(57)【要約】  本発明は、プローブのペア（各ペアの１つのプローブは電気泳動タグで標識されている）で、二重鎖構築物を形成および切断することによって、複数の標的核酸配列を検出する方法に関する。二重鎖の構築物の切断は、電気泳動タグを放出する。次いで、この電気泳動タグは、標的配列の存在または量を示すために分離および同定される。本発明は、多重反応において特に有用であり、ここで複数の標的配列は、１つの反応において検出される。核酸の検出において有用なキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の複数のポリヌクレオチドを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
各ポリヌクレオチドについて、該ポリヌクレオチドの１つの領域に相補的なヘルパープローブ、ならびに該ヘルパープローブおよび該領域に隣接する該ポリヌクレオチドに相補的な電気泳動プローブを、提供する工程であって、その結果、該ヘルパープローブおよび該電気泳動プローブが、互いへのハイブリダイゼーションおよび該ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際に認識二重鎖を形成し、各電気泳動タグが分離プロフィールにおいて識別可能なピークを形成するように、各電気泳動プローブは、他の電気泳動タグのピークと異なる分離特性または検出特性を有する電気泳動タグに結合される、工程；
ハイブリダイゼーション条件下で、該サンプル、該ヘルパープローブ、および該電気泳動プローブを混合してアッセイ混合物を形成し、その結果、認識二重鎖を形成する工程；
該電気泳動タグが放出されるように切断部位で該認識二重鎖を切断する工程；ならびに
複数のポリヌクレオチドの各々を検出するために、放出された該電気泳動タグを分離および同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記放出された電気泳動タグの各々が、１５０〜５０００ダルトンの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離工程の前に、前記分離プロフィールから切断されていない電気泳動プローブを排除するために、前記アッセイ混合物を処理するさらなる工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記電気泳動プローブの各々が、前記切断部位に対して、前記電気泳動タグから反対側に位置付けられたヌクレオチドに結合された捕捉リガンドを有し、ここで該処理工程が、捕捉因子と該捕捉リガンドとを反応させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】
前記切断工程が、前記切断されていない電気泳動プローブの電荷と反対の電荷を有する放出された電気泳動タグを生成する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記電気泳動プローブの各々が、前記切断部位に対して、前記電気泳動タグから反対側に位置付けられたヌクレオチドに結合されたクエンチャーを有し、その結果、分離する際、切断されていない電気泳動プローブが、前記分離プロフィールにおいてシグナルを生じない、方法。
【請求項７】
請求項１、２、３、４、５、または６のいずれかに記載の方法であって、前記分離特性が電気泳動移動度であり、そして前記複数が５〜１００の範囲である、方法。
【請求項８】
前記放出された電気泳動タグの各々が、−０．００１〜０．５の範囲の異なる電荷／質量比を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記放出された電気泳動タグの少なくとも１つが、正電荷を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記放出された電気泳動タグの全てが、負電荷を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の方法であって、前記切断工程がｈＯＧＧ１タンパク質によって実施され、そして前記電気泳動プローブが、以下の式：
３’−（Ｎ）ｊ−Ｚ−（Ｂ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって規定され、
ここで、ＢおよびＮは各々ヌクレオチドであり；ｊは８〜４０の範囲の整数であり；ｋは１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、７，８−ジヒドロ−８−オキソ−２’−デオキシグアノシン、ホルアミドピリミジン（ｆｏｒａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）グアノシン、およびメチルホルアミドピリミジングアノシンからなる群より選択され；Ｄは蛍光色素であり；そしてＭは移動度改変部分であり、該移動度改変部分が、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素、および硫黄からなる群より選択される、水素以外の１００個までの原子を有する結合または有機分子である、方法。
【請求項１２】
前記Ｚが、７，８−ジヒドロ−８−オキソ−２’−デオキシグアノシンであり、そして少なくとも１つのＮが、前記捕捉リガンドと結合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の１つ以上の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在検出するためのキットであって、該キットは、以下：
ヘルパープローブおよび電気泳動プローブの複数のペアであって、ペアのヘルパープローブの各々は標的ポリヌクレオチドの１つの領域に相補的であり、そして同一のペアの電気泳動プローブの各々は該ヘルパープローブおよび該領域に隣接する該標的ポリヌクレオチドに相補的であり、その結果、該ヘルパープローブおよび該電気泳動プローブが、互いへのハイブリダイゼーションおよび該標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際に認識二重鎖を形成し、各電気泳動タグが分離プロフィールにおいて識別可能なピークを形成するように、各電気泳動プローブが、他の電気泳動タグのピークと異なる分離特性または検出特性を有する電気泳動タグに結合される、キット
【請求項１４】
前記認識二重鎖を認識および切断するための切断因子をさらに備える、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１３に記載のキットであって、前記電気始動プローブが、以下の式：
（Ｄ，Ｍ）−Ｔ
によって規定される群より選択され、
Ｄは蛍光色素であり；Ｍは移動度改変部分であり、該移動度改変部分が、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素、および硫黄からなる群より選択される、水素以外の１００個までの原子を有する結合または有機分子であり；そしてＴは、捕捉リガンドに結合されたオリゴヌクレオチドである、キット。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキットであって、前記電気泳動プローブが、以下の式：
３’−（Ｎ）ｊ−Ｚ−（Ｂ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって規定される群よりされ、
ここで、ＢおよびＮは各々ヌクレオチドであり；ｊは８〜４０の範囲の整数であり；ｋは１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、７，８−ジヒドロ−８−オキソ−２’−デオキシグアノシン、ホルアミドピリミジングアノシン、およびメチルホルアミドピリミジングアノシンからなる群より選択される、キット。
【請求項１７】
請求項１３、１４、１５、または１６のいずれかに記載のキットであって、前記複数のプローブペアが５〜５０の範囲である、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の核酸配列を検出および／または定量する方法に関する。詳細には、本発明は、標的核酸配列、特に選択された複数の発現された遺伝子の、同時検出または同時定量に有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ゲノムワイド（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）発現測定についてのいくつかの強力な技術の開発は、広範囲の条件および刺激に応答して生物の遺伝子（全部ではないが）の大きなセットの協調された活性を研究および理解するための機会を生み出す（例えば、ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：６８０−６８６（１９９７）；Ｗｏｄｉｃｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１３５９−１３６７（１９９７）；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ，２４３−２５１（１９９７）；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：６３０−６３４（２０００））。これらの技術を用いた研究は、遺伝子の減少したサブセットが特定の機能を実施するために同時調節されるようであり、そして発現された遺伝子のサブセットが表現型により細胞を分類するために使用され得ることを示す（例えば、ＳｈｉｆｆｍａｎおよびＰｏｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：５９８−６０１（２０００）；Ａｆｓｈａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，４０３：５０３−５１１（２０００）；Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：５３１−５３７（１９９９）；ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１５：５３０−５３６（２００２）など）。
【０００３】
薬物開発における目的の領域は、生体異物化合物の代謝または毒性効果に関連する遺伝子の発現プロフィールである。いくつかの研究は、遺伝子の数十のセットが、化合物毒性の指標として作用し得ることを示している（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６０：１１８９−１１９４（２００１）；Ｗａｒｉｎｇら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２０：３５９−３６８（２００１）；Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，６４：１３７−１４９（２０００）など）。
【０００４】
従って、単一アッセイにおいて、複数の発現した遺伝子の、簡便でありかつ正確な測定を提供する技術における関心が存在する。このような測定のための現在のアプローチには、多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、スポットテッド合成マイクロアレイ（ｓｐｏｔｔｅｄ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒｙ）、カラーコードマイクロビーズ、およびロボット装置を用いる単一検体アッセイが挙げられる（例えば、Ｌｏｎｇｕｅｖｉｌｌｅら、（上記）；Ｅｌｎｉｆｒｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３：５５９−５７０（２０００）；Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０：５４９−５５７（２０００）など）。残念なことに、これらのアプローチはいずれも、いくつかの理由（自動化の困難性、試薬の使用、感度、結果の一貫性などを含む）から所望の測定について、完全に満足のいく解決を提供しない（例えば、Ｅｌｎｉｆｒｏ（上記）；Ｈｅｓｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４６３−４６８（２００１）；ＫｉｎｇおよびＳｉｎｈａ，ＪＡＭＡ，２８６：２２８０−２２８８（２００１））。
【０００５】
上記を考慮して、薬物開発および医療的診断剤は、単一細胞サンプルまたは組織サンプルにおける複数の遺伝子発現の、正確で、簡便でかつ同時の測定のための、非アレイベースの、非ＰＣＲベースの方法が利用可能になることによって進歩する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、切断因子によって認識される部位を含む核酸構築物を形成することによって、サンプルにおける複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するための、方法および組成物に関する。このような形成後、これらの構築物は、タグを放出するために選択的に切断され、次いで分離および同定される。１つの局面において、構築物における結合状態と溶液中の遊離状態との間でのプローブの平衡交換または循環に起因して、放出されたタグは蓄積される。別の局面において、核酸構築物の切断は、構築物の不安定化によって解離を促進する。両方の場合において、解離は、構築物の形成および切断の新しい循環のための標的ポリヌクレオチドを遊離させ、それによって、放出されたタグの蓄積を可能にする。
【０００７】
別の局面において、本発明は、サンプル中の複数の標的ポリヌクレオチドの存在または非存在を検出するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（１）ポリヌクレオチドの１つの領域に相補的なヘルパープローブ、ならびにこのヘルパープローブおよびこの領域に隣接するポリヌクレオチドに相補的な電気泳動プローブを、各ポリヌクレオチドについて提供する工程であって、その結果、ヘルパープローブおよび電気泳動プローブが、互いへのハイブリダイゼーションおよびポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際に認識二重鎖を形成し、各電気泳動タグが分離プロフィールにおいて識別可能なピークを形成するように、各電気泳動プローブが、他の電気泳動タグのピークと異なる分離特性または検出特性を有する電気泳動タグに結合されている、工程；（２）ハイブリダイゼーション条件下で、サンプル、ヘルパープローブ、および電気泳動プローブを混合してアッセイ混合物を形成し、その結果、認識二重鎖を形成する工程；（３）電気泳動タグが放出されるように切断部位で認識二重鎖を切断する工程；ならびに（４）複数のポリヌクレオチドの各々を検出するために、放出された電気泳動タグを分離および同定する工程。
【０００８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを包含する。このようなキットは、複数の所定の標的ポリヌクレオチドの各々を検出または定量するための、ヘルパープローブと電気泳動プローブとのペアを備える。このようなキットはさらに、ヘルパープローブ、電気泳動プローブ、および標的ポリヌクレオチド間に形成される核酸構築物を切断するための切断因子を備える。
【０００９】
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドの多重測定のために現在利用可能な技術を超えるのいくつかの利点を有する検出手段およびシグナル発生手段を提供する。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アッセイ混合物から分離されるタグの検出および／または測定が、非常に減少したバックグラウンドおよび感度の有意な上昇を提供すること；（２）分離の容易さのために特別に設計されたタグの使用が、簡便な多重性能を提供すること；（３）切断およびタグ放出後の核酸構築物の再形成が、シグナル増幅を可能にすること；（４）この方法を、等温条件下で実施して、高価な温熱性循環装置の必要性を排除すること；（５）ヘルパープローブと電気泳動プローブとの間の、切断用二本鎖認識構築物の形成が、二本鎖基質上でのみで選択的に作動する切断因子の広範な選択肢を提供すること。
（発明の詳細な説明）
本発明は、同じアッセイの混合物における複数の標的ポリヌクレオチドの検出の方法および／または定量の方法に関する。本発明の方法によれば、検出される各々の標的ポリヌクレオチドについて、互いに相補的な領域を有するがが、これらの対応する標的ポリヌクレオチドの一本鎖形態が存在しなければ、アッセイ条件下で安定な二重鎖を互いに形成しないように設計されるヘルパープローブおよび電気泳動プローブが提供される。従って、図１Ａに示されるように、安定な多重鎖複合体は、全部で３つのメンバー（ヘルパープローブ（１００）、電気泳動プローブ（１０２）および標的ポリヌクレオチド（１０６））の存在下でのみ、アッセイ条件下で形成される。ヘルパープローブおよび電気泳動プローブに関して、電気泳動プローブ（１０２）は、所定のアッセイ条件下で、単独では、安定な二重鎖を標的ポリヌクレオチド（１０６）と形成できないように設計されている。このような複合体（１０７）が形成される場合、ヘルパープローブ（１０８）および電気泳動プローブ（１０８’）の相補的な領域は、ハイブリダイズして認識二重鎖（１１２）を形成する。三本鎖複合体を形成するために、ヘルパープローブ（１００）および電気泳動プローブ（１０２）の両方は、の標的ポリヌクレオチド（１０６）の部位（１１０’）および（１１４’）に対して相補的な領域（１１０）および（１１４）をそれぞれ有する。標的ポリヌクレオチド（１０６）は、一本鎖ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＭＡ（ｍＲＮＡ）のような一本鎖ＲＮＡのどちらかであり得る。
【００１０】
図１Ｂに示されるように、本発明のアッセイの操作において、ヘルパープローブおよび電気泳動プローブの対（１２０）は、それらの対応する標的ポリヌクレオチドが存在するときはいつでも、対の間の認識二重鎖（１２４）の形成を許容する条件下で複数の標的ポリヌクレオチド（１２２）と混合し得る。認識二重鎖（１２４）は、二重鎖形態で存在する核酸のみを特異的に切断する（１２６）切断因子によって認識される電気泳動プローブの断片（本明細書中で電気泳動タグまたは「ｅタグ（ｅ  Ｔａｇ）」と記載される）を放出する。従って、一本鎖核酸（結合していないヘルパープローブ、結合していない電気泳動プローブ、および標的ポリヌクレオチドを含む）は、切断も改変もされない。好ましくは、切断因子は、基質が、２本のＤＮＡ鎖、２本のＲＮＡ鎖または１本のＤＮＡ鎖、１本のＲＮＡ鎖を含む二重鎖構造であるかまたはこの二重鎖構造を含む、ヌクレアーゼである。電気泳動プローブの切断の後、認識二重鎖は、不安定化する。なぜなら、この二重鎖において塩基対を形成するヌクレオチドはほとんど無く、次いでこれが、３本鎖複合体全体の不安定化（１２８）をもたらす。標的ポリヌクレオチドを越えた実質的に過剰濃度の電気泳動プローブを提供する工程を包含するアッセイ条件下で、切断されていない電気泳動プローブは、検出可能な量の放出された電気泳動タグが、アッセイ混合物中に蓄積するまで、複合体の形成および切断の連続するサイクル（１３０）に関与する。アッセイ反応の完了後、放出された電気泳動タグは、従来の分離技術（例えば、キャピラリー電気泳動、マイクロボアクロマトグラフィーなど）を使用して分離されそして同定される（１３２）。
【００１１】
以下により十分に記載するように、本発明の重要な局面は、アッセイで生成する電気泳動タグの組である。一般的に、一組の電気泳動タグは、広い範囲に渡る種々の構造を有する分子の群から選択され得る。組を構成する第一の基準は、各々の電気泳動タグが、所定の分離方法および検出方法下で、同じ組の他の全ての電気泳動タグと区別できなければならないことであり、Ｓｉｎｇｈ、米国特許第６，３２２，９８０号；Ｓｉｎｇｈ、ＰＣＴ広報ＷＯ  ００／６６６０７；およびＳｉｎｇｈら、ＰＣＴ広報ＷＯ  ０１／８３５０２で記載される（これらの参考文献は参考として援用される）。すなわち、組の各々の電気泳動タグは、分離した後に検出および定量されることを可能にする、他のタグと異なる検出および／または分離の特徴を有さなくてはならない。好ましくは、電気泳動タグは、蛍光特性によって検出され、そして電気泳動によって分離される；しかし、他の液相分離技術、特にクロマトグラフィーがまた使用され得る。組の電気泳動タグは、経験的に選択され得る；しかし、以下に記載するように、組のメンバーはまた、予想される分離特性を有する分子ビルディングブロックから組み立てられ得る。
【００１２】
標的ポリヌクレオチドを含むサンプルは、細胞培養物、動物組織または植物組織、微生物など、広い範囲に渡る供給源に由来し得る。サンプルは、本発明のアッセイのために従来の技術を使用して調製され、これは得られたサンプルが由来する供給源に依存し得る。サンプル調製技術の指示は、基本的な論文（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）；Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」１５２巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）など）に見い出され得る。哺乳類の組織培養、細胞などの供給源については、標的ＲＮＡのサンプルは、従来の細胞溶解技術（例えば、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭジチオトレイトール、１０００ユニット／ｍＬ  胎盤ＲＮＡａｓｅインヒビターまたは２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）によって調製され得る。
【００１３】
（定義）
「キャピラリー電気泳動」とは、キャピラリーチューブ中またはキャピラリープレート中での電気泳動であって、分離カラムの直径または分離プレートの厚みが約２５〜５００ミクロンの間であり、分離媒体全体での効率的な熱放散を可能にし、その結果、この媒体中での熱対流が小さい、電気泳動を意味する。
【００１４】
「篩マトリクス（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）」または「篩媒体（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）」とは、マトリクスを通しての荷電種の電気泳動移動を遅延させるに効果的である、架橋されているかまたは架橋されていないポリマーを含む、電気泳動媒体を意味する。
【００１５】
１つの分子の、別の分子（例えば、標的ポリヌクレオチドについてのプローブ）に対する結合に関連して、「特異的な」または「特異性」は、その分子と他の分子とでの実質的により低い認識、接触、または複合体形成とともに、これらの２つの分子間での安定な複合体の認識、接触、および形成を意味する。１つの局面では、第１分子の、第２分子に対する結合に関連して、「特異的な」とは、この第１分子が反応物またはサンプル中の別の分子を認識して複合体を形成する程度まで、これが第２分子と最大数の複合体を形成することを意味する。好ましくは、この最大数は、少なくとも５０％である。一般に、特異的結合事象に関与する分子は、その表面上に、または空洞内に、互いに結合する分子間での特異的認識を生じる領域を有する。特異的結合の例としては、以下が挙げられる：抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド間での二重鎖または三重鎖の形成、レセプター−リガンド相互作用など。本明細書中で用いられる場合、特異性または特異的結合に関連して、「接触する」とは、２つの分子が、短距離の非共有結合化学相互作用（例えば、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用など）がこれらの分子の相互作用を支配するに充分に近いことを意味する。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、複数の蛍光標識に関連して、用語「スペクトル分解可能な」とは、これらの標識の蛍光発光バンドが、それぞれの標識が結合している電気泳動タグが、標準的光検出系（例えば、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号などまたはＷｈｅｅｌｅｓｓら，２１−７６頁，Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）に記載される系によって例示されるような、バンド通過フィルターと光電子増倍管との組み合わせの系を用いることなど）によって、それぞれの標識によって発せられる蛍光シグナルに基づいて識別され得るに充分に異なる、すなわち、充分に重複していないことを意味する。
【００１７】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で用いられる場合、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結された、天然または改変のヌクレオシドモノマーの直鎖状オリゴマーを意味する。オリゴヌクレオチドとしては、規則的パターンのモノマー間の相互作用（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対合、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対合など）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらの芳香族形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されて、数モノマー単位（例えば、３〜４）から数十モノマー単位（例えば、４０〜６０）までのサイズの範囲に及ぶオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが一続きの文字（例えば、ＡＴＧＣＣＴＧ）によって表されるときはいつも、そうでないと示されない限り、このヌクレオチドは、左から右に向かって５’→３’の順にあり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表し、そして「Ｕ」はリボヌクレオシドであるウリジンを表すことが理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然のデオキシヌクレオチドを含む；しかし、これらはまた、リボヌクレオシドまたは非天然のヌクレオチドアナログを含み得る。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが本発明において用いられ得ることが当業者には明らかである。例えば、酵素によるプロセシングを必要とする場合、通常、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが要求される。同様に、酵素が活性について特定のオリゴヌクレオチド基質必要要件またはポリヌクレオチド基質必要要件（例えば、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖など）を有する場合、このオリゴヌクレオチド基質またはポリヌクレオチド基質についての適切な組成の選択は、特に、論文（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）および同様の参考文献）によって誘導されて、充分に当業者の知識範囲内である。
【００１８】
用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含め、天然のヌクレオチドの直鎖状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、クローニングベクター、発現ベクター、トランスポゾン、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌ゲノムおよび同様の化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
二重鎖に関連して、「完全一致する」とは、二重鎖を構成するポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖におけるあらゆるヌクレオチドが他方の鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合するように互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対合を包含する。三重鎖に関連して、この用語は、この三重鎖が、完全に一致した二重鎖およびあらゆるヌクレオチドがこの完全に一致した二重鎖の塩基対とＨｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ会合を受ける第３の鎖からなることを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「不一致」は、二重鎖または三重鎖中のヌクレオチドの対またはトリプレットがＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合および／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合および／または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を受けることができないことを意味する。本明細書中で用いられる場合、相補的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの間での「安定な二重鎖」とは、このような化合物のかなりの割合が、一本鎖形態とは逆に、互いに二重鎖形態または二本鎖形態にあることを意味する。好ましくは、このようなかなりの割合は、より低い濃度での鎖の少なくとも１０％であり、より好ましくは３０％である。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、「ヌクレオシド」は、（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されるとおりの２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル形態を包含する）天然のヌクレオシドを包含する。ヌクレオシドに関連する「アナログ」としては、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する、合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などに記載される）が挙げられ、唯一の条件は、これらが特異的にハイブリダイゼーションし得ることである。このようなアナログとしては、結合特性を増強するように、複雑さを減らすように、特異性を増すように、などと設計された、合成ヌクレオシドが挙げられる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、「プローブ」とは、文脈に依存して、各単独または両方が集合的にのいずれかで、「ヘルパープローブ」および／または「電気泳動プローブ」を言及し得る。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、「アンプリコン」とは、増幅反応の産物を意味する。すなわち、これは、１以上の出発配列から複製される（通常二本鎖の）ポリヌクレオチド集団である。１以上の出発配列は、１以上のコピーの同じ配列であってもよく、またはこれは異なる配列の混合物であってもよい。好ましくは、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、またはクローニングベクター中での複製においてのいずれかで産生される。
【００２３】
「標的配列」または「標的ポリヌクレオチド」は、検出または定量されるべき目的の核酸配列である。
【００２４】
プローブは、プローブの少なくとも１つの領域が、核酸配列の相補体の少なくとも１つの領域と実質的な配列同一性を共有する場合、核酸配列と「ハイブリダイズし得る」。「実質的な配列同一性」は、少なくとも約８０％、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、そして最も好ましくは１００％の配列同一性である。ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の配列同一性を決定する上で、ＵおよびＴは、同じヌクレオチドであるとみなすことに留意するべきである。例えば、配列ＡＴＣＡＧＣを含むプローブは、配列ＧＣＵＧＡＵを含む標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし得る。
【００２５】
本発明のプローブは、標的配列といかなる配列同一性をも共有しないさらなる核酸配列を含み得ることが意図される。逆に、標的配列は、プローブといかなる配列同一性をも共有しないさらなる核酸配列を含むこともまた意図される。好ましくは、プローブおよび標的配列は、連続した少なくとも約６ヌクレオチドの領域において実質的な配列同一性を共有する。実質的な配列同一性の領域は、より好ましくは、連続した少なくとも約８ヌクレオチド、なおより好ましくは、連続した少なくとも約１０ヌクレオチド、そして最も好ましくは、連続した少なくとも約１２ヌクレオチドである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「Ｔｍ」は、「融点」を参照する際に使用される。融点は、二本鎖核酸分子の集団が、半分に解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算するための幾つかの式が、当該分野で周知である。標準的な参考文献によって示されるように、核酸が、１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にある場合に、Ｔ，，の簡単な概算値は、式Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算され得る（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照のこと）。他の参考文献（例えば、Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．＆ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ＮＭＲ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｇ．Ｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１０５８１−９４（１９９７））は、Ｔｍの計算のために、構造および環境ならびに配列特性まで考慮に入れる、より洗練された計算を含む。
【００２７】
本明細書および特許請求の範囲において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用される。一方では、標本または培養物（例えば、微生物学的培養物）を含むことを意味する。他方では、生物学的サンプルおよび環境的サンプルの両方を含むことを意味する。サンプルとしては、合成起源の標本が挙げられ得る。生物学的サンプルは、動物（ヒトを含む）、流体、固体（例えば、便）または組織、ならびに液体および固形食および飼料製品および成分（例えば、衛生物品）、野菜、肉および肉副製品、ならびに廃棄物であり得る。生物学的サンプルは、家庭用動物、および野生化動物または野生動物（例えば、有蹄類、熊、魚、げっ歯類などの動物が挙げられるが、これらに限定されない）の全ての種々のファミリーから得られ得る。環境的サンプルとしては、環境物質（例えば、表面物質）、土壌、水および産業的サンプル、ならびに食料および衛生処理用の器機、装置、設備、器具、使い捨て物品および使い捨てでない物品から得られるサンプルが挙げられる。これらの例は、本発明の適用可能なサンプルの型を制限するように解釈されるべきではない。
【００２８】
標的ポリヌクレオチドに対する参照において、用語「供給源」は、ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含む任意のサンプルを意味する。標的核酸の好ましい供給源は、生物学的サンプル（培養物、血液、唾液、脳髄液、胸水、乳、リンパ、痰、精液、および動物組織および植物組織が挙げられるが、これらに限定されない）である。
【００２９】
アッセイ条件に対する参照において、用語「等温」は、本発明に従った電気泳動プローブの開裂が実行される均一なまたは一定の温度を意味する。この温度は、標的ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドへのプローブのハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖が、遊離またはハイブリダイズしていないプローブと遊離またはハイブリダイズしていない標的ポリヌクレオチド配列とが平衡である、言い換えると、プローブとポリヌクレオチドが「可逆的にハイブリダイズする」と本明細書でいわれる条件にあるように選択される。通常、ポリヌクレオチドの少なくとも１％、好ましくは２０〜８０％、通常は９５％未満は、等温条件下でプローブとハイブリダイズする。従って、等温条件下では、プローブ、またはその部分とハイブリダイズするポリヌクレオチド分子が存在し、そしてプローブとハイブリダイズしていない分子と動力学的に平衡である。幾らかの温度の変動が生じ得、依然として本発明の利益を達成し得る。変動は、一般的に、本発明の方法を実行するのに必須でなく、通常、実質的な改善を何ら提供しない。従って、用語「等温」は、温度変動の使用、特に、温度の無秩序または制御されない変動を含むが、特に、熱サイクル（幾つかの公知の増幅手順（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）において使用される）といわれる温度の変動の型は排除する。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「キット」とは、物質を送達するための任意の送達システムをいう。反応アッセイの文脈において、このような送達システムとしては、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素など）および／または支持物質（例えば、緩衝液、アッセイを実行するための指示書など）の、ある位置から別の位置への貯蔵、輸送、または送達を可能にするシステムが挙げられる。例えば、キットしては、適切な反応試薬および／または支持物質を含む１つ以上の封入体（例えば、箱）が挙げられる。このような内容物は、一緒にまたは別々に意図するレシピエントへ送達され得る。例えば、第１の容器は、アッセイに使用するための酵素を含み得、一方、第２の容器は、プローブを含む。
【００３１】
（認識二重鎖の形成および切断）
好ましくは、ヘルパープローブおよび電気泳動プローブは、従来の技術を用いて生成された合成オリゴヌクレオチドを含む。以下により詳細に説明されるように、電気泳動プローブの移動度改変領域および検出可能標識は、好ましくは、プローブの合成の最終工程においてオリゴヌクレオチド部分に結合され得るホスホラミダイト前駆体を形成することによって、オリゴヌクレオチド部分に結合される。
【００３２】
このようなプローブの各対のヘルパープローブおよび電気泳動プローブは各々、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域および認識二重鎖を形成するように対の他のプローブにハイブリダイズする領域を保有する。認識二重鎖を形成するように互いにハイブリダイズする領域は、互いに相補的なヌクレオチド配列を有する。この相補性は、完全に適合した二本鎖を生じる必要はない。実際に、以下に記載されるように、幾つかの場合において、認識二重鎖は、切断因子のための特定の認識構造として役立つ不適合の塩基対を意図的に含む。これらのプローブ対の領域は、標的ポリヌクレオチドの非存在下における認識二重鎖の融点が、このアッセイの操作温度より低い、好ましくは、操作温度より４℃低い（より好ましくは７〜１０℃低い）ように設計され、その結果、認識二重鎖を形成する領域のハイブリダイゼーションは、標的ポリヌクレオチドの非存在下においては、ほとんど生じないか、または全く生じない。融点（Ｔｍ）は、所定の核酸二本鎖の５０％が溶融する（すなわち、一本鎖になる）温度として規定される。Ｔｍは、反応条件（例えば、溶液の塩濃度）に依存する。所望のＴｍは、代表的に、相補領域の長さおよびヌクレオチド塩基組成の操作によって達成される。他の方法もまた、二本鎖Ｔｍを調節するために利用され得る。これらとしては、安定性ヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合（例えば、ペプチド核酸、ホスホラミデート、２’−メトキシリボヌクレオシドなど）を有する相補的塩基対の幾らか、または全部の不適合、置換の組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。アッセイ反応の操作温度が、約６０℃である場合、認識二重鎖を形成する正確な相補性領域の好ましい長さは、連続した約８〜２０塩基（塩基組成および配列に依存する）である。他の反応条件は、潜在的に、異なるサイズ範囲をもたらす；このことは、実験的に容易に決定される。
【００３３】
プローブと標的核酸を含む溶液との接触の際に、２つのプローブオリゴヌクレオチドのプローブ領域は、それらのそれぞれの標的領域にハイブリダイズし、これらは、代表的に、図１に示されるように、互いに隣接している（それらは、真近に隣接する必要はない）。これが生じる場合、２つのプローブ鎖の互いに相補的な領域は、互いに極近接するように制限され、従って、会合した二本鎖の安定性を増加させる。認識二重鎖を形成する領域は、標的の存在下で形成された二本鎖のＴｍが、アッセイの操作温度とほぼ等しいか、またはそれより上であるように設計され、好ましくは、互いに相補的な領域が、二本鎖を形成するような操作温度より４℃上（より好ましくは、７℃または１０℃上）である。プローブの互いに相補的な領域の好ましい長さは、連続した約８〜２０相補的塩基（塩基組成および配列に依存する）である。標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブの領域は、種々の様式で設計され得る。例えば、これらの領域は、認識二重鎖を形成する領域と同様に設計され得、ここで、いずれかの領域単独（すなわち、１つのプローブ鎖＋標的鎖）のＴｍは、操作温度より低いが、プローブ鎖および標的鎖の両方が存在し、認識二重鎖を形成する領域がハイブリダイズしている場合、操作温度より高い。これらはまた、プローブ領域のＴｍが、両方とも操作温度より高いように設計され得るか、または、それらは、１つのＴｍが、操作温度より高く、そしてもう１つが操作温度より低いように設計され得る。どのような設計が、選択されたとしても、認識二重鎖を形成する領域が、標的の存在下でのみ安定な二本鎖を形成するという必要性は、適合されなければならない。標的ポリヌクレオチドに相補的なプローブの領域は、好ましくは、８〜５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは、８〜３０ヌクレオチド長である。これらの領域は、より長いものであり得るが、最大の適用は、このさらなる長さを必要とせず、そしてこれらのより長いオリゴヌクレオチドの合成は、より短いオリゴヌクレオチドよりもコストと時間を消費する。
【００３４】
１つまたは両方のプローブ配列が、所望の標的ポリヌクレオチドと反応するように選択され、そして好ましくは、所望でない標的ポリヌクレオチドのいずれとも反応（すなわち交差反応）しないように選択される。１つのプローブ領域が、所望でない標的とハイブリダイズするが、他のプローブ領域が、ハイブリダイズしない場合、両方のプローブセグメントが、形成されるべき認識二重鎖のためにハイブリダイズする必要がないので、アッセイは、依然として適切に機能する。
【００３５】
上記のヘルパープローブおよび電気泳動プローブの対を用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出するために、以下の一般的な手順が使用される：１）ヘルパープローブと電気泳動プローブの対をサンプルに添加し、２）適切な領域のアニーリングが生じるようにインキュベートし、３）電気泳動タグを解放するように形成する認識二重鎖を切断し、そして４）遊離した電気泳動タグを分離して、そして同定する。アニーリング条件は、実際の適用、プローブの設計、ポリヌクレオチドの性質および標的が含まれるサンプルの組成に依存して変化し得る。しかし、この条件は、上述のＴｍ要件を満たすように選択されなければならない。好ましくは、インキュベート温度は、好ましくは、５℃と７０℃との間、より好ましくは３０℃と６５℃との間である。
【００３６】
ヘルパープローブ、電気泳動プローブと標的ポリヌクレオチドとの間の上記複合体を形成するためのアッセイ条件およびオリゴヌクレオチド配列を選択するための指針は、当該分野で見出され得る（例えば、Ｈｏｇａｎら，米国特許第５，４５１，５０３号；Ｗｅｓｔｅｒｎら，同第６，１２１，００１号；Ｒｅｙｎａｌｄｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９７：５１１−５２０（２０００）；Ｗｅｔｍｕｒ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６：２２７−２５９（１９９１）など）。従って、これらの参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【００３７】
認識二重鎖は、切断が生じるために二本鎖構造を必要とする化学的ヌクレアーゼまたはタンパク質ヌクレアーゼのいずれかを含む切断因子によって切断される。広範な種々の切断因子が、本発明の方法で使用され得る。化学的ヌクレアーゼは、以下の参考文献に記載される：Ｓｉｇｍａｎら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ：ｎｅｗ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９：２０７−２３６（１９９０）；およびＴｈｕｏｎｇら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｈｅｌｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３２：６６６−６９０（１９９３）。一般に、オリゴヌクレオチドベースの化学的ヌクレアーゼは、３つの構成要素を有する：ｉ）配列特異的結合のためのオリゴヌクレオチド部分、ｉｉ）切断部分、およびｉｉｉ）オリゴヌクレオチドを切断部分に結合するための連結部分。配列特異的結合は、一本鎖標的とのワトソン−クリック二重鎖の形成、二重鎖標的との「Ｄループ」の形成、および二重鎖標的との三重鎖構造の形成によって達成されている。これらの場合の全てにおいて、オリゴヌクレオチド部分は、化学的ヌクレアーゼの認識部位を規定する。
【００３８】
切断部分は、５’末端、３’末端、両方の末端、またはオリゴヌクレオチド部分の内部塩基に連結され得る；従って、オリゴヌクレオチドベースの化学的ヌクレアーゼについて、認識部位は、その切断部位とは別個であり得る。ＤＮＡ標的についての切断部分は、代表的に、以下の２つの型のうち１つである：切断をもたらす拡散性のラジカル（例えば、ヒドロキシル）を生成するために化学的に活性化された薬剤、またはテザー化タンパク質ヌクレアーゼ。
【００３９】
好ましくは、認識二重鎖は、十分既定されかつ反復可能な切断特性を有するタンパク質ヌクレアーゼで切断される。本発明での使用に適切なヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよび修復酵素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明での使用に適切なヌクレアーゼとしては、Ｆｐｇタンパク質、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（Ｎｔｈ）タンパク質、ＡｌｋＡタンパク質、Ｔａｇタンパク質、ＭＰＧタンパク質、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧタンパク質）、ＭｕｔＹタンパク質、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ、ｃｖ−ＰＤＧタンパク質、８−オキソ−グアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＯＧＧ１）、ＦＥＮ−１、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ、λエキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈなどが挙げられる。このような酵素は、複数の供給業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＴｒｅｖｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））から市販されている。多くの制限エンドヌクレアーゼが、本発明での使用に適切である。放出された電気泳動タグが、認識二重鎖由来の可能な限り少ないヌクレオチドを含むように、二重鎖の末端で効果的に切断し得る制限エンドヌクレアーゼが好ましい。好ましい制限エンドヌクレアーゼとしては、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＮｌａＩＩＩ、ＢｓｓＫ１、ＤｐｎＩＩ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＭｂｏＩＩ、ＰｌｅＩ、ＭｎｌＩ、ＡｌｗＩなどが挙げられ、これらは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手可能である。好ましくは、ヌクレオチドの熱安定性改変体が使用され、その結果、アッセイ反応温度は、４０℃〜７０℃の範囲で、そしてより好ましくは４０℃〜６５℃の範囲で、そしてなおより好ましくは５０℃〜６５℃の範囲で実施され得る。
【００４０】
「ＤＮＡ修復酵素」は、ＤＮＡ修復機構の構成要素である酵素であり、この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼではない。ＤＮＡ修復酵素としては、例えば、塩基切除修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）およびミスマッチ修復（ＭＭＲ）に関与する酵素が挙げられる。修復酵素の基質特異性および機構の決定における化学的構造の役割の概説については、ＳｉｎｇｅｒおよびＨａｎｇ、Ｃｈａｐｔｅｒ２，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ＆  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｒｕｏｍａおよびＨａｌｌｉｗｅｌｌ編）、ＯＩＣＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９８を参照のこと。
【００４１】
塩基切除修復（ＢＥＲ）酵素は、損傷したＤＮＡから遊離塩基を切り出す。ＢＥＲ酵素の基質は、主に、酸化的に損傷した塩基、アルカリ化付加物、脱アミノ化生成物および特定の型の単一塩基ミスマッチのような小さいＤＮＡ損傷である。塩基切除修復酵素としては、ＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、Ｆｐｇタンパク質、Ｎｔｈタンパク質、ＡｌｋＡタンパク質、Ｔａｇタンパク質、ＭＰＧタンパク質、ＵＤＧタンパク質、ＭｕｔＹタンパク質、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶおよびｃｖ−ＰＤＧ）が挙げられる。これらの特異的酵素は、ＢＥＲ経路の第一工程で作用し、ここで、ＤＮＡグリコシラーゼは、変更された塩基と糖−リン酸骨格を接続するＮ−グリコシル結合を加水分解して、遊離塩基を放出する。残りの無塩基（ａｂａｓｉｃ）（ＡＰ）部位は、ＡＰエンドヌクレアーゼによってニック形成される。いくつかのグリコシラーゼは、ＡＰリアーゼ活性を伴い、これは、ＡＰ部位に対して３’側に鎖の中断を生じる。Ｆｐｇタンパク質およびＮＴｈタンパク質は、ＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼであり、ＤＮＡに対する酸化的損傷の主要なプリン生成物およびピリミジン生成物をそれぞれ切り出す。ＡｌｋＡタンパク質は、アルキル化、脱アミノ化または酸化によって誘導された種々の損傷塩基を除去する。Ｔａｇタンパク質は、３−メチルアデノシンおよび３−メチルグアニンを切り出すＤＮＡグリコシラーゼである。これらの酵素は、二本鎖ＤＮＡ基質中に存在する損傷に対して活性である。ＵＤＧ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの両方からウラシルを除去する。ＭｕｔＹタンパク質は、アデニン−グアニンまたはアデニン−シトシンのミスマッチを認識し、そしてアデニンを切り出すＤＮＡグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである。上記の酵素は全て、Ｅ．ｃｏｌｉ起源である。
【００４２】
さらに、ヒトＭＰＧ（メチルプリングリコシラーゼ）は、二本鎖ＤＮＡ中のアルキル化、脱アミン化および酸化的損傷塩基を認識する。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶは、ＵＶ光誘導性のｃｉｓ−ｓｙｎシクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）に特異的なグリコシラーゼ／ＡＰリアーゼである。Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルスのピリミジンダイマーグリコシラーゼ（ｃｖ−ＰＤＧ）は、ｃｉｓ−ｓｙｎＣＰＤだけではなく、ｔｒａｎｓ−ｓｙｎ−ＩＩ異性体に対しても特異的である。代表的なグリコシラーゼ／リアーゼを、表１に列挙する。
【００４３】
【表１−１】
2005511033.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
2005511033.tif 000003
ＮＥＲ酵素の基質は、広範な種々の嵩高な歪曲したＤＮＡ付加物および特定の非歪曲型のＤＮＡ損傷である。ＮＥＲの間に、この損傷は、オリゴヌクレオチドフラグメントの一部として放出される。ヌクレオチド切除修復酵素の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵｖｒＡＢＣエキソヌクレアーゼが挙げられ、これは、広いスペクトルの遺伝毒性ＤＮＡ付加物を認識する。ピリミジンダイマーおよび６−４光産物に加えて、ＵｖｒＡＢＣエキソヌクレアーゼの基質としては、ソラレン、４−ニトロキノリンオキシド、シスプラチン、ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）、アフラトキシンＢ１、Ｎ−アセトキシ−２−アセチルアミノフルオレン、７，１２−ジメチルベンゾ［ａ］アントラセンジオールエポキシド、マイトマイシンＣおよびその他多数が挙げられる。ＵｖｒＡＢＣエキソヌクレアーゼ複合体は、３つのタンパク質（ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢおよびＵｖｒＣ）からなり、これは、複数工程の二項性（ｂｉｍｏｄａｌ）切除反応において、損傷を含むフラグメントを認識および放出する。切り出されたオリゴヌクレオチドは、１２〜１３ヌクレオチドのサイズを有する。しかし、ヒト細胞において、損傷配列は、２４〜３２マーのオリゴヌクレオチド内で放出される。
【００４５】
第三の主要なＤＮＡ修復機構であるＭＭＲは、単一のミスマッチヌクレオチドおよび短いループを修正する。切除修復系に加えて、他の重要な修復経路（ＤＮＡ損傷の直接的逆転（Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびＤＮＡ光分解酵素）および二本鎖中断／組換え修復を含む）もまた、遺伝的安定性を維持する際の基本的な因子である。
【００４６】
ヌクレアーゼは、一般に、ヌクレアーゼがポリヌクレオチド分析物を可逆的に加水分解する場合に、オリゴヌクレオチドの切断を、過剰な酵素で達成可能な最大速度の迅速さの少なくとも半分（好ましくは、最大速度の少なくとも７５％）で進行させるのに十分な量で存在する。５’−ヌクレアーゼの濃度は、通常実験的に決定される。好ましくは、濃度におけるさらなる増加が、増幅のための時間を５倍（好ましくは２倍）を超えて減少させない十分な濃度が使用される。一般的に、主な制限因子は、試薬の費用である。次いで、これに関して、ポリヌクレオチド分析物または少なくとも標的ポリヌクレオチド配列、および酵素は、一般に、触媒量で存在する。
【００４７】
この酵素によって切断されるプローブは、通常、大過剰であり、好ましくは、１０−９Ｍ〜１０−５Ｍであり、そして本発明に従うその切断の全体的速度を最大化する量で使用され、ここで、この速度は、可能な反応の最大速度の少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％である。５０％未満のプローブ濃度を使用して、本発明に従って生成されるフラグメントの検出を容易にし得る。プローブの量は、少なくとも、所望される産物の分子数ほどである。通常、プローブの濃度は、０．１ｎＭ〜１μＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭである。プローブの濃度を増大させることにより、反応速度が、プローブ配列、温度、標的ポリヌクレオチド配列の濃度および酵素濃度に依存する制限値に到達することに留意すべきである。多くの検出方法について、非常に高い濃度のプローブが、検出をより困難にし得る。
【００４８】
本発明に従う方法を実施する際に、水性媒体が使用される。この媒体についてのｐＨは、通常、約４．５〜９．５の範囲、より通常は約５．５〜８．５の範囲、そして好ましくは約６〜８の範囲である。ｐＨおよび温度は、可逆的な加水分解またはプローブの切断が本発明に従って生じる平衡状態を達成するように、選択される。いくつかの例において、本発明の方法のこれらの工程の速度、効率および特異性を最適化するために、反応パラメータにおいて妥協が生じる。種々の緩衝剤を使用して、決定の間に所望のｐＨを達成し、そしてｐＨを維持し得る。例示的な緩衝剤としては、ボレート、ホスフェート、カルボネート、Ｔｒｉｓ、バルビタールなどが挙げられる。使用される特定の緩衝剤は、本発明にとって重要ではないが、個々の方法において１種の緩衝剤が、別の緩衝剤を上回って好まれ得る。
【００４９】
上述したように、本発明に従う反応は、等温条件下で実行される。この反応は通常、プローブ：ポリヌクレオチド複合体の融点に近い温度で実行される。従って、採用される温度は、多数の因子に依存する。通常、本発明に従うプローブの切断のためには、温度はプローブの長さおよび配列に依存して約３５℃〜９０℃である。高速の反応を提供するためには、６０℃〜８５℃の比較的高い温度を使用することが通常所望される。形成されたフラグメントの量は、インキュベーション時間およびインキュベーション温度に依存する。一般に、中程度の温度が、この方法を実行するために通常採用される。利用される正確な温度はまた、塩濃度、ｐＨ、使用した溶媒、ならびに標的ポリヌクレオチド配列の長さおよび組成、ならびに上述したようにプローブの長さおよび組成に依存して変化する。最適な反応温度の選択は、採用されるヌクレアーゼの温度依存性を考慮することが理解される。
【００５０】
切断認識二重鎖由来の特に好ましいタンパク質ヌクレアーゼとしては、以下が挙げられる：Ｆｐｇタンパク質、Ｍｕｔ  Ｙタンパク質、ｈＯＧＧ１タンパク質、Ｎｔｈタンパク質（エンドヌクレアーゼＩＩＩ）、ヒトＡＰエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  Ｈおよびλエンドヌクレアーゼ。これらのヌクレアーゼのうち２つを使用する本発明の実施形態は、図２Ａ〜２Ｂに示される。
【００５１】
図２Ａにおいて、切断因子としてｈＯＧＧ１タンパク質を使用する本発明の実施形態が示される。ヘルパープローブ（２０２）および電気泳動プローブ（２００）は、標的ポリヌクレオチド（２０４）との安定な複合体（２０７）の形成を許容するアッセイ条件下で混合される。好ましくは、本発明の電気泳動プローブ（２００）は、式：
３’−（Ｎ）ｊ−Ｚ−（Ｎ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって定義され、ここで、Ｎはヌクレオチドであり、ｊは８〜４０の範囲の整数であり、ｋは１〜３の範囲の整数であり；Ｚは、認識二重鎖である場合、ｈＯＧＧ１タンパク質によって認識される改変されたヌクレオシドであり、好ましくは、Ｚは、７，８−ジヒドロ−８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（「８−オキソ−Ｇ」）、ホルアミドピリジングアノシン（ｆｏｒａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）またはメチルホルアミドピリミジングアノシン（ｍｅｔｈｙｌｆｏｒａｍｉｄｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）であり；（Ｍ，Ｄ）は以下により充分に記載される。好ましくは、部分「３’−（Ｎ）ｊ」の少なくとも１つのヌクレオチドは補足リガンドに結合され、分離により切断されていないプローブまたはタグのついていないフラグメント（２１０）を排除する。好ましくは、捕捉リガンドはビオチンであり、捕捉因子はストレプトアビジンである。
【００５２】
複合体（２０７）は、デオキシシトシン：８−オキソ−Ｇ塩基対を含む認識二重鎖（２０５）を含む。認識二重鎖（２０５）は、ｈＯＧＧ１タンパク質によって認識され、８−オキソ−Ｇは切除され（２０９）、電気泳動タグ（２０８）を放出し、そして５’リン酸を有するフラグメント（２１０）を切断する。好ましくは、本発明の電気泳動タグ（２０８）は式：
３’−ｓ−（Ｎ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって定義され、ここで、「ｓ」は５つの炭素原子と２つの酸素原子を含む開環糖であり、Ｎはヌクレオチドであり、ｋは１〜３の範囲の整数であり、そして（Ｍ，Ｄ）は移動度改変基および検出可能な標識（以下でより十分に記載される）である。好ましくは、構造「−（Ｍ，Ｄ）」は、リン酸リンカーによって（Ｎ）ｋに結合される。本実施形態の電気泳動プローブ（２００）は、以下で記載されるように、従来のホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）化学を使用して合成され得、ここで特に、８−オキソ−Ｇホスホラミダイトモノマーは、Ｋｏｉｚｕｍｅら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１３：１５１７−１５３４（１９９４）；Ｋｏｈｄａら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，９：１２７８−１２８４（１９９６）などによって開示されているように作製される。電気泳動プローブ（２００）の切断または交換は、複合体（２０７）の不安定化（２１２）を引き起こし、従って、標的ポリヌクレオチド（２０４）は、別の複合体（２０７）へのリサイクル（２１４）に利用可能となる。好ましくは、Ｗｅｓｔｅｒｎらの米国特許第６，１２１，００１号によって教示されるように、提供される標的またはヘルパープローブ（２０２）の高モル濃過剰で電気泳動プローブ（２００）を提供することがリサイクル（２１４）を亢進する。放出された電気泳動タグの十分な量が蓄積されるまで、この反応は、しばらく継続する（２１５）。反応時間は実験的に決定され、そして当業者によって容易に操作されるパラメータ（例えば、反応温度、ヌクレアーゼ濃度、ヘルパープローブ濃度、電気泳動プローブ濃度、塩濃度、プローブ長および組成など）に依存する。反応が終了する際、検出のために、アッセイ混合物から、そして互いから電気泳動タグが分離される。以下でより十分に記載するように、この分離工程は、好ましくは、放出された電気泳動タグの分離または検出を妨げる物質をアッセイ混合物から排除する工程を包含する。このような工程は、（１）クエンチャーを電気泳動プローブに結合させる工程であって、その結果、放出された電気泳動タグと分離される場合に、切断されていないプローブの蛍光標識は検出不能である、工程、（２）捕捉リガンドを電気泳動プローブに（好ましくは切断部位と反対側のプローブ上に）結合させる工程であって、ここで捕捉リガンドは、相互結合因子またはレセプター（境界プローブまたは境界フラグメントに、（電気泳動分離のために）放出された電気泳動タグの電荷と反対の電荷を与える）と混合される、工程、（３）分離されることから排除するために、高分子量化合物、または、粒状物質などを濾過する工程、を含む。
【００５３】
反応が終了した後、電気泳動タグ（２０８）は分離され、そして以下でより十分に記載されるように同定される（２１６）。
【００５４】
図２Ｂにおいて、切断因子としてＭｕｔ  Ｙタンパク質を使用する本発明の実施例が示される。ヘルパープローブ（２２０）および電気泳動プローブ（２２２）は、標的ポリヌクレオチド（２２１）との安定な複合体（２２８）の形成を許容するアッセイ条件下で合わされる。好ましくは、本発明の電気泳動プローブ（２２２）は、式：
３’−（Ｎ）ｊ−Ａ−（Ｎ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって定義され、ここで、Ｎはヌクレオチドであり、ｊは８〜４０の範囲の整数であり、ｋは１〜３の範囲の整数であり、そして（Ｍ，Ｄ）は以下でより十分に記載される。上述のように、好ましくは、「３’−（Ｎ）ｊ」部分の少なくとも１つのヌクレオチドが、分離から非切断プローブまたは非タグフラグメント（２３４）を排除するために、結合した捕捉リガンドを有する。好ましくは、この捕捉リガンドはビオチンであり、捕捉因子はストレプトアビジンである。
【００５５】
本発明のヘルパープローブ（２２０）は、式：
５’−（Ｎ）ｊ−Ｚ’−（Ｎ）ｋ−３’
によって定義され、ここで、Ｎ、ｋおよびｊは上で定義した通りであり、そしてＺ’（２２６）は、認識二重鎖中のデオキシアデノシンと塩基対形成する場合に、ｍｕｔ  Ｙタンパク質によって認識される改変されたヌクレオシドであり、好ましくはＺ’は、７，８−ジヒドロ−８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（「８−オキソ−Ｇ」）である。
【００５６】
複合体（２２８）は、デオキシアデノシン：８−オキソ−Ｇ塩基対を含む認識二重鎖（２２４）である。認識二重鎖（２２４）は、ｍｕｔ  Ｙタンパク質によって認識され、そして、８−オキソ−Ｇと塩基対形成したデオキシアデノシンが切除され、電気泳動タグ（２３２）および５’リン酸を有する切断フラグメント（２３４）を放出する。好ましくは、本発明の電気泳動タグ（２３２）は、式：
３’−Ａ−（Ｎ）ｋ−（Ｍ，Ｄ）
によって定義され、ここで、Ａはデオキシアデノシンであり、Ｎはヌクレオチドであり、ｋは１〜３の範囲の整数であり、そして（Ｍ，Ｄ）は移動度改変基、および、以下により十分に記載される検出可能な標識である。好ましくは、構造「−（Ｍ，Ｄ）」は、リン酸リンカーによって（Ｎ）ｋに結合されている。本実施形態のヘルパープローブ（２２０）は、上述されたような従来のホスホラミダイト化学を使用して合成され得る。電気泳動プローブ（２２２）の切断または交換は、複合体（２２８）の不安定化（２３０）を引き起こし、その結果、標的ポリヌクレオチド（２２１）は、別の複合体（２２８）へのリサイクル（２４０）に利用可能となる。再度、Ｗｅｓｔｅｒｎらの米国特許第６，１２１，００１号によって教示されるように、標的またはヘルパープローブ（２２０）の高モル過剰で電気泳動プローブ（２２２）を提供することは、リサイクル（２４０）を亢進する。放出された電気泳動タグの十分な量が蓄積されるまで、この反応は、しばらく継続する（２３８）。反応時間は実験的に決定され、そして当業者によって容易に操作されるパラメータ（例えば、反応温度、ヌクレアーゼ濃度、ヘルパープローブ濃度、電気泳動プローブ濃度、塩濃度、プローブ長および組成など）に依存する。反応が終了すると、電気泳動タグは検出のために、アッセイ混合物から、および互いから分離される（２４２）。必要に応じて、上述したように、さらなる工程が取られて、放出された電気泳動タグの分離から妨害物質を排除し得る。
【００５７】
（電気泳動プローブおよび電気泳動タグ）
本発明に従って、複数の対のヘルパープローブおよび電気泳動プローブが、サンプル中の複数の標的ポリヌクレオチドの検出および／または量の測定のために使用される。プローブ対の数は、検出されることが求められる標的ポリヌクレオチドの数と同じであるか、またはそれよりも大きくなり得る。特に、１対以上の対のプローブが、同じ標的ポリヌクレオチドに対するものであり得る。アッセイ中のプローブ対の数は、２〜１００の範囲であり得、好ましくは５〜５０の範囲であり得、より好ましくは１０〜３０であり得る。一般に、本発明の電気泳動プローブは、切断された場合に、分離および同定される電気泳動タグになる、１以上のレポーター基の結合を含む多数の改変を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
電気泳動タグ（Ｅ）は、活性種、特に一重項酸素に対して安定であり、そして検出基またはレポーター基を含む、水溶性有機化合物である。その他の点では、Ｅはサイズおよび構造において広範に変化し得る。好ましくは、Ｅは中性ｐＨで荷電を保有し、約１５０〜１０，０００ダルトンの範囲、より好ましくは１５０〜５０００ダルトンの範囲、そして最も好ましくは１５０〜２５００ダルトンの範囲の分子量を有する。Ｅの好ましい構造は、以下により十分に記載される。好ましくは、検出基は、電気化学的なシグナル、蛍光シグナル、または色素生産性シグナルを生じる。最も好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを生じる。本発明の組成物は、本発明の多重化のアッセイを実行するために一緒に使用され得る、複数の電気泳動タグを含む。好ましくは、組成物中の複数の電気泳動タグは、少なくとも５つであり、そしてより好ましくは、少なくとも１０個である。なおさらに好ましくは、数多性は、５〜２００の範囲であり、より好ましくは５〜１００の範囲または５〜７５の範囲、または５〜５０の範囲、または１０〜３０の範囲である。好ましくは、複数の組成物中の電気泳動タグは、各々、独自の電荷対質量比、および／または、同じ複数のものの他のメンバーについて独自の光学特性のいずれかを有する。好ましくは、この光学特性は、発光スペクトル、蛍光寿命などのような蛍光特性である。より好ましくは、この蛍光特性は、発光スペクトルである。例えば、複数の各電気泳動タグの各々は、同じ蛍光発光特性を有し得るが、各々は独自の電荷対質量比の点で互いに異なる。他方で、複数の電気泳動タグの２つ以上は、同一の荷電対質量比を有し得るが、それらは独自の蛍光特性（例えば、スペクトル的に分解可能な発光スペクトル）を有し、従ってこれら複数の全てのメンバーが電気泳動分離および蛍光測定の組み合せによって識別可能である。
【００５９】
好ましくは、複数の電気泳動タグが、電気泳動的分離および蛍光により検出される。好ましくは、実質的に同一の蛍光特性を有する電気泳動タグは、電気泳動図における別個のピークが、分離条件下で形成されるように、異なる電気泳動移動度を有する。隣接するピークが別個であること、すなわち重なりがないことの尺度は、電気泳動分離能であり、これは、隣接する最大ピークの２つの標準偏差のより大きい方の４倍で割った隣接する最大ピークの間の距離である。好ましくは、隣接するピークは、少なくとも１．０、より好ましくは、少なくとも１．５、および最も好ましくは、少なくとも２．０の分離能を有する。所定の分離および検出システムにおいて、所望の分離能は、複数の電気泳動タグ（そのメンバーは、少なくともピーク分離の程度が異なる電気泳動的移動度を有する）を選択することによって得られ得、このような量は、当業者に周知のいくつかの要因（シグナル検出システム、蛍光部分の性質、タグの拡散係数、篩いマトリクスの存在または非存在、電気泳動装置の性質（例えば、チャネルの存在または非存在、分離チャネルの長さなど）が挙げられる）に依存する。好ましくは、本発明の複数の電気泳動タグは、従来の篩いマトリクスの存在下または非存在下のいずれかにおいて、従来のキャピラリー電気泳動装置によって分離される。例示的なキャピラリー電気泳動装置としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３１０、３１００および３７００；Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）モデルＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００または４０００；ＳｐｅｃｔｒｕＭｅｄｉｘ遺伝分析システムなどが挙げられる。好ましくは、このような従来の装置において、複数の電気泳動タグの電気泳動的移動度は、少なくとも１％、より好ましくは、少なくとも１〜１０％の範囲の割合だけ異なる。
【００６０】
電気泳動的移動度は、ｑ／Ｍ２／３に比例し、ここでｑは、分子上の電荷であり、Ｍは、分子量である。所望であれば、最も近い電気泳動的標識の間の決定の条件下での移動度における差異は、少なくとも約０．００１、通常は０．００２、より通常は、少なくとも約０．０１であり、そして、０．０２以上であり得る。
【００６１】
電気泳動タグＥの好ましい構造は、（Ｍ，Ｄ）であり、Ｍは、移動度改変部分であり、Ｄは、検出部分である。記載「（Ｍ，Ｄ）」は、Ｍ部分およびＤ部分の順番は、そのいずれかの部分が、切断可能な連結Ｌに隣接し得ることを示すために使用される。すなわち、「Ｔ−Ｌ−（Ｍ，Ｄ）」は、２つの形態：「Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｔ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」のうちのいずれかの電気泳動プローブを示す。
【００６２】
検出部分Ｄは、蛍光標識または色素、色素形成標識または色素、電気化学標識などであり得る。好ましくは、Ｄは、蛍光色素である。本発明とともに使用するための例示的蛍光色素としては、以下の文献で開示される水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素、およびエネルギー移動色素が挙げられる：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，第８版，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）；Ｌｅｅら，米国特許第６，１９１，２７８号；Ｌｅｅら，米国特許第６，３７２，９０７号；Ｍｅｎｃｈｅｎら，米国特許第６，０９６，７２３号；Ｌｅｅら，米国特許第５，９４５，５２６号；Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２８１６−２８２２（１９９７）；Ｈｏｂｂ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号；Ｋｈａｎｎａら，米国特許第４，３１８，８４６号；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，米国特許第３，９３２，４１５号；Ｅｃｋｅｒｔら，米国特許第２，１５３，０５９号；Ｅｃｋｅｒｔら，米国特許第２，２４２，５７２号；Ｔａｉｎｇら，国際特許公開ＷＯ０２／３０９４４；など。さらなる特定の例示的な蛍光色素としては、以下が挙げられる：５−カルボキシローダミン６Ｇおよび６−カルボキシローダミン６Ｇ；５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンおよび６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−カルボキシテトラメチルローダミンおよび６−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシフルオレセインおよび６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，７’−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、ならびに２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインおよび２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン。最も好ましくは、Ｄは、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。
【００６３】
Ｍは、一般に規定の電気泳動システムにおいて特定の電荷−対−質量比（従って、特定の電気泳動的移動度）を有するかもしくは有するように設計された化学基、または部分である。移動度改変部分の例示的な型は、以下に議論される。ｎ個の電気泳動プローブのセットにおいて、各特有の移動度改変因子（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は、Ｍｊと示され、ここでｊ＝１〜ｎであり、ｎは、上記の値を有する。移動度改変部分は、質量改変領域および／もしくは電荷改変領域または質量改変領域かつ電荷改変領域として作用する単一の領域を含むと考えられ得る。本発明において利用されるプローブセットにおいて、移動度改変部分は、以下の特徴の打ちの１つ以上を有し得る：（ｉ）電荷ではなく質量の変動に起因する、特有の電荷−対−質量比；（ｉｉ）質量および電荷の両方の変化に起因する、特有の電荷−対−質量比；ならびに（ｉｉｉ）約−０．０００１から約０．５の間、通常は、約−０．００１から約０．１の間の特有の電荷−対−質量比。上記のように、Ｄは、代表的には、異なる電気泳動プローブのセットまたは複数の異なる電気泳動プローブの間で共通しているが、プローブセットの間で異なっていてもよく、このことにより、放出される電気泳動タグの特有の電気泳動移動度に寄与することになる。
【００６４】
移動度改変部分Ｍのサイズおよび組成は、結合から鎖中の約１００原子、通常、約６０原子以下、より通常には、約３０原子以下まで変化し得、ここでその原子は、炭素、酸素、窒素、リン、ホウ素および硫黄である。一般に、結合以外の場合、移動度改変部分は、約０〜約４０、より通常は、約０〜約３０のヘテロ原子を有し、これは、上記のヘテロ原子に加えて、ハロゲンまたは他のヘテロ原子を含み得る。ハロゲン以外の原子の総数は、概して、約２００原子未満、通常は、約１００原子未満である。酸性基が存在する場合、移動度改変部分が存在する媒体のｐＨに依存して、種々のカチオンがその酸性基と結合され得る。その酸は、有機酸であっても無機酸であってもよく、これらとしては、カルボン酸、チオノカルボン酸（ｔｈｉｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌ）、チオカルボン酸、ヒドロキサム酸、リン酸、亜リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、ボロン酸、硝酸、亜硝酸などが挙げられる。正電荷については、置換基としては、アミノ（アンモニウムを含む）、ホスホニウム、スルホニウム、オキソニウムなどが挙げられ、ここで置換基は、一般に、約１〜６個の炭素原子の脂肪族であり、ヘテロ原子１個あたりの炭素原子の総数は、通常、約１２個未満、通常、約９個未満である。側鎖としては、アミン、アンモニウム塩、ヒドロキシル基（フェノール基を含む）、カルボキシル基、エステル、アミド、ホスフェート、複素環が挙げられる。Ｍは、ホモオリゴマーであっても、ヘテロオリゴマーであってもよく、これらは、同じかまたは異なる化学的特性の異なるモノマー（例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有する。
【００６５】
荷電した移動度改変部分は、一般に、負電荷または正電荷しか有さないが、これは、電荷の組み合わせを有し得、特に、ここで、移動度改変部分が結合される領域は、荷電され、移動度改変部分が反対の電荷を有する。移動度改変部分は、オリゴマー化に対して異なる官能性を提供し、１つの電荷を有する単一のモノマーを有してもよいし、２つのモノマーを用いてもよい（一般には２つのモノマー）。置換されたジオールが使用され得、ここでその置換基は、荷電され、二塩基酸である。このようなオリゴマーの例示は、ジオールまたはジアミノの組み合わせである（例えば、２，３−ジヒドロキシプロピオン酸、２，３−ジヒドロキシコハク酸、２，３−ジアミノコハク酸、２，４−ジヒドロキシグルタル酸など）。ジオール化合物またはジアミノ化合物は、二塩基酸によって連結され得る。その二塩基酸としては、上記の無機二塩基酸、およびシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、炭酸などのような二塩基酸が挙げられる。エステルを使用する代わりに、アミドが使用され得、ここで、アミノ酸またはジアミンおよび二酸が使用され得る。あるいは、ヒドロキシルまたはアミンとアルキレン基またはアリーレン基が連結され得る。
【００６６】
電荷を提供するか、または電荷を提供するように改変され得る置換基を有するモノマーを使用することによって、所望の電荷−質量比を有する移動度改変部分を提供し得る。例えば、セリンまたはスレオニンを使用することによって、ホスフェートでヒドロキシル基を改変して、負に荷電した移動度改変部分を提供し得る。アルギニン、リジン、およびヒスチジンを用いることで、正に荷電した移動度改変部分を提供する。オリゴマー形成を従来の方法で実施することによって、適切な大きさにされた移動度改変部分を提供し得る。この異なる移動度改変部分は、異なる順序のオリゴマーを有しており、一般的には、１〜２０のモノマー単位、より通常は、約１〜１２のモノマー単位を有している。ここで、１つの単位は、１〜２の異なるモノマーを有し得る反復単位を意図する。ほとんどの部分について、オリゴマーは、核酸標的結合領域以外と共に使用され得る。このモノマー単位の多官能性は、他の部分に結合するのに使用され得る末端に官能性を提供し、その結果、反応に対して利用可能な官能性を使用して、異なる官能性を提供し得る。例えば、活性化オレフィンとの反応のために、カルボキシル基をアミノエチルチオールと反応させ、そのカルボキシル基をチオール官能性と置換し得る。
【００６７】
約１〜約３個の電荷を有するモノマーを使用することによって、少数のモノマーを使用して、そして分子量の変化を伴う移動度バリエーションを提供し得る。約２〜４個の各々の官能性を有するポリオールポリカルボン酸が特に興味深く、このポリオールポリカルボン酸としては、例えば、酒石酸、２，３−ジヒドロキシテレフタル酸、３，４−ジヒドロキシフタル酸、Δ５−テトラヒドロ−３，４−ジヒドロキシフタル酸などがある。さらなる負電荷を提供するために、これらのモノマーを二塩基酸（例えば、リン酸誘導体）とオリゴマー形成し、リン酸ジエステルを形成し得る。あるいは、このカルボン酸をジアミンと共に使用して、ポリアミドを形成し得るが、一方、このヒドロキシル基を使用して、エステル（例えば、リン酸エステル）、またはエーテル（例えば、グリコール酸のエーテル）などを形成し得る。移動度を変化させるために、異なる分子量の種々の脂肪族基（例えば、ポリメチレン、ポリオキシアルキレン、ポリハロ脂肪族基もしくは芳香族基、ポリオール（例えば、糖））を使用し得、ここで、移動度は、少なくとも約０．０１、より通常は少なくとも約０．０２およびより通常は少なくとも約０．５異なる。
【００６８】
別の局面において、（Ｍ，Ｄ）部分は、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用される化学骨格から構築される。例えば、以下の参考文献は、多様な移動度改変部分を作製するのに有用な骨格化合物を記載する：ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／１９７３５，１９９１年１２月２６日）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２０２４２，１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０００９１，１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｅ）（Ｈｏｂｂｓ  ＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース骨格との非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ，Ｃ．Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））；Ｃｈｅｎｇら，米国特許第６，２４５，９３７号；Ｈｅｉｚｍａｎｎら，「Ｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２：１７１−１７４（１９９７）；Ｐａｖｉａら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：６５９−６６６（１９９６）；Ｏｓｔｒｅｓｈら，米国特許第５，８５６，１０７号；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５（１９９４）；など。好ましくは、この局面において、Ｄは、骨格上の置換基であり、そしてＭは、残りの骨格である。
【００６９】
なお別の局面において、（Ｍ，Ｄ）部分は、一般的であるかまたは市販されている、同一であるかもしくは異なる１種以上の連結試薬、架橋試薬、および標識試薬から構築され、これらの試薬は、特に合成の全てもしくは一部について市販のＤＮＡ合成器もしくはペプチド合成器を使用した、容易な組みたてを可能にする。この局面において、（Ｍ，Ｄ）部分は、ホスホジエステル結合およびアミド結合によって一般的に連結されるサブユニットからなる。例示的には、前駆体として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−保護ヘキサエチレングリコールホスホラミダイト、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、１２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ドデシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、２−［２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ］エチル−（２−シアノエチル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、５’−フルオレセインホスホラミダイト、５’−ヘキサクロロ−フルオレセインホスホラミダイト、５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホラミダイト、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、３−（４，４’ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１８−Ｏジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート、テキサスレッド−Ｘ−スクシンイミジルエステル、５−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステルおよび６−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル、ビス−（４−カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンジ（スクシンイミジルエステル）、５−（（Ｎ−（５−アミノペンチル）アミノカルボニル）テトラメチルローダミンおよび６−（（Ｎ−（５−アミノペンチル）アミノカルボニル）テトラメチルローダミン、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）；４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）；ならびに同様の試薬。上記の試薬は、例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、および同様の試薬提供業者から市販されている。従来の合成スキームにおける上記の試薬の使用は、当該分野で周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６））。特に、Ｍは、以下の試薬から構築され得る：ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−保護ヘキサエチレングリコールホスホラミダイト、６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、１２−（４−モノエトキシトリチルアミノ）ドデシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、２−［２−（４−モノメトキシトリチル）アミノエトキシ］エチル−（２−シアノエチル）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト、９−Ｏ−ジメトキシトリチル−トリエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、３（４，４’ジメトキシトリチルオキシ）プロピル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−１’，２’−ジデオキシリボース−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１８−Ｏジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデシル−１−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト、スクシンイミジル���ランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）；Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；ｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）；ならびに４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）。
【００７０】
Ｍはまた、公知のポリマーサブユニット合成方法によって調製されるポリマー鎖を含み得る。選択された長さのポリエチレンオキシド含有鎖を形成する方法は、周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。規定されたサイズのマルチサブユニットポリマー単位を、直接的に、または連結基を介して、互いに連結するこれらの方法は、広範なポリマー（例えば、ポリエーテル（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポリエステル（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリペプチド、オリゴサッカリド、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリホスホネートおよびそれらのブロックコポリマー（荷電した連結基または無電荷の連結基により連結される複数のサブユニットのユニットからなるポリマーを含む））に適用可能であることが理解され得る。ホモポリマーに加えて、本発明に従って使用されるポリマー鎖は、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリプロピレン単位を交互に有するポリエチレンオキシド単位）を含む。別の例としては、ホモポリマーまたは混合ポリマーとしての、選択された長さおよびアミノ酸組成のポリペプチド（すなわち、天然のアミノ酸残基または人工のアミノ酸残基を含む）がある。
【００７１】
別の局面において、（Ｍ，Ｄ）の検出部分は、エネルギー移動機構による蛍光シグナルを生成する。好ましくは、この局面において、Ｄは、「Ｄ１−ｇ−Ｄ２」を形成し、ここで、Ｄ１およびＤ２は、分子のアクセプター−ドナー対であり（例えば、Ｗｕら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８：１−１３（１９９４））、そしてｇは、Ｄ１およびＤ２を実質的に一定の距離に維持する剛性リンカーである。剛性リンカーｇの選択におけるガイダンスは、Ｗｅら（上で引用される）、ならびに米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；同第５，９４５，５２６号；および同第６，００８，３７９号に見出され得る。この対において、Ｄ１またはＤ２の一方がアクセプター分子であり、他方がドナー分子である。本発明で使用するための例示的なエネルギー移動検出部分は、Ｌｅｅら、米国特許第５，９４５，５２６号；Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２８１６−２８２２（１９９７）；Ｔａｉｎｇら，国際特許出願ＷＯ０２／３０９４４などの参考文献に開示される。好ましくは、剛性リンカーｇは、Ｄ１とＤ２との間の距離が、１０〜１００Åの範囲内の実質的に一定の距離に維持されるように選択される。これらの連結が、一重項酸素の存在に対して安定であるという条件で、広範な連結基が用いられ得る。好ましくは、Ｄ１およびＤ２は、一連のフルオレセイン、ローダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミン１１０、ローダミンＸ、テトラメチルローダミンおよびそれらのハロゲン化誘導体から選択される。より好ましくは、Ｄ１およびＤ２の両方が、フルオレセイン色素である。
【００７２】
１つの局面において、ｇは、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１およびＲ１−Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ１−Ｘ３のいずれかから選択され得、後者は、Ｄ１およびＤ２に関していずれかの配向で存在し；ここで、Ｘ１は、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ５アルキルジイル，Ｘ１，Ｃ（＝Ｏ））であり、その結果、括弧内の任意の１〜３個の部分が、任意の一列の順序で整列し；Ｒ２は、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、フラン、ピロール、イソピロール、イソアゾール、ピラゾール、イソイミダゾール、ピラン、ピロン、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサジン、インデン、ベンゾフラン、チオナフテン、インドールおよびナフタレンからなる群から選択される５〜６員環であり；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ５アルキルジイルである。
【００７３】
多数の電気泳動タグは、電荷を提供するためのオリゴペプチド、特に、２〜６個のモノマー、通常は２〜４個のモノマーのオリゴペプチド、リジン、アルギニンおよびヒスチジンから生じる正電荷、またはアスパラギン酸およびグルタミン酸から生じる負電荷のいずれかを含み得る。もちろん、当業者は、天然に存在するアミノ酸を使用する必要はなく、非天然アミノ酸または合成アミノ酸（例えば、タウリン、ホスフェート置換セリンまたはスレオニン、Ｓ−α−スクシニルシステイン、ジアミンとアミノ酸のｃｏ−オリゴマーなど）を使用する。
【００７４】
本発明の一実施形態において、電荷付与部分は、都合良くは、主にアミノ酸から構成されるだけでなく、チオ酸（ｔｈｉｏａｃｉｄ）および１〜５個の炭素原子を有する他のカルボン酸を含み得る。この電荷付与部分は、１つの部分あたり、約１〜約３０個、好ましくは約１〜約２０個、より好ましくは約１〜約１０個のアミノ酸を有し得、そしてまた、約１〜約３個のチオ酸または他のカルボン酸を含み得る。しかし、非電荷サブ領域と共に使用される場合、荷電したサブ領域は、一般に、約１〜約４個、頻繁には約１〜約３個のアミノ酸を有する。上記のように、任意のアミノ酸（天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方）が、用いられ得る。
【００７５】
特定の実施形態において、Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｄは、以下の式により表され得る：
Ｔ−Ｌ−（アミノ酸）ｎ−Ｌ’−蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）
ここで、Ｌ’は、結合または水素以外の１〜２０個の原子の連結基であり、ｎは、１〜２０であり、そしてＬは、ポリペプチド結合部分への切断可能な結合である。この実施形態において、Ｔは、切断可能な結合によって、末端アミノ酸に連結される。例示の目的でかつ限定することなく、この実施形態の一例は、蛍光物質がフルオレセインであり、Ｌ’が、このフルオレセインのメタ−カルボキシルおよびリジンの末端アミノ基を含むアミド結合の形態の結合であり、そしてＴがペプチド結合部分である例である。
【００７６】
このような標識結合体に基づく電気泳動タグは、以下のように表され得る：
フルオレセイン−（ＣＯ）ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（アミノ酸）ｎ
ここで、特定の化合物の中性ｐＨにおける式および電荷を、以下の表２に示す。
【００７７】
【表２】
2005511033.tif 000004
ここで、ｑは、電荷であり、Ｍは、質量であり、そして移動度は、ｑ／Ｍ２／３に比例する。
【００７８】
別の実施形態において、移動度改変部分Ｍは、アルキレンまたはアラルキレン（約１〜約２個の脂肪族領域および約１〜約２個の芳香族領域（一般的には、ベンゼン）を有する二価の脂肪族基を含む）の使用に依存し、ここで、これらの基は、置換されていても非置換であってもよく、通常は非置換であり、約２〜約１６個、より通常は約２〜約１２個の炭素原子を有し、ここで、この移動度改変部分は、同じかまたは異なる蛍光物質を、モノマー単位（例えば、ヌクレオチド）に連結し得る。この移動度改変部分は、カルボキシ基、ヒドロキシ基またはアミノ基で終結し得、エステルまたはアミドとして存在する。蛍光団上の置換基を変えることによって、当業者は、少なくとも約５個以上、通常は少なくとも９個の単位の質量を、キャピラリー電気泳動における良好な分離を得ることが出来るように変更し得る。さらなるバリエーションを提供するために、チオスクシンイミド基が、窒素および硫黄におけるアルキレン基またはアラルキレン基を結合するために用いられ得、その結果、炭素原子の総数は、約２〜約３０、より通常は約２〜約２０の範囲であり得る。上記の基の代わりに、または上記の基と組み合わせて、親水性を加えるために、当業者は、アルキレンオキシ基を使用し得る。
【００７９】
すでに述べられたように、移動度改変部分の性質に加えて、多様性が、標識の化学的特性および光学的特性、移動度に影響を与える移動度改変部分の化学的性質におけるバリエーション（例えば、折り畳み、溶媒との相互作用および溶媒中のイオン）などによって達成され得る。本発明の一実施形態において、この移動度改変部分は、オリゴマーであり得、ここで、この移動度改変部分は、支持体上で合成されても、クローニングまたは発現によって適切な宿主において産生されてもよい。都合良くは、ポリペプチドは、末端基以外に、わずか１つのシステインまたはセリン／スレオニン／チロシン、アスパラギン酸／グルタミン酸またはリジン／アルギニン／ヒスチジンしか存在しない場合に生成され得、その結果、特有の官能基（これは差次的に官能化され得る）が存在する。保護基を使用することによって、当業者は、側鎖の官能基を末端アミノ酸の官能基と区別し得る。また、適切な設計によって、当業者は、移動度改変部分上の異なる部位に存在する同じ官能基の間の好ましい反応を提供し得る。当業者がオリゴペプチドの調製のために合成を使用するかクローニングを使用するかは、かなりの程度まで、移動度改変部分の長さに依存する。
【００８０】
置換アリール基は、質量改変領域および電荷改変領域の両方として働き得る。種々の官能基が、芳香族基（例えば、フェニル）に置換されて、電位泳動タグに質量および電荷を提供し得る。このアリール基は、末端基であり得、ここで、わずか１つの連結官能基しか必要ではなく、その結果、遊離ヒドロキシル基が、アシル化され得るか、電気泳動タグ上に存在するヒドロキシルに、側鎖として結合され得るか、または２つの官能基（例えば、フェノール性ヒドロキシル（これは、亜リン酸エステル形成に役立ち得る）、および他の置換基（例えば、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、アルコキシカルボニル、アルキルチオなど））を有し得、ここで、これらの基は、荷電していても無電荷であってもよい。
【００８１】
標識結合体は、当該分野で周知の結合体化技術を利用して調製され得る。Ｍは、低分子の互いの結合を提供する官能基を有する低分子から、通常は直鎖で合成され得る。このような官能基としては、カルボン酸、アミンおよびヒドロキシ基またはチオール基が挙げられる。本発明によると、この電荷付与部分は、コア鎖から伸びている１つ以上の側鎖を有し得る。この側鎖は、標識または電荷付与部分の別の分子への連結を提供する官能基を有する。用いられる官能基の反応から生じる共通の官能基は、結合される分子の間の共有結合を形成することによって例示される。このような官能基は、ジスルフィド、アミド、チオアミド、ジチオール、エーテル、ウレア、チオウレア、グアニジン、アゾ、チオエーテル、カルボキシレートおよびエステル、ならびに硫黄およびリンを含有するエステルおよびアミド（例えば、スルホネート、リン酸エステル、スルホンアミド、チオエステルなど）などである。
【００８２】
電気泳動タグの成分の結合は、上で考察される。検出可能部分と移動度改変部分との間の連結は、一般に、切断誘導部分の作用に対して安定であり、その結果、この移動度改変部分および検出可能部分は、電気泳動プローブからの電気泳動タグの切断の間に、この電気泳動プローブからインタクトな単位として遊離し得る。
【００８３】
ほとんどの部分について、この移動度改変部分は、結合であり、ここで、この検出可能部分または標識は、標的結合部分に直接結合されるか、または鎖中の約１〜約５００以上、通常は約１〜約３００原子、より通常は約２〜約１００原子の連結である。この実施形態において、鎖中の原子の総数は、決定される全ての標識を認識するのに必要な多様性にかなりの程度まで依存する。ほとんどの部分に対する移動度改変部分の鎖は、炭素、窒素、酸素、リン、ホウ素および硫黄から構成される。種々の置換基が、この移動度改変部分に存在し得、この置換基は、天然に存在するモノマーの一部として天然に存在し得るか、または合成によって導入され得る。鎖中に存在し得る官能基としては、アミド、リン酸エステル、エーテル、エステル、チオエーテル、ジスルフィド、ホウ酸エステル、硫酸エステルなどが挙げられる。側鎖としては、アミン、アンモニウム塩、ヒドロキシル基（フェノール基を含む）、カルボキシル基、エステル、アミド、ホスフェート、複素環、特に、窒素複素環（例えば、ヌクレオチド塩基）、およびアミノ酸側鎖（例えば、イミダゾールおよびキノリン）、チオエーテル、チオール、または電気泳動タグの移動度を変化するための他の目的の基が挙げられる。
【００８４】
移動度改変部分は、ホモオリゴマー化合物、または同じかもしくは異なる化学特性の異なるモノマー（例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸）を有するヘテロオリゴマー化合物であり得る。一実施形態において、電気泳動タグは、リンカーを有し、このリンカーは、移動度改変部分と検出可能な標識分子（通常は、蛍光物質）との間の連結を提供し得るリンカー、または検出可能な標識分子への連結のために使用され得る官能基を有する。検出可能な標識分子に個々に結合し得る異なる官能基を有することによって、当業者は、電気泳動タグの多様性の機会を増大する。異なる官能基への結合のための異なる蛍光物質を使用して、異なる蛍光物質は、電気泳動タグの発光および電荷対質量の非における差異を提供し得る。
【００８５】
（捕捉リガンド）
電気泳動プローブに結合された捕捉リガンドは、関連の電気泳動タグの電荷とは異なる（好ましくは、逆の）電荷を、切断されていないかまたは部分的に切断されたプローブに与えるために使用され得る。このようなリガンドはまた、切断されていないかもしくは部分的に切断されたプローブ、または他の反応成分を結合または吸着して、このような物質が遊離した電気泳動タグと共に分離されることを除外する。
【００８６】
リガンドおよびレセプターとしては、ビオチンおよびストレプトアビジン、リガンドおよび抗リガンド（例えば、ジゴキシンおよびその誘導体および抗ジゴキシン）などが挙げられる。オリゴヌクレオチドに結合体化したリガンドを有することによって、当業者は、電形動プローブ／標的複合体をリガンドに関して隔離し、ハイブリダイズしていないプローブを除去し、次いで結合した電気泳動タグを遊離させ得る。あるいは、正電荷を有するリガンドに対するレセプターが、反応生成物に加えられ、ここで、分解されていないプローブ／標的複合体に対する結合は、遊離した電気泳動タグの反対方向へのこの複合体の移動を生じる。従って、本発明の局面は、遊離した電気泳動タグと反対の電荷を有する電気泳動タグを提供することである。このことは、正電荷のレセプターまたは切断されていない電気泳動プローブで捕捉リガンドに結合する捕獲試薬を提供することによって都合良く達成される。
【００８７】
都合良くは、リガンドおよびレセプターは、通常、約１ｋＤ未満のリガンドを有する。これは、リガンドとしてのビオチン、およびレセプター（捕獲試薬）／正電荷分子としてのアビジン（これは高度に正電荷である）の使用により例示される。ビオチン／アビジンの代わりに、これは、他の対を有し得る（ここで、レセプター（例えば、抗体）が天然で正電荷であるか、または１つ以上の正電荷の実体（例えば、アルギニン、リジンまたはヒスチジン、アンモニウムなど）との結合体化により作製される）。正電荷の部分の存在は、電気泳動プローブ（分解されていないプローブおよび分解されたプローブの両方を含む）の実質的な除去において多くの利点を有する。
【００８８】
所望の場合、このレセプターが、このレセプターが結合する分子を物理的に隔離するために使用され得、標的結合部分またはこのリガンドを保持する改変された標的結合部分を含むインタクトな電気泳動プローブ全体が除去される。これらの改変された標的結合部分は、出発物質の分解の結果として、調製、異常な切断などの間の混入物であり得るか、または標的結合配列の他の非特異的分解産物であり得る。上記のように、ビオチンによって例示されるリガンドが、標的結合部分（例えば、最後から２番目のヌクレオチド）に結合され、その結果、切断の際に、電気泳動タグから分離される。
【００８９】
他のレセプターとしては、天然または合成のレセプター（例えば、免疫グロブリン、レクチン、酵素など）が挙げられる。望ましくは、このレセプターは、アビジンの場合と同様に、天然で正電荷を帯びているか、または正電荷部分（単数または複数）（例えば、アンモニウム基、塩基性アミノ酸等）の負荷によって、正電荷を帯びるように作製される。アビジンは、検出プローブおよびその分解産物に結合したビオチンに結合する。アビジンは、正電荷を帯び、一方、切断された電気泳動タグは、負電荷を帯びている。従って、切断されていないプローブだけでなくその分解産物からの、切断された電気泳動タグの分離は、従来の分離方法を使用することによって容易に達成される。あるいは、このレセプターは、固体支持体または高分子量の高分子（例えば、血管壁、粒子（例えば、磁気粒子、セルロース、アガロースなど））に結合され得、そして物理的分離または遠心分離、透析などによって分離され得る。この方法は、アッセイの特異性をさらに増大し、そしてより高い程度の多重化を可能にする。
【００９０】
（蛍光クエンチング）
電気泳動プローブは、インタクトな電気泳動プローブが蛍光を発するのを防ぐように、クエンチャーと蛍光基（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）との組み合わせを有し得る。このクエンチャーおよび蛍光基は、切断部位の異なる側にあるべきである。反応が進行し、そしてプローブから蛍光基が放出され、そしてそれによりクエンチャーから除かれるにつれて、蛍光基が蛍光を発し得る。未切断のプローブは、分離の際に検出不能であり、そして放出された電気泳動タグの検出と干渉しない。
【００９１】
（プローブの合成）
ペプチド鎖として電荷付与部分または移動度改変部を形成するための合成の型を実行するための化学は、当該分野で周知である。例えば、Ｍａｒｇｌｉｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７０）３９：８４１−８６６を参照のこと。一般的に、このような合成は、その反応に関与するべきではない官能基を、適切な保護基でブロックすることを包含する。次いで、遊離の官能基が反応して所望の結合を形成する。このペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８０）８５：２１４９−２１５４およびＨｏｕｇｈｔｅｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９８０）１６：３１１−３２０）におけるように、樹脂上で生成し得る。次いで、このペプチドを、公知の技術に従ってこの樹脂から除去する。
【００９２】
ペプチドの合成に利用可能な多くの技術の要約は、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔら，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  （１９６９）に見出され得；そして固相ペプチド合成については、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，「Ｈｏｒｍｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，（１９７３），第２巻，４６頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見いだされ得；そして溶液合成については、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒら，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、第１巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９６５に見出され得る。
【００９３】
一般的に、これらの方法は、伸長するペプチド鎖に、１つ以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸を連続的に付加することを包含する。通常、適切な保護基は、最初のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを保護する。次いで、保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合を形成するのに適切な条件下で、適切に保護された相補的基（アミノ基またはカルボキシル基）を有する順番で次のアミノ酸を付加することにより、不活性な固体支持体に結合され得るかまたは溶液で利用され得る。次いで、この保護基は、この新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、次いで、次のアミノ酸（適切に保護されている）が、付加される（以下同様）。全ての所望のアミノ酸が適切な順番で結合された後、任意の残っている保護基（および任意の固体支持体）を、連続的または同時に除去して、最終ペプチドを得る。保護基は、所望の場合、利用される特定の保護基に依存して公知の方法に従って除去される。例えば、保護基は、水素および炭担持パラジウム、液体アンモニア中のナトリウムなどを用いる還元；トリフルオロ酢酸、フッ化水素酸などを用いる加水分解により除去され得る。
【００９４】
ホスホラミダイトまたは関連の化学を使用する電気泳動プローブの合成については、多くのガイドが文献で利用可能である：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第８版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２）；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３−２３１１  （１９９２）；Ｍｏｌｋｏら，米国特許第４，９８０，４６０号；Ｋｏｓｔｅｒら，米国特許第４，７２５，６７７号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号など。これらの化学の多くは、電気泳動プローブの構成要素を、自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）モデル３９２または３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機など）で簡便に合成することを可能にする。
【００９５】
移動度改変部の一部としてヌクレオチドを含むｅタグ試薬の合成は、標準的なホスホラミダイト化学を使用する固相支持体上でのアセンブリにより容易にかつ効率的に達成され得る。得られた移動度改変部は、上で考察した標識および／またはポリペプチド結合部分に連結され得る。
【００９６】
ヌクレオチドを含む電気泳動プローブの合成は、標準的なホスホラミダイト化学を使用して、プローブ合成の間に固相支持体上でアセンブリすることにより容易にかつ効率的に達成され得る。このｅタグ部分は、最終ヌクレオシド残基のカップリング後にプローブの５’末端にアセンブリされ、これが、アッセイの間の電気泳動タグの一部になる。
【００９７】
１つのアプローチにおいて、電気泳動タグは、単一または数個のモノマーホスホラミダイトビルディングブロック（色素残基を含む）から連続的に構築され、これは、その質量対電荷比に基づいて独特の電気泳動移動度を有するタグを生成するように選択される。従って、この電気泳動プローブは、ホスフェートリンカーにより架橋される、可変の電荷対質量比のモノマー単位から構成される。
【００９８】
図３は、電気泳動タグの推定溶出時間および実験溶出時間（＊）を示す。Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、およびＣ１８は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡから市販されるホスホラミダイトスペーサーである、これらの単位は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル，Ｏ−シアノエチルホスホラミダイトの誘導体であり、「Ｑ」で示される。Ｃ３は、ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）オキシプロピルＱであり；Ｃ６は、ＤＭＴオキシヘキシルＱであり；Ｃ９は、ＤＭＴオキシ（トリエチレンオキシ）Ｑであり；Ｃ１２は、ＤＭＴオキシドデシルＱであり；Ｃ１８は、ＤＭＴオキシ（ヘキサエチレンオキシ）Ｑである。ｅタグ部分は、シグナルの連続的スペクトル（次々に溶出して、それらの１つも一緒に溶出しない）を生成するように合成される（図４）。
【００９９】
上記のｅタグ分子の全ては、うまく作用し、そして容易に分離可能であり、４０分で溶出する。より早く溶出するタグを生成するために、高度に荷電した低分子量のタグを、代表的に使用する。いくつかの型のホスホラミダイトモノマーは、早い溶出時間を有する高度に荷電したタグの合成を可能にする。ジカルボキシレートホスホラミダイト（図５、左）の使用は、モノマーカップリングにつき３の負電荷の付加を可能にする。種々のフルオレセイン誘導体（図５、右）は、タグの色素成分が、標準のフルオレセインよりも高質量を保有することを可能にする。一般的なリン酸化試薬と組み合わせたポリヒドロキシル化ホスホラミダイト（図６）は、高度にリン酸化されたタグの合成を可能にする。これらの試薬と他の質量改変リンカーホスホラミダイトとの組み合わせは、早い溶出時間を有するタグの合成を可能にする。
【０１００】
１つの例示的な合成アプローチを図７に概説する。市販の６−カルボキシフルオレセインから出発して、フェノールヒドロキシル基を、無水物を使用して保護する。ピリジン中の無水イソ酪酸を使用したが、他の改変物が等しく適切である。保護基としてエステル官能基を選択することの重要性に留意することは重要である。この種は、ホスホラミダイトモノマー合成の間、およびオリゴヌクレオチド構築の間インタクトなままである。これらの基は、合成されたオリゴ体（ｏｌｉｇｏ）がアンモニアを使用して脱保護されるまで除去されない。保護の後、次いで粗製物質は、カップリング剤としてＤＣＣを使用してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）を形成することによりインサイチュで活性化される。ＤＣＵ副生成物を濾別し、そしてアミノアルコールを添加する。多くのアミノアルコールは市販されており、これらのいくつかは、アミノ酸の還元から誘導される。アミンのみが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを置換するのに十分に反応性である。標準的な抽出処理をすると、９５％収率の生成物が得られる。この物質を、ホスフィチル化してホスホラミダイトモノマーを生成する（図７）。さらなるｅタグ部分の合成については、対称ビスアミノアルコールリンカーを、アミノアルコールとして使用する（図８Ａ）。このようにして、次いで第２のアミンを、ホスフィチル化反応の前に多数のカルボン酸誘導体（図８Ｂに示されるいくつかの可能な安息香酸により例示される）とカップリングする。この方法論を使用して、種々の電荷対質量比を有する、数百、数千までものｅタグ部分が、標準的な化学を使用してＤＮＡ合成機でプローブ合成の間に容易に組み立てられ得る。
【０１０１】
あるいは、ｅタグ部分は、出発物質として５−アミノフルオレセインを使用する代替のストラテジーを介して得られる（図９Ａ）。５−アミノフルオレセインを大過剰の二酸二塩化物に大容積の溶媒中で添加するすることにより、ダイマー形成に対して優勢なモノアシル化生成物の形成が可能になる。フェノール基は、これらの条件下では反応性ではない。水性処理により、末端酸塩化物をカルボン酸に変換する。この生成物は、６−カルボキシフルオレセインに類似しており、そして同じ一連の工程を使用して、その保護されたホスホラミダイトモノマーに変換される（図９Ａ）。多くの市販の二酸二塩化物および二酸が存在し、この二酸は、ＳＯＣｌ２または塩化アセチルを使用して二酸二塩化物に変換され得る。この方法論は、第２の移動度改変因子が使用されるという点において非常に魅力的である。このように、１０種の市販の改変されたホスホラミダイトおよび１０種の二酸二塩化物および１０種のアミノアルコールが入手可能な場合、１０００種の異なるｅタグ部分の可能性が存在する。多くの市販の二酸二塩化物およアミノアルコールが存在する（図９Ｂ）。これらの合成アプローチは、理想的にはコンビナトリアルケミストリーに適する。
【０１０２】
種々のマレイミド誘導体化ｅタグ部分もまた合成されている。これらの化合物は、５’−チオール誘導体化ＤＮＡ配列に連続して生体結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）されて、５’−ヌクレアーゼアッセイにかけられた。切断の際に形成された例示的な種は、図１０に示される。
【０１０３】
電位泳動タグは、結合化合物への連結に適切な一方の末端における官能基を有して組み立てられ得る。従って、オリゴヌクレオチドについては、特にそのオリゴヌクレオチドが合成された後、まだ固体支持体上にある間、およびブロック基が除去される前に、オリゴヌクレオチド鎖の５’または３’のいずれかに結合するようにホスホラミダイトまたはリン酸エステルを連結部位に有し得る。電気泳動タグにオリゴヌクレオチドを連結するための他の技術（例えば、電気泳動タグ上の官能基と特異的に反応する官能基（例えば、マレイミドおよびチオール、またはアミノおよびカルボキシ、または還元的アミノ化条件下でのアミノおよびケト）をオリゴヌクレオチド末端で有すること）が存在するが、ホスホラミダイト付加が好ましい。
【０１０４】
電気泳動プローブを調製する際に特に興味深いことは、固体支持体ホスホラミダイト化学を使用して、オリゴヌクレオチド合成の一部として電気泳動プローブを構築することである。この手順を使用して、オリゴヌクレオチドの５’位または３’位（通常は、５’位）において次の続きのホスフェートを結合する。付加されたホスホラミダイトは、天然のヌクレオチドを有しても非天然のヌクレオチドを有してもよい。ホスホラミダイト化学の代わりに、他の型のリンカー（例えば、チオアナログ、アミノ酸アナログなど）を使用し得る。また、置換されたヌクレオチドを使用し得、この場合、質量改変領域および／または電荷改変領域は、このヌクレオチドに結合され得るか、またはリガンドが、このヌクレオチドに結合され得る。このようにして、電気泳動プローブの領域を含むホスホラミダイト結合（ｌｉｎｋ）が、付加され、これにより、オリゴヌクレオチド鎖の合成が完了した場合、電気泳動タグの領域の付加を続けて、この分子を完成する。簡便には、一方の末端のホスホラミダイトまたはリン酸エステルとブロックされた官能基とを有する異なる領域のビルディングブロックの各々を提供し、ここで遊離の官能基（主にヒドロキシル）が、ホスホラミダイトと反応し得る。１つの部位にホスホラミダイトを有し、そして別の部位に保護されたヒドロキシルを有する分子を異なる領域に使用することにより、電気泳動プローブは、末端領域まで構築され得、これは、保護されたヒドロキシルを必要としない。
【０１０５】
合成の例示は、２〜３個の炭素原子のアルキレンを有するジオール（例えば、アルキレンジオール、ポリアルキレンジオール）、アルキレンアミン、またはポリ（アルキレンアミン）ジオールを使用することであり、ここで、アルキレンは、２〜３個の炭素原子のアルキレンであり、そして窒素は、例えば、ブロック基または１〜６個の炭素原子のアルキル基で置換されており、ここで１つのジオールは、従来の保護基（例えば、ジメチルトリチル基）でブロックされる。この基は、質量改変領域として作用し得、そしてアミノ基と共に電荷改変領域としても作用し得る。所望の場合、質量改変因子は、ホスホラミダイト化学を介して連結されるビルディングブロックを使用して組み立てられ得る。このようにして、電荷改変因子は、質量改変因子の間に散在され得る。例えば、１、２、３．．．．ｎ個の単位を有する一連のポリエチレンオキシド分子を調製し得る。多数の負電荷を導入することが望まれる場合、小さなポリエチレンオキシド単位を使用し得、そして質量改変領域および電荷改変領域を、ホスフェート単位により連結された複数のポリエチレンオキシド単位を有することにより構築し得る。あるいは、大きなスペーサーを使用することにより、より少ないホスフェート基が存在し、その結果、大きな質量の差がなくても、質量対電荷比の差が大きくなる。
【０１０６】
使用される化学は、オリゴヌクレオチド合成において使用される従来の化学であり、ここでヌクレオチド以外のビルディングブロックが使用されるが、反応は従来のホスホラミダイト化学であり、ブロック基は、従来のジメトキシルトリチル基である。当然のことながら、自動化合成機と適合する他の化学も使用され得るが、このプロセスをさらに複雑にする理由はない。
【０１０７】
（分離および検出）
電気泳動タグは、種々の液相分離技術（電気泳動およびクロマトグラフィーが挙げられる）により分離されるように設計され得る。好ましくは、選択された分離技術は、データ読み出しとして分離プロフィール（例えば、電気泳動図またはクロマトグラム）を提供し、ここで使用される複数の電気泳動タグは、分離したピークまたはバンドとして識別可能である。移動度改変領域および検出可能な標識の組成は、使用される分離技術に関して選択される。好ましくは、放出された電気泳動タグは、電気泳動により分離される。
【０１０８】
電気泳動方法は周知であり、そして例えば、Ｋｒｙｌｏｖら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ  （２０００）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｃｏｌｂｕｒｎ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ  （１９９２）；米国特許第５，３７４，５２７号；同第５，６２４，８００号；同第５，５５２，０２８号；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，  １９９５年１月，第２章（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などに記載される。種々の適切な電気泳動媒体は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他の供給メーカーから市販されており、これらとしては、自動化機器（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「３７００」型機および「３１００」型機）で使用するための、非架橋媒体が挙げられる。特定の分離において使用される最適な電気泳動条件（例えば、ポリマー濃度、ｐＨ、温度、電圧、変性剤の濃度）は、多くの因子（分離される化合物のサイズ範囲、それらの組成などを含む）に依存する。従って、本発明の適用は、特定の分離についての条件を最適化するための標準的な予備試験を必要とし得る。
【０１０９】
電気泳動分離の間および電気泳動分離後に、分離された化合物の蛍光シグナルおよび移動時間（または移動距離）を記録することにより、または相対的蛍光および電気泳動タグの移動の順序のチャート（例えば、電気泳動図として）を構築することにより、電気泳動タグを、検出または同定する。このような検出を実行するために、電気泳動タグは、標準的な手段（例えば、高輝度水銀灯、レーザーなど）により照射され得る。代表的には、電気泳動タグは、Ｈｅ−Ｎｅガスレーザーまたは固体ダイオードレーザーにより生成されるレーザー光により照射される。次いで、蛍光シグナルが、感光性検出器（例えば、光電子増倍管電荷結合素子など）により検出され得る。例示的電気泳動検出システムは、他に記載される（例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号；同第６，１４２，１６２号など）。
【０１１０】
反応の完了（これは、例えば、シグナル（例えば、上記のような蛍光）の変化をモニタリングすることにより、またはアリコートを採取して全遊離電気泳動タグについてアッセイすることによりモニタリングされ得る）後に、今度は混合物を分析し得る。機器に依存して、同じ光源により活性化され、そして異なる検出可能な標識において発光する１〜４つの異なる蛍光基が使用され得る。改良として、５種以上の異なる蛍光基が利用可能であり、ここでさらなる光源が必要とされ得る。電気化学的検出は、米国特許第６，０４５，６７６号に記載される。
【０１１１】
一実施形態において、切断された各電気泳動タグの存在は、その電気泳動タグに含まれる蛍光標識により決定される。標識された電気泳動タグの混合物の分離は、代表的には、電気分離により行われ、これは、電場の印加により（好ましくは、エレクトロキネシス（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｓｉｓ）（動電学的フロー）もしくは電気泳動的フローまたは電気浸透フロー内の電気泳動フローの組み合わせにより）液体中の成分を分離して、電気泳動タグ混合物を個々のフラクションまたはバンドに分離することを包含する。電気分離は、異なる移動度に基づく電場中の分子の移動および分離を包含する。電気分離の種々の形態としては、限定ではなく例示として、フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、およびミセル動電学的クロマトグラフィーが挙げられる。キャピラリー電気泳動は、好ましくは、動電学的フロー（電気泳動的フロー、誘電泳動的フローおよび／または電気浸透フローを含む）による、電気分離を包含し、約１〜約２００マイクロメートル、通常、約１０〜約１００マイクロメートルの断面寸法のチューブまたはチャネルで行われる。このキャピラリーは、長い独立したキャピラリーチューブまたはケイ素、石英、ガラスもしくはプラスチックで構成されるウェハもしくはフィルムにおけるチャネルであり得る。
【０１１２】
キャピラリー電気分離において、電気泳動タグを含む反応混合物のアリコートを、増幅および他の反応が行われるキャピラリーデバイスの一部であってもキャピラリーデバイスに連結されてもよい電気分離チャネルに導入することにより、電気分離に供する。次いで、チャネル内に含まれる電導性媒体に電位を印加して、この組み合わせ内の成分の移動を達成する。一般的に、印加される電位は、当該分野で周知の慣例に従って所望の成分の電気分離を達成するのに十分である。当業者は、本発明において使用される所定の試薬セットおよび／または切断された標識の性質、反応媒体の性質などに適切な電位を決定し得る。媒体および電位に関するパラメーターを含む電位分離に関するパラメーターは、通常、所望の成分の最大の分離を達成するように最適化される。これは、経験的に達成され得、そして当業者の十分技術範囲内である。
【０１１３】
均一アッセイについて、サンプル、第１および電気泳動のプローブ、ならびに補助試薬を、連結領域の切断を支持する反応混合物中に混合する。この混合物を処理して、電気泳動タグをこの混合物の他の成分から分離し得る。次いで、この混合物（電気泳動タグを富化されているかまたは富化されていない）を、電気泳動デバイス（通常、ミクロ流体電気泳動デバイスまたはキャピラリー電気泳動デバイスおよび電気泳動分離に必要とされるように改変された媒体）に移され得る。分離チャネルからインタクトな電気泳動タグ分子を除去することが望まれる場合、電気泳動タグが放出される場合に放出されないリガンドを電気泳動タグに結合する。あるいは、全体の電荷が電気泳動タグの電荷と反対になるように電気泳動タグと反対の電荷を有する相互結合メンバーを付加することにより、これらの分子は、放出された電気泳動タグ分子と反対の電極に向かって移動する。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンを使用し得、この場合、ストレプトアビジンが正電荷を有する。ペプチド検体の場合、一実施形態は、リガンドがペプチド検体と共に残る部位において切断される。例えば、電気泳動タグをメチオニンのメチル基と置換し得る。改変されたメチオニンのピラゾロンを使用して、利用可能なリジンに結合し得る。ピラゾロンのアミノ基は、ビオチンと置換される。次いで、臭化シアンを用いて切断が達成され、電気泳動タグが放出されるが、ビオチンは、ペプチド、および結合メンバーから放出されなかった任意の電気泳動タグと共に残る。次いで、アビジンを使用して、極性を変化させるか、または検体に対する標的結合部分もしくは標的結合部分に対して結合体化した電気泳動タグを隔離する。
【０１１４】
キャピラリー電気泳動については、１つ以上の検出ゾーンを使用して、分離された切断された標識を検出し得る。反応の性質、移動度改変部分などに依存して、いくつかの検出ゾーンを利用することは、当然本発明の範囲内である。単一のチャネルまたは複数のチャネルに付随する多数の検出ゾーンが存在し得る。この検出ゾーンにおける使用に適切な検出器としては、例として、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェフォトダイオード、線形またはアレイの電荷結合素子（ＣＣＤ）チップ、ＣＣＤカメラモジュール、分光蛍光計などが挙げられる。励起光源としては、例えば、濾光（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）ランプ、ＬＥＤ、レーザーダイオード、気体レーザー、液体レーザーおよび固体レーザーなどが挙げられる。検出は、レーザー走査励起、ＣＣＤカメラ検出、同軸光ファイバー、単一またはアレイ配置での共焦点往復蛍光検出などであり得る。
【０１１５】
検出は、キャピラリー電気泳動カラムの分析に関連する公知の方法のいずれかによるものであり得、これらとしては、米国特許第５，５６０，８１１号（第１１欄、第１９〜３０行）、同第４，６７５，３００号、同第４，２７４，２４０号および同第５，３２４，４０１号（これらの関連する開示は、本明細書に参考として援用される）に示される方法が挙げられる。電気泳動分野の当業者は、広範囲の電位または電場強度が使用され得ることを認識する。例えば、１０〜１０００Ｖ／ｃｍの電場が使用され、約２００〜約６００Ｖ／ｃｍがより代表的である。市販のシステムについての電圧の上限は、約４０〜約６０ｃｍのキャピラリー長で約３０ｋＶであり、最大約６００Ｖ／ｃｍ電場を与える。ＤＮＡについては、代表的には、キャピラリーは、電気浸透フローを減少させるようにコーティングされ、そしてキャピラリーの注入末端は、負電位に維持される。
【０１１６】
検出の容易さのために、装置全体は、光学的に透明なプラスチック材料から製造され得、これにより一般的に、約１８０〜１５００ｎｍ、通常約２２０〜約８００ｎｍ、より通常には約４５０〜約７００ｎｍの範囲の波長の光が、低い透過損失を有することを可能にする。適切な材料としては、溶融シリカ、プラスチック、石英、ガラスなどが挙げられる。
【０１１７】
（キット）
本発明の別の局面は、標的配列への結合の際に認識構造を形成し得るプローブ、およびこの構造を切断するために使用され得る酵素を備えるキットを提供する。間接的な方法については、このプローブは、本発明による一対のプローブである。
【０１１８】
多重反応については、本発明はまた、複数の標的配列を並行して検出または定量するために使用され得る一組のプローブを備えるキットを提供する。繰り返しになるが、間接的な方法については、このプローブは、本発明による一対のプローブである。このキットはさらに、その対応する標的配列に対する各プローブの結合の際にこれらのプローブを認識し得、かつ切断し得る酵素を備え得る。
【０１１９】
本発明の他の方法およびキットは、本開示に従って当業者により処方され（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）得る。以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、いかなる場合も本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
（２プローブアッセイにおいて制限酵素を使用する標的認識）
以下を含有する２０μｌの反応系を構築する：
２μｌの１０×制限酵素反応緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）
０．２μｌの１０μｇ／μｌ  アセチル化ＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）
１μｌの２０μＭ  活性化プローブ
１μｌの２０μＭ  シグナルプローブ
０．５μｌの１０Ｕ／μｌ  ＴａｑＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）
標的ＤＮＡ
ヌクレアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，ＭＡ）で、２０μｌの最終容積にする。
この反応混合物を、６０℃で４時間インキュベートベートした。１０μｌの反応生成物を、ＰＥ光学プレート中で、内部標準として作用する１μｌの１００ｎＭのフルオレセインおよび１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  アビジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓｅ，ＭＯ）と混合した。この生成物を、ＡＢＩ３１００遺伝子分析機（ＰＥ  Ｃｏｒｐ．）を使用して分離した。泳動条件を以下のように設定した：３０℃の泳動温度、１５ｋＶの予備泳動電圧、１８０秒の予備泳動時間、３ＫＶの注入電圧、１００秒の注入時間、１５ＫＶの泳動電圧、１２００秒の泳動時間、およびｍ秒あたり１４０データポイントのサンプリング速度。
【０１２１】
代表的な結果を図１１に示す。上のパネルは、制限酵素を含む反応の生成物を示す。内部コントロール（ＦＡＭ）は、約１４００秒で溶出した（ピーク１）。放出された電気泳動タグは、約１５５０秒で溶出した（ピーク２）。下のパネルは、制限酵素なしで実行されたコントロール反応を示す。これらの電気泳動図における非標識ピーク（主にピーク１の左側）は、非特異的反応生成物またはプローブ調製由来の混入物である。
プローブおよび合成標的配列を以下に示す（全て５’から３’の方向で示される）：
【０１２２】
【化１】
2005511033.tif 000005
ＴａｑＩの認識配列は、ＴＣＧＡであり、これは、プローブの配列において下線を付している。切断はチミジン残基の後で起こり、Ｔａｇ１−Ｔを電気泳動タグとして放出する。この標的ＤＮＡは、１０９コピー／μｌの濃度におけるユビキチン遺伝子のインビトロ転写物の１μｌか、または２００ｐＭの合成オリゴヌクレオチドのいずれかであった。
【０１２３】
（実施例２）
（２プローブアッセイにおいてＤＮＡ修復酵素を使用する標的認識）
ＤＮＡ修復酵素もまた、本発明を実施する際に利用され得る。例えば、ヒトアプリン／アピリミジン（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ）エンドヌクレアーゼ（ＡＰＥ）を利用する以外は上記のアッセイに類似のアッセイは、以下の成分とアセンブルされ得る：
２μｌの１０×ＡＰＥ反応緩衝液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
１μｌの２０μＭ  活性化プローブ
１μｌの２０μＭ  シグナルプローブ
１０μｌの０．１Ｕ／μｌ  ＡＰＥ酵素（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
１μｌの標的ＤＮＡ
ヌクレアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，ＭＡ）を、最終容積２０μｌになるまで加える。
【０１２４】
この反応混合物を、本実施例において選択された酵素活性に適切な条件（例えば、３７℃で４時間）でインキュベートするべきである。この生成物を、同じ機器および泳動条件を使用して、上記のようにキャピラリー電気泳動により分割し得る。ＡＰＥの認識配列は、無塩基部位（シグナルプローブ配列において下線を付している）であり、切断はリボースの３’末端で起こる。シグナルプローブの切断は、組成物Ｔａｇ１−Ｃｄｓ（Ｃ）の分子の期待される移動度を有する電気泳動タグを放出する。プローブおよび合成標的配列を以下に列挙する（全て５’から３’の方向）：
【０１２５】
【化２】
2005511033.tif 000006
標的ＤＮＡは、１０９コピー／μｌの濃度におけるユビキチン遺伝子のインビトロ転写物か、または２００ｐＭの合成オリゴヌクレオチドのいずれかであった。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１Ａ】図１Ａは、ヘルパープローブおよび電気泳動プローブが、標的ポリヌクレオチドと結合し、認識２重鎖結合を含む安定な複合体を形成する方法の例を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、複数の標的ポリヌクレオチドを検出するための本発明の１つの実施形態の操作を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、切断因子がｈＯＧＧ１タンパク質である、本発明によるアッセイの例を示す
【図２Ｂ】図２Ｂは、切断因子がＭｕｔＹタンパク質である、本発明によるアッセイの例を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、キャピラリー電気泳動により分離された電気泳動タグの予測された溶出時間および実験的（＊）溶出時間を示す。Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９およびＣ１８は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡから市販されるホスホラミダイトスペーサーである。この単位は、「Ｑ」によって示される、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル、Ｏ−シアノエチルホスホラミダイトの誘導体である。Ｃ３は、ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）オキシプロピルＱであり；Ｃ６は、ＤＭＴオキシへキシルＱであり；Ｃ９は、ＤＭＴオキシ（トリエチンオキシ）Ｑであり；Ｃ１２は、ＤＭＴオキシドデシルＱであり；Ｃ１８は、ＤＭＴオキシ（ヘキサエチレンオキシ）Ｑである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図３Ｉ】図３Ｉは、例示的な放出された電気泳動タグの構造を示す。
【図４】図４は、個々の電気泳動タグの分離を表す複数の電気泳動図を示す。この図は、レポーター（レポーターは、ＡＣＬＡ番号によって同定される）の得られる分解能を示す。
【図５】図５は、従来のＤＮＡシンセサイザーにおける電気泳動プローブの合成のためのホスホラミダイト前駆体を示す。
【図６】図６は、電荷改変因子ホスホラミダイト（ＥＣまたはＣＥは、シアノエチルであり、またＤＭＴは、ジメチルトリチルである）を示す。
【図７】図７は、ヒドロキシアミン前駆体を用いたフルオレセインホスホラミダイトを産生するためのスキームを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、市販の６−カルボキシフルオレセインのＮＨＳエステルで開始する１つの例示的な合成アプローチを示す。ここでフェノールヒドロキシル基は、無水物を使用することで保護される。標準的な抽出処理の際に、産生物の９５％収率の生成物が得られる。この物質は、ホスファチル化され、ホスホラミダイトモノマーを生成する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、アミノアルコールとしての対称ビスアミノアルコールリンカーの使用を示し、次いで第２のアミンが、複数のカルボン酸誘導体とカップリングされることを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、開始材料として５−アミノフルオレセインを使用し、そして５−アミノフルオレセインをその保護されたホスホラミダイトモノマーに変換するための同様の一連の工程を使用する代替のストラテジーの使用を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、アミノ色素のｅ−タグホスホラミダイトモノマーへの変換のために使用され得るいくつかの分離改変因子を示す。
【図１０】図１０は、マレイミド結合前駆体由来のいくつかの電気泳動タグの構造を与える。
【図１１】図１１は、酵素を用いるかまたは用いないアッセイの予測される結果を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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