(57)【要約】本発明は、連続細孔構造を有する球状粒子の形態の多孔性ゼラチン材料および流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造に関する。本発明はまた、前記多孔性ゼラチン材料および構造の調製のための方法も含む。連続細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料を調製するための方法は、均質水性ゼラチン溶液を調製する工程、ＨＬＤ値＞９を有する乳化剤を添加する工程、有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加する工程、有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加する工程、およびゼラチン材料を固化させる工程を含む。本発明による材料の使用もまた含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料を調製する方法であって、
均質水性ゼラチン溶液を調製する工程、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加する工程、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加する工程、
有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加する工程、および
ゼラチン材料を固化させる工程
を含む方法。
【請求項２】
均質水性ゼラチン溶液を調製すること、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、および
ゼラチン溶液を型に流し込みすることにより得ることができる流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を調製する方法。
【請求項３】
ゼラチン材料を化学的に架橋させる工程をさらに含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
化学的架橋をヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネートのような多官能または２官能イソシアネート化合物、グルタルジアルデヒドのような多官能または２官能アルデヒドにより、またはホルムアルデヒドを用いて行う請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤が、トゥイーン８０、トゥイーン４０、ミルジ５２およびブリジ５８からなる群より選択される請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＨＬＢ値＜８を有する乳化剤が、スパン８５、スパン６５およびアトモス３００からなる群より選択される請求項１または３ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、シクロヘキサン、トルエン、パラフィン油および工業用ベンゼンからなる群より選択される請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒が、シクロヘキサンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
連続的細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料であって、
均質水性ゼラチン溶液を調製すること、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、
有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加すること、および
ゼラチン材料を固化させること
により製造される材料。
【請求項１０】
均質水性ゼラチン溶液を調製すること、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、
有機溶媒とＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、および
ゼラチン溶液を型内に流し込みすること
により得ることができる流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造。
【請求項１１】
請求項１ないし８のいずれか１項記載の通りに製造された多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造の、細胞のための担体としての使用。
【請求項１２】
生体適合性の多孔性材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造が、人工皮膚、人工臓器、脂肪組織および血管の培養のために用いられる請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
請求項１ないし８のいずれか１項記載の通りに製造された多孔性ゼラチン材料または流し込みされた多孔性３次元ゼラチン構造の、移植物を製造するための使用。
【請求項１４】
前記流し込みされた３次元ゼラチン構造が、管、耳およびインビボ様構造から選択される請求項２ないし８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
物質の生産のために、細胞のための担体として請求項９記載の生体適合性の多孔性ゼラチン材料または請求項１０記載の流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を個体内に移植するための方法であって、該個体内に該生体適合性の多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を移植すること、ついで、該生体適合性の多孔性材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造上の該細胞に物質を生産させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、球状粒子の形態の連続構造を有する多孔性ゼラチン材料、流し込みされた（cast）３次元多孔性ゼラチン構造、その製造方法およびその使用に関する。
【０００２】
背景技術
ほとんどの動物細胞は表面依存性である、すなわち、それらは、生存および／または増殖可能であるためには表面に付着しなければならない。従来は、この表面は、ガラスフラスコまたはプラスチックフラスコの内面であった。大規模な細胞の培養または細胞の移植において大きな困難が伴われてきた。それらの細胞の大きさは、５〜２０μｍである。
【０００３】
微小担体は、細胞が付着し得、細胞が増殖し得る０．２ｍｍ直径の小粒子である（バン・ベーゼル，Ａ．Ｌ．  ネーチャー２１６（１９６７）６４〜６５ページ「細胞株の生長および均質培養中の微小担体上の１次細胞」）。それらの粒子は、大規模で表面依存性細胞を培養することをある程度まで容易にしている。
【０００４】
最も普通のタイプの微小担体は、デキストランで作られ、正の基による誘導化（derivatisation）により修飾された球状担体からなる。これは細胞が担体に付着するようにさせる。細胞を付着させるもう１つの方法は、ゼラチンの担体を製造することか、またはデキストラン粒子の表面にゼラチンを結合させることかのいずれかである。ゼラチンは、細胞が通常付着する物質であるコラーゲンで作られている。現在細胞のために入手可能である担体は、全ての側面において最適ではない。それらの担体は、しばしば均質である、すなわち、細胞は、その表面上でのみ付着／生長し得る。その結果、細胞の付着／細胞の生長のために利用可能な表面は、担体の表面積に限定されるであろう。さらに、細胞は、インビトロでの通常３次元と比較して２次元でのみ付着／生長し得る。先行技術の系のもう１つの限定要因は、担体が培養容器内での培養のために用いられるとき、細胞は、攪拌系により引き起こされる力により損傷し得ると言うことである。
【０００５】
ある程度まで、このことは、乳化方法により多数の包含されている内腔（cavity）を有する粒子を調製することによりすでに解決されている（キエル・ニルソンおよびクラウス・モスバッハ、スウェーデン特許８５０４７６４−５、多孔性粒子、その製造方法およびその使用）。この特許明細書は、どのように多数の包含されている内腔を有する粒子が、マトリックス材料の水溶液に、固体、液体、またはガス状内腔形成化合物を加えることにより調製されうるかを開示する。粒子が水に不溶性の分散剤中での分散により形成された後、マトリックスは、冷却、共有架橋結合、または重合により水に不溶性にされる。内腔形成化合物は、包含された内腔を獲得するために除去される。
【０００６】
上記粒子は、イオン交換体、ゲルろ過媒体、クロマトグラフィー媒体、および細胞培養中の微小担体として用いられ得る。そのマトリックスは、タンパク質、多糖、またはポリアクリルアミドで作られている。
【０００７】
スウェーデン特許８５０４７６４−５による発明は、粒子の内腔の一部が細胞の付着／細胞の生長のために利用可能であった粒子を提供した。しかしながら、このように得られた粒子はいくつかの側面において最適ではなかったこともわかっている。最適には、全ての内腔は、連続多孔性相と連続マトリックス相が得られるように相互連絡している。本発明においては、この状態は、予想外にも、乳化剤と溶媒の組み合わせによりゼラチンの場合に獲得された。
【０００８】
加えて、この状態は、粒子と他の３次元形状の両方を調製することを可能とした。この相分離は、所望される形状の調製にとって必要な時間の長さにわたってミクロなレベルで安定でなければならない。さらに、相分離は、マクロなレベルで相の分離をもたらしてはならない。これは、多孔性のない形態をもたらすからである。
【０００９】
発明の概要
１つの側面によれば、本発明は、連続細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料の調製のための方法であって、均質水性ゼラチン溶液を調製する工程、ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加する工程、有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加する工程、有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加する工程、およびゼラチン材料を固化させる工程を備える方法に関する。
【００１０】
第２の側面によれば、本発明は、均質な水性ゼラチン溶液を調製すること、ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加すること、およびゼラチン材料を固化させることにより製造される連続細孔構造を有する球状粒子の形態の多孔性ゼラチン材料に関する。
【００１１】
さらなる側面によれば、本発明は、均質水性ゼラチン溶液を調製すること、ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、ゼラチン溶液を型の中に流し込むことにより得ることができる流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を調製するための方法に関する。
【００１２】
他の側面によれば、本発明は、均質水性ゼラチン溶液を調製すること、ＨＬＤ値＞９を有する乳化剤を添加すること、有機溶媒およびＨＬＤ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、およびゼラチン溶液を型の中に流し込むことにより得ることができる流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造に関する。
【００１３】
さらに別の側面によれば、本発明は、本発明により製造される多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造の細胞のための担体としての使用に関する。
【００１４】
さらなる側面によれば、本発明は、移植物（implant）を作るために上述のように製造された多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造の使用に関する。
【００１５】
本発明のもう１つの側面は、物質の生産のために、細胞のための担体として上記生体適合性の多孔性ゼラチン材料または上記流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を個体内に移植するための方法であって、該個体内に該生体適合性の多孔性ゼラチン材料または該３次元多孔性ゼラチン構造を移植すること、ついで、該生体適合性の多孔性材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造上の細胞に該物質を生産させることを含む方法に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の１態様によれば、上記方法は、さらに、ゼラチン材料を化学的に架橋させる工程を含む。この架橋は、ヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネートのような多官能または２官能イソシアネート化合物、グルタルジアルデヒドのような多官能または２官能アルデヒドを用いて行うことができる。ゼラチンは、また、液状またはガス状のホルムアルデヒドによっても架橋させることができる。
【００１７】
別の態様によれば、乳化剤は、ＨＬＢ値＞９を有するトゥイーン（Tween）８０（ポリオキシソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ値＝１５）、トゥイーン４０（ポリオキシエチレンステアリン酸、ＨＬＢ値＝１５）、ミルジ（Myrj）５２（ポリオキシエチレンステアリン酸、ＨＬＢ値＝１７）およびブリジ（Brij）５８（ポリオキシエチレンセチルアルコール、ＨＬＢ値＝１６）からなる群より選択されるが、これらに限らない。
【００１８】
さらに別の態様によれば、乳化剤は、ＨＬＢ値＜８を有するもので、スパン（Span）８５（ＨＬＢ値＝２）、スパン６５（ＨＬＢ値＝２）およびアトモス（Atmos）３００（ＨＬＢ値＝２．５）からなる群より選択されるが、これに限らない。
【００１９】
「アトモス」は、アイスクリームおよび氷菓で用いられる一連のモノおよびジグリセリド乳化剤の商標である（縮刷版化学辞典、第６版、１９６１、１１６ページ）。
【００２０】
別の態様によれば、有機溶媒は、シクロヘキサン、トルエン、パラフィン油および工業油からなる群より選択されるが、これに限らない。
【００２１】
本発明による特に好ましい態様によれば、有機溶媒はシクロヘキサンである。
【００２２】
乳化剤のＨＬＢ値についての要求が充足されている限り、本発明による方法における乳化剤の選択は重要ではない。どの乳化剤を随意の剤として選択することができるということは、当業者にとって明白である。
【００２３】
乳化剤は、ＨＬＢ値として叙述される親水性−親油性バランスによって特徴付けられる。ＨＬＢ値は、通常１〜２０にわたる。低いＨＬＢ値は、乳化剤の親油性部分が主たるものであることを示し、高い値は、乳化剤が主に親水特性を有することを示す（ガレニスク・ファルマシ（Galenisk farmaci）、エリック・サンデル、第３版、１９８２、９７ページ）。
【００２４】
８５０４７６４−５において、細孔構造は、調製の工程の１つにおいて、均質ゼラチン溶液中に有機溶媒を乳化させることにより製造される。このエマルジョンは、ＨＬＢ値＜８を有する乳化剤、例えばスパン８５により安定化される。このタイプの乳化剤は、水相中に溶媒の安定なエマルジョンをもたらす。ゼラチン溶液の固化点を下回る冷却の後、溶媒を除去する。結果として、相互連絡していない多数の包含された内腔を有する材料ができる。
【００２５】
本発明によれば、連続細孔構造は、調製プロセスの工程の１つにおいて、ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む溶媒、例えばシクロヘキサンを均質水性ゼラチン溶液に加えることにより調製される。このタイプの乳化剤は、溶媒中の水相の安定なエマルジョンを生成する。しかしながら、水相の体積は、溶媒相の体積よりはるかに大きいので、このことは、不安定な比率となる。この不安定な比率は、所望の形状を調製するのに十分である時間安定な予期されない微視的な相分離をもたらす。ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤のゼラチン相への添加は、微視的な相分離を促進する。先行技術から本発明を区別するもう１つの特徴は、本発明は、ゼラチンがマトリックス形成化合物として用いられるときのみ機能すると言うことである。多糖とポリアクリルアミドを用いて行った実験は、いずれの微視的な相分離ももたらさない。したがって、現在の知識を用いると、この新規な発明は、マトリックス形成化合物としてのゼラチンでのみ機能する。それゆえ、独特で、予測されない事柄が、ゼラチンと乳化剤系の組合せで起こる。上述のように、８５０４７６４−５に開示された発明は、多数のマトリックス形成材料中に、包含された内腔を提供し、粒子の内腔が相互接続されていないので、最大数の細胞が付着／生長し得ない。８５０４７６４−５において、別々の液滴／細孔がこのようにして得られるが、しかし本発明によれば、２つの連続相が得られ、１つはゼラチン−水相であり、１つは溶媒層であり、それらは固化すると、連続細孔構造を提供する。
【００２６】
第１の組成物のゼラチン溶液への添加は、所定温度で相分離をもたらす。異なる相は、裸眼では可視的ではないが、しかし、混合物は白色がかったものとなる。本発明の１態様によれば、３次元ゼラチン構造は、ゼラチン溶液に第１の組成物を添加した後、型の中にゼラチン溶液を流し込みすることにより得ることができる。型は、いずれのタイプの型であってよく、ゼラチン構造の意図される最終用途に適合され得る。例えば、ゼラチン構造は、管、耳、または指、つま先、乳首または鼻のような他のインビボ様構造に流し込みされる。
【００２７】
第２の組成物（スパン８５を含むシクロヘキサン）のゼラチン溶液への添加は、溶媒により取り囲まれる液滴を生成し、該液滴は、スパン８５により安定化される。それらの液滴は、ゼラチン相および溶媒相を含む。両方の相は連続的である。第２の組成物の添加は、球状の粒子をもたらす。
【００２８】
本発明の別態様によれば、生体適合性の多孔性材料または流し込みされた３次元ゼラチン構造は、人工皮膚、人工器官、脂肪組織および血管を培養するために用いられる。
【００２９】
本発明による生体適合性の多孔性材料は、細胞培養における細胞のための担体としておよび個体内の移植の前後の所望の物質の生産のための生存細胞（existing cells）のための担体として用いることができる。細胞は、個体自身の細胞か、または別の起源（その種に特徴的かまたはその種にとって外的である）由来の細胞かのいずれかであり得る。いくつかの場合には、細胞それ自体が、例えば、移植後脂肪細胞に変換されるように増殖し得る担体上の付着した初期段階の脂肪細胞（前脂肪細胞）のような所望の生産物であり得る。適用の１つの分野は、例えば、形成外科術である。
【００３０】
細胞の添加無しに人の体の中に本発明により製造された多孔性構造を移植することもまた可能である。移植後、身体内の隣接する細胞は、構造内に移動し、コロニー形成するであろう。移植された構造が溶解した後、コロニー形成した細胞は、移植物に対応する構造を形成するであろう。ゼラチン材料の架橋度は、ゼラチン構造が身体内で溶解するのにかかる時間を制御する。したがって、意図される用途のために溶解を制御することが可能である。このことの例が、細胞を伴わずに本発明による担体をしわの基底に注入する形成外科術に存在する。担体を取り囲む細胞は、担体に向かって移動し、担体をコロニー化する。徐々に、担体が、取り囲む酵素により溶解されるにつれ、移動した細胞は、しわの基底を占める。このことは、しわを平滑化させる。
【００３１】
さらにもう１つの例は、薬物を試験するときに、付着する細胞を有する本材料を用いることである。付着する細胞の状態を反映する変数を測定することにより、潜在的な薬物の有効性／毒性についての予測を行うことができる。
【００３２】
もう１つの例は、皮膚に対する異なるタイプの外傷を治療するために用いることのできる担体上の皮膚細胞である。もう１つの例は、例えば、心筋梗塞の治療に用いることのできる筋原細胞（筋肉細胞）である。もう１つの例は、肝臓損傷における毒性物質を無害にするために用いることのできる肝細胞（肝臓細胞）である。ランゲルハンス島のようなより複雑な構造もまた、多孔性担体におよび／または多孔性担体内に付着し得る。ランゲルハンス島は、複数の異なる細胞タイプで構成されており、血糖値を調節する系を構成する。それらの島は、顕著に大きく、５０〜２００μｍの細孔サイズの担体を必要とする。
【００３３】
本明細書で用いられる「物質」と言う用語は、種々の細胞または微生物により生産され得る物質、例えば、抗生物質、パーキンソン病の重要物質であるドーパミンのような薬理学的物質、および癌の治療の活性物質である種々のインターフェロンに関する。
【００３４】
球状粒子および流し込みされた３次元ゼラチン構造の両方と組み合わせて本明細書で用いられる「多孔性」と言う用語は、該粒子および構造が、細胞が生長し得る細孔を含むということに関する。
【００３５】
本発明によれば、生体適合性の多孔性ゼラチン材料の分解性は、ゼラチンの架橋度により決定される。ある剤は、例えば、分散物の流し込みの間に生体適合性の多孔性材料への細胞の付着を強化または変化させるために加えられ、または、その剤は、ポリマーに化学的に結合し得るかもしくは後に加えられ得る。細胞の付着に影響を与える剤は、単純な分子かまたはタンパク質かのいずれかであり得る。前者の例は、ヘキサメチレンジアミンおよびアミノカプロン酸のような正または負に荷電した物質である。また、脂肪酸のような荷電していない構造もマトリックスに付着し得る。より複雑な構造の例は、アミノ酸配列アルギニン−グリシン−アスパラギンまたはその誘導体を含むペプチドである。この配列は、担体への細胞の付着を促進する。タンパク質の例は、フィブロネクチンおよびラミニンである。また、ＥＣＭ（細胞外マトリックス）のようなタンパク質の未確定（non-defined）混合物（組織の抽出により得られる）を用いることもできる。
【００３６】
拒絶反応を防止するために、ゲル粒子は、身体の細胞およびタンパク質が付着細胞を認識するか、付着細胞と反応することを防止する役割をする別の材料の中の付着細胞で封入し得る。この材料は、多糖かまたはポリマーであり得る。したがって、その材料は、身体のタンパク質および細胞に対してある種の機械的バリヤーとして機能する。
【００３７】
調製方法と製造に使用される原料に依存して、いくつかのタイプのゼラチンが存在する。それらのゼラチンタイプは、多孔性材料にさまざまの特性を提供するために用いることのできる異なる特性を有する。さらに、ゼラチンは、さらなる新規の望ましい特性を獲得するために調製の前に修飾することができる。この修飾は、分画のような物理的方法または化学反応により行うことができる。
【００３８】
個々の用途に適切な形状を得るために、調製された分散物は、先行技術の方法に従って、異なる３次元構造に成形することができる。すなわち、球状粒子は、乳化法により得ることができ、膜は、プレート上／プレート間での流延により得ることができる。特別な構造が、特別に作られた型内で流し込み成形でき、例えば耳である。機械的方法を含む仕上げプロセスもまた、最終構造を得るために用いることができる。
【００３９】
生体適合性の多孔性材料は、細胞が、連続多孔性構造の内部と、生体適合性の多孔性材料の外部の両方に存在するように調製される。このことは、材料の最適な使用をもたらす。
【００４０】
本明細書の記載において、「細胞のための担体」と言う表現は、種々の細胞の培養で用いられ得る担体と、細胞が所望の物質の生産を達成するために用いられ得る担体を包含することを意図する。また、「細胞のための担体」と言う表現は、ヒトの身体内の移植のための医療用移植物も含む。本発明による生体適合性の多孔性ゼラチン材料の調製における驚くべき効果は、当該材料内で得られる連続細孔が当該材料の断面を通して均一に分布すると言うことである。したがって、生体適合性の多孔性ゼラチン材料内の細胞のより均一な分布が達成される。
【００４１】
例
例１．大きな連続細孔を有する球状ゼラチン粒子の調製
１３ｇのゼラチンを攪拌しながら、４０℃に加熱することにより１００ｍｌの水に溶解させる。続く全ての工程は、攪拌しながら実施される。この溶液に、２１ｇのトゥイーン８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）を加える。トゥイーンは、一連の乳化剤と界面活性剤の商標である。それらは、ヘキシトランヒドリドの脂肪酸部分エステルのポリオキシエチレン誘導体である（縮刷版化学辞典、第６版、１９６１年、１１８２ページ）。上記混合物を３５℃に冷却する。次いで、１ｇのトゥイーン８０を含む３４ｍｌのシクロヘキサンを加える。混合物をさらに３２℃に冷却し、そうして２ｇのスパン８５（ソルビタントリオレエート）を含む３４ｍｌのシクロヘキサンを加える。スパンは、一連の乳化剤と界面活性剤の商標である。それは、ヘキシトランヒドリド（またはソルビタン）の脂肪酸部分エステルである（縮刷版化学辞典、第６版、１９６１年、１０６３ページ）。ゼラチンが固化するまで混合物をさらに冷却する。アセトンで洗浄することにより、乳化剤とシクロヘキサンを除去する。アセトンを蒸発させることにより粒子を乾燥させることができる。
【００４２】
例２．小さな連続細孔を有する球状ゼラチン粒子の調製
１３ｇのゼラチンを攪拌しながら、４０℃に加熱することにより１００ｍｌの水に溶解させる。続く全ての工程も攪拌しながら実施する。この溶液に１５ｇのトゥイーン８０を加える。混合物を３５℃に冷却する。次いで、１．５ｇのトゥイーン８０を含む１２ｍｌのシクロヘキサンを加える。混合物をさらに３２℃に冷却し、そうして３ｇのスパン８５を含む５８ｍｌのシクロヘキサンを加える。ゼラチンが固化するまで混合物をさらに冷却する。アセトンで洗浄することにより乳化剤とシクロヘキサンを除去する。アセトンを蒸発させることにより粒子を乾燥させることができる。
【００４３】
例３．架橋法１
１０ｇの多孔性材料を、４８０ｍｇの酢酸ナトリウム３水和物が溶解した、１２０ｍｌのアセトンおよび３０ｍｌの水と混合する。この材料を、０．４５ｍｌのヘキサメチレンジイソシアネートおよび０．０６ｍｌのトリエチルアミンの添加により２時間架橋させる。架橋した粒子を水とアセトンで洗浄する。アセトンを蒸発させることにより粒子を乾燥させる。
【００４４】
例４．架橋法２
１０ｇの多孔性材料を、７．２ｇリン酸ナトリウムが溶解した４００ｍｌの水と混合する。この材料を０．８ｍｌのヘキサメチレンジイソシアネートと５μｌのトリエチルアミンの添加により１時間架橋させる。架橋した粒子を水とアセトンで洗浄する。アセトンを蒸発させることにより粒子を乾燥させる。
【００４５】
上記材料の製造において、より高いトゥイーン濃度を用いることにより、より大きな連続細孔を得ることができる。シクロヘキサンの量を増やすことによっても、より大きな細孔が得られ、同時に、より大きな総細孔体積が得られる。攪拌速度を増加させることにより、より小さな細孔が得られる。したがって、広い範囲内で膜の多孔性を変化させることは容易である。
【００４６】
生体適合性の多孔性材料の熱、酵素等に対する耐性は、架橋度に比例する。例えば、ヘキサメチレンジイソシアネートのような架橋剤の濃度の増加は、耐性の増加をもたらす。架橋時間の増加もまた耐性の増加をもたらす。調製において用いられる架橋剤は、例えば、ジイソシアネートおよびポリイソシアネートのように２官能性または多官能性であり得、また、アルデヒドも２官能性および多官能性であり得る。ゼラチンを架橋させる他の先行技術の方法も用いられ得る。
【００４７】
架橋は、成形前に分散物に架橋剤を加えることにより粒子の調製中に起こり得る。代替として、成形された構造は、後に架橋することができる。冷却するときゼラチンが固化するので多孔性ゼラチン構造が維持されるからである。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月7日(2005.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料を調製する方法であって、
均質水性ゼラチン溶液を調製する工程、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加する工程、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加する工程、
有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加する工程、および
ゼラチン材料を固化させる工程
を含む方法。
【請求項２】
流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を調製する方法であって、
均質水性ゼラチン溶液を調製する工程、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加する工程、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加する工程、および
ゼラチン溶液を型に流し込みする工程
を含む方法。
【請求項３】
ゼラチン材料を化学的に架橋させる工程をさらに含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
化学的架橋をヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネートのような多官能または２官能イソシアネート化合物、グルタルジアルデヒドのような多官能または２官能アルデヒドにより、またはホルムアルデヒドを用いて行う請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤が、トゥイーン８０、トゥイーン４０、ミルジ５２およびブリジ５８からなる群より選択される請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＨＬＢ値＜８を有する乳化剤が、スパン８５、スパン６５およびアトモス３００からなる群より選択される請求項１または３ないし５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
有機溶媒が、シクロヘキサン、トルエン、パラフィン油および工業用ベンゼンからなる群より選択される請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
有機溶媒が、シクロヘキサンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
連続細孔構造を有する球状の多孔性ゼラチン材料であって、
均質水性ゼラチン溶液を調製すること、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、
有機溶媒およびＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む第１の組成物を添加すること、
有機溶媒およびＨＬＢ値＜８を有する乳化剤を含む第２の組成物を添加すること、および
ゼラチン材料を固化させること
により得ることができる材料。
【請求項１０】
均質水性ゼラチン溶液を調製すること、
ＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を添加すること、
有機溶媒とＨＬＢ値＞９を有する乳化剤を含む組成物を添加すること、および
ゼラチン溶液を型内に流し込みすること
により得ることができる流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造。
【請求項１１】
ゼラチンが化学的に架橋されている請求項９に記載のゼラチン材料または請求項１０に記載のゼラチン構造。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項記載の通りに製造された多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造の、細胞のための担体としての使用。
【請求項１３】
前記多孔性材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造が、人工皮膚、人工臓器、脂肪組織および血管の培養のために用いられる請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
請求項１ないし１１のいずれか１項記載の通りに製造された多孔性ゼラチン材料または流し込みされた多孔性３次元ゼラチン構造の、移植物を製造するための使用。
【請求項１５】
前記流し込みされた３次元ゼラチン構造が、管、耳およびインビボ様構造から選択される請求項１０または１１記載の構造。
【請求項１６】
生物学的物質の生産のために、細胞のための担体として、請求項９または１１記載の多孔性ゼラチン材料または請求項１０または１１記載の流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を個体内に移植するための方法であって、前記材料または構造を前記細胞上に導入し、該個体内に前記多孔性ゼラチン材料または流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を移植し、前記材料または構造上の該細胞に前記物質を生産させることを含む方法。
【請求項１７】
請求項９または１１記載の多孔性ゼラチン材料または請求項１０または１１記載の流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を個体内に移植するための方法であって、前記材料または構造を治療が必要な部位に移植し、隣接する細胞を前記部位に移行させ、例えばしわを平滑化するために前記部位でコロニー化させることを含む方法。
【請求項１８】
損傷した組織のインビボ治癒を改善するための方法であって、適切な細胞を請求項９または１１記載の多孔性ゼラチン材料または請求項１０または１１記載の流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造上に導入し、前記材料または構造を損傷した組織の部位に移植することを含む方法。
【請求項１９】
損傷した組織のインビボ治癒を改善するための方法であって、請求項９または１１記載の多孔性ゼラチン材料または請求項１０または１１記載の流し込みされた３次元多孔性ゼラチン構造を移植し、前記材料または構造を損傷した組織の部位に移植し、個体磁心の細胞を前記材料または構造上で増殖させることを含む方法。
【国際調査報告】
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