(57)【要約】機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター
【請求項２】
色素体形質転換ベクターにおいて機能性である制御配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
【請求項３】
制御配列が色素体ゲノムにおいて作用するプロモーターを含む、請求項2記載のベクター。
【請求項４】
プロモーターがPrrn 16S rRNAである、請求項3記載のベクター。
【請求項５】
制御配列がpsbA 5'エレメント及びpsbA 3'エレメントを含む、請求項4記載のベクター。
【請求項６】
制御配列が、外来遺伝子をコードするDNA配列の転写及び翻訳の増強を提供することができる5'UTRをさらに含む、請求項2記載のベクター。
【請求項７】
制御配列が、外来遺伝子をコードするDNA配列に転写物安定性を賦与することができる3'非翻訳領域（UTR）をさらに含む、請求項2記載のベクター。
【請求項８】
制御配列が遺伝子10 5'UTRをさらに含む、請求項2記載のベクター。
【請求項９】
制御配列が遺伝子10 5'UTR/rps 16 3'UTRをさらに含む、請求項8記載のベクター。
【請求項１０】
第一の隣接配列が16S/trnIであり、かつ第二の隣接配列がtrnA/23Sである、請求項1記載のベクター。
【請求項１１】
第一の隣接配列が約4kbである、請求項1記載のベクター。
【請求項１２】
第二の隣接配列が約4kbである、請求項1記載のベクター。
【請求項１３】
高等植物種の色素体ゲノムへの安定的組み込みのための成分であり、第一及び第二の隣接DNA配列が、該色素体ゲノムのスペーサー領域内の配列に実質的に相同であり、かつ該隣接配列が、該高等植物種の色素体ゲノムにおいて保存されている、請求項1記載のベクター。
【請求項１４】
スペーサー領域が、転写的に活性なスペーサー領域である、請求項13記載のベクター。
【請求項１５】
5'UTRがpsbAの5'UTRである、請求項6記載のベクター。
【請求項１６】
3'UTRがpsbAの3'UTRである、請求項7記載のベクター。
【請求項１７】
選抜可能マーカーをコードするDNA配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
【請求項１８】
選抜可能マーカーが、抗生物質なしの選抜可能マーカーである、請求項17記載のベクター。
【請求項１９】
抗生物質なしの選抜可能マーカーが、ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（BADH）である、請求項18記載のベクター。
【請求項２０】
選抜可能マーカーをコードするDNA配列が、抗生物質耐性選抜可能マーカーをコードする、請求項17記載のベクター。
【請求項２１】
抗生物質耐性選抜可能マーカーがaadAである、請求項20記載のベクター。
【請求項２２】
請求項1記載のベクターによって安定的に形質転換された植物。
【請求項２３】
請求項22記載の植物の子孫。
【請求項２４】
請求項22記載の植物の種子。
【請求項２５】
目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列を有する色素体ゲノムを含む、請求項22記載の植物の非緑色部分。
【請求項２６】
請求項1記載のベクターで形質転換された少なくとも一つの原色素体をさらに含む、請求項22記載の植物。
【請求項２７】
請求項1記載のベクターによって形質転換された体細胞胚。
【請求項２８】
機能的に接続された成分として、非緑色色素体において機能性のプロモーターと、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、選抜可能な形質を賦与するポリペプチドをコードする少なくとも一つの付加的な構造遺伝子又はその機能性部分とを含む発現カセットを含む非緑色色素体を含有する非緑色植物細胞であって、該異種DNA配列の転写が、該プロモーターと、転写終結領域と、相同的組み換えによる該色素体のゲノムへの発現カセットの安定的組み込みを促進する該発現カセットに隣接する色素体DNA隣接配列とによって制御される、非緑色植物細胞。
【請求項２９】
体細胞胚形成を通して再生することができる、請求項28記載の非緑色植物細胞。
【請求項３０】
請求項1記載の色素体形質転換ベクターで形質転換された色素体ゲノムを有するトランスジェニック非緑色植物細胞であって、体細胞胚形成を通して再生されるトランスジェニック非緑色植物細胞。
【請求項３１】
請求項1記載のベクターを植物色素体の色素体ゲノムへ組み込む工程を含む、体細胞胚形成を通して色素体を形質転換する方法。
【請求項３２】
工程を含む体細胞胚形成を通して植物が再生される、非緑色外植片を使用して色素体形質転換を達成する方法。
【請求項３３】
機能的に接続された成分として、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、選抜可能マーカーをコードするDNA配列と、相同的組み換えによる葉緑体ゲノムへの発現カセットの安定的組み込みを促進する発現カセットに隣接する色素体DNA配列とを含む発現カセットを含む色素体を含有する植物細胞であって、体細胞胚形成を通して再生される植物細胞。
【請求項３４】
目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列を含み、体細胞胚形成を通して再生することができる非緑色植物細胞であって、該目的のポリペプチドをコードする該異種DNA配列が、該非緑色植物細胞に含有されている色素体に組み込まれている、非緑色植物細胞。
【請求項３５】
機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において作用するプロモーターと、色素体において作用する選抜可能マーカーをコードするDNA配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換することができる色素体形質転換ベクター。
【請求項３６】
機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において機能性である制御配列と、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞内にある色素体を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター。
【請求項３７】
請求項1記載の色素体形質転換ベクターを植物細胞の色素体ゲノムへ組み込む工程；及び
目的のポリペプチドを発現させるため該植物細胞を増殖させる工程
を含む、異種DNA配列によりコードされる目的のポリペプチドを非緑色植物細胞において作製する方法。
【請求項３８】
外因性のベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（badh）遺伝子を発現するよう請求項1記載のベクターを介して非緑色植物細胞を形質転換する工程を含む、トランスジェニック植物を視覚的に選抜する方法。
【請求項３９】
機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において機能性である制御配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の支援を受けた研究に関する言及
本願において報告される研究は、一部、NIH R 01 GM63879からの資金提供によって支援された。
【０００２】
発明の分野
本発明の領域は、植物色素体の遺伝子操作に関する。より具体的には、本発明は、色素体形質転換を通した非緑色植物細胞の形質転換、及びその後の体細胞胚形成を通した非緑色植物細胞の再生に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
色素体は、高レベルの導入遺伝子発現（Daniellら、2002）、単一の形質転換イベントにおける多遺伝子の操作（DeCosaら、2001；Ruizら、2003；Daniell＆Dhingra、2002）、母性遺伝を介した導入遺伝子封じ込め（Daniell 2002）、遺伝子サイレンシングの欠如（Leeら、2003；DeCosaら、2001）、部位特異的導入遺伝子組み込みによる位置効果（Daniellら、2002）、及び多面発現効果（Daniellら、2001；Leeら、2003）を含む多数の魅力的な利点を示すため、遺伝子操作にとって理想的である。葉緑体遺伝子操作は、ワクチン抗原の超発現（hyper-expression）及び貴重な治療用タンパク質の作製に最も適している。本発明者らは、様々な生物医学的適用のためのヒト・エラスチン由来ポリマーの発現を証明して以来（Gudaら、2000）、コレラ、炭疽のワクチン抗原（Daniellら、2001、Daniell 2003）、モノクローナル抗体（Daniellら、2001）、並びにヒト血清アルブミン（Fernandezら、2003）、マガイニン（DeGrayら、2001）、インターフェロン（Daniell 2003）、及びインスリン様増殖因子（Daniell、2003）を含むヒト治療用タンパク質を発現させるためにこのアプローチを拡張してきた。他のいくつかの研究室が、トランスジェニック葉緑体において、安定性を改良するためのヒト成長ホルモン・インターフェロン-GUS融合タンパク質（Reddyら、2003）及び破傷風ワクチン抗原（Tregoningら、2003）を発現させている。これらの治療用タンパク質は、全て例外なく、様々な環境グループにより主張されている植物由来薬剤のための食用作物のゼロ・トレランス（zero-tolerance）を満たすトランスジェニック・タバコ葉緑体において発現させられている。
【０００４】
しかしながら、作製、精製、保管、及び輸送のコストを劇的に減少させ、そして静脈内送達に関連した合併症を最小限に抑えるため、治療用タンパク質及びワクチン抗原の経口送達が緊急に必要とされている。ニンジン（Daucus carota L.）は、食事における糖、ビタミンA、C、及び繊維の優れた供給源であるため、ヒト及び動物の消費のために世界中で使用されている最も重要な野菜のうちの一つである。ニンジン植物は、2年で生活環が完了する二年生である。一年目、植物は可食である多肉主根を産生する。地中に放置された場合、植物は、寒い季節を経た後、2年目に花成する（Yan,W.＆Hunt,L.「コムギ及びニンジンの春化データの再分析（A Reanalysis of Vernalization Data of Wheat and Carrot）」、Annals of Botany 84,615-619（1999）。さらに、栽培されたニンジン作物における葉緑体ゲノムは、厳密に母性遺伝を通して伝達される（Vivekら、1999）。従って、ニンジンは環境的に安全であり、食用作物に関して主張されている導入遺伝子流出に対するゼロ・トレランスを達成するため、花粉及び種子を介した導入遺伝子流出から二重に防御されている。ニンジンの体細胞胚は、単細胞由来であり、反復性の胚形成を通して繁殖する；これは、治療用タンパク質を作製するための必須要件のうちの一つである、細胞培養物の均一な供給源（均質な単一の起源）を提供する。ニンジン細胞は急速に分裂し、大きなバイオマスがバイオリアクターを使用して作製される。培養されたニンジン細胞は、可食であり、かつ正確な用量のワクチン抗原又は生物薬剤を送達するために直接使用され得る。可食ニンジンを介して送達される場合、料理される必要はなく、このことは、消費の際の治療用タンパク質の構造的完全性を保存するであろう。培養培地上で長期にわたり生存可能であるため、封入された胚は、凍結保存及び調節された発芽のための人工種子として使用される（Tessereau,H.、B.Florin、M.C.Meschine、C.Thierry、及びV.Petard、1994）。従って、増強された医学的又は栄養学的な価値を有するトランスジェニック・ニンジンは、ヒト又は動物の健康の改善において重大な役割を果たし得る。
【０００５】
しかしながら、ニンジン葉緑体ゲノムを操作するためには、いくつかの主要な障害を克服しなければならない。従来、葉緑体ゲノムは、大きな葉緑体を含有している緑色の葉を外植片として使用することによってのみ形質転換されてきた。第一の難題は、小さな原色素体へ外来DNAを導入し、非緑色色素体において機能する適当な制御配列及び選抜可能マーカーを同定することである。第二の難題は、外植片として葉を使用しながら、体細胞胚形成を介して葉緑体トランスジェニック植物を再生成させ、器官形成により提示されるその後の数回にわたる選抜の利益を欠くホモプラスミーを達成することである。これらの理由のため、葉緑体遺伝子操作は、トマト（Rufら、2001）及びジャガイモ（Sidorovら、1999）のようなタバコ以外の少数のナス科作物においてのみ達成されており、後者の作物は不稔性のままであった。たとえ器官形成を介した緑色葉からの再生が可能であったとしても、非ナス科作物の形質転換は引き続き難題である。例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis）トランスジェニック植物は不稔性であり（Sidkarら、1998）、アブラナ（oilseed rape）においては安定的組み込み又はホモプラスミーすら達成され得なかった（Bing Kai Houら、2003）。
【０００６】
表1は、葉緑体における導入遺伝子発現の開発の例示的なリストを示す。
【０００７】
（表１）葉緑体における導入遺伝子発現
2005532069.tif 000002
2005532069.tif 000003
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の一つの局面は、体細胞胚形成を通したニンジン色素体形質転換のための高度に効率的な方法を使用した色素体を形質転換する方法を記載する。さらに、本発明のその他の局面は、体細胞胚形成を通した色素体形質転換が可能なベクターを提供する。さらに、もう一つの局面は、本明細書に記載された方法及びベクターを通して体細胞胚形成を通して形質転換された、形質転換された色素体、植物、及び植物部分を提供する。本願は、当技術分野の知識と協同して、再生が体細胞胚形成を通して媒介される、いくつかの主要な作物の色素体ゲノムを操作するための必要な案内及び指示を提供する。禾穀類（コムギ、イネ、トウモロコシ、サトウキビ）、マメ科植物（ダイズ、アルファルファ）、油料作物（ヒマワリ、オリーブ）、換金作物（ワタ、コーヒー、チャ、ゴム、アマ、コルクガシ、マツ）、野菜（ナス、キュウリ、キャッサバ、トウガラシ、アスパラガス等）、果実（リンゴ、サクラ、バナナ、プランテーン、メロン、ブドウ、グアバ）、堅果（カシュー、クルミ、ピーナッツ）、及び樹木（ナツメヤシ等）が、体細胞胚形成を通して再生される。本発明のもう一つの局面は、同一プライマー（ユニバーサル色素体プライマー）を使用した、多様な異なる種のための葉緑体ベクターの構築物を示す。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の一つの局面において、体細胞胚形成を介して植物細胞細胞培養物から再生させられたホモプラスミックな植物が提供される。本発明のもう一つの局面は、植物細胞の体細胞胚形成をもたらすことができる、非緑色外植片において使用され得る色素体形質転換ベクターである。本発明のさらにもう一つの局面は、非緑色可食植物部分における導入遺伝子発現を提供する。本発明の局面は、さらに、単子葉植物、マメ科植物、野菜、果実作物の形質転換、及びこれらの植物の非緑色植物部分における導入遺伝子発現を記載する。本発明のもう一つの局面は、非緑色植物部分を形質転換するのに適している色素体形質転換ベクターを使用した異種タンパク質の発現を提供する。その他の局面において、異種タンパク質を体細胞胚形成を介して発現させるため色素体ゲノムを形質転換する方法、目的のタンパク質を発現する形質転換された植物及びそれらの子孫が、提供される。本発明のさらにもう一つの局面は、植物の小さな原色素体への外来DNAの導入、及び非緑色色素体において機能する選抜マーカーの同定である。本発明のさらに他の局面は、ホモプラスミーを達成するため体細胞胚形成を介して再生させられた葉緑体トランスジェニック植物を提供する。
【００１０】
本願の好ましい局面は、高等植物の全ての色素体に適用可能である。これらの色素体には、果実、野菜、及び花に存在する有色体；ジャガイモのような塊茎に存在するアミロプラスト；高等植物の根にある原色素体；いずれも植物の非緑色部分に存在する白色体及び（暗所で発現する）エチオプラストが含まれる。本願の局面は、完全には緑色でない様々な葉緑体の発達段階にも適用可能である。
【００１１】
定義
本開示をよりよく理解するため、特記しない限り、本願の全体にわたってそれらの意味を保持すべき以下の定義が、本願を適切な情況に置くために適用される。
【００１２】
異種とは、一般に、別々の遺伝子起源に由来することを意味する。当然、本発明は、異種及び同種のDNAの使用、並びに植物色素体における発現に適しているオペロンを企図する。
【００１３】
発現カセットとは、一般に、当技術分野において、クローニングされた1個又は複数個の遺伝子の転写及び翻訳を可能にするために必要な制御配列を含有しているクローニング・ベクターと理解される。
【００１４】
適切に折り畳まれた、とは、ネイティブの宿主細胞において発現された天然に存在するタンパク質と同様のタンパク質の折り畳まれ方と一致する正常な高次構造的配置へと折り畳まれたタンパク質を意味するものと理解されるべきである。
【００１５】
本願の全体にわたり、植物に言及する場合、本明細書に開示された本発明の局面は、色素体を含有している全ての生物及び植物の色素体の形質転換を企図することが理解されるべきである。明瞭の目的のため、「高等植物」という語句には、一般に、ナス科及び非ナス科の植物、並びに作物、果実、花、野菜、豆、薬用植物の例示的なリスト、並びに当業者が高等植物であると認識するであろうその他の全ての植物が含まれる。
【００１６】
実質的に相同とは、以下の明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用されるように、50％を越えた、最も好ましくは80％を越えた、さらに好ましくは90％、95％、又は99％を越えた、ネイティブのヒト血清アルブミン配列との相同性の程度を意味する。実質的な配列同一性又は実質的な相同性とは、本明細書において使用されるように、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がもう一つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との実質的な構造的又は機能的な等価性を示すことを示すために使用される。実質的な配列同一性又は実質的な相同性を有する配列の間の構造的又は機能的な違いは僅少であろう；即ち、それらは、所望の適用において示されたように機能する配列の能力に影響を与えないであろう。例えば、違いは、様々な種の間のコドン使用頻度の固有の変動によるものであり得る。配列の長さ又は構造が異なっていたとしても、2個以上の異なる配列の間に有意な量の配列のオーバラップもしくは類似性が存在する場合、又は異なる配列が類似した物理的特徴を示す場合、構造的な違いは僅少であると見なされる。そのような特徴には、例えば、発現を維持し、かつタンパク質をネイティブの高次構造的状態へと適切に折り畳む能力、画定された条件の下でハイブリダイズする能力、又は明確な免疫学的交差反応性、類似した生物薬剤学的活性を示す能力等が含まれる。これらの特徴は、各々、既知の方法を使用して、熟練した実務者によって容易に決定され得る。
【００１７】
非緑色色素体とは、一般に、緑色でない任意の色素体をさす。そのような色素体の例には、果実、野菜、及び花に存在する有色体；ジャガイモのような塊茎に存在するアミロプラスト；高等植物の根にある原色素体；白色体及び（暗所で発現する）エチオプラスト、並びに緑色でない様々な葉緑体の発達段階が含まれる。さらに、非緑色の植物部分及び植物細胞は、当技術分野においてよく特徴決定され理解されている。
【００１８】
スペーサー領域とは、当技術分野において、2個の遺伝子間の領域と理解される。植物の葉緑体ゲノムは、高度に保存されたヌクレオチド配列を有するスペーサー領域を含有している。これらのスペーサー領域のヌクレオチド配列の高度に保存された性質のため、葉緑体ゲノムは、異なる植物又は個々の作物種のための個々のベクターを構築する必要のない、多様な植物種の葉緑体を形質転換するためのベクターの構築にとって理想的なスペーサー領域である。機能性遺伝子に隣接する配列が「スペーサー領域」と呼ばれることが周知であることは、当技術分野においてよく理解されている。スペーサー領域の特別な特色は、出願日が1998年5月15日であり、タイトルが「発現ベクターの普遍的な色素体組み込み、形質転換された植物、及びそれらの産物（UNIVERSAL CHLOROPLAST INTEGRATION OF EXPRESSION VECTORS,TRANSFORMED PLANTS AND PRODUCTS THEREOF）」である本出願人らの出願第09/079,640号に明確に記載されている。上記出願第09/079,640号は、参照として本明細書に組み入れられる。高等植物葉緑体ゲノム内に少なくとも60個の転写的に活性なスペーサー領域が存在することは、周知であった（Sugita,M.、Sugiura.M.、「Regulation of Gene Expression in Chloroplasts of Higher Plants」、Plant Mol.Biol.,32：315-326,1996）。特に、スギタ（Sugita）らは、文献の表IIに見られるように、転写単位と呼ばれる60個の転写的に活性なスペーサー領域を報告した。転写的に活性なスペーサー領域は既知であるため、本出願人らの米国特許出願第09/079,640号に記載されたようなユニバーサル・ベクターは、多様な高等植物葉緑体ゲノム内に含有されている同定されたスペーサー領域において使用され得る。スギタらにおける教示を利用することにより、遺伝子間スペーサー領域は、色素体ゲノム内に容易に位置付けられる。従って、これは、当業者が、psbA、psbAの5'非翻訳領域（UTR）、及び目的のタンパク質をコードする遺伝子を含有しているユニバーサル・ベクターを、スギタらによって同定された高等植物に見出されるスペーサー領域へと挿入するために、本出願人らの米国特許出願第09/079,640号において教示された方法を使用することを可能にする。上記の出願及び文献は、参照として組み入れられる。
【００１９】
選抜可能マーカーは、所望の植物細胞を選抜する手段を提供し、色素体形質転換のためのベクターは、典型的には、選抜可能マーカー遺伝子の発現を提供する構築物を含有している。マーカー遺伝子は、選抜物質、即ち、抗生物質、除草剤による天然の阻害に抵抗するか、それらを減弱化もしくは不活性化するポリペプチド、又はベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼのようなアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（参照として本明細書に完全に組み入れられる2001年4月18日出願の本出願人らの出願第09/807,722号に記載）を発現する植物が発現可能なDNA配列である。又は、選抜可能マーカー遺伝子は、他の何らかの可視に反応性の応答を提供し得る、即ち、植物もしくは植物細胞に直接適用された又は植物もしくは植物細胞の増殖培地中に存在する何らかの物質の存在下において、選抜可能マーカー遺伝子を発現していない植物又は植物細胞に対して示差的な外観又は増殖パターンを引き起こし得る。
【００２０】
いずれの場合にも、そのような選抜可能マーカー遺伝子を含有している植物又は植物細胞は、同定の目的のための示差的な表現型を有するであろう、即ち、それらは非形質転換細胞から区別可能であろう。特徴的な表現型は、構築物を含有している細胞、細胞群、組織、器官、植物部分、又は植物全体の同定を可能にする。マーカー表現型の検出は、マーカー遺伝子と連結された第二の遺伝子を有する細胞の選抜を可能にする。
【００２１】
色素体構築物を含有している植物細胞の同定のためのそのようなマーカーの使用は、文献に記載されている。下記の例においては、細菌aadA遺伝子がマーカーとして発現される。aadA遺伝子の発現は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を賦与し、従ってこのマーカーを発現している植物細胞の同定を可能にする。aadA遺伝子産物は、選抜可能マーカー遺伝子産物を含む葉緑体を有する細胞の継続的な増殖及び緑化を可能にする。植物色素体において機能することが示されている様々な色素体プロモーター及び細菌プロモーターを含む、多数の付加的なプロモーター領域も、選抜可能マーカー遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。
【００２２】
逆方向反復領域（Inverted Repeat Regions）は、（IRA及びIRBとして既知の）色素体ゲノムの逆方向反復領域に存在する相同性の領域であり、形質転換された色素体1個当たり2コピーの導入遺伝子が予想される。相同性の領域が、色素体ゲノムの逆方向反復領域外に存在する場合には、形質転換された色素体1個当たり1コピーの導入遺伝子が予想される。
【００２３】
構造的等価物とは、一般に、天然細胞において発現されたネイティブ・タンパク質と同様の高次構造を維持しているタンパク質を意味するものと理解されるべきである。
【００２４】
ベクター
本願は、特に色素体形質転換のための、色素体形質転換が可能なベクターの使用を企図する。そのようなベクターには、米国特許第5,693,507号及び米国特許第5,932,479号においてダニエル（Daniel）により同定されたpUC、pBR322、pBLUESCRIPT、pGEM、及びその他全てのような色素体発現ベクターが含まれる。隣接配列が葉緑体ゲノムの装飾された反復配列（embroidered repeat）の外部に位置しているベクターも含まれる。これらの出版物及び特許は、個々の出版物又は特許が各々特別かつ個々に参照として組み入れられると示されるように、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２５】
ユニバーサル・ベクターは、1999年3月4日に公開された国際公開公報第99/10513号、及び1998年5月15日出願の出願第09/079,640号（これらの参照は、いずれも、完全に組み入れられる）に記載されている。
【００２６】
葉緑体形質転換のため当研究室において開発された基本pLDベクターが使用された（Daniellら、1998；Daniellら、2001b；De Cosaら、2001；Gudaら、2000；Kotaら、1999）。葉緑体における高レベルの外来タンパク質発現（tspの3〜21％）が、SD 5'配列を使用して、異なるタンパク質に関して示された（Daniellら、2001b；DeGrayら、2001；Kotaら、1999）。
【００２７】
本明細書に記載されたベクターは例示的な例であり、米国特許出願第09/079,640号に記載されたような異なるプロモーター、米国特許出願第09/807,722号に記載されたもののような異なる選抜マーカー、及び多様な植物色素体ゲノムへの組み込みに適している異なる隣接配列を用いてベクターが構築され得ることに注意されたい。
【００２８】
色素体ゲノムを形質転換するための一般的な方法論
この例示的な例は、本出願人らの発明を実施するために必要な工程の全てを一般に示す。当然、当技術分野において既知であるその他の適当な方法が、代用されるか、又は本明細書に記載された例の方法論を補足するために使用されてもよい。
【００２９】
植物からのゲノムDNAの単離
乳鉢及び乳棒、液体窒素、新鮮な濃緑色の葉。DNeasyプラント・ミニ・キット（DNeasy Plant Mini Kit）（QIAGEN Inc.）。
【００３０】
葉緑体隣接配列のPCR増幅
PCR反応のための材料：ゲノムDNA（50〜100ng/μl）、dNTP、10×pfu緩衝液、フォワードプライマー、リバースプライマー、オートクレーブ処理済み蒸留H2O、及びターボ（Turbo）pfu DNAポリメラーゼ。
【００３１】
ベクター構築
1．プラスミドpUC19又はpBlueScript SK（+/-）。
2．種特異的なPCR増幅された葉緑体隣接配列DNA。
3．色素体において機能性のプロモーター、葉緑体遺伝子の5'UTR、選抜可能マーカー遺伝子、目的の遺伝子、及び葉緑体3'UTR。
4．制限酵素及び緩衝液。
5．平滑末端を形成させるための3'突出部を除去するためのT4 DNAポリメラーゼ、及び平滑末端を形成させるための5'突出部のフィルイン（fill-in）、又はクレノウ・ラージ断片（平滑末端を形成させるための5'突出部のフィルイン）、付着末端の脱リン酸のためのアルカリホスファターゼ、ホスホジエステル結合を形成させるためのDNAリガーゼ、及び適当な緩衝液。
6．異なる温度に設定された水浴又はインキュベーター。
【００３２】
バイオリスティック（biolistics）の調製
1．オーブンで乾燥させたオートクレーブ処理済みワットマン（Whatman）ろ紙＃1（直径55mm）。
2．100％エタノール。
3．ボックス内のオートクレーブ処理されたチップ、アルミホイルに包まれたオートクレーブ処理済みキムワイプ（kimwipes tissues）。
4．50％グリセロール中、-20℃で保管された無菌金粒子（注1及び2参照）。
5．100％エタノールへの浸漬により滅菌された無菌のラプチャー・ディスク（rupture discs）（1100psi）及びマクロキャリアー（macrocarriers）。
6．オートクレーブ処理済みのスチール・マクロキャリアー・ホルダー及びストッピング・スクリーン。
7．新鮮に調製された2.5mM CaCl2：1.84gを計量し、5mL H2Oに溶解させ、0.2μmフィルターで濾過滅菌する。
8．0.1Mスペルミジン（高度に吸湿性）：1Mスペルミジン・ストックを10×に希釈し、1.5mLエッペンドルフ・チューブに100μLずつ分注し、-20℃で保管する。単回使用後に各チューブを廃棄する。
【００３３】
植物組織培養のための培地調製
2．5．1．タバコ
1000ml用の培地：4.3g MS塩（INVITROGEN INC.）、H2O（分子生物学等級）、100mg/Lミオイノシトール、lmg/LチアミンHCl、シュート誘導のための3％ショ糖及び根誘導のための2％ショ糖、1mg/L 6-ベンジル・アミノプリン（BAP；1mg/mLストックから1mLを使用）、0.1mg/Lインドール-3-酢酸（1mg/mL IAAストックから0.1mLを使用）、根誘導のための1mg/Lインドール-3-酪酸（lmg/mL IBAストックから1mLを使用）。オートクレーブ処理された培地に、それが45℃〜50℃に冷却された時点で、500mg/Lスペクチノマイシンを添加する（100mg/mLストックから5mLの濾過滅菌されたスペクチノマイシンを使用）。
【００３４】
可食作物
ジャガイモ
1000mL用の培地：4.3g MS塩、B5ビタミン（1gミオイノシトール、10mgニコチン酸、10mgピリドキシンHCl、100mgチアミンHClを溶解させることにより100mL H2Oで100×溶液を作成；10mLを使用し、残りの溶液は4℃で保管）、5mg/lゼアチン・リボシド（1mg/mL ZRストックから0.5mLを使用）、0.1mg/l α-ナフタレン酢酸（1mg/mL NAAストックから0.1mLを使用）、40〜500mg/Lスペクチノマイシン。
【００３５】
トマト
1000mL用の培地：4.3g MS塩、B5ビタミン（lO×ストックから10mL）、0.2mg/lインドール-3-酢酸（1mg/mL IAAストックから0.2mLを使用）、3mg/l 6-ベンジルアミノプリン（1mg/mL BAPストックから3mLを使用）。300又は500mg/Lスペクチノマイシン。
【００３６】
全ての植物生長培地に関して、1N KOH又は1N NaOHでpH5.8に調整し、6g/lフィタゲル（phytagel）（Sigma）を添加した後、121℃で20分間オートクレーブ処理する。BAP、IAA、IBA、NAA、ZRのlmg/mLストックの調製のためには、それぞれ：10mgの粉末を計量し、まず1滴又は2滴の1N NaOHに溶解させ、最終容量を10mLにし；全ての植物生長制御剤を1〜2ヶ月間、4℃で保管する）。
【００３７】
トランスジェニック植物の分子的分析
タバコ葉緑体への遺伝子組み込みに関するPCR分析
50μL用のPCR反応：1.0μlゲノムDNA（50〜100ng/μl）、1.5μl dNTP（ストック10mM）、5.0μl（10×PCR緩衝液）、1.5μlフォワードプライマー（ネイティブ葉緑体ゲノム上に対合（land）；ストック10μM）、1.5μlリバースプライマー（導入遺伝子上に対合；ストック10μM）、39.0μlオートクレーブ処理済み蒸留H2O、及び0.5μl Taq DNAポリメラーゼ。
【００３８】
サザンブロットによるホモプラスミーの分析
1．脱プリン溶液：0.25N HCl（12.1N HCl；Fisher Scientific USAから0.4mL HClを使用、蒸留H2Oで最終容量500mLにする）。
2．トランスファー緩衝液：0.4N NaOH、1M NaCl（16g NaOH及び58.4g NaClを計量し、蒸留H2Oに溶解させ最終容量を1000mLにする）。
3．20×SSC：3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム三ナトリウム塩（sodium citrate trisodium salt）（175.3g NaCl、88.2g Na3C6H507・2H2O 900mL H2Oを計量し、1N HClを使用してpH7.0に調整し、蒸留H2Oで最終容量を1000mLにし、オートクレーブ処理する）。
4．2×SSC：180mLの蒸留H2Oに20mLの20×SSCを添加する。
【００３９】
ウェスタンブロットによるタンパク質分析
1．アクリルアミド／ビス：4℃で保管されたFischer（USA）からの既製品。
2．10％SDS：10g SDSを90mL脱イオン水に溶解させ、容量を100mLにし、室温で保管する。
3．分離用ゲル緩衝液：1.5MトリスHCl（80mLの水に27.23gのトリス塩基を添加し、6N HClでpH8.8に調整し、最終容量を150mLにする。オートクレーブ処理後4℃で保管する）。
4．濃縮用ゲル緩衝液：0.5MトリスHCl（60mLの水に6.0gのトリス塩基を添加する。6N HClでpH6.8に調整する。容量を100mLにする。オートクレーブ処理後4℃で保管する）。
5．試料緩衝液（SDS還元緩衝液）：3.55mLの水に、1.25mL 0.5MトリスHCl（pH6.8）、2.5mLグリセロール、0.2mL（10％SDS）、2.0mL（0.5％ブロモフェノール・ブルー）を添加する。室温で保管する。使用前に950μLの試料緩衝液に50μLのβ-メルカプトエタノール（βME）を添加する。
6．10×ランニング緩衝液（pH8.3）：30.3gトリス塩基、144.0gグリシン、及び10.0g SDSを〜700mLの水に溶解させる（溶解しない場合にはさらに水を添加する）。容量を1Lにし、4℃で保管する。
7．10×PBS：80g NaCl、2g KC1、26.8g Na2HP04・7H2O（又は14.4g Na2HP04）、2.4g KH2PO4を800mLの水中に計量する。HClでpHを7.4に調整し、容量を1Lにする。オートクレーブ処理後、室温で保管する。
8．20％APS：1mLの水に200mgの過硫酸アンモニウムを溶解させる（2週間毎に新鮮なものを作成）。
9．1500mL用のトランスファー緩衝液：900mLの水に300mL 10×ランニング緩衝液、300mLメタノール、0.15g SDSを添加し、容量を1Lにする。
【００４０】
植物抽出緩衝液
2005532069.tif 000004
【００４１】
使用直前にPMSFを添加する（PMSF結晶を溶解させるためボルテックス処理する）。
【００４２】
PMSF（フェニルメチル・スルホニル・フロリド）：ボルテックス処理により17.4mgの粉末PMSFを1mLのメタノールに溶解させ、最大1ヶ月間、-20℃で保管する。
【００４３】
方法
植物からのゲノムDNAの単離
供給元の指示に従い、DNeasyプラント（Plant）キット（QIAGEN Inc.）を使用して、新鮮な緑色の葉からゲノムDNAを抽出する。
【００４４】
葉緑体隣接配列の増幅
特定の植物種の葉緑体DNA又はゲノムDNAからの種特異的隣接配列は、タバコ葉緑体ゲノムの既知の高度に保存された配列を使用して設計されたプライマー・セットを使用したPCRの補助により増幅される。
【００４５】
PCR反応を実行するための条件：PCRには三つの主要な工程が存在し、それは30〜40サイクル繰り返される。（1）94℃における変性：二本鎖葉緑体DNAを分離させるため。（2）54〜64℃におけるアニーリング：プライマーが水素結合の形成により一本鎖DNAに結合し、DNAポリメラーゼがテンプレートのコピーを開始する。（3）72℃における伸張：DNAポリメラーゼが、72℃で、プライマーと強く水素結合を形成するテンプレートを伸長させる。ミスマッチ・プライマーは強い水素結合を形成せず、従って、これらの温度は全てDNA配列相同性に基づき変動し得る。テンプレートに相補的な塩基が、プライマーの3'側にカップリングされる。ポリメラーゼが、3'から5'への方向でテンプレートを読みながら、5'から3'へとdNTPを付加し、テンプレートに相補的な塩基が付加される。
【００４６】
葉緑体形質転換ベクター
左及び右の隣接部は、導入遺伝子の安定的組み込みのための相同的組み換え部位として役立つ葉緑体ゲノム内の領域である。強力なプロモーター並びに5'UTR及び3'UTRが、葉緑体における導入遺伝子の効率的な転写及び翻訳に必要である。多重遺伝子発現に関しては、単一のプロモーターがオペロンの転写を制御してもよく、個々のリボソーム結合部位は各コーディング配列の上流に操作されなければならない（2）（図10）。以下の工程がベクター構築において使用される：
1．タバコ葉緑体ゲノムの既知の配列（葉緑体の16S〜23S領域）に基づき設計されたプライマーによる色素体の隣接配列の増幅。
2．（マルチプル・クローニング部位を排除するため）PvuII制限酵素で消化され、（クローニング・ベクターの再環状化を防止するため）50℃で5分間アルカリホスファターゼ（CIP）の補助により脱リンされたpUC19プラスミドへと葉緑体ゲノムの隣接配列を含有しているPCR産物を挿入する。68℃で10分間CIP酵素を不活化する。
【００４７】
（T4 DNAポリメラーゼ又はクレノウ・フィリング（filling）の補助により平滑末端化された）葉緑体形質転換カセットを、現在までに調査された全ての高等植物に保存されているスペーサー領域内の非反復PvuII部位で消化されたクローニング・ベクターへとクローニングする。
【００４８】
微粒子銃（particle gun）を介した外来遺伝子の葉緑体への送達
これは、導入遺伝子を色素体へ送達するための最も成功している単純な技術であり、バイオリスティック（Biolistic）PDS-1000/He微粒子送達システム（Particle Delivery System）（18、19）と呼ばれている。この技術は、多様な植物種において外来DNAの標的組織への送達に成功していることが立証されており、導入遺伝子の組み込みは、タバコ（2）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）（20）、ジャガイモ（21）、トマト（25）の葉緑体ゲノムにおいて達成されており、コムギ（22）、ニンジン、キンセンカ、及びアカトウガラシ（23）においては一過性の発現が達成されている（注5参照）。
【００４９】
金粒子懸濁物の調製
1．1mLの100％エタノールに50〜60mgの金粒子を懸濁させ、2分間ボルテックス処理する。
2．（卓上微量遠心分離機を使用して）最大速度〜10,000×gで3分間スピンする。
3．上清を廃棄する。
4．lmlの新鮮な70％エタノールを添加し、1分間ボルテックス処理する。
5．室温で15分間インキュベートし、断続的に振とうする。
6．10,000×gで2分間スピンする。
7．上清を廃棄し、1mlの無菌蒸留H2Oを添加し、l分間ボルテックス処理し、室温で1分間放置し、10,000×gで2分間スピンする。
8．上記のH2Oでの洗浄過程（工程7）を3回繰り返す。
9．金ペレットを1mLの50％グリセロールに再懸濁させ、ストックを-20℃のフリーザーで保管する。
【００５０】
五つの試料のための金粒子への葉緑体ベクターの沈殿
1．1分間のボルテックス処理後、1.5mLチューブに50μlの金粒子をとる。
2．10μlのDNA（約1μg/μlプラスミドDNA）を添加し、30秒間混合物をボルテックス処理する。
3．50μlの2.5M CaCl2を添加し、30秒間混合物をボルテックス処理する。
4．20μlの0.1Mスペルミジンを添加し、4℃で20分間混合物をボルテックス処理する。
【００５１】
金粒子上にコーティングされた葉緑体ベクターの洗浄
1．200μlの100％エタノールを添加し、30秒間ボルテックス処理する。
2．3000×gで40秒間スピンする。
3．エタノール上清を流し出す。
4．エタノール洗浄を5回繰り返す。
5．最後の工程において、エタノールを注意深く流し出し、35〜40μlのエタノール（100％）を添加する。
【００５２】
マクロキャリアーの調製
1．100％エタノールへの15分間の浸漬によりマクロキャリアーを滅菌し、空気乾燥させた後、プラスチック・キャップの補助により無菌のスチール・リング・ホルダーにそれらを挿入する。
2．金-プラスミドDNA懸濁物をボルテックス処理し、マクロキャリアーの中心に8〜10μlをピペットで移し、空気乾燥させる。
【００５３】
試料の打ち込みのための遺伝子銃のセットアップ
1．微細なティッシュペーパーを使用して、100％エタノールでガン・チャンバー及びホルダーを拭く（ドアはアルコールで拭かない）。
2．真空ポンプを作動させる。
3．ヘリウム・ガス・タンクのバルブ（ヘリウム圧力制御装置）を作動させる（左回り）。
4．調整ハンドルを使用して、所望のラプチャー・ディスク圧力より〜200から250psi高くゲージ・バルブ（アジャスタブル・バルブ）を調節する（右回り）。
5．遺伝子銃を作動させる。
6．（5分間の100％エタノールへの浸漬により滅菌された）ラプチャー・ディスクをラプチャーディスク保持キャップに置き、ガス加速チューブへときつくねじ込む。
7．マクロキャリアー・ランチ・アセンブリーにストッピング・スクリーンを置き、その上に、葉緑体ベクターを含む金粒子を含むマクロキャリアーをスクリーンに対して下向きに置く。マクロキャリアー・カバーリッドでアセンブリーをねじ留め、ガン・チャンバーへ挿入する。
8．抗生物質を含有していない培地に浸されたろ紙（ワットマンNo.1）の上に打ち込むべき完全な葉又は外植片を置く。ターゲット・プレート・シェルフの上に試料プレートを置き、ガン・チャンバーへ挿入し、ボンバーメント・チャンバー・ドアを閉じる。
9．真空計ディスプレイに圧力（最大28インチHg）を構築するためVacスイッチを押す。同じスイッチをホールド・ポイントに下げ、破裂したディスクの爆発音が聞こえるまで、ファイヤー（Fire）スイッチを押す。
10．真空を放出させるためベント（Vent）スイッチを押し、試料を除去するためチャンバーを開ける。
11．ヘリウム・ガス・シリンダー上のメイン・バルブ（ヘリウム圧力制御装置）を閉じることにより、システムをシャット・ダウンする。遺伝子銃チャンバー内にある程度の真空を作出し、両方の圧力計がゼロ読み取りを示すまで時々ファイヤー・スイッチを使用して維持する。真空圧を放出させ、遺伝子銃及び真空ポンプを切る。
12．打ち込まれた試料プレートを、暗所で（即ち、アルミホイルで覆い）培養室で2日間インキュベートし、3日目に外植片を適当な切片へと切り、選抜培地上に置く。
【００５４】
植物組織培養及び葉緑体形質転換
タバコ葉緑体形質転換
タバコ（Nicotiana tabacum cv.Petit Havana）のための高度に効率的かつ再現可能なプロトコルが確立されている（Daniell,H.（1997）Methods in Mol.Biol.Recombinant gene expression protocols.62,463-489）。
1．4週齢濃緑色タバコ葉の背軸側（下側）に葉緑体ベクターを打ち込み、無選抜培地で2日間暗所で葉をインキュベートする。
2．3日目に、打ち込まれた葉外植片を小さな正方形切片（5mm）へと切り、選抜剤としての500mg/lスペクチノマイシンと共にMS塩、lmg/lチアミンHCl、100mg/lミオイノシトール、3％ショ糖、lmg/l BAP、及び0.1mg/l IAAを含有している選抜培地に背軸面を向けて外植片を置く。
3．トランスジェニック・シュートが、形質転換の3〜5週間後に出現するはずである。シュート葉を再び小さな正方形の外植片（2mm）に切り、ホモプラスミーを達成するため、新鮮な培地上での2回目の選抜に供する。
4．500mg/lスペクチノマイシンと共に、MS塩、lmg/lチアミンHCl、100mg/lミオイノシトール、2％ショ糖、及びlmg/l IBAを含有している発根培地上で（導入遺伝子組み込みに関してPCRにより確認された）トランスジェニック・シュートを再生させる。
5．高湿度下のポットへトランスジェニック植物を移し、さらなる生長及び特徴決定のため、温室又はグロース・チャンバーにそれらを移動させる。
【００５５】
可食作物の色素体形質転換
ある植物種からの葉緑体DNAを（未知の配列の）もう一つの種を形質転換するために使用するためのユニバーサル・ベクターの概念は、ダニエル（Daniell）のグループによって開発された（8）。この概念を使用して、下記のようにして、トマト及びジャガイモの両方の葉緑体ゲノムが形質転換された。
【００５６】
ジャガイモ葉緑体形質転換
タバコ葉緑体ベクターを使用して、ジャガイモ栽培品種FL1607の葉組織が、バイオリスティックを介して形質転換され、安定的なトランスジェニック植物が、選抜aadA遺伝子マーカー及び視覚的な緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子を使用して回収された（21）。
1．ジャガイモ葉（3〜4週齢）に打ち込みをし、無選抜培地上で2日間暗所でインキュベートする。
2．3日目、小さな正方形切片（5mm）へと葉を切り取り、B5ビタミン、5mg/l ZR、0.1 NAA、及び3％ショ糖を含有しているMS培地上に置く。散光下での2週間毎の継代培養の後、スペクチノマイシン選抜圧を徐々に増加させる（40〜400mg/l）。
3．B5ビタミン、O.O1mg/L NAA、O.1mg/L GA3、2％ショ糖、及び40〜400mg/lスペクチノマイシンを含有しているMS培地上でトランスジェニック・ジャガイモ・カルスからシュートを再生させる。
4．根誘導のため、B5ビタミン、2％ショ糖、及び40〜400mg/lスペクチノマイシンを含有している基本MS培地にトランスジェニック・シュートを移す。トランスジェニック小植物をグロース・チャンバーに移す。
【００５７】
トマト葉緑体形質転換
タバコ葉緑体ベクターを使用して、極めて低い光度を使用して、トランスジェニック色素体を有するトマト（Lycopersicon esculentum cv.IAC Santa Clara）植物が生成させられた（25）。
1．4週齢のトマト葉に打ち込みをし、無選抜培地上で2日間暗所でインキュベートする。
2．打ち込まれた葉を小さな切片へと切り取り、0.2mg/L IAA、3mg/L BAP、3％ショ糖、及び300mg/Lスペクチノマイシンを含有しているシュート誘導培地上に置く。
3．シュート誘導のない3〜4ヶ月の期間の後、スペクチノマイシン耐性初代カルスを選抜する。
4．0.2mg/L IAA、2mg/L ZR、2％ショ糖、及び300mg/Lスペクチノマイシンを含有しているシュート誘導培地にトランスジェニック・カルスを移した後、約4週間以内にシュートを再生させ、次いで無ホルモン培地上で発根させる。再生したトランスジェニック植物を温室に移す。
【００５８】
トランスジェニック植物の分子的分析
トランスジェニック・シュートのPCRスクリーニング
この方法は、変異体と核トランスジェニック植物と葉緑体トランスジェニック植物とを区別するために使用されている。組み込み点に隣接してネイティブ葉緑体ゲノム上に一つのプライマーを対合させ、aadA遺伝子上に第二のプライマーを対合させることにより（26。適当なサイズのPCR産物が、葉緑体形質転換体において生成するはずである。このPCR産物は、核トランスジェニック植物又は変異体では入手され得ないため、核組み込み又は変異体の可能性が排除されるはずである。
1）供給元の指示に従うことによりDNeasyプラント・キット（QIAGEN Inc.）を使用して、トランスジェニック葉組織からゲノムDNAを抽出する。より少量のトランスジェニック組織の場合には、緩衝液の容量を適当に減少させてもよい。
2）隣接配列の増幅のための前記と同じ条件に従い、適当なプライマーを使用して、Taq DNAポリメラーゼ（QIAGEN Inc.）を用いてPCR反応を実行する。
【００５９】
サザンブロットによるホモプラスミーの分析
サザンブロット分析において、適当な制限酵素で消化されたタバコ色素体ゲノムは、隣接領域のみならず導入遺伝子カセットも含んでいるトランスジェニック葉緑体と比較して、より小さな断片（隣接領域のみ）を、野生型植物においては産生するはずである。さらに、トランスジェニック植物におけるホモプラスミーは、トランスジェニック断片のみが観察される場合に達成される。
【００６０】
DNAの膜へのトランスファー
1．（対照として野生型を含む）トランスジェニック試料から適当な制限酵素によりゲノムDNA（〜2から10μg）を消化し、40Vで4時間100mLで5μL EtBr（10mg/mLストックから）を含有している0.8％アガロース・ゲル上で消化されたDNAを泳動させる。
2．15分間0.25N HCl（脱プリン溶液）にゲルを浸し、2回蒸留H2Oで5分間ゲルを濯ぐ。
3．DNAを変性させるため、20分間トランスファー緩衝液にゲルを浸す。
4．トランスファー緩衝液を使用して、一晩、ゲルからナイロン膜（まず水に予め浸し、次いで5分間トランスファー緩衝液に浸す）へDNAをトランスファーする。
5．翌日、各5分間2×SSC緩衝液で2回膜を濯ぎ、ろ紙上で5分間空気乾燥させる。適当な（C3）設定でGSジーンリンカー（GeneLinker）UVチャンバー（Chamber）（Bio-Rad）を使用して、トランスファーDNAを膜に架橋する。
【００６１】
プローブの調製
1．適当な制限酵素で（葉緑体ゲノムの隣接配列を含有している）プラスミドを消化する。
2．95℃で5分間45μL隣接DNA断片（50〜250ng）を変性させ、次いで、2〜3分間氷上に置く。
3．レディ・ツー・ゴー（Ready-To-Go）DNAラベリング・ビーズ（Labeling Beads）（-dCTP）チューブ（Amersham Biosciences,USA）に変性プローブを添加し、チューブを弾くことにより穏やかに混合する。
4．5μLの放射性α32P（dCTP；Amersham Biosciences,USA）をプローブ混合物に添加し、37℃で1時間インキュベートし、プローブクアント（ProbeQuant）G-50マイクロカラム（Micro Columns）（Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA）を使用してプローブをろ過する。
【００６２】
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション
（DNAトランスファー側を溶液に向けて）ブロットをハイブリダイゼーション・ボトルに置き、10mLのクイック・ハイブ（Quik-Hyb）（Stratagene,USA）を添加する。
【００６３】
68℃で1時間インキュベートする。標識されたプローブに100μLの超音波処理されたサケ精子（10mg/mLストック；Stratagene,USA）を添加し、94℃で5分間加熱し、膜及びクイック・ハイブ（Quik-Hyb）溶液を含有しているボトルに添加する。68℃で1時間インキュベートする。
【００６４】
洗浄及びオートラジオグラフィー
1．プローブを含むクイック・ハイブ（Quik-Hyb）溶液を廃棄し、室温で15分間50mL（2×SSC緩衝液及び0.1％SDS）で2回膜を洗浄する。
2．60℃で15分間、50mL（0.1×SSC緩衝液及び0.1％SDS）で2回膜を洗浄する。
3．サラン・ラップで洗浄膜を包み、暗所でブロットをx線フィルムに曝し、現像の準備が整うまで-70℃で放置する。
【００６５】
ウェスタンブロットによる導入遺伝子発現の決定
植物タンパク質の抽出
1．液体窒素中で100mgの葉を破砕し、氷上で200μLの抽出緩衝液を試料に添加する。
2．適当な容量の新鮮に調製された2×試料ローディング緩衝液を、分注された植物抽出物に添加する（50μL β-メルカプトエタノール及び950μL試料ローディング緩衝液を含有しているストックから）。
3．ローディング色素と共に4分間試料を煮沸し、10,000×gで2分間遠心分離し、次いで、直ちに20μLの試料をゲルにロードする。
【００６６】
ゲルの泳動
試料をゲルにロードし、タンパク質に対応するマーカー・バンドが中央にくるまで、100Vで30分間、次いで、150Vで1時間泳動させる。
【００６７】
タンパク質の膜へのトランスファー
30Vで一晩又は65Vで2時間又は100Vで1時間、ミニ・トランスファー・ブロット・モジュール（Mini Transfer Blot Module）を使用してゲルから膜へとタンパク質をトランスファーする。サラン・ラップで包まれた膜は、必要であれば、-20℃で数日間保管され得る。
【００６８】
膜のブロッキング
1．トランスファーの後、水で膜を濯ぎ、PTM（100mL 1×PBS、50μL 0.05％トゥイーン20、及び3g粉乳（3％））中、室温で1時間膜をインキュベートする。
2．15mLのため適当な希釈率で一次抗体を添加し、室温で2時間インキュベートする。各5分間1×PBSで2回膜を洗浄する。
3．20mLのため適切な希釈率で二次抗体を添加する。シェーカー上で室温で1.5時間インキュベートする。
4．PT（100ml 1×PBS+50μLトゥイーン20）で15分間、最後に1×PBSで10分間、2回洗浄する。
【００６９】
ブロットのX線フィルムへの曝露
1．1.5mLチューブで750μLの各化学発光溶液（Luminol Enhancer and Stable Peroxide）を混合し、膜に添加し、完全にカバーする。
2．余分な溶液を拭き取り、適当な期間、ブロットをx線フィルムに曝し、フィルムを現像する。
【００７０】
種子の滅菌
1．1mL 70％エタノールを含む微量遠心分離チューブで少量の種子を1分間ボルテックス処理する。短時間のスピンの後、エタノールを廃棄する。
2．チューブに1mLの殺菌溶液（1.5％漂白剤及び0.1％トゥイーン20）を添加し、15分間断続的にボルテックス処理する。短時間のスピンの後、溶液を廃棄する。
3．無菌蒸留水で3回種子を洗浄する。
4．トランスジェニック葉緑体植物における母性遺伝を決定するため、500μg/mLスペクチノマイシンが補足されたRMOP基本培地を含有しているプレートに、滅菌水を用いて種子をスプレーする。
【００７１】
結果の評価
葉緑体トランスジェニック植物における母性遺伝
葉緑体ゲノムへ組み込まれた導入遺伝子は母性遺伝する。タバコのトランスジェニック種子を、500μg/mLスペクチノマイシンを含有しているRMOP基本培地上で発芽させた場合、これは明白である。トランスジェニック実生においては選抜剤の有害効果は存在しないはずであるが、形質転換されていない実生は影響を受けるであろう。
【００７２】
CTB-GM1-ガングリオシド結合ELISAアッセイ
1．モノシアロガングリオシド-GM1｛重炭酸緩衝液（15mM Na2C03、35mM NaHCO3、pH9.6）中3.0μg/mL｝でマイクロタイター・プレート（96穴ELISAプレート）をコーティングし、対照として、2〜3ウェルをBSA（重炭酸緩衝液中3.0ug/mL）でコーティングする。
2．4℃で一晩プレートをインキュベートする。
3．1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）を含む0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）により37℃で2時間ウェルをブロッキングする。
4．PBST緩衝液（0.05％トゥイーン20を含有しているPBS）で3回ウェルを洗浄する。
5．PBS中の形質転換植物及び非形質転換植物からの可溶性タンパク質並びに細菌CTBを添加することにより、プレートをインキュベートする。
6．一次抗体（0.5％BSAを含有している0.01M PBSTで1：8000希釈されたウサギ抗コレラ血清）を添加し、37℃で2時間プレートをインキュベートする。
7．PBST緩衝液で3回ウェルを洗浄する。
8．1：50,000希釈された二次抗体（マウス抗ウサギIgG-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートを含む0.5％BSA含有0.01M  PBST）を添加し、37℃で2時間プレートをインキュベートする。
9．シグマ・ファースト（Sigma Fast）pNPP基質でプレートを現像する。3M NaOHを添加することにより、反応を中止させ、405nmでプレート吸光度を読み取る。
【００７３】
マクロファージ溶解アッセイは以下の通りである。
1．CHAPS界面活性剤を含有している抽出緩衝液（4％CHAPS、10mM EDTA、100mM NaCl、200mMトリスHCl、pH8.0、400mMショ糖、14mM β-メルカプトエタノール、2mM PMSF）及びCHAPS界面活性剤を含まないもの200μLを使用して、100mgのトランスジェニック葉から粗抽出物タンパク質を単離する。
2．10,000×gで5分間試料をスピンし、上清及びホモジネートの両方をアッセイに使用する。
3．120μLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；Invitrogen life technologies製）中でインキュベートされた（50％コンフルエンスに増殖した）マクロファージ細胞RAW264.7を96穴プレートへ播種する。
4．ウェルから培地を吸引し、250ng/mLのタンパク質を含有している100μLの培地を粗葉抽出物に添加する。
5．対照プレートには、植物材料及び緩衝液の毒性を試験するため、葉画分を含まないDMEMのみを添加する。
6．もう一つのプレートにおいては、最上列が1：14希釈率の植物抽出物を有するよう、2倍段階希釈された植物試料からの40μLの希釈物をRAW 264.7細胞へ添加する。
7．細胞死を査定するため、5時間後、（1×PBSに溶解させ濾過滅菌したストック5mg/ml MTTから）20□LのMTT 3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；Sigma）を、細胞を含有している各ウェルに添加する。
8．37℃で5時間プレートをインキュベートする。針及び注射器を用いて培地を除去する。各ウェルに200□LのDMSOを添加し、結晶を溶解させるためピペットを上下させる。プレート・リーダーに移し、550nmで吸光度を測定する。
【００７４】
活性PAは、上清画分及びホモジネート画分の両方に見出された。しかしながら、CHAPS界面活性剤を含む抽出緩衝液が使用された場合には、最大マクロファージ溶解活性は上清に認められた。
【００７５】
可食ワクチンとしてのコレラ毒素（CTB）抗原
葉緑体トランスジェニック植物は、ワクチンの作製にとって理想的である。熱に対して不安定な大腸菌エンテロトキシンの毒素Bサブユニット（LTB）、又はビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）のコレラ毒素（CTB）は、ワクチン抗原のための可能性のある候補と見なされている。未修飾ネイティブCTB遺伝子の葉緑体ゲノムへの組み込みは、トランスジェニック葉緑体における高レベルのCTB蓄積を証明した（Daniell,H.ら（2001）.J.Mol.Biol.311,1001-1009）。この新たなアプローチは、ネイティブCTB遺伝子の高レベルの発現を可能にするのみならず、多くのワクチン抗原の機能にとって重大な四次構造の役割のため不可欠である多量体タンパク質の葉緑体における適切な組み立てをも可能にした。トランスジェニック植物におけるCTBの発現レベルは、3.5％〜4.1％tspであり、タンパク質の機能性は、精製細菌抗原に類似している植物抽出物中の組み立てられたペンタマーの結合凝集体により証明され、結合アッセイは、葉緑体によって合成されたCTB及び細菌CTBの両方が、腸膜GM1-ガングリオシド受容体に結合することを確認し、このことから、トランスジェニック葉緑体におけるCTBペンタマーの正確な折り畳み及びジスルフィド結合形成が確認された（図11）。
【００７６】
さらに、本発明は、（前記のような）CTB、炭疽、ペスト、及び2002年12月26日出願のPCT/US02/41503号に記載されたものを含む当技術分野において既知であり記載されているその他の全てのワクチンのような、色素体を介して発現された可食ワクチンの例を企図する。上記出願は、参照として完全に組み入れられる。本発明の局面は、さらに、経口送達のための非緑色植物細胞で発現されるであろうインターフェロン、IGF-1、インスリンのようなその他の治療用タンパク質の発現を企図する。そのような治療用タンパク質の例示的な記載は、植物色素体における治療用タンパク質の発現が記載されている、米国仮出願第60/393,439号；第60/393,428号；第60/393,451号；第60/393,649号；及び第60/393,438号に基づく優先権を主張しているPCT出願に見出され得る。
【００７７】
ワクチンの経口送達、及び抗生物質選抜可能マーカーを使用しないトランスジェニック植物の選抜
ホウレンソウ由来のベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（BADH）遺伝子は、タバコの葉緑体ゲノムを形質転換するため、選抜可能なマーカーとして使用されている（Daniell,H.ら、（2001）Curr.Genet.39,109-116）。トランスジェニック植物は、ベタイン・アルデヒド（BA）を含有している培地上で選抜された。BADH活性を保持しているトランスジェニック葉緑体は、毒性BAを有益なグリシン・ベタイン（GB）へと変換する。aadA遺伝子及びBADH遺伝子の両方を含有している構築物を打ち込まれたタバコ葉は、シュート再生効率の極めて劇的な違いを示した。形質転換及び再生はBA選抜の方が25％効率的であり、植物繁殖はスペクチノマイシンと比較してBAの方が迅速であった。葉緑体トランスジェニック植物は、種々の発達段階において、非形質転換対照より15〜18倍高いBADH活性を示した。高いBADHレベルの発現、及びその結果としてのグリシン・ベタインの蓄積は、多面発現効果をもたらさず、トランスジェニック植物は、形態学的に正常であり、非形質転換対照植物と同様に種子を与えた。
【００７８】
トランスジェニック葉緑体におけるヒト治療用タンパク質の作製
ヒト血清アルブミン（HSA）タンパク質。
ヒト血清アルブミン（HSA）は、血中の全タンパク質の60％を占め、多数のヒト治療において広範に使用されている。HSAを発現する葉緑体トランスジェニック植物は、生成させられている（Fernandez-San Millanら、（2003）Plant Bitechnol.J.1,71-79）。葉緑体トランスジェニック植物におけるHSA発現のレベルは、最大11.1％tspまで達成された。トランスジェニック葉緑体におけるHSA封入体の形成は、タンパク質の精製に有利であった。封入体は、遠心分離により沈殿し、単一の遠心分離工程により可溶性画分に存在する細胞タンパク質の大部分から容易に分離された。遠心分離による封入体の精製は、高価なアフィニティー・カラム又はクロマトグラフィ技術の必要を排除し得る。
【００７９】
HSAの精製
1．0.2M NaCl、25mMトリスHCl（pH7.4）、2mM PMSF、及び0.1％トリトンX-100を含有している抽出緩衝液を使用して、形質転換された組織からのHSA封入体を可溶性にする。
2．10,000×gでスピンする。6M Gu-HCl、0.1M βME、及び0.25mMトリスHCl（pH7.4）を含有している緩衝液にペレットを懸濁させる。
3．100mM NaCl、50mMトリスHCl（pH8.5）、及び1mM EDTAを含有している緩衝液で植物抽出物を100倍に希釈する。
4．37％のポリエチレングリコール処理を使用した沈殿によりHSAタンパク質を濃縮する。
5．SDS-PAGEゲルの泳動によりタンパク質画分を分離し、供給元の指示に従い（Bio-Rad,USA）、銀試薬でゲルを染色する。
【００８０】
電子顕微鏡検及び免疫金標識
1．形質転換葉及び非形質転換葉を1〜3mmの正方形に切る。
2．真空で15分間及び4℃で12時間、0.1Mカコジル酸緩衝液pH7.4（2.5％グルタルアルデヒド、2％パラホルムアルデヒド、及び5mM CaCl2）でそれらを固定する。
3．固定の後、0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）で2回試料を濯ぐ。
4．95％までの段階的なエタノール系列を通して固定試料を脱水し、次いで、60℃で24時間LRW樹脂へと移植する。
5．ライカ・ウルトラカット（Leica Ultracut）Tウルトラミクロトームを使用して、極めて薄い切片を切り、切片をニッケル・グリッドへ収集する。
6．残余のアルデヒド基を不活化するため、PBS緩衝液で調製された0.05Mグリシンの中で15分間切片をインキュベートする。
7．グリッドをブロッキング溶液（2％脱脂粉乳を含有しているPBS）の液滴の上に置き、30分間インキュベートする。
8．ヤギ抗ヒト・アルブミン・ポリクローナル抗体（ブロッキング溶液中1：1000〜1：10,000の希釈率範囲）で1時間切片をインキュベートする。
9．ブロッキング溶液で6×各5分間切片を洗浄する。
10．ブロッキング溶液で1：40希釈された10nm金とのウサギ抗ヤギIgG二次抗体コンジュゲートと共に2時間切片をインキュベートする。
11．切片をブロッキング溶液で6×5分間、PBSで3×5分間洗浄し、PBSで希釈された2％グルタルアルデヒドで5分間切片を固定する。
12．固定された切片をPBSで3×各5分間、次いで蒸留水で5×各2分間洗浄する。
13．酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を使用して切片を染色し、60kvの透過型電子顕微鏡下で試料を調査する。
【００８１】
注
1．50％グリセロールに懸濁した金粒子は、-20℃で数ヶ月間保管され得る。スペルミジン・ストックの再凍結及び解凍は回避する；解凍後に一度使用し、残りの溶液は廃棄する。新鮮に調製されたCaCl2溶液を濾過滅菌後に使用する。オートクレーブ処理しない。
2．金へのDNAの沈殿効率及びマクロキャリアーへのDNA-金粒子混合物の展開は、極めて重要である。バイオリスティックを介した高い形質転換効率のためは、アルコール蒸発後に、金粒子の厚いフィルムがマクロキャリアー・ディスク上に出現するべきである。散在した又は不十分な金の沈殿は、形質転換効率を減少させる。
3．一般に、発現カセットの各側の1000bp隣接配列領域が、導入遺伝子の安定的な組み込みを促進するのに適切である。
4．5'非翻訳領域（5'UTR）及び3'非翻訳領域（3'UTR）制御シグナルの使用は、色素体におけるより高レベルの導入遺伝子発現にとって必要である（13）。植物葉緑体における導入遺伝子の発現は、機能性プロモーター、安定なmRNA、効率的なリボソーム結合部位に依存し；効率的な翻訳は5'及び3'の非翻訳領域（UTR）によって決定される。葉緑体形質転換エレメントPrrn、psbA5'UTR、3'UTRは、タバコ葉緑体ゲノムから増幅され得る。
5．2日間の暗所インキュベーションの後の打ち込まれた葉が、1回目の選抜のため小さな正方形切片（5〜7mm）へと切除されるべきであり、再生したトランスジェニック・シュートが、2回目の選抜のため小さな正方形切片（2〜4mm）へと切除されるべきである。
6．タバコ、ジャガイモ、及びトマトの組織培養物の適当な増殖のための植物グロース・チャンバーの温度は、約26〜28℃であるべきである。ジャガイモ及びトマトにおける初期のトランスジェニック・シュート誘導は、散光を必要とする。しかしながら、より高い強度はタバコには有害ではない。
7．形質転換効率は、タバコと比較して、ジャガイモ及びトマト両方の栽培品種で極めて不十分である。
8．タバコ葉緑体ベクターは、他の植物種に使用された場合には、低い形質転換頻度を与える。例えば、ペチュニア葉緑体隣接配列が、タバコ葉緑体ゲノムを形質転換するために使用され（DeGray,G.ら、（2001）,Plant Physiol.127,852-862）、それは極めて低い形質転換効率をもたらした。
【００８２】
散光条件下で、高度に再生中のトマト栽培品種（Microtom）シュートは、トランスジェニック植物のさらなる生長を阻害する早熟の花成を生じる。従って、最初のシュート誘導期の後、シュートは正常な光条件に移動されるべきである。
【００８３】
例示的な実施例1：ニンジン形質転換を介した体細胞胚形成
高レベルの耐塩性（最大500mM NaCl）を示すホモプラスミックなトランスジェニック・ニンジン植物が、体細胞胚形成を介して、ニンジン細胞培養物から急速に再生した。ニンジン葉緑体ゲノムは、厳密に母性遺伝し、植物は、1年目には種子を産生しないため、導入遺伝子流出の完全な封じ込めを提示する。ニンジン細胞は急速に繁殖し、大きなバイオマスがバイオリアクターを使用して作製され；体細胞胚は単細胞に由来し；培養培地上で長期間生存可能であり、封入された胚は、凍結保存及び調節された発芽のための人工種子として使用される；これらの特色は、植物において作成された薬学的タンパク質のための理想的な作製系及びそれらの経口送達を提供する。BADH発現細胞は、それらを非形質転換黄色細胞から区別する、緑色による視覚的な選抜を提供する。有用な形質が、初めて、非タバコ作物において葉緑体ゲノムを介して操作された。これは、非緑色外植片及び体細胞胚形成を使用して達成された最初の色素体形質転換であり、非緑色可食部分における単子葉植物、マメ科植物、野菜、果実作物の形質転換、及び導入遺伝子発現への扉を開くものである。
【００８４】
この実施例は、体細胞胚形成を介して再生される外植片として非緑色組織を使用したニンジンの安定的かつ高度に効率的な色素体形質転換の最初の報告を提示する。有用な植物形質（耐塩性）が、初めて、葉緑体ゲノムを介して非ナス科作物において発現された。従来は、タバコ葉緑体ゲノムのみが、除草剤に対する抵抗性（Daniellら、1998）、昆虫に対する抵抗性（McBrideら、1995；Kotaら、1999；DeCosaら、2001）、病気に対する抵抗性（DeGrayら、2001）、渇水に対する抵抗性（Leeら、2003）、及び毒性金属のフィトレメディエーション（Ruizら、2003）を賦与するために操作されていた。さらに、BADH酵素の発現は、非トランスジェニック黄色細胞からのトランスジェニック緑色細胞の視覚的な選抜を促進した。世界中で消費されている主要作物として、この報告は、外植片としての非緑色組織の使用及び再生のための体細胞胚形成を必要とする、高等植物種における色素体ゲノムの遺伝子操作のモデルとして役立つはずである。
【００８５】
結果及び考察
ニンジン色素体形質転換ベクターの構築
ニンジン葉緑体ベクターは、相同的組み換えを介した組み込みのため、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域へと発現カセットをターゲティングする。この組み込みの部位は、当研究室から以前に報告されたユニバーサル葉緑体形質転換ベクター（pLD）に類似しているが（Daniellら、1998；Gudaら、2000）、発現カセットの片側の隣接配列のサイズが、相同的組み換えの効率を増強するため2倍にされた。結果として、隣接配列は、〜4kbに増加した。葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-gfp/BADH（図1A）は、（緑色組織及び非緑色組織における発現を促進し、GFP蛍光により形質転換体をスクリーニングするための）遺伝子10 5'UTR/rps16 3'UTRにより制御されたgfp遺伝子、並びに（光により制御される緑色組織における発現を促進するための）psbA 5'及び3'UTRの下で発現されるbadh遺伝子を保有しているニンジン特異的ベクターである。ファージT7遺伝子10に由来する遺伝子10 5'UTRを除き、全ての5'及び3'制御エレメントが、タバコ・ゲノムDNAからPCR増幅された。このカセット中の両導入遺伝子の転写は、核によりコードされたRNAポリメラーゼ及び色素体によりコードされたRNAポリメラーゼの両方のための制御エレメントを含有しており、そのため、緑色組織においても非緑色組織においても転写を促進する全長Prrn 16S rRNAプロモーターによって駆動される。葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-aadA/BADH（図1B）は、それぞれRBS（リボソーム結合部位）/3'psbA UTR及び遺伝子10 5'UTR/rpsl6 3'UTR制御エレメントの制御下で全長16S rRNAプロモーターにより発現が駆動されるaadA遺伝子及びbadh遺伝子を保有している。
【００８６】
さらに、本願において記載されたような色素体ゲノムを形質転換するために、米国特許出願第09/079,640号に記載されたユニバーサル・ベクターが使用され得ることに注意すべきである。
【００８７】
ニンジン色素体の形質転換及び植物再生
ニンジン（Daucus carota L.cv.Half long）の茎セグメントから誘導された黄色の微細な細胞懸濁培養物に、記載されたようにして（Daniell、1997；Kumar及びDaniell、2003）、ニンジン葉緑体ベクターpDD-Dc-gfp/BADH及びpDD-Dc-aadA/BADHを打ち込んだ。pDD-Dc-gfp/BADHベクターで形質転換されたニンジン培養物は、20mMベタイン・アルデヒド（BA）で選抜された場合、共焦点顕微鏡下で観察されるGFPを発現しているカルス及び体細胞胚を産生した（図2A〜C）。GFPを発現している体細胞胚がBA選抜で急速に再生し得ることは全く明白ではあったが、このベクターを使用するためには二つの主要な制限が存在した。BAは非常に高価であり（$2000〜$3000/gm）、このことが、実施され得る実験の数を制限し、badh遺伝子は、発達及び光による制御下にあるpsbAプロモーター及びUTRエレメントにより制御されていた。不運にも、培養されたニンジン細胞は、発達の初期段階においては非緑色であり、従ってbadh発現は最小限に抑えられていた。従って、もう一つの葉緑体ベクターを使用して、ニンジン細胞を形質転換するべく、さらなる努力がなされた。葉緑体ベクターpDD-Dc-aadA/BADHを使用して、異なる濃度（150〜450mg/L）のスペクチノマイシンを含有している固形培地（MSB＋3mg/L 2,4-D、1mg/Lカイネチン）における5回の打ち込みから、2〜3ヶ月以内に7個の独立のトランスジェニック細胞系が回収された。さらに、トランスジェニック・カルスを1ヶ月間350mg/Lスペクチノマイシンに移し、500mg/Lスペクチノマイシンを使用して繁殖させた。全てのトランスジェニック細胞培養物を、26±2℃の温度で100lxの光度下でインキュベートした。トランスジェニック細胞培養物を誘導し繁殖させるため、選抜剤と共に3mg/L 2,4-D及び1mg/Lカイネチンが補足されたMSB培地を、増殖培地として使用した。トランスジェニック培養物を繁殖させるため、それらを2〜3週間毎に固形培地上で継代培養し、散光（50lx）の下で130rpmで液体培地（MSB＋0.1mg/L 2,4-D）において増殖させた。2,4-Dを含まない培地（MSB＋0.2mg/Lカイネチン）は、胚原性カルスを小植物へと変換するための植物再生培地として使用された。（500mg/Lスペクチノマイシンを含有している）基本MSB培地で維持されたトランスジェニック植物を、成熟主根系を誘導するためにポット内の土壌に移し、さらなる特徴決定に使用した。
【００８８】
トランスジェニック・ニンジン細胞の可視の選抜
トランスジェニック・ニンジン及び非トランスジェニック・ニンジンのインビトロ細胞培養研究において、ニンジン細胞が色に基づき区別され得ることに注意することは興味深かった。badh導入遺伝子を保持しているトランスジェニック・ニンジン細胞は常に緑色であり、非トランスジェニック細胞は黄色であった（図3A〜B参照）。トランスジェニック明緑色細胞が真にトランスジェニックであることを試験するため、ヘテロプラスミックな（部分的に形質転換された色素体）ニンジン細胞培養物を選抜なしの増殖培地上に置き、分離させたところ；3〜4週間以内に緑色細胞及び黄色細胞が視覚的に分離された（図3C〜D）。トランスジェニック緑色細胞は導入遺伝子組み込み陽性であることが確認され、黄色細胞は形質転換されていないことが見出された。さらに、細胞を異なる濃度のNaClに曝した場合には、非形質転換細胞の分裂の抑制が可能であった。この可視の選抜系は、直列反復配列（direct repeats）（Iamtham及びDay、2002）を使用した選抜可能抗生物質マーカー遺伝子を排除しつつ、非形質転換細胞から形質転換細胞を区別するために重要であろう。トランスジェニック葉緑体における葉緑素の生合成又は安定性の増強におけるBADH酵素の役割を検討することは、興味深いであろう。
【００８９】
ニンジン色素体への導入遺伝子組み込みの確認
ニンジン葉緑体ベクターpDD-Dc-aadA/BADHは、相同的組み換えにより、色素体ゲノムの16S-23Sスペーサー領域へaadA遺伝子及びbadh遺伝子を組み込む。ニンジン細胞系への導入遺伝子組み込みは、1.6kbのPCR産物を産生する内部プライマー・セット（色素体のtrnI領域に対合する）3P及び（aadA遺伝子に対合する）3Mを使用したPCRにより確認された（図4A）。これは、葉緑体16S rRNA遺伝子の変異により引き起こされた、スペクチノマイシン選抜で入手され得る変異体を排除する。核トランスジェニック細胞系と葉緑体トランスジェニック細胞系とを区別するため（図4B）、16S-Fプライマーをネイティブ葉緑体ゲノム上の組み込み部位の200bp上流に対合させ、1MプライマーをaadA遺伝子に対合させた；これにより、2.5kbサイズのPCR産物が生成した。このPCR産物は核トランスジェニック植物においては入手され得ないため、核組み込みの可能性は排除された。このように、PCR分析は、多数の推定トランスジェニック系の迅速なスクリーニングを可能にし、変異体又は核トランスジェニック系を排除する。
【００９０】
トランスジェニック・ニンジン色素体におけるホモプラスミーの決定
PCRにより確認されたトランスジェニック・ニンジン細胞系を、選抜剤の存在下での数回の選抜のため液体培地で1週間毎に繰り返し継代培養した。異なるトランスジェニック細胞系から発達した、AflIII及びPvuIIで消化された非形質転換ニンジン植物及び形質転換ニンジン植物から単離された全ゲノムDNAを使用して、サザンブロット分析を実施した（図4C）。形質転換ニンジン色素体及び非形質転換ニンジン色素体の両方における16S-rRNA領域（左隣）におけるAflIII制限部位の存在、及び非形質転換色素体のtrnI隣接領域とtrnA隣接領域との間、及びbadh導入遺伝子の中央領域における非反復PvuII部位の存在により、非形質転換系及びトランスジェニック系の両方における予測されたサイズの断片の切り出しが可能であった。ヘテロプラスミー又はホモプラスミーを確認するため、AflIII及びPvuIIで消化されたニンジン植物のゲノムDNAに、4.9kbの放射性DNAプローブをハイブリダイズさせた。このプローブ断片は、AflIII及びPvuIIで消化することにより、葉緑体ベクターpDD-DC-aadA/BADHから単離された；この断片は、葉緑体ベクターの2.4kbのtrnI隣接配列及び2.5kbの導入遺伝子配列を含んでいる（図1B）。選抜剤（350mg/Lスペクチノマイシン）上での液体培地での2回の継代培養の後発達したトランスジェニック植物は、ヘテロプラスミーを示し（図4C、レーン2）、高濃度の選抜剤（500mg/Lスペクチノマイシン）が補足された液体培地での8〜10回の継代培養の後、細胞系から発達した植物は、ホモプラスミーを示した（図4C、レーン3〜8）。
【００９１】
ニンジン細胞、根、及びシュートにおけるBADH酵素活性
記載されたようにして（Daniellら、2001）、形質転換されていない及び形質転換されたニンジン細胞培養物、主根（ニンジン）、及び葉からの粗抽出物において、BADH酵素活性をアッセイした。BADH酵素活性を査定することにより、G-25カラムを使用して脱塩された各試料からのタンパク質の粗抽出物50μgを使用して、ニンジン植物の細胞及び異なる部分においてbadh導入遺伝子の発現を観察した。ベタイン・アルデヒドの存在下で、BADH酵素は、NAD＋をNADHに変換し、その反応速度はNAD＋の還元による340nmにおける吸光度の増加により測定された。トランスジェニック色素体（細胞、主根、及び葉）からの粗抽出物は、ニンジンの非形質転換組織と比較して上昇したレベルのBADH活性を示す（図5A）。より高いBADH活性が、ニンジン植物の葉、主根、及び懸濁培養物中のトランスジェニック細胞に観察され、このことから、全長16SプロモーターPrrn及び遺伝子10 UTRが、様々な組織において導入遺伝子を発現させるのに高度に適していることが確認された。これらの制御エレメントは、全ての組織において均一に機能すると予想されるため、本発明者らは、観察されたBADH活性の違いは、色素体ゲノムのコピー数の変動によるものであるかもしれないと推定する。異なる組織においては色素体ゲノムのコピー数が有意に異なり、葉と比較して根に観察されるのは5％のみであることが既知である（Sasakiら、1990）。しかしながら、ニンジン主根において観察された高いBADH酵素活性（葉の75％）は、存在する多数の有色体によるのかもしれず；このことは、色素体コピーのわずか5％しか含有していない植物において通常観察される根が無色ではなく、橙色又は紫色であることから明白であった。
【００９２】
ニンジン細胞、根、及びシュートにおけるBADHタンパク質発現
細胞、主根、及び葉におけるBADH活性の結果をさらに確認するため、形質転換ニンジン組織及び非形質転換ニンジン組織から調製された粗抽出物を使用してウェスタンブロット分析を実施し、各試料からの画分（50μgタンパク質）を10％SDS-PAGEに供した。ニトロセルロース膜にトランスファーされたタンパク質に、ネイティブBADHに対してウサギにおいて作製されたポリクローナル抗BADH血清（Elisa Soto博士の好意により提供された；Figueroa-Sotoら、1999）をハイブリダイズさせ、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ連結二次抗体を使用して抗原性ペプチドを検出した。badh発現は、非形質転換ニンジン組織（細胞、主根、及び葉；レーン1〜3）には検出されなかった。しかしながら、トランスジェニック試料（図5B）においては、ニンジン細胞懸濁培養物（レーン4）と比較してより高度の発現が、葉（レーン6）及び主根（レーン7）に観察された。ニンジン根及び葉組織におけるBADHタンパク質蓄積は、トランスジェニックの根及びシュートにおけるBADH酵素活性で得られた結果と平行であった。
【００９３】
ニンジン細胞懸濁培養物における耐塩性及びBADH活性
塩ストレスがBADH活性に影響を与えるか否かを試験するため、ニンジン細胞懸濁培養物で異なる塩濃度（0〜500mM NaCl）の下で実験を実施した。ニンジン細胞において2週間実施された研究は、非形質転換細胞より高い液体培地中のNaCl濃度で、形質転換細胞が持続され増殖し得ることを示した（図6A〜B）。100mlの培地を含有している500mL三角フラスコを使用して、ニンジン培養物は、形質転換及び非形質転換の両方で11.82gの細胞を産生したが、100mM NaClの存在下においては、2週間後に8.75gのトランスジェニック細胞（1096％）及び1.29gの非形質転換細胞（161％）が得られた（使用された初期培養物が、フラスコ1個当たり0.8gを含有していた場合、図6A〜B参照）。さらに、100〜300mM NaClに曝された場合、BADH酵素活性はトランスジェニック・ニンジン細胞培養物において刺激された。最大の顕著なBADH活性は、100及び200mM NaClで見られ（図6C）、そのような増加は非形質転換細胞においては有意でなかった。これは、非緑色の細胞又は根における色素体ゲノムの低いコピー数にもかかわらず、発達段階に関係なく、全長Prrnプロモーター及び遺伝子10 5'UTRが全ての組織において効率的な転写及び翻訳を促進することを示している。
【００９４】
ニンジン植物に対する塩の効果
異なる塩濃度（100〜500mM NaCl）を、ポット内の土壌に移された形質転換ニンジン植物及び非形質転換ニンジン植物において試験した。badh導入遺伝子を保持しているトランスジェニック植物は、最大400mM NaClでよく生長したが（図7）、非形質転換植物は、200mM NaCl超では2週間後にポット内で生存することができなかった。
【００９５】
本発明の一つの局面は、体細胞胚形成を通したニンジン色素体形質転換のための高度に効率的な過程を使用した色素体を形質転換する方法を記載する。本発明のさらに他の局面は、体細胞胚形成を通した色素体形質転換が可能なベクターを提供する。さらにもう一つの局面は、本明細書に記載された方法及びベクターを通して体細胞胚形成を通して形質転換された、形質転換された色素体、植物、及び植物部分を提供する。本願は、当技術分野についての知識と協同で、再生が体細胞胚形成を通して媒介されるいくつかの主要な作物の色素体ゲノムを操作するための必要な案内及び指示を提供する。禾穀類（コムギ、イネ、トウモロコシ、サトウキビ）、マメ科植物（ダイズ、アルファルファ）、油料作物（ヒマワリ、オリーブ）、換金作物（ワタ、コーヒー、チャ、ゴム、アマ、コルクガシ、マツ）、野菜（ナス、キュウリ、キャッサバ、トウガラシ、アスパラガス等）、果実（リンゴ、サクラ、バナナ、プランテーン、メロン、ブドウ、グアバ）、堅果（カシュー、クルミ、ピーナッツ）、及び樹木（ナツメヤシ等）が、体細胞胚形成を通して再生される。
【００９６】
以前に、少数のトランスジェニック体を得るための多数の葉外植片の打ち込みを通した葉緑体形質転換が報告された。例えば、ジャガイモにおいては、200回の打ち込みから2個のトランスジェニック・シュートのみが、長期にわたる組織培養の後、回収された（Sidorov、1999）。著者らは、トマト色素体の形質転換がほぼ2年を要すると報告した（Rufら、2001）。対照的に、5回の打ち込みから8〜10週間以内に、安定的な導入遺伝子組み込みが7個のニンジン・トランスジェニック細胞系において確認され、液体培地での反復的な8〜10回の毎週の継代培養により細胞培養物でホモプラスミーが達成された。（ポットに入植する準備が整っている）ニンジン・トランスジェニック植物は、ホモプラスミック細胞系から1ヶ月以内に生成した。色素体ゲノムへの導入遺伝子組み込みのためニンジンにおいて得られた形質転換のそのような高い頻度は、いくつかの理由によるかもしれない。同一種、即ちニンジン（Daucus carota L.cv.Half long）のネイティブ葉緑体ゲノムからの長い隣接配列が相同的組み換えのために使用された。対照的に、トマト及びジャガイモの両方において色素体形質転換のために使用された葉緑体ベクターは、タバコ葉緑体ゲノムからの隣接配列を含有していた。同様に、ペチュニア葉緑体隣接配列がタバコ葉緑体ゲノムを形質転換するために使用された場合（DeGrayら、2001）、それは極めて低い形質転換効率をもたらした。従って、この研究領域を進歩させるためには、有用作物の葉緑体ゲノムが配列決定されるべきである。（ニンジンの場合そうであったように）葉緑体DNA配列がGenbankにおいて入手可能でない場合、相同的組み換えのための隣接配列を入手することは、非常に困難である。
【００９７】
この研究におけるもう一つの重要な観察は、培養されたニンジン細胞の原色素体における高レベルの導入遺伝子発現である。Sidorovらは、ジャガイモ塊茎のアミロプラストにおける、葉と比較して50倍少ないGFP蓄積を報告した。全く対照的に、本発明者らは、葉と比較して観察された53％のBADH活性を報告している。有色体が合理的な量の外来遺伝子産物を蓄積することが報告されていたとしても（Rufら、2001）、これは、原色素体における導入遺伝子発現の最初の報告である。badh遺伝子の翻訳を制御する異種遺伝子10 5'UTRは、実際、プロモーター欠失であった。葉緑体psbA 3'UTRは、転写物を安定化することが既知であり、転写終結が不充分であり、終結効率は30％である。しかしながら、より高いレベルの発現が、（トウモロコシ種子のような、又は線虫に対する抵抗性のためには根における）原色素体において望まれる場合には、転写を増強するため、遺伝子10 5'UTRの上流にプロモーターを挿入することが望ましいかもしれない。
【００９８】
ニンジン系においてホモプラスミーを達成するためには、数回の選抜（8〜10回）が高い選抜圧と共に必要であった。液体培養において、ニンジン細胞の表面は、全て、増殖培地に直接曝される。これは、非形質転換色素体の増殖を阻止する可能性のある高い選抜圧を意味する。液体培地中のニンジン細胞は、2,4-Dを含有している固形培地と比較して速く繁殖する。2,4-Dがニンジン細胞から除去されたならば、それらは急速に成熟体細胞胚へと変換され、小植物を豊富に生じさせる。ホモプラスミーを達成するためのもう一つの要件は、細胞1個当たりの何千個もの色素体ゲノムへの組み込みのためのテンプレートの利用可能性である。本発明者らは、完全な葉緑体複製起点を含有している葉緑体隣接配列の使用が、葉緑体内の多数のテンプレートを提示し（Daniellら、1990）、1回目の選抜ですらホモプラスミーの達成を支援すること（Gudaら、2000）を、以前に示した。ニンジン葉緑体ベクター内の葉緑体複製起点の包含（oriが他の植物種と同じ位置に存在していると仮定）は、少数回の細胞分裂でのホモプラスミーの達成を支援したはずである。
【００９９】
ニンジン細胞は、植物への変換のための成熟培地に曝されるまで、二次的な体細胞胚を産生する体細胞胚を通した迅速な増殖（反復性の胚形成）の大きな可能性を有しており、この培養物は、数年間インビトロで維持され得る。ニンジン（Daucus carota L.cv.US-Harumakigosun）においては、5年間適当な増殖培地上で維持された胚原性ニンジン・カルスが、回転式バイオリアクターを使用した液体細胞培養を通して、生産性の減少なしに245日間連続的に多数の植物（4×107小植物／L培地／日）を産生した（Nagamoriら、1999）。体細胞胚のもう一つの利点は、それらが人工種子として使用され得るという点である。合成又は人工の種子とは、植物の商業的な繁殖において使用するためのアルギン酸ナトリウム・ビーズ又はマトリックスに封入された体細胞胚と定義される。例えば、（15％RHにまで脱水され、湿潤空気中で90％RHにまで再水和される）アルギン酸-ジェラン（gellan）ゴムに封入されたニンジン体細胞胚は、土壌において最大73％発芽し（Timbertら、1996）、固定化細胞の再生の頻度は、非固定化細胞を通して得られたものより約1.5倍高く改善された（Nagamoriら、1999）。人工種子技術によれば、ニンジン及びその他の植物種における望ましい選抜された遺伝子型が、長時間凍結保存され得（Tessereauら、1994）、これらの栄養繁殖体は、温室又は圃場における同期化された植物の移植のためオンデマンドで使用され得る。治療用タンパク質の不均一性を最小限に抑えるためには、作製のための単一の起源が高度に望まれる。
【０１００】
グリシン・ベタイン（GB）は、全ての生存生物に共通して存在している化合物であり、多くの高等植物、細菌、海生種、及び哺乳動物種が、水不足又は塩ストレスの下でGBを蓄積することが、研究により示唆されている。植物、細菌、及び哺乳動物腎臓組織において、GBは、浸透圧調節物質（osmoprotectant）として作用する。ブタ腎臓において、BADHは、皮質及び髄質内部に集中しており、尿素及び高度の塩化合物に曝されている尿細管周囲の細胞に特に集中している（Figueroa-Sotoら、1999）。グリシン・ベタインは、高張性及び致死レベルの尿素に曝されているにもかかわらず腎細胞が正常に生存し機能するのを支援する、ラットの腎臓髄質内部において同定された主要な適合性の有機的なオスモライト（osmolytes）のうちの一つである。
【０１０１】
これらの事実は、ヒト又は動物により消費される食物におけるBADH酵素の存在又はGBの蓄積が有益であろうことを示唆している。植物において、塩分ストレスは、潅漑実行及び増加中の淡水供給量の需要のため、作物植物の生長及び収量にとって引き続きますます有害となりつつあり；従って、耐塩性の作物植物の操作は、長期にわたり強く求められてきた目的である（Apse MP及びBlumwald E、2002）。これらのストレスからの傷害を減少させるための有効な一つのメカニズムは、遺伝子操作を通した、植物中のグリシン・ベタインのような浸透圧調節化合物の高い細胞内レベルの蓄積である（Ronteinら、2002）。
【０１０２】
実験プロトコル
色素体形質転換ベクターの構築
製造業者のプロトコルに従い、DNeasyプラント・ミニ・キット（Qiagen Inc.）を使用して、葉から単離されたニンジン・ゲノムDNAから、ニンジン隣接配列を表わすDNA断片を増幅した。その隣接配列断片を、プラチナ（Platinum）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen Inc.）を使用して、タバコ葉緑体遺伝子配列から生成させたプライマーを用いて増幅した。増幅された断片は、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域を表し、サイズは〜4.2kbである。PCR増幅されたDNA断片を、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ（Promega）で処理し、シュリンプ・アルカリホスファターゼ（Shrimp Alakaline phosophatase）（Promega）で脱リン酸されたPvuIIで消化されたpBluescript II KSへとクローニングした。キナーゼ反応及び脱リン酸反応は、製造業者の指示の通りに実施した。葉緑体プロモーター及び制御配列は、タバコ葉緑体ゲノムに関して入手可能な情報に基づくPCRを使用して増幅した（アクセッション番号NC_001879）。ニンジン特異的葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-gfp/BADH（図1A）は、gfp/BADH発現カセットを表す平滑末端化されたClaI-SacI断片を、ニンジン葉緑体DNA隣接配列のPvuII部位へと挿入することにより構築した。sm-gfp遺伝子はTAIRから得られた。同様に、ニンジン葉緑体形質転換ベクターpDD-DC-aadA/BADH（図1B）は、脱リン酸の後に、aadA/BADH発現カセットを表す平滑末端化されたApaI断片を、ニンジン葉緑体DNA隣接配列のPvuII部位へと挿入することにより構築した。細菌及びDNAの取り扱いは、標準的な分子生物学プロトコルの通りに実施した。
【０１０３】
注目すべきことに、使用される可能性のあるベクターは、2002年12月26日出願の米国特許出願PCT/us02/41503号に記載されたようなダブル・バレル色素体ベクターである。この出願は参照として完全に組み入れられるが、簡潔のため、本発明者らは、葉緑体ダブル・ベクターを記載している特定の一節を含めた。以下に提供される記載は、本願の図9〜28に示されるプラスミドについての理解を支援するであろう。
【０１０４】
従来、葉緑体形質転換は、少数のナス科作物においてのみ達成されてきた。この技術の他の作物への拡張には、いくつかの難題が存在する。従来は、緑色葉緑体のみが形質転換され、葉が外植片として使用されていた。しかしながら、単子葉植物を含む多くの作物の場合、培養された非緑色細胞又はその他の非緑色植物部分が外植片として使用される。これらの非緑色組織は、葉緑体の代わりに、遺伝子発現及び遺伝子制御の系が全く異なる原色素体を含有している。形質転換において、形質転換された原色素体は、成熟葉緑体へと発達しなければならず、形質転換細胞は全ての発達段階における選抜過程に耐え生存しなければならない。従って、主要な難題は、異なる発達段階で、明所及び暗所での選抜に耐え生存する能力を葉緑体に提供することである。植物細胞において形質転換される葉緑体は1個又は2個のみであり、これらの色素体が、選抜圧に耐え生存し、繁殖し、確立される能力を有していなければならない一方で、他の全ての非形質転換色素体が選抜過程において排除されなければならないため、これは絶対的に重大である。ダブル・バレル色素体ベクターは、原色素体においても成熟葉緑体においても機能性の制御シグナルにより駆動される同じ選抜可能マーカー（又は選抜マーカーのスペクトル）を解毒することができる2個の異なる酵素をコードする遺伝子を使用することにより、これを達成する。
【０１０５】
本明細書に記載された色素体ベクターは、いくつかのそのような非制限的な例のうちの一つである。葉緑体隣接配列は、適当なコーディング配列、及び導入遺伝子カセットが挿入されるスペーサー領域を含有している。転写されるスペーサー領域及び転写的にサイレントなスペーサー領域を含む色素体ゲノム内の任意のスペーサー配列が、導入遺伝子組み込みのためターゲティングされ得る。aphA-6遺伝子及びaphA-2（nptII）遺伝子の両方が、アミノグリコシド・ホスフォトランスフェラーゼ・ファミリーに属する酵素をコードするが、それらは異なる原核生物に由来する。葉緑体ゲノムの原核性のため、これらの遺伝子は、コドン最適化なしにトランスジェニック葉緑体において使用するのに理想的である。原核生物起源の遺伝子は、トランスジェニック葉緑体において極めて高いレベルで発現されている（全可溶性タンパク質の最大47％、DeCosaら、2001）。両酵素は、類似した触媒作用を有しているが、aphA-6遺伝子産物は、カナマイシンを解毒する拡張された能力を有しており、アミカシンを含むアミノグリコシド解毒のより広いスペクトルを提供する。カナマイシンを選抜可能マーカーとして選択することの利点は、ほとんどの単子葉植物に観察されるスペクチノマイシン耐性、又は選抜過程において観察される16S rRNA遺伝子の自発的な点突発変異と異なり、それが天然の抵抗性を有していないという点である。さらに、カナマイシンは、ヒトでは抗生物質として臨床的に使用されておらず、カナマイシン耐性核導入遺伝子を含有しているいくつかの作物が、ヒトの消費のためFDAによって既に承認されており（例えば、トマト味の調味料）、現在市場に出ている。
【０１０６】
図36に示されるように、この非制限的な例において、導入遺伝子は全て色素体Prrnプロモーターにより制御される；この16S rRNAプロモーターはネイティブ葉緑体ゲノム内のrRNAオペロン全体を駆動し、核にコードされたRNAポリメラーゼ及び色素体にコードされたRNAポリメラーゼの両方のための結合部位を含有している。従って、このプロモーターは、原色素体及び葉緑体の両方で機能することができる（緑色でも非緑色も、明所でも暗所でも）。aphA-6遺伝子は、非緑色組織に存在する原色素体において、暗所での効率的な翻訳が可能な遺伝子10 5'UTRによりさらに制御される（16S rRNAプロモーター及び遺伝子10 UTRにより制御された図32及び図2におけるトウモロコシ及びニンジンの非緑色細胞の原色素体におけるGFP発現を参照）。rpsl6 3'UTRは、aphA-6遺伝子転写物を安定化するために使用された。他方、aphA-2（nptll）遺伝子は、葉緑体において、光制御され、明所で高度に効率的なpsbAプロモーター、5'及び3'のUTRにより制御される（A.Fernandez-San Millan、A.Mingeo-Castel、M.Miller、及びH.Daniell、2003,「タンパク質分解に対して高度に感受性のヒト血清アルブミンを過剰発現させ精製するための葉緑体トランスジェニック・アプローチ（A chloroplast transgenic approach to hyper-express and purify Human Serum Albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation）」Plant Biotechnology Journal（印刷中）参照；国際公開公報第01/72959号も参照のこと）。従って、原色素体及び葉緑体の両方で明所及び暗所で制御シグナルにより駆動されるaphA-6遺伝子及びaphA-2遺伝子の両方の組み合わせは、形質転換された色素体／葉緑体を、24時間を通して連続的に選抜可能剤から防御する。適当な制御シグナルを有する目的の（1個以上の）遺伝子（遺伝子X）が、ダブル・バレル選抜可能系の下流又は上流に挿入される。複数個の遺伝子がスペーサー領域に挿入されるため（DeCosaら、2001、Daniell＆Dhingra、2002）、挿入される導入遺伝子の数は、オペロンの転写、転写物プロセシング、又は翻訳において問題とならない（国際公開公報第01/64024号）。この例の変形においては、異なる導入遺伝子とカップリングされたaphA-6遺伝子及びaphA-2遺伝子が、適当な隣接配列を使用して同じ葉緑体ゲノム内の異なるスペーサー領域に挿入され、両ベクターの共形質転換を介して導入される。
【０１０７】
植物材料形質転換及びトランスジェニック植物の再生
MS塩（Murashige及びSkoog、1962）、B5ビタミン（Gamborgら、1968）、2％ショ糖、及び0.8％寒天を含む培地を含有している植物組織培養チューブで、無菌のニンジン植物（Daucus carota L.cv.Half long）を育てた。胚軸を0.5mmセグメントに切り、3％ショ糖、0.1mg/l 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）pH5.7を含有している50mlのMSB液体培地中に置いた。26±2℃及び120rpmでの3週間の連続的な振とうの後、遊離した細胞を、100μMメッシュで収集し、遠心分離し（10分間150×g）、新鮮な培地に再懸濁させた。急速に増殖する同種の黄色細胞を、毎週継代培養した。100μMメッシュでろ過されたニンジンの微細な細胞懸濁培養物を、3mg/L 2,4-D及び1mg/Lカイネチンが補足されたMSB固形培地に均一に広げ、ニンジン特異的色素体ベクター（図1A〜B）を打ち込んだ。暗所で2日間インキュベートされた打ち込まれたカルスを、3mg/L 2,4-D、1mg/Lカイネチン、及び異なる濃度のベタイン・アルデヒド（10、15、20、及び25mM BA）及びスペクチノマイシン（150、250、350、及び450mg/L）を含有しているMSB培地上で選抜した。培養物を、50〜100lxの光度及び26±2℃の温度で16/8時間の昼／夜周期でインキュベートした。トランスジェニック培養物を、選抜剤が補足された固体培地及び液体培地の両方を使用して繁殖させた。（0.2mg/Lを含有しているMSB培地上で）体細胞胚形成を通して作製されたトランスジェニック植物を、ポット内の土壌に移した。1週間目は高湿度を維持するためポットをプラスチックの袋で覆い、1週間目は漸進的に減少する濃度のMS塩を潅注し、その後、2週間目には水道水を潅注した。
【０１０８】
DNA抽出、PCR、及びサザンブロット分析
全ゲノムDNAを、トランスジェニック・ニンジンのPCR及びサザンブロット分析のため、植物DNeasyキット（Quiagen Inc.USA）を使用して単離した。PCR反応は、lO×PCR緩衝液及びプライマー対3P/3M（隣接配列上に対合/aadA遺伝子上に対合）及び16SF/1M（ネイティブ葉緑体ゲノム/aadA遺伝子上に対合）と共にTaq DNAポリメラーゼを使用して、5分間94℃で50ngのDNAテンプレートを変性させ、25 PCRサイクル（94℃で1分間、64℃でl分間、72℃で3分間）、72℃で10分間の最終伸張を実行することにより実施された。
【０１０９】
サザンブロット分析に関しては、植物DNAをPvuII及びAflIIIで消化し、PvuII及びAflIIIでpDD-Dc-aadA/badhベクターDNAを消化することにより生成したプローブクアント（ProbeQuant）G-50カラム（Amersham,USA）を使用して32Pで標識された4.9kbのプローブとハイブリダイズさせるため、ナイロン膜に移した。ストラタジーン・クイック・ハイブ（Stratagene Quick-HYB）ハイブリダイゼーション溶液及び供給元の指示を使用して（Stratagene,USA）、ブロットにプローブをハイブリダイズさせた。
【０１１０】
BADH酵素活性及びイムノブロット分析
記載されたようにして（Daniellら、2001）、抽出及びBADH（ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ）活性に関するアッセイを実施した。1gのニンジン組織を、50mMヘペス-KOH（pH8.0）、1mM EDTA、20mM二亜硫酸ナトリウム、10mMホウ酸ナトリウム、5mMアスコルビン酸、及び5mM DTTを含有している2mLの緩衝液中で破砕した。粗抽出物を、10分間4℃で10,000×gで遠心分離し、上清をセファデックス（Sephadex）G-25カラム（Amersham Pharmacia biotech,USA）を使用して脱塩した。反応を開始するために25℃で1mM BAが添加されたアッセイ緩衝液（50mMヘペス-KOH、pH8.0；1mM EDTA、5mM DTT、1mM NAD＋）において、1分後及び10分後に、340nmで分光光度的にBADHによるNAD＋還元を測定した。
【０１１１】
イムノブロット分析に関しては、全可溶性タンパク質を、100mgのニンジン組織から2×レムリ緩衝液を使用して単離した。その混合物を5分間沸騰し、10,000×gで5分間遠心分離した。50μgの全可溶性タンパク質（ブラッドフォード（Bradford）アッセイで定量された）を含有している上清を10％SDS-PAGEゲル上にロードし、ブロッティング膜にトランスファーした。膜に、BADHに対してウサギで作製されたポリクローナル抗BADH血清（Elisa Soto博士より提供された）をハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたペプチドを、Lumi-Phos（商標）WB化学発光試薬（Pierce,USA）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結二次抗体を使用して検出した。
【０１１２】
耐塩性に関するトランスジェニック植物の分析
それぞれ0、100、200、300、400、及び500mM NaClを含有しているポット内の土壌に移された同じ形態形成生長相及び高さのトランスジェニック・ニンジン植物及び非トランスジェニック・ニンジン植物を、耐塩性に関して分析した。植物はグロース・チャンバーで維持し、1ヶ月間、異なるレベルの塩を含有している食塩水を毎日潅注した。
【０１１３】
例示的な実施例2：ワタ形質転換
材料及び方法
植物材料及び形質転換
繊維が除去されたワタ（Gossypium hirsutum L.cv.Coker310FR）種子を、2分間70％エタノールへ浸漬することにより滅菌した後、〜4％の有効塩素を含有している次亜塩素酸ナトリウム溶液により8分間処理し、次いで0.1％塩化第二水銀溶液（w/v）により5分間処理した。表面滅菌及び4〜5回の滅菌水での洗浄の後、種皮を柔らかくするため種子を4〜5時間滅菌水中に維持し、それを完全に除去した後、種子を、1.5％ショ糖と共に半分の強度のMS塩（Murashige及びSkoog、1962）及びB5ビタミン（Gamborgら、1968）を含有している1/2 MSB培地上に置いた。5日齢の実生の胚軸外植片（4〜6mm長）を、カルスの誘導のため、（MS塩、B5ビタミン、0.1mg/l 2,4-D、0.5mg/lカイネチン、及び3％グルコースを含有している）MST1培地上に垂直に置いた。均一に分布した胚形成前（pro-embryognic）のカルスに、ヘリウムに基づくバイオリスティック微粒子銃（Bio-Rad）を使用して、葉緑体ベクターでコーティングされた金粒子を打ち込んだ。ワタ・カルスの形質転換は、以下のパラメータを使用して最適化された：0.6μm金粒子マクロキャリアー；27in.Hgチャンバー真空；1550psiヘリウム圧；6mmラプチャー・ディスク・マクロキャリアー・ギャップ；6mmマクロキャリアー飛距離、6cm標的距離、及び10μl金粒子上にコーティングされた葉緑体ベクター。打ち込み後の培養物を、24時間暗所でインキュベートし、その後、50mg/lカナマイシンが補足された選抜培地MST1に移し、750luxの光度及び28±2℃の温度で16/8時間の昼／夜周期でインキュベートした。トランスジェニック胚原性培養物を、50mg/lカナマイシンが補足されたMST1培地上で繁殖させ（図34）、培養物における導入遺伝子aphA-6遺伝子の組み込みをPCRにより確認した（図35）。
【０１１４】
例示的な実施例3：発現カセット構築
材料及び方法
隣接配列の増幅及びクローニング
製造業者のプロトコルに従い、キアゲン（Qiagen）植物抽出キットを使用して、隣接配列を表すDNA断片を、葉から単離された植物ゲノムDNAから増幅した。隣接配列断片を、プラチナ（Platinum）Pfx DNAポリメラーゼ（Invitrogen Inc.）を使用して、プライマーADLF-5' gtgtcagtgtcggcccagcagag 3'及びADLR-5' aacaggggtcaaggtcggccag 3'により増幅した。増幅された断片は、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域を表し、サイズは〜4.2kbである。PCR増幅されたDNA断片を、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ（Promega）で処理し、シュリンプ・アルカリホスファターゼ（Shrimp Alakaline phosophatase）（Promega）で脱リン酸されたPvuIIで消化されたpBluescript II KSへとクローニングした。キナーゼ反応及び脱リン酸反応は、製造業者の指示の通りに実施した。ニンジン特異的隣接領域を保有しているクローンを、pDA-35と名付けた。
【０１１５】
発現カセットの構築
pDA-29は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を賦与するaadA遺伝子、並びに毒性ベタイン・アルデヒドのグリシン・ベタインへの分解を代謝するbadh遺伝子を保持している、pBluescript II KSへとクローニングされた葉緑体特異的発現カセットである。第一の遺伝子の発現は、5'末のシャイン・ダルガーノ配列及び3'末のpsbA 3'UTRの制御の下で16S Prnnプロモーターにより駆動される。badh遺伝子の発現は、異種T7遺伝子10 5'UTR及びrpsl6 3'UTRにより制御される。aadA遺伝子はpLD-CtV（Daniellら、1998）由来であり、BALLA遺伝子はpLD-BADH（Daniellら、2001）由来であった。第二の葉緑体発現カセットpDA-30は、可溶性の修飾された緑色蛍光タンパク質（TAIRより入手）をコードするsm-gfp遺伝子及びbadh遺伝子を保持している。sm-gfpの発現は、16S Prrnプロモーターにより駆動され、異種T7遺伝子10 5'UTR及びrpsl6 3'UTRにより制御される。badh遺伝子の発現は、psbAプロモーター／5'UTR及び3'UTRにより制御される。プロモーター及び制御配列は、タバコ葉緑体ゲノムに関して入手可能な情報（Shinozakiら、1987）に基づくPCRを使用して増幅された。
【０１１６】
葉緑体形質転換ベクターの構築
葉緑体形質転換ベクターpDD-XX-aadA/badhは、pDA-29発現カセットと共に隣接配列を保有しているpDAベクターの誘導体である。pDA-29からの発現カセットは、ApaI断片として得られ、製造業者の指示の通りにクレノウDNAポリメラーゼ（NEB）を使用して平滑末端化され、PvuIIで消化され脱リン酸されたpDA-35へとクローニングされた。他の種特異的葉緑体形質転換ベクターpDD-XX-gfp/badhは、ニンジン隣接配列及びpDA-30発現カセットを保有している。pDA-30からの発現カセットは、ClaI/SacI断片として導出され、平滑末端化され、PvuIIで消化され脱リン酸されたpDA-35へとクローニングされた。細菌及びDNAの取り扱いは、標準的な分子生物学プロトコルの通りに実施された。
【０１１７】
例示的な実施例4：トウモロコシ形質転換
トウモロコシ葉緑体ゲノムの遺伝子操作のため、トウモロコシ葉緑体ゲノム内のターゲティングされた組み込み部位に隣接するトウモロコシ特異的配列（trnI及びtrnA）を、特異的なPCRプライマーで増幅し、ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（BADH）選抜可能マーカー及び緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子発現カセットに隣接するようサブクローニングした。
【０１１８】
カルス培養を、HiII（F1）メイズ植物の自家受粉した穂の上で作製された、無菌的に切除された未熟な接合子胚（長さ1〜2mm）から開始させた。.1％トゥイーン20（ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（polyoxyethylene sorbitan monolaurate））を含有している2.6％次亜塩素酸ナトリウム（市販の漂白剤を用いて調製）を含有している溶液で、連続的な振とうの下で20分間、穂を表面滅菌し、次いで無菌蒸留水で4回濯いだ。次いで、丸い胚盤側が露出し、幼芽-幼根軸側が培地に接するよう、N6塩、及びビタミン（463.0mg/l （NH4）2SO4、2830.0mg/l KNO3、400mg/l KH2PO4、166.0mg/l CaCl2、185mg/l MgSO4.7H2O、37.3mg/l Na2-EDTA、27.85mg/l FeSO4.7H2O、1.6mg/l H3BO3、4.4mg/l MnS04.H2O、.8 KI、1.5mg/l ZnSO4.7H2O）、2％ショ糖、及び1.0mg/l 2,4-D（2,4ジクロロ-フェノキシ酢酸）を含有しているカルス誘導培地CI-1上に胚を置いた。カルス培養物は25〜28℃で暗所で維持され、2週間毎に継代培養された。
【０１１９】
胚原性カルスの粒子打ち込み
微小発射体（micro projectiles）をDNA（pDA34-ZM-gfp-BADH及びpDA33-ZM-aadA-BADH）でコーティングし、打ち込みをバイオリスティック装置PDS1000/HE（Bio-Rad）で実施した。
【０１２０】
打ち込みの前に、胚原性カルスを選抜し、無菌濾紙（ワットマンNo.1）に移し、標準的なペトリ・プレート（100×15mm）内の新鮮な培地の表面上に置いた。次いで、以下のようにして、金粒子（0.6μm）をプラスミドDNAでコーティングした：洗浄された金粒子50μlを、10μlのDNA（1μg/μl）、50μlの2.5M CaCl2、20μlの0.1Mスペルミジンと混合し、ボルテックス処理した。粒子を3000rpmで数秒間遠心分離し、次いで、エタノールを流し出した。エタノール洗浄を5回繰り返し、次いで、ペレットを100％エタノール30μlに再懸濁させ、打ち込みに使用されるまで、氷上に置いた（コーティングされた粒子は、2時間以内に使用された）。打ち込みは、部分真空（28インチHg）下の試料チャンバーにレベル2で標的試料をロードすることにより、バイオリスティック装置PDS1000/He（Bio Rad）で実施した。
【０１２１】
カルス培養に、1100psiのラプチャー・ディスクを使用して、メイズ葉緑体形質転換ベクターを打ち込んだ。打ち込みの後、外植片を新鮮な培地に移し；プレートを微孔性テープで密封し、25〜28℃で暗所でインキュベートした。
【０１２２】
選抜
選抜は打ち込みの2日後に開始した。打ち込まれたカルスを、5〜20mM BA（ベタイン・アルデヒド）又は25〜100mg/lストレプトマイシンを含有しているカルス誘導培地に移した。浸透圧を維持するため、BAと組み合わせられた50〜150mMNaClを使用した選抜も実施した。
【０１２３】
再生
再生は、1.0mg/l NAA（α-ナフタレン酢酸）、2％ショ糖、2g/lミオイノシトール、及び.3％フィタゲル、pH5.8が補足されたMs塩及びビタミンを含有している培地Rlにカルスを移すことにより、打ち込みの6〜8週間後に開始した。再生した植物を、1/2のMS塩及びビタミン、3％ショ糖、及び.3％フィタゲル、pH5.8を含有しているR2に移した。再生した植物を、明所で維持した（16/8時間光周期）。
【０１２４】
シュート繁殖
トウモロコシ種子の表面滅菌及び発芽
トウモロコシ種子を、継続的な振とうの下、20分間、.1％トゥイーン20を含有している2.6％次亜塩素酸ナトリウム（市販の漂白剤から調製）を含有した溶液で表面滅菌し、次いで、無菌蒸留水で4回濯いだ。種子を、暗所でpH5.8のMS培地上で生長させた。3日齢の実生から無菌的に節切片を切除した。節切片は、発芽した実生上に透明な区分として出現し、7番目の節を表す。切除した場合、節の横断面は1.3〜1.5mmの長さである。
【０１２５】
節切片の粒子打ち込み
打ち込みの前に、20〜30個の節切片を、アクロピチラ末端（acropitila end）を上にして、各ペトリ・プレートの中心に置いた。打ち込みは、1100、1300、及び1550psiのラプチャー・ディスクを使用して、メイズ葉緑体ベクターにより実施された。
【０１２６】
複数のシュートの誘導及び選抜
節切片外植片を、125℃で連続光の下、Ms塩及びビタミン、1.0mg/l 6BA（6-ベンジルアミノプリン）、3％ショ糖、及び5g/lフィタゲルpH5.8から構成されたシュート繁殖培地SM1上に求頂末端（acropital end）を上にして置いた。最初のシュート先端からのシュート先端クランプの開始が、培養の2〜4週間後に起こった。打ち込みの2日後、形質転換された節切片を、5〜20mM BA又は50〜100mg/lストレプトマイシン選抜剤を含有しているシュート繁殖培地に移した。その後の2週間隔での継代培養は、5〜20mM BA又は25〜100mg/lストレプトマイシンを含有している選抜シュート繁殖培地で緑色クランプを選抜し、分割し、継代培養することにより実施された。
【０１２７】
再生
MS塩及びビタミン、5mg/l IBA及び3％ショ糖、pH5.8を含有している再生培地M1に移すことにより、複数のシュート・クランプを再生させた。1/2のMS塩及びビタミン、3％ショ糖及び3g/lフィタゲル、pH5.8を含有しているM2培地にシュート先端クランプを移すことにより、発達したシュートを再生させた。さらに、全ての再生培地に、選抜剤としての5〜20mM BA又は25〜100mg/lストレプトマイシンが補足されることに注意すべきである。
【０１２８】
抗生物質耐性遺伝子を含まないトウモロコシ葉緑体ゲノムを操作するため、メイズ・カルスに、選抜可能マーカー又はスクリーニング可能マーカーとしての緑色蛍光タンパク質（GFP）及びベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（BADH）遺伝子を含有している葉緑体発現ベクターを打ち込んだ。ベタイン・アルデヒド（BA）選抜をストレプトマイシンと比較するため、aadA遺伝子及びBADH遺伝子を含有しているもう一つの葉緑体発現ベクターを構築した。推定トランスジェニック・イベント数は、ストレプトマイシンよりBA選抜の方が高かった。BAでスクリーニングされたトランスジェニック・トウモロコシ組織を、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して調査した。GFP蛍光はトウモロコシの体細胞胚全体に観察された。トウモロコシの葉緑体形質転換は、可食ワクチンの作製及び生物薬剤の経口送達のための適当な道を提供する。
【０１２９】
トウモロコシ葉緑体形質転換ベクター
トウモロコシ葉緑体形質転換ベクターは、トウモロコシ葉緑体ゲノムの逆方向反復（IR）領域への導入遺伝子の組み込みを促進する。ベクターpLD-Corn-BADHは、構成性16S rRNAプロモーターにより駆動され、ペチュニア色素体ゲノムからのpsbA遺伝子の3'UTR領域により制御されるキメラのaadA遺伝子及びBADH遺伝子を含有している。この構築物において、aadA及びBADHはいずれも葉緑体にとって好ましいリボソーム結合部位、GGAGGを保有している。トウモロコシ葉緑体形質転換のため使用されたもう一つのベクターpLD-Corn-UTR-BADHは、ジシストロン（dicistron）の発現を駆動する構成性16S rRNAプロモーターを有しているが、BADHは、増強された発現のため、プロモーター及びpsbA遺伝子の5'UTR及びpsbA遺伝子の3'UTRの制御下にある。トウモロコシ種子の有色体における外来タンパク質の発現が望まれるため、目的の遺伝子は、細胞性調節がない制御配列の調節下にある必要がある。この情況において、適当な候補制御配列の例は、T7遺伝子10-リーダー配列及びcry2Aa2 UTRである。T7遺伝子10-リーダー配列は、トランスジェニック有色体において外来タンパク質を発現させるために使用される。cry2Aa2 UTRは、緑色組織においてpsbA UTRと同程度の効率で同程度の量の外来タンパク質を有色体に蓄積させることが本発明者により示されている。従って、psbAが緑色組織における最も効率的に翻訳される葉緑体遺伝子のうちの一つであるため、付加的なベクターのための選抜可能マーカーは、psbAプロモーター及び5'UTRの制御下にあるBADH遺伝子を使用する。緑色組織又は非緑色胚原性カルスが導入遺伝子をトウモロコシ葉緑体ゲノムへ導入するために使用される場合には、それぞれ光制御されるpsbAプロモーター／UTR又は16S rRNAプロモーター／遺伝子10 UTRを使用することが好ましい。
【０１３０】
本出願人がトウモロコシ、ワタ、及びニンジンにおける体細胞胚形成を証明した例の以下のリストは、本明細書に含有される本出願人らの記載及び例のため、多数の植物の形質転換が適当であることを明白に証明している。胚形成を実行するよう多数の植物を形質転換する能力は、多様な植物における体細胞胚形成を通した植物形質転換の方法論を例示している以下に列挙される例証的な参照の数によりさらに支持される。以下の参照は、胚形成を介した作物の再生及び／又は核ゲノムを介した作物／植物形質転換の例である。結果として、当業者は、非緑色植物細胞を通した色素体形質転換を達成するために、本明細書に記載された葉緑体ベクターと協調的に、以下の例示的な参照に記載された体細胞胚形成のためのプロトコルを使用することができる。換言すると、当業者は、下記のプロトコルが、本明細書内の記載に適用可能であることを認識するであろう。本願に完全に組み入れられるこの以下の参照の列挙は、体細胞胚形成を通した植物形質転換を記載している。
【０１３１】
作物：
メイズ：
J.F.Petolino、N.L.Hopkins、B.D.Kosegi、M.Skokut「遺伝学的形質転換及びハイブリダイゼーション：メイズの胚原性カルスのウィスカー（Whisker）により媒介された形質転換（genetic transformation and hybridization: Whisker-mediated transformation of embryogenic callus of maize.）」19：781-786（2000）。
【０１３２】
ダイズ：
H.N.Trick、J.J.Finer.「ダイズ［Glycine max（L.）Merrill］胚原性懸濁培養組織の超音波処理により支援されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）により媒介された形質転換（Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean [Glycine max (L.) Merrill] embryogenic suspension culture tissue.）」Plant Cell Reports 17：482-488（1998）。
【０１３３】
コムギ：
A.Pellegrineschi、R.M.Brito、L.Velazquez、L.M.Noguera、W.Pfeiffer、S.McLean、D.Hoisington.「三つのデューラムコムギ栽培品種の外植片及びバイオリスティック形質転換頻度に対する温和な熱及び渇水ストレスによる前処理の効果（The effect of pretreatment with mild heat and drought stresses on the explant and biolistic transformation frequency of three durum wheat cultivars.）」Plant Cell Rep 20：955-960（2002）。
【０１３４】
オオムギ：
M.Manoharan、L.S.Dahleen.「カルスの粒子打ち込みによる商業的なオオムギ（Hordeum vulgare L.）栽培品種コンロン（Conlon）の遺伝学的形質転換（Genetic transformation of the commercial barley (Hordeum vulgare L.) cultivar Conlon by particle bombardment of callus）」Plant Cell Rep 21：76-80（2002）。
【０１３５】
Meyeong-Je C.、Wen J.、及びLemaux P.G.「再生可能性の改善及び減少した白化を通した頑強なオオムギ栽培品種の形質転換（Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism.）」Plant Science 138：229-244。
【０１３６】
イネ：
Sung-Ho Lee、Nigel W.Blackhall、J.Brian Power、Edward C .Cocking、David Tepfer、及びMichael R.Davey.「アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のRi TL-DNA由来のrolA遺伝子によるイネの遺伝学的及び形態学的な形質転換（Genetic and morphological transformation of rice with the rolA gene from the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes）」Plant Science,161：917-925（2001）。
【０１３７】
ヒマワリ：
S.Weber、W.Friedt、N.Landes、J.Molinier、C.Himber、P.Rousselin、G.Hahne、R.Horn.「ヒマワリ（Helianthus annuus L.）の改善されたアグロバクテリウムにより媒介された形質転換：軟化酵素及び超音波処理の査定（Improved Agrobacterium-mediated transformation of sunflower (Helianthus annuus L.): assessment of macerating enzymes and sonication.）」Plant Cell Rep 21：475-482（2003）。
【０１３８】
ワタ：
B.Chaudhary、S.Kumar、K.V.S.K.Prasad、G.S.Oinam、P.K.Bunna、D.Pental.「遅い脱水は、ワタ（Gossypium hirsutum L.cv.Coker 310 FR）の形質転換された体細胞胚からの高頻度のシュート回収をもたらす（Slow desiccation leads to high-frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutum L.cv.Coker 310 FR).）」Plant Cell Rep.21：955-960（2003）。
【０１３９】
サトウキビ：
Gil A.Enriquez-Obregon、Roberto I.Vazquez-Padron、Dmitri L.Prieto-Samsonov、Gustavo A.De la Riva、Guillermo Selman-Housein.「アグロバクテリウムにより媒介された形質転換による除草剤抵抗性サトウキビ（Saccharum officinarum L.）植物（Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation）」Planta 206：20-27（1998）。
【０１４０】
サトウダイコン：
S.Kifle、M.Shao、C.Jung、D.Cai.「サトウダイコン（Beta vulgaris L.）の毛状根における遺伝子発現を研究するための改善された形質転換プロトコル（An improved transformation protocol for studying gene expression in hairy roots of sugar beet (Beta vulgaris L.)）」Plant Cell Reports 18：514-519（1999）。
【０１４１】
バナナ：
T.R.Ganapathi、N.S.Higgs、P.J.Balint-Kurti、C.J.Arntzen、G.D.May、J.M.Van Eck.「バナナ栽培品種ラスタリ（Rasthali）（AAB）の胚原性細胞懸濁物のアグロバクテリウムにより媒介された形質転換（Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic cell suspensions of the banana cultivar Rasthali (AAB)）」Plant Cell Reports 20：157-162（2001）。
【０１４２】
キャッサバ：
P.Zhang、G.Legris、P.Coulin、J.Puonti-Kaerlas.「粒子打ち込みを介した安定的に形質転換されたキャッサバ植物の作製（Production of stably transformed cassava plants via particle bombardment.）」Plant Cell Reports 19：939-945（2000）。
【０１４３】
オートムギ：
H.F.Kaeppler、G.K.Menon、R.W.Skadsen、A.M.Nuutila、A.R.Carlson.「緑色蛍光タンパク質を発現している細胞の視覚的な選抜を介したトランスジェニック・オート麦植物（Transgenic oat plants via visual selection of cells expressing green fluorescent protein.）」Plant Cell Reports 19：661-666（2000）。
【０１４４】
Meyeong-Je C.、Wen J.、及びLemaux P.G.「種子に由来する高度に再生性の培養物の微小発射体打ち込みを介したオートムギの高頻度の形質転換（High-frequency transformation of oat via microprojectile bombardment of seed-derived highly regenerative cultures.）」Plant Science 148：9-17（1999）。
【０１４５】
薬用植物：
「アグロバクテリウムで形質転換された組織を使用することによるウマゴヤシ（Medicago）の種間体細胞ハイブリッドの選抜（Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using agrobacterium-transformed tissues）」Plant Science,Volume 69,Issue 2,1990、189〜198頁  M.R.Thomas、L.B.Johnson、及びF.F.White
【０１４６】
「成熟イチイ（Taxus）の形質転換：抗癌剤タキソールのインビトロ作製を遺伝学的に調節するためのアプローチ（Genetic transformation of mature Taxus : an approach to genetically control the in vitro production of the anticancer drug, taxol）」Plant Science,Volume 95,Issue 2,1994、187〜196頁  Kyung-Hwan Han、Paul Fleming、Kevin Walker、Matthew Loper、W.Scott Chilton、Ursula Mocek、Milton P.Gordon、及びHeinz G.Floss
【０１４７】
Giri,A.、Banerjee,S.、Ahuja,P.S.、及びGiri,C.C.、1997.「アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用したアコチツム・ヘテロフィルム・ウォール（Aconitum heterophyllum Wall）における毛状根の作製（Production of hairy roots in Aconitum heterophyllum Wall.using Agrobacterium rhizogenes.）」In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 33 4、293〜296頁。
【０１４８】
Pradel, H.、Dumkelehmann, U.、Diettrich, B.、及びLuckner, M.、1997.「ジギタリス・ラナタ（Digitalis lanata）の毛状根培養物。二次代謝及び植物再生（Hairy root cultures of Digitalis lanata. Secondary metabolism and plant regeneration.）」J Plant Physiol 151、209〜215頁。
【０１４９】
豆、野菜、及び果実：
「ファセオラス・ポリアンツス・グリーンマン（Phaseolus polyanthus Greenman）（Year Bean）におけるカルスからの稔性植物の再生（Regeneration of Fertile Plants from Callus in Phaseolus polyanthus Greenman(Year Bean)）」Annals of Botany, Volume 88, Issue.3, September 2001、371〜377頁  Mukund Zambre、Pascal Geerts、Alain Maquet、Marc Van Montagu、Willy Dillen、及びGeert Angenon
【０１５０】
「トランスジェニック・ブドウ（Vitis vinifera）における3個の構成性プロモーター及び増強された誘導体の調節下での二機能性緑色蛍光タンパク質（GFP）融合マーカーの発現（Expression of a bifunctional green fluorescent protein (GFP) fusion marker under the control of three constitutive promoters and enhanced derivatives in transgenic grape (Vitis vinifera)）」Plant Science,Volume 160,Issue 5,April 2001、877〜887頁  Zhijian Li、Subramanian Jayasankar、及びD.J.Gray
【０１５１】
「ブドウ体細胞胚のアグロバクテリウムにより媒介された形質転換及びブドウ・クロム・モザイク・ネポウイルス（grapevine chrome mosaic nepovirus）（GCMV）のコート・タンパク質を発現するトランスジェニック植物の再生（Agrobacterium-mediated genetic transformation of grapevine somatic embryos and regeneration of transgenic plants expressing the coat protein of grapevine chrome mosaic nepovirus (GCMV)）」Plant Science,Volume 102,Issue 2,1994、161〜170頁  O.Le Gall、L.Torregrosa、Y.Danglot、T.Candresse、及びA.Bouquet
【０１５２】
「大多数の二倍体再生体をもたらすカンタロープ・シャランテ・メロン（cantaloupe charentais melon）（Cucumis melo L.var.cantalupensis）の形質転換のための信頼性の高いシステム（A reliable system for the transformation of cantaloupe charentais melon (Cucumis melo L.var.cantalupensis) leading to a majority of diploid regenerants）」Scientia Horticulturae,Volume 84,Issues 1-2,28 April 2000、91〜99頁  Monique Guis、Mohamed Ben Amor、Alain Latche、Jean-Claude Pech、及びJean-Paul Roustan
【０１５３】
M.A.McLean及びP.J.Charest、「北米におけるトランスジェニック樹木の制御（The regulation of transgenic trees in North America.）」Silvae Genet.49（2000）、233〜239頁（パパイヤ（Papaya）に関する）。
【０１５４】
「安定的に形質転換された胚原性カルスからのトランスジェニック・ピーナッツ植物の再生（Regeneration of transgenic peanut plants from stably transformed embryogenic callus）」Plant Science,Volume 93,Issues 1-2,1993、185〜194頁  Peggy Ozias-Akins、Jennifer A.Schnall、William F.Anderson、Chong Singsit、Thomas E.Clemente、Michael J.Adang、及びArthur K.Weissinger
【０１５５】
「微小発射体打ち込みによるキュウリ組織の形質転換：移入された機能性遺伝子及び非機能性遺伝子を含有している植物の同定（Transformation of cucumber tissues by microprojectile bombardment: identification of plants containing functional and non-functional transferred genes）」Gene,Volume 118,Issue 2,10 September 1992、255〜260頁  Paula P.Chee及びJerry L.Slightom
【０１５６】
H.Tsukazaki、Y.Kuginuki、R.Aida、T.Suzuki.「キャベツの倍加半数体系のアグロバクテリウムにより媒介された形質転換（Agrobacterium-mediated transformation of a doubled haploid line of cabbage.）」Plant Cell Rep（2002）21：257-262
【０１５７】
花：
「バラ（Rosa hybridaL.）のバイオリスティック形質転換（Biolistic Transformation of Rose (Rosa hybridaL.)）」Annals of Botany,Volume 81,Issue 1, January 1998、109〜114頁  R.MARCHANT, J.B.POWER、J.A.LUCAS、及びM.R.DAVEY
【０１５８】
「胚原性カルスのアグロバクテリウムにより媒介された形質転換を介したユリ科観賞植物アガパンツス・プレコックス（Agapanthus praecox）ssp.オリエンタリス（orientalis）（レイトン（Leighton））レイトン（Leighton）のトランスジェニック植物の作製（Production of transgenic plants of the Liliaceous ornamental plant Agapanthus praecox ssp.orientalis (Leighton) Leighton via Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic calli）」Plant Science,Volume 161,Issue 1,June 2001、89〜97頁  Sakae Suzuki、Kanyaratt Supaibulwatana、Masahiro Mii、及びMasaru Nakano
【０１５９】
「キクの体細胞胚形成及びアグロバクテリウムにより媒介された形質転換（Somatic embryogenesis and Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum）」Plant Science,Volume 97,Issue 1,1994、95〜101頁  Daniela Pavingerova、Josef Dostal、Rena Biskova、及びVojtch Benetka
【０１６０】
樹木：
「トランスジェニック・クルミ体細胞胚におけるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）からの全長cryIA（c）遺伝子の高レベルの発現（High levels of expression of full-length cryIA(c) gene from Bacillus thuringiensis in transgenic somatic walnut embryos）」Plant Science,Volume 131,Issue 2,2 February 1998、181〜193頁  Abhaya M.Dandekar、Gale H.McGranahan、Patrick V.Vail、Sandra L.Uratsu、Charles A.Leslie、及びJ.Steven Tebbets
【０１６１】
M.Delledonneら、「新規のアラビドーシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）システイン・プロティナーゼ阻害剤によるホワイト・ポプラ（white poplar）（Populus alba L.）の形質転換及び虫害抵抗性の分析（Transformation of white poplar (Populus alba L.) with a novel Arabidopsis thaliana cystine proteinase inhibitor and analysis of insect pest resistance）」Mol.Breed.7（2001）、35〜42頁。
【０１６２】
L.H.Zhuら、「rolB遺伝子によるリンゴ根茎M.9/29の形質転換、及び発根及び生長に対するその影響（Transformation of the apple rootstock M.9/29 with the rolB gene and its influence on rooting and growth）」Plant Sci.160（2001）、433〜439頁。
【０１６３】
R.L.Bellら、「rolC遺伝子による「ブーレ・ボスク（Beurre Bosc）」セイヨウナシの形質転換（Transformation of'Beurre Bosc'pear with the rolC gene）」J.Am.Soc.Hort.Sci.124（1999）、570〜574頁。
【０１６４】
C.El Euchら、「トランスジェニック・ハイブリッド・クルミ微小挿穂（microcuttings）におけるアンチセンス・カルコン・シンターゼRNAの発現。フラボノイド含有量及び発根能に対する効果（Expression of antisense chalcone synthase RNA in transgenic hybrid walnut microcuttings. Effect on flavonoid content and rooting ability.）」Plant Mol.Biol.38（1998）、467〜479頁。
【０１６５】
R.Scorzaら、「プラム・ポックス・ポチウイルス（plum pox potyvirus）コート・タンパク質遺伝子を含有しているプラム・ポックス・ウイルス抵抗性トランスジェニック・セイヨウスモモにおける転写後遺伝子サイレンシング（Post-transcriptional gene silencing in plum pox virus resistant transgenic European plum containing the plum pox potyvirus coat protein gene）」Transgenic Res.10（2001）、201〜209頁。
【０１６６】
J.L.Norelliら、「アタシン（attacin）E遺伝子を発現しているトランスジェニック「モーリング（Malling）26」リンゴは、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）に対する増加した抵抗性を有する（Transgenic 'Malling 26' apple expressing the attacin E gene has increased resistance to Erwinia amylovora）」Euphytica 77（1994）、123〜128頁。
【０１６７】
J.P.Reynoirdら、「ヒアロホラ・セクロピア（Hyalophora cecropia）からのアタシン（attacin）E遺伝子を発現しているトランスジェニック・セイヨウナシにおける改善された火傷病に対する抵抗性に関する最初の証拠（First evidence for improved resistance to fire blight in transgenic pear expressing the attacin E gene from Hyalophora cecropia）」Plant Sci.149（1999）、23-31頁。
【０１６８】
V.Leveeら、「胚原性組織のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）との共培養後のストローブマツ（Pinus strobus L.）の安定的遺伝学的形質転換（stable genetic transformation of white pine (pinus strobus l.) after cocultivation of embryogenic tissues with agrobacterium tumefaciens）」Mol.Breed.5 （1999）、429-440頁。
【０１６９】
A.R.Wenckら、「ドイツトウヒ（Picea abies）及びテーダマツ（Pinus taeda）の高効率のアグロバクテリウムにより媒介された形質転換（high-efficiency agrobacterium-mediated transformation of norway spruce (picea abies) and loblolly pine (pinus taeda)）」Plant Mol.Biol.39（1999）、407〜416頁。
【０１７０】
D.D.Ellisら、「粒子加速によるピセア・グラウカ（Picea glauca）（ホワイト・スプルース（white spruce））の安定的形質転換（Stable transformation of Picea glauca (white spruce) by particle acceleration）」Bio/Technology 11（1993）、84〜89頁。
【０１７１】
M.Fladung、「トランスジェニック・ハコヤナギ（Populus）における遺伝子安定性  I．隣接DNA配列及びT-DNA構造（Gene stability in transgenic aspen (Populus).I .Flanking DNA sequences and T-DNA structure）」Mol.Gen.Genet.260（1999）、574-581頁。
【０１７２】
「アグロバクテリウムにより媒介された形質転換後のビャクダン（Santalum album L.）におけるマーカー遺伝子の導入及び発現（Introduction and expression of marker genes in sandalwood (Santalum album L.) following Agrobacterium-mediated transformation）」Plant Science,Volume 131,Issue 1,15 January 1998、53〜63頁  Veena Shiri及びK.Sankara Rao
【０１７３】
「アグロバクテリウム・リゾゲネスにより媒介された形質転換により誘導されたトランスジェニック・ウッディ・レグメ（woody legume）（Robinia pseudoacacia L.,black locust）の再生及び形態学的改変（Regeneration of a transgenic woody legume (Robinia pseudoacacia L., black locust) and morphological alterations induced by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation）」Plant Science,Volume 88,Issue 2,1993、149〜157頁  Kyung-Hwan Han、Daniel E.Keathley、John M.Davis、及びMilton P.Gordon
【０１７４】
針葉樹種：
K.Klimaszewska、D.Lachance、M.Bernier-Cardou、R.G.Rutledge「ピセア・マリアナ（Picea mariana）、P.グラウカ（glauca）、及びP.アビエス（abies）のトランスジェニック組織系における導入遺伝子組み込みパターン及び発現レベル（Transgene integration patterns and expression levels in transgenic tissue lines of Picea mariana, P.glauca and P.abies）」Plant Cell Reports published online first DOI10.1007/S00299-003-0626-5（2003）。
【０１７５】
V.Levee、M.-A.Lelu、L.Jouanin、D.Cornu、G.Pilate「ハイブリッド・カラマツ（Larix kaempferi T L.decidua）のアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより媒介された形質転換及びトランスジェニック植物再生（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybrid larch (Larix kaempferi T L.decidua) and transgenic plant regeneration）」Plant Cell Reports 16：680-685（1997）。
【０１７６】
S.L.Bishop-Hurley、R.J.Zabkiewicz、L.Grace、R.C.Gardner、A.Wagner、C.Walter「針葉樹遺伝子操作：トランスジェニックのピヌス・ラジアタ（Pinus radiata）（D.Don）及びピセア・アビエス（Picea abies）（Karst）植物は除草剤バスターに対して抵抗性である（Conifer genetic engineering: transgenic Pinus radiata (D.Don) and Picea abies (Karst) plants are resistant to the herbicide Buster）」Plant Cell Reports 20：235-243（2001）
【０１７７】
L.-N.Tian、P.J.Charest、A.Seguin、R.G.Rutledge「ハイグロマイシン耐性は、クロトウヒ（Picea mariana）のバイオリスティック形質転換のための有効な選抜可能マーカーである（Hygromycin resistance is an effective selectable marker for biolistic transformation of black spruce (Picea mariana)）」19：358-362（2000）。
【０１７８】
サツマイモ：
「アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるサツマイモ（Ipomoea batatas （L.） Lam.）の形質転換並びにササゲ・トリプシン阻害剤及びスノードロップ・レクチンを発現している植物の再生（Transformation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) with Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin）」Plant Science,Volume 107,Issue 2,1 June 1995、215〜227頁  C.A.Newell、J.M.Lowe、A.Merryweather、L.M.Rooke、及びW.D.O.Hamilton
【０１７９】
アマ：
「アグロバクテリウムにより媒介された形質転換からのトランスジェニックアマ植物：キメラ再生体の発生率及びトランスジェニック植物の遺伝（Transgenic flax plants from Agrobacterium mediated transformation: incidence of chimeric regenerants and inheritance of transgenic plants）」Plant Science,Volume 91,Issue 2,1993、139-148頁  Jin-Zhuo Dong及びAlan McHughen
【０１８０】
コーヒー：
T.Hatanaka、Y.E.Choi、T.Kusano、H.Sano「アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより媒介された形質転換を介した胚原性カルスからのコーヒー・コーヒー・カネホラ（Coffea canephora）のトランスジェニック植物（Transgenic plants of coffee Coffea canephora from embryogenic callus via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）」19：106-110（1999）。
【０１８１】
ゴム：
P Montoro、N Teinseree、W Rattana、P Kongsawadworakul及びN Michaux-Ferriere（2000）「ヘベラ・ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）（ゴムノキ）の砕けやすいカルスにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンスにより媒介された遺伝子移入に対する外因性カルシウムの効果（Effect of exogenous calcium on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in Hevea brasiliensis (rubber tree) friable calli）」Plant Cell reports.19：851-855（2000）。
【０１８２】
チャ：
Mondal、Bhattacharya、Ahuja、Chand「体細胞胚のアグロバクテリウムにより媒介された形質転換により得られたトランスジェニック・チャ［Camellia sinensis（L.）O.Kuntze cv.Kangra Jat］植物（Transgenic tea [Camellia sinensis (L.) O.Kuntze cv.Kangra Jat] plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos）」Plant Cell Reports 20：712-720（2001）
【０１８３】
ココア：
「アグロバクテリウムにより媒介された形質転換のための対抗選抜抗生物質としてのモキサラクタム（Moxalactam）、及びテオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）体細胞胚形成に対するその正の効果（Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis）」Plant Science,Volume 164,Issue 4,April 2003、607〜615頁  Gabriela Antunez de Mayolo、Siela N.Maximova、Sharon Pishak、及びMark J.Guiltinan
【０１８４】
本明細書及び本願に含有される全ての参照、並びに参考文献の項に列挙された全ての参照が、参照として本願に完全に組み入れられる。
【０１８５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図1（A〜B）は、ニンジン葉緑体形質転換ベクターの物理的地図を示す。図1（A）は、ニンジン葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-gfp/BADHが、それぞれT7遺伝子10 5'非翻訳領域（UTR）/rps16 3'UTR並びにPpsbA 5'及び3'UTRの制御下で発現されるgfp遺伝子及びBADH遺伝子を保持していることを示す。PEP認識部位及びNEP認識部位の両方を有している16S r-RNA遺伝子のPrrnプロモーターが、カセットの発現を駆動する。図1（B）は、ニンジン葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-aadA/BADHが、aadA遺伝子及びBADH遺伝子を保持していることを示す。aadA遺伝子の発現は、シャイン・ダルガーノ配列及びpsbA 3'UTRの制御下にあり、BADHの発現は、遺伝子10 5'及びrpsl6 3'UTRにより制御される。トランスジェニック植物のサザン分析のためのプローブとして使用されたAflIII/PvuIIで消化された〜4.9kbのDNA断片、及びニンジン色素体への導入遺伝子組み込みの存在を確認するために使用されたプライマー3P/3M及び16SF/1Mの対合部位が示されている。
【図２】図2（A〜C）は、488nm青色アルゴン（レーザー）で緑色の蛍光放射で共焦点蛍光顕微鏡下で可視であった、葉緑体ベクターpDD-DC-GFP/BADHで形質転換されたニンジン培養物におけるGFPの発現を示す。図2（A）は、非形質転換対照ニンジン培養物を示し、図2（B）は、形質転換された胚原性カルスを示し、図2（C）は、球状の体細胞胚へと分化した形質転換された胚原性ニンジン・カルスを示し、図2（D）は、子葉段階へと分化した体細胞胚を示す。
【図３】図3（A〜D）は、緑色トランスジェニック細胞の黄色非トランスジェニック・ニンジン細胞培養物からの視覚的な選抜を示す。図3（A〜B）は、トランスジェニック・ニンジン細胞培養物は、発現BADHによって緑色になったが（プレートA）、野生型培養物は黄色のままであったことを示す（プレートB）。ヘテロプラスミックなトランスジェニック細胞系が選抜剤を含まない培地上に置かれた場合、トランスジェニック・ニンジン細胞培養物は、緑色トランスジェニック細胞培養物として、黄色の非トランスジェニック・ニンジン細胞培養物から区別され得る（プレートC及びD）。
【図４】図4（A〜C）は、ニンジン色素体ゲノムへの導入遺伝子（aadA及びBADH）の組み込みが、PCR及びサザンブロット分析により確認されたことを示す。図4（A）は、内部プライマー・セット3P（隣接配列上に対合）及び3M（aadA遺伝子上に対合）の使用により、64℃のアニーリング温度で〜1.65kbのサイズのPCR産物が増幅され、それにより植物細胞系への導入遺伝子組み込みが確認されたことを示す。図4（B）は、プライマー・セット16SF（ネイティブ葉緑体ゲノム上に対合）及び1M（aadA遺伝子上に対合）の使用により、64℃のアニーリング温度で〜2.5kbのサイズのPCR産物が生じ、それにより、導入遺伝子の色素体特異的な組み込みが確認されたことを示す。レーン2は、非トランスジェニック・ニンジン細胞からのDNAを表し、レーン2〜9は、7個のトランスジェニック・ニンジン細胞系からのDNAを表す。プライマー対（3P/3M及び16SF/1M）についてのプライマー対合部位は、図1Bに示されている。図4（C）は、非形質転換ニンジン及びベクターpDD-Dc-aadA/BADHで形質転換されたニンジンの色素体ゲノムのサザンブロット分析を示す。AflIII及びPvuIIで消化され、ニトロセルロース膜にトランスファーされたニンジン・ゲノムDNA（1レーン当たり5μg）に、4.9kbの放射標識されたP32 DNAプローブ（2.4kbの隣接配列及び2.5kbの導入遺伝子配列を含有している、図1B参照）をハイブリダイズさせた。レーン1、非形質転換トランスジェニック植物からの対照DNAは2.4kbのサイズのバンドを示し、細胞系1からのヘテロプラスミックなトランスジェニック植物（レーン2）は、両方のバンドを示した。異なる細胞系（レーン3〜8）からのトランスジェニック植物におけるホモプラスミーは、トランスジェニック細胞の液体培地中での反復的な継代培養により達成された。
【図５】図5（A〜B）は、BADH酵素活性（nmol/分/mg/タンパク質）を示し、BADH発現は、非形質転換ニンジン及び色素体ベクターpDD-Dc-aadA/BADHで形質転換されたニンジンからのタンパク質抽出物において分析された。図5（A）は、NAD+依存性BADH酵素の還元が、ベタイン・アルデヒドの存在下で340nmでNADHの形成に関して分析されたことを示す。形質転換されていない細胞懸濁物（U）、ニンジン根（U）、及び葉（U）には、極めて低いBADH活性が検出された。他方、形質転換されたニンジン細胞懸濁物（T）には約54％、根（T）には約72％という、葉（T）組織と比較して高いBADH活性が記録された。図5（B）は、BADH発現がウェスタンブロットにより分析されたことを示す。形質転換された及び形質転換されていないニンジン細胞培養物、根、及び葉の組織からの全細胞抽出物を調製し、各試料からの50μgの全可溶性タンパク質を、10％SDS-PAGEで泳動させ、タンパク質をImmuno-blot（商標）PVDF細胞膜へトランスファーし、ネイティブBADHに対してウサギで作製されたポリクローナル抗BADH血清をハイブリダイズさせた。抗原性ペプチドが、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結二次抗体を使用して検出された。レーン1、2、3は、形質転換されていない細胞培養物、根、及び葉からの全ニンジン抽出物を含有しており、レーン4、5、6は、形質転換された細胞培養物、根、及び葉からの全ニンジン抽出物を含有している。トランスジェニック細胞は、葉（レーン6）より約50％少ないBADHタンパク質を発現し（レーン4）、根は約25％少ないBADHタンパク質を発現している（レーン5）。
【図６】図6（A〜C）は、非形質転換ニンジン細胞懸濁培養物及び葉緑体ベクターpDD-DC-aadA/BADHで形質転換されたニンジン細胞懸濁培養物の増殖に対する、異なる塩濃度の効果を示す。図6（A）は非形質転換ニンジン細胞培養物における乾燥塊を示す。図6（B）は、100mM NaClを含有している液体培地中で作製された形質転換細胞培養物を示す。図6（C）は、塩の存在下におけるBADH活性の刺激を示す。懸濁培養物中の非形質転換ニンジン細胞及び形質転換ニンジン細胞が、0、100、200、及び300mM NaClを含有している液体培地中で、速度130rpmのシェーカー上に2週間置かれた。100及び200mM NaClを含有している液体培養培地の場合、高いレベルのBADH活性がトランスジェニック細胞培養物中に認められた。
【図７】非形質転換ニンジン植物（U）及び形質転換ニンジン植物（T）に対する塩（100〜500mM NaCl）の効果。トランスジェニック植物が、異なる濃度のNaClで1ヶ月間試験された。植物は、4週まで隔日、異なる濃度のNaClを含有している水を潅注された。
【図８】プラスミドpDD-Ta-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びトリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）（Ta）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図９】プラスミドpDD-So-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びサッカラム・オフィシナラム（Saccharum officinarum）（So）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図１０】プラスミドpDD-Dc-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びダウカス・カロタ（Daucus carota）（Dc）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図１１】プラスミドpDD-Dc-aadA/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／スペクチノマイシンXL-1 Blue MRF' Tc、及びダウカス・カロタ（Daucus carota）（Dc）からの隣接領域を有しているpDA-29（aadA/BADH発現カセット）を例示する。
【図１２】プラスミドpDD-Dc-gfp/BADHを示す。より具体的には、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びダウカス・カロタ（Daucus carota）（Dc）からの隣接領域を有しているプラスミドpDA-30（gfp/BADH発現カセット）。
【図１３】プラスミドpDD-Gh-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）（Gh）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図１４】プラスミドpDD-Gh-aadA/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／スペクチノマイシンXL-1 Blue MRF' Tc、及びゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）（Gh）からの隣接領域を有しているpDA-29（aadA/BADH発現カセット）を例示する。
【図１５】プラスミドpDD-Gh-gfp/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／XL-1 Blue MRF' Tc、及びゴッシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）（Gh）からの隣接領域を有しているpDA-30（gfp/BADH発現カセット）を例示する。
【図１６】プラスミドpDD-Zm-aadA/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／スペクチノマイシンXL-1 Blue MRF' Tc、及びジー・メイズ（Zea mays）（Zm）からの隣接領域を有しているpDA-29（aadA/BADH発現カセット）を例示する。
【図１７】プラスミドpDD-Zm-gfp/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／XL-1 Blue MRF' Tc、及びジー・メイズ（Zea mays）（Zm）からの隣接領域を有しているpDA-30（gfp/BADH発現カセット）を例示する。
【図１８】プラスミドpDD-Zm-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びジー・メイズ（Zea mays）（Zm）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図１９】プラスミドpDD-Pv-aphA-6/nptII（スイッチグラス（switchgrass））を示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びパニカム・ビルガツム（Panicum virgatum）（Pv）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図２０】プラスミドpDD-Pv-aadA/BADHを示す（スイッチグラス（switchgrass））。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞：アンピシリン／スペクチノマイシンXL-1 Blue MRF' Tc、及びパニカム・ビルガツム（Panicum virgatum）（Pv）からの隣接領域を有しているpDA-29（aadA/BADH発現カセット）を例示する。
【図２１】プラスミドpDD-Cd-aphA-6/nptII（バミューダグラス（bermudagrass））を示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞：アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びシノドン・ダクチロン（Cynodon dactylon）（Cd）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図２２】プラスミドpDD-Nt-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）（Nt）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図２３】プラスミドpDD-Os-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びオリザ・サチバ（Oryza sativa）（Os）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図２４】プラスミドpDA-66を示す。より具体的には、そのプラスミドは、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びタバコ（Tobacco）からの隣接領域を有しているpLD-CtV基本ベクター（修飾されたMCS）の誘導体であるpsbA 5'UTR骨格ベクターpUC19を例示する。
【図２５】プラスミドpDD-Ta-aadA/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／スペクチノマイシンXL-1 Blue MRF' Tc、及びトリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）（Ta）からの隣接領域を有しているpDA-29（aadA/BADH発現カセット）を例示する。
【図２６】プラスミドpDD-Ta-gfp/BADHを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／XL-1 Blue MRF' Tc、及びトリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）（Ta）からの隣接領域を有しているpDA-30（gfp/BADH発現カセット）を例示する。
【図２７】プラスミドpDD-Hv-aphA-6/nptIIを示す。より具体的には、そのプラスミドは、骨格ベクターpBluescript II KS、選抜可能マーカー／宿主細胞アンピシリン／Kan／XL-1 Blue MRF' Tc、及びホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）（Hv）からの隣接領域を有しているpDA-76（aphA-6/nptII発現カセット）を例示する。
【図２８】本明細書に含有されている記載による、アミノグリコシドに対する耐性を賦与するaphA-6遺伝子及びaphA-2遺伝子を保持しているダブル・バレル色素体ベクターの概略図である。
【図２９】図29A及び30Aは、隣接領域がPCRを使用して増幅された、メイズ葉緑体形質転換ベクターの構築を例示する。PCR産物がクローニングされ、発現カセットがtrnI/trnA遺伝子間の転写的に活性なスペーサー領域に挿入された。図30Aの発現カセットは、それぞれ（5'）遺伝子10/rpsl6 3'及びpsbA 5'/3'UTRにより制御されるGFP及びBADHの発現を駆動するPrrnプロモーターを有している。31Aの発現カセットは、aadA及びBADHの発現を駆動するPrrnプロモーターを有している。後者遺伝子は、（5'）遺伝子10/rps16 3'UTRにより制御される。図29B及び30Bは、大腸菌において試験されたメイズ葉緑体形質転換ベクターにおける遺伝子の機能を示す。GFP発現を観察するため、細胞がLB寒天（Amp）プレート上に播種され、37℃で一晩インキュベートされた。pDD34-ZM-GFP-BADHを保有している細胞は、図30Bに見られるように、UV光に曝された際に蛍光を発するのが見られた。aadA遺伝子発現を試験するため、pDD33-ZM-aadA-BADHプラスミドを保有している細胞が、スペクチノマイシン（100mg/ml）を含有しているLB寒天プレート上に播種され、37℃で一晩インキュベートされた。図31Bに見られるように、形質転換細胞はスペクチノマイシン上で増殖する。
【図３０】図29A及び30Aは、隣接領域がPCRを使用して増幅された、メイズ葉緑体形質転換ベクターの構築を例示する。PCR産物がクローニングされ、発現カセットがtrnI/trnA遺伝子間の転写的に活性なスペーサー領域に挿入された。図30Aの発現カセットは、それぞれ（5'）遺伝子10/rpsl6 3'及びpsbA 5'/3'UTRにより制御されるGFP及びBADHの発現を駆動するPrrnプロモーターを有している。31Aの発現カセットは、aadA及びBADHの発現を駆動するPrrnプロモーターを有している。後者遺伝子は、（5'）遺伝子10/rps16 3'UTRにより制御される。図29B及び30Bは、大腸菌において試験されたメイズ葉緑体形質転換ベクターにおける遺伝子の機能を示す。GFP発現を観察するため、細胞がLB寒天（Amp）プレート上に播種され、37℃で一晩インキュベートされた。pDD34-ZM-GFP-BADHを保有している細胞は、図30Bに見られるように、UV光に曝された際に蛍光を発するのが見られた。aadA遺伝子発現を試験するため、pDD33-ZM-aadA-BADHプラスミドを保有している細胞が、スペクチノマイシン（100mg/ml）を含有しているLB寒天プレート上に播種され、37℃で一晩インキュベートされた。図31Bに見られるように、形質転換細胞はスペクチノマイシン上で増殖する。
【図３１】共焦点顕微鏡下で研究された胚原性メイズ培養物におけるGFP発現を示す。図32Aは、非トランスジェニック対照であり、図32B〜Cは、形質転換されたメイズ胚原性カルスである。図30〜31における選抜は、打ち込まれたカルスをBA又はストレプトマイシンを含有しているカルス誘導培地に移すことにより、打ち込みの2日後に開始された。8週間後、異なる打ち込み実験からの多数の健康な増殖中のカルスが、蛍光実体顕微鏡及び共焦点顕微鏡の下でGFP発現に関して調査された。体細胞胚は、BA又はストレプトマイシンを含有しているメイズ再生培地上で再生させられた。
【図３２】図32（A〜B）は、ストレプトマイシン又はベタイン・アルデヒドを含有している再生培地上のメイズ植物を示す。図32Aは、トランスジェニック・メイズの構築物は選抜培地上で生長したが、非形質転換メイズ植物は生長しなかったことを示す、選抜剤上で生長することができたメイズ葉緑体トランスジェニック植物を例示する。図32Bは、適当なプライマーを使用した葉緑体トランスジェニック植物のPCR確認を示す。レーン1〜3、pDD34-ZM-gfp-BADHで形質転換された植物及びレーン4〜5、pDD33-ZM-aadA-BADHで形質転換された植物。レーン-及び+はそれぞれ陰性及び陽性の対照を表す。ゲノムDNAは葉組織から単離され、PCRは、適当なプライマーを使用して、形質転換組織及び非形質転換組織で実施された。
【図３３】図33（A〜C）は、50mg/lカナマイシンが補足された培地MST1（0.1mg/l 2,4-D及び0.5mg/lカイネチン）で選抜された葉緑体ベクターpDDC-aphA6/aphA2で形質転換されたワタ培養物（Gossypium hirsutum cv.Coker310FR）を示す。図33（A）は非形質転換対照ワタ・カルスを示す。図33（B）は形質転換された初代ワタ・カルスを示し、図33（C）は、トランスジェニック初代ワタ・カルス（プレートB）から継代培養された形質転換ワタ・カルスを示す。
【図３４】図34（A〜B）は、ワタ色素体ゲノムへの導入遺伝子（aphA6及びaphA2）組み込みがPCRにより確認されたことを示す。図34（A）は、内部プライマー3P（隣接配列上に対合）及びaphA6-rev（aphA6遺伝子上に対合）の使用によって、64℃のアニーリング温度で〜1.7kbのサイズのPCR産物が増幅され、それにより、ワタ・カルスへの導入遺伝子組み込みが確認されたことを示す。図34（B）は、プライマー・セット16SF（ネイティブ葉緑体ゲノム上に対合）及びaphA6-rev（aphA6遺伝子上に対合）の使用によって、64℃のアニーリング温度で〜2.5kbのサイズのPCR産物が生じ、それにより、導入遺伝子の色素体特異的な組み込みが確認されたことを示す。レーン1は1kbプラス（Plus）分子マーカー（ラダー）を表す。レーン2は、非トランスジェニック・ワタ・カルスからのDNAを表し、レーン3は、50mg/lカナマイシンで選抜されたトランスジェニック・ワタ・カルスからのDNAを表す。
【図３５】aadA/BADH発現カセットの配列（配列番号：1）を示す。
【図３６】gfp/BADH発現カセットの配列（配列番号：2）を示す。
【図３７】aphA-6/nptII発現カセットの配列（配列番号：3）を示す。
【図３８】一般的な色素体形質転換ベクターの概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【国際調査報告】
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