(57)【要約】本発明は、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体および抗体フラグメントの検出のための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７およびそれらの変異体からなる群より選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物。
【請求項２】
さらにキャリアを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること；
（ｂ）ポリペプチド／抗体複合体を検出すること；
を含み、ここでポリペプチド／抗体複合体の検出は、エールリヒアに対する抗体が試験サンプル中に存在することの表示である、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の実行前に、工程（ａ）の複合体を測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指標試薬に接触させること、をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓに対する抗体の存在が検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓに対する抗体の存在が検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
抗体が抗体のフラグメントである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
試験サンプル中の抗体の量が測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが基材に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが配列番号１で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが配列番号２で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが配列番号３で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドが配列番号４で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが配列番号５で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが配列番号６で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが配列番号７で示される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
１またはそれ以上のポリペプチドが多量体として提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
試験サンプルが哺乳動物から得られる生物学的サンプルである、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物が、ヒトおよびイヌからなる群より選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
方法が、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、および間接イムノ蛍光アッセイからなるアッセイ群より選ばれるアッセイを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを含む装置。
【請求項２２】
哺乳動物中でのエールリヒア感染の同定のための１またはそれ以上のポリペプチドの使用説明をさらに含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
エールリヒア感染の同定が、以下の（ａ）および（ｂ）を含むエールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を用いて行われる、請求項２２に記載の装置：
（ａ）ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること；
（ｂ）ポリペプチド／抗体複合体を検出すること；ここでポリペプチド／抗体複合体の検出は、エールリヒア感染が存在することの表示である。
【請求項２４】
エールリヒア感染がＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓにより引き起こされる、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
包材、および包材に入れられた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチド、を含む製品。
【請求項２６】
包材が、１またはそれ以上のポリペプチドが哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定に使用できると表示するラベルを含む、請求項２５に記載の製品。
【請求項２７】
エールリヒア感染の同定が、以下の（ａ）および（ｂ）を含むエールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を用いて行われる、請求項２６に記載の製品：
（ａ）ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させること；
（ｂ）ポリペプチド／抗体複合体を検出すること；ここでポリペプチド／抗体複合体の検出は、エールリヒア感染が存在することの表示である。
【請求項２８】
エールリヒア感染がＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓにより引き起こされる、請求項２６に記載の製品。
【請求項２９】
（ａ）エールリヒア感染を有していると疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、生物学的サンプルに接触させること；
（ｃ）ポリペプチド／抗体複合体を検出すること；
を含み、ここでポリペプチド／抗体複合体の検出は、哺乳動物がエールリヒア感染を有していることの表示である、哺乳動物におけるエールリヒア感染の診断方法。
【請求項３０】
工程（ｃ）の実行前に、工程（ｂ）の複合体を測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指標試薬に接触させること、をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
エールリヒア感染がＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓにより引き起こされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
エールリヒア感染がＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓにより引き起こされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物がヒトまたはイヌである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓのポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記ポリペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選ばれる、モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体および抗体フラグメントの検出および定量のための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）は、哺乳動物宿主の循環するリンパ球に感染する真正の細胞内病原である。Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓは、イヌおよびヒトに感染してそれぞれイヌ単球エールリヒア症（ＣＭＥ）およびヒト単球エールリヒア症（ＨＭＥ）を引き起こす、同じ亜属の構成員である。イヌの疾患は、熱、リンパ節炎、体重減少、および汎血球減少により特徴づけられる。ヒトにおいてこの疾患は、熱、頭痛、筋肉痛、および白血球減少により特徴づけられる。早期の検出および処置が、イヌおよびヒト両方のエールリヒア症の処置に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、これらの疾患の診断の補助としてしばしば用いられる。これらのアッセイは、患者の血液、血漿、または血清からの抗−エールリヒア抗体の、感染した細胞、細胞溶解産物、または精製したエールリヒアタンパク質、への結合を測定する、若しくは検出するものである。しかし、抗−エールリヒア抗体またはそれらのフラグメントを検出する現在知られたアッセイは、これらの試験に用いられるエールリヒア抗原の純粋でない性質に直接関連する感受性および特異性の問題のために、非常に限られた有用性しかない。高度に精製された試薬が、より正確なアッセイを構築するために必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の概要）
本発明の目的は、抗−Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ抗体および抗−Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体を検出するための試薬および方法を提供することにある。本発明のこのおよび他の目的は、以下に記載する１またはそれ以上の態様により提供される。
【０００５】
本発明の１つの態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７およびそれらの変異体からなる群より選ばれる単離されたポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０００６】
本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７およびそれらの変異体からなる群より選ばれる単離されたポリペプチド、およびキャリアを含む組成物を提供する。
【０００７】
本発明のまた他の態様は、エールリヒアに対する抗体の存在の検出方法を提供する。その方法は、ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、エールリヒアに対する抗体を含むと疑われる試験サンプルに接触させることを含む。ポリペプチド／抗体複合体が検出される。ポリペプチド／抗体複合体の検出は、エールリヒアに対する抗体が試験サンプル中に存在することの表示である。
【０００８】
本発明のさらなる他の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、含む装置、および哺乳動物においてエールリヒア感染の同定のための１またはそれ以上のポリペプチドの使用説明を提供する。
【０００９】
本発明のまた他の態様は、包材、および包材に入れられた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチド、を含む製品を提供する。その包材は、１またはそれ以上のポリペプチドが哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定に使用できると表示するラベルを含む。
【００１０】
本発明のさらなる他の態様は、哺乳動物におけるエールリヒア感染の診断方法を提供する。その方法は、エールリヒア感染を有していると疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、およびポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７で示されるポリペプチドおよびそれらの変異体からなる群より選ばれる１またはそれ以上のポリペプチドを、生物学的サンプルに接触させることを含む。ポリペプチド／抗体複合体が検出され、ここでポリペプチド／抗体複合体の検出は、その哺乳動物がエールリヒア感染を有していることの表示である。
【００１１】
本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群より選ばれるＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓのポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体を提供する。
【００１２】
したがって、本発明は、エールリヒアの抗体および抗体フラグメントの検出のための正確なアッセイに使用する、高度に精製されたポリペプチドおよび抗体を提供する。
【００１３】
（発明の詳細な記載）
本発明のポリペプチド
本発明は、Ｅ．ｃａｎｉｓおよびＥ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体および抗体フラグメントの検出のための高度に精製された試薬を提供する。特に、本発明は、配列番号１〜７で示されるポリペプチド配列に対して、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドを提供する。表１を参照のこと。配列番号１〜７で示されるポリペプチド配列に対して１００％の同一性を含まないポリペプチドは、「変異体」と見なされ、そして本発明のポリペプチドと見なされる。
【００１４】
Ｅ．ｃａｎｉｓペプチドは、天然Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原に対して生じさせたマウスモノクローナル抗体（ＩＩＩＨ７）に結合したアミノ酸配列を測定することによるファージディスプレイ技術を用いて同定された。ＩＩＩＨ７モノクローナル抗体を用いて、ＰＤＨ１０ファージディスプレイライブラリーにおいてウイルス発現ペプチドをアフィニティー精製した。ＩＩＩＨ７に結合した配列またはミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅｓ）は、Ｅ．ｃａｎｉｓおよびＥ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓの外膜タンパク質に対して強い配列相同性を示した。両種の外膜タンパク質は、多形遺伝子ファミリーによりエンコードされ、これは、タンパク質の多重再生産をもたらす。
【００１５】
【表１】
2005502586.tif 000002
【００１６】
同一性は、アミノ酸配列の類似性を意味し、この分野で認識される意味を有する。同一性を有する配列は、同一若しくは類似のアミノ酸を共有し、ここで類似のアミノ酸は、好ましくは保存されたアミノ酸である。保存されたアミノ酸は、参照配列によりエンコードされるアミノ酸と類似の側鎖および性質（例えば、親水性、疎水性、芳香族）を有するアミノ酸である。したがって、参照配列（即ち、配列番号１〜７）と８５％のアミノ酸配列同一性を共有する候補配列は、候補配列の参照配列とのアライメントの後、候補配列のアミノ酸の８５％が、参照配列の対応するアミノ酸と同一性を有すること、および／または保存されたアミノ酸変異を構成すること、を必要とする。
【００１７】
配列は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌに修正された（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７のアルゴリムのような、数学的アルゴリズムを用いて同一性の計算のためにアラインされる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０のＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３により、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実行して、本発明のポリペプチドと同一性を有するアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的のためにギャップのあるアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２に記載されたようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用した場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。アラインされた候補配列の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、同一性の計算を行う際には無視される。
【００１８】
本発明のポリペプチドのアミノ酸がいずれもの組み合わせで置換、欠失、若しくは付加された変異体は、本発明により企図される。自然発生する変異体および自然発生しない変異体は、本発明に含まれ、変異技術または直接合成により製造されてもよい。
【００１９】
タンパク質工学および組み換えＤＮＡ技術の知られた方法を用いて、本発明のポリペプチドの特徴を改善若しくは変化させるために、変異体を作製してもよい。このような変異体には、活性にほとんど影響しないようなこの分野で知られた一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、転移、繰り返し、および置換が含まれる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４７：１３０６−１３１０  （１９９０）に提供され、ここでは筆者は、アミノ酸配列が変化することについての許容性を研究する２つの主要な戦略があると、示している。
【００２０】
第１の戦略は、進化の過程での自然淘汰によるアミノ酸置換の許容性を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することにより、種間で保存されてきたアミノ酸位置が同定できる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能に重要であると考えられる。対照的に、置換が自然淘汰により許容されてきたアミノ酸位置は、タンパク質機能に決定的ではない位置であることを示す。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は修飾されたとしても、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントへのポリペプチドの特異的結合活性を依然維持する。
【００２１】
第２の戦略は、遺伝子工学を利用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置においてアミノ酸の変異を導入し、タンパク質機能に決定的な領域を同定するものである。例えば、部位誘導変異若しくはアラニン走査変異（分子中のすべての残基における単一のアラニン変異の導入）を用いることができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５  （１９８９））。得られた変異体分子は、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントに対する特異的な結合について試験される。
【００２２】
Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．によると、これらの２つの戦略は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど許容性を有していることを明らかにした。筆者らは、アミノ酸変異がタンパク質中のある特定のアミノ酸位置において許容的でありそうなことをさらに示した。例えば、最も埋没したまたは内側の（タンパク質の３次構造内の）アミノ酸残基は、無極性側鎖を必要とし、ここでは表面または外側の側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。さらに、許容された保存性アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置き換え；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの置き換え；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの置き換え；アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの置き換え；塩基性残基であるＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置き換え；芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置き換え；並びに小型アミノ酸であるＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置き換え；を伴う。
【００２３】
保存的アミノ酸置換に加えて、本発明の変異体には、（ｉ）１またはそれ以上の非保存的アミノ酸残基による置換、ここで置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりエンコードされていてもされていなくてもよい；（ｉｉ）置換基を有する１またはそれ以上のアミノ酸残基による置換；（ｉｉｉ）ポリペプチドの安定性および／または溶解性を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、成熟ポリペプチドの他の化合物との融合；（ｉｖ）ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、リーダー若しくは分泌配列、または精製を容易にする配列のような、さらなるアミノ酸とのポリペプチドの融合；が含まれる。このような変異体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあるとみなされる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、抗−エールリヒア抗体に特異的に結合する。この文脈において「特異的に結合する」は、ポリペプチドは抗−エールリヒア抗体を認識しこれに結合するが、試験サンプル中の他の分子を実質的に認識せず、これらに結合しないことを意味する。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、抗−エールリヒア抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを含む。エピトープは、ポリペプチドの抗原決定基である。エピトープは、直線状、連続エピトープ、またはコンホメーションエピトープでもよい。本発明のポリペプチド内のエピトープは、いくつかの方法により同定できる。例えば、米国特許番号４，５５４，１０１号；ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ，  ＣＡＢＩＯＳ  ４：１８１−１８６  （１９８８）を参照のこと。例えば、本発明のポリペプチドは、単離しスクリーニングすることができる。一連の短鎖ペプチドは、全ポリペプチド配列に渡るものであり、タンパク質分解による切断により調製できる。はじめとして、例えば、２０量体のポリペプチドフラグメントにつき、各々のフラグメントが、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で認識されるエピトープの存在について試験できる。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、２０量体ポリペプチドフラグメントのようなポリペプチドは、プラスチックの多重ウェルプレートの壁のような固体担体に結合する。抗体の集合はラベル化され、非特異的吸着が遮蔽される条件下で、固体担体に添加され、ラベル化されていない抗原に結合し、結合していない抗体および他のタンパク質は洗い流される。抗体の結合は、例えば、無色の指標試薬が着色した反応産物に変換する反応により、検出される。段階的により小さく、重なったフラグメントを、同定された２０量体から試験し、目的のエピトープをマッピングすることができる。
【００２６】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、通常のペプチド合成器を用いて合成され、この合成器はこの分野でよく知られたものである。本発明のポリペプチドは、組み換えにより製造することもできる。エールリヒアポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、この分野でよく知られた技術を用いて適当な発現系で発現できる発現ベクター中に導入することができる。種々の細菌、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫の発現系が、この分野で利用可能であり、このような発現系のいずれも使用することができる。任意に、エールリヒアポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、細胞を含まない翻訳系で翻訳されることができる。
【００２７】
所望により、エールリヒアポリペプチドは、融合タンパク質として製造することができ、これは、アミノ酸リンカーやシグナル配列のような他のアミノ酸配列、並びにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびスタフィロコッカルタンパク質Ａのようなタンパク質精製において有用なリガンド、を含むことができる。１つ以上のエールリヒアポリペプチドが、融合タンパク質中に存在できる。所望により、異なるエールリヒア株または単離体からのエールリヒアポリペプチドの種々の組み合わせも、融合タンパク質に含めることができる。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、いくつかの繰り返しのエールリヒアポリペプチドを含むように合成することができる。これは、多量体ポリペプチドである。これらの繰り返しのポリペプチドは、例えば配列番号１で示されるポリペプチドのように、２またはそれ以上繰り返される１つの特異的なポリペプチドを含むことができる。あるいは、繰り返しのポリペプチドは、１またはそれ以上の他の異なるエールリヒアポリペプチドのコピーを伴う特定のエールリヒアポリペプチドの１またはそれ以上のコピーを含む。本発明のポリペプチドは、１またはそれ以上のポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、または完全長ポリペプチドとともに組み合わせること、または合成することができる。好ましくは、１またはそれ以上のポリペプチドは、本発明の他のポリペプチドまたは他のエールリヒアタンパク質である。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、配列番号１〜７で示されるポリペプチド若しくはそれらの変異体のフラグメントを含むこともできる。例えば、ポリペプチドのフラグメントは、６から２０アミノ酸のいずれの数のアミノ酸をも含むことができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、好ましくはキャリアと組み合わされる。キャリアは、本発明のポリペプチドの媒体である。キャリアには、例えば、賦形剤、希釈材、アジュバント、および安定剤が含まれる。このような安定剤の例としては、血清アルブミンおよびゼラチンのようなタンパク質；グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、およびラクチトールのような糖類；およびリン酸若しくはコハク酸から主として構成されるバッファー；がある。
【００３１】
Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓおよびＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓの種々の株および単離体が発生し、これらの株および単離体のいずれのポリペプチドも、本発明に用いることができる。エールリヒア遺伝子およびポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列は、この分野で知られている。例えば、Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ  ＯＭＰ遺伝子ファミリーのいくつかの配列およびＥ．ｃａｎｉｓ  Ｐ３０遺伝子ファミリーのいくつかの配列は、ＷＯ９９／１３７２０に開示されている。
【００３２】
検出方法
本発明の方法は、生物学的サンプル、環境サンプル、または実験室サンプルのような試験サンプル中のＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓまたはＥｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体または抗体フラグメントを検出する。生物学的サンプルには、例えば、イヌやヒトのような哺乳動物からの血清、血液、細胞、血漿、または組織を含めることができる。試験サンプルは、本発明のポリペプチドと組み合わせる前に、未処理のもの、沈殿されたもの、分画されたもの、分離されたもの、希釈されたもの、濃縮されたもの、または精製されたもの、でもよい。
【００３３】
本方法は、ポリペプチド／抗体複合体が形成できる条件下で、本発明のポリペプチドを試験サンプルに接触させることを含む。サンプル中でのポリペプチドと抗−エールリヒア抗体との複合体の形成が、検出される。本発明の１つの態様として、ポリペプチド／抗体複合体は、酵素のような、抗体に結合する指標試薬が検出可能な反応を触媒する時に、検出される。任意に、シグナル発生化合物を含む指標試薬は、ポリペプチド／抗体／指標複合体を形成できる条件下でポリペプチド／抗体複合体に適用できる。ポリペプチド／抗体／指標複合体が、検出される。任意に、ポリペプチドまたは抗体は、ポリペプチド／抗体複合体の形成前に、指標試薬によりラベル化することができる。本方法は、任意に正または負のコントロールを含むことができる。
【００３４】
本発明のアッセイには、限定されないが、競争に基づくもの、直接反応またはサンドウィッチ型アッセイ、が含まれる。アッセイは、固相若しくは基材を使用でき、または免疫沈降若しくは固相を利用しない他の方法により実行できる。固相若しくは基材を使用する場合、本発明のポリペプチドは、ミクロタイターウェル、マグネチックビーズ、非マグネチックビーズ、カラム、マトリックス、膜、合成若しくは天然繊維（例えば、ガラスまたはセルロースに基づく物質、またはポリエチレン、ポリプロピレン、若しくはポリエステルのような熱可塑性ポリマー）から構成される繊維状マット、粒子状物質（例えば、ガラスまたは種々の熱可塑性ポリマー）から構成される焼結構造、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホン等（一般的に元来合成されたもの）から構成されるキャストされた膜状フィルム、のような固体担体若しくは基材に直接的または間接的に結合する。好ましい基材は、焼結した、ポリエチレンの微細粒子であり、多孔質ポリエチレンとして一般的に知られた、例えば、Ｃｈｒｏｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの１０〜１５ミクロンの多孔質ポリエチレンである。これらの基材物質のすべては、フィルム、シート、若しくはプレートのような適当な形で用いてもよく、または紙、ガラス、プラスチックフィルム、若しくは繊維のような適切な不活性キャリア上に被覆され、結合し、またはラミネートされてもよい。ペプチドを固相に固定化する適当な方法には、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等が含まれる。
【００３５】
本発明のポリペプチドを用いて、限定されないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ＩＦＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、血球凝集（ＨＡ）、および蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）等のアッセイにより、抗−エールリヒア抗体若しくは抗体フラグメントを検出できる。本発明の好ましいアッセイは、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、例えば、ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイである。米国特許番号５，７２６，０１０号を参照のこと。
【００３６】
１つの型のアッセイ形式として、１またはそれ以上のポリペプチドが、固相または基材上に被覆できる。抗−エールリヒア抗体を含んでいると疑われる試験サンプルは、固相のポリペプチドに対する試験サンプルの抗体か、または、固相のポリペプチドに対するエールリヒアに対して特異的な抗体にコンジュゲートした指標試薬化合物のいずれか、の抗原／抗体複合体を形成するのに充分な条件下で、エールリヒアに対して特異的な抗体にコンジュゲートしたシグナル発生化合物を含む指標試薬と伴に、一定時間インキュベートされる。抗−エールリヒア抗体にコンジュゲートした指標試薬の固相への結合の低下は、定量的に測定できる。確認されたエールリヒア陰性試験サンプルから発生したシグナルと比べたシグナルの測定可能な低下は、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の存在を示す。この型のアッセイは、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の量を定量することができる。
【００３７】
他の型のアッセイ形式として、本発明の１またはそれ以上のポリペプチドが、担体または基材上に被覆される。本発明のポリペプチドは、指標試薬にコンジュゲートし、試験サンプルに添加される。この混合物は、担体または基材に適用される。エールリヒア抗体が試験サンプル中に存在すると、これらは、指標試薬にコンジュゲートしたポリペプチドおよび担体に固定化されたポリペプチドに結合することとなる。ポリペプチド／抗体／指標複合体は、検出することができる。この型のアッセイは、試験サンプル中の抗−エールリヒア抗体の量を定量することができる。
【００３８】
ポリペプチド／抗体複合体またはポリペプチド／抗体／指標複合体の形成は、放射性測定、色測定、蛍光測定、大きさ分離、または沈殿方法により検出することができる。任意に、ポリペプチド／抗体複合体の検出は、シグナル発生化合物を含む指標試薬に結合する第２の抗体の添加による。ポリペプチド／抗体複合体に関連するシグナル発生化合物（ラベル）を含む指標試薬は検出することができ、これには、発色剤、酵素のような触媒、フルオロセインやローダミンのような蛍光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム、ルテニウム、およびルミノールのような化学発光化合物、放射性元素、直接視覚化ラベル、さらに補因子、阻害因子、マグネティックパーティクル等が含まれる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ等が含まれる。特定のラベルの選択は、決定的なものではないが、それ自身または１またはそれ以上の他の物質と組み合わせることのいずれかにより、シグナルを発生できることとなる。
【００３９】
複合体の形成は、試験サンプル中における抗−Ｅ．ｃａｎｉｓまたは抗−Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ抗体の存在の指標となる。したがって、本発明の方法を用いて、患者におけるＥ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ感染を診断することができる。本発明の各々のポリペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓ若しくはＥ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、またはポリペプチドと抗体の交差反応によりその両方を検出することができる。
【００４０】
本発明の方法は、試験サンプル中のエールリヒア抗体の量または数を示すこともできる。酵素のような多数の指標試薬により、存在する抗体の量は、発生するシグナルに比例する。試験サンプルの型に依存して、適当なバッファー試薬により希釈でき、濃縮でき、または何ら操作をすることなく固相に接触できる。例えば、存在する抗体の存在および／または量を測定するために、あらかじめ希釈された血清や血漿サンプル、または尿のように濃縮された標本を試験することが好ましい。
【００４１】
本発明は、サンプル中の抗−エールリヒア抗体を検出するためのアッセイキットをさらに含む。キットは、本発明の１またはそれ以上のポリペプチド、およびサンプル中でのポリペプチドのエールリヒア抗体への結合を検出する手段、を含む。キットは、本発明の１またはそれ以上のポリペプチド、および哺乳動物におけるエールリヒア感染の同定のための１またはそれ以上のポリペプチドの使用説明を含む装置、を含むことができる。キットは、また、キットの１またはそれ以上のポリペプチドがエールリヒア感染の同定のために用いられることを示すラベルを含む包材、を含むことができる。バッファー、コントロール等のような、当業者に知られた他の成分が、このような試験キットに含まれてもよい。本発明のポリペプチド、アッセイ、およびキットは、例えば、患者におけるエールリヒア感染の個々のケースを診断するのに有用であり、またエールリヒア流行の疫学的研究に有用である。
【００４２】
本発明のポリペプチドおよびアッセイを、他のポリペプチドまたはアッセイと組み合わせて、他の微生物とともにエールリヒアの存在を検出することができる。例えば、本発明のポリペプチドおよびアッセイは、心糸状虫および／またはＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒを検出する試薬と組み合わせることができる。
【００４３】
モノクローナル抗体
本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに存在するＥ．ｃａｎｉｓまたはＥ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓの免疫学的エピトープに特異的に結合するモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を開発することができる。
【００４４】
抗体またはそれらのフラグメントを、リバーシブルフロークロマトグラフィック結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、または間接イムノ蛍光アッセイのようなアッセイ系に利用して、存在する場合には、試験サンプル中のエールリヒアポリペプチドの存在を測定することができる。さらに、これらの抗体、特にモノクローナル抗体は、ＣＮＢｒ活性化セファロースに似たマトリックスに結合することができ、組み換えおよび天然エールリヒア抗原およびタンパク質を精製するようなために、例えば、細胞培養物若しくは血液血清から特定のエールリヒアタンパク質のアフィニティー精製に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、治療用途または他の同様の応用のためにキメラ抗体を製造するために用いることもできる。
【００４５】
エールリヒアエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体は、当業者により製造することができる。このような抗体を製造するための一般的な方法はよく知られており、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９４  （１９７５）に記載されており、また、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．（１９８２）に総説されており、さらに、Ｌ．  Ｔ．  Ｍｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：６０４−６１９（１９９０）により教示される。無限増殖する抗体産生細胞系は、細胞融合により作製でき、またＢリンパ球の発癌性ＤＮＡへの直接の形質転換、またはエプスタインバーウイルスによる形質導入のような他の技術によっても作製できる。
【００４６】
以下は、例示の目的のためのみに提供され、上記の広い用語として記載された本発明の範囲を限定するためのものではない。この開示の中に引用されたすべての参照文献は、参照することにより本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４７】
イヌ血清中のＥ．ｃａｎｉｓ抗体の検出
合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイの性能を、部分的に精製されたＥ．ｃａｎｉｓ抗原を使用する市販のＥ．ｃａｎｉｓＳＮＡＰ（登録商標）アッセイの性能と比較した。部分的に精製された天然抗原を、組織培養物中で成長させたＥ．ｃａｎｉｓ微生物から得、分画遠心およびカラムクロマトグラフィーにより部分的に精製した。合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイに使用する合成ペプチドは、Ｅ．ｃａｎｉｓ  Ｐ３０−１またはＥ．ｃａｎｉｓ  Ｐ−３０ペプチドの単量体形態であり、それぞれ配列番号１および配列番号２で示される。
【００４８】
Ｅ．ｃａｎｉｓ陽性イヌサンプルと疑われる７０の集合を、アリゾナ、テキサス、およびアーカンソンから得、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイおよび天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイを用いて試験した。サンプルをまた、間接ＩＦＡを用いて試験した。要約すると、ＩＦＡアッセイは、ＩＦＡスライド上に被覆されたＥ．ｃａｎｉｓ感染細胞およびフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）ラベル化ウサギ抗−イヌＩｇＧを用いて行った。Ｅ．ｃａｎｉｓを、細胞培養物から採取し、バッファーで希釈してＩＦＡスライド上に被覆した。試験サンプルの希釈をバッファーにて行い、被覆されたＩＦＡスライドと伴にインキュベートし、その後洗浄し、ＦＩＴＣラベル化抗−イヌコンジュゲートと伴にインキュベートした。スライドを洗浄し、紫外線光学顕微鏡により観察した。ＩＦＡの結果を、フルオロセイン活性の力価により記録する。これは、ＩＦＡスライドに反応する最後のサンプル希釈を示す。１：１００より大きいかまたは等しいＩＦＡ力価のサンプルは、陽性である。
【００４９】
一致しない結果については、Ｅ．ｃａｎｉｓウエスタンブロットを確認アッセイとして用いた。要約すると、Ｅ．ｃａｎｉｓ抗原を、組織培養物から採取し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、その後ニトロセルロース膜に転写した。転写の後、膜を異種タンパク質により一晩４℃で遮蔽した。イヌのＥ．ｃａｎｉｓ抗体陽性および陰性血清サンプルの希釈した試験サンプルを、ブロットと伴に室温で２時間インキュベートした。そして、ブロットを洗浄し、市販の抗−イヌＩｇＧ：ペルオキシダーゼコンジュゲート試薬と伴に１時間インキュベートし、洗浄した。シグナルを、市販のペルオキシダーゼ指標試薬と伴に細片のインキュベーションにより発生させた。３０，０００ドルトンの分子量のイムノドミナントバンドに対する反応が、ウエスタンブロットによる陽性結果確認に必要であった。例えば、Ｓｕｋｓａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．  １４：５０−５５  （２０００）を参照のこと。
【００５０】
合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイおよび天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、米国特許番号５，７２６，０１０号に記載されたものと同様のアッセイ系を含んでいた。要約すると、試験サンプルをリバースフロークロマトグラフィック結合アッセイ装置に適用して流し、フローマトリックスに飽和させた。これは、連続した複合体の形成を容易にする。これにより、試験サンプル中のエールリヒア抗体は、固定化されていないラベル化された特異的結合試薬に最初に結合する。合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイの場合は、固定化されていないラベル化された特異的結合試薬は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした本発明のポリペプチドである。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイとしては、試薬は、部分的に精製された天然抗原を含む。この複合体は、固定化された分析物捕捉試薬に結合する。合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイとしては、固定化された分析物捕捉試薬は、ウシ血清アルブミンにコンジュゲートした本発明の１またはそれ以上のポリペプチドである。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイとしては、捕捉試薬は、部分的に精製された天然抗原である。吸収性のリザーバが飽和したフローマトリックスに接触し、それにより流体の流れを逆転させる。検出器および洗浄溶液をフローマトリックスに付与する。液体試薬は、結合していないサンプルおよび結合していないラベル化された特異的結合試薬を除去し、固定化された分析物捕捉試薬の位置における分析物複合体の検出を容易にする。これらの実験で用いた基材は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）であった。
【００５１】
結果
アッセイ結果を、表２に示す。結果は、５つのグループに分けることができる。
第１グループは、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイ、天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイ、およびＩＦＡにおいて陽性であった４７サンプルを含む。これらは、抗体陽性サンプルであり、これらのサンプルについては、追加の試験を行わなかった。
【００５２】
第２グループは、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイにおいて陽性、天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイにおいて陰性、ＩＦＡにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により確認した１０サンプル（Ｎｏ．１５、１７、１８、２０、２２、２３、２４、４１、４２および４６）を含む。これらは、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイで陽性であり、天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイで偽陰性であった、真陽性サンプルである。
【００５３】
第３グループは、ＩＦＡにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により陰性であることを確認した５サンプル（Ｎｏ．１、２、３、４、および５）を含む。これらは、ＩＦＡで偽陽性であった、真陰性サンプルである。これらのサンプルの５つすべては、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイにより陰性であると正しく同定された。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイでは、３つのサンプル（Ｎｏ．１、２および５）を陰性であると正しく同定したが、２つのサンプル（Ｎｏ．３および４）については、偽陽性の結果を与えた。
【００５４】
第４グループは、ＩＦＡにおいて陰性であり、ウエスタンブロット分析により陽性であることを確認した７サンプル（Ｎｏ．６、７、８、９、１０、１１、および１２）を含む。これらは、ＩＦＡで偽陰性であった、陽性サンプルである。すべての７つのサンプルは、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイにより真陽性であった。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイでは、７サンプルのうちわずか２つしか（Ｎｏ．７および１１）を陽性として正しく同定できず、７サンプルのうち５つ（Ｎｏ．６、８、９、１０、および１２）については、これら５サンプルについて偽陰性の結果として、間違って同定した。
【００５５】
第５グループは、ＩＦＡにおいて陽性であり、ウエスタンブロット分析により陽性であることを確認した１サンプル（Ｎｏ．２１）を含む。合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイおよび天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、陰性の結果を与えた。これは、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイおよび天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイ両方において偽陰性であった、陽性サンプルである。
【００５６】
したがって、７０サンプルが試験され、これらのサンプルの６５が真陽性サンプルであった。合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、９８．５％（６４／６５）の感度で、６４の陽性サンプルを正しく同定した。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、７５．３％（４９／６５）の感度で、４９のサンプルを正しく同定した。５つの真陰性サンプルについては、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、１００％（５／５）の感度で５つの陰性サンプルを正しく同定した。天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、６０％（３／５）の感度で３の陰性サンプルを正しく同定した。したがって、合成ペプチドＳＮＡＰ（登録商標）アッセイは、天然抗原ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイに比べ、より感度が高く、特異的である。
【００５７】
【表２】
2005502586.tif 000003
【００５８】
【表３】
2005502586.tif 000004
【００５９】
【表４】
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【国際公開パンフレット】
2005502586.tif 000006
2005502586.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502586.tif 000035
【国際調査報告】
2005502586.tif 000036
2005502586.tif 000037
2005502586.tif 000038
2005502586.tif 000039
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