(57)【要約】対象の組織における血管形成をダウンレギュレートするための新規の核酸構築物が提供される。核酸構築物は（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｂ）特定の組織または細胞においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含む。この場合、リガンド結合ドメインは、特定の組織または細胞に存在するリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化される。過度な又は異常な血管新生又は細胞増殖によって特徴付けられる疾患を治療するためのこの核酸構築物の使用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、
（ｂ）特定の組織または細胞において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含む核酸構築物であって、
前記リガンド結合ドメインは、前記特定の組織または細胞に存在するリガンドと結合することができるように選択され、一方、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することにより、前記アポトーシスシグナル伝達分子の前記エフェクタードメインが活性化される核酸構築物。
【請求項２】
前記シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーターおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである請求項１記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである請求項１記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される請求項３記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記アポトーシスシグナル伝達分子は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される請求項１記載の核酸構築物。
【請求項６】
請求項１の核酸構築物で形質変換された哺乳動物細胞。
【請求項７】
血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物を対象に投与することを含む、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションする方法であって、前記核酸構築物は、
（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、
（ｂ）血管形成性細胞の前記亜集団において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域
とを含み、そして、
前記リガンド結合ドメインは、血管形成性細胞の前記亜集団に存在するリガンドまたは血管形成性細胞の亜集団にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することにより、前記アポトーシスシグナル伝達分子の前記エフェクタードメインが活性化され、それにより、組織における血管形成がダウンレギュレーションされる方法。
【請求項８】
さらに、血管形成性細胞の前記亜集団に前記リガンドをもたらすために好適な手段で対象に前記リガンドを投与することを含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
対象に対する前記リガンドの前記投与は、
（ｉ）全身的なインビボ投与、
（ｉｉ）対象の身体から取り出された細胞へのエクスビボ投与（この場合、前記細胞は、その後、対象の前記身体に再導入される）、および
（ｉｉｉ）局所的なインビボ投与
からなる群から選択される方法によって行われる請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーターおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アポトーシスシグナル伝達分子は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される請求項７記載の方法。
【請求項１４】
対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションする方法であって、
（ａ）血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物であって、
（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域（この場合、前記エフェクタードメインは、リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合した後に活性化されるよう選択される）と、
（ｉｉ）血管形成性細胞の前記亜集団において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域
とを含む核酸構築物を対象に投与すること、そして
（ｂ）対象に前記リガンドを投与し、それにより、組織における血管形成をダウンレギュレーションさせること
を含む方法。
【請求項１５】
対象に対する前記リガンドの前記投与は、
（ｉ）全身的なインビボ投与、
（ｉｉ）対象の身体から取り出された細胞へのエクスビボ投与（この場合、前記細胞は、その後、対象の前記身体に再導入される）、および
（ｉｉｉ）局所的なインビボ投与
からなる群から選択される方法によって行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーターおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記アポトーシスシグナル伝達分子は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物を有効成分として含み、かつ薬学的に受容可能なキャリアを含む、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションするための薬学的組成物であって、前記核酸構築物は、
（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、
（ｂ）血管形成性細胞の前記亜集団において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域
とを含み、そして、
前記リガンド結合ドメインは、前記特定の組織または細胞に存在するリガンドと結合することができるように選択され、一方、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することにより、前記アポトーシスシグナル伝達分子の前記エフェクタードメインが活性化される薬学的組成物。
【請求項２１】
前記シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーターおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される請求項２２記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記アポトーシスシグナル伝達分子は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される請求項２０記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物の治療効果的な量を投与することを含む、過度な血管新生に関連する疾患または状態を処置する方法であって、前記核酸構築物は、
（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、
（ｉｉ）血管形成性細胞の前記亜集団において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域
とを含み、そして、
前記リガンド結合ドメインは、血管形成性細胞の前記亜集団に存在するリガンドまたは血管形成性細胞の前記亜集団にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することにより、前記アポトーシスシグナル伝達分子の前記エフェクタードメインが活性化され、それにより、組織における血管形成がダウンレギュレーションされ、そして過度な血管新生に関連する疾患または状態が処置される方法。
【請求項２６】
さらに、血管形成性細胞の前記亜集団に前記リガンドをもたらすために好適な手段で対象に前記リガンドを投与することを含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
対象に対する前記リガンドの前記投与は、
（ｉ）全身的なインビボ投与、
（ｉｉ）対象の身体から取り出された細胞へのエクスビボ投与（この場合、前記細胞は、その後、対象の前記身体に再導入される）、および
（ｉｉｉ）局所的なインビボ投与
からなる群から選択される方法によって行われる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーターおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記アポトーシスシグナル伝達分子は、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬからなる群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍の細胞においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物の治療効果的な量を投与することを含む、対象において腫瘍を処置する方法であって、前記核酸構築物は、
（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、
（ｉｉ）前記腫瘍の細胞において前記キメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域
とを含み、そして、
前記リガンド結合ドメインは、前記腫瘍の細胞に存在するリガンドまたは前記腫瘍の細胞にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、前記リガンドが前記リガンド結合ドメインに結合することにより、前記アポトーシスシグナル伝達分子の前記エフェクタードメインが活性化され、それにより、前記腫瘍の細胞におけるアポトーシスが誘導される方法。
【請求項３３】
さらに、前記リガンドを前記腫瘍の細胞にもたらすために好適な様式で対象に前記リガンドを投与することを含む請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記シス作用調節エレメントは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＩＩ型ヘキソキナーゼプロモーターおよびＬ−プラスチンプロモーターからなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野及び背景
本発明は、対象の特定の組織領域における血管形成をダウンレギュレーションするために使用することができる核酸構築物および薬学的組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、特定の細胞サブセットにおけるアポトーシスを活性化するために使用することができ、従って、過度または異常な血管新生または細胞増殖を特徴とする疾患の処置を可能にする核酸構築物に関する。
【０００２】
血管形成は、新しい血管の成長、すなわち、毛細管内皮細胞による移動、増殖および管形成に主に依存するプロセスである。血管形成のとき、内皮細胞はその静止期から抜け出し、迅速に増殖する。血管形成性表現型への細胞の移行に関わる分子機構は明らかにされていないが、新しい血管の形成をもたらす一連の事象が詳しく報告されている［Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、４８〜５０（１９９７）］。血管の成長には、内皮の出芽［Ｒｉｓａｕ，Ｗ．、Ｎａｔｕｒｅ、３８６、６７１〜６７４（１９９７）］または挿入成長［Ｐａｔａｎ，Ｓ．他、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、５１、２６０〜２７２（１９９６）］のいずれかが伴う。最初の経路では、下記の事象列が生じ得る：（ａ）血管の基底部（通常は後毛細管小静脈）および間質基質の溶解；（ｂ）刺激に向かう内皮細胞の遊走；（ｃ）先導する内皮細胞の後について行く内皮細胞の増殖；（ｄ）内皮の列／芽における内腔の形成（管形成）；（ｅ）血液の流れを可能にするための芽の交会吻合による枝分れおよびループの形成；（ｆ）周皮細胞（すなわち、内皮周囲細胞および平滑筋細胞）による血管の外皮化；および（ｇ）未成熟な血管の周りでの基底膜の形成。新しい血管はまた、二次的な経路によっても、すなわち、既に存在する血管の内腔への間質組織柱の挿入によっても形成され得る。これらの柱のその後の成長およびそれらの安定化は、血管内腔の区画化および局所的な血管網の再構成をもたらす。
【０００３】
様々な血管形成因子により、血管形成プロセスは支配されている。病変時には、血管形成因子と抗血管形成因子との間における微妙な平衡が乱れ、それにより、自己非制限的な内皮細胞増殖および内皮周囲細胞増殖を誘発することが理解されている。最近まで、眼での血管新生、関節炎、皮膚病および腫瘍の様々な疾患において生じる血管形成は治療的に抑制することが困難であった。
【０００４】
従って、すべての抗血管形成治療の基本的な目標は、増殖中の微小血管の病巣をその正常な休止期に戻すこと、およびその再成長を防止することである［Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（第５版、編者：Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｔ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．、Ｓａｍｕｅｌ  Ｈｅｌｌｍａｎ、Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９７年）］。
【０００５】
抗血管形成治療は、腫瘍成長（例えば、網膜症、良性および悪性の血管形成腫瘍）の進行を遅らせることができるので、確固たる臨床的方法である。
【０００６】
一般に、毛細血管の制御されない成長によって引き起こされる疾患（糖尿病網膜症、乾癬、関節炎、血管腫、腫瘍の成長および転移など）はどれも、抗血管形成治療の標的である。
【０００７】
例えば、臨床的に確認できないサイズ（例えば、数ｍｍ３）を越えての固形腫瘍の進行性成長には、新しい血管が継続して形成されること（腫瘍血管形成として知られているプロセス）が要求される。腫瘍の成長および転移は血管形成依存的である。腫瘍は、腫瘍自身が成長するために栄養分および酸素を送達するための新しい毛細血管の成長を継続して刺激しなければならない。従って、腫瘍血管形成の防止または腫瘍の存在する血管の選択的な破壊（血管標的化治療）のいずれかが抗血管形成腫瘍治療の基礎である。
【０００８】
近年、多数の抗血管形成作用剤が、悪性疾患を処置するために開発されており、そのうちのいくつかが既に臨床試験中である（総説については、Ｈｅｒｂｓｔ他（２００２）、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２９：６６〜７７を参照のこと）。
【０００９】
腫瘍抗血管形成処置のための最も研究されている標的は、ヒトにおける血管形成を調節する支配的なプロセス、すなわち、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のその受容体（ＶＥＧＦＲ）との相互作用である。ＶＥＧＦＲの血管形成作用を調節する作用剤には、（ｉ）ＶＥＧＦタンパク質自体または受容体に向けられた抗体（例えば、ｒｈｕＭＡｂ  ＶＥＧＦ）；（ｉｉ）ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する小分子化合物（例えば、ＺＤ６４７４およびＳＵ５４１６）；（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲにより標的化されるリボザイムが含まれる。
【００１０】
他の新規な血管形成阻害剤には、２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ２）（他にない特徴的な抗腫瘍性および抗血管形成性を有する、エストラジオールの天然の代謝産物）、ならびにアンギオスタチンおよびエンドスタチン（それぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩのタンパク質分解切断フラグメント）が含まれる。
【００１１】
前臨床モデルでは有望であるが、今日まで、臨床試験で試験されたすべての抗血管形成作用剤の全身投与では、成功率が限られていること、そして、血小板減少症、白血球減少症および喀血を含む相当の毒性が明らかにされている。これらの結果は、進行した悪性腫瘍に対する治療として現在の腫瘍血管形成作用剤を使用することには限界があり得ることを示唆している。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他は、抗血管形成治療の開始と抗腫瘍効果との間での時間のずれにより、治療に対する応答の前に初期の腫瘍成長が生じ得ることを示している［Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  Ｓ他（１９９８）、Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、１７：２１７ａ］。さらに、最近の研究では、血管形成の調節が毛細血管床の間で異なり得ることが示唆され、このことは、抗血管形成治療は器官／組織特異的に最適化する必要があり得ることを示唆している［Ａｒａｐ他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：３７７〜３８０］。
【００１２】
興味深いことに、良好でない結果もまた、平滑筋細胞増殖に向けられた抗血管形成治療（例えば、ヘパリン、ヘパリンペプチドによる処置）が冠状動脈疾患患者における心筋虚血に対して行われたときに得られている［Ｌｉｕ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、７９：１３７４〜１３８７（１９８９）；Ｇｏｌｄｍａｎ他、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、６５：２１５〜２２５（１９８７）；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ他、ＪＡＣＣ、１５（２）：４７５〜４８１（１９９０）］。心臓血管疾患を処置するためのそのような作用剤の使用に関連する様々な制限には、（ｉ）心臓血管疾患患者に対して許容できないレベルの危険性をもたらす全身毒性；（ｉｉ）手術後の血管創傷治癒の妨害；（ｉｉｉ）周囲の内皮および／または他の内側平滑筋細胞に対して生じ得る損傷が含まれた。
【００１３】
抗血管形成因子の全身投与に関連するこれらの障害および固有的な障害（すなわち、インビトロでの不安定性に基づく製造上の制限および高用量が要求されること；ならびに最善とは言えない効果の原因と考えられるボーラス投与のピーク速度論）の点で、血管新生関連疾患を処置することにおける血管形成因子の効果的な使用が制限される。
【００１４】
血管形成プロセスを調節する新しい遺伝子の同定とともに、体細胞遺伝子治療が、これらの制限を克服するために試みられている。多大の努力が、ガン、心臓血管疾患および末梢血管疾患の遺伝子治療法を開発することに向けられているが、効果的かつ特異的な遺伝子送達に対する大きな障害が依然として存在する［総説については、Ｆｅｌｄｍａｎ  ＡＬ（２０００）、Ｃａｎｃｅｒ、８９（６）：１１８１〜９４を参照のこと］。一般に、組換えウイルスベクターを運搬体として使用する、目的とする遺伝子による遺伝子治療の主要な制限因子は、目的とする遺伝子を標的組織に特異的に導く能力である。
【００１５】
これらの制限を克服するための試みには、細胞傷害性遺伝子にコンジュゲート化された組織特異的なプロモーターの使用が含まれていた。例えば、内皮特異的なプロモーターの制御下で発現する細胞傷害性遺伝子の内皮細胞標的化が、ＴＮＦαを内皮細胞において特異的に発現させるためにＫＤＲプロモーターまたはＥ−セレクチンプロモーターを使用したＪａｇｇｅｒ他により記載されている［Ｊａｇｇａｒ  ＲＴ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９７）、８（１８）：２２３９〜４７］。Ｏｚａｋｉ他は、ヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をＨＵＶＥＣに送達するためにフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）プロモーターを使用した［Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（１９９６）、７（１３）：１４８３〜９０］。しかしながら、これらのプロモーターは、弱い活性を示しただけであり、高レベルの発現をもたらさなかった。
【００１６】
ＫｏｎｇおよびＣｒｙｓｔａｌにより提示された代わりの方法では、抗血管形成因子の腫瘍特異的な発現が含まれた。しかしながら、今日まで、内因性抗血管形成作用剤の組換え形態の毒性は明らかにされていない。だが、いくつかの合成された抗血管形成作用剤は前臨床モデルにおいて毒性を伴っている［ＫｏｎｇおよびＣｒｙｓｔａｌ（１９９８）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、９０：２７３〜７６］。
【００１７】
アンギオスタチンもまた可能な抗血管形成作用として使用されている［Ｆａｌｋｍａｎ他、Ｃｅｌｌ、１９９７（１月２４日）、８８（２）：２７７〜８５］。しかしながら、腫瘍における血管形成の調節に関与する因子の重複性のために、アンギオスタチン治療は単独では効果的であるとはほとんど考えられていない。
【００１８】
従って、対象の特定の組織領域における血管形成を効率的にダウンレギュレーションするための新規な方法で、同時に、先行技術の抗血管形成方法を特徴づける毒性副作用を有しない方法が必要であることが広く認識されており、そしてそのような方法を有することは非常に好都合である。
【００１９】
発明の要約
本発明の１つの局面により、（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｂ）特定の組織または細胞においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含む核酸構築物が提供される。この場合、リガンド結合ドメインは、特定の組織または細胞に存在するリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化される。
【００２０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、上記に記載される核酸構築物で形質転換された哺乳動物細胞が提供される。
【００２１】
本発明の別の局面により、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションする方法であって、血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物を対象に投与することを含む方法が提供される。この場合、核酸構築物は、（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｂ）血管形成性細胞の亜集団においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含み、そして、リガンド結合ドメインは、血管形成性細胞の亜集団に存在するリガンドまたは血管形成性細胞の亜集団にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化され、それにより、組織における血管形成がダウンレギュレーションされる。
【００２２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴により、この方法はさらに、血管形成性細胞の亜集団にリガンドをもたらすために好適な手段で対象にリガンドを投与することを含む。
【００２３】
本発明のさらに別の局面により、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションする方法であって、（ａ）血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物であって、（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域（この場合、エフェクタードメインは、リガンドがリガンド結合ドメインに結合した後に活性化されるよう選択される）と、（ｉｉ）血管形成性細胞の亜集団においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含む核酸構築物を対象に投与すること、そして（ｂ）対象にリガンドを投与し、それにより、組織における血管形成をダウンレギュレーションさせることを含む方法が提供される。
【００２４】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、対象に対するリガンドの投与は、（ｉ）全身的なインビボ投与、（ｉｉ）対象の身体から取り出された細胞へのエクスビボ投与（この場合、細胞は、その後、対象の身体に再導入される）、および（ｉｉｉ）局所的なインビボ投与からなる群から選択される方法によって行われる。
【００２５】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、シス作用調節エレメントは、ＰＰＥ−１プロモーター、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター、ＴＩＥ−１プロモーター、ＴＩＥ−２プロモーター、エンドグリンプロモーター、フォンビルブランドプロモーター、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター、ＦＬＴ−１プロモーター、Ｅｇｒ−１プロモーター、ＩＣＡＭ−１プロモーター、ＶＣＡＭ−１プロモーター、ＰＥＣＡＭ−１プロモーター、ＣＡｒＧボックスエレメントおよび大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーターからなる群から選択される内皮細胞特異的または内皮周囲細胞特異的なプロモーターである。
【００２６】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、リガンド結合ドメインは細胞表面受容体のリガンド結合ドメインである。
【００２７】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子およびホスファターゼ受容体からなる群から選択される。
【００２８】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、アポトーシスシグナル伝達分子は、ＦａｓおよびＴＮＦＲからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のさらに別の局面により、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションするための薬学的組成物であって、血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物を有効成分として含み、かつ薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物が提供される。この場合、核酸構築物は、（ａ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｂ）血管形成性細胞の亜集団においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含み、そして、リガンド結合ドメインは、特定の組織または細胞に存在するリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化される。
【００３０】
本発明のさらなる局面により、過度な血管新生に関連する疾患または状態を処置する方法であって、血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物の治療効果的な量を投与することを含む方法が提供される。この場合、核酸構築物は、（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｉｉ）血管形成性細胞の亜集団においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含み、そして、リガンド結合ドメインは、血管形成性細胞の亜集団に存在するリガンドまたは血管形成性細胞の亜集団にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化され、それにより、組織における血管形成がダウンレギュレーションされ、そして過度な血管新生に関連する疾患または状態が処置される。
【００３１】
さらに本発明のさらなる局面により、対象において腫瘍を処置する方法であって、腫瘍の細胞においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物の治療効果的な量を投与することを含む方法が提供される。この場合、核酸構築物は、（ｉ）アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域と、（ｉｉ）腫瘍の細胞においてキメラなポリペプチドの発現を行わせるためのシス作用調節エレメントをコードする第２のポリヌクレオチド領域とを含み、そして、リガンド結合ドメインは、腫瘍の細胞に存在するリガンドまたは腫瘍の細胞にもたらされるリガンドと結合することができるように選択され、一方、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することにより、アポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインが活性化され、それにより、腫瘍の細胞におけるアポトーシスが誘導される。
【００３２】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、方法はさらに、リガンドを腫瘍の細胞にもたらすために好適な様式で対象にリガンドを投与することを含む。
【００３３】
記載される好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴により、シス作用調節エレメントは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＩＩ型ヘキソキナーゼプロモーターおよびＬ−プラスチンプロモーターからなる群から選択される。
【００３４】
本発明は、特異的かつ標的化された様式で血管形成および腫瘍細胞増殖を効率的にダウンレギュレーションするための新規な方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に取り組むことに成功している。
【００３５】
図面の簡単な記述
本発明は、例のみとして、添付された図面を参照してここに記載される。次に図面を詳細に特に参照することにより、示される特定の事項は、例としてであり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけであり、そして本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために示されることに重点が置かれている。この点に関して、本発明の基本的な理解のために必要とされるよりも詳しく本発明の構造的詳細を示すことはなされておらず、しかし、図面とともに理解される説明により、本発明のいくつかの形態がいかにして実際に具体化され得るかが当業者には明らかになる。
図中：
図１ａ〜ｂはＴＮＦＲ１の細胞外領域ならびにＦａｓの膜貫通領域および細胞内領域から構築され、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローン化されたＦａｓキメラ遺伝子（ａ）またはアデノウイルスベクターにクローン化されたＦａｓキメラ遺伝子（ｂ）の概略図である。
図２ａ〜ｂはプロアポトーシス遺伝子（ＦａｓキメラおよびＴＮＦＲ１）のアポトーシス活性を例示する。図２ａには、ｐｃＤＮＡ−３−ＴＮＦＲ１（下段パネル）またはコントロール空ベクター（上段パネル）のいずれか、およびＧＦＰをコードする発現ベクターでトランスフェクションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）が例示される。図２ｂには、ｐｃＤＮＡ−３−Ｆａｓ−ｃ（下段パネル）またはコントロール空ベクター（上段パネル）のいずれか、およびＧＦＰをコードする発現ベクターでトランスフェクションされた２９３細胞が例示される。トランスフェクション細胞は、蛍光顕微鏡観察を使用して可視化され、アポトーシス活性が形態学的に決定された。
図３ａ〜ｆはプロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。トランスフェクションの２４時間後、ＢＡＥＣ細胞を２．５％グルタルアルデヒドで固定処理し、加工した。アポトーシス過程の連続した段階にある細胞が示される。
図４はトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞および２９３細胞における示されたプロアポトーシス遺伝子のアポトーシス活性を定量するヒストグラムである。
図５ａはＡｄＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃのＰＣＲ分析を示す。レーン１〜２−ＰＰＥ−１プロモーターおよびＦａｓ−ｃ遺伝子を包含するプロモーターを使用して得られたＰＣＲ産物。レーン３〜４−Ｆａｓ−ｃプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物。レーン５〜６−テンプレートＤＮＡの非存在下で得られたＰＣＲ産物。
図５ｂは、ＡｄＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃでトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞のウエスタンブロット分析である。タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブランに転写し、そしてＴＮＦＲ１の細胞外部分に対するポリクローナル抗体でプローブした。レーン１〜２−ｐｃＤＮＡ３−Ｆａｓ−ｃのＢＡＥＣトランスフェクション細胞（陽性コントロール）。レーン３〜４−ＡｄＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃウイルスの示されたＭＯＩでトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞。レーン５−非トランスフェクション細胞。レーン６〜７−ＡｄＰＰＥ−Ｌｕｃの示されたＭＯＩでトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞。
図６ａ〜ｄは内皮細胞のアポトーシスに対するＦａｓ−キメラの過剰発現の影響を例示する顕微鏡写真である。ＢＡＥＣ細胞に、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−キメラ（図６ａ）；Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ルシフェラーゼ（図６ｂ）；Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−キメラおよびＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ（図６ｃ）；Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ルシフェラーゼおよびＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−ＧＦＰ（図６ｄ）を、それぞれ１０００のＭＯＩで感染させた。顕微鏡写真は、感染の７２時間後、ｘ１０の倍率で撮影された。
図７は内皮細胞に対するＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス特異的作用を例示するヒストグラムである。内皮細胞（ＢＡＥＣ、ＨＵＶＥＣ）および非内皮細胞（正常な皮膚繊維芽細胞−ＮＳＦ）の生存率を、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−キメラウイルスまたはコントロール（ルシフェラーゼ）ウイルスのいずれかによる感染の７２時間後にクリタルバイオレット染色によって定量した。
図８はＦａｓ−キメラにより媒介されるアポトーシスに対するＴＮＦα投与の用量応答作用を示す。ＢＡＥＣにＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃを感染させた。感染の４８時間後、ＴＮＦを増殖培地に（示された用量で）加えた。生存率を、その２４時間後にクリタルバイオレットアッセイによって測定した。
図９ａ〜ｅはＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。示された細胞は、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃによる感染後４８時間、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でインキュベーションされた。クリタルバイオレット染色が感染の７２時間後に行われた。
図１０ａは、内皮細胞に対するＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ｃのＴＮＦα依存的アポトーシス作用を例示する用量応答曲線である。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラの示されたＭＯＩを感染させたＢＡＥＣ細胞の生存率をＴＮＦαとのインキュベーション後に測定した。
図１０ｂ〜図１０ｄは、非内皮細胞ＮＳＦに対する、ＴＮＦαリガンドおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス作用を例示する。図１０ｂ−コントロールウイルスを感染させたＮＳＦ。図１０ｃ−Ａｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラを感染させたＮＳＦ。図１０ｄ−Ａｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラを感染させ、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションされたＮＳＦ。
図１１ａ〜ｃはＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃのインビボ抗腫瘍作用を例示する。Ｂ１６メラノーマ細胞を接種したマウスに対して、腫瘍が触診可能となったときに、Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃ、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラ、コントロールウイルスまたは生理的食塩水を静脈内注射した。図１１ａ−処置期間中に測定された腫瘍面積。図１１ｂ−処置期間が終了した時の腫瘍重量。図１１ｃ−Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃ処置マウスおよびコントロールマウスにおける腫瘍の状態を表す画像。
【００３６】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、過度または異常な血管新生または細胞増殖を特徴とする疾患を処置するために使用することができる核酸構築物および方法に関する。詳細には、本発明は、血管形成に関与する細胞を特異的に標的化し、かつ殺すために使用することができ、従って、血管形成のダウンレギュレーションおよび抗腫瘍治療を可能にする。
【００３７】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより良く理解することができる。
【００３８】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、または図面に例示される構成要素の組立および配置の細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は説明のためであり、従って限定であるとして見なされるべきではないことを理解しなければならない。
【００３９】
抗血管形成治療の最も基本的な目標の１つは、増殖中の微小血管の病巣をその正常な休止期に戻すこと、およびその再成長を防止することである。
【００４０】
今日まで、様々な抗血管形成治療法が用いられており、これらは、抗血管形成作用剤の全身投与が用いられ、また、ほとんどが、血小板減少症、白血球減少症および／または喀血を処置者に生じさせる毒性副作用のために、成功が限られている。これらの先行技術の方法に伴う毒性副作用は、用いられた抗血管形成作用剤の非特異的な発現、および健康な組織がこれらの作用剤にさらされること、または重複性、従って、使用された抗血管形成作用剤が効果的でないことの結果である。
【００４１】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、プロアポトーシス作用剤の組織特異的な発現および特異的な活性化の組合せにより、血管形成に関与する細胞の選択的なアポトーシスが、標的化されていない組織または細胞にこれらの作用剤がさらされることなく可能であること、従って、先行技術の処置方法を特徴づける毒性副作用および冗長性を避けることができることを明らかにしている。
【００４２】
従って、本発明の１つの局面により、対象の組織における血管形成をダウンレギュレーションする方法が提供される。本明細書中で使用される表現「血管形成をダウンレギュレーションする」は、新しい血管の形成をもたらす血管形成プロセスを遅くすることまたは停止させることのいずれかを示す。
【００４３】
本発明のこの局面による方法は、血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシスを生じさせるために設計および構成された核酸構築物を対象に投与することによって行われる。本明細書中で使用される表現「血管形成性細胞」は、血管形成のプロセスに関係または寄与する任意の細胞を示す。従って、血管形成性細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
血管形成性細胞の亜集団においてアポトーシス作用剤の特異的な発現を行わせるために、本発明の核酸構築物は、アポトーシスシグナル伝達分子（例えば、Ｆａｓ、ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬなど）のエフェクタードメインに融合されたリガンド結合ドメイン（これは、例えば、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリンキナーゼ、受容体トレオニンキナーゼ、細胞接着分子またはホスファターゼ受容体の細胞表面受容体ドメインであり得る）を含むキメラなポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド領域を含む。
【００４５】
そのようなキメラなポリペプチドは、リガンド結合ドメインの活性化（すなわち、リガンドの結合によるリガンド結合ドメインの活性化）がアポトーシスシグナル伝達をアポトーシスシグナル伝達分子のエフェクタードメインを介して開始させる限り、任意のアポトーシスシグナル伝達ドメインに融合された任意のリガンド結合ドメインを含むことができる。
【００４６】
リガンド結合ドメインおよびそれに融合されるアポトーシスシグナル伝達ドメインの選択は、アポトーシスのために標的化される血管形成性細胞のタイプに従って影響される。例えば、内皮細胞の特定のサブセット（例えば、増殖中の内皮細胞、または腫瘍性表現型を示す内皮細胞）を標的化するとき、キメラなポリペプチドは、そのような内皮細胞の環境において生来的に存在し、かつ好ましくは、標的化されていない他の組織の内皮細胞には存在しないリガンド（例えば、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ）と結合することができるリガンド結合ドメインを含む。そのようなリガンドは、内皮細胞によって分泌され得る（オートクリン）か、または周りの腫瘍細胞によって分泌され得るか（パラクリン）、またはこれらの内皮細胞に対して特異的に標的化され得る。
【００４７】
好適なキメラなポリペプチドの例が下記の実施例の節の実施例２に示される。好ましくは、キメラなポリペプチドは、下記の実施例の節の実施例２〜４に詳しく記載されるＦａｓ−ｃキメラである。
【００４８】
そのようなキメラなポリペプチドの使用は、下記の実施例の節に示されるように、アポトーシスのために標的化されていない他の細胞サブセットにおける活性化を避けながら、血管形成性細胞の特定のサブセットにおいてアポトーシスの効率的かつ確固たる活性化を可能にするので特に好都合である。
【００４９】
アポトーシスの細胞特異性をさらに高めるために、本発明の核酸構築物は、血管形成性細胞の亜集団においてキメラなポリペプチドの発現を行わせることができるシス作用調節エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）をコードする第２のポリヌクレオチド領域をさらに含む。
【００５０】
本発明の核酸構築物により利用され得る好適なプロモーター／エンハンサーの例には、内皮特異的なプロモーター、例えば、プレプロエンドセリン−１（ＰＰＥ−１）プロモーター（Ｈａｒａｔｓ  Ｄ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９５（３月）、９５（３）：１３３５〜４４）、ＰＰＥ−１−３ｘプロモーター［ＰＣＴ／ＩＬ０１／０１０５９；Ｖａｒｄａ−Ｂｌｏｏｍ  Ｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００１（６月）、８（１１）：８１９〜２７］、ＴＩＥ−１プロモーター（Ｓ７９３４７、Ｓ７９３４６）およびＴＩＥ−２プロモーター（Ｕ５３６０３）［Ｓａｔｏ  ＴＮ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９３（１０月１５日）、９０（２０）：９３５５〜８］、エンドグリンプロモーター［Ｙ１１６５３；Ｒｉｕｓ  Ｃ、Ｂｌｏｏｄ、１９９８（１２月１５日）、９２（１２）：４６７７〜９０］、フォンビルブランド因子［ＡＦ１５２４１７；Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＣＪ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８７（７月）、８４（１３）：４３９３〜７］、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１プロモーター［Ｘ８９７７７、Ｘ８９７７６；Ｒｏｎｉｃｋｅ  Ｖ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、１９９６（８月）、７９（２）：２７７〜８５］、ＦＬＴ−１プロモーター［Ｄ６４０１６、ＡＪ２２４８６３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｋ、：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９５（１１月１７日）、２７０（４６）：２７９４８〜５３］、Ｅｇｒ−１プロモーター［ＡＪ２４５９２６；Ｓｕｋｈａｔｍｅ  ＶＰ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ、１９８７（９月／１０月）、１（４）：３４３〜５５］、Ｅ−セレクチンプロモーター［Ｙ１２４６２；Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｔ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９１（２月５日）、２６６（４）：２４６６〜７３］、内皮接着分子プロモーター、例えば、ＩＣＡＭ−１［Ｘ８４７３７；Ｈｏｒｌｅｙ  ＫＪ、ＥＭＢＯ  Ｊ、１９８９（１０月）、８（１０）：２８８９〜９６］、ＶＣＡＭ−１［Ｍ９２４３１；Ｉａｄｅｍａｒｃｏ  ＭＦ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９２（８月１５日）、２６７（２３）：１６３２３〜９］、ＰＥＣＡＭ−１［ＡＪ３１３３３０、Ｘ９６８４９；ＣＤ３１、Ｎｅｗｍａｎ  ＰＪ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０（３月９日）、２４７（４９４７）：１２１９〜２２］、血管平滑筋特異的エレメント、例えば、ＣＡｒＧボックス  Ｘ５３１５４および大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）プロモーター［ＡＦ３３２５９６；Ｌａｙｎｅ  ＭＤ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、２００２、９０：７２８〜７３６］、そして大動脈優先的発現遺伝子−１［Ｙｅｎ−Ｈｓｕ  Ｃｈｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻第５０号、４７６５８〜４７６６３、２００１年１２月１４日］が含まれる。
【００５１】
好ましくは、本発明の構築物により利用されるプロモーターは、増殖中の血管形成性細胞または特定の表現型（例えば腫瘍性）の血管形成性細胞において機能的である。本発明と一緒に使用されるのに非常に好適なプロモーターは、下記の実施例の節においてさらに記載されるＰＰＥ−１−３ｘプロモーターである。本発明と一緒に使用されるのに最も好適なベクター構築物は、広く使用されているアデノウイルスベクターおよびその誘導体である。
【００５２】
本発明の核酸構築物は、さらなるポリヌクレオチド配列をさらに含むことができ、例えば、選択マーカーもしくはレポーターポリペプチドをコードする配列、細菌における複製起点をコードする配列、単一のｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にする配列（ＩＲＥＳ）、プロモーター−キメラポリペプチドコード領域のゲノム組み込みのための配列、および／または哺乳動物発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手することができる）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手することができる）、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手することができる）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手することができる）、ならびにそれらの誘導体）に一般に含まれる配列をさらに含むことができる。
【００５３】
好ましくは、本発明の核酸構築物は、例えば、全身投与経路によって、または経口投与、直腸投与、経粘膜投与（特に経鼻投与）、経腸投与もしくは非経口投与の経路によって対象に投与される。全身投与には、筋肉内注射、皮下注射および髄質内注射、ならびにくも膜下注射、直接的な心室（脳室）内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射、眼内注射または腫瘍内が含まれる。
【００５４】
好ましくは、対象は哺乳動物であり、より好ましくはヒトであり、最も好ましくは、腫瘍成長、増殖中の糖尿病網膜症、関節炎などを特徴づける過度のまたは異常な血管新生を特徴とする疾患に罹患しているヒトである。
【００５５】
本発明の核酸構築物は、それ自体で、または薬学的組成物の一部（有効成分）として対象に投与することができる。
【００５６】
先行技術は、ネイクドポリヌクレオチドまたはキャリアにより提供されるポリヌクレオチドを広範囲の様々な細胞タイプに効率的に送達するために使用され得る多数の送達方法について教示している（例えば、Ｌｕｆｔ（１９９８）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、７６（２）：７５〜６；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ、９１（３）：８５２〜６２；Ｒａｊｕｒ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、８（６）：９３５〜４０；Ｌａｖｉｇｎｅ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２３７（３）：５６６〜７；Ａｏｋｉ他（１９９７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２３１（３）：５４０〜５を参照のこと）。
【００５７】
本明細書中で使用される「薬学的組成物」は、本明細書中に記載される有効成分または活性な作用剤の１つまたは複数と、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤などの他の化学的成分との調製物を示す。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００５８】
以降、表現「生理学的に受容可能なキャリア」および表現「薬学的に受容可能なキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ投与された核酸構築物の生物学的な活性および性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。補助剤がこれらの表現には含まれる。
【００５９】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために薬学的組成物に加えられる不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００６０】
薬物を配合し、投与するための様々な技術が、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【００６１】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達（特に経鼻送達）、経腸送達または非経口送達（筋肉内注射、皮下注射および髄質内注射、ならびにくも膜下注射、直接的な心室（脳室）内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射、眼内注射を含む）が含まれ得る。
【００６２】
あるいは、薬学的組成物は、全身的な様式ではなく、局所的な様式で、例えば、薬学的組成物を患者の組織領域内に直接的に注射することによって投与することができる。本発明に関連して、腫瘍組織内への直接的な投与は、局所的な投与の関連する一例である。
【００６３】
本発明の薬学的組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣剤作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【００６４】
本発明に従って使用される薬学的組成物は、従って、薬学的に使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に受容可能なキャリアを使用して従来の様式で配合することができる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【００６５】
注射の場合、薬学的組成物の有効成分は、水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理的食塩水などの生理学的に適合し得る緩衝液中に配合することができる。経粘膜投与の場合、透過させられるバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【００６６】
経口投与の場合、薬学的組成物は、活性な化合物をこの分野で広く知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアは、薬学的組成物を、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【００６７】
糖衣錠コアには、様々な好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【００６８】
経口使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【００６９】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【００７０】
鼻腔吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジであって、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【００７１】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、そして懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【００７２】
非経口投与される薬学的組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は適切な油性注射用懸濁物または水性注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または作用剤を含有することができる。
【００７３】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、パイロジェン非含有水に基づく滅菌された溶液）を用いて構成される粉末形態にすることができる。
【００７４】
本発明の薬学的組成物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【００７５】
本発明に関連して使用される好適な薬学的組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より詳細には、治療効果的な量は、処置されている対象の障害の症状（例えば、骨量の進行性喪失）を防止もしくは緩和もしくは改善するために、または処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の量を意味する。
【００７６】
治療効果的な量の決定は、特に、本明細書中に示される詳しい開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７７】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、所望される濃度または力価を達成するために、骨化石症のネズミＳｒｃ欠損モデル（Ｂｏｙｃｅ他（１９９２）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０、１６２２〜１６２７；Ｌｏｗｅ他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４４８５〜４４８９；Ｓｏｒｉａｎｏ他（１９９１）、Ｃｅｌｌ、６４、６９３〜７０２）などの動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【００７８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物におけるインビトロでの標準的な薬学的手法によって決定することができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用される投薬量範囲を決定する際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬物形態および使用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５年、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁を参照のこと）。
【００７９】
投薬量および投薬間隔は、腫瘍の進行を遅らせるために十分である有効成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）に合わせて個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロでのデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を測定することができる。
【００８０】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回または多数回の投与で行うことができ、この場合、処置クールは、数日から、数週間まで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【００８１】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【００８２】
本発明の組成物は、所望する場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供されることができる。パッケージ物は、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができる（ブリスターパッケージ物など）。パッケージ物またはディスペンサーデバイスには、投与に関する説明書が伴い得る。パッケージ物またはディスペンサーにはまた、医薬品の製造または使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物に対する米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る薬学的キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記にさらに詳しく記載されているかのように、示された状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、表示され得る。
【００８３】
本発明の薬学的組成物は、細胞による核酸構築物の取り込み、核酸構築物によりコードされるキメラなポリペプチドの細胞における発現、または発現したキメラなポリペプチドの活性を改善し得る任意のさらなる成分をさらに含むことができる。
【００８４】
例えば、ＥＣ細胞内へのアデノウイルスベクターの取り込みを、操作された抗体または小ペプチドでベクターを処理することによって高めることができる。そのような「アデノボディー（ａｄｅｎｏｂｏｄｙ）処理は、アデノウイルス構築物を細胞表面のＥＧＦ受容体に向かわせることにおいて効果的であることが示されていた（Ｗａｔｋｉｎｓ他、１９９７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：１００４〜１０１２）。さらに、Ｎｉｃｋｌｉｎ他は、ファージディスプレーにより単離された小ペプチドが、内皮細胞におけるベクターの特異性および効率を増大させ、そして培養において肝臓細胞における発現を低下させたことを示している（Ｎｉｃｋｌｉｎ他、２０００、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０２：２３１〜２３７）。最近の研究では、ＦＧＦ再標的化アデノウイルスベクターはマウスにおいてｔｋの毒性を低下させた（Ｐｒｉｎｔｚ他、２０００、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：１９１〜２０４）。
【００８５】
リガンドにさらされている細胞の標的化が好ましいが、本発明では、リガンドにさらされていない細胞またはリガンドによる影響を生来的に受けない細胞における本発明の核酸構築物の発現もまた考えられることが理解される。そのような場合、本発明の方法は、形質転換された細胞にそのようなリガンドを投与する工程を含む。そのような投与は、上記に記載された投与方法のいずれかを使用して行うことができる。好ましくは、アポトーシスシグナル伝達の活性化が非常に特異的であるように、リガンドは、例えば、抗体の共役した標的化を使用して、細胞が標的化される様式で投与される。アポトーシス活性化のこの方法は、より詳しくは下記の実施例の節に記載される。
【００８６】
従って、本発明は、過度または異常な血管形成を特徴とする組織領域における血管形成をダウンレギュレーションするための核酸構築物、そのような構築物を含む薬学的組成物、およびそのような構築物の利用方法を提供する。
【００８７】
本発明は特定の細胞サブセットにおける標的化された発現を可能にするので、本発明はまた、様々な腫瘍を処置するために改変し、使用することができる。
【００８８】
従って、本発明の別の局面により、腫瘍の処置方法が提供される。
【００８９】
本発明のこの局面による方法は、上記に記載されたキメラなポリペプチドを腫瘍細胞において発現させることによって行われる。
【００９０】
従って、本発明のこの局面により、ポリペプチドキメラの発現が、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）プロモーター［ＡＦ２９３３２１Ｓ３；Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｅ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１（１月／２月）、２１（１Ａ）：３２９〜３１］、ｈＴＥＲＴプロモーター［ＡＨ００７６９９；Ｇｕ  Ｊ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００２（１月）、９（１）：３０〜７］、ＩＩ型ヘキソキナーゼプロモーター［ＡＦ１４８５１２；Ｋａｔａｂｉ  ＭＭ、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９９（１月２０日）、１０（２）：１５５〜６４］、またはＬ−プラスチンプロモーター［Ｌ０５４９０、ＡＨ００２８７０、ＭＭＵ８２６１１；Ｐｅｎｇ  ＸＹ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００１（６月１日）、６１（１１）：４４０５〜１３］（これらに限定されない）などの腫瘍特異的なエレメントによって行われる。
【００９１】
腫瘍細胞におけるポリペプチドキメラ（例えば、Ｆａｓ−ｃ）の発現は、これらの細胞におけるアポトーシスを活性化し、従って、細胞死を生じさせ、これにより、その後、腫瘍増殖の鈍化または停止、そしておそらくは腫瘍の収縮がもたらされる。
【００９２】
本発明のさらなる目的および利点および新規な特徴が、限定であることを意図しない下記の実施例を検討したとき、当業者に明らかになる。さらに、本明細書中上記に示され、そして請求項の節に記載されるような本発明の様々な実施形態および局面のそれぞれは、実験的裏づけが下記の実施例に見出される。
【００９３】
実施例
次に、下記の実施例が参照される。下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定的な様式で例示する。一般に、本明細書中で使用される命名法、および下記に記載される組換えＤＮＡ技術における実験室的手法は、この分野において広く知られ、一般的に用いられているものである。標準的な技術が、クローン化、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、そして増幅および精製のために使用される。一般に、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応は、製造者の説明書に従って行われる。これらの技術および様々な他の技術は、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に従って行われる。このマニュアルは、以降、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」として示される。他の一般的な参考文献が本明細書中に示されている。それらにおける手法は、この分野では広く知られていると考えられ、そして読者の利便のために示される。それらに含まれる情報はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる。
【００９４】
実施例１
内皮細胞（ＢＡＥＣ）および２９３細胞におけるプロアポトーシス遺伝子活性に対するインビトロアッセイ
ガンの処置において、抗血管形成治療は、成長中の腫瘍に栄養を与える発達中の脈管構造を標的とする［Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（１９９５）、３３３（２６）：１７５７〜６３］。アポトーシス（すなわち、プログラム化された細胞死）の研究が進行しているので、選択的かつ効率的な細胞死調節因子をコードする多数の遺伝子がこれまでに同定されている［Ｓｔｒａｓｓｅｒ他、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（２０００）、６９：２１７〜４５］。
【００９５】
本研究により、抗血管形成治療のために最も好適な作用剤を同定するために、プロアポトーシス遺伝子がいくつかスクリーニングされた。ＭＯＲＴ１（ＦＡＤＤ−Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３８２４）、ＲＩＰ（受容体相互作用タンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ２５９９５）、ＣＡＳＨ（ｃ−ＦＬＩＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０１０１２７）、ＭＡＣＨ（カスパーゼ８、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ９８１７２）、ＣＰＰ３２（カスパーゼ３、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ１３７３７）、カスパーゼ９（Ｕ６０５２１）、およびＦａｓ−キメラ（Ｆａｓ−ｃ）（すなわち、ＴＮＦＲ１の細胞外領域と、Ｆａｓの膜貫通領域および細胞内領域とから構築された、２つの「デス受容体」の以前に記載された融合体）［Ｂｏｌｄｉｎ  ＭＰ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９５）、２７０（１４）：７７９５〜８、図１ａを参照のこと］を含むいくつかのプロアポトーシス遺伝子がＰＣＲ増幅され、そして、広く知られている先行技術のクローン化技術を使用してｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）哺乳動物発現ベクターにクローン化された。
【００９６】
これらのプロアポトーシス遺伝子構築物をＢＡＥＣ細胞（ウシ大動脈内皮細胞細胞）および２９３細胞（これはコントロールの非内皮細胞として使用された）においてｐＧＦＰと一緒に同時に発現させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、蛍光顕微鏡観察を使用して分析した。アポトーシス細胞が、蛍光顕微鏡観察を使用して、典型的な形態学（すなわち、小さい丸い形状）に基づいて同定された（図２ａ〜ｂ）。アポトーシス表現型のさらなる評価を、電子顕微鏡観察を使用して行った（図３ａ〜ｆ）。アポトーシス作用の定量により、ＭＯＲＴ１、ＴＮＦＲ１およびＦａｓ−キメラがＢＡＥＣ細胞および２９３細胞において最も大きいアポトーシス活性を誘導したことが明らかにされた（図４ａ〜ｂ）。カスパーゼ３およびカスパーゼ９はこれに関してあまり強くなかった。これは、おそらくは、それらが不活性なチモーゲン形態であったためである。これらの結果に基づき、Ｆａｓ−キメラ（Ｆａｓ−ｃ）遺伝子を、抗血管形成治療において使用されるアデノウイルスベクターを作製するために選択した。
【００９７】
実施例２
改変されたＰＰＥ−１プロモーターの制御下にあるＦａｓ−キメラをコードする組換えアデノウイルスの作製
全長のＦａｓ−キメラをコードするｃＤＮＡを、改変されたプレプロエンドセリン１プロモーターを含有するプラスミドｐＰＡＣＰＰＥ１−３ｘにサブクローン化した（図１ｂを参照のこと）。組換えアデノウイルスを、ヒト胚腎臓２９３細胞にこのプラスミドをｐＪＭ１７プラスミドと同時トランスフェクションすることによって作製した。ウイルスのクローン化の成功をＰＣＲ増幅によって確認した（図５ａ）。
【００９８】
標的細胞におけるＦａｓ−ｃの発現を明らかにするために、内皮ＢＡＥＣ細胞を、示された力価のＡｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃで形質導入した。形質導入の７２時間後、細胞を溶解し、細胞タンパク質を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分離した、ウエスタンブロット分析を、抗ＴＮＦＲ１抗体（Ｓｃ−７８９５、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行った。図５ｂに明らかにされるように、４５ｋＤで移動する顕著なバンドが明瞭に認められ、その発現は用量依存的であった。このことは、キメラタンパク質の正しい折り畳みおよび発現を示唆している。対照的に、形質導入されていない内皮細胞、またはコントロールの空ウイルスベクターで形質導入された細胞では、対応するバンドが認められなかった。従って、これらの結果により、Ｆａｓ−ｃのアデノウイルス媒介による遺伝子移入は標的細胞における導入遺伝子の発現をもたらすことが確認された。
【００９９】
実施例３
Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃの発現は内皮細胞においてアポトーシスを誘導する
内皮細胞のアポトーシスを誘導するＡｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓキメラの能力を測定した。図６ａ〜ｂに示されるように、プレプロエンドセリンにより行われる内皮細胞のアデノウイルス媒介による形質導入は明白かつ甚だしい細胞死をもたらした；Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃ（１０３のＭＯＩ）を感染させたＨＵＶＥＣおよびＢＡＥＣは、膜の突起形成、円形化および収縮、そして培養ディッシュからの剥離を含む、アポトーシスを受けている接着性細胞の形態学的特徴を有した。対照的に、コントロールウイルスを同じＭＯＩで感染させた細胞は正常な外見および成長速度を維持した。１００のＭＯＩで形質導入された細胞は最少程度の細胞死を示しただけであった（データは示されず）。
【０１００】
Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃの細胞傷害的性質のさらなる評価を、レポーター遺伝子ＧＦＰをＰＰＥ−１プロモーターの制御下で発現する細胞においてこのウイルスを発現させることによって行った。図６ｃ〜ｄから明かであるように、形質導入された細胞のほとんどが、典型的なアポトーシスの外見を形質導入の７２時間後には獲得し、これに対して、コントロールウイルスおよびＡｄ−ＰＰＥ−ＧＦＰで同時形質導入された細胞は正常に見えた。
【０１０１】
Ｆａｓ−ｃの細胞傷害的作用を、クリスタルバイオレット染色を使用して定量した。図７に示されるように、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃによるＢＡＥＣおよびＨＵＶＥＣへの感染はそれぞれ５７％および６５％の致死率をもたらし、一方、コントロールウイルスは細胞生存率に影響を及ぼさなかった。
【０１０２】
プロアポトーシスベクターＡｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃの内皮細胞特異性を、ＮＳＦ（正常な皮膚繊維芽細胞）にこのベクターを感染させることによって明らかにした。これらの細胞は、低レベルのＰＰＥ−１を発現する［Ｖａｒｄａ−Ｂｌｏｏｍ，Ｎ．他、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、８、８１９〜２７（２００１）］が、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃによる感染によって影響を受けなかった。対照的に、組換えベクターＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ｃはこれらの細胞においてアポトーシスを誘導した。
【０１０３】
実施例４
Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃ受容体およびＴＮＦαリガンドの同時投与は選択的な様式でプロアポトーシス作用を増強する
Ｆａｓ−ｃ発現細胞におけるアポトーシス作用を増強するＴＮＦαの能力を調べた。ヒトＴＮＦαを、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃ（１００のＭＯＩ）によるウイルス感染の４８時間後、内皮細胞培養物に加えた。細胞生存率を２４時間後にアッセイした。図８に示されるように、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）は、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃ感染細胞の生存率における７３％の減少を誘導し、これに対して、著しい死は、ＴＮＦα単独によって、またはコントロールウイルス（Ａｄ−Ｌｕｃ）を感染させた細胞では起こらなかった。
【０１０４】
ＴＮＦαの作用を裏付けるために、細胞特異性を検討した。ＮＳＦ細胞（正常な皮膚繊維芽細胞）、ＤＡ３細胞（マウス乳腺ガン）、Ｄ１２２細胞（ルイス肺ガン）およびＢ１６メラノーマ細胞にＡｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃまたはコントロールウイルスを感染させた。４８時間後、培養にＴＮＦαを加え、細胞の形態学をクリスタルバイオレットによる染色の後に評価した。図９ａ〜ｅに示されるように、Ａｄ−ＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃを感染させた非内皮細胞は正常な外観を示し、ＴＮＦによる影響を受けなかった。他方、Ｆａｓ−ｃによるＢＡＥＣへのアデノウイルス媒介による感染は、ＴＮＦが加えられたとき、細胞生存率の顕著な低下をもたらした。ＣＭＶプロモーターによってもたらされるＦａｓ−ｃの非選択的なアポトーシス活性が、内皮細胞に対するＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ｃのＴＮＦ依存的なアポトーシス作用を例示する図１０ａにおいて明らかにされる。示されたＭＯＩのＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラを感染させたＢＡＥＣ細胞の生存率をＴＮＦとのインキュベーションの後に測定した。
【０１０５】
注目すべきことに、内皮細胞非特異的ベクターのＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ｃは内皮細胞および非内皮細胞の両方のＴＮＦα依存的なアポトーシスを生じさせた（図１０ｂ〜ｄ）。
【０１０６】
実施例５
Ａｄ−ＰＰＥ１−Ｆａｓ−ｃはマウスにおけるＢ１６メラノーマのインビボでの成長阻害を誘導する
Ｂ１６メラノーママウスモデルを、ＰＰＥ１−３ｘプロモーターから発現されるＦａｓ−ｃの抗腫瘍作用を調べるために使用した。Ｂ１６メラノーマ細胞（８ｘ１０５）を４０匹のＣ５７ｂｌ／６マウスの脇腹領域に皮下注射した。腫瘍が触診可能になったとき（約５ｘ５ｍｍ）、マウスを下記のように４つの群に無作為に分けた：（ｉ）コントロール−生理的食塩水の注射；（ｉｉ）コントロールウイルス（ＰＰＥプロモーターにより制御されるルシフェラーゼを含有するアデノウイルス）；（ｉｉｉ）プレプロエンドセリン（ＰＰＥ）プロモーターにより制御されるＦａｓ−ＴＮＦ受容体キメラ遺伝子を含有するＡｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃウイルス；および（ｉｖ）内皮細胞非特異的なＣＭＶプロモーターにより制御されるＦａｓ−ＴＮＦ受容体キメラ遺伝子を含有するＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ウイルス。
【０１０７】
腫瘍サイズ（長さおよび幅）を、ハンドカリパスを使用して測定した。図１１ａに示されるように、腫瘍サイズは、コントロールのマウスと比較した場合、Ａｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃまたはＡｄ−ＣＭＶ−３ｘ−Ｆａｓ−ｃで処置されたマウスについてはより低かった。処置期間を終了した時の腫瘍重量もまた、Ａｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃ処置マウスの方が低かった（図１１ｂ）。Ａｄ−ＰＰＥ１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃが注射されたマウスはその腫瘍の顕著な壊死を示した（図１１ｃ）。
【０１０８】
本発明がその具体的な実施形態とともに記載されているが、多くの代替および改変および変化が当業者には明かであることはいうまでもないことである。従って、本発明は、添付された請求項の精神および広い範囲に含まれるすべてのそのような代替および改変および変化を包含するものとする。本明細書中で言及されているすべての刊行物および特許および特許出願およびそのアクセション番号により識別される配列は、個々の刊行物または特許または特許出願またはそのアクセション番号により識別される配列のそれぞれが、参考として本明細書中に組み込まれることが具体的かつ個々に示されていたかのようにそれと同じ程度に、本明細書内への参照により本明細書中にその全体が組み込まれる。さらに、本明細書中におけるいずれかの参照事項の引用または同一化は、そのような参照事項が本発明に対する先行技術として利用できるということの許可として解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１ａ】ＴＮＦＲ１の細胞外領域ならびにＦａｓの膜貫通領域および細胞内領域から構築され、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローン化されたＦａｓキメラ遺伝子（ａ）の概略図である。
【図１ｂ】ＴＮＦＲ１の細胞外領域ならびにＦａｓの膜貫通領域および細胞内領域から構築され、アデノウイルスベクターにクローン化されたＦａｓキメラ遺伝子（ｂ）の概略図である。
【図２ａ】プロアポトーシス遺伝子（ＦａｓキメラおよびＴＮＦＲ１）のアポトーシス活性を例示する。図２ａには、ｐｃＤＮＡ−３−ＴＮＦＲ１（下段パネル）またはコントロール空ベクター（上段パネル）のいずれか、およびＧＦＰをコードする発現ベクターでトランスフェクションされたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）が例示される。
【図２ｂ】プロアポトーシス遺伝子（ＦａｓキメラおよびＴＮＦＲ１）のアポトーシス活性を例示する。図２ｂには、ｐｃＤＮＡ−３−Ｆａｓ−ｃ（下段パネル）またはコントロール空ベクター（上段パネル）のいずれか、およびＧＦＰをコードする発現ベクターでトランスフェクションされた２９３細胞が例示される。トランスフェクション細胞は、蛍光顕微鏡観察を使用して可視化され、アポトーシス活性が形態学的に決定された。
【図３ａ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図３ｂ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図３ｃ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図３ｄ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図３ｅ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図３ｆ】プロアポトーシス遺伝子でトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞の電子顕微鏡観察像である。
【図４】トランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞および２９３細胞における示されたプロアポトーシス遺伝子のアポトーシス活性を定量するヒストグラムである。
【図５ａ】ＡｄＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃのＰＣＲ分析を示す。
【図５ｂ】ＡｄＰＰＥ−Ｆａｓ−ｃでトランスフェクションされたＢＡＥＣ細胞のウエスタンブロット分析である。
【図６ａ】内皮細胞のアポトーシスに対するＦａｓ−キメラの過剰発現の影響を例示する顕微鏡写真である。
【図６ｂ】内皮細胞のアポトーシスに対するＦａｓ−キメラの過剰発現の影響を例示する顕微鏡写真である。
【図６ｃ】内皮細胞のアポトーシスに対するＦａｓ−キメラの過剰発現の影響を例示する顕微鏡写真である。
【図６ｄ】内皮細胞のアポトーシスに対するＦａｓ−キメラの過剰発現の影響を例示する顕微鏡写真である。
【図７】内皮細胞に対するＡｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス特異的作用を例示するヒストグラムである。
【図８】Ｆａｓ−キメラにより媒介されるアポトーシスに対するＴＮＦα投与の用量応答作用を示す。
【図９ａ】ＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。
【図９ｂ】ＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。
【図９ｃ】ＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。
【図９ｄ】ＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。
【図９ｅ】ＴＮＦαリガンドおよびＦａｓ−ｃ受容体の共同作用により媒介される内皮細胞特異的なアポトーシスを例示する顕微鏡写真である。
【図１０ａ】内皮細胞に対するＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−ｃのＴＮＦα依存的アポトーシス作用を例示する用量応答曲線である。
【図１０ｂ】非内皮細胞ＮＳＦに対する、ＴＮＦαリガンドおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス作用を例示する。
【図１０ｃ】非内皮細胞ＮＳＦに対する、ＴＮＦαリガンドおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス作用を例示する。
【図１０ｄ】非内皮細胞ＮＳＦに対する、ＴＮＦαリガンドおよびＡｄ−ＣＭＶ−Ｆａｓ−キメラのアポトーシス作用を例示する。
【図１１ａ】Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃのインビボ抗腫瘍作用を例示する。
【図１１ｂ】Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃのインビボ抗腫瘍作用を例示する。
【図１１ｃ】Ａｄ−ＰＰＥ−１−３ｘ−Ｆａｓ−ｃのインビボ抗腫瘍作用を例示する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【国際調査報告】
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