(57)【要約】本発明は、霊長動物多能性幹細胞を分化させることにより軟骨細胞系譜の細胞を取得するための系を提供する。その過程は、所望の細胞種の増殖を促進する分化剤の混合物中で、細胞を微小集積または他の凝集形態として培養する段階を含む。子孫は、II型コラーゲンもしくはアグリカン、または軟骨細胞系譜に特有の他の産物を合成し得る。本開示に従って得られる軟骨細胞および軟骨細胞前駆細胞は、研究および臨床療法における使用に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも5%の細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する、霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる細胞集団。  
【請求項２】
少なくとも5%の分化細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成し、
系が分化細胞が産生される元となった未分化pPS細胞系譜をさらに含む、
軟骨細胞系譜の細胞を産生する系の一部として霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる細胞集団。
【請求項３】
請求項1記載の分化細胞集団、および得られる元となった未分化pPS細胞を含む、膵臓ホルモン分泌細胞を産生する系。
【請求項４】
エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する細胞が1%未満である、前記請求項のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項５】
Koppelら、Biomaterials 22:1407、2001に記載される動物モデルにおいて2ヶ月以内に6 mm穴を閉鎖する、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項６】
霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られ、請求項1〜3記載の分化細胞の特徴を有する子孫を形成し得る、インビトロ培養において増殖する軟骨細胞前駆細胞の集団。
【請求項７】
含んでいる未分化pPS細胞が1%未満である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項８】
テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）を高レベルで発現するように遺伝子改変した細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項９】
霊長動物胚幹細胞の樹立株と同じゲノムを有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項１０】
pPS細胞を分化させ、その後分化細胞を軟骨細胞分化因子の混合物と共に培養する段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を取得する方法。
【請求項１１】
pPS細胞を分化させて胚様体を形成する段階を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
軟骨細胞分化因子の混合物が、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、増殖分化因子（GDF）、骨形成タンパク質（BMP）、ヘッジホッグタンパク質（HH）、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
細胞集団がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する条件下で、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団をインキュベートする段階を含む、軟骨を産生する方法。
【請求項１４】
生理的適合性賦形剤中の請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を含む、インビボで軟骨を産生、修復、または維持するための薬学的組成物。
【請求項１５】
インビボで再吸収される基質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
化合物を請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団と混合する段階、化合物と混合したことに起因する細胞集団における任意の表現型変化または代謝変化を判定する段階、およびその変化を化合物が軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力と関係づける段階を含む、軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団を被験者に投与する段階を含む、被験者において軟骨を再構築する方法。
【請求項１８】
被験者において軟骨を再構築する医薬品の調製における、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団の使用。
【請求項１９】
関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症を治療する、または美容整形に使用する医薬品の調製における、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団の使用。
【請求項２０】
pPS細胞がヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項２１】
pPS細胞がヒト胚幹細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、細胞生物学、胚幹細胞、および細胞分化の分野に関する。軟骨の特徴を有する、新しい供給源由来の分化細胞を開示する。
【０００２】
関連出願の参照
本願は、2001年12月7日に出願された米国特許仮出願第60/339,043号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
軟骨破壊は2つの疾患群の顕著な特徴である：変性疾患である変形性関節症、および主に炎症に起因する関節リウマチ。破壊は、関節痛およびかなりの身体障害となり得る程度の運動機能障害を引き起こす。
【０００４】
過去20年間で、疾患の進行を阻害するのに効果的な抗炎症薬の開発において、かなりの進歩がなされた。しかし、破壊が既に起こっている場合、関節軟骨の再生を助けるためには新たな療法が必要である。
【０００５】
再生医療の分野における最近の試みは、軟骨を修復し得る細胞集団の開発に向けられてきた。国際公開公報第96/18728号は、関節軟骨細胞の樹立株について報告している。国際公開公報第98/55594号は、軟骨細胞を増殖および分化させる方法を報告している。国際公開公報第00/27996号は、最小必須培地、増殖因子、脂質、およびアミノ酸を含む、軟骨細胞様細胞用の無血清培地を報告している。米国特許第6,150,163号（Genzyme）では、脱分化したヒト関節軟骨細胞をTGF-βおよびインスリンまたはインスリン様増殖因子を含む培地中で培養するという、軟骨細胞培地の組成および培養手順を概説している。
【０００６】
Jorgensenら（Ann. Rheum. Dis. 60:305, 2001）は、関節炎において軟骨および骨を修復するための幹細胞における最近の進歩について概説している。Jakobら（J. Cell. Biochem. 26:81, 2001）は、軟骨形成（chondrogenesis）および軟骨の形成（cartrilage formation）を増強する、成人ヒト関節軟骨細胞の拡大および再分化に関与する特異的増殖因子を研究した。M. Brittberg（Clin. Orthop. 367 Suppl:S147, 1999）は、純粋な軟骨細胞または他の間葉細胞を自己からまたは健常組織供給源由来の同種移植片として回収し、インビトロで拡大し、次に欠損症の人に高密度で移植するという、現在の軟骨細胞移植手順について概説している。
【０００７】
これらの臨床方法は当初こそ成功したものの、病院に来院する軟骨変性のほとんどの例を治療するためには、軟骨細胞の現在の供給源では不十分であることは明らかである。
【０００８】
Kramerら（Mech. Dev. 92:193, 2000）は、マウス胚幹細胞を骨形成タンパク質（BMP-2およびBMP-4）で調節し、軟骨細胞の特徴であるアルシアンブルーで染色し、かつ転写因子スクレラクシスを発現する細胞を産生し得ることを報告した。残念ながら、胚幹細胞発生のマウスモデルはそれ自体特異な例であり、他の種に適用可能な分化のためのストラテジーはもたらされていない。実際に、多能性幹細胞が再現性よく単離される他の哺乳動物種はほとんど存在しない。
【０００９】
ごく最近になって、Thomsonらがヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Science 282:114, 1998）。同時に、Gearhartらが胎児性腺組織からヒト胚生殖（hEG）細胞株を導出した（Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998）。単に白血病抑制因子（LIF）と共に培養することにより分化から回避され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は非常に特別な条件下で維持されねばならない（米国特許第6,200,806号；国際公開公報第99/20741号；国際公開公報第01/51616号）。
【００１０】
したがって、ヒト多能性細胞を十分に機能的な分化細胞種に分化させる、全く新しいパラダイムを開発することが必要である。
【発明の開示】
【００１１】
概要
本発明は、多能性細胞から軟骨細胞系譜の細胞に分化した霊長動物細胞を効率的に産生する系を提供する。研究および臨床療法に適した軟骨細胞が大幅に濃縮された細胞集団について説明する。
【００１２】
本発明の1つの態様は、霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる、軟骨細胞を含む細胞集団である。例示的なpPS細胞はヒト胚幹細胞である。軟骨細胞系譜の細胞は、内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する能力によって同定され得る。好ましくは、集団は、弾性軟骨、繊維軟骨、肥大軟骨、または骨を最低限の比率で含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、pPS細胞を分化させることによって得られ、成熟軟骨細胞の特徴を有する子孫を形成し得る、インビトロ培養で増殖する軟骨細胞前駆細胞の集団である。軟骨細胞はもはや多能性ではなく、軟骨細胞発生経路に拘束されている。集団内の未分化多能性細胞の比率は好ましくは最低限に抑えられ、残りの未分化細胞はさらなる増殖において軟骨細胞の形成に関与する細胞ではない。選択的に、テロメラーゼ活性を増加させることにより幹細胞の複製能力を改善することができる。
【００１４】
本発明の別の態様は、（例えば、胚様体を形成させることにより）pPS細胞を分化させる段階、次の微小集積培養等において軟骨細胞分化因子の混合物と共に分化細胞を培養する段階を含む、本発明の細胞集団を取得する方法である。適切な因子は本開示で後にさらに詳細に記載するが、これには、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、増殖分化因子（GDF）、骨形成タンパク質（BMP）、ヘッジホッグタンパク質（HH）、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）が含まれる。
【００１５】
本発明の別の態様は、結合組織タンパク質が産生される条件下で本発明の細胞集団をインキュベートすることにより、軟骨を産生する方法である。本発明の別の態様は、化合物を本発明の細胞集団と混合しその効果を判定することにより、軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の細胞集団を含む、インビボで軟骨を産生、修復、または維持する薬学的組成物、および例えば美容整形、または関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症の治療において、被験者の軟骨を再構築するそのような医薬品の使用である。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様を、以下の記載においてさらに説明する。
【００１８】
詳細な説明
本発明は、多能性幹細胞からヒト軟骨細胞を効率的に分化させる方法を示すことにより、この細胞の大きな集団を産生する問題を解決する。
【００１９】
まず通常の分化を開始させ、次に軟骨細胞の増殖を促進する因子の存在下で培養することによって分化過程に焦点を合わせることにより、ヒト胚幹（hES）細胞等の多能性幹（pPS）細胞を軟骨細胞分化経路に沿って誘導することができる。軟骨細胞系譜の細胞を効率的に産生するのに有用である因子の組み合わせの最適化を助けるストラテジーを開発した。本発明の技術は、II型コラーゲンおよびアグリカンのような結合組織成分の合成によってインビボで軟骨を形成し得る細胞が濃縮された細胞集団の産生に向けられている。
【００２０】
hES細胞は無期限に増殖させることができるため、hES細胞から軟骨細胞を効率的に産生する方法の開発は重要である。したがって本発明は、無限量の軟骨細胞を産生するために使用され得る系を提供する。
【００２１】
以下の開示は、本発明の軟骨細胞を作製する方法についての十分な説明を提供する。研究および医薬開発においてこれらの細胞がいかに用いられ得るかの広範な例証も提供する。本開示はまた、関節可動性を回復させるためまたは美容目的のための、軟骨の再生および再構築にpPS由来軟骨細胞を使用する薬学的組成物、装置、および治療方法を提供する。
【００２２】
定義
本開示の目的上、特記しない限り、「軟骨細胞」という用語は軟骨細胞経路由来の任意の細胞を意味する。これには、II型コラーゲンおよびアグリカンの合成により軟骨を形成し得る成熟細胞が含まれる。また、成熟軟骨細胞を形成するように拘束された、自己複製可能な前駆細胞も含まれる。
【００２３】
細胞の個体発生との関連では、形容詞「分化した」とは相対語である。「分化細胞」とは、比較する細胞よりも発生経路をさらに下方に進行した細胞のことである。
【００２４】
本開示で用いる「分化剤」とは、軟骨細胞系譜の分化細胞（前駆細胞および最終的分化細胞を含む）を産生するために、本発明の培養系に用いる一群の化合物の1つを指す。化合物の作用形態に関しては限定しない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導もしくは補助することにより、特定の表現型により細胞の増殖を促進することによりまたは他の増殖を遅延させることにより、分化過程を補助する可能性がある。それはまた、培地中に存在する、または、そうでなければ望まれない細胞種への経路に沿って分化させる細胞集団によって合成される可能性がある他の因子に対する阻害剤として作用してもよい。
【００２５】
原型の「霊長動物多能性幹細胞」（pPS細胞）は受精後任意の時点の前胚組織、胚組織、または胎児組織由来の全能性細胞であり、8〜12週齡のSCIDマウスで奇形腫を形成する能力、または組織培養において同定可能な全3胚葉の細胞を形成する能力等の標準技術として公認の試験によると、適切な条件下で3つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）すべての派生物であるいくつかの様々な細胞種の子孫を産生し得る特徴を有する。この用語には、様々な種類の幹細胞の樹立株および記載の方法で多能性である初期組織から得られる細胞の両方を含む。
【００２６】
pPS細胞の定義には、Thomsonら（Science 282:1145、1998）によって記載されるヒト胚幹（hES）細胞、アカゲザル幹細胞（Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995）、マーモセット幹細胞（Thomsonら、Biol. Reprod. 55:254、1996）等の他の霊長動物の胚幹細胞、およびヒト胚生殖（hEG）細胞（Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998）に例示される様々な種類の胚細胞が含まれる。他の種類の多能性細胞もまた、この用語に含まれる。胚組織、胎児組織、または他の供給源由来であるか否かにかかわらず、全3胚葉の派生物である子孫を産生し得る霊長動物起源の任意の細胞が含まれる。pPS細胞は、好ましくは悪性の供給源由来ではない。細胞は核型が正常であることが望ましい（必ずしも必要とは限らない）。
【００２７】
pPS細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその派生物の実質的な割合が、胚起源または成体起源の分化細胞と明らかに区別できる未分化細胞の形態学的特徴を示す場合に、「未分化である」と記載される。未分化pPS細胞は当業者により容易に認識され、2次元の顕微鏡視野において、典型的に、高い核/細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーとして見える。集団内の未分化細胞のコロニーは、分化した隣接細胞に囲まれていることが多いと理解されている。
【００２８】
「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、他の種類の細胞と共培養され、第2の種類の細胞が増殖できる環境を提供する1つの種類の細胞を表すのに用いられる用語である。ある種類のpPS細胞は、初代マウス胚線維芽細胞、不死化マウス胚線維芽細胞、またはhES細胞から分化したヒト線維芽細胞様細胞により支持され得る。pPS細胞集団は、分割後にpPS細胞の増殖を支持するために新鮮なフィーダー細胞を添加せずに少なくとも1回増殖した場合、フィーダー細胞を「本質的に含まない」と称される。
【００２９】
「胚様体」という用語は「凝集体」と同義の専門用語であり、pPS細胞が単層培養において過剰増殖した場合または懸濁培養液中で維持される場合に現れる分化および未分化細胞の凝集塊を意味する。胚様体は、形態学的基準および免疫細胞化学法により検出可能な細胞マーカーによって識別可能ないくつかの胚葉に典型的に由来する、様々な細胞種の混合物である。
【００３０】
「増殖環境」とは、目的の細胞がインビトロにおいて増殖、分化、または成熟する環境のことである。環境の特徴には、細胞を培養する培地、存在し得る増殖因子または分化誘導因子、存在する場合には支持構造（例えば、固体表面上の基層）が含まれる。
【００３１】
任意の適切な人工的操作手段によりポリヌクレオチドが細胞に導入された場合、または細胞がそのポリヌクレオチドを受け継いだ最初に改変された細胞の子孫である場合、その細胞は「遺伝的に改変された」、「トランスフェクトされた」、または「遺伝的に形質転換された」と称される。ポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする転写可能な配列を含むことが多く、これにより細胞はこのタンパク質をレベルを増加して発現することが可能となる。改変された細胞の子孫が同じ改変を有する場合、遺伝的改変は「遺伝性である」と称される。
【００３２】
一般的技術
分子遺伝学および遺伝子工学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrookら、Cold Spring Harbor)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (MillerおよびCalos編)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、Wiley & Sons) の現行版に記載されている。分子生物学、タンパク質化学、および抗体技術は、Current Protocols in Protein Science（J.E. Colliganら編、Wiley & Sons)；Current Protocols in Cell Biology（J.S. Bonifacinoら、Wiley & Sons)、およびCurrent Protocols in Immunology（J.E. Colliganら編、Wiley & Sons)に見出すことができる。本開示で引用する遺伝子操作用の試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech、およびSigma-Aldrich Co.等の市販業者から入手可能である。
【００３３】
細胞培養法は、一般に、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique（R.I. Freshney編、Wiley & Sons）；General Techniques of Cell Culture（M.A. HarrisonおよびI.F. Rae、Cambridge Univ. Press）、およびEmbryonic Stem Cells: Methods and Protocols（K. Turksen編、Humana Press）の現行版に記載されている。組織培養用の供給品および試薬は、Gibco/BRL、Nalgene-Nucn International、Sigma Chemical Co.、およびICN Biomedicals等の市販業者から入手可能である。
【００３４】
軟骨の生物学および病理学の一般的局面、ならびに関節の維持における軟骨細胞の役割は、以下の参考教科書に見出すことができる：J.F. Stoltz編によるMechanobiology: Cartilage and Chondrocyte、IOS Press 2000；M.Adolphe編によるBiological Regulations of the Chondrocytes、CRC Press 1992；G.E. Friedlaenderら編によるBone and Cartilage Allografts、Amer. Acad. Orthopaedic 1991；J.F. WoessnerおよびD.S. Howell編によるJoint Cartilage Degradation、Marcel Dekker 1992；R.B. MartinらによるSkeletal Tissue Mechanics、第2版、Spring Verlag 1998；Molecular and Developmental Biology of Cartilage、B. DeCrombruggheら編、Ann. N.Y. Acad. Sci. Vol.785:1996；およびP.K. Levangieら編によるA Comprehensive Analysis、第3版、F A Davis, 2000。
【００３５】
幹細胞の供給源
本発明は、様々な種類の幹細胞を用いて実施され得る。幹細胞のうち本発明での使用に適した細胞は、胚盤胞または妊娠中の任意の時点で採取される胎児もしくは胚組織等の、妊娠後に形成される組織由来の霊長動物幹（pPS）細胞である。限定されない例は、以下に例証するような、胚幹細胞または胚生殖細胞の初代培養または樹立株である。
【００３６】
本発明の技術は初代胚組織または胎児組織に直接実行することも可能であり、この場合、最初に未分化細胞株を樹立することなく、軟骨細胞を生じる可能性を有する初代細胞から直接軟骨細胞を導出する。
【００３７】
胚幹細胞
胚幹細胞は、霊長動物種のメンバーの胚盤胞から単離され得る（米国特許第5,843,780号；Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844、1995）。ヒト胚幹（hES）細胞は、Thomsonら（米国特許第6,200,806号；Science 282:1145、1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ページ以降、1998）およびReubinoffら、Nature Biotech. 18:399、2000の記載する技術により、ヒト胚盤胞細胞から調製することが可能である。hES細胞に相当する細胞種には、国際公開公報第01/51610号（Bresagen）に概説されるような、原始外胚葉様（EPL）細胞等のその多能性派生物が含まれる。
【００３８】
hES細胞をヒトの着床前胚から調製することができる。または、インビトロで受精した（IVF）胚を使用することもできる、または1細胞期のヒト胚を胚盤胞段階まで増殖させることもできる（Bongsoら、Hum Reprod 4: 706、1989）。G1.2培地およびG2.2培地で、胚を胚盤胞段階まで培養する（Gardnerら、Fertil. Steril. 69:84、1998）。プロナーゼ（Sigma）に短時間曝露することにより、発生した胚盤胞から透明帯を除去する。胚盤胞を1:50希釈したウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に30分間曝露し、DMEMで5分間3回洗浄し、1:5希釈したモルモット補体（Gibco）に3分間曝露する免疫手術（Solterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099、1975）により、内部細胞塊を単離する。DMEMでさらに2回洗浄した後、穏やかにピペッティングして無傷の内部細胞塊（ICM）から溶解した栄養外胚葉細胞を除去し、ICMをmEFフィーダー層上にプレーティングする。
【００３９】
9〜15日後、1 mM EDTAを添加したカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水（PBS）に曝露することにより、ディスパーゼもしくはトリプシンに曝露することにより、またはマイクロピペットで機械的に解離することにより、内部細胞塊に由来する増殖物を凝集塊に解離し、新鮮な培地中のmEF上に再度プレーティングする。未分化の形態を有して増殖するコロニーをマイクロピペットで個別に選択し、機械的に凝集塊に解離し、再度プレーティングする。ES様の形態は、細胞質に対して核の比率が明らかに高く顕著な核小体を有する小型のコロニーとして特徴づけられる。得られたES細胞は、短時間トリプシン処理してダルベッコPBS（2 mM EDTAを含む）に曝露し、IV型コラゲナーゼ（約200 U/mL；Gibco）に曝露することにより、またはマイクロピペットで個別にコロニーを選択することにより、1〜2週間ごとに日常的に分割する。凝集塊の大きさは、約50〜100細胞が最適である。
【００４０】
胚生殖細胞
ヒト胚生殖（hEG）細胞は、最終月経期から約8〜11週間後に得られるヒト胎児物質中に存在する始原生殖細胞から調製することができる。適切な調製方法は、Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726、1998および米国特許第6,090,622号に記載されている。
【００４１】
簡潔に説明すると、生殖隆起を等張緩衝液ですすぎ、0.05% トリプシン/0.53 mM EDTAナトリウム溶液（BRL）0.1 mL中に置き、1 mm3の塊に切断する。次に100μLチップを通して組織をピペッティングし、細胞をさらに脱凝集する。37℃で約5分間インキュベートし、EG増殖培地約3.5 mLを添加する。EG増殖培地は、DMEM、4500 mg/L D-グルコース、2200 mg/L mM NaHCO3；15% ES認定ウシ胎仔血清（BRL）；2 mMグルタミン（BRL）；1 mMピルビン酸ナトリウム（BRL）；1000〜2000 U/mLヒト組換え白血病抑制因子（LIF、Genzyme）；1〜2 ng/mL ヒト組換えbFGF（Genzyme）；および10μMフォルスコリン（10% DMSO中）である。別のアプローチでは、ヒアルロニダーゼ/コラゲナーゼ/DNAseを用いてEG細胞を単離する。腸間膜を伴う生殖原基または生殖隆起を胎児物質から切り取り、生殖隆起をPBSですすぎ、その後HCD消化溶液（0.01% V型ヒアルロニダーゼ、0.002% DNAse I、0.1% IV型コラゲナーゼ、すべてSigma製でありEG増殖培地で調製する）0.1 mL中に置く。組織を細かく切って37℃で1時間または一晩インキュベートし、EG増殖培地1〜3 mLに再懸濁し、フィーダー層上にプレーティングする。
【００４２】
96ウェル組織培養プレートを、LIF、bFGF、およびフォルスコリンを含まない改変EG増殖培地で3日間培養したフィーダー細胞（例えば、STO細胞、ATCC番号CRL 1503）のサブコンフルエントな層で調製し、5000ラドのγ-照射で不活性化する。各ウェルに、初代生殖細胞（PGC）懸濁液約0.2 mLを添加する。7〜10日後に1回目の継代をEG増殖培地で行い、各ウェルを、あらかじめ照射したSTOマウス線維芽細胞で調製した24ウェル培養皿の1ウェルに移す。EG細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、毎日培地を交換してこの細胞を培養するが、典型的にこれは7〜30日後または1〜4継代後である。
【００４３】
未分化状態におけるpPS細胞の増殖
pPS細胞は、分化を促進せずに増加を促進する培養条件を用いて培養し、連続的に増殖させることが可能である。血清を含む代表的なES培地は、80% DMEM（ノックアウトDMEM、Gibco等）、20%の既知組成ウシ胎仔血清（FBS、Hyclone）または血清代替品（国際公開公報第98/30679号）のどちらか、1%非必須アミノ酸、1 mM L-グルタミン、および0.1 mMβ-メルカプトエタノールから作製する。使用する直前に、ヒトbFGFを4 ng/mLになるように添加する（国際公開公報第99/20741号、Geron Corp.）
【００４４】
従来通り、ES細胞は、典型的には胚または胎児組織由来の線維芽細胞であるフィーダー細胞層上で培養する。妊娠13日目のCF1マウスから胚を回収してトリプシン/EDTA 2 mLに移し、細かく切断し、37℃で5分間インキュベートする。10% FBSを添加し、細胞片を定着させ、細胞を90% DMEM、10% FBS、および2 mMグルタミンで増殖させる。フィーダー細胞層を調製するには、細胞を照射し、増殖を阻害するがES細胞を支持する因子の合成はできるようにする（約4000ラドγ-照射）。0.5%ゼラチンで培養プレートを一晩コーティングし、ウェル当たり375,000個の照射mEFをプレーティングし、プレーティングしてから5時間〜4日後に使用する。pPS細胞をプレーティングする直前に、新鮮なhES培地で培地を交換する。
【００４５】
Geronの研究者は、pPS細胞がフィーダー細胞なしでも未分化状態で維持され得ることを見出した。フィーダーを含まない培養環境には、適切な培養基層、特にマトリゲル（Matrigel）（登録商標）またはラミニン等の細胞外基質が含まれる。pPS細胞は、>15,000細胞cm-2（選択的には90,000 cm-2〜170,000 cm-2）でプレーティングする。典型的には、細胞が完全に分散される前に酵素消化を停止する（例えば、コラゲナーゼIVで約5分）。約10〜2000細胞の凝集塊を、さらに分散させることなく基層上に直接プレーティングする。または、PBS中の0.5 mM EDTA溶液中で約5分間インキュベートすることにより、プレートがコンフルエントに達する以前に酵素を用いずに細胞を回収することができる。培養容器から洗浄回収した後、さらに分散させることなく細胞を新しい培養にプレーティングする。
【００４６】
無フィーダー培養は、分化させることなく細胞の増殖を支持する因子を含む栄養培地により支持する。そのような因子は、照射した（約4,000ラド）初代マウス胚線維芽細胞、テロメル化したマウス線維芽細胞、またはpPS細胞由来の線維芽細胞様細胞等のそのような因子を分泌する細胞と共に培地を培養することにより、培地中に導入され得る。フィーダーを20% 血清代替品および4 ng/mL bFGFを添加したKO DMEM等の無血清培地中に約5〜6 x 104 cm-2の密度でプレーティングすることにより、培地を馴化することができる。1〜2日間馴化した培地にさらにbFGFを添加し、これを用いてpPS細胞培養液を1〜2日間支持する。別の方法としてまたはさらに、FGF-2またはFGF-4受容体のリガンド、c-kitのリガンド（幹細胞因子等）、gp130に関連する受容体のリガンド、インスリン、トランスフェリン、脂質、コレステロール、ヌクレオシド、ピルベート、およびβ-メルカプトエタノール等の還元剤等の、分化させることなく増殖を支持する他の因子を添加することも可能である。無フィーダー培養法の特徴は、国際公開公報第01/51616号およびXuら、Nat.Biotechnol. 19:971, 2001においてさらに考察されている。
【００４７】
顕微鏡下で、ES細胞は、高い核/細胞質比、顕著な核小体、細胞の接合部がほとんど識別できない小型のコロニー形成を伴って見える。霊長動物ES細胞は、時期特異的胚抗原（SSEA）3および4、ならびにTra-1-60およびTra-1-81と称する抗体を用いて検出可能なマーカーを発現する可能性がある（Thomsonら、Science 282:1145、1998）。マウスES細胞をSSEA-1の陽性対照として、ならびにSSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81の陰性対照として使用できる。SSEA-4は、ヒト胚性癌腫（hEC）細胞に常に存在する。インビトロにおけるhES細胞の分化では、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81の発現が消失し、SSEA-1の発現が増加する。このpPS細胞は、hEG細胞でも認められる。
【００４８】
多能性細胞の軟骨細胞への分化
本発明の軟骨細胞は、所望の表現型を有する細胞を濃縮する特殊な増殖環境で幹細胞を培養、分化、または再プログラミングすることにより得られる（所望の細胞の増殖によるか、または他の細胞種の阻害もしくは死滅による）。これらの方法は、前項に記載した霊長類多能性幹（pPS）細胞を含む多くの種類の幹細胞に適用可能である。
【００４９】
本発明の細胞集団および単離される細胞がpPS細胞の樹立株に由来する場合、これらの細胞はその由来の元となった株と同じゲノムを有することになる。このことは、任意の核型異常のほかに、pPS細胞と軟骨細胞との間で染色体DNAが90%を超えて同一であることを意味し、軟骨細胞が未分化株から通常の有糸分裂の過程を経て得られることが推測され得る。導入遺伝子を導入するためまたは内因性遺伝子をノックアウトするために組換え法により処理した軟骨細胞は、未操作の遺伝子エレメントはすべて保存されているため、依然として元となった株と同じゲノムを有すると見なされる。
【００５０】
分化過程の開始
pPS細胞から軟骨細胞を導出する効果的な方法は、非特異的な様式でpPS細胞の分化を開始し、同時にまたはその後開始細胞を軟骨細胞特異的分化因子と混合すると言うのが、本発明の仮説である。
【００５１】
1つの別法は、pPS細胞に胚様体または凝集塊を形成させることである：例えば、ドナーpPS細胞培養を過剰増殖させることにより、または胚様体の形成を可能にする低接着性性質の基質を有する培養容器中で懸濁培養でpPS細胞を培養することによる。例示的な方法では、1 mg/mLコラゲナーゼ中で5〜20分間インキュベートすることにより、hES細胞のコンフルエントな単層培養物を回収し、塊に解離する。次に、1%非必須アミノ酸、1 mMグルタミン、0.1 mMβ-メルカプトエタノールを添加した80%ノックアウトDMEM（Gibco）および20%非加熱非働化ウシ胎仔血清（Hyclone）からなる培地中で、非接着性細胞培養プレート（Coaster）にプレーティングする。ウェル当たり2 mlの培地を添加することにより、胚様体に1日おきに培地を添加する。
【００５２】
別法として、分化過程は、非特異的分化パラダイムで培養することによっても開始され得る。例えば、培地中にレチノイン酸（RA）またはジメチルスルホキシド（DMSO）を含めることによる。分化を開始する別の方法は、ポリオルニチン等の分化過程を刺激する基質上に未分化pPS細胞をプレーティングすることによる。国際公開公報第01/51616号を参照されたい。
【００５３】
軟骨細胞に向けた分化の駆動
培養物を軟骨細胞経路に方向づけるため、直前の項に記載したように開始させたpPS細胞を、軟骨細胞分化因子の混合物中で培養する。それぞれの因子は、単独でまたは組み合わせで、細胞を軟骨細胞経路に沿って分化させ、軟骨細胞表現型を有する細胞を増殖させ、他の細胞種の増殖を阻害し、または別の様式で軟骨細胞を濃縮する可能性がある。本発明を実施するために、軟骨細胞が濃縮される機構を理解する必要はない。
【００５４】
軟骨細胞分化混合物の候補化合物には、トランスフォーミング増殖因子（特に、TGFβ1、TGFβ2、およびTGFβ3）、線維芽細胞増殖因子（特に、塩基性線維芽細胞増殖因子、FGF-2）、増殖分化因子（特に、GDF-5、GDF-6、およびGDF-7）、骨形成タンパク質（特に、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、およびBMP-7）、ヘッジホッグタンパク質（特に、インディアンヘッジホッグ、IHH）、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）が含まれる。Gibcoは、塩基性FGFの好ましい供給源である。他の化合物のほとんどは、R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリスから入手可能である。
【００５５】
シグナル伝達因子およびその受容体のプロファイルは分化が進行するにつれて変化し、結果として生じる細胞集団もまた時間と共に変化しているというのが、本発明の仮説である。潜在的軟骨細胞分化因子をスクリーニングするため、pPS細胞を0〜10日間の様々な期間凝集体として培養し、手順の第2段階のための広範な分化段階をとらえることができる。各時点で、開始された凝集塊を脱凝集させ、候補因子の混合物を含む培地中に再プレーティングする。
【００５６】
pPS細胞の軟骨細胞への分化は細胞が塊中に保存される場合に増強されることも、本発明の仮説である。塊中の細胞間の相互作用は、細胞を脱分化から回避するのに重要であり、所望の表現型への経路に沿って経路を定める可能性がある。
【００５７】
したがって、限られた量のトリプシン等のプロテアーゼを使用して、または機械的粉砕により、凝集細胞を穏やかに分離する。次に、微小集積培養として知られる高密度培養に再プレーティングする。手短に説明すると、細胞凝集塊を約10%血清を含む培地中で約6 x 107細胞/mLになるように懸濁し、ゼラチン等の適切な基質であらかじめコーティングした96ウェルプレート中に50μL/ウェルで（各ウェルの底の1/4を満たす）プレーティングする。2時間後、細胞は互いに接着し、細胞プラグを形成することになる。この時点で、さらに培地200μLを添加し、高密度であるため必要であれば毎日培地を交換しながら細胞を培養する。軟骨細胞は、細胞塊を互いに結合する大量の基質を合成する。
【００５８】
次に細胞塊を、所望の表現型の選択または増殖を引き起こすのに十分な期間（おそらく、1週間ないし2週間）、分化因子の混合物と共に培養する。予備実験として、機能的な群において因子を研究する‐例えば、TGFβ、GDF、およびBMPの混合物を作製し、他の群、IHH、PTHrP、bFGF、およびアスコルビン酸との様々な組み合わせにおいて、軟骨細胞分化を駆動する能力について試験する。最初に試験する濃度範囲は、BMP、GDF、およびTGFβに関しては10〜100 ng/mL；PTHrPに関しては10〜100 nM；およびIHHに関しては0.1〜1 mMである。次の項に記載するように表現型マーカーにより細胞を解析した後、分化に不必要な群を排除し、重要な群を個々の成分に分割して精査する。何回か繰り返した後、所望の表現型を生じる特定の因子または2つ、3つ、もしくはそれ以上の因子の混合物を含む、最小成分混合物を決定する。
【００５９】
同じ受容体に結合する他のリガンドまたは抗体も、本開示に引用する任意の受容体リガンドと同等物であると考えられ得る。
【００６０】
トランスフォーミング増殖因子β（TGFβ）は胚発生の様々な面を制御しており、交感神経副腎前駆細胞の環境において発現される（Wallら、Curr. Opin. Genet. Dev. 4:517, 1994）。いくつかの系において、TGFβは副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）の発現を制御している（Patederら、J. Cell Physiol. 188:343, 2001）。BMPおよび増殖分化因子（GDF）は、関節形成を含む骨格形成中に中心的役割を果たしていると考えられている（Francis-Westら、Cell Tissue Res 1296:111, 1999）。インディアンヘッジホッグ（IHH）は、軟骨細胞増殖を刺激する機械的刺激伝達複合体の必須成分である（Wuら、J. Biol. Chem. 276:36290, 2001）。軟骨内骨化中、分泌される2つのシグナルIHHおよびPTHrPは、軟骨細胞の肥大分化の開始を制御する負のフィードバックループを形成すると考えられている。骨形成タンパク質（BMP）は、骨格成分のパターン形成ならびに軟骨および骨の形成の誘導機構のシグナル経路の介在物質であると考えられている（Hoffmannら、Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 11:23, 2001）。BMPは、IHH/PTHrPフィードバックループの潜在的相互作用因子として意味づけられている（Mininaら、Development 128:4523, 2001）。BMPはIHHおよびPTHrPと非常によく相互作用し、軟骨細胞の増殖および分化を調製する可能性がある。
【００６１】
本ストラテジーによって得られるpPS細胞由来軟骨細胞は、前駆細胞を高い比率で含む場合がある。このような場合には、軟骨細胞成熟因子と共にさらなる期間培養することにより、細胞を分化経路のさらに下流に駆動することができる。成熟因子の効果的な混合物の候補には、インスリン様増殖因子（IGF）およびインスリン等の増殖因子と組み合わせた上記の分化因子が含まれる。
【００６２】
分化細胞の特徴
細胞は、多くの表現型基準に従って特徴づけされ得る。基準には、形態学的特徴の顕微鏡観察、発現する細胞マーカーの検出または定量、インビトロで測定可能な機能的基準、および宿主動物に注入した際の挙動等が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
表現型マーカー
本発明の細胞は、それらが軟骨細胞に特徴的な表現型マーカーを発現するか否かに従って特徴づけされ得る。
【００６４】
II型コラーゲンおよびアグリカンは、関節軟骨を形成する細胞の特異的マーカーとして使用され得る。また、培養物を、それぞれ弾性軟骨および繊維軟骨のマーカーであるエラスチンおよびI型コラーゲンの非存在についてスクリーニングする。培養物を、軟骨内骨形成中に生じる一過性の軟骨細胞表現型を示す、それぞれ肥大軟骨および骨のマーカーであるX型コラーゲンおよびオステオカルシンの非存在についてスクリーニングすることもできる。これらのヒトマーカーに対する市販抗体の表を以下に示す。
【００６５】
組織特異的マーカーは、細胞表面マーカーについてのフロー免疫細胞化学法、または細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーについての免疫組織化学法（例えば、固定化細胞または組織切片）等の、任意の適切な免疫学的手法を用いて検出することができる。フローサイトメトリー解析の詳細な方法は、Gallacherら、Blood 96:1740, 2000に記載されている。細胞表面抗原の発現は、標準的な免疫細胞化学法またはフローサイトメトリーアッセイ法において、選択的に細胞を固定化した後、および選択的に標識二次抗体または標識を増幅する他のコンジュゲートを用いて、有意に検出可能な量の抗体が抗原に結合した場合に陽性と定義される。特異的抗体の供給源として考えられるものを表1に示す。
【００６６】
（表１）結合組織マーカーに対する抗体の市販供給源
2005511083.tif 000002
【００６７】
組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット解析法、ドットブロットハイブリダイゼーション解析法、または標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを用いる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（RT-PCR）によりmRNAレベルで検出することもできる。さらなる詳細については、米国特許第5,843,780号を参照されたい。本開示に記載する特定マーカーの配列データは、GenBank等の公的データベースから入手可能である。
【００６８】
移植を容易にするためには、分化因子の混合物、培養条件、およびタイミングを精緻化することにより、およびこれらのマーカーに従うことにより、集団内の軟骨細胞またはその前駆細胞の特徴を有する集団における細胞の比率を最大にすることが有利である。少なくとも5%の細胞がII型コラーゲンもしくはアグリカンまたはその両方を合成する集団は、集団内の他の細胞が不活性であるかまたは結合組織内において他の役割を果たす場合に（線維芽細胞または間葉細胞等）、有効である可能性がある。少なくとも25%の細胞がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成するまで濃縮された集団は、数多くの状況においてより有効である。
【００６９】
軟骨再生に関する治療応用には、通常、細胞集団の弾性軟骨、繊維軟骨、肥大軟骨、および骨を形成する能力を最小限に抑えることが望ましい。このことは、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する（単独でまたは組み合わせで）細胞の比率ができるだけ低く、好ましくはII型コラーゲンまたはアグリカンについて陽性染色される細胞の1/5未満、または1%未満であることを意味する。未分化pPS細胞が残存する比率が低い集団もまた望ましい。好ましい集団は、SSEA-4+ve、Oct-4+ve、または内因性テロメラーゼ逆転写酵素の発現陽性が1%ないし0.2％未満である。
【００７０】
動物モデル実験
臨床応用に関して軟骨細胞の発達について持たれる多大な関心は、細胞集団が宿主内で軟骨を形成し関節機能を回復する能力である。軟骨細胞機能の再構成は、いくつかの確立した動物モデルを用いて試験され得る。
【００７１】
ウサギの外耳に6 mmの穴をあけ、付着する皮膚はそのままにしたモデルを用いて、予備実験を行うことができる。軟骨細胞と共に播種した基質を次に移植し、穴の閉鎖についてウサギをモニターする（ten Koppelら、Biomaterials 22:1407, 2001）。
【００７２】
または、ウサギ大腿の内側大腿顆の重量荷担面に、全層欠損を生じることができる（Gringoloら、Biomaterials 22:2417, 2001）。医用材料上に播種した、または微小集積培養から多細胞凝集塊として集めた軟骨細胞を用いて、傷を修復する。骨膜または筋膜等の膜を用いて移植片を定位置に収めてもよいし、または外科的ダーツ（surgical durt）を用いて基質移植片を定位置に保持することもできる。全層欠損は髄腔からその部位に血液が浸透するのを可能にし、内因性幹細胞を含む凝血塊を生じる。本研究は、内側顆よりもむしろ、滑車溝において生じた欠損に対してなされ得る。これは非重量荷担面であり、移植片は内側顆からほど容易に除去されない。
【００７３】
手術から1〜6ヵ月後、治療部位由来の組織試料を、移植細胞および軟骨沈着を有する集団について検査する。これには、II型コラーゲンおよびアグリカンについての免疫染色が含まれる。移植片の重要な形態学的特徴には、軟骨の厚さ、軟骨表面の滑らかさ、および欠損辺縁における移植片および内因性軟骨の組込みが含まれる。
【００７４】
別の選択肢として、下にある骨または髄腔にまで貫通しない部分層欠損を生じることができる（Hunzikerら、Clin. Orthop. 391 Supp:S171, 2001）。この種の欠損は、変形性関節症のモデルとなる。変形性関節症の別のモデルには、卵巣摘出したウサギの膝関節へのエストラジオールの注射が含まれ、これはヒトの変形性関節症に見られる欠陥に似た顆表面適合性の喪失を引き起こす（Tsaiら、Clin Orthoop, 291:295, 1993）。
【００７５】
分化細胞の遺伝子改変
本発明の多くの軟骨細胞集団は、実質的な増殖能を有する。必要に応じて、内因性遺伝子からの転写を増加させることによって、または導入遺伝子を導入することによって、細胞中のテロメラーゼ逆転写酵素（TERT）のレベルを増加させることにより複製能をさらに増強することができる。特に適切なのは、国際公開公報第98/14592号に提供されるヒトテロメラーゼ（hTERT）の触媒成分である。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Bodnarら、Science 279:349、1998およびJiangら、Nat. Genet. 21:111、1999に記載されている。遺伝子改変細胞は、標準的な方法に従って、RT-PCR法、テロメラーゼ活性（TRAPアッセイ法）、hTERTの免疫細胞化学染色、または複製能により、hTERTの発現について評価することができる。myc、SV40ラージT抗原、またはMOT-2をコードするDNAで細胞を形質転換する等の、細胞を不死化する他の方法もまた意図している（米国特許第5,869,243号、国際公開公報第97/32972号、および国際公開公報第01/23555号）。
【００７６】
必要に応じて、本発明の細胞を調製またはさらに処理し、インビトロで未分化細胞を除去すること、またはインビボで復帰細胞をに対抗して防ぐことができる。集団から未分化幹細胞を減少させる1つの方法は、TERTプロモーターまたはOCT-4プロモーター等の未分化細胞において優先的な発現を引き起こすプロモーターの制御下にエフェクター遺伝子が存在するベクターを、集団にトランスフェクションすることである。エフェクター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質等の細胞選別に導くレポーターであってよい。エフェクターは、例えば毒素またはカスパーゼ等のアポトーシスの介在物質をコードし、細胞に対して直接溶解性であってよい（Shinouraら、Cancer Gene Ther. 7:739, 2000）。エフェクター遺伝子は、抗体またはプロドラッグ等の外部薬剤の毒素効果に対して細胞を感受性にさせる効果を有してもよい。例示的には、発現する細胞をガンシクロビルに対して感受性にさせる単純ヘルペスチミジンキナーゼ（tk）遺伝子である（米国特許出願第60/253,443号）。または、エフェクターは、未分化表現型に復帰する任意の細胞をインビボで天然抗体に感受性にさせる、外来決定因子の細胞表面発現を引き起こし得る（米国特許出願第60/253,357号）。
【００７７】
研究および臨床療法における軟骨細胞の使用
本発明は、様々な重要な研究、開発、および商業目的のために、多数の軟骨細胞を産生する方法を提供する。
【００７８】
本発明の細胞を用いて、他の系譜の細胞で優先的に発現されるcDNAに比較的汚染されないcDNAライブラリーを調製することができる。本発明の分化細胞を用いて、標準的な方法に従い、軟骨細胞およびその派生物のマーカーに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製することも可能である。
【００７９】
特に関心が持たれるのは、薬剤開発および臨床療法を目的とした本発明の組成物の使用である。
【００８０】
薬剤スクリーニング
本発明の細胞を用いて、軟骨細胞前駆細胞および成熟軟骨細胞の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド等）または環境条件（培養条件または操作等）をスクリーニングすることができる。
【００８１】
1つの例においては、（未分化または分化パラダイムに向けて開始された）pPS細胞を用いて、軟骨細胞への成熟を促進する、または長期培養において軟骨細胞の増殖および維持を促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補成熟因子または増殖因子を異なるウェル中の細胞に添加し、その後さらなる培養および細胞の使用に関する所望の基準によって生じる任意の表現型変化を判定することにより、それら因子を試験する。これにより、pPS由来の軟骨細胞ばかりでなく軟骨から単離される軟骨細胞およびその前駆細胞についても、導出および培養方法の改善が導き出され得る。
【００８２】
他の例は、軟骨を成形または再構築するその役割において軟骨細胞活性に影響を及ぼす可能性を有する小分子薬剤の効果の測定に、軟骨細胞を使用することである。この目的のために、インビトロで細胞を試験化合物と混合し、遺伝子発現またはタンパク質合成に及ぼす化合物の影響を判定することができる。スクリーニングは、動物モデルにおいて細胞の挙動に及ぼす化合物の影響を測定することにより、インビボで行うこともできる。
【００８３】
本発明の他のスクリーニング方法は、軟骨細胞の増殖、発達、または毒性への潜在的効果についての薬学的化合物の試験に関する。この種のスクリーニングは、化合物が軟骨細胞自体への薬学的効果を有するように設計される場合ばかりでなく、他所での主要な薬理学的効果のために設計された化合物の軟骨細胞に関連する副作用を試験するためにも適している。
【００８４】
当業者は一般に、標準的な教科書「In Vitro Methods in Pharmaceutical Research」、Academic Press、1997および米国特許第5,030,015号を参照する。候補薬学的化合物の活性の評価は、一般に本発明の分化細胞を、単独または他の薬剤と組み合わせた候補化合物と混合することを伴う。研究者は、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または機能的活性における任意の変化を判断し（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）、化合物の効果を観察された変化と関連づける。
【００８５】
まず細胞生存度、残存、形態、ならびに特定のマーカーおよび受容体の発現に及ぼす影響により、細胞毒性を判断することが可能である。染色体DNAに及ぼす薬剤の影響は、DNA合成または修復を測定することにより判断し得る。特に細胞周期の不定期における[3H]-チミジンまたはBrdUの取り込み、または細胞複製に必要なレベルを上回る取り込みが、薬剤の影響と一致する。望まれない効果には、中期の拡散によって判断される姉妹染色分体交換の異常な比率も含まれる。さらなる詳細については、当業者はA. Vickers（「In vitro Methods in Pharmaceutical Reseach」、Academic Press、1997の375〜410ページ）を参照されたい。
【００８６】
臨床療法における軟骨細胞
本発明はまた、そのような療法を必要とする患者において軟骨を含む筋骨格構造を保持または回復するための、軟骨細胞前駆細胞またはその派生物の使用を提供する。関節可動性の機能障害をもたらす任意の病態が考慮され得る。衝撃による外傷に起因する損傷およびスポーツ障害が含まれる。本発明の細胞はまた、変性を引き起こす主要な病態を十分に制御することを提供し、変形性関節症および関節リウマチ等の変性疾患の損失機能を回復するための治療にも考慮される。長吻（proboscis）の手術を含むがこれに限定されない、美容整形への本発明の細胞の使用も意図する。G.C. BurgetおよびF.J. MenickによるAesthetic Reconstruction of the Nose、Mosby Year Book 1994；Nikolay GogolらによるThe Nose、David R. Godine publisher、1993；およびYooら、J. Urol. 162:1119, 1999を参照されたい。
【００８７】
本発明に従って作製される軟骨細胞は、生理的適合性賦形剤を使用し、細胞懸濁液として投与されるように調製され得る（必要に応じて、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用）。生理的適合性賦形剤とは、例えば、300 mL中の1.25 mM硫酸ゲンタマイシン（70μmol/L）、2.0 mMアンホテリシン（2.2μmol/L）、7.5 mL L-アスコルビン酸（300μmol/L）、25 mL血清またはその同等物（10% vol/volまで）である。軟骨細胞移植手順中、損傷を受けた軟骨をキャップで覆い、機械的手段または生体適合性フィブリン接着剤等の接着性保持手段により固定する。移植賦形剤中の培養軟骨細胞（約10 x 106軟骨細胞を含む約0.6 mL）を、約23ゲージの針を用いて、被覆キャップの下に注入する。
【００８８】
または、例えばコラーゲン膜を使用して形成された基質上で増殖させることにより、軟骨細胞を調製する（市販のコラーゲン基質パッドは、Ed. Geistlich Sohne、スイスから入手可能である）。移植の2、3日前に、増殖培地を移植賦形剤に交換する。手術時に、軟骨細胞の付着した基質を、生体適合性接着剤を用いて損傷した軟骨の部位に接着する。被覆キャップまたは基質は軟骨が修復するのに十分な期間その場に残り、その後例えば移植から2〜3ヵ月以内に身体内に吸収または再吸収される。再吸収可能なキャップおよび基質の設計および使用のさらなる詳細は、国際公開公報第01/08610号に見出すことができる。
【００８９】
いつもと同様、患者選択の最終責任、投与形態、および支持構造および手術の選択肢の選択は、管理する臨床医の責任である。
【００９０】
商品流通できるように、本発明の軟骨細胞は、典型的にヒト投与に十分に無菌的な条件下で調製される等張賦形剤を含む薬学的組成物の形態で提供される。細胞組成物の医薬品における一般原則については、当業者には、G. MorstynおよびW. Sheridan編によるCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy、Cambridge University Press, 1996を参照されたい。組成物は、治療後最初の2、3ヶ月の間、軟骨細胞を定位置に保つための基質を含んでもよい。吸収可能な医用生体材料は、その後の外科的切除の必要性を省いてくれる。国際公開公報第01/086101号に記載されているコラーゲン基質パッドの他に、可能性がある他の基質には、生体再吸収可能なポリマーフリース基質（Rudertら、Cells Tissues Organs 167:95, 2000）；ヒアルロナン誘導体（Grigoloら、Biomaterials 22:2417, 2001）；ポリ(L-ラクチド-ε-カルポラクトン)でできたスポンジ（Hondaら、J. Oral Maxillofac. Surg. 58:767, 2000）、およびコラーゲン-フィブリン基質（Clin. Exp. Rheumatol. 18:13, 2000）が含まれる。
【００９１】
本発明はまた、その生産、流通、または使用中のいかなる時点においても存在する細胞セットおよび他の成分を含む。細胞セットは、同じゲノムを共有する場合がある未分化pPS細胞または他の分化細胞種と組み合わせた、分化したpPS由来細胞の種類（軟骨細胞、その前駆細胞、およびサブタイプ等）に例証されるがこれらに限定されない、本開示に記載する2つまたはそれ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット中の各細胞種は、一緒に包装してももしくは同じ施設内の別の容器に包装しても、または事業関係を共有する同じ事業体または別の事業体の管理下で別の場所で包装してもよい。本発明の産物は、選択的に、関節軟骨の再構築または美容整形等の所望の目的のための取扱説明書を添付した適切な容器に包装される。
【００９２】
当業者は、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明が日常的な最適化の問題として変更され得ることを理解すると考えられる。
【００９３】
多数従属の特許請求の範囲を認める管轄において要求されるべき本発明の態様には、以下のものが含まれる。
1. 少なくとも5%の細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する、霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる細胞集団。  
2. エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する細胞が1%未満である、請求項1記載の細胞集団。
3. Koppelら、Biomaterials 22:1407, 2001に記載される動物モデルにおいて2ヶ月以内に6 mm穴を閉鎖する、霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる細胞集団。  
4. 霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られ、請求項1〜3記載の細胞の特徴を有する子孫を形成し得る、インビトロ培養において増殖する軟骨細胞前駆細胞の集団。
5. 含んでいる未分化pPS細胞が1%未満である、請求項1〜3記載の細胞集団。
6. テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）を高レベルで発現するように遺伝子改変した細胞を含む、請求項1〜5記載の細胞集団。
7. 霊長動物胚幹細胞の樹立株と同じゲノムを有する、前項のいずれか一項記載の細胞集団。
8. 前項のいずれか一項記載の分化細胞集団、およびそれが得られる元となった未分化pPS細胞株を含む、2つの細胞集団。
9. pPS細胞を分化させ、その後分化細胞を軟骨細胞分化因子の混合物と共に培養する段階を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞集団を取得する方法。
10. pPS細胞を分化させて胚様体を形成する段階を含む、請求項9記載の方法。
11. 軟骨細胞分化因子の混合物が、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、増殖分化因子（GDF）、骨形成タンパク質（BMP）、ヘッジホッグタンパク質（HH）、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項9〜10記載の方法。
12. 細胞集団がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する条件下で、請求項1〜7記載の細胞集団をインキュベートする段階を含む、軟骨を産生する方法。
13. 生理的適合性賦形剤中の請求項1〜7記載の細胞集団を含む、インビボで軟骨を産生、修復、または維持するための薬学的組成物。
14. インビボで再吸収される基質をさらに含む、請求項13記載の薬学的組成物。
15. 化合物を請求項1〜7記載の細胞集団と混合する段階、化合物と混合したことに起因する細胞集団における任意の表現型変化または代謝変化を判定する段階、およびその変化を化合物が軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力と関係づける段階を含む、軟骨細胞の増殖、分化、または軟骨成分の合成を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法。
16. 請求項1〜7記載の細胞集団を被験者に投与する段階を含む、被験者において軟骨を再構築する方法。
17. 被験者において軟骨を再構築する医薬品の調製における、請求項1〜7記載の細胞集団の使用。
18. 関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症の治療、または美容整形での使用のための医薬品の調製における、請求項1〜7記載の細胞集団の使用。
19. pPS細胞がヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、前項のいずれか一項記載の細胞集団、組成物、方法、または使用。
20. pPS細胞がヒト胚幹細胞である、前項のいずれか一項記載の細胞集団、組成物、方法、または使用。
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月7日(2004.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも5%の細胞が内因性遺伝子からII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する、単離された霊長動物多能性幹（pPS）細胞を分化させることによって得られる細胞集団。  
【請求項２】
請求項1記載の分化細胞集団、および得られる元となった未分化pPS細胞を含む、膵臓ホルモン分泌細胞を産生する系。
【請求項３】
エラスチン、I型コラーゲン、X型コラーゲン、またはオステオカルシンを合成する細胞が1%未満である、前記請求項のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項４】
Koppelら、Biomaterials 22:1407、2001に記載される動物モデルにおいて2ヶ月以内に6 mm穴を閉鎖する、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化細胞集団。
【請求項５】
アグリカンとしてpPS細胞を分化させ、分化細胞を軟骨細胞分化因子の混合物と共に培養する段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の分化細胞集団を取得する方法。
【請求項６】
軟骨細胞分化因子の混合物が、トランスフォーミング増殖因子（TGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、増殖分化因子（GDF）、骨形成タンパク質（BMP）、ヘッジホッグタンパク質（HH）、L-アスコルビン酸、および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）から選択される1つまたは複数の因子を含む、請求項9記載の方法。
【請求項７】
細胞集団がII型コラーゲンまたはアグリカンを合成する条件下で、請求項1〜4のいずれか一項記載の分化細胞集団をインキュベートする段階を含む、軟骨を産生する方法。
【請求項８】
インビボで再吸収される基質と組み合わせて、生理的適合性賦形剤中の請求項1〜4のいずれか一項記載の分化細胞集団を含む、インビボで産生、修復、または維持するための薬学的組成物。
【請求項９】
関節の外傷、関節炎、もしくは変形性関節症を治療する、または美容整形に使用する医薬品の調製における、請求項1〜4のいずれか一項記載の分化細胞集団の使用。
【請求項１０】
pPS細胞がヒト胚幹細胞、またはヒト胚盤胞から得られる細胞の子孫である、前記請求項のいずれか一項記載の産物、方法、または使用。  
【国際調査報告】
2005511083.tif 000003
2005511083.tif 000004
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