(57)【要約】本発明は代謝症候群、循環器疾患および／またはアテローム性動脈硬化症の予防または処置に用いられる分子をスクリーニングするための組成物および方法に関する。特に、本発明はアポリポタンパク質ＡＩＶに類似する新規タンパク質の活性に及ぼす被験化合物の影響の決定に基づいて化合物をスクリーニングするための方法およびキットに関する。本発明はまたトリグリセリドの濃度を低下させる、ならびに／またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）の濃度もしくは発現を低下させる、ならびに／またはＶＬＤＬの濃度を低下させる、ならびに／またはＬｐＬおよび／もしくはＨＬの活性を上昇させる、ならびに／またはコレステロール逆輸送を増加させるための組成物および方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を調整する被験化合物の能力を決定することを含む、哺乳動物における循環性アポリポタンパク質ＣＩＩＩもしくはアポリポタンパク質ＣＩＩＩに富む脂質粒子のレベルを低下させる、ならびに／またはリポタンパク質リパーゼおよび／もしくは肝臓リパーゼの活性を上昇させる、ならびに／またはコレステロール逆輸送を増加させるための化合物を選択、同定または特徴づけするための方法。
【請求項２】
インビトロでまたはエクソビボでＡＡ４ＲＰタンパク質の合成を調整する被験化合物の能力を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を上昇させる被験化合物の能力を決定する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
インビトロまたはエクソビボで被験化合物をＡＡ４ＲＰ遺伝子プロモーターの配列のすべてまたは部分を含有する転写プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を含む細胞と接触させること、およびレポーター遺伝子の発現を変調する上記被験化合物の能力を決定することを含む、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
ＨＤＬまたはＶＬＤＬ粒子への、特にＨＤＬ粒子でのＡＡ４ＲＰタンパク質のとり込みを増加させる被験化合物の能力を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
患者の血中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩレベル、特にアポリポタンパク質ＣＩＩＩに富むリポタンパク質を低下させることによるか、またはＬｐＬおよび／もしくはＨＬの活性を上昇させることによるか、またはコレステロール逆輸送を増加させることによる循環系病理または代謝症候群の治療的または予防的処置のための医薬品を調製するためのＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を調整する化合物の使用。
【請求項７】
ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を調整する化合物が、ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を上昇または模倣する化合物である、請求項６記載の使用。
【請求項８】
医薬品が、アテローム性動脈硬化症の治療的または予防的処置のためである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を調整する化合物が、その発現またはその分泌を刺激または阻止する、請求項６または８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
ＡＡ４ＲＰタンパク質の活性を調整する化合物が、ＨＤＬ粒子におけるＡＡ４ＲＰタンパク質の濃度を上昇または低下させる、請求項６または８のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝症候群、循環器疾患および／またはアテローム性動脈硬化症の予防または処置に有用な分子をスクリーニングするための組成物および方法に関する。特に、本発明は、被験化合物の新規アポリポタンパク質ＡＩＶ関連タンパク質（ＡＡ４ＲＰ）の活性に及ぼす影響の決定に基づいて化合物をスクリーニングするための方法に関する。本発明は、またトリグリセリドの濃度を低下させる、ならびに／またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）の濃度もしくは発現を低下させる、ならびに／または肝臓リパーゼ（ＨＬ）およびリポタンパク質リパーゼ（ＬｐＬ）の活性を上昇させる、ならびに／またはＶＬＤＬの濃度を低下させるための組成物および方法にも関する。
【０００２】
代謝症候群および循環器疾患は、世界中で最も深刻な懸念を有する疾患になってきている。（心筋梗塞、脳血栓等からの）随伴障害および主要な死因であるアテローム性動脈硬化症は、多因子疾患である。
【０００３】
スタチンの発見およびそのすべてで好ましい結果が得られているこの薬物を用いる臨床試験の開始以来、この１０年間ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）に注意が集中している。ＬＤＬレベルと循環器リスクの間で直接的な相関性が実証されているので、ＬＤＬコレステロールは、保健機関により主要なパラメーターとして採用されている。
【０００４】
今では、多くの疫学的な研究および臨床試験の公開されている結果（ＶＡＨＩＴ）により、ＬＤＬに加えて、トリグリセリドおよびＨＤＬ（高密度リポタンパク質）がアテローム発生において重要な役割を果たすことが示されている。ＨＤＬは、抗アテローム生成リポタンパク質であり、その濃度はリスクと逆相関する。トリグリセリド、ならびに特にトリグリセリドに富む、および／またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）を含有するリポタンパク質はアテローム性動脈硬化症に関する独立したリスク因子としてもはや疑う余地はない。
【０００５】
アポＣＩＩＩは、肝臓および腸で合成される７９個のアミノ酸からなるタンパク質である［１］。これはカイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）およびＨＤＬ（高密度リポタンパク質）の成分である［２］。
【０００６】
アポＣＩＩＩは、ＬｐＬの活性を遮断することによりその脂肪分解を阻止するので、アポＣＩＩＩの濃度は血漿トリグリセリドの代謝の制御およびアテローム生成の可能性のあるトリグリセリド富化リポタンパク質の血漿レベルの決定において重要な役割を果たす［３］。
【０００７】
アポＣＩＩＩ濃度は、アテローム性動脈硬化症および循環器疾患に対する素因の基礎となる多くの病態生理学的状態と相関し得る。
【０００８】
ＶＬＤＬおよびＬＤＬ粒子におけるアポＣＩＩＩ濃度が、血漿トリグリセリドレベルよりも更に特異的な循環器リスクの測定であることも示されている［４］。
【０００９】
トリグリセリドの濃度は、またＬｐＬおよびＨＬの脂肪分解作用によっても制御される。インビボでＬｐＬの好ましい基質は、トリグリセリド富化リポタンパク質、例えば、カイロミクロンおよびＶＬＤＬにより代表される大きな粒子であるが、一方ＨＬは、更に効率的に小さなリポタンパク質、例えばＬＤＬおよびＨＤＬ［５、６］（特にＨＤＬ２［７］）を加水分解する。
【００１０】
ＬｐＬおよびＨＬは、またＨＤＬリモデリングにおけるその作用を介するコレステロール逆輸送にも役割を果たす。ＬｐＬは、トリグリセリド富化リポタンパク質におけるその作用を介して、細胞由来のコレステロールの第１のアクセプターであるプレβ−ＨＤＬの形成に参加する［８−１０］。
【００１１】
ＨＬおよびＬｐＬの双方は、プレβ−ＨＤＬの形成に参加するが、作用のメカニズムは異なっている。ＨＬは、トリグリセリド富化ＨＤＬ２を加水分解し、これは結果的にプレβ−ＨＤＬ型の小型ＨＤＬの形成に至り、したがって肝臓におけるＨＤＬコレステロールの選択的取り込みに参加する［１１］。ＨＬおよびＳＲ−ＢＩ（ＨＤＬ取り込みおよびＨＤＬコレステロールの肝臓への移動に関与する肝臓レセプター）は、コレステロール流出の促進において、並行作用ではなく、組み合わせ作用を有し［７］、それによりコレステロール逆輸送の現象における酵素の本質的な役割が実証される。
【００１２】
したがって、アポＣＩＩＩの量を変調するための、およびとりわけ低減するための分子、方法またはキットの発見または開発は治療、診断、および／または実験の分野における大きな進歩である。
【００１３】
したがって、トリグリセリドまたはＶＬＤＬの量を変調するための、およびとりわけ低減するための、またはコレステロール逆輸送を制御するための分子、方法、もしくはキットの発見または開発もまた治療、診断、および／または実験の分野における大きな進歩である。
【００１４】
本発明は、代謝症候群および循環器疾患の管理のための先行技術の治療計画に対する代替的な解決法を提案する。実際に本発明は、活性分子の研究および開発のための特に有利な標的を提示する新規タンパク質の機能的特徴づけについて記載する。更に上記標的は、問題の代謝経路について特異的であることという重要な利点を有している。
【００１５】
更にとりわけ、本発明は、脂質およびリポタンパク質、とりわけトリグリセリドおよびアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）に富むリポタンパク質の代謝を制御する新規タンパク質の同定の結果である。
【００１６】
３６６個のアミノ酸を含む上記タンパク質は、以下の１次構造を有している。（配列番号１）
【００１７】
【表１】
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【００１８】
上記タンパク質は、以前に肝臓再生に関与している可能性があるとして記載されたタンパク質ＲＡＰ３の配列に相当する（ゲンバンクアクセッション番号：ＡＦ２０２８８９．１：Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  Ｈ．Ｎ．、Ｇｒｏｅｎｉｎｋ  Ｍ．、Ｌｅｅｇｗａｔｅｒ  Ａ．Ｃ．Ｊ．およびＣｈａｍｕｌｅａｕ  Ｒ．Ａ．Ｆ．Ｍ．、提出（１９９９年１１月９日）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｍｅｉｂｅｒｇｄｒｅｅｆ  ９、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １１０５  ＡＺ、オランダ）。
【００１９】
これはまたＧｅｎｓｅｔ社により出願された特許出願国際公開公報第０１／００８０３  Ａ２号（上記出願の配列番号３）のＡＡ４ＲＰタンパク質（アポリポタンパク質ＡＩＶ関連タンパク質）に相当する。上記ＡＡ４ＲＰタンパク質は、脂質代謝に関与するアポリポタンパク質のファミリーのメンバーである。
【００２０】
本発明は、ここでＡＡ４ＲＰと命名された前記のタンパク質が、インビボでトリグリセリドおよびＶＬＤＬの濃度を低減できることを示す。本発明は、したがって上記タンパク質が、アテローム生成脂質のマーカーであるアポＣＩＩＩの濃度をインビボで低減することが可能であることを示している。
【００２１】
したがって、本発明は、リポタンパク質、とりわけトリグリセリドおよびアポＣＩＩＩを含有するものの代謝の制御における、ＡＡ４ＲＰと命名された新規タンパク質の機能的な役割の発見の結果である。
【００２２】
本発明はまた、ＡＡ４ＲＰの１つまたはそれ以上の免疫原性ドメインを含むＡＡ４ＲＰの１次構造に由来するペプチドの生成についても記載する。
【００２３】
本発明は、更にヒトリポタンパク質で、または実際には遊離の形態でＡＡ４ＲＰを認識する抗体の、免疫原性ペプチドからの生成について更に記載し、そしてそれによりそれのアッセイが可能になる。上記抗ＡＡ４ＲＰ抗体の開発によりこのアポリポタンパク質をＨＤＬに局在させることが可能になり、コレステロール逆輸送における非常に有望な役割が確認される。
【００２４】
したがって、本発明は、代謝症候群、循環器疾患、およびとりわけアテローム性動脈硬化症の予防または処置のための新規活性分子を開発するのに用いることができる新規標的および手段について記載する。また本発明を用いて代謝症候群、循環器疾患病理、およびとりわけアテローム性動脈硬化症を進展させる素因またはリスクを検出することもできる。
【００２５】
したがって、本発明の第１の目的は、循環器疾患または代謝疾患において活性である化合物を開発するためのＡＡ４ＲＰの使用に基づく。
【００２６】
アポリポタンパク質ＡＩＶ関連タンパク質（ＡＡ４ＲＰ）
本発明では、ＡＡ４ＲＰ（またはＡＡ４ＲＰタンパク質）なる用語は、配列番号１の配列またはいずれかの変異体、誘導体または相同体を含むポリペプチドを意味する。とりわけ、それは、多型、スプライシング、変異等の結果である配列番号１のいずれかの天然変異体である。したがってかかる天然変異体は１つまたはそれ以上の残基等の１つまたはそれ以上の変異または置換、欠失を含むことができる。相同体なる用語は更にその他の種、例えばげっ歯類、ウシ等のＡＡ４ＲＰポリペプチドを示す。
【００２７】
一般的に、ＡＡ４ＲＰなる用語は配列番号１の配列または、１つもしくはそれ以上のアミノ酸の１つもしくはそれ以上の変異、欠失、置換もしくは付加を含むいずれかの誘導体を有するポリペプチドを示す。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１の配列を有するＡＡ４ＲＰから生成されたポリクローナル抗体により認識される。更に好ましくは、アナログは、ＡＡ４ＲＰの少なくとも１つの免疫学的または生物学的特性を保存している。特に、生物学的特性は、例えば、トリグリセリドまたはアポＣＩＩＩ濃度の制御である。好ましい変異体は、配列番号１の少なくとも８０％を含み、なお更に好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも９０％の同一性を含む。同一性の程度を例えばＣＬＵＳＴＡＬ法にしたがって決定することができる。特異的変異体は配列番号１の配列の最大５個のアミノ酸で影響を受ける変異または置換を有する。
【００２８】
本発明による特異的誘導体は、本明細書で前記したＡＡ４ＲＰフラグメント、とりわけ配列番号１の一部を含むポリペプチドである。この点で、本発明の目的は、配列番号１の配列のフラグメントを含み、そして少なくとも１つのヒトＡＡ４ＲＰの免疫原性ドメインを含有するポリペプチドである。
【００２９】
実際に、本出願では抗体生成、アッセイ試験、競合物質として等で用いられるＡＡ４ＲＰの、好ましくはＡＡ４ＲＰの免疫原性部分を含有するポリペプチドフラグメントの生成について記載する。
【００３０】
特に、柔軟性［１２、１３］、親水性［１４、１５］、抗原性［１６］、および２次構造［１７、１８］、を評価するアルゴリズムを用いて上記ポリペプチドを開発した。
【００３１】
この様式で、本出願者は、免疫学的にまたは生物学的に興味のある分子の領域を同定した。具体的な実例は、配列番号１の配列の残基２０から１１４に相当する（または含む）ポリペプチドである。
【００３２】
本発明によるポリペプチドフラグメントは、好ましくは２００個以下のアミノ酸、より好ましくは１５０個以下のアミノ酸を含有する。これは好ましくは少なくとも１つのＡＡ４ＲＰエピトープを含有する。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１の配列の２００個以下のアミノ酸を含み、そして配列番号１の配列の少なくとも残基５０から８０を含有する。
【００３３】
本発明の範囲内で、「免疫原性フラグメント」なる用語は、エピトープ、好ましくはＴまたはＢエピトープを含むポリペプチドのいずれかの部分を意味する。したがってかかるフラグメントは配列番号１の配列の少なくとも７個の連続したアミノ酸、好ましくは配列番号１の配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、更に好ましくは配列番号１の配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含むのが有利である。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、示されたアミノ酸配列に付加された異種性残基を含むことができる。したがって、本発明の目的は、配列番号１の配列のすべてもしくは部分、またはその天然変異体および異種性成分を含むポリペプチドである。
【００３５】
異種性成分は、アミノ酸、脂質、糖等に相当し得る。これはまた化学的、酵素的、放射性標識された（複数の）基等でもよい。とりわけ、異種性成分は、マーカー、スクリーニング物質、安定化剤、免疫原性を増強するかまたは生成を促進する作用物質、保護物質、ペプチドの細胞への浸透を促進する物質、毒素、または活性化合物、抗体等でよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは可溶性形態、精製された形態、またはキャリヤ分子、例えばＫＬＨもしくは血清アルブミン、またはいずれかその他の不活性分子（例えば合成性）、例えばビーズと複合化された形態でよい。本発明によるポリペプチドは自然発生血液タンパク質、とりわけ別のアポリポタンパク質による夾雑がないのが好ましい。具体例では、ポリペプチドは、とりわけ抗体産生のためにキャリヤ分子に結合している。慣用される方法により結合を実施することができる［１９、２０］。ポリペプチドは、いずれか別のポリペプチド性またはペプチド性分子、例えばペプチド、ポリペプチド、または生物学的に活性なタンパク質に抱合または融合されていてもよい。
【００３７】
慣用される方法、例えば参照文献［２１］および実施例に記載される固相合成による人工的な合成によりポリペプチドを調製することができる。得られたポリペプチドが自然発生産物によるいずれかの夾雑を避ける限り、人工的な合成が有利である。いずれかの生物学的、酵素的、または遺伝学的方法により、およびとりわけ適当な宿主細胞における相当する核酸の発現により本発明のポリペプチドを生成できることは理解される。この点に関して、本発明の別の目的は、例えば前記で定義されたポリペプチドをコードする核酸分子に在る。上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはｃＤＮＡでよく、そしてことによるとプロモーター領域を含むことができる。更に核酸をベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、人工染色体等）にクローン化することができる。かかる核酸を本発明のポリペプチドのインビトロまたは直接インビボ生成に用いることができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドをスクリーニング試験で、滴定試験でまたは例えば試験補正のための標準として使用することができる。これをインビトロまたはインビボでのＡＡ４ＲＰ活性の制御に用いることもできる。殊に、抗ＡＡ４ＲＰ抗体の産生に興味深い。
【００３９】
本発明の目的は、例えば前記で定義したポリペプチドを含む組成物に基づく。具体的な組成物は、ＡＡ４ＲＰのすべてまたは部分を含有するポリペプチドおよび医薬的に許容されるベヒクルを含む。ベヒクルは、生理食塩水、等張、緩衝溶液でよく、場合により安定化剤、乳化剤等と組み合わせることができる。
【００４０】
抗体
本発明の別の目的は、例えば前記で定義したポリペプチドを認識する抗体に基づく。有利な様式では、抗体は、上記ポリペプチドに特異的である、すなわち上記ポリペプチドで免疫することにより調製される。
【００４１】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでよい。更に、抗体なる用語はいずれかの抗体フラグメントまたは誘導体、特に同一の抗原特異性を保存するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体のフラグメントまたは誘導体をも示す。かかる抗体フラグメントまたは誘導体は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ等、ヒト化抗体、多機能抗体（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）等を含む。動物を免疫し、そして血清（ポリクローナル）または脾臓細胞（適当な細胞系との融合によりハイブリドーマを生成するため）を回収することを含む慣用される方法により上記抗体を産生することができる。
【００４２】
種々の種、例えばマウス、げっ歯類、霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、ニワトリ等からポリクローナル抗体を産生する方法は、参照文献［１９］に見出すことができる。簡単には、抗原をアジュバント、例えばフロイントのアジュバントと組み合わせ、そして通常皮下注射により動物に投与する。反復して注射を行う。血液サンプルを収集して、そして免疫グロブリンまたは血清を単離する。
【００４３】
モノクローナル抗体を産生するための方法を特にＨａｒｌｏｗら［２２］または参照文献［２３］に見出すことができる。簡単には、上記方法は、抗原で動物を免疫し、続いて脾臓細胞を回収し、次いでこれを不死化細胞、例えばミエローマ細胞に融合することを含む。得られたハイブリドーマはモノクローナル抗体を産生し、そして限界希釈により選択されて個々のクローンを単離することができる。例えば参照文献［２４］に記載されるように、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーの選択により抗体を産生することもできる。
【００４４】
慣用される方法にしたがって、プロテアーゼを用いる消化によりＦａｂまたはＦａｂ’２フラグメントを生成することができる。例えば参照文献［２５、２６］に記載されるようにヒト化抗体を調製することができる。
【００４５】
好ましい態様では、本発明は、配列番号１の配列の残基２０から１１４に含まれるエピトープに対する抗体に関する。
【００４６】
別の具体的な態様によれば、本発明は、ヒト以外の哺乳動物を配列番号１の配列の一部を含む免疫原性ペプチドで免疫することにより得られるいずれかの抗ＡＡ４ＲＰ抗体に関する。かかるポリクローナル抗体をウサギにおいて９５個のアミノ酸の合成ペプチドに対して産生した。上記抗体を用いて、ウェスタンブロットによりＡＡ４ＲＰが主にＨＤＬに局在することを実証した。対照マウスでは、２次元免疫電気泳動の後に認識された細分画が、コレステロール逆輸送の間の細胞由来のコレステロールの最初のアクセプターであるプレβＨＤＬに見出された。
【００４７】
本発明はまた、例えば前記で定義したポリペプチド、とりわけ配列番号１の配列のすべてまたは部分、特に残基５０から８０を含むポリペプチドをヒト以外の哺乳動物に注射すること、次いで抗体または抗体産生細胞を回収することを含む抗ＡＡ４ＲＰ抗体を産生するための方法にも関する。
【００４８】
本発明による抗体を異種性成分、例えば毒素、マーカー、薬物、またはその他の治療薬と結合させることができる。結合は、共有結合であってもなくてもよく、直接的または結合物質もしくはスペーサーによってもよい。マーカーは、放射活性マーカー、酵素、蛍光物質、磁性粒子、等で例示することができる。毒素の実例としては、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、リシン等がある。薬物または治療薬は、例えばリンホカイン、抗生物質、アンチセンス分子、成長因子等である。かかる異種性領域の結合を実施するための方法は例えば米国特許第４２７７１４９号に記載されている。
【００４９】
本発明の抗体は、特に治療、診断、予防において、および実験分野において、例えば抗原を精製するために多くの用途がある。インビトロでは、とりわけスクリーニング物質として、または種々の生物学的サンプル（血液サンプル、例えば血漿、もしくは血清、またはその他の生物学的液体、例えば尿、組織液等）から抗原を精製するためにこれを用いることができる。またこれを用いて、本明細書に後記するように、対象から採取したサンプル中の、または細胞培養、典型的には哺乳動物、特にヒトから収集した血液サンプルにおいて、ＡＡ４ＲＰの存在（または量）を検出または定量することもできる。
【００５０】
スクリーニング試験
本発明の別の目的は、化合物を選択、同定または特徴づけするための方法であり、該方法はＡＡ４ＲＰの活性を変調、特に増強する被験化合物の能力を決定することを含む。
【００５１】
したがって上記方法により、ＡＡ４ＲＰの活性を変調（低下または上昇）させる、とりわけ上昇させる被験化合物の能力を決定することにより、循環性アポリポタンパク質ＣＩＩＩの、またはアポリポタンパク質ＣＩＩＩに富む脂質粒子のレベルを低下させる、ならびに／またはＬｐＬのおよび／もしくはＨＬの活性を上昇させる、ならびに／またはコレステロール逆輸送を増加させることができる化合物の選択、同定または特徴づけが可能になる。とりわけ選択的に、すなわち本質的には別のアポリポタンパク質の活性に直接的な影響を及ぼすことなく、ＡＡ４ＲＰ活性を上昇させることができる化合物を定義する。本発明の方法はとりわけアテローム性動脈硬化症または循環器疾患を処置するための活性化合物を選択、同定または特徴づけするのに有用である。
【００５２】
本発明では、「ＡＡ４ＲＰ活性」なる用語は、特にこのタンパク質の合成（転写、翻訳等）、その成熟、輸出、または細胞外分泌、レセプターとのその相互作用、粒子（とりわけＨＤＬおよびＶＬＤＬ）への組み込み、その分解等を意味する。したがって、ＡＡ４ＲＰ活性を上昇させる化合物はＡＡ４ＲＰの合成を増加させる作用物質、ＡＡ４ＲＰ輸出または分泌を増加させる作用物質、ＡＡ４ＲＰの競合物質、ＡＡ４ＲＰの活性を模倣する作用物質等であってよい。
【００５３】
第１の好ましい態様によれば、本発明の方法はＡＡ４ＲＰ合成、すなわち、特にその遺伝子またはＲＮＡの転写もしくは翻訳を増加させる被験化合物の能力を決定することを含む。
【００５４】
別の好ましい態様によれば、本発明の方法は、ＨＤＬ粒子中のＡＡ４ＲＰの濃度を上昇させる被験化合物の能力を決定することを含む。
【００５５】
別の好ましい態様では、本発明の方法は、ＶＬＤＬ粒子中のＡＡ４ＲＰの濃度を上昇させる被験化合物の能力を決定することを含む。
【００５６】
更に好ましい態様では、本発明の方法はＡＡ４ＲＰの生物学的作用を模倣する被験化合物の能力を決定することを含む。実施例で説明するように、上記生物学的作用は、特にトリグリセリドまたはアポＣＩＩＩの濃度を低下させることを含む。
【００５７】
別の好ましい態様によれば、本発明の方法はＡＡ４ＲＰの生物学的作用を模倣する被験化合物の能力を決定することを含む。実施例で説明するように、上記生物学的作用は特にＬｐＬおよび／またはＨＬの活性を上昇させることを含む。
本発明の方法を異なる手段で、インビトロで、細胞もしくは無細胞試験で、またはインビボで実施することができる。これらは結合試験、機能的試験等でよい。
【００５８】
第１の試験は、化合物とＡＡ４ＲＰとの間の相互作用の測定に基づく。この態様では、該方法は、被験化合物をＡＡ４ＲＰまたはそのフラグメントと接触させること、および被験化合物のＡＡ４ＲＰまたはそのフラグメントに対する結合を測定することを含む。
【００５９】
上記試験をインビトロで、いずれかの適当な装置（試験管、皿、フラスコ等）で実施することができる。固定したパートナー、例えばＡＡ４ＲＰ（カラム、ビーズ、支持体、ガラス、フィルター、膜等）の１つを用いて実施することが可能である。被験化合物の結合をいずれか公知の方法により、特に電気泳動、ゲル移動、免疫化学等により実証することができる。特にＡＡ４ＲＰの標識リガンドの存在下で反応を実施し、そして被験化合物による標識リガンドの結合の置換を測定することにより結合を実証することができる。例えば標識リガンドは抗ＡＡ４ＲＰ抗体またはかかる抗体のフラグメントでよい。
【００６０】
本発明による試験の別の型はＡＡ４ＲＰの転写活性に基づく。上記方法は、被験化合物をＡＡ４ＲＰ遺伝子のプロモーター配列のすべてまたは部分を含む核酸と接触させること、および被験化合物の核酸に対する結合または被験化合物による核酸活性の変調を決定することを含む。
【００６１】
結合試験を実施するために、プロモーター配列のすべてまたは部分を含む核酸を使用し、そしてインビトロで被験化合物がそれに結合する能力を決定することが可能である。配列の部分は、好ましくはプロモーター配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、更に好ましくはプロモーター配列の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含有する。更に、プロモーター配列のいくつかのフラグメントを同時に試験することが可能である。
【００６２】
転写試験を実施するために、レポーター遺伝子に機能的に連結されたＡＡ４ＲＰ遺伝子プロモーターのすべてまたは部分を含むレポーター系を使用するのが有利である。この点に関して、該方法の好ましい態様は、ＡＡ４ＲＰ遺伝子のプロモーター配列のすべてまたは部分を含む転写プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子を含む細胞と被験化合物を接触させること、およびレポーター遺伝子の発現に及ぼす被験化合物の影響を決定することを含む。ＡＡ４ＲＰ遺伝子プロモーターの配列を配列番号２で表す。
【００６３】
本発明の別の態様は、被験化合物をＡＡ４ＲＰまたはそのフラグメントを発現する細胞と接触させること、および細胞によるＡＡ４ＲＰまたはそのフラグメントの発現または分泌に及ぼす被験化合物の影響を決定することを含む。
【００６４】
本明細書に後記するように、本発明の方法を異なる型の細胞、プロモーター、レポーター遺伝子で、および異なる条件下で実施することができる。
【００６５】
ａ）宿主細胞
本発明に記載するいくつかのスクリーニング方法により、上記細胞のレポーター遺伝子の発現、もしくはＡＡ４ＲＰの発現の決定を可能にする特異的な条件下で被験化合物を宿主細胞と接触させる工程、またはＡＡ４ＲＰ合成の別の工程が提供され、それにより被験化合物の効果に関係する情報が得られる。古典的には、被験化合物の影響を上記化合物の不在下で測定した（レポーター遺伝子の）発現または活性と比較する。
【００６６】
用いた細胞は実験室で培養することができるいずれかの細胞でよい。好ましい態様では、細胞は哺乳動物細胞（肝細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、筋肉細胞等）である。更に好ましくは、上記細胞はヒトである。それを初代培養するか、または細胞系を確立することができる。別の態様では、原核細胞（細菌）、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ等）、植物細胞等を用いることもまた可能である。
【００６７】
ｂ）レポーター系
特定の態様では、本発明は、特異的プロモーターの制御下に置かれたレポーター遺伝子を含むレポーター系を利用する。上記構築物またはそれを含有するいずれかのカセットもしくはベクターを細胞試験に用いることができる宿主細胞に導入する。
【００６８】
特に、上記レポーター遺伝子は、その転写物または発現生成物を生物学的抽出物中で検出または検定することができるいずれかの遺伝子でよい。例えば、それはヒトＡＡ４ＲＰそのものをコードする遺伝子、または更に、ルシフェラーゼを、およびとりわけホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼを、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等をコードする遺伝子でよい。「遺伝子」なる用語は広義で、いずれかの核酸、特にｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ等を意味することは理解される。
【００６９】
レポーター遺伝子は、それが何であろうと、例えば前記で定義したようなＡＡ４ＲＰのプロモーター配列の少なくとも一部またはその機能的変異体を含むプロモーターの制御下に置かれる。上記特異的配列は、同一の配向でまたは逆の配向で、プロモーターの上流、下流、または内部に１つまたはそれ以上のコピー（好ましくは１から１０個、そして更に好ましくは１から６個）で存在し得る。本発明の好ましい態様では、レポーター遺伝子を特にヒトの、ＡＡ４ＲＰ遺伝子の完全プロモーター配列を含むプロモーターの制御下に置く。
【００７０】
この点に関しては、本発明の目的はまた、特にヒトのＡＡ４ＲＰ遺伝子のプロモーター配列のすべてまたは部分を含むプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含む核酸にも関する。ＡＡ４ＲＰ遺伝子プロモーターの配列を配列番号２で表す。配列の最後の４つの残基は、エクソン１の先頭に相当する。残基１０２７から１０３２は、ＴＡＴＡボックスに相当する。プロモーター配列の該部分は上記配列の少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、更に好ましくは少なくとも３０個、なお更に好ましくは少なくとも５０個の連続した核酸を含む。プロモーターは、別の遺伝子プロモーター由来の異種性領域、例えばサイレンサーまたはエンハンサーシグナル、制御されたまたは組織特異的特性を付与する配列等を含むこともできる。プロモーターは、別のプロモーター由来の、例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ極初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等由来の領域を組み合わせたハイブリッドプロモーターでよい。
【００７１】
構築物をいずれかの適当なベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等にクローン化することができる。いずれかの古典的な方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、トランスフェクション物質等により構築物またはベクターを宿主細胞の導入することができる。細胞またはその子孫をいずれか適当な培地（ＤＥＭＥ、ＲＰＭＩ等）で成長させることができる。
【００７２】
ｄ）接触
被験化合物をその（複数の）効果、その濃度、細胞の型および技術的考慮にしたがって、異なる回数で細胞と接触させることができる。いずれかの適当な支持体上で、およびとりわけプレート、皿上で、試験管またはフラスコ中で接触を実施することができる。概して、多くのおよび異なる試験を連続して行うことを可能にするマルチウェルプレートで接触を実施する。典型的な支持体には、マイクロタイタープレートおよび更にとりわけ９６または３８４ウェル（またはそれ以上）を含むプレートなどがあり、これらは操作が容易である。
【００７３】
支持体および被験化合物の特性に依存して、種々の量の細胞を用いて本明細書に記載する方法を実施することができる。古典的には、１０３から１０６個の細胞、好ましくは１０４から１０５個の細胞を適当な培養培地中ある型の被験化合物と接触させる。実例としては、９６ウェルプレートでは各ウェルで１０５個の細胞を望ましい量の被験化合物と共にインキュベートすることができる。３８４ウェルプレートでは各ウェルで１０５個未満の細胞および典型的には１×１０４から４×１０４個の細胞を概して被験化合物と共にインキュベートする。
【００７４】
化合物の型（その毒性、細胞に入るその能力等）、細胞数、インキュベーション時間等にしたがって使用者が被験化合物の量（または濃度）を調整することができる。概して、１ｎＭから１ｍＭの範囲の量の被験化合物に細胞を暴露する。もちろん本発明から逸脱することなくその他の濃度を試験することができる。各化合物を異なる濃度で並行して試験することもできる。
【００７５】
必要な場合、細胞、例えばリポソーム、カチオン性脂質または重合体の内部への化合物の浸透を促進する異なるアジュバントおよび／またはベクターおよび／または生成物を用いることもできる。
【００７６】
典型的には数分から数時間、概して１から４８時間の間、接触を維持する。特に、試験が、レポーター遺伝子の発現を含む場合、細胞および種々の試薬を、レポーター遺伝子の発現産物のデノボ合成が可能になるほどに十分な時間接触させておくのが好ましい。
【００７７】
ｄ）効果の測定
被験化合物の効果の測定または実証を、用いる試験にしたがって異なる手段で実施することができる。
【００７８】
インビトロ結合の検出のための方法は以前に記載されている。レポーター系の発現を検出または決定することを含む細胞試験に関しては、いくつかの解決法が可能である。
【００７９】
それは転写活性の決定でよい。この目的で、一方は実験条件下で、他方は対照状況下で全ＲＮＡを細胞培養物から抽出する。ＲＮＡを検定して（またはプローブとして使用して）、（複数の）のレポーター遺伝子の発現における変化を分析する。
【００８０】
それはレポーター遺伝子の発現産物の可視化またはアッセイでもよい。用いるレポーター遺伝子の型にしたがって種々の方法で上記可視化（または上記アッセイ）を実施することができる。β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼをコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、測定は、例えば光学密度または蛍光発光でよい。
【００８１】
具体的な態様では、レポーター遺伝子の発現をレポーター遺伝子の発現産物の基質の加水分解に関して測定する。例えば、多くの基質を用いてβ−ラクタマーゼの発現を評価することができる。特に、基質は、β−ラクタム核を含有し、そしてその加水分解を制御することができるいずれかの生成物でよい。好ましい基質は、β−ラクタマーゼに特異的であるもの（すなわちこれは概して哺乳動物細胞においてβ−ラクタマーゼ不在下では加水分解されない）、哺乳動物に対して毒性でなく、および／またはその加水分解産物を例えば蛍光、放射活性、酵素活性に基づく方法またはいずれかその他の検出方法により容易に測定できるものである。
【００８２】
また発現産物を免疫学的または免疫酵素的方法、例えば特異的抗体により検定することもできる。この系は特に、例えば被験化合物で処理されたまたはされていない細胞により合成されたＡＡ４ＲＰを検定するのに適している。
【００８３】
概して、レポーター遺伝子産物（または基質の加水分解産物）の存在を当業者に公知の古典的な方法（蛍光、放射活性、Ｏ．Ｄ．、ルミネセンス、ＦＲＥＴ（国際公開公報第００３７０７７号参照）、ＳＰＡ、バイオチップ、免疫学的方法）により決定することができる。概して、細胞における被験化合物の活性を決定し、この効果を被験化合物の不在下で観察された活性と、またはいずれかの被験化合物の不在下で決定された平均値と比較する。
【００８４】
また選択された化合物を動物において検証することを可能にする第２の試験を、発現されたＨＤＬの量を決定することにより、または上記化合物で処理された細胞におけるコレステロール逆輸送における有意な変化を未処理細胞と比較して決定することにより実施することもできる。トリグリセリドおよび／またはアポＣＩＩＩの血漿濃度を測定することも可能である。
【００８５】
本発明の方法により同定することができる化合物は、異なる特性、構造および起源、特に生物学的化合物、核因子、コファクター等の化合物、化学的、合成性化合物等でよい。これはまたライブラリー、特に化学的ライブラリーまたはタンパク質、ペプチドもしくは核酸ライブラリー等でもよい。
【００８６】
化合物の使用
用いる標的の生理学的機能的特性を考慮して、ＡＡ４ＲＰ活性を変調、特に上昇または模倣することができる化合物（実際には本明細書に前記した方法により同定される）を、患者の血中のアポリポタンパク質ＣＩＩＩレベル、とりわけアポリポタンパク質ＣＩＩＩに富む脂質粒子を低下させることにより、またはＬｐＬおよび／もしくはＨＬの活性を上昇させることにより、またはコレステロール逆輸送を増加させることにより、循環系疾患または代謝症候群の治療的または予防的処置に用いることができる。
上記化合物は種々の病理学、特に循環系病理、代謝症候群およびとりわけアテローム性動脈硬化症を処置することができる。
【００８７】
この点に関して、本発明は、概して代謝または循環系病理の治療的または予防的処置のための医薬品の調製のための、ＡＡ４ＲＰの活性を変調、好ましくは上昇または模倣する化合物の使用に関する。とりわけ、病理はアテローム性動脈硬化症（異常リポタンパク質血漿に因るか、または因らない）、インスリン抵抗性、２型糖尿病等である。
【００８８】
本発明の別の目的は、血中のトリグリセリドおよび／またはアポＣＩＩＩのレベル、とりわけトリグリセリドおよび／またはアポＣＩＩＩに富む脂質粒子のレベルを低下させるための医薬品の調製のための、ＡＡ４ＲＰ活性を上昇または模倣する化合物の使用に在る。
【００８９】
本発明の別の目的は、ＬｐＬおよび／またはＨＬの活性を上昇させるため、とりわけリポタンパク質のトリグリセリドのレベルを低下させるための医薬品の調製のための、ＡＡ４ＲＰ活性を上昇または模倣する化合物の使用に在る。
【００９０】
本発明の別の目的は、コレステロール逆輸送を制御するための医薬品の調製のための、ＡＡ４ＲＰ活性を上昇または模倣する化合物の使用に在る。特に上記制御は、ＬｐＬおよび／またはＨＬおよび／もしくはＳＲ−ＢＩの活性における上昇を介して生じる。
【００９１】
本発明の局面で、「処置」なる用語は予防的、治療的、緩和的処置、および患者の管理（苦痛の軽減、延命、生活の質の改善、疾患の進行の遅延化等）を意味する。処置を、特に疾患の遅発現象を志向する別の作用物質もしくは処置と組み合わせて、または別の活性物質で行うこともできる。本明細書の前記で記したように、用いる化合物はＡＡ４ＲＰ活性の選択的アクチベーターであるのが好ましい。
【００９２】
本明細書の前記で示したように、用いる化合物は、ＡＡ４ＲＰの活性を模倣する、ＡＡ４ＲＰ発現もしくは分泌を刺激する、および／または、主に末梢の細胞由来のコレステロールを抽出し、そしてそれが除去される肝臓へのその移動を促進するその能力に因り、アテローム性動脈硬化症に対して保護的な役割を果たすことが解っているＨＤＬ粒子におけるＡＡ４ＲＰの濃度を上昇させる化合物であるのが好ましい［２７］。
【００９３】
本発明は、また対象に（選択的な）ＡＡ４ＲＰのアクチベーター、特にＡＡ４ＲＰの活性を模倣する、ＡＡ４ＲＰ発現もしくは分泌を刺激する、および／またはＨＤＬ粒子中のＡＡ４ＲＰの濃度を上昇させる化合物を投与することを含む循環系病理を処置する方法にも関する。投与は、この型の治療的研究法において古典的に用いられるいずれかの経路による、例えば、特に全身的または経口経路による、特に注射、とりわけ静脈内、皮膚内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内等によるものでよい。
【００９４】
診断的使用／アッセイ
本発明を代謝症候群の診断、スクリーニング、または検出に用いることもできる。
【００９５】
したがってこの点に関して、本発明は、対象における代謝または循環系障害またはかかる障害に対する素因を検出するための方法であって、対象に由来するサンプル中のＡＡ４ＲＰまたは相当するＲＮＡの存在または量を決定する工程を含む方法に関する。
【００９６】
本発明は、また対象における代謝もしくは循環系障害、またはかかる障害に対する素因を検出するための方法であって、対象に由来するサンプル中のＡＡ４ＲＰまたはその遺伝子すなわちＲＮＡの配列における変化の存在を決定する工程を含む方法に関する。
【００９７】
また本発明を、対象に由来するサンプル中のＡＡ４ＲＰを検定することを含む、治療的処置、ワクチンによる処置、食事療法等の有効性のモニター観察に用いることもできる。処置期間中の異なる時点でアッセイを実施することができる。
【００９８】
例えば本明細書で前記したような抗体により有利な様式でＡＡ４ＲＰのアッセイまたは検出を実施することができる。この局面では、ヒトにおける定量アッセイがＩＭＭＡＧＥ（登録商標）またはＡＲＲＡＹ（登録商標）免疫化学システム（Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、フランス）において有利に開発されており、これにより動的免疫ネフェロメトリー分析による、競合または非競合的な血漿タンパク質の高度に正確なアッセイが可能になる。いずれか別のアッセイ方法、免疫学的またはそうでない、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー、ドットブロット、免疫比濁法等を用いることができることは理解される。更に、ＡＡ４ＲＰをコードするＲＮＡに関してアッセイを実施することもできる。この場合、例えばｍＲＮＡ配列のすべてまたは部分に相補的である核プローブを用いるハイブリダイゼーションによりアッセイを行うことができる。
【００９９】
この点に関して、本発明はまたＡＡ４ＲＰをコードするハイブリダイゼーションのすべてまたは部分を含み、そして標識されている核プローブにも関する。該プローブは１本鎖核酸であるのが好ましい。これをいずれか公知の系、例えば放射活性、蛍光、ルミネセンス、酵素等により標識することができる。プローブは好ましくは５００個以下のヌクレオチド、更に好ましくは４００個以下のヌクレオチドを含む。これを支持体、例えばガラススライド、シリカ、ナイロン膜、ビーズ、カラム等に固定することができる。
【０１００】
本発明は、同様に代謝障害の診断、スクリーニング、もしくは検出の方法を実施するための、または活性分子をスクリーニングまたは選択するためのキットに関する。上記キットは、有利にはＡＡ４ＲＰまたはその変異体に特異的な抗体またはプローブまたはプライマー、および有利には検出または増幅またはハイブリダイゼーション反応を実施するための試薬を含む。有利な様式では、化合物の選択のためのキットは例えば本明細書で前記したようなレポーター系およびレポーター遺伝子発現を検出するための試薬、または例えばＡＡ４ＲＰ遺伝子の部分またはプロモーターを含む核酸を含むことができる。
【０１０１】
限定のためではなく、本発明の説明の目的で提示する以下の実施例で、更に詳細に本発明について記載する。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
ペプチド配列
１．適当なペプチド配列の選択
以下のペプチドフラグメントを合成した。上記フラグメントを柔軟性、親水性、抗原性、および２次構造を予測する異なるアルゴリズムを用いて規定した。９５個のアミノ酸を含有する上記フラグメントは配列番号１の配列の残基２０から１１４に相当する。
【０１０３】
【表２】
2005502883.tif 000004
【０１０４】
２．ペプチド合成
ＡＢＩ４３１  Ａ自動合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）で、Ｂｏｃ／Ｂｚｌストラテジーを用いてＭＢＨＡ０．５ｍｍｏｌ（ミリモル）（０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂上で固相合成法［２１］によりペプチドを合成した。キャッピングなしでジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下、各アミノ酸を２回結合させた。側鎖保護基は、以下のとおりであった。Ａｒｇ（Ｔｓ）、Ａｓｐ（Ｏｃｈｅｘ）、Ｇｌｕ（Ｏｃｈｅｘ）、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｔｒｐ（ｆｏｒｍｙ）およびＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。
【０１０５】
ＤＣＭ培地中１０％のβ−メルカプトエタノール、５％のジイソプロピルエチルアミンの存在下で２時間、次いでＮＭＰ培地中で２時間処理することにより支持体からの切断の前にヒスチジン残基のＤｎｐ基をペプチドから除去した。ペプチド樹脂をＤＣＭ培地中５０％のＴＦＡで２０分間処理して、末端アミノ酸Ｂｏｃを除去した。ペプチドを樹脂から切断し、そして低速および高速ＨＦ手順にしたがって同時に脱保護した。ｐ−クレゾール０．７５ｇ、ｐ−チオクレゾール０．２５ｇ、およびジメチルスルフィド０．５ｍｌの存在下、０℃で樹脂１ｇを無水ＨＦ２．５ｍｌで処理した。
【０１０６】
３時間後、真空蒸発によりフッ化水素およびジメチルスルフィドを除去し、そして残留スカベンジャーおよび２次産物をジエチルエーテルで抽出した。反応容器にｐ−クレゾール０．７５ｇ、ｐ−チオクレゾール０．２５ｇ、および無水ＨＦ１０ｍｌを再度充填し、そして混合物を０℃で１．５時間インキュベートした。蒸発によりフッ化水素を除去し、残留物をジエチルエーテルの存在下で混合した。残留物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、そして酢酸の１０％の水溶液２００ｍｌで抽出し、次いで凍結乾燥した。
【０１０７】
３．質量分析
イオンエレクトロスプレイ質量分析器で分子量を決定した。イオンスプレイを装備した単一の四重極イオンエレクトロスプレイ質量分析器（噴霧器により補助されたエレクトロプレイ）（Ｓｃｉｅｘ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）でＡＰＩ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｓｃｉｅｘ）を用いてエレクトロスプレイスペクトルを入手した。
【０１０８】
４．免疫付与
ペプチドを完全フロイントのアジュバントで乳化し、そして最初の２回の注射では注射あたり０．５ｍｇの用量で、続いて２週毎に同一アジュバント中のペプチド０．２５ｍｇをブースター投与でウサギに皮下注射した。
【０１０９】
実施例２
ウサギ特異的抗ＡＡ４ＲＰ抗体の単離
２７％の硫酸ナトリウムでの沈殿によりポリクローナル抗体を単離し、次いでＡＡ４ＲＰペプチド残基２０から１１４アミノ酸を結合させた、活性化セファロース４Ｂゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した［２８］。抗原性のゲルに保持されなかったタンパク質をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：リン酸塩（ｐＨ７．２）５０ｍｍｏｌ／ｌ、ＮａＣｌ１５０ｍｍｏｌ／ｌ）で洗浄することによりゲルから除去した。ＡＡ４ＲＰゲルに特異的に結合しなかった分画をＰＢＳ２５ｍｍｏｌ／ｌで除去した。ＡＡ４ＲＰ特異的ポリクローナルＩｇＧをグリシン（ｐＨ２．８）０．２Ｍで溶出した。精製された抗体を直ぐにＰＢＳ１０ｍｍｏｌ／ｌに対して透析し、次いでＡｍｉｃｏｎシステム（カットオフ１００ｋＤ）（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄｒ．Ｂｅｒｖｅｌｙ、マサチューセッツ州、米国）での限外濾過により濃縮し、タンパク質含量に関して検定し［２９］、次いでアリコート１ｍｌ（１ｍｇ）で−３０℃で保存した。
【０１１０】
１．ウェスタンブロット分析
１．１−プロトコル：
ウェスタンブロットにより抗体純度および特異性を分析した［３０］。
ヒトＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ粒子を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（５〜２４％）に供し、次いでニトロセルロース膜に移し、そして精製された抗ヒトＡＡ４ＲＰ抗体と反応させた。免疫反応性タンパク質を西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合抗ＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓａｎｏｆｉ−Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）で可視化した。化学ルミネセンスにより反応を展開した（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃ）。
【０１１１】
１．２−結果
得られた結果を図１に示す。この図では、抗ＡＡ４ＲＰ抗体により表される特異的なバンドが３２．５および４７．５ｋＤａの分子量マーカーの間に位置する。
【０１１２】
１．３−解釈
異なるヒトリポタンパク質に関するイムノブロットの結果はＡＡ４ＲＰがＶＬＤＬおよびＨＤＬに、主にＨＤＬに局在したことを示している。
ＶＬＤＬにおけるＡＡ４ＲＰの存在はこれらのトリグリセリド富化リポタンパク質の代謝制御、およびしたがって、これらのアテローム生成脂質の濃度の変調におけるこのアポリポタンパク質の役割を説明している。
ＨＤＬにおけるＡＡ４ＲＰの局在は、疑う余地なくコレステロール逆輸送におけるこれらの粒子の役割に関連している。実際に、ＨＤＬ内の大部分のアポリポタンパク質は、ＨＤＬによる細胞由来コレステロールの摂取およびそれが除去される肝臓への移動を促進する。
【０１１３】
２．２次元電気泳動およびブロッティング
２．１−プロトコル
以下のサンプルを研究した。
・対照サンプル由来の血漿、
・ヒトＡＡ４ＲＰに関してトランスジェニックであるマウス由来の血漿。
【０１１４】
各サンプル２０μｌをＧｅｌｂｏｎｄ（ＦＭＣ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国）の１．５ｃｍウェルのバルビタール・バッファー（ｐＨ８．６）５０ｍｍｏｌ中０．７５％のアガロースゲルに負荷した。電気泳動を１次元で、ブロモフェノール・ブルー染色アルブミンマーカーが７．５ｃｍ移動するまで実施した。電気泳動を２次元で２〜１５％のポリアクリルアミドゲルグラジエント（１５×１５ｃｍ）で実施した。サンプル（０．５×７ｃｍ）をアガロースゲルから切除し、互いに水平にポリアクリルアミドに置き、１％のアガロースで被覆した。４℃でトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）−グリシンバッファー（ｐＨ８．３）２５ｍＭ中１００Ｖで１９時間、電気泳動を実施した。半乾燥ブロッティング系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｍｅａ、スウェーデン）を用いてトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）−グリシンバッファー（ｐＨ８．３）２５ｍＭ中ニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ０．４５μｍ）にゲルをイムノブロッティングした。膜を抗ＡＡ４ＲＰポリクローナル抗体と共にインキュベートし、そしてＡＡ４ＲＰに特異的に結合したものをペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ＩｇＧで可視化した。酵素反応を化学ルミネセンスにより展開した（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃ）。
【０１１５】
１．２−結果
結果を図２に示す。これはトランスジェニックマウスおよび対照マウスでＡＡ４ＲＰは、プレ−β−ＨＤＬに局在し、一方ヒトＡＡ４ＲＰに関してトランスジェニックであるマウスのα−ＨＤＬにのみアポリポタンパク質が存在したことを示している。
【０１１６】
１．３−解釈
プレ−β−ＨＤＬにおけるＡＡ４ＲＰの存在は、末梢細胞から肝臓へのコレステロールの移動におけるこのアポリポタンパク質の関与を支持する第２の論拠である。遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の後、α−ＨＤＬに大量のＡＡ４ＲＰが存在したが、対照マウスのこのＨＤＬ細分画ではこれは全く存在せず、注目に値する。この異なる再分配は、ＨＤＬの変異に関係すると推定され、この変異でＡＡ４ＲＰが、ＨＤＬ代謝に関与する異なる因子、例えばＣＥＴＰ（コレステリルエステル転移タンパク質）、ＬＣＡＴ（レシチン：コレステロール・アシルトランスフェラーゼ）、またはＰＬＴＰ（リン脂質転移タンパク質））などを変調する。
【０１１７】
実施例３
トリグリセリドレベルに及ぼすＡＡ４ＲＰの過剰発現の影響
１−プロトコル
脂質富化の食餌を続けたＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスまたは対照マウスからのサンプルを生理学的血清で１／３または１／５に希釈し、次いでＣＦＡＳ脂質標準物質、参照番号７５９３５０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｉｍ  Ｇｍｂｈ、ドイツ）で準備した検量線に対してトリグリセリドに関して検定した。検量線は１６から５００μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたる。各サンプル希釈または較正点の１００μｌを９６ウェル滴定プレートの各ウェルに入れた。次に、トリグリセリド試薬参照番号７０１９１２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｉｍ  Ｇｍｂｈ、ドイツ）２００μｌを各ウェルにくわえ、そして３７℃で３０分間インキュベートした。４９２ｎｍに設定した分光光度計で光学密度（ＯＤ）を読み取った。各サンプルのトリグリセリド濃度を１次方程式ｙ＝ａｘ＋ｂ（式中、ｙはＯＤを表し、ｘはトリグリセリド濃度を表す）としてプロットした標準曲線から算出した。
【０１１８】
２−結果
結果を以下の表１および図３に表す。
【０１１９】
【表３】
2005502883.tif 000005
【０１２０】
結果は、ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおいてトリグリセリドレベルが有意に低かったことを示している（スチューデントのｔ検定ｐ＜０．００１）。
【０１２１】
３−解釈
脂質富化の食餌を与えた対照マウスにおけるトリグリセリドレベルの上昇は、遺伝子導入（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の後に鋭く低下した。この低下は、恐らくトリグリセリド富化脂質、例えばカイロミクロンおよびＶＬＤＬの異化作用の加速、続いて異なる異化エフェクターの活性の上昇、例えばリポタンパク質リパーゼ（ＬｐＬ）の活性の上昇、ＬｐＬ活性化のコファクターの増加または上記活性を阻止するアポＣＩＩＩのごとき因子の低減に因る。
【０１２２】
実施例４
アポＣＩＩＩレベルに及ぼすＡＡ４ＲＰの過剰発現の影響
１−プロトコル
ヒトＡＡ４ＲＰを過剰発現するマウスにおけるアポＣＩＩＩをＡＲＲＡＴ（登録商標）免疫化学系（Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、フランス）の免疫ネフェロメトリーにより検定した。脂質正常マウスからのプールした血清を標準として用いた。そのアポＣＩＩＩ濃度は、２５μｇ／ｍｌであった。リン酸カリウム（ｐＨ７．２）０．０１Ｍで標準を希釈することにより、４μｇ／ｍｌから２５μｇ／ｍｌの検量線を準備した。
【０１２３】
脂質富化の食餌を続けた、ヒトＡＡ４ＲＰを過剰発現するまたはしないマウスからの血漿サンプル、およびノックアウトホモ接合体（−／−）、ヘテロ接合体（＋／−）または野生型（＋／＋）マウスからの血漿サンプルを標準と同一条件下で１／６または１／１２に希釈した。各較正点および実験中の異なるマウスからの各サンプル４２μｌをマウス抗アポＣＩＩＩ４２μｌと共に（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の入った反応セル中で）インキュベートした。サンプル中のアポＣＩＩＩ濃度は、抗原−抗体反応中に形成される沈殿に反映される光度に正比例する。
【０１２４】
２−結果
ａ）ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスおよび対照マウス（脂質富化の食餌）におけるアポＣＩＩＩ
結果を以下の表ＩＩおよび図４に示す。
【０１２５】
【表４】
2005502883.tif 000006
【０１２６】
結果は、ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおいてアポＣＩＩＩレベルがおよそ３倍低かったことを示している。
【０１２７】
ｂ）ＡＡ４ＲＰノックアウトホモ接合体（−／−）、ヘテロ接合体（＋／−）または野生型（＋／＋）マウスにおけるアポＣＩＩＩ
結果を以下の表ＩＩＩおよび図５に示す。
【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
結果は、ＡＡ４ＲＰノックアウトマウスのアポＩＩＩレベルが、最も高かったことを示している。
【０１３０】
３−解釈
脂質富化の食餌を与えたＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおけるアポＣＩＩＩの低下、およびＡＡ４ＲＰノックアウトマウスにおけるアポＣＩＩＩレベルの上昇が観察され、これはトリグリセリド濃度に関する結果と合致し、したがって残留トリグリセリド富化粒子の除去におけるＡＡ４ＲＰの積極的な役割が確認される。
【０１３１】
実施例５
異なるリポタンパク質におけるトリグリセリドの分布
１−プロトコル
脂質富化の食餌を続けたＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスまたは対照マウスからの血漿の２００μｌ分画に関してＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬにおけるトリグリセリドの分布を研究した。
ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｍｅａ、スウェーデン）に組み込んだＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムで異なる粒子を分画化した。異なる分画をＰＢＳ０．０１Ｍ、ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）０．１Ｍで、流速０．２ｍｌ／分で溶出した。各フラクションのトリグリセリド濃度を本明細書で前記したように決定した。
【０１３２】
２−結果
結果を図６で表す。
３−解釈
ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおいて脂質富化の食餌を与えた後の対照マウスにおけるトリグリセリド富化粒子の蓄積が観察され、残留粒子の除去におけるＡＡ４ＲＰの役割が確認される。
【０１３３】
実施例６
ヒトＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおけるＬｐＬおよびＨＬ活性
１−プロトコル
トランスジェニックマウスおよびＦＶＢ／Ｎ遺伝的バックグラウンドを有する対照マウスからのヘパリン処理後血漿（ヘパリン注射後５分に収集）に関して試験を実施した。放射性標識トリオレインと共にインキュベートすることにより、およびコファクター（アポＣＩＩ）の存在下で全リパーゼ活性を決定した。各血漿サンプルとトリオレインとのインキュベーションの後であるが、この場合はＬｐＬ活性を除去するためにアポＣＩＩの不在下およびＮａＣｌ１Ｍの存在下でＨＬ活性を決定した。次いで遊離脂肪酸のモル数を決定することにより各血漿サンプル中のリパーゼ活性を算出した。最後に、全リパーゼ活性からＨＬ活性を差し引くことによりＬｐＬ活性を算出した。
【０１３４】
２−結果
結果を図７で表す。これは、対照と比較してＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおいて全リパーゼ活性、ＨＬ活性、およびＬｐＬ活性が有意に低下したことを示している。
【０１３５】
３−解釈
ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスにおけるＬｐＬおよびＨＬ酵素活性の上昇は、ＡＡ４ＲＰの活性と合致している。
・トリグリセリドおよびアポＣＩＩＩ濃度の低下（実施例３、４および５で観察された）
・その代謝に参加するためのコレステロール抽出およびＨＤＬおよびプレ−β−ＨＤＬにおけるＡＡ４ＲＰの局在の増加（実施例２）。
【０１３６】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】抗ＡＡ４ＲＰ抗体特異性のＳＤＳ  ＰＡＧＥ対照ならびにＶＬＤＬおよびＨＤＬにおけるＡＡ４ＲＰ分布の証明。
【図２】２次元電気泳動およびブロッティングによる血漿中のＡＡ４ＲＰの検出。
【図３】トリグリセリドレベルに及ぼすＡＡ４ＲＰの過剰発現の影響。
【図４】ＡＡ４ＲＰトランスジェニック動物および対照におけるアポＣＩＩＩレベルに及ぼすＡＡ４ＲＰの過剰発現の影響。
【図５】ＡＡ４ＲＰ「ノックアウト」ホモ接合体およびヘテロ接合体動物におけるアポＣＩＩＩレベルに及ぼすＡＡ４ＲＰの過剰発現の影響。
【図６】ＡＡ４ＲＰトランスジェニックマウスおよび対照の異なる脂質粒子におけるトリグリセリド分布。
【図７】ヒトＡＡ４ＲＰに関してトランスジェニックであるマウスおよび対照におけるＨＬおよびＬｐＬ酵素活性。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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