(57)【要約】ＭＩＦ活性に関連する病理学的状態の治療を含む、様々な障害の治療において有益性を有するＭＩＦのインヒビターが提供される。ＭＩＦのインヒビターはその立体異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む以下の構造（Ｉａ）（Ｉｂ）を有するが、式中ｎ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、ＹおよびＺはここに定義されている。医薬上許容される担体と組み合わせてＭＩＦのインヒビターを含有する組成物、ならびにそれを使用するための方法が提供される。
2005500266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2005500266.tif 000193
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ
（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項２】
以下の構造：
【化２】
2005500266.tif 000194
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは１であり；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；  および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項３】
Ｘは酸素である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｙは−ＮＯ2である請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4は
【化３】
2005500266.tif 000195
である請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ4は
【化４】
2005500266.tif 000196
である請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造：
【化５】
2005500266.tif 000197
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ2であり；
Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０，Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；ただしＲ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項９】
Ｘは酸素である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚは−ＣＨ2−およびｎは１である請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ4は
【化６】
2005500266.tif 000198
である請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ4は
【化７】
2005500266.tif 000199
である請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
以下の構造：
【化８】
2005500266.tif 000200
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは―Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であり；
Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6から
なる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、およびＸが酸素であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、およびＸが酸素であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項１４】
Ｘは酸素である請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｚは−ＣＨ2−およびｎは１である請求項１３に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ4は
【化９】
2005500266.tif 000201
である請求項１３に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ4は
【化１０】
2005500266.tif 000202
である請求項１３に記載の化合物。
【請求項１８】
以下の構造：
【化１１】
2005500266.tif 000203
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は
【化１２】
2005500266.tif 000204
；そして
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項１９】
Ｘは酸素である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｚは−ＣＨ2−でありｎは１である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｙは−ＮＯ2である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２３】
以下の構造：
【化１３】
2005500266.tif 000205
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルである；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は
【化１４】
2005500266.tif 000206
；そして
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項２４】
Ｘは酸素である請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｚは−ＣＨ2−でありｎは１である請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項２３に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｙは−ＮＯ2である請求項２３に記載の化合物。
【請求項２８】
以下の構造：
【化１５】
2005500266.tif 000207
（式中、
Ｘは酸素であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルである；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、およびＹが−Ｃ（
＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨメチルではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項２９】
Ｚは−ＣＨ2−でｎは１である請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項２８に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｙは−ＮＯ2である請求項２８に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ4は
【化１６】
2005500266.tif 000208
である請求項２８に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ4は
【化１７】
2005500266.tif 000209
である請求項２８に記載の化合物。
【請求項３４】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化１８】
2005500266.tif 000210
【請求項３５】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化１９】
2005500266.tif 000211
【請求項３６】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化２０】
2005500266.tif 000212
【請求項３７】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化２１】
2005500266.tif 000213
【請求項３８】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化２２】
2005500266.tif 000214
【請求項３９】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化２３】
2005500266.tif 000215
【請求項４０】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化２４】
2005500266.tif 000216
【請求項４１】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化２５】
2005500266.tif 000217
【請求項４２】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化２６】
2005500266.tif 000218
【請求項４３】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化２７】
2005500266.tif 000219
【請求項４４】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化２８】
2005500266.tif 000220
【請求項４５】
該構造が下記を含む請求項２１に記載の化合物：
【化２９】
2005500266.tif 000221
【請求項４６】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化３０】
2005500266.tif 000222
【請求項４７】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化３１】
2005500266.tif 000223
【請求項４８】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化３２】
2005500266.tif 000224
【請求項４９】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化３３】
2005500266.tif 000225
【請求項５０】
該構造が下記を含む請求項２７に記載の化合物：
【化３４】
2005500266.tif 000226
【請求項５１】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化３５】
2005500266.tif 000227
【請求項５２】
該構造が下記を含む請求項２１に記載の化合物：
【化３６】
2005500266.tif 000228
【請求項５３】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化３７】
2005500266.tif 000229
【請求項５４】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化３８】
2005500266.tif 000230
【請求項５５】
該構造が下記を含む請求項２６に記載の化合物：
【化３９】
2005500266.tif 000231
【請求項５６】
該構造が下記を含む請求項２１に記載の化合物：
【化４０】
2005500266.tif 000232
【請求項５７】
該構造が下記を含む請求項４に記載の化合物：
【化４１】
2005500266.tif 000233
【請求項５８】
医薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせて請求項１に記載の化合物を含む組成物。
【請求項５９】
以下の構造：
【化４２】
2005500266.tif 000234
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキルおよびジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩の有効量を患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者においてＭＩＦ活性を低下させる方法。
【請求項６０】
温血動物における炎症を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６１】
温血動物における敗血症性ショックを治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６２】
温血動物における関節炎を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６３】
温血動物における癌を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６４】
温血動物における急性呼吸窮迫症候群を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６５】
温血動物における炎症性疾患を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６６】
炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、および喘息からなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
温血動物における自己免疫障害を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６８】
自己免疫障害が糖尿病、喘息、および多発性硬化症からなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
温血動物における免疫応答を抑制するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項７０】
温血動物における血管新生を減少させるための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項７１】
温血動物における過剰グルココルチコイドレベルに関連する疾患を治療するための方法であって、請求項１に記載の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法。
【請求項７２】
該疾患がクッシング病である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＭＩＦ活性を調節する作用物質を検出するための方法であって、
ＭＩＦを含有するサンプルを１種の作用物質と接触させるステップと；および
ＭＩＦに結合する抗体の能力の差異を測定することによって該作用物質がＭＩＦを調節する能力を検出するステップと、を含む方法
【請求項７４】
該抗体はモノクローナル抗体である請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＭＩＦに融合タンパク質、突然変異体またはその変形が含まれる請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
ポリペプチドの活性を調節する作用物質をスクリーニングするための代理マーカーとして抗体結合を使用する方法であって、
該ポリペプチドを被検調節剤と接触させるステップと、
該ポリペプチドをモノクローナル抗体と接触させるステップと、および
対照と比較して異なる該ポリペプチドの能力を検出するステップと、を含む方法。
【請求項７７】
以下の構造：
【化４３】
2005500266.tif 000235
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−
Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項７８】
以下の構造：
【化４４】
2005500266.tif 000236
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは１であり；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項７９】
Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８０】
Ｘは酸素である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８１】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８２】
Ｙは−ＮＯ2である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８３】
Ｒ4は
【化４５】
2005500266.tif 000237
である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８４】
Ｒ4は
【化４６】
2005500266.tif 000238
である請求項７８に記載の化合物。
【請求項８５】
以下の構造：
【化４７】
2005500266.tif 000239
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であり；
Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０，Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項８６】
Ｘは酸素である請求項８５に記載の化合物。
【請求項８７】
Ｚは−ＣＨ2−およびｎは１である請求項８５に記載の化合物。
【請求項８８】
Ｒ4は
【化４８】
2005500266.tif 000240
である請求項８５に記載の化合物。
【請求項８９】
Ｒ4は
【化４９】
2005500266.tif 000241
である請求項８５に記載の化合物。
【請求項９０】
以下の構造：
【化５０】
2005500266.tif 000242
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択される）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項９１】
Ｚは−ＣＨ2−およびｎは１である請求項９１に記載の化合物。
【請求項９２】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項９１に記載の化合物。
【請求項９３】
Ｙは−ＮＯ2である請求項９１に記載の化合物。
【請求項９４】
Ｒ4は
【化５１】
2005500266.tif 000243
である請求項９１に記載の化合物。
【請求項９５】
Ｒ4は
【化５２】
2005500266.tif 000244
である請求項９１に記載の化合物。
【請求項９６】
以下の構造：
【化５３】
2005500266.tif 000245
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ2であり；
Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０であり、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただしＲ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、およびＸが酸素であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項９７】
Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である請求項９６に記載の化合物。
【請求項９８】
Ｘは酸素である請求項９６に記載の化合物。
【請求項９９】
Ｚが−ＣＨ2−でありｎは１である請求項９６に記載の化合物。
【請求項１００】
Ｒ4は
【化５４】
2005500266.tif 000246
である請求項９６に記載の化合物。
【請求項１０１】
Ｒ4は
【化５５】
2005500266.tif 000247
である請求項９６に記載の化合物。
【請求項１０２】
以下の構造：
【化５６】
2005500266.tif 000248
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は
【化５７】
2005500266.tif 000249
からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択される）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩。
【請求項１０３】
Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である請求項６７に記載の化合物。
【請求項１０４】
Ｘは酸素である請求項２に記載の化合物。
【請求項１０５】
Ｚは−ＣＨ2−でありｎは１である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０６】
Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である請求項６７に記載の化合物。
【請求項１０７】
Ｙは−ＮＯ2である請求項２に記載の化合物。
【請求項１０８】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化５８】
2005500266.tif 000250
【請求項１０９】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化５９】
2005500266.tif 000251
【請求項１１０】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６０】
2005500266.tif 000252
【請求項１１１】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６１】
2005500266.tif 000253
【請求項１１２】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６２】
2005500266.tif 000254
【請求項１１３】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６３】
2005500266.tif 000255
【請求項１１４】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６４】
2005500266.tif 000256
【請求項１１５】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６５】
2005500266.tif 000257
【請求項１１６】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６６】
2005500266.tif 000258
【請求項１１７】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６７】
2005500266.tif 000259
【請求項１１８】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６８】
2005500266.tif 000260
【請求項１１９】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化６９】
2005500266.tif 000261
【請求項１２０】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化７０】
2005500266.tif 000262
【請求項１２１】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化７１】
2005500266.tif 000263
【請求項１２２】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化７２】
2005500266.tif 000264
【請求項１２３】
該構造が下記を含む請求項９２に記載の化合物：
【化７３】
2005500266.tif 000265
【請求項１２４】
該構造が下記を含む請求項９３に記載の化合物：
【化７４】
2005500266.tif 000266
【請求項１２５】
該構造が下記を含む請求項１０７に記載の化合物：
【化７５】
2005500266.tif 000267
【請求項１２６】
それを必要とする患者においてＭＩＦ活性を低下させるための方法であって、以下の構造：
【化７６】
2005500266.tif 000268
（式中、
Ｘは酸素もしくは硫黄であり；
Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5からなる群から選択され；
Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
ｍは０、１もしくは２であり；
ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０であり、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；
Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され；
Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6からなる群から選択され；
Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8からなる群から選択され；
Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるか：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；
Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；そして
Ｒ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択され；
ただし：
Ｒ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｙが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；
Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素、およびＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；
Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；および
Ｒ1がメチル、Ｒ2が水素または７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素、およびＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない）、
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩の有効量を該患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１２７】
温血動物における炎症を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１２８】
温血動物における敗血症性ショックを治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１２９】
温血動物における関節炎を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３０】
温血動物における癌を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３１】
温血動物における急性呼吸窮迫症候群を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３２】
温血動物における炎症性疾患を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３３】
炎症性疾患が関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、および喘息からなる群から選択される請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
温血動物における自己免疫障害を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３５】
自己免疫障害が糖尿病、喘息、および多発性硬化症からなる群から選択される請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
温血動物における免疫応答を抑制するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３７】
温血動物における血管新生を減少させるための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３８】
温血動物における過剰グルココルチコイドレベルに関連する疾患を治療するための方法であって、請求項７７に記載の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法。
【請求項１３９】
該疾患がクッシング病である請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
１つの化合物を調製するための式Ｉ：
【化７７】
2005500266.tif 000269
の化合物と、式ＩＩ：
【化７８】
2005500266.tif 000270
の化合物とを反応させるステップであって、それにより式ＩＩＩ：
【化７９】
2005500266.tif 000271
の化合物が得られ、式中Ｒ4からなる群から選択されるＲ3はアミノ、置換アミノ水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルであるステップと；および
式ＩＩＩの化合物とＸ−Ｒ4を含む化合物とを反応させるステップであって、式中ＸがＣｌ、Ｂｒ、およびＩを含んでおり、および式中Ｒ4が水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびアミノアルキルＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中Ｒ’およびＲ’’は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、それにより式ＩＶ：
【化８０】
2005500266.tif 000272
の化合物を入手するステップと、を含む工程であって、このとき式ＩＶの化合物がＭＩＦインヒビターとして使用するために適合する工程。
【請求項１４１】
Ｒ4は
【化８１】
2005500266.tif 000273
である請求項１４０記載の工程。
【請求項１４２】
Ｒ4は
【化８２】
2005500266.tif 000274
である請求項１４０記載の工程。
【請求項１４３】
１つの化合物を調製するための式ＡＩ：
【化８３】
2005500266.tif 000275
の化合物と式ＩＩ：
【化８４】
2005500266.tif 000276
の化合物とを反応させるステップであって、それにより式ＡＩＩＩの化合物：
【化８５】
2005500266.tif 000277
が得られ、式中Ｒ4を含むＲ3がアミノ、置換アミノ水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択されるステップと；および
式ＡＩＩＩの化合物とＸ−Ｒ4を含む化合物とを反応させるステップであって、式中ＸがＣｌ、Ｂｒ、およびＩを含んでおり、および式中Ｒ4が水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびアミノアルキルＲ’Ｒ’’Ｎ（ＣＨ2）x−からなる群から選択され、式中Ｒ’およびＲ’’は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルからなる群から選択され、式中ｘは２〜４であり、それにより式ＡＩＶ：
【化８６】
2005500266.tif 000278
の化合物を得るステップと、を含む工程であって、このとき式ＩＶの化合物がＭＩＦインヒビターとしての使用に適切である工程。
【請求項１４４】
Ｒ4は
【化８７】
2005500266.tif 000279
である請求項１４３記載の工程。
【請求項１４５】
Ｒ4は
【化８８】
2005500266.tif 000280
である請求項１４３記載の工程。
【請求項１４６】
ＭＩＦが病原である疾患または障害を治療するための医薬組成物であって、該医薬組成物がＭＩＦ阻害化合物および該疾患もしくは障害を治療するための薬物を含んでおり、このとき該薬物が測定可能なＭＩＦ阻害活性を有していない医薬組成物。
【請求項１４７】
ＭＩＦが病原である疾患または障害を治療するための医薬組成物であって、該医薬組成物がＭＩＦ阻害化合物と、非ステロイド抗炎症薬、抗感染症、β刺激薬、ステロイド、抗ヒスタミン剤、抗癌薬、喘息薬、敗血症薬、関節炎薬、および免疫抑制薬からなる群から選択される薬物とを含んでいる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般にマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）のインヒビター、該ＭＩＦインヒビターを同定する方法、および当該インヒビターの投与によってＭＩＦ関連性障害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）であるリンホカインは、宿主防御におけるマクロファージ機能のメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）であると同定されており、その発現は遅延型過敏症、免疫調節、炎症、および細胞性免疫と関連している。Ｍｅｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｃａｌａ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６６：１９７−２２３，  １９９７を参照。サイズが１２〜１３キロダルトン（ｋＤａ）の範囲内にあるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、数種の哺乳類および鳥類種において同定されている；例えば、Ｇａｌａｔら，  Ｆｅｄ．  Ｅｕｒ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ３１９：２３３−２３６，  １９９３；Ｗｉｓｔｏｗら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：１２７２−１２７５，  １９９３；Ｗｅｉｓｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：７５２２−７５２６，  １９８９；Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：７５６−７５９，  １９９３；Ｂｌｏｃｋｉら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２：２０９５−２１０２，  １９９３；およびＢｌｏｃｋｉら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２６９−２７０，  １９９２を参照。ＭＩＦは、最初はマクロファージ遊走をブロックできると特性付けられたが、ＭＩＦはさらにまたインターフェロン−γによってもたらされる機序とは相違する機序によって、マクロファージ付着に影響を及ぼす；マクロファージがインターロイキン−１−β、インターロイキン−６、および腫瘍壊死因子αを発現するように誘導する；ＨＬＡ−ＤＲをアップレギュレートする；一酸化窒素シンターゼおよび一酸化窒素の濃度を上昇させる；ならびにドノバンリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ）腫瘍細胞を殺滅してマイコプラズマアビウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｖｉｕｍ）増殖を阻害するようにマクロファージが活性化すると思われる。免疫回避分子としての潜在的役割に加えて、ＭＩＦは不完全フロイントもしくはリポソーム中でウシ血清アルブミンもしくはＨＩＶ  ｇｐ１２０と一緒に投与されると、免疫アジュバントとして機能することができ、それにより完全フロイントに匹敵する抗原誘発性増殖を引き出す。さらに、ＭＩＦはグルココルチコイド・カウンターレギュレーターおよび血管由来因子であるとも報告されている。グルココルチコイドによって誘導されるが阻害はされない少数のタンパク質の１つとして、ＭＩＦは、グルココルチコイドの免疫抑制作用を軽減するように機能する。したがって、ＭＩＦは、グルココルチコイドの免疫抑制作用を調節する強力な要素であると見なされている。そこで、その活性／遺伝子発現が過剰な外因性グルココルチコイドの投与によって過剰誘導されると（例えば炎症、免疫等を抑制するための臨床的な適応である場合）、ＭＩＦ自体が炎症／免疫反応を悪化させてしまうので重大な毒性がある。Ｂｕｃｃａｌａら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３３：２４３−２５２，  １９９８を参照。
【０００３】
ＭＩＦは、ｅｒｋリン酸化およびＭＡＰキナーゼならびにマトリックスメタロプロテアーゼ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、およびＩＬ−１  ｍＲＮＡのアップレギュレーションを含有する細胞内カスケードを順に活性化する特異的受容体を通して細胞上に対して機能するとも考えられているが（Ｏｎｏｄｅｒａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：４４４−４５０，  ２０００を参照）、ＭＩＦは適切な基質（例えば、ドーパクロム）を互変異性化する能力によって例証されるような内因性酵素活性も有している。さらに、この酵素活性がＭＩＦに対する生物学的応答ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）でこのタンパク質の活性を媒介するかどうかは依然として不明である。ＭＩＦの部位特異的突然変異誘発によって十分な内活性を有してはいるが酵素活性は有していない突然変異体が作成されたが（Ｈｅｒｍａｎｏｗｓｋｉ−Ｖｏｓａｔｋａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１２８４１−１２８４９，  １９９９）、Ｓｗｏｐｅらは、サイトカイン活性とＭＩＦの触媒部位との間に直接的な関連があると報告している（Ｓｗｏｐｅら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７（１３）：３５３４−３５４１，  １９９８）。したがって、ドパクロムトートメラーゼ単独の阻害を通してＭＩＦ活性のインヒビターを同定する戦術によって、臨床的に価値のあるＭＩＦ活性のインヒビターが得られるかどうかは不明である。ＭＩＦのその細胞表面受容体に対する阻害を評価する能力もまた、高親和性受容体が現時点では判明していないので限定されている。
【０００４】
ＭＩＦインヒビターを開発することへの関心は、ＭＩＦが感染部位でマクロファージを濃縮させるサイトカイン活性、および細胞媒介性免疫について知られているという観察に由来する。さらに、ＭＩＦはマクロファージ付着、食作用および殺腫瘍活性のメディエーターとして知られている。Ｗｅｉｓｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：２００６−２０１１，  １９９１を参照。したがって、ＭＩＦの阻害は、さもなければマクロファージが炎症部位へ持ち込む可能性があるサイトカイン、成長因子、ケモカインおよびリンホカインの間接的阻害を生じさせる。ヒトＭＩＦ  ｃＤＮＡはＴ細胞株から単離されており、活性形態としてホモ三量体を形成する１１５アミノ酸残基を含む約１２．４ｋＤａの分子量を有するタンパク質をコードする（Ｗｅｉｓｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：７５２２−７５２６，  １９８９）。ＭＩＦは活性化Ｔ細胞中で最初に観察され、現在では肝臓、肺、目の水晶体、卵巣、脳、心臓、脾臓、腎臓、筋肉等を含む様々な組織中で報告されている。Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３（１）：６１−６７，  １９９９を参照。ＭＩＦのまた別の特徴は、ＥＲ／ゴルジ経路を介しての古典的分泌へと方向付ける伝統的リーダー配列が欠けていることである（すなわち、リーダーレス［ｌｅａｄｅｒｌｅｓｓ］タンパク質）。
【０００５】
ＭＩＦのサイトカイン活性を中和することによって機能するＭＩＦインヒビター（およびＭＩＦインヒビターを同定する方法）は、他のタイプのインヒビターに優る重要な利点を提供する。例えば、トートメラーゼ活性単独と炎症応答との関連については意見が分かれている。さらに、細胞内で機能するインヒビターは、関連標的へのそれらの作用または細胞の内側の標的の活性によってしばしば毒性である。リガンド受容体複合体の小分子インヒビターは、同定することはもちろんのこと、最適化すること、および開発することも困難である。ＭＩＦのようなサイトカインの理想的インヒビターは、細胞から遊離されると効果的に中和されるようにＭＩＦ自体を変化させるインヒビターである。この活性を備える小分子は、タンパク質と薬物のような化学物質との基本的な相違があるため、抗体よりも優れている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の概要）
ＭＩＦは様々な組織で同定され、多数の病理学的事象と関連付けられているので、当該分野にはＭＩＦのインヒビターを同定する必要がある。さらにまたそのようなインヒビターを含有する医薬組成物、ならびに免疫関連障害または例えば腫瘍関連血管新生等のその他のＭＩＦによって誘発される病理学的事象を治療するためのその使用に関連する方法も必要である。好ましい実施形態は、これらの必要を満たし、そしてその他の利点を同様に提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
好ましい実施形態では、その立体異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む以下の一般構造（Ｉａ）および（Ｉｂ）：
【０００８】
【化１】
2005500266.tif 000003
【０００９】
を有するＭＩＦのインヒビターが提供される。式中ｎ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ、ＹおよびＺは下記に規定した通りである。
【００１０】
好ましい実施形態のＭＩＦインヒビターは広範囲の治療用途にわたって有用性を有しており、様々な免疫関連反応、腫瘍増殖（例えば、前立腺癌等）、糸球体腎炎、炎症、マラリア貧血、敗血症性ショック、腫瘍関連血管新生、硝子体網膜症、乾癬、移植片対宿主病（組織拒絶）、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、中耳炎、クローン病、急性呼吸窮迫症候群、遅延型過敏症等を含むがそれらに限定されない様々な障害、疾病または病理学的状態を治療するために使用できる。例えば、Ｍｅｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｃａｌａ（上記）参照；Ｓｗｏｐｅ  ａｎｄ  Ｌｏｌｉｓ，  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３９：１−３２，  １９９９；Ｗａｅｂｅｒら，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．  １５（１）：４７−５４，  １９９９；Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２（１）：１７−２８，  １９９８；Ｂｕｃａｌａ，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４０：７４−８２，  １９９８；Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７６（３−４）：１５１−１６１，  １９９８；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｂｕｃａｌａ，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｔｏｄａｙ  ３（１１）：５０２−５０７，  １９９７；Ｂｕｃａｌａら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １０（１４）：１６０７−１６１３，  １９９６を参照。このような方法には、好ましい実施形態によって提供されるような１つまたは複数のＭＩＦインヒビターの有効量を、好ましくはそれを必要とする動物に医薬組成物の形状で投与するステップが含まれる。したがって、別の好ましい実施形態では、医薬上許容される担体および／または希釈剤と組み合わせて好ましい実施形態の１つまたは複数のＭＩＦインヒビターを含有する医薬組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
ある好ましい実施形態の１つの戦術は、ＭＩＦの構造変化を、したがってモノクローナル抗体に対する免疫反応性の欠如を誘発できるようにＭＩＦと相互作用する分子を特性付ける。この変化は、スクリーニングによって同定されると、ＭＩＦの小分子インヒビターを同定する。この特定の態様は、免疫反応性の消失が活性に対する代用薬（例えば、サイトカイン活性、酵素活性、補因子活性等）として機能できるあらゆる生体活性ポリペプチドへと拡大することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
第１実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００１３】
【化２】
2005500266.tif 000004
【００１４】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルからなる群から選択される；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００１５】
第２実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００１６】
【化３】
2005500266.tif 000005
【００１７】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは１であり；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００１８】
第２実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である；またはＲ4は
【００１９】
【化４】
2005500266.tif 000006
【００２０】
である。
【００２１】
第３実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００２２】
【化５】
2005500266.tif 000007
【００２３】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ2であり；Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０，Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない。
【００２４】
第３実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；あるいはＲ4は
【００２５】
【化６】
2005500266.tif 000008
【００２６】
である。
【００２７】
第４実施形態では以下の構造を有する化合物：
【００２８】
【化７】
2005500266.tif 000009
【００２９】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは―Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4はメチルではない。
【００３０】
第４実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；あるいはＲ4は
【００３１】
【化８】
2005500266.tif 000010
【００３２】
である。
【００３３】
第５実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００３４】
【化９】
2005500266.tif 000011
【００３５】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は
【００３６】
【化１０】
2005500266.tif 000012
【００３７】
である；およびＲ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する。
【００３８】
第５実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である。
【００３９】
第６実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００４０】
【化１１】
2005500266.tif 000013
【００４１】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5であり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は
【００４２】
【化１２】
2005500266.tif 000014
【００４３】
である；およびＲ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する。
【００４４】
第６実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である。
【００４５】
第７実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００４６】
【化１３】
2005500266.tif 000015
【００４７】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素であり、そしてYが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてYが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨメチルではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてYが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００４８】
第７実施形態の態様では、Ｚは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である；あるいはＲ4は
【００４９】
【化１４】
2005500266.tif 000016
【００５０】
ある。
【００５１】
第８実施形態では、医薬上許容される担体もしくは希釈剤と組み合わせた第１実施形態の化合物を含む組成物が提供される。
【００５２】
第９実施形態では、以下の構造：
【００５３】
【化１５】
2005500266.tif 000017
【００５４】
を有する化合物またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩の有効量を患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者においてＭＩＦ活性を低下させる方法が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００５５】
第１０実施形態では、温血動物の炎症を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００５６】
第１１実施形態では、温血動物の敗血症性ショックを治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００５７】
第１２実施形態では、温血動物の関節炎を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００５８】
第１３実施形態では、温血動物の癌を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００５９】
第１４実施形態では、温血動物の急性呼吸窮迫症候群を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６０】
第１５実施形態では、温血動物の炎症性疾患を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。第１５実施形態の態様では、炎症性疾患には関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、および喘息が含まれることがある。
【００６１】
第１６実施形態では、温血動物の自己免疫障害を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。第１６実施形態の態様では、自己免疫障害には糖尿病、喘息、および多発性硬化症が含まれる。
【００６２】
第１７実施形態では、温血動物の免疫応答を抑制するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６３】
第１８実施形態では、温血動物の血管新生を減少させるための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。
【００６４】
第１９実施形態では、温血動物の過剰グルココルチコイドレベルに関連する疾患を治療するための、第１実施形態の化合物の有効量を該動物に投与するステップを含む方法が提供される。第１９実施形態の１つの態様では、該疾患はクッシング病である。
【００６５】
第２０実施形態では、ＭＩＦ活性を調節する作用物質を検出するための、ＭＩＦを含有するサンプルを１種の作用物質と接触させるステップと；および１つの抗体をＭＩＦへ結合させる分化能力を測定することによって該作用物質がＭＩＦを調節する能力を検出するステップとを含む方法が提供される。第２０実施形態の１つの態様では、該抗体はモノクローナル抗体である。第２０実施形態の１つの態様では、ＭＩＦには融合タンパク質、突然変異体またはその変形が含まれている。
【００６６】
第２１実施形態では、ポリペプチドの活性を調節する作用物質をスクリーニングするための代理マーカーとして抗体結合を使用するための、該ポリペプチドを被検調節剤と接触させるステップと、該ポリペプチドをモノクローナル抗体と接触させるステップと、および対照と比較して異なる該ポリペプチドの活性を検出するステップとを含む方法が提供される。
【００６７】
第２２実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００６８】
【化１６】
2005500266.tif 000018
【００６９】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００７０】
第２３実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００７１】
【化１７】
2005500266.tif 000019
【００７２】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは１であり；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【００７３】
第２３実施形態の態様では、Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である；またはＸは酸素である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である；またはＲ4は
【００７４】
【化１８】
2005500266.tif 000020
【００７５】
である。
【００７６】
第２４実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００７７】
【化１９】
2005500266.tif 000021
【００７８】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であり；Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０，Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4はメチルではない。
【００７９】
第２４実施形態の態様では、Ｘは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；あるいはＲ4は
【００８０】
【化２０】
2005500266.tif 000022
【００８１】
である。
【００８２】
第２５実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００８３】
【化２１】
2005500266.tif 000023
【００８４】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む。
【００８５】
第２５実施形態の態様では、Ｚは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である；またはＲ4は
【００８６】
【化２２】
2005500266.tif 000024
【００８７】
である。
【００８８】
第２６実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００８９】
【化２３】
2005500266.tif 000025
【００９０】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ2であり；Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０であり、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素であり、そしてＸが酸素であるときはＲ4はメチルではない。
【００９１】
第２６実施形態の態様では、Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である；またはＸは酸素である；またはＺが−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；あるいはＲ4は
【００９２】
【化２４】
2005500266.tif 000026
【００９３】
である。
【００９４】
第２７実施形態では、以下の構造を有する化合物：
【００９５】
【化２５】
2005500266.tif 000027
【００９６】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は
【００９７】
【化２６】
2005500266.tif 000028
【００９８】
を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む。
【００９９】
第２７実施形態の態様では、Ｒ1は−ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である；またはＸは酸素である；またはＺは−ＣＨ2−でありそしてｎは１である；またはＹは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3である；またはＹは−ＮＯ2である。
【０１００】
第２８実施形態では、それを必要とする患者においてＭＩＦ活性を低下させるための、以下の構造を有する化合物：
【０１０１】
【化２７】
2005500266.tif 000029
【０１０２】
またはその立体異性体、プロドラッグ、もしくは医薬上許容される塩の有効量を該患者に投与するステップを含む方法が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5を含んでおり；Ｚは−ＣＨ2−または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０であり、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中ｘは２〜４であり、そして式中Ｒ’およびＲ”は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含む；Ｒ2およびＲ3は独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、および−ＮＲ5Ｒ6を含む；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、およびＲ8を含む；Ｒ5およびＲ6は独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルを含む；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Xが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素または７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。
【０１０３】
第２９実施形態では、温血動物の炎症を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１０４】
第３０実施形態では、温血動物の敗血症性ショックを治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１０５】
第３１実施形態では、温血動物の関節炎を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１０６】
第３２実施形態では、温血動物の癌を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１０７】
第３３実施形態では、温血動物の急性呼吸窮迫症候群を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１０８】
第３４実施形態では、温血動物の炎症性疾患を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。第３４実施形態の態様では、炎症性疾患には関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、および喘息が含まれる。
【０１０９】
第３５実施形態では、温血動物の自己免疫障害を治療するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。第３５実施形態の態様では、自己免疫障害には糖尿病、喘息、および多発性硬化症が含まれる。
【０１１０】
第３６実施形態では、温血動物の免疫反応を抑制するための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１１１】
第３７実施形態では、温血動物の血管新生を減少させるための、第２８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。
【０１１２】
第３８実施形態では、温血動物の過剰グルココルチコイドレベルに関連する疾患を治療するための、第３８実施形態の化合物の有効量を該動物へ投与するステップを含む方法が提供される。第３８実施形態の１つの態様では、疾患はクッシング病である。
【０１１３】
第３９実施形態では、１つの化合物を調製するための、式Ｉの化合物：
【０１１４】
【化２８】
2005500266.tif 000030
【０１１５】
と、式ＩＩの化合物：
【０１１６】
【化２９】
2005500266.tif 000031
【０１１７】
とを反応させ、それにより式ＩＩＩの化合物：
【０１１８】
【化３０】
2005500266.tif 000032
【０１１９】
を得るステップであって、式中Ｒ4を含むＲ3はアミノ、置換アミノ水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルであるステップ；および式ＩＩＩの化合物とＸ−Ｒ4を含む化合物とを反応させるステップであって、式中ＸがＣｌ、Ｂｒ、およびＩを含んでおり、そして式中Ｒ4が水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびアミノアルキルＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含んでおり、式中Ｒ’およびＲ”は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含み、式中ｘは２〜４であり、それにより式ＩＶの化合物：
【０１２０】
【化３１】
2005500266.tif 000033
【０１２１】
を得るステップとを含む工程が提供される。式ＩＶの化合物はＭＩＦインヒビターとしての使用に適切である。
【０１２２】
第３９実施形態の態様では、Ｒ4は
【０１２３】
【化３２】
2005500266.tif 000034
【０１２４】
である。
【０１２５】
第４０実施形態では、１つの化合物を調製するための、式ＡＩの化合物：
【０１２６】
【化３３】
2005500266.tif 000035
【０１２７】
と、式ＩＩの化合物：
【０１２８】
【化３４】
2005500266.tif 000036
【０１２９】
とを反応させ、それにより式ＡＩＩＩの化合物：
【０１３０】
【化３５】
2005500266.tif 000037
【０１３１】
を得るステップであって、式中Ｒ4を含むＲ3がアミノ、置換アミノ水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、および置換複素環アルキルであるステップ；および式ＡＩＩＩの化合物とＸ−Ｒ4を含む化合物とを反応させるステップであって、式中ＸがＣｌ、Ｂｒ、およびＩを含んでおり、および式中Ｒ4が水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびアミノアルキルＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含んでおり、式中Ｒ’およびＲ”は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、およびジアルキルを含み、式中ｘは２〜４であり、それにより式ＡＩＶの化合物：
【０１３２】
【化３６】
2005500266.tif 000038
【０１３３】
を得るステップとを含む工程が提供される。式ＩＶの化合物はＭＩＦインヒビターとして使用に適切である。
【０１３４】
第４０実施形態の態様では、Ｒ4は
【０１３５】
【化３７】
2005500266.tif 000039
【０１３６】
である。
【０１３７】
第４１実施形態では、ＭＩＦが病原である疾患または障害を治療するための医薬組成物が提供される。該医薬組成物はＭＩＦ阻害化合物および該疾患もしくは障害を治療するための薬物を含んでおり、このとき該薬物は測定可能なＭＩＦ阻害活性を有していない。
【０１３８】
第４２実施形態では、ＭＩＦが病原である疾患または障害を治療するための医薬組成物が提供される。該医薬組成物はＭＩＦ阻害化合物、および非ステロイド抗炎症薬、抗感染症、β刺激薬、ステロイド、抗ヒスタミン剤、抗癌薬、喘息薬、敗血症薬、関節炎薬、および免疫抑制薬からなる群から選択される薬物とを含んでいる。
【０１３９】
これらやその他の実施形態およびその態様は以下の詳細な説明を参照すると明白になるであろう。そのために、特定の方法、化合物および／または組成物をより詳細に説明しており、それによってその全体が参照してここに組み込まれる様々な参考文献を本明細書中に示す。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【０１４０】
以下の説明および実施例では、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、その適用範囲内に包含される本発明の多数の変形および修飾を認識できるであろう。したがって、好ましい実施形態の説明は本発明の範囲を限定すると見なすべきではない。
【０１４１】
好ましい実施形態を理解するための手掛かりとして、以下に特定の定義を本明細書において提供する。
【０１４２】
ここで使用する用語「ＭＩＦ活性」は広義の用語であり、少なくとも一部にはマクロファージ遊走阻止因子によって媒介される活性もしくは作用を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。したがって、ＭＩＦ活性にはマクロファージ遊走、トートメラーゼ活性（例えば、フェニルピルビン酸塩もしくはドーパクロムを使用する）、エンドトキシン誘導性ショック、炎症、グルココルチコイド・カウンター調節、３Ｔ３線維芽細胞内へのチミジン取り込みの誘導、ｅｒｋリン酸化の誘導およびＭＡＰキナーゼ活性の阻害が含まれるがそれらに限定されない。
【０１４３】
ここで使用する用語「搬出（ｅｘｐｏｒｔ）」は広義の用語であり、エネルギー依存性、もしくはエネルギー依存性ではない場合もある、正規のリーダー配列を介する標準リーダー配列特異的によって方向付けさせられる分泌以外のメカニズムによって、翻訳された細胞産物を細胞膜もしくは細胞外空間へ搬送する代謝的に活性なプロセスを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。さらに、「搬出」は、リーダー配列依存性である分泌とは相違して、ブレフェルジンＡ（すなわち、搬出されたタンパク質はＥＲ／ゴルジを介しては搬送されない；ブレフェルジンＡは搬出されたタンパク質のトラフィッキングに直接作用を及ぼさないと予想される）およびその他の類似化合物に対して抵抗性である。ここで使用するように、「搬出」はさらにまた「非古典的な分泌」と言うこともできる。
【０１４４】
ここで使用する用語「リーダーレスタンパク質」は広義の用語であり、正規のリーダー配列が欠如しており、および細胞の内側から細胞外環境へ搬出されるタンパク質もしくはポリペプチドを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。細胞外環境におけるリーダーレスタンパク質とは、細胞外空間内に位置する、または細胞膜の外面と結び付いているタンパク質を意味する。好ましい実施形態の状況の範囲内では、リーダーレスタンパク質には例えばマクロファージ遊走阻止因子およびそのフラグメントのような天然に存在するタンパク質ならびにリーダー配列を欠除するが搬出されるように操作されているタンパク質、またはリーダーレスタンパク質、もしくはその画分と他のタンパク質との融合を含むように操作されているタンパク質が含まれる。
【０１４５】
ここで使用する用語「インヒビター」は広義の用語であり、ＭＩＦの構造を変化させるおよび／またはＭＩＦに対するモノクローナル抗体と競合して該インヒビターの不在下での活性もしくは搬出と比較してＭＩＦの少なくとも１つの活性または細胞からのＭＩＦの搬出を低下させることのできる分子（例えば、天然化合物もしくは合成化合物）を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。これを言い換えると、「インヒビター」は、インヒビターを含めずに実施されたアッセイと比較して、インヒビターを用いて実施されたアッセイにおいて細胞外および／または細胞内で測定されたＭＩＦの量、検出されたＭＩＦ活性またはＭＩＦ中のタンパク質の量における統計的有意な変化がある場合に構造および／または活性および／または搬出を変化させる。
【０１４６】
ここで使用する用語「結合剤」は広義の用語であり、インヒビターを含むＭＩＦに結合するあらゆる分子を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１４７】
一般に、ＭＩＦインヒビターはＭＩＦの生理的機能を阻害するので、したがってＭＩＦが病原性である可能性がある疾患の治療に有用である。
【０１４８】
特定の好ましい実施形態では、その立体異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む以下の構造（Ｉａ）および（Ｉｂ）：
【０１４９】
【化３８】
2005500266.tif 000040
【０１５０】
を有するＭＩＦのインヒビターが提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、および−Ｓ（Ｏ）mＲ5であり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、およびアミノアルキルＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−を含み、式中Ｒ’およびＲ”は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、もしくはジアルキルであり、そして式中ｘは２〜４であり；Ｒ2およびＲ3は同一または相違しており、独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、もしくは−ＮＲ5Ｒ6である；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、もしくはＲ8である；Ｒ5およびＲ6は同一または相違しており、独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、もしくは置換複素環アルキルを含む：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、
【０１５１】
【化３９】
2005500266.tif 000041
【０１５２】
複素環アルキルもしくは置換複素環アルキルである；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキルである；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。特定の実施形態では、１つまたは複数の条件は適用されないことがある。
【０１５３】
１つの好ましい実施形態では、その立体異性体、プロドラッグおよび医薬上許容される塩を含む以下の構造（Ｉａ）および／または（Ｉｂ）を有する化合物：
【０１５４】
【化４０】
2005500266.tif 000042
【０１５５】
を該患者に投与することによってそれを必要とする患者のＭＩＦ活性を低下させるための方法が提供される。式中Ｘは酸素もしくは硫黄であり；Ｙは−ＮＯ、−ＮＯ2、―Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ5、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−ＮＲ5Ｃ（＝Ｏ）Ｒ5、−ＮＲ5ＳＯ2Ｒ5、もしくは−Ｓ（Ｏ）mＲ5であり；Ｚは−ＣＨ2もしくは−Ｃ（＝Ｏ）−であり；ｍは０、１もしくは２であり；ｎは０、１もしくは２であり、ただしｎが０、Ｚが−Ｃ（＝Ｏ）−であるときは；Ｒ1は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキル、ジアルキル、またはアミノアルキルＲ’Ｒ”Ｎ（ＣＨ2）x−であり、式中Ｒ’およびＲ”は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、もしくはジアルキルであり、そして式中ｘは２〜４であり；Ｒ2およびＲ3は同一または相違しており、独立してハロゲン、−Ｒ5、−ＯＲ5、−ＳＲ5、もしくは−ＮＲ5Ｒ6である；Ｒ4は−ＣＨ2Ｒ7、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ5Ｒ6、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ7、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ7、もしくはＲ8である；Ｒ5およびＲ6は同一または相違しており、独立して水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、もしくは置換複素環アルキルである：またはＲ5およびＲ6は一緒にそれらが付着している窒素原子とともに複素環もしくは置換複素環を形成する；Ｒ7はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキルである；そしてＲ8は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルもしくは置換複素環アルキルである；ただしＲ1がフェニル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は水素でもメチルでもない；Ｒ1がメチル、Ｒ2およびＲ3がどちらも水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−ＮＯ2であるときはＲ4はメチルではない；Ｒ1が水素もしくはメチル、Ｒ2が７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨではない；およびＲ1がメチル、Ｒ2が水素もしくは７−クロロ、Ｒ3が水素、Ｘが酸素であり、そしてＹが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ2ＣＨ3であるときはＲ4はメチルではない。特定の実施形態では、１つまたは複数の条件は適用されないことがある。
【０１５６】
ここで使用する上記の用語には以下の意味がある。ここで使用する用語「アルキル」は広義の用語であり、１〜１０個の炭素原子を含有する直鎖状、分枝状、非環状もしくは環状、不飽和もしくは飽和脂肪族炭化水素を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。一方、用語「低級アルキル」は１〜６個の炭素原子を含有するアルキルと同じ意味を有する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれる；一方、飽和分岐アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が含まれる。代表的な飽和環状アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、−ＣＨ2シクロプロピル、−ＣＨ2シクロブチル、−ＣＨ2シクロペンチル、−ＣＨ2シクロヘキシル等が含まれる；一方、不飽和環状アルキルにはシクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等が含まれる。環状アルキルは「同素環式環」とも呼ばれており、例えばデカリンおよびアダマンタンのようなジ−およびポリ−同素環式環が含まれる。不飽和アルキルは、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重もしくは三重結合（各々、「アルケニル」もしくは「アルキニル」と呼ばれる）を含有している。代表的な直鎖状および分枝状アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が含まれる；一方、代表的な直鎖状および分枝状アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル等が含まれる。
【０１５７】
ここで使用する用語「アリール」は広義の用語であり、例えばフェニルもしくはナフチルのような芳香族炭素環部分を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１５８】
ここで使用する用語「アリールアルキル」は広義の用語であり、例えばベンジル、−ＣＨ2（１または２−ナフチル）、−（ＣＨ2）2フェニル、−（ＣＨ2）3フェニル、−ＣＨ（フェニル）2等のようなアリール部分と置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１５９】
ここで使用する用語「ヘテロアルキル」は広義の用語であり、５〜１０員を有し、さらに窒素、酸素および硫黄から選択された少なくとも１つのヘテロ原子を有し、そして単環式環系および二環式環系の両方を含む少なくとも１つの炭素原子を含有する芳香族複素環式環を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。代表的なヘテロアリールには、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ベンゾキサゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シノリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルが含まれる（がそれらに限定されない）。
【０１６０】
ここで使用する用語「ヘテロアリールアルキル」は広義の用語であり、例えば−ＣＨ2ピリジニル、−ＣＨ2ピリミジニル等のようなヘテロアリール部分で置換された少なくと１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６１】
ここで使用する用語「複素環」および「複素環式環」は広義の用語であり、飽和、不飽和または芳香族のいずれかであり、そして窒素、酸素および硫黄から独立して選択された１〜４個のヘテロ原子を含んでいる５〜７員の単環式環、または７〜１４員の多環式環、複素環式環を意味することを制限なく含み、このとき窒素および硫黄ヘテロ原子は必要に応じて酸化されてよく、および窒素ヘテロ原子は必要に応じて四級化されてよく、そして上記の複素環のいずれかがベンゼン環ならびに三環（およびそれ以上）の複素環式環へ融合されている二環式環を含む、通常の意味で使用される。複素環は、いずれかのヘテロ原子もしくは炭素原子を介して付着させられてよい。複素環には、上記に定義したようにヘテロアリールが含まれる。したがって、上記に列挙した芳香族ヘテロアリールに加えて、複素環にはモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が含まれる（がそれらに限定されない）。
【０１６２】
ここで使用する用語「複素環アルキル」は広義の用語であり、例えば−ＣＨ2モルホリニル等のような複素環と置換された少なくとも１つのアルキル水素原子を有するアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６３】
ここで使用する用語「置換（された）」は広義の用語であり、上記の基（例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環もしくは複素環アルキル）のいずれかを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。このとき少なくとも１つの水素原子は置換基と置換されている。ケト置換基（「−Ｃ（＝Ｏ）−」）の場合には、２個の水素原子が置換されている。置換されている場合、好ましい実施形態の状況内での「置換基」には、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキル、置換複素環アルキル、−ＮＲaＲb、−ＮＲaＣ（＝Ｏ）Ｒb、−ＮＲaＣ（＝Ｏ）NＲaＲb、−ＮＲaＣ（＝Ｏ）ＯＲb、−ＮＲaＳＯ2Ｒb、−ＯＲa、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲa−Ｃ（＝Ｏ）Ｒa、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲaＲb、−OＣ（＝Ｏ）ＮＲaＲb、−ＳＨ、−ＳＲa、−ＳOＲa、−Ｓ（＝O）2Ｒa、−OＳ（＝O）2Ｒa、−Ｓ（＝O）2ＯＲaが含まれ、ＲaおよびＲbは同一または相違しており、独立して水素、アルキル、ハロアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、複素環、置換複素環、複素環アルキルまたは置換複素環アルキルである。
【０１６４】
ここで使用する用語「ハロゲン」は広義の用語であり、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６５】
ここで使用する用語「ハロアルキル」は広義の用語であり、例えばトリフルオロメチル等のようなハロゲンで置換された少なくとも１つの水素原子を有するアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６６】
ここで使用する用語「アルコキシ」は広義の用語であり、例えばメトキシ、エトキシ等の酸素架橋（すなわち、−Ｏ−アルキル）を介して付着させられたアルキル部分を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６７】
ここで使用する用語「チオアルキル」は広義の用語であり、メチルチオ、エチルチオ等のような硫黄架橋（すなわち、−Ｓ−アルキル）を介して付着させられたアルキル部分を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６８】
ここで使用する用語「アルキルスルホニル」は広義の用語であり、メチルスルホニル、エチルスルホニル等のようなスルホニル架橋（すなわち、−ＳＯ2−アルキル）を介して付着させられたアルキル部分を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１６９】
ここで使用する用語「アルキルアミノ」および「ジアルキルアミノ」は広義の用語であり、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等のような窒素架橋（すなわち、−Ｎ−アルキル）を介して付着させられた各々１つのアルキル部分または２つのアルキル部分を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７０】
ここで使用する用語「ヒドロキシアルキル」は広義の用語であり、少なくとも１つのヒドロキシル基で置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７１】
ここで使用する用語「モノ−もしくはジ（シクロアルキル）メチル」は広義の用語であり、例えばシクロプロピルメチル、ジシクロプロピルメチル等のような１つまたは２つのシクロアルキル基で置換されたメチル基を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７２】
ここで使用する用語「アルキルカルボニルアルキル」は広義の用語であり、−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル基で置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７３】
ここで使用する用語「アルキルカルボニルオキシアルキル」は広義の用語であり、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル基もしくは−ＯＣ（＝Ｏ）アルキル基で置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７４】
ここで使用する用語「アルキルオキシアルキル」は広義の用語であり、−Ｏ−アルキル基で置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７５】
ここで使用する用語「アルキルチオアルキル」は広義の用語であり、−Ｓ−アルキル基で置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７６】
ここで使用する用語「モノ−もしくはジ（アルキル）アミノ」は広義の用語であり、各々１つのアルキルまたは２つのアルキルでそれぞれ置換されたアミノを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７７】
ここで使用する用語「モノ−もしくはジ（アルキル）アミノアルキル」は広義の用語であり、モノ−もしくはジ（アルキル）アミノで置換されたアルキルを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。
【０１７８】
好ましい実施形態の状況では以下の番号付け図式を使用する：
【０１７９】
【化４１】
2005500266.tif 000043
【０１８０】
Ｚ部分に依存して、好ましい実施形態の代表的な化合物にはＺがメチレン（−ＣＨ2−）のときは以下の構造（ＩＩ）が、そしてＺがカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）であるときは構造（ＩＩＩ）が含まれる：
【０１８１】
【化４２】
2005500266.tif 000044
【０１８２】
また別の実施形態では、構造（ＩＶ）、（Ｖ）および（ＶＩ）によってそれぞれ表されるように、ｎは０、１、もしくは２である：
【０１８３】
【化４３】
2005500266.tif 000045
【０１８４】
さらにまた別の実施形態では、好ましい実施形態の化合物はＸが酸素であるときは以下の構造（ＶＩＩ）を、そしてＸが硫黄であるときは構造（ＶＩＩＩ）を有する：
【０１８５】
【化４４】
2005500266.tif 000046
【０１８６】
Ｙ基に依存して、好ましい実施形態の化合物は下記の構造（ＩＸ）〜（ＸＩＩＩ）を有する：
【０１８７】
【化４５】
2005500266.tif 000047
【０１８８】
好ましい実施形態の化合物は一般に、遊離酸または遊離塩基として使用できる。あるいはまた、好ましい実施形態の化合物は好ましくは酸または塩基付加塩の形状であってよい。好ましい実施形態の遊離塩基アミノ化合物の酸付加塩は、当業者にはよく知られている方法によって調製することができ、有機酸および無機酸から形成することができる。適切な有機酸には、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、マンデル酸、経皮酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、グリコール酸、グルタミン酸、およびベンゼンスルホン酸が含まれる。適切な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、および硝酸が含まれる。遊離酸の塩基付加塩は、同様に当業者にはよく知られている方法によって調製することができ、アルカリおよびアルカリ土類金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウムまたはカルシウム）から選択されたカチオンならびにアンモニウムカチオンのような適切な塩基から形成することができる。構造（Ｉａ）または（Ｉｂ）について用語「医薬上許容される塩」はありとあらゆる許容される塩の形態を含むことが意図されている。
【０１８９】
構造（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物は、この分野の当業者に知られている有機合成技術にしたがって、ならびに実施例１に示す代表的な方法によって製造することができる。一般に、構造（Ｉａ）の化合物は以下の反応図式にしたがって作成することができる。
【０１９０】
反応図式１
【０１９１】
【化４６】
2005500266.tif 000048
【０１９２】
一般に、構造ｉｉｉのクロロ中間物は知られている技術によって対応するアルコールｉｉから調製することができる。アルコール中間物は、順に適切な作用物質との反応によって出発物質ｉから調製できる。代表的な反応物質および条件は、実施例１に示す。
【０１９３】
反応図式２
【０１９４】
【化４７】
2005500266.tif 000049
【０１９５】
構造ｖｉのＮ−置換ピペラジンは、保護された中間物ｖ（この場合には、例証のためにＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルもしくは「Ｂｏｃ」を用いて保護されている）の脱保護によって調製できる。保護された中間物は、所望のＲ4基の添加によってＮ−保護ピペラジンｉｖから作製できる。
【０１９６】
反応図式３
【０１９７】
【化４８】
2005500266.tif 000050
【０１９８】
反応図式１からの中間物ｉｉｉを反応図式３からの中間物ｖｉと反応させて構造（Ｉａ）を有する好ましい実施形態の化合物を得ることができる。
【０１９９】
反応図式４
【０２００】
【化４９】
2005500266.tif 000051
【０２０１】
あるいはまた、反応図式１の中間物ｉｉｉを保護された中間物ｉｖａと反応させて、保護された反応生成物ｖｉｉを得ることができる。その後この保護された反応生成物を脱保護させて中間物ｖｉｉｉを得ることができ、その後所望のＲ4基を添加することによって構造（Ｉａ）を有する好ましい実施形態の化合物を得ることができる。
薬物標的としてのＭＩＦ
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、その活性が様々な病態生理学的状態に関係すると見なされてきたので、薬物標的としての分析に十分に適合すると思われる。例えば、ＭＩＦは炎症応答および細胞増殖のどちらにおいても重大なメディエーターであることが示されている。これに関連して、ＭＩＦはサイトカイン、下垂体ホルモンとして、グルココルチコイド誘発性免疫調節剤として、そしてまさに近年には神経免疫調節剤として、およびニューロン機能において重要な役割を果たすことが示すされている。Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４：７０７−７１４，  １９９８；Ｂｕｃａｌａ，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４０：７４−８２，  １９９８；Ｂａｃｈｅｒら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４（４）：２１７−２３０，  １９９８を参照。さらに近年は、抗ＭＩＦ抗体には様々な用途があり、血管新生の減少が観察されたこととともに、腫瘍増殖を顕著に低下させることが証明された。Ｏｇａｗａら，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １２（４）：３０９−３１４，  ２０００；Ｍｅｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｃａｌａ（上記）を参照。したがって、ＭＩＦを阻害できる小分子は、炎症反応の治療、血管新生の減少、ウイルス感染症、細菌感染症の治療、癌（特に腫瘍形成およびアポトーシス）の治療、移植片対宿主病および随伴する組織拒絶反応の治療において重大な価値を有している。ＭＩＦインヒビターは、様々な免疫関連反応、腫瘍増殖、糸球体腎炎、炎症、マラリア貧血、敗血症性ショック、腫瘍関連血管新生、硝子体網膜症、乾癬、移植片対宿主病（組織拒絶反応）、アトピー性皮膚炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性肺障害、中耳炎、クローン病、急性呼吸窮迫症候群、遅延型過敏症において特に有用な可能性がある。ＭＩＦインヒビターは、ストレスおよびグルココルチコイド機能障害（例えばグルココルチコイド作用の逆調節（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）；またはアラキドン酸放出のグルココルチコイド媒介性抑制の無効化（Ｃｙｓ−６０に基づく触媒性ＭＩＦオキシドレダクターゼ活性またはＪＡＢＩ／ＣＳＮＳ−ＭＩＦ相互作用に基づくメカニズム））の治療において有用である可能性がある。
【０２０２】
ＭＩＦインヒビターの有用性の１つの例は、エンドトキシン曝露後に検出可能なＭＩＦの血清濃度が急性期（１〜８時間）の間に徐々に上昇し、８時間でピークに達し、急性期後（＞８時間）中には２０時間まで持続するという事実によって証明できる。いずれの動作理論にも束縛されないが、ＭＩＦは、例えば感染症への局所的応答の一部として、エンドトキシン誘発性ショックの前炎症段階の間に活性化Ｔ細胞およびマクロファージによって作り出されると思われる。例えば低濃度のＬＰＳ、またはＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γによるような前炎症性刺激によっていったん放出されると、マクロファージ由来のＭＩＦは内毒素性ショックの急性期中に産生するＭＩＦの原因となると推定される。ＬＰＳに応答してＭＩＦを放出する下垂体およびマクロファージはどちらも、感染がもはや局所部位に限定されない場合には、内毒素性ショックの急性期後におけるＭＩＦの原因であると推定される。例えば、これにより参照してここに組み込まれる、抗ＭＩＦ抗体を用いてのこれらの結果を記載している米国特許第６，０８０，４０７号を参照。
【０２０３】
ここで証明されるように、好ましい実施形態のインヒビターは、ＬＰＳチャレンジ後のマウスにおいて死亡を阻害し、おそらくＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αレベルを低下させる。したがって、様々な炎症性状態はＭＩＦインヒビターでの治療に敏感に反応する可能性がある。これに関連して、特に有益なことに、ＭＩＦ活性および／またはその放出の阻害を使用して炎症応答およびショックを治療することができる。有益な作用は、ショック応答の早期および遠隔期のどちらでの介入によっても達成できる。これに関連して、ＭＩＦ阻害の保護作用の原因であるいずれの理論もしくはメカニズムにも束縛されないが、抗ＭＩＦについての研究は、抗ＭＩＦ抗体の誘導は循環血清のＴＮＦ−αレベルにおいて感知可能な（３５〜４０％までの）減少と関連していることを証明した。この減少は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマクロファージに対するＭＩＦのＴＮＦ−α誘導活性と一致しており、そしてＭＩＦは、この時点ではＭＩＦは循環中では検出できないという事実にもかかわらず、エンドトキシン投与後１〜２時間で発生する血清中でのＴＮＦ−αレベルの極めて高いピークについて、一部の原因となる可能性があることを示唆している。したがって、ＭＩＦ阻害療法は炎症応答の早期段階で有益である可能性がある。
【０２０４】
ＭＩＦはさらにまたショック応答の急性期後の段階の間にも重要な役割を果たす可能性があるので、このため例えば抗ＴＮＦ−α療法のような他の治療法が無効である遠隔期段階での介入の機会を提供する。ＭＩＦの阻害は高濃度（すなわち、循環内への下垂体ＭＩＦの放出を誘導する濃度）のエンドトキシンでチャレンジ投与された動物、およびＴＮＦ−αを用いてチャレンジ投与された動物において致死性ショックから保護することができる。したがって、ＭＩＦを阻害してＴＮＦでチャレンジ投与された動物を保護する能力は、敗血性ショックから遠隔の急性期後にＭＩＦの中和が有効である可能性を示唆している。
【０２０５】
ここで証明されるように、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βレベルは少なくとも一部の例ではＭＩＦレベルと相関している。したがって、抗ＭＩＦ小分子は移植片拒絶反応、ＣＮＳ疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症等）の免疫媒介性および炎症性要素、筋ジストロフィー、止血疾患（例えば、凝固障害、静脈閉塞病等）、アレルギー性神経炎、肉芽腫、糖尿病、移植片対宿主病、慢性腎損傷、脱毛症（脱毛）、急性膵炎、関節疾患、うっ血性心不全、心血管疾患（再狭窄、アテローム硬化症）、関節疾患、および変形性関節症を含む、様々なＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−１β関連性疾患状態において有用である可能性がある。
【０２０６】
さらに、当該分野におけるその他の証拠は、ステロイドが、サイトカイン産生の強力なインヒビターではあるが、実際にＭＩＦ発現を増加させることを示唆している。Ｙａｎｇら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４（６）：４１３−４２４，  １９９８；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７４（２５）：１８１００−１８１０６，１９９９；Ｃａｌａｎｄｒａ  ａｎｄ  Ｂｕｃａｌａ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７（１）：７７−８８，  １９９７；Ｂｕｃａｌａ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １０（１４）：１６０７−１６１３，  １９９６を参照。したがって、例えば炎症、ショックのようなサイトカイン媒介性病態生理学的状態、および例えば関節リウマチのような特に慢性炎症性状態であるその他のサイトカイン媒介性病理的状態の治療のためにステロイド療法と組み合わせてＭＩＦインヒビターを利用することは特別に有用である可能性がある。このような併用療法は、病原性応答またはその他の炎症応答が開始した後でさえ有益な場合がある。例えば、臨床状況では、敗血性ショック症状の発症に引き続いてステロイドを投与してもほとんど有益性がないことが証明されている。Ｂｏｎｅら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１７：６５３−６５８，  １９８７；Ｓｐｒｉｎｇら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３１１：１１３７−１１４１，  １９８４を参照。ステロイド／ＭＩＦ阻害併用療法を使用すると、この障害を克服することができる。さらに、当業者であれば、このような治療法を、ＭＩＦの放出および／またはその活性を局所的および／または全身性で阻害するように調整できることを理解できる。
アッセイ
ＭＩＦのインヒビターとしての化合物の有効性は、様々なアッセイ法によって測定できる。好ましい実施形態の適切なインヒビターは、ＭＩＦおよび／またはＭＩＦ搬出と関連する１つまたは複数の活性を減少させることができる。構造（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）または任意の他の構造の化合物は、ＭＩＦのインヒビターとしての活性について、以下で説明するアッセイを含む（がそれらに限定されない）この目的のための１つまたは複数の一般的に許容されているアッセイによって評価できる。
【０２０７】
これらのアッセイは、一般に搬出を監視するアッセイ；エフェクターもしくは小分子結合を監視するアッセイ、およびＭＩＦ活性を監視するアッセイの３つのカテゴリーに分類することができる。しかし、これらのアッセイの組合せが本出願の範囲内に含まれることを言及しておかなければならない。驚くべきことに、ＭＩＦのエピトープマッピングが生物学的活性の代用として機能すると考えられる。例えば、１つのアッセイでは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ＭＮ）から市販で入手できるようなモノクローナル抗体を使用して測定すると、候補インヒビターの存在が細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）からのＭＩＦの搬出の検出をブロックするが、一方、ポリクローナル抗体はＭＩＦが存在することを証明する。さらに、細胞に基づく、もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用すると、これらの潜在的インヒビターがＭＩＦ活性を阻害することを証明できる。あるいはまた、これら２種のアッセイ（すなわち、結合アッセイおよび活性アッセイ）を組み合わせて、同様にＭＩＦ活性に影響を及ぼしながら被検化合物の結合（例えば、モノクローナル抗体を置換する、またはそれらの結合を阻害する能力）を検出する単独アッセイにすることができる。このようなアッセイには、ＥＬＩＳＡ型アッセイ（もしくは類似の結合アッセイ）をＭＩＦ互変異性アッセイもしくは類似の機能的アッセイと組み合わせるすることが含まれる。当業者であれば容易に認識できる可能性があるので、目的の化合物がＭＩＦへ結合する能力を検出できることを前提にすると、精密アッセイを使用するのは不適切である。さらに、このアッセイは好ましくは、生物学的に活性なＭＩＦとは相互作用するが不活性なＭＩＦとは相互作用しない化合物を選択するので、該化合物がＭＩＦ活性を阻害する能力を検出する。
【０２０８】
さらにまた、生物学的に不活性なＭＩＦとではなく活性なＭＩＦとのモノクローナル抗体結合を阻害する能力を証明する化合物（例えば、阻害された小分子）は、ＭＩＦの構造を変化させる、または抗体結合のために必要なエピトープをブロックするいずれかの方法でＭＩＦと相互作用している化合物（例えば、小分子）の存在を必然的に示唆する。他の実施形態では、ＭＩＦ阻害活性は、さらにまたＭＩＦを含むポリペプチド複合体の形成を妨害した結果として認識することができる。このような複合体の妨害は、構造的変化を生じ、検出を阻害することがある。したがって、ＭＩＦの構造的変化を監視するアッセイの使用は、ｍＡｂと小分子のような化合物との間での競合を測定するアッセイに加えて、またはそのようなアッセイの代わりとしてのいずれかで使用したときに有益である。種々のこのようなアッセイが当該分野において知られており、熱量測定法、円偏光二色性法、蛍光エネルギー移動法、光散乱法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、表面プラズモン共鳴法、シンチレーション近接アッセイ等が含まれる（米国特許第５，２４６，８６９号を参照）。国際特許出願第ＷＯ０２／０７７２０−Ａ１号および第ＷＯ９７／２９６３５０Ａ１号も参照。したがって、当業者であれば結合を、および好ましくはＭＩＦの活性部位の近くでの構造的変化もしくは置換を示す任意のアッセイを利用できることを認識することができる。より複雑な近接アッセイおよび構造的アッセイの数種についての説明を以下で記載するが、この記述は単に例示であり、決して好ましい実施形態で利用できる技術のタイプを限定すると見なすべきではない。
【０２０９】
１つの実施例では、円偏光二色性法を利用して候補インヒビターの結合を測定することができる。円偏光二色性（ＣＤ）は一部には、大多数の生物学的タンパク質巨大分子が非対称的モノマー単位であるＬ−アミノ酸によって作られており、それらはすべてが光学活性の特性を有しているという事実に基づいている。さらに、ＤＮＡまたはαヘリカルポリペプチドのような合成構造は適切な分光法システムを使用して測定できる光学的性質を有している。実際に、容易に測定される分光法パラメータにおける大きな変化は、様々な状況下での構造的状態および構造的状態における変化を同定し、ときどきは巨大分子内もしくは巨大分子に付着させられた単一基の摂動を観察するための選択的手段を提供することができる。さらに、ＣＤ分析は、様々な巨大分子と小分子およびリガンドとの相互作用を精査するためにしばしば使用されてきた。Ｄｕｒａｎｄら，  Ｅｕｒ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ２７（２）：１４７−１５１，１９９８；Ｋｌｅｉｆｅｌｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９（２６）：７７０２−７７１１，  ２０００；Ｂｉａｎｃｈｉら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３８（４２）：１３８４４−１３８５２，  １９９９；Ｓａｒｖｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４３４（２）：３０４−３１６，  １９９９を参照。
【０２１０】
パストゥールの原理は、光学活性分子が非対称性でなければならないと述べている；すなわち、分子およびその鏡像は重ね合わすことができない。平面偏光は、同位相で移動する左円偏光および右円偏光の組合せである。この光と非対称性分子との相互作用は１つの円偏光成分の優先的相互作用を生じさせるが、これは吸収領域では、差分吸収（すなわち二色性）として観察される。Ｕｒｒｙ  Ｄ．  Ｗ．「生体分子構造への分光法アプローチ（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＩＩ．，  ｐｐ．  ３３−１２０（１９６９）；Ｂｅｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ，「円偏光二色性：原理および適用（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．，  （２０００）を参照。
【０２１１】
円偏光二色性は、特定波長で発色団が平面偏光と相互作用すると結果として発生する吸収現象である。吸収帯は、その発色団に対する右および左円偏光成分の差分吸収に依存して負または正のいずれでもあり得る。実際の光相互作用の領域から数ミリミクロンの目的の発色団のバックグラウンドの寄与を測定する旋光分散（ＯＲＤ）とは異なり、ＣＤは事象が発生する波長での光学事象を測定する長所を提供する。そこで円偏光二色性は、その発色団の電子遷移に特異的である。Ｂｅｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ、「円偏光二色性：原理および適用（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．，  （２０００）を参照。
【０２１２】
巨大分子の溶液への円偏光二色性の適用は、構造的状態を同定する能力を生じさせた（Ｂｅｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ、「偏光二色性：原理および適用（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．  Ｙ．，  （２０００）を参照）。この技術は巨大分子のランダムコイル、αヘリックス、およびβ鎖構造の状態を識別することができる。タンパク質では、αヘリカル線維性タンパク質はαヘリカルポリペプチドの吸収曲線に極めて類似する吸収曲線を示すが、リゾチームおよびリボヌクレアーゼのような既知の構造の球状タンパク質では、ヘリカル構造はＸ線結晶学研究とは少ししか一致しない。球状タンパク質におけるもう１つの困難の原因は、約２８０ｎｍでは分子上で芳香族発色団が優勢であることにある。ヘリカル変化の興味深い例は、ミオグロビンおよびアポミオグロビンを使用して証明されている。補欠分子族のヘムを除去した後、残っているアポタンパク質は２５％減少させられた残留円偏光二色性楕円率を有している。このヘリックス消失の原因は、分子内の１０〜１５残基の巻き戻し（ｕｎｃｏｉｌｉｎｇ）に帰すことができる。その他の非ペプチドである光学的に活性な発色団には、巨大分子の一次アミノ酸配列に配置したときにはチロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびシステインが含まれる。非ペプチド楕円率の例には、リボヌクレアーゼにおけるジスルフィド転位およびインスリンのシステイン転位が含まれる。
【０２１３】
したがって、円偏光二色性を使用するとＭＩＦの構造に影響を及ぼす能力について候補インヒビターをスクリーニングすることができる。
【０２１４】
ここに提供した特定の実施形態では、ＭＩＦ結合剤もしくはインヒビター複合体形成は、ＭＩＦおよび検出可能に標識された結合剤を含む複合体の存在を検出することによって測定できる。以下でさらに詳細に説明するように、例えば蛍光偏光による蛍光エネルギー信号検出はＭＩＦ結合剤分子複合体の形成を提示する信号レベルの測定を提供する。したがって、ここに提供したように、候補インヒビターの不在下および存在下でのＭＩＦ結合剤複合体形成の蛍光エネルギー信号に基づく比較は、該作用物質がＭＩＦと結合剤との相互作用を変化させるかどうかを同定するための方法を提供する。例えば、結合剤はＭＩＦ基質、抗ＭＩＦ抗体、または既知のインヒビターであってよく、一方、候補インヒビターは試験される化合物であってよいが、またはその逆も同様である。
【０２１５】
上記のように、特定の好ましい実施形態はさらにまた、一部には、ＭＩＦ−結合剤複合体形成の蛍光エネルギー信号に基づく測定に関係する。蛍光エネルギー信号検出は、例えば、蛍光偏光または蛍光共鳴エネルギー移動によって、あるいは当該分野で知られている他の蛍光法によって行うことができる。特定の他の実施形態の例として、ＭＩＦポリペプチドは標識でき、加えて、候補インヒビターはエネルギー移動分子ドナー−アクセプター対を含むことができ、そしてエネルギードナーからエネルギーアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動のレベルが測定される。
【０２１６】
特定の実施形態では、候補インヒビターおよび／または結合剤は検出可能に標識され、そして特に好ましい実施形態では候補インヒビターおよび／または結合剤は蛍光エネルギー信号を生成することができる。候補インヒビターおよび／または結合剤は、例えば、当該分野で知られておりそして本明細書中に記載される方法に基づいて使用される特定蛍光エネルギー法にしたがって選択された様々な蛍光材料（例えば、蛍光体）のいずれかである適切なレポーター分子もしくは部分を共有的もしくは非共有的に付着させることによって検出可能に標識することができる。本明細書中で提供されるような蛍光レポーター部分および方法については、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，（「蛍光プローブおよび研究用化学薬品ハンドブック１９９６年、第６版（１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．）」，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ；「蛍光プローブおよび研究用化学薬品ハンドブック１９９９年、第７版（１９９９  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．）」，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｌｉｔ／およびその中に挙げられた参考文献の中で見いだすことができる。好ましい実施形態においてこのような蛍光体として使用するために特に好ましいのは、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、およびＣｙ−５である。しかし、あらゆる適切な蛍光体を使用することができ、そして特定の実施形態ではここに挙げたもの以外の蛍光体が好ましい場合がある。
【０２１７】
ここに提供したように、蛍光エネルギー信号にはあらゆる蛍光発光、励起、エネルギー移動、消光、または脱消光事象等が含まれる。典型的には蛍光エネルギー信号は適切な波長の光線に応答して蛍光検出可能に標識された候補インヒビターおよび／または結合剤によって媒介することができる。簡潔に、そして理論に束縛されることは望まないが、蛍光エネルギー信号の生成には基底状態から励起状態へと蛍光体のエネルギー状態を一時的に上昇させる適切なエネルギー源（例えば、選択された蛍光レポーター部分または蛍光体に対して適切な波長の光線）による蛍光体の励起が含まれる。励起された蛍光体は、順に典型的には励起のために好ましい波長とは異なる（例えば、通例はより長い）波長を有する検出可能な光線の形状でエネルギーを放出し、そしてそうすることでそのエネルギー的に基底の状態へと戻る。好ましい実施形態の方法は、当業者が習熟している基準にしたがって不要な実験を行わずに容易に選択できる特定の蛍光体、基質標識法および検出機器に依存したいずれかの蛍光エネルギー信号の使用を含んでいる。
【０２１８】
特定の実施形態では、蛍光エネルギー信号は蛍光偏光（ＦＰ）信号である。他の特定の実施形態では、蛍光エネルギー信号は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）信号であってよい。他の特定の好ましい実施形態では、蛍光エネルギー信号は蛍光消光（ＦＱ）信号または蛍光共鳴分光（ＦＲＳ）信号であってよい。（ＦＰ、ＦＲＥＴ、ＦＱおよびＦＲＳに関する詳細については、例えば、国際特許出願第ＷＯ９７／３９３２６号；第ＷＯ９９／２９８９４号；Ｈａｕｇｌａｎｄ，（「蛍光プローブおよび研究用化学薬品ハンドブック１９９６年、第６版（１９９６  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．）」，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ，  ｐ．４５６；およびそれらの中に言及されている参考文献を参照。）
エネルギー源からの光子の吸収と引き続く光子の発光の間に発生する蛍光体の平均角変位の測定値であるＦＰは、蛍光体の励起状態中の回転拡散の程度および速度、分子のサイズおよび形状、溶液の粘性および溶液温度に依存する（Ｐｅｒｒｉｎ，  １９２６  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｒａｄ．  １：３９０）。粘度および温度が一定に維持された場合は、ＦＰは蛍光体の見かけのモル体積またはサイズに直接的に関連する。偏光値は、明確な平面（例えば、垂直面および水平面）において測定された蛍光強度の比率であり、したがって蛍光体の強度によって影響を受けない無次元量である。ここで提供される検出可能に標識された候補インヒビターおよび／または結合剤のような低分子量蛍光体は、溶液中で急速な分子回転を行うことができ（すなわち、低異方性）、したがって低蛍光偏光示度を発生させる。ここで提供されるＭＩＦのような高分子量分子へ複合させると、基質の蛍光体部分は溶液中で相対的に緩徐な分子回転を示す複合体と会合し（すなわち、高異方性）、高い蛍光偏光示度を発生させる。
【０２１９】
ＭＩＦ：候補インヒビターおよび／または結合剤複合体の偏光値と比較して遊離の検出可能に標識された候補インヒビターおよび／または結合剤の偏光値のこの相違を使用して、複合された（例えば、結合した）状態と遊離の状態との比率を測定することができる。さらにまたこの相違を使用して、例えば、作用物質の不在下で検出されたＦＰを該作用物質の存在下で検出されたＦＰと比較することによって、このような複合体の形成および／または前形成された複合体の安定性に対する候補作用物質（例えば、候補インヒビター）の影響を検出することができる。ＦＰ測定は、反応成分を分離せずに実施することができる。
【０２２０】
上記のように、好ましい実施形態の１つの態様は、ＭＩＦの活性を変化させるインヒビターを同定する方法を提供するためにモノクローナル抗体、既知のインヒビターまたはその他の結合剤の結合または置換、および／あるいは候補インヒビターとＭＩＦとの複合体形成を利用する。驚くべきことに、好ましい実施形態のインヒビターは、このような非従来型方法において同定された。これに関連して、１つのクラスの化合物は、細胞から自然に生成されるが、不活性な（組換えの）ＭＩＦ（市販によって入手可能であるもののような）を認識する抗体の能力に影響を及ぼさずに生物学的に活性なＭＩＦへのモノクローナル抗体結合を阻害する／減少させる能力を証明し、さらにｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＩＦ活性の顕著な調節も証明した。したがって、抗体結合は酵素活性にとっての代用物としても好ましく、したがって各候補化合物について費用がかかり複雑な酵素アッセイを実行する必要を排除する。当業者であれば容易に理解できるように、酵素活性を回避できる能力は高スループット使用のために極めて良好に適している可能性があるアッセイを導く。
【０２２１】
さらに、当業者であれば容易に理解できるように、このようなアッセイはＭＩＦの状況外で酵素もしくは生物学的活性を結合アッセイによって置換できる場合は常に使用できる。例えば、不活性形態（例えば、小分子阻害形態）を認識しないモノクローナル抗体によって生物学的活性形態が認識される酵素または他のポリペプチドが好ましい。酵素が使用される状況では、モノクローナル抗体は活性部位に結合できるが、小分子によって置換され得る。したがって、抗体を置換するあらゆる小分子は潜在的な酵素インヒビターとしての強力な例であり得る。当業者であれば理解できるように、抗体は酵素の活性状態に依存して構造を変化させるエピトープを認識でき、そしてこのエピトープへの抗体結合を妨害するような小分子の結合もまたたとえエピトープが活性部位になくても酵素活性の代用物として機能することができる。したがって、ここで利用するアッセイのタイプは、抗体置換が活性損失を予測させる本質的にあらゆるポリペプチドを用いて使用できるように拡大することができる。そこで、その最も単純な形状では、例えば酵素およびその関連中和抗体のような任意のポリペプチドを使用して、この抗体を置換する小分子についてスクリーニングし、それによって予想されるインヒビターを同定することができる。
【０２２２】
ＭＩＦ結合剤／候補インヒビター複合体は、上記のような例えば共精製、共沈降、共免疫沈降、放射分析もしくは蛍光測定アッセイ、ウェスタンイムノブロット解析、例えば固相リガンド−カウンターリガンド吸着剤法、アフィニティークロマトグラフィーおよび表面親和性プラズモン共鳴法のような親和性法を含む親和性捕捉法、ＮＭＲ等のようなＭＩＦと別の分子との分子間相互作用を示すための当該分野で知られている様々な技術のいずれかによって同定することができる（例えば、米国特許第５，３５２，６６０号を参照）。このような複合体の存在の測定には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体および単鎖抗体等（特に、ＭＩＦまたは結合剤に結合する抗体）を含む抗体を使用することができる。
【０２２３】
標識ＭＩＦおよび／または標識結合剤／候補インヒビターはさらにまた複合体の存在を検出するためにも使用できる。目的の分子は、例えば様々な酵素、蛍光物質、発光物質および放射性物質のいずれかである適切なレポーター分子またはいずれかの部分を共有的または非共有的に付着させることによって標識することができる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、それらに限定されない。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、フィコエリトリン、テキサスレッド、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬおよびＣｙ−５が含まれるが、それらに限定されない。適切な発光物質には、ルミノールが含まれるがそれには限定されず、適切な放射性物質には放射性リン［32Ｐ］、ヨウ素［125Ｉ］もしくは［131Ｉ］またはトリチウム［3Ｈ］が含まれる。
【０２２４】
ＭＩＦおよび結合剤および／または候補インヒビターは、成分間の分子間複合体を形成させる条件下で、そしてそのために十分な時間の間混合される。このような複合体の形成に適切な条件は当該分野で知られており、溶液中の複合体の存在を検出するためおよび／または遊離の基質を検出するための溶液条件および方法を含む、ここに提供される教示に基づいて容易に測定することができる。
【０２２５】
複合体内での検出可能に標識された結合剤および／または候補インヒビターのＭＩＦとの会合、ならびに／あるいはこのような複合体の一部ではない結合剤および／または候補インヒビターとの結び付きは、基質によって生じる蛍光エネルギー信号の検出によって１つの好ましい実施形態にしたがって同定することができる。典型的には、蛍光エネルギー信号を検出するためのエネルギー源は当業者が精通している基準にしたがって、それを用いて基質が標識される蛍光レポーター部分に依存して選択される。（ａ）ＭＩＦおよび（ｂ）検出可能に標識された結合剤および／または候補インヒビターを含有する試験溶液が蛍光エネルギー信号を発生するエネルギー源に曝され、蛍光エネルギー信号は様々なよく知られている機器のいずれかによって検出され、特定の蛍光エネルギー信号にしたがって同定される。好ましい実施形態では、蛍光エネルギー信号は偏光フィルターを装備した分光蛍光計を使用して検出できる蛍光偏光信号である。特に好ましい実施形態では、蛍光偏光アッセイは、例えば様々な反応チャンバー間で相違する反応成分もしくは条件を有する高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を提供するために、ＬＪＬ  ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（登録商標）  Ａｎａｌｙｓｔ（ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製，サニーベール、  ＣＡ）プレートリーダーを使用して読み取ることのできる複数の反応チャンバーの各々において同時に実施される。蛍光偏光示度を得るために適切な他の機器の例には、ＰＯＬＡＲＳＴＡＲ（登録商標）（ＢＭＧ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  オッフェンブルク、ドイツ）、ＢＥＡＣＯＮ（登録商標）（Ｐａｎｖｅｒａ，  Ｉｎｃ．，マディソン、ＷＩ）およびＰＯＬＡＲＩＯＮ（登録商標）（Ｔｅｃａｎ，  Ｉｎｃ．，リサーチ・トライアングル・パーク、ＮＣ）装置が含まれる。
【０２２６】
ＭＩＦと結合剤および／または候補インヒビターとの間で形成された複合体の存在の測定は、ここで提供される蛍光エネルギー信号法を含む上記の方法、および当該分野で知られているような様々な方法によって実施できる。このような方法には、限定する目的ではなく例として挙げると、ＦＰ、ＦＲＥＴ、ＦＱ、その他の蛍光分析アッセイ、共精製、共沈降、共免疫沈降、放射分析、ウェスタンイムノブロット分析、例えば固相リガンド−カウンターリガンド吸着剤法、アフィニティークロマトグラフィーおよび表面親和性プラズモン共鳴法のような親和性法を含む親和性捕捉法、円偏向二色性等が含まれる可能性がある。これらおよびその他の有用な親和性法については、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ  Ｒ．Ｋ．，  「タンパク質の精製：原理および実践（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），  １９８７，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ；Ｗｅｉｒ，  Ｄ．Ｍ．，  「実験免疫学ハンドブック、１９８６年（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９８６）」，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｏｓｔｏｎ；およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．ら，「固定化親和性リガンド法（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，  １９９２，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照されたい。これらは、親和性技術を含む、複合体を単離および特性付けるための技術に関する詳細についてその全体が参照してここに組み込まれる。様々な実施形態では、ＭＩＦは、ＭＩＦが約１０4Ｍ-1以上、好ましくは約１０5Ｍ-1以上、より好ましくは約１０6Ｍ-1以上、さらになおより好ましくは約１０7Ｍ-1以上〜１０11Ｍ-1のＫaで結合剤および／または候補インヒビターと結合する場合は、特異的結合を介して結合剤および／または候補インヒビターと相互作用することができる。結合パートナーの親和性は、上記の蛍光エネルギー信号法にしたがって得られたデータから、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０（１９４９）によって報告されたもののような従来型データ処理法を使用して容易に算定することができる。
【０２２７】
例えば、蛍光エネルギー信号が蛍光偏光信号である様々な実施形態では、遊離の検出可能に標識された候補インヒビターおよび／または結合剤の蛍光異方性（偏光中の）はＭＩＦの不在下で測定でき、そして十分に結合した基質の蛍光異方性（偏光中の）は滴定量のＭＩＦの存在下で測定できる。偏光中の蛍光異方性は、蛍光体の励起状態の寿命の間に標識された候補インヒビターおよび／または結合剤が受ける回転運動の量の関数として変動する。その結果、遊離の、および十分に結合した候補インヒビターおよび／または結合剤の異方性を有用に使用して、例えば候補作用物質が存在する条件のような所定の実験条件セットにおいてＭＩＦに結合した候補インヒビターおよび／または結合剤の画分を決定することができる。（例えば、Ｌｕｎｄｂａｌａｄら，  １９９６  Ｍｏｌｅｃ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １０：６０７；Ｄａｎｄｌｉｋｅｒら，  １９７１  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ７：７９９；Ｃｏｌｌｅｔｔ，  Ｅ．，  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  Ｌｉｇｈｔ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（偏光：基本および応用），  １９９３  マーセル・デッカー、ニューヨークを参照）。
【０２２８】
特定の好ましい実施形態は、一部にはＭＩＦ−結合剤複合体の形成および安定性、ならびに／またはＭＩＦ−候補インヒビター複合体の形成を監視するための分子間エネルギー移動の使用に関連する。
【０２２９】
エネルギー移動（ＥＴ）は、２つの分子であるエネルギー寄与「ドナー」分子およびエネルギー受容「アクセプター」分間の共鳴相互作用により生じる。エネルギー移動は、（１）ドナーの発光スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルに重複し、そして（２）ドナーとアクセプターが互いに一定の距離（例えば、約１０ｎｍ未満）内に存在する場合に生じ得る。エネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプターの接近によって必然的に決定され、そして距離に伴って６の出力として低下する。したがってＥＴの測定はアクセプターとドナー化合物の接近を強く反映し、そしてＥＴの変化は、例えばドナーとアクセプターの会合または解離のようなこれら化合物の近接性の変化を敏感に反映する。
【０２３０】
このため、１つの好ましい実施形態の態様は、ＭＩＦまたは１つもしくは複数のＥＴドナーを含むＭＩＦ−結合剤複合体をＥＴアクセプター分子と接触させ、該ＥＴドナーを励起させて励起させられたＥＴドナー分子を作成し、そしてＥＴドナーからＥＴアクセプターへのエネルギー移動によって生じた信号を検出することによって、適切な部分において、候補ＭＩＦインヒビターをアッセイする方法を提供することである。さらにここで提供されるように、該方法は、ドナー−アクセプター対として機能できるあらゆる適切なＥＴドナー分子およびＥＴアクセプター分子を使用することができる。
【０２３１】
特定の好ましい実施形態では、ＥＴドナーとアクセプター分子間のエネルギー移動によって生じる検出可能な信号は、上記のような蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の結果として生じる。ＦＲＥＴは、励起したドナー蛍光体からのエネルギーがアクセプター蛍光体へ直接移動させられたときに、分子内、または異なる２種の分子間で発生する（概観については、Ｗｕら，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１８：１−１３，  １９９４を参照）。
【０２３２】
好ましい実施形態の他の態様では、候補インヒビターがＭＩＦ搬出を実行する能力が試験される。
【０２３３】
このようなアッセイの第１ステップは、細胞外でＭＩＦを検出するために実行される。このアッセイのためには、ＭＩＦを発現する試験細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）が使用される。試験細胞は、自然にタンパク質を産生できるか、またはそれをトランスフェクトされた発現ベクターから産生することができるかのいずれかである。試験細胞は、好ましくは、通常にタンパク質を発現し、したがって、トランスフェクションは単に発現レベルを増加させるだけである。したがって、ＭＩＦおよびＩＬ−１の発現については、ＴＨＰ１細胞が好ましい。ＨＩＶ  ｔａｔのようなウイルス由来タンパク質をアッセイするときには、試験細胞が該タンパク質を「自然に」産生しない場合は、当業者であれば容易に理解できるように試験細胞が所望のタンパク質を発現するように、それらを適切なベクターを用いて容易にトランスフェクトすることができる。
【０２３４】
発現に続いて、ＭＩＦは様々なよく知られてる方法および手順のいずれか１つによって検出される。このような方法には、フローサイトメトリーと組み合わせた抗体の染色、共焦点顕微鏡、画像解析、細胞サイトゾルもしくは培地の免疫沈降、細胞培地のウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、１Ｄもしくは２Ｄゲル分析、ＨＰＬＣ、またはバイオアッセイが含まれる。最初のスクリーニングに適切なアッセイ法はＥＬＩＳＡである。ＭＩＦ搬出は、他のアッセイ法の１つによって、好ましくは代謝標識後の細胞培地の免疫沈降法によって確認できる。簡潔には、ＭＩＦタンパク質を発現する細胞は、メチオニンおよび／またはシステインを含まない培地中で35Ｓ−メチオニンおよび／または35Ｓ−システインを用いて１５分間、パルス標識され、過剰なメチオニンおよび／またはシステインを補給した培地中で追跡される。培地画分が回収され、例えば、微量遠心分離のような遠心分離によって明澄化される。１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸塩（ＤＯＣ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｎＭ  ＰＭＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌアプロチニン、１０ｎｇ／ｍｌロイペプチン、および１０ｎｇ／ｍｌペプスタチンを含有する溶解緩衝液が明澄化された培地へ添加される。ＭＩＦに対する抗体が添加され、低温でのインキュベーション後に、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）もしくはＧａｍｍａＢｉｎｄ（登録商標）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような沈降用二次抗体もしくは免疫グロブリン結合タンパク質がその後のインキュベーションのために添加される。平行して、対照として細胞質タンパク質が監視され、免疫沈降法では細胞質タンパク質に対する抗体が好ましい。免疫複合体がペレット化され、氷冷した溶解緩衝液を用いて洗浄される。複合体はさらに氷冷したＩＰ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％  ＤＯＣ、１％  ＮＰ−４０、０．１％  ＳＤＳ）で洗浄される。免疫複合体はＳＤＳゲルサンプル緩衝液内へ直接に溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて電気泳動される。ゲルは蛍光間接撮影法のために処理され、乾燥させられてＸ線フィルムへ露光させられる。あるいは、細胞は、レポーターを用いてタグ標識されたＭＩＦを生成するように操作され、その結果、活性なＭＩＦの存在はレポーターの代理活性によるものとなり得る。
【０２３５】
理論に束縛されることは望まないが、本インヒビターは、その生物学的活性をブロックするために十分なようにタンパク質の構造を変化させる様式で、自然に産生されたＭＩＦ複合体と直接相互作用することによって機能すると考えられる。この相互作用は、相互作用の正確な部位を決定するためにＭＩＦ化合物共結晶のＸ線結晶学によってマッピングすることができる。１つの部位は、ＭＩＦのトートメラーゼ活性の原因となるポケットの位置を決定する。
【０２３６】
ＭＩＦ搬出のインヒビターについてのスクリーニングアッセイは、インヒビターのタイプおよび影響を受ける活性の性質にしたがって変動する。アッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施できる。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイはＭＩＦ活性または多重化を評価するように設計されており、そしてｉｎ  ｖｉｖｏアッセイはモデル細胞もしくは動物システム中の、ＭＩＦ活性、細胞外および細胞内局在性を評価するように設計される。これらアッセイのいずれにおいても、適正な対照と比較した統計学的有意な増加または減少が、増強または阻害を示す。
【０２３７】
１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ＭＩＦがマクロファージ遊走を阻害する能力に対する候補化合物の影響を試験することによって実施できる。簡潔には、ヒト末梢血単球が、Ｗｅｉｓｅｒら，Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９０：１６７−１７８，  １９８５およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１０：７５２−７５９，  １９７３によって記載されているように、本質的にアガロースドロップアッセイシステムのインジケーター細胞として好ましい。マクロファージ遊走を分析するその他のアッセイシステムもまた使用できる。そのようなアッセイは、Ｈｅｍａｎｏｗｓｋｉ−Ｖｏｓａｔｋａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：１２８４１−１２８４９，  １９９９に報告されている。
【０２３８】
また別のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ＭＩＦがドパクロムのＤ−異性体の互変異性化を触媒する能力を測定するように設計されている（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２：１４３−１４９，  １９９６；Ｗｉｎｄｅｒら，Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １０６：１５３−１６６，  １９９３；Ａｒｏｃａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２７７：３９３：３９７を参照）。簡潔には、この方法では、候補インヒビターの存在下および不在下でＤ−ドパクロムがＭＩＦに対して提供され、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸（ＤＨＩＣＡ）への互変異性化を触媒する能力が監視される。しかし、より迅速な反応速度が観察されるＤ−ドパクロムのメチルエステルを使用することが好ましい。互変異性化の検出は、様々な標準方法のいずれか１つによって実施できる。
【０２３９】
類似のアッセイでは、ＭＩＦがフェニルピルビン酸塩の互変異性化を触媒する能力を試験できる（Ｊｏｈｎｓｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８（４８）：１６０２４−１６０３３，  １９９９を参照）。簡潔には、この方法では、典型的にはフェニルピルビン酸塩もしくは（ｐ−ヒドロキシフェニル）ピルビン酸塩のケトン化が分光法によって追跡される。さらに、生成物の形成は、1Ｈ  ＮＭＲ解析のための、ＭＩＦでのこれらの化合物の処理およびそれに続くリンゴ酸塩への転換によって実証できる。
【０２４０】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、ここで記載するように、ＭＩＦ核酸分子を含有している発現ベクターを用いて一過性または安定性のどちらかでトランスフェクトさせた細胞中で実施できる。これらの細胞は候補化合物の存在下または不在下でＭＩＦ活性（例えば、アポトーシスの調節、増殖等）または細胞外および細胞内局在性を測定するために好ましい。アポトーシスについてアッセイする場合は、例えば、核酸の断片化および細胞の多孔性を試験するための色素染色および顕微鏡検査を含む様々な細胞分析法を使用できる。
【０２４１】
モデル細胞または動物システムでは、該系に組換え型もしくは天然型のＭＩＦを提供し、または試験化合物の存在下もしくは不在下で内因性ＭＩＦ発現を誘導し、それにより該系の病因の統計学的に有意な増加または減少を測定することによってその他のアッセイを実施できる。例えば、毒性ショック応答を誘導するためにはＬＰＳを使用できる。
【０２４２】
ここに簡潔に記載したアッセイを使用して、ＭＩＦに特異的であるインヒビターを同定することができる。
【０２４３】
ここに記載したアッセイのいずれかでは、試験細胞は自然にＭＩＦを発現することができる（例えば、ＴＨＰ−１細胞）か、または該タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子の導入後にＭＩＦを発現することができる。トランスフェクションおよび形質転換プロトコルは当該分野においてよく知られており、Ｃａ2ＰＯ4−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いた感染、ＤＥＡＤ−デキストラン媒介トランスフェクション等が含まれる。上記のタンパク質の代わりとして、キメラＭＩＦタンパク質（すなわち、ＭＩＦタンパク質と他のタンパク質もしくはタンパク質フラグメントとの融合）、またはリーダー配列が欠如するように操作されたタンパク質配列を使用することもできる。同様に、分泌、搬出または細胞質保持を指令するように融合体を構築することができる。ありとあらゆるこれらの配列はインヒビターのアッセイを助けるために、ＭＩＦを有する融合構築物中で使用できる。宿主細胞はまた、罹患、ウイルス感染等の結果としてＭＩＦを発現することもできる。リーダー配列によって搬出される分泌タンパク質はよく知られており、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧα）、成長ホルモン、肝細胞成長因子、トランスフェリン、神経成長因子、血管内皮細胞成長因子、オボアルブミン、およびインスリン様成長因子が含まれる。同様に、細胞質タンパク質はよく知られており、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アクチンおよびその他の細胞骨格タンパク質、ならびにプロテインキナーゼＡもしくはＣのような酵素が含まれる。最も有用な細胞質タンパク質もしくは分泌タンパク質は、ＥＬＩＳＡのような便宜的アッセイで容易に測定されるものである。３種のタンパク質（リーダーレスタンパク質、分泌タンパク質、および細胞質タンパク質）は自然に、試験細胞中での同時トランスフェクションによって、または別の宿主細胞内へと個別にトランスフェクトされて共発現させることができる。さらに、ここに記載したアッセイについては、細胞は安定に形質変換される、または一時的に該タンパク質を発現することができる。
【０２４４】
免疫沈降法は、阻害を決定するために使用できるそうしたアッセイの１つである。簡潔には、自然にＭＩＦを発現するかまたは導入されたベクター構築物からＭＩＦを発現する細胞がメチオニンおよび／またはシステインを含まない細胞培地中で、典型的には１５分間以上の短期間で、35Ｓ−メチオニンおよび／または35Ｓ−システインを用いて標識される。パルス標識化に引き続いて、細胞はリーダーレスタンパク質がヘパリン結合性である場合は、過剰な未標識メチオニンおよびシステインにヘパリンを加えて補給した培地を用いて洗浄される。その後細胞は、様々な期間にわたり同一追跡培地中で培養される。候補インヒビターまたはエンハンサーが種々の濃度で培地に添加される。培地上清が回収され、そして明澄化される。上清は抗ＭＩＦ免疫血清またはモノクローナル抗体とともに、またはペプチドタグが存在する場合は抗タグ抗体とともにインキュベートされ、さらにその後、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ株１、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、またはＧａｍｍａ−ｂｉｎｄ（登録商標）Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のような展開試薬と一緒にインキュベートされる。免疫複合体が遠心分離によってペレット化され、１％  ＮＰ−４０および０．５％  デオキシコール酸塩、ＥＧＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンを含有する緩衝液中で洗浄される。その後、沈降物は、リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、デオキシコール酸塩、ＮＰ−４０、およびＳＤＳを含有する緩衝液中で洗浄される。免疫複合体はＳＤＳゲルサンプル緩衝液中へ溶出させられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離される。ゲルが蛍光間接撮影法のために処理され、乾燥させられ、Ｘ線フィルムに露光させられる。
【０２４５】
あるいは、細胞上清中のＭＩＦを検出して定量するためにはＥＬＩＳＡが好ましいことがある。ＥＬＩＳＡは、高スループットスクリーニングにおける検出のために好ましい。簡潔には、９６ウェルプレートが抗ＭＩＦ抗体または抗タグ抗体でコーティングされ、洗浄され、２％ＢＳＡを用いてブロックされる。その後、細胞上清がウェルに添加される。インキュベーションおよび洗浄に引き、続き二次抗体（例えば、ＭＩＦへ）が添加される。二次抗体は、酵素のような標識もしくは検出試薬またはビオチンへ結合させることができる。さらなるインキュベーションの後、展開試薬が添加され、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＭＩＦの量が測定される。展開試薬は、二次抗体（典型的には抗イソタイプ抗体）に結合した酵素またはストレプトアビジンに結合させた酵素の基質、またはストレプトアビジンに結合させた酵素の基質である。適切な酵素は当該分野においてよく知られており、基質（例えば、ＡＢＴＳ）に対して作用して比色反応を生じさせる西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。酵素に結合させた二次抗体を使用しなくても、抗ＭＩＦ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼまたは他の同等の検出試薬に直接に結合させることもできることは認識されている。所望であれば、細胞上清を検出レベルを上昇させるために濃縮することができる。さらに、ＥＬＩＳＡ等のような検出方法を使用して、ＭＩＦの細胞内ならびに細胞外レベルを監視することもできる。細胞内レベルが所望される場合は、細胞溶解液が好ましい。細胞外レベルが所望である場合は、培地をスクリーニングすることができる。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡは、さらにまた、高スループットで複数の候補インヒビターまたはエンハンサーをスクリーニングするように容易に適応させることができる。簡潔には、このようなアッセイは通常、細胞に基づき、９６ウェルプレート中で実施される。自然にＭＩＦを発現するかまたは安定にＭＩＦを発現する試験細胞が、発現された生成物の検出に十分なレベル（例えば、約２０，０００個の細胞／ウェル）でプレーティングされる。しかし、細胞が該タンパク質を自然には発現しない場合は、例えば、エレクトロポレーションもしくはＣａ2ＰＯ4−媒介トランスフェクションによって、一過性発現が達成される。エレクトロポレーションのためには、細胞（例えば、１５０，０００個の細胞／ｍｌ）およびベクターＤＮＡ（５μｇ／ｍｌ）の混合液１００μｌが９６ウェルプレートの個々のウェル内に分注される。細胞は９６ウェル電極を装備した装置（例えば、ＥＣＭ  ６００エレクトロポレーションシステム、ＢＴＸ、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社製）を使用してエレクトロポレーションされる。エレクトロポレーションの最適条件は、特定の宿主細胞のタイプに合わせて経験的に決定される。電圧、抵抗およびパルス長は変更される典型的パラメータである。エレクトロポレーションを最適化するためのガイドラインは、製造業者から得ることができるか、または例えば「分子生物学における最新プロトコール（Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８７のようなプロトコールマニュアル中に見出すことができる。細胞は等量の培地で希釈され、４８時間インキュベートされる。エレクトロポレーションは、哺乳類細胞、酵母細胞、細菌等を含む様々な細胞タイプについて実施できる。インキュベーション後、インヒビターを含む、または含まない培地が添加され、細胞はさらに１〜２日間インキュベートされる。この時点で、培養培地が回収され、タンパク質がここに記載したアッセイのいずれかによって調査される。好ましくは、ＥＬＩＳＡが使用され、該タンパク質が検出される。５０μＭの初期濃度が試験される。この量が統計学的有意な搬出の減少またはモノクローナルＡｂ検出の低下を生じさせる場合は、候補インヒビターはさらに用量応答で試験される。
【０２４７】
あるいは、濃縮された上清がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動され、ナイロンもしくはニトロセルロースのような固体担体上へ移すことができる。その後、ＭＩＦは、同位体または非同位体レポーター基を含有するＭＩＦに対する抗体を使用して、イムノブロット法（Ｈａｒｌｏｗ，「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８８を参照）によって検出される。これらのレポーター基には、酵素、補因子、色素、放射性同位体、発光分子、蛍光分子、およびビオチンが含まれるがそれらに限定されない。好ましくは、レポーター基は125Ｉまたは西洋ワサビペルオキシダーゼであり、これらは、２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸と一緒にインキュベートすることで検出できる。上記に記載したこれらの検出アッセイは、ＭＩＦがペプチドタグを含有している場合には、使用するために容易に適合させられる。このような場合は、抗体はペプチドタグに結合する。その他のアッセイには、ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む、サイズまたは電荷に基づくクロマトグラフィーが含まれる。
【０２４８】
あるいは、細胞培地内に存在する活性なＭＩＦの量を定量するためにはバイオアッセイを使用できる。例えば、ＭＩＦの生体活性はマクロファージ遊走アッセイによって測定できる。簡潔には、ＭＩＦを含有する発現ベクターでトランスフェクトした細胞が約３０時間にわたり培養され、その間に候補インヒビターまたはエンハンサーが添加される。インキュベーション後、細胞はさらなる１６時間のインキュベーションのために、低血清培地へ移される。培地が除去され、遠心分離により明澄化される。プロテアーゼインヒビターを含有する溶解緩衝液が培地に添加されるか、あるいはまた細胞が溶解させられて内部レベルが以下のように測定される。その後、ＭＩＦの生体活性が、マクロファージ遊走アッセイ、イソメラーゼ活性、または増殖アッセイによって測定される。増殖アッセイは、様々な量の溶出液を培養された休止３Ｔ３細胞に添加することによって実施される。トリチウム化チミジンが培地に添加され、ＴＣＡ沈降係数が約２４時間後に測定される。生体色素であるＭＴＴの減少が増殖を測定するためのもう１つの方法である。標準として、精製された組換えヒトＦＧＦ−２を使用することができる。当該分野で利用できる他の適切なバイオアッセイでは、ＣＰＳ誘発性毒性ショック、ＴＳＳＴ−１誘発性毒性ショック、コラーゲン誘発性関節炎等のような他の機能についてアッセイすることができる。
【０２４９】
その他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成アッセイには、コラーゲンゲル内の内皮細胞の増殖（Ｇｏｔｏら，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６９：５０８，  １９９３）、ＭＩＦタンパク質を搬出する細胞からチャンバーによって分離されたコラーゲンゲル上の脳毛細管内皮細胞の同時培養（Ｏｋａｍｕｒｅら，  Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．  １８６：１４７１，  １９９２；Ａｂｅら，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９２：５４，  １９９３）を測定するバイオアッセイ、または細胞移動アッセイ（Ｗａｒｒｅｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１７８９，  １９９５を参照）が含まれる。
【０２５０】
抗体の産生
ここで使用する用語「抗体」は広義の用語であり、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体およびモノクローナル抗体ならびにそのような抗体の抗原結合フラグメントを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。好ましい実施形態の抗ＭＩＦ／標的抗体に関して、ここで使用する用語「抗原」は広義の用語であり、マクロファージ遊走阻止因子ポリペプチドもしくは標的ポリペプチド、その変形または機能的フラグメントを意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。抗ＭＩＦ／標的抗体、またはこのような抗体の抗原結合フラグメントは、その標的ポリペプチドもしくはエピトープに対して少なくとも約１×１０5Ｍ-1、一般的には、少なくとも約１×１０6Ｍ-1、および好ましくは少なくとも約１×１０8Ｍ-1の特異的結合活性を有すると特性付けることができる。ＭＩＦ／標的ポリペプチド特異的エピトープに対する特異的結合活性を保持している抗ＭＩＦ／標的抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｄおよびＦｖフラグメントは好ましい実施形態に含まれている。特に興味深いのは、活性ポリペプチドに結合し、結合すると阻害性小分子と置換される抗体である。当業者であれば、そのような置換が構造的変化の結果であり、例えば、エピトープの性質の変化、エピトープとの競合的結合、またはそのエピトープによる抗体の立体障害の結果であることを理解できる。1つの例では、酵素の活性部位は特定の抗体についてのエピトープであり、該活性部位もしくはその近くに小分子が結合すると、該抗体の免疫反応性が失われ、それによって酵素活性についての代用マーカーとして抗体の免疫反応性の消失を使用することを可能にする。
【０２５１】
さらに、ここで使用する用語「抗体」は広義の用語であり、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能抗体およびヒト化抗体ならびにその抗原結合フラグメントを含む天然型抗体ならびに非天然型抗体を意味することを（制限なく）含む通常の意味で使用される。このような非天然型抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築できるか、組換え的に生成できるか、または例えば可変性重鎖および可変性軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって得ることができる（Ｈｕｓｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ連結抗体、単鎖抗体、および二官能抗体を作成するこれらおよびその他の方法は当該分野においてよく知られている（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，「抗体エンジニアリング第３版（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２ｄ  ｅｄ．）」，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｈｉｌｙａｒｄら，「タンパク質エンジニアリング：実践アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）を参照）。
【０２５２】
特定の好ましい実施形態では、抗ＭＩＦ／標的抗体は、上記のように、天然源から調製できるかまたは組換え的に作成できる、例えばＭＩＦもしくは標的ポリペプチドの活性部位領域を含む単離ペプチド、あるいは、上記のような合成ペプチドを含むＭＩＦ／標的ポリペプチドの免疫原性フラグメント（例えば、８〜３０以上の連続アミノ酸配列を含む免疫原性配列）を免疫原として使用して惹起させることができる。ＭＩＦ／標的ポリペプチドの非免疫原性ペプチド部分はハプテンを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のような担体分子へ結合させることによって、または該ペプチド部分を融合タンパク質として発現させることによって、免疫原性にすることができる。他の様々な担体分子およびハプテンを担体分子へ結合させる方法は当該分野においてよく知られている（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上記、１９９２）。
【０２５３】
例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、またはその他の哺乳類においてポリクローナル抗体を惹起させる方法は当該分野においてよく知られている。さらに、モノクローナル抗体は、当該分野においてよく知られており日常的に行われる方法を使用して得ることができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上記、１９９２）。例えば、標的ポリペプチドで免疫した哺乳動物由来の脾臓細胞をＳＰ／０２骨髄腫細胞のような適切な骨髄腫細胞株に融合させて、ハイブリドーマ細胞を作成することができる。クローン化されたハイブリドーマ細胞株は、標識された標的ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを使用してスクリーニングされ、所望の特異性を有する標的ポリペプチドモノクローナル抗体を分泌するクリーンを同定することができる。所望の特異性および親和性を有する標的ポリペプチドモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマが単離されると、これは抗体の持続的な供給源として利用することができ、これらは例えば、標準化キットを調製するために有用である。同様に、例えば一本鎖抗標的ポリペプチドを発現する組換えファージもまた、標準化キットを調製するために使用できるモノクローナル抗体を提供する。
【０２５４】
ＭＩＦのインヒビターを利用する適用および方法
ＭＩＦのインヒビターは上記のように様々な適用可能な用途を有している。ＭＩＦの候補インヒビターは、細菌、真菌、植物、寄生虫、化学物質（小分子）のライブラリー、ペプチドもしくはペプチド誘導体等のような様々な起源から単離または作成することができる。さらに、当業者であれば、対照レベルからの統計学的有意な変動が観察されるときに阻害が発生していることを認識できる。
【０２５５】
病状および止血においてＭＩＦが様々な役割を果たすことを前提にすると、ＭＩＦ活性またはＭＩＦの細胞外局在化の阻害が治療効果を有する可能性がある。例えば、近年の研究は、ＭＩＦが内毒素血症のメディエーターであり、その場合は、抗ＭＩＦ抗体がマウスをＬＰＳに誘導される死亡から完全に防御することを証明している。Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：７５６−７５９（１９９３）；Ｃａｌａｎｄｒａら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９：１８９５−１９０２，  １９９４；Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２：１９８−２０１，  １９９４を参照。さらに、抗ＭＩＦ抗体は、敗血症性ショックを誘発するグラム陽性菌を惹起投与したマウスにおいて生存率を顕著に上昇させた。Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７６：１５１−１６１，  １９９８。他の研究は、腫瘍細胞の増殖におけるＭＩＦの役割、およびＭＩＦのアンチセンス阻害がアポトーシス刺激に対する抵抗性をもたらすことを実証している。Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ４：７０７−７１４，  １９９８；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４３（１）：６１−６７，  １９９９を参照。さらに、ＭＩＦがグルココルチコイド作用の逆調節剤（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であるという所見は、ＭＩＦの細胞外局在化を阻害する方法により、自己免疫、炎症、内毒素血症、および成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、中耳炎、炎症性関節疾患およびクローン病を含む様々な病理学的状態の治療が可能となる可能性があることを示す。Ｂｅｒｎｈａｇｅｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７６：１５１−１６１，  １９９８；Ｃａｌａｎｄｒａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７７：６８−７１，１９９５；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ３：３２０−３２３，  １９９７。ＭＩＦは血管新生性であるとも認識されているので、このサイトカインの阻害は抗血管新生活性を有しいる場合があり、癌、糖尿病性網膜症、乾癬、血管障害、受胎能、肥満およびクッシング病やアジソン病のようなグルココルチコイド機能障害の遺伝性疾患を含むがそれらに限定されない血管新生性疾患において特に有用である。
【０２５６】
ＭＩＦ活性または搬出のインヒビターは治療的に使用することができ、さらに特定細胞に特異的な細胞表面受容体に結合する標的部分と組み合わせて利用できる。インヒビターもしくはエンハンサーの投与は、一般的には、確立されたプロトコールに従う。好ましい実施形態の組成物は、例えば、経口、経鼻、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与を含む望ましい投与方法に合わせて処方することができる。他の実施形態の範囲内で、ここに記載した組成物は徐放性インプラントの一部として投与することができる。さらにまた別の実施形態の範囲内では、好ましい実施形態の組成物は凍結乾燥物とした場合に安定性を提供する適切な賦形剤を利用して凍結乾燥物として調製し、引き続いて再水和させることができる。
【０２５７】
別の実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦインヒビターを含有する医薬組成物が提供される。投与目的のためには、好ましい実施形態の化合物は医薬組成物として調製できる。好ましい実施形態の医薬組成物は、好ましい実施形態の１つまたは複数のＭＩＦインヒビター（すなわち、構造（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）の化合物）と医薬上許容される担体および／または希釈剤を含んでいる。ＭＩＦのインヒビターは特定の障害を治療するために有効である量で、すなわちＭＩＦレベルまたは活性、症状の低下を達成するために十分な量で、および／あるいは好ましくは、患者にとって許容できる毒性で該組成物中に存在する。好ましくは、好ましい実施形態の医薬組成物は、投与形路に依存して１用量当たり約０．０１ｍｇ未満から約１，０００ｍｇより多い量まで、好ましくは約０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８もしくは０．９ｍｇから約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、６００、７００、８００、もしくは９００ｍｇまで、およびさらに好ましくは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、もしくは２５ｍｇから約３０、３５、４０、４５、５０、５５、もしくは６０ｍｇまでの量でＭＩＦのインヒビターを含んでいてよい。しかし特定の実施形態では、上記の量より低用量または高用量が好ましい場合がある。適切な濃度および用量は当業者が容易に決定できる。
【０２５８】
医薬上許容される担体および／または希釈剤については当業者であれば精通している。液状溶液として調製される組成物については、許容される担体および／または希釈剤として生理食塩液および無菌水が挙げられ、さらに必要に応じて、抗酸化物質、緩衝剤、殺菌剤、およびその他の一般的な添加物を含むことができる。該組成物はさらにまた、ＭＩＦのインヒビターに加えて、希釈剤、分散剤および界面活性剤、結合剤および潤滑剤を含有する丸剤、カプセル剤、顆粒剤、または錠剤として調製できる。当業者は、さらにまたＭＩＦのインヒビターを適切な方法で、そして例えば「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  イーストン，  ＰＡ  １９９０に記載されているような許容されている実践方法にしたがって調製することができる。
【０２５９】
さらに、好ましい実施形態の状況内にはプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、このようなプロドラッグが患者に投与されたときにｉｎ  ｖｉｖｏで構造（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）の化合物を放出する任意の共有的に結合させられた担体である。プロドラッグは、一般的には、日常的に行われている操作によるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで親化合物を産生させることのいずれかによって、修飾が切断されるような方法で官能基を修飾することによって調製される。
【０２６０】
立体異性体に関しては、構造（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物はキラル中心を有している場合があり、ラセミ体、ラセミ混合物として、および個々のエナンチオマーもしくはジアステレオマーとして生じる場合がある。このようなすべての異性体形態は、好ましい実施形態の範囲内に含まれ、これにはそれらの混合物も含まれる。さらに、構造（Ｉａ）および（Ｉｂ）の化合物の一部の結晶形態は、多形体として存在することがある、これは好ましい実施形態に含まれる。さらに、構造（Ｉａ）および（Ｉｂ）の一部の化合物は、水またはその他の有機溶媒と一緒に溶媒和物を形成する場合もある。このような溶媒和物は、同様に好ましい実施形態の範囲内に含まれる。
【０２６１】
また別の実施形態では、炎症性疾患、関節炎、免疫関連障害等を含む様々な障害または疾患を治療する方法が提供される。このような方法には、好ましい実施形態の化合物を該障害または疾患を治療するために十分な量で温血動物へ投与するステップが含まれる。このような方法には、好ましくは医薬組成物の形態での好ましい実施形態のＭＩＦのインヒビターの全身性投与が含まれる。ここで使用する全身性投与には、経口および非経口投与方法が含まれる。経口投与については、ＭＩＦのインヒビターの適切な医薬組成物には粉剤、顆粒剤、丸剤、錠剤およびカプセル剤、ならびに液剤、シロップ剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。これらの組成物には、さらに香味料、保存料、懸濁剤、増粘剤、および乳化剤、そしてその他の医薬上許容される添加物が含まれることがある。非経口投与については、好ましい実施形態の化合物は、水性注射液として調製できる。これは、ＭＩＦ活性および／または搬出のインヒビターに加えて、緩衝剤、抗酸化物質、静菌剤、そしてそのような溶液で一般に使用される他の添加物を含有していることがある。
【０２６２】
上記のように、好ましい実施形態の化合物の投与は、極めて広範囲の障害または疾患を治療するために使用できる。詳細には、好ましい実施形態の化合物は炎症、癌、免疫障害等を治療するために温血動物へ投与することができる。
【０２６３】
ＭＩＦ阻害化合物は、他の医薬化合物を用いた治療と組み合わせて使用される場合がある。好ましい実施形態では、ＭＩＦ阻害化合物は、ＭＩＦ阻害化合物が病因である、またはＭＩＦが疾患プロセスにおいて中心的またはその他の役割を果たしている疾患または状態を治療するために使用される従来型薬物と組み合わされて与えられる。特に好ましい実施形態では、構造（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）の化合物を含むがそれに限定されない１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物を、様々な癌、喘息もしくは他の呼吸疾患、敗血症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、または他の炎症性疾患、免疫障害、あるいはＭＩＦが病因である他の疾患もしくは障害を治療するための薬剤を含むがそれに限定されない、１つまたは複数のさらなる医薬化合物と組み合わせられた医薬組成物が提供される。
【０２６４】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、１つまたは複数の非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）または関節炎もしくはその他の炎症性疾患を治療するための他の医薬化合物と組み合わされて与えられる。好ましい化合物には、セレコキシブ；ロフェコキシブ；例えばアスピリン、セレコキシブ、トリサルチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサレート、スリンダク、およびトルメチンのようなＮＳＡＩＤｓ；ならびに、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、βメタゾン、ベルコメタゾンジプロピオネート、ブデソニド、リン酸デキサメタゾンナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、βメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸βメタゾン、吉草酸βメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール、およびデキサメタゾンのようなコルチコステロイド剤と組み合わされて存在している。
【０２６５】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、１つまたは複数のβ刺激薬、吸入用コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、ホルモンまたはその他の喘息、急性呼吸困難、もしくは呼吸疾患を治療するためのその他の医薬化合物と組み合わされて与えられる。好ましい化合物には、例えば一般に処方される気管支拡張薬のようなβ刺激薬；例えばベクロメタゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、モメタゾンのような吸入用コルチコステロイド、および例えばプレドニゾン、プレドニゾロンおよびメチルプレドニゾロンのような形態のプレドニゾン；例えばアザタジン、カルビノキサミン／シュードエフェドリン、セチリジン、シプロヘプタジン、デキスクロルフェニルアミン、フェキソフェナジン、ロラタジン、プロメタジン、トリペレナミン、ブロムフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマスチン、ジフェンヒドラミンのような抗ヒスタミン剤；および例えばエピネフリンのようなホルモンと組み合わされて与えられる。
【０２６６】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、医薬組成物中で、例えばアザチオプリンもしくはコルチコステロイドのようなＩＢＤを治療するための医薬化合物を、組み合わされて与えられる。
【０２６７】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、医薬組成物中で、例えばパクリタキセルのような癌を治療するための医薬化合物と組み合わされて与えられる。
【０２６８】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、医薬組成物中で、免疫抑制化合物と組み合わされて与えられる。特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、例えばライム病、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））、もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のような自己免疫障害を治療するための１つまたは複数の薬物と組み合わせられて与えられる。このような薬物には、例えば、インジナビル、アンブレナビル、サキナビル、ロピナビル、リトナビル、およびネルフィナビルのようなプロテアーゼインヒビター；例えばジドブジン、アバカビル、ラミブジン、イダノシン、ザルシタビンおよびスタブジンのようなヌクレオシド逆転写酵素インヒビター；例えばテノフォビルジソプロキシルフマレートのようなヌクレオチド逆転写酵素インヒビター；例えばデラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピンのような非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター；例えばエタネルセプト、インフリキシマブ、およびその他の腫瘍壊死因子を阻害もしくは妨害する化合物；例えばアミブジンおよびジドブジンのような抗ウイルス薬が含まれる。
【０２６９】
特に好ましい実施形態では、１つまたは複数のＭＩＦ阻害化合物が、ステロイド剤もしくは抗感染症薬のような敗血症を治療するための医薬化合物と組み合わせられて与えられる。ステロイド剤の例には、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、βメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、リン酸デキサメタゾンナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、βメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸βメタゾン、吉草酸βメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール、およびデキサメタゾンが含まれる。抗感染症薬の例には、駆虫薬（メベンダゾール）、アミノグリコシド（ゲンタマイシン、ネオマイシン、トブラマイシン）、抗真菌性抗生物質（アムホテリシンｂ、フルコナゾール、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン、ミカチン、トルナフテート）、セファロスポリン系（セファクロール、セファゾリン、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン）、βラクタム系抗生物質（セフォテタン、メロペネム）、クロラムフェニコール、マクロライド系（アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン）、ペニシリン系（ペニシリンＧナトリウム塩、アモキシリン、アンピシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、ピペラシリン、チカルシリン）、テトラサイクリン系（ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、バシトラシン；クリンダマイシン；コリスチメタン酸ナトリウム；硫酸ポリミキシンｂを含む抗生物質；バンコマイシン；アシクロビル、アマンタジン、ジダノシン、エファビレンツ、フォスカメット、ガンシクロビル、インジナビル、ラミブジン、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、スタブジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ジドブジンを含む抗ウイルス薬；キノロン（シプロフロキサシン、レボフロキサシン）；スルホンアミド（スルファジアジン、スルフィソキサゾール）；スルホン（ダプゾン）；フラゾリドン；メトロニダゾール；ペンタミジン；スルファニルアミドゥムクリスタリナム；ガチフロキサシン；およびスルファメトキサゾール／トリメトプリムが含まれる。
【０２７０】
特定の疾患の治療においては、例えばエタノール、ブピバカイン、クロロプロカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、ロピバカイン、テトラカイン、デスフルラン、イソフルラン、ケタミン、プロポフォール、セボフルラン、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、マルカイン、メペリジン、メタドン、モルヒネ、オキシコドン、レミフェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ナルブフィン、トラマドール、ベンゾカイン、ジブカイン、塩化エチル、キシロカイン、およびフェナゾピリジンのような麻酔薬と組み合わせてＭＩＦインヒビターを用いて患者を治療することが有用である場合がある。
［実施例］
好ましい実施形態のＭＩＦのインヒビターを、実施例１に記載する方法によって調製できる。実施例２は、活性もしくは搬出の阻害のための、好ましい実施形態の化合物をスクリーニングするためのアッセイを提示する。
【０２７１】
［実施例１］
代表的な化合物の合成
【０２７２】
【化５０】
2005500266.tif 000052
【０２７３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（３５ｍｌ）中のニトロ酢酸エチルの溶液（６．７０ｍｌ、６０．１ｍｍｏｌ）を、９５％  ＮａＨ（１．５２ｇ、６０．２ｍｍｏｌ）を分割しながら用いて処理した。水素の発生が終了した後、反応混合液を８０℃で１５分間加熱した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（６５ｍｌ）中のＮ−メチルイサトイン酸無水物１の溶液（１１．１ｇ、６２．５ｍｍｏｌ）を１５分間かけて添加し、その後、反応液を１２０℃で１８時間加熱した。蒸留により溶媒を除去し、残留物を水に溶解させ、６Ｎ  ＨＣｌを用いて酸性化させた。生じた沈殿を回収し、水で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２／エーテルからの残渣の再結晶化により、黄色固体としてキノリノン２ａ（５．７５ｇ、４３％）が得られた。
【０２７４】
【化５１】
2005500266.tif 000053
【０２７５】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（３５ｍｌ）中のマロン酸ジエチルの溶液（１８．８ｍｌ、１１１ｍｍｏｌ）を、９５％  ＮａＨ（２．８０ｇ、１１１ｍｍｏｌ）を分割しながら用いて処理した。水素の発生が終了した後、反応混合液を８０℃で１５分間加熱した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１４０ｍｌ）中のＮ−メチルイサトイン酸無水物１の溶液（２２．０ｇ、１２４ｍｍｏｌ）を１５分間かけて添加し、その後、反応液を１２０℃で１８時間加熱した。蒸留により溶媒を除去し、残留物を水中に溶解させ、６Ｎ  ＨＣｌを用いて酸性化させた。生じた沈殿を回収し、水で洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２／エーテルからの残渣の再結晶化により、白色固体としてキノリノン２ｂ（１１．７ｇ、４０％）が得られた。
【０２７６】
【化５２】
2005500266.tif 000054
【０２７７】
アルコール２（６．２ｇ  ２ａ；１１．１ｇ  ２ｂ）をＰＯＣｌ３（２ａについては７０ｍＬ；２ｂについては１４０ｍＬ）中に溶解させ、この溶液を９５℃で３時間加熱した。蒸留によってＰＯＣｌ３を除去し、反応混合液を氷水５００ｍＬ中に注ぎ入れた。飽和ＮａＨＣＯ３を使用してこの水溶液を中和し、沈殿を濾過によって回収し、塩化メチレン中に再溶解させ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗反応生成物をエチルエーテルからの再結晶化によって精製して３．５ｇの３ａ（５２％）または７．８ｇの３ｂ（６５％）を得た。
【０２７８】
【化５３】
2005500266.tif 000055
【０２７９】
Ｎ−ＢＯＣピペラジン４（５．０ｇ；２７ｍｍｏｌ）をピリジン（１５ｍＬ）中に溶解させ、２０ｍｇのＤＭＡＰを添加した。この溶液に純酸塩化物を０〜５℃で５分間にわたってゆっくりと添加した。生じた粘性ペーストを室温で一晩（１５時間）攪拌し、その後氷上に注ぎ入れた。白色結晶沈殿を濾過により回収し、風乾させ、減圧下で乾燥させて対応するＮ−ＢＯＣ−Ｎ−アシルピペラジン５ａ（６．５ｇ；８３％）または５ｂ（４．８ｇ；９４％）を得た。直ちに次のステップで粗反応生成物を使用して、この化合物を１００ｍＬの塩化メチレン中に溶解させ、純ＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。室温に３時間置いた後、溶液を蒸発させ、残留物を塩化メチレン中に溶解させ、ＮａＨＣＯ３（飽和）で洗浄した。塩化メチレンを用いて水性相を１０回抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で混合有機相を乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させて、化合物６ａ（４．５ｇ；２段階にわたって９１％；７５％）、または化合物６ｂ（２．９５ｇ；２段階にわたって７０％；６６％）、またはＬａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓから市販で入手できるような化合物６ｃ（製品番号１８６９８）を得た。
【０２８０】
【化５４】
2005500266.tif 000056
【０２８１】
トルエン中のクロロキノロン３の溶液にピペラジン６を添加し、ピリジン１０滴を添加し、その後１２〜１４時間にわたり１００℃へ加熱した。この混合液を室温へ冷却し、乾燥するまで蒸発させ、塩化メチレン中に再溶解させ、食塩水で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で有機溶媒を乾燥させ、減圧下で除去した。クロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ８５：１５）により、出発原料（３０〜４０％）を回収するとともにＣＢＸ生成物７を得た。この反応の生成物の収量を表１に提供する。
【０２８２】
【表１】
2005500266.tif 000057
【０２８３】
分析データ
７ａ．  ｍｐ（融点）  １６７〜１５９℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ７．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｄｔ，１Ｈ），７．４９（ｄ，１Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ），７．３５（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｂｓ，４Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．３（ｔ，４Ｈ）；Ｃ１９Ｈ１９Ｏ４Ｎ４ＳについてのＨＲＭＳ（ＦＡＢ）計算値３９９．１１２７、実測値３９９．１１１７；Ｃ１９Ｈ１８Ｎ４Ｏ４Ｓについての分析計算値：Ｃ、５７．２８；Ｈ、４．５５；Ｎ、１４．０６；Ｏ、１６．０６；Ｓ、８．０５、実測値：Ｃ、５６．７８；Ｈ、４．５０；Ｎ、１３．７３。
【０２８４】
７ｂ．  ｍｐ（融点）２１５〜２１７℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ７．８５（ｄｄ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｍ，５Ｈ），７．４２（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｍ，４Ｈ）；Ｃ２１Ｈ２１Ｎ４Ｏ４についてのＨＲＭＳ（ＦＡＢ）の計算値３９９．１５６３、実測値３９３．１５４０；Ｃ２１Ｈ２０Ｎ４Ｏ４についての分析計算値：Ｃ、６４．２８；Ｈ、５．１４；Ｎ、１４．２８；Ｏ、１６．３１、実測値：Ｃ、６４．８４；Ｈ、５．１６；Ｎ、１３．７８。
【０２８５】
７ｃ．  ｍｐ（融点）１８３〜１８５℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ７．９５（ｄｄ，１Ｈ），７．６１（ｍ，１Ｈ），７．４８（ｍ，１Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｍ，１Ｈ），７．２５（Ｍ，１Ｈ），７．０７（Ｍ，１Ｈ），４．４４（ｑ，２Ｈ），３．９５（ｂｓ，４Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｂｓ，４Ｈ），１．４４（ｔ，３Ｈ）；Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ３ＳについてのＨＲＭＳ（ＦＡＢ）の計算値４２６．１４８８、実測値４２６．１４８７；Ｃ２２Ｈ２３Ｎ３Ｏ４Ｓについての分析計算値：Ｃ、６２．１０；Ｈ、５．４５；Ｎ、９．８８；Ｏ、１５．０４、Ｓ，７．５４、実測値：Ｃ、６２．０８；Ｈ、５．４５；Ｎ、９．７７。
【０２８６】
７ｄ．  ｍｐ（融点）１６４〜１６６℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ７．９２（ｄｄ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｍ，５Ｈ），７．３７（ｍ，１Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｑ，２Ｈ），３．６５（ｂｓ，７Ｈ），３．２０（ｂｓ，４Ｈ），１．４６（ｔ，３Ｈ）；Ｃ２４Ｈ２６ＮＯ３についてのＨＲＭＳ（ＦＡＢ）の計算値４２０．１９２３、実測値４２０．１９３４；Ｃ２４Ｈ２５Ｎ３Ｏ４についての分析計算値：Ｃ、６９．７２；Ｈ、６．０１；Ｎ、１０．０２；Ｏ、１５．２６、実測値：Ｃ、６６．３２；Ｈ、６．０１；Ｎ、９．６６。
【０２８７】
７ｅ．  ｍｐ（融点）１８９〜１９１℃；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ７．９６（ｄｄ，１Ｈ），７．７１（ｄｔ，１Ｈ），７．５１（ｂｄ，１Ｈ），７．４４（ｂｄ，１Ｈ），７．３７（ｂｔ，１Ｈ），７．０９（ｄ，１Ｈ），６．５１（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｂｍ，４Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｔ，４Ｈ），；Ｃ１９Ｈ１９Ｎ４Ｏ５についてのＨＲＭＳ（ＦＡＢ）の計算値３８３．１３５５、実測値３８３．１３５８；Ｃ１９Ｈ１８Ｎ４Ｏ５についての分析計算値：Ｃ、５９．６８；Ｈ、４．７４；Ｎ、１４．６５、実測値：Ｃ、５９．３９；Ｈ、４．７９；Ｎ、１４．３６。
【０２８８】
［実施例２］
マクロファージ遊走アッセイ
マクロファージの遊走を、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｓｔｎｙら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１０（３）：７５２−７５９，  １９７３によって記載されているアガロースドロップアッセイおよび毛細管法を使用して測定した。簡潔には、マクロファージを含有するサンプルを内径１．２ｍｍ、長さ７５ｍｍのヘマトクリット管に添加した。これらの管をヒートシールし、１００×Ｇで３分間遠心分離し、細胞−液界面で切断し、Ｓｙｋｅｓ−Ｍｏｏｒｅ培養チャンバー内のシリコーングリースドロップ中に包埋した。この培養チャンバーには、対照タンパク質（ＢＳＡ）またはサンプルのいずれかが含まれる。遊走領域を、３７℃での２４および４８時間のインキュベーション後に、マクロファージファンの影像がトレースし、遊走領域が面積測定法により測定して決定した。
【０２８９】
あるいはまた、９６ウェルプレートの各ウェルを、各ウェルの中央部に分注した水中の０．８％（ｗ／ｖ）Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅの液体１マイクロリットルで予めコーティングした。このプレートをアガロースドロップがちょうど乾燥するまで穏やかにライトボックス内で加温した。０．２％アガロース（ｗ／ｖ）を含有し、３７℃へ加熱した培地（ＭＩＦまたは他の対照を含む、もしくは含まない）中に２５％（ｖ／ｖ）までの細胞懸濁液を含有するマクロファージ２マイクロリットルを予めコーティングしたプレートウェルへ添加し、５分間かけて４℃へ冷却させた。その後、各ウェルに培地を充填し、３７℃の５％ＣＯ２−９５％大気下で４８時間インキュベートした。アガロースドロップからの遊走は、２４および４８時間後にドロップ辺縁から遊走の周囲までの距離を測定することによって測定した。
【０２９０】
遊走アッセイ
組換えマウスおよびヒト野生型およびマウス変異体ＭＩＦの単球遊走阻害活性を、修正ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバーフォーマット中のヒト末梢血単核球またはＴ細胞欠失単核球を使用して分析した。カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭ−標識単球を、Ｌ−グルタミン（フェノールレッドを含まない）および０．１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中に２．５〜５×１０６／ｍＬの濃度で懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート（２００μＬ）を、３７℃に予め加温したＵ底９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，ケンブリッジ、ＭＡ）のウェルに添加する。ＲＰＭＩ  １６４０中のＭＩＦを細胞懸濁液へ添加し、１、１０、１００および１，０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度とした。この培養プレートを温度調節したプレートリーダーのチャンバー内に入れ、３０秒間混合し、３７℃で１０〜２０分間インキュベートする。インキュベーション中に、１０もしくは２５ｎｇ／ｍＬでの２８μＬの予め加温したヒト単球化学走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１；Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．，ロッキーヒル、ＮＪ）または０．１ｍｇ／ｍＬ  ＨＳＡを含むＲＰＭＩ  １６４０をＣｈｅｍｏ  ＴＸプレート（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，ゲーサーズバーグ、ＭＤ；ウェル径３ｍｍ、フィルター孔径５μＭ）の底部ウェルへ添加した。フィルタープレートをベースプレートへ注意深く追加した。処理した細胞懸濁液をインキュベーターから取り出し、フィルタープレートの各ウェルに３０μＬ添加した。組立てたプレートを、５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿チャンバー内で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞懸濁液をフィルター表面から吸引し、引き続いてフィルターをベースプレートから取り除き、各フィルター区間に５０μＬの１×  ＨＢＳＳを添加することによって３回洗浄した。洗浄の合間には、スキージ（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社製）を使用して残留ＨＢＳＳを除去した。フィルターを風乾させ、その後４８５ｎｍでの励起および５３５ｎｍでの発光により、蛍光プレートリーダーにおいて直接読み取った。化学走化性遊走指数またはランダム遊走指数は、所定ウェルセットについての平均フィルター結合蛍光をＭＣＰ−１もＭＩＦも含有していないウェル中のフィルターの平均蛍光で割った数値であると定義されている。蛍光標識細胞の滴定により、このアッセイで検出した蛍光レベルが細胞数との直線的な関係を有することが明らかになった（示されていない）。
【０２９１】
［実施例３］
トートメラーゼアッセイ
互変異性化反応は、本質的にＲｏｓｅｎｇｒｅｎら，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２（１）：１４３−１４９，  １９９６によって報告されているように実施した。Ｄ−ドパクロムから５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸への変換を評価した。０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を含有するサンプル液中に０．４２ｍＭの基質および１．４μｇのＭＩＦを含有する１ｍＬのサンプルキュベットを調製し、イミノクロム吸光度の低下率を４７５ｎｍで追跡した。対照としてＬ−ドパクロムを使用した。さらに、反応生成物は、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ４．０）および１５％メタノールを含有する流速１．２ｍＬ／分の移動相を利用して、ＨＰＬＣを使用して追跡することができる。蛍光測定法による検出は２９５／３４５ｎｍで行った。
【０２９２】
あるいはまた、ピルビン酸フェニルまたは（ｐ−ヒドロキシフェニル）ピルビン酸を利用した互変異性化反応は本質的にＪｏｈｎｓｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３８：１６０２４−１６０３３，  １９９９によって報告されている通りに実施した。このバージョンでは、ピルビン酸フェニルのケトン化が２８８ｎｍ（ε＝１７３００Ｍ−１  ｃｍ−１）で監視され、（ｐ−ヒドロキシフェニル）ピルビン酸のケトン化は３００ｎｍ（ε＝２１６００Ｍ−１  ｃｍ−１）で監視される。アッセイ混合液を、初期ライナー率を得るために、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＨＰＯ４緩衝液（１ｍＬ、ｐＨ６．５）および十分に希釈したＭＩＦ溶液のアリコート（２．３ｍｇ／ｍＬ溶液０．５〜１．０μＬ、最終濃度９３〜１８６ｎＭ）を含有している。このアッセイを、エタノール中で作製した原液から少量（１〜３．３μＬ）のピルビン酸フェニルまたは（ｐ−ヒドロキシフェニル）ピルビン酸のいずれかを添加することによって開始した。ピルビン酸フェニルまたは（ｐ−ヒドロキシフェニル）ピルビン酸の結晶形態は、もっぱらエノール異性体としてのみ存在した（Ｌａｒｓｅｎら，  Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｂ  ２８：９２−９６，１９７４）。基質の濃度範囲は１０〜１５０Ｍに及ぶ可能性があり、０．５％  ｖ／ｖ未満ではエタノールによるＭＩＦ活性の有意な阻害は観察されなかった。
【０２９３】
［実施例４］
免疫沈降法およびウェスタンブロット分析
候補化合物の活性、ＭＩＦ発現、トラッフィキング、および搬出を特性付けるように、細胞培養実験を設計した。免疫沈降法のための細胞および馴化培地画分は、遠心分離機中での１５分間の遠心分離による明澄化の後に培地画分へ４００μｌの溶解緩衝液（１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸塩、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．０１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｎｇ／ｍｌのアプロチニン、１０ｎｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｎｇ／ｍｌのペプスタチン）を添加する以外は、本質的に以前に報告された（Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚら，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ４：２６５−２７５，  １９９１；Ｆｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚら，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ６３８：１０９−１２６）通りに調製した。細胞または培地画分をＭＩＦに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と一緒にインキュベートし、さらにＧａｍｍａＢｉｎｄ（登録商標）Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製、ウプサラ、スウェーデン）を添加してさらに３０分間インキュベーションした。免疫複合体を微量遠心分離により沈降させ、溶解緩衝液で３回洗浄し、さらに氷冷した免疫沈降法用の洗浄緩衝液で４回洗浄した（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％デオキシコール酸塩、１％  ＮＰ−４０、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）。免疫複合体はＳＤＳゲルサンプル緩衝液１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．００４％ブロムフェノールブルー、２ｍＭ  ＥＧＴＡ中で直接に解離させ、さらに１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このゲルを蛍光間接撮影法のために処理し、乾燥させ、そして−７０℃でＸ線フィルムに露光させた。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを免疫沈降させるときには、ウサギ抗−ＮＰＴ抗体（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ製、ボールダー、ＣＯ）を使用した。
【０２９４】
ウェスタンブロット分析のためには、タンパク質を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから２５ｍＭ  ３−［ジメチル（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパン−スルホン酸（ｐＨ９．５）、２０％メタノールを含有する低温緩衝液中のニトロセルロース膜（孔径０．４５μｍ）へ０．４ａｍｐｓで９０分間移した。細胞馴化培地のウェスタンブロット分析のためには、培地を遠心分離し（８００ｇで１０分間）、上清を膜濾過（１０ｋＤａ  カットオフ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０  Ａｍｉｃｏｎ）により１０分の１に濃縮した。その後サンプルを還元条件下で１６％  ＳＤＳ  Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ、サンディエゴ、ＣＡ）上で溶解させ、２０Ｖで３時間にわたりニトロセルロース膜（Ｎｏｖｅｘ）上に移した。膜を、ウサギポリクローナル抗−ラット抗体（１：１０００）（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｂｉｏｌａｂ、サンディエゴ、ＣＡ）と一緒に、そして引き続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体（１：１０００）（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、ＩＬ）と一緒にインキュベートした。ＭＩＦはクロロナフトノール／Ｈ２Ｏ２を用いた展開によって可視化した。組換えＭＩＦ（２ｎｇ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入、ミネアポリス）を電気泳動にかけ、標準として移した。膜を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＮ３、０．３５％ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレートおよび５％無脂肪粉乳（Ｃａｍａｔｉｏｎ社製，ロサンゼルス、ＣＡ）中で室温で１時間かけてブロックした。膜はモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入、製品番号ＭＡＢ２８９、ミネアポリス、ＭＮ）またはポリクローナル抗体（ヤギポリクローナル血清、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製、製品番号ＡＦ−２８９−ＰＢ）と一緒にインキュベートした。インキュベーション後、膜を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＮａＮ３、および０．０５％ポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレートを含有する緩衝液を１０回取り替えて室温で洗浄した。モノクローナル抗体を用いた場合は、膜をその後１μｇ／ｍＬウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ウェストグローブ、ＰＡ）を含有するブロッキング緩衝液中で室温で３０分間インキュベーションした。ポリクローナルのプロービングのためには、インキュベーションにウサギ抗ヤギ抗体（Ｓｉｇｍａ、製品番号Ｇ５５１８）を使用した。その後膜を１Ｌの上記の緩衝液中で洗浄し、１５μＣｉの１２５Ｉタンパク質Ａ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製、コスタメサ、ＣＡ）を含有するブロッキング緩衝液１００ｍｌ中で１時間インキュベートし、１Ｌの緩衝液で洗浄した。放射性シグナルをオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０２９５】
ある実験では、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、さらに例えば化合物７ｅのような候補化合物の様々な量を用いて処理したＴＨＰ−１細胞から、一晩馴化させた培地を採取し、ＭＩＦ結合を検出するために、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いる免疫沈降法によってスクリーニングした。図１に示したように、馴化培地は、１０μＭの化合物７ｅの存在下でモノクローナル抗体を使用した場合に検出可能なＭＩＦの統計的有意な消失を証明したが、これはポリクローナル抗体を用いた場合には観察されなかった。この反応は、ＭＩＦ酵素活性に化合物７ｅが及ぼす作用を正確に映し出している。したがって、この実験はモノクローナル反応性が酵素活性に対する代理マーカーとして機能できることを証明している。
【０２９６】
別の実験（図２）では、様々な濃度の５種のインヒビターアナログをＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞に対して添加し、一晩かけてインキュベートした。翌日、検出した免疫反応性のＭＩＦの量をＥＬＩＳＡによって評価した。化合物７ｅは、アナログ化合物７ｂおよび化合物７ｄを用いて得られた応答に類似して、２μＭのＥＤ５０によって用量依存性様式で、ＭＩＦを認識する抗体の能力を阻害した。対照的に、アナログ化合物７ａおよび化合物７ｃの活性はほぼ１００倍以上高かった。
【０２９７】
また別の実験（図３）では、化合物７ｅがＴＨＰ−１細胞によって産生されたＭＩＦの免疫反応性を低下させる能力を測定した。ＴＨＰ−１細胞を１０μｇ／ｍＬのＬＰＳを用いて処理し、１０μＭの化合物７ｅをＬＰＳ刺激後の様々な時点で添加し、抗ＭＩＦモノクローナルを用いて免疫反応性を監視した。示すように、化合物７ｅの添加後、免疫反応性は急速に消失した。したがって、この実験は、化合物が最初に様々な時点に細胞培養へ添加され、その後対応する馴化培地サンプルを時間依存性方法で処理した場合の、ＭＩＦの検出に対する化合物もしくは緩衝液のみである対照の活性を測定する。
【０２９８】
上記の実験（図３）では、化合物７ｅがＭＩＦタンパク質への抗体結合を調節する能力をＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞の存在下で分析した。しかし、図４に示した実験では、化合物７ｅがＭＩＦの抗体認識を調節する能力を生きている細胞の不在下で予め馴化させた培地を使用して試験した。この実験では、ＬＰＳを上記の通りに培地中のＴＨＰ−１細胞へ添加した。６時間後、馴化培地を除去し、細胞残屑を取り除いて、ＭＩＦの量が２２ｎｇ／ｍＬであると決定した。この予め馴化させた培地をその後２群に分割した。両群を３７℃で様々な時間にわたってインキュベートし、その後化合物７ｅまたは緩衝液のみ（対照）を添加して３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。検出可能なＭＩＦのレベルを、検出用のモノクローナル抗ＭＩＦ抗体を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。ＭＩＦ特異的ＥＬＩＳＡシグナルの急速な消失は化合物７ｅの存在に依存している。ＭＩＦの対照レベルは変化しない。したがって、この実験は、化合物７ｅがＭＩＦと相互作用し、この抗体が細胞の不在下でもなお引き続いて、ＭＩＦと相互作用する抗体の能力をブロックすることを実証した。この相互作用は触媒部位で生じるので、または触媒活性を抑制するので、免疫反応性の消失は酵素活性の消失および／またはＭＩＦ関連活性と相関している。
【０２９９】
［実施例５］
細胞外位置決定アッセイ
さらにＭＩＦ搬出を調節する化合物７ｅのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性を評価するために、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、ＶＡ）を選択した。
【０３００】
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（１ウェル当たり３×１０６個の細胞）を１２ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製）内にプレーティングし、ＲＰＭＩ／１％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ローガン、ＵＴ）中で培養した。５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿大気中で３時間インキュベートした後、付着していない細胞を取り除き、ＲＰＭＩ／１％  ＦＢＳを用いて２回洗浄した。その後、細胞を、純度が約９５％で発熱物質を含まない水中に再懸濁させた、濃度範囲が１ｐｇ／ｍｌ〜１，０００ｎｇ／ｍｌ（用量応答実験のために）のＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）またはＴＳＳＴ−１（Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サラソータ、ＦＬ）と一緒に２４時間インキュベートした。時間経過実験のために、平行培養の馴化培地を、１ｎｇ／ｍｌ  ＴＳＳＴ−１またはＬＰＳによる刺激後に０．５、１、２、４、８および２４時間の間隔をあけて取り出した。阻害試験のためには、ＲＡＷ２６４．７細胞（１ウェル当たり３×１０６個の細胞）を０．０１Ｍ〜１０Ｍの化合物７ｅまたは緩衝液（対照として）の存在下で１ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）または１ｎｇ／ｍｌのＴＳＳＴ−１と一緒に２４時間インキュベートした。細胞馴化培地中のＭＩＦをフィルター上で濃縮し、サンプル中に残留しているＭＩＦをウェスタンブロッティング法により分析し、さらにＭＩＦバンド密度もＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ（登録商標）によって測定した。
【０３０１】
ＲＡＷ細胞を、１ｎｇ／ｍＬのＴＳＳＴ−１またはＬＰＳのいずれかの添加によってＭＩＦを発現するように誘導して、２４時間培養した。図５に示したように、緩衝液のみを用いてインキュベートした細胞と比較して、化合物７ｅは濃度依存的様式で馴化培地中の免疫検出可能なＭＩＦレベルを低下させ、約０．０４μＭのＩＣ５０を生じた。ＲＡＷ細胞のＴＳＳＴ−１刺激に引き続いて化合物７ｅの存在下で検出したＭＩＦのレベルを図６に示す。緩衝液のみを用いてインキュベートした細胞と比較して、約０．３μＭのＩＣ５０を生じた。
【０３０２】
［実施例６］
細胞培養、トランスフェクションおよび代謝標識
アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した標的細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １６５０）を、４８ウェルプレートにおいて、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｎＭ非必須アミノ酸、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補給したＤＭＥＭ中で一晩培養した。その後、標的細胞を、２μｇ／ｍｌのＣｓＣｌ精製プラスミドＤＮＡを含有しているトランスフェクション緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．９ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４））でトランスフェクトした。各ウェルにＤＮＡを含有している３００μｌのトランスフェクション緩衝液を添加した。細胞を３７℃で３０分間培養し、緩衝液を吸引した。１００μｍのクロロキンを添加した加温培地を１．５時間かけて添加した。この培地を除去し、完全培地を用いて細胞を２回洗浄する。その後、細胞を４０〜４８時間培養した。目的のプラスミドを、選択可能なマーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含有するｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、パロアルト、ＣＡ）をと共に同時にトランスフェクトした。２μｇの目的のプラスミドを１０μｇのｐＭＡＭｎｅｏと同時トランスフェクトすると、トランスフェクトされた細胞の７０％以上が、免疫蛍光顕微鏡検査法によって測定したときに、ＭＩＦおよびｎｅｏの両方を発現した。
【０３０３】
免疫沈降アッセイのために、標的細胞を、１ｍＬのメチオニンおよびシステインを含有しないＤＭＥＭ中で、１００μＣｉの３５Ｓ−メチオニンおよび／または３５Ｓ−システインを用いて１５分間かけて代謝的にパルス標識した。標識後、細胞単層は、過剰（１０ｍＭ）の未標識メチオニンおよびシステインを補給したＤＭＥＭを用いて１〜２分間かけて１回洗浄した。その後、細胞をこの培地２ｍｌ中で示した時間の間培養し、細胞上清をリーダーレスタンパク質の存在について免疫沈降させる。示した培養物については、追跡培地に示した濃度で調節剤を補給した。
【０３０４】
あるいはまた、ＥＬＩＳＡによる解析のために、標的細胞を２５０μｌの０．１Ｍ炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．４）を用いて１〜２分間かけて１回洗浄し、直ちに吸引した。あるいはまた塩含量の高い溶液が好ましい場合がある。細胞を０．５％  ＦＢＳと２５μｇ／ｍｌのヘパリンを含有する培地で洗浄し、さらに示した時間の間、この同一の培地中で細胞をインキュベートした。示した培養物については、追跡培地に示した濃度で調節剤を補給した。ｈＣＧ−αのようなリーダー配列を含有するタンパク質またはいずれかその他の非ヘパリン結合タンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされた細胞については、炭酸塩での洗浄およびヘパリン含有培地は省略することができる。
【０３０５】
［実施例７］
ＭＩＦインヒビターについての高スループット・スクリーニングアッセイ
ＭＩＦインヒビターについての高スループット・スクリーニングアッセイをＴＨＰ−１細胞によって産生したＭＩＦを使用して９６ウェル形式で実施し、以下の通りに行った。ＭＩＦアッセイを上記の通りにＥＬＩＳＡによって実施した。ＴＨＰ−１細胞を、２０μｇ／ｍｌの細菌ＬＰＳを含有するＲＰＭＩ培地中の約５×１０６個の細胞／ｍＬへ再懸濁し、この細胞を１８〜２０時間インキュベートした。引き続いて細胞上清を回収し、推定インヒビターとともにインキュベートした。簡潔には、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、Ｎｏ．３５９０）ＥＬＩＳＡプレートを４μｇ／ｍｌの濃度で３７℃、２時間かけてＭＩＦモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製、製品番号ＭＡＢ２８９）でコーティングした。未希釈培養上清をＥＬＩＳＡプレートへ添加して室温で２時間インキュベートした。その後、これらのウェルを洗浄し、ビオチン化ＭＩＦポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製、製品番号ＡＦ−２８９−ＰＢ）を添加し、その後ストレプトアビジン−ＨＲＰおよび色素産生基質を添加した。ＭＩＦの量を、ＭＩＦ標準曲線からの外挿によって計算した。
【０３０６】
［実施例８］
血清中の候補インヒビターのＨＰＬＣ分析
ｉｎ  ｖｉｖｏで任意の小分子の作用を評価する前に、血液のような体液中の化合物を定量的方法で検出できることが望まれる。化合物７ｅを含むＭＩＦのインヒビターのような試験化合物を最初に再現可能に検出し、その後、生体液中でのその濃度を測定するための分析方法を確立した。
【０３０７】
ＲＰ−ＨＰＬＣを、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ−８（内径４．６×７５ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製、ミルフォード、ＭＡ）を使用するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ社製Ｈｐ−１１００型を用いて実施した。移動相は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する３５％アセトニトリル／水のイソクラティック溶液であった。吸光度を２３５ｎｍで監視した。血清中の試験化合物の量を測定するために、サンプル血清タンパク質を、最初に５０％アセトニトリルを用い（４℃、一晩）、続いて、１４，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって分離した。次いで、上清をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、既知の標準の検量線に基づいて化合物の濃度を計算した。この手順にしたがって、逆相ＨＰＬＣを使用して、スパイクされた試験サンプル（示されていない）を使用して１．５〜８００ｎｇ（Ｒ２＝１）の線形範囲内で化合物７ｅを検出した。化合物７ｅ（０．４ｍｇ／２０ｇ、マウス）を接種した動物由来の血清について上記の分析方法を適用し、化合物７ｅの循環中濃度を定量的に測定した。
【０３０８】
化合物７ｅを定量するための上記の方法の発達に伴って、化合物の様々な投与経路の有効性を評価して生体活性を特性付けることが可能である。時間依存性の血清の生体内利用率を試験するために、動物を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）（図７Ａ）および胃管栄養により経口的に化合物７ｅを用いて処置した（図７Ｂ）。
【０３０９】
［実施例９］
ＭＩＦのＩｎ  ｖｉｖｏでの阻害
以下のＩｎ  ｖｉｖｏ実験の目的は、化合物７ｅを使用してＭＩＦを阻害する初期ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を確証することであった。ＬＰＳによって誘導される毒性は、ＭＩＦならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの過剰産生に関連すると思われる。そこでこれらの炎症メディエーターを中和または阻害することによって動物をエンドトキシンショックから保護することができる。本モデルを選択したのは、これが敗血症および敗血症性ショックの再現性がありかつ迅速な致死モデルを提供するからである。
【０３１０】
リポ多糖（ＬＰＳ）の用量は、各実験の前に新しく作製した。ＬＰＳ（大腸菌［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ］  ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ社製）をエンドトキシンの５ｍｇバイアルへ０．５％  ＴＥＡ（１ｍＬ  ＵＳＰ水＋５ｍＬトリエチルアミン（Ｐｉｅｒｃｅ社製））を添加することによって再構成した。再構成した後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。引き続いて、この溶液を３０秒間ずつ３回、５６〜６０℃の水浴超音波処理器中で超音波処理した。超音波処理後、混合液を連続して３分間、ボルテックスミキサーで撹拌した。これでＬＰＳの原液の使用準備が整った。
【０３１１】
血液中でのＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αおよびＭＩＦの検出
１０週齢（２０±２ｇ）の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、キングストン、ＮＹ）を１ケージ当たり５匹ずつの群で収容し、動物には飼料および水を自由に摂取させ、実験を実施する前に少なくとも１週間馴化させた。実験当日、マウスの体重を計量し、平均体重がほぼ等しくなるように各群１０匹となるように無作為に配分した。マウスにはＬＰＳ（大腸菌０１１１：Ｂ４、１０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ［体重］）およびＤ−ガラクトサミン（５０ｍｇ／ｋｇ［体重］）のｉ．ｐ．注射直前に２００μＬの調製化合物７ｅまたは緩衝液単独を腹腔内注射した。各用量のＬＰＳ（体重２０ｍｇのマウスに対して０．２ｍＬ）を腹腔内投与し、最終濃度が１ｍｌ当たり５０ｍｇのＤ−ガラクトサミンと混合した。心臓穿刺により採取した血液試料の採取後に、動物を屠殺した。典型的な採取は、ＬＰＳ処置４時間後に実施した。血清を、製造業者のプロトコールにしたがって血清分離器（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製、ミネアポリス、ＮＪ）中で分離した。マウス血清ＩＬ−１およびＴＮＦ−を、製造業者の指示にしたがって「マウスＩＬ−１βイムノアッセイまたはマウスＴＮＦ−αイムノアッセイ」キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製、ミネアポリス、ＭＮ）を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。マウス血清中のＭＩＦ濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＣｈｅｍｉＫｉｎｅ  ＭＩＦキット、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製、サンディエゴ、ＣＡ）によって定量した。サンプルを２回ずつ分析し、結果の平均をとった。
【０３１２】
マウスＬＰＳモデル
８〜１０週齢（２０±２ｇ）の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを上記の通りに収容し、馴化させた。実験当日、マウスの体重を計量し、各群５匹の平均体重がほぼ等しくなるように無作為に配分した。マウスにはＬＰＳ（大腸菌０５５Ｂ５、Ｓｉｇｍａ製）（４０、１０、５、２もしくは０．５ｍｇ／ｋｇ［体重］）および５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ガラクトサミンのｉ．ｐ．注射後に２００Ｌの調製化合物７ｅまたは緩衝液（平均２０ｍｇ／ｋｇ［化合物］）を注射した。最初の１８時間中には２時間毎、その後７日間は１日２回マウスを観察した。これらの試験については、動物の生存率を評価するためにカプラン・マイアー推定法を使用した。
【０３１３】
すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためには、カテゴリーデータについてはフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）検定、連続変量についてはマンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して治療群間の標準統計学的比較を実施した。血清中ＩＬ−１レベルが血清中ＭＩＦと相関しているかどうかを判定するためには、フィッシャー検定を適用した。解析は、Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ  ５．０ソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製、バークリー、ＣＡ）を用いて実施した。両側検定を受け、０．０５未満の数値である報告されたすべてのｐ値は統計的有意性を示すと見なされた。
【０３１４】
マウスモデル系（雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス）における内因性ＭＩＦの基線レベルを決定し、そしてさらにＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた処置後の内因性ＭＩＦにおける増加の速度および程度を判定するために、初期対照実験を実施した。雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５０ｍｇ／ｋｇのβ−ガラクトサミンを混合したＬＰＳ（０１１１：Ｂ１）を用いて処置した。血清中のＭＩＦのレベルは、上記の通りにＬＰＳ／ガラクトサミン処置の０、２、５および６時間後にＨＰＬＣによって測定した。この代表的実験の開始時に、内因性ＭＩＦの基線レベルは約４５ｎｇ／ｍＬであった。しかし、この６時間に及ぶ実験の経過にわたって、採取された血清サンプル中で検出されたＭＩＦのレベルには時間依存性上昇が見られた。マウスを化合物７ｅ（５０％水溶液中で調製）および１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳで処置すると、検出できる循環中ＭＩＦのレベルには統計的有意な減少が見られた（ｐ＝０．０５）。図９Ａに示した実験では、ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝２０）マウスにはＬＰＳ投与時に２０ｍｇ／ｋｇ［体重］の化合物７ｅを腹腔内注射した。血液サンプルを５．５時間後に採取した。結果は、該インヒビターで処置した動物はＬＰＳに応答する能力が低下しており、そしてＭＩＦレベルの低下が検出されることを証明している。マウスにＬＰＳ用量の半分（５ｍｇ／ｋｇ）を投与したまた別の試験では、血清中のＭＩＦを処置の４時間後に測定した。このデータは、ＭＩＦにおける高度に統計的有意な（ｐ＝０．０００３）６０％の減少を明らかにしている（図９Ｂ）。また別の試験では、ＭＩＦおよびＩＬ−１βの両方をＥＬＩＳＡによってマウス血清中で測定した。図１０に示したように、これらの間には直接的かつ高度に有意な相関が存在する。この相関はまた、ＭＩＦとＴＮＦ−α間でも観察された（データは示していない）。同様の実験で、血清中１Ｌ−１βレベルおよび血清中ＴＮＦ−αレベルの減少が２０ｍｇ／ｋｇの化合物７ｅの投与後に観察された（図１１）。
【０３１５】
ＬＰＳによって誘発される実験的毒性ショック試験では、ＭＩＦおよびＴＮＦ−αが中心的役割を果たすことが明らかになった。ＬＰＳがマクロファージ様細胞がＭＩＦを産生するように刺激し、これが順にマクロファージ様細胞によるＴＮＦ−α分泌を誘導するという事実は、ＬＰＳの病因におけるＭＩＦの潜在的役割を示唆している。化合物７ｅがＬＰＳショックを防止できるかどうかを試験するために、β−Ｄ−ガラクトサミンを用いて感作したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける致死性ＬＰＳ媒介性ショックのモデルを使用した。致死量のＬＰＳの注射（２、５および１０ｍｇ／ｋｇ）時点での化合物７ｅを用いた処置は、生存率を６％から４７％へ上昇させた（ｐ＝０．０００４）（図１２）。これらの作用は使用されるＬＰＳの濃度によって調節されるので、高濃度のＬＰＳを使用した場合には、化合物７ｅの作用が飽和性であるので、したがって特異的であることを証明している。表２は、化合物７ｅが濃度依存性でマウスをＬＰＳによって誘導される毒性ショックから保護することを示している、数回の生存率実験の要約である（使用したマウス計２１０匹）。図１３もまた、このデータを左側の軸上には２５％生存時間が示されたグラフの形で示している。
【０３１６】
【表２】
2005500266.tif 000058
【０３１７】
ＭＩＦは化合物７ｅの作用を圧倒する
外因性組換えヒトＭＩＦは、化合物７ｅと一緒に投与されたときに該化合物の有益な作用を覆すことができるので、化合物７ｅはマウス血清中におけるＭＩＦレベルを調節することによってＬＰＳに対する動物の抵抗を増加させるように機能するという仮説を支持している。この実施例では、１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳおよび２０ｍｇ／ｋｇの化合物７ｅに加えて動物に３００μｇ／ｋｇのヒト組換えＭＩＦを摂取させること以外は、マウスを標準ＬＰＳプロトコルを用いて処置した。１２時間後に、統計的有意に多数のマウスが化合物７ｅを用いてＬＰＳに耐えて生存したが（ｐ＜０．０１）、この生存率はＭＩＦの投与によって中和される（データは示していない）。
【０３１８】
［実施例１０］
コラーゲン誘発性関節炎モデルにおけるＭＩＦインヒビター
１０〜１２週齢のＤＢＡ／１ＬａｃＪマウス２０匹をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）中に乳化させたウシコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ  １００ｇ）を用いて尾の基部で第０日に免役した。第７日、同一経路を介してコラーゲンの第２回投与を（フロイント不完全アジュバントに乳化させて）実施した。第１４日には、マウスの皮下に１００ｍｇのＬＰＳ（０５５：Ｂ５）を注射した。第７０日には、マウスに４０ｇのＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）を腹腔内注射した。カリパスによって計測した足の厚みにしたがって群を分け、無作為割り付けした後に均衡出発群を作成した。緩衝液中の化合物を第７１、７２、７３および７４日に投与した（０．４ｍｇ／用量での計８回の用量：約２０ｍｇ／ｋｇ［体重］）。その後、マウスの足の厚みを２人の観察者が第７４日に試験した。図１４には本実験を時系列で示した。本実験では、回復した（完全関節炎が減少した）マウスにサイトカイン産生並びに急性炎症を刺激するために第７０日にＬＰＳの最終腹腔内注射により処置した。図１５は、化合物７ｅ処置マウスでは賦形剤単独で処置された対照動物（１．９９ｍｍ）に比較して足の浮腫の減少が軽度である（１．８７ｍｍ）ことを証明している（ｐ＜０．０５）。最終時点に、処置群における動物は対照群と比較してコラーゲン誘発性関節炎の完全発現に到達しなかった（データは示していない）。
【０３１９】
また別の実験では、１０〜１２週齢のＤＢＡ／１Ｊマウス１５匹をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）中に乳化させたウシコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ  １００ｇ）を用いて尾の付け根第０日に免疫した。第２１日、フロイント不完全アジュバントに乳化させたコラーゲンの第２回投与を、同一経路によって投与した。第２８日には、マウスの皮下に１００ｍｇのＬＰＳ（０５５：Ｂ５）を注射した。第７１日には、マウスに４０ｇのＬＰＳ（０１１１：Ｂ４）を腹腔内注射した。群および治療プロトコルは上記と同一であった。第７４日には血液サンプルを採取し、サイトカインを測定した。図１６は、化合物７ｅが未処理のＣＩＡサンプルと比較して血清中のＭＩＦレベルを低下させたことを示している。血清中ＴＮＦ−αレベルのいっそうより有意な阻害が検出された。
【０３２０】
［実施例１１］
実施例１に記載した方法によって以下のＭＩＦのインヒビターを調製した。これらのＭＩＦインヒビターの各々は上記の構造（１ａ）の化合物のクラスに属し、以下の部分が組み込まれている：
【０３２１】
【化５５】
2005500266.tif 000059
【０３２２】
トートメラーゼアッセイの結果は、各々のＭＩＦインヒビター化合物がＭＩＦ活性の有意な阻害を示すことを実証した。
【０３２３】
【化５６】
2005500266.tif 000060
【０３２４】
【化５７】
2005500266.tif 000061
【０３２５】
【化５８】
2005500266.tif 000062
【０３２６】
【化５９】
2005500266.tif 000063
【０３２７】
【化６０】
2005500266.tif 000064
【０３２８】
【化６１】
2005500266.tif 000065
【０３２９】
【化６２】
2005500266.tif 000066
【０３３０】
【化６３】
2005500266.tif 000067
【０３３１】
【化６４】
2005500266.tif 000068
【０３３２】
【化６５】
2005500266.tif 000069
【０３３３】
【化６６】
2005500266.tif 000070
【０３３４】
【化６７】
2005500266.tif 000071
【０３３５】
【化６８】
2005500266.tif 000072
【０３３６】
【化６９】
2005500266.tif 000073
【０３３７】
【化７０】
2005500266.tif 000074
【０３３８】
【化７１】
2005500266.tif 000075
【０３３９】
【化７２】
2005500266.tif 000076
【０３４０】
【化７３】
2005500266.tif 000077
【０３４１】
【化７４】
2005500266.tif 000078
【０３４２】
【化７５】
2005500266.tif 000079
【０３４３】
【化７６】
2005500266.tif 000080
【０３４４】
【化７７】
2005500266.tif 000081
【０３４５】
【化７８】
2005500266.tif 000082
【０３４６】
【化７９】
2005500266.tif 000083
【０３４７】
【化８０】
2005500266.tif 000084
【０３４８】
【化８１】
2005500266.tif 000085
【０３４９】
【化８２】
2005500266.tif 000086
【０３５０】
【化８３】
2005500266.tif 000087
【０３５１】
【化８４】
2005500266.tif 000088
【０３５２】
【化８５】
2005500266.tif 000089
【０３５３】
【化８６】
2005500266.tif 000090
【０３５４】
【化８７】
2005500266.tif 000091
【０３５５】
【化８８】
2005500266.tif 000092
【０３５６】
【化８９】
2005500266.tif 000093
【０３５７】
【化９０】
2005500266.tif 000094
【０３５８】
【化９１】
2005500266.tif 000095
【０３５９】
【化９２】
2005500266.tif 000096
【０３６０】
【化９３】
2005500266.tif 000097
【０３６１】
【化９４】
2005500266.tif 000098
【０３６２】
【化９５】
2005500266.tif 000099
【０３６３】
【化９６】
2005500266.tif 000100
【０３６４】
【化９７】
2005500266.tif 000101
【０３６５】
【化９８】
2005500266.tif 000102
【０３６６】
【化９９】
2005500266.tif 000103
【０３６７】
【化１００】
2005500266.tif 000104
【０３６８】
【化１０１】
2005500266.tif 000105
【０３６９】
【化１０２】
2005500266.tif 000106
【０３７０】
【化１０３】
2005500266.tif 000107
【０３７１】
【化１０４】
2005500266.tif 000108
【０３７２】
【化１０５】
2005500266.tif 000109
【０３７３】
【化１０６】
2005500266.tif 000110
【０３７４】
【化１０７】
2005500266.tif 000111
【０３７５】
【化１０８】
2005500266.tif 000112
【０３７６】
【化１０９】
2005500266.tif 000113
【０３７７】
［実施例１２］
トートメラーゼアッセイの結果は、実施例１１のうちの以下の化合物が特に高レベルのＭＩＦ活性の阻害を示すことを実証した。
【０３７８】
【表３】
2005500266.tif 000114
【０３７９】
【表４】
2005500266.tif 000115
【０３８０】
【表５】
2005500266.tif 000116
【０３８１】
【表６】
2005500266.tif 000117
【０３８２】
【表７】
2005500266.tif 000118
【０３８３】
【表８】
2005500266.tif 000119
【０３８４】
【表９】
2005500266.tif 000120
【０３８５】
【表１０】
2005500266.tif 000121
【０３８６】
［実施例１３］
以下のＭＩＦのインヒビターを調製した。これらのＭＩＦインヒビターの各々は上記に記載した構造（Ｉｂ）を有する化合物のクラスに属する：
【０３８７】
【化１１０】
2005500266.tif 000122
【０３８８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、Ｙ、Ｚおよびｎは上記の構造（Ｉｂ）について規定されている。トートメラーゼアッセイの結果は、各々のＭＩＦインヒビター化合物がＭＩＦ活性の有意な阻害を示すことを実証した。
【０３８９】
【化１１１】
2005500266.tif 000123
【０３９０】
【化１１２】
2005500266.tif 000124
【０３９１】
【化１１３】
2005500266.tif 000125
【０３９２】
［実施例１４］
特定の実施形態のＭＩＦインヒビターは、以下の反応図式、図式５および図式６にしたがって調製できる。これらのＭＩＦインヒビターの各々は上記の構造（Ｉａ）の化合物のクラスに属する。
【０３９３】
反応図式５
この図式では、イサトイン酸無水物をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のＮａＨの溶液中のマロン酸ジエチルと反応させる。次いで、結果として生じる中間物（「１Ｍ００」と呼ぶ）をＰＯＣｌ３との反応によって塩素化して、中間物（「１Ｍ００（Ｃｌ２）」と呼ぶ）を得る。次いで、１Ｍ００（Ｃｌ２）を酢酸中のＮＨ４ＯＡＣと反応させて、中間物（「１Ｍ００（Ｃｌ）」と呼ぶ）を得る。その後、１Ｍ００（Ｃｌ）」をＤＭＦ中のＮ−アシルピペラジンと反応させる。ピペラジン化合物のアシル基は、置換基（「Ｒ３」と呼ぶ）として、図式５に示したようにフラニル基またはチエニル基のいずれか、または後の実施例で列挙したような他の基を含む。結果として生じる中間物を、その後、ハロゲン化合物と反応させる。ハロゲン原子と結合した置換基（「Ｒ４」と呼ぶ）には、後の実施例で列挙するような様々な基が含まれる可能性がある。結果として生じる化合物は、上記の構造（Ｉａ）の化合物である。この反応図式におけるステップを下記に詳細に記載する。図式５にしたがって調製した化合物は、−ＣＯＯＥｔ部分が組み込まれており、以下では「Ｍ」を含有する参照番号で表示する。
【０３９４】
【化１１４】
2005500266.tif 000126
【０３９５】
反応図式６
この図式では、４−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノロンを硝酸と酢酸の混合液と反応させる。次いで、結果として生じる中間物をＰＯＣｌ３との反応によって塩素化させて、別の中間物を得る。その中間物を、その後、ＤＭＦ中のＮ−アシルピペラジンと反応させる。ピペラジン化合物のアシル基は、図式５の説明で挙げたＲ３基を置換基として含む。結果として生じる中間物を、その後、図式５の説明で挙げたＲ４が置換基として含まれているハロゲン化合物と反応させる。結果として生じる化合物は上記の構造（Ｉａ）の化合物である。この反応図式におけるステップを以下で詳細に記載する。図式６にしたがって調製した化合物には−ＮＯ２部分が組み込まれており、以下では「Ｎ」を含有する参照番号によって表示する。
【０３９６】
【化１１５】
2005500266.tif 000127
【０３９７】
構造（Ｉａ）を有する化合物のクラスに属する様々なＭＩＦのインヒビターを図式５または図式６にしたがって調製した。表４は、調製した化合物の参照番号のリストである。名称「１Ｍ１＃＃」は、化合物が図式５にしたがって調製され、−ＣＯＯＥｔ部分およびＲ３としてのフラン部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｍ２＃＃」は、化合物が図式５にしたがって調製され、−ＣＯＯＥｔ部分およびＲ３としてのチオフェン部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｎ１＃＃」は、化合物が図式６にしたがって調製され、−ＮＯ２部分およびＲ３としてのフラニル部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｎ２＃＃」は、化合物が図式６にしたがって調製され、−ＮＯ２部分およびＲ３としてのチオフェン部分が組み込まれていることを示している。名称の最後の２文字は化合物のＲ４基を示している。
【０３９８】
【表１１】
2005500266.tif 000128
【０３９９】
ハロゲン化Ｒ４基「０９」は［マーチの上級有機化学、反応、メカニズム、および構造
、第５版（ＭＡＲＣＨ’Ｓ  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，
Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．）］，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，  Ｅｄｓ．，  Ａ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐ．４３７（２００１）に開示されている。わずかに相違する反応図式である図式７および８を使用して、この部分が組み込まれているＭＩＦのインヒビターを調製する。
【０４００】
反応図式７
【０４０１】
【化１１６】
2005500266.tif 000129
【０４０２】
反応図式８
【０４０３】
【化１１７】
2005500266.tif 000130
【０４０４】
構造（Ｉａ）を有する化合物のクラスに属する様々なＭＩＦのインヒビターを図式９または図式１０にしたがって調製した。
【０４０５】
反応図式９
【０４０６】
【化１１８】
2005500266.tif 000131
【０４０７】
反応図式１０
【０４０８】
【化１１９】
2005500266.tif 000132
【０４０９】
表５は、調製した化合物の参照番号のリストである。名称「１Ｍ＃＃１」は、化合物が図式９にしたがって調製され、−ＣＯＯＥｔ部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｍ＃＃２」は、化合物が図式９にしたがって調製され、−ＮＯ２部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｎ＃＃１」は、化合物が図式１０にしたがって調製され、−ＣＯＯＥｔ部分が組み込まれていることを示している。名称「１Ｎ＃＃２」は、化合物が図式１０にしたがって調製され、−ＮＯ２部分が組み込まれていることを示している。文字ＭまたはＮに続く２文字はＲ３部分を識別する番号に対応している。
【０４１０】
【表１２】
2005500266.tif 000133
【０４１１】
【表１３】
2005500266.tif 000134
【０４１２】
構造（Ｉａ）を有する化合物のクラスに属する様々なＭＩＦのインヒビターを以下の図式に従って調製した。
【０４１３】
反応図式１１
【０４１４】
【化１２０】
2005500266.tif 000135
【０４１５】
トルエン（４０ｍｌ）中の１Ｍ００（３３．０ｇ；０．１４ｍｏｌｅ）の懸濁液に１０８ｇのＰＯＣｌ３（０．７ｍｏｌｅ）を添加した。生じた溶液を還流させながら１．５時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、残留油をヘプタンにより連続的に抽出した（ＴＬＣにより制御）。混合したヘプタン画分を蒸発させ、残留物を水２００ｍｌと一緒に加熱し、濾過した。収率は２７ｇ（７０％）であった。
【０４１６】
室温で１８時間の乾燥後、得られたジクロロ化合物を２５０ｍｌ容量の丸底フラスコに移し、それに対して酢酸１５０ｍｌおよび酢酸アンモニウム２４．０ｇを添加した。この反応混合液を還流しながら約６時間加熱した（ＬＣＭＳおよびＴＬＣにより制御）。反応混合液中で出発原料を検出できなくなった時点で、高温溶液を水中に注入し、生じた沈殿を濾過して除去した。表６には、収率（ｇおよび％）；融点；質量対電荷比（Ｍ／Ｚ）に関するデータを提供する。ここでは、Ｍ／Ｚ＝７５４．１［３×Ｍ］＋、５０３．３［２×Ｍ］＋・、τ（８分間、ラン）、およびＬＣＭＳによって測定した純度である。
【０４１７】
【表１４】
2005500266.tif 000136
【０４１８】
反応図式１２
【０４１９】
【化１２１】
2005500266.tif 000137
【０４２０】
２０ｍｌのＮＭＰ中の１Ｍ００（Ｃｌ）（３．２７ｇ；１３．０ｍｍｏｌ）の溶液に対して、アシルピペラジン（２．３４ｇ；１３．０ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（１．４６ｇ；１３．０ｍｍｏｌ）を順次添加した。この反応混合液を１００〜１２０℃で１５時間攪拌した。この反応を２０％ＮＨ４Ｃｌ溶液を用いて停止させ、生じた沈殿を濾過し、水で洗浄した。この生成物を室温の減圧下でＰ２Ｏ５上でデシケーター中で乾燥させた。この生成物をこれ以上精製せずに次の反応に使用した。
【０４２１】
２５ｍｌのＮＭＰ中のクロロキノロン１Ｍ００（Ｃｌ）（２．９ｇ；１３．０ｍｍｏｌ）、アシルピペラジントリフルオロアセテートＡＶ−００２０（４．０ｇ；１３．０ｍｍｏｌ）、およびＤＡＢＣＯ（２．９１ｇ；２６．０ｍｍｏｌ）の混合液を１００℃で一晩攪拌した。この混合液を５０ｍｌの食塩水中に注入し、生じた固体を濾過して取り出し、、水で洗浄し、室温の減圧下でＰ２Ｏ５上でデシケーター中で乾燥させた。この生成物をこれ以上精製せずに次の反応に使用した。
【０４２２】
得られた化合物の収率およびさらなる情報を表７に提供する。１Ｍ１の名称を有する化合物については、ＸはＯであり、Ｒ２はＣＯＯＥｔである。１Ｍ２の名称を有する化合物については、ＸはＳであり、Ｒ２はＣＯＯＥｔである。１Ｎ１の名称を有する化合物については、ＸはＯであり、Ｒ２はＮＯ２である。１Ｎ２の名称を有する化合物については、
ＸはＳであり、Ｒ２はＮＯ２である。
【０４２３】
【表１５】
2005500266.tif 000138
【０４２４】
反応図式１３
【０４２５】
【化１２２】
2005500266.tif 000139
【０４２６】
無水ＮＭＰ（３ｍｌ）中のＮａＨ（０．０４ｇ；１．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に化合物１Ｍ１（もしくは１Ｍ２）または１Ｎ１（もしくは１Ｎ２）（０．８ｍｍｏｌ）を添加した。ガスの発生が終了した後、臭化物（０６−２０）（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液を、出発原料の痕跡を検出できなくなるまで攪拌した（ＬＣＭＳにより制御）。ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍｌ）の１０％溶液をこの反応液に添加し、生じた混合液をＤＣＭで抽出した。化合物１Ｍ１および１Ｍ２は分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８シリカカラム、１５０ｍｍ×４１ｍｍ、４０ｍＬ／分、勾配：水−アセトニトリル＝６０：４０〜５：９５、２０分間）によって単離しそして精製した。この経路にしたがって調製した化合物は、表５に記載の化合物名称にしたがって上付き文字「Ａ」によって表示する。
【０４２７】
無水ＤＭＦ（５ｍｌ）中の化合物１Ｍ１（もしくは１Ｍ２）または１Ｎ１（もしくは１Ｎ２）（１．０ｍｍｏｌ）に臭化物（０６−２０）（２．０ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２００ｍｇ）を添加した。化合物１Ｍ１２２；１Ｍ２２２；１Ｎ１２２；１Ｎ２２２は、４．０ｍｍｏｌの臭化シクロペンチルを含む１，４−ジオキサン中で得た。この反応混合液を２０〜４０時間にわたり８０〜１００℃で攪拌した（ＬＣＭＳにより制御）。ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍｌ）の１０％溶液をこの反応に添加し、生じた混合液をＤＣＭを用いて抽出した。化合物１Ｍ１０６−１Ｎ２２０は分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８シリカカラム、１５０ｍｍ×４１ｍｍ、４０ｍｌ／分、勾配：水−アセトニトリル＝８０：２０〜５：９５、４０分間）によって単離しそして精製した。表５には、純度のデータおよび生じた化合物についてのその他のデータを提供する。化合物１Ｎ１１９＊ＨＣｌを分取ＨＰＬＣ（Ｃ−１８シリカカラム、１５０ｍｍ×４１ｍｍ、４０ｍｌ／分、勾配：水−アセトニトリルＨＣｌ（０．００１％）＝８０：２０〜５：９５、４０分間）によって単離しそして精製した。この経路にしたがって調製した化合物は、表８に記載の化合物名称にしたがって上付き文字「Ｂ」によって表示した。化合物の物理的特性を表８に提供する。「１」を含む名称は、該化合物がレジオ異性体であることを示している。
【０４２８】
【表１６】
2005500266.tif 000140
【０４２９】
【表１７】
2005500266.tif 000141
【０４３０】
反応図式１４
【０４３１】
【化１２３】
2005500266.tif 000142
【０４３２】
ＭｅＣＮ（２３５ｍｌ）中のキノロン１Ｎ０１（もしくは１Ｍ０１）（１４．０８ｇ；６３．９４ｍｍｏｌ）および塩化トリエチルベンジルアンモニウム（５８．４ｇ；２５６．５ｍｍｏｌ）の溶液に２６ｍｌのＰＯＣｌ３（２８２．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を水（３３５ｍｌ）中で２時間攪拌した。沈殿を濾過し、水で洗浄し、乾燥させ、高温のシクロヘキサンで洗浄し、そして乾燥させた。調製した化合物の物理的特性を表９に提供する。
【０４３３】
【表１８】
2005500266.tif 000143
【０４３４】
反応図式１５
【０４３５】
【化１２４】
2005500266.tif 000144
【０４３６】
３ｍｌのＤＭＦ中の１Ｎ０１（Ｃｌ）（６４０ｍｇ；２．６８ｍｍｏｌ）の溶液に対して、ｔ−ブチルオキシカルボニルピペラジン（５００ｍｇ；２．６８ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（３３０ｍｇ；２．６８ｍｍｏｌ）を順次添加した。この反応混合液を室温で一晩攪拌した。（１Ｍ０１（Ｃｌ）については、この反応液を６０℃で一晩攪拌した。）水（１５ｍｌ）を用いて反応を停止させ、生じた沈殿を濾過し、水で洗浄した。（１Ｍ０１（Ｃｌ）については、２０％  ＮＨ４Ｃｌ溶液（１５ｍｌ）を用いて反応を停止させ、ＤＣＭ（３×３ｍｌ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去し、ヘキサンを用いて残留物を粉末状にした。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄した。）生成物は室温の減圧下でＰ２Ｏ５上でデシケーター中で乾燥させた。これを１ｍｌのＴＦＡ中に溶解させ、１時間維持した。この溶液を２０ｍｌのエーテルを用いて粉末状にし、沈殿を濾過し、エーテルで洗浄し、空気中で乾燥させた。調製した化合物の物理的特性を表１０に提供する。
【０４３７】
【表１９】
2005500266.tif 000145
【０４３８】
反応図式１６
【０４３９】
【化１２５】
2005500266.tif 000146
【０４４０】
３ｍｌのＤＭＦ中の１Ｎ０１（Ｃｌ）（５０ｍｇ；０．４１９ｍｍｏｌ）の溶液に対して、３−トリフルオロ酢酸チエノイルピペラジン（６９ｍｇ；０．４４０ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（４７ｍｇ；０．４１９ｍｍｏｌ）を順次添加した。この反応混合液を室温で一晩攪拌した。水（１５ｍｌ）を用いて反応を停止させ、生じた沈殿を濾過し、水で洗浄した。生成物を、室温の減圧下でＰ２Ｏ５上でデシケーター中で乾燥させた。この図式にしたがって調製した生成物は表１１に化合物の名称に続く上付き文字「Ａ」によって指名した。
【０４４１】
反応図式１７
【０４４２】
【化１２６】
2005500266.tif 000147
【０４４３】
２ｍｌのＤＭＦ中のピロール−２−カルボン酸（９１ｍｇ；０．８２ｍｍｏｌ）およびＣＤｌ（１３３ｍｇ；０．８２ｍｍｏｌ）の混合液を室温で一晩攪拌した（１Ｍ０８１、１Ｍ０９１、１Ｍ２２１、１Ｍ２７１、１Ｎ０８１、１Ｎ２２１の場合はＮＭＰ（１ｍｌ）中で；１Ｍ０７１、１Ｍ１５１、１Ｍ１８１、１Ｍ１９１、１Ｍ２１１、１Ｎ０７１、１Ｎ１５１、１Ｎ１８１、１Ｎ２７１の場合はＤＭＳＯ（１ｍｌ）中で）。その後１ＮＰ１ＴＦＡを添加し、この混合液を６０℃で６時間混合した（１Ｍ１８１、１Ｎ１８１の場合は室温で）。この混合液を食塩水５ｍｌを用いて希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２ｍｌ）を用いて抽出した。混合した抽出物を水（１ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた（１Ｍ０７１、１Ｍ１５１、１Ｍ１９１、１Ｍ２１１、１Ｎ０７１、１Ｎ１５１、１Ｎ１９１、１Ｎ２１１の場合は、混合液を水で希釈し、沈殿した粉末を濾過して取り出し、水で洗浄し、風乾させ、ｉ−ＰｒＯＨ中の５〜６ＮのＨＣｌ溶液中に溶解させた。この溶液を還流させながら１０分間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物はエーテルまたはアセトンを用いて粉末状にした。得られた沈殿を濾過して標的化合物の塩酸塩を得た）。得られた残留物は標的化合物であった。この図式にしたがって調製した生成物を、表１１では化合物の名称に続く上付き文字「Ｂ」によって示す。「（２）」を含む名称は、該化合物がレジオ異性体であることを示している。
【０４４４】
【表２０】
2005500266.tif 000148
【０４４５】
【表２１】
2005500266.tif 000149
【０４４６】
上記の選択した図式に記載した通りに調製したＭＩＦインヒビターの収量を表１２に示す。「（１）」または「（２）」を含む名称は、該化合物がレジオ異性体であることを示している。
【０４４７】
【表２２】
2005500266.tif 000150
【０４４８】
【表２３】
2005500266.tif 000151
［実施例１５］
【０４４９】
以下の図式は、酸のＢｏｃ−誘導体を合成するための一般的な手順を提供する。
【０４５０】
反応図式２０
【０４５１】
【化１２７】
2005500266.tif 000152
【０４５２】
Ｈ2Ｏ（９ｍｌ）中のＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸（１ｇ；７．５１ｍｍｏｌ、純度９８％、ＡＶＯＣＡＤＯ、＃１５０３３）、Ｎａ2ＣＯ3（１．７５ｇ；１６．５ｍｍｏｌ）およびｉ−ＰｒＯＨ（１ｍｌ）の混合液を溶解するまで攪拌した。その後、Ｂｏｃ2Ｏ（１．９６７ｇ；９．０１ｍｍｏｌ）を添加し、その混合液を室温で一晩攪拌した。得られた懸濁液を水（１０ｍｌ）で希釈し、ヘキサン（５ｍｌ）で抽出した。下相を分離し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）を添加し、攪拌混合液を酸性化させてｐＨ２〜３に調整した。ＥｔＯＡｃ相を分離し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍｌ）を用いて水相を抽出した。混合した抽出物を水（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。残留物をエーテルから結晶化させ、得られた沈殿を濾過して取り出し、真空乾燥後にＮ−Ｂｏｃ−チアゾリジン−４−カルボン酸（１．０３ｇ；５９％）を得た。
【０４５３】
［実施例１６］
アルキルピペラジンは、以下の図式にしたがって合成することができる。
【０４５４】
反応図式２１
【０４５５】
【化１２８】
2005500266.tif 000153
【０４５６】
二塩化メチレン（５ｍｌ）中の新しく蒸留した塩化チオニル（３．９ｍｌ；０．０５３ｍｏｌ）の溶液を二塩化メチレン（２５ｍｌ）中の２−チオフェンメタノール（４．２ｍｌ；０．０４４ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．４ｍｌ；０．０５ｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、一滴ずつ添加した。温度は２０℃未満に維持した。その後１時間以内に４０℃へ上昇させ、砕いた氷上に注ぎ入れ、ＣＨ2Ｃｌ2相を分離し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。その後、これをＣＨ2Ｃｌ2（４５ｍｌ）中のＮ−Ｂｏｃ−ピペラジン（２ｇ；０．０１１ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５ｍｌ；０．０１１ｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、一滴ずつ添加した。Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ａ．  Ｍｅａｎｗｅｌｌ，  Ｐｉｙａｓｅｎａ  Ｈｅｗａｗａｓａｍ，  Ｊｅａｎｉｎｅ  Ａ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｊ．Ｊ．  Ｋｉｍ  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｊｏｈｎ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｇａｍｂｅｒｄｅｌｌａ，  Ｈａｒｏｌｄ  Ｊ．  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｍ．  Ｓｅｉｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｂ．  Ｚａｖｏｉｃｏ，「血小板ｃＡＭＰホスホジエステラーゼのインヒビター。水溶性１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］キノリン−２−オン誘導体の側鎖末端の第４構造変化（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃＡＭＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ．  ４．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  １，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｂ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ−２−ｏｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９３）  Ｖｏｌ．  ３６．，  ｐｐ．３２５１−３２６４；Ｅｌｅｎａ  Ｃａｒｃｅｌｌｅｒ，  Ｍａｎｕｅｌ  Ｍｅｒｌｏｓ，  Ｍａｒｔａ  Ｇｉｒａｌ，  Ｃａｒｍｅｎ  Ａｌｍａｎｓａ，  Ｊａｖｉｅｒ  Ｂａｒｔｒｏｌｉ，  Ｊｕｌｉａｎ  Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｆａｎｅｌｌ，  ａｎｄ  Ｊａｖｉｅｒ  Ｆｏｒｍ，「ＰＡＦアンタゴニストとしての１−アシル−４−（（２−メチル−３−ピリジル）シアノメチル）ピペラジンの合成および構造−活性関係（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  １−Ａｃｙｌ−４−（（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙａｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｓ  ａｓ  ＰＡＦ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）」，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９３），  Ｎｐ．３６，  ｐｐ．２９８４−２９９７を参照。この混合物を室温で一晩攪拌し、減圧下で溶媒を除去し、残留物をエーテルで抽出した。エーテル溶液を減圧下で蒸発させ、残留物をＴＦＡ（３．３ｍｌ；０．０４３ｍｏｌ）中に溶解させ、３０分間維持した。減圧下でＴＦＡを除去し、エーテルを用いて残留物を粉末状にし、沈殿を濾過し、風乾させて１−（２−トリメチル）ジトリフルオロ酢酸ピペラジン（３．１６ｇ；７２％）を得た。Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ａｒｃｈｅｒ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃｏｏｋ，  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒ  Ｔａｙｌｏｒ，「求電子芳香族置換。第３４部。ジチエノール［１，２−ｂ：４，３−ｂ’］ベンゼン，ジチエノール［１，２−ｂ：３，４−ｂ’］ベンゼン、およびジチエノール［２，１−ｂ：３，４−ｂ’］ベンゼンのトリチウム除去のための部分速度比（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｐａｒｔ  ３４．  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒａｔｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｒｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｔｈｉｅｎｏｌ［１，２−ｂ：４，３−ｂ’］ｂｅｎｚｅｎｅ，Ｄｉｔｈｉｅｎｏｌ［１，２−ｂ：３，４−ｂ’］， Ｄｉｔｈｉｅｎｏｌ［２，１−ｂ：３，４−ｂ’］ｂｅｎｚｅｎｅ）」，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  ＩＩ．（１９８３），  ｐｐ．８１３−８１９を参照。
【０４５７】
反応図式２２
【０４５８】
【化１２９】
2005500266.tif 000154
【０４５９】
二塩化メチレン（５ｍｌ）中の新しく蒸留した塩化チオニル（３．９ｍｌ；０．０５３ｍｏｌ）の溶液を二塩化メチレン（２５ｍｌ）中のフルフリルアルコール（３．８ｍｌ；０．０４４ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．４ｍｌ；０．０５ｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、一滴ずつ添加した；温度は２０℃未満に維持した。この混合液を１時間攪拌した。その後、溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍｌ）中に溶解させた。得られた溶液をＣＨ2Ｃｌ2（４５ｍｌ）中のＮ−Ｂｏｃ−ピペラジン（２ｇ；０．０１１ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４ｍｌ；０．０２９ｍｏｌ）の攪拌溶液に一滴ずつ添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、減圧下で溶媒を除去し、エーテルを用いて残留物を抽出した。エーテル溶液を減圧下で蒸発させ、残留物をＴＦＡ（３．３ｍｌ；０．０４３ｍｏｌ）中に溶解させ、３０分間維持した。減圧下でＴＦＡを除去し、エーテルを用いて残留物を粉末状にし、得られた黒色沈殿を濾過した。その後、この沈殿を２００ｍｌのＭｅＯＨ中に溶解させ、活性炭を添加し、この混合物を還流させながら３０分間加熱した。活性炭を濾過し、溶媒を蒸発させ、エーテルを用いて残留物を粉末状にした。得られた白色沈殿を濾過し、風乾させて１−（２−フリルメチル）ジトリフルオロ酢酸ピペラジン（１．６４ｇ；４０％）を得た。Ｒ．  Ｒｕｋｅｓ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｄｉｅｎｓｔｂｉｅｒｏｖａ，「α−メチルフラルの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  α−ｍｅｔｈｙｌｆｕｒａｌ）」，  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （１９５４），  Ｖｏｌ．  １９，  ｐｐ．６０９−６１０を参照。
【０４６０】
［実施例１７］
スルホンアミドは、以下の図式にしたがって合成することができる。
【０４６１】
４−ヒドロキシ−１−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−０１と表示する）
ニトロ酢酸エチル（１５．９６ｇ，１２０ｍｍｏｌ）の溶液をＮ2大気下でジメチルアセトアミド中の水素化ナトリウム（鉱油中で６０％，５．２８ｇ，１３２ｍｍｏｌ）の懸濁液へゆっくりと添加した。この混合液を水素ガスの発生が終了するまで室温で攪拌し、９０℃で３０分間加熱し、室温まで冷却させた。ジメチルアセトアミド中のＮ−メチルイサトイン酸無水物（２３．３８ｇ，１３２ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、１２０℃で一晩加熱した。この混合液を室温へ冷却し、氷水中に注ぎ入れ、低温１０％ＨＣｌによって酸性化した。形成した固体を濾過し、水で数回洗浄して、７．１ｇ（２７％）の黄色固体を得た。Ｍｐ（融点）１９３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．６０（ｓ，３Ｈ）、７．３７（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２２１（Ｍ＋１），２４３（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ10Ｈ8Ｎ2Ｏ4）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４６２】
【化１３０】
2005500266.tif 000155
【０４６３】
４−クロロ−１−メチル−３−ニトロ−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−０２と表示する）
７０ｍｌのオキシ塩化リン中の５９５−０１（６．２ｇ，２８．１８ｍｍｏｌ）の懸濁液を９０℃で３時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させた。この残留物を氷水中に懸濁させ、重炭酸ナトリウムによって中和した。形成した固体を濾過し、乾燥させて４．９１ｇ（７３％）の褐色固体を得た。Ｍｐ（融点）２３５℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．７２（ｓ，３Ｈ）、７．５６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２３９（Ｍ＋１），２６１（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ10Ｈ7Ｎ2Ｏ3Ｃｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ
。
【０４６４】
４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５９５−０３と表示する）
２−チオフェンカルボニルクロリド（２．０４ｇ，１．４９ｍｌ）を、ピリジン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル−１−ピペラジンカルボキシレート（２．５ｇ，１３．４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２０ｍｇ）の溶液に対して０℃のＮ2大気下で添加し、室温で一晩加熱した。この混合液を氷水中に注ぎ入れ、沈殿を濾過し、水を用いて数回洗浄し、乾燥させて白色固体（３．５ｇ，８８％）を得た。Ｍｐ（融点）７６℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．４２（ｓ，１２Ｈ），３．４０（ｍ，４Ｈ），３．６１（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２９７（Ｍ＋１），３１９（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ3Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４６５】
【化１３１】
2005500266.tif 000156
【０４６６】
ピペラジン−１−イル−チオフェン−２−イル−メタノン（５９５−０４と表示する）
ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の５９３−０３（３．５ｇ，１１．８ｍｍｏｌ）の溶液に対して、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。この溶液を室温で３時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をクロロホルム中に溶解させた。有機層を重炭酸ナトリウムの飽和溶液により洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させそして蒸発させて、２．２０ｇ（９５％）の粘性褐色油を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ２．７８（ｍ，４Ｈ），３．５９（ｍ，４Ｈ），７．１２（ｔ，Ｊ＝４．１，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  １９７（Ｍ＋１）。
【０４６７】
１−メチル−３−ニトロ−４−［４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−１Ｈ−キノロン−２−オン（５９３−０６と表示する）
５９５−０４（１ｇ，５．５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１．７４ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）をトルエン（１００ｍＬ）中の５９５−０２（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、１００℃で１５時間加熱した。溶媒を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィーによる残留物の精製（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ，４９：１）により１．０５ｇ（５３％）の黄色固体を得た。Ｍｐ（融点）１０５℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．１９（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ．４Ｈ），７．１４（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３９９（Ｍ＋１），４２１（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ19Ｈ18Ｎ4Ｏ4Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４６８】
【化１３２】
2005500266.tif 000157
【０４６９】
３−アミノ−１−メチル−４−［（４−チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−１Ｈ−キノロン−２−オン（５９５−０９と表示する）
エタノール中の５９５−０６（６００ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）の懸濁液にＰｄ／Ｃ（１０％，７５ｍｇ）を添加した。この懸濁液を６０℃のＨ2大気下で４時間攪拌した。高温混合液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）に通して濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させた。残留物をエタノールによって再結晶化させて４９０ｍｇ（８８％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）２０２℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）；δ３．２０（ｂｒ，２Ｈ），３．４９（ｂｒ，２Ｈ），３．６５（ｂｒ．２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），４．１３（ｂｒ，２Ｈ），４．７１（ｂｒ，２Ｈ），７．０８（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２２−７．２６（ｍ，３Ｈ），７．３４−７．３７（ｍ，３Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３６９（Ｍ＋１），３９１（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ19Ｈ20Ｎ4Ｏ2Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４７０】
Ｎ−｛１−メチル−２−オキソ−４−［４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−１，２−ジヒドロ−キノリン−３−イル｝−メタンスルホンアミド（５９５−１５と表示する）
塩化メタンスルホニル（０．１ｍＬ，１．３ｍｍｏｌ）をピリジン（２ｍＬ）中の５９
５−０９（１２０ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）の溶液に対して、Ｎ2大気下で一滴ずつ添加し、さらに室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を酢酸エチル中に溶解させた。有機相は飽和ＮａＨＣＯ3溶液、水および食塩水によって連続的に洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4上で有機相を乾燥させそして蒸発させ、その残留物をエーテルで洗浄して１０３ｍｇ（７３％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）２２３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．０８（ｓ，３Ｈ），３．３１（ｍ，４Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｍ，４Ｈ），７．１５（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．８４（ｓ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ４４７（Ｍ＋１），４６９（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ20Ｈ22Ｎ4Ｏ4Ｓ2）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４７１】
【化１３３】
2005500266.tif 000158
【０４７２】
他のスルホンアミドを類似の合成経路にしたがって調製することができる。
【０４７３】
［実施例１８］
スルホニルは以下の図式にしたがって合成することができる。
【０４７４】
ｐ−トリルスルファニル−酢酸エチルエステル（５９５−２９と表示される）
無水ＴＨＦ中の４−メチルベンゼンエチオール（５ｇ，４０．２５）の溶液を室温でＴＨＦ中のＮａＨ（鉱油中で６０％，１．９８ｇ，４８．３０）の懸濁液へ一滴ずつ添加し、Ｎ2大気下で３０分間攪拌した。ブロモ酢酸エチル（４．９ｍＬ，４４．２７）をこの溶液にゆっくりと添加し、さらに３時間室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。残留物を希ＨＣｌ中に溶解させ、酢酸エチルによって抽出した。混合した有機相を、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、水および食塩水を用いて連続的に洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させた。有機相を蒸発させて、８．４６ｇ（９９％）の無色の油を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）；δ１．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２１０（Ｍ＋１），２３３（Ｍ＋２３）。
【０４７５】
（トルエン−４−スルホニル）−酢酸エチルエステル（５９５−３５と表示する）
クロロメタン中の５９５−２９（１０ｇ，４７．５５ｍｍｏｌ）の溶液にｍ−クロロ過安息香酸（２１．３１ｇ，９５．１０ｍｍｏｌ）を分割しながら０℃で添加した。この混合液を室温へ加温し、一晩攪拌した。形成した固体を濾過し、濾液を１Ｎ  ＮａＯＨ、水および食塩水によって連続的に洗浄した。Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させそして蒸発させて９．８ｇ（８５％）の無色油を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）；δ１．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），４．０８（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２４３（Ｍ＋１），２６５（Ｍ＋２３）。
【０４７６】
【化１３４】
2005500266.tif 000159
【０４７７】
４−ヒドロキシ−１−メチル−３−（トルエン−４−スルホニル）−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−３６と表示する）
５９５−３５（９．８ｇ，４０．４９ｍｍｏｌ）の溶液をＮ2大気下でジメチルアセトアミド中の水素化ナトリウム（鉱油中で６０％，１．７８ｇ，４４．５２ｍｍｏｌ）の懸濁液中にゆっくりと添加した。水素ガスの発生が終了するまで、この混合液を室温で攪拌し、その後３０分間かけて９０℃へ加熱し、室温へ冷却した。ジメチルアセトアミド中のＮ−メチルイサトイン酸無水物（７．８８ｇ，４４．５２ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、１２０℃で一晩加熱した。この混合液を室温へ冷却し、氷水中へ注ぎ入れ、低温１０％ＨＣｌによって酸性化した。形成した固体を濾過し、水によって数回洗浄して、５．７ｇ（４３％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）１９１℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ２．３９（ｓ，３Ｈ），３．４４（ｓ，３Ｈ），７．３６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３３０（Ｍ＋１），３５２（Ｍ＋２３）．分析（Ｃ17Ｈ15ＮＯ4Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４７８】
【化１３５】
2005500266.tif 000160
【０４７９】
４−クロロ−１−メチル−３−（トルエン−４−スルホニル）−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−４６と表示する）
３０ｍＬの酸塩化リン中の５９５−３６（５．２ｇ，５．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を１３０℃で３０時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を氷水中に懸濁させ、重炭酸ナトリウムにより中和した。形成した固体を濾過して乾燥させて、２．３ｇ（４３％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）１９３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ２．３８（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｓ，３Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ３４８（Ｍ＋１），３７０（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ17Ｈ14ＮＯ3ＳＣｌ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８０】
１−メチル−４−［４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−３−（トルエン−４−スルホニル）−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−４８と表示する）
ジイソプロピルエチルアミン（０．３８ｍＬ，２．２２ｍｍｏｌ）をトルエン中の５９５−４６（２８９ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ）および５９５−０４（１９５ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、１０５℃で一晩加熱した。この溶液を冷却し、減圧下で溶媒を蒸発させた。油性残留物へ水を添加し、超音波処理にかけた。形成した固体を濾過し、水およびエーテルで洗浄し、３６０ｍｇ（８６％）の黄色固体を得た。Ｍｐ（融点）２１３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ２．３７（ｓ，３Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｍ，４Ｈ），３．９４（ｍ，４Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ５０８（Ｍ＋１），５３０（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ26Ｈ25Ｎ3Ｏ4Ｓ2）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８１】
【化１３６】
2005500266.tif 000161
【０４８２】
４−ヒドロキシ−３−メタンスルホニル−１−メチル−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−０５と表示する）
酢酸エチルメタンスルホニル（３．７８ｇ，２２．７４ｍｍｏｌ）の溶液をＮ2大気下でジメチルアセトアミド中の水素化ナトリウム（鉱油中で６０％，１．０７ｇ，２５ｍｍｏｌ）の懸濁液中へゆっくりと添加した。水素ガスの発生が終了するまでこの混合液を室温で攪拌し、その後３０分間かけて９０℃へ加熱し、室温へ冷却した。ジメチルアセトアミド中のＮ−メチルイサトイン酸無水物（４．４３ｇ，２５ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、１２０℃で一晩加熱した。この混合液を室温へ冷却し、氷水中へ注ぎ入れ、低温１０％ＨＣｌによって酸性化した。形成した固体を濾過し、水で数回洗浄して、２．７６ｇ（４８％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）１７０℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．５１（ｓ，３Ｈ），３．５９（ｓ，３Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２５４（Ｍ＋１），２７６（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ11Ｈ11ＮＯ4Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８３】
４−クロロ−３−メタンスルホニル−１−メチル−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−１４と表示する）
３０ｍＬの酸塩化リン中の５９５−０５（１．５ｇ，５．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を１３０℃で３０時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を氷水中へ注ぎ入れで懸濁させ、重炭酸ナトリウムにより中和した。形成した固体を濾過しそして感想させて、７７３ｍｇ（４８％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）２２１℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−
ｄ6）；δ３．４８（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），７．４９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２７２（Ｍ＋１），２９４（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ11Ｈ10ＣｌＮＯ3Ｓ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８４】
【化１３７】
2005500266.tif 000162
【０４８５】
３−メタンスルホニル−１−メチル−４−［４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（５９５−１６と表示する）
ジイソプロピルエチルアミン（０．３８ｍＬ，２．２２ｍｍｏｌ）をトルエン中の５９５−１４（３０ｍｇ，１．１１ｍｍｏｌ）および５９５−０４（２３９ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、１０５℃で一晩加熱した。この溶液を冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させた。油性残留物へ水を添加し、超音波処理した。形成した固体を濾過し、水とエーテルで洗浄して３８４ｍｇ（８１％）の黄色固体を得た。Ｍｐ（融点）２２４℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ３．３６（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｍ，４Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．９１（ｍ，４Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ４３２（Ｍ＋１），４５４（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ20Ｈ21Ｎ3Ｏ4Ｓ2）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８６】
【化１３８】
2005500266.tif 000163
【０４８７】
［実施例１９］
４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−３−カルボン酸エチルエステル（５９５−６８と表示する）
マロン酸ジエチル（８０ｇ，０．０５０ｍｏｌ）の溶液をＮ2大気下でジメチルアセトアミド中の水素化ナトリウム（鉱油中で６０％，２２ｇ，０．５５ｍｏｌ）の懸濁液にゆっくりと添加した。水素ガスの発生が終了するまで、この混合液を室温で攪拌し、９０℃へ３０時間加熱し、そして室温へ冷却した。ジメチルアセトアミド中のイサトイン酸無水物（８９．７２ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加し、１２０℃で１５時間加熱した。この混合液を室温へ冷却し、氷水中へ注ぎ入れ、低温１０％ＨＣｌによって酸性化した。形成した固体を濾過し、水を用いて数回洗浄し、５５ｇ（４７％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）１７３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．３０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），４．３３（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），１１．５０（ｓ，１Ｈ），１３．５（ｓ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２３４（Ｍ＋１），２５６（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ12Ｈ11ＮＯ4）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８８】
２，４−ジクロロ−キノリン−３−カルボン酸エチルエステル（５９５−７２と表示する）
２００ｍＬの酸塩化リン中の５９５−６８（３５ｇ，１５０ｍｍｏｌ）の懸濁液を還流しながら３０分間加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を氷水中に注ぎ入れ、重炭酸ナトリウムにより中和した。形成した固体を濾過し、乾燥させて３９ｇ（９７％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）９３℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．３７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），４．４９（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．２８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）；ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２７０（Ｍ＋１），２９２（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ12Ｈ9Ｃｌ2ＮＯ2）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４８９】
４−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−３−カルボン酸エチルエステル（５９５−７６と表示する）
酢酸アンモニウム（１２．６ｇ，１６４ｍｍｏｌ）を酢酸（１５０ｍＬ）中の５９５−７２（４０．１７ｇ，１４９ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。混合液を１４０℃で４時間加熱した。この溶液を冷却し、氷水中へ注ぎ入れた。形成した固体を濾過し、水によって洗浄し、乾燥させて白色固体（３４ｇ，９１％）を得た。Ｍｐ（融点）１８６℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．３７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），４．５０（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ２５２（Ｍ＋１）．分析結果（Ｃ12Ｈ10ＣｌＮＯ3）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４９０】
【化１３９】
2005500266.tif 000164
【０４９１】
２−オキソ−４−［４−（チオフェン−２−カルボニル）−ピペラジン−１−イル］−１，２−ジヒドロ−キノリン−３−カルボン酸エチルエステル（５９５−７７と表示する）
ジメチルアセトアミド中の５９５−７６（７ｇ，２７．８ｍｍｏｌ）の溶液に１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（６．２３ｇ，５５．６ｍｍｏｌ）および５９５−０４（６ｇ，３０．６ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を１１５℃で１５時間加熱した。この反応混合液を冷却し、氷水中へ注ぎ入れた。形成した固体を濾過し、水で洗浄し、乾燥させて白色固体（７ｇ，６２％）を得た。Ｍｐ（融点）１９８℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．２８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．１２（ｍ，４Ｈ），３．８７（ｍ，４Ｈ），４．２８（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｔ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ４１２（Ｍ＋１），４３４（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ21Ｈ21Ｎ3Ｏ4Ｓ．０．５  Ｈ2Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４９２】
１−（４−フルオロベンジル）−２−オキソ−４−［４−チオフェン−２−カルボニル］−ピペラジン−１−イル」−１，２−ジヒドロ−キノリン−３−カルボン酸エチルエステル（５９５−７８と表示する）
ＤＭＦ中の水素化ナトリウム（鉱油中で６０％，０．７８ｇ，１９．４６ｍｍｏｌ）の懸濁液にＤＭＦ中の５９５−７７（７ｇ，１７．０３ｍｍｏｌ）の溶液をゆっくりと添加した。この懸濁液を室温で３０分間加熱した。この溶液にゆっくりと４−フルロ臭化ベンジルを添加し、さらに２時間攪拌した。この混合液を氷水中に注ぎ入れ、低温１０％ＨＣｌによって酸性化した。形成した固体を分離し、水で洗浄し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ，４９：１）によって精製して５．９ｇ（６７％）の白色固体を得た。Ｍｐ（融点）５２℃，1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）；δ１．３０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．１６（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｍ，４Ｈ），４．３２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１４−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．２４−７．２７（ｍ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４４−７．４７（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ５２０（Ｍ＋１），５４２（Ｍ＋２３）．分析結果（Ｃ28Ｈ26ＦＮ3Ｏ4Ｓ．Ｈ2Ｏ）Ｃ，Ｈ，Ｎ。
【０４９３】
【化１４０】
2005500266.tif 000165
【０４９４】
［実施例２０］
以下では、上記のような一般構造１（ａ）および１（ｂ）の化合物ライブラリーの合成について説明する。名称の中に「Ｍ」を含む化合物には、−ＣＯＯＥｔ部分が組み込まれている。名称の中に「Ｎ」を含む化合物には、−ＮＯ2部分が組み込まれている。「Ｍ」または「Ｎ」に続く２文字は、それぞれ、下記に提供する官能基Ｒ２およびＲ３に対する数記号に対応する。「Ｍ」または「Ｎ」に先行する文字は、官能基Ｒ１に対する数記号に対応する。化合物は、「＋ｉ」を含む記号を伴う場合を除いて、以下の構造を有している。
【０４９５】
【化１４１】
2005500266.tif 000166
【０４９６】
「＋ｉ」を含む記号を有する化合物では、Ｒ３は窒素原子ではなくキノロン基の酸素原子上の置換基であり、すなわち以下に示すような構造１（ｂ）の化合物である。記号表示「ｉ」は好ましい実施形態における他の場所で現れるが、窒素原子ではなくキノロン基の酸素原子上の置換基に関連する。
【０４９７】
【化１４２】
2005500266.tif 000167
【０４９８】
Ｒ１官能基についての数記号
【０４９９】
【表２４】
2005500266.tif 000168
【０５００】
Ｒ２官能基についての数記号
【０５０１】
【化１４３】
2005500266.tif 000169
【０５０２】
Ｒ３官能基についての数記号
【０５０３】
【化１４４】
2005500266.tif 000170
【０５０４】
調製したＭＩＦインヒビターの数記号を表１３に示す。
【０５０５】
【表２５】
2005500266.tif 000171
【０５０６】
中間物またはＭＩＦインヒビターを調製するための反応図式の詳細を下記に示す。
【０５０７】
反応図式２１
【０５０８】
【化１４５】
2005500266.tif 000172
【０５０９】
以下の化合物のすべてを、類似もしくは同一の手順を使用して得た：化合物１Ｍ２１；収量１７６ｍｇ，５６．５６％；化合物１Ｍ３１；収量６４ｍｇ，２０．６０％；化合物１Ｍ４１；収量１１０ｍｇ，３５．４８％；化合物１Ｍ５１；収量１３９ｍｇ，４４．１８％；化合物１Ｍ６１；収量８８ｍｇ，２８．３７％；化合物２Ｍ１３；収量１１４ｍｇ，３８．０９％；化合物２Ｍ２１；収量１１３ｍｇ，３６．７３％；化合物２Ｍ２３；収量１３７ｍｇ，３６．１６％；化合物２Ｍ３１；収量２７ｍｇ，８．６７％；化合物２Ｍ３３；収量１４１ｍｇ，３７．４５％；化合物２Ｍ４１；収量７２ｍｇ，２３．３０％；化合物２Ｍ４３；収量１１７ｍｇ，３１．５４％；化合物２Ｍ５１；収量６５ｍｇ，２１．２０％；化合物２Ｍ５３；収量９１ｍｇ，２４．８７％；化合物２Ｍ６１；収量１１３ｍｇ，３６．９４％；化合物２Ｍ６３；収量１２７ｍｇ，３３．９９％；化合物３Ｍ１１；収量５８ｍｇ，１９．００％；化合物３Ｍ２１；収量１３４ｍｇ，４３．３２％；化合物３Ｍ３１；収量１１７ｍｇ，３７．５０％；化合物３Ｍ４１；収量１４１ｍｇ，４５．８３％；化合物３Ｍ５１；収量１１９ｍｇ，３８．４２％；化合物３Ｍ６１；収量１４２ｍｇ，４５．８５％；および化合物３Ｍ６３；収量４０ｍｇ，１１．００％．
反応図式２２
【０５１０】
【化１４６】
2005500266.tif 000173
【０５１１】
［実施例２１］
酸のＢｏｃ誘導体を以下の反応図式にしたがって調製した。
【０５１２】
反応図式２３
【０５１３】
【化１４７】
2005500266.tif 000174
【０５１４】
図式２５にしたがって調製した化合物についての収量および純度を表１３−１に示す。
【０５１５】
【表２６】
2005500266.tif 000175
【０５１６】
［実施例２２］
一連のＭＩＦインヒビターを以下の反応図式にしたがって調製した。反応物質は以下のように短縮形で示した：ＤＣＭ＝ジクロロメタン；ＤＭＡ＝ジメチルアセトアミド；ＤＭＦ＝Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＨＯＡｃ＝酢酸；ＭｅＣＮ＝アセトニトリル；ＤＡＢＣＯ＝トリエチレンジアミン；ＴＥＢＡＣ＝塩化ベンジルトリエチルアンモニウム；ＮＭＰ＝１−メチル−２−ピロリジノン；ＢＯＣ＝ｔｅｒｔ−ＢｕＯＣＯ；ＰＰＡ＝ポリリン酸；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸。
【０５１７】
【化１４８】
2005500266.tif 000176
【０５１８】
２５０ｍｌのジオキサンおよび１５０ｍｌのトルエンの混合液中の２−アミノ−５−メチル安息香酸（６７．７ｇ，０．４５ｍｏｌｅ）の強撹拌溶液に、８０ｍｌのジオキサン中のジホスゲン（９７．６ｇ，０．４９ｍｏｌｅ）の溶液を一滴ずつ添加した。この反応混合液を１２時間撹拌し、その後沈殿を濾過し、エーテルで洗浄した。濾液およびエーテル画分を混合し、溶媒を減圧下で除去した。ヘキサンを用いて残留物を滴定し、生じた沈殿を濾過し、ヘキサンで洗浄し、室温で一晩かけて乾燥させた。化合物２０００：収量６６．５ｇ（８４％）、純度９３％（ＬＣＭＳ）．
【０５１９】
【化１４９】
2005500266.tif 000177
【０５２０】
無水ＤＭＡ中のＮａＨ（１８．９ｇ，０．４７ｍｏｌｅ）の撹拌懸濁液に、マロン酸エステルを一滴ずつ添加した。この反応混合液を２０分間撹拌し、３０℃へ冷却した。生じた溶液にイサトイン酸無水物を分割しながら添加した。この反応混合液を１３０〜１５０℃で１０時間加熱し、その後に蒸留してＤＭＡを除去した。水を用いて残留物を滴定し、１０％ＨＣｌを使用してｐＨ＝３に酸性化させた。生じた沈殿を濾過して取り出し、水で洗浄した。固体物質を２Ｌ入りの三角フラスコ内に入れ、水１Ｌを添加し、Ｋ2ＣＯ3を使用してｐＨを１２〜１３へ調整した。得られた溶液を濾過し、濾液を１０％ＨＣｌによってｐＨ＝２〜３に酸性化した。沈殿を濾過して取り出し、エーテルで洗浄し、ジオキサンから結晶化させた。化合物２Ｍ００：収量２３．３ｇ（２４％），純度；９０％（ＬＣＭＳ）．
【０５２１】
【化１５０】
2005500266.tif 000178
【０５２２】
トルエン（４０ｍｌ）中の２Ｍ００（２３．０ｇ，０．０９３ｍｏｌｅ）の懸濁液に７１．３ｇのＰＯＣｌ3（４３ｍｌ，０．４６５ｍｏｌｅ）を添加した。得られた溶液を環流させながら１．５時間加熱した。溶媒を減圧下で蒸留し、生じた油をヘプタンにより連続的に抽出した（ＴＬＣにより制御）。混合したしたヘプタン画分を蒸発させ、残留物を２００ｍｌの水と一緒に加熱し、濾過した。室温で１８時間かけて乾燥させた後、得られたジクロロ化合物を２５０ｍｌ丸底フラスコへ移し、それに対して９０ｍｌの酢酸および８．０ｇの酢酸アンモニウムを添加した。この反応混合液を環流させながら約２時間加熱した（ＬＣＭＳおよびＴＬＣにより制御）。反応混合液中で出発物質を検出できなかった場合は、高温溶液を水中に注ぎ入れ、生じた沈殿を濾過して取り除いた。上記の図式にしたがって調製した化合物についての収量および純度を、表１４に示す。
【０５２３】
【表２７】
2005500266.tif 000179
【０５２４】
【化１５１】
2005500266.tif 000180
【０５２５】
方法Ａ：ＤＭＡ中の２Ｍ００（１．０ｇ，３．７７ｍｍｏｌ）の溶液にアシルピペラジン（０．７５ｇ，４．１６ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（０．８４ｇ，７．５ｍｍｏｌ）を連続して添加した。この反応混合液を１００〜１２０℃で１５時間撹拌した。２０％のＮＨ4Ｃｌ溶液を用いてこの反応を停止させ、生じた沈殿を濾過して取り出し、水で洗浄した。生成物を室温の減圧下でデシケーター中でＰ2Ｏ5上で乾燥させた。生成物を、これ以上精製せずに次の反応に使用した。
【０５２６】
方法Ｂ：３ｍｌのＤＭＦ中のクロロキノロン２Ｍ００（１．０ｇ，３．７７ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸アシルピペラジン、ＡＶ−００５０（１．５５ｇ，４．１４ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（０．８４ｇ，７．５３ｍｍｏｌ）の混合液を１０１℃で一晩撹拌し、この混合液を５０ｍｌの食塩水中に注ぎ入れた。得られた固体を濾過して取り出し、水で洗浄し、室温の減圧下でデシケーター中でＰ2Ｏ5上で乾燥させた。生成物はこれ以上精製せずに次の反応に使用した。
【０５２７】
得られた化合物の収量は表１５に示す。
【０５２８】
【表２８】
2005500266.tif 000181
【０５２９】
【化１５２】
2005500266.tif 000182
【０５３０】
無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中のＮａＨ（０．０３ｇ，０．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に化合物２Ｍ１０（０．３０ｇ，０．７ｍｍｏｌ）を添加した。ガスの発生が終了した後に、臭化ベンジル（０．１９ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を添加した。出発原料の痕跡が検出できなくなるまで反応混合液を撹拌した（ＬＣＭＳにより制御）。ＮＨ4Ｃｌ（２ｍｌ）の２０％溶液をこの反応に添加し、生じた混合液をＤＣＭを用いて抽出した。ＨＰＬＣ（Ｃ−１８シリカカラム、１５０ｍｍ×４１ｍｍ，４０ｍｌ／分、水−アセトニトリルの勾配＝６０：４０〜５：９５、２０分間）により化合物２Ｍ１２を単離しそして精製した。化合物２Ｍ１２：収量１１４ｍｇ（３１％）、純度＞９９％（ＨＰＬＣ）：
【０５３１】
【化１５３】
2005500266.tif 000183
【０５３２】
方法Ａ：無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＮａＨ（０．０３ｇ，０．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に化合物１Ｍ６０（３００ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）を添加した。ガスの発生が終了した後（約３０分）、エーテル中の塩化ジメチルアミノエチル（２．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合液を１００℃（エーテルは蒸留によって除去した）で１２時間加熱した。この溶液を室温へ冷却し、混合液のｐＨはＡｃＯＨの１％水溶液によってｐＨ９へ調整した。この混合液をＤＣＭ（３×３ｍｌ）を用いて抽出し、混合したＤＣＭ画分を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。ＤＣＭは回転式エバポレーター上で除去し、この生成物をプレップＴＬＣ（ｐｒｅｐ  ＴＬＣ）（ＡｎａｌＴｅｃｈシリカゲルＧＦ，１０００ｇｍ，溶離剤：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＨ＝４：１）によって精製した。化合物１Ｍ６４：収量８４ｍｇ（２４％）、純度＞９９％（ＨＰＬＣ）。
【０５３３】
方法Ｂ：３ｍｌのＮＭＰ中のＮａＨ（０．１１４ｇ，２．８４ｍｍｏｌ；鉱油中で６０％分散）の懸濁液に分割しながらキノロン２Ｍ５０（０．３３ｇ，０．６７６ｍｍｏｌ）を添加した。ガスの発生が終了した後（約３０分）、この混合液を室温で３０分間撹拌し、ジメチルアミノエチルクロリド塩酸塩（０．１９５ｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を１００℃で一晩加熱した。この反応混合液を冷却し、水（２５ｍｌ）中に注ぎ入れ、得られた固体を濾過して取り出し、水で洗浄し、８５℃で一晩乾燥させた。標的異性体をプレップＴＬＣによって単離した（ＡｎａｌＴｅｃｈシリカゲルＧＦ，１５００ｇｍ，溶離剤：ＥｔＯＡｃ中の１０％トリエチルアミン、下方スポット）。化合物２Ｍ５４：収量６８ｍｇ（１８％）。
【０５３４】
【化１５４】
2005500266.tif 000184
【０５３５】
無水ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＮａＨ（０．０３ｇ，０．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に化合物１Ｍ６０（３００ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）を添加した。ガスの発生が終了した（約３０分）、エーテル中の塩化ジメチルアミノエチル（２．１ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。この反応混合液を１００℃（エーテルは蒸留によって除去した）で１２時間加熱した。この溶液を室温へ冷却し、混合液のｐＨはＡｃＯＨの１％水溶液によってｐＨ＝９へ調整した。この混合液をＤＣＭ（３×３ｍｌ）を用いて抽出し、混合したＤＣＭ画分を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。ＤＣＭは回転式エバポレーター上で除去し、この生成物をプレップＴＬＣ（ＡｎａｌＴｅｃｈシリカゲルＧＦ，１０００ｇｍ，溶離剤：ＣＨＣｌ3：ＥｔＯＨ＝４：１）によって精製した。化合物１Ｍ６４：収量５７ｍｇ、純度＞９９％（ＨＰＬＣ）。以下の化合物のすべてを、類似または同一の手順を使用して得た：化合物１Ｍ３４：収量７７ｍｇ，２２．００％；化合物１Ｍ５４：収量５８ｍｇ，１６．８８％；化合物１Ｍ６４：収量８４ｍｇ，２４．００％；化合物２Ｍ１４：収量５７ｍｇ，１６．２５％；化合物２Ｍ３４：収量６３ｍｇ，１７．９５％；および化合物２Ｍ６４：収量４２ｍｇ，１２．００％．
反応図式２４
化合物１Ｍ１５．．．３Ｍ６５：以下に列挙した化合物のすべてを、化合物１Ｍ６４について上記に記載した方法を使用して得た：化合物３Ｍ１５；３６ｍｇ，１３％；化合物３Ｍ６５；５ｍｇ，１％；化合物１Ｍ６５；３１ｍｇ，９％；化合物１Ｍ４５；３４ｍｇ，１０％；化合物１Ｍ５５；５１ｍｇ，１５％；化合物１Ｍ３５；５１ｍｇ，１４％；化合物３Ｍ４５；５２ｍｇ，１５％；化合物３Ｍ２５；２４ｍｇ，７％；化合物３Ｍ３５；７１ｍｇ，２０％；化合物３Ｍ３５ｉ；１６ｍｇ，４％；化合物３Ｍ１５ｉ；２２ｍｇ，８％；化合物１Ｍ６５ｉ；２０ｍｇ，６％；化合物１Ｍ４５ｉ；２７ｍｇ，８％；化合物１Ｍ３５ｉ；２８ｍｇ，８％；化合物３Ｍ６５ｉ；２３ｍｇ，６％．
反応図式２５
【０５３６】
【化１５５】
2005500266.tif 000185
【０５３７】
ＤＣＭ（１００ｍｌ）中のｐ−トルイジン（１０ｇ，９３．３ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（１３．６ｍｌ）の溶液に
【０５３８】
【化１５６】
2005500266.tif 000186
【０５３９】
０〜５℃で（氷水浴）一滴ずつモノエチルマロネートクロリド（１７．７２ｍｌ）を添加した。反応の終了（ＴＬＣにより制御）後、反応混合液を水（３００ｍｌ）の中に注ぎ入れ、ｐＨをＨＣｌ（濃）によって調整した。有機相を分離し、水相はＤＣＭ（３×５０ｍｌ）によって抽出した。混合したＤＣＭ抽出液は食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。ＤＣＭは回転式エバポレーター上で除去し、残留物を６００ｍｌのＭｅＯＨおよび４００ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨの混合液中に溶解させた。この反応混合液を環流させながら３時間加熱し、室温へ冷却し、２Ｎ  ＨＣｌによってｐＨ２へ酸性化した。減圧下でＭｅＯＨを除去し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍｌ）によって水を抽出した。有機相は食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。この残留物に４０ｇのＰＰＡを添加し、マグネチックスターラーで混合液を撹拌し、１７０℃で３時間加熱した。この反応混合液を室温へ冷却し、５００ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを用いてゆっくりと希釈した。生じた溶液のｐＨを、ＮａＯＨの２０％水溶液によってｐＨ４へ調整した。形成した沈殿を濾過して取り出し、水で洗浄し、ＮａＯＨ上でデシケーター中で一晩乾燥させた。０５の収量は１３．２ｇ（８１％）であった。
【０５４０】
氷酢酸（２００ｍｌ）中の１３．２ｇの５−メチル−２，４−ジヒドロキシキノリンの溶液に２５ｍｌのＨＮＯ3（６３％）をゆっくりと添加した。反応混合液を９０℃で３０分間加熱し、室温へ冷却し、水（７００ｍｌ）中に注ぎ入れた。形成した沈殿を濾過によって取り出し、水で洗浄した。得られた化合物をデシケーター中でＮａＯＨ上で一晩乾燥させた。０６の収量は７．６８ｇ（４４％）であった。
【０５４１】
【化１５７】
2005500266.tif 000187
【０５４２】
氷酢酸（６００ｍｌ）中のジヒドロキシキノロノン０１（５０ｇ）の撹拌懸濁液へＨＮＯ3（６３％）の９８ｍｌを添加した。この反応混合液を９０℃で３０分間加熱し、室温へ冷却した。形成した沈殿を濾過によって取り出し、水で洗浄した（５×１００ｍｌ）。得られた化合物を、デシケーター中でＰ2Ｏ5上で乾燥させた。１Ｎ００の収量は５２．７ｇ（８２％）であった。
【０５４３】
反応図式２６
【０５４４】
【化１５８】
2005500266.tif 000188
【０５４５】
ＤＭＦ（７５ｍｌ）中の５−クロロイサトイン酸無水物３０００（１５ｇ，７５．９１ｍｍｏｌ）の溶液に対して、無水炭酸カリウム（８．８５ｇ）およびヨウ化メチル（１４．４６ｇ，１１４ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合液を室温で１８時間撹拌し、氷水中へ注ぎ入れた。沈殿を濾過して取り出し、水で洗浄し、デシケーター中でＰ2Ｏ5上で一晩乾燥させた。化合物３００１：収量１５．３ｇ（９５％）、純度＞９０％（ＬＣＭＳ），化合物３００３：収量１８．２ｇ（７９％）、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）。以下の化合物のすべてを、類似または同一の方法を使用して得た：化合物３００２：収量１６．１ｇ，７４％、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）；化合物３００３：収量１８．２ｇ，７８．５％、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）。
【０５４６】
【化１５９】
2005500266.tif 000189
【０５４７】
【化１６０】
2005500266.tif 000190
【０５４８】
５０ｍｌのＤＭＦ中のニトロ酢酸エチル（７．５ｍｌ，６８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に対して、２．８５ｇのＮａＨを分割しながら添加した。水素発生が終了した後、この混合液を８０℃で１５分間加熱した。６０ｍｌのＤＭＦ中のＮ−メチルイサトイン酸無水物３００１（１５ｇ，７１ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間かけて添加し、その後でこの反応液を１２０℃で１８時間加熱した。溶媒を蒸留によって除去し、残留物を水中に溶解させ、６Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ＝４へ酸性化した。沈殿を回収し、水で洗浄し、デシケーター中でＮａＯＨ上で乾燥させた。化合物３Ｎ０１：収量１６．６ｇ（９２％）、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）。化合物３Ｎ０３：収量１８．５ｇ（８９％）、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）。化合物３Ｎ０３：収量１８．５ｇ，８９％、純度＞９０％（ＬＣＭＳ）．
反応図式２７
【０５４９】
【化１６１】
2005500266.tif 000191
【０５５０】
ＭｅＯＨ（２９０ｍｌ）中のキノロン３Ｎ００（１８．８ｇ，７８．１ｍｍｏｌ）および塩化トリエチルベンジルアンモニウム（７１ｇ，３１２ｍｍｏｌ）の溶液に対して、ＰＯＣｌ3（３２ｍｌ，３４４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、そして残留物を水（２９０ｍｌ）中で３時間撹拌した。沈殿した固体を濾過して取り出し、水で洗浄して乾燥させ、高温シクロヘキサンで洗浄し、乾燥させ、ＴＨＦ−ヘキサンから二重結晶化させた。化合物３Ｎ００（Ｃｌ）：収量５．５９ｇ，２８％、純度＞９５％（ＬＣＭＳ）．
【０５５１】
【化１６２】
2005500266.tif 000192
【０５５２】
２ｍｌのＤＭＦ中のクロロキノロン３Ｎ００（Ｃｌ）（０．３０ｇ，１．１６ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸アシルピペラジンＡＶ−００５０（０．４５ｇ，１．２２ｍｍｏｌ）およびＤＡＢＣＯ（０．２６ｇ，２．３２ｍｍｏｌ）の混合液を一晩撹拌した。その後、この混合液を水（１５ｍｌ）中に注ぎ入れ、得られた固体を濾過して取り出し、水で洗浄し、デシケーター中でＰ2Ｏ5上で乾燥させた。化合物３Ｎ５０（Ｃｌ）：収量０．５０ｇ，９０％、純度＞９５％（ＬＣＭＳ）・
好ましい実施形態をその特定実施形態と関連付けて記載してきた。これはさらに修飾できること、そして本出願は、一般に本発明の原理にしたがっているあらゆる変形、使用、または発明の翻案、および本発明が関する分野における既知もしくは慣習的実践の範囲内に含まれるような、および本発明の範囲内およびそのあらゆる同等物に含まれるような本開示からのそのような逸脱を含むことが意図されている。技術的参考文献、許可された特許、および特許出願を含むがそれらに限定されないここに挙げたあらゆる参考文献はそれらの全体が参照してここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０５５３】
【図１】ＬＰＳ刺激および様々なマイクロモル濃度の化合物７ｅを用いての処理後の、ＴＨＰ−１細胞の細胞質抽出液（Ｃ）ならびに馴化培地（Ｍ）中の抗ＭＩＦモノクローナル抗体（図１Ａ）および抗ＭＩＦポリクローナル血清（図１Ｂ）を用いた抗体免疫沈降を示しているオートラジオグラムのスキャン画像である。さらに種々の画分中で検出されたトートメラーゼ活性の結果が示されている。プラス記号はトートメラーゼ活性あり、マイナス記号は活性が検出不能、そして＋／−記号は部分活性ありを示している。
【図２】ＬＰＳ刺激ＴＨＰ−１細胞の本出願書で主張された組成物の５種のアナログを用いた処理後の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示したグラフである。さらに各アナログがモノクローナル抗体結合を阻害する能力も描出されているが、この能力は用量依存性である。
【図３】ＬＰＳを用いた刺激および培養中の様々な時点での１０μＭの化合物７ｅの添加後の、ＥＬＩＳＡを使用して測定したＴＨＰ−１細胞の馴化培地中のＭＩＦの免疫反応性のグラフ表示である。この図では、ＬＰＳはゼロ時点で添加され、化合物７ｅはＬＰＳ処理の０、２、４および６時間後に添加された。この実験では６群のＴＨＰ−１細胞が使用され、すべてが標準培地条件下で培養された。実験の開始時に、第１群の細胞には緩衝液単独、第２群の細胞には化合物７ｅを含有する緩衝液が添加された。緩衝液中の化合物７ｅは、その後様々な時点に他の各群に添加されたが、第３群へは２時間後、第４群へは４時間後、第５群へは６時間後、および第６群へは２２時間後に添加された。サンプルは緩衝液または緩衝液＋サンプルが添加された後の指示時間に各群から採取され、抗ＭＩＦモノクローナル抗体を使用してＭＩＦの検出可能なレベルについてアッセイされた。化合物の不在下では（第１群）、検出可能なＭＩＦのレベルは実験の時間経過にしたがって増加した。化合物の存在下では、ＭＩＦの検出は遮断された。
【図４】化合物７ｅがＭＩＦ検出に及ぼす作用を追跡した、ＥＬＩＳＡに基づく実験のグラフ表示である。この実験デザインでは、試験サンプルは細胞残屑が除去されている前馴化細胞培地である。試験サンプル中のＭＩＦの出発濃度は約２２ｎｇ／ｍｌであると算出された。化合物は３７℃での培養を開始後に様々な時点に添加された。各サンプルはその後さらに３０分間培養され、その後ＭＩＦの検出可能なレベルが再び測定された。
【図５】ＥＬＩＳＡによって測定したときに、化合物７ｅを用いた処理が実施されなかった対照細胞集団と比較して、化合物７ｅ処理およびＬＰＳ誘発性ＲＡＷ２６４．７細胞からの馴化培地中に存在するＭＩＦの相対率を表している棒グラフである。上方パネルは、下方パネルにおけるＥＬＩＳＡによって測定された画分と同一画分のウェスタンブロットを示している。
【図６】ＥＬＩＳＡによって測定したときに、化合物７ｅを用いて処理が実施されなかった対照細胞集団と比較して、化合物７ｅ処理およびＴＳＳＴ−１誘発性ＲＡＷ２６４．７細胞からの馴化培地中に存在するＭＩＦの相対率を表している棒グラフである。上方パネルは、下方パネルにおけるＥＬＩＳＡによって測定された画分と同一画分のウェスタンブロットを示している。
【図７】化合物７ｅの腹腔内注射（図７Ａ）または２０ｇの化合物７ｅの経口胃管投与（図７Ｂ）後のマウス血清中の化合物７ｅのＨＰＬＣ検出のグラフ表示である。結果は平均値±ＳＥＭとして示されている（Ｎ＝マウス５匹）。
【図８】ＬＰＳ／ガラクトサミン誘発投与後の様々な時点でのマウス血清中のＥＬＩＳＡ検出ＭＩＦ遊離のグラフ表示である。結果は平均値±ＳＥＭとして示されている（Ｎ＝マウス５匹）。
【図９】化合物７ｅ（０．４ｍｇ／２０ｇ［マウス］）の存在下または不在下で、１０ｍｇ／ｋｇ  ＬＰＳ誘発投与（図９Ａ）５時間後の血清中ＭＩＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）または５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ誘発投与（図９Ｂ）４時間後の標準化血清中ＭＩＦのＥＬＩＳＡデータを示したグラフである。
【図１０】雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスのＬＰＳ／ガラクトサミン刺激５時間後の血清中１Ｌ−１β（ｐｇ／ｍｌ）対血清中ＭＩＦ（ｎｇ／ｍｌ）間の相関を示しているＥＬＩＳＡ測定値を示したグラフである。
【図１１】ＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）刺激４時間後および２０ｍｇ／ｋｇ［体重］の化合物７ｅ（ｉ．ｐ．）の存在下または不在下でのＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡ検出を示している棒グラフである。
【図１２】２ｍｇ／ｋｇ（図１２Ａ）、５ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｂ）、または１０ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｃ）のＬＰＳ処理およびＤ−ガラクトサミン（５０ｍｇ／ｋｇ）処理時点における２０ｍｇ／ｋｇの化合物７ｅまたは対照賦形剤を用いての腹腔内投与後のＢａｌｂ／ｃマウスの累積生存率対生存期間（時間）を示した図である（生存期間についてのカプラン・マイヤー評価）。各実験には、対照賦形剤を接種した１５匹および当該化合物を接種した１５匹を含む３０匹のマウスが含まれていた。
【図１３】化合物７ｅ（２０ｍｇ／ｋｇ［体重］）の存在下または不在下でマウスの２５％の生存期間対ＬＰＳ濃度（ｍｇ；Ｓｉｇｍａ０５５：Ｂ５）およびＤ−ガラクトサミン（５０ｍｇ／ｋｇ）を示しているグラフである。このデータは各３０匹のマウスを使用した６回の実験の平均値を示している。
【図１４】コラーゲン誘発性マウス関節炎モデルにおいて関節炎を阻害することについてＭＩＦインヒビターを試験するための実験プロトコールを示している。
【図１５】第７４日に足浮腫を表す足の厚みのカリパスによる測定値を示している棒グラフである。数値は、１群当たり１０匹の動物についての平均値±ＳＥＭとして表示されている。
【図１６】ＥＬＩＳＡによって測定されたコラーゲン誘発性関節炎マウスの血清中のＭＩＦ（図１６Ａ）およびＴＮＦ（図１６Ｂ）レベルを示した棒グラフである。数値は、動物７匹の平均値±ＳＥＭとして表示されている。対照はコラーゲンまたは化合物を用いて処理されたマウスであり、ＣＩＡはコラーゲン誘発性関節炎マウスを表しており、そして化合物７ｅは処理されたＣＩＡマウスを表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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