(57)【要約】本発明は、組換えＭＶＡウイルスの作製のために用いる変異ＭＶＡワクシニアウイルス、ならびにこれらの変異ＭＶＡウイルスを感染させた宿主細胞に関する。本発明はさらに、ＤＮＡベクター構築物、ならびに変異ＭＶＡウイルスおよびＤＮＡベクター構築物を用いて組換えＭＶＡを作製する方法に関する。本発明の変異ＭＶＡワクシニアウイルスは、ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノム内で不活性化されていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とするＭＶＡノックアウト変異体。
【請求項２】
ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子またはその機能的部分がウイルスゲノムからの欠失により不活性化されていることを特徴とする、請求項１に記載のＭＶＡノックアウト変異体。
【請求項３】
請求項１または２に記載の前記ＭＶＡに感染していることを特徴とする宿主細胞。
【請求項４】
真核細胞である請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
ＢＨＫ−２１細胞、ＢＳ−Ｃ−１細胞、ＭＡ１０４細胞またはＣＶ−１細胞である請求項４に記載の真核細胞。
【請求項６】
ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子をコードするか、または機能的に同等のＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ由来ポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡベクター構築物。
【請求項７】
前記構築物が外来タンパク質をコードするＤＮＡ配列をさらに含む、請求項６に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項８】
前記外来抗原が治療用ポリペプチドおよび病原性因子からなる群に由来する異種ポリペプチドである、請求項７に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項９】
前記治療用ポリペプチドがｔ−ＰＡまたはインターフェロンからなる請求項８に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１０】
前記病原性因子が、ウイルス、細菌、原虫および寄生体ならびに腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞の関連抗原、またはそれらの機能的部分からなる、請求項９に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１１】
前記ウイルスがインフルエンザウイルス、麻疹および呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスまたは乳頭腫ウイルスからなる群から選択される、請求項９に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１２】
前記原虫が熱帯熱マラリア原虫である請求項９に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１３】
前記細菌が結核を引き起こすマイコバクテリアである請求項９に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１４】
前記腫瘍関連抗原が、黒色腫関連分化抗原、例えばチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、癌・精巣抗原、例えばＭＡＧＥ−１、２、３、およびＢＡＧＥ、腫瘍上で過剰発現する非変異の共通抗原、例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１およびｐ５３から選択される、請求項８に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１５】
前記ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌおよび外来タンパク質コード領域がそれぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須部位に隣接するＤＮＡ配列に隣接している、請求項６〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１６】
前記非必須部位はＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位である、請求項１５に記載のＤＮＡベクター。
【請求項１７】
プラスミドである、請求項６〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１８】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞を請求項１または２の組換えＭＶＡに感染させる工程と、
該宿主細胞を請求項６〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物でトランスフェクションする工程と、
ＣＥＦ細胞またはニワトリ胚由来ＬＳＣＣ−Ｈ３２細胞または鳥類の細胞、例えば、ウズラ線維芽細胞ＱＴ６またはＱＴ３５細胞で増殖させることにより、復元されたＭＶＡを選択する工程と、
からなる、組換えＭＶＡを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＭＶＡウイルスの作製に用いる変異ＭＶＡワクシニアウイルス、ならびにこれらの変異ＭＶＡウイルスを感染させた宿主細胞に関する。本発明はさらに、ＤＮＡベクター構築物、ならびに変異ＭＶＡウイルスとＤＮＡベクター構築物とを用いて組換えＭＶＡを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属に属している。ワクシニアウイルスのある種の株は、天然痘に対して免疫化するための生ワクチンとして長年にわたって用いられている。株の例としては、英国のリスター研究所（Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＥｌｓｔｒｅｅ株がある。ワクチン接種を原因とした合併症（非特許文献１）の可能性があるため、また１９８０年にＷＨＯにより天然痘は根絶されたとの宣言が出されたため、今日ではリスクが高い人のみが天然痘に対するワクチン接種を受けている。
【０００３】
ワクシニアウイルスは、外来抗原の生産および送達用のベクターとしても使用されている（非特許文献２）。この場合、ＤＮＡ組換え技術によりワクシニアウイルスのゲノムに導入しようとする外来抗原をコードするＤＮＡ（遺伝子）を必要とする。仮にその遺伝子が、ウイルスのライフサイクルに必須でないウイルスＤＮＡの部位に組み込まれた場合、新しく生産される組換えワクシニアウイルスが感染性となる可能性がある。すなわち、外来細胞に感染することにより組み込まれたＤＮＡ配列を発現することが可能である（特許文献１および２）。このようにして調製した組換えワクシニアウイルスは、一方では感染の予防のための生ワクチンとして、他方では真核細胞における異種タンパク質の生産のために用いることが可能である。
【０００４】
ワクシニアウイルスは、最も広範に評価がなされている生ベクター（ｌｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）の１つであり、組換えワクチンとしてのその使用を支持する特別な特徴を備えている。すなわち、このウイルスは非常に安定であり、安価に製造され、投与が容易で、多量の外来ＤＮＡを組み込むことが可能である。このウイルスは抗体と細胞毒性反応の両方を誘発させる利点を持ち、比較的自然な方法で免疫系に抗原を提示することを可能にし、多様な動物モデルにおいて感染性疾患に対する防護ベクターワクチンとしての使用が成功している。さらに、ワクシニアベクターは、組換えタンパク質の構造−機能相関を解析するため、液性および細胞性免疫応答の標的を決定するため、ならびに特定の疾患に対する防護に必要な免疫防御の種類を検討するための、極めて貴重な研究ツールである。
【０００５】
しかしながら、ワクシニアウイルスはヒトに対して感染性であり、実験室における発現ベクターとしてのその使用は、安全上の懸念および規制による影響を受けてきた。さらに、例えばヒトにおける新規な治療法または予防法のための組換えタンパク質または組換えウイルス粒子を作製するために、組換えワクシニアウイルスを将来適用する可能性は、組換えワクシニアベクターが増殖的に複製することが原因で閉ざされている。文献に記載されている組換えワクシニアウイルスの大部分は、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株が基となっているが、この株は神経毒性が高いためヒトおよび動物における使用には不適であることが知られている（非特許文献３）。
【０００６】
ＶＶの標準株の安全性に関する懸念に対しては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの限られた複製能力およびｉｎ  ｖｉｖｏでの無毒性を特徴とする高度に弱毒化されたウイルス株からワクシニアベクターを開発することにより対処されている。望ましくない副作用を回避するために特別に培養されたウイルス株が長年にわたって知られている。したがって、ニワトリ胚線維芽細胞でワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株（ＣＶＡ）を長期間連続して継代培養することにより、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を育成することが可能となっている（総説については、非特許文献４および特許文献３を参照）。ＭＶＡウイルスは、ブダペスト条約の要件に従って、ＣＮＣＭ（フランス国７５７２４  パリ  セデックス１５  リュ  ド  ドクトゥール  ルー  ２５（２５，ｒｕｅ  ｄｅ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５）に所在のパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に、１９８７年１２月１５日に寄託番号Ｉ−７２１として寄託された。
【０００７】
野生型ＣＶＡ株と比較してゲノム内の変化を調べるためにＭＶＡウイルスの分析が行われ、６つの主要な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ）が同定されている（非特許文献５）。この改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａは低い毒力を有しているにすぎない。すなわち、ワクチン接種に用いた場合、副作用がないことになる。したがって、このウイルスは免疫不全状態の対象者への最初のワクチン接種に特に適している。ＭＶＡ株の優れた特性は多くの臨床試験で実証されている（非特許文献６および７）。
【０００８】
最近、ＭＶＡゲノム内またはＴＫ遺伝子内の欠失ＩＩＩの部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を有し、宿主域が制限され、高度に弱毒化されたＭＶＡウイルスを用いた、新規なワクシニアウイルス・ベクター系が樹立された（非特許文献８ならびに特許文献４）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における長期連続継代培養により得られたＭＶＡはＣＥＦにおいて非常に効率良く増殖可能であるが、ヒトおよび他のほとんどの哺乳動物の細胞内では増殖的に生育する能力を失っている（非特許文献５および非特許文献９）。ヒト細胞におけるウイルス複製は感染後期に阻害され、成熟感染性ビリオンへのアセンブリが妨げられる。それにもかかわらず、ＭＶＡは、非許容細胞中でさえもウイルス遺伝子および組換え遺伝子を高レベルで発現することが可能であり、効率的で、例外的に安全な発現ベクターとしての役割を果たしうる（非特許文献１０）。
【０００９】
動物モデルでは、組換えＭＶＡを基にした候補ワクチンは、インフルエンザウイルス、免疫不全ウイルスおよびプラスモディウム寄生体を含む種々の感染性因子に対して免疫原性かつ／または防御性であることが見いだされている。さらに、癌の治療における組換えＭＶＡの潜在的有用性がいくつかの腫瘍モデル系において立証された（非特許文献１１および１２）。興味深いことに、組換えＭＶＡは、複製能力のあるワクシニアウイルス・ベクターと比較して、標的抗原に対して同等またはより良好な免疫応答を誘導し、先在性のワクシニアウイルス特異的免疫によって影響されることが著しく少ない（非特許文献１３）。現在のところ、ＭＶＡはベクター開発に最適のワクシニアウイルス株であると考えられる。いくつかの組換えＭＶＡワクチンが、既に腫瘍の免疫療法およびヒト免疫不全ウイルス感染の予防における臨床研究に供されている。
【００１０】
ＭＶＡゲノムは、ウイルス調節因子をコードする数個の読み取り枠（ＯＲＦ）を含んでいる（非特許文献１４）。それらのうちの１つは、ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌであり（非特許文献１４）、ＶＶ遺伝子Ｅ３Ｌとしても知られている（非特許文献１５）。ウイルスタンパク質Ｅ３Ｌは、ＶＶによりコードされる重要なインターフェロン（ＩＦＮ）耐性因子の１つである（非特許文献１６）。このタンパク質は、ｄｓＲＮＡに結合して、ＰＫＲおよび２’−５’オリゴアデニル酸シンテターゼ（２−５Ａ−Ｓ）のいずれの活性化も阻害することが示されている（非特許文献１７および１８）。Ｅ３Ｌの産生は、ヒトＨｅＬａ細胞を含む各種哺乳動物宿主細胞におけるＶＶの複製に必須であるとされているが、ＣＥＦにおけるウイルスの増殖には必須でないことが見いだされた（非特許文献１９および２０）。
【００１１】
ＭＶＡの用途をさらに開発するために、ＤＮＡ組換えによりワクシニアウイルスのＭＶＡ株に外来遺伝子を導入することによって組換えＭＶＡを得る新たな方法を探求した。組換えＭＶＡを得るために予め確立した戦略は、選択および非選択マーカー遺伝子、例えば、大腸菌のｇｐｔおよびｌａｃＺまたはワクシニアウイルスのＫ１Ｌ遺伝子配列を、ゲノムへ同時挿入することに基づいている（非特許文献１０および２１）。ＭＶＡゲノムへのこれらの異種マーカーの導入により、クローン化組換えウイルスの単離が非常に容易になる。しかし、クローニング操作中に、突然変異誘発因子であるミコフェノール酸またはＸ−Ｇａｌ／ＤＭＦＡのような選択剤または色素原物質を補足する必要があり、および／または選択的宿主細胞を用いる必要がある。さらに、付加された外来遺伝子配列が維持されることは、臨床適用に用いられるベクターウイルスには望ましいことではなく、ウイルスゲノムにさらに遺伝子工学的処理を施して望ましくないマーカーを除去する必要がある（非特許文献１２および２１）。
【特許文献１】
欧州特許出願第８３，２８６号
【特許文献２】
欧州特許出願第１１０，３８５号
【特許文献３】
スイス国特許第５６８  ３９２号
【特許文献４】
米国特許第５，１８５，１４６号
【非特許文献１】
シェル（Ｓｃｈａｅｒ）、Ｚｅｉｔｓｃｈｒ．ｆｕｅｒ  Ｐｒａｅｖｅｎｔｉｖｍｅｄｉｚｉｎ、第１８巻、４１〜４４ページ、１９７３年。
【非特許文献２】
スミスら（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第２巻、３８３〜４０７ページ、１９８４年。
【非特許文献３】
モリタら（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖａｃｃｉｎｅ、第５巻、６５〜７０ページ、１９８７年。
【非特許文献４】
メイル，エー（Ｍａｙｒ，Ａ．）、ホッホスタイン−ミンツェル，ブイ（Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，Ｖ．）およびスティックル，エイチ（Ｓｔｉｃｋｅｌ，Ｈ．）、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、第３巻、６〜１４ページ、１９７５年。
【非特許文献５】
マイアー，エイチ（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．）、サッター，ジー（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．）およびメイル，エー（Ｍａｙｒ，Ａ．）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｒ．第７２巻、１０３１〜１０３８ページ、１９９１年。
【非特許文献６】
メイルら（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  第１６７巻、３７５〜３９０ページ、１９８７年。
【非特許文献７】
スティクルら（Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．第９９巻、２３８６〜２３９２ページ、１９７４年。
【非特許文献８】
サッター，ジー（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．）およびモス，ビー（Ｍｏｓｓ，Ｂ．）、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ  第８４巻、１９５〜２００ページ、１９９５年。
【非特許文献９】
サッターら（Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６８巻、第７号、４１０９〜４１１６ページ、１９９４年。
【非特許文献１０】
サッター，ジー（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．）およびモス，ビー（Ｍｏｓｓ，Ｂ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０８４７〜１０８５１ページ、１９９２年。
【非特許文献１１】
モスら（Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、第３９７巻、７ページ、１９９６年。
【非特許文献１２】
ドレックスラーら（Ｄｒｅｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第５９巻、４９５５ページ、１９９９年。
【非特許文献１３】
ラミレツら（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、第７４巻、７６５１ページ、２０００年。
【非特許文献１４】
アントインら（Ａｎｔｏｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２４４巻、３６５ページ、１９９８年。
【非特許文献１５】
ゲベルら（Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７９巻、２４７ページ、１９９０年。
【非特許文献１６】
スミスら（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｅｍ．Ｖｉｒｏｌ．第８巻、４０９ページ、１９９８年。
【非特許文献１７】
チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＮＡＳ  第８９巻、４８２５ページ、１９９２年。
【非特許文献１８】
リバスら（Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２４３巻、４０６ページ、１９９８年。
【非特許文献１９】
ベアッティーら（Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ）、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、第１２巻、８９ページ、１９９６年。
【非特許文献２０】
チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６９巻、６６０５ページ、１９９５年。
【非特許文献２１】
スタイブ  シーら（Ｓｔａｉｂ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２８巻、１１３７〜１１４８ページ、２０００年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、上記の不都合を回避し、組換えＭＶＡを作製する改善された方法を提供することが本発明の目的である。ＭＶＡウイルスのゲノムを変化させない意図であったので、この要件に適合する方法を使用する必要があった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
これは、特許請求の範囲の独立請求項の特徴により達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に示されている。
本発明によれば、ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子またはその機能的部分（機能を有する部分）がウイルスゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする新規なＭＶＡノックアウト変異体が提供される。
【００１４】
前記ＯＲＦ  ０５０Ｌの機能的部分としては、例えば、Ｅ３Ｌタンパク質のカルボキシ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（チャンおよびヤコブス（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｊａｃｏｂｓ）、１９９３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１９４巻、５３７ページ）、または、細胞インターフェロン応答タンパク質との配列類似性を有し、Ｚ−ＤＮＡに結合可能であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥ３Ｌの機能に必要である、Ｅ３Ｌタンパク質のアミノ末端ドメイン（ブラントおよびヤコブス（Ｂｒａｎｄｔ  ＆  Ｊａｃｏｂｓ）、２００１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７５巻、８５０ページ）などがある。したがって本明細書で用いる場合、ＯＲＦ  ０５０Ｌの機能的部分とは、Ｅ３Ｌタンパク質のフラグメントであって、ＭＶＡゲノム内で不活性化することによりＣＥＦ細胞において変異ＭＶＡが複製しなくなるようなフラグメントであると定義する。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、ＭＶＡ  ＯＲＦ  ０５０Ｌ遺伝子またはその機能的部分は、ウイルスゲノムから欠失させることにより不活性化されている。
代替例として、Ｅ３Ｌ機能に欠陥のある組換えＭＶＡを、配列突然変異誘発、例えば挿入突然変異誘発によりフレームシフトを導入して機能的Ｅ３Ｌタンパク質合成の不活性化をもたらすか、またはＥ３Ｌ遺伝子の転写を特異的に阻害することにより、作製してもよい。この組換えＭＶＡは、外来遺伝子を導入してその後トランスフェクションされた株を選択する方法、すなわち組換えＭＶＡを作製する方法において用いるのに好都合である。
【００１６】
人為操作したウイルスをウサギＲＫ−１３細胞およびハムスターＢＨＫ−２１細胞において連続クローニングすることによる、一時的に宿主域を選択する最近確立された方法（スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｔｅｃｎｉｑｕｅｓ、第２８巻、１１３７ページ）を用いて、ウイルスゲノムからＥ３Ｌコード配列が欠失した変異ＭＶＡ（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ）を作製した。ＢＨＫ−２１細胞の感染時に実施したウイルスタンパク質のウエスタンブロット分析により、前記ウイルスがＥ３Ｌタンパク質を産生できないことが示された。ＢＨＫ−２１細胞中の増殖能力について比較したところ、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌは元の非変異ＭＶＡ  Ｆ６と同程度の効率で複製した（図２Ｄ）。
【００１７】
驚くべきことに、発明者らがＭＶＡ増殖用の好ましい細胞培養系であるＣＥＦ中でウイルスの増殖を試験したとき、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌは生産的に複製することが不可能であることが認められた（図２）。この所見は特に驚くべきことであった、というのも以前はＶＶゲノムからＥ３Ｌを欠失させてもＣＥＦにおけるウイルスの複製には影響を及ぼさないとされていたからである（ベアッティーら（Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）１９９６年、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ、第１２巻、８９ページ；チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）１９９５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６９巻、６６０５ページ）。
【００１８】
ＭＶＡ−ΔＥ３ＬのゲノムにＥ３Ｌをコードする配列を正確に再挿入することにより、ＣＥＦにおけるウイルスの増殖能が回復し、復帰突然変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ−Ｒｅｖが生じた（図２Ｃ、２Ｄ）。このデータは、ＣＥＦにおけるＭＶＡの子孫形成にＥ３Ｌの機能が必須であることを裏付けた。さらに、ＭＶＡプラスミドベクターへＥ３Ｌ遺伝子配列をクローニングし、該プラスミドベクターをＭＶＡ−ΔＥ３Ｌに感染させたＢＨＫ−２１細胞へトランスフェクションすることにより、ＣＥＦでの増殖選択により直接単離可能な組換えＭＶＡが生成された。
【００１９】
この驚くべき所見から出発し、発現ベクターまたはワクチンとして使用するための組換えＭＶＡを迅速かつ効率よく生産するための必須ツールとして、変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌが役割を果たすことを特徴とする方法を開発した。
【００２０】
とりわけ有利な点は、組換えＭＶＡのこのような厳密な増殖選択を（ｉ）臨床用ＭＶＡワクチンの生産に適した十分確立された組織培養であるＣＥＦで実施可能なこと、および（ｉｉ）既に十分に特性解析されている本来のＭＶＡ遺伝子型を単純に復元することに基づいていることである。
【００２１】
本発明の基礎をなす原理は、ＭＶＡがＣＥＦ上に存在し、適切なＤＮＡ配列（Ｅ３Ｌコード配列および任意選択で（例えば異種タンパク質をコードする）さらなるＤＮＡ配列）が導入されない限りは、複製が起こらないということである。したがって、本方法／ＭＶＡノックアウト変異体は、組換えＭＶＡの選択に適しており、したがって組換えＭＶＡを効率よく作製するためのツールとしての機能を果たす。
【００２２】
本明細書で用いているように、「組換えＭＶＡ」という用語は、例えばＤＮＡ組換え技術により遺伝的に改変されており、ワクチンまたは発現ベクターとしての使用に供されるＭＶＡを意味する。
【００２３】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウイルスは以下のように調製することが可能である。
Ｅ３Ｌタンパク質またはＥ３Ｌ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とを含み、いずれのＤＮＡ配列も、ＭＶＡゲノム内の非必須部位（例えば欠失ＩＩＩなどの天然に存在する欠失部位など）に隣接するＤＮＡ配列に隣接しているＤＮＡ構築物を、細胞、好ましくは真核細胞に導入する。好ましい真核細胞は、相同的組換えが可能なようにＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを生産的に感染させた、ＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、ＢＳＣ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２６）、ＣＶ−１細胞（ＥＣＡＣＣ  ８７０３２６０５）またはＭＡ１０４細胞（ＥＣＡＣＣ  ８５１０２９１８）である。ひとたびＤＮＡ構築物が真核細胞に導入され、Ｅ３ＬをコードするＤＮＡおよび外来ＤＮＡがウイルスＤＮＡと組換えられれば、ウイルスの増殖を支持するためにＥ３Ｌの機能を必要とする細胞、例えばＣＥＦ細胞で継代することにより、所望の組換えワクシニアウイルスＭＶＡを単離することが可能である。組換えウイルスのクローニングは、プラーク精製として知られている方法により可能である（例えばナカノら（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、１５９３〜１５９６ページ（１９８２年）、フランケら（Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９１８〜１９２４ページ（１９８５年）、チャクラバーチら（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３４０３〜３４０９ページ（１９８５年）、ファシら（Ｆａｔｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９７〜１０５ページ（１９８６年）を参照）。
【００２４】
挿入するＤＮＡ構築物は、線状でも環状でもよい。環状ＤＮＡを用いることが好ましい。プラスミドを用いることが特に好ましい。
ＤＮＡ構築物は、ＭＶＡゲノム内の非必須部位（例えば欠失ＩＩＩ部位）の左右に隣接する配列を含んでいてよい（サッター  ジーおよびモス  ビー（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ．）（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０８４７〜１０８５１ページ。
【００２５】
外来ＤＮＡ配列を、非必須部位、例えば天然に存在する欠失、の両側に隣接する配列の間に挿入することが可能である。
外来ＤＮＡ配列は、例えばｔ−ＰＡもしくはインターフェロンなどの治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、または病原性因子由来の遺伝子であってよい。病原性因子とは、疾病を引き起こし得るウイルス、細菌および寄生体、ならびに生物体内で無制限に増殖することにより病的に増殖する腫瘍細胞であると理解されたい。そのような病原性因子の例は、デビス，ビー．ディー．ら（Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．）の著書（Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｈａｒｐｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されている。病原性因子の好ましい遺伝子は、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えばＨＩＶ  ＩやＨＩＶ  ＩＩ）、ヒト肝炎ウイルス（例えばＨＣＶやＨＢＶ）、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、熱帯熱マラリア原虫、および結核を引き起こすマイコバクテリア、の遺伝子である。
【００２６】
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、黒色腫関連分化抗原（例えばチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２）、癌・精巣抗原（例えばＭＡＧＥ−１、−２、−３、およびＢＡＧＥ）、腫瘍上で過剰発現される非変異型の共通抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１およびｐ５３）、の遺伝子である。
【００２７】
外来のＤＮＡ配列または遺伝子が発現されることを可能にするためには、遺伝子の転写の要件とされる調節配列がＤＮＡ上に存在することが必要である。そのような調節配列（プロモーターと呼ばれている）は当業者に知られており、例えば、欧州特許出願公開第１９８，３２８号に記載のワクシニア１１ｋＤａ遺伝子の調節配列および７．５ｋＤａ遺伝子の調節配列（欧州特許出願公開第１１０，３８５号）である。
【００２８】
ＤＮＡ構築物は、例えば、リン酸カルシウム沈殿（グラハムら（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌ．第５２巻、４５６〜４６７ページ（１９７３年）、ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌｌ  ７７７〜７８５ページ（１９７９年））、エレクトロポレーション（ニューマンら（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１巻、８４１〜８４５ページ（１９８２年））、マイクロインジェクション（グレスマンら（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１０１巻、４８２〜４９２ページ（１９８３年））、リポソーム（ストラウビンガーら（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１０１号、５１２〜５２７ページ（１９８３年））、スフェロプラスト（シャフナー（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻、２１６３〜２１６７ページ（１９８０年））、または当業者に知られている他の方法を用いたトランスフェクションにより細胞内に導入することが可能である。リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクションを用いることが好ましい。
【００２９】
ワクチンを調製するために、本発明により作製したＭＶＡワクシニアウイルスを生理学的に許容し得る形態に加工する。これは、天然痘のワクチン接種に用いるワクチン調製における長年の経験に基づいて行うことが可能である（カプラン（Ｋａｐｌａｎ）、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．第２５巻、１３１〜１３５ページ（１９６９年））。一般的に、約１０６〜１０７個の組換えＭＶＡ粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプルに入れた２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンを含む１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥する。凍結乾燥物には、非経口投与に適した増量剤（マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンなど）または他の補助剤（抗酸化薬、安定剤等）を含まれていてよい。次いでガラスアンプルを密封し、好ましくは−２０℃未満の温度で、数カ月間にわたり保存することが可能である。
【００３０】
ワクチン接種のために、凍結乾燥物を０．１〜０．２ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、非経口投与、例えば、皮内接種することが可能である。本発明によるワクチンは、皮内注射することが好ましい。軽度の腫脹および発赤、時にはかゆみも、注射部位に認められることがある（スティクルら（Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．）、前出）。投与法、用量および投与回数を、当業者が既知の方法により最適化することが可能である。外来抗原に対する高レベルの免疫応答を得るために、必要に応じてワクチンを長期にわたって数回投与することが好都合である。
【００３１】
まとめると、組換えＭＶＡの作製のための本発明の方法は、次の工程からなる。すなわち、上述のような宿主細胞に組換えＭＶＡを感染させる工程、宿主細胞に本発明のＤＮＡベクター構築物をトランスフェクションする工程、ならびにＣＥＦ細胞またはニワトリ胚由来ＬＳＣＣ−Ｈ３２細胞（ロスおよびカーデン（Ｒｏｔｈ  ＆  Ｋａａｄｅｎ）、１９８５年  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第４９巻、６３４〜６３６ページ）または鳥類の細胞（例えば、ウズラ線維芽細胞ＱＴ６細胞またはＱＴ３５細胞）で増殖させることにより復元されたＭＶＡを選択する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下の詳細な実施例は、本発明をよりよく理解するのに寄与するためのものである。しかし、本発明を実施例の主題に限定するという印象を与えることを意図するものではない。
【実施例】
【００３３】
１．ウイルスの増殖および精製
１．１  ＭＶＡおよびＭＶＡ−ΔＥ３Ｌウイルスの増殖
ＭＶＡウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）培養物で起源株ＣＶＡを連続継代することにより生産された、著しく弱毒化されたワクシニアウイルスである。ワクシニアＭＶＡ株の生産の歴史、特性および用途の一般的な総説については、メイルら（Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．）によりＩｎｆｅｃｔｉｏｎ、第３巻、６〜１４ページ（１９７５年）に発表された概説を参照することが可能である。ＣＥＦへの適応の結果として、他の細胞系でのＭＶＡウイルスの増殖は著しく制限される。例外的に、よく特性解析され、維持が容易な細胞株であるベビー・ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）は、ＭＶＡを増殖させ、効率の高いＣＥＦと同程度に効率良く組換え遺伝子を発現させるので、発現ベクターおよび組換え生ワクチンの開発における標準化されたＭＶＡ増殖用に推奨されている（ドレクスラーら（Ｄｒｅｘｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第７９巻、３４７〜３５２ページ）。
【００３４】
ＭＶＡウイルスは、それが適応した宿主細胞であるＣＥＦ細胞で通常増殖させた。ＣＥＦ細胞を調製するために、インキュベートした鶏卵から１１日齢の胚を分離し、端部（ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ）を除去し、胚を小片に切断し、２５％トリプシンからなる溶液中で室温で２時間にわたり徐々に分離した。得られた細胞懸濁液を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）および２ｍＭグルタミンを含む１倍量の培地Ｉ（ＭＥＭイーグル、例えば、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）［スイス  バーゼル所在］から入手可能、注文番号０７２−１５００）で希釈し、細胞用ふるい（例えば、テクノマラ  アーゲー（Ｔｅｃｈｎｏｍａｒａ  ＡＧ）［スイス  チューリッヒ所在］から入手可能、注文番号Ｂｅｌｌｃｏ  １９８５、１５０メッシュ）を通してろ過し、この細胞を卓上遠心分離機（ヘルムレ  カーゲー（Ｈｅｒｍｌｅ  ＫＧ）［Ｄ−７２０９ドイツ連邦共和国ゴスハイム（Ｇｏｓｈｅｉｍ）所在］で室温、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して沈降させた。細胞沈降物を最初の容積の４分の１容の培地Ｉに懸濁し、このようにして得られたＣＥＦ細胞を細胞培養皿に広げた。細胞を培地Ｉ中で３７℃のＣＯ２インキュベーター内で所望の細胞密度に応じて１〜２日間増殖させ、直接感染させるかまたはさらに１〜２回細胞を継代してから感染させるために用いた。初代培養物の調製に関する明確な説明は、アール．アイ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）の著書「Ｃｕｌｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ」、アラン  アール．リス出版（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｖｅｒｌａｇ）［ニューヨーク所在］（１９８８年）第１１章９９ページ以降に記載されている。
【００３５】
ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌは、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させたベビー・ハムスター腎臓細胞ＢＨＫ−２１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）中で常法により増殖させる。ＢＨＫ−２１細胞は、加湿空気−５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で維持した。
【００３６】
ウイルスを次のように感染に用いた。細胞を１７５ｃｍ２細胞培養用ボトル中で培養した。８０〜９０％コンフルエントの状態で培地を除去し、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ／ダルベッコ、例えば、アニメド  アーゲー（Ａｎｉｍｅｄ  ＡＧ）［スイス  ミュッテンツ（Ｍｕｔｔｅｎｚ）所在］、注文番号２３．１００．１０）に含めたＭＶＡウイルス懸濁液（細胞当たり０．０１個の感染性粒子（＝ｐｆｕ）、０．０１ｍｌ／ｃｍ２）とともに１時間インキュベートした。次いで培地を加え（０．２ｍｌ／ｃｍ２）、約８０％の細胞が円形化するまで、ボトルを３７℃で２〜３日インキュベートした。さらなる処理（精製等）の前に、ウイルス溶解物を細胞および培地とともに、処理せずに細胞培養ボトル中で−３０℃で保存した。
【００３７】
１．２  ウイルスの精製
可能な限り純粋で、宿主細胞に特異的な成分を含まないウイルス調製物を得るために行った精製工程は、ＭＶＡおよびＷＲウイルスの場合と同じであった（ジョクリク（Ｊｏｋｌｉｋ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１８巻、９〜１８ページ（１９６２年）、ツアルトウら（Ｚｗａｒｔｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第２９巻、５２３〜５２９ページ（１９６２年））。予め感染させてから−３０℃で保存した細胞培養物を解凍し、残っている細胞をプラスチック基材から振り落とすか、またはかき落とし、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）遠心分離機、ＧＳＡローター、５０００ｒｐｍ、１０℃で１時間）により細胞とウイルスを培地から取り出した。ウイルスおよび細胞小片からなる沈降物をＰＢＳ（沈降物の容積の１０〜２０倍）に１回懸濁し、懸濁液を上記のように遠心分離した。新たな沈降物を１０倍量のＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に懸濁し、残りの依然として無傷の細胞を崩壊させ、細胞膜からウイルス粒子を放出させるために超音波で短時間処理した（直径４ｍｍのチップを装着したＬａｂｓｏｎｉｃ  １５１０、ベンダーアンドホベイン（Ｂｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｂｅｉｎ）［スイス  チューリッヒ所在］から入手可能、６０ワット、室温で２×１０秒）。細胞核および比較的大きな細胞の破片は、続いて懸濁液を短時間遠心分離して除去した（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）ＧＳＡローター、デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．）［Ｄ−６３５３ドイツ連邦共和国バド  ナウハイム（Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ）所在］から入手可能、３０００ｒｐｍ、１０℃で３分間）。沈降物を、上記のように再度ＲＳＢ緩衝液に懸濁し、超音波で処理し、遠心分離した。回収した、遊離ウイルス粒子を含む上清を合わせ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中３５％ショ糖１０ｍｌのパッド上に重層し、Ｋｏｎｔｒｏｎ  ＴＳＴ２８．３８／１７ローター（コントロンインストルメンテ（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）［スイス  チューリッヒ所在］；ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ  ２７ローターに相当）中で１４０００ｒｐｍ、１０℃で９０分間遠心分離した。上清を傾瀉し、ウイルス粒子を含む沈降物を１０ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、超音波で短時間処理し（室温で２×１０秒、上記の装置）、さらに精製するため段階的勾配に供した。勾配の各段階はそれぞれ１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解したショ糖５ｍｌからなるものとした（ショ糖濃度段階：２０％、２５％、３０％、３５％および４０％）。勾配試料をＫｏｎｔｒｏｎ  ＴＳＴ２８．３８／１７ローターで１４０００ｒｐｍ、１０℃で３５分間遠心分離した。この遠心分離の後、ウイルス粒子を含むいくつかの分離帯が３０％ショ糖と４０％ショ糖の間の勾配の領域に見えた。この領域を勾配試料からサイフォン作用により排出させ（１０ｍｌ）、このショ糖溶液をＰＢＳ（２０ｍｌ）で希釈し、この溶液から遠心分離（Ｋｏｎｔｒｏｎ  ＴＳＴ２８．３８／１７ローター、１４０００ｒｐｍ、１０℃で９０分間）によりウイルス粒子を沈降させた。この時点でほとんど純粋なウイルス粒子のみからなる沈降物を、ウイルス濃度が平均１〜５×１０９ｐｆｕ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解した。精製ウイルス保存溶液を、後続の実験のために直接またはＰＢＳで希釈して使用した。
【００３８】
２．ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌウイルスの構築および特性解析
２．１  Ｅ３Ｌ欠失プラスミドの構築
Ｅ３Ｌ遺伝子の両側に隣接するＭＶＡゲノムのＤＮＡ配列を、ＭＶＡ（クローン化分離株Ｆ６、ＣＥＦで第５８２継代）のＤＮＡを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。Ｅ３Ｌの上流隣接領域のプライマーは、５’−ＡＴＡＴＧＡＴＴＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣ−３’（下線部はＡｐａＩ部位）および５’−ＧＴＣＡＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧＡＧＡＡＣＴＡＡＣ−３’（下線部はＮｏｔＩ部位）であった。下流領域のプライマーは、５’−ＴＡＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＧＴＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＡＴＴＴＣ−３’（下線部はＭｌｕＩ部位）および５’−ＧＴＴＡＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＧＴＴＡＴＣ−３’（下線部はＢａｍＨＩ部位）とした。構築物をＡｐａＩ／ＮｏｔＩまたはＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐΔＫ１Ｌ（スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２８巻、１１３７〜１１４８ページ）の対応する部位に挿入して、Ｅ３Ｌ欠失プラスミドｐΔＥ３Ｌ−Ｋ１Ｌを得た。
【００３９】
２．２  変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの形成および単離
変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを、以前に記載された方法（スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２８巻、１１３７〜１１４８ページ）を用いて作製した。簡単に述べると、６ウェル組織培養プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）［米国ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）所在］で増殖させた１×１０６個のコンフルエントなＢＨＫ−２１細胞の単層に細胞当たり０．０１ＩＵの感染効率（ＭＯＩ）でＭＶＡを感染させた。感染９０分後に、製造業者の推奨に従いリン酸カルシウムを用いてウェル当たり１０μｇのプラスミドｐΔＥ３Ｌ−Ｋ１Ｌ  ＤＮＡで細胞をトランスフェクションした（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ（登録商標）トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在］）。感染４８時間後に細胞をハーベストし、凍結−解凍を３回行い、カップ超音波処理器（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＨＤ  ２００［ドイツ国バンデリン（Ｂａｎｄｅｌｉｎ）所在］）でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で１０倍希釈系列とした物（１０−１〜１０−４）を用いて、６ウェル組織培養プレートで増殖させたＲＫ−１３細胞のサブコンフルエントな状態の単層に感染させた。３７℃で３日間インキュベートした後、変異ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌに感染したＲＫ−１３細胞巣を、空気置換ピペットを用いて吸引により２０μｌ容を採取し、５００μｌの培地を入れた微小遠心チューブに移し、ＲＫ−１３細胞の単層を新たに感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。ＲＫ−１３細胞での継代時にすべての親ＭＶＡを除去した後、組換えウイルスを１０倍希釈系列とした物（１０−１〜１０−６）を用いて、６ウェル組織培養プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）［米国ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）所在］で増殖させたサブコンフルエントな状態のＢＨＫ−２１細胞に感染させた。良く分離された感染ＢＨＫ−２１細胞巣をハーベストし、Ｋ１Ｌ陰性の変異ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを単離した。
【００４０】
クローン化したＭＶＡ単離株のウイルスＤＮＡを先に記載したように（スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）２０００年）、ＰＣＲを用いて常法により分析した。変異ＭＶＡのゲノム中のＥ３Ｌ遺伝子座をモニターするために、ＯＲＦ  Ｅ３Ｌに隣接する遺伝子配列由来のオリゴヌクレオチド、５’−ＡＴＡ  ＴＧＡ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ−３’および５’−ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣ−３’を用いた。
【００４１】
（サザンブロット分析）  ウイルス感染ＢＨＫ細胞から単離した全ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロース中でのゲル電気泳動により分離し、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋膜に移し、［α−３２Ｐ］ＣＴＰで標識したＥ３Ｌ遺伝子の下流隣接領域に及ぶＰＣＲ断片からなるＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＱｕｉｃｋＨｙｂ（登録商標）のプロトコール（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＧｍｂＨ［ドイツ国ハイデルベルク所在］に従ってプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを実施した。２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムｐＨ７．０溶液（ＳＳＣ）／０．１％ＳＤＳを用いて、膜を６５℃で３０分間２回洗浄し、室温で２回洗浄した。このブロットをＫｏｄａｋ  ｘ−Ｏｍａｔフィルムに曝露した。
【００４２】
（ウエスタンブロット分析）  ６ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントなＢＨＫ−２１細胞の単層に細胞あたり１０ＩＵのウイルスを１時間接種した。感染細胞を培地で短時間洗浄し、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、４０μｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない新鮮な培地とともにインキュベートした。２４時間後、細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。次いで、タンパク質を、２５ｍＭトリス、１９．２ｍＭグリシンおよび２０％メタノールを含む緩衝液（ｐＨ８．３）中で２時間にわたりニトロセルロース膜（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））にエレクトロブロッティングした。２％（重量／容積）ＢＳＡ、０．０５％（容積／容積）Ｔｗｅｅｎ、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）中で終夜ブロッキングした後、ブロットを、抗Ｅ３Ｌマウス・モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＴＷ２．３（ユウェンら（Ｙｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１９５巻、７３２〜７４４ページ、１９９３年）の上清の１０倍希釈物を用いてブロッキング緩衝液中で１時間探索した。洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗マウス抗体（ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、カタログ番号１１１−０３５−１１４、ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）［ドイツ国ハンブルク所在］、希釈率１：１００００）をブロッキング緩衝液で５０００倍希釈したものと共にブロットを１時間インキュベートし、再び洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ｘ−Ｏｍａｔフィルムを用いて高感度化学発光法（ＥＣＬ、製造業者）による可視化により現像した。
【００４３】
２．３．ウイルス増殖の分析
低率増殖プロファイルを測定するために、ＣＥＦまたはＢＨＫ−２１単層に細胞当たり０．０５感染単位（ＩＵ）のＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させた後、ウイルスの増幅をモニターした。５ＩＵの感染効率（ＭＯＩ）で細胞を感染させて、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖの１段階の増殖を分析した。すべての感染実験に、６ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントな単層を用いた。３７℃で６０分間ウイルスを吸着させた後、接種物を除去した。感染細胞をＲＰＭＩ  １６４０で２回洗浄し、１０％ＦＣＳを含む新鮮ＲＰＭＩ  １６４０培地とともに５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。感染後（ｐ．ｉ．）複数の時点で感染細胞をハーベストし、凍結−解凍と短時間の超音波処理によりウイルスを放出させた。得られた溶解物の段階希釈物を６ウェル組織培養プレートで増殖させたコンフルエントなＢＨＫ−２１単層上で２連で平板培養した。ウイルス感染細胞のワクシニアウイルス特異免疫染色のために、４８時間ｐ．ｉ．の時点で培地を除去し、細胞をアセトン：メタノール（１：１、１ｍｌ／ウェル）で短時間固定した。洗浄し、ＰＢＳ−２％ＦＣＳ中でブロッキングした後、細胞をポリクローナルウサギ抗ワクシニア抗体（ＩｇＧフラクション、バイオジェネシス社（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｌｔｄ．）［英国プール（Ｐｏｏｌｅ）所在］、カタログ番号９５０３−２０５７、ＰＢＳ−３％ＦＣＳで１：１００００に希釈）とともに６０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体（例えば、２次抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした（ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））、カタログ番号１１１−０３５−１１４、ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）［ドイツ国ハンブルク所在］、ＰＢＳ−３％ＦＣＳで１：１０００に希釈）を加え、４５分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、抗体で標識された細胞をジアニシジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｎｏ．０９１４３）基質溶液で処理し、染色細胞巣を計数し、ワクシニアウイルス・プラーク・アッセイと同様にウイルス力価を計算した（ＩＵ／ｍｌ）。
【００４４】
（ウイルスＤＮＡの分析）  感染細胞からウイルスゲノムＤＮＡを既述（アール  ピーおよびモス  ビー（Ｅａｒｌ  Ｐ  ＆  Ｍｏｓｓ  Ｂ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）のように単離した。ウイルスＤＮＡの複製を評価するために、スロット・ブロット装置を用いて全ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋膜にトランスファーし、３２Ｐ標識ＭＶＡ  ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。放射活性をホスホイメージャ分析装置（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）で定量した。
【００４５】
（［３５Ｓ］メチオニン標識ポリペプチドの分析）  １２ウェルプレート中のＢＨＫおよびＣＥＦ細胞単層に、２０のＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬもしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させるか、または疑似感染させた。４℃で４５分間吸着させた後、ウイルス接種物をあらかじめ加温した組織培養培地で置換して、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベートした。感染後、表示された時点で細胞をメチオニン非含有培地で３７℃で１０分間洗浄し、各ウェルに５０μＣｉの［３５Ｓ］メチオニンを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２ｍｌの０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０溶解緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて１０分間、感染細胞単層の細胞質抽出物を調製した。細胞抽出物からのポリペプチドを１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。
【００４６】
（ＤＮＡ断片化の分析）  ＣＥＦに、２０のＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬもしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させるか、または疑似感染させた。細胞を感染後１６時間および２４時間の時点でハーベストし、前述したように全ＤＮＡを抽出した。沈殿させたＤＮＡを１００μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、ＲＮａｓｅ（終濃度：１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間処理し、１％アガロースゲルで分離した。臭化エチジウムで染色してＤＮＡ断片を可視化した。
【００４７】
（ヘキスト染色）  直径１２ｍｍのカバーガラスを備えた１２ウェルプレート中でコンフルエントな状態まで増殖させたＣＥＦ細胞に、５もしくは２０のＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬもしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させるか、または非感染とした。感染後１６時間および２４時間の時点で細胞をヘキスト３３４３で室温で３０分間染色し、蛍光顕微鏡下で写真撮影した。アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞との比を計数により求め、平均値および平均値の標準誤差の３倍（平均値／３×ＳＥＭ）として表した。
【００４８】
（カスパーゼ活性のアッセイ）  １２ウェル組織培養プレートで増殖させた５×１０５個のコンフルエントなＣＥＦ単層に、２０ＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬおよびＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させるか、または疑似感染させた。４℃での感染９０分後に、細胞を１０％ラクトアルブミンおよび５％ＢＭＳを含むＭＥＭで２回洗浄し、３７℃で１６時間インキュベートした。細胞をハーベストし、遠心分離により集め、ＰＢＳで１回洗浄し、溶解緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中細胞２×１０７個／ｍｌとして氷上で１０分間インキュベートした後激しく渦流混合することにより溶解した。１００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して抽出物を清澄化し、新しいバイアルに移した。ＤＥＶＤ切断活性を測定するために、抽出物を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、４０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１ｍＭジチオトレイトール［ＤＴＴ］、（ｐＨ７．０）を含み、０．１％ＣＨＡＰＳ｛３’−［（３’−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート｝、１００μｇのウシ血清アルブミンおよびアセチル−ＤＥＶＤ−７−アミノ−４−メチルクマリブ（ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）（最終濃度：１０μＭ）を添加した反応緩衝液（有糸分裂希釈緩衝液（ラゼブニク，ワイ．エー．、コール，エス．、クーク，シー．エー．、ネルソン，ダブリュ．ジー．およびアーンシャウ，ダブリュ．シー．（Ｌａｚｅｂｎｉｋ，Ｙ．Ａ．、Ｃｏｌｅ，Ｓ．、Ｃｏｏｋｅ，Ｃ．Ａ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．（１９９３年）「細胞を含まないｉｎ  ｖｉｔｒｏ有糸分裂抽出物におけるアポトーシスの核事象：アポトーシスの活性相の分析用モデルシステム（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｓ：  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１２３巻、７〜２２ページ）で１：１０に希釈した。反応は、平底の９６ウェルプレートで３７℃で１時間、３連で実施した。次いで、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＣｙｔｏｆｌｕｏｒ（登録商標）９６リーダーで３９０ｎｍ（励起）および４６０ｎｍ（発光）における蛍光を測定して、遊離ＡＭＣを測定した。バックグラウンドの蛍光（緩衝液と基質のみ）を差し引いた値を算出し、平均値および平均値の標準誤差の３倍（平均値／３×ＳＥＭ）として表した。
【００４９】
（ＥＬＩＳＡによるアポトーシスの測定）  細胞数１×１０５のコンフルエントなＣＥＦ単層に、それぞれ５、１０および２０のＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬおよびＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させるか、または疑似感染させた。感染後１６時間の時点で、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット（ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）［マンハイム所在］を用い、製造業者の指示に従ってアポトーシスの程度を分析した。概要を述べると、感染後１６時間の時点で培地を除去し、細胞を溶解緩衝液中でインキュベートした。溶解後、無傷の核を遠心分離によりペレットとし、上清のアリコートをマイクロタイター・プレートのストレプトアビジンでコーティングしたウェルに移した。試料中に存在するアポトーシス性ヌクレオソームの量を、ＤＮＡおよびヒストンに対して作製したマウス・モノクローナル抗体ならびに分光光度分析を用いて測定した。
【００５０】
（ヨウ化プロピジウム染色）  核の断片化を測定するため、６ウェル組織培養プレートで増殖させた１×１０６のコンフルエントなＣＥＦ単層に５ＩＵおよび２０ＩＵのＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬおよびＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させた。４℃での感染９０分後に、細胞を１０％ラクトアルブミンおよび５％ＢＭＳを含むＭＥＭで２回洗浄した。感染後の様々な時点で細胞をトリプシン処理し、回収し、７０％エタノール中に４℃で保存した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、終濃度５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳに再懸濁した。試料を暗所に４℃で１時間保存し、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）装置で分析したが、これはすでに報告されているように実施した（ニコレッティ，アイ．、ミグレオラティ，ジー．、パグリアッシ，エム．シー．、グリグナニ，エフ．およびリカルディ，シー．（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ，Ｉ．、Ｍｉｇｌｉｏｒａｔｉ，Ｇ．、Ｐａｇｌｉａｃｃｉ，Ｍ．Ｃ．、Ｇｒｉｇｎａｎｉ，Ｆ．ａｎｄ  Ｒｉｃｃａｒｄｉ，Ｃ．）（１９９１年）、「プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによる胸腺細胞のアポトーシスを測定する迅速かつ簡単な方法（Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｒｅｔｒｙ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１３９巻、２７１〜２７９ページ）。
【００５１】
３．組換えＭＶＡウイルスの作製
３．１  ベクタープラスミドの構築
Ｅ３Ｌを用いた選択による組換えＭＶＡの作製を可能にするために、ＭＶＡゲノム内に天然に生じる欠失ＩＩＩの部位に正確に組換えＤＮＡを挿入するためのＭＶＡ隣接配列（ｆｌａｎｋＩＩＩ−１およびｆｌａｎｋＩＩＩ−２）を含むｐＩＩＩプラスミド・ベクター（サッターおよびモス（Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ）１９９２年、スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）２０００年）を基にして、新規のベクタープラスミドを構築した。プラスミド・ベクターｐＩＩＩ−Ｅ３−ＰｓＨ５を作製するために、ＭＶＡ  Ｅ３Ｌ遺伝子の完全長コード配列をその本来のプロモーター配列の転写制御下にある状態で含む６２７ｂｐのＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより調製し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理し、ＢａｍＨＩ切断部位を介してプラスミドｐＬＷ９のｆｌａｎｋＩＩＩ−１およびｆｌａｎｋＩＩＩ−２のＤＮＡ配列の間に挿入した（ウイアット，エル．ら（Ｗｙａｔｔ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１４巻、１４５１〜１４５８ページ）。ｇｆｐ読み取り枠を含む７２３ｂｐのＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテックラボラトリーズ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ＧｍｂＨ［ドイツ国ハイデルベルク所在］）から切り出し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、ｐＩＩＩ−Ｅ３−ＰｓＨ５のＳｍａＩ切断部位に挿入して、ｐＩＩＩ−Ｅ３−ＰｓＨ５−ｇｆｐを得た。
【００５２】
３．２  組換えＭＶＡ−ＰｓＨ５−ｇｆｐの形成および単離
６ウェル組織培養プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）［米国ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）所在］で増殖させた１×１０６のコンフルエントなＢＨＫ−２１細胞の単層に、細胞あたり０．０１ＩＵの感染効率（ＭＯＩ）でＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させた。感染９０分後に、リン酸カルシウムを用いて製造業者の推奨に従いウェル当たり１０μｇのｐＩＩＩ−Ｅ３−ＰｓＨ５−ｇｆｐ  ＤＮＡで細胞をトランスフェクションした（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔ（登録商標）トランスフェクションキット、アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在］）。感染４８時間後に、細胞をハーベストし、凍結−解凍を３回行い、カップ超音波処理器（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＨＤ  ２００［ドイツ国バンデリン（Ｂａｎｄｅｌｉｎ）所在］）でホモジナイズした。ハーベストした材料を培地で１０倍希釈系列としたもの（１０−１〜１０−４）を用いて、６ウェル組織培養プレートで増殖させたＣＥＦ細胞のサブコンフルエントな単層に感染させた。３７℃で３日間インキュベートした後、組換えＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞巣をＧＦＰ合成についてモニターし、空気置換ピペットを用いて２０μｌの容積を吸引により採取し、５００μｌの培地を入れた微小遠心チューブに移し、さらにＣＥＦ細胞単層に感染させるために凍結−解凍と超音波により処理した。ＣＥＦ細胞におけるプラーク精製を３回連続して実施した後に、組換えＭＶＡ−ＰｓＨ５−ｇｆｐウイルスをＣＥＦ単層に感染させて増幅し、ＤＮＡをＰＣＲにより分析してウイルス・ストックの遺伝学的均一性を確認した。
【００５３】
（結果）
（変異ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの作製）
ＭＶＡのライフサイクルにおける重要なインターフェロン耐性遺伝子Ｅ３Ｌの意義を評価するために、相同的組換えを用いて、ＭＶＡゲノム内のＥ３Ｌ読み取り枠の完全なプロモーター配列およびコード配列をワクシニアウイルスＫ１Ｌ遺伝子発現カセットで置換した（図１Ａ）。このマーカーは、ウサギ腎臓ＲＫ−１３細胞への感染時に変異ウイルスの厳密な選択的増殖を可能にし、第２段階では、非選択的増殖条件を用いて、隣接する反復ＤＮＡ配列間のさらなる相同的組換えにより同マーカーが再び簡単に除去される（スタイブら（Ｓｔａｉｂ  ｅｔ  ａｌ．）２０００年）。Ｅ３Ｌ遺伝子配列が欠失した組換えＭＶＡを、ＲＫ−１３およびＢＨＫ−２１細胞単層での数回のプラーク精製中に単離した。プラークのクローニング中、予想されたゲノム変異をＰＣＲによりモニターした（図１Ｂ）。一次ウイルス・ストックをＢＨＫ−２１細胞上で増幅し、ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析により再評価し（図１Ｃ）、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌと命名した。アラビノシドＣの存在下または非存在下で調製した細胞溶解物のウエスタンブロット分析から、野生型ＭＶＡを感染させた細胞でのＥ３Ｌタンパク質の合成が確認されたが、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させた後にはＥ３Ｌポリペプチドを検出することは不可能であった（図１Ｄ）。
【００５４】
（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの複製はＣＥＦにおいて阻害される）
ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの２次ウイルス・ストックを作製するために、コンフルエントなＣＥＦ単層に低い感染効率（ＭＯＩ）で感染させたが、驚くべきことに、ウイルスは増殖しなかった。宿主域の表現型を想定して、ＢＨＫ−２１細胞およびＣＥＦ細胞の感染後のウイルス増殖を比較分析しようとした。増殖の欠如は、ウイルスの複製または伝播の欠陥に起因している可能性があった。最初に、細胞当たり０．１感染単位（ＩＵ）でＭＶＡまたはＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを細胞に感染させる多段階増殖実験においてウイルスの収率を測定した（図２Ａ、２Ｂ）。この感染効率では、ＢＨＫ−２１細胞内でのＭＶＡおよびＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの複製と伝播はほぼ同じであり、感染後２０時間〜４８時間で達した感染力の力価のピークは非常に類似していた（図２Ａ）。予想通り、ＭＶＡはＣＥＦ細胞中では効率よく複製された。これに対して、ＣＥＦにおけるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの力価は感染させた力価と比較して絶え間なく低下し、生産的ウイルス増殖が事実上ないことが示唆された（図２Ｂ）。さらに、１０のＭＯＩを用いて感染させて１段階のウイルス増殖を分析したが、再びＢＨＫ−２１細胞中ではＭＶＡとＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの増殖能力が同等であることを見出した。多段階増殖分析からのデータを並べると、感染後８、２２または４８時間にＣＥＦ中で検出されたＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの感染力の力価はウイルス吸着後に認められた感染力のレベルに決して到達しなかった（図２Ｃ、２Ｄ）。これらの実験からＭＶＡ−ΔＥ３ＬはＣＥＦにおいて特異的な複製上の欠陥を有すると結論した。このような宿主域表現型がＥ３Ｌ遺伝子配列の欠失のみに起因することを検証するために、その本来のプロモーター配列の転写制御下にあるＥ３Ｌ遺伝子をＭＶＡ−ΔＥ３Ｌのゲノムに再挿入して復帰突然変異ＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを作製した。概要を述べると、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染ＢＨＫ細胞をトランスフェクションするために、完全長のＥ３Ｌ遺伝子発現カセットならびにそのゲノム上の隣接配列からなるＤＮＡ断片を含むプラスミド・ベクターｐＥ３Ｌｒｅｖを用いた。復帰突然変異ウイルスＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖは、ＣＥＦ単層におけるプラーク精製により容易に単離可能であった。Ｅ３Ｌが安定に再挿入されたことがＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにより確認され、細胞溶解物のウエスタンブロット分析により野生型ＭＶＡと同等のレベルでＥ３Ｌタンパク質が合成されることが明らかになった（データは示さず）。追加のスクリーニングまたは選択を実施する必要なしにＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを単離可能であったという事実が既に、ＣＥＦにおけるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの増殖不全を首尾よく復帰変異させたことを示唆していた。それに対応して、ＢＨＫ−２１細胞およびＣＥＦ細胞の両方におけるＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖの多段階および１段階増殖分析において、ウイルス複製のレベルが野生型ＭＶＡと同様であることを見出した（図２Ａ〜Ｄ）。以上のデータから、我々は、このウイルスが長期間継代されて生育してきた細胞培養系であるＣＥＦにおいて、ＭＶＡの複製を維持するためにＥ３Ｌの機能が必要であると結論した。
【００５５】
（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させたＣＥＦにおけるウイルスのタンパク質およびＤＮＡ合成の低下）
ＣＥＦのＭＶＡ−ΔＥ３Ｌへの非許容感染をより十分に解析するために、感染性ウイルス子孫が生産されないことがウイルスのタンパク質合成の低下に起因するかどうかを測定しようとした。ＣＥＦおよびＢＨＫ細胞を、ＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させた後の様々な時点で［３５Ｓ］メチオニンで代謝的に標識した。各標識期間の後に、溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。ＭＶＡを感染させたＢＨＫ細胞では、後期ウイルスタンパク質合成が感染５時間後に起こり、感染１０時間後には細胞のタンパク質合成を強力に遮断して顕著となった（図３Ａ）。ＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させたＢＨＫ細胞ではウイルスタンパク質について同様のパターンが認められた（図３Ａ）。ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させたＣＥＦでは、豊富な後期ウイルスタンパク質合成が感染５時間後および１０時間後に認められた（図３Ｂ）。これに対して、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させたＣＥＦ細胞では、ウイルスのタンパク質産生に特異的なポリペプチドのバンドを検出することはほとんど不可能であった（図３Ｂ）。感染５時間後の時点で、一般的な後期ウイルスタンパク質と移動度が等しいいくつかの弱いポリペプチドのバンドが、宿主細胞のタンパク質合成の顕著な遮断を伴って見られるようになった。
【００５６】
ウイルス後期タンパク質が豊富に合成されるかどうかはウイルスＤＮＡの複製に依存するので、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌのライフサイクルにおけるこの段階を調べ、ＢＨＫ−２１細胞およびＣＥＦ細胞への感染について比較した。１段階感染における様々な時点で感染細胞から全ＤＮＡを単離し、このＤＮＡを膜にトランスファーしてその膜を放射活性標識したＭＶＡ−ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることにより、ウイルスのＤＮＡ合成をモニターした（図３Ｃ、３Ｄ）。図３Ｃに示すように、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡを感染させたＢＨＫ−２１細胞では、非常に類似した動態および量を伴うウイルスＤＮＡの蓄積が起こった。ＣＥＦ細胞においても、両ウイルスを感染させた後にウイルスＤＮＡが次第に多く合成されることが見出された（図３Ｄ）。しかし、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬによるＣＥＦへの非許容感染の場合、感染６時間後および１２時間後の時点で検出されたＤＮＡは許容条件に比べると少量であった。したがって、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染ＣＥＦで認められたタンパク質合成の著しい減少はウイルス特異的ＤＮＡ複製の著しい阻害とは相関していなかったが、ウイルスＤＮＡの生産は非許容感染において比較的遅い時点で停止したようである。
【００５７】
（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させたＣＥＦにおけるアポトーシスの誘導）
ウイルスタンパク質合成の顕著な停止とウイルスＤＮＡ複製の能力維持とを特徴とするこの感染表現型は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのワクシニアウイルスの非許容感染（スペーナーら（Ｓｐｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、ラムゼイ−エウイングおよびモス（Ｒａｍｓｅｙ−Ｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ）、１９９５年）を想起させるものであった。ワクシニアウイルスのＣＨＯへの不稔感染にはアポトーシスの誘導を伴うが、これは牛痘ウイルス遺伝子ＣＨＯｈｒの同時発現により回避し得る（インクら（Ｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、ラムゼイ−エウイングおよびモス（Ｒａｍｓｅｙ−Ｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ）、１９９８年）。さらに、またワクシニアのＥ３Ｌ遺伝子産物がワクシニアウイルスに感染したＨｅＬａ細胞においてアポトーシスの誘導を阻害するとの報告もある（リーおよびエステバン（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｂａｎ）、１９９４年、キブラーら（Ｋｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年）。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌによる感染２４時間以内に光学顕微鏡によりＣＥＦ培養物をモニターすると異常な細胞収縮が観察されたので、ＣＥＦ細胞におけるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの増殖制限がアポトーシスに関連している可能性があるかどうかを探求することは重要であると思われる。アポトーシスに関する最初の標準的アッセイでは、ヌクレオソームの「ＤＮＡラダー」（ウイリーら（Ｗｙｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８０年）に相当する１８０ｂｐ多量体へのＤＮＡの特徴的な切断についてモニターした。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ、ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖのいずれかを感染させたＣＥＦ培養から細胞の全ＤＮＡを単離し、アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。１６時間および２４時間ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させたＣＥＦ細胞の試料において、アポトーシスを示唆する細胞ＤＮＡの典型的な断片化が観察された。これに対して、ＭＶＡまたは復帰突然変異ウイルスＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させたＣＥＦ細胞の試料ではそのようなＤＮＡのラダー形成は検出されなかった（図４Ａ）。アポトーシスの他の特徴は、核外ヌクレオソームの出現である。したがって、ＣＥＦの培養物をヘキスト３３４３で染色し、個々の細胞におけるアポトーシス小体についてスクリーニングした。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの感染１６時間後に、ヘキスト３３４３で広範に染色された細胞質の空胞を容易に検出可能であった（図４Ｂ）。さらに、このアッセイでは、３００〜５００個の細胞を含む無作為に選択した範囲において細胞外染色を有する細胞の割合を測定することによりアポトーシス細胞の数を定量することが可能であった（３連で実施、図４Ｃ）。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌによる感染後には、細胞あたり５ＩＵの感染効率を用いた場合で全細胞の約２０％にアポトーシスの明らかな徴候が認められた。細胞あたり２０ＩＵの感染効率で行った実験では、アポトーシス細胞の割合は約３０％に増加した。これに対して、野生型ＭＶＡまたは復帰突然変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３ｒｅｖを感染させた細胞で最高４％、および疑似感染細胞のわずか１％が核外染色について陽性として計数された。このアポトーシス過程がＤＮＡレベルのみで起こるのではないことを示すために、特異的ペプチド基質Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＤＥＶＤ）を用いてカスパーゼによる細胞内タンパク質分解を調べた（サルベセンおよびディキシト（Ｓａｌｖｅｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｉｘｉｔ）、１９９７年）。確立された蛍光アッセイを用いて、感染１６時間後にＣＥＦから調製した細胞抽出物におけるＤＥＶＤ切断活性を測定した（リンシンガーら（Ｌｉｎｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）。この場合も、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌによる感染後には著しく増強されたＤＥＶＤ切断活性が認められたが、ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ感染細胞からの抽出物では検出可能な活性があるとしてもごくわずかしか含んでいなかった（図４Ｄ）。これらの結果は、ＣＥＦにおけるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの増殖不全はアポトーシスの誘導に関連していることを明確に示していた。
【００５８】
さらに、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染ＣＥＦにおけるアポトーシスの開始が、宿主域を制限された表現型に一層明らかに関連しうるどうか評価することを試みた。本発明者らの以前の実験は、すべての細胞の感染を保証するはずの細胞あたり２０ＩＵの感染効率で実施されたが、約３０％の細胞がヘキスト染色でアポトーシス細胞と評価されたにすぎなかった。したがって、最初に、アポトーシスの度合に関してＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを一層注意深く力価測定することに関心が払われた。ＣＥＦ細胞に１、５、１０または２０ＩＵのＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ、ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させ、感染１６時間後にマウス・モノクローナル抗体によるアポトーシス性ヌクレオソームを特異的に検出するＥＬＩＳＡを用いてアポトーシスを定量した（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキット、ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）［マンハイム所在］）（図５Ａ）。細胞あたりの最低用量１ＩＵのＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを接種したＣＥＦに明らかなアポトーシスの徴候が見出された。感染に用いるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ量の増加に伴いアポトーシスのレベルが一貫して増大したのに対して、さらに高い用量でＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させてもバックグラウンドレベルをわずかに超える量の細胞死がもたらされたに過ぎなかった。ヘキスト染色によるアポトーシス細胞の計数の精度は、感染細胞単層の取り扱い時にアポトーシス細胞の一部が脱離して分析の対象から外れると思われるため、限られたものであった可能性がある。ＭＯＩ２０での感染後に存在する細胞死の割合を分析する別のプロトコールを用いるために、アポトーシス状態の核をヨウ化プロピジウムで染色し、様々な時点でフローサイトメトリーにより計数した（ニコレッティら（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年）。ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させてから６時間という早い時点で、ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを感染させたＣＥＦと比較してアポトーシス状態の核の数が多いことが検出された（図５Ｂ）。後続の時点ではＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染ＣＥＦにおける死細胞の割合は連続的に増加し、感染２４時間後に全細胞の約７０％になった。このデータは、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染ＣＥＦで認められるアポトーシスの程度と動態とがタンパク質およびＤＮＡの合成の低下を特徴とする増殖制限を示す表現型と相関することを示唆していた。
【００５９】
（ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させたＣＥＦにおけるＩ型ＩＦＮの誘導）
Ｅ３Ｌが欠失したワクシニアウイルスＷＲによるＨｅＬａ細胞におけるアポトーシスの誘導は、ＩＦＮにより調節される主要な抗ウイルス酵素ＰＫＲおよびＲＮａｓｅＬの活性化を妨げる強力なｄｓＲＮＡ結合タンパク質としてのＥ３Ｌの機能に関連づけられている（リーおよびエステバン（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｂａｎ）、１９９４年；キブラーら（Ｋｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年）。このワクシニアウイルス変異体の他の特有な特徴は、ＩＦＮ処理に対するその高い感受性である（ベアッティーら（Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年；ベアッティーら（Ｂｅａｔｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年）。興味深いことに、ワクシニアウイルス・コペンハーゲン感染時においても、Ｅ３Ｌ機能の欠失はインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ−３）の活性化によるＩＦＮ−β合成の誘導をもたらす。したがって、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬによりＣＥＦを感染させた後のＩＦＮの存在についてモニターし比較することを試みた。我々は６ウェル組織培養プレートで増殖させたＣＥＦ単層に細胞あたり１０ＩＵのＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ、ＭＶＡ、ＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ、野生型ワクシニアウイルスＣＶＡ、またはＷＲを接種した。細胞を含まない上清を感染２４時間後に収集し、確立されたアッセイを用いて組換え型ニワトリＩＦＮ（ｒｅｃＩＦＮ、２５０Ｕ／ｍｌ）と比較してニワトリＩ型ＩＦＮの活性について試験した（図６）。野生型ワクシニアウイルスＣＶＡを感染させた細胞の上清は、検出可能なＩＦＮ活性を含んでいなかった（図６Ａ）。同じ結果がワクシニアウイルスＷＲの感染後にも得られた（データは示さず）。これに対して、ＭＶＡ感染ＣＥＦの培地にはＩＦＮ活性が明らかに存在していた（図６Ｂ）。驚くべきことに、最高レベルのＩＦＮがＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ感染後に認められ、対照として用いたｒｅｃＩＦＮで得られた活性と同程度の活性に達した（図６Ｃ）。ＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖの感染後にも、より低いレベルではあるが、変異型でないＭＶＡの感染後と同等のＩＦＮ活性が検出された（図６Ｄ）。このデータは既に、ＭＶＡによるＣＥＦの許容感染が生物学的に活性なＩ型ＩＦＮの蓄積を誘発し、一方、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの非許容感染はさらに多くのＩＦＮを産生させることを示すものであった。
【００６０】
（ＣＥＦにおけるワクシニアウイルス感染に対するＩＦＮ処理の効果）
哺乳動物細胞へ感染させた場合、ワクシニアウイルスの複製はＩＦＮ活性に対して比較的抵抗性であることが認められている。興味深いことに、このことは、ニワトリのインターフェロンによる前処理がワクシニアウイルスの増殖を阻害し得るＣＥＦ培養物の場合には異なるようである。ＭＶＡ感染に対するＩＦＮの効果を測定するために、ＣＥＦ単層を漸増量の組換え型ニワトリＩ型ＩＦＮで２４時間前処理してから、該培養物を低いＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬもしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ、または比較のためにワクシニアウイルスＣＶＡもしくはＷＲに感染させた。感染４８時間後に細胞単層を固定し、ウイルス感染細胞巣をワクシニアウイルス特異免疫染色により可視化した（図７）。ワクシニアウイルスＣＶＡまたはＷＲの感染後には、疑似感染処理または低量のＩＦＮ（培地１ｍｌあたり１または１０Ｕ  ＩＦＮ）で処理した単層において形成されたような多数のウイルスプラークが示された。さらに、培地１ｍｌあたり１０ＵのＩＦＮを存在させると、通常より小さいウイルスプラークが少なくなった。培地１ｍｌあたり１００ＵのＩＦＮまたは培地１ｍｌあたり１０００のＩＦＮとプレインキュベートした単層にはもはやプラーク形成は検出されなかった（データは示さず）。ＭＶＡ感染ＣＥＦを免疫染色した結果、細胞単層から離れていない状態のウイルス陽性細胞巣が認められ、ＭＶＡ感染による一般的な細胞変性が比較的低いことが実証された。このようなプラーク表現型の差があるにもかかわらず、ＩＦＮ処理した際のＭＶＡ感染細胞巣の形成は、ワクシニアウイルスＷＲまたはＣＶＡで認められるプラーク形成と非常に類似していた。培地１ｍｌあたり最高１０ＵまでのＩＦＮで処理した単層にはＭＶＡ感染細胞が認められた。この後者の量は細胞巣の数と大きさに明らかに影響を及ぼし、一方、より高いＩＦＮ濃度では完全な増殖阻害がもたらされた。これと非常に対照的に、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを接種した単層にはＩＦＮ処理とは関係なく検出可能なウイルス感染細胞は存在せず、この変異体がＣＥＦにおいて生産的に複製することは不可能であることが確認される。これに対して、ＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ感染では、野生型ＭＶＡで確立されたパターンと同じ細胞巣形成が再び認められた。このデータは、ＣＥＦにおけるワクシニアウイルス感染の相対的なＩＦＮ感受性を示唆した以前の試験を裏付けるものであり、また、ＣＥＦ適応ＭＶＡのＩＦＮによる阻害がワクシニアウイルス株ＷＲおよびＣＶＡの感染時に認められるＩＦＮ効果と非常に類似していることをさらに示していた。
【００６１】
（Ｅ３Ｌ機能の復元による組換えＭＶＡの作製）
ワクシニアウイルス感染における単一遺伝子依存的な宿主域表現型を、変異ウイルスゲノムへの該宿主域遺伝子の再挿入による効率のよい組換えウイルスの選択に見事に用いることが可能である。ＣＥＦにおけるＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの増殖制限がそのような宿主域選択を可能にするものであるかどうかを確認するために、ＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位へ、その本来のプロモーターの転写制御下にあるＥ３Ｌコード配列を再導入することを目的として、ＭＶＡ挿入プラスミドを構築した。ワクシニアウイルス特異的プロモーターＰｍＨ５とともに発現させるモデル組換え遺伝子として機能するＡ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ  ｇｆｐ遺伝子の発現カセットを付加することにより、ＭＶＡベクタープラスミドｐＩＩＩ−Ｅ３Ｌ−ＰＨ５−ｇｆｐが得られた（図７Ａ）。このプラスミドをＭＶＡ−ΔＥ３Ｌに感染したＢＨＫ−２１細胞へトランスフェクションした後、ウイルス特異的細胞変性効果を示す多くの細胞の間にｇｆｐ遺伝子を発現しているいくつかの細胞群が認められた。このことは、組換えＭＶＡが形成されたことを示唆するものであった。ＣＥＦにおけるウイルス増殖の選択的復元について試験するために、トランスフェクション後に得られたウイルス材料の１０倍希釈物を６ウェル組織培養プレートで増殖させたＣＥＦ単層に接種した。３日後、事実上すべてがＧＦＰ産生細胞を含むウイルスプラークの形成が認められた。ＣＥＦでさらに増幅させるために処理した１０個の十分に分離したプラークから、さらに１継代後に組換えＭＶＡ−ＰＨ５−ＧＦＰの８種の単離株を回収した。ウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析により、すべてのウイルス単離株がそのゲノム内の欠失ＩＩＩの部位に安定な挿入配列を有する本物の組換え体であることが立証された（図７Ｂ）。これらのウイルス単離株が容易に得られたことは、ＣＥＦにおけるＭＶＡの増殖にはＥ３Ｌの機能が本質的に必要であることを反映しており、また、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬのＥ３Ｌ特異的な回復を、組換えＭＶＡを作製するための効率的な宿主域選択プロトコールとして提案することが可能であることを示唆している。
【００６２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌの構築および特性解析を示す図。（Ａ）ＭＶＡゲノムおよびＥ３Ｌ遺伝子配列を欠失させるためにデザインされたプラスミドｐΔＫ１Ｌ−Ｅ３Ｌの模式的マップを示す。ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を最上部に示す。Ｅ３Ｌ遺伝子に隣接するＭＶＡ−ＤＮＡ配列（ｆｌａｎｋ−Ｅ３ＬＩおよびｆｌａｎｋ−Ｅ３ＬＩＩ）をｐΔＫ１Ｌにクローニングし、相同的組換えによるＫ１Ｌ選択マーカーの挿入を誘導して、ＭＶＡゲノムからＥ３Ｌのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠失させた。Ｋ１Ｌ遺伝子の発現により、ＲＫ１３細胞内において不安定な中間体ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ＋Ｋ１Ｌを選択的に増殖させることが可能となる。付加的反復配列（ＬａｃＺ）が関与する第２の相同的組換えの際にＫ１Ｌマーカー遺伝子が欠失した後、最終的な突然変異ウイルスＭＶＡ−ΔＥ３Ｌが生じる。（Ｂ）ウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析を示す。（Ｃ）ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析を示す。（Ｄ）ＡｒａＣの存在下または非存在下でＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡを感染させたＣＥＦからの溶解物のウエスタンブロット分析を示す。Ｅ３Ｌ特異マウス・モノクローナル抗体ＴＷ９により検出されたＥ３Ｌタンパク質バンドを矢印で示す。
【図２】ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（●）、ＭＶＡｗｔ（ＭＶＡ−Ｆ６）（四角）およびＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（三角）を高用量（Ａ，Ｂ）および低用量（Ｃ，Ｄ）で感染させた後のＣＥＦ細胞（Ａ，Ｃ）およびＢＨＫ細胞（Ｂ，Ｄ）内のウイルス増殖の分析を示す図。Ｃは、ＣＥＦ細胞においてＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖおよび野生型ＭＶＡと比較してＭＶＡ−ΔＥ３Ｌが多段階に増殖したことを示す。Ｄは、ＢＨＫ細胞においてＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖおよび野生型ＭＶＡと比較してＭＶＡ−ΔＥ３Ｌが多段階に増殖したことを示す。
【図３】（Ａ，Ｂ）ウイルスポリペプチドの合成を示す図。（Ａ）ＢＨＫ細胞および（Ｂ）ＣＥＦ細胞をＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ、ＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖに感染させ（レーン９〜１２）、表記の感染後時間（ｈｐｉ）において［３５Ｓ］メチオニンで３０分間標識した。細胞溶解物を１０％ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動により分析し、オートラジオグラフィーにより可視化した。タンパク質標準品（レーンＭ）については、左側にそれらの分子質量（キロダルトン単位）を示す。非感染細胞（Ｕ）を対照とした。（Ｃ，Ｄ）ウイルスＤＮＡの合成を示す図。ＢＨＫ‐２１細胞（Ｃ）およびＣＥＦ細胞（Ｄ）をＭＶＡ−ΔＥ３ＬまたはＭＶＡで感染させてから０時間、２時間、４時間、６時間および８時間後に分離したＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋膜上に固定し、３２Ｐで標識したＭＶＡ−ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより分析した。放射活性を、ホスホイメージ分析装置で定量した。
【図４】ＣＥＦ細胞における、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌによるアポトーシスの誘導を示す図。（Ａ）ＤＮＡ断片化を分析するために、セミコンフルエントな単層状態のＣＥＦ細胞に細胞あたり２０ＰＦＵのＭＯＩでＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（レーン１、２）、ｗｔＭＶＡ（レーン３、４）もしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（レーン５、６）を感染させるか、または非感染（レーン７）とした。感染１６時間後（レーン１、３、５）および感染２４時間後（レーン２、４、６）にウイルスＤＮＡ抽出物を得、１％アガロースでゲル電気泳動を行って分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。陽性対照として、ＤＮＡラダー調製キット（ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得た試料を適用した（レーン８）。（Ｂ）カバーガラス上で増殖させた疑似感染（ｍｏｃｋ）またはＭＶＡ感染ＣＥＦ細胞を用いてヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３４３による染色を実施した。１６時間後に細胞をヘキスト３３４３で３０分間染色した。細胞あたり５ＰＦＵのＭＯＩでＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（ΔＥ３Ｌ）、非組換えＭＶＡ（ＭＶＡ）もしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（Ｅ３ｒｅｖ）を感染させるか、または疑似感染させた（ｍｏｃｋ）ＣＥＦ細胞の顕微鏡写真を撮影した。（Ｃ）細胞あたり５および２０ＰＦＵのＭＯＩで、ＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（□、１番目）、ＭＶＡ（□、２番目）またはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（□、３番目）を感染させたＣＥＦ細胞について、感染後１６および２４時間後にヘキスト３３４３で染色したアポトーシス細胞数を数えた。結果を、平均値／３×ＳＥＭとして示す。疑似感染させたＣＥＦを、４番目に淡灰色で示す。（Ｄ）細胞あたり５および２０ＰＦＵのＭＯＩでＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（□）、ＭＶＡ（□）もしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（□）を感染させたＣＥＦ細胞または非感染ＣＥＦ細胞において、ＤＥＶＤ切断の誘導を測定した。ＤＥＶＤ切断活性は、材料および方法の項目に記載したように各混合物から１０μｌ試料を３連で測定した。結果を、平均値／３×ＳＥＭとして示す。
【図５】アポトーシスの用量依存性および時間依存性を示す図。（Ａ）アポトーシスの感染用量依存性を、疑似感染させたＣＥＦ細胞（淡灰色、４番目）、またはＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（□、１番目）、ＭＶＡ（□、２番目）およびＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（□、３番目）に感染させた細胞についてＥＬＩＳＡにより測定した。細胞死検出ＥＬＩＳＡを、感染１６時間後に製造業者の指示に従って実施した（ロシュ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。４０５ｎｍ（対照：４９０ｎｍ）における吸光度を測定した。結果を、平均値／２×ＳＥＭとして示す。（Ｂ）アポトーシスの時間依存性を、細胞あたり２０ＰＦＵのＭＯＩでＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（□）、ＭＶＡ（□）もしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（□）を感染させるか、または疑似感染させたＣＥＦ細胞について分析した。細胞を表示した時点でハーベストし、終夜固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【図６】ＣＥＦにＭＶＡ−ΔＥ３Ｌを感染させた後のニワトリＩ型ＩＦＮの合成を示す図。６ウェル組織培養プレートで増殖させたＣＥＦ単層に細胞あたり１０ＩＵのＭＶＡ−ΔＥ３Ｌ（Ｃ）、ＭＶＡ（Ｂ）、ＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖ（Ｄ）、野生型ワクシニアウイルスＣＶＡ（Ａ）を接種した。細胞を含まない上清を感染後２４時間目に採取し、ニワトリＩ型ＩＦＮの活性について、組換えニワトリＩＦＮ（ｒｅｃＩＦＮ、２５０Ｕ／ｍｌ）と比較して試験した。
【図７】ＣＥＦにおけるＭＶＡ感染に対するＩＦＮ処理の効果を示す図。ＣＥＦ単層を漸増量の組換えニワトリＩ型ＩＦＮとともに２４時間インキュベートした後、培養物に低ＭＯＩでＭＶＡ、ＭＶＡ−ΔＥ３ＬもしくはＭＶＡ−Ｅ３ｒｅｖを、または比較のためにワクシニアウイルスＣＶＡもしくはＷＲを感染させた。感染後４８時間目に細胞単層を固定し、ウイルス感染細胞巣を、ワクシニアウイルス特異的免疫染色を用いて可視化した。
【図８】Ｅ３Ｌレスキューによる組換えＭＶＡの生成およびＣＥＦ細胞における増殖選択を示す図。（Ａ）ＭＶＡゲノムの模式的マップ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限マップ）およびベクタープラスミドｐＩＩＩ−Ｅ３Ｌ−ＰｍＨ５−ｇｆｐの模式的マップを示す。ｆｌａｎｋ−１およびｆｌａｎｋ−２は、外来遺伝子ならびに選択マーカーＥ３ＬをＭＶＡゲノム内の欠失ＩＩＩの部位へと導くＤＮＡ配列に相当する。外来遺伝子は、改変型のワクシニアウイルス初期／後期プロモーターＰｍＨ５により制御される。（Ｂ）ウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析。組換えＭＶＡ−ＰｍＨ５−ｇｆｐ（ｒｅｃＭＶＡ）の８種のクローン、または非組換えＭＶＡ（ＷＴ）から単離されたゲノムＤＮＡ、およびプラスミドｐＩＩＩ−Ｅ３Ｌ−ＰｍＨ５−ｇｆｐ  ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、固有のＤＮＡフラグメントを増幅させた。１ｋｂ  ＤＮＡラダーをＤＮＡフラグメントの分子量のための標準として用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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