(57)【要約】  本発明は動物細胞およびトランスジェニック動物においてＨＢＭタンパク質を発現させるのに用いられる方法および材料に関する。本発明また高骨量遺伝子、対応する野生型遺伝子、およびその変異体を発現するトランスジェニック動物にも関する。本発明はコード化配列などの核酸、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主、医薬用組成物の開発方法、骨発達に関与する分子の同定方法、ならびに骨発達に関与する疾患の診断および処置方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は骨粗鬆症を処置、診断および予防するための方法を志向する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の位置５８２におけるチミンを少なくとも含み、配列番号２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結され、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くことができるプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物。
【請求項２】
配列番号４をコードする配列を含み、配列番号４の位置１７１のバリンに相当するバリンのコドンを少なくとも含む核酸であって、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くことができる、機能的に連結されたプロモーター領域をさらに含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物。
【請求項３】
核酸が配列番号２を含む請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
配列番号１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結された、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有する、骨密度変調の研究のためのトランスジェニック動物であって、骨量が、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される１つ以上のパラメーターについて、同一種の非トランスジェニック動物と比較して、変調されているトランスジェニック動物。
【請求項５】
プロモーター領域が、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０およびＥＦ−１ａ、ＣＭＶβアクチン、ヒストン、Ｉ型コラーゲン、ＴＧＦβ１、ＳＸ２、ｃｆｏｓ／ｃｊｕｎ、Ｃｂｆａ１、Ｆｒａ／Ｊｕｎ、Ｄｌｘ５、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、またはコラゲナーゼプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
プロモーター領域が、骨特異的プロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
プロモーター領域が、ＣＭＶβアクチンプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
プロモーター領域が、Ｉ型コラーゲンプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の胚。
【請求項１０】
トランスジェニック動物が、ヒトＨＢＭタンパク質を発現する請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ヒトＨＢＭタンパク質が、骨組織において最も多く発現される請求項１０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
ＨＢＭ表現型を表す請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
骨量が、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される１つ以上のパラメーターについて、同一種の非トランスジェニック動物と比較して、変調されている請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
ヒトＨＢＭタンパク質が発現され、繁殖力があり、ヒトＨＢＭ遺伝子をその子孫に伝える請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
ヒトＬＲＰ５タンパク質が発現され、繁殖力があり、ヒトＨＢＭ遺伝子をその子孫に伝える請求項４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載のトランスジェニック動物またはその子孫から産生されたトランスジェニック動物。
【請求項１７】
ＬＲＰ５をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、該変化が、相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ５遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ５遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ５遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含む核酸の、胚性幹細胞または多能性細胞への導入により引き起こされ、該核酸が内因性遺伝子と相同組換えできるトランスジェニックマウス。
【請求項１８】
ジーンターゲティングのための核酸の中央セクションが、ＡＴＧ開始コドンの操作された欠失、操作されたフレームシフト変異、操作された停止コドン、ネオマイシン抵抗性配列、ｌｏｘＰ組換え部位、または合成転写中止配列を含む請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
ジーンターゲティングのための核酸が、マウスＬＲＰ５遺伝子のイントロン配列およびエクソン配列の双方をさらに含む請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
ジーンターゲティングのための核酸が、マウスＬＲＰ５遺伝子のアミノ酸配列の位置１７０においてグリシンからバリンへの変化をコードするコドンをさらに含み、変化した遺伝子がＨＢＭタンパク質をコードする請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
前記変化が、ＬＲＰ５遺伝子を発現しないようにするＬＲＰ５遺伝子の破壊である請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２２】
ＬＲＰ６をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、該変化が、相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ６遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ６遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ６遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含む核酸の、胚性幹細胞または多能性細胞への導入により引き起こされ、該核酸が内因性遺伝子と相同組換えでき、該トランスジェニック動物が変調されたＷｎｔ活性、Ｄｋｋ活性、脂質レベルまたは骨量を有するトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
前記変化が、ＬＲＰ６遺伝子を発現しないようにするＬＲＰ６遺伝子の破壊である請求項２２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２４】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝える請求項２２に記載のトランスジェニックマウスまたはその子孫。
【請求項２５】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝える請求項１７から２４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝えるトランスジェニックマウスであって、子孫が、野生型と比較して、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される少なくとも３つのパラメーターにより示される変調された骨量の表現型を表す請求項１７から２４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２７】
マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞へ導入することで産生される請求項１７から２６のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２８】
請求項１７から２７のいずれかに記載のトランスジェニックマウスから産生されたトランスジェニックマウス。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物からなる動物の第１群および対照動物の第２群を含む骨密度変調の研究のための動物モデル。
【請求項３０】
対照動物群が、ヒトＬＲＰ５をコードする核酸を含む細胞を有するトランスジェニック動物を含む請求項２９に記載の動物モデル。
【請求項３１】
骨量決定要素の研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）該トランスジェニック動物における少なくとも１つの骨発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３２】
骨量のモデュレーターの研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与するステップと、
（ｃ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物における少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３３】
骨量の研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）実験手順を施すステップと、
（ｃ）実験手順を施された動物における少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
被験化合物が、注射投与、経口投与、坐薬投与、移植片投与、または局所的投与される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
実験手順が、卵巣切除、骨負荷の制限、および骨負荷の増強の中から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
トランスジェニック動物群がＨＢＭを発現し、ＨＢＭを発現し、被験化合物を投与されたトランスジェニック動物において骨量密度が変調されている請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
トランスジェニックマウス群がＨＢＭを発現し、ＨＢＭを発現し、被験化合物を投与されたトランスジェニックマウスにおいて骨量密度が上昇している請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
被験化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ミネラル、ビタミン、天然生成物、または合成有機化合物を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
実験手順が、外科的手順、遺伝子治療手順、薬物治療手順、食事療法、または運動を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＢＭが骨障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）骨障害の表現型を有する動物の胚を供するステップと、
（ｂ）請求項１から４のいずれかに記載の核酸を該胚の第１の群に導入するステップと、
（ｃ）胚を偽妊娠マウスに移すステップと、
（ｄ）得られたマウスの少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項４１】
骨形成／再吸収の代理マーカーを同定する方法であって、
（ａ）請求項２９に記載の骨発達の動物モデルを供するステップと、
（ｂ）該動物における代理マーカー候補を定量的に測定するステップと、
（ｃ）トランスジェニック動物群の測定値を対照動物群の測定値と比較するステップと、
を含む方法。
【請求項４２】
ＨＢＭが心臓障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物の少なくとも１つの心臓健康パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項４３】
ＨＢＭが心臓障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与するステップと、
（ｃ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物の少なくとも１つの心臓健康パラメーターを測定するステップと、
を含む方法であって、被験化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ミネラル、ビタミン、天然生成物、または合成有機化合物を含む方法。
【請求項４４】
心臓健康パラメーターが、血清脂質濃度である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
心臓保護処置から骨量変調効果をスクリーニングする方法であって、
請求項３１に記載の方法を含み、心臓保護処置を前記動物の第１群のサブグループに投与するステップをさらに含む方法。
【請求項４６】
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物またはその子孫に由来する単離された細胞。
【請求項４７】
骨芽細胞または破骨細胞である請求項４６に記載の単離された細胞。
【請求項４８】
内因性ＬＲＰ５の発現が、相同組換えまたは非相同組換えにより導入された変化した遺伝子の調節配列により変調されるトランスジェニック動物。
【請求項４９】
骨密度を変調する方法であって、
ＬＲＰ５、ＨＢＭまたはＬＲＰ６の内因性の発現を変調する化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項５０】
心臓保護処置から骨量変調効果をスクリーニングする方法であって、
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
心臓保護処置を該動物の第１群のサブグループに投与するステップと、
少なくとも処置されたマウスにおいて少なくとも１つの骨変調パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項５１】
前記核酸が、配列番号４の位置１３３０で少なくともアラニンからバリンへの置換をさらにコードする請求項１から１６のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項５２】
相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ５遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ５遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ５遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含み、内因性遺伝子と相同組換えできる核酸。
【請求項５３】
中央セクションが、ＡＴＧ開始コドンの操作された欠失、操作されたフレームシフト変異、操作された停止コドン、ネオマイシン抵抗性配列、ｌｏｘＰ組換え部位、または合成転写中止配列を含む請求項５２に記載の核酸。
【請求項５４】
マウスＬＲＰ５遺伝子のイントロン配列およびエクソン配列の双方をさらに含む請求項５２に記載の核酸。
【請求項５５】
マウスＬＲＰ５遺伝子のアミノ酸配列の位置１７０でグリシンからバリンへの変化をコードするコドンをさらに含む請求項５２に記載の単離された核酸。
【請求項５６】
ＬＲＰ５をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスを産生する方法であって、
（ａ）請求項５２に記載の核酸を供するステップと、
（ｂ）該核酸をマウス胚性幹細胞に導入するステップと、
（ｃ）該核酸を含む胚性幹細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の胚盤胞を偽妊娠マウスに移すステップと、
（ｆ）移した胚盤胞を、該核酸に関してキメラであるマウスに発達させるステップと、
を含む方法。
【請求項５７】
胚性幹細胞の導入が、マイクロインジェクションによるものである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）キメラマウスと野生型マウスと交配させ、前記変化に関してヘテロ接合性であるマウスを得るステップと、
（ｂ）該ヘテロ接合性マウスを交配させ、前記変化に関してホモ接合性であるマウスを産生するステップと、
をさらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
骨量に関連する遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２９に記載の骨発達の動物モデルを供するステップと、
（ｂ）該動物における遺伝子発現のプロファイルを測定するステップと、
（ｃ）該動物の第１の群の測定値を動物の対照群の測定値と比較するステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に遺伝的、ゲノムおよび分子生物学の分野に関する。本発明は高骨量遺伝子(high bone mass gene)および対応する野生型遺伝子、ならびにそれの変異体の単離、検出および配列に関する。本発明はまた高骨量（ＨＢＭ）遺伝子、対応する野生型遺伝子およびそれの変異体にも関する。本発明で同定された遺伝子は骨発達のオントロジーおよび生理学に関係している。本発明はまた核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主、医薬用組成物を開発する方法、骨発達に関与する分子を同定する方法、ならびに骨発達に関与する疾患の診断および処置方法をも提供する。本発明は、さらにＨＢＭ表現型を研究するためのトランスジェニック動物、ＨＢＭ遺伝子の作用のメカニズム、ならびに正常および異常な骨状態に影響する因子および処置に関する。好ましい実施形態では、本発明は代謝性骨疾患、例えば骨粗鬆症などの骨の正常および異常な状態を処置、診断、予防およびスクリーニングする方法を志向する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症の最も一般的な型の２つは閉経後および老年性骨粗鬆症である。骨粗鬆症は男性および女性を襲い、その他の骨の異常と共に、高齢者にとってかつてない健康上のリスクを提示している。骨粗鬆症の最も一般的な型は閉経期に関連する。大抵の女性は月経の停止後３から６年以内に骨の骨梁区画の骨量の２０から６０％を喪失する。この急速な喪失は一般に骨吸収および形成の増加に関連する。しかしながら、再吸収のサイクルはより優勢であり、結果的には骨量の純損失となる。骨粗鬆症は閉経後の女性の間では一般的で深刻な疾患である。米国内でおよそ２５００００００人の女性がこの疾患に苦しんでいる。骨粗鬆症の結果は双方共に個人にとって有害であり、また疾患の続発症から慢性化ならびに過度および長期の援助（入院および老人ホームでの介護）の必要性のために多大な経済的損失の原因となる。これはとりわけより高齢の患者において真実である。さらに、骨粗鬆症は一般に生命を脅かす症状としては考えられていないが、死亡率の２０から３０％は高齢の女性の股関節部の骨折に関連している。この大きなパーセンテージの死亡率が直接的に閉経後骨粗鬆症に関連し得る。
【０００３】
閉経後骨粗鬆症の影響に対して最も脆弱な骨の組織は骨梁骨である。この組織はしばしば海綿状骨と称され、とりわけ関節近くの骨の末端近くおよび脊椎の椎骨に集中している。骨梁組織は互いに相互接続している小型の構造ならびに骨の外側表面および中央の骨幹を構成するより堅固で、密な皮質組織を特徴とする。この骨梁の交差する網目は外側の皮質構造に対して側壁保持を提供し、全体の構造の生物機械的強度にとって非常に重要である。閉経後骨粗鬆症では、網目の再吸収および骨梁の喪失が第１次的であり、これは骨不全および骨折に至る。閉経後の女性の骨梁の喪失に鑑みて、最も一般的な骨折が骨梁支持に高度に依存する骨に関連するもの、例えば椎骨、大腿骨頚部および前腕であることは驚くべきことではない。実際に、股関節部骨折、コーレス骨折、および椎骨圧挫が閉経後骨粗鬆症の徴候である。
【０００４】
最も早くに認められた閉経後骨粗鬆症の処置の方法はエストロゲン置換療法である。この治療は高頻度で成功するが、長期にわたるエストロゲン処置の望ましくない副作用のために患者のコンプライアンスが低い。前記したエストロゲン置換療法の高頻度の副作用には月経の再発、胃内ガス貯留、抑うつ、および乳癌または子宮癌の恐れなどがある。子宮摘出を行っていないその女性の子宮癌の既知の脅威を制限するために、エストロゲンおよびプロゲスチンの周期的治療法がしばしば用いられる。このプロトコルは受胎調節計画に用いられるものに類似しており、しばしばプロゲスチンの副作用特性のために女性に耐容されない。さらに最近では、元来乳癌の処置のために開発された特定の抗エストロゲンが閉経後骨粗鬆症の実験モデルで有効であることが示されている。これらの作用物質のなかにラロキシフェン(米国特許第5,393,763号およびBlackら、J.Clin.Invest.93:63-69(1994))がある。加えて、乳癌の処置に広く用いられている臨床薬であるタモキシフェンは乳癌を患う閉経後の女性の骨塩量を増加させることが示されている(Loveら、N.Engl.J.Med.326:852-856(1992))。
【０００５】
閉経後骨粗鬆症の処置のための別の治療はカルシトニンの使用である。カルシトニンは骨再吸収を阻止し、多くの国でこの使用が承認されている天然発生ペプチドである(Overgaardら、Br.Med.J.305:556-561(1992))。しかしながらカルシトニンの使用は幾分制限されている。その効果は骨塩量の増加においてまさに中程度であり、処置には非常に経費がかかる。閉経後骨粗鬆症の処置のための別の治療はビスホスフォネートの使用である。これらの化合物は元来パジェット病および悪性高カルシウム血症で使用するために開発されたものである。これらは骨再吸収を阻止することが示されている。アレンドロネートはこのクラスの化合物の１つであり、閉経後骨粗鬆症の処置用に承認されている。これらの作用物質は骨粗鬆症の処置の助けとなり得るが、これらの作用物質は骨軟化症、骨における極度に長い半減期（２年以上）、および「凍結骨症候群(frozen bone syndrome)」、例えば正常な骨リモデリングの休止の可能性を含む潜在的な傾向性をも有している。
【０００６】
老年性骨粗鬆症は骨塩量の喪失により特徴づけられ、骨折率、罹患率および関連する死亡率の増加に至るという点で閉経後骨粗鬆症に類似している。これは一般に晩年、すなわち７０歳後に起こる。組織化学的には、老年性骨粗鬆症は女性においてより一般的になっているが、より高齢の男性集団の出現で、この疾患は双方の性別における主要な因子になりつつある。ホルモン例えばテストステロンまたはエストロゲンがこの疾患で、あるとすれば何の役割を果たしているのかは明らかではなく、その病因は不明確である。この疾患の処置はあまり満足のいくものではない。ホルモン治療、女性ではエストロゲン、男性ではテストステロンは不明瞭な結果を示しており；カルシトニンおよびビスホスフォネートは幾分役立つ。
【０００７】
成熟時の骨格の骨量のピークは主として遺伝子調節下にある。双生児の研究により成人の一卵性双生児間の骨量の不一致は二卵性双生児間の不一致よりも小さいことが示されており(Slemendaら、J.Bone Miner.Res.6:561-567(1991);Youngら、J.Bone Miner.Res.6:561-567(1995);Pocockら、J.Clin.Invest.80:706-710(1987);Kellyら、J.Bone Miner.Res.8:11-17(1993))、骨格骨量の不一致の６０％またはそれ以上までが遺伝されていると推定されている(Krallら、J.Bone Miner.Res.10:S367(1993))。骨格骨量のピークは老齢期の骨量の最も強力な決定要因であるが(Huiら、Ann.Int.Med.111:355-361(1989))、成人および晩年の加齢関連の骨損失の速度もまた強力な決定要素(determinant)である(Huiら、Osteoporosis Int.1:30-34(1995))。骨量は原則的に骨折リスクの決定要素であるので、遺伝した成熟時に達成した骨格骨量のピークは晩年の骨折の個々のリスクの重要な決定因子である。従って、骨量の遺伝的基盤の研究は骨粗鬆症による骨折の病因学において相当興味深いものである。
【０００８】
最近では、骨粗鬆症の分野で骨量ピークの遺伝的調節に強く興味をもたれるようになってきている。興味は主に、正常範囲内での骨量の変動にとの関連性を試験するための適当な多型性を有する候補遺伝子に注がれているか、または骨粗鬆症の患者に見出される範囲の骨量低下に関連する遺伝子および遺伝子座の試験に注がれている。ビタミンＤレセプター遺伝子座（ＶＤＲ）(Morrisonら、Nature,367:284-287(1994))、PTH遺伝子(Howardら、J.Clin.Endocrino.Metab.80:2800-2805(1995);Johnsonら、J.Bone Miner.Res.8:11-17(1995);Gongら、J.Bone Miner.Res.10:S462(1995))、およびエストロゲンレセプター遺伝子(Hosoiら、J.Bone Miner.Res.10:S170(1995);Morrisonら、Nature 367:284-287(1994))がこの仕事で最も傑出している。骨量（表現型）は連続的、量的、多遺伝子的特質であり、環境因子、例えば栄養、同時罹患している疾患、年齢、身体活動度、およびその他の因子により混乱されるので、これらの研究は困難である。また、この型の研究設計には多くの対象が必要とされる。とりわけ今日までのＶＤＲ研究の結果は解り難く、矛盾している(Garneroら、J.Bone Miner.Res.10:1283-1288(1995);Eismanら、J.Bone Miner.Res.10:1289-1293(1995);Peacock、J.Bone Miner.Res.10:1294-1297(1995))。さらに、この仕事はこれまでは、遺伝的影響が骨量において効果を奏するメカニズムにそれほど光を注いでいない。
【０００９】
骨量ピークは環境因子よりもむしろ遺伝的因子により主に決定されることは周知であるが、骨量の変動に関連する遺伝子座（および究極的には遺伝子）を決定する研究は困難で、経費がかかる。連鎖解析、例えば同胞対または拡大家族の力を利用する研究設計は単純な関連性研究よりも一般に有益であるが、後者も価値がある。しかしながら、骨量に関係する遺伝連鎖研究は２つの主要な問題により妨害される。第１の問題は前記で簡単に論じた表現型である。骨量は連続的な、量的な特質であり、別個の表現型を確立するのは困難である。測定のための各々の解剖学的な部位はいくつかの遺伝子により影響を受け、その多くは部位間で異なっているかもしれない。第２の問題は表現型の年齢要素である。個体を骨量が低いと同定できるまでに、その親またはその他の前世代の構成員が死亡している可能性が高く、従って研究に利用できず、若い世代は未だ骨量ピークに達していないかもしれず、その表現型の遺伝子分析を不正確にしている。
【００１０】
それにもかかわらず、連鎖解析を用いて遺伝的「障害」を引き起こす遺伝子の位置を見出すことができ、障害の生化学的性質の知識を何ら必要としない、すなわち障害を引き起こすと考えられている変異タンパク質を知っている必要はない。伝統的な研究法は公知のタンパク質を評価すべき候補として関連づける、疾患の過程に関係する仮説に依存する。連鎖解析を用いる遺伝子局在研究法を用いて最初に欠損遺伝子が位置する一般的な染色体領域を見出し、次にできるだけ正確に具体的な変異遺伝子の位置を決定するために領域の大きさを徐々に狭めることができる。候補領域内で遺伝子そのものを見出した後、メッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質を同定し、ＤＮＡと一緒に変異に関して検査する。
【００１１】
疾患を引き起こす変化した遺伝子を見出す前でも疾患の位置を出生前診断に用いることができるので、遺伝子局在研究法は現実的な意味を有している。連鎖解析により、その多くが病気の子供を有してもいない家族が、疾患遺伝子のキャリヤであるかどうかを知り、分子診断を通して生まれていない子供の状態を評価することが可能になる。次いで、家族内の疾患の伝達を用いて欠陥遺伝子を見出すことができる。本明細書で用いるように、「高骨量」（ＨＢＭ）に対する言及は病態への言及と類似しているが、現実的な観点から、対象が骨粗鬆症として知られている疾患を回避するのを、高骨量が実際に助けることができる。
【００１２】
親から子孫への染色体の遺伝の性質のために連鎖解析は可能である。減数分裂の間に、２つの親の相同対は娘細胞への適切な分離に導かれる。それらは並び、対を形成しているが、２つの相同体は染色体片を交換し、その事象を「クロスオーバー」または「組換え」と称される。得られた染色体はキメラであり、すなわちそれらは双方の親相同対に由来する部分を含有している。２つの配列が染色体上ですぐ近くであるほど、組換え事象がその間で生じる可能性は低くなり、より近くで連鎖する。連鎖解析実験では、染色体上の２つの位置は、それらの間の組換えの頻度を決定するために、１世代から次の世代に追跡される。遺伝される疾患の研究では、染色体位置の１つを疾患遺伝子またはその正常な対応物により標識する、すなわち染色体領域の遺伝を、個体が障害の症状を表示するかどうかを試験することにより決定することができる。標識する２つの相同体が、それらが保持する「マーカー」配列のコピーに基づいて区別され得るように、その他の位置を集団の天然の変動を示すＤＮＡ配列により標識する。どの家族でも、遺伝的マーカー配列の遺伝を病態の遺伝と比較する。常染色体優性の障害、例えば高骨量を担持する家族内で、罹患する全ての個体がマーカーの同一の形態を担持し、罹患していない全ての個体は少なくとも１つのマーカーとは異なる形態を担持する場合、疾患遺伝子およびマーカーが互いに接近して位置している可能性が大きい。このように、染色体を公知のマーカーで系統的に調べ、病態と比較することができる。異なる家族から得られたデータを組み合わせて、統計学的方法を用いてコンピューターにより一緒に分析する。結果は、それらの間で異なる距離が可能である遺伝子マーカーおよび疾患の間の連鎖の可能性を示す情報である。陽性の結果は、疾患がマーカーに非常に接近しており、一方陰性の結果は染色体上で非常に離れているか、または全く異なる染色体上であることを意味し得る。
【００１３】
連鎖解析は、規定のマーカー遺伝子座で罹患家族の全員を分類し、特定の病態の同時遺伝をマーカープローブで評価し、それによりどのような頻度でそのうちの２つが同時に遺伝されたかを決定することにより実施される。組換え頻度を２つの遺伝子座の遺伝子距離の測定として用いることができる。組換え頻度１％は１地図単位または１センチモルガン（ｃＭ）と等価であり、これはＤＮＡ１０００ｋｂとほぼ等価である。この関係は約２０％または２０ｃＭまで保持される。
【００１４】
ヒトの全ゲノムは３３００ｃＭの長さである。５から１０ｃＭのマーカー遺伝子座内の未知の疾患遺伝子を見出すために、ヒト全ゲノムをおよそ１０ｃＭ間隔で有益なマーカー遺伝子座およそ３３０を検査することができる(Botsteinら、Am.J.Hum.Genet.32:314-331(1980))。連鎖結果の信頼性は多くの統計学的方法を用いることにより確立される。ヒトにおける連鎖解析に最も一般的に用いられる方法は、Ott、Am.J.Hum.Genet.28:528-529(1976)によりコンピュータープログラムＬＩＰＥＤに組み込まれたＬＯＤスコア法(Morton,Prog.Clin.Biol.Res.147:245-265(1984);Mortonら、Am.J.Hum.Genet.38:868-883(1986))である。ＬＯＤスコアは２つの遺伝子座が所定の距離で連鎖する可能性の、連鎖しない可能性に対する比率の対数である（＞５０ｃＭ離れている）。対数値を用いる利点は同一の疾患を有する家族間で和を取ることができる点である。これは比較的小型のヒト家族で行うことが必要となる。
【００１５】
慣例により、＋３．０以上の全ＬＯＤスコア（すなわち規定の組換え頻度での連鎖の可能性は連鎖していない可能性よりも１０００倍大きくなる）はその特定の組換え頻度での連鎖の有意な証拠であると考えられる。−２．０未満の全ＬＯＤスコア（すなわち連鎖していない可能性は規定の頻度での連鎖の可能性よりも１００倍大きくなる）は検討中の２つの遺伝子座が特定の組換え頻度で連鎖されていないという強力な証拠であると考えられる。最近までは、たいていの連鎖解析が２点データを基にして実施されており、これは検討中の障害と特定の遺伝子マーカー間の関係である。しかしながら、ここ数年のヒトゲノムのマッピングにおける急速な進歩およびコンピューター方法学における付随的な改良の結果として、多点データを用いる連鎖解析を実行することが可能になっている。マーカー間の組換え距離が解っている場合、多点解析により疾患といくつかの連結された遺伝子マーカーの間の連鎖の同時解析が提供される。
【００１６】
多点解析は２つの理由から有利である。第１に通常家系の有益性が増す。各々の家系は、マーカー遺伝子座に関してヘテロ接合性である親の数および家族内の罹患した個体数に依存して、特定量の潜在性の情報を有している。しかしながら、全てのそれらの個体において有益であるほど十分に多型性であるマーカーは少ししかない。複数のマーカーが同時に検討される場合、次いで少なくとも１つのマーカーに関してヘテロ接合性である個体の可能性は大きく増加する。第２に、マーカー間で疾患遺伝子の位置の提示を決定することができる。これによりフランキングマーカーの同定が可能になり、従って疾患遺伝子が属する小型の領域の単離が実際に可能になる。Lathropら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3443-3446(1984)は、多点解析に関して最も広く用いられているコンピューターパッケージ、ＬＩＮＫＡＧＥについて記載している。
【００１７】
当分野では高骨量表現型に関連する遺伝子を同定する必要性がある。高骨量遺伝子および表現型の研究のための手段に関する必要性もある。より一般的には、診断手段および処置の開発のための必要性がある。本発明はこれら、およびその他の重要な目的を志向する。
【発明の開示】
【００１８】
本発明は遺伝子連鎖および変異分析による染色体１１ｑ１３．３上のＬＲＰ５遺伝子およびＬＲＰ５遺伝子のＨＢＭ遺伝子座の同定について記載する。ＬＲＰ５遺伝子およびそれがコードするＬＲＰ５タンパク質を発明者および共同研究者は以前にＺｍａｘ１遺伝子およびＺｍａｘ１（またＺｍａｘとも）と称した。遺伝子およびその産物はその他の研究者により別の命名法によりＬＲ３とも称されている。Ｚｍａｘ、Ｚｍａｘ１、ＬＲＰ５およびＬＲ３は同義語である。遺伝子に連結した遺伝子マーカーの使用はその発見の助けとなった。連鎖解析および変異分析を用いることにより、ＨＢＭの素因を有するヒトを容易に同定することができる。バクテリア人工染色体を用いるクローニング法により発明者が１１ｑ１３．３の染色体領域に着目して、常染色体優性遺伝子のシークエンシングを促進することが可能になった。加えて、本発明はＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定し、ＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭ表現型を生成するＬＲＰ５遺伝子の位置５８２でのグアニンからチミンへの多型性を同定する。
【００１９】
本発明によると、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定し、これを用いてヒトがＨＢＭに対する素因を有しているかどうかを決定することができ、従って骨密度低下を特徴とする疾患、例えば骨粗鬆症などになりにくいか、または異常な高骨密度を特徴とする疾患、例えば大理石骨病に対する素因を有し、なりやすいかどうかを決定することができる。ＨＢＭ遺伝子を有する高齢の個体はＨＢＭタンパク質を発現し、従って骨粗鬆症を進展させない。換言すれば、ＨＢＭ遺伝子は骨粗鬆症のサプレッサーである。このインビボ観察は、正常な個体のＨＢＭ遺伝子もしくはタンパク質、またはそのフラグメントでの処置が骨粗鬆症を改善するという強力な証拠である。
【００２０】
本発明は、動物モデルにおける骨密度変調の研究に有用であるＬＲＰ５およびＨＢＭのための発現ベクターを提供する。発現ベクターは動物組織、とりわけ骨組織において広範にＬＲＰ５およびＨＢＭの発現を誘導するプロモーターを含む。発現ベクターはまたトランスジェニックおよびその他の遺伝的に修飾された動物の産生のための直線状核酸配列を提供するのにも役立つ。
【００２１】
１つの実施形態によると、ＬＲＰ５を発現しないノックアウトマウスや相同なマウスＨＢＭタンパク質を発現するノックインマウスを産生するために、マウスおよびその他の動物においてジーンターゲティングするためのベクターが提供される。予め融合した接合体においてノックアウトカセットをインビトロで欠失させることができる条件的ノックアウト／ノックインベクターが提供される。本発明はジーンターゲティングベクターの組換えＤＮＡを含む動物胚幹性細胞を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、ＬＲＰ５およびＨＢＭを発現する動物細胞が、骨密度のモデュレーターの調査に使用するために提供される。
【００２３】
さらに別の実施形態によると、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を発現するトランスジェニック動物または一般的なプロモーターおよび骨特異的プロモーターの調節下のその他の関連する変異体が提供される。内因性ＬＲＰ５遺伝子または異種性ＬＲＰ５もしくはＨＢＭ遺伝子が、誘導可能なまたは条件的なプロモーター、例えばＧＥＮＥＳＷＩＴＣＨ（登録商標）系の調節下であるトランスジェニック動物もまた提供される。本発明は、ＨＢＭ表現型およびその分子メカニズムの研究、診断およびスクリーニング手段の開発、ならびに処置および治療用化合物の試験および開発のためのこれらの動物の使用方法を提供する。
【００２４】
さらに、このような処置は骨損傷、とりわけ骨折の処置において、このような損傷の治癒における骨リモデリングのために指示される。本発明の手段により例えばストレス骨折由来の人が病気にかかりやすいまたは苦痛（すなわち圧により誘導される微小骨折、実際に骨皮質を通る真性骨折に至る）を同定および／または処置できる。さらに、本発明の方法および組成物は、治療の過程が骨リモデリングに関与する２次骨粗鬆症、例えば副腎皮質ステロイド投与を伴う内分泌条件、甲状腺機能亢進症、性腺機能低下症、血液学的悪性腫瘍、吸収不良およびアルコール依存症、およびビタミンＤおよび／またはリン酸塩代謝物に伴う障害、例えば骨軟化症およびくる病、および骨リモデリング異常または障害を特徴とする疾患、例えばパジェット病の処置ならびに良性または悪性であり得る骨の新生物に有用である。
【００２５】
種々の実施形態では、本発明はＨＢＭおよびＬＲＰ５を発現する核酸、タンパク質、ベクター、形質転換された宿主、およびヒトＨＢＭおよびＬＲＰ５遺伝子および関連する変異体を担持するトランスジェニック動物、ＨＢＭ相同体に関するノックイン動物またはこれらの遺伝子に関するノックアウト動物を志向する。
【００２６】
加えて、本発明は例えば骨発達障害のための遺伝子治療、医薬品開発、および診断アッセイを含む本発明の前記の実施形態の適用を志向する。好ましい実施形態では、本発明は骨粗鬆症の処置、診断、予防およびスクリーニングのための方法を志向する。
【００２７】
本発明の別の態様によると、配列番号２の位置５８２でチミンを少なくとも含み、配列番号２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結され(operably linked)、動物細胞および／またはヒト細胞においてタンパク質の発現を導く(direct)プロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物が提供される。
【００２８】
意図される別の実施形態は、配列番号４をコードし、配列番号４の位置１７１のバリンに相当するバリンのコドンを少なくとも含む配列を含む核酸であって、動物細胞および／またはヒト細胞においてタンパク質の発現を導く、機能的に連結したプロモーター領域をさらに含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物；配列番号１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結された、動物細胞および／またはヒト細胞においてタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有する骨密度変調(bone density modulation)の研究のためのトランスジェニック動物を含む。このような動物の子孫もまた意図される。動物は好ましくはマウスであるが、いずれかの非ヒト動物（例えば霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、ヒツジ、ウシ等）を含み得る。
【００２９】
このような動物は、骨密度または骨量(bone mass)の変調の研究および骨密度または骨量の変調に影響する方法および処置の開発に有用である。骨密度および／または骨量の変調を、１つまたはそれ以上のパラメーター、例えば骨塩量(bone mineral density)、骨強度、骨梁数(trabecular number)、骨の大きさ、および骨組織結合性(bone tissue connectivity)の変化により評価することができる。
【００３０】
本発明の別の目的は、配列番号２の位置５８２でチミンを少なくとも含み、配列番号２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結され、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む動物の胚を提供することである。
【００３１】
相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ５遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ５遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ５遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含む核酸を提供することも本発明のさらなる目的である。
【００３２】
本発明の別の目的は、そのゲノムがＬＲＰ５をコードする遺伝子に変化(alteration of the gene)を有するトランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニックマウスを産生する方法を提供することである。この方法は、
（ａ）ＬＲＰ５またはＨＢＭをコードする核酸を供するステップと；
（ｂ）該核酸をマウス胚幹性細胞に導入するステップと；
（ｃ）該核酸を含む胚性幹細胞を選択するステップと；
（ｄ）ステップ（ｃ）の胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入するステップと；
（ｅ）ステップ（ｄ）の胚盤胞を偽妊娠マウスに移すステップと；
（ｆ）移した胚盤胞を、該核酸に関してキメラであるマウスに発達させるステップと；
を含むことができる。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、記載されたように得られた動物は、次いで、例えば、キメラマウスと野生型マウスと交配させ、前記変化に関してヘテロ接合性であるマウスを得るステップと；該ヘテロ接合性マウスを交配させ、前記変化に関してホモ接合性であるマウスを産生するステップと；により、さらに交配させることができる。
【００３４】
本発明の別の態様によると、ＨＢＭ発現を変調する作用物質を同定するための方法であって、（ａ）請求項１３に記載の細胞を供するステップと；（ｂ）該細胞を被験化合物に暴露するステップと；（ｃ）ＨＢＭの発現を測定するステップと；を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明の別の目的は、前記トランスジェニック動物の第１の群を供するステップと；（ｂ）被験化合物を投与するステップと；（ｃ）被験化合物を投与された動物における少なくとも１つの発達のパラメーターを測定するステップとにより骨量モデュレーターを研究することである。特に限定されるものではないが、被験化合物は、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ミネラル、ビタミン、天然生成物、または合成有機化合などを含む。
【００３６】
別の態様では、骨量変調および骨発達を、前記トランスジェニック動物の１つの群を利用し、動物に実験手順を施し、発達のパラメーターを測定する方法により研究することができる。実験手順には、例えば、卵巣切除、骨負荷の制限(restricted bone loading)および骨負荷の増強(increased bone loading)などがある。
【００３７】
本発明の別の態様によると、単離された核酸配列（配列番号６８９〜６９７）：
(1)
5’-GTCAGCCTGGAGGAGTTCTCA-3’;
5’-TCACCCTTGGCAATACAGATGT-3’;および
6-FAM-5’-CCCACCCATGTGCCCGTGACA-3’;または
(2)
5’-CGTGATTGCCGACGATCTC-3’;
5’-TTCCGGCCGCTAGTCTTGT-3’;および
6-FAM-5’-CGCACCCGTTCGGTCTGACGCAGTAC-3’
を含む、ヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡまたはＨＢＭ  ｍＲＮＡを定量するための試薬セットが提供される。
【００３８】
別の試薬セットは、
5’-CTTTCCCCACGAGTATGTTGGT-3’;および
5’-AAGGGACCGTGCTGTGAGC-3’;および
6-FAM-5’-AGCCCCTCATGTGCCTCTCAACTTCATAG-3’
を含む。
【００３９】
本発明の別の態様によると、１つまたはそれ以上の以下のアミノ酸の置換：Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ｅ１２８Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｇ１９９Ｖ、Ｍ２８２、Ｇ４７９Ｖ、Ｇ７８１Ｖ、Ｑ１０８７Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑを有する配列番号３の変異体が提供される。
【００４０】
本発明の別の目的はＬＲＰ６の対応する変異体を提供することである。ＬＲＰ６の好ましい変異体はＧ１５８Ｖを含む。
【００４１】
さらに本発明の実施の形態によると、ＨＢＭが他の骨障害に及ぼす影響を研究する方法であって、（ａ）骨障害の表現型を有する動物の胚を供するステップと；（ｂ）ＬＲＰ５、ＨＢＭ、その変異体をコードする核酸を該胚の第１の群に導入するステップと；（ｃ）胚を偽妊娠マウスに移すステップと；（ｄ）得られたマウスの少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと；の工程を含む方法が提供される。核酸は、いずれの動物に由来してもよく、ヒトＬＲＰ５またはヒトＨＢＭに限定されない。
【００４２】
本発明のさらなる態様によると、ＬＲＰ５またはＨＢＭに関連する心臓障害を研究する方法であって、（ａ）前記したトランスジェニック動物の第１群を供するステップと；（ｂ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物の少なくとも１つの心臓健康パラメーターを測定するステップと；を含む方法が提供される。別の方法では、推定される心臓病薬から有効なものをスクリーニングするのにこれらの動物を用いることができる。
【００４３】
本発明のさらに別の実施形態によると、心臓保護処置の骨量変調効果を評価する方法であって、請求項９に記載の動物の第１群を提供するステップと；心臓保護処置(cardio-protective treatment)を該動物の第１群のサブグループに施すステップと；少なくとも処置されたマウスにおいて少なくとも１つの骨変調パラメーターを測定するステップとを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明の別の態様によると、骨量のモデュレーターの研究方法であって、（ａ）配列番号１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結された、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有する動物の第１群を供するステップと；（ｂ）被験化合物を投与するステップと；（ｃ）被験化合物を投与された動物における少なくとも１つの骨発達パラメーターを測定するステップとを含む方法が提供される。
【００４５】
別の態様によると、骨量に及ぼす実験手順の影響を研究する方法であって、（ａ）配列番号１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結された、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有する動物の第１群を供するステップと；（ｂ）実験手順を施すステップと；（ｃ）少なくとも１つの骨量のパラメーターを測定し、実験手順を施された動物における骨量を評価するステップとを含む方法が提供される。
【００４６】
本発明のこれらのおよびその他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本明細書および請求の範囲の理解を助けるために、以下の定義を提供する。
【００４８】
「遺伝子」は、その鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを介して特定のペプチドに特徴的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「遺伝子」なる用語は介在性、非コード化領域および制御領域を含み、５’および３’末端を含むことができる。
【００４９】
「核酸」は、一本鎖および二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）、ｒＲＮＡ、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチド、およびオリゴマー、ならびにポリヌクレオチドを含むことを意味する。ハイブリッド、例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡの三本鎖領域または二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含んでもよい。修飾塩基、例えばビオチン化、トリチル化、フルオロフォア、イノシン等を含んでもよい。
【００５０】
「遺伝子配列」は、遺伝子を含む、非転写または非翻訳配列を含有するＤＮＡを含む核酸分子を意味する。該用語はまた同一ＤＮＡ分子上に存在する（複数の）遺伝子、（複数の）遺伝子フラグメント、（複数の）非転写配列または（複数の）非翻訳配列のいずれかの組み合わせを含むことをも意図する。
【００５１】
本発明の核酸配列をＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたはその組み合わせを含む種々の供給源から誘導することができる。このような配列は天然発生イントロンを含んでも含まなくてもよいゲノムＤＮＡを含むことができる。さらにこのようなゲノムＤＮＡをプロモーター領域および／またはポリ（Ａ）配列に随伴されて得ることができる。配列、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをいずれかのいくつかの方法で得ることができる。当分野で周知の手段によりゲノムＤＮＡを適当な細胞から抽出し、精製することができる。また別に、ｍＲＮＡを細胞から単離し、これを用いて逆転写またはその他の手段によりｃＤＮＡを生成することができる。
【００５２】
「ｃＤＮＡ」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によりＲＮＡ鋳型から生成された相補性またはコピーＤＮＡを意味する。従って、「ｃＤＮＡクローン」は１つの鎖が、クローニングベクターまたはＰＣＲ増幅で運び込まれた目的のＲＮＡ分子に相補的である二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。ｃＤＮＡはまた逆転写酵素による一本鎖合成の後の一本鎖でもよい。この形態では、これはＰＣＲ鋳型に有用であり、クローニングベクターに運び込まれる必要はない。この用語は介在配列が除去されている遺伝子を含む。従って「遺伝子」なる用語はしばしば一般的に用いられるように、ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡクローンを含む核酸分子をも含む。
【００５３】
「組換えＤＮＡ」は、インビトロでｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列をスプライシングするか、または方法例えばＰＣＲ変異誘発により配列を変化させることにより操作されている分子を意味する。
【００５４】
「クローニング」は特定の遺伝子またはその他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿入するためのインビトロ組換え技術の使用を意味する。望ましい遺伝子のクローニングに成功するために、ＤＮＡフラグメントを作製するための方法、フラグメントをベクター分子に結合させるための方法、それが複製できる宿主に複合性のＤＮＡ分子を導入するための方法、および受容者宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択するための方法を用いることが必要である。
【００５５】
「ｃＤＮＡライブラリー」は、特定の組織または細胞供給源で発現される遺伝子の全体的または部分的レパートリーを含むｃＤＮＡインサートを含有する組換えＤＮＡ分子を意味する。当業者に既知の、ならびに、例えばCowellおよびAustin、「cDNAライブラリープロトコル」Methods in Molecular Biology(1997)に記載される方法によりこのようなｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。
【００５６】
「クローニングベヒクル」は、宿主細胞内で複製できるプラスミドまたはファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ配列を意味する。この用語は人工染色体、例えばＢＡＣおよびＹＡＣを含むこともできる。クローニングベヒクルは、このようなＤＮＡ配列がＤＮＡの本質的な生物学的機能を喪失せずに確定できる様式で切断され得る１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、これは形質転換細胞の同定において使用するのに適したマーカーを含有できる。
【００５７】
「発現」は、遺伝子の最終産物を生成するための、遺伝子配列の転写およびそれに続くプロセシングステップ、例えば得られたｍＲＮＡの翻訳を含む過程を意味する。最終産物はタンパク質（例えば酵素またはレセプター）または核酸（例えばｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはその他の制御配列）でよい。「発現調節配列(expression control sequence)」なる用語は、構造遺伝子に機能的に連結された場合、その遺伝子の発現を調節または制御するヌクレオチド配列を意味する。これには例えばｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、λファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域および原核または真核細胞で遺伝子の発現を調節することが解っているその他の配列などがある。発現調節配列は、ベクターが原核または真核細胞宿主において機能的に連結された遺伝子を発現するように設計されているかどうかに依存して変化し、転写エレメント、例えばエンハンサーエレメント、終止配列、組織特異性エレメントならびに／または翻訳開始および終止部位を含有することができる。
【００５８】
「発現ベヒクル」は、クローニングベヒクルに類似するベヒクルまたはベクターを意味するが、これは宿主への形質転換の後、クローン化されている遺伝子を発現することができる。クローン化遺伝子は通常発現調節配列の調節下にある（すなわちそれに機能的に連結されている）。
【００５９】
「オペレーター」は、特異的レプレッサーと相互作用できるＤＮＡ配列を意味し、それにより（複数の）隣接する遺伝子の転写を調節する。
【００６０】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得るＤＮＡ配列を意味する。このような配列の存在によりＲＮＡポリメラーゼを結合させ、機能的に連結された遺伝子配列の転写を開始することができる。
【００６１】
「プロモーター領域」は、転写の開始に必要であるプロモーターおよびその他の遺伝子配列を含むことを意図する。プロモーター領域の存在は機能的に連結された遺伝子配列の発現を引き起こすのに十分である。「プロモーター」なる用語はしばしば当分野で一般的にプロモーター領域を示すために用いられる。特定の細胞型で遺伝子の発現を導く多くの異なるプロモーターが当分野で公知である。組織特異的プロモーターは特定の組織型の細胞でより高レベル（または低レベル）の発現を引き起こす核酸配列を含むことができる。
【００６２】
「機能的に連結された」は、プロモーターが遺伝子の発現の開始を調節することを意味する。宿主細胞への導入時にプロモーターが（複数の）近接したＤＮＡ配列の１つまたはそれ以上の種のＲＮＡへの転写を決定する場合、プロモーターは近接したＤＮＡの配列に機能的に連結されている。プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を開始できる場合、プロモーターはＤＮＡ配列に機能的に連結されている。
【００６３】
「原核生物」は、細菌などの真核を有さない全ての生物を意味する。
【００６４】
「真核生物」は、哺乳動物細胞などの真核を有する生物および細胞を意味する。
【００６５】
「宿主」には原核生物および真核生物、例えば酵母および糸状菌類、ならびに植物および動物細胞などがある。該用語は複製可能な発現ベヒクルの受容者である生物または細胞を含む。
【００６６】
本明細書で用いられる「動物」なる用語は、ヒト以外の全ての脊椎動物を含む。これはまた胚および胎仔段階を含む全ての発達段階の個々の動物を含む。
【００６７】
「トランスジェニック動物」は、直接的または間接的に、慎重な遺伝子操作によるかまたは細胞下レベルで操作された先祖からの遺伝により、例えば組換えウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス）でのマイクロインジェクションまたは感染により受け取った遺伝情報を担持する１つまたはそれ以上の細胞を含有する動物である。この導入されたＤＮＡ分子を染色体に組み込むことができるか、またはこれは染色体外複製ＤＮＡでよい。
【００６８】
本明細書で用いる「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、未分化細胞であることを意味する、多能性の通常胚由来の細胞または細胞株である。これらの細胞はまた、宿主胚に組み込まれた場合、相同組換えおよびそれに続く体内のいずれかの組織への発達により外来性ＤＮＡを組み込むことが可能である。当分野でよく理解されている方法により胚組織以外の供給源から多能性細胞を単離することが可能である。
【００６９】
マウスの胚性幹細胞により、トランスジェニック細胞を選択し、ジーンターゲティングを実施するための研究が可能になった。別のトランスジェニック動物トランスジェニック技術で可能であるよりもさらに多くの遺伝子操作がこれにより可能になる。例えば、マウスＥＳ細胞をインビトロでコロニーとして成長させるのが比較的容易である。標準的な手順により細胞をトランスフェクトでき、抗生物質抵抗性によりトランスジェニック細胞をクローンで選択することができる。例えばDoetschmanら、胚性幹細胞での遺伝子移入(gene transfer in embryonic stem cells)、Pinkert編、Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook(1994)、Academic Press Inc.、ニューヨーク115-146頁参照。さらに、この方法の効率は、十分なトランスジェニックコロニー（数百から数千）を生成して相同組換えのための第２の選択を可能にできるようなものである。次いでマウスＥＳ細胞を、生殖細胞を含む正常な宿主胚と組み合わせて、その強度を保持するために、得られたキメラ動物において全て組織まで発達させることができる。次いでトランスジェニック修飾を次世代まで伝えることができる。
【００７０】
初期移植前マウス胚から胚性幹（ＥＳ）細胞株をインビトロで誘導するための方法は周知である。例えばEvansら、Nature 29:154-156(1981)およびMartin、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 78:7634-7638(1981)参照。繊維芽細胞の支持細胞層または分化阻止供給源が存在すれば、未分化状態でＥＳ細胞を継代することができる。
【００７１】
「体細胞」なる用語は、精子もしくは卵細胞ではないか、または精子もしくは卵細胞になることができるいずれかの動物またはヒト細胞を示す。「生殖細胞」または「生殖系細胞」なる用語は、精子もしくは卵細胞のいずれかであるか、または精子もしくは卵細胞に発達することができ、従って子孫にその遺伝情報を渡すことができるいずれかの細胞を意味する。「生殖細胞株トランスジェニック動物」なる用語は、遺伝情報が生殖細胞株に組み込まれ、それにより遺伝情報を子孫に移す能力を付与するトランスジェニック動物を意味する。このような子孫が実際にいくつかまたは全てのその情報を有している場合、次いでそれもまたトランスジェニック動物である。
【００７２】
遺伝情報の遺伝子変化は、受容者が属する動物の種に対して外来性であるか、または特定の個々の受容者に対してのみ外来性であり得る。後者の場合、変化したまたは導入された遺伝子は、内在性の遺伝子とは異なって発現されるかもしれない。
【００７３】
遺伝子の「フラグメント」は、遺伝子配列のいずれかの部分を意味する。生物学的に活性なフラグメントとは、遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を保持する遺伝子のいずれかの部分を意味する。
【００７４】
「生物学的に活性」とは、保存的に置換された変異体、タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子、またはタンパク質のポリペプチドフラグメントを含むタンパク質およびポリペプチドの形態であって、野生型タンパク質またはポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を保持するものを意味する。好ましくは、活性は、骨量の発達または表現型における変化を誘起する活性である。生物学的に活性とはまたＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）、ＬＰＲ６、およびＨＢＭ、例えばＷｎｔ経路に関連するシグナル発生経路を直接的または間接的であろうとなかろうと、およびインビボまたはインビトロアッセイであろうとなかろうと、変調する能力を意味する。
【００７５】
「有効量」または「投与有効量」または「治療上有効量」は、本発明のポリペプチドの生物学的活性を変調する作用物質の量を意味する。
【００７６】
「変異体」は、構造および生物学的活性または免疫学的特性が遺伝子全体または遺伝子のフラグメントのいずれかに実質的に類似している遺伝子を意味する。２つの遺伝子が類似の活性を有している場合、たとえコードされるアミノ酸残基の配列が同一でなくても、これらは本明細書でその用語が用いられるような変異体と考えられる。
【００７７】
「核酸の増幅」は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−βレプリカーゼの使用に基づく増幅方法のような方法を意味する。これらの方法は当分野で周知であり、例えば米国特許第4,683,195号および第4,683,202号に記載されている。ＰＣＲを実施するための試薬およびハードウェアは市販により入手可能である。ＨＢＭから配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくはＨＢＭ領域またはそこの標的領域の側面に位置する領域の配列に相補的であり、それに特異的にハイブリダイズする。増幅により作製されたＨＢＭ配列を直接シークエンシングすることができる。また別に、増幅された（複数の）配列を配列分析の前にクローン化することができる。
【００７８】
「抗体」は、非限定例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、ヒト化、二重特異性、多重特異性、primatized（商標）抗体を含むことを意味する。「抗体」なる用語は、好ましくはＨＢＭタンパク質およびそのフラグメントに、またはＨＢＭ領域、とりわけＨＢＭ遺伝子座またはその部分に由来する核酸配列に結合できるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメント、ならびにその免疫学的結合等価物を意味する。抗体なる用語は共に同種の分子体、または混合物、例えば複数の異なる分子体から構成される血清生成物を意味するために用いられる。タンパク質をタンパク質合成器で合成により調製し、キャリヤ分子に結合させ、数ヶ月にわたってウサギに注射することができる。ＨＢＭタンパク質またはフラグメントに対する免疫反応性に関してウサギ血清を試験する。マウスにタンパク質またはそのフラグメントを注射することによりモノクローナル抗体を作ることができる。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ＥＢＭタンパク質またはそのフラグメントで特異的免疫反応性に関して試験する。Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1988)。これらの抗体はアッセイおよび医薬品において有用である。
【００７９】
ＬＲＰ５遺伝子およびそれがコードするＬＲＰ５タンパク質は以前から発明者によりＺｍａｘ１遺伝子およびＺｍａｘ１と称されている。遺伝子およびその生成物はまた当分野ではＬＲ３とも称されている。Ｚｍａｘ、Ｚｍａｘ１、ＬＲＰ５およびＬＲ３は同義語である。「ＨＢＭタンパク質」とは、それがグリシン１７１のバリンへの変化を有する以外はＬＲＰ５と同一であるタンパク質を意味している。ＨＢＭタンパク質はＬＲＰ５真性相同体をコードするいずれかの生物に関して定義されている。例えば、マウスＨＢＭタンパク質とはグリシン１７１のバリンへの置換体を有しているマウスＬＲＰ５を意味する。
【００８０】
本発明の１つの実施形態では、「ＨＢＭ遺伝子」とはＨＢＭ特性または表現型を示す個体において見出されるゲノムＤＮＡ配列を意味し、その配列は配列番号４で示されるタンパク質をコードする。ＨＢＭ遺伝子およびＬＲＰ５遺伝子は対立遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子によりコードされるタンパク質は骨量上昇を引き起こす特性を有しているが、一方ＬＲＰ５遺伝子によりコードされるタンパク質は有していない。ＨＢＭ遺伝子およびＬＲＰ５遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子は位置５８２でチミンを有しているが、一方ＬＲＰ５遺伝子は位置５８２でグアニンを有しているという点で異なっている。ＨＢＭ遺伝子は配列番号２に示す核酸配列を含む。ＨＢＭ遺伝子を「ＨＢＭ多型性」とも称することができる。
【００８１】
本発明のまた別の実施形態では、「ＨＢＭ遺伝子」はまた、ＨＢＭ表現型に至るＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）またはＬＲＰ６のいずれかの対立遺伝子変異体をも意味することができる。このような変異体は、本明細書で記載する野生型タンパク質コード化配列からの変化、および／またはＬＲＰ５の発現調節配列における変化を含んでよい。このような変異体の好ましい実例はＬＲＰ５タンパク質の発現増加に至る内因性ＬＲＰ５プロモーター領域の変化である。
【００８２】
「正常」、「野生型」、「影響されない」および「ＬＲＰ５」の全ては、配列番号３に示すタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列を意味する。ＬＲＰ５遺伝子は位置５８２でグアニンを有する。ＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）遺伝子は配列番号１に示す核酸配列を含む。「正常」、「野生型」、「影響されない」および「ＬＲＰ５」はまた骨量増加に寄与しないタンパク質をコードするゲノム配列の対立遺伝子変異体をも意味する。ＬＲＰ５遺伝子はヒト集団において一般的であり、一方ＨＢＭ遺伝子は希少である。
【００８３】
「５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ」は、５個のＹＷＴＤ反復とそれに続くＥＧＦ反復からなる、ＬＲＰ５タンパク質で見出される反復単位を意味する。
【００８４】
「骨発達」は、一般に、例えば正常な発達、疾病状態の経過中に生じる変化、および加齢と共に生じる変化などの長期にわたる骨の変化に関わるいずれかの過程を意味する。これは構造変化および動的速度変化、例えば成長速度、吸収速度、骨修復速度等を意味し得る。「骨発達障害」は、とりわけ、例えば疾病状態の経過中に生じる変化、および加齢と共に生じる変化などの骨発達におけるいずれかの障害を意味する。骨発達は本質的に進行性かまたは周期性でよい。骨発達中に変化し得る骨の態様には、例えばミネラル化、特定の解剖学的特長の形成、および種々細胞型の相対数または絶対数などがある。
【００８５】
「骨変調」または「骨形成の変調」は、当業者に理解されるように、例えばとりわけ破骨および造骨活性による骨再吸収および骨付加成長などの骨リモデリングに関与するいずれかの生理学的過程に影響する能力を意味し、本明細書で用いるいくつかまたは全ての骨形成および発達を含み得る。
【００８６】
骨は、破骨細胞により古いまたは不必要な骨を除去し、骨芽細胞により新たな骨を再構築することにより継続的にそれ自体を改造および更新している動的組織である。これらの過程間の共役の本質は、骨成長中のモデリングならびにリモデリングおよび修復による成人の骨格完全性の維持の双方に寄与して機械的使用の毎日の必要性に合致する。骨再吸収および形成の間の均衡の非共役による引き起こされる多くの骨疾患がある。加齢と共に骨ターンオーバーにおける漸進的な「生理学的」不均衡があり、これはとりわけ閉経によるエストロゲン補助の喪失のために女性において悪化し、進行性の骨喪失に至る。骨量の低下および骨構築の劣化は骨脆弱性および特発性骨折の増加に至る。喪失された骨の１０％ごとに骨折の危険性は倍化する。脊椎または近接する大腿骨において、正常な骨量ピーク以下の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）２．５またはそれ以上の標準偏差を有する個体を骨粗鬆症と分類する。しかしながら、正常以下の、１と２．５の間の標準偏差のＢＭＤを有するオステオペニア個体は明らかに骨喪失関連障害を患う危険性がある。
【００８７】
パラメーターの測定、例えばｐＤＸＡ−Ｘ線法による骨ミネラル密度（ＢＭＤ）および骨ミネラル含量（ＢＭＣ）、Ｘ線による骨の大きさ、厚さまたは体積、例えばカルシエン標識により測定される骨形成速度ｐＱＣＴおよび／またはＣＴ法により測定される全体、骨梁および中央シャフト密度、μＣＴ法により測定される結合性およびその他の組織学的パラメーター、好ましくは各々大腿骨および脊椎で測定される機械的屈曲および圧縮力により骨変調を評価することができる。当業者に理解されるように、これらの測定値の性質により、各々は所定の状況に関して多かれ少なかれ適当であり得る。さらに、骨折の有無の臨床履歴、骨形状、骨形態学、結合性、正常な履歴、骨折修復速度、およびその他の骨品質のパラメーターなどのパラメーターおよび方法論が当分野で公知であり、使用されている。最も好ましくは、このような測定が適当である場合、骨品質を脊椎の圧縮力により評価できる。骨変調を種々パラメーターの変化速度により評価することもできる。最も好ましくは、骨変調を１つ以上の年齢で評価する。
【００８８】
「正常な骨密度」は、ＨＢＭ連関研究の文脈では、２つの標準偏差内でＺスコア０の骨密度を意味する。一般的な文脈では、正常な骨密度パラメーターの範囲は通常の統計学的方法により決定される。正常なパラメーターは年齢および性別で正規化されたパラメーターの標準偏差約１または２内にあり、好ましくは標準偏差約２である。有意な統計的測定は関連する測定値が平均と有意に異なる可能性を提示できるＰ値である。有意なＰ値はＰ＜０．０５、０．０１、０．００５および０．００１であり、好ましくは少なくともＰ＜０．０１である。
【００８９】
「ＨＢＭ」は、この用語が骨密度、ミネラル含量および大きさに関しても表現し得るが、高骨量を意味する。
【００９０】
「ＨＢＭ表現型」は、骨変調の１、２、３、４、５またはそれ以上の定量パラメーター、好ましくは骨密度およびミネラル含量および骨力パラメーターにおいて、そのパラメーターの年齢および性別の標準を超えて標準偏差約２またはそれ以上、好ましくは２、２．５、３またはそれ以上の増加を特徴とし得る。ＨＢＭ表現型は、少なくとも１つのパラメーター、好ましくは少なくとも２つのパラメーター、および最も好ましくは少なくとも３つまたはそれ以上のパラメーターにおける統計学的に有意な増加を特徴とする。ＨＢＭ表現型はまた、１つまたはそれ以上の骨品質パラメーターにおける増加をも特徴とし、最も好ましくは増加しているパラメーターがいずれかの骨品質パラメーターの低下により随伴される。最も好ましくは、骨変調パラメーターおよび／または骨品質測定値における増加が１つ以上の年齢で観察される。
【００９１】
「ＬＲＰ５系」は、精製されたタンパク質、細胞抽出物、細胞、動物、ヒトまたは、ＬＲＰ５が正常または変異形態で提示されている物のいずれかその他の組成物を意味する。
【００９２】
「単離された」なる用語は、ヒトの手により天然の環境から変化されている物質を意味する。単離されたペプチドは例えば実質的に純粋な形態であるか、またはそうでなければ例えば単離された細胞株またはトランスジェニック動物における発現により元来の環境から移動されている。単離された配列は、当該単離された配列の少なくとも１つの末端が天然の状態において隣接する配列と隣接しないように、例えば実質的に純粋な形態の分子である、または、その元来の環境から移動されている。
【００９３】
「代理マーカー」は、ＨＢＭ遺伝子または骨量増加とまたはその双方と関連しているが、骨密度よりも測定が容易である細胞、組織、ヒトまたは動物において観察できる診断用指標、症状、徴候またはその他の特徴を意味する。一般的な代理マーカーの概念は診断医学において十分承認されている。
【００９４】
本発明は各々配列番号１および３により同定された形態のＬＲＰ５遺伝子およびＬＲＰ５タンパク質、およびその他の密接に関連する変異体、ならびにその正確な発現に必要なＬＲＰ５の隣接する染色体領域を包含する。好ましい実施形態では、本発明は配列番号１の核酸配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを志向する。
【００９５】
Ｉ．序論
本発明はまた各々配列番号２および４により示される形態のＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭタンパク質、およびその他の密接に関連する変異体ならびにその正確な発現に必要なＨＢＭ遺伝子の隣接する染色体領域をも包含する。好ましい実施形態では、本発明は配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを志向する。より好ましくは、本発明は配列番号２の核酸配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドであって、その１５個の連続するヌクレオチドの１つはヌクレオチド５８２のチミンであるヌクレオチドを志向する。
【００９６】
本発明はまたＬＲＰ５遺伝子領域のヌクレオチド配列およびＨＢＭ遺伝子領域のヌクレオチド配列にも関連する。さらにとりわけ、好ましい実施形態はＬＲＰ５遺伝子領域Ｂ２００Ｅ２１ＨおよびＢ５２７Ｄ２−Ｈのセグメントを含有するＢＡＣクローンである。好ましい実施形態は配列番号５〜１２からなるＢＡＣクローンのヌクレオチド配列である。
【００９７】
本発明はまたＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子のためのＤＮＡプローブ、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子におけるヌクレオチド多型性、およびＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の制御エレメントを同定するためのヌクレオチド配列の使用にも関する。
【００９８】
本発明はさらに染色体１１ｑ１３．３上の遺伝子マーカーＤ１１Ｓ９８７とＳＮＰ  ＣＯＮＴＩＧ０３３−６の間のＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の染色体位置の位置決定、ならびにＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子のＤＮＡ配列について記載する。染色体位置は遺伝子のマッピングに用いられるマッピングパネルにさらなる遺伝子マーカーを付加することにより、およびさらなる個体を含むように家系を拡張することにより染色体位置を絞り込んだ。遺伝子型を同定された新たな個体が領域を狭める重大な組換え事象を宿すので、家系の拡張は非常に重要である。１１ｑ１３．３の領域で遺伝子を同定するために、この染色体領域を含有するＢＡＣクローンのセットを同定した。ゲノムＤＮＡシークエンシングのための鋳型として、および直接ｃＤＮＡ選択によりコード化配列を同定するための試薬としてもＢＡＣクローンを供した。ゲノムシークエンシングおよび直接ｃＤＮＡ選択を用いて１１ｑ１３．３から１５０００００個のＤＮＡの塩基対特徴付けをした。この領域内でＬＲＰ５遺伝子を同定し、次いで罹患および非罹患個体の変異分析の後、ＨＢＭ遺伝子を見出した。
【００９９】
遺伝子が特定の染色体領域に遺伝子的に位置決定されている場合、重複クローンのセットにおけるＤＮＡの領域全体のクローニング（物理的マッピング）、直接ｃＤＮＡ選択の組み合わせによるこれらのクローンによりコードされる遺伝子の特徴付け、エクソントラッピングおよびＤＮＡシークエンシング（遺伝子同定）、ならびにＨＢＭ家系の罹患および非罹患メンバーの比較ＤＮＡシークエンシングによるこれらの遺伝子における変異の同定（変異分析）を含む一連のステップにより分子レベルでこの領域の遺伝子を特徴付けすることができる。
【０１００】
物理的マッピングは、目的の染色体領域における独特の分子標識を増幅するように設計されたＰＣＲアッセイを用いて大腸菌またはサッカロマイセス・セレヴィシエにおいて増殖したベクターにクローン化されたヒトＤＮＡのライブラリーをスクリーニングすることより達成される。ＨＢＭ候補領域の物理的マッピングを作製するために、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ:Bacterial Artificial Chromosome）にクローン化されたヒトＤＮＡのライブラリーを、ヒトゲノムプロジェクトの努力により予め染色体１１ｑ１２−ｑ１３にマッピングされた配列標識部位（ＳＴＳ:Sequence Tagged Site）マーカーのセットでスクリーニングした。
【０１０１】
ＳＴＳはＰＣＲにより検定することができるヒトゲノムにおける独特な分子標識である。ヒトゲノムプロジェクトの努力を合わせることにより、２２個の常染色体および２個の性染色体における数千のＳＴＳの位置が決定された。位置クローニングの努力のために、遺伝子マッピングに用いられたマーカーを物理的マッピングのためのＳＴＳとしても使用できるので、物理的地図が遺伝子地図に結びつけられる。ＢＡＣライブラリーを遺伝子マーカー、遺伝子、およびランダムＤＮＡフラグメントから誘導されるＳＴＳの組み合わせでスクリーニングすることにより、目的の染色体領域における全てのＤＮＡを表す重複クローンからなる物理的地図を組み立てることができる。
【０１０２】
ＢＡＣは大腸菌で増殖させたヒトまたはその他のＤＮＡの大きな（８０キロ塩基から２００キロ塩基）セグメントのためのクローニングベクターである。ＢＡＣを用いて物理地図を構築するために、ＢＡＣクローンのライブラリーをスクリーニングして、所定のＳＴＳまたはＳＴＳのセットに相当するＤＮＡ配列を宿す個々のクローンを同定する。たいていのヒトゲノムの至るところでＳＴＳマーカーがおよそ２０から５０キロ塩基離れて配置されており、個々のＢＡＣクローンは典型的に少なくとも２つのＳＴＳマーカーを含有するようになる。加えて、スクリーニングされたＢＡＣライブラリーはヒトゲノムを６回被覆するのに十分なクローン化ＤＮＡを含有する。従って、個々のＳＴＳは典型的には１個以上のＢＡＣクローンを同定する。およそ５０キロ塩基離れて位置する一連のＳＴＳマーカーで６倍被覆するＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより、一連の重複ＢＡＣクローンからなる物理地図、すなわちＢＡＣコンティグをヒトゲノムのいずれかの領域に関して組み立てることができる。物理地図を調製するために用いられた多くのＳＴＳマーカーもまた遺伝子マーカーであるので、この地図は遺伝子地図に密接に結びつけられている。
【０１０３】
物理地図を構築する場合、ゲノムのＳＴＳ地図に、所定の位置で重複するＢＡＣクローンを同定することが不可能になるギャップが存在することがしばしば生じる。典型的には、公に利用可能な文献およびワールド・ワイド・ウェブ・リソースにより同定されたＳＴＳのセットから物理地図を最初に構築する。最初の地図は未知の分子距離のギャップにより分けられたいくつかの別個のＢＡＣコンティグから成る。これらのギャップを埋めるＢＡＣクローンを同定するために、ギャップのいずれかの側のクローンの末端から新規のＳＴＳマーカーを開発する必要がある。これはギャップをフランキングする２００から３００の末端塩基対をシークエンシングし、１００またはそれ以上の塩基対の配列を増幅するＰＣＲアッセイを開発することにより行われる。末端配列がヒトゲノム内で独特であることが実証される場合、次いで新規のＳＴＳを用いてＢＡＳライブラリーをスクリーニングし、物理地図のギャップからのＤＮＡを含有するさらなるＢＡＣを同定することができる。ＨＢＭ候補領域の大きさ（２，０００，０００またはそれ以上の塩基対）の領域を被覆するＢＡＣコンティグを組み立てるために、しばしばいくつかのクローンの末端から新規のＳＴＳマーカーを開発することが必要である。
【０１０４】
ＢＡＣコンティグを構築した後、重複クローンのこのセットを、染色体領域をコードする遺伝子を同定するための鋳型として提供する。多くの方法により遺伝子同定を達成することができる。一般的に３つの方法が用いられている。（１）染色体領域全体を表すＢＡＣコンティグから選択されたＢＡＣのセットをシークエンシングでき、コンピューターによる方法を用いて全ての遺伝子を同定することができる、（２）ＢＡＣコンティグからのＢＡＣを試薬として用いて、直接ｃＤＮＡ選択と称される方法により、領域においてコードされる遺伝子に相当するｃＤＮＡクローニングすることができる、または（３）エクソントラッピングと称される手順において特異的ＤＮＡ配列モチーフを選択することにより、ＢＡＣコンティグからのＢＡＣを用いてコード化配列を同定することができる。本発明は最初の２つの方法により同定された遺伝子を含む。
【０１０５】
ＨＢＭ候補領域を表す全ＢＡＣコンティグをシークエンシングするために、プラスミドベクターへのサブクローニングおよびそれに続くこれらのサブクローンのＤＮＡシークエンシングのためのＢＡＣのセットを選択した。ＢＡＣにクローニングされたＤＮＡはゲノムＤＮＡを表すので、このシークエンシングをｃＤＮＡシークエンシングと区別するためにゲノムシークエンシングと称する。目的の染色体領域のゲノムシークエンシングを開始するために、いくつかの非重複ＢＡＣクローンを選択した。各々のＢＡＣクローンに関するＤＮＡを調製し、クローンを無作為の小型のフラグメントに剪断し、これを続いて標準的なプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１８にクローニングする。次いでプラスミドクローンを成長させて小型のフラグメントを増殖させ、これはシークエンシングの鋳型になる。ＢＡＣ  ＤＮＡ配列のための十分な被覆および配列の品質を確実にするために、十分なプラスミドクローンをシークエンシングしてＢＡＣクローンの６倍の被覆を生じる。例えば、ＢＡＣが１００キロ塩基対である場合、次いでファゲミドをシークエンシングして６００キロ塩基の配列を生じる。ファゲミドベクターでのクローニングの前にＢＡＣ  ＤＮＡを無作為に剪断するので、６００キロ塩基対の未処置のＤＮＡ配列をコンピューターによる方法により配列コンティグと称する重複ＤＮＡ配列に組み立てることができる。コンピューターによる方法で最初の遺伝子を同定する目的のために、各々のＢＡＣ６倍の被覆が１０００塩基対から２００００塩基対の１０個から２０個の配列コンティグを生じるのに十分である。
【０１０６】
本発明で用いるシークエンシング計画は、最初にＨＢＭ候補領域のＢＡＣコンティグから「種」ＢＡＣをシークエンシングすることである。次いで「種」ＢＡＣの配列を用いてコンティグから最低限重複するＢＡＣを同定し、続いてこれらをシークエンシングした。この方法で、各ＢＡＣに残るいくつかの小型の配列ギャップを伴う候補領域全体をシークエンシングした。この配列をコンピューターによる遺伝子同定のための鋳型として提供した。コンピューターによる遺伝子同定の１つの方法はＢＡＣの配列を公に利用可能なｃＤＮＡのデータベースおよびゲノム配列、例えばユニジーン、ｄｂＥＳＴ、Ｇｅｎｂａｎｋと比較することである。これらの比較は典型的にはコンピューターアルゴリズムおよびプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを用いて行う(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。ＢＡＣ配列をタンパク質配列に翻訳し、そしてタンパク質配列を用いて、タンパク質配列を分析するために設計されたＢＬＡＳＴのバージョンを用いて公に利用可能なタンパク質データベースを検索することができる(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))。別の方法はコンピューターアルゴリズム、例えばＭＺＥＦ(Zhang、Proc.Natl.Acad.Sci.94:565-568(1997))およびＧＲＡＩＬ(Uberbacherら、Methods Enzymol.266:259-281(1996))を用いることであり、これは全てのエクソンに一般的である特異的ＤＮＡ配列モチーフの存在、およびヒトタンパク質コード化配列に典型的なコドン利用の存在に基づいて配列におけるエクソンの位置を推定する。
【０１０７】
コンピューターによる方法での遺伝子の同定に加えて、直接ｃＤＮＡ選択(Del Mastroら、Genome Res.5(2):185-194(1995))によっても遺伝子を同定した。直接ｃＤＮＡ選択では、目的の組織からのｃＤＮＡプールを調製し、候補領域からのＢＡＣを液体ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用して、ＢＡＣのコード化領域に塩基対形成するｃＤＮＡを捕捉する。本明細書にて記載した方法では、ポリＡ  ＲＮＡからｃＤＮＡの第１の鎖をランダムプライミングし、標準的な方法によりｃＤＮＡの第２の鎖を合成し、ｃＤＮＡフラグメントの末端にリンカーを加えることにより、いくつかの異なる組織からｃＤＮＡプールを作製した。リンカーを用いてｃＤＮＡプールを増幅する。ＢＡＣクローンをインビトロＤＮＡ合成のための鋳型として用いてＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを作製する。次いでＢＡＣ  ＤＮＡのビオチン標識コピーを変性し、これもまた変性されている、ＰＣＲ増幅し、リンカーを付けた過剰のｃＤＮＡプールと共にインキュベートする。ＢＡＣ  ＤＮＡおよびｃＤＮＡを溶液中にアニーリングさせ、ＢＡＣとｃＤＮＡの間のヘテロ二本鎖を、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズを用いて単離する。次いでＢＡＣにより捕捉されたｃＤＮＡをリンカー配列に相補的なプライマーを用いて増幅し、ハイブリダイゼーション／選択方法を第２ラウンドで繰り返す。直接ｃＤＮＡ選択の２回目のラウンドの後、ｃＤＮＡフラグメントをクローニングし、これらの直接選択されたフラグメントのライブラリーを作製する。
【０１０８】
直接選択により単離されたｃＤＮＡクローンを２つの方法により分析する。ＨＢＭ候補領域からのＢＡＣのプールはゲノムＤＮＡ配列を提供するために用いられるので、ｃＤＮＡは個々のＢＡＣにマッピングされなければならない。これはマイクロタイター皿でＢＡＣを整列させ、そのＤＮＡを高密度グリッドで複製することにより達成する。次いで個々のｃＤＮＡクローンをグリッドにハイブリダイズして、直接選択に用いたセットからの個々のＢＡＣに対する配列同一性を有することを確認し、そのＢＡＣの特異的同一性を決定する。個々のＢＡＣに対応することが確認されたｃＤＮＡクローンをシークエンシングする。直接選択により単離されたｃＤＮＡクローンが以前に同定された遺伝子と配列同一性または類似性を共有するかどうかを決定するために、ＤＮＡおよびタンパク質コード化配列をプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを用いて公に利用可能なデータベースと比較する。
【０１０９】
ＢＡＣシークエンシングおよび直接ｃＤＮＡ選択により提供されるゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の組み合わせにより、その領域における推定遺伝子の最初のリストが得られる。その領域の遺伝子は全てＨＢＭ遺伝子座に関する候補であった。各遺伝子をさらに特徴付けるために、ノーザンブロットを実施して各遺伝子に対応する転写物の大きさを決定し、推定エクソンが一緒に転写されて個々の遺伝子を作製することを決定した。各遺伝子のノーザンブロット分析のために、直接選択されたｃＤＮＡクローンから、またはゲノムＤＮＡからもしくは目的の推定遺伝子をコードするＢＡＣから特異的フラグメントをＰＣＲ増幅することによりプローブを調製した。ノーザンブロットにより転写物の大きさおよびそれが発現された組織に関する情報が得られた。高度には発現されない転写物に関しては、反応の鋳型として目的の組織からのＲＮＡを用いて逆転写ＰＣＲアッセイを実施する必要があるときもあった。
【０１１０】
コンピューターによる方法によるおよび直接ｃＤＮＡ選択による遺伝子同定により、染色体の領域における遺伝子についての独特な情報が提供される。遺伝子が同定された場合、次いで各々の遺伝子における変異に関して異なる個体を試験することが可能である。
【０１１１】
本発明はまた各々配列番号２および４により示される形態のＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭタンパク質、およびその他の密接に関連する変異体、ならびにその正確な発現に必要なＨＢＭ遺伝子の隣接する染色体領域をも包含する。好ましい実施形態では、本発明は配列番号２の単離された核酸配列およびその変異体を志向する。配列番号２の変異体には、配列番号２の核酸配列またはそのフラグメントに対して少なくとも約９０％、好ましくは９５％、またはより好ましくは９８％の類似性または同一性を有しているポリヌクレオチドが含まれる。従って、配列番号２またはそのフラグメントに９６％、９７％、および９９％類似している配列もまた本明細書にて意図される。
【０１１２】
ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡまたは標準的なデフォルトパラメーターを用いるその他の適当なアルゴリズムを用いて高骨量（ＨＢＭ）変異体間の変異体の程度の決定を実施することができる。好ましくは、配列番号２のコード化領域に関して同一性を決定するが、非コード化ドメインを含めることもできる。加えて、アラインメントプログラムを用いて、保存配列または異なる動物種にわたる潜在モチーフを同定することができる。アラインメントプログラムを用いて、関連する遺伝子およびそれがコードするタンパク質の核酸および／またはタンパク質配列を整列させることができる。好ましいアラインメントプログラムにはＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＰＩＬＥＵＰおよびＧＡＰなどがあり、好ましくはこれをデフォルトパラメーターと共に用いる。例えば、このようなプログラムを用いてＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１としても公知）、ＨＢＭ、ＬＤＬレセプター関連タンパク質６（ＬＲＰ６）および関連する配列の配列を整列させることができる。
【０１１３】
ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも例えば９０％「類似する」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり１０個までの点変異を含み得ること以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。参照配列のこれらの変異は配列番号２のいずれの位置で生じてもよく、サイレントでもよく、または、アミノ酸置換をコードしても、しなくてもよい。
【０１１４】
別の実施形態は、配列番号２のこのようなポリヌクレオチド変異体が、配列番号２の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００または５００個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含むことを意図する。さらに好ましくは、このようなポリヌクレオチド変異体は、配列番号２または配列番号２の別の変異体のヌクレオチド５８２において多型性（Ｇ→Ｔ置換）に対応する連続する核酸配列を有し、それによりコードされるポリペプチドが対象に投与された場合、これは骨量を変調する変異を含む。意図される配列番号２の全ての変異体は、対象に投与された場合、骨変調を誘起するタンパク質またはポリペプチドをコードする特性を有する。対象に投与された場合に骨量の変調に寄与し得る別の変異体は、ＨＢＭ多型性を含有することが解っているドメイン内にあり、これはβプロペラドメイン（ＹＷＴＤモチーフ）をコードする。また別に、骨量を変調し、および／または対象におけるＨＢＭ表現型に至るＬＲＰ５の別の変異体は、ＬＲＰ５の別の保存されたドメイン、例えば図４（例えばＲＧＤ細胞外付着部位、ＬＤＬおよびカルシウムの結合部位、システイン富化成長因子反復、理想ＰＥＳＴ領域、および内部移行ドメイン）に示すもののいずれかをコードする核酸配列における変異に起因し得る。
【０１１５】
意図されるＨＢＭポリヌクレオチドにはストリンジェント条件下で配列番号２にハイブリダイズするものが含まれる。特に限定されるものではないが、当分野で公知のハイブリダイゼーション法には、（ａ）５０℃で０．１ｘＳＳＰＥ（０．６２ＭのＮａＣｌ、０．０６ＭのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０７５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄；（ｂ）４２℃で５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６から８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸で洗浄、続いて４２℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄；ならびに（ｃ）６５℃で０．５ＭのＮａＰＯ４、７％ＳＤＳで洗浄、続いて６０℃で０．５ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄などがある。配列番号２またはその核酸フラグメントに対するハイブリダイゼーションによりＨＢＭ変異体を単離することができる別の条件を、ハイブリダイゼーション温度を変化させることにより実行できる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列番号２またはそのフラグメントの融点（Ｔｍ）以下の約２０℃で実施される。好ましいストリンジェンシーは配列番号２またはそのフラグメントのＴｍ以下の約５から１０℃で実施される。さらなるハイブリダイゼーション条件をSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)の第11章に記載されるよう、または当業者に知られているように調製することができる。
【０１１６】
また別に、縮重プライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、哺乳動物ライブラリー（例えばウマ、霊長類、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ネコ、ブタ、およびイヌ）をプロービングして配列番号２またはそのフラグメントの変異体を同定することができる。好ましくはストリンジェント条件下で配列番号２のオープンリーディグフレームに、またはその配列の非コード化部分にハイブリダイズするプライマーを利用する。さらに好ましくは、このようなプライマーは配列番号２内の保存されたドメインにハイブリダイズする。例えば、保存されたドメインはＹＷＴＤβプロペラドメインまたはその他のドメインをコードするもの、例えば図４に列挙するものを含む。好ましいプライマーは典型的には１５ヌクレオチドの長さであるが、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５または４０ヌクレオチドの長さに変化し得る。異種性ハイブリダイゼーションは、縮重ＰＣＲプライマーを用いて標的遺伝子または核酸ハイブリダイゼーションを増幅することである。対応するアミノ酸配列（例えばその配列番号４フラグメント）をコードできる可能な全てのヌクレオチド配列を表す、１０以上、好ましくは１５またはそれ以上のヌクレオチドの長さの混合オリゴヌクレオチドを調製することにより、配列番号２およびそれによりコードされるポリペプチドの変異体に関するプローブを得ることができる。この方法はGouldら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(6):1934-1938(1989)により明確に文献化されている。
【０１１７】
別の実施形態には、配列番号４およびそのフラグメントに少なくとも約９０％類似し、対象に投与された場合にその対象において骨量を変調するＨＢＭポリペプチドをコードする核酸などがある。このようなＨＢＭポリペプチドには配列番号４の位置１７１またはマウス相同体の位置１７０に対応するバリン（ＧｌｙのＶａｌへの置換）を有する変異体などがある。その他の好ましい実施形態には、配列番号４の少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００またはそれ以上の連続するするアミノ酸を有する高骨量ポリペプチドなどがある。このような意図される連続する配列は好ましくは高骨量、例えば配列番号４のバリン１７１に対応する多型性と重複する。配列番号４およびそのフラグメントに少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％および９９％類似するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた意図される。
【０１１８】
別の実施形態では、配列番号４をコードする合成核酸であって、配列番号４におけるアミノ酸は変化しないが、恐らく該配列番号４をコードする得られた合成ポリヌクレオチドは配列番号２に少なくとも約５０％類似するものであるように、コードの縮重に基づいて保存置換(conservatively substituted)されている核酸が意図される。
【０１１９】
配列番号４またはそのフラグメントの参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が配列番号４の参照アミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５個までのアミノ酸変化を含んでよい以外は、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列に９５％同一であるアミノ酸を有するポリペプチドを得るために、参照配列の５％までのアミノ酸残基が欠失または別のアミノ酸と置換され得るか、または参照配列の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の変化は参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこかで、参照配列において別個に残基の間かまたは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続するグループのいずれかで散在して生じ得る。
【０１２０】
アミノ酸残基が保存置換されているさらなるＥＢＭポリペプチドおよび該ＨＢＭポリペプチドをコードする核酸が意図される。例えば、表現型としてサイレントアミノ酸置換を作製する方法に関する手引きはBowieら、「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する認容性(Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」Science 247:1306-1310(1990)にて提供され、ここで著者はアミノ酸配列の変化に対する認容性の研究に関して２つの主要な研究法があることを示している。第１の方法は、変異が天然の選択により許容されるか、または拒絶される進化の過程に依存する。第２の研究法は遺伝子操作を用いて、クローン化された遺伝子の特定の位置でのアミノ酸変化、および機能を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを導入する。これらの研究により、タンパク質が驚くほどにアミノ酸置換に認容性があることを示している。著者はさらに、アミノ酸変化がタンパク質の特定の位置で許容状態である可能性があることを示している。Bowieら（前出）では多くの表現型置換が記載されており、そこに引用された参照は、参照によりその全てを本明細書に組み込む。あまり保存されていない種にわたるドメインであって、構造的にまたは機能的に重要なドメイン（例えば結合部位、触媒部位、もしくはβプロペラまたはその他の図４に記載されるドメイン）に相当しないドメインにおける置換が好ましい。
【０１２１】
ＬＲＰ５／ＨＢＭの変異体
Springerら、J.Molecular Biology 283:837-862(1998)に記載するように、２個のＹＷＴＤ−プロペラ含有分子（ニワトリＬＲＰ１およびヒトニドゲン、各々Ｓｗｉｓｓ−ＰＲＯＴ参照ＬＲＰ１  ＣＨ７およびＮＩＤＯ  ＨＵ１を用いる）からのモデル予測に基づいて、ＬＲＰ５第１βプロペラモジュールの構造モデルを作製した。モデルに基づいて、特定のアミノ酸残基をＨＢＭ／ＬＲＰ５の重要な変異体として同定した。以下の３つのカテゴリーがこのような変異体の実例を提供する。
【０１２２】
βプロペラの形状は側面が内側に傾斜し、中央に孔があいているディスクに類似している。残基１７１はプロペラモジュール１の翼４のドメインの外側または上部表面のループにある。従って、変異体は別の翼の構造的に同等の位置にある残基において変化した残基を含み；および結合ポケットに対してさらにわずかに内部にあるが、依然表面に接近可能な残基が、ＨＢＭによる骨量変調の研究に、骨量障害の医薬品および処置の開発に、ならびに本発明の別の目的に関する本発明の重要な実施形態である。このような変異体の実例は以下のとおりである。
【０１２３】
Ａ２１４Ｖ（翼５の１７１の等価な位置；アラニンは別のプロペラで保存されていない）、
Ｅ１２８Ｖ（翼３の１７１の等価な位置；グルタミン酸は別のプロペラで保存されていない）、
Ａ６５Ｖ（翼２の１７１の等価な位置；アラニンは１から３のプロペラで保存されているが４では保存されていない）、
Ｇ１９９Ｖ（翼５の接近可能な内部の位置；グリシンは１から３のプロペラで保存されているが４では保存されていない）；および
Ｍ２８２Ｖ（翼１の接近可能な内部の位置；メチオニンは１から３のプロペラで保存されているが４では保存されていない）。
【０１２４】
ＬＲＰ５は４つのβプロペラ構造を有している。１／３のβプロペラモジュールはヒトＬＲＰ５の残基１７１に相当する位置でグリシンを保存している。従って、別のプロペラの等価の位置でバリンを担持する変異体は本発明の重要な実施形態である。以下の変異体はＨＢＭによる骨量変調の研究に、骨量障害の医薬品および処置の開発に、ならびに本発明の別の目的に有用である。Ｇ４７９Ｖ、Ｇ７８１ＶおよびＱ１０８７Ｖ。
【０１２５】
Ｇ１７１Ｖ  ＨＢＭ多型性により、開いた結合ポケットに突出し、リガンド／タンパク質相互作用を変化させる可能性があるバリン残基からの側鎖を伴うβプロペラ１の「占有空間」に至る。グリシン残基はＬＲＰ５プロペラ１、２および３で保存されるが、プロペラ４ではグルタミン酸が保存される。従って、ＨＢＭの以下の変異体がＨＢＭによる骨量変調の研究に、骨量障害の医薬品および処置の開発に、ならびに本発明の別の目的に関する本発明の重要な実施形態である。
【０１２６】
Ｇ１７１Ｋ（これは荷電した側鎖を導入する）、
Ｇ１７１Ｆ（これは環状の側鎖を導入する）、
Ｇ１７１Ｉ（これは分岐した側鎖を導入する）、および
Ｇ１７１Ｑ（これはプロペラ４残基を導入する）。
【０１２７】
さらに、ＬＲＰ６はＬＲＰ５の最も密接な相同体である。従って、ＬＲＰ６により骨密度を変調させることもできる。ＬＲＰ６は、ＬＲＰ５と同一ではないが、類似していると予測されるβプロペラ構造を有している。ヒトＬＲＰ５のグリシン１７１に対応する位置はヒトＬＲＰ６のグリシン１５８である。従って、ＬＲＰ６の対応する変異体はＬＲＰ５対その関連するフェミリーメンバーの特異性の研究に、骨量障害の医薬品および処置の開発に、ならびに本発明の別の目的に関する本発明の重要な実施形態である。とりわけ、例えば、ヒトＬＲＰ６およびその他の種のＬＲＰ６相同体の類似の変異体の構造的に等価な位置、残基１５８でのグリシンのバリンへの置換は重要な研究用手段を提示している。
【０１２８】
当業者はこれらが、本発明をよりうまく記載するために提示される極わずかな説明用の実例であり、多くのその他の変異体が本発明の範囲内になることを意図し得ることを認識している。
【０１２９】
ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の骨量変調活性を決定する方法を、骨量を研究するための異なる動物モデルを用いて実施することができる。例えば、卵巣切除されたネズミモデルまたは自然発生骨粗鬆症マウス株を利用して、ＬＲＰ５変調物質が動物モデルにおいて相応して骨量を変調するかどうかを決定することができる。このようなマウスのインビボ分析に関しては、Kaluら、J.Bone Miner.Res.14:593-601(1999)、およびShimizuら、Mamm.Genome 10:81-87(1999)を参照されたい。
【０１３０】
使用することができるさらなるインビボアッセイは、ＬＲＰ５の発現が変化しているか、またはＨＢＭをコードする核酸が導入されているトランスジェニック動物およびノックアウト動物である。次いでこれらの動物を利用して骨量を変調する化合物または組成物を同定することができる。
【０１３１】
本発明のポリペプチドは好ましくは、単離された形態で提供される。「単離されたポリペプチド」とは元来の環境から除去されたポリペプチドを企図する。従って、組換え宿主細胞内で生成および含有されるポリペプチドは、本発明の目的に関して「単離された」と考えることができる。「単離されたポリペプチド」とは部分的または実質的に組換え宿主から精製されているポリペプチドであるとも意図される。同様に、「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」とは別の核酸およびタンパク質夾雑物から精製されている核酸配列を意味する。
【０１３２】
本発明はまた各々配列番号１および３に示される形態のＬＲＰ５遺伝子およびＬＲＰ５タンパク質、ならびにその他の密接に関連する変異体をも包含する。本発明はまたその正確な発現に必要なＬＲＰ５の隣接する染色体領域をも包含する。
【０１３３】
好ましい実施形態では、本発明は配列番号１の核酸配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを志向する。配列番号１および３で示される形態のＬＲＰ５遺伝子およびＬＲＰ５タンパク質の変異体を、各々Ｇ１７１Ｖ  ＨＢＭ多型性を有さないＨＢＭ遺伝子およびＨＢＭタンパク質に関して前記したように一般的に同定することができる。
【０１３４】
本発明はまたＬＲＰ５遺伝子領域のヌクレオチド配列およびＨＢＭ遺伝子領域のヌクレオチド配列にも関する。さらにとりわけ、好ましい実施形態はＬＲＰ５遺伝子領域Ｂ２００Ｅ２１−ＨおよびＢ５２７Ｄ１２−Ｈのセグメントを含有するＢＡＣクローンである。好ましい実施形態は配列番号５〜１２からなるＢＡＣクローンのヌクレオチド配列である。
【０１３５】
本発明はまたＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子に関するＤＮＡプローブを同定するためのヌクレオチド配列、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、ＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子におけるヌクレオチド多型性、ならびにＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子の制御エレメントの使用に関する。
【０１３６】
ＩＩ．ＤＸＡ測定を用いる表現型分類
Creighton大学(Omaha、Nebraska)で実施した脊髄骨ミネラル含量（ＢＭＣ）および骨ミネラル密度（ＢＭＤ）測定はNorland Instrumentsデンシトメーター（Norland XR2600デンシトメーター、二重エネルギーＸ線吸光光度分析法、ＤＸＡ）を用いて行った。別の位置での脊髄ＢＭＣおよびＢＭＤは利用できる機械を用いた。現在米国で操作されているＤＸＡ機械は８００と推定される。最も大きな都市にはＤＸＡ能力、通常LunarまたはHologic機械を有するオフィスまたは撮影所がある。脊椎ＢＭＣおよびＢＭＤデータを提供する各々の場所には機械からのプリントアウトのコピーを含み、ＢＭＤの測定のための目的の領域が適当に選択されていることの証明が提供される。完全な臨床履歴および骨格放射線写真が得られた。
【０１３７】
ヒトおよび動物対象、好ましくはヒトにおけるＨＢＭ表現型を診断基準：例えば非常に高度な脊椎ＢＭＤ；いずれかの公知の高骨量症候群を欠く臨床履歴；ならびに四肢骨格の正常な形状を示すラジオグラフィー放射線写真；を用いて記載することができる。
【０１３８】
ＩＩＩ．マイクロサテライトマーカーの遺伝子型解析
遺伝子間隔をJohnsonら、Am.J.Hum.Genet.60:1326-1332(1997)により元来報告されたものより小さな領域まで狭めるために、染色体１１ｑ１２−１３上のさらなるマイクロサテライトマーカーを分類した。新規のマーカーには、D11S4191、D11S1883、D11S1785、D11S4113、D11S4136、D11S4139(Dibら、Nature 380:152-154(1996)、FGF3(Polymeropolousら、Nucl.Acids Res.18:7468(1990))、ならびにＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー１、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー２、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー４、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー６、およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７などがある（図２参照）。
【０１３９】
資格のある瀉血専門医が血液（２０ｍｌ）を、薄紫色のキャップのチューブ（ＥＤＴＡ含有）に抜き取って入れた。ＤＮＡ抽出まで血液を冷蔵保存した。品質または収量が低下しないで冷蔵庫で７日間保存した血液からＤＮＡを抽出した。離れた場所で血液を抜き取られたこれらの対象に関しては、多くの場合、配送プロトコルを用いて成功した。血液サンプルを冷却するための冷凍パックと共に発泡スチロール容器に入れて、翌日配達で配送した。薄紫色のキャップのチューブを個々のプラスチック配送用チューブ上に、そして次いで「ジップ・ロック」バイオハザードバッグに内に置いた。翌日にサンプルが到着したとき、これを即座に処理してＤＮＡを抽出した。
【０１４０】
ＤＮＡ抽出手順はGentra Systems,Inc.(Minneapolis、ミネソタ州)から購入したキットを使用した。簡単には、手順は３容量の赤血球溶解バッファーを全血に添加することを含む。室温で１０分間インキュベートした後、Beckmanテーブルトップ遠心で溶液を２０００Ｘｇで１０分間遠心した。白血球ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁した。一度ペレットが完全に再懸濁され、細胞の塊がなくなったら、溶液をＲＮアーゼＡで、３７℃で１５分間消化した。提供されたタンパク質沈殿溶液の添加によりタンパク質を沈殿させ、遠心により除去した。イソプロパノールの添加により上澄からＤＮＡを沈殿させた。この方法は単純および迅速であり、１から２時間を要するのみであり、同時に多量のサンプルの処理が可能であった。ＤＮＡ収量は通常全血２０ｍｌに関して＞８ｍｇであり、ＭＷ＞５０ｋｂであった。保存コード化された５０μｇアリコートで、−８０℃でエタノール沈殿としてＤＮＡが得られた。
【０１４１】
蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーおよび未標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡを遺伝子型解析した。Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville、アイオワ州)から標識および未標識オリゴヌクレオチドを入手した。マイクロサテライト遺伝子型解析のためのその他の全ての試薬はPerkin Elmer-Applied Biosystems,Inc.(「PE-ABI」)(Norwalk、コネチカット州)から購入した。個々のＰＣＲ反応を、ＰＥ−ＡＢＩに記載されるように、AmpliTaq（商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いて各々のマーカーに関して実施した。反応物を脱イオン化ホルムアミド、ブルー・デキストランおよびＴＡＭＲＡ  ３５０サイズ・スタンダード（ＰＥ−ＡＢＩ）を含有する負荷バッファー３．５μｌに加えた。９５℃で５分間加熱してＤＮＡを変性させた後、モデル３７７ＤＮＡシークエンサー(PE-ABI、Foster City、カリフォルニア州)の操作マニュアルに記載されているように、サンプルを負荷し、電気泳動した。ゲル電気泳動の後、PE-ABI GENESCAN（登録商標）およびGENOTYPER（商標）ソフトウェアを用いてデータを分析した。最初に、GENESCAN（商標）ソフトウェア内で、分析の第１ステップの前にレーントラッキングを手作業で最適化した。ゲルレーンデータを抽出した後、各レーンの標準的な曲線プロファイルを試験し、直線性およびサイズコーリングを確認した。これらのパラメーターのいずれかで問題を有したレーンを再トラッキングし、確認した。一度全レーンをトラッキングし、サイズスタンダードを正確に同定すると、対立遺伝子同定のためにデータをGENOTYPER（商標）にインポートした。対立遺伝子の呼び出し（ビニング）を迅速にするために、Dr.Guy Van Campのインターネットウェブサイト(<http://alt.www.uia.ac.be/u/dnalab/ld.html>)からのプログラム・Linkage Designerを使用した。このプログラムはGENOTYPER（商標）により作製したデータの家系ドローイングプログラムCyrillic(バージョン2.0、Cherwell Scientific Publishing Limited,Oxford、英国)へのインポート、およびそれに続くＬＩＮＫＡＧＥ(Lathropら、Am.J.Hum.Genet.37:482-498(1985))プログラムを用いる連鎖解析を大いに促進する。
【０１４２】
ＩＶ．連鎖解析
図１は本発明の遺伝子連鎖研究において使用した個体の家系を示す。とりわけ、LINKAGE(Lathropら、Am.J.Hum.Genet.37:482-498(1985))プログラムのMLINKおよびLINKMAPコンポーネントを用いて２点連鎖解析を実施した。家系／マーカーデータをMakepedプログラムへのｐｒｅファイルとしてCyrillicからエクスポートし、連鎖解析用に適当なｐｅｄファイルに変換した。
【０１４３】
元来の連鎖解析は３つのモデルを用いて実施した。（ｉ）常染色体優性、十分に浸透したモデル、（ｉｉ）浸透度が低下した常染色体優性モデル、および（ｉｉｉ）量的形質モデル。広く拡大した親族の２２人のメンバーからのリンクマーカーに関してＤＮＡを分析することにより、ＨＢＭ遺伝子座は染色体１１ｑ１２−１３にマッピングされた。６から２２ｃｍの範囲の間隔で２２個の常染色体にわたる３４５個の蛍光マーカーのパネルを伴う高度に自動化された技術を用いた。染色体１１のこの領域からのマーカーのみが連鎖の証拠を示した（ＬＯＤスコア〜３．０）。最も高いＬＯＤスコア（５．７４）が２点により得られ、多点解析はD11S987（図２の地図位置５５）であった。９５％信頼区間によりマーカーD11S905とD11S937の間にＨＢＭ遺伝子座が配置された（図２の地図位置４１−７１）。ハプロタイプ分析でもＬＲＰ５遺伝子がこの同一の領域に配置される。マーカーD11S987、D11S905およびD11S937のさらなる記載をGyapayら、Nature Genetics 7巻(1994)に見出すことができる。
【０１４４】
本発明では、発明者はＨＢＭ間隔をマーカーD11S987とGTC HBM マーカー５の間の領域に狭めることを報告している。これらの２つのマーカーは元来の分析(D11S905およびD11S937)からデリミッティング・マーカーの間にあり、そして互いにおよそ３ｃｍである。マーカーD11S4191、D11S1883、D11S1785、D11S4113、D11S4136、D11S4139(Dibら、Nature 380:152-154(1996)、ＦＧＦ３(Polymeropolousら、Nucl.Acids Res.18:7468(1990))（遺伝子マーカーに関する情報はゲノムデータベースのインターネットサイト、http://gdwww.gdv.org/ <http://gdvwww.gdv.org/>で見出すことができる）、ならびにマーカー、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー１、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー２、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー４、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー６、およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７からの遺伝子型データを用いて間隔を狭めることができる。
【０１４５】
図１で示すように、前記の遺伝子マーカーを用いるハロタイプ解析により、ＬＲＰ５遺伝子が局在する染色体１１の間隔を有意に絞り込む個体９０１９および９０２０の組換え事象（交差）を同定する。個体９０１９はＨＢＭ遺伝子を有する母方の染色体からの染色体１１の部分、および染色体１１相同体からの部分を遺伝しているＨＢＭを罹患する個体である。ＨＢＭ遺伝子担持染色体から遺伝された部分は、マーカーＤ１１Ｓ９３５、Ｄ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー４、Ｄ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ１２９６、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー６、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー２、Ｄ１１Ｓ９７０、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー３、Ｄ１１Ｓ１１３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー１、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５を含む。Ｄ１１Ｓ４１３６からおよびテロメア方向へ続く部分は非ＨＢＭ染色体に由来する。このデータによりＬＲＰ５遺伝子はマーカーＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５に対してセントロメアよりの位置に配置される。個体９０２０もまた重要な組換え事象を呈する非罹患個体である。この個体はＨＢＭ遺伝子を担持する彼女の父（個体０１１５）の染色体１１相同体からのマーカーＤ１１Ｓ９３５、Ｄ１１Ｓ１３１３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー４、Ｄ１１Ｓ９８７、Ｄ１１Ｓ１２９６およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー６、ならびにＨＢＭ遺伝子を担持しない彼女の父の染色体１１からのマーカーＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー２、Ｄ１１Ｓ９７０、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー１、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５、Ｄ１１Ｓ４１３６、Ｄ１１Ｓ４１３９、Ｄ１１Ｓ１３１４、およびＤ１１Ｓ９３７を含む組換え父方染色体１１を遺伝する。マーカーＤ１１Ｓ１１３は個体０１１５のそのホモ接合体特性のため情報価値がない。この組換え事象によりＨＢＭ領域のセントロメア境界はマーカーＤ１１Ｓ１２９６とＤ１１Ｓ９８７の間に配置される。
【０１４６】
また２点連鎖解析を用いて染色体１１上のＬＲＰ５遺伝子の位置を確認した。十分な浸透度のモデルでの２点連鎖解析の連鎖結果を以下の表１に提示する。この表は第１コラムで遺伝子マーカー、および表の上から全体にわたって組換え分画を列挙する。列の各セルは第１列で示す組換え分画でＬＲＰ５遺伝子に対する連鎖に関して試験した個々のマーカーのＬＯＤスコアを示す。例えば、マーカーＤ１１Ｓ９７０でのピークＬＯＤスコアは７．６６であり、これはハロタイプ解析により定義された間隔内にある。
【０１４７】
【表１】
2005511002.tif 000002
【０１４８】
単一塩基多型（ＳＮＰ）がさらにＨＢＭ領域を定義する。このＳＮＰはＳＮＰ  コンティグ０３３−６と称され、そして遺伝子マーカーＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５に対して２５ｋｂセントロメアよりに位置する。このＳＮＰは遺伝子マーカーＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７に対してテロメアよりである。ＳＮＰ  コンティグ０３３−６はＨＢＭ罹患個体０１１３に存在する。しかしながら、０１１３の息子であるＨＢＭ罹患個体９０１９はこのＳＮＰを担持しない。従って、これは交差がこのＳＮＰに対してセントロメアよりであることを示している。遺伝子マーカーＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７のプライマー配列を以下の表２に示す。
【０１４９】
【表２】
2005511002.tif 000003
【０１５０】
記載した親族は非常に興味深いいくつかの特徴を有し、顕著なものでは彼らの骨は、非常に高密度であるが、絶対的に正常な形態を有している。ＨＢＭに罹患した個体の骨格の外寸は正常であり、髄腔は存在するが、造血の干渉はない。ＨＢＭに罹患したメンバーは骨折に対して抵抗するようであり、試験したメンバーには神経学的な症状はなく、いずれかの器官や系における機能の障害の症状はない。親族のＨＢＭに罹患したメンバーはひどい病気または身体障害もなく、高齢まで生存する。さらに、ＨＢＭ表現型はその他の骨障害、例えば骨粗鬆症、骨粗鬆症偽性神経膠腫、エンゲルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ファン・ブッヘム病、メロレオストーシス、大理石骨病、濃化異骨症、硬化狭窄症、オステオポイキローシス、先端巨大症、パジェット病、繊維性骨異形成症、管状狭窄症、骨形成不全症、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、偽性偽性副甲状腺機能低下症、１次および２次性副甲状腺機能亢進症および随伴される症候群、高カルシウム尿症、甲状腺の髄様癌、骨軟化症ならびにその他の疾患に適合しない。明らかに、このファミリーのＨＢＭ遺伝子座は骨密度の制御において非常に強力で、実質的な役割を有しており、その同定は骨密度を制御する（複数の）経路および骨粗鬆症のような疾患の病因を理解するのに重要なステップである。
【０１５１】
加えて、ＨＢＭ遺伝子を担持する、従ってＨＢＭタンパク質を発現する年輩の個体は正常な個体の骨量特性の喪失を示さない。換言すれば、ＨＢＭ遺伝子は骨粗鬆症のサプレッサーである。本質的には、ＨＢＭ遺伝子を担持する個体はＨＢＭタンパク質を与えられ、結果的に骨粗鬆症を進行しない。このインビボ観察は、正常な個体のＨＢＭ遺伝子もしくはタンパク質、またはそのフラグメントでの処置が骨粗鬆症を改善するという強い証拠である。
【０１５２】
Ｖ．物理マッピング
ＨＢＭ遺伝子座のクローニングおよび特徴付けのための試薬を提供するために、前記した遺伝子マッピングデータを用いて染色体１１ｑ１３．３．上にＬＲＰ５遺伝子を含有する領域の物理地図を構築した。物理地図は分子ランドマークの順序付けされたセットおよび染色体１１ｑ１３．３．からのＬＲＰ５遺伝子領域を含有するＢＡＣクローンのセットから成る。
【０１５３】
種々の公に利用可能なマッピングリソースを利用してＨＢＭ領域の既存のＳＴＳマーカー(Olsonら、Science 245:1434-1435(1989))を同定した。リソースにはGDB、the Whitehead Institute Genome Center、dbSTSおよびdbEST(NCBI)、11db、Texas Southwestern大学 GESTEC,the Stanford Human Genome Center、ならびにいくつかの参照文献(Courseauxら、Genomics 40:13-23(1997)、Courseauxら、Genomics 37:354-365(1996)、Guruら、Genomics 42:436-445(1997)、Hosodaら、Genes Cells 2:345-357(1997)、Jamesら、Nat.Genet.8:70-76(1994)、Kitamuraら、DNA Reseach 4:281-289(1997)、Lemmensら、Genomics 44:94-100(1997)、Smithら、Genome Res.7:835-842(1997))などがある。地図を手作業で組み込み、ＬＲＰ５を含有する領域にマッピングするマーカーを同定した。
【０１５４】
ＧＤＢまたは参照文献から入手した既存のＳＴＳに関するプライマーを以下の表３に列挙する。従って、表３はＬＲＰ５遺伝子領域の物理地図を調製するために用いたＳＴＳマーカーを示す。
【０１５５】
【表３Ａ】
2005511002.tif 000004
【表３Ｂ】
2005511002.tif 000005
【表３Ｃ】
2005511002.tif 000006
【表３Ｄ】
2005511002.tif 000007
【表３Ｅ】
2005511002.tif 000008
【０１５６】
公に利用可能なゲノム配列、または配列由来のＢＡＳインサート末端のいずれかから新規のＳＴＳを開発した。クロスマッチ(P.Green,Washington大学)を用いて自動的にベクターおよび反復配列マスキング、および続いてプライマー３(Rozen、Skaletsky(1996、1997))を用いるプライマーピッキングを実施するスクリプトを使用してプライマーを選択した。プライマー３はwww.genome.wi.mit.edu/genome software/other/primer3.html <http://www.genome.wi.mit.edu/genome software/other/primaer3.html>で利用可能である。
【０１５７】
各々のプライマー対に関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を最初にＭｇＣｌ２濃度に関して最適化した。標準的なバッファーは１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、２．７ｎｇ／μｌのヒトＤＮＡ、AmpliTaq(Perkin Elmer)０．２５単位、およびＭｇＣｌ２濃度１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．４ｍＭであった。サイクリング条件には９４℃で２分間の最初の変性、続いて９４℃で１５秒間、５５℃で２５秒間、および７２℃で２５秒間の４０サイクル、続いて７２℃で３分間の最後の伸長などがある。最適化の最初のラウンドからの結果に依存して、必要な場合さらに条件を最適化した。可変値には、５８℃または６０℃までのアニーリング温度の上昇、４２までのサイクル数の増加、および３０秒までのアニーリングおよび伸長時間、並びにAmpliTaqGold(Perkin Elmer)の使用などがある。
【０１５８】
Research Geneticsから購入した全ヒトＢＡＣライブラリーからのＤＮＡプールのＰＣＲ基盤のスクリーニングにより、目的のＳＴＳマーカーを含有するＢＡＣクローン(Kimら、Genomics 32:213-218(1996)、Shizuyaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:8794-8797(1992))を入手した。ヒトＤＮＡの９つのゲノム等価物に相当するライブラリープレート１−５９６に由来するＤＮＡプールを使用した。最初のスクリーニング方法はスーパープール、すなわち３８４ウェルライブラリープレートからの全ＢＡＣクローンに由来するＤＮＡの混合物に対する個々のマーカーのＰＣＲ反応を含んだ。各々の陽性スーパープールに関して、プレート（８）、列（１６）およびコラム（２４）のプールをスクリーニングして独特なライブラリーアドレスを同定した。ＰＣＲ産物を１ｘＴＢＥ中０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル(Sigma)で、１５０ボルトで４５分間電気泳動した。使用した電気泳動ユニットはOwl Scientific ProductsのＡ３−１システムモデルであった。典型的には、ゲルには５０ウェル／段のレーンが１０段含まれていた。分子量マーカー（１００ｂｐラダー、Life Technologies、Bethesda、メリーランド州）をゲルの双方の末端で負荷した。ゲルの画像をＫｏｄａｋ  ＤＣ４０  ＣＣＤカメラで捕捉し、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで処理した。ゲルデータをタブ区切りしたテキストファイルとしてエクスポートした；スクリーニングしたライブラリー、ゲルイメージファイルおよびスクリーニングされたマーカーについての情報をファイルの名前に含めた。カスタマイズされたＰｅｒｌスクリプトを用いて、データ保存および分析のためのFilemaker(商標)PRO(Claris Corp.)データベースにこれらのデータを自動的にインポートした。不完全なまたは不明瞭なクローンアドレス情報が得られた場合、独特な完全なライブラリーアドレスを回復するために、別の実験を実施した。
【０１５９】
ライブラリーに由来するクローンＢＡＣ培養物の回収には、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール(Sigma)を含有するＬＢ寒天(Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1982))上のライブラリーウェルからサンプルを画線することなどがある。２つの個々のコロニーおよび最初の画線の四分円の部分を適当なＳＴＳマーカーでコロニーＰＣＲにより確認のために試験した。１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１５％グリセロールを含有するＬＢブロス中−７０℃で陽性クローンを保存した。
【０１６０】
いくつかの異なる型のＤＮＡ調製法をＢＡＣ  ＤＮＡの単離に用いた。以下に列挙した手作業によるアルカリ性溶解ミニプレッププロトコル(Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1982))をたいていの適用、すなわち制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析、ＦＩＳＨマッピングに用いて成功したが、末端シークエンシングでの再現性は成功しなかった。末端シークエンシングの目的で、特にＢＡＣ  ＤＮＡ調製にはAutogenおよびQiagenプロトコルを使用した。
【０１６１】
５０ｍｌコニカルチューブ中、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するTerrific Broth  １５ｍｌ中、３７℃で２０時間、３００ｒｐｍで振盪しながら細菌を成長させた。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００Ｄ中３００ｒｐｍ（〜１８００ｇ）で、４℃で１５分間培養物を遠心した。次いで上澄をできるだけ完全に吸引した。この工程で細胞ペレットを２週間まで−２０℃で凍結する場合もあった。次いでペレットをボルテックスして細胞をホモジナイズし、凝集を最低限にした。Ｐ１溶液（５０ｍＭ  グルコース、１５ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００μｇ／ｍｌＲＮアーゼＡ）２５０μｌを加え、混合物をピペットで上下させて混合した。次いで混合物を２ｍｌエッペンドルフチューブに移した。次いでＰ２溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を加え、混合物を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。Ｐ３溶液（３Ｎ  ＫＯＡｃ、ｐＨ５．５）３５０μｌを加え、次いで白色沈殿を形成するまで混合物を穏やかに混合した。溶液を氷上で５分間インキュベートし、次いでマイクロヒュッジ中４℃で１０分間遠心した。上澄を注意深く新しい２ｍｌエッペンドルフチューブに移し（白色沈殿を避ける）、イソプロパノール０．９ｍｌを添加し、溶液を混合し、氷上で５分間放置した。サンプルを１０分間遠心し、上澄を注意深く除去した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、５分間空気乾燥した。ペレットをＴＥ８（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ）２００μｌに再懸濁し、ＲＮアーゼＡ(Boehringer Mannheim)を１００μｇ／ｍｌまで加えた。サンプルを３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＣ２Ｈ３Ｏ２Ｎａ・３Ｈ２Ｏを０．５Ｍまで、およびエタノール２容量を添加することにより沈殿させた。サンプルを１０分間遠心し、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、続いて空気乾燥し、ＴＥ８  ５０μｌに溶解した。このＤＮＡ調製に関する典型的な収量は細菌培養１５ｍｌあたり３から５μｇであった。１０から１５μｌをHindIII制限分析に使用した；５μｌをNotI消化およびＣＨＥＦゲル電気泳動によるクローンインサートサイジングに使用した。
【０１６２】
５０ｍｌコニカルチューブ中、１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２Ｘ  ＬＢブロス  １５ｍｌにＢＡＣを接種した。４つのチューブを各クローンに関して接種した。培養物を３７℃で一晩（〜１６時間）激しく振盪しながら（＞３００ｒｐｍ）成長させた。ＢＡＣ  ＤＮＡ単離のための標準的な条件はAutogen740製造者により推奨されるものに従った。培養サンプル３ｍｌをAutogenチューブに全体で６０ｍｌまたはクローンあたり２０チューブに配置した。Autogenプロトコルの一部として、最終的にサンプルを１５秒間振盪しながらＴＥ８  １００μｌに溶解させた。Autogenプロトコルを終了した後、ＤＮＡ溶液を各別個のチューブから写し、２ｍｌエッペンドルフチューブにプールした。多量の細片を含むチューブ（細片をペレット化する工程から持ち越し）を避けた。次いでチューブをＴＥ８  ０．５ｍｌで連続的にすすぎ、この溶液をプールした材料に加えた。ＤＮＡ溶液を４℃で保存した；凝集は−２０℃での凍結時に生じる傾向があった。このＤＮＡを直接制限マッピング、ＣＨＥＦゲル分析またはＦＩＳＨマッピングに使用するか、または以下に記載するように末端シークエンシング反応において使用するためにさらに精製した。
【０１６３】
ＤＮＡ溶液の容量をＴＥ８で２ｍｌに調整し、次いでサンプルを穏やかに混合し、６５℃で１０分間加熱した。次いでＤＮＡ溶液を４℃で５分間遠心し、上澄を１５ｍｌコニカルチューブに移した。次いでＮａＣｌ濃度を０．７５Ｍ（５Ｍ  ＮａＣｌ〜０．３ｍｌをサンプル２ｍｌに）に調整した。次いで全容量をQiagenカラム平衡バッファー（バッファーＱＢＴ）で６ｍｌに調整した。次いでＤＮＡを含有する上澄をカラムに適用し、重力流により進入させた。カラムをQiagenバッファーＱＣ  １０ｍｌで２回洗浄した。次いで結合ＤＮＡを、６５℃を維持したバッファーＱＦの１ｍｌアリコートで別個に４回溶出した。イソプロパノール１．７容量（〜２．８ｍｌ）でＤＮＡを沈殿させた。次いで各サンプルを４個の別個の２．２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、室温で２時間かまたは一晩インキュベートした。サンプルをマイクロヒュッジ中４℃で１０分間遠心した。上澄を注意深く除去し、７０％エタノール１ｍｌを添加した。サンプルを再度遠心し、この段階でＤＮＡペレットがしばしばほぐれるので、上澄を注意深く除去した。サンプルを再度遠心して、マイクロピペットチップで除去された残りの液体を濃縮した。次いでＤＮＡペレットをデシケーター中１０分間乾燥させた。滅菌蒸留および脱イオン化Ｈ２Ｏ  ２０μｌを各チューブに加え、次いでこれを４℃で一晩放置した。各クローンに関して４つの２０μｌサンプルをプールし、チューブを別の滅菌蒸留および脱イオン化Ｈ２Ｏ  ２０μｌで、最終容量１００ｍｌですすいだ。次いでサンプルを６５℃で５分間加熱し、次に穏やかに混合した。ＮｏｔＩ消化および非切断λＤＮＡとの比較により評価されるように、典型的な収量は培養物６０ｍｌあたり２から５μｇであった。
【０１６４】
１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢブロス  ３ｍｌをオートクレーブAutogenチューブに分配した。各クローンに関して１本のチューブを用いた。接種用にはグリセロールストックを−７０℃保存から取り出し、ドライアイス上に置いた。グリセロールストックの小部分を元来のチューブから滅菌トゥースピックで取り出し、Autogenチューブに移した；トゥースピックは廃棄する少なくとも２分前までAutogenチューブ中に放置した。接種後チューブをテープで被覆してきつく密閉されていることを確認した。全サンプルを接種したとき、チューブ単位をAutogenラックホルダーに移し、２５０ｒｐｍで、３７℃で１６から１７時間、回転シェーカーに配置した。成長させた後、製造者により定義されるようなＢＡＣ  ＤＮＡ調製に関する標準的な条件を用いてAutogenをプログラムした。プログラムの一部として、サンプルはＴＥ８に溶解せず、ＤＮＡペレットを乾燥させたままにした。プログラムを完了したとき、チューブを出力トレイから取り出し、滅菌蒸留および脱イオン化Ｈ２Ｏ  ３０μｌをチューブの底に直接添加した。次いでチューブを穏やかに２から５秒間振盪し、次にパラフィルムで被覆し、室温で１から３時間インキュベートした。次いでＤＮＡサンプルをエッペンドルフチューブに移し、シークエンシングに直接用いるか、または後で使用するために４℃で保存した。
【０１６５】
ＶＩ．物理マッピングのためのＢＡＣクローン特徴付け
制限フラグメントの大きさの分析のために、手作業によるアルカリ性溶解またはAutogenプロトコルのいずれかにより調製したＤＮＡサンプルをHindIIIで消化した。このデータを用いてクローン間の重複の程度を比較した。典型的には１から２μを各反応に使用した。反応混合物には、最終容量２５μｌ中、１ｘバッファー２(New England Biolabs)、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン(New England Biolabs)、５０μｇ／ｍｌＲＮアーゼＡ(Boehringer Mannheim)、およびHindIII(New England Biolabs)２０単位が含まれた。消化物を３７℃で４から６時間インキュベートした。ＣＨＥＦゲル分析によりインサートの大きさを推定するためにＢＡＣ  ＤＮＡをまたＮｏｔＩでも消化した（以下を参照）。反応条件はNotI  ２０単位を使用した以外はHindIIIの条件と同一であった。ブロムフェノール・ブルーおよびキシレンシアノールを含有する６ｘFicoll負荷バッファー６μｌを電気泳動の前に添加した。
【０１６６】
０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１ｘＴＢＥ中０．６％アガロース(Seakem、FMC Bioproducts)でHindIII消化を分析した。モデルＡ４電気泳動ユニット(Owl Scientific)でゲル（２０ｃｍｘ２５ｃｍ）を５０ボルトで２０から２４時間電気泳動した。分子量サイズマーカーには未消化λＤＮＡ、HindIII消化λＤＮＡおよびHaeIII消化  Ｘ１７４ＤＮＡなどがあった。分子量マーカーをゲルに負荷する前に６５℃で２分間加熱した。画像をＫｏｄａｋ  ＤＣ４０  ＣＣＤカメラで捕捉し、Ｋｏｄａｋ  １Ｄソフトウェアで分析した。
【０１６７】
ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩ（BioRad）電気泳動ユニットで製造者の推奨に従ってNotI消化を分析した。簡単には、１％アガロースゲル（BioRadパルスフィールドグレード）を０．５Ｘ  ＴＢＥで調製し、電気泳動ユニット中１４℃で３０分間平衡にし、６ボルト／ｃｍで１４時間、循環しながら電気泳動した。切り換え時間は１０秒から２０秒まで傾斜させた。電気泳動の後ゲルを０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染色した。分子量マーカーには未消化λＤＮＡ、HindIII消化λＤＮＡ、λラダーＰＦＧラダー、および低値域ＰＦＧマーカー(全てNew England Biolabsから)などがあった。
【０１６８】
手作業によるアルカリ性溶解またはAutogenプロトコルのいずれかにより調製したＢＡＣ  ＤＮＡを、Bioprime標識キット(BioRad)を用いて、製造者の推奨にわずかな修飾を加えたものに従って、ＦＩＳＨ分析のために標識した。ＤＮＡおよそ２００ｎｇを各反応物５０μｌに使用した。３μｌを２％アガロースゲル上で分析し、標識の程度を決定した。インサイチュ・ハイブリダイゼーションの前にSephadex  Ｇ５０スピンカラムを用いて反応物を精製した。分裂中期のＦＩＳＨを記載されるように(Maら、Cytogenet.Cell Genet.74:266-271(1996))実施した。
【０１６９】
ＶＩＩ．ＢＡＣ末端シークエンシング
ＢＡＣインサート末端のシークエンシングは前記した２つの方法のいずれかにより調製されたＤＮＡを利用した。DYEnamic Energy TransferプライマーおよびAmershamのDynamic Directサイクルシークエンシングキットをシークエンシング反応に使用した。Ｍ１３〜４０正方向シークエンシングプライマーを含む既製シークエンシングミックス（カタログ番号ＵＳ７９７３０）をＴ７  ＢＡＣベクター終端に用いた；既製シークエンシングミックス（カタログ番号ＵＳ７９５３０）をＳＰ６  ＢＡＣベクター終端のためのＭ１３−２８逆方向シークエンシングプライマー（カタログ番号ＵＳ７９３３９）と混合した。シークエンシング反応ミックスには４つの蛍光標識色素プライマーの１つ、４つのジデオキシ終止ミックスの１つ、ｄＮＴＰ、反応バッファー、およびThermosequenaseが含まれた。各ＢＡＣ  ＤＮＡサンプルに関して、ＢＡＣ  ＤＮＡサンプル  ３μｌを４ＰＣＲ  ストリップチューブに等分した。次いで４つの色素プライマー／終止ミックスの組み合わせの１つの２μｌを４つのチューブの各々に加えた。次いでチューブを密閉し、そしてＰＣＲの前に短時間遠心した。熱循環条件には９５℃で１分間の変性、４５℃で１５秒間のアニーリング、および７０℃で１分間の伸長の、全部で３５サイクルが含まれる。循環の後、プレートを短時間遠心して全液体をチューブの底に集めた。次いで滅菌蒸留および脱イオン化Ｈ２Ｏ  ５μｌを各チューブに加え、プレートを密閉し、そして再度短時間遠心した。次いで各ＢＡＣに関する４つのサンプルを一緒にプールした。次いで７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ  １．５μｌおよび−２０℃の１００％エタノール  １００μｌを各チューブに加えることによりＤＮＡを沈殿させた。ピペッティングを上下に一度行ってサンプルを混合した。次いでプレートを密閉し、そして氷上で１０分間インキュベートした。テーブルトップＨａｒａｅｕｓ遠心でプレートを４℃、４０００ｒｐｍ（３，２９０ｇ）で３０分間遠心してＤＮＡを回収した。上澄を除去し、そして過剰の液体をペーパータオルで吸い取った。−２０℃の７０％エタノール  １００μｌを各チューブに加え、４℃で４０００ｒｐｍ（３２９０ｇ）で１０分間再遠心することによりペレットを洗浄した。上澄を除去し、そして再度過剰の液体をペーパータオルで吸い取った。残りのわずかな液体は、プレートを上下逆さまにしてペーパータオルの上に置き、そして遠心が８００ｒｐｍにちょうど達するまで遠心することにより除去した。次いでサンプルを室温で３０分間空気乾燥した。チューブにキャップをして、そして電気泳動まで−２０℃で乾燥保存した。電気泳動の直前に、ＤＮＡをAmersham負荷色素  １．５μｌに溶解した。次いでプレートを密閉し、そして２０００ｒｐｍ（８２５ｇ）で遠心した。次いでプレートをプレートシェーカーで１〜２分間ボルテックスした。次いでサンプルを２０００ｒｐｍ（８２５ｇ）で短時間遠心した。次いでサンプルを６５℃で２分間加熱し、そして即座に氷上に置いた。ＡＢＩ３７７蛍光シークエンサーで、製造者の推奨に従って標準的なゲル電気泳動を実施した。
【０１７０】
ＶＩＩＩ．ＨＢＡ  ＢＡＣ  ＤＮＡのサブクローニングおよびシークエンシング
ＬＲＰ５遺伝子領域の物理地図によりその内部にＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を含有するＢＡＣクローンのセットが提供される。該領域からのいくつかのＢＡＣのＤＮＡシークエンシングが完了した。ＤＮＡ配列データは、当業者がＬＲＰ５遺伝子およびＨＢＭ遺伝子を同定するか、または（複数の）遺伝子を同定するためのプローブを調製するか、または（複数の）遺伝子を同定するためのＤＮＡ配列多型性を同定するために用いることができるデータを含む独特な試薬である。
【０１７１】
ＢＡＣ  ＤＮＡのQiagen精製(Qiagen,Inc.、製品文献に記載されているように）または標準的なプラスミドＤＮＡのアルカリ性溶解／塩化セシウム調製の変法である手作業による精製の２つのプロトコルのいずれか１つに従って、ＢＡＣ  ＤＮＡを単離した(例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1997))。簡単には、手作業によるプロトコルでは、細胞をペレット化し、ＧＴＥ（５０ｍＭ  グルコース、２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）およびリゾチーム（５０ｍｇ／ｍｌ溶液）、続いてＮａＯＨ／ＳＤＳ（１％ＳＤＳ／０．２Ｎ  ＮａＯＨ）そして次に３Ｍ  ＫＯＡｃ（ｐＨ４．５から４．８）の氷冷溶液に再懸濁した。濾過した上澄にＲＮアーゼＡを加えて、続いてプロテイナーゼＫおよび２０％ＳＤＳを加えた。次いでＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、乾燥し、そしてＴＥ（１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に再懸濁した。ＢＡＣ  ＤＮＡを塩化セシウム密度勾配遠心(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1997))によりさらに精製した。
【０１７２】
単離した後、ＨＰＬＣを用いて(Hengen、Trends in Biochem.Sci.22:273-274(1997))ＢＡＣ  ＤＮＡを２０００から３０００ｂｐのインサートの大きさまで水力学的に剪断した。剪断後、ＤＮＡを濃縮し、そして標準的な１％アガロースゲル上で分離した。おおよその大きさに相当する単一の分画をゲルから切除し、そして電気溶出により精製した(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring、ニューヨーク州(1989))。
【０１７３】
次いで精製されたＤＮＡフラグメントをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。次いで平滑末端ＤＮＡを独特なＢｓｔＸＩリンカーアダプター（配列番号６２７−６２８）（１００から１０００倍過剰のモル濃度の５’ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＧＧＧおよび５’ＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ）にライゲートした。これらのリンカーはＢｓｔＸＩ切断ｐＭＰＸベクター（発明者が構築）に相補的であったが、オーバーハングは自己相補的ではなかった。従って、リンカーはコンカテマー化されず、また切断ベクターは容易に自身に再ライゲートしない。リンカー適応インサートを１％アガロースゲル上で組み込まれていないインサートから分離し、GeneClean(BIO 101,Inc.)を用いて精製した。次いでリンカー適応インサートを修飾pBlueScriptベクターにライゲートして「ショットガン」サブクローンライブラリーを構築した。ベクターはアダプターダイマーがクローン化されるときに読み枠内になるクローニング部位で読み枠外ｌａｃＺ遺伝子を含有し、それによりこれらを青色により避けることが可能になる。
【０１７４】
続く全ての工程はＡＢＩ３７７自動ＤＮＡシークエンシング法によるシークエンシングに基づいた。プロトコルの主要な改変のみを強調して提示する。簡単には、次いでライブラリーをＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した(Life Technologies,Bethesda、メリーランド州、ＤＨ５α形質転換プロトコル)。アンピシリンおよびＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含有する抗生物質プレートに播種することによりこれを評価した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。次いで成功した形質転換体をクローンの播種およびシークエンシングのための採取に用いた。培養物を３７℃で一晩成長させた。シリカビーズＤＮＡ調製法(Ngら、Nucl.Acids.Res.24:5045-5047(1996))を用いてＤＮＡを精製した。この様式でクローンあたりＤＮＡ２５μｇが得られた。
【０１７５】
次いでＡＢＩ色素ターミネーター化学を用いてこれらの精製したＤＮＡサンプルをシークエンシングした。ＡＢＩ３７７機械上でＡＢＩ色素ターミネーター配列解読を行い、データを直接ＵＮＩＸ機械に移し、続いてゲルのレーントラッキングを行った。全ての読みをＰＨＲＡＰ(P.Green、Abstracts of DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop V、1996年1月、157頁)を用いてデフォルトパラメーターおよびクオリティースコアでアセンブルを行った。最初のアセンブリは６倍被覆で行い、平均８から１５コンティグが得られた。最初のアセンブリの後、失くした相手（一本鎖の読みのみを提供したクローンからの配列）を同定し、ＡＢＩ技術でシークエンシングしてさらなる重複コンティグの同定を可能にした。ウォーキングのためのプライマーをGenome TherapeuticsプログラムＰｉｃｋプライマーを用いてクローンの末端近くで選択してギャップの閉鎖を促進した。これらのウォークを選択したクローンおよびプライマーを用いてシークエンシングした。データをＰＨＲＡＰで配列コンティグに再アセンブルした。
【０１７６】
ＩＸ．コンピューター法による遺伝子同定
ＢＡＣ配列のコンティグへのアセンブリの後、コンティグをコンピューター解析に供し、コード化領域および公知の遺伝子に類似するＤＮＡ配列を担持する領域を同定した。このプロトコルには以下の工程が含まれた。
【０１７７】
１．コンティグのデギャップ：配列コンティグはしばしば、個々のＡＢＩ配列の読みが挿入されているかまたは欠失している位置を表す記号（ピリオドの記号で印が付けられている）を含んでいる。コンティグの自動コンピューター解析の前に、ピリオドを除去した。元来のデータは後で参照するために保持した。
【０１７８】
２．クロスマッチプログラムを用いて配列内のＢＡＣベクター配列を「マスキング」した(Phil Green、<http://chimera.biotech.washington.edu/UWGC>)。前記で詳記したショットガンライブラリー構築によりショットガンライブラリーにいくつかのＢＡＣベクターが残るので、このプログラムを用いてＢＡＣコンティグの配列をＢＡＣベクターと比較し、次の工程の前にいずれかのベクター配列をマスキングした。マスキングされた配列を配列ファイルで「Ｘ」と印を付け、続く分析の間不活性のままであった。
【０１７９】
３．ＢＡＣ配列を夾雑する大腸菌配列を、ＢＡＣコンティグを全大腸菌ＤＮＡ配列と比較することによりマスキングした。
【０１８０】
４．ヒトゲノムに一般的であることが解っている反復エレメントを、クロスマッチを用いてマスキングした。このクロスマッチの実行において、ＢＡＣ配列をヒト反復エレメントのデータベースと比較した(Jerzy Jerka,Genetic Information Research Institute,Palo Alto、カリフォルニア州)。マスキングした反復をＸで印を付け、そして続く分析の間不活性のままであった。
【０１８１】
５．ＭＺＥＦコンピュータープログラムを用いて配列内のエクソンの位置を予測した(Zhang、Proc.Natl.Acad.Sci.94:565-568(1997))。
【０１８２】
６．Blastn2アルゴリズム(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて配列を公に利用可能なユニジーンデータベース(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine、38A、8N905、8600 Rockville Pike、Bethesda、メリーランド州 20894;www.ncbi.nlm <http://www.ncbi.nlm>.nih.gov)と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０（ここでＥは予測される可能性スコアカットフであり、Ｖは結果の報告時にリターンしたデータベースエントリーの数であり、Ｂは結果の報告時にリターンした配列アラインメントの数である(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)))であった。
【０１８３】
７．６個の読み枠全てに関して配列をタンパク質に翻訳し、タンパク質配列をGenpept Swissport PIR(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine、38A、8N905、8600 Rockville Pike、Bethesda、メリーランド州 20894;www.ncbi.nlm.nih.gov)からコンパイルされた非重複性タンパク質データベースと比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８４】
８．ＢＡＣ  ＤＮＡ配列をblastn2(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて、直接選択実験（以下で記載する）から誘導したｃＤＮＡクローンのデータベースと比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝２５０、Ｂ＝２５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８５】
９．ＢＡＣ配列をblastn2(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて、染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域からのその他の全てのＢＡＣの配列と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８６】
１０．ＢＡＣ配列をblastn2(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて、染色体１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域からのＢＡＣの末端から誘導した配列と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８７】
１１．ＢＡＣ配列をblastn2(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて、Genbankデータベース(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine、38A、8N905、8600 Rockville Pike、Bethesda、メリーランド州 20894;www.ncbi.nlm.nih.gov)と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８８】
１２．ＢＡＣ配列をblastn2(Altschulら、(1997))を用いて、Genbankデータベース(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine、38A、8N905、8600 Rockville Pike、Bethesda、メリーランド州 20894;www.ncbi.nlm.nih.gov)のＳＴＳ部門と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝５０、Ｂ＝５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１８９】
１３．ＢＡＣ配列をblastn2(Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))を用いて、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）Ｇｅｎｂａｎｋデータベース(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine、38A、8N905、8600 Rockville Pike、Bethesda、メリーランド州 20894;www.ncbi.nlm.nih.gov)と比較した。この検索のためのパラメーターは、Ｅ＝０．０５、Ｖ＝２５０、Ｂ＝２５０であり、ここでＥ、Ｖ、およびＢは前記で定義したとおりである。
【０１９０】
Ｘ．直接ｃＤＮＡ選択による遺伝子同定
１次リンカー結合ｃＤＮＡプールを骨髄、頭蓋冠、大腿骨、腎臓、骨格筋、精巣および脳全体から調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを頭蓋冠および大腿骨組織から調製し(Chomczynskiら、Anal.Biochem.162:156-159(1987);D’Alessioら、Focus、9:1-4(1987))、ｍＲＮＡの残りをClontech(Palo Alto、カリフォルニア州)から購入した。同一組織からオリゴ（ｄＴ）およびランダムにプライミングされたｃＤＮＡプールを作製するために、一方の反応でｍＲＮＡ  ２．５μｇをオリゴ（ｄＴ）プライマーと混合し、他方の内で下線を付している反応でｍＲＮＡ  ２．５μｇをランダムヘキサマーと混合し、双方を製造者の推奨(Life Technologies、Bethesda、メリーランド州)に従って第１および第２鎖ｃＤＮＡに変換した。対形成したリン酸化ｃＤＮＡリンカー（以下の配列参照）を１：１の比率（各々１０μｇ）で混合することにより一緒にアニーリングし、６５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却した。
【０１９１】
対形成したリンカーオリゴ１／２
OLIGO 1: 5’CTGAGCGGAATTCGTGAGACC3’ (SEQ ID NO:12)
OLIGO 2: 5’TTGGTCTCACGTATTCCGCTCGA3’ (SEQ ID NO:13)
対形成したリンカーオリゴ３／４
OLIGO 3: 5’CTCGAGAATTCTGGATCCTC3’ (SEQ ID NO:14)
OLIGO 4: 5’TTGAGGATCCAGAATTCTCGAG3’ (SEQ ID NO:15)
対形成したリンカーオリゴ５／６
OLIGO 5: 5’TGTATGCGAATTCGCTGCGCG3’ (SEQ ID NO:16)
OLIGO 6: 5’TTCGCGCAGCGAATTCGCATACA3’ (SEQ ID NO:17)
対形成したリンカーオリゴ７／８
OLIGO 7: 5’GTCCACTGAATTCTCAGTGAG3’ (SEQ ID NO:18)
OLIGO 8: 5’TTGTCACTGAGAATTCAGTGGAC3’ (SEQ ID NO:19)
対形成したリンカーオリゴ１１／１２
OLIGO 11: 5’GAATCCGAATTCCTGGTCAGC3’ (SEQ ID NO:20)
OLIGO 12: 5’TTGCTGACCAGGAATTCGGATTC3’ (SEQ ID NO:21)
【０１９２】
製造者(Life Technologies、Bethesda、メリーランド州)の指示書に従って、全てのオリゴ（ｄＴ）およびランダムプライミングしたｃＤＮＡプール（以下を参照）にリンカーをライゲートした。
【０１９３】
オリゴ（ｄＴ）および骨髄から調製したランダムプライミングしたｃＤＮＡプールにオリゴ１／２をライゲートした。オリゴ（ｄＴ）および頭蓋冠から調製したランダムプライミングしたｃＤＮＡプールにオリゴ３／４をライゲートした。オリゴ（ｄＴ）ならびに脳および骨格筋から調製したランダムプライミングしたｃＤＮＡプールにオリゴ５／６をライゲートした。オリゴ（ｄＴ）および腎臓から調製したランダムプライミングしたｃＤＮＡプールにオリゴ７／８をライゲートした。オリゴ（ｄＴ）および大腿骨から調製したランダムプライミングしたｃＤＮＡプールにオリゴ１１／１２をライゲートした。
【０１９４】
各々１：１、１：１０および１：１００希釈のライゲーション反応物１μｌを用いてＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡプールを長さの分布に関して評価した。Perkin Elmer 9600でＰＣＲ反応を実施し、反応物２５μｌ容量はＤＮＡ  １μｌ、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２００ｍＭ  各ｄＮＴＰ、１０μＭ  プライマーおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer)１単位を含有し、以下の条件下で増幅された。９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で２分間の３０サイクル。増幅されたｃＤＮＡプールの長さの分布を１％アガロースゲル上で電気泳動により評価した。ランダムプライミングおよびオリゴ（ｄＴ）プライミングされたｃＤＮＡプールを最もよく提示するＰＣＲ反応を拡大して、各ｃＤＮＡプール〜２−３μｇを生成した。直接選択反応のための出発ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライミングされたｃＤＮＡ  ０．５μｇと混合したランダムプライミングされたｃＤＮＡ  ０．５μｇを含んでなった。
【０１９５】
直接ｃＤＮＡ選択手順で用いられた５４ＢＡＣからのＤＮＡをNucleobond AXカラムを用いて製造者(The Nest Group,Inc.)により記載されるように単離した。
【０１９６】
ＢＡＣを等モル量でプールし、製造者(Boehringer Mannheim)の指示書に従ってニック翻訳により単離されたゲノムＤＮＡ  １μｇをビオチン１６−ＵＴＰで標識した。当業者に実施できる方法によりビオチンの組み込みをモニター観察した(Del MastroおよびLavett、Methods in Molecular Biology(1996),Humana Press Inc.,ニュージャージー州)。
【０１９７】
当業者に実施できる方法を用いて直接ｃＤＮＡ選択を実施した(Del MastroおよびLavett、Methods in Molecular Biology(1996),Humana Press Inc.,ニュージャージー州)。簡単には、２つの別個の反応でｃＤＮＡプールを多重化した。一方の反応では骨髄、頭蓋冠、脳および精巣からのｃＤＮＡプールを混合し、他方では骨格筋、腎臓および大腿骨からのｃＤＮＡプールを混合した。ｃＤＮＡプールでは反復、酵母配列およびプラスミドの抑制をコット２０まで実施した。ビオチン化ＢＡＣ  ＤＮＡ１００ｎｇを抑制されたｃＤＮＡと混合し、コット２００まで溶液中でハイブリダイズさせた。ビオチン化ＤＮＡおよび同族ｃＤＮＡをストレプトアビジンコーティングした常磁性ビーズ上で捕捉した。ビーズを洗浄し、１次選択されたｃＤＮＡを溶出した。これらのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、直接選択の第２ラウンドを実施した。直接選択の第２ラウンドの生成物を２次選択された材料と称する。以前に１１ｑ１２−１３(Evans、Genomics 18:473-477(1993))にマッピングされることが示されたガラニンｃＤＮＡクローンを用いて選択の２つのラウンドの間の富化をモニター観察した。
【０１９８】
骨髄、頭蓋冠、大腿骨、腎臓、骨格筋、精巣および全脳からの２次選択材料を以下に示すオリゴ１、３、５、７および１１の修飾プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、製造者の推奨に従ってＵＤＧベクターｐＡＭＰ１０(Life Technologies、Bethesda、メリーランド州)にクローン化した。
【０１９９】
修飾されたプライマー配列：
Oligo1-CUA: 5’CUACUACUACUACTGAGCGGAATTCGTGAGACC3’ (SEQ ID NO:22)
Oligo3-CUA: 5’CUACUACUACUACTCGAGAATTCTGGATCCTC3’ (SEQ ID NO:23)
Oligo5-CUA: 5’CUACUACUACUATGTATGCGAATTCGCTGCGCG3’ (SEQ ID NO:24)
Oligo7-CUA: 5’CUACUACUACUAGTCCACTGAATTCTCAGTGAG3’ (SEQ ID NO:25)
Oligo11-CUA: 5’CUACUACUACUAGAATCCGAATTCCTGGTCAGC3’ (SEQ ID NO:26)
【０２００】
各組織供給源からのクローン化された２次選択された材料を、MAX Efficiency DH5aコンピテント細胞(Life Technologies、Bethesda、メリーランド州)に、製造者に推奨されるように形質転換した。各々の形質転換された供給源から３８４個のコロニーを採取し、９６ウェルマイクロタイタープレートに整列させた。
【０２０１】
全ての２次選択されたｃＤＮＡクローンをＭ１３色素プライマー・ターミネーター・サイクル・シークエンシングキット(Applied Biosystems)を用いてシークエンシングし、ＡＢＩ３７７自動蛍光シークエンサー(Applied Biosystems)によりデータを収集した。
【０２０２】
全配列をＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＡプログラムを用いて分析した(Altschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)、Altschulら、Nucl.Acids.Res.25:3389-3402(1997))。ｃＤＮＡ配列をヒト反復、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、大腸菌ＤＮＡに由来する配列を含有するデータベースと比較し、クロスマッチプログラムを用いてデータセットからバックグラウンドクローンを除去した。既知遺伝子(Genbank)およびＨＢＭ領域に由来するＢＡＣ配列に対するＢＬＡＳＴＮ２プログラムを用いて比較の別のラウンドをも実施した。結果およびさらなる分析のためにデータベースに蓄えられたデータに従って、これらの配列に対して＞９０％相同であるｃＤＮＡをファイリングした。同定されたが、ＨＢＭ領域に由来するＢＡＣ配列に対して有意な類似性を有さなかったか、またはクロスマッチにより排除されたｃＤＮＡ配列を、ＨＢＭ領域からのＢＡＣを含有するナイロン膜にハイブリダイズさせて、これらが標的にハイブリダイズするかどうかを確認した。
【０２０３】
ハイブリダイゼーション分析を用いてｃＤＮＡクローンを、それを選択するＢＡＣ標的にマッピングした。ＨＢＭ領域から同定されたＢＡＣを整列させ、９６ウェルマイクロタイタープレートで成長させた。２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地を９６ウェルマイクロタイタープレートのリッドに注いだ。一度寒天が固化すると、プレカットＨｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ナイロン膜(Amersham)を寒天の上部に置き、手持ち型の９６ウェルレプリカプレーター(V&P Scientific,Inc.)を用いてＢＡＣを膜上に２通りずつスタンプした。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。製造者の推奨に従って膜を処理した。
【０２０４】
ハイブリダイゼーションによりマッピングする必要があるｃＤＮＡをそのクローンを増幅するのに適切なプライマー（オリゴ１、３、５、７および１１）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅のために、プライマーを修飾して、リンカー処理されたジゴキシゲニン分子をオリゴヌクレオチドの５’で含有するようにした。ｃＤＮＡプール（前記）の調製にて記載したのと同一の条件下でＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ反応物の５μｌを負荷することにより１％アガロースゲル上での電気泳動によりＰＣＲ産物を品質および量に関して評価した。ハイブリダイゼーション溶液（５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．５Ｘ  Ｂｌｏｔｔｏ、２．５％ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍｌが入った５０ｍｌコニカルチューブ中でスタンプされたＢＡＣを含有するナイロン膜を個々にプレハイブリダイズした。５０ｍｌコニカルチューブをロティサリー・オーブン（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に６５℃で２時間置いた。各ｃＤＮＡプローブ２５ｎｇを変性し、そしてナイロン膜およびハイブリダイゼーション溶液が入った個々の５０ｍｌコニカルチューブに加えた。６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施した。以下の溶液の各々を用いて６５℃で２０分間、フィルターを洗浄した。３ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ；１ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳおよび；０．１ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ。
【０２０５】
５０ｍｌコニカルチューブから膜を取り出し、皿に置いた。各膜の間にアセテートシートを置き、互いに貼り付くのを防いだ。製造者(Boehringer Mannheim)の推奨に従って膜を抗ＤＩＧ−ＡＰおよびＣＤＰ−Ｓｔａｒと共にインキュベートした。膜をサランラップで包み、Ｋｏｄａｋ  Ｂｉｏ−Ｍａｘ  Ｘ線フィルムに１時間暴露した。
【０２０６】
ＸＩ．ｃＤＮＡクローニングおよび発現分析
直接ｃＤＮＡ選択およびゲノムＤＮＡシークエンシングにより同定された遺伝子の発現を、公に利用可能なデータベースと比較して特徴付けするために、一連の実験を実施してＨＢＭ領域の遺伝子をさらに特徴付けした。最初にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用するために、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、またはゲノムＤＮＡの部分をＤＮＡ分子のプール（ｃＤＮＡライブラリー）またはＲＮＡ集団（ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥ）から増幅できるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡを含有する反応物においてＰＣＲプライマーを使用して、ゲノム（ＢＡＣ）配列に基づいて予測される大きさの産物が作製されることを確認した。次いで多くのｃＤＮＡライブラリーを特異的ｃＤＮＡまたはＥＳＴの存在に関して試験した。特定のｃＤＮＡライブラリーにおける転写ユニットのフラグメントの存在により、同一転写ユニットの別の部分が同様に存在する可能性が高いことが示される。
【０２０７】
新規の遺伝子を特徴付けするのに必要とされるデータの重要な部分は、プロセシングされた転写物またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のヌクレオチドの長さである。当業者はｍＲＮＡの長さを主にノーザンブロットハイブリダイゼーション(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1989))により決定する。重要な領域のシークエンシングされたＢＡＣに有意な配列類似性を展示するＥＳＴ群および直接選択されたｃＤＮＡクローンを便宜上およそ３０キロ塩基のユニットにグループ分けした。各３０キロ塩基のユニット内に、１つまたはそれ以上の独立した転写ユニットを含む１から５０個までのＥＳＴおよび直接選択されたｃＤＮＡクローニングがあった。市販により入手可能な試薬(Multiple Tissue Northern blot;Clontech,Palo Alto、カリフォルニア州)を用いて製造者に推奨される条件下で、１つまたはそれ以上のＥＳＴまたは直接選択されたｃＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブとして用いて種々の組織のｍＲＮＡの長さを決定した。
【０２０８】
大腿骨および頭蓋冠骨組織から志向的にクローン化されたｃＤＮＡライブラリーを当業者に周知の方法（例えばSoares、in Automated DNA Sequencing and Analysis、Adams,FieldsおよびVenter編、Academic Press,ニューヨーク州、110-114頁、(1994))により構築した。最初に骨をハンマーで断片に破砕し、小片を液体窒素中で凍結し、組織パルベライザー(Spectrum Laboratory Products)で粉末まで小さくした。ポリトロンホモジナイザー(Brinkman Instruments)を用いて標準的な酸グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出バッファー(例えばChomczynskiおよびSacchi、Anal.Biochem.162:156-159(1987))で粉末化された骨をホモジナイズすることにより、粉末化された骨からＲＮＡを抽出した。加えて、ヒト脳および肺全ＲＮＡをClontechから購入した。ダイナビーズｄＴを用いて、製造者の推奨に従って(Dynal,Inc.)ポリＡ  ＲＮＡを全ＲＮＡから単離した。配列：5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEQ ID NO:27)のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始した。このプライマーをｃＤＮＡの３’末端でNotI制限部位（下線部）を導入した。「ワンチューブ」ｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造者(Life Technologies,Bethesda、メリーランド州)に記載されるように、第１および第２鎖合成を実施した。二本鎖ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、分子の末端が平滑であり(Soares、in Automated DNA Sequencing and Analysis、Adams、FieldsおよびVenter編、Academic Press、ニューヨーク州、110-114頁(1994))、次に平滑末端ｃＤＮＡがＢｉｏｇｅｌカラム(Huynhら、DNA Cloning、1巻、Glover編、IRL Press、Oxford、49-78頁、(1985))により、またはｓｉｚｅ−ｓｅｐ４００セファロースカラム(Pharmacia、カタログ番号27-5105-01)を用いて大きさで選択されることを確実にした。４００塩基対またはそれ以上の長さのｃＤＮＡのみを次の行程で使用した。次いで当分野で周知の方法により(Soares、1994)、ＥｃｏＲＩアダプター（配列：５’ＯＨ−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−ＯＨ３’（配列番号２８）および５’ｐ−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−ＯＨ３’（配列番号２９））を二本鎖ｃＤＮＡにライゲートした。次いでNotIで消化することによりｃＤＮＡの３’末端からＥｃｏＲＩアダプターを除去した(Soares、1994)。次いでｃＤＮＡをプラスミドベクターpBluescript（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋にライゲートし(Stratagene、La Jolla、カリフォルニア州)、そして当業者に周知のエレクトロポレーション法によりライゲートされた材料を大腸菌ＤＨ１０ＢまたはＤＨ１２Ｓに形質転換した(Soares、1994)。３７℃で一晩成長させた後、Mega-prepキット(Qiagen,Chatsworth、カリフォルニア)に関して指示されるように処理することによりプレートを擦り取った後、大腸菌コロニーからＤＮＡを回収した。１次形質転換体の全数の一部を計数し、そして平均のインサートの大きさおよびｃＤＮＡインサートを含まないプラスミドのパーセンテージを決定することによりｃＤＮＡライブラリーの品質を推定した。さらなるｃＤＮＡライブラリー（ヒト全脳、心臓、腎臓、白血球、および胎児脳）をLife Technologies、Bethesda,メリーランド州から購入した。
【０２０９】
オリゴ（ｄＴ）およびランダムヘキサマー（Ｎ６）の双方でプライミングされたｃＤＮＡライブラリーを用いて、ＨＢＭ領域：ヒト骨、ヒト脳、ヒト腎臓およびヒト骨格筋（骨格筋（ｄＴ）および腎臓（ｄＴ）ｃＤＮＡライブラリー以外は、全てのｃＤＮＡライブラリーが発明者により作製された）内に転写されたｃＤＮＡクローンを単離するために使用した。各々のｃＤＮＡライブラリーの４つの１０ｘ１０アレイを以下のように調製した。１次形質転換体を用いてｃＤＮＡライブラリーを２．５ｘ１０６に力価を調節した。適当な容量の凍結ストックを用いてＬＢ／アンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）２ｌを接種した。この接種した液体培養を各々４ｍｌの４００本のチューブに等分した。各チューブにはおよそ５０００ｃｆｕが入っていた。チューブを３０℃で一晩穏やかに振盪しながらインキュベートした。培養物をＯＤ０．７から０．９まで成長させた。培養物の各々に関して等分した培養物１００μｌおよび８０％グリセロール３００μｌにより凍結ストックを調製した。ストックをドライアイス／エタノール浴中で凍結させて−７０℃で貯蔵した。残りの培養物はQiagen(Chatsworth、カリフォルニア州)スピン・ミニプレップ・キットを用いて製造者の指示に従って調製されたＤＮＡであった。４００培養物からのＤＮＡをプールして８０カラムを作り、そしてプールを整列させた。ＰＣＲにより目的のＨＢＭ  ｃＤＮＡのクローンを含有するようにｃＤＮＡライブラリーを決定した。推定されるエクソンを増幅するためにマーカーを設計した。一度標準的なＰＣＲ最適化を実施し、そして特異的ｃＤＮＡライブラリーを目的のｃＤＮＡクローンを含有するように決定すると、マーカーを使用して整列させたライブラリーをスクリーニングした。同一マーカーを用いる第２のＰＣＲにより、ｃＤＮＡクローンの存在を示す陽性アドレスを確認した。
【０２１０】
一度ＨＢＭ領域に由来する目的の特異的転写物に相当するｃＤＮＡクローンを含有する可能性があるようにｃＤＮＡライブラリーを同定すると、ＥＳＴまたは直接選択された目的のｃＤＮＡに同等なｃＤＮＡインサートを含有するクローンまたは複数のクローンを単離するように操作した。標準的な「コロニースクリーニング」法の変法(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989))によりこれを達成した。具体的には、２０個の１５０ｍｍ  ＬＢ＋アンピシリン寒天プレートにｃＤＮＡライブラリーの２００００コロニー形成ユニット（ｃｆｕ）を広げ、そしてコロニーを３７℃で一晩成長させた。コロニーをナイロンフィルター(AmerchamのHybondまたは等価物)に移し、そして本質的には記載されているように(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989))２つのフィルターを一緒に通過させることにより２通りずつ調製した。次いで「マスター」プレートをさらに６から８時間インキュベートしてコロニーを再び成長させた。次いでフィルターを連続して変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で２分間、中和溶液（０．５Ｍ  トリスＣｌ、ｐＨ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で２分間（２回）処理することにより細菌コロニーに由来するＤＮＡをナイロンフィルターに貼り付けた。２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの溶液で１分間洗浄し、その上ティッシュペーパーでふき取ることにより細菌コロニーをフィルターから除去した。フィルターを空気乾燥し、そして真空化８０℃で１から２時間焼いた。
【０２１１】
ランダムヘキサマー標識(FinebergおよびVogelstein、Anal.Biochem.132:6-13(1983))によるか、または反応に遺伝子特異的プライマーを含めランダムヘキサマーを含めないことにより（小型フラグメント用）ｃＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを調製した。特異活性を算出し、そして＞５ｘ１０８ｃｐｍ／１０８μｇ  ｃＤＮＡであった。次いでコロニー膜を１０ｍＭ  トリスＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間予備洗浄した。予備洗浄の後、フィルターを６Ｘ  ＳＳＣ＞２ｍｌ／フィルター、５０％脱イオン化ホルムアミド、２％ＳＤＳ、５ｘデンハート溶液、および１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで、４２℃で３０分間プレハイブリダイゼーションした。次いでフィルターを変性α３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプローブを含有するハイブリダイゼーション溶液（６ｘＳＳＣ、２％ＳＤＳ、５ｘデンハート溶液、および１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）に移し、そして４２℃で１６から１８時間インキュベートした。
【０２１２】
１６から１８時間のインキュベーションの後、２Ｘ  ＳＳＣ、２％ＳＤＳ中、常に振盪しながら、室温で２０分間フィルターを洗浄し、続いて各々を６５℃、１５分間で２回洗浄した。２回目の洗浄は０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６５℃で１５分間実施した。次いでフィルターをプラスチックラップで包み、そしてＸ線写真フィルムに数時間から一晩暴露した。フィルムを現像した後、プレート上の個々のコロニーをオートラジオグラフプレート上で整列させて、アンピシリン含有ＬＢブロスの溶液１ｍｌに採取した。３７℃で１から２時間振盪した後、溶液のアリコートを２次スクリーニング用に１５０ｍｍプレートに載せた。２次スクリーニングは、個々のコロニーが採取用に明確に同定されるように、〜２５０個のコロニーを含有するプレートで実施したこと以外は、１次スクリーニング（前記）と同一であった。
【０２１３】
放射線標識プローブでスクリーニングしたコロニーがｃＤＮＡクローンを生じた後、制限エンドヌクレアーゼ切断、ＰＣＲおよび直接シークエンシングによりクローンを特徴付けして、元来のプローブと単離されたクローンの間の配列同一性を確認した。全長ｃＤＮＡを得るために、同定されたクローンの末端からの新規の配列を用いてライブラリーを再度プローブした。ノーザンブロット分析によりｃＤＮＡクローンの長さが全長であることが推定されるまで、この方法を繰り返した。
【０２１４】
全長クローンを単離するための別の方法としてＲＴ−ＰＣＲを用いた。ｃＤＮＡを合成し、そして「Superscript One Step RT-PCR」キット(Life Technologies,Gaithersburg、メリーランド州)を用いて増幅した。手順にはＲＮＡ  １．５μｇを以下のものに添加することが含まれた。ＭｇＳＯ４およびｄＮＴＰを伴う専用バッファーミックスである提供された反応物ミックス２５μｌ、センスプライマー（１０μＭ）１μｌおよび抗センスプライマー（１０μＭ）１μｌ、逆転写酵素１μｌ、並びに提供されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼミックス、ならびに加圧滅菌水で反応物ミックス全量を５０μｌにする。次いで反応物をサーモサイクラー内に置いて、予測される生成物のキロ塩基あたり５０℃で１５から３０分、次いで９４℃で１５秒間、５５から６０℃で３０秒間および６８から７２℃で１分間の１サイクル、そして最終的に７２℃で５から１０分間の１サイクルであった。サンプルをアガロースゲル上で分析した。生成物をゲルから切除し、そしてゲル(GeneClean、Bio  101)から精製した。精製された生成物をｐＣＴＮＰ(General Contractor DNA Cloning System、5Prime-3Prime,Inc.)にクローン化し、そしてシークエンシングしてクローンが目的の遺伝子に対して特異的であったことを確認した。
【０２１５】
候補遺伝子の５’および３’末端をクローニングする方法として、Marathon  ｃＤＮＡ増幅キット(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)を用いて、製造者の指示に従ってｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施した。第１鎖合成を実施することにより全ＲＮＡからｃＤＮＡプールを調製し、ここで全ＲＮＡサンプルのサンプルを修飾オリゴ（ｄＴ）プライマーと混合し、７０℃まで加熱し、氷上で冷却し、そして続いて以下のものを添加した。５ｘ第１鎖バッファー、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、およびＡＭＶ  逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）。チューブを４２℃で１時間インキュベートし、そして次に反応物チューブを氷上に置いた。第２鎖合成に関しては、以下の成分：５ｘ第２鎖バッファー、１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、滅菌水、２０ｘ  第２鎖酵素カクテルを直接反応チューブに加え、そして反応チューブを１６℃で１．５時間インキュベートした。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを反応チューブに加え、そして１６℃で４５分間インキュベートした。ＥＤＴＡ／グリコーゲンミックスを添加して第２鎖合成を停止させた。サンプルをフェノール／クロロホルム抽出および酢酸アンモニウム沈殿に供した。大きさの分布に関してアガロースゲル上で分析することによりｃＤＮＡプールを品質に関して検査した。次いでMarathon  ｃＤＮＡアダプター(Clontech)をｃＤＮＡ末端にライゲートした。特異的アダプターは５’または３’末端の増幅を可能にするプライミング部位を含有し、選択した遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）の配向に依存した。二本鎖ｃＤＮＡのアリコートを以下の試薬に添加した。１０μＭ  Marathon  ｃＤＮＡアダプター、５ｘ  ＤＮＡライゲーションバッファー、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ。反応物を１６℃で一晩インキュベートした。反応物を加熱して不活性化し、反応を停止させた。以下のものを希釈した二本鎖ｃＤＮＡプールに添加することによりＰＣＲを実施した。１０ｘ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応バッファー、１０μＭ  ｄＮＴＰミックス、１０μＭ  ＧＳＰ、１０μＭ  ＡＰ１プライマー（キット）、５０ｘ  Advantage ｃＤＮＡポリメラーゼミックス。熱循環条件は９４℃３０秒間、５サイクルの９４℃５秒間、７２℃４分間、５サイクルの９４℃５秒間、７０℃４分間、２３サイクルの９４℃５秒間、６８℃４分間。ＰＣＲの最初のラウンドの後、ＧＳＰを用いて実施してアダプターの末端を伸長してアダプタープライマー結合部位を作製し、目的の特異的ｃＤＮＡの指数関数的増幅を観察した。通常第２のネステッドＰＣＲを実施して特異的ｃＤＮＡを確認する。ＲＡＣＥ産物をアガロースゲル上で分析し、そして次に切除してゲルから精製した(GeneClean、BIO 101)。次にＲＡＣＥ産物をｐＣＴＮＲ(General Contractor DNA Cloning System、5’-3’,Inc.)にクローン化し、そして該クローンを確認するために決定したＤＮＡ配列は目的の遺伝子に特異的であった。
【０２１６】
ＸＩＩ．変異分析
前記の手順を用いて比較遺伝子を同定し、各遺伝子からのエクソンを変異検出分析に供した。比較ＤＮＡシークエンシングを用いて染色体１１ｑ１２−１３からＨＢＭ候補遺伝子における多型性を同定した。候補遺伝子のＤＮＡ配列を患者のリンパ芽球腫細胞株から増幅した。
【０２１７】
発明者は原因である多型性を検索するための候補領域から増幅したＰＣＲ産物の直接ＤＮＡシークエンシングの分析に基づく方法を開発した。手順は、多型性の分離を見出すためのＨＢＭファミリーの異なるサブセットおよび多型性の頻度を評価するための集団パネルを用いる３つの段階から成った。ファミリーリソースは罹患した全ての個体が同一の原因多型性を共有するという仮定に至る１人の創始者から導かれる。
【０２１８】
最初、発端者、娘および彼女の母親、父親および兄弟から成るＨＢＭファミリーのサブセットにおいて候補領域をスクリーニングした。同時に単一染色体参照配列を生成し、比較に用いた。母親および娘がこの核ファミリーでＨＢＭ多型性を担持し、多型性の伝達をモニター観察する能力を提供した。最終結果は、２個のＨＢＭ染色体および６個の非ＨＢＭ染色体がスクリーニングされたということである。これにより多くの頻出する対立遺伝子の切除が可能になった。罹患した個体に独占的に存在する対立遺伝子のみが分析の次のレベルまで通過した。
【０２１９】
次いでこの元来のファミリーにおいてＨＢＭ表現型で独占的に分離された多型性を、２つの別の核ファミリーから成るＨＢＭ家系の拡張された部分において再試験した。これらのファミリーは５人のＨＢＭおよび３人の非罹患個体から成る。この群のＨＢＭ個体は２つの重要なクロスオーバー個体を含み、重要な領域のセントロメアおよびテロメア境界を提供する。これらの個体と罹患したその親の間の多型性の遺伝をトラッキングすることにより、重要な領域をさらに絞り込むことが可能になった。この群ではスクリーニングしてＨＢＭ全染色体が７個に、そして非ＨＢＭ全染色体が１７個になった。
【０２２０】
所定の多型性が拡張された群においてＨＢＭ表現型で独占的に分離を続けた場合、次いで集団パネルを試験した。８４人のこのパネルは正常な骨ミネラル密度を有していることが解っている４２人の個体、および関連性はないが類型的でない骨ミネラル密度であることが解っている４２人の個体から構成された。この目的で、正常な骨ミネラル密度はＢＭＤ  Ｚスコア０の２標準偏差内である。第２の群は広く用いられている個体のＣＥＰＨパネルからであった。この集団において稀に見出されたいずれかの分離多型性を、続いて全ＨＢＭ家系およびさらに大きな集団において試験した。
【０２２１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＨＢＭファミリーのＤＮＡおよび単一染色体対照からシークエンシング鋳型を作成した。１１ｑ１２−１３上のＨＢＭ領域内の遺伝子の酵素的増幅を、各エクソンおよび各遺伝子の推定５’制御エレメントをフランキングするオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲで達成した。プライマーを選択して、各エクソンおよびスプライシングのいずれかの側の各イントロン内の１５またはそれ以上の塩基対を増幅した。全てのＰＣＲプライマーをキメラとして作製し、色素プライマーシークエンシングを促進した。合成中にＭ１３−２１Ｆ（５’−ＧＴＡ  Ａ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’）（配列番号３０）および−２８ＲＥＶ（５’−ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’）（配列番号３１）プライマー結合部位を各順行性および逆行性ＰＣＲプライマーの５’末端に各々構築した。ＡｍｐｌｉＴａｑ  ２Ｕ、５００ｎＭ  プライマーおよび１２５μＭ  ｄＮＴＰを含むＰＣＲ  ５０μｌ中ゲノムＤＮＡ  １５０ｎｇを使用した。バッファーおよび循環条件は各プライマーセットに特異的であった。TaqStart抗体(Clontech)を出発ＰＲに使用してプライマーダイマー形成を最低限にした。１０％生成物をアガロースゲル上で試験した。シークエンシング前に適当なサンプルを脱イオン水で１：２５に希釈した。
【０２２２】
標準的なEnergy Transferプライマー(Amercham)プロトコルに従って各ＰＣＲ産物をシークエンシングした。全反応を９６ウェルトレイで行った。４つの別個の反応、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに関して１つずつを各鋳型に関して実施した。各反応はシークエンシング反応ミックス２μｌ、および希釈した鋳型３μｌを含んだ。次いでプレートをホイルテープでヒートシールし、サーマル・サイクラー内に置き、製造者の推奨に従って循環させた。循環後、４つの反応物をプールした。プールした生成物３μｌを新たな９６ウェルプレートに移し、製造者の負荷色素１μｌを各ウェルに加えた。９６ウェル全てのピペッティング手順をＨｙｄｒａ  ９６  ピペッティング・ステーション(Robbins Scientific、米国)で行った。プールした材料１μｌをＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシークエンサーで２．４ｋＶ実行で１０時間作動する４８レーンゲルに直接負荷した。
【０２２３】
Polyphred(Washington大学)を用いてConsed(Washington大学)で表示するために配列セットをアセンブルした。全ての関係するファミリーのメンバーおよび特定の標的領域の対照を提示する群で配列をアセンブルした。これを３段階の各々に関して別個に行った。順行性および逆行性の読みを単一染色体鋳型および着色した参照配列からの読みと一緒に各個体に関して包括した。Polyphredは紫色のフラッグで可能性のある多型性部位を示した。２つのリーダーは別個に各アセンブリを表示し、紫色のフラッグを付した部位の正当性を評価した。
【０２２４】
成熟ｍＲＮＡに存在する２３エクソン全ておよび１次転写体のいくつかのその他の部分を、２人のＨＢＭ罹患および２人の非罹患個体の核ファミリーのヘテロ接合性に関して評価した。以下の表に示すように２５個のＳＮＰを同定した。
【０２２５】
【表４】
2005511002.tif 000009
【０２２６】
表４で示した多型性に加えて、２つのさらなる多型性が配列番号２にも存在し得る。これらは配列番号２の２００２位置における変化である。グアニンまたはアデニンのいずれかがこの位置に現れ得る。この多型性はサイレントであり、そしてアミノ酸配列におけるなんらかの変化は随伴されない。第２の変化はシトシン（Ｃ）のチミン（Ｔ）への変化に相当する配列番号２の４０５９においてである。この多型性の結果、バリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）への対応するアミノ酸変化に至る。別の多型性は候補遺伝子エクソンおよび隣接するイントロン配列において見出された。表４に列挙された多型性のいずれか１つもしくは組み合わせ、または前記で論じた２つもまた、配列番号２に存在した場合に骨量には小さな影響しかないであろう。
【０２２７】
本発明は前記で同定した点変異を有する配列番号１の核酸配列を有する核酸配列を包含する。
【０２２８】
好ましくは、本発明は配列番号２の核酸を包含する。とりわけ、ＬＲＰ５のコード化配列（ＨＢＭ遺伝子）の５８２位置でのＧからＴへ変化する塩基対置換は、全てのＨＢＭ個体のヘテロ接合体として同定され、非罹患個体では見出されなかった（すなわちｂ５２７ｄ１２−ｈ  コンティグ０８７Ｃ  １．ｎｔ）。図５はＢ５２７Ｄ１２におけるコンティグの順序を示す。ＨＢＭ遺伝子に関する転写の方向は左から右である。Ｂ５２７Ｄ１２のコンティグ３０８Ｇの配列はＨＢＭ遺伝子に対するコード化領域の逆相補体である。従って、ＣからＡへの塩基変化置換として表４に示すコンティグ３０８Ｇの相対的多型性は、ＨＢＭ遺伝子のＧからＴへの置換に対する相補体である。この変異はグリシン１７１のバリンとの置換を引き起こす（Ｇ１７１Ｖ）。
【０２２９】
ＨＢＭ多型性は異なる群の個体のＤＮＡ配列を試験することにより確認された。ＨＢＭ家系の全メンバー（３８人の個体）のうち、罹患した（すなわち骨量が上昇している）個体のみ（Ｎ＝１８）からのヘテロ接合体でＨＢＭ多型性が観察された。非罹患親族（Ｎ＝２０）（ＢＭＤＺ＜２．０）では、ＨＢＭ多型性は全く観察されなかった。この多型性がＨＢＭ家系の外側の個体でも観察されたかどうかを決定するために、２９７人の表現型個体をＨＢＭ遺伝子の部位で特徴付けした。ＨＢＭ多型性の部位でヘテロ接合性であったものはいなかった。非表現型対照群では、６４人の個体で５８２位置でのヘテロ接合性が観察されたものはいなかった。これらを考慮して、このデータにより高骨量表現型を表示する家系において観察された多型性がＬＲＰ５遺伝子の位置５８２でのＧ→Ｔ多型性に強く相関することが判明した。さらに、この結果を以下で記載するＡＳＯの結果と合わせて、ＨＢＭ多型性がＨＢＭ表現型と遺伝的に分離され、ＨＢＭ多型性および表現型の双方が一般集団では稀であることが確立された。
【０２３０】
ＸＩＩＩ．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ:Allele specific oligonucleotide）分析
ＨＢＭ多型性を含有するアンプリコンを目的のエクソンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。個体の適切な集団を以下のように９６ウェルマイクロタイタープレートでＰＣＲ増幅した。１Ｘ  Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲバッファー（カタログ番号Ｍ１８８３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有）、１００ｍＭ  ｄＮＴＰ、２００ｎＭ  ＰＣＲプライマー（配列番号６２９−６３０）（１８６３Ｆ：ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣおよび１８６４Ｒ：ＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ）、Ａｍｐｌｉｔａｑ  １単位、およびゲノムＤＮＡ  ２０ｎｇを含有するＰＣＲ反応物（２０μｌ）を調製し、以下のＰＣＲ条件下で増幅した。９４℃で１分間、（９４℃、３０秒間；５８℃、３０秒間；７２℃、１分間  Ｘ３５サイクル）、７２℃、５’分間、４℃を維持。次いで負荷色素を加え、生成物１０μｌを１μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１．５％アガロースゲル上で１００から１５０Ｖで５から１０分間電気泳動した。変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｎ  ＮａＯＨ）中ゲルを２０分間処理し、水で短時間すすいだ。次いでゲルを１Ｍ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．５Ｍ  ＮａＣｌ中で２０分間中和し、水ですすいだ。ゲルを１０Ｘ  ＳＳＣ中に２０分間浸漬し、１０Ｘ  ＳＳＣ中ナイロントランスファー膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋−Ａｍｅｒｓｈａｍ）に一晩ブロッティングした。フィルターを６Ｘ  ＳＳＣで１０分間すすぎ、ＵＶ架橋した。
【０２３１】
ほぼ中央で多型性を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計した。オリゴヌクレオチドは５’末端でリン酸不含であり、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから購入した。オリゴヌクレオチドの配列（配列番号６３１〜６３２）は、
2326 ZMAX.ASO.g: AGACTGGGGTGAGACGC
2327 ZMAX.ASO.t: CAGACTGGGTTGAGACGCC
である。
【０２３２】
多型性ヌクレオチドには下線を付している。オリゴを標識するために、１μｇ／μｌ  ＡＳＯオリゴ（２３２６．ＺＭＡＸ．ＡＳＯ．ｇまたは２３２７．ＺＭＡＸ．ＡＳＯ．ｔ）１．５μｌ、ｄｄＨ２Ｏ  １１μｌ、１０Ｘ  キナーゼ順行性バッファー２μｌ、γ３２Ｐ−ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ミリモル）５μｌ、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ）１μｌを混合し、反応物を３７℃で３０から６０分間インキュベートした。次いで反応物を９５℃で２分間放置し、Ｈ２Ｏ  ３０ｍｌを加えた。Ｇ２５マイクロスピンカラム(Pharmacia)を用いてプローブを精製した。
【０２３３】
５ｘＳＳＰＥ  １０ｍｌ、５Ｘ  デンハート溶液、２％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性ソニケートサケ精子ＤＮＡ中４０℃で２時間ブロットをプレハイブリダイズした。次いでキナーゼ処理したオリゴの全反応物ミックスを新鮮なハイブリダイゼーションバッファー（５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート溶液、２％ＳＤＳ）１０ｍｌに添加し、４０℃で少なくとも４時間から一晩ハイブリダイズした。
【０２３４】
全ての洗浄を５ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで行った。最初の洗浄は４５℃で１５分間であった；次いで溶液を交換し、フィルターを５０℃で１５分間洗浄した。次いでフィルターを２つの増感スクリーニングを有するＫｏｄａｋ  バイオマックス・フィルムに−７０℃で１５分から１時間暴露した。必要な場合、フィルターを５５℃で１５分間洗浄し、再度フィルムに暴露した。沸騰０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中１０分間少なくとも３回洗浄することによりフィルターをストリップ状にした。
【０２３５】
ＡＳＯの対立遺伝子特異的アッセイを最もよくとらえた２つのフィルムをAdobe PhotoShopにスキャンすることによりデジタル画像に変換した。これらの画像をGraphic Converterで互いに積層し、スコア化してFileMaker Pro4.0に保存した（図参照）。
【０２３６】
民族的に多様な集団におけるＨＢＭ対立遺伝子頻度を決定するために、種々の民族群からの６７２人のランダムな個体を対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法により分類した。この集団にはＣＥＰＨ祖父母（本来の白色人種）９６人、白色人種１９２人、アフリカ系アメリカ人１９２人、ヒスパニック系９６人、およびアジア系９６人の個体が含まれた。これらの個体のいずれかのＨＢＭ多型性の存在に関して証拠は得られなかった。全体では、９１１人の個体全員が直接シークエンシングまたはＡＳＯハイブリダイゼーションのいずれかにより分類された。全てＨＢＭ多型性の部位でヘテロ接合性ＧＧであった（図１４）。この情報は、ＨＢＭ対立遺伝子が種々民族集団において希少性であることを説明している。
【０２３７】
従って本発明はＨＢＭ対立遺伝子を有する個体を同定する迅速な方法を提供する。この方法を骨粗鬆症またはその他の骨傷害に対する罹患性に関して個体を診断およびスクリーニングする分野で用いることができる。該アッセイを用いてＨＢＭ対立遺伝子または本明細書で記載した別の多型性を有する別の個体を同定することもできる。
【０２３８】
ＸＩＶ．ＬＲＰ５の細胞局在
非同位体インサイチュ・ハイブリダイゼーションによるラット脛骨における遺伝子発現
Pathology Associates International(PAI)、Frederick、メリーランド州によりインサイチュ・ハイブリダイゼーションを行った。この研究は、骨成長およびリモデリングの分野で特に強調されているラットの骨におけるＬＲＰ５遺伝子を発現する特定の細胞型を決定するために実施した。この研究で用いたＬＲＰ５プローブをヒト（ＨｕＺｍａｘ１）およびマウス（ＭｓＺｍａｘ１）双方のｃＤＮＡから作製し、これは８７％の配列同一性を共有する。ヒトおよびマウスＬＲＰ５とラットＬＲＰ５の相同性は公知である。
【０２３９】
例えば非同位体インサイチュ・ハイブリダイゼーションによる遺伝子発現を以下のとおり実施したが、その他の方法は当業者に公知である。二酸化炭素窒息によって安楽死させた生後６から８週間の雌のSprague Dawleyラット２匹から脛骨を収集した。死後直ぐに遠位末端を除去し、近接した脛骨をＯＣＴ包埋培地中液体窒素で急速凍結した。組織を−８０℃のフリーザ中で貯蔵した。
【０２４０】
ｃＤＮＡからのＰＣＲ産物を増幅するためのプローブ以下のように調製した。ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ産物を増幅するためのプライマーを、ヒトＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＯ１７４９８）およびマウスＬＲＰ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６４９８４）の双方の公開された配列を用いて選択した。ＬＤＬレセプターファミリーの別の遺伝子との交差反応を最低限にするために、ＰＣＲ産物をタンパク質コード化領域の細胞内部分から誘導した。ｃＤＮＡクローンを鋳型として用いて反応容量５０μｌでＰＣＲを実施した。１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ａｍｐｌｉｔａｑ  １単位、２００μＭ  ｄＮＴＰおよび２μＭ  各プライマーを含有した。ＰＣＲ循環条件は９４℃で１分間、続いて９４℃で３０秒間、５５度で３０秒間、７２℃で３０秒間の３５サイクル；続いて７２℃で５分間の伸長であった。次いで１．５％アガロース酢酸トリスゲル上で反応物を流した。ＤＮＡをアガロースから溶出し、エタノール沈殿し、１０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０に再懸濁した。ゲル精製ＰＣＲ産物をマウスおよびヒトｃＤＮＡの双方に関して調製し、インサイチュ・ハイブリダイゼーションのためにPathology Associates Internationalに供給した。
【０２４１】
ヒトおよびマウスＰＣＲプライマーおよび産物の配列は以下のとおりであった。
ヒトＬＲＰ５センスプライマー（配列番号６３３）（ＨＢＭ２５３）
CCCGTGTGCTCCGCCGCCCAGTTC
ヒトＬＲＰ５アンチセンスプライマー（配列番号６３４）（ＨＢＭ４６５）
GGCTCACGGAGCTCATCATGGACTT
ヒトＬＲＰ５  ＰＣＲ産物（配列番号６３５）
CCCGTGTGCTCCGCCGCCCAGTTCCCCTGCGCGCGGGGTCAGTGTGTGGACCTGCGCCTGCGCTGCGACGGCGAGGCAGACTGTCAGGACCGCTCAGACGAGGTGGACTGTGACGCCATCTGCCTGCCCAACCAGTTCCGGTGTGCGAGCGGCCAGTGTGTCCTCATCAAACAGCAGTGCGACTCCTTCCCCGACTGTATCGACGGCTCCGACGAGCTCATGTGTGAAATCACCAAGCCGCCCTCAGACGACAGCCCGGCCCACAGCAGTGCCATCGGGCCCGTCATTGGCATCATCCTCTCTCTCTTCGTCATGGGTGGTGTCTATTTTGTGTGCCAGCGCGTGGTGTGCCAGCGCTATGCGGGGGCCAACGGGCCCTTCCCGCACGAGTATGTCAGCGGGACCCCGCACGTGCCCCTCAATTTCATAGCCCCGGGCGGTTCCCAGCATGGCCCCTTCACAGGCATCGCATGCGGAAAGTCCATGATGAGCTCCGTGAGCC
マウスＬＲＰ５センスプライマー（配列番号６３６）（ＨＢＭ６５５）
AGCGAGGCCACCATCCACAGG
マウスＬＲＰ５アンチセンスプライマー（配列番号６３７）（ＨＢＭ６５６）
TCGCTGGTCGGCATAATCAAT
マウスＬＲＰ５  ＰＣＲ産物（配列番号６３８）
AGCAGAGCCACCATCCACAGGATCTCCCTGGAGACTAACAACAACGATGTGGCTATCCCACTCACGGGTGTCAAAGAGGCCTCTGCACTGGACTTTGATGTGTCCAACAATCACATCTACTGGACTGATGTTAGCCTCAAGACGATCAGCCGAGCCTTCATGAATGGGAGCTCAGTGGAGCACGTGATTGAGTTTGGCCTCGACTACCCTGAAGGAATGGCTGTGGACTGGATGGGCAAGAACCTCTATTGGGCGGACACAGGGACCAACAGGATTGAGGTGGCCCGGCTGGATGGGCAGTTCCGGCAGGTGCTTGTGTGGAGAGACCTTGACAACCCCAGGTCTCTGGCTCTGGATCCTACTAAAGGCTACATCTACTGGACTGAGTGGGGTGGCAAGCCAAGGATTGTGCGGGCCTTCATGGATGGGACCAATTGTATGACACTGGTAGACAAGGTGGGCCGGGCCAACGACCTCACCATTGATTATGCCGACCAGCGA
【０２４２】
以下のようにリボプローブを合成した。再増幅産物の上流にＴ３プロモーターか、または下流にＴ７プロモーターのいずれかを組み込むように設計したキメラプライマーでＰＣＲ産物を再増幅した。得られたＰＣＲ産物を鋳型として用いてインビトロ転写（ＩＶＴ）によりジゴキシゲニン標識リボプローブを合成した。ジゴキシゲニン−１１−ＵＴＰ(Boehringer-Manheim)の存在下ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ  ＩＶＴキット(Ambion)を用いて、製造者に従って、各々Ｔ７およびＴ３ポリメラーゼを用いてアンチセンスおよびセンスリボプローブを合成した。次いでＤＮＡをＤｎａｓｅ−１で消化し、組み込まれなかったジゴキシゲニンを超遠心により除去した。変性ポリアクリルアミドゲルを通す電気泳動によりリボプローブの完全性を評価した。分子の大きさを１００から１０００塩基対（ｂｐ）ＲＮＡラダー（Ａｍｂｉｏｎ）の電気泳動可動性で比較した。ブロット免疫化学によりプローブの収量および標識を評価した。リボプローブを５μｌアリコートで、−８０℃で貯蔵した。
【０２４３】
インサイチュ・ハイブリダイゼーションを以下のように実施した。ＪｕｎｇＣＭ３０００クリオスタット(Leica)で凍結ラット骨を５μＭ切片に切断し、付着性スライド(Instrumedics)にマウントした。ｍＲＮＡ分解を避けるために全スライドを調製するまで切片をクリオスタット中−２０℃で保持し、その後４％パラホルムアルデヒド中１５分間の後固定した。後固定の後、１ｎｇ／ｍｌアンチセンスまたはセンスのいずれかのリボプローブと共にPathology Associates International(PAI)にカスタマイズされたハイブリダイゼーションバッファー中５８℃でおよそ４０時間切片をインキュベートした。ハイブリダイゼーションの後、スライドを一連のハイブリダイゼーション後ストリンジェンシー洗浄に供し、非特異的プローブ結合を低減させた。アルカリ性ホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体（ＦＡＢフラグメント）を用いる免疫化学によりハイブリダイゼーションを可視化した。アルカリ性ホスファターゼ沈殿基質であるニトロブルー・塩化テトラゾリウム／リン酸ブロモクロロインドリル(Boehringer-Manheim)、を色素原として用いて染色の程度に依存してハイブリダイズした細胞を紫色からほぼ黒色まで染色した。組織切片を核ファストレッドで対比染色した。アッセイ対照はプローブの省略、プローブおよび抗ジゴキシゲニン抗体の省略を含めた。
【０２４４】
アンチセンスプローブとのハイブリダイゼーションを実証するために、ｍＲＮＡに関する陽性ハイブリダイゼーションシグナルを示す紫色から黒色の細胞質および／または核周囲染色を可視化することにより特異的な細胞型を評価した。各細胞型を同型切片と比較し、これを各々のセンスプローブでハイブリダイズした。アンチセンスプローブで染色が観察され、センスプローブで染色されないかまたは弱いバックグラウンドであった場合、結果は陽性であると考えられた。
【０２４５】
各々の研究プローブに関するハイブリダイゼーションシグナルの細胞局在を表５にまとめた。ＬＲＰ５に関するハイブリダイゼーションが骨幹端内の骨内膜および骨梁骨などのリモデリングに関与した骨の部分で主として検出された。骨膜および骨端の選択された骨裏打ち細胞におけるハイブリダイゼーションもまた観察された。成長プレート内の軟骨細胞において、とりわけ増殖性軟骨細胞においても陽性シグナルが認められた。インサイチュ・ハイブリダイゼーション結果の代表的な顕微鏡写真に関しては図１０、１１および１２を参照されたい。
【０２４６】
【表５】
2005511002.tif 000010
【０２４７】
これらの研究により骨リモデリングおよび骨形成に関与する細胞におけるＬＲＰ５の位置的な発現が確認される。増殖帯ならびに近接する骨幹端の骨芽細胞および破骨細胞におけるＬＲＰ５発現により、ＬＲＰ５遺伝子が骨成長およびミネラル化の過程に関与していることが示唆される。骨芽細胞および破骨細胞の活性および分化は、骨が形成されるような発達中に、および成長中に、ならびに骨が持続的にリモデリングしているような成年期に密接に協調される。骨内部構造の形成および骨リモデリングは活性化された破骨細胞による骨再吸収と、続く骨芽細胞による新規材料の沈着とを合わせた結果である。ＬＲＰ５はＬＤＬレセプター遺伝子に関連し、従って骨リモデリングの過程における機械感覚および続くシグナル発生に関与するレセプターであり得る。従って、この遺伝子の発現レベルの変化は骨のリモデリングの速度およびミネラル化の程度に影響する。
【０２４８】
ＸＶ．アンチセンス
アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに対して相補的な塩基配列を含有する短い合成核酸である。生存細胞におけるＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションはＲＮＡ機能に干渉し、最終的にはタンパク質発現を遮断する。従って、部分配列が解っているいずれかの遺伝子をアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化させることができる。
【０２４９】
アンチセンス技術は広く用いられる研究手段になりつつあり、ゲノムシークエンシングの試みにより同定された治療用標的の確証および解明に果たす役割の重要性が増してきている。
【０２５０】
アンチセンス技術は、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを利用することにより遺伝子発現を阻止するために開発された。アンチセンスオリゴヌクレオチドの阻止効果に関していくつか可能なメカニズムがある。中でもＲＮアーゼ  ＨによるｍＲＮＡの分解はタンパク質機能阻止の主要なメカニズムであると考えられている。この技術は元来標的遺伝子の機能を解明するために用いられたが、注意深くそして適切に設計された場合治療適用をも有し得る。
【０２５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さでよい。本発明のアンチセンス核酸を、当分野で公知の手順を用いてキメラ合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）を天然発生ヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増強するか、またはアンチセンスおよびセンス核酸間で形成された二本鎖の物理学的安定性を増強するように設計した種々に修飾したヌクレオチドを用いて、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）を化学的に合成することができ、例えばホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる修飾されたヌクレオチドの実例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシヒドロキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｉ−メチルグアニン、Ｉ−メチルリノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、プセウドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ｔ−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンなどがある。
【０２５２】
加えて、モルフォリノオリゴヌクレオチドを使用することができる。モルフォリノはリボース部分をモルフォリノ基に修飾したオリゴマーである。この技術は米国特許第5,185,444号に網羅されており、そしてSummertonおよびWeller、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187-195(1997年6月)に記載されている。ＨＢＭもしくはＬＲＰ５タンパク質または、ＬＲＰ５および／またはＨＢＭと相互作用してそれにより、例えば転写および／または翻訳を阻止することによりタンパク質の発現を阻止するタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかまたは結合するように、本発明のアンチセンス核酸分子を典型的には対象に投与するか、またはインサイチュで生成する。ハイブリダイゼーションは安定した二本鎖を形成するために慣用されるヌクレオチド相補性による、例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主要な溝での特異的相互作用を介するものである。本発明のアンチセンス核酸分子投与経路の実例としては組織部位での直接注射などがある。また別に、アンチセンス核酸分子を修飾して選択した細胞を標的化し、次に全身的に投与することができる。例えば、全身投与用には、アンチセンス分子を、レセプターまたは選択された細胞表面で発現される抗原に特異的に結合するように、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結させることにより修飾することができる。アンチセンス核酸分子を本明細書に記載するベクターを用いて細胞に分配することもできる。
【０２５３】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子である。μ−アノマー核酸分子は相補性ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のγ−ユニットとは反対に、鎖は互いに並行に進む(Gaultierら、Nucleic Acids.Res.15:6625-6641(1987))。アンチセンス核酸分子はまた２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoueら、Nucleic Acids.Res.15:6131-6148(1987))またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ(Inoueら、FEBS Lett.215:327-330(1987))を含むこともできる。さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムは、それに対する相補性領域を有する一本鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡである。従って、リボザイム（例えばハンマーヘッドリボザイム(HaselhoffおよびGerlach、Nature 334:585-591(1988)に記載))を用いてＬＲＰ５またはＨＢＭ  ｍＲＮＡ転写物を切断し、それによりＬＲＰ５またはＨＢＭ  ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。ＬＲＰ５またはＨＢＭコード化核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書に開示するＬＲＰ５またはＨＢＭ  ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号１または３）のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＨＢＭまたはＬＲＰ５コード化ｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymena L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。例えば、双方共に参照により本明細書に組み込むCechら、米国特許第4,987,071号およびCechら、米国特許第5,116,742号を参照されたい。また別に、ＬＲＰ５またはＨＢＭ  ｍＲＮＡを用いてＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えばBartel,D.およびSzostak,J.W.、Science 261:1411-1418(1993)を参照されたい。また別に、ＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子の制御領域（例えばＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的であるヌクレオチド配列を標的化して、ＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子の標的細胞における転写を阻止する三重らせんを形成することによりＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子発現を阻止することができる。一般的にはHelene,C.、Anticancer Drug Des.6(6):569-584(1991);Helene,C.ら、Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36(1992);およびMaher,L.J.、Bioassays 14(12):807-815(1992)を参照されたい。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いてＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子発現を阻止することもできる。これは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のための技術であり、ここで標的遺伝子活性を同族二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）で特異的に消滅させる。ＲＮＡｉは多くの態様で植物のＰＴＧＳに類似し、そしてトリパノソーマ、ヒドラ、プラナリア、線虫およびショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)などの多くの無脊椎動物において検出されている。これは転移エレメント可動性および抗ウイルス状態形成の変調に関与し得る。哺乳動物系のＲＮＡｉはＰＣＴ出願WO00/63364に開示されており、これは参照によりその全てを本明細書に組み込む。基本的には、標的（ＬＲＰ５またはＨＢＭ）に相同的であるｄｓＲＮＡを細胞に導入し、そして遺伝子活性の配列特異的低減を観察する。小型および干渉性の双方のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が企図される。���えばＹｕら、PNAS 99:6047-6052(2002);Paddisonら、Genes and Development 16:948-958(2002);Brummelkampら、Science 296:550-553(2002);Tuschl,Nature Biotechnology 20:446-448(2002);およびその参照文献を参照されたい。
【０２５４】
実例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製を以下のように実施できる。骨芽細胞様ネズミ細胞株、ＭＣ３Ｔ３のアンチセンス技術を用いて研究を実施した。これらの細胞を誘発して骨分化配列と共に発達させることができる。初期増殖期は分化マーカーの最低限の発現およびコラーゲン性細胞外マトリックスの初期合成により特徴付けられる。分化マーカーの導入後、コラーゲンマトリックス合成が必要とされる。一度コラーゲンマトリックス合成が開始されると、骨芽細胞マーカー遺伝子が明確な一過性配列で活性化される。アルカリ性ホスファターゼが初期に誘起されるが、一方骨シアロタンパク質(bone sialoprotein)およびオステオカルシンが分化過程の後記で出現する。遺伝子発現のこの一過性配列は成熟およびミネラル化過程をモニター観察するのに有用である。マトリックスミネラル化は、成熟化が開始した後数日までは始まらず、細胞層−培養プレートの界面近くのマトリックス内に深在するコラーゲン原繊維上またはその内部でのミネラルの沈着に関与する。培養骨芽細胞により形成されたコラーゲン原繊維随伴ミネラルはインビボで網状骨に見出されるものに類似し、従って研究用試薬として汎用される。
【０２５５】
製造者の説明書に従って（米国特許第5,849,902号）、分化の最初の週にＭＣ３Ｔ３細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。
【０２５６】
ＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）のために設計したオリゴヌクレオチドを以下に提示する（配列番号６３９〜６４１）、
10875: AGUACAGCUUCUUGCCAACCCAGUC
10876: UCCUCCAGGUCGAUGGUCAGCCCAU
10877: GUCUGAGUCCGAGUUCAAAUCCAGG
【０２５７】
図１３はＭＣ３Ｔ３細胞におけるＬＲＰ５のアンチセンス阻止の結果を示す。前記で示した３つのオリゴヌクレオチドをＭＣ３Ｔ３にトランスフェクトし、標準的な手順に従ってＲＮＡを単離した。ノーザン分析によりＬＲＰ５転写物の著明に低下して安定な状態のレベルが明確に示されるが、一方対照遺伝子ＧＡＰＤＨは未変化のままであった。このように、前記したプライマーを用いるアンチセンス技術により骨生物学におけるＬＲＰ５発現の役割の研究が可能になる。
【０２５８】
ＸＶＩ．酵母２ハイブリッド
骨密度を変調するためにＬＲＰ５が関与するシグナル発生経路を同定するために、酵母２ハイブリッドタンパク質相互作用技術を利用した。この技術によりテスタータンパク質が酵母転写系に結合することにより互いに相互作用するタンパク質の同定が促進される(FieldsおよびSong、Nature 340:245-246(1989);FieldsおよびSongによる米国特許第5,283,173号;Johnston、Microbiol.Rev.51:458-476(1987);Keeganら、Science 231:699-704(1986);Durfeeら、Genes Dev.7:555-569(1993);Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582(1991);Fieldsら、Trends in Genetics 10:286-292(1994);ならびにGyurisら、Cell 75:791-803(1993))。第１に、相互作用するタンパク質を探し求めるタンパク質である「ベイト」タンパク質を酵母転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合させる。第２に、同一の酵母転写因子の転写活性化ドメインに融合するｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡライブラリーを構築し；これをプレイライブラリーと称する。ベイト構築物およびプレイライブラリーを酵母細胞に形質転換し、次に接合させて二倍体細胞を生成する。ベイトがｃＤＮＡライブラリーからの特異的プレイと相互作用する場合、活性化ドメインはこの相互作用を介してプロモーターの近傍にもたらされる。次いで選択マーカー遺伝子により転写が誘導され、選択培地上での成長が相互作用タンパク質の存在を示す。
【０２５９】
本明細書で論じる酵母２ハイブリッド実験で用いるアミノ酸配列は細胞質ドメイン全体および膜貫通ドメインの一部から成り、これを以下に示す（アミノからカルボキシへの配向）（配列番号７６５）：
ＲＶＶＣＱＲＹＡＧＡ  ＮＧＰＦＰＨＥＹＶＳ  ＧＴＰＨＶＰＬＮＦＩ  ＡＰＧＧＳＱＨＧＰＦ  ＴＧＩＡＣＧＫＳＭＭ  ＳＳＶＳＬＭＧＧＲＧ  ＧＶＰＬＹＤＲＮＨＶ  ＴＧＡＳＳＳＳＳＳＳ  ＴＫＡＴＬＹＰＰＩＬ  ＮＰＰＰＳＰＡＴＤＰ  ＳＬＹＮＭＤＭＦＹＳ  ＳＮＩＰＡＴＶＲＰＹ  ＲＰＹＩＩＲＧＭＡＰ  ＰＴＴＰＣＳＴＤＶＣ  ＤＳＤＹＳＡＳＲＷＫ  ＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳ  ＤＳＤＰＹＰＰＰＰＴ  ＰＨＳＱＹＬＳＡＥＤ  ＳＣＰＰＳＰＡＴＥＲ  ＳＹＦＨＬＦＰＰＰＰ  ＳＰＣＴＤＳＳ
【０２６０】
推定される膜貫通ドメインの最後の６個のアミノ酸を太字で示す。推定ＳＨ３ドメインには下線を付している。ＬＲＰ５またはＨＢＭ対立遺伝子によりコードされるタンパク質のいずれかの５０個またはそれ以上のアミノ酸の別のアミノ酸配列をベイトして用いることもできる。ベイトとして用いられるポリペプチドの上限の大きさは完全な膜貫通ドメインの存在によってのみ限定され（図４参照）、これによりベイトは酵母２ハイブリッド系における無機能性が付与される。これらのさらなるベイトタンパク質を用いて、限局性付着シグナル発生経路か、またはこれらのＨＢＭまたはＬＲＰ５タンパク質が作用し得る別の経路において、ＨＢＭまたはＬＲＰ５によりコードされるタンパク質と相互作用するさらなるタンパク質を同定することができる。一度同定すると、限局性付着シグナル発生経路か、またはこれらのＨＢＭが作用し得る別の経路においてタンパク質を制御する作用物質を同定する方法を、ＨＢＭおよびＬＲＰ５タンパク質に関して本明細書に記載するように実施することができる。
【０２６１】
細胞質ＬＲＰ５シグナル発生経路を同定するために、ＬＲＰ５の細胞質ドメインをベイトベクターにサブクローニングした。第１のベクターはｐＤＢｌｅｕであり、これを用いて脳をスクリーニングし、ＨｅｌａプレイｃＤＮＡライブラリーをベクターｐＰＣ８６(Clontech)にクローニングした。第２のベイトベクターはｐＤＢｔｒｐであり、これを用いてベクターｐＯＰ４６のＴＥ８５骨肉種細胞株に由来するｃＤＮＡプレイライブラリーをスクリーニングした。広く利用可能な別の適当なベクターはｐ８６(Gibco,iest(商標)システム)である。当業者に公知の標準的な技術をＦｉｅｌｄｓおよびSong、Nature 340:245-246(1989);FieldsおよびSongによる米国特許第5,283,173号;Johnston、Microbiol.Rev.51:458-476(1987);Keeganら、Science 231:699-704(1986);Durfeeら、Genes Dev.7:555-569(1993);Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-9582(1991);Fieldsら、Trends in Genetics 10:286-292(1994);ならびにGyurisら、Cell 75:791-803(1993))に記載されるように用いることができる。ベイト構築物およびプレイｃＤＮＡライブラリーを標準的な手段を用いて酵母に形質転換した。
【０２６２】
タンパク質相互作用スクリーニングを実施するために、ベイト酵母株の一晩培養物を２％グルコースを含むＳＤ選択培地（ｐＤＢＬｅｕ，ＳＤ−Ｌｅｕ培地，ｐＤＢｔｒｐ、ＳＤ−ｔｒｐ培地）２０ｍｌ中で成長させた。培養物を３０℃で一晩激しく振盪した。培養物を完全培地（２％グルコースを含むＹＥＰＤ）で１：１０に希釈し、次に培養物を振盪しながら３０℃で２時間インキュベートした。
【０２６３】
凍結したプレイライブラリーを解凍し、酵母細胞を２％グルコースを含むＹＥＰＤ培地１５０ｍｌ中３０℃で２時間、それらを成長させることにより再活性化した。フィルターユニットを７０％エタノールで滅菌し、滅菌水で洗浄してエタノールを除去した。ベイトおよびプレイ双方の培養物の細胞密度を６００ｎｍでのＯＤを決定することにより測定した。ＯＤ６００の１ｍｌ＝４つの各酵母株の細胞数に相当する適当な容量の酵母細胞、ベイトおよびプレイ（ライブラリー）を５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに置いた。次いで混合物を滅菌フィルターユニットを通して濾過した。次いでフィルターを予め加温したＹＥＰＤ寒天プレートに細胞側を上にして移し、フィルターの下部の気泡を全て除去した。次いでプレートを３０℃で６時間インキュベートした。１つのフィルターを５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに移し、２％グルコースを含むＳＤ  １０ｍｌを加えた；細胞をボルテックスしながら１０秒間再懸濁した。
【０２６４】
１次二倍体細胞（ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐプレート上で成長）の数対ＳＤ−ＴｒｐおよびＳＤ−Ｌｅｕプレート上でのみ成長するコロニー形成ユニットの数を決定した。異なる希釈物をプレートし、３０℃で２日間インキュベートした。次いでコロニー形成ユニットの数を計数した。二倍体コロニーの数（ＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレート上のコロニー）によりプレイ構築物のライブラリー全体がベイトを発現する酵母と接合したかどうかの算出が可能になる。この情報はスクリーニングの品質を判定するために重要である。
【０２６５】
Ａ．間接的選択
次いで５つのフィルターメーティングからの懸濁細胞をプールし、細胞を遠心により５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに沈殿させた。次いで細胞を２％Ｇｌｃを含むＳＤ培地１６ｍｌに再懸濁した。滅菌ガラスビーズを伴う８スクエアプレートの各々（ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ）にこの細胞懸濁液２ｍｌをプレートし、３０℃で１８から２０時間インキュベートすることにより二倍体を選択した。
【０２６６】
次いで細胞をスクエアプレートからかき取り、細胞を遠心し、１本の５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに合わせた。次いで細胞ペレットを２％グルコースを含むＳＤ培地２５ｍｌに再懸濁した。次いでNeugebauerチャンバーで適当な希釈物（通常１：１００から１：１０００）を計数することにより細胞数を決定した。およそ５ｘ１０７個の二倍体細胞を選択培地にプレートした。無関係のプレイベクターと組んだベイト株の成長について観察することが、どの選択プレートをライブラリースクリーニングに関して選択しなければならないかの決定の助けとなる。一般に、全てのスクリーニングをＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓ；ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、５ｍＭ  ３ＡＴを伴うスクエアプレートの各々にプレートし、ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓ、−Ａｄｅが推奨される。
【０２６７】
次いで酵母細胞を滅菌ガラスビーズと共に均質に広げ、３０℃で４日間インキュベートした。ＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐプレートにかき取った細胞懸濁液の異なる希釈物をプレートすることにより酵母細胞を形成するコロニーの数を決定した。通常１０−３および１０−４希釈物１００μｌのプレートによりプレートあたり１００から１０００個のコロニーが得られた。
【０２６８】
Ｂ．直接選択
接合した酵母細胞を伴う５つのフィルターを各々別個の５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに移し、細胞を２％Ｇｌｃを含むＳＤ培地１０ｍｌに各々再懸濁し、続いて１０秒間ボルテックスした。再懸濁した細胞を合わせ、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心を用いて３０００ｒｐｍで遠心した。上澄を捨て、２％Ｇｌｃを含むＳＤ培地６ｍｌに細胞を再懸濁した。懸濁液２ｍｌを各選択スクエアプレートに広げ、３０℃で４から５日間インキュベートした。
【０２６９】
Ｃ．単一のコロニーの単離
単離されたコロニーからの酵母細胞を滅菌トゥースピックで採取し、９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。細胞をＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓ培地５０μｌに再懸濁し、３０℃で１日間インキュベートした。次いで酵母細胞を９６ウェル様式のＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓプレートにスタンプし、３０℃で２日間インキュベートした。酵母細胞をナイロンフィルター被覆ＹＥＰＤプレートにもスタンプし、３０℃で１日間インキュベートした。ナイロンフィルター上の細胞をβ−Ｇａｌレポーター活性の分析に用いた。
【０２７０】
滅菌トゥースピックでＳＤ−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、−Ｈｉｓプレートから酵母コロニーをかき取り、必要な場合、β−Ｇａｌ活性に従って、必要な場合再設定し、次に２０％グリセロールに再懸濁した。これは−８０℃で貯蔵するためのマスタープレートとして提供された。
【０２７１】
ＤＮＡ調製に関しては、グリセロールストックからの酵母細胞をＳＤ−Ｔｒｐプレートにスタンプし、３０℃で２日間インキュベートした。インキュベーションの２日後、酵母コロニーはコロニーＰＣＲおよびシークエンシングに備えられていた。標準的なコロニーＰＣＲ条件を用いて、相互作用スクリーニングから回収したプレイからのインサートを増幅した。標準的なシークエンシング反応およびABI377(Perkin Elmer)蛍光シークエンシング機械を用いてシークエンシングを行った。
【０２７２】
Ｄ．ベイト／プレイ相互作用の確認
目的のプレイのグリセロールストックを解凍し、グルコース−Ｔｒｐを含むＳＤの一晩培養物１０ｍｌに接種した。一晩成長させた後、ＢＩＯ  １０１  ＲＰＭ  酵母プラスミド単離キットを培養物１０ｍｌと共に用いてプラスミドＤＮＡ調製を実施した。培養物を遠心し、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移した。次いで酵母溶解マトリックスをペレットに加え、続いてアルカリ性溶解溶液２５０μｌを加えた。次いでサンプルを５分間ボルテックスした。中和溶液２５０μｌを加え、サンプルを短時間混合した。マイクロ遠心でサンプルを室温で２分間遠心した。上澄をスピンフィルターに移して細片および溶解マトリックスを回避した。グラスミルク・スピンバッファー２５０μｌを加え、チューブを反転させて混合した。サンプルを１分間遠心し、キャッチ・チューブの液体を捨てた。洗浄溶液５００μｌを加え、サンプルを１分間遠心し、洗浄溶液を捨てた。洗浄工程を１回繰り返し、続いて１分間乾燥遠心してスピンフィルターの外に残りの液体を追いやった。フィルターを新たなキャッチ・チューブに移し、滅菌Ｈ２Ｏ  １００μｌを加え；次いでサンプルを短時間ボルテックスして再懸濁し、３０秒間遠心してキャッチ・チューブの底部にＤＮＡを回収した。
【０２７３】
次いで標準的な手順を用いてＤＮＡ５μｌをＤＨ１０Ｂ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ  細胞に形質転換し、グリセロールストックを調製した。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐスピン・ミニプレップ・キットを用いてミニプレップＤＮＡを調製した。最後にＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＥＢバッファー  ３０μｌで溶出した。次いで標準的な手順を用いて、プラスミドＤＮＡサンプル１μｌを用いて酵母細胞を形質転換した。ＳＤ−Ｔｒｐ培地上で２日間成長させた後、コロニーを採取し、新鮮培地にパッチした。同様に、ベイトコロニーをＳＤ−Ｌｅｕ培地にパッチした。双方を３０℃で一晩成長させた。
【０２７４】
接合のために、ベイトおよびプレイパッチからの細胞を一緒にＹＡＰＤ培地上に広げ、３０℃で１２時間インキュベートした。次いでこのプレートをＳＤ寒天Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレートにレプリカプレートし、３０℃で２日間成長させた。相互作用の力を試験するために、これらのプレートをＳＤ寒天Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ、５ｍＭ  ３ＡＴおよび１０ｍＭ  ３ＡＴを含むＳＤ寒天Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ、ＳＤ寒天Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｄｅ、およびＳＤ寒天Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｕｒａ培地上にレプリカプレートし、３０℃で２日間成長させた。
【０２７５】
Ｅ．Ｇａｌａｃｔｏｎ  Ｓｔａｒ  β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ
選択プレート上での画線および陽性インテラクターのレプリカプレートの後、ＳＤ培地２００μｌが入った９６ウェル皿にコロニーを置き、ウェル１および９６をブランクにしておいた。最初の９６ウェル皿からの１０μｌを、ＳＤ培地１００μｌが入った別の平底９６ウェル皿に置いた。対照は陰性対照および非常に弱い陽性対照から成った。ＯＤ６００（９６ウェル分光光度計を利用して１の値は１ｘ１０７セルに相当する）で細胞密度を測定した。通常ＯＤは０．０３から０．１０の間であった。特に照度計のためのマイクロプレートを用いて、反応混合物５０μｌを各ウェルにピペッティングした。次いで培養物５０μｌを加え、ピペッティングを上下に２回行って混合した。反応物を室温で３０分間インキュベートして、続いて照度計を用いて相対光単位を測定した。
【０２７６】
表６は試験した３つのプレイライブラリーからの酵母２ハイブリッドスクリーニングで同定された遺伝子を列挙する。２つの遺伝子、ｚｙｘｉｎおよびａｘｉｎは３つ全てのスクリーニングのＬＲＰ５の細胞性ドメインと相互作用することが見出された。３つの遺伝子、α−アクチニン、ＴＣＢおよびＳ１−５は３つのスクリーニングの２つと相互作用した。
【０２７７】
細胞−細胞および細胞−マトリックス接触（限局的接触／付着板）の部位で見出された種々のタンパク質がＬＲＰ５の細胞質ドメインと相互作用することが示された。これにはα−アクチン、Ｔｒｉｏ、Ｐｉｎｃｈ様タンパク質およびＺｙｘｉｎなどが含まれる。ＰＩＮＣＨはインテグリン結合キナーゼ、インテグリンの初期シグナラーおよび成長因子シグナル発生経路と相互作用することが解っているＬＩＭドメイン含有タンパク質である。酵母２ハイブリッドスクリーニングにおいて密接に関連する遺伝子を見出すことにより細胞外マトリックスシグナルからインテグリンシグナル発生に連結される新規の経路の可能性が出現する。Ｔｒｉｏもまた限局性付着に局在することが解っており、細胞−マトリックス相互作用および細胞移動に関与する細胞骨格再編成を協調させるのに重要な役割を果たすと考えられている。Ｚｙｘｉｎはもう一つのＬＩＭドメイン含有タンパク質であり、これもまた付着板に局在し、そしてインテグリンシグナル発生を介して誘引が伝達されたときに、細胞骨格の再編成に関与すると考えられている。Ｚｙｘｉｎもまたαアクチニンと相互作用し、これはＬＲＰ５と相互作用することが同定された。別の同定されたＬＩＭドメイン含有タンパク質にはマウスアジュバのヒト相同体、ＬＩＭＤ１および新規のＬＩＭＤ１様タンパク質などがある。
【０２７８】
アクシンもまた２ハイブリッド実験から同定した。このタンパク質はＷｎｔシグナル発生経路の阻止に関与し、腫瘍サプレッサーＡＰＣと相互作用する。ここでは前記した限局性付着シグナル発生との連関がある。２つの経路の１つの一般的な工程はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３の阻止に関与し、これが今度はβ−カテニン／Ｌｅｆ−１およびＡＰ−１転写因子の活性化に至る。アクシン／ＡＰＣはこれおよびインテグリン結合キナーゼに関与する。Ｗｎｔ経路は胚形成中の細胞運命を決定するのに役割を有している。不適切に活性化された場合、Ｗｎｔ経路もまた癌を導き得る。Ｗｎｔ経路もまた細胞骨格再編成において役割を有しているようである。アフリカツメガエル胚アッセイでは、ＨＢＭおよびＷｎｔ５ａタンパク質の組み合わせが、前記対照およびＷｎｔ５ａ単独スコアを超えて穏やかであったＬＲＰ５およびＷｎｔ５ａの組み合わせよりも非常に大きな程度でＷｎｔ経路を刺激した。ＨＢＭおよびＬＲＰ５細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はＷｎｔ５ａの不在下でＷｎｔシグナル発生の穏やかな刺激を引き起こし、これはＨＢＭ  ＥＣＤの存在下でＷｎｔ５ａの存在によりわずかに増加した。限局性付着シグナル発生におけるＬＲＰ５関与を表すモデルを図１５に示す。
【０２７９】
このデータを、インテグリンシグナル発生経路が機械的ストレスおよび付着に対する細胞応答における役割を有していることを示唆する別の研究と合わせた。これにより骨生物学におけるＬＲＰ５の作用のメカニズムに関する魅力的なモデルが提供される。機械的ストレスの直接的な検出か、または機械的感覚に関連する細胞外マトリックスの分子の結合のいずれかにＬＲＰ５が関与することが可能である。続く経路によるシグナル発生は骨細胞の細胞形態学、細胞付着、遊走、増殖、分化、およびアポトーシスに及ぼす影響のために骨リモデリングに関与し得る。
【０２８０】
【表６】
2005511002.tif 000011
【０２８１】
図１５に表すモデルおよび表６に示す結果に鑑みて、本発明により意図される別の態様は、限局性付着シグナル発生を制御することにより骨密度および骨量障害制御することである。該制御はＤＮＡ、ｍＲＡＮ転写物または酵母２ハイブリッド系により同定されるような限局性付着シグナル発生経路に関与するいずれかのメンバーによりコードされるタンパク質を制御することにより制御を発生させることができる。
【０２８２】
ＨＢＭ酵母２ハイブリッド系により同定される新規核酸およびタンパク質もまた企図される。これには、非限定例としては配列番号６４５（Ａｊｕｂａ）、配列番号６５１（プロテイン１を含有するＬＩＭドメインをコードする遺伝子に類似の遺伝子）、配列番号６５６（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ富化タンパク質）、配列番号６５８（ＰＩＮＣＨ様遺伝子）、配列番号６６９（Ａｊｕｂａタンパク質）、配列番号６７２（ＴＲＩＯに類似するタンパク質）、配列番号６７３、配列番号６７８（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ富化タンパク質）および配列番号６８１（ＰＩＮＣＨ様タンパク質）などがある。
【０２８３】
ＸＶＩＩ．ＬＲＰ５／ＬＲＰ６およびＨＢＭ機能
最近の研究ではＬＲＰ５がＷｎｔシグナルトランスダクション経路に関与することが示されている。Gongら、は最近骨発達におけるＬＲＰ５の役割をさらに支持する結果を公表している(Gongら、Cell 107:513-523(2001))。Ｇｏｎｇおよび共同研究者による研究では常染色体劣性障害骨粗鬆症・偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）を引き起こすＬＲＰ５の変異について記載している。彼らはＯＰＰＧがＬＲＰ５機能喪失により引き起こされと結論づけ、ＬＲＰ６をＷｎｔ経路における重複性のレセプターとして意味づけている。最近、ＬＲＰ５機能喪失は低骨量表現型に至ることが示されている(Katoら、J.Cell.Biol.157:303-314(2002))。
【０２８４】
Ｗｎｔ経路は肢初期発生学的発達において重要である。Nusse、Nature 411:255-256(2001);およびMaoら、Nature 411:321-325(2001)。Ｗｎｔタンパク質は膜貫通タンパク質Frizzled(Fz)と相互作用する分泌タンパク質である。ＬＲＰタンパク質、例えばＬＲＰ５およびＬＲＰ６はＦｚとの複合体でＷｎｔシグナルを変調すると考えられている(Tamaiら、Nature 407:530-535(2000))。Ｗｎｔ経路はDisheveledタンパク質（Ｄｓｈ）を介して細胞内で作用し、今度はリン酸化β−カテニンからのグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）を阻止する。リン酸化β−カテニンはユビキチン化の後急速に分解される。しかしながら安定化β−カテニンは核に蓄積および移動して、そこでＴ細胞因子（ＴＣＦ）転写アクチベーター複合体のコファクターとして作用する。
【０２８５】
タンパク質ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、初期発達の頭部形成に必要なＷｎｔ経路のアンタゴニストである(Glinkaら、Nature 391:357-362(1998))。Ｄｋｋ−１およびＷｎｔ経路におけるその機能は例えばKrupnikら、Gene 238:301-313(1999);Fediら、J,Biol.Chem.274:19465-19472(1999);Dkk-1およびWnt経路に関してはWuら、Curr.Biol.10:1611-1614(2000)、Shinyaら、Mech.Dev.98:3-17(2000)、Mukhopadhyayら、Dev.Cell 1:423-434(2001)およびPCT特許出願番号WO00/52047並びに各々に引用されている参照文献に記載されている。Dkk-1はDshの上流で作用することが解っているが、Ｄｋｋ−１による阻止のメカニズムの特性はちょうど解明され始めたばかりである。Ｄｋｋ−１はマウス胚性肢芽において発現され、その破壊は肢形態形成異常、とりわけ発生欠損に至る(Gotewoldら、Mech.Dev.89:151-153(1999);およびMukhopadhyayら、Dev.Cell 1:423-434(2001))。
【０２８６】
Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５との間の相互作用は、2001年5月17日出願の米国特許出願第60/291,311号;2002年2月1日出願の第60/353,058号、および2002年3月4日出願の第60/361,293号で本発明者により開示された実験でＬＲＰ５のリガンド結合ドメインと相互作用するタンパク質のための、酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）スクリーニングにより見出された。２ハイブリッドスクリーニングは当分野で一般的な手順であり、これは例えばGietzら、Mol.Cell.Biochem.172:67-79(1997);Young、Biol.Reprod.58:302-311(1998);BrentおよびFinley、Ann.Rev.Genet.31:663-704(1997);並びにLuおよびHannon編、Yeast Hybrid Technologies、Eaton Publishing、Natick、マサチューセッツ州(2000)に記載されている。さらに最近では、別の研究によりＤｋｋ−１がＬＲＰの結合パートナーであり、Ｗｎｔ経路をＬＲＰとの直接結合を介して変調することが確認されている(R.Nusse、Nature 411:255-256(2001);A.Baficoら、Nat.Cell Biol.3:683-686(2001);M.Semenov、Curr.Biol.11:951-961(2001);B.Mao、Nature 411:321-325(2001)、Zorn、Curr.Biol.11:R592-595(2001)ならびにL.Liら、J.Biol.Chem.277:5977-5981(2002))。
【０２８７】
Maoおよび共同研究者(2001)はＤｋｋ−１をＬＲＰ６のリガンドとして同定し、Ｄｋｋタンパク質がＬＲＰ６のＷｎｔコレセプター機能を阻止するという点で、Ｄｋｋ−１およびＬＲＰ６が拮抗的に相互作用することを示唆している。そのグループは同時免疫沈澱を用いて、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６相互作用が直接であることを証明した。Ｄｋｋ−２もまた直接ＬＲＰ６に結合することが見出された。しかしながら、Ｍａｏらは、いずれかのＤｋｋタンパク質とＬＲＰ５の間では相互作用が観察されず、ＬＤＬＲ、ＶＬＤＬＲ、ＡｐｏＥＲまたはＬＲＰとの相互作用も見出されなかったことを報告している。加えて、Maoらは市販のＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ）を用いて、ＬＲＰ６がＷｎｔシグナル発生を阻止のＤｋｋ−１の効果を決定できることを実証した。類似の結論がアフリカツメガエル胚の類似の研究から引き出された。ＬＲＰ６機能的ドメインの欠失分析により、ＥＧＦ反復（βプロペラ）３および４がＤｋｋ−１結合に必要であり、ＬＲＰ６のリガンド結合ドメインはＤｋｋ−１結合に影響しないことが示された。Ｍａｏらの知見は本発明者により得られたデータとは対照的であり、これはＬＲＰ５のリガンド結合ドメインが酵母におけるＤｋｋ−１結合に必要であり、十分であることを示している。古典的な生化学的リガンド・レセプター研究を用いて、ＭａｏらはＤｋｋ−１／ＬＲＰ６に関してＫｄ＝０．３４ｎＭ、およびＤｋｋ−２／ＬＲＰ６に関してＫｄ＝０．７３ｎＭを決定した。
【０２８８】
Semenovら(2001)はＭａｏのグループの結果を証明し、Ｄｋｋ−１がＷｎｔまたFrizzledに直接結合しないが、むしろＬＲＰ６と相互作用することを同時免疫沈澱により確認した。そのスキャッチャード分析によりＤｋｋ−１／ＬＲＰ６に関してＫｄ＝０．５ｎＭが見出された。SemenovらはまたＤｋｋ−１がＬＲＰ５／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ８複合体を排除し得ることを実証し、これはＤｋｋ−１がＬＲＰ５との相互作用を介してＷｎｔシグナル発生を抑制することもできることを意味している。システイン２２０がアラニンに変化しているＤｋｋ−１変異体はＬＲＰ６結合を排除し、Ｗｎｔシグナル発生を抑制できない。アフリカツメガエル胚の研究によりその結果が確認され、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６の機能的な結果：Ｗｎｔシグナル発生の抑制が示された。彼らのアフリカツメガエル研究により、ＬＲＰ６／Ｄｋｋ−１が、Ｗｎｔ平面内細胞極性形成経路と相対して、標準的なβ−カテニン媒介によるＷｎｔ経路に特異的であり得ることもまた示唆された。
【０２８９】
Baficoら(2001)は１２５Ｉ標識Ｄｋｋ−１分子を用いて、Ｋｄ＝０．３９ｎＭであるその唯一の膜レセプターとしてＬＲＰ６を同定した。また、Ｄｋｋ−１／ＬＲＰ６相互作用の機能的結果は、Ｄｋｋ−１が極度に低濃度（３０ｐＭ）で加えられた場合でさえも、標準的なＷｎｔシグナル発生の抑制であった。
【０２９０】
最初に2001年5月17日出願の米国特許出願第60/291,311号;2002年2月1日出願の第60/353,058号および2002年3月4日出願の第60/361,293号にて本発明者により開示されたように、Ｄｋｋ−１はＬＲＰ５媒介Ｗｎｔシグナル発生を抑制できるが、ＨＢＭ媒介Ｗｎｔシグナル発生の抑制よりも効果が低い。ＬＲＰ５におけるＨＢＭ変異が機能または活性化変異を獲得することであるので、この観察はとりわけ興味深い。すなわち、標準的な経路を介するＷｎｔシグナル発生はＨＢＭ対ＬＲＰ５で増強される。理論に縛られるのは望まないが、この相互作用によりＨＢＭとさらに一般的なＬＲＰ５／ＬＲＰ６の間の発達シグナル発生の差異の説明が提供される。
【０２９１】
別のＷｎｔまたはＤｋｋファミリーメンバーのさらなる調査により、Ｗｎｔ経路による作用の微妙な差異が示され、特定の細胞または組織において発現されるＬＲＰ／Ｄｋｋ／Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄレパートリーの機能として達成されるＷｎｔシグナル発生における複雑性および変動性が実証される。これはヒトおよびＨＢＭトランスジェニック動物におけるＨＢＭ表現型の見かけの骨特異性を証明できる。これらの微妙な変化は可能性のある治療および／または薬物介入の開発において考慮されなければならない。ＬＲＰ５シグナル発生を単純にオンまたはオフするのは望ましくない。
【０２９２】
ＨＢＭで観察されるＬＲＰ５のＤｋｋ阻止の有効性の低下が、ＤｋｋのＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭへの結合を増強または防御することにより媒介される必要はないであろう。１つ以上のメカニズムが関与しているであろう。実際に発明者はＤｋｋ−１がＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＨＢＭに結合するのを観察している。さらに、Ｄｋｋファミリーの別のメンバーが差別的にＬＲＰ５／ＬＲＰ６／ＨＢＭ活性に影響することが観察されている。むしろ、より好ましい研究法は、できるだけＨＢＭの微妙な効果に近い再生により、望ましい保護利益に至る薬物または治療を開発することである。ＨＢＭの動物モデルへの影響を比較することによる、可能性のある薬物および治療を絞り込み、試験する能力は本発明の主要な特徴である。
【０２９３】
本発明のトランスジェニック動物および方法を利用して、ＨＢＭ表現型の動物モデルの文脈で、可能性のある治療用化合物および方法をスクリーニングすることができる。従って、本発明の動物モデルおよび方法は未来の薬物および治療の開発において非常に貴重な手段を提示する。本発明は骨粗鬆症の有効なモデルを開発し、骨量および脂質変調の理解を深め、そして骨量および脂質代謝を変調するための重要な研究手段を提供する。
【０２９４】
ＬＲＰ５によりコードされるタンパク質は構造的に低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬレセプター）に相関する。Goldsteinら、Ann.Rev.Cell Biology 1:1-39(1985);Brownら、Science 232:34-47(1986)参照。ＬＤＬレセプターは、コレステロールを含む脂質−タンパク質凝集体である低密度リポタンパク質の取り込みに寄与する。ＬＤＬレセプターの欠損を有する個体はコレステロール除去が不十分であり、アテローム性動脈硬化症を進展させる傾向がある。加えて、欠損ＬＤＬレセプターを有する細胞はコレステロールの生成の増加を示し、これは部分的にはコレステロール合成酵素のフィードバック制御の変化により、部分的にはこれらの酵素の遺伝子の転写増加による。いくつかの細胞型ではコレステロールはステロイドホルモンの形成のための前駆体である。従って、ＬＤＬレセプターは間接的なシグナルトランスダクションタンパク質としても機能し、遺伝子発現を制御できる。
【０２９５】
グリシン１７１アミノ酸は、このアミノ酸もまたＬＲＰ５のマウス相同体で見出されるので、ＬＲＰ５の機能に重要である可能性がある。密接に関連するＬＲＰ６(Genbankアクセッション番号JE0272)タンパク質もまた対応する位置でグリシンを含有する(Brownら、Biochemical and Biophysical Research Comm.248:879-888(1988))。天然の選択により重要な位置でのアミノ酸変化を有する変異が発生から防御されるので、タンパク質の構造または機能において重要であるアミノ酸は種間で観察される傾向がある。
【０２９６】
加えて、ＬＲＰ５の細胞外ドメインは５つのＹＷＴＤモチーフ、それに続くＥＧＦモチーフから成る４つの反復を含有する。この反復もまたＬＤＬレセプターおよびその他のＬＤＬレセプター関連タンパク質において見出されるので、この５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復は明確な折り畳みタンパク質ドメインを形成する可能性がある。最初の３つの５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復はその構造において非常に類似しているが、一方４番目の反復は高度に分岐している。グリシン１７１はＬＲＰ５の１番目の５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復の中央ＹＷＴＤモチーフに生じる。ＬＲＰ５の別の２つの類似の５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復もまた対応する位置でグリシンを含有し、ＬＤＬレセプタータンパク質における５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復でも同様である。しかしながら、アミノ酸の１７．６％のみがＬＲＰ５の最初の３つの５ＹＷＴＤ＋ＥＧＦ反復およびＬＤＬレセプターの１つの反復の中で同一である。これらの観察により、グリシン１７１がこの反復の機能に必須であり、グリシン１７１での変異がＬＲＰ５の機能的変化を引き起こすことが示される。ｃＤＮＡおよびペプチド配列を図６Ａ〜６Ｅに示す。ヌクレオチド位置５８２での重要な塩基は太字で示し、下線を付している。
【０２９７】
ノーザンブロット分析（図７Ａ−Ｂ）により、ＬＲＰ５がヒト骨組織および多くのその他の組織において発現されることが示される。多重組織ノーザンブロット(Clonteck、Palo Alto、カリフォルニア州)をＬＲＰ５に由来するエクソンでプロービングした。図７Ａに示すように、５．５ｋｂのＬＲＰ５転写物は心臓、腎臓、肺、肝臓および膵臓において高度に発現され、骨格筋および脳においては低レベルで発現される。図７Ｂに示す第２のノーザンブロットにより、５．５ｋｂの転写物の大きさが確認され、ＬＲＰ５が骨、骨髄、頭蓋冠およびヒト骨芽細胞株において発現されることが示された。
【０２９８】
これらを考慮に入れて、酵母２ハイブリッド結果と合わせたこれらの結果により、ＬＲＰ５遺伝子におけるＨＢＭ多型性がＨＢＭ表現型に寄与し、ＬＲＰ５遺伝子が骨発達において重要であることが示される。加えて、ＬＲＰ５の変異が骨ミネラル化および発達を変化させ得るので、ＬＲＰ５に結合する分子は骨発達を有用に変化させ得る可能性がある。このような分子には、例えば小型分子、タンパク質、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマー等がある。
【０２９９】
ＸＶＩＩＩ．核酸、ベクター、形質転換体および宿主細胞の調製
本発明の大量の核酸を適当な宿主細胞における複製により生成することができる。望ましいフラグメントをコードする天然または合成核酸フラグメントを、原核または真核細胞に導入でき、そこで複製できる組換え核酸構築物、通常ＤＮＡ構築物に組み込む。通常核酸構築物は単核宿主、例えば酵母または細菌における複製に適しているが、培養哺乳動物または植物またはその他の真核細胞株への（ゲノム内での組み込みを伴う、および伴わない）導入を企図することもできる。本発明の方法により生成される核酸の精製については、例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1989))またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、J.Wiley & Sons、ニューヨーク州(1992)に記載されている。
【０３００】
本発明の核酸を化学的合成により、例えばBeaucageら、Tetra.Letts.22:1859-1862(1981)により記載されるホスホラミデート法またはMatteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)によるトリエステル法により生成することもでき、市販されている自動化されたオリゴヌクレオチド合成器で実施することができる。相補鎖を合成し、適当な条件下で鎖を一緒にアニーリングするか、またはＤＮＡポリメラーゼを用いて適当なプライマー配列と共に相補的な鎖を加えるいずれかにより化学合成の一本鎖生成物から二本鎖フラグメントを得ることができる。
【０３０１】
原核または真核細胞宿主に導入するために調製された核酸構築物は、望ましいタンパク質をコードする企図される核酸フラグメントを含む、宿主により認識される複製系を含んでなってよく、好ましくはタンパク質コード化セグメントに機能的に連結した転写および翻訳開始制御配列をも含む。発現ベクターには例えば複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）および発現調節配列、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネーター配列、ならびにｍＲＮＡ安定化配列などがある。適当な場合、元来のＨＢＭまたはＬＲＰ５タンパク質に由来しても、またはその他のレセプターに由来しても、または同一物もしくは関連種の分泌タンパク質に由来しても、分泌シグナルが含まれ、これによりタンパク質が細胞膜を通過するおよび／もしくはそこに留まり、従ってその機能的トポロジーを達成するか、または細胞から分泌されることが可能になる。このようなベクターを当分野で公知の標準的な組換え技術、例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1989))またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク州(1992)の手段により調製することができる。
【０３０２】
適当なプロモーターおよびその他の必要なベクター配列を、宿主において機能的であるように選択し、適当な場合天然にＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子に随伴されるものを含むことができる。作動可能な細胞株および発現ベクターの組み合わせの実例はSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1989))またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、J.Wiley & Sons、ニューヨーク州(1992)に記載されている。多くの有用なベクターが当分野で公知であり、Stratagene、New England Bio Labs、Promega Biotech等のような製造供給元から入手することができる。プロモーター、例えばｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖系酵素プロモーターを原核細胞宿主において使用することができる。有用な酵母プロモーターにはメタロチオネイン、３−ホスホギリセレートキナーゼまたはその他の解糖系酵素、例えばエノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素等のプロモーター領域などがある。酵母発現に使用するのに適したベクターおよびプロモーターは欧州特許第73,675A号に記載されている。適当な外来の哺乳動物プロモーターにはＳＶ４０に由来する初期および後記プロモーター(Fiersら、Nature 273:113(1978))またはネズミモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスまたはポリオーマ由来のプロモーターがある。加えて、構築物を増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に結合させて、遺伝子の複数のコピーを作成することができる。適当なエンハンサーおよびその他の発現調節配列に関しては、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression,Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州(1983)をも参照されたい。
【０３０３】
このような発現ベクターは自己複製できるが、当分野で周知の方法によりこれらを宿主細胞のゲノムに挿入することにより複製することができる。
【０３０４】
発現およびクローニングベクターは選択マーカー、すなわちベクターで形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含有する可能性がある。この遺伝子の存在によりインサートを発現するこれらの宿主細胞のみの成長が確実になる。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質またはその他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセート等に対する抵抗性を付与する；ｂ）栄養要求欠損を補完する；またはｃ）複合培地から利用できない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする、例えば杆菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主のための適当なマーカーは当分野で周知である。
【０３０５】
目的の核酸を含有するベクターをインビトロで転写することができ、得られたＲＮＡを周知の方法、例えば注射(Kuboら、FEBS Letts.241:119(1988)参照)により宿主細胞に導入するか、またはエレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはその他の物質を用いるトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；感染（この場合ベクターは感染性物質、例えばレトロウイルスゲノムである）；ならびにその他の方法などの、細胞宿主の型に依存して変化する当分野で周知の方法によりベクターを直接宿主細胞に導入することができる。一般的にはSambrookら(1989)およびAusubelら(1992)を参照されたい。前記したものなどの当分野で公知の方法による核酸の宿主細胞への導入を本明細書では「形質転換」と称する。前記した核酸を導入した細胞はこのような細胞の子孫を含むことをも意味する。
【０３０６】
本発明の大量の核酸およびタンパク質を、ベクターまたは原核または真核宿主細胞に適合するその他の発現ベヒクル中のＬＲＰ５またはＨＢＭ核酸またはその一部を発現させることにより調製することができる。最も一般的に用いられる原核細胞宿主は大腸菌の株であるが、しかしながら、別の原核細胞、例えば枯草菌またはシュードモナスを用いることもできる。
【０３０７】
哺乳動物またはその他の真核宿主細胞、例えば酵母、繊維状菌類、植物、昆虫または両生類もしくは鳥類の種の宿主細胞が本発明のタンパク質の生成に有用である。培養での哺乳動物細胞の増殖はそれ自体周知である。JakobyおよびPastan(編)Cell Culture.Methods in Enzymology、58巻、Academic Press,Inc.、Harcourt Brace Javanovich、ニューヨーク州(1979)。一般に用いられる哺乳動物宿主細胞株の実例はＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、例えば高発現、望ましいグリコシル化パタンーンまたはその他の特徴を提供するために、その他の細胞株が適当であり得ることは当業者には理解されよう。
【０３０８】
ベクター構築物の様式に依存してマーカーを使用することにより、クローンを選択する。マーカーは同一または異なるＤＮＡ分子、好ましくは同一のＤＮＡ分子にあってよい。原核細胞宿主では、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたはその他の抗生物質に対する抵抗性により形質転換体を選択できる。温度感受性に基づく特定の産物の生成が適当なマーカーを提供することもできる。
【０３０９】
本発明の核酸で形質転換された原核または真核細胞は本発明の核酸およびタンパク質の生成のみならず、例えばＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質の特性の研究にも有用である。
【０３１０】
当業者に理解されるように、アンチセンス核酸配列はＬＲＰ５またはＨＢＭの発現を防御または現象させるのに有用である。例えば、ＬＲＰ５もしくはＨＢＭ遺伝子またはＬＲＰ５もしくはＨＢＭ領域に由来する別の配列の全てまたは一部を含有する核酸ベクターをアンチセンス配向のプロモーターの調節下に置き、細胞に導入することができる。このような細胞内のアンチセンス構築物の発現はＬＲＰ５またはＨＢＭ転写および／または翻訳および／または複製と干渉する。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉方法学もまた企図される。
【０３１１】
本明細書に開示するＬＲＰ５およびＨＢＭ遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて別の種における相同性ＬＲＰ５およびＨＢＭ遺伝子配列およびタンパク質を同定する。これらのＬＲＰ５およびＨＢＭ遺伝子配列およびタンパク質を、それが単離された種に関する本明細書で記載した診断／予後、治療および薬物スクリーニング法に使用する。
【０３１２】
ＸＩＸ．タンパク質発現および精製
本発明のＥＢＭタンパク質の発現および精製を本質的に以下の概要のように実施することができる。ＨＢＭ遺伝子、大腸菌における組換えタンパク質のクローニングおよび発現のために遺伝子発現系、例えばｐＥＴシステム(Novagen)に由来する膜および分泌タンパク質のクローニング、発現および精製を選択した。またペプチドタグ、Ｈｉｓ−ＴａｐをコードするＤＮＡ配列を目的のＤＮＡ配列の３’末端に融合し、組換えタンパク質生成物の精製を促進した。いずれかの５’終止シグナル配列の変化を避けるために、融合には３’末端を選択した。
【０３１３】
例えばＨＢＭをクローニングするために配列番号１、３および５〜１２に示した核酸から選択した核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製した。ＨＢＭヌクレオチド配列の５’および３’末端に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、Life Technologies(Gaithersburg、メリーランド州)から購入した。５’終端でNcoIクローニング部位を含むように全ての順行性プライマー（配列の５’末端に特異的）を設計した。NcoI部位内でコードされるメチオニン残基で、続いてバリン残基でタンパク質翻訳を可能にするようにこれらのプライマーを設計し、ＨＢＭ  ＤＮＡ配列によりタンパク質がコードされる。全ての逆行性プライマー（配列の３’末端に特異的）は５’終端でEcoRI部位を含み、それによりＨＢＭ配列のｐＥＴ−２８ｂの読み枠へのクローニングが可能になる。ｐＥＴ−２８ｂベクターは、６個のヒスチジン残基を含む（Ｃ末端で）さらなる２０個のカルボキシル末端アミノ酸をコードする配列を提供し、これはヒスチジンアフィニティタグを含んでなった。
【０３１４】
ＨＢＭ遺伝子からのゲノムＤＮＡ調製物をＰＣＲ増幅のための鋳型ＤＮＡの供給源として使用した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1994))。ＨＢＭヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ配列を増幅するために、最終容量１００μｌで２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、定義されたＨＢＭに相補的であり、それをフランキングする１μＭ  合成オリゴヌクレオチドプライマー（順行性および逆行性プライマー）、０．２ｍＭ  各デオキシヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ  ２．５単位(Amplitaq、Roche Molecular Systems,Inc.、Branchburg、ニュージャージー州)が入った反応バイアルにゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ）を導入した。
【０３１５】
熱循環反応の完了時に増幅したＤＮＡの各サンプルをQiaquick Spin PCR精製キット(Qiagen、Gaithersburg、メリーランド州)を用いて精製した。増幅したＤＮＡサンプル全てを制限エンドヌクレアーゼ、例えばＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ(New England BioLabs、Beverly,マサチューセッツ州)を用いる消化に供した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。次いでＤＮＡサンプルを１．０％ＮｕＳｅｉｖｅ(FMC BioProducts、Rockland、メイン州)アガロースゲルでの電気泳動に供した。臭化エチジウムおよび長波ＵＶ照射に暴露することによりＤＮＡを可視化した。アガロースゲルから単離した切片に含まれるＤＮＡをＢｉｏ  １０１ＧｅｎｅＣｌｅａｎキットプロトコル(Bio 101、Vista、カリフォルニア州)を用いて精製した。
【０３１６】
制限エンドヌクレアーゼ、例えばＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ(New England BioLabs、Beverly,マサチューセッツ州)を用いる消化によりｐＥＴ−２８ｂベクターをクローニング用に調製した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。挿入した遺伝子の５’末端に融合できるヒスチジンアフィニティタグをコードするｐＥＴ−２８ｂベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼを用いる消化により調製した。
【０３１７】
消化に続いて、ＤＮＡインサートを予め消化したｐＥＴ−２８ｂ発現ベクターにクローン化した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。次いで以下に記載するように、ライゲーション反応の生成物を用いて大腸菌のＢＬ２１株を形質転換した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。
【０３１８】
標準的な方法に従ってコンピテント細菌大腸菌株ＢＬ２１または大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をクローン化されたＨＢＭ配列組換えｐＥＴ発現プラスミドで形質転換した(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。簡単には、ライゲーション反応物１μｌをエレクトロコンピテント細胞５０μｌと混合し、高電圧に供し、その後サンプルをＳＯＣ培地（０．５％酵母抽出物、２．０％トリプトン、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４および２０ｍＭ  グルコース）０．４５ｍｌ中３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。次いでサンプルを２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン含有ＬＢ寒天プレートに広げて、一晩成長させた。次いでＢＬ２１の形質転換されたコロニーを採取し、以下に記載するように分析してクローン化されたインサートを評価した。
【０３１９】
元来のＰＣＲ増幅クローニング反応で用いたＨＢＭ配列に特異的な同一の順行性および逆行性プライマーを用いて、組換えｐＥＴ−２８ｂ  ＨＢＭヌクレオチド配列で形質転換した個々のＢＬ２１クローンをクローン化されたインサートのＰＣＲ増幅により分析した。発現ベクター中のＨＢＭ配列の組み込みは増幅の成功により証明される(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.(1994))。
【０３２０】
適切にクローン化されたＨＢＭヌクレオチド配列を担持する組換えｐＥＴ−２８ｂベクターの個々のクローンを採取し、ＬＢブロス５ｍｌ＋２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン中で一晩インキュベートした。翌日プラスミドＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製プロトコル(Qiagen Inc.、Chatsworth 、カリフォルニア州)を用いて精製した。
【０３２１】
ｐＥＴベクターをクローニングまたはプラスミド調製の目的でいずれかの大腸菌Ｋ−１２株、例えばＥＭＳ１７４、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等で増殖させることができる。発現のための宿主にはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌株などがある。これらの宿主は、ｌａｃＩ遺伝子、ｌａｃＵＶ５プロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子を担持するλ誘導体であるバクテリオファージＤＥ３のリソゲンであった。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを誘導し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが機能的Ｔ７プロモーター、例えばｐＥＴ−２８ｂを含有し、目的の遺伝子を担持するいずれかの標的プラスミドを転写する。株には例えばＢＬ２１（ＤＥ３）などがある(Studierら、Meth.Enzymol.185:60-89(1990))。
【０３２２】
組換えＨＢＭ配列を発現するために、プラスミドＤＮＡ５０ｎｇを前記したように単離して、前記したようにコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細菌を形質転換した（ｐＥＴ発現キットの一部としてNovagenにより提供される）。ＨＢＭ組換え構築物に関して記載したように、ｌａｃＺ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）をｐＥＴ−Ｓｙｓｔｅｍに発現させる。形質転換された細胞をＳＯＣ培地中１時間培養し、次に培養物を２５μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン含有ＬＢプレートにプレートした。翌日に細菌性コロニーをプールし、硫酸カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地にて６００ｎＭで光学密度０．５から１．０Ｏ．Ｄ．単位まで成長させ、その点で１ｍＭ  ＩＰＴＧを培養物に３時間加えてＨＢＭ組換えＤＮＡ構築物の遺伝子発現を誘導した。
【０３２３】
ＩＰＴＧでの遺伝子発現のインキュベーションの後、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心を用いて３５００ｘｇで４℃で１５分間の遠心により細菌を収集した。ペレットをcold ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＴＥバッファー）５０ｍｌに再懸濁した。次に細胞を２０００ｘｇで４℃で２０分間遠心した。湿ったペレットの重量を測定し、タンパク質精製の準備まで−８０℃で凍結した。
【０３２４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現系
また別に、ＨＢＭおよびＬＲＰ５を真核細胞において発現させることができる。真核細胞、例えば哺乳動物由来の細胞株はシスチン富化ドメイン、例えばＥＧＦおよびＬＤＬＲモデュールを含有する適切に折り畳まれたタンパク質を発現することがさらに可能である。
【０３２５】
構築物の開発
ＩｇＧ−ＦｃへのＨＢＭおよびＬＲＰ５細胞外ドメイン融合（ＥＣＤ）を調製した。これらのＩｇＧ−ＦｃドメインへのＥＣＤ融合によりＬＲＰ５／ＨＢＭレセプターの内因性膜貫通および細胞質部分が除去され、分泌融合タンパク質が生成されるはずである。エンテロキナーゼ認識部位によりＬＲＰ５／ＨＢＭ  ＥＣＤからＦｃ領域が分離され、Ｆｃドメインの存在しない精製されたＬＲＰ５またはＨＢＭ  ＥＣＤタンパク質を得ることができる。この構築に用いられたベクターは、アデノ主要後記プロモーターの大部分がｔｅｔオペレーターの６個の反復により置換された(Gossenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))ｐＥＤの誘導体であるｐＨＴｏｐ(Kaufmanら、Nuc.Acids.Res.19:4485-490(1991))であった。このベクターはデヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有し、細胞株ＣＨＯ／Ａ２（以下の記載を参照）に導入されたとき、非常に効率的に機能する。高発現のクローンを、高濃度メソトレキセート（ＭＴＸ）中で生存する細胞を単離することにより選択することができる。
【０３２６】
ＣＨＯ発現ベクターｐＨＴＯＰ−ＦｃをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化した。アクリルアミドゲル切片からの電気溶出により、介在配列を精製して残りのベクターから除去した。ＳａｌＩはｐＨＴＯＰ−Ｆｃにおいて５’を内在性のミツバチ・メリチンシグナル配列まで切断し、ＮｏｔＩはちょうど５’でコード化配列ＩｇＧ１−Ｆｃまで切断する。得られたＳａｌＩ−ＮｏｔＩ  ｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターはシグナル配列が除去されており、ＮｏｔＩクローニング部位はＩｇＧ−Ｆｃへの５’融合の作製を施しやすい。ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６におけるＬＲＰ５全長およびｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６におけるＨＢＭ全長を別個にＸｍａ１（シグナル配列をコードするＯＲＦの領域内で切断する）およびＢａｍＨＩ（ＯＲＦ内で切断する）で消化してＬＲＰ５およびＨＢＭの２２８６ｂｐ５’フラグメントを作製した。ＨＢＭからＬＲＰ５を区別する変異体はこのフラグメントに在る。別に、ＬＲＰ５  ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化してＬＲＰ５とＨＢＭ遺伝子の双方に共通する１８００ｂｐ３’フラグメントを単離した。一緒にするとこれらの２個のフラグメントはＨＢＭおよびＬＲＰ５細胞外ドメインのコード化配列、少しのシグナル配列の最初の６個のアミノ酸のコード化配列ならびに細胞外ドメインの末端の前の１８個の終末アミノ酸を構成し、本発明者はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットから配列（配列番号６９８）「ＳＰＡＨＳＳ」の末端まで推定した。
【０３２７】
合成二本鎖を設計して、イニシエーターメチオニンおよびＫｏｚａｋ配列を含む元来のＸｍａｌ部位の５’のＬＲＰ５／ＨＢＭシグナル配列コード化配列を再生した。ＳａｌＩ（５’）およびＸｍａｌ（３’）付着末端を含有するようにこの二本鎖を設計して末端を適応させて前記した遺伝子フラグメントをｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターに適応させた。以下に提示するような２つの部分的相補性オリゴヌクレオチド（配列番号６９９〜７００）からこの合成二本鎖を構築した。
5’-TCGACCACCATGGAGGCAGCGCCGC-3’
3’-GGTGGTACCTCCGTCGCGGCGGGCC-5’
【０３２８】
第２の合成二本鎖を設計して元来のＳａｃＩ部位から配列「．．．．．ＳＰＡＨＳＳ」のセリンに続く細胞外ドメインの推定される末端までを再生し、またＩｇＧ−Ｆｃの下流へのフレーム内融合を可能にするクローニング部位をコードした。ＳａｃＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）付着末端を含有するようにこの二本鎖を設計して前記した遺伝子フラグメントをｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターに適応させた。以下に提示するような２つの部分的相補性オリゴヌクレオチド（配列番号７０１−７０２）からこの合成二本鎖を構築した。
5’-CATGTGTGAAATCACCAAGCCGCCCTCAGACGACAGCCCGGCCCACAGCAGTGGC-3’
3’-TCGAGTACACACTTTAGTGGTTCGGCGGGAGTCTGCTGTCGGGCCGGGTGTCGTCACCGCCGG-5’
【０３２９】
フラグメント、合成二本鎖、およびベクターを一緒に単一の反応でライゲートした。ＬＲＰ５およびＨＢＭに関して別個の反応を実施した。ライゲーション混合物を用いてエレクトロコンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、一般的なＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ３’フラグメントをプローブとして用いて、得られたコロニーを放射活性コロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。挿入したＬＲＰ５またはＨＢＭと共にプラスミドを含有するコロニーを同定し、プラスミドを複数の候補から単離し、その配列をＤＮＡシークエンシングにより証明した。次いで証明された構築物をＣＨＯ細胞へのトランスフェクションに使用した。
【０３３０】
ＣＨＯ安定細胞株の確立
ＴｅｔレプレッサーとヘルペスウイルスＶＰ１６転写ドメインの間に転写アクチベーター（ｔＴＡ）、融合タンパク質を安定して組み込むことにより（Gossenら）、ＣＨＯ／Ａ２細胞株をＣＨＯ  ＤＵＫＸ  Ｂ１１(UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220(1980))から誘導する。ｐＨＴｏｐＨＢＭ−１．ＦｃをＣＨＯ／Ａ２細胞に、およびｐＨＴｏｐＺｍａｘ１．ＦｃをＣＨＯ／Ａ２細胞にトランスフェクトすることにより（リポフェクションを用いて）、細胞外ＨＢＭ−１．ＦｃおよびＬＲＰ５．Ｆｃを発現するＣＨＯ細胞株を確立した。細胞を０．０２μＭ  メソトレキセート中で培養することによりクローンを選択した。後でクローンを最終濃度０．５μＭ  メソトレキセートまで段階的に増幅した。
【０３３１】
ＣＨＯ安定細胞株のスクリーニング
複数のクローンを種々の技術によりスクリーニングした。ウェスタンブロットアッセイにより（マウス）抗ヒトＩｇＧ．Ｆｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を用いてクローンをスクリーニングした。また同一クローンを３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓで６時間パルス、または１５分間パルスで代謝的に標識し、続いて放射標識Ｍｅｔ／Ｃｙｓ不含の培地中で１時間、４時間、または２４時間追跡した。条件培地、および細胞抽出物から得たタンパク質に関して免疫沈澱を実施した。次いで精製を実施し、続いて当分野で公知のＮ末端シークエンシングを用いてタンパク質をシークエンシングした。
【０３３２】
融合タンパク質精製
条件培地またはＣＨＯ安定細胞の細胞抽出物からＬＲＰ５−ＩｇＧまたはＨＢＭ−ＩｇＧ融合タンパク質を精製することができる。プロテインＡに対するアフィニティ結合（例えばプロテインＡコーティングビーズまたはカラムを使用する）により融合タンパク質を単離する。次いでエンテロキナーゼ消化により続いてＺｍａｘ／ＨＢＭ１  ＥＣＤタンパク質からＩｇＧ−ＦＣドメインを切断することができる。
【０３３３】
細胞株およびタンパク質の可能な使用
リガンドハンティング、抗体作製、結晶構造の決定および競合結合アッセイにおいて使用するための精製されたタンパク質を作製するために安定した細胞株を使用することができる。
【０３３４】
当業者に公知の種々の方法学を用いて単離されたタンパク質を精製することができる(Coliganら、Current Protocols in Protein Science、John Wiley & Sons(1995))。例えば凍結細胞を解凍し、バッファーに再懸濁し、小容量マイクロフルイダイザー(M-110Sモデル、Microfluidics International Corp.、Newton、マサチューセッツ州)を数回通過させることにより破壊した。得られたホモジネートを遠心して透明な上澄（粗抽出物）を得て、続いて濾過して粗抽出物をカラムで分画化する。ＯＤ２８０ｎｍでの吸光度により分画をモニター観察し、ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析できる。
【０３３５】
精製したタンパク質の濃度を分光光度計でアミノ酸含量から算出した吸光計数を用いて定量する(Perkins,Eur.J.Biochem.157:169-180(1986))。またタンパク質濃度を標準としてウシ血清アルブミンを用いてBfadfordの方法(Anal.Biochem.72:284-254(1976)およびLowryら、J.BIol.Chem.193:265-275(1951))により測定する。
【０３３６】
種々濃度のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルをＢｉｏＲａｄ(Hercules、カリフォルニア州)から購入し、クウーマシー・ブルーで染色した。分子量マーカーはウサギ骨格筋ミオシン（２００ｋＤａ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウサギ筋肉ホスホリラーゼＢ（９７．４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）、卵白アルブミン（４５ｋＤａ）、ウシ炭酸脱水酵素（３１ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、卵白リゾチーム（１４．４ｋＤａ）およびウシアプロチニン（６．５ｋＤａ）を含むことができる。
【０３３７】
一度望ましいタンパク質の十分量が得られると、種々の目的に用いることができる。典型的な使用は結合に特異的な抗体の生成である。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかでよく、当分野で周知のインビトロまたはインビボ技術により生成することができる。記載するように同定され、単離されたいずれかのペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体をネズミハイブリドーマから調製することができる(Kohler、Nature 256:495(1975))。要約すると、マウスにＨＢＭタンパク質数マイクログラムを２週間にわたって接種する。次いでマウスを屠殺する。抗体を生成する細胞をマウス脾臓から取り出す。次いで脾臓細胞をポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。融合に成功した細胞をマイクロタイタープレートで希釈し、培養物の成長を続けさせる。ウェルあたりの抗体の量をイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ(Engvall、Meth.Enzymol.70:419(1980))により測定する。抗体産生クローンを広げ、さらに増殖させてＨＢＭ抗体を生成させる。その他の適当な技術にはリンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロ暴露、または別に、ファージもしくは類似のベクター中の抗体のライブラリーの選択などがある。Huseら、Science 246:1275-1281(1989)参照。抗体生成に関するさらなる情報についてはDavisら、Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、ニューヨーク州セクション21-2(1989)参照。
【０３３８】
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６ポリクローナル抗体
ヒトＬＲＰ５（配列番号３）およびＬＲＰ６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７４２６４）の双方に対してポリクローナル抗体を作成した。ＬＲＰ５アミノ酸配列からのペプチドを５つの目標に基づく免疫原として選択した。１）ＬＲＰ５とＬＲＰ６アミノ酸配列の間の差異を最大にする（アミノ酸同一性７１％）。図２７参照。配列比較のために、典型的には１つの配列が参照配列の機能を果たし、被験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、被験および参照配列をコンピューターにインプットし、必要な場合続くコーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで配列比較アルゴリズムが（複数の）被験配列に関して、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に相対する配列同一性パーセントを算出する。２）配列アラインメントおよび類似性検索を実施することにより別の公知の遺伝子との交差反応の可能性を最低にする。比較のための配列の最適アラインメントを例えばSmithおよびWaterman、Adv.Appl.Math.2:482(1981)のローカル相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似の方法のための検索により、これらのアルゴリズムおよびWisconsin遺伝学ソフトウェアパッケージ、Genetics Computer Group、585 Science Dr.Madison、ウィスコンシン州に含まれるプログラムにおけるその他のアルゴリズムにより、または肉眼検査（一般的にはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1997)）により行うことができる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはAltschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはNational Center for Biotechnology Informationを通して公に入手可能である。3)Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ、Genetics Computer Group、575 Science Dr.Madison、ウィスコンシン州に含まれるプログラムを用いて、PeptideStructureタンパク質分析により決定されるできるだけ最高の抗原性指標を有するペプチドを入手する。４）ファミリー遺伝子および遺伝子の細胞外および細胞質領域に相対する位置内の高度に相同性のドメイン（例えばＥＧＦ様ドメインおよびＬＤＬレセプター反復）に相対するペプチドの位置付け。５）ならびに、ヒトＬＲＰ５特異的抗体、ヒトアミノ酸配列（配列番号３）をマウスＬＲＰ５配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６４９８４）と比較し、前記の基準に基づいてペプチドを選択し、加えて２つの種間の配列類似性を最低にした（図２６参照）。
【０３３９】
前記の同一の基準を用いて、ＬＲＰ６特異的ペプチドをポリクローナル抗体産生に関して選択した。表は選択したアミノ酸配列、ヒト配列とマウス配列間のペプチド内でのアミノ酸相違を列挙する。ニュージランド白色ウサギにおけるペプチド合成および続くポリクローナル抗体産生のために全てのペプチド配列（アミノ酸１２〜１８の範囲）をSigma/Genosys(St.Louis、ミズーリー州)に提供した。各免疫ウサギの血清に由来するＩｇＧ分画をプロテインＧセファロース(Amersham)を用いて単離した。これらのペプチドを用いるポリクローナル抗体作製を別の種、例えばニワトリにおいて同様に行うことができる。ヒト（参照）およびネズミ／げっ歯類配列間の類似性の程度が高い場合、これはしばしば有利である。
【０３４０】
【表７】
2005511002.tif 000012
【０３４１】
ファージディスプレイにより発展された一本鎖Ｆｖ分子
ＬＲＰ５配列（配列番号３）からペプチドを選択してファージディスプレイにより一本鎖Ｆｖ分子をスクリーニングした。合成およびそれに続くｓｃＦｖ分子のためのファージディスプレイスクリーニングのために全部で１７個のペプチドをＬＲＰ５配列から選択した。Cambridge、英国のCambridge Antibody Technology(CaT)で全てのペプチド合成およびファージディスプレイ研究を実施した。前記した基準に基づいてペプチドを選択した。
【０３４２】
【表８】
2005511002.tif 000013
【０３４３】
これらの領域の多くは（例えば４０１〜４２１、４２１〜４４１、７８１〜８０１、および１２２９〜１２４９）はマウスＬＲＰ５と１００％同一性を共有することに注目されたい（図２６参照）。従って、マウスおよびヒトの双方の形態のタンパク質に対してこれらを使用することができる。ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の双方を認識する抗体の作製を促進するためにペプチド４２１−４４１を含めた（図２７参照）。ＨＢＭ変異部位（ＬＲＰ５残基１６１−１８１）にわたる２個のペプチドを合成し、一方はＬＲＰ５配列を有し、他方はＨＢＭ配列を含有した。
【０３４４】
一度ｓｃＦｖ分子を単離すると、これを試薬として免疫化学において用いて種々のヒトの正常および疾患組織におけるＬＲＰ５タンパク質発現を検出した。ＬＲＰ５の細胞外ドメインのペプチド１０００−１０２１（ＩＫＲＡＫＤＤＧＴＱＰＦＶＬＴＳＬＳＱＧＱＮ）（配列番号７１４）に対する３つのファージクローンの詳細なｓｃＦＶ抗体免疫組織化学分析により心筋、腎臓、肺および肝臓での陽性染色が示された。前立腺癌における発現もまた検出した。これらの結果はｍＲＮＡ組織分布プロファイルおよび公開されたＬＲＰ５  ｍＲＮＡ局在性(Kimら、J.Biochem.124:1072-1076(1998))の報告と合致する。得られたファージクローンはプールから生じ、これをシークエンシングして分子のＦｖ領域における変異体の可能性を同定した。一度同定すると、次いで無傷および機能的免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）分子の最終的な組み立てのためにＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトするため、適当なｓｃＦＶを可変性重鎖および可変性軽鎖ＤＮＡ構築物にサブクローン化することができる。次いで当分野で公知なように、さらに特異性および反応性に関して細胞により発現されるＩｇＧを特徴付けすることができる。
【０３４５】
モノクローナル抗体の作製
例えばＢａｌｂ／ｃマウスの完全な細胞およびアデノウイルス免疫によりモノクローナル抗体をＬＲＰ５およびＨＢＭおよびその変異体に発展させることができる。例えばＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から樹状細胞を単離することができ、細胞をインビトロで成長因子ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で広げた。次いで樹状細胞をＨＢＭまたはＬＲＰ５アデノウイルス粒子で感染させることができる。次いでＢａｌｂ／ｃマウスへの静脈内注射の前に２４時間細胞を培養する。３から４週毎に２から３回、３か月にわたって樹状細胞（１ｘ１０６セル／マウス）を注射した。
【０３４６】
また別に、例えばｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター中の精製されたＨＢＭおよびＬＲＰ５  ＤＮＡをコロイド金粒子にコーティングすることができる。次いで遺伝子銃技術を用いてこの粒子を望ましいマウスに皮下注射することができる。マウスあたりｃＤＮＡおよそ５μｇを注射することができる。２週毎に４から６回、およそ３か月にわたって注射を行う。
【０３４７】
別の意見は、ＨＢＭおよびＬＲＰ５およびその各々のアデノウイルスを過剰発現する細胞（動物のいずれかの種であるが、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウス株または非特異的タンパク質への限定的な抗原応答に関連する、使用されているマウス株と同一の種）を２から３週毎に必要に応じて約１．５から３か月間マウスに注射する。マウスからの出血をＥＬＩＳＡ（精製されたタンパク質またはタンパク質融合体を使用する）、細胞基盤のＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色およびウェスタンブロッティングにより元来のおよび変性タンパク質との反応性に関して試験できる。動物に由来する血清サンプルをＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）によりＬＲＰ５またはＨＢＭアデノウイルスで感染した細胞を用いてスクリーニングすることができる。次いでマウスからの最強の反応性を有する脾臓細胞（抗体産生細胞）をミエローマと融合させてハイブリドーマ細胞を作製することができる。次いでハイブリドーマからの条件培地を続くクローニングのための陽性細胞コロニーに関してスクリーニングする。次いで腹水産生のためにこれらのクローン化された細胞をマウスの腹腔内に注射することができる。
【０３４８】
ポリクローナル抗体の適用
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６を志向するポリクローナル抗体を発展させてこれらのタンパク質の機能を決定し、種々組織、細胞またはいずれかの生物学的サンプルにおける発現パターンおよびレベルを分析した。ＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６および関連する変異体に対するポリクローナル抗体の使用には、非限定例としては、骨横断面マウントの分析、組織分布、罹患／非罹患ファミリーメンバーの骨バイオプシサンプルからのタンパク質の発現の評価（例えば骨細胞消化、骨髄間質細胞培養の外植）、一過性または安定性トランスフェクト細胞におけるタンパク質発現レベルの評価、組織、血清または体液におけるタンパク質濃度を評価すること、リガンドハンティングおよび機能的アッセイ開発のためのこれらのタンパク質の全長またはフラグメントの精製、これらのタンパク質と相互作用するリガンドまたはタンパク質の同定、ならびにＬＲＰ６、ＬＲＰ５およびＨＢＭ、および関連する変異体のシグナル発生経路の解明などがある。
【０３４９】
例えばＬＲＰ５をｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)にクローン化した。これを用いて３５Ｓ標識インビトロ翻訳(Promega、Madison、ウィスコンシン州)ＬＲＰ５を作製した。ペプチド免疫原：ＲＷＫＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳＤＳＤＰＹ（配列番号７１１）を志向する抗体（１０μｇ／ｍｌ）３１０９および３１１０を、１０μｇ／ｍｌ特異的ペプチド（すなわちＲＷＫＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳＤＳＤＰＹ）（配列番号７１１）もしくは非特異的ペプチド（すなわちＳＧＷＮＥＣＡＳＳＮＧＨＣＳＨ）（配列番号７１２）のいずれかの存在下かまたはペプチド不含でインビトロ翻訳産物２０μｌと組み合わせ、そして４℃で１．５時間インキュベートした。次いでプロテインＡセファロースをサンプル（予め網状赤血球ライゼートで約１．５時間遮断した）に加え、そしてサンプルを４℃で１時間振盪した。プロテインＡセファロースをＰＢＳ  ０．５ｍｌで３回洗浄した。続いて結合タンパク質を４〜１２％グラジエントＮｕＰＡＧＥゲル(Invitrogen)上で製造者の指示書に従って分離した。ゲルを８０℃で３０分間乾燥させ、そして次にＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルムに２４から４８時間暴露した。特異的プローブが３５Ｓ標識ＬＲＰ５免疫沈澱タンパク質に関していずれかの抗体と有意に競合するのが観察された。競合は非特異的タンパク質では観察されなかった。
【０３５０】
これらの抗体を免疫組織化学に用いることもできる。例えば、ＨＢＭトランスジェニックおよび野生型マウスを、ＣＯ２麻酔を用いて屠殺した。マウス頭蓋冠を無傷で取り出し、軟部組織を穏やかに切開した。さらに処理および分析するために、骨を１０％リン酸塩緩衝ホルマリン中２４時間固定した。固定の後、頭蓋冠をＴＢＤ−２脱灰試薬(Sandon、Pittsburgh、ペンシルバニア州)で約７から８時間脱灰し、次に等級別アルコールで脱水した。次いで頭蓋冠を頭頂骨の中央部分を通ってラムダ状縫合および冠状縫合まで矢状縫合に対して垂直に二等分し、パラフィン包埋した。４から６個の、５μｍ厚の典型的な切片を切断した。
【０３５１】
例えばウサギポリクローナル抗体、ＬＲＰ５／ＨＢＭ（すなわち抗体３１０９および３１１０）はＨＢＭトランスジェニックおよび野生型の双方のマウス頭蓋冠でＬＲＰ５を認識する。タンパク質発現の存在量およびパターンを評価するために抗ＬＲＰ５または抗ＨＢＭ抗体を用いてＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質を検出することができる。抗体を検出可能な物質に結合させる（すなわち物理的連結）ことにより検出を促進することができる。検出可能な物質の実例としては、種々酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射活性材料などがある。適当な酵素の実例には西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがあり；適当な補欠分子族複合体の実例としてはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどがあり；適当な蛍光材料の実例にはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンなどがあり；発光材料の実例としてはルミノールなどがあり；生物発光材料の実例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびアクオリエンなどがあり；適当な放射活性材料には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈなどがある。また別に、１次ＬＲＰ５ポリクローナル抗体の存在を検出する２次抗体を用いることができる。実例は全てのウサギ免疫グロブリンを認識する抗体である。この２次抗体を前記したのと同一の様式で結合させて検出を促進することができる。対照はアビジンペルオキシダーゼを伴うサンプルを含むが、しかし抗体は含まなかった。間質細胞および間葉細胞の強い陽性染色が縫合部分で観察された。野生型マウスと比較してＨＢＭの頭蓋冠の骨膜内で前骨芽細胞および骨芽細胞が、いくつかの骨細胞が抗体３１０９および３１１０と共に観察された。ＨＢＭトランスジェニックマウスの組織頭蓋冠切片の高度な拡大図により骨細胞および縫合部分内の細胞の顕著な細胞膜染色が示された。
【０３５２】
ＸＸ．使用方法：遺伝子治療
近年、遺伝的および後天的疾患の遺伝子治療の分野で著明な技術的進歩が為されている。(Kayら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12744-12746(1997))遺伝子治療を、治療目的のための慎重なＤＮＡ移動として特徴付けることができる。遺伝子移動方法の改良により疾患の多様な型の処置のための遺伝子治療プロトコルの開発が可能になっている。遺伝子治療はまた新規治療用遺伝子の同定、ウイルス性および非ウイルスの双方の遺伝子分配システムにおける改良、遺伝子制御のよりよい理解、ならびに細胞単離および移植における改良における最近の進歩を巧みに利用している。
【０３５３】
先行する実験ではＨＢＭ遺伝子が骨量上昇を付与する優性変異として同定されている。この変異が優性であるという事実はＨＢＭタンパク質の発現が骨量上昇を引き起こすことを示している。ＨＢＭ遺伝子を担持する、従ってＨＢＭタンパク質を発現する老齢の個体は骨粗鬆症を患わない。これらの個体はＨＢＭタンパク質で処置されている個体と同等である。これらの観察はＨＢＭタンパク質での治療的処置は骨粗鬆症を防御するという強力な実験的表示である。ＨＢＭ遺伝子の骨量上昇活性を「ＨＢＭ機能」と称する。
【０３５４】
従って、本発明によれば、間葉幹細胞にＨＢＭ機能を供給する方法もまた提供される。(Onyiaら、J.Bone Miner.Res. 13:20-30(1998);Koら、Cancer Res.54:4614-4619(1996))。このような機能を供給することにより骨粗鬆症に対する保護が提供される。ＨＢＭ遺伝子または該遺伝子の部分を、遺伝子が染色体外に留まるようにベクターの細胞に導入することができる。このような状況では、遺伝子は染色体外位置から細胞により発現される。
【０３５５】
組換えおよび染色体外維持の双方のための遺伝子を導入するためのベクターは当分野で公知であり、いずれかの適当なベクターを用いることができる。ＤＮＡを細胞に導入するための方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿、およびウイルス性形質導入が当分野で公知であり、方法の選択は当業者の能力内である(Robbins編、Gene Therapy Protocols、Human Press、ニュージャージー州(1997))。ＨＢＭ遺伝子で形質転換された細胞をモデル系として用いて骨粗鬆症および骨成長を促進する薬物処置を研究することができる。
【０３５６】
一般的に前記で論じたように、ＨＢＭ遺伝子またはフラグメントを、適用可能な場合、遺伝治療法を用いて間葉幹細胞におけるこのような遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。野生型遺伝子が正常に発現されるこれらの細胞においてさえ、所定のＨＢＭタンパク質、またはそのフラグメントの発現レベルを上昇させることも有用であり得る。例えばFriedman、Therapy for Genetic Disease,Friedman編、Oxford University Press、105-121頁(1991)に記載されるように一般に認められている方法に従って遺伝子治療を実施する。
【０３５７】
発現調節エレメントに連結され、間葉幹細胞内で複製可能なＨＢＭ遺伝子のコピーを含有するウイルスまたはプラスミドベクターを調製する。適当なベクターは公知であり、例えば米国特許第5,252,479号およびWO93/07282（その開示は全て参照により本明細書に組み込む）に記載されている。次いでベクターを骨髄に局所的、または全身的（別の部位に位置するいずれの間葉幹細胞にも到達させるために、すなわち血中で）のいずれかで親に注射する。トランスフェクトされた遺伝子が標的細胞の各々のゲノムに永久的に組み込まれない場合、処置を定期的に繰り返さなければならない。
【０３５８】
当分野で公知の遺伝子移入系は本発明の遺伝子治療法の実行において有用であり得る。これにはウイルス性および非ウイルス性移動方法が含まれる。ポリオーマ、すなわちＳＶ４０(Madzakら、J.Gen.Virol.73:1533-1536(1992))、アデノウイルス(Berkner、Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:39-61(1992);Berknerら、Bio Techniques 6:616-629(1988);Gorzigliaら、J.Virol.66:4407-4412(1992);Quantinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584(1992)、Rosenfeldら、Cell 68:143-155(1992);Wilkinsonら、Nucl.Acids Res.20:2233-2239(1992);Stratford-Perricaudetら、Hum.Gene Ther.1:241-256(1990))、ワクシニアウイルス(Mackettら、Biotechnology 24:495-499(1992))、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka、Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:91-123(1992);Ohiら、Gene 89:279-282(1990))、ＨＳＶおよびＥＢＶなどのヘルペスウイルス(Margolskee、Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:67-90(1992);Johnsonら、J.Virol.66:2952-2965(1992);Finkら、Hum.Gene Ther.3:11-19(1992);Breakfieldら、Mol.Neurobiol.1:337-371(1987);Fresseら、Biochem.Pharmacol.40:2189-2199(1990))、ならびに鳥類のレトロウイルス(Brandyopadhyayら、Mol.Cell Biol.4:749-754(1984);Petropouplosら、J.Virol.66:3391-3397(1992))、ネズミ(Miller、Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:1-24(1992);Millerら、Mol.Cell Biol.5:431-437(1985);Sorgeら、Mol.Cell Biol.4:1730-1737(1984);Mannら、J.Virol.54:401-407(1985))およびヒト起源(Pageら、J.Virol.64:5370-5276(1990);Buchschalcherら、J.Virol.66:2731-2739(1992);)などの多くのウイルスが遺伝子移動ベクターとして用いられている。たいていのヒト遺伝子治療プロトコルは無能化されたネズミレトロウイルスに基づいている。
【０３５９】
当分野で公知の非ウイルス性遺伝子移動法には化学的技術、例えばリン酸カルシウム共沈殿(Gahamら、Virology 52:456-467(1973);Pellicerら、Science 209:1414-1422(1980))、機械的技術、例えばマイクロインジェクション(Andersonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5399-5403(1980);Gordonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384(1980);Brinsterら、Cell 27:223-231(1981);Constantiniら、Nature 294:92-94(1981))、リポソームを介する膜融合媒介移動(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417(1987);Wangら、Biochemistry 28:9508-9514(1989);Kanedaら、J,Biol.Chem.264:12126-12129(1989);Stewartら、Hum.Gene Ther.3:267-275(1992);Nabelら、Science 249:1285-1288(1990);Limら、Circulation 83:2007-2011(1992))および直接ＤＮＡ取り込みおよびレセプター媒介ＤＮＡ移動(Wolffら、Science 247:1465-1468(1990);Wuら、BioTechniques 11:474-485(1991);Zenkeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3655-3659(1990);Wuら、J.Biol.Chem.264:16985-16987(1989);Wolffら、BioTechniques 11:474-485(1991);Wagnerら、(1990);Wagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4255-4259(1991);Cottenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4033-4037(1990);Curielら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8850-8854(1991);Curielら、Hum.Gene Ther.3:147-154(1991))などがある。ウイルス媒介遺伝子移動を、周囲細胞ではなく間葉幹細胞への直接インビボベクターと組み合わせることができる(Romanoら、In Vivo 12(1):59-67(1998);Gonezら、Hum.Mol.Genetics 7(12):1913-1919(1998))。また別に、レトロウイルスベクタープロデューサー細胞株を骨髄に注射することができる(Culverら、Science 256:1550-1552(1992))。次いでプロデューサー細胞の注射によりベクター粒子の継続的な供給源が提供される。この技術は手術不能な脳腫瘍のヒトにおいての使用が認可されている。
【０３６０】
生物学的および物理学的遺伝子移動方法を組み合わせた研究法では、いずれかの大きさのプラスミドＤＮＡをアデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン結合抗体と組み合わせ、得られた複合体をアデノウイルスベクターと結合させる。次いで３分子複合体を用いて細胞を感染させる。アデノウイルスベクターにより、結合したＤＮＡが損傷を受ける前に、エンドソームの効率的な結合、内部移行および分解が可能になる。
【０３６１】
リポソーム／ＤＮＡ複合体が直接インビボ遺伝子移動を媒介できることが示されている。標準的なリポソーム調製では遺伝子移動方法は非特異的であるが、インビボ取り込みおよび発現が、例えば直接インサイチュ投与に続いて腫瘍沈着物に局在することが報告されている(Nabel、Hum.Gene Ther.3:399-410(1992))。
【０３６２】
ＸＸＩ．使用方法：研究手段としておよび医薬品開発のための形質転換宿主およびトランスジェニック動物
ＨＢＭ、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６遺伝子を担持する細胞および動物はモデル系として用いられ、治療用物質としての可能性を有する物質を研究および試験するための貴重な研究手段である(Onyiaら、J.Bone Miner.Res.13:20-30(1998);Broderら、Bone 21:225-235(1997))。この目的のための細胞は典型的には培養された間葉幹細胞である。これを体細胞系または生殖系ＨＢＭ遺伝子と共に個体から単離することができる。また別に、前記したように細胞株を操作してＨＢＭ遺伝子を担持するようにできる。被験物質を細胞に適用した後、細胞の形質転換された表現型を決定する。形質転換された細胞のいずれかの形質、例えば培養物中の骨マトリックスの形成(Broderら、Bone 21:223-235(1997))、機械的特性(Kizerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:1013-1018(1997))、マーカー遺伝子の発現および推定される治療用物質の適用に対する応答を評価することができる。
【０３６３】
トランスジェニック修飾動物および細胞株を用いて治療用物質を試験することができる。トランスジェニック修飾には、例えばＬＲＰ５遺伝子の挿入、ならびにＨＢＭ遺伝子および破壊された相同遺伝子の挿入などがある。また別に、慣用される技術、例えばCapecchi、Science 244:1288(1989);Valancuisら、Mol.Cell Biol.11:1402(1991);Hastyら、Nature 350:243(1991);Shinkaiら、Cell 68:855(1992);Mombaertsら、Dell 68:869(1992);Philpottら、Science 256:1448(1992);Snouwaertら、Science 257:1083(1992);Donehowerら、Nature 356:215(1992)に記載される技術を用いて挿入された動物の（複数の）ＬＲＰ５遺伝子および／または（複数の）ＨＧＭ遺伝子を別の遺伝的変化の挿入または欠失により破壊することができる。被験物質を動物に投与した後、骨の成長を評価しなければならない。被験物質が骨の成長を変調する（例えば増強する）場合、すると被験物質が治療物質候補である。これらの動物モデルが、可能性のある治療用生成物の非常に重要なベヒクルを提供する。
【０３６４】
本発明はまた、内因性遺伝子の発現が活性化されており、さらに増幅され得る動物および細胞株をも提供し、これはＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質をコードする内因性ＤＮＡのインビトロ操作およびトランスフェクションを必要としない。これらの方法は例えばPCT出願WO94/12650および米国特許第5,968,502号に記載されており、これは双方共にその全てを参照により本明細書に組み込む。加えて、本発明は、内因性活性化または過剰発現がインサイチュ相同組換え、相同組換え、または非正統的組換え法により達成される方法を含む。これらの方法は例えばPCT出願WO99/15659およびWO00/49162に記載されており、その双方ともにその全体に参照により本明細書に組み込む。
【０３６５】
トランスジェニックおよびジーンターゲティング動物の作製
本発明はヒトＨＢＭ表現型を反復する遺伝的に修飾された動物を提供する。採用した研究法は、ゲノムに組み込まれたヒトＧからＴのヌクレオチド置換を有するトランスジェニックおよびジーンターゲティングの双方の動物の作製に関与し、動物はヒトＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）を発現するかまたは骨量を変化させる表現型を生み出す変異体を発現する。本発明の製造に続いて、Katoら(Journal of Cell Biology 157:303-314(2002))は最近低骨量表現型を実証するＬＲＰ５ノックアウトマウスの作製について記載している。Katoおよび共同研究者により記載された結果はＬＲＰ５がピーク骨量の決定因子であるという仮説に合致し、本発明の利用性の態様を実証する。
【０３６６】
ＨＢＭ多型性を過剰発現するトランスジェニックマウス
ＣＭＶｂアクチンまたはＩ型コラーゲンプロモーターのいずれかを利用してヒトＨＢＭ  ｃＤＮＡの発現を引き出すプラスミド構築物を調製した。最も一般的に用いられる哺乳動物発現のためのプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびＥＦ−１ａ（ヒト伸長因子１ａ−サブユニット）に由来する。ＣＮＶはヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから誘導される。ＣＭＶはたいていの細胞株においてＲＳＶまたはＳＶ４０よりも強力なプロモーターである。ＲＳＶプロモーターは鳥類ウイルスから誘導され、鳥類細胞株において強力なプロモーターである傾向がある。ＳＶ４０プロモーターは大きなＴ抗原、例えばＣＯＳ−１を含む細胞株において良好に発現される。これらの細胞株ではプラスミドはより高いコピー数で複製される。ＥＦ−１ａは組換えタンパク質発現のためにより広範に用いられ始めている。ＥＦ−１ａはヒト伸長因子１ａサブユニットからのプロモーターであり、遺伝子は哺乳動物細胞株において高度に発現され保存される。
【０３６７】
キメラＣＭＶｂアクチンプロモーターは骨などトランスジェニックマウスにおける偏在性遺伝子発現を生み出すことが知られているより強力なプロモーターである。このプロモーターを選択して、報告されている内因性マウスＬＲＰ５遺伝子の広範な発現と合致する様式でＨＢＭの発現を誘導した。ＨＢＭ表現型は骨において観察されるが、ＨＢＭ遺伝子は別の組織において直接的または間接的効果を有し得る。従って、別の強力な偏在性プロモーターを当業者に公知であるように利用することができる。
【０３６８】
Ｉ型コラーゲンプロモーターは組織限定遺伝子発現を提供し、この場合発現は本来骨に限定されている。骨においてＨＢＭの発現に至り得る別の骨特異的プロモーターが利用可能である。例えば、骨芽細胞の増殖に関連するプロモーターにはヒストン、Ｉ型コラーゲン、ＴＧＦβ１、ＭＳＸ２、ｃｆｏｓ／ｃＪｕｎおよびＣｂｆａ１を用いることができる。アルカリ性ホスファターゼ、ＭＧＰ、Ｃｂｆａ１、Ｆｒａ／ＪｕｎおよびＤｌｘ５などの骨マトリックス成熟化に随伴されるプロモーターを用いることもできる。オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロプタンパク質などの骨ミネラル化作用に随伴されるプロモーター、およびコラゲナーゼを用いることもできる。当業者に公知であるように、プロモーター選択を例えば組織発現、制御可能な変調の程度等により決定する。例えば、Ｉ型コラーゲンプロモーターを選択してＨＢＭが、骨におけるＬＲＰ５発現の内因性パターンに類似する一時的、空間的および骨細胞特異的パターンで骨において発現されることを確認した。
【０３６９】
野生型ＬＲＰ５遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウス
ＬＲＰ５の発現を誘導するＣＭＶｂアクチンおよびＩ型コラーゲンプロモーターを用いてプラスミド構築物を調製した。これらの動物をＨＢＭトランスジェニックマウスの対照動物モデルとして提供できる。さらなる対照には非トランスジェニック同腹仔および野生型同一の遺伝的背景の動物などがある。これらの動物の調製方法はＨＢＭ多型性を過剰発現するマウスに関して論じられているものに類似している。
【０３７０】
ＨＢＭ多型性を発現するジーンターゲティングマウス
ＨＢＭノックイン（ＫＩ）対立遺伝子およびＬＲＰ５ノックアウト（ＫＯ）対立遺伝子を含有する動物を作製するために用いることができるジーンターゲティング構築物を調製した。ジーンターゲティング構築物はエクソン３にＨＢＭ多型性を含有し、転写停止配列に連結され、ｌｏｘ  Ｐ部位が側面に位置するネオマイシン選択カセットを含んだ。マウスＬＲＰ５におけるＨＢＭ多型性はマウスＬＲＰ５相同体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０６４９８４）の位置１７０でのグリシンのバリンへのアミノ酸配列の変化に至る。相同組換えを用いて構築物をマウスゲノムに安定して導入する。転写停止配列が機能して修飾されたＬＲＰ５対立遺伝子の転写を完全に遮断する場合、次いで機能的ＬＲＰ５ノックアウト対立遺伝子を作製する。これはＬＲＰ５遺伝子に関するホモ接合性ノックアウト動物の作製を促進する。
【０３７１】
ノックイン対立遺伝子を作製する場合、Ｃｒｅレコンビナーゼを用いて、修飾されたエクソン３およびｌｏｘＰ部位の１つのコピーをそのままにして、ネオマイシン選択カセットを切除することができる。Ｃｒｅを一細胞受精胚に導入してＨＢＭの偏在性発現を促進するか、またはトランスジェニックマウスと動物の交雑により骨特異的ＨＢＭ発現を得ることができる。ＨＢＭノックイン対立遺伝子に関してホモ接合性動物を作製することができる。また別に、当分野で公知であるように、ホモ接合性動物からの核が準備された卵母細胞（例えば脱核されている）に移される核移動技術により動物を作製することができる。例えばCampbellら、Nature 380:64-68(1996)参照。ノックアウトマウスを作製するさらなる方法には、ＡＴＧ開始コドンが欠失または変異されている相同組換えベクターを操作すること、ベクターにフレームシフト変異を操作すること、プロモーター領域の重要な部分の欠失を操作すること、および／または遺伝子の重要な領域を欠失するようにベクターを操作することなどがある。
【０３７２】
材料および方法
ＬＲＰ５プラスミドＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳの構築
全長ＬＲＰ５  ｃＤＮＡ構築物をLife TechnologiesからのｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６．０ベクター（Ｇａｔｅｗａｙクローンシステムの一部）のＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位に操作して、ＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳを作製した。５’側をＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｂａＩのいずれかで、それと共に３’側でＥｃｏＲＶまたはＥｃｏＲＩのいずれかで消化することによりベクターからインサート（５，２７８ｂｐ）を放出することができる。
【０３７３】
４つの独立した粒子クローンからＬＲＰ５構築物を作製した。これらのクローンをＬＲＰ５特異的プライミングしたｃＤＮＡライブラリーから単離した。部分的ＬＲＰ５  ｃＤＮＡクローンは内部探査シークエンシングクローンセットに、オリゴｄＴプライミングＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＬ２３６Ｂ  Ｐ００４９Ｅ０８として存在した。このクローンを５’プライミング末端でトランケートした。全長ｃＤＮＡを作製するのに必要なより多くの５’プライム含有フラグメントを単離するために、Clontechヒト肝臓ポリＡ  ｍＲＮＡ（カタログ番号６５１０〜１、ロット番号９０６００３２）およびｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングキット（カタログ番号１８２４８〜０１３）のLife Technologies SuperScript(登録商標)プラスミドシステムからＬＲＰ５遺伝子特異的ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーをＬ４０１と称した。製造者のプロトコルを以下の修飾を伴って実施した。１）第１および第２鎖合成反応の双方におけるＤＥＰＣ処理水をα−３２Ｐ−ｄＣＴＰと置き換えた。２）およそ１ｋｂ間隔でＬＲＰ５遺伝子に特異的であるように選択されたオリゴヌクレオチドを用いて逆転写をプライミングした。公のデータベースに対してプログラムＢＬＡＳＴを用いてこれらの配列を調査してＬＲＰ５遺伝子特異性を確認した。３）２つの別個の逆転写反応を実施した。最初の反応（Ａ）は以下の、より多くのＬＲＰ５遺伝子の３’領域、（配列番号７１５〜７１８）47114: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCTTGGCAATACAGATGTGGGA-3’,47116: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCAGTAGCTCCTCTCGGTGGC-3’,47118: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCGCTCATCATGGACTTTCCG-3’,および47120: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCGCACTGCTGTTTGATGAGG-3’にアニーリングするオリゴヌクレオチドでプライミングした。第２の反応（Ｂ）は前記した４つのオリゴヌクレオチド、および（配列番号７１９〜７２１）47108: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCGAGTGTGGAAGAAAGGCTGC-3’,47110: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCAGTAGAGCTTCCCCTCCTGC-3’,および47112: 5’-CGTACGTAAAGCGGCCGCGTCCATCACGAAGTCCAGGT-3’を使用した。全てのオリゴヌクレオチドはＮｏｔＩリンカー配列を含有し、０．０２μｇ／μｌの濃度で使用した。４）双方の逆転写反応物に由来するＳａｌＩ適合ｃＤＮＡを１％アガロース、０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、１ｘ  ＴＡＥゲル上の電気泳動によりサイズ分画化した。０．６から８．０ｋｂの臭化エチジウム染色ｃＤＮＡをゲルから切除した。製造者のプロトコルを用いてエレクトロエルーション(ISCO Little Blue Tank Electroelutor(登録商標))によりアガロースゲルからｃＤＮＡを精製した。次いで反応ＡおよびＢに由来する精製ｃＤＮＡを一緒にプールした。５）サイズ分画化ＳａｌＩ適合ｃＤＮＡをＮｏｔＩ−ＳａｌＩ消化pBluescript(登録商標)(Stratagene、La Jolla、カリフォルニア州)にライゲートした。
【０３７４】
ライゲートされたライブラリーｃＤＮＡ（３μｌ）を用いてエレクトロコンピテント大腸菌（ElectroMAX（登録商標）ＤＨ１０Ｂ細胞およびプロトコル、Life Technologiesカタログ番号18290-015、BioRad E.coliパルサー、電圧１．８ＫＶ、３−５ミリ秒パルス）を形質転換した。形質転換された細胞をＬＢアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレートにプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。およそ１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）を５０，０００ｃｆｕ／１５０ｍｍプレートの密度でプレートした。ＬＢ培地でプレートから細胞を洗い流し、遠心により収集した。ＱＩＡＧＥＮ  プラスミドＧｉｇａキットおよびプロトコル（カタログ番号１２１９１）を用いて最終濃度２．０５μｇ／μｌでプラスミドＲＮＡを細胞から精製した。
【０３７５】
ライブラリースクリーニングに使用するための２つのプローブを、鋳型としてライブラリーＬ４０１  １００ｎｇを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製した。標準的なＰＣＲ技術を用いた。反応混合物は各オリゴプライマー  １０ピコモル；０．２ｍＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ(PE Applied Biosystemsカタログ番号N808~0260)；Ｅｘｐａｎｄ（商標）High Fidelity Taq DNAポリメラーゼ  １．５単位、および１ｘ  ＰＣＲ反応バッファー(Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号731-641；１０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）を含有した。混合物を９９℃で１分間インキュベートし、続いて９６℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３０サイクル、７２℃で７分間の最終インキュベーションを行った(MJResearch DNA Engine(登録商標)Tetrat PCT-225)。ＬＲＰ５遺伝子のＮｏｔＩ−ＳａｌＩフラグメントを増幅するオリゴ（配列番号７２２−７２３）１０７３３５：５’−CAGCGGCCTGGAGGATGC−３’および１０７３３８：５’−CGGTCCAGTAGAGGTTTCG−３’を用いて第１鎖を作製した。ＬＲＰ５遺伝子のＳａｃＩ−ＫｐｎＩフラグメントを増幅するオリゴ（配列番号７２４−７２５）１０７３４１：５’−CATCAGCCGCGCCTTCATG−３’および１０７３４２：５’−CCTGCATGTTGGTGAAGTAC−３’を用いて第２鎖を作製した。Qiaquick（登録商標）キットおよび製造者のプロトコル（Qiagenカタログ28106）を用いて双方のＰＣＲ産物を精製し、次いで製造者のプロトコルに従ってベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogenカタログ番号K4600）にサブクローン化した。精製されたプラスミドＤＮＡ（標準的な分子生物学技術を使用）の制限消化および続くＤＮＡ配列分析(ABI Prism BigDye Terminator Cycle(登録商標)シークエンシング、カタログ番号4303154、ABI377機器)により陽性サブクローンを同定した。各々の配列確認されたｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローンのＥｃｏＲＩ制限消化(New England Biolabs、カタログ番号R0101L)によりプローブＤＮＡを単離した。１％アガロース、０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、１ｘ  ＴＡＥゲル上のゲル電気泳動により制限フラグメントをサイズ分画化した。インサートＤＮＡをゲルから切除し、製造者のプロトコルに従ってClontech NucleoSpin(登録商標)核酸精製キット（カタログ番号K3051−２）を用いて精製した。Prime-It II(登録商標)ランダムプライマー標識キットおよびプロトコル（Stratagene、カタログ番号300385）を用いて、精製されたＤＮＡフラグメント（２５〜５０ｎｇ）をRedivue（登録商標）（ａ３２Ｐ）−ｄＣＴＰ(Amersham Pharmacia、カタログ番号AA0005）で標識した。組み込まれなかったｄＣＴＰをAmershamのNICK（登録商標）カラムおよびプロトコル（カタログ番号17-0855-02）で除去した。
【０３７６】
ライブラリーＬ４０１のスクリーニングの第２ラウンドを開始し、ＬＲＰ５遺伝子のフラグメントを単離した。最初に４３個の１５０ｃｍ  ＬＢ−１００μｇ／ｍｌアンピシリン寒天プレートをＬ４０１に由来する１次形質転換体で、プレートあたり約３,０００〜４，０００コロニーの密度でプレートした。標準的な分子生物学プロトコルを用いて、前記したように５００，０００から１，０００，０００ｃｐｍ／ｍｌハイブリダイゼーションバッファーで３２Ｐ標識プローブ（ＮｏｔＩ−ＳａｌＩフラグメント）を用いてこのライブラリーをスクリーニングした。この１次スクリーニングから、ＬＲＰ５プローブに対する陽性ハイブリダイゼーションに基づいて、１３個の単一コロニーが同定された。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ミニプレップキットおよびプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カタログ番号２７１０６）を用いて調製したプライマーＤＮＡを前記のように制限消化および配列分析により分析した。このスクリーニングからｃＤＮＡクローン＃４４を単離し、配列が部分的ＬＲＰ５クローンを含有することを確認した。
【０３７７】
第２のライブラリースクリーニングでは、１０４個の１５０ｃｍ  ＬＢ−１００μｇ／ｍｌアンピシリン寒天プレートをＬ４０１に由来する１次形質転換体で、プレートあたり約３０００−４０００コロニーの密度でプレートした。３２Ｐ標識プローブ（ＳａｃＩ−ＫｐｎＩ）を用いて、正確に前記したようにこのライブラリーをスクリーニングした。この１次スクリーニングで、ＬＲＰ５プローブに対する陽性ハイブリダイゼーションに基づいて、４８個の単一コロニーが同定された。これらのコロニーは単一のコロニー単離体ではないので、４８個の１次単離体の各々をプレートあたりおよそ５００コロニーの密度でプレートする２次スクリーニングを開始した。次いでこれらのコロニーを、プローブとして標識ＳａｃＩ−ＫｐｎＩフラグメントを用いて１次と正確に同様にスクリーニングした。４８個の１次クローンのうち３４個がＬＲＰ５プローブに対して陽性ハイブリダイゼーションになり、単一コロニーから単離された。プラスミドＤＮＡを調製し、前記したように分析した。ｃＤＮＡ単離体＃７１  ２をこのスクリーニングから単離し、配列が部分的ＬＲＰ５クローンを含有することを確認した。
【０３７８】
全例でいずれかのＬＲＰ５遺伝子単離体の配列を参照配列（すなわちＨＢＭ家系の罹患メンバーに由来する野生型ＬＲＰ５対立遺伝子の配列）と比較した。文献でＤＮＡ多型性がこの遺伝子に関して報告されていたので、この分析は重要であった。この参照配列によりＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７８２０のポリペプチドをコードすることが予測される。
【０３７９】
ＺｍａｘＩＧＩ  ３ＡＳを調製するために用いた４個の別個の部分クローンは以下のとおりである。
【０３８０】
１）塩基１−１３６６：ＬＲＰ５  ｃＤＮＡ構築物、ＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３からＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントが得られた。ＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３は、ＬＲＰ５の全ＯＲＦを含有する５０５７ＢＰインサートを含有する。クローンを平滑末端化し、そしてｐＳＴＢｌｕｅ−１のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ誘導体の骨ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに由来する５’クローンを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩの骨ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ産物に由来する３’クローンと融合させることによりこのクローンを作製した。ＤＮＡｚｙｍｅポリメラーゼを用いてＬＲＰ５特異的順行性プライマー（配列番号７２６）５’−ＧＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣ−３’および逆行性プライマー（配列番号７２７）５’−ＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＴ−３’を用いてＰＣＲを実施した。得られた３．７ｋｂ  ＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローン化した。全長クローン作製するために、５’および３’プラスミドをＧｉｂｃｏ／ＢＲＬのＤＭ１（ｄａｍ−）に形質転換した。５’プラスミドをＸｂａＩで消化し、そして３’プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたプラスミドをＴ４ポリメラーゼで埋めて平滑末端を作製し、そしてＢｃｌＩで切断した。１．７ｋｂ  ５’フラグメントおよび３．５ｋｂ  ３’フラグメントをゲル精製し、一緒にライゲートし、そしてｐＳＴＢｌｕｅ１のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。これにより塩基１００で始まるコード化配列を伴う短い５’ＵＴＲが提供される。さらに、これは５’多重クローニング部位でいくつかのさらなる制限部位を担持する。このフラグメントは位置５５８でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７８２０配列に相対する、結果的にＡ（ＡＦ０７７８２０）からＧに変化するＤＮＡ多型性をも含有し；この変異はアミノ酸の差異には至らない（Ｐｒｏ）。
【０３８１】
２）塩基１３６７−２４０３：前記の市販のヒト肝臓ＲＮＡから作製されたＬＲＰ５遺伝子プライミングｃＤＮＡライブラリーからこのクローンを入手した。このフラグメントは単離体＃４４から得られたＤＮＡのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ片である。配列はGenbankアクセッション番号ＡＦ０７７８２０と同一である。
【０３８２】
３）塩基２４０４−４０１３：前記したのと同一のライブラリーに由来する単離体＃７１−２からこのＢａｍＨＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントを入手した。位置３４５６にはＧ（ＡＦ０７７８２０）からＡに至るＤＮＡ多型性がある。このヌクレオチドの差異はコード化アミノ酸（Ｖａｌ）では変化しない。
【０３８３】
４）塩基４０１４−５２７８：このＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントは内部クローンＬ２３６Ｂ  Ｐ００４９Ｅ０８に由来する。これをオリゴｄＴプライミングＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから入手した。停止コドンは塩基４９４７に出現する。クローンは、１２０ｂｐポリＡテイル続いてＮｏｔＩ部位を含む３’ＵＴＲ配列の３３１ｂｐを含有する。このサブクローニング工程で用いる３’ＮｏｔＩ部位は、ライブラリー構築の間にポリＡの末端で導入された、付加されたリンカーの結果である。ＤＮＡ多型性は塩基４５１５に存在し、アミノ酸レベルではサイレントである（Ｌｅｕ）Ｇ（ＡＦ０７７８２０）からＣへの変化に至る。
【０３８４】
ＬＲＰ５遺伝子の５’セクションを作製するために、ＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントおよびＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをpBluescript(登録商標)(Stratagene)のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位にライゲートした。遺伝子の３’セクションはＬＲＰ５単離体＃７１  ２からの１．６１ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントをＬ２３６Ｂ  Ｐ００４９Ｅ０８からの１．２６ｋｂ  ＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントへのライゲーションにより入手した。これらの２つのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位にライゲートした。ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ５’セクションおよびＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ３’セクションのライゲーションにより、全長ＬＲＰ５ｃＤＮＡをベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６．０(Life Technologies)のＸｂａＩ−ＮｏｔＩ部位に操作した。得られたプラスミド、ＺｍａｘＧＩ  ３ＡＳはＸｂａＩ部位からの５２７８ｂｐの、ベクター多重クローニング部位のＮｏｔＩ部位へのインサートを含有する。このクローンはベクターに存在するＣＭＶプロモーターに関してアンチセンス配向である。ＬＲＰ５コード化配列は１００塩基で始まり、４９４７塩基で終わり、１２０ｂｐポリＡテイルを含む３−プライミングＵＴＲ配列の３３１ｂｐが続く。この全長ｃＤＮＡは、予測されるアミノ酸配列を変化しない、参照配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７８２０）からの３つのＤＮＡ多型性を含有する。これらの多型性は位置５５８ではプロリン残基を維持するＡからＧに至り；位置３４５６ではバリン残基を維持するＧからＡに至り；位置４５１５ではロイシン残基を維持するＧからＣに至る。
【０３８５】
ＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳ（図２５）の配列はまた、位置１３３０でアラニンのバリンへのアミノ酸変化に至る、Ｃ（配列番号１およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１７４９８）のＴへの変化に至る配列番号１の塩基４０８８に相対するＤＮＡ多型性をも含有する。これはＭＢＭ家系の罹患メンバーに由来する野生型対立遺伝子で決定された配列およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７８２０の公開された配列に合致する。ＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳはまた配列番号１に相対する５’末端で２９個のさらなる塩基、ならびに付加的なＧ、ポリＡトラクトの１２０塩基、およびＮｏｔＩ部位から成る３’末端を有する。
【０３８６】
ＨＢＭ変異Ｇ１７１Ｖの作製
ＰＣＲを用いて、アミノ酸１７１でグリシンからバリンへの予測されるアミノ酸変化に至るＨＢＭ変異を全長ヒトＬＲＰ５  ｃＤＮＡ（プラスミドＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳ）に導入して、位置６１１のＧをＴに変化させた。ＬＲＰ５遺伝子の内因性ＮｏｔＩ部位をフランキングするオリゴ（配列番号７２８）１０７３３５：（５’−ＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣ−３’）および（配列番号７２９）４９５１３：（５’−ＣＧＧＧＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣ−３’）を用いてＨＢＭ変異の導入を行った。この方法によりＰＣＲ産物の３’末端で新規ＰｖｕＩＩ部位が作製される。該産物の５’末端にＳｃａＩ部位を導入するオリゴを用いて第２のＰＣＲ反応を完了し、３’プライミング末端でＬＲＰ５の内因性ＳａｌＩ部位を含有する。Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）手順（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＣＲ産物を精製し；前記したベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。全て前記のとおり、プラスミドＤＮＡを単一の細菌性コロニーから精製し、制限消化および続く配列分析により分析した。配列確認されたｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローンを各々ＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩおよびＳｃａＩ−ＳａｌＩで制限消化した。得られたＤＮＡフラグメントを前記のとおりサイズ分画化し、精製した。次いでこれらの２つのフラグメントをＮｏｔＩ−ＳａｌＩ消化により調製したベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）にサブクローン化した。ＰｖｕＩＩおよびＳｃａＩ産物の双方は二本鎖核酸を消化するのに用いた場合、平滑末端を生じる。従って、得られたライゲートされたフラグメントはＰｖｕＩＩまたはＳｃａＩ部位のいずれかを再生することができず、新たに導入されたＨＢＭ変異を除いてコンセンサスＬＲＰ５配列のみを含有する。全長ＬＲＰ５遺伝子に変異を導入するために、この得られたプラスミドをＭｓｃＩおよびＳａｌＩで消化したが、一方ＬＲＰ５プラスミドＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３のＸｂａＩ−ＭｓｃＩ消化によりＬＲＰ５の５’領域が得られた。これらの２つのフラグメントを一緒にＸｂａＩ−ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）にライゲートし、結局類似の１．３６６ｋｂ  ＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントを作製した。違いはこの構築物が前記したＨＢＭ変異を含有するということだけである。次いでＬＲＰ５遺伝子に関して正確に前記のとおり、この新たに作製されたＨＢＭ変異を含むＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントの置換を伴う全長ＨＢＭ  ｃＤＮＡをｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６．０に集めた。ＤＮＡ配列分析により全ｃＤＮＡインサートを確認し、ＨＢＭ変異の導入を確認した。
【０３８７】
得られたプラスミド、ＨＢＭＧＩ  ２ＡＳ（図２４）はベクターの多重クローニング部位のＸｂａＩ部位からＮｏｔＩ部位への５，２７８ｂｐのインサートを含有する。このクローンはベクターにおけるＣＭＶプロモーターに関してアンチセンス配向である。ＨＢＭコード化配列は１００塩基で始まり、４９４７塩基で終わり、１２０ｂｐポリＡテイルを含む３−プライミングＵＴＲ配列の３３１ｂｐが続く。この全長ｃＤＮＡは、アミノ酸配列を変化しない、参照配列からの３つのＤＮＡ多型性を含有する。これらの多型性は位置５５８ではプロリン残基を維持するＡからＧへの変化に至り；位置３４５６ではバリン残基を維持するＧからＡへの変化に至り；位置４５１５ではロイシン残基を維持するＧからＣへの変化に至る。加えて、ＨＢＭ変異は位置６１１（ＬＲＰ５のＧからＨＢＭのＴ）に存在し、これによりＨＢＭ家系の罹患メンバーに見出されるように、アミノ酸位置１７１でグリシンからバリンへの予測されるアミノ酸変化に至る。このインサート配列を用いてＨＢＭ過剰発現トランスジェニックマウスに用いられる構築物を作製した。
【０３８８】
導入遺伝子調製
本明細書で提供される実例はどのようにトランスジェニック動物を調製できるかの説明である。当分野で公知のようにさらなるトランスジェニック動物を調製できる。例えばGlenn Monastersleyら編、Strategies in Transgenic Animal Studies(Amer.Soc.Microbiology 1995)およびそこに引用される参照文献を参照されたい。
【０３８９】
ＣＭＶβアクチンプロモーター−ＨＢＭ  ｃＤＮＡ（ＨＢＭＭＣＢＡ）
ＣＭＶβアクチン−ＨＢＭ構築物、ｐＣＸ−ＥＧＦＰを調製するために、キメラＣＭＶβアクチンプロモーターを含有するプラスミドを４７７８ｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメントとして精製した。続いて、ＨＢＭＧＩ  ２ＡＳからＨＢＭ  ｃＤＮＡを４９９４ｂｐ  ＸｂａＩ／ＤｒａＩフラグメントとして切除し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントと共に処理し、ＥｃｏＲＩリンカーにライゲートし、ＥｃｏＲＩで消化した。次いでこのフラグメントをｐＣＸ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩ  ７２６５ｂｐ  ＣＭＶβアクチン−ＨＢＭフラグメントを精製したマウス胚にマイクロインジェクションを行った。
【０３９０】
Ｉ型コラーゲンプロモーター−ＨＢＭ  ｃＤＮＡ（ＨＢＭＭＴＩＣ）
最初にｐＢＳ（ＳＫ−）（Stratagene）ポリリンカーを別のポリリンカー（すなわちＫｐｎ１−ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ−ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ−ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ−ＳｃａＩ−ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩ−ＳａｃＩを含む）と置換することにより、ラットＩ型コラーゲンプロモーター−ＨＢＭ構築物を作製し、これをＢＳ（ＳＫ−）Ａ／Ｄと称する。ｐｃＤＮＡ  Ｉ(Invitrogen,Inc.)からのＳＶ４０スプライシングおよびポリ（Ａ）ｎＸｂａＩ−ＮｃｏＩ領域（７５０ｂｐ）を直接ＢＳ（ＳＫ−）Ａ／Ｄにクローン化した。次に、４９９４ｂｐ  ＥｃｏＲＩ  ＨＢＭ  ｃＤＮＡフラグメント（前記）をＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。３６４０ｂｐ  ＸｂａＩであるＩ型コラーゲンプロモーターフラグメントをＢＳ（ＳＫ−）（Stratagene）のＸｂａＩ部位にサブクローン化した。次いでプロモーターフラグメントをＢＳ（ＳＫ−）からＳａｃＩＩで切除し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＳｐｅＩで消化し、ＨＢＭ  ＢＳ（ＳＫ−）Ａ／Ｄ構築物にライゲートし、ＮｄｅＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑し、ＳｐｅＩで消化した。ＳｐｅＩ／ＣｌａＩ９４３５ｂｐ  Ｉ型コラーゲン−ＨＢＭフラグメントを精製して、マウス胚にマイクロインジェクションを行った。
【０３９１】
ＣＭＶβアクチンプロモーター−ＬＲＰ５  ｃＤＮＡ（Ｚｍａｘ１ＷＴＣＢＡ）
前記からＣＭＶβアクチンプロモーター−ＨＢＭ  ｃＤＮＡ構築物を用いて最終プラスミドを作製した。以下の３つのフラグメントを一緒にライゲートした。１）ＨＢＭＭＣＢＡに由来する６．３４ｋｂ  ＸｂａＩ−ＫｐｎＩバックボーンフラグメント；２）ｂアクチンプロモーターの３’末端およびＨＢＭ  ｃＤＮＡの５’末端を含有するＨＢＭＭＣＢＡに由来する０．６４ｋｂ  ＸｂａＩ−ＳａｐＩフラグメント；ならびに３）野生型配列を含有するＬＲＰ５  ｃＤＮＡに由来する２．８ｋｂ  ＳａｐＩ−ＫｐｎＩフラグメント。７．２ｋｂ  ＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＣＭＶβアクチン−ＬＲＰ５フラグメントを精製して、マウス胚にマイクロインジェクションを行った。
【０３９２】
Ｉ型コラーゲンプロモーター−ＬＲＰ５  ｃＤＮＡ（Ｚｍａｘ１ＷＴＴＩＣ）
前記からのＩ型コラーゲン−ＨＢＭ  ｃＤＮＡ構築物を用いて最終プラスミドを作製した。ＨＢＭＭＴＩＣプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで直線化し、ＳａｌＩで切断して８．５２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントを生じるか、またはＳａｐＩで切断して２．９８ｋｂ  ＳａｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを生じた。次いで野生型配列を含有するＬＲＰ５  ｃＤＮＡに由来する２．８ｋｂ  ＳａｐＩ−ＳａｌＩフラグメントを前記の２つのフラグメントにライゲートして最終プラスミドを作製した。９．４ｋｂ  ＳｐｅＩ−ＣｌａＩ  Ｉ型コラーゲン−ＬＲＰ５フラグメントを精製して、マウス胚にマイクロインジェクションを行った。
【０３９３】
インビトロ導入遺伝子発現の確認
ＨＢＭＭＣＢＡ  ＨＢＭＭＴＩＣ、Ｘｍａｘ１ＷＴＣＢＡおよびＺｍａｘＷＴＴＩＣに関するプラスミド構築物を一過性にヒト骨芽（ＨＯＢ）細胞にトランスフェクトし、機能性に関する試験としてｍＲＮＡ発現を測定した。
【０３９４】
一過性トランスフェクション
ＨＯＢ−０２−０２細胞はＨＯＢ−０２−Ｃ１細胞に由来するクローン性、老化後、細胞株である(Bodineら、J.Bone Miner.Res.11:806-819(1996))。親細胞株と同様に、ＨＯＢ−０２−０２細胞は温度感受性ＳＶ４０ラージＴ抗原変異体、ｔｓＡ２０９を発現する。結果的に、これらの細胞は許容温度３４℃で増殖するが、非許容温度３７℃以上で分割を停止する。親細胞株と同様に、５％ＣＯ２／９５％加湿空気インキュベーター(Forma Scientific、Marietta、オハイオ州)中３４℃で成長培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１％ペニシリン・ストレプトマシンおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−１を含有するＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）でＨＯＢ−０２−０２細胞を培養する。
【０３９５】
一過性トランスフェクションに関して、ＨＯＢ−０２−０２細胞を成長培地に４００，０００セル／ウェルで６ウェルプレートに播種し、３４℃で一晩インキュベートした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００トランスフェクション試薬を用いて、製造者の指示書に従って(Life Technologies、Rockville、メリーランド州)、０．３ｍｇ／ウェル  ＣＭＶβアクチン−ＨＢＭ発現プラスミド、Ｉ型コラーゲン−ＨＢＭ発現プラスミド、または対応する空のベクターのいずれかで細胞をトランスフェクトした。３４℃で２４時間インキュベートした後、培地を交換し、細胞をさらに３９℃で２４時間インキュベートした。この最後のインキュベーションの終わりに、細胞をハンクス緩衝食塩水ですすいだ。次いでＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を用いて、製造者の指示書(GibcoBRL、Grand Island、ニューヨーク州)に従って、全細胞ＲＮＡを単離した。前記したようにＲＮＡをＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼと処理して夾雑するＤＮＡを除去した(Bodineら、J.Cell.Biochem.65:368-387(1997))。
【０３９６】
ｍＲＮＡ発現のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ
ヒトおよびマウスＬＲＰ５  ｃＤＮＡ配列に基づいて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブを選択した。図２６に説明するように、ヒトおよびマウスＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）配列のアラインメントの分析により、選択した配列を遺伝子特異的であるように設計した。
【０３９７】
以下のプライマーおよびプローブセットを用いて、製造者(PE Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州)に記載されるように、ヒト細胞から単離されたＲＮＡのＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を実施した。
ヒトＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ：（配列番号７３０〜７３２）
順行性プライマー：５’−ＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＣＡ−３’
逆行性プライマー：５’−ＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＧＴ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡ−３
【０３９８】
ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのヒトＧＡＰＤＨコントロールキットでの多重プロトコルを用いて、実験的プライマー／プローブセットの結果をヒトＧＡＰＤＨレベルに正規化した。以下のプライマーおよびプローブセットを用いて、製造者(PE Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州)に記載されるように、ネズミ細胞および組織から単離されたＲＮＡの種特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
ヒトＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ−１：（配列番号７３３〜７３５）
順行性プライマー：５’−ＣＧＴＧＡＴＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＣＴＣ−３’
逆行性プライマー：５’−ＴＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＣＴＴＧＴ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＣＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＴＡＣ−３’
マウスＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ−１：（配列番号７３６〜７３８）
順行性プライマー：５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＴＴＧＧＴ−３’
逆行性プライマー：５’−ＡＡＧＧＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＣ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＡＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧ−３’
【０３９９】
ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの１８ＳリボソームＲＮＡコントロールキットでの多重プロトコルを用いて、実験的プライマー／プローブセットの結果を１８ＳリボソームＲＮＡレベルに正規化した。これらの結果の要旨を図１７〜２０に提示する。
【０４００】
トランスジェニックマウスの作製
ＤＮＡマイクロインジェクション
最初にEpicentre TechnologiesのＧＥＬアーゼプロトコルに従って、マイクロインジェクションのための導入遺伝子フラグメントを１％アガロースゲル上で精製した。次いでフラグメントを塩化セシウム密度勾配でさらに精製し、５ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡに対して広範に透析した。
【０４０１】
標準的な手段に従って、直線化ＤＮＡをマウス胚にマイクロインジェクションした。ＤＮＡを１次的に受精Ｃ５７ＢＬ／６Ｔマウス胚の雄前核に注射した。注射された胚（ｎ＝２０−３５）を交配後０．５日の偽妊娠Swiss Webster胚受体の卵管（片側的に）移した。１０から１４日日齢に子孫の尾のバイオプシを行い、そして遺伝子型に分類した。
【０４０２】
ジーンターゲティングトランスジェニックマウスの作製
ジーンターゲティングベクターおよびプローブ
胚幹（ＥＳ）細胞のＬＲＰ５遺伝子を修飾するために、２つのジーンターゲティングベクターを構築した。図１６で説明する、Ｚｍａｘ１−ＫＩ／ＫＯ  Ａ＆Ｂと称する２つの構築物を２つの変異の型、ＬＲＰ５遺伝子のノックアウト（ＫＯ）、およびマウスモデルを作製するためのＣｒｅリコンビナーゼ依存性のヌクレオチド置換のノックイン（ＫＩ）（すなわちＨＢＭ家系のマウスＬＲＰ５におけるグリシン１７０のバリンアミノ酸への置換）を生じるように設計した。
【０４０３】
初めに、マウスＬＲＰ５遺伝子のエクソン５つを含むマウスゲノムＤＮＡ  ＢＡＣクローン４７３Ｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＺ０９５４１３）のゲノムＤＮＡを用いて骨ジーンターゲティングベクターを構築した。Research Genetics(Huntsville、アラバマ州)によりエクソン３に関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）スクリーニングを用いてマウス１２９ＳｖＪゲノムＢＡＣライブラリーからこのクローンを単離した。順行性プライマーの配列（５’−ＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号７３９）および逆行性プライマーの配列（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号７４０）を用いてＰＣＲによりエクソン３を増幅し；以下の熱循環条件を用いた。９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクル。このクローンのマウスＬＲＰ５遺伝子との同一性を、鋳型としてＢＡＣクローンＤＮＡを用いてエクソン３をシークエンシングすることにより確認した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【０４０４】
ＬＲＰ５ノックイン／ノックアウトベクター
プローブとしてサブクローン化されたエクソン１、エクソン２およびエクソン３を用いて、エクソン５を通ってエクソン１に広がる領域をシークエンシングすることにより、サザンブロット分析によりゲノムＢＡＣクローン４７３Ｐ５の組成を特徴付けした。ＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）ＫＩ／ＫＯ標的化のために２つの異なる構築物を調製した。これらの構築物（ＡおよびＢ）は相同性のフランキングアームにおいてのみ異なる。構築物（Ａ）は相同性の６．５ｋｂ  ＢｓｔＥＩＩ−ＸｂａＩ  ５’アームおよび相同性の１ｋｂ  ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ  ３’アームを含有し；一方構築物（Ｂ）は相同性の１ｋｂ  ５’アームおよび相同性の６．０ｋｂ  ３’アームを含有する。相同性の短いアームおよび長いアームを、ネオマイシン抵抗性遺伝子(MC1-Neo、Stratagene)および合成転写中止配列(synthetic transcriptional pause sequence)(Promega)を含有するＬｏｘＰフランキングカセットにライゲートすることにより構築物を調製した。
【０４０５】
双方のＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ標的化ベクター（ＡおよびＢ）を、エクソン３でＧ１７０Ｖアミノ酸置換をコードするＧからＴへのヌクレオチド置換するように修飾した。鋳型として相同性の短いアームの野生型配列を用いて、重複ＰＣＲ変異誘発によりこれらの修飾を導入した。加えて、Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）標的化ベクターの１ｋｂの短いアームを、５’終端ＰｍｅＩ制限認識部位を含むように修飾した。配列（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴ−３’）（配列番号７４１）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＧＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＣＣＴ−３’）（配列番号７４２）の逆行性（変異原性）プライマーを用いて５’重複フラグメントを作製した。３０サイクルで利用した熱循環条件は９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。配列（５’−ＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＧＡＧＣ−３’）（配列番号７４３）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＧ−３’）（配列番号７４４）の逆行性（変異原性）プライマーを用いて３’フラグメントを作製した。３０サイクルで利用した熱循環条件は９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。最終重複ＰＣＲは鋳型としてＰＣＲ反応の５’フラグメントおよび３’フラグメント各々１ｍｌを利用し、各々５’および３’フラグメントの順行性および逆行性プライマーならびに同一の熱循環パラメーターを用いて増幅を実施した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いて最終ＰＣＲ産物をクローン化した。変異誘発されたエクソン３を６００ｂｐ  ＢｓｍＢＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）から切除し、Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ａ）に移した。
【０４０６】
ＥＳ細胞クローンを標的化するＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ａ）遺伝子のスクリーニングし、特徴付けするためのプローブを、ＢＡＣクローン４７３Ｐ５の制限フラグメントのサブクローニングにより調製した。５’外側プローブは４００ｂｐ  Ｎｄｅ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントであり、および３’外側プローブは５００ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩフラグメントである。
【０４０７】
相同性の標的化ベクター領域をフランキングする、および直ぐ隣接するゲノムフラグメントのＰＣＲクローニングによりＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）の外側プローブを調製する。Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）に用いられる５’外側プローブは配列（５’−ＴＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣ−３’）（配列番号７４５）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧ−３’）（配列番号７４６）の逆行性プライマーを用いて作製された４９８ｂｐフラグメントである。これらのプライマーを用いて３０サイクルで利用した熱循環条件は、９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。３’外側プローブは配列（５’−ＣＣＴＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧ−３’）（配列番号７４７）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣ−３’）（配列番号７４８）の逆行性プライマーを用いて作製された６００ｂｐフラグメントである。これらのプローブを用いて３０サイクルで利用した熱循環条件は、９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。双方のプローブはゲノムサザン分析においてＬＲＰ５遺伝子に特異的である。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【０４０８】
ＬＲＰ５  ｍＲＮＡ構造および転写レベルのリボヌクレアーゼ保護分析のためのプローブをエクソン３からエクソン４を含有するｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲクローニングすることにより調製した。ＰＣＲ反応は鋳型として完全ｃＤＮＡ、配列（５’−ＴＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣ−３’）（配列番号７４９）の順行性プライマー、配列（５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧ−３’）（配列番号７５０）の逆行性プライマーおよび以下の３０サイクルのための熱循環条件を使用した。９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【０４０９】
ＥＳ細胞におけるジーンターゲティング
ジーンターゲティングのために胚幹（ＥＳ）細胞に直線状標的化ベクター５０ｍｇと共にエレクトロポレーションを行い、エレクトロポレーション開始日から７から１０日後に２００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で選択した。Ｇ４１８抵抗性クローンを採取し、広げ、凍結保存した。ＬＲＰ５の野生型および標的化対立遺伝子を各々４ｋｂおよび５ｋｂフラグメントとして検出する、５’外側プローブを用いるＥｃｏＲＩゲノムサザン制限断片長分析により抵抗性クローニングを相同組換えに関してスクリーニングした。ジーンターゲティングＥＳ細胞クローンを解凍し、広げ、ＬＲＰ５の野生型および標的化対立遺伝子を各々９ｋｂおよび８ｋｂフラグメントとして検出する、３’外側プローブを用いるＳｃａＩゲノム制限断片長分析により特徴付けした。ジーンターゲティングクローンをＬＲＰ５エクソン３の配列分析により特徴づけし、ＧからＴへの置換が相同組換えに含まれたことを確認した。
【０４１０】
胚盤胞注射によるジーンターゲティングマウスの作製
キメラマウスを作製するために、ジーンターゲティングＥＳ細胞クローンを解凍し、広げ、交配後（ｐ．ｃ．）３．５宿主Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞の胞胚腔に９−１４  ＥＳ細胞を注射した。次いで注射された胚盤胞（１２−１７）を２．５ｐ．ｃ．偽妊娠Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚受体の子宮に片側的に移し、出産まで発達させた。キメラ雄は１２９ＳｖＥｖ雌に戻し交配し、ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なプライマーでＰＣＲ遺伝子型解析することにより標的化対立遺伝子の伝達に関して試験する。
【０４１１】
Ｃｒｅレコンビナーゼを介するネオマイシン抵抗性カセットのインビトロ欠失
ＬＲＰ５  ＫＩ／ＫＯマウスからＬＲＰ５  ＫＩマウスを作製するために、Ｃｒｅ発現プラスミド（２ｍｇ／ｍｌ）の、ＬＲＰ５  ＫＩ／ＫＯ前融合接合体の雄前核へのマイクロインジェクションにより、ネオマイシン抵抗性（ＫＯ）カセットを欠失させた。ＫＯカセットの欠失をカセット挿入部位のＰＣＲ分析により確認した。
【０４１２】
トランスジェニックマウスの遺伝子型解析
５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％ＳＤＳおよび０．８ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するバッファー５００μｌによりマウス尾断片からゲノムＤＮＡを単離した。サンプルを振盪しながら５５℃で一晩インキュベートする。１０μｌ  アリコートを９９℃で５分間熱不活化し、１：２０で水で希釈した。ＰＣＲに関しては、希釈したＤＮＡ  １μｌを以下の条件下で増幅した。変性：９６℃で４．５分間；４５サイクル：９６℃で３０秒間；６３℃で１分間；７２℃で１分間；伸長：７２℃で５分間；４℃を維持。
【０４１３】
以下のプライマーセットを遺伝子型解析に使用する。
ＨＢＭＭＣＢＡ：
５’プライマー：２９６塩基対フラグメント
順行性：５’−ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＧＣＧ−３’（配列番号７５１）
逆行性：５’−ＧＣＣ  ＧＣＡＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’（配列番号７５２）
３’プライマー：４００塩基対フラグメント
順行性：５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  Ａ−３’（配列番号７５３）
逆行性：５’−ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ−３’（配列番号７５４）
ＨＢＭＭＴＩＣ：
５’プライマー：３８２塩基対フラグメント
順行性：５’−ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ−３’（配列番号７５５）
逆行性：５’−ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’（配列番号７５６）
３’プライマー：５２４塩基対フラグメント
順行性：５’−ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’（配列番号７５７）
逆行性：５’−ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＡＧＧ−３’（配列番号７５８）
【０４１４】
サザン分析による遺伝子型の確認
マウスゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＬＲＰ５  ｃＤＮＡに由来する１．０ｋｂ  ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントでプロービングした。プローブは導入遺伝子陽性動物の５ｋｂフラグメントにハイブリダイズした。
【０４１５】
表現型解析
インビボおよびエクソビボの双方のアッセイを用いてトランスジェニックマウスの表現型を評価する。Ｃ５７ＢＬ／６および１２９ＳｖＥｖと称する野生型マウスの２つの株を研究してトランスジェニックおよびジーンターゲティングマウスにおける表現型評価のための対照データを提供する。加えて非トランスジェニック同腹仔動物を対照として使用する。
【０４１６】
インビボ分析
ｐＤＸＡ：野生型およびトランスジェニックマウスを麻酔し、重量測定し、ＬＵＮＡＲ小動物ＰＩＸＩｍｕｓ装置を用いて骨格の全身Ｘ線スキャンを作製した。マウスが離乳したときに（すなわち３週齢で）スキャンを始め、２週間隔で繰り返す。野生型動物を３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、および２９週でスキャンする。トランスジェニック動物のスキャンは１７週までの期間実施する。種々身体領域のＢＭＤ（骨ミネラル密度）、ＢＭＣ（骨ミネラル含量）、ＴＴＭ（全組織質量）、および脂肪％に関してスキャンを分析する。
【０４１７】
Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線像：麻酔動物のｐＤＸＡスキャンの後、骨の大きさの測定を可能にするＦａｘｉｔｒｏｎ装置を使用して別のＸ線撮影を行った。
【０４１８】
カルセイン標識：動物に１５ｍｇ／ｋｇ  カルセインを２回連続で腹腔内に投与する。１回目の投与は安楽死の９日前に行い、２回目は骨形成速度の測定を可能にする安楽死の２日前に行った。
【０４１９】
エクソビボ分析
ＲＮＡ単離：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を用いて脛骨およびその他の組織から全ＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡ発現を決定した。
【０４２０】
ｐＱＣＴ：右遠位骨幹端の全および骨梁密度ならびに骨幹中央の皮質密度を決定するために右大腿骨の軟部組織を取り除き、７０％エタノールに保存した。
【０４２１】
ＭｉｃｒｏＣＴ：右大腿骨を用いて遠位骨幹端の骨梁インデックスを決定した。
【０４２２】
組織学：右大腿骨を用いて遠位骨幹端の骨面積並びに静的および動的パラメーターを決定した。
【０４２３】
曲げ強さ：左大腿骨の軟部組織を取り除き、骨幹中央の曲げ強さの３点解析の前に−２０℃で保存した。
【０４２４】
椎骨の圧縮強度：Ｔ１０Ｌ６−７から脊椎全体を取り出した。軟部組織を脊椎に残し、分析まで脊椎を−２０℃で保存した。Ｌ５椎骨で圧縮強度を測定した。
【０４２５】
血清：動物を安楽死させ、血液から血清を調製して全コレステロール、トリグリセリド、オステオカルシンおよびその他の生化学的代理マーカーを想定する。
【０４２６】
組織学的分析：実例には免疫細胞化学、例えば骨原性マーカーのインサイチュ・ハイブリダイゼーションおよびアポトーシスを被る細胞のＴＵＮＥＬ染色などがある。
【０４２７】
結果
トランスジェニックプラスミド構築物からの発現の確認
非常に低レベルの内因性生成物ＬＲＰ５発現を有するＨＯＢ−０２−０２細胞にＨＢＭ（ＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ）および野生型（Ｚｍａｘ１ＷＴＣＢＡおよびＺｍａｘ１ＷＴＴＩＣ）プラスミド構築物を一過性でトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ＲＮＡを単離し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して細胞におけるＬＲＰ５／ＨＢＭのｍＲＮＡレベルを決定した。プラスミドＤＮＡの夾雑を調節するために、前ＲＴ工程伴うかまたは伴わず、ＲＴ工程は行わずにＰＣＲを実施し、非常に低レベルのＬＲＰ５／ＨＢＭ  ｍＲＮＡを検出した。しかしながら、ＲＴ工程では、ＣＭＶ−ｂ−ガラクトシダーゼ対照でトランスフェクトした細胞と比較して、ＣＭＶ−ｂ−アクチンプロモーター構築物でトランスフェクトした細胞においてＨＢＭおよびＬＲＰ５  ｍＲＮＡの１０００倍増加が観察された。Ｉ型コラーゲンプロモーター構築物はＨＢＭおよびＬＲＰ５  ｍＲＮＡのおよそ１０倍の増加を示し、これはＣＭＶβアクチンプロモーターと比較して、このプロモーターの特性が弱いことと合致する。図１７参照。
【０４２８】
ＨＢＭ／ＬＲＰ５発現に関して種特異的なＴａｑｍａｎ（登録商標）試薬
ＬＲＰ５／ＨＢＭに関する種特異的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブセットを開発した。ＨＯＢ細胞およびマウスＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を用いる一連の実験では、マウスバックグラウンドのＬＲＰ５／ＨＢＭ  ｍＲＮＡを測定し、逆も同様である。これらの試薬は種特異的発現の検出および定量に有用である。図１８にて実証するように、プライマーセットはマウスおよびヒト細胞株において種特異的である。さらに、図１９は、マウスＲＮＡのバックグラウンドにおけるヒトＬＲＰ５  ＲＮＡの定量測定を実証する。これらのＴａｑｍａｎ（登録商標）セットを用いて、マウストランスジェニック株で発現されているヒトまたはマウスＨＢＭまたはＬＲＰ５（またはその他のＨＢＭ用変異体）メッセージのレベルを決定することができる。
【０４２９】
種特異的Ｔａｑｍａｎ（登録商標）試薬はトランスジェニックマウス組織における内因性ＬＲＰ５  ｍＲＮＡレベルおよびヒトＬＲＰ５／ＨＢＭ  ｍＲＮＡレベルの双方を特徴付けるための新規手段である。これらの手段には従来の方法、例えばノーザンハイブリダイゼーションおよび標準ＲＴ−ＰＣＲに勝るいくつかの利点がある。これらの利点のいくつかは以下の通りである。（１）特異性、小領域（＜１００ｂｐ）のみが増幅されるので、プライマーおよびプローブは交差反応性がないかまたは最低であると予測される領域をシークエンシングするために選択される；（２）速度、手順はそれほど労働集約的ではないので；（３）正確性、真の定量性であるので；および（４）感受性、極少量の出発材料（すなわちＲＮＡ）を要求し、およびシグナル対雑音比が高いので。骨から多量のＲＮＡを得ることは困難であるので、骨におけるｍＲＮＡレベルを分析するためにこれらの利点はとりわけ重要である。従って、ＨＢＭおよびＬＲＰ５発現のＴａｑｍａｎ（登録商標）分析のために開発されたプライマーセットは本発明の重要な実施形態である。当業者は、本明細書に記載されるプライマーが好ましい実施形態であり；得られた核酸が実質的に同一の機能を実施し続ける限り、修飾、例えばプライマーまたは塩基置換の伸長またはトランケーションが本発明に包含されることを認識している。
【０４３０】
トランスジェニックマウスにおけるＨＢＭ発現
ＣＭＶｂアクチン（ＨＢＭＭＣＢＡ）構築物に関して８匹のトランスジェニック創始動物を作製し、繁殖プログラムを開始して株を確立した。図２０に示すＴａｑｍａｎ（登録商標）分析により決定したｍＲＮＡの発現により４つの株における骨発現の変動性レベルが示された。脛骨では、以下の範囲の発現レベル（ＨＯＢ−０３−Ｃ５細胞の内因性ＬＲＰ５に相対して）が示された。株１８（ｘ１０から１１倍）；株２（ｘ７から１０倍）；株１３（ｘ１から２倍）および株２８（ｘ１倍）。プロモーターの公知の活性に基づいて推定される別の組織においても発現が検出された。株２および１３に関しては、ＨＢＭ発現の最高レベルが心臓において見出された。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）遺伝子型解析アッセイは潜在的ホモ接合性動物に関してスクリーニングする。
【０４３１】
Ｉ型コラーゲン（ＨＢＭＭＴＩＣ）構築物に関して６匹のトランスジェニック創始動物を作製し、繁殖プログラムを開始して株を確立した。最初に試験した２つの株でｍＲＮＡの発現が見出された。株１９では、脛骨および大腿骨においてのＨＯＢ−０３−Ｃ５細胞のＬＲＰ５よりも発現が各々７から８倍および１９から２０倍多かった。株３５では脛骨および大腿骨において検出された発現は低レベルであった。
【０４３２】
ＨＢＭトランスジェニックマウスのインビボｐＤＸＡ測定
ＨＢＭＭＣＢＡ構築物
図２１（Ａ〜Ｃ）で説明する、５週および９週時点でのトランスジェニックマウスの分析により、これまで試験した１つの株のＢＭＤ値が対照に比較して大きいことが示された。５週では、大腿骨、椎骨および全身におけるＨＢＭＭＣＢＡ株２（ｎ＝１１）ＢＭＤが各々２１％、２４％および１０％野生型対照よりも大きかった。９週（ｎ＝３）ではＢＭＤにおけるこれらの増加が各々１９％、３２％および１２％に達した。１７週以上では、株２のパーセント増加が野生型対照に相対して各々１０％、１１％、および８％であった。
【０４３３】
ＨＢＭＭＴＩＣ構築物
図２１（Ｄ〜Ｆ）で説明する、５週および９週時点でのトランスジェニックマウスの分析により、試験した２つの株のＢＭＤ値が対照動物に比較して有意に大きいことが示された。５週では、大腿骨、椎骨および全身におけるＨＢＭＭＴＩＣ株１９（ｎ＝５）ＢＭＤが各々６３％、７０％および４１％野生型対照よりも大きかった。９週（ｎ＝２）ではＢＭＤにおけるこれらの増加が各々５２％、６４％および３７％に達した。１７週以上では各々３５％、４０％、および２８％であった。５週では、大腿骨、椎骨および全身におけるＨＢＭＭＴＩＣ株３５（ｎ＝１）ＢＭＤが各々４％、４７％および６％野生型対照よりも大きかった。９週（ｎ＝３）ではこれらの増加が各々３２％、４３％および１８％に達した。１７週ではＢＭＤにおける割合の増加が各々２０％、３３％、および１９％であった。Ｉ型コラーゲンプロモーターによりＨＢＭ発現が誘導されている２つのさらなるＨＢＭトランスジェニック株１８８および１８９はＨＢＭ表現型を有していることが示された。１７週以上では株１８８により大腿骨、椎骨および全骨におけるＢＭＤの２３％、３５％および２２％の増加が実証される。
【０４３４】
全体では、トランスジェニックマウスのＢＭＤ結果が、ＨＢＭ罹患家系において観察された表現型と同程度の類似性を示している（Johnsonら、Am.J.Hum.Genetics 60:1326-1332(1997))。例えば、罹患した個体で測定された椎骨ＢＭＤは非罹患ファミリーのメンバーよりもおよそ３４から６３％大きい。トランスジェニック動物由来の椎骨ＢＭＤに関するデータは９週齢で正常よりも大きい〜３０から７０％の範囲になる。
【０４３５】
トランスジェニックマウスのエクソビボ分析
非観血的骨画像診断による動物のモニター観察により、選択されたトランスジェニック株において検出された骨密度の増加をさらに調べるために、５および９週齢で直接骨密度測定および組織学的分析に関してこれらの株の動物において剖検を実施した。左大腿骨を単離し、清浄し、XCT Research 末梢型定量用コンピューター断層撮影(pQCT;Stradtec Medizintechnik、Pforzheim、ドイツ)に配置した。大腿骨の遠位末端を置き、この点から２．５ｍｍ近接で全体および骨梁測定に関してｐＱＣＴスキャニングを開始した。皮質測定のためのｐＱＣＴスキャンは最初のスキャンから３．５ｍｍ近接（すなわち遠位末端から６ｍｍ近接）で開始した。ｐＱＣＴスキャンは０．５ｍｍ厚で、ボクセル（すなわち、３次元画素）のサイズは０．０７ｍｍであり、切片を通る３６０の投影から成る。スキャンが完了した後、画像をモニターに表示し、各スキャンの大腿骨全体を含む目的の領域の輪郭を描いた。双方向性アルゴリズムを用いて軟部組織を自動的に除去し、第１の切片における残りの骨の密度（全体密度）を決定した。次いで骨の外側の５５％を求心的らせん状に剥がし、第１の切片の残りの骨の密度（骨梁密度）をｍｇ／ｃｍ３で報告した。第２の切片では、双方向性アルゴリズムを用いて皮質と骨梁骨間の境界を決定し、皮質骨の密度を決定した。
【０４３６】
株２Ｆ１  ＣＭＶβアクチン−ＨＢＭの５週齢のトランスジェニックマウスの分析により、トランスジェニック雄マウスにおいて全体密度、骨梁密度および皮質密度が非トランスジェニック雄に対して各々２０％、３７％および４％高いことが示された。後の時点で、トランスジェニックおよび非トランスジェニック動物間の差異がこの株では減少する。しかしながら、株１９に由来する５週齢のＩ型コラーゲン−ＨＢＭトランスジェニック雄では、非トランスジェニック同腹仔よりもさらにもっと劇的な骨密度の増加が明白であった。全体密度、骨梁密度および皮質密度が各々５３％、１０４％および５％高かった。株１９の動物では、表７で示すように、全体および骨梁骨密度の増加を伴う表現型が９週齢を超えて維持されることが見出された。１７週では、全体および骨梁密度は各々４６％、２０２％増加した。株１９の全体骨梁パラメーターに及ぼす影響は３つの時点全てで統計的に有意に高かった（ｐ＜０．００１）。Ｉ型コラーゲン−ＨＢＭトランスジェニック株３５の雄から、骨表現型発現の幾分異なったパターンが明らかであった。５週齢の全体密度、骨梁密度および皮質密度がわずかばかり高かった（各々７％、４％および４％）。しかしながら、９週齢では表７に示すように、これらのパラメーターの明らかなおよび統計的に有意な増加が明白になった。全体および骨梁骨密度は株３５では１７週齢を通して上昇したままである。
【０４３７】
Ｉ型コラーゲンプロモーターを伴う２つの別のＨＢＭトランスジェニック株が研究され、株１９に類似する劇的な高骨密度表現型を示している。株１８８および１８９の双方に由来する雄では、全体骨密度は非トランスジェニック動物と比較して４０％まで増加した。骨梁骨密度は９週齢で７５％増加した。１７週では、株１８８雄の全体および骨梁骨密度は対照動物、例えば非トランスジェニック同腹仔を越えて、４２％および１６１％であった。これらの値はこの週齢で株１９に認められる効果に合致する。株１８８の雌は９週で３６％および１４４％の増加を、全体および骨梁骨密度は各々２６％および１４８％の増加を示している。株１８９に由来する雌は９週で２７％および６４％まで、２６週齢では１５％および８４％まで増加する全体および骨梁密度を有した。
【０４３８】
とりわけ「骨特異的」Ｉ型コラーゲン導入遺伝子を伴う、骨細胞分化の段階により影響を受ける表現型の加齢関連発現の異なるパターンの出現は予期されない。株２および株１９の双方の動物は５週齢で脛骨サンプルのＨＢＭ  ｍＲＮＡに匹敵するレベルを発現し、これらのレベルはこの週齢でみかけの骨表現型を示さない別の株よりも有意に大きい（＞７から８倍）。Ｉ型コラーゲンプロモーターにより誘導される株１９は株２とは異なって、骨以外の組織における導入遺伝子の非常に低い発現を示す。５週齢では株３５の動物は骨では低レベル発現を示し、別の組織では発現を示さない。ＨＢＭ／ＬＲＰ５特異的抗体を用いる頭蓋冠の骨切片の免疫組織化学により５週齢の株２および株１９、ならびに９週齢の株３５に由来するトランスジェニック動物の骨細胞では、非トランスジェニック同腹仔に対してより強い染色強度が表される。
【０４３９】
ｐＱＣＴ分析により表される知見を、μＣＴ装置(Scanco)を用いて、より高い解像度でさらに試験した。画像化される領域がおよそ４ｍｍ近接に伸びる大腿骨の遠位末端を含み、関節軟骨の軸に対して垂直にするように大腿骨を配置した。μＣＴ測定を開始するための参照の株を成長プレートとの重複が最低になるように配置し、２００スキャン切片（９ｍｍ厚）に関して近接に広げる。μＣＴ測定を完了した後、顆状突起が十分に溶け込んでいる第１の切片を同定した。皮質は排除するが、最大量の骨梁腔を含むように目的の領域の輪郭を描いた。最初の３０個の切片に関して、５切片ごとに目的の領域を抜き取り、溶け込ませた。残りの１０５個の切片に関して、１０から２０切片ごとに目的の領域を抜き取った。骨梁腔が規則正しくなるほど、目的の領域を抜き取る必要性のある頻度が少なくなる。目的の各領域を抜き取った後、その先行したものと溶け込ませた。１３５個全ての切片で目的の領域が確立された後、３５０の閾値設定を用いて３次元評価を実施した。
【０４４０】
ｐＱＣＴにより同定された骨密度増加をμＣＴにより確認し、骨構築のエレメントを含むように拡張した。株２トランスジェニック動物では、μＣＴ骨容量／全容量、結合性密度および骨梁の厚みが各々５０％、８３％および１２％高かった。結合性密度および骨梁の厚みの双方の指標は、密度の増加が構造強度の増加にも随伴されることを示唆している。骨表面／骨容量はトランスジェニック雄で１７％低く、これは吸収性表面および窩がほとんどないのかもしれないことを示唆し得る。骨梁骨応答はさらに非脱灰ゴルドナー染色切片の組織学的評価によりさらに確認され、これはトランスジェニック雄の遠位大腿骨骨幹端の骨ミネラル部分が３６％大きいことを示した。動的組織形態計測分析により、カルセイン二重標識により決定されるように、骨ミネラル沈着速度の実質的な増加（＋１００％）が導入遺伝子の骨増加に部分的に寄与し得ることが示された。ｐＱＣＴにより明らかな株１９の骨梁骨に及ぼす動的効果がμＣＴにより支持され、ここでトランスジェニック雄において骨容量／全容量、骨梁数、骨梁の厚みおよび結合性密度が各々１３０％、４５％、３０％および１２１％高いことが見出された。これらの効果の全てがｐ＜０．０１で統計的に有意であった。株１９の５週齢で認められた骨表現型は９週齢の動物で保持され、ここで、表７で示すように、骨容量／全容量、骨梁数および結合性密度が非トランスジェニック同腹仔よりも有意に高かった。
【０４４１】
株３５トランスジェニック動物のμＣＴ分析は別の２つの株とは幾分異なったパターンを示した。株３５の５週齢の雌においてｐＱＣＴにより示された、ちょうど中程度の密度増加と対照的に、より大きな画像解析を有し、より大きな容積測定サンプルを含むμＣＴを用いて統計的に有意な効果（ｐ＜０．０１）が認められた。骨容量／全容量、骨梁の厚みおよび結合性密度は３５％、９％および２７％高かった。類似の結果が株３５５週齢雄において認められ、ここで骨容量／全容量および結合性密度は各々３７％および４５％増加し、これはμＣＴ分析により明らかであり、ここではｐＱＣＴによりわずかな増加が示された。株３５トランスジェニック雄とその非トランスジェニック同腹仔との差異は加齢と共に増加するようで、全密度（２８％）および骨梁密度（５２％）の統計的に有意な増加が９週齢でのｐＱＣＴにより明白である。μＣＴの結果はこの株の骨表現型における加齢に関連する多様性を支持し、トランスジェニックと非トランスジェニック動物とのその差異を示している。骨容量／全容量および結合性密度に関して、これらのパラメーターは５週齢で認められるものの倍化以上であり、各々９７％および１８８％になる。トランスジェニック動物で認められる骨容量増加は、ＨＢＭ家系の成人男性罹患メンバーの骨バイオプシサンプルで検出されたこのパラメーターにおける有意な増加と合致する。トランスジェニック株において影響を受けることが見出された別のパラメーターはピーク／成体骨量増加に至る変化を反映することができ、これはマウスのこの株では１７から２０週齢の間で生じる。
【０４４２】
株１９由来の頭蓋冠の免疫組織化学により、骨膜を裏打ちする前骨芽および骨芽細胞株ならびにミネラル化骨に存在する骨細胞における導入遺伝子の強い発現が示された。トランスジェニック動物における骨膜の骨芽細胞は膨らんでそして立方体様の、活発に細胞外マトリックスを分泌する指示的細胞であるようだ。対照的に、非トランスジェニック同腹仔の骨膜細胞は平坦な裏打ち細胞のように思われる。骨芽細胞分化および機能的マーカーであるアルカリ性ホスファターゼに関する染色が増加し、対照と比較してトランスジェニック動物における細胞の活発な分泌状態が確認される。さらなる分析により、トランスジェニックマウス頭蓋冠におけるＴＵＮＥＬ陽性骨細胞、骨芽細胞および間質細胞の数の低減が示され、これはアポトーシスの減少を示唆している。９週齢雄非トランスジェニックマウスからの頭蓋冠では間質細胞ｍｍ２あたりアポトーシス性骨芽細胞が３０．９±１．８（ｎ＝９）であり、一方ＨＢＭ導入遺伝子に由来する頭蓋冠では、間質細胞ｍｍ２あたりアポトーシス性骨芽細胞が１１．６±２．８（ｎ＝９）であった。これらを考慮に入れて、これらの結果はトランスジェニック動物におけるＢＭＤ増加は骨芽細胞数および活性の増加が原因となり、これは部分的には機能的寿命の延長が原因となり得る。
【０４４３】
過剰発現トランスジェニック株で認められる骨密度および骨構築変化は潜在的により大きな生物機械的強度を示唆している。５週齢の株１９雄の大腿骨の３点曲げ強度を評価することによりこれを直接試験した。大腿骨から軟部組織を取り除き、デジタルノギスを用いて大腿骨の長さを測定した。ｐＱＣＴを用いて遠位末端から６ｍｍで骨膜および骨内膜外周および皮質の厚みを測定した。次いで大腿骨を、根幹中央の中心が５ｍｍ離れて位置する固定支持体から等距離になるように準備台に置いた。Instron5543の負荷装置のクロスバーを根幹中央に置き、１ｍｍ／分の速度で骨折を生じるまで力を適用した。力対転移曲線を作成し、Instron Merlinソフトウェアを用いてピーク負荷を決定した。骨膜外周の増加が原因であると思われる力の７５％増加（ｐ＜０．０１）があり、これは皮質の厚みの増加に至る。従って、ＨＢＭトランスジェニック動物において認められるように、骨密度および骨幾何学における変化は生物機械的強度の増加に翻訳される。
【０４４４】
ＬＤＬ関連レセプタータンパク質のクラス内のＨＢＭ／ＬＲＰ５の会合を鑑みて、変異が脂質プロファイルに影響し得るかどうかを決定することは興味深いことであった。実際に、ＨＢＭ家系における脂質研究（すなわち８人の罹患および７人の非罹患メンバー）により、罹患メンバーでトリグリセリドおよびＶＬＤＬレベルが統計的に低いことが示された。Hitachi 911装置でBoehringer Mannheim（コレステロール用）およびRoshe（トリグリセリド用）試薬を用いてトランスジェニック株に由来する血清サンプルを分析した。ｖｉａ  ｏ−キノン・イミン色素（これはコレステロールとの酵素反応の後に形成される）を介して３７℃、５０５ｎｍでの光度測定によりコレステロールを測定した。トリグリセリド測定のための酵素法は、トリグリセリドおよび脂肪酸の加水分解の後のトリグリセリドのグリセロール部分の決定に基づく。酵素反応の最終色素生成物を５０５ｎｍで測定した。２株トランスジェニック動物の５週齢雄では、血清コレステロールはわずかに低下したが、血清トリグリセリドレベルはトランスジェニック動物において、その非トランスジェニック同腹仔に対して２６％まで低下した。９週齢の株２動物の限定的なサンプルでは、トリグリセリドレベルは２０％低いままであった。同様に、５週齢では株１９のトランスジェニック雄のトリグリセリドレベルは３２％低かった。対照的に５週齢では株３５のトランスジェニック雄および雌の双方でトリグリセリドレベルは低くなかった。５週齢株３５動物では骨容量／全体容量が統計的に大きいという事実は、脂質変化が直接骨格表現型に関連しないことを示唆している。これは９週齢の株３５動物のトリグリセリドレベルが極わずか低下した（１１％）という事実により支持されるようだが、５週齢よりも実質的に高い骨密度を呈した。これらの株における導入遺伝子の発現のレベルおよび部位が異なることが原因で、血清脂質レベルを、ＨＢＭ／ＬＲＰ５を介して骨表現型に有利に影響する作用物質に関する代理マーカーとして提供できるという可能性を考慮から外すことができない。
【０４４５】
ＨＢＭまたはＨＢＭ様遺伝子に基づくこれらのおよびその他のトランスジェニック株は骨恒常性の特性を解明するための貴重なモデルとして提供される。全ての種における骨密度はその通例の負荷条件に適応する。ＨＢＭ家系ではおよびトランスジェニック株では、骨格のセンサー／エフェクターシステムが、より大きな骨密度に至るより大きな負荷シグナルを認知するようである。骨負荷の増加が骨密度の増加を導くことができ、非負荷または廃用性が骨密度喪失を導くことを示す実験モデルを確立した。これらの実験パラダイムにおけるトランスジェニック動物の骨格の組織学的、生化学的および遺伝的応答を評価することにより、骨恒常性に寄与するセンサー／エフェクターシステムに関する多くの情報が得られる。骨ターンオーバーが変化した、非限定例としてはステロイド欠乏誘起骨減少症および加齢関連骨減少症などの、別の確立されたモデルにおけるトランスジェニック動物の適用により、骨恒常性におけるＬＲＰ５の役割およびＨＢＭ変異により誘起される有利な変化の特性を理解するうえで手掛かりとなる。
【０４４６】
トランスジェニックマウスにおけるＬＲＰ５過剰発現
野生型ＬＲＰ５の過剰発現の役割を評価するために、およびＨＢＭの効果との対比のために、Ｉ型コラーゲンプロモーターにより誘導されたＬＲＰ５を発現するトランスジェニックマウスを作製した。統計的に増加した全体および骨梁大腿骨密度がこれらの株の１つ(LRPWWTTIC-19)の９週齢で観察される。ＨＢＭトランスジェニック株で認められるほど大きくはないが、骨容量および結合性密度の有意な増加を示すμＣＴ測定により観察が支持される。９週齢の非トランスジェニックマウスに相対するＨＢＭおよびＬＲＰ５トランスジェニックマウスに関する骨格パラメーターにおけるパーセンテージ変化の比較を以下の表７に示す。
【０４４７】
【表９】
2005511002.tif 000014
【０４４８】
群は導入遺伝子の発現のレベルが骨格表現型パラメーターに随伴される個々の分析に関して表されているので、もう１つのＬＲＰ５トランスジェニック株のさらなる評価は有意なｐＱＣＴ値を示さなかった。野生型レセプターの過剰発現がタンパク質同化性骨表現型を生み出すが、表現型の変化はＨＢＭ変異により大きく拡大される。
【０４４９】
ＨＢＭジーンターゲティング
ＬＲＰ５  ＫＩ／ＫＯジーンターゲティングベクターを１２９  ＳｖＥｖ，Ｃ５７ＢＬ／６  ＥＳおよび１２９ＥＳ細胞にエレクトロポレートする。ゲノムＤＮＡの制限断片長分析およびＰＣＲ増幅したフラグメントのシークエンシングを用いてジーンターゲティングされたクローンを同定することができる。ジーンターゲティングベクターのノックイン版により、マウスゲノムへの影響を最小にしてＨＢＭ変異の内因性ＬＲＰ５ゲノム遺伝子座への導入が可能になる。それによりさらに天然の環境で、すなわち、例えばトランスジェニックマウスまたはトランスフェクトされた細胞株のような過剰発現モデルではなく、ＨＢＭタンパク質の生成が可能になる。ジーンターゲティングベクターのノックアウト版を、１つの機能的ＬＲＰ５対立遺伝子の喪失に至る可能性のある転写停止配列を含有するように操作した。この変異を有するヘテロ接合性動物を繁殖させ、ヌル対立遺伝子に関する胚ホモ接合性の生成に至る。ジーンターゲティングベクターの異なる設計では、ｌｏｘ  Ｐ部位を位置決定して内因性ＬＲＰ５遺伝子の条件的ノックアウトの生成を促進することができる。Ｃｒｅレコンビナーゼの存在下、ＬＲＰ５遺伝子の重要な領域をｌｏｘ  Ｐ部位の間で欠失させ、従って、結果的に１つの機能的対立遺伝子を喪失する可能性ができる。次いで動物の繁殖を用いてヌル対立遺伝子を伴うホモ接合体を作製する。別のリコンビナーゼ酵素系、例えば同族ｆｒｔ部位と組み合わせたｆｌｐリコンビナーゼを用いて欠失を作製することができる。胚へのプラスミド注射、およびＣｒｅを発現するトランスジェニック動物の使用などの前記した多くの方法でリコンビナーゼを投与することができる。Ｃｒｅの発現を誘導するために用いられるプロモーターを、ＬＲＰ５遺伝子の広範なまたは組織特異的な欠失に至る様式で選択することができ、従って条件的ノックアウトに至る。別の実施形態では、誘導系、例えばGeneSwitchおよびテトラサイクリンパラダイムを用いてＣｒｅ酵素そのものを発現させることができる。
【０４５０】
ＬＲＰ６ジーンターゲティングされたノックアウトマウス
ＬＲＰ６遺伝子の最初のイントロンに挿入された遺伝子トラップベクターを担持するOmnibank（登録商標）胚性幹（ＥＳ）細胞を用いてＬＲＰ６ノックアウトマウスを作製した。挿入部位の３’で宿主遺伝子転写物にスプライシングされた５’遺伝子トラップベクター配列から成る融合転写物の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により、Omnibank配列タグ（ＯＳＴ）により挿入された位置はＬＲＰ６遺伝子であることが決定された。遺伝子トラップベクターはＬＲＰ６エクソン１を遺伝子トラップのＩＲＥＳ−ＬａｃＺ−ＰｏｌｙＡエレメントの強制スプライシングにより、機能的にマウスＬＲＰ６遺伝子をノックアウトし、ＬＲＰの転写を防御する。
【０４５１】
Ｃ５７ＢＬ／６  アルビノ宿主胚盤胞に注射することによりＥＳ細胞でキメラマウスを作製し、ＯＳＴ３８８０８と同定し、これを次いで偽妊娠雌に写し、誕生まで発達させた。生殖系列キメラを１２９ＳｖＥＶＢｒｄ株マウスに戻し交配させ、近交系１２９８ＳｖＥｖＢｒｄの遺伝的背景でＬＲＰ６のノックアウト対立遺伝子を維持した。ＬＲＰ６−ＫＯ対立遺伝子の生殖系列伝達を遺伝子トラップ特異的配列のＰＣＲ増幅により同定した。ヘテロ接合性ＬＲＰ６−ＫＯの交配対を連続的繁殖に使用した。ｗｔおよびＬＲＰ６−ＫＯ子孫の遺伝子型をテイルＤＮＡ  ＰＣＲにより決定する。
【０４５２】
雌ヘテロ接合性ノックアウトマウスの９週齢での骨密度の測定により、μＣＴで測定されたような骨容量、骨梁数、および骨梁の厚さに有意（ｐ＜０．０５）な低下が示された。これらの結果は、ＬＲＰ６もまた骨密度の変調に関与し、治療および薬物の開発の標的であるという仮説に合致する。従って、ＬＲＰ６トランスジェニック動物およびＬＲＰ６の骨変調変異体を発現するトランスジェニック動物は本発明の範囲内であることが企図される。
【０４５３】
トランスジェニック動物および細胞の使用
本発明のトランスジェニック動物および細胞の使用はＨＢＭ表現型の代理マーカーを同定するための方法における有用な手段である。本発明により提供される代理マーカーはまた予定される処置の評価およびスクリーニングのための有用な手段でもある。ＨＢＭ遺伝子を担持する個体は骨量が上昇している。ＨＢＭ遺伝子は、骨発達に関与する別の分子の活性、レベル、発現パターン、および修飾状態を変化させることによりこの表現型を引き起こす。種々の確立された技術を用いて、その活性、レベル、発現パターン、および修飾状態が、ＬＲＰ５遺伝子を含有する株とＨＢＭ遺伝子を含有する株との間で異なっている分子、好ましくはタンパク質またはｍＲＮＡを同定することが可能である。このような株は例えば、細胞不含抽出物、細胞、組織または生存生物、例えばマウスまたはヒトでよい。ＬＲＰ５の変異形態に関しては、ＬＲＰ５の完全欠失、タンパク質の細胞外もしくは細胞内部分を欠く変異、またはＬＲＰ５遺伝子のいずれか別の変異を用いることができる。アンチセンスＬＲＰ５  ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドの発現を用いてＬＲＰ５タンパク質の生成を阻止することも可能である。ＨＢＭの変異に関しては、ＨＢＭの完全欠失、ＨＢＭタンパク質の細胞外もしくは細胞内部分を欠く変異、またはＨＢＭ遺伝子のいずれか別の変異を用いることができる。アンチセンスＨＢＭ  ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチドの発現をまたはＲＮＡ干渉方法学用いてＨＢＭタンパク質の生成を阻止することも可能である。
【０４５４】
ＬＲＰ５株およびＨＢＭ株の比較により同定された分子を、医薬品開発またはヒトもしくは動物の骨疾患の診断における代理マーカーとして使用することができる。また別に、このような分子を骨疾患の処置に用いることができる。Schenaら、Science 270:467-470(1995)参照。
【０４５５】
例えばマウス相同体遺伝子座にＨＢＭ遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを構築する。遺伝子型ＨＢＭ／＋のマウスは生存可能で、健康であり、骨量が上昇している。骨量上昇の代理マーカーを同定するために、ＨＢＭ／＋（すなわちヘテロ接合性）およびアイソジェニック＋／＋（すなわち野生型）マウスを剖検する。双方の組織ｍＲＮＡを各動物から抽出し、＋／＋個体で発現されたｍＲＮＡに相当する「遺伝子チップ」を構築する。異なる組織に由来するｍＲＮＡを各遺伝子型の動物から単離し、逆転写し、蛍光標識し、次に固体支持体に貼り付けた遺伝子フラグメントにハイブリダイズさせる。２つの集団間の蛍光強度の比率は＋／＋およびＨＢＭ／＋動物の特異的ｍＲＮＡの相対的存在度の指標である。また別に、野生型およびトランスジェニック動物からｍＲＮＡを単離することができる。これらのサンプルから調製したｃＤＮＡはインビトロで転写されて、特注のまたは市販により入手可能な、例えばAffymetrixにより製造されるような遺伝子アレイチップで使用するための標識ｍＲＮＡが得られる。表現型の機能として発現が変化している遺伝子のセットを種々の通常のコンピューター分析により同定することができる。野生型対照と相対して過剰または過少発現するｍＲＮＡをコードする遺伝子は、ＨＢＭ遺伝子により協調的に制御される遺伝子の候補である。
【０４５６】
既に見出されているタンパク質と同一のシグナル発生カスケードの一部である新規タンパク質を同定するための１つの標準的な手順は以下の通りである。細胞を放射活性亜リン酸と反応させ、既に見出されているタンパク質を多かれ少なかれ活性であるように操作する。次いで細胞の別のタンパク質のリン酸化状態をポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィー、または類似の技術によりモニター観察する。既知のタンパク質の活性レベルを、例えば特異的インヒビター、例えば薬物もしくは抗体を用いて野生型を変異タンパク質と比較すること、単純に既知の細胞外タンパク質を添加するか、もしくは添加しないこと、または既知タンパク質発現のアンチセンスインヒビターを使用することなどの多くの方法により操作することができる(Tamuraら、Science 280(5369):1614-1617(1998);Meng、EMBO J.17(15):4391-4403(1998);Cooperら、Cell 1:263-273(1982))。
【０４５７】
別の実例では、ＬＲＰ５のセンスまたはアンチセンスいずれかのｃＤＮＡを発現するＴＥ８５骨肉腫細胞においてリン酸化のレベルが異なるタンパク質を同定する。ＴＥ８５細胞は正常では高レベルのＬＲＰ５を発現する(Dongら、Biochem.&Biophys.Res.Comm.251:784-790(1998))。センス構築物を含有する細胞はさらに高レベルのＬＲＰ５を発現するが、アンチセンス構築物を発現する細胞は低レベルを発現する。３２Ｐの存在下で細胞を成長させ、収穫し、溶解し、ライゼートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流し、タンパク質を分離し、ゲルをオートラジオグラフィーに供する(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons(1997))。センスとアンチセンス細胞株３２の間の強度が異なるバンドはそのリン酸化状態または絶対レベルがＬＲＰ５のレベルに応答して変化するリンタンパク質を表す。３２Ｐ標識の代替として、未標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、市販により入手可能な抗ホスホチロシン抗体をプローブとして用いて免疫ブロッティングに供することができる(Thomasら、Nature 376(6537):267-271(1995))。アンチセンスＲＮＡの発現の代替として、化学的に修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションを用いることができる(Woolfら、Nucleic Acids Res.18(17):1763-1769(1990))。
【０４５８】
多くの骨障害、例えば骨粗鬆症は発症が遅く、そして処置に対する応答が遅い。従って骨発達およびミネラル化の代理マーカーを開発することが有用である。このようなマーカーは骨障害の処置を開発するのに、および骨障害を後に発達させるリスクがある患者を診断するのに有用であり得る。好ましいマーカーの実例は、例えば米国特許第5,455,179号、同第5,641,837号および同第5,652,112号（その開示は参照によりその全てを本明細書に組み込む）に記載されているＮ−およびＣ−末端テロペプチドマーカーである。ＨＩＶ疾患の分野では、ＣＤ４計数およびウイルス負荷が疾患の進行の有用な代理マーカーである(Vlahovら、JAMA 279(1):35-40(1998))。骨疾患の分野で類似の代理マーカーが必要とされている。
【０４５９】
代理マーカーは容易に試験され、非特異的影響に対しては相対的に非感受性であるという何かしら特徴的であり得る。例えば、代理マーカーは組織または血清におけるタンパク質またはｍＲＮＡのような分子でよい。また別に、代理マーカーは診断徴候、例えば痛みに対する感受性、反射応答等でよい。
【０４６０】
さらに別の例では、ＨＢＭ遺伝子を担持するヒトの家系を用いて骨量上昇の代理マーカーを同定する。ＨＢＭ遺伝子を担持する３人の個体から、およびＨＢＭ遺伝子を担持しない近親の３人の個体から血液サンプルを採取する。これらの個体の血清中のタンパク質を２次元ゲル系で電気泳動し、ここで一方の次元では大きさによりタンパク質を分離し、もう一方の次元では等電点によりタンパク質を分離する(Epsteinら、Electrophoresis 17(11):1655-1670(1996))。タンパク質に対応するスポットを同定する。いくつかのスポットが異なる量で、または正常なその親族に比較してＨＢＭ個体ではわずかに異なる位置で存在することが予期される。これらのスポットは代理マーカーの候補であるタンパク質に相当する。タンパク質の同定はマイクロシークエンシングにより決定され、診断試験手順に使用するための標準的な方法によりタンパク質に対する抗体を生成することができる。ＨＢＭタンパク質またはその他の代理マーカー候補に関する診断アッセイには、本発明で記載した抗体およびヒト体液、膜、骨、細胞、組織またはその抽出物中のＨＢＭを検出するためのリポーター分子の使用などがある。抗体を検出可能なシグナルを提供する物質と共に共有結合的または非共有結合的に結合させることにより抗体を標識することができる。多くの科学文献および特許文献では、種々のレポーター分子または、放射性核種、酵素、蛍光、化学ルミネサンスまたは色素原物質などの標識が記載されている(米国特許第3,817,837号;第3,850,752号;第3,939,350号;第3,996,345号;第4,277,437号;第4,275,149号;および第4,366,241号)。トランスジェニックまたは遺伝的に修飾された動物を代理マーカー同定のための方法に提供することもできる。
【０４６１】
これらの抗体を用いて、正常な個体および骨障害、例えば骨粗鬆症、骨粗鬆症偽性神経膠腫、エンゲルマン病、リビング病、高ホスファターゼ血症、ファン・ブッヘム病、メロレオストーシス、大理石骨病、濃化異骨症、硬化狭窄症、オステオポイキローシス、先端巨大症、パジェット病、繊維性骨異形成症、管状狭窄症、骨形成不全症、副甲状腺機能低下症、偽性副甲状腺機能低下症、偽性偽性副甲状腺機能低下症、１次および２次性副甲状腺機能亢進症および随伴される症候群、高カルシウム尿症、甲状腺の髄様癌、骨軟化症ならびにその他の疾患を罹患する患者における代理マーカー候補のレベルを測定する。臨床の場で抗体を用いて血清中のタンパク質のレベルを測定する技術は十分に確立されている。特定の疾患または疾患の型を担持する個体における高レベルまたは低レベルで一貫して存在するタンパク質が代理マーカーとして有用である。
【０４６２】
骨障害の診断において代理マーカーを用いることができる。例えば、高頻度の骨折で医師のもとを訪れる子供を検討する。根底の原因は子供の虐待、不適切な子供の挙動または骨障害であろう。骨障害を迅速に試験するために、前記した抗体を用いて代理マーカータンパク質のレベルを測定する。
【０４６３】
代理マーカーの修飾状態のレベルを開発中の薬物の、可能性のある有効性の指標として測定することができる。骨発達またはミネラル化における変化を観察するのに長い時間を必要とするかもしれないので、骨障害の処置を行うときに代理マーカーを使用することがとりわけ便利である。例えば、前記したように、「ＨＢＭ誘導ｍＲＮＡセット」と称する骨ｍＲＮＡのセットが＋／＋マウスに比較してＨＢＭ／＋マウスにおいて過剰発現されることが見出されている。このセットの発現を代理マーカーとして使用することができる。具体的には、＋／＋マウスの化合物での処理がＨＢＭ誘導ｍＲＮＡセットの過剰発現に至る場合、次いでその化合物はさらなる開発のための候補として有望であると考えられる。
【０４６４】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかでＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質を用いることにより、またはそのフラグメントを結合させることにより化合物をスクリーニングするのにとりわけ有用である。
【０４６５】
このような試験に用いられるＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントは、溶液中で遊離である、固体支持体に貼り付けられている、または細胞表面上の骨に位置する、のいずれでもよい。薬物スクリーニングの１つの方法はタンパク質またはフラグメントを発現する組換え核酸で安定して形質転換された真核または原核生物宿主細胞を、好ましくは競合結合アッセイにおいて利用する。このような細胞を生存可能なまたは固定されたいずれかの形態で標準的な結合アッセイに使用することができる。例えばＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントと被験物質との間で複合体を形成するために測定するか、またはＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントと既知のリガンドとの間の複合体の形成が被験物質により干渉される程度を試験することができる。
【０４６６】
従って、本発明はこのような作用物質をＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントと接触させること、および当分野で公知の方法により（ｉ）作用物質とＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとの間の複合体の存在、または（ｉｉ）ＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在に関して検定することからなる薬物のスクリーニングの方法を提供する。このような競合結合アッセイでは、ＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントは典型的には標識されている。遊離のＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはフラグメントは、タンパク質：タンパク質複合体に存在するものから分離されており、遊離（すなわち非複合化）の標識の量は各々、被験物質のＬＲＰ５もしくはＨＢＭへの結合、またはＬＲＰ５もしくはＨＢＭ：リガンド結合とのその干渉の測定値である。
【０４６７】
薬物スクリーニングのための別の技術は、ＬＲＰ５もしくはＨＢＭタンパク質に対して適当な結合親和性を有する化合物に関する高速大容量スクリーニングを提供し、これは国際公開公報第号84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べると、異なる小型ペプチド試験化合物の多くを固体基質、例えばプラスチックピンまたはその他の表面上で合成する。ペプチド試験化合物をＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質と反応させ、洗浄する。次いで結合ＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質を当分野で公知の方法により検出する。前記した薬物スクリーニング技術において使用するために精製されたＬＲＰ５またはＨＢＭをプレートに直接コーティングすることができる。しかしながら、タンパク質に対する非中和抗体を用いて抗体を捕捉してＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質を固相上に固定することができる。
【０４６８】
本発明はまたＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質を特異的に結合できる中和抗体が被験化合物と、ＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメントへの結合に関して競合する競合薬物スクリーニングアッセイの使用をも企図する。この様式では、抗体を用いてＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質の１つまたはそれ以上の抗原決定基を共有するいずれかのペプチドの存在を検出することができる。
【０４６９】
薬物スクリーニングのための別の技術は、非機能的ＬＲＰ５またはＨＢＭ遺伝子を有する宿主真核細胞株または細胞（例えば前記したもの）の使用に関与する。これらの宿主細胞株または細胞はＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質レベルで欠損がある。宿主細胞株または細胞は薬物化合物の存在下で成長する。宿主細胞の成長速度を測定して、化合物がＬＲＰ５またはＨＢＭ欠損細胞の成長を制御できるかどうかを決定する。
【０４７０】
合理的な薬物設計の目標は、目的の生物学的に活性なタンパク質またはそれが相互作用する小型分子（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）の構造アナログを、例えばそのタンパク質のより活性なまたは安定した形態である薬物、または、例えばインビボでそのタンパク質の機能を増強または干渉する薬物を作るために、生成することである。例えばHodgson、Bio/Technology 9:19-21(1991)参照。１つの研究法では、最初に目的のタンパク質（例えばＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質）の、または例えばＬＲＰ５またはＨＢＭレセプターもしくはリガンド複合体の３次元構造を、Ｘ線結晶学により、コンピューターモデリングにより、または最も典型的には研究法の組み合わせにより決定する。それほど頻繁ではないが、タンパク質の構造に関して有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づくモデリングにより得ることができる。合理的な薬物設計の実例は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの開発である(Ericksonら、Science 249:527-533(1990))。加えて、ペプチド（例えばＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質）をアラニンスキャンにより分析する(Wells、Methods in Enzymol.202:390-411(1991))。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａと置換し、ペプチドの活性に及ぼすその影響を決定する。ペプチドの各々のアミノ酸残基をこの様式で分析してペプチドの重要な領域を決定する。
【０４７１】
機能アッセイにより選択される標的特異的抗体を単離し、次にその結晶構造を解析することも可能である。原理的には、この研究法により続く薬物設計が基づき得るファルマコアが得られる。機能的、薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を作製することにより結局タンパク質結晶学を迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位を元来のレセプターのアナログであると予測される。次いで抗ｉｄを用いて化学的または生物学的に生成されたペプチドバンクのバンクからペプチドを同定および単離することができる。次いで選択されたペプチドはファルマコアとして働く。
【０４７２】
従って、例えば望ましいＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質活性または安定性を有するか、またはＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト等として作用する薬物を設計できる。クローン化されたＬＲＰ５またはＨＢＭ配列の利用性のおかげで、ＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質の十分量を利用してＸ線結晶学のような分析研究を実施することができる。加えて、本明細書で提供されるＬＲＰ５またはＨＢＭタンパク質配列の知識により、Ｘ線結晶学の代わりに、またはそれに加えてコンピューターモデリング技術を用いる研究が導かれる。
【０４７３】
トランスジェニック動物の使用により、同定された薬物候補（「リード」として公知である）をさらに研究することができる。本発明のトランスジェニック動物は薬物リードを試験し、さらに精密にするために用いることができる、骨密度変調の動物モデルを作製するのに有用である。前記したトランスジェニック動物は、本明細書で企図されるＬＲＰ５およびＨＢＭまたはＨＢＭ様トランスジェニック動物の１つの実例を提示するものである。当業者は本発明の修飾において特定の目的に通常的に適用される変動および考慮すべき事項を認識している。トランスジェニック動物モデルの開発の実例は、例えばStrategies in Transgenic Animal Science(1995,MonasterskyおよびRobl編、Washigton,DC:American Society for Microbiology)で示され、その参考文献は全て参照によりその全てを本明細書に組み込む。
【０４７４】
実例としては、トランスジェニック動物の少なくとも２つの群を記載するように作製して、一方の群がＨＢＭを、他方の群がＬＲＰ５を発現するようにできる。これらの動物を数日から動物の余命までにわたる期間、候補物質で処置することができる。骨量の変化および／またはＨＢＭ表現型の代理マーカーに関して動物をモニター観察する。このような研究で用いられるトランスジェニック動物はヒトＨＢＭタンパク質およびＬＲＰ５タンパク質または各々の種もしくはその変異体で定義されるＨＢＭおよびＬＲＰ５相同タンパク質を発現することができる。偏在性プロモーターまたは公知の骨特異的プロモーターにより発現を誘導することができる。異なるプロモーターを利用して動物の群を比較することは情報価値がある。
【０４７５】
本発明による方法のトランスジェニック動物は、ＨＢＭ、ＬＲＰ５を発現するか、または動物の元来のプロモーターの調節下ではいずれも発現しない、ノックイン（ＫＩ）および／またはノックアウト（ＫＯ）動物例えばマウスを含むこともできる。前記したように（ならびに当分野の他の文献、例えば米国特許第6,187,991号および第6,187,992号、およびそこに引用される参考文献（これは参照によりその全てを本明細書に組み込む））ＥＳ細胞における相同組換えによりこのような動物を作製することができる。候補薬物で処置したトランスジェニック動物の実験群を非観血的手段により、前記したように代理マーカーのモニター観察により、および／または所定の時点で剖検された動物の骨のエクソビボ分析によりモニター観察することができる。
【０４７６】
同様に、食事調節（例えばビタミン、ミネラル、タンパク質、脂質等の摂取の変化）、卵巣切除、精製されたＨＢＭまたはＬＲＰタンパク質の全てもしくは一部の直接投与、アンチセンスヌクレオチドの投与、ＬＲＰ５に対する抗体、または成人の遺伝子治療のような処置の効果を、本発明によるトランスジェニック動物に対する処置の全身投与により調査することができる。このような処置には、エストロゲン、タモキシフェン、ラロキシフェン、（またはその他の選択的エストロゲンモデュレーター、ＳＥＲＭ）、ビタミンＤアナログ、カルシトニン、カテプシンＫインヒビター、スタチン（例えばシムバスタチン、パラバスタチンおよびロバスタチン）、ビスホスフォネート、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、米国特許第6,190,880号および第5,866,364号に記載される骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ならびに前記の化合物の組み合わせなどがある。
【０４７７】
ＬＲＰ５およびＬＲＰ６間の、およびＬＤＬレセプターに対する相同性、ならびにＨＢＭ対象において変調されている心臓健康のためのマーカーのさらなる観察を考慮すると、本明細書に開示された新規研究方法を、公知の心臓保護処置から骨変調効果をスクリーニングするための用いることは本発明の実施形態である。それにより本発明は、骨保護および骨質を改善する両方の治療方法を提供する。モデルは薬物を試験し、ＬＲＰ５およびＨＢＭに関連する脂質変調効果を研究するのに有用である。
【０４７８】
ＬＲＰ５およびＨＢＭ遺伝子の種々変異の影響を、本発明に従ってトランスジェニック動物のさらなる株を作製することにより調査でき、ここでこれらの動物はこのような変異を含む。骨発達または代理マーカーの直接測定の比較により、本発明の実施形態は遺伝子治療試薬をスクリーニングするのに有用な研究手段、候補薬物治療、および骨発達変調の分子メカニズムの解明を提供する。当業者はこれらの目標を達成するための本発明の方法の使用の仕方を知っている。
【０４７９】
本発明は予期される遺伝子治療を試験するための方法および有用な研究手段を提供する。トランスジェニックノックアウトマウスは予期される遺伝子治療を試験するのに有用である。例として、内因性ＬＲＰ５またはＨＢＭを発現しないトランスジェニックノックアウト動物例えばマウスを前記のように作製する。予期される遺伝子治療、例えばＣＭＶβアクチンプロモーターにより誘導される組換え複製欠損アデノウイルスコード化ヒトＨＢＭタンパク質を投与する。骨密度のパラメーターおよび／または代理マーカーを、治療を行っている間モニター観察する(Ishibashiら、J.Clin.Invest.92:883-893(1993))。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーセット、例えば前記したものを用いてトランスジェニックＨＢＭの発現を測定することができる。当業者は代替方法、例えばノーザンブロット法を知っている。生殖系列トランスジェニック動物、ノックアウト（ヌル対立遺伝子）バックグラウンド、および野生型内因性ＬＲＰ５バックグラウンド動物の群内および群間の双方の処置および未処置動物の比較により、遺伝子治療の種々の様式の相対的有効性を評価するための補足的対照が提供される。
【０４８０】
本明細書で企図されるトランスジェニック動物モデルの使用には、非限定例としては、（１）骨細胞（例えば骨芽細胞および破骨細胞）機能および数を研究するためのトランスジェニック動物の頭蓋冠に由来する骨細胞培養を作製するための供給源；（２）トランスジェニック動物の卵巣切除（ｏｖｘ）によりエストロゲン喪失の影響を研究するためのモデル；（３）骨に及ぼす機械的負荷およびその他のストレス／強度試験を試験するためのモデル；（４）骨異常を展示する、別の遺伝的修飾がなされたまたは天然発生変異動物に繁殖させる繁殖モデル；(Chipmanら、PNAS 90:1701-1705(1993);Phillipsら、Bone 27:219-226(2000);Kajkenovaら、J.Bone Min.Res.12:1772-1779(1997);Jilkaら、J.Clin.Invest.97:1732-1740(1996);Takahashiら、Bone and Mineral 24:245-255(1994))；（５）重量負荷すなわち重力の影響を試験するための骨不適切／廃用（ｍｉｓ／ｄｉｓｕｓｅ）モデル；（６）骨代謝を変調できるかまたは変調することが解っている試薬を同定およびスクリーニングするためのモデル（例えばＰＴＨ、エストロゲン、ビタミンＤアナログ、ビスホスフォネート、スタチン、レプチン、ＢＭＰ、アポＥ、ＳＥＲＭＳ）；（７）骨折修復を改善するための予期される処置を調査するためのモデルなどがある。トランスジェニック動物を骨疾患、脂質疾患、Ｗｎｔシグナル発生等の別の遺伝的（または遺伝的に修飾された）マウスモデルと交雑繁殖させることができる。これらの実例としては骨形成不全症（ｏｉ）マウス、特発性骨折（ｓｆｘ）マウス、アポＥ異常を伴う動物、ＴＣＦ−ＬａｃＺまたはその他のレポーター遺伝子（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ）でＷｎｔシグナル発生をモニター観察するトランスジェニック動物等がある。
【０４８１】
非限定的な例としては、ｐＤＥＸＡ、ｐＱＣＴおよびマイクロＣＴによる骨密度測定；組織学；分子マーカー分析、アポトーシス、細胞増殖、細胞サイクル、ミネラル化、血清生化学、転写プロファイル等のような方法を用いてトランスジェニック動物モデルを分析することができる。
【０４８２】
ＸＸＩＩ．使用方法：鳥類および哺乳類動物牧畜
ＬＲＰ５  ＤＮＡおよびＬＲＰ５タンパク質および／またはＨＢＭ  ＤＮＡおよびＨＢＭタンパク質を脊椎動物および好ましくはヒト治療薬に、および家畜繁殖用を含めて鳥類および哺乳類脊椎動物薬に用いることができる。例えばニワトリ、雄ドリ、雌ドリ、シチメンチョウ、ダチョウ、アヒル、キジおよびウズラなどの鳥類を高骨量の遺伝子および経路の同定から利益を得ることができる。文献に引用されている多くの例(例えばMcCoyら、Res.Vet.Sci.60(2):185-186(1996))では、牧畜条件を原因とする脆弱な骨により、ケージ病、骨粗鬆症および高死亡率が引き起こされる。鳥類の骨粗鬆症またはその他の骨障害を処置するためのさらなる治療薬は牧畜産業、例えば食肉および卵の生産の福利および経済状態にかなり有利な影響を及ぼし得る。
【０４８３】
ＸＸＩＩＩ．使用方法：骨発達に影響する遺伝的変化の検出のためのＬＲＰ５特異的オリゴヌクレオチドを用いる診断アッセイ
骨発達の変化または疾患がＬＲＰ５遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の変化に関与すると推定される場合、特定のオリゴヌクレオチドを構築し、それを用いて骨発達に影響する骨組織またはその他の組織におけるＬＲＰ５  ｍＲＮＡまたはＨＢＭ  ｍＲＮＡのレベルを各々評価することができる。
【０４８４】
例えば骨密度に影響するＨＢＭ遺伝子をヒトが有しているかどうかを試験するために、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することができる。標準的な方法により２つのオリゴヌクレオチドを合成するか、または特注のオリゴヌクレオチドの販売者から入手する。Ｏｌｉｇｏ４．０プライマー・ピッキングプログラム(Wojchich Rychlik、1992)またはいずれかの適当な代替を用いて標準的な基準により長さおよび塩基組成を決定する。オリゴヌクレオチドの１つを、用いるＰＣＲ条件下でＨＢＭ  ＤＮＡにのみハイブリダイズするように設計する。その他のオリゴヌクレオチドをＬＲＰ５ゲノムＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計して、これらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＤＮＡ増幅が便宜的に同定されたＤＮＡフラグメントを生成するようにする。例えば、以下の条件を用いる場合、プライマー対ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＣＣ（配列番号３２）およびＡＡＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡＣＣＴＧ（配列番号３３）はＤＮＡサンプルから５３０塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅する。工程１では９５℃で１２０秒間；工程２では９５℃で３０秒間；工程３では５８℃で３０秒間；工程４では７２℃で１２０秒間；ここで工程２から４を３５回繰り返す。卵胞、全血、または頬側口腔から組織サンプルを入手できる。
【０４８５】
前記の手順で作製したフラグメントを標準的な技術によりシークエンシングする。ＨＢＭ遺伝子に関する個々のヘテロ接合性はグリシン１７１のコドンの２番目の位置で等量のＧおよびＴを示す。正常なすなわちホモ接合性野生型の個体はこの位置でＧのみを示す。類似の通常的な手順を用いて本発明による別の多型性および変異体のためのアッセイを開発することができる。
【０４８６】
ＰＣＲに加えて別の増幅技術、例えばライゲーション媒介ＰＣＲまたはＱ−βレプリカーゼに関与する技術(Cahillら、Clin.Chem.37(9):1482-1485(1991))を代替として用いることができる。例えばオリゴヌクレオチドAGCTGCTCGTAGCTGTCTCTCCCTGGATCACGGGTACATGTACTGGACAGACTGGGT（配列番号３４）およびTGAGACGCCCGGATTGAGCGGGCAGGGATAGCTTATTCCCTGTGCCGCATTACGGC（配列番号３５）を変性ヒトＤＮＡサンプルとハイブリダイズさせ、ＤＮＡリガーゼと処置し、次にプライマーオリゴヌクレオチドＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡ（配列番号３６）およびＧＣＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＣＴ（配列番号３７）を用いるＰＣＲ増幅に供することができる。最初の２つのオリゴヌクレオチドでは、外側の２７塩基がプライマー結合部位に相当するランダム配列であり、内側の３０塩基がＬＲＰ５遺伝子の配列に相当する。最初のオリゴヌクレオチドの末端のＴはＨＢＭ遺伝子に相当する。最初の２つのオリゴヌクレオチドは、ＨＢＭ遺伝子を担持するヒトＤＮＡにハイブリダイズしたときにのみライゲートし、これは増幅可能な１１４塩基ＤＮＡフラグメントの形成に至る。
【０４８７】
アガロースゲル電気泳動、定量用ハイブリダイゼーション、または分子生物学の当業者に公知の核酸検出のための等価な技術により増幅産物を検出することができる(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring、ニューヨーク州(1989))。
【０４８８】
ＬＲＰ５遺伝子またはＨＢＭ遺伝子における別の変化を同一の型の増幅検出手順により、これらの変化を同定するように設計されたオリゴヌクレオチドを使用することにより診断することができる。これらの手順を動物およびヒトにおいて使用して、骨発達に影響するＬＲＰ５またはＨＢＭにおける変化を同定することができる。
【０４８９】
脊椎動物細胞を遺伝的に操作するためのベクターの状況で、ＬＲＰ５またはＨＢＭのｃＤＮＡを各々骨特異的プロモーターに融合させることにより骨組織におけるＬＲＰ５またはＨＢＭの発現を達成することができる。ＤＮＡをウイルスキャプシッドにパッケージングすることにより、カチオン性リポソーム、エレクトロポレーションを使用することにより、またはリン酸カルシウムトランスフェクションによりＤＮＡ構築物を細胞に導入する。トランスフェクトされた細胞、好ましくは骨芽細胞を培養物中で研究するか、または骨への直接注射により、もしくは骨芽細胞の静脈内注射により、続いて骨組織への組み込みにより動物の骨組織に導入することができる(Koら、Cancer Research 56(20):4614-4619(1996))。例えば骨芽細胞で特異的に活性であるオステオカルシンプロモーターを用いてＬＲＰ５遺伝子またはＨＢＭ遺伝子の転写を導くことができる。いくつかのベクターおよびトランスフェクション方法、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくはカチオン性リポソームを用いるトランスフェクションの後に維持されるベクター、または本明細書に記載したその他の方法およびベクターのいずれかを用いることができる。
【０４９０】
機能的ＬＲＰ５タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベル変化は骨ミネラル化のレベルに影響する。機能的ＬＲＰ５タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベルを操作することにより、骨発達に影響し、骨ミネラル化のレベルを上昇または低下させることが可能である。例えば骨粗鬆症の患者において骨ミネラル化を増大させることは有用であろう。また別に、大理石骨病またはパジェット秒の患者において骨ミネラル化を低下させることは有用であろう。ＬＲＰ５レベルまたはＨＢＭレベルの変化を研究手段として用いることもできる。具体的には、そのレベルまたは修飾状態がＬＲＰ５またはＨＢＭの機能的レベルにおける変化に応答して変化するタンパク質、ｍＲＮＡおよびその他の分子を同定することが可能である。骨障害の病理および病因は公知であり、例えばRubinおよびFarber(編)、Pathology、第2版、S.B.Lippincott Co.、Philadelphia、ペンシルバニア州(1994)に記載されている。
【０４９１】
種々の技術を用いて機能的ＬＲＰ５またはＨＢＭのレベルを変化させることができる。例えばＬＲＰ５の細胞外部分もしくはその変異体、またはＨＢＭもしくはその変異体の静脈内または骨内注射により処置したヒト、動物または鳥類の体内のＬＲＰ５活性またはＨＢＭ活性の各々のレベルが変化する。ＬＲＰ５タンパク質またはＨＢＭタンパク質のトランケート版を注射して機能的ＬＲＰ５タンパク質またはＨＢＭタンパク質のレベルを各々変化させることもできる。ＬＲＰ５またはＨＢＭの特定の形態は内因性タンパク質の活性を増強するが、一方別の形態は抑制性である。
【０４９２】
好ましい実施形態では、ＨＢＭタンパク質を用いて骨粗鬆症、骨折またはその他の骨障害を処置する。別の好ましい実施形態では、ＨＢＭタンパク質の細胞外部分を使用する。このＨＢＭタンパク質は任意でタンパク質を細胞表面に付着させる基の付加により修飾されていてもよい。タンパク質を医薬的に許容される溶液で調製し、注射または許容される薬物動態および分配を達成する別の方法により投与する。
【０４９３】
この方法の第２の実施形態では、ＬＲＰ５またはＨＢＭレベルは遺伝子治療技術により上昇または低下する。ＬＲＰ５またはＨＢＭレベルを上昇させるために、前記したように、骨芽細胞または別の有用な細胞型を遺伝的に操作して高レベルのＬＲＰ５またはＨＢＭを発現される。また別に、ＬＲＰ５またはＨＢＭレベルを低下させるために、ＬＲＰ５またはＨＢＭ  ｍＲＮＡの翻訳可能なレベルを特異的に低減させるアンチセンス構築物を使用することができる。概して、組織非特異的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターまたは発現ベクターにおいて見出される、市販により入手可能な別のプロモーターを用いることができる(Wuら、Toxicol.Appl.Pharmcol.141(1):330-339(1996))。好ましい実施形態では、ＬＲＰ５  ｃＤＮＡまたはそのアンチセンスが骨特異的プロモーター、例えばオステオカルシンまたは別のプロモーターにより転写され、骨組織において特異的発現を達成する。この方法で、ＬＲＰ−５発現ＤＮＡ構築物またはＨＢＭ発現構築物を非骨細胞に導入する場合、これは発現されない。
【０４９４】
この方法の第３の実施形態では、ＬＲＰ５またはＨＢＭに対する抗体を用いてその機能を阻止する。このような抗体は本明細書で同定されている。
【０４９５】
この方法の第４の実施形態では、ＬＲＰ５機能またはＨＢＭ機能のアゴニストまたはアンタゴニストである薬物を使用する。このような薬物は本明細書にて記載されており、医薬品開発の当業者に周知の医薬品化学の技術により最適化される。
【０４９６】
ＬＲＰ５およびＨＢＭはいくつかのタンパク質、例えばアポＥと相互作用する。ＬＲＰ５またはＨＢＭとアポＥまたはその他の結合パートナーとの相互作用を阻止する分子は骨発達およびミネラル化を変化させると予測される。このようなインヒビターは骨粗鬆症、骨大理石病、またはその他の骨ミネラル化の疾患の処置において薬物として有用であろう。このようなインヒビターは低分子量化合物、タンパク質またはその他の型の分子でよい。Kimら、J.Biochem.(Tokyo)、124(6):1072-1076(1998)参照。
【０４９７】
標準的な薬物スクリーニング技術によりＬＲＰ５またはＨＢＭと相互作用するタンパク質との相互作用のインヒビターを単離することができる。例えばＬＲＰ５タンパク質（もしくはそのフラグメント）またはＨＢＭ（もしくはそのフラグメント）を固体支持体例えばマイクロタイターウェルのベースに固定することができる。第２のタンパク質またはタンパク質フラグメント、例えばアポＥを誘導体化して例えば蛍光を用いる検出を補助する。ＬＲＰ５またはＨＢＭのこのタンパク質−タンパク質ドメインを各々特異的に阻止できる候補化合物の存在下、ヨウ素またはビオチンを次いでＬＲＰ５またはＨＢＭに添加し、従ってその膜セグメントに随伴される問題を回避する。この型の薬物スクリーニングは医薬品開発の分野の当業者に周知である。
【０４９８】
ＬＲＰ５およびＨＢＭは骨発達に関与するので、ＬＲＰ５およびＨＢＭに結合するタンパク質もまた骨発達に関与することが予測される。標準的な方法、例えば同時免疫沈澱、同時分画化、または２ハイブリッドスクリーニング(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons (1997))によりこのような結合タンパク質を同定することができる。例えば２ハイブリッド系を用いてＬＲＰ５相互作用タンパク質またはＨＢＭ相互作用タンパク質を同定するために、ＬＲＰ５またはＨＢＭの細胞外ドメインをＬｅｘＡに融合させ、酵母ベクターｐＥＧ２０２（「bait」）に関して発現させ、酵母株ＥＧＹ４８において発現させた。酵母株を適当なベクター中、候補相互作用タンパク質に融合したガラクトース誘導転写活性化配列をコードする「ｐｒｅｙ」ライブラリーで形質転換する。この方法により相互作用タンパク質を最初に選択し、続いて確認するための技術は分子生物学の当業者に周知である(Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons (1997))。
【０４９９】
好ましい実施形態では、ＨＢＭと相互作用するが、ＬＲＰ５とは相互作用しないタンパク質を前記の手順の変法を用いて同定する(Xuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(2):12473-12478(1977年11月))。この２ハイブリッド系の変法は２つのベイトを用い、ＬＲＰ５およびＨＢＭを各々ＬｅｘＡおよびＴｅｔＲに融合させる。また別にＨＢＭと相互作用するがＬＲＰ５とは相互作用しないタンパク質を単離することができる。これらの手順は分子生物学の当業者に周知であり、標準２ハイブリット手順の単純な変法である。
【０５００】
ＬＲＰ５またはＨＢＭと相互作用する物質を単離するまた別の方法として生化学的研究方法を用いる。ＬＲＰ５タンパク質またはそのフラグメント、例えば細胞外ドメイン、またはＨＢＭタンパク質またはそのフラグメント、例えば細胞外ドメインを化学的にセファロースビーズに結合させる。ＬＲＰ５またはＨＢＭ結合ビーズをカラムに注ぐ。生物学的抽出物、例えば脂質分画、血清タンパク質、骨バイオプシの上澄のタンパク質、または穏やかに溶解した骨芽細胞に由来する細胞内容物をカラムに添加する。非特異的結合化合物を溶出し、カラムを低塩バッファーで数回洗浄し、次に強固に結合した化合物を高塩バッファーで溶出することができる。これらはＬＲＰ５またはＨＢＭに結合する候補化合物であり、標準的な試験および対照実験により特異的結合に関して試験することができる。タンパク質を結合させるのに用いるセファロースビーズおよび結合を実施するための方法は市販により入手可能であり(Sigma)、本明細書に記載した手順はタンパク質生化学の分野の当業者に周知である。
【０５０１】
前記の手順の変法として、高塩によりＬＲＰ５またはＨＢＭセファロースカラムから溶出されるタンパク質を次いでＨＢＭ−ＬＲＰ５セファロースカラムに添加する。付着せずに流れるタンパク質はＬＲＰ５に結合するが、ＨＢＭには結合しないタンパク質である。また別に、カラムを使用する順序を逆にすることによりＨＢＭタンパク質に結合するが、ＬＲＰ５タンパク質には結合しないタンパク質を単離することができる。
【０５０２】
単離された化合物を標準的な方法、例えば２Ｄゲル電気泳動、クロマトグラフィーおよび質量分析により同定することができる。
【０５０３】
ＸＸＩＶ．使用方法：形質転換随伴組換え（ＴＡＲ）クローニング
ＬＲＰ５の新規対立遺伝子変異体の同定に必須なものは、個体における遺伝子の双方のコピーの配列を試験する能力である。これを達成するために、２つの「フック」、すなわち有意な類似性の領域をゲノム配列内で同定して、これがクローン化されるべきＤＮＡの部分をフランキングするようにする。最も好ましくは、このフックの１つ目を目的の最初のエクソンに対して５’の配列から誘導し、２つ目を目的の最後のエクソンに対して３’の配列から誘導する。これらの２つの「フック」を細菌／酵母シャトルベクター、例えばLarionovら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7384-7387(1997)に記載されるベクターにクローン化する。別の類似のベクター系を用いることもできる。ＬＲＰ５遺伝子の全ゲノムコピーを回収するために、２つの「フック」を含有するプラスミドを制限エンドヌクレアーゼで直線化するか、またはＰＣＲのような別の方法により生成する。この直線状ＤＮＡフラグメントをヒトゲノムＤＮＡと一緒に酵母細胞に導入する。典型的には、サッカロマイセス・セレヴィシエを宿主細胞として用いるが、Kouprinaら(Genome Res.8:666-672(1998))は同様にニワトリ宿主細胞の使用を報告している。形質転換の過程の間および後に、組換え事象により内因性宿主細胞が直線状プラスミドを環状に変換し、それにより「フック」に相同なヒトゲノムＤＮＡの領域がプラスミドに挿入される。このプラスミドを回収し、当業者に周知の方法により分析することができる。明らかに、この反応の特異性には、直線状フラグメントに存在する「フック」に類似する配列を認識する、宿主細胞の機構が必要である。しかしながら、ヒトゲノムに共通する重複反復配列を用いてげっ歯類／ヒトハイブリッド細胞株からヒトＤＮＡのフラグメントを回収することについて記載するKouprinaら(Genomics 53(1):21-28(1998年10月))に示されるように、１００％配列同一性は必要ではない。
【０５０４】
別の例では、Larionovら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(8):4469-4474(1998年4月)に記載されるように、「フック」のみが必要である。「ラジアルＴＡＲクローニング」と称するこの型の実験に関して、組換えを誘導するための配列類似性の別の領域をゲノムの反復配列から誘導する。この方法で、ＬＲＰ５遺伝子コード化領域に隣接するＤＮＡの領域を回収し、機能に影響し得る変化に関して試験することができる。
【０５０５】
ＸＸＶ．使用方法：ゲノムシークエンシング
ＨＢＭ遺伝子またはＬＲＰ５に連結した多型性遺伝子マーカーの使用は骨粗鬆症またはその他の骨疾患に対する感受性を予測するのに非常に有用である。Kollerら、Amer.J.Bone Min.Res.13:1903-1908(1998)、多型性遺伝子マーカーの使用が連鎖解析に有用であることを実証した。同様に、高骨量遺伝子内の多型性遺伝子マーカーの同定により、骨発達に影響する別の遺伝的損傷と連鎖不均衡にある特異的対立遺伝子変異体の同定が可能になる。ＢＡＣからのＤＮＡ配列を使用して、ジヌクレオチドＣＡｎ反復を同定し、以下に示す、この反復を含有するゲノムＤＮＡを増幅する２つの独特なＰＣＲプライマーを設計し、
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６  Ｌ：ＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＣ（配列番号３８）
Ｂ２００Ｅ２１Ｃ１６  Ｒ：ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号３９）
遺伝子マッピング研究に使用した。
【０５０６】
この方法は別の当業者に用いられて成功している(例えばSheffieldら、Genet.4:1837-1844(1995);LeBlanc-Straceskiら、Genomics 19:341-349(1994);Chenら、Genomics 25:1-8(1995))。集団または個人でのこれらの試薬の使用により彼らの骨粗鬆症の危険性が予測される。同様に、例えば前記の表４で示す一塩基多型（ＳＮＰ）を同様に用いて骨疾患を進展させる危険性またはＨＢＭ遺伝子の場合骨粗鬆症に対する抵抗性を予測することができる。
【０５０７】
ＸＸＶＩ．使用方法：組織石灰化の変調
ヒト体内での組織の石灰化は十分文献化されている。Towlerら、J.Biol.Chem.273:30427-30434(1998)はモデル系の発達中の頭蓋の石灰化を制御することが解っているいくつかのタンパク質が石灰化大動脈において発現されることを実証した。骨芽前駆細胞で転写される遺伝子であるＭｓｘ２の石灰化血管組織における発現は、骨発達において重要である遺伝子がその他の組織の石灰化に関与していることを示している。ＨＢＭタンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストでの処置は、その実証された骨ミネラル密度に及ぼす影響のために石灰化（例えば脈管構造、象牙質および頭蓋内臓の骨）を緩解する可能性がある。組織の石灰化が実証される実験系では、ＬＲＰ５活性の過剰発現または抑制により、ＬＲＰ５遺伝子により直接制御される分子の同定が可能になる。これらの遺伝子は組織石灰化を変調することを目指す治療の潜在性標的である。例えば、動物、例えばＬＤＬＲ−／−、マウスに高脂肪食を与え、観察して、ＬＲＰ５を含む組織石灰化のマーカーの発現を実証する。次いでＬＲＰ５もしくはＨＢＭタンパク質に対する抗体、ＬＲＰ５もしくはＨＢＭ  ｃＤＮＡに対して志向するアンチセンスオリゴヌクレオチドで、またはＬＲＰ５もしくはＨＢＭタンパク質に結合することが解っている化合物またはその結合パートナーもしくはリガンドでこれらの動物を処置する。血管組織からＲＮＡまたはタンパク質を抽出し、組織で発現される遺伝子の相対発現レベルを当分野で周知の方法により決定する。組織において制御される遺伝子は組織石灰化のモデュレーターとして医薬品開発に可能性のある治療標的である。
【０５０８】
本発明の、個体に与えるための核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、小型分子またはその他の医薬上有用な化合物を組成物の形態で、当分野で周知の医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤と共に投与することができる。個体は哺乳動物または鳥類、好ましくはヒト、ラット、マウスまたは鳥類でよい。このような組成物を個体に医薬上有効な量で投与することができる。投与される量は処置される症状および処置される患者に依存して変化する。組成物を単独でまたはその他の処置と組み合わせて投与することができる。
【実施例】
【０５０９】
［実施例］
本発明を以下の実施例を参考にして記載するが、該実施例は説明のために提供され、本発明をいかなる様式ででも限定することを意図するものではない。当分野で周知である標準的な技術か、または具体的に以下で記載した技術を利用した。
【０５１０】
［実施例１］
医師が発端者をCreigton Osteoporosis Centerに送り、骨密度異常であると思われるものを評価した。彼女は１８歳であり、背中の痛みのために２年前に治療に来たが、これは彼女が乗客として乗っていた自動車が追突された自動車事故によるものであった。彼女の損傷は下背部への軟部組織損傷であり、痛みおよび筋肉圧痛の徴候が現れた。放射線写真での骨折または不全脱臼の証拠はなかった。彼女は終日学校に通うことができたが、２年間痛みが続いた。彼女がセンターに来院するまでに痛みはほぼ消散し、彼女は高校生として通常生活に戻った。身体診察により身長６６インチ、および体重１２８ポンドの健常な若い女性であることが示された。全体骨格の放射線写真により骨は皮質が厚く高密度に見えることが示された。骨格の全ての骨が関係していた。最も重要なことに、全ての骨の形状は全く正常であった。脊髄のＢＭＣはＬ１−４で９４．４８グラムであり、脊髄ＢＭＤはＬ１−４で１．６６７ｇｍ／ｃｍ２であった。ＢＭＤは女性のピーク骨格質量を超えて標準偏差５．６２（ＳＤ）であった。これらはＨｏｌｏｇｉｃ２０００〜を用いるＤＸＡにより測定した。次いで彼女の母親をスキャンし、腰椎ＢＭＣは５８．０５グラムおよびＢＭＤは１．５００ｇｍ／ｃｍ２であることが見出された。彼女の母親の値はピーク質量を超えて４．１２ＳＤになり、同等のヒトを超えて４．９８の値になる。彼女の母親は５１歳で、身長６５インチ、および体重１４０ポンドであった。彼女の母親は極めて良好な健康状態であり、筋骨格疾患またはその他の症状の病歴がなかった。彼女の父親は腰椎ＢＭＣ７５．３３グラムおよびＢＭＤは１．１１８ｇｍ／ｃｍ２であった。これらの値は男性のピーク骨質量を超えて０．２５ＳＤになる。彼は良好な健康状態であり、身長７２インチ、および体重１８７ポンドであった。
【０５１１】
これらの臨床データにより、発端者が彼女の母親から形質を遺伝していることが示唆され、これは非常に高い骨量に至るが、それ以外は正常な骨格であり、母方の家系が注目された。米国特許第5,691,153号では、これらのメンバーの２２人がＤＸＡによる骨量の測定値を有した。一例では、発端者の母方の祖父が死去したが、しかしながら医学的記録、生前の骨格放射線写真およびＤＮＡ遺伝子型解析のためのパラフィン包埋された胆嚢標本は得られた。彼の放射線写真は、大腿骨および脊髄を含む試験可能な全ての骨で明らかに極端な密度が示され、彼は罹患メンバーに含まれた。本発明では、３７人の情報価値の在る個体を含むように家系を広げている。元来の試験以来、追加された１４人の個体の中で２人の個体が重要なクロスオーバーを宿しているので、この追加により元来の親族関係よりも有意に改善された(Johnsonら、Am.J.Hum.Genet.60:1326-1332(1997))。個体１２から１４および１５への男性から男性への伝達の存在によりＸ連鎖を除外する。
【０５１２】
［実施例２］
本発明はＨＢＭ遺伝子領域に由来する２つのＢＡＣクローンから誘導されたＤＮＡ配列について記載し、これらのクローンの集合である以下の表８で明らかである。クローンｂ２００ｅ２１−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０８１２；配列番号１０〜１１）は1997年12月30日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)、10801 Blvd大学、Manassas、バージニア州20110-2209米国に寄託された。クローンｂ５２７ｄ１２−ｈ（ＡＴＣＣ番号９８０７２０；配列番号５〜９）は1998年10月2日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)、10801 Blvd大学、Manassas、バージニア州20110-2209米国に寄託された。これらの配列は独特な試薬であり、当業者はこれを用いてＬＲＰ５遺伝子に関するＤＮＡプローブ、遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマー、ＬＲＰ５遺伝子におけるヌクレオチド多型性、またはＬＲＰ５遺伝子の制御エレメントを同定することができる。
【０５１３】
【表１０】
2005511002.tif 000015
【０５１４】
［実施例３］
ＨＢＭ過剰発現トランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスに由来する頭蓋冠および脛骨移植片培養物の転写プロファイリング
ＨＢＭ表現型の代理マーカーおよび骨量変調治療のための推定標的および本発明の方法による薬物の同定ならびに転写プロファイリングによるＨＢＭに関連する遺伝子の同定および特徴付けのための本発明のトランスジェニック動物の使用を実証する。
【０５１５】
骨特異的Ｉ型コラーゲンプロモーター下でＨＢＭを発現するトランスジェニックマウス（株１９）を含む生仔（１２日齢）マウスから頭蓋冠および脛骨を入手する。４匹のトランスジェニックおよび４匹の非トランスジェニックマウスから頭蓋冠をプールし、コラゲナーゼで消化した。消化物を培養中に置いた。頭蓋冠培養物をアスコルビン酸およびβリン酸グリセロール含有または不含で１９日間維持した。ＲＮＡを１９日に単離した。
【０５１６】
骨髄間質細胞を脛骨から洗い流し、個々の動物からの脛骨を次いで２連続コラゲナーゼ消化に供した。コラゲナーゼ消化に続いて骨チップを培養に置き３つの連続する播種が得られた。播種３からの細胞は播種１および２からの細胞よりも非常にゆっくりと成長した。播種１から３（継代１）の全面成長細胞からＲＮＡを単離した。頭蓋冠および脛骨培養物の双方からのＲＮＡをＵ７４Ａｖ２転写プロファイリングアレイで分析した。
【０５１７】
アスコルビン酸およびβリン酸グリセロールでの処理により、遺伝子のセットが全く異なる差次的発現に至った。処置細胞の分化を示す処置の後、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＫＰ）遺伝子発現が増加した。処置細胞から得られたデータは未処置細胞から得られたデータとは質が異なっており、同型培養間で遺伝子発現の変動もあった。
【０５１８】
非トランスジェニックおよびトランスジェニックマウスの転写プロファイルはいくつかの関連遺伝子、例えばＳ１００Ａ１、ＭＭＰ９、およびＭＴ１の発現における差異を示した。
【０５１９】
各群（すなわち非トランスジェニックおよびＨＢＭトランスジェニック）４匹のマウスからの脛骨移植片培養物の転写プロファイルにマウス−マウス間の変動がある。この変動は正規化の後にも依然認めることができる。しかしながら変動はなんら有意な程度までデータの解釈に影響しない。変動はこれらの細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定においても認められる。
【０５２０】
結果を以下に要約する。その転写プロファイルにおいて播種１および播種２は類似している（播種３とは異なっている）。これは、これらの細胞の成長特性における差異による可能性がある。播種１はまたトランスジェニックおよび非トランスジェニックプロファイル間でも大きな差異を示すが、恐らく播種１が播種２または３のいずれかよりも相対的により混合された細胞集団であるのが原因である。
【０５２１】
非トランスジェニックおよびＨＢＭトランスジェニックマウス間の遺伝子発現におけるいくつかの差異はヒトＨＢＭ１家系からの罹患および非罹患個体間で認められる差異と合致する。一例として、Ｓ１００Ａ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８７６８７）はトランスジェニック骨芽細胞培養において上方制御される。この遺伝子によりコードされるタンパク質は２ＥＦ−ハンド・カルシウム結合モチーフを含有するタンパク質のＳ１００ファミリーのメンバーである。Ｓ１００タンパク質は広範な細胞の細胞質および／または核に局在し、多くの細胞性過程、例えば細胞サイクルの進化および分化の制御に関与する。マトリックス・メタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ７２７９４）もまたトランスジェニック骨芽細胞培養において上方制御される。マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質は正常な生理学的過程、例えば胚発達、生殖、および組織リモデリングにおいて、ならびに疾患過程、例えば関節炎および転移において細胞外マトリックスの分解に関与する。たいていのＭＭＰは不活性なプロタンパク質として分泌され、これは細胞外プロテイナーゼにより切断されたときに活性化する。この遺伝子によりコードされる酵素はＩＶおよびＶ型コラーゲンを分解する。
【０５２２】
ＨＢＭトランスジェニック骨芽細胞培養物で下方制御される遺伝子の中で、システイン富化金属結合タンパク質であるメタロチオネイン１（ＭＴ１）（Genbankアクセッション番号S62785）が抗酸化剤として重要な働きをすることが示されている。その活性は炎症過程の細胞毒性を媒介する。骨および軟骨の双方でこれは発現される。
【０５２３】
当業者は本明細書に記載する方法を用いてトランスジェニック骨組織において差次的に発現される別の遺伝子を決定することができる。転写プロファイリングデータから、いくつかの方法でトランスジェニックマウス脛骨のプロファイルがヒトＨＢＭ家系の罹患メンバーのプロファイルに類似していることを示すことができる。
【０５２４】
［実施例４］
トランスジェニックマウスを用いる負荷試験
トランスジェニック修飾、例えばＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＨＢＭ発現、過剰発現またはノックアウトの骨発達に及ぼす影響を負荷または非負荷プロトコルを用いて評価することができる。負荷または非負荷に供された骨成長速度、遺伝子発現応答プロファイリング、およびＨＢＭ表現型の生化学的パラメーターをこれらの方法によりさらに特徴付けすることができる。本発明のトランスジェニック動物を用いるこれらの方法は、ＨＢＭ表現型の望ましい特性を再現する処置および薬物の開発における貴重な手段である。
【０５２５】
４点屈曲装置を用いてトランスジェニックまたは非トランスジェニックマウスの脛骨に機械的負荷をかける。インビボで正確な外力適用に関して装置を較正する。装置はバルサ材から成り、１ｍｍ厚の外科用チューブで被覆した４個の丸いパッドを通して力を適用する。上部のパッドは４．５ｍｍ離れており、１２ｍｍ離れている下部のパッド間の中心にある。４点屈曲で、脛骨の外側で圧迫、および内側で張力を伴う２個の内側のパッドの間の骨組織に一定の屈曲モーメントが隈なく分配される。装置の説明を図２８に示す。上部遠位パッドは脛骨−腓骨接合部（ＴＦＪ）に対して１ｍｍ近位で脚と接触し、下部遠位パッドはＴＦＪに対して２．５ｍｍ遠位の内側表面と接触する。最大屈曲領域はＴＦＪに１から６ｍｍ近位から、または遠位末端から８．５から１３．５ｍｍである。この領域は放射線写真により定義されている。負荷装置は各実験の前に較正されており、負荷は各動物に関して毎日記録される。機械をゼロに合わせ、負荷において何らかのドリフトがある場合は調整する。脚位置および適用される負荷は動物および日の間で一致し、脚位置による下部の変動は１０％未満であり、負荷では変動は１．６％未満である(Haginoら、J.Bone Miner.Res.8:347-357(1993))。
【０５２６】
機械的負荷は右下肢に適用され、その間マウスは希イソフルラン麻酔（２％）下にある。信頼性のある脚位置は、プラットフォーム上の標準的な位置にマウスを配し、右脚を鐙に置き、膝を負荷装置と並べることにより達成される。イソフルランは短時間作用性であるので、負荷の間の動きを防御できるが、負荷の数秒以内に正常な体重負荷作用が戻る。イソフルランからの適当な回復および脚に損傷を生じていないことに関して作用をモニター観察する。片側性神経切断により脱負荷を達成することができる(Kodamaら、Bone 25:183-190(1999))。加えて、４点負荷の適用の間にインビボで脛骨に株ゲージを適用することができる。
【０５２７】
蛍光色素標識：組織形態計測に関して研究すべき全マウスは、組織収集の１０および３日前に投与される二重カルセイン標識を受ける。長期間負荷研究のマウスは負荷の前に、最終二重カルセイン注射に加えてテトラサイクリンのベースライン注射を受ける。これらの注射を注射に適した希釈で１ｍｌ／ｋｇで調製する。２５ｇマウスのための注射容量は０．２５ｍｌになる。全注射は皮下注射であり、穏やかな沈静下で与えられる（２％イソフルラン）。
【０５２８】
カルセイン標識(Sigma、St.Louis、ミズーリ州)を６．２ｍｇ／ｋｇで注射する。２つのカルセイン標識を異なる２日で、すなわち剖検前３および１０日に投与する。この蛍光色素標識を用いて非脱灰組織の表面のミネラル化を同定し、処置の最終週の間の骨形成の速度を定量する。標識は脱灰骨を試験するＢｒｄＵまたはインサイチュウ・ハイブリダイゼーション研究には用いられない。
【０５２９】
テトラサイクリン（Pfizer、コネチカット州）を２５ｍｇ／ｋｇで注射する。単回テトラサイクリン標識を０日に長期間研究（５週以上）の全動物に投与する。この蛍光色素標識は研究の開始時に表面のミネラル化を標識し、実験中の全骨形成の定量を可能にする。
【０５３０】
ＢｒＤＵ（ブロモデオキシウリジン、Boehringer Mannheim）を４０ｍｇ／ｋｇで注射し、ベヒクルは静菌性である。マウスに６時間間隔で５回注射し、ＤＮＡ合成を２４時間にわたって標識する。最後の注射は組織収集の１時間前である。
【０５３１】
動物に固定液を灌流する場合を除いて、ＣＯ吸入により死亡を誘起する。全ての負荷および廃用研究用に右および左脛骨を切除する。右肢は負荷または処置された脚であり、左は処置対照である。右脛骨の負荷領域から、および左脛骨の類似の領域から組織を収集する。マウスでは、平均負荷領域が脛骨−腓骨接合部（ＴＦＪ）に対して１から６ｍ近位であるように決定している。
【０５３２】
非脱灰皮質骨サンプル：脛骨、大腿骨および脊椎を非脱灰骨切片の標準的な組織形態測定のために収集する。大部分の筋肉を除去し、骨を７０％ＥｔＯＨ中に４８時間置く。のこぎりで骨を切断し、分析用に以下のサンプルを作製する。ａ）ＴＦＪを含む脛骨骨幹；ｂ）遠位大腿骨、およびｃ）ディスクを含まない脊椎体。脛骨骨幹をビラヌエバ色素中に７２時間置いて、次いで８０％エタノールに戻す。全てのその他の骨を直接脱水に移す。次の１４日の間、標本を等級別エタノールおよびアセトン中で脱水し、次いで別個の修飾メタクリル酸メチルで包埋する。包埋された脛骨皮質サンプルをミクロトームのこぎり（１６００モデル、Leica、ドイツ）で、７０μｍの横断切片にし、切片は領域から収集する。負荷領域から切片を取り、ラットＴＦＪに対して５から７ｍｍ近位で、遠位末端から９から１３ｍｍで、０．８ｍｍの切片間距離を有する切片を作製する。各脛骨に由来する２つの切片をマウントし、無作為な数字を付け、分析する。
【０５３３】
脱灰皮質骨サンプル：脚の軟部組織が固化するまで４％パラホルムアルデヒドで動物組織を灌流する。脛骨を切除し、筋肉を剪刀で取り除き、一方骨は冷４％パラホルムアルデヒドに浸す。骨膜および小型の筋肉層は無傷のまま残す。インサイチュウ・ハイブリダイゼーション研究用に、ＲＮＡアーゼ不含材料で全ての作業を行う。脛骨の負荷領域からの４から５ｍｍの切片をのこぎりで無傷脛骨から切除し、４％パラホルムアルデヒド中４℃で２４時間固定する。固定後、骨を７％ＥＤＴＡ(Sigma)中ｐＨ６．５で２から３週間脱灰する。次いで骨を１％ＭｇＣｌ中に６時間置き、アルカリ性ホスファターゼ活性を回復させる。骨幹セグメントをＪＢ−４プラス(Polyscience)またはパラフィンに包埋する。横断切片をミクロトーム(Reichert Jung)でタングステン・カーバイドナイフを用いて５μｍの厚さに切断する。切片をポリ１−リジン(Sigma)またはコーティングスライドにマウントする。
【０５３４】
図２９に示すように、負荷に供したマウスのカルセイン染色により、ヘテロ接合性ＨＢＭトランスジェニックマウス（１９株）では、非トランスジェニック対照マウスよりも大きな成長が示される。単一株（５Ｎまたは７Ｎ、２Ｈｚで３６サイクル）を５日間投与した。１５日に収穫された組織でカルセイン標識を５および１２日に生じた。
【０５３５】
本発明を詳細に記載してきたが、多くの変更および修飾を為すことができ、このような変更および修飾を本発明の精神および範囲から逸脱することなく為すことができることは当業者に認識されよう。
【０５３６】
本明細書に引用した特許、特許出願および公開は参照によりその全てを全ての目的のために本明細書に組み込む。さらに2000年4月5日に出願された米国特許出願第09/543,771号および第09/544,398号、1999年1月13日出願の出願第09/229,319号、1998年1月13日出願の米国仮出願第60/071,449号ならびに1998年10月23日出願の米国仮出願第60/105,511号は参照によりその全てを全ての目的のために本明細書に組み込む。
【０５３７】
加えて、本出願は2001年5月11日出願の出願第60/290,071号;2001年5月17日出願の第60/291,311号;2002年2月1日出願の第60/353,058号、および2002年3月4日出願の第60/361,293号の優先権を主張する;各々の開示は参照によりその全てを全ての目的のために本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０５３８】
【図１】図１は遺伝子連鎖研究に用いられた個体の家系を示す。各々の個体の下に、ＩＤ番号、脊髄ＢＭＤに関するｚ−スコアがあり、対立遺伝子が、染色体１１上の重要なマーカーを示す。黒ぬりの記号は「患っている」個体を表す。「Ｎ」を含む記号は「患っていない」個体である。３７人の個体からのＤＮＡについて遺伝子型を同定した。クエスチョンマークは遺伝子型が同定されなかった未知の遺伝子型または個体を示す。
【図２】図２は１１ｑ１３．３におけるＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ含量物理地図を表す。ＳＴＳマーカーは遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣエンドシークエンスを長い水平方向の線の上に記す。ＧＤＢに存在するマーカーに関しては、同一の命名法を用いている。遺伝子座の名前（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）は利用可能な場合、第１次名の後に括弧の中に列挙する。ＢＡＣエンドシークエンスから誘導したＳＴＳをＢＡＣ名と共に列挙し、クローンの左および右末端に関して各々ＬまたはＲと続ける。２つの大きな矢印はＨＢＭの重要な領域を定義する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳの下の水平方向の線は、９倍の適用範囲のＢＡＣライブラリーのＰＣＲ基盤のスクリーニングにより同定されたＢＡＣクローンを示す。白丸はライブラリースクリーニング中、マーカーが対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示している。クローン名は以下の慣用法を用いる。ＢＡＣに関してはＢ、プレート、列および囲みアドレス、続いてＨがＨＢＭプロジェクトを示す（すなわちＢ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３】図３Ａ〜３Ｆはイントロン配列の側面に位置しているＬＲＰ５のゲノム構造を示す。翻訳は下線を付したエクソン１の「ＡＴＧ」により開始される。ＨＢＭ遺伝子の多型性の部位はエクソン３であり、下線を付した「Ｇ」により表され、それによりこのヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にはエクソン２３内で下線を付している（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１およびエクソン２３、配列番号６２）。
【図４】図４はＹＷＴＤスペーサー、細胞外付着部位、ＬＤＬおよびカルシウムの結合部位、システイン富化成長因子リピート、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を伴う理想的なＰＥＳＴ領域および内部移行ドメインを含むＬＲＰ５のドメイン構成を示す。図４はまたＨＢＭタンパク質で生じるグリシンのバリンへの変化の部位を示す。シグナルペプチドはアミノ酸１〜３１に位置し、細胞外ドメインはアミノ酸３２〜１３８５に位置し、膜貫通セグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に位置し、細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に位置する。
【図５】図５はＨＢＭ遺伝子に関連するＢＡＣコンティグＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の略図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｊは野生型遺伝子ＬＲＰ５のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号３）配列を示す。ヌクレオチド５８２でのグアニンのチミンへの塩基対置換の位置（配列番号２、４）には下線を付している。この対立遺伝子変異体はＨＢＭ遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子は１７１位置でグリシンのバリンへのアミノ酸置換を有するタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は塩基１から７０の境界であり、３’ＵＴＲは塩基４９１６−５１２０の境界である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは種々組織におけるＬＲＰ５の発現を示すノーザンブロット分析である。
【図８】図８はＰＣＲ産物分析である。
【図９】図９はＬＲＰ５エクソン３変異の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド検出である。
【図１０】図１０は１００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１１】図１１は４００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１２】図１２は４００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いる、骨内膜での骨芽細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１３】図１３はＭＣ−３Ｔ３細胞でのＬＲＰ５発現のアンチセンス阻止を示す。
【図１４】図１４は、野生型ＬＲＰ５対立遺伝子（左パネル、Ｇ特異的オリゴ；５５℃、洗浄）と比較したＨＢＭ対立遺伝子（右パネル、Ｔ特異的オリゴ；５８℃、洗浄）の希少性を説明するＬＲＰ５エクソン３対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）アッセイを示す。右パネルで現れる陽性スポットは陽性対照である。
【図１５】図１５は接着斑情報伝達におけるＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）の潜在的役割を表すモデルを示す。
【図１６】図１６は内因性マウスＬＲＰ５のノックアウトまたはＨＢＭ多型性の条件的ノックインのための２つのＬＲＰ５ジーンターゲティングベクターを模式的に表す。Ｂ、Ｘ、およびＲは各々ＤＮＡ  ＢＡＣ４７３５Ｐ５におけるＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を示す。エクソン３、４および５を黒色の長方形で示す。ＡＧ−＞Ｔ塩基変化はＨＢＭ多型性を作製するためにエクソン３の塩基２４で操作される。ネオマイシン抵抗性遺伝子および合成休止配列を含有するＬｏｘＰフランキングされるカセットならびにＥＳ細胞クローンのスクリーニングおよび特徴付けに用いられるプローブの位置をも示す。
【図１７】図１７はトランスジェニック（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ）および野生型（すなわちＺｍａｘＷＴＣＢＡおよびＺｍａｘＷＴＴＩＣ）プラスミド構築物により発現を確認する。これらの構築物をＨＯＢ−０２−０２細胞に一過性にトランスフェクトし、ｍＲＮＡレベルをＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＰＣＲを用いて決定した。ＨＢＭＭＣＢＡおよびＺｍａｘＷＴＣＢＡを表の左のコラムで示し（すなわちＣＭＶβアクチン）ならびにＨＢＭＭＴＩＣおよびＺｍａｘＷＴＴＩＣを表の右のコラムで示す（すなわちＩ型コラーゲン）。
【図１８】図１８はヒトおよびマウスＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセット間の比較を示す。ＨＯＢ（ＨＯＢ−０３−Ｃ５）およびマウス（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１）骨芽細胞ｍＲＮＡをプローブおよびプライマーを用いて分析した。
【図１９】図１９はＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて、ヒトおよびマウスＲＮＡ混合物バックグラウンドで発現されたヒトＺｍａｘ−１  ｍＲＮＡの定量を示す。結果は添加したヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡ（ｎｇ）対測定したヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡ（ｎｇ）を表す。
【図２０】図２０はＴａｑＭａｎ（登録商標）により分析されたｍＲＮＡ発現に基づくトランスジェニックマウスにおけるＨＢＭの発現を表す。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは脊椎（図２１Ａ）、大腿骨（図２１Ｂ）および全身（図２１Ｃ）においてＨＢＭＭＣＢＡ構築物を発現する種々トランスジェニックマウス株の分析を表す。  図２１Ｄ〜Ｆは脊椎（図２１Ｄ）、大腿骨（図２１Ｅ）および全身（図２１Ｆ）においてＨＢＭＭＴＩＣ構築物を発現する種々トランスジェニックマウス株の分析を表す。  図２１Ｇ〜Ｌは脊椎、大腿骨および全身において１７週を通じてＨＢＭＭＴＩＣ構築物を発現するトランスジェニックマウス株の分析を表す。
【図２２】図２２はインビボｐＤＸＡ分析＊を用いて、５週でのＨＢＭトランスジェニックマウスにおけるＢＭＤ（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ構築物）の変化を表す。ＢＭＤ変化を、これもまた５週齢のみである野生型動物と比較して提示する。
【図２３】図２３はインビボｐＤＸＡ分析＊を用いて、９週でのＨＢＭトランスジェニックマウスにおけるＢＭＤ（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ構築物）の変化を表す。ＢＭＤ変化を、これもまた９週齢のみである野生型動物と比較して提示する。
【図２４】図２４（Ａ〜Ｄ）はＨＢＭＧＩ  ２ＡＳベクターインサートの配列（配列番号７５９）を提示する。
【図２５】図２５（Ａ〜Ｄ）はＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳベクターインサートの配列（配列番号７６０）を提示する。
【図２６】図２６（Ａ〜Ｃ）はヒト（配列番号７６１）およびマウス（配列番号７６２）ＬＲＰ５アミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図２７】図２７（Ａ〜Ｃ）はヒトＬＲＰ５（配列番号７６３）およびＬＲＰ６（配列番号７６４）アミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図２８】図２８はマウスの骨成長に及ぼす負荷の影響を試験するための装置を説明する。
【図２９】図２９は骨負荷のＨＢＭトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの骨成長に及ぼす影響の組織形態学的説明を提示する。
【配列表】
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2005511002.tif 000257
2005511002.tif 000258
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2005511002.tif 000260
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2005511002.tif 000299
2005511002.tif 000300
2005511002.tif 000301
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2005511002.tif 000309
2005511002.tif 000310
2005511002.tif 000311
2005511002.tif 000312
2005511002.tif 000313
2005511002.tif 000314
2005511002.tif 000315
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2005511002.tif 000317
2005511002.tif 000318
2005511002.tif 000319
2005511002.tif 000320
2005511002.tif 000321
2005511002.tif 000322
2005511002.tif 000323
2005511002.tif 000324
2005511002.tif 000325
2005511002.tif 000326
2005511002.tif 000327
2005511002.tif 000328
2005511002.tif 000329
2005511002.tif 000330
2005511002.tif 000331
2005511002.tif 000332
2005511002.tif 000333
2005511002.tif 000334
2005511002.tif 000335
2005511002.tif 000336
2005511002.tif 000337
2005511002.tif 000338
【図１Ａ】
2005511002.tif 000339
【図１Ｂ】
2005511002.tif 000340
【図２Ａ】
2005511002.tif 000341
【図２Ｂ】
2005511002.tif 000342
【図３Ａ】
2005511002.tif 000343
【図３Ｂ】
2005511002.tif 000344
【図３Ｃ】
2005511002.tif 000345
【図３Ｄ】
2005511002.tif 000346
【図３Ｅ】
2005511002.tif 000347
【図３Ｆ】
2005511002.tif 000348
【図４】
2005511002.tif 000349
【図５】
2005511002.tif 000350
【図６Ａ】
2005511002.tif 000351
【図６Ｂ】
2005511002.tif 000352
【図６Ｃ】
2005511002.tif 000353
【図６Ｄ】
2005511002.tif 000354
【図６Ｅ】
2005511002.tif 000355
【図６Ｆ】
2005511002.tif 000356
【図６Ｇ】
2005511002.tif 000357
【図６Ｈ】
2005511002.tif 000358
【図６Ｉ】
2005511002.tif 000359
【図６Ｊ】
2005511002.tif 000360
【図７】
2005511002.tif 000361
【図８】
2005511002.tif 000362
【図９】
2005511002.tif 000363
【図１０】
2005511002.tif 000364
【図１１】
2005511002.tif 000365
【図１２】
2005511002.tif 000366
【図１３】
2005511002.tif 000367
【図１４】
2005511002.tif 000368
【図１５】
2005511002.tif 000369
【図１６】
2005511002.tif 000370
【図１７】
2005511002.tif 000371
【図１８】
2005511002.tif 000372
【図１９】
2005511002.tif 000373
【図２０】
2005511002.tif 000374
【図２１Ａ】
2005511002.tif 000375
【図２１Ｂ】
2005511002.tif 000376
【図２１Ｃ】
2005511002.tif 000377
【図２１Ｄ】
2005511002.tif 000378
【図２１Ｅ】
2005511002.tif 000379
【図２１Ｆ】
2005511002.tif 000380
【図２１Ｇ】
2005511002.tif 000381
【図２１Ｈ】
2005511002.tif 000382
【図２１Ｉ】
2005511002.tif 000383
【図２１Ｊ】
2005511002.tif 000384
【図２１Ｋ】
2005511002.tif 000385
【図２１Ｌ】
2005511002.tif 000386
【図２２】
2005511002.tif 000387
【図２３】
2005511002.tif 000388
【図２４Ａ】
2005511002.tif 000389
【図２４Ｂ】
2005511002.tif 000390
【図２４Ｃ】
2005511002.tif 000391
【図２４Ｄ】
2005511002.tif 000392
【図２５Ａ】
2005511002.tif 000393
【図２５Ｂ】
2005511002.tif 000394
【図２５Ｃ】
2005511002.tif 000395
【図２５Ｄ】
2005511002.tif 000396
【図２６Ａ】
2005511002.tif 000397
【図２６Ｂ】
2005511002.tif 000398
【図２６Ｃ】
2005511002.tif 000399
【図２７Ａ】
2005511002.tif 000400
【図２７Ｂ】
2005511002.tif 000401
【図２７Ｃ】
2005511002.tif 000402
【図２８】
2005511002.tif 000403
【図２９】
2005511002.tif 000404
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月14日(2004.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の位置５８２におけるチミンを少なくとも含み、配列番号２の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結され、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くことができるプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物。
【請求項２】
配列番号４をコードする配列を含み、配列番号４の位置１７１のバリンに相当するバリンのコドンを少なくとも含む核酸であって、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くことができる、機能的に連結されたプロモーター領域をさらに含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物。
【請求項３】
核酸が配列番号２を含む請求項１または２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
配列番号１の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む配列に機能的に連結された、動物細胞および／またはヒト細胞におけるタンパク質の発現を導くプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を有する、骨密度変調の研究のためのトランスジェニック動物であって、骨量が、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される１つ以上のパラメーターについて、同一種の非トランスジェニック動物と比較して、変調されているトランスジェニック動物。
【請求項５】
プロモーター領域が、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０およびＥＦ−１ａ、ＣＭＶβアクチン、ヒストン、Ｉ型コラーゲン、ＴＧＦβ１、ＳＸ２、ｃｆｏｓ／ｃｊｕｎ、Ｃｂｆａ１、Ｆｒａ／Ｊｕｎ、Ｄｌｘ５、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、またはコラゲナーゼプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
プロモーター領域が、骨特異的プロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
プロモーター領域が、ＣＭＶβアクチンプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
プロモーター領域が、Ｉ型コラーゲンプロモーター領域である請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の胚。
【請求項１０】
トランスジェニック動物が、ヒトＨＢＭタンパク質を発現する請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ヒトＨＢＭタンパク質が、骨組織において最も多く発現される請求項１０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
ＨＢＭ表現型を表す請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
骨量が、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される１つ以上のパラメーターについて、同一種の非トランスジェニック動物と比較して、変調されている請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
ヒトＨＢＭタンパク質が発現され、繁殖力があり、ヒトＨＢＭ遺伝子をその子孫に伝える請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
ヒトＬＲＰ５タンパク質が発現され、繁殖力があり、ヒトＨＢＭ遺伝子をその子孫に伝える請求項４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれかに記載のトランスジェニック動物またはその子孫から産生されたトランスジェニック動物。
【請求項１７】
ＬＲＰ５をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、該変化が、相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ５遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ５遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ５遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含む核酸の、胚性幹細胞または多能性細胞への導入により引き起こされ、該核酸が内因性遺伝子と相同組換えできるトランスジェニックマウス。
【請求項１８】
ジーンターゲティングのための核酸の中央セクションが、ＡＴＧ開始コドンの操作された欠失、操作されたフレームシフト変異、操作された停止コドン、ネオマイシン抵抗性配列、ｌｏｘＰ組換え部位、または合成転写中止配列を含む請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
ジーンターゲティングのための核酸が、マウスＬＲＰ５遺伝子のイントロン配列およびエクソン配列の双方をさらに含む請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
ジーンターゲティングのための核酸が、マウスＬＲＰ５遺伝子のアミノ酸配列の位置１７０においてグリシンからバリンへの変化をコードするコドンをさらに含み、変化した遺伝子がＨＢＭタンパク質をコードする請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
前記変化が、ＬＲＰ５遺伝子を発現しないようにするＬＲＰ５遺伝子の破壊である請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２２】
ＬＲＰ６をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、該変化が、相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ６遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ６遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ６遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含む核酸の、胚性幹細胞または多能性細胞への導入により引き起こされ、該核酸が内因性遺伝子と相同組換えでき、該トランスジェニック動物が変調されたＷｎｔ活性、Ｄｋｋ活性、脂質レベルまたは骨量を有するトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
前記変化が、ＬＲＰ６遺伝子を発現しないようにするＬＲＰ６遺伝子の破壊である請求項２２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２４】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝える請求項２２に記載のトランスジェニックマウスまたはその子孫。
【請求項２５】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝える請求項１７から２４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
繁殖力があり、前記変化した遺伝子をその子孫に伝えるトランスジェニックマウスであって、子孫が、野生型と比較して、骨密度、骨力、骨梁数、骨の大きさおよび骨組織結合性の中から選択される少なくとも３つのパラメーターにより示される変調された骨量の表現型を表す請求項１７から２４のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２７】
マウス胚性幹細胞をマウス胚盤胞へ導入することで産生される請求項１７から２６のいずれかに記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２８】
請求項１７から２７のいずれかに記載のトランスジェニックマウスから産生されたトランスジェニックマウス。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物からなる動物の第１群および対照動物の第２群を含む骨密度変調の研究のための動物モデル。
【請求項３０】
対照動物群が、ヒトＬＲＰ５をコードする核酸を含む細胞を有するトランスジェニック動物を含む請求項２９に記載の動物モデル。
【請求項３１】
骨量決定要素の研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）該トランスジェニック動物における少なくとも１つの骨発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３２】
骨量のモデュレーターの研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与するステップと、
（ｃ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物における少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３３】
骨量の研究方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）実験手順を施すステップと、
（ｃ）実験手順を施された動物における少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
被験化合物が、注射投与、経口投与、坐薬投与、移植片投与、または局所的投与される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
実験手順が、卵巣切除、骨負荷の制限、および骨負荷の増強の中から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
トランスジェニック動物群がＨＢＭを発現し、ＨＢＭを発現し、被験化合物を投与されたトランスジェニック動物において骨量密度が変調されている請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
トランスジェニックマウス群がＨＢＭを発現し、ＨＢＭを発現し、被験化合物を投与されたトランスジェニックマウスにおいて骨量密度が上昇している請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
被験化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ミネラル、ビタミン、天然生成物、または合成有機化合物を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
実験手順が、外科的手順、遺伝子治療手順、薬物治療手順、食事療法、または運動を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＢＭが骨障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）骨障害の表現型を有する動物の胚を供するステップと、
（ｂ）請求項１から４のいずれかに記載の核酸を該胚の第１の群に導入するステップと、
（ｃ）胚を偽妊娠マウスに移すステップと、
（ｄ）得られたマウスの少なくとも１つの発達パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項４１】
骨形成／再吸収の代理マーカーを同定する方法であって、
（ａ）請求項２９に記載の骨発達の動物モデルを供するステップと、
（ｂ）該動物における代理マーカー候補を定量的に測定するステップと、
（ｃ）トランスジェニック動物群の測定値を対照動物群の測定値と比較するステップと、
を含む方法。
【請求項４２】
ＨＢＭが心臓障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物の少なくとも１つの心臓健康パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項４３】
ＨＢＭが心臓障害に及ぼす影響を研究する方法であって、
（ａ）請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
（ｂ）被験化合物を投与するステップと、
（ｃ）被験化合物を投与されたトランスジェニック動物の少なくとも１つの心臓健康パラメーターを測定するステップと、
を含む方法であって、被験化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ミネラル、ビタミン、天然生成物、または合成有機化合物を含む方法。
【請求項４４】
心臓健康パラメーターが、血清脂質濃度である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
心臓保護処置から骨量変調効果をスクリーニングする方法であって、
請求項３１に記載の方法を含み、心臓保護処置を前記動物の第１群のサブグループに投与するステップをさらに含む方法。
【請求項４６】
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物またはその子孫に由来する単離された細胞。
【請求項４７】
骨芽細胞または破骨細胞である請求項４６に記載の単離された細胞。
【請求項４８】
内因性ＬＲＰ５の発現が、相同組換えまたは非相同組換えにより導入された変化した遺伝子の調節配列により変調されるトランスジェニック動物。
【請求項４９】
心臓保護処置から骨量変調効果をスクリーニングする方法であって、
請求項１から２８のいずれかに記載のトランスジェニック動物の第１群を供するステップと、
心臓保護処置を該動物の第１群のサブグループに投与するステップと、
少なくとも処置されたマウスにおいて少なくとも１つの骨変調パラメーターを測定するステップと、
を含む方法。
【請求項５０】
前記核酸が、配列番号４の位置１３３０で少なくともアラニンからバリンへの置換をさらにコードする請求項１から１６のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項５１】
相同組換えによるジーンターゲティングのための核酸であって、マウスＬＲＰ５遺伝子に相同である第１セクションと、マウスＬＲＰ５遺伝子の別のセクションに相同である第２セクションと、第１および第２セクション間におけるＬＲＰ５遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列の変化または核酸の挿入を含む中央セクションとを含み、内因性遺伝子と相同組換えできる核酸。
【請求項５２】
中央セクションが、ＡＴＧ開始コドンの操作された欠失、操作されたフレームシフト変異、操作された停止コドン、ネオマイシン抵抗性配列、ｌｏｘＰ組換え部位、または合成転写中止配列を含む請求項５１に記載の核酸。
【請求項５３】
マウスＬＲＰ５遺伝子のイントロン配列およびエクソン配列の双方をさらに含む請求項５１に記載の核酸。
【請求項５４】
マウスＬＲＰ５遺伝子のアミノ酸配列の位置１７０でグリシンからバリンへの変化をコードするコドンをさらに含む請求項５１に記載の単離された核酸。
【請求項５５】
ＬＲＰ５をコードする遺伝子に変化を加えたゲノムを有するトランスジェニックマウスを産生する方法であって、
（ａ）請求項５１に記載の核酸を供するステップと、
（ｂ）該核酸をマウス胚性幹細胞に導入するステップと、
（ｃ）該核酸を含む胚性幹細胞を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の胚盤胞を偽妊娠マウスに移すステップと、
（ｆ）移した胚盤胞を、該核酸に関してキメラであるマウスに発達させるステップと、
を含む方法。
【請求項５６】
胚性幹細胞の導入が、マイクロインジェクションによるものである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）キメラマウスと野生型マウスと交配させ、前記変化に関してヘテロ接合性であるマウスを得るステップと、
（ｂ）該ヘテロ接合性マウスを交配させ、前記変化に関してホモ接合性であるマウスを産生するステップと、
をさらに含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
骨量に関連する遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）請求項２９に記載の骨発達の動物モデルを供するステップと、
（ｂ）該動物における遺伝子発現のプロファイルを測定するステップと、
（ｃ）該動物の第１の群の測定値を動物の対照群の測定値と比較するステップと、
を含む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月18日(2004.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明の別の態様によると、単離された核酸配列（配列番号７３６〜７４４）：
(1)
5'-GTCAGCCTGGAGGAGTTCTCA-3';
5'-TCACCCTTGGCAATACAGATGT-3';および
6-FAM-5'-CCCACCCATGTGCCCGTGACA-3';または
(2)
5'-CGTGATTGCCGACGATCTC-3';
5'-TTCCGGCCGCTAGTCTTGT-3';および
6-FAM-5'-CGCACCCGTTCGGTCTGACGCAGTAC-3'
を含む、ヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡまたはＨＢＭ  ｍＲＮＡを定量するための試薬セットが提供される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーおよび未標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡを遺伝子型解析した。Integrated DNA Technologies,Inc(Coralville、アイオワ州)から標識および未標識オリゴヌクレオチドを入手した。マイクロサテライト遺伝子型解析のためのその他の全ての試薬はPerkin Elmer-Applied Biosystems,Inc.(「PE-ABI」)(Norwalk、コネチカット州)から購入した。個々のＰＣＲ反応を、ＰＥ−ＡＢＩに記載されるように、AmpliTaq（商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いて各々のマーカーに関して実施した。反応物を脱イオン化ホルムアミド、ブルー・デキストランおよびＴＡＭＲＡ  ３５０サイズ・スタンダード（ＰＥ−ＡＢＩ）を含有する負荷バッファー３．５μｌに加えた。９５℃で５分間加熱してＤＮＡを変性させた後、モデル３７７ＤＮＡシークエンサー(PE-ABI、Foster City、カリフォルニア州)の操作マニュアルに記載されているように、サンプルを負荷し、電気泳動した。ゲル電気泳動の後、PE-ABI GENESCAN（登録商標）およびGENOTYPER（商標）ソフトウェアを用いてデータを分析した。最初に、GENESCAN（商標）ソフトウェア内で、分析の第１ステップの前にレーントラッキングを手作業で最適化した。ゲルレーンデータを抽出した後、各レーンの標準的な曲線プロファイルを試験し、直線性およびサイズコーリングを確認した。これらのパラメーターのいずれかで問題を有したレーンを再トラッキングし、確認した。一度全レーンをトラッキングし、サイズスタンダードを正確に同定すると、対立遺伝子同定のためにデータをGENOTYPER（商標）にインポートした。対立遺伝子の呼び出し（ビニング）を迅速にするために、Dr.Guy Van Campのインターネットウェブサイト(alt.www.uia.ac.be/u/dnalab/ld.html)からのプログラム・Linkage Designerを使用した。このプログラムはGENOTYPER（商標）により作製したデータの家系ドローイングプログラムCyrillic(バージョン2.0、Cherwell Scientific Publishing Limited,Oxford、英国)へのインポート、およびそれに続くＬＩＮＫＡＧＥ(Lathropら、Am.J.Hum.Genet.37:482-498(1985))プログラムを用いる連鎖解析を大いに促進する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
本発明では、発明者はＨＢＭ間隔をマーカーD11S987とGTC HBM マーカー５の間の領域に狭めることを報告している。これらの２つのマーカーは元来の分析(D11S905およびD11S937)からデリミッティング・マーカーの間にあり、そして互いにおよそ３ｃｍである。マーカーD11S4191、D11S1883、D11S1785、D11S4113、D11S4136、D11S4139(Dibら、Nature 380:152-154(1996)、ＦＧＦ３(Polymeropolousら、Nucl.Acids Res.18:7468(1990))（遺伝子マーカーに関する情報はゲノムデータベースのインターネットサイト、dwww.gdv.org/で見出すことができる）、ならびにマーカー、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー１、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー２、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー３、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー４、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー５、ＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー６、およびＧＴＣ  ＨＢＭ  マーカー７からの遺伝子型データを用いて間隔を狭めることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
２．クロスマッチプログラムを用いて配列内のＢＡＣベクター配列を「マスキング」した(Phil Green、chimera.biotech.washington.edu/UWGC)。前記で詳記したショットガンライブラリー構築によりショットガンライブラリーにいくつかのＢＡＣベクターが残るので、このプログラムを用いてＢＡＣコンティグの配列をＢＡＣベクターと比較し、次の工程の前にいずれかのベクター配列をマスキングした。マスキングされた配列を配列ファイルで「Ｘ」と印を付け、続く分析の間不活性のままであった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
大腿骨および頭蓋冠骨組織から志向的にクローン化されたｃＤＮＡライブラリーを当業者に周知の方法（例えばSoares、in Automated DNA Sequencing and Analysis、Adams,FieldsおよびVenter編、Academic Press,ニューヨーク州、110-114頁、(1994))により構築した。最初に骨をハンマーで断片に破砕し、小片を液体窒素中で凍結し、組織パルベライザー(Spectrum Laboratory Products)で粉末まで小さくした。ポリトロンホモジナイザー(Brinkman Instruments)を用いて標準的な酸グアニジニウム・チオシアネート・フェノール・クロロホルム抽出バッファー(例えばChomczynskiおよびSacchi、Anal.Biochem.162:156-159(1987))で粉末化された骨をホモジナイズすることにより、粉末化された骨からＲＮＡを抽出した。加えて、ヒト脳および肺全ＲＮＡをClontechから購入した。ダイナビーズｄＴを用いて、製造者の推奨に従って(Dynal,Inc.)ポリＡ  ＲＮＡを全ＲＮＡから単離した。配列：5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO:27)のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始した。このプライマーをｃＤＮＡの３’末端でNotI制限部位（下線部）を導入した。「ワンチューブ」ｃＤＮＡ合成キットを用いて、製造者(Life Technologies,Bethesda、メリーランド州)に記載されるように、第１および第２鎖合成を実施した。二本鎖ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、分子の末端が平滑であり(Soares、in Automated DNA Sequencing and Analysis、Adams、FieldsおよびVenter編、Academic Press、ニューヨーク州、110-114頁(1994))、次に平滑末端ｃＤＮＡがＢｉｏｇｅｌカラム(Huynhら、DNA Cloning、1巻、Glover編、IRL Press、Oxford、49-78頁、(1985))により、またはｓｉｚｅ−ｓｅｐ４００セファロースカラム(Pharmacia、カタログ番号27-5105-01)を用いて大きさで選択されることを確実にした。４００塩基対またはそれ以上の長さのｃＤＮＡのみを次の行程で使用した。次いで当分野で周知の方法により(Soares、1994)、ＥｃｏＲＩアダプター（配列：５’ＯＨ−ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧ−ＯＨ３’（配列番号２８）および５’ｐ−ＣＴＣＧＴＧＣＣＧ−ＯＨ３’（配列番号２９））を二本鎖ｃＤＮＡにライゲートした。次いでNotIで消化することによりｃＤＮＡの３’末端からＥｃｏＲＩアダプターを除去した(Soares、1994)。次いでｃＤＮＡをプラスミドベクターpBluescript（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋にライゲートし(Stratagene、La Jolla、カリフォルニア州)、そして当業者に周知のエレクトロポレーション法によりライゲートされた材料を大腸菌ＤＨ１０ＢまたはＤＨ１２Ｓに形質転換した(Soares、1994)。３７℃で一晩成長させた後、Mega-prepキット(Qiagen,Chatsworth、カリフォルニア)に関して指示されるように処理することによりプレートを擦り取った後、大腸菌コロニーからＤＮＡを回収した。１次形質転換体の全数の一部を計数し、そして平均のインサートの大きさおよびｃＤＮＡインサートを含まないプラスミドのパーセンテージを決定することによりｃＤＮＡライブラリーの品質を推定した。さらなるｃＤＮＡライブラリー（ヒト全脳、心臓、腎臓、白血球、および胎児脳）をLife Technologies、Bethesda,メリーランド州から購入した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
ほぼ中央で多型性を有する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を設計した。オリゴヌクレオチドは５’末端でリン酸不含であり、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから購入した。オリゴヌクレオチドの配列（配列番号６３１〜６３２）は、
2326 ZMAX.ASO.g: AGACTGGGGTGAGACGC
2327 ZMAX.ASO.t: CAGACTGGGTTGAGACGCC
である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
本明細書で論じる酵母２ハイブリッド実験で用いるアミノ酸配列は細胞質ドメイン全体および膜貫通ドメインの一部から成り、これを以下に示す（アミノからカルボキシへの配向）（配列番号８１２）：
【化１】
2005511002.tif 000405
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２６】
ＣＨＯ発現ベクターｐＨＴＯＰ−ＦｃをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化した。アクリルアミドゲル切片からの電気溶出により、介在配列を精製して残りのベクターから除去した。ＳａｌＩはｐＨＴＯＰ−Ｆｃにおいて５’を内在性のミツバチ・メリチンシグナル配列まで切断し、ＮｏｔＩはちょうど５’でコード化配列ＩｇＧ１−Ｆｃまで切断する。得られたＳａｌＩ−ＮｏｔＩ  ｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターはシグナル配列が除去されており、ＮｏｔＩクローニング部位はＩｇＧ−Ｆｃへの５’融合の作製を施しやすい。ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６におけるＬＲＰ５全長およびｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６におけるＨＢＭ全長を別個にＸｍａ１（シグナル配列をコードするＯＲＦの領域内で切断する）およびＢａｍＨＩ（ＯＲＦ内で切断する）で消化してＬＲＰ５およびＨＢＭの２２８６ｂｐ５’フラグメントを作製した。ＨＢＭからＬＲＰ５を区別する変異体はこのフラグメントに在る。別に、ＬＲＰ５  ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化してＬＲＰ５とＨＢＭ遺伝子の双方に共通する１８００ｂｐ３’フラグメントを単離した。一緒にするとこれらの２個のフラグメントはＨＢＭおよびＬＲＰ５細胞外ドメインのコード化配列、少しのシグナル配列の最初の６個のアミノ酸のコード化配列ならびに細胞外ドメインの末端の前の１８個の終末アミノ酸を構成し、本発明者はＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットから配列（配列番号７４５）「ＳＰＡＨＳＳ」の末端まで推定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
合成二本鎖を設計して、イニシエーターメチオニンおよびＫｏｚａｋ配列を含む元来のＸｍａｌ部位の５’のＬＲＰ５／ＨＢＭシグナル配列コード化配列を再生した。ＳａｌＩ（５’）およびＸｍａｌ（３’）付着末端を含有するようにこの二本鎖を設計して末端を適応させて前記した遺伝子フラグメントをｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターに適応させた。以下に提示するような２つの部分的相補性オリゴヌクレオチド（配列番号７４６〜７４７）からこの合成二本鎖を構築した。
5'-TCGACCACCATGGAGGCAGCGCCGC-3'
3'-GGTGGTACCTCCGTCGCGGCGGGCC-5'
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２８】
第２の合成二本鎖を設計して元来のＳａｃＩ部位から配列「．．．．．ＳＰＡＨＳＳ」のセリンに続く細胞外ドメインの推定される末端までを再生し、またＩｇＧ−Ｆｃの下流へのフレーム内融合を可能にするクローニング部位をコードした。ＳａｃＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）付着末端を含有するようにこの二本鎖を設計して前記した遺伝子フラグメントをｐＨＴＯＰ−Ｆｃベクターに適応させた。以下に提示するような２つの部分的相補性オリゴヌクレオチド（配列番号７４８〜７４９）からこの合成二本鎖を構築した。
5'-CATGTGTGAAATCACCAAGCCGCCCTCAGACGACAGCCCGGCCCACAGCAGTGGC-3'
3'-TCGAGTACACACTTTAGTGGTTCGGCGGGAGTCTGCTGTCGGGCCGGGTGTCGTCACCGCCGG-5'
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４０】
【表７】
2005511002.tif 000406
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４４】
一度ｓｃＦｖ分子を単離すると、これを試薬として免疫化学において用いて種々のヒトの正常および疾患組織におけるＬＲＰ５タンパク質発現を検出した。ＬＲＰ５の細胞外ドメインのペプチド１０００−１０２１（ＩＫＲＡＫＤＤＧＴＱＰＦＶＬＴＳＬＳＱＧＱＮ）（配列番号７６１）に対する３つのファージクローンの詳細なｓｃＦＶ抗体免疫組織化学分析により心筋、腎臓、肺および肝臓での陽性染色が示された。前立腺癌における発現もまた検出した。これらの結果はｍＲＮＡ組織分布プロファイルおよび公開されたＬＲＰ５  ｍＲＮＡ局在性(Kimら、J.Biochem.124:1072-1076(1998))の報告と合致する。得られたファージクローンはプールから生じ、これをシークエンシングして分子のＦｖ領域における変異体の可能性を同定した。一度同定すると、次いで無傷および機能的免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）分子の最終的な組み立てのためにＣＯＳ細胞に同時トランスフェクトするため、適当なｓｃＦＶを可変性重鎖および可変性軽鎖ＤＮＡ構築物にサブクローン化することができる。次いで当分野で公知なように、さらに特異性および反応性に関して細胞により発現されるＩｇＧを特徴付けすることができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
例えばＬＲＰ５をｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)にクローン化した。これを用いて35Ｓ標識インビトロ翻訳(Promega、Madison、ウィスコンシン州)ＬＲＰ５を作製した。ペプチド免疫原：ＲＷＫＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳＤＳＤＰＹ（配列番号７５８）を志向する抗体（１０μｇ／ｍｌ）３１０９および３１１０を、１０μｇ／ｍｌ特異的ペプチド（すなわちＲＷＫＡＳＫＹＹＬＤＬＮＳＤＳＤＰＹ）（配列番号７５８）もしくは非特異的ペプチド（すなわちＳＧＷＮＥＣＡＳＳＮＧＨＣＳＨ）（配列番号７５９）のいずれかの存在下かまたはペプチド不含でインビトロ翻訳産物２０μｌと組み合わせ、そして４℃で１．５時間インキュベートした。次いでプロテインＡセファロースをサンプル（予め網状赤血球ライゼートで約１．５時間遮断した）に加え、そしてサンプルを４℃で１時間振盪した。プロテインＡセファロースをＰＢＳ  ０．５ｍｌで３回洗浄した。続いて結合タンパク質を４〜１２％グラジエントＮｕＰＡＧＥゲル(Invitrogen)上で製造者の指示書に従って分離した。ゲルを８０℃で３０分間乾燥させ、そして次にＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ−ＡＲフィルムに２４から４８時間暴露した。特異的プローブが35Ｓ標識ＬＲＰ５免疫沈澱タンパク質に関していずれかの抗体と有意に競合するのが観察された。競合は非特異的タンパク質では観察されなかった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７３】
４つの独立した粒子クローンからＬＲＰ５構築物を作製した。これらのクローンをＬＲＰ５特異的プライミングしたｃＤＮＡライブラリーから単離した。部分的ＬＲＰ５  ｃＤＮＡクローンは内部探査シークエンシングクローンセットに、オリゴｄＴプライミングＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＬ２３６Ｂ  Ｐ００４９Ｅ０８として存在した。このクローンを５’プライミング末端でトランケートした。全長ｃＤＮＡを作製するのに必要なより多くの５’プライム含有フラグメントを単離するために、Clontechヒト肝臓ポリＡ  ｍＲＮＡ（カタログ番号６５１０〜１、ロット番号９０６００３２）およびｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングキット（カタログ番号１８２４８〜０１３）のLife Technologies SuperScript(登録商標)プラスミドシステムからＬＲＰ５遺伝子特異的ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーをＬ４０１と称した。製造者のプロトコルを以下の修飾を伴って実施した。１）第１および第２鎖合成反応の双方におけるＤＥＰＣ処理水をα−32Ｐ−ｄＣＴＰと置き換えた。２）およそ１ｋｂ間隔でＬＲＰ５遺伝子に特異的であるように選択されたオリゴヌクレオチドを用いて逆転写をプライミングした。公のデータベースに対してプログラムＢＬＡＳＴを用いてこれらの配列を調査してＬＲＰ５遺伝子特異性を確認した。３）２つの別個の逆転写反応を実施した。最初の反応（Ａ）は以下の、より多くのＬＲＰ５遺伝子の３’領域、（配列番号７６２〜７６５）47114: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCTTGGCAATACAGATGTGGGA-3',47116: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCAGTAGCTCCTCTCGGTGGC-3',47118: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCGCTCATCATGGACTTTCCG-3',および47120: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCGCACTGCTGTTTGATGAGG-3'にアニーリングするオリゴヌクレオチドでプライミングした。第２の反応（Ｂ）は前記した４つのオリゴヌクレオチド、および（配列番号７６６〜７６８）47108: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCGAGTGTGGAAGAAAGGCTGC-3',47110: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCAGTAGAGCTTCCCCTCCTGC-3',および47112: 5'-CGTACGTAAAGCGGCCGCGTCCATCACGAAGTCCAGGT-3'を使用した。全てのオリゴヌクレオチドはＮｏｔＩリンカー配列を含有し、０．０２μｇ／μｌの濃度で使用した。４）双方の逆転写反応物に由来するＳａｌＩ適合ｃＤＮＡを１％アガロース、０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、１ｘ  ＴＡＥゲル上の電気泳動によりサイズ分画化した。０．６から８．０ｋｂの臭化エチジウム染色ｃＤＮＡをゲルから切除した。製造者のプロトコルを用いてエレクトロエルーション(ISCO Little Blue Tank Electroelutor(登録商標))によりアガロースゲルからｃＤＮＡを精製した。次いで反応ＡおよびＢに由来する精製ｃＤＮＡを一緒にプールした。５）サイズ分画化ＳａｌＩ適合ｃＤＮＡをＮｏｔＩ−ＳａｌＩ消化pBluescript(登録商標)(Stratagene、La Jolla、カリフォルニア州)にライゲートした。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７５】
ライブラリースクリーニングに使用するための２つのプローブを、鋳型としてライブラリーＬ４０１  １００ｎｇを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製した。標準的なＰＣＲ技術を用いた。反応混合物は各オリゴプライマー  １０ピコモル；０．２ｍＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ(PE Applied Biosystemsカタログ番号N808~0260)；Ｅｘｐａｎｄ（商標）High Fidelity Taq DNAポリメラーゼ  １．５単位、および１ｘ  ＰＣＲ反応バッファー(Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号731-641；１０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．３）を含有した。混合物を９９℃で１分間インキュベートし、続いて９６℃で１５秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の３０サイクル、７２℃で７分間の最終インキュベーションを行った(MJResearch DNA Engine(登録商標)Tetrat PCT-225)。ＬＲＰ５遺伝子のＮｏｔＩ−ＳａｌＩフラグメントを増幅するオリゴ（配列番号７６９〜７７０）１０７３３５：５’−CAGCGGCCTGGAGGATGC−３’および１０７３３８：５’−CGGTCCAGTAGAGGTTTCG−３’を用いて第１鎖を作製した。ＬＲＰ５遺伝子のＳａｃＩ−ＫｐｎＩフラグメントを増幅するオリゴ（配列番号７７１〜７７２）１０７３４１：５’−CATCAGCCGCGCCTTCATG−３’および１０７３４２：５’−CCTGCATGTTGGTGAAGTAC−３’を用いて第２鎖を作製した。Qiaquick（登録商標）キットおよび製造者のプロトコル（Qiagenカタログ28106）を用いて双方のＰＣＲ産物を精製し、次いで製造者のプロトコルに従ってベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Invitrogenカタログ番号K4600）にサブクローン化した。精製されたプラスミドＤＮＡ（標準的な分子生物学技術を使用）の制限消化および続くＤＮＡ配列分析(ABI Prism BigDye Terminator Cycle(登録商標)シークエンシング、カタログ番号4303154、ABI377機器)により陽性サブクローンを同定した。各々の配列確認されたｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）クローンのＥｃｏＲＩ制限消化(New England Biolabs、カタログ番号R0101L)によりプローブＤＮＡを単離した。１％アガロース、０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、１ｘ  ＴＡＥゲル上のゲル電気泳動により制限フラグメントをサイズ分画化した。インサートＤＮＡをゲルから切除し、製造者のプロトコルに従ってClontech NucleoSpin(登録商標)核酸精製キット（カタログ番号K3051−２）を用いて精製した。Prime-It II(登録商標)ランダムプライマー標識キットおよびプロトコル（Stratagene、カタログ番号300385）を用いて、精製されたＤＮＡフラグメント（２５〜５０ｎｇ）をRedivue（登録商標）（ａ32Ｐ）−ｄＣＴＰ(Amersham Pharmacia、カタログ番号AA0005）で標識した。組み込まれなかったｄＣＴＰをAmershamのNICK（登録商標）カラムおよびプロトコル（カタログ番号17-0855-02）で除去した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
１）塩基１−１３６６：ＬＲＰ５  ｃＤＮＡ構築物、ＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３からＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントが得られた。ＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３は、ＬＲＰ５の全ＯＲＦを含有する５０５７ＢＰインサートを含有する。クローンを平滑末端化し、そしてｐＳＴＢｌｕｅ−１のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ誘導体の骨ランダムプライミングｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに由来する５’クローンを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩの骨ｄＴプライミングｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲ産物に由来する３’クローンと融合させることによりこのクローンを作製した。ＤＮＡｚｙｍｅポリメラーゼを用いてＬＲＰ５特異的順行性プライマー（配列番号７７３）５’−ＧＣＣＣＧＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＣＧＡＣ−３’および逆行性プライマー（配列番号７７４）５’−ＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＴ−３’を用いてＰＣＲを実施した。得られた３．７ｋｂ  ＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにクローン化した。全長クローン作製するために、５’および３’プラスミドをＧｉｂｃｏ／ＢＲＬのＤＭ１（ｄａｍ−）に形質転換した。５’プラスミドをＸｂａＩで消化し、そして３’プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化されたプラスミドをＴ４ポリメラーゼで埋めて平滑末端を作製し、そしてＢｃｌＩで切断した。１．７ｋｂ  ５’フラグメントおよび３．５ｋｂ  ３’フラグメントをゲル精製し、一緒にライゲートし、そしてｐＳＴＢｌｕｅ１のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。これにより塩基１００で始まるコード化配列を伴う短い５’ＵＴＲが提供される。さらに、これは５’多重クローニング部位でいくつかのさらなる制限部位を担持する。このフラグメントは位置５５８でＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７８２０配列に相対する、結果的にＡ（ＡＦ０７７８２０）からＧに変化するＤＮＡ多型性をも含有し；この変異はアミノ酸の差異には至らない（Ｐｒｏ）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８６】
ＨＢＭ変異Ｇ１７１Ｖの作製
ＰＣＲを用いて、アミノ酸１７１でグリシンからバリンへの予測されるアミノ酸変化に至るＨＢＭ変異を全長ヒトＬＲＰ５  ｃＤＮＡ（プラスミドＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳ）に導入して、位置６１１のＧをＴに変化させた。ＬＲＰ５遺伝子の内因性ＮｏｔＩ部位をフランキングするオリゴ（配列番号７７５）１０７３３５：（５’−ＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣ−３’）および（配列番号７７６）４９５１３：（５’−ＣＧＧＧＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＧＣ−３’）を用いてＨＢＭ変異の導入を行った。この方法によりＰＣＲ産物の３’末端で新規ＰｖｕＩＩ部位が作製される。該産物の５’末端にＳｃａＩ部位を導入するオリゴを用いて第２のＰＣＲ反応を完了し、３’プライミング末端でＬＲＰ５の内因性ＳａｌＩ部位を含有する。Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）手順（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＣＲ産物を精製し；前記したベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローン化した。全て前記のとおり、プラスミドＤＮＡを単一の細菌性コロニーから精製し、制限消化および続く配列分析により分析した。配列確認されたｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯクローンを各々ＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩおよびＳｃａＩ−ＳａｌＩで制限消化した。得られたＤＮＡフラグメントを前記のとおりサイズ分画化し、精製した。次いでこれらの２つのフラグメントをＮｏｔＩ−ＳａｌＩ消化により調製したベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）にサブクローン化した。ＰｖｕＩＩおよびＳｃａＩ産物の双方は二本鎖核酸を消化するのに用いた場合、平滑末端を生じる。従って、得られたライゲートされたフラグメントはＰｖｕＩＩまたはＳｃａＩ部位のいずれかを再生することができず、新たに導入されたＨＢＭ変異を除いてコンセンサスＬＲＰ５配列のみを含有する。全長ＬＲＰ５遺伝子に変異を導入するために、この得られたプラスミドをＭｓｃＩおよびＳａｌＩで消化したが、一方ＬＲＰ５プラスミドＧＴＣ．Ｚｍａｘ１  １３のＸｂａＩ−ＭｓｃＩ消化によりＬＲＰ５の５’領域が得られた。これらの２つのフラグメントを一緒にＸｂａＩ−ＳａｌＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）にライゲートし、結局類似の１．３６６ｋｂ  ＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントを作製した。違いはこの構築物が前記したＨＢＭ変異を含有するということだけである。次いでＬＲＰ５遺伝子に関して正確に前記のとおり、この新たに作製されたＨＢＭ変異を含むＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントの置換を伴う全長ＨＢＭ  ｃＤＮＡをｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６．０に集めた。ＤＮＡ配列分析により全ｃＤＮＡインサートを確認し、ＨＢＭ変異の導入を確認した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９７】
以下のプライマーおよびプローブセットを用いて、製造者(PE Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州)に記載されるように、ヒト細胞から単離されたＲＮＡのＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を実施した。
ヒトＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ：（配列番号７７７〜７７９）
順行性プライマー：５’−ＧＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＣＡ−３’
逆行性プライマー：５’−ＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＧＴ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡ−３
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９８】
ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのヒトＧＡＰＤＨコントロールキットでの多重プロトコルを用いて、実験的プライマー／プローブセットの結果をヒトＧＡＰＤＨレベルに正規化した。以下のプライマーおよびプローブセットを用いて、製造者(PE Applied Biosystems、Foster City、カリフォルニア州)に記載されるように、ネズミ細胞および組織から単離されたＲＮＡの種特異的ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
ヒトＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ−１：（配列番号７８０〜７８２）
順行性プライマー：５’−ＣＧＴＧＡＴＴＧＣＣＧＡＣＧＡＴＣＴＣ−３’
逆行性プライマー：５’−ＴＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＴＣＴＴＧＴ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＣＧＣＡＣＣＣＧＴＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＴＡＣ−３’
マウスＺｍａｘ１−１／ＨＢＭ−１：（配列番号７８３〜７８５）
順行性プライマー：５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＡＣＧＡＧＴＡＴＧＴＴＧＧＴ−３’
逆行性プライマー：５’−ＡＡＧＧＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡＧＣ−３’
プローブ：６−ＦＡＭ−５’−ＡＧＣＣＣＣＴＣＡＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧ−３’
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０３】
初めに、マウスＬＲＰ５遺伝子のエクソン５つを含むマウスゲノムＤＮＡ  ＢＡＣクローン４７３Ｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＺ０９５４１３）のゲノムＤＮＡを用いて骨ジーンターゲティングベクターを構築した。Research Genetics(Huntsville、アラバマ州)によりエクソン３に関するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）スクリーニングを用いてマウス１２９ＳｖＪゲノムＢＡＣライブラリーからこのクローンを単離した。順行性プライマーの配列（５’−ＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号７８６）および逆行性プライマーの配列（５’−ＡＧＧＴＴＧＧＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号７８７）を用いてＰＣＲによりエクソン３を増幅し；以下の熱循環条件を用いた。９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクル。このクローンのマウスＬＲＰ５遺伝子との同一性を、鋳型としてＢＡＣクローンＤＮＡを用いてエクソン３をシークエンシングすることにより確認した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０５】
双方のＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ標的化ベクター（ＡおよびＢ）を、エクソン３でＧ１７０Ｖアミノ酸置換をコードするＧからＴへのヌクレオチド置換するように修飾した。鋳型として相同性の短いアームの野生型配列を用いて、重複ＰＣＲ変異誘発によりこれらの修飾を導入した。加えて、Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）標的化ベクターの１ｋｂの短いアームを、５’終端ＰｍｅＩ制限認識部位を含むように修飾した。配列（５’−ＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴ−３’）（配列番号７８８）の順行性プライマーおよび配列：
【化２】
2005511002.tif 000407
（配列番号７８９）の逆行性（変異原性）プライマーを用いて５’重複フラグメントを作製した。３０サイクルで利用した熱循環条件は９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。配列：
【化３】
2005511002.tif 000408
（配列番号７９０）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＧ−３’）（配列番号７９１）の逆行性（変異原性）プライマーを用いて３’フラグメントを作製した。３０サイクルで利用した熱循環条件は９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。最終重複ＰＣＲは鋳型としてＰＣＲ反応の５’フラグメントおよび３’フラグメント各々１ｍｌを利用し、各々５’および３’フラグメントの順行性および逆行性プライマーならびに同一の熱循環パラメーターを用いて増幅を実施した。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いて最終ＰＣＲ産物をクローン化した。変異誘発されたエクソン３を６００ｂｐ  ＢｓｍＢＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）から切除し、Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ａ）に移した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０７】
相同性の標的化ベクター領域をフランキングする、および直ぐ隣接するゲノムフラグメントのＰＣＲクローニングによりＺｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）の外側プローブを調製する。Ｚｍａｘ１  ＫＩ／ＫＯ（Ｂ）に用いられる５’外側プローブは配列（５’−ＴＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣ−３’）（配列番号７９２）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧ−３’）（配列番号７９３）の逆行性プライマーを用いて作製された４９８ｂｐフラグメントである。これらのプライマーを用いて３０サイクルで利用した熱循環条件は、９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。３’外側プローブは配列（５’−ＣＣＴＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧ−３’）（配列番号７９４）の順行性プライマーおよび配列（５’−ＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣ−３’）（配列番号７９５）の逆行性プライマーを用いて作製された６００ｂｐフラグメントである。これらのプローブを用いて３０サイクルで利用した熱循環条件は、９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間である。双方のプローブはゲノムサザン分析においてＬＲＰ５遺伝子に特異的である。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０８】
ＬＲＰ５  ｍＲＮＡ構造および転写レベルのリボヌクレアーゼ保護分析のためのプローブをエクソン３からエクソン４を含有するｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲクローニングすることにより調製した。ＰＣＲ反応は鋳型として完全ｃＤＮＡ、配列（５’−ＴＧＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣ−３’）（配列番号７９６）の順行性プライマー、配列（５’−ＴＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＴＧ−３’）（配列番号７９７）の逆行性プライマーおよび以下の３０サイクルのための熱循環条件を使用した。９５℃で０．５分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間。ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ  Ｔ／Ａクローニングキットを用いてＰＣＲ産物をクローン化した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１３】
以下のプライマーセットを遺伝子型解析に使用する。
ＨＢＭＭＣＢＡ：
５’プライマー：２９６塩基対フラグメント
順行性：５’−ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＧＣＧ−３’（配列番号７９８）
逆行性：５’−ＧＣＣ  ＧＣＡＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’（配列番号７９９）
３’プライマー：４００塩基対フラグメント
順行性：５’−ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  Ａ−３’（配列番号８００）
逆行性：５’−ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ−３’（配列番号８０１）
ＨＢＭＭＴＩＣ：
５’プライマー：３８２塩基対フラグメント
順行性：５’−ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ−３’（配列番号８０２）
逆行性：５’−ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’（配列番号８０３）
３’プライマー：５２４塩基対フラグメント
順行性：５’−ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’（配列番号８０４）
逆行性：５’−ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＡＧＧ−３’（配列番号８０５）
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３８】
【図１】図１は遺伝子連鎖研究に用いられた個体の家系を示す。各々の個体の下に、ＩＤ番号、脊髄ＢＭＤに関するｚ−スコアがあり、対立遺伝子が、染色体１１上の重要なマーカーを示す。黒ぬりの記号は「患っている」個体を表す。「Ｎ」を含む記号は「患っていない」個体である。３７人の個体からのＤＮＡについて遺伝子型を同定した。クエスチョンマークは遺伝子型が同定されなかった未知の遺伝子型または個体を示す。
【図２】図２は１１ｑ１３．３におけるＨＢＭ領域のＢＡＣ／ＳＴＳ含量物理地図を表す。ＳＴＳマーカーは遺伝子、ＥＳＴ、マイクロサテライト、ランダム配列、およびＢＡＣエンドシークエンスを長い水平方向の線の上に記す。ＧＤＢに存在するマーカーに関しては、同一の命名法を用いている。遺伝子座の名前（Ｄ１１Ｓ＃＃＃＃）は利用可能な場合、第１次名の後に括弧の中に列挙する。ＢＡＣエンドシークエンスから誘導したＳＴＳをＢＡＣ名と共に列挙し、クローンの左および右末端に関して各々ＬまたはＲと続ける。２つの大きな矢印はＨＢＭの重要な領域を定義する遺伝子マーカーを示す。ＳＴＳの下の水平方向の線は、９倍の適用範囲のＢＡＣライブラリーのＰＣＲ基盤のスクリーニングにより同定されたＢＡＣクローンを示す。白丸はライブラリースクリーニング中、マーカーが対応するＢＡＣライブラリーアドレスを増幅しなかったことを示している。クローン名は以下の慣用法を用いる。ＢＡＣに関してはＢ、プレート、列および囲みアドレス、続いてＨがＨＢＭプロジェクトを示す（すなわちＢ３６Ｆ１６−Ｈ）。
【図３】図３Ａ〜３Ｆはイントロン配列の側面に位置しているＬＲＰ５のゲノム構造を示す。翻訳は下線を付したエクソン１の「ＡＴＧ」により開始される。ＨＢＭ遺伝子の多型性の部位はエクソン３であり、下線を付した「Ｇ」により表され、それによりこのヌクレオチドはＨＢＭ遺伝子の「Ｔ」である。ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にはエクソン２３内で下線を付している（エクソン１、配列番号４０；エクソン２、配列番号４１；エクソン３、配列番号４２；エクソン４、配列番号４３；エクソン５、配列番号４４；エクソン６、配列番号４５；エクソン７、配列番号４６；エクソン８、配列番号４７；エクソン９、配列番号４８；エクソン１０、配列番号４９；エクソン１１、配列番号５０；エクソン１２、配列番号５１；エクソン１３、配列番号５２；エクソン１４、配列番号５３；エクソン１５、配列番号５４；エクソン１６、配列番号５５；エクソン１７、配列番号５６；エクソン１８、配列番号５７；エクソン１９、配列番号５８；エクソン２０、配列番号５９；エクソン２１、配列番号６０；エクソン２２、配列番号６１およびエクソン２３、配列番号６２）。
【図４】図４はＹＷＴＤスペーサー、細胞外付着部位、ＬＤＬおよびカルシウムの結合部位、システイン富化成長因子リピート、膜貫通領域、ＣＫ−ＩＩリン酸化部位を伴う理想的なＰＥＳＴ領域および内部移行ドメインを含むＬＲＰ５のドメイン構成を示す。図４はまたＨＢＭタンパク質で生じるグリシンのバリンへの変化の部位を示す。シグナルペプチドはアミノ酸１〜３１に位置し、細胞外ドメインはアミノ酸３２〜１３８５に位置し、膜貫通セグメントはアミノ酸１３８６〜１４１３に位置し、細胞質ドメインはアミノ酸１４１４〜１６１５に位置する。
【図５】図５はＨＢＭ遺伝子に関連するＢＡＣコンティグＢ５２７Ｄ１２およびＢ２００Ｅ２１の略図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｊは野生型遺伝子ＬＲＰ５のヌクレオチド（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号３）配列を示す。ヌクレオチド５８２でのグアニンのチミンへの塩基対置換の位置（配列番号２、４）には下線を付している。この対立遺伝子変異体はＨＢＭ遺伝子である。ＨＢＭ遺伝子は１７１位置でグリシンのバリンへのアミノ酸置換を有するタンパク質をコードする。５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は塩基１から７０の境界であり、３’ＵＴＲは塩基４９１６−５１２０の境界である。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは種々組織におけるＬＲＰ５の発現を示すノーザンブロット分析である。
【図８】図８はＰＣＲ産物分析である。
【図９】図９はＬＲＰ５エクソン３変異の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド検出である。
【図１０】図１０は１００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１１】図１１は４００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１２】図１２は４００倍拡大した、センスおよびアンチセンスプローブを用いる、骨内膜での骨芽細胞のインサイチュ・ハイブリダイゼーションによるマウスＬＲＰ５の細胞局在化である。
【図１３】図１３はＭＣ−３Ｔ３細胞でのＬＲＰ５発現のアンチセンス阻止を示す。
【図１４】図１４は、野生型ＬＲＰ５対立遺伝子（左パネル、Ｇ特異的オリゴ；５５℃、洗浄）と比較したＨＢＭ対立遺伝子（右パネル、Ｔ特異的オリゴ；５８℃、洗浄）の希少性を説明するＬＲＰ５エクソン３対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）アッセイを示す。右パネルで現れる陽性スポットは陽性対照である。
【図１５】図１５は接着斑情報伝達におけるＬＲＰ５（Ｚｍａｘ１）の潜在的役割を表すモデルを示す。
【図１６】図１６は内因性マウスＬＲＰ５のノックアウトまたはＨＢＭ多型性の条件的ノックインのための２つのＬＲＰ５ジーンターゲティングベクターを模式的に表す。Ｂ、Ｘ、およびＲは各々ＤＮＡ  ＢＡＣ４７３５Ｐ５におけるＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を示す。エクソン３、４および５を黒色の長方形で示す。ＡＧ−＞Ｔ塩基変化はＨＢＭ多型性を作製するためにエクソン３の塩基２４で操作される。ネオマイシン抵抗性遺伝子および合成休止配列を含有するＬｏｘＰフランキングされるカセットならびにＥＳ細胞クローンのスクリーニングおよび特徴付けに用いられるプローブの位置をも示す。
【図１７】図１７はトランスジェニック（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ）および野生型（すなわちＺｍａｘＷＴＣＢＡおよびＺｍａｘＷＴＴＩＣ）プラスミド構築物により発現を確認する。これらの構築物をＨＯＢ−０２−０２細胞に一過性にトランスフェクトし、ｍＲＮＡレベルをＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＰＣＲを用いて決定した。ＨＢＭＭＣＢＡおよびＺｍａｘＷＴＣＢＡを表の左のコラムで示し（すなわちＣＭＶβアクチン）ならびにＨＢＭＭＴＩＣおよびＺｍａｘＷＴＴＩＣを表の右のコラムで示す（すなわちＩ型コラーゲン）。
【図１８】図１８はヒトおよびマウスＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセット間の比較を示す。ＨＯＢ（ＨＯＢ−０３−Ｃ５）およびマウス（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１）骨芽細胞ｍＲＮＡをプローブおよびプライマーを用いて分析した。
【図１９】図１９はＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて、ヒトおよびマウスＲＮＡ混合物バックグラウンドで発現されたヒトＺｍａｘ−１  ｍＲＮＡの定量を示す。結果は添加したヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡ（ｎｇ）対測定したヒトＬＲＰ５  ｍＲＮＡ（ｎｇ）を表す。
【図２０】図２０はＴａｑＭａｎ（登録商標）により分析されたｍＲＮＡ発現に基づくトランスジェニックマウスにおけるＨＢＭの発現を表す。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは脊椎（図２１Ａ）、大腿骨（図２１Ｂ）および全身（図２１Ｃ）においてＨＢＭＭＣＢＡ構築物を発現する種々トランスジェニックマウス株の分析を表す。  図２１Ｄ〜Ｆは脊椎（図２１Ｄ）、大腿骨（図２１Ｅ）および全身（図２１Ｆ）においてＨＢＭＭＴＩＣ構築物を発現する種々トランスジェニックマウス株の分析を表す。  図２１Ｇ〜Ｌは脊椎、大腿骨および全身において１７週を通じてＨＢＭＭＴＩＣ構築物を発現するトランスジェニックマウス株の分析を表す。
【図２２】図２２はインビボｐＤＸＡ分析*を用いて、５週でのＨＢＭトランスジェニックマウスにおけるＢＭＤ（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ構築物）の変化を表す。ＢＭＤ変化を、これもまた５週齢のみである野生型動物と比較して提示する。
【図２３】図２３はインビボｐＤＸＡ分析*を用いて、９週でのＨＢＭトランスジェニックマウスにおけるＢＭＤ（すなわちＨＢＭＭＣＢＡおよびＨＢＭＭＴＩＣ構築物）の変化を表す。ＢＭＤ変化を、これもまた９週齢のみである野生型動物と比較して提示する。
【図２４】図２４（Ａ〜Ｄ）はＨＢＭＧＩ  ２ＡＳベクターインサートの配列（配列番号８０６）を提示する。
【図２５】図２５（Ａ〜Ｄ）はＺＭＡＸＧＩ  ３ＡＳベクターインサートの配列（配列番号８０７）を提示する。
【図２６】図２６（Ａ〜Ｃ）はヒト（配列番号８０８）およびマウス（配列番号８０９）ＬＲＰ５アミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図２７】図２７（Ａ〜Ｃ）はヒトＬＲＰ５（配列番号８１０）およびＬＲＰ６（配列番号８１１）アミノ酸配列のアラインメントを提示する。
【図２８】図２８はマウスの骨成長に及ぼす負荷の影響を試験するための装置を説明する。
【図２９】図２９は骨負荷のＨＢＭトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの骨成長に及ぼす影響の組織形態学的説明を提示する。
【国際調査報告】
2005511002.tif 000409
2005511002.tif 000410
2005511002.tif 000411
2005511002.tif 000412