウスにおけるＣＰＲおよびＰ４５０発現。ａ．成体雄および雌ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB（白色バー）およびＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB（灰色バー）マウス（ｎ＝３）における肝臓テストステロン６β−ヒドロキシラーゼ活性。値は、平均±ＳＥＭで示す。独立ｔ検定を使用して、ｐ＜０．０５。
ｂ．ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBおよびＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALBマウス由来の肝臓ミクロソームにおけるテストステロン６β、７α、および１６β水酸化。ｐｍｏｌ／分／ｎｍｏｌＰ４５０、平均±ＳＥＭ、括弧内の数字に示した活性は、野生型＝１００％と比較したサンプル中の活性％をを示す。アッセイを二連で行った（ｎ＝４）。
ｃ．成体雄および雌ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBおよびＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウス由来の肝臓ミクロソームのＣＰＲおよび種々のＰ４５０に対するポリクローナル抗血清での免疫ブロッティング。ｓｔｄ＝タンパク質標準。
ｄ．雌ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB（ｉ）およびＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB（ｉｉ）マウス由来の肝臓切片のＣＹＰ３Ａ１に対するポリクローナル抗血清での免疫染色（位相差顕微鏡、倍率×４）。
【００６６】
図５：肝臓ＣＰＲヌルマウスの薬物処置。時間０での腹腔内投与による３００ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェンでの処置後の成体雄ＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALB（黒塗りの四角）およびＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウス（白抜きの円）におけるａ．肝臓グルタチオンレベルおよびｂ．血清アラニンアミノトランスフェラーゼレベル（ｎ＝３）。値は、平均±ＳＥＭで示す。
ｃ．腹腔内投与による２０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムでの処置後の種々の遺伝子型の成体雄マウスの立ち直り反射の回復に要した時間。値は、平均±ＳＥＭで示す。
【００６７】
［方法］
ＣＰＲフロックス化マウスおよびノックアウトマウスの作製
マウスＣＰＲ遺伝子のエクソン３〜１６を含む１２ｋｂのＳａｌＩフラグメントから置換型ターゲティングベクターを構築した。同方向でｌｏｘＰ部位に隣接し、且つ選択マーカー（ネオマイシン（ｎｅｏ））を含み、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）プロモーターによって駆動されるカセットを、イントロン４に挿入した。第３のｌｏｘＰ部位を、イントロン１５にクローニングした。エレクトロポレーションによって構築物をＧＫ１２９／１胚（ＥＳ）細胞にトランスフェクトし、その後ＥＳ細胞を９６ウェルプレートにプレートし、Ｇ４１８選択を適用した。サザン分析によって証明されるように８つのＧ４１８耐性クローンが特異的相同組換えを受けていることが見出され、これらの正確にターゲティングされたＥＳ細胞クローン（ＣＰＲlox/+）のうちの２つを拡大し、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、交配後（ｄｐｃ）２．５日のレシピエント偽妊娠マウスに導入した。雄キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、ＣＰＲlox/+遺伝子型の生殖系列の伝達を確認するためのサザン分析によってヘテロ接合性の子孫をスクリーニングした。ＣＰＲlox遺伝子座を含むこれらのＥＳクローンのうちの５つを、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むベクター（ｐＭＣ１Ｃｒｅ）で一過性にトランスフェクトした。選択することなくコロニーを獲得し、９６ウェルプレートに単離した。３〜４日後、プレートを２つの二連のプレートに分け、さらに３〜４日後に一方のプレートを凍結させ、他方をさらに分けた。感受性コロニーを同定するために５日目までにこれらのプレートのうちの１つでＧ４１８選択を適用した。３〜４日後に２連のプレートからＤＮＡを調製した。プライマー１１０５および１１８４を含む６００ｂｐのＰＣＲフラグメントを使用したサザンブロット分析によって、ＥＳクローン（８００）を試験した（図１ａ）。スクリーニングしたこれらのクローンのうちの９つは、エクソン５〜１５を含むフロックス化配列の切り出しを示した。これらのＥＳ細胞クローン（ＣＰＲ+/-）のうちの２つを拡大し、キメラマウスを作製した。雄キメラをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配し、ヘテロ接合性子孫をサザンブロット分析でスクリーニングして、生殖系列の伝達を確認した。
【００６８】
マウスの繁殖および維持
１２９Ｐ２ｘＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景におけるＣＰＲ+/+マウスとの無作為な繁殖によってＣＰＲ+/-マウスを維持した。ＣＰＲ+/-マウスを互いに交配してＣＰＲ-/-遺伝子型の生存度を決定した。
ＣＰＲlox/+マウスを交配してホモ接合性ＣＰＲlox/loxマウスを産生し、１２９Ｐ２ｘＣ５７ＢＬ／６遺伝的背景における無作為な繁殖によって維持した。ＣＰＲlox/lox株をＣＰＲ+/-と交配して、ＣＰＲlox/-株を作製した。
ラットアルブミンプロモーター（４）の調節下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウス株を、ＣＰＲＣＰＲlox/lox（ＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALB）およびＣＰＲlox/-（ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB）株の両方と交配して、肝臓特異的ＣＰＲ条件付きノックアウトマウスを作製した。ＣｒｅALB導入遺伝子の存在を、ＰＣＲによって決定した（データは示さず）。
【００６９】
マウスの薬物処置
ペントバルビタールでの睡眠時間−成体雄ＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALB、ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB、ＣＰＲlox/-およびＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBマウス（ｎ＝３）に単回腹腔内（ｉ．ｐ．）用量のペントバルビトンナトリウム（Ｓａｇａｔａｌ）（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した。マウスが気を失った時間よびその後回復した時間（立ち直り反射時間）を測定した。アセトアミノフェン処置−成体雄ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスおよびＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBマウスに、３００ｍｇ／ｋｇ体重のアセトアミノフェンを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内投与した。処置後種々の時点で、マウスを屠殺し（ｎ＝４）、分析のための血液および組織を採取した。
【００７０】
免疫ブロッティングおよび生化学アッセイ
分画遠心法によって凍結組織からミクロソーム画分を調製し、前に記載のようにタンパク質濃度を決定した。前に記載のように９％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）ゲルを使用してウェスタンブロットを行い、ニトロセルロース膜に電気ブロッティングした。一次抗体としてヒトＣＰＲ（５）に対して惹起したポリクローナル抗血清を使用し、二次抗体としてロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼＩｇＧを使用した（Ｓｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｕｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）。化学発光（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）およびＸＡＲ５オートラジオグラフィフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）によって免疫反応性を決定した。Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（６）の方法によってグルタチオンレベルを測定し、以前に記載のように（５）シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を決定した。
【００７１】
血液化学
心穿刺によってヘパリン添加チューブに採血し、遠心分離によって血清を調製した。血清を直後に分析するか、４週間を超えない期間−７０℃で保存した。Ｃｏｂａｓ  ＦａｒａＩＩ遠心分離分析器（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ）での市販のキット（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）の使用によって血清アラニンアミノトランスフェラーゼおよびコレステロールの分析を行った。
【００７２】
組織病理学
組織サンプルをホルマリン−ＰＢＳ中で２４時間固定し、保存のために８０％エタノールに移すか、コルクディスク上のＯＣＴ中に包埋して急速冷凍し、−７０℃で保存した。ホルマリン固定サンプルを切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色するか、ラットＣＰＲまたは種々のＰ４５０に対するポリクローナル抗体での免疫染色のために処理した。急速冷凍した組織サンプルを、凍結切片にし、脂質含有量を決定するためのＯｉｌＲｅｄＯでの染色のために処理した。
【００７３】
統計分析
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用のＳｔａｔｖｉｅｗプログラム（ｖ４．５）（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して統計分析を行った。
【００７４】
マウス肝細胞の単離
野生型および肝臓ＣＰＲ−ヌルマウスを、ペントバルビトン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射によって麻酔し、直ちに肝臓を無カルシウムクレブス−リンゲルリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＫＲＰＢ）で流速１２ｍｌ／分で１０分間、その後１２ｍｌ／分の無カルシウムクレブス−リンゲル炭酸水素酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ＫＲＨＢ）で５分間、その後０．３ｍＭ塩化カルシウムを含む０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼを含むＫＲＨＢを１２ｍｌ／分で１０分間、肝門静脈を介して灌流した。次いで、取り出した肝組織の機械的破壊、ふるい絹での濾過、およびＫＲＨＢでの洗浄によって細胞懸濁液を産生した。
【００７５】
肝細胞の細胞培養
マウス肝細胞を、８．３％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（４１ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（４１μｇ／ｍｌ）、リン酸トリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ブロス（８．３％、ｖ／ｖ）、ヒドロコルチゾン２１−ヘミコハク酸（１０μＭ）、インスリン（１μＭ）、ヘミン（５μｇ／ｍｌ）、およびグルタミン（２４０μｇ／ｍｌ）を補足した完全ＬｅｉｂｏｗｉｔｚＬ１５（ＣＬ−１５）培地にて３７℃で成長させた。肝細胞を、６ウェルプレート上にウェルあたり８×１０5細胞の密度で播種し、３７℃で１日間インキュベートし、その後アデノウイルスベクターによってヒトシトクロムＰ４５０  ３Ａ４−ヒトシトクロムＰ４５０レダクターゼ融合遺伝子を感染させた。
【００７６】
Ａｄ−３Ａ４／ｒｅｄプラスミド構築およびウイルス調製
ヒトＰ４５０ｋ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）−Ｐ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）融合ｃＤＮＡは、隣接修飾ＣＹＰ３Ａ４およびＣＰＲコード配列を含んでいた。Ｋｏｚａｋ配列の後且つＡＴＧ開始コドンの直前へのＫｐｎＩ制限部位の挿入およびＴＧＡ終止コドンの欠失によってＣＹＰ３Ａ４配列のＮ末端を修飾した。第１の５７アミノ酸（ＥＲアンカー）のコード配列の欠失によってＣＰＲ配列を修飾し、ＮｏｔＩ制限部位によってＣ末端に隣接させた。ＣＹＰ３Ａ４−ＣＰＲ融合ｃＤＮＡを、シャトルベクターｐｓｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入し（図６を参照のこと）、ＡｄＥａｓｙＸＬアデノウイルスベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＡｄ−３Ａ４／ｒｅｄウイルスを調製した。
【００７７】
ウイルス感染および培養細胞における触媒活性の決定
ＡｄＥａｓｙＸＬアデノウイルスベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の方法にしたがって、肝細胞にＡｄ−３Ａ４／ｒｅｄアデノウイルスを感染させた。ウイルス感染から４日後、細胞培地を、２ｍｌの新鮮なＣＬ−１５＋ブフラロール（１０μＭ）またはミダゾラム（１０μＭ）と置換した。インキュベーションから０．５、１、２、および４時間後、２００μｌアリコートの培地を、質量分析の内部標準として５μＭデキストロルファンを含む２００μｌの氷冷アセトニトリルを含むエッペンドルフチューブに移した。
【００７８】
ブフラロール、ミダゾラム、および特定の代謝製品の質量分析
タンデム型質量分析器を備えた逆相ＨＰＬＣ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用してブフラロールおよびミダゾラムの喪失分析を行った。各標準およびサンプルのアリコート（２０μＬ）を、液体クロマトグラフィシステムに注入し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＭｅｒｃｕｒｙＭＳ  Ｌｕｎａ  ３μＭ  Ｃ１８（２）、２０×２ｍｍ  ＨＰＬＣカラムを使用した流速０．５ｍＬ／分での０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸を含む５０％Ｈ2Ｏおよび５０％アセトニトリルの定組成条件下で溶離した。
【００７９】
親化合物および特定のフラグメント製品の陽イオンを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン３．５を備えたＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｏｒｏｍｅｔｅｒを使用してＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ）モードでモニターした（ブフラロール親陽性イオンについては２６２．４１ｍ／ｚ、この場合の特定製品のイオンについては１８８．１２ｍ／ｚ；ミダゾラム親陽イオンについては３２６．３５ｍ／ｚ、この場合の特定製品のイオンについては２９１．２２ｍ／ｚ；および内部標準デキストロルファン親陽イオンについては２５８．４７ｍ／ｚ、この場合の特定製品のイオンについては１５７．２１ｍ／ｚ）。
【００８０】
特定の代謝製品１’−ヒドロキシブフラロールおよび１’−ヒドロキシミダゾラムの外観の分析を、上記と同様であるが、ＨＰＣＬカラムからの勾配溶離を使用して行い、１’−ヒドロキシブフラロール親陽イオンのＭＲＭは２７８．４ｍ／ｚ、この場合の特定の製品のイオンは１８６．２ｍ／ｚであり、１’−ヒドロキシミダゾラム親陽イオンのＭＲＭは３４２．３ｍ／ｚ、この場合の特定の製品のイオンは２０３．２ｍ／ｚである。
【実施例１】
【００８１】
条件付きＣＰＲノックアウトマウスの作製
ＣＰＲは、ＮＡＤＰＨ／フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）結合ドメインを含む多ドメインタンパク質である。Ｅ．ｃｏｌｉで発現させた場合、これらのドメインは折りたたまれて機能的ポリペプチドを形成し、ＦＡＤドメインの場合、多数の外来化合物の一電子還元を独立して触媒することができる。この理由のために、本発明者らは、ＣＰＲ遺伝子のエクソン３〜１６を対象とし、これら両ドメインが欠失された構築物を作製した（図１ａ）。この構築物を、胚幹細胞にトランスフェクトし、多数のマウス株を作製した。フロックス化ＣＰＲターゲティング構築物の正確な組み込みを、ＣＰＲlox/+マウスから単離したゲノムＤＮＡ（レーン１および５（９．２ｋｂ／８ｋｂのバンド））のサザン分析（図１ｂ）によって確認し、野生型マウス（ＣＰＲ+/+）から得たパターンをレーン２（８ｋｂのバンドのみ）に示す。Ｃｒｅリコンビナーゼが一過性に発現されるＥＳ細胞から作製したマウスのゲノムＤＮＡにより、第１と第３のｌｏｘＰ部位との間のＣＰＲ遺伝子が欠失された（図１ｂ）レーン６（ＣＰＲ+/-、８ｋｂ／３．２ｋｂのバンド））。フロックス化ＣＰＲ遺伝子座（ＣＰＲlox/lox）にホモ接合性のマウスまたは１つのフロックス化したマウスおよび１つの欠失ＣＰＲ遺伝子座（ＣＰＲlox/-）を、適切なマウス株の交配によって作製した。これらのマウス由来のゲノムＤＮＡのサザン分析を、レーン７および８（ＣＰＲlox/lox、９．２ｋｂのバンドのみ）およびレーン３および４（ＣＰＲlox/-、９．２ｋｂ／３．２ｋｂ）に示す。これらの後者のマウスは、明らかに完全に正常であり、野生型同腹子と異なる表現型を示さず、その成長および発達、血液の化学的性質、器官のサイズおよび構造、ならびに繁殖力が同一であった（データ示さず）。
【実施例２】
【００８２】
肝臓ＣＰＲヌルマウスの作製
ＣＰＲ対立遺伝子を不活化するＣｒｅリコンビナーゼの能力を試験するために、ＣＰＲlox/-を保有するマウスに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによってＣｒｅ発現が調節される改変アデノウイルスを注射した。ＡｄＣｒｅ１の単回静脈内注射から１週間後、肝臓ミクロソームの免疫ブロッティングおよび肝臓切片の免疫染色によって測定したところ肝臓ＣＰＲ発現が９５％を超えて減少した（示さず）。
【００８３】
ＣＰＲlox/loxマウスとラットアルブミンプロモーターによってＣｒｅ発現が調節された株との交配によってＣＰＲの特異的肝臓欠失を行った。ＣＰＲlox/+＋ＣｒｅALBと同定されたマウスを、ＣＰＲlox/loxマウスと戻し交配してＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALB株を作製するか、ＣＰＲヘテロ接合性ヌルと交配してＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスを作製した。ＣｒｅALB導入遺伝子の存在を、ＰＣＲによって決定した（データ示さず）。これらの交配のいずれから誕生した子孫は、親遺伝子型から予想したところメンデル比で見出され、発達中のＣｒｅ導入遺伝子の日和見性の発現から胚は死亡しないことを示す。
【００８４】
ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスおよびＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALBマウスは出生後にその野生型同腹子と明白な表現型の相違は示されなかった。これらの遺伝子型のマウスは正常に成長および発達した。新生児期にアルブミンプロモーターが活性化されたので、本発明者らは、６〜８週齢のマウスにおける肝臓ＣＰＲレベルを調査した。マウスがＣｒｅALB遺伝子型にヘテロ接合性であるので、３つの遺伝子型が予想される（すなわち、なし、１つ、または両方のＣＰＲが欠失された遺伝子型）。このことは実際に真であることが証明された。高い効率でのフロックス化対立遺伝子の欠失が認められた；１つのＣＰＲ対立遺伝子が欠失されたマウスでは、雄および雌の両方で半分のＣＰＲ発現および活性しか見出されなかった（図２ａ、肝臓、トラック２および３に対して４および５、トラック７および８に対して９および１０）。遺伝型ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBのマウスでは、免疫反応性ＣＰＲタンパク質バンドは、雄および雌の両方で本質的に存在せず（図２ａ、それぞれレーン１および６）、これらの動物の肝臓のミクロソーム画分がＣＰＲタンパク質をほとんど完全に欠くことを示す。図２に示す免疫ブロットの長期曝露（通常の１０倍超）の際、ＣＰＲの正確な分子量に対応する非常にわずかなバンドが認められた（示さず）。ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスにおける肝臓ＣＰＲ活性は、雄（９２．５％）および雌（９４．５％）の両方で９０％を超えて減少した（図２ｂ）。シトクロムｂ５レダクターゼ（おそらくＮＡＤＨからｐ４５０系に電子を伝達することができる酵素）の活性は変化しなかった（示さず）。ＣＰＲ免疫染色が切片全体に及ぶ野生型マウスと対照的に、ＣＰＲに対するポリクローナル抗血清で染色したＣＰＲ肝臓ヌルマウス由来の肝臓切片では、免疫反応性タンパク質を含む細胞はほとんど無く（図２ｃ）、以前に報告したように領域様式で静脈周囲領域により集中する傾向がある。遺伝子ストラテジーを使用したＣＰＲの欠失は、ＣＰＲ免疫染色を行っていない肝細胞がいかなるＣＰＲ活性も示すことができないことを意味する。肝臓ミクロソーム画分で認められる非常に低い残存ＣＰＲ活性は、肝細胞以外の細胞および／またはアルブミンプロモーター（したがってＣｒｅ発現）が不活性な細胞でのＣＰＲの連続発現に起因し得る。ＣＰＲ欠失の特異性を、両方の性のＣＰＲlox/+＋ＣｒｅALBマウス、ＣＰＲlox/+マウス、およびＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBマウスの腎臓でＣＰＲ発現の変化が認められないことを示すことによって証明した（図２ａ、腎臓；レーン３、４、および５（雄）ならびに８、９、および１０（雌））。約５０％のＣＰＲタンパク質レベルの減少が、たった１つのＣＰＲ対立遺伝子を失った子孫におけるＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスおよびＣＰＲlox/-マウスで認められた（図２ａ、レーン１および２（雄）ならびに６および７（雌））。さらに、タンパク質発現は、腎臓ミクロソーム画分におけるＣＰＲ活性を反映し（図２ｂ）、雄および雌両方のＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスはＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBマウスの約半分のＣＰＲ活性を示す。ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスおよびＣＰＲ+/+＋ＣｒｅALBマウス由来の腎臓および肺切片のＣＰＲ抗血清での免疫染色（図２ｃ）によってＣＰＲ欠失の組織特異的な性��をさらに確認し、両株で染色は同一であった。
【実施例３】
【００８５】
肝臓ＣＰＲヌルマウスの特徴づけ
肝臓ＣＰＲがヌルのマウスは、コントロールと明らかな表現型の相違は示さなかった。マウスは、その野生型対応物と同一の速度で成長し、生存率や挙動に変化はなかった。アンドロゲンおよびエストロゲンの代謝における肝臓Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ系の公知の活性にもかかわらず、ＣＰＲ肝臓ヌルマウスは野生型（ＣＰＲ+/+またはＣＰＲlox/lox）マウスと交配した場合に正常な繁殖力を示し、肝臓ホルモン代謝は繁殖力に影響を与えないことを示す。
【００８６】
より詳細な分析により、雄および雌の肝臓ＣＰＲヌルが共に肝腫脹を示し、野生型マウス（４％）と比較して体重（７．５％）に対して肝臓が約５０％増加することが示された。さらに、肝臓は血の気が無く、組織は雑色で脆い（図３ａ、ｃ）。顕微鏡試験により、小滴性および大滴性の脂肪変化の存在が明らかとなり、前者が優勢である（図３ｂ、プレートｉおよびｉｖに対してｉｉｉおよびｖｉｉ）。そうでなければ、中心領域（ｃｅｎｔｒｉｚｏｎａｌ）および門脈周囲領域の肝細胞は共に正常に出現し、肝細胞の増殖またはアポトーシスの明らかな増加は認められなかった。
【００８７】
ＳＲ１９（示さず）またはＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（図３ｂ、プレートｉｉおよびｖｉに対してｉｖおよびｖｉｉｉ）での染色によって証明されるように、肝臓ＣＰＲを欠くマウスの肝臓は、コレステロールおよびトリグリセリドの両方に関して高脂血症であった。肝臓コレステロールの増加は、胆嚢中の胆汁酸のほとんど完全な欠乏に付随した。この表現型の所見を、ＣＹＰ７Ａ１（コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ）などのＰ４５０の不活化（伝えられるところによれば胆汁酸生合成の律速21〜23）によって説明することができる。コレステロールの破壊が無い場合、本発明者らは、循環コレステロールが増加したと予想したが、正確には、その反対が認められ、血清コレステロールレベルが劇的に減少した（６５％超）（図３ｃ）。しかし、コレステロールホメオスタシスの調節は複雑であり、上記データは、ミクロソームＰ４５０系が循環コレステロールレベルの決定に重要な役割を果たすことを証明する。出生後死亡率を増大させるＣＹＰ７Ａ１の欠失が記載されている21が、血清コレステロールレベルは本質的に変化しない22。本研究で死亡率の増加が認められなかったという事実は、出生後に起こり、３〜４週間後にピークに達するというおそらくＣＰＲ欠失の条件付き性質に起因していた（示さず）。ＣＹＰ７Ａ-/-マウスが野生型マウスと類似の血清コレステロールレベルを有することが報告されており、肝臓ＣＰＲヌルマウスの肝臓コレステロールの蓄積が新規合成に起因する範囲を評価するために、これらのマウスに３ヶ月間まで無脂肪食を与えることに留意することは興味深い。これらの条件下では、肝臓および血清コレステロールの認められた変化は部分的に逆転しただけであった（データ示さず）。
【００８８】
通常の環境下では、肝臓中のコレステロール蓄積により、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ、ＨＭＧＣｏＡ合成酵素、およびスクアレン合成酵素、およびＬＤＬ受容体などの多数の重要な脂質生成遺伝子に対するステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）転写因子の作用の阻害によるコレステロール取り込みおよび生合成のフィードバック抑制が誘発される。ＳＲＥＢＰ１（７）の短縮「ドミナントポジティブ」形態を発現するトランスジェニックマウスが本明細書中で見出される類似の肝腫脹および肝臓脂質含有量の上昇を示すことに留意することが興味深い。しかし、これらのマウスは、本質的に正常な血清脂質の化学的性質を示した。
【００８９】
上記データにより、Ｐ４５０系は循環コレステロールレベルの調節においてさらなる重要な役割を果たし、これらの酵素の阻害により血清中のコレステロールが増加するよりもむしろ減少し得ることが示唆される。肝臓ＣＰＲヌルはまた、血清トリグリセリドの減少に対応して肝臓トリグリセリドレベルが顕著に増大することを証明した（図３ｃ）。ＣＹＰ４Ａタンパク質は脂肪酸代謝に関与するが26〜28、認められた著しい増加をこの活性が存在しないことによって説明することができる可能性は低く、脂質レベルの調節におけるＣＰＲおよび／またはＰ４５０系の潜在的に新規の機能が示される。しばしばＣＹＰ４Ａおよび脂肪酸蓄積に関連する肝臓ペルオキシソーム活性の不変が、肝臓ＣＰＲヌルで認められた（示さず）。直感に反して、コントロールと比較してレダクターゼヌルマウスの血清中の循環トリグリセリドレベルは、２５％（ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALB）および７０％（ＣＰＲlox/lox＋ＣｒｅALB）減少した（図３ｃ）。
【実施例４】
【００９０】
肝臓ＣＰＲヌルマウスのＰ４５０活性
肝臓Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性に対するＣＰＲ欠失の効果を決定するために、本発明者らは、テストステロンのミクロソーム水酸化を測定した（図４ａ）。ｐｍｏｌの代謝製品／ｎｍｏｌのＰ４５０で示す場合、雄および雌の両方で６β−ヒドロキシテストステロン形成（ＣＹＰ３Ａタンパク質に関連する活性）の９０％減少が測定され、この組織中のＣＰＲの欠如によりＰ４５０機能が著しく欠損することを示す。ＣＹＰ２ＡサブファミリーのＰ４５０によって行われたテストステロンの７α水酸化は雄および雌の両方で９９％を超えて減少し、１６β水酸化は両方の性の肝臓ＣＰＲヌルで検出不可能であった（図４ａ）。テストステロン代謝の著しい減少に加えて、ＣＰＲlox/-＋ＣｒｅALBマウスで７−メトキシレゾルフィンのＯ−脱アルキル化もほとんど完全に除去され、ｎｍｏｌの代謝製品／ｎｍｏｌのＰ４５０で示す場合、雄で９９．５％および雌で９８．５％減少した（示さず）。したがって、ＣＰＲの肝臓欠失により肝臓で複数のＰ４５０が不活化することが明らかである。
【００９１】
興味深いことに、肝臓ＣＰＲを欠くマウスは、シトクロムＰ４５０含有量が著しく増加する；オスで４５０％増加し、雌で５００％を超えて増加した（図４ｂ）。Ｐ４５０発現のこの大きな増加を、肝臓ミクロソームの異なる遺伝子ファミリー由来のＰ４５０に対する抗血清での免疫ブロッティングによってさらに証明した（図４ｃ）。一定の酵素（例えば、ＣＹＰ２ＢおよびＣＹＰ３Ａ遺伝子ファミリーのメンバー）については、誘導は非常に大きかった。実際、これらのＰ４５０は、強力な外因性Ｐ４５０インデューサーをマウスに投与した場合に認められたレベルと少なくとも同等のレベルに誘導された。肝臓免疫染色は、ＣＹＰ３Ａ  Ｐ４５０の発現が野生型マウスの静脈周囲または小葉中心領域に限定される一方で、ヌルマウスではＣＹＰ３Ａは高レベルで切片全体に局在することを明らかに示した（図４ｄ）。これらの新規且つ基本的な所見は、マウスＰ４５０系の性分化の媒介として同定された因子に加えて、内因性因子は肝臓シトクロムＰ４５０含有量に著しく影響を与え得ることを証明する。しかし、これがなぜ起こるかは不明である。Ｐ４５０活性の非存在下では、これらの酵素の基質である内因性誘導因子（例えば、糖質コルチコイド）が蓄積することができ、あるいは、Ｐ４５０の代謝回転が減少し得る。これについての論理的根拠は、ＣＰＲがヘムオキシゲナーゼへの電子供与体であり、トランスフェクトした細胞におけるＣＰＲ発現の増加によりＰ４５０レベルが減少するという所見に基づく。最後に、Ｐ４５０活性の非存在に対する新規の代償性調節応答が存在し得る。
【実施例５】
【００９２】
インビボ表現型
鎮痛薬パラセタモール（アセトアミノフェン）は、シトクロムＰ４５０によって反応性の高い肝毒性中間体Ｎ−アセチルベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）に活性化され、これはグルタチオンとの抱合によって解毒することができるが、圧倒的なこの不活化経路により肝毒性を示し、致命的結果を招く。これらの効果におけるＰ４５０系の役割を明白に証明するために、アセトアミノフェンを単回腹腔内用量で雄コントロールおよび肝臓ＣＰＲヌルマウスに投与した（図５ａ、ｂ）。コントロールでは、投与から１時間以内に肝臓グルタチオンが９０％減少するが（図５ａ）、ＣＰＲヌルではこのレベルは変化しないままであった。さらに、処置から２４時間後、野生型マウスは血清ＡＬＴの顕著な上昇（広範でおそらく致死的な肝臓損傷）を示すが、肝ＣＰＲ  ＡＬＴを欠くマウスでは変化しないままであった。
【００９３】
薬物代謝に関与するシトクロムＰ４５０は、体内組織全体に分布し、薬物代謝の有意な比率（３０％まで）が肝外であり得ると推定されている。肝外代謝レベルおよび薬物動態に対する肝臓ＣＰＲヌルのインビボ効果を試験するために、本発明者らは、バルビツール酸誘導性睡眠時間を測定した。この方法は、薬物代謝活性の指標として１９６０年代から使用されている。コントロールでは、ペントバルビトンの投与（２０ｍｇ／ｋｇ）では睡眠を誘導することができなかったが、遺伝子型ＣＰＲ3lox/-＋ＣｒｅALBまたはＣＰＲ3lox/3lox＋ＣｒｅALBの肝臓ＣＰＲを欠くマウスでは、２時間を超えて睡眠した。ＣＰＲヘテロ接合性ヌルマウス（ＣＰＲ+/-）（すなわち、１つのＣＰＲ対立遺伝子を欠き、それによりＣＰＲ活性が約５０％低い）のペントバルビトン処置により、平均睡眠時間が約５０分になり、明確な遺伝子−投薬量効果を示し、このＣＰＲ活性がこの基質の代謝についてインビボで律速でもある。上記の薬物応答の顕著な変化は、肝外代謝がこの化合物の動態の重要でない役割しか果たさないことを示す。データはまた、シトクロムｂ５／ｂ５レダクターゼを介したＮＡＤＨからのＰ４５０の潜在的な別の電子伝達経路が小さな役割しか果たさない（あるとすれば、薬物動態）ことを示す。
【００９４】
本発明の動物の最も興味深い態様の１つは、１つの遺伝子の欠失によって、組織特異的様式で多遺伝子ファミリー全体の機能が除去されたことである。肝臓の場合、Ｐ４５０系全体が本質的に不活化され、それにより胆汁酸産生および薬物代謝が顕著に減少した。肝臓表現型にもかかわらず、肝臓ＣＰＲヌルマウスが生存し（１８ヶ月超）、正常に繁殖した。この並外れた所見は、成体の肝臓Ｐ４５０系が生命に不可欠ではなく、さらに哺乳動物の有毒な環境要因からの保護でその役割を強調することを意味する。現在、ステロイドホルモンなどの内因性分子の肝臓代謝は、内因性ホルモンのホメオスタシスであまり重要でないようである。しかし、Ｐ４５０系は、脂質ホメオスタシスおよび肝臓脂質レベルの調節で主要な役割を果たす。本発明の動物、これら由来の組織および／または細胞、その産生方法、ならびに前記の全ての使用により、最終的に基本的問題（その多くが数十年間未解決である）に取り組むことが可能である。
【実施例６】
【００９５】
肝臓ＣＰＲ−ヌルマウス由来の単離肝細胞におけるヒトシトクロムＰ４５０３Ａ４活性の発現
この研究では、肝臓ＣＰＲ−ヌルマウス由来の単離肝細胞に、ＣＭＶプロモーターの調節下でヒトシトクロムＰ４５０  ３Ａ４−シトクロムＰ４５０レダクターゼ融合遺伝子を保有するアデノウイルスを感染させた。これにより、感染肝細胞でヒトＰ４５０  ３Ａ４活性が発現され、「ヒト化」代謝系の基本としてＣＰＲ−ヌル動物由来の細胞を使用することができることを示す。
【００９６】
肝臓ＣＰＲ−ヌル肝細胞Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ活性に対するヒト組換えＣＹＰ３Ａ４／レダクターゼの効果を決定するために、ミダゾラムおよびブフラロールを使用してＣＹＰ３Ａ４の触媒活性を測定し、添加した薬物の消滅およびＡｄ−３Ａ４／ｒｅｄ融合ベクターで感染させたか感染させていない野生型マウス由来の肝細胞および肝臓ＣＰＲ−ヌルマウス由来の肝細胞中の代謝製品１’ヒドロキシ−ミダゾラムおよび１’ヒドロキシ−ブフラロールの蓄積をモニターした。インキュベーションから４時間後に、ミダゾラムとインキュベートした肝臓ＣＰＲ−ヌルマウス由来の肝細胞培養物中の１’ヒドロキシ−ミダゾラム濃度は、野生型マウス由来の培養物中で産生されたものの約２５％に過ぎなかった。しかし、図７に示すグラフで認められるように、Ａｄ−３Ａ４／ｒｅｄを感染させたＣＰＲ−ヌルマウス由来の培養物は、野生型動物より約３倍の１’ヒドロキシ−ミダゾラムを産生した。図８から明らかなように、ミダゾラムの消滅に対応する効果が認められた。
【００９７】
同様に、ブフラロールとの４時間のインキュベーションにより、肝臓ＣＰＲ−ヌルマウス由来の肝細胞中の１’ヒドロキシ−ブフラロール濃度は野生型マウス由来の培養物で産生されたものの約１０％のみであり、Ａｄ−３Ａ４／ｒｅｄを感染させたＣＰＲ−ヌルマウス由来の培養物中の１’ヒドロキシ−ブフラロールの濃度は野生型動物由来のものの約６５％であった（図９）。図１０のグラフで認められるように、ブフラロール消滅の対応する効果が認められた。
【００９８】
これらの結果は、ＣＹＰ３Ａ４−ＣＰＲ融合タンパク質の発現はシトクロムＰ４５０が介在する代謝をＣＰＲ−ヌル動物由来の肝細胞に戻し、さらに、ミダゾラムおよびブフラロール代謝に関する異なる程度の機能回復によって示されるように、これの少なくともいくつかがヒトシトクロムＰ４５０  ３Ａ４活性の発現に起因することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】マウスＣＰＲ遺伝子のターゲティングを示す図である。
【図２】肝臓ＣＰＲヌルマウスにおけるＣＰＲの肝臓特異的欠失を示す図である。
【図３】肝臓ＣＰＲヌル表現型の特徴づけを示す図である。
【図４】肝臓ＣＰＲヌルマウスにおけるＣＰＲおよびＰ４５０発現を示す図である。
【図５】肝臓ＣＰＲヌルマウスの薬物処置を示す図である。
【図６】シャトルベクターｐｓｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶのＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ部位にライゲーションしたｐｓｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−３Ａ４（ヒトＰ４５０レダクターゼｃＤＮＡ（第１の５７アミノ酸欠失コドン）との全長ヒトＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡ融合）を示す図である。
【図７】ミダゾラム代謝時のマウス肝細胞による１’ヒドロキシ−ミダゾラム産生を示す図である。
【図８】マウス肝細胞によるミダゾラム代謝時のミダゾラム濃度を示す図である。
【図９】ブフラロール代謝時のマウス肝細胞による１’ヒドロキシ−ブフラロール産生を示す図である。
【図１０】マウス肝細胞によるブフラロール代謝時のブフラロール濃度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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