(57)【要約】その内部で少なくとも１つのスチルベン・シンターゼ（ＳＴＳ）遺伝子構成が変換されるようになる遺伝子導入植物であり、それに対応するスチルベンの構成的作出が遺伝子導入ＳＴＳ酵素によって合成されると共に、通常の生理的発育を維持している。好ましい実施例は遺伝子導入レズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）を赤色植物の中に含有させる。植物作出方法は、遺伝子導入レズヴァーラトロール酵素の高レベル前駆体を含有する受容植物を選択することを含む。
2005502304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その内部で転換された遺伝ベクターであって、スチルベン・シンターゼ遺伝子をコード化する分離または合成ＤＮＡからなるベクターを包含する赤色転換植物。
【請求項２】
前記スチルベン・シンターゼ遺伝子がレズヴァーラトロール・シンターゼ遺伝子をコード化する請求項１記載の赤色転換植物。
【請求項３】
前記遺伝ベクターが、プラスミドであり、前記スチルベン・シンターゼ遺伝子がレズヴァーラトロール・シンターゼ遺伝子である請求項１記載の赤色転換植物。
【請求項４】
前記転換植物が赤葉レタスである請求項１記載の赤色転換植物。
【請求項５】
前記転換植物が生存可能な種子を作出できる請求項１記載の赤色転換植物。
【請求項６】
スチルベン・シンターゼ遺伝子またはスチルベン・シンターゼ遺伝子の一部で転換された転換植物であり、前記スチルベン・シンターゼ遺伝子が、或る特定のスチルベン・シンターゼ酵素をコード化し、この特定のスチルベン・シンターゼ酵素が、前記転換植物内の或る特定のスチルベンの構成レベルを合成し、前記転換植物が、自然な未転換状態において、前記スチルベン・シンターゼ遺伝子に対する高レベルの前駆体を含有する転換植物。
【請求項７】
前記スチルベン・シンターゼ遺伝子が、レズヴァーラトロール・シンターゼ遺伝子であり、前記特定のスチルベン・シンターゼ酵素が、レズヴァーラトロール・シンターゼであり、前記特定のスチルベンが、レズヴァーラトロールである請求項６記載の転換植物。
【請求項８】
前記転換植物が赤葉レタスである請求項６記載の転換植物。
【請求項９】
その内部で転換した特定の遺伝子導入スチルベン・シンターゼ（ＳＴＳ）酵素を含有する遺伝子導入植物を受容植物から得られるように作出する方法であって、前記方法が、
ａ）遺伝子導入ＳＴＳ酵素の前駆体を高レベルで含有する受容植物を選ぶ工程と、
ｂ）前記特定のＳＴＳ酵素をコード化するＳＴＳ遺伝子またはＳＴＳ遺伝子の一部からなる遺伝ベクターを用意し、前記ＳＴＳ遺伝子または前記ＳＴＳ遺伝子の一部が、受容植物における前記特定のＳＴＳ酵素の構成発現に適しているプロモータを備える工程と、
ｃ）遺伝ベクターを受容植物に転換する工程と、そして
ｄ）高構成レベルの遺伝子導入・スチルベンを含有する転換植物を選択し、成長させる工程と、
を包含する方法。
【請求項１０】
前記選択工程が、さらに、組織培養システムにおけるカルス培養株として前記受容植物を成長させる工程と、前記ＳＴＳ酵素のための前駆体のレベルについて前記カルス培養株を分析する工程とを包含する請求項９記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子導入レズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）酵素を含有する遺伝子導入植物を受容植物から得られるように作出する方法であって、前記方法が、
ａ）高レベルの４−クマロイルＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを含有する受容植物を選択する工程と、
ｂ）ＲＳ遺伝子またはＲＳ酵素の一部からなる遺伝ベクターを用意し、ＲＳ遺伝子またはＲＳ遺伝子の一部が、受容植物におけるＲＳ酵素の構成発現に適しているプロモータを備えている工程と、
ｃ）遺伝ベクターを受容植物に転換する工程と、そして、
ｄ）高構成レベルの遺伝子導入レズヴァーラトロールを含有する転換植物を選択し、成長させる工程と、
を包含する方法。
【請求項１２】
遺伝子導入レズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）酵素を含有する遺伝子導入植物を受容植物から得られるように作出する方法であって、前記方法が、
ａ）高構成レベルのアントシアニンを含有する食用部分を有する受容植物を選択する工程と、
ｂ）ＲＳ酵素をコード化するＲＳ遺伝子またはＲＳ遺伝子の一部からなる遺伝ベクターを用意し、ＲＳ遺伝子またはＲＳ遺伝子の一部が、受容植物におけるＲＳ酵素の構成発現に適しているプロモータを備える工程と、
ｃ）遺伝ベクターを受容植物に転換する工程と、そして
ｄ）食用部分に高構成レベルのレズヴァーラトロールを含有する転換植物を選択して成長させる工程と、
を包含する方法。
【請求項１３】
前記受容植物が、赤葉レタスである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
或る植物の食用部分から作った未発酵ジュースの飲料であって、前記ジュースが、少なくとも１μｇ／ｍｌのレズヴァーラトロールを含有することを特徴とする飲料。
【請求項１５】
グラム乾燥重量あたり少なくとも１μｇのレズヴァーラトロールを含有することを特徴とする乾燥果実および野菜。
【請求項１６】
グラム乾燥重量あたり少なくとも１μｇのレズヴァーラトロールを含有することを特徴とする粉末状植物抽出物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子導入植物（ｔｒａｎｓｆｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ）および植物材料に関するものであり、さらに具体的に言うと、本発明は、植物中に、レズヴァーラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）や、その他のスチルベンを作出することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
癌腫は、男女共に共通して最大の死因となっており、癌腫を化学的に予防することが、罹病率および死亡率を減らすための最も直接的な方法の１つである。癌予防薬としては、非ステロイド系抗炎症薬があり、たとえば、インドメサシン、アスピリン、ピロキシカム、スリンダクがあり、いずれもコックス（ＣＯＸ）を抑制する。過去３０年以上にわたる、新規な癌予防薬に対する調査において、何千もの植物サンプルおよび抽出物が研究され、これら抽出物のうち数百について、コックスを抑制する可能性が評価された。ペルー産の桂皮クインクアングラータ（Ｃａｓｓｉａ ｑｕｉｎｇｕａｎｇｕｌａｔａ）からの抽出物が、強力な抑制剤として確認され、そして、活性成分が、レズヴァーラトロール（３，５，４’−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）であると確認された。１９９７年に、ブドウ中に有る、或いは別の食物中にも有る植物性アレキシンであるレズヴァーラトロールが精製されて、３つの主要発癌段階を表す分析において、癌腫を化学的に予防する機能を有することが証明されたということが、１９７４年に「サイエンス・ジャーナル」（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ）で報告された。レズヴァーラトロールは、抗酸化剤および抗突然変異物質として作用し、ＩＩ相薬代謝酵素（初発防止活性）を誘発する、ということが発見された。すなわち、レズヴァーラトロールは、抗炎症性効果を伝え、且つ、シクロオキシゲナーゼ及びヒドロペルオキシダーゼ機能（抗促進活性）を抑制し、そして、癌腫の抗進行活動を誘発したのである。それに加えて、レズヴァーラトロールは、培養株で発癌性物質を処理されたマウスの乳腺において、新生物発生前病変の進行を抑制し、そして、マウス皮膚癌モデルにおいて、腫瘍形成を抑制したのである（Ｊａｎｇ Ｍ．Ｓ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７５：２１８−２２０， １９９７）。これらのデータも、世界中の多数の科学者達も、我々が摂取する食物内にある普通の成分であるレズヴァーラトロールが、人間の潜在的な化学的癌予防薬として調査されるに値する、と強く示唆しているのである。
【０００３】
アルコール、心臓血管病、およびフレンチ・パラドックスが、過去２０年間にわたり世界中の医療科学団体によって熱心に調査され、追跡され続けてきた。長年の多数の研究で、アルコール摂取と虚血性心臓病とを比較したとき、これらが逆相関曲線またはＵ字形曲線のいずれかを示し、どのような種類のアルコールでも一日あたり２杯程度の量を摂取することが、まったく飲まない場合と比較して、冠状動脈疾患の罹患率を減らすことに結びついているが、それ以上の摂取することは、梗塞、卒中などの危険度を増大させることを示している。ほとんどのアルコール飲料による心臓保護効果は、おそらく、高密度リポタンパク質の増大と、血小板凝集を阻止し線維素溶解を向上させるアルコールの能力によるものであるが、赤ワインによる良好な結果が顕著である。この赤ワイン独特の心臓保護特性は、白ワイン（シャンペンを除く）にはごくわずかしか含まれていないフラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）およびスチルベノイド（ｓｔｉｌｂｅｎｏｉｄ）の作用にある。調査された内の最高のフラボノイドは、レズヴァーラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）およびケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）であり、これらは、アルファトコフェロール（ａｌｐｈａｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）よりに強力な抗酸化特性を与える。グレープジュースでは、フラボノイドの量は、赤ワインのだいたい半分くらいの量である。しかしながら、植物性アレキシンであるレズヴァーラトロールは、微生物病原体に襲われたり感染したりしない限り、通常、ブドウでは産出されない。
【０００４】
レズヴァーラトロールは、植物性アレキシンであるから、３１の属および１２のファミリにわたって広がる少なくとも７２の植物種によって作出される。レズヴァーラトロールを作出するために最も研究された植物は、ブドウとピーナッツである。米国の、そして特にドイツの大学では、上記の２つの植物における植物−病原性相互作用に積極的に注目してきた。巨大化学製品医薬品会社であるバイエル社（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）は、この植物性アレキシンについて積極的にスポンサーとなって取り組んでいる。バイエル社は、レズヴァーラトロール（植物性アレキシン）作出に伴う遺伝子（スチルベン・シンターゼ）を分離し、遺伝子導入植物において発現させたとき、レズヴァーラトロールが植物への病原体攻撃に対する抵抗を増大させることを証明した。また、バイエル社は、自分達が分離したブドウ・スチルベン・シンターゼ遺伝子についての特許出願も行っている。フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒ．）は、遺伝子導入タバコにおけるスチルベン・シンターゼ遺伝子の過剰発現が、（共通の前駆体基質上でのカルコン・シンターゼ及びスチルベン・シンターゼ間の競争により）無菌花粉という結果に至らしめるという論文を、植物ジャーナル誌（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ） （Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１（３）： ４８９−４９８， １９９７）に発表した。
【０００５】
現在では、他にも、粉末状のレズヴァーラトロールを販売しているカナダの会社（ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅ：ファーマ・サイエンス社）があり、この会社も、レズヴァーラトロールは化学的に合成される、と主張している。その商品名は、「Ｒｅｓｖｅｒｉｎ：レズヴェリン」である。このカナダの会社は、非常に高い価格でほんの少量だけしか供給することができない。また、過去数年間で、レズヴァーラトロールが、フィトエストロゲンである、ということを証明した報告もたくさんあった。これらから、レズヴァーラトロールには、また、エストロゲン作用を真似るという意味が含まれ、それ故、レズヴァーラトロールは非ステロイド性エストロゲン補助剤としての可能性を有し、骨粗鬆症を阻止することもでき得るであろう。
【０００６】
このようなスチルベンの抗酸化利点および抗突然変異利点を利用しようとする際に生じる困難性は、１つには、スチルベンがたいていは植物性アレキシンであるが故に、遺伝子が植物内に自然に存在する場合であってさえも、スチルベンは感染したり損傷した植物にしか見つけられず、健康な植物では見つからない、ということなのである。したがって、ブドウにはスチルベン・シンターゼ（ＳＴＳ）遺伝子および活性ＳＴＳ酵素が有るにもかかわらず、通常では、新鮮で健康なブドウにはレズヴァーラトロールがないので、一般消費者は、普通にブドウを摂取しても、何ら効果が得られない。したがって、高構成レベルの１つ以上の所望スチルベンを含有する植物を作出する必要がある。
【０００７】
（発明の概要）
したがって、本発明の一態様は、少なくとも１つのスチルベン・シンターゼ（ＳＴＳ）遺伝子構造がその内部に導入され、それに対応するスチルベンの構成的作出が遺伝子導入ＳＴＳ酵素によって合成される、というようになる遺伝子導入植物を提供することである。別の態様においては、遺伝子導入植物の受精能および生理的発育が、スチルベンの特定の発現範囲でクローンを選択することによって制御され得る。この植物は、好ましくは、遺伝子導入ＳＴＳに対し高レベルの前駆体をその食用部分に自然に作出する普通の野菜である。更に好ましくは、この植物は、普通は生で食されるが、必要に応じて調理することもできる、という葉野菜である。好適なＳＴＳ遺伝子は、レズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）である。レズヴァーラトロール・シンターゼ遺伝子の転換に適した受容植物の一例は、赤葉レタス（Ｌａｃｔｕｃａ Ｓａｔｉｖａ）である。赤葉レタスは、赤レタスとも呼ばれる。本発明による受容植物の他の例としては、これに限定されないが、スイカや、イチゴや、ホウレン草、赤キャベツ、赤サトウキビなどの色つき野菜や果物がある。
【０００８】
また、他の態様によれば、本発明は、少なくとも１つのレズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）遺伝子構造がその内部で転換されて、レズヴァーラトロールの構成作出が遺伝子導入ＲＳ酵素によって合成される、というようになる遺伝子導入植物を提供する。好ましくは、この植物は赤葉レタスである。
【０００９】
さらに別の態様によれば、本発明は、遺伝子導入植物で作った食物に関係しており、１つの実施例は、このような遺伝子導入植物から開発したジュースから成る飲料である。したがって、この実施例に対する好ましい植物は、飲物へと処理されて、遺伝子導入レズヴァーラトロールを含有したジュースを大量に生産することができるのである。本発明のさらに別の態様においては、遺伝子導入レズヴァーラトロールを含有した乾燥野菜や乾燥果物が提供される。この実施例においては、植物を食する場合には、適当な量の流体を含ませることもできる。またさらに別の実施例においては、レズヴァーラトロールを含ませ状態で遺伝子導入植物から植物抽出物を作出することができる。これらの抽出物は、濃縮形態であってもよいし、非濃縮形態（たとえば、粉末形態）であってもよい。
【００１０】
また別の態様によれば、本発明は、その中に転換された或る特定の遺伝子導入ＳＴＳ酵素を含有している、健康な遺伝子導入植物を作出する方法を提供する。好ましい実施例において、本発明による方法を使用して得られた遺伝子導入植物は、さらに、通常の生理的発育を維持しながら、高構成レベルの遺伝子導入レズヴァーラトロールを含有するのである。この方法は、（１）遺伝子導入ＳＴＳ酵素の高レベルの前駆体を含有する受容植物を選択する；（２）ＳＴＳ酵素をコード化するＳＴＳ遺伝子又はＳＴＳ遺伝子の一部からなる遺伝ベクターを用意し、ＳＴＳ遺伝子又はＳＴＳ遺伝子の一部に、受容植物のＳＴＳ酵素の構成的な発現に適したプロモータが提供されるようにする；（３）遺伝ベクターを受容植物に転換する；そして、（４）高構成レベルのスチルベンを含有する転換植物を選択して、成長させる；という工程から成る。
【００１１】
内在性スチルベン・シンターゼについて調べるためには、プローブとして、既知のＳＴＳ遺伝子の保存領域に従って構成されたオリゴヌクレオチドを使用することができ、続いて、候補受容植物のゲノムのサザンブロット分析を行う。
【００１２】
前駆体レベル分析に対しては、例えば、ＨＰＬＣのような生化学的検査（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ）を使用できる。４−クマロイル−ＣｏＡ（４−Ｃｈｏｕｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡ）及びマロニル−ＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）は、ＲＳやその他のスチルベン・シンターゼ酵素に共通した２つの前駆体である。あるいは、高前駆体レベルは、自然状態での植物の外観の「赤み」のような、同じ生化学的酵素触媒反応の他の中間体のレベルから推定することができる。「赤み」は、アントシアニンの蓄積によるものであり、その中間体は、ＲＳに対する既知の前駆体である。
【００１３】
遺伝ベクターにおけるＳＴＳ遺伝子は、ｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡ、或いは、適切なＳＴＳ遺伝子を含有する植物から分離したゲノムＤＮＡである。当該スチルベンを合成することのできるような植物は、候補供与体植物であってもよい。ＳＴＳ遺伝子或いは当該ＳＴＳ遺伝子のｃＤＮＡは、既知のＳＴＳ遺伝子の保存領域に一致するオリゴプライマーを使用して得ることができる。分離したＳＴＳ  ＤＮＡは、従来の選択可能なマーカー（たとえば、抗生物質抵抗遺伝子）と、受容植物の挿入ＳＴＳ  ＤＮＡの構成発現を生じさせることのできる従来のプロモータ−とで、遺伝ベクターにクローン化され得る。
【００１４】
この方法の好ましい実施例においては、遺伝ベクターは、ＲＳ酵素をコード化するＲＳ遺伝子またはＲＳ遺伝子の一部を担持していて、その結果、高構成レベルの遺伝子導入レズヴァーラトロールが遺伝子導入植物において発現されることになる。遺伝子導入ＲＳ酵素に利用できる前駆体は、アントシアニン作出のための非遺伝子導入植物により当然に使用される。受容植物は、高レベルの自然発生アントシアニンおよびその前駆体を示す赤い色を有する種のものである。
【００１５】
別の好ましい実施例においては、受容植物は、組織培養方法によって再生されて、カルス（ｃａｌｌｕｓ）が前駆体レベルに対して分析される。遺伝子導入レズヴァーラトロール・シンターゼ酵素の高構成レベル前駆体を発現することがわかっているカルスおよび小植物が選択される。こうすることで、（遺伝子導入ＲＳ酵素を発現し始めたために、遺伝子導入スチルベンの生合成のための前駆体を激減させ始めた）転換植物が、成熟植物へ成長していっても、組織培養の途中で良好な健康状態を維持することができるようにするのである。
【００１６】
ここで使用しているＳＴＳ遺伝子という用語は、さまざまなＳＴＳ酵素をコード化する遺伝子のファミリを意味している。ＳＴＳ酵素は、スチルベン・ファミリの異なったメンバーの合成に触媒作用を及ぼす。レズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）遺伝子とは、レズヴァーラトロール・シンターゼ酵素（ＲＳ酵素）をコード化するＳＴＳ遺伝子ファミリの特定のメンバーを意味している。ＲＳ酵素は、４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡの３，４’，５−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン（レズヴァーラトロール）への転換に触媒作用を及ぼす。
【００１７】
赤みは、一般的な方法で決定されるのであり、目で観察可能でき、当業者によって広く認められ、周知である。「赤」と見とめられる植物の例としては、赤葉レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、赤バヤム（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、赤キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、赤ビート（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、紫キャベツ、赤ビート根、赤アマランス、赤サトウキビ、赤ホウレンソウ、赤スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）、赤イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、キイチゴがある。
【００１８】
ここで用いる「健全な・健康な」という用語は、たとえば、サイズや色と言ったような外観に従って、観察可能な種の正常範囲内にある一般的に健全な状態を意味している。
【００１９】
ここで使用する「繁殖性」という用語は、生育可能な種子を形成するようにするための種の能力を意味している。
【００２０】
（詳細な説明）
以下に述べる実施例は、本発明の種々の態様を例示するために使用されるものである。
【００２１】
赤葉レタスのレズヴァーラトロールの作出
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅからのレズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）遺伝子は、クローン化やトランスフォーメーション（形質変換）に対し、ＳＴＳ遺伝子ファミリの構成メンバとしてこの実施例で使用されるスチルベン・シンターゼ遺伝子である。説明並びに理解を容易にするために、遺伝子導入ＲＳ酵素によって作出されるＲＶと、遺伝子導入ＳＴＳ酵素によって作出されるスチルベンとは、それぞれ、遺伝子導入ＲＶ、および遺伝子導入・スチルベン、というように言及する。ＲＳ遺伝子に対する受容植物としては、この実施例では赤葉レタスが選択される。これは、赤葉レタスが、４−クマロイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡがその前駆体である高レベルのアントシアニン色素を含有しているためである。たとえば、ナリンゲニン・カルコン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ ｃｈａｌｃｏｎｅ）は、アントシアニン生合成酵素触媒反応の中間体であり、この場合、４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡは、前駆体である。４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡは、図１に示すように、レズヴァーラトロール（ＲＶ）に対する既知の前駆体でもある。したがって、転換されたレタス内には、ＲＳによってＲＶへ転換するための前駆体がたくさんあるのである。さらに、レタス種は、種々の既知のＲＶ遺伝子の相同領域を表すオリゴヌクレオチドと交配させることによって、その天然ゲノムにおけるＲＶ関連遺伝子の存在に対するテストがされた。テストを行なったサザンブロット分析（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）で雑種が全く発生しなかったことが証明され、レタスには内在性ＲＳ遺伝子がなく、本発明の好ましい実施例に従って、レタスで適切な受容植物が作られることを示した。その結果、このような高構成レベルのＲＶが、遺伝子導入赤葉レタスにおいて達成されるのである
【００２２】
着手するにあたり、まず地域のスーパーマーケットから、赤ブドウ（栽培品種Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ）を入手した。これらブドウに紫外線を１０分間照射し、レズヴァーラトロール・シンターゼの転換を誘発させ、１２時間待ってから、紫外線を照射されたブドウからｍＲＮＡを抽出した。ＲＳ遺伝子のオリゴプライマー５’および３’を作り、逆転写ＰＣＲを介して、遺伝子のｃＤＮＡ配列を引き出した。また、Ｒｅｄ ＦｌａｍｅブドウのゲノムＤＮＡを抽出し、ここで再びＰＣＲを介して、ゲノムＲＳ遺伝子（１イントロンを有する）を分離した。ＲＳは、複数遺伝子ファミリである。それ故、これらすべてをマップ化し、配列し、特徴づけた。
【００２３】
２つの標準長ｃＤＮＡクローン（Ｒ１およびＲ６５と命名した）および２つのゲノム・クローン（Ｇ１４およびＧ１７と命名した）を選び、カリフラワー・モザイク病ウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ） （ＣａＭｖ）３５Ｓプロモータによって駆動される発現ベクター（ｐＢＩ１２１）へ、これらクローンをライトゲート（ｌｉｇａｔｅ：結紮）した。クローンＲ６５，Ｇ１４，およびＧ１７は、ＢａｍＨ１およびＳａｃ１制限サイトを介して、ｐＢＩ１２１へライゲートされるが、クローンＲ１は、ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１制限サイトを介して、ｐＢＩ１２１へライゲートされた。このプラスミド発現ベクターを、次いで、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ； 株ＬＢＡ４４０４）に転換した。ＲＳ遺伝子と共にｐＢＩ１２１を担持するアグロバクテリウムは、カナマイシン耐性淘汰を介して選択される。その後、図２Ａ〜図２Ｄに示すように、４つの異なった構造物を担持している４つの異なったアグロバクテリウムのコロニーを得た。
【００２４】
並行して、また５種類の赤レタスをスクリーンにかけ検査し、子葉外植体からの組織培養において、それらの再生可能性を査定した。赤レタス種のＲｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌを選択したのは、本願発明者達が行なった組織培養観察記録から作出した小植物の内で、最高で最速の再生を示したためである。
【００２５】
実験が繰り返えされ、今度は子葉を２平方ミリメータの面積に正方形にカットして、アグロバクテリア内で３０分間培養した。その後、水洗いし、Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌに対して確立された組織培養観察記録を行った。再生された小植物は、発芽誘導培地内で１５０ｍｇ／Ｌ濃度のカナマイシンを使用して選んだ。これらの小植物を根付かせてから移植し、３０〜３５日間生育させた後で、ＲＮＡ、ＤＮＡ用に葉を刈り取り、ＨＰＬＣを使用してレズヴァーラトロール定量化のための抽出が行なわした。
【００２６】
ノーザン及びサザン分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎａｌｙｓｅｓ）で、ＲＳ遺伝子（Ｒ１，Ｒ６５，Ｇ１４，およびＧ１７）が発現したことが証明された。葉サンプルの有機溶媒抽出が、レズヴァーラトロール分析に対して発表された観察記録に従って行われ、ＨＰＬＣを使用して分析され、そして、シグマ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した純粋なレズヴァーラトロール・サンプルが標準的な基準として使用された。
【００２７】
同様に転換されて選択されたタバコ植物を使用した実験も、通常の緑葉植物と同様に肯定的な対照として機能するかどうかをみるために行なわれた。
ＨＰＬＣ定量化からのデータでは、タバコとは対照的に（最良で、約０．３６μｇ／ｇ  ｆ．ｗ．）、遺伝子導入赤レタスが、高構成量のレズヴァーラトロール（葉の生体重４μｇ／ｇ以上）を作出することができることを示している。遺伝子導入赤レタスは、乾燥重量を使用して比較した場合、遺伝子導入タバコに比較して、最高１０倍のレズヴァーラトロールを作出できる。非転換植物には検出可能なレズヴァーラトロールは全く見えない。出願人が行なった遺伝子導入赤レタスのアントシアニン・レベルについての定量化から得られた重要な観察およびデータは、アントシアニン・レベルが、非転換の対照と比較して、半分に減ったということである。このデータは、４−クマロイルＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡの前駆体が、ＲＳによってレズヴァーラトロール作出へと向けられ、そして、野菜においてレズヴァーラトロール・シンターゼ（ＲＳ）遺伝子をさらに過剰に発現させることができたならば、赤レタスのレズヴァーラトロール濃度を更なる高レベルにまで拡大する可能性が依然としてあることを示している。過剰発現の方法には、更に強い構成プロモータまたはダブル・プロモータを使用すること、より効率的な転換を行えるウィルスのオメガ粒子配列を使用すること、そして、アクチン・プロモータのような他のプロモータを使用すること、がある。
【００２８】
このシステムは、また、高レベルのレズヴァーラトロールを収量するために、他にも色付きの植物や果物が使用できる可能性の有る、ということを示している。毎日１００ｇの野菜を食すると仮定するならば、４００μｇ以上のレズヴァーラトロールを人体に供給することになる。それ故、本願出願人は、癌腫や、心臓脈管系疾病や、その他潜在的疾病に対して化学予防能力を有する新しい植物性栄養補給食品の生成方法を可能にするにあたり、本願の新規な発明の可能性を予見するものである。
【００２９】
以下、遺伝子導入赤葉レタスを得るのに使用される手順を詳細に説明する。
受容植物材料の選択及び確立
４種類の赤レタス、すなわち、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｃａｎａｓｔａ、Ｌｏｌｌｏ Ｒｏｓｓａ、 Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌ （オランダＮｏｖａｒｔｉｓ ｓｅｅｄｓ Ｂ．Ｖ．社）、Ｒｅｄ Ｒａｐｉｄ （台湾Ｋｎｏｗｎ−ｙｏｕ Ｓｅｅｄｓ Ｃｏ．社）を、それらの赤みおよび再生能力について組織培養でテストした。
全再生全プロセスは、若干の修正を加えて、アメリカ合衆国Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． の、Ｃｕｒｔｉｓ 外． による「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」の４４号５９〜７０頁（１９９５年）に記載されている通り行なった。各種類からの１０個の種子を、１０％Ｃｌｏｒｏｘを使用して１０分間表面滅菌し、滅菌ＲＯ水で３回洗浄した。次に、２５０ｍｌの円錐形フラスコ内のＭＳ＋Ｂ５培地（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ． Ｍ−５５１９）に種子をまき、２３±２℃の温度で、１６時間光周期、１８μｍｏｌ／ｓ／ｍ２の光度（昼光色蛍光灯）で、７日間成長させた。
７日経った苗の子葉をその頂端を除去して切り取り、葉柄はそのまま残した。針を使用して、子葉の葉脈に沿って背軸面を繰り返し突き刺した。（４．７１ｇ／ＬのＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／ｌの蔗糖、２ｇ／ｌのカゼイン加水分解物、２ｍｇ／ｌの２，４ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ， Ｓｉｇｍａ）、０．２５ｍｇ／ｌのカイネチン、９．９ｍｇ／ｌのチアミンＨＣＬ、９．５ｍｇ／ｌのピリドキシン−ＨＣＬ、４．５ｍｇ／ｌのニコチン酸、５．５ｇ／ｌのｐｈｙｔａｇｅｌからなる、ｐＨ５．８の）液体ＵＭ培地に、子葉を１０分間浮かせ、傷を付けた表面を培地と接触させた。その後、子葉を取り出し、ＵＭ寒天培地に浸漬させた。種子を発芽させるために、同じ条件の下に、外植体を２日間培養した。
【００３０】
ＵＭ固体培地での２日後、（４．７１ｇ／ＬのＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／ｌの蔗糖、０．０４ｍｇ／ｌのＮＡＡ（Ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ酢酸）、０．５ｍｇ／ｌのベンジル・アミノ・プリン（ＢＡＰ）、５００ｍｇ／ｌのＣａｒｂｅｉｃｉｌｌｉｎ、１００ｍｇ／ｌのセフォタキシム、１５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン、５．５ｇ／ｌのｐｈｙｔａｇｅｌからなる、ｐＨ５．８の）ＳＩ寒天培養基に子葉を移し、背軸面をＳＩ培養基と接触させた。そして、種子は、発芽するように培養され、２１日ごとに新しいＳＩ寒天培地へ植え継いだ。
【００３１】
４９日後に、癒傷組織（カルス）および新芽（シュート）の生じた外植体を、０．１１％（ｗ／ｖ）２［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ＭＥＳ）で、５０ｍｌのＳＩ寒天培地へ移した。
約１ｃｍの高さになった新芽を２５０ｍｌの円錐形フラスコに移した。それぞれのフラスコには、（４．７１ｇ／ＬのＭＳ塩及びビタミン、３０ｇ／ｌの蔗糖、０．０４ｍｇ／ｌのＮＡＡ（Ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ酢酸）、１５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン、５．５ｇ／ｌのｐｈｙｔａｇｅｌからなり、ｐＨ５．８の）５０ｍｌの発根用寒天培地が入っていた。これらの新芽は、種子を発芽させるのと同じ条件で、培養された。
【００３２】
ブドウからのＳＴＳ遺伝子の分離および遺伝ベクターの構造
植物材料
熟成した果物で、市販のグレープヴァインＶｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅが、グレープヴァインＲＳ遺伝子の分離用の植物材料として使用された。
【００３３】
全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ抽出
０．２ｇのＶｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ果皮組織を、乳鉢および乳棒を使って液体窒素内ですりつぶした。ＲＮＡとｇＤＮＡの両方全体を、若干の修正を行ったが、Ｋｎａｐｐ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｅ による（ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ ｆｒｏｍ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓａｍｐｌｅ ｏｆ Ｏｒｃｈｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ． Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ２１；５４−５６頁）に記載されているのと同じ方法を使用して抽出した。３％ＣＴＡＢ；２％ＰＶＰ；１．４２ＭのＮａＣｌ；２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）；１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）および５ｍＭのアスコルビン酸を含有する抽出バッファを２ｍｌ使用してＶｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ果皮組織の全ＲＮＡまたはｇＤＮＡを抽出した。これらのサンプルを１５分間、６５℃で加熱してから、クロロフォルム抽出を行ってタンパク質性物質を除去した。５％ＣＴＡＢ（５％ＣＴＡＢと０．７ＭのＮａＣｌ）を、１／５体積分、サンプルの水相に添加して多糖類を除去し、１５分間、６５℃で加熱した。別のクロロフォルム抽出を行った。２体積分の氷のように冷たい１００％ＥｔＯＨをサンプルの水相に添加し、１５分間、−２０℃で培養した。全ＲＮＡおよびｇＤＮＡを、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭ５４１０Ｃ冷凍遠心分離機を使用して、室温で１５分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離した後に、ペレット化した。これらのペレットを７０％ＥｔＯＨで洗浄し、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭ（登録商標）濃縮機で乾燥させてから、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０と１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。３μｌの分離した全ＲＮＡまたはｇＤＮＡと１μｌのローディング・バッファ（１ＸＴＢＥ内の０．０２５％ブロムフェノールブルー、０．０２５％キシレン・シアノール、３０％グリセロール）を、それぞれ０．２５μｇのラムダＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩおよびｐｈｉＸ１７４ ＤＮＡ／ＨａｅＩＩＩマーカーと共に１％アガロース・ゲル上へロードした。水平方向ゲル電気泳動を１／２時間、１００Ｖで行わせた。ＥｔＢｒ着色剤とＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＥａｇｌｅＥｙｅ ＩＩ Ｊｏｕｎｉｏｒドキュメンテーション・システムを使用して、抽出した全ＲＮＡまたはｇＤＮＡの量、質を視覚化し、計算した。
【００３４】
プライマ判定
Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ ＳＴＳ （ｐＳＶ２１、ｐＳＶ２５、ｐＳＶ３６８）、Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｌａｍｂｒｕｓｃｏａ Ｆｏｇｌｉａ Ｆｒａｓｔａｇｌｉａｔａ ＳＴＳ （ＶＶＬＳＴＳ）、Ｐｈａｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐ． ＢＳ （ｐＢｉｂｓｙ８１１、ｐＢｉｂｓｙ２ｌ２）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）ＳＴＳ （ａｒｑｒｅｓｏｌ、ａ００７６９）、およびＰｉｍｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ （Ｓｃｏｔｓ ｐｉｎｅ） ＳＴＳ （ＰＳＴＳ１及びＰＳＴＳ２） のすべて現存の遺伝子配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のインターネット・ウェブサイトのＧｅｎＢａｎｋから入手された。すべての相同性検索を、テキサス州  ヒューストンのＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ のＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ＣｅｎｔｅｒからのＢＣＭ Ｓｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒ のＣｌｕｓｔａｌＷ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを使用して実施した。
【００３５】
標準長グレープヴァインＲＳ遺伝子の分離に使用したプライマは、図４Ａ〜図４Ｄに示すように、現存のｐＳＶ２１，ｐＳＶ２５，ｐＳＶ３６８ （Ｍｅｌｃｈｉｏｒ ａｎｄ Ｋｉｎｄｌ， Ｏｐｔｉｍａ． Ａｃｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙ． ２８８：５５２−５５７， １９９１），およびＶＶＬＳＴＳ（Ｓｐａｖｏｌｉ Ｆ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４：７４３―７５５、１９９４） の多重配列によって決定した。
プライマ配列およびプライマの溶融温度の決定後、これらはアメリカ合衆国のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ Ｃｕｓｔｏｍ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｅｒｖｅｉｃｅ， Ｌ．Ｔ．Ｉ．に注文して営利的に合成された。
【００３６】
全ＲＮＡの逆転写
１μｇの紫外線誘発Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ果皮全ＲＮＡ葉全ＲＮＡをテンプレートとして用い、３’プライマ（３５ＧＳＴＳ２ａ）のアニール化を１０分間、６５℃で行なった。プライマアニール化後、５０μｌの最終体積において２００ｕｎｉｔｓ／μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＬＴＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ）、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＴＭ １Ｘ反応バッファ、１０ｍＭのＤＴＴおよび２００μＭのｄＮＴＰで、全ＲＮＡを逆転写した。逆転写は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製 ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍにおいて、１時間、４２℃で実施した。次いで、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ逆転写酵素を１５分間、７０℃で不活性化した。
【００３７】
ｃＤＮＡは、Ｔｒｉｓ緩衝フェノールおよびクロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）摘出を介して精製した。次いで、水相が、１／１０体積の３Ｍナトリウム酢酸塩および２．５体積の氷のように冷たい１００％ＥｔＯＨで沈殿された。ペレットを、２０μｌの滅菌ミリ−Ｑ水（ｍｉｌｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒ）に溶解した。
【００３８】
ｃＤＮＡおよびｇＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応
Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ果皮の、２０ｕｌのｃＤＮＡおよび２０ｎｇのｇＤＮＡの両方を、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。５ｕｎｉｔｓ／μｌのＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼを１Ｘ Ｔｆｌ反応バッファ内に含む５０μｌの全体積でのＰＣＲ反応は、それぞれ、２００ｎｇ／μｌの５’プライマ３５ＧＳＴＳ１および３’プライマ３５ＧＳＴＳ２ａ、２００μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭの硫酸マグネシウムを提供し（アメリカ合衆国Ｐｒｏｍｅｇａ社）、滅菌状態ミリ−Ｑ水を補給した。
【００３９】
グレープヴァインＲＳ遺伝子のＰＣＲ増幅は、９２℃で５分間保持し、９２℃で１分の変性時間を４０サイクル行い、５５℃で２分間、そして、７２℃で２分間の時間延長でアニール化することによって行った。７２℃でさらに６分間の時間延長を行ってからＰＣＲを完了した。
【００４０】
５μｌのＰＣＲ反応を、１％アガロース内の水平方向ゲル電気泳動によって分離し、定量化した。所望のＭＷフラグメントの存在を決定した後、４５μｌのＰＣＲ反応の残りを、１／１０体積の１０Ｘ ＳＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ． Ｃｌ， ｐＨ ８．０； １００ｍＭ Ｎａｃｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０）、１／１０体積の４Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、および２．５体積の氷のように冷たいＥｔＯＨで選択沈殿させた。ペレットを、ｐＧＥＭ−Ｔ（＋） ＴＭベクターにライゲートするためにＴＥ内で溶解した。
【００４１】
ｐＧＥＭ−Ｔ（＋）へのクローニング
Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ果皮の、ｃＤＮＡ及びｇＤＮＡのＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ（＋）ＴＭベクター・システム・キット（アメリカ合衆国Ｐｒｏｍｅｇａ社．）を使用してｐＧＥＭ−Ｔ（＋）ベクターにクローン化した。１：３（ベクター：インサート）の比で、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物を、全体積１０μｌにおいて３ｕｎｉｔｓ／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１Ｘバッファを用いてｐＧＥＭ−Ｔ（＋） ＴＭベクターにライゲート（結紮）し、１６℃で一晩培養した。
【００４２】
ライゲート化後、１０μｌのライゲート反応混合物を、２００μｌのＸＬ１−青色コンピテント細胞に転換した（アメリカ合衆国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）。これらの細胞を１０分間氷の中に置いてから、５分間３７℃に置き、次いで、１分間氷に戻した。１ｍｌの単純ＬＢ液体培地を加え、３７℃で１時間培養した。１時間の回復時間後、細胞を、３０秒間、１１，０００回転数／分の遠心分離によって集め、次いで、５０μｌの単純液体培地に再懸濁した。５０μｌを用いて１．５％ＬＢ寒天プレート上に１００μｇ／ｍｌアンピシリンと共に広げた。これらのプレートを、３７℃で一晩培養した。
【００４３】
適正なサイズのインサートを持つ確実なクローンが、制限酵素ＳａｌＩおよびＣｌａＩ（アメリカ合衆国のＮＥＢ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて選定され、プラスミド・ミニプレップ後、製造業者の推奨する条件に従って消化された。
【００４４】
推定Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＳＴＳ遺伝子の特徴づけ
推定Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子は、分離された後で、制限酵素マッピング（図５）と、配列分析（図６および図７）と、水治療法カーブのプロッティング（図３）で特徴づけられた。
【００４５】
制限酵素マッピング
現存のグレープヴァインＲＳ遺伝子（ｐＳＶ２１，ｐＳＶ２５，ｐＳＶ３６８，ＶＶＬＳＴＳ）の制限酵素マッピングを、ウェブサイトＷｅｂｃｕｔｔｅｒ ２．０を使用して同定した。
こうして得られた制限酵素マップに従って、ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ（アメリカ合衆国のＮＥＢ）を用いて、Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子の推定クローンを製造業者推奨の条件で消化した。消化後、反応物を、４５分間、１００Ｖで稼働する水平方向ゲル電気泳動を使用して１％アガロス・ゲルについて分析した。ゲルを観察するのに、Ｅａｇｌｅ−Ｂｙｅ ＩＩ Ｊｕｎｉｏｒドキュメンテーション・システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用した。
【００４６】
配列分析
推定Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子の配列を、ジデオキシ・ヌクレオチド連鎖終止反応法を用いて分析した。順向プライマ（ｓｓＤＮＡ塩基配列決定）および逆向プライマ（ｄｓＤＮＡ塩基配列決定）での塩基配列決定反応のためにＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２塩基配列決定キット（スエーデン国Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた。これらの反応物に、３５Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用してラベルをつけた。６％のポリアクリルアミド・ゲルを、塩基配列決定装置Ｓ２（アメリカ合衆国Ｌ．Ｔ．Ｉ． Ｉｎｃ．社）を使用して５０Ｗでランさせた。ほぼ１６時間、Ｋｏｄａｘの増感スクリーン・カセット内のＫｏｄａｘ ＭＲ Ｂｉｏ−Ｍａｘフィルムを露光させることによって、オートラジオグラフィを行った。次いで、これらのフィルムをＫｏｄａｘ現像液、Ｋｏｄａｘ定着液で現像した。配列は、手動で読み込んだ。クローンＲ６５の５’配列の最初の３００個の塩基は、グレープＲＳ遺伝子のＰＳＶ２１グループに属することを示した。
【００４７】
水治療法カーブ
ペンシルバニア州立大学の生化学および分子生物学部によって維持されている水治療法プロットについてのウェブサイトを利用して、Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ ＲＳ（ｐＳＶ２１）、Ｐｈａｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐ． ＢＳ（ｐＢｉｂｓｙ８１１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ＲＳ（ａｒｑｒｅｓｏｌ）、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ＳＴＳ（ＰＳＴＳ１）に対し、水治療法カーブをプロットした。水治療法カーブは、Ｋｙｔｅ／Ｄｏｌｉｔｔｌｅ法に基づいてプロットした。
【００４８】
Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子の発現ベクターへのクローン化
Ｖｉｔｉｓ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子の４つのクローンを発現ベクターｐＢＩ １２１にクローン化した。クローンＲ６５、，Ｇ１４， Ｇ１７は、ＢａｒｎＨＩ及びＳａｃｌ制限サイトを介して、ｐＢＩ １２１ベクターにクローン化された。クローンＲ１は、それぞれ、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲ１制限サイトを介して、ｐＢＩ １２１にクローン化された。遺伝子は、構成ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモータによってドライブされた。クローン化したベクターが、図２Ａ〜図２Ｄに示してある。
【００４９】
ＲＳ遺伝子構造を含むプラスミドのアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４への転換
１．  培養液と、トランスフォーマントのプレート及びリストリークに対し、充分なＹＥＰを調製する。トランスフォーメーションあたり５ｍｌの培養液、外植用に１ｍｌ、プレート用に２０〜４０ｍｌ必要である。（ＹＥＰ：固形１０ｇ／ｌ ｐｈｙｔａｇａｒあたり、１０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ， １０ｇ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ， ５ｇ ＮａＣｌ；）。
２．  ２８℃で２ｍｌのＹＥＰ内においてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ＬＢＡ ４４０４のコロニーＯ／Ｎを成長させる。
３．  予備の２５０ｍｌのフラスコに５０ｍｌのＹＥＰを加え、６００ナノメートルの波長で０．５〜１のＯＤに２５０回転数／分でシェイクする。
４．  ５分間、氷上で培養株を冷やし、５分間、５，０００回転数／分以下で回転させる。
５．  上澄みを慎重に別容器に移し、１ｍｌの０℃、２０ｍＭのＣａＣｌ２内でチューブを再懸濁させる。０℃で静かにかつ完全に再懸濁させる。
６．  ０．１ｍｌのアリクォットを予め冷やしておいた微量遠心チューブに計量分配する。
７．  ＤＮＡのラグ（ｌｕｇ）を細胞に加え、静かにかつ徹底的に混ぜ合わせ、ドライアイス−ＥｔＯＨ浴内で凍結させる。
８．  ５分間、３７℃浴内に細胞を置く。
９．  １ｍｌのＹＥＰを加え、２〜４時間、静かにシェイクしながら培養する。
１０．微量遠心管内において４０００回転数／分で４５秒間、遠心分離する。
ピペット・チップで、前部で１００〜２００μｌの培地を別容器に移し、ピペット操作および／または渦作用によって残りの培地に細胞を再懸濁させ、２５μｇ／ｍｌカナマイシン上で培養する。培養は２８℃で行う。２〜３日でコロニーが現れるはずである。
【００５０】
アグロバクテリウムによる赤レタスの転換
１．  レタス種子、Ｖａｒ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌを、１０分間、１０％ｗ／ｖのｃｈｌｏｒｏｘで表面滅菌し、清潔な蒸留水で３回洗浄した。
２．  ９ｃｍ直径のペトリ皿に入れた発芽培地で種子を発芽させた（３０種子／皿）。１８ｕｍｏ１／ｓ／ｍ２光度の光を１６時間照射しながら２４℃で培養した。
３．  バイナリ・ベクターｐＢＩ１２１構造（Ｒ１，Ｒ６５，Ｇ１４，Ｇ１７）を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＬＢＡ４４０４を、２１０回転数／分のシェーカ内で１日間、ｐＨ７の、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩および２ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で生育した。
４．  ９ｃｍ直径のペトリ皿にＵＭ寒天培地の２０ｍｌアリクォットを注入し、凝固させる。
５．  ＵＭ液内に１枚の滅菌済み７ｃｍ直径ワットマン濾紙を浸漬し、ＵＭ寒天培地の表面上へ置く。
６．  ７日経った苗から、葉柄を残して子葉を切り取り、子葉の頂点を除去する。細い針を用いて背軸に切れ目を入れる。外科用メスを使用して、子葉の表面を横切って浅い切れ目（１ｍｍ間隔）を入れる。アグロバクテリウム培養液内に１０分間、子葉を浮かせる。アグロバクテリアを使用しないことを除いて、同じように制御を行う。
７．  子葉を取り出し、滅菌済みの濾紙でブロット乾燥させ、用意したＵＭ皿（１０子葉／皿）に移す。種子を発芽させるのと同じ条件の下に、２日間培養する。
８．以下のようなテスト・プレートをセットアップする。
９．  Ａ．アグロバクテリウム接種のない対照外植体
ｉ．   ＳＩ培地
ｉｉ．  ＳＩ培地＋１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩、
ｉｉｉ． Ｓｉ培地＋１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩。
Ｂ．アグロバクテリウムを接種した外植体
ｉ．   ＳＩ培地＋１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩、
ｉｉ．  ＳＩ培地＋１５０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩。
１０．  外植体をＳＩ培地に移し、約２ｍｍ深さまで子葉の柄端を培地内に浸漬する。種子の発芽に関して培養を行い、１７日ごとに新しいＳＩ寒天培地で植え継ぎ培養する。
１１．  ４０日後、カルスおよび新芽を作出した外植体を２５０ｍｌ容量のフラスコに移す。各フラスコには、６０ｍｌのＳＩ寒天培地と０．１１％ｗ／ｖのＣａｒｂｅｉｃｉｌｌｉｎが入っている。１フラスコあたり４つの外植体を、８０ｕｍｏｌ／ｓ／ｍ２の光度の強い光で培養する。
１２．  約１ｃｍ高さになったときに新芽を発根培地に移し、８０ｕｍｏｌ／ｓ／ｍ２の光度の強い光で培養する。
１３．  発根時、植物を慎重に容器から取り出し、寒天を洗い流し、バーミキュライトを満たした１０インチの鉢に植物を移す。３日間、清潔なポリエチレン袋で植物を囲い、それらを取り出す。次いで、植物を充分な太陽光の下で生育させ、Ｇｒａｖｉｏｔａ肥料を与える。３５日後に、これらの植物をノーザン、サザンについて分析し、レズヴァーラトロール収量についてのＨＰＬＣ分析用の有機溶媒を使用して抽出を行った。
【００５１】
遺伝子導入植物の選択
ピアシング後、アグロバクテリアを有する子葉が構造物を担持する。次に、子葉をＵＭ寒天培地に浸漬し（１５子葉／プレート以下）、２日間、１８ｕｍｏｌ／ｓ／ｍ２（昼光色蛍光灯）の光度、１６時間の光周期で、２３±２℃において培養した。
２日後、子葉をＳＩ寒天培地上に置き、背軸面を培地と接触させた。子葉は、上記の条件で生育させた。色選択のために、子葉を２１日ごとに新しいＳＩ寒天培地に植え継ぎした。１ｍｍ以下の段階で赤色になった小さい新芽を廃棄する一方で、ピンク色及び緑色になっている小植物は、２日間、ＵＭ寒天培地に置いた。そして、前記ピンク色または緑色の小植物の内、この段階で赤くなってしまったものも廃棄し、残ったピンク色あるいは緑色の小植物を新しいＳＩ寒天培地に植え継ぎした。そして、高さ１ｃｍ以下になった植物を発根用寒天培地に植え置いた。
カナマイシン選択のために、１週間、ＳＩ寒天培地に置いた後、子葉をＳＩ＋１５０μｇ／ｍｌカナマイシン硫酸塩寒天培地へ移し替えた。そして、４週間毎に、ＳＩ＋１５０μｇ／ｍｌカナマイシン硫酸塩寒天培地に植え継ぎを行った。
【００５２】
上記の手順を使用して、Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子を赤レタスにクローン化するのに成功し、遺伝子導入レズヴァーラトロールが遺伝子導入植物に作出した。上記の方法を使用することによって得られた結果を以下に示す。
受容植物材料
４つの栽培品種のＬａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａを、アントシアニン・レベルおよび再生能力を見つけるために、試験管内でテストした。４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡはこれらの２つの生合成経路に対して共通の前駆体であるから、このテストの後で、レズヴァーラトロールに対する前駆体（すなわち、４−クマロイルＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡ）の量をアントシアニン・レベルから推定することができるようになる。４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡのレベルは、当業者が直接決定することができ得るもので、本発明の範囲内にあると考えられることは了解されたい。
【００５３】
表１は、 Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｃａｎａｓｔａ、Ｌｏｌｌｏ Ｒｏｓｓａ、Ｒｅｄ Ｒａｐｉｄ、Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌについての、ＵＭ培地での２日後の子葉の赤み、ＳＩ培地での１４日後のＣａｌｌｉの色、およびＳＩ培地での３７日後の再生能力の分析を示している。
【００５４】
以下に示す表１からわかるように、ＵＭ培地において２日後、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌの子葉が最も赤色が強く、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌの子葉が最も赤色が弱いことが示された。ＳＩ培地で２週間後にＣａｌｌｉが形成され、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｃａｎａｓｔａ、 Ｌｏｌｌｏ ＲｏｓｓａおよびＲｅｄ Ｒａｐｉｄが他の色のＣａｌｌｉよりも明るい緑色のＣａｌｌｉを有することを示した。Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌに関して、赤Ｃａｌｌｉは、他の色のＣａｌｌｉよりも高いパーセンテージで存在した。Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＲａｐｉｄおよびＲｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌのみが、ピンク色、暗赤色、白色のＣａｌｌｉを有していたた。
【表１】
2005502304.tif 000003
【００５５】
２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）、オーキシンは、アントシアニンの形成をトリガする。高アントシアニン作出は、転換に使用しようとしている栽培品種を選ぶ基準の１つである。アントシアニン・レベルが高ければ高いだけ、それだけ利用できる基質（４−ｃｏｕｒｍａｒｏｙｌ−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡ）が多いことを意味する。したがって、ＳＴＳ遺伝子が赤レタスに転換されたとき、遺伝子生成物は使用するに充分な基質を有する。このことは、遺伝子導入植物の色選択を容易にする。たとえば、子葉の未転換部が赤い場合、明るいピンクまたは暗いピンクへの色変化がより顕著になる。さらに、 Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌの子葉は、子葉全体にわたって均一な色を有する（図３ａ）。
【００５６】
再生能力に関しては、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌ では９０％以上、ｃａｌｌｉが小植物で再生された。Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌは、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｃａｎａｓｔａや、 Ｌｏｌｌｏ Ｒｏｓｓａや、Ｒｅｄ Ｒａｐｉｄと比較して、最高の再生能力を持っていた。Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｒａｐｉｄでは、約７０％〜９０％のｃａｌｌｉが小植物に再生されていた。このことは、遺伝子導入植物を選択するに必要とされる時間を短縮することになろう。故に、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌが、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子の転換用の植物材料として選択されるものである。
【００５７】
Ｒｅｄ ＦｌａｍｅブドウからのＲＳ遺伝子
プライマ判定
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ （ｐＳＶ２１、ｐＳＶ２５、ｐＳＶ３６８）およびＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｌａｍｂｒｕｓｃｏａ Ｆｏｇｌｉａ Ｆｒａｓｔａｇｌｉａｔａ （ＶＶＬＳＴＳ）から分離した既存のブドウＲＳｃＤＮＡのＣｌｕｓｔａｌＷ配列は、非常に類似しており、８７．５％の相同性を共有していることを示した（図４）。配列の５’，３’端での共通領域を、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅから標準長遺伝子を分離するために決定した。５’プライマは、５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＡＡ ＣＴＴ ＡＡＴ ＣＴＴ ３’（３５ＧＳＴＳ１と呼ぶ）を決定し、そして、３’プライマは、５’ＡＴＣ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＴＴＡ ＡＴＴ、ＴＧＴ ３’（３５ＧＳＴＳ２ａと呼ぶ）を決定した。これらは、図４において赤で強調してある。３５ＧＳＴＳ１は、ＳａｌＩリンカーを、３５ＧＳＴＳ１Ｃ２ａは、ＣｌａＩリンカーを、共に５’端のところに含む。
【００５８】
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子のｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ推定クローン
ＭＷ１．３ｋｂのＶｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子を、ＲＴおよびＰＣＲ後に得た。ｐＧＥＭ−Ｔ（＋）における１８のクローンのうち、１２のクローンは、ＳａｌＩおよびＣｌａＩでの消化後、０．９ｋｂから１．６ｋｂまでのインサート・サイズを含んでいた。ｇＤＮＡについては、１．６ｋｂの断片が得られた。ＳａｌＩおよびＣｌａＩで消化した１８のクローンは、すべて、１．５ｋｂから１．６ｋｂまでのインサート・サイズを含んでいた。
【００５９】
制限酵素マッピング
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅの１２のｃＤＮＡクローン及び１８のｇＤＮＡクローンに、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの消化を行った。Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＦｌａｍｅのｃＤＮＡの３つのクローンが、現存のブドウＲＳ遺伝子と同様の制限酵素マップを有することがわかった（図５ａ）。ｃＤＮＡの３つのクローンの制限マッピング、Ｒ１，ＲＳ，Ｒ８が、図５ｃに示してある。Ｒ１のサイズは、１．３ｋｂであり、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトではなくて１つのＫｐｎＩサイトを所有していた。Ｒ５に関して、それは、１．２ｋｂのサイズを有し、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの各サイトに対して１つのサイトを持っていた（表２）。これら３つのクローンに、制限酵素マップが現存のブドウＲＳのそれとなんら類似性を示さない他の３つのクローン（Ｒ３，Ｒ６，Ｒ１２）と共に、配列分析を行った。
【００６０】
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＦｌａｍｅのｇＤＮＡクローンのインサートのＭＷが、表２に列挙してある。１８のクローンのうち、４つのクローンは、１．５ｋｂサイズであり、５つのクローンは、１．６ｋｂサイズであった。すべてのクローンが、ＰｓｔＩ、 ＫｐｎＩサイトを有すると共に、１つのクローン（Ｇ１３）だけは、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを持っていた。Ｇ１３，Ｇ１４およびＧ１７についての制限マップが、図５の（ｄ）に示してあり、互いに類似している。９つすべてのクローンに、配列分析を行った。
【表２】
2005502304.tif 000004
【００６１】
配列分析
ＢＬＡＳＴプログラム（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用する最初の３００ｂｐ配列分析では、ｃＤＮＡクローン、ＲｌおよびＲ５は、表３で示すように、ｐＳＶ２５に対し９４．５％相同体であったことを示した。しかし、Ｒ５は８５ｂｐが無くなっていた。Ｒ３，Ｒ６５およびＲ１２については、これらは皆ｐＳＶ２１に対して同じ配列で、９７．５％の相同性を持っていた。Ｒ６は、図６に示すように、ＶＶＬＳＴＳに対して相同であり、９９％の相同性レベルを有するが、８２ｂｐが失われていた。
【００６２】
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＦｌａｍｅのｇＤＮＡクローンに関しては、Ｇ１３は、ｐＳＶ２１に対して９３％の相同性を示した（表３）。表３に示される４つのｇＤＮＡクローン（Ｇ５，Ｇ９，Ｇ１４，Ｇ１７）は、ＶＶＬＳＴＳに対して９９％の相同性であった。最初の３００ｂｐ塩基配列決定分析後、これら４つのｇＤＮＡクローンは、同じ配列であるとわかった。
【表３】
2005502304.tif 000005
【００６３】
ｐＳＶ２１およびＶＶＬＳＴＳに対して相同であるクローンをｃＤＮＡおよびｇＤＮＡの両方から分離したので、配列はこれらのクローン間で行った。図７において、Ｒ１２およびＧ１３は、類似しているが、各に同一ではなかった。同じ結果が、Ｒ６およびＧ１４についても得られた（図６）。
【００６４】
水治療法カーブ
図６に示した Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ ＲＳ （ｐＳＶ２１）、 Ｐｈａｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐ． ＢＳ （ｐＢｉｂｓｙ８１１）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ＲＳ （ａｒｑｒｅｓｏｌ）およびＰｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ＳＴＳ （ＰＳＴＳ１）についての水治療法カーブは、互いに類似している。これらを３つのメイン領域に分けた。すなわち、疎水性Ｎ末端（ａ．ａ．  １〜１２７）、親水性中間部（ａ．ａ．  １２８〜３１３）、疎水性混合物、そして、親水性Ｃ末端（ａ．ａ．  ３１４〜３９２）である。ａ．ａ位置は、ｐＳＶ２１に基づいている。
【００６５】
クローンｐＵＣＳＴＳ−Ｒ１，Ｒ３，Ｒ１２は、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅからの標準長ｃＤＮＡ  ＳＴＳ遺伝子である。配列分析によれば、これらは、ｐＳＶ２５（Ｒ１）及びｐＳＶ２１（Ｒ３およびＲ１２）に対して相同である。これらのｃＤＮＡクローンのＭＷは、５’（３５ＧＳＴＳ１）および３’（３５ＧＳＴＳ２ａ）プライマを使用した場合、１．１７９ｋｂから１．２３７ｋｂまでの範囲となる、予期したＭＷとは一致しない。しかし、これらは、それぞれ１．３２３ｋｂ，１．３ｋｂ，１．２５１ｋｂ，１，５４７ｋｂであるｐＳＶ２１、ｐＳＶ２５、ｐＳＶ３６８、ＶＶＬＳＴＳのＭＷに一致する（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ ａｎｄ Ｋｉｎｄｌ， Ｏｐｔｉｍａ． Ａｒｃｈ． Ｂｏｏｃｈｅｍ， ａｎｄ Ｂｉｏｐｙ． ２８８：５５２−５５７， １９９１ ａｎｄ Ｓｐａｖｏｌｉ Ｆ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４：７４３−７５５， １９９４）。
【００６６】
さらに、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ１２の制限マップは、現存のブドウＲＳ遺伝子と同じではない（図５ａおよび図５ｃ）。これらの違いは、使用される異なった栽培品種によって説明され得る。
【００６７】
ｐＵＣＳＴＳ−Ｒ５およびＲ６に関しては、配列分析は、これらが、それぞれ８５ｂｐ及び８２ｂｐ欠失を有することを示した。Ｒ５はｐＳＶ２５に相同であり、Ｒ６はＶＶＬＳＴＳに相同であるが、この欠失が、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）に転位を生じさせる。翻訳が３つのコードンを使用してアミノ酸を作るとき、オープンリーディングフレームにおける転位は、タンパク質の機能性に影響を及ぼす。したがって、これらの２つのクローンは、クローン化人為結果と考えられる。
【００６８】
分離したｇＤＮＡクローンｐＵＣＳＴＳ−Ｇ５，Ｇ９，Ｇ１３，Ｇ１４，Ｇ１７は、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅからの標準長ＳＴＳ遺伝子である。１．５ｋｂ〜１．６ｋｂの範囲にあるクローンのサイズは、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａから分離したｇＤＮＡ  ＳＴＳ遺伝子、Ｖｓｔ１およびＶｓｔ２に一致する（Ｗｉｅｓｅ Ｗ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：６６７−６７７， １９９４）。
【００６９】
Ｖｓｔ１およびＶｓｔ２の配列は、イントロンの配列についてを除いて利用できないので、ｇＤＮＡ  ＳＴＳクローンの配列分析は、Ｖｓｔ１およびＶｓｔ２と比較することはできない。しかし、Ｖｓｔ１は、ｐＳＶ２５に対して９８％の相同である（Ｗｉｅｓｅ Ｗ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：６６７−６７７， １９９４）。したがって、ｇＤＮＡ  ＳＴＳクローンは、ｐＳＶ２５とも比較することができない。配列分析から、得られたｇＤＮＡクローンは、ｐＳＶ２１（Ｇ１３）、或いは、ＶＶＬＳＴＳ（Ｇ５，Ｇ９，Ｇ１４，Ｇ１７）のいずれかと相同である。このことは、異なった栽培品種を使用することによって、再度説明できる。別の理由としては、ｐＳＶ２５に類似する遺伝子が、この実験において分離されていないことにあるかも知れない。
【００７０】
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＦｌａｍｅからのｇＤＮＡ  ＲＳクローンの制限マップは、現存のＲＳ遺伝子の制限マップに対する類似性を示さない（図５ａ，５ｂ，５ｄ）。いろいろ異なった栽培品種を使用したことが、この結果に対する理由かも知れない。
【００７１】
Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ ＦｌａｍｅのｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ  ＲＳ遺伝子について完全な配列が得られなかったことにより、ＲＳ遺伝子のこれらのクローンについての水治療法カーブはプロットできない。しかしながら、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ ＳＴＳ （ｐＳＶ２１）と、Ｐｈａｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐ． ＢＳ （ｐＢｉｂｓｙ８１１）と、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ＳＴＳ（ａｒｑｒｅｓｏｌ）と、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ＳＴＳ（ＰＳＴＳ１）とについての水治療法カーブは、図３に示すように、他の３つのメイン領域と互いに類似していた。Ｐｒｅｉｓｉｇ−Ｍｕｌｌｅｒ Ｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６：８３４９−８３５８， １９９７は、ＳＴＳとＢＳとのＮ−末端が、基質認識または特定の原因となるとともに、Ｃ−末端が、生成物形成の原因となることを示している。異なった植物のＳＴＳは、完全に保存される。また、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ（ｐＳｖ２１）およびＡｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ＲＳ（ａｒｇｒｅｓｏｌ）がレズヴァーラトロールを作出し、Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ＳＴＳ（ＰＳＴＳ１）が生成物としてピノシルビンを作出するにもかかわらず（Ｓｃｈａｎｚ Ｓ．， ＦＥＢＳ． ３１３（１）：７１−７４， １９９２）、これら３植物間のＳＴＳは類似している。
【００７２】
ＳＴＳおよびＢＳも保存される。ＳＴＳが４−クマロイル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを利用するのに対し、ＢＳは、ｍ−ｈｙｄｒｏｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡおよびｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡを利用するのであるが、それにもかかわらず、これらの水治療法カーブは類似している。Ｆｌｉｅｇｍａｎｎ Ｊ． （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８：４８９−５０３， １９９２）によれば、ＳＴＳは、オリジナルの好ましい基質以外の基質を利用できるが、率は低い（Ｋｍ値よりも低い）。これにより、類似する水治療法カーブの説明が可能である。
【００７３】
転換植物の分析
種々の遺伝子構造で転換した植物を、ＲＶ濃度について分析した。その結果を表４に示す。
【表４】
2005502304.tif 000006
【００７４】
アントシアニン・レベルも分析した。表５は、対照および遺伝子導入Ｌ． ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ Ｂｏｗｌの、Ａ５３０／ｇで表したアントシアニン・レベルを示している。
【表５】
2005502304.tif 000007
【００７５】
分析は、植物を充分な太陽光の下に置いて目で観察したときに、アントシアニン・レベルが著しく低下したのを証明した。それ故、遺伝子導入レタスに見えるアントシアニン・レベルは、レズヴァーラトロール収量に反比例する。
【００７６】
種子は、高レベル（＞３μｇ／ｇ．ｆ．ｗ．）のレズヴァーラトロールを含む赤レタス植物内で生存できない。より低いＲＶレベル（＜１．５μｇ／ｇ．ｆ．ｗ．）では、種子は生存可能である。これらの転換された赤レタス植物のジュースは、（約１．２μｇ  ＲＶ／ｇ．ｆ．ｗ．を発現する釈転換植物の未希釈ジュースを得ることにより）約１μｇ／ｍｌから、（約４．８μｇ  ＲＶ／ｇ．ｆ．ｗ．を発現する転換植物の未希釈ジュースを得ることにより）４μｇ／ｍｌまでのＲＶ濃度を有するジュースを産出することができる。植物内に自然に発現されたＲＶはグリコシル化されて容易に人体に吸収されるから、このジュースは、そのまま飲むことができて、消費者は、ＲＶを吸収することができるようになる。あるいは、転換植物をドライフルーツまたは野菜として摂取してもよく、そうすれば、摂取するたびに、さらに多量の量のＲＶを摂取できるようになるのである。
【００７７】
遺伝子の安定性
・  ＜１．５μｇ／ｇ．ｆ．ｗ．のＲＶが発現した遺伝子導入植物の種子からの再生は、導入遺伝子が少なくとも２世代にわたって安定していることを示す。
・  ＞３μｇ／ｇ．ｆ．ｗ．のＲＶが発現した遺伝子導入植物の組織培養からの再生は、導入遺伝子が、試験管内で１０世代の再生後も安定していることを示す。
異なった遺伝子導入植物のＲＶのＨＰＬＣ分析が、図８Ａ〜図８Ｅに示してある。ＨＰＬＣ分析の方法は、次の通りである。
【００７８】
推定Ｌ． ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ ＢｏｗｌおよびＮ． ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉからの
レズヴァーラトロール摘出
レズヴァーラトロールを、若干の修正を行ったが、Ｈａｉｎ Ｒ． （Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５：３２５−３３５， １９９０）およびＣｅｌｏｔｔｉ Ｅ． （Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ． ７３０：４７−５２， １９９６）に記載されているような推定遺伝子導入Ｌ． ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ ＢｏｗｌおよびＮ． ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉから抽出した。
推定遺伝子導入Ｌ． ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ ＢｏｗｌおよびＮ． ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉからの新鮮な葉５ｇを液体窒素内において乳鉢、乳棒で粉状になるまで粉砕した。粉末が解け始める前に、新しいメタノール（ＭｅＯＨ）１ｍｌ／ｇを添加し、室温で２４時間、摘出を行った。ＭｃＯＨ摘出後、スラリーを１５分間７，０００回転数／分で遠心分離にかけ、細胞破片を除去した。２体積のミリ−Ｑ水を上澄みに加えた。この溶液を、１５秒間、９ｍｌの酢酸エチルと混ぜ合わせた。チューブを３分間、４℃まで冷却し、次いで、５分間、−２０℃に置いた。チューブの冷却は、有機相と水相とへの分離を向上させた。有機相を回収すると共に、水相を、６ｍｌの酢酸エチルでさらに二回抽出した。有機相を回収してから、無水ナトリウム硫酸塩を添加していかなる水の痕跡も除去した。水相は、アントシアニン判定のために使用した。有機相は、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴＭ真空コンセントレータで濃縮した。５０μｌのＭｅＯＨを乾燥サンプルに添加した。
【００７９】
ＨＰＬＣ分析
推定遺伝子導入サンプルは、ＳｈｉｍａｄｚｕのモデルＣＢＭ−１０  逆相ＨＰＬＣシステム（日本国島津製作所）を用いて分析した。６ｎｇ／μ１の、化学的に合成されたトランス・レズヴァーラトロール（アメリカ合衆国Ｓｉｇｍａ社）が、標準機として使用された。抽出サンプルの５０μｌを、移動相として、水：氷酢酸：アセトニトリル（７５：５：２０）を含むＣ１８カラム（１２５ｍｍ×５ｍｍ）に通した。流量は、０．５ｍｌ／ｍｉｎに設定し、ダイオードアレーＵＶ検出器（ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ）を３０６ナノメートルのところに設定した。レズヴァーラトロールの滞留時間は、約１７分であった。
【００８０】
可視光分光光度計を使用したアントシアニン判定
推定遺伝子導入Ｌ． ｓａｔｉｖａ ｃｖ Ｒｅｄ Ｓａｌａｄ ＢｏｗｌおよびＮ． ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｘａｎｔｈｉのアントシアニン判定で使用した方法は、若干変更したが、Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ （１９９０）に記載してある通りであった。アントシアニンは水相に溶解されるが、レズヴァーラトロールは有機相に溶解されるために、抽出方法は、レズヴァーラトロール判定の方法に従った。１ｍｌの水相を、光路１０ｍｍキュベットにおいて、ＤｕＴＭ ６５０分光光度計（アメリカ合衆国Ｂｅｃｋｍａｎ社．）によって読んだ。５３０ナノメートルおよび６５７ナノメートルの吸光度を測定し、アントシアニン・レベルを式（Ａ５３０−０．２５Ａ６５７）／（新鮮重ｇ）によって算出した。アントシアニン濃度は、Ａ５３０／ｇとして表した。アントシアニンの吸収ピークが、吸光度５３０ナノメートルで測定された。６５７ナノメートルでの吸収ピークに関しては、酸性ＭｃＯＨにおける劣化葉緑素生成物が測定された。
【図面の簡単な説明】
【図１】
レズヴァーラトロールおよびナリンゲニン・カルコンの生合成経路の最終段階を示す。
【図２Ａ〜図２Ｄ】
Ｒ１ＲＳ遺伝子（図２Ａ）と、Ｒ６５ＲＳ遺伝子（図２Ｂ）と、Ｒ１４ＲＳ遺伝子（図２Ｃ）と、Ｒ１７ＲＳ遺伝子（図２Ｄ）とを担持しているプラスミドｐＢＩ１２１の遺伝子マップである。
【図３】
（ａ）Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｏｐｔｉｍａ ＲＳ（ｐＳＶ２１）、（ｂ）Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ ＲＳ（ａｒｇｒｅｓｏｌ）、（ｃ）Ｐｉｎｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ＳＴＳ（ＰＳＴＳ１）、そして（ｄ）Ｐｈａｌｅｎｏｐｓｉｓ ｓｐ． ＢＳ （ｐＢｉｂｓｙ８１１）、それぞれのハイドロパシー曲線である。
【図４Ａ〜図４Ｄ】
ＣｌｕｓｔｒａｌＷを使用して配列させられた４つの現存のブドウＲＳｃＤＮＡ、ｐＳＶ２１、ｐＳＶ２５、ｐＳＶ３６８およびＶＶＬＳＴＳを示す。標準長Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ＲＳ遺伝子を分離するために使用されるプライマが、箱状に囲んだ部分に示してある。
【図５】
（ａ）ブドウＲＳ（ｐＳＶ２１、ｐＳＶ２５、ｐＳＶ３６８、ＶＶＬＳＴＳ）、（ｂ）ブドウＲＳイントロン（Ｖｓｔｌ−１およびＶｓｔ２−１）、（ｃ）Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ｃＤＮＡ（Ｒ１，Ｒ５，Ｒ８）、（ｄ）Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ． Ｒｅｄ Ｆｌａｍｅ ｇＤＮＡ（Ｇ１３，Ｇ１４，Ｇ１７）、それぞれの制限マップであり、箱で囲んだ領域にイントロンがある。
【図６】
推定のブドウＲＳ ＣＤＮＡ Ｒ６、  ＧＤＮＡ Ｇ１４、ブドウＲＳ ＶＶＬＳＴＳ の間のＤＮＡ配列である。
【図７】
推定のＲＳ ｃＤＮＡ Ｒ１２、ｇＤＮＡ Ｇ１３、ブドウＲＳ ｐＳＶ２１間のＤＮＡ配列である。
【図８Ａ〜図８Ｅ】
対照におけるＲＶの分析に対するＨＰＬＣ溶出プロフィール（図８Ａ）と、プラスミドＧ１４（図８Ｂ），Ｇ１７（図８Ｃ），Ｒ１（図８Ｄ），Ｒ１５（図８Ｅ）を含有する遺伝子導入ラインである。ＲＶピークは矢印で示してある。
【図１】
2005502304.tif 000008
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2005502304.tif 000014
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
2005502304.tif 000019
【図７】
2005502304.tif 000020
【図８Ａ】
2005502304.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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