(57)【要約】ヒト乳房腫瘍は不均一な癌細胞を含む。ヒト乳癌細胞を免疫無防備状態のマウスで増殖させた動物異種移植モデルを用いて、我々は、ごく一部の乳癌細胞しか新規腫瘍を形成する能力を有しないことを見出した。新規腫瘍を形成する能力は確率的な性質ではなく、むしろ一定の癌細胞集団で新規腫瘍を形成させる能力が減り、他の集団で新規腫瘍を形成させる能力が濃縮された。腫瘍形成性細胞は、表面マーカー発現に基づき、非腫瘍形成性癌細胞から区別することができる。我々は予測的に、腫瘍形成性細胞をCD44+CD24-/loLINEAGE-として同定し単離した。この集団由来の細胞は100個という少ない細胞で、動物異種移植モデルにおいて腫瘍形成することができたが、非腫瘍形成性集団由来の何万という細胞は腫瘍を形成できなかった。腫瘍形成性細胞は連続継代でき、毎回、多数のCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞と共に、表現型が雑多な非腫瘍形成性癌細胞集団を含む、新規腫瘍が形成された。これは自己複製し分化する正常幹細胞の能力を連想させる。可能性のある治療標的の発現がまた、腫瘍形成性集団と非腫瘍形成性集団との間で異なった。Notch活性化は腫瘍形成性細胞の生存を促進し、Notch4に対するブロッキング抗体により腫瘍形成性乳癌細胞のアポトーシスが引き起こされた。2005511754.tif 000016
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形腫瘍の細胞を、Notch4ポリペプチドに対し誘導される治療上有効な量の作用物質と接触させる過程を含む、固形腫瘍のサイズを縮減するための方法。
【請求項２】
治療上有効な量が、固形腫瘍内の固形腫瘍幹細胞の細胞死を引き起こす、または増殖を阻害するのに十分な量である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
作用物質が、Notch4ポリペプチドに対し誘導される、抗体、ペプチド、または小分子である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
抗体、ペプチド、または小分子が、Notch4の細胞外ドメインに対し誘導される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
固形腫瘍の細胞を、Notch4リガンドの活性を調節する治療上有効な量の作用物質と接触させる過程を含む、固形腫瘍のサイズを縮減するための方法。
【請求項６】
Notch4リガンドが、Delta1、Delta2、Delta様リガンド4(Dll4)、Jagged1、およびJagged2からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
作用物質がNotchリガンドアゴニストである、請求項5記載の方法。
【請求項８】
作用物質がNotchリガンドアンタゴニストである、請求項5記載の方法。
【請求項９】
固形腫瘍の細胞を、Maniac Fringeの活性を調節する治療上有効な量の作用物質と接触させる過程を含む、固形腫瘍のサイズを縮減するための方法。
【請求項１０】
作用物質がManiac Fringeアゴニストである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
作用物質がManiac Fringeアンタゴニストである、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
固形腫瘍の細胞を、固形腫瘍の固形腫瘍幹細胞を選択的に標的とする作用物質または作用物質の組み合わせと接触させる過程であって、作用物質または作用物質の組み合わせが固形腫瘍幹細胞を死滅させるまたはその増殖を阻害する過程を含む、固形腫瘍幹細胞を死滅させるまたはその増殖を阻害するための方法。
【請求項１３】
作用物質または作用物質の組み合わせと接触させた後、固形腫瘍中の固形腫瘍幹細胞の死またはその増殖の阻止を同定する過程をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
死滅が固形腫瘍幹細胞における細胞死の活性化によるものである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
細胞死がアポトーシスである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
作用物質または作用物質の組み合わせがNotch-4シグナル伝達を阻害する、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
作用物質が、Notch4ポリペプチドに対して誘導される抗体、ペプチド、または小分子である、請求項12記載の方法。
【請求項１８】
抗体、ペプチド、または小分子が、Notch4の細胞外ドメインに対し誘導される、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
作用物質または作用物質の組み合わせが、Notch4リガンドの活性を調節する、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
Notch4リガンドが、Delta1、Delta2、Delta様リガンド4(Dll4)、Jagged1、およびJagged2からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
作用物質または作用物質の組み合わせが、Maniac Fringeの活性を調節する、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
固形腫瘍幹細胞が、CD44、上皮特異的抗原(ESA)、およびB38.1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーCD44を発現する、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカー上皮特異的抗原(ESA)を発現する、請求項12記載の方法。
【請求項２５】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーB38.1を発現する、請求項12記載の方法。
【請求項２６】
固形腫瘍幹細胞が、固形腫瘍の非腫瘍形成性癌細胞によるCD24の平均発現よりも低いレベルのマーカーCD24を発現する、請求項12記載の方法。
【請求項２７】
固形腫瘍幹細胞が、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD31、CD45、CD64、およびCD140bからなる群より選択される少なくとも1つのLINEAGEマーカーを発現することができない、請求項12記載の方法。
【請求項２８】
固形腫瘍が、上皮癌または肉腫である、請求項12記載の方法。
【請求項２９】
上皮癌が、乳癌または卵巣癌である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
固形腫瘍の細胞をインビボで、固形腫瘍の固形腫瘍幹細胞を選択的に標的とする作用物質または作用物質の組み合わせと接触させる過程であって、作用物質または作用物質の組み合わせが固形腫瘍幹細胞を死滅させるまたはその増殖を阻害する過程を含む、固形腫瘍のサイズを縮減するための方法。
【請求項３１】
作用物質または作用物質の組み合わせと接触させた後、固形腫瘍中の固形腫瘍幹細胞の死またはその増殖の阻止を同定する過程をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
死滅が固形腫瘍幹細胞における細胞死の活性化によるものである、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
細胞死がアポトーシスである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
作用物質または作用物質の組み合わせがNotch-4シグナル伝達を阻害する、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
作用物質が、Notch4ポリペプチドに対して誘導される抗体、ペプチド、または小分子である、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
抗体、ペプチド、または小分子が、Notch4の細胞外ドメインに対し誘導される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
作用物質または作用物質の組み合わせが、Notchリガンドの活性を調節する、請求項30記載の方法。
【請求項３８】
Notch4リガンドが、Delta1、Delta2、Delta様リガンド4(Dll4)、Jagged1、およびJagged2からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３９】
作用物質または作用物質の組み合わせが、Maniac Fringeの活性を調節する、請求項30記載の方法。
【請求項４０】
固形腫瘍幹細胞が、CD44、上皮特異的抗原(ESA)、およびB38.1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項30記載の方法。
【請求項４１】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーCD44を発現する、請求項30記載の方法。
【請求項４２】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカー上皮特異的抗原(ESA)を発現する、請求項30記載の方法。
【請求項４３】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーB38.1を発現する、請求項30記載の方法。
【請求項４４】
固形腫瘍幹細胞が、CD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD31、CD45、CD64、およびCD140bからなる群より選択される少なくとも1つのLINEAGEマーカーを発現することができない、請求項30記載の方法。
【請求項４５】
固形腫瘍幹細胞が、固形腫瘍の非腫瘍形成性癌細胞によるCD24の平均発現よりも低いレベルのマーカーCD24を発現する、請求項30記載の方法。
【請求項４６】
固形腫瘍が、上皮癌または肉腫である、請求項30記載の方法。
【請求項４７】
上皮癌が、乳癌または卵巣癌である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
(a)固形腫瘍幹細胞上に存在するマーカーを同定する過程と；
(b)固形腫瘍幹細胞上に存在するマーカーに選択的に結合する生体分子または生体分子のセットを得る過程と；
を含む、固形腫瘍幹細胞を選択的に標的とするための方法。
【請求項４９】
生体分子が標的固形腫瘍幹細胞を遺伝的に調節する、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
遺伝的調節により固形腫瘍幹細胞死が起こる、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
生体分子または生体分子のセットが、二重特異性結合体を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
生体分子または生体分子のセットが、アデノウイルスベクターを含む、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
アデノウイルスベクターが選択的に固形腫瘍幹細胞を標的とする、請求項49記載の方法。
【請求項５４】
選択的に固形腫瘍幹細胞を標的とする、生体分子または生体分子のセット。
【請求項５５】
生体分子が標的固形腫瘍幹細胞を遺伝的に調節する、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
遺伝的調節により固形腫瘍幹細胞死が起こる、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
生体分子または生体分子のセットが、二重特異性結合体を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
生体分子または生体分子のセットが、アデノウイルスベクターを含む、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
アデノウイルスベクターが選択的に固形腫瘍幹細胞を標的とする、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
精製した固形腫瘍幹細胞の細胞用量を動物に導入する過程を含み、
(a)固形腫瘍幹細胞が固形腫瘍由来であり、
(b)固形腫瘍幹細胞集団が、未分画腫瘍細胞に比べ少なくとも2倍濃縮されている、
動物おいて腫瘍を形成させるための方法。
【請求項６１】
動物が免疫無防備状態の動物である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
動物が哺乳類である、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
哺乳類が免疫無防備状態の哺乳類である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
哺乳類がマウスである、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
マウスが免疫無防備状態のマウスである、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
免疫無防備状態のマウスが、ヌードマウス、SCIDマウス、NOD/SCIDマウス、Beige/SCIDマウス；およびβ2ミクログロビン欠損NOD/SCIDマウスからなる群より選択される、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
細胞用量中の細胞数が約100〜約5×105細胞の間である、請求項60記載の方法。
【請求項６８】
細胞用量中の細胞数が約100〜500細胞の間である、請求項60記載の方法。
【請求項６９】
細胞用量中の細胞数が約100〜200細胞の間である、請求項60記載の方法。
【請求項７０】
細胞用量中の細胞数が約100細胞である、請求項60記載の方法。
【請求項７１】
固形腫瘍幹細胞が、CD44、上皮特異的抗原(ESA)、およびB38.1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現する、請求項60記載の方法。
【請求項７２】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーCD44を発現する、請求項60記載の方法。
【請求項７３】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカー上皮特異的抗原(ESA)を発現する、請求項60記載の方法。
【請求項７４】
固形腫瘍幹細胞が、細胞表面マーカーB38.1を発現する、請求項60記載の方法。
【請求項７５】
固形腫瘍幹細胞が、固形腫瘍由来の非腫瘍形成性癌細胞によるCD24の平均発現よりも低いレベルのマーカーCD24を発現する、請求項60記載の方法。
【請求項７６】
固形腫瘍幹細胞が、検出可能なレベルの1または複数のLINEAGEマーカーを発現せず、LINEAGEマーカーがCD2、CD3、CD10、CD14、CD16、CD31、CD45、CD64、およびCD140bからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は概して、化学的または物理的特性を決定することによる生物学的材料の調査または分析に関し、特に癌の診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
乳癌は女性において最も一般的な癌であるが、転移性乳癌は依然として不治の病である。転移性乳癌の検出および治療の進歩にも関わらず、現在の治療では治療抵抗性癌細胞の出現による限界があるため、この疾患による死亡率は高いままである。その結果、転移性乳癌は現在の治療戦略を使用しても不治の病のままである。
【０００３】
固形腫瘍では一般に、腫瘍細胞のほんの一部しか、インビトロクローン化アッセイにおいてコロニーを形成することができない。インビボで腫瘍を形成させるためには典型的には多数の細胞を移植しなければならない。これらの観察結果は確率的モデルにより説明されていた。このモデルでは、各腫瘍細胞は増殖して新しい腫瘍を形成する能力を有しているが、常にこの能力を表すことができるのは細胞のごく一部にすぎない。
【０００４】
あるいは、顕著に増殖するまたは新しい腫瘍を形成することができる固形腫瘍細胞は稀なサブセットにすぎないが、このサブセットに含まれる細胞は非常に効率よく増殖または腫瘍形成するという可能性が考えられる。ほんの小さな同定可能な固形腫瘍細胞のサブセットのみが、増殖して新しい固形腫瘍を形成する能力を有するとすれば、これは癌治療にとって重要な意味を有するであろう。固形腫瘍を根絶するためには、この細胞小集団を死滅させる必要があるであろう。
【０００５】
造血幹細胞および神経系幹細胞の予測的同定および単離は、これらの細胞の理解において急速な進歩をもたらしている。このように、腫瘍形成性細胞集団を予測的に同定し単離することができれば、ずっと効果的に、抗固形腫瘍治療および診断の開発に焦点を合わせることができるであろう。
【発明の開示】
【０００６】
発明の開示
本発明は、確立された固形腫瘍内のわずかな割合の腫瘍形成細胞が幹細胞の特性を有するという発見に基づく。これらの固形腫瘍幹細胞は、より多くの固形腫瘍幹細胞、ならびに腫瘍中の大多数の細胞、大規模な増殖能力および新しい腫瘍を生じさせる能力を失った癌細胞の両方を生じさせる。このように、固形腫瘍細胞の不均一性は、固形腫瘍幹細胞から生じる様々な腫瘍細胞型の存在を反映している。
【０００７】
本発明は、固形腫瘍幹細胞に対して全体的に、そして今回特異的に、抗癌療法を誘導することができる方法を提供する。従来の癌治療が結果を著しく改善できないのは、一部には、これらの治療は、大規模な増殖が可能で他の全ての固形腫瘍細胞型を生じさせることができる、固形腫瘍内の固形腫瘍幹細胞を標的とすることができないことによる。このように固形腫瘍の効果的な治療では、固形腫瘍幹細胞への治療の直接ターゲッティングにより、固形腫瘍細胞の腫瘍形成性サブセット、すなわち固形腫瘍幹細胞を標的とし、除去することができる治療戦略が必要である。したがって、本発明はNotch4ポリペプチドに対して誘導される治療上有効な量の作用物質と固形腫瘍の細胞を接触させることにより、固形腫瘍のサイズを縮減する方法を提供する。Notch4-シグナル伝達の阻害により、固形腫瘍幹細胞の増殖が損なわれる。本発明はまた、Maniac Fringeの活性を調節する治療上有効な量の作用物質と固形腫瘍の細胞を接触させることにより、固形腫瘍のサイズを縮減する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、固形腫瘍幹細胞機能および固形腫瘍から単離した様々な細胞群による細胞機能のインビボおよびインビトロアッセイを提供する。本発明は、固形腫瘍から単離した様々な細胞集団(例えば、固形腫瘍幹細胞を濃縮させた細胞集団)を使用して固形腫瘍幹細胞の増殖に影響を与える因子を同定する方法を提供する。本発明の方法により、固形腫瘍内の表現型が不均一な細胞集団を特徴付けることができる。特に、大規模な増殖という幹細胞特性および他の全ての腫瘍細胞型を生じさせる能力を有する腫瘍内の表現型が異なる細胞集団を同定し、単離し、特徴づけることができる。固形腫瘍幹細胞は治療後に腫瘍を再構築させることができる真の腫瘍形成性細胞である。
【０００９】
このように本発明は、診断用または治療用作用物質に固形腫瘍幹細胞を選択的に標的とさせる方法を提供する。本発明はまた、固形腫瘍幹細胞を選択的に標的とする作用物質、例えば生体分子を提供する。
【００１０】
いくつかの局面では、本発明は、抗癌剤をスクリーニングするための方法；抗癌療法を試験するための方法；新規経路を標的とする薬物を開発するための方法；新規抗癌剤治療標的を同定するための方法；病理学的試料における悪性細胞の同定および診断方法；固形腫瘍幹細胞薬物感受性を試験およびアッセイするための方法；薬物感受性を予測する特定因子を測定するための方法；および患者をスクリーニングするための方法(例えば、マンモグラフィーのための補助として)を有効に提供する。
【００１１】
発明の実施の形態
序論
概して、本発明により、正常な幹細胞生物学の原理を適用して、固形腫瘍幹細胞を単離し、特徴づけた。固形腫瘍幹細胞は、以下に記述されるものと同様の方法およびアッセイを使用して、本明細書で記述されるように構造的および機能的に規定される。固形腫瘍幹細胞は、無秩序な発達において「自己複製」および「分化」を受け、腫瘍を形成し、異常な細胞型を生じさせ、さらに突然変異が起きて時間と共に変化しうる。固形腫瘍幹細胞の機能的特徴は、腫瘍形成性であること、さらなる腫瘍形成性細胞を生じさせること(「自己複製」)、および非腫瘍形成性腫瘍細胞を生じさせることができること(「分化」)である。固形腫瘍幹細胞の発生起源は固形腫瘍癌の異なる型の間で変動することがある。典型的には、固形腫瘍は視認され、その発生起源ではなく、その位置により最初に同定される。したがって、本明細書で開示したマーカーを使用する、本発明の方法を使用することができる。そのマーカーは一貫して、多数の患者の固形腫瘍幹細胞の単離または同定において有益である。
【００１２】
本発明により固形腫瘍幹細胞を単離または濃縮することができる固形腫瘍の例としては、肉腫および癌、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、へん平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は特に肉腫および上皮癌、例えば卵巣癌および乳癌に適用可能である。
【００１３】
細胞の濃縮集団におけるような「濃縮(enriched)」は、分画した細胞セットにおける特定のマーカーを有する細胞の数が、未分画の細胞セットにおけるマーカーを有する細胞の数に比べて増大したことに基づいて規定することができる。しかしながら、「濃縮」という用語は好ましくは、試験マウスにおいて、制限希釈頻度で腫瘍を形成する細胞の最小数として、腫瘍形成性機能により規定することができる。固形腫瘍幹細胞モデルはこれらの２つの(表現型および機能型)濃縮規定間のつながりを提供する。
【００１４】
特に、我々は、乳癌が新生物性細胞の不均一な集団を含むことを見出した。ヒト乳癌細胞を免疫無防備状態のマウスにおいて増殖させる異種移植モデルを用いて、我々は、ごく一部の乳癌細胞のみが新規腫瘍を形成する能力を有することを見出した。新規腫瘍を形成する能力は確率的な性質ではなかった。むしろ、ある一定の癌細胞集団は新規腫瘍を形成する能力が減少し、一方、他の集団は新規腫瘍形成する能力が濃縮されていた。実際、我々は一貫して、表面マーカー発現に基づいて最も腫瘍形成性であるのはどの細胞かが予測できた。
【００１５】
本発明の方法を用いて、我々は、予測的に腫瘍形成性細胞をCD44+CD24-/lowLINEAGE-として同定し単離した。この集団由来の細胞はわずか100個の細胞で免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍形成することができたが、非腫瘍形成性集団由来の細胞では何万もの細胞でも腫瘍を形成することができなかった。CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞は、更なるCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞ならびにオリジナルの腫瘍中に存在する非腫瘍形成性細胞の表現型混合集団を含む新規腫瘍を形成することができたという点において、幹細胞のような特性を示した。潜在的な治療標的の発現もまた、癌の腫瘍形成性集団と非腫瘍形成性集団との間では異なっていた。
【００１６】
Notch4-シグナル伝達の阻害により、インビトロおよびインビボにおける乳癌幹細胞の増殖が減少した。このように固形腫瘍の効果的な治療には、固形腫瘍幹細胞を治療の直接標的とすることにより、固形腫瘍細胞の腫瘍形成性サブセット、すなわち固形腫瘍幹細胞を標的として排除することができる治療戦略が必要とされる。
【００１７】
動物異種移植モデル
癌細胞不均一性モデルの予測により固形癌細胞の新しい腫瘍を形成する能力が変動するかどうかを試験するために、我々は動物異種移植モデルを開発した。このモデルでは、免疫不全マウスにおいて原発性または転移性ヒト乳癌を効率よく、そして再現性よく増殖させ、分析することができる。我々は、NOD/SCID免疫不全マウスモデルを修飾したものを使用した。この修飾モデルでは、ヒト乳癌がマウスの乳房脂肪体領域で効率よく増殖した。Sakakibara Tら、Cancer J. Sci. Am. 2:291-300(1996)を参照のこと。また、公開PCT特許出願、国際公開公報第02/12447も参照のこと。これらの全体の内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
このように、本発明は固形腫瘍細胞を宿主動物に注入することにより腫瘍を確立する動物異種移植モデルを提供する。宿主動物は、線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュなどのモデル生物であってよく、好ましくは、マウス(ヌードマウス、SCIDマウス、NOD/SCIDマウス、Beige/SCIDマウス)、ラット、ウサギ、または霊長類などの実験哺乳類とすることができる。注入細胞の関与を最大とするために、レシピエントとして重度の免疫不全NOD-SCIDマウスを選択した。免疫不全マウスはヒト組織を拒絶せず、SCIDおよびNOD-SCIDマウスはヒトの造血および組織移植のインビボ研究に対する宿主として使用されている。McCuneら、Science 241:1632-9(1988);Kamel-Reid & Dick、Science 242:1706-9(1988);Larochelleら、Nat. Med. 2:1329-37(1996)。さらに、Beige/SCIDマウスもまた使用されている。NOD/SCIDマウスは従来、正常ヒト造血幹細胞の増殖に対するインビボモデルとして有効であった(Larochelle Aら、Nature Medicine 2:1329-1337(1996);Peled Aら、Science 283:845-8(1999);Lapidot Tら、Science 255:1137-1141(1992))、ヒト神経幹細胞(Uchida Nら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:14720-5(2000))およびヒト急性骨髄性白血病(AML)幹細胞(Lapidot Tら、Nature 17:367:645-648(1994);Bonnet D & Dick JE、Nature Medicine 3:730-737(1997))。他の有益なマウスはβ2ミクログロビン欠損NOD/SCIDマウスである。Kollet Oら、Blood 95:3102-3105(2000)。
【００１９】
癌細胞のいくつかの従来のクローン化インビトロアッセイは解釈が困難であった。異なる腫瘍由来の細胞が異なる程度まで増殖し、無限に連続継代させることができる細胞(不死細胞)が得られるのは稀だからである。同様に、腫瘍形成性のいくつかの従来のインビボアッセイは解釈が困難であった。幾人かの患者由来の癌細胞は移植されたが、他の患者由来の病理学的に類似する癌細胞は移植できなかったからである。対照的に、本発明の動物異種移植モデルでは、試験された全ての患者サンプルにより腫瘍形成が可能であった。
【００２０】
下記アッセイでは、8週齢の雌NOD-SCIDマウスに麻酔をかけ、その後、エトポシド(30mg/kg)をIP注射した。同時に、トロカールを使用してエストロゲンペレットを首の後の皮下に配置した。全ての腫瘍注入/移植はこの処置の5日後に実施した。新鮮な試料を移植するために、ヒト乳癌サンプルを手術後1時間以内に受理した。腫瘍を細かく刻み、2-mm3の小片を得た。その後、マウスに2-mmの切開部を形成し、原発腫瘍の2-mm片を挿入し、または107個の胸水細胞を胸に注入した。6-0縫合糸を胸および乳頭の周囲に2度巻き付け、移植片を定位置に保持した。ネキサバン(Nexaban)を使用して切開部を密閉し、腫瘍増殖について毎週マウスをモニタした。胸水由来の癌細胞を注入するために、胸腔穿刺直後に細胞を受理し、HBSSで洗浄した。生存可能な細胞数をソーティング中に計数し、血球計算器を用いて確認した。遠心分離後、示した数の細胞を100μlの無血清-RPMI/Matrigel(登録商標)混合物(1:1体積)に懸濁させた。ニックを乳頭から約1-cm作成し、18-ゲージの針を挿入し、乳頭直下の皮下組織に通した。その後、細胞を乳房脂肪体の領域に注入した。針挿入部位はネキサバンで密閉し細胞が漏れるのを防いだ。
【００２１】
製剤化ならびに細胞を動物異種移植モデルに注入するための他の一般的な技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第20版(Mack Publishing Co.ペンシルバニア州イーストン)において見出すことができる。適した経路としては、非経口送達が挙げられ、例えば、一部の例を挙げると、筋内、皮下、髄内注入、ならびに、くも膜下、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注入が挙げられる。注入用に、本発明の作用物質は水溶液中に、好ましくはハンクス溶液、リンガー液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合可能な緩衝液中に製剤化してもよい。そのような経粘膜投与のためには、浸透させるべき障壁に適した侵透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は当技術分野において一般に周知である。
【００２２】
以下に記述するアッセイでは、選別していないT1およびT3細胞、ならびにT2の2-mm片を動物に注入した。T4〜T9由来の注入細胞を図1および表3で記述したようにフローサイトメトリーにより単離した。注入用の固形腫瘍細胞は原発性乳房腫瘍(T2)ならびに転移性胸水(T1、T3〜T9)から得た。マウスにおいて1代継代させた後の細胞にいくつかのアッセイを実施し(継代1；下記表3を参照のこと)、患者から直接得た無継代の新鮮なまたは凍結した腫瘍サンプルに他のアッセイを実施した(無継代；下記表3を参照のこと)。細胞培養では、継代1原発性乳癌細胞を、3つ組の12-ウエル皿に、胎児ウシ血清(1%)、インスリン(5μg/ml)、ヒドロコルチゾン(1μg/ml)、EGF(10μg/ml)、コレラトキシン(0.1μg/ml)、トランスフェリンおよびセレニウム(GIBCO BRL、推奨希釈物)、pen/strep、ならびにフンギゾン(Gibco/BRL)を補充したHAM-F12培地に蒔いた。培地を2日に1度交換した。
【００２３】
下記表1に示すように、我々が入手できた固形腫瘍サンプルはすべて動物異種移植モデルにおいて移植された。乳癌細胞は9人の異なる患者(腫瘍1〜9；T1〜T9と示す)から得、動物異種移植モデルにおいて増殖させた。
【００２４】
【表１】
2005511754.tif 000002
【００２５】
動物で継代させた腫瘍は、腫瘍形成性画分および非腫瘍形成性画分の両方を含む、患者由来のオリジナルの腫瘍中に存在した癌細胞と表現型が類似する不均一な癌細胞を含んだ(例えば、図1aおよび図1bを参照のこと)。この結果から、動物異種移植モデルの環境は非腫瘍形成性細胞画分の生存と不適合ではないことが証明される。癌細胞の腫瘍形成性および非腫瘍形成性画分はマウス腫瘍において同様の細胞周期分布を示し(図2gおよび図2h)、非腫瘍形成性細胞がマウス中で分裂できることが証明された。
【００２６】
要約すると、我々は、かなりの数の癌細胞を回収できたがその後移植に失敗した試料には遭遇しなかった。1つのサンプルのみがマウスで連続継代できなかった。このように、本明細書で特徴付けた腫瘍および腫瘍形成性細胞は、アッセイにおいて増殖能力について選択したサブセットではなく、我々が入手可能であった乳癌試料全てを代表するものであった。さらに、我々は動物異種移植モデルを使用して肉腫細胞を増殖させた。このように、動物異種移植モデルは確実に、クローン化ヒト前駆体、すなわち固形腫瘍幹細胞の移植をサポートする。
【００２７】
腫瘍形成性固形腫瘍幹細胞の特徴づけ
上記のように、固形腫瘍幹細胞は細胞表面マーカーにより機能的に特徴付けることができる。これらの細胞表面マーカーは、細胞表面マーカーに特異的に結合する試薬により認識することができる。例えば、固形腫瘍幹細胞の表面上の蛋白質、炭水化物、または脂質は、特定の蛋白質または炭水化物に対し特異的な抗体に免疫学的に認識できる(マーカーに対する抗体の構築および使用については、Harlow、Using Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1999)を参照のこと)。固形腫瘍幹細胞(本発明の「癌幹細胞」)の細胞表面に存在するおよびこれらの細胞の細胞表面に存在しないマーカーセットは、固形腫瘍幹細胞に特有である。そのため、固形腫瘍幹細胞は、細胞表面マーカーの陽性・陰性選択により選択することができる。固形腫瘍幹細胞に結合する試薬は、固形腫瘍幹細胞の陽性選択に使用することができる「陽性マーカー」(すなわち、固形腫瘍幹細胞の細胞表面に存在するマーカー)である。固形腫瘍幹細胞に結合する試薬「陰性マーカー」(すなわち、固形腫瘍幹細胞の細胞表面上に存在しないが固形腫瘍から得られる他の細胞の表面には存在するマーカー)は、固形腫瘍幹細胞でない、集団内の固形腫瘍細胞を排除するために(すなわち、固形腫瘍幹細胞でない細胞を排除するために)使用することができる。
【００２８】
細胞間の区別は細胞表面マーカーの検出された発現を基本とすることができ、対照細胞集団による平均発現と比較して、細胞表面マーカーの検出された発現を比較することによる。例えば、固形腫瘍幹細胞上でのマーカーの発現は、固形腫瘍幹細胞と同じ腫瘍に由来する他の細胞によるマーカーの平均発現と比較することができる。マーカー発現により細胞間の区別を実施する他の方法は、マーカー発現に基づくフローサイトメトリーによる細胞ゲーティング法を含む(Givan A、Flow Cytometry：First Principles、 (Wiley-Liss、ニューヨーク1992)；Owens MA & Loken MR、Flow Cytometry:Principles for Clinical Laboratory Practice, (Wiley-Liss、ニューヨーク1995)を参照のこと)。
【００２９】
「試薬の組み合わせ」とは、固形腫瘍幹細胞の表面に存在する(陽性マーカー)または存在しない(陰性マーカー)のいずれかの細胞表面マーカーに、または陽性および陰性マーカーの組み合わせに結合する、少なくとも2つの試薬である。固形腫瘍幹細胞表面マーカーに特異的な抗体の組み合わせを使用すると、肉腫、卵巣癌、および乳房腫瘍を含む様々な固形腫瘍から固形腫瘍幹細胞を単離または濃縮するのに有益な本発明の方法となる。試薬の組み合わせの使用に対する指針は、参照として組み込まれる、公開PCT特許出願、国際公開公報第01/052143号において見出すことができる。
【００３０】
本明細書で記述したフローサイトメトリー分析のための細胞を調製するために、固形腫瘍を細かく切り刻み、M119培地(Gibco/BRL、メリーランド州ロックヴィル、USA)中、絶えず撹拌しながら37℃で2〜4時間、200μ/mlのコラゲナーゼ3(Worthington)により消化させることにより、固形腫瘍または胸水の単一細胞懸濁液を作成した。抗体は、抗CD44、抗CD22、抗B38.1、抗EGFR、抗HER2/neu、抗ESA-FITC(Biomeda、カリフォルニア、USA)、抗H2K、およびヤギ抗ヒトNotch4(Santa Cruz Products、カリフォルニア州サンタクルス、USA)を含んだ。CD44(Saddik M & Lai R、J. Clin. Pathol.52(11):862-4(1999))およびCD24(Aigner Sら、Blood:89(9):3385-95(1997))は接着分子である。B38.1は乳癌/卵巣癌特異的マーカーとして記述されている(Ahrens Tら、Oncogene 20:3399-408、(2001);Uchida Nら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:14720-5(2000);Kufe DWら、Cancer Research 43:851-857(1983))。LINEAGEマーカー抗体は、抗-CD2、-CD3、-CD10、-CD16、-CD18、-CD31、-CD64および-CD140bであった。記載がなければ、抗体はPharmingen(カリフォルニア州サンディエゴ、USA)から入手できる。アッセイによっては、抗体は直接様々な蛍光色素に結合した。ビオニチル化されるH2Kを除き、それぞれ直接蛍光体に結合した抗CD44、抗CD24、抗B38.1、抗EGFR、抗HER2/neu、抗ESA、抗H2K、ストレプタビジン-Phar-レッド、ヤギ-抗ヒトNotch4、ロバ抗ヤギIg-FITC、抗LINEAGE-シトクロム(LINEAGE抗体は抗-CD2、-CD3、-CD10、-CD14、-CD18、-CD31、-CD64および-CD140bであった)で、分離した腫瘍細胞を染色した。マウス細胞および/またはLINEAGE+細胞は、フローサイトメトリー中にH2K+(クラスI MHC)細胞またはLINEAGE+細胞を廃棄することにより排除することができる。死細胞は生死判別染料7-AADを用いて排除することができる。フローサイトメトリーおよび細胞選別はFACSVantage(Becton Dickinson、カリフォルニア州サンノゼ、USA)で実施することができる。データファイルはCell Questソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて解析することができる。
【００３１】
我々は、乳癌細胞が、CD44、CD24、およびB38.1を含む様々な細胞表面マーカーの発現に関して不均一であることを見出した。
【００３２】
これらのマーカーが腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性細胞から区別することができるかどうかを決定するために、フローサイトメトリーを使用して1代継代T1またはT2細胞から、各マーカーに対し陽性または陰性である細胞を単離した。示したマーカーの発現に基づき、図1で記述したようにフローサイトメトリーにより細胞を単離し、NOS/SCIDマウスの乳房脂肪体に注入後腫瘍を形成することができるかについてアッセイした。12週間の間毎週、観察および触診により腫瘍についてマウスを調べた。その後、マウスを全て検死し、小さすぎて触診できない注入部位の増殖を捜した。「触診可能な腫瘍」は、扱うことができる、触ることができる、または感じることができる腫瘍として、医療技術分野の当業者には周知である。検死時にのみ検出されたCD24+集団由来の腫瘍を除き、全ての腫瘍が視診および触診により容易に明らかであった。
【００３３】
各集団の200,000〜800,000個の細胞を注入した場合、CD44+細胞(8/8)、B38.1+細胞(8/8)またはCD24-/low細胞(12/12)はすべて、注入12週間以内に視認可能な腫瘍を生じさせたが、CD44-細胞(0/8)またはB38.1-細胞(0/8)注入はどれも、検出可能な腫瘍を形成しなかった(表2)。各集団について、形成した腫瘍の数/実施した注入数の比を示す。
【００３４】
【表２】
2005511754.tif 000003
【００３５】
CD24+細胞を注入した位置では触診により腫瘍が検出できなかったが、CD24+細胞を注入した12匹のマウスのうち2匹で、注入部位に小さな増殖物を含んでいることが検死時に検出された。これらの増殖物は、選別されたCD24+細胞に常に混入する1〜3%のCD24-細胞により、または増殖能力が減少したCD24+細胞により生じた可能性が最も高い(表2)。CD44+細胞はもっぱらB38.1+であったので、我々は以後のアッセイにおいてはCD44およびCD24マーカーに焦点を当てた。
【００３６】
正常な細胞型に関連するいくつかの抗原(LINEAGEマーカーCD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64およびCD140b)は、マウスにおいて複数回継代させた腫瘍の分析に基づくと、癌細胞により発現されないことがわかった。無継代または継代早期の腫瘍細胞からLINEAGE＋細胞を排除することにより、正常ヒト白血球、内皮細胞、中皮細胞および線維芽細胞を排除した。顕微鏡試験により、LINEAGE-腫瘍細胞では一貫して、新生物細胞が出現した(図1gおよび図1h)。
【００３７】
腫瘍または胸水中のLINEAGE-癌細胞の平均15%(8%〜26%の範囲)がCD44+CD24-/lowであった(図1a〜1f)。9人の患者から単離したCD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞または他のLINEAGE-癌細胞集団をマウスの胸に注入した(表3)。未分画の継代T1またはT2細胞を注入した場合、50,000個の細胞は一貫して腫瘍を生じさせたが、10,000個の細胞が腫瘍を生じさせたのはわずかな場合にすぎなかった(表3)。対照的に、1,000個という少数のT1またはT2 CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞が、全ての場合において腫瘍を生じさせた(表3)。T1およびT2では、CD24+であるがCD44+LINEAGE-である細胞は最大20,000個まででも、腫瘍を形成しなかった(図1k)。これらのデータから、CD44+CD24-/lowLINEAGE-集団は、未分画腫瘍細胞に対し、NOD/SCIDマウスにおいて腫瘍を形成する能力が10〜50倍濃縮されていることが示唆される。
【００３８】
CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞が継代腫瘍(T1、T2、T3)または無継代腫瘍(T1、T4〜T6、T8、T9)のいずれから単離されたかどうかに関わらず、細胞は腫瘍形成活性について濃縮された(表3)。T7は我々が試験した9つの癌のうち、唯一このパターンに適合しなかったことに注意されたい(表3、以下参照)。CD44+CD24-/lowLINEAGE-およびCD24+LINEAGE-癌細胞は、継代および無継代試料の両方において一貫して腫瘍形成活性が減少した(表3)。そのため、異種移植片および無継代患者腫瘍は表現型が多様な細胞型の同様の集団から構成され、どちらの場合も、CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞は増殖して新規腫瘍を形成する能力を有した(p<0.001)。
【００３９】
表3により、腫瘍形成性乳癌細胞は、ESA+CD44+CD24-/low集団において高度に濃縮されたことが示される。細胞は1代継代(継代1と示す)腫瘍1、腫瘍2および腫瘍3、2代継代腫瘍3(継代2と示す)、無継代T1、T4、T5、T6、T8およびT9(無継代と示す)、または無継代T7細胞(無継代T7と示す)から単離した。各表現型の細胞の示した数をNOD/SCIDマウスの胸に注入した。
【００４０】
【表３】
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#T5 ESA-CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞による腫瘍形成は2〜4週遅れた。
*これらの実験では2,000個の細胞を注入した。示したマーカーの他に、全ての実験において選別した全ての細胞はLINEAGE-であり、T1、T2およびT3由来の腫瘍形成性細胞をさらにB38.1+として選択した。
【００４１】
単一腫瘍形成性細胞が腫瘍を形成することができ、移植した腫瘍形成性細胞が全て腫瘍を生じさせたとすると、Porter EH & Berry RJ, Br. J. Cancer 17:583(1964)およびTaswell C, J. Immunol. 126:1614(1981)の方法に従い、改良最大尤度分析法により計算した腫瘍形成性細胞の頻度は、約5/105である。そのため、この計算は腫瘍形成性細胞(すなわち、固形腫瘍幹細胞)の頻度を過小評価しているかもしれない。この計算は移植に影響することがある細胞-細胞相互作用および局所環境因子を考慮していないからである。CD44+CD24+LINEAGE-集団およびCD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞は図1で記述したようにフローサイトメトリーにより単離した。
【００４２】
MCF-7細胞の限界希釈分析により、この細胞系由来のクローン化未選別細胞の割合は、腫瘍由来の選別した濃縮乳癌幹細胞の割合と同様であることが示された。マウスは、4〜6 1/2ヶ月間、またはマウスが腫瘍により病気になるまで毎週観察した。
【００４３】
注入12週間後、20,000個の腫瘍形成性CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞および20,000個の非腫瘍形成性CD44+CD24+LINEAGE-細胞の注入部位を、組織像により調べた。CD44+CD24-/lowLINEAGE-注入部位は直径約1cmの腫瘍を含んだが、CD44+CD24+LINEAGE-注入部位は検出可能な腫瘍を含まなかった。CD44+CD24+LINEAGE-注入部位では組織像により正常なマウス乳房組織のみが見られたが(図1i)、CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞により形成された腫瘍は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色セクションにより判断されるように、悪性細胞を含んだ(図1j)。各々に1,000〜50,000個の細胞を投与した58匹のマウス由来のCD44+CD24+LINEAGE-注入部位を16〜29週後に調べても、腫瘍は検出されなかった。継代および無継代腫瘍由来のLINEAGE-細胞の腫瘍形成性および非腫瘍形成性サブセットはどちらも、Wright染色またはPapanicolaou染色および顕微鏡分析により判別されるように、>95%の癌細胞を含んだ(図1gおよび図1h)。
【００４４】
腫瘍のうちの3つでは、CD44+CD24-/low集団のESA+サブセットを単離することにより腫瘍形成活性のさらなる濃縮が可能であった。ESA(上皮特異的抗原、Ep-CAM)発現は、良性の反応性中皮細胞から上皮癌細胞を区別する(Packeisen Jら、Hybridoma 18:37-40、1999)。CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性集団は典型的には生存乳癌細胞の約8〜25%を占めたが、データでは、いくつかの腫瘍において、ESA+サブセットを選択することにより、腫瘍形成性細胞のさらに小さな集団が同定できることが示唆される。
【００４５】
ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞を継代T1から単離した場合、200個という少数の細胞が一貫して注入６ヶ月後に約1cmの腫瘍を形成したが、2000個のESA-CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞または20,000個のCD44+CD24+細胞は常に腫瘍を形成することができなかった(表1)。これらのデータにより、ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-集団は、未分画腫瘍細胞に対し、腫瘍形成能力が50倍をこえて濃縮されていたことが示唆される(表1)。ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-集団は1代継代T1細胞の2〜4％を占めた(癌細胞の2.5〜5%)。無継代T5細胞由来のESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-集団(癌細胞の0.6%)はまた、ESA-CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞に比べ腫瘍形成活性が濃縮されていたが、ESA+およびESA-画分はどちらも、何らかの腫瘍形成活性を有した(表1)。無継代T5細胞の中では、1000個という少数のESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞が一貫して腫瘍を形成した。
【００４６】
我々がT7としたコメドサブタイプ乳管腺癌では、CD44+CD24-/lowおよびCD44+CD24+集団の両方において腫瘍形成活性が観察された(表1、図1f)。これにより何人かの患者由来の腫瘍形成性細胞では細胞表面マーカー発現が異なるかもしれないことが示唆される。
【００４７】
固形腫瘍幹細胞から生じる腫瘍の発現型の多様性
少数のCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞が新しい腫瘍を生じさせる能力は、正常な幹細胞の器官形成能力を連想させた。正常な幹細胞は自己複製し、増殖能力の減少した表現型が様々な細胞を生じさせる。腫瘍形成性乳癌細胞もまたこれらの特性を示すかどうか試験するために、200個のESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-T1または1,000個のCD44+CD24-/lowLINEAGE-T2細胞から生じた腫瘍をフローサイトメトリーにより分離し分析した。二次性腫瘍におけるESA、CD44またはCD24の不均一発現パターンは、腫瘍形成性細胞の由来となるオリジナルの腫瘍の表現型の複雑さと似ていた(図2aおよび図2bを図2eおよび図2fと比較されたい)。これらの二次性腫瘍の中で、CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞は腫瘍形成性のままであったが、LINEAGE-癌細胞の他の集団は非腫瘍形成性のままであった(継代2；表1)。このように、腫瘍形成性細胞は、さらなるCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞、ならびに腫瘍形成性細胞が由来する原発性腫瘍の複雑さを再現する表現型が多様な非腫瘍形成性細胞の両方を生じさせた。T1、T2およびT3由来のこれらのCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞をマウスで4ラウンドの腫瘍形成を通して連続継代したところ、各ラウンドで同様の結果が得られ、増殖減少は見られなかった。これらの結果から、CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性癌細胞は正常な幹細胞の自己複製および分化と類似する過程を受けることが示唆される。
【００４８】
T1由来の腫瘍形成性および非腫瘍形成性癌細胞の細胞周期状態の比較により、どちらも同様の細胞周期分布を示すことが明らかになった(図2gおよび図2h)。そのため、どの集団も細胞周期の特定の段階の細胞について濃縮されておらず、非腫瘍形成細胞は、異種移植モデルにおいて少なくとも限定された数の分裂を受けることができた。
【００４９】
腫瘍形成性癌細胞を予測的に同定する意味
腫瘍形成性CD44+CD24-/lowLINEAGE-集団は、正常な幹細胞と、大規模に増殖することができる能力、発達または増殖能力の減少した様々な細胞型を生じさせる能力を共有する。腫瘍形成性集団の大規模な増殖能力は、200個の継代または1000個の無継代ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞という少数の細胞が、NOD/SCIDマウスにおいて連続移植することができる腫瘍(直径1cmを超える)を生じさせることができることにより証明された。T1、T2およびT3由来の腫瘍形成性集団を単離し、NOD/SCIDマウスにより4代連続継代させた。この大規模な増殖能力は、検出可能な腫瘍を形成する能力に欠ける大部分のCD44-および/またはCD24+癌細胞と対照的である。CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞集団はさらなる腫瘍形成性CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞を生じさせることができるだけでなく、大部分の腫瘍を構成する表現型が多様な非腫瘍形成性細胞を生じさせることができた。これは、2ラウンドの連続継代後であっても当てはまった。このように、ほとんどの腫瘍由来のCD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞は固形腫瘍幹細胞の特性を示すと考えられる。
【００５０】
我々のデータから、ある画分の細胞のみが大規模に増殖する能力を有し、他の細胞は制限された増殖能力しか有さないという固形腫瘍細胞の階層が存在することが証明される。これらの結果から、表現型が異なる固形腫瘍細胞の集団は、大規模に増殖して新しい腫瘍を形成させる能力が、他の集団に比べて本質的に大きいことが証明される。ほとんどの腫瘍で、我々は、癌細胞が腫瘍形成性であるかまたは腫瘍形成活性が減少しているかをマーカー発現に基づいて予測することができた。腫瘍形成性乳癌細胞は、非腫瘍形成性乳癌細胞に比べて桁違いに腫瘍を形成し易かったが、全ての注入腫瘍形成細胞が腫瘍を形成したわけではないという意味では、腫瘍形成性には確率的な要素も存在するかもしれない。乳癌細胞分裂は遺伝学的に不安定であり、腫瘍形成性集団由来の個々の乳癌細胞は、細胞分裂中に生じる染色体異常の結果、時として増殖できないことがある。Murphy KLら、FASEB Journal 14 :2291-2302 (2000)。
【００５１】
9つの独立した腫瘍のうち8つが一般的な細胞表面表現型を有する腫瘍形成性細胞の小さな集団を含むという観察は、固形腫瘍生物学を理解し、有効な癌療法を開発するために深い意味を有する。現在の癌治療が転移性疾患を治療することができないのは、腫瘍形成性細胞を効果的に死滅させることができないことによるかもしれない。非腫瘍形成性細胞が特定の治療法により優先的に死滅させられると、腫瘍は縮むかもしれないが、残った腫瘍形成性細胞が腫瘍の再発を促進する可能性がある。腫瘍形成性の集団に焦点を合わせることにより、特定の腫瘍内の実質的に全ての腫瘍形成性細胞により発現される重要な蛋白質を同定することができる。腫瘍形成性癌細胞の予測的同定では、より機能的に不均一な癌細胞の集合よりもむしろ腫瘍形成性細胞に焦点を合わせることにより、より効果的な治療標的、腫瘍形成細胞の蔓延を検出する診断マーカー、およびより有効な予後マーカーを同定することが可能となるはずである。
【００５２】
治療標的としてのNotch4
我々は腫瘍形成性細胞の重要な生物学的機能を調節することができる蛋白質の発現を探した。Notch受容体の活性化は従来乳癌に関係があるとされており、Notchシグナル伝達は、活性化Ras腫瘍遺伝子をトランスフェクトした細胞の形質転換において役割を果たす。Berry LWら、Development 124(4):925-36(1997)；Morrison SJら、Cell 101 (5):499-510 (2000)。腫瘍形成性癌細胞および正常な幹細胞の類似特性を考え、我々は、様々な正常幹細胞の自己複製および癌細胞系の増殖を制御することが知られているNotchシグナル伝達経路などの標的に焦点を絞った。
【００５３】
我々は、Notch4が腫瘍形成のどちらにおいても役割を果たすことを発見した。個々の固形腫瘍内では、腫瘍形成性細胞の小さな小集団のみが高レベルのNotch4を発現する。Notch4を認識する抗体は、乳癌腫瘍細胞の増殖をインビトロおよびインビボで遮断する。1つの態様では、抗体はNotch4の細胞外ドメインに結合する。特定の態様では、抗体はポリペプチド領域
2005511754.tif 000005
に結合する。しかしながら、Notch活性化を阻害する任意の抗Notch4抗体を使用して腫瘍の生存を阻止することができる。
【００５４】
我々はRT-PCRにより、T1 CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞がNotch4を発現することを見出した(図3a)。そのため、我々は、培養中の細胞をNotchリガンドDelta、Delta-Fcの可溶形態に曝露することにより、乳癌細胞中でのNotch活性化の効果を試験した。Morrison SJら、Cell 101:499-510(2000)。我々は、可溶性Deltaにより、未分画の培養T1癌細胞により形成されるコロニーの数が5倍に増大することを見出した（図3b）。このように、Notch活性化により、クローン化癌細胞、すなわち固形腫瘍幹細胞の生存または増殖が促進された。
【００５５】
Notch4シグナル伝達の阻害により生存または増殖が減少するかどうかを試験するために、我々は、Notch経路レポーター遺伝子活性化を減少させるNotch4に対するポリクローナルブロッキング抗体に細胞を曝露した(図3c)。抗Notch4抗体はSanta Cruz Products(カリフォルニア州サンタクルス、USA)から購入した。この抗体はポリペプチド領域
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に結合する。Notchリポーターアッセイのために、HES-1-ルシフェラーゼリポーターコンストラクトを、Liu AYら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10705-10710(1997)により記述されているように作成した。-194〜+160のHES-1マウス遺伝子のフラグメントをPCRにより増幅させ、KpnI部位とBgl II部位との間のpGL2基本ベクター(Promega)にサブクローン化した。MCF-7細胞に、HES-1-lucコンストラクトおよびpSV2Neoを共トランスフェクトし、ゲネチシンを含む培地で選択した。
【００５６】
RT-PCRのために、Trizol(Gibco BRL)を用いてRNAを単離した。Notch4遺伝子発現分析のために、T1、MCF-7およびMCF-10A細胞から単離した0.2mgのRNAの逆転写を、遺伝子特異的アンカープライマー
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を用いて実施した。Notch4フラグメントを以下のプライマー：
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および
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を用いて増幅させた。
【００５７】
トランスフェクトしたMCF-7細胞を、Notch4ポリクローナル抗体(Santa Cruz;20μg/ml最終濃度)、可溶性Delta-Fc(Morrison SJら、Cell 101:499-510(2000))またはNotch4抗体ブロッキングペプチド(4mg/100ml最終濃度、Santa Cruz Products)、
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の存在下または非存在下で、12-ウエルプレートにおいて共培養した。
【００５８】
Jarriault Sら、Nature 377:355-358(1995)により記述されているように、ルシフェラーゼアッセイを実施した。Delta-FcまたはFc対照蛋白質を、Morrison SJら、Cell 101:499-510(2000)の方法に従い分泌するように操作された293細胞の上清から濃縮した。Morrison SJら、Cell 101:499-510(2000)により以前に記述されているように、架橋抗Fc抗体(Jackson Immunoresearch)と共に、Delta-FcまたはFc対照蛋白質を乳癌細胞培養物に添加した。
【００５９】
細胞をこの抗Notch4抗体に曝露させると、コロニーの形成がほぼ完全に阻害された(図3b)。この阻害は、それに対して抗体を作成したNotch4ペプチドと共に抗体をプレインキュベートすることによりほぼ完全に排除された。これにより細胞表面上のNotch4に対する抗体の結合がおそらく妨害された(図3b)。抗Notch4抗体はまた、MCF-7乳癌細胞系によるコロニー形成を阻害したが、正常な乳房上皮由来のMCF-10細胞系によるものは阻害しなかった(Soule HDら、Cancer Research 50、6075-6086(1990))。抗Notch4抗体が腫瘍形成を阻害するかどうかを決定するために、対照緩衝液または抗Notch4抗体のいずれかとインキュベートさせた100〜500個のESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞をマウスに注入した。200〜500個の未処理細胞の11回の注入のうち9回、および100個の未処理細胞の11回の注入の1回が腫瘍を形成した(図3d)。対照的に、抗Notch4抗体で処理した100または200個の細胞の注入では、腫瘍は形成されず、500個の抗体-処理細胞による腫瘍形成は対照細胞に比べ遅れた(図3d)。
【００６０】
Notch4シグナル伝達は腫瘍惹起細胞に生存シグナルを提供する
我々は次に、抗Notch4抗体がコロニー形成を阻害する機構を調べた。Notch刺激は、一部の環境では自己複製を促進し、他の環境では増殖を阻害し、そして他の場合では生存を促進することが示されている。これらの可能性の間の区別を行うために、4つの腫瘍から単離した未分画癌細胞、MCF-7細胞およびMCF-10細胞について、抗Notch4抗体に曝露した後の増殖および細胞死の分析を行った。抗Notch4抗体に曝露したMCF-7細胞(Notch4を発現、補足図1)と未処理細胞とでは、抗体曝露後24時間で、細胞周期分布に著しい差異はなかった(図4a)。しかしながら、MCF-7細胞、T10から単離された未分画腫瘍細胞、またはT1 ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-乳癌腫瘍形成性細胞(MCF10細胞またはT7およびT8から単離した未分画腫瘍細胞ではない)を抗Notch4ブロッキング抗体に曝露すると、抗体曝露後36時間に、アポトーシスに特徴的な分解されたDNAを持つ細胞が蓄積し、細胞のかなりの割合においてカスパーゼ3/7の活性化が生じた(図4bおよび図4c)。
【００６１】
アポトーシスアッセイのために、腫瘍形成性T1細胞(ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-)またはT7、T8およびT10由来のLINEAGE-腫瘍細胞をフローサイトメトリーにより選別し、コラーゲンコート組織培養プレート上で増殖させた。T10腫瘍形成性細胞はまだ特徴付けがなされていない。抗Notch4ポリクローナル抗体(Santa Cruz、カルフォルニア州、USA)をその後培地(20mg/ml最終濃度)に添加し、一方、対照プレートにはPBSを添加した。抗Notch4抗体をブロックするために、抗Notch4抗体を氷上で30分間ブロッキングペプチド(Santa Cruz、カリフォルニア州、USA)と共にプレインキュベートし、その後、培地に添加した。48時間後、細胞にトリプシン処理を施し、収集した。105細胞をHBSS 2%熱不活性化ウシ胎仔血清中に懸濁させ、その後、FAM-DEVD-FMK、カスパーゼ3および7に特異的なカロキシフルオレセイン標識ペプチド基質(CaspaTag(商標)Caspase Activity Kit、Intergen Company、ニューヨーク、USA)を用いて生細胞中の活性カスパーゼを検出することにより、アポトーシスについてアッセイした。カスパーゼ陽性細胞はFACSVantageフローサイトメーター(Becton Dickinson、カリフォルニア州、USA)を用いて陰性細胞から区別した。細胞周期およびアポトーシスのためのPI染色を、Clarke MFら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11024-11028(1995)により記述されるように実施した。
【００６２】
これらのデータから、いくつかの新規ヒト腫瘍では、Notch経路活性化が乳癌細胞の腫瘍形成性集団に必要な生存シグナルを提供することが示唆される。
【００６３】
乳癌幹細胞のための治療標的としてのManiac Fringe
Jagged（Shimizuら、Journal of Biological Chemistry 274(46) 32961-9(1999);Jarriaultら、Molecular and Cellular Biology 18:7423-7431(1998)）、Serrate、およびDelta(ならびに各々のバリアント、例えば、Delta1、Delta2、Delta3、Delta4、Jagged1、およびJagged2、LAG-2ならびにAPX-1（C.エレガンス）)などの鋭い名前を有する蛋白質は、Notch受容体に結合し、隣接細胞が神経前駆体にならないようにする下流シグナル伝達経路を活性化する。最近同定されたリガンドはDll4であり、動脈内皮において発現されるDeltaファミリーのNotchリガンドである。Shutterら、Genes Dev 14(11):1313-8(2000)。
【００６４】
Notchリガンドは、無差別にNotchファミリー受容体に結合して活性化する可能性がある。Fringeファミリーメンバー(Paninら、Nature 387(6636)：908-912(1997))のような他の遺伝子の発現が、Notch受容体とNotchリガンドとの相互作用を調節するのかもしれない。Numbファミリーメンバーが細胞内でNotchシグナル伝達を調節するということも考えられる。
【００６５】
Notchへのリガンド結合により、Notchを開裂するプレセニリン-1-依存的γ-セクレターゼ様蛋白質が活性化される。De Strooperら、Nature 398：518-522(1999)、Mummら、Molecular Cell.5:197-206(2000)。細胞外領域での開裂では、フリン様転換酵素が必要であるかもしれない。Logeatら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 95:8108-8112(1998)。細胞内ドメインが放出され、DNA結合蛋白質RBP-Jと結合することにより遺伝子をトランス活性化する。Katoら、Development 124:4133-4141(1997)。Notch1、Notch2およびNotch4は、Enhancer of Split(HES)ファミリーのメンバーなどの遺伝子をトランス活性化すると考えられ、Notch3シグナル伝達は抑制性であるかもしれない。Beatusら、Development 126:3925-3935(1999)。最後に、Fringeファミリー内の分泌蛋白質はNotch受容体に結合しその機能を調節する。Zhang & Gridley、Nature 394(1998)。
【００６６】
Notchシグナル伝達の阻害薬(例えば、NumbおよびNumb様；またはNotch活性化をブロックする抗体もしくは小分子)を、固形腫瘍幹細胞を阻害するために、本発明の方法において使用することができる。このようにNotch経路は、固形腫瘍幹細胞を死滅させ、またはその増殖を阻害するように調節される。
【００６７】
Notchシグナル伝達経路はT1癌幹細胞およびMCF-7細胞の増殖に重要な役割を果たすと考えられるので、我々は腫瘍1癌細胞の異なる集団により、Notch4およびFringeファミリーのメンバーの発現を決定した。フローサイトメトリーにより、腫瘍形成性および非腫瘍形成性癌細胞のどちらもがNotch4を発現することが示された。我々は次に、Fringeファミリーのメンバーの発現について2つの腫瘍を調べた。3つのFringe蛋白質、Manic、LunaticおよびRadicalは全て、Notch受容体をグリコシル化し、受容体シグナル伝達を調節する。しかしながら、4つのNotch受容体の各々を介するシグナル伝達に対する特定のFringeの影響は異なりうる。さらに、各Fringeは異なる部位で特定のNotch受容体をグリコシル化し、特定のリガンドに対し特異な応答が得られると考えられる。
【００６８】
Trizol(Gibco BRL、メリーランド州ロックフィル)を用いて固形腫瘍細胞からRNAを単離した。逆転写後、以下のプライマーを使用してEGF-RおよびHer2/neuフラグメントを増幅させた：
それぞれ、EGF-Rに対しては、
2005511754.tif 000011
Her2/neuに対しては、
2005511754.tif 000012
。Fringe転写物に対するRT-PCRを、以下の外部プライマー
（それぞれ、Manic Fringeに対しては、
2005511754.tif 000013
Radical Fringeに対しては、
2005511754.tif 000014
ならびにLunatic Fringeに対しては、
2005511754.tif 000015
）ならびに以下の内部プライマーを使用して実施した。
【００６９】
0.1ugの未分離腫瘍RNAを用いたRT-PCRにより、T1細胞がManic Fringe、Radical FringeおよびLunatic Fringeを発現することが証明されたが、100個のESA+B38.1+CD24-/lowLINEAGE-(腫瘍形成性)細胞のRT-PCRにより、これらの細胞はManic Fringeを発現するが、Lunatic FringeまたはRadical Fringeは発現しないことが証明された。単一細胞RT-PCRにより調べると、6つ全てのT1腫瘍形成性細胞がManic Fringeを発現したが、6つの非腫瘍形成性細胞のうちManic Fringeを発現したのはたった2つであった。対照的に、調べた非腫瘍形成性単一細胞の全てがLunatic FringeおよびRadical Fringeを発現したが、腫瘍形成性単一細胞のうちそれらを発現したものはなかった。無継代乳癌細胞の異なる集団による発現の差があるかどうかを見るため、無継代T5幹細胞および非腫瘍形成性細胞によるFringe発現を決定した。単一細胞RT-PCRにより、試験したT5乳癌幹細胞6つ全てがManic Fringeを発現したが、細胞の1/6のみがLunatic Fringeを発現し、試験した6つの細胞のうち1つのみがRadical Fringeを発現したことがそれぞれ示された。対照的に、試験した非腫瘍形成性細胞全てがLunatic Fringeを発現し、6つのうち5つがRadical Fringeを発現し、6つの細胞うち1つのみがManic Fringeを発現した。このように、腫瘍形成性および非腫瘍形成性無継代T5細胞による異なるFringe遺伝子の発現は継代T1細胞において見られるパターンを反映した。Manic Fringeは発癌形質転換に関与するとされている。これらのデータから、遺伝子の腫瘍形成性および非腫瘍形成性新生物細胞による示差的な発現が、これらの細胞における腫瘍形成を調節すると考えられる生物学的に関連する経路に関わることが証明される。異なるFringe遺伝子が乳癌細胞の運命決定に直接関与するか、その示差的な発現が単に特定の細胞集団と関連するかについては、まだ試験すべき状態である。
【００７０】
固形腫瘍幹細胞の選択的ターゲティング
我々は、腫瘍形成性乳癌細胞(すなわち、固形腫瘍幹細胞、特に腫瘍1(T1)細胞)によるEGF-R、Her2/neu、Notch4、Manic Fringe、Lunatic FringeおよびRadical Fringeの発現を決定した。EGF-RおよびHER2/neuは、乳癌細胞増殖に関与する可能性のある治療標的である。
【００７１】
フローサイトメトリーを使用して、NOD/SCIDマウスで1代継代させたT1細胞の部分集団を単離した。細胞を抗EGF-R、抗CD24、抗Lineage、抗マウス-H2K、および7AADまたは抗HER2/neu、抗CD24、抗Lineage、抗マウス-H2K、および7AADで染色した。死細胞(7AAD+)、マウス細胞(H2K+)およびLINEAGE+細胞を全ての分析から排除した。ネステッドプライマーを使用したRT-PCRもまた実施し、パネル内のサンプルにつき1細胞においてまたはパネル内のサンプルにつき10細胞において、EGF-Rを検出しまたはHER2/neuを検出した。
【００７２】
T1中の腫瘍形成性細胞集団に焦点をあてることにより、我々は、この特定の腫瘍における可能な治療標的として、おそらくEGF-R Radical FringeおよびLunatic Fringeを排除しつつ、Her2/neu Notch4およびManic Fringeを同定することができた。腫瘍形成性細胞のほとんどが検出可能なレベルのHER2/neu蛋白質およびmRNAを発現したが、我々はほとんどの腫瘍形成性細胞においてEGF-Rの発現を検出できなかった。
【００７３】
腫瘍形成性T1細胞は、非腫瘍形成性細胞よりも低レベルの抗EGF-R抗体で染色され、EGR-R発現は腫瘍形成細胞中の単一細胞レベルでは検出できなかった。検出可能なレベルのEGF-Rを発現しなかった細胞が腫瘍形成性であるかどうかを試験するために、1,000〜2,000個の腫瘍形成性細胞をまた、EGFR発現に関して選別し、NOD/SCIDマウスに注入した。4つの場合のうち4つで腫瘍が形成し、EGF-R-細胞が腫瘍形成性であることが確認された。対照的に、我々は、腫瘍形成性および非腫瘍形成性T1細胞間のHER2/neu発現の実質的な差異が検出できなかった。予測されたように、1,000〜2,000個のHER2/neu+細胞は4つの場合のうち4つにおいて腫瘍を生じさせた。これらの観察から、腫瘍形成性集団と非腫瘍形成性集団との間で治療標的の発現に差異がありうることが示唆される。
【００７４】
非腫瘍形成性癌細胞のみを死滅させる療法では、一時的な腫瘍の後退が得られるかもしれないが、腫瘍を根絶することはできないので、これらの結果から、HER2/neu発現細胞を死滅させる作用物質が、この腫瘍中でEGF-R発現細胞を死滅させる作用物質よりも効果的でありうることが示唆される。他の乳癌腫瘍はこれらの遺伝子の異なる発現パターンを表すかもしれない。このように、腫瘍形成性細胞の予測的同定および単離により、腫瘍形成に重要な因子のより集中的な生物学的、生物化学的および分子的特徴づけが可能となり、この細胞集団への治療薬の特異的ターゲティングが可能となり、より効果的な癌治療が開発されるはずである。
【００７５】
本発明の固形幹細胞および固形幹細胞子孫を、固形腫瘍細胞に対する生物学的作用物質の効果を決定する方法、例えば、診断、治療、または診断と治療の組み合わせにおいて使用することができる。「作用物質」または「化合物」という用語は、その効果が有害であろうと、有益であろうと、またはそれ以外であろうと、腫瘍細胞に効果を有しうる任意の作用物質(例えば、ウイルス、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、薬物、抗体、プロドラッグ、他の「生体分子」または他の物質)を示す。固形腫瘍幹細胞および固形腫瘍幹細胞子孫の数および性質をいくつかの他の様式で増大、減少または調節する様々な生物作用物質の能力は、創薬分野の当業者に周知の方法によりアッセイすることができる。
【００７６】
1つの態様では、Notch4リガンド、抗Notch4抗体、またはNotchシグナル伝達/応答経路における蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する他の治療薬を含む薬学的組成物は、任意の有効な方法により投与することができる。例えば、有効濃度の抗Notch治療薬を含む生理学的に適した溶液は、局所的に、眼内に、非経口で、経口で、鼻内に、静脈内に、筋内に、皮下に、または任意の他の効果的な手段により投与することができる。特に、抗Notch治療薬は、標的組織の腫瘍細胞を治療するのに有効な量で、注射針により直接標的癌または腫瘍組織に注入しうる。または、体腔、例えば目の中、胃腸管、尿生殖路(例えば、膀胱)、肺および気管支系などに存在する固形腫瘍は、有効濃度の抗Notch4治療薬を含む生理学的に適した組成物(例えば、無菌の、生理食塩水またはリン酸緩衝液などの溶液、懸濁液、またはエマルジョン)を、注射針を用いた直接注入を介して、あるいはカテーテルまたは癌もしくは腫瘍に冒された中空器官内に配置された他の送達チューブを介して受けることができる。X線、ソノグラム、または光ファイバ可視化システムなどの任意の有効な画像装置を使用して、標的組織の位置を突き止め、注射針またはカテーテルチューブを案内してもよい。代替策として、有効濃度の抗Notch治療薬を含む生理学的に適した溶液を全身の血液循環に投与し、直接到達することができないまたは解剖学的に単離することができない癌または腫瘍を治療してもよい。そのような操作は全て、標的腫瘍と十分接触するように抗Notch4作用物質を配置し、(作用物質の性質により)抗Notch4作用物質を腫瘍細胞と接触させ、そのような細胞に形質導入させ、またはトランスフェクトさせるという共通の目的を有する。
【００７７】
固形腫瘍を有する癌患者の治療の際には、治療上有効な量の抗Notch治療薬を投与することができる。「治療上有効な」用量は、患者において症状の改善または生存の延長を得るのに十分な化合物の量を示す。そのような化合物の毒性および治療効力は、例えばLD50(集団の50%に対する致死用量)およびED50(集団の50%において治療上有効な用量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験により得られるデータを、ヒトにおいて使用するための範囲用量を製剤化する際に使用することができる。そのような化合物の用量は、好ましくはED50を含んで毒性がほとんどまたは全く無い循環濃度範囲内にある。用量は、採用する投与形態および利用する投与経路により、この範囲内で変動してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物に対し、治療上有効な用量は細胞培養アッセイにより最初に評価することができる。用量は、細胞培養において決定されるIC50を含む循環血漿濃度範囲が達成されるように、動物モデルで製剤化してもよい。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有益な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定しうる。
【００７８】
他の態様では、選択的に固形腫瘍幹細胞を標的とする生体分子または生物作用物質は遺伝子治療戦略を使用することができる。例えば、生体分子は、固形腫瘍幹細胞により発現されるマーカーを使用して固形腫瘍幹細胞を標的とする遺伝子療法自殺ベクターとすることができる。1つの態様では、ベクターはB38.1マーカーに結合するように再命令されたアデノウイルスベクターである。我々は抗繊維(anti-fiber)およびB38.1抗体をProlinx(Prolinx、Inc.、ワシントン州ボセル、USA)法(Douglas JTら、Nature Biotechnology 14(11):1574-8(1996)を参照されたい)により結合させた。我々が修飾した抗瘤(anti-knob)および抗B38.1抗体を共に混合すると、架橋し、二重特異性結合体が得られた。結合体の抗繊維抗体部分はアデノウイルスに結合することができ、抗B38.1部分は乳癌幹細胞に結合することができる。AdLacZウイルスを抗繊維のみとインキュベートすると、ウイルスの感染性がブロックされる。二重特異性結合体とインキュベートしたウイルスの感染性は、高レベルのB38.1抗原を発現する細胞においてのみ回復する。遊離B38.1抗体により阻害されるため、再ターゲティングは特異的である。結果として、二重特異性結合体はベクターの感染性を調節することができ、その天然の指向性をブロックし、固形腫瘍幹細胞表面マーカーを発現する細胞へ感染を誘導することができる。
【００７９】
腫瘍学分野の当業者であれば、ベクターと共に、選択したベクターの形質導入またはトランスフェクション効率を維持し、安全な注入を促進するのに適した担体またはビヒクルを含む組成物中で、ベクターを投与すべきであることは理解できる。そのような担体は、pH平衡生理学的緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または重炭酸塩緩衝液、生理食塩水、持続放出組成物、および標的作用物質を治療すべき固形腫瘍幹細胞と接触するように安全におよび効果的に配置するのに有益な任意の他の物質としてもよい。
【００８０】
治療する特定の状態によっては、作用物質は、全身または局所用に製剤化され投与されてもよい。製剤化および投与技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第20版(Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン)において見出すことができる。適した経路としては、いくつか例を挙げると、経口、直腸内、経皮、膣内、経粘膜、または腸内投与；非経口送達、例えば筋内、皮下、髄内注射、ならびにくも膜下、直接脳室内、静脈内、腹膜内、鼻腔内、または眼内注入が挙げられる。
【００８１】
注入のために、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的生理食塩緩衝液中で製剤化してもよい。そのような経粘膜投与のためには、浸透すべきバリヤに適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は当技術分野で一般に周知である。
【００８２】
活性成分に加えて、これらの薬学的組成物は、活性化合物を、薬学的に使用することができる調製物へと加工するのを容易にする、賦形剤および助剤を含む、適した薬学的に許容される担体を有してもよい。経口投与用に製剤化された調製物は、錠剤、カプセルまたは溶液形態としてもよい。本発明の薬学的組成物は、それ自体周知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、微粉化、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥過程により製造してもよい。非経口投与用の薬学的組成物は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、適した油状注入懸濁液として調製してもよい。適した親油溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水溶性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。選択的に、懸濁液はまた、適した安定化剤または高濃度溶液の調製を可能とする化合物の溶解度を増大させる作用物質を含んでもよい。
【００８３】
的確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して各医者が選択することができる(例えば、Finglら、In The Pharmacological Basis of Therapeutics、Ch.1、pg.1(1975)を参照のこと)。担当医は、毒性または器官の機能不全により、どのようにして、いつ、投与を終了、中断、または調節するかを知っているであろう。いいかえれば、担当医は、臨床反応が十分でなければ(毒性を除く)、治療をより高いレベルに調節することも知っているであろう。対象の臨床疾患の管理における投与用量の量は、治療すべき状態の重篤度および投与経路により変えることができる。Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals、第12版(CRC Press 1996); Physicians’ Desk Reference 第55版(2000)を参照のこと。状態の重篤度は、例えば、部分的に、適当な予後評価法により評価してもよい。さらに、用量およびおそらく用量頻度はまた、個々の患者の年齢、体重、および応答により変動する。上記プログラムに匹敵するプログラムを獣医学において使用してもよい。
【００８４】
本発明の1つ以上の態様の詳細を上記で説明した。好ましい方法および材料について説明しているが、本明細書で記述した方法および材料と類似するまたは等価の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【００８５】
明細書および添付の請求の範囲において、単数形は複数の指示物を含む。本明細書で特に規定されていなければ、本明細書で使用される技術的および科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書で引用した特許および出版物は全て、参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１−１】腫瘍形成性細胞の分離を示した図である。フローサイトメトリーを使用して、腫瘍1(T1；図1a、図1b)、腫瘍3(T2；図1c)、腫瘍5(T5；図1d)、腫瘍6(T6；図1e)および腫瘍7(T7；図1f)細胞の小集団を分離し、NOD/SCIDマウスにおいて腫瘍形成性を試験した。T1(図1b)およびT3(図1c)はNOD/SCIDマウスにおいて1代継代させた(P)。細胞の残りは患者から除去した直後に得られた凍結または未凍結サンプルであった(UP)。細胞は、CD44、CD24、LINEAGEマーカー、およびマウス-H2Kに対する抗体(マウスから得られた継代腫瘍に対する)、および7AADを用いて染色した。死細胞(7AAD+)、マウス細胞(H2K+)およびLINEAGE+正常細胞を全ての分析から除去した。各プロットは生存ヒトLINEAGE-癌細胞のCD24およびCD44染色パターンを示したものであり、各試料中の癌細胞/全細胞の割合として囲んだ腫瘍形成性癌集団の頻度を示す。腫瘍3(T3)細胞はPapanicolaou染色により染色し、顕微鏡検査を実施した(100x対物レンズ)。非腫瘍形成性(図1g)および腫瘍形成性(図1h)集団のどちらも、新生物外観を有する、大きな核および顕著な核小体を有する細胞を含んでいた。CD24+注入部位(図1i；20x対物レンズ倍率)からの組織像は正常なマウス組織のみを示し、CD24-/low注入部位(図1j；40x対物レンズ倍率)は悪性細胞(図1k)を含んでいた。マウスの代表的な腫瘍は、CD44+CD24-/lowLINEAGE-注入部位であり、CD44+CD24+LINEAGE-注入部位ではない。
【図１−２】MCF-7およびMCF-10細胞によるNotch4の発現を示した補足図である。MCF-7細胞(補足図1a)およびMCF-10細胞(補足図1b)は抗Notch4抗体により染色した。T1細胞およびMCF-7細胞はMCF-10細胞よりも高レベルの蛋白質を発現する(補足図1c)。Notch4 mRNAの発現を検出するためにネステッドプライマーを使用してRT-PCRを実施した。Notch4は、MCF-7細胞およびMCF-10細胞により発現された。逆転写酵素(RT)を反応から排除するとメッセージは検出されなかった(MCF10/無RT)。我々は、MCF-7細胞がRNAおよび蛋白質両レベルでNotch4を発現したことを確認した。イントロンスパニングNotch4-特異的PCRプライマーの2つの異なる対を使用してこれらのデータをそれぞれ確認した。活動中の「MCF-7」細胞のサブラインが異なればNotch4の発現が異なりうることに注目されたい。Osborne CKら、Breast Cancer Research & Treatment. 9:111-121(1987)。
【図２】固形腫瘍幹細胞から生じる腫瘍の表現型の多様性を示す図である。プロットは腫瘍1(T1；図2a、図2cおよび図2e)または腫瘍2(T2；図2b、図2dおよび図2f)由来の生存ヒトLINEAGE-癌細胞のCD24およびCD44またはESA染色パターンを図示したものである。T1 CD44+LINEAGE-細胞(図2a)またはT2 LINEAGE-細胞(図2b)は、NOD/SCIDマウスにおいて1代継代させた腫瘍から得た。T1由来のESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞(図2c)またはT2由来のCD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞(図2d)を分離し、NOD/SCIDマウスの乳房に注入した。図2eおよび図2fで示したプロットは、これらの細胞から生じた腫瘍の分析を示したものである。どちらの場合も、腫瘍形成性細胞は、オリジナルの腫瘍で観察されたものと類似する、表現型が多様な細胞を含む腫瘍を形成した。T1から分離したESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞(図2g)および残りのLINEAGE-非腫瘍形成性癌細胞(図2h)の細胞周期状態を、Morrison SJおよびWeissman IL、Immunity 1:661-673(1994)の方法に従い、DNA含量のヘキスト33342染色により決定した。腫瘍形成性および非腫瘍形成性細胞集団は同様の細胞周期分布を示した。
【図３】Notch4に対するブロッキング抗体が固形腫瘍幹細胞によるコロニー形成を阻止したことを示す。図3aはT1腫瘍形成性乳癌細胞によるNotch4発現を示したものである。NOD/SCIDマウスにおいて1代継代させた腫瘍形成性(CD44+CD24-/lowLINEAGE-)T1細胞を抗Notch4抗体により染色した。図3bは、Fc抗体(対照)、抗Notch4ポリクローナル抗体(Ab)、抗Notch4ポリクローナル抗体+ブロッキングペプチド(Ab+Block)、Delta-Fc(Delta)、Delta+抗Notch4 Ab(Delta+Ab)、およびDelta+抗Notch4ポリクローナル抗体+ブロッキングペプチド(Delta+Ab+B)を補足した図示組織培地中で14日間、増殖させたコロニー形成/無選別20,000T1細胞を示す。可溶性Delta-Fc(Delta)はコロニー形成を刺激し(p<0.001)、一方、抗Notch4ポリクローナル抗体(Ab)はDelta-Fcの存在下でコロニー形成を阻害した(Delta+Ab)(p<0.001)。抗体を抗Notch4抗体を作成するのに使用されるペプチドと共にプレインキュベートすると、抗体の阻害効果はほとんど完全に反転した(Ab+Block；Delta+Ab+Block；p<0.001)。図3bは、可溶性デルタ-Fc(Delta)が対照Fcコンストラクト(対照)と比較してNotchを活性化したことを示すNotch経路リポーター遺伝子アッセイである。抗Notch4ポリクローナル抗体(Ab)は、可溶性Delta-Fcが存在した場合(Delta+Ab)においてさえ、Notch活性化を阻害した。ポリクローナル抗体がそれに対して作成されたブロッキングペプチド(Block)を添加すると、Notch活性化を阻害する抗体の能力が一部反転した(Delta+Ab+Block)。図3dでは、ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性細胞を1代または2代継代T1腫瘍から分離した。示した数の細胞を、対照緩衝液中で、または抗Notch4ポリクローナル抗体と共にインキュベートした後で、マウスの乳房脂肪体の領域に注入した。腫瘍形成を５ヶ月間モニタした。500個の抗体処理細胞による腫瘍形成は平均3週間遅れたことに注意されたい。
【図４】Notch4シグナル伝達が腫瘍惹起細胞に生存シグナルを提供することを示した図である。図4aは、対照MCF-7細胞(網掛け)および抗Notch4抗体に曝露後24時間のMCF-7細胞(白抜き)の細胞周期状態を、Clarke MFら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11024-11028(1995)およびRyan JJら、Mol.&Cell.Biol.1:711-719(1993)の方法によるDNA含量のPI染色により決定したものを示す。各群は同様の細胞周期分布を示した。図4bは、抗Notch4抗体と共に(+Ab)もしくは無しで、培地で48時間増殖させたPI+アポトーシス性MCF-10、MCF-7、ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-腫瘍形成性腫瘍1(T1)細胞、または培地で5日間増殖させたH2K-腫瘍7(T7)、腫瘍8(T8)、もしくは腫瘍10(T10)細胞がフローサイトメトリーで同定されたことを示す図である。抗体添加後のアポトーシスの始まりの時期は、いくつかの他の死亡シグナル後に見られるものと類似していた。Clarke MFら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11024-11028(1995)(bcl-xs)；Ryan JJら、Mol. & Cell. Biol. 1:711-719(1993)(p53))。抗体はT1およびT10細胞に対し致命的あることに注意されたい。図4cは、抗Notch4抗体に曝露した48時間後、蛍光発生基質CaspoTag(商標)を使用したフローサイトメトリーにより測定すると、活性化カスパーゼ3および/または7を発現する細胞の割合は、対照細胞に比べ、T1腫瘍惹起細胞およびMCF-7細胞では著しく増大したが、MCF-10細胞ではそうではなかったことを示す。腫瘍1(T1)腫瘍形成性(ESA+CD44+CD24-/lowLINEAGE-)細胞を、表3で記述するようにフローサイトメトリーにより分離した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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