(57)【要約】ＲＯＣＫ経路におけるポリペプチドと、上記ポリペプチドの活性を調整する化合物とを接触させる工程を含む、膀胱平滑筋収縮性を調整するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＣＫ経路におけるポリペプチドと、該ポリペプチドの活性を調整する化合物とを接触させる工程を含む、膀胱平滑筋活性を調整するための方法。
【請求項２】
該ポリペプチドがＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２あるいはその両方である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ポリペプチドの活性が、
カルバコールに対する応答、
ニューロキニンＡに対する応答、
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストに対する応答、および
電気刺激に対する応答
からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該応答が膀胱収縮である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該膀胱平滑筋活性が収縮性である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
膀胱平滑筋活性を調整する工程を含む、下部尿路障害または過活動性膀胱について哺乳動物を処置する方法。
【請求項７】
該哺乳動物と、ＲＯＣＫ経路におけるポリペプチドの活性を調整する化合物とを接触させる工程を含む、下部尿路障害または過活動性膀胱について哺乳動物を処置する方法。
【請求項８】
該ポリペプチドが、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２あるいはその両方である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ポリペプチドの活性が、
カルバコールに対する応答、
ニューロキニンＡに対する応答、
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストに対する応答、および
電気刺激に対する応答
からなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該応答が膀胱収縮である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該膀胱平滑筋活性が収縮性である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
該膀胱平滑筋活性がＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２あるいはその両方の発現または活性に関連する、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２あるいはその両方の活性が、
カルバコールに対する応答、
ニューロキニンＡに対する応答、
Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストに対する応答、および
電気刺激に対する応答
からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該応答が膀胱収縮である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該膀胱平滑筋が収縮性である、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、平滑筋の収縮性を調整するための新規に同定された方法に関し、特に、下部尿路障害および過活動性膀胱、特にヒトのこれらの障害を処置するための方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
平滑筋における収縮性器官を活性化するためのキーシグナルは、細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］i）における増加であることが広く受け入れられている。これにより、カルモジュリン（以下「ＣａＭ」）に対するＣａ２＋の結合を促進し、得られたＣａ２＋−ＣａＭ錯体は、ミオシンのミオシン軽鎖（以下「ＭＬＣ」）をリン酸化するミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）を活性化し、平滑筋の収縮が起こる（総説としてHorowitzら、Physiological Reviews，７６（４），９６７〜１００３（１９９６）を参照）。しかし、近年、Ｃａ２＋と独立して、平滑筋の収縮性を調整可能な第二の機構が確認された。Ｇ蛋白に結合する興奮性受容体の活性化は、「Ｃａ２＋−感作」と呼ばれるプロセスにおいて［Ｃａ２＋］iを変化させる必要なく、平滑筋の収縮を生じ得る。小さなＧＴＰａｓｅ  Ｒｈｏおよびその下流エフェクターの１つであるＲｈｏ関連キナーゼ（以下、「Ｒｈｏ−キナーゼ」および「ＲＯＣＫ」）は、この経路において重要な役割を果たすことが示された。活性化されたＲＯＣＫが、平滑筋ミオシンホスファターゼをリン酸化し、従って不活性化し、この酵素によってＭＬＣの脱リン酸化を防ぎ、Ｃａ２＋に対する平滑筋の収縮性機構を感作する（総説として、Somylo, a.p. & Somylo, a.v.，Journal of Physiology，５２２，１７７〜１８５（２０００）を参照）。
【０００３】
ＲＯＣＫの特定のインヒビターＹ−２７６３２の使用（Uehataら、Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７）；Daviesら、Biochemical Journal，３５１，９５〜１０５（２０００）；Ishizakiら、Molecular Pharmacology，５７，９７６〜９８３（２０００））は、多くの組織（例えば、血管（Uehataら、Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７））、気道（Iikukaら、European Journal of Pharmacology，４０６，２７３〜２７９（２０００）；Yamagataら、Pulmonary Pharmacology and Therapeutics，１３，２５〜２９（２０００）および性器（Chitaleyら、Nature Medicine，７（１），１１９〜１２２，（２００１）；Reesら、British Journal of Pharmacology，１３３，４５５〜４５８（２００１）の平滑筋など））において、収縮のＣａ２＋−依存性制御でのこの酵素の役割を示す。さらに、近年、Jeziorら、British Journal of Pharmacology，１３４，７８〜８７（２００１）は、単離されたウサギの膀胱平滑筋において、Ｙ−２７６３２がベタネコールで誘発された収縮を弱めることが示された。しかし、本発明が示される前に、膀胱平滑筋におけるＲＯＣＫの役割は知られておらず、まだ満たされていない医学的な必要性、すなわち、下部尿路障害および／または過活動性膀胱のための新しい処置の必要性が残っている。
【０００４】
（発明の開示）
本発明は、ＲＯＣＫで媒介される経路における活性の調整を介して、平滑筋の収縮を調整する方法に関する。このような方法は、限定されないが、尿路障害、特に、下部尿路障害および／または過活動性膀胱（以下、「本発明の疾患」または「疾患」と称する）を含む、特定の疾患の処置の方法に関するものを目的とする。さらなる局面では、本発明は、本発明によって提供される材料または方法を使用し、このような処置に影響を与え得る同定された化合物または他の化合物と疾患とを相関付けるＲＯＣＫで媒介される経路における不均衡に関連する疾患を調整することにより、アゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、インヒビター）を同定するための方法に関する。なおさらなる局面では、本発明は、ＲＯＣＫで媒介される経路における不適切な活性またはレベルに関連する疾患を検出するための診断アッセイに関する。
【０００５】
本発明はさらに、ＲＯＣＫ経路におけるポリペプチドと、上記ポリペプチドの活性を調整する化合物とを接触させる工程を含む、膀胱の平滑筋活性を調整するための方法を提供する。
【０００６】
更なる方法は、上記ポリペプチドがＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２またはその両方である方法である。
【０００７】
別の方法は、上記ポリペプチドの活性が、カルバコールに対する応答、ニューロキニンＡに対する応答、Ｐ２Ｘ受容体アゴニストに対する応答、および電気刺激に対する応答からなる群から選択される方法である。
【０００８】
本発明はまた、上記応答が膀胱収縮である方法を提供する。
【０００９】
上記膀胱平滑筋活性が収縮性である方法もまた提供される。
【００１０】
本発明はまた、膀胱平滑筋活性を調整する工程を含む、下部尿路障害または過活動性膀胱のために哺乳動物を処置する方法を提供する。
【００１１】
哺乳動物と、ＲＯＣＫ経路においてポリペプチドの活性を調整する化合物とを接触させる工程を含む、下部尿路障害または過活動性膀胱のために哺乳動物を処理するさらなる方法もまた提供される。
【００１２】
なおさらなる方法は、上記膀胱平滑筋の活性が、ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２またはその両方の発現または活性に関する方法である。
【００１３】
ＲＯＣＫ１またはＲＯＣＫ２またはその両方の活性が、カルバコールに対する応答、ニューロキニンＡに対する応答、Ｐ２Ｘ受容体アンタゴニストに対する応答、および電気刺激に対する応答からなる群から選択される方法もまた、本発明によって提供される。
【００１４】
（図面の簡単な記載）
【００１５】
図１は、雄ラット組織におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの発現を示すグラフである。ＲＯＣＫＩまたはＲＯＣＫＩＩの特異的なメッセージを、ＧＡＰＤＨの特異的なメッセージに対して正規化し、それぞれのサンプルのｍＲＮＡの相対量を、任意に設定した心臓のｍＲＮＡレベルの相対量を１.０ユニットとして比較した。それぞれの棒は、４サンプルの平均値をあらわし、垂直線は平均標準偏差を表す。
【００１６】
図２は、単離された雄ラット膀胱のカルバコールで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を示すグラフであり；典型的なトレースおよびデータである。それぞれの点は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してP＜０.０５。
【００１７】
図３は、カルバコールで誘発された応答である、単離された雄ラット膀胱のカルバコールで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を、１００ｍＭ  ＫＣｌによって誘発された応答の割合として示すグラフである。それぞれの点は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００１８】
図４は、単離された雄ラット膀胱のＮＫＡで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を示すグラフであり、典型的なトレースおよびデータである。それぞれの点は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００１９】
図５は、ＮＫＡで誘発された応答である、単離された雄ラット膀胱のＮＫＡで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を、１００ｍＭ  ＫＣｌによって誘発された応答の割合として示すグラフである。それぞれの点は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００２０】
図６は、単離された雄ラット膀胱のＫＣｌで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を示すグラフであり、典型的なトレースおよびデータである。それぞれの点は、５実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。
【００２１】
図７は、ＫＣｌで誘発された応答である、単離された雄ラット膀胱のＣｌで誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２およびビヒクルの効果を、１００ｍＭ  ＫＣｌによって誘発された応答（最大応答）の割合として示すグラフである。それぞれの点は、５実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。
【００２２】
図８は、単離された雄ラット膀胱の１０μＭ  α，β−メチレンＡＴＰで誘発された収縮に対する、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＨＡ−１０７７およびビヒクルの効果を示すグラフであり、アンタゴニストまたはビヒクルでインキュベーションした後、α，β−メチレンＡＴＰに対する応答の典型的なトレースのデータである。それぞれの棒は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。網掛けの円は、組織片に対する１０μＭ  α，β−メチレンＡＴＰの添加を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００２３】
図９は、アンタゴニストまたはビヒクルでインキュベーションした後の、単離された雄ラット膀胱の１０μＭ  α，β−メチレンＡＴＰで誘発された収縮に対する、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＨＡ−１０７７およびビヒクルの効果を、コントロール応答の割合として示すグラフである。それぞれの棒は、４〜６実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。網掛けの円は、組織片に対する１０μＭ  α，β−メチレンＡＴＰの添加を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００２４】
図１０は、単離された雄ラット膀胱の電気的に誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２の効果を示すグラフである。（Ａ）は、二段階の応答を示す、周波数１６Ｈｚで個々の電気的に誘発された典型的な膀胱収縮を示し、（Ｂ）におけるトレースは、刺激の全ての周波数で、電気的に誘発された膀胱収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２の効果を示す。（Ｃ）のデータは、電気的に誘発された収縮の後、Ｙ−２７６３２またはビヒクルでインキュベーションした、振幅（ａ）および曲線下の領域（ｂ）における変化の割合である。各点は、４実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００２５】
図１１は、単離された雄ラット膀胱の電気的に誘発された収縮に対する１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１μＭアトロピンおよび１０μＭ  α，β−メチレンＡＴＰの種々の組み合わせの効果を示すグラフである。データは、Ｙ−２７６３２および／またはアトロピン（Ａ）またはＹ−２７６３２および／またはα，β−メチレンＡＴＰ（Ｂ）またはビヒクルでインキュベーションした後、電気的に誘発された収縮の振幅（ａ）および曲線下の領域（ｂ）における変化の割合として表されている。各点は、４〜５実験の平均値であり、垂直の棒は、平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較した単一アンタゴニストの効果Ｐ＜０.０５。＃アトロピンまたはα，β−メチレンＡＴＰ単独と比較したＹ−２７６３２の効果Ｐ＜０.０５。＃＃アトロピンまたはα，β−メチレンＡＴＰ単独の効果と比較した、Ｙ−２７６３２とアトロピンまたはα，β−メチレンＡＴＰとの組み合わせの効果Ｐ＜０.０５。
【００２６】
図１２は、単離された雄ラット膀胱のベースライン膀胱張力に対する、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＨＡ−１０７７およびビヒクルの効果を示すグラフである。（Ａ）のデータは、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７またはビヒクルで４５分間インキュベートし、１５分ごとに測定したベースライン膀胱張力（ｇ）であり、（Ｂ）のデータは、前処理張力の割合として現したベースライン膀胱張力の変化である。各点は、平均値であり、垂直の棒は、５〜２５実験の平均標準偏差を示す。＊ビヒクルと比較してＰ＜０.０５。
【００２７】
（発明の記載）
下部尿路障害および過活動性膀胱のための新規な処置を提供する、まだ満たされていない医学的必要性に基づいて、雄ラット組織（膀胱を含む）におけるＲＯＣＫの発現を観察し、インビトロでの雄ラットの膀胱収縮性におけるＹ−２７６３２を用いたＲＯＣＫ阻害の効果を評価する研究が行われた。よく使用され、一般に受け入れられているＲＯＣＫ研究のためのモデルとしてラットが選択され、ヒト疾患に関連する重要な情報および洞察が提供された。本発明は、部分的に、これらの研究に基づいていた。
【００２８】
これらの研究の態様は、雄ラット膀胱におけるＲＯＣＫの発現を観察し、インビトロでのこの組織の収縮性に関するＹ−２７６３２を用いたＲＯＣＫ阻害効果を評価した。ＲＯＣＫのイソ型であるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの両方は、雄ラット膀胱において高いレベルで検出されることが観察された。ＲＯＣＫＩＩのレベルは、ラット大動脈、脳、肝臓、腎臓および骨格筋と比較すると、膀胱において、より高い（実施例１を参照）。さらなる実験により、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、カルバコール（３×１０−６Ｍで５８±１１％）およびＮＫＡを顕著に弱める；１０−６Ｍで誘発された膀胱での収縮を６９±１３％弱める。さらに、Ｙ−２７６３２は、塩化カリウム（ＫＣｌ：１０〜１００ｍＭ）に対する収縮性応答において測定可能な効果を示さなかった。意外にも、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、Ｐ２Ｘ受容体アゴニストα，β−メチレンＡＴＰに対する膀胱の収縮性応答を顕著に弱めた（１０μＭ；３０±７％）。さらに、ＲＯＣＫインヒビターである塩酸ファスジル（ＨＡ−１０７７；１０μＭ）はまた、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された応答を顕著に阻害した（２２±６％）。さらに、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、電気的に誘発された膀胱収縮（２〜１６Ｈｚ）の振幅およびＡＵＣを顕著に弱めた。さらに、応答の振幅およびＡＵＣに対するＹ−２７６３２の効果は、それぞれα，β−メチレンＡＴＰ（１０μＭ）またはアトロピン（１μＭ）単独の効果とは顕著な違いがなかった。これらの研究は、雄ラット膀胱におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの存在を示し、この組織におけるＧ蛋白に結合した収縮性機構におけるこれらのキナーゼの関与を示す。
【００２９】
本発明が部分的に基づくこのような研究は、単離された雄ラット膀胱のＧ蛋白で結合した収縮性応答におけるＲＯＣＫに対する役割を示した。このことは、Ｙ−２７６３２が、この組織においてカルバコールおよびＮＫＡで誘発された収縮を弱めるという観測によって支持される。ラット膀胱におけるこれらのアゴニストに対する応答はそれぞれ、Ｍ３ムスカリン様アセチルコリン受容体（Longhurstら，British Journal of Pharmacology，１１６，２２７９〜２２８５（１９９５）；Tongら，Journal of Autonomic Pharmacology，１７，２１〜２５（１９９７））およびタキキニンＮＫ２受容体（Hallら，British Journal of Pharmacology，１０７（３），７７７〜７８４，（１９９２））によって媒介されることが以前に示されており、これらはＧ蛋白に結合する（総説として、Eglenら，Trends in Pharmacological Sciences，１５，１１４〜１１９（１９９４）；KhawajaおよびRogers，International Journal of Biochemistry and Cell Biology，２８（７），７２１〜７３８（１９９６））。実際に、カルバコールおよびＮＫＡは、イノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）の産生を増加させることが示されており、ＩＰ３はＣａ２＋を放出するためにＣａ２＋を細胞内に貯蔵するものとして作用する（Iacovouら，Journal of Urology，１４４，７７５〜７７９（１９９０）；Harrissら，Journal of Urology，１５４，１２４１〜１２４５（１９９５）；Torrensら，Neuropeptides，３１，２４３〜２５１（１９９７））。その後に続く［Ｃａ２＋］iの増加は、カルモジュリン（ＣａＭ）に対するＣａ２＋の結合を促進し、得られたＣａ２＋−ＣａＭ錯体は、ミオシンのＭＬＣをリン酸化するためのＭＬＣＫを活性化し、排尿筋の平滑筋収縮が起こる（総説として、Horowizら，Physiological Reviews，７６（４），９６７〜１００３（１９９６）を参照）。それに加えて、Ｙ−２７６３２は、単離された雄ラット膀胱のＫＣｌで誘発された収縮応答に対して何の効果も持たなかった。ＫＣｌによって誘発された膀胱の収縮は、細胞外Ｃａ２＋に依存し、電圧感作性Ｃａ２＋チャネルを介するＣａ２＋流への関与を示すＣａ２＋チャネルアンタゴニストによって阻害されることが以前に示されている（Loweら，European Journal of Pharmacology，１９５，２７３〜２７９（１９９１）；Visserら，Urology Research，２８，２６０〜２６８（２０００））。従って、膀胱においてＫＣｌにさらされた後に、［Ｃａ２＋］iが増加する機構は、Ｇ蛋白に結合する経路とは独立しており、これらの応答に対してＹ−２７６３２の効果が無いことは、ＲＯＣＫが媒介するＣａ２＋感作機構が、この組織のＧ蛋白に結合する収縮応答に特異的に関与することのさらなる証拠を提供する。
【００３０】
ＲＯＣＫは、２つのイソ型、すなわちＲＯＣＫＩ（p１６０ＲＯＣＫ／ＲＯμ；Ishizakiら，EMBO Journal，１５，１８８５〜１８９３（１９９６））およびＲＯＣＫＩＩ（ＲＯＫμ；Leungら，Journal of Biological Chemistry.，２７０，２９０５１〜２９０５４（１９９５））を有する、セリン／スレオニン蛋白キナーゼである（Matsuiら，１９９６）。ＲＯＣＫＩは、ＲＯＣＫＩＩとそれらの構造全体で６４％の配列同一性を有し、２つのイソ型は、キナーゼドメインにおいて９０％同一性をもつ（総説として、Amanoら，Experimental Cell Research，２６１，４４〜５１（２０００））。本研究は、雄ラット膀胱中のＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの両方の存在を確認した。さらに、これら両方のイソ酵素のレベルは、雄ラットの脳、肝臓、腎臓および骨格筋において検出されるものよりも高く、一方、ＲＯＣＫＩのレベルは、膀胱よりもラット大動脈中で高かった。興味深いことに、雄ラット膀胱中のＲＯＣＫＩＩのレベルは、ラット大動脈中で検出されるレベルよりも高かった。このことは、ラットまたは他の種の膀胱におけるＲＯＣＫの発現を最初に示し、雄ラット膀胱中にＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩが存在することが確認されることより、この組織中でのこれらのイソ酵素の役割が示された。本発明は、哺乳動物、特にヒトにおけるこのような発現パターンを提供する。さらに、Ｙ−２７６３２（および別のＲＯＣＫインヒビターＨ−１０７７、本明細書中の他の部分を参照）が、アゴニストによって誘発される収縮応答の非存在下で膀胱の調子を弱めるという観察は、雄ラット膀胱にＲＯＣＫが存在することのさらなる証拠を提供する。本発明はさらに、インビボで膀胱の調子のベースラインを維持することにＲＯＣＫが役に立つことを提供する。Ｙ−２７６３２は、報告されたＫｉ値０.１４μＭを有するＲＯＣＫ（Uehataら，Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７））の両方のイソ型に対する非常に選択的なインヒビターである。ＲＯＣＫＩについて０.２２μ（Ishizakiら，Molecular Pharmacology，５７，９７６〜９８３（２０００）、ＲＯＣＫＩＩについて０.３０μＭ（Ishizakiら，Molecular Pharmacology，５７，９７６〜９８３（２０００）である。さらに、Ｙ−２７６３２は、蛋白キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびＭＬＣＫよりもＲＯＣＫイソ型について約２００〜３００倍（Uehataら，Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７）；μ倍（Ishizakiら，Molecular Pharmacology，５７，９７６〜９８３（２０００））および１２５０倍（Uehataら，Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７））選択的であり、さらにまた平滑筋収縮において役割を持つ（総説として、Horowitzら，Physiological Reviews，７６（４），９６７〜１００３（１９９６）を参照）。Daviesら、Biochemical Journal，３５１，９５〜１０５（２０００）はまた、Ｙ−２７６３２が、他のセリン／スレオニン蛋白キナーゼの多くについて最小限の効果しか持たないことを示している。本発明はまた、本研究において使用されたＹ−２７６３２の濃度（１０μＭ）がＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの両方を阻害する一方、平滑筋収縮性に関連する他のキナーゼ（ＭＬＣＫおよびＰＫＣを含む）には何の効果も持たないことを提供する。本発明の基礎の一部分として行われた研究は、この濃度のＹ−２７６３２が、Ｐ��Ｃアクチベーター、ホルボールエステルに対する単離された雄ラット膀胱の収縮応答に対して何の効果も持たないことを示した（総説として、Nambiら，Pharmacology Reviews and Communications，８，２９〜３８（１９９６）を参照）。ここで、ＰＫＣアクチベーターは、ＰＫＣアンタゴニストＧＦ１０９２０３Ｘによって阻害された（Toullecら，Journal of Biological Chemistry，２６６，１５７７１〜１５７８１（１９９１）；未公開の観察）。それ故に、本発明を限定するものではない１つのモデルが、Ｙ−２７６３２を処置した後にカルバコールで誘発された膀胱収縮およびＮＫＡで誘発された膀胱収縮を弱めることは、この組織における他のキナーゼに対する効果よりもＲＯＣＫの阻害に起因するものであることを示す。本発明の一実施形態は、疾患を処置するために使用されるＲＯＣＫＩおよび／またはＲＯＣＫＩＩの選択的インヒビターに関する。本研究におけるカルバコールで誘発される膀胱収縮に対するＹ−２７６３２の効果は、ＨＡ−１０７７に加えてＹ−２７６３２が単離されたウサギの膀胱平滑筋のベタネコールで誘発される収縮を弱めることが示されている、Jeziorら，Pharmacology，１３４，７８〜８７（２００１）の効果と一致している。膀胱平滑筋におけるＣａ２＋感作機構の存在に関するさらなる証拠はまた、カルバコールで誘発された収縮が、ラット（Maggiら，General Pharmacology，１９，７３〜８１（１９８８））、ウサギ（Kishiiら，Japanese Journal of Pharmacology，５８，２１９〜２２９（１９９２）およびYoshimuraら，International Journal of Urology，４，６２〜６７（１９９７））において細胞外および細胞内のＣａ２＋の両方が書法もう失われた後になお存在するという観察から与えられる。Ｙ−２７６３２はまた、気道（Janssenら，Journal of Applied Physiology，９１，１１４２〜１１５１（２００１））および胃腸（Swardら，２０００）の平滑筋を含む他の組織におけるムスカリン様アセチルコリン受容体で媒介される収縮応答を弱める。さらに、ＮＫＡで媒介される収縮応答におけるＲＯＣＫの役割は、この経路を薬理学的に操作するためにＹ−２７６３２を使用して、単離されたヒト気管支において示された（Yamagataら，Pulmonary Pharmacology and Therapeutics，１３，２５〜２９（２０００））。しかし、本発明は、膀胱においてＮＫＡで誘発される調子に対するＹ−２７６３２の開示された効果の新しい観察に部分的に基づく。
【００３１】
ＫＣｌで誘発された膀胱収縮応答に対するＹ−２７６３２の効果を観察する上述の実験に加えて、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮に対するＹ−２７６３２の効果を試す実験もさらに行った。α，β−メチレンＡＴＰは、Ｐ２Ｘ１受容体を介する膀胱平滑筋の収縮を誘発し（Suzukiら，British Journal of Pharmacology，１１２，１１７〜１２２（１９９４））、ここで、Ｐ２Ｘ１受容体は、電圧依存性Ｃａ２＋チャネルを通るＣａ２＋イオン流と、受容体を直接的に介するＣａ２＋イオン流とを生じる膜の脱分極を媒介する（Suzukiら，British Journal of Pharmacology，１１２，１１７〜１２２（１９９４））。それ故に、ＫＣｌ刺激を用いた実験に加えて、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された応答に対するＹ−２７６３２の効果はまた、ＲＯＣＫで媒介されたＣａ２＋感作機構が、Ｇ蛋白に結合する受容体で媒介される刺激に特異的に結合することを確認し、特異性を制御するために使用可能である。驚くべきことに、Ｙ−２７６３２は、雄ラット膀胱においてα，β−メチレンＡＴＰで誘発される収縮を顕著に弱めた。このことが平滑筋収縮機構に対するＹ−２７６３２の非選択的な効果に起因しているわけではないことを確認するために、ＨＡ−１０７７の効果をまた、α，β−メチレンＡＴＰで誘発される収縮に対して試験し、顕著には異ならない同様の阻害効果が観察された。ＨＡ−１０７７は、ＲＯＣＫＩについて報告されたＫｉ値０.３３μＭ（Uehataら，Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７））およびＲＯＣＫＩＩについてＩＣ５０１.９μＭ（Davisら，Biochemical Journal，３５１，９５〜１０５（２０００））を有する、ＲＯＣＫの両イソ型の選択的なインヒビターである。それ故に、本研究において使用された濃度（１０μＭ）のＨＡ−１０７７は、以前の刊行物に基づけば、ＲＯＣＫの両イソ型を阻害する。しかし、Uehataら，Nature，３８９，９９０〜９９４（１９９７）は、ラット脳由来のＰＫＣについてＫｉ値９.３μＭを報告しているが、それとは逆に、Davisら，Biochemical Journal，３５１，９５〜１０５（２０００）は、２０μＭのＨＡ−１０７７は、このキナーゼのヒト形態に対する顕著な阻害効果を有さないことを明らかにしている。さらに、研究により、ＨＡ−１０７７は、ＰＫＣアクチベーター、ホルボールエステルに対する雄ラットの単離された膀胱の収縮に対する阻害効果は有さないことが示された。それ故に、これらの結果は、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮に対するＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７の効果が、ＲＯＣＫで媒介される収縮経路に対する選択的な効果によって媒介されていると最も考えられ、この組織における他の収縮機構の調整の結果ではないことを示す。実際に、ＫＣｌで誘発された膀胱収縮に対するＹ−２７６３２の効果が無いことは、この仮説と一致する。（他のキナーゼに対するＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７の可能性のある効果は以下に論述する。）しかし、これらの驚くべき結果にもかかわらず、Ｙ−２７６３２の効果は、雄ラット膀胱において、α，β−メチレンＡＴＰで誘発される雄ラットの膀胱収縮応答（参考、約５０％  対  ３０％）と比較した場合、Ｇ蛋白に結合する受容体収縮応答（カルバコールおよびＮＫＡ）を弱める程度で選択性を示す。さ���に、選択性はまた、Ｇ蛋白に結合する受容体で誘発される膀胱収縮応答およびＫＣｌで誘発される膀胱収縮応答に対するＹ−２７６３２の効果間で観察される。
【００３２】
ＲＯＣＫの阻害により、単離された雄ラット膀胱におけるα，β−メチレンＡＴＰで誘発された収縮が調整される機構は決定されないままである。しかし、１つの可能性は、Ｙ−２７６３２がプロスタグランジン（ＰＧ）で媒介される収縮性機構に影響を与えることである。実際に、内因性ＰＧは、いくつかの平滑筋産生における刺激によって収縮の強度を調整すること（Orehekら，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，１９４，５５４〜５６４（１９７５）；Maggiら，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，２３０，５００〜５１３（１９８４））およびＡＴＰがＰＧ合成の既知の刺激剤であること（Brownら，European Journal of Pharmacology，６９，８１〜８６（１９８１））が報告されている。それに加えて、単離されたウサギ膀胱内でＡＴＰに対してさらした後にＰＧレベルの増加が検出され（G.F.Anderson，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，２２０，３４７〜３５２（１９８２））、ウサギにおけるＡＴＰに対する収縮性膀胱応答（G.F.Anderson，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，２２０，３４７〜３５２（１９８２）；Anderssonら，British Journal of Pharmacology，７０，４４３〜４５２（１９８０））、およびラットにおけるα，β−メチレンに対する応答（Naramatsuら，British Journal of Pharmacology，１２２，５５８〜５６２（１９９７））が、インドメタシン感受性である。アラキドン酸（ＡＡ）（ＰＧ合成の前駆体）は、ウサギ大腿動脈由来の平滑筋繊維におけるＲＯＣＫを直接的に活性化し（Arakiら，European Journal of Physiology，４４１，５９６〜６０３（２００１））、単離されたウサギの肺動脈のＡＡで誘発された収縮性応答がＹ−２７６３２によって弱められる（Fuら，FEBS Letters，４４０，１８３〜１８７（１９９８））。それに加えて、ＨＡ−１０７７は、単離されたウサギ大動脈のＰＧで誘発された収縮を阻害する（Setoら，European Journal of Pharmacology，１９５，２６７〜２７２（１９９１））。それ故に、単離された雄ラット膀胱のα，β−メチレンＡＴＰで誘発された応答をＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７によって弱めることは、ＰＧで媒介された機構に対する調整効果によって媒介され得る。この点において、収縮は、単離されたラット（Jeremyら，Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology，３３４，４６３〜４６７（１９８６））、ハムスター（Tramontanaら，Naunyn Schmiedebergs Archives of Pharmacology，３６１，４５２〜４５９（２０００））の膀胱においてカルバコールおよびＮＫ２受容体アゴニストによって誘発され、ＰＧ合成を刺激することが示されている。このことは、膀胱におけるこれらのアゴニストに対する応答についてのＹ−２７６３２の応答を弱める効果はまた、ＰＧで媒介される経路における効果もに関与し得ることを示す。あるいは、他のＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７感受性酵素は、雄ラット膀胱のα，β−メチレンＡＴＰで誘発された収縮に関与し得る。しかし、蛋白キナーゼＣ関連蛋白キナーゼ２（ＰＲＫ２；Mukaiら，Biochemical and Biophysical Research Communications，１９９，８９７〜９０４（１９９４））、細胞骨格の制御において役割を果たすＲｈｏエフェクター（Maesakiら，Molecular Cell.，４，７９３〜８０３（１９９９）；Vincentら，Molecular Cell Biology，１７，２２４７〜２２５６（１９９７））は、Ｙ−２７６３２およびＨＡ−１０７７の両方によって阻害されることが示されているＲＯＣＫ以外で唯一の他の公知のキナーゼである（Daviesら，Biochemical Journal，３５１，９５〜１０５（２０００））。本研究において使用されるインヒビターの濃度（１０μＭ）は、上述の刊行物に基づいてＰＲＫ２を阻害する。Ｙ−２７６３２はまた、Ｋｉ値３.１μＭを有する、ＰＲＫスーパーファミリーの別のメンバーであるＰＲＫ１（これはまた、蛋白キナーゼNと呼ばれている）を阻害することも示されているが、このキナーゼに対するＨＡ−１０７７の効果についてのデータは公開されていない。しかし、膀胱中のこれらのキナーゼの存在する役割および可能性のある役割は決定されないままである。α，β−メチレンＡＴＰで誘発される応答を弱めるための、平滑筋中に存在するさらなるキナーゼおよび酵素に対するＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７の効果は、除外することができない。さらに、これらのインヒビターが、α，β−メチレンＡＴＰで誘発される膀胱収縮に関与する他の機構上で作用する（例えば、Ｐ２Ｘ１受容体に対する直接的な阻害効果）という１つのモデルがあるが、このモデルは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
単離されたラットおよびテンジクネズミの膀胱における電場刺激に対する収縮応答は、アトロピンとα，β−メチレンＡＴＰを用いたＰ２Ｘ受容体の脱感作との組み合わせによって阻害され、アセチルコリンおよびＡＴＰは、収縮を開始するために神経末端から共に放出されることが示され、それぞれムスカリン様受容体およびＰ２Ｘ受容体によって媒介される（BradingおよびWilliams，１９９０）。これらの成分はそれぞれ、排尿中の膀胱に対する効果の性質において異なっており、ＡＴＰは主に排尿開始に関与している一方、コリン作用伝達は、排尿の維持に影響を与えていると提案されている（Theobald，１９９５）。実際に、ラット排尿筋における単一の神経刺激に対する収縮応答は二段階であり、第２段階はアトロピンによって優先的にブロックされる（Maggiら，Journal of Autonomic Pharmacology，５，２２１〜２３０（１９８５）；Bhatら，British Journal of Pharmacology，９６，８３７〜８４２（１９８９）；Bradingら，British Journal of Pharmacology，９９，４９３〜４９８（１９９０））。従って、本願発明者の以下の予備実験は、コリン作用性（カルバコール）膀胱収縮応答とプリン作用性（α，β−メチレンＡＴＰ）膀胱収縮応答との間のＹ−２７６３２の効果におけるある程度の選択性が存在することを示し、この選択性が電気刺激に対する単離された雄ラット膀胱の収縮応答においても示されるか否かを観察するために実験を行った。電気刺激は、膀胱張力の迅速な増加（収縮の振幅として測定される）の後、第２の持続性収縮（ＡＵＣとして測定される）を含む、本質的に二段階である雄ラット膀胱の収縮応答を誘発した。第２の持続性収縮段階は、α，β−メチレンＡＴＰを用いたＰ２Ｘ受容体の脱感作と比較して、アトロピンによって優先的に弱められ、これはこの種の以前の研究結果と一致する（Maggiら，Journal of Autonomic Pharmacology，５，２２１〜２３０（１９８５）；Bradingら，British Journal of Pharmacology，９９，４９３〜４９８（１９９０））。さらに、Ｙ−２７６３２は、アトロピンと同じ程度まで、およびα，β−メチレンＡＴＰより大きな程度まで、二次持続性収縮成分を顕著に弱めた。アトロピンを用いたＹ−２７６３２の付随性処置はまた、α，β−メチレンＡＴＰとＹ−２７６３２との組み合わせより大きな程度まで、収縮の第２段階を阻害した。このことは、インビトロでの電気刺激に対する持続性収縮応答によって表される、膀胱におけるコリン作用性刺激の収縮効果が、ＲＯＣＫで媒介される経路に関与するという見解と一致する。電場刺激に対する収縮応答の振幅は、アトロピンおよびα，β−メチレンＡＴＰの両方によって同じ程度まで弱められ、このことは、コリン作用性およびプリン作用性伝達の両方の関与を示す。しかし、Ｙ−２７６３２は、電気刺激に対する初期の迅速な膀胱の収縮応答を同様に弱め、さらに、その程度は、アトロピン単独の効果よりも顕著に大きく、α，β−メチレンＡＴＰの効果と同程度であった。従って、これらの結果は、ＲＯＣＫが、単離された雄ラット膀胱のＰ２Ｘ受容体で媒介される収縮応答に関与するというさらなる証拠を与える。さらに、本研究は、少なくとも部分的に、雄ラット膀胱における電気刺激に対する二段階収縮応答に対するＹ−２７６３２の効果において、選択性��また示すことが可能であることを示す。
【００３４】
本研究の結果は、下部尿路障害または過活動性膀胱の薬理学的処置に関して、特に驚くべきことである。過活動性膀胱を含む種々の形態の膀胱障害の現在の治療法（総説として、Wyndaeleら，British Journal of Urology，８８，１３５〜１４０（２００１））は、主に抗ムスカリン作用剤の使用に関し、これらは、口内乾燥症および便秘を含む副作用によって制限される（総説として、Chappleら，Urology，５５，３３〜４６（２０００））。従って、ＲＯＣＫインヒビターは、膀胱の機能障害、ムスカリン作用性受容体の下流作用の処置において潜在的に有用であり、これらの好ましい化合物は、他の改良された性質の中でもとりわけ、副作用がない。しかし、多くの研究は、正常な生理学的状態において、ＡＴＰはヒト膀胱平滑筋収縮において限定された役割を持っているかもしれないが、プリン作用性関係伝達は、この組織における疾患状態において顕著に密接な関係を有している可能性を示している（Saitoら，British Journal of Urology，７２，２９８〜３０２（１９９３）；Baylissら，Journal of Urology，１６２，１８３３〜１８３９（１９９９））。従って、ＲＯＣＫインヒビターはまた、Ｐ２Ｘで媒介される収縮機構の調整を介して、膀胱の機能障害と関連する病理学的変化に対する治療効果を発揮し得る。
【００３５】
上述の研究は、雄ラット膀胱におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩの存在を同定し、ＲＯＣＫで誘発されたＣａ２＋感作が、この組織においてＧ蛋白に結合する応答において役割を果たすことが示された。さらに、この組織のＰ２Ｘで媒介された収縮性応答においてＲＯＣＫで媒介される経路の役割もまた示されるが、実際の機構は決定されていないままである。本発明の一実施形態は、膀胱におけるコリン作用性およびプリン作用性の伝達の両方におけるＲＯＣＫで媒介される収縮機構の二重の役割を提供し、本明細書中で提供されるようなＲＯＣＫスクリーニングによって同定されるものを含むＲＯＣＫインヒビターが、哺乳動物、特にヒトにおける膀胱平滑筋の薬理学における変化に関連する下部尿路障害および／または過活動性膀胱の処置において治療的に有用であることを示す。
【００３６】
本発明の方法において使用されるようなＲＯＣＫのさらなる実施形態は、以下を含むポリペプチドに関する：（ａ）ＲＯＣＫの配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド；
（ｂ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド；（ｃ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチド；（ｄ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離されたポリペプチド；（ｅ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列；および
（ｆ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列と比較して、０.９５、０.９６、０.９７、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するかまたは含む単離されたポリペプチド；（ｇ）（ａ）〜（ｆ）におけるこのようなポリペプチドのフラグメントおよび改変体。
【００３７】
本発明の方法において有用なポリペプチドは、ＲＯＣＫファミリーのポリペプチドのメンバーである。本明細書中のどこかに記載されているように、それらのポリペプチドは平滑筋収縮性に関連し、それらに関連する疾患に関係があるため、これらのポリペプチドは目的とするものである。
【００３８】
ＲＯＣＫの生物学的性能は、本明細書中で、「ＲＯＣＫの生物学的活性」または「ＲＯＣＫ活性」と称され、特定のものは本明細書中で詳細に記載され、他のものは当該分野で公知である。好ましくは、本発明の方法において有用なポリペプチドは、ＲＯＣＫの少なくとも１つの生物学的活性を示す。
【００３９】
本発明の方法において有用な他のポリペプチドはまた、全ての対立遺伝子形態およびスプライス改変体を含む、上述のポリペプチドの改変体を含む。このようなポリペプチドは、挿入、欠失、および保存的または非保存的であってもよい置換、またはそれらの任意の組み合わせによって参照ポリペプチドから改変される。特に好ましい改変体は、例えば、任意の組み合わせにおいて、５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸が挿入され、置換され、または欠失されているものである。
【００４０】
本発明の方法において有用なポリペプチドの好ましいフラグメントは、ＲＯＣＫのアミノ酸配列由来の、少なくとも３０、５０または１００連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはＲＯＣＫのアミノ酸配列から切断または欠失した少なくとも３０、５０または１００連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。好ましいフラグメントは、ＲＯＣＫの生物学的活性（類似の活性または改良された活性を有するもの、または望ましくない活性が減少したものを含む）を媒介する生物学的に活性なフラグメントである。さらにまた好ましいのは、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるそれらのフラグメントである。
【００４１】
本発明の方法において有用なポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプチドを製造するために使用され得る；それ故に、これらの改変体は、本発明の全長ポリペプチドを製造するための中間体として使用され得る。本発明のポリペプチドは、「成熟」蛋白の形態であってもよいか、または前駆体または融合蛋白のようなさらに大きな蛋白の一部分であってもよい。しばしば、分泌若しくはリーダー配列、プロ配列、精製において補助となる配列（例えば、複数のヒスチジン残基）または組み換え産生中の安定性のためのさらなる配列を包含する、付加されるのアミノ酸配列を含むことが有利である。
【００４２】
本発明の方法において有用なさらなるポリペプチドは、任意の適切な様式、例えば、天然に生じる供給源から単離によって、発現系（以下を参照）を含む遺伝操作された宿主細胞から、または例えば自動化ペプチド合成機を用いる化学合成によって、またはこのような方法の組み合わせによって、調製することができる。このようなポリペプチドを調製する手段は当該技術分野で充分に理解されている。
【００４３】
さらなる局面では、本発明は、ＲＯＣＫポリヌクレオチドを含む方法に関する。このようなポリヌクレオチドとして以下のものが挙げられる：（ａ）ＲＯＣＫのポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；
（ｂ）ＲＯＣＫのポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド；
（ｃ）ＲＯＣＫのポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチド；（ｄ）ＲＯＣＫの単離されたポリヌクレオチド；（ｅ）ＲＯＣＫのポリペプチドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；（ｆ）ＲＯＣＫのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド；（ｇ）ＲＯＣＫのポリペプチドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド；（ｈ）ＲＯＣＫのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド；（ｉ）ＲＯＣＫのポリヌクレオチド配列と比較して、同一性指数０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９を有するポリヌクレオチド配列を有するかまたは含む単離されたポリヌクレオチド；（ｊ）ＲＯＣＫのポリペプチド配列と比較して、同一性指数０.９５、０.９６、０.９７、０.９８、または０.９９を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するかまたは含む単離されたポリヌクレオチド；並びに上述のポリヌクレオチドのフラグメントおよび改変体であるポリヌクレオチド、または、それらの全長にわたって、上述のポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド。
【００４４】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドの好ましいフラグメントとしては、ＲＯＣＫポリヌクレオチドの配列由来の少なくとも１５、３０、５０または１００連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、またはＲＯＣＫポリヌクレオチドの配列から切断または欠失した少なくとも３０、５０または１００連続するヌクレオチドを有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４５】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドの好ましい改変体としては、スプライス改変体、対立遺伝子改変体、および１つ以上の単一ヌクレオチド多形体（ＳＮＰ）を有するポリヌクレオチドを含む多形体が挙げられる。
【００４６】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドとしてはまた、例えば、任意の組み合わせにおいて、いくつかの、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、または付加されている、ＲＯＣＫのアミノ酸配列を含むポリペプチド改変体をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４７】
さらなる局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である、本明細書中の方法において有用なポリヌクレオチドを提供する。従って、以下に示すＲＮＡポリヌクレオチドが提供される：（ａ）ＲＯＣＫのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含み；（ｂ）ＲＯＣＫのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であり；（ｃ）ＲＯＣＫのＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含み；または（ｄ）ＲＯＣＫのＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であり；並びにそれらに対して相補的なＲＮＡポリヌクレオチド。
【００４８】
本発明の方法において有用な好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して、特に、類似の生物学的機能／性能を有すると予想される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＲＯＣＫ活性を有する。
【００４９】
本発明の方法において有用なさらなるポリヌクレオチドは、ヒトの膀胱平滑筋の細胞中のｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡライブラリーから標準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を用いて得てもよい（例えば、Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（１９８９）を参照）。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーのような天然供給源から得ることができるか、または周知および市販の技術を用いて合成可能である。
【００５０】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドが本発明のポリペプチドの組み換え産生のために使用される場合、ポリヌクレオチドは、単独で成熟ポリペプチドのコード配列を含んでもよいか、または他のコード配列（例えば、リーダー若しくは分泌配列、プレ−蛋白、またはプロ−蛋白、またはプレプロ−蛋白配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの）を有するリーディングフレーム中に成熟ポリペプチドのコード配列を含んでもよい。例えば、融合したポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列は、コード可能である。本発明のこの局面の特定の好ましい実施形態では、マーカー配列は、pQEベクター（Qiagen, Inc.）において供給され、Gentzら，Proc Natl Acad Sci USA（１９８９）８６：８２１〜８２４に記載されるように、ヘキサヒスチジンペプチドであるかまたはＨＡタグである。このポリヌクレオチドはまた、非コード５’配列および３’配列、例えば、転写配列、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡを安定化させる配列を含有し得る。
【００５１】
ＲＯＣＫのポリヌクレオチド配列に対して同一、または充分な同一性を有する、本発明において有用なポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用し得る。このようなプローブおよびプライマーは、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、およびＲＯＣＫに対して高い配列同一性を有し、典型的には少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子（ヒト供給源由来のパラログおよびヒトまたはラット以外の種由来のオルソログおよびパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために使用してもよい。好ましいプローブおよびプライマーは、一般的には、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、少なくとも１００ヌクレオチドとまではいかないが、少なくとも５０ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。さらに特に好ましいプライマーは、２０〜２５ヌクレオチドを有する。
【００５２】
本発明の方法において有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ヒトまたはラット以外の種由来のホモログを含む）は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＲＯＣＫポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメント、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドの配列を有する標識されたプローブを用いてライブラリーをスクリーニングする工程；および、上記ポリヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含むプロセスによって得てもよい。このようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知である。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、以下の成分を含む溶液中４２℃で一晩インキュベートが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×Denhardt's溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ/ｍＬの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡ；その後、約６５℃で０.１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄。従って、本発明はまた、単離されたポリヌクレオチド、好ましくは、ＲＯＣＫまたはそれらのフラグメント、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドの配列を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングすることによって得られる、少なくとも１００のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明の方法において有用な組み換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当該分野で周知のプロセスによって産生され得る。従って、さらなる局面では、本発明は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む発現系、このような発現系を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組み換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。細胞を用いない翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いてこのような蛋白を産生するために使用可能である。
【００５４】
組み換え産物について、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドのための発現系またはそれらの一部分を組み込むために遺伝子操作されることが可能である。ポリヌクレオチドは、多くの標準的な実験マニュアル、例えば、Davisら，Basic Methods in Molecular Biology（１９８６）およびSambrookら（同書）中に記載される方法によって、宿主細胞内に導入されてもよい。ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入する好ましい方法としては、例えば、カルシウムホスフェートトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランで媒介されるトランスフェクション、トランスベクション、ミクロ注射、カチオン性脂質で媒介されるトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入（ballistic introduction）または感染が挙げられる。
【００５５】
適切な宿主の代表的な例としては、微生物細胞、例えば、Streptococci、Staphylococci、E.coli、StreptomycesおよびBacillus subtilis細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞およびAspergillus細胞；昆虫細胞、例えば、Drosophila Ｓ２およびSpodoptera Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびBowes melanoma細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００５６】
発現系の多くの変形、例えば、染色体、エピソームおよびウイルス誘導系、例えば、微生物プラスミドから誘導されるベクター、バクテリオファージから誘導されるベクター、トランスポゾンから誘導されるベクター、酵母エピソームから誘導されるベクター、挿入エレメントから誘導されるベクター、酵母染色体エレメントから誘導されるベクター、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス（例えばＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鷄痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のベクター、並びにそれらの組み合わせから誘導されるベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント（例えばコスミドおよびファージミド）から誘導されるものがが使用可能である。発現系は、発現を制御および発生させる制御領域を含有してもよい。一般的に、宿主中でポリペプチドを産生するポリヌクレオチドを維持、成長または発現可能な任意の系またはベクターを使用してもよい。適切なポリヌクレオチド配列は、種々の周知および日常的な技術、例えば、Sambrookら（同上）中に記載されるような技術のいずれかによって発現系内に挿入されてもよい。適切な分泌シグナルは、小胞体の内腔、細胞周辺腔または細胞外環境内で翻訳された蛋白を分泌可能な所望のポリペプチドに組み込まれてもよい。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、または、異種シグナルであってもよい。
【００５７】
本発明のポリペプチドがスクリーニングアッセイにおいて使用するために発現される場合、ポリペプチドが細胞表面で産生されることが一般的に好ましい。この場合には、細胞は、スクリーニングアッセイにおいて使用する前に収集されてもよい。ポリペプチドが培地内に分泌される場合、ポリペプチドを回収し精製するために、培地は回収することができる。細胞内で産生される場合、細胞は、ポリペプチドが回収される前に最初に溶解されなければならない。
【００５８】
本発明の方法において有用なポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組み換え細胞培養物から回収し、精製可能である。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製のために使用される。蛋白を再折りたたみするための周知の技術は、ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性する場合、活性構造を再生するために使用されてもよい。
【００５９】
本発明の方法において有用なポリヌクレオチドは、関連遺伝子における突然変異を検出する、診断試薬として使用されてもよい。ｃＤＮＡまたはゲノム配列におけるＲＯＣＫのポリヌクレオチドによって特徴付けられ、機能障害に関連する遺伝子の突然変異形態の検出は、診断ツールを提供する。それは、遺伝子の発現不全、過剰発現または改変された空間的または一時的な発現から生じる、疾患の診断、または疾患に対する感受性を加え、または定義可能である。遺伝子における突然変異を保有する個体は、当該技術分野で周知の種々の技術によってＤＮＡレベルで検出し得る。
【００６０】
診断のための核酸は、被検体の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検から得られてもよい。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用されてもよいか、またはＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または分析の前の他の増幅技術を用いて酵素的に増幅されてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、同様の様式で使用してもよい。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズ変化によって検出可能である。点変異は、増幅したＤＮＡを標識されたＲＯＣＫヌクレオチド配列に対してハイブリダイズすることによって同定可能である。完全にマッチした配列は、ＲＮａｓｅ消化によって、または融解温度の違いによって、ミスマッチの二本鎖とは区別可能である。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性剤を用いるかまたは用いずに、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動的移動における変化によって、または直接的なＤＮＡ配列決定によって検出し得る（例えば、Myersら，Science（１９８５）２３０：１２４２を参照）。特定の位置での配列変化はまたヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護）または化学的開裂方法によって明らかにされてもよい。（Cottonら，Proc Natl Acad Sci USA（１９８５）８５：４３９７〜４４０１を参照）。
【００６１】
ＲＯＣＫポリヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイは、例えば遺伝子突然変異および改変体の充分なスクリーニングを行うために構築可能である。このようなアレイは、好ましくは、高強度アレイまたはグリッドである。アレイ技術の方法は周知であり、汎用的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝子結合および遺伝子可変性を含む分子遺伝子学における種々の疑問に対処するために使用可能であり、例えば、M. Cheeら，Science，２７４，６１０〜６１３（１９９６）および本明細書中に引用される他の参考文献を参照のこと。
【００６２】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現のレベルの異常な減少または増加の検出はまた、本発明の疾患に対する被検体の感受性を診断または決定するために使用してもよい（実施例も参照のこと）。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野で周知の方法、例えば、核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のいずれかを用いて、ＲＮＡレベルで測定可能である。宿主から誘導されるサンプル中で、蛋白（例えば、本発明のポリペプチド）のレベルを決定するために使用可能なアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【００６３】
従って、別の局目では、本発明は、（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくはＲＯＣＫのヌクレオチド配列またはフラグメントまたはそれらのＲＮＡ転写物；（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくはＲＯＣＫのポリペプチドまたはそれらのフラグメント；または（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくはＲＯＣＫのポリペプチドに対する抗体を含む、診断キットに関する。
【００６４】
このような任意のキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は、相当量の成分を含んでもよいことが理解される。このようなキットは、疾患または疾患に対する感受性の診断、特に、とりわけ本発明の疾患または疾患に対する感受性の診断において使用する。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチド配列はまた、組織発現研究のためのツールとして価値がある。このような研究は、ポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡを検出することによって、組織中のコードされたポリペプチドの発現パターンに関する指標を与えてもよい、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能にする。使用される技術は当該技術分野で周知であり、ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションのような、グリッド上に整列させたクローンに対するin situハイブリダイゼーション技術（Schenaら，Science，２７０，４６７〜４７０，１９９５およびShalonら，Genome Res，６，６３９〜６４５，１９９６）およびＰＣＲのようなヌクレオチド増幅技術が挙げられる。好ましい方法は、Perkin Elmerから入手可能なTAQMAN（商標）技術を使用する。これらの研究から得られた結果から、生体中のポリペプチドの正常な機能の指標を知ることができる。それに加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パターンと同じ遺伝子の代替形態（例えば、潜在的な突然変異または規則的な突然変異をコードするポリペプチドにおける改変を有するもの）によってコードされたｍＲＮＡの発現パターンとの比較研究は、本発明のポリペプチドの役割または疾患におけるそれらの不適切な発現の役割に価値ある洞察を与えることができる。このような不十分な発現は、一時的、空間的、または単純に定量的な性質を有していてもよい。
【００６６】
本発明のＲＯＣＫ１ポリペプチドは、膀胱および大動脈で発現する（実施例１を参照）。本発明のＲＯＣＫ２ポリペプチドは、膀胱で発現する（実施例１を参照）。
【００６７】
本発明のさらなる局目は、抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメント、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに対して免疫特異性である抗体を産生するための免疫抗原として使用可能である。用語「免疫特異性」は、抗体が、従来技術の他の関連ポリペプチドに対する親和性よりも、本発明のポリペプチドに対するかなり大きな親和性を有していることを意味する。
【００６８】
本発明のポリペプチドに対して作成される抗体は、ポリペプチドまたはエピトープを有するフラグメント、または細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物に対して、日常的なプロトコルを用いて投与することによって得てもよい。モノクローナル抗体の産生のために、連続した細胞株培養物によって産生される抗体を提供する任意の技術が使用可能である。例としては、ハイブリドーマ技術（Kohler，G.およびMilstein，C.，Nature（１９７５）２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，Immunology Today（１９８３）４：７２）およびEＢV−ハイブリドーマ技術（Coleら，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，７７〜９６，Alan R. Liss, Inc.，１９８５）が挙げられる。
【００６９】
例えば米国特許第４,９４６,７７８号に記載されるような一本鎖抗体を産生するための技術はまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するために適用可能である。さらにまた、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を含む他の生物を、ヒト化抗体を発現させるために使用してもよい。
【００７０】
上述の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために、またはアフィニティクロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するために使用してもよい。本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、とりわけ本発明の疾患を処置するために使用してもよい。
【００７１】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとして使用してもよい。従って、さらなる局面では、本発明は、疾患がすでに個体の中で確立されているか否かにかかわらず、哺乳動物を疾患から守るために、哺乳動物を、抗体および／またはT細胞免疫応答を作るのに充分な、本発明のポリペプチド（例えば、サイトカインを産生するT細胞または細胞障害性T細胞を含む）を用いて接種する工程を含む、哺乳動物における免疫学的応答を誘発するための方法に関する。哺乳動物における免疫学的応答はまた、上記動物を本発明の疾患から守るための抗体を産生する免疫学的応答を誘発するために、インビボでポリヌクレオチドの発現を指向するベクターおよびポリペプチドをコードするベクターを介して、本発明のポリペプチドを送達することを含む方法によって誘発されてもよい。ベクターを投与する１つの方法は、所望の細胞内で、粒子上のコーティングまたは他のものとして加速させることによる。このような核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含んでもよい。ワクチンを使用するために、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、ワクチン処方物（組成物）として通常は提供される。処方物はさらに、適切なキャリアを含んでもよい。ポリペプチドが胃の中で破壊される場合があるため、好ましくは非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または皮膚内注射）で投与される。非経口投与のために好適な処方物としては、特定の酸化防止剤、バッファー、静菌剤および受容者の血液を用いて処方物を等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液；および懸濁剤または増粘剤を含有し得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。処方物は、単位用量または複数用量の容器中、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル中に存在してもよく、使用直前に滅菌溶液キャリアを添加することのみが必要なフリーズドライ条件下で貯蔵されてもよい。ワクチン処方物はまた、処方物の免疫原性を高めるためにアジュバント系、例えば、水中油系および当該技術分野で公知の他の系を含んでもよい。用量は、ワクチンの特定の活性に依存し、日常的な実験によって容易に決定可能である。
【００７２】
本発明のポリペプチドは、１つ以上の疾患状態、特に本明細書中に記載の本発明の疾患に関連する、１つ以上の生物学的機能を有する。それ故に、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することは有用である。従って、さらなる局面では、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このような方法は、本明細書中上述のような本発明の疾患の治療および予防目的のために利用し得るアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は、種々の供給源、例えば、細胞、細胞の存在しない調製物、化学ライブラリー、化学化合物の収集、および天然産物の混合物から同定してもよい。このようにして同定されるアゴニストまたはアンタゴニストは、天然または修飾された基質、リガンド、受容体、酵素等であってもよく、ポリペプチドであってもよい場合には、それらの構造的模倣物または機能的模倣物（Coliganら，Current Protocols in Immunology １（２）：Chapter５（１９９１））または低分子であってもよい。このような低分子は、好ましくは、２,０００ダルトン未満、より好ましくは３００〜１,０００ダルトン、および最も好ましくは４００〜７００ダルトンの分子量を有する。これらの低分子は有機分子であることが好ましい。
【００７３】
スクリーニング方法は、候補化合物に関連する直接的または間接的な標識を用いて、ポリペプチドまたは細胞またはポリペプチドを有する膜、またはそれらの融合蛋白に対する候補化合物の結合を単純に測定してもよい。あるいは、スクリーニング方法は、標識された競合物（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に対して、ポリペプチドに対する候補化合物の競合的な結合を（定量的または定性的に）測定または検出することを必要とし得る。さらに、これらのスクリーニング方法は、ポリペプチドを有する細胞に対して適切な検出システムを用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害によって発生するシグナルを生じるか否かを試験してもよい。活性化のインヒビターは、一般的には、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合物の存在によってアゴニストによる活性化に対する効果が観察される。さらに、スクリーニング方法は、候補化合物と本発明のポリペプチドを含有する溶液とを混合して、混合物を形成する工程と、この混合物中のＲＯＣＫ活性を測定する工程と、この混合物のＲＯＣＫ活性と候補化合物を含有しないコントロール混合物のＲＯＣＫ活性とを比較する工程とを単に含んでもよい。
【００７４】
本発明のポリペプチドは、従来の低容量スクリーニング法において使用されてもよく、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式で使用されてもよい。このようなＨＴＳ形式としては、充分に確立されている９６ウェルマイクロタイタープレート、より最近には、３８４ウェルマイクロタイタープレートの使用だけではなく、Schullekら，Anal Biochem.，２４６，２０〜２９，（１９９７）によって記載されるナノウェル方法のような新しい方法も挙げられる。
【００７５】
融合蛋白、例えば、本明細書中で上述のような、Fc部分およびＲＯＣＫポリペプチドから作成されるものはまた、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するためのハイ−スループットスクリーニングアッセイのために使用可能である（D. Bennettら，J Mol Recognition，８：５２〜５８（１９９５）；およびK. Johansonら，J Biol Chem.，２７０（１６）：９４５９〜９４７１（１９９５）を参照）。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体はまた、細胞中のｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生の際に添加された化合物の効果を検出するためのスクリーニング方法を構築するために使用されてもよい。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは、当該技術分野で公知の標準的な方法によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞関連レベルを測定するために構築されてもよい。このことを、適切に操作された細胞または組織から、ポリペプチドの産生を阻害または増進し得る薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストともまた呼ばれる）を発見するために使用することが可能である。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、もしあれば、当該技術分野で公知の標準的な受容体結合技術を介して、膜結合または溶解性受容体を同定するために使用されてもよい。これらとしては、限定されないが、リガンド結合および架橋アッセイが挙げられ、ここで、ポリペプチドは放射性同位体（例えば１２５Ｉ）で標識されており、化学的に修飾されており（例えば、ビオチニル化）、または検出または精製のために好適なペプチド配列に融合されており、推定受容体の供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）を用いてインキュベートされている。他の方法としては、表面プラズモン共鳴および分光学のような生物物理学的技術が挙げられる。これらのスクリーニング方法はまた、もしあれば、受容体に対するポリペプチドの結合と競合するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用されてもよい。このようなアッセイを行うための標準的な方法は、当該技術分野で充分に理解されている。
【００７８】
本発明のポリペプチドのアンタゴニストの例としては、抗体、またはある場合には、オリゴヌクレオチドまたはリガンド、基質、受容体、酵素等に密接に関連する蛋白、が挙げられ、ポリペプチドである場合には、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素等のフラグメント；または本発明のポリペプチドに結合するが応答を誘導せず、その結果、ポリペプチドの活性が抑えられる低分子が挙げられる。
【００７９】
スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびＲＯＣＫ遺伝子の使用を必要としてもよい。トランスジェニック動物を構築する分野は充分に確立されている。例えば、ＲＯＣＫ遺伝子は、滅菌された卵母細胞の雄性前核内にマイクロ注射を介して導入してもよく、移植前または移植後の胚芽内にレトロウイルスを移してもよく、電気穿孔のような遺伝的に修飾された胚幹細胞株を宿主の胚細胞に注射してもよい。特に有用なトランスジェニック動物は、動物遺伝子が動物のゲノム内でヒト等価体に交換されている、いわゆる「ノックイン」動物である。ノックイントランスジェニック動物は、標的の確認のために、薬物開発プロセスにおいて有用であり、ここで、化合物はヒト標的に特異的である。他の有用なトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの動物オルソログの発現および内因性ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの発現が、部分的または完全に無くなっている、いわゆる「ノックアウト」動物である。遺伝子ノックアウトは、特定の細胞または組織に対して標的化されてもよく、技術の限界の結果として特定の細胞または組織中でのみ行われてもよく、動物における全ての、または実質的に全ての細胞中で行われてもよい。トランスジェニック動物の技術はまた、動物全体の発現−クローニング系を与え、導入された遺伝子は、大量の本発明のポリペプチドを与えるように発現される。
【００８０】
上述の方法において使用するためのスクリーニングキットは、本発明のさらなる局面を形成する。このようなスクリーニングキットは、以下のものを含む：（ａ）本発明のポリペプチド；（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組み換え細胞；（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体；
ここで、ポリペプチドは好ましくはＲＯＣＫを有するものである。
【００８１】
任意のこのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は相当量の成分を含んでもよいことが理解される。
【００８２】
（用語集）
以下の定義は、本明細書中上記で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、並びにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントを含む。
【００８４】
「単離された」は、天然の状態から「人の手によって」改変されたことを意味し、すなわち、天然に生じる場合、その元来の環境から変化または除去されるか、またはその両方をされることを意味する。本明細書中でこの用語が使用される場合、例えば、生体中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、天然状態の共に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。さらに、形質転換、遺伝子操作または任意の他の組み換え方法によって生物に導入されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物が生きていても生きていなくてもよく、その生物中にまだ存在している場合であっても「単離されて」いる。
【００８５】
「ポリヌクレオチド」は、一般的には、非修飾または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、任意のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）をいう。「ポリヌクレオチド」は、限定されないが、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。それに加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域をいう。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つ以上の改変された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「改変された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのような通常でない塩基を含む。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされてもよく；従って、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または発酵学的に改変された形態、並びにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチドを包含し、しばしば、オリゴヌクレオチドのことをいう。
【００８６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに結合する２つ以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチド、すなわちペプチド同配体をいう。「ポリペプチド」は、通常はペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーといわれるような短鎖と、一般的に蛋白といわれるようなさらに長い鎖との両方をいう。ポリペプチドは、２０遺伝子でコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」は、天然プロセス（例えば、後翻訳プロセス）または当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって改変されたアミノ酸配列を含む。このような改変は、基本的なテキストおよびより詳細な専攻論文および膨大な研究文献に充分に記載されている。改変は、ポリペプチド（ペプチド骨格を含む）、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端中のいずれかで起こってもよい。同じ種類の改変が、所与のポリペプチド中の種々の部位で同程度または変動する程度まで存在し得ることが理解される。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の改変を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝であってもよく、分枝が存在するかまたは存在しない環状であってもよい。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチドおよび分枝環状ポリペプチドは、後翻訳天然プロセスから生じてもよく、または合成方法によって製造されてもよい。改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性加工、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、サルフェート化、アルギニル化のような、トランスファー−ＲＮＡで媒介されるアミノ酸の蛋白への付加、およびユビキチン化（例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties，第２編、T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，１９９３；Wold，F.，Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，１〜１２，Post-translational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，１９８３；Seifterら，「Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactors」、Meth Enzymol，１８２，６２６〜６４６，１９９０，およびRattanら，「Protein Synthesis：Post-translational Modifications and Aging」、Ann NY Acad Sci，６６３，４８〜６２，１９９２を参照）。
【００８７】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、参照配列よりも短いが、参照ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を本質的に保持しているポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、ＲＯＣＫの参照配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００８８】
「改変体」は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、それらの本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの典型的な改変体は、参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変していてもしていなくてもよい。ヌクレオチドの変更は、以下に議論されるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断において生じてもよい。ポリペプチドの典型的な改変体は、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、改変は、参照ポリペプチドの配列および改変体が最終的に密接して類似であり、多くの領域で同一であるようにが限定されている。改変体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせにおいて、１つ以上の置換、挿入、欠失によってアミノ酸配列が異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝的コードによってコードされるものであるか、またはそうでなくてもよい。典型的な保存的置換は、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；並びにPheおよびTyrを含む。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体は、対立遺伝子のように天然に生じてもよいか、または天然に生じることが知られていない改変体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然には生じない改変体は、突然変異誘発技術または直接合成によって製造されてもよい。また、改変体として含まれるのは、１つ以上の後翻訳変更、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化等を有するポリペプチドである。実施形態は、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびスレオニンのリン酸化、およびＣ末端グリシンの修飾を含む。
【００８９】
「対立遺伝子」は、ゲノム中の所与の遺伝子座で生じる遺伝子の２つ以上の代替形態のうちの１つをいう。
【００９０】
「多形体」は、集合内のゲノム中の所与の位置でのヌクレオチド配列（関連する場合、コードされるポリペプチド配列）における変種をいう。
【００９１】
「単一ヌクレオチド多形体」（ＳＮＰ）は、集団内のゲノムの単一のヌクレオチド位置でのヌクレオチド可変性の発生をいう。ＳＮＰは、ゲノムの遺伝子内または遺伝子間領域内で生じてもよい。ＳＮＰは、対立遺伝子の特定の増幅（Allele Specific Amplification）（ＡＳＡ）を用いてアッセイ可能である。プロセスのためには、少なくとも３つのプライマーが必要である。通常のプライマーは、アッセイされる多形体に対して逆相補的に使用される。この通常のプライマーは、多形性塩基由来の５０〜１５００bpであることができる。他の２つ（以上の）プライマーは、最終の３個の塩基が多形体を作る２つ（以上の）対立遺伝子の１つがマッチするように揺らぐこと以外は、互いに同一である。次いで、通常のプライマーおよび対立遺伝子に特異的なプライマーのうち１つをそれぞれ用いて、２つ（以上の）ＰＣＲ反応をサンプルＤＮＡ上で行う。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「スプライス改変体」は、同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されるＲＮＡ分子から作られるが、代替的なＲＮＡスプライシングを受けているＤＮＡ分子をいう。代替的なＲＮＡスプライシングは、一般的にはイントロンを除去するために一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受ける場合に生じ、異なるアミノ酸配列をコードし得るｍＲＮＡ分子のうちの１つより多いｍＲＮＡ分子の産生を生じる。用語スプライス改変体はまた、上述のｃＤＮＡ分子によってコードされる蛋白をいう。
【００９３】
「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般的に、同一性は、比較される配列の長さにわたって、それぞれの２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の対応関係がヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸で完全にとれることことをいう。
【００９４】
「％同一性」−完全に対応していない配列について、「％同一性」が決定され得る。一般的に、比較される２つの配列は、配列間の最大相関を与えるように整列される。これは、整列の程度を高めるために、１つまたは両方の配列のいずれかに「ギャップ」の挿入を含んでいてもよい。％同一性は、同じまたは非常に類似した長さの配列にとって特に適切である、それぞれの比較される配列全長にわたって決定されてもよく（いわゆるグローバル整列）、または、等しくない長さの配列にとってより適切である、さらに短い、規定された長さにわたって決定され得る（いわゆるローカル整列）。
【００９５】
「類似度」はさらに、２つのポリペプチド配列間の関係のさらに精密な測定である。一般的には、「類似度」は、残基基準に基づく残基について、比較される配列のそれぞれから１つの残基対間の完全な対応（同一性のように）だけではなく、完全に対応関係になくても、進化の基準に基づいて、１つの残基が他のものと実質的に同様であるか否かを考慮した、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この確度は、関連する「スコア」を有し、このスコアから２つの配列の「％類似度」を決定可能である。
【００９６】
２つ以上の配列の同一性および類似度を比較するための方法は当該技術分野で周知である。従って、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Packageバージョン９.１（Devereux Jら、Nucleic Acis Res，１２，３８７〜３９５，１９８４，Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USAから入手可能）において入手可能なプログラム）、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰが、２つのポリヌクレオチド間の％同一性および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％類似度を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、SmithおよびWatermanの「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し（J Mol Biol，１４７，１９５〜１９７，１９８１，Advances in Applied Mathematics，２，４８２〜４８９，１９８１）、２つの配列間の類似度の最適な単一領域を見つける。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが類似でない２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列を比較するのにさらに適しており、さらに短い配列がさらに長い配列の一部分であると推定するプログラムである。それと比較すると、ＧＡＰは、２つの配列を整列させ、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズムに従って「最大類似度」を見つける（J Mol Biol，４８，４４３〜４５３，１９７０）。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さの配列を比較するのにより適しており、整列は全長にわたって予想される。好ましくは、各プログラムにおいて使用されるパラメータ「Gap Weight」および「Length Weight」はそれぞれ、ポリヌクレオチド配列について５０および３であり、ポリペプチド配列について１２および４である。好ましくは、％同一性および％類似性は、比較される２つの配列が最適に整列される場合に決定される。
【００９７】
配列間の同一性および／または類似度を決定するための他のプログラムはまた、当該技術分野で公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S Fら，J Mol Biol，２１５，４０３〜４１０，１９９０，Altschul S Fら，Nucleic Acids Res.，２５：３８９〜３４０２，１９９７，National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ），Bethesda，Maryland，USAから入手可能、NCＢＩのホームページwww.ncbi.nlm.nih.govからアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R,Methods in Enzymology，１８３，６３〜９９，１９９０；Pearson W RおよびLipman D J，Proc Nat Acad Sci USA，８５，２４４４〜２４４８，１９８８，Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部分として入手可能）である。
【００９８】
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and Henikoff J G，Proc.Nat.Acad Sci.USA，８９，１０９１５〜１０９１９，１９９２）は、比較の前に、ヌクレオチド配列が最初にアミノ酸配列へと翻訳されることを含む、ポリペプチド配列の比較において使用される。
【００９９】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して、問い合わせポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定するために使用される。問い合わせおよび参照配列は、最適に整列され、プログラムのパラメータは、以下に記載されるように、デフォルト値に設定される。
【０１００】
「同一性指数」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）と参照配列とを比較するために使用され得る配列関係の測定値である。それ故に、例えば、参照ポリヌクレオチド配列に対して０.９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が参照配列の各１００ヌクレオチドごとに平均５個までの違いを含んでもよいことを除き、参照配列と同一である。このような違いは、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、転位および塩基転換または挿入を含む置換からなる群から選択される。これらの違いは、参照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端位置、または参照配列中のヌクレオチドの間で独立してか、または参照配列内の１つ以上の隣接した群のいずれかに散在するこれらの末端位置の間のどこかで生じてもい。言い換えると、本明細書中上述のように、参照ポリヌクレオチド配列と比較して０.９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るために、参照配列中のヌクレオチド１００ごとに平均５までが欠失、置換または挿入、またはそれらの任意の組み合わせをされてもよい。同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９については、同様に必要な変更を加えて適用する。
【０１０１】
同様に、ポリペプチドについては、例えば、参照ポリペプチド配列と比較して０.９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が、参照配列の各１００アミノ酸ごとに平均５までの違いを含んでもよい以外は、参照配列と同一である。このような違いは、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的な置換および非保存的な置換または挿入を含む置換からなる群から選択される。これらの違いは、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置、または参照配列中のペプチドの間で独立してか、または参照配列内の１つ以上の隣接した群のいずれかに散在するこれらの末端位置の間のどこかでで生じてもい。言い換えると、本明細書中上述のように、参照ポリペプチド配列と比較して０.９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るために、参照配列中のペプチド１００ごとに平均５までが欠失、置換または挿入、またはそれらの任意の組み合わせをされてもよい。同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９については、同様に必要な変更を加えて適用する。
【０１０２】
ヌクレオチドまたはアミノ酸の違いの数と同一性指数との間の関係は、以下の式で表され得る：
ｎa≦Ｘa−（Ｘa・Ｉ）
式中：
ｎaは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の違いの数であり、
ｘaは、それぞれＲＯＣＫまたはＲＯＣＫ中のヌクレオチドまたはアミノ酸の全数であり、
Ｉは、同一性指数であり、
・は、乗算操作の記号であり、
ここで、ＸaおよびＩの非整数部分の積は、Ｘaからそれを引く前に最も近い整数にまで丸められる。
【０１０３】
「ホモログ」は、参照配列に対して高い程度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示すために当該技術分野で一般的に使用される一般的な用語である。このような関連は、本明細書中上記で定義されるように２つの配列間で同一性および／または類似性の程度を決定することによって定量化してもよい。この一般的な用語の意味に含まれるのは、用語「オルソログ」、および「パラログ」である。「オルソログ」は、別の種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価体であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「パラログ」は、機能的に類似の同じ種内にあるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【０１０４】
「融合蛋白」は、２つの、しばしば関連性のない融合遺伝子またはそれらのフラグメントによってコードされる蛋白をいう。一例では、ＥＰ−Ａ−０４６４５３３−Ａは、別のヒト蛋白またはそれらの一部分とともに免疫グロブリン分子の一定領域の種々の部分を含む融合蛋白を開示する。多くの場合において、融合蛋白の一部分として免疫グロブリンFc領域を使用することは、例えば、改良された薬動力学性の結果生じる治療および診断において使用するために有利である［例えば、ＥＰ−Ａ０２３２２６２を参照］。一方、ある使用については、融合蛋白が発現し、欠失し、精製した後のFc部分を欠失可能なことが望ましい。
【０１０５】
特許および特許明細書を含むが、これらに限定されない、本明細書中で引用される全ての刊行物および引用文献は、個々の刊行物または引用文献が、それが本明細書中に完全に記載されているかのように本明細書中の参考によって組み込まれることを特に個別に示されているかのように、全体として本明細書中に参考として組み込まれる。この出願の特許請求の優先権に対する任意の特許明細書もまた、刊行物および参考文献についての上述の様式で、全体として本明細書中に参考として組み込まれる。
【０１０６】
「ＮＫＡ」はニューロキニンＡを意味する。
【０１０７】
明細書中で「ＲＯＣＫ」は、当該技術分野で知られているように、ＲＯＣＫ１および／またはＲＯＣＫ２遺伝子または蛋白、特に哺乳動物のＲＯＣＫ、特にヒトＲＯＣＫを含む、ｒｈｏキナーゼをいう。例えば、ヒトＲＯＣＫは、米国特許第５,９０６,８１９号中に記載されている（ヒトおよびウシＲＯＣＫ）。
【０１０８】
「調整する」は、特定の応答および／または活性の量および／または質、および／または効果における変化を生じる、本明細書中の活性を意味する。応答および／または活性における両方の増加および／または減少が含まれる。
【０１０９】
（実施例）
本発明はさらに、本発明を明瞭にする目的で以下の実施例を用いて説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するように意図されず、解釈されない。本発明が本明細書中に特定的に記載されるもの以外に実施されてもよいことは明らかである。本明細書の教示の観点から本発明の多くの変更および改変が可能であり、それ故に、本発明の範囲内である。以下の実施例は、他に詳細に言及されない限り、当業者にとって既知で日常的な標準的な技術を用いて行われる。
【０１１０】
（実施例１：発現研究）
５匹の雄スプレーグ−ドーリー（Sprague−Dawley）ラット（３５０〜６００ｇ；Charles River，U.S.A.）をイソフルラン（１００％酸素中４％）で麻痺させ、頚部脱臼により殺した。以下の組織を露出させ、取り出した；膀胱、大動脈、心臓、肝臓、腎臓、脳および骨格筋（横隔膜）。ラット組織からの全ＲＮＡの単離を以前に記載されたように行った（Sambrookら、１９８９）。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析（Heidら、１９８６）を使用して、ラット組織におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩのｍＲＮＡの相対レベルを決定した。逆転写の前に、各サンプルの全ＲＮＡ１〜２μｇをRQ Dnase １（Promega Biotech.，Madison，U.S.A.）を用いて処理した。各逆転写されたｃＤＮＡを１００μlおよび５μlに希釈し、各ＰＣＲ反応にかけた。逆転写およびＰＣＲ反応を製造者の指示に従って行った（Applied Biosystems，Foster City，U.S.A.）。増幅サイクルの間、ＦＡＭリポーター顔料の増加する蛍光シグナルを用いて、ＲＯＣＫＩまたはＲＯＣＫＩＩ配列に特異的な増幅を検出した。げっ歯類グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーおよびAppiled Biosystemsから得られたプローブセットを使用してＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを増幅させた。この増幅は、ＲＮＡ量の変化の内部制御として、試験される全てのサンプルについて同じ反応中に含まれていた。各配列に特異的な増幅を４ツ組で行った。続けて、異なるｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次いで、各組織の相対的なｍＲＮＡレベルを心臓組織のレベルと比較した（ｍＲＮＡ心臓レベルを任意に１.０と設定する）。オリゴヌクレオチドプライマーおよびTaqmanプローブをPrimer Expressソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて設計し、Applied Biosystemsによって合成した。順プライマー、逆プライマー、およびプローブの配列は以下のとおりであった：
ＲＯＣＫＩ−
順プライマー−AGGCCTGTGCCAAACCTTT
逆プライマー−TGGTCCCTGTGGGACTTAACA
Taqmanプローブ−CCGCCTGCCCTAGAGTGTCGAAGA
ＲＯＣＫＩＩ−
順プライマー−CCCGATCATCCCCTAGAACC
逆プライマー−TTGGAGCAAGCTGTCGACTG
Taqmanプローブ−CAACAAAACCAGTCCATTCGGCGGC
【０１１１】
A．発現研究の結果
高レベルのＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩのｍＲＮＡが、雄ラット膀胱において検出された（図１）。他のラット組織におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩのレベルと比較すると、大動脈におけるＲＯＣＫＩのｍＲＮＡレベルが最も高く、それに次いで膀胱における発現が高レベルであった。逆に、雄ラット膀胱におけるＲＯＣＫＩＩレベルは、雄ラット大動脈において検出されるレベルのほぼ２倍であった。雄ラット脳、肝臓、腎臓および骨格筋におけるＲＯＣＫＩおよびＲＯＣＫＩＩのレベルは、雄ラット膀胱および大動脈におけるこれらのキナーゼのレベルと比較して低かった。
【０１１２】
（実施例２：臓器浴研究）
A．一般的な調製
６７匹の雄スプレーグ−ドーリーラット（３５０〜６００ｇ；Charles River，U.S.A.）をイソフルラン（１００％酸素中４％）で麻痺させ、頚部脱臼によって殺した。正中線に沿って切断し、膀胱を露出させ、取り出し、長手方向に切断して、２個のほぼ等しい大きさの膀胱片を作った。次いで、各膀胱片を、１５ｍＬの組織浴中で１ｇの静止張力下で長手方向に取り付けた。組織を以下の組成のKrebs溶液に浸した（単位ｍＭ）：ＮａＣｌ  １１８；ＫＣｌ  ４.７；ＮａＨＣＯ３  ２５；ＫＨ２ＰＯ４  １.２；ＭｇＳＯ４  ０.５８；ＣａＣｌ２  ２.５およびグルコース  １１。ヒーター循環システム（VWR１１３０；VWR Scientific Products，U.S.A.）を用いて、浴の温度を３７℃に維持し、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を通気した。組織を電気刺激装置（Ｓ８８；Astro-Med Inc.，U.S.A.）を用いて刺激した。
【０１１３】
Ｂ．実験プロトコル
全ての組織を１ｇの静止張力下６０分間で平衡化し、その間、浴媒体を数回取り替えた。カルバコールおよびニューロキニンＡ（ＮＫＡ）をアゴニストとして用いる実験のために、組織を１００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）にさらし、ピーク収縮に到達させ、カルバコールおよびＮＫＡに対する応答を正規化させた。次いで、組織を６０分洗浄し、次いで、Ｙ−２７６３２またはビヒクルとともに４５分間インキュベートした。次いで、濃度−カルバコールまたはＮＫＡに対する応答曲線を作った。６０分間の平衡化時間の後、収縮性試験基質としてＫＣｌを用いる実験において、組織をＹ−２７６３２またはビヒクルを用いて４５分インキュベートし、次いで、ＫＣｌに対する濃度−応答曲線を作った。α，β−メチレンＡＴＰで誘発された応答についてのＹ−２７６３２の効果を観察する実験において、平衡時間の後にα，β−メチレンＡＴＰを組織に添加し、ピーク収縮性応答に到達させ、次いで、６０分間洗浄した（応答の脱感作を避けるため）。次いで、組織をアンタゴニストまたはビヒクルで４５分インキュベートし、α，β−メチレンＡＴＰに対する第２のチャレンジを行った。電気刺激実験のために、コントロール周波数−応答曲線を以下のパラメーターを用いて行った：１５０ボルト、３０秒で０.５ｍパルス幅、１５分間隔、２、４、８および１６Ｈｚの周波数。組織を各周波数の刺激の間に洗浄した。次いで、組織をアンタゴニストまたはビヒクルを用いて４５分インキュベートし、第２の周波数−応答曲線を作った。全ての実験が終了した際に、ラット膀胱片をテトロドトキシン（TTＸ；１μＭ）で１５分インキュベートし、第３の周波数−応答曲線を実行して、活動電位生成の結果である、これらの組織における電気刺激に対する応答を確認した。Ｐ２Ｘ受容体の脱感作アゴニストとしてα，β−メチレンＡＴＰを用いる実験において、以下のコントロール周波数−応答曲線を作り、α，β−メチレンＡＴＰを浴に添加し、１０分間インキュベートした。次いで、α，β−メチレンＡＴＰに対する第２のチャレンジを行って、このアゴニストに対する収縮性応答の脱感作を確認し、その後、さらなるアンタゴニストを添加し、４５分間インキュベートした。次いで、第２の周波数−応答曲線を上述のように実行した。
【０１１４】
Ｃ．データ採取および分析
膀胱の張力の変化を、ＭＰ１００WＳWインターフェース（Biopac Systems Inc.，U.S.A.）（１秒あたり２０サンプル）を取り付けた５０ｇ等積力変換器（TSD１２５Ｃ；Biopac Systems Inc.，U.S.A.）を用いて測定し、AcqKnowledgeバージョン３.５.７ソフトウェア（Biopac Systems Inc.，U.S.A.）を用いてオフラインで分析した。アゴニストの適用によって誘発された膀胱収縮の振幅（ｇ）を測定した。濃度−応答曲線のために、アゴニストの各濃度に対するピーク応答に到達した後に、この測定を行った。アゴニストによって誘発された膀胱張力における変化は、各組織における１００ｍＭ  ＫＣｌに対する収縮性応答の割合として表現され（ここで、使用される収縮性試験の基質はＫＣｌであり、１００ｍＭはまた、最大応答であり、濃度−応答曲線において使用される最大濃度であった）、対になっていないStudentのt検定によってビヒクルコントロールと比較した。電場刺激に対する収縮性膀胱の振幅（ｇ）および応答の曲線（ＡＵＣ）下の領域を測定した。ベースラインの膀胱張力を、試験基質の投与２分前に測定し、試験基質によって生じるベースラインからの残りの膀胱張力における変化を、４５分間のインキュベーション期間の間に１５分間隔で測定した。ベースライン膀胱張力および電気刺激に対する膀胱収縮性応答における変化を、アンタゴニストの投与前および投与後の変化割合として表し、対になっていないStudentのt検定によってビヒクルコントロールと比較した。０.０５未満のＰ値は、統計的に有意な差であると考えられた。全ての値は±平均標準偏差である。
【０１１５】
D．薬物および溶液
薬物および化学物質を以下の供給源から得た：Tocris Cookson Ltd，U.S.A.からのＹ−２７６３２（（＋）−（R）−トランス−４−（１−アミノ−エチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸一水和物）およびファスジル（塩酸塩；ＨＡ−１０７７）；Sigma Aldrich Chemicals，U.S.A.からの塩化カルバミルコリン（カルバコール）、ニューロキニンＡ、塩化カリウム、α，β−メチレンＡＴＰ、アトロピン（サルフェート）およびテトロドトキシン。Krebsリンガー溶液を自社で製造した（GlaxoSmithKline，U.S.A.）。全ての薬物を蒸留水に溶解した。試験基質を最大１５０μlで浴に添加し、報告された濃度は最終的な浴濃度である。
【０１１６】
E．臓器浴研究の結果
（１）カルバコールで誘発された膀胱収縮およびＮＫＡで誘発された膀胱収縮における１０μＭ  Ｙ−２７６３２の効果
カルバコール（１０−９〜１０−４Ｍ）を蓄積的に添加することにより、単離された雄ラット膀胱片の持続性濃度依存性収縮を誘発した（図２および３）。ビヒクル実験におけるカルバコールに対する最大応答は、１０−５Ｍカルバコールで５.３±０.９ｇであり、１００ｍＭ  ＫＣｌに対する応答が１０５.０±２８.２％であった（図２および３；ｎ＝６）。アゴニスト非存在下でのカルバコールＥＣ５０は１８３.５±６８.９ｎＭであった。予備試験により、１および３μＭのＹ−２７６３２を用いた前処理はカルバコールで誘発された収縮に何の影響も与えないことが示された（未公開結果）。しかし、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を用いた前処理は、１０−９〜３×１０−６Ｍカルバコールの濃度で、顕著にカルバコールで誘発された収縮を弱め、３×１０−６Ｍで５８.１±１０.５％の阻害があった（図２および３；ｎ＝４）。１０−５〜１０−４カルバコール濃度で、収縮はＹ−２７６３２によって弱められたが、この阻害は顕著ではなかった。Ｙ−２７６３２の存在下でのカルバコールＥＣ５０は１０３４.３±３３６.１ｎＭであり、計算されたアゴニスト用量比（ＤＲ）は５.６３であり、アンタゴニストアフィニティ（ｐＫb）は５.６７であった。これらの予備実験およびＹ−２７６３２の選択性について以前に公開されたデータ（考察を参照）から、濃度１０μＭのＹ−２７６３２を次の実験において使用した。
【０１１７】
ＮＫＡ（１０−９〜１０−６）を蓄積的に添加することにより、単離された雄ラット膀胱片の持続性濃度依存性収縮が誘発された（図４および５）。ビヒクル実験におけるＮＫＡに対する最大応答は、３×１０−７ＭのＮＫＡで４.２±０.４ｇであり、１００ｍＭ  ＫＣｌに対する応答は１３６.２±２４.８％であった（図４および５；ｎ＝４）。アンタゴニスト非存在下でのＮＫＡ  ＥＣ５０は６.５±３.９ｎＭであった。１０μｍのＹ−２７６３２を用いた前処理は、全ての濃度のアゴニストでＮＫＡで誘発された収縮を顕著に弱め、３×１０−７Ｍ  ＮＫＡで阻害は６８.６±１２.７％であった（図４および５；ｎ＝５）。Ｙ−２７６３２の存在下でのＮＫＡ  ＥＣ５０は、３２.４±９.４ｎＭであり、計算されたアゴニスト用量比（ＤＲ）は４.９８であり、アンタゴニストアフィニティ（pＫb）は５.６０であった。
【０１１８】
（２）ＫＣｌで誘発された膀胱収縮についての１０μＭ  Ｙ−２７６３２の効果
ＫＣｌ（１〜１００ｍＭ）の蓄積的な添加により、１０ｍＭ以上の濃度で単離された雄ラット膀胱片の持続性濃度依存性収縮を誘発した（図６および７）。ビヒクル実験におけるＫＣｌに対する最大応答は、１００ｍＭのＫＣｌで８.７±０.５ｇであった（ｎ＝５）。１００ｍＭより高い濃度のＫＣｌは、単離された雄ラット膀胱の応力緩和を誘発した（未公開観察）。アンタゴニストの非存在下におけるＫＣｌ  ＥＣ５０は３１±４.３ｍＭであった。１０μＭのＹ−２７６３２を用いた前処理は、試験されたいずれの膀胱片においてもＫＣｌに対する収縮性応答に効果がなかった（図６および７；ｎ＝５）。
【０１１９】
（３）α，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮についての１０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＨＡ−１０７７の効果
１０μＭのα，β−ＡＴＰの添加により、３.９±０.５ｇの平均振幅を有する単離された雄ラット膀胱片の収縮性応答を誘発した（図８；ｎ＝１４）。興味深いことに、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮を３０.０±７.２％まで顕著に弱めた（図８および９；ｎ＝４）。この予測されない実験結果をさらに観察するために、別のＲＯＣＫインヒビターＨＡ−１０７７（塩酸ファスジル；Daviesら、２０００）の効果はまた、単離された雄ラット膀胱におけるα，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮についても試験された。ＨＡ−１０７７（１０μＭ）はまた、α，β−メチレンＡＴＰで誘発された膀胱収縮を２２.１±５.７％まで顕著に弱めた（図８および９；ｎ＝５）。ＨＡ−１０７７によるこの阻害は、α，β−メチレンＡＴＰ誘発された膀胱収縮の阻害後にＹ−２７６３２で処理したものとは顕著には異なっていなかった。
【０１２０】
（４）電気的に誘発された膀胱収縮に関して、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、並びにＹ−２７６３２、アトロピンおよびα，β−メチレンＡＴＰの組み合わせの効果
電気刺激は、膀胱張力の迅速な増加の後の持続性収縮を含む、二段階の、２、４、８および１６Ｈｚでの単離された雄ラット膀胱の周波数依存性収縮を誘発した（図１０A）。全ての実験グループについてコントロール周波数−応答曲線から電気的に誘発された膀胱収縮の平均振幅は、２、４、８および１６Ｈｚでそれぞれ、２.０±０.４ｇ、２.９±０.５ｇ、３.９±０.７ｇおよび４.８±０.８ｇであった。さらに、これらの収縮についての平均ＡＵＣは、２、４、８および１６Ｈｚでそれぞれ、４５.９±１０.３、６７.７±１５.０、９０.３±１８.５および１０８.９±２１.０であった（ｎ＝２６）。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、刺激の全ての周波数で電気的に誘発された膀胱収縮の振幅およびＡＵＣを両方とも顕著に弱めた（図１０ＢおよびＣ；ｎ＝４）。電気的に誘発された膀胱収縮の振幅およびＡＵＣについてのＹ−２７６３２の効果との顕著な違いはなかった。
【０１２１】
電気的に誘発された膀胱収縮についてのＹ−２７６３２の効果をさらに特徴決定するために、Ｙ−２７６３２、ムスカリン様アンタゴニストアトロピンの組み合わせ、およびＰ２Ｘ受容体とα，β−メチレンＡＴＰの脱感作を用いて実験を行った。アトロピン（１μＭ）は、２および４Ｈｚで、電気的に誘発された膀胱収縮に何の効果もなかったが、８および１６Ｈｚでこれらの応答を顕著に弱めた（図１１Ａ（ａ）；ｎ＝５）。さらに、アトロピンは、刺激の全ての周波数でのこれらの収縮のＡＵＣを顕著に弱め、応答の振幅に対するこのアンタゴニストの阻害効果よりも大きな程度で顕著に弱めた（図１１Ａ（ｂ））。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）単独では、アトロピン単独の場合よりも電場刺激に対する収縮性応答についての振幅に対する効果を顕著に大きく弱めた（図１１Ａ（ａ））が、これらの応答のＡＵＣに対するＹ−２７６３２またはアトロピンのいずれかの効果は、顕著には異ならなかった（図１１Ａ（ｂ））。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）およびアトロピン（１μＭ）を用いたラット膀胱の随伴性インキュベーションは、刺激の全ての周波数で、電気的に誘発された膀胱収縮の振幅およびＡＵＣの両方を顕著に弱めた（図１１Ａ（ａ）および（ｂ）；ｎ＝４）。さらに、Ｙ−２７６３２とアトロピンの組み合わせの阻害効果は、Ｙ−２７６３２またはアトロピン単独の効果よりも顕著に大きかったが、但し、２Ｈｚの電気刺激に対する収縮応答のＡＵＣはこれらの実験グループ間で顕著な違いが観測されず、例外であった（図１１Ａ（ａ）および（ｂ））。
【０１２２】
α，β−メチレンＡＴＰ（１０μＭ）を用いたＰ２Ｘ受容体の脱感作は、２および４Ｈｚでの電気的に誘発された膀胱収縮の振幅およびＡＵＣに何の効果も与えなかったが、８および１６Ｈｚでのこれらの応答の両パラメーターを顕著に弱めた（図１１Ｂ（ａ）および（ｂ）；ｎ＝４）。電気的に誘発された膀胱収縮応答の振幅およびＡＵＣに対するα，β−メチレンＡＴＰの効果に顕著な違いはなかった。さらに、これらの応答のＡＵＣに対するアトロピン単独の阻害効果は、α，β−メチレンＡＴＰ単独の効果より顕著に大きく、一方、電気的に誘発された膀胱収縮の振幅におけるこれらのアンタゴニストの効果には顕著な違いは観測されなかった（図１１ＡおよびＢ）。電気的に誘発された膀胱収縮の振幅におけるＹ−２７６３２（１０μＭ）単独の効果は、α，β−メチレンＡＴＰ単独の効果とは顕著には異ならず（図１１Ｂ（ａ））、一方、Ｙ−２７６３２は、α，β−メチレンＡＴＰよりもこれらの応答のＡＵＣについて顕著に大きな阻害効果を有していた（図１１Ｂ（ｂ））。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）およびα，β−メチレンＡＴＰ（１０μＭ）を用いたラット膀胱片の蓄積的なインキュベーションにより、刺激の全ての周波数で電気的に誘発された膀胱収縮の振幅およびＡＵＣを顕著に弱めた（図１１Ｂ（ａ）および（ｂ）；ｎ＝４）。さらに、Ｙ−２７６３２とα，β−メチレンＡＴＰとの組み合わせの阻害効果は、Ｙ−２７６３２単独またはα，β−メチレンＡＴＰ単独の効果よりも顕著に大きかった。それに加えて、単離されたラット膀胱片に対するＹ−２７６３２およびアトロピンの蓄積的な添加は、Ｙ−２７６３２およびα，β−メチレンＡＴＰの組み合わせよりも、電気的に誘発された収縮のＡＵＣに対してより大きな弱める効果があり、一方、これらの応答の振幅についてはアンタゴニスト２つの組み合わせ間に違いは観察されなかった（図１１ＢおよびＣ）。周波数−応答曲線は、全ての実験グループにおいてTTＸのさらなる投与によって無くなった（１μＭ：ｎ＝２６；未公開データ）。
【０１２３】
（５）ベースライン膀胱張力についての試験基質の効果
Ｙ−２７６３２（１０μＭ）は、４５分間のインキュベーション時間の間にベースライン膀胱張力を顕著に下げ、応力緩和は０.４０±０.０５ｇに達し、ベースラインから４７.０±２.５％の量まで減少した（ｎ＝２２；図１２）。同様に、ＨＡ−１０７７（１０μＭ）は、ベースライン膀胱張力を顕著に下げ、３６.１±１.６％まで減少させ、４５分後には０.３０±０.０１ｇであった（ｎ＝５；図１２）。ベースライン膀胱張力に対するＹ−２７６３２およびＨＡ−１０７７の効果は、顕著には異ならなかった。本研究において使用された全ての他の試験基質は、ベースライン膀胱張力に何の効果も持たなかった。
【０１２４】
（６）アゴニストで誘発された膀胱収縮および電気的に誘発された膀胱収縮およびベースライン膀胱張力に対するビヒクルの効果
試験基質（蒸留水）のためのビヒクルの投与は、全ての実験グループにおけるアゴニストで誘発された収縮または電気的に誘発された収縮およびベースライン膀胱張力に何の効果も持たなかった。
【０１２５】
本明細書中に引用された全ての文献およびこれに対し優先権を主張する特許明細書は、全体として本明細書中に参考として組み込まれる。本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されるものに加える本発明の種々の変更は、上述の記載から当業者に明らかになる。このような変更は、本特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書中で引用される特許、明細書および刊行物の開示は、全体として参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
原文に記載なし
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月27日(2004.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532305000001.app
【国際調査報告】
2005532305.tif 000016