(57)【要約】本発明は、ワクチンを製造するための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用に関する。該リポペプチドは、少なくとも１つの非ペプチド親油性ベクターへヒドラゾン結合によって溶液中において連結されているペプチド化合物を含む。本発明はまた、ＨＣＶの天然配列ＮＳ３に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの製造のための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用であって、前記リポペプチドは、非ペプチド性質の少なくとも１つの親油性ベクターへヒドラゾン結合によって連結されたペプチド化合物によって構成されており、そして以下の一般式（Ｉ）：
［（（Ｒ1）（Ｒ2）i）Ｄ−Ｈ］ｊ−Ｐ      （Ｉ）
［式中、
（Ｒ1）（Ｒ2）iＤは該親油性ベクターを示し、ここで：
−  ｉは０または１を示し、
−  ｉが０に等しい場合、Ｄは結合を示し、
−  ｉが１に等しい場合、Ｄは、飽和、不飽和または芳香族の、単または多環式ヘテロ環を示し、
−  Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり得、各々、式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’（式中、Ｌは脂質の残基を示し、Ｅはスペーサーを示し、そしてｆおよびｆ’は、各々、ＬとＥ並びにＥとＤを連結する官能基を示す）を有する基を示し、そして
−  Ｐは、該ペプチド化合物を示し、
−  Ｈは、該親油性ベクターによって保有されるアルデヒド官能基と該ペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体官能基との間での溶液中における連結によって形成される該ヒドラゾン結合を示し、
−  ｊは、１〜３を示す］
を有することを特徴とする、使用。
【請求項２】
ｉが０に等しく、ｊが１に等しく、そしてＬが、ステロール、ステロール誘導体、あるいは４〜３０炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ステロール誘導体がコレステロール誘導体であり、そして前記炭素鎖が式ＣＨ3−（ＣＨ2）14−に対応することを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｅが、１〜１８の炭素原子ならびに適用可能な場合は１〜１６のヘテロ原子および／またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される１〜７の基を含む、直鎖、分枝鎖または環式の、飽和または不飽和の炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ｆが−ＣＯ−ＮＨ−または−ＣＯ−Ｏ−結合を示し、そしてｆ’が−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−ＣＯ−結合を示すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記親油性ベクターが式（II）：
【化１】
2005527513.tif 000023
に対応することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記親油性ベクターが式（III）：
【化２】
2005527513.tif 000024
［式中、Ｌは、請求項１〜３のいずれか１項に定義される通りである］
に対応することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
式（III）において、Ｌが式ＣＨ3−（ＣＨ2）14−を有する炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
該ペプチド化合物Ｐが、１またはそれ以上のペプチド抗原および１またはそれ以上のペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックによって形成される群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
該ペプチド抗原が、ペプチドならびにグリコペプチドおよびシュードペプチドを含むペプチド誘導体によって形成される群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックが、以下の一般式（IV）：
（Ｂ2Ｍ）m（ＸＮ）nＡ      （IV）
に対応し、
式中：
−  Ｂ2は、以下の１またはそれ以上の一般式（ａ）または（ｂ）：
【化３】
2005527513.tif 000025
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてＷは、結合、あるいは１〜１８の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄および窒素から選択される１〜１２の原子を含む、直鎖、分枝鎖または環状の、飽和または不飽和の炭素鎖（該炭素鎖は、場合によっては１〜１６のハロゲン原子によって置換されている）を示す］に対応し、
−  Ｘは、１〜６のアミノ酸を含む、Ｘ’オリゴペプチドの残部を示し、
−  Ａは、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、スレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される、同じかまたは異なるアミノ酸の鎖を含む、少なくも三官能性のＡ’化合物の残部を示し、
−  ｍは、１〜３２の整数であり、
−  ｎは、０〜３２の整数であり、そして、
ＭおよびＮは、各々、それぞれ、Ｂ2とＡとの間（ｎ＝０の場合）またはＢ2とＸとの間（ｎが０とは異なる場合）、そしてＸとＡとの間（ｎが０とは異なる場合）の連結基を示し、そして、互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基から選択される官能基を含むことを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
一般式（IV）を有する化合物が、ｍが４〜１６の整数であり、ｎが２〜８の整数であり、Ｘが２〜４のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドの残部を示し、そしてＡが２〜８のリシン残基を含みかつデンドリマーの形態をとる鎖の残部であり、そしてＢ2が（−）−シキミ酸および（−）−キナ酸から選択される１またはそれ以上のコンポーネントの残部を示すようなものであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記リポペプチドの混合物が、１〜２０の異なるリポペプチド、好ましくは１〜１０の異なるリポペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
該リポペプチドが複合ミセル（composite micelles）の形態であることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
該ペプチド化合物が、感染因子（infectious agent）または癌から誘導される抗原によって構成されていることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
該感染因子が、細菌、寄生生物またはウイルスタイプのものであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
該ウイルスタイプの感染因子がＨＩＶウイルスまたはＨＣＶウイルスであることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
該ペプチド化合物が、ＨＩＶウイルスのＧａｇ、ＰｏｌまたはＮｅｆ蛋白質由来の配列であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
該リポペプチドの混合物が、ＨＩＶウイルスのＧａｇ、ＰｏｌまたはＮｅｆ蛋白質由来の少なくとも２つの配列を含有することを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
該リポペプチドの混合物が、ペプチドが以下の配列：
−  Ｇａｇ  １７−３５
−  Ｇａｇ  ２５３−２８４
−  Ｐｏｌ  ３２５−３５５
−  Ｎｅｆ  ６６−９７  および
−  Ｎｅｆ  １１６−１４７
を有するリポペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
該ワクチンが、経粘膜、経皮または筋肉内投与用に処方されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
該混合物が、更に、１またはそれ以上の臨床的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
該賦形剤が、マンニトールまたはポリソルベート８０、あるいはこれら２つの混合物であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
該感染因子ＨＣＶのペプチド化合物Ｐが、以下のペプチド配列：
−  ＨＣＶ  １  ＨｚＡｃ：
H-K(COCH2NHNH2)GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
−  ＨＣＶ  ２  ＨｚＡｃ：
H-K(COCH2NHNH2)GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
−  ＨＣＶ  ３  ＨｚＡｃ：
H-K(COCH2NHNH2)GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2
によって構成されていることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項２５】
ＮＳ３  １００７−１０３７と名付けられた以下の配列：
H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
を含むＨＣＶウイルスの天然ペプチド配列。
【請求項２６】
ＮＳ３  １１７４−１１９５と名付けられた以下の配列：
H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
を含むＨＣＶウイルスの天然ペプチド配列。
【請求項２７】
ＮＳ３  １５２４−１５５３と名付けられた以下の配列：
H-KGAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2
を含むＨＣＶウイルスの天然ペプチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンを製造するための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用に関し、前記リポペプチドは、非ペプチドタイプの少なくとも１つの親油性ベクターへ、ヒドラゾン結合によって、溶液中で連結されたペプチド化合物によって構成されている。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンを製造するためのリポペプチドの使用は、既に記載されている：例えば、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９８／０２６０５は、免疫応答を誘発するためのリポペプチドの複合ミセル（composite micelles）を記載している。このような使用は、所定の化学組成から出発して、クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子と共同して抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって同時に提示される多様なコレクションのペプチド抗原を免疫系へ与えることを可能にする。従って、提示される抗原の特定の細胞［：ヘルパーＴ細胞（“ヘルパー”Ｔリンパ球、ＨＴＬ）、抗体産生Ｂ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ）］を活性化することが可能である。
【０００３】
各個体における防御的ポリクローナル免疫応答を誘発するために、ワクチン組成のエピトープ多様性の増加は、最も有望なストラテジーの１つである。
【０００４】
いくつかの実験は、Ｎ−ε−パルミトイルリシンによりＣ末端位で修飾されている複数のエピトープを有するいくつかのペプチドでの免疫化に続いて、複数の細胞性応答が極めて効率的に誘発され得ることを示した。
【０００５】
従って、例えば、７〜８の異なる成分を含むリポペプチドのいくつかの混合物は、霊長類（Bourgault-Villada et al., 1997, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 19, 81-87; Mortara et al., 1999, J. Virol, 73, 4447-4451; Mortara et al., 2000, Virology, 278, 551-561）およびヒト（Gahery-Segard et al., 2000, J. Virol., 74, 1694-1703; Pialoux et al., 2001, AIDS, 15 1239 − 1249）中のウイルスに対する特異的Ｔ細胞応答を誘発するために使用された。
【０００６】
Ｐｉａｌｏｕｘらによる研究は、ヒト免疫不全ウイルス（１型ウイルス、ＨＩＶ−１）による感染についてのモデルにおける、２４から３３残基の長さを有する６リポペプチドの混合物６００μｇ〜３ｍｇの用量（１ペプチド当たり１００μｇ〜５００μｇ）を受容した健康なボランティアの大部分においてＨＴＬおよびＣＴＬ応答を誘発することが可能であったことを示した。第Ｉ相臨床試験において使用された６リポペプチドのカクテルの耐性および免疫原性は、このような合成製剤が従来の組換えワクチンの有望な代替アプローチであることを確認した。
【０００７】
当該分野において公知のリポペプチドは、ペプチドのＣ末端またはＮ末端位での固相におけるペプチド合成によって構築される。これらのリポペプチドは、親油性のものであり、そして従って、水溶液中で凝集する傾向にある。従って、工業規模でのそれらの製造時に遭遇する主な障害は、非常に制限された分離能力（resolving power）を有する分取ＲＰ−ＨＰＬＣを使用する精製工程を伴う。所望の生成物は、カラム上における制限された負荷でのみ、副産物から分離され得る。従って、工業規模でワクチンを調製するために、そしてＣ末端位における分枝リポペプチドを考慮した場合、作業コストの大部分は、クロマトグラフィー工程の反復に充てられる。従って、精製収率は、比較的低く、典型的には実験室規模で１０、そして恐らく工業規模ではより低く（１０〜１００ｍｇ）、１〜２％、またはワクチンのバッチのサイズが１０倍増加されるとなおより低い。
【０００８】
リポペプチドの複合ミセルを調製する目的は、抗原を提示する各細胞の近位における、ワクチンの全成分の等しい分散を確実にすることであり、主題は、抗原提示細胞との物理的連絡を介して、ヘルパーＴリンパ球と細胞傷害性Ｔリンパ球との間の細胞協働（cell cooperation）を可能にすることである。効率的な細胞協働を達成するために、リンパ球は、タイプＩおよびタイプＩＩ主要組織適合遺伝子複合体によって提供される同一の抗原提示細胞エピトープを、表面上で、同時に認識しなければならない。臨床試験において実験的に得られる結果は、ヘルパーＴエピトープがリポプチド抗原において同定されかつ細胞傷害性Ｔエピトープが同一組成を有する別のリポペプチドに存在すると同定される、効率的な免疫応答を得ることが可能であることを確認する（Gahery-Segard et al., 2000, J. Virol., 74, 1694-1703; Pialoux et al., 2001, AIDS, 15 1239 − 1249）。
【０００９】
先行技術に従うリポペプチドの複合ミセルを得るために、各リポペプチドは、精製されて、そしてそれらが混合される前に個々にキャラクタライズされなければならない。先行技術に従って混合を行うために、各リポペプチドは、ワクチンの成分である各リポペプチドの完全な溶媒和を可能にする条件下で個々に溶解されなければならない（ＰＣＴ／ＦＲ９８／０２６０５）。核磁気共鳴を使用しての溶液の研究は、この状態の溶解は、高濃度（８０％）の酢酸水溶液においてのみ得られることを示した。従って、先行技術に従う方法は、個々に各成分を溶解し、それらの混合物を調製し、それをホモジナイズし、そして次いで稀釈および続いての凍結乾燥前に、０．２２μｍの多孔性を有するフィルターを備える滅菌濾過を行うために、酢酸水溶液（８０％）中におけるリポペプチドの比較的長い滞在時間（residence time）を包含する。このような溶媒中での滞在時間は、酸に対して感受性である特定の親油性ベクターまたは特定のペプチド鎖と非適合性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本願出願人は、その製造が先行技術に従うワクチンのそれにおける欠点を有しない、ワクチンを工業規模で製造するという目標を設定した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明の主題は、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用によるワクチン製造であり、該リポペプチドは、好ましくは、ペプチド化合物の均質混合物の同時脂質化（simultaneous lipidation）によって得られ、そして非ペプチド性質の少なくとも１つの親油性ベクターへヒドラゾン結合により連結されたペプチド化合物によって構成されており、そして以下の一般式（Ｉ）を有する：
［（（Ｒ1）（Ｒ2）i）Ｄ−Ｈ］ｊ−Ｐ      （Ｉ）
式中、
（Ｒ1）（Ｒ2）iＤは該親油性ベクターを示し、式中：
−  ｉは０または１を示し、
−  ｉが０に等しい場合、Ｄは結合を示し、
−  ｉが１に等しい場合、Ｄは、飽和、不飽和または芳香族の、単または多環式ヘテロ環を示し、
−  Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり得、各々、式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’（式中、Ｌは脂質の残基を示し、Ｅはスペーサーを示し、そしてｆおよびｆ’は、各々、ＬとＥへ並びにＥとＤへ連結する官能基を示す）を有する基を示し、そして
−  Ｐは、該ペプチド化合物を示し、
−  Ｈは、該親油性ベクターによって保有されるアルデヒド官能基と該ペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体官能基との溶液中における連結によって形成される該ヒドラゾン結合を示し、
−  ｊは、１〜３を示す。
【００１２】
ｊが２または３を示す場合、リポペプチドの混合物は、水性媒体中の均質な溶液または懸濁液を形成しなければならず、そして所望の免疫原性のものでなければならない。
【００１３】
１つの好ましい実施形態において、式（Ｉ）に従うリポペプチドの少なくとも１つの混合物の使用は、有利には、ｉが０に等しく、ｊが１に等しく、そして基Ｌ（Ｒ1およびＲ2に関連して定義される式Ｌ−ｆ−Ｅ−ｆ’における）が、例えば、ステロール、ステロール誘導体（例えば、コレステロール誘導体）、あるいは４〜３０炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝の炭素鎖を示すようなものである。このような炭素鎖は、パルミチン酸（Ｌが式ＣＨ3−（ＣＨ2）14−に対応する）またはオレイン酸（Ｌが式ＣＨ3−（ＣＨ2）7−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）7−に対応する）のような脂肪酸の親油性部分を形成する。
【００１４】
本発明の１つのより好ましい実施形態において、ステロール誘導体はコレステロール誘導体であり、そして炭素鎖は式ＣＨ3−（ＣＨ2）14−に対応する。
【００１５】
更に、Ｅは、有利には、１〜１８の炭素原子ならびに必要に応じて１〜１６のヘテロ原子（例えば、窒素または酸素）および／またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される１〜７の基を含む、直鎖、分枝鎖または環式の、飽和または不飽和の炭素鎖を示す。Ｅは、場合によっては、１〜８のヒドロキシルまたはアミノ基および／または１〜１６のハロゲン原子（例えば、塩素またはフッ素）によって置換されていてもよい。
【００１６】
同様に、ｆは、有利には、−ＣＯ−ＮＨ−または−ＣＯ−Ｏ−結合を示し、そしてｆ’は、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−ＣＯ−結合を示す。
【００１７】
本発明の意味において、
−“炭素環”（“シクロアルキル”とも呼ばれる）は、３〜８の炭素原子を含む単または多環式炭素環（例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）を意味すると理解され；
−“アリール”は、５〜１４の炭素原子を含む芳香族、単または多環式炭素環（例えば、フェニル、ナフチルまたはクレシル）を意味すると理解され；
−“ヘテロ環”は、窒素、酸素および硫黄から選択される１またはそれ以上のヘテロ原子を含む炭素環（例えば、ピペラジン）を意味すると理解され；
−“ヘテロアリール”は、窒素、酸素および硫黄から選択される１またはそれ以上のヘテロ原子を含むアリール（例えば、ピリジン、ピリミジンまたはピラジン）を意味すると理解される。
【００１８】
本発明に従う好ましい親油性ベクターの例は、以下の式（II）および（III）に対応する：
【００１９】
【化１】
2005527513.tif 000002
【００２０】
式中、Ｌは上記に定義される通りであり、そして例えば、式ＣＨ3−（ＣＨ2）14−の炭素鎖（即ち、パルミチン酸の親油性部分）を示す。
【００２１】
式（Ｉ）におけるペプチド化合物Ｐは、１またはそれ以上のペプチド抗原および１またはそれ以上のペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティック（dendrimeric glycomimetics）によって形成される群から選択され得る。
【００２２】
本発明の意味において、“１またはそれ以上の”ペプチド抗原またはデンドリマー性のグリコミメティックは、ペプチド化合物Ｐが、それによってリポペプチドの混合物の活性を改変させること無しに共に連結された、単一または数個のペプチド抗原またはデンドリマー性のグリコミメティックによって構成され得るという事実を意味すると理解される。
【００２３】
ペプチド抗原は、有利には、ペプチドならびにグリコペプチド（glycopeptides）およびシュードペプチド（pseudopeptides）を含むペプチド誘導体によって構成される群から選択される。
【００２４】
本発明の意味において、用語“ペプチド”は、それらの性質および数に関わらず、数個のアミノ酸の任意の鎖を意味すると理解され；従って、用語“ペプチド”は、オリゴペプチド（ジペプチドまたはトリペプチド）およびポリペプチドもしくは蛋白質の両方を意味する。“グリコペプチド”は、糖質（それらが、単糖類（例えば、中性糖）または多糖類である）と共有結合によって結合されたペプチドを意味すると理解される。“シュードペプチド”は、その１またはそれ以上のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）が非ペプチド結合（例えば、−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、−ＣＨ2−ＮＨ−または−ＣＯ−ＮＨ−Ｏ−結合）で置換されているペプチドを意味すると理解される。
【００２５】
本発明の意味において、“ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティック”は、その構造がアミノ酸またはそれらの誘導体に基づいておりそして非常に枝分かれした形態、樹状（arborescent）タイプのものである、グリコミメティックを意味すると理解される。
【００２６】
前記ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックは、以下の一般式（IV）に対応する：
（Ｂ2Ｍ）m（ＸＮ）nＡ      （IV）
式中：
−  Ｂ2は、以下の１またはそれ以上の一般式（ａ）または（ｂ）：
【００２７】
【化２】
2005527513.tif 000003
【００２８】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてＷは、結合、あるいは１〜１８の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄および窒素から選択される１〜１２の原子を含む、直鎖、分枝鎖または環状の、飽和または不飽和の炭素鎖（該炭素鎖は、場合によっては１〜１６のハロゲン原子によって置換されている）を示す］に対応し、
−  Ｘは、１〜６のアミノ酸を含む、Ｘ’オリゴペプチドの残部を示し、
−  Ａは、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、スレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される、同じかまたは異なるアミノ酸の鎖を含む、少なくも三官能性のＡ’化合物の残部を示し、
−  ｍは、１〜３２の整数であり、
−  ｎは、０〜３２の整数であり、そして、
−  ＭおよびＮは、各々、それぞれ、Ｂ2とＡとの間（ｎ＝０の場合）またはＢ2とＸとの間（ｎが０とは異なる場合）、そしてＸとＡとの間（ｎが０とは異なる場合）の連結基を示し、そして、互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基の中から選択される官能基を含む。
【００２９】
式（IV）を有する化合物は、国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ００／０２１９４に記載されている。
【００３０】
本発明の意味において、“保護”基は、Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE and P.G.M. WUTS, Second Edition 1991, J. WILEY and Sonsという題名の仕事において規定されるように、ヒドロキシル官能基またはジオール（この場合、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4から選択される２つの基が、互いに共有結合的に連結されて一緒に環を形成し得る）を保護する保護基を意味すると理解される。例として、そして非限定的には、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔブチルジフェニルシリル、トリメチルシリルエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル、メトキシ−メチル、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、メチルチオメチル、アセチル、または２’，３’−ジメトキシブタン−２’，３’−ジイル基が挙げられ得る。
【００３１】
例として、そして非限定的には、以下の一般式（ａ）および（ｂ）において：
−  好適なハロゲン原子は、臭素、塩素およびフッ素であり；そして
−  好適な炭素鎖は、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔブチル、ペンチル、．．．）、アルケニル基（ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、．．．）、アルキニル基（エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、．．．）、シクロアルキル基（シクロペンチル、シクロヘキシル、．．．）、ヘテロ環（ピペラジン、．．．）、アリール基（フェニル、クレシル、．．．）、ヘテロアリール基（ピリジン、ピリミジン、ピラジン、．．．）、ポリエチレングリコール基あるいは、また、ポリアミンである。
【００３２】
式（ａ）および（ｂ）は、キナ酸およびシキミ酸ならびに環の１、３、４および／または５位に保有されるヒドロキシルを保護することによって得られるそれらの誘導体のいくつかの残部（rests）を示す。
【００３３】
本発明に従う１つの好ましい実施形態において、一般式（IV）に従う化合物は、ｍが４〜１６の整数であり、ｎが２〜８の整数であり、Ｘが２〜４のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドの残部であり、そしてＡが２〜８のリシン残基を含みかつデンドリマーの形態をとるオリゴペプチドの残部であり、そしてＢ2が（−）−シキミ酸および（−）キナ酸から選択される１またはそれ以上の化合物の残部を示すようなものである。
【００３４】
式（Ｉ）に従うリポペプチドの混合物において、式（IV）に従うペプチド化合物の存在は、マンノースレセプターまたはマンノースレセプターに関連するＣ−レクチンファミリーレセプターを有する細胞へリポペプチドを選択的に運搬する（vectorize）ことを可能にする。従って、式（IV）に従う、ペプチド抗原およびデンドリマー性のグリコミメティックによって構成されるＰペプチド化合物を含む、リポペプチドの混合物は、マンノースレセプターに関連するＣ−レクチンファミリーレセプターを発現する細胞へ、上記リポペプチドの混合物を標的化させることを可能にする。
【００３５】
本発明に従うリポペプチドの混合物の使用は、有利には、１〜２０の異なるリポペプチド、好ましくは１〜１０の異なるリポペプチドを含む。
【００３６】
ワクチンを製造するためのリポペプチドの混合物の本発明に従う使用は、全タイプのワクチン（即ち、慣用的には予防ワクチン、それだけではなく“治療用途のワクチン”も）の製造における使用に及ぶ。このようなワクチンは、細菌、ウイルスまたは寄生生物起源の感染性疾患あるいは種々のタイプの癌に対して向けられ得る。本発明に従う使用はまた、種々の感染性疾患に対応するペプチド抗原の混合物を含む多価ワクチンの製造を可能にする。
【００３７】
従って、本発明に従うワクチンは、予防的ワクチン接種の観点からだけでなく、治療的観点からもまた有効であり；特に、本発明に従う親油性ワクチンは、新規のエピトープに対する応答を惹起するため、ならびに確立された免疫応答の分極（polarisation）を分極化または強化するために使用され得る。観察された結果は、実際に、リポペプチドが感染した患者において新規の抗−ＨＩＶ、ＣＤ４、ＣＤ８免疫応答を誘発し得るということを示している。
【００３８】
ペプチド化合物は、有利には、ウイルスタイプ（例えば、ＨＩＶまたはＨＣＶ）の感染因子（infectious agent）から誘導されるペプチド抗原によって構成されている。
【００３９】
本発明に従う少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用は、好ましくは、経粘膜または経皮投与、また非経口投与（筋肉内、皮下、皮内、静脈内）用に処方される。
【００４０】
現在入手可能な大抵のワクチンは、非経口投与され、これは、訓練された医療従事者を必要とし、高い費用を伴い、注射の部位での反応を誘発し得、そして特定の状況下で、汚染された注射器の使用に続く感染を生じさせる（例えば、ＨＩＶおよび肝炎ウイルスの伝染）。ＷＨＯ評価によれば、発展途上国において、無滅菌注射器の広範な再使用のために、ワクチン接種目的のために行われる注射の５０％において、安全な予防措置が採られていない（Jodar L. et al., Vaccine, 19 (2001), 1594-1605; Kane A. et al., Bull WHO 77 (1999) 801-807）。更に、注射針の使用は、一般的に、子供の場合、痛みを伴う。従って、投与し易く、経済的であり、そして実施が容易である免疫化プロトコルを有する、新世代のワクチンを開発する必要があるようである。
【００４１】
粘膜および経皮ワクチンは、非経口的に投与されるワクチンの魅力的な代替物を示す。粘膜投与（例えば、経鼻投与）は、多くの病原体について開放されている部位で免疫応答を誘発することを可能にし、そして経口投与（これは、抗原提示細胞への制限されたアクセス、腸管における蛋白質分解、および小さな幅の免疫応答を伴うままである）の効率的な代替物である。
【００４２】
外部環境との主な接触面である皮膚はまた、多数の病原体の侵入を妨げる免疫バリアである。それは、例えば、ケラチノサイト、そして特に、ランゲルハンス細胞のような特定のイムノコンピテント細胞を有し、リンパ腺とフィットアップ（fit up）され、、ならびにＴリンパ球のサブクラスを有しており、全体は“皮膚関連リンパ組織”（Skin-associated lymphoid tissue, ＳＡＬＴ）を形成している（Bos J.D., et al., Immunol. Today, 14, (1993), 75-78）。
【００４３】
細胞膜を通過するそれらの能力は、リポペプチドが粘膜表面を通ってエピトープを輸送し、従って、それらは局部免疫系にだけではなく全身系にも送達される（国際出願番号ＷＯ  ０１４１７９７）。本発明に従う、少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用は、更に、疎水性質のリポペプチドとの、ファンデルワールス型の相互作用および極性部分による水中での良好な溶媒和を確実にし得る、賦形剤または両親媒性せいしつの構成成分を含む。
【００４４】
これらの賦形剤または両親媒性成分は、大部分について、極性または荷電アミノ酸により構成され得る。
【００４５】
本発明に従う１つの好ましい実施形態において、リポペプチドの混合物は、更に、１またはそれ以上の臨床的に許容される賦形剤を含む。
【００４６】
特に有利な様式において、臨床的に許容される賦形剤は、マンニトールまたはポリソルベート８０、あるいはこれら２つの混合物である。
【００４７】
本発明は、特に、ペプチド抗原として、ＨＩＶウイルスのＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ蛋白質からの少なくとも２つの配列を含むワクチン、特に、Ｇａｇ１７−３５、Ｇａｇ２５３−２８４、Ｐｏｌ３２５−３５５、Ｎｅｆ６６−９７、Ｎｅｆ１１６−１４７配列の混合物、そして、より詳細には、実施例１に記載のようなリポペプチドに関する。
【００４８】
使用されるリポペプチドにおいて、追加のリシンが各ペプチドのＣ末端に導入され、Ｃ末端カルボン酸がアミド化される。このリシンの側鎖のアミン官能基（ｅ−ＮＨ2）は、ヒドラゾン結合を含むスペーサーを介して結合されたパルミトイル部分によって修飾される。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、本発明に従う使用は、ペプチド抗原として、以下のペプチド配列を含む：
【００５０】
【化３】
2005527513.tif 000004
【００５１】
本発明はまた、以下の天然配列に関連する：
【００５２】
【化４】
2005527513.tif 000005
【００５３】
従って、これらは免疫原性のものである。
【００５４】
上記実施形態に加えて、本発明は、更に、本発明に従う少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用の実施例、ならびに実施例５に従うワクチン用量（ＳＩＶ）の注射後のマカクにおける免疫原性の分析結果を示す図１を参照する、以下の説明から明らかとなる他の実施形態を包含する。
【００５５】
以下の実施例において、以下の略語を使用した：ｅｑ．：当量；  Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル；  Ｆｍｏｃ：９−フルオレニル−メトキシカルボニル；  Ｍｔｔ：４−メチル−トリチル；  ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；  ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；  ＣＨ2Ｃｌ2：ジクロロメタン；  ＭｅＯＨ：メタノール；  ＥｔＯＨ：エタノール；  ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；  ＡｃＯＨ：酢酸；  ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル；  Ｈ2Ｏ：水；  ＡｃＯ-ＮＨ4+：酢酸アンモニウム；  ＣＤＣｌ3：重水素化クロロホルム；  ＥＤＴ：エタンジチオール；  ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン；  ＤＭＳＯ−ｄ６：ジメチルスルホキシド−ｄ６（完全に重水素化）；  ＮａＩＯ4：過ヨウ素酸ナトリウム；  ＮａＣｌ：塩化ナトリウム；  Ｎａ2ＳＯ4：硫酸ナトリウム；  ＭｇＳＯ4：硫酸マグネシウム；  ＫＨ2ＰＯ4：リン酸二水素カリウム；  ＰＡＬ：“ペプチド
−アミドリンカー”；  ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメ
チルアミノ）−ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート；  ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール；  ＨＢＴＵ：：Ｎ−［（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）（ジメチルアミノ）メチレン］−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド；  ＤＩＥＡ：ジイソプロピル−エチルアミン；  ＴＥＡＰ：トリエチルアミンホスフェート；  ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；  ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー；  ＥＳ−ＭＳ：エレクトロスプレイ質量分析；  ＴＯＦ−ＰＤＭＳ：プラズマ脱離質量分析（plasma desorption mass spectrometry）；  ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィーを使用する分析と連結された質量分析（mass spectrometry coupled with analysis using liquid chromatography）；  1Ｈ  ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴；  13Ｃ  ＮＭＲ  ：炭素核磁気共鳴。
【実施例】
【００５６】
実施例１：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量（ＨＩＶ−ＨｚＰＡＭリポペプチド）の調製
１）ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成：
５つのペプチド、Ｃ末端で導入されたリシンの側鎖におけるα−ヒドラジノアセティック基（α−ｈｙｄｒａｚｉｎｏａｃｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）によって官能化された、ＨＩＶ−１ウイルスのＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ蛋白質の誘導体を調製した。これらのヒドラジノペプチドを、トリフルオロ酢酸塩の形態で固相合成した。（従来の）Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル ストラテジー、ならびに最近記載された方法［Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−ヒドラジノ酢酸］を、Ｃ末端位におけるリシルアミド残基の脱保護されたε−アミノ基へのヒドラジノアセチル基の標的化導入のために使用した（BONNET D. et al., J. Org. Chem, 2001 and 特許出願PCT/FR00/02336）。配列に依存して、合成の収率は、１０〜５０％である。切断および脱保護後、ペプチドの同定を、ＥＳ．ＭＳ．を使用して検査した。ヒドラジノペプチドは、２４時間１１０℃での塩酸６Ｎ  ＨＣｌ：フェノール、１０：１を用いての完全な酸加水分解後に、アミノ酸組成分析を受ける。
【００５７】
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Ｓｉｍａｔｚｕ  ６Ａ  ＨＰＬＣシステムにおけるＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径１２．５ｍｍおよび２５０ｍｍ長、プレカラム付き）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、Ｓｉｍａｔｚｕ  １０Ａ  ＨＰＬＣシステム上でのＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径４．６ｍｍおよび２５０ｍｍ長）を使用して行う。
【００５８】
溶出溶媒（溶媒ＡおよびＢ）は以下の通りである：
−  溶媒Ａ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水
−  溶媒Ｂ（精製）：プロパン−２−オール／Ｈ2Ｏ混合液（４０：６０）中ＴＦＡ０．０５％。
−  溶媒Ｂ（反応に続く、分析）：アセトニトリル／Ｈ2Ｏ混合液（８０：２０）中ＴＦＡ０．０５％。
【００５９】
溶出速度は、３０分間で１０〜１００％緩衝液Ｂの線形勾配、１０分間の１００％緩衝液Ｂ、１０分間の１０％緩衝液Ｂを使用して、１ｍｌ／ｍｉｎである（２１５ｎｍで検出、温度：５０℃）。
【００６０】
トリフルオロ酢酸塩の形態である得られたペプチドを、以下の表Ｉに示す。
【００６１】
【表１】
2005527513.tif 000006
【００６２】
得られたヒドラジノペプチドについての溶出時間を、以下の表ＩＩに示す。
【００６３】
【表２】
2005527513.tif 000007
【００６４】
２）“水和Ｐａｍベクター”：［３−（２，２−ジヒドロキシ−アセチルアミノ）−プロピル］−アミドヘキサデカン酸の形態でも存在する、Ｐａｍ親油性ベクター［３−（２−オキソ−アセチルアミノ）−プロピル］−アミドヘキサデカン酸の合成：
パルミトイル基およびグリオキシリル基から構成される、このベクターの合成は、ＭＥＬＮＹＫらにより特許出願番号ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７において（実施例４：親油性ベクター“ＩＩＩａ”の合成）およびＢｏｎｎｅｔらにより（BONNET D et coll., Tetrahedron Letters, 2000）記載されている。
【００６５】
５００ｍｌフラスコにおいて、１０ｇ（６６．６ミリモル）の酒石酸１を、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５樹脂１質量％の存在下で、１００％純粋エタノール２００ｍｌ中に溶解する。フラスコに、４Ａ活性化モレキュラーシーブを含有するソックスレーシステム（soxhlet system）を備える。エタノールを４８時間還流する。次いで、反応媒体を、ｎo４焼結ガラスを使用して濾過し、該樹脂を除去する。濾液を減圧下で濃縮し、そして淡黄色オイルが得られる。残渣２を、Ｐ2Ｏ5を使用して一晩乾燥させ、そして追加の精製様式を用いずに使用する（ｍ＝１３．４６ｇ、収率＝９８．０％）。
【００６６】
薄膜クロマトグラフィーを使用しての以下に示す化合物２の分析は、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯＨ溶出液（９０／１０／０．１／０．０５）において、Ｒｆ＝０．７６である。
【００６７】
【化５】
2005527513.tif 000008
【００６８】
１３．４６ｍｇ（６５．２６ミリモル）の化合物２を、１００％純粋エタノール１５５ｍｌ中に溶解し、そして１，３−ジアミノプロパン５６ｍｌ（６６５．２６ミリモル）へ滴下する。次いで、反応媒体を室温で３時間撹拌する。次いで、過剰の１，３−ジアミノプロパンを、減圧下での蒸発およびエタノール（３×２００ｍｌ）の存在下での共沸エントレインメント（azeotropic entrainment）により除去する。得られる黄色オイルを、一晩Ｐ2Ｏ5を使用して乾燥させ、エタノール／トルエン混合液（１／１）中におき、そして減圧下で濃縮する（３×２００ｍｌ）。ペースト形態の黄色化合物を、このようにして得る。この化合物を、エチルエーテル／エタノール（５／１）混合液５０ｍｌ中に析出させ、次いで濾過し、そして白色析出物を、エチルエーテルの存在下、０℃で１時間３０分間撹拌する。次いで、焼結ガラスを使用して濾過し、そして最少量のエチルエーテルで２回コールド洗浄する（cold washed）。残渣固体３を、Ｐ2Ｏ5を使用して一晩乾燥させる（ｍ＝１３．９２ｇ、収率＝８１．３％）。
【００６９】
以下に示す化合物３の分析は、以下の通りである：ＴＨＦ／ＡｃＯＨ／Ｈ2Ｏ／ＡｃＯ-ＮＨ4+（３５／２０／１０／１％質量で(massic））において、Ｒｆ＝０．３４。
【００７０】
【化６】
2005527513.tif 000009
【００７１】
９９６．９ｍｇ（３．８ミリモル）の化合物３を、水１５ｍｌに溶解する。溶液のｐＨ（８．５に等しい）を、１．４６ｇのクエン酸を使用して３．２５まで低下させる。次いで、１．０６  ｇ（４．９ミリモル）の固体ＮａＩＯ4を、水浴を使用して室温で維持された反応混合物へ、５分間４段階で添加した。１０分後、５７０ｍｇの酒石酸（３．８ミリモル）を添加して、反応していない過剰なＮａＩＯ4を中和する。室温で１０分間撹拌した後、２４ｍｌのＮ−メチルモルホリンでｐＨを８．６へ調節する。反応媒体を７０ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オールおよび２０ｍｌの水で稀釈する。次いで、２．１６ｇ（１．６ｅｑ．）のスクシンイミジルパルミトエート（succinimidyl palmitoate）を、該溶液へ添加し、これを室温で一晩撹拌する。次いで、ｐＨを、７．１１ｇのクエン酸で３．５へ調節する。該媒体を、４０ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で稀釈し、そして１４０ｍｌのジクロロメタンそして次いで１００ｍｌのクロロホルムで抽出する。有機相を１００ｍｌの飽和ＫＨ2ＰＯ4溶液で２回、１００ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、次いでＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過しそして減圧下で濃縮する。残渣の固体化合物を、溶出液としてＣＨ2Ｃｌ2／ＡｃＯＥｔ／ＥｔＯＨ混合液（７０／２２／５）を使用してシリカで精製する。９５１．４ｍｇの親油性ベクター（IIIa）（即ち、４２．３％の収率）が、このようにして得られる。
【００７２】
【化７】
2005527513.tif 000010
【００７３】
３）リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、２．２２マイクロモルの値のペプチドに対応する（対イオンおよび該凍結乾燥物（lyophilisates）のペプチド含有量を考慮に入れる）、５つのＨＩＶペプチド（ＨＩＶ １ ＨｚＡｃ；ＨＩＶ ２ ＨｚＡｃ；ＨＩＶ ３ ＨｚＡｃ；ＨＩＶ ４ ＨｚＡｃおよびＨＩＶ ５ ＨｚＡｃ）の各々の当質量混合物（equimassic mixture）９．６ｍｇを使用して行った。この混合物を８５μｌの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターIIIa（９７７μｇ、２．５２マイクロモル）を５ｍｍ直径のガラスボール（glass balls）を用いて磁気撹拌しながら７１４ｍｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に添加する（即ち、該ペプチドに対して１．１４モル当量）。反応媒体の全容量（１．７ｍｌ）は、２―メチル−プロパン−２−オールを添加することによって達成される。時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。マイクロ分取実験（micro-preparative experiment）を、生成物の同定を可能にするために行う：サンプルを取り、Ｃ３カラム（Zorbax, 4.6 mm x 250 mm）においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF Voyager ABI 4192（ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間３００ｍｓ、α−シアノケイ皮酸マトリックス）を備えるMALDI-TOF質量分析を使用して、それらを同定する。４時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。得られるリポペプチドについての保持時間（ret.）を、下記の表IIIに示す。
【００７４】
【表３】
2005527513.tif 000011
【００７５】
４）リポペプチドの混合物の調製
イオン交換：
ＴＦＡ塩の形態のリポペプチドを、ｐＨ３の酢酸水溶液に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（C4 Nucleoprep カラム, 25 mm x 100 mm）上にロードし、次いで同一の溶媒を使用して洗浄し（洗浄操作は、５カラムのそれに対して容積当量で行う）、その後、水／プロパン−２−オール（６０：４０）中ｐＨ３の酢酸溶媒へ移すことなく続けることによって溶出する。
【００７６】
最終調製：
凍結乾燥したリポペプチドの混合物を、酢酸の１０％溶液へ溶解し、その後、０．２２μメンブラン（SLGV, Millipore）上での滅菌濾過（sterilising filtration）を行う。
【００７７】
５）ワクチン用量の調製：
臨床的に許容される賦形剤（マンニトール／リポペプチド  １０／１（ｗ／ｗ）およびポリソルベート８０／リポペプチド  ２／７（ｗ／ｗ））の導入後、溶液を水中に稀釈し、そして滅菌ガラスアンプル中にアリコートし、その後、最終の凍結乾燥を行う。
【００７８】
ヒトに対して第Ｉ相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル２．５ｍｇである。
【００７９】
実施例２：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量（ＣＨＶ  ＨｚＰＡＭリポペプチド）の調製
１）ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成：
それらのＮ末端がα−ヒドラジノアセティック基で官能化された、ＨＣＶ−１ウイルスのＮＳ３タンパク質から誘導される、３つのペプチドを調製した。これらのヒドラジノペプチドを、トリフルオロ酢酸塩の形態で固相合成した。（従来の）Ｆｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチルストラテジー、ならびに最近記載されたプロセス［Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−ヒドラジノ酢酸］を、実施例１のように、Ｎ−末端位のリシルアミド残基の除去によって脱保護されたε−アミノ基へのヒドラジノアセチル基の標的化導入のために使用した。配列に依存して、合成収率は、１０〜５０％である。ペプチドの同定は、ＥＳ．ＭＳによってチェックした。ヒドラジノペプチドを、２４時間１１０℃での塩酸６Ｎ  ＨＣｌ：フェノール（１０：１）を用いるトータル酸加水分解後、アミノ酸組成の分析に供する。
【００８０】
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Ｓｉｍａｔｚｕ  ６Ａ  ＨＰＬＣシステムにおけるＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径１２．５ｍｍおよび２５０ｍｍ長、プレカラム付き）上のＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いる分析を、Ｓｉｍａｔｚｕ  １０Ａ  ＨＰＬＣシステム上でのＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径４．６ｍｍおよび２５０ｍｍ長）上で行った。
【００８１】
溶出溶媒（溶媒ＡおよびＢ）は以下の通りである：
−  溶媒Ａ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水
−  溶媒Ｂ（精製）：プロパン−２−オール／Ｈ2Ｏ混合液（４０：６０）中ＴＦＡ０．０５％。
−  溶媒Ｂ（反応に続く、分析）：Ｎプロパノール／Ｈ2Ｏ混合液（８０：２０）中ＴＦＡ０．０５％。
【００８２】
溶出速度は、３０分間で１０〜１００％緩衝液Ｂの線形勾配、５分間の１００％緩衝液Ｂ、１０分間の０％緩衝液Ｂを使用して、１ｍｌ／ｍｉｎである（２１５ｎｍで検出、温度：５０℃）。
【００８３】
得られたヒドラジノペプチドを下記の表ＩＶに示す。
【００８４】
【表４】
2005527513.tif 000012
【００８５】
ヒドラジノペプチドについての保持時間を下記の表Ｖに示す。
【００８６】
【表５】
2005527513.tif 000013
【００８７】
２）Ｐａｍベクターの合成：
パルミトイル基およびグリオキシリル基からなる、このベクターIIIaの合成は、実施例１において記載される。
【００８８】
３）リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、１０．７７マイクロモルの値のペプチドに対応する（対イオンおよび該凍結乾燥物（lyophilisates）のペプチド含有量を考慮に入れる）、３つのヒドラジノペプチドの各々の当質量混合物（equimassic mixture）４１．８ｍｇを使用して行った。この混合物を４１５μｌの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターIIIa（４７５７μｇ、１２．２８マイクロモル、即ち、該ペプチドに対して１．１４当量）を５ｍｍ直径のガラスボール（glass balls）を用いて磁気撹拌しながら添加し、９５０μｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解する。反応媒体の全容量（８．２９０ｍｌ）は、２―メチル−プロパン−２−オールを添加することによって到達する。
【００８９】
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
【００９０】
マイクロ分取実験（micro-preparative experiment）を、生成物の同定を可能にするために行う：サンプルを取り、Ｃ３カラム（Zorbax, 4.6 mm x 250 mm）においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF質量分析（MALDI-TOF Voyager ABI 4192、ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間３００ｍｓ、α−シアノケイ皮酸マトリックス）を使用して、それらを同定する。
【００９１】
４時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
【００９２】
得られるリポペプチドについての保持時間は、下記の表VIに示される保持時間を有する。
【００９３】
【表６】
2005527513.tif 000014
【００９４】
３’）分枝グリコミメティックを有するリポペプチドの合成
この合成は、前記で得られたＨＣＶヒドラジノペプチドと、本発明の式（ＩＶ）に従う、Ｃ−末端リシルアミド残基の除去によって脱保護されたε−アミノ基上へヒドラジノアセチル基が導入されるＦｍｏｃ／ｔｅｒｔ−ブチル ストラテジーを使用して合成されたリシンツリー（lysine tree）から作製された４つの原子価（テトラキノイル化ツリー（tetraquinoylated tree））を有する分枝したグリコミメティックとの混合物に基づいて行われる。
【００９５】
［（Ｑｕｉ）4ＡＫＨｄｚ］として公知のこのグリコミメティックの合成は、特許出願番号ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７の実施例２に記載されている。
【００９６】
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。２．１４マイクロモルのヒドラジノペプチドに対応する、３つのヒドラジノペプチドの各々の当質量混合物（equimassic mixture）８．９ｍｇを、２．３ｍｇ（または１．６μモル）のヒドラジングリコミメティックへ添加する。１４０μｌの水を使用しての湿潤化後に形成されるゲルへ、２−メチル−プロパン−２−オール（４１０μｌ）中の溶液中に配置された親油性ベクターＩＩＩａ（１６４０マイクログラム、または１．１４ペプチド当量）を、多数の５ｍｍ直径のガラスボール（glass balls）を用いて磁気撹拌しながら、添加する；最終容積は２．７ｍｌである。
【００９７】
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
【００９８】
３時間後、混合物を水中に稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
【００９９】
４）および４’）リポペプチドの混合物の調製
実施例１に記載されるようなイオン交換に続いて、３）および３’）で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、１０％酢酸溶液へ溶解し、その後、０．２２ミクロンメンブラン（SLGV， Millipore）上で滅菌濾過を行う。
【０１００】
５）および５’）ワクチン用量の調製
５）Ｍａｎｎｉｔｏｌ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）製剤：［３リポペプチド、Ｐａｍベクター］
臨床的に許容される賦形剤（マンニトール／リポペプチド  １０／１（ｗ／ｗ）およびポリソルベート８０／リポペプチド  ２／７（ｗ／ｗ））の導入に続いて、溶液を水中に稀釈し、そして滅菌ガラスアンプル中にアリコートし、その後、最終の凍結乾燥を行う。
【０１０１】
５’）マンニトール−脂質化（lipidated）グリコミメティック製剤：［３リポペプチド＋グリコミメティック、Ｐａｍベクター］
リポペプチドと脂質化グリコミメティック［（Ｑｕｉ）4ＡＫＨｄｚ］との凍結乾燥化混合物を、酢酸の１０％溶液へ溶解し、その後、０．２２ミクロン（SLGV， Millipore）メンブラン上で滅菌濾過を行う。臨床的に許容される賦形剤（マンニトール／リポペプチド  １０／１（ｗ／ｗ））の導入に続いて、溶液を滅菌フラスコ中で水に稀釈し、その後最終の凍結乾燥を行う。
【０１０２】
ヒトに対して第Ｉ相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル２．５ｍｇである。
【０１０３】
実施例３：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量（ＨＣＶ  ＨｚＣＣｈｏｌリポペプチド）の調製
１）ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成
合成は、実施例２のものと同一である。
【０１０４】
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Ｓｉｍａｔｚｕ  ６Ａ  ＨＰＬＣシステムにおけるＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径１２．５ｍｍおよび２５０ｍｍ長、プレカラム付き）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いる分析を、Ｓｉｍａｔｚｕ  １０Ａ  ＨＰＬＣシステムについてＣ３分取カラム（Ｚｏｒｂａｘカラム：３００Å、５μＭ、直径４．６ｍｍおよび２５０ｍｍ長）上で行った。
【０１０５】
溶出溶媒（溶媒ＡおよびＢ）は以下の通りである：
−  溶媒Ａ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水
−  溶媒Ｂ：プロパン−２−オール／Ｈ2Ｏ混合液（４０：６０）中ＴＦＡ０．０５％。
【０１０６】
溶出速度は、３０分間で０〜１００％緩衝液Ｂの線形勾配、５分間の１００％緩衝液Ｂ、１０分間の０％緩衝液Ｂを使用して、１ｍｌ／ｍｉｎである（２１５ｎｍで検出、温度：５０℃）。
【０１０７】
２）"水和Ｃｃｈｏｌベクター"［３−（２−オキソ−アセチルアミノ）−プロピル］
−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル  エステル）の形態でもある、Ｃｃｈｏｌベクター（［３−（２，２−ジヒドロキシ−アセチルアミノ）−プロピル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル  エステルの合成
このベクターの合成は、ＭＥＬＮＹＫらにより、特許出願番号ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７、実施例４：“ＩＩＩｃ”親油性ベクターの合成［本発明において式（ＩＩ）に対応する］において記載される。
【０１０８】
３）リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、２．９６マイクロモルのペプチドに対応する（対イオンおよび該凍結乾燥物（lyophilisates）のペプチド含有量を考慮に入れる）、３つのＨＣＶペプチド（ＨＣＶ １ ＨｚＡｃ；ＨＣＶ ２ ＨｚＡｃおよびＨＣＶ ３ ＨｚＡｃ）の各々の当質量混合物（equimassic mixture）１２．２ｍｇを使用して行った。この混合物を１１５μｌの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターＩＩ（１９２６μｇ、３．３７４マイクロモル、即ち、該ペプチドに対して１．１４当量）を５ｍｍ直径のガラスボール（glass balls）を用いて磁気撹拌しながら添加し、２９２μｌの２−メチル−プロパン−２−オール中に溶解する。反応媒体の全容量（２．３ｍｌ）は、２―メチル−プロパン−２−オールを添加することによって到達される。
【０１０９】
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
【０１１０】
マイクロ分取実験（micro-preparative experiment）を、生成物の同定を可能にするために行う：サンプルを取り、Ｃ３カラム（Zorbax, 4.6 mm x 250 mm）においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF質量分析（MALDI-TOF Voyager ABI 4192、ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間３００ｍｓ、α−シアノケイ皮酸マトリックス）を使用して、それらを同定する。
【０１１１】
４時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
【０１１２】
得られるリポペプチドについての保持時間は、下記の表VIIに示される。
【０１１３】
【表７】
2005527513.tif 000015
【０１１４】
３’）分枝グリコミメティックを有するＣＣｈｏｌリポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。この合成は、該ヒドラジノペプチドを、４つの原子価を有する分枝したグリコミメティック［（Ｑｕｉ）4ＡＫＨｄｚ］をヒドラジノペプチドと混合することから開始されて行われる。２．９マイクロモルのヒドラジノペプチドに対応する、３つのヒドラジノペプチド（３において記載）の各々の当質量混合物（equimassic mixture）１２ｍｇを、３．３ｍｇ（または２．２μモル）のヒドラジングリコミメティックへ添加する。２００μＬの水を使用しての湿潤化後に形成されるゲルへ、２−メチル−プロパン−２−オール（５１０μｌ）中の溶液中に配置された親油性ベクター（ＩＩ）（３３６０マイクログラム、または１．１４ペプチド当量）を、多数の５ｍｍ直径のガラスボール（glass balls）を用いて磁気撹拌しながら、添加する。最終容積は３．８ｍｌである。
【０１１５】
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行してモニターされる。
【０１１６】
４時間後、混合物を水中に稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
【０１１７】
３）および３’）に従う（グリコミメティックを有するまたは有しない）ＣＣｈｏｌリポペプチドの場合、更なる精製工程が、かなりの量（quite considerable）の反応していないヒドラジン前駆体を排除するために必要とされる。
【０１１８】
反応媒体のこの精製は、Ｃ４  Ｄｅｌｔａｐａｋ  ＷＡＴＥＲＳカラム（１５μＭ、３００Å、８ｍｍ直径および１００ｍｍ長）を備えているＳｈｉｍａｄｚｕ  ６Ａシステム上でのＲＰ−ＨＰＬＣを使用して行われる。
【０１１９】
溶出溶媒（溶媒ＡおよびＢ）は以下の通りである：
−  溶媒Ａ：ＴＦＡ０．０５％を含む脱イオン水、
−  溶媒Ｂ（精製）：プロパン−２−オール／Ｈ2Ｏ混合液（４０：６０）中ＴＦＡ０．０５％。
【０１２０】
溶出速度は、１２分間で０〜８０％緩衝液Ｂの線形勾配、次いで１００％の緩衝液Ｂを使用して、２ｍｌ／ｍｉｎである。溶出されたリポペプチドフラクションを凍結し、そして凍結乾燥する。
【０１２１】
４）および４’）リポペプチドの混合物の調製
実施例１に記載されるようなイオン交換に続いて、３）および３’）で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、１０％酢酸溶液へ溶解し、その後、０．２２ミクロンメンブラン（SLGV， Millipore）上で滅菌濾過を行う。
【０１２２】
５）および５’）ワクチン用量の調製
５）マンニトール−Ｔｗｅｅｎ製剤：［３リポペプチド、ＣＣｈｏｌベクター］
臨床的に許容される賦形剤（マンニトール／リポペプチド  １０／１（ｗ／ｗ）およびポリソルベート８０／リポペプチド  ２／７（ｗ／ｗ））の導入に続いて、リポペプチド溶液を滅菌フラスコ中で水で稀釈し、その後、最終の凍結乾燥を行う。
【０１２３】
５’）マンニトール−脂質化（lipidated）グリコミメティック製剤：［３リポペプチド＋グリコミメティック、ＣＣｈｏｌベクター］
臨床的に許容される賦形剤（マンニトール／リポペプチド  １０／１（ｗ／ｗ））の導入に続いて、リポペプチドと脂質化グリコミメティック溶液を滅菌フラスコ中で水で稀釈し、その後、最終の凍結乾燥を行う。
【０１２４】
ヒトに対して第Ｉ相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル２．５ｍｇである。
【０１２５】
実施例４：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する免疫応答を誘発する、ワクチン能を有するリポペプチドの能力の、マウスにおける評価（前臨床試験）
Ａ／特異的リンパ増殖応答
それらのＮ末端（実施例２を参照のこと）またはそれらのＣ末端（実施例１の合成プロトコルを参照のこと）がα−ヒドラジノアセティック基によって官能化された、ＨＣＶ−１ウイルスのＮＳ３タンパク質から誘導された、３つのペプチドを、Ｐａｍベクターによって脂質化した（lipidated）。
【０１２６】
これらのリポペプチドの免疫原性を、同系Balb/cおよびC57bl/6マウスにおいて、３つのＮ末端またはＣ末端リポペプチドＰａｍベクター（１マウス当たり１．２ｍｇの該混合物、１００μｇのリポペプチドと同等）、または３つの天然ペプチド（１マウス当たり１００μｇ）＋モンタニドＩＳＡ  ７２０、または３つの天然ペプチドのみ（１マウス当たり１００μｇ）の皮下注射後に分析した。
【０１２７】
リンパ増殖（Lymphoproliferation）を、以下に記載されるように、マウス脾臓細胞の培養後に測定する：
脾臓を回収し、そしてＲＰＭＩ  １６４０培地（GIBCO BRL）中４℃でインキュベートする。次いで、該細胞をナイロンメンブラン上で砕く。該細胞を、４℃で１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離する。赤血球を、４℃で１０分間、溶解緩衝溶液の存在下で溶解させる。次いで、細胞を、自己マウス血清を４％含有するＨＬ−１培地（Biowhittaker）中で遠心分離する。次いで、細胞をポリスチレン製の９６−Ｕ形状のウエル培養プレート（Costar）中に、、１ウエル当たり１００μｌの量で、分配する。天然合成ペプチド（Neosystem）をＨＬ−１培地（Biowhittaker）中に稀釈し、次いで、１ウエル当たり１００μｌの量で添加して、２５μｇ／ｍｌの最終濃度を得る。
【０１２８】
培養プレートを、湿った雰囲気および５％のＣＯ2下、３７℃で７２時間インキュベートする。トリチウム化メチル−チミジン（Amersham）をＨＬ−１培地（Amersham）中に稀釈し、次いで２５μｌ中１μＣｕｒｉｅの割合で、各ウエルへ添加する。１６時間のインキュベーション後、細胞を、ＴＯＭＴＥＣシステムを備えるガラスファイバーフィルター（Wallac）上において回収する。次いで、トリチウム化チミジンの取り込み（incorpoaration）を、ベータカウンター（Wallac 140 microbeta counter）を使用して測定する。
【０１２９】
この分析の結果を下記の表VIIIに示す。
【０１３０】
【表８】
2005527513.tif 000016
【０１３１】
【表９】
2005527513.tif 000017
【０１３２】
これらの分析結果は、同系Balb/cおよびC57bl/6マウスに皮下注射された両方の構築タイプ（Ｎ末端位およびＣ末端位）が、ＨＣＶペプチド配列−特異的リンパ増殖応答を誘発し得るを示す。
【０１３３】
Ｂ／液性応答
Ａ／において使用したＮ末端位での３つのリポペプチドは、マウスにおいて液性応答を誘発するためにアッセイした。３つの天然ペプチドおよびモンタニド ＩＳＡ ７２０（montanide ISA 720）もまたコントロールとしてアッセイした。
【０１３４】
マウスを、１．２ｍｇ（１００μｇと同等のＰａｍベクターリポペプチド＋マンニトール＋Ｔｗｅｅｎ、あるいはモンタニド（montanide）の存在下での天然ペプチドの混合物１００μｇ）の皮下投与によって免疫化した。免疫化続いての第１５日および第２９日でのリコール(recall)を行った。血清を、第１回の抗原投与後、第１４、２８および４２日でサンプリングした。
【０１３５】
抗原特異的免疫グロブリンの定量分析を以下のように行った：
ペプチド抗原を、１０μｇ／ｍｌの濃度で、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．２）中に溶解させる。１ウエル当たりこの溶液１００μｌを、９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｂ（ＮＵＮＣ）培養プレート中に添加する。４℃で一晩インキュベーションしそしてＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎ緩衝液において２回洗浄した後、ウエルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を３％含有するＰＢＳ緩衝液の存在下で飽和する。室温で２時間インキュベートした後、ウエルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中で洗浄した（wash out）。次いで、１／１００に稀釈した血清１００μｌを添加して４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄を行う。ペルオキシダーゼで標識された二次抗体（マウス抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Sanofi Pasteur）を、室温で１時間、１ウエル当たり１００μｌの割合で、ＰＢＳ−ＢＳＡ  １％緩衝液中でインキュベートする。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ中で４回洗浄後、反応を、曝露緩衝液（revelation buffer）（過ホウ酸ナトリウムを含むリン酸−クエン酸緩衝液、SIGMA）中に稀釈されたオルトフェニルジアミンジヒドロクロリド（OPD, SIGMA）の存在下に曝露する。暗所中での３０分間インキュベーション後、反応を、１ウエル当たり５０μｌの割合で１Ｍ ＨＣＬの存在下で停止させる。読み取り（reading）を、４９２ｎｍの波長で行う。結果を下記の表ＩＸ中に示す。
【０１３６】
【表１０】
2005527513.tif 000018
【０１３７】
使用したリポペプチドは、２つのリコール（recalls）によって続けられる免疫化を続ける、これら同一のマウスモデル中での特異的抗体の産生によって特徴付けられる液性応答を誘発し得ないことを示す。この結果は、これら同一配列が、油性アジュバント（例えば、モンタニド  ＩＳＡ  ７２０ｎ）の存在下で投与される場合に、非常に重要な抗体応答（これは、第１免疫化（first immunisation）からである場合に検出可能である）を誘発するという点で、なおいっそう新規である。この結果は、リポペプチドが、細胞性タイプの応答の方向において非常に明確に免疫に向けられていることを示す。
【０１３８】
Ｃ／ＰａｍおよびＣＣｈｏｌベクターの比較
リポペプチドの混合物の免疫原性を、マウスにおいて評価した。上記実施例２および３に示される異なる製剤（３リポペプチド、Ｐａｍベクター；３リポペプチド＋グリコミメティック、Ｐａｍベクター；３リポペプチド、ＣＣｈｏｌベクター；３リポペプチド＋グリコミメティック、ＣＣｈｏｌベクター）をアッセイした。
【０１３９】
１）舌下免疫化プロトコル
注射可能な調製物（Ｈ2Ｏ2 ｐｐｉ）のために５μｌの水に溶解させた各脂質混合物４８０μｇを用いて、マウスを舌下免疫化する。リコールを、以前と同一条件下で、第１免疫化後第１４日に行う。１４日後、動物を殺し、脾臓を回収し、そして脾臓細胞を、１０μｇ／ｍｌの濃度で、異なる天然ペプチド（単独または混合）の存在下で培養する。
【０１４０】
２）培養上清中に産生されるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の定量分析
マウスＩＬ−２特異的一次抗体（ラット抗−マウスＩＬ−２、Pharmingen 18161D）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）中そして２μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートする。１ウエル当たり５０μｌのこの溶液を、Ｍａｘｉｓｏｒｂ（ＮＵＮＣ）９６−ウエル培養プレートへ添加する。４℃で一晩インキュベートしそして洗浄をＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎ緩衝液中２回行った後、該ウエルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を３％含有するＰＢＳ緩衝液の存在下で飽和する。室温で２時間インキュベーション後、２回洗浄を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液中で行う。次いで、１００μｌの培養上清を添加し、そして４℃で一晩インキュベートする。組換えマウスＩＬ−２稀釈範囲を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ（２０ｎｇ〜０．３ｐｇ）中で調製し、そしてこの調製物１００μｌを各ウエルに配置する。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄を行う。
【０１４１】
マウスＩＬ−２特異的ビオチン化二次抗体（ビオチンラット抗−マウスＩＬ−２、Pharmingen 18172D）を、室温で１時間、１ウエル当たり１００μｌの割合で、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝液中においてインキュベートする。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１ｍｇ／ｍｌまで稀釈されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Jackson Immunoresearch）を、室温で３０分間、１００μｌの容積で各ウエルへ添加する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で４回洗浄後、反応を、曝露緩衝液（revelation buffer）（過ホウ酸ナトリウムを含むリン酸−クエン酸緩衝液、SIGMA）中に稀釈されたオルトフェニルジアミンジヒドロクロリド（OPD, SIGMA）の存在下に曝露する。暗所中での３０分間インキュベーション後、反応を、１ウエル当たり５０μｌの割合で１Ｍ ＨＣＬの存在下で停止させる。読み取り（reading）を、４９２ｎｍの波長で行う。
【０１４２】
３）別の舌下免疫化プロトコル
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を、５μｌのリポペプチド混合物（約４０μｇのリポペプチドと等価の４８０μｇの粉末）の舌下投与によって免疫化した。リコールを、同量のリポペプチド混合物で、この第１免疫化後第１４日に行う。５ Ｂａｌｂ／ｃマウス（IFFA-CREDO）のグループを、４つの製剤：［３リポペプチド＋グリコミメティック、ＣＣｈｏｌベクター］；［３リポペプチド、ＣＣｈｏｌベクター］；［３リポペプチド＋グリコミメティック、Ｐａｍベクター］；［３リポペプチド＋グリコミメティック、Ｐａｍベクター］の各々について形成させた。
【０１４３】
リコール後第７日に、マウスを殺し、脾臓を回収し、そして動物の各群に従ってグループ化する。各グループのマウスの細胞を、個々にまたは混合物で開始して異なる天然ペプチド（濃度１０μｇ／ｍｌ）を使用して再刺激する。細胞培養後２４時間に、上清を回収して、それらのＩＬ−２含有率を定量する。結果を、上清１ｍｌ当たりのＩＬ−２のピコグラムで示す。
【０１４４】
下記の表Ｘは、マウスにおける異なるリポペプチド混合物についての免疫原性分析を示す。
【０１４５】
【表１１】
2005527513.tif 000019
【０１４６】
得られた結果は、ＣＣｈｏｌベクターによる脂質化（lipidation）から得られるリポペプチドは、Ｐａｍベクターによる脂質化から得られるリポペプチドよりも良好な応答を誘発することを示す。
【０１４７】
これらのＣＣｈｏｌリポペプチドは、それらが粘膜に（mucosally）、そして特には舌下に投与される場合、特に免疫原性であると判る。
【０１４８】
実施例５：サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に対するＣＴＬタイプ応答を誘発するリポペプチドワクチンの能力の、マカク（Macaque）における評価
１）ヒドラジノペプチドの合成
特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７の実施例１は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＮｅｆおよびＧａｇ蛋白質から誘導されるペプチド配列からの、α−ヒドラジノアセティック基によって官能化されたペプチドの合成を記載している。
【０１４９】
ここで使用されるペプチド配列は、ＳＩＶ１配列（下記の表ＸＩの新規の配列を参照のこと）以外は、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７に記載されるものと同一である。
【０１５０】
【表１２】
2005527513.tif 000020
【０１５１】
＊特許出願番号ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７に記載されるＳＩＶ  １配列と比較して、ここに示されるＳＩＶ  １’配列は、１１０位および１１２位に２つの突然変異を含む）。
【０１５２】
２）親油性ベクターの合成
親油性ベクターは、実施例１に記載のベクターＩＩＩａである。
【０１５３】
３）リポペプチドの合成
特許出願ＰＣＴ／ＦＲ０１／０２７８７の実施例８は、ヒドラジノペプチドおよび親油性ベクターをカップリングするための方法を記載している。
【０１５４】
このように合成されるリポペプチドの名称および分子量は、以下の表ＸＩＩに与えられる：
【０１５５】
【表１３】
2005527513.tif 000021
【０１５６】
４）リポペプチドの混合物の調製
ＲＰ−ＨＰＬＣを使用し、そして短い勾配（short gradient）を使用して、実施例１に記載されるようなイオン交換に続いて、３）で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、５％酢酸溶液へ溶解し、その後、０．２２ミクロンメンブラン（SLGV， Millipore）上で滅菌濾過を行う。
【０１５７】
５）ワクチン用量(doses)の調製
マンニトール−Ｔｗｅｅｎ製剤：
工程４）後、マンニトール、ならびに１０単位用量の調製のために十分な量のＴｗｅｅｎ８０を導入し、この用量当たりの組成は以下の通りである：
・１用量は、３．５ｍｇペプチド当量（１ペプチド当たり０．５ｍｇ）、または約４．２ｍｇのリポペプチドを示す。
・アピロジェニックマンニトール（apyrogenic mannitol）：１用量当たり約４２ｍｇ。
・ポリソルベート８０：１用量当たり約１ｍｇ
・１用量当たりの粉末の総量：約４７ｍｇ
・−２０℃で保存。
【０１５８】
得られる用量を、溶液中のこの製剤で置換することによって、僅かに乳白光を発する溶液が得られる。
【０１５９】
脂質化したマンニトール−グリコミメティック製剤
混合物は、ヒドラジノペプチド（トリフルオロアセテート）（１ヒドラジノペプチド当たり５．８ｍｇ）の混合物の同時脂質化（simultaneous lipidation）（実施例３、パート３’）におけるように）によって調製され、ここへ、分枝したグリコミメティック（［（Ｑｕｉ）4ＡＫＨｄｚ］）、１２．９ｍｇ）を添加する。
【０１６０】
脂質化後、混合物を稀釈し、次いで凍結乾燥させた。トリフルオロアセテート対イオンを、短い勾配を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって、アセテート対イオンで置換した。
【０１６１】
凍結乾燥後、粉末を水および５％酢酸中に溶解し、その後、該調製物を０．２２μメンブラン（SLGV, Millipore）上での滅菌濾過に供する。マンニトールを、１１単位用量の調製物に十分な量で導入し、この調製物の１用量当たりの組成は以下の通りである：
・１用量は、３．４ｍｇペプチド当量＋グリコミメティック（１ペプチド当たり０．５ｍｇ）または約４．２ｍｇのリポペプチドを示す
・アピロジェニックマンニトール（apyrogenic mannitol）：１用量当たり約４２ｍｇ。
・１用量当たりの粉末の総量：約４７ｍｇ
・−２０℃で保存。
【０１６２】
得られる用量を、溶液中のこの製剤で置換することによって、僅かに乳白光を発する溶液が得られる。
【０１６３】
７）マンニトールＴｗｅｅｎ製剤のマカクにおける研究
１単位用量（unit dose）は、１動物当たり使用され、そして注射によって投与される。該用量は、注射可能な調製物の場合、水中に稀釈され（１用量当たり１ｍｌ）、乳白光を発する溶液が得られる。
【０１６４】
生成物（添加剤無し）を、１０ポイントの注射（１ポイント当たり１００μｌ）で皮内（４マカク）、筋内（４マカク）投与した。３週間隔で３回注射を行い、そして最後の注射後２ヶ月にリコールを投与した。プレ免疫化の間、第３免疫化後１５日およびリコール後１４日に採取した血液サンプルにおいて、免疫応答をアッセイした。
【０１６５】
該ペプチドによる全ての血液単核細胞（PBMC、末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells））の前もってのインビトロ再刺激に続いて、ガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）を分泌する循環しているエフェクター（effectors）およびそれらの前駆体の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して評価することにより、免疫化効率をアッセイした。
【０１６６】
ＰＢＭＣの調製：
ＰＢＭＣを、リンパ球分離培地（lymphocyte separation medium）（Flow Laboratories, Glasgow, UK or Pharmacia, Uppsala, Suede）上の勾配における遠心分離によって単離し、そして直ちに使用する。
【０１６７】
インビトロにおける再刺激：
ＰＢＭＣ（１６．１０6細胞）を、５百万／ｍｌで完全ＲＰＭＩ １６４０培地に配置し、そして４百万細胞の４チューブにアリコートし、これを、リポペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で一晩インキュベートする。
【０１６８】
いくつかの細胞系を作製する：
系０：ペプチド無し；
系１：SIV1 HzPam (LP1)およびSIV2 HzPam (LP2)有り；
系２：SIV3 HzPam (LP3)、SIV4 HzPam (LP4)およびSIV5 HzPam (LP5)有り；
系３：SIV6 HzPam (LP6)およびSIV 7HzPam (LP7)有り。
【０１６９】
次の日に１回洗浄後、細胞系を、１ｍｌ当たり２百万細胞の割合および１ウエル当たり２ｍｌの割合で、２４ウエル培養プレートに配置する。第３および７日に、インターロイキン２（ＩＬ−２、１０ＵＩ／ｍＬ）を、第７日での培地の交換と共に、添加する。これらのエフェクターを、培養の第１２日後にアッセイし、そしてアッセイの直前に２回洗浄した。
【０１７０】
ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮ−アッセイ：
ニトロセルロースの９６ウエル培養プレート（Millipore）を、先ず、マウス抗サルＩＦＮ−γモノクローナル抗体（mabtech clone GZ-4）と共に４℃で一晩感作する（リン酸緩衝溶液中１／１０００稀釈：最終段階で、濃度１マイクログラム／ｍｌ）。滅菌ＰＢＳ緩衝溶液での洗浄およびＣＯ2雰囲気下３７℃での２時間の完全培地による飽和後、１ｍｌ当たり５マイクログラムの最終濃度で、異なるペプチド有り（以下の段落を参照のこと）、ＩＬ−２無しで、（または、ネガティブコントロールの場合はペプチド無しで）、エフェクター細胞を二重で配置する（１ウエル当たり１０００００細胞）。インキュベーションを３７℃で２４時間維持する。次いで、培養プレートを、ＰＢＳで、次いでＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで数回洗浄する。この洗浄後、培養プレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ、１％ＢＳＡ（mabtech clone 7-B6-1, １マイクログラム／ｍｌ、最終段階）中で１／１０００まで稀釈したビオチン化マウス抗サルγ−ＩＦＮモノクローナル抗体と共に、４℃で一晩または３７℃で２時間インキュベートする。
【０１７１】
数回の洗浄後、反応を、１ｍｌ当たり２．５マイクログラムの割合で、アルカリ性エクストラアビジン−ホスフェート（Extravidine-phosphatase）（SIGMA）によって曝露する（インキュベーション  室温で１時間）。追加洗浄後、測定可能な着色（colouration）を、１５〜３０分間、ニトロブルーテトラゾリウムサブストレート（BioRad）を用いて発色する。次いで、培養プレートを水でリンスし、そして乾燥する。アッセイの読み取りを、×４０実体顕微鏡（Leica MZ6）を使用してスポット（コントラストのついた中心および拡散したアウトライン）をカウントすることによって行う。各々の紫色のスポットは、γ−ＩＦＮを分泌する細胞、即ちＳＦＣ（スポット形成細胞（Spot Forming Cell））に対応する。
【０１７２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために使用する小さいペプチドの混合物：
（９〜１５マーの混合物）：
L3.P1 (nef 155-178のエピトープ) = 156-165 ; 168-177; 165-174
L3.P2 (nef 155-178のエピトープ) = 157-165 ; 169-178 ; 166-174
L3.P3 (nef 155-178のエピトープ) = 158-167 ; 162-171 ; 167-175
L4.P1 (nef 201-225のエピトープ) = 201-211 ; 205-213 ; 211-219 ; 215-225
L4.P2 (nef 201-225のエピトープ) = 201-210 ; 205-212 ; 214-223 ; 210-219
L4.P3 (nef 201-225のエピトープ) = 203-211 ; 206-215 ; 215-223 ; 204-212
L5.P1 (nef 221-247のエピトープ) = 222-229 ; 236-244 ; 225-233
L5.P2 (nef 221-247のエピトープ) = 224-233 ; 239-247.
Mix6 (nef 201-225のエピトープ) = 201-211 ; 205-213 ; 211-219 ; 215-225 ; 201-210 ; 205-212
L7P1 (gag 246-281のエピトープ) = 250-257 ; 255-263 ; 261-269 ; 268-276 ; 253-262。
【０１７３】
８）結果：
以下の表ＸＩＩＩは、各動物について、第３免疫化後１５日またはリコール後１４日に有意な様式でＳＦＣを検出することを可能にしたペプチド混合物を示す：
【０１７４】
【表１４】
2005527513.tif 000022
【０１７５】
第１グループ（マカク1053, 1059, 1060, 1066）は、皮内投与された７リポペプチドの混合物を受容した。結果は２マカク（1053および1066）において陽性応答を示し、これらは小さなペプチド各々の１プール（pool）を認識する。これらの応答は、最後の免疫化後１５日に見ることができる。第２グループ（マカク1051, 1062, 1068, 1077）は、筋内投与された７リポペプチドの混合物を受容した。４マカクのうち３つが小さなペプチドの１プールに対してＣＤ８応答を示し（２マカク、1051および1062）、第３番目は３プールに対して向けられた応答を有した（マカク1077）。これらの応答は、マカク1051および1062の場合には最後の免疫化後１５日に、そしてマカク1051, 1062および1077の場合にはリコール後１５日に見ることが出来た。動物1051から得られた細胞系２で得られた詳細な結果は、図１に示される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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