(57)【要約】本発明は、テストサンプル中の検体を決定するためのラテラルフロー酵素アッセイデバイスおよびテストキットに関する。さらに本発明は、酵素基質を検体として直接使用することによって検体を決定するためのラテラルフロー法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中における検体の存在を決定するための方法であって、
ａ）毛管現象によって液体を移送可能な乾燥マトリックス材を含み、前記サンプルを受け取る開始域と、少なくとも一つの固定した酵素を有する反応域、とを少なくとも有する、ラテラルフローテストストリップを組み入れるテストデバイスを提供すること、および；
ｂ）該サンプルを開始域に接触させることによって、テストストリップを通じる液相の移動を生じさせること；
ｃ）反応域における酵素による検体の共有結合修飾によって直接的、または間接的に反応域で引き起こされる、検出可能なシグナルを決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップａ）において提供されたテストストリップが、追加の試薬域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）において提供されたテストストリップが、追加の乾燥した試薬を開始域および／または試薬域および／または反応域に含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
テストストリップ上のウィックによって、ステップｂ）で発生する液体の流れが強くなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出可能なシグナルが酵素反応の生成物によって発生し、前記生成物は可視であって、ほとんど溶解しないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップｃ）での検出可能なシグナルが、リサイクル酵素反応を用いることによって発生することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サンプル中の検体の存在を決定するためのラテラルフローテストデバイスであって、毛管現象によって液体を移送可能な乾燥マトリックス材を含み、前記サンプルを受け取る開始域と、少なくとも一つの固定した酵素を有する反応域、とを少なくとも有するテストストリップを組み入れ、前記テストストリップ上の酵素と任意の追加の試薬は、検体の共有結合修飾に適しており、即ち直接的あるいは間接的に検出可能なシグナルを発生させるために適している、前記デバイス。
【請求項８】
テストストリップが、さらに乾燥マトリックス材に取り付けられる固体支持体を備えることを特徴とする、請求項７に記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項９】
テストストリップが、さらに乾燥試薬を含有する、試薬域を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイスであって、テストストリップが、乾燥した界面活性剤抽出剤を含有する開始域、および１種または２種以上の乾燥した酵素基質、および／またはコファクターを含有する試薬域、ならびに少なくとも一種類の固定された酵素を含有する反応域を含むことを特徴とする、前記デバイス。
【請求項１１】
テストストリップが、さらにウィックを含むことを特徴とする、請求項７〜１０のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項１２】
さらにハウジングを備えることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項１３】
反応域で形成されるシグナルの検分を可能にすると同時に、操作の簡易化、および汚染を防止するために、反応域および／または試薬域が、透明なフィルムによって保護されることを特徴とする、請求項７〜１２のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項１４】
テストストリップが、界面活性剤抽出剤としてＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）を含有する開始域、および基質ＮＢＴとグルコースとを含有する試薬域、ならびに固定された酵素グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとを含有する反応域を含むことを特徴とする、請求項７〜１３のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイス。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイスの酵素アッセイにおける使用。
【請求項１６】
表面試験のための請求項１４に記載のラテラルフローテストデバイスの使用。
【請求項１７】
液体試験のための請求項１４に記載のラテラルフローテストデバイスの使用。
【請求項１８】
請求項７〜１４のいずれかに記載のラテラルフローテストデバイスを含む酵素アッセイテストキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、テストサンプル中の検体を決定するためのラテラルフロー酵素アッセイデバイスおよびテストキットに関する。本発明はさらに、前記検体を酵素基質あるいは補基質(co-substrate)として使用することにより、検体を検出するためのラテラルフロー法に関する。
【０００２】
技術背景
多くの生化学の分析は酵素アッセイに基づいている。多種多様なアッセイは、臨床化学、衛生検査および分子生物学、細菌学、水質試験とを含む生命科学の分野で使用されている。
【０００３】
概して、対象の検体は酵素触媒反応のための基質、あるいは補基質であり、前記酵素触媒反応は、さらなる基質成分の追加を伴って、元の検体よりも生成物を容易に検出し、定量しやすくする。このようなアッセイは、一回または複数回の酵素ステップを含み得る。検出方法は、吸光度の増大、特に色の変化、蛍光性の変化、発光性の変化、表面電位の変化、もしくは円偏光二色性、光散乱度などその他の光学特性の変化、または他の容易に定量できる物理特性の変化を含み得る。
【０００４】
定性的あるいは定量的な検体の検出を目的とする実験室での試験のほとんどは、検体の直接的な定量よりも容易に検出可能なシグナルを生じるための確定したプロトコルに従って正確な量の２種以上の試薬液を加えるというフォーマットを使用している。
【０００５】
一般的な酵素アッセイの手順において、オペレータは、サンプルの溶液中の検体と反応させるための酵素および基質反応成分が必要になる。それに加えて、緩衝成分および対象の検体をサンプルマトリックスから抽出する剤、さらに酵素成分、さらに酵素コファクター、追加のシグナル成分、ならびに未知の濃度サンプルと比較するためのポジティブコントロールとして、既知の基準濃度を有する検体が必要であろう。
【０００６】
好ましくない化学的交差反応、および／または不適切なイオン状態、および／または保管に不安定性をもたらす効果のために、異なるアッセイ成分は多くの場合、別の成分と相容れない。結果として、アッセイ成分は２種以上の別個の試薬に生成される必要がある。即ち酵素アッセイを実行するためには、サンプルに加えるための少なくとも独立した酵素および基質試薬を有するのが一般的である。
【０００７】
結果として、酵素アッセイのための実験プロトコルは、多くの場合において長時間を要し、かつ複雑であり、アッセイを実行する前の広範囲にわたって準備するステップおよび特殊な装置、ならびにオペレータに対する高い技術と訓練を必要とする。液体ベースで行われるアッセイはさらに、管などの反応槽、およびマイクロピペットなどの正確な量の溶液を分注するための手段、ならびに使用後に安全に反応成分を処分する手段が必要となる。
【０００８】
それに加えて多くの場合、液体試薬内の溶液中で酵素を安定化することは困難である。冷凍の乾燥試薬は安定性を向上させるが、再水和（rehydration）させるために１種または２種以上の溶液の供給が必要となり、またこの余分なステップは、ユーザにとって重要な利便性の減少に相当する。
【０００９】
酵素アッセイのための新規で高い利便性を有するフォーマットまたはデバイスは、以下に述べる項目を特徴とする場合、重要な恩恵を提供する。
・長い時間を要さず、かつ複雑な準備に要するステップを必要とせず、取扱が簡易
・１種からいくつかのアッセイ試薬を取り込み、安定な調合が可能
・適切な機器によって読み込める可能性
・ポジティブコントロールの同装置内への組み込み
・製造が容易
・屋外での使用を可能にする強固な構造
【００１０】
このようなデバイスは、未熟練のオペレータによる操作、実験室環境の内外での使用の両方に非常に適している。
【００１１】
近年イムノアッセイの分野において、重要な進歩が達成されている。ラテラルフローアッセイにおいて、試薬とサンプルは、１種または２種以上の特定の検体を検出するための試薬を含む線状のマトリックス内部を移送されるが、該ラテラルフローアッセイは、上記した要求事項を充足する。ラテラルフローアッセイは、典型的にイムノアッセイであり、検体は特異抗体の結合によって特定される。大部分のアッセイは、結果としてアッセイの非固定層（mobile phase）から固定層（immobile phase）に検体を移動させる検体特定を伴って、２種の結合イベントに依存する。第１の結合反応は、非固定層において、検体と検体に対する標識付きの特異結合分子との間に起こる。第２の結合反応は、標識付きの検体結合分子合成物（analyte-binding molecule-label complex）と反応域に固定化された第２の特異結合分子との間に起こる。この２つの結合反応が組み合わさり、検体が存在する場合にラベルを反応が起きる場所に集中させ、検体検出の基盤を形成する。
【００１２】
例えばUS5591645は、固定化された検体結合剤、および非固定化された検体結合剤を含む液体サンプル中における検体の存在を決定するための方法およびデバイスを開示している。
【００１３】
同類の方法およびデバイスは、US5770460に開示されており、検体の検出は、固定された検体結合剤によって捕捉される前の、検体結合剤と非固定層の検体に付けられた標識との結合に依存する。
【００１４】
ラテラルフローアッセイについて、例えばWO97/09620に記載されており、共有結合した酵素を伴う検体結合剤が、検体と結合し、次いで拡散しないように取り付けられる検体レセプタと結合し、それによって検体が存在する場合に、酵素は固定化される。
【００１５】
US5710005は、非固定層に存在する１種または２種以上の成分を無期限に固定化する、結合反応のいくつかの例を含み、これはラテラルフローアッセイのための抗体結合反応に加えて使用され得る。
【００１６】
従来技術のラテラルフローアッセイにおける、検体検出の重要なステップは、非固定層から固定層への標識の局所化であり、これは結合剤の結合の相互作用による間接的な結果であって、その一つに対して酵素、またはその他の標識が連結される。
【００１７】
今日では、ラテラルフローテストフォーマットの更なる簡易化が可能で、および標識されない、または検体の永久的な結合がなされる酵素アッセイへの使用が可能であることが分かっている。
【００１８】
発明の概要
本発明は、サンプル中における検体の存在を決定するための方法であって、
ａ）毛管現象によって液体を移送可能な乾燥マトリックス材を含み、前記サンプルを受け取る開始域（start zone）と、少なくとも一つの固定した酵素を有する反応域（reaction zone）、とを少なくとも有する、ラテラルフローテストストリップを組み入れるテストデバイスを提供すること、および；
ｂ）該サンプルを開始域に接触させることによって、テストストリップを通じる液相の移動を生じさせること；
ｃ）反応域における酵素による検体の共有結合修飾によって直接的、または間接的に反応域で引き起こされる、検出可能なシグナルを決定すること
を含む、前記方法に関する。
【００１９】
１つの好適な態様において、ステップａ）で提供されたテストストリップは追加の試薬域を含む。
【００２０】
一つの態様において、ステップａ）で提供されたテストストリップは、追加の乾燥した試薬を開始域、および／または試薬域、および／または反応域に含む。
【００２１】
別の態様において、テストストリップ上のウィックによって、ステップｂ）において発生した液体の流れが強くなる。
【００２２】
ある好適な態様において、検出可能なシグナルは酵素反応の生成物によって発生し、前記生成物は可視であって、ほとんど溶解しない。
【００２３】
ある好適な態様において、ステップｃ）での検出可能なシグナルは、リサイクル酵素反応（recycling enzyme reaction）によって発生する。
【００２４】
本発明はさらに、サンプル中の検体の存在を決定するためのラテラルフローデバイスであって、毛管現象によって液体を移送可能な乾燥マトリックス材を含み、前記サンプルを受け取る開始域と、少なくとも一つの固定した酵素を有する反応域、とを少なくとも有するテストストリップを組み入れ、前記テストストリップ上の酵素と任意の追加の試薬は、検体の共有結合修飾に適しており、即ち直接的あるいは間接的に検出可能なシグナルを発生させるために適している、前記デバイスに関する。
【００２５】
ある好適な態様において、テストストリップはさらに乾燥マトリックス材に取り付けられた固体支持体を備える。
【００２６】
ある好適な態様において、テストストリップはさらに乾燥試薬を含有する試薬域を含む。
【００２７】
特に好適なある態様において、テストストリップは、乾燥した界面活性剤抽出剤を含有する開始域、１種または２種以上の乾燥した酵素基質、および／またはコファクターを含有する試薬域、ならびに少なくとも一種類の固定された酵素を含有する反応域を含む。
【００２８】
別の好適な態様において、テストストリップはさらにウィックを含む。
【００２９】
別の態様において、テストデバイスはさらにハウジングを含む。
【００３０】
特に好適なある態様において、ラテラルフローテストストリップは、界面活性剤抽出剤としてＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）を含有する開始域、および基質ＮＢＴとグルコースを有する試薬域、ならびに固定された酵素グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼとを含有する反応域を含む。
【００３１】
本発明はさらに、酵素アッセイにおける本発明に従うテストデバイスの使用に関する。
【００３２】
ある好適な態様において、該テストデバイスは表面試験に使用される。
【００３３】
別の好適な態様において、該デバイスは液体試験に使用される。
【００３４】
本発明はさらに、本発明に従うラテラルフローテストデバイスを含む酵素アッセイテストキットに関する。
【００３５】
発明の詳細な記述
本発明は、ラテラルフロー原理が酵素アッセイに使用可能であるという発見に基づく。従来技術に従うラテラルフローイムノアッセイにおいて、検体の特異性は、検体と使用される抗体分子の抗原認識領域との特異結合の相互作用によって生じるものであり、該結合はアッセイの所要時間と比較して、その効果は永続する。これはリガンド−レセプタ結合に類似している。２種類の異なる試薬を必要とする。
【００３６】
１．ラテラルフローイムノアッセイデバイスに固定された標識されていない抗体分子は、デバイスの画定された位置にある検体の捕捉という目的にかなう。
【００３７】
２．いわゆるサンドイッチアッセイフォーマットにおいて、第二試薬は抗体分子を含み、これらはデバイスに固定されておらず、標識が付けられている。また、これらの分子はイムノアッセイ中に検体に結合する。いわゆる競合アッセイフォーマットにおいて、第二試薬は、検体と同一の、固定された抗体捕捉分子の認識ドメインによって結合し得る認識トレーサーリガンド分子（labelled tracer ligand molecule）を含み、その結果、前記結合可能なトレーサーは、サンプル中に存在する検体の量に反比例する。
【００３８】
検体のアッセイは、捕捉する位置で標識を検出することによっても実現される。検体自体は、標識検出のためのシグナルに寄与しない。
【００３９】
従来技術に従って、代替の分子が抗体の役割を担うために使用され、これはこのような分子が、特定でかつ永続する結合を検体に提供する場合による。
【００４０】
逆に、本発明に従う酵素アッセイにおいては、検体検出のシグナルは認識によって実現されない。検体は、抗体、レセプタ、あるいはその他の分子いずれとも永久的に結合しない。検体は、酵素反応における検体の一時的な関与によって検出される。この酵素反応の間、検体は化学的に修飾され、したがって直接的あるいは間接的に、検出可能なシグナルを生じる反応に関与する。結果として、本発明に従う酵素アッセイにおいて、検体の特性は、検体を基質もしくは補基質またはコファクターとして使用し、化学的に検体を修飾する酵素によって提供される。即ち検体の検出および定量のためのシグナルは、検体を伴った酵素媒介の反応のターンオーバーに依存する。
【００４１】
本発明に従うラテラルフロー酵素アッセイは、少なくとも一つのラテラルフローテストストリップを備えるラテラルフローデバイスを用いて実行される。このテストストリップは、少なくとも一つの、毛管現象によって液体を移送可能な乾燥マトリックス材、サンプルを受け取る開始域、および検体に特殊で検出可能なシグナルを発生させる酵素反応が行われる反応域を含む。
【００４２】
典型的に、乾燥マトリックス材は固体支持体に固定されており、吸収性のある相互連結する多孔性パッドの形状を有する。マトリックス材は典型として、従来のセルロース紙、ニトロセルロース、あるいは親水性などのアッセイの特性を向上させるように化学的に処理された誘導体（derivative）などの吸収性に優れた物質である。マトリックス材は、関連のアッセイ試薬の安定性、およびアッセイの化学的性質、ならびにフローレートなどのラテラルフロー特性と矛盾しないように選ばれるべきである。固体支持体は、典型として非吸水性物質であり、多くの場合にポリエステルシートなどのプラスチックである。該サポートは、典型として乾燥マトリックス材に接着剤で固定される。以上に述べた全ての物質は、当業者によって広く認知されている。
【００４３】
開始域は、好ましくはテストストリップの一端に定められる。分析されるサンプルは開始域に施与される。ある好適な態様において、開始域は吸い取り紙から構成されるサンプルパッドである。ガラス繊維物質、ポーレックス（登録商標（ポーレックス・コーポレーション））シート材のような繊維状プラスチック物質、およびビスコースとポリエステルを含む不織布も使用できる。好ましくは、このような物質は単一のシート状、あるいは層状である。サンプルパッドの容積容量は、デバイスの初期サンプル吸い込み量を画定する。サンプルパッドはさらにフィルターとして働き、好ましくない粒状物質の反応域への進入防止を助ける。開始域の物質は、充満した非固定化され得るアッセイ成分の残りのデバイス部分への解放の制御を助け、従ってこの目的と矛盾しないようにされるべきである。
【００４４】
例えばピペットを使用して、あるいは開始域を液体サンプルに浸すことによって、開始域に微量の液体サンプルを加えることが可能である。開始域は、酵素アッセイの成分、および／または反応域での非特異的結合効果を防ぐ（妨害する）ための化学物質、および／またはアッセイ成分の親水性、溶解性ならびにラテラルフロー特性を向上させるための化学物質、および／または検体解放剤（analyte release agent）、および／または抽出剤、好ましくは界面活性剤抽出剤などの、該開始域上で乾燥する成分を含む。
【００４５】
反応域は、開始域またはさらにテストストリップの下部に直接隣接してもよい。反応域は、安定状態の酵素アッセイの１種または２種以上の成分を含有し、特に少なくとも１種の反応域に固定された酵素を含む。追加の成分は、追加の固定化酵素、および／または固定された、あるいは乾燥した酵素基質、補基質、コファクターなどであり得る。好適な態様において、反応域は、変性を起こさずにタンパク質を非共有結合または共有結合して固定するために適し、かつ物質のラテラルフロー特性に適するように選ばれるパッド、または膜である。特に好適な態様において、反応域は、高タンパク質結合能を伴うニトロセルロース膜で構成される。また、この膜はセルロースアセテートを組み入れてもよい。パッドまたは膜は、酵素停止化の前、および／または後で処置されてよく、これは、検体および／またはアッセイ成分の非特異結合などの、好ましくない効果を最小限にするため、および／または親水性、およびラテラルフローを向上させるためである。アッセイを含む反応が起こり、元のサンプル内における検体の存在を示す生成物が生成されるのは、反応域上においてである。
【００４６】
ある好適な態様において、テストストリップはさらに試薬域を含み、これは概してサンプルパッドに利用される物質と同類の物質から構成され、好ましくは吸い取り紙、ガラスファイバー、ポリエチレンファイバー、またはポリエステルから構成され、開始域と反応域との間に、あるいはこれらの一方または両方に重なるように位置する。試薬域は１種または２種以上の、酵素基質成分などの安定状態で乾燥したアッセイ成分を含み、および／または反応域における非特異的結合効果を防ぐ（妨害する）ための化学物質と、および／またはアッセイ成分の親水性、溶解性ならびにラテラルフロー特性を向上させるための化学物質、および／または検体解放剤、および／または抽出剤、好ましくは界面活性剤抽出剤を開始域の代わりに、あるいは開始域に追加して含む。試薬域の物質は、充満した非固定化され得るアッセイ成分の反応域への解放の制御を助け、従ってこの目的と矛盾しないようにされるべきである。
【００４７】
別の好適な態様において、テストストリップはウィックまたは同種の手段を組み込み、これはテストストリップのマトリックスからデバイスを通じて、液体サンプルを引っ張るものであり、したがって、サンプルパッドから毛管の流れを押し動かす。溶液のウィックへの流れは、サンプルパッドおよび試薬パッドから固定化酵素が反応する場所への持続する流れを確保し、生成物生成の量を最大化する。このウィックは、典型としてサンプルパッドに利用される物質と同類のもので構成される。ある好適な態様において、ウィックは吸い取り紙で構成される。吸収パッドの容積容量が一杯になった場合のみ、サンプルの容積は有限ではないとみなして、アッセイはエンドポイントに至る。
【００４８】
一つの態様において、テストデバイスは、デバイスによって生じるどんなシグナルも検出されるようにする一方で、使用中のデバイスの汚染を防ぐために、デバイスの反応域および／または試薬域を薄く覆う、プラスティックまたはその他の適切な物質で作られるフィルムをさらに備える。例えば、偽の肯定的な結果は、NADおよびNADHを検出するためにデザインされたデバイスを用いるときに生じることがあり、これは使用中に反応域に触れた場合、指にこれらの成分が自然と存在することによって起きる。このフィルムの利用は、操作を容易にし、汚染の危険性を避けることを可能にする。
【００４９】
一つの態様において、テストデバイスは、デバイスに追加の強度と剛性を提供するために、および汚染することなくデバイスの操作を容易にするために、プラスティックケースまたはその他のハウジングをさらに備える。好ましくは、テストストリップは、部分的にのみハウジングに覆われる。好ましくは、開始域はサンプルの施与を容易にすることを確実にするために、サンプルのハウジングに覆われない。
【００５０】
多種のテストストリップの吸収領域は全て同一平面上にあり、各領域間の液体サンプルの毛管流動を可能にする。このプロセスでは、検体をサンプル内のマトリックスから抽出するための界面活性剤など、テストストリップ上に乾燥状態で配置されるどんな成分も溶液に戻される。全ての領域は、例えば酵素反応の成分を保管するのを助ける、あるいは酵素反応に適した反応条件（例えばpH）を提供する、安定剤または緩衝剤などの試薬をさらに含んでもよい。いくつかの応用例について、酵素反応と化学反応を組み合わせると、例えば検出可能なシグナルの発生が改良されるように、有益であるかもしれない。この場合には、化学反応の成分は同様に乾燥状態でテストストリップの領域に含まれる。
【００５１】
本発明に従うある好適な態様において、酵素反応の基質は、低分子量を有し、溶液中で固定されないため、試薬パッドに配置される。酵素は、高分子量を有し、比較的固定されるため、反応パッドに置かれる。特に好適なある態様において、反応パッドはニトロセルロース膜で構成され、酵素は密に結合し、事実上該ニトロセルロース膜に固定される。
【００５２】
本発明に従うテストストリップをより複雑な分析に適応させるために、複数の試薬域が必要に応じて領域デザインに組み込まれてよく、および／または複数の酵素成分が反応域上の異なる点に置かれてもよい。
【００５３】
この方法における複数の成分の配置によって、コントロール反応を本発明に従うデバイスに対して、完全に組み込むことを可能にする。この反応は、デバイスが正しく作動していることを評価するために、および適切なコントロール反応と対象の検体をアッセイすることにより生成される生成物の量との間の半定量的な比較を容易にするために用いられ得る。
【００５４】
一つの態様は、２種以上の酵素もしくは酵素群またはテストデバイス上の独立した位置にある２種以上の対象の検体を検出することができるその他の試薬を使用する。
【００５５】
一つのさらなる態様は、同一のテストストリップ内で酵素アッセイおよびイムノアッセイの両方を組み込む。
【００５６】
図２は、本発明に従うラテラルフローテストストリップの概略的な説明図である。自己粘着性のプラスティックベース（６）上に、開始域（１）としてサンプルパッド、部分的に重なり合った試薬域（２）、酵素（３）をその上に固定させて伴う反応域（４）がある。反応域に隣接するのは、ウィック（５）である。
【００５７】
ラテラルフロー酵素アッセイによってサンプル中における検体を検出するための本発明の方法は、
ａ）本発明に従うラテラルフローテストデバイスを提供すること
ｂ）毛管作用によって液体が開始域からテストストリップのその他の領域に引っ張られるように、サンプルをテストストリップの開始域に施与すること
ｃ）検出可能なシグナルを反応域で決定すること
を含む。
【００５８】
液体サンプルがテストストリップに施与される場合、液体サンプルの体積は通常テストストリップの端まで流動することを確保するために十分な量である。デバイスは、バルク流体（bulk fluid）から直接的にサンプリングするために使用されてもよく、これは毛管流動を開始させてデバイスを起動し、デバイスの容量に従ってサンプルの体積を吸い上げるために、デバイスの開始域を該流体に接触するように持ってくることで行われる。この点において、デバイスは“セルフサンプリング”とも言える。
【００５９】
乾燥した、または小体積の液体サンプルの場合において、サンプルの開始域への施与および毛管流動の発生は、加湿剤の使用により容易になる。サンプルの使用の前および／または後に、加湿剤が開始域に加えられてもよい。
【００６０】
サンプルを施与した後に加湿剤が施与される場合、第１のステップにおいて、例えばテストストリップの開始域をサンプルに押しつけること、もしくはサンプルエリア一面をテストストリップで拭うこと（例えば、表面の清浄度を決定する場合）によって、ある量の固体あるいは小体積の液体サンプルがテストストリップに施与される。第２のステップにおいて、液体流動を可能にするような適切な量の加湿剤が施与される。好ましくは、加湿剤は水もしくは緩衝液である。いずれの場合においても、加湿剤はサンプルから検体を解放するための界面活性剤などの抽出剤を含有し得る。
【００６１】
特に表面試験、例えば食品調製または製造業界などに適応する、この態様の別の型において、微量の加湿剤を開始域に施与してから表面が拭き取られる。加湿液は、表面から開始域への検体の移送を容易にし、サンプルマトリックスから検体を液に解放するための界面活性剤や同類の剤などの適切な抽出剤を含有してよい。開始域のサンプルパッドを圧縮するために加えられる圧力が試薬パッドおよび前方への毛管流動を開始させる。
【００６２】
さらに洗練された態様において、開始域の液体容量は、確定した加湿液の体積、例えば一滴あるいは確定した数の滴が、サンプルパッドを湿らすのに十分であり、デバイスのその他の要素に浸透して、アッセイを開始するために十分ではない量に調節される。サンプリング後、第２の体積の加湿液が開始域の容量を超えるために加えられ、通常の液体サンプルの挙動に従ってサンプルがデバイスを通って移動することを可能にする。この方法では、デバイスは、ラテラルフローを開始させるための第２の液量を加えるに先立って、容量に余地をもつ。
【００６３】
サンプルを施与した後に、毛管現象により液体は、一旦満たされてから、開始域からテストストリップの次の領域に引っ張られる。試薬域が存在する場合において、該領域上の乾燥したアッセイの成分は再水和し、液体と一緒に反応域へ運ばれる。反応域にある成分も同様に再水和する。ここで、酵素成分は固定されているので、検体および全てのアッセイ成分は、同一のポジション（position）で存在し、反応が検出可能なシグナルを発生させることを可能にする。
【００６４】
検出可能なシグナルは、吸収性、蛍光性、または発光性の変化、あるいはｐＨ値の変化、好ましくは可視的な変化である吸収性の変化のような適切な手段によって可視あるいは測定可能であると言える。
【００６５】
ある好適な態様において、酵素反応によって形成される検出可能な生成物は、反応域の溶液に対する溶解性が大きく減少する、あるいは反応域のマトリックスに対して基質よりもより大きな親和性を有する。これは、溶解性を有する液流による前記生成物の移動を減少させて、反応領域の一箇所に集中、堆積させることであって、検出感度を得る。
【００６６】
ある特別な態様において、反応域にあるマトリックスおよび反応域に隣接するマトリックスは、さらに生成物の堆積を容易にし、局所化させる疎水性を向上させるために修飾される。
【００６７】
本発明はさらに、少なくとも一つの本発明に従うテストデバイスを備えるテストキットに関する。それに加えて、さらに加湿剤もしくは標準液のような補助物質に加えて、検出方法のプロトコルが書かれた文書、あるいは標準カラーチャートなどを含み得る。いくつかの酵素反応および／または応用に有益な剤として停止液が含まれ得る。
【００６８】
本発明におけるテストデバイス、テストキットおよび方法は、酵素を用いて検体が検出されるどのような酵素アッセイに対しても適しており、ここで、酵素は化学的に（共有結合して）検体を修飾することが可能で、したがって直接的あるいは間接的に検出可能なシグナルを発生する。直接的に検出可能なシグナルの発生とは、酵素によって化学的に修飾された後に、検体自身が検出可能なシグナルを発生するということである。間接的に検出可能なシグナルの発生とは、検体を伴う酵素媒介の反応に寄与する、あるいは酵素媒介の反応に関連した二次的な反応に寄与する別の化学物質が、検出可能なシグナルを発生させるために用いられ、ここでは、テストストリップに組み込まれる化学物質が検出可能なシグナルのための主要な前駆体として振る舞う。
【００６９】
間接的な検出可能なシグナルの発生を伴う、酵素アッセイの一例は、検体が酵素にとって必要不可欠なコファクターもしくは補基質であるアッセイであって、当該酵素は追加の基質を、同時に検出可能な生成物あるいは追加の酵素反応あるいは化学反応によって検出可能な生成物に変化する生成物に変化させる。
【００７０】
適切な酵素アッセイの例を示す。
−NADおよび適切なジアホラーゼ基質、例えばNBT、を組み入れる基質製剤を使用する、酵素グルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼによるグルコースの決定。
−WO94/25619に開示されている方法によるATPの決定。当業者は、本開示内容を使用し、このアッセイを本発明のフォーマットに適合させ得る。
−NADH、2-オキソグルタラートおよび適切なジアホラーゼ基質、例えばNBT、を組み入れる基質製剤を使用する酵素グルタミン酸塩デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼおよびウレアーゼによる、体液中の尿素の決定。
【００７１】
−適切なペルオキシダーゼ基質、例えば4-アミノフェナゾンおよびフェノールを組み入れる基質製剤を使用する酵素コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼによる、血清コレステロールの決定。
−NADおよび適切なジアホラーゼ基質、例えばNBTを組み入れる基質製剤を使用する酵素アルコールデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼによる、アルコールの決定。
−ホスホエノールピルビン酸塩、オキサロアセテート、NADHおよび適切なジアホラーゼ基質、例えばNBTを組み入れる基質製剤を使用する、酵素ホスホエノールピルビン酸塩カルボキシラーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ならびにジアホラーゼによる、体液中の二酸化炭素および／または重炭酸塩の決定。
−NAD(H)比色分析アッセイ（colorimetric assay）を使用するバイオマスの検出。
【００７２】
以下において、本発明に従う酵素アッセイの適切なフォーマットが、NAD(H)比色分析アッセイとともに例証される。これは、サンプル中において、NAD(P)がNAD(P)Ｈに転換されることによって存在するバイオマスのマーカーとして、NAD(P)とNAD(P)Hの総プール量を測定して、サンプル中のバイオマスの存在を検出する方法である。
【００７３】
サンプル中に存在する、酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、例えばNADおよびNADPは適切な酵素（E1）が第二基質（S1）を伴うことによって、還元型のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、例えばNADHおよびNADPH、に転換され得る。
【化１】
2005502363.tif 000002
【００７４】
適切な酵素E1は、NAD(P)をNAD(P)Hに転換させるどのような酵素でもよい。好適な態様において、該酵素はデヒドロゲナーゼ、例えばグルコース-6リン酸塩デヒドロゲナーゼである。
第二のステップでは、酸化型および還元型（スキームＩの（ｘ＋ｙ）NAD(P)H）のいずれも検出することができる。
【００７５】
例えば、反応スキームＩＩに記述されているように、追加の酵素反応あるいは化学反応を用いる検出可能なシグナルP2の発生によって検出がなされる。
【化２】
2005502363.tif 000003
【００７６】
これらの反応からのシグナルは、色の変化、その他のスペクトル特性、蛍光特性、発光、あるいは電気化学的ポテンシャルの変化であり得る。
【００７７】
検出感度を向上させるために、サンプル中のNAD(P)とNAD(P)Hの両方はリサイクルされてよい。
【００７８】
反応スキームＩＩより分かるように、化学的または酵素の検出方法という点で、NADHとNADPHは直接的に、もしくは適切な化学伝達物質あるいは酵素触媒反応のいずれかを介し、適切なドナー分子S2との反応によって、NADもしくはNADPに再転換される。
このドナーの還元、デヒドロゲナーゼの第２の生成物、または生成した還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、バイオマスの存在を示す指標として用いられるシグナルP2をもたらす。
【００７９】
そして、この反応で発生するNAD(P)は、サンプル中のNAD(P)のNAD(P)Hへの元々の転換に使用された同じ酵素E1を用いることによって、再びNAD(P)Hにリサイクルされる。結果として、アッセイの検出感度を向上させ、特に少量のバイオマスの検出に適する簡単なサイクルシステムがもたらされる。このサイクルシステムを正しく機能させるために、余分の酵素基質S1およびS2の提供が必要となる。サイクル反応のスキームは図１に示される。
【００８０】
NAD(H)アッセイの一つの好適なフォーマットにおいて、吸い取り紙から構成される開始域は乾燥した界面活性剤抽出剤を保有し、同様に吸い取り紙もしくはガラスファイバーで構成される試薬域はアッセイに使用される酵素の基質を含有し、高タンパク質結合能を伴うニトロセルロース膜で構成される酵素自身は反応域に固定されている。このアッセイのための好適な試薬は、開始域の界面活性剤抽出剤としてDTAB（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）であり、酵素グルコースデヒドロゲナーゼ、および反応域に固定されたジアホラーゼ、ならびに対応基質NBT、試薬域上に乾かされたグルコースである。
【００８１】
代わりにDTABを試薬域上に乾かされた基質試薬に組み入れてもよい。
【００８２】
開始域に施与される液体サンプルは、毛管作用によって試薬域へ移動し、そこで酵素基質は再水和し、反応域に固定された酵素へサンプルを伴って移動する。検体NAD、NADH、NADPおよび／またはNADPHの存在下では、黄色のNBTは酵素とその基質との反応によって紺色のホルマザン塩に転換し、目に見える色の変化をもたらす。ホルマザン生成物の可溶性は低下し、該生成物が反応箇所の近くに集中するように作用し、より濃い色を与える。サンプル中に存在するそれぞれの検体分子に対して多くの発色する分子を生成し、試薬域から供給される基質を提供して、２種の酵素がNAD(P)およびNAD(P)Hをリサイクルするので高い検出感度が達成される
【００８３】
その他の態様において、NAD(P)Hおよびジアホラーゼとともに、容易に検出可能な生成物を生成するために、その他のテトラゾリウム化合物またはジアホラーゼ基質がNBTの代用になり得る。別の態様において、酵素ジアホラーゼを適切な化学試薬、例えばメルドラブルー(Meldola’s Blue)およびNBT、に取り替えてもよく、これらはNAD(P)Hの存在下において、容易に検出可能な生成物を生成することができる。
【００８４】
２種の重要なパラメータの測定を可能にするため、例えば同じサンプルを用いる単一のデバイスでサンプル衛生状態を検査するために、タンパク質と比色分析反応を起こす試薬は、NAD(P)およびNAD(P)Hを検出するために用いられる酵素および基質から離れた位置の反応ストリップに固定されてもよい。
【００８５】
同一サンプル中のタンパク質およびNADのアッセイは、サンプルの組成に関する追加の検出感度と情報を提供する。ビウレット反応法、ラウリー(Lowry)法、クマシー(Coomassie)染色法、BCA法、およびニンヒドリン反応法などの多種のプロテイン検出方法に従う検出に必要とされるものは、タンパク質を検出するための試薬として、本発明の方法において使用可能である。タンパク質を検出するための試薬は、好ましくはオクタハロゲン化していないサルフォンフタレイン群から、望ましくはフェノールサルフォンフタレイン、およびクレゾールサルフォンフタレインからなる群から選択される。適切な試薬は、例えばブロモフェノール・ブルー、ブロモクレゾール・グリーン、ブロモクレゾール・パープル、ブロモフェノール・レッド、ブロモチモール・ブルーおよびブロモクロロフェノールである。
【００８６】
NAD(H)比色分析アッセイを使用するバイオマス検出のための説明と同じ原理が同様にその他のアッセイに応用されると考えられ、アッセイ用の基質およびその他の試薬は、パッドで乾かされ、溶液のデバイスを横切る溶液のラテラルフローに関して固定された酵素の上流にあり、しかしサンプルを適用または捕捉する点、あるいはその下流ではないようにする。
【００８７】
また、デバイスでのこのようなアッセイを２種以上組み入れること、または酵素アッセイとその他のアッセイのタイプ、例えばデバイスでのイムノアッセイあるいはタンパク質アッセイとの組み合わせることを容易にするために、図２に従うデバイスのデザインを変化させて利用できると考えられる。該デザインを変化させた詳細な例として、デバイスのサンプルゾーンからのラテラルフローは、それぞれのアッセイの離れた反応域に向かう２つ以上の方向を持ち得る（双方向ラテラルフローまたは多方向ラテラルフロー）と考えられる。
【００８８】
当該技術分野における酵素アッセイと比較して、本発明に従うラテラルフロー酵素アッセイは、いくつかの優位性を帯びている。
【００８９】
ボトルの液体試薬製剤を使用する前記の簡単なテストストリップフォーマットでアッセイが実行される場合、ドロッパーボトルを使用して、一滴の基質製剤およびパッドに置かれる酵素製剤とが必要となる。一つの典型として、滴のサイズはそれぞれの溶液で３０μｌであり、好都合なことにボトルおよび溶液の流体運動によるサイズの減少は抑制され、典型例として熟練した研究者のみが使用する、容積測定マイクロピペットを使用しなくてよい。同等のアッセイにおいて、本発明のデバイスフォーマットを使用し、事前に乾燥させた試薬を伴うと、製剤中に４％もしくはそれ以下のみの酵素が必要とされる。これは、従来の液体テストフォーマットと比較して、物質コストの重要な削減に相当する。
【００９０】
加えて、本発明に従うテストフォーマットは、
−個別にデバイス上で乾かされる異なった相容れない成分は、安定した試薬製剤として離れた位置に置かれ得る。
−サンプルを組み込むもの以外のどのような溶液も必要としないことを意味し、アッセイを実行するための本デバイスの使用において、一度の液体追加ステップしか必要としない。全てのアッセイ成分は、同一のデバイスに存在するので、アッセイを実行するために、従来の液体テストで必要とされるいくつかの試薬ボトルを必要とせず、１種のアイテムだけが必要になる。
−その他の試薬およびデバイスのその他の場所に配置される基質および試薬へのサンプリング作用の直接的な影響を受けることなく、サンプリングが可能であり、これはサンプリングパッドの使用によるもので、該サンプルパッドで表面全体を拭う、あるいはサンプルパッドを液体に浸して行われる。例えば、サンプルパッドを液に浸して行うサンプリングの場合、バルクサンプル（bulk sample）への溶離による基質試薬の損失の危険性は、ラテラルフロー原理を使用しないフォーマットと比較して低い。
【００９１】
−サンプルに対して連続的に起こる“ステップ”（例：一連の抽出；基質との混合；酵素反応；生成物形成および析出）を可能にし、１種の液体の追加によって開始され、適切な、連続的にも起こる再水和およびアッセイに必要な試薬の混合が行われる。これにより、エンドユーザーの操作は簡易化される。
−サンプルが一度加えられると、それ以上のステップまたはデバイスの取扱いをユーザーに必要としない（例：フィルターの除去が不要；洗浄ステップが不要）。
−従来の液相アッセイと比較して、比較的少量の成分、特に酵素成分を必要とする。これは、多くの場合酵素が最も高価な成分であるアッセイにおいて特に重要である。
【００９２】
−試薬が２種以上の離れた場所に離れて位置するため、ならびに試薬が乾燥した状態で保管されるために、１種または２種以上のアッセイの試薬の僅かな汚染によって引き起こされる保管時の偽のバックグラウンド交叉反応を防ぐ。
−重要なことに、アッセイの間、毛管流動は未反応の可溶のアッセイ成分−特にシグナル生成物の前駆体を、色形成の領域から引き離すので、アッセイバックグラウンドは減少する。可溶の成分が無数に存在する同類の静的な（非毛管流動）アッセイと比較して、この方法では、生成物に対する前駆物質の非特異転換のバックグラウンド効果は低減される。
−目および／または読み取り機器によって、反応域における生成物の読み取りが可能である。
−大量生産が可能である。
−屋外での使用に適した強固な構造が可能である。
【００９３】
これ以上のさらなる説明がされない場合においても、当該技術分野の業者は、先行の説明を使用し、本発明を最大限に利用し得るものと考えられる。好適で詳細な態様および例は従って、単に説明を目的とするものであり、開示内容の残りのどの部分にも制限を加えるものではない。
【００９４】
以上および以下において引用する全ての出願書類、特許、および出版物、ならびに2001年9月11日に出願された対応のEP01121820.3の全開示内容は、本明細書に参照として組み入れる。
【００９５】
図および表、ならびにその他の場所で使われる略字は、以下の意味を表す。
ATP      アデノシン５’三リン酸
DTAB    ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド
NAD      ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）
NAＤ(P)  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとニコチンアミドアデニンリン酸（酸化型）
NAD(P)H  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとニコチンアミドアデニンリン酸（還元型）
NADH    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）
NADP    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）
NADPH  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）
NBT      ニトロブルーテトラゾリウム
【００９６】
例
例１ NADアッセイ用デバイス
本発明の例において、ニトロセルロースのリアクションストリップ、紙のサンプルパッド、試薬パッドおよびウィックを含むデバイスは、図２に示すように構成される。デバイスは、不活性のプラスティックサポート上にニトロセルロース膜を含む、ミリポアＳＲ膜（Millipore SR membrane）に基づいている。プラスティックサポートの自己粘着部は、サンプルパッド、試薬パッドおよびウィックのように振る舞う、適切なペーパーストリップを取り付けることを可能にする。デバイスは２０ｃｍ幅のストリップによって構成され、５ｍｍ幅の個々のデバイスに切り分けられる。グルコース４５０ｍＭおよび２ｍｇ／ｍｌのNBT、ならびにクエン酸塩１０ｍＭを含む基質製剤の溶液の中に試薬パッドを浸し、そして組立てに先だって乾かす。
【００９７】
使用するストリップを用意するために、トリス２００ｍＭ、３ｍｇ／ｍｌのジアホラーゼ、８ｍｇ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含む酵素製剤１μｌをストリップのニトロセルロース部に加え、２０℃で１０分間乾かす。この配置では、酵素と基質製剤は離されたままであり、長時間にわたってデバイスの安定性を向上させる。加えて、５ｍｍ幅の試薬パッドはそれぞれ、約２０μｌの基質の相当物を含有し、リアクションストリップ上に固定された酵素が、持続する一連の反応時間だけ基質を有することを確保する。使用される酵素の量はかなり少量であり、酵素は概してこのタイプのアッセイにおいて最も高価な化学物質であるので、従来の液体製剤と比較して、有意義な節約が達成される。
【００９８】
このアッセイは、１５pmolのNADを含有する溶液をサンプルパッドへ追加して実行される。該サンプルは試薬パッドへ移動し、そこで酵素基質が再水和し、サンプルを伴ってニトロセルロース反応パッドへ移動する。ここで、NADおよびアッセイ酵素ならびに基質が反応して、２０℃において５分以内に可視の紫のホルマザン生成物が生成し、このデバイスが溶液中のNADを検出可能であることを示す。実験が繰り返される際に、NAD溶液の代わりに蒸留水コントロールをサンプルとして用いると、２０℃において１０分後、紫色は形成されない。
【００９９】
例２ 乳酸塩アッセイ用デバイス
本発明の第２の例において、デバイスは例１に記載のものと同様の方式で構成され、生物学上重要な乳酸塩化合物を検出するために用いられる。この例において、酵素製剤は、ｐＨ８．０のトリス４００ｍＭ、５ｍｇ／ｍｌのジアホラーゼ、７．３ｍｇ／ｍｌの乳酸塩デヒドロゲナーゼからなり、例１に記載されているように、ストリップのニトロセルロース部分に乾かされる。試薬パッドは、NAD１００ｍＭ、２．５ｍｇ／ｍｌのNBTの溶液に浸されて準備され、それらは組立ての前に乾かされる。
【０１００】
アッセイは、１μmolのリチウム乳酸塩を含有する溶液をサンプルパッドに追加することにより、実行される。アッセイは例１と同様に進む。乳酸塩および酵素ならびに基質が反応して、２０℃において５分以内に可視の紫のホルマザン生成物を生成し、このデバイスは溶液中の乳酸塩を検出可能であることを示す。実験が繰り返し行われる際に、蒸留水コントロールを乳酸塩溶液の代わりにサンプルとして用いると、２０℃において１０分後、紫色は形成されない。
【０１０１】
例３ 低減されるバックグラウンド色形成
テストストリップのパッドに加えられる、ボトルの液体試薬製剤を使用する前記NADアッセイは、NBTとアッセイ酵素との光に誘発される相互作用の経時変化によって、偽のバックグラウンド色形成に対して敏感である。本発明のデバイスにおけるこの効果を評価するための実験として、以上の例１に記載されているように用意される２種のデバイスは、２０℃の蒸留水６０μｌをサンプルパッドに加えられることで作動する。一方のデバイスは、２０℃で５分間暗い状態に保たれ、他方のデバイスは、周囲の室内照明下に２０℃で５分間保たれており、前記配置でのサンプルパッドにおいて導かれた、液体ベースのテストと同等の光に誘発されるバックグラウンド反応を生じるのに十分である。ストリップがこれらの照明のあたる条件下に無期限置かれたとしても、バックグラウンド色形成は観察されず、基質および酵素の位置より上方にあるその他の反応物質が過剰に毛管移動するために、このフォーマットは周囲の室内照明による干渉、およびその他の偽のバックグラウンド効果にに対して非常に影響を受けにくいことを示す。
【０１０２】
例４ バクテリアの検出
バクテリアを検出するための本デバイスの使用を実演するために、７．２×１０７  コロニー形成数／ｍｌ（好気性菌生数により決定される）を含有する３０μｌの大腸菌NovaBlue（Novagen社、カタログNo.69009-3）培養液を、例１に記載されているように用意されるストリップのサンプルパッドに加える。該デバイスを動作させるために、水に対して０．３％ｗ／ｖのDTABからなる３０μｌの抽出溶液をサンプルパッドに加え、液体サンプルが毛管作用によってデバイスを通じて移動するために十分な体積を提供する。抽出剤はサンプルパッドに存在するバクテリアを溶解し、細胞内NAD(P)およびNAD(P)Hが比固定化サンプル層を伴って、試薬パッドを介して反応パッドに移動することを可能にする。NAD(P)(H)の存在を示す紫の発色は、５分以内に得られ、衛生検査アッセイにおける、“汚染”という結果に同等である。バクテリアを含まない無菌培養液を用いて繰り返し実験を行う場合、色形成は観察されない。
【０１０３】
例５ 衛生テスト
表面の衛生状態をサンプリングするための本デバイスの使用を実演するために、テストステンレス鋼表面、これは商業的な食品調理および製造分野で使われる代表的なものであるが、これに対して新鮮なターキーのミンチの抽出物を塗りつけ、乾かす。そして、３０μｌの蒸留水一滴を、２番目の例に記載されているように用意したストリップのサンプルパッドと、いずれかの残骸（debris）がテスト表面からパッドに移送されるように、表面全体を引っ張られるサンプルパッドとに加えられる。反応パッドもしくは試薬パッドに触れないように、およびサンプルパッドのみがテスト表面に接触することを確実にするように注意を払う。０．３％ｗ／ｖのDTABを含む３０μｌの抽出溶液をパッドに加えてアッセイを開始させ、この抽出溶液は、サンプルパッドの残骸に存在するNAD(P)分子もしくはNAD(P)H分子を解放し、液体サンプルが試薬パッドを介して反応パッドに移動することを可能にする。５分以内に紫色が反応パッドに形成され、生物学的物質がテスト表面に存在することを示す。サンプルパッドで、汚れたテスト表面を拭かずに実験を繰り返す場合、発光は観察されない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明で利用され得る酵素反応のスキームである。
【図２】本発明に従うラテラルフローテストデバイスの概要図である。
【図１】
2005502363.tif 000004
【図２】
2005502363.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2005502363.tif 000006
2005502363.tif 000007
2005502363.tif 000008
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2005502363.tif 000037
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502363.tif 000038
【国際調査報告】
2005502363.tif 000039
2005502363.tif 000040
2005502363.tif 000041
2005502363.tif 000042