(57)【要約】本発明は、生体適合性、生分解性の硫酸カルシウムマトリクスを提供し、該マトリクスは、組織形成において使用するための硫酸カルシウム活性化血小板を含む。このマトリクスは、堅い組織（例えば、骨形成）を刺激するのに特に有用である。このマトリクスはまた、増殖因子および／またはトランスフェクト可能な遺伝子をさらに含み、これらの封入は、目的の組織の増殖を刺激するのに有用であり得る。本発明は、哺乳動物において組織の増殖を促進するために使用され得る生体適合性、生分解性のマトリクスのファミリーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を活性化する方法であって、該方法は以下：
（ａ）第１の温度で血小板含有流体サンプルを提供する工程；および
（ｂ）血小板を活性化するのに十分な量の発熱性塩を該サンプルに添加する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２】
前記サンプルが、多血小板血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、トロンビン活性を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血小板が、トロンビンによって活性化されない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の温度が、周囲温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記塩が、約３０℃〜約５０℃の範囲の温度に流体の温度を上げる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記塩が、約４０℃〜約４５℃の範囲の温度に流体の温度を上げる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発熱性塩が、発熱性硫酸カルシウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血小板が、活性化の際に増殖因子を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増殖因子が、血小板由来増殖因子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物において、予め選択された部位で骨形成を促進する方法であって、該方法は、以下：
該部位に硫酸カルシウムおよび硫酸カルシウム活性化血小板を含む生理活性マトリクスを提供する工程を包含し、ここで該生理活性マトリクスは、該部位で骨形成を促進する、
方法。
【請求項１２】
前記部位が骨欠損である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨欠損が骨空洞または骨折である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記骨折が癒着不能骨折である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生理活性マトリクスが増殖因子をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記増殖因子が血小板由来増殖因子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生理活性マトリクスが核酸をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が、前記部位で、予め選択された発現可能な遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、前記予め選択された部位で細胞にトランスフェクトされ、そして該細胞によって発現され得る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生理活性マトリクスが、前記予め選択された部位で細胞の浸潤、増殖および分化を可能にするような寸法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が骨前駆体細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生理活性マトリクスがトロンビン活性を実質的に含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記活性化血小板が、多血小板血漿中に位置付けられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１１に記載の方法であって、該方法は、前記予め選択された部位に目的の形を生成するために生理活性マトリクスを操作する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
前記硫酸カウシウム活性化血小板が、請求項１に記載の方法によって生成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
結晶性硫酸カルシウムおよび硫酸カルシウム活性化血小板の混合物を含む、生理活性マトリクス。
【請求項２８】
前記マトリクスがトロンビン活性を実質的に含まない、請求項２７に記載のマトリクス。
【請求項２９】
増殖因子をさらに含む、請求項２７に記載のマトリクス。
【請求項３０】
前記増殖因子が血小板由来増殖因子である、請求項２９に記載のマトリクス。
【請求項３１】
核酸をさらに含む請求項２７または請求項２９に記載のマトリクス。
【請求項３２】
前記核酸が、予め選択された前記部位で発現可能な遺伝子をコードする、請求項３１に記載のマトリクス。
【請求項３３】
前記生理活性マトリクスが、前記予め選択された部位で細胞の浸潤、増殖および分化を可能にするような寸法である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が骨前駆体細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が骨芽細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
生理活性マトリクスであって、該マトリクスは以下：
（ｉ）外表面を規定し、そして結晶性硫酸カルシウムおよび多血小板血漿を含み、そして必要に応じて第１の増殖因子をさらに含む、第１のドメイン；ならびに
（ｉｉ）結晶性硫酸カルシウムおよび多血小板血漿を含み、そして必要に応じて第２の異なる増殖因子をさらに含む、第１のドメインの外表面上に部位付けされる第２のドメイン
を含み、
ただし第１のドメインおよび第２のドメインの少なくとも１つは、増殖因子を含む、
生理活性マトリクス。
【請求項３７】
前記第１のドメインの多血小板血漿が、硫酸カルシウム活性化血小板を含む、請求項３６に記載のマトリクス。
【請求項３８】
前記第２のドメインの多血小板血漿が、硫酸カルシウム活性化血小板を含む、請求項３６または請求項３７に記載のマトリクス。
【請求項３９】
前記第１のドメインがトロンビン活性を実質的に含まない、請求項３６に記載のマトリクス。
【請求項４０】
前記第２のドメインがトロンビン活性を実質的に含まない、請求項３６または請求項３９に記載のマトリクス。
【請求項４１】
前記第１のドメインが、前駆体細胞の浸潤、増殖および分化を可能にするような寸法である、請求項３６に記載のマトリクス。
【請求項４２】
前記第２のドメインが、前駆体細胞の浸潤、増殖および分化を可能にするような寸法である、請求項３６に記載のマトリクス。
【請求項４３】
前記第１のドメインが第１の増殖因子を含む、請求項３６に記載のマトリクス。
【請求項４４】
前記第２のドメインが第２の増殖因子を含む、請求項３６または請求項４３に記載のマトリクス。
【請求項４５】
哺乳動物において、予め選択された部位で目的の核酸を発現させる方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該哺乳動物における該予め選択された部位に請求項３２のマトリクスを導入する工程；および
（ｂ）該予め選択された部位で該核酸の発現を可能にする工程、
を包含する、
方法。
【請求項４６】
前記核酸が増殖因子をコードする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記増殖因子が骨芽増殖因子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸が、血小板由来増殖因子および骨形態形成タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸がプロモーター配列をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記部位が骨欠損である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記骨欠損が、骨空洞または骨折である、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、その開示が本明細書中で参考として援用される、２００１年８月９日に出願された米国特許出願６０／３１１，２１６の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、組織修復、ならびに、より詳細には硬組織形成を促進するための生理活性マトリクス、このようなマトリクスを作製する方法、およびこのようなマトリクスの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
骨の形成は、胚発生の間に開始し、そして再構築を通じて成体の生活の間続く動的プロセスである。時折、骨はまた、骨修復が必要とされる場合に再生され得る。細胞外マトリクス形成を伴う細胞の増殖および分化を含む、複雑な系列の事象が、骨形成に要求される。類似の系列の事象が、骨修復の間に生じる。
【０００４】
骨の修復および再生のプロセスは、他の組織における創傷治癒のプロセスに類似する。一般的に、損傷に応答して、周囲の組織から、間葉細胞が創傷部位へと移動し、そして軟骨細胞または骨細胞へと分化する。代表的な系列の事象としては、以下が挙げられる：出血、血餅形成；損傷した組織の除去と同時発生する血餅の溶解；肉芽組織の内殖；軟骨の形成；毛細管内植および軟骨ターンオーバー；迅速な骨形成（仮骨組織）；ならびに、最終的に、仮骨の皮質骨および海綿質への再構築。従って、骨修復は、多くの細胞型および調節分子を含む複雑なプロセスである。骨折修復に関与する様々な細胞集団としては、幹細胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、および破骨細胞が挙げられる。
【０００５】
多くの成長因子もまた、再生プロセスに関与する。これらとしては、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびインスリン成長因子（ＩＧＦ）ファミリーのメンバーが挙げられる。ＰＤＧＦは、例えば、インタクトな頭蓋冠および単離されたラットの骨芽細胞の両方において、骨細胞複製およびＤＮＡ合成を刺激することが示されている。新規の骨形成を刺激し得る能力を有することが報告されている他の成長因子またはホルモンとしては、酸性線維芽細胞増殖因子、エストロゲン、マクロファージコロニー刺激因子、およびカルシウム調節剤（例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ））が挙げられる。
【０００６】
骨修復に関与する他の調節因子は、全身性のホルモン、サイトカイン、成長因子、および増殖および分化を調節する他の分子を含むことが公知である。種々の骨誘導剤が精製され、そしてポリペプチド成長因子様分子であることが示されている。骨原性成長因子に富む供給源は、多血小板血漿である。この血小板は、新脈管形成および骨形成を促進する助けをするＰＤＧＦ、ＴＧＦ−βなどのような成長因子を含む顆粒を有する。
【０００７】
外傷、癌手術または発生における誤りの結果として生じる欠損を再構築するために用いられるような、骨再構築の技術は、骨修復を促進するための新しい方法により改良される。自己骨移植片、または軟部組織および血管が付着した骨移植片の使用のような、現在用いられている再構築方法は、費用および困難性の両方の有意な欠点と関連している。例えば、有用な量の自己骨を収集することは、容易に達成されず、そして自己移植片でさえ、頻繁に、感染されるかまたは再吸収を受ける。
【０００８】
骨成長を誘導する従来の方法は、コラーゲンのような材料を用いる骨成長を支持するために、合成インプラントまたはマトリクスを使用している。生理活性マトリクスを設計する際に、以下の特徴に対する特定の考慮がなされなければならない：生体適合性、足場材料（組織特異的細胞の移動および増殖を可能にするマトリクスの能力）、充填（充填、従って、再生部位の本来の形状を保存する能力）、障壁効果（再生部位の再増殖から関連のない細胞を排除する能力）、およびキャリア機能（操作された移植片の生理活性因子を運ぶおよび送達する能力）。しかし、生理活性マトリクスを設計する際の最も重要な制限の１つとして、どの増殖因子および細胞接着分子が、最終的に、組織形成を助けるおよび制御するのかを決定することができないままである。
【０００９】
いくつかのグループは、骨刺激タンパク質およびポリペプチドを用いることがインビボでの骨修復に影響を与える可能性を調査している。しかし、組換えタンパク質を精製する時間および費用を含む、これらの型の処置プロトコルと関係する多くの欠点が存在する。また、一旦、動物に投与されると、ポリペプチドは、治療剤として一般的に所望されるものよりも、より不安定になり得、そしてこれらは、タンパク質分解の攻撃の影響を受けやすいかもしれない。さらに、組換えタンパク質の投与は、種々の阻害、さもなければ、有害な免疫応答を開始し得る。さらなる制限は、頻繁に、キャリアの、有意なレベルの活性薬剤を所望の成長部位（ｌｏｃｕｓ）へと送達するためのキャリアの能力に関連する。例えば、多くの材料が、ＰＤＧＦの持続性放出について試験されている。ポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ）は、一般的に用いられるが、非常に迅速に吸収されると考えられる。ＰＬＬＡの改変は、改善された再吸収速度および延長された再吸収速度を有する、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）として提唱されている。しかし、両方の場合、細胞付着は制限され得る。また、これらのポリヒドロキシ酸は、移植部位において、望ましくない組織反応を伴って、酸性分解生体産物を生成し得る。最近、酸性化合物に起因する組織反応を制限し、そして細胞付着を改善するために、ＰＬＬＡとキトサン（細胞外マトリクス中のグルコサミノグリカンに構造的に類似する合成化合物）との組み合わせのような他の改変が、提唱されている。また、コラーゲンディスクまたはメチルセルロースゲルが、これらの迅速な再吸収速度に起因する制限された結果を伴って、ＰＤＧＦを送達するために使用されている。ヒドロキシアパタイト結晶のアニオン性特徴は、最近、ＰＤＧＦのようなカチオン性生理活性分子を送達するために用いられている。この場合に再生される骨組織は、合成ヒドロキシアパタイト（非再吸収性化合物）の存在により定量的に変化される。これらの場合の各々において、生体マトリクスの必要とされる性質のいくつかは、本質的に失われている。いくつかの場合、足場材料は、放出を助けるまで与えられるか、または他の場合では、足場材料を補助するまで与えられる組織充填物である。
【００１０】
成長因子治療に加えて、骨成長を誘導する従来の方法は、遺伝子治療の使用を意図している。しかし、現在、肝臓および筋肉以外の組織においてプラスミドＤＮＡを送達することにはいくつかの制限がある。体細胞遺伝子治療の初期の試みは、エキソビボ遺伝子治療（例えば、標的細胞が体から取出され、組換え遺伝子を保有するベクターでトランスフェクトまたはインフェクトされ、そして体へと再移植される（「自己細胞移入」））と呼ばれる、遺伝子を組織に導入する間接的手段に依存する。種々のトランスフェクション技術が、現在、利用可能であり、これらは、ＤＮＡをインビトロで細胞へと移入するために用いられ得；これらとしては、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、または組換えウイルスベクターでの形質導入が挙げられる。このようなエキソビボ処置プロトコルは、ＤＮＡを以下を含む種々の異なる細胞型へと移入するために提唱されている：上皮細胞（米国特許第４，８６８，１１６号；ＭｏｒｇａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ  ＷＯ８７／００２０１；Ｍｏｒｇａｎら、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：１４７６−１４７９；ＭｏｒｇａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、米国特許第４，９８０，２８６号）、内皮細胞（ＷＯ８９／０５３４５）、肝細胞（ＷＯ８９／０７１３６；Ｗｏｌｆｆら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３３４４−３３４８；Ｌｅｄｌｅｙら、１９８７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：５３３５−５３３９；ＷｉｌｓｏｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、ＷＯ８９／０７１３６；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８４３７−８４４１），線維芽細胞（Ｐａｌｍｅｒら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：１０５５−１０５９；Ａｎｓｏｎら、１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４：１１−２０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５７５−１５７８；ＮａｕｇｈｔｏｎおよびＮａｕｇｈｔｏｎ、米国特許第４，９６３，４８９号）、リンパ球（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０）、ならびに造血幹細胞（Ｌｉｍ，Ｂ．ら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８８９２−８８９６；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【００１１】
他の組織におけるトランスフェクション効率を改善するために、いくつかの研究が、脂質とポリマーとの異なる組み合わせでのプラスミドＤＮＡのコーティングを提唱する。例えば、ＤＮＡ分子を正に電荷した脂質でコーティングすることは、細胞によるＤＮＡの取り込みを助ける。直接的なインビボ遺伝子移入は、リポソーム（Ｌｅｄｌｅｙら、１９８７，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０：１）または、ウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含むプロテオリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１０６８）中に捕捉されたＤＮＡ；およびポリリジン−糖タンパク質キャリア複合体に連結されたＤＮＡの処方物を用いて試みられた。さらに、「遺伝子銃」が、細胞への遺伝子送達のために用いられている（オーストラリア国特許第９０６８３８９号）。さらに、裸のＤＮＡまたはリポソームと会合したＤＮＡが、細胞へのＤＮＡの移入のために間質空間へと注入するための液体キャリア溶液中に処方され得ることが推測されている。
【００１２】
おそらく、エキソビボであろうとインビボであろうと、現在の考案されている遺伝子治療に関係する最も大きな問題の１つは、ＤＮＡを標的化細胞集団へと効率的に移入すること、およびインビボでの遺伝子産物の高レベル発現を達成することが出来ないことである。ウイルスベクターは、最も効率的な系と考えられ、そして組換え複製欠損ウイルスベクターは、エキソビボおよびインビボの両方で細胞を形質転換（すなわち、インフェクト）するために用いられている。このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ならびにヘルペスウイルスベクターが挙げられている。遺伝子移入での高い効率の一方、ウイルスベクターの使用に関係する主要な不利益としては、多くのウイルスベクターが非分裂細胞に感染することが出来ないこと；挿入突然変異に関係する問題；ウイルスおよび潜在的なヘルパーウイルス産生に対する炎症反応、ならびに／または有害なウイルスの産生および有害なウイルスの他のヒト患者への伝染が挙げられる。
【００１３】
殆どの細胞型の、外来ＤＮＡを取込みそして発現する効率が低いことに加えて、多くの標的細胞集団は、体内における数が少なくて、特定の標的細胞型に対するＤＮＡの提示の効率が、なおさらに低下することが見出されている。現在、ＤＮＡが、標的化細胞に対して標的化される効率を増大させるための改良された方法の必要性がある。
【００１４】
骨修復および骨再生のプロセスにおける欠陥は、いくつかのヒトの疾患および障害（例えば、骨粗しょう症および骨形成不全症）の発症に関連している。骨修復機構の不全もまた、もちろん、臨床整形外科の診療における有意な合併症（例えば、骨折後の繊維質の偽関節（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）、インプラント界面不全（ｉｍｐｌａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆａｉｌｕｒｅｓ）、および大同種移植片不全（ｌａｒｇｅ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｆａｉｌｕｒｅｓ））と関係している。従って、他のマトリクス、およびこのようなマトリクスを作製するためのより効率的な方法、ならびに骨成長を誘導するためのこのようなマトリクスを使用する方法、および遺伝子治療と組合わせてこのようなマトリクスを使用する方法の必要性がまだある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物において組織の増殖を促進するために使用され得る生体適合性、生分解性のマトリクスのファミリーを提供する。このマトリクスは、硬組織形成（例えば、骨形成または軟骨形成）を刺激するために特に有用であり、従って、硬組織における欠損の修復に使用され得る。特定の環境下では、マトリクス中に血小板を含む（これは、活性化された場合、新しい組織形成を増強する増殖因子（例えば、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βを放出する）ことが、有益であり得る。今までは、血小板は、代表的には、精製されたトロンビン（例えば、精製されたウシトロンビン）への曝露によって活性化されている。しかし、ウシトロンビンでの血小板の活性化は、所望され得ない。なぜなら、（ｉ）ウシトロンビンは、完全に特徴づけされ得ず、そしてバッチからバッチへと変化し得、そして（ｉｉ）このアプローチは、不要な因子（例えば、プリオン）を、トロンビンの供給源からこのマトリクスの意図されるレシピエントへと感染させる固有の危険性を有するからである。
【００１６】
本発明は、部分的または完全に脱水された発熱性の塩（例えば、発熱性硫酸カルシウム）が、水溶液中で再水和されるプロセスに（例えば、多血小板血漿中の）血小板を曝すことによって、血小板を活性化することが可能であるという発見に一部基づいている。このアプローチを使用することによって、トロンビンへの曝露により血小板を予め活性化する必要がない。得られたマトリクスは、硫酸カルシウム結晶（骨の増殖を支持することにおいて有用であり得る）、および活性化血小板（両方の増殖を誘導する）を含む。従って、得られたマトリクスは、トロンビンで血小板を活性化することに付随する固有の問題を有さない。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「多血小板血漿」は、その血漿が由来した血液サンプルより高い密度、より好ましくは２倍の密度、および最も好ましくは４倍の密度の血小板を有する任意の血漿調製物を意味すると理解される。本明細書中で使用される場合、用語「発熱性の塩」は、水溶液と組み合わされた場合、その溶液の温度を上昇させ、そして組織形成を支持し得る結晶格子を生成する任意の塩を意味すると理解される。本明細書中で使用される場合、用語「発熱性硫酸カルシウム」は、水溶液と組み合わされた場合、その水溶液の温度を上昇させる任意の硫酸カルシウム塩を意味すると理解される。発熱性硫酸カルシウムは、部分的または完全に脱水され、従って１カルシウムイオンあたり２個より少ない水分子、より好ましくは１個より少ない水分子を含む。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、血小板を活性化する方法を提供する。この方法は、第１の温度で血小板含有流体サンプル（例えば、多血小板血漿）を提供することを包含する。次いで、発熱性の塩（例えば、発熱性硫酸カルシウム）が、サンプルの温度を閾値点まで上昇させるのに十分な量でサンプルに添加される。一旦、この溶液が、閾値点またはそれより高い温度に達すると、サンプル中の血小板の一部が活性化される。得られたマトリクスは、硫酸カルシウム活性化血小板を含む。このマトリクスは、実質的にトロンビン活性を不含であり得、そして実質的にトロンビン活性化血小板を不含であり得る。
【００１９】
用語「硫酸カルシウム活性化血小板」は、発熱性硫酸カルシウムへの血小板の曝露によって、血小板が活性化されている（例えば、血小板由来増殖因子を産生するように刺激されている）血小板のサンプルまたは調製物を意味すると理解される。本明細書中で使用される場合、血小板含有サンプルまたは血小板含有調製物は、この調製物またはこのサンプルがラテックス凝集アッセイによってアッセイされた場合、フィブリノーゲン含有溶液中の可溶性フィブリン単量体複合体の濃度における検出可能な増加を誘導するのに十分なトロンビンを含まない場合、「実質的にトロンビン活性を含まない」と理解される。
【００２０】
１つの実施形態において、このサンプルは、周囲温度（例えば、室温、より具体的には約２０℃）で提供される。しかし、塩の添加は、好ましくは、サンプルに、約３０℃〜約５０℃の範囲、およびより好ましくは約４０℃〜約４５℃の範囲の温度までの上昇を引き起こす。次いで、血小板は、上昇した温度への曝露によって活性化され、そして特定の増殖因子（例えば、ＰＤＧＦおよびＴＧＦβ）を放出する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中の予め選択された部位において骨形成を促進する方法を提供する。この方法は、その部位に、硫酸カルシウムおよび硫酸カルシウム活性化血小板を含む生物活性マトリクスを提供する工程を包含し、ここで、この生物活性マトリクスは、その部位における骨形成を促進する。このマトリクスは、好ましくは、トロンビン活性を実質的に有さず、そして／またはトロンビン活性化血小板を実質的に含まない。
【００２２】
１つの実施形態において、この方法は、骨欠損（例えば、骨空洞または骨折）の部位における骨の形成を促進するために使用され得る。本発明のデバイスが癒着不能骨折（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ  ｂｏｎｅ  ｆｒａｃｔｕｒｅ）の処置において特に有益であり得ることが企図される。
【００２３】
別の実施形態において、このマトリクスは、増殖因子、抗生物質、または別の薬学的活性薬剤のような添加剤、あるいは遺伝子治療のための薬剤をさらに含む。１つの好ましい実施形態において、このマトリクスは、増殖因子をさらに含む。このマトリクスは、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、およびＩＧＦからなる群から選択される増殖因子を含み得る。しかし、１つの好ましい実施形態において、このマトリクスは、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦのうちの１つ以上をさらに含む。
【００２４】
別の実施形態において、この生物活性マトリクスは、その部位において発現可能な、予め選択された遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸（例えば、ベクター）をさらに含む。この核酸は、好ましくは、予め選択された部位において細胞中にトランスフェクトされ得、そしてその細胞により発現され得る。従って、本発明のマトリクスは、哺乳動物中の予め選択された部位での遺伝子治療を容易にするための、センスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列をコードする核酸を送達するために使用され得る。
【００２５】
しかし、本発明のマトリクスが、遺伝子治療を容易にするための核酸、医薬（例えば、抗生物質のような生物活性物質）、および増殖因子のうちの１つ以上を含み得ることが企図される。このような添加剤の選択が、このマトリクスの意図される用途に依存することが企図される。
【００２６】
別の実施形態において、このマトリクスは、好ましくは、予め選択された部位における細胞（例えば、骨前駆細胞（例えば、骨芽細胞））の浸潤、増殖および分化を可能にするように寸法取られた結晶格子である。得られたマトリクスは、成形しやすく、そして予め選択された部位における任意の目的の形状を作るために操作され得る。例えば、このマトリクスは、骨空洞または骨折の中へ挿入され、次いで本来の骨の構造を模倣および／またはその間に適合する（ｉｎｔｅｒｆｉｔ）ように成形され得る。
【００２７】
別の局面において、本発明は、硫酸カルシウムおよび硫酸カルシウム活性化血小板の混合物を含む生物活性マトリクスを提供する。このマトリクスは、トロンビン活性を実質的に有さず、そして／またはトロンビン活性化血小板を実質的に含まない。このマトリクスの組織形成活性は、マトリクス中に増殖因子（例えば、ＰＤＧＦまたはＢＭＰ）を組み込むことによって増強され得る。さらに、または代替的には、このマトリクスは、例えば、その部位において発現可能な、予め選択された遺伝子をコードする核酸をさらに含み得る。
【００２８】
別の局面において、本発明は、多機能性生物活性マトリクスを提供する。このマトリクスは、他の表面を規定し、そして結晶性硫酸カルシウムおよび多血小板血漿を含む第１ドメインを含む。第１ドメインは、必要に応じて第１の増殖因子をさらに含む。結晶性硫酸カルシウムおよび多血小板血漿を含む第２ドメインが、第１ドメイン上に（好ましくは第１ドメインの外表面あたりに）配置される。この第２ドメインは、必要に応じて、第２の、異なる増殖因子をさらに含む。しかし、これらのドメインの少なくとも１つ（しかし、好ましくは両方）は、増殖因子をさらに含む。
【００２９】
１つの実施形態において、第１ドメインの多血小板血漿は、硫酸カルシウム活性化血小板を含み、そして／または第２ドメインの多血小板血漿は、硫酸カルシウム活性化血小板を含む。これらのドメインの１つ（しかし、好ましくは両方）は、トロンビン活性を実質的に有さず、そして／またはトロンビン活性化血小板を実質的に含まない。さらに、第１ドメインおよび／または第２ドメインは、前駆細胞（例えば、骨前駆細胞（例えば、骨芽細胞））の浸潤、増殖および分化を可能にするように寸法取られた結晶格子である。１つの実施形態において、第１ドメインは、必要に応じて、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、これは血管の形成を刺激する）を含む。別の実施形態において、第２ドメインまたは外側のドメインは、必要に応じて、増殖因子（例えば、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−β）またはマトリクス中への細胞（例えば、骨前駆細胞）の移動を刺激または促進し得る任意の他の増殖因子を含み得る。しかし、各ドメイン中または各層中へ組み込むための増殖因子の選択は、目的の部位において作製される実際の組織に依存する。この型のデバイスは、適切な骨前駆細胞を呼び込むことによって、階層化された骨再生を可能にする。一旦、細胞がそれらの好ましい位置に移動すると、細胞は適切な細胞型に分化される。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、哺乳動物において組織形成、より好ましくは硬組織形成を促進するための生物活性のマトリクスのファミリーを提供する。全ての生物活性マトリクスは、結晶性硫酸カルシウムマトリクスを含み、そして必要に応じて、種々の添加剤のうちの１つ以上を含む。１つの実施形態において、この結晶性マトリクスは、添加剤として、多血小板血漿の形態の活性化血小板、好ましくは硫酸カルシウム活性化血小板を含む。別の実施形態において、この結晶性マトリクスは、このマトリクスがレシピエントに移植された場合に所望の効果を誘導するか、または所望の効果の原因となる生物活性薬剤（例えば、抗生物質、増殖因子または別の薬学的活性薬剤）を含む。別の実施形態において、この結晶性マトリクスは、このマトリクスがレシピエントに移植された場合に遺伝子治療を容易にするための核酸（例えば、目的のヌクレオチド配列を含むベクター）を含む。特定のマトリクスのための添加剤の選択が、最終的には意図されるマトリクスの機能に依存することが企図される。
【００３１】
本発明の実施において有用な結晶性硫酸カルシウムマトリクスは、種々の出発材料を使用して作製され得る。本発明の実施の間、発熱性硫酸カルシウム（例えば、部分的または完全に脱水された硫酸カルシウム）が、水溶液と合わされる。これは、発熱反応、および新しい結晶性硫酸カルシウムの形成を生じる。
【００３２】
本発明の実施において有用な、部分的または完全に脱水された硫酸カルシウムは、硫酸
カルシウム二水和物（ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ）の焼成（ｃａｌｃｉｎａｔｉｏｎ）によって製造され得る。焼成は、部分的脱水または完全な脱水を生じるように調節され得る。焼成の方法に依存して、異なる形態の半水化物が得られ得る。これらの形態は、α−半水化物またはβ−半水化物と呼ばれる。β−形態は、毛細管の孔を有する微細結晶の線維状凝集体であり、一方α−形態は、桿状または角柱の形態の切断フラグメントおよび結晶からなる。α−半水化物が水と混合されると、得られる生成物は、β−半水化物から得られる生成物より強く、かつ硬い。
【００３３】
硫酸カルシウム半水化物はまた、焼セッコウ、セッコウ半水化物、および乾燥硫酸カルシウムとして公知である。硫酸カルシウム半水化物は、種々の供給源から得られ得る。例えば、医薬品等級の硫酸カルシウム半水化物は、米国Ｇｙｐｓｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から市販されている。さらに、α形態の硫酸カルシウム半水化物は、ＬＩＦＥＣＯＲＥ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｈａｓｋａ，ＭＮからＣＡＰＳＥＴ（登録商標）の商品名で入手可能であり得る。
【００３４】
硫酸カルシウムマトリクスは、組織形成の支持体として、長い年数使用されてきた。その上、硫酸カルシウムは、１００年にわたって整形外科学において、そして約３０年間歯科学において、安全に使用されてきている（Ｐｅｌｔｉｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．９７，３１１，１９５９；Ｃａｌｈｏｕｎら、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．４２，１２４４，１９６３；Ｓｉｄｑｕｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６，１３２７，１９９５；Ｓｏｔｔｏｓａｎｔｉ，Ｃｏｍｐｅｎｄ．Ｃｏｎｔｉｎ．Ｅｄｕｃ．Ｄｅｎｔ．ＩＩＩ，２２６，１９９２；Ｓｏｔｔｏｓａｎｔｉ  Ｐｒａｃｔ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃｓ  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ．Ｄｅｎｔ．５，６１，１９９３；Ａｎｄｒｅａｎａ，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ６９，６０１，１９９８；Ａｎｄｒｅａｎａ，Ｓ．，Ｃｏｖａｎｉ，Ｕ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ５，５，１９９８；Ｓａｔｏら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９，１８９５，１９９８；Ｐｅｃｏｒａら、Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．８４，４２４，１９９７；Ａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  １７，８９５，１９９６；Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｃ．Ｄ．，Ａｐｐ，Ｇ．Ｒ．Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ４２，６８５，１９７１；およびＳｏｔｔｏｓａｎｔｉ，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．Ｕｐｄａｔｅ  ４，６９，１９９３）。これらの研究は、再生部位での炎症反応のような硫酸カルシウムの有害な効果は示さない。
【００３５】
硫酸カルシウムの組織形成（誘導活性（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ））を支持する能力は、組織誘導（誘導活性（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ａｃｉｔｉｖｉｔｙ））を支持する組織片マトリクスの能力と区別され得る。理想的な再生マトリクスは、組織作動性であり、その結果、組織形成は、可能になり（誘導活性）そして促進される（誘導活性）。
【００３６】
１つの好ましい硫酸カルシウムマトリクスは、多血小板血漿由来の活性化血小板（例えば、硫酸カルシウム活性化血小板）を含む。
【００３７】
多血小板血漿は、濃縮血小板を含む血漿であり、当該分野で公知の種々の技術を使用して、全血（より好ましくは、自己全血）から作製され得る。例えば、本発明の実施に有用な多血小板血漿は、全血を遠心分離に供し、多血小板血漿を赤血球から分離することによって調製され得る。次いで、多血小板血漿画分は、第２回の遠心分離に供され、血小板のペレットおよび血小板の少ない血漿を産生する。大部分の血小板の少ない血漿は、除去され得、濃縮血小板および僅かな割合の血小板の少ない血漿を後に残し得る。次いで、血小板の少ない血漿は、濃縮血小板を再懸濁するために使用され得る。多血小板血漿を調製するために有用な遠心分離機は、種々の販売元から得られ得、これらとしては、例えば、ＰＬＡＣＯＮＴＭ遠心分離機が挙げられ、ＯＣＴ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡから得られ得る。
【００３８】
平均して、全血血小板数は、血液１μＬあたりで１５０×１０３〜３５０×１０３の範囲であるが：多血小板血漿において、血小板濃度の３〜４倍の増加が、達成され得る。活性化された場合、例えば、アゴニストに対して曝露することによって、血小板は、濃縮体およびα−顆粒の内容物を放出し、膜リン脂質由来の物質を合成し、そして凝固カスケード事象を開始する（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００）。血小板アゴニストは、代表的に、強いアゴニストまたは弱いアゴニストとして分類される（Ｈｏｆｆｍａｎら、２０００，前述，およびＢｌｏｃｋｍａｎｓら、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９，１４３，１９９５）。１つの定義によって、強いアゴニストは、凝固が阻害される場合でさえ、顆粒の分泌を引き起こし得るアゴニストである。トロンビンおよびコラーゲンは、強いアゴニストの例として考えられる。対照的に、弱いアゴニスト（例えば、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）およびエピネフリン）は、分泌のための凝固が起こるのに必要とされる。熱は、血小板活性化における弱いアゴニストとして作用し得ることが報告されている（Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５６，２４４，１９９７，およびＧａｄｅｒら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７４，８６，１９９０）。活性化の際に、血小板濃縮体（最も迅速に、血小板細胞小器官から分泌される）は、ＡＤＰおよびＡＴＰならびにセロトニンを放出する。α−顆粒は、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β１、結合組織活性化ぺプチドＩＩＩ（ＣＡＴＰＩＩＩ）、トロンボスポンジン、第Ｖ因子、フィブリノーゲン、第ＸＩ因子、プラスミノーゲン活性化インヒビター１（ＰＡＩ−１）、および接着タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、ファイブロネクチン、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）、およびＰ−セレクチン（ＧＭＰ−１４０とも呼ばれる、Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンと構造的に類似））を放出し得る。血小板中に見出される細胞質因子は、第ＸＩＩＩ因子および血小板誘導性内皮細胞増殖因子（ＰＤＥＣＧＦ）である。
【００３９】
硫酸カルシウム結晶は、骨成長を支持するために作用するが、硫酸カルシウムの多血小板血漿との組み合わせが、マトリクスを凝固させ、血小板がインビボで通常提供する、修復因子を提供することが見出されている。これらのマトリクス要素および増殖因子の多くが、細胞の増殖および分化の制御ならびに組織形成に関与することが示された。多血小板血漿が硫酸カルシウムと組み合わされる場合、溶液の温度を約３０℃と約５０℃の間（および、より好ましくは約４０℃〜約４５℃）にまで上昇し得る、得られる発熱反応は、その上に配置された活性化血小板を有するリン酸カルシウム結晶の形成を生じる、ことが本明細書中で示された。多血小板血漿中で、トロンビンまたは他のアゴニストに曝露することによって血小板を前もって活性化する必要性を排除する。
【００４０】
別の好ましい硫酸カルシウムマトリクスは、結晶性硫酸カルシウムおよび増殖因子を含む。好ましい増殖因子としては、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。ＰＤＧＦは、種々の細胞に対して多機能性作用を誘発する。ＰＤＧＦは、中胚葉誘導性細胞（例えば、繊維芽細胞、脈管平滑筋、グリア細胞および軟骨細胞）に対して分裂促進性である。また、ＰＤＧＦは、好中球、単球および線維芽細胞の、強力な化学誘引剤および活性化因子である。ＰＤＧＦの他の作用としては、細胞外マトリクスタンパク質の合成および分解を調節する能力ならびにさらなる増殖因子の合成を刺激する能力が挙げられる。従って、ＰＤＧＦは、組織損傷に対する細胞応答において、中胚葉細胞増殖および活性の刺激剤ならびに修復プロセスに関与する他の細胞に対する化学誘引剤として必須の役割を果たす。
【００４１】
結晶性硫酸カルシウムおよび増殖因子を含むマトリクスは、水溶液中で発熱性硫酸カルシウムを増殖因子と合わせることによって形成される。溶液の温度を約３０℃と約５０℃との間（より好ましくは、約４０℃〜約４５℃まで）まで上昇し得る、得られた発熱反応は、その中に配置された増殖因子を含むリン酸カルシウム結晶の形成を生じる。
【００４２】
別の好ましい硫酸カルシウムマトリクスは、結晶性硫酸カルシウムおよび核酸を含む。好ましい実施形態において、目的の遺伝子（例えば、組織成長刺激因子をコードする遺伝子）をコードする核酸ベクターは、硫酸カルシウムマトリクスと合わされる。このようなマトリクスは、水溶液中で、発熱性硫酸カルシウムを目的の核酸と合わせることによって形成される。溶液の温度を約３０℃と約５０℃との間（より好ましくは、約４０℃〜約４５℃）まで上昇し得る、得られた発熱性反応は、その中に配置される核酸を有するリン酸カルシウム結晶の形成を生じる。得られるマトリクスは、移植される場合、移植部位で遺伝子治療を容易にするためにトランスフェクト細胞を使用され得る。この実施形態が、骨成長を刺激することにおいて有用である一方、他の組織（例えば、脈管組織および心臓血管組織）の成長を刺激するためにもまた使用され得る。
【００４３】
本発明の背景において、目的の核酸は、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ核酸、デオキシリボ核酸あるいはペプチジル核酸であり得る。これらの名称は、分子生物学において、従来使用される。簡単には、「センス」は、標的配列と相同であるかまたは同一である配列を保有する核酸をいう一方、アンチセンスは、標的配列に対して相補的である配列と相同であるかまたは同一である配列を保有する核酸をいう。本発明によって追求される目的に従って、目的の核酸は、目的の少なくとも１つの遺伝子、および細胞または宿主生物体において発現されるようにするエレメント、を含む。目的の核酸は、有利には、プレスミドＤＮＡまたはウイルスベクター（これらのベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス由来であり、特に、ワクシニアウイルスまたはＭＶＡウイルス、疱疹ウイルス、アデノ随伴ウイルスなど）の形態である。
【００４４】
本発明の内容物において使用され得るプラスミドの選択は、広い。これらは、任意の起源（原核生物的または真核生物的）であり得るか、または種々の要素を組み立てることによって形成され得る。一般的な方法において、これらのプラスミドは、当業者に公知である。膨大な数のプラスミドが市販されている一方、遺伝子操作技術を使用してこれらを構築することはまた可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。プラスミドは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得、これは、例えば、ｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＥＰ４、またはｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来である。指標として、本発明において使用される、プラスミドＤＮＡは、当該分野の一般的な実施に従って、増幅されそして精製され得る。これが現在広く公知である技術であるとすれば、ほんの短い記載によって処理の様式が提供され、これは、プラスミドを産生細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に導入する工程、これらの細胞を適切な条件（当該分野の一般的な知識およびプラスミドによって実施される選択系に基づいて、当業者によって容易に確立される条件）下で培養する工程、および慣例的な技術を使用してプラスミドＤＮＡを回収する工程からなる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，前述を参照のこと）。精製工程はまた、例えば、仏国出願ＦＲ  ９６１１０７５号に記載される方法、または文献に公開される任意の他の方法を実施することによって認識され得る。
【００４５】
目的の核酸は、アンチセンスＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡをコードし得、次いで、これは、治療目的のポリペプチドに翻訳される。核酸は、ゲノムの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または混合（少なくとも１つのイントロンが欠失されるミニ遺伝子）型であり得、そして宿主細胞に関して同種であるかまたは異種であり得る。この核酸がコードするポリペプチドが、天然に見出されるタンパク質（ネイティブまたは短縮化タンパク質）の全てもしくは一部、または改善された生物学的特徴および／もしくは改変された生物学的特徴を示す変異型の全てもしくは一部、に対応し得る。ポリペプチドはまた、キメラのポリペプチドであり得、これは、種々の起源の融合配列の結果である。目的の核酸は、化学的合成またはクローニング（適切なプローブを使用するＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ＰＣＲなど）によって得られ得、そして分子生物学の従来の技術を使用して改変され得る。
【００４６】
本発明の文脈において、組織増殖の促進因子（例えば、ＰＤＧＦ、またはＢＭＰのような成長因子）をコードする目的の遺伝子を使用することは有利であり得る。この一覧が限定的ではなく、他の遺伝子もまた使用され得ることは、留意される。
【００４７】
目的の核酸によって保有される遺伝子は、細胞または宿主生物体においてこれらの遺伝子を発現するために必要とされるエレメントの制御下に配置される。これらのエレメントは、遺伝子をＲＮＡに転写されるようにし、そしてｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳されるようにするエレメントである。
【００４８】
これらのエレメントの中で、プロモーターは特に重要である。このプロモーターは、真核生物またはさらにウイルス起源の任意の遺伝子から単離され得、そして構成的であり得るかまたは制御可能であり得る。あるいは、プロモーターは。当該遺伝子の天然のプロモーターであり得る。その上、プロモーターは、そのプロモーター活性が改善されるように改変され得、転写を阻害する領域を抑制する、構成的プロモーターを制御可能にするかまたはその逆をする、制限部位を導入するなどをする。種々のウイルスプロモーター（例えば：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＨＳＶ１ウイルスＴＫ遺伝子のプロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期プロモーター、およびアデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）プロモーター）または種々の真核生物プロモーター（マウスもしくはヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、１−アンチトリプシン（肝臓特異的）、免疫グロブリン（リンパ球特異的）、界面活性剤、ＣＦＴＲ（肺特異的）またはアクチン（筋肉特異的）遺伝子のプロモーター）は、本発明の実施において有用である。本来、目的の核酸は、発現を改善するエレメント（イントロン配列、シグナル配列、核局在化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳまたは他の型の翻訳開始部位など）または宿主細胞において核酸の維持をする他のもの（複製起点など）をさらに含み得る。このようなエレメントは、当業者に公知である。
【００４９】
別の実施例において、本発明は、複数の成物を含む多機能マトリクスを提供する。例えば、この多機能マトリクスは、内部マトリクス含んでも、または結晶硫酸カルシウム核、および、必要に応じて第１の成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）を含んでもよい。内部マトリクスまたは核の周囲に配置されるのは、結晶硫酸カルシウム、および、必要に応じて第２の異なる成長因子（例えば、ＰＤＧＦおよび／またはＴＧＦ−β）を含む外部マトリクスであり得る。この型のマトリクスは、置換される組織を模倣する異種組織の形成を促進する。さらに、１つ以上の内部マトリクスまたは外部マトリクスは、核酸（例えば、組織内で発現する目的のタンパク質をコードするもの）をさらに含み得る。
【００５０】
前述の総括論議の観点から、以下に示される特定の実施例は、実例のみを表し、発明の範囲の制限は意図しない。他の包括的または特定の構成は、当業者に明らかである。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
本実施例は、硫酸カルシウムを、多血小板血漿における血小板の活性化に用い得る。
【００５２】
（（ａ）材料）
本実施例において、および以下の実施例において、ＬＩＦＥＣＯＲＥ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｃｈａｓｋａ  ＭＮ，ＵＳＡ）製の発熱性硫酸カルシウム（商品名ＣＡＰＳＥＴ（登録商標）、医療用グレードの硫酸カルシウムα−半水化物粉末）を入手した。多血小板血漿は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  ＮＹ．製を購入した。ウシトロンビンおよびＩ型コラーゲン（ラット尾部由来）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ．Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製を入手した。ヒト組換血小板由来成長因子（ｒｅＰＤＧＦ−ＢＢ）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製を入手した。抗ヒト形質転換成長因子−β１抗体（マウス内で生じる抗血清ＩｇＧ分画）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製を入手した。抗ヒト血小板由来成長因子抗体（ヤギ内で生じる抗血清ＩｇＧ分画）、精製マウスＩｇＧおよび精製ヤギＩｇＧはＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ．Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）製を入手した。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）−ＰＣ（０．４μｍ培養プレート挿入物）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製を購入した。Ｅｘｔｒｕｄｅ  ＰＳ（登録商標）（ポリビニルシロキサンインプレッション（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）材）は、Ｋｅｒｒ  Ｃｏｒｐ（Ｒｏｍｕｌｕｓ，ＭＩ）製を入手した。ポリビニルシロキサンテンプレートは、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｇａｍｍａ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ  ＯＲ）から譲り受けた。３Ｈ−チミジン（比活性  １ｍＣｉ／ｍｌ）は、ＩＣＮ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製を入手した。組織培養培地および補助栄養は、ＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）製を購入した。
【００５３】
他の全ての化学物質は、入手可能な最も高いグレードのものであり、様々な販売元から購入した。
【００５４】
（（ｂ）方法）
以下の方法を、本実施例および以降の実施例の両方で用いた。
【００５５】
（（ｉ）多血小板血漿の調達）
研究目的の多血小板血漿（血小板単位）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓから入手した。血小板単位は、全血の１単位から分離した血小板の濃度であり、少量の元の血漿中に懸濁した。通常の血小板の単位は、１，１００×１０９／Ｌ血小板以上である。首尾一貫させるために、実験を、同じ血液型および大部分が共通の血液型の単位（Ｏ  Ｒｈ  陽性）を用いて行った。
【００５６】
（（ｉｉ）ヒト骨芽細胞の単離および培養条件）
ヒトの主な骨芽細胞培養物は、海綿状ヒト骨サンプル（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．，Ｋｕｌｂｅ，Ｋ．Ｄ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．２０．２１１，１９９３；およびＧｏｔｏｈら，Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．８，２３９，１９９０）から入手するが、これは第３臼歯の摘出の間に取り出し、そして他の物は廃棄する必要があった。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄに従って、適切なドナー同意を得た後、すべてのサンプルを、健康な若い個人（１８〜３０歳）から収集した。この骨サンプルを、軟部組織から注意深くふき取り、最終的に適切な切片（５ｍｍ）にフラグメント化した。骨細胞緩衝液（ＢＣＢ）中で洗浄した後、この切片を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を含むＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有する培地に置いた。フラスコ内のコンフルエンスが５０％に達するまで、２〜４週間、骨の外に細胞を播種させた。この細胞を、加湿した、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で、３７℃で維持した。３〜５代の継代細胞を、以下の実験に用いた。
【００５７】
これらの細胞は、アルカリホスファターゼ活性およびオステオカルシンレベルで増加することが示されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９３，前出を参照；Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ．ら，Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．５，２２９，１９８４；およびＢｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｊ．Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１１９，１７７６，１９８４）。
【００５８】
（（ｉｉｉ）骨芽細胞増殖のアッセイ）
増殖実験の前に、コンフルエントフラスコヒトの骨芽細胞を、短い時間（２分）トリプシン処理し、そして収集した。次いで、この細胞を、遠心分離し、そしてＢＧＪｂ培地（ＦＣＳなし）中に再懸濁した。この細胞濃度を、０．８×１０５細胞／ｍｌに調整した。製造業者の指示に従って、適当な数の培養プレートウェルを、０．５ｍｌのＢＧＪｂ培地を各々のウェルに添加して準備し、そしてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）−ＰＣ  ０．４μｍ培養プレート挿入物を、ウェル中に置き、適当に湿らせた。次いで、生体材料を、細胞培養物を懸濁するための滅菌挿入物中に置いた。０．５ｍｌの細胞懸濁液を、各挿入物に添加した。その細胞を３７℃で２４時間接触および増殖させた。
【００５９】
ＤＮＡ合成を評価するために、インキュベーション時間の最後の４時間、５０μＬの３Ｈ−チミジン溶液（１１μＣｉ／ｍＬ）を各挿入物に添加した。この方法で、１つの挿入物当り１．０μＣｉ／ｍＬの最終濃度に達した。その時間の終りに、パスツールピペットで培地を穏やかに除去し、そして全ての非付着性細胞を洗い除くために、サンプルを０．５ｍｌの冷却ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、移植片材料を有する挿入物を、新しいプレートウェルに移した。細胞に関する放射活性を評価するために、０．５ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡを、各ウェルに前もって添加し、次いで、０．５ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡを、各挿入物に添加した。このサンプルを、３７℃で１時間インキュベートした。挿入物の上清のアリコート（３５０μｌ）およびウェルの上清のアリコート（１５０μｌ）を収集し、シンチレーションバイアルに移し、０．５ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌで中和した。１０ｍｌのＬＩＱＵＩＳＣＩＮＴＴＭシンチレーション液を各サンプルに加え、そして液体シンチレーション分析により計数した。３Ｈ−チミジン取込みの値は、始めの細胞の付着ならびに細胞の増殖能力の両方に反映されることが考えられる。
【００６０】
（（ｉｖ）データの統計分析）
データを、１分当りのカウント（ＣＰＭ）群として表す。各群は、３つのサンプルを含む。群間の差異を、ＡＮＯＶＡによって統計的に分析し、次いでＳｃｈｅｆｆｅ多重比較テストを行った。０．１の有意水準を用いた（α＝０．１）。実験を３回繰り返した。
【００６１】
（（ｃ）実験）
増殖アッセイの１時間前に、硫酸カルシウムの７５０ｍｇのアリコートを、表１に記載したように、種々の異なるマトリクスと合わせた。
【００６２】
【表１】
2005500881.tif 000002
試験用の種々のマトリクスを、以下のように作製した。粉末形態の発熱性硫酸カルシウムと、２７９μＬの二重濾過蒸留滅菌水（ＣＳ，コントロール群）または同量（２７９μｌ）のトロンビンプレ活性化多血小板血漿（ＣＳ／ＴｈｒＰＲＰ）または非プレ活性化多血小板血漿ＲＰ（ＣＳ／ＰＲＰ）とを混合した。半分量の二重濾過蒸留滅菌水（１３９μＬ）を加えた他の試験群と、半分量（１３９μＬ）のトロンビンプレ活性化多血小板血漿（ＣＳ／Ｔｈｒ５０％ＰＲＰ）または非プレ活性化多血小板血漿（ＣＳ／５０％ＰＲＰ）とを混合した。別の試験群（２７９μｌ）に、コラーゲン活性化した多血小板血漿（ＣＳ／ｃｏｌｌＰＲＰ）または水中のコラーゲン（ＣＳ／Ｃｏｌｌ）（ちょうど２７９μＬ）を加えた。
【００６３】
各群（上記の量の硫酸カルシウムから作製した）は、３つの同一のサンプルを含む。滅菌ポリビニルシロキサンテンプレートを用いて、これらの各サンプルは、標準的なサイズのディスク（直径４．５ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）として作製される。全てのサンプルを、設定時間の全体（１時間）を室温で維持した。
【００６４】
多血小板血漿の活性化を、異なる方法で達成した。トロンビン活性化の場合、Ｍａｒｘら（Ｍａｒｘら，Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ．Ｐａｔｈｏｌ．８５，６３８，１９９８）に従って、１０００単位のウシトロンビンを、６ｍｌの多血小板血漿とを混合したが、一つを例外として：ＣａＣｌ２を必要とせず、溶解したトロンビンを代用した。コラーゲンの活性化（Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ編，２０００；Ｂｌｏｃｈｍａｎｓら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４３，４４５，１９８６）（ＣＳ／ＣｏｌｌＰＲＰ）の場合、５００μｇのコラーゲンを、２７９μＬの多血小板血漿中に溶解した。さらに１つの群（ＣＳ／ＰＤＧＦ−ＢＢ）を、硫酸カルシウム粉末（７５０ｍｇ）と２７９μＬのヒトｒｅＰＤＧＦ−ＢＢ水溶液（４×１０−９）との混合により得た。
【００６５】
硫酸カルシウムと多血小板血漿との組み合わせ（ＣＳ／ＰＲＰ）、および硫酸カルシウムと５０％の多血小板血漿と５０％の水との組み合わせ（ＣＳ／５０％ＰＲＰ）の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）による評価により、硫酸カルシウム単独の全体的な構成との明白な差異を有さない、多血小板血漿の有機マトリクスと一体化された構造が示された。硫酸カルシウムのサンプルは、棒状または角柱状の形態にある二水和物結晶の沈殿を示した。従って、硫酸カルシウムを多血小板血漿と組み合わせた際に、硫酸カルシウムの微細構造の特徴および性質は保存され、そしてまた、多血小板血漿と一体化された。
【００６６】
骨芽細胞増殖アッセイの結果を、図１にまとめる。この図１において、増殖は、１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）で示される。この細胞を、２４時間培養した。インキュベーションの最後の２時間の間に３Ｈチミジンを添加し、そして３ＨチミジンのＤＮＡへの組み込みを、増殖活性の尺度とみなした。統計分析を、ＡＮＯＶＡと、続くシェフェの多重比較試験（α＝０．１；ｎ＝３）とによって実施した。
【００６７】
ＣＳ／ＰＲＰサンプル、ＣＳ／５０％ＰＲＰサンプル、およびＣＳ／ＣｏｌｌＰＲＰサンプルにおいて培養されたヒト初代骨芽細胞はすべて、最も高い増殖レベル（ｐ＜０．００１）を示し、これらの３つの群の間に統計的有意差は存在しなかった。多血小板血漿をトロンビンで予め活性化した場合（ＣＳ／ＴｈｒＰＲＰまたはＣＳ／Ｔｈｒ５０％ＰＲＰ）、骨芽細胞は、非活性化多血小板血漿サンプルまたはコラーゲン活性化多血小板血漿サンプルと比べて、より低いレベルの増殖を示した（統計的有意差、ｐ＜０．００１）。硫酸カルシウムを、トロンビン単独（ＣＳ／Ｔｈｒ）またはコラーゲン単独（ＣＳ／Ｃｏｌｌ）と混合した場合、統計的有意差は、コントロールの増殖レベル（ＣＳ）と比較して、感知できる程のものではなかった。これらの結果は、予め活性化されていなかった多血小板血漿を、発熱性硫酸カルシウムで活性化することによって、骨芽細胞増殖を促進することが可能であるということを示す。実際、ＣＳ／ＰＲＰは、最高レベルの骨芽細胞増殖を達成するためにトロンビンの活性化を必要とせず、従って、動物由来のタンパク質（例えば、牛海綿状脳症のような）の使用に関連する危険性および制限もまた回避される。
【００６８】
（実施例２）
本実施例もまた、多血小板血漿が、硫酸カルシウムへの曝露によって活性化され得ることを実証する。さらに、本実施例は、硫酸カルシウムマトリクス中に多血小板血漿を含ませることの利点の一部が、ＰＤＧＦおよび／またはＴＧＦ−βの放出に一部由来し得ることを実証する。サンプルを、実施例１に本質的に記載のような手順を使用して、表２にまとめられるように作製し、実施例１におけるものと同じディスクサイズを生成した。
【００６９】
【表２】
2005500881.tif 000003
この実施例において、ＣＳ／ＰＲＰ群はまた、冷蔵庫で処理された（ＣＳ／ＰＲＰ−Ｒｅｆｒｉｇ）。なぜなら、硫酸カルシウムの沈殿反応は発熱反応であり、３０〜５０分間の設定時間の間に、４０〜４５℃の温度に達するからである（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９９１，前出，およびＯ’Ｂｒｉｅｎ，１９８９，前出）。この冷蔵庫処理サンプルは、それらが６時間前に調製され、そして迅速に冷蔵庫内でインキュベートされたという違いがあるのみで、通常の調製技術に従って調製された。このようにして、設定時間全体の間、サンプルは７〜８℃の一定温度でインキュベートされ、発熱反応は緩徐化し、そしてその材料は、通常の設定温度に到達しなかった。
【００７０】
以下のプロトコールを、抗体の処理に使用した：沈殿後、サンプルを、１ｍｌの抗ＰＤＧＦ溶液（１．９×１０−７Ｍ）中で３７℃にて３０分間インキュベートし、１ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１ｍｌの抗ＴＧＦ−β１溶液（１．７×１０−７Ｍ）中で３７℃にて３０分間インキュベートした（ＣＳ／ＰＲＰ−抗体およびＣＳ／抗体）。コントロール（ＣＳ／ＰＲＰ−ＩｇＧ）は、ヤギＩｇＧの溶液（１．９×１０−７Ｍ）での処理と、続くマウスＩｇＧの溶液（１．７×１０−７Ｍ）での処理とを受けた。他のすべてのサンプルは、１ｍｌのＰＢＳ中で３７℃にて１時間にわたり維持された。増殖アッセイの前に、すべてのサンプルを、１ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄した。得られたマトリクスを、実施例１に記載の増殖アッセイを使用してアッセイし、そして得られたデータを、実施例１に記載のようにして分析した。
【００７１】
この結果を図２に示す。図２において、ヒト初代骨芽細胞の増殖は、１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）で示される。図２に示されるように、ＣＳ／ＰＲＰ調製物において培養されたヒト初代骨芽細胞またはＩｇＧ処理後の同じ調製物において培養されたヒト初代骨芽細胞（ＣＳ／ＰＲＰ−ＩｇＧ）は、最も高い増殖レベルを示した（ｐ＜０．００１）。また、これらの２つの群の間に統計的有意差は存在しない。ＣＳ／ＰＲＰ調製物を、抗ヒトＰＤＧＦ抗体および抗ヒトＴＧＦ−β１抗体で処理した場合（ＣＳ／ＰＲＰ−抗体）、その増殖レベルは、先の２つの群よりも低かった（統計的有意差、ｐ＜０．００１）。ＣＳ／ＰＲＰ−Ｒｅｆｒｉｇは、特定の抗体処理群（ＣＳ／ＰＲＰ−抗体）に匹敵する増殖レベルを示し、そしてＣＳ／ＰＲＰ群またはＣＳ／ＰＲＰ  ＩｇＧ処理群（ＣＳ／ＰＲＰ−ＩｇＧ）よりも低い増殖レベルを示した。理論に束縛されることを望まないが、発熱性の結晶沈殿反応の間に放出される熱は、少なくとも部分的に、血小板を活性化するように作用し得るようである。また、再ＰＤＧＦ−ＢＢ（ｒｅＰＤＧＦ−ＢＢ）（ＣＳ／ＰＤＧＦ−ＢＢ）のためのキャリアとして硫酸カルシウムを使用した場合、骨芽細胞は、コントロール（ＣＳ）と比較して、より高い増殖レベル（統計的有意差）を示した。
【００７２】
図３に示されるような、さらなるコントロール実験において、ＣＳ単独（ＣＳ）と、抗ヒトＰＤＧＦ抗体および抗ヒトＴＧＦ−β１抗体で予め処理されたＣＳ（ＣＳ／抗体）との間に、統計的有意差は見出されなかった。これらのサンプルは、上記のようにして調製され、そして細胞増殖アッセイおよび統計分析は、実施例１に記載のようにして実施された。硫酸カルシウム単独（ＣＳ）において培養された細胞、または抗ヒトＰＤＧＦ抗体および抗ヒトＴＧＦ−β１抗体で処理された後に同じ調製物（ＣＳ／抗体）において培養された細胞は、匹敵する増殖レベルを示した（統計的有意差なし）。抗体処理による増殖活性の阻害は認められなかった。これらの特定の抗体は、それ自体では増殖を阻害せず、代わりにＣＳ／ＰＲＰサンプル中において、血小板の放出したＰＤＧＦおよびＴＧＦ−β１の活性を中和した。
【００７３】
（実施例３）
本実施例は、硫酸カルシウム−多血小板血漿マトリクスが、市販のＧｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ｐｕｔｔｙと同様のレベルの骨芽細胞増殖を支持し得ることを示す比較データを提供する。
【００７４】
サンプルを、実施例１および２の教示に従って調製した。Ｇｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ｐｕｔｔｙ（脱塩された骨マトリクス）を、Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ，ＮＪ）から入手した。Ｇｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ｐｕｔｔｙサンプル（ＧｒａｆｔｏｎＰｕｔｔｙ）を、同じポリビニルシロキサンテンプレートを使用して調製した：この骨マトリクス化合物の特有の可塑性により、他のすべての調製物と同じ標準サイズのディスクのサンプルを調製することが可能であった。
【００７５】
骨芽細胞増殖アッセイ、およびそこから得られたデータを、実施例１に考察したようにして分析した。この結果を図４にまとめる。図４において、ヒト初代骨芽細胞の増殖は、１分間あたりのカウント（ｃｐｍ）で示される。図４の結果により、ＣＳ／ＰＲＰサンプルにおいて培養されたヒト初代骨芽細胞は、Ｇｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ｐｕｔｔｙ（脱塩された骨マトリクス）と匹敵する増殖レベル（統計的有意差なし）を示し、そしてＣＳまたはＣＳ／ＰＤＧＦ−ＢＢよりも高い増殖レベル（統計的有意差、ｐ＜０．００１）を示すことが実証される。さらに、再ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＣＳ／ＰＤＧＦ−ＢＢ）のためのキャリアとして硫酸カルシウムを使用した場合、骨芽細胞は、硫酸カルシウム単独と比較して、より高い増殖レベル（統計的有意差、ｐ＜０．００１）を示した。
【００７６】
（実施例４）
本実施例は、遺伝子治療プロトコールにおいて硫酸カルシウムベースのマトリクスを用いることの実現可能性を示す。
【００７７】
以下の研究により、硫酸カルシウムが、裸のＤＮＡと組み合わされる能力が示された。硫酸カルシウムが物理的に保有され得、かつプラスミドの生物学的特徴を改変しないという事実を考慮すると、硫酸カルシウムの緩徐な吸収速度によって、長時間にわたるプラスミドの送達が達成され得る。硫酸カルシウム粉末を、プラスミドＤＮＡの水溶液と混合した場合、これは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）をヒト胚性腎臓細胞株に送達し得た。
【００７８】
ＨＥＰＥ緩衝化生理食塩水（ＨｅＢＳ）およびＣａＣｌ２の存在下において、ＣＳ／プラスミドの組み合わせの粉砕化粒子を、７５％コンフルエンシーでヒト胚性腎臓細胞（２９３細胞）に播種し、そしてトランスフェクションを、２４時間目、４８時間目および７２時間目に、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で評価した。７２時間目に、５μｌのｐＥＧＦＰ−Ｃ１水溶液（２０μｇのプラスミド）と混合された６ｍｇの硫酸カルシウムを含有するＣＳ／プラスミドの組み合わせは、ほぼ５％の細胞集団をトランスフェクトし得た。他方、従来のリン酸カルシウム沈殿（ＣＰｐ）方法は、１０μｇのプラスミドを細胞層に播種した場合に、３２．５％の細胞集団をトランスフェクトし得た。
【００７９】
別の実験系において、ＨｅＢＳ／ＣａＣｌ２中に懸濁された粉砕化ＣＳ／プラスミドの上清が細胞をトランスフェクトする能力を評価した。この場合では、３０μｇのプラスミドを硫酸カルシウムに組み込んだ。２９３細胞を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１でトランスフェクトした。この細胞を、リン酸カルシウム沈殿プロトコールを使用してか、またはＨｅＢＳ／ＣａＣｌ２中にＣＳ／プラスミドを懸濁した後のＣＳ／プラスミド由来の上清を用いて、トランスフェクトした。７２時間のインキュベーション後、細胞を収集し、そして緑色（ＦＬ１）帯域通過フィルターにおける蛍光放出について、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーにより分析した。リン酸カルシウムでトランスフェクトされた細胞のうち約５４％が蛍光性であったが、ＣＳ／プラスミド上清でトランスフェクトされた細胞では約１０％が蛍光性であった。この実験により、粉砕化されたＣＳ／プラスミドマトリクスからプラスミドが放出されること、そして放出される場合に、それらのプラスミドはなお細胞をトランスフェクトし得ることが確証付けられる。従って、硫酸カルシウムは、プラスミドの生物学的活性を改変せず、そして細胞にＤＮＡを送達し得るようである。
【００８０】
（参考としての援用）
本明細書に言及された特許文書および科学技術論文の各々の開示内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００８１】
（等価物）
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具現化され得る。従って、前述の実施形態は、すべての観点から、本明細書に記載される本発明における制限ではなく、例示とみなされるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記述によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、そして特許請求の範囲と等価な意味および範囲の圏内にあるすべての変更が、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１は、異なる硫酸カルシウムマトリクス処方物の存在下での、初代ヒト骨芽細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図２】図２は、異なる硫酸カルシウムマトリクス処方物の存在下での、初代ヒト骨芽細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図３】図３は、抗ＰＤＧＦ抗体および抗ＴＧＦ−β抗体の組合せで前処理されたか、または前処理されていない硫酸カルシウムマトリクスにおける初代ヒト骨芽細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図４】図４は、硫酸カルシウムマトリクスおよびＧｒａｆｔｏｎ（登録商標）Ｐｕｔｔｙにおける初代ヒト骨芽細胞の増殖を示す棒グラフである。
【図１】
2005500881.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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