(57)【要約】本発明の一態様において、異なる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸のライブラリーをスクリーニングして細胞または生物体の表現形質を変化させるキメラタンパク質を同定する。キメラタンパク質は特定の標的遺伝子または経路に対する先知識がなくても同定できる。あるキメラタンパク質は多数のジンクフィンガードメインを含み、たとえば、熱抵抗性、溶媒抵抗性、変化した細胞成長度、インシュリン生産、分化および薬剤抵抗性を誘導できる。
2005511049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工転写因子をコーディングする異種核酸を含む変形細胞であって、前記人工転写因子は、前記変形細胞と実質的に同じであり、かつ異種核酸および人工転写因子を欠く対照細胞に比べて変形細胞にストレス抵抗性を与える、変形細胞。
【請求項２】
前記人工転写因子が２つのジンクフィンガードメインを含む請求項１記載の変形細胞。
【請求項３】
前記細胞が細菌細胞である請求項１記載の変形細胞。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞である請求項１記載の変形細胞。
【請求項５】
前記ストレス抵抗性が、熱抵抗性、溶媒抵抗性、重金属抵抗性、浸透圧抵抗性、極限ｐＨ抵抗性、化学物質抵抗性、寒さ抵抗性、遺伝子毒性製剤抵抗性および放射能抵抗性の形質のうち一つ以上を含む請求項２記載の変形細胞。
【請求項６】
前記変形細胞が、人工転写因子を発現し、人工転写因子を欠く実質的に同一の培養細胞に比べて増大したストレス抵抗性を示すことを特徴とする請求項１記載の変形細胞。
【請求項７】
請求項１記載の変形細胞を提供する段階；
前記変形細胞を人工転写因子が生産される条件下で保持する段階；および
人工転写因子以外の、培養された細胞によって生産された生成物を回収する段階を含む、細胞生成物の生産方法。
【請求項８】
前記変形細胞が人工転写因子以外の異種タンパク質をコーディングする核酸を含み、前記生成物が異種タンパク質である請求項７記載の生産方法。
【請求項９】
前記生成物が代謝産物または内生（endogenous）タンパク質である請求項７記載の生産方法。
【請求項１０】
前記変形細胞が異種タンパク質をコーディングする第２核酸をさらに含み、前記異種タンパク質が代謝産物の生産に関与することを特徴とする請求項８記載の生産方法。
【請求項１１】
前記変形細胞が２０℃〜４０℃に保たれることを特徴とする請求項７記載の生産方法。
【請求項１２】
前記変形細胞が、人工転写因子を欠く実質的に同一細胞の成長を抑制する条件下で保持されることを特徴とする請求項７記載の生産方法。  
【請求項１３】
前記人工転写因子がジンクフィンガードメインを含むことを特徴とする請求項７記載の生産方法。
【請求項１４】
前記ジンクフィンガードメインが、表１５に記載されたジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基に相応するＤＮＡ接触残基の集合を含むことを特徴とする請求項１３記載の生産方法。
【請求項１５】
前記人工転写因子が少なくとも３つのジンクフィンガードメイン配列を含み、前記配列の各ジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基が表１５の列に記載された任意の３つの連続するジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基に各々相応することを特徴とする請求項１４記載の生産方法。
【請求項１６】
前記ストレス抵抗性が、熱抵抗性、溶媒抵抗性、重金属抵抗性、浸透圧抵抗性、極限ｐＨ抵抗性、化学物質抵抗性、寒さ抵抗性および放射能抵抗性のうち一つ以上を含む請求項７記載の生産方法。
【請求項１７】
標的タンパク質をコーディングする遺伝子、および前記人工キメラタンパク質をコーディングする配列を含む異種核酸を含み、前記人工キメラタンパク質が（１）異種核酸を含まない細胞に比べて細胞のタンパク質生産量を増加させ、また（２）標的タンパク質をコーディングする遺伝子の転写を直接的に調節する転写調節領域に結合していない細胞。
【請求項１８】
前記人工キメラタンパク質が２つのジンクフィンガードメインを含み、ＤＮＡに結合することを特徴とする請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が真核細胞であり、人工キメラタンパク質がゲノム（genomic）ＤＮＡ部位に結合するためにＰＢ０８、Ｋ＿Ｆ０２またはＫ＿Ｄ１０と競争することを特徴とする請求項１７記載の細胞。
【請求項２０】
前記人工キメラタンパク質が細胞の細胞周期進行速度を変化させる請求項１７記載の細胞。
【請求項２１】
前記遺伝子が内生遺伝子である請求項１７記載の細胞。
【請求項２２】
（１）人工転写因子を含まない細胞に比べて真核細胞による標的タンパク質の生産量を増加させ、また（２）標的タンパク質をコーディングする遺伝子の転写を直接的に調節する転写調節領域に結合しない人工転写因子。
【請求項２３】
複数のジンクフィンガードメインを含み、真核細胞において細胞周期進行速度を変化させる人工転写因子。
【請求項２４】
請求項１７に記載の細胞を提供する段階；および
前記人工キメラタンパク質が細胞の異種核酸を含まない細胞に比べて標的タンパク質の生産量を増加させる条件下で、前記細胞を保持する段階を含むタンパク質生産方法。
【請求項２５】
前記タンパク質が分泌タンパク質である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
分泌タンパク質をコーディングする内生遺伝子および人工転写因子をコーディングする配列を含む異種核酸を含む細胞であって、前記人工転写因子が異種核酸を含まない細胞に比べて細胞の分泌タンパク質の生産量を増加させる細胞。
【請求項２７】
前記細胞が真核細胞であり、分泌タンパク質がインシュリンである請求項２６記載の細胞。
【請求項２８】
前記人工転写因子が、０８＿Ｄ０４＿ｐ６５が特異的に結合する内生ＤＮＡ部位に特異的に結合することを特徴とする請求項２６記載の細胞。
【請求項２９】
前記人工転写因子が、内生ＤＮＡ部位に特異的に結合し、内生ＤＮＡ部位に結合するために０８＿Ｄ０４＿ｐ６５と競争する請求項２６記載の細胞。
【請求項３０】
前記人工転写因子が下記のアミノ酸配列を含む請求項２６記載の細胞：
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４５）；またはＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４６）
（ここで、Ｂはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｊは疎水性アミノ酸である。）
【請求項３１】
請求項２４記載の細胞を提供する段階；および
前記異種核酸を含まない細胞に比べて前記人工転写因子が細胞のインシュリン生産量を増加させる条件下で細胞を保持する段階を含むインシュリン生産方法。
【請求項３２】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子であって、前記人工転写因子がないときは内生インシュリン遺伝子を発現しない哺乳動物細胞において内生インシュリン遺伝子の発現を誘導する人工転写因子。
【請求項３３】
人工転写因子をコーディングする核酸を含まない同一細胞に比べて毒性物質に対する細胞の感受性を変化させる人工転写因子。
【請求項３４】
人工転写因子をコーディングする核酸を含み、発現する細胞であって、前記人工転写因子が前記核酸を含まない同一細胞に比べて毒性物質に対する細胞の感受性を変化させる細胞。
【請求項３５】
前記毒性物質が薬剤（drug）である細請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
前記感受性が増加する請求項３４記載の細胞。
【請求項３７】
前記感受性が減少する請求項３４記載の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、真菌細胞である請求項３４記載の細胞。
【請求項３９】
前記毒性物質がケトコナゾールである請求項３８記載の細胞。
【請求項４０】
前記人工転写因子が３つのジンクフィンガードメインを含む請求項３４記載の細胞。
【請求項４１】
前記人工転写因子が、内生ＤＮＡ部位に結合し、前記内生ＤＮＡ部位に結合するために、表５に記載されたジンクフィンガータンパク質と競争することを特徴とする請求項３９記載の細胞。  
【請求項４２】
細胞において、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２Ｃ、ＹＬＬ０５３ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗのタンパク質の発現または活性を７０％以上同等に変化させることを含む、真菌細胞の薬剤抵抗性を変化させる方法。
【請求項４３】
複数の核酸を含む核酸ライブラリーであって、複数の核酸のうち各核酸が少なくとも３つのジンクフィンガードメインの配列を含むキメラタンパク質をコーディングし、ここで、少なくとも２つのジンクフィンガードメインは天然型タンパク質では互いに隣接して現れない、核酸ライブラリーを提供する段階；
前記ライブラリーの構成員（member）を試験細胞の複製物に導入して形質転換細胞を得る段階；
前記形質転換された細胞を毒性物質の存在下で培養する段階；および
前記毒性物質に対する感受性が試験細胞に比べて変化した細胞を、前記形質転換された細胞から同定する段階を含む、
毒性物質に対する細胞の感受性を変化させる人工キメラタンパク質の同定方法。
【請求項４４】
前記試験細胞が真菌細胞であり、前記毒性物質が抗真菌製剤である請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記試験細胞が癌細胞であり、前記毒性物質が抗分裂製剤（anti-mitotic agent）である請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸によってコーディングされるキメラタンパク質が転写調節ドメインを含む請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
選択された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質のジンクフィンガードメイン配列を含むが、同定された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質の転写調節ドメインは含まない第２のキメラタンパク質をコーディングする核酸を製作する段階をさらに含む請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
（ｉ）前記選択された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質のジンクフィンガードメイン配列、および（ｉｉ）同定された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質の転写調節ドメインでない転写調節ドメインを含む、第２のキメラタンパク質をコーディングする核酸を製作する段階をさらに含む請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
３つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子をコーディングする配列を含み、前記人工転写因子の発現が少なくとも一つの脊椎動物細胞において神経細胞の表現型を誘導する核酸。
【請求項５０】
前記ジンクフィンガードメインのうち、少なくとも一つが下記の配列を有する請求項４９記載の核酸：
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５０）
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５１）；または
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５２）
（ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり；Ｘｂは疎水性アミノ酸である。）
【請求項５１】
前記人工転写因子が下記の配列を含む請求項５０記載の核酸：
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５３）  
（ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり；Ｘｂは疎水性アミノ酸である。）
【請求項５２】
請求項４４記載の核酸を含む脊椎動物細胞を提供する段階；および
前記脊椎動物細胞を、人工転写因子が生産され、神経突起の形成が誘導される条件下で培養する段階を含む、脊椎動物細胞において神経突起の形成を誘導する方法。
【請求項５３】
前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
前記脊椎動物細胞が人工転写因子を生産する前の幹細胞である請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
３つのジンクフィンガードメインからなる人工転写因子をコーディングする配列を含み、前記人工転写因子の発現が少なくとも一つの脊椎動物細胞において骨細胞形成（osteogenesis）を誘導する核酸。
【請求項５７】
前記ジンクフィンガードメインの少なくとも一つが下記の配列を有する請求項５６記載の核酸：
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５４）；
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５５）；
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５６）；または
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５７）
（ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり；Ｘｂは疎水性アミノ酸である。）
【請求項５８】
前記人工転写因子が下記のアミノ酸配列を含む請求項５７記載の核酸：  
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５８）
（ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり；Ｘｂは疎水性アミノ酸である。）
【請求項５９】
請求項４４記載の核酸を含む脊椎動物細胞を提供する段階；および
前記脊椎動物細胞を、人工転写因子が生産され、骨細胞形成が誘導される条件下で培養する段階を含む、脊椎動物細胞において骨細胞形成を誘導する方法。
【請求項６０】
複数のジンクフィンガードメインを含み、幹細胞の分化能力を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸および幹細胞を提供する段階；
前記核酸を幹細胞に導入する段階；および
前記人工転写因子が生産され、前記幹細胞の分化能力を変化させる条件下で前記幹細胞を保持する段階を含む、幹細胞の分化能力を変化させる方法。
【請求項６１】
前記人工転写因子が幹細胞の分化を誘導することを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記人工転写因子が幹細胞の自家複製（self-renewal）能力を増大させることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記幹細胞が胚性幹細胞である請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
前記幹細胞が脊椎動物幹細胞または植物幹細胞である請求項６０記載の方法。
【請求項６５】
前記幹細胞が造血幹細胞（hematopoietic stem cell）、神経前駆細胞（neuronal progenitor cell）または筋肉前駆細胞（muscular progenitor cell)である請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
各々少なくとも２つのジンクフィンガードメイン、および転写を活性化または抑制する調節ドメイン配列を含む異なる人工転写因子をコーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
所定の形質（trait）を有する細胞を提供する段階；
前記核酸ライブラリーの構成員を前記細胞内に導入する段階；
前記所定の形質を変化させるライブラリーの構成員を同定する段階；および
前記同定された構成員のジンクフィンガードメイン配列は含むが、同定された構成員の調節ドメインと同一の調節ドメインは含まないＤＮＡ結合ポリペプチドをコーディングする配列を含むコーディング核酸を製造する段階を含む、人工転写因子の同定方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、同定された構成員の調節ドメインを有しない請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、同定された構成員の調節ドメインに比べて突然変異された調節ドメインを含む請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、同定された構成員の調節ドメインと反対の機能を果たす調節ドメインを含む請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞に前記コーディング核酸を導入し、前記細胞の所定形質を評価することをさらに含む請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
前記同定段階が、所定の環境条件に対する抵抗性；分化；逆分化；増殖；アポトーシス（apoptosis）；血清−独立性（serum-independence）；病原体抵抗性；および病原体感受性からなる群から選ばれる特性を有する細胞を同定することを含む請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
複数の第１核酸および第２核酸を複数含み、ここで、
（ａ）複数の第１核酸の各々が少なくとも２つのジンクフィンガードメインおよび転写を活性化する第１の機能ドメインを含む人工キメラタンパク質をコーディングし、
（ｂ）複数の第２核酸の各々が少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含み、第１の機能ドメインは含まない人工キメラタンパク質をコーディングする、核酸ライブラリー。
【請求項７３】
前記複数の第２核酸の各々によってコーディングされる人工キメラタンパク質が前記第１の機能ドメインとは異なる第２の機能ドメインを含む請求項７２記載の核酸ライブラリー。
【請求項７４】
前記第１の機能ドメインが活性化ドメインであり、前記第２の機能ドメインが抑制ドメインである請求項７２記載の核酸ライブラリー。
【請求項７５】
前記第１の機能ドメインが活性化ドメインであり、前記第２の機能ドメインが第１の活性化ドメインと異なる効率の活性化ドメインである請求項７３記載の核酸ライブラリー。
【請求項７６】
前記第１の機能ドメインがヒストン脱アセチル化酵素（deacetylase）ドメインである請求項７２記載の核酸ライブラリー。
【請求項７７】
請求項７２記載の核酸ライブラリーを提供する段階；
前記所定の形質を有する細胞に核酸ライブラリーの構成員を導入する段階；および
前記所定の形質を変化させるライブラリー構成員を同定する段階を含む、複数のキメラタンパク質の同定方法。
【請求項７８】
発現されると試験細胞の所定の形質を変化させる第１の人工キメラタンパク質をコーディングする核酸を含む試験細胞の複製細胞を提供する段階；
２つのジンクフィンガードメインを含む異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする、複数の核酸を含む核酸ライブラリーの構成員を各複製細胞に導入する段階；および
前記各複製細胞がライブラリーの第１の構成員によってコーディングされるキメラタンパク質および導入された前記核酸ライブラリーの構成員によってコーディングされる第２のキメラタンパク質を発現する複製細胞をスクリーニングして所定の形質がさらに変化した細胞を同定する段階を含む、複数のキメラタンパク質の同定方法。
【請求項７９】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む各々の異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする、複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
細胞の所定の形質を変化させる前記ライブラリーの第１および第２の構成員を同定する段階；および
前記同定された第１および第２のライブラリー構成員によって各々コーディングされる第１および第２のポリペプチドを発現する細胞を製造する段階を含む、変形細胞の製造方法。
【請求項８０】
前記同定段階が、細胞複製物に前記核酸ライブラリーの構成員を導入して形質転換細胞を提供し、所定の形質が変化した第１および第２の細胞を同定することを含む請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記製造された細胞に対して前記所定形質を評価する段階をさらに含む請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞の製造段階が、前記第１のポリペプチドをコーディングする第１の遺伝子および前記第２のポリペプチドをコーディングする第２の遺伝子を細胞に導入することを含む請求項７９記載の方法。
【請求項８３】
前記第１および第２の遺伝子が同一核酸の成分（components）である請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞の製造段階が、前記第１のポリペプチドをコーディングする第１の遺伝子を含む第１の細胞を、前記第２のポリペプチドをコーディングする第２の遺伝子を含む第２の細胞と融合することを含む請求項７９記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
所定の形質を有する細胞に前記核酸ライブラリーの構成員を導入する段階；
前記所定の形質を変化させるライブラリーの構成員を同定する段階；および
下記の変異体またはキメラタンパク質を各々コーディングする複数の核酸を含む第２のライブラリーを製作する段階を含む、キメラタンパク質の同定方法：  
（１）１〜６個のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって、前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質と区別される変異体、
（２）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質のジンクフィンガードメインおよび追加のジンクフィンガードメインを含み、前記追加のジンクフィンガードメインが第２のライブラリーの構成員の間で多様に変化するキメラタンパク質、
（３）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の変異体であって、他のジンクフィンガードメインで置換されたジンクフィンガードメイン位置の下位集合（subset）および前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の相応する位置にあるジンクフィンガードメインと同一な少なくとも一つの不変ジンクフィンガードメインを有する変異体、または
（４）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の変異体であって、前記第２のライブラリーの構成員のうち、一つ以上のジンクフィンガードメインの位置が、前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質内の位置における特定のドメインがその位置における他のジンクフィンガードメインよりも高い頻度で現れるように変化させた変異体。
【請求項８６】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを各々含む異なる人工転写因子を各々コーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
前記ライブラリーの構成員を試験細胞の複製物に導入して複数の形質転換細胞を提供する段階；
前記形質転換細胞を人工転写因子が発現される条件下で保持する段階；
前記複数の形質転換細胞から、試験細胞に比べて変化した表現型を有する複数の表現型変換細胞（phenotypically altered cell）を同定する段階；
前記複数の各表現型変換細胞内の転写体（transcripts）またはタンパク質の量をプロファイリング（profiling）して各表現型変換細胞のプロファイルを提供する段階；および
前記プロファイルを互いに比較して、前記複数細胞のうち少なくとも２つの表現型変換細胞においてその量が試験細胞に比べて同じように変化した一つ以上の転写体またはタンパク質を同定する段階を含む、
人工転写因子の標的（target）を同定する方法。
【請求項８７】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子であって、前記人工転写因子が発現されない対照細胞に比べて細胞の表現形質を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む異種核酸を含む変形細胞を提供する段階；
前記変形細胞における発現が前記対照細胞に比べて変化した標的遺伝子を同定する段階；および
前記異種核酸を含み、前記人工転写因子を発現し、標的遺伝子の活性が変化した試験細胞の表現形質を評価する段階を含む、
細胞の評価方法。  
【請求項８８】
前記標的遺伝子の活性が遺伝子突然変異によって変化する請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記標的遺伝子の活性が二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはリボザイムによって変化する請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
前記標的遺伝子の活性が標的遺伝子の過発現によって変化する請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子であって、前記人工転写因子が発現されない対照細胞に比べて細胞の表現形質を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む異種核酸を含む変形細胞を提供する段階；
前記ライブラリー核酸を変形細胞の複製物に導入する段階；および
前記人工転写因子による表現形質の変化を減少させるライブラリー核酸を同定する段階を含む、
人工転写因子を評価する方法。
【請求項９２】
前記ライブラリー核酸がｃＤＮＡライブラリー核酸を含む請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記ライブラリー核酸が、異なる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸を含む請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
前記異なる人工キメラタンパク質が、異なるジンクフィンガードメインを含む請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含むが、少なくとも一つのジンクフィンガードメインが天然型タンパク質から由来することを特徴とする、異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
所定の形質を有する細胞に前記核酸ライブラリー構成員を導入する段階；および
前記所定の形質を変化させるライブラリー構成員を有する細胞を同定する段階を含む、
キメラタンパク質の同定方法。
【請求項９６】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする複数の核酸を含むが、前記複数核酸のうち少なくとも一つの構成員の少なくとも一つのジンクフィンガードメインが表１に記載されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする核酸ライブラリーを提供する段階；  
前記核酸ライブラリー構成員を所定の形質を有する細胞に挿入する段階；および
前記ライブラリー構成員が前記所定の形質を変化させた細胞を同定する段階を含む、
キメラタンパク質の同定方法。
【請求項９７】
（１）核酸によってコーディングされるポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインが各々天然型タンパク質由来のジンクフィンガードメインであるが、（ｉ）同じ天然型タンパク質では同時に現れず、または（ii）同じ天然タンパク質では前記ポリペプチドにおける配列とは異なり、（２）前記第１のジンクフィンガードメインが複数の核酸の間で多様に変化し、（３）前記第２のジンクフィンガードメインが複数の核酸の間で多様に変化する、第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を含む複数の細胞を含む細胞ライブラリーを提供する段階；
対照細胞と表現型が異なるライブラリー細胞を同定する段階；および
前記同定されたライブラリー細胞から核酸を回収する段階を含む、
キメラタンパク質の同定方法。
【請求項９８】
人工転写因子を生産する細胞において異種の過発現されたタンパク質の溶解度を改善する人工転写因子をコーディングする単離された核酸。
【請求項９９】
前記人工転写因子が複数のジンクフィンガードメインを含む請求項９８記載の核酸。
【請求項１００】
前記細胞が細菌細胞である請求項９８記載の核酸。
【請求項１０１】
前記タンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項９８記載の核酸。
【請求項１０２】
前記タンパク質がＡＫＴタンパク質を含む請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０３】
前記複数のジンクフィンガードメインがＱＳＴＲ−ＤＳＡＲ−ＲＤＨＴ−ＷＳＮＲまたはＶＳＴＲ−ＤＧＮＶ−ＱＳＮＲ−ＱＳＮＫドメインを含む請求項９９記載の核酸。
【請求項１０４】
請求項９８〜１０３のいずれか一項に記載の異種核酸を含む変形細胞。
【請求項１０５】
異種標的タンパク質をコーディングする配列を含む第２核酸を含む請求項１０４に記載の変形細胞を提供する段階；および
前記変形細胞を人工転写因子および異種標的タンパク質が生産される条件下で保持する段階を含む、  
異種標的タンパク質の生産方法。
【請求項１０６】
前記変形細胞が培養細胞である請求項１０５記載の方法。
【請求項１０７】
前記変形細胞が対象（subject）内に存在する請求項１０５記載の方法。
【請求項１０８】
請求項１に記載の変形細胞を提供する段階；
前記変形細胞を人工転写因子が生産される条件下で保持する段階；および
前記培養細胞から生産された人工転写因子でない産物を回収する段階を含む、
細胞産物の生産方法。
【請求項１０９】
少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む異なる人工キメラタンパク質を各々コーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；
所定の形質を有する第１の細胞に前記核酸ライブラリー構成員を導入して形質転換された細胞を提供する段階；
前記形質転換された細胞から、前記ライブラリー構成員が所定の形質を変化させた細胞を同定する段階；
前記同定、変化された細胞から核酸ライブラリー構成員を回収する段階；
前記所定の形質外の表現形質が第１の細胞と異なる第２の細胞に前記核酸ライブラリー構成員を挿入する段階；および
前記核酸ライブラリー構成員を含み、該核酸ライブラリー構成員がコーディングする人工キメラタンパク質を発現する第２の細胞を評価する段階を含む、
第１の細胞から第２の細胞に変化した形質を転移させる方法。
【請求項１１０】
前記第１および第２の細胞が真核細胞である請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
前記第１および第２の細胞が酵母細胞である請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
前記第１および第２の細胞が哺乳動物細胞である請求項１１０記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１および第２の細胞の増殖特性が異なる請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
前記第１細胞が癌細胞であり、前記第２の細胞が非癌細胞（non-cancerous）である請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
前記評価された第２の細胞が所定の形質が変化したかどうかによって評価される請求項１０９記載の方法。
【請求項１１６】
配列番号：２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２６０，２６２および２６４からなる群から選ばれたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１１７】
請求項１１６のポリペプチドをコーディングする核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項１１８】
３つのジンクフィンガードメインから構成され、その発現が少なくとも一つの真核細胞のウイルス複製、ウイルス生産およびウイルス感染性からなる群から選ばれた特性を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸。
【請求項１１９】
３つのジンクフィンガードメインを含み、その発現が真核細胞と共同培養されるか、真核細胞によって調節された（conditioned）培地で培養された幹細胞を調節する真核細胞の能力を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸。
【請求項１２０】
３つのジンクフィンガードメインを含み、その発現が分泌されたタンパク質をグリコシル化させる哺乳動物細胞の能力を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸。
【請求項１２１】
前記分泌されたタンパク質が少なくとも一つの免疫グロブリン（immunoglobulin）可変ドメインを含む異種タンパク質である請求項１２０記載の核酸。
【請求項１２２】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１２０記載の核酸。
【請求項１２３】
３つのジンクフィンガードメインを含み、その発現が外生（exogenous）核酸を受け入れる細胞の能力を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
多くの遺伝子は、通常プロモーターまたはエンハンサー領域内にある該遺伝子内の特定のＤＮＡ部位に結合するポリペプチド転写因子による転写水準で調節される。これらのタンパク質は、プロモーター部位でＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を活性化または抑制することによって標的遺伝子の発現を調節する。活性化因子（activator）であるかまたは抑制因子（repressor）であるかにかかわらず多くの転写因子は、構造的に単位モジュール性（module）を有する。そのような単位モジュールは、構造的に別個のドメインとしてフォールディングが可能であり、ＤＮＡ結合、二量化（dimerization）または転写機構（transcriptional machinery）との相互作用のような特定の機能を有する。活性化ドメインまたは抑制ドメインのようなエフェクター（effector）ドメインは、異種転写因子のＤＮＡ−結合ドメインに連結されてもその機能を維持する（BrentおよびPtashne, (1985) Cell 43:729-36;Dawson et al., (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31）。
【０００２】
人工転写因子は、ジンクフィンガードメイン（zinc finger domain）のキメラタンパク質として製作できる。たとえば、ＷＯ０１／６０９７０（Kimら）は、ジンクフィンガードメインの特異性を決定する方法と特定の標的部位を認識する人工転写因子の製作方法を開示している。人工転写因子の適用の一つとして、特定の標的遺伝子の発現を変化させることが挙げられる。標的部位は標的遺伝子の調節領域で同定され、人工転写因子は少なくとも一つの標的部位を認識するように操作される。このような人工転写因子が細胞内に導入されると、これらは該当する標的部位に結合して転写を調節する。標的遺伝子の発現を調節するこのような方法はしばしば転写因子を同定するための「標的−誘導（target-driven）」接近法として引用されている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明の一態様において、本発明は次の段階を含む方法を特徴とする：（１）第１および２の結合ドメインを含む人工キメラポリペプチドを発現する異種核酸を有する細胞を複数含むライブラリーであって、この際、第１および２の結合ドメインは互いに異種であり、複数の細胞の各構成員の第１および第２の結合ドメインは他の構成員のものと異なることを特徴とするライブラリーを提供する段階；および（２）対照細胞に比べて異なる形質を有する細胞を前記ライブラリーから同定する段階。結合ドメインは、たとえば、ジンクフィンガードメインのように独立的にフォールディング（folded）されたモジュールであり得る。多くの実施態様において、結合ドメインはＤＮＡ結合ドメインであり、対照細胞は一般的に核酸ライブラリーを含まないか、対照核酸を含む細胞である。対照細胞はライブラリーが作られた母細胞であるか、またはその誘導細胞である。
【０００４】
特定の形質は、観察、選抜、推論および／または定量できる、測定可能なすべての表現形質である。本発明に用いられるキメラタンパク質は、互いに異種である少なくとも２つの結合ドメインを含む。２つの結合ドメインは異なる天然型タンパク質から由来し得る。２つの領域は同じ天然型タンパク質から由来することもあるが、キメラタンパク質においては該当する天然型タンパク質とは異なる配列に位置する。
【０００５】
多くの実施態様において、細胞はレポーター遺伝子を含まない。すなわち、キメラポリペプチドの発現によって調節される標的遺伝子に対する先験的な情報がなくても細胞を選別できる。また、細胞は、特定形質に関連するか、関連しないマーカー（marker）の追加的な標識子（indicator）としてレポーター遺伝子を含んでもよい。同様に、少なくとも一つの標的遺伝子がスクリーニングの前に同定されていてもよい。
【０００６】
他の例において、特定形質は、ある化合物（たとえば、天然または人工化合物）を生産することであり得る。前記化合物は抗生剤、増殖抑制剤、麻酔剤、タンパク質などである。
【０００７】
また他の例において、特定形質は重金属、塩度、環境毒素、生物毒素、病原菌、寄生物質、他の環境的極限（例：乾燥、熱、寒さ）などの環境条件に対する抵抗性、ストレス（例：熱、寒さ、極限ｐＨ、アンモニアのような化学物質、薬剤、浸透圧、電離放射線）に対する抵抗性または薬剤抵抗性であり、この際、特定形質の変化は、敏感性または抵抗性の増加または減少のどちらの方向でもあり得る。
【０００８】
また他の実施態様において、細胞は植物、動物（例：哺乳類）、菌類または細菌の細胞である。哺乳動物細胞の場合、特定形質は細胞増殖；サイトカイン、ホルモンまたは信号物質の生産；細胞信号経路の活性化および生理的経路（例：ブドウ糖恒常性、代謝、肥満）の活性化である。
【０００９】
ＤＮＡ結合ドメインは、たとえば、ジンクフィンガードメインである。典型的に、第１のジンクフィンガードメインはライブラリーの核酸の間で多様に変化し、第２のジンクフィンガードメインもまたライブラリーの核酸の間で多様に変化する。核酸はまた少なくとも一つの第３ＤＮＡ結合ドメイン、たとえば、第３ジンクフィンガードメインを発現することもできる。
【００１０】
発現される各ポリペプチドのジンクフィンガードメインは異なる天然型タンパク質から由来するジンクフィンガードメインと同じであるか、ＤＮＡ接触位置における突然変異体のような天然型タンパク質の誘導体であり得る。天然型タンパク質は、たとえば、菌類（例：酵母）、植物または動物由来タンパク質（例：ヒトやネズミタンパク質のような哺乳類のタンパク質）のように、任意の真核生物のジンクフィンガータンパク質であり得る。各々のポリペプチドは第３、第４、第５および／または第６のジンクフィンガードメインをさらに含み得る。各々のジンクフィンガードメインはヒトなどの哺乳類由来ジンクフィンガードメインであり得る。
【００１１】
選択的に、複数の細胞の核酸は１０，２０，３０，４０または５０個以上の互いに異なる３−塩基対ＤＮＡ部位を認識するのに十分な数の異なるジンクフィンガードメインをコーディングする。一実施態様において、複数の核酸は３０，２０，１０または５個以下の互いに異なる３−塩基対ＤＮＡ部位を認識するのに十分な数の異なるジンクフィンガードメインをコーディングする。
【００１２】
細胞ライブラリーの各核酸から発現されたポリペプチドは、転写活性化および抑制ドメイン、メチル化ドメイン、アセチル化ドメインまたは脱アセチル化ドメインのような機能性転写調節ドメインをさらに含み得る。また、多くのキメラポリペプチドは特定転写調節ドメインと融合していなくても作動する。ポリペプチドをコーディングする核酸は構造性（constitutive）または誘導性（inducible）プロモーターに作動可能に連結できる。
【００１３】
前記方法は、同定された細胞から核酸を分離することをさらに含み得る。分離された核酸の配列は確認でき、核酸にコーディングされたポリペプチドを分離することもできる。前記方法はまたポリペプチドが特異的に認識する核酸結合部位を同定することをさらに含み得る。結合部位は、たとえば、コンピュータを用いた一連の配列（特に、調節配列（regulatory sequence））データベースの検索を通じて確認されるか、インビトロで該ポリペプチドに結合する核酸を選別する方法（例：SELEX）で確認できる。核酸塩基配列のコンピュータデータベースは既に同定された核酸結合部位またはそれと類似する部位を検索することによって分析することができる。
【００１４】
前記方法は、同定された細胞内で少なくとも一つの内生遺伝子の発現または発現された少なくとも一つの内生（endogenous）ポリペプチドの量／活性を、たとえば、ｍＲＮＡプロファイリング（例：微細配列（microarray）分析）、２−Ｄゲル電気泳動、タンパク質リガンド（例：抗体）配列、および／または質量分光法（mass spectroscopy）などを用いて分析することを含み得る。また、一つまたは少数の遺伝子またはタンパク質をプロファイルできる。一実施態様においては、プロファイルを参照プロファイル（reference profile）のデータベースと比較する。他の実施態様においては、同定されたキメラポリペプチドの発現によって変化した発現プロファイルを有する遺伝子の調節部位を比較してキメラポリペプチドの発現によって直接または間接的に発生する共同調節（coodinate regulation）を決定する候補部位を同定する。
【００１５】
また、前記方法は、変化した形質を示すように細胞を培養することを含む。たとえば、変化した特性が代謝産物の生産量の増加であれば、本発明は代謝産物を生産するための細胞培養を含み得る。細胞はライブラリーから分離された細胞、またはキメラポリペプチドをコーディングする核酸を再導入した細胞であってもよい。キメラポリペプチドの発現は、たとえば、精巧な形質変換のために誘導プロモーターを使用するか、他の条件のプロモーター（例：細胞型特異的プロモーター（cell type specific promoter））を用いて誘導できる。キメラポリペプチドをコーディングする核酸を有する細胞は有機体（organism）に導入（例：生体外処理（ex vivo treatment））されるか、遺伝子転換体（transgenic organism）の製作に使用できる。
【００１６】
一実施態様において、少なくともいくつかのライブラリー構成員は互いに異なる調節ドメインを有するタンパク質をコーディングする。たとえば、一部のライブラリー構成員は活性化ドメインを、他の一部要素は抑制ドメインを含み得る。すなわち、ＤＮＡ結合ドメインの個別的組合せが、ある場合は活性化ドメインとの融合ライブラリーを意味し、他の場合は抑制ドメインとの融合ライブラリーを意味することもある。また、一部のライブラリー構成員は活性化ドメインを含む反面、他の構成員は調節ドメインを含まない。
【００１７】
次は表現型のいくつかの例である：幹細胞群（例：造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、または臍帯血幹細胞）およびインビトロで制限された拡張能力を有する他の細胞の拡張；幹細胞分化抑制；細胞の増大した分化能力（例：分化された細胞または幹細胞）；変化したストレス抵抗性（例：熱、寒さ、極限ｐＨ、細胞培養の際に生成するアンモニアのような化学物質、薬剤、塩（浸透圧）、電離放射線などに対する増加または減少した抵抗性）；癌細胞などにおいて増大すると分かっている、電離放射線または毒性物質（例：抗癌剤）に対する敏感性；ウイルス感染／増殖補助能力（例：Ｃ型感染ウイルス増殖）；ウイルス、細菌または原生生物などの病原菌への抵抗能力；細胞内ＲＮＡｉ効率性増大；形質導入効率性の増大；細胞や有機体の老化遅延；成長因子が転化されていない無血清（serum-free）の化学的に定義された培地における成長、細胞含有体（inclusion body）の形成遅延または除去；および細胞内タンパク質分泌増加。
【００１８】
前記方法は次の適用例を含む：病原体（例：病原細菌）内の必須遺伝子の同定；細菌の発病原因である（宿主または病原体の）遺伝子の同定；薬剤候補の標的同定、信号伝達経路における遺伝子発見、微生物の製作および産業的生命工学、商業的利用のための代謝産物の生産量増大、および成長方式の調節（例：微生物の成長促進または癌細胞の成長抑制）。
【００１９】
他の態様において、本発明は、（ａ）タンパク質をコーディングする（細胞内生または外生）遺伝子および（ｂ）人工転写因子を含む培養された細胞であって、前記細胞が前記遺伝子は含むが前記転写因子は含まない同一細胞よりも高い水準に前記タンパク質を生産し、前記転写因子は、前記遺伝子に作動可能に連結された調節領域に結合すること以外の方式でタンパク質の生産に影響を及ぼす、培養された細胞を提供する。この際、「人工」は天然型ではないことを意味し、「遺伝子」は、染色体（chromosomal）またはゲノム（genomic）（すなわち、イントロンを含む）ＤＮＡ、および内生または（一時的にまたは安定的に遺伝子導入された）外生遺伝子の「コーディング配列」を意味する。
【００２０】
人工転写因子は２つ、３つまたは４つ以上のジンクフィンガードメインを含むキメラＤＮＡ結合ドメインを含み得る。人工転写因子はまた調節ドメイン（活性および抑制ドメインの要約リスト）を含み得る。少なくとも一つまたは２つの個別ジンクフィンガードメインは天然型（哺乳類、植物またはヒト）から由来し得る。一実施態様においては、すべてのジンクフィンガードメインが天然型である。
【００２１】
人工転写因子は細胞の異種（heterologous）遺伝子によってコーディングできる。異種転写因子をコーディングする異種遺伝子は誘導プロモーターによって調節できる。また、細胞は少なくとも２つ以上の人工転写因子を含み得る。
【００２２】
たとえば、（ｉ）人工転写因子は、第１の遺伝子を欠く同一細胞または培養細胞が、第１の遺伝子に作動可能に連結された調節領域とは異なる調節領域に作動可能に連結された第２の遺伝子によってコーディングされる第２のタンパク質を、第２の遺伝子を含むが該転写因子を含まない同一細胞よりも高い水準に生産させ、（ii）転写因子は第２の遺伝子に作動可能に連結された調節領域に結合すること以外の方式で第２のタンパク質の生産に影響を及ぼす。他の例において、（ｉ）前記細胞はまた第２のタンパク質をコーディングする第２の遺伝子をさらに含み、（ii）該細胞は第２の遺伝子を含むが転写因子は含まない同一細胞よりも高い水準に第２のタンパク質を生産し、（iii）転写因子は第２の遺伝子に作動可能に連結された調節領域に結合すること以外の方式で第２のタンパク質の生産に影響を及ぼすことがある。第１の遺伝子に作動可能に連結された調節領域は、第２の遺伝子に作動可能に連結された調節領域と異なることもある。
【００２３】
第１および２の転写因子は次を含む群から選択される。  
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＦＥＣＫＤＣＧＫＡＦＩＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＤＳＳＮＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＥＫＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＤＳＳＮＬＴＲＨＩＲＩＨ）、  
ｂ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＳＣＧＩＣＧＫＳＦＳＤＳＳＡＫＲＲＨＣＩＬＨＴＧＥＫＰＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＫＬＮＲＨＫＫＲＨＴＧＥＫＰＹＶＣＤＶＥＧＣＴＷＫＦＡＲＳＤＥＬＮＲＨＫＫＲＨＴＧＥＫＰＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＲＨＲＲＩＨ）、および  
ｃ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨＴＧＥＫＰＹＲＣＥＥＣＧＫＡＦＲＷＰＳＮＬＴＲＨＫＲＩＨＴＧＥＫＰＹＲＣＥＥＣＧＫＡＦＲＷＰＳＮＬＴＲＨＫＲＩＨＴＧＥＫＰＦＡＣＰＥＣＰＫＲＦＭＲＳＤＮＬＴＱＨＩＫＴＨ）。
【００２４】
他の態様において、本発明はタンパク質を生産する方法を提供する。この方法は、本願に記述された（例：前記の）細胞を提供する段階；前記遺伝子を含むが転写因子は含まない同一細胞よりも高い水準（例：２倍、３倍、５倍、１０倍または１００倍以上）のタンパク質生産を許容する条件下で細胞を培養する段階；細胞によって生産されたタンパク質を検出するか、細胞および／または細胞周囲の培地から発現されたタンパク質を精製する段階を含む。遺伝子は内生または外生遺伝子であってもよく、内生遺伝子の場合、天然型遺伝子または天然型遺伝子に比べて遺伝的に変形された遺伝子（たとえば、調節配列の挿入または修飾によって）であってもよい。また、内生遺伝子の例としては、ホルモン、細胞表面受容体（receptor）、抗体、生長因子、付着（adhesion）タンパク質、神経伝達物質、および酵素をコーディングする遺伝子などを含む。外生遺伝子はＣＭＶまたはアデノウイルスのようなウイルスプロモーターに連結され、細胞は哺乳類由来細胞であってもよい。
【００２５】
また、前記方法は、前記細胞をある対象（subject）に導入することをさらに含み得る。前記方法はまた、精製されたタンパク質を薬剤学的に許容可能な担体とともに製剤化（formulating）することを含み得る。
【００２６】
前記方法は次のような特徴の一つ以上を含む：前記転写因子が、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされたルシフェラーゼマーカータンパク質の生産を１．１または２倍以上増加させるのに十分な量で細胞内に存在する；前記転写因子が、ＳＶ４０プロモーターに連結された遺伝子によってコーディングされたアルカリフォスファターゼマーカータンパク質の発現を２倍、５倍、７倍、１０倍以上増加させるのに十分な量で細胞内に存在する；前記転写因子が、複数の内生遺伝子の発現を直接的に変化させる；転写因子が細胞分割率（rate of division）を変化させる；前記転写因子がＰＢ０８、Ｋ＿Ｆ０２またはＫ＿Ｄ１０によって特異的に認識される天然型ＤＮＡ結合部位に競争的に結合し、５０ｎＭ以下のＤＮＡ部位に対する解離常数を有する；前記転写因子が、ＰＢ０８、Ｋ＿Ｆ０２またはＫ＿Ｄ１０によって特異的に認識されるＤＮＡ結合部位と部分重複されるＤＮＡ部位を特異的に認識する；前記転写因子が、ＱＳＮＲ−ＤＳＮＲ；ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲ；ＤＳＡＲ−ＲＤＫＲ；ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ；ＲＤＥＲ−ＱＴＨＲ；ＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ；ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ；ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱ，ＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ；ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１からなる群から選ばれる２つの連続するジンクフィンガードメインを含み、この際、４文字標識は、各々ジンクフィンガードメインの−１、＋２、＋３および＋６ＤＮＡ接触残基に存在するアミノ酸を認識する；前記転写因子が配列番号：２１、２２または２３のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
前記転写因子は配列番号２１、２２、または２３において１〜８個のアミノ酸が置換、挿入または欠失されることによって変形されたアミノ酸配列を含み得る。置換は、たとえば、金属配位システイン（Cysteine）および−１位置の間のようなＤＮＡ接触残基以外の位置で行われてもよく、保存的（conservative）置換であってもよい。前記転写因子は図１７、１８および１９に示されている核酸によってコーディングされるアミノ酸を含む。
【００２８】
他の例において、転写因子は不変部位で一つ〜３つの置換を含む次の３つのジンクフィンガードメインを含む：  
ａ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２４）；  
ｂ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５）；および  
ｃ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２６）、
【００２９】
他の例において、転写因子は不変部位における一つ〜３つの置換を含む例である次の４つのジンクフィンガードメインのうち少なくとも３つを（この順に）含む：  
ａ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２７）；  
ｂ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２８）；  
ｃ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２９）；および  
ｄ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３０）。
【００３０】
他の例において、転写因子は不変部位における一つ〜３つの置換を含む例である次の４つのジンクフィンガードメインの少なくとも３つを（この順に）含む：  
ａ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３１）；  
ｂ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３２）；  
ｃ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３３）；および  
ｄ）Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３４）。
【００３１】
前記リストにおいて、Ｘａは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンであり；Ｘｂは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。
【００３２】
他の態様において、本発明は細胞内（例：インビトロまたはインビボ）で標的タンパク質をコーディングする核酸の発現を含む標的タンパク質の生産方法を提供し、この際、細胞は、異種転写因子を含まない細胞とは違い、タンパク質の生産量を増加させる異種の人工転写因子を含む。一実施態様において、異種転写因子は標的タンパク質をコーディングする遺伝子の転写を直接調節しないで外の方法で生産量を増加させる。たとえば、異種転写因子は標的タンパク質をコーディングする核酸を直接調節する調節領域に結合しない。転写因子はタンパク質として細胞内に導入されるか、それをコーディングする核酸の導入および転写によって導入できる。前記方法は本願に記載された他の特徴を含み得る。
【００３３】
また他の態様において、本発明は転写因子を同定する方法を提供する。前記方法は次の段階を含む：互いにキメラをなす２つのジンクフィンガードメインを有し、各々異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；複数の細胞の各々にライブラリー構成員を導入する段階；複数の細胞から第１の転写調節配列に作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされる第１の標的タンパク質の生産増大を示す細胞を同定する段階；および第１の転写調節配列と異なる第２の転写調節配列に作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされた第２の標的タンパク質の生産を増大させるライブラリー構成員の能力を評価する段階。
【００３４】
前記方法は次に述べる特徴の一つ以上を含み得る：第１および第２の標的タンパク質は同じである；ライブラリー構成員が導入された細胞は、各々、第２の転写調節配列に作動可能に連結された第２の標的タンパク質をコーディングする遺伝子を含む；前記細胞は真核細胞である；第１および／または第２の転写調節配列はウイルス調節配列を含む；前記方法は、第１および第２の標的タンパク質の生産を増加させるライブラリーの構成員によってコーディングされた転写因子をコーディングする遺伝子を含む宿主細胞を製造する段階をさらに含む；前記方法は宿主細胞から第１および第２の標的タンパク質とは異なる、第３標的タンパク質を生産する段階をさらに含む；そして、評価は同定された細胞の評価を含む。第２または第３標的タンパク質は、たとえば、エリスロポエチン（erythropoietin）、トロンボポエチン（thrombopoietin）、成長因子、インターロイキン（interleukin）またはケモカイン（chemokine）のような、分泌タンパク質であってもよい。他の実施態様においては、標的タンパク質は代謝産物の生産経路において反応を促進する酵素である。また、本願に記述された他の特徴を含み得る。
【００３５】
関連態様において、本発明はキメラタンパク質を同定する方法を提供する。前記方法は次を含む：少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む異なる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；特定の条件下で、第１の転写調節配列に作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされた第１の標的タンパク質を所定水準に生産する試験用細胞を提供する段階；複数の核酸の各構成員を試験細胞の複製物に導入して複数の形質転換細胞を提供する段階；複数の形質転換された細胞またはその子孫細胞から、特定の条件下で第１の標的タンパク質を所定水準とは異なる水準に生産する細胞を同定する段階；および、第１の転写調節配列とは異なる第２の転写調節配列に作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされた第２の標的タンパク質の生産量増大を示す同定された細胞内ライブラリー構成員の能力を評価する段階。また、本願に記述された他の特徴を含み得る。
【００３６】
他の態様において、本発明は異種遺伝子のない標準宿主細胞に比べて、標的遺伝子によってコーディングされた標的タンパク質の生産量を３０％以上増加させる人工転写因子をコーディングする異種遺伝子を含む遺伝物質を有する宿主細胞を提供する。一実施態様においては、転写因子は標的タンパク質の転写を直接的に調節しない。他の実施態様においては、転写因子は標的タンパク質の転写を直接的に調節する。宿主細胞は、プロモーター（例：ウイルスプロモーター）に作動可能に連結された、ｌａｃＺ、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＧＦＰ、ルシフェラーゼなどをコーディングする配列のような塩基配列またはレポーター構造体（reporter construct）を含み得る。また、細胞は本願に記述された他の特徴を有することもある。
【００３７】
他の態様において、本発明は、少なくとも２つ、３つまたは４つ以上のジンクフィンガードメインから構成されたポリペプチドをコーディングする異種遺伝子を含む宿主細胞を提供する。この際、該ポリペプチドは５０ｎＭ以下の平衡解離常数で天然型ＤＮＡに結合し、ＰＢ０８、Ｋ＿Ｆ０２またはＫ＿Ｄ１０とＤＮＡ結合部位に競争的に結合する。細胞は本願に記述された他の特徴を有することもある。
【００３８】
また他の態様において、本発明は、標的タンパク質をコーディングする第１の異種遺伝子、および第２の異種遺伝子の導入がない場合よりも少なくとも３０％以上に標的タンパク質の生産量を増加できる人工転写因子をコーディングする第２の異種遺伝子を含む細胞を提供する。この際、転写因子は標的タンパク質の転写を直接調節しない。細胞は本願に記述された他の特性を有することもある。
【００３９】
さらに他の態様において、本発明は次の配列を有する遊離されたポリペプチドを提供する：Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ５−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ５−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ５−Ｘｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：３５）。この際、前記ポリペプチドは、ヒト２９３細胞において、適正濃度で存在する場合、次のような効果を一つ以上示す：ａ）ＣＭＶプロモーターに連結されたルシフェラーゼをコーディングする遺伝子の発現を２倍以上増加させる；ｂ）ＳＶ４０プロモーターに連結されたＳＥＡＰをコーディングする遺伝子の発現を２倍以上増加させる；およびｃ）細胞の増殖速度を５０％以上増加または抑制させる。
【００４０】
他の態様において、本発明は、後生動物由来細胞の分化状態を変化させる方法を提供し、この方法は細胞の分化状態を変化させるのに十分な量の人工転写因子を細胞において発現させる。一実施態様において、分化された状態は神経（Neuronal）表現型（例：神経突起（neurite）拡張、シナプス（synapse）形成、または神経細胞マーカー発現）または骨細胞表現型（例：骨細胞マーカー発現）によって特定できる。一実施態様において、分化された状態を、細胞の分化能力（pluripotency）を増加させるように、たとえば、幹細胞または前駆細胞のように分化が進んでいる状態に変える。一実施態様においては、分化された状態は一つの分化状態から他の分化状態に変わる（例：筋肉細胞状態から骨細胞状態に、神経細胞状態からグリア（glia）細胞状態になど）。一実施態様において、人工転写因子は神経突起の拡張を誘導する。たとえば、細胞は幹細胞、神経細胞、神経堤（neural crest）細胞または神経根源細胞（neuronal progenitor cell）である。人工転写因子は前記の転写因子、たとえば、ニューロ１−ｐ６５（Neuro1-p65）またはニューロ１（Neuro1）系の分子である（後記参照）。人工転写因子は天然型ＤＮＡ結合部位に対する結合のためにＮｅｕｒｏ１−ｐ６５と競争し得る。人工転写因子はＮｅｕｒｏ１−ｐ６５と同じ部位またはＮｅｕｒｏ１−ｐ６５が結合したＤＮＡ部位と重複する部位に結合できる。
【００４１】
他の実施態様において、人工転写因子は、筋細胞（Myoblast）のように元は骨細胞でない細胞において、骨細胞特定的なマーカー（marker）を誘導する。
【００４２】
他の態様において、本発明は次の段階を含む、転写因子を同定する方法を提供する：少なくとも２つのジンクフィンガードメインから構成された互いに異なる人工転写因子をコーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；複数の各細胞にライブラリーの構成員を導入する段階；および複数の細胞から分化状態が変化した細胞を選別する段階。前記方法は次のような特性を一つ以上含み得る：細胞は幹細胞である；細胞は神経細胞、神経堤（neural crest）細胞または神経根源細胞である；そして、分化された状態は神経高度成長（outgrowth）または神経突起形成を含む。また、他の特性を含み得る。
【００４３】
また他の態様において、本発明は複数の転写因子を同定する方法を提供する。この方法は次の段階を含む：２つ以上のジンクフィンガードメインから構成された互いに異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；細胞の所定形質を変化させるライブラリーの第１の構成員を同定する段階；および、細胞を選別して所定形質がさらに変化した細胞を同定する段階、この段階において、各スクリーニングされた細胞はライブラリーの第１の構成員によってコーディングされる転写因子および同じ核酸ライブラリーまたは人工転写因子の他の核酸ライブラリーの第２の構成員によってコーディングされた転写因子を発現する。前記方法は第１および第２の転写因子の存在下での追加のスクリーニング段階を含み得る。ある場合には、前記方法は第１の構成員の影響による表現型の変化を逆転させる第２のライブラリー構成員を同定することを含む。この方法は本願に記述された他の特徴を含み得る。
【００４４】
他の態様において、本発明は次の段階を含む、変形された細胞を製作する方法を提供する：少なくとも２つのジンクフィンガードメインから構成された各々異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；細胞の所定形質を変化させる第１および第２のライブラリー構成員を同定する段階；第１および第２のライブラリー構成員によって各々コーディングされた第１および第２のポリペプチドを発現する細胞を製造する段階。前記方法はまた第３構成員のような追加の構成員に拡張できる。前記方法はまた製造された細胞の所定形質を評価することをさらに含み得る。
【００４５】
前記方法はさらに次の特性の一つ以上を含み得る：製造方法は、第１のポリペプチドをコーディングする第１の遺伝子および第２のポリペプチドをコーディングする第２の遺伝子を細胞内に導入することを含む；第１および第２の遺伝子は同じ核酸の構成要素である；ここで、製造方法は、第１のポリペプチドをコーディングする第１の遺伝子を含む第１細胞と第２のポリペプチドをコーディングする第２の遺伝子を含む第２の細胞を融合することを含む；所定の形質は代謝産物の生産である；所定の形質は標的ポリペプチドの生産である；そして、生産は分泌を含む。本願に説明された他の特徴も使用できる。
【００４６】
次の方法はジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ライブラリーの有機体的性質をスクリーニングするためにウイルスを用いる方法に関するものである。転写因子を同定する方法は次を含む：各々少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む互いに異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；複数のウイルスまたはウイルス粒子（viral particles）を形成するために、哺乳動物細胞を感染させるウイルスまたはウイルス粒子にライブラリー構成員を含ませる（packing）段階；複数の非−ヒト哺乳動物実験細胞に複数のウイルスまたはウイルス粒子を導入する段階；および複数の細胞から変形された表現型を示す実験細胞を同定する段階。たとえば、各実験細胞（subject）は検出可能な障害（disorder）を有する；複数のウイルスまたはウイルス粒子はグループ（pool）に分けられ、各々のグループは複数の実験細胞を構成する個々の実験細胞に導入される；複数のウイルスやウイルス粒子は個々の試料（samples）を含むが、各試料は核酸ライブラリーの単一核酸内に含まれており、各試料は各実験体に導入される。
【００４７】
一態様において、本発明は、人工転写因子をコーディングする異種核酸を含む変形細胞であって、前記人工転写因子が前記変形（modified）細胞と実質的に同じであり、異種核酸および人工転写因子を欠く対照細胞に比べて変形細胞にストレス抵抗性を与える、変形細胞を提供する。たとえば、人工転写因子は少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む。一つまたはそれ以上のジンクフィンガードメインは、たとえば、下記表１に示す天然型ドメインであってもよい。代表的な人工転写因子は、たとえば、本願に記載された熱抵抗または溶剤（solvent）抵抗タンパク質のように、少なくとも一つの連続的なモチーフ（motifs）から構成された転写因子を含む。
【００４８】
変形された細胞は原核または真核細胞であってもよい。ストレス抵抗性は次の形質を一つ以上含む：熱抵抗性、溶剤抵抗性、重金属抵抗性、浸透圧抵抗性、極限ｐＨ抵抗性、化学物質抵抗性、寒さ抵抗性、ゲノム毒性物質に対する抵抗性および放射性物質抵抗性。ストレス抵抗性は抵抗性のない細胞が死ぬか生長できない条件下で生存または生長させる。たとえば、変形された細胞は人工転写因子を発現でき、同じ培養条件の人工転写因子のない細胞よりもストレスに対して遥かによく耐えられる。本発明はまたこのような人工タンパク質を提供し、このタンパク質は核酸を含む同一細胞に比べて毒性物質に対する細胞の感受性を変化させる。
【００４９】
他の態様において、前記方法は次の細胞生成物の生産方法を含む：人工転写因子をコーディングする異種核酸を含む変形された細胞を提供する段階；人工転写因子が生産される状態に変形された細胞を保持する段階；および培養された細胞によって生産された人工転写因子外の産物を回収する段階。前記人工転写因子は、たとえば、ストレス抵抗性、またはタンパク質の生産、代謝産物の生産の変化などのような前記の他の特性を与えることができる。たとえば、人工転写因子は少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む。少なくとも一つのジンクフィンガードメインは表１に記載されたような天然型であってもよい。代表的な人工転写因子は前記少なくとも一つの連続的なモチーフ（例：少なくとも２つ、３つまたは４つの連続するモチーフ、または非連続形態を含みながら、少なくとも３つのモチーフと同じ形態）から構成された転写因子を含む。
【００５０】
代表的な生成物は代謝産物またはタンパク質（例：内生または外生タンパク質）を含む。  たとえば、変形細胞は人工転写因子以外の異種タンパク質をコーディングする核酸を含み、その生成物は異種タンパク質である。他の例において、変形細胞はまた異種タンパク質をコーディングする第２核酸を含み、その異種タンパク質は代謝産物の生産に関与する。変形細胞は２０〜４０℃または３７℃以上の温度で保存できる。一実施態様において、人工転写因子を欠く実質的に同一な細胞の成長が抑制される条件下で変形された細胞を保持する。
【００５１】
一実施態様において、前記ジンクフィンガードメインは下記表１５に記述するジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基に該当するＤＮＡ接触残基セットを含む。関連する実施態様において、人工転写因子は少なくとも３つ以上のジンクフィンガードメインの整列（array）を含み、この際、各整列のＤＮＡ接触残基は下記表１５の一列（row）に示す任意の連続する３つのジンクフィンガードメインのＤＮＡ接触残基に各々該当する。また他の実施態様において、人工転写因子は下記表１５の一列に示すジンクフィンガードメイン配列を含むタンパク質と競争する。
【００５２】
他の態様において、本発明は、標的遺伝子をコーディングする遺伝子および人工キメラタンパク質をコーディングする配列を含む異種核酸を含む細胞を提供する。この際、前記人工キメラタンパク質は、（１）異種核酸を含まない細胞に比べてタンパク質の生産量を増加させ、（２）標的タンパク質をコーディングする遺伝子の転写を直接調節できる転写調節領域に結合しない。前記人工転写因子は、たとえば、ＤＮＡに結合する、２つ以上のジンクフィンガードメインを含む。少なくとも一つのジンクフィンガードメインは、たとえば、下記表１の天然型ドメインのような天然型であってもよい。代表的な人工転写因子は前記の少なくとも一つの連続的なモチーフから構成された転写因子を含む。一実施態様において、前記細胞は真核細胞であり、人工キメラタンパク質はゲノム（genomic）ＤＮＡ結合部位に対してＰＢ０８、Ｋ＿Ｆ０２またはＫ＿Ｄ１０と競争する。
【００５３】
一実施態様において、人工キメラタンパク質は細胞周期進行速度を変化（例：増加または減少）させる。本発明はまたこのような人工転写因子を提供する。
【００５４】
前記細胞はタンパク質の生産方法に使用でき、この方法は次の段階を含む：細胞を提供する段階；および人工キメラタンパク質が異種核酸を含まない細胞に比べて細胞による標的タンパク質の生産量を増加させる条件で細胞を培養する段階。前記タンパク質は、たとえば、分泌タンパク質、細胞質タンパク質または核内タンパク質であってもよい。
【００５５】
他の態様において、本発明は分泌タンパク質をコーディングする内生遺伝子および、  異種核酸を含まない細胞に比べて細胞によって生産される分泌タンパク質の量を増加させる人工転写因子をコーディングする塩基配列を含む異種核酸を含む細胞を提供する。一実施態様において、前記細胞は真核細胞であり、前記分泌タンパク質はインシュリンである。一実施態様において、前記人工転写因子は、０８＿Ｄ０４＿ｐ６５が特異的に結合する内生ＤＮＡ部位に結合する。他の実施態様において、前記人工転写因子は細胞内のＤＮＡ部位に特異的に結合し、内生ＤＮＡ部位に対する結合のために０８＿Ｄ０４＿ｐ６５と競争する。前記人工転写因子は、たとえば、次のようなアミノ酸配列を含む：  
【００５６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４５）；または
【００５７】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４６）
【００５８】
この際、Ｂはフェニルアラニンまたはチロシンを意味し、Ｊは疎水性アミノ酸を意味する。
【００５９】
前記細胞は分泌タンパク質（例：インシュリン）を生産する方法に使用できる。前記細胞は、たとえば、異種核酸を含まない細胞に比べて、人工転写因子が細胞によるインシュリンの生産量を増加させる条件で培養される。同じように、本発明は少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む転写因子を提供し、この際、前記人工転写因子は、人工転写因子のない状態では細胞内生インシュリン遺伝子を発現しない哺乳動物細胞において内生インシュリン遺伝子の発現を誘導する。
【００６０】
また他の態様において、本発明は核酸を含まない同一の細胞に比べて毒性物質（例：薬剤（例：抗菌剤（例：ケトコナゾール）））に対する敏感性を変化させる人工転写因子を提供する。前記敏感性は増加または減少し得る。一実施態様において、前記細胞は菌類細胞である。前記人工転写因子は、たとえば、少なくとも２つ（例：少なくとも３つ）のジンクフィンガードメインを含む。少なくとも一つのジンクフィンガードメインは表１の天然型ドメインのような天然型であってもよい。代表的な人工転写因子は本願に記載された少なくとも一つの連続するモチーフを有する転写因子を含む。前記人工転写因子は、たとえば、内生ＤＮＡ部位に結合し、細胞内のＤＮＡ結合部位に対して下記表５のジンクフィンガータンパク質と競争する。
【００６１】
他の態様において、本発明は菌株細胞の薬剤抵抗性を変化させる方法を提供する。前記方法は、ＡＱＹ１，ＹＪＲ１４７Ｗ，ＹＬＬ０５２Ｃ，ＹＬＬ０５３ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗと少なくとも７０％以上類似するタンパク質の発現または活性を変化させることを含む。この発現は、たとえば、転写因子を用いて変化させることができる。
【００６２】
また他の態様において、本発明は毒性物質に対する細胞の敏感性を変化させる人工キメラタンパク質を同定する方法を提供する。その方法は次を含む：少なくとも３つのジンクフィンガードメインの配列を含み、このうち、少なくとも２つの隣接するジンクフィンガードメインは天然型タンパク質では隣接して現れないキメラタンパク質をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；形質転換された細胞を生産するためにライブラリー構成員を試験細胞に導入する段階；形質転換された細胞を毒性物質の存在下で培養する段階；および形質転換された細胞から、試験細胞に比べて毒性物質に対する敏感性が変わった細胞を選別する段階。前記試験細胞は、たとえば、菌株細胞であり、前記毒性物質は抗菌株製剤である。他の例において、前記試験細胞は癌細胞であり、前記毒性物質は抗体細胞分裂（anti-mitotic）製剤である。複数の各核酸によってコーディングされるキメラタンパク質は転写調節ドメインを含み得る。
【００６３】
前記方法は、選別された細胞においてライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質のジンクフィンガードメイン配列は含むが、同一細胞のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質の転写調節ドメインは含まない第２のキメラタンパク質をコーディングする核酸を製作することをさらに含み得る。前記方法はまた（ｉ）選別された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質のジンクフィンガードメイン配列、および（ii）同定された細胞内でライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質の転写調節ドメイン以外の転写調節ドメインを含む第２のキメラタンパク質をコーディングする核酸を構成することを含み得る。
【００６４】
他の態様において、本発明は３つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子をコーディングする塩基配列を含む核酸を提供し、この際、前記人工転写因子の発現は少なくとも一つの脊椎動物細胞において神経細胞表現型を誘導する。一例において、ジンクフィンガードメイン中の少なくとも一つは次の塩基配列を有する：
【００６５】
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５０）
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５１）；または
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５２）、
【００６６】
この際、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘｂは疎水性アミノ酸である。前記人工転写因子は、たとえば、次の配列を含む。Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５３）。この際、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘｂは疎水性アミノ酸である。
【００６７】
一つの方法は前記核酸を含む脊椎動物細胞（例：哺乳動物細胞、またはヒト細胞）を提供し、前記人工転写因子が発現され、神経突起が形成される条件下で該細胞を培養することを含む。一例において、前記脊椎動物細胞は人工転写因子の生産前の幹細胞である。
【００６８】
他の態様において、本発明は３つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子をコーディングする塩基配列を含む核酸を特徴とする。この際、人工転写因子の発現は少なくとも一つの脊椎動物細胞において骨細胞化（osteogenesis）を誘導する。前記ジンクフィンガードメインの少なくとも一つは、たとえば、次の塩基配列を有する：  
【００６９】
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５４）；
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５５）；
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５６）：または
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５７）：
【００７０】
この際、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシン、Ｘｂは疎水性アミノ酸であり、あるいは前記人工転写因子は次のアミノ酸塩基配列を含み得る：
【００７１】
Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｘｂ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘｂ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ−Ｘ１−６−Ｃｙｓ−Ｘ２−５−Ｃｙｓ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｘｂ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｘ３−５−Ｈｉｓ（配列番号：２５８）：この際、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘｂは疎水性アミノ酸である。
【００７２】
一つの方法は前記核酸を含む脊椎動物細胞を提供し、前記人工転写因子が発現され、骨細胞化が誘導される条件下で該脊椎動物細胞を培養することを含む。
【００７３】
他の態様において、本発明は幹細胞の分化能力を変化させる方法を提供する。この方法は次を含む：複数のジンクフィンガードメインを含み、幹細胞の分化能力を変化させる人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸と幹細胞を提供する段階；前記核酸を幹細胞に導入する段階；および前記人工転写因子の発現で前記幹細胞の分化能力を変化させる条件で前記幹細胞を培養する段階。前記人工転写因子は、たとえば、幹細胞の分化を誘導する。他の例において、前記人工転写因子は幹細胞の自家複製（self-renewal）能力を増加させる。前記幹細胞は胎児幹細胞、脊椎動物幹細胞、植物幹細胞、造血幹細胞、神経根源細胞または筋肉根源細胞であり得る。
【００７４】
また他の態様において、本発明は次を含む方法を提供する：各々少なくとも２つのジンクフィンガードメインおよび転写を活性化または抑制する調節ドメインの配列を含む互いに異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；所定の形質を有する細胞を提供する段階；核酸ライブラリー成分を前記細胞に導入する段階；所定の形質を変化させるライブラリー構成員を同定する段階；および同定された構成員からのジンクフィンガードメイン配列を含むが、同定された構成員の調節ドメインと同じ調節ドメインは含まない、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコーディングする配列を含むコーディング核酸を製造する段階。前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、たとえば、同定された構成員の調節ドメインを欠いている。また他の例において、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは同定された構成員の調節ドメインが突然変異された調節ドメインを含む。一実施態様において、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは同定された構成員の調節ドメインと相反する機能を有する調節ドメインを含む。
【００７５】
前記方法はまた細胞に前記核酸を導入し、該細胞の所定形質を評価することをさらに含んでもよい。同定段階は次を含む群から選択される特性を有する細胞を同定することを含んでもよい：与えられた環境条件に対する抵抗性；分化；脱分化（dedifferentiation）；増殖；細胞死滅（apoptosis）；血清−独立性（serum-independence）；病原菌抵抗性；および病原菌敏感性。
【００７６】
他の態様において、本発明は、人工転写因子を生産する細胞において過発現された異種タンパク質の水溶性を向上させる人工転写因子をコーディングする、分離された核酸を提供する。前記人工転写因子は、たとえば、複数のジンクフィンガードメインを含む。前記細胞は細菌または真核細胞であってもよい。一例において、前記タンパク質はＡＫＴタンパク質のような哺乳類由来タンパク質である。一実施態様において、前記複数のジンクフィンガードメインは次のドメインを含む：ＱＳＴＲ−ＤＳＡＲ−ＲＤＨＴ−ＷＳＮＲまたはＶＳＴＲ−ＤＧＮＶ−ＱＳＮＲ−ＱＳＮＫ。本発明はまた、請求項９９〜１０４のいずれかに該当する異種核酸を含む変形細胞を提供する。本発明はまた、異種標的タンパク質を生産する方法を提供する。前記方法は異種標的タンパク質をコーディングする配列を含む第２核酸を含む変形細胞を提供し、前記変形細胞を人工転写因子および異種標的タンパク質が生産される条件下で培養することを含む。前記変形細胞は培養細胞または対象体内の生細胞であってもよい。
【００７７】
他の態様において、本発明は変化した形質を第１細胞から第２の細胞に転移させる方法を提供する。この方法は次を含む：少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む互いに異なる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；前記核酸ライブラリー構成員を第１細胞に導入して形質転換された細胞を提供する段階；前記ライブラリー構成員の一つによってある形質が変化した細胞を前記形質転換された細胞から選別する段階；同定された前記変形細胞から核酸ライブラリー構成員を分離する段階；前記ライブラリー構成員を第２細胞に導入する段階：この際、第２細胞は所定の形質とは異なる表現形質によって第１細胞と区別される；および前記核酸ライブラリー構成員を含み、該核酸ライブラリー構成員がコーディングする人工キメラタンパク質を発現する第２細胞を評価する段階。前記第１および第２の細胞は、たとえば、酵母または哺乳動物細胞のような真核細胞である。前記第１および第２の細胞は増殖または分化の特性によって区別される。たとえば、第１細胞は癌細胞である反面、第２の細胞は癌細胞ではないか、またはその反対である。評価された第２細胞は所定の形質の変化によって評価できる。
【００７８】
他の態様において、本発明は３つのジンクフィンガードメインを含む人工転写因子をコーディングする配列を含む核酸を提供する。前記人工転写因子の発現は、たとえば、少なくとも一つの真核細胞の特性を変化させ、この際、特性はウイルス増殖、ウイルス生産およびウイルス感染を含む群から選択される；前記人工転写因子の発現は、真核細胞と同時培養（co-cultured）されるか、または真核細胞によって調節された培地で培養される幹細胞を調節する真核細胞の能力を変化させる；前記人工転写因子の発現は、分泌タンパク質（例：抗体）を糖鎖化する哺乳類培養細胞（例：ＣＨＯ細胞）の能力を変化させる；そして、前記人工転写因子の発現は、外生核酸を受け入れる細胞の能力を変化させる。
【００７９】
また他の態様において、本発明は転写因子を同定する方法を提供する。この方法は次を含む：各々少なくとも２つのジンクフィンガードメインを含む互いに異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；基本形質を有する細胞に前記核酸ライブラリー構成員を導入する段階；所定の形質を変化させるライブラリー構成員を同定する段階；および下記（１）〜（４）を各々コーディングする核酸を複数含む第２のライブラリーを製造する段階。（１）一つ〜６つのアミノ酸の置換、挿入または欠失によって、前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質と区別される変異体、（２）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質のジンクフィンガードメインおよび追加のジンクフィンガードメインを含み、前記追加のジンクフィンガードメインが第２のライブラリーの構成員の間で多様に変わるキメラタンパク質、（３）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の変異体であって、他のジンクフィンガードメインで置換されたジンクフィンガードメイン位置の下位集合（subset）および前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の相応する位置にあるジンクフィンガードメインと同一である少なくとも一つの不変ジンクフィンガードメインを有する変異体、および／または（４）前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質の変異体であって、第２のライブラリーの構成員のうち、少なくとも一つのジンクフィンガードメインの位置が前記同定された構成員に相応する人工キメラタンパク質内の特定ドメインがその位置において他のジンクフィンガードメインよりも高い頻度で現れるように変化した変異体。前記方法は前記の他の特性を含み得る。
【００８０】
他の態様において、本発明は次を含む転写因子を同定する方法を提供する：少なくとも２つのジンクフィンガードメインおよび転写を活性化または抑制する第１の転写調節ドメインを有するＤＮＡ結合要素を含む異なる人工転写因子をコーディングする核酸を複数含む核酸ライブラリーを提供する段階；所定の形質を有する細胞に前記核酸ライブラリー構成員を導入する段階；所定の形質を変化させるライブラリー構成員を同定する段階；および前記第１の調節ドメインとは異なる第２の調節ドメインおよび同定された前記構成員のＤＮＡ結合要素をコーディングする核酸を製作する段階。関連する一つの方法は調節ドメインのない転写因子を同定し、調節ドメインを添加すること；または調節ドメインを含む転写因子から調節ドメインを除去することを含む。一部の転写因子は転写調節ドメインがなくても作用できる。本発明はまた、複数のジンクフィンガードメインおよび第１の調節ドメインから構成された人工転写因子を提供する。前記人工転写因子は細胞内で生産される場合、第１の形質を示すが、第１の調節ドメインが不活性化され、該ドメインと反対の特性を有する第２の調節ドメインが含まれる場合、第２の形質を示す。
【００８１】
一例において、前記第１の調節ドメインは転写を活性化し、前記第２の調節ドメインは転写を抑制する。他の例において、前記第１の調節ドメインは転写を抑制し、前記第２の調節ドメインは転写を活性化する。また他の例において、前記第１の調節ドメインは前記第１の範囲まで転写を活性化し、前記第２の調節ドメインは前記第１の範囲の５０％未満範囲まで転写を活性化する。前記方法は製作された核酸を試験細胞に導入し、この試験細胞の所定形質を評価することを含んでもよい。一実施態様において、前記同定された構成員は細胞の分割率を増加させ、製作された核酸は細胞分割率を減少させる転写因子をコーディングする。他の実施態様において、前記同定された構成員は化合物に対する抵抗性を惹起し、製作された核酸は化合物に対する感受性を惹起する転写因子をコーディングする。
【００８２】
他の態様において、本発明は次の段階を含む、転写因子を同定する方法を提供する：前記第１および第２の複数の核酸を含むライブラリーを提供する段階であって、この際、第１の複数の核酸は各々少なくとも２つのジンクフィンガードメインおよび転写を活性化させる調節ドメインを含む互いに異なる人工転写因子をコーディングし、第２の複数の核酸は各々少なくとも２つのジンクフィンガードメインおよび転写を抑制する調節ドメインを含む互いに異なる人工転写因子をコーディングする段階；所定の形質を有する細胞に前記核酸ライブラリー構成員を導入する段階；および所定の形質を変化させるライブラリー構成員を同定する段階。
【００８３】
また、本発明は、第１細胞において人工ジンクフィンガーキメラタンパク質の表現型を確認し、第２細胞においてタンパク質を発現し、第２細胞の表現型を確認することを含む方法を提供する。前記方法は、たとえば、第１細胞（例：酵母菌株（strain）または２９３細胞のようなヒト細胞株（cell line））において所定の表現型を変化させる転写因子ライブラリーの構成員を同定し、その構成員を別の細胞（例：別の酵母菌株またはＨｅｌａ細胞）で発現させることを含み得る。前記第１細胞は他の菌株または細胞株よりもスクリーニングにさらに適する。
【００８４】
他の態様において、本発明は次の段階を含む、抗真菌製剤に対する真菌菌株の感受性を変化させる方法を提供する：少なくとも３つのジンクフィンガードメインからなる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸を真菌細胞に導入する段階；および細胞に導入された核酸が発現される条件下で真菌細胞を培養する段階。前記真菌細胞は、たとえば、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、ヒストプラスマ(Histoplasma）またはクリプトコックス（Cryptococcus）などの酵母細胞である。一実施態様において、前記人工キメラタンパク質はＫ１〜Ｋ１１から選択されたタンパク質のジンクフィンガー整列のアミノ酸配列を含む（実施例３）。
【００８５】
前記方法は次の特徴の少なくとも一つを含み得る：前記人工キメラタンパク質は転写調節ドメイン（例：転写活性または抑制ドメイン）からなる；前記細胞内の人工キメラタンパク質の発現は水運搬体（water transporter）の転写水準を変化させる；Ｓ．セレビジエー（S. cerevisiae）細胞内の前記人工キメラタンパク質の発現はＹＬＬ０５３遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子の転写水準を変化させる；前記人工キメラタンパク質はＫ１〜Ｋ１１から選別されたポリペプチドと特定のＤＮＡ結合部位に対して競争する。
【００８６】
他の態様において、本発明は抗真菌製剤に対する真菌菌株の感受性を変化させる方法を提供する。前記方法は、ＹＬＬ０５３、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗと３０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％以上同一な５０個以上のアミノ酸の配列を含むタンパク質の発現または活性を変化させることを含む。前記真菌細胞は、たとえば、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）、ヒストプラスマ（Histoplasma）またはクリプトコックス（Cryptococcus）などのような酵母細胞である。一実施態様において、活性または発現の増加によって感受性が減少される；すなわち、抵抗性が増加する。他の実施態様において、感受性を減少させるため、すなわち、抵抗性を増加させるために活性または発現を増加させる。他の実施態様において、感受性を増加させるために活性または発現を減少させる。活性または発現を変化させることは、人工転写因子の発現、ＹＬＬ０５３、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗ遺伝子に相応する少なくとも２０個塩基の配列を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に接触されるか、または化学物質を細胞に接触させることを含み得る。
【００８７】
関連する一つの方法は、前記タンパク質との相互作用に対して試験化合物（例：小さい有機化合物）をスクリーニングして、たとえば、ＹＬＬ０５３／ＡＱＹ１関連タンパク質の抑制を同定するか、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２Ｃ、ＹＬＬ０５３ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗの活性または発現を変化させる試験物質をスクリーニングすることを含む。  
【００８８】
他の態様において、本発明は抗真菌製剤に対する真菌菌株の敏感性を変化させる人工キメラタンパク質を同定する方法を提供する。この方法は次を含む：天然型タンパク質においては少なくとも２つのジンクフィンガードメインが互いに隣接しないジンクフィンガードメインの少なくとも３つの配列からなる人工キメラタンパク質をコーディングする複数の核酸からなる核酸ライブラリーを提供する段階；形質転換された真菌細胞を生産するために真菌細胞に前記複数の核酸を各々導入する段階；抗真菌製剤の存在下で前記形質転換された真菌細胞を保持（例：培養（culturing））する段階；および前記形質転換された真菌細胞のうち対照細胞に比べて抗真菌製剤に対する敏感性が変化した細胞を選別する段階。
【００８９】
前記方法は次の特性の一つ以上を含み得る：対照真菌細胞は形質転換されていないか、または対照核酸で形質転換される；複数の核酸各々によってコーディングされるキメラタンパク質は転写調節ドメインを含む；真菌細胞は、たとえば、カンジダ（Candida）、ヒストプラスマ（Histoplasma）またはクリプトコックス（Cryptococcus）のような病原性真菌細胞である。
【００９０】
また、前記方法は、たとえば、（ｉ）各々選別された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質のジンクフィンガードメイン配列、および（ii）前記選別された細胞内のライブラリー構成員によってコーディングされるキメラタンパク質の転写調節ドメイン以外の転写調節ドメインからなる第２のキメラタンパク質をコーディングする核酸を製作することを含み得る。前記方法は前記の他の特性を含み得る。
【００９１】
他の態様において、本発明は、抗真菌製剤に対する真菌細胞の抵抗性を相殺させる製剤を同定する方法を提供する。この方法は次を含む：ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２Ｃ、ＹＬＬ０５３ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗを含むポリペプチドに試験物質を接触させる段階；および、前記試験物質とポリペプチドの相互作用を明らかにする段階：この際、相互作用とは、試験物質の抗真菌製剤に対する抵抗性を相殺させる製剤としての有用性を意味する。また、前記方法は、たとえば、前記試験物質および抗真菌製剤を真菌細胞と接触させ、前記細胞の生存または生長を評価することを含み得る。前記細胞は抗真菌製剤（例：ケトコナゾール）に対する抵抗性を有する細胞であってもよい。
【００９２】
他の態様において、本発明は次の段階を含む、前記人工転写因子によって調節される標的遺伝子を同定する方法を提供する：少なくとも２つのジンクフィンガードメインを各々含む互いに異なる人工転写因子を各々コーディングする複数の核酸を含む核酸ライブラリーを提供する段階；前記ライブラリーの各構成員を試験細胞の複製物に導入して複数の形質転換された細胞を提供する段階；前記形質転換された複数の細胞から、試験細胞に比べて表現型が変形された複数の表現型変換細胞（phenotypically altered cell）を同定する段階；および、前記複数細胞のうち、少なくとも２つの表現型変換細胞においてその量が同じように変化した少なくとも一つの転写体またはタンパク質を同定する段階。
【００９３】
一実施態様において、前記方法は、たとえば、試験細胞内における遺伝子変形（例：突然変異または過発現）または他の方法（例：ＲＮＡ干渉（interference）、アンチセンス（anti-sense）または抗体結合）によって少なくとも２つの表現型変換細胞においてその量が同じように変化した転写体またはタンパク質の活性を変化させることを含む。ある場合には、複数の転写体またはタンパク質の活性が変化する。
【００９４】
一実施態様において、前記複数の類似に変化した転写体またはタンパク質は各表現型変換細胞内の転写体またはタンパク質の量をプロファイリングし、各表現型変換細胞のプロファイルを提供し、該プロファイルを互いに比較することによって同定する。前記プロファイルは、たとえば、核酸またはタンパク質アレイ（array）、ＳＡＧＥ標識（tag）、ディファレンシャル・ディスプレー（differential display）または相殺ハイブリダイゼーション（subtractive  hybridization）などを用いて得られる。
【００９５】
一実施態様において、前記細胞はヒト癌細胞のような癌細胞である。前記一つ以上の同定された転写体は人工転写因子のない細胞には存在しない転写体である。
【００９６】
前記同定された転写体のうちの一つによってコーディングされるポリペプチドは標的と相互作用する試験化合物を検索するスクリーニングにおいて標的ポリペプチドとして使用できる。この試験化合物は標的ポリペプチドの活性を増大または抑制するかを決定するために分析できる。一実施態様において、前記試験化合物は１０、５、または２ｋＤａ以下の分子量を有する小分子である。
【００９７】
前記のすべての方法にキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸ライブラリーが使用できる。「ライブラリー」とは、類似するが同一ではない生分子（biomolecules）の物理的集合を意味する。前記集合は、たとえば、一つの容器（vessel）に集まるか、固体支持体上の分離された領域または分離された容器に（群または個別に）物理的に分離できる。ライブラリーの個別構成員は集合的に二重に存在してもよい。ライブラリーは１０、１０２、１０３、１０５、１０７または１０９以上の互いに異なる構成員または１０１３、１０１２、１０１０、１０９、１０７、１０５または１０３未満の互いに異なる構成員を含み得る。
【００９８】
代表的な第１のライブラリーは複数の核酸を含み、各核酸は少なくとも第１、第２および第３のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする。前記「第１、第２および第３」はポリペプチドにおいて如何なる順序でも存在できる３つの分離されたドメインを意味する：たとえば、各ドメインは他のドメインのいずれか一つまたは両方のＮ−末端またはＣ−末端に位置できる。第１のジンクフィンガードメインは複数の核酸間で多様に変わる。第２のジンクフィンガードメインも複数の核酸間で多様に変わる。少なくとも１０の互いに異なるジンクフィンガードメインがライブラリーに現れる。一実施態様において、ライブラリー構成員のうち少なくとも０．５、１、２、５％、１０％、または２５％は次の特性の一つまたは両方を示す。（１）各々は少なくとも一つのｐ１Ｇレポータープラスミドの転写をインビボで少なくとも１．２５倍抑制する；（２）各々は少なくとも一つの標的部位に７、５、３、２、１、０．５または０．０５ｎＭ以下の解離常数（dissociation constant）で結合する。第１および第２のジンクフィンガードメインは異なる天然型タンパク質から由来するか、天然型タンパク質内における整列とは異なる整列に位置してもよい。たとえば、第１および第２のジンクフィンガードメインはポリペプチド内で隣接するか、天然型タンパク質においては少なくとも一つの介在（intervening）ジンクフィンガードメインによって分離されていてもよい。
【００９９】
代表的な第２のライブラリーは少なくとも第１および第２のジンクフィンガードメインを含むポリペプチドをコーディングする核酸を複数含む。各ポリペプチドの第１および第２のジンクフィンガードメインは、（１）互いに異なる天然型タンパク質のジンクフィンガードメインと同じである（そして、一般的に同じ天然型タンパク質内に存在しないか、天然型タンパク質内の相対的位置とは異なる整列で位置する）、（２）天然型タンパク質のドメインと、４つ、３つ、２つまたは一つ以下のアミノ酸基が異なり、または（３）天然型タンパク質では隣接しないジンクフィンガードメインである。同じジンクフィンガードメインとは、第１の金属配位残基（主としてシステイン）から最後の金属配位残基（主としてヒスチジン）までの各アミノ酸が同じであるジンクフィンガードメインを意味する。第１のジンクフィンガードメインは複数の核酸間に多様で変化し、第２のジンクフィンガードメインも複数の核酸間で多様に変化する。天然型タンパク質は真核細胞由来のジンクフィンガータンパク質であってもよく：たとえば、真菌（例：酵母）、植物、または動物タンパク質（例：ヒトまたはネズミタンパク質のような哺乳類タンパク質）である。各ポリペプチドはまた第３、第４、第５および／または第６のジンクフィンガードメインを含み得る。各ジンクフィンガードメインはヒトのような哺乳類由来のジンクフィンガードメインであってもよい。
【０１００】
突然変異されたジンクフィンガードメインのような他の形態のライブラリーを使用することもできる。
【０１０１】
一実施態様において、ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸ライブラリーまたはそのようなタンパク質自体のライブラリーは異なる調節ドメインを有する構成員を含み得る。このライブラリーは、たとえば、活性化ドメインを有する少なくとも１０％の構成員と、抑制ドメインを有する少なくとも１０％の他の構成員とを含み得る。他の例において、少なくとも１０％は活性または抑制ドメインを有し、他の少なくとも１０％は調節ドメインを有しない。また他の例においては、一部は活性化ドメインを含み；他の一部は抑制ドメインを含み；残りは調節ドメインを全く含まない。たとえば、少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０％のような他の百分率を使用できる。
＊＊＊
【０１０２】
１．Ｎｅｕｒｏ１ｐ６５および関連分子
【０１０３】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１０４】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＫＨ  
Ｘ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＣＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：３６）、
【０１０５】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。また、前記整列は次のように略称する：ＱＳＮＲ−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：
【０１０６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＫＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：３７）、および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＫＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＣＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：３８）。  
【０１０７】
前記ポリペプチドは、たとえば、ネズミのＮｅｕｒｏ２ａ細胞に効果的な濃度で存在するとき神経突起を誘導し得る。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３または２個以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的（conservative）置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。たとえば、前記ポリペプチドは１０ｎＭ以下のＫｄを有し、標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＮｅｕｒｏ１ｐキメラＺＦＰ（配列番号：２）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性化または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは一つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１０８】
また、前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：２のアミノ酸を含む分離されたポリペプチドは配列番号：１の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー（enhancer）配列、インシュレーター（insulator）配列、非翻訳（untranslated）調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１０９】
さらに、本発明は、前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、少なくとも部分的に前記ポリペプチドによる帰結となる神経突起を拡張する神経細胞であってもよい。
【０１１０】
２．Ｏｓｔｅｏ１ｐ６５および関連分子
【０１１１】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１１２】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＴＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：３９）、
【０１１３】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。また、前記整列は次のように略称する：ＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１１４】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＴＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４０）；
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＴＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４１）；
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４２）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＴＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４３）。
【０１１５】
前記ポリペプチドは、たとえば、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株に効果的な濃度で存在するとき、骨芽細胞（osteoblasts）の他の標識またはアルカリホスファターゼを誘導できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：４内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：４内に存在するジンクフィンガードメイン内の８、６、４、３、または２つ未満の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：４内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。たとえば、前記ポリペプチドはＫｄ  １０ｎＭ未満で結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＯｓｔｅｏ１ｐキメラＺＦＰ（配列番号：４）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１１６】
また、前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：４のアミノ酸を含む分離されたポリペプチドは配列番号：３の配列を含む核酸によってコーディングされてよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体上に挿入されてもよい。
【０１１７】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、少なくとも部分的に人工キメラポリペプチドによる帰結となる骨芽細胞の表現型を有する幹細胞であってもよい。
【０１１８】
３．０８＿Ｄ０４＿６および関連分子
【０１１９】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１２０】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４４）、
【０１２１】
この際、Ｂは任意のアミノ酸または選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸または選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列はまた次のように略称する：ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ＶＳＳＲ。代表的な他の人工ポリペプチドは次を含む：  
【０１２２】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４５）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４６）
【０１２３】
前記ポリペプチドは、たとえば、ヒト２９３細胞に効果的な濃度で存在するとき、インシュリン遺伝子の発現を誘導できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：６内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：６内に存在するジンクフィンガードメイン内で８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：６内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ未満のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のために０８＿Ｄ０４＿６キメラＺＦＰ（配列番号：６）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１２４】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：６のアミノ酸を含む分離されたポリペプチドは配列番号：５の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結される。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１２５】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、少なくとも部分的に人工キメラポリペプチドによる帰結となるインシュリン遺伝子を発現するヒト細胞であってもよい。また、本発明は本願に記述された細胞をインビトロ内で培養することを含むインシュリン生産方法、または前記ポリペプチドまたはこれをコーディングする核酸を対象の細胞内に導入することによって対象でインシュリンを生産する方法を提供する。
【０１２６】
４．Ｐ＿Ｂ０８および関連分子
【０１２７】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１２８】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４７）、
【０１２９】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。また、前記整列は次のように略称する：ＱＳＮＲ−ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１３０】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４８）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：４９）。
【０１３１】
たとえば、該ポリペプチドは効果的な濃度で存在するとき、２９３細胞においてＳＶ４０−ＳＥＡＰレポーター構造体によってコーディングされるレポーターポリペプチドのような異種ポリペプチドの発現を増加できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：８のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：８内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：８内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＰ＿Ｂ０８キメラＺＦＰ（配列番号：８）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１３２】
また、前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：８のアミノ酸を含む分離されたポリペプチドは配列番号：７の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１３３】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、増加された異種ポリペプチドの生産を有する哺乳動物細胞であってもよい。
【０１３４】
５．Ｋ＿Ｄ１０および関連分子
【０１３５】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１３６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＮＪＸＱＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５０）、
【０１３７】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列はまた次のように略称する：ＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：
【０１３８】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＮＪＸＱＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５１）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＷＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５２）。
【０１３９】
前記ポリペプチドは哺乳動物細胞内に十分な濃度で存在する場合細胞の増殖を少なくとも３０、４０、５０または６０％減少できる。細胞増殖は予定された培養（incubation）時間後の細胞数によって評価される。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：１０内のジンクフィンガー整列と同じであるか、または配列番号：１０内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：１０内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ＿Ｄ１０キメラＺＦＰ（配列番号：１０）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性化または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１４０】
また、前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：１０のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：９の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１４１】
さらに、本発明は、前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞はまた核酸を発現する。前記宿主細胞は、たとえば、ポリペプチドを含まない同一細胞に比べて細胞増殖速度が減少した哺乳動物細胞であってもよい。
【０１４２】
６．Ｋ＿Ｆ０２および関連分子
【０１４３】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１４４】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＡＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＥＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５３）、
【０１４５】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列は次のように略称する：ＤＳＡＲ−ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ−ＱＴＨＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１４６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＥＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）（配列番号：５４）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＤＸＳＡＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＥＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５５）。
【０１４７】
前記ポリペプチドは２９３細胞のような哺乳動物細胞において少なくとも５０、１００または１２０％まで細胞の増殖を増加できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：１２のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：１２内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：１２内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ＿Ｆ０２キメラＺＦＰ（配列番号：１２）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１４８】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：１２のアミノ酸を含む分離されたポリペプチドは配列番号：１１の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターまたは細胞特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に導入されてもよい。
【０１４９】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、ポリペプチドを含まない同一細胞に比べて増加した細胞増殖速度を有する哺乳動物細胞であってもよい。
【０１５０】
７．Ｋ１２＿Ａ１１および関連分子
【０１５１】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１５２】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＦＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５６）。
【０１５３】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列は次のように略称する：ＲＤＨＴ−ＱＳＮＶ−ＱＴＨＲ−ＱＦＮＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１５４】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５７）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＦＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５８）
【０１５５】
前記ポリペプチドは哺乳動物細胞内でウイルスプロモーターのような強力なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子のような異種遺伝子の発現を増加できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２６０のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２６０内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２６０内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ１２＿Ａ＿１１キメラＺＦＰ（配列番号：２６０）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。Ｋ１２＿Ａ＿１１キメラＺＦＰは抑制ドメインを含んでいるので、異種遺伝子のプロモーターに直接結合することによって異種遺伝子の発現を増加させ得る。
【０１５６】
また、前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：２６０のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：２５９の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような調節配列に作動可能に連結されたことを含み得る。一実施態様において、前記コーディング核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に導入されてもよい。
【０１５７】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。
【０１５８】
８．Ｋ４４−１６−Ｅ１２および関連分子
【０１５９】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１６０】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：５９）、  
【０１６１】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列は次のように略称する：ＱＳＨＶ−ＱＳＳＲ−ＱＴＨＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１６２】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６０）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６１）。
【０１６３】
前記ポリペプチドは哺乳動物細胞内でウイルスプロモーターのような強力なプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子のような異種遺伝子の発現を増加できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２６２のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２６２内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２６２内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ４４−１６−Ｅ１２キメラＺＦＰ（配列番号：２６２）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。Ｋ４４−１６−Ｅ１２キメラＺＦＰは抑制ドメインを含んでいるので、異種遺伝子のプロモーターに直接結合することによって異種遺伝子の発現を増加させないであろう。
【０１６４】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：２６２のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：２６１の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１６５】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。前記宿主細胞は、たとえば、増加された異種タンパク質生産の表現型を有する２９３細胞のような哺乳動物細胞であってもよい（例：ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された遺伝子によってコーディングされる分泌および細胞内のレポータータンパク質）。
【０１６６】
９．Ｋ１３＿Ｂ０８および関連分子
【０１６７】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１６８】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６２）、
【０１６９】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。前記整列は次のように略称する：ＱＳＮＲ−ＱＳＳＲ−ＱＴＨＲ−ＲＤＫＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：
【０１７０】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＫＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６３）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＳＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６４）。
【０１７１】
前記ポリペプチドは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子によってコーディングされるＳＥＡＰタンパク質に対して増加したＳＥＡＰ生産を惹起し得る。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２６４のジンクフィンガー整列と同じであるかまたは配列番号：２６４内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２６４内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ１３＿Ｂ０８キメラＺＦＰ（配列番号：２６４）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１７２】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：２６４のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：２６３の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー（enhancer）配列、インシュレーター（insulator）配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターや細胞特異的プロモーターのような条件的プロモーターに作動可能に連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか染色体内に挿入されてもよい。
【０１７３】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現できる。
【０１７４】
１０．Ｆ１０４＿ｐ６５および関連分子
【０１７５】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１７６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６５）、
【０１７７】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。この整列は次のように略称する：ＲＤＨＴ−ＲＳＨＲ−ＱＳＨＲ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：  
【０１７８】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６６）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６７）。
【０１７９】
たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：１８のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：１８内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：１８内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＦ１０４＿ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：１８）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０１８０】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：１８のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：１７の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１８１】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現する。
【０１８２】
１１．Ｆ１２１＿ｐ６５および関連分子
【０１８３】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１８４】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６８）、
【０１８５】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；また、Ｊは任意のアミノ酸または選択的に疎水性アミノ酸である。該整列は次のように略称する：ＱＳＨＴ−ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ。他の人工ポリペプチドの例は次を含む：
【０１８６】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＨＪＸＴＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：６９）；および
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＴＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＳＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：７０）。
【０１８７】
たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２０のジンクフィンガー整列と同じであるか、または配列番号：２０内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２０内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＦ１２１＿ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：２０）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。前記ポリペプチドは、たとえば、インシュリン−類似成長因子２（insulin-like growth factor-2）の発現を調節するのに使用されてもよい。
【０１８８】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：２０のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：１９の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１８９】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現する。
【０１９０】
１２．Ｋ４４−１１−Ｄ０１とＫ４４−１１−Ｇ１２および関連分子
【０１９１】
また他の態様において、本発明は次の配列を含む人工ポリペプチドを提供する：
【０１９２】
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＮＪＸＩＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＣＸＳＮＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：２６５），
ＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＳＨＪＸＶＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＶＸＳＴＪＸＲＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＲＸＤＮＪＸＱＨＸ（３−５）ＨＸ（１−６）ＢＸＣＸ（２−５）ＣＸＸＸＢＸＱＸＴＨＪＸＲＨＸ（３−５）Ｈ（配列番号：２６６）、
【０１９３】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。この整列は次のように略称する：ＱＳＨＶ−ＳＱＮＩ−ＱＴＨＲ−ＣＳＮＲおよびＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ。
【０１９４】
たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：１４または配列番号：１６のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２０内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：１４または１６内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＦ１２１＿ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：１４または１６）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。ポリペプチドは、たとえば、タンパク質生産を調節するのに使用できる。
【０１９５】
前記ポリペプチドをコーディングする核酸を提供する。たとえば、配列番号：１４または１６のアミノ酸を含むポリペプチドは配列番号：１３または１５の配列を含む核酸によってコーディングされてもよい。提供された核酸はプロモーター配列、エンハンサー配列、インシュレーター配列、非翻訳調節配列、ポリＡ添加部位などのような、作動可能に連結された調節配列を含み得る。一実施態様において、前記核酸は誘導プロモーターまたは細胞−型特異的プロモーターのような条件的プロモーターに連結されている。前記核酸はベクターに含まれるか、染色体内に挿入されてもよい。
【０１９６】
さらに、本発明は前記ポリペプチドを含む宿主細胞（例：哺乳類宿主細胞）を提供する。この宿主細胞は前記核酸を含み、発現する。
【０１９７】
＊＊＊
本願において、「解離常数（dissociation constant）」は、一つの９−塩基対標的部位を含む２８−塩基対二本鎖ＤＮＡとの結合に関するポリペプチドの平衡解離常数を意味する。解離常数は、室温で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．７、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μＭ  ＺｎＳＯ４  １０％グリセロール、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５ｍＭ  ＤＴＴおよび０．１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）中で結合精製タンパク質を用いたゲルシフト分析（Gel Shift Assay）によって決定する。追加的な細部事項は実施例１０およびレバーとパボの方法（RebarとPabo, Science, 263, 671-673, 1994）に提示されている。
【０１９８】
本発明の「スクリーニング」は、所定の特性を有する少なくとも一つの特定の構成員を検索するためにライブラリー構成員を分析する過程を意味する。たとえば、各細胞が神経突起を拡張するかどうかを分析する。スクリーニングの他の形態である「選別」においては、各構成員を直接的に分析しない。かえって、特定の形質を有する構成員だけが残る条件下で、構成員を対象とする分析を行う。選別は生存（例：薬剤抵抗性）または表面結合（例：基質への接着）などによって媒介されてもよい。このような選別過程は「スクリーニング」の概念に含まれる。
【０１９９】
「塩基接触部位」、「ＤＮＡ接触部位、または「核酸接触部位」はＺＩＦ２６８のアルギニン７３、アスパラギン酸７５、グルタミン酸７６およびアルギニン７９のアミノ酸部位に構造的に相応するジンクフィンガードメインの４つのアミノ酸位置を意味する。
【０２００】
【化１】
2005511049.tif 000003
【０２０１】
このような位置は各々−１、２、３および６の位置を意味する。塩基接触位置（base contacting position）に相応する疑問（query）配列における部位を同定するために、疑問配列は、疑問配列のシステインおよびヒスチジン残基がＺｉｆ２６８のフィンガー３のシステインおよびヒスチジン残基と整列するように目標のジンクフィンガードメインに整列される。ヨーロッパバイオインフォマティクス連合（Thompsonら(1994)Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）のＣｌｕｓｔａｌＷ  ＷＷＷサービスはこのような配列整列のための便利な方法を提供する。
【０２０２】
保存的アミノ酸置換は類似の側鎖（side chain）を有する残基の相互交換を意味する。たとえば、脂肪族（Aliphatic）側鎖を有するアミノ酸基はグリシン、アラニン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル（aliphatic-hydroxyl）側鎖を有するアミノ酸基はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸基はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸基はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸基はリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；酸性側鎖を有するアミノ酸基はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり；および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基はシステインおよびメチオニンである。状況に応じて、同じ群に属するアミノ酸は相互交換可能である。追加的な保存的アミノ酸置換群はバリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラニン−バリン；アスパラギン酸−グルタミン酸；およびアスパラギン−グルタミンである。
【０２０３】
「異種ポリペプチド」は、天然型配列を有するポリペプチド（例：雑種（hybrid）ポリペプチド）または天然型ポリペプチドと同一配列を有するが、天然型ではない中間体として存在するポリペプチドを意味する。
【０２０４】
「ハイブリッド」および「キメラ」は、次から由来するアミノ酸配列を含む非−天然型ポリペプチドを意味する：（ｉ）少なくとも２つの天然型配列、または同じ天然型配列の隣接しない領域であって、ハイブリッド内で隣接する該領域；（ii）少なくとも一つの人工配列（例：天然型ではない配列）および少なくとも一つの天然型配列；または（iii）少なくとも２つの人工配列（同一または相違）。人工配列の例は、天然型配列の突然変異体または新規にデザインされた配列を含む。「人工配列」は天然型配列中に存在しない。ここで記述された任意の人工配列（タンパク質、核酸）に関連して、本発明は同一要素を有する配列を意味するが、次のように全体ゲノム配列が明らかにされた有機体内には存在しない：人類（Homo sapiens）、ハツカネズミ類（Mus musculus）、シロイヌナズナ類（Arabidopsis thaliana）、ショウジョウバエ類（Drosophila melanogaster）、大腸菌類（Escherichia coli）、酵母類（Saccharomyces cerevisiae）、およびイネ類（Oryza sativa）。前記配列を有する分子は前記有機体中の一つの細胞内の異種分子として発現できる。
また、本発明は本願に記述された方法によって製造された配列（必然的に「人工」の概念ではない）を含む。その方法は、たとえば、互いに異なるジンクフィンガードメインをコーディングする核酸配列を連結する方法または表現型スクリーニングの方法である。本発明はそのような配列を含む細胞を提供する。
【０２０５】
本発明の「厳格な条件下のハイブリダイゼーション」は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）、４５℃の条件下でハイブリッド化した後、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃で２回洗浄する条件を意味する。
【０２０６】
「結合優位（binding preference）」は、他の部位に比べて一つの核酸結合部位を選択するポリペプチドの特性を区別することを意味する。たとえば、ポリペプチドが２つの互いに異なる核酸結合部位に結合できる量的制限があるとき、ポリペプチドがインビボまたはインビトロで他の部位に優先してさらに多く結合する部位を意味する。
【０２０７】
「対照細胞」はすべての種類の標準細胞を意味する。一例において、対照細胞はジンクフィンガータンパク質を発現する細胞の母細胞である。すなわち、ジンクフィンガータンパク質を発現する細胞と実質的に同じであるが、ジンクフィンガードメインを生成しない細胞を意味する。
【０２０８】
多くの長所のうち、多くの方法および組成は新規かつ有用なキメラタンパク質、すなわち、キメラ転写因子の同定および利用に関わっている。一部の実施態様は少なくとも一つの次のような長所を含む：ｉ）細胞内の遺伝子の発現を増大または減少するように調節できる。ある所定の人工キメラ転写因子も適切な転写活性化ドメインとの融合または抑制ドメインとの融合によって転写活性体または阻害体に変換できる。また、転写調節ドメインがなくても、たとえば、ＴＡＴＡボックスおよび開始部位（initiator element）の近くに結合することによって、キメラ転写因子が強力な阻害体になれる。また、互いに異なるＤＮＡ結合特異性を有する活性体および阻害体の両方を含むライブラリーのスクリーニングも可能である。ii）遺伝子発現を細密に調節できる。ＤＮＡ−結合親和力によって、キメラ転写因子は、たとえば、中間乃至強い活性化および抑制のような範囲の効果を惹起できる。これは完全な非活性化または特定の標的遺伝子の高い水準の過発現によってのみ得られるものではない様々な表現型として現れる。たとえば、目的とする表現型を推進するためにいくつかの遺伝子の協同作業が要求される場合、幅広い特異性が利点となり得る。他の場合は、狭い特異性が要求される。特異性を柔軟に調節する一つの方法は、ジンクフィンガードメインを挿入または除去することである。３−フィンガーＺＦＰｓは理論的に６−フィンガーＺＦＰｓよりもさらに多くの遺伝子を調節する。iii）ＺＦＰライブラリー接近法を幅広く適用できる。転写調節機構は高度に維持されており、すべての公知の有機体は生きている間ＤＮＡおよび転写を使用するので、ＤＮＡに結合したキメラタンパク質はある目的とする細胞に対しても使用できる。また、ここに記述された多くの方法は有用なキメラタンパク質を同定するために細胞に対する先験的情報（例：ゲノム配列）を要求しない。ｖ）ＺＦＰ−ＴＦは主転写調節因子のような主調節タンパク質の機能を模倣できる。たとえば、ＺＦＰ−ＴＦは主調節タンパク質と同じ部位に結合するか、重なる部位に結合してもよい。vi）遺伝子発現変化の水準およびこれによるＺＦＰ−ＴＦによって生成した表現型の範囲は細胞内のＺＦＰ−ＴＦの発現程度を変化させることによって細密に調節できる。
【０２０９】
本願に記述されたすべての特許、特許出願および参考文献は参照によって完全に援用される。次の特許出願：ＷＯ  ０１／６０９７０（キムら）；米国出願第６０／３３８，４４１号；米国出願第６０／３１３，４０２号；米国出願第６０／３７４，３５５号；米国出願第６０／３７６，０５３号；米国出願第６０／４００，９０４号；米国出願第６０／４０１，０８９号；および米国出願第１０／２２３，７６５号はすべての目的で参照によって完全に明白に援用される。本発明の少なくとも一つの態様による細部事項は添付の図面および下記明細書に示されている。本願に記述されたある特徴も本願に説明された他の両立可能な（compatible）特徴と組合せて使用できる。本発明の他の特徴、目的および利点は明細書および図面、および請求項から明らかになるであろう。
【発明の詳細記述】
【０２１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の一態様において、細胞または個体の表現形質を変化させるキメラタンパク質を同定するために、互いに異なる人工キメラタンパク質をコーディングする核酸のライブラリーをスクリーニングする。キメラタンパク質は特定の標的遺伝子または経路に対する先知識がなくても同定できる。
【０２１１】
一例において、ライブラリーの各核酸は複数のジンクフィンガードメインを含む人工ポリペプチドをコーディングする。たとえば、前記のように別のキメラタンパク質をコーディングする核酸ライブラリーを製作できる。ライブラリー構成員は個々の細胞または培養中の細胞に導入できる。コーディングされたポリペプチドの発現のための時間が経った後、変形された表現形質を有する細胞または有機体を同定する。形質が変形された細胞のうち少なくとも一つにおいてライブラリー核酸が回収され、表現型に影響を与えるキメラポリペプチドを同定するようになる。
【０２１２】
このような方法は、下記では一般的にキメラジンクフィンガードメインの側面で記述したが、他のＤＮＡ結合ドメインまたは細胞信号（signal）ドメインを含む他の構造ドメインに容易に適用可能である。
【０２１３】
ライブラリーの製作：１．構造ドメインの例
【０２１４】
核酸ライブラリーは少なくとも一つの構造ドメインのキメラ人工タンパク質をコーディングし、発現できる核酸を含むように製作される。ある態様においては、構造ドメインは、様々な結合特異性を有するタンパク質をコーディングするライブラリーのように、様々な特異性を有する核酸結合ドメインである。
【０２１５】
様々な構造ドメインは優れた親和度および優れた特異性を有する核酸に結合すると知られている。二本鎖ＤＮＡを認識する構造的モチーフに対する概説として文献［PaboとSauer (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:1053-95; PatikoglouとBurley (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:289-325; Nelson (1995) Curr Opin Genet Dev. 5:180-189]がある。核酸結合ドメインのいくつかの例は次を含む:
【０２１６】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガーは約３０個のアミノ酸残基からなる小さいポリペプチドドメインであって、そのうち、システインまたはヒスチジンからなる４個のアミノ酸残基が適切に配置されて亜鉛イオンと配位結合ができる（総説としては、たとえば、文献［Klug and Rhodes (1987) Trends Biochem. Sci. 12: 464-469 (1987); Evans and Hollenberg, (1988) Cell 52: 1-3; Payre and Vincent (1988) FEBS Lett. 234: 245-250; Miller et al., (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:99-102；およびRosenfeld and Margalit, (1993) J. Biomol. Struct. Dyn. 11: 557-570］を参照）。したがって、ジンクフィンガードメインは亜鉛イオンと配位結合する残基の種類によって、たとえば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２類、Ｃｙｓ２−Ｃｙｓ２類、Ｃｙｓ２−ＣｙｓＨｉｓ類などに分類できる。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーにおいて亜鉛と配位結合する残基は典型的に次のように配置されている：
【０２１７】
Ｘａ−Ｘ−Ｃ−Ｘ２−５−Ｃ−Ｘ３−Ｘａ−Ｘ５−Ψ−Ｘ２−Ｈ−Ｘ３−５−Ｈ（配列番号：７２）
【０２１８】
ここで、Ψ（プサイ）は疎水性残基であり（Wolfe et al., (1999) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 3:183-212）、「Ｘ」は任意のアミノ酸を示し、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、下付きはアミノ酸の個数を示し、ハイフンでつないだ２つの下付きは介入アミノ酸の典型的な範囲を示す。普通、介入するアミノ酸はフォールディングされてα−へリックスに対して充填される逆平行（anti-parallel）β−シートを形成するが、β−シートが短く、非理想的、または存在しない場合もある。フォールディングによって、亜鉛と配位結合する側鎖が亜鉛イオンと配位結合するのに適合な四面体構造を有するように配置される。塩基接触残基はフィンガーのＮ−末端に位置し、先行するループ領域内にある。
【０２１９】
便宜のために、ジンクフィンガードメインの主なＤＮＡ接触残基を次の例に基づいて−１、２、３および６として番号付けた：
【０２２０】
-1 1 2 3 4 5 6
Xa-X-C-X2-5-C-X3-Xa-X-C-X-S-N-Xb-X-R-H-X3-5-H (配列番号：７３)、
【０２２１】
ここで、Ｘａはフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘｂは疎水性残基である。
【０２２２】
前記例に示したように、ＤＮＡ接触残基はシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）およびアルギニン（Ｒ）である。前記モチーフはＣＳＮＲに略記できる。本明細書に使用されたように、そのような略記は前記モチーフに相応するドメインを含む一部類の配列をいう。前記部類はまた、特定のポリペプチド配列、通常、前記モチーフに相応する表１または２に記載の配列を含む配列を有する種（species）を含む。２つの配列が同じモチーフを有する場合、各配列を区別するために数字を使用できる。
【０２２３】
ジンクフィンガータンパク質は通常、直列に配置された３つ以上のジンクフィンガードメインから構成できる。たとえば、モチーフが連続的に記載されたジンクフィンガードメインには、他のフォールディングされたドメインが散在してはいないが、ドメインの間に本明細書に記述された柔軟なリンカーのようなリンカーを含み得る。
【０２２４】
ジンクフィンガードメイン（「ＺＦＤ」）は最もありふれた真核生物ＤＮＡ−結合モチーフ中の一つであって、酵母から高等植物およびヒトに至る様々な種から発見される。ヒトゲノムにも数千個以上、たぶん４，５００個以上のジンクフィンガードメインが存在すると推測される。ジンクフィンガードメインはジンクフィンガータンパク質から同定されるか、それから単離できる。ジンクフィンガータンパク質の非制限的な例としては、ＣＦ２−ＩＩ；クルッペル（Kruppel）；ＷＴ１；バソヌクリン（basonuclin）；ＢＣＬ−６／ＬＡＺ−３、赤血球クルッペル−類似転写因子；転写因子Ｓｐ１、Ｓｐ２、Ｓｐ３およびＳｐ４；転写抑制剤ＹＹ１；ＥＧＲ１／Ｋｒｏｘ２４；ＥＧＲ２／Ｋｒｏｘ２０；ＥＧＲ３／Ｐｉｌｏｔ；ＥＧＲ４／ＡＴ１３３；Ｅｖｉ−１；ＧＬＩ１；ＧＬＩ２；ＧＬＩ３；ＨＩＶ−ＥＰ１／ＺＮＦ４０；ＨＩＶ−ＥＰ２；ＫＲ１；ＺｆＸ；ＺｆＹ；およびＺＮＦ７などがある。
【０２２５】
後述する電算化方法を用いて配列が明らかになったゲノムまたは核酸データベース中にコーディングされたすべてのジンクフィンガードメインを同定できる。そのようなジンクフィンガードメインはどれでも使用できる。また、電算化方法などの人為的ジンクフィンガードメインがデザインされている（例：Dahiyat and Mayo, (1997) Science 278: 82-7）。
【０２２６】
少なくともいくつかのジンクフィンガードメインはＲＮＡまたはタンパク質のような非−ＤＮＡリガンドに結合する。したがって、ジンクフィンガードメインのキメラまたはジンクフィンガードメインと異なるタイプのドメインのキメラがただＤＮＡだけでなく、様々な標的化合物を認識して使用できる。ＷＯ０１／６０９７０、米国特許出願第６０／３７４，３５５号（出願日：２００２年４月２２日）および米国特許出願第１０／２２３，７６５号（出願日：２００２年８月１９日）は人工ジンクフィンガータンパク質を製作するために使用できる例示的なジンクフィンガードメインを記述している。また、下記表１参照。
【０２２７】
ホメオドメイン
ホメオドメインは、ＤＮＡの副溝（minor groove）と接触するＮ−末端アーム、および、次いで主溝（major groove）と接触する３つのα−ヘリックスから構成された簡単な真核生物ドメインである（たとえば、Laughon, (1991) Biochemistry 30: 11357-67参考）。３番目のα−ヘリックスは主溝に位置し、最も重要なＤＮＡ−接触側鎖を含有する。ホメオドメインは三番目のα−ヘリックスに至る転換点（turn）に存在する高度に保存されたモチーフを有する。このモチーフは、ドメインの疎水性コア中に充填される不変のトリプトファンを含む。このモチーフは、プロサイト（Prosite）データベース（Falquet et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:235-238参照）にＰＤＯＣ０００２７（［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｙ／Ｇ］−［Ａ／Ｓ／Ｌ／Ｖ／Ｒ］−Ｘ（２）−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｃ／Ｎ］−Ｘ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ］−Ｘ  （４）−［Ｌ／Ｉ／Ｖ］−［Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｅ／Ｓ／Ｔ／Ａ／Ｉ／Ｙ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｆ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｋ／Ｈ］−Ｗ−［Ｆ／Ｙ／Ｖ／Ｃ］−Ｘ−［Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｔ／Ａ／Ｈ］−Ｘ（５）−［Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｗ］；配列番号：７７）として公知である。ホメオドメインは細胞同一性を決定し、有機体の発生過程中に位置的な情報を提供する転写因子から普通発見される。そのような古典的なホメオドメインは、ゲノム上にクラスター（cluster）の形で存在するが、クラスターのホメオドメインの順序はボディー軸（body axis）に沿ってそれらの発現パターンにほぼ相応する。ホメオドメインは、たとえば、Ｈｏｘ−１のようなホメオドメインとの整列（alignment）によって、またはホメオドメインプロファイルまたはホメオドメインヒドン・マルコフ・モデル（hidden Markov Model；ＨＭＭ；下記参照）、たとえば、ＰｆａｍデータベースのＰＦ０００４６またはＳＭＡＲＴデータベースの「ＨＯＸ」との整列によって、または前記プロサイトモチーフＰＤＯＣ０００２７によって同定できる。
【０２２８】
ヘリックス・ターン・ヘリックスタンパク質
このＤＮＡ結合モチーフは多くの原核生物転写因子から普通発見される。たとえば、ＬａｃＩ族、ＡｒａＣ族など多くの亜族がある。名称における２つのヘリックスは、二番目のα−ヘリックスをＤＮＡの主溝内に配置させ、その主溝に対して充填される一番目のα−ヘリックスおよび前記二番目のα−ヘリックスをいう。これらのドメインはＨＭＭ、たとえば、ＳＭＡＲＴデータベースから得られるＨＴＨ＿ＡＲＡＣ，ＨＴＨ＿ＡＲＳＲ，ＨＴＨ＿ＡＳＮＣ，ＨＴＨ＿ＣＲＰ，ＨＴＨ＿ＤＥＯＲ，ＨＴＨ＿ＤＴＸＲ，ＨＴＨ＿ＧＮＴＲ，ＨＴＨ＿ＩＣＬＲ，ＨＴＨ＿ＬＡＣＩ，ＨＴＨ＿ＬＵＸＲ，ＨＴＨ＿ＭＡＲＲ，ＨＴＨ＿ＭＥＲＲおよびＨＴＨ＿ＸＲＥプロファイルとの整列によって同定できる。
【０２２９】
ライブラリーの製作：２．構造ドメインの同定
【０２３０】
様々な方法を用いて構造ドメインを同定できる。同定されたドメインをコーディングする核酸は核酸ライブラリーの製作に用いられる。また、このようなドメインをコーディングする核酸はライブラリーによってコーディングされる追加のドメインを提供するために多様化（例：突然変異）できる。
【０２３１】
電算化方法（Computational Method）
【０２３２】
本明細書に記述された方法によって単離されたＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を公知の配列のデータベース、たとえば、タンパク質配列を注釈したデータベースまたは核酸結合ドメインに対する記入を含む注釈を付けたデータベースと比較できる。また他の実施態様において、特徴づけられていない配列、たとえば、注釈づけられていないゲノム配列、ＥＳＴまたは全長ｃＤＮＡ配列のデータベース；特徴づけられた配列のデータベース、たとえば、SwissProtまたはＰＤＢ；およびドメインのデータベース、たとえば、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍ（Corpet et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:267-269）、およびＳＭＡＲＴ（Simple Modular Architecture Research Tool, Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244）が核酸結合ドメイン配列の供給源（source）を提供できる。疑問アミノ酸配列と比較するために、核酸配列データベースをすべての６個のリーディング・フレーム（reading frame）で翻訳できる。候補核酸結合ドメインをコーディングするものと標識された核酸配列を適合な核酸供給源、たとえば、ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡから増幅できる。そのような核酸配列を発現ベクターにクローニングできる。コンピュータに基づくドメイン同定の前記過程をオリゴヌクレオチド合成器およびロボットシステムと提携して高い作業処理能力でドメインをコーディングする核酸を生産できる。候補ドメインをコーディングするクローニングされた核酸を宿主発現ベクターに貯蔵し、制限酵素−媒介サブクローニングまたは部位−特異的組換え酵素−媒介サブクローニング（米国特許第５，８８８，７３２号参照）によってＺｉｆ２６８フィンガー１および２とともに発現ベクター、たとえば、翻訳融合ベクターに容易に導入できる。このような高い作業処理能力を有する方式で異なる候補核酸結合ドメインをコーディングする核酸を含有する複数のマイクロタイタープレートを生成できる。
【０２３３】
出発配列またはプロファイルからドメインを同定する詳細な方法は当業界に周知されている。たとえば、プロサイト（［Hofmann et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27:215-219］参照）、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ（［Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10］参照）などを参照。簡単なストリング（string）検索を行って疑問配列または疑問プロファイルに対する同一性を有するアミノ酸配列を見つけることができ、たとえば、Ｐｅｒｌを用いてテキストファイルをスキャンできる。このように同定された配列は初期入力配列に対して約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の同一性を示す。
【０２３４】
疑問ドメインと類似するドメインを共用のデータベース、たとえば、文献［Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10］のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて同定できる。たとえば、スコア＝５０、単語長さ＝３のＸＢＬＡＳＴパラメーターを用いてＢＬＡＳＴタンパク質の検索を行うことができる。文献［Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402］に記述されたように、疑問配列または検索された配列に間隔（gaps）を導入できる。ＸＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムに対するデフォルト変数はアメリカのメリーランド州ベセスダに所在する国立保健院内の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から求められる。
【０２３５】
プロサイトプロファイルＰＳ０００２８およびＰＳ５０１５７を用いてジンクフィンガードメインを同定できる。ＳＷＩＳＳＰＲＯＴが発表した８０，０００個のタンパク質配列のうちには上記の２つのプロファイルは各々３１８９および２３１６個のジンクフィンガードメインと検索される。様々な異なる技法を用いて関連タンパク質の多重配列整列からプロファイルを構築できる。グリブスコフ（Gribskov）ら［Gribskov et al., (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159］は、シンボル比較表を用いて残基頻度分布が提供された多重配列整列を各位置に対する加重値に転換した。たとえば、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースおよび文献［Luethy et al., (1994) Protein Sci. 3:139-1465］を参照。
【０２３６】
目標のＤＮＡ結合ドメインのヒドン・マルコフ・モデル（Hidden Markov Models；ＨＭＭ’ｓ）は、たとえば、Ｐｆａｍデータベース、リリース２．１のようなそのようなモデルのデータベースから生成するか、得られる。追加的なドメインを発見するために、たとえば、前記デフォルト変数を用いてＨＭＭでデータベースを検索できる（例：Bateman et al. (2002) Nucleic Acids Research 30:276-280参照）。または、使用者は前記パラメーターを最適化できる。境界スコア（threshold score）を選択して配列データベースを濾過することによって、境界以上のスコアを有する配列が候補ドメインとして表示されるようにできる。Ｐｆａｍデータベースの説明は文献［Sonhammer et al., (1997) Proteins 28(3):405-420］にあり、ＨＭＭに関する詳細な説明は、たとえば、文献［Gribskov et al., (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al,. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al., (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531;およびStultz et al., (1993) Protein Sci. 2:305-314］にある。
【０２３７】
ＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Simple Modular Architecture Research Tool, Schultz et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857；およびSchultz et al., (2000) Nucl. Acids Res 28:231）は、ＨＭＭｅｒ２検索プログラム（Durbin et al., (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press.）のヒドン・マルコフ・モデルでプロファイルすることによって、同定されたジンクフィンガードメインのカタログ（ＺｎＦ＿Ｃ２Ｈ２；ＺｎＦ＿Ｃ２Ｃ２；ＺｎＦ＿Ｃ２ＨＣ；ＺｎＦ＿Ｃ３Ｈ１；ＺｎＦ＿Ｃ４；ＺｎＦ＿ＣＨＣＣ；ＺｎＦ＿ＧＡＴＡ；およびＺｎＦ＿ＮＦＸ）を提供する。
【０２３８】
ハイブリダイゼーションに基づく方法
【０２３９】
様々な形態のＤＮＡ結合ドメインをコーディングする核酸集合体を分析してアミノ末端およびカルボキシ末端の保存された境界部配列をコーディングする配列プロファイルが得られる。そのような保存された境界部配列をコーディングする配列にハイブリダイゼーションできる縮退オリゴヌクレオチドをデザインできる。また、そのような縮退オリゴヌクレオチドの有効性はそれらの組成と公知のゲノム配列上の可能なアニーリング部位の頻度を比較することによって評価できる。複数の反復されたデザインによって縮退オリゴヌクレオチドを最適化できる。たとえば、公知のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを比較することによって天然型配列中の隣接フィンガーの間のリンカー領域の共通配列を明らかにている（文献［Agata et al., (1998) Gene 213:55-64］参照）。そのような縮退オリゴヌクレオチドは複数のＤＮＡ結合ドメインを増幅させるのに用いられる。増幅されたドメインを試験ジンクフィンガードメインとしてハイブリッド核酸中に挿入し、後続的に本明細書に記述された方法に従って標的部位に対する結合を分析する。
【０２４０】
ライブラリーの製作：３．構造ドメインをコーディングする核酸
【０２４１】
ライブラリーを構成するのに用いられる核酸は様々な方法によって得られる。ライブラリー核酸成分の一部の構成員は天然型ドメインをコーディングできる。さらに、一部の核酸構成員は他の無作為的方法または突然変異によって得られた変異体である。一般的に、単一ドメインのみをコーディングする構成核酸は、他のドメインとの融合体をコーディングする核酸を創出するために互いに組合せることができる。
【０２４２】
天然型ドメインの分離
【０２４３】
ドメインのライブラリーをヒトのような真核生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから構築できる。このため、複数の方法を用いることができる。たとえば、前述のように、利用可能なアミノ酸配列の電算検索でドメインを同定できる。核ドメインをコーディングする核酸を単離し、たとえば、プロモーター、活性化ドメインおよび選別マーカーを含有するベクターのような、細胞内発現に適したベクター内に挿入できる。また他の実施態様において、保存されたモチーフにハイブリダイゼーションする縮退オリゴヌクレオチドを用いて、たとえば、ＰＣＲによって該モチーフを含有する複数の関連ドメインを増幅させる。たとえば、クルッペル−類似Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガーを文献（Agataら（1998） Gene 213:55-64）の方法によって増幅できる。この方法はまた、たとえば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）−（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）−Ｐｒｏ−（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（配列番号：７４）のパターンを有する配列である、天然型ジンクフィンガードメインリンカーペプチド配列を保有する。しかも、非選別的ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ配列のライブラリーをスクリーニングすることとは異なり、目標のドメインに制限された集合をスクリーニングすることは、ライブラリー複雑性が非常に減少し、大規模のライブラリーを完全にスクリーニングすることの内生的な難しさによって目的とする配列を落とす可能性を減少させる。
【０２４４】
ヒトゲノムは複数のジンクフィンガードメインを含有し、このうち、多数は特性化および同定されていない。ジンンクフィンガードメインを有するタンパク質をコーディングする数千個の遺伝子があることと推定される（Pellegrino and Berg, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:671-675）。これらのヒトジンクフィンガードメインは、新規なＤＮＡ−結合タンパク質を構築できる様々なドメインの広範囲な集合である。ヒトジンクフィンガードメインの多くの例は２００２年８月１９日に出願されたＷＯ０１／６０９７０、米国出願第６０／３７４，３５５号（出願日：２００２年４月２２日）および米国出願第１０／２２３，７６５号によく示されている。下記表１を参考できる。
【０２４５】
【表１】
2005511049.tif 000004
2005511049.tif 000005
【０２４６】
各ジンクフィンガードメインがユニークな３−〜４−ｂｐ配列を認識する場合、すべての可能な３−〜４−ｂｐ配列に結合するのに必要なドメインの総数はただ６４〜２５６（４３〜４４）個である。ヒトゲノムの天然型目録がすべての可能な認識部位を特異的に認識できる十分な数のユニークなジンクフィンガードメインを含有できる。これらのジンクフィンガードメインは人工キメラＤＮＡ−結合タンパク質を構築するための貴重な供給源である。核酸ライブラリーは天然型ジンクフィンガータンパク質、前記ドメインの人工突然変異およびこれらの組合せを含むタンパク質をコーディングする核酸を含み得る。
【０２４７】
突然変異ドメイン
【０２４８】
一実施態様において、ライブラリーは天然型配列の人工変位である少なくとも一つの構造ドメインをコーディングする核酸を含む。一実施態様において、このような変異ドメインは縮退形態（degenerated patterned）のライブラリーから構成される。核酸結合ドメインの場合、核酸結合面に近いか、隣接する位置は突然変異の標的部位となる。たとえば、突然変異された試験用ジンクフィンガードメインは縮退形態のライブラリーを用いることによって任意の突然変異部位で、可能なアミノ酸のサブセット（subset）に作ることができる。縮退コドンセットは各位置にプロファイルをコーディングするのに利用できる。たとえば、疎水性残基のみ、脂肪族残基のみまたは親水性残基のみをコーディングするコドンセットを利用できる。フォールディングされたポリペプチドをコーディングする全長クローンのために前記ライブラリーを選別できる。文献［Cho et al., (2000) J. Mol. Biol. 297(2): 309-19］は、縮退オリゴヌクレオチドを用いてそのような縮退ライブラリーを製造する方法を提供し、また、全長ポリペプチドをコーディングするライブラリー核酸を選別する方法を提供する。このような核酸は制限酵素切断部位を用いて発現プラスミド内に容易に挿入できる。
【０２４９】
適合なコドンおよび所定位置における各ヌクレオチドの相対比率の選択は、遺伝子コードを示す表の簡単な調査、または電算化アルゴリズムによって決定できる。たとえば、前記チョ（Cho）らの文献では、タンパク質配列の目的とするプロファイルを入力し、そのプロファイルの配列をコーディングする好ましいオリゴヌクレオチドデザインを出力する電算プログラムが記載されている。
いくつかの有用なジンクフィンガードメインに対してZhangら, (2000) J. Biol. Chem. 275:33850-33860; RebarとPabo (1994) Science 263:671-673; Segal (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758; Gogusら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2159-2164; Drierら, (2001) J. Biol. Chem. 276: 29466-29478; Liuら, (2001) J. Biol. Chem. 276(14): 11323-11334;およびHsuら, (1992) Science 257:1946-50を参考する。
【０２５０】
ライブラリーの製作：４．キメラジンクフィンガータンパク質ライブラリー
【０２５１】
様々なキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸のライブラリーは実施例１に記述するように、連続的な連結によって形成できる。各核酸が３つ、４つまたは５つ以上のジンクフィンガードメインを有するタンパク質をコーディングするようにライブラリーが製造できる。いくつかの実施態様においては、特に大規模のライブラリーを作るために各ジンクフィンガータンパク質がジンクフィンガードメインのセットのいずれかを無作為で含むように考案できる。ジンクフィンガードメインのセットは、たとえば、６４個の可能な３−塩基対下位部位のうち、３０、４０、５０またはそれ以上をカバーする範囲の特異性を有するドメインを示すように選択できる。このセットは約１２、１５、２０、２５、３０、４０または５０個以上の異なるジンクフィンガードメインを含み得る。これらのドメインのいくつかまたはすべては天然型タンパク質から分離されたドメインであってもよい。
【０２５２】
一つの例示的なライブラリーは各フィンガーごとに３つのジンクフィンガーおよび３０個の可能なドメインを有するキメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を含む。完全に表示された形態であるとき、該ライブラリーは３０３の結果である２７，０００個の配列を含む。該ライブラリーは３０個の可能なすべてのドメインをコーディングする核酸のプール（pool）が各段階で付加される連続的な連結によって製造できる。最終ライブラリーはプールとして貯蔵できる。
【０２５３】
一実施態様においては、ライブラリーは無作為の集合として貯蔵できる。他の実施態様においては、各構成員が分離され、住所化が可能な位置に貯蔵され（たとえば、整列され）、配列分析される。４０，０００〜５０，０００個の製造されたライブラリー構成員の高効率配列分析（high throughput sequencing）後に、完全な範囲を得るため、落とされたキメラ組合を個別的に組み立てることができる。たとえば、マイクロタイタープレートなどに一旦整列されると、各構成体は追加の分析または特定の応用のためにさらに回収できる。目的とする表現型を有する細胞は選別され、特徴化される。他の実施態様において、各ライブラリー構成員は細胞に形質転換され、各細胞は特徴化される。すなわち、核酸マイクロアレイ分析を用いて内生遺伝子の転写が変化したかを決定する（下記の「キメラジンクフィンガータンパク質の調節能力プロファイル化」参照）。
【０２５４】
核酸ライブラリーの細胞内導入
【０２５５】
核酸ライブラリーは様々な方法で細胞内に導入できる。一例として、ライブラリーは各核酸ライブラリーの多重複製を含む無作為的プールとして貯蔵する。そのプールの一部は細胞に形質転換される。他の実施態様において、個々のライブラリー構成員は個別的に貯蔵され（例：マイクロタイタープレートの分離されたウェル（well）または整列の分離された住所に貯蔵）、個別的に細胞に導入される。
【０２５６】
他の実施態様において、ライブラリー構成員は全体ライブラリーに比べて複雑でないプールに貯蔵される。たとえば、各プールは１０５または１０６の異なる構成員を有するライブラリーから１０３の異なるライブラリー構成員を含み得る。あるプールが特定効果をもたらす構成員を有するものとして同定される場合、そのプールは表現型効果を媒介する個別ライブラリー構成員を同定するために分析できる。このような接近法は、アポトーシスを誘導するキメラタンパク質に対するスクリーニングにおけるように、変形された細胞の回収が難しい場合に有用である。
【０２５７】
核酸ライブラリーは様々な方法によって細胞に導入できる。代表的な方法は電気突孔法（米国特許第５，３８４，２５３号）、粒子銃（遺伝子銃）技術（参考：米国特許第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；および第５，６１０，０４２号；およびＷＯ９４／０９６９９）；リポソーム-媒介されたトランスフェクション（例：LIPOFECTAMINE（登録商標）（Invitrogen）またはSUPERFECT（登録商標）（QIAGEN GmbH）を使用；Nicolauら, Methods Enzymol., 149: 157-176, 1987.）；リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質転換（例：Rippe et al.,(1990) Mol. Cell Biol., 10: 689-695）；直接的な微細注入または超音波粉砕ローディング；受容体媒介トランスフェクション（例：ＥＰ２７３０８５）およびアグロバクテリア−媒介形質転換（参考：米国特許第５，５６３，０５５号および第５，５９１，６１６号）。ここで使用された「形質転換」という用語は、外生核酸を細胞に導入するいずれの方法も含む。
【０２５８】
インビトロまたはインビボで細胞に核酸ライブラリーを導入するためにウイルス粒子を使用できる。一実施態様において、ウイルス包装（packaging）はライブラリー核酸を個体内細胞に導入するのに用いられる。他の実施態様において、ライブラリー核酸がインビトロで細胞に導入された後細胞が個体に伝達される。
【０２５９】
ライブラリー核酸の導入後、ライブラリー核酸が発現されてライブラリーによってコーディングされるキメラタンパク質が細胞によって生成される。ライブラリー核酸の不変領域は発現を可能にする必須調節および支持配列を提供できる。そのような配列は転写プロモーター、転写終結部位、スプライス部位ドナーおよびアセプター（splice site donors and acceptors）、非翻訳調節部位（ポリＡ追加部位）、細菌複製開始部位（origin of replication）およびライブラリー核酸の存在を指すか、ライブラリー核酸の選別に用いられるマーカー（markers）を含む。
【０２６０】
キメラタンパク質をコーディングする核酸ライブラリーのスクリーニング
【０２６１】
スクリーニングにおいて、細胞または個体は変形された表現型を示すものを同定するために分析される。このような過程は目標の表現型によって異なる。可能な表現型の数が莫大となるにつれて、スクリーニングの可能な方法も莫大となる。数多くの遺伝子スクリーニングおよび選別が、突然変異体または特定の表現型を示す天然型遺伝子の過発現を同定するために行われた。各方法はキメラタンパク質をコーディングする有用な核酸ライブラリー構成員を同定するのに適用できる。スクリーニングは、ライブラリー核酸を含む各細胞または個体の分析および選別、すなわち、生存または特定の処理に耐える他の特徴を示す細胞または個体の分析を含み得る。
【０２６２】
細胞を分析する代表的な方法は顕微鏡（例：光学、共焦点、蛍光、電子走査および透過電子）、蛍光根拠細胞分類（sorting）、鑑別遠心分離、鑑別結合、免疫分析、酵素分析、成長分析、およびインビボ分析などを含む。
【０２６３】
一部のスクリーニングは特定の環境条件を含む。この条件に対して敏感であるか抵抗性がある細胞が同定される。
【０２６４】
一部のスクリーニングは、細胞の特定様態（例：走化性（chemotaxis）、形態変化またはアポトーシス）、または個体の特定様態（例：植物による走光性（phototaxis）、ショウジョウバエ属の交配行動など）を要求する。一態様において、細胞または個体は、顕微鏡および選択的に変形細胞を自動で検索する電算プログラムを用いて視覚的検査によって直接的に分析できる。他の態様においては、細胞または個体は、目的とする表現型に係る分析または他の標識体（indicator）を用いて分析できる。
【０２６５】
一部のスクリーニングは細胞増殖に関連する。対照細胞（例：正常細胞）と異なる速度で増殖する細胞が同定される。また、増殖信号（例：成長因子または他のミトゲン（mitogen））に異なって反応する細胞が同定できる。細胞は信号に多かれ少なかれ敏感してもよい。
【０２６６】
細胞分化に関連するスクリーニングが用いられる。スクリーニングおよびキメラジンクフィンガータンパク質の使用は分化および様々な細胞の増殖能力を調節するために使用できるが、細胞はヒトまたはヒト以外のＥＳ細胞および体腔（somatic）幹細胞のような幹細胞を含む。ジンクフィンガータンパク質は、ＥＳ細胞を神経母細胞（neuronal progenitor cells）または造血幹細胞（hematopoietic stem cells）のように制限された系列（lineage）に直接分化させる場合に発見できる。また、幹細胞を限定された細胞分裂−後（post-mitotic）細胞亜型に、たとえば、ＥＳ細胞のおよび／または神経幹細胞のドパミン性またはコリン性神経への直接的分化に、直接分化させるジンクフィンガータンパク質に対するスクリーニングが可能であろう。
【０２６７】
分化を分析する他の表現型のうち、標識遺伝子および標識タンパク質の発現を観察することが可能である。前記標識は次を含む：  
【０２６８】
・  上皮細胞用ＦＬＫ１（チョら，(2001) Blood 98:3635-42; Nishikawaら, Development 125: 1747-1757）、
・  血管平滑筋細胞−特異的平滑筋用ミオシン重鎖（Drabら,(1997) FASEB J 11:905-15）  
・  骨−特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）および骨細胞用オーステオカルシ（osteocalci）(Demersら,(2000) Cancer 88:2919-26)
・  白血球用ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５（Ｏｄｙら，(2000) Blood 96:3988-90, Martinら, (2000) Blood 96:2511-9）
・  造血幹細胞用Ｆｌｋ−２およびＣＤ３４（Julieら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001,Vol. 98, Issue 25, 14541-14546, Woodward & Jenkinson. Eur J Immunol 2001 Nov;31(11):3329-38, George AAら, Blood 2001 Jun 15;97(12):3925-30）
・  造血幹細胞およびＭＳＣ前駆細胞用ＣＦＵ（Frimbergerら, Exp Hematol 2001 May;29(5):643-52）
・  骨髄繊維細胞用Muc-18(CD146)(Filshieら, (1998) Leukemia 12:414-21)
・  軟骨細胞用コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＶ型および軟骨細胞発現タンパク質−６８（Carlbergら, (2001) Differentiation 67:128-38, Steckら, (2001) Biochem J 353:169-74）
・  脂肪細胞用脂質−結合タンパク質（ＡＬＢＰ）および脂肪酸移動物質（transporter）(Amriら,(1995) J. Biol. Chem. 270:2367-2371, Bastieら, (1999) J Biol Chem 274:21920-5, Frohnertら, (1999) J. Biol. Chem. 274, 3970 3977, Teboulら, (2001) Biochem. J. 360:305 312)
・  神経幹細胞用ＣＤ１３３（Uchida Nら,(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:14720-5）
・  星状膠細胞用ＧＦＡＰ（Daiら, (2001) Genes Dev 15:1913-25） 
・  神経用微小管−関連タンパク質−２（Royら, (2000) Nat Med 6:2717）
【０２６９】
抗癌効果、アポトーシスの変化およびウイルス抵抗性などの他の特性で哺乳類由来細胞をスクリーニングすることが可能である。たとえば、ウイルス感染またはウイルスの生成に対する抵抗細胞を選別することによって、抗−ウイルス製剤に用いられる人工キメラタンパク質を同定することが可能である。
【０２７０】
類似に、細胞信号経路における変化も経路の活性または不活性と関連する探り針（probe）を使用するか、経路の活性または不活性と関連する認識すべき標識を用いて検索できる。
【０２７１】
あるスクリーニングは代謝産物、分泌タンパク質および翻訳後修飾されたタンパク質のような目標の合成物の生成と関係がある。たとえば、細胞は合成物の増大された生産量で同定できる。他の例において、細胞は好ましくない副産物のような合成物の減少した生産量で同定できる。目標の細胞は反応細胞、マイクロアレイ分析、化学検索分析および免疫分析の使用を含む様々な方法によって同定できる。
【０２７２】
特定の実施態様のさらに多くの例は次を含む：
１）タンパク質可溶性：
大腸菌において、多くの異種タンパク質は封入体（inclusion body）として発現される。本発明においては、大腸菌で発現されるヒトタンパク質の溶解性分画を増加させるキメラジンクフィンガータンパク質を同定した（実施例１２参考）。これによれば、本発明は発現された（例：細胞内過発現された）異種タンパク質の溶解度を変化させる（例：増加させる）人工転写因子またはキメラジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０２７３】
２）糖鎖化（Glycosylation）：
抗体を含む治療用タンパク質は主にＣＨＯ細胞で生産される。しかし、このようなタンパク質は適切な糖鎖化様式（Glycosylation pattern）を備えていない。一実施態様において、Ｂ細胞から生産される抗体の特徴である糖鎖化を一つ以上（例：すべて）含む抗体のような分泌タンパク質に変形されたＣＨＯ細胞を同定するために、キメラタンパク質をコーディングするライブラリーがスクリーニングされる。これによれば、本発明はＣＨＯ細胞によって分泌される抗体のように、ＣＨＯ細胞によって分泌されるタンパク質のような分泌タンパク質の糖鎖化を変化させる、人工転写因子またはキメラジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０２７４】
３）ウイルス力価（titer）：
一実施態様において、細胞培養でウイルス力価を増加または減少させるキメラタンパク質を糾明するために、キメラタンパク質をコーディングするライブラリーがスクリーニングされる。ウイルスは遺伝子伝達体のような伝達体として使用できる。たとえば、治療用ウイルスは特定の形態の癌を治療するために開発中である（例：アデノウイルス）。ウイルス力価の増大は治療用ウイルスの製作に有用である。反面、細胞培養およびインビボでのウイルス生産阻害はウイルス性疾病を治療するのに有用である。これによれば、本発明は真核生物または哺乳動物細胞のような細胞でのウイルス生産を変化（例：増加または減少）させる人工転写因子またはキメラジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０２７５】
４）形質転換効率：
多くの真核細胞株または原核個体における遺伝子工学は低いトランスフェクションまたは形質転換効率によって限界がある。人工転写因子はトランスフェクションまたは形質転換効率が増大するように改造された細胞で選別できる。そのような因子の選別は、限定された濃度の標識または標識で形質転換した後、標識獲得した細胞の選別で選別可能である。これにより、本発明は細胞のＤＮＡ獲得効率またはＤＮＡ獲得過程の耐性を変化させる人工転写因子またはキメラジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０２７６】
５）栄養細胞（Feeder cells）
栄養細胞の生産によるように、幹細胞の増殖または分化を補助できるように培養細胞の特徴を変化させる人工転写因子または他のキメラタンパク質を同定できる。培養細胞はヒトまたは哺乳動物細胞であってもよい。このような細胞は、同じ環境で培養された幹細胞を幹細胞が増殖または分化するようにする細胞を同定するためにスクリーニング（例：ライブラリー構成員プーリング）できる。人工転写因子は培地に分泌される主なサイトカインおよび成長因子を活性化できる。前記培地は幹細胞の分化または増殖を誘導（例：自家複製の補助を通じて）するのに用いられる。これにより、本発明は培地を調節するか、幹細胞の分化または増殖調節のような幹細胞の行動様式を変化させる哺乳動物細胞の能力を変化（例：増加）させる人工転写因子またはキメラジンクフィンガータンパク質を提供する。
【０２７７】
一種類の細胞を用いて人工転写因子をスクリーニングし、他の種類の細胞で人工転写因子を発現することもまた可能である。このような過程は一般的に転写因子によって誘導された第１細胞から第２細胞への表現型転移に使用される。たとえば、本発明者らは広範囲で互いに異なる２つの細胞株において部分的ジンクフィンガータンパク質の発現プロファイルを決定した；細胞株は癌細胞ではないヒト胎生期腎臓２９３細胞およびヒト頸部癌細胞であるＨｅＬａである。本発明者らはそのプロファイルが非常に類似することを確認した。同じように、酵母においても本発明者らは一つの菌株内のあるＺＥＰによって誘導された表現型が互いに異なる菌株に転移できることを確認した。
【０２７８】
幹細胞
【０２７９】
ここで記述する方法は一般的なある細胞にも適用可能であり、また、ある後生動物個体由来の幹細胞にもその様式の調節に特に有用である。幹細胞は自家複製（self-renewal）能力および分化可能性を有する細胞である。自家複製は無限に延長できる。幹細胞は高度に分化された子女細胞（descendants）を生産できる（WattおよびHogan（2000） Science  287: 1427-1430）。ヒト胚性幹細胞の培養に関する最近の成功によって細胞に基づく治療のための細胞根源を提示するようになった。しかし、幹細胞の維持、複製および分化は時によって難しい場合がある。たとえば、ＥＳ細胞はインビトロで無作為に分化する傾向を示す。
【０２８０】
キメラ転写因子ライブラリーは細胞分化を調節できるタンパク質を同定するのに用いられる。たとえば、制限された有糸分裂−後細胞亜型（defined post-mitotic cell subtype）（たとえば、ドパミン性またはコリン性神経）に幹細胞の分化を直接誘導するキメラ転写因子を同定できる。
【０２８１】
自家複製能力を増加させて分化を阻害するか分化の範囲および性格に直接影響を及ぼすタンパク質を同定できる。このようなタンパク質は、一般的に人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を幹細胞または前駆細胞（progenitor）に導入し、その細胞の表現型を分析することによって同定できる。
【０２８２】
幹細胞の分化や増殖を調節する方法は、未分化細胞の大量供給を提供し、特定細胞形態への分化を調節することを可能にする。このような調節は治療目的または他の適用（例：形質転換動物の発達、インビトロ内細胞培養など）への使用が可能なように開発できる。
他の例において、ある場合には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を限定された系列に直接分化させるキメラ転写因子を同定できる。したがって、ＥＳ細胞から神経母細胞（neuronal progenitor）または造血幹細胞を生産できる。また、１）分化された細胞を他の分化状態で適応させるか、２）分化された細胞を幹細胞または前駆細胞（pluripotent progenitor cell）を作り出す未分化状態で適応させるように誘導するキメラＺＦＰのようなキメラタンパク質を同定できる。
【０２８３】
同定方法は特定の標的遺伝子に対する情報を必要とない。標的遺伝子は、たとえば、同定されたキメラ転写因子によって活性や発現が変化した遺伝子を転写体またはタンパク質のプロファイルで同定するスクリーニング後に同定できる。ＺＦＰ−ＴＦによって調節された遺伝子の同定は細胞分化を理解するのに役立つだろう。
【０２８４】
細胞産物の生産
【０２８５】
本発明は、タンパク質または代謝産物のような細胞産物を生産する細胞の能力を変化させる人工転写因子（例：キメラジンクフィンガータンパク質）を提供する。細胞産物は内生または異種タンパク質であってもよい。たとえば、特定のタンパク質（例：特定の内生タンパク質）、過発現タンパク質、異種タンパク質またはミスフォールド（mis-folded）タンパク質のような、タンパク質を生産する細胞の能力を増加させる人工転写因子を同定することが可能である。
【０２８６】
一実施態様において、細胞は、たとえば、酵素的または蛍光的に追跡可能なレポータータンパク質を生産する能力に対してスクリーニングできる。一例において、レポータータンパク質は対照細胞において過発現される場合に不溶性である。たとえば、細菌細胞は封入体を減少させる人工転写因子に対してスクリーニングできる。他の実施態様において、レポータータンパク質は原核または真核細胞によって分泌される。細胞は、さらに高い分泌産物の増加、増大した糖鎖化、リン酸化またはタンパク質分解過程のような翻訳後修飾に対して同定できる。
【０２８７】
一実施態様において、細胞は異なる２つのレポータータンパク質の活性を変化(例：増加または減少)させる能力で同定される。レポータータンパク質は、活性、位置(例：分泌/細胞質/核内)、サイズ、溶解性、等電点(isoelectric point)、重合状態、翻訳-後調節、翻訳調節および転写調節(例：異なる配列によって調節されるレポータータンパク質をコーディングする遺伝子)で区分できる。本発明は、このような特徴で区分される異なる少なくとも２つのレポーター遺伝子を変形させる人工転写因子(例：ジンクフィンガータンパク質)やレポーター遺伝子を選択的に調節するジンクフィンガータンパク質を含む。
【０２８８】
表現型スクリーニング方法は人工転写因子を分離するのに利用できるので、ジンクフィンガータンパク質がどのようにタンパク質生産の増加を媒介するかを優先的に知る必要はない。確認可能な機構は、次のうちの少なくとも一つの変形を含む；翻訳機構、転写過程、転写、分泌、タンパク質分解、ストレス抵抗性、代謝産物の生産のような触媒活性。一例において、人工転写因子は代謝経路において少なくとも一つの酵素発現を調節でき、これによって代謝産物またはタンパク質のような細胞産物の生産を増加できる。
【０２８９】
反復（iterative）考案
【０２９０】
キメラＤＮＡ結合タンパク質が同定されると、細胞の表現型を変化させる能力は様々な方法によって改善できる。たとえば、約６〜２００個または５０〜２０００個の構成員を有する小型ライブラリーまたは大型ライブラリーは特別に同定されたキメラタンパク質の最適化に利用できる。
【０２９１】
反復考案の一番目の代表的な実施態様においては、オリジナルキメラＤＮＡ結合タンパク質を変化させるのに突然変異技術が用いられる。この技術はオリジナルタンパク質の、たとえば、第１のライブラリーから同定されたタンパク質の、変異体である構成員を含む第２のライブラリーを製作するのに適用される。このような技術の例は次を含む：誤謬−誘発（error-prone）ＰＣＲ（Leungら(1989) Technique 1:11-15）、組換え、無作為切断を用いたＤＮＡシャフリング（shuffling）(Stemmer (1994) Nature 389-391), Cocoら(2001) Nature Biotech. 19:354、位置特異的突然変異（Zollnerら(1987) Nucl Acids Res 10:6487-6504）、カセット突然変異化（cassette mutagenesis）(Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208:564-586);縮退オリゴヌクレオチドの挿入(Griffithsら(1994) EMBO J 13: 3245)；連続的連結、事前に製造され、整列されたライブラリーから特異的構成員のプール（pool）化、組換え（例：性的ＰＣＲおよび「ＤＮＡシャフリング（登録商標）（Maxygen, Inc., CA）」、またはこれらの方法の組合せ。
【０２９２】
一実施態様において、ライブラリーはアミノ酸位置を突然変異させるように製作される。たとえば、キメラジンクフィンガータンパク質の場合、アミノ酸の位置はＤＮＡ接触残基に近接できるが、ＤＮＡ接触残基そのものではない。他の実施態様において、ライブラリーはキメラタンパク質内の各々コーディングされたドメインが様々であるが、キメラＤＮＡ結合タンパク質が同定される初期のライブラリーよりは一層制限される。キメラジンクフィンガードメインでは、特定のドメインをコーディングする核酸はオリジナルキメラタンパク質に存在するドメインの特異性と類似する特異性を有すると知られている他のジンクフィンガータンパク質の間で多様に変化し得る。
【０２９３】
一部の技術は、一部の機能的特性を示す少なくとも２つのキメラＤＮＡ結合タンパク質ドメインをコーディングする核酸から、新しいキメラＤＮＡ結合タンパク質を創出することを含む。このようなＤＮＡシャフリングおよび基本ドメイン交換（swapping）などの技術は新しいドメインの組合せを創出する。米国特許第６，２９１，２４２号参照。ＤＮＡシャフリングはドメイン交換だけでなく、点突然変異（point mutation）を導入できる。シャフリング反応は、目的とする表現型を誘導するキメラタンパク質コーディング核酸配列から始まる。核酸はシャフリングされる。第２のライブラリーはシャフリング産物から製作され、類似または強化された条件下で目的とする形質を誘導する構成員に対してスクリーニングされる。もし初期ライブラリーがすべての可能なドメイン組合せがスクリーニングされるように広範囲であれば、同一な初期ライブラリーから分離されたドメインのＤＮＡシャフリングは無駄になる。ＤＮＡシャフリングは範囲（coverage）が幅広い場合、または幅広いスクリーニングが合理的でない場合に有用である。
【０２９４】
反復考案の第２の実施態様においては、目的とする表現型を生成するキメラＤＮＡ結合タンパク質が各ドメインの多様化によって変化する。ドメインは、１回に一つずつ、または一回に一つ以上に、順次変化できる。
【０２９５】
次の例は３つのジンクフィンガードメイン：フィンガーＩ、IIおよびIIIを含み、目的とする表現型を生産するオリジナルキメラタンパク質を意味する。第２のライブラリーはその各核酸構成員が初期に同定されたタンパク質と同一なフィンガーIIおよびフィンガーIIIをコーディングするように製作される。しかし、ライブラリーはオリジナルタンパク質のフィンガーＩと異なる、フィンガーＩの核酸構成員を含む。相違点はコーディングされたキメラタンパク質のアミノ酸配列を変化させる単一ヌクレオチドであるか、さらに根本的であり得る。第２のライブラリーはフィンガーＩの塩基−接触残基が様々な形態で製作されるか、フィンガーＩの塩基−接触残基は変わりないが、隣接残基が多様化できる。また、第２のライブラリーは、少なくとも２０、３０、４０または６０個の異なるトリヌクレオチド位置を認識する、十分な数のジンクフィンガードメインを含み得る。
【０２９６】
第２のライブラリーは細胞または個体の表現型を変化させる成分を同定するようにスクリーニングされる。変化の範囲はオリジナルタンパク質によるものと類似するかまたはさらに広い。
【０２９７】
同時にまたは連続的に、第３ライブラリーはフィンガーIIを多様に製作でき、第４ライブラリーはフィンガーIIIを多様に製作できる。もしキメラタンパク質または既に同定された変異体が十分であれば、キメラタンパク質をさらに向上させるためにすべてのドメインを多様化する必要はない。他の場合には、各ドメインを再最適化することが必要である。
【０２９８】
もし同時に他のドメインが多様化されるとすれば、特定のライブラリーから向上した変異体は他のライブラリーを製作するために互いに組換えることができる。このようなライブラリーも類似にスクリーニングされる。
【０２９９】
反復考案の３番目の実施態様においては、この方法がジンクフィンガードメインまたは調節ドメインのようなドメインを挿入、置換または欠失することを含む。挿入されたジンクフィンガードメインはキメラタンパク質の特異性を増加させるか、その結合親和度を増加できる。ある場合には、結合親和度の増加がキメラタンパク質を創出する表現型を強化することもある。第２の活性化ドメインまたは補助因子を誘導するドメインのような、挿入調節ドメインはキメラタンパク質が生産する表現型を強化することもある。欠失はキメラタンパク質の活性の特異性を強化または拡張させ、これは削除されたドメインの寄与度などによる。
【０３００】
反復考案の４番目の実施態様において、この方法はオリジナルキメラタンパク質と第２のキメラＤＮＡ結合タンパク質を細胞で共発現することを含む。第２のキメラタンパク質は異なるキメラをコーディングする核酸ライブラリーをスクリーニングして同定できる。  
一実施態様において、第２のキメラタンパク質はオリジナルキメラタンパク質を発現する細胞でライブラリーをスクリーニングして同定される。他の実施態様において、第２のキメラタンパク質は独立的に同定される。
【０３０１】
キメラジンクフィンガータンパク質の調節特性のプロファイリング（profiling）
【０３０２】
細胞の表現型を変化させるキメラ転写因子の特性をさらに確認して、このタンパク質が直接または間接的に調節する内生遺伝子を同定できる。普通、キメラ転写因子は内生遺伝子を細胞内で生成される。表現型の変化前、変化期間または変化後のような適切な時間に細胞を分析して細胞内または培地に存在する転写体やタンパク質の発現水準を測定する。たとえば、細胞からｍＲＮＡを抽出し、核酸マイクロアレイ分析を通じて分析する。
【０３０３】
核酸マイクロアレイ分析は、たとえば、フォトリソグラフィー法（例：米国特許第５，５１０，２７０号参照）、機械的方法（例：米国特許第５，３８４，２６１号に記載された直接流れ（directed flow）法）またはピン基盤（pin based）法（米国特許第５，２８８，５１４号に記載）などの様々な方法によって製作できる。この分析は、発現された特定の遺伝子に対する核酸を検出するのに適した特別なキャプチャープローブ（capture probe）を各住所に有するように製作される。
【０３０４】
ｍＲＮＡは、たとえば、文献（Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, N.Y）に記述されたようにＤｎａｓｅを処理し、ゲノムＤＮＡを除去し、オリゴ−ｄＴを結合した固体基質にハイブリダイゼーションすることを含む一般の方法で分離できる。基質を洗浄した後、ｍＲＮＡを溶出させる。分離されたｍＲＮＡを米国特許第４，６８３，２０２号に記載されたように、ｒｔＰＣＲなどによって逆転写させ、任意に増殖させる。増殖または逆転写過程中、標識されたヌクレオチドの挿入によって核酸を標識できる。好ましい標識の例は、赤色蛍光染料Ｃｙ５（Amersham）または緑色蛍光染料Ｃｙ３（Amersham）のような蛍光標識を含む。一方、核酸をビオチンで標識し、ストレプトアビジンピコエリトリン（Molecular Probes）などの標識されたストレプトアビジンとのハイブリダイゼーションで検出できる。
【０３０５】
次いで、標識された核酸をアレイに接触させる。さらに、対照核酸または参考核酸を同じアレイに接触できる。対照核酸または参考核酸を標本核酸の標識とは異なる標識、たとえば、異なる最大放出（emission）波長を有する標識で認識できる。標識された核酸をハイブリダイゼーションの条件でアレイと接触させる。アレイを洗浄した後、アレイの各アドレスで蛍光を検出するために映像化する。
【０３０６】
プロファイルを作って評価する一般的な方法はアレイの各アドレスでハイブリダイゼーションを検出する段階を含む。各アドレスのハイブリダイゼーションの程度は数字で表示してベクター、一次元マトリックス、または一次元アレイで貯蔵する。ベクターｘはアレイの各アドレスに対する値を有する。たとえば、特定のアドレスでハイブリダイゼーションの程度に対する数値はｘａという変数で貯蔵される。この数値は、各地域の背景水準、標本量および他の変異条件に合わせて調節できる。また、対照標本から核酸を準備し、同一または異なるアレイにハイブリダイゼーションできる。ベクターｙはベクターｘと等しく製作する。たとえば、２つのベクターの関数である数学式を用いて標本発現プロファイルを対照プロファイルと比較できる。この比較は、２つのプロファイルの類似性を示す値数などのスカラー（scalar）値として評価できる。アレイによって検出される異なる遺伝子に加重値を与えるために前記ベクターのいずれかまたはすべてはマトリックスによって変換できる。
【０３０７】
発現データはデータベース、たとえば、ＳＱＬデータベース（例：オラクル（Oracle）またはサイベース（Sybase）データベース環境）のような関連データベースに貯蔵できる。データベースは数個の表を有する。たとえば、処理されていない（raw）発現データを、各縦列は分析される遺伝子（例：アドレスまたはアレイ）に該当し、各横列は標本に該当する一つの表に貯蔵できる。別途の表は、識別子、および使用したアレイのバッチ（batch）数字、日付および他の品質管理情報などの標本情報を貯蔵できる。
【０３０８】
同様に調節される遺伝子は共に調節される遺伝子を同定するために発現データをクラスタリング（clustering）することによって同定できる。このようなクラスターはキメラジンクフィンガータンパク質によって同等に調節される遺伝子セットを表示する。遺伝子は階層的クラスタリング（hierarchical clustering)[例:Sokal and Michener (1958) Univ. Kans. Sci. Bull. 38:1409参照]、ベイジアンクラスタリング（Bayesian clustering）、カッパー平均クラスタリング（k-means clustering）、および自体組織地図（self-organizing maps)［Tamayo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2907参照］を用いてクラスタリングできる。
【０３０９】
標本発現プロファイルの対照発現プロファイル（例：対照細胞）との類似性は、たとえば、標本発現水準のログをプレディクター（predictor）または対照発現値のログと比較し、この比較結果をプロファイル内の例示値のすべての遺伝子に対する重要度によって調整することによって決定できる。
【０３１０】
また、活性化されたキメラタンパク質を有する細胞内でタンパク質をプロファイリングできる。代表的なタンパク質プロファイリング法の一例として、個別タンパク質の種類を特定化する２−Ｄゲル電気泳動(gel electrophoresis)および質量分光法(mass spectroscopy)が含まれる。２−Ｄゲル上の個別「点」は加水分解された後、質量分光器で分析される。この方法はタンパク質構成要素および、多くの場合の、翻訳段階の変形をすべて見極めることができる。
【０３１１】
タンパク質および核酸のプロファイリング方法はキメラタンパク質の特性に関する情報だけでなく、細胞内で作動する自然機構に関する情報も提供できる。たとえば、キメラタンパク質の発現によって増加したタンパク質または核酸は、キメラタンパク質の発現によって引起される表現型の変化に対して自然的作用体（effector）であってもよい。
【０３１２】
さらに、他の方法を用いて人工キメラタンパク質によって直接または間接的に調節される標的遺伝子およびタンパク質を同定できる。一例として、人工キメラタンパク質が表現形質に及ぼす効果を相殺（例：抑制）させる変化を挙げることができる。このような変化は染色体遺伝子内の突然変異および特定遺伝子の過発現のような遺伝的変化だけでなく、ＲＮＡ干渉（例：二本鎖ＲＮＡによる）のような他の変化も含む。
【０３１３】
特定の一例として、病原性細菌またはカビのような細胞内で条件的に発現される場合、成長欠陥または致死を引起こすキメラＺＦＰを分離する。このようなＺＦＰは、ＺＦＰをコーディングする核酸を含むＺＦＰライブラリーを有する細胞の形質転換によって同定でき、核酸の発現は誘導性プロモーターによって調節される。形質転換体は誘導性および非誘導性培地で培養された後、誘導性および非誘導性プレート上に複製される。非誘導性プレートで正常に成長するが、誘導性プレート上では増殖欠陥を示すコロニーが観察され、これらは「条件的致死」または「条件的増殖欠陥」コロニーとして同定される。
【０３１４】
（ａ）ｃＤＮＡライブラリーを用いた標的遺伝子の同定
ｃＤＮＡ発現ライブラリーは上述の「条件的致死」または「条件的増殖欠陥」菌株に形質転換される。形質転換体は誘導性プレートに塗布される。欠陥を引き起こすＺＦＰの存在および発現にもかかわらず生存するコロニーを分離する。欠陥形質を補完するｃＤＮＡの配列を分析する。このｃＤＮＡは、欠陥形質に媒介するキメラＺＦＰによって調節される標的遺伝子の直接的または間接的転写体であってもよい。
【０３１５】
（ｂ）第２のＺＦＰライブラリーを用いた標的遺伝子の確認
第１のキメラタンパク質の効果を抑制する第２のキメラタンパク質が同定される。第２のキメラタンパク質の標的遺伝子は（第１のキメラタンパク質の存在または不在時）同定される。
【０３１６】
たとえば、ＺＦＰライブラリーは（欠陥を引起こす第１のキメラＺＦＰを含む）「条件的致死」または「条件的成長欠陥」に形質転換される。形質転換体は誘導性プレートに塗布される。導入されたＺＦＰの発現によって生存できるコロニーは「抑制された菌株」として同定される。第２のＺＦＰの標的遺伝子はＤＮＡマイクロアレイ分析によって分析される。比較分析は次の４つの菌株の間で行い得る：１）ＺＦＰのない菌株；２）第１のＺＦＰのみを有する菌株；３）第２のＺＦＰのみを有する菌株；４）第１および第２のＺＦＰをすべて有する菌株。たとえば、第１および第２のキメラＺＦＰによって反対方向に調節される遺伝子が成長−欠陥表現型に媒介する標的遺伝子の候補となる。この方法はただ増殖欠陥だけでなく、いずれの表現形質にも適用できる。
【０３１７】
(ｃ)発現プロファイル分析によって同定された共調節（co-regulated）遺伝子
キメラＺＦＰの標的候補は発現プロファイリング（expression profiling）によって同定できる。段階的に、キメラＺＦＰの表現型に媒介する標的候補を決定するために、標的候補を個別的に過発現または抑制（例：遺伝子欠失またはＲＮＡ干渉）できる。さらに、この分析法を多重標的候補に対して適用できる。これは少なくともいくつかの場合に、少なくとも一つの候補が表現型を示すことを妨げる必要があるためである。このような接近法の一例が実施例３（ケトコナゾール抵抗性）に示されている。
【０３１８】
(ｄ)時間−推移分析（Time-Course Analysis）
キメラＺＦＰの標的は細胞をキメラＺＦＰに露出させた後遺伝子発現の特徴的な経時変化を分析して同定できる。たとえば、キメラＺＦＰをコーディングする遺伝子は誘導プロモーターに連結できる。代表的な誘導プロモーターはドキシサイクリン（doxycycline）のような小分子（small molecule）によって調節される。キメラＺＦＰをコーディングする遺伝子は細胞に導入される。ｍＲＮＡ試料は誘導プロモーターによる誘導後、様々な時間に細胞から得られる。たとえば、図１３では、ＺＦＰ  Ｆ１０４−ｐ６５の誘導過程で活性化または抑制された遺伝子が見られる。
【０３１９】
（ｅ）タンパク質導入とｃＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた、哺乳動物細胞におけるＺＦＰ−ＴＦの一次標的遺伝子の同定
キメラタンパク質を転移（transduction）によって細胞内に伝達することもまた可能である。タンパク質は細胞外部条件で供給され、細胞はそのタンパク質を自身に転移させる。この接近は外生核酸の融合（integration）、伝播(propagation）などに対するおそれを除去するだろう。タンパク質の量は正確に調節できる。一実施態様において、キメラＺＦＰはＴａｔまたはＶＰ２２のタンパク質転移ドメインに融合（fusion）される。
【０３２０】
培養細胞に転移されたキメラタンパク質の効能を分析するために、キメラタンパク質は、たとえば、タンパク質転移ドメインとの融合のように、培養培地に添加される。調節された標的遺伝子の検索はシクロヘキシミド（cycloheximide）のようなタンパク質合成阻害剤の添加で向上できる。したがって、一次標的遺伝子の翻訳が遮断され、その一次標的遺伝子によってコーディングされたタンパク質によって調節される遺伝子が検索される。一次標的遺伝子の同定はＤＮＡマイクロアレイ分析によって発見できる。
【０３２１】
一次標的遺伝子を同定するためのシクロヘキサミドの使用は、キメラタンパク質が細胞内の異種核酸によってコーディングされた場合にもまた使用できる。たとえば、異種核酸の発現は３０、２０、１５、１０または５分以内に誘導でき、この際、シクロヘキサミドを添加できる。
【０３２２】
（ｆ）活性分析
潜在標的遺伝子の機能は、たとえば、二本鎖ＲＮＡ（dsRNA）によるＲＮＡ干渉（RNAi）、アンチセンス（anti-sense）技術、リボザイム（Ribozyme）、または標的遺伝子の突然変異によって、標的遺伝子の活性を抑制することによって分析できる。標的遺伝子の活性が減少した細胞または個体はＲＮＡｉを処理していない対照群細胞または個体と比較し、分析できる。また他の例において、標的遺伝子を調節するとされる人工ジンクフィンガータンパク質を発現する細胞または個体にＲＮＡｉが処理される。一つの表現形質を誘導する人工ジンクフィンガータンパク質の効能はＲＮＡｉの存在または不在下で分析できる。ある場合には、もし潜在的標的遺伝子が実際に決定的標的であれば、ＲＮＡｉ処理が潜在標的を不活性化することは人工ジンクフィンガータンパク質による表現形質を弱化できる。
【０３２３】
ｄｓＲＮＡは、たとえば、カセット（cassette）の両方向にＴ７プロモーターを含ませて一つのカセットを両方向から転写して製造できる。カセット内の挿入体（insert）は潜在的標的遺伝子の相補的な配列を含むように選択される［HiScribe（登録商標）ＲＮＡｉ転写キット（New England Biolabs, MA）およびFire, A. (1999) Trends Genet. 15, 358-363を参照］。ｄｓＲＮＡはさらに小さい切片に分解できる［たとえば、米国特許出願第２００２−００８６３５６号参照］。ｄｓＲＮＡは哺乳動物細胞において遺伝子発現を不活性化させるのに使用できる［Clemens,ら(2000) Proc. Natl. Sci. USA 97, 6499-6503; Billy, E.ら(2001) Proc. Natl. Sci. USA 98, 14428-14433; Elbashirら(2001) Nature. 411(6836):494-8; Yang, D.ら(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9942-9947参照］。
【０３２４】
標的ＤＮＡ部位の確認
【０３２５】
キメラＤＮＡ結合タンパク質に関連して、目標の表現型を生産するキメラＤＮＡ結合タンパク質の標的部位を決定するために様々な方法が使用できる。このような方法は標的部位を探すために単独でまたは組合せて使用できる。
【０３２６】
一実施態様において、発現プロファイルによる情報はキメラジンクフィンガータンパク質によって認識される標的部位を同定するのに用いられる。キメラジンクフィンガータンパク質によって共調節される（co-regulated）遺伝子の調節領域（regulatory region）は、すべての、または大部分の調節領域内に共通して存在するモチーフを同定するために比較される。
【０３２７】
他の実施態様において、生化学的方法がキメラジンクフィンガータンパク質によって結合されるＤＮＡ部位を決定するために用いられる。たとえば、クロマチン免疫沈澱（Chromatin immuno-precipitation）実験は、キメラジンクフィンガータンパク質が結合した核酸を分離するのに使用できる。分離された核酸はＰＣＲ方法で増幅され、配列が分析される。Gogusら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2159-2164の例を見ることができる。他の例として、ＳＥＬＥＸ方法を使用できる。さらに、個別キメラジンクフィンガータンパク質の結合特異性に関する情報は標的部位を予測するのに用いられる。その予測は証明されるか、他の結果（例：クロマチン免疫沈澱、インシリコ（in-silico）共調節された遺伝子分析およびＳＥＬＥＸからの結果）を解釈する指標として使用できる。
【０３２８】
また他の態様において、潜在的標的部位は、各々のジンクフィンガー構成要素の結合特異性に関する情報に基づいて推論される。たとえば、図１０Ａおよび１０Ｂから分かるように、Ｎ−末端ないしＣ−末端でジンクフィンガードメインを含むキメラ：ＣＳＮＲ、ＲＳＮＲおよびＱＳＮＲは標的部位５’−ＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号：１３０）を認識すると予想される。ＣＳＮＲ、ＲＳＮＲおよびＱＳＮＲドメインは各々ＧＡＣ、ＧＡＧおよびＧＡＡにＤＮＡ結合特異性を有する。予想標的部位は、Ｃ−末端からＮ−末端への順にドメインを考慮し、それらの認識特異性を連結して５’から３’方向に一本鎖の標的部位を得ることによって形成する。
【０３２９】
たとえ大部分の場合、キメラジンクフィンガータンパク質が転写調節子の機能をするだろうが、ある場合には、キメラジンクフィンガータンパク質がＲＮＡまたはタンパク質標的に結合してそれらの表現型効果を媒介する。ある天然型ジンクフィンガータンパク質は実際にこのような高分子に結合する。
【０３３０】
キメラ転写因子の追加的特徴
【０３３１】
キメラ核酸結合ドメインをコーディングするライブラリーに関連して、コーディングされたポリペプチドは次の少なくとも一つの特徴を含み得る。このような特徴はそのライブラリーのすべての構成員の間で変わらないか、多様である。一例として、ある核酸は活性化ドメインを含むポリペプチドをコーディングし、他のものは阻害ドメインを含むか、転写調節ドメインを有しない。
【０３３２】
活性化ドメイン
本発明に用いられる転写活性化ドメインは、酵母から由来するＧａｌ４活性化ドメインおよびヘルペスシンプレックスウイルス（herpes simplex virus）から由来するＶＰ１６ドメインを含むが、これに制限されない。転写を活性化させるドメインの能力は、既に公知のＤＮＡ結合ドメインに融合させ、その公知のＤＮＡ結合ドメインが認識する部位に連結された標識遺伝子の発現がキメラタンパク質によって活性化されるかを決定して確認される。
【０３３３】
活性化ドメインの例として次のｐ６５由来のドメインがある：
【０３３４】
ＹＬＰＤＴＤＤＲＨＲＩＥＥＫＲＫＲＴＹＥＴＦＫＳＩＭＫＫＳＰＦＳＧＰＴＤＰＲＰＰＰＲＲＩＡＶＰＳＲＳＳＡＳＶＰＫＰＡＰＱＰＹＰＦＴＳＳＬＳＴＩＮＹＤＥＦＰＴＭＶＦＰＳＧＱＩＳＱＡＳＡＬＡＰＡＰＰＱＶＬＰＱＡＰＡＰＡＰＡＰＡＭＶＳＡＬＡＱＡＰＡＰＶＰＶＬＡＰＧＰＰＱＡＶＡＰＰＡＰＫＰＴＱＡＧＥＧＴＬＳＥＡＬＬＱＬＱＦＤＤＥＤＬＧＡＬＬＧＮＳＴＤＰＡＶＦＴＤＬＡＳＶＤＮＳＥＦＱＱＬＬＮＱＧＩＰＶＡＰＨＴＴＥＰＭＬＭＥＹＰＥＡＩＴＲＬＶＴＡＱＲＰＰＤＰＡＰＡＰＬＧＡＰＧＬＰＮＧＬＬＳＧＤＥＤＦＳＳＩＡＤＭＤＦＳＡＬＬＳＱ（配列番号：１３１）
【０３３５】
代表的なＧａｌ４活性化ドメインの配列は次の通りである：
【０３３６】
ＮＦＮＱＳＧＮＩＡＤＳＳＬＳＦＴＦＴＮＳＳＮＧＰＮＬＩＴＴＱＴＮＳＱＡＬＳＱＰＩＡＳＳＮＶＨＤＮＦＭＮＮＥＩＴＡＳＫＩＤＤＧＮＮＳＫＰＬＳＰＧＷＴＤＱＴＡＹＮＡＦＧＩＴＴＧＭＦＮＴＴＴＭＤＤＶＹＮＹＬＦＤＤＥＤＴＰＰＮＰＫＫＥＩＳＭＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ（配列番号：１３２）
【０３３７】
バクテリアにおいて、活性化ドメインの機能は野生型ＲＮＡ重合酵素アルファサブユニットＣ−末端ドメインまたはタンパク質結合ドメインと融合したＣ−末端ドメインのような突然変異アルファサブユニットＣ−末端ドメインによって模倣できる。
【０３３８】
抑制ドメイン
必要に応じて、活性化ドメインの代わりに抑制ドメインをＤＮＡ結合ドメインに融合できる。真核生物の抑制ドメインの例としては、Ｋｉｄ、ＵＭＥ６、ＯＲＡＮＧＥ、グルーチョ（groucho）およびＷＲＰＷ（Dawsonら, (1995) Mol. Cell Biol. 15:6923-31参照）などから由来する抑制ドメインが含まれる。抑制ドメインの能力はそのドメインを公知のＤＮＡ結合ドメインと融合させ、その公知のＤＮＡ結合ドメインによって認識される配列が連結された標識遺伝子が融合タンパク質によって阻害されるかを決定することによって確認できる。
【０３３９】
代表的な抑制ドメインは次のＵＭＥ６タンパク質から由来するドメインである：
【０３４０】
ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ（配列番号：１３３）
【０３４１】
他の代表的な抑制ドメインはＫｉｄタンパク質から由来するドメインである。
【０３４２】
ＶＳＶＴＦＥＤＶＡＶＬＦＴＲＤＥＷＫＫＬＤＬＳＱＲＳＬＹＲＥＶＭＬＥＮＹＳＮＬＡＳＭＡＧＦＬＦＴＫＰＫＶＩＳＬＬＱＱＧＥＤＰＷ（配列番号：１３４）
【０３４３】
また他のキメラ転写因子は活性化ドメインも抑制ドメインも含まない。かえって、このような転写因子は、結合した内生転写因子(例：活性因子または抑制因子)を置換するか、これらと競争して転写を変化させる。
【０３４４】
ペプチドリンカー
ＤＮＡ結合ドメインは様々なリンカーによって連結できる。リンカーの有用性とデザインはこの技術分野でよく知られている。特に有用なリンカーは、核酸によってコーディングされるペプチドリンカーである。したがって、第１のＤＮＡ結合ドメイン、ペプチドリンカー、および第２のＤＮＡ結合ドメインをコーディングする合成遺伝子を製造できる。このようなデザインは大規模な合成多数−ドメインＤＮＡ結合タンパク質を製造するために繰り返すことができる。ＰＣＴ  ＷＯ９９／４５１３２およびキムおよびパボ（Kim and Pabo, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7）は、ジンクフィンガードメインを連結するのに適したペプチドリンカーのデザインを記述している。
【０３４５】
無作為コイル、α−螺旋またはβ−ひだ状の３次構造を形成する追加的なペプチドリンカーを使用できる。適した柔軟性のあるリンカーを形成するポリペプチドはこの技術分野でよく知られている（Robinson and Sauer (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5929-34参照）。柔軟性のあるリンカーは典型的にグリシンを含むが、これはグリシンが側鎖を欠いているため唯一の回転自由度を有するアミノ酸であるためである。親水性を増加させるためにセリンまたはトレオニンをリンカーに挿入できる。また、結合親和度を増加させるためにＤＮＡのリン酸骨格と相互作用できるアミノ酸を使用できる。このようなアミノ酸の適切な使用によって親和度の増加と配列特異性の減少との間のバランスを取ることができる。もし、リンカーが厳格な伸張性を要求する場合、文献［Pantoliano et al. (1991) Biochem. 30:10117-10125］に記述された螺旋状リンカーのようなα−螺旋リンカーを使用できる。また、リンカーはコンピュータモデリングによってデザインできる（米国特許第４，９４６，７７８号参照）。分子モデリングのためのソフトウエアは市販のものを使用できる（たとえば、Molecular Simulation, Inc., San Diego, CA）。このようなリンカーは、タンパク質工学分野で実施される標準的な突然変異誘導技術および適切な生物理学的テスト、および本明細書に記述された機能的分析法を用いて、抗原性を減少させ／減少させるか、安定性を増加させるための目的などに任意に最適化する。
【０３４６】
ジンクフィンガードメインを活用した実施のために、ジンクフィンガー間の天然ペプチドをジンクフィンガーと共に連結するためのリンカーとして使用できる。そのような天然リンカーとして典型的なものはＴｈｒ−Ｇｌｙ−（ＧｌｕまたはＧｌｎ）−（ＬｙｓまたはＡｒｇ）−Ｐｒｏ−（ＴｙｒまたはＰｈｅ）（配列番号：７４）である（アガタら、前記参照）。一般的に、天然型ジンクフィンガーと結合する配列に基づいてリンカーを選別できる。
【０３４７】
二量化ドメイン
ＤＮＡ結合ドメインを連結するまた他の方法は二量化ドメイン、特に異種二量化ドメイン（Pomerantz et al. (1998) Biochemistry 37: 965-970参照）を用いることである。この実施形態によれば、ＤＮＡ結合ドメインが別個のポリペプチド鎖で存在する。たとえば、一番目のポリペプチドはＤＮＡ結合ドメインＡ、リンカーおよびドメインＢをコーディングする反面、二番目のポリペプチドはドメインＣ、リンカーおよびドメインＤをコーディングする。当業者は特性が明らかになった多くの二量化ドメインから一つの二量化ドメインを選別できる。同種二量体が好ましくない場合、異種二量体化を選好するドメインを使用できる。特に、適用可能な二量化ドメインはコイル化されたコイルモチーフ、たとえば、二量体平衡または逆平衡コイル化されたコイルである。優先的に異種二量体を形成するコイル化されたコイル配列も入手できる（Lumb and Kim, (1995) Biochemistry 34:8642-8648）。二量化ドメインのまた他の種類として二量化が小分子によってまたは信号伝達経路を通じて誘発されるものがある。たとえば、ＦＫ５０６の二量体形態は２つのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインを二量化するのに使用できる。このような二量化ドメインは追加的な調節段階を提供するために利用できる。  
【０３４８】
非ＤＮＡ適用キメラタンパク質
【０３４９】
本願の実施例を非ＤＮＡ結合ドメインの互いに異なる組合せを含むキメラタンパク質をコーディングする核酸のライブラリーを製作するために変形でき、非ＤＮＡ結合ドメインには細胞内信号伝達ドメイン（ＳＨ２、ＳＨ３、ＰＤＺ、Ｃｈｅドメインまたはリン酸化ドメイン）がある。ライブラリーによってコーディングされたキメラタンパク質は細胞内で発現でき、変形された表現型を有する細胞は同定される。たとえば、信号伝達ドメインの異なる組合せからなるキメラタンパク質が細胞増殖速度の減少または増加を同定できる。
【０３５０】
ジンクフィンガータンパク質の発現
【０３５１】
本願に記述された方法は、分子生物学、生化学、古典的遺伝学および組換え遺伝学分野の典型的技術の使用を含み得る。本発明の一般的な利用方法を提示した基礎文献の例としては、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)を含む。
【０３５２】
本願に記述された他に加えて、ジンクタンパク質をコーディングする核酸は、合成遺伝子を製造するために、リンカーとして合成オリゴヌクレオチドを用いて製作できる。他の例として、合成オリゴヌクレオチドは、人工または合成のＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型から一つ以上のジンクフィンガードメインをコーディングする配列を増幅させるためにプライマーとして使用される［米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，２０２号；ＰＣＲプロトコール（protocol）：方法と応用に対する案内（A Guide to Methods and Applications）(Innisら, eds, 1990)］参照］。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）のような方法がｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムまたはジンクフィンガータンパク質ライブラリーから直接核酸配列を増幅させるのに使用できる。変質オリゴヌクレオチドを本書に提供された配列を用いて類似体（homologs）を増幅させるように考案できる。制限酵素部位をプライマーに挿入できる。
【０３５３】
ジンクフィンガータンパク質の遺伝子発現は当業界で公知の方法、たとえば、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、全体ＲＮＡまたはｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡの分離、ノーザンブロット（Northern blotting）、ドットブロット（dot blotting）、その場合でのハイブリダイゼーション（in situ  hybridization）、ＲＮａｓｅ保護（protection）分析、核酸アレイ技術およびそれと類似する分析法などを用いて分析できる。
【０３５４】
人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは複製および／または発現のために原核または真核細胞を形質転換させる前にベクター内にクローニングできる。このベクターはプラスミド、ファージ（phage）またはシャットル（shuttle）ベクターのような原核生物由来のベクターであるか、真核生物由来のベクターである。
【０３５５】
タンパク質発現
人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングするポリヌクレオチドの組換え発現(例：高い水準)を得るために、適合なコーディング核酸を発現ベクターにサブクローニング(subcloning)でき、該発現ベクターは直接転写のための強力なプロモーター、転写/翻訳終結部位および翻訳開始部位に対するリボソーム結合部位を含む。適合なバクテリアプロモーターは当業界に公知であり、次の例に具体的に提示されている(例：Sambrookら,およびAusubelら, 前記文献)。バクテリア発現システムは発現のために有用であるが、たとえば、大腸菌(E. coli)、バチルス(Bacillus sp.)およびサルモネラ(Salmonella)(Palvaら, (1983) Gene 22:229-235; Mosbachら, (1983) Nature 302:543-545)がある。このような発現システムのためのキットは市販のものを使用できる。哺乳動物細胞、酵母(例：S. cerevisiae, S. pombe, Pichia,およびHanseula)および昆虫細胞における真核生物発現システムは当業界で公知であり、また市販されている。
【０３５６】
異種核酸の直接発現に用いられるプロモーターの選別は適用範囲によって異なる。プロモーターは、天然型であるとき、転写開始部位からの距離と同一な転写開始部位からの距離に位置することが好ましい。しかし、当業界に公知のように、このような距離に対する若干の変化はプロモーターの機能が損なわれることなく適用可能である。
【０３５７】
プロモーターに加えて、発現ベクターは一般的に宿主細胞における発現に要求されるすべての追加的な要素が含まれた転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的発現カセットは、コーディング核酸に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位および翻訳終結部位に要求される信号を含む。カセットの追加的な構成要素には、エンハンサーおよび、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として用いられた場合、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位（splice donor and acceptor sites）を有するイントロンが含まれてもよい。
【０３５８】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは効率的終結のために構造遺伝子の転写終結領域を下流（downstream）に含まなければならない。終結部位はプロモーター配列が由来する同一な遺伝子から得られるか、または異なる遺伝子から得られる。
【０３５９】
細胞内に遺伝的情報を伝達するのに用いられる特定の発現ベクターは特別に重要ではない。従来の原核または真核細胞において発現のために用いられたベクターはいずれも使用できる。標準バクテリア発現ベクターはｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦおよびｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、およびＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺのような融合発現システムを含む。分離の便宜のため、エピトープタグ（epitope tag）または組換えタンパク質を追加でき、たとえば、ｃ−ｍｙｃ−またはヘキサ−ヒスチジンタグがある。
【０３６０】
発現ベクターは、ＳＶ４０ベクター、パピロマウイルスベクターおよびエプステイン・バー・ウィルス由来のベクターのような真核ウイルス由来の調節要素を含み得る。他の代表的な真核ベクターにはｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネイン（metallothionein）プロモーター、マウス乳房癌ウイルスプロモーター（murine mammary tumor virus promoter）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Rous sarcoma virus promoter）、ポリヘドリン（polyhedrin）プロモーターまたは真核細胞の発現に効果的に現れたプロモーターの指示下にタンパク質発現が許容される他のベクターが含まれる。
【０３６１】
真核ベクターからのタンパク質発現は誘導プロモーターを用いて調節できる。誘導プロモーターの使用によって、発現水準はテトラサイクリン（tetracycline）またはエクジソン（ecdysone）のような誘導製剤の濃度によって決定でき、これはこのような製剤に対する感応要素をプロモーターに併合させることによって行われる。一般的に、高い水準の発現はただ誘導物質があるときにのみ誘導プロモーターから得られ；基本水準は最小限である。真核タンパク質の発現が真核細胞に有害な場合、誘導発現ベクターがしばしば用いられる。
【０３６２】
ある発現システムはチミジンリン酸化酵素（thymidine kinase）およびジヒドロ葉酸（dihydrofolate）還元酵素のように遺伝子を増幅できるマーカー（marker）を有するものもある。変形的に、遺伝子増幅を含まない高効率の発現システムは、昆虫細胞にバキュロウイルス（baculovirus）ベクターを用いることと同様に、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下に、ミトコンドリア呼吸鎖（mitochondrial respiratory chain）のコーディング配列および糖分解タンパク質コーディング配列を有するものも適する。
【０３６３】
一般的に、発現ベクターに含まれる要素はまた大腸菌、組換えプラスミドを有するバクテリアの選別のための抗生剤抵抗性コーディング遺伝子および真核配列の挿入が許容されるプラスミドの非必須領域内の同一な制限部位に作用するレプリコン（replicon）を含む。  原核配列は真核細胞内のＤＮＡ複製を妨げないものとして選択できる。
【０３６４】
標準トランスフェクション方法は、多量のジンクフィンガータンパク質を発現するバクテリア、哺乳類、酵母または昆虫の細胞株を作るために用いられ、このように発現されたタンパク質は標準技術を用いて分離される（Colleyら, J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)参照）。真核および原核細胞の形質転換は標準技術に従って行われる（Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wuら, eds, 1983)参照）。
【０３６５】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入するために従来のいずれの方法も使用できる。このような方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、原形質体（protoplast）融合、電気穿孔法（electroporation）、リポソーム（liposomes）、微細注入（microinjection）、プラズマベクター（plasma vectors）、ウイルスベクター（viral vectors）およびその他のクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する従来の方法を含む（Sambrookら, supra参照）。ただ使用された特別な遺伝工学過程が少なくとも一つの遺伝子を宿主細胞に成功的に導入する能力があるかのみが重要である。
【０３６６】
発現ベクターを細胞内に導入した後、トランスフェクトされた細胞は発現するのによいか、または発現を活性化する条件下で培養される。タンパク質は細胞抽出物、細胞膜構成要素または小胞（vesicle）から分離でき、または培養液から分離できる。
【０３６７】
また、適切な調節配列を有する発現ベクターはショウジョウバエ類、線虫類、ゼブラフィッシュ（zebrafish）、蛙類（Xenopus）またはマウス類のようなモデル個体内で人工ジンクフィンガーをコーディングする異種遺伝子を発現するのに使用できる（Riddleら, eds., C. elegans II.  Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997参照）。
【０３６８】
タンパク質精製
ジンクフィンガータンパク質は、前述のように、ある適切な発現システムによって製造された物質から精製できる。
【０３６９】
ジンクフィンガータンパク質は標準方法によって高い純度で精製でき、このような方法には硫酸アンモニウム、カラムクロマトグラフィー、親和度（affinity）による分離、免疫分離（immunopurification）およびその他の物質を用いた選別沈澱を含む（Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；米国特許第４，６７３，６４１号；Ausubelら，前記文献；およびSambrookら，前記文献）。たとえば、ジンクフィンガータンパク質は他の段階との組合せのように、分離段階で使用できる親和度タグ（affinity tag）を含み得る。
【０３７０】
組換えタンパク質は一般的にプロモーター誘導後多量の形質転換されたバクテリアによって発現されるが、発現は構成的であり得る（constitutive）。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は誘導プロモーターシステムの一例である。バクテリアは当業界の標準方法に従って培養される。細胞タンパク質の分離のため、新規または冷凍のバクテリア細胞が用いられる。バクテリアに発現されたタンパク質は不溶性凝集体（「封入体」（「inclusion bodies」））を形成できる。封入体からタンパク質を精製するのに適合な様々な方法がある（Sambrookら，前記文献；Ausubelら，前記文献参照）。もしタンパク質が溶解性であるか、ペリプラズム（periplasm）に伝達された形態であれば、細胞溶解物（lysates）またはペリプラズム分離液（periplasmic preparations）から得られる。
【０３７１】
選別的沈澱
塩添加−溶解または析出（Salting-in or out）法は、ジンクフィンガータンパク質または汚染タンパク質を選別的に沈澱させるのに使用できる。代表的な塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムはタンパク質の溶解度に基づいてタンパク質を沈澱させる。さらに強い疎水性のタンパク質であるほどさらに低い濃度の硫酸アンモニウムで沈澱される傾向にある。一般的な方法には硫酸アンモニウムの濃度が２０〜３０％になるように飽和硫酸アンモニウムを添加させる段階を含む。この濃度は多くの疎水性の強いタンパク質を沈澱させる。沈澱物は目標のタンパク質が沈澱されたか、上澄み液に溶けているかを決定するために分析される。目標のタンパク質を沈澱させると知られた濃度になるように上澄み液に硫酸アンモニウムを添加する。その後、沈澱物は緩衝液に溶解し、過量の塩は必要に応じて透析またはダイアフィルトレーション（diafiltration）で除去される。
【０３７２】
カラムクロマトグラフィー
ジンクフィンガータンパク質は、タンパク質の大きさ、表面電位、疎水性およびリガンドに対する親和力に基づいて他のタンパク質から分離できる。さらに、タンパク質に反応する抗体はカラムマトリックスおよび免疫分離されたタンパク質に接合できる。このようなすべての方法は当業界で公知である。クロマトグラフィー技術はいずれの規模でも行うことができ、用いた方法はいずれの規模でも行うことができ、多くの他の製造会社（例：Pharmacia Biotech）の装置を用いて行うこともできる（一般的に、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)参照）。
【０３７３】
同じように、一般的なタンパク質の精製過程は、生産細胞内の人工ジンクフィンガータンパク質の発現にその生産が変化した（例：増大した）タンパク質を回収するのに使用できる。
【０３７４】
遺伝子および細胞−利用治療法
【０３７５】
前記本発明の一態様は、人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングする単離されたＤＮＡ分子を提供する。このような単離されたＤＮＡ分子は遺伝子を治療する目的で様々なＤＮＡ構造およびベクターに挿入できる。本願に用いられた「ベクター」は、他の核酸分子を共有的に連結して運搬できる核酸分子の構成要素である。ベクターは、プラスミド、コスミド、人工染色体（artificial chromosomes）およびウイルス要素を含む。ベクターは宿主細胞内で複製するか、宿主ＤＮＡに統合される構成要素である。ウイルスベクターは、たとえば、複製損傷レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウイルスを含む。遺伝子治療ベクターは哺乳動物のような対象に投与するために考案されるが、対象の細胞はベクター内に含まれた治療用遺伝子を発現できる。
【０３７６】
遺伝子治療ベクターは、５’調節要素、エンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域、信号配列（signal sequence）、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位および３’調節領域のような調節要素を含み得る。たとえば、５’調節要素、エンハンサーまたはプロモーターは治療用ポリペプチドをコーディングするＤＮＡの転写を調節できる。その調節は組織特異的であってもよい。たとえば、調節は目的とする遺伝子の転写を皮質神経または神経膠細胞のような脳細胞；造血細胞または上皮細胞（endothelial）のみに制限できる。他の方途として、調節要素はステロイド、テトラサイクリンまたはそれと類似する外部薬剤に対する反応を含み得る。したがって、治療用ジンクフィンガーポリペプチド（例：ＶＥＧＦを調節するポリペプチド）の発現の水準および時期は調節できる。
【０３７７】
遺伝子治療用ベクターは、核酸として、ウイルスの、または非活性化されたウイルスの構成要素として、またはリポソームまたは他の運搬媒介体として伝達されるために製作できる。他の方途として、ウイルスベクターのような遺伝子運搬製剤は遺伝子伝達システムを生成する組換え細胞から生産できる。適切なウイルスベクターにはモロニーレトロウイルス（Moloney retrovirus）のようなレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）のようなレンチウイルスなどが含まれる。ＨＳＶは神経組織細胞を感染させるのに潜在的に有用である。
【０３７８】
遺伝子治療用ベクターは、たとえば、静脈内注射、局部投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）または定位（stereotactic）注射（Chenら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって対象生物に投与できる。遺伝子治療製剤は、たとえば、徐放出マトリックスで製剤の放出を遅延または持続させるなど追加的調剤が可能である。治療用組換えトリ-ドメインポリペプチドを提供する一つの方法は、対象生物から抽出された骨髄細胞に遺伝子治療ベクターを挿入することである。たとえば、細胞はレトロウイルス遺伝子治療ベクターを用いて感染され、培地で成長する。一方、治療対象に放射能を照射して骨髄細胞を除去する。治療対象の骨髄は遺伝子治療ベクターに感染した培養細胞でさらに満たされる。治療対象の回復および治療用ポリペプチドの生産は細心に観察される。
細胞−基盤治療方法は、培養細胞にプロモーターと作動可能に連結された人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を導入することを含む。人工ジンクフィンガータンパク質は培養細胞内の内生遺伝子を調節するか、培養細胞に目的とする表現型を生産するように選別できる。また、形質転換遺伝子の挿入のような核酸組換えを用いて幹細胞のような細胞を修飾することが可能であり、形質転換遺伝子は内生遺伝子を調節する人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングする。修飾された幹細胞は対象生物に投与できる。インビトロ内の幹細胞の培養方法は米国特許出願第２００２−００８１７２４号に記述されている。特定例において、幹細胞は対象生物の体内で分化するように誘導でき、形質転換遺伝子を発現する。たとえば、幹細胞は、肝、脂肪または骨筋肉細胞に分化できる。幹細胞は、肝、脂肪、骨筋肉細胞のような目的とする組織形態の細胞を生産する系列から由来できる。
【０３７９】
他の実施態様において、本願に記述されているように、人工ジンクフィンガータンパク質を発現するか、または発現可能な組換え細胞は代替療法で治療対象に使用できる。たとえば、プロモーター（例：ステロイドホルモン受容体−調節プロモーターのような誘導プロモーター）に作動可能に連結された人工ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸はヒト、またはブタ組換え細胞のような哺乳動物などの非ヒト細胞に導入できる。細胞は培養され、アルギン酸ポリリジンのような生物学的親和性物質にカプセル化され、治療対象に移植できる（Lanza (1996) Nat. Biotechnol. 14:1107; Jokiら(2001) Nat. Biotechnol. 19:35；および米国特許第５，８７６，７４２号参照）。人工ジンクフィンガータンパク質が分泌タンパク質をコーディングする内生遺伝子を調節する実施態様において、分泌ポリペプチドの生産は治療対象に薬物（例：ステロイドホルモン）を投与することによって調節できる。
【０３８０】
また他の態様において、人工ジンクフィンガータンパク質を発現するか、発現できる組換え細胞はインビトロで培養される。組換え細胞によって生産されるタンパク質は細胞または細胞周囲の培養液から回収（例：分離）できる。
【０３８１】
タンパク質生産変化の標的
【０３８２】
一実施態様において、核酸ライブラリーは、少なくとも一つの特定の標的タンパク質の生産、合成または活性を変化させる人工ジンクフィンガータンパク質を同定するためにスクリーニングされる。変化は標的タンパク質の活性または量を増加または減少できる。スクリーニングの対象である表現型は少なくとも一つの標的タンパク質の変化した生産または活性が関係あるか、それ自体の生産または活性水準である。たとえば、内生標的遺伝子の調節配列（例：プロモーター）の統制下に、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、またはＧＦＰコーディング遺伝子などの遺伝子）を活性化または抑制する人工転写因子に対する核酸ライブラリースクリーニングが可能である。ある代表的なタンパク質は次を含む：細胞表面タンパク質（例：糖鎖化した表面タンパク質）、癌関連タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、神経伝達体（neurotransmitter）、細胞表面受容体（例：細胞表面受容体リン酸化酵素、７つの膜透過性受容体、ウイルス受容体および共受容体（co-receptor））、細胞外構造体結合タンパク質、細胞−結合タンパク質および病原性抗原（例：バクテリア抗原、マラリア抗原など）。標的タンパク質には、エノラーゼ（enolases）、サイトクロムＰ４５０、アシルトランスフェラーゼ（acyltransferases）、メチラーゼ（methylases）、ＴＩＭ障壁酵素（TIM barrel enzymes）およびイソメラーゼ（isomerases）などが含まれる。
【０３８３】
さらに細分化した例としては次を含む：インテグリン、細胞接合分子または「ＣＡＭ」（例：カドヘリン、セレクチン、Ｎ−ＣＡＭ、Ｅ−ＣＡＭ、Ｕ−ＣＡＭおよびＩ−ＣＡＭなど）；タンパク質分解酵素（例：ズブチリシン、トリプシン、キモトリプシン；ウロキナーゼまたはヒト組織−型プラスミノゲン活性化酵素のようなプラスミノゲン）；ボンベシン（bombesin）；因子ＩＸ、トロンビン；ＣＤ−４；血小板−誘導成長因子；インシュリン−類似成長因子−Ｉおよび−II；神経成長因子；繊維芽細胞成長因子（例：ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；内皮成長因子（ＥＧＦ）；ＶＥＧＦａ；形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなＴＧＦ；インシュリン−類似成長因子結合タンパク質；赤血球生成促進因子；血小板生成促進因子；ムチン；ヒト血清アルブミン；成長ホルモン（例：ヒト成長ホルモン）；プロインシュリン、インシュリンＡ−鎖およびインシュリンＢ−鎖；副甲状腺ホルモン；甲状腺促進ホルモン；チロキシン；卵胞促進ホルモン；カルシトニン；心房性ナトリウム排泄増加タンパクＡ、ＢまたはＣ；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩ；造血成長因子；組織壊死因子（例：TNF-αおよびTNF-β；エンケファリナーゼ；ミューラー管抑制物質；性腺刺激ホルモン−関連ペプチド；組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；ホルモンまたは成長因子受容体；リウマチ因子；骨誘導因子；インターフェロン（たとえば、インターフェロン−α，β，γ）；コロニー促進因子（ＣＳＦｓ）（たとえば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４など；崩壊促進因子；および免疫グロブリン。いくつかの実施態様においては、標的は癌のような疾病に関わっている）。
【実施例】
【０３８４】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【０３８５】
実施例１：ジンクフィンガーライブラリーの構築
一例において、サッカロマイセス・セレビジエー（Saccharomyces cerevisiae）の様々な表現型は、ジンクフィンガータンパク質（ＺＥＰ）発現ライブラリーを用いて遺伝子発現を調節することによって変化させる。このような代表的なライブラリーのジンクフィンガータンパク質は３または４個のジンクフィンガードメイン（ＺＦＤｓ）からなり、各々９−〜１２−塩基対のＤＮＡ配列を認識する。キメラジンクフィンガータンパク質は標的遺伝子の先験的知識がなくても同定される。互いに異なる３つの転写因子種類はライブラリー内のＺＦＰから生産される：ＺＦＰがプロモーター領域の近い部位に結合する場合、単離されたＺＦＰ自体が効果的な転写リプレッサーとして機能し；また、ＺＦＰは転写活性化または阻害のために、転写活性化ドメインまたは抑制ドメインに融合したタンパク質として発現される。
【０３８６】
本発明では、３−フィンガーまたは４−フィンガージンクフィンガータンパク質を製作するため、モジュールビルディングブロックとして４０個の異なるジンクフィンガードメインを用いた。これらの最大限界値として、３−フィンガーＺＦＰライブラリーは６４，０００（＝４０３）配列を、４−フィンガーＺＦＰライブラリーは２，５６０，０００（＝４０４）配列を有する。
【０３８７】
これらのＺＦＰ発現プラスミドのライブラリーを酵母細胞内に形質転換させた。各々の形質転換細胞において、異なるＺＦＰ転写因子が発現され、ゲノム上の任意の標的遺伝子を調節した。このような遺伝子発現パターンの変化は表現形質の変化を引起こす。多数の形質転換細胞をスクリーニングして目的とする表現型を有する単一クローンを分離できる。さらに、調節された標的遺伝子は、遺伝子発現プロファイル（例：ＤＮＡマイクロアレイ分析を通じて）のゲノム−範囲分析によって同定できるか、形質転換体に導入されたジンクフィンガータンパク質を同定した後標的ＤＮＡ配列に対するインシリコ（in silico）予測で同定できる。
【０３８８】
（１）酵母菌株
使用したＳ．セレビジエー菌株は、ＹＰＨ４９９ａ（MATa, ade2-101, ura352, lys2-801, trp1-63, his3-△  200, leu2-△ 1, GAL+）である。酵母細胞の形質転換は酢酸リチウム形質転換法（Gietz ら, (1992) Nucl. Acids Res 20:1245）を用いて行った。
【０３８９】
（２）ｐ３プラスミドの製作
ジンクフィンガータンパク質のライブラリーを製作するのに用いられる親ベクター（parental vector）はｐ３プラスミドである。ｐ３は次のような方法でｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン，San Diego CA）を操作して製作した。ｐｃＤＮＡ３ベクターをHindIIIおよびXhoIで切断した。相応するオーバーハング（overhangs）を有する合成重複部位オリゴヌクレオチドを切断されたｐｃＤＮＡ３に連結した。重複部位はヘマグルチニン（ＨＡ）標識および核位置信号（nuclear localization signal）をコーディングする核酸を含む。また、重複部位は、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩに対する制限酵素切断部位と終結コドンを含む。ベクター内のＳＶ４０由来のＸｍａＩ部位は、ＸｍａＩ切断、切断されたオーバーハンの端部を充填し、また両末端をさらに連結することによって破壊した。
【０３９０】
（３）ｐＹＣＴ−Ｌｉｂプラスミドの製作
本発明では、酵母におけるジンクフィンガータンパク質の条件的発現のための親ベクターとしてｐＹＣＴ−Ｌｉｂを用いた。ｐＹＣＴ−Ｌｉｂは誘導ＧＡＬ１プロモーター（図１）を含む酵母シャットルベクターである。他の特徴としては、（ｉ）核位置信号（ＮＬＳ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）標識、および（ii）トリプトファンのない合成最小培地でプラスミド含有細胞の選別のためのＴＲＰ１遺伝子を含む配列を挙げることができる。  
【０３９１】
Ｔ７プライマー部位からＳｐｈＩ部位にポリリンカー領域は次の配列を含み得る：
【０３９２】
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＴＣＴＡ（配列番号：１３５）
【０３９３】
ｐＹＣＴ−Ｌｉｂは次のように製作した。酵母発現プラスミドｐＹＥＳＴｒｐ２  （Invitrogen, San Diego CA）はＮｇｏＭ４によって切断した後、ベクターから２μ  ｏｒｉ断片を除去するためにＰｓｔＩで部分切断した。切断されたＮｇｏＭ４−ＰｓｔＩからの５．０ｋｂ  ＤＮＡ断片はゲル電気泳動後分離し、ｐＲＳ３１３（前方向プライマー：  ５’−ＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧ  ＴＣＣＴＴＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号：１３６）、逆方向プライマー：５’−ＣＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＧ  ＧＣＧＧＡＣＧＧＡＴＣＧＣＴＴＧＣＣＴ（配列番号：１３７））から増幅されたＣＥＮ−ＡＲＳ断片と結合した。
【０３９４】
Ｂ４２活性化ドメインをコーディングするＤＮＡセグメントはＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断して除去し、これにＶ５エピトープ標識および核位置信号をコーディングするＤＮＡ断片を置換導入した。該ＤＮＡ断片はｐＹＥＳＴｒｐ２からＰＣＲ増幅（前方向プライマー：５’−ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：１３８）、逆方向プライマー：５’−ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号：１３９））し、これをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位に結合した。このプラスミドをｐＹＴＣ−Ｌｉｂ（図１）と命名した。
【０３９５】
（４）ｐＹＣＴ−Ｌｉｂ−Ｇａｌ４プラスミド製作
ｐＹＣＴ−Ｌｉｂ−Ｇａｌ４を製作するために、Ｇａｌ４活性化ドメインは酵母ゲノムＤＮＡ（前方向プライマー：５’−ＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号：１４０）、逆方向プライマー：５’−ＡＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＣＣＧＴＴＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣ−３’配列（配列番号：１４１））からＰＣＲ−増幅し、ｐＹＣＴ−ＬｉｂのＮｏｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位に挿入してｐＹＴＣ−Ｌｉｂ−Ｇａｌ４を製作した。Ｇａｌ４活性化ドメインをコーディングする代表的配列および連結配列は次を含む：
【０３９６】
【化２】
2005511049.tif 000006
【０３９７】
（５）ｐＹＣＴ−Ｌｉｂ−Ｕｍｅ６プラスミドの製作
ｐＹＣＴ−Ｌｉｂ−Ｕｍｅ６を製作するために、Ｓ．セレビジエーＵｍｅ６の５０８〜５９４のアミノ酸をコーディングするＤＮＡ断片を酵母ゲノムＤＮＡ（前方向プライマー：  ５’−ＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号：１４３）、逆方向プライマー：５’−ＡＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＡＧＡＡＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’（配列番号：１４４））から増幅し、ｐＹＣＴ−ＬｉｂのＮｏｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位の間に挿入した。この８７−アミノ酸領域は転写抑制ドメインとして機能する（KadoshおよびStruhl (1997) Cell 89:365-371）。Ｕｍｅ６抑制ドメインをコーディングする代表的配列および連結配列は次の配列を含む：
【０３９８】
【化３】
2005511049.tif 000007
【０３９９】
（６）ライブラリーの製作
３つのＺＦＤのアレイを有するジンクフィンガータンパク質をコーディングする、３−フィンガータンパク質ライブラリー（「３−Ｆライブラリー」）は４０個の異なるＺＦＤまたは「フィンガー」をコーディングする核酸から製作した。４−フィンガータンパク質ライブラリー（「４−Ｆライブラリー」）は２７個の異なるＺＦＤをコーディングする核酸から製作した（下記表２）。
【０４００】
【表２】
2005511049.tif 000008
【０４０１】
前記表２の２列の上付きは、１）Zhangら, (2000) J. Biol. Chem. 275:33850-33860; 2) RebarおよびPabo(1994) Science 263:671-673; 3) Segal (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758; 4) Gogusら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2159-2164; 5)Drierら, (2001) J. Biol. Chem. 276: 29466-29478; 6)Liuら(2001)J. Biol. Chem. 276(14):11323-11334; 7)Hsuら, (1992) Science 257:1946-50を示す。
【０４０２】
図７は、様々な３−フィンガータンパク質ライブラリーを構築する方法を示す。各ＺＦＤをコーディングする核酸断片は「単一フィンガー」ベクターを形成するために個別的にｐ３ベクター内にクローニングされた。同一量の各「単一フィンガー」ベクターを組合せてプールを形成した。プールの一部はＡｇｅＩとＸｈｏＩで切断して切断されたベクター断片を得た。このベクター断片を３０分間脱リン酸化酵素で処理した。プールの他の一部はＸｍａＩとＸｈｏＩで切断して単一フィンガーをコーディングするセグメントを得た。ＡｇｅＩおよびＸｈｏＩで切断されたプールから切断されたベクター核酸をＸｍａＩおよびＸｈｏＩ切断によってベクターから放出された核酸セグメントと結合した。このような結合は、各々２つのジンクフィンガードメインをコーディングするベクターを生成した。大腸菌を形質転換した後、約１．４×１０４個の個別形質転換体を得、２−フィンガーライブラリーを形成した。２−フィンガーライブラリーの挿入領域のサイズは４０個コロニーのＰＣＲ分析によって確認した。ライブラリー構成員の９５％は所定のサイズの挿入を示した。
【０４０３】
３−フィンガーライブラリーを製作するために、単一フィンガーをコーディングするＤＮＡセグメントを２つのフィンガーをコーディングするプラスミドに挿入した。２−フィンガーライブラリーはＡｇｅＩおよびＸｈｏＩで切断した。２つのジンクフィンガードメインを有する切断されたプラスミドは単一フィンガー（前記と同一な方法でＸｍａＩおよびＸｈｏＩで切断された）をコーディングする核酸に結合した。この連結の生成物を大腸菌内に形質転換させて２．４×１０５個の個別形質転換体を得た。挿入領域の確認でライブラリー構成員が３つのジンクフィンガードメインをコーディングする配列を優勢に有することを確認した。
【０４０４】
４−フィンガーライブラリーを製作するために、２−フィンガードメインをコーディングするＤＮＡセグメントを、２−フィンガーをコーディングするプラスミドに挿入した。２−フィンガーライブラリーはＸｍａＩおよびＸｈｏＩで切断し、２−フィンガードメインをコーディングする核酸セグメントを得た。２−フィンガーライブラリーはまたＡｇｅＩおよびＸｈｏＩで切断し、切断されたプラスミドプールを得た。２つのジンクフィンガードメインをコーディングする核酸配列を含有する切断されたプラスミドは２つのジンクフィンガードメインをコーディングする核酸セグメントに連結して異なる組合せの４−フィンガータンパク質を生成した。この連結の生成物を大腸菌内に形質転換させて約７×１０６の個別形質転換体を生成した。
【０４０５】
（７）酵母内の発現のためのライブラリーの製作
３−フィンガー（３−Ｆ）および４−フィンガー（４−Ｆ）ライブラリーをｐＹＴＣ−Ｌｉｂ、ｐＹＴＣ−Ｇａｌ４およびｐＹＴＣ−Ｕｍｅ６のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。このサブクローニングの段階では、転写調節ドメインを有するか、有しない３および４つのフィンガーＺＦＰをコーディングする６つの異なるライブラリーが生成された。大腸菌内での増幅後、各ライブラリーは酢酸リチウムを用いて酵母菌株であるＹＰＨ４９９ａ内に形質転換させた。形質転換は約１．５×１０７コロニーを生成した。ライブラリーの挿入領域のサイズは５０コロニーのＰＣＲ分析で確認した。９５％のライブラリー構成員は正確な挿入サイズを含んでいた。形質転換体はＴＥ緩衝溶液に再懸濁し、−８０℃でグリセロールに保管した。
【０４０６】
実施例２：ガラクトース培地上の成長−欠陥形質転換体
酵母細胞の成長を損なうキメラジンクフィンガータンパク質を同定するために３−Ｆライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングはキメラジンクフィンガータンパク質を条件的に発現させるためにＧＡＬプロモーターを使用する。従来の研究は、過発現時に致命的な遺伝子を同定するために、酵母ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列にＧＡＬプロモーターを使用した（Liuら, (1992) Genetics 132:665-673; Ramerら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11589-11593; Espinetら, (1995) Yeast 11:25-32; Akadaら, (1997) Mol. Gen. Genet 254: 267-274; Stevensonら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 3946-3951）。
【０４０７】
酵母菌株ＹＰＨ４９９ａは３−Ｆライブラリーから核酸で形質転換させた。形質転換体を、トリプトファンを欠き、グルコースを含有する合成最小培地が入っているプレート上で３０℃で２日間成長させた。これらの各グルコースプレートはガラクトースプレートおよび第２のグルコースプレート上に複製−培養した。複製プレートは３０℃で一晩培養した。その後、各ガラクトースプレートをそれに相応するグルコースプレートと比較した。ガラクトース上で成長しなかったが、グルコース上で成長したコロニーを同定した。このコロニーをグルコースプレートから回収し、さらにガラクトース培地上にストリーキング（streaking）して再試験を行った。再試験された各コロニーからライブラリープラスミドを得た。プラスミドの成長欠陥がジンクフィンガータンパク質の発現によるものであるかを確証するためにＹＰＨ４９９ａ内に再質転換させた。如何なるジンクフィンガータンパク質もコーディングしない２つのベクタープラスミドｐＹＴＣとｐＹＴＣ−Ｇａｌ４を対照群として同様に行った。
【０４０８】
表３から分かるように、３−Ｆと４−Ｆライブラリーから形質転換体の０．７％〜２．８％はガラクトース培地で成長できなかった。このような百分率は、対照群ｐＹＴＣ−Ｌｉｂベクター対照群（０．１％）およびｐＹＴＣ−Ｌｉｂ−Ｇａｌ４ベクター対照群（０．２％）で得られた値と類似するか、遥かに高かった。
【０４０９】
【表３】
2005511049.tif 000009
【０４１０】
グルコース上で成長−欠陥を示す１０個のコロニーからプラスミドを回収した。プラスミド（Ｌ１ないしＬ１０）を酵母細胞内に再形質転換させた。１０個のプラスミドをすべて再試験した。回収されたプラスミドで形質転換された細胞はグルコース培地では成長したが、ガラクトース培地では成長できなかった。このような１０個のプラスミドによってコーディングされたジンクフィンガータンパク質をＤＮＡ配列分析（表４）によって分析した。これらのタンパク質に対する潜在的標的ＤＮＡ結合部位は構成要素ジンクフィンガードメインの結合特異性に関する情報から類推した。
【０４１１】
【表４】
2005511049.tif 000010
【０４１２】
実施例３：抗菌薬物に対する抵抗性
ケトコナゾール（Ketoconazol）は経口吸収される抗菌性（antimycotic）イミダゾール（imidazole）薬剤である。これは特定の粘膜の治療のために投与できる。ケトコナゾールは酵母および他の真菌類においてエルゴステロール（ergosterol）の生合成を遮断し（Burdenら, (1989) Phytochemistry 28:1791-1804）、細胞の代謝に追加的効果を示す（Kellyら, (1992) In Fernandes, P. B. (Ed.) New Approaches for Antifungal Drug, Birkhauser, Boston, pp.155-187）。
【０４１３】
ケトコナゾールに対する試験菌株ＹＰＨ４９９ａの真菌抵抗（fungistatic）反応を確認するために、ＹＰＨ４９９ａ菌株１０７細胞を異なる濃度の薬剤を含有する合成培地上に塗布した。本発明者らは、３５μＭのケトコナゾールがＹＰＨ４９９ａ細胞の増殖を阻害することを確認し、ケトコナゾール−抵抗酵母コロニーをスクリーニングするためにこのような濃度を使用した。
【０４１４】
３−フィンガーおよび４−フィンガーライブラリーからプラスミドを含有する１×１０７酵母細胞を、ジンクフィンガータンパク質の発現を誘導するために、２％ガラクトース含有合成培養液で３０℃、３時間培養し、その後、３５μＭケトコナゾール（ICN Biomedicals）を含有する合成ガラクトースアガプレートに塗布した。３０℃で４日間培養した後、３５μＭケトコナゾールを含有するガラクトース培地上に約１２０個のクローンがコロニーを形成した。これらのケトコナゾール抵抗性酵母コロニーを採取して３５μＭケトコナゾールを含有する新鮮な合成ガラクトース寒天プレートにストリーキングした。１２０個の抵抗性クローンのうち、２３個のクローンを無作為に選別した。各々の２３個のクローンに対して、抵抗表現型はプラスミド回収で確認した。プラスミドを分離して増幅のために大腸菌内に形質転換させ、酵母菌株であるＹＰＨ４９９ａ内に再形質転換させた（Ausubelら(Eds)(1995) Current Protocols in Molecular Biology John WileyおよびSons Ltd, New York）。同じ数の形質転換体を、３５μＭケトコナゾールを含有するか、含有しない合成ガラクトース寒天プレートにスポット（spot）した。再形質転換体は、薬剤抵抗性がジンクフィンガータンパク質のガラクトース−誘導発現によって誘導されたものであるかを確認するために、ケトコナゾールを含有するか、含有しない合成グルコース寒天プレートにまたスポットした。
【０４１５】
一つの実験において、各形質転換体から５×１０４細胞を順次希釈し（１０−１、１０−２および１０−３倍）、３５μＭのケトコナゾールを含有するか、含有しないガラクトースまたはグルコース供給された培地にスポットした。細胞の成長を３０℃で４日後観察し、同じプレート上の対照群と比較した。対照群は、ケトコナゾールの抵抗性を誘導しないジンクフィンガータンパク質をコーディングするプラスミドおよびジンクフィンガータンパク質をコーディングする挿入体を有しないｐＹＴＣ−Ｌｉｂプラスミドを含んでいた。２３個のすべての場合において、回収されたプラスミドを再試験した。さらに、ケトコナゾール抵抗性をただガラクトース培地に塗布された細胞のみで観察し、これにより、ジンクフィンガータンパク質の発現がケトコナゾール抵抗性を誘導することが分かる。
【０４１６】
ケトコナゾール抵抗形質転換体から分離されたプラスミドの塩基配列を分析し、酵母ゲノム内の予想標的配列を予測した（表５）。１１個のユニークなクローンが同定された（表５）。
【０４１７】
【表５】
2005511049.tif 000011
【０４１８】
このようなタンパク質のアミノ酸配列を下記に示す（ジンクフィンガードメインは下線で表示し、転写調節ドメインを[  ]内に示す）。Ｋ１：ＱＳＨＶ−ＱＦＮＲ−ＲＳＨＲ−Ｕｍｅ６は次のアミノ酸配列を含む：
【０４１９】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＨＱＣＧＫＡＦＩＱＳＦＮＬＲＲＨＥＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＭＥＣＧＫＡＦＮＲＲＳＨＬＴＲＨＱＲＩＨＡＡＡＡ[ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ]（配列番号：２２１）
【０４２０】
Ｋ２：ＲＳＮＲ−ＲＳＮＲ−ＱＳＳＲ１−ＱＳＨＴ−Ｕｍｅ６は次のアミノ酸配列を含む：
【０４２１】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＤＣＧＫＳＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨＡＡＡＡ[ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ]（配列番号：２２２）
【０４２２】
Ｋ３：ＲＳＮＲ−ＲＳＮＲ−ＱＧＴＲ−ＱＳＨＲ５−Ｕｍｅ６は次のアミノ酸配列を含む：
【０４２３】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＧＴＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＹＶＣＲＥＣＧＲＧＦＲＱＨＳＨＬＶＲＨＫＲＴＨＡＡＡＡ[ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ]（配列番号：２２３）
【０４２４】
Ｋ４：ＲＳＮＲ−ＲＳＮＲ−ＱＧＴＲ−ＱＴＨＱ−Ｕｍｅ６は次のアミノ酸配列を含む：
【０４２５】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＩＣＲＫＣＧＲＧＦＳＲＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＲＧＴＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨＡＡＡＡ[ＮＳＡＳＳＳＴＫＬＤＤＤＬＧＴＡＡＡＶＬＳＮＭＲＳＳＰＹＲＴＨＤＫＰＩＳＮＶＮＤＭＮＮＴＮＡＬＧＶＰＡＳＲＰＨＳＳＳＦＰＳＫＧＶＬＲＰＩＬＬＲＩＨＮＳＥＱＱＰＩＦＥＳＮＮＳＴＡＣＩ]（配列番号：２２４）
【０４２６】
Ｋ５：ＶＳＳＲ−ＤＧＮＶ−ＶＳＳＲ−ＶＤＹＫ−Ｇａｌ４は次のアミノ酸配列を含む：
【０４２７】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳＬＲＲＨＥＴＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＳＧＮＬＲＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳＬＲＲＨＥＴＴＨＴＧＥＫＰＦＨＣＧＹＣＥＫＳＦＳＶＫＤＹＬＴＫＩＲＴＨＡＡＡＡ[ＮＦＮＱＳＧＮＩＡＤＳＳＬＳＦＴＦＴＮＳＳＮＧＰＮＬＩＴＴＱＴＮＳＱＡＬＳＱＰＩＡＳＳＮＶＨＤＮＦＭＮＮＥＩＴＡＳＫＩＤＤＧＮＮＳＫＰＬＳＰＧＷＴＤＱＴＡＹＮＡＦＧＩＴＴＧＭＦＮＴＴＴＭＤＤＶＹＮＹＬＦＤＤＥＤＴＰＰＮＰＫＫＥＩＳＭＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ]（配列番号：２２５）
【０４２８】
Ｋ６：ＭＨＨＥ−ＱＳＮＲ１−ＶＳＳＲ−ＱＧＤＲ−Ｇａｌ４は次のアミノ酸配列を含む：
【０４２９】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＭＳＨＨＬＫＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＥＣＫＤＣＧＫＡＦＩＱＫＳＮＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＴＣＫＱＣＧＫＡＦＳＶＳＳＳＬＲＲＨＥＴＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＧＤＬＲＲＨＩＲＴＨＡＡＡＡ[ＮＦＮＱＳＧＮＩＡＤＳＳＬＳＦＴＦＴＮＳＳＮＧＰＮＬＩＴＴＱＴＮＳＱＡＬＳＱＰＩＡＳＳＮＶＨＤＮＦＭＮＮＥＩＴＡＳＫＩＤＤＧＮＮＳＫＰＬＳＰＧＷＴＤＱＴＡＹＮＡＦＧＩＴＴＧＭＦＮＴＴＴＭＤＤＶＹＮＹＬＦＤＤＥＤＴＰＰＮＰＫＫＥＩＳＭＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ]（配列番号：２２６）
【０４３０】
Ｋ７：ＤＧＮＶ−ＱＳＨＴ−ＱＳＳＲ１−ＤＧＨＲ−Ｇａｌ４は次のアミノ酸配列を含む：
【０４３１】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＳＧＮＬＲＶＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＤＣＧＫＳＦＳＱＳＳＳＬＩＲＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＰＧＨＬＶＲＨＩＲＴＨＡＡＡＡ[ＮＦＮＱＳＧＮＩＡＤＳＳＬＳＦＴＦＴＮＳＳＮＧＰＮＬＩＴＴＱＴＮＳＱＡＬＳＱＰＩＡＳＳＮＶＨＤＮＦＭＮＮＥＩＴＡＳＫＩＤＤＧＮＮＳＫＰＬＳＰＧＷＴＤＱＴＡＹＮＡＦＧＩＴＴＧＭＦＮＴＴＴＭＤＤＶＹＮＹＬＦＤＤＥＤＴＰＰＮＰＫＫＥＩＳＭＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ]（配列番号：２２７）
【０４３２】
Ｋ８：ＤＧＡＲ−ＲＤＴＮ−ＱＴＨＱ−ＲＤＴＮは次のアミノ酸配列を含む：
【０４３３】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＰＧＡＬＶＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＮＨＩＲＴＨＡＡＡＡＲＧＭＨＬＥＧＲＩＭ  （配列番号：２２８）
【０４３４】
Ｋ９：ＲＤＨＴ−ＱＴＨＱ−ＱＳＨＴ−ＤＧＮＶは次のアミノ酸配列を含む：
【０４３５】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨＴＧＥＫＰＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＤＳＧＮＬＲＶＨＩＲＴＨＡＡＡＡＲＧＭＨＬＥＧＲＩＭ  （配列番号：２２９）
【０４３６】
Ｋ１０：ＲＤＨＴ−ＱＴＨＱ−ＱＳＨＴは次のアミノ酸配列を含む：
【０４３７】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＨＤＣＧＫＳＦＲＱＳＴＨＬＴＱＨＲＲＩＨＴＧＥＫＰＹＫＣＥＥＣＧＫＡＦＲＱＳＳＨＬＴＴＨＫＩＩＨＡＡＡＡＲＧＭＨＬＥＧＲＩＭ（配列番号：２３０）
【０４３８】
Ｋ１１：ＲＤＨＴ−ＱＳＨＶ−ＱＳＨＶは次のアミノ酸配列を含む：
【０４３９】
ＭＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＮＳＴＱＡＭＧＡｐｐｋｋｋｒｋｖｇｉｒｉｐｇｅｋｐＦＱＣＫＴＣＱＲＫＦＳＲＳＤＨＬＫＴＨＴＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨＴＧＥＫＰＹＥＣＤＨＣＧＫＳＦＳＱＳＳＨＬＮＶＨＫＲＴＨＡＡＡＡＲＧＭＨＬＥＧＲＩＭ（配列番号：２３１）
【０４４０】
同一の一般のモチーフ（例：４個のＤＮＡ接触残基のセット）を有するジンクフィンガードメインを２個、３個またはそれ以上を含み、前記如何なるタンパク質とも同一な一連の順に整列された残りのジンクフィンガータンパク質はまた真菌細胞に薬剤抵抗性を付与できる。
【０４４１】
あるクローンはジンクフィンガードメインと類似する構造を含む。Ｋ２、Ｋ３およびＫ４の第１および第２のフィンガーは互いに同じである。このようなクローンでは、４個のフィンガーのうち３つが他のタンパク質の相応する位置にあるフィンガーと同じである。これらのＺＦＰの関係がただ偶然ではないだろう（Ｐ＜１．６×１０−５）。したがって、Ｋ２、Ｋ３およびＫ４  ＺＦＰは生体内の同一の標的部位に結合し、同一の標的遺伝子を調節できる。
【０４４２】
さらに、Ｋ１０クローンによってコーディングされるジンクフィンガータンパク質はＫ９およびＫ１１クローンにコーディングされたものと密接な関連がある。Ｋ９、Ｋ１０およびＫ１１から発見されたＱＴＨＱ、ＱＳＨＴおよびＱＳＨＶフィンガーは同じ３−ｂｐ  ＤＮＡ部位：５’−ＨＧＡ−３’を認識できる。それらが構造的に類似すると仮定する場合、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１１  ＺＦＰｓはインビボで同一の標的に結合し、同一の遺伝子を調節できる。関連のあるクローン（例：Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４；そして、Ｋ９、Ｋ１０、Ｋ１１）において、各２つの群を有するすべてのＺＦＰは調節様相が同じ類型を含む。Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４クローンは各々Ｕｍｅ６抑制ドメインを含む。Ｋ９、Ｋ１０およびＫ１１クローンは専用転写調節ドメインがなくても各々機能する。
【０４４３】
少なくとも２つのＺＦＰが細胞内に共形質転換される場合、相乗的または追加的効果を示し得る。たとえば、Ｋ４およびＫ５  ＺＦＰが共発現される場合、酵母細胞はケトコナゾールに対して完全に抵抗性を有することになった。この組合せは約１，０００倍の表現形質の増大をもたらす。
【０４４４】
ＺＦＰ突然変異はＤＮＡ接触残基を変化させるか、調節ドメインを置換して製作した。一つの突然変異（ＶＳＳＲ−ＤＧＡＶ−ＶＳＳＲ−ＶＤＹＫ−ＧＡＬ４ＡＤ）において、Ｋ５の第２のジンクフィンガーのアスパラギンＤＮＡと接触する残基はアラニンに突然変異された。ゲルシフト分析は、このような突然変異されたＺＦＰの予想ＤＮＡ部位に対する結合力が１０倍以上減少することを示す。このような突然変異Ｋ５タンパク質は酵母細胞に薬剤抵抗性を付与しない。他の突然変異においては、Ｋ５ジンクフィンガータンパク質のＧａｌ４活性化ドメインを、それをコーディングするＤＮＡ配列前に終結コドンを挿入して削除した。このようなタンパク質もまたケトコナゾール抵抗性を付与しない。類似する結果が他のケトコナゾール抵抗性ＺＦＰからも得られた。
【０４４５】
Ｋ５  ＺＦＰに融合した活性化ドメインがＵｍｅ６抑制ドメインで置換される場合、Ｕｍｅ６−形タンパク質はケトコナゾール抵抗性表現型を逆にした。Ｕｍｅ６−形タンパク質を発現する細胞は対照細胞に比べてケトコナゾールにさらに敏感にした。このような結果は、目的とする表現型効果を有する転写因子を生産するために、表現型を悪化させる転写因子を選別し、接合調節ドメイン（例：機能的方向性の転換（switching））を変形させることによって転写因子を選別できることを示す。目的とする形質と異なる反対の形質に対するスクリーニングは目的とする表現型自体をスクリーニングすることよりもさらに容易である。機能的方向性を転換する置換の例としては、一つの調節ドメイン型を他の型または他の調節ドメインで置換することおよび調節ドメインを除去することが含まれる。Ｋ５  ＺＦＰの場合、薬剤敏感性を増大させるタンパク質は薬剤抵抗性を増加させるタンパク質をスクリーニングし、その転写活性化ドメインを転写抑制ドメインで置換して得られた。
【０４４６】
【表６】
2005511049.tif 000012
【０４４７】
薬剤抵抗表現型に関連する遺伝子を同定するためにＤＮＡマイクロアレイ分析を用いた。本発明者らは同一の表現型を付与する異なるＺＦＰが直接的または間接的に表現型と関わる異なる発現を有する同定遺伝子セットを調節すると推論した。３個のＺＦＰの「Ｋ５、Ｋ６およびＫ７」を発現プロファイルの分析のために選択した。この３つの転写因子はＧａｌ４活性化ドメインを含む。酵母の６４００個のオープン・リーディング・フレームのうち、１０個が少なくとも２つの異なるＺＦＰ転写因子によって２倍以上活性化され、４つの活性化したオープン・リーディング・フレームは試験した３つのすべてのＺＦＰ転写因子によって活性化された。４つのオープン・リーディング・フレームはＹＬＬ０５３Ｃ、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２ＣおよびＹＰＬ０９１Ｗである。
【０４４８】
表７は、少なくとも一つのキメラＺＦＰによって調節された遺伝子の数を示す。
【０４４９】
【表７】
2005511049.tif 000013
【０４５０】
ケトコナゾールを細胞外に排出すると知られているＰＤＲ５は２つのＺＦＰであるＫ６およびＫ７によって活性化され、Ｋ５によっては活性化されなかった。このような結果は、Ｋ５がＰＤＲ５−無関係な機構でケトコナゾール抵抗性を付与し、酵母においてケトコナゾール抵抗性を誘発するのに少なくとも２つの経路が関与することを示す。一つの経路はＰＤＲの活性によるが、もう一つはＰＤＲ５と関係ない。
【０４５１】
薬剤抵抗表現型に関連する新しい遺伝子を同定するために、本発明者らは３つの試験ＺＦＰ転写因子によって活性化された４つの遺伝子中の一つを過発現する細胞の薬剤抵抗表現型を分析した。本発明者らは遺伝子中の一つの「ＹＬＬ０５３Ｃ」がその遺伝子の過発現時、ケトコナゾール抵抗性を誘発することを発現した。前記表６に示したＹＬＬ０５３Ｃはカンジダアルビカン（Candida albicans）の細胞膜および水分通路（water channel）タンパク質と相同する。ＹＬＬ０５３Ｃのアミノ酸配列は次の通りである：  
【０４５２】
ＭＷＦＰＱＩＩＡＧＭＡＡＧＧＡＡＳＡＭＴＰＧＫＶＬＦＴＮＡＬＧＬＧＣＳＲＳＲＧＬＦＬＥＭＦＧＴＡＶＬＣＬＴＶＬＭＴＡＶＥ
ＫＲＥＴＮＦＭＡＡＬＰＩＧＩＳＬＦＭＡＨＭＡＬＴＧＹＴＧＴＧＶＮＰＡＲＳＬＧＡＡＶＡＡＲＹＦＰＨＹＨＷＩＹＷＩＳＰＬＬＧ
ＡＦＬＡＷＳＶＷＱＬＬＱＩＬＤＹＴＴＹＶＮＡＥＫＡＡＧＱＫＫＥＤ（配列番号：２３２）
【０４５３】
カンジダアルビカン（Candida albicans）の水分通路１タンパク質（ＡＱＹ１）のアミノ酸配列は次の通りである：  
【０４５４】
ＭＶＡＥＳＳＳＩＤＮＴＰＮＤＶＥＡＱＲＰＶＹＥＰＫＹＤＤＳＶＮＶＳＰＬＫＮＨＭＩＡＦＬＧＥＦＦＧＴＦＩＦＬＷＶＡＦＶＩＡ
ＱＩＡＮＱＤＰＴＩＰＤＫＧＳＤＰＭＱＬＩＭＩＳＦＧＦＧＦＧＶＭＭＧＶＦＭＦＦＲＶＳＧＧＮＬＮＰＡＶＴＬＴＬＶＬＡＱＡＶＰ
ＰＩＲＧＬＦＭＭＶＡＱＭＩＡＧＭＡＡＡＧＡＡＳＡＭＴＰＧＰＩＡＦＴＮＧＬＧＧＧＡＳＫＡＲＧＶＦＬＥＡＦＧＴＣＩＬＣＬＴＶ
ＬＭＭＡＶＥＫＳＲＡＴＦＭＡＰＦＶＩＧＩＳＬＦＬＧＨＬＩＣＶＹＹＴＧＡＧＬＮＰＡＲＳＦＧＰＣＶＡＡＲＳＦＰＶＹＨＷＩＹＷ
ＶＧＰＩＬＧＳＶＩＡＦＡＩＷＫＩＦＫＩＬＫＹＥＴＣＮＰＧＱＤＳＤＡ（配列番号：２３３）
【０４５５】
ＹＬＬ０５３Ｃ遺伝子生成物はＰＤＲ５遺伝子生成物と同様にケトコナゾールを細胞外に排出する作用を通じて抵抗性を付与する。このような結果は、表現型の変化に係る遺伝子が細胞の遺伝子発現プロファイル分析によって同定できることを示す。さらに、遺伝子同定は同一の表現型（本実施例において、ケトコナゾール抵抗性）を誘発する互いに異なるキメラＺＦＰの使用によって更に容易になる。
【０４５６】
実施例４：熱抵抗性形質転換体スクリーニング
本発明では、酵母細胞に熱抵抗性を付与するタンパク質をコーディングする核酸を同定するために、キメラジンクフィンガーをコーディングするライブラリーをスクリーニングした。
【０４５７】
３−フィンガーライブラリーの核酸を含有する１×１０７酵母細胞を２％ガラクトースを含有するＳＤ合成培養液で３０℃、３時間培養した後、５２℃で２時間徐々に回転培養した。熱処理後、培養液をガラクトース培地に載せ、これを３０℃で５日間培養した。成長酵母コロニーは熱抵抗表現型を確認するためにガラクトース培養液に希釈させて５２℃で２時間培養した。これらの細胞からプラスミドを分離して前述の方法で酵母内に再形質転換させた。再形質転換体は３０℃ガラクトース培養液で３時間培養した後、５２℃で２時間培養した。培養された再形質転換体はＳＤガラクトースアガプレートに４段階で希釈してスポットした。熱抵抗性が突然変異体のジンクフィンガータンパク質の発現によって誘導されたことを確認するために、再形質転換体を前記と同様な条件のＳＤグルコース培養液で培養した後、ＳＤグルコース寒天プレートにスポットした。ｐＹＴＣベクターの形質転換体および無作為に選択された３−フィンガータンパク質をコーディングするプラスミドを対照群として用いた。
【０４５８】
熱抵抗酵母細胞はジンクフィンガータンパク質発現プラスミドで形質転換された細胞から同定された。ｐＹＴＣ−Ｌｉｂプラスミドまたは無作為に選定されたジンクフィンガータンパク質をコーディングするプラスミドを含有する野生型細胞を陰性対照群として使用した。総１０７細胞をガラクトース培養液で増殖した。ガラクトースはジンクフィンガータンパク質の発現を誘導した。細胞は５２℃で２時間熱処理した後、最小ガラクトース寒天プレートに移した。３０℃で５日間培養した後、２６個のコロニーがプレートで成長した。本発明者らは、このコロニーからプラスミドを回収し、ＹＰＨ４９９ａ内に再形質転換させた。これから様々な程度の熱抵抗性を示す９個のクローンを分離した。普通、このようなクローンのジンクフィンガータンパク質発現は熱処理後ガラクトース培地では細胞の１０％以上が生存するよう誘導されたが、グルコースでは誘導されなかった。対照プラスミドで形質転換された細胞ではただ０．３％のみが同一条件で生存した。新しく成長した形質転換細胞は凍結保管された細胞よりも実験条件でよく生存した。このような結果は特定のジンクフィンガータンパク質の発現が酵母細胞において熱抵抗性を誘導できることを示す。ＺＦＰは、回収されたライブラリープラスミドのＤＮＡ塩基配列分析で特徴付けられた（表８）。
【０４５９】
【表８】
2005511049.tif 000014
【０４６０】
実施例５：神経突起の生成
本発明者らは、神経細胞タイプに分化できるマウス神経芽細胞腫（neuroblastoma）細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａにおいて神経突起形成を誘導するジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸を検索するために核酸ライブラリーをスクリーニングした。本発明者らは、細胞の形態の変化および神経標識遺伝子の発現によって証明することにより神経分化を誘導する新規なキメラＺＦＰを発見した。
【０４６１】
材料および方法
ライブラリーの製作
前記実施例１に示すように、３−フィンガーおよび４−フィンガーＺＦＰ−Ｔｆライブラリーを各々４０個および２５個のジンクフィンガードメインを用いて製作した。３−フィンガーと４−フィンガーライブラリーは各々略９−および１２−ｂｐ  ＤＮＡ結合部位を認識する。ＺＦＰはｐ６５転写活性化ドメインおよびＫＲＡＢ抑制ドメインとの融合タンパク質として発現された。
【０４６２】
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞培養と神経分化
マウス神経芽細胞腫ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は１０％ＦＢＳと抗生剤を含むＭＥＭ−α培地で３７℃、９５％空気と５％ＣＯ２の湿った空気状態で培養された。細胞は９６−ウェルプレートのウェル当たりの８．０×１０３細胞になるように分株し、リポフェクタミンプラス試薬（LIPOFECTAMINE PLUS（商標）reagent）（Invitrogen, CA）を用いてＺＦＰ  ５０ｎｇおよびＬａｃＺ標識プラスミド２０ｎｇを共に製造社の方法に従ってトランスフェクトした。インビトロ分化はレチノイン酸（ＲＡ）（１０ｕＭ）を添加するか、または添加しない条件で行われ、トランスフェクトされていない細胞の数を減らすためにＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）をトランスフェクションしてから２４時間後に処理した。細胞を９６時間培養した後固定し、β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）の活性を観察するために染色後写真撮影した。β−ガラクトシダーゼ−陽性細胞のうち、神経突起の長さが細胞体の直径よりも少なくとも２倍以上拡張した場合、分化した細胞とみなした。
【０４６３】
結果および考察
神経突起生成を誘導するＺＦＰ−ＴＦのスクリーニング
神経分化を誘導するＺＦＰ−ＴＦをスクリーニングするために、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をライブラリープラスミドおよびＬａｃＺ遺伝子を含む標識プラスミドで一過性トランスフェクトした。ＬａｃＺ発現はトランスフェクトされた細胞の形態を視覚化するのに使用された。分化する細胞は未分化細胞よりも徐々に成長し、未分化細胞が細胞集団で優勢になるので、トランスフェクトされていない細胞を除去するためにトランスフェクションしてから２４時間後に培養細胞にＧ４１８を処理した。５日後、細胞を固定してＬａｃＺ−染色した。その後、細胞形態的特徴によって細胞を分類した。特に、本発明者らは神経突起の長さおよび太さが増加した細胞を同定した。
【０４６４】
本発明者らは神経突起生成を変化させるいくつかのＺＦＰ−ＴＦを同定した。このＺＦＰ−ＴＦは様々な程度に神経突起生成に影響を与えた。Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５と命名されたＺＦＰ−ＴＦは、誘導される神経突起の長さと厚さの測定値からみるとき、分化に最も優れた効果を示した。また、Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５−トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞の神経突起生成増大を示す標識は１０ｕＭ  ＲＡ（レチノイン酸）で細胞を処理した場合にも観察された。
【０４６５】
Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５をコーディングする核酸配列およびアミノ酸配列を図１４に示す。Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５核酸はＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１ジンクフィンガードメインを誘導するキメラＺＦＰをコーディングする。同じモチーフを有する他のＺＦＰおよび／またはＮｅｕｒｏ１−ｐ６５の結合部位に少なくとも部分的に重なる部位に結合するＺＦＰもまた分化を調節すると予測した。ジンクフィンガー−ＤＮＡ結合部位リスト（表６参照）に基づいて、Ｎｅｕｒｏ１の予想される結合部位は５’−ＧＡＣＧＡＡＧＡＡ−３’である。
【０４６６】
神経突起の生成を誘導するためにＮｅｕｒｏ１−ｐ６５はｐ６５活性化ドメインを必要とする。ＫＲＡＢ転写抑制ドメインと融合されたか、または如何なるエフェクタードメインも有しない同一のジンクフィンガードメインは神経突起生成を誘導しない。図８および表９参照。また、Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５（Neuro1-p65mut）のジンクフィンガードメインが有するＤＮＡ結合能力を失うと予想される突然変異によって、神経突起生成を誘導する能力が失われるのでＮｅｕｒｏ１−ｐ６５のＤＮＡ結合能力は重要である。
【０４６７】
細胞においてＮｅｕｒｏ１−ｐ６５が発現される間神経標識遺伝子の発現水準を示すために実時間（Real-time）ＰＣＲを用いた。同じように、ＲＡ−処理された細胞とＺＦＰ−ＴＦで処理された細胞間の分化過程の様々な時間ポイント別遺伝子発現パターンを比較するために核酸マイクロアレイ分析を用いた。Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５は少なくともインビトロで神経芽細胞腫細胞が分化するのに必須的な経路を活性化させ得る。
【０４６８】
【表９】
2005511049.tif 000015
【０４６９】
実施例６：骨細胞生成
Ｃ２Ｃ１２細胞は筋芽細胞（myoblast）系列から由来するが、骨形成タンパク−２（ＢＭＰ−２）（Katagiri, T.ら, (1994) J. Cell. Biol. 127, 1755）の存在下で骨芽細胞（osteoblast）に分化できる。いくつかの天然型転写因子がこのような過程を統制する候補者として同定された（Lee, K.-S.ら, (2000) Mol. Cell. Biol. 20:8783; Nakashima, K.ら, (2002) Cell 108:17）。
【０４７０】
本発明者らはＢＭＰ−２が存在しないとき、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞から骨芽細胞に分化転換（transdifferentiation）するように誘導するキメラジンクフィンガータンパク質をスクリーニングした。キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングするライブラリー核酸をＣ２Ｃ１２細胞に一過性にトランスフェクトし、ＢＭＰ−２のない条件で分化転換する細胞をスクリーニングした。トランスフェクトしてから７日後、形質転換細胞を骨芽細胞の標識であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（Katagiri, T.ら, (1994) J. Cell. Biol. 127:1755）で染色した。
【０４７１】
約２０００個のＺＦＰ−ＴＦのスクリーニングから、約３０％の細胞において強いＡＬＰ染色を誘導する一つの活性化タンパク質Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５を同定した。ＡＬＰで染色された細胞の百分率はＬａｃＺ染色によって検出されるトランスフェクトされた細胞の百分率と同等であった。このような結果から、本発明者らは、Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５転写因子がＢＭＰ−２なしにＣ２Ｃ１２筋芽細胞から骨芽細胞に分化転換を促進できると結論付けた。
【０４７２】
陽性対照群としては、細胞を１μｇ／ｍｌのＢＭＰ−２で処理した。ほとんど１００％の陽性対照群細胞はＢＭＰ−２処理によって強いＡＬＰ染色を示した。ＢＭＰ−２で処理せず、対照ベクターでトランスフェクトした陰性対照群細胞はただ背景のみが染色された。Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５はＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ１−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲジンクフィンガードメイン（Ｎ−末端からＣ−末端に）からなる４−フィンガータンパク質である。図１５を参照。このタンパク質はＤＮＡ構成要素５’−ＧＧＧＧＣＷＲＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：２３４）を認識すると予測される。
【０４７３】
このような実験において、マウス筋芽細胞細胞株であるＣ２Ｃ１２は４．５ｇ／Ｌグルコース、１０％ＦＢＳおよび抗生剤を含むダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium: DMEM）で３７℃、９５％空気および５％ＣＯ２を含む湿った空気条件で保持された。細胞は９６−ウェルプレート当たりの１．０×１０４細胞に分株した。細胞はリポフェクタミンプラス（LIPOFECTAMINE PLUＳ（商標）、Invitrogen）を用いて製造社の方法に従ってライブラリー核酸５０ｎｇをトランスフェクトした。トランスフェクト後２４時間に、成長培地は２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに取り替え、細胞をさらに６日間培養した。
【０４７４】
Ｃ２Ｃ１２細胞が骨芽細胞に分化するか否かを調べるため、Katagiri, T.ら, (1994) J. Cell. Biol. 127:1755に記載の通りにＡＬＰ染色を行った。
【０４７５】
要約すると（実施例５および６に従って）、２つの異なる細胞分化過程を誘導できるタンパク質を発見するために人工転写因子ライブラリーをスクリーニングした。言い換えれば、この方法は特定の幹細胞の生物学的知識を要しない。
【０４７６】
実施例７：インシュリン調節
本発明者らは、キメラジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸をヒト２９３細胞株に安定的にトランスフェクトし、形質転換細胞に対するＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて各々のキメラジンクフィンガーによって調節された遺伝子を分析した（図４、５および９を参照）。本発明者らは、ヒトインシュリン遺伝子の発現を６０倍以上増加させるキメラジンクフィンガータンパク質（０８＿Ｄ０４−ｐ６５）を同定した。
【０４７７】
０８＿Ｄ０４−ｐ６５が、異なるヒト細胞株においてインシュリン遺伝子の発現を誘導するかどうかを確認するために、０８＿Ｄ０４−ｐ６５をコーディングする核酸をＨｅｌａ細胞に一過性にトランスフェクトし、ＨｅＬａ細胞の核酸発現がインシュリン遺伝子の発現を８０倍に増加させることを確認した。
【０４７８】
したがって、０８＿Ｄ０４−ｐ６５、その誘導体および機能的に類似するジンクフィンガータンパク質は糖尿病治療剤として使用できる。０８＿Ｄ０４−ｐ６５または機能的に類似するジンクフィンガータンパク質をコーディングするＤＮＡを糖尿病患者にウイルス性運搬またはカプセル化した形態（例：リポゾーム）で伝達できる。一旦、ＤＮＡが細胞に伝達されると、ジンクフィンガータンパク質は発現され、インシュリンの生産を誘導できる。ある実施態様においては、ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸がＴｅｔ−誘導性プロモーターのような誘導プロモーターに作動可能に連結されてもよい。誘導物質として、ドキシサイクリンを用いて、小さい化学物質でインシュリン生産の水準を調節することが可能でる。０８＿Ｄ０４−ｐ６５のようなインシュリン−誘導性ジンクフィンガータンパク質は異なるヒト細胞株で作用し得るため、膵臓細胞（例：ベータ細胞と非ベータ細胞）および非膵臓細胞の両方において作用し得る。
【０４７９】
インシュリンの酵素の発現工程酵素を誘導する人工転写因子を同定することもまた可能である。細胞はこのような転写因子およびインシュリン遺伝子を誘導する転写因子、例：０８＿Ｄ０４−ｐ６５を誘導する転写因子を発現するように操作できる。さらに、インシュリン−誘導ジンクフィンガータンパク質は生体外細胞治療に使用できる。一つの例として、患者の細胞をインシュリン−誘導ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸の導入によってインビトロで変形できる。変形細胞は以降患者または他の対象動物に移植できる。
【０４８０】
材料および方法
ＺＦＰ−ＴＦを発現する細胞株のＤＮＡマイクロアレイ分析
ジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸はＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞株（Invitrogen）に製造者の方法に従って安定的に導入された。要約すると、ｐＬＦＤ−ｐ６５またはｐＬＦＤ−Ｋｉｄベクターから切断されたＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ（Invitrogen CA）にサブクローニングした。この断片はジンクフィンガータンパク質をコーディングする配列を含む。結果物として得られたプラスミドはｐＯＧ４４（invitrogen）とともにＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞に共同トランスフェクトした。ドキシサイクリンの誘導下にＺＦＰ−ＴＦを発現する安定した挿入細胞が得られた。
【０４８１】
７４５８ヒトＥＳＴクローンを含むＤＮＡマイクロアレイはゲノミックトリー（Genomictree、韓国）から購入した。ＺＦＰ−ＴＦを安定的に発現するＦｌｐＴＲｅｘ−２９３細胞は１μｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下（＋Ｄｏｘ）または不在下（−Ｄｏｘ）で４８時間培養した。総ＲＮＡを各々の試料から得た。−Ｄｏｘ試料から得られたＲＮＡは標準（Ｃｙ３）として、＋Ｄｏｘは実験試料（Ｃｙ５）として用いられた。マイクロアレイ分析は製造社の方法に従って行った。中間値の和が５００以下であるものは赤色で表示し、分析しなかった。
【０４８２】
特定のジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸はＨｅＬａ細胞においても発現された。０８＿Ｄ０４  ＺＦＰを含有するｐＬＦＤ−ｐ６５はリポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）（商標）２０００（Invitrogen）を用いてＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトした。ジンクフィンガータンパク質をコーディングしないｐＬＦＤ−ｐ６５ベクターは対照群として同等に細胞にトランスフェクトした。
【０４８３】
実施例８
哺乳動物細胞において標識遺伝子の発現を変化させるタンパク質のコーディング核酸を同定するためにキメラジンクフィンガーをコーディングするライブラリーをスクリーニングした。
【０４８４】
ライブラリーの製作
４−および３−フィンガータンパク質として、変形ｐｃＤＮＡ３ベクターであるＰ３に挿入された２種類のＺＦＰライブラリーを製造した。このようなライブラリーの製作は前記の方法に従って行った。
【０４８５】
ＺＦＰプラスミドによるトランスフェクション  
ヒト胎生期腎臓２９３細胞を９５％空気および５％二酸化炭素を含有する湿った空気条件で１０％ＦＢＳの１００μｌ  ＤＭＥＭで培養し、９６ウェルプレートのウェルに分株してトランスフェクトの一日前まで育てた。プラスミドは各ライブラリーの個別的コロニーから各々分離してリポフェクタミンプラス（インビトロジェン）において製造社の方法に従って２９３細胞にトランスフェクトした。ＭＴＴ分析のために、機能ドメインが融合したジンクフィンガータンパク質遺伝子を含む５０ｎｇのプラスミドをウェル当たりの５×１０３細胞で培養された細胞にトランスフェクトした。ＳＥＡＰ分析のために、１０ｎｇのｐＳＥＡＰ２−対照（クローンテック）プラスミドをウェル当たりの１×１０４細胞で培養された細胞に機能ドメインが融合したジンクフィンガータンパク質遺伝子を含む５０ｎｇのプラスミドとともにトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は分析前３日間３７℃で培養した。
【０４８６】
ＳＥＡＰ分析  
トランスフェクトしてから３日後に、培地を新しいチューブに移し、６５℃で３０分間熱処理して内生アルカリホスファターゼを失活させた。培地２５μｌを２×ＳＥＡＰ分析緩衝液（２Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８）１０ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２  １０μｌ、１Ｍ酵母アルギニン２００μｌ、パラ−ニトロフェニルリン酸４４．５２ｍｇ）の同量と混合した。３７℃で指示された時間培養した後４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０４８７】
ルシフェラーゼ分析  
ルシフェラーゼを分析するために、各々５ｎｇのＣＭＶ−ルシフェラーゼおよびｐＲＬ−ＳＶ４０プラスミドをＺＦＰコーディングプラスミド５０ｎｇとともに９６ウェルプレートで育てた２９３細胞に共同−トランスフェクトした。３日間培養した後、細胞を収集し、デュアルルシフェラーゼレポーター分析システム（プロメガ）を用いて製造社の方法に従ってルシフェラーゼを分析した。
【０４８８】
ＭＴＴ分析  
ＭＴＴ分析は、細胞の成長を測定するのに用いられる。代謝活性のある細胞によって還元されたテトラゾリウムＭＴＴ（tetrazolium MTT）は黄色に変わった。黄色の吸光度測定値は生きている細胞の個数を示す。ＭＴＴ分析はＭＴＴ分析キット（Trevigen）を用いて行った。ＭＴＴ分析はトランスフェクト後３日目に行った。簡略に説明すると、１０μｌのＭＴＴ溶液を直接細胞培養液に添加し、二酸化炭素培養器で２時間培養した。その後、ＭＴＴ分析キットに含まれている界面活性剤（detergent）１００μｌを添加して２時間暗室で培養した後、パワー−ウェーブ３４０ｘ（Bio-Tek Instrument）で５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０４８９】
細胞数を確認するために、２９３細胞を２４ウェルプレートに１．５×１０４細胞／ウェルでトランスフェクトの一日前に分株した。ＺＦＰ−コーディング核酸または対照ベクタープラスミド２００ｎｇをトランスフェクトしてから３日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＴＥ（１０ｍＭトリス１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）緩衝液３０μｌで希釈した後ヘマサイトメーター（hemacytometer）で測定した。
【０４９０】
結果 
タンパク質生産性の変化
核酸ライブラリーが異種核酸の発現を変化させたかどうかを調べた。ＺＦＰが細胞内で生産される外部タンパク質の量に影響を与えたかどうかを調べるために、ＳＥＡＰ（分泌性アルカリホスファターゼ）をレポータータンパク質として用いた。表１０は８１個のウェルから得られた代表的な結果を示すが、各ウェルは、ライブラリーから無作為に選択されたキメラＺＦＰをコーディングする核酸でトランスフェクトされた細胞を含み、３つのウェルは、対照群ベクターでトランスフェクトされた標準細胞を含む。いくつかのウェルは、無作為ＺＦＰをコーディングする核酸でトランスフェクトされた細胞を含むウェルおよび対照ベクターでトランスフェクトされた細胞を含むウェルに比べて増加した吸光度を示した。
【０４９１】
【表１０】
2005511049.tif 000016
【０４９２】
ｐ６５ドメインに融合した一つのジンクフィンガータンパク質であるＰ＿Ｂ０８が最も高いＳＥＡＰ活性を示す。このようなＺＦＰは３つの別々のトランスフェクトにおいてＳＥＡＰプラスミドでトランスフェクトして再確認した。表１１は、そのような再確認結果のうち一つを示す。この分析においてＰ＿Ｂ０８に対するＰ値は０．００８である。Ｐ＿Ｂ０８は親プラスミドに比べて約１６倍増加したＳＥＡＰ活性を示す。
【０４９３】
【表１１】
2005511049.tif 000017
【０４９４】
ＳＥＡＰ分析は外部タンパク質の生産を分析するのに使用したので、観察されたＳＥＡＰ活性の増加に対する原因は様々であるが、たとえば、一つはｐＳＥＡＰ２−対照プラスミドのＳＥＡＰ遺伝子発現に用いられたＳＶ４０プロモーターの直接的または間接的活性化である。他の理由は、分泌経路に係るタンパク質の作用の増大した活性またはタンパク質生産に係る一般的な機構の活性化を含む。ＳＥＡＰの増加した活性の機構は、他のレポータータンパク質（例：非分泌レポーター）および他のプロモーターに連結されたレポーターのような他のタンパク質の生産に対するｐ＿Ｂ０８の効果を決定することによって明らかにできる。
【０４９５】
これを調査するために、２９３Ｆ細胞においてＣＭＶプロモーターの調節下にあるＳＥＡＰレポーター（ＣＭＶ−ＳＥＡＰ）を用いて幅広いスクリーニングを行った。ＳＥＡＰタンパク質の活性を増加させる２つのＺＦＰであるＫ４４＿１１＿Ｄ０１およびＫ４４＿１１＿Ｇ１２を分離した。このような２つのＺＦＰは２つの他のレポータープラスミドであるＳＶ４０−ＳＥＡＰおよびＣＭＶプロモーターの調節下にあるルシフェラーゼ（ＣＭＶ−Ｌｕｃ）を用いてまた確認した。表１２にその結果の一部を示す。Ｋ４４＿１１＿Ｄ０１およびＫ４４＿１１＿Ｇ１２は親プラスミド（ベクター）と比較して約３倍に増加したＳＥＡＰ活性を示した。Ｋ４４＿１１＿Ｄ０１はＳＶ４０−ＳＥＡＰの活性を示したが、ＣＭＶ−ルシフェラーゼは示さず、これは前記活性化が分泌のようなＳＥＡＰに特異的な機構に関連していることを示唆する。これに対し、Ｋ４４＿１１＿Ｇ１２は、ＳＶ４０−ＳＥＡＰおよびＣＭＶ−ルシフェラーゼの両方に対して約２〜３倍増加した活性を示したが、これは、その機構がプロモーターまたはレポーターに特異的でないことを暗示する。したがって、Ｋ４４＿１１＿Ｇ１２は、真核細胞のような細胞にタンパク質の生産を一般的に増加させるのに使用できる。
【０４９６】
【表１２】
2005511049.tif 000018
【０４９７】
ジンクフィンガータンパク質であるＫ４４−１６−Ｅ１２（図２５）およびＫ１２＿Ａ１１（図２４）は、ＣＭＶ−ＳＥＡＰおよびＳＭＶ−Ｌｕｃ発現によって表示された通り、タンパク質の生産を変化させ得る。
【０４９８】
同様な例として、サイクリンＤ１の過発現があるタンパク質の生産を増加させると報告されている（米国特許第６，２１０，９２４Ｂ１号）。サイクリンＤ１の発現を直接的または間接的に活性化させるジンクフィンガータンパク質はタンパク質の生産を上向調節できるが、ジンクフィンガータンパク質の効果は更に強力に、または広範囲に変化する。サイクリンＤ１の過発現と類似する生理的効果をもたらす他のジンクフィンガータンパク質をこのような分析によって分離できる。このようなジンクフィンガータンパク質は目標のタンパク質生産の増加に用いられる。
【０４９９】
細胞成長速度の変化  
ｋｉｄドメインに結合した２つのＺＦＰであるＫ＿Ｄ１０およびＫ＿Ｆ０２は、ＭＴＴ分析結果に基づいて対照群と比較したとき最大変異を示すため、細胞成長を調節する代表的ＺＦＰとして選別された。ＭＴＴ分析結果を確認するために、２９３細胞にＫ＿Ｄ１０およびＫ＿Ｆ０２をトランスフェクトした後細胞数を確認した。このような結果は、親ベクターでトランスフェクトしたウェルの細胞数と比較して相対的な百分率に転換し、表１３ａに示す。親ベクターと比較して、対照群に比べて細胞成長活性においてＫ＿Ｄ１０は約３倍の阻害を示し、Ｋ＿Ｆ０２は約２．７倍の活性化を示した。Ｋ＿Ｄ１０およびＫ＿Ｆ０２に対するＰ値は各々０．００１および０．０１であった。配列の情報は、図１８および１９を参照。
【０５００】
【表１３ａ】
2005511049.tif 000019
【０５０１】
細胞成長速度の変化  
本発明者らは、細胞成長および増殖速度を変化させることができるジンクフィンガータンパク質を同定した。このような重要表現型は癌およびウイルス感染のような疾病および発達過程に関連している。細胞成長および増殖を調節するジンクフィンガータンパク質の能力は、細胞アポトーシス（apoptosis）調節、細胞分化、宿主細胞防御（例：ウイルス感染に対する）およびｐ５３−媒介信号伝達を含む。
【０５０２】
これらの形質の一つ以上を生産するジンクフィンガータンパク質は直接または間接的に細胞成長または信号伝達を調節する遺伝子を調節する。前記特定のジンクフィンガータンパク質は、ＭＴＴ分析によって検索されたように、細胞成長に検地できる効果をもたらす。たとえば、２つのジンクフィンガータンパク質は対照群に比べて少なくとも２倍の細胞成長の違いを示した。この分析が一過性トランスフェクトしてから３日後の細胞から観察されたことを考慮すると、この２倍の違いは有意義である。さらに、細胞数の変化はＭＴＴ分析を用いて検索された相違点が分析に特異的でないことを確認させる。
【０５０３】
細胞成長がこのように細胞生理の重要な変数であるので、この実験は細胞成長を調節する十分な数のジンクフィンガータンパク質を分離するために、大規模のスクリーニングに拡大できる。このような各ジンクフィンガータンパク質を発現する細胞の遺伝子発現パターンのプロファイリングのためにｃＤＮＡマイクロアレイを使用できる。このプロファイルは細胞増殖または死滅に関わる新規な遺伝子および経路を同定できる。
【０５０４】
このような実験はジンクフィンガータンパク質が、細胞増殖を変化させる場合におけるように、哺乳動物細胞において様々な表現型を誘導できることを示す。
【０５０５】
実施例９：溶媒抵抗性バクテリア細胞
人工キメラジンクフィンガータンパク質の結果として有機溶媒に抵抗性を示す細胞において、人工キメラジンクフィンガータンパク質を発現するバクテリア細胞をスクリーニングした。互いに異なる３つのジンクフィンガータンパク質が大腸菌細胞にヘキサン（hexane）抵抗性を付与する能力を同定した（表１３ｂ）。核酸抵抗性は、ジンクフィンガータンパク質中の一つの「ＨＴ−１、ＨＴ−２およびＨＴ−３」を発現する形質転換体の生存率を対照細胞の生存率と比較して分析した。対照群細胞は共ベクター（empty vector）（Ｃ１）またはＺＦＰ−１のいずれかを含んでいた。ＺＦＰ−１構造体（construct）はヘキサン抵抗性を与えず、ＲＤＥＲ−ＱＳＳＲ−ＤＳＫＲのフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質をコーディングする。ヘキサン抵抗性−付与ジンクフィンガータンパク質を発現するバクテリア細胞は２００倍増加したヘキサン抵抗性を示した。
【０５０６】
【表１３ｂ】
2005511049.tif 000020
【０５０７】
このようなジンクフィンガータンパク質に対する発現プラスミドはＩＰＴＧ−誘導プロモーターを含む。各ヘキサン抵抗性誘導ＺＦＰを発現する形質転換体はＩＰＴＧの有無によって区別された。ＨＴ−２を発現する形質転換体はＩＰＴＧの存在下でさらに高いヘキサン抵抗性を示すのに対し、ＨＴ−１またはＨＴ−３発現細胞はＩＰＴＧがなくてもヘキサン抵抗性を示した。
【０５０８】
【表１４】
2005511049.tif 000021
【０５０９】
大腸菌発現のためのＺＦＰをコーディングする核酸ライブラリーの製作
大腸菌でのみジンクフィンガータンパク質を発現させるために、本発明者らはｐＹＴＣ−Ｌｉｂ酵母ベクターにクローニングされたジンクフィンガータンパク質をｐＺＬ１にサブクローニングした。ｐＺＬ１はｐＢＴ−ＬＧＦ２（クローンテック、Palo Alto, CA）を操作して製作された。Ｐｌａｃ−ＵＶ５はｐＢＴ−ＬＧＦ２からＰＣＲ（前方向プライマー：５’−ＧＡＣＡ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ−３’（配列番号：２３６）；逆方向プライマー：５’−ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＡ−３’（配列番号：２３７））によって増幅した。ＰＣＲ産物はｐＹＴＣ−ＬｉｂベクターのＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ部位の間にクローニングした。このベクターをｐＹＴＣ−ｌａｃと命名した。ｐＹＴＣ−ｌａｃはＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断して次の要素を含むＤＮＡ断片をサブクローニングした：Ｐｌａｃプロモーター−Ｖ５エピトープ−ＭＣＳ。切断されたＤＮＡ断片はゲル−電気泳動後分離してｐＢＴ−ＬＧＦ２のＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位の間にサブクローニングした。結果ベクターをｐＺＬ１として命名した。ｐＹＴＣ−Ｌｉｂに構築された３Ｆ−または４Ｆ−ＺＦＰライブラリーはＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断した。切断されたＤＮＡ断片はゲル−分離してｐＺＬ１のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位の間にサブクローニングし、これによって、大腸菌発現ライブラリーを製作した。
【０５１０】
溶媒抵抗性スクリーニング
大腸菌菌株であるＤＨ５αは原核発現のために構成された３−フィンガーまたは４−フィンガーＺＦＰ核酸ライブラリーで形質転換された。形質転換体はクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）含有ＬＢで一晩培養した。一晩培養した培地は１ｍＭ  ＩＰＴＧおよびクロラムフェニコールを含有する新鮮なＬＢ培地１ｍｌに１：５００に希釈してＺＦＰ発現を誘導した。３０℃で３時間培養後、ヘキサンを１．５％加え、速やかにボルテックス（vortexing）してヘキサンおよび大腸菌培養液エマルジョンを製造した。混合液を３７℃で３時間回転させながら（２５０ｒｐｍ）培養し、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートに分株した。プラスミドは成長したコロニープールから分離し、ＤＨ５α内に形質転換させた。その後、形質転換体に前記の方法に従ってヘキサン処理を行った。ヘキサン抵抗性に対する選別は２回さらに繰り返した。選別の３番目の段階後クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートで育った２０個の個別的コロニーからプラスミドを回収した。このプラスミドをＤＨ５α内に再形質転換させた。各形質転換体は前記の方法に従ってヘキサン−抵抗性に対して再確認された。コーディングされたジンクフィンガータンパク質を調べるためにヘキサン抵抗性を誘導するプラスミドの配列調査を行った。
【０５１１】
実施例１０：熱−抵抗バクテリア細胞
本発明者らは、細胞に熱抵抗性を与えるジンクフィンガータンパク質をスクリーニングした。互いに異なるジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸ライブラリーを大腸菌細胞内に形質転換させた。この細胞を熱にさらした後、熱抵抗性細胞を回収した。表現型スクリーニングの３番目の段階後選択された２３個のコロニーから個別的にプラスミドを分離した。１０個の異なるジンクフィンガータンパク質が同定され（表１５）、熱抵抗性の増大は熱処理条件でＺＦＰ形質転換体および対照細胞であるＣ１またはＺＦＰ−２の生存率と比較して分析した。Ｃ１またはＺＦＰ−２は各々空ベクター（empty vector）または無関係なＺＦＰ（ＱＴＨＴ−ＲＳＨＲ−ＱＴＨＲ１）の形質転換体を意味する。５０℃で２時間熱処理条件で９９．９９％以上の野生型細胞が死んだ。これに対し、このような極限の条件下で、あるＺＦＰ−ＴＦ形質転換体は６％程度生存し、これは熱抵抗性表現型が７００倍増加したことを示す。この値はすなわち、ストレス条件で生存したＺＦＰ−ＴＦ発現細胞の百分率（６．３％）を同一の条件で生存したＣ１の百分率（０．００８５％）で割った値である。ＺＦＰ発現はＩＰＴＧによって誘導されるので、熱抵抗性を誘導するＺＦＰの形質転換体をＩＰＴＧの有無下でその表現型を分析した。Ｔ−１またはＴ−１０形質転換体はＩＰＴＧの存在下でさらに高い熱抵抗性を示した。
【０５１２】
【表１５】
2005511049.tif 000022
【０５１３】
熱抵抗性スクリーニング
原核細胞発現用ライブラリーは前記実施例９の方法に従って製作した。大腸菌菌株ＤＨ５αを３−フィンガーまたは４−フィンガーＺＦＰライブラリーで形質転換させ、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢで一晩培養した。一晩培養した培養液を１ｍＭ  ＩＰＴＧおよびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮なＬＢ培地１ｍｌに１：５００に希釈してＺＦＰ発現を誘導した。これを３０℃で３時間培養した後、１００μｌをマイクロ−遠心分離チューブに移した後、５０℃の水浴で２時間培養した。培養液をクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢプレートに載せた。成長したコロニープールからプラスミドを分離してＤＨ５α内に形質転換させた。熱抵抗性の選別は再形質転換を用いて繰り返した。３番目の選別後、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢで育った３０個のコロニーから個別的にプラスミドを分離してＤＨ５α内に再形質転換した。各形質転換体は前記の方法に従って熱抵抗性を分析した。ＺＦＰを同定するために熱抵抗性を誘導するプラスミドの配列を分析した。
【０５１４】
実施例１１：ＺＦＰ  Ｆ１２１＿Ｐ６５による遺伝子
Ｆ１２１_ｐ６５ジンクフィンガータンパク質をヒト胎生期腎臓２９３細胞で発現した。細胞の転写体（transcripts）をプロファイリングし、プロファイリングされた転写体をＦ１２１_ｐ６５を発現しない対照細胞と比較した。Ｆ１２１_ｐ６５によって上向き調整された転写体の例を表１６に示す。Ｆ１２１_ｐ６５は他の遺伝子中のインシュリン−類似成長因子２（insulin-like growth factor 2）の転写を増加させる。
【０５１５】
【表１６】
2005511049.tif 000023
【０５１６】
実施例１２：大腸菌における外生タンパク質溶解度の変化
本発明者らは、大腸菌で発現された組換えタンパク質であるＡｋｔ１の溶解度を増加させるジンクフィンガータンパク質をスクリーニングした。哺乳類のＡｋｔ１遺伝子をｐＥＴ１２ｂベクターにクローニングし、Ａｋｔ１  ＯＲＦのＣ−末端にＧＦＰを連結した。互いに異なるジンクフィンガータンパク質をコーディングする核酸ライブラリーで大腸菌細胞を形質転換した。溶解性Ａｋｔ１を発現する細胞はさらに多くの蛍光ＧＦＰを生成するので、Ａｋｔ１の増加した溶解度をＦＡＣＳ分離によって分析した。８番目の表現型スクリーニング後個別コロニーを選別し、ウエスタンブロット（Western Blot）分析によってＺＦＰが発現された細胞とＣ１が発現された細胞間の溶解性分画（fraction）のＡｋｔ１量を比較することによって溶解度の増加を分析した。ウエスタンブロット結果は、映像分析ソフトウエアであるＱＵＡＮＴＩＴＹ  ＯＮＥ（Bio-rad, Hercules, CA）を用いて定量化した。Ｃ１は、共ベクターであるｐＺＬ１形質転換体を意味する。２つの互いに異なるジンクフィンガータンパク質が大腸菌で発現された組換えＡｋｔ１タンパク質の溶解度を増加させると同定された。
【０５１７】
Ｃ１における溶解および非溶解分画間のＡｋｔ１タンパク質量の比は３２．５：６７．５であった。これに対し、あるジンクフィンガータンパク質で形質転換された細胞は溶解分画におけるＡｋｔ１の比が２倍増加したことが分かった。この値は、すなわち、ＺＦＰ−ＴＦ発現細胞の溶解分画Ａｋｔ１タンパク質量の百分率（６６．１％）をＣ１における量（３２．５％）で割った値である。
【０５１８】
【表１９】
2005511049.tif 000024
【０５１９】
【表２０】
2005511049.tif 000025
【０５２０】
組換えタンパク質の溶解度増加のためのスクリーニング
原核細胞発現用ライブラリーは前記実施例９の方法に従って製作した。大腸菌菌株ＤＨ５α内にＺＦＰライブラリーおよびＡｋｔ１発現ベクターを共に共同−形質転換させ、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢで一晩培養した。一晩培養した培養液を１ｍＭ  ＩＰＴＧ、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する新鮮なＬＢ培地１ｍｌに１：５００に希釈してＺＦＰの発現を誘導した。３０℃で３時間培養した後、１０６細胞をＦＡＣＳバンテージフローサイトメーター（Vantage flow cytometer）でＦＡＣＳ分析して高い蛍光を示す５〜１０％の細胞を分離した。ＧＦＰ発現またはｐＥＴ２１ｂ空ベクターで形質転換された細胞を各々陽性または陰性対照群として用いて背景（background）蛍光水準を定めた。
【０５２１】
分離された細胞をクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地で一晩培養した。培養液からプラスミドを分離してＤＨ５αを形質転換させた。組換えタンパク質の増加した溶解度に対するスクリーニングは再形質転換体を用いて繰り返した。８番目の選別後、ＬＢ＋クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）プレートで成長した個別コロニーからプラスミドを分離してＤＨ５αを形質転換した。各形質転換体はウエスタンブロット分析によるＡｋｔ１溶解度の増加に対して分析した。ＺＦＰを同定するためにＡｋｔ１の溶解度を増加させるプラスミドの配列を分析した。
【図面の簡単な説明】
【０５２２】
【図１】酵母プラスミドｐＹＴＣ−Ｌｉｂの遺伝子マップである。
【図２】例示的な標的−誘導接近方法の模式図である。
【図３Ａ】例示的なジンクフィンガータンパク質ライブラリーの製造方法に対する模式図である。
【図３Ｂ】例示的な表現型−誘導接近方法の模式図である。
【図４】一時的にトランスフェクトされたＺＦＰの発現プロファイルを示す。  左図において、ｐ６５活性化ドメインのみを発現する細胞を対照細胞と比較した。右図において、Ｆ１２１ｐ６５ジンクフィンガータンパク質を発現する細胞を対照細胞と比較した。対角線から離脱した各点はその発現が実質上変化した遺伝子を意味する。
【図５】安定的にトランスフェクトされたＺＦＰの発現プロファイルを示す図である。
【図６】図６のＡはＫ５  ＺＦＰに対するＤＮＡ−結合ドメイン突然変異および作用ドメインの変化が薬剤抵抗性に及ぼす影響を示し、図６のＢはＫ５とＹＬＬ０５３Ｃ過多発現の効果を示す。
【図７】３−フィンガーライブラリーの製作方法を示す。
【図８】対照細胞および神経突起の形成が誘導されたＺＦＰ−発現細胞の写真である。  図８のＡはレチノイン酸（ＲＡ）を処理していないｐｃＤＮＡ３（空ベクター）−トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞であり、図８のＢはＲＡを処理していないＮｅｕｒｏ１−ｐ６５（また０８＿Ｄ０１−６５とも呼ぶ）であり、図８のＣは１０ｕＭ  ＲＡを処理したｐｃＤＮＡ３（空ベクター）−トランスフェクトされた細胞であり、図８のＤは１０ｕＭ  ＲＡを処理したＮｅｕｒｏ１−ｐ６５の発現である。
【図９】インシュリン遺伝子が過発現された細胞に対する比較マイクロアレイデータを示す。  キメラＺＦＰは０８＿Ｄ０４−ｐ６５である。その配列は図１６に示されている。
【図１０Ａ】ＺＦＰ  ＤＮＡ結合特異性を列挙する表である。
【図１０Ｂ】ジンクフィンガードメインおよび認識部位配列の相互連関性を示す模式図である。
【図１１】人工ＺＦＰの標的を同定する方法に対するフローチャートである。
【図１２】分化を誘導するＺＦＰを同定する方法に対する模式図である。
【図１３】Ｆ１０４−ｐ６５ＺＦＰが存在する細胞に対する様々な時間帯別比較マイクロアレイ資料を示す。
【図１４】神経突起を誘導できるタンパク質であるＮｅｕｒｏ１−ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。  Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５はジンクフィンガードメインＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１およびｐ６５転写活性化ドメインを含む。ＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１−ｐ６５のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質が神経突起をまた誘導できる。
【図１５】骨細胞を誘導できるタンパク質であるＯｓｔｅｏ１−ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。  Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ１−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲおよびｐ６５活性化ドメインを含む。ＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ１−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲ−ｐ６５のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も骨細胞を誘導できる。
【図１６】インシュリン生産（図９）を増加させるタンパク質である０８＿Ｄ０４＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：５）とアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。  ０８＿Ｄ０４＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ＶＳＳＲおよびｐ６５活性化ドメインを含む。ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ＶＳＳＲのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もインシュリンの生産を増加させることができる。
【図１７】ＳＶ４０−ＳＥＡＰの生産を増加させるタンパク質であるＰ＿Ｂ０８に対するコーディング核酸配列（配列番号：７）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。  Ｐ＿Ｂ０８はジンクフィンガードメインであるＱＳＮＲ１−ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲとｐ６５活性化ドメインを含む。ＱＳＮＲ１−ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もＳＶ４０−ＳＥＡＰの生産を増加させることができる。
【図１８】細胞増殖を減少させるタンパク質であるＫ＿Ｄ１０に対するコーディング核酸配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。  Ｋ＿Ｄ１０はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱおよびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も細胞増殖を抑制できる。
【図１９】細胞増殖を増加させるタンパク質、Ｋ＿Ｆ０２に対するコーディング核酸配列（配列番号：１１）とアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。  Ｋ＿Ｆ０２はジンクフィンガードメインであるＤＳＡＲ２−ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ１−ＱＴＨＲ１およびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＤＳＡＲ２−ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ１−ＱＴＨＲ１のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も細胞増殖を増加させることができる。
【図２０】タンパク質の発現を増加させるタンパク質であるＫ４４＿１１＿Ｄ０１に対するコーディング核酸配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。  Ｋ４４＿１１＿Ｄ０１はジンクフィンガードメインＱＳＨＶ−ＱＳＮＩ−ＱＴＨＲ１−ＣＳＮＲ１とｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＱＳＮＩ−ＱＴＨＲ１−ＣＳＮＲ１のドメインと同一なＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もタンパク質発現を増加させることができる。
【図２１】タンパク質発現を増加させるタンパク質であるＫ４４＿１１＿Ｇ１２に対するコーディング核酸配列（配列番号：１５）およびアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。  Ｋ４４＿１１＿Ｇ１２はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ１およびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ１のドメインと同一なＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もタンパク質発現を増加できる。
【図２２】Ｆ１０４＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１７）およびアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。  Ｆ１０４＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＤＨＴ−ＲＳＨＲ−ＱＳＨＲ２−ｐ６５を含む。
【図２３】Ｆ１２１＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。  Ｆ１２１＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＴ−ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ｐ６５を含む。ＱＳＨＴ−ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もインシュリン−類似成長因子２の転写を増加させることができる。
【図２４】ジンクフィンガードメインであるＲＤＨＴ−ＱＳＮＶ２−ＱＴＨＲ１−ＱＦＮＲ−ｋｉｄを含むＫ１２＿Ａ１１に対するコーディング核酸配列（配列番号：２５９）およびアミノ酸配列（配列番号：２６０）を示す。
【図２５】ジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＱＳＳＲ１−ＱＴＨＲ１−ｋｉｄを含むＫ４４−１６−Ｅ１２に対するコーディング核酸配列（配列番号：２６１）およびアミノ酸配列（配列番号：２６２）を示す。
【図２６】ジンクフィンガードメインであるＱＳＮＲ１−ＱＳＳＲ１−ＱＴＨＲ１−ＲＤＫＲ−ＫＩＤを含むＫ１３＿Ｂ０８に対するコーディング核酸配列（配列番号：２６３）およびアミノ酸配列（配列番号：２６４）を示す。  図１４〜図２６のＤＮＡ配列はＨＡタグ（tag）（灰色下線）をコーディングする配列および核位置信号（nuclear localization signal、ボックスで表記）をコーディングする配列を含み得る。開始および終了コドンは下線で表示されている。小文字は連結配列を示す。アミノ酸配列において、イタリック体および網かけ文字はジンクフィンガードメインを示し、網かけ文字でありながらイタリック体でないものはｋｉｄやｐ６５ドメインのような調節ドメインを示す。  図１４〜図２４のＤＮＡ配列はＨＡタグ（tag）（灰色下線）をコーディングする配列および核位置信号（ボックスで表記）をコーディングする配列を含む。開始および終了コドンは下線で表示されている。網かけ文字はｋｉｄまたはｐ６５ドメインのような調節ドメインをコーディングする配列を示す。小文字は連結配列を示す。アミノ酸配列と関連して、イタリック体および網かけ文字はジンクフィンガードメインを示し、網かけ文字でありながらイタリック体でないものはＫｉｄやｐ６５ドメインのような調節ドメインを示す。
【０５２３】
【図１】
2005511049.tif 000026
【図２】
2005511049.tif 000027
【図３Ａ】
2005511049.tif 000028
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2005511049.tif 000031
【図６】
2005511049.tif 000032
【図７】
2005511049.tif 000033
【図８】
2005511049.tif 000034
【図９】
2005511049.tif 000035
【図１０Ａ】
2005511049.tif 000036
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2005511049.tif 000038
【図１２】
2005511049.tif 000039
【図１３】
2005511049.tif 000040
【図１４】
2005511049.tif 000041
【図１５】
2005511049.tif 000042
【図１６】
2005511049.tif 000043
【図１７】
2005511049.tif 000044
【図１８】
2005511049.tif 000045
【図１９】
2005511049.tif 000046
【図２０】
2005511049.tif 000047
【図２１】
2005511049.tif 000048
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
2005511049000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月26日(2003.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005511049.tif 000052
【図２】
2005511049.tif 000053
【図３Ａ】
2005511049.tif 000054
【図３Ｂ】
2005511049.tif 000055
【図４】
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【図５】
2005511049.tif 000057
【図６】
2005511049.tif 000058
【図７】
2005511049.tif 000059
【図８】
2005511049.tif 000060
【図９】
2005511049.tif 000061
【図１０Ａ】
2005511049.tif 000062
【図１０Ｂ】
2005511049.tif 000063
【図１１】
2005511049.tif 000064
【図１２】
2005511049.tif 000065
【図１３】
2005511049.tif 000066
【図１４】
2005511049.tif 000067
【図１５】
2005511049.tif 000068
【図１６】
2005511049.tif 000069
【図１７】
2005511049.tif 000070
【図１８】
2005511049.tif 000071
【図１９】
2005511049.tif 000072
【図２０】
2005511049.tif 000073
【図２１】
2005511049.tif 000074
【図２２】
2005511049.tif 000075
【図２３】
2005511049.tif 000076
【図２４】
2005511049.tif 000077
【図２５】
2005511049.tif 000078
【図２６】
2005511049.tif 000079
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
前記方法は次の特徴の少なくとも一つを含み得る：前記人工キメラタンパク質は転写調節ドメイン（例：転写活性または抑制ドメイン）からなる；前記細胞内の人工キメラタンパク質の発現は水運搬体（water transporter）の転写水準を変化させる；Ｓ．セレビジエー（S. cerevisiae）細胞内の前記人工キメラタンパク質の発現はＹＬＬ０５３Ｃ遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子の転写水準を変化させる；前記人工キメラタンパク質はＫ１〜Ｋ１１から選別されたポリペプチドと特定のＤＮＡ結合部位に対して競争する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
他の態様において、本発明は抗真菌製剤に対する真菌菌株の感受性を変化させる方法を提供する。前記方法は、ＹＬＬ０５３Ｃ、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗと３０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％以上同一な５０個以上のアミノ酸の配列を含むタンパク質の発現または活性を変化させることを含む。前記真菌細胞は、たとえば、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンセヌラ（Hansenula）、ヒストプラスマ（Histoplasma）またはクリプトコックス（Cryptococcus）などのような酵母細胞である。一実施態様において、活性または発現の増加によって感受性が減少される；すなわち、抵抗性が増加する。他の実施態様において、感受性を減少させるため、すなわち、抵抗性を増加させるために活性または発現を増加させる。他の実施態様において、感受性を増加させるために活性または発現を減少させる。活性または発現を変化させることは、人工転写因子の発現、ＹＬＬ０５３Ｃ、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗ遺伝子に相応する少なくとも２０個塩基の配列を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に接触されるか、または化学物質を細胞に接触させることを含み得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
関連する一つの方法は、前記タンパク質との相互作用に対して試験化合物（例：小さい有機化合物）をスクリーニングして、たとえば、ＹＬＬ０５３Ｃ／ＡＱＹ１関連タンパク質の抑制を同定するか、ＡＱＹ１、ＹＪＲ１４７Ｗ、ＹＬＬ０５２Ｃ、ＹＬＬ０５３ＣまたはＹＰＬ０９１Ｗの活性または発現を変化させる試験物質をスクリーニングすることを含む。  
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
１．Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５および関連分子
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
前記ポリペプチドは、たとえば、ネズミのＮｅｕｒｏ２ａ細胞に効果的な濃度で存在するとき神経突起を誘導し得る。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３または２個以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的（conservative）置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。たとえば、前記ポリペプチドは１０ｎＭ以下のＫｄを有し、標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＮｅｕｒｏ１−ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：２）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性化または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは一つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
２．Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５および関連分子
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
前記ポリペプチドは、たとえば、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株に効果的な濃度で存在するとき、骨芽細胞（osteoblasts）の他の標識またはアルカリホスファターゼを誘導できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：４内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：４内に存在するジンクフィンガードメイン内の８、６、４、３、または２つ未満の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：４内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。たとえば、前記ポリペプチドはＫｄ  １０ｎＭ未満で結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＯｓｔｅｏ１−ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：４）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
３．０８＿Ｄ０４＿  ｐ６５および関連分子
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
前記ポリペプチドは、たとえば、ヒト２９３細胞に効果的な濃度で存在するとき、インシュリン遺伝子の発現を誘導できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：６内のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：６内に存在するジンクフィンガードメイン内で８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：６内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ未満のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のために０８＿Ｄ０４＿  ｐ６５キメラＺＦＰ（配列番号：６）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上の追加のジンクフィンガードメインを含み得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
前記ポリペプチドは哺乳動物細胞内でウイルスプロモーターのような強力なプロモーターに作動可能に連結された遺伝子のような異種遺伝子の発現を増加できる。たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：２６０のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：２６０内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：２６０内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ１２＿Ａ１１キメラＺＦＰ（配列番号：２６０）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。Ｋ１２＿Ａ１１キメラＺＦＰは抑制ドメインを含んでいるので、異種遺伝子のプロモーターに直接結合することによって異種遺伝子の発現を増加させ得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
この際、Ｂは任意のアミノ酸であるか、選択的にフェニルアラニンまたはチロシンである；Ｊは任意のアミノ酸であるか、選択的に疎水性アミノ酸である。この整列は次のように略称する：ＱＳＨＶ−ＱＳＮＩ−ＱＴＨＲ−ＣＳＮＲおよびＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
たとえば、分離された前記ポリペプチドは配列番号：１４または配列番号：１６のジンクフィンガー整列と同じであるか、配列番号：１４または１６内に存在するジンクフィンガードメインにおいて８、６、４、３、または２つ以下の置換によって変わったアミノ酸配列を含み得る。置換は保存的置換であってもよい。前記分離されたポリペプチドは配列番号：１４または１６内のジンクフィンガー整列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９７％同一な配列を有してもよい。一実施態様において、前記ポリペプチドは標的ＤＮＡ部位に特異的に結合してもよい。前記ポリペプチドは、たとえば、１０ｎＭ以下のＫｄで結合する部位のような標的ＤＮＡ部位に対する結合のためにＫ４４−１１−Ｄ０１またはＫ４４−１１−Ｇ１２キメラＺＦＰ（配列番号：１４または１６）と競争できる。また、前記ポリペプチドは活性または抑制ドメインのような転写調節ドメインを含み得る。前記ポリペプチドは１つ、２つまたは３つ、またはそれ以上のジンクフィンガードメインを含み得る。ポリペプチドは、たとえば、タンパク質生産を調節するのに使用できる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５２２】
【図１】酵母プラスミドｐＹＴＣ−Ｌｉｂの遺伝子マップである。
【図２】例示的な標的−誘導接近方法の模式図である。
【図３Ａ】例示的なジンクフィンガータンパク質ライブラリーの製造方法に対する模式図である。
【図３Ｂ】例示的な表現型−誘導接近方法の模式図である。
【図４】一時的にトランスフェクトされたＺＦＰの発現プロファイルを示す。  左図において、ｐ６５活性化ドメインのみを発現する細胞を対照細胞と比較した。右図において、Ｆ１２１ｐ６５ジンクフィンガータンパク質を発現する細胞を対照細胞と比較した。対角線から離脱した各点はその発現が実質上変化した遺伝子を意味する。
【図５】安定的にトランスフェクトされたＺＦＰの発現プロファイルを示す図である。
【図６】図６のＡはＫ５  ＺＦＰに対するＤＮＡ−結合ドメイン突然変異および作用ドメインの変化が薬剤抵抗性に及ぼす影響を示し、図６のＢはＫ５とＹＬＬ０５３Ｃ過多発現の効果を示す。
【図７】３−フィンガーライブラリーの製作方法を示す。
【図８】対照細胞および神経突起の形成が誘導されたＺＦＰ−発現細胞の写真である。  図８のＡはレチノイン酸（ＲＡ）を処理していないｐｃＤＮＡ３（空ベクター）−トランスフェクトされたＮｅｕｒｏ２Ａ細胞であり、図８のＢはＲＡを処理していないＮｅｕｒｏ１−ｐ６５（また０８＿Ｄ０１−６５とも呼ぶ）であり、図８のＣは１０ｕＭ  ＲＡを処理したｐｃＤＮＡ３（空ベクター）−トランスフェクトされた細胞であり、図８のＤは１０ｕＭ  ＲＡを処理したＮｅｕｒｏ１−ｐ６５の発現である。
【図９】インシュリン遺伝子が過発現された細胞に対する比較マイクロアレイデータを示す。  キメラＺＦＰは０８＿Ｄ０４＿ｐ６５である。その配列は図１６に示されている。
【図１０Ａ】ＺＦＰ  ＤＮＡ結合特異性を列挙する表である。
【図１０Ｂ】ジンクフィンガードメインおよび認識部位配列の相互連関性を示す模式図である。
【図１１】人工ＺＦＰの標的を同定する方法に対するフローチャートである。
【図１２】分化を誘導するＺＦＰを同定する方法に対する模式図である。
【図１３】Ｆ１０４−ｐ６５ＺＦＰが存在する細胞に対する様々な時間帯別比較マイクロアレイ資料を示す。
【図１４】神経突起を誘導できるタンパク質であるＮｅｕｒｏ１−ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。  Ｎｅｕｒｏ１−ｐ６５はジンクフィンガードメインＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１およびｐ６５転写活性化ドメインを含む。ＱＳＮＲ１−ＱＳＮＫ−ＣＳＮＲ１−ｐ６５のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質が神経突起をまた誘導できる。
【図１５】骨細胞を誘導できるタンパク質であるＯｓｔｅｏ１−ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。  Ｏｓｔｅｏ１−ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ１−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲおよびｐ６５活性化ドメインを含む。ＲＤＫＲ−ＱＴＨＲ１−ＶＳＴＲ−ＲＤＫＲ−ｐ６５のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も骨細胞を誘導できる。
【図１６】インシュリン生産（図９）を増加させるタンパク質である０８＿Ｄ０４＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：５）とアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。  ０８＿Ｄ０４＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ＶＳＳＲおよびｐ６５活性化ドメインを含む。ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ＶＳＳＲのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もインシュリンの生産を増加させることができる。
【図１７】ＳＶ４０−ＳＥＡＰの生産を増加させるタンパク質であるＰ＿Ｂ０８に対するコーディング核酸配列（配列番号：７）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。  Ｐ＿Ｂ０８はジンクフィンガードメインであるＱＳＮＲ１−ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲとｐ６５活性化ドメインを含む。ＱＳＮＲ１−ＤＳＮＲ−ＤＳＮＲのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もＳＶ４０−ＳＥＡＰの生産を増加させることができる。
【図１８】細胞増殖を減少させるタンパク質であるＫ＿Ｄ１０に対するコーディング核酸配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。  Ｋ＿Ｄ１０はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱおよびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＷＳＮＲ−ＷＳＮＲ−ＲＤＮＱのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も細胞増殖を抑制できる。
【図１９】細胞増殖を増加させるタンパク質、Ｋ＿Ｆ０２に対するコーディング核酸配列（配列番号：１１）とアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。  Ｋ＿Ｆ０２はジンクフィンガードメインであるＤＳＡＲ２−ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ１−ＱＴＨＲ１およびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＤＳＡＲ２−ＲＤＫＲ−ＲＤＥＲ１−ＱＴＨＲ１のドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質も細胞増殖を増加させることができる。
【図２０】タンパク質の発現を増加させるタンパク質であるＫ４４＿１１＿Ｄ０１に対するコーディング核酸配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。  Ｋ４４＿１１＿Ｄ０１はジンクフィンガードメインＱＳＨＶ−ＱＳＮＩ−ＱＴＨＲ１−ＣＳＮＲ１とｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＱＳＮＩ−ＱＴＨＲ１−ＣＳＮＲ１のドメインと同一なＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もタンパク質発現を増加させることができる。
【図２１】タンパク質発現を増加させるタンパク質であるＫ４４＿１１＿Ｇ１２に対するコーディング核酸配列（配列番号：１５）およびアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。  Ｋ４４＿１１＿Ｇ１２はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ１およびｋｉｄ抑制ドメインを含む。ＱＳＨＶ−ＶＳＴＲ−ＲＤＮＱ−ＱＴＨＲ１のドメインと同一なＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もタンパク質発現を増加できる。
【図２２】Ｆ１０４＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１７）およびアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。  Ｆ１０４＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＲＤＨＴ−ＲＳＨＲ−ＱＳＨＲ２−ｐ６５を含む。
【図２３】Ｆ１２１＿ｐ６５に対するコーディング核酸配列（配列番号：１９）およびアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。  Ｆ１２１＿ｐ６５はジンクフィンガードメインであるＱＳＨＴ−ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴ−ｐ６５を含む。ＱＳＨＴ−ＲＳＨＲ−ＲＤＨＴのドメインと同一パターンのＤＮＡ接触残基を有する少なくとも２つまたは３つの連続的なジンクフィンガードメインを有する他の人工タンパク質もインシュリン−類似成長因子２の転写を増加させることができる。
【図２４】ジンクフィンガードメインであるＲＤＨＴ−ＱＳＮＶ２−ＱＴＨＲ１−ＱＦＮＲ−ｋｉｄを含むＫ１２＿Ａ１１に対するコーディング核酸配列（配列番号：２５９）およびアミノ酸配列（配列番号：２６０）を示す。
【図２５】ジンクフィンガードメインであるＱＳＨＶ−ＱＳＳＲ１−ＱＴＨＲ１−ｋｉｄを含むＫ４４−１６−Ｅ１２に対するコーディング核酸配列（配列番号：２６１）およびアミノ酸配列（配列番号：２６２）を示す。
【図２６】ジンクフィンガードメインであるＱＳＮＲ１−ＱＳＳＲ１−ＱＴＨＲ１−ＲＤＫＲ−ｋｉｄを含むＫ１３＿Ｂ０８に対するコーディング核酸配列（配列番号：２６３）およびアミノ酸配列（配列番号：２６４）を示す。  図１４〜図２６のＤＮＡ配列はＨＡタグ（tag）（灰色下線）をコーディングする配列および核位置信号（nuclear localization signal、ボックスで表記）をコーディングする配列を含み得る。開始および終了コドンは下線で表示されている。小文字は連結配列を示す。アミノ酸配列において、イタリック体および網かけ文字はジンクフィンガードメインを示し、網かけ文字でありながらイタリック体でないものはｋｉｄやｐ６５ドメインのような調節ドメインを示す。  図１４〜図２４のＤＮＡ配列はＨＡタグ（tag）（灰色下線）をコーディングする配列および核位置信号（ボックスで表記）をコーディングする配列を含む。開始および終了コドンは下線で表示されている。網かけ文字はｋｉｄまたはｐ６５ドメインのような調節ドメインをコーディングする配列を示す。小文字は連結配列を示す。アミノ酸配列と関連して、イタリック体および網かけ文字はジンクフィンガードメインを示し、網かけ文字でありながらイタリック体でないものはＫｉｄやｐ６５ドメインのような調節ドメインを示す
【国際調査報告】
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