(57)【要約】本発明は、構造ＨＣＶ抗原、該構造抗原の機能的部分又は該構造抗原のエピトープを発現する能力のある組換えＭＶＡに関する。本発明は更に、特にワクチンの形態であり本発明の組換えＭＶＡを含んだ薬剤組成物に、本発明の組換えＭＶＡを含んだ真核細胞に、及び、該組換えＭＶＡの種々の用途、例えば、組換え構造タンパク質の製造、ＨＣＶ感染及びこれによって引き起こされる疾病の治療及び予防に適した薬剤に関する。本発明は更に、組換えＭＶＡを製造するための方法及び該組換えＭＶＡによってコードされた組換えＨＣＶ構造ポリペプチド、並びに該組換えＭＶＡのＤＮＡ又はＲＮＡに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ構造抗原若しくはその機能的部分をコードする又はＨＣＶ構造抗原のエピトープをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、組換えＭＶＡ。
【請求項２】
キャプシドタンパク質コア及び／又はエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及び／又はエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の構造抗原の遺伝子をＤＮＡ配列として含むことを特徴とする、請求項１の組換えＭＶＡ。
【請求項３】
Ｅ１及びＥ２をコードする配列をＤＮＡ配列として含むことを特徴とする、請求項１又は２の組換えＭＶＡ。
【請求項４】
Ｅ２をコードする該ＤＮＡがＥ２の変異型をコードすることを特徴とする、請求項３の組換えＭＶＡ。
【請求項５】
Ｅ２の該変異型が、Ｅ２の親油性部分の少なくとも一部が除去された分泌型であることを特徴とする、請求項４の組換えＭＶＡ。
【請求項６】
該ＤＮＡ配列がＭＶＡゲノム中の非必須領域に組み込まれていることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項７】
該ＤＮＡ配列がＭＶＡゲノム中の天然に存する欠失の部分に組み込まれていることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項８】
該天然に存する欠失の部位が、欠失III又はＭＶＡゲノム中の非必須領域にある他の欠失である、請求項７の組換えＭＶＡ。
【請求項９】
該ＤＮＡ配列が、ワクシニアウイルス特異的プロモータの転写調節下に及び／又はワクシニアウイルス起源でないプロモータの調節下にあり、好ましくはエンハンサー要素等のような更なる調節配列と連結していることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項１０】
該ＤＮＡ配列が、ワクシニアウイルス特異的初期／後期プロモータＰ７．５の転写調節下にあることを特徴とする、請求項９の組換えＭＶＡ。
【請求項１１】
Ｅ１とＥ２とがヘテロ２量体を形成し得ないものであることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項１２】
上記請求項１ないし１１の１又は２以上の少なくとも１の組換えＭＶＡ及び薬剤学的に許容し得る担体及び補助薬を含む、薬剤組成物。
【請求項１３】
ワクチンの形態である、請求項１２の薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡに感染させてあることを特徴とする、真核細胞。
【請求項１５】
該細胞がニワトリ胚繊維芽細胞又は幼ハムスター腎臓細胞好ましくはBHK-21、又は抗原提示細胞好ましくは樹状細胞であることを特徴とする、真核細胞。
【請求項１６】
ＨＣＶ感染及びそれによって引き起こされる疾病、特に慢性肝疾患及び肝腫瘍の治療及び予防のための、請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの使用。
【請求項１７】
組換えＨＣＶ構造タンパク質の産生のためのワクチンの製造のための、又は該組換えタンパク質を産生する真核細胞の作成のための、請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの使用。
【請求項１８】
動物又はヒトの免疫感作のための、請求項１２又は１３の薬剤組成物の使用。
【請求項１９】
組換えＨＣＶ構造ポリペプチド又はその機能的部分の製造のための方法であって、
（ａ）請求項９又は１０の細胞を適切な条件下に培養するステップと、そして
（ｂ）組換えＨＣＶ構造ポリペプチド、その機能的部分又はそのエピトープを発現させ、単離しそして所望により精製するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２０】
組換えＭＶＡを製造するための方法であって、
（ａ）組換えＭＶＡベクターを製造するために、請求項１に規定されたＤＮＡ配列又はその機能的部分又はエピトープを、ＭＶＡベクターの非必須領域内に導入するステップと、
（ｂ）該組換えＭＶＡベクターを真核細胞に導入して該細胞中で該ベクターを増幅するステップと、そして
（ｃ）所望によりウイルス粒子を又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡを単離するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２１】
上記請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの、好ましくは単離された形態の、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶ構造抗原、該構造抗原の機能的部分又は該構造抗原のエピトープを発現する能力のある組替えＭＶＡに関する。更には、本発明は、特にワクチンの形態である薬剤組成物、及び本発明による組換えＭＶＡ，本発明の該組換えＭＶＡを含んだ真核細胞、並びに、該組換えＭＶＡの種々の応用、例えば、組換え構造タンパク質の製造のための及び、ＨＣＶ感染及びそれによって引き起こされる疾病の治療及び予防に特に適した薬剤組成物の製造のための応用、組換えＭＶＡ及び該組換えＭＶＡによってコードされた組換え構造ＨＣＶポリペプチドを製造するための方法、及び該組換えＭＶＡのＤＮＡ又はＲＮＡを、記述している。
【背景技術】
【０００２】
〔緒言〕
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科（Flaviviridae）に属する陽性鎖（positive strand）ＲＮＡウイルスである。それは、輸血後の、及び特定集団内（8, 35）における、非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な病原因子である。感染患者の70％以上が、肝硬変そして肝細胞癌へと更に進行していく危険を伴った慢性の肝炎を発症する（30, 53）。現在の治療方法は限られている（39, 40, 31, 24, 13）。多くの努力が、ワクチンを開発するために費やされており、幾つかの有望な結果が得られているが（9, 41, 22, 25）、これまでのところ、有効な及び／又は治療用のワクチンは未だ得られていない。
【０００３】
ＨＣＶ構造タンパク質、例えばウイルスキャプシドタンパク質核、及びエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２は、有望なワクチン標的である。すなわち、コア抗原は、種々のＨＣＶ遺伝子型及びサブタイプにおいて高度に保存されている（6）。ヌクレオキャプシド等のような内部抗原には、種々のモデル、例えば狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びインフルエンザウイルス等において、防御的免疫応答が伴う（14, 33, 62）。次のような種々のアプローチによって、ＨＣＶ核特異的抗体及び細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導及び検出し得る（23, 32）。対照的に、コアタンパク質は、宿主細胞のアポトーシス、転写、形質転換及び免疫提示の調節に関わる多くの調節的機能を有しているように思われる（43, 4）。組換えＥ１及びＥ２タンパク質によるチンパンジーの免疫感作は、同種のものによる攻撃に対して、おそらく中和抗体の誘導によって、防御を誘導する（9）。多くの報告によれば、Ｅ２のＮ末端に存する超可変領域（ＨＶＲ）は、重要な中和部位であり得る（20, 34, 67, 68）。
【０００４】
適当な動物モデルが無いことは、ＨＣＶ感染に対する宿主の免疫反応及びワクチン摂取による防御の評価についての研究を実質的に複雑化させている。生産性の高いＨＣＶ増幅のための効率のよいインビトロ細胞培養系が無いこと並びに感染した肝臓組織及び血液中にＨＣＶ粒子が少しの量しか存在しないことは、例えば生弱毒化又は不活性化ウイルスに基づく、より通常のワクチンの作成及び評価の障害となっていた。抗原コード配列の発現のための、生きたキャリアウイルスに基づくベクターワクチンの使用は、ＨＣＶワクチン開発において代わりのアプローチを提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＣＶ感染に対するヒト及び動物の予防及び治療に適し且つ上記の欠点を回避している新規の作用物質を提供することが、本発明の一目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、この目的は、ＨＣＶ構造抗原、ＨＣＶ構造抗原の機能的部分及び／又は該ＨＣＶ構造抗原のエピトープ好ましくは表面エピトープを発現することができるように修飾された組換えＭＶＡによって解決される。
【０００７】
本発明の好ましい具体例は、次の記述から、並びに含まれる請求の範囲から得ることができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＨＣＶ構造抗原、その機能的部分又は該ＨＣＶ構造抗原のエピトープをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＭＶＡが、ワクチンの製造に極めて適していることが示された。このことは、特に、ＨＣＶのコア抗原の産生又は同時産生がワクチンの免疫原性に影響を及ぼさないということにおいて、驚くべきことであった。正確に言うと、文献（19）は、感染した又はワクチン接種を受けた宿主における免疫応答は、複製能力あるワクシニアウイルスによって特定の仕方で抑制されることを示している。従って、ＨＣＶ構造抗原の産生のためのベクターとしてＭＶＡを使用することによってもまた、そのような免疫抑制が起こるものと想定することができる。しかしながら、予想外にも、ＭＶＡベクターの使用によれば、そのような免疫抑制は再び帳消しにされた。この、驚くべき実験的に支持された結果は、ワクチン開発、特にワクチン抗原としてのＨＣＶ抗原に基づくワクチン開発のための卓越した基礎を提供する。
【０００９】
本発明に従って用いられるウイルスベクターは、おそらく複製欠陥のために（42, 45, 60, 50）臨床使用にとって安全であることが証明されている、高度に弱毒化されたワクシニアウイルスである修飾されたワクシニアウイルスAnkara（ＭＶＡ）に基づく。ワクチンとしての組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）は、種々の異種抗原に対するＴ細胞及び抗体応答を刺激するのに効果的であること、並びに動物チャレンジモデルにおける試験において、インフルエンザ、エイズ、はしか及びマラリアを含むヒトの感染性疾患に対し防御することが証明されている（61, 3, 27, 52, 15, 59, 1）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ワクチンの製造のための組換えＭＶＡの使用がそれ自体知られているにも拘わらず、ＨＣＶ構造抗原例えばＨＣＶのコア抗原並びにＥ１及びＥ２との組み合わせにおけるワクチンの使用は、本件において自明でない。
【００１１】
ＨＣＶ構造抗原は、それら自体知られている。それらには、キャプシドタンパク質コア（Core）、エンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びエンベロープ糖タンパク質Ｅ２が含まれる。
【００１２】
ワクチンの製造のためにはＨＣＶ構造抗原を完全に発現させることは必要でないと理解されている。実験者はまた、特定の実験スケジュール及び望む結果に従って、構造抗原の一部分のみを、特に、ＨＣＶ構造抗原の天然の機能的部分又はエピトープを、発現させることもできる。例えば、機能的部分としては、ＨＣＶ構造抗原の免疫原性の部分が挙げられる。この例としては、Ｃ末端コアタンパク質領域（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸127〜190）、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１タンパク質領域アミノ酸220〜371、並びに、糖タンパク質Ｅ２のＮ末端にある超可変領域１を構成する27個のアミノ酸が挙げられる（Rehermann & Chisari 2000, Curr Top. Microbiol. Immunol 242: 299-325, Penin et al. 2001 J Viro 75: 5703-5710）。これらの構造抗原の機能的部分としては、例えば、ウイルス様ヌクレオキャプシド粒子のアセンブリーに十分であるＨＣＶコアタンパク質の124個のＮ末端アミノ酸（Kunkel et al., J. Virol 75: 2119-2129, 2001）、及び、エンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２のヘテロ２量体形成に必須の膜貫通ドメインであるＴＭＤ−Ｅ１アミノ酸350〜370又はＴＭＤ−Ｅ２アミノ酸717〜740（Op de Beeck et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 31428-31437）、又は小胞体を通過することのできるものであるそれら糖タンパク質の分泌型が挙げられる。好ましくは、これは、Ｅ１又はＥ２の膜貫通領域を、それらタンパク質がもはや膜に保持されなくなるような仕方で欠失その他の変異によって変えることにより、達成される（Michalak et al., 1997, J Gen Virol 78: 2299-2306）。
【００１３】
ＨＣＶ構造抗原のエピトープは知られている。それらには、例えば、ＭＨＣ−Ｉ制限Ｔ細胞エピトープである、コアアミノ酸２〜10、コアアミノ酸35〜44、コアアミノ酸41〜49、コアアミノ酸85〜98、コアアミノ酸132〜140、コアアミノ酸167〜176、コアアミノ酸178〜187、コアアミノ酸181〜190、Ｅ１アミノ酸220〜227、Ｅ１アミノ酸233〜242、Ｅ１アミノ酸363〜371、Ｅ２アミノ酸401〜411、Ｅ２アミノ酸489〜496、Ｅ２アミノ酸621〜628又はＥ２アミノ酸725〜733（Rehermann & Chisari 2000, Curr Top Microbiol Immunol 242: 299-325）が含まれる。更なる例としては、Ｅ１エピトープアミノ酸312〜326が挙げられる。ＨＣＶ構造抗原のエピトープはまた、それ自体知られた技術で決定でき、例えばKoziel et al., 1995, J. Clin Invest 96: 2311-2321に記載されている。
【００１４】
本発明の好ましい一具体例においては、組換えＭＶＡはＥ１及びＥ２をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。特に、Ｅ１抗原をＥ２抗原の末端を除去した形のものとを、両抗原が同時産生されるように組み合わせて用いるのが有利である。「末端を除去した」は、Ｅ２糖タンパク質の親油性部分が除去されることを意味している。組換えＭＶＡのこの具体例においては、ワクチン接種後に、Ｅ１抗原に対する細胞性免疫応答、すなわちＥ１特異的細胞障害性Ｔ細胞の誘導が、Ｅ１抗原を完全なＥ２タンパク質と共に発現する組換えＭＶＡによるワクチン接種と比較して、顕著に増大することが示された。異なったＨＣＶ構造抗原、特にＥ１及びＥ２を、単一のＭＶＡベクター上でなく、少なくとも２つのベクター上に配列することもできるものと理解される。結果的に、これもまたＨＣＶ構造抗原の同時発現をもたらす。
【００１５】
本発明によれば、変異とは、欠失、塩基の置換又は塩基の付加を意味する。化学的修飾もまた可能である。
【００１６】
組換えＭＶＡにおけるＨＣＶ構造抗原の配列は、コード配列と調節要素、例えばプロモータ及びエンハンサとの機能的連結が形成されるような仕方でなされなければならない。適切なＤＮＡクローニング技術が、当業者には利用できる。ここに例えば、Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 又はAusubel, F.M. et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NYを挙げることができる。ここに、これらの刊行物は例示として言及されている。特に、コードしているＤＮＡ配列は、ＭＶＡ−ＨＣＶベクターウイルスに感染した細胞内でポリペプチドの正しいプロセッシングがなされるような仕方で、配列及び選択がなされなければならない。
【００１７】
ＭＶＡゲノム中への外来ＤＮＡ配列の組み込みは、好ましくは、ＭＶＡの複製及び感染の能力に必須でない領域において行われる。例えば、ＭＶＡの天然の欠失部位が、組み込み部位として可能である。このウイルスのライフサイクルに本質的な影響を及ぼさないこれらの欠失部位には、欠失Ｉ、II、III、IV、V及びVIが含まれ、好ましいのは欠失II及びIIIである（Meyer, H. Sutter, G. and Mayr, A. 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038）。こうして作成される組換えＭＶＡは、感染性である、すなわち外来細胞に感染し、組み込まれたＨＣＶの外来ＤＮＡ配列を発現することができる。そのような組換えウイルスは、ＨＣＶによって引き起こされる疾患の治療又は予防のための非常に安全な生ワクチンとして適している。
【００１８】
本発明による組換えＭＶＡは、以下に一般的に記載するようにして作成することができる。詳細な記述は、実施例に見出すことができる。ＭＶＡのＤＮＡ中へのＨＣＶ構造抗原の挿入は、例えば、相同組換えにより行われ、それにおいては、挿入すべき配列はその両端に、ＭＶＡゲノム中の天然に存在する欠失部位例えば欠失II又はIIIの近くに存する配列と組換えられることができるような配列を付加される（Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396）。
【００１９】
ＭＶＡゲノム中の欠失部位、例えば欠失II又はIIIの近くに存するＭＶＡ−ＤＮＡ配列で両側を挟まれたＨＣＶ構造抗原又はその機能的部分又はエピトープを含んだＤＮＡ構築物は、相同組換えのために、ＭＶＡに感染した細胞内に導入される。挿入されたこのＤＮＡ構築物は、鎖状でも環状でもよい。好ましくは、環状ＤＮＡ分子、特にプラスミドが挿入される。
【００２０】
ＨＣＶの構造抗原をコードするＤＮＡ配列の発現のためには、そのＤＮＡ配列の転写を可能にする調節配列が必要である。そのような調節配列例えばプロモータ及びエンハンサは、それ自体知られている。それらには、例えば、ワクシニア11ｋＤａ遺伝子（ＥＰ０１９８３２８を参照）、7.5ｋＤａ遺伝子（ＥＰ０１１０３８５を参照）又は合成のワクシニアウイルス特異的プロモータ（Sutter et al., Vaccine 1994, 12:1032を参照）も含まれる。
【００２１】
このＤＮＡ構築物は、それ自体知られている方法例えば、リン酸カルシウム沈殿法による（Graham et al., Virol. 52, 456-467, 1973; Wigler et al., Cell 777-785, 1979）、エレクトロポレーションによる（Neumann et al., EMBO J. 1, 841-845, 1982）、マイクロインジェクションによる（Graessmann, et al., Meth. Enzymology 101, 482-492, 1983）、リポソーム技術により（Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512-527, 1983）、スフェロプラスト技術により（Schaffner Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2173-2167, 1980）その他のそれ自体知られている方法で、トランスフェクションする過程でＭＶＡ感染細胞内に挿入することができる。好ましくは、リン酸カルシウム法が用いられる。
【００２２】
ＤＮＡ構築物を真核細胞中に入れ、続いてＨＣＶのＤＮＡをウイルスのＤＮＡと組換えた後、組換えＭＶＡは、それ自体知られた仕方で、好ましくはマーカー遺伝子という手段により、単離することができる（Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596, 1982: Franke et al., Mol. Cell. Biol. 1918-1924, 1985, Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 3403-3409, 1985, Fathi et al., Virology 97-105, 1986）。
【００２３】
本発明に従って作成されたＭＶＡはまた、マーカー遺伝子を担持していてもよい。そのようなマーカー遺伝子は、それ自体知られた方法による組換えウイルスの単離を容易にする。そのようなマーカー遺伝子はそれ自体が知られており、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、アルコールデヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼ、ピューロマイシン、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ヒグロマイシン、分泌型アルカリ性ホスファターゼ又は緑及び青色蛍光タンパク質のような、タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
【実施例】
【００２４】
本発明の組換えウイルスを作成する他の方法、例えば、以下の実施例により詳細に記述されるクローニング法等も可能であるものと理解される。
【００２５】
〔ウイルスの増殖及び精製〕
ＭＶＡウイルスの増殖
ＭＶＡウイルスは、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）培養上での一連の長期継代によってワクシニアウイルス株Ankara（ＣＶＡ）から導かれた高度に弱毒化されたワクシニアウイルスである。ＭＶＡ株の産生の歴史、特徴及び用途に関する一般的概説については、Infection 3, 6-14 [1975]中にMayr et al.によって発行された要約を参照することができる。ＣＥＦ中での弱毒化のために、ＭＶＡウイルスは、この鳥類宿主細胞中で高い力価を以って複製する。しかしながら、哺乳類細胞中では、ＭＶＡの増殖は、強く阻害され、典型的なプラーク形成は検出されない。このため、ＭＶＡウイルスはＣＥＦ細胞上で増殖させた。ＣＥＦ細胞の調製のために、インキュベートされているニワトリの卵からの11日齢の胚を単離し、両端部を除去し、0.25％のトリプシンよりなる溶液中で、37℃にて20分間胚をホモジナイズして解離させた。得られた細胞懸濁液を濾過し、細胞をSorvall RC-3B遠心機中で2000ｒｐｍにて５分間室温で遠心することにより沈降させ、10倍量の培地Ａ（ＭＥＭイーグル、例えばLife Technologies GmbH, Eggenstein, ドイツより入手可能）に再懸濁させ、再びSorvall RC-3B遠心機中で2000ｒｐｍにて室温で沈降させた。細胞ペレットを10％牛胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（100単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（100ｍｇ／ｍｌ）及び２ｍＭのグルタミンを含有するＲ培地Ａに、500000個／ｍｌを含有する細胞懸濁液が形成されるように再懸濁させた。こうして得られたＣＥＦ細胞を、細胞培養皿に播いた。これらを、培地Ａ中でＣＯ2インキュベータ内で１〜２日37℃にて所望の細胞密度に増殖させ、そのまま又は更なる継代の後に感染に使用した。基本培養物の調製のための詳細な記述は、R.I. Freshneyの書籍"Cultures of animal Cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983]第11章第99頁に見出すことができる。
【００２６】
感染させるためにＭＶＡウイルスを次のようにして使用した。ＣＥＦ細胞を、175ｃｍ2の細胞培養フラスコ中で培養した。90〜100％コンフルエントとなったとき、培地を除去し、培地Ａ中で、ＭＶＡウイルス懸濁液（細胞あたり0.01感染単位（ＩＵ）、0.02ｍｌ／ｃｍ2）と共に細胞を１時間インキュベートした。次いで、培地Ａを追加し（0.2ｍｌ／ｃｍ2）、フラスコを37℃にて２〜３日インキュベートした（約90％の細胞が細胞病原性効果を呈するまで）。細胞単層を掻き取って培地に入れることにより、そしてSorvall RC-3B遠心機中で3000ｒｐｍで５分間４℃にて遠心して細胞をペレット化することにより、生のウイルス株調製物を調製した。この生のウイルス調製物を−20℃にて更なる処理（例えば、ウイルスの精製）まで保存した。
【００２７】
ウイルス精製
可能な限り純粋で且つ宿主細胞に特有の成分を含まないウイルス調製物を得るために行った精製ステップは、Joklikによって記述されたところ（Virology 18, 9-18[1962]）に類似したものであった。−20℃にて保存しておいた生のウイルス株調製物を解かし、ＰＢＳ（沈降物体積の10〜20倍）中に一旦懸濁させ、懸濁液を上記と同様に遠心した。この新たな沈降物を10倍量のトリス緩衝液１（10ｍＭトリス塩酸、ｐＨ9.0）に懸濁させ、細胞残滓を更に減らし且つウイルス粒子を細胞材料から遊離させるために、懸濁液を超音波で短時間処理した（Labsonic, L.B. Braun Biotech International, Melsungen, ドイツ；室温60Ｗにて10秒２回）。核及びこれより大きな残滓は、引き続き懸濁液をく短く遠心することで除去した（Sorvall GSAロータ、入手可能先DuPont Co., D-6353 Bad Nauheim, ドイツ、10℃及び3000ｒｐｍで３分）。再び、沈降物をトリス緩衝液１に一旦懸濁させ、上記のようにして超音波処理し遠心した。ウイルス粒子を含まない回収上清を合わせ、10ｍＭトリス塩酸、ｐＨ9.0中の36％ショ糖10ｍｌよりなるパッド上に積層し、Beckman SW 27/28ロータ中で80分間、13500ｒｐｍで４℃にて遠心した。上清を捨て、ウイルス粒子を含んだ沈降物を10ｍｌの１ｍＭトリス塩酸、ｐＨ9.0中に採取し、超音波による短い処理によりホモジナイズし（上記装置、室温にて10秒２回）、更なる精製のために20〜40％ショ糖勾配にかけた（１ｍＭトリス塩酸中ショ糖、ｐＨ9.0）。この勾配で、50分間Beckman SW41 ロータ中13000ｒｐｍで４℃にて遠心した。遠心後、ウイルス粒子を含んだ分離したバンドを、該バンドより上の液量を吸引した後に、ピペッティングにより収穫した。得られたショ糖溶液を３倍量のＰＢＳで希釈し、ウイルス粒子を再び遠心により沈降させた（Beckman SW27/28, ４℃にて13500ｒｐｍで60分間）。今や主として純粋なウイルス粒子よりなるペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、平均１〜５×109ＩＵ／ｍｌに対応するウイルス濃度となるように平衡化させた。この精製されたウイルス原液を−80℃にて貯蔵し、そのまま又はＰＢＳで希釈して、次の実験のために使用した。
【００２８】
修飾したワクシニアウイルスAnkara（ＭＶＡ）は、限定された宿主スペクトルを有する高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株であるが、ヒト由来の細胞及び研究された他の殆どの哺乳類細胞株において増殖することができない。しかしながら、ウイルス遺伝子の発現は非許容性細胞中でも影響を受けないことから、組換えＭＶＡは、例外的に安全で効果的な発現ベクター及び組換えワクチンとして使用することができる。
【００２９】
こうして、本発明の一具体例において、ワクシニアウイルスの初期／後期プロモータＰ７．５の調節下にＨＣＶ構造抗原を発現することができるＭＶＡウイルスが構築された。
【００３０】
ＨＣＶ構造抗原を発現するこの組換えＭＶＡウイルスは、例えば、癌患者において免疫療法のために免疫感作の目的で使用することができる。
【００３１】
更には、ＨＣＶ構造抗原を発現するこの組換えＭＶＡウイルスは、免疫療法のためのヒトへの免疫感作のために、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ及びＢ細胞と組み合わせて使用することができる。
【００３２】
更には、この組換えＭＶＡウイルスは、免疫療法のためにヒトに投与することのできる免疫エフェクター細胞の形成のために、生体外（ex vivo）で抗原提示細胞例えば樹状細胞と組み合わせて使用することができる。
【００３３】
この組換えＭＶＡウイルスは、組換えによるＨＣＶ構造タンパク質の製造のために更に使用することができる。
【００３４】
本発明の組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、ワクチン又は治療剤の製造のために薬剤学的に許容し得る形態へと変形される。ここに、水痘の予防接種に用いられるＭＶＡワクチンの製造においてなされた経験（Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392に記載されているような）から利益を得ることができる。通常、100ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中約106〜108個の組換えＭＶＡ粒子が、アンプル中、好ましくはガラスアンプル中で、２％のペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下に凍結乾燥される。凍結乾燥物は、非経口投与に適した希釈剤（マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、乳糖又はポリビニルピロリドン等）又は他の補助薬（抗酸化剤、安定化剤等）を含有することができる。次いで、ガラスアンプルを閉じ、好ましくは−20℃未満で数ヶ月貯蔵することができる。
【００３５】
予防接種又は治療のために、凍結乾燥物は、0.1〜0.5ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩溶液中に溶解させ、非経口的に例えば筋肉内ワクチン接種により、又は局所的に例えば皮内ワクチン接種により、又は腫瘍内への又は腫瘍部位へのワクチン接種によって、投与することができる。本発明のワクチン又は治療剤は、好ましくは筋肉内投与される（Mayr, A. et al., [1978] Zbl. Bakt. Hyg., . Abt. Orig. B 167, 375-390）。投与経路、投与量及び投与回数は、既知の仕方で当業者により最適化されることができる。外来抗原に対する適切な免疫を獲得するためには、より長期間にわたってワクチンを投与するのが適当であり得る。
【００３６】
本発明はまた、組換えＭＶＡウイルスに感染した真核細胞をも含む。それらには、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞、幼ハムスター腎臓細胞、好ましくはＢＨＫ−２１細胞、又は抗原提示細胞例えば樹状細胞、マクロファージ又はＢリンパ球が含まれる。
【００３７】
組換えＭＶＡウイルスは、上記のようにして、より詳細には、ＨＣＶ感染及びそれによって引き起こされる疾病特に慢性肝疾患及び肝腫瘍の治療及び予防のために使用できるワクチンの製造のために使用される。当然、組換えウイルスという手段により、組換えＨＣＶ構造タンパク質も産生され、単離及び精製を経て純粋な形で得られる。本発明によれば、組換えＨＣＶタンパク質は、ＨＣＶ構造抗原を意味し、この語はまた、ＨＣＶ構造抗原の機能的部分又はエピトープ、特にＨＣＶ構造抗原の表面エピトープをも包含する。
【００３８】
本発明は、組換えＭＶＡのＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。
【００３９】
以下において、本発明は、実施例を参照して更に詳細に記述されている。しかしながら、本発明は、当該特定の具体例に限定されず、添付の請求の範囲との組み合わせて明細書の範囲内において、変更することができる。
【００４０】
添付の図は、本発明、特に実施例を更に理解するのに役立つ。
【００４１】
〔材料及び法法〕
〔細胞株及びウイルス〕
初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、幼ハムスター腎臓BHK-21（ATCC CCL-10）、ウサギ腎臓RK-13（ATCC CCL-37）及びマウスP815（H-2d, ATCC TIB64）細胞を、最少必須培地（ＭＥＭ）又はＲＰＭ１６４０倍地で、10％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充して増殖させた。細胞は、５％ＣＯ2の湿った空気という雰囲気で37℃にて維持した。
【００４２】
ワクシニアウイルスＭＶＡ（クローニングした単離物、F6, 45, 60）を、日常的に増殖させ、感染単位（ＩＵ）／ｍｌを決定するために、その力価を、ＣＥＦ中でワクシニアウイルス特異的免疫染色によって検出した。この研究には、582番目のＣＥＦ継代からのウイルスを用いた。ワクシニアウイルスＭＶＡ特異的中和抗体を定量するために、Ｅ．coliのlacZレポータ遺伝子（60）をコードする組換えウイルスＭＶＡ−ＬＺを、プラーク減少アッセイにおいて用いた。
【００４３】
〔プラスミド構築物〕
ＨＣＶ構造遺伝子を含んだＭＶＡベクタープラスミドの構築のために、Y. Wangから入手したＨＣＶ−ｃＤＮＡ（北京大学、GeneBank Accession number D10934, 63, 38）をクローン化したもののＤＮＡ断片を調製した。EcoRIとHindIIIによるpUC18/CE1E2の切断によりＨＣＶアミノ酸１〜742のコード配列を含んだＤＮＡ部分を得、平滑末端の形成のためにクレノウポリメラーゼで処理し、pIIIdHR-P7.5の唯一のPmeI部位にクローン化して、pIIIdHR-P7.5-HCV(1-742)を得た。
【００４４】
ＭＶＡベクタープラスミドpIIIdHR-p7.5-HCV(1-661)及びpIIIdHR-P7.5-HCV(151-661)を得るために、ＨＣＶアミノ酸１〜661又はアミノ酸151〜651をコードするＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同じＨＣＶ−ｃＤＮＡマトリックスから増幅し、そこでは次のオリゴヌクレオチドを使用した：HCV-5'-1 5'-CAT GGG AAT TCC CAT GAG-3', HCV-5'-151 5'-GGC GCT GCG AAT TCC ATG GCG CAT GGC GTC CGG-3' 及び HCV-3'-661 5'-GGG GGG GAA TTC TCA CTC TGA TCT ATC CCT GTC-3'（EcoRI部位に下線を引いてある）。ＰＣＲ産物を、EcoRIで切断し、クレノウで平滑末端化してpIIIdHR-P7.5のPMEI部位にクローニングした。
【００４５】
〔組換えウイルスの形成〕
６個のウェルを備えた組織培養プレート（Corning, Corning, NY, アメリカ合衆国）中のほぼコンフルエントなBHK-21細胞の単層にＭＶＡを、細胞あたり0.01感染単位の多重度で感染させ、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Molecular Biochemicals Mannheim, ドイツ）により、メーカーの説明書に従って、ウェルあたり1.5μｇのプラスミドＤＮＡで感染後90分間形質転換させた。感染の24時間後、細胞を収穫し、記載に従って、ｒＭＶＡの単離のために宿主細胞スペクトルの一過性の拡張（58）を選択することによって処理した。組換えウイルスは、RK-13細胞単層中における典型的な感染巣の形成があった後に見られた。RK-13細胞は、非経口ＭＶＡの生産的増殖を支持しなかった。RK-13細胞におけるプラーク精製の３回の増殖サイクルの後、ｒＭＶＡをBHK-21細胞を経由させて選択可能マーカー遺伝子K1Lを除去した。ウイルスの出発材料をBHK-21細胞中で調製し、ショ糖パッドによる２段階の超遠心によって精製し、ワクシニア特異的免疫染色によってＣＥＦ細胞上で力価を測定し、小分けして−80℃にて貯蔵した。
【００４６】
〔組換えタンパク質の分析〕
BHK-21細胞の単層を、細胞あたり10感染単位のｒＭＶＡに感染させた。感染24時間後に細胞を収穫し、遠心により集め、ＳＤＳゲルローディング緩衝液（50ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ6.8、２％ＳＤＳ、0.04％ブロムフェノールブルー、84ｍＭのβ−メルカプトエタノール、20％グリセロール）中で溶解させた。総細胞タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース上にエレクトロブロッティングした。ブロット膜をリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）中、２％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び0.05％（Ｖ／Ｖ）Tween20で１時間ブロックし、次いで、同じＰＢＳで希釈したポリクローナルウサギ抗ＨＣＶ−Ｅ２抗体（血清 RE2116, 1:5000）、ポリクローナルウサギ抗ＨＣＶ抗体（Antigenix, Amerika Inc./BioTrade, Vienna, オーストリア、1:10000）又はモノクローナルマウス抗ＨＣＶコア抗体Ｃ１（1:5000、Ramsey C. Cheung, Stanford University School of Medicine, Stanford CA, アメリカ合衆国より拝受）と共に、４時間インキュベートした。ＰＢＳ中0.05％のTween20で洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを接合した抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ抗体（Dianova, Hamburg, ドイツ）と共に１時間インキュベートし、ブロック緩衝液で10000倍希釈し、インキュベートし、再度洗浄してLumi-Light ウエスタンブロット基質（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, ドイツ）によって可視化した。分泌された組換えＨＣＶタンパク質の調節のために、無血清optiＭＥＭ（Gibco BRL）中で増殖させたＭＶＡ感染培養からの無細胞上清を、感染24時間後に集めた。上清からのタンパク質を等量の氷冷エタノールで沈殿させ、10000×ｇ／４℃での１時間の遠心により回収し、ＰＢＳ中に再懸濁させて、ウエスタンブロット分析に付した。
【００４７】
エンドグリコシダーゼEndoH及びPNGase F（New England Biolabs,Frandfurt am Main, ドイツ）を、組換えタンパク質の脱グリコシル化に用いた。感染細胞から又は培養上清から沈殿させた総タンパク質を、メーカーの指示書に従って、１％β−メルカプトエタノールを含んだ0.5％ＳＤＳ中で、EndoH又はPNGase Fにより、100℃にて10分間又は37℃にて２時間変性させ、切断し、そしてウエスタンブロットにより分析した。
【００４８】
〔動物の免疫感作及び血清サンプルの取得〕
５匹ずつのBALB/cマウスよりなる群（６〜８週齢、Charles River, Sulzfeld,ドイツ）を、０、38および81日目に、各動物あたり１×108単位の感染性ＭＶＡ又はｒＭＶＡ（滅菌ＰＢＳ0.5ｍｌ中）で腹腔内免疫感作した。マウスは、後眼窩血管叢から−７、21、48、103及び158日目に出血させた。血液をマイクロ遠心管に集め、室温にて４時間インキュベートし、そして2700×ｇ／４℃で10分間遠心した。得られた血清は−20℃で貯蔵した。
【００４９】
〔ＥＬＩＳＡによる抗体測定〕
酵素免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、血清プローブ中におけるＨＣＶ核及びＥ２抗原に対する抗体の存在の判定のために用いた。１μｇ／ｍｌの濃度で96ウェルの平底プレート（MaxiSorp Surface, Nunc, Wiesbaden, ドイツ）をコートするために使用した抗原は、ＨＣＶ核タンパク質（アミノ酸２〜192、Bio Trade, Vienna, オーストリア）又はＥ. coli中で産生させたＨＣＶ Ｅ２タンパク質（アミノ酸450〜565）であった。アジ化ナトリウム0.02％を含んだＰＢＳに抗原を懸濁させ、ウェル当たり50μｌ播き、４℃にて終夜インキュベートした。続いて、各ウェルの内容物を除去し、0.05％Tween20を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。ブロック緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ中１％のＢＳＡ）をウェル当たり200μｌ加え、プレートを37℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロック緩衝液中の２倍連続希釈の血清サンプルを、ウェル当たり100μｌ加えて37℃にて３時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄ステップの後、ヤギ抗マウスイムノグロブリンＧ接合アルカリ性ホスファターゼ（Dianova, Hamburg, ドイツ、ブロック緩衝液で1000倍希釈）を加えて37℃にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで８回洗浄した後、ウェルをリン酸パラニトロフェニル基質（Sigma, Deisenhofen, ドイツ）で可視化した。室温にて30分間インキュベートした後、0.5ＭのＮａＯＨの添加によって反応を停止させ、マイクロプレート読取装置（Model 550, Bio Rad Laboratries, Munich, ドイツ）で405ｎｍにて吸光度を測定した。抗体力価は、カットオフの２倍の大きさの吸光度（ＯＤ）をもたらす２倍連続希釈物として計算した。カットオフ値は、非組換えＭＶＡでワクチン接種した対照マウスからの血清の平均ＯＤと見積もった。
【００５０】
〔ＭＶＡ特異的抗体応答の分析〕
ワクシニアウイルスＭＶＡ特異的抗体は、組換えＭＶＡ−ＬＺを用いたプラーク減少試験によって分析した。免疫感作したマウスからの２倍連続希釈物を、全量200μｌのＰＢＳ中において200単位の感染性ＭＶＡ−ＬＺと反応させ、37℃にて３時間インキュベートした。その後、コンフルエントのBHK-21単層を、ダブルアプローチにおいてインキュベートし、ワクチン接種48時間後に、ウイルス感染した細胞よりなる病巣を、上述のようにして（16）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド基質（X-Gal, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, ドイツ）による染色によって可視化した。青色染色された病巣をカウントし、各血清について得られえた個数を、免疫感作前の血清又は無血清の対照と比較した。抗体は、病巣数の50％減少をもたらした２倍連続希釈物として計算した。
【００５１】
〔脾臓細胞培養及び細胞障害性試験〕
この方法は、本質的に、以前に記載したようにして（5）行った。マウスに対する最後のウイルスワクチン接種の12週後に得られた脾臓細胞を、インビトロ応答細胞として用いた。５×106個の細胞を、10％のＦＣＳ、25μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したRPMI1640培地中で、５μｇ／ｍｌのＥ１ペプチド（ＨＣＶアミノ酸312〜326）の存在下に増殖させた。２日目に、培養液に10％ＴＣＧＦを加えた。７日後にエフェクター細胞を収穫し、51Ｃｒ遊離試験を用いて、特異的細胞毒性について試験した。１×106個のP815又はＴ２標的細胞を、200μｌのRPMI／10％ＦＣＳ中で75μＣｉのＮａ51ＣｒＯ4と共に37℃にて１時間インキュベートした。RPMI／10％ＦＣＳで細胞を洗浄し、５μｇ／ｍｌのＥ１ペプチド（ＨＣＶアミノ酸312〜326）又は１μｇ／ｍｌのA/PR/8/34−インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質Ｍ１ペプチドと共に、37℃にて30分間３回インキュベートした。96ウェルのプレート中で37℃にて５時間、応答細胞及び標的細胞を種々の比率で同時培養した。遊離した51Ｃｒ量を測定するために、30μｌの上清を収穫した。全てのサンプルをTopCount NXT（Packard, Downers Grove, イリノイ州）中でカウントし、特異的遊離のパーセンテージを次のようにして計算した：〔（実験的遊離−自発的遊離）／（総遊離−自発的遊離）〕×100。遊離は、分当たりのカウント数として測定した。試験はダブルアプローチで行った。再刺激のためには、非免疫感作BALB/cマウスから得られ10μｇ／ｍｌのＥ１ペプチド（ＨＣＶアミノ酸312〜326）と共に２時間インキュベートした５×106個の照射（3000ｒａｄ）した脾臓細胞を、１×106個のエフェクター細胞に加えて、10％ＦＣＳ、25μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン及び10％ＴＣＧＦを補充したRPMI培地中で７日間増殖させた。
【００５２】
〔結果〕
〔ＨＣＶ−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２遺伝子の発現のためのｒＭＶＡの設計及び単離〕
従来の研究は、ワクシニアウイルスＫ１Ｌ遺伝子の一過性発現に基づいて宿主域の選択を可能にするベクタープラスミドによる、ｒＭＶＡの適切な作成及び単離を示していた（58）。上述の新規の技術の使用のために、ＨＣＶ標的遺伝子配列を、ＭＶＡベクタープラスミドpIIIdHR-P7.5中にクローン化した。得られたプラスミドpIIIdHR-HCV/1-742, pIIIdHR-HCV/1-661及びpIIIdHR-HCV/151-661は、ポリタンパク質のアミノ酸１〜742、１〜661又は151〜651をコードするＨＣＶ−ｃＤＮＡを含むものであった。ｒＭＶＡは、ＭＶＡに感染しpIIIdHR-HCV/1-742、pIIIdHR-HCV/1-661又はpIIIdHR-HCV/151-661でトランスフェクトされたBHK-21細胞中で形成された。感染細胞溶解液の連続希釈物を、選択可能マーカー遺伝子Ｋ１Ｌの一過性発現時に組換えウイルスの選択的増殖を可能にするRK-13細胞に播いた。RK-13細胞上での３回のクローニング継代の後ｒＭＶＡのみが検出可能となり−これはウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析で確認された（データ示さず）−そして、このウイルス単離物を、BHK-21細胞中でのプラーク形成で更に精製した。該細胞中でのｒＭＶＡの増殖はＫ１Ｌ遺伝子発現からは独立であり、ウイルスゲノム中でＫ１Ｌ遺伝子を両側から挟んでいる反復的ＤＮＡ配列の間への相同組換えによって該マーカー遺伝子の喪失が起こった（図１Ａ）。BHK-21細胞を介した数回の継代の後、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析は、ウイルスゲノムは、安定に組み込まれたＨＣＶ標的遺伝子配列を含むがＫ１Ｌ遺伝子はもはや含まないことを明らかにした（図１Ｂ）。得られたウイルスＭＶＡ−ＨＣＶ／１〜742、ＭＶＡ−ＨＣＶ／１〜661及びＭＶＡ−ＨＣＶ／151〜661の増幅及び精製により、高力価のウイルス調製物が得られ、これを更なる分析に用いた。
【００５３】
〔ｒＭＶＡ感染後のＨＣＶタンパク質の合成〕
形成されたｒＭＶＡは、ベクターワクチン候補としては、ＨＣＶ抗原の放出について及び免疫的特徴づけのために試験しなければならないことから、組織培養感染中でのＨＣＶタンパク質の産生を完全に決定するべきである。感染24時間後に収穫されたＢＨＫ２１細胞溶解液のＳＤＡ ＰＡＧＥ分析及びイムノブロットによって示されているように、コア、Ｅ１及びＥ２タンパク質という異なったコード配列を含んだｒＭＶＡの全てが、ＨＣＶ構造タンパク質の合成を調節した（図２Ａ，Ｂ）。ＨＣＶコアタンパク質に対して作られたモノクローナル抗体は、MVA-HCV/1-742又はMVA-HCV/1-661感染細胞中で作られた約21ｋＤａコアタンパク質の等量を特異的にもたらしたが、MVA-HCV/151-661又は非組換えＭＶＡに感染させたときにはそのようなタンパク質バンドは検出されなかった（図２Ａ）。後の時間において、そしてコアタンパク質の増大と共に、第２の23ｋＤａのタンパク質バンドが検出できた。ＨＣＶエンベロープタンパク質の合成は、Ｅ２特異的ポリクローナルウサギによって制御された。図２Ｂによれば、３種の組換えウイルスの全てがＥ２ポリペプチドを形成し、それらは、MVA-HCV/1-742については約60ｋＤａの、そしてMVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/151-661については約50ｋＤａの分子量を有するタンパク質とて可視化された。後者のウイルスは両者共に、Ｃ末端を除去したＥ２配列を有するＨＣＶポリタンパク質の発現カセットを含んでいる。より小さい数種の他のタンパク質バンドもポリクローナル血清で染色され、それらは、野生型ＭＶＡに感染させた細胞からの対照溶解液にも検出されたことから、おそらくＨＣＶをコードしないタンパク質であろう
【００５４】
更には、ｒＭＶＡ感染におけるＨＣＶタンパク質合成の反応動力学を制御すべきである。我々は、BHK-21細胞の単層複数を、細胞当たり10感染単位のMVA-HCV/1-742に同時に感染させ、感染後２日の期間中の数個の時点においてウェスタンブロット用に細胞溶解液を調製した（図２Ｃ，Ｄ）。既に感染４時間後には、ＨＣＶコアタンパク質の合成が検出でき（図２Ｃ）、これに対して、最初の組換えＥ２タンパク質は感染８時間後に明らかに出現した（図２Ｄ）。両組換えタンパク質の量は、感染後24時間の期間中に明瞭に増加した。野生型ＭＶＡに24時間感染させた細胞の溶解液を、陰性対照とした。
【００５５】
〔ｒＭＶＡにより作成した細胞結合型及び分泌型Ｅ２抗体の分析〕
放出される抗原の転写後調節は、免疫原性と防護能力に実質的影響を及ぼし得る。ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２は、グリコシル化によって高度に修飾されており、おそらく、カルボキシ末端の疎水性のアンカードメインを有する１型膜貫通糖タンパク質であろう。Ｅ２膜貫通アンカーの除去は、Ｅ２細胞外ドメインの分泌をもたらす（概説は17を参照）。哺乳類細胞の感染では、真核細胞のＭＶＡ発現系は、組換えタンパク質の真正の転写後修飾をもたらし得る。このプロセスの制御のため、ｒＭＶＡへの感染中に合成されたＥ２タンパク質が、生化学的に特徴付けられた。BHK-21細胞をMVA-HCV/1-742、MVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/151-661に感染させた。感染細胞からの総細胞溶解液（図３Ａ）又は上清の沈殿物（図３Ｂ)をPNGase Fで処理し、ポリクローナル抗Ｅ２抗血清を用いてウエスタンブロットにより分析した。細胞溶解液中の約60ｋＤａ（MVA-HCV/1-742）又は約50ｋＤａ（MVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/155-661）のＥ２タンパク質を、グリコシル化されていないＥ２のペプチド骨格に対応する約33ｋＤａ（全長Ｅ２）又は31ｋＤａ（末端除去Ｅ２）のサイズへと、それぞれ減少させた（図３Ａ）。分泌型Ｅ２は、膜貫通ドメインにおいて末端除去したＥ２を産生する組換えウイルスMVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/151-661への感染後にのみ、検出された。分泌型Ｅ２は、見かけの分子量約75ｋＤａを有する細胞結合型Ｅ２よりも高度に修飾されている。PNGawe Fによる処理で、このタンパク質もまた、末端除去されたＥ２ペプチド骨格に対応する約31ｋＤａのサイズへと縮小されるであろう。次のステップにおいて、分泌型Ｅ２タンパク質におけるグリコシル化の型を更に特徴づけした。細胞をMVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/151-661に感染させ、感染細胞の細胞溶解液又は上清をエンドグリコシラーゼＨで処理した（図４）。しかし、約50ｋＤａから約32ｋＤａへの分子量減少によって検出されたところでは、細胞内Ｅ２はEndoHに感受性であったが（図４Ａ）、分泌型Ｅ２は影響を受けなかった（図４Ｂ）。PNGase F切断したＥ２バンドは、Endo H切断した対応するバンドより分子量が低く、これは後の酵素が、切断後にAsnの側鎖にGlcNAc基を残すからである。この観察結果は、Ｃ末端除去Ｅ２のゴルジ装置の通過中における、より複雑なグリコシル化に対応している。
【００５６】
〔ｒＭＶＡによるマウスのワクチン接種は、ＨＶＣ及びワクシニアウイルスに特異的な免疫応答を引き起こす〕
ワクシニアウイルス組換え体によるＨＣＶコアタンパク質の産生は、マウスにおいて免疫抑制を媒介することが知られていることから（36）、今や、種々のｒＭＶＡワクチンの免疫感作性をマウスで試験した。加えて、我々のｒＭＶＡワクチンのうち２種によって産生された全長ＨＣＶコアタンパク質による免疫応答の可能な調節を測定するべきである。こうして、ＨＣＶ−Ｅ１及び−Ｅ２抗原に対するＨＣＶ特異的な液性又は細胞性応答を分析した。組換え型又は野生型ＭＶＡ ＭＣＶ−Ｅ１によるBALB/cマウスの３回にわたる腹腔内免疫感作の後、Ｅ１（312-326）−BALB/c−エピトープに対する特異的ＣＴＬ応答を検討した。Ｅ１ペプチドで刺激したとき、MVA/HCV/151-661又はMVA-HCV/1-661で免疫感作した動物から得られた脾臓細胞は、Ｅ：Ｔ比９：１で75％のＥ１特異的溶解を示し、MVA-HCV/1-742で免疫感作した動物から得られた脾臓細胞は、47％の特異的溶解を示した（図５）。Ｃ末端除去したＥ２タンパク質を発現するｒＭＶＡで免疫感作したマウスの脾臓細胞との培養では、より高いＥ１特異的溶解が観察された。
【００５７】
ＨＣＶのＥ２タンパク質に対する抗体応答について、同じBALB/cマウスの血清サンプルをＥＬＩＳＡにより更に検討した（図６）。平均力価１：2512（MVA-HCV/151-661）、1:933（MVA-HCV/1-661）及び1:176（MVA-HCV/1-742）のＥ２特異的抗体が検出された。群間の差は統計学的には有意でなかったものの、より高い量の抗Ｅ２抗体が、MVA-HCV/151-661で免疫感作した動物に見出された。
【００５８】
ＨＣＶコアタンパク質は、既に述べたように、免疫調節機能を示す。今や、MVA-HCV/151-661注射マウスの一層高い抗Ｅ２抗体応答を、同ウイルスにおけるコアタンパク質の大きな末端除去に帰すことができるか否かを検討した。ＨＣＶ核もワクシニアウイルスＭＶＡ特異的な免疫応答の誘導を調節することが期待された。こうして、ＥＬＩＳＡに用いたのと同じマウスの血清中のＭＶＡ中和抗体の量を測定した。表１によれば、全長又は末端除去コアタンパク質を発現する組換え又は野生型ＭＶＡで免疫感作した群間において、抗ＭＶＡ抗体応答に差はなかった。
【００５９】
〔実験の要約〕
これまでの実験は、一連の動物モデル系において、ウイルス抗原を放出する組換えＭＶＡワクチンの免疫原性及び防御的効果のためのデータを確立している（61, 29, 27, 64, 44, 59）。しかしながら、依然として、ＨＣＶ感染に対するワクチンに対する緊急の需要があり、適切な免疫原性と可能な防御能力とを有するワクチン候補を同定する必要があった。ＨＣＶ抗原の産生についてのＭＶＡの適切性についての検討のため、構造タンパク質Ｅ１−Ｅ２をコードするＨＣＶ遺伝子配列の発現カセットを挿入した一連のｒＭＶＡを構築した。我々は、全長ＨＣＶキャプシド／コアタンパク質を有する若しくは有しない、ＨＣＶ−Ｅ１−Ｅ２エンベロープタンパク質又は分泌型Ｅ２抗原を産生するように設計された、組換えＭＶＡの特徴の決定を望んだ。ｒＭＶＡの作成と単離は、一過性の宿主範囲−遺伝子選択にあり（58）、この技術は、比較試験のために数種のＭＶＡベクターウイルスを調製しなければならないときに特に適していることを示した。ワクシニアウイルスの初期／後期プロモータP7.5の調節下に異なったＨＣＶコード配列を発現する組換えＭＶＡは、容易に得られ、始めの実験は、全ての構築物が同様な量のＨＣＶ構造タンパク質を対応する仕方で産生することを示した。
【００６０】
ＨＣＶコア配列は、ウイルスゲノム中で最も高度に保存されている領域の一つであり、異なったＨＣＶ遺伝子型のウイルスに及び、コアタンパク質を、免疫感作のための抗原の一つとして興味深いものとしている（6, 57, 7）。しかしながら、コアをワクチン候補に含めるのは、極めて疑問である。なぜならその多機能的特徴は、宿主細胞のアポトーシス、転写、形質転換及び免疫提示の調節に関与している可能性があるからである（43, 4）。組換えＭＶＡによるポリタンパク質アミノ酸１〜742及び１〜661をコードするＨＣＶ配列の発現は、第一に、21ｋＤａのコアタンパク質の合成をもたらす（図２Ａ）。組換えタンパク質の産生量の増加を伴った感染の後期になって初めて、23ｋＤａサイズの第２のコア特異的タンパク質バンドを見ることができた。この23ｋＤａのタンパク質は、おそらく、最初のポリタンパク質切断で生じた191個のアミノ酸を有する未成熟のコアタンパク質であろうが、これに対して21ｋＤａのタンパク質は、おそらく、ウイルス粒子に存在する成熟コアタンパク質であろう（28, 26, 51, 55, 66）。上記データは、ＭＶＡ−ＨＣＶベクター感染細胞におけるコアポリペプチドの効率的な初期合成及びプロセッシングを示している。
【００６１】
MVA-HCV/1-742による感染の後、約60ｋＤａのＥ２タンパク質の合成が確認され、これは厳格に細胞結合性であった（図２Ｂ）。細胞培養上清中における75ｋＤａのＣ末端除去Ｅ２タンパク質の増幅は、ＨＣＶ感染細胞における分泌経路の機能性を示唆した。MVA-HCV/1-661及びMVA-HCV/151-661によって産生される細胞結合型の及び分泌型の末端除去Ｅ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる比較は（図３ＡＢ）、分泌型の方が遅く移動することを示した。これはグリコシル化が異なることによるものであった。従って、両Ｅ２タンパク質は、PGNAseによる脱グリコシル化の後は、同じレベルで移動した。更には、分泌型Ｅ２は、エンドグリコシダーゼＨによる処理に対して感受性がなく、このことは、ゴルジ装置による輸送中に複雑な糖類を取り込むことを明瞭に示している。しかしながら、ＨＣＶ−Ｅ１タンパク質の発現は正式には分析されなかったが、Ｅ２タンパク質はＨＣＶポリタンパク質の下流部分を形成しており、Ｅ２合成を実証したことはＥ１配列の産生を示唆するものである。この考えの正しさは、組換えＭＶＡ−ＨＣＶウイルスによるワクチン接種後のＥ１特異的Ｔ細胞応答の検出によって確認された。
【００６２】
これらのワクチンの免疫原性を比較試験するために、BALB/cマウスをワクチン接種して、全てのベクターウイルスによって産生されたＨＣＶエンベロープタンパク質に直接向けられた免疫応答について検討した。エンベロープ抗原については、Ｅ１及びＥ２特異的ＣＴＬが、ＨＣＶ感染したヒト及びチンパンジーの肝臓及び抹消血中に存在する（Walker 1996, Sem. Virol.）。ＨＣＶ感染チンパンジーにおける免疫応答の研究の、より最近のデータは、ＣＤ８＋ＣＴＬに、感染の急速な停止が伴うことを示唆している（12）。長期持続ＣＴＬの細かな特異性分析は、ＨＣＶタンパク質の９個の異なったエピトープＥ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ５ａを明らかにし、そのうちの４個のエピトープがＥ１／Ｅ２配列中に存在している。Ｅ１エピトープ312-326は、ワクチン接種したBALB/cマウスからの脾臓細胞のインビトロ再刺激のために成功裏に用いられ、３種の全てのｒＭＶＡワクチンによって誘導されるエピトープ特異的ＣＴＬが検出された。興味深いことに、Ｅ１特異的ＣＴＬは、最後の免疫感作の１２週より以後にも検出可能であった。このことは、長期にわたる免疫感作が、長期間持続する（記憶相）Ｅ１特異的Ｔ細胞応答を誘導することを示唆している。
【００６３】
ＨＣＶコアタンパク質の同時合成は、Ｅ１特異的ＣＴＬ応答の誘導には影響を及ぼさなかったが、しかし、Ｃ末端除去分泌型Ｅ２タンパク質を産生するベクターウイルスによる免疫感作は、より高いＥ１特異的細胞障害性を誘導するように思われた。糖タンパク質Ｅ１及びＥ２は複合体を形成し、それは、小胞体（ＥＲ）中で、疎水性の膜貫通配列の相互作用のために当該タンパク質のＣ末端において保持されている（10）。Ｅ２膜貫通領域の除去又は変異は、天然のＥ１−Ｅ２複合体の形成を阻害し、Ｅ１糖タンパク質の正しいフォールディングを妨げる（11, 48）。ＭＨＣ−Ｉ分子による提示のためには、Ｅ１抗原は小胞体から導かれるように思われるが、細胞質プロセッシングを必要とし（54）、インフルエンザ核タンパク質又は細胞糖タンパク質のチロシナーゼについて示唆されているように（2, 47）、おそらく欠損のある膜貫通糖タンパク質をサイトゾル内へと入れる二次的な輸出経路によるものであろう。分泌型Ｅ２を産生するベクターウイルスによる免疫感作後の一層高いＣＴＬ活性についてのこの発見から、分泌経路へ向けての末端除去されたＥ２の動員は、上記プロセッシング経路によるＥ１利用を可能にし、ＭＨＣ−Ｉに限局されたＥ１抗原の提示の増強を可能にすると推測できよう。
【００６４】
チンパンジーモデルにおける組換えＨＣＶエンベロープ抗原による予防的ワクチン接種後に達成された防護は、Ｅ２特異的抗体と相関付けられている（9）。従って、ＨＣＶ中和抗体の誘導のためのワクチン接種の抗原候補としてＥ２タンパク質に大きな注意が払われた（68, 56）。実験におけるＥ２特異的な液性免疫応答の研究の過程で、３種全てのｒＭＶＡワクチンでの免疫感作後に形成される特異的抗体が見出された。膜貫通ドメインが末端で除去された分泌型Ｅ２タンパク質を合成するベクターによってワクチン接種した動物からの血清中に、より高い抗体力価が得られた。当然、Ｅ２の分泌は、よりよい抗体応答を誘導し得るが、これに対して、細胞内に保持される複合体の形成のための全長のＥ１及びＥ２タンパク質の相互作用は、重要なエピトープをマスクして最適な免疫提示を妨げ得る。複製能力のあるワクシニアウイルスによって産生されるＨＣＶコアタンパク質は、宿主の免疫応答、特にワクシニアウイルス特異的免疫応答を抑制するように思われる（Large et al., 1999, J. Immunol 162: 931-938）。ここに示したワクチン接種実験において、これらのデータに対応して、最もよいＥ２特異的抗体応答は、コア抗原の不存在下に末端除去したＥ２を産生するMVA-HCV/151-661ワクチンによって誘導されるように思われた。ワクシニアウイルス特異的中和抗体応答についての付随的分析は、しかしながら、殆ど等しい量のワクシニアウイルス特異的免疫が、全てのｒＭＶＡ−ＨＣＶワクチンによって誘導されることを示した。しかしながら、全ての免疫感作試験の結果の評価は、複製欠陥ワクシニアウイルスＭＶＡを発現ベクターとしたＨＣＶコア抗原は（少なくとも本実験においては）、検出し得る効果を有しないという結論に至った。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
要約すると、この研究は、成熟したコア及びエンベロープタンパク質の効率的産生のためにｒＭＶＡが使用し得ることを証明している。更には、各ｒＭＶＡワクチンによるBALB/cマウスのワクチン接種は、同等な量のＥ２特異的抗体及び長期持続Ｅ１特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導し、ＨＣＶ感染に対する有望なワクチンとしての更なる評価のための、上記ウイルスベクターの有用性を証明している。
【００６６】
こうして、本発明によれば、ｒＭＶＡは、ＨＣＶ感染に対する有力なワクチン候補として研究された。最初のステップにおいては、ＭＶＡ感染での組換えＨＣＶタンパク質の合成を特徴づけるため、そしてワクチンとしての使用におけるそれらの免疫原性を評価するために、主要なＨＣＶビリオン構成要素をコードする全ての配列を発現するＭＶＡベクターワクチンが構築された。
【００６７】
この研究においては、ｒＭＶＡによるインビトロ感染時に産生される全長ＨＣＶ構造タンパク質の、強力な合成及び効率的な転写後成熟が検出された。ｒＭＶＡ免疫感作に対するBALB/cマウスにおけるＨＣＶ−Ｅ１及びＥ２抗原特異的液性又は細胞性免疫応答の誘導も示すことができた。全てのワクチンが、均衡のとれた量のワクシニアウイルス特異的循環抗体をもたらした。本データは、完全ＨＣＶコア抗原を含むｒＭＶＡ発現ＨＣＶ構造抗原の高い免疫原性を示唆している。
【００６８】
【表１】
2005502362.tif 000002
【００６９】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】ＨＣＶの構造タンパク質の遺伝子配列を含んだ組換えＭＶＡのゲノム構造の構築。（Ａ）制限酵素HindIIIについてのＭＶＡゲノムの概念的マップ。ＨＣＶコード配列は、ワクシニアウイルスの初期／後期プロモータＰ７．５の転写調節下にあり、相同組換えにより、ＭＶＡゲノム内の欠失部位IIIに挿入された。Flank１及びFrank２は、欠失部位IIIの近くに存するＭＶＡのＤＮＡ配列をいい、ＭＶＡゲノム中へ組換えを導くのに役立つ。Rec2は、Flank１の右端に対応する283塩基対の反復するＭＶＡのＤＮＡ配列の位置を示しており、相同組換えによって出来上がった組換えウイルスのゲノムからのK1L選択的マーカの除去を可能にする。組換えＭＶＡ−ＨＣＶ−151−661、ＭＶＡ−ＨＣＶ−１−661及びＭＶＡ−ＨＣＶ−１−742のゲノム構造の図解が下に示されている。
【図１Ｂ】欠失部位IIIに挿入された遺伝子配列の調節のためのウイルスＤＮＡのＰＣＡ分析。アガロースゲル電気泳動によって分離された、特徴的ＤＮＡ断片の増幅のためのマトリックスＤＮＡとして役立つ野生型ＭＶＡ及び組換えＭＶＡ−ＨＣＶ−151−661、ＭＶＡ−ＨＣＶ−１−661及びＭＶＡ−ＨＣＶ−１−742のゲノムＤＮＡ。１ｋＢのラダー（Gibco）は、塩基対数（ｂｐ）で表した分子量のマーカ（Ｍ）として与えられた。
【図２ＡＢ】及び
【図２ＣＤ】組換えＭＶＡによるＨＣＶコア及びＥ２タンパク質の合成。BHK-21細胞を10ＩＵ／細胞のＭＶＡ又はＭＶＡ−ＨＣＶに感染させ、感染後24時間（Ａ、Ｂ）又は示した時間点（Ｃ，Ｄ）において収穫した。細胞溶解液からのタンパク質をＳＤＳ10％ＰＡＧＥによって分離し、モノクローナルマウス抗ＨＣＶコア（Ａ，Ｃ）又はＥ２特異的ポリクローナルウサギ抗体（Ｂ，Ｄ）を用いて、ウェスタンブロット法により分析した。ＨＣＶに特異的なタンパク質バンドを矢印で示してある。この位置及びタンパク質標準の分子量（ｋＤａ）は、レーンＭＷに示してある。
【図３】組換えＭＶＡによって製造された細胞結合型及び分泌型Ｅ２タンパク質によるグリコシル化。ＭＶＡ感染BHK-21細胞からの総細胞タンパク質（Ａ）又は上清のタンパク質沈殿物（Ｂ）を、ＳＤＳ／β−メルカプトエタノール中で、エンドグリコシダーゼPNGaseＦの存在下（＋）又は不存在下（−）にインキュベートして変性させ、ＳＤＳ10％ＰＡＧＥで分離し、ポリクローナルウサギ抗Ｅ２血清を用いたウエスタンブロット法により分析した。ＨＣＶ−Ｅ２に特異的なタンパク質バンドを矢印で示してある。レーンＭＷにある数字は、タンパク質標準の位置及び分子量（ｋＤａ）を示している。
【図４】組換えＭＶＡによって製造された細胞結合型及び分泌型Ｅ２タンパク質によるエンドＨ感受性の分析。BHK-21細胞を組換えＭＶＡ／151−166又はＭＶＡ−ＨＣＶ／１−661又は非組換えＭＶＡに、10のＭＯＩにて24時間感染させた。感染培養からの総細胞タンパク質（Ａ）又は上清のタンパク質沈殿物（Ｂ）を変性させ、PNGaseＦ又はエンドＨの存在下（＋）又は不存在下（−）にインキュベートし、ＳＤＳ10％ＰＡＧＥで分離し、ポリクローナルウサギ抗Ｅ２血清を用いてウエスタンブロット法により分析した。ＨＣＶ−Ｅ２に特異的なタンパク質バンドを矢印で示してある。レーンＭＷの数字は、タンパク質標準の位置及び分子量（ｋＤａ）を示している。
【図５】ＭＶＡ−ＨＣＶでワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣＴＬによよる、Ｅ１ペプチドでパルスした標的細胞の特異的溶解。組換えＭＶＡ−ＨＣＶ／151−661（Ａ）、ＭＶＡ−ＨＣＶ／１−661（Ｂ）又はＭＶＡ−ＨＣＶ／１−724（Ｃ）でワクチン接種したマウスから脾臓細胞を得、そしてインビトロでＥ１ペプチドアミノ酸312〜326により再刺激した。これらのエフェクターを、与えられたＥ：Ｔ関係において、４時間51Ｃｒ放出試験においてＥ１ペプチドアミノ酸312〜326（■）又はFluペプチド（□）でパルスしておいたP815標的に対して、細胞障害性につき試験した。非組換えＭＶＡでワクチン接種したマウスからの脾臓細胞は対照として働き、Ｅ１ペプチドアミノ酸312〜326（◆）又はFluペプチド（Ｘ）と共にインキュベートしておいたP815標的に対して試験した。
【図６】組換えＭＶＡでワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥ２特異的抗体応答。組換え型又は野生型ＭＶＡの108ＩＵで３回免疫感作しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスからの２倍連続希釈の血清を、Ｅ２特異的抗体についてＥＬＩＳＡにより試験した。全ての血清変換動物の標準化した平均の抗Ｅ２力価のｌｏｇ（２）値が示してある。標準偏差はバーで表してある。最上部の数字は、血清変換動物と完全分析した動物との関係を示している。
【図１Ａ】
2005502362.tif 000003
【図１Ｂ】
2005502362.tif 000004
【図２ＡＢ】
2005502362.tif 000005
【図２ＣＤ】
2005502362.tif 000006
【図３】
2005502362.tif 000007
【図４】
2005502362.tif 000008
【図５】
2005502362.tif 000009
【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月20日(2003.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ構造抗原若しくはその機能的部分をコードする又はＨＣＶ構造抗原のエピトープをコードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、組換えＭＶＡ。
【請求項２】
キャプシドタンパク質コア及び／又はエンベロープ糖タンパク質Ｅ１及び／又はエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の構造抗原の遺伝子をＤＮＡ配列として含むことを特徴とする、請求項１の組換えＭＶＡ。
【請求項３】
Ｅ１及びＥ２をコードする配列をＤＮＡ配列として含むことを特徴とする、請求項１又は２の組換えＭＶＡ。
【請求項４】
Ｅ２をコードする該ＤＮＡがＥ２の変異型をコードすることを特徴とする、請求項３の組換えＭＶＡ。
【請求項５】
Ｅ２の該変異型が、Ｅ２の親油性部分の少なくとも一部が除去された分泌型であることを特徴とする、請求項４の組換えＭＶＡ。
【請求項６】
該ＤＮＡ配列がＭＶＡゲノム中の非必須領域に組み込まれていることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項７】
該ＤＮＡ配列がＭＶＡゲノム中の天然に存する欠失の部分に組み込まれていることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項８】
該天然に存する欠失の部位が、欠失III又はＭＶＡゲノム中の非必須領域にある他の欠失である、請求項７の組換えＭＶＡ。
【請求項９】
該ＤＮＡ配列が、ワクシニアウイルス特異的プロモータの転写調節下に及び／又はワクシニアウイルス起源でないプロモータの調節下にあり、好ましくはエンハンサー要素等のような更なる調節配列と連結していることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項１０】
該ＤＮＡ配列が、ワクシニアウイルス特異的初期／後期プロモータＰ７．５の転写調節下にあることを特徴とする、請求項９の組換えＭＶＡ。
【請求項１１】
Ｅ１とＥ２とがヘテロ２量体を形成し得ないものであることを特徴とする、上記請求項の１又は２以上の組換えＭＶＡ。
【請求項１２】
上記請求項１ないし１１の１又は２以上の少なくとも１の組換えＭＶＡ及び薬剤学的に許容し得る担体及び補助薬を含む、薬剤組成物。
【請求項１３】
ワクチンの形態である、請求項１２の薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡに感染させてあることを特徴とする、真核細胞。
【請求項１５】
該細胞がニワトリ胚繊維芽細胞又は幼ハムスター腎臓細胞好ましくはBHK-21、又は抗原提示細胞好ましくは樹状細胞であることを特徴とする、請求項１４の真核細胞。
【請求項１６】
ＨＣＶ感染及びそれによって引き起こされる疾病、特に慢性肝疾患及び肝腫瘍の治療及び予防のための、請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの使用。
【請求項１７】
組換えＨＣＶ構造タンパク質の産生のためのワクチンの製造のための、又は該組換えＨＣＶ構造タンパク質を産生する真核細胞の作成のための、請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの使用。
【請求項１８】
動物又はヒトの免疫感作のための、請求項１２又は１３の薬剤組成物の使用。
【請求項１９】
組換えＨＣＶ構造ポリペプチド又はその機能的部分の製造のための方法であって、
（ａ）請求項１４又は１５の細胞を適切な条件下に培養するステップと、そして
（ｂ）組換えＨＣＶ構造ポリペプチド、その機能的部分又はそのエピトープを発現させ、単離しそして所望により精製するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２０】
組換えＭＶＡを製造するための請求項１ないし１１の何れかによる方法であって、
（ａ）組換えＭＶＡベクターを製造するために、請求項１に規定されたＤＮＡ配列又はその機能的部分又はエピトープを、ＭＶＡベクターの非必須領域内に導入するステップと、
（ｂ）該組換えＭＶＡベクターを真核細胞に導入して該細胞中で該ベクターを増幅するステップと、そして
（ｃ）所望によりウイルス粒子を又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡを単離するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２１】
上記請求項１ないし１１の１又は２以上の組換えＭＶＡの、好ましくは単離された形態の、ＤＮＡ又はＲＮＡ。
【国際調査報告】
2005502362.tif 000132
2005502362.tif 000133
2005502362.tif 000134
2005502362.tif 000135
2005502362.tif 000136
2005502362.tif 000137
2005502362.tif 000138
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