(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症（MS）を治療する方法に関する。好ましくは、阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
c-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法。
【請求項４】
c-kit阻害剤が非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
阻害剤が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が以下からなる群より選択される、請求項4記載の方法：
‐ピリミジン誘導体、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
‐インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン、
‐単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、
‐ならびにキナゾリン誘導体。
【請求項７】
c-kit阻害剤が、以下の式IIの化合物から選択される、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法：
2005502614.tif 000009
式中、R1、R2およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、または環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；
ならびにR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【請求項８】
c-kit阻害剤が、4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドである、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
c-kit阻害剤が、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
c-kit阻害剤が活性化c-kitの阻害剤である、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
活性化c-kit阻害剤がSCF活性化c-kitを阻害することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤が構成的に活性化された変異体c-kitを阻害することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
以下を含むスクリーニング法によって得ることができる、選択的で強力かつ非毒性の活性化c-kit阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法：
a）（i）活性化c-kit、および（ii）試験する少なくとも一つの化合物を、成分（i）と成分（ii）とが複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【請求項１４】
スクリーニング法が、SCF活性化野生型c-kitを同様に阻害することができる変異体活性化c-kitの阻害剤である、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択することからなる段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
活性化c-kitが、段階a）のSCF活性化野生型c-kitである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
推定の阻害剤が、段階a）において10 μMより高い濃度で試験される、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
IL-3が、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地に0.5 ng/mlから10 ng/ml、好ましくは1 ng/mlから5 ng/mlを含む濃度で存在する、請求項13から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
IL-3依存的細胞が、肥満細胞、トランスフェクトした肥満細胞、BaF3およびIC-2からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度をインビトロまたはインビボで測定する、請求項13から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を試験して選択することからなる段階をさらに含む、請求項13から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
試験がインビトロまたはインビボで行われる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
変異体活性化c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学的技術を用いて測定する、請求項13から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
c-kitリン酸化の量を測定する、請求項13から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
同定および選択された化合物が、強力、選択的かつ非毒性の野生型c-kit阻害剤である、請求項13から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
以下の段階を含むスクリーニング法によって得ることができるc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法：
a）永続的に活性化されたc-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおける変異）を発現する細胞を用いて、それぞれがIC50＜10 μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、複数の被験化合物について、細胞死の程度を測定することによって増殖アッセイを行う段階、
b）c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞である野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階（a）において同定された候補化合物のサブセットについて増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットについて増殖アッセイを行い、細胞死の程度を測定することによって、それぞれがIC50＜10 μMを有する、好ましくはIC50＜1 μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを選択する段階。
【請求項２６】
細胞死の程度が3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
多発性硬化症を予防し、発病を遅延させ、かつ治療するための、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
多発性硬化症を治療する薬剤を製造するためのc-kit阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症（MS）を治療する方法に関する。好ましくは、阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（MS）は、1868年に初めて記述され、非常に変化しやすい疾患であり、通常、20歳代から50歳代のあいだに発症する。MSは、若い白人男性に罹患する最も一般的な障害の残る神経障害である。アメリカ人少なくとも350,000人がMSを有し、女性は男性の2倍の罹患率であった。MSは通常、年齢15歳から50歳のあいだに発症する；発症時の平均年齢は30歳である。ほぼ全てのMS患者が、疾患の経過の何らかの時点で、疲労、痙性、振せん、運動の減少、抑うつ、疼痛、泌尿器合併症、および認識障害のような症状を示す。
【０００３】
多発性硬化症の最も一般的な兆候は、知覚および視覚運動機能障害である。MSは、中枢神経系の白質全体に、プラークと呼ばれる1〜4 cmの病変が散在することを伴う。プラークの初期発達の際、血管周囲炎症細胞（リンパ球、プラズマ細胞、マクロファージ）が白質実質に浸潤して、ミエリンの破壊に重要な役割を果たすと考えられている。このプロセスの後、星状細胞による広範囲の神経膠症およびプラーク端部で増殖する乏突起膠細胞による異常な再ミエリン形成の試みが起こる。さらに、それぞれのプラークに免疫グロブリンが沈着する。この疾患に関与する慢性炎症性自己免疫反応は、Steimanら、Annu. Rev. Neurosci. 17：247、1993；Miller, S.D.ら、Immunol. Today 15：356、1994；Ffrench-Constant, C.、Lancet 343：271〜274、1994；Brocke, S.ら、Trends in Microbiol. 2：250、1994において総説されている。
【０００４】
さらに、ミエリンの破壊によって、自己または新規抗原プラス自己に対して向けられる免疫攻撃が起こる可能性があるが、これはウイルスによって誘発されると考えられており、Rodriguez、「Multiple Sclerosis：basic concepts and hypothesis」、Mayo Clin. Pro. 64：570〜6（1989）において論評されている。多くのファミリーおよびサブファミリー（ヘルペトウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、レンチウイルス亜科、パラクソウイルス科、トガウイルス科）由来のウイルスは、様々な種の動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ヒツジ）において髄鞘脱落を誘発する。Dal Cantoら、Ann. Neurol. 11：109（1982）。これらの知見は、免疫系がミエリンの破壊に至るメカニズムに関係しているという考え方を強化する。
【０００５】
この点において、浸潤するCD4 T-細胞（Th1細胞）は、前炎症性サイトカイン（インターロイキン(IL)-2、インターフェロン(IFN)-γ、および腫瘍壊死因子(TNF)-α）を産生して、これによって抗原提示細胞様マクロファージが活性化されて炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、およびIL-8）、ならびにIL-12を産生する。IL-12はさらにIFN-γを誘導する。このような循環する様式において、慢性自己抗原誘導免疫応答は、CNSに対する髄鞘脱落攻撃を生じると考えられる。
【０００６】
当技術分野において、活性化Th1細胞およびマクロファージのエフェクター機能を標的とすることによって、MSにおいて免疫媒介CNS損傷を制限するいくつかの治療アプローチが提唱されている。免疫抑制剤は、現在用いられ、および試験中である物質の大部分を占め、Noseworthy, J.H.、「Immunosuppressive therapy in multiple sclerosis：pros and cons」、International MS Journal 1：79〜89、1994において論評されている。例は、副腎皮質刺激ホルモン、コルチコステロイド、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、2-クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）、ミトキサントロン、スルファサラジン、メソトレキセート、総リンパ様放射線照射、およびインターフェロン-βである。しかし、非特異的免疫抑制の際に感染症が起こる危険性があり、いくつかの細胞障害剤の毒性副作用は臨床治療に適していない。その上、そのような治療はいずれも、現在のところ有効でないことが示されている。
【０００７】
その結果、問題は、安全性対有効性に関してより良好な代替治療を発見することである。
【０００８】
肥満細胞（MC）は、CD34、c-kit、およびCD13抗原を発現する造血幹細胞の特定のサブセットに由来する、組織要素である（Kirshenbaumら、Blood 94：2333〜2342、1999、およびIshizukaら、Curr. Opin. Immunol. 5：937〜43、1993）。未成熟なMC前駆細胞は血流の中を循環し、組織において分化する。これらの分化および増殖プロセスは、サイトカインの影響下にあり、最も重要なサイトカインの一つは、Kitリガンド（KL）、スチール因子（SL）、または肥満細胞増殖因子（MCGF）とも呼ばれる、幹細胞因子（SCF）である。SCF受容体は、III型受容体チロシンキナーゼファミリーに属する癌原遺伝子c-kitによってコードされる（BoissanおよびArock、J. Leukoc Biol. 67：135〜48、2000）。この受容体はまた、他の造血細胞または非造血細胞において発現される。SCFによるc-kit受容体のライゲーションは、その二量体形成を誘導し、その後リン酸基転移が起こり、様々な細胞質内物質が動員され、活性化される。これらの活性化物質は、細胞の増殖および活性化を担う多数の細胞内シグナル伝達経路を誘導する（BoissanおよびArock、2000）。肥満細胞は、組織での位置および構造が不均一であるのみならず、機能的および組織化学的レベルにおいても不均一であることを特徴とする（AldenborgおよびEnerback、Histochem. J. 26：587〜96、1994；Braddingら、J. Immunol. 155：297〜307、1995；Iraniら、J. Immunol. 147：247〜53、1991；Millerら、Curr. Opin. Immunol. 1：637〜42、1989；ならびにWelleら、J. Leukoc Biol. 61：233〜45、1997）。
【０００９】
肥満細胞は様々な炎症性メディエータ（セロトニン、ヒスタミン、および血管活性ペプチド）を含み、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンシリーズの双方のアラキドン代謝物を放出しうる。そのため、肥満細胞は、CNS炎症の門番役であると見なすことができる。実際に、これらの分子は、局所血流および血管の透過性に対して強力な作用を有する。この作用によって、肥満細胞は、血液／脳関門を超える自己反応性T細胞の流入を促進するために重要な役割を果たしうる。さらに、Askenaseら（1983）、J. Exp. Med. 157：862〜873は、活性化T細胞が、肥満細胞に結合して脱顆粒を誘導する抗原特異的因子を分泌できることを証明した。Ibrahimら（1974）、J. Neurol. Sci. 21：431〜478は、肥満細胞が哺乳類脳のCNSに存在して、通常、血管に関連することを証明した。これは、血管活性ペプチド（ヒスタミンおよびセロトニン）がCNS肥満細胞に存在することが証明されているという事実によってさらに支持される（Edvinssonら、1977、Neurology 27：878〜883）。
【００１０】
より最近、髄鞘脱落病変内およびその周囲の肥満細胞がKrugerら（1990）、「Mast cells and multiple sclerosis：A light and electron microscopic study of mast cells in multiple sclerosis emphasizing staining procedure.」、Acta Neurol Scand 81：31〜36によって、MS脳において認められたが、正常脳では認められなかった。Ibrahimら（1996）、J. of Neuroimmunol. 70：131〜138も同様に、MSプラークの内部および周囲、特に慢性的に活性な部位でトリプターゼ陽性細胞（肥満細胞）を観察した。
【００１１】
その上、CNS肥満細胞によって血管活性アミン、カリクレイン、アラキドン酸代謝物、およびサイトカインが放出されると、さらに炎症細胞のCNSへの移動を促進する可能性がある（Bebo BF Jr、Yong T, Orr EL, Linthicum DS（1996）、「Hypothesis：a possible role for mast cells and their inflammatory mediators in the pathogenesis of autoimmune encephalomyelitis.」、J. Neurosci. Res. 45：340〜348）。
【００１２】
その他に、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（MOG）-誘導急性EAEモデルを用いて、肥満細胞欠損W/W(v)マウスが、野生型の先天性の同腹子と比較した場合に、疾患発生率の有意な減少、疾患発症の遅延、および平均臨床スコアの減少を示すことが示されている。二群のMOG-特異的TおよびB細胞反応に差を認めず、W/W(v)動物には全体的なTまたはB細胞欠損が存在しないことを示している。W/W(v)マウスにおいて肥満細胞集団を再構築すると、初期および重度の疾患の野生型レベルへの誘導を回復する、Secor VH（2000）、J. Exp. Med. 191(5)：813〜821。
【００１３】
実際に、肥満細胞依存的メディエータは、本明細書において三つの群に分類される：予め形成された顆粒関連メディエータ（ヒスタミン、プロテオグリカン、および中性プロテアーゼ）、脂質由来メディエータ（プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン）、ならびに様々なサイトカイン（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1b、およびIFN-γ）。本明細書において、CNS肥満細胞によるそのようなメディエータの放出は、プラーク浸潤Th1細胞の存在に直接または間接的に関与して、最終的にMSの発症に至ることが判明した。
【００１４】
MSの病因において役割を有する肥満細胞を破壊することからなる、MSの新たな治療経路が提供される。チロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤は、この目標に到達するために特に適している。
【発明の開示】
【００１５】
説明
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法に関する。
【００１６】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導体（国際公開公報第94/14808号）、および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、セレオインドール（seleoindole）およびセレニド（国際公開公報第94/03427号）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際公開公報第91/15495号）、ピリミジン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）から選択される。
【００１７】
好ましくは、このチロシンキナーゼ阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００１８】
もう一つの態様において、本発明は、c-kit阻害剤をそのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法に向けられる。
【００１９】
好ましくは、c-kit阻害剤は非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である。そのような阻害剤は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択することができる。
【００２０】
好ましい化合物の中でも、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）のようなピリミジン誘導体、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、4-アミノ置換キナゾリン（米国特許第3,470,182号）、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン（米国特許第3,800,039号）、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）、4-アニリノキナゾリン化合物（米国特許第4,464,375号）、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン（米国特許第3,551,427号）に注目することは興味深い。
【００２１】
そのため、好ましくは本発明は、非毒性の強力かつ選択的なc-kit阻害剤を投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法に関する。このような阻害剤は、ピリミジン誘導体、より詳細には式IのN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体から選択されうる：
2005502614.tif 000002
式中、R1、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の説明に組み入れられる、欧州特許第564 409 B1号に記載される意味を有する。
【００２２】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式IIに対応する化合物から選択される：
2005502614.tif 000003
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキルまたは環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；
かつR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２３】
好ましくはR7は以下の基である：
2005502614.tif 000004
これらの化合物において、以下のように定義されることが好ましい：
R1は、複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4はC1-C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、
かつR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基、例えば以下の基：
2005502614.tif 000005
のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２４】
したがって好ましい態様において、本発明は、以下の式に対応するCGP57148B：4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドとして当技術分野で公知である化合物の有効量を投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法に関する：
2005502614.tif 000006
【００２５】
本化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載され、特に有用であるβ型は国際公開公報第99/03854号に記載されている。
【００２６】
または、c-kit阻害剤は以下から選択することができる：
インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン；
単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、キナゾリン誘導体；ならびに
2-フェニル-キナキソリン誘導体、例えば2-フェニル-6,7-ジメトキシキナキソリンのようなキナキソリン。
【００２７】
好ましい局面において、本発明は、c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、上記の方法を意図する。
【００２８】
さらなる態様において、上記のc-kit阻害剤は、活性化c-kitの阻害剤である。本発明の枠組みにおいて、「活性化c-kit」という表現は、点突然変異、欠失、挿入から選択される少なくとも一つの変異を含む、構成的に活性化された変異体c-kitを意味するが、天然のc-kit配列（配列番号：1）の改変および変化型も意味する。そのような変異、欠失、挿入、改変および変化は、トランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、ならびにc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインにおいて起こりうる。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitを意味する。c-kitを活性化するために好ましい、選択的なSCF濃度は、5×10-7 M〜5×10-6 Mを含み、好ましくは2×10-6 M付近である。好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kitの自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位に、少なくとも一つの変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を有する。もう一つの好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。そのような欠失は、例えば、c-kit d(573-579)と呼ばれるコドン573と579の間にある。c-kitの膜近傍ドメインに近位の点突然変異V559Gもまた重要である。
【００２９】
この点において、本発明は、以下を含むスクリーニング法によって得ることができる活性化c-kitの、選択的で強力な非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、多発性硬化症を治療する方法を意図する：
a）（i）活性化c-kitと（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、（i）と（ii）の成分が複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）で同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【００３０】
本スクリーニング法はさらに、SCF活性化野生型c-kitを阻害することもできる、活性化変異体c-kitの阻害剤（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）である段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階からなる段階を含みうる。
【００３１】
または、段階a）において活性化c-kitは、SCF活性化野生型c-kitである。
【００３２】
本発明を実施するための最良の様式は、段階a）において10μMを超える濃度で推定の阻害剤を試験する段階からなる。適切な濃度は、例えば10、15、20、25、30、35、または40μMである。
【００３３】
段階c）において、IL-3は、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地において、0.5 ng/ml〜10 ng/mlの濃度で、好ましくは1 ng/ml〜5 ng/mlの濃度で存在する。
【００３４】
IL-3依存的細胞の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
増殖および生存に関して、c-kitを本来発現してそれに依存している細胞株。そのような細胞において、以下の技法を用いてヒト肥満細胞株を確立することができる：正常なヒト肥満細胞を、c-kitシグナルペプチドとTAG配列とを含む変異体c-kitをコードする配列を含むレトロウイルスベクターに感染させることができ、それによって変異体c-kitおよび造血細胞において発現された野生型c-kitを、抗体によって区別することができる。
【００３５】
この技術は、細胞の死を誘導せず、遺伝子移入が安定であり満足できる収率（約20％）を生じることから都合がよい。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られた血液に由来する前駆細胞を培養することによって、日常的に得ることができる。この点において、他の血液成分から単核球を分離するために、臍帯静脈からのヘパリン処置（heparinated）血をフィコール勾配上で遠心する。次に、免疫磁気選択系MACS（Miltenyi biotech）を用いて、上記の単離細胞からCD34+前駆細胞を精製する。次に、CD34+細胞をMCCM培地（L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5×10-5 Mβ-メルカプトエタノール、20％仔ウシ胎児血清、1％ウシ血清アルブミン、および100 ng/ml組換え型ヒトSCFを添加したα-MEM）において、105個/mlの細胞濃度で5％CO2大気中、37℃で培養する。培地を5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合（％）は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはトルイジンブルー染色を用いて毎週評価する。抗トリプターゼ抗体も同様に、培養物における肥満細胞を検出するために用いることができる。培養10週間後、肥満細胞の純粋な細胞集団（＜98％）が得られる。
【００３６】
標準的な技法を用いて、上記のように確立された細胞株をトランスフェクトするために、c-kitを発現するベクターを調製することが可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenら（1987）EMBO J. 6（11）、3341〜3351に記載されている。c-kitのコード部分（3000 bp）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅することができ、かつクローニングすることができる：
2005502614.tif 000007
【００３７】
NotIおよびXhoIによって消化したPCR産物を、T4リガーゼを用いてpFlag-CMVベクター（SIGMA）に挿入して、ベクターをNotIおよびXhoIによって消化して、CIP（Biolabs）を用いて脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを用いて細菌クローンXL1-blueを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを用いて確認する：
2005502614.tif 000008
適切なカセットを用いて、当技術分野において日常的で一般的な技法によって部位特異的変異誘発を行う。
【００３８】
ベクターMigr-1（ABC）は、成熟肥満細胞をトランスフェクトするために用いられるレトロウイルスベクターを構築するための基礎として用いることができる。このベクターは、IRESの3'末端でGFPをコードする配列を含むことから都合がよい。これらの特徴によって、蛍光血球計算器による直接分析を用いてレトロウイルスに感染した細胞を選択することができる。先に述べたように、c-kit cDNAのN末端配列は、異種のc-kitを内因性のc-kitと区別するために有用であるFlag配列を導入するために、改変することができる。
【００３９】
用いることができる他のIL-3依存的細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：
‐c-kitの野生型または変異型（膜近傍および触媒部位において）を発現するBaf3マウス細胞は、Kitayamaら（1996）、Blood 88：995〜1004、およびTsujimuraら（1999）、Blood 93：1319〜1329に記述される。
‐c-kitWTまたはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14665〜14669に示される。
【００４０】
IL-3非依存的細胞株は以下の通りである：
‐HMC-1、肥満細胞白血病患者に由来する因子非依存的細胞株は、構成的キナーゼ活性を有する膜近傍変異体c-kitポリペプチドを発現する（Furitsu Tら、J. Clin. Invest. 1993、92：1736〜1744；Butterfieldら、「Establishment of immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia.」、Leuk Res. 1988、12：345〜355、およびNagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92：10560〜10564）。
‐P815細胞株（814位でc-kit変異を本来発現する肥満細胞腫）は、Tsujimuraら（1994）、Blood、83：2619〜2626に記述されている。
【００４１】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。インビボで測定する場合、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位の間に、少なくとも一つの変異を有する活性化変異体c-kit、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を発現する細胞株が好ましい。
【００４２】
活性化変異体c-kitを発現する細胞株の例は先に述べた通りである。
【００４３】
もう一つの好ましい態様において、方法はさらに、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階を含む。これは、インビトロまたはインビボで測定することができる。
【００４４】
したがって、上記の方法に従って同定および選択された化合物は、強力で選択的な非毒性の野生型c-kit阻害剤である。
【００４５】
または、上記のスクリーニング法はインビトロで実施することができる。この点において、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学技術を用いて、活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量を測定する。
【００４６】
なおさらなる態様において、本発明はスクリーニングが以下を含む、先に記載した多発性硬化症を治療する方法を意図する：
a）それぞれがIC50＜10μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって同定するために、永続的な活性化c-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）を発現する細胞を用いて、複数の被験化合物によって増殖アッセイを行う段階、
b）特にc-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階a）において同定された候補化合物のサブセットによって増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイを行い、それぞれがIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【００４７】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される一般的な技術である。
【００４８】
本発明に従う方法には、多発性硬化症を予防する、発病を遅らせる、および／または治療する段階が含まれる。
【００４９】
したがって、本発明は、多発性硬化症を治療する薬剤を製造するために上記の化合物を用いることを含む。
【００５０】
本発明において用いられる薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸手段を含むがこれらに限定されない、任意の数の経路によって投与してもよい。
【００５１】
活性成分の他に、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体を含んでもよい。製剤および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）の最新版において見いだされる。
【００５２】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調剤することができる。そのような担体によって、患者が摂取するために薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調剤することができる。
【００５３】
経口で用いるための薬学的調製物は、活性化合物と固体賦形剤との組み合わせによって得ることができる。適した賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアおよびトラガカントを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質のような、糖質またはタンパク質増量剤である。望ましければ、クロスリンクしたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【００５４】
糖衣丸の中心部は、同様にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適した有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい濃縮糖溶液のような適したコーティングと共に用いてもよい。製品を特定するため、または活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けするために、染料または色素を錠剤または糖衣丸のコーティングに加えてもよい。
【００５５】
経口で用いることができる薬学的調製物には、ゼラチン製のカプセル剤と共にゼラチン製の軟密封カプセル、グリセロールまたはソルビトールのようなコーティングが含まれる。押して適合させる（push-fit）カプセルは、乳糖またはデンプンのような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および選択的に安定化剤と混合した活性成分を含みうる。軟カプセルにおいて、活性成分は、安定化剤と共にまたは安定化剤を含まずに脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールのような適した液体に溶解または懸濁してもよい。
【００５６】
非経口投与に適した薬学的製剤は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝生理食塩液のような生理的に適合性の緩衝液において調製してもよい。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として調製してもよい。適した親油性溶媒または媒体には、ゴマ油のような脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂質多価陽イオン性アミノポリマーも同様に輸送のために用いてもよい。選択的に、懸濁液はまた、高濃度溶液を調製することができるように、適した可溶化剤または化合物の溶解度を増加させる物質を含んでもよい。
【００５７】
薬学的組成物は、塩として提供してもよく、それらは塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、およびコハク酸等を含むがこれらに限定されない多くの酸によって形成することができる。塩は、対応する遊離の塩基型の場合より、水性または他のプロトン溶媒において溶解性となる傾向がある。他の場合において、好ましい調製物は、以下の任意または全てを含んでもよい凍結乾燥粉末であってもよい：pH範囲4.5〜5.5で、使用前に緩衝液と混合される1〜50 mMヒスチジン、0.1〜2％ショ糖、および2〜7％マンニトール。
【００５８】
本発明において用いるために適した薬学的組成物には、意図する目的を達成するためにc-kit阻害剤が有効量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、十分に当業者の能力範囲内である。治療的有効量は、症状または病態を改善する活性成分の量を意味する。治療の有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法、例えばED50（集団の50％において治療的に有効である用量）、およびLD50（集団の50％において致死的である用量）によって決定してもよい。毒性効果対治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表記することができる。大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。先に述べたように、本発明に従うチロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【国際公開パンフレット】
2005502614.tif 000010
2005502614.tif 000011
2005502614.tif 000012
2005502614.tif 000013
2005502614.tif 000014
2005502614.tif 000015
2005502614.tif 000016
2005502614.tif 000017
2005502614.tif 000018
2005502614.tif 000019
2005502614.tif 000020
2005502614.tif 000021
2005502614.tif 000022
2005502614.tif 000023
2005502614.tif 000024
2005502614.tif 000025
2005502614.tif 000026
2005502614.tif 000027
2005502614.tif 000028
2005502614.tif 000029
2005502614.tif 000030
2005502614.tif 000031
2005502614.tif 000032
2005502614.tif 000033
2005502614.tif 000034
2005502614.tif 000035
2005502614.tif 000036
2005502614.tif 000037
2005502614.tif 000038
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005502614.tif 000039
【国際調査報告】
2005502614.tif 000040
2005502614.tif 000041
2005502614.tif 000042