(57)【要約】３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノール（Ｅ０９）を含む抗癌コーティング組成物を開示する。より詳しくは、該コーティング組成物は、Ｅ０９および製剤ビヒクルを含む。該製剤ビヒクルは、Ｅ０９の溶解性および安定性を改善する。更に、該コーティング組成物には、該コーティング組成物の膀胱内送達の際に、膀胱壁への該コーティング組成物のより良い付着を与えるコーティング剤が含まれうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノールおよび製剤ビヒクルを含む緩衝化溶液を含む抗癌製剤。
【請求項２】
抗癌製剤が凍結乾燥されている請求項１に記載の抗癌製剤。
【請求項３】
緩衝化溶液が約９〜約９．５のｐＨを有する、請求項１に記載の抗癌製剤。
【請求項４】
製剤ビヒクルが、tert−ブタノール／水、エタノール／水および２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン溶液から成る群より選択される、請求項１に記載の抗癌製剤。
【請求項５】
充填剤を更に含む請求項１に記載の抗癌製剤。
【請求項６】
充填剤がラクトースである請求項５に記載の抗癌製剤。
【請求項７】
３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノールおよび製剤ビヒクルを含む緩衝化凍結乾燥溶液を含む、膀胱癌を処置するための抗癌製剤。
【請求項８】
緩衝化凍結乾燥溶液が約９〜約９．５のｐＨを有する、請求項７に記載の抗癌製剤。
【請求項９】
製剤ビヒクルが、tert−ブタノール／水、エタノール／水および２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン溶液から成る群より選択される、請求項７に記載の抗癌製剤。
【請求項１０】
充填剤を更に含む請求項７に記載の抗癌製剤。
【請求項１１】
充填剤がラクトースである請求項１０に記載の抗癌製剤。
【請求項１２】
抗癌製剤であって、緩衝化製剤ビヒクル中に溶解した３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノールを含み、該緩衝化製剤ビヒクルが、約９〜約９．５のｐＨを有し、そして該製剤ビヒクルが、tert−ブタノール／水、エタノール／水および２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン溶液から成る群より選択される抗癌製剤。
【請求項１３】
充填剤を更に含む請求項１２に記載の抗癌製剤。
【請求項１４】
充填剤がラクトースである請求項１３に記載の抗癌製剤。
【請求項１５】
約９〜約９．５の範囲内のｐＨ、約１．３９３〜約１．４０６の範囲内の屈折率、および約０．９４〜約０．９５の範囲内の相対密度を有するインドールキノンを含む抗癌製剤。
【請求項１６】
インドールキノンが、３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノールである、請求項１５に記載の抗癌製剤。
【請求項１７】
コーティング組成物を更に含む請求項１６に記載の抗癌製剤。
【請求項１８】
コーティング組成物が、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キトサン塩酸塩、レクチンおよびポリカルボフィルから成る群より選択される、請求項１７に記載の抗癌製剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロス・リファレンス
本出願は、２００１年１１月１日出願の米国仮出願第６０／３４４，４４６号の恩典を主張し、その全内容を本明細書中に援用する。
発明の背景
膀胱癌は、全ての悪性癌の約２％を占め、男性および女性においてそれぞれ５番目および１０番目に最も一般的な癌である。American Cancer Society は、１９９７年に、５４，５００人の新患者および１１，７００人の死者があったと推定した。表在性膀胱癌（ｐＴａ、ｐＴ１およびＣＩＳ）は、初回症候での癌の７０〜８０％を占める。表在性膀胱癌の取り扱いは、内視鏡による外科的切除後、しばしば、残りの腫瘍細胞を根絶させることおよび腫瘍再発を防止することの双方の目的で、一連のアジュバント膀胱内化学療法または免疫療法によって行うことができる（Herr HW (1987) Intravesical therapy - a critical review. Urol Clin N Am 14:399-404）。膀胱内投与される抗腫瘍薬（Mitomycin Ｃ［ＭＭＣ］、エピルビシン（epirubicin）およびチオＴＥＰＡ）および免疫療法（ＢＣＧ）はどちらも、腫瘍再発率を減少させるのに有効であるが、筋肉浸潤性腫瘍への疾患進行が妨げられるかどうかは不明である（Newling D (1990) Intravesical therapy in the management of superficial transitional cell carcinoma of the bladder: the experience of the EORTC GU group, Br J Cancer 61:497-499; Oosterlink et al. (1993) A prospective European Organization for Research and Treatment of Cancer Genitourinary Group randomized trial comparing transurethral resection followed by a single instillation of epirubicin or water in single stage Ta, T1 papillary carcinoma of the bladder. J Urol 149:749-752）。この知見は、膀胱癌による死亡率がなお高いという事実とともに、より有効な治療薬を開発する要求を強くしている（Oosterlink et al. 1993）。
【０００２】
一つのこのような治療薬は、生体還元性（bioreductive）薬物として知られている化合物のクラスに属するＭＭＣである（Workman 1994）。ＭＭＣは、表在性膀胱癌を処置するのに用いられる抗腫瘍薬の一つである（Maffezzini et al, 1996, Tolley et al, 1996）。ＭＭＣは、細胞性レダクターゼによって細胞毒性種に活性化されるが、生体還元性活性化に関与する特異的レダクターゼ酵素の役割は、まだ不十分にしか定義されていないし、論争の余地がある（Cummings et al, 1998a）。これは、ＮＡＤＨかまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として用いて、種々のキノンベース化合物の２電子還元を触媒する細胞質フラビンタンパク質である酵素ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ、ＥＣ１．６．９９．２）について特に真実である（Schlager and Powis, 1988, Siegel et al, 1990）。しかしながら、構造的に関連した化合物Ｅ０９（５−アジリジニル−３−ヒドロキシメチル−１メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロプ−（３−エン−ａ−オール）は、ＭＭＣよりもＮＱＯ１にとってはるかに良い基質であり（Walton et al, 1991）、in vitro の好気的条件下では、ＮＱＯ１活性と化学的感受性との間に充分な相関がある（Robertson et al, 1994, Fitzsimmons et al, 1996, Smitkamp-Wilms et al, 1994）。しかしながら、低酸素条件下では、Ｅ０９の性質は著しく異なり、ＮＱＯ１の多い細胞において認められるＥ０９毒性の増強はほとんどまたは全くない（Plumb and Workman, 1994）。しかしながら、ＮＱＯ１欠乏細胞系では、大きい低酸素性細胞毒性比が報告された（Workman, 1994）。したがって、Ｅ０９は、ＮＱＯ１の多い腫瘍の好気的部分またはＮＱＯ１欠乏腫瘍の低酸素部分を利用する可能性を有する（Workman, 1994）。
【０００３】
Ｅ０９が臨床的には評価されているが、第１相臨床試験における三つの部分的寛解（three partial remissions）の報告にもかかわらず、その後の第２相試験において、ＮＳＣＬＣ、胃癌、乳癌、膵臓癌および結腸癌に対して活性が認められなかった（Schellens et al, 1994, Dirix et al, 1996）。これら知見は、いくつかの腫瘍タイプがＮＱＯ１レベルを上昇させたという報告（Malkinson et al, 1992, Smitkamp-Wilms et al, 1995, Siegel et al, 1998）と一緒に前臨床研究（Hendriks et al, 1993）を考えると、特に失望する。Ｅ０９の臨床的効力不足を説明するのに、いくつか可能な説明が考えられた（Connors, 1996, Phillips et al, 1998）。最近の研究は、臨床でのＥ０９の失敗が、不充分な薬力学的相互作用のためでなく、腫瘍への不充分な薬物送達の結果であるかもしれないということを示した（Phillips et al, 1998）。Ｅ０９の急速な血漿離脱（ヒトの場合、ｔ１／２＝１０分）は、多細胞層を介する不充分な浸透とともに、Ｅ０９が、その薬物動態学的寿命の範囲内では血管から数ミクロンを超えて浸透することはないということを示唆している（Schellens et al, 1994, Phillips et al, 1998）。ＮＱＯ１の多い腫瘍および欠乏腫瘍へのＥ０９の腫瘍内投与は、（好気的部分または低酸素部分への損傷の区別は確認されなかったが）有意の成長遅延を生じ、Ｅ０９が腫瘍に送達されうるならば、治療的作用を得ることができるということが示唆された（Cummings et al, 1998b）。これら望ましくない特性は、全身性疾患の処置に重大な妨げであるが、逆説的には、それらは、表在性膀胱癌のような第三の区画（a third compartment）で生じる癌を処置するのに好都合でありうる。この筋書きでは、薬物送達は膀胱内経路で問題がなく、無血管組織中へのＥ０９の浸透は、膀胱内での治療的に関係のある薬物濃度の維持によって（例えば、１時間の点滴注入を用いて）増加させることができる。膀胱内にＥ０９を点滴注入するこの方法は、有用でありうるが、膀胱内に有効量のＥ０９を送達することができる薬物送達ビヒクルがなお要求されている。
【０００４】
［非特許文献１］    Herr HW (1987). Urol. Clin. N. Am., 14:399-404
［非特許文献２］    Newling D (1990), Br. J. Cancer., 61:497-499
［非特許文献３］    Oosterlink et al. (1993). J Urol., 149:749-752
［非特許文献４］    Workman P (1994). Oncol Res., 6: 461-475
［非特許文献５］    Maffezzini M, Simonata A, Zanon M, Raber M and Carmig ani G (1996). J. Urol., 155: 91-93
［非特許文献６］    Tolley DA, Parmar MKB, Grigor KM, Lallemand G and the Medical Research Council superficial bladder cancer working party (1996). J. Urol., 155: 1233-1238
［非特許文献７］    Cummings J, Spanswick VJ, Tomaz M and Smyth JF (1998a). Biochem. Pharmacol., 56:405-414
［非特許文献８］    Schlager JJ and Powis G (1988). Cancer Chemother. Pharmacol., 22: 126-130
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［非特許文献１０］    Walton MI, Smith PJ and Workman P (1991). Cancer Commun., 3: 199-206
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［非特許文献１４］    Plumb JA and Workman P (1994). Int. J. Cancer, 56:134-139
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［非特許文献１６］    Dirix LY, Tonnesen F, Cassidy J, Epelbaum R, Huinink WWT, Pavlidis N, Sorio R, Gamucci T, Wolff I, Tevelde A, Lan J, and Verweij J (1996). Eur J. Cancer, 32A: 2019-2022
［非特許文献１７］    Malkinson AM, Siegel D, Forrest GL, Gazdar AF, Oie HK, Chan DC, Bunn PA, Mabry M, Dykes DJ, Harrison SD and Ross D (1992). Cancer Res., 52:4752-4757
［非特許文献１８］    Smitkamp-Wilms E, Giaccone G, Pinedo HM, Van Der Laan BFAM and Peters GJ (1995) Br. J. Cancer, 72: 917-921
［非特許文献１９］    Siegel D, Franklin WA and Ross D (1998). Clin. Cancer Res., 4: 2065-2070
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［非特許文献２１］    Connors TA (1996). Eur. J. Cancer., 32A: 1833-1834.
［非特許文献２２］    Phillips RM, Loadman PM and Cronin BP (1998). Br. J. Cancer, 77:2112-2119
［非特許文献２３］    Schellens JHM, Planting AST, Van Acker BAC, Loos WJ, De Boer-Dennert M, Van Der Burg MEL, Koier I, Krediet RT, Stoter G and Verweij J (1994). J. Natl. Cancer Inst., 86: 906-912
［非特許文献２４］    Phillips RM, Loadman PM and Cronin BP (1998). Br. J. Cancer, 77:2112-2119
［非特許文献２５］    Cummings J, Spanswick VJ, Gardiner J, Ritchie A and Smyth, IF (1998b). Biochem. Pharmacol., 55: 253-260
発明の簡単な要旨
広範な側面において、本発明は、癌を処置するための組成物に関する。より具体的には、本発明の組成物は、膀胱癌を処置する膀胱内点滴注入のために製剤化された医薬製品を含む。これら医薬製品は、３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノール（Ｅ０９）などがあるがこれに制限されるわけではない抗腫瘍作用を有する生体還元性アルキル化インドロキノン（indoloquinone）と、製剤ビヒクルを含む。本発明の製剤ビヒクルは、溶液の物理的特性、例えば、溶解性、凍結乾燥、および凍結乾燥溶液の再構成の容易さを改善する。
【０００５】
本発明の一つの態様により、本発明の組成物は、３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノール（Ｅ０９）および製剤ビヒクルを含む。一つの態様によると、この製剤ビヒクルは、tert−ブタノールと水の混合物である。もう一つの態様において、製剤ビヒクルは、エタノールと水の混合物である。なおもう一つの態様において、製剤ビヒクルは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。本発明のこれら組成物態様は、当該技術分野において知られているまたは開発された技法によって凍結乾燥させることができる。本発明の凍結乾燥組成物は、
本発明のもう一つの態様によると、本発明の組成物は、Ｅ０９とコーティング剤を含む。このコーティング剤は、膀胱壁への組成物のより良い付着を可能にする。その結果、組成物、特に、Ｅ０９が接触し、無血管組織に浸透して、そこに膀胱癌を処置するのに充分な時間含まれうる。本発明の一つの態様において、コーティング剤はプロピレングリコールである。本発明の他の代表的な態様において、コーティング剤は、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キトサン塩酸塩、レクチンまたはポリカルボフィルから成る群より選択することができる。本発明のなおもう一つの態様において、本発明の組成物は、リポソームによって膀胱壁に送達させることができる。もう一つの態様において、本発明の組成物は、ミクロスフェアによって膀胱壁に送達させることができる。もう一つの態様において、本発明の組成物は、患者の静脈内に送達させることができる。
発明の詳しい説明
本発明の態様は、膀胱内点滴注入によって膀胱癌を処置するための組成物に関する。一つの態様によると、本発明の組成物は、３−ヒドロキシメチル−５−アジリジニル−１−１−メチル−２−［１Ｈ−インドール−４，７−ジオン］プロペノール（Ｅ０９）と製剤ビヒクルを含む。本発明の製剤ビヒクルは、Ｅ０９の溶解性および安定性を改善する溶媒である。本発明の広範な側面において、本発明の製剤ビヒクルは、アルコールおよび水の混合物でありうる。本発明の種々の態様によると、Ｅ０９は、粉砕などの物理的操作を伴うことなく、製剤ビヒクル中に溶解する。本発明の組成物は、より多くの量のＥ０９を溶解させることができるので、用量単位に関して更なる柔軟性が得られる。一つの態様により、８．０ｍｇ／用量単位のＥ０９含有量が考えられる。他の態様において、点滴注入用量は、全容量の４０ｍＬ中に約０．５ｍｇ〜約１６ｍｇである。
【０００６】
Ｅ０９の溶解性を改善することに加えて、本発明の製剤ビヒクルは、良好な凍結乾燥用ビヒクルである。例えば、本発明の製剤ビヒクルは、本発明の組成物を凍結乾燥させる時間を最小限にする。したがって、本発明の一つの態様において、本発明の組成物を約４．５日未満で凍結乾燥させることが可能である。更に、本発明の組成物は、凍結乾燥された後に安定である（表４を参照されたい）。本発明の製剤ビヒクルは、凍結乾燥工程中のＥ０９の結晶化を最小限にすると考えられる。その結果、Ｅ０９の結晶化量を減少させることにより、本発明の組成物を再構成するのに、より少量の流体しか必要とされない。結果として、凍結乾燥組成物について減少した再構成容量によって、より大きいバッチサイズを得ることができる。
【０００７】
一つの態様によると、本発明の組成物は、Ｅ０９と、tert−ブタノールを含む製剤ビヒクルを含む。本発明のもう一つの態様によると、製剤ビヒクルは、エタノールおよび水の混合物を含む。なおもう一つの態様において、製剤ビヒクルは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。一つの代表的な態様において、製剤ビヒクルは、水中４０％ tert−ブタノールを含む。当業者が理解するであろうように、tert−ブタノールの量は変動し得る。この tert−ブタノール溶液は、水と比較すると、Ｅ０９をより良く溶解する。tert−ブタノール製剤ビヒクルを利用することにより、Ｅ０９の溶解度は少なくとも９．５ｍｇ／ｍｌであるが、水へのＥ０９の溶解度は、約０．２ｍｇ／ｍｌである。その結果、所与の一定量のＥ０９を溶解させるのに、より少量の tert−ブタノールしか必要とされない。更に、所与の溶液中には、より多くの量のＥ０９を溶解させることができる。すなわち、本発明の組成物は、Ｅ０９が水中に溶解している溶液と比較すると、より高い濃度のＥ０９を有するであろう。
【０００８】
本発明のもう一つの態様によると、組成物は、Ｅ０９、製剤ビヒクルおよび充填剤を含む。一つの代表的な態様において、ラクトースを充填剤として利用することができる。当業者が理解するであろうように、当該技術分野において知られているまたは開発された他の充填剤を利用することができると考えられる。もう一つの代表的な態様によると、本発明の組成物は、緩衝化することができる。一つの態様において、組成物を、約９〜約９．５のｐＨに緩衝化する。この組成物は、いずれか既知のまたは開発された緩衝剤でも緩衝化することができる。本発明のこれら組成物は、膀胱内送達用に配合するかまたは凍結乾燥させることができる。当業者が理解するであろうように、本発明の組成物は、当該技術分野において知られているまたは開発された方法によって凍結乾燥させることができる。凍結乾燥組成物は、再構成用ビヒクルで再構成することができる。一つの代表的な態様によると、この再構成用ビヒクルは、２％重炭酸ナトリウム、０．０２％エデト酸二ナトリウム、およびプロピレングリコール：水（６０：４０Ｖ／Ｖ）を含む。この再構成用ビヒクルは、本発明の凍結乾燥組成物を溶解し、安定な２４時間までの投与のための溶液を生成する。更に、本発明の再構成用ビヒクルは、６０／４０／２／０．０２％ｖ／ｖ／ｗ／ｗのプロピレングリコール／水／重炭酸ナトリウム／エデト酸ナトリウムを含む抽出可能容量の５ｍＬの再構成されたＥ０９を有するアンプルを提供する。
【０００９】
本発明のもう一つの側面において、本発明の組成物は、コーティング剤も含む。本発明のコーティング剤は、膀胱壁への組成物のより良い付着を与える。その結果、組成物、具体的にはＥ０９が接触し、無血管組織に浸透して、そこに膀胱癌を処置するのに充分な時間含まれうる。本発明の一つの態様において、コーティング剤はプロピレングリコールである。本発明の他の代表的な態様において、コーティング剤は、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キトサン塩酸塩、レクチンまたはポリカルボフィルから成る群より選択することができる。
【００１０】
本発明のなおもう一つの態様において、本発明の組成物は、リポソームによって膀胱壁に送達させることができる。本発明の一つの態様によると、用いられるリポソームは、単膜または多重膜であり、ステアリルアミン、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＴＡＰ）または１，２−トリアシル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＡＰ）などの少なくとも一つの陽イオンリン脂質を含有する。本発明のもう一つの態様において、表面リポソームは、ポリエチレングリコールでコーティングされて、それらリポソームの循環半減期を延長することができる。本発明のなおもう一つの態様において、ホスファチジルコリンおよびコレステロールなどがあるがこれに制限されるわけではない中性荷電リポソームを、本発明の組成物のリポソーム封入に用いることもできる。もう一つの態様において、本発明のこれら組成物は、当該技術分野において知られているまたは開発されたものなどのミクロスフェアによって膀胱壁に送達させることができる。
【００１１】
なおもう一つの態様において、本発明の組成物は、患者に静脈内的に送達させることができる。本発明の凍結乾燥組成物は、本発明の製剤ビヒクルを用いて再構成することができる。次に、その再構成組成物は、所望の濃度に希釈し、患者に静脈内的に送達させることができる。
【００１２】
次の実験を行って、一連のヒト膀胱腫瘍および正常膀胱組織におけるＮＱＯ１の活性を、酵素的技法および免疫組織化学的技法双方で決定した。更に、次の実験は、細胞系に対するＥ０９の好気的活性が、弱酸性条件下で増大するという事実（Phillips et al., 1992）に基づいて、膀胱内治療によって生じる可能性がある全身毒性を減少させるための戦略を評価する。酸性ビヒクル中のＥ０９の投与は、膀胱内でより大きい活性を生じると考えられ、血流中に吸収される薬物はいずれも、細胞外ｐＨの上昇のために、相対的に不活性になると考えられる。次の実験は、酸性条件下でのＥ０９の活性化におけるＮＱＯ１の役割も決定する。
【００１３】
腫瘍および正常膀胱の検体採集。組織採集の倫理的承認は、Local Research Ethical Committee（Bradford NHS Trust）より得、インフォームドコンセント後の患者から試料を採取した。合計１７対の冷ピンチ生検を、膀胱鏡検査法で、腫瘍の形式的経尿道的切除の直前に、膀胱腫瘍と、肉眼では正常に見える膀胱粘膜から採取した。３検体は、膀胱切除術を受けた患者から採取し、腫瘍試料および正常試料は、外科的切除から１時間以内に病理学者が解剖した。検体を液体窒素中でフラッシュ凍結させ、ＮＱＯ１酵素分析のために輸送した。追加の生検を、前の生検部位のすぐ隣の正常膀胱粘膜から採取し、その手順の最後に、切除された腫瘍と一緒に、常套の組織学的分析のためにホルマリン中で送った。この方法で、膀胱腫瘍および正常膀胱尿路上皮の酵素学は、各々の患者の適切な組織の組織学と直接的に関連付けられ得ると考えられる。免疫組織化学は、その後保管される、組織学用に調製されたロウのブロックにより行った。
【００１４】
ＮＱＯ１活性の生化学的決定。指数関数的成長相の細胞培養物を、トリプシン処理し、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、氷上で音波処理した（Semat ２５０細胞音波処理機において４０％能サイクルおよび出力設定４で３ｘ３０秒バースト）。ＮＱＯ１活性およびタンパク質濃度を、下記のように決定した。組織は、１ｍｌ組織ホモジナイザー（Fisher Scientific）を用いて、スクロース（０．２５Ｍ）中で均一化した（１０％ｗ／ｖホモジネート）。細胞質ゾル画分は、Beckman Optima ＴＬ超遠心機中で４℃で、そのホモジネートを１８，０００ｇで４分間遠心分離後、上澄みを更に、１１０，０００ｇで１時間遠心分離することによって調製した。上澄み中のＮＱＯ１活性は、分光光度法により（Beckman ＤＵ６５０分光光度計）、ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ，Sigma Aldrich, UK）のジクマロール感受性還元を６００ｎｍで測定することによって決定した（Traver et al, 1992）。この検定は、組織および細胞双方のホモジネート中のＮＱＯ１活性を測定する場合に用いるのに広く認められており、ＮＱＯ１活性については、他の検定より好ましいことが分かっている（Hodnick and Sartorelli, 1997）。各々の反応は、ウシ血清アルブミン（０．７ｍｇ  ｍｌ−１，Sigma Aldrich, UK）を含有する最終容量の１ｍｌのトリスＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中に、ＮＡＤＨ（２００ｌｚＭ）、ＤＣＰＩＰ（４０／ｉＭ，Sigma Aldrich, UK）、ジクマロール（必要な場合、２０ｕＭ，Sigma Aldrich, UK）、組織の細胞質ゾル画分（５０ｐ，ｌ／検定）を含有した。ＤＣＰＩＰ還元速度は、反応曲線の初期直線部分（３０ｓ）から計算し、そして結果を、ＤＣＰＩＰについての２１ｍＮＴ’ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて、還元ＤＣＰＩＰのｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質によって表した。タンパク質濃度は、Bradford 検定（Bradford, 1976）を用いて決定した。
【００１５】
免疫組織化学。精製ラットＮＱＯ１への（ウサギで上昇した）多クローン性抗体は、Richard Knox 教授（Entact Pharma Plc）による寄贈であった。免疫組織化学研究で用いるための抗体の確認は、精製ヒトリコンビナントＮＱＯ１と、一団のヒト由来細胞系に由来する細胞抽出物の双方を用いて、ウェスタンブロット分析により行った。これら細胞系には、Ｈ４６０（ヒトＮＳＣＬＣ）、ＲＴ１１２（ヒト膀胱癌）、ＨＴ−２９（ヒト結腸癌）、ＢＥ（ヒト結腸癌）、ＭＴ１（ヒト胸部）およびＤＬＤ−１（ヒト結腸癌）が含まれた。ＢＥ細胞系は、ＮＱＯ１のＣ６０９Ｔ多形性変異型の遺伝子型とされていて、この多形性に関してホモ接合突然変異体である（したがって、ＮＱＯ１酵素活性を欠いている）（Traver et al, 1992）。細胞を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水中で洗浄し、そして２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２５Ｆｔｇ  ｍｌ−１のロイペプチンを含有するトリスＨＣｌ（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）中での音波処理（氷上で３０秒）によって溶解させた。タンパク質濃度は、Bradford 検定（Bradford, 1976）を用いて決定し、合計１２．５ｕｇのタンパク質（Lamelli 試料負荷用緩衝液中）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用した。ニトロセルロース紙への電気泳動転移後、膜を、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳ／Tween ２０（０．１％）中において室温で１時間ブロックした。膜をＴＢＳ／Tween ２０（０．１％）中で洗浄後、ウサギ抗ラットＮＱＯ１抗体（１：１００希釈）を加え、室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳ／Tween ２０（０．１％）中で充分に洗浄後、二次抗体に結合した抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＴＢＳ／Tween ２０中、１：５０００希釈）を加えた。タンパク質は、ＥＣＬに基づく化学発光により、製造者（Amersham Pharmacia Biotech, Bucks, UK）によって記載されているように可視化した。
【００１６】
免疫組織化学的研究のために、全ての組織（腫瘍および正常膀胱粘膜双方）を、１０％ホルマリン中で固定し、常套法によって処理し、パラフィンロウ中に包埋した。各々の組織ブロックからの二つの切片を、１枚のスライド上に置き、一方の切片を試験に、もう一方をネガティブ対照（一次抗体なし）とした。各々の試料から合計５個の切片を、（ネガティブ対照を加えた）ＮＱＯ１について染色し、合計１７人の患者からの腫瘍試料および正常試料を分析した。切片（５，ｕｍ）を脱ロウし、再水和し、一次抗体（１：４００希釈）と一緒に４時間インキュベートした。次に、切片を洗浄し、ビオチニル化マウス抗ウサギＩｇＧと一緒に３０分間インキュベート後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ試薬およびＤＡＢ（Vector Laboratories Ltd, Peterborough, UK）を用いてイムノペルオキシダーゼ染色を行った。切片は、標準法にしたがってヘマトキシリンで対比染色した。
【００１７】
細胞培養研究および化学的感受性研究。Ｅ０９は、ＮＤＤＯ Oncology, Amsterdam による寄贈であり、ＭＭＣは、Department of Pharmacy, St Lukes Hospital, Bradford より入手した。Ｈ４６０（ヒトＮＳＣＬＣ）細胞系は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）より入手した。ＨＴ−２９（ヒト結腸癌）、ＲＴ１１２／８３（ヒト膀胱癌上皮）、ＥＪ１３８（ヒト膀胱癌）およびＴ２４／８３（ヒト膀胱移行上皮細胞癌）細胞系は、European Collection of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）より入手した。Ａ２７８０（ヒト卵巣癌）およびＢＥ（ヒト結腸癌）細胞は、Dr T Ward（Paterson Institute, Manchester, UK）による寄贈であった。細胞系は全て、ウシ胎児血清（１０％）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ／５０ｊｕｇ／ｍｌ）を補足し且つＨＥＰＥＳ（２５ｍＫ）で緩衝化したＲＰＮＩＩ１６４０培地中で単層培養物として維持した。細胞培養材料は全て、Gibco ＢＲＬ（Paisley, UK）より購入した。細胞を、ＭＭＣまたはＥ０９に一定範囲の用量で１時間暴露し、そして化学的感受性を、５日間の回復期間後にＭＴＴ検定を用いて評価した。その詳細は他に記載されている（Phillips et al, 1992）。薬物暴露の際に用いられた培地のｐＨは、少量ずつの濃ＨＣｌを用いて調整した（２０ｍｌの培地への４０，濃ＨＣｌ［１０．５Ｍ］は、６．０のｐＨを与える）。検量線は、培地中の広範囲のｐＨ値（ｐＨ３．５〜１１）にわたって実行し、これらｐＨ条件の安定性を、３７℃で１時間のインキュベーション時間にわたって監視した。全てのｐＨ値において、１時間の薬物暴露時間にわたって、培地のｐＨに有意の変化が認められなかった（データは示されていない）。
【００１８】
ＨＴ−２９多細胞スフェロイドを、寒天（１％ｗ／ｖ）でベースコーティングされたＴ２５フラスコ中に５ｘ１０５個の細胞を播種することによって調製し、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、未成熟スフェロイドを、２５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０増殖培地が入っているスピナーフラスコ（Techne）に移し、そして５０ｒｐｍで撹拌することによってスフェロイドを懸濁液中で保持した。スフェロイドが、約５００Ａｍの直径に達した時点で、それらを化学的感受性研究用に採取した。多細胞スフェロイドを、一定範囲のＥ０９濃度に３７℃においてｐＨｅ６．０と７．４で１時間暴露した。薬物インキュベーション後、スフェロイドをＨＢＳＳ中で２回洗浄後、トリプシンＥＤＴＡを用いて単細胞へと解離させた。次に、解離したスフェロイドを、ＨＢＳＳ中で洗浄後、９６ウェルプレート中にプレーティングし（１ｘ１０３個細胞／ウェル）、３７℃で４日間インキュベートした。化学的感受性は、他に記載のＮＭ検定（Phillips et al, 1992）を用いて評価した。
【００１９】
７．４および６．０のｐＨｅ値でのＥ０９の活性化におけるＮＱＯ１の役割は、ＮＱＯ１阻害剤フラボンアセチックアシッド（ＦＡＡ）を用いて評価した。その詳細は、他に記載されている（Phillips, 1999）。ＦＡＡは、ＮＡＤＨに関するＮＱＯ１の競合阻害剤であり、２ｍＭの最終濃度において、ＮＱＯ１の阻害は＞９５％であるが、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびシトクロムｂ５レダクターゼの活性は、ほとんど変化しない（＜５％阻害）。簡単にいうと、（ＮＱＯ１の多い）Ｈ４６０細胞を、９６ウェルプレート中に２ｘ１０３個／ウェルの細胞密度でプレーティングした。３７℃で一晩インキュベーション後、培地を、無毒性濃度のＦＡＡ（２ｍＭ）を含有する新鮮培地（ｐＨ７．４）と交換し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、培地を、ｐＨｅ７．４かまたは６．０でＥ０９（薬物濃度範囲）およびＦＡＡ（２ｍＭ）を含有する新鮮培地と交換した。３７℃で更に１時間インキュベーション後、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、成長培地中において３７℃で５日間インキュベートした。化学的感受性は、上記のＮＭ検定によって決定し、そして結果を、ＩＣ５０値、選択性比（ｐＨｅ７．４でのＩＣ５０／ｐＨｅ６．０でのＩＣ５０）および防御比（ＦＡＡ／Ｅ０９組合せのＩＣ５０／Ｅ０９単独のＩＣ５０）によって表した。
【００２０】
基質特異性。精製ヒトＮＱＯ１の基質特異性への酸性ｐＨｅの影響を、以前に記載されたように決定した（Phillips 1966, Walton et al, 1991）。ＮＱＯ１に媒介されるヒドロキノン種へのキノンの還元は、慣用的な検定によって検出するのが難しいので、レポーターシグナル発生工程の使用を必要とする。この検定において、ヒドロキノンは、中間の電子受容体として作用し、その後、それがシトクロムｃを還元し、これを分光光度法によって容易に検出することができる。リコンビナントヒトＮＱＯ１は、単離されたヒトＮＱＯ１の完全長ｃＤＮＡ配列を含有するｐＫＫ２３３−２発現プラスミドで形質転換された大腸菌（Ｅ．coli）に由来した（Beall et al, 1994）。ＩＰＴＧ誘導後、ＮＱＯ１を、サイバクロンブルー（cybacron blue）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。その詳細は、他に記載されている（Phillips, 1996）。この精製タンパク質は、約３１ｋＤａの分子量および１３９／Ａｍｏｌ還元ＤＣＰＩＰ／分／ｍｇタンパク質の比活性を有した（Phillips, 1996）。リコンビナントヒトＮＱＯ１によるＥ０９の還元は、前に公表された方法（Phillips, 1996）にしたがって、Beckman ＤＵ６５０分光光度計において５５０ｎｍで測定されたシトクロムｃの還元速度を測定することによって、ｐＨ６．０と７．４で決定した。結果は、シトクロムｃについてのモル吸光係数の２１．１ｍＭ−１ｃｍ−１を用いて、還元シトクロムｃのｕｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質によって表した。
【００２１】
細胞内ｐＨの測定。細胞内ｐＨは、蛍光ｐＨ指示薬ＢＣＥＣＦ（２，７−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）カルボキシフルオレセイン（Molecular Probes, Eugene, USA）を用いて、製造者の指示にしたがって決定した。細胞の密集したフラスコをＨＢＳＳで洗浄して、血清含有ＲＰＭＩ培地の痕跡を全て除去した後、ＢＣＥＣＦのエステル化型（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）と一緒に、３７℃においてＨＢＳＳ中２［ｔＭ］の濃度で１時間インキュベートした。非変性洗剤 Pluronic をそのプローブに加えて、分散を助けた。次に、細胞を洗浄してＢＣＥＣＦ−ＡＭの痕跡を全て除去後、トリプシン処理した後、血清不含／フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Gibco BRL, Paisley, UK）中に、ｐＨ６において１０６個／ｍｌの細胞濃度で１時間懸濁させた。蛍光測定値は、Perkin-Elmer 蛍光分光光度計においてＵＶ等級使い捨て４ｍｌキュベット（Fischer Scientific）中、５００ｎｍおよび４５０ｎｍの励起波長（１０ｎｍの励起バンドパススリット）および５３０ｎｍで固定された発光波長（２．５ｎｍの発光バンドパススリット）で決定した。これらは、研究中の機械およびシステムに最適の設定であることが確かめられた。原位置検量検定は、４〜９の範囲の６種類のｐＨについてのｐＨｉ決定毎に、イオノホア、ニゲリシンを２２．８ｐ，Ｍの濃度で用いてｐＨｅとｐＨｉとを平衡させて行った。５００ｎｍ／４５０ｎｍでの蛍光比の計算は、バックグラウンド蛍光を各々のｐＨでのブランク（細胞不含の血清不含、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ）から差引後に計算した。
【００２２】
腫瘍検体および正常膀胱検体におけるＮＱＯ１の活性。２０人の一連の患者から得られた腫瘍（Ｇ２ｐＴａ〜Ｇ２／Ｇ３Ｔ４の等級／段階）および正常膀胱粘膜（３例の膀胱切除検体を含む）の対合試料におけるＮＱＯ１の生化学的活性を、表１に示す。腫瘍検体では、５７１．４ｎｍｏｌ／分／ｍｇ〜検出不能（＜０．１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）までの広範囲のＮＱＯ１活性が存在した。組織学的に正常な膀胱粘膜検体では、ＮＱＯ１活性は、１９０．９〜＜０．１ｎｍｏｌ／分／ｍｇであった。大部分の患者において、腫瘍のＮＱＯ１活性は、正常膀胱粘膜の場合より大であった。腫瘍の等級および段階は、ＮＱＯ１活性と相関しなかった（表１）。
【００２３】
ＮＱＯ１抗体の確認およびＮＱＯ１の免疫組織化学的位置確認。ウェスタンブロット分析は、細胞抽出物および精製ヒトＮＱＯ１双方について認められる約３１ｋＤａにおける単一バンドで、多クローン性抗ラットＮＱＯ１抗体がヒトＮＱＯ１と交差反応するということを示している（図１）。精製ＮＱＯ１の滴定は、バンド強度を減少させ（図１Ｂ）、細胞抽出物の場合、バンド強度はＮＱＯ１酵素活性と定性的に一致した（図１Ａ）。更に、この抗体は、Ｃ６０９Ｔ多形性の結果としてＮＱＯ１活性を欠いているＢＥ細胞系においてＮＱＯ１を検出しない（図１Ｃ）。ウェスタンブロットでは、非特異的結合が認められなかった。腫瘍組織、膀胱壁、尿管および尿道のＮＱＯ１タンパク質のイムノペルオキシダーゼ染色を、図２に示す。生化学的検定によって決定される高〜中間レベルのＮＱＯ１を有する表在性および浸潤性の腫瘍（ｐＴａ−パネルＡ、Ｇ３ｐＴ２−パネルＢおよびＧ３ｐＴ４−パネルＣ）（表１の患者番号１、４および５）は、明らかに、ＮＱＯ１についてポジティブに染色された。染色は、ストロマ細胞がほとんどまたは全く染色されていない腫瘍細胞の細胞質に限られた（パネルＢおよびＣ）。
【００２４】
中間または低レベルのＮＱＯ１活性を有する他の腫瘍の場合、染色は、高レベルのＮＱＯ１タンパク質を含有する細胞のポケットを有して不均一であった（データは示されていない）。正常膀胱壁切片は、膀胱切除術を受けた患者（Ｇ３ｐＴ４膀胱腫瘍）から入手し、尿管および尿道は、膀胱切除術を受けた別の患者（Ｇ３ｐＴ３ａ膀胱腫瘍）から入手した。膀胱壁では、尿路上皮にＮＱＯ１染色が認められなかったが（パネルＤ）、平滑筋層に僅かな染色が存在した。尿道（パネルＥ）はネガティブであったが、尿管の内腔面上の細胞は、ポジティブに染色された（パネルＦ）。しかしながら、尿管内層の基底層は、ネガティブに染色された（パネルＦ）。尿管および尿道または示された膀胱壁の断面には、浸潤性悪性腫瘍または生体内原位置の癌の証拠が認められなかった（パネルＤ）。１６例の他の正常膀胱生検および膀胱切除検体において、尿路上皮のポジティブ染色は認められなかった（データは示されていない）。
【００２５】
基質特異性および化学的感受性へのｐＨの影響。ＮＱＯ１の基質として役立つＥ０９の能力は、ｐＨによって影響されず、ｐＨ７．４および６．０においてそれぞれ２１．１０±２．３および２１．３０±１．５ｐｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の還元シトクロムｃ比活性であった。７．４および６．０のｐＨｅ値におけるＥ０９およびＭＭＣへの、一定範囲のＮＱＯ１活性（＜１．０〜１，８９８±２７６ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）を有する一団の細胞系の応答を、表２および図２に示す。ｐＨｅ＝７．４において、ＮＱＯ１活性と、Ｅ０９への化学的感受性との間には充分な相関があった（図３）。ＭＭＣの場合（表２、図３）、ＮＱＯ１と化学的感受性との間の関係は（ｐＨｅ７．４において）明白であったが、この関係は、Ｅ０９によって示される程度に顕著ではなく、広範囲のＮＱＯ１活性（＜１．０〜１，８９８ｎｍｏｌ／分／ｍｇの範囲）をカバーする、狭い範囲（０．９〜７．０ｔｔＭの範囲）のＩＣ５０値が細胞系で認められた。ＭＭＣおよびＥ０９は両方とも６．０のｐＨｅ値において細胞に選択的に一層毒性であるが、ＳＲ値（ＳＲ＝ＩＣ５０ｐＨｅ７．４／ＩＣ５０ｐＨｅ６．０として定義される選択性比）は、Ｅ０９については３．９２〜１７．２１であったのに対してＭＭＣは１．０２〜４．５０であり（表２）、Ｅ０９のはるかに大きい活性の増強が認められた。Ｅ０９の活性は、ＮＱＯ１の多い細胞系および欠乏細胞系双方において、ｐＨｅが６．０に低下した場合に増大し、そしてＮＱＯ１と化学的感受性との間の関係は、細胞が酸性条件下でＥ０９に暴露された場合、良好なままであった（図３）。対照培養物では、ＭＴＴ検定によって決定したところ、（薬物の不存在下において）ｐＨｅが６．０に低下した場合、細胞死滅は認められなかった。ＦＡＡ（２ｍＭ）の存在下および不存在下の７．４および６．０のｐＨｅ値におけるＥ０９へのＨ４６０細胞の応答を、表３に示す。どちらのｐＨｅ値でも、Ｅ０９へのＨ４６０細胞の応答は、ＦＡＡの存在下において減少した。Ｅ０９＋ＦＡＡのＩＣ５０をＥ０９単独のＩＣ５０値で割ったものとして定義される防御比は、酸性および生理学的ｐＨｅ値下（それぞれ、１４．６３および１３．９５、表３）の細胞について類似していた。ＦＡＡの存在下および不存在下におけるｐＨｅ７．４でのＩＣ５０をｐＨｅ６．０でのＩＣ５０で割ったものとして定義される選択性比も類似していたおり、Ｅ０９単独およびＥ０９＋ＦＡＡについてそれぞれ６．３１および６．０２のＳＲ値であった（表３）。Ｅ０９へのＨＴ−２９多細胞スフェロイドの応答を、図４に示す。ｐＨｅ６．０においてＥ０９に暴露されたスフェロイドは、ｐＨｅ７．４の場合より有意に応答性であり、それぞれ、９．８９±０．８９および２４．２４±３．２９ＡＭのＩＣ５０値であった。スフェロイドは、どちらのｐＨｅ値でも、単層としてＥ０９に暴露された同様の細胞よりも、Ｅ０９への応答性が有意に少なく、スフェロイド対単層のＩＣ５０値比は、７．４および６．０のｐＨｅ値においてそれぞれ、２０２および３４１であった。
【００２６】
ｐＨｉへの酸性ｐＨｅ条件の影響。ｐＨｅ６．０での１時間インキュベーション後のＰＭ値は、Ａ５４９、ＲＴ１１２／８３およびＡ２７８０細胞においてそれぞれ、６．４４±０．０４、６．５１±０．０２および６．４２±０．０５であった。イオノホア、ニゲリシンの添加は（ｐＨｅ６．０での１時間インキュベーション後）、ｐＨｅとｐＨｉを平衡させた。
【００２７】
生体還元性薬物開発によれば、最終的に選択性を決定するであろう二つの臨界的因子は、腫瘍の酵素学および低酸素の存在である（Workman, 1994）。序論に概説されたように、ＮＱＯ１の存在および不存在は、腫瘍の好気的部分（ＮＱＯ１の多い細胞）かまたは低酸素部分（ＮＱＯ１欠乏腫瘍）に標的指向することを目指したＥ０９に基づく適切な治療的戦略の設計の中心である。Workman（1994）は、Ｅ０９が、毒性の原因となるものは、ヒドロキノンでなくセミキノン（１電子還元生成物）であるという仮説に基づいて、好気的条件下および低酸素条件下のＥ０９の異なった性質について考えられる機構を概説した。ＮＱＯ１欠乏細胞では、１電子レダクターゼの結果として生じるセミキノンは、酸化還元循環して速やかに親化合物に戻ると考えられるので、相対的に無毒性であると考えられる。酸化還元循環の結果として生じるフリーラジカル種は、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼによって解毒されると考えられるが、低酸素条件下において、セミキノンは相対的に安定であると考えられる。これが主要毒性種であった場合、低ＮＱＯ１の細胞に対するＥ０９の活性は、増強されると考えられる。しかしながら、ＮＱＯ１の多い細胞では、形成される主要生成物はヒドロキノンであると考えられる。好気的毒性は、セミキノン種または親キノンへのヒドロキノンの戻し酸化（back oxidation）の結果として生じることがあり（Butler et al, 1996）、フリーラジカル生成を引き起こすと考えられる。しかしながら、低酸素条件下において、ヒドロキノンは一層安定であろうし、これが相対的に無毒性であるなら、低酸素下におけるＮＱＯ１細胞に対するＥ０９の活性は、増強されないと考えられる。好気的条件下および低酸素条件下におけるＥ０９の作用機構は複雑であるが、生物学的データは、Ｅ０９が、ＮＱＯ１の多い腫瘍の好気的部分またはＮＱＯ１欠乏腫瘍の低酸素部分を標的とすべきであるということを示唆している（Workman, 1994）。
【００２８】
腫瘍組織および正常膀胱組織のＮＱＯ１活性の分析は、ＮＱＯ１の多い腫瘍かまたはＮＱＯ１欠乏である腫瘍を有する患者を明確に識別した（表１）。その一部のＮＱＯ１の多い腫瘍では、酵素活性は、正常膀胱尿路上皮に対して増加する。免疫組織化学的研究は、正常ストロマ細胞と対照的に腫瘍細胞に限定された染色があることにより、これら生化学的測定値を確認する（図２、パネルＡ、ＢおよびＣ）。正常膀胱組織では、膀胱の尿路上皮内層（図２、パネルＤ）および尿道（図２、パネルＥ）に、ＮＱＯ１染色が存在しなかった。尿管の表層（図２、パネルＦ）の弱い染色が認められたが、その下にある尿管基底層は、ネガティブに染色された。同様に、膀胱、尿管および尿道の平滑筋層の弱い染色も認められた（データは示されていない）。これら研究は、（疾患のいろいろな等級および段階にある）膀胱腫瘍を有する患者の割合が、腫瘍細胞の好気的部分に対して向けられたＥ０９に基づく療法により潜在的に利用されうると考えられるＮＱＯ１活性の点で、有意の差を示すということを示唆している。低酸素性ＮＱＯ１欠乏細胞を選択的に死滅させるＥ０９の能力に関して、ＮＱＯ１活性を欠いている腫瘍を有する一部の患者も存在する（表１）。膀胱腫瘍が、低酸素緊張状態の領域を含有するか否かは知られていないので、この問題を扱うために、そして腫瘍中のＮＱＯ１活性と低酸素との関係を決定するために、ピモニダゾール（pimonidazole）（Kennedy et al, 1997）などの低酸素マーカーを用いる更なる研究が必要とされる。
【００２９】
生化学的および免疫組織化学的研究は、Ｅ０９を（好気的条件下で）活性化する適切な腫瘍酵素学を有する一部の患者が存在することを示しているが、膀胱内化学療法は、血液供給に入る薬物のために、全身毒性を引き起こすことがありうる。この研究は、更に、酸性ビヒクル中のＥ０９の投与は、膀胱内のＥ０９の力価を増大させるという仮説（Phillips et al, 1992）、および血流に到達するいずれの薬物も、ｐＨｅの上昇のために、比較的不活性になると考えられるという仮説に基づいて、全身毒性のいずれの危険も最小限にする可能性のある戦略を評価した。好気的細胞についての選択性は、ＮＱＯ１活性によってなお決定されると考えられるので、ＮＱＯ１が、酸性ｐＨｅ条件下でのＥ０９の活性化において果たす役割を決定することは不可欠である。広範囲のＮＱＯ１活性を有する一団の細胞系において、ｐＨｅを６．０に低下させることは、全ての場合に、好気的条件下でＥ０９の力価を増大させる（３．９２〜１７．２１のＳＲ値、表２）。ＭＭＣの場合、力価も、低ｐＨｅ値で増大するが、毒性のｐＨ依存性増加の大きさは、Ｅ０９と比較して減少する（１．０２〜４．５０のＳＲ値、表２）。ＭＭＣに関して、酸性条件下で増加した活性についての一つの説明は、ＭＭＣが、酸性条件下でＮＱＯ１の基質になるという事実に起因していた（Pan et al, 1993, Siegel et al, 1993）。これは、Ｅ０９についてはあてはまらない。なぜなら、精製ヒトＮＱＯ１によるＥ０９の還元速度は、ｐＨによって影響されないからである（ｐＨ７．４および６．０においてそれぞれ、２１．１０±２．３０および２１．３０±１．５０  ｌｉｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の還元シトクロムｃ）。最近の研究は、細胞内ｐＨが、ニゲリシンとの同時インキュベーションによって低下する場合（ｐＨｉ＝６．５）だけを除き、Ｅ０９の活性が酸性条件下（ｐＨｅ＝６．５）で増大するということを示している（Kuin et al, 1999）。この研究の結果は、細胞をｐＨｅ６．０条件下で培養した場合、ｐＨｉが酸性になるので（ｐＨｉ値は、細胞系に依存して６．４２±０．０５〜６．５１±０．０２である）、この知見と一致している。
【００３０】
この研究で用いられた一団の細胞系では、７．４および６．０双方のｐＨｅ値において、ＮＱＯ１活性と化学的感受性との間に良好な相関がある（図３）。好気的条件下における（ｐＨｅ７．４での）ＮＱＯ１活性と応答との間の強い関係は、いくつかのグループによって以前に確かめられており（Robertson et al, 1994, Fitzsimmons et al, 1996, Smitkamp-Wilms et al, 1994）、ＮＱＯ１が、好気的条件下でのＥ０９の作用機構において中心的な役割を果たしているという明確な証拠が存在する（Workman, 1994）。ｐＨｅ６．０でのＮＱＯ１活性と応答との良好な相関は、Ｅ０９が、ｐＨ６．０でなおＮＱＯ１の良好な基質であるという事実とともに、ＮＱＯ１が、好気的条件下の酸性ｐＨｅ値でのＥ０９の作用機構において有意の役割を果たしているということを示唆する。しかしながら、ＢＥ細胞（Ｃ６０９Ｔ多形性の結果としてＮＱＯ１活性を欠いている，Traver et al, 1992）に対するＥ０９の活性も、酸性ｐＨｅ条件下で増大する（表２）ということに注目することは興味深い。これは、好気的条件下で増加したＥ０９活性について、ＮＱＯ１とは無関係の機構が存在するということを示唆している。これは、ＮＱＯ１阻害剤ＦＡＡの使用によって確証される｛「防御比」（Ｅ０９＋ＦＡＡのＩＣ５０値をＥ０９のＩＣ５０値で割った比率として定義される）が、ｐＨｅ７．４および６．０双方で類似している（それぞれ、１３．９５および１４．６３、表３）｝。ＮＱＯ１が、ｐＨｅ６．０でのＥ０９の活性化において中心的な役割を果たしていた場合、ｐＨｅ６．０での防御比は、ｐＨｅ７．４での防御比より有意に大であると考えられる。ＮＱＯ１とは無関係のＥ０９活性化の背後にある機構は不明であるが、アジリジン環構造の反応性はプロトン化によって増大し、強力なアルキル化種であるアジリジニウムイオンへの開環を引き起こすということが周知である（Mossoba et al, 1985, Gutierrez, 1989）。また、Ｅ０９は、他の１電子レダクターゼの基質であり（Maliepaard et al, 1995, Saunders et al, 2000）、これら酵素によるＥ０９の代謝が、ｐＨ依存性であるかどうかを評価するために設計される更なる研究を決定する必要がある。Ｅ０９の力価は、ｐＨｅを６．０未満に低下させることによって更に増大させることができるが（Phillips et al, 1992）、これら条件は、ｐＨが５．５に低下した場合、Ｅ０９が漸進的に一層不安定になるので（ｔ’／ｓ＝３７分）、有意の臨床的利点を与えるとは考えられない。薬理学的観点から、ビヒクル中においてｐＨ６．０でのＥ０９の投与は、望ましいであろうと考えられる。これは、Ｅ０９活性を有意に増大させるのみならず、Ｅ０９の安定性も、薬物暴露パラメーターを治療的レベルで維持するのに充分であると考えられる（ｔｌｈ＝２．５時間）。
【００３１】
in vitro の三次元培養モデルに対するＥ０９の活性に関して、この研究は、ｐＨｅを６．０に低下させることは、多細胞スフェロイドに対するＥ０９の力価を増大させるが、この作用の大きさは、単層培養物と比較して減少するということを示した（図４）。ｐＨｅの低下が、スフェロイド中のいたるところでより多くの細胞を死滅させるか否か、またはそれが、媒質に暴露されたスフェロイドの表面に限られるかどうかは知られていない。ＭＭＣとの比較において、ＭＭＣに暴露された組織培養物（histocultures）を用いた従来の研究は、生理学的ｐＨｅ条件と酸性ｐＨｅ条件との間の毒性に差がないということを示した（Yen et al, 1996）。スフェロイドに対するＥ０９毒性のｐＨ依存性増加は、ｐＨｅの操作が、多層充実性膀胱腫瘍を処置する場合に有用であるのみならず、ＭＭＣにまさる利点を与えることがありうるということを示唆する。しかしながら、多細胞スフェロイドは、おそらくは、無血管組織を介するＥ０９の不充分な浸透性のために、Ｅ０９への応答性が単層よりも有意に少ないということが述べられるはずである（Phillips et al, 1998）。それにもかかわらず、Ｅ０９は、スフェロイド中の＞９０％の細胞を死滅させることができ（図４）、少なくともより高い用量で、Ｅ０９の浸透は、スフェロイドの表面から若干離れて存在している細胞を根絶させるのに充分であるということが示唆される。
【００３２】
最後に、この研究の結果は、疾患のいろいろな段階および等級にある膀胱腫瘍を有する患者の集団内に、ＮＱＯ１の発現に関して大きい不均一性が存在するということを示した。大部分の患者は、上昇したレベルのＮＱＯ１を有する腫瘍を有するが、僅かな一部の患者は、ＮＱＯ１活性を欠いていると考えられる。本明細書中に記載のＮＱＯ１活性の不均一性は、種々の腫瘍タイプのいくつか他の研究と一致する（Malkinson et al, 1992, Smitkamp-Wilms et al, 1995, Siegel et al, 1998）。これら知見は、生体還元性薬物での治療的介入の前の個々の患者の「酵素プロファイリング」が、有効でありうるという見解（Workman, 1994）を強くする。これは、知る限りにおいて、膀胱腫瘍のＮＱＯ１の活性および細胞内位置確認を特性決定し、そして表在性および局所浸潤性の膀胱腫瘍に対するＥ０９の評価を支持する強い確証を与えるための最初の研究である。この研究は、好気的条件下において、Ｅ０９が、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．４）よりも酸性条件下（ｐＨ６．０）ではるかに強力であるということを明確に示した。この増加したＥ０９力価の機構は、ＮＱＯ１とは無関係であると考えられ、しかもこれは、選択性を改善する（または減少させる）ことはないが、それは、Ｅ０９の治療的有効量を減少させるという点で、有益であると証明されうる。用量減少は、Ｅ０９の力価の減少が、血流中の増加したｐＨｅのためであるという事実とともに、Ｅ０９の膀胱内投与によって生じる全身毒性が低いと考えられるということを示唆する。更に、この研究は、生理学的条件下でのＥ０９の活性が、「高」ＮＱＯ１発現性組織（すなわち、腫瘍）と比較して、ＮＱＯ１の「正常」発現を有する組織においてはるかに低いということを示している。この研究の結果は、Ｅ０９の膀胱内投与が、膀胱腫瘍に対する活性を有することがありうるという提案を支持する強い確証を与える。
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【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表２】
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【００３５】
【表３】
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【００３６】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ヒトＮＱＯ１の免疫組織化学的分析で用いるための多クローン性抗ラットＮＱＯ１抗体の確認。パネルＡ：ＮＱＯ１についての細胞抽出物（１２．５ｐ，ｇ／列の負荷タンパク質）のウェスタンブロット分析。列１〜５は、それぞれ、ＤＬＤ−１（７９４±１２１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）、ＨＴ−２９（６８８±５２ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）、Ｈ４６０（１６５２±１４２ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）、ＭＴ１（２８７±５３ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）およびＲＴ１１２（３０±３ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）からの抽出物であり、この括弧内の値はＮＱＯ１活性である。列６は、分子量マーカー（ＥＣＬタンパク質分子量マーカー，Amersham Pharmacia Biotech, UK）である。パネルＢ：精製ヒトリコンビナントＮＱＯ１を用いたウェスタンブロット分析。列１〜５は、それぞれ、０．２５ｐｍｏｌ、０．１２５ｐｍｏｌ、０．０６２５ｐｍｏｌ、０．０３１２ｐｍｏｌおよび０．０１５６ｐｍｏｌのタンパク質の量である。パネルＣ：Ｈ４６０細胞（列１〜２）およびＢＥ細胞（列３〜４）に由来する細胞抽出物（２５／，ｃｇ／列の負荷タンパク質）のウェスタンブロット分析。
【図２】ヒト膀胱腫瘍、正常な膀胱、尿道および尿管におけるＮＱＯ１の免疫組織化学的位置確認。腫瘍（パネルＡ、ＢおよびＣ）は、生化学的方法によって決定されたように、高〜中間レベルのＮＱＯ１活性を有したＧ２ｐＴａ（パネルＡ，［ｘ２００］）およびＧ３ｐＴ２（パネルＢ［ｘ１００］）およびＧ３ｐＴ４（パネルＣ［ｘ２００］）として分類した。パネルＤ（ｘ１００）は、Ｇ３ｐＴ４腫瘍について膀胱切除術を受けた患者からの肉眼では正常に見える膀胱切片を貫く組織学的断面であり、これら切片で腫瘍は識別されなかったが、若干の炎症性変化が明らかであった。パネルＥおよびＦ（ｘ２００）は、これら切片に浸潤性または生体内原位置の癌腫の形跡のない尿道および尿管である。切片は全て、ＮＱＯ１抗体で染色した。ネガティブ染色（一次抗体を含まない）は明瞭であった（データは示されていない）。
【図３】パネルの細胞系の、正常な生理学的ｐＨである７．４（○）または酸性ｐＨ値である６．０（）の下でのＥ０９（パネルＡ）またはＭＭＣ（パネルＢ）への応答とＮＱＯ１活性との関係。Ｅ０９についてのｐＨ７．４での回帰分析データ（シグマプロット（Sigma Plot） グラフ算法によって決定される）は、ｒ＝０．８８６、勾配＝−０．５２であり、ｐＨ６．０でのＥ０９の回帰分析データは、ｒ＝０．８０４、勾配＝−０．５１であった。ＭＭＣについてのｐＨ７．４での回帰分析は、ｒ＝０．８４９、勾配＝−０．１９であり、ｐＨ６．０では、ｒ＝０．６０９、勾配＝−０．２３であった。
【図４】酸性（ｐＨｅ＝６．０，０）および生理学的（ｐＨｅ＝７．４，０）細胞外ｐＨ条件下におけるＥ０９に１時間暴露後のＨＴ−２９多細胞スフェロイドの応答。示された値は、３回の独立した実験の平均±標準偏差である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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