(57)【要約】病変組織または損傷組織の修復に使用するための組織移植片構成物を提供する。本組織移植片構成物は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物と、追加の内皮細胞と、該移植片構成物における血管様構造の形成の開始を増強する少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む。予め選択した細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、あるいは、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞または他の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来の細胞集団であってもよいが、修復対象の組織に基づいて選択されることが好ましい。これらの組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法およびこれらの移植片構成物の調製方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための、血管様構造を有する組織移植片構成物であって、
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物と、
追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
該予め選択した追加の細胞集団が該組織移植片構成物における該血管様構造の形成開始を増強することを特徴とする、組織移植片構成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞の集団を含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項５】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、線維芽細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項６】
さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項７】
血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項８】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種すること特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項９】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項１０】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１に記載の移植片構成物。
【請求項１１】
組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種し該移植片構成物を形成し、該予め選択した追加の細胞集団により該組織移植片の該血管様構造の開始を増強する工程と、
脊椎動物の修復が必要な部位に該移植片構成物を移植する工程と、
を包含する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞集団を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、線維芽細胞を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記移植片構成物が、さらにヘパリナーゼを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記移植片構成物が、血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、および血清増殖因子からなる群から選択される増殖因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、前記マトリックス組成物上で前記内皮細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に該内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞も前記予め選択した追加の細胞集団も拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、前記マトリックス組成物上で該内皮細胞培養する工程と、
前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させるのに十分な時間にわたって、該予め選択した追加の細胞集団を該マトリックス組成物上で培養する工程と、
をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
in vitroで血管も血管様構造も形成しないで、前記内皮細胞を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、該内皮細胞を前記マトリックス組成物上で培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した細胞集団を拡大させる（expand）のに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で該予め選択した追加の細胞集団を培養する工程をさらに包含する、請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記移植片構成物を移植する前に、前記内皮細胞を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大させる（expand）ことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記移植片構成物を移植する前に、前記予め選択した追加の細胞集団を拡大（expand）させないことを特徴とする、請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための、血管様構造を有する組織移植片構成物を調製する方法であって、
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、および脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種し、該予め選択した追加の細胞集団により該組織移植片の該血管様構造の形成開始を増強する工程を包含する方法。
【請求項３４】
前記移植片構成物を前記脊椎動物に移植する前に、in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、前記内皮細胞を前記マトリックス組成物上で培養する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法であって、
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、および脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種し、該予め選択した追加の細胞集団により該組織移植片の血管新生の開始を増強する工程と、
血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該マトリックス組成物上でin vitroで培養する工程と、
脊椎動物の修復が必要な部位に前記移植片構成物を移植する工程と、
を包含する方法。
【請求項３６】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、角化上皮細胞、非角化上皮細胞、および中胚葉由来細胞からなる群から選択される細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞集団を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも一つの追加の細胞集団が、平滑筋細胞前駆細胞の集団を含むことを特徴とする、請求３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種した後に、該マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記マトリックス組成物に前記予め選択した追加の細胞集団を接種した後に、該マトリックス組成物に前記内皮細胞を接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記マトリックス組成物に、前記内皮細胞と前記予め選択した追加の細胞集団とを同時に接種することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
病変組織または損傷組織の修復に使用するための血管新生した組織移植片構成物であって、
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、および脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物と、
追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、
in vitroで血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、該内皮細胞を該マトリックス組成物上で培養したこと、かつ、
該予め選択した追加の細胞集団により該組織移植片の血管新生の開始を増強することを特徴とする、組織移植片構成物。
【請求項４３】
前記マトリックス組成物が、肝臓の基底膜を含有することを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または４２のいずれか１項に記載の組織移植片構成物。
【請求項４４】
前記マトリックス組成物が、脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンを含有することを特徴とする、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または４２のいずれか１項に記載の組織移植片構成物。
【請求項４５】
患者の病変組織または損傷組織を治療する方法であって、該病変組織もしくは損傷組織を請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または４２のいずれか１項に記載の組織移植片構成物で修復する工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜本発明の範囲＞
本発明は、マトリックス組成物由来の血管新生が促進された組織移植片、および病変組織または損傷組織を修復するためにその組織移植片を使用する方法に関する。特に、本発明は、組織移植片構成物の修復能を高めるために、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種したマトリックス組成物を含む、血管新生が促進された組織移植片を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、損傷組織または病変組織の修復に使用するための、内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種したマトリックス組成物を含む組織移植片構成物を目的とする。本発明に従って使用するマトリックス組成物は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択される。このマトリックス組成物は、好ましくは、高度に保存されたコラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを含む。本発明において使用するマトリックス組成物は、温血脊椎動物の組織由来である。
【０００３】
本発明に従って調製する組織移植片構成物は実質的に細胞を持たないマトリックスであり、これは、in vivoで見出されたマトリックス環境に類似する優れた細胞成長のための基質を提供する。このマトリックス組成物の天然の組成および立体構造は、in vitroにおける細胞の付着および増殖を促進し、また、移植片構成物がin vivoで移植される際の組織再構築を誘導する、細胞成長のためのユニークな基質を提供する。
【０００４】
組織移植片の物質として、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンは、宿主内の移植表面に内因性組織の成長を誘導する（すなわち、移植片物質は再構築を誘導する）。この組織移植片構成物は、そのように利用すれば、この移植片構成物で置換された組織の成長または再生のためのマトリックスとして役立つだけでなく、内因性組織のそのような成長または再生を促進したり誘導したりすると考えられる。これらの移植片物質は、内因性組織の再生を誘導するため、移植可能なシート形態、または注入可能な流体形態もしくはゲル形態で使用し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンから選択されるマトリックス組成物を含み、さらに、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団も含む組織移植片構成物を目的とする。本発明はまた、組織移植片構成物の血管新生をin vivoで促進する方法を目的とする。この血管新生が促進された組織移植片構成物は、組織移植片組成物を宿主へ移植または注入する前に、内皮細胞または内皮細胞前駆体（例えば前駆細胞または幹細胞）および少なくとも一つの予め選択した追加の細胞タイプもしくは指定された細胞タイプを、in vitroでマトリックス組成物に接種することによって調製する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの実施形態は、病変組織または損傷組織の修復のために使用する組織移植片構成物を提供する。この組織移植片構成物は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲからなる群から選択されるマトリックス組成物、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む。
【０００７】
別の実施形態において、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した組織移植片構成物を提供する。この組織移植片構成物は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物、追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む（in vitroで血管または血管様構造を形成させるために、十分な時間、この内皮細胞をこのマトリックス組成物上で培養した）。
【０００８】
別の実施形態において、in vivoで組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、移植片構成物を形成させるために、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程、および脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。
【０００９】
また別の実施形態において、in vivoで組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。本方法は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導するのに十分な時間にわたってこの内皮細胞をin vitroで培養する工程と、脊椎動物の修復が必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程を包含する。
【００１０】
これらの方法の実施形態のいずれにおいても、内皮細胞をマトリックス組成物に接種した後に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、または内皮細胞をマトリックス組成物に接種する前に、予め選択した追加の細胞集団を接種し得、あるいは内皮細胞と予め選択した追加の細胞集団とを同時にもしくはほぼ同時に接種し得る。
【００１１】
この内皮細胞は、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいてマトリックス組成物上で培養し得る。あるいは、この内皮細胞は、in vitroで血管または血管様構造を形成しないで内皮細胞を拡大する（すなわち、この内皮細胞が少なくとも１回分裂させる）のに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で培養し得る。あるいは、この移植片構成物は、内皮細胞を拡大させないで移植し得る。これらの実施形態のうちのいずれにおいても、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物を注入する前に拡大させてもよいし、拡大させ（すなわち、少なくとも1回の細胞分裂周期を経て発達させ）なくてもよい。
【００１２】
また別の実施形態では、病変組織または損傷組織を修復するために使用する組織移植片構成物を調製する方法を提供する。本方法は、移植構成物を形成するために、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。本方法はさらに、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、in vitroにおいてマトリックス組成物上で内皮細胞を培養する工程を包含し得る。
【００１３】
これらの実施形態のうちいずれにおいても、少なくとも一つの追加の細胞集団は、非角化の上皮細胞集団もしくは角化上皮細胞集団、または線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞（例えば、幹細胞）、周皮細胞、および骨形成原細胞からなる群から選択される中胚葉由来細胞の集団を含み得る。様々な実施形態において、マトリックス組成物には、内皮細胞およびこれらの付加的な細胞タイプの１種以上を接種し得る。（すなわち、マトリックス組成物には、内皮細胞とともに、これらの付加的な細胞タイプの１種、２種、３種等を接種し得る。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜本発明の詳細な説明＞
本発明は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物を含み、さらに追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含む組織移植片構成物を目的とする。このマトリックス組成物に、内皮細胞および予め選択した外因性細胞集団を接種し、病変組織または損傷組織を修復するために使用する。本発明によれば、「損傷組織」とは、損傷し、裂傷し、切断され、または外科的に切除され、あるいは修復を必要とする部位を欠落している（例えば先天的欠損または先天的奇形）組織を意味する。
【００１５】
このマトリックス組成物は、肝臓の基底膜ならびにその抽出物および水解物に由来する細胞外マトリックス組成物から調製し得るが、加えて、例えば単離された基底膜層を形成する他の培養組織、あるいは市販の加工コラーゲン組成物や精製コラーゲン組成物からも調製し得る。本発明に従って使用され得る市販の加工コラーゲン組成物の例としては、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）、ＡＰＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標）、およびＰＥＲＩ−ＧＵＡＲＤ（登録商標）が挙げられる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）基底膜マトリックス（ベクトン・ディッキンソン社）は、ＥＨＳ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）腫瘍の可溶化基底膜抽出物である腫瘍由来基底膜組成物で、ゲル状であり再構築された基底膜を形成している。ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）（ライフ・セル社）は、細胞を除去するよう加工した死体真皮由来の組成物である。ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）（インテグラ・ライフサイエンス社）はウシコラーゲンおよびコンドロイチン硫酸塩からなる無細胞性の皮膚組成物である。ＡＰＰＬＩＧＲＡF（登録商標）（ノバルティス社）は、ヒト線維芽細胞ならびに他の細胞性成分および無細胞性の成分を接種した合成ポリ乳酸含有組成物である。また、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標）は、Ｖｉｃｒｙｌの網状脊椎におけるヒト線維芽細胞の同種皮膚移植片である。ＰＥＲＩ−ＧＵＡＲＤ（登録商標）（バイオ・バスキュラー社）は化学的に架橋したウシの心膜から調製した組成物である。精製コラーゲンおよび加工コラーゲンはまた、当該分野で既知の技術によって製造し得る（例えば、米国特許第6,127,143号、同第5,814,328号、同第5,108,424号および同第4,883,864号を参照のこと）。
【００１６】
本発明に従って使用する内皮細胞は、大血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、動脈内皮細胞および静脈内皮細胞を含む、任意のタイプの内皮細胞集団由来であり得る。成熟内皮細胞（例えば、器官または血管から採取されたもの）または内皮細胞前駆体（例えば、前駆細胞または幹細胞）のいずれも、本発明に従って使用し得る。さらに、内皮細胞は、幼若動物からでも老齢動物からでも採取することができるが、幼若動物から採取した内皮細胞の方が好ましい。
【００１７】
一つの実施形態において、予め選択した追加の外因性細胞集団は、非角化上皮細胞集団もしくは角化上皮胞集団であってもよいし、または、線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、多能性を有する前駆細胞、周皮細胞、骨形成原細胞もしくは他の任意の適切な細胞タイプからなる群から選択される中胚葉由来細胞集団であってもよい。
【００１８】
マトリックス組成物と内皮細胞とを結合させる、予め選択した追加の外因性細胞集団は、修復対象の組織の細胞タイプに基づいて選択し得る。例えば、皮膚が修復されることになっている場合、予め選択した外因性細胞集団は、非角化上皮細胞であってよいし、心臓組織が修復されることになっている場合は、予め選択した外因性細胞集団は心筋細胞であってよい。別の実施形態において、治療される患者から単離された自家細胞をこのマトリックス組成物に接種する。
【００１９】
一つの実施形態において、マトリックス組成物と内皮細胞とを結合させる少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞を含む。都合のよいことに、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞は、内皮細胞と共に、移植片構成物中の血管または血管様構造の形成を促進し得る。別の実施形態において、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞前駆細胞と共に、付加的な細胞タイプを添加し得る。
【００２０】
また別の実施形態において、少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団は、多能性を有する前駆細胞集団を含む。マトリックス組成物は、損傷組織の修復を助ける細胞の中へ、これらの多能性を有する前駆細胞の分化を誘導し得る。都合のよいことに、内皮細胞集団および多能性を有する前駆細胞集団を接種したマトリックス組成物は、様々な異なるin vivo部位に移植し得、この前駆細胞は、特定の環境に対して適切な細胞タイプへ分化する。例えば、腱または靭帯部位に内皮細胞および多能性を有する前駆細胞を含む組成物を移植すると、この移植片構成物は腱または靭帯へと再構築する。
【００２１】
マトリックス組成物、内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を組み合わせることにより、in vitroおよび／またはin vivoにおいて血管新生が驚異的に増強し、マトリックス組成物のみと内皮細胞のみとの組み合わせ、またはマトリックス組成物のみと内皮細胞以外の治療因子としての細胞タイプとの組み合わせのいずれかの使用と比較して、組織機能のより高い創傷治癒能および優れた回復を有する組織移植片構成物を提供する。
【００２２】
様々な実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、マトリックス組成物に予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、またはマトリックス組成物に内皮細胞を接種する前に、マトリックス組成物に予め選択した追加の細胞集団を接種し得るか、または内皮細胞および予め選択した追加の細胞集団を同時にもしくはほぼ同時に接種し得る（様々な典型的な実施形態については、図１を参照）。
【００２３】
そのような一つの実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、そして、構成物を病変部位へ移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上でこの内皮細胞を培養し得る。マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前にマトリックス組成物上で予め選択した細胞を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させ（すなわち、少なくとも１回の細胞分裂周期を経て発達させ）てもよいし、拡大させなくてもよい。
【００２４】
あるいは、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、そして、移植片を移植する前に、血管もしくは血管様構造の形成または成分を誘導しないで内皮細胞を拡大させるために、マトリックス組成物上でその内皮細胞を培養し得る。本実施形態において、移植片構成物の移植の前にマトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団は、移植片構成物の病変部位への移植前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００２５】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、このマトリックス組成物を移植し得る。
【００２６】
代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に予め選択した細胞集団を拡大させる（すなわち、この細胞を少なくとも１回分裂させる）ために、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養し得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した外因性細胞集団を接種した後において、また、in vivoで移植片を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片の移植の前にマトリックス組成物上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前にこの内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００２７】
別の実施形態において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植片を移植し得る。
【００２８】
また別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団を同時にまたはほぼ同時に接種し得る。本実施形態において、内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団をマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片を移植することもできる。内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００２９】
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物は、in vitroにおいてマトリックス組成物上で培養される細胞の増殖および分化を支える生理的環境を有利に提供する。従って、マトリックス組成物上に細胞を接種し得、以下に記述するように、当業者に公知の標準的な細胞培養技術を用いて細胞を培養し、移植用組織移植片を作成してそれを必要としている宿主に移植し得る。
【００３０】
肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物が、細胞の成長を支える基質となれる能力は、宿主への移植の前に、内皮細胞集団および／または予め選択した追加の外因性細胞集団を拡大させる機会を提供する。内皮細胞を拡大させる場合、そのような拡大は、移植前に、血管または血管様構造の形成（すなわち、in vitroにおける移植片構成物の潜在的な血管新生）をもたらし得、移植片構成物が移植されると、移植片の創傷治癒能を向上させる。移植片構成物を移植する前に、血管または血管様構造を形成させること、あるいは、移植片構成物を移植する前に内皮細胞を拡大させることにより、移植片を移植したときの創傷治癒能が高められる。それは例えば、移植片構成物表面で成長する細胞の分化および遊走を促進し、移植片構成物内の細胞の増殖を促進するという作用によるものである。
【００３１】
移植の前に、追加の内皮細胞および予め選択した追加の外因性細胞集団をマトリックス組成物上で培養する実施形態において、細胞成長を寄与する条件下で、マトリックス組成物上でこれらの細胞を培養する。培養細胞は、マトリックス組成物と直接的に接触するかまたは間接的に接触（例えば、液性の伝達）し得る。細胞成長に寄与する条件とは、組織および細胞培養について現在認められている手順の下で、細胞増殖に最適であると考えられる無菌技術、温度（例えば、約３７℃）、および栄養供給量などの環境要因である。最適の培養条件は特定の細胞タイプに依存するが、一般に細胞成長の条件は、当技術分野で周知である。
【００３２】
本発明に従ったマトリックス組成物は、移植片物質として様々な形態で使用し得、また、移植片構成物を移植する前に、in vitroにおいて内皮細胞およびその他の細胞タイプを培養するために使用し得る。これらの形態としては、シート型構造、ゲル形態、（例えば、組織の粉砕または消化による）流動組成物、および当業者に公知の細胞／組織培養液に添加するための抽出物が挙げられる。このマトリックス組成物またはその成分は、細胞接着のための表面を提供し、かつ／または細胞分化および／または細胞増殖を誘導し得る。このマトリックス組成物は、組織培養／細胞培養として適用する前に滅菌することが好ましい。しかし、抗生物質が細胞培養液に含まれている場合、滅菌していない組成物を使用し得る。
【００３３】
一つの実施形態において、移植片構成物を移植する前に、細胞培養のために細胞増殖に寄与する条件下で、肝臓基底膜組織シート上に細胞を直接接種する。これらの組織は多孔性であるため、細胞の栄養素がマトリックス全体に拡散し得る。従って、肝臓の基底膜のどちらの面上においても細胞を接種し、培養し得る。
【００３４】
移植片構成物の移植前に培養するために、マトリックス組成物上に接種された内皮細胞および／または予め選択した追加の外因性細胞集団は、無機物、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質、もしくはラミニンやフィブロネクチンなどの糖タンパク質を含む栄養素、および／または上皮細胞増殖因子、血管内皮細胞由来増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子様分子、トランスフォーミング成長因子β、線維芽細胞増殖因子、あるいは別の血清増殖因子などの増殖因子の存在下で成長させることができる。一つの実施形態において、in vitroでの細胞増殖を持続させ誘導する能力を高め、さらにin vivoでの再構築を誘導するため、流動形態または粉末形態のマトリックス組成物を、標準的な細胞培地に補充するために用いることができる。市販の細胞培地体培地（血清含有でも無血清でもよい）の存在下において、マトリックス組成物上でこの細胞を成長させることができる。
【００３５】
一つの実施形態において、マトリックス組成物および内皮細胞を組み合わせるために、少なくとも一つの予め選択した追加の細胞集団は、内皮細胞とともに移植片構成物の血管または血管様構造の形成を促進するための、平滑筋細胞および／または平滑筋細胞への分化能を有する前駆細胞であってよい。平滑筋細胞をヘパリナーゼで処理すると、増殖細胞に特徴的な表現型の変化を誘導し得ることが知られている。このため、マトリックス組成物に、内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、ヘパリナーゼが細胞培地中に含まれ得る。例えば、フラボバテリウム・ヘパリナム（Flavobaterium heparinum）由来の4単位/mlのヘパリナーゼは、短時間（例えば、6時間）培地に含有させ得るか、または、培地に常に存在させ得る。
【００３６】
また、サブコンフルエントな細胞単層としての基質上に接種された平滑筋細胞には、分裂能による表現型の変化が起こることが知られている。平滑筋細胞が内皮細胞のコンフルエントな単層で共培養されると、表現型の変化が阻害される。このため、マトリックス組成物に内皮細胞および平滑筋細胞集団および／または平滑筋細胞前駆細胞集団を含む少なくとも一つの予め選択した外因性細胞集団を接種する実施形態においては、この細胞がサブコンフルエントな細胞単層としてマトリックス組成物に付着するように、追加の内皮細胞をマトリックス組成物上に接種し得る。別の実施形態において、細胞がサブコンフルエントな細胞単層としてのマトリックス組成物に付着するように、内皮細胞、平滑筋細胞および／または平滑筋前駆細胞をマトリックス組成物上に接種し得る。
【００３７】
一つの実施形態において、マトリックス組成物、追加の内皮細胞、および予め選択した追加の外因性細胞集団を含有する特許請求されている組成物を、宿主の中への移植するための生体適合性マトリックス中に被包し得る。この被包マトリックスは、栄養素を被包された細胞に拡散させ、さらにこの被包された細胞の産物を、被包された細胞から宿主の細胞へと拡散させるように構成し得る。生細胞を被包するのに適する生体適合性ポリマーは当業者に知られている。例えば、ポリリシン／アルギン酸塩封入法（polylysine/alginate encapsulation process）が、F.LimとA.Sunによって既に記載されている（Science,Vol.210,pp.908-910）。実際に、人工臓器として移植するために、本発明のマトリックス上の細胞を被包すれば、肝臓の基底膜それ自体を有利に使用することができる。
【００３８】
一つの実施形態において、in vivoにおいて組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種して移植片構成物を形成する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位にこの移植片構成物を移植する工程とを包含する。この方法の一つの実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上でその内皮細胞を培養し得る。移植片構成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物の移植の前に、マトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、予め選択した追加の細胞集団を、移植片構成物の病変部位への移植の前に拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００３９】
あるいは、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種することができ、移植片を移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導しないでマトリックス組成物上でその内皮細胞を培養して、内皮細胞を拡大させることもできる。本実施形態において、移植片構成物の移植の前に、マトリックス組成物上で内皮細胞を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００４０】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後に、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、その後直ちに、この組織片構成物は内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、移植し得る。
【００４１】
本方法の代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、予め選択した細胞集団を拡大させるために、マトリックス組成物上でこの予め選択した細胞集団を培養し得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した細胞集団を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、マトリックス組成物上で内皮細胞を培養することによってこの細胞を拡大させるのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、この内皮細胞を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４２】
別の実施形態において、マトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種し得、その後直ちに、内皮細胞も予め選択した追加の外因性細胞集団のいずれも拡大させることなく、この移植片構成物を移植し得る。
【００４３】
また別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とをマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させることもできるし、２つの細胞集団を拡大させないで移植片構成物を移植することもできる。この内皮細胞を拡大させる場合、内皮細胞の拡大は、血管または血管様構造の形成を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４４】
本発明に従って、病変組織または損傷組織の修復に使用するために、血管新生した組織移植片構成物もまた提供する。この血管新生した移植片構成物は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物を含有し、さらに追加の内皮細胞および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を含み、ここでこの内皮細胞は、in vitroにおいて血管または血管様構造を形成させるのに十分な時間にわたって、マトリックス組成物上で培養した。
【００４５】
別の実施形態において、in vivoにおける組織移植片構成物の血管新生を促進する方法を提供する。この方法は、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程と、in vitroにおいて血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞と付加的な細胞集団とを該マトリックス組成物上で培養する工程と、脊椎動物の修復の必要な部位に移植片構成物を移植する工程を包含する。
【００４６】
本発明のマトリックス組成物は、移植の前に、初めは小さな細胞集団（in vitroで拡大し得る）を接種し得る。都合のよいことに、in vitroにおいて内皮細胞をマトリックス組成物上で培養すると、この内皮細胞を接種することによって、in vitroでこの移植片の血管新生を誘導し得る。このマトリックス組成物はさらに、血管新生を促進するために、平滑筋細胞もしくは平滑筋細胞前駆細胞、または線維芽細胞などの別の細胞タイプを接種し得る。
【００４７】
この実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞を接種し、構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、その内皮細胞をマトリックス組成物上で培養し得る。マトリックス組成物に内皮細胞を接種した後において、またin vivoで移植片構成物を移植する直前までの任意の時点において、このマトリックス組成物に少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得る。従って、移植片構成物を移植する前に、マトリックス組成物上で予め選択した細胞集団を培養するのに許容する時間によって、移植片構成物の病変部位への移植の前に、予め選択した追加の細胞集団を拡大させてもよいし、拡大させなくてもよい。
【００４８】
代替的な実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した追加の外因性細胞集団を接種し得、移植片構成物を移植する前に、この予め選択した細胞集団をマトリックス上で培養して、予め選択した細胞集団を拡大させ得る。この実施形態において、マトリックス組成物に予め選択した細胞集団を接種した後に、このマトリックス組成物に内皮細胞を接種する。この実施形態において、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造を形成するために内皮細胞を拡大するのに十分な時間にわたって、内皮細胞をマトリックス組成物上で培養する。
【００４９】
別の実施形態において、マトリックス組成物に内皮細胞と予め選択した追加の外因性細胞集団とを同時にまたはほぼ同時に接種し得る。この実施形態において、移植片構成物を移植する前に、予め選択した追加の外因性細胞集団と内皮細胞とをマトリックス組成物上で培養し、これら２つの細胞集団を拡大させる。
【００５０】
病変組織または損傷組織を修復するのに使用する組織移植片構成物を調製する方法もまた提供する。この方法は、移植片構成物を形成するために、肝臓の基底膜、その抽出物および水解物、ならびに脊椎動物の粘膜下組織以外の組織に由来する加工したコラーゲンからなる群から選択されるマトリックス組成物に、内皮細胞集団および少なくとも一つの予め選択した追加の外因性細胞集団をin vitroで接種する工程を包含する。この方法はさらに、移植片構成物を病変部位に移植する前に、血管または血管様構造の形成を誘導するのに十分な時間にわたって、内皮細胞をマトリックス組成物上で培養する工程を包含し得る。
【００５１】
このマトリックス組成物は、本来脊椎動物の肝臓組織に関連する細胞成分から単離することにより調製した肝臓の基底膜（ＬＢＭ）から作製し得る。以下に記載する調製技術は、実質的にあらゆる細胞成分を除去したＬＢＭから本質的な細胞外マトリックス組成物を提供する。
【００５２】
本発明のマトリックス組成物に使用する基底膜は、典型的には、食肉生産用（例えば、ブタ、ウシ、ヒツジまたは他の脊椎動物が挙げられる）をはじめとする飼育される動物から採取した肝臓組織から調製する。従って、本発明に従って使用する組成物の調製に用いる肝臓組織は、商業的に安価な供給源から調達できる。ＬＢＭ組成物を本発明の送達システムで使用する場合、この組成物は、有害な宿主免疫応答を誘導することはない。
【００５３】
無細胞のＬＢＭ組成物を調製するために、細胞外成分が実質的に破壊されないようにしながら細胞外成分から肝臓組織の細胞成分を遊離させるのに十分な時間にわたって、肝臓組織を細胞解離溶液で処理し、細胞成分を細胞外成分から単離する。細胞解離溶液には、カオトロピック試薬もしくは酵素、またはその両方が含まれるのが普通である。
【００５４】
ＬＢＭの調製における第１工程は、肝臓組織の表面積と体積の比を高めるため、肝臓組織セグメントを切片化する（例えば、条片やシート状にする）ことである。肝臓組織を、厚さ約50〜500μ、より好ましくは約250〜300μの一連のシートにスライスしてもよい。新たに採取した肝臓組織は標準的なミートスライサーを使用して、スライスすることもできるし、凍結しクリオマイクロトーン（cryomicrotone）でスライスすることもできる。次いで、関連する細胞外基底膜マトリックスから成分である肝細胞を遊離させる溶液で肝臓組織薄片を処理する。
【００５５】
肝臓組織は、酵素（例えばトリプシンやペプシンなどのプロテアーゼ）を含む溶液で処理し得る。ＬＢＭがコラーゲン構造を有しており、細胞解離中の膜構造の分解を最小限に留めたいので、細胞解離のために使用する酵素溶液中でのコラーゲン特異的酵素活性を最小限にする必要がある。さらに、肝臓組織は、カルシウムキレート剤またはカオトロピック試薬（例えば、TritonＸ−100）を用いて処理することも普通である。従って、肝臓組織は、酵素およびカオトロピック試薬を含む細胞解離溶液中に組織切片もしくは条片を懸濁させることによって処理する。しかし、組織を酵素処理しないで、カルシウムキレート剤またはカオトロピック試薬を使用して細胞解離することもできる。
【００５６】
約0.05〜2重量％のプロテアーゼ、より代表的には約0.1〜約1重量％のプロテアーゼ含む溶液に肝臓組織薄片を懸濁することにより、攪拌しながら細胞解離を実施し得る。必要に応じて、細胞膜マトリックスを実質的に分解させないで基底膜からの細胞の遊離および単離を最適化するのに有効量のカオトロピック試薬またはカルシウムキレート剤を、この溶液に含ませることもできる。
【００５７】
マトリックスから全細胞を遊離させるのに十分な時間にわたって、肝臓組織を細胞解離溶液に接触させた後、得られたＬＢＭを生理食塩水で１回以上すすぎ、必要に応じて、使用するまで、水和状態または部分的な脱水状態で凍結保存する。細胞解離は、実質的に基底膜から全細胞を遊離させるため、複数の処理を必要とし得る。任意の残存する酵素活性を除去または阻害するために、得られたＬＢＭの調製物をさらに処理し得る。例えば、得られた基底膜を加熱または１種以上のプロテアーゼ阻害剤で処理し得る。
【００５８】
別の実施形態では、ＬＢＭは以下のように調製し得る。新たに採取した肝臓組織を、標準的なミートスライサーを使用して、厚さ約50〜約2000μの一連のシート片にスライスすることもできるし、この組織を凍結し、ミートスライサーまたはクリオマイクロトーンでスライスすることもできる。次いで、肝臓組織を、脱イオン水、生理食塩水、またはバッファー等により１回以上すすぎ、必要に応じて、使用するまで、水和状態または部分的な脱水状態で凍結保存する。例えば、肝臓のシート片または条片を、脱イオン水、生理食塩水またはバッファーでそれぞれ１回ずつ３０分間３回すすぐこともできる。次いで、例えば篩を用いて肝臓切片からすすぎ溶液を濾し取り、各肝臓切片を篩上でマッサージ(massage)することもできるし、超音波を用いて、肝細胞の溶解を促進し、かつ肝臓の基底膜から機械的に肝細胞および肝細胞断片を分離することもできる。
【００５９】
次いで、関連する細胞外基底膜マトリックスから肝細胞および他の成分を遊離させるトリプシン等のプロテアーゼを含む溶液に肝臓薄片を接触させる。肝臓の基底膜がコラーゲン構造を有しており、細胞解離中の膜構造の分解を最小限に留めたいので、プロテアーゼ消化工程で使用する酵素溶液中では、コラーゲン特異的酵素活性を最小限にする必要がある。代表的には、肝臓組織を、プロテアーゼ処理と同時に、ＥＤＴＡ等のカルシウムキレート剤にも接触させる。
【００６０】
一つの好ましい実施形態において、必要に応じて攪拌しながら、0.02重量％のトリプシンを含み、ＥＤＴＡを0.05重量%の濃度で含む溶液に肝臓切片を接触させることにより、プロテアーゼ消化工程を実施する。プロテアーゼ消化工程は、加熱(代表的には約37℃)しながら実施することが好ましい。上述のすすぎ工程および機械的解離工程を、プロテアーゼ消化工程の後に繰り返してもよい。
【００６１】
次いで、非変性剤を含む溶液に肝臓切片を接触させる。この工程は、室温で、必要に応じて攪拌しながら実施することが好ましい。非変性剤としては、3％  TritonＸ−100が好ましい。非変性剤をほぼ完全に（100％でなくともよいが）除去するため、肝臓切片を非変性剤に接触させた後、上述のすすぎ工程を繰り返す。必要に応じ、機械的な解離工程を繰り返してもよい。
【００６２】
非変性剤による処理の後、肝臓切片を変性剤を含む溶液に接触させる。この工程は、室温で、必要に応じて攪拌しながら実施することが好ましい。変性剤としては、4％デオキシコレートが好ましい。次いで、残留している界面活性剤できるだけ除去するため、上述のようにＬＢＭを十分にすすぐ。ＬＢＭは使用するまで保存することができるが（例えば、4℃の脱イオン水中で）、この精製手順の後直ちに使用することもできる。
【００６３】
ＬＢＭは調製後、米国特許第5,275,826号に記載されている流動化粘膜下組織の調製法と同様の方法で流動化し得る（本明細書中に特に援用することにより組み込むものとする）。裂傷、切断、磨砕、煎断等によりＬＢＭを微粉砕する。肝臓の基底膜を凍結または凍結乾燥状態で磨砕することが好ましいが、肝臓の基底膜の懸濁液を高速（高剪断）ブレンダー中で処理し、必要なら、過剰水を遠心しデカントして脱水するという方法によっても良い結果が得られる。さらに、プロテアーゼ（例えばコラゲナーゼ）または他の適切な酵素（例えば、グリカナーゼ）、あるいはマトリックスの構造成分を破壊する他の酵素を用い、組織を溶解化して実質的に均質な溶液を生成するのに十分な時間にわたって、酵素消化することによって、微粉砕した流動化組織を可溶化し得る。
【００６４】
本発明に従って、経皮的なドラッグデリバリーもしくは経粘膜的なドラッグデリバリーで使用する流動化ＬＢＭの粘性は、ＬＢＭ成分の濃度および水和化の程度をコントロールすることにより操作し得る。粘性は、25℃で、約2〜約300,000cpsの範囲に調節し得る。より高い粘性を有する製剤（例えば、ゲル剤）をＬＢＭ消化溶液からも調製し得る。それは、消化された物質を透析した後、ＬＢＭ消化溶液のｐＨを約5.0〜約9.0に調節することにより行う。
【００６５】
ＬＢＭはまた、抽出物形態で調製し得る。簡潔に述べると、ＬＢＭを4℃で約24時間攪拌しながら抽出バッファーに懸濁し得る。抽出混合液を4℃で約30分間遠心（12,000×g）し、上清を回収し得る。次いで、不溶性の物質を抽出バッファーで洗浄し、遠心の工程を繰り返し、洗浄液を元の上清と併せることができる。この上清を脱イオン水で十分に透析し（MWCO約3,500）、透析物を12,000×gで遠心し得る。上清は直ちに使用することもできるし、凍結乾燥して保存することもできる。
【００６６】
本発明に従って、粉末形態のＬＢＭも使用し得る。粉末形態は、組織を液体窒素下で微粉砕し、粒径0.1〜1mm2の粒子を形成することによって調製し得る。次いで、この粒子状複合体を一晩凍結乾燥し滅菌して、固形状の実質的に無水の粒子状組成物を形成する。あるいは、粉末形態のＬＢＭは、流動化ＬＢＭから、粉砕されたＬＢＭの懸濁液または溶液を乾燥させることにより形成し得る。粉末形態、流動形態、ゲル形態、または抽出物形態のＬＢＭは、本発明に従って移植片構成物を移植する前に、内皮細胞および予め選択した細胞集団を培養するのに使用し得る。
【００６７】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、ＡＬＬＯＤＥＲＭ（登録商標）、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標）、ＰＥＲＩ−ＧＵＡＲＤ（登録商標）、およびＡＰＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）は、市販の加工コラーゲン組成物である。精製コラーゲンおよび加工コラーゲンはまた、当該分野で既知の技術によっても調製し得る。例えば、米国特許第6,127,143号、同第5,814,328号、同第5,108,424号、および同第4,883,864号を参照されたい（本明細書中に援用することにより組み込むものとする）。
【実施例】
【００６８】
＜実施例１＞
＝＝＝肝臓基底膜組成物の調製＝＝＝
本実験に使用する2mM  EDTA緩衝カオトロピック溶液
１４０mM     NaCl
５mM         KCl
０．８mM     MgSO4
０．４mM     KH2HPO4
２mM         EDTA
２５mM       NaHCO3
方法：
肝臓切片の調製：
−７０℃で凍結した肝臓を、クリオマイクロトーンで厚さ約50μの切片にスライスした。次いで、この肝臓組織切片に、上記のカオトロピック溶液（2mM ＥＤＴＡ）による酵素処理（0.1％トリプシン）を供した。
【００６９】
肝臓切片を、5本の50ｍｌチューブに入れ、各チューブに緩衝酵素処理溶液25mlを加えた。肝臓組織を、37℃のウォーターバスで軽く振とうしながら1時間インキュベートした。肝臓切片を、室温で1時間攪拌／振とうしながらＰＢＳで2回洗浄した。上記の酵素処理工程を、3回繰り返した。凍結組織は1cmの立方体にスライスし、液体窒素下で、工業用ブレンダーを用いて2mm2未満の粒子状物質に粉砕し、使用するまで‐80℃で保存した。
【００７０】
＝＝肝臓基底膜の抽出物の調製＝＝
これらの研究に使用した抽出バッファーは、4Mグアニジンおよび2M尿素を含有した（それぞれ、50mM Tris-HCl、ｐＨ7.4で調製）。肝臓の基底膜組織粉末を、フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、Ｎ−エチルマレイミド、およびベンザミジン（プロテアーゼ阻害剤）を含む（それぞれ１ｍＭ）抽出バッファー（25％ w/v）に懸濁し、4℃で24時間激しく撹拌した。その後、抽出混合液を4℃で30分間遠心(12,000×g)し、上清を回収した。不溶性の物質は、抽出バッファーで簡単に洗浄し、遠心し、洗浄液を元の上清と併せた。この上清を、30倍量の脱イオン水（72時間にわたり9回取替えた）でSpectrapor(MWCO 3,500、スペクトラム・メディカル・インダストリーズ(Spectrim Medical Industries)、ロサンゼルス、カリフォルニア州）のチューブで十分に透析した。いかなる不溶性の物質も除去するために、透析物を12,000×gで遠心し、この上清は直ちに使用しるか、もしくは凍結乾燥して保存した。
【００７１】
＝＝流動化させた肝臓基底膜組織の調製＝＝
0.5Mの酢酸溶液（0.1％ペプシン含有）100ｍｌに５ｇの粉末状組織を加え、４℃で７２時間消化することにより、微粉砕した物質を部分的に消化した。部分的に消化した後、この懸濁液を4℃で20分間遠心（12,000rpm）し、不溶性のペレットを捨てた。この上清を、4℃で、0.01M酢酸を数回取り換えながら透析し（MWCO  3,500）、ＬＢＭの水解物にクロロホルム（900mlの0.01M酢酸に対し5mlのクロロホルム）を加えることにより、この溶液を滅菌した。無菌の0.01M酢酸をさらに２度取り換えてＬＢＭの透析を続け、クロロホルムを除去した。その後、透析バッグの内容物を、無菌的な容器に無菌操作で移した。得られた流動組成物を４℃で保存した。
【００７２】
＝＝肝臓基底膜のゲル組成物の調製＝＝
ゲル形態のＬＢＭを調製するために、８mlの流動化ＬＢＭを、1.2mlの10×PBSバッファー（5mg/Lフェノールレッドを含む10×リン酸緩衝生理食塩水）（0.04N HCl（約1.6ml）を加え、pHを6.6〜7.4に調節し、pHが>8にシフトするまで0.05N NaOH（約1.2ml）を加えた）と混合した。最終量を水で12mlに調節した。
【００７３】
＜実施例２＞
＝＝＝内皮細胞の成長＝＝＝
肝臓の基底膜組織を上記の通り調製する。様々な方法（γ線照射、過酢酸等）により滅菌した後、細胞増殖のための平坦な表面（50mm2）を作るために、この組織をポリプロピレンフレーム内に固定する。培地栄養素が、肝臓の基底膜組織の両方の表面へ届くように、このフレームを組織培養液に浸す。内皮細胞および平滑筋細胞を肝臓の基底膜に接種し、（3×104細胞／組織片）、次いで、37℃、5％  CO2の95％エアインキュベーターに入れる。様々な時間培養した後、細胞を接種した肝臓の基底膜組織を、10％の中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して切片（6μｍ）を作成する。細胞増殖の特性を明らかにするために、様々な組織学染色および免疫組織化学的染色を実施する。これらの方法を用いて血管または血管様構造を観察する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の移植片構成物の代替的な調製を示すフローチャートである。
【図１】
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【国際調査報告】
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