(57)【要約】本発明は、場合によってはモノクローナルとなる自然抗体で、単球またはマクロファージによるＩＬ−１Ｒａの強い生成を誘発する能力があるものと、そのような抗体を炎症性のあるいは自己免疫性の疾患の治療のために用いる使用法とに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＰハプテンと、ミオシン、アクチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびチューブリンの中から選ばれた少なくとも一つの自己抗原とに反応するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であり、マクロファージまたは単球におけるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
破傷風トキソイドとは反応しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＩＶＩｇと比べて、とりわけＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と比べて１００を超える、ＤＮＰハプテンに対する反応性を有する、請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
多価ＩＶＩｇと比べて、とりわけＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と比べて５０を超える、ミオシン、アクチン、ＭＢＰおよびチューブリンの中から選ばれた少なくとも一つの自己抗原に対する反応性を有する、請求項１から請求項３のいずれか一つに記載の抗体。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一つで規定したモノクローナル抗体の調製方法であり、以下の手順を含むことを特徴とする方法：
ａ）健康なドナーの血液に由来するＢリンパ球をＥＢＶによって形質転換し、
ｂ）ＥＬＩＳＡ検定によって、ＤＮＰハプテンと少なくとも一つの所与の自己抗原とを認識する能力のあるＩｇＧを分泌する各培養ウェル中のクローンを識別し、
ｃ）手順ｂ）で識別したクローンを増幅し、
ｄ）手順ｃ）のクローンが生成した抗体を精製し、そして、
ｅ）ヒトのマクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発するモノクローナル抗体を選別する。
【請求項６】
自己抗原が、ＤＮＡ、アクチン、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびチューブリンの中から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
手順ｂ）で識別したクローンがＩｇを分泌しない骨髄腫と融合されることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する能力があることを特徴とする、請求項５から請求項７のいずれか一つに記載の方法から得られるモノクローナル抗体。
【請求項９】
マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する能力のあるモノクローナル抗体を生成することを特徴とする、請求項５から請求項７のいずれか一つに記載の方法によって識別、増幅される、ＥＢＶ  Ｂリンパ球のクローン。
【請求項１０】
マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する能力があることを特徴とする、請求項９に記載のクローンによって得られるモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１から請求項４、請求項８および請求項１０のいずれか一つに記載の抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物。
【請求項１２】
静脈注射、皮下注射あるいは筋肉注射による投与に適合していることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＩｇＧの部分集団を調製する方法であり、以下の手順を含むことを特徴とする方法：
ａ）ＤＮＰ−リジンを担持させた不溶性の担体を用意し、
ｂ）手順ａ）で得た担体上に多価Ｉｇを吸着させ、
ｃ）担体に結合したＤＮＰ部分に保持されたＩｇを溶離させることで、ＤＮＰと相互作用する画分を回収し、
ｄ）所与の自己抗原に対する反応性を有する画分を選別し、
そして、
ｅ）ｍＲＮＡおよび分泌されたタンパク質のレベルで、マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する画分を選別する。
【請求項１４】
手順ｄ）が、初めの多価Ｉｇの活性に対する活性の上昇度を比較対照値としてとって、破傷風トキソイドに対する反応性を測定することを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
手順ｄ）がＥＬＩＳＡ検定を含み、該検定が、とりわけＤＮＡ、アクチン、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、およびチューブリンの中から選ばれた自己抗原のパネル上で行われることを特徴とする、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
手順ａ）で得られた固体の担体の上にロードするＩｇが、凍結乾燥され、溶液にされた多価ＩｇＧの状態で、または液体状で、あるいは０Ｍから３Ｍまで変化可能な濃度のＮａＣｌを含むリン酸緩衝液中での多価ＩｇＧの製造過程で得られる中間画分の状態で吸着されることを特徴とする、請求項１３から請求項１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
マクロファージまたは単球におけるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発するための医薬品を製造するための、請求項１３から請求項１６のいずれか一つに記載の方法によって得られるＩｇＧの部分集団の使用法。
【請求項１８】
ＩｇＧの部分集団が、多価Ｉｇ、または治療用ＩＶＩｇの製造過程で得られる他のあらゆる中間画分から調製されることを特徴とする、請求項１７に記載の使用法。
【請求項１９】
医薬品の調製のための、請求項１から請求項４、請求項８および請求項１０のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体の使用法。
【請求項２０】
炎症性疾患の治療および予防を目的とする医薬品の調製のための、請求項１９に記載の使用法。
【請求項２１】
敗血症および敗血性ショックの治療および予防を目的とする医薬品の調製のための、請求項１９に記載の使用法。
【請求項２２】
関節炎、リウマチ性関節炎、多発性関節炎、骨粗鬆症、腸の炎症性疾患、自己免疫疾患、移植の拒絶反応、虚血、外傷性傷害、特に脳の外傷性傷害、乾癬、皮膚疾患、再狭窄、呼吸器疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギーおよび癌の治療および予防を目的とする医薬品の調製のための、請求項１９に記載の使用法。
【請求項２３】
炎症性疾患、敗血症および敗血症ショック、関節炎、リウマチ性関節炎、多発性関節炎、骨粗鬆症、腸の炎症性疾患、虚血、外傷性傷害、特に脳の外傷性傷害、乾癬、皮膚疾患、再狭窄、呼吸器疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギーおよび癌の治療および予防を目的とする医薬品の調製のための、請求項１７または請求項１８に記載の使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球またはマクロファージによるＩＬ−１Ｒａの強い生成を誘発する能力のあるＩｇＧクラスの自然抗体の使用法、および、炎症性または自己免疫性の疾患の治療のための前記抗体の使用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１はサイトカインであり、炎症性反応において枢要な役割を果たす二つのタンパク質（ＩＬ−１ａ並びにＩＬ−１ｂ）に対応する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ、Ｂｌｏｏｄ、１９９６、８７：２０９５、２１３７）。ＩＬ−１は活性化したマクロファージが生成するものと考えられているが、血管細胞、上皮細胞、皮膚細胞、神経細胞、樹状細胞、繊維芽細胞および軟骨細胞のような、リンパ系もしくは非リンパ系細胞によっても合成される。それは、感染およびその他の形態の外傷性傷害に対する宿主反応の中心的な伝達物質であると考えられている。
【０００３】
ＩＬ−１は多機能性サイトカインであり、免疫系のみならず、他の細胞系の非常に多様な細胞に作用する。ＩＬ−１は中枢神経系に直接作用し、膵臓のランゲルハンス細胞によるインシュリンの分泌の抑制を引き起こし、細胞性免疫、体液性免疫および自然免疫の反応を刺激する。
【０００４】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、多くの細胞上に発現する表面受容体に結びついて作用し、一連のシグナルを発生させるのだが、該シグナルは、細胞増殖、アポトーシス、サイトカインの誘導、プロスタグランジンの生成、受容体の活性化および分解酵素の分泌に対する効果を有している。
【０００５】
ＩＬ−１ａおよびＩＬ−１ｂと相互に作用する受容体は二つ存在する。Ｔ細胞、繊維芽細胞および上皮細胞に発現するＩ型受容体（８０Ｋｄ）は、シグナルを伝達するためにＩＬ１ＲａｃＰ（ＩＬ−１修飾タンパク質）との相互作用を必要とし、Ｂ細胞、好中球およびマクロファージに発現するＩＩ型受容体（６７Ｋｄ）は、細胞内領域を欠くために、シグナルの伝達を行うことができない。
【０００６】
ＩＬ−１ファミリーの第三のメンバーであるＩＬ−１Ｒａ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）は、ＩＬ−１ａおよびＩＬ−１ｂの天然のアンタゴニストとして作用し、Ｉ型のＩＬ−１受容体と相互作用するが、細胞内シグナルや生物学的反応の変換はしない。これらの三つのタンパク質は、２５％から３０％の共通のアミノ酸を有する。ＩＬ−１ＲａとＩＩ型受容体との結びつきは低い。
【０００７】
ＩＬ−１は、感染症だけではなく、多くの病変に対する宿主防衛の伝達物質と考えられており、高いレベルの循環性のＩＬ−１は、多様な臨床的症状、および、特に敗血性ショックと関連している。その活性は、転写、翻訳そして分泌のレベルで微細に調節される。その他の調節メカニズムにより、他のサイトカインの作用、ＩＬ−１受容体の発現の違い、およびＩＬ−１Ｒａのような天然の抑制剤の生成が生じる。
【０００８】
多くの実験による研究といくつかの臨床試験により、敗血性ショック、リウマチ性関節炎、移植の拒絶反応、心臓発作および心虚血のような、いくつかの病変において、ＩＬ−１Ｒａの保護的な役割が明らかになっている。
【０００９】
ＩＬ−１ＲａはＩＬ−１の競合物質として作用することができ、したがって、有益な治療物質となる。国際公開第９５／１６７０６号パンフレット、国際公開第９９／３６５４１パンフレット、国際公開第０１／４２３０５号パンフレット、国際公開第０１／４１７９２号パンフレットおよび国際公開第０１／４２３０４号パンフレットは、ＩＬ−１Ｒａのペプチド、変異したペプチド、および様々な病変の治療のためのそれらの使用法を記載している。
【特許文献１】国際公開第９５／１６７０６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／３６５４１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／４２３０５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／４１７９２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／４２３０４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、可溶性の遺伝子組換えＩＬ−１Ｒａを用いる治験によって、敗血性ショック、リウマチ性関節炎そしてＧＶＨにおけるこの薬品の高い効果が明らかにはなったが、遺伝子組換えＩＬ−１Ｒａの量を非常に増やすことが必要であること、またその半減期が短いことが、それを用いる上での障害となっている。
【００１１】
したがって、ＩＬ−１Ｒａの生成を特異的に刺激し、したがって、ＩＬ−１の炎症活性の抑制を目指すあらゆる方法は、リウマチ性関節炎、ＧＶＨおよびその他のもののような、いくつかの急性あるいは慢性の炎症疾患の治療において治療上の利点を有する。
【００１２】
本発明は、ＩＬ−１Ｒａ（インターロイキン１受容体アンタゴニスト）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（そしてｉｎ  ｖｉｖｏ）での生成を強く刺激する能力をもつが、前炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ（インターロイキン１ｂおよび１ａ）の生成は刺激しない抗体の使用法に関するものである。これらのＩｇＧタイプのヒト抗体は、ＥＬＩＳＡで、アクチン、ミオシン、チューブリン、ＤＮＡまたはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のような自己のタンパク質を認識するが、破傷風トキソイドのようなワクチン抗原は認識しないことを特徴とする。これらはまた、ジニトロフェニルハプテン即ちＤＮＰハプテンと結合する能力によっても選別される。
【００１３】
そういうわけで、これらの抗体は、あらゆる治療用の用途においてＩＬ−１Ｒａの好適な代替物になりえ、上記に提起した課題に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そういうわけで第一の局面として、本発明は、ＤＮＰハプテンと、ミオシン、アクチン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびチューブリンの中から選ばれた少なくとも一つの自己抗原とに反応する、ＩｇＧクラスの自然抗体に関するものであり、ｍＲＮＡおよび分泌されたタンパク質のレベルでＩＬ−１Ｒａの過剰発現を引き起こすことを特徴とする。
【００１５】
「過剰発現」という用語は、ＩＬ−１Ｒａの発現率が、本発明の抗体による刺激を受けていない細胞の発現率よりも少なくとも５０％上回るということを意味する。
【００１６】
「ＩｇＧクラスの自然抗体」は、抗体、抗体の画分もしくは部分集団、または自己抗原に対する反応性を有するモノクローナル抗体を指す。ＩｇＧの部分集団は、多価Ｉｇ、または治療用ＩＶＩｇの製造過程で得られる他のあらゆる中間画分から調製される。
【００１７】
好ましくは、そのような自然抗体は、破傷風トキソイドおよびその他の非自己抗原とは反応しない。
【００１８】
さらに詳細には、それらは、ＩＶＩｇと比べて、とりわけＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と比べて、１００、１２５あるいは１５０を超える、ＤＮＰハプテンに対する反応性を有する。さらに、これらの抗体は、多価ＩＶＩｇと比べて、とりわけＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と比べて、５０、７５あるいは１００を超える、ＤＮＡ、ミオシン、ＭＢＰ、アクチン、およびチューブリンの中から選ばれた少なくとも一つの自己抗原に対する反応性を有する。活性の上昇度は、ＩｇＧの部分集団の場合には、比較対照値である当初の多価Ｉｇの活性と比べて、あるいは、自然抗体がモノクローナル抗体である場合には、基準となるモノクローナル抗体と比べて計算することができる。
【００１９】
第二の局面として、本発明は、上記に規定したＩｇＧの部分集団を調製する方法に関するものであり、以下の手順を含むことを特徴とする。
ａ）ＤＮＰ−リジンを担持させた不溶性の担体を用意し、
ｂ）手順ａ）で得られた担体上に多価Ｉｇを吸着させ、
ｃ）担体上に保持されたＩｇを溶離させることで、ＤＮＰと相互作用する画分を回収し、
ｄ）所与の自己抗原に対する反応性を有する画分を選別し、
そして、
ｅ）マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する画分を選別する。
【００２０】
多価Ｉｇの一般的な調製方法は、当業者には既知であり、基本的には以下の手順を有する。
・ドナープールに由来する血漿を、沈殿、吸着、濾過、そして限外濾過によって分画する（最初の画分「ＰＳＯ１」の取得）、
酸性のｐＨでのペプシンによる処理、製剤、配分、そして凍結乾燥を行う（製品ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）の取得）、
・いうまでもなく、多価Ｉｇは他の方法を用いても調製することができる。
【００２１】
実際には、市販されている多価ＩｇＧ、とりわけＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）（ＬＦＢ、フランス）の許容性と効果は、ＩＴＰ、川崎病、そして「Ｂｉｒｄｓｈｏｔ」タイプの脈絡網膜炎など、ＭＡが得られることとなった病変の治療において、特に認知されている。
【００２２】
本発明の枠組みでは、「多価Ｉｇ」というのは、多価ＩｇＧの全体、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ａｂ）のような多価ＩｇＧ断片、そして多価ＩＶＩｇの製造過程で得られる、あらゆる中間画分を意味する。
【００２３】
手順ａ）は、固体の担体、特にＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）、Ａｆｆｉｐｒｅｐ（登録商標）、Ａｆｆｉｇｅｌ（登録商標）のゲルなど、ＣＮＢｒ、ＮＨＳまたはＣ5Ｈ8Ｏ2（グルタルアルデヒド）で活性化されたゲルの上に、ＤＮＰ−リジンを担持させることで行うことができる。したがって、本方法では、手順ａ）で得られた固体の担体の上にロードするＩｇＧは、凍結乾燥後に溶液にした多価ＩｇＧまたは液体状の多価ＩｇＧの状態で、あるいは０Ｍから３Ｍまで変化可能な濃度のＮａＣｌを含むリン酸緩衝液中での多価ＩｇＧの製造過程で得られる中間画分の状態で吸着される。
【００２４】
手順ｂ）で保持されたＩｇＧの溶離は、ＩｇＧとＤＮＰの結合を分断し、特にグリシン−ＨＣｌまたはヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）のようなカオトロープの中から選んだイオン緩衝液で行うが、これは、緩衝液のｐＨおよび／またはモル濃度が変化する条件下で行う。
【００２５】
手順ｄ）はＥＬＩＳＡ検定を含み、該検定は、とりわけ、ＤＮＡ、アクチン、ミオシン、ＭＢＰ、およびチューブリン、あるいは他のあらゆる自己抗原から選ばれた自己抗原のパネル上で行う。この手順はまた、当初の多価Ｉｇの活性に対する活性の上昇度を比較対照値としてとって、例えば破傷風トキソイドのようなワクチン抗原に対する反応性を測定することを含んでもよい。
【００２６】
つぎに、手順ｅ）で、上記で提起した特性を有する部分集団、つまり、マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａのタンパク質とｍＲＮＡの過剰発現を誘発する部分集団を選別する。マクロファージまたは単球で自然に観察される基底レベルの発現と比較して、発現に有意な増大（例えば５０％以上（例えば１００％または２００％）の増大）が検出される場合に、過剰発現があると考える。
【００２７】
本発明はまた、この方法によって得られる部分集団にも関わるものである。
【００２８】
本発明はまた、上記に規定したモノクローナル抗体の調製方法にも関するものであり、以下の手順を含むことを特徴とする。
ａ）健康なドナーの血液に由来するＢリンパ球をＥＢＶによって形質転換し、
ｂ）ＥＬＩＳＡ検定によって、ＤＮＰハプテンと少なくとも一つの所与の自己抗原とを認識する能力のあるＩｇＧを分泌する各培養ウェル中のクローンを識別し、
ｃ）手順ｂ）で識別したクローンを増幅し、
ｄ）手順ｃ）のクローンが生成した抗体を精製し、そして
ｅ）ヒトのマクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発するモノクローナル抗体を選別する。
【００２９】
自然Ｉｇの発現の安定性を向上させるために、手順ｂ）で識別したクローンは、Ｉｇを分泌しない骨髄腫と融合させてもよい。
【００３０】
この方法においては、自己抗原は、ＤＮＡ、アクチン、ミオシン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびチューブリンの中から選んでよい。
【００３１】
もう一つの面において、本発明は、ＥＢＶによって形質転換したＢ細胞のクローンを目指すが、該クローンは、選別され、骨髄腫と融合したり、あるいはしなかったりして、上に述べた方法で増幅したものである。これらのクローンは、自然モノクローナル抗体を生成し、マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する能力があることを特徴とする。
【００３２】
本発明はまた、前記クローンによって得られたモノクローナル抗体にも関するものである。そのような抗体には、マクロファージまたは単球によるＩＬ−１Ｒａの過剰発現を誘発する能力がある。
【００３３】
もう一つの実施態様において、本発明は、上記に規定した自然抗体（抗体の部分集団あるいはモノクローナル抗体）と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物に関するものである。好ましくは、この組成物は、静脈注射、皮下注射あるいは筋肉注射による投与に適合したものである。
【００３４】
本発明はまた、上述の自然抗体を医薬品の調製に用いることも目指すものである。好ましくは、この医薬品は炎症性疾患の治療および予防を目的とするものである。有効となりうるのは、敗血症および敗血性ショックの治療および予防、関節炎、リウマチ性関節炎、多発性関節炎、骨粗鬆症、腸の炎症性疾患、自己免疫疾患、移植の拒絶反応、虚血、外傷性傷害、特に脳の外傷性傷害、乾癬、皮膚疾患、再狭窄、呼吸器疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギーおよび癌の治療および予防についてである。
【００３５】
図１は、リンパ球混合培養（ＭＬＣ）により刺激されたヒトリンパ球の増殖に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の抑制能力を示す。
【００３６】
図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃは、ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の効果を示す。
【００３７】
図３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウスマクロファージによるＩＬ１Ｒａの分泌を示す。
【００３８】
図４は、様々な量のＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分によって刺激されたＴＨＰ１細胞によるＩＬ−１Ｒａの生成を示す。
【００３９】
図５は、ＭＬＣにより刺激されたヒトリンパ球の増殖に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗Ｄモノクローナル抗体との抑制能力を示す。
【００４０】
図６Ａ、図６Ｂは、ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗Ｄモノクローナル抗体の効果を示す。
【００４１】
図７は、様々な量（２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）の抗Ｄモノクローナル抗体によって刺激されたＴＨＰＡ細胞によるＩＬ−１Ｒａの生成を示しており、
−モノクローナル抗体がＤ４１／９６のとき、抗ＤＮＰは（＋＋＋）、
−モノクローナル抗体がＤ３２／９７のとき、抗ＤＮＰは（＋）、
−モノクローナル抗体がＤ３５／９７のとき、抗ＤＮＰは（−）、
−モノクローナル抗体がＤ８３／９７のとき、抗ＤＮＰは（−）である。
【００４２】
図８は、２５μｇ／ｍｌのＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）によって、または、Ｃ１（ＤＮＰ＋＋）ＥＢＶ＋Ｂ細胞もしくはＣ２（ＤＮＰ−）ＥＢＶ＋Ｂ細胞の培養に由来するＩｇＧによって刺激されたＴＨＰ１細胞の培養上清中の、ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−１Ｒａの量を示す。
【実施例１】
【００４３】
例１：健康なドナーから得た血漿プール由来のポリクローナル免疫グロブリンから、抗ＤＮＰＩｇＧ画分を得る（ＩＶＩｇ）。
【００４４】
すでに明らかなように（仏国特許出願第９９／１６６３２号）、ＩＶＩｇの調製薬（ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）、ＬＦＢ）を、ＤＮＰ−リジンと結合した免疫吸着剤ＮＨＳ−Ａｆｆｉｐｒｅｐの上を通過させることによって、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）で溶離させることで、ロードしたＩｇＧの０．１３％に相当する溶出液を入手できる。この溶出液は、ＥＬＩＳＡで、ＤＮＰ−アルブミンに対して、そして、アクチン、ミオシン、ＭＢＰ、ＤＮＡおよびチューブリンのような多くの自己抗原に対して強い反応性を有するが、破傷風トキソイドに対しては有さない（表１）。
【００４５】
【表１】
2005519027.tif 000002
【００４６】
この抗ＤＮＰ画分は、ＭＬＣにおいて適合性のないヒトＰＢＬの二つの懸濁液の増殖を、初めのＩｇＧ（ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標））の１０倍から２０倍抑制する能力がある（図１）。
【００４７】
ＭＬＣの上清中にある、いくつかのサイトカインの存在をＥＬＩＳＡで分析した結果、ＩＦＮｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦａおよびＴＧＦｂの分泌は、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）よりも抗ＤＮＰ画分によって強く抑制されることが分かった。逆に、抗ＤＮＰ画分は、ＩＬ−１Ｒａの合成を非常に強く刺激する（図２）。
【００４８】
２×１０6個のマウスの腹膜マクロファージを、抗ＤＮＰ画分と共に２４時間、４８時間および７２時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すると、マウスＩＬ−１Ｒａの放出を引き起こすが、逆に、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と共に培養してもいかなる効果もない（図３）。
【００４９】
ＴＨＰ１細胞（ヒト単球細胞系）におけるＩＬ−１ＲａのｍＲＮＡ量の測定を定量ＰＣＲで行った。アクチンのｍＲＮＡの発現レベルに対するＩＬ−１ＲａのｍＲＮＡの発現レベルは非常に増大したが、これは抗ＤＮＰ画分の存在下でＴＨＰ１細胞を培養した後であって、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）の存在下では増大しなかった（表２）。ＴＮＦαのｍＲＮＡの発現もまた、その画分の存在下で増大するが、その程度はずっと低い。
【００５０】
【表２】
2005519027.tif 000003
【００５１】
同様に、抗ＤＮＰ画分によって刺激されたＴＨＰ１細胞の上清が大量のＩＬ−１Ｒａを含む一方で、同じ濃度では、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）は、このサイトカインの生成を全く誘発しない（図４）。
【００５２】
先行の実験（特許出願第９９／１６６３２号）で明らかになったように、このｉｎ  ｖｉｖｏで投与した抗ＤＮＰ画分によって、コラーゲンによって誘発される多発性関節炎、ラットにおいてＭＢＰによって誘発される実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、およびＮＯＤマウスにおける糖尿病の進行が予防される。
【００５３】
この予防効果のある活性は、分画されていないＩＶＩｇより、抗ＤＮＰＩｇＧを注入した後に高まる。これらの自然抗体は、ある種の炎症性疾患の効果的な治療法となりうるだろう。
【実施例２】
【００５４】
例２：ＩＬ−１Ｒａの生成を刺激する特性を有する、ヒトの自然モノクローナル抗体を得る。
【００５５】
例２．１：免疫付与されたドナーに由来するヒト末梢血リンパ球からモノクローナル抗体を生成する。
【００５６】
Ｒｈ＋赤血球によって免疫付与されたドナーの血液に由来するＢリンパ球をＥＢＶウイルスによって形質転換した後、一連のヒトモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を得た。それらの抗体はすべてＩｇＧ１タイプであり、Ｒｈ＋赤血球を凝集させる特性を有している。したがって、それらはＤ抗原に特異的である。
【００５７】
１４個の抗ＤＭａｂを、ＤＮＰハプテンと上記の自己抗原とを認識する能力についてＥＬＩＳＡでテストした。
【００５８】
１４個のＭａｂのうち、Ｄ４１とＤ３２の二つのＭａｂだけがＤＮＰを認識するが、Ｄ４１だけが自己抗原と結合するものの、破傷風トキソイドとは結合しない。他のＭａｂは、いかなる自己抗原についても、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）より優れた認識を示さない（表３）。
【００５９】
【表３】
2005519027.tif 000004
【００６０】
ＭＬＣにおいて適合性のないヒトリンパ球の増殖を抑制する抗ＤＭａｂの能力は、それらがＤＮＰと反応するか否かに係わらず、全ての抗体について、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）の能力よりも優れている（図５）。
【００６１】
ＭＬＣの上清中でのサイトカインの放出についての研究では、Ｄ４１とＤ３２の二つのＭａｂだけがＤＮＰと反応し、ＤＮＰへのそれらの反応性に比例してＩＬ−１Ｒａの合成が増大することが明らかになった（図６）。他のサイトカインの合成は、それらの反応性がどうあろうとも、Ｍａｂによって減少したり（ＩＬ−４）変化がなかったりする（ＩＮＦｇおよびＴＮＦａ）（図６）。
【００６２】
Ｄ４１およびＤ３２Ｍａｂによって刺激されたＴＨＰ１細胞の上清が大量のＩＬ−１Ｒａを含む一方で、同じ濃度では、Ｄ３５およびＤ８３Ｍａｂは、そのサイトカインの僅かな生成しか誘発しない（図７）。
【００６３】
例２．２：健康なドナーに由来するヒト末梢血リンパ球からモノクローナル抗体を生成する。
【００６４】
健康なドナーの血液に由来するＢリンパ球をＥＢＶで形質転換して、ウェル当たり１０5個の細胞の割合で培養した。ウェルの上清を、ＤＮＰハプテンとアクチンとを認識する能力のあるＩｇＧの存在について、ＥＬＩＳＡでテストした。最も陽性であった四つのウェルをプールし（Ｃ１）、そしてウェル当たり１０００、１００、５０および１０個の細胞に希釈することによりクローニングした。同じアプローチを、抗ＤＮＰ活性およびアクチン活性について陰性のウェルを選別するためにも用いた（Ｃ２）（表４）。
【００６５】
【表４】
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【００６６】
ウェルＣ１およびＣ２の細胞を増幅することで、プロテインＧの精製を行うために十分な量の抗体を得た。得られた抗体はＩｇＧタイプであり、表４は、Ｊ＋７（調合液１）とＪ＋１４（調合液２）から採取した上清から行った二つの精製の結果を示し、ウェルＣ１から精製したＩｇＧがＤＮＰを認識し、いくつかの自己抗原に対する反応性を有することを示している。逆に、ウェルＣ２のＩｇＧは、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と比較して、いかなる活性の上昇も有していない。
【００６７】
二つのウェルＣ１およびＣ２から精製したＩｇＧを、ＴＨＰ１細胞の存在下で、２５μｇ／ｍｌの量で培養した。細胞増殖はＣ１のＩｇＧの存在下では抑制されるが、Ｃ２のＩｇＧでは抑制されず（データは非表示）、Ｃ１のＩｇＧだけが、ＴＨＰ１細胞によるＩＬ−１Ｒａのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成を刺激する（図８）。
【００６８】
ウェルＣ１およびＣ２の細胞は、モノクローナルＩｇＧを得るためには、ウェル当たり０．５個の細胞でクローニングする。
【００６９】
これらすべての結果によって、いくつかの自己抗原に対するＩｇＧタイプの抗体の反応性と、ＩＬ−１Ｒａの合成を誘発する能力の増大との間には、それらが単球またはマクロファージによるポリクローナルであろうとモノクローナルであろうと、正の相関があることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】リンパ球混合培養（ＭＬＣ）により刺激されたヒトリンパ球の増殖に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の抑制能力を示したグラフ。
【図２Ａ】ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の効果を示したグラフ。
【図２Ｂ】ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の効果を示したグラフ。
【図２Ｃ】ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分の効果を示したグラフ。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウスマクロファージによるＩＬ１Ｒａの分泌を示したグラフ。
【図４】様々な量のＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗ＤＮＰ画分によって刺激されたＴＨＰ１細胞によるＩＬ−１Ｒａの生成を示したグラフ。
【図５】ＭＬＣにより刺激されたヒトリンパ球の増殖に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗Ｄモノクローナル抗体との抑制能力を示したグラフ。
【図６Ａ】ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗Ｄモノクローナル抗体の効果を示したグラフ。
【図６Ｂ】ＭＬＣにより刺激されたヒトＰＢＬによるサイトカインの生成に対する、ＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）と抗Ｄモノクローナル抗体の効果を示したグラフ。
【図７】様々な量（２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）の抗Ｄモノクローナル抗体によって刺激されたＴＨＰＡ細胞によるＩＬ−１Ｒａの生成を示したグラフ。
【図８】２５μｇ／ｍｌのＴＥＧＥＬＩＮＥ（登録商標）によって、または、Ｃ１（ＤＮＰ＋＋）ＥＢＶ＋Ｂ細胞もしくはＣ２（ＤＮＰ−）ＥＢＶ＋Ｂ細胞の培養に由来するＩｇＧによって刺激されたＴＨＰ１細胞の培養上清中の、ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−１Ｒａの量を示したグラフ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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