(57)【要約】本発明者らは、2つの始原生殖細胞で特異的に発現する遺伝子、FragilisおよびStellaを記載した。ヒトStellaおよびFragilisの配列および使用、ならびにFragilisと関係がある幾つかの関連するマウス配列を開示する。StellaおよびFragilisは始原生殖細胞のマーカーであり、これらを使用して、細胞集団中のこのような細胞を同定することができる。これらは、癌などの疾患を診断、治療および/または予防するために使用することもできる。
2005532808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトStellaアミノ酸配列、好ましくは配列番号4で示される配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項２】
ヒトFragilisアミノ酸配列、好ましくは配列番号6で示される配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項３】
Fragilis 9-27(好ましくは配列番号8で示される配列を含む)、Fragilis 2(好ましくは配列番号10で示される配列を含む)、Fragilis 3(好ましくは配列番号12で示される配列を含む)、Fragilis 4(好ましくは配列番号14で示される配列を含む)、Fragilis 5(好ましくは配列番号16で示される配列を含む)、Fragilis 6(好ましくは配列番号18で示される配列を含む)、Ifitm1、Ifitm2、Ifitm3またはENSG142056からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項４】
(a)配列番号4で示されるヒトStellaの配列、(b)配列番号6で示されるヒトFragilisの配列、(c)配列番号8で示されるヒトFragilis 9-27の配列、(d)配列番号10で示されるマウスFragilis 2の配列、(e)配列番号12で示されるマウスFragilis 3の配列、(f)配列番号14で示されるマウスFragilis 4の配列、(g)配列番号16で示されるマウスFragilis 5の配列、および(h)配列番号18で示されるマウスFragilis 6の配列からなる群から選択される配列から本質的になるポリペプチド。
【請求項５】
請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチドと、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または95%の相同性を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれかに記載の核酸の15個以下の隣接アミノ酸の配列、好ましくは10個未満の隣接アミノ酸の配列を含むポリペプチド。
【請求項７】
請求項1から6のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
ヒトStella核酸配列、好ましくは配列番号3で示される配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項９】
ヒトFragilis核酸配列、好ましくは配列番号5で示される配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項１０】
Fragilis 9-27(好ましくは配列番号7で示される配列)、Fragilis 2(好ましくは配列番号9で示される配列)、Fragilis 3(好ましくは配列番号11で示される配列)、Fragilis 4(好ましくは配列番号13で示される配列)、Fragilis 5(好ましくは配列番号15で示される配列)およびFragilis 6(好ましくは配列番号17で示される配列)からなる群から選択されるFragilis核酸配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体。
【請求項１１】
(a)配列番号3で示されるヒトStellaの配列、(b)配列番号5で示されるヒトFragilisの配列、(c)配列番号7で示されるヒトFragilis 9-27の配列、(d)配列番号9で示されるマウスFragilis 2の配列、(e)配列番号11で示されるマウスFragilis 3の配列、(f)配列番号13で示されるマウスFragilis 4の配列、(g)配列番号15で示されるマウスFragilis 5の配列、および(h)配列番号17で示されるマウスFragilis 6の配列からなる群から選択される配列から本質的になる核酸配列。
【請求項１２】
請求項7から11のいずれかに記載の核酸配列と、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または95%の相同性を有する核酸配列。
【請求項１３】
請求項7から12のいずれかに記載の核酸の25個以下の隣接ヌクレオチドの配列、好ましくは15個の隣接ヌクレオチドの配列を含む核酸。
【請求項１４】
請求項7から13のいずれかに記載の核酸配列の相補配列。
【請求項１５】
1つまたは複数のヌクレオチド置換を有する請求項7から14のいずれかに記載の核酸配列を含む核酸であって、1つまたは複数の置換が、遺伝コードの縮重の結果として前記核酸のコード特異性を変えることはない核酸。
【請求項１６】
請求項7から15のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項7から16のいずれかに記載の核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項1から6のいずれかに記載のポリペプチドを生成する方法であって、請求項6から15のいずれかに記載の核酸、請求項16に記載のベクター、または請求項17に記載の宿主細胞を提供すること、およびポリペプチドをコードする核酸の発現を可能にすることを含む方法。
【請求項１９】
多能性細胞を同定するための方法であって、細胞中の請求項1から6のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項7から15のいずれかに記載の核酸を検出することを含む方法。
【請求項２０】
Stellaおよび/またはFragilisに特異的な5'および3'プライマーを使用して、推定多能性細胞から核酸を増幅させるステップ、およびこのようにして生じた増幅核酸を検出するステップを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
核酸配列をin situハイブリダイゼーションによって検出する、請求項19または20に記載の方法。
【請求項２２】
核酸配列を、核酸でコードされるタンパク質産物を検出することによって検出する、請求項19、20または21に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドを免疫染色によって検出する、請求項19または22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項1から6のいずれかに記載のポリペプチド、またはその任意のエピトープに特異的に結合することができる抗体。
【請求項２５】
Fragilisの細胞外ドメインと特異的に結合することができる、請求項24に記載の抗体。
【請求項２６】
多能性細胞を同定および/または単離するための請求項24または25に記載の抗体の使用。
【請求項２７】
請求項19から23および27のいずれか一項に記載の方法によって同定される多能性細胞。
【請求項２８】
個体の疾患の治療法または予防法であって、個体の細胞中のStellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性を調節することを含む方法。
【請求項２９】
Stellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性を上方制御することを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
Stellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性を下方制御することを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
Stellaおよび/またはFragilisアンチセンス核酸と、細胞またはその要素を接触させることを含む、請求項28または30に記載の方法。
【請求項３２】
RNA干渉(RNAi)を含む、請求項28、30または31に記載の方法。
【請求項３３】
個体の疾患の治療法または予防法で使用するためのStellaまたはFragilisポリペプチドまたは核酸、あるいはStellaまたはFragilisに対する抗体。
【請求項３４】
疾患を治療するための薬剤組成物を調製するためのStellaまたはFragilisポリペプチドまたは核酸、あるいはStellaまたはFragilisに対する抗体の使用。
【請求項３５】
個体の細胞中のStellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性の調節を検出することを含む、疾患の診断法。
【請求項３６】
疾患が精巣腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、肺癌、大細胞癌、子宮癌、および平滑筋肉腫からなる群から選択される、請求項28から35のいずれかに記載の方法または使用。したがってStellaは、このような組織のあるいはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を治療または診断するのに適している。
【請求項３７】
StellaまたはFragilisと結合することができる分子を同定する方法であって、(a)StellaまたはFragilisポリペプチドを与えるステップ、(b)StellaまたはFragilisポリペプチドと候補分子を接触させるステップ、および(c)場合により、候補分子とStellaまたはFragilisポリペプチドの間の結合を検出するステップを含む方法。
【請求項３８】
StellaまたはFragilisの調節物質、好ましくはStellaまたはFragilisのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、(a)StellaまたはFragilisポリペプチドを与えるステップ、(b)StellaまたはFragilisポリペプチドと候補分子を接触させるステップ、および(c)StellaまたはFragilisポリペプチドの活性の調節を検出するステップを含む方法。
【請求項３９】
ポリペプチドを、好ましくはライブラリーの形の複数の候補分子と接触させる、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項37、38または39に記載の方法によって同定されるStellaまたはFragilisの調節物質。
【請求項４１】
個体の疾患の治療法または予防法における、好ましくは請求項37から36、または請求項40に記載の方法によって同定されるStellaまたはFragilisのアンタゴニストの使用。
【請求項４２】
請求項7から15のいずれかに記載の核酸、または請求項16に記載のベクターを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４３】
マウスである、請求項42に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
請求項42または43に記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞または組織。
【請求項４５】
StellaまたはFragilisタンパク質と特異的に相互作用することができる化合物を同定する方法における、請求項42または43に記載のトランスジェニック非ヒト動物または請求項44に記載の細胞または組織の使用。
【請求項４６】
トランスジェニック動物が改変型Stella遺伝子または改変型Fragilis遺伝子、あるいは両方を含むことを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４７】
改変が、Stellaおよび/またはFragilisの欠失、機能の消失をもたらすStellaおよび/またはFragilisの突然変異、標的または無作為突然変異したヌクレオチド配列を有する外因性遺伝子のStellaおよび/またはFragilisへの導入、他種由来の外因性遺伝子のStellaおよび/またはFragilisへの導入、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項46に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４８】
機能的に破壊された内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、好ましくは異種Stellaおよび/またはFragilisタンパク質をコードするトランス遺伝子をそのゲノム中に含み発現する動物。
【請求項４９】
宿主細胞中のStellaおよび/またはFragilis遺伝子を機能的に破壊する核酸構築体であって、(a)非相同置換部分;(b)非相同置換部分の上流に位置する第一の相同領域であって、第一のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する第一の相同領域;および(c)非相同置換部分の下流に位置する第二の相同領域であって、第二のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、第二のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列が、天然に存在する内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子中の第一のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列の下流に位置を有する第二の相同領域を含む核酸構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生、分子生物学および遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、初期の始原生殖細胞(PGC)群においてのみ発現される遺伝子、ならびに細胞集団中のPGCなどの多能性および多分化能細胞、多能性胚性幹細胞(ES)および多能性胚性生殖細胞(EG)の同定における、このような遺伝子およびその産物の使用に関する。これらは、非多能性から多能性になる細胞状態の変化、および非多能性細胞においてこの状態を与えることを可能にする際のマーカーでもある。
【背景技術】
【０００２】
受精後、初期の哺乳動物胚は、4期の卵割を経て、16細胞の桑実胚を形成する。これらの細胞は、さらなる分裂期の後、胚盤胞に進行し、そこで細胞は2つの異なる領域、すなわち胚を形成する内部細胞塊、および胎盤などの胚体外組織を形成する栄養胞に分かれることができる。
【０００３】
胚盤胞の形成までに、胚の一部分を形成する細胞は全能性である。言い換えれば、それぞれの細胞は、完全な個体胚、および胚の発生に必要とされるすべての胚体外組織を生成する能力を有する。胚盤胞の形成後、内部細胞塊の細胞はもはや全能性ではなく、それらが一定範囲の異なる組織を生成することができる点で多能性である。これらの細胞に関する知られている指標は、酵素アルカリ性ホスファターゼおよびOct4の発現である。
【０００４】
始原生殖細胞(PGC)は、すべての3つの主要生殖層に分化する能力を有する、多能性細胞である。哺乳動物においてPGCは、尿膜の底部から、後腸上皮および後腸間膜を介して移動して、性腺原基でコロニー形成する。PGC由来の細胞は、特徴的に低い細胞質/核の比を有し、通常は顕著な核小体を有する。PGCは、胚の生殖隆起の除去、性腺原基からのPGCの解離、およびPGCの回収によって、胚から単離することができる。初期のPGC群は、受精後7.25日で出現する尿膜の底部で見られる、約45(45)のアルカリ性ホスファターゼ陽性細胞の群からなることが報告されている(Ginsburg他、(1990)Development 110:521〜528)。
【０００５】
PGCには、現代のバイオテクノロジーおよび分子生物学において多数の用途がある。これらは、トランスジェニック動物の生成において有用であり、PGC由来の胚性生殖(EG)細胞は、胚幹(ES)細胞とほぼ同じ方式で使用することができる(Labosky他、(1994)Development 120:3197〜3204)。さらにPGCは、胎児発育の試験、ならびに変性疾患の治療における組織再生、および外傷後に損傷した組織の再増殖用の多能性幹細胞の提供において有用である。特に、PGCは幾つかの特別な性質を有しているが、体細胞の運命を獲得しているPGCの創始集団を囲む近隣の細胞から失われる、基本的な多能性を有している。PGCと周囲の体細胞は、共通の祖先を共有している。しかしながら、創始PGCは数が少なく、胚組織および周囲の体細胞から単離するのが困難であり、このことがPGCの試験、それらを利用する技法の開発を複雑にしている。
【０００６】
PGCの創始群中での遺伝子の発現、およびPGC特異的遺伝子発現とこれらの細胞における多能性の保持との間の関係について、当分野ではほとんど知られていない。PGCに関する幾つかの指標が知られている。例えば、組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ(TNAP)の発現が、初期PGCに関する指標として使用されてきている(Ginsburg他、(1990)Development 110:521〜528)。Oct4はPGC中では発現されるが、体細胞中では発現されないことが知られている(Yoem他、(1996)Development 122:881〜894)。BMP4などの他のマーカーは、体細胞組織中で主に発現されることが知られている(Lawson他、(1999)Genes & Dev.13:424〜436)。しかしながら、これらの遺伝子の中で、PGCに特異的なものは存在しない。なぜならそれらは、他の組織型においても発現されるからである。したがって、PGCのマーカーとして使用することができ、生殖細胞発生の生物学、および多能性状態の性質の見通しを与えることができる遺伝子の同定に関する必要性が、当分野では存在する。
【非特許文献１】Ginsburg他、(1990)Development 110:521〜528
【非特許文献２】Labosky他、(1994)Development 120:3197〜3204
【非特許文献３】Yoem他、(1996)Development 122:881〜894
【非特許文献４】Lawson他、(1999)Genes & Dev.13:424〜436
【特許文献１】非公開国際特許出願PCT/GB02/00215号
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【非特許文献６】Ausubel、F.M.他(1995および定期的追補、Current Protocols in Molecular Biology、ch.9、13、および16、John Wiley & Sons、New York、N.Y.)
【非特許文献７】B.Roe、J.Crabtree、およびA.Kahn、1996、DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques、John Wiley & Sons
【非特許文献８】J.M.PolakおよびJames O'D.McGee、1990、In Situ Hybridization:PrinciplesおよびPractice ;Oxford University Press
【非特許文献９】M.J.Gait(Editor)、1984、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach、Irl Press
【非特許文献１０】D.M.J.LilleyおよびJ.E.Dahlberg、1992、Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology、Academic Press
【非特許文献１１】Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow、David Lane、Ed Harlow(1999、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ISBN 0-87969-544-7)
【非特許文献１２】Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)、David Lane(Editor)(1988、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ISBN 0-87969-314-2)、1855.Handbook of Drug Screening、Ramakrishna Seethala編、Prabhavathi B.Fernandes(2001、New York、NY、Marcel Dekker、ISBN 0-8247-0562-9)
【非特許文献１３】Lab Ref:A Handbook of Recipes、Reagents、およびOther Reference Tools for Use at the Bench、Edited Jane Roskams and Linda Rodgers、2002、Cold Spring Harbor Laboratory、ISBN 0-87969-630-3
【特許文献２】PCT/GB02/00215
【特許文献３】国際出願PCT/GB02/00215
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
参照によりその内容がここに組み込まれている、本発明者らの非公開国際特許出願PCT/GB02/00215号は、2つの齧歯類遺伝子StellaおよびFragilisの配列および使用を開示する。この文書は、StellaおよびFragilisが、PGCおよび他の多能性細胞によって発現されることを示している。マウスのStellaおよびFragilisの配列も、それぞれ配列番号2および配列番号1としてここで述べられている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここで本発明者らは、ヒトのStellaおよびFragilis配列、ならびにFragilisファミリーの遺伝子のメンバーを含めた、新規な遺伝子Fragilis 9-27、Fragilis 2、Fragilis 3、Fragilis 4、Fragilis 5およびFragilis 6の配列を開示する。本発明者らは、ヒトのFragilis相同体、Ifitm1、Ifitm2、Ifitm3およびHuman ENSG142056の配列も開示する。ここに記載する遺伝子およびポリペプチドは、抗体などの関連産物を含めて、幾つかの方法において、例えば癌などの疾患を診断、治療および/または予防するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第1の態様に従って、本発明者らは、ヒトStellaアミノ酸配列、好ましくは配列番号4で示される配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１０】
本発明の第2の態様に従って、ヒトFragilisアミノ酸配列、好ましくは配列番号6で示される配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１１】
本発明の第3の態様に従って、本発明者らは、Fragilis 9-27(配列番号8で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 2(配列番号10で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 3(配列番号12で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 4(配列番号14で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 5(配列番号16で示される配列を含むことが好ましい)およびFragilis 6(配列番号18で示される配列を含むことが好ましい)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１２】
本発明の第4の態様として、(a)配列番号4で示されるヒトStellaの配列、(b)配列番号6で示されるヒトFragilisの配列、(c)配列番号8で示されるヒトFragilis 9-27の配列、(d)配列番号10で示されるマウスFragilis 2の配列、(e)配列番号12で示されるマウスFragilis 3の配列、(f)配列番号14で示されるマウスFragilis 4の配列、(g)配列番号16で示されるマウスFragilis 5の配列、および(h)配列番号18で示されるマウスFragilis 6の配列からなる群から選択される配列から本質的になるポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の第5の態様に従って、本発明者らは、前述の態様のいずれかに記載のポリペプチドと、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または95%の相同性を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明は、第6の態様において、前述の態様のいずれかに記載の核酸の15個以下の隣接アミノ酸の配列、好ましくは10個未満の隣接アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供する。
【００１５】
本発明の第7の態様では、前述の態様のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００１６】
本発明の第8の態様に従って、本発明者らは、ヒトStella核酸配列、好ましくは配列番号3で示される配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１７】
本発明者らは、本発明の第9の態様に従って、ヒトFragilis核酸配列、好ましくは配列番号5で示される配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１８】
本発明の第10の態様に従って、Fragilis 9-27(好ましくは配列番号7で示される配列)、Fragilis 2(好ましくは配列番号9で示される配列)、Fragilis 3(好ましくは配列番号11で示される配列)、Fragilis 4(好ましくは配列番号13で示される配列)、Fragilis 5(好ましくは配列番号15で示される配列)およびFragilis 6(好ましくは配列番号17で示される配列)からなる群から選択されるFragilis核酸配列を含む核酸配列、またはその断片、相同体、変異体、もしくは誘導体を提供する。
【００１９】
本発明の第11の態様として、本発明者らは、(a)配列番号3で示されるヒトStellaの配列、(b)配列番号5で示されるヒトFragilisの配列、(c)配列番号7で示されるヒトFragilis 9-27の配列、(d)配列番号9で示されるマウスFragilis 2の配列、(e)配列番号11で示されるマウスFragilis 3の配列、(f)配列番号13で示されるマウスFragilis 4の配列、(g)配列番号15で示されるマウスFragilis 5の配列、および(h)配列番号17で示されるマウスFragilis 6の配列からなる群から選択される配列から本質的になる核酸配列を提供する。
【００２０】
本発明の第12の態様に従って、本発明者らは、開示する核酸配列と、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または95%の相同性を有する核酸配列を提供する。
【００２１】
本発明の第13の態様において、本発明者らは、開示する核酸の25個以下の隣接ヌクレオチドの配列、好ましくは15個の隣接ヌクレオチドの配列を含む核酸を提供する。
【００２２】
本発明の第14の態様に従って、開示する核酸配列の相補配列を提供する。
【００２３】
本発明者らは、本発明の第15の態様に従って、開示する核酸配列、および1つまたは複数のヌクレオチド置換を含む核酸を提供し、その中の1つまたは複数の置換が、遺伝コードの縮重の結果として、前記核酸のコード特異性を変えることはない。
【００２４】
本発明の第16の態様に従って、本発明者らは、このような核酸配列を含むベクターを提供する。
【００２５】
本発明の第17の態様に従って、本発明者らは、開示する核酸配列を含む宿主細胞を提供する。
【００２６】
本発明の第18の態様に従って、開示するポリペプチドを生成する方法を提供し、この方法は、開示する核酸、開示するベクター、または開示する宿主細胞を提供すること、およびポリペプチドをコードする核酸の発現を可能にすることを含む。
【００２７】
本発明者らは、本発明の第19の態様に従って、細胞中のこのようなポリペプチド、またはこのような核酸を検出することを含む、多能性細胞を同定するための方法を提供する。
【００２８】
この方法は、Stellaおよび/またはFragilisに特異的な5'および3'プライマーを使用して、推定多能性細胞から核酸を増幅させるステップ、およびこのようにして生じた増幅核酸を検出するステップを含むことが好ましい。核酸配列はin situハイブリダイゼーションによって検出することが好ましい。核酸配列は、核酸でコードされるタンパク質産物を検出することによって、検出することが好ましい。ポリペプチドは、免疫染色によって検出することが好ましい。
【００２９】
本発明の第20の態様に従って、開示するポリペプチドに特異的な抗体を提供する。この抗体は、Fragilisの細胞外ドメインと特異的に結合することできることが好ましい。
【００３０】
本発明者らは、本発明の第21の態様に従って、多能性細胞を同定および/または単離するためのこのような抗体の使用を提供する。
【００３１】
本発明の第22の態様として、開示する方法によって同定される多能性細胞を提供する。
【００３２】
本発明者らは、本発明の第23の態様に従って、個体の疾患の治療法または予防法を提供し、この方法は、個体の細胞中のStellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性を調節することを含む。
【００３３】
この方法は、Stellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性を、上方制御することを含むことが好ましい。
【００３４】
本発明は、第24の態様において、個体の疾患の治療法または予防法で使用するためのStellaまたはFragilisポリペプチドまたは核酸、あるいはStellaまたはFragilisに対する抗体を提供する。
【００３５】
本発明の第25の態様では、疾患を治療するための薬剤組成物を調製するためのStellaまたはFragilisポリペプチドまたは核酸、あるいはStellaまたはFragilisに対する抗体の使用を提供する。
【００３６】
本発明の第26の態様に従って、本発明者らは、疾患の診断法を提供し、この方法は、個体の細胞中のStellaおよび/またはFragilisの発現および/または活性の調節を検出することを含む。
【００３７】
好ましい実施形態では、疾患は、精巣腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、肺癌、大細胞癌、子宮癌、および平滑筋肉腫からなる群から選択される。したがって、Stellaは、このような組織のあるいはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を治療または診断するのに適している。
【００３８】
本発明者らは、本発明の第27の態様に従って、StellaまたはFragilisと結合することができる分子を同定する方法を提供し、この方法は、(a)StellaまたはFragilisポリペプチドを与えるステップ、(b)StellaまたはFragilisポリペプチドと候補分子を接触させるステップ、および(c)場合により、候補分子とStellaまたはFragilisポリペプチドの間の結合を検出するステップを含む。
【００３９】
本発明の第28の態様に従って、StellaまたはFragilisのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を提供し、この方法は、(a)StellaまたはFragilisポリペプチドを与えるステップ、(b)StellaまたはFragilisポリペプチドと候補分子を接触させるステップ、および(c)StellaまたはFragilisポリペプチドの活性の調節を検出するステップを含む。
【００４０】
ポリペプチドは、好ましくはライブラリーの形の複数の候補分子と接触させることが好ましい。
【００４１】
本発明者らは、本発明の第29の態様に従って、個体の疾患の治療法または予防法における、好ましくは前述の態様のいずれかに記載の方法によって同定される、StellaまたはFragilisのアンタゴニストの使用を提供する。
【００４２】
配列表
配列番号1は、マウスFragilisの核酸配列を示し、一方、配列番号2は、マウスStellaの核酸配列を示す。
【００４３】
配列番号3はヒトStellaの核酸配列を示し、配列番号4はヒトStellaのアミノ酸配列を示し、配列番号5はヒトFragilis 1-8Dの核酸配列を示し、配列番号6はヒトFragilis 1-8Dのアミノ酸配列を示し、配列番号7はヒトFragilis 9-27/Leu13の核酸配列を示し、配列番号8はヒトFragilis 9-27/Leu13のアミノ酸配列を示し、配列番号9はマウスFragilis 2の核酸配列を示し、配列番号10はマウスFragilis 2のアミノ酸配列を示し、配列番号11はマウスFragilis 3の核酸配列を示し、配列番号12はマウスFragilis 3のアミノ酸配列を示し、配列番号13はマウスFragilis 4の核酸配列を示し、配列番号14はマウスFragilis 4のアミノ酸配列を示し、配列番号15はマウスFragilis 5の核酸配列を示し、配列番号16はマウスFragilis 5のアミノ酸配列を示し、配列番号17はマウスFragilis 6の核酸配列を示し、配列番号18はマウスFragilis 6のアミノ酸配列を示す。
【００４４】
詳細な説明
本発明の実施は、他に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来的技法を使用するものであり、これらは当業者の能力の範囲内である。このような技法は、文献中で説明されている。例えば、J.Sambrook、E.F.Fritsch、およびT.Maniatis、1989、Molecular Cloning.A Laboratory Manual、Second Edition、Books1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel、F.M.他(1995および定期的追補;Current Protocols in Molecular Biology、ch.9、13、および16、John Wiley & Sons、New York、N.Y.);B.Roe、J.Crabtree、およびA.Kahn、1996、DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques、John Wiley & Sons;J.M.PolakおよびJames O'D.McGee、1990、In Situ Hybridization:PrinciplesおよびPractice;Oxford University Press;M.J.Gait(Editor)、1984、Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach、Irl Press;D.M.J.LilleyおよびJ.E.Dahlberg、1992、Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology、Academic Press;Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol NO.I by Edward Harlow、David Lane、Ed Harlow(1999、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ISBN 0-87969-544-7);Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow(Editor)
、David Lane(Editor)(1988、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ISBN 0-87969-314-2)、1855.Handbook of Drug Screening、Ramakrishna Seethala編、Prabhavathi B.Fernandes(2001、New York、NY、Marcel Dekker、ISBN 0-8247-0562-9);およびLab Ref:A Handbook of Recipes、Reagents、およびOther Reference Tools for Use at the Bench、Edited Jane Roskams and Linda Rodgers、2002、Cold Spring Harbor Laboratory、ISBN 0-87969-630-3を参照のこと。これらの一般的教本のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。
【００４５】
STELLAおよびFRAGILIS
本開示は、FragilisおよびStella核酸、ポリペプチド、ならびにその断片、相同体、変異体および誘導体を一般に提供する。特に本発明者らは、ヒトStellaおよびFragilis核酸、ポリペプチド、および断片などを提供する。
【００４６】
名称「Fragilis」と「GCR1」は、互いに同義のものとして理解すべきであり、同様に、「Stella」と「GCR2」は同義であるとみなすべきである。一般に、文脈が他に必要としない限り、用語「Fragilis」は、Fragilis自体、Fragilis 9-27、Fragilis 2、Fragilis 3、Fragilis 4、Fragilis 5およびFragilis 6を含めたFragilisファミリーの任意のメンバーを指すと解釈すべきである。さらに、Ifitm1、Ifitm2、Ifitm3およびENSG142056は、用語「Fragilis」に含まれることが好ましい。開示するStellaおよびFragilis配列は、高等動物、例えば霊長類、特にホモサピエンス(ヒト)に由来することが好ましい。
【００４７】
したがって、好ましい実施形態ではFragilisは、文脈が必要とするときは、配列番号5で示されるヒト核酸配列、または配列番号6で示されるヒトアミノ酸配列を指すと解釈すべきである。さらに、好ましい実施形態ではStellaは、文脈が必要とするときは、配列番号3で示されるヒト核酸配列、または配列番号4で示されるヒトアミノ酸配列を指すと解釈すべきである。
【００４８】
ヒトStellaおよびFragilisは、PCT/GB02/00215に開示されるマウスStellaおよびFragilis配列と、相同性および機能によって関連付けられ、本文書中では配列番号1および配列番号2としても述べられる。FragilisおよびStellaは、PGC特異的な転写産物である。FragilisはPGCの系列関与のプロセス中に上方制御され、一方StellaはFragilisの後に上方制御され、PGCの運命への関与を示す。
【００４９】
ヒトFragilis(生殖細胞制限的-1、GCR1としても知られる)は、132のアミノ酸タンパク質をコードしており、予想分子量は14.5kDである。EMBLプログラムPredictProteinの最適モデルによって、外側に位置するN末端およびC末端の2つの経膜ドメインが予想される。BLASTP検索によって、Fragilisがインターフェロン誘導性タンパク質ファミリーの新規な要素であることが明らかになった。1つの原型要素、ヒト9-27(Leu-13抗原と同一)は、白血球および内皮細胞中のインターフェロンによって誘導され、抗増殖性および同型接着シグナルの変換と関連がある、マルチマー複合体の要素として細胞表面に位置する(Deblandre、1995)。BLASTN検索によって、Fragilis配列が、胚および成体からの多くの異なる組織に由来するEST中で発見されたことが明らかになり、Fragilisが、癌を含めた異なる発生および細胞生物学的概念において、共通の役割を果たしている可能性があることが示され、このことは以下でさらに詳細に記載する。データベース検索によって、未知の機能を有するラットのインターフェロン誘導性タンパク質(sp:INIBRAT、pir:JC1241)との配列の整合性が明らかである。Fragilis配列は、本発明者らのスクリーニングでは数倍出現するようであり、PGC中での高レベルの発現が示される。
【００５０】
第2の遺伝子、ヒトStella、(Stella)は、159のアミノ酸タンパク質をコードしており、17.5kDである。この遺伝子は、ネズミおよび齧歯類Stella以外の任意の知られているタンパク質と配列相同性がなく、幾つかの核局在コンセンサス配列を含み、非常に塩基性pIであり、DNAとの考えられる親和性が示される。さらに、考えられる核輸送シグナルが同定され、Stellaが、核と細胞質の間を動く可能性があることが示される。BLASTN分析によって、Stella配列は着床前胚および生殖系(新生児卵巣、メス12.5中腎および性腺など)ESTのみで見られることが明らかであり、全能性および多能性細胞中でのその主な発現が示される。興味深いことに、StellaはそのN末端に、SAPモチーフとある程度の配列同一性を有する、調節ドメインを含むことを、本発明者らは発見した。このモチーフは、染色体編成と関係がある推定DNA結合ドメインである。さらに、SMARTプログラムによって、そのC末端のスプライシング因子モチーフ様構造の存在が明らかであり、これらの発見によって、染色体編成およびRNAプロセシングにおける、Stellaの考えられる関与が示される。
【００５１】
Fragilisおよび/またはStellaポリペプチドに対して、抗体を産生することができる。特に、経膜ポリペプチドである、Fragilisの細胞外ドメインに対して、抗体を産生することができる。
【００５２】
ここで開示する抗体、ポリペプチドおよび核酸は、細胞集団中のPGCを同定するのに有用である。したがって、ここに記載する方法および組成物によって、例えば生殖組織の発生およびトランスジェニック動物の作製の研究に有用なPGCを単離するための手段およびここに記載する方法によって単離したときのPGCが提供される。
【００５３】
FragilisおよびStellaの相同体を使用して、PGCおよびESまたはEG細胞などの他の多能性細胞を同定することもできる。
【００５４】
さらに、ここに記載する方法および組成物は、分化および細胞運命の調節におけるStellaおよびFragilisの役割に鑑みて、癌を治療または予防するのに有用である。
【００５５】
ヒトSTELLAおよびFRAGILIS
ネズミStellaおよびFragilis遺伝子を、実施例に示す方法によって単離する。これらについては、本発明者らの国際出願PCT/GB02/00215中に詳細に開示する。単離したネズミFragilis配列は配列番号1として示し、一方マウスStella配列は配列番号2として示す。
【００５６】
ヒトのStellaおよびFragilisの相同体を、以下の項でさらに詳細に記載し、(必要な場合)、標準的な技法によって、同定およびクローニングすることができる。
【００５７】
ヒトSTELLA
ヒトStella核酸配列
[配列表1]
2005532808.tif 000003
【００５８】
ヒトStellaアミノ酸配列
[配列表2]
2005532808.tif 000004
【００５９】
ヒトStellaの発現
ヒトStellaは、精巣、結腸、肺、子宮、および胚中心B細胞を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００６０】
ヒトStellaの疾患
ヒトStellaの異常な発現と関係がある疾患には、精巣腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、肺癌、大細胞癌、子宮癌、および平滑筋肉腫がある。
【００６１】
したがってヒトStellaは、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００６２】
ヒトFRAGILIS
ヒトFragilisはFragilis 1-8Dとも呼ぶ。
【００６３】
ヒトFragilis核酸配列
[配列表3]
2005532808.tif 000005
【００６４】
ヒトFragilisアミノ酸配列
[配列表4]
2005532808.tif 000006
【００６５】
ヒトFragilisのゲノム位置
ヒトFragilisは、染色体11上、染色体位置11p15.5に位置する。
【００６６】
ヒトFragilisの疾患
ヒトFragilis 1-8Dは、胃;腺癌;腺癌細胞系;脂肪;クッシング症候群の副腎皮質腺腫;副腎;大動脈;腹水;骨;骨髄;脳;乳;乳、正常;軟骨;子宮頚癌細胞系;結腸;結腸、内側;クローン病を有する3人の患者由来の結腸粘膜;さい帯血;対応する非癌性肝臓組織;胚癌腫;胚癌腫、細胞系;子宮内膜、腺癌細胞系;類上皮癌腫;類上皮癌腫細胞系;眼;包皮;4プールのあまり分化していない腺癌;急性骨髄性白血病由来;慢性骨髄性白血病由来;胆嚢;頭部、首;心臓;肝細胞癌、細胞系;ヒト網膜;ヒト骨格筋;副腎腫;副腎腫、細胞系;視床下部、細胞系;インスリノーマ;虹彩;ランゲルハンス島;腎臓;腎臓、腫瘍;大細胞癌;大細胞癌、未分化;平滑筋肉腫;平滑筋肉腫細胞系;レンズ;白血球;肝臓;肺;肺巣状繊維;肺、正常;肺腫瘍;リンパ;髄質;転移性軟骨肉腫;混合型(40masのプール);粘膜表皮癌腫;筋肉;筋肉(骨格筋);神経芽腫細胞;正常な上皮;正常な頭部/首部組織;視神経;骨肉腫、細胞系;卵巣;卵巣(3つのプール);膵臓;乳頭状漿液卵巣癌、転移性;副甲状腺;クロム親和性細胞腫;下垂体;胎盤;胎盤、正常;プール;プールした脳、肺、精巣;プールした結腸、腎臓、胃;プールした肺および脾臓;プールした膵臓および脾臓;扁桃由来の主要b-細胞(細胞系);主要な肺上皮細胞;原始神経外胚葉;前立腺;前立腺、正常;前立腺腫瘍;精製した膵島;腎細胞腺癌;網膜上皮色素および脈絡膜;乳頭状漿液腫瘍;皮膚;脾臓;扁平上皮癌、あまり分化していない(4プールの腫瘍、原発性および転移性);胃;軟骨下骨;精巣;精巣、正常;甲状腺;扁桃;2つのプールした扁平上皮癌;子宮;子宮、腫瘍;完全な胚を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００６７】
したがってヒトFragilisは、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００６８】
ヒトFragilis 9-27/LEU13
ヒトFragilisと関係がある配列、すなわちヒトFragilis 9-27(Leu13としても知られる)も同定する。この配列は、Fragilisファミリーのタンパク質の要素を含む。
【００６９】
ヒトFragilis 9-27/Leu13核酸配列
[配列表5]
2005532808.tif 000007
【００７０】
ヒトFragilis 9-27/Leu13アミノ酸配列
[配列表6]
2005532808.tif 000008
【００７１】
ヒトFragilis 9-27/Leu13のゲノム位置
ヒトFragilis 9-27/Leu13は、染色体11上に位置する。
【００７２】
ヒトFragilis 9-27/Leu13の疾患
ヒトFragilis 9-27/Leu13は、胃;腺癌;腺癌、細胞系;脂肪;クッシング症候群の副腎皮質腺腫;羊膜、正常;腹水;骨;骨髄;脳;乳;子宮頚癌細胞系;軟骨肉腫;結腸;結腸、内側;さい帯血;耳;胚癌腫;流行性腫瘍;類上皮癌腫;眼;眼前方部;急性骨髄性白血病由来;慢性骨髄性白血病由来;生殖細胞;頭部、首;首、正常;心臓;ヒト網膜;視床下部、細胞系;インスリノーマ;腎臓;腎臓腫瘍;大細胞癌;大細胞癌、未分化;平滑筋腫;平滑筋肉腫;白血球;肝臓;肺;肺、正常;リンパ;髄質;混合型(40masのプール);粘膜表皮癌腫;筋肉;筋肉(骨格筋);神経腫瘍;正常な頭部/首部組織;鼻;視神経;変形性軟骨;卵巣;膵臓;乳頭状漿液卵巣癌、転移性;副甲状腺;クロム親和性細胞腫;下垂体;胎盤;胎盤、正常;プール;プールした;プールした脳、肺、精巣;プールした膵臓および脾臓;扁桃由来の主要b-細胞(細胞系);原始神経外胚葉;前立腺;前立腺、正常;精製した膵島;網膜上皮色素層;網膜上皮色素および脈絡膜;皮膚;脾臓;胃;精巣、細胞系;精巣、正常;扁桃;小柱網;子宮;子宮、腫瘍;完全な胚を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００７３】
したがってヒトFragilis 9-27/Leu13は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００７４】
マウスFRAGILIS2
さらに本発明者らは、幾つかのマウスの配列を同定し(すなわち、Fragilis 2、Fragilis 3、Fragilis 4、Fragilis 5およびFragilis 6)、これらはFragilisと関係があり、Fragilisファミリーのメンバーを含む。
【００７５】
マウスFragilis 2核酸配列
[配列表7]
2005532808.tif 000009
【００７６】
マウスFragilis 2アミノ酸配列
[配列表8]
2005532808.tif 000010
【００７７】
マウスFragilis 2の疾患
マウスFragilis 2は、成体;さい弓;結腸;胚;胚癌腫;頭部;心臓;海馬;肝臓;リンパ;マクロファージ;乳腺;下顎;筋肉;膵臓;プール;プールした肺腫瘍;プールした乳腺腫瘍;唾液腺;皮膚;小腸;脾臓;自然発生腫瘍、乳に転移するもの幹細胞源;胃;脳弓下器官および最後野;t細胞;精巣;胸腺;腫瘍、バイオプシーサンプル;腫瘍、組織全体;腫瘍、乳に転移するもの;子宮;完全な胚を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００７８】
したがって、マウスFragilis 2、およびそのヒト相同体は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００７９】
マウスFragilis 3
マウスFragilis 3核酸配列
[配列表9]
2005532808.tif 000011
【００８０】
マウスFragilis 3アミノ酸配列
[配列表10]
2005532808.tif 000012
【００８１】
マウスFragilis 3のゲノム位置
マウスFragilis 3は、染色体16上に位置する。
【００８２】
マウスFragilis 3の疾患
マウスFragilis 3は、成体;さい弓、円形精子細胞、多数のマウスから集めたもの;精巣を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００８３】
したがって、マウスFragilis 3、およびそのヒト相同体は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００８４】
マウスFragilis 4
マウスFragilis 4核酸配列
[配列表11]
2005532808.tif 000013
【００８５】
マウスFragilis 4アミノ酸配列
[配列表12]
2005532808.tif 000014
【００８６】
マウスFragilis 4の疾患
マウスFragilis 4は、腸;小脳;結腸;胚;頭部;心臓;腎臓;肝臓;肺;リンパ;マクロファージ;乳腺;胎盤;脾臓;自然発生腫瘍、乳に転移するもの幹細胞源;胃;t細胞;胸腺;腫瘍、バイオプシーサンプル;腫瘍、組織全体;腫瘍、乳に転移するもの;膣を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００８７】
したがって、マウスFragilis 4、およびそのヒト相同体は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００８８】
マウスFragilis 5
マウスFragilis 5核酸配列
[配列表13]
2005532808.tif 000015
【００８９】
マウスFragilis 5アミノ酸配列
[配列表14]
2005532808.tif 000016
【００９０】
マウスFragilis 5のゲノム位置
マウスFragilis 5は、染色体6上に位置する。
【００９１】
マウスFragilis 5の疾患
マウスFragilis 5は、胚;腫瘍、組織全体を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００９２】
したがって、マウスFragilis 5、およびそのヒト相同体は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００９３】
マウスFragilis 6
マウスFragilis 6核酸配列
[配列表15]
2005532808.tif 000017
【００９４】
マウスFragilis 6アミノ酸配列
[配列表16]
2005532808.tif 000018
【００９５】
マウスFragilis 6のゲノム位置
マウスFragilis 6は、染色体7上に位置する。
【００９６】
マウスFragilis 6の疾患
マウスFragilis 6は、dbEST Library Tissue Type、脾臓制限的;cDNA源:in vitro受精卵;リンパ;脊髄;脾臓を含めた、幾つかの組織中で発現される。
【００９７】
したがって、マウスFragilis 6、およびそのヒト相同体は、このような組織のまたはこのような組織と関連がある任意の疾患、特にこのような組織の癌または腫瘍を、治療または診断するのに適している。
【００９８】
ヒトIFITM1、IFITM2 IFITM3およびENSG142056
ヒトIfitm1、Ifitm2 Ifitm3
本発明者らは、染色体11(p15.5)上に位置するFragilis遺伝子の4つの相同体を開示する。この領域は、マウスChr7上のFragilisファミリーの遺伝子座と同じ位置に存在する(図9)。これらのタンパク質それぞれをコードする核酸も開示する。
【００９９】
これらの遺伝子の3つ、Ifitm1(9-27)、Ifitm2(1-8D)およびIfitm3(1〜8U)は、fragilis遺伝子クラスターと58〜65%の類似性を共有しており、18kbのゲノム伸長部内に位置する[AR Lewin、LE Reid、M McMahon、GR Stark、IM Kerr:Molecular analysis of a human interferon-inducible gene family.Eur J Biochem 1991、199:417〜423]。
【０１００】
これらの遺伝子は、タイプ1/2のインターフェロンに応答性があり、抗増殖性シグナルおよび同型細胞接着と関連がある、インターフェロン誘導性経膜(Ifitm)タンパク質をコードしている。RL Friedman、SP Manley、M Mcahon、IM Kerr、GR Stark:Transcriptional and posttranscriptional regulation of interferon-induced gene expression in human cells.Cell 1984、38:745〜755;JM Kelly、CS Gilbert、GR Stark、IM Kerr:Differential regulation of interferon-induced mRNAs and c-myc mRNA by alpha- and gamma-interferons.Eur J Biochem 1985、153:367〜371;SS Evans、DB Lee、T Han、TB Tomasi、RL Evans:Monoclonal antibody to the interferon-inducible protein Leu-13triggers aggregation and inhibits proliferation of leukemic B cells.Blood 1990、76(12):2583〜2593;およびSS Evans、RP Collea、JA Leasure、DB Lee:IFN-a induces homotypic adhesion and Leu-13 expression in human B lymphoid cells.J. Immunol 1993、150:736〜747を参照のこと。
【０１０１】
ヒトIfitm遺伝子座内のインターフェロン刺激応答要素(ISRE、GGAAAN(N)GAAAC)は、3つのヒトIfitm遺伝子のインターフェロンに対する応答性を与える(AR Lewin、LE Reid、M McMahon、GR Stark、IM Kerr:Molecular analysis of a human interferon-inducible gene family.Eur J Biochem 1991、199:417〜423;LE Reid、AH Brasnett、CS Gilbert、ACG Porter、DR Gewert、GR Stark、IM Kerr:A single DNA response elemnt can confer inducibility by both alpha-and gamma-interferons.Proc Natl Acad Sci USA 1989、86:840〜844)。同様のISREコンセンサス配列は、特にfragilis、fragilis 2およびfragilis 5と関係がある、マウスのFragilisファミリー群内でも見られる(図9)。
【０１０２】
ヒトENSG142056
本発明者らはさらに、第4の遺伝子ENSG142056、2つのエクソンを有する新規の遺伝子が、マウスfragilis 4(83%のDNA配列類似性)および近隣のIfitm2と非常に類似していることを開示する。したがって、ヒトFragilisファミリー相同体は、マウス中の5つのFragilis遺伝子と同様のゲノムクラスターを形成する。
【０１０３】
他のFragilis相同体
本発明者らは、雌牛の2つのFragilisファミリー様遺伝子(ウシ1〜8U、ウシ9-27)、およびラットの4つの遺伝子(P26376、JC1241、NP110460、AAD48010)も同定した。ラットの遺伝子は、おそらくインターフェロン誘導性として示されるが、ヒトIfitm遺伝子と類似の2
つのウシ遺伝子は、インターフェロンシグナルに応答することが報告されてきている(DJ Hayzer、E Brinson、MS Runge:A rat beta-interferon-induced mRNA:sequence characterization.Gene 1992、117(2):227〜228;17.JK Pru、KJ Austin、AL Haas、TR Hansen:Pregnancy and interferon-tau upregulate gene expression of members of the 1〜8family in the bovine uterus.Biol Reprod 2001、65(5):1471〜1480)。
【０１０４】
ヒトおよびSTELLAの機能
ヒトStellaおよびFragilisの機能を、本文書中で開示する。ヒトStellaおよびFragilisは、それらのマウス対照物の性質を広く示すであろうことも予想される。ここに開示するヒト配列とそれらのマウスStellaおよびFragilisの配列の機能の相同性は、相補性試験によって確認することができる。このような相補性試験の一例は、以下のパラグラフで述べる。
【０１０５】
マウスのStellaおよびFragilisの突然変異体は、遺伝子ノックアウト技術によって、ES細胞を使用することによって、標準的技法を使用することによって作製される。他の詳細は、実施例、特に実施例11〜15中に与える。ヒトSTELLAおよびFRAGILISクローンは、BACライブラリーなどのヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、またはヌクレオチド合成によって、あるいはここで開示する配列を使用するヒトcDNAライブラリーのPCRによって、単離することができる。
【０１０６】
したがって、これらのBACクローンは、ゲノムクローンの卵母細胞へのマイクロインジェクションによって、あるいはウイルスベクターを使用することによるES細胞へのトランスフェクション、リポフェクションによって、マウスゲノム中に導入することができる。ヒトのSTELLAおよびFRAGILISの相同体を担持するトランスジェニックマウスを作製し、マウスのStellaまたはFragilisの突然変異体と交配させる。ヒト相同体が適切な調節配列を含み、したがってマウス遺伝子と同様に発現される場合、それが真の相同体である場合、突然変異マウスの表現型の欠失が克服されるであろう。野生型の表現型は、トランスジェニックノックアウトマウスに戻るであろう。
【０１０７】
BACクローンを改変して、GFPなどのレポーター遺伝子を含ませることができる。マウスゲノムを導入してトランスジェニックマウスを作製すると、レポーター構築体を使用して、ヒト相同体が適切な一時的および空間的発現型を示すかどうか、確認することができる。この発現分析を、前に記載した突然変異体の表現型奪回と組み合わせて、ヒト遺伝子がネズミ遺伝子の相同体であるかどうか、確認されると思われる。
【０１０８】
ネズミ遺伝子およびヒト遺伝子を、ネズミ腫瘍に対するそれらの影響に関して試験することができる、他の方法が存在する。腫瘍が機能獲得の結果である場合、RNAiまたは他のアンチセンス手法を使用して、抑制が表現型を変えるかどうかを調べることが可能であると思われる。腫瘍が機能の損失の結果生じる場合、トランス遺伝子(BACなど、あるいは適切な組織特異的制御配列の調節下)を、細胞またはマウスに導入して、それらが腫瘍に対して影響があるかどうかを調べることができる。
【０１０９】
BAC改変およびトランスジェニックマウスの作製に関する手順は、John、R M他、Developmental Biology、volume236、2001に記載された技法、または任意の他の適切な技法を使用することができる。
【０１１０】
STELLAの疾患およびFRAGILIS関連疾患
ヒトStellaおよびFragilisは、以下でさらに詳細に記載するように、幾つかの組織および細胞、特に幾つかの腫瘍または癌細胞および組織で発現される。したがって、ここに記載するStellaおよび/またはFragilisポリペプチド、核酸、抗体、ペプチドなどは、このような組織および細胞と関連がある任意の疾患、例えば組織および細胞の腫瘍または癌の診断および/または治療または予防において、使用することができる。
【０１１１】
StellaおよびFragilisと関連がある疾患の例は、個々のStellaおよびFragilis配列に関する前の項で述べている。
【０１１２】
このような腫瘍および癌の個々の他の例には、精巣腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、肺腫瘍、大細胞癌、子宮腫瘍、および平滑筋肉腫があるが、これらだけには限られない。あるいは、もしくは追加的に、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患には、以下の腺癌;クッシング症候群の副腎皮質腺腫;子宮頚癌;クローン病;胚癌腫;子宮内膜腺癌;類上皮癌腫;あまり分化していない腺癌;急性骨髄性白血病;慢性骨髄性白血病;肝細胞癌;副腎腫;インスリノーマ;虹彩;腎臓腫瘍;大細胞癌;大細胞癌、未分化;平滑筋肉腫;肺巣状繊維;転移性軟骨肉腫;粘膜表皮癌腫;神経芽腫;乳頭状漿液卵巣癌、転移性;副甲状腺;クロム親和性細胞腫;前立腺腫瘍;乳頭状漿液腫瘍;扁平上皮癌、好ましくはあまり分化していないものを含めた組織の任意の1つまたは複数の疾患がある。
【０１１３】
STELLAおよびFRAGILISポリペプチド
ここに開示するポリペプチド配列は、配列表に述べる特定の配列、またはその断片、あるいはFragilisまたはStellaタンパク質から得られる配列に限られず、任意の源、例えば、関連細胞の相同体、他種およびその変異体または誘導体からの相同体から得られる相同配列も含むことは理解されよう。ただしそれらは、場合により、StellaまたはFragilis(Fragilis 2、3、4、5および6などの関連配列含む)の生物学的活性の少なくとも1つを有するものとする。
【０１１４】
したがって本開示は、配列表中を含めて本記載中に述べるアミノ酸配列の変異体、相同体、または誘導体、ならびにここに開示するヌクレオチド配列にコードされている、アミノ酸配列の変異体、相同体、または誘導体を含む。好ましい実施形態では、StellaおよびFragilisの相同体および変異体は、PCT/GB02/00215に開示された配列は含まず、詳細にはそれぞれ配列番号2および1で述べられる、マウスStellaおよびFragilis配列は含まない。さらにそれらは、いかなる機能も記さずに前に開示したこれらの遺伝子、例えばAC006927.26.74831.117191(染色体12、p12.3)のいかなる配列部分も含まないことが好ましい。特に、好ましい実施形態は、開示された可能性がある任意のEST(発現配列タグ)、例えば以下のEST:gi|1953020|gb|AA300687.1|AA300687 EST13535精巣腫瘍cDNA5'端;gi|8149136|gb|AW959452.1|AW959452 EST371522 MAGEre配列、MAGF cDNA(結腸腫瘍);gi|10896747|gb|BF091037.1|BF091037 MR3-SN0036-120900-007-h05SNO036 cDNA(胃、正常);およびgi|3367222|gb|AI066520.1|AI066520ovl7hOl.xlNCI_CGAP_GC3e cDNAクローンIMAGE:1637617 3'(集めた生殖細胞腫瘍)のいずれかの1つまたは複数を含まない。
【０１１５】
他の好ましい実施形態では、StellaおよびFragilisの変異体、相同体などは、以下のESTのいずれかの1つまたは複数を含まない:
gi|2335869|gb|AA564230.1|AA564230 nk43h01.s1 NCI_CGAP_GC2cDNAクローンIMAGE:1016305 3'(生殖細胞腫瘍);gi|3076239|gb|AA927342.1|AA927342 om69eO5.s1 NCI_CGAP_GC4 cDNAクローンIMAGE:1552448 3'(集めた生殖細胞腫瘍); gi|2959237|gb|AA864924.1|AA864924 oh44hO8.sl NCI_CGAP_GC4 cDNAクローンIMAGE:1469535 3'(集めた生殖細胞腫瘍);
gi|9512276|gb|BE466414.1|BE466414 hz2ld11.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:3208629 3'(集めた生殖細胞腫瘍);gi|5837653|gb|AI990772.l|AI990772ws23fO2.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAcDNAクローンIMAGE:2498043 3'(集めた生殖細胞腫瘍);gi|5741162|gb|AI948852.1|AI948852 wq37cO9.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:2473456 3'(集めた生殖細胞腫瘍);
gi|4734510|gb|AI650531.1|AI650531 wa92b04.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:2303599 3'(集めた生殖細胞腫瘍);gi|5849349|gb|A W002433.1|AW002433 wu61hO7.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:2524573 3'(集めた生殖細胞腫瘍); gi|5746921|gb|AI954611.1|AI954611 wq34b05.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:2473137 3'(集めた生殖細胞腫瘍);
gi|4735956|gb|AI651977.1|AI651977 wb64h02.x1 NCI_CGAP_GC6 cDNAクローンIMAGE:2310483 3'(集めた生殖細胞腫瘍);gi|19763950|gb|BQ028671.1|BQ028671 UI-1-EEO-ayz-b-02-0-UI.s1;NCI_CGAP_P17 cDNAクローンUI-I-EEO-ayz-b-02-0-UI 3'(絨毛癌);gi|9890324|gb|BE619386.1|BE619386 601473204F1 NIH_MGC_68 cDNAクローンIMAGE:3876145 5'(肺、大細胞癌);
gi|l0344247|gb|BE888191.1|BE888191 601511709F1 NIH_MGC_71 cDNAクローンIMAGE:3912866 5'(子宮、平滑筋肉腫);および
gi|1933621|gb|AA286758.1|AA286758 zs5lal1.r1 NC1_CGAP_GCB1 cDNAクローンIMAGE:7009885'(胚中心B細胞)。
【０１１６】
相同体
開示するポリペプチドは、任意の源、例えば関連ウイルス/細菌タンパク質、細胞の相同体および合成ペプチド、ならびにそれらの変異体または誘導体から得られる相同配列を含む。したがってポリペプチドは、哺乳動物(例えばマウス、ラットまたはウサギ)、特に霊長類、さらに詳細にはヒトなどの動物を含めた他種由来のFragilisおよび/またはStellaの相同体をコードする配列も含む。より詳細には、相同体はヒト相同体を含む。
【０１１７】
本発明の文書の文脈では、相同配列または相同体は、例えば本明細書の配列表に示すように、FragilisまたはStellaと、少なくとも30、好ましくは50、70、90または100のアミノ酸に関するアミノ酸レベルが、少なくとも60、70、80または90%同一である、好ましくは少なくとも95または98%同一である、アミノ酸配列を含むと解釈される。本文書の文脈では、相同配列は、FragilisまたはStellaの配列、例えばFragilis(配列番号6)およびStella(配列番号4)、またはFragilisファミリーのメンバーの配列Fragilis 9-27(配列番号8で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 2(配列番号10で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 3(配列番号12で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 4(配列番号14で示される配列を含むことが好ましい)、Fragilis 5(配列番号16で示される配列を含むことが好ましい)およびFragilis 6(配列番号18で示される配列を含むことが好ましい)と、好ましくは少なくとも50または100、好ましくは200、300、400または500のアミノ酸に関するアミノ酸レベルが、少なくとも15、20、25、30、40、50、60、70、80または90%同一である、好ましくは少なくとも95または98%同一である、アミノ酸配列を含むと解釈される。
【０１１８】
相同性は類似性の点で考えることもできるが(すなわち、類似の化学的性質/機能を有するアミノ酸残基)、本発明の文書の文脈では、配列同一性の点で、相同性を表すことが好ましい。
【０１１９】
相同性の比較は、肉眼によって行うことができ、あるいはさらに通常は、容易に利用可能な配列比較プログラムによって行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間の相同性の割合を計算することができる。
【０１２０】
相同性の割合は、隣接配列に関して計算することができる。すなわち、1つの配列が他の配列と一直線に並んでおり、1つの配列中のそれぞれのアミノ酸は、他の配列中の対応するアミノ酸と、1度に1つの残基を直接比較される。これは「非ギャップ」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような非ギャップアラインメントは、比較的少数の残基(例えば50未満の隣接アミノ酸)に関してのみ行われる。
【０１２１】
これは非常に簡単で堅実な方法であるが、例えば、他の同一の配列対において、1つの挿入または欠失によって、以下のアミノ酸残基がアラインメントから除外され、したがって、全体的なアラインメントを行うと、相同性の割合の大幅な低下がおそらく生じるであろうことは考慮に入れていない。したがって、大部分の配列比較法は、全体的な相同性の値を過度に害さない、考えられる挿入および欠失を考慮に入れた、最適なアラインメントを生み出すように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して、局所の相同性を最大にすることを試みることによって行われる。
【０１２２】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントに存在するそれぞれのギャップに、「ギャップペナルティー」を割り当て、その結果、同数の同一のアミノ酸に関して、2つの比較配列間の高い関連性を表す、可能な限り少数のギャップを有する配列アラインメントによって、多数のギャップを有するものより高い値が得られるであろう。「アフィンギャップコスト」が典型的には使用され、これはギャップの存在に関する比較的高いコスト、およびギャップ中のそれぞれの二次的残基に関する小さなペナルティーを課す。これは、最も一般的に使用されるギャップのスコアシステムである。高いギャップペナルティーは当然ながら、少数のギャップを有する最適なアラインメントを生み出すであろう。大部分のアラインメントプログラムによって、ギャップペナルティーを変えることが可能である。しかしながら、配列比較用にこのようなソフトウェアを使用するときは、デフォルト値を使用することが好ましい。例えばGCG Wisconsin Bestfitパッケージ(以下参照)を使用するときは、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに関しては12、それぞれの伸長部に関しては4である。
【０１２３】
したがって、最大の相同性の割合の計算は、ギャップペナルティーを考慮に入れて、最適なアラインメントを生み出すことを第一に必要とする。このようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestftパッケージ(University of Wisconsin、U.S.A.;Devereux他、1984、Nucleic Acids Research 12:387)である。配列比較を実施することができる、他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ(Ausubel他、1999同書、18章を参照)、FASTA(Atschul他、1990、J.Mol.Biol、403〜410)、および比較ツールのGENEWORKSスイートがあるが、これらだけには限られない。BLASTとFASTAの両方が、オフラインおよびオンライン検索用に利用可能である(Ausubel他、1999同書、7-58〜7-60ページを参照)。しかしながら、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。
【０１２４】
最終的な相同性の割合は同一性について測定することができるが、アラインメントプロセス自体は典型的には、全か無かの対の比較に基づくものではない。その代りに、化学的類似性または進化距離に基づいて、それぞれの対ごとの比較に値を割り当てる、測定した類似性のスコアマトリクスを一般的に使用する。一般的に使用されるこのようなマトリクスの一例は、BLOSUM62マトリクス-BLASTスイートのプログラム用のデフォルトマトリクスである。GCG Wisconsinプログラムは、パブリックデフォルト値、または供給された場合は一般記号比較表(他の詳細に関してはユーザーマニュアルを参照のこと)を一般的に使用する。GCGパッケージのパブリックデフォルト値、あるいは他のソフトウェアの場合はBLOSUM62などのデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。
【０１２５】
ソフトウェアにより最適なアラインメントが得られると、相同性の割合、好ましくは配列同一性の割合を計算することができる。ソフトウェアは典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数的結果をもたらす。
【０１２６】
変異体および誘導体
ここに記載するアミノ酸配列に関する用語「変異体」または「誘導体」は、配列由来または配列の1つ(または複数)のアミノ酸の任意の置換体、変異体、修飾体、交換体、欠失体、付加体を含む。好ましくは、生成するアミノ酸配列は、非修飾配列と実質的に同じ活性を保持しており、配列表に示すFragilisおよび/またはStellaポリペプチドと、少なくとも同じ活性を好ましくは有する。したがって、配列の重要な特徴、すなわちそれらがPGCおよび他の多能性細胞、ESまたはEG細胞などに特異的であり、細胞集団中でこれらの細胞のマーカーとして働くことができることが、保持されることが好ましい。
【０１２７】
実施例中に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいはその断片または相同体は、ここに記載する方法および組成物に使用するために、修飾することができる。典型的には、配列の生物学的活性を保つ修飾を行う。アミノ酸の置換は、例えば1、2または3〜10、20または30個の置換で行うことができる。ただし修飾配列は、非修飾配列の生物学的活性を保持するものとする。アミノ酸の置換は、非天然類似体の使用、例えば治療的に投与するポリペプチドの血漿半減期を増大させることを、含むことができる。
【０１２８】
FragilisおよびStellaの天然の変異体は、保存的なアミノ酸の置換を含む可能性がある。保存的な置換は、例えば以下の表に従って定義することができる。第二列の同ブロック、好ましくは第三列の同ラインのアミノ酸は、互いに置換することができる。
【０１２９】
【表１】
2005532808.tif 000019
【０１３０】
断片
ここに開示し、マーカーとして有用なポリペプチドは、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、および配列番号18で述べる配列の断片を含めた、前述の完全長ポリペプチド、およびその変異体の断片も含む。
【０１３１】
ポリペプチドは、任意のFragilisおよび/またはStellaポリペプチドの完全長配列の断片も含む。断片は、少なくとも1つのエピトープを含むことが好ましい。エピトープを同定する方法は、当分野ではよく知られている。断片は典型的には、少なくとも6個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも10、20、30、50または100個のアミノ酸を含む。
【０１３２】
Fragilisおよび/またはStellaアミノ酸配列由来の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145または150個、あるいはより多くの残基を含む、好ましくはこれらからなる、断片が含まれる。
【０１３３】
Stella/Fragilisタンパク質、およびその対立遺伝子および種変異体のポリペプチド断片は、保存置換体を含めた、1つまたは複数の(例えば5、10、15または20個の)置換体、欠失体または挿入体を含むことができる。置換体、欠失体および/または挿入体が存在する場合、例えば異なる種において、配列表に示す50%、40%または20%未満のアミノ酸残基が、改変されていることが好ましい。
【０１３４】
FragilisおよびStella、ならびにそれらの断片、相同体、変異体、および誘導体は組換え手段によって作製することができる。しかしながら、それらは、当業者によく知られている技法を使用する、固相合成などの合成手段によって作製することもできる。タンパク質を融合タンパク質として生成して、例えば抽出および精製に助力することもできる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、6xHis、GAL4(DNA結合および/または転写活性化ドメイン)およびβ-ガラクトシダーゼがある。融合タンパク質パートナーと当該のタンパク質配列の間にタンパク質分解切断部位を封入して、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも、好都合である可能性がある。融合タンパク質は、当該配列のタンパク質の機能を害さないことが好ましい。動物細胞由来の細胞抽出物の精製によって、タンパク質を得ることもできる。
【０１３５】
ここに開示するFragilisおよび/またはStellaポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、実質的に単離された形であってよい。このようなポリペプチドは、意図する目的のタンパク質を害さない担体または希釈剤と混合することができ、依然として実質的に単離されたものとしてみなすことができることは理解されよう。Fragilis/Stellaの変異体、相同体、断片または誘導体は、実質的に精製された形であってもよく、この場合は調製物中にタンパク質が一般に含まれ、90%を超える、例えば95%、98%または99%の調製物中のタンパク質がタンパク質である。
【０１３６】
ここに開示するFragilis/Stellaポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、明示標識で標識することができる。明示標識は、ポリペプチドなどを検出することができる、任意の適切な標識であってよい。適切な標識には、例えば125Iなどの放射性標識、酵素、抗体、ポリヌクレオチド、およびビオチンなどの連結基がある。標識ポリペプチドを、イムノアッセイなどの診断手順において使用して、サンプル中のポリペプチドの量を測定することができる。ポリペプチドまたは標識ポリペプチドを、標準的プロトコルを使用して動物およびヒト中の前記ポリペプチドに対する免疫反応性を検出するために、血清学的または細胞仲介イムノアッセイにおいて使用することもできる。
【０１３７】
場合によっては標識される、ここに開示するFragilis/Stellaポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、固相、例えばイムノアッセイ用ウエルまたはディップスティックの表面に固定することもできる。このような標識および/または固定ポリペプチドは、適切な試薬、対照、教示書などを含む、キット中、適切な容器中にパッケージすることができる。このようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによるポリペプチドまたはその対立遺伝子または種変異体に対する抗体の検出法において、使用することができる。
【０１３８】
イムノアッセイ法は当分野ではよく知られており、(a)前記タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを提供すること、(b)抗体-抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生物サンプルを前記ポリペプチドと共にインキュベーションすること、および(c)前記ポリペプチドを含む抗体-抗原複合体が形成されるかどうかを判定することを一般に含む。
【０１３９】
ここに開示するFragilis/Stellaポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、in vitroまたはin vivoの細胞培養系で使用して、疾患におけるその役割を含めた細胞機能における、これらの対応する遺伝子およびその相同体の役割を試験することができる。例えば、切断または修飾ポリペプチドを細胞中に導入して、細胞中に存在する正常な機能を害することができる。ポリペプチドは、組換え発現ベクター由来のポリペプチドのin situ発現によって、細胞中に導入することができる(以下参照)。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を調節するための誘導性プロモーターを、場合によっては担持する。
【０１４０】
昆虫細胞または哺乳動物細胞などの適切な宿主細胞の使用は、このような翻訳後の修飾(例えばミリスチン化、グリコシル化、切断、ラピデーション(lapidation)、およびチロシン、セリンまたはスレオニンのリン酸化)を必要とされるようにもたらして、最適な生物学的活性を組換え発現産物に与えると予想される。ここに開示するFragilis/Stellaポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体が発現される、このような細胞培養系をアッセイ系で使用して、細胞中のポリペプチドの機能を害するかあるいは高める、候補物質を同定することができる。
【０１４１】
FRAGILIS/STELLA核酸
本発明者らは、幾つかのFragilisおよびStella核酸、およびその断片、相同体、変異体、および誘導体を概略的に提供する。これらの核酸配列は、ここに開示する、特に配列表に開示する、ポリペプチド配列をコードすることが好ましい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、Stellaおよび/またはFragilis核酸、好ましくは配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15および配列番号17からなる群から選択される核酸、またはその断片、相同体、変異体、および誘導体を含む。
【０１４２】
特に本発明者らは、ここに開示するFragilisおよび/またはStellaポリペプチドのいずれかをコードする、核酸を提供する。したがって、用語「GCR核酸」、「Fragilis核酸」および「Stella核酸」は、それに応じて解釈されたい。しかしながら好ましくは、このような核酸は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15および配列番号17として述べる任意の配列、または任意の対応するポリペプチドをコードする配列、およびこのような核酸の断片、相同体、変異体、または誘導体を含む。したがって、前述の用語は好ましくは、これらの配列を指すと解釈されたい。
【０１４３】
好ましい実施形態では、Stella核酸は配列番号3で述べる配列を有する核酸を含み、Fragilis核酸は配列番号5で述べる配列を有する核酸を含む。しかしながら、任意のFragilisファミリーのメンバー、例えば:Fragilis 9-27(好ましくは配列番号7で示される配列)、Fragilis 2(好ましくは配列番号9で示される配列)、Fragilis 3(好ましくは配列番号11で示される配列)、Fragilis 4(好ましくは配列番号13で示される配列)、Fragilis 5(好ましくは配列番号15で示される配列)およびFragilis 6(好ましくは配列番号17で示される配列)をコードする核酸も含まれる。
【０１４４】
ここで使用するように本文書中では、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および核酸は、互いに同義であるものとする。「ポリヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは非修飾RNAまたはDNA、または修飾RNAまたはDNAであってよい。「ポリヌクレオチド」は、非制限的に、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖と二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、および一本鎖と二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖と二本鎖領域の混合物であってよい、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」は、RNAまたはDNA、あるいはRNAとDNAの両方を含む三連鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾塩基を含むDNAまたはRNA、および安定性または他の理由で修飾された骨格を有するDNAまたはRNAも含む。「修飾」塩基は、例えばトリチル化塩基および異常塩基、イノシンなどを含む。様々な修飾がDNAおよびRNAになされており;したがって「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られる、化学、酵素、または代謝修飾形のポリヌクレオチド、およびウイルスおよび細胞に特徴的な化学形のDNAおよびRNAを含む。「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドとしばしば呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
【０１４５】
多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸は、遺伝コードの縮重の結果として、同じポリヌクレオチドをコードすることができることは、当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者は通常の技法を使用して、ここに記載するポリヌクレオチドにコードされているポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドンの使用を反映することができることは理解されよう。
【０１４６】
変異体、誘導体および相同体
ここに記載するポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAを含むことができる。これらは一本鎖または二本鎖であってよい。これらは、その中に合成または修飾ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドへの幾つかの異なる型の修飾が、当分野で知られている。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオネート骨格、分子の3'および/または5'端でのアクリジンまたはポリシン鎖の添加がある。本文書の目的のために、本明細書に記載するポリヌクレオチドは、当分野で利用可能な任意の方法によって修飾することができることを理解されたい。このような修飾を行って、in vivo活性またはポリヌクレオチドの寿命を増大させることができる。
【０１４７】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その二重らせんの二本の鎖は、個別または組み合わせて、ここに記載する方法および組成物に含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補配列も含まれることは理解されよう。
【０１４８】
ヌクレオチド配列に関する、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、配列由来または配列のヌクレオチドの1つ(または複数)の任意の置換体、変異体、修飾体、交換体、欠失体、または付加体を含む。ただし、生成するヌクレオチド配列は、多能性細胞に特異的であり、好ましくはPGC、ES細胞またはEG細胞に特異的であるものとする。生成するヌクレオチド配列は、PGCに特異的であることが最も好ましい。
【０１４９】
前に示したように、配列同一性に関しては、「相同体」は、配列表中に示す関連配列と、少なくとも5%の同一性、少なくとも10%の同一性、少なくとも15%の同一性、少なくとも20%の同一性、少なくとも25%の同一性、少なくとも30%の同一性、少なくとも35%の同一性、少なくとも40%の同一性、少なくとも45%の同一性、少なくとも50%の同一性、少なくとも55%の同一性、少なくとも60%の同一性、少なくとも65%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも75%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、あるいは少なくとも95%の同一性を有することが好ましい。
【０１５０】
少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも96%の同一性、より好ましくは少なくとも97%の同一性、より好ましくは少なくとも98%の同一性、より好ましくは少なくとも99%の同一性が存在することがより好ましい。ヌクレオチド相同性の比較は、前に記載したのと同様に実施することができる。好ましい配列比較プログラムは、前に記載したGCG Wisconsin Bestfitプログラムである。デフォルトスコアリングマトリクスは、それぞれの同一ヌクレオチドに関して10、およびそれぞれのミスマッチに関して9のマッチ値を有する。それぞれのヌクレオチドに関して、デフォルトギャップ作製ペナルティーは50であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは3である。
【０１５１】
ハイブリダイゼーション
本発明者らは、本明細書に示す任意の配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体と、あるいは前述の任意のものの相補体と選択的にハイブリダイズすることができる、ヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、少なくとも15ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも20、30、40または50ヌクレオチド長であることが好ましい。
【０１５２】
本明細書で使用する、用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と接合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応の技術で行われる増幅のプロセスを含むものとする。
【０１５３】
本明細書に示すヌクレオチド配列、またはそれらの相補体と、選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、一般に少なくとも20、好ましくは少なくとも25または30、例えば少なくとも40、60または100、あるいはより多くの隣接ヌクレオチドの領域で、本明細書に示す対応するヌクレオチド配列と、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80または90%、およびより好ましくは少なくとも95%または98%相同であろう。
【０１５４】
用語「選択的にハイブリダイズ可能」は、プローブとして使用するポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを大幅に越えるレベルで、プローブとハイブリダイズすることが見出されている条件下で、使用することを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、他のポリヌクレオチドが、例えばスクリーニングするcDNAまたはゲノムDNAライブラリー中に存在するために、起こる可能性がある。この事象では、バックグラウンドは、プローブとライブラリーの非特異的DNA要素間の標的DNAで観察される特異的相互作用の10倍未満、好ましくは100倍未満もの強度の相互作用によって生じるシグナルのレベルを示す。相互作用の強度は、例えばプローブを、例えば32Pで放射標識することによって、測定することができる。
【０１５５】
ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel(1987、Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology、Vol 152、Academic Press、San Diego CA)中に教示されたように、核酸結合複合体の溶解温度(Tm)に基づき、以下で説明するように明確な「厳密性」を与える。
【０１５６】
最高厳密性は約Tm〜5℃(プローブのTm未満の5℃);高厳密性、約5℃〜10℃、Tm未満;中程度厳密性、約10℃〜20℃、Tm未満;および低厳密性、約20℃〜25℃、Tm未満で、典型的には存在する。当業者により理解されるように、最高厳密性のハイブリダイゼーションを使用して、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができ、一方で中程度(あるいは低)厳密性ハイブリダイゼーションを使用して、類似または関連のポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１５７】
好ましい態様において、本発明者らは、厳密条件(例えば65℃およびO.1xSSC{1xSSC=0.15MのNaCl、0.015MのNa3クエン酸pH 7.0})下において、Fragilis/Stella核酸、あるいはその断片、相同体、変異体、または誘導体とハイブリダイズすることができる、ヌクレオチド配列を開示する。
【０１５８】
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その二重らせんの二本の鎖は、個別または組み合わせて、本開示によって含まれる。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補配列も、開示され含まれることを理解されたい。
【０１５９】
ここに開示する配列と100%相同ではないが、本開示の範囲内であるポリヌクレオチドは、幾つかの方法で得ることができる。本明細書に記載する他の変異体の配列は、例えば一定範囲の個体、例えば異なる群からの個体から作製したDNAライブラリーを、プローブ処理することによって得ることができる。さらに、他のウイルス/細菌、または細胞相同体、特に哺乳動物細胞(例えばラット、マウス、ウシ、およびヒト細胞を含めた霊長類細胞)で見られる細胞相同体を得ることができ、このような相同体およびその断片は一般に、本明細書の配列表に示す配列と、選択的にハイブリダイズすることができるであろう。このような配列は、ゲノムDNAから作製したcDNAライブラリー、または他の動物種由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブ処理すること、および中程度〜高厳密性の条件下においてこのようなライブラリーを、配列番号1または3の全部または一部を含むプローブを用いて、プローブ処理することによって得ることができる。類似の考慮事項は、FragilisおよびStellaの種相同体および対立遺伝子変異体を得るために適用される。
【０１６０】
ここに記載するポリヌクレオチドを使用して、プライマー、例えばPCRプライマー、他の増幅反応用プライマー、例えば放射活性または非放射活性標識を使用する従来的手段によって、明らかな標識で標識したプローブを生成することができ、あるいはポリヌクレオチドをベクターにクローニングすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他の断片は、少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、30または40ヌクレオチド長であり、本明細書で使用する用語ポリヌクレオチドにも含まれる。好ましい断片は、500、200、100、50または20ヌクレオチド長未満である。
【０１６１】
DNAポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド、およびプローブは、組換えによって、合成によって、あるいは当業者に利用可能な任意の手段によって、生成することができる。これらは標準的技法によってクローニングすることもできる。
【０１６２】
一般にプライマーは、一度に所望の核酸配列、1ヌクレオチドの段階的製造を含む、合成手段によって生成される。自動化された技法を使用する、これを行うための技法は、当分野では容易に利用可能である。
【０１６３】
長いポリヌクレオチドは一般に、組換え手段を使用して、例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)クローニング技法を使用して生成される。これは、クローニングすることを望む配列領域の側面に、一対のプライマー(例えば、約15〜30のヌクレオチド)を作製すること、動物またはヒト細胞から得たmRNAまたはcDNAとプライマーを接触させること、所望領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行うこと、増幅断片を単離すること(例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって)、および増幅DNAを回収することを含む。適切な制限酵素認識部位を含むようにプライマーを設計して、その結果、増幅DNAを適切なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０１６４】
ヌクレオチドベクター
ポリヌクレオチドは、組換え複製ベクターに取り込ませることができる。ベクターを使用して、適合性のある宿主細胞において核酸を複製することができる。したがって他の実施形態において、本発明者らは、ポリヌクレオチドを複製ベクターに導入すること、ベクターを適合性のある宿主細胞に導入すること、およびベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、ポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収することができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの細菌、酵母菌、哺乳動物細胞系、および他の真核細胞系、例えば昆虫Sf9細胞がある。
【０１６５】
好ましくは、ベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらすことができる調節配列と動作可能に連結している、すなわちベクターは、発現ベクターである。用語「動作可能に連結している」は、記載する要素が、それらがその目的とする方式で機能することができる関係にあることを意味する。コード配列と「動作可能に連結している」制御配列は、コード配列の発現が調節配列と適合性がある条件下で行われるような方法で結び付いている。
【０１６６】
調節配列を、例えば他の転写制御要素を加えることにより改変して、調節配列が対象とする転写のレベルを転写調節物質に対してより応答性があるものにすることができる。
【０１６７】
ベクターを、以下に記載するように適切な宿主細胞に形質転換またトランスフェクトして、タンパク質の発現をもたらすことができる。この方法は、タンパク質をコードするコード配列のベクターによる発現をもたらすための条件下で、前に記載した発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養すること、および場合によっては、発現したタンパク質を回収することを含むことができる。
【０１６８】
ベクターは例えば、複製起点、場合によっては前記ポリヌクレオチドの発現用のプロモーター、および場合によってはプロモーターの制御物質を備える、プラスミドまたはウイルスベクターであってよい。ベクターは、1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。例えば宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために、ベクターを使用することができる。
【０１６９】
タンパク質をコードする配列と動作可能に連結している調節配列には、プロモーター/エンハンサー、および他の発現制御シグナルがある。発現ベクターをその中で使用するために設計した宿主細胞と適合性がある、これらの調節配列を選択することができる。用語「プロモーター」は、当分野ではよく知られており、大きさおよび複雑性が最少プロモーターから上流要素およびエンハンサーを含むプロモーターの範囲である核酸領域を含む。
【０１７０】
プロモーターは典型的には、哺乳動物細胞中において機能的であるプロモーターから選択されるが、原核生物のプロモーター、および他の真核生物細胞において機能的であるプロモーターを使用することができる。プロモーターは典型的には、ウイルスまたは真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えばプロモーターは、その中で発現が起こるであろう細胞のゲノム由来のプロモーターであってよい。真核生物のプロモーターに関しては、それらは、偏在的方式で機能するプロモーター(α-アクチン、β-アクチン、チューブリンのプロモーターなど)、あるいは代替的に、組織特異的方式で機能するプロモーター(ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーターなど)であってよい。プロモーターは、特異的刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体と結合するプロモーターであってもよい。例えばモロニーネズミ白血病ウイルスの長い末端反復(MMLVLTR)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、あるいはヒトサイトメガロウイルス(CMV)IEプロモーターなどのウイルスプロモーターを使用することもできる。
【０１７１】
誘導性であることがプロモーターに有利である可能性もあり、その結果、異種遺伝子の発現のレベルを、細胞の寿命中に制御することができる。誘導性は、プロモーターを使用して得られる発現のレベルを、制御することができることを意味する。
【０１７２】
さらに、任意のこれらのプロモーターは、他の制御配列、例えばエンハンサー配列を加えることによって改変することができる。前に記載した2つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含む、キメラプロモーターを使用することもできる。
【０１７３】
STELLAおよび/またはFRAGILISポリペプチドの発現
生物学的活性があるStellaおよび/またはFragilisを発現させるために、Stellaおよび/またはFragilis、またはその相同体、変異体、または誘導体をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入するコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター中に挿入する。
【０１７４】
当業者によく知られる方法を使用して、Stellaおよび/またはFragilis、ならびに適切な転写および翻訳調節要素をコードする配列を含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、in vitro組換えDNA技法、合成技法、およびin vivo遺伝的組換えがある。このような技法は、Sambrook、J.他(1989;Molecular Cloning、A Laboratory Manual、ch.4、8、and16〜17、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.)およびAusubel、F.M.他(1995および定期的追補; Current Protocols in Molecular Biology、ch.9、13、および16、John Wiley & Sons、New York、N.Y.)中に記載されている。
【０１７５】
様々な発現ベクター/宿主系を使用して、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列を含ませ発現させることができる。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物;酵母菌発現ベクターを用いて形質転換された酵母菌;ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系; ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)またはタバコモザイクウイルス(TMV))または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)を用いて形質転換された植物細胞系;あるいは動物細胞系を含むが、これらだけには限られない。任意の適切な宿主細胞を使用することができる。
【０１７６】
「調節要素」または「制御配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う、ベクターの非翻訳領域(すなわち、エンハンサー、プロモーター、および5'および3'非翻訳領域)である。このような要素は、それらの強度および特異性が変わる可能性がある。使用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを含めた、任意の数の適切な転写および翻訳要素を使用することができる。例えば、細菌系においてクローニングするとき、BLUESCRIPTファージミド(Stratagene、La Jolla、Calif.)またはPSPORT1プラスミド(GIBCO/BRL)などのハイブリッドlacZプロモーターなどの誘導的プロモーターを使用することができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞で使用することができる。植物細胞のゲノム(例えば、熱ショック、RUBISCO、および保存タンパク質遺伝子)由来、または植物ウイルス(例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列)由来のプロモーターまたはエンハンサーを、ベクターにクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列の多数のコピーを含む、細胞系を作製することが必要である場合、SV40またはEBV系のベクターを、適切な選択可能マーカーと共に使用することができる。
【０１７７】
細菌系では、幾つかの発現ベクターを、Stellaおよび/またはFragilisを目的とする使用に応じて選択することができる。例えば、多量のStellaおよび/またはFragilisが、抗体の誘導に必要とされるとき、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示する、ベクターを使用することができる。このようなベクターには、多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクター、BLUESCRIPT(Stratagene)などであって、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列が、ベクター中の配列のアミノ末端Metおよび後のβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列に、インフレームでベクターに連結することができ、したがって、ハイブリッドタンパク質が生成されるベクター、pINベクター(Van Heeke、G.およびS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503〜5509)などがあるが、これらだけには限られない。pGEXベクター(Promega、Madison、Wis.)を使用して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、次に遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または因子XAプロテアーゼ切断部位を含むように設計することができ、したがって、当該のクローニングポリペプチドを、自由にGST部分から切り離すことができる。
【０１７８】
酵母菌Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHなどの構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターを使用することができる。概要に関しては、Ausubel(上記)およびGrant他(1987;Methods Enzymol.153:516〜544)を参照のこと。
【０１７９】
植物の発現ベクターを使用する場合、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列の発現は、任意の数のプロモーターによって行うことができる。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、あるいはTMV由来のオメガリーダー配列(Takamatsu、N.(1987)EMBO J.6:307〜311.)と組み合わせて使用することができる。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物のプロモーター、または熱ショックプロモーターを使用することができる(Coruzzi、G.他(1984)EMBO J.3:1671〜1680;Broglie、R.他(1984)Science 224:838〜843;およびWinter、J.他(1991)Results Probl.Cell Differ.17:85〜105.)。これらの構築体は、直接的なDNA形質転換または病原体仲介のトランスフェクションによって、植物細胞に導入することができる。このような技法は、幾つかの一般的に入手可能な概要に記載されている(例えば、Hobbs、S.またはMurry、L.E.、McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill、New York、N.Y.;pp.191〜196中を参照)。
【０１８０】
昆虫系を使用して、Stellaおよび/またはFragilisを発現させることもできる。例えば、1つのこのような系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして使用して、Spodoptera frugiperda細胞中あるいはTrichoplusia幼虫において、外来性遺伝子を発現させる。Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。Stellaおよび/またはFragilisを首尾よく挿入することによって、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成されるであろう。したがって、この組換えウイルスを使用して、例えばStellaおよび/またはFragilisを発現させることができる、S frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させることができる(Engelhard、E.K.他(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91:3224〜3227)。
【０１８１】
哺乳動物宿主細胞では、幾つかのウイルス系発現系を使用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列は、後期プロモーターおよびトリプレットリーダー配列からなる、アデノウイルスの転写/翻訳複合体に連結させることができる。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を使用して、感染した宿主細胞中でStellaおよび/またはFragilisを発現させることができる、生命力のあるウイルスを得ることができる(Logan、J.およびT.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655〜3659)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中での発現を増大させることができる。
【０１８２】
したがって、例えば、Stellaおよび/またはFragilisタンパク質は、ヒト胚腎臓293(HEK293)細胞または付着性dhfr CHO細胞中で発現される。受容体発現を最大にするために、典型的にはすべての5'および3'非翻訳領域(UTR)を、pCDNまたはpCDNA3ベクターへの挿入前に、受容体cDNAから除去する。これらの細胞は、リポフェクションによって個々の受容体cDNAでトランスフェクトし、400mg/mlのG418の存在下で選択する。選択の3週間後、個々のクローンを集め、さらなる分析用に増殖させる。ベクターのみでトランスフェクトしたHEK293またはCHO細胞は、陰性対照として働かせる。個々の受容体を安定して発現している細胞系を単離するために、約24のクローンを典型的には選択し、ノーザンブロット分析によって分析する。受容体mRNAは一般に、分析するG418耐性クローンの約50%で検出可能である。
【０１８３】
ヒト人工染色体(HAC)を使用して、プラスミド中に含ませ発現させることができる断片より大きな、DNA断片を送達することもできる。約6kb〜10MbのHACを構築して、治療目的の従来的送達法(リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞)によって送達する。
【０１８４】
特異的開始シグナルを使用して、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列のより効率の良い翻訳を得ることもできる。このようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列がある。Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列、およびその開始コドンおよび上流配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、他の転写または翻訳調節シグナルが、必要とされる可能性はない。しかしながら、コード配列、またはその断片のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンは、挿入体全体の翻訳を確実にするために、正しいリーディングフレームでなければならない。外因性の翻訳要素および開始コドンは、様々な起源、天然および合成であってよい。文献中に記載されたエンハンサーなどの使用する特定の細胞系に適したエンハンサーを封入することによって、発現の効率を増大させることができる(Scharf、D.他(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125〜162)。
【０１８５】
さらに宿主細胞菌株を、挿入配列の発現を調節する、あるいは所望の方式で発現したタンパク質をプロセシングするその能力に関して選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂肪化、およびアシル化があるが、これらだけには限られない。タンパク質から「prepro」を切断する、翻訳後プロセシングを使用して、正しい挿入、フォールディング、および/または機能を容易にすることもできる。翻訳後活性に関して特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを有する、異なる宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびW138)は、American Type Culture Collection(ATCC、Bethesda、Md.)から入手可能であり、これらを選択して、外来性タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすることができる。
【０１８６】
組換えタンパク質の長期、高収率の生成のために、安定した発現が好ましい。例えば、Stellaおよび/またはFragilisを安定して発現することができる細胞系は、同じまたは別のベクター上に、ウイルス起源の複製起点および/または内因性の発現要素、および選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる、発現ベクターを使用して形質転換することができる。ベクターを導入した後で、選択培地に移す前に、細胞を富化培地中で約1〜2日間増殖させることができる。選択可能なマーカーの目的は、選択耐性を与えることであり、それが存在することによって、導入した配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収が可能になる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技法を使用して、増殖させることができる。
【０１８７】
任意の数の選択系を使用して、形質転換された細胞系を回収することができる。これらは、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler、M.他(1977)Cell 11:223〜32)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy、1.他(1980)Cell 22:817〜23)を含むが、それらだけには限られず、それぞれtk-またはapr-細胞中で使用することができる。また抗代謝剤、抗生物質、または除草剤耐性を、選択の基本として使用することができる。例えばdhfrは、メトトキセレートに対する耐性を与え(Wigler、M.他(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:3567〜70);nptは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え(Colbere-Garapin、F.他(1981)J.Mol.Biol.150:1〜14);およびalsまたはpatは、それぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える(Murry、上記)。他の選択可能な遺伝子、例えばtrpBが記載されてきており、これは細胞がトリプトファン、またはhisDの代わりにインドールを使用するのを可能にし、これは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用するのを可能にする(Hartman、S.C.およびR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047〜51)。近年、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーの目に見えるマーカーの使用が人気を得てきている。これらのマーカーは、形質転換体を同定するためだけではなく、特定のベクター系に起因する一時的または安定したタンパク質発現の量を、定量するためにも使用することができる(Rhodes、C.A.他(1995)Methods Mol.Biol.55:121〜131)。
【０１８８】
マーカー遺伝子発現の存在/不在は、当該の遺伝子が存在することも示唆するが、遺伝子の存在および発現を確認しなければならない可能性がある。例えば、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列を含む形質転換細胞を、マーカー遺伝子機能の不在により同定することができる。あるいはマーカー遺伝子を、1つのプロモーターの調節下において、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列とタンデムに配置することができる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、タンデム遺伝子の発現も通常は示す。
【０１８９】
あるいは、Stellaおよび/またはFragilisをコードする核酸配列を含み、Stellaおよび/またはFragilisを発現する宿主細胞を、当業者に知られている様々な手順によって同定することができる。これらの手順には、核酸またはタンパク質配列を検出および/または定量するための膜、溶液、またはチップ系技術を含めた、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、およびタンパク質バイオアッセイ、またはイムノアッセイ技法があるが、これらだけには限られない。
【０１９０】
Stellaおよび/またはFragilisをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、またはプローブまたは断片、またはStellaおよび/またはFragilisをコードするポリヌクレオチドの断片を使用する増幅によって検出することができる。核酸増幅系アッセイは、Stellaおよび/またはFragilisをコードするDNAまたはRNAを含む形質転換体を検出するために、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列に基づく、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。
【０１９１】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して、Stellaおよび/またはFragilisの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。このような技法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性細胞選別(FACS)がある。Stellaおよび/またはFragilis上の2つの非干渉エピトープに対して反応性があるモノクローナル抗体を使用する、二箇所、モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを使用することができる。これらおよび他のアッセイは、当分野では例えばHampton、R.他(1990;Serological Methods、a Laboratory Manual、Section IV、APS Press、St Paul、Minn)中、およびMaddox、D.E.他(1983;J.Exp.Med.158:1211〜1216)中に、充分に記載されている。
【０１９２】
広く様々な標識および結合技法が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸アッセイにおいて、これらを使用することができる。Stellaおよび/またはFragilisをコードするポリヌクレオチドと関連がある配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを生成するための手段には、標識ヌクレオチドを使用する、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、またはPCR増幅がある。あるいは、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するために、ベクターにクローニングすることができる。このようなベクターは当分野では知られており、市販されており、これらを使用して、T7、T3、またはSP6などの適切なRNAポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの手順は、Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo、Mich.)、Promega(Madison、Wis.)およびU.S.Biochemical Corp.(Cleveland、Ohio)によって提供されるキットなどの様々な市販のキットを使用して行うことができる。検出を容易にするために使用することができる、適切なレポーター分子または標識には、放射性核酸、酵素、蛍光物質、化学発光物質、または発色剤、ならびに基質、補体、阻害剤、磁気粒子などがある。
【０１９３】
Stellaおよび/またはFragilisをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養することができる。形質転換細胞により生成されたタンパク質は、使用する配列および/またはベクターに応じて、細胞膜中に位置するか、細胞内に分泌されるかあるいは含まれる可能性がある。当業者によって理解されるように、Stellaおよび/またはFragilisをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを設計して、原核生物または真核生物細胞膜中のStellaおよび/またはFragilisの分泌を指示する、シグナル配列を含ませることができる。他の構築体を使用して、Stellaおよび/またはFragilisをコードする配列と、可溶性タンパク質の精製を容易にする、ポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列を結合させることができる。このような精製を容易にするドメインには、固定金属、タンパク質Aドメインの精製を可能にし、固定免疫グロブリン、およびFLAGS伸長/親和性精製系(Immunex Corp.、Seattle、Wash)において使用されるドメインの精製を可能にする、ヒスチジン-トリプトファン分子などの金属キレートペプチドがあるが、これらだけには限られない。FactorXAまたはエンテロキナーゼ(Invitrogen、San Diego、Calif)に特異的な配列などの切断可能な連結配列を、精製ドメインとStellaおよび/またはFragilisコード配列の間に封入することを使用して、精製を容易にすることができる。1つのこのような発現ベクターは、Stellaおよび/またはFragilis、およびチレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に、6個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、固定金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMIAC;Porath、J.他(1992)Prot.Exp.Purif.3:263〜281中に記載)による精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からStellaおよび/またはFragilisを精製するための手段をもたらす。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Kroll、D.J.他(1993;DNA Cell Bi
ol.12:441〜453)中に与えられている。
【０１９４】
Stellaおよび/またはFragilisの断片は、組換え生成によってのみだけではなく、固相技法を使用する直接的なペプチド合成によっても生成することができる(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149〜2154)。タンパク質合成は、手作業による技法によって、あるいは自動操作によって行うことができる。自動式合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成装置(Perkin Elmer)を使用して、行うことができる。Stellaおよび/またはFragilisの様々な断片を別々に合成し、次いで組み合わせて、完全長分子を生成することができる。
【０１９５】
組換えSTELLAおよびFRAGILISタンパク質
本発明者らは、StellaおよびFragilisタンパク質、例えば組換えタンパク質の発現も与える。これらのタンパク質は、当分野で一般的に知られている幾つかの方法によって発現させることができ、どのようにしてこれを行うことができるかの例を、以下で与える。
【０１９６】
StellaおよびFragilisのヌクレオチド配列を、TRI-系ベクター(Qiagen)にクローニングする。第二のコドンを前方に含むStella配列(すなわち、第一のATGコドンを含まないStellaのN末端断片)を、製造者の教示書に従い、適切な制限酵素部位を使用して、pQEベクターにクローニングする。QIA発現pQEベクターは、大腸菌中での6xHis-タグタンパク質の高レベルの発現を可能にする。
【０１９７】
Hisタグは、Stella遺伝子のN末端部分に置かれる。組換えタンパク質は、製造者の教示書に従い、Ni-NTAカラム上での親和性クロマトグラフィーによって精製する。Hisタグは、適切なプロテアーゼを使用して切断する。
【０１９８】
組換えによって発現させたStellaおよびFragilisタンパク質は、生物学的に活性があることが見出されている。
【０１９９】
調節物質、アゴニストおよびアンタゴニスト
ここに記載する方法および組成物は、幾つかの実施形態では、例えば癌などの疾患の治療法または予防法において、StellaおよびFragilisなどのタンパク質の活性を阻害、低下、または増大させることによるものである。一般にこれらの方法は、Stellaおよび/またはFragilisの活性または発現の調節物質を使用する。
【０２００】
Stellaおよび/またはFragilisタンパク質の活性を増大させることができる物質は、その活性のアゴニストと呼ばれる。同様に、アンタゴニストは、関連タンパク質の活性を低下させる。
【０２０１】
当分野で使用される、用語「アンタゴニスト」は、ある酵素と結合し、その酵素の活性を阻害する化合物を指すと一般に解釈される。しかしながら、ここで使用する用語は、必ずしも分子と結合することによってではなく、分子の活性を阻害する任意の物質を広く指すことを目的とする。したがってこの用語は、StellaまたはFragilisなどのタンパク質の発現、または制御分子の生合成、またはStellaまたはFragilisの活性の調節物質の発現に影響を与える物質を含む。阻害される特異的活性は、酵素または分子によって示されるか、あるいはそれらに特徴的な任意の活性、例えば場合によりStellaおよび/Fragilisの任意の活性、例えばシグナル変換活性またはPGC特異的活性であってよい。
【０２０２】
アンタゴニストは、関連分子上の1つのまたは複数の部位、好ましくは酵素の触媒部位と結合し、それらと競合することができる。好ましくは、このような結合は、分子と他の物体の間の相互作用(例えば、酵素とその基質の間の相互作用)を阻害する。しかしながら、アンタゴニストは、触媒部位と直接結合することを必ずしも必要とはせず、その結合が酵素または分子の活性を低下させる限りは、例えば隣接部位、他のタンパク質(例えば、酵素と複合体形成するタンパク質)、あるいは細胞上または細胞中の他の物体と結合することができる。
【０２０３】
酵素などの酵素のアンタゴニストに関する場合、アンタゴニストは、酵素の基質、またはこの酵素と結合することができるこの断片を含むことができる。さらに、自然に生成させたか、あるいはペプチド合成により生成させた、基質の全体または断片を使用して、酵素の結合部位に関して基質と競合させることができる。あるいは、さらに、酵素と結合することができる、免疫グロブリン(例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体)を使用することができる。アンタゴニストは、結合相互作用を害することができる、ペプチドまたは他の小分子も含むことができる。アンタゴニストの他の例は以下でさらに詳細に述べ、当業者にも明らかであろう。
【０２０４】
関連Stellaおよび/またはFragilisタンパク質の阻害剤の活性の阻害は、細胞中のタンパク質または阻害剤の発現のレベルを低下させることによって行うこともできる。例えば細胞は、アンチセンス化合物、例えばStellaおよび/またはFragilism RNAに特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドで、処理するすることができる。病原形の接着性タンパク質の発現のレベルも、このように制御することができる。
【０２０５】
一般に、アゴニスト、アンタゴニストおよび調節物質は、原子または分子などの物質を含み、分子は無機または有機、生物学的エフェクター分子および/または生物学的エフェクター分子などの物質をコードする核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸(PNA)、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドの合成類似体、リボヌクレオチドの合成類似体、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸類似体、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、脂肪酸および炭水化物であってよい。物質は、溶液中または懸濁液中に存在することができる(例えば、結晶、コロイドまたは他の粒子形で)。物質は、モノマー、ジマー、オリゴマーなど、あるいはそれ以外は複合体の形で、存在することができる。
【０２０６】
用語「調節物質」、「アンタゴニスト」および「物質」、は、構造タンパク質、酵素、サイトカイン(インターフェロンおよび/またはインターロイキンなど)抗生物質だけには限られないが、これらを含めたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、抗体またはその一部分が天然、合成または人造であってよい、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはFv断片などのその有効部分、ペプチドホルモン、受容体、シグナル分子または他のタンパク質;オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、人工または天然染色体(例えば酵母菌人工染色体)またはその一部分、mRNA、tRNA、rRNAまたはリボザイムを含めたRNA、またはペプチド核酸(PNA)だけには限られないが、これらを含めた、以下で定義する核酸;ウイルスまたはウイルス様粒子;修飾または非修飾であってよい、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその合成類似体;修飾または非修飾であってよい、アミノ酸またはその類似体;非ペプチド(例えばステロイド)ホルモン;プロテオグリカン;脂質;または炭水化物も含むものとする。ポリペプチドの活性部位と結合しそこを占有し、それによって触媒部位と基質を接触不能にして、その結果正常な生物学的活性を妨げる、無機および有機化学物質を含めた小分子も含まれる。小分子の例には、小ペプチドまたはペプチド様分子があるがこれらだけには限られない。
【０２０７】
特定の実施形態では、RNA干渉(RNAi)の技法を使用して、遺伝子活性、例えばStellaおよび/またはFragilis活性を無効またはノックアウトする、あるいは低下させることができる。全体的な戦略は、当該のそれぞれの遺伝子に特異的な二本鎖RNA(dsRNA)を作製して、これを当該の細胞にトランスフェクトして、特定の遺伝子の発現を阻害することである。
【０２０８】
以下のプロトコルを使用することができる:PCR産物のサンプルを、水平方向ゲル電気泳動、およびQiagen QiaQuick PCR精製キットを使用して精製したDNAによって分析する。Ambion T7 Megascriptキットを使用する遺伝子特異的一本鎖RNAの調製において、1μgのDNAを鋳型として使用する。一本鎖RNAを鋳型の二本鎖から生成させ、精製し、15分間で90℃に加熱し、次に一晩で室温に徐々に冷却することによって即座にアニーリングする。dsRNAのサンプルは水平方向ゲル電気泳動によって分析し、従来的手段によって関連細胞に導入する。
【０２０９】
調節物質、アゴニストおよびアンタゴニストの同定
Stellaおよび/またはFragilis活性または発現の調節物質、アゴニストおよびアンタゴニストは、当分野で知られている任意の手段によって同定することができる。このような推定分子は、Stella(または必要な場合はFragilis)と推定分子の間の結合を検出するアッセイにおいて、Stellaおよび/またはFragilisとのそれらの結合によって同定することができる。
【０２１０】
調節物質、アゴニストまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイは、場合によっては活性の調節の検出を含めて、候補分子の存在下、候補分子の不在下において、Stellaおよび/またはFragilisの任意の活性の調節を検出することを典型的には含む。これらのアッセイは、StellaまたはFragilisを、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸、または細胞、オルガネラ、抽出物、またはこれらを含む他の物質の形で候補分子と、接触させることを含む。(以下に記載するような)StellaまたはFragilisの関連活性を検出して、候補調節物質の存在が何らかの影響を有するかどうかを、確定することができる。Stellaおよび/またはFragilisに結合する、かつ/あるいはStellaおよび/またはFragilisの転写または発現に影響を与える、候補調節物質を検出するためのプロモーター結合アッセイも使用することができる。したがって、候補調節物質をさらなる試験用に選択することができ、あるいは使用するために単離することができる。このようなスクリーニング手順の詳細は当分野ではよく知られており、例えばRamakrishna Seethala、Prabhavathi B.Fernandes編、Handbook of Drug Screening中に記載されている(2001、New York、NY、Marcel Dekker、ISBN 08247〜0562〜9)。
【０２１１】
ここに記載するスクリーニング法は、in vivoアッセイで使用することが好ましいが、これらはin vitroでの使用に適合させることができる。in vivoアッセイは一般に、Stellaおよび/またはFragilisを含む細胞を候補分子に曝すことを含む。in vitroアッセイでは、Stellaおよび/またはFragilisを、場合によっては粗製または半精製細胞抽出物、または精製タンパク質などの他の要素の存在下で、候補分子に曝す。in vitroアッセイを行う場合、これらのアッセイは、候補分子のアレイ(例えばアレイ状ライブラリー)を使用することが好ましい。in vivoアッセイが好ましい。したがって好ましくは、Stellaおよび/またはFragilisは細胞中に、非均質に含まれることが好ましい。このような細胞は、Stellaおよび/またはFragilisを発現させるために工学処理された、トランスジェニック細胞であることが好ましい。
【０２１２】
Stellaおよび/またはFragilisを含む細胞の任意の成分、オルガネラなどを、使用することができることは理解されよう。好ましい実施形態は、例えば記載するStellaおよび/またはFragilisを含む細胞核を含む、核調製物を使用する。核調製物は、例えば洗浄処理によって浸透または半浸透可能である、1つまたは複数の核を含むことができる。
【０２１３】
したがって、特定の実施形態では、アッセイ形式は以下のことを含むことができる:マルチウエルのマイクロタイタープレートを設定して、それぞれのウエルでStellaおよび/またはFragilisを発現する、1つまたは複数の細胞を含ませる;個々の候補分子、または候補分子の集合を、個々のウエルに加えて、測定するStellaおよび/またはFragilis活性を調節することができる。集合を使用する場合、これらを他の集合にさらに分けて、同じ方法で試験することができる。
【０２１４】
代替的あるいは追加的に、前に記載したアッセイ法、「減法」手順を使用して、Stellaおよび/またはFragilisの調節物質、アゴニストまたはアンタゴニストを同定することもできる。このような「減法」手順の下では、調節物質として機能することができる1つまたは複数の候補分子を含む、複数の分子が提供され(例えば細胞抽出物、核抽出物、分子のライブラリーなど)、1つまたは複数の要素が、複数の分子から除去、枯渇または激減される。次いで「激減」抽出物などを、記載するようにStellaおよび/またはFragilis(またはその要素)を含む細胞に曝すことによって、活性に関してアッセイする。
【０２１５】
したがって例えば、「免疫枯渇」アッセイを行って、以下のような調節物質を同定することができる。核抽出物は、多能性細胞、例えば多能性EG/ES細胞から調製することができる。抽出物を枯渇または分画して、適切な抗体を用いる免疫枯渇法の使用などによって、推定調節物質を除去することができる。抽出物が調節物質を欠いている場合、それはStellaおよび/またはFragilisの機能または活性または発現に影響を与える能力を失う。一連の激減および/または枯渇が、調節物質、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するために必要とされる可能性がある。
【０２１６】
前述の「枯渇」または「激減」アッセイを予備ステップとして使用して、他のスクリーニング用に推定調節因子を同定することができることも理解されよう。さらに、あるいは代替的に、「枯渇」または「激減」アッセイを使用して、他の手段(例えば、本文書の他の箇所に記載した「陽性」スクリーニング)によって推定調節物質として同定した、分子の調節活性を確認することができる。
【０２１７】
アッセイを施し、当該のものであることが見出されている候補分子を単離し、さらに試験することができる。当該の分子の単離法は、使用する分子の型、分子がライブラリーの形であるかどうか、何個の候補分子が任意の一時に試験されるか、バッチ手順が続くかどうかなどに依存するであろう。
【０２１８】
候補分子は、ライブラリーの形で与えることができる。本発明の好ましい実施形態では、2つ以上の候補分子を同時にスクリーニングする。候補分子のライブラリー、例えばポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物のライブラリー(コンビナトリアルライブラリーなど)、アンチセンスDNAまたはアンチセンスRNAなどのアンチセンス分子のライブラリー、抗体ライブラリーなどを、当分野で知られている手段によって作製することができる。このようなライブラリーは、高スループットスクリーニングに適している。Stellaおよび/またはFragilisを含む異なる細胞を、ライブラリーの個々のメンバーに曝して、1つまたは複数のレポーターの発現を検出することができる。アレイ技術をこの目的で使用することができる。例えばマイクロタイタープレートのウエル中に、細胞を空間的に分離することができる。
【０２１９】
好ましい実施形態では、小分子ライブラリーを使用する。この用語によって本発明者らは、その分子量がそれぞれ約50kDa未満である、分子のライブラリーを指す。特定の実施形態では、小分子ライブラリーは、好ましくは約30kDa未満、より好ましくは約15kDa未満、最も好ましくは約10kDa未満などの分子量を有する分子を含む。このような「小分子」ライブラリーは、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、20アミノ酸未満、例えば15、10または5アミノ酸のペプチド、単純化合物などを含むことができる。
【０２２０】
代替的あるいは追加的に、以下でさらに詳細に記載するコンビナトリアルライブラリーを、Stellaおよび/またはFragilisの調節物質、アンタゴニストまたはアゴニストに関してスクリーニングすることができる。
【０２２１】
Stellaおよび/またはFragilisの任意の活性を、アッセイの基として使用することができる。特に、Stellaおよび/またはFragilisによって仲介される細胞活性をアッセイして、アンタゴニストを同定することができる。例えば、Fragilisファミリーのメンバーは、細胞間の同型接着を担い、推定アンタゴニストまたはアゴニストのFragilisファミリーのメンバーによって仲介される接着活性に対する影響は、例えば当分野で知られている細胞接着アッセイを使用して、アッセイすることができる。さらに本発明者らは、Fragilisファミリーのメンバーは、細胞サイクルの回数を増大させることができ;したがって、細胞サイクル周期を、候補分子の存在下および不在下でアッセイして、Fragilis活性のアンタゴニストまたはアゴニストを同定することができることを示している。
【０２２２】
ライブラリー
ポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどの候補分子のライブラリーは、ここに記載する方法および組成物で使用することができる。このようなライブラリーを、レポーターの発現を検出するために、レポーターをコードする核酸(またはこのような核酸を含む細胞)に曝す。
【０２２３】
巨大ライブラリーの所望メンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレー技法によって代表されるように、当分野で知られている。多様なペプチド配列が繊維状バクテリオファージの表面上に提示される(ScottおよびSmith(1990上記)、このようなシステムは、標的抗原と結合する特異的抗体断片のin vitro選択および増幅用の抗体断片(およびそれらをコードするヌクレオチド配列)のライブラリーを作製するのに、有用であることが証明されてきている。VHおよびVL領域をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌の周辺質空間に断片を向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結し、結果として生成する抗体断片は、バクテリオファージの表面上に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質(例えばpIIIまたはpVIII)との融合体として提示される。あるいは抗体断片は、ラムダファージキャプシド(ファージ体)の外側に提示される。ファージ系提示システムの利点は、それらは生物系であるので、選択したライブラリーのメンバーは、細菌細胞中のその選択したライブラリーのメンバーを含むファージを単に増殖させることによって、増幅させることができることである。さらに、ポリペプチドライブラリーのメンバーをコードするヌクレオチド配列は、ファージまたはファージミドベクターに含まれるので、塩基配列決定、発現および後の遺伝的操作は比較的簡単である。
【０２２４】
バクテリオファージ抗原提示ライブラリー、およびラムダファージ発現ライブラリーを構築するための方法は、当分野でよく知られている(McCafferty他(1990)上記;Kang他(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.、88:4363;Clackson他(1991)Nature、352:624;Lowman他(1991)Biochemistry、30:10832;Burton他(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.、88:10134;Hoogenboom他(1991)Nucleic Acids Res.、19:4133;Chang他(1991)J. Immunol.、147:3610;Breitling他(1991)Gene、104:147;Marks他(1991)上記;Barbas他(1992)上記;HawkinsおよびWinter(1992)J.Immunol.、22:867;Marks他、1992、J.Biol.Chem.、267:16007;Lerner他(1992)Science、258:1313、これらは参照により本明細書に組み込まれている)。このような技法は、ポリペプチドライブラリーの一般的発現用に必要な場合は、変更することができる。
【０２２５】
1つの特に有利な手法は、scFvファージライブラリーを使用することである(Bird、R.E.他(1988)Science 242:423〜6、Huston他、1988、Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.、85:5879〜5883;Chaudhary他(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.、87:1066〜1070;McCafferty他(1990)上記;Clackson他(1991)上記;Marks他(1991)上記;Chiswell他(1992)Trends Biotech.、10:80;Marks他(1992)上記)。バクテリオファージコートタンパク質上に提示される、scFvライブラリーの様々な実施形態が記載されてきている。例えば参照により本明細書に組み込まれている、W096/06213およびW092/01047(Medical Research Council他)およびW097/08320(Morphosys、上記)中に記載されたのと同様のファージディスプレー手法の改良も知られている。
【０２２６】
他のライブラリー選択技術には、バクテリオファージラムダ発現系があり、いずれも前に記載されたのと同様の(Huse他(1989)Science、246:1275;CatonおよびKoprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87;Mullinax他(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、87:8095;Persson他(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.、88:2432)、バクテリオファージプラークとして、あるいは溶原菌のコロニーとして、それらを直接スクリーニングすることができ、これらは本発明で使用する。これらの発現系を使用して、約106のオーダーあるいはそれを超える多数の異なるライブラリーのメンバーをスクリーニングすることができる。他のスクリーニング系は、例えばライブラリーのメンバーの直接的化学合成を利用するものである。1つの初期の方法は、W084/03564中に記載されたものなどの一組のピンまたはロッドでのペプチドの合成に関するものである。それぞれのビーズが個々のライブラリーのメンバーであるペプチドライブラリーを形成するビーズでのペプチドの合成に関する類似の方法は、米国特許第4,631,211号中に記載されており、関連法はW092/00091中に記載されている。ビーズ系の方法の有意な改良点は、それぞれのビーズをオリゴヌクレオチドなどの独特な識別タグで標識して、それぞれのライブラリーのメンバーのアミノ酸配列の識別を容易にすることを含む。これらの改良型のビーズ系の方法は、W093/06121中に記載されている。
【０２２７】
他の化学合成法は、それぞれの異なるライブラリーのメンバー(例えば独特なペプチド配列)をアレイ中の別々の予め定義した位置に配置する方式の表面上でのペプチド(またはペプチド模倣体)のアレイの合成に関するものである。それぞれのライブラリーのメンバーの同一性は、アレイ中のその空間的位置によって決定される。所定の分子(例えば受容体)と反応性があるライブラリーのメンバーの間の結合相互作用が生じる、アレイ中の位置を決定し、それにより空間的位置に基づいて、反応性があるライブラリーのメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第5,143,854号;W090/15070およびW092/10092;Fodor他(1991)Science、251:767;DowerおよびFodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.、26:271中に記載されている。
【０２２８】
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するための他のシステムは、ライブラリーのメンバーのin vitro合成用の無細胞の酵素機構の使用を含む。一方法では、標的リガンドおよびPCR増幅に対する他のラウンドの選択によって、RNA分子を選択する(TuerkおよびGold(1990)Science、249:505;EllingtonおよびSzostak(1990)Nature、346:818)。類似の技法を使用して、所定のヒト転写因子と結合するDNA配列を同定することができる(ThiesenおよびBach(1990)Nucleic Acids Res.、18:3203;BeaudryおよびJoyce(1992)Science、257:635;W092/05258およびW092/14843)。巨大ライブラリーを作製するための方法と同様の方法で、in vitro翻訳を使用して、ポリペプチドを合成することができる。安定したポリソーム複合体を一般的に含むこれらの方法は、W088/08453、W090/05785、W090/07003、W091/02076、W091/05058、およびW092/02536中にさらに記載されている。W095/22625およびW095/11922(Affymax)に開示されたものなどのファージ系ではない他のディスプレーシステムでは、ポリソームを使用して選択用のポリペプチドを提示する。これらの文書、およびすべての前述の文書も、参照により本明細書に組み込まれている。
【０２２９】
ライブラリーは、ジンクフィンガーのライブラリーを特に含むことができる。ジンクフィンガーは当分野で知られており、転写因子として作用する。適切なジンクフィンガーのライブラリーは、例えばWO96/06166およびWO98/53057に開示されている。ジンクフィンガーのライブラリーの構築は、例えばWO98/53058およびWO98/53060に開示されたものと同様に、特定のDNA配列との相互作用の決定に関するルールを使用することができる。メチル化DNAと特異的に相互作用することができるジンクフィンガーは、WO99/47656に開示されている。前述のジンクフィンガーのライブラリーは、例えばWO01/25417に開示されたものと同様に、アレイの形で固定することができる。したがって、細胞の能力を変えることができる好ましい分子は、ジンクフィンガーを含む。
【０２３０】
コンビナトリアルライブラリー
ライブラリー、特に候補分子のライブラリーは、適切にはコンビナトリアルライブラリーの形であってよい(コンビナトリアルケミカルライブラリーとしても知られる)。
【０２３１】
「コンビナトリアルライブラリー」は、本文書中でこの用語を使用するときは、無作為に選択されたサブユニットからなる、多種の化学化合物の集合である。コンビナトリアルライブラリーは、レポーターの発現を引き起こすことができ、場合によっては細胞の能力を変えることができる分子に関して、スクリーニングすることができる。
【０２３２】
タンパク質分解酵素および非タンパク質分解酵素に対して活性があるライブラリー、Gタンパク質結合受容体(GPCR)のアゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非GPCR標的(例えば、インテグリン、イオンチャンネル、ドメイン相互作用体、核受容体、および転写因子)に対して活性があるライブラリー、および全細胞腫瘍および抗感染標的のライブラリーを特に含めた、化学化合物の様々なコンビナトリアルライブラリーが、現在入手可能である。コンビナトリアルライブラリーの包括的概要、特にそれらの構築および使用は、DolleおよびNelson(1999)、Journal of Combinatorial Chemistry、Vol 1 No 4、235〜282中に与えられている。Combinatorial peptide library protocols (Shmuel Cabilly、Totowa、N.J.編:Humana Press、cl998.Methods in Molecular Biology;v.87)にも参照されている。特異的なコンビナトリアルライブラリー、およびそれらの構築に関する方法は、米国特許第6,168,914号(Campbell他)中、およびBaldwin他(1995)、「Synthesis of a Small Molecule Library Encoded with Molecular Tags」、J.Am.Chem.Soc.117:5588〜5589中、ならびにこれらの文書で述べられた参照文献に開示される。
【０２３３】
好ましい実施形態では、スクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーは、おそらく細胞の要素と相互作用する分子を含み、遺伝子発現に影響を与えるように設計されているライブラリーである。例えば、クロマチン構造タンパク質に対するコンビナトリアルライブラリーを、スクリーニングすることができる。この実施形態に有用な他のライブラリーには、ヒストン修飾酵素(例えばヒストンアセチル化またはヒストンメチル化酵素)、またはDNA修飾、例えばDNAメチル化または脱メチル化に対するコンビナトリアルライブラリーがある。
【０２３４】
ケミカルコンビナトリアルライブラリー、その生成および使用を記載する、他の参照文献は、URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/から入手可能なものがあり、The Chemical Generation of Molecular Diversity.Michael R.Pavia、Sphinx Pharmaceuticals、A Division of Eli Lilly(1995年7月に発表);Combinatorial Chemistry:A Strategy for the Future-MDL Information Systems discusses the role its Project Library plays in managing diversity libraries(1995年7月に発表);Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization、Adnan M.M. Mjalli and Barry E.Toyonaga、Ontogen Corporation(1995年7月に発表);Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally Directed Non-Peptide Library.Sarvajit Chakravarty、Babu J.Mavunkel、Robin Andy、Donald J.Kyle*、Scios Nova Inc.(1995年7月に発表);Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity Keith Davies and Clive Briant、Chemical Design Ltd.(1995年7月に発表);A Database System for Combinatorial Synthesis Experiments-Craig James and David Weininger、Daylight Chemical Information Systems、Inc.(1995年7月に発表);An Information Management Architecture for Combinatorial Chemistry、Keith Davies and Catherine White、Chemical Design Ltd.(1995年7月に発表);Novel Software Tools for Addressing Chemical Diversity、R.S.Pearlman、Laboratory for Molecular Graphics and Theoretical Modeling、College of Pharmacy、University of Texas(1996年6月/7月に発表);Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategies in Drug Discovery:An Opinion、Yvonne Connolly Martin、Computer Assisted Molecular Design Project、Abbott Laboratories(1996年6月/7月に発表);Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University of Louisville:A Description、Arno F.Spatola、Department of Chemistry、University of Louisville(1996年6月/7月に発表);Chemically Generated Screening Libraries:Present and Future.Michael R.Pavia、Sphinx Pharmaceuticals、A Division of Eli Lilly(1996年6月/7月に発表);Chemical Strategies For Introducing Carbohydrate Molecular Diversity Into The Drug Discovery Process.Michael J.Sofia、Transcell Technologies Inc.(1996年6月/7月に発表);Data Management for Combinatorial Chemistry.Maryjo Zaborowski、Chiron Corporation and Sheila H.DeWitt、Parke-Davis Pharmaceutical Research、Division of Warner-Lambert Company(1995年11月に発表);およびThe Impact of High Throughput Organic Synthesis on R&D in Bio-Based Industries、John P.Devlin(1996年3月に発表)を含む。
【０２３５】
コンビナトリアルケミストリーの技法は、新たな薬剤リード化合物を作製するための最新の方法の間で広く受け入れられている(Gallop、M.A.他、1994、J.Med.Chem.37:1233〜1251;Gordon、E.M.他、1994、J.Med.Chem.37:1385〜1401)。使用されている1つのコンビナトリアル手法は、固相担体のそれぞれの粒子の異なる構造体を含むライブラリーの合成、ライブラリーと可溶性受容体の相互作用、マクロ分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定、および同定した「ビーズ」によって担持される構造の決定を含む戦略に基づいている(Lam、K.S.他、1991、Nature 354:82〜84)。この手法の代替法は、固相担体からの化合物の明確な等分試料の連続的放出であり、後に溶液中の活性を決定し、活性化合物が放出された粒子を同定し、直接的な塩基配列決定によって(Salmon、S.E.他、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11708〜11712)、あるいはそのコードを読み取ることによって(Kerr、J.M.他、1993、J.Am.Chem.Soc.115:2529〜2531;Nikolaiev、V.他、1993、Pept.Res.6:161〜170;Ohlmeyer、M.H.J.他、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922〜10926)、その構造を解明する。
【０２３６】
可溶性の無作為なコンビナトリアルライブラリーは、ペプチドの等モル混合物を作製するための単純な原理を使用して合成することができ、この原理はFurka(Furka、A.他、1988、Xth Intemational Symposium on Medicinal Chemistry、Budapest 1988;Furka、A.他、1988、14th International Congress of Biochemistry、Prague 1988;Furka、A.他、1991、Int.J.Peptide Protein Res.37:487〜493)によって最初に記載された。反復スクリーニング用の可溶性ライブラリーの構築も、記載されてきている(Houghten、R.A.他、1991、Nature 354:84〜86)。K.S.Lamは、不溶性の無作為コンビナトリアルライブラリーを使用する、新規で予想外の強力な技法を開示した。Lamは、それぞれの担体が均一な分子構造の試験化合物を有するように、固相担体上で無作為コンビナトリアルライブラリーを合成し、固相結合プロトコル(Lam、K.S.他、1991、Nature 354:82〜84)によって、担体から試験化合物を事前に除去することなく、ライブラリーをスクリーニングした。
【０２３７】
したがって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー(例えばコンビナトリアルケミカルライブラリー)、細胞抽出物、体液(例えば尿、血液、涙、汗、または唾液)、あるいは合成または天然産物の他の混合物(例えば小分子または発酵作用混合物のライブラリー)であってよい。
【０２３８】
分子のライブラリーは、例えばアミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、あるいはペプチドまたはタンパク質の断片;核酸(例えば、アンチセンス;DNA;RNA;またはペプチド核酸、PNA);アプタマー;あるいは炭水化物または多糖を含むことができる。ライブラリーのそれぞれのメンバーは単体であってよく、あるいは混合物の一部分(例えば圧縮ライブラリー)であってよい。ライブラリーは精製化合物を含むことができ、あるいは「汚れた状態」(すなわち、多量の不純物を含む)であってよい。
【０２３９】
市販のライブラリー(例えばAffymetrix、ArQule、Neose Technologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma、またはTriposeからのもの)を、ここに記載する方法と共に使用することもできる。
【０２４０】
前に記載したライブラリー以外に、多様性ファイルと呼ばれる特別なライブラリーを使用して、新しい方法の特異性、信頼性、または再現性を評価することができる。多様性ファイルは、アッセイにおいて非特異的検出をもたらす可能性があると思われる、多くのクラスの化合物に代表される、多数の化合物(例えば、1000以上の小分子)を含む。多様性ファイルは市販されており、あるいは前に列挙した売主から市販されている個々の化合物から構築することもできる。
【０２４１】
抗体
これらのタンパク質の活性を制御するために使用することができる(例えば、癌などの疾患の治療法または予防法用の)、Stellaおよび/またはFragilisの特異的アンタゴニストは、タンパク質に対する抗体を含むことができる。
【０２４２】
本明細書で使用する抗体は、選択した標的と結合することができる、完全な抗体、またはFv、ScFv、Fab'およびF(ab')2を含めた抗体断片、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、CDR移植および人化抗体を含めた工学処理した抗体、およびファージディスプレーまたは他の技法を使用して生成した、人工的に選択した抗体を指す。FvおよびScFvなどの小断片には、それらの小さな大きさとその結果生じる優勢な組織分布を考慮すると、診断および治療用途に関する有利な性質がある。
【０２４３】
ここに記載する抗体は、PGCおよび他の多能性細胞、ESまたはEG細胞などの検出用に特に示すものである。したがって、それらの抗体は、標識などのエフェクタータンパク質を含む、改変型抗体であってよい。特に好ましいのは、in vivoまたはin vitroで抗体の分布の画像化を可能にする標識である。このような標識は、放射活性標識または放射線不透過性標識、金属粒子などであってよく、これらは胚または細胞塊内において、容易に肉眼で見ることができる。さらに、これらの標識は、組織サンプル上において肉眼で見ることができる、蛍光標識または他の標識であってよい。
【０２４４】
組換えDNA技術を使用して、ここに記載する抗体を改良することができる。したがって、キメラ抗体を構築して、診断または治療用途における、その免疫原性を低下させることができる。さらに、CDR移植[欧州特許出願0239400(Winter)参照]、および場合によっては骨格修飾[EP0239400]によって、抗体を人化することにより、免疫原性を最小にすることができる。
【０２４５】
抗体は動物血清から得ることができ、あるいはモノクローナル抗体またはその断片の場合、細胞培養において生成される。組換えDNA技術を使用して、細菌または好ましくは哺乳動物細胞培養物において、確立された手順に従い抗体を生成することができる。選択した細胞培養系は、抗体生成物を分泌することが好ましい。
【０２４６】
したがって本発明者らは、抗体を生成するための方法であって、前記抗体のタンパク質をコードする第二のDNA配列と適切なリーディングフレームで連結したシグナルペプチドをコードする第一のDNA配列と、動作可能に連結したプロモーターを含む、発現カセットを含むハイブリッドベクターで形質転換した、宿主、例えば大腸菌または哺乳動物細胞を培養すること、および前記タンパク質を単離することを含む方法を開示する。
【０２４７】
in vitroでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、通常の標準的な培養培地である適切な培養培地、例えば、哺乳動物細血清、例えばウシ胎児血清、または微量元素および増殖維持サプリメント、例えば供給細胞、正常なマウス腹膜滲出細胞、脾臓細胞など、骨髄マクロファージ、2-アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などを場合によっては補った、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)またはRPMI1640培地で行われる。細菌細胞または酵母菌細胞である宿主細胞の増殖は、当分野で知られている適切な培養培地、例えば細菌の場合は培地LB、NZCYM、NZYM、NZM、Terrific Broth、SOB、SOC、2xYT、またはM9 Minimal Mediumで、酵母菌の場合は培地YPD、YEPD、Minimal Medium、またはComplete Minimal Dropout Mediumで同様に行われる。
【０２４８】
In vitroでの生成によって、比較的純粋な抗体調製物が得られ、多量の所望の抗体を与えるためのスケールアップが可能である。細菌細胞、酵母菌または哺乳動物細胞培養に関する技法は、当分野で知られており、均質懸濁液培養、例えばエアリフト反応器中あるいは連続式攪拌反応器中、あるいは固定または捕獲細胞培養、例えば中空線維、ミクロカプセル中、アガロースミクロビーズまたはセラミックカートリッジ上のものを含む。
【０２４９】
多量の所望の抗体は、in vivoで哺乳動物細胞を増殖させることによって得ることもできる。この目的で、所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を、組織適合性のある哺乳動物に注射して、抗体生成腫瘍の増殖を引き起こす。場合によっては、注射前に、炭化水素、特にプリスタン(テトラメチル-ペンタデカン)などの鉱油で、動物を初回抗原刺激する。1〜3週間後、これらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、適切なミエローマ細胞とBalb/cマウス由来の抗体生成脾臓細胞の融合によって得られるハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を生成するハイブリドーマ細胞系Sp2/0由来のトランスフェクト細胞を、場合によってはプリスタンで前処理したBalb/cマウスの腹膜内に注射し、1〜2週間後に腹水液を動物から採取する。
【０２５０】
前述の技法、および他の技法は、例えば参照により本明細書に組み込まれている、KohlerおよびMilstein、(1975)Nature 256:495〜497;米国特許第4,376,110号;HarlowおよびLane、Antibodies:a Laboratory Manual、(1988)Cold Spring Harbor中に論じられている。組換え抗体分子の調製に関する技法は、前述の参照文献中、および例えばEP0623679;EP0368684およびEP0436597中にも記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５１】
細胞培養物上清は、優先的にPGCまたは他の多能性細胞、ESまたはEG細胞などの免疫蛍光染色によって、免疫ブロッティングによって、酵素イムノアッセイ、例えばサンドウィッチアッセイまたはドットアッセイ、あるいはラジオイムノアッセイによって、所望の抗体に関してスクリーニングする。
【０２５２】
抗体を単離するために、培養物上清中または腹水液中の免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムとの沈降、ポリエチレングリコールなどの吸湿性物質での透析、選択膜を介した濾過などによって、濃縮することができる。必要な場合かつ/あるいは望むならば、一般的なクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、DEAE-セルロースでのクロマトグラフィーおよび/または(免疫-)親和性クロマトグラフィー、例えばFragilisまたはStella、またはその断片、あるいはタンパク質-Aに関する親和性クロマトグラフィーによって、抗体を精製する。
【０２５３】
モノクローナル抗体を分泌する、ハイブリドーマ細胞も提供する。好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定しており、所望の特異性のモノクローナル抗体を分泌し、解凍および再クローニングによって冷凍保存した培養物から活性化させることができる。
【０２５４】
Fragilisおよび/またはStellaを対象とするモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系を作製するための方法であって、適切な哺乳動物、例えばBalb/cマウスを1つまたは複数のFragilisまたはStellaポリペプチド、またはその抗原断片で免疫処置し;免疫処置した哺乳動物の抗体産生細胞を、適切なミエローマ細胞系の細胞と融合させ、融合で得られたハイブリッド細胞をクローニングし、所望の抗体を分泌する細胞のクローンを選択することを特徴とする方法も含まれる。例えば、Fragilisおよび/またはStellaで免疫処置したBalb/cマウスの脾臓細胞を、ミエローマ細胞系PAIまたはミエローマ細胞系Sp2/0-Agl4の細胞と融合させ、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌に関してスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
【０２５５】
好ましいのは、ハイブリドーマ細胞系を作製するための方法であって、Balb/cマウスを、Fragilisおよび/またはStellaを発現する10と107と108個の間の細胞、および適切なアジュバントを数回、例えば4〜6回、数ヶ月にわたって、例えば2〜4ヶ月、皮下および/または腹膜内に注射することによって免疫処置し、免疫処置したマウス由来の脾臓細胞を、最後の注射の2〜4日後に採取し、融合促進剤、好ましくはポリエチレングリコールの存在下においてミエローマ細胞系PAIの細胞と融合させることを特徴とする方法である。好ましくはミエローマ細胞は、3〜20倍過剰な免疫処置したマウス由来の脾臓細胞と、約30%〜約50%の分子量約4000のポリエチレングリコールを含む溶液中で融合させる。融合後、細胞を、本明細書で前に記載した適切な培養培地に広げ、選択培地、例えばHAT培地を一定間隔で補って、正常なミエローマ細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖するのを防ぐ。
【０２５６】
本明細書で前に記載したFragilisおよび/またはStellaに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする挿入体を含む組換えDNAも開示する。定義により、このようなDNAは、コード一本鎖DNA、前記コードDNA、その相補DNA、またはこれらの相補(一本鎖)DNA自体からなる二本鎖DNAを含む。
【０２５７】
さらに、Fragilisおよび/またはStellaに対する抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするDNAは、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメイン、またはそれらの突然変異体をコードする真正DNA配列を有する酵素合成または化学合成したDNAであってよい。真正DNAの突然変異体は、前述の抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするDNAであって、その中で1つまたは複数のアミノ酸が欠失しているか、あるいは1つまたは複数の他のアミノ酸と交換されているDNAである。前記修飾は、抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインのCDRの外側であることが好ましい。このような突然変異DNAは、1つまたは複数のヌクレオチドが、同じアミノ酸をコードする新しいコドンによって、他のヌクレオチドに置換されているサイレント突然変異体であるとも考えられる。このような突然変異配列は、縮重配列でもある。縮重配列は、無限数のヌクレオチドが、本来コードされているアミノ酸配列の変化をもたらさずに、他のヌクレオチドに置換されている遺伝コードの意味で縮重している。このような縮重配列は、それらの異なる制限部位、および/または特定の宿主、特に大腸菌によって好まれる特定コドンの頻度のために、重鎖ネズミ可変ドメインおよび/または軽鎖ネズミ可変ドメインの最適な発現を得るために、有用である可能性がある。
【０２５８】
用語、突然変異体は、当分野で知られている方法に従って、真正DNAのin vitroでの突然変異誘発によって得られる、DNAの突然変異体を含むものとする。
【０２５９】
完全なテトラマー免疫グロブリン分子の作製、およびキメラ抗体の発現用に、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えDNA挿入体を、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するDNAと融合させ、例えばハイブリッドベクターへの取り込み後に、次いで適切な宿主細胞に移す。
【０２６０】
ヒト定常ドメインg、例えばγ1、γ2、γ3、またはγ4、好ましくはγ1またはγ4と融合させた、Fragilisおよび/またはStellaに対する抗体の重鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入体を含む組換えDNAも開示する。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκと融合させた、Fragilisおよび/またはStellaに対する抗体の軽鎖ネズミ可変ドメインをコードする挿入体を含む組換えDNAも開示する。
【０２６１】
他の実施形態において本発明者らは、組換えポリペプチドをコードする組換えDNAであって、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインがスペーサー基によって連結しており、宿主細胞中での抗体の処理を容易にするシグナル配列、および/または抗体の精製を容易にするペプチドをコードするDNA、および/または切断部位および/またはペプチドスペーサーおよび/またはエフェクター分子を場合によっては含む組換えDNAを開示する。
【０２６２】
エフェクター分子をコードするDNAは、診断または治療用途に有用なエフェクター分子をコードするDNAであるとする。したがって、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒することができる酵素であるエフェクター分子が特に示される。このようなエフェクター分子をコードするDNAは、天然に存在する酵素または毒素をコードするDNA、またはその突然変異体の配列を有しており、当分野でよく知られている方法によって作製することができる。
【０２６３】
抗ペプチドSTELLAおよびFRAGILIS抗体
StellaおよびFragilisペプチド配列に対する、抗ペプチド抗体を生成することができる。選択する配列は、以下のマウス配列に基づくものであってよい;
Fragilis:ASGGQPPNYERIKEEYEおよびRDRKMVGDVTGAQAYA
Stella:MEEPSEKVDPMKDPETおよびCHYQRWDPSENAKIGKN
【０２６４】
免疫処置した動物から抗ペプチド抗体を誘導する際に使用するためにヒトStellaおよびFragilisからの対応する配列を選択することができる。ウサギへの注射、および例えばHarlowおよびLane(上記)中に記載された他の従来的手段によって、抗体を生成することができる。
【０２６５】
抗体はElisaアッセイおよびウエスタンブロッティングによって調べ、実施例中に記載したのと同様に免疫染色用に使用する。
【０２６６】
治療用ペプチド
ここに開示するポリペプチド、例えばStellaおよびFragilisポリペプチドは、これらの配列の任意の部分を含むペプチドの形で、癌を含めた様々な疾患を治療するために、治療用に使用することができる。
【０２６７】
このようなFragilisおよび/またはStellaペプチドを治療用に使用する場合、天然に存在するアミノ酸のみからなるわけではないが、修飾されて、例えば免疫原性が低下している、患者体内での循環半減期が増大している、生物学的利用能が増大している、かつ/あるいは有効性および/または特異性が増大しているペプチドを使用することが好ましい。
【０２６８】
幾つかの手法を使用して、治療用途にペプチドを修飾している。1つの手法は、ペプチドまたはタンパク質と、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)などの様々なポリマーを結合させることである。例えば米国特許第5,091,176号、米国特許第5,214,131号および米国特許第5,264,209号を参照のこと。
【０２６９】
天然に存在するアミノ酸と、様々な非コードまたは修飾アミノ酸、D-アミノ酸およびN-メチルアミノ酸などの置換を使用して、Stellaおよび/またはFragilisペプチドを修飾することもできる。
【０２７０】
他の手法は、N-スクシンイミジル3-(2ピリジルジチオ)プロピオネート、スクシンイミジル6-[3-(2ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル6-[3-(2ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエートなどの二官能性架橋剤を使用することである(米国特許第5,580,853号を参照のこと)。
【０２７１】
立体配座が制限されている、ここに開示するペプチドの誘導体を使用することが、望ましい可能性がある。立体配座の制限とは、ペプチドが呈する三次元形状の安定性および好ましい立体配座を指す。立体配座の制限には、ペプチド中の1残基の立体配座の移動に関する局所的制限;幾つかの二次構造単位を形成することができる残基である基の立体配座の移動に関する領域制限;および全体のペプチド構造に関する全体的制限がある。
【０２７２】
ペプチドの活性がある立体配座は、環化などの共有結合の修飾によって、あるいはγ-ラクタムまたは他の型の架橋の取り込みによって、安定させることができる。例えば、側鎖を骨格に環化して、相互作用部位のそれぞれの側にL-γ-ラクタム部分を作製することができる。Hruby他、「Applications of Synthetic Peptides」、Synthetic Peptides:A User's Guide:259〜345(W.H.Freeman & Co.1992)を概略的に参照のこと。環化は、例えばシスチン架橋の形成、それぞれの末端アミノ酸のアミノ末端基とカルボキシ末端基の結合、またはLys残基または関連相同体のアミノ基と、Asp、Gluまたは関連相同体のカルボキシ基の結合によって、行うこともできる。ヨード酢酸無水物を使用する、ポリペプチドのα-アミノ基とリシン残基のε-アミノ基の結合を、行うこともできる。WoodおよびWetzel、1992、Int'l J.Peptide Protein Res.39、533〜39を参照のこと。
【０２７３】
米国特許第5,891,418号に記載された他の手法は、金属-イオン複合体骨格をペプチド構造に含ませることである。典型的には、好ましい金属-ペプチド骨格は、所与の複合体金属イオンの配位範囲に必要とされる、必要数の特定の配位基に基づく。一般に、有用となる可能性がある大部分の金属イオンは、4〜6の配位数を有する。ペプチド鎖中の配位基の性質には、窒素原子、アミン、アミド、イミダゾール、またはグアニジノ官能基を有する;チオールまたはジスルフィドのイオウ原子;およびヒドロキシ、フェノール、カルボニル、またはカルボキシル官能基の酸素原子がある。さらに、ペプチド鎖または個々のアミノ酸を化学的に改変して、例えばオキシム、ヒドラジノ、スルフリジル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、またはモルホリノなどの配位基を含ませることができる。ペプチド構築体は、直鎖または環状のいずれかであってよいが、しかしながら、直鎖の構築体が典型的には好ましい。小さな直鎖ペプチドの一例はGly-Gly-Gly-Glyであり、これはその骨格中に、配位数4で金属イオンと複合体形成することができる4つの窒素原子(N4複合体系)を有する。
【０２７４】
治療用ペプチドの性質を改善するための他の技法は、非ペプチドペプチド擬似体を使用することである。広く様々な有用な技法を使用して、ペプチドの正確な構造を解明することができる。これらの技法には、アミノ酸の塩基配列決定、x線結晶分析、質量分析法、核磁気共鳴分析法、コンピュータ支援の分子のモデル化、ペプチドの地図化、およびこれらの組合せがある。ペプチドの構造分析により一般に、ペプチドのアミノ酸配列、およびその原子要素の三次元的配置を含む、多量のデータが与えられる。この情報から、治療活性に必要とされる化学的官能性を有するが、より安定性がある、例えば生物学的分解を受けにくい、非ペプチドペプチド擬似体を設計することができる。この手法の一例は、米国特許第5,811,512号中に与えられている。
【０２７５】
治療用ペプチドを化学的に合成するための技法は、前述の参照文献中に記載されており、Borgia and Fields、2000、TibTech 18、243〜251によっても概説されており、その中に含まれる参照文献中に詳細に記載されている。
【０２７６】
トランスジェニック動物
本発明者らはさらに、正常な発現レベルと比較して高レベルまたは低レベルで、天然または組換えStellaおよび/またはFragilis、または相同体、変異体または誘導体を発現することができる、トランスジェニック動物を記載する。場合によって、機能的Stellaおよび/またはFragilisを発現しないトランスジェニック動物(「Stellaノックアウト」または「Fragilisノックアウト」)が含まれる。StellaおよびFragilisノックアウトは、Stellaおよび/またはFragilis遺伝子の欠失または置換を含む1つまたは複数の機能の突然変異の消失を含めて、Stellaおよび/またはFragilis遺伝子またはその遺伝子の任意の一部分の機能破壊の結果として生じる可能性がある。突然変異は一箇所突然変異を含み、Stellaおよび/またはFragilisのコード領域または非コード領域を標的とすることができる。
【０２７７】
このようなトランスジェニック動物は、ブタ、ヒツジまたは齧歯類などの非ヒト哺乳動物であることが好ましい。トランスジェニック動物は、マウスまたはラットであることが最も好ましい。このようなトランスジェニック動物をスクリーニング手順において使用して、Stellaおよび/またはFragilisのアゴニストおよび/またはアンタゴニストを同定すること、ならびにin vivoにおける疾患の治療剤としてのそれらの有効性を試験することができる。
【０２７８】
Stellaおよび/またはFragilisを欠くマウスは、様々な目的で使用することができる。例えば、工学処理してStellaおよび/またはFragilisの生成に欠陥があるトランスジェニック動物は、Stellaおよび/またはFragilisのアゴニストおよび/またはアンタゴニストを同定するためのアッセイにおいて使用することができる。潜在的薬剤(候補リガンドまたは化合物)を評価して、それがStellaおよび/またはFragilisの不在下で生理的応答を生み出すかどうかを判定するための1つのアッセイが設計されている。これは、前に論じたトランスジェニック動物に薬剤を投与し、次いで特定の応答に関して動物をアッセイすることによって行うことができる。
【０２７９】
場合により、Stellaおよび/またはFragilisノックアウト動物由来の組織を、潜在的薬剤(候補リガンドまたは化合物)が、StellaまたはFragilisと結合するかどうかを判定するための結合アッセイにおいて使用することができる。このようなアッセイは、工学処理してStellaおよび/またはFragilisの生成に欠陥があるトランスジェニック動物から第一のStellaおよび/またはFragilis調製物、および任意の同定されたリガンドまたは化合物と結合することが知られている源から第二のStellaおよび/またはFragilis調製物を得ることによって行うことができる。一般に、第一の調製物と第二の調製物は、それらを得る源以外すべての点で類似している。例えば、トランスジェニック動物(前および以下に記載するものなど)由来の脳組織をアッセイにおいて使用する場合、正常(野生型)動物由来の匹敵する脳組織を、第二の調製物の源として使用する。それぞれの調製物は、単独および候補リガンドまたは化合物の存在下において、Stellaおよび/またはFragilisと結合することが知られているリガンドと共にインキュベートする。候補リガンドまたは化合物は、幾つかの異なる濃度で調べることが好ましいであろう。
【０２８０】
知られているリガンドによる結合が試験化合物による結合と代わる程度を、第一の調製物と第二の調製物の両方に関して決定する。トランスジェニック動物由来の組織はアッセイにおいて直接使用することができ、あるいは組織を処理して、それ自体がアッセイにおいて使用されるStellaおよび/またはFragilisタンパク質を単離することができる。好ましいトランスジェニック動物はマウスである。結合アッセイと適合性がある任意の手段を使用して、リガンドを標識することができる。これは非制限的に、放射活性、酵素、蛍光または化学発光標識(および前でさらに詳細に記載した他の標識技法)を含むと思われる。
【０２８１】
さらに、Stellaおよび/またはFragilisのアンタゴニストは、機能的Stellaおよび/またはFragilisを発現する野生型動物に、およびStellaおよび/またはFragilisの機能の低発現または無発現と関係がある任意の表現型特性を示す同定済みの動物に、候補化合物などを投与することによって、同定することができる。
【０２８２】
非ヒトトランスジェニック動物を作製するための方法は当分野で知られており、以下の実施例中にさらに詳細に記載する。トランスジェニック遺伝子構築体を、動物の生殖系列に導入して、トランスジェニック哺乳動物を作製することができる。例えば、構築体の1個または数個のコピーを、標準的なトランスジェニック技法によって、哺乳動物胚のゲノムに取り込ませることができる。
【０２８３】
例示的実施形態では、ここに記載するトランスジェニック非ヒト動物を、導入遺伝子を非ヒト動物の生殖系列中に導入することによって生成させる。様々な発生段階の胚の標的細胞を、導入遺伝子を導入するために使用することができる。胚の標的細胞の発生の段階に応じて、異なる方法が使用される。トランスジェニック動物を生成させるために使用する任意の動物の特定の系は、一般的な良い健康状態、良い胚の収率、胚中の良い前核の鮮明度、および良い生殖適合性のために選択する。さらに、ハプロタイプは重要な要因である。
【０２８４】
導入遺伝子の胚中への導入は、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなどの当分野で知られている任意の手段によって行うことができる。例えば、StellaまたはFragilisの導入遺伝子は、分化中の哺乳動物の細胞中に構築体の1つまたは複数のコピーを保持させるための受精哺乳動物卵の前核への構築体のマイクロインジェクションによって、哺乳動物中に導入することができる。導入遺伝子構築体を受精卵に導入した後、卵はin vitroで、様々な量の時間インキュベートすることができ、または卵を代理宿主に再移植することができ、あるいはこの両方が可能である。成熟状態までのin vitroでのインキュベーションも含まれる。1つの一般的な方法は、種に応じて約1〜7日間in vitroで胚をインキュベートし、次いでそれらを代理宿主に再移植することである。
【０２８５】
トランスジェニック的に操作された胚の子孫は、組織切片のサザンブロット分析によって、構築体の存在に関して試験することができる。外因性のクローニングされた構築体の1つまたは複数のコピーが、このようなトランスジェニック胚のゲノムに安定的に組み込まれた状態である場合、トランスジェニック的に加えられた構築体を担持する、永続的なトランスジェニック哺乳動物系を樹立することが可能である。
【０２８６】
同腹仔のトランスジェニック的に改変した哺乳動物は、構築体の子孫のゲノム中への取り込みに関して、生後にアッセイすることができる。このアッセイは、所望の組換えタンパク質産物またはその切片をコードするDNA配列に対応するプローブと、子孫由来の染色体物質をハイブリッド形成することにより、行うことが好ましい。そのゲノム中に構築体の少なくとも1つのコピーを含むことが発見されている、これらの哺乳動物の子孫は、成熟状態まで増殖する。
【０２８７】
本文書の目的では、接合子は本質的に、完全な生物に発達することができる二倍体細胞の形成体である。一般に接合子は、自然に形成された核、または1つまたは複数の配偶子由来の2つの半数体核の融合によって人工的に形成された核を含む卵からなる。したがって、配偶子核は、本来適合性がある核、すなわち、分化を経て機能的生物に発達することができる、生命力のある接合子をもたらす核でなければならない。一般に、正倍数性の接合子が好ましい。異数性の接合子が得られる場合、染色体の数は、いずれかの配偶子が由来する正倍数性の生物に関して、2以上変わらないはずである。
【０２８８】
同様の生物学的考慮事項に加えて、物理的考慮事項も、接合子の核または接合子核の一部分を形成する遺伝物質に加えることができる外因性遺伝物質の量(例えば体積)を左右する。遺伝物質が除去されない場合、加えることができる外因性遺伝物質の量は、物理的に破壊されずに吸収される量に制限される。一般に、挿入される外因性遺伝物質の体積は、約10ピコリットルを超えないであろう。添加の物理的影響は、接合子の生命力を物理的に害するほど大きくはないはずである。DNA配列の数および多様性の生物学的制限は、個々の接合子および外因性遺伝物質の機能に応じて変わり、当業者には容易に明らかであろう。なぜなら、生成する接合子の外因性遺伝物質を含めた遺伝物質は、接合子の機能的生物への分化および発達を開始させ状態を維持することが、生物学的に可能であるはずであるからである。
【０２８９】
接合子に加えられる導入遺伝子構築体のコピーの数は、加えられる外因性遺伝物質の合計量に依存し、遺伝的形質転換を起こすことができる量である。理論的には、ただ1つのコピーのみが必要とされる。しかしながら、一般には、多数のコピー、例えば導入遺伝子構築体の1,000〜20,000個のコピーを使用して、1つのコピーが機能的であることを確実にする。外因性DNA配列の表現型発現を増大させるために、挿入する外因性DNA配列それぞれの2つ以上の機能的コピーを有することは、利点があることが多い。
【０２９０】
外因性遺伝物質を核遺伝物質に加えることができる任意の技法は、それが細胞、核膜、または他の既存の細胞または遺伝的構造を害さない限り、使用することができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって核遺伝物質に優先的に挿入される。細胞および細胞構造体のマイクロインジェクションは知られており、当分野で使用されている。
【０２９１】
再移植は標準的な方法を使用して行われる。通常は、代理宿主に麻酔をかけ、胚を卵管に挿入する。個々の宿主に移植する胚の数は種によって変わるが、通常はその種が本来生み出す子孫の数に匹敵するであろう。
【０２９２】
代理宿主のトランスジェニック子孫は、任意の適切な方法によって、導入遺伝子の存在および/または発現に関してスクリーニングすることができる。スクリーニングは、導入遺伝子の少なくとも一部分と相補的なプローブを使用して、サザンブロットまたはノーザンブロット分析によって、行われることが多い。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析を、導入遺伝子産物の存在に関してスクリーニングするための代替的または追加的な方法として使用することができる。典型的には、尾部組織からDNAを調製し、導入遺伝子のサザン分析またはPCRによって分析する。あるいは、高レベルで導入遺伝子を発現すると考えられる組織または細胞を、サザン分析またはPCRを使用して導入遺伝子の存在および発現に関して試験するが、任意の組織または細胞型を、この分析用に使用することができる。
【０２９３】
導入遺伝子の存在を評価するための代替的または追加的な方法には、非制限的に、酵素および/または免疫アッセイなどの適切な生化学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性に関する組織染色、フローサイトメトリー分析などがある。血液中の導入遺伝子産物の存在を検出するため、および様々な型の血液細胞および他の血液成分のレベルに対する導入遺伝子の影響を評価するために、血液の分析も有用である可能性がある。
【０２９４】
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物と適切なパートナーを交配させることによって、あるいはトランスジェニック動物から得た卵および/または精子のin vitro受精によって得ることができる。パートナーとの交配を行う場合、そのパートナーはトランスジェニックおよび/またはノックアウトであってもなくてもよく、パートナーがトランスジェニックである場合、それは同じまたは異なる導入遺伝子、あるいは両方を含むことができる。あるいはパートナーは、親系統であってよい。in vitro受精を使用する場合、受精胚を代理宿主に移植することができ、あるいはin vitroでインキュベートすることができ、またはこの両方が可能である。いずれかの方法を使用して、前に記載した方法、または他の適切な方法を使用することにより、導入遺伝子の存在に関して子孫を評価することができる。
【０２９５】
ここに記載する方法に従い生成させたトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を含むであろう。前述のように、外因性遺伝物質は、幾つかの実施形態では、Stellaおよび/またはFragilisタンパク質の生成をもたらすDNA配列であろう。さらに、このような実施形態では配列は、転写調節要素、例えば、プロモーターと結合し、これによって、特定の型の細胞中での導入遺伝子産物の発現が可能になることが好ましい。
【０２９６】
(場合により)StellaまたはFragilisの空間的または時間的な発現、あるいは両方を制御するために、調節要素(プロモーターまたはエンハンサー)を操作することが可能であることは理解されよう。例えば、特定の調節要素を、発現が幾つかの組織のみに限られるように、外因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子座から削除することができる。あるいは、調節要素の1つのみ、幾つか、あるいは複数を含む、導入遺伝子を調製することができる。Stellaおよび/またはFragilisに関してこのように作製し、時間的なまたは空間的、あるいはこの両方で異所発現する性質を有するトランスジェニック動物は、Stellaおよび/またはFragilisの遺伝子機能を調べるのに有用であろう。
【０２９７】
レトロウイルス感染を使用して、導入遺伝子を非ヒト動物に導入することもできる。発達中の非ヒト胚は、in vitroで胚盤胞段階まで培養することができる。この時間中、卵割球がレトロウイルス感染の標的である可能性がある(Jaenich、R.(1976)PNAS 73:1260〜1264)。卵割球の効率の良い感染は、透明帯を除去するための酵素処理によって得られる(Manipulating the Mouse Embryo、Hogan編(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1986)。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、典型的には導入遺伝子を担持する複製欠陥レトロウイルスである(Jahner他(1985)PNAS 82:6927〜6931;Van der Putten他(1985)PNAS 82:6148〜6152)。ウイルス生成細胞の単層上で卵割球を培養することによって、トランスフェクションが容易かつ効果的に行われる(Van der Putten上記;Stewart他(1987)EMBO J.6:383〜388)。あるいは、後期段階で感染を行うことができる。ウイルスまたはウイルス生成細胞を、卵割腔に注射することができる(Jahner他(1982)Nature 298:623〜628)。大部分の創始細胞は、導入遺伝子の寄せ集めである。なぜなら、細胞の亜群中のみで取り込みが起こり、これによってトランスジェニック非ヒト動物が形成されるからである。さらに、創始細胞は、様々なレトロウイルス用の挿入体である導入遺伝子を、一般に子孫に分離するゲノム中の異なる位置に含むことができる。さらに、妊娠中の胚の子宮内レトロウイルス感染によって、導入遺伝子を生殖系列に導入することもできる(Jahner他(1982)上記)。
【０２９８】
導入遺伝子導入用の第三の型の標的細胞は、胚性幹細胞(ES)である。ES細胞をin vitroで培養した着床前胚から得て、胚と融合させる(Evans他(1981)Nature 292:154〜156;Bradley他(1984)Nature 309:255〜258;Gossler他(1986)PNAS 83:9065〜9069;およびRobertson他(1986)Nature 322:445〜448)。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションによって、あるいはレトロウイルス仲介の形質導入によって、ES細胞中に効率よく導入することができる。このような形質転換ES細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と後に組み合わせることができる。ES細胞は後に胚にコロニー形成し、生成するキメラ動物の生殖系列に貢献する。概要に関しては、Jaenisch、R.(1988)Science 240:1468〜1474を参照のこと。
【０２９９】
本発明者らは、非ヒトトランスジェニック動物であって、改変型Stellaおよび/またはFragilis遺伝子、好ましくは前に記載した遺伝子を、場合により、StellaまたはFragilis機能のモデルとして有することを特徴とするトランスジェニック動物も提供する。遺伝子への改変には、欠失または他の機能的突然変異の消失、標的または無作為突然変異があるヌクレオチド配列を有する外因性遺伝子の導入、他種由来の外因性遺伝子の導入、またはこれらの組合せがある。トランスジェニック動物は、改変用に同型または異型のいずれかであってよい。これらの動物および動物由来の細胞は、Stellaおよび/またはFragilisの機能を調節することができる、生物学的活性がある物質をスクリーニングするのに有用である。スクリーニング法は、前に記載したStellaおよび/またはFragilis関連疾患用の可能性のある治療剤の特異性および作用を決定するために、特に使用される。これらの動物は、身体中のStellaおよび/またはFragilisタンパク質の役割を調べるためのモデルとして有用である。
【０３００】
他の態様は、機能的に破壊された外因性Stella遺伝子またはFragilis遺伝子、あるいは両方を有するが、そのゲノム中に異種Stellaおよび/またはFragilisタンパク質(すなわち、他種由来のStellaおよび/またはFragilis遺伝子)をコードする導入遺伝子も担持し、それを発現するトランスジェニック動物に関する。動物がマウスであり、異種StellaまたはFragilisがヒトStellaまたはFragilisであることが好ましい。ヒトStellaおよび/またはFragilisを用いて再構築した、動物、またはこのような動物由来の細胞系を使用して、ヒトStellaおよび/またはFragilisをin vivoおよびin vitroで阻害する物質を同定することができる。例えば、ヒトStellaおよび/またはFragilisを介したシグナルを誘導する刺激を、試験する物質の存在下および不在下において、動物、または細胞系に施すことができ、動物、または細胞系での応答を測定することができる。ヒトStellaおよび/またはFragilisをin vivoまたはin vitroで阻害する物質は、物質の不在下での応答と比較した物質の存在下での低い応答に基づいて、同定することができる。
【０３０１】
本発明者らは、Stellaおよび/またはFragilis欠損トランスジェニック非ヒト動物(「Stella/Fragilisノックアウト」または「Stella/Fragilisゼロ」)も与える。このような動物は、好ましくは内因性StellaまたはFragilis(場合により)のゲノム配列が害されたかあるいは欠失した結果として、低いStella/Fragilis活性を示すか、あるいはまったく示さない動物である。内因性StellaまたはFragilisのゲノム配列は、ゼロ対立遺伝子によって置換することができ、野生型Stella/Fragilis配列の非機能的部分を含む可能性がある。例えば、内因性StellaまたはFragilisのゲノム配列は、異種配列、例えばレポーター配列および/または選択可能マーカーを含むことができる害された配列を含む、Stella/Fragilisの対立遺伝子によって置換することができる。Stella/Fragilisノックアウトマウス中の内因性StellaまたはFragilisのゲノム配列は、StellaまたはFragilisの対立遺伝子によって置換されていることが好ましく、その中ではコード配列の1つまたは複数、好ましくはすべてが、このような害された配列、好ましくはlacZ配列およびネオマイシン耐性配列によって置換されている。機能的に害されているゲノムStella/Fragilis配列は、マウスStella/Fragilisゲノム配列を含むことが好ましい。
【０３０２】
このような動物は、StellaまたはFragilis活性、あるいは両方を示さないことが好ましい。動物は、配列表中に示すStellaまたはFragilisタンパク質の活性を示さないことがさらに好ましい。Stella/Fragilisノックアウトは、以下でさらに詳細に記載するように、当分野で知られている様々な手段によって作製することができる。Stellaノックアウトマウスの構築の具体的な記載は、以下の実施例20以降に開示する。
【０３０３】
本発明者らはさらに、宿主細胞中の機能的に破壊されたStella/Fragilis遺伝子の核酸構築体を開示する。この核酸構築体は、a)非相同置換部分;b)非相同置換部分の上流に位置する第一の相同領域であって、第一のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する第一の相同領域;およびc)非相同置換部分の下流に位置する第二の相同領域であって、第二のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有し、第二のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列が、天然に存在する内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子中の第一のStellaおよび/またはFragilis遺伝子配列の下流に位置を有する第二の相同領域を含む。さらに、第一および第二の相同領域は、核酸分子が宿主細胞中に導入されるとき、核酸構築体と宿主細胞中の内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子の間の相同的組換えに充分な長さである。好ましい実施形態では、非相同置換部分は、好ましくはlacZおよび陽性選択発現カセットを含み、好ましくは制御要素と動作可能に連結したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現レポーターを含む。
【０３０４】
他の態様は、その中に前に記載した核酸構築体を組み込んだ組換えベクターに関する。さらに他の態様は、その中に核酸構築体を導入して、それによって核酸構築体と宿主細胞の内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子の間の相同的組換えを可能にし、内因性Stella/Fragilis遺伝子の機能破壊が生じている宿主細胞に関する。宿主細胞は、肝臓、脳、脾臓または心臓由来のStella/Fragilisを通常発現する哺乳動物細胞、またはマウス胚性幹細胞などの多能性細胞であってよい。その中に核酸構築体が導入されており、内因性Stellaおよび/またはFragilis遺伝子に関して相同的に組換えられた胚性幹細胞をさらに開発することによって、胚性幹細胞の子孫でありしたがってそれらのゲノムにStella/Fragilis遺伝子の障害を有する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物が生じる。次いで、それらの生殖系列にStella/Fragilis遺伝子の障害を有する動物を選択し、それらを交配して、すべての体細胞および生殖細胞中にStella/Fragilis遺伝子の障害を有する動物を生み出すことができる。次いで、このようなマウスを交配して、Stella/Fragilis遺伝子の障害に関して同型にすることができる。
【０３０５】
細胞集団中の多能性細胞の検出
ここに記載するポリヌクレオチドプローブまたは抗体は、細胞集団中の始原生殖細胞(PGC)などの多能性細胞、胚性幹細胞(ES)などの幹細胞、および胚性生殖(EG)細胞を検出するために使用することができる。本明細書で使用するように、「細胞集団」は、1つまたは複数のPGC、ESまたはEG細胞を含むことができる、細胞の任意の集合である。細胞の集合はPGCのみからならず、少なくとも1つの他の細胞型を含むことが好ましい。
【０３０６】
細胞集団は、胚および胚組織だけでなく、成体組織、および培養において増殖させた組織、ならびに前述のいずれかに由来する細胞調製物を含む。
【０３０７】
ここに記載するポリヌクレオチドは、核酸ハイブリッド形成技法によって、PGCまたは他の多能性細胞、例えばESまたはEG細胞など中のFragilisおよびStellaの転写産物を検出するために使用することができる。このような技法には、プライマーをFragilisおよび/またはStellaの転写産物とハイブリッド形成させ、それを使用して転写産物を増幅させ、検出可能なシグナルを与えるPCR;およびFragilisおよび/またはStellaの転写産物の特定の配列に特異的なプローブを使用して、標的細胞中の転写産物を検出する標識プローブのハイブリッド形成がある。
【０３０８】
本明細書で前に示したように、プローブは、当分野で知られているように、放射活性、放射線不透過性、蛍光性または他の標識で標識することができる。
【０３０９】
抗体を使用して、Fragilisおよび/またはStellaを検出することもできる。Fragilisは特に、抗Fragilis抗体によって標的化され細胞表面で検出することができる細胞外ドメインを有する。あるいは、細胞内scFvを使用して、細胞中のFragilisおよび/またはStellaを検出することができる。
【０３１０】
特に示されるのは、免疫染色およびFACS技法である。適切な蛍光物質は当分野で知られており、化学蛍光物質およびGFPなどの蛍光ポリペプチド、およびその突然変異体を含む(WO97/28261を参照のこと)。化学蛍光物質は、その合成中に免疫グロブリン分子にそのための結合部位を取り込ませることによって、免疫グロブリン分子と結合させることができる。
【０３１１】
蛍光物質は蛍光タンパク質であることが好ましく、それはGFPまたはその突然変異体であることが有利である。GFPおよびその突然変異体は、当分野でよく知られている方法に従い融合ポリペプチドとして発現させることによって、免疫グロブリンまたは標的分子と共に合成することができる。例えば、転写単位を、所望のGFPおよび免疫グロブリンまたは標的のインフレーム融合体として構築することができ、従来のPCRクローニングおよび連結技法を使用して、前に記載したようにベクター中に挿入することができる。
【０３１２】
シグナルを生成することができる任意の標識で、抗体を標識することができる。シグナルは、検出可能な遺伝子産物の発現の誘導などの任意の検出可能なシグナルであってよい。検出可能な遺伝子産物の例には、ルシフェラーゼおよびGFPなどの生物発光ポリペプチド、β-ガラクトシダーゼおよびCATなどの特異的アッセイによって検出可能なポリペプチド、およびを宿主細胞に特徴的な増殖を調節するポリペプチド、HIS3などの代謝に必要な酵素など、またはG418などの抗生物質耐性遺伝子がある。好ましい態様では、シグナルは細胞表面で検出可能である。例えばシグナルは、発光または蛍光シグナルであってよく、これは細胞の外側から検出可能であり、FACSまたは他の光学的選別技法による細胞選別を可能にする。
【０３１３】
蛍光標識した抗体の光学的検出に基づく、光学イムノセンサー技術を使用することが好ましい。イムノセンサーは、相補種の結合を検出するシグナル変換物質と結合した抗原または抗体種を含む生化学的検出装置である(Rabbany他、1994 Crit Rev Biomed Eng 22:307〜346;Morgan他、1996 Clin Chem 42:193〜209)。このような相補種の例には、抗原Zif268および抗Zif268抗体がある。イムノセンサーによって、血清または全血などの複合サンプル中に存在する、抗体、抗原またはハプテンの量の定量的測定値が生成する(Robinson 1991 Biosens Bioelectron 6:183〜191)。イムノセンサーの感度は、それらをスピードおよび精度が必要とされる状況に理想的なものにしている(Rabbany他、1994 Crit Rev Biomed Eng 22:307〜346)。
【０３１４】
イムノセンサーによって使用される検出技法には、免疫相互作用の電気化学的、圧電的、または光学的検出がある(Ghindilis他、1998 Biosens Bioelectron 1:113〜131)。間接的イムノセンサーは、例えば蛍光または発光物質との結合後に検出される別の標識種を使用する(Morgan他、1996 Clin Chem 42:193〜209)。直接型イムノセンサーは、電位差、電流、抵抗、質量、熱または光学的性質の変化によって結合を検出する(Morgan他、1996 Clin Chem 42:193〜209)。間接型イムノセンサーは、非特異的結合のために、少ない問題点に遭遇する可能性がある(Attridge他、1991 Biosens Bioelecton 6:201〜214;Morgan他、1996 Clin Chem 42:193〜209)。
【０３１５】
予防法および治療法
本発明者らは、過剰量および不充分量のStellaおよび/またはFragilis活性と関係がある、異常な状態を治療する方法を提供する。これらの例には、前に開示したStella関連疾患およびFragilis関連疾患がある。
【０３１６】
Stellaおよび/またはFragilisの活性が過剰である場合、幾つかの手法が利用可能である。一手法は、薬剤として許容可能な担体と共に記載する阻害剤化合物(アンタゴニスト)を対象に有効量投与して、関連分子とStellaおよび/またはFragilisの結合を阻害することによって、または第二のシグナルを阻害し、それによって異常な状態を緩和することによって、活性化を阻害することを含む。
【０３１７】
他の手法では、Stellaおよび/またはFragilisがリガンドと結合することによって作用する場合、依然としてリガンドと結合することができる可溶形のStellaおよび/またはFragilisポリペプチドを、内因性Stellaおよび/またはFragilisと競合させて投与することができる。このような競合剤の典型的な実施形態は、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドの断片を含む。
【０３１８】
さらに他の手法では、内因性Stellaおよび/またはFragilisをコードする遺伝子の発現を発現阻害技法を使用して阻害することができる。知られているこのような技法は、内部で生成させたかあるいは別々に投与されるアンチセンス配列の使用を含む。例えば、O'Connor、J Neurochem(1991)56:560 in Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.(1988)を参照のこと。あるいは、遺伝子と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給することができる。例えば、Lee他、Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooney他、Science(1988)241:456;Dervan他、Science(1991)251:1360を参照のこと。これらのオリゴマー自体を投与することができ、あるいは関連オリゴマーをin vivoで発現させることができる。
【０３１９】
Stellaおよび/またはFragilisの過小発現およびその活性と関係がある異常な状態を治療するために、幾つかの手法が利用可能でもある。一手法は、Stellaおよび/またはFragilisを活性化させる化合物、すなわち前に記載したアゴニストを、薬剤として許容可能な担体と組み合わせて、対象に治療上有効量投与して、それによって異常な状態を緩和することを含む。あるいは、遺伝子療法を使用して、対象中の関連細胞によるStellaおよび/またはFragilisの内因性の生成に影響を与えることができる。
【０３２０】
例えば、本文書中に記載するポリヌクレオチドは、複製欠陥レトロウイルスベクター中での発現用に工学処理することができる。したがって、レトロウイルス発現構築体を単離し、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで、形質導入したパッケージ化細胞中に導入することができ、その結果パッケージ化細胞は、当該の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を現生成する。in vivoの細胞を工学処理するため、in vivoのポリペプチドを発現させるために、これらの生産者細胞を対象に投与することができる。遺伝子療法の概要に関しては、Human Molecular Genetics、T Strachan and A P Read、BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)中、Chapter20、Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中に引用された参照文献)を参照のこと。
【０３２１】
製剤および投与
Stellaおよび/またはFragilisペプチドおよびポリペプチド、およびアゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分子などのペプチドおよびポリペプチドを、適切な薬剤担体と組み合わせて処方することができる。このような製剤は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、および薬剤として許容可能な担体または賦形剤を含む。このような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。当業者によく知られているように、製剤は投与形式に適合しなければならない。本発明者らはさらに、前述の組成物の1つまたは複数の成分を充填した1つまたは複数の容器を含む、薬剤パックおよびキットを記載する。
【０３２２】
ポリペプチドおよび他の化合物は単独で、あるいは治療用化合物などの他の化合物と共に使用することができる。
【０３２３】
薬剤組成物の全身投与の好ましい形には、典型的には静脈内注射による注射がある。皮下、筋肉内、または腹膜内などの他の注射経路を使用することができる。全身投与の他の手段には、胆汁酸塩またはフシジン酸などの浸透物質、または他の洗浄物質を使用する経粘膜および経皮投与がある。さらに、腸溶性または被包性製剤に適切に配合した場合、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は局所的であってもよく、かつ/あるいは、軟膏、ペースト、ゲルなどの形で局在してよい。
【０３２４】
必要とされる用量範囲は、ペプチドの選択、投与の経路、製剤の性質、対象の状態の性質、および主治医の判断に依存する。しかしながら、適切な用量は、0.1〜100μg/対象1kgの範囲である。しかしながら、必要とされる用量の広範囲の変化が、様々な利用可能な化合物、および様々な投与経路の異なる有効性を鑑みて予想される。例えば、経口投与には、静脈内注射による投与よりも、高用量が必要であると予想される。このような用量レベルの違いは、当分野で充分理解されているように、最適化のための標準的な経験的手順を使用して調節することができる。
【０３２５】
治療で使用されるポリペプチドは、前に記載した「遺伝子療法」としばしば呼ばれる治療療法において、対象で内因的に、生成することもできる。したがって、例えば、対象由来の細胞をDNAまたはRNAなどのポリヌクレオチドで工学処理して、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを使用することによって、ex vivoでポリペプチドをコードさせることができる。次いで細胞を、対象に導入する。
【０３２６】
薬剤組成物
本発明者らは、治療上有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ベクターまたは抗体(Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドなど)、および場合によっては薬剤として許容可能な担体、希釈剤または賦形剤(これらの組合せ含む)を投与することを含む、薬剤組成物も提供する。
【０３２７】
薬剤組成物は、ヒト医学および獣医学においてヒトまたは動物に使用するためのものであってよく、任意の1つまたは複数の薬剤として許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤を典型的には含む。治療用途に許容可能な担体または希釈剤は、薬剤分野ではよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中に記載されている。薬剤担体、賦形剤または希釈剤の選択肢は、目的の投与経路および標準的薬剤慣習に関して選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を、あるいはこれらを追加的に含むことができる。
【０３２８】
防腐剤、安定剤、染料、および香料剤さえも、薬剤組成物中に与えることができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルがある。抗酸化剤および懸濁剤も使用することができる。
【０３２９】
異なる送達系に応じて、異なる組成物/製剤要件が存在する可能性がある。例えば、ここに記載する薬剤組成物を配合し、小ポンプを使用して、あるいは粘膜経路によって、例えば鼻腔スプレーまたは吸引用エアロゾルまたは摂取溶液として、あるいは例えば静脈内、筋肉内、または皮下経路による送達用の注射可能な形に組成物を配合して非経口的に、送達することができる。あるいは、両方の経路により送達されるように、製剤を設計することができる。
【０３３０】
物質を胃腸粘膜を介して粘膜に送達する場合、その物質は、胃腸管を介した移動中に、安定性を保つことができなければならない;例えば物質は、タンパク質分解に対して耐性があり、酸性pHにおいて安定性があり、胆汁の洗浄効果に対して耐性がなければならない。
【０３３１】
適切な場合、薬剤組成物は、吸引によって、座薬またはペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏または粉剤の形で局所に、皮膚パッチを使用することによって、スターチまたはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で経口的に、あるいは単独または賦形剤と混合させてカプセルまたは卵中に、あるいは香料剤または着色剤を含む、エリキシル剤、溶液または懸濁液の形で、投与することができ、あるいは薬剤組成物は、非経口的、例えば静脈内、筋肉内または皮下に注射することができる。非経口的投与に関しては、組成物を、他の物質、例えば充分な塩または単糖を含むことができる、滅菌水溶液の形で最も効率よく使用して、その溶液を血液と等張にすることができる。頬または舌下投与用に、従来方式で配合することができる錠剤またはトローチ剤の形で、組成物を投与することができる。
【０３３２】
ワクチン
他の実施形態は、哺乳動物の免疫応答を誘導するための方法であって、抗体および/またはT細胞免疫応答を生み出して前記動物をStellaおよび/またはFragilis関連疾患から保護するのに充分なStellaおよび/またはFragilisポリペプチド、またはその断片を、哺乳動物に接種することを含む方法に関する。
【０３３３】
さらに他の実施形態は、哺乳動物の免疫応答を誘導する方法であって、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドを、Stellaおよび/またはFragilisポリヌクレオチドのin vivoでの発現を指示するベクターを介して送達して、このような免疫応答を誘導して、前記動物を疾患から保護するための抗体を生成させることを含む方法に関する。
【０３３４】
他の実施形態は、免疫/またはワクチン製剤(組成物)に関するものであり、これを哺乳動物宿主中に導入すると、その哺乳動物中でStellaおよび/またはFragilisポリペプチドに対する免疫応答を誘導し、その組成物は、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチド、あるいはStellaおよび/またはFragilis遺伝子を含む。ワクチン製剤は、適切な担体をさらに含むことができる。
【０３３５】
Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドは胃内で分解される可能性があるので、それは非経口的に投与することが好ましい(皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む)。非経口投与に適した製剤には、製剤をレシピエントの血液と等張にする、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射溶液;ならびに、懸濁剤または増粘剤を含むことができる、水性および非水性滅菌懸濁溶液がある。製剤は、一回用量または多用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に存在してよく、使用の直前に滅菌液状担体の添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存することができる。ワクチン製剤は、水中油系および当分野で知られている他の系などの製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系も含むことができる。用量はワクチンの特異的活性に依存し、通常の実験によって容易に決定することができる。
【０３３６】
ここに記載する1つまたは複数のポリペプチドまたはペプチドから、ワクチンを調製することができる。
【０３３７】
活性成分として免疫原性ポリペプチドまたはペプチドを含む、ワクチンの調製物は、当業者に知られている。典型的には、このようなワクチンは、注射溶液として、液体溶液または濁溶液のいずれかとして調製され、注射前に液体に溶かすかあるいは懸濁させるのに適した固体形を調製することもできる。調製物は乳化することもでき、あるいはリポソーム中に被包されたタンパク質であってよい。活性免疫原性成分は、薬剤として許容可能であり活性成分と適合性がある、賦形剤と混合されることが多い。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。
【０３３８】
さらに、望むならばワクチンは、少量の助剤物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、および/またはアジュバントなどを含むことができ、これらはワクチンの有効性を高める。有効である可能性があるアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(COP11637、ノル-MDPと呼ばれる)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリロキシ)-エチルアミン(CGP19835A、MTP-PEと呼ばれる)、および細菌から抽出した三成分、モノホスホリル脂質A、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を2%スクアレン/Tween80乳濁液中に含む、RIBIがあるが、これらだけには限られない。
【０３３９】
アジュバントおよび他の物質の他の例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム(alum)、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳濁液、水中油型乳濁液、ムラミールジペプチド、細菌内毒素、脂質X、Corynebacterium parvum(Propionobacterium acnes)、Bordetella pertussis、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンA、サポニン、リポソーム、レバミソール、DEAE-デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントがある。このようなアジュバントは、様々な源から、例えばMerck Adjuvant 65(Merck and Company、Inc.、Rahway、N.J.)、またはフロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratories、Detroit、Michigan)が市販されている。
【０３４０】
典型的には、Amphigen(水中油型)、Alhydrogel(水酸化アルミニウム)、またはAmphigenとAlhydrogelの混合物などのアジュバントが使用される。水酸化アルミニウムのみも、ヒトにおける使用が認められている。
【０３４１】
免疫原とアジュバントの割合は、両者が有効量で存在する限りは、広範囲で変わる可能性がある。例えば、水酸化アルミニウムは、ワクチン混合物(Al2O3主成分)の約0.5%の量で存在してよい。ワクチンを配合して、0.2〜200μg/ml、好ましくは5〜50μg/ml、最も好ましくは15μg/mlの範囲の最終濃度の免疫原を含ませることが好都合である。
【０３４２】
配合後、ワクチンを滅菌容器中に取り込ませることができ、次いでそれを密封し、低温、例えば4℃で保存し、あるいはそれを凍結乾燥することができる。凍結乾燥によって、安定した形での長期の保存が可能である。
【０３４３】
ワクチンは、従来は非経口的に、例えば皮下または筋肉内注射によって投与されている。他の投与形式に適した他の製剤には、座薬、および幾つかの場合は経口製剤がある。座薬に関しては、従来の結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ;このような座薬は、0.5%〜10%、好ましくは1%〜2%の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤には、このような通常使用される賦形剤、例えば薬剤等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形をとり、10%〜95%、好ましくは25%〜70%の活性成分を含む。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥させた物質は、投与前に、例えば懸濁液として、還元することができる。還元はバッファー中で行うことが好ましい。
【０３４４】
例えばEudragit「S」、Eudragit「L」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースを含む腸溶性コーティングを有する、患者に経口投与するためのカプセル、錠剤およびピルを提供することができる。
【０３４５】
ここに記載するポリペプチドは、中性または塩形としてワクチンに配合することができる。薬剤として許容可能な塩には、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基で形成される)があり、これらは例えば塩酸またはリン酸などの無機酸で、または例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、および例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインなどの有機塩基に由来してもよい。
【０３４６】
投与
典型的には内科医が、個々の対象に最も適しているであろう実際の用量を決定し、その用量は、個々の患者の年齢、体重および応答性と共に変わるであろう。以下の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、さらに高いかあるいはさらに低い用量範囲がメリットがある、個々の場合が存在する可能性がある。
【０３４７】
ここに開示する薬剤組成物およびワクチン組成物は、直接的注射によって投与することができる。組成物は、非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮投与用に配合することができる。典型的には、それぞれのタンパク質は、0.01〜30mg/体重1kg、好ましくは0.1〜10mg/体重1kg、より好ましくは0.1〜1mg/体重1kgの用量で投与することができる。
【０３４８】
用語「投与する」は、ウイルスまたは非ウイルス技法による送達を含む。ウイルス送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターがあるが、これらだけには限られない。非ウイルス送達機構には、脂質仲介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン表面両親媒性物質(CFA)、およびこれらの組合せがある。このような送達機構の経路には、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸、局所、または舌下経路があるが、これらだけには限られない。
【０３４９】
用語「投与する」には、粘膜経路による送達、例えば吸入用鼻腔スプレーまたはエアロゾルとして、摂取可能な溶液としての送達、送達が、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路などの注射形によるものである非経口投与があるが、これらだけには限られない。
【０３５０】
用語「同時投与する」は、例えばそれぞれのポリペプチド、およびアジュバントなどの他の物質の投与の部位および時間が、免疫系の必要な調節が得られるようなものであることを意味する。したがって、ポリペプチドおよびアジュバントは、同時に同じ部位に投与することができるが、アジュバントと異なる時間に異なる部位にポリペプチドを投与することに、利点がある可能性がある。ポリペプチドとアジュバントは、同じ送達媒体で送達することもでき、ポリペプチドと抗原は、結合状態および/または非結合状態、かつ/あるいは遺伝子工学的に結合状態および/または非結合状態であってよい。
【０３５１】
Stellaおよび/またはFragilisポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ヌクレオチド、抗体など、および場合によってはアジュバントを、一回投与あるいは多数回投与として、宿主対象に別々に投与あるいは同時投与することができる。
【０３５２】
ここに記載するワクチン組成物および薬剤組成物は、注射(非経口、皮下および筋肉内注射を含む)、鼻腔内、粘膜、経口、膣内、尿道または眼内投与などの幾つかの異なる経路によって、投与することができる。
【０３５３】
ここに記載するワクチンおよび薬剤組成物は、従来通り非経口的に、例えば皮下または筋肉内注射によって投与することができる。他の投与形式に適した他の製剤には、座薬、幾つかの場合は経口製剤がある。座薬に関しては、従来の結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ、このような座薬は、0.5%〜10%、おそらく1%〜2%の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤には、このような通常使用される賦形剤、例えば薬剤等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどがある。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形をとり、10%〜95%、好ましくは25%〜70%の活性成分を含む。ワクチン組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥させた物質は、投与前に、例えば懸濁液として、還元することができる。還元はバッファー中で行うことが好ましい。
【０３５４】
診断アッセイ
本発明者らは、診断用試薬として診断において、あるいは遺伝的分析で使用するためのStellaおよび/またはFragilisポリヌクレオチドおよびポリペプチド(およびこれらの相同体、変異体および誘導体)の使用を記載する。Stellaおよび/またはFragilis核酸(相同体、変異体および誘導体含む)と相補的な核酸、あるいはこれらとハイブリッド形成することができる核酸、ならびにStellaおよび/またはFragilisポリペプチドに対する抗体も、このようなアッセイにおいて有用である。
【０３５５】
本発明者らは、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドまたは核酸の天然変異体、Stellaおよび/またはFragilis関連疾患の診断における、このような天然変異体の使用を提供する。Stellaおよび/またはFragilisの多型は、核酸レベルの違いを含んでよく、これがアミノ酸レベルの違いを示すか、あるいは示さない可能性がある。このようなStellaおよび/またはFragilis変異体または突然変異体は、アミノ酸レベルの変化を含むようなものであることが好ましい。しかしながら本発明者らは、非コード領域、例えばプロモーターおよびエンハンサーなどの発現調節領域に存在する、Stellaおよび/またはFragilisの多型も開示する。
【０３５６】
Stellaおよび/またはFragilisの多型には、1つまたは複数の核酸の欠失、1つまたは複数の核酸の挿入、逆位などがある。Stellaおよび/またはFragilisの多型は、単一ヌクレオチド多型を含むことが好ましい。
【０３５７】
Stellaおよび/またはFragilisの多型は、群中の個体間において適切なレベルで(核酸であれタンパク質であれ)、配列を比較することによって確認することができる。配列の違いは異なる物理的性質に反映される可能性があり、これらの違いを検出するための技法は物理的性質の変化の検出を利用することができる。例えば、単一ヌクレオチド多型は、制限断片長の多型(すなわち、制限酵素による消化の受けやすさの違い)として検出することができる。さらにSNPSは、ゲル中の核酸断片またはタンパク質断片の移動または移動性に影響を与える可能性がある。
【０３５８】
Stellaおよび/またはFragilisの非コード多型は、Stellaおよび/またはFragilisの非コード領域を塩基配列決定することによって、確認することができる。例えば、エンハンサーおよびプロモーターなどのStellaおよび/またはFragilis遺伝子の調節領域を塩基配列決定して、多型を確認することができる。このような非コード多型のStellaおよび/またはFragilisの発現レベルに対する影響は、突然変異Stellaおよび/またはFragilis配列を含むトランスジェニックマウス(以下に記載)を構築すること、あるいは発現構築体を作製すること、および細胞系へのトランスフェクションによって決定することができる。それぞれの場合、Stellaおよび/またはFragilisの発現レベルを、RT-PCRまたは抗体ウエスタン染色によって検出して、Stellaおよび/またはFragilisの発現の調節における突然変異の影響を決定する。有用なStellaおよび/またはFragilisの多型は、Stellaおよび/またはFragilisレベルの上方制御または下方制御によって、発現のレベルを調節する多型である。
【０３５９】
したがって本発明者らは、Stellaおよび/またはFragilisの非コード領域、好ましくはStellaおよび/またはFragilisの調節領域、好ましくは生物中のStellaおよび/またはFragilisの発現のレベルを調節することができるStellaおよび/またはFragilisのプロモーターおよび/またはエンハンサーの変異体または突然変異体または多型を与える。本発明者らは、このような変異体または突然変異体または多型、好ましくは非コード多型の2つ以上の組も与える。本発明者らは、核酸および/またはアミノ酸位置を確認するためのこのような変異体または多型または変異体の組の使用も与え、その中ではこのような位置の変化は、Stellaおよび/またはFragilisの発現のレベルに影響を与える。
【０３６０】
本発明者らは、Stellaおよび/またはFragilisの変異体または突然変異体または多型、好ましくは非コード多型を含むトランスジェニック動物も与える。
【０３６１】
機能不全と関連がある突然変異形のStellaおよび/またはFragilis遺伝子を検出することによって、Stellaおよび/またはFragilisの過少発現、過剰発現または改変型発現に起因する、疾患または疾患への罹患性の診断に加えることができるか、あるいはそれを定義することができる診断ツールが与えられる。Stellaおよび/またはFragilis遺伝子(調節配列を含む)の突然変異体を担持する個体は、様々な技法によりDNAレベルで検出することができる。
【０３６２】
例えば、DNAを患者から単離することができ、Stellaおよび/またはFragilisのDNA多型のパターンを決定することができる。同定したパターンは、Stellaおよび/またはFragilisの過剰、過少または異常発現と関連がある疾患に罹患していることが知られている、患者の対照と比較する。Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患と関連がある遺伝的多型パターンを示す患者を、したがって同定することができる。Stellaおよび/またはFragilis遺伝子の遺伝的分析は、当分野で知られている任意の技法によって行うことができる。例えば、Stellaおよび/またはFragilis対立遺伝子のDNA配列を決定することによって、RFLPまたはSNP分析などによって、個体をスクリーニングすることができる。Stellaおよび/またはFragilisの遺伝子配列またはその発現を調節する任意の配列中のDNA多型の存在を検出することによって、Stellaおよび/またはFragilisの過剰、過少または異常発現と関連がある疾患の遺伝的素因を有する患者として、患者を同定することができる。
【０３６３】
次いでこのように同定した患者を治療して、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患、またはより攻撃性の強い初期段階のStellaおよび/またはFragilis関連の疾患の発生を予防して、疾患のさらなる発生または発症を予防することができる。Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患は、例えば前に記載したのと同様の任意の癌を含む。
【０３６４】
本発明者らはさらに、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患と関連がある、患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットを開示する。このキットは、DNAサンプル回収手段、および遺伝的多型パターンを決定し、次いでそれを対照サンプルと比較して、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患への患者の罹患性を決定するための手段を含む。Stellaおよび/またはFragilisポリペプチド、および/またはこのようなポリペプチド(またはその断片)に対する抗体を含む、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患を診断するためのキットも与える。
【０３６５】
診断用の核酸は、対象の細胞から、血液、尿、唾液、組織バイオプシーまたは解剖材料などから得ることができる。好ましい実施形態では、患者の指刺傷から得た血液細胞からDNAを得て、吸収紙上に血液を回収する。他の好ましい実施形態では、AmpliCard.TM.(University of Sheffield、Department of Medicine and Pharmacology、Royal Hallamshire Hospital、Sheffield、England S10 2JF)上に血液を回収する。
【０３６６】
DNAは検出用に直接使用することができ、あるいは分析前に、PCRまたは他の増幅技法を使用することによって、酵素を用いて増幅させることができる。当該の遺伝子内の特定の多型DNA領域を標的とする、オリゴヌクレオチドDNAプライマーを、標的配列のPCR反応増幅において得られるように、作製することができる。RNAまたはcDNAを、同様に鋳型として使用することもできる。鋳型DNAから増幅させたDNA配列を、次いで制限酵素を使用し分析して、増幅させた配列中に存在する遺伝的多型を決定し、それによって患者の遺伝的多型の概略を与えることができる。制限断片の長さは、ゲル分析によって確認することができる。代替的あるいは追加的に、SNP(単一ヌクレオチド多型)分析などの技法を使用することができる。
【０３６７】
欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した、増幅産物の大きさの変化によって検出することができる。増幅DNAを標識したStellaおよび/またはFragilisヌクレオチド配列とハイブリッド形成させることによって、点突然変異を確認することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によって、あるいは溶解温度の違いによって、ミスマッチ二重らせんと区別することができる。DNA配列の違いも、変性剤ありまたは無しでのゲル中のDNA断片の電気泳動移動度の変化によって、あるいは直接的なDNA塩基配列決定によって検出することができる。例えば、Myers他、Science(1985)230:1242を参照のこと。特定の位置における配列の変化も、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRNaseおよびS1保護アッセイなど、または化学的切断法によって、明らかにすることができる。Cotton他、Proc Natl Acad Sci USA(1985)85:4397〜4401を参照のこと。他の実施形態では、Stellaおよび/またはFragilisヌクレオチド配列、またはその断片を含む、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝的突然変異体の効率の良いスクリーニングを行うことができる。アレイ技術法はよく知られており、一般的な適用性を有し、これらを使用して、遺伝子発現、遺伝的関係、および遺伝的多様性を含めた、分子遺伝学の様々な問題に取り込むことができる。(例えば、:M.Chee他、Science、Vol 274、pp 610〜613(1996)を参照のこと)。
【０３６８】
一本鎖立体構造多型(SSCP)を使用して、突然変異型核酸と野生型核酸の間の電気泳動移動度の違いを検出することができる(Orita他(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA:86:2766、Cotton(1993)Mutat Res 285:125〜144;およびHayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9:73〜79も参照)。サンプルおよび対照Stellaおよび/またはFragilis核酸の一本鎖DNA断片は変性させ、復元させることができる。一本鎖核酸の二次構造は配列に応じて変わり、結果として生じる電気泳動移動度の変化によって、一塩基の変化でさえも検出が可能である。DNA断片は、標識プローブを用いて、標識または検出することができる。アッセイの感度は、(DNAよりも)RNAを使用することによって高めることができ、その中で二次構造は、配列の変化に対してより敏感になる。好ましい実施形態では、主題の方法はヘテロ二重らせん分析を使用して、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重らせん分子を分離する(Keen他(1991)Trends Genet 7:5)。
【０３６９】
診断アッセイによって、例えば前に記載したのと同様に、Stellaおよび/またはFragilis関連の疾患への罹患性を、診断または決定するための方法が与えられる。
【０３７０】
Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドおよび核酸の存在を、サンプル中において検出することができる。したがって、前に列挙した感染および疾患は、対象由来のサンプルから、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチド、あるいはStellaおよび/またはFragilisのmRNAの異常に低いかあるいは高いレベルを測定することを含む方法によって、診断することができる。サンプルは、発現のレベルまたはパターンの空間的または時間的変化を含めた、高い、低いあるいはそれ以外の場合は異常なStellaおよび/またはFragilis発現と関連がある疾患に、罹患しているかあるいは罹患する疑いがある生物由来の細胞または組織サンプルを含むことができる。このような疾患に罹患しているかあるいは罹患する疑いがある生物中のStellaおよび/またはFragilisの発現のレベルまたはパターンは、疾患の診断手段として、正常な生物における発現のレベルまたはパターンと有効に比較することができる。
【０３７１】
したがって、一般的に本発明者らは、サンプル中のStellaおよび/またはFragilis核酸を含む核酸の存在を検出する方法であって、前記核酸に特異的な少なくとも1つの核酸プローブとサンプルを接触させること、および前記サンプルを核酸の存在に関して調べることによる方法を記載する。例えば、核酸プローブは、Stellaおよび/またはFragilis核酸、またはその一部分と特異的に結合し、検出する2つの間に結合することができ;複合体自体の存在も検出することができる。さらに本発明者らは、Stellaおよび/またはFragilisポリペプチドの存在を検出する方法であって、ポリペプチドと結合することができる抗体と細胞サンプルを接触させること、および前記サンプルをポリペプチドの存在に関して調べることによる方法を開示する。これは、抗体とポリペプチドの間で形成される複合体の存在を調べること、またはポリペプチドと抗体の間の結合を調べることによって、好都合に行うことができる。2つの物質間の結合を検出する方法は当分野で知られており、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)、表面プラズモン共鳴などを含む。
【０３７２】
低発現または高発現は、ポリヌクレオチドを定量するための当分野でよく知られている任意の方法、例えばPCR、RT-PCR、RNase保護、ノーザンブロッティング、および他のハイブリッド形成法などを使用して、RNAレベルで測定することができる。宿主由来のサンプル中のStellaおよび/またはFragilisなどのタンパク質のレベルを測定するために使用することができるアッセイ技法は、当業者によく知られている。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびELISAアッセイがある。
【０３７３】
本発明者らは、疾患またはStellaおよび/またはFragilis関連の疾患への罹患性(感染含む)用の診断キットも記載する。診断キットは、Stellaおよび/またはFragilisポリヌクレオチド、またはその断片;相補ヌクレオチド配列;Stellaおよび/またはFragilisポリペプチド、またはその断片、またはStellaおよび/またはFragilisポリペプチドに対する抗体を含む。
【０３７４】
本発明の他の態様
本発明者らは、配列番号3と少なくとも90%相同である核酸分子、および配列番号5と少なくとも75%相同である核酸分子を提供する。
【０３７５】
本発明者らは、配列番号3または配列番号5、あるいは配列番号7、9、11、13、15および17のいずれか由来のヌクレオチドのあるいはこれらと少なくとも90%相同である配列の隣接伸長部を含む、ポリヌクレオチドを開示する。この隣接ヌクレオチドの伸長部は、50ヌクレオチド長、好ましくは40、35、30、25、20、15または10ヌクレオチド長であることが有利である。
【０３７６】
ヒト遺伝子FragilisおよびStellaは、新規なポリペプチドをコードしており、それらの配列は、配列番号4および配列番号6で述べられる。他のFragilis遺伝子は、配列番号8、10、12、14、16および18で設定される。したがって本発明者らは、ここに記載する核酸によってコードされるポリペプチド、およびここに開示する任意のポリペプチドをコードする核酸を開示する。ポリペプチドは、配列番号4および配列番号6で述べられる配列を有することが好ましい。
【実施例】
【０３７７】
以下の実施例1から9は、齧歯類のFragilisおよびStella遺伝子のクローン化および特徴づけに関係し、ここに参照のため本発明に含める。
【０３７８】
(実施例1)
単一細胞cDNA差次的スクリーニング法による始原生殖細胞(PGC)初期集団に特異的な齧歯類遺伝子の同定と特徴付け
始原生殖細胞(PGC)の創始(founder)集団が確立することとなる、生殖細胞系統の特異化に関与する遺伝子を同定するための単一細胞分析法を開発する。PGCの細胞系統の特異化には、体細胞では発現されない特定の遺伝子セットの発現が伴うと判定されている。
【０３７９】
遺伝子同定の方法は、PGCが含まれるマウス7.25日胚断片由来の単細胞から作成したライブラリーの、差次的スクリーニング法に主に基づく。この単一細胞cDNA差次的スクリーニング法はBradyとIscove(1993)が最初に発表したが、後にCathaline DulacとRichard Axelが改変し、ラットのフェロモン受容体遺伝子の同定の成功をもたらした(Dulac,C.とAxel、1995)。記載の若干の改変を施して、このAxelらの方法を採用する。
【０３８０】
PGC初期集団を有する胚断片の単一細胞cDNAの構築
マウスのPGC初期集団は、胎生7.25日の新生尿膜底部にある、アルカリ性ホスファターゼ陽性の約40個の細胞の塊で構成されると報告されている(Ginsburg,M.、Snow,M.H.L.とMcLaren,A. (1990))。近交系の129SvおよびC57BL/6マウスにおける正確なPGC塊の場所は、アルカリ性ホスファターゼのホールマウント染色とメチレンブルーによる半薄片染色の両方用い、顕微鏡法で決定される。PGC塊が検出できる最初の段階は後期線条(Late Streak)期であり(Downs,K.M.とDavies,T. (1993))、尿膜芽が現れる上皮層のすぐ下に、際立って染色された細胞集団が認められる。この領域は、胚外組織と胚内組織の境界部で、原条の最も中央部分のちょうど背後であり上部にあたる。この塊は少なくとも早期/中期芽(Early/Mid Bud)期までここに存在し続ける。近交系129Svマウスでは、このPGC塊はC57BL/6系統の場合より若干多くの数の細胞を含んでおり、より緊密に詰まっていることが認められている。初期PGCがより良く回収できるので、129Sv系統を以下の実験に使用する。
【０３８１】
10%FCSを加え25mM HEPESにより緩衝したDMEM内で129Sv胚をE7.5に室温で単離し、各胚の発生段階を解剖顕微鏡下で決定する。正確な発生段階は、同腹仔の胚においてさえ相当に異なる可能性がある。無芽(no bud)期、または早期芽(early bud)(尿膜)期の胚をさらに解剖するために選ぶが、このことにより、解剖顕微鏡下で観察するとき、PGCを含む領域が多少同定し易くなる。PGC塊を含んでいると予想される断片を、固形ガラス針を用いて非常に正確に切り出す。この領域を、37℃で10分間0.25%トリプシン-1mM EGTA/PBSで処理することにより、単一細胞に分離し、マウスピペットで穏やかにピペッティングする。この解剖断片は通常250〜300個の細胞を含む。この穏やかな細胞分散法により、内臓内胚葉層はシート状細胞のまま保たれた。
【０３８２】
上記細胞懸濁液からマウスピペットで単一細胞を無作為に取り出し、各単一細胞を(空気泡を作ることは避けながら)薄壁PCRチューブに入れた。このPCRチューブは、4μlの氷冷した細胞溶解バッファー(80ng/ml pd(T)24、5μg/ml プライムRNase阻害剤、324U/ml RNAガード、また各10mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを含む、50mM Tris-HCl (pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0.5% NP-40)含んでいた。単一細胞に付随して移される培養液の容量は、0.5μl未満である。このチューブを短時間遠心し、細胞が溶解バッファー中にあることを確実にする。それぞれ実験において合計19個の単一細胞を取り出し、また1つのチューブは細胞を入れずに、PCR増幅法の陰性対照として使用した。チューブに収集した細胞は、次の手順を開始するまですべて氷上で保存する。
【０３８３】
上記チューブを65℃で1分間インキュベートすることにより細胞を溶解し、室温で1〜2分間静置してオリゴdTをRNAにアニールさせる。50Uモロニーネズミ白血病ウイルス(MMLV)逆転写酵素および0.5Uトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素を加え、37℃で15分間インキュベートすることにより、第一鎖cDNA合成を阻害する。これら逆転写酵素を10分間65℃で失活させる。この逆転写反応は15分間に制限し、C末端から500〜1000塩基長の、比較的同サイズのcDNAを合成させる。このことにより次のPCR増幅が正当に代表的なものとなる。
【０３８４】
次に、合成した第一鎖cDNAの5末端にポリA末端鎖を付加するため、4.5μlの2xテーリングバッファー(200mMカコジル酸カリウム(pH7.2)、4mM CoCl2、0.4mM DTT、10Uの末端転移酵素を含む200mM dATP)を上記反応物に加え、37℃で15分間インキュベートする。この試料を10分間65℃で熱失活させる。この時点でこの反応物には、C末端にポリT鎖そしてN末端にポリA鎖を備えた合成cDNAが含まれ、特異的プライマーを使用したPCRによる増幅が可能な状態である。
【０３８５】
10mM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、100μg/mlウシ血清アルブミン、0.05%トリトンX100、1mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10UのTaqポリメラーゼ、および5μgのAL1プライマーから成る溶液で、各チューブの内容物を100μlにする。このAL1プライマーの配列は、ATT GGA TCC AGG CCG CTC TGG ACA AAA TAT GAA TCC (T)24である。PCR増幅を次の手順に従い行う。94℃で1分間、42℃で2分間、そして72℃で6分間、以上の1サイクルにつき10秒間の伸長時間を入れて25サイクル。Taqポリメラーゼを5ユニット追加し、同じ手順で、しかし伸長時間無しで、さらに25サイクル行う。この時点で各チューブには、単一細胞由来の増幅cDNA生成物が含まれている。溶液中のタンパク質成分をフェノール/クロロホルム処理で抽出し、増幅cDNAをエタノールで沈殿させ最終的に100μlのTE(pH8.0)に懸濁する。5μlのcDNA溶液を1.5%アガロースゲルに流し、増幅が成功したか検査する。試料の多くは、主に500塩基対から1200塩基対の間の大変強い「スメア」なバンドを示し、これは単一細胞cDNAが効率よく増幅されたことを示す。増幅に成功した試料のみを以下の「細胞分類」分析で使用する。
【０３８６】
(実施例2)
マーカー遺伝子発現調査によるPGCの同定
切除した上記胚断片には、理論的に3つの主要部分が含まれる。尿膜中胚葉、PGC、およびPGC周囲の胚体外中胚葉である。これらの試料の中からPGC由来の単一細胞cDNAを同定するために、この領域の様々な細胞の種類により発現されるか抑圧されると知られている4つのマーカー遺伝子(BMP4、TNAP、Hoxb1、およびOct4)を調べ、構築されたcDNAの陽性および陰性選択を行った。
【０３８７】
無/早期芽(No/Early Bud)期にBMP4は、新生尿膜と、中胚葉構成部分である発生中羊膜、絨毛膜、および内臓壁卵黄嚢で発現されると報告されている(Lawson,K.A.、Dunn,N.R.、Roelen,B.A.J.、Zeinstra,L.M.、Davis,A.M.、Wright,C.V.E.、Korving,J.P.W.F.M.、とHogan,B.L.M. (1999))。BMP4の発現境界ははっきりしており、推定PGCが決定される羊膜中胚葉から続く上皮層下の中胚葉領域では、その発現は完全に除外される。したがってBMP4をこの選別のための陰性マーカーとして使用する。BMP4のC末端部を増幅するためのプライマー対を設計する(5': GCC ATA CCT TGA CCC GCA GAA G, 3': AAA TGG CAC TCA GTT CAG TGG G)。PCR増幅は0.5μlのcDNA溶液をテンプレートとして次の手順に従い行う。95℃で1分間、55℃で1分間、そして72℃で1分間、以上を20サイクル試験した。83個の試料中57個の試料が予想のサイズのバンドを示し、これらの単一細胞でBMP4が発現されたことを示す。これらの試料は尿膜中胚葉由来と考えられ、したがってPGC由来細胞を代表する候補の中から除外する。
【０３８８】
PGCのための早期マーカーとして長い間使用されてきた組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ(TNAP)(Ginsburg,M.、Snow,M.H.L.とMcLaren,A. (1990))の発現を次に調べる。プライマー対を設計し(5': CCC AAA GCA CCT TAT TTT TCT ACC, 3': TTG GCG AGT CTC TGC AAT TGG)、上記と同じPCR反応を行う。26個の試料中、22個の試料がTNAPに対し陽性であると判断される。胚切片のアルカリ性ホスファターゼ染色から、PGC周囲の体細胞はまた、PGC内より発現レベルは若干低いものの、TNAPをある程度発現することが知られている。したがって、これらの22個の陽性試料の中には、PGCだけでなく体細胞になる運命の細胞もまだ含まれているはずである。
【０３８９】
分化全能性PGCで発現されるが体細胞では発現されないと知られている遺伝子の1つに、Oct4がある(Yoem,Y.II.、Fuhrmann,G.、Ovitt,C.E.、Brehm,A.、Ohbo,K.、Gross,M.、Hubner,K.とScholer,H.R. (1996))。この段階でPGCを体細胞から区別するためのマーカーとしてOct4が使用可能か調べるため、22個の試料においてPCR (5': CAC TCT ACT CAG TCC CTT TTC, 3': TGT GTC CCA GTC TTT ATT TAA G)によりOct4の発現を検査する。22個の試料はすべて同様なレベルでOct4を発現し、この段階の体細胞はまだ活発にOct4 RNAを転写していることを示す。
【０３９０】
22個の試料でのTNAP発現量をサザンブロット分析(逆ノーザンブロット分析)により定量する。単一ES細胞cDNAの増幅で確認されていることだが、単一細胞法の増幅が正当に代表的であることを考慮すると、細胞同定の完全な指標にはならないものの、サザンブロット分析により元の単一細胞で発現される遺伝子量の半定量的測定が可能になる。しかしTNAP分析の結果、22個の試料中10個の試料は同程度の比較的強いバンドを示し、残りの12個の試料は弱いシグナルを示す。以上の結果は、これら22個の試料は、強いTNAP発現を示す(したがってPGC由来とされる)ものと弱いTNAPを示すものの、少なくとも2つのグループに分類できることを示す。
【０３９１】
PGC周囲の体細胞はHoxb1を発現し始めるがPGCはHoxb1を発現しない、という可能性(Kirstie Lawson博士からの私信)についても調査する。プライマー対を設計し(5': AAC TCA TCA GAG GTC GAA GGA, 3': CGG TGC TAT TGT AAG GTC TGC)、上記と同じPCR反応を行う。試験した22個の試料中で12個の試料が陽性であり、より重要なことには、これら12個の試料は、サザンブロット分析で弱いTNAPシグナルを示したものと、完全に一致する。
【０３９２】
以上のすべての結果を考慮して、83個の試料中、Oct4(+)、TNAP(++)、BMP4(-)、およびHoxb1(-)である10個の試料がPGC起源のものであると結論する。PGC創始集団数が40で、断片中の細胞数が250〜300個であることを考えると、この(10/83)という比は妥当である。
【０３９３】
(実施例3)
単一細胞cDNAライブラリーの差次的スクリーニング
cDNA増幅効率はチューブ毎に異なるため、ライブラリー構築のためには、最も効率的にcDNAが増幅された試料を選ぶことが重要である。6つの異なる遺伝子(リボソームタンパク質S12、中間径フィラメントタンパク質であるビメンチン、βチューブリン-5、αアクチン、Oct4、E-カドヘリン)の上記10個のPGC候補の試料における増幅を、サザンブロット分析により調べた。これら6つすべての遺伝子増幅の全体的な結果から、ライブラリー構築のために3つのcDNA調製試料を選別する。
【０３９４】
二本鎖cDNAを最大量得るために、100μlの上記PCRバッファー(1μlのAmplitaqを含む)中の5μlの細胞cDNAについて、次の手順に従い伸長段階を行う。94℃で5分間、42℃で5分間、そして72℃で30分間。溶液をフェノール/クロロホルム処理により抽出し、増幅cDNAをエタノールで沈殿させ、TEに懸濁し、EcoRIで完全に消化する。PCRプライマーと過剰のdNTPはキアゲン社PCR精製キットを用い除去し、精製したcDNAをすべて2%の低融点アガロースに流す。500塩基対を超えるcDNAは、キアゲン社Gel精製キットを用い切断し精製する。精製cDNAをエタノールで沈殿させ、TEに懸濁し、λZAPIIベクターアームに連結する。連結したベクターをまとめて(packaged)、力価測定し、T3およびT7プライマーを用い20プラークからの挿入断片を増幅することにより、連結が成功したクローンの比をモニターする。95%を超えるファージが挿入断片を有していると判明する。
【０３９５】
上記の3つの遺伝子、リボソームタンパク質S12、βチューブリン-5、およびOct4を、5000プラークをスクリーニングすることにより定量し、3つの中で最良のライブラリー(S12 0.62%、βチューブリン0.4%、Oct4 0.5%)を差次的スクリーニングに使用する。PGCプローブを備えた比較相手として、最も効率よく増幅された周囲の体細胞cDNAの1つ(Oct4(+)、TNAP(+/-)、BMP(-)、Hoxb1(+))を、同様のサザンブロット分析により選択する。
【０３９６】
ライブラリーを15cmディッシュ1皿につき1000プラークの密度で蒔き、大型プラーク(直径)2mmを得て、アマシャム社製ハイボンドN+フィルターを使用し、二重化リフトを取る。これらのフィルターを1%ウシ血清アルブミンおよび4%SDSを含む0.5Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.3)に入れ、65℃で予備的ハイブリッド形成を行う。1μlの元の細胞cDNAを、冷却dCTPの不在下新たに加えた100μCiの32PdCTPと共に、AL1プライマーを用い10サイクル再増幅して合計50μlの反応物にし、次にアマシャム社製Nick(商標)スピンカラムを用い精製することにより、細胞cDNAプローブを調製する。フィルターを1.0X107cpm/mlで少なくとも16時間ハイブリッド形成させる(1枚目のフィルターは体細胞プローブとハイブリッド形成させ、2枚目のフィルターはPGCプローブとハイブリッド形成させる)。ハイブリッド形成後、フィルターを0.5%SDSを含む0.5X SSCで3回65℃で洗浄し、適当なシグナルが得られるまでX線フィルムに露出する(通常1〜2日)。
【０３９７】
上記2枚の二重化フィルターの陽性プラークを慎重に比較する。スクリーニングした5000個のプラークの中280個のプラークを差異的に発現した遺伝子を代表する候補として選ぶ。280個のプラークすべての挿入断片をT3およびT7プライマーを用いて増幅し、1.5%ゲルに流し、ダブルサンドイッチサザンブロット法を行った。各メンブレンはそれぞれPGCおよび体細胞プローブを用い、スクリーニングと同条件でハイブリッド形成させる。280個のクローンの中で38個のクローンを差異的に発現した遺伝子として選別する。次にこれらのクローンを第2のPGCおよび体細胞cDNAプローブを用いハイブリッド形成させる。その結果、両方のPGC cDNAには共通であるが、両方の体細胞cDNAには含まれていないか少量の20個のクローンを、38個のクローンの中から得た。これらの20個のクローンすべてについて、配列決定する。
【０３９８】
PGC初期集団に高度に特異的な遺伝子
上記20個のクローンは11個の異なる遺伝子を表している(2つのクローンが2回、1つのクローンが3回現れ、そして1つのクローンが6回現れる)。発現特異性をさらに厳密に検査するため、これら11個のクローンのためのプライマー対を設計し、異なる10個の単一PGC候補cDNAと異なる10個の単一体細胞cDNAで、PCRにより発現を検査する。それらの内2個のクローンが、PGC cDNAに対し高度に特異的な発現を示す。
【０３９９】
最初の遺伝子はFragilis(生殖細胞限定-1、Fragilis)で、137アミノ酸から成る予想分子量15.0kDのタンパク質をコードする。マウスFragilisの核酸配列を配列番号2に記す。
【０４００】
Fragilisは2つの膜貫通ドメインを有し、アミノ末端およびカルボキシル末端は細胞外に位置している。Fragilisは、インターフェロン(IFN)誘導性膜貫通タンパク質ファミリーの新たに発見されたメンバーであり(Deblandre,G.A.他、Expression cloning of an interferon-inducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. J. Biol. Chem. 270、23860〜23866頁(1995); Friedman,R.L.、Manly,S.P.、McMahon,M.、Kerr,I.M.とStark,G.R. Transcriptional and posttranscriptional regulation of interferon-induced gene expression inhuman cells. Cell 38、745〜755頁(1984))、多くの異なる胚組織および成体組織由来の発現配列タグ(EST)で検出され、これは異なる発生過程でFragilisが共通の役割を担っている可能性を示唆している。原型メンバーの1つに、白血球および内皮細胞内のIFN誘導性ヒト9-27(Leu-13抗原と同一)タンパク質があり、ホモ型接着および抗増殖シグナルの伝達に関与する多量体複合体の細胞表面構成部分である(Deblandre,G.A.ら、Expression cloning of an interferon-inducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. J. Biol. Chem. 270、23860〜23866頁(1995); Evans,S.S.、Collea,R.P.、Leasure,J.A.とLee,D.B. IFN-a induces homotypic adhesion and Leu-13 expression in human B lymphoid cells. J. Immunol. 150、736〜747頁(1993); Evans,S.S.、Lee,D.B.、Han,T.、Tomasi,T.B.とEvans,R.L. Monoclonal antibody to the interferoninducible protein Leu-13 triggers aggregation and inhibits proliferation of leukemic B cells. Blood 76、2583〜2593頁(1990))。
【０４０１】
原型フラジリスファミリーメンバーの1つに、白血球および内皮細胞内のインターフェロン誘導性ヒト9-27(Leu-13抗原と同一)タンパク質があり、抗増殖シグナルの伝達およびホモ型接着シグナルに関与する多量体複合体の構成部分として細胞表面に位置する(Deblandre、1995)。
【０４０２】
BLASTN検索により、Fragilis配列は多くの異なる胚組織および成体組織由来の発現配列タグ(EST)で見出されることが明らかになり、これは異なる発生および細胞生物学的過程でFragilisが共通の役割を担っている可能性を示している。データベース検索により、機能不詳のラットインターフェロン誘導性タンパク質(sp:INIB RAT、pir:JC1241)と配列が一致することが明らかになる。Fragilis配列は本発明者らのスクリーニングに6回現れ、PGCでの発現レベルが高いことを示している。
【０４０３】
二番目の遺伝子はStellaで、150アミノ酸から成る18kDのタンパク質をコードする。マウスStellaの核酸配列を配列番号1に記す。
【０４０４】
Stellaは既知のどのタンパク質とも配列相同性共有せず、核内移行コンセンサス配列をいくつか含み、また高塩基性pIを有し(pI=9.67、塩基性残基含有率=23.3%)、これらはDNAへの親和性の可能性を示している。さらに核外移行シグナルである可能性のある配列も同定され、Stellaは核と細胞質を行き来する可能性を示している。BLASTN分析では、Stella配列は着床前胚および生殖系列(新生子卵巣、メス12.5中腎および性腺など)のESTにのみ見出され、全能性および多能性細胞においてStellaが支配的に発現されることを示している。興味深いことに、StellaのN末端には、SAPモチーフにいくらか配列類似性を有するモジュールドメインが存在することが判明した。このモチーフは、染色体の組織化に関与する推定DNA結合ドメインである。また、そのC末端には明らかにスプライシングファクターモチーフに似た構造が存在する。これらの知見は、Stellaが染色体の組織化およびRNAプロセシングに関与している可能性を示唆する。
【０４０５】
(実施例4)
FragilisおよびStellaの発現のスクリーニングによるPGCの同定
実施例2においてPGCはBMP4、TNAP、Hoxb1、およびOct4を分析することにより同定されるが、これらのどの1つの遺伝子もPGC状態のマーカーとして採用できない。しかし、FragilisとStellaは両方ともその目的で使用できる可能性がある。
【０４０６】
Fragilisの発現を調べる。プライマー対を設計し(5': CTACTCCGTGAAGTCTAGG、3': AATGAGTGTTACACCTGCGTG)、上記と同じPCR反応を行う。生殖細胞に反応能のある細胞で、Fragilisの発現を検出した。生育したPGCは、Fragilisを発現しているこの細胞集団から形成された。
【０４０７】
Stellaの発現の境界は特にはっきりしており、この発現は大部分PGCに限定される。したがって、StellaをPGC選別の陽性マーカーに使用する。StellaのC末端部分を増幅するため、プライマー対を設計する(5': GCCATTCAGATGTCTCTGCAC, 3': CTCACAGCTTGAGGCTTCTAA)。実施例1のPGCから得られるcDNA溶液0.5μlをテンプレートとして使用し、次の手順に従いPCR増幅を行う。95℃で1分間、55℃で1分間、そして72℃で1分間、以上20サイクル。試験した83個の試料の中で、PGCから採取した試料のみがStellaの発現を示す。したがって、StellaはPGC運命の陽性マーカーである。
【０４０８】
FragilisおよびStellaに対する抗体は、同様に多能性細胞を検出するために使用できる。Fragilisに対する抗体は生殖細胞に反応能のある細胞を検出するために、そしてStellaに対する抗体はPGCを検出するために使用するのが好ましい。
【０４０９】
以上のように、FragilisとStellaは両方ともPGC運命の陽性マーカーであり、PGCを陽性として同定するために使用できる。
【０４１０】
ISHによるPGCの同定
上記の2遺伝子のin vivoでの発現を、in situハイブリッド形成法により調べる。Fragilisの発現は、E6.0からE6.5(前線条(PreStreak)期)にエピブラスト全体で非常に弱く始まり、エピブラスト基部周縁細胞の数層で強くなる。胚外外胚葉で発現されるBMP4は、生殖細胞反応能の誘導とFragilisの発現に重要なシグナル伝達分子の1つである。インターフェロンなど他のシグナルがFragilisの誘導に関わっている可能性は高い。この発現は発生中の原条基部後部端で早期/中期線条(Early/Mid Streak)期に強まり、後期線条(Late Streak)期にこの位置で非常に強くなる。この発現は早期頭屈(Early Head Fold)期まで続き、やがて次第に消滅する。E8.5に移動しているPGCでは発現は検出されない。
【０４１１】
Stellaの発現は、発生中の原条基部後部端で中期/後期線条(Mid/Late Streak)期に始まり、同じ位置で以後の段階に次第に強くなる。この発現は特異的であり、PGCが細胞塊として分化し始めると考えられる領域で、それぞれが染色され点在する単一細胞が認められる。後期芽/早期頭屈(Late Bud/Early Head Fold)期には、初期細胞塊だけでなく、その細胞塊から移動していると考えられる一部の細胞も染色される。E8.5およびE9.5には、移動中PGCと考えられる細胞集団が非常に特異的に染色される。
【０４１２】
以上の結果から、Fragilisは、細胞系譜の特異化および生殖細胞反応能、そしてその後PGCの過程において上方制御される遺伝子であり、FragilisがPGC運命を決定した後はStellaが活性化される、と結論する。
【０４１３】
以上のことから、細胞系譜特異化および/または生殖細胞反応能などの多能化を検出する方法の中で、Fragilisの発現を検出してもよい。同様に、例えば始原生殖細胞としての運命決定など、細胞の運命決定を検出するためStellaの発現を検出してもよい。
【０４１４】
(実施例5)
生殖系列発生期のFragilisおよびStellaの発現
StellaおよびFragilisに対する抗体を、初期胚におけるこれらの遺伝子の発現検出に使用する。これらの遺伝子はそれぞれ始原生殖細胞で発現されることが判明する。特に、Fragilisは、生殖細胞の割り当て時期に、PGC反応能細胞を標識する最初の遺伝子であることが判明する。Stellaは、系譜が限定された創始PGCおよびそれ以降の生殖細胞系統においてのみ発現される。
【０４１５】
図3は胚性幹(ES)細胞におけるマウスFragilisの発現を示す。
【０４１６】
Fragilisは多能性ESおよびEG細胞で発現される。PGCからEG細胞が派生する間、Fragilisの発現がEG細胞で再び現れることが判明する。これらの細胞の特異化が完了した後、後期PGCはFragilisに対して陰性を示す。
【０４１７】
図5はE7.2マウス胚でのホールマウントin situハイブリッド形成法により検出したマウスFragilisの発現を示す。
【０４１８】
E7.25胚において創始PGC集団が分化する初期尿膜底部で、Fragilisが強く発現する。Fragilisの発現はE7.5まで続いたが、E8.5に移動中のPGCで発現は検出されなかった。Fragilisは生殖細胞反応能があるエピブラスト細胞基部で最初に検出される。BMP4の起源である胚外外胚葉組織と統合されたとき、エピブラスト細胞にFragilisの発現が誘導され得る。BMP4変異マウスではFragilisの発現は無く、これはこれらの胚ではPGCが存在しないことと一致する(Lawson他、1999)。
【０４１９】
図4はPGCにおけるマウスStellaの発現を示す。
【０４２０】
PGCで強いStellaの発現は、EG細胞では下方制御される。ES細胞でもStellaは低レベルで発現する。StellaおよびFragilisは、ESおよびEG細胞でノーザンブロット分析により検出可能である。Stellaは系譜限定PGCの際立った塊内の単一細胞でE7.0で最初に検出され、それ以降は、移動PGCさらに後にそれらが性腺に入るときに検出される。図7はE9.0胚の性腺へ移動する過程のPGCでのStellaの発現を示す。Stellaは創始PGC集団のための決定的なマーカーとしてこれまでに知られている唯一の遺伝子である。
【０４２１】
図6はE7.2マウス胚でのホールマウントin situハイブリッド形成法により検出したマウスStellaの発現を示す。
【０４２２】
図8。単一細胞cDNAのPCR分析により検出された、単一細胞におけるマウスのFragilisおよびStellaの発現。Stella発現を示す単一細胞よりもFragilis発現を示す単一細胞がより多くあることに注意すること。Fragilisを最高レベルで発現する細胞のみが、Stellaを発現し、生殖細胞運命を獲得することが認められる。Stellaを発現する細胞は、Hoxb1の発現を示さないことが判明した。Fragilisを低レベルで発現しStellaを発現しない細胞は、体細胞になり、Hoxb1の発現を示す。創始PGC集団もまた高レベルのTnapを示す。創始PGCと体細胞の両方ともOct4、T(Brachyury)、およびFgf8の発現を示す。
【０４２３】
(実施例6)
個別細胞でのFragilisおよびStellaの発現
StellaおよびFragilisの細胞内での所在も判定した。Fragilisは原形質膜と、ゴルジ体の単独の細胞質スポットに局在する。Stellaは推定の核内移行シグナルと核外移行シグナルを有し、細胞質と核の両方に局在する。
【０４２４】
FragilisはPGCのゴルジ体ならびに原形質膜で認められる。Fragilisの細胞表面局在化は、インターフェロン誘導性遺伝子ファミリーのメンバーとして、予想されるものである(Deblandre、1995)。エピブラスト基部周縁でのFragilisの発現が、生殖細胞反応能の始まりを示す。Fragilisは、そのエクソン1の上流にIFN応答配列を有し、したがってエピブラスト基部細胞のBMP4による初期刺激の後、IFNにより誘導される可能性が非常に高い。これらのIFN誘導性タンパク質は、抗増殖シグナル伝達が可能な多量体複合体を、TAPA1などの他のタンパク質と形成することができる。このことは、体細胞は急速に分裂し続けるが、創始PGCの細胞分裂周期は6時間から16時間に増大する理由であるかもしれない。
【０４２５】
推定上の核内移行シグナルおよび核外移行シグナルを持っているStellaは、細胞質と核の両方で認められた。Stellaの発現開始の後、E8.5までにFragilisの発現は消失する。したがって、Fragilisの発現は生殖細胞反応能の始まりを示し、Stellaの発現はこの特異化の終焉を示す。創始PGCでのStellaの発現は、体細胞運命からの脱出を示し、細胞の多能性状態と一致する。これらの研究結果は、体細胞になるかもしれない細胞に生殖系列になる運命を課すには、特別な遺伝子組が必要であることを示している。生殖細胞が体細胞になるのを防ぐために、多くの生物体には複雑な転写機構が備えられていることから、Stellaはその核と細胞質を行き来できる能力を用い、転写および翻訳制御においてある役割を担っている可能性がある。卵母細胞および着床前胚におけるStellaの発現は、Stellaが全能性および多能性の点でより幅広い役割を担っていることを示している。
【０４２６】
(実施例7)
FragilisとStellaの連関
Fragilisを発現する細胞の一部のみが、Stellaを発現するに至る。Fragilisを最高レベルで発現する細胞のみがPGCになり、Stellaを発現し始める。さらに、Stellaに陽性なPGCはHoxb1を発現することはない。より重要なことには、Fragilisを低レベルで発現する体細胞のみが、Hoxb1を発現する。さらに、体細胞のみが、Lim1およびEvx-1というホメオボックスを含む他の2つの遺伝子を発現する。したがって、Hoxb1、Evx-1、およびLim1の発現を欠いていることが、生殖細胞運命の特異化に重要なようである。
【０４２７】
図8aおよび8bは単一細胞PGCおよび体細胞における様々な遺伝子発現をPCR分析により示す。
【０４２８】
Oct4はPGCのための決定的なマーカーではないということも、本発明者らの実験により示される。Oct4の発現は、全能性および多能性細胞において以前証明された(Nichols、199、Pesce、1998; Yeom、1996)。しかしOct4はすべてのPGCおよび体細胞で同程度に発現することが判明する。しかしT(Brachyuri)およびFgf8の発現がPGC内で認められ、最初は中胚葉細胞になる運命だった胚細胞の中からPGCが採用されることが示される。
【０４２９】
(実施例8)
PGCへの特異化
創始PGCおよびその隣接体細胞は、エピブラスト基部細胞由来の共通の起源を有する。創始PGCおよびその隣接体細胞を分析することにより、生殖細胞運命への特異化に重要な役割を果たす遺伝子を系統的にスクリーニングする方法を確立した。Fragilisはインターフェロン(IFN)誘導遺伝子であり、生殖細胞反応能とホモ型会合を高め、推定生殖細胞をその隣接体細胞から分離するが、このような例は発生過程の他の状況にもあてはまる可能性がある。Stellaの発現はFragilisの発現が高い細胞で起こる。Fragilisは生殖細胞の特異化が完了すればもはや必要とされないが、Stellaの発現は生殖細胞系統で継続される。Stellaは卵母細胞および早期移植前発生胚でも発現されるから、全能性/多能性細胞全般にわたり重要であるかもしれない。
【０４３０】
(実施例9)
生殖系列および多能性幹細胞
PGCは多能性胚性生殖(EG)細胞を派生するために使用できる。しかし、EG細胞と異なり、胚盤胞に導入されるとPGCは発生に関与しない。PGCはシグナル伝達分子に反応できないか、転写が抑圧される。PGCは特異化されてしまうと、その細胞表面にFragilisを発現しない。しかし、EG細胞はES細胞と同様に、その細胞表面にFragilisを明らかに発現する。ノーザンブロット分析から判断すると、EG細胞もES細胞も共にStellaを発現する。ただし、Stellaの発現レベルはESおよびEG細胞ではPGCよりも低い。したがってFragilisとStellaは多能性幹細胞において役割を果たしている。したがってこれらの遺伝子はこれらの多能性幹細胞のマーカーであり、そこではこれらの幹細胞に多能性を供与する役割も果たしている可能性もある。
【０４３１】
(実施例10)
PGC特異化におけるFragilisとStellaの提案された役割
典型的なIFN誘導性細胞表面タンパク質であるFragilisは、そのファミリーメンバーすべてに共通な特定の性質をおそらく共有する(Deblandre,G.A.他、Expression cloning of an interferon-inducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. J. Biol. Chem. 270、23860〜23866頁(1995); Evans,S.S.、Collea,R.P.、Leasure,J.A.とLee,D.B. IFN-a induces homotypic adhesion and Leu-13 expression in human B lymphoid cells. J. Immunol. 150、736〜747頁(1993); Evans,S.S.、Lee,D.B.、Han,T.、Tomasi,T.B.とEvans,R.L. Monoclonal antibody to the interferoninducible protein Leu-13 triggers aggregation and inhibits proliferation of leukemic B cells. Blood 76、2583〜2593頁(1990))。
【０４３２】
急性で一過性であるfragilisの発現自体が、1時間以内に最大40倍まで増加しIFNが無くなった後急速に減衰するIFN誘導性遺伝子の動態(Friedman,R.L.、Manly,S.P.、McMahon,M.、Kerr,1. M.とStark,G.R. Transcriptional and posttranscriptional regulation of interferon-induced gene expression inhuman cells. Cell 38、745〜755頁(1984))と一致する。このFragilis陽性細胞集団は、TNAP陽性細胞約100個に相当し(Lawson,K.A.とHage,W.J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found. Symp. 182、68〜84頁(1994); Ginsburg,M., Snow,M.H.L.とMcLaren,A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development 110、521〜528頁(1990))、これはstella陽性細胞数より大きい。
【０４３３】
本発明者らの推定によると、129/SvEv系統マウスのstella陽性細胞塊は約36〜43個の細胞であり、45個と予想される新生PGCに近い。fragilis陽性細胞はおそらくホモ型接着を通じて細胞集落を形成し(Evans,S.S.、Collea,R.P.、Leasure,J.A.とLee,D.B. IFN-a induces homotypic adhesion and Leu-13 expression in human B lymphoid cells. J. Immunol. 150、736〜747頁(1993); Evans,S.S., Lee,D.B., Han,T., Tomasi,T.B.とEvans,R.L. Monoclonal antibody to the interferoninducible protein Leu-13 triggers aggregation and inhibits proliferation of leukemic B cells. Blood 76、2583〜2593頁(1990))、そこから創始PGCが採用され、したがって体細胞組織となる運命の細胞の大部分から分離される。これらのIFN誘導性細胞表面タンパク質は抗増殖シグナル伝達が可能であるが(Deblandre,G.A.他 Expression cloning of an interferoninducible 17-kDa membrane protein implicated in the control of cell growth. J. Biol. Chem. 270、23860〜23866頁(1995))、おそらくこのことが、体細胞が急速に分裂し続ける一方で、新生PGCでは細胞分裂周期が6時間から16時間に増大する機構であろう。
【０４３４】
エピブラスト細胞でのfragilisの誘導は、本発明者らのin vitro実験で示されるように、それ自体ではstellaの発現に十分でないかもしれない。すなわち、in vivoでのPGC特異化のためには、ニッチ内と考えられるところで、ある特異的なシグナルが誘導には必要かもしれない(Lawson,K.A.他、Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev. 13、424〜436頁(1999); McLaren,A. Signaling for germ cells. Genes Dev. 13、373〜376頁(1999))。このシグナルは、生殖細胞運命に特異化する過程で、fragilisに結合するある特異的なリガンドかもしれない。新生PGCが確立すると、fragilisの発現はE8.0までに減少し、生殖隆起へ向かっての移動へとPGCをホモ型接着から解き放つ(Wylie,C. Germ cells. Cell 96、165〜174頁(1999); Gomperts,M., Garcia-Castro,M., Wylie,C.とHeasman,J. Interactions between primordial germ cells play a role in their migration in mouse embryos. Development 120、135〜141頁(1994))。fragilisは、発生期の胚の他の部分で発現されることが明らかであるから、他の機能も有しているはずである。この点から、fragilisが多能性ES細胞および胚性生殖細胞においても発現されることを記しておく(データ略)。そこではfragilisはその多能性状態を拡大する役割を担っているかもしれない。
【０４３５】
stellaの役割は核と細胞質を行き来できるstellaの能力により部分的に制御されている可能性がある。例えば体細胞でのstellaの過剰発現が、PGCの場合は大部分あるように、そのタンパク質が核内でなく細胞質内に保持される原因となることが認められる(データ略)。PGCの特異化に関与する特に重要な意味を持つ現象は、領域特異的なホメオボックス遺伝子の抑圧であり、このことにより新生PGCは体細胞運命から回避される。stellaの発現はPGCの生成に最も強く関連しているから、この遺伝子はPGCでのHox遺伝子抑圧の開始または維持どちらかの主たる候補である。卵母細胞においてまた着床前の発生を通じてstellaが検出されることは(B.Payer他、未発表データ; Sato,M.他、Identification of PGC7, a new gene expressed specifically in preimplantation embryos and germ cells. Mech. Dev. 113、91〜94頁(2002))、マウスの全能性/多能性状態のすべての段階において、stellaが重要な意味を持つ役割を果たしている可能性を示唆している。
【０４３６】
(実施例11)
Fragilis 2、Fragilis 3、Fragilis 4、およびFragilis 5
マウスにおける始原生殖細胞の特異化は、指令となるシグナル伝達現象に依存する。この現象は第一に、エピブラスト細胞に生殖細胞反応能を与え、次に、反応能を持った前駆体に生殖細胞運命を課する。膜貫通タンパク質をコードするインターフェロン誘導性遺伝子であるfragilisは、生殖細胞反応能の獲得に関連しているとされた最初の遺伝子である。
【０４３７】
本実施例および以下の実施例(実施例11から20)において、Chr7のfragilis遺伝子座近傍70kbの範囲内にクラスター形成している、さらに4つのfragilis関連遺伝子、fragilis 2〜5について記述する。これらの遺伝子は多くの哺乳類種に存在し、ヒトでもChr11のシンテニー領域にクラスター形成している。マウスでは、fragilis 2およびfragilis 3はfragilisに近接し、始原生殖細胞特異化の領域で後者と重複する発現をする。単一細胞分析を用い、これら3つのfragilis関連遺伝子はすべて、新生始原生殖細胞ならびに性腺生殖細胞において、支配的であることを確認する。
【０４３８】
インターフェロン誘導性遺伝子であるFragilisファミリーは、マウスでの生殖細胞特異化と密接に結び付いている。さらに、それが進化の上で保存されていることは、すべての哺乳類でそれがおそらく重要な意味を持つ役割を果たしていることを示唆する。これらの遺伝子を詳細に分析することにより、発生期におけるインターフェロンのシグナル伝達分子としての役割も明らかになる可能性がある。
【０４３９】
(実施例12)
実施例の背景
マウスでの生殖系列決定は、着床後の原腸形成期の胚における指令となるシグナル伝達により起こると考えられている[1,2]。まずエピブラスト基部細胞が、胚外外胚葉由来のシグナル伝達分子に反応することを原因の1つとして、E6.5に生殖細胞反応能を獲得する。これら反応能を備えた細胞の一部が、次に始原生殖細胞(PGC)の運命を獲得し、E7.5の初期尿膜芽底部に位置する胚基部後方領域に、約45個の創始生殖細胞が検出される[1,2]。分泌されたシグナル伝達分子、すなわち、BMP4、BMP8b、BMP2、ならびにSmad1およびSmad5などのBMPシグナル伝達経路の構成分子が、PGC特異化に関与しているようである[3-7]。しかし、in vitro培養細胞での実験およびBMP-4欠損マウスの分析は、PGC運命の獲得にはさらに別のシグナルが必要であることを示唆するが、それが何であるかはまだ明らかにされていない[2,3]。
【０４４０】
推定インターフェロン誘導性遺伝子であるfragilisを同定した。この遺伝子は、エピブラストの生殖細胞反応能獲得に明らかに関与している膜貫通タンパク質をコードする[8]。胚外外胚葉はエピブラスト組織でのfragilis発現を誘導することができ、BMP4がこの誘導に必要とされる[8]。fragilisはE6.5にエピブラスト基部で発現されるが、クローン分析によると、そこはPGC反応能がある細胞が存在している領域である[1]。原腸形成期にこれらの基部細胞が基部後方領域に移動するにつれ、初期尿膜芽底部にある細胞集落で、fragilisの発現が増加する。fragilisを最高レベルで発現している細胞が、生殖細胞の特徴であるTNAPおよびstella/PGC-7の発現を開始する[8,9,10]。fragilisを高レベルで発現しているこれらの新生PGCは、新生PGCでのHoxb1を含むHox遺伝子の抑圧も示す[8]。
【０４４１】
fragilisとPGC特異化の強い関連性を考慮し、生殖細胞の発生期に、この遺伝子がどのように制御され、また正確にどのような機能を果たしているかについて、さらなる調査を開始した。この目的に向け、fragilisはネズミ遺伝子の新しいファミリーに属し、そのファミリーには類似性の高い5つの膜貫通タンパク質をコードする5つのメンバーが含まれることを、ここに報告する。より重要なことには、それらの遺伝子は70kbのゲノム領域にクラスター形成している。ヒト、ウシ、およびラットにおいてFragilisファミリーの相同体をいくつか発見したことから、それらの遺伝子は哺乳類種の中で進化の上で保存されているようである。全部ではないとしても大部分の相同遺伝子は、インターフェロンシグナル伝達に応答性があると報告されており、このことは、少なくともネズミとヒトの遺伝子座に、保存されたインターフェロン刺激応答配列(ISRE)が存在することと一致する。さらに、fragilis、fragilis 2、およびfragilis 3に近接して座位する2メンバーも新生PGCで発現されることが、in situハイブリッド形成法および単一細胞発現分析で明らかにされる。ただし着床後胚におけるその2メンバーの発現全体のパターンは、他の点では特徴的であるが。したがって、Fragilisファミリー遺伝子の研究は、特にそれらの相同体はホモ型細胞接着を媒介することと、細胞分裂周期を長引かせることに関与しているとされていることから[14,15]、PGC特異化の理解に重要な意味を持つ。これらの研究はまた、これまで胚発生に関連して考慮されることがなかった、インターフェロンがシグナル伝達物質としてどのように作用しているかということについても、明らかにする可能性がある。
【０４４２】
(実施例13)
材料と方法  データベース検索と実験動物
EnsemblとNCBIゲノムブラウザをデータ取得に使用する。
【０４４３】
In situハイブリッド形成実験に用いた胚および生殖隆起は、それぞれ129x129またはF1xGoF1母に由来した。単一細胞分析に用いた胚および生殖隆起は、それぞれ129xSvEvまたはOct4GFP(129)xMF1母に由来した。膣栓の形成日をE0.5と見なした。DownsとDavies[22]に従い胚の段階決定を行った。
【０４４４】
(実施例14)
材料と方法  In situハイブリッド形成法
fragilisおよびfragilis 2〜5のcDNAの3'断片を、下記のプライマーを用いPCR増幅し、pGEMT(プロメガ社)ベクターにクローン化した。DIG RNA標識キット(Sp6/T7、ロシェ社)を用いて、DIG標識アンチセンスRNAプローブを合成した。胚および尿生殖隆起でのin situハイブリッド形成法は、既報[23,24]と同様に行った。1μg/mlのDIG標識RNAプローブを含んだハイブリッド形成バッファー(50%ホルムアルデヒド、1.3xSSC(pH5)、5mM EDTA(pH8)、50μg/ml酵母RNA、0.2%Tween-20、0.5%CHAPS、100μg/mlのヘパリンを含むDEPC処理水)を使用し、70℃で一晩ハイブリッド形成を実行した。アルカリ性ホスファターゼ標識抗DIG Fab断片(ロシェ社)とBMパープルアルカリ性ホスファターゼ基質(ロシェ社)を使用し、ハイブリッド形成したプローブを検出した。
【０４４５】
(実施例15)
材料と方法  単一細胞cDNAの調製、PCRおよびサザンブロット分析
DMEM/10%ウシ胎児血清/25m MHEPES(pH7.4)内で、早期芽(Early bud)期の胚(E7.5)および生殖隆起(E11.5)を単離した。始原生殖細胞および生線生殖細胞をそれぞれ切除し、単一細胞に分離した。後者をマウスピペットで採取し、そのcDNAを既報[25]と同様に増幅した。stellaのcDNAおよびfragilisとfragilis 2〜5のcDNAの3'断片をPCR増幅するため(25サイクルの増幅)、次のプライマーを使用した。stella: 5'CTCACAGCTTGAGGCTTCTAA3'、5'GCGATTCAGATGTCTCTGCAC3'、fragilis: 5'GTTATCACCATTGTTAGTGTCATC3'、5'AATGAGTGTTACACCTGCGTG3'; fragilis 3: 5'GATCTTCAGCATCCTTATGGTC3'、5'GAAGGTAACATTTGCATACGCG3'; fragilis 2: 5'CCTTCCTTATTCTCACTCTG3'、5'GTTGCAAGACATCTCACATC3'; fragilis 4: 5'AACTTGGAGGCTGCAAGGCAG3'、5'CTCGGAACTCTTAGTTATAGTC3'; fragilis 5: 5'TGCTCTGGTCATCTCCCTCA3'、5'CAGGATAAGGGGCAACTCTG3'。PCR生成物を1.5%アガロース/TBE電気泳動ゲルに流した。サザンブロット分析のために、単一細胞のcDNAをハイボンドN+メンブレン(アマシャム社)にブロットし、fragilis、fragilis 2、およびfragilis 3のcDNAの3'領域、また全長stellacDNAを含む32αP dCTP標識DNAプローブを用いプローブした。GAPDHをローディング対照として使用した。ブロッティングシグナルは富士フィルム社製FLA5000スキャナを用い検出した。シグナル強度はGAPDHシグナルと比較し定量した。すなわち、遺伝子相対発現レベルは、遺伝子シグナルのGAPDHシグナルに対する比として計算し、続いてブロットにつき最高のハイブリッド形成シグナルで割ることにより、この比を規格化した。ドットブロット分析のためには、全長fragiliscDNAをブロットし、32αP dCTP標識3'プローブを用いプローブした。
【０４４６】
(実施例16)
Fragilis遺伝子ファミリー
fragiliscDNA配列をテンプレートに用いensemblゲノムブラウザ(www.ensembl.org)を検索し、中程度から高程度のfragilisとのDNA配列類似性(45〜74%)を備えた8つのマウス遺伝子を同定した。これらの遺伝子の5つについて、種々の胚組織および成体組織由来のESTが報告されており、そのうちの4つはfragilis同様の2エクソン構造を有している。後者のゲノム上の位置を分析し、マウスChr7(F5)の遠位端上でfragilis遺伝子座の周辺70kbの領域内に、この4つの遺伝子がクラスター形成していることが明らかになった。したがって本発明者らはこの4つの新しい遺伝子をfragilis 2〜5と名付け、それらの遺伝子のゲノム上の位置、fragilisとの類似性、そして生殖細胞に関連した発現パターン(下記参照、図9)を反映させる。検出した残り4つの推定遺伝子は、報告されたESTをほとんど、または大部分は全く備えておらず、またfragilisと異なり、単一エクソンでコードされる。したがってそれらを擬似遺伝子と見なす。
【０４４７】
上記Fragilisファミリー遺伝子が進化的に保存されているかどうかを判定するため、ヒトゲノムChr11(p15.5)上に、マウスFragilisの4つの相同体を同定した。これはマウスChr7上のFragilisファミリー座位の、まさにシンテニー領域である(図9)。これらのうちの3つの遺伝子Ifitm1(9-27)、Ifitm2(1-8D)、およびIfitm3(1-8U)は、fragilis遺伝子クラスターと58〜65%の類似性を共有し、18kbのゲノム範囲に座位している[11]。それらは1および2型インターフェロンに応答性があり、インターフェロン誘導膜貫通(Ifitm)タンパク質をコードし、抗増殖シグナル伝達およびホモ型細胞接着に関与する[12-15]。4番目の遺伝子ENSG142056は2つのエクソンを備えた新しい遺伝子で、高い類似性をマウスのfragilis 4(83%のDNA配列類似性)と隣接Ifitm2に対し有する。したがって、ヒトのFragilisファミリー相同体はマウスの5つのFragilis遺伝子と同様のゲノムクラスターを形成する。しかし系統樹分析により、2つのFragilis遺伝子のみ、すなわちfragilis 4と、fragilis、fragilis 2、またはfragilis 3のどれか1つが、マウスからヒトへ保存されたことが示唆される(データ略)。したがって、以後の遺伝子複製は両方の種で独立に起こった可能性がある。また、2つのFragilisファミリー類似遺伝子をウシで(ウシ1-8U、ウシ9-27)、また4つをラットで(P26376、JC1241、NP110460、AAD48010)同定した。このラット遺伝子は推定インターフェロン誘導性遺伝子と注解が付けられた一方で、ヒトifitm遺伝子に類似したこの2つのウシ遺伝子は、インターフェロンシグナル伝達に応答性があると報告されている[16,17]。ウシおよびマウスゲノムマッピング情報が限られているため、現段階では、これらの相同遺伝子もクラスター形成して組織されているかどうか推定はできない。ヒトifitm遺伝子座内のインターフェロン刺激応答配列(ISRE, GGAAAN(N)GAAAC)により、上記3つのヒトIfitm遺伝子にインターフェロンへの応答性が与えられる[11,18]。同様のISREコンセンサス配列は、マウスのFragilisファミリークラスター内でも、特にfragilis、fragilis 2、およびfragilis 5と関連して、見つかっている(図9)。
【０４４８】
ネズミのfragilisファミリーおよび関連遺伝子は、104から144アミノ酸の5つの類似性の高い転写物をコードし、それぞれは2つの予想される膜貫通ドメインを含んでいる(図10)。ヒト、ウシ、およびラットfragilis類似遺伝子との配列類似性は同程度に高い(全体で68%のアミノ酸類似性)。第一の膜貫通ドメインならびにそれに続き第二の膜貫通ドメインの始まりまでの範囲が、種内および種間で最も保存度の高い領域を構成していることを記しておく。
【０４４９】
(実施例17)
fragilis、fragilis 2、およびfragilis 3は着床後の早期発生段階で発現する
Fragilisファミリーの5つの遺伝子の発現パターンを、対応するmRNAの3'領域(150〜200塩基対)にわたるプローブを用い、ホールマウントin situハイブリッド形成法で分析した。これらのプローブは、Fragilisファミリーのメンバー間で有意な交差ハイブリッド形成をしないことが、ドットブロット分析により示される(データ略)。報告されたように、fragilisの発現は、E5.5とE6.5のエピブラストに限られることを確認した。より重要なことに、E7.5あたりで、PGC特異化が起こる領域にある尿膜底部の細胞集団内で、fragilisの発現が強い(図11a〜c)[8]。fragilis 2とfragilis 3もE5.5胚のエピブラスト内で発現する(図11g、データ略)。fragilis 2の発現はそれ以後顕著に下方制御されるが、fragilis 3の発現は胚組織で同程度のレベルに保たれる。E7.5にfragilis 2は中胚葉後部で検出されるが、fragilis 3の発現はエピブラスト全体で認められる。より意味深いことには、fragilis 2とfragilis 3は両方とも、fragilisと同様に、新生PGCクラスターの起源となる領域で、高レベルで発現する(図11 i/i'、n/n')。このように、Fragilisファミリーのこれら3つのメンバーは、PGC特異化の時期と部位で、顕著に発現する。
【０４５０】
8.5Eに、尿膜底部および尿膜の基部3分の1の範囲の細胞で、fragilisの発現が見られる(図11d)。さらに、発生期の脳の前側面にシグナルが検出される(図11e)。この段階では、fragilis 2は胚の尾方半の中胚葉で発現するが(図11j、k)、fragilis 3は発生期の心臓を除いて胚全体に存在するようである(図11p〜r)。この段階では、尿膜底部および尿膜の基部3分の1の範囲の単一細胞で発現が顕著により強く現れていることは、注目すべきである(図11q)。PGCが後腸に沿って移動し始めるE9.5には、fragilisのシグナルが陥乳後腸の始まり部分の細胞集団に見られる。さらに、このシグナルは咽頭弓で増大するようである(図11f)。この段階では、fragilis 2の発現は、尾芽、第12体節に対し尾側の中胚葉、および肺原基に限られているようである(図11l)。
【０４５１】
最初の3つの上記ファミリーメンバーと対照的に、fragilis 4とfragilis 5のどちらも、着床後初期では発現を示さない(E7.0〜E8.5、データ略)。その結果、E5.5とE9.5の間に胚ではファミリークラスターの中心部の3遺伝子、すなわち、fragilis、fragilis 2、fragilis 3のみが発現する。それらの発現パターンには特徴があるが、創始生殖細胞が局在する領域内では注目に値する重複が生じる。このことは3隣接遺伝子、fragilis、fragilis 2、およびfragilis 3は、クラスター内に存在すると考えられる制御要素を共有している可能性を示唆する。これらの制御要素はまた、特に新生PGC領域近辺での上記遺伝子の重複発現パターンの原因である可能性がある。
【０４５２】
(実施例18)
PGCおよび隣接体細胞でのfragilis、fragilis 2、fragilis 3の単一細胞分析
生殖細胞特異化の点から新Fragilisファミリーメンバーの発現に関するより正確な情報を得るために、E7.5胚の初期尿膜芽底部に位置するPGCおよび周囲の体細胞由来の単一細胞cDNAを検査した。新生PGCではfragilis 2とfragilis 3の両方が発現され、生殖細胞マーカーであるstella/PGC7の転写を示す(図13a)[8,10]。この2つのFragilisファミリーメンバーは、stella/PGC7の発現を欠く周辺体細胞でも検出された[8]。重要なことであるが、隣接体細胞と比較して、新生PGCではfragilis 2およびfragilis 3は支配的にまた高レベルで発現されることが、サザンブロットを使用した半定量分析で示された(図13b、c)。これはfragilisに見られるパターンを模倣している。ただし後者の発現は生殖細胞により特異的である。In situハイブリッド形成のデータと組み合わせて、これらの知見は、ある共通の制御要素が創始PGCでの3Fragilis遺伝子の上方制御された発現に関与しているという考えを、さらに支持するものである。
【０４５３】
PGC特異化直後以降の発生段階の間に、尿膜に関連し、また移動前PGCが存在すると考えられている位置にある細胞集団で、Fragilisファミリーの3つの遺伝子すべてが発現される(図11d、k、q)。本発明者らの分析からは現段階ではPGCの移動中の正確な遺伝子発現は不明である。しかし、生殖隆起内の単一細胞由来のcDNAについてin situハイブリッド形成法とPCR分析を用い、E11.5〜E12.5に性腺生殖細胞でfragilis、fragilis 2、およびfragilis 3の明白な発現を認めた(図14)。fragilis 3の発現は中腎にまで及ぶが、fragilisとfragilis 2のシグナルは生殖隆起に限定されていた。断続的な染色パターンがfragilisについて見られたが、これは生殖細胞に限定されたstella/PGC7の発現を模倣するものである(図14b)。上記PCR分析に加えこのパターンは、E11.5の生殖細胞では、fragilisが単独にではないとしても、支配的に発現されることを示唆する。これより初期の胚の場合と同様に、fragilis 4とfragilis 5のどちらも性腺生殖細胞では検出されなかった(データ略)。
【０４５４】
(実施例19)
考察
本研究ではネズミFragilis遺伝子ファミリーの同定を記述する。この遺伝子ファミリーは哺乳類種において保存されていると考えられ、そのメンバーは、類似性の高い5つの膜貫通タンパク質をコードする。このFragilisファミリーの3つのメンバー、fragilis、fragilis 2、およびfragilis 3が発現を示し、その発現は生殖細胞の特異化と発生に関連している。Fragilisタンパク質は細胞膜に局在し、生殖細胞とその周囲の隣接細胞の間での相互作用を媒介するために重要である可能性がある。この3遺伝子は早期にE5.5で発現され、それ以後はそれぞれ異なった程度に発現されるが、3遺伝子とも新生PGC内で上方制御された発現を示す。その遺伝子座にこの発現のために必要なシス制御要素が存在し、性腺PGC内にも存続すると考えられる。さらに研究すれば、これらの制御要素がどこに局在し、fragilis関連遺伝子の発現をどのように制御するかが明らかにされるであろう。
【０４５５】
Fragilisファミリーの5つのメンバーは、ゲノムの小領域にクラスター形成しているが、fragilis 4とfragilis 5はどちらも初期胚または胚性生殖細胞で発現されないようである。クラスター中央部に座位するfragilis、fragilis 2、およびfragilis 3遺伝子と対照的に、この2つのメンバーがクラスターの末辺縁に座位していることは、注目されることである。この発現の欠如は、境界要素の存在が原因かもしれず、それはクラスター中央部の遺伝子に対する制御要素の作用を制限するかもしれない。配列を比較すると、2つの種では遺伝子複製は独立に起こった可能性が示唆されるため、直接隣接する複製遺伝子の複製と維持に、何らかの進化上の制約が存在する可能性があるようである。シンテニー領域にあるFragilisファミリーの4つのヒト相同体も、ゲノム上にクラスター形成しており、またこのファミリー遺伝子との類似性が高いから、これらの相同体もマウスにおけるのと同様な機能を果たしている可能性があると提案したい。
【０４５６】
Fragilis遺伝子座内にインターフェロン刺激応答配列(ISRE)のコンセンサス配列がいくつか存在し、またそれらの遺伝子がヒトおよびウシのインターフェロン誘導性コンセンサス配列に類似性を有していることは、fragilisおよびfragilis関連遺伝子はインターフェロンに応答性があることを強く示唆する。実際に、ヒトIfitm1、Ifitm2、およびItitm3遺伝子の5'側に隣接して存在するISREの縦列反復は、fragilisエクソン1の5'側隣接領域にも存在する[11]。インターフェロンは、分泌シグナル伝達分子として、これまで主に免疫応答過程、細胞成長阻害およびアポトーシス制御への関与が指摘されてきた[19]。インターフェロンは着床後胚で発現するが、その発生における役割は詳しくは発表されていなかった[20,21]。本発明者らの研究はインターフェロンが生殖細胞発生に関与している可能性を指摘した。今後の研究により、Fragilis遺伝子が、この遺伝子が発現されるすべてのまたは一部の場合に、インターフェロンシグナルに応答するか、決定されるであろうし、マウスおよびヒトの遺伝子座に保存されたISRE配列が存在することから、応答するものと予想する。
【０４５７】
(実施例20)
結論
インターフェロン誘導性遺伝子であり、膜貫通タンパク質をコードする、Fragilisファミリーを同定した。その5つのメンバーは、マウスゲノムの70kbの領域にクラスターを形成しており、そこにはISRE配列も含まれる。中央部に座位するfragilis、fragilis 2、およびfragilis 3遺伝子は、生殖細胞特異化が起こる領域で発現されるから、特に興味が持たれる。このファミリーは哺乳類種間で進化上保存され、同様の機能を果たしている可能性がある。Fragilisファミリーを詳しく研究することにより、胚発生においてインターフェロンがどのような役割を担っているかも示される可能性がある。
【０４５８】
(実施例21)
Stellaはマウスの正常な初期発生に必要とされる母性効果遺伝子である
本実施例および以下の実施例(実施例21から25)では、マウスにおいてstella遺伝子の標的変異が与える影響を調査した。哺乳類卵母細胞の母性遺伝には、全能性や後天的修飾に重要なタンパク質1、ならびに初期発生に重要な因子を含み、これらは母性効果遺伝子と呼ばれる遺伝子から転写される2-7。
【０４５９】
Stellaはこれらの母性遺伝タンパク質の1つであり、また着床前胚、始原生殖細胞、および多能性細胞で発現する8,9。異型接合動物間の交配ではstellaの無い見かけ上正常な子が出生した一方で、stella欠損メスでは、そのメスの卵母細胞には母性遺伝のStellaが欠損しているため、著しく受胎率が減少したことを本発明者らは示す。
【０４６０】
胚発生における表現型の影響は、母性stellaの変異遺伝子型の結果であるから、Stellaは母性効果遺伝子である。実際、Stellaタンパク質を欠く胚は着床前の発生が損なわれ、胚盤胞期に達することが稀であることを実証する。さらに、ヒト卵母細胞で発現されるSTELLA10は、ヒト多能性細胞および生殖細胞腫瘍でも発現されることを示す。興味深いことには、STELLAが宿るヒト染色体12pは、これらの腫瘍で一貫して過剰発現される11。このような知見から、ヒト初期発生期にSTELLAはマウスの場合と同様な役割を果たし、生殖細胞腫瘍に関与している可能性が示唆される。
【０４６１】
本研究の目的は、マウスでの機能喪失分析によりstellaの役割を解明することである。前研究では、stella(別名PGC7)の発現が、特に始原生殖細胞(PGC)8,9系譜に限定された創始細胞集団で、E7.25に生殖細胞特異化の過程の間に活性化されることを示した。それ以後stellaは、オスの性腺では約E15.5まで、そしてメスの性腺では約E13.5まで、生殖系列で発現される。stellaの発現は新生卵巣の未成熟卵母細胞で再開され、後に成熟中の卵母細胞と着床前の胚で検出される(図15a〜l)8。接合子が形成されたすぐ後に、Stellaは細胞質でも検出されるが、前核に蓄積する(図15d〜f)。細胞質と核の染色はどちらも、杯盤胞期に至るまで卵割期の間継続し、その後Stellaは、新生PGCに再び現れるまで8,9下方制御される(図15g〜l、データ略)8。
【０４６２】
(実施例22)
材料と方法
免疫蛍光法
胚は4%のパラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで3回洗浄し、AB-バッファー(1%トリトン-X100、0.2%SDS、10mg/ml BSAを含むPBS)で透過処理した。同バッファーは、次の抗体のインキュベーションと洗浄でも使用した。次に胚を一次抗体(抗stella91:200、抗PGC781:2000)と4℃で一晩インキュベートし、3回洗浄し、そして二次抗体(アレクサ564、モレキュラープローブス社、1:500)と室温で1〜2時間インキュベートした。AB-バッファーでさらに3回洗浄した後、一度胚をPBSですすぎ、0.1mg/mlのRnase A(ロシェ社)を含むPBSで37℃で30分間インキュベートした。最後にヨウ化プロピジウム(2μg/ml)を含むPBSで10分間インキュベートし、やはりヨウ化プロピジウムを含むベクタシールド(ベクターラボラトリーズ社)マウンティングメディアを用いスライドグラスにマウントした。
【０４６３】
E11.5のPGC-染色のため、生殖隆起をPBSで洗浄し、トリプシン/EDTA(ギブコ社)で10分間37℃で処理し、PBSで希釈し細胞懸濁液に分解した。ポリL-リジン処理したスライドグラスに細胞を定着させ、3%ホルムアルデヒドで15分間固定した。0.2%トリトンX-100を含むPBSで透過処理しPBSで3回洗浄した後、3%BSAを含むPBS(次の洗浄および抗体の希釈でも使用)で細胞を40分間ブロックし、一次抗体(抗Stella1:100、抗SSEA1(=TG1)、P.Beverley 1:2)と4℃で一晩インキュベートした。次に細胞を洗浄し二次抗体(アレクサ564、アレクサ488、モレキュラープローブス社、1:500)と1.5時間インキュベートした。洗浄後、Rnase(0.1mg/ml)処理を室温で1時間行い、細胞をToto-3(モレキュラープローブス社、1:1000)を含むベクタシールドを用いマウントした。
【０４６４】
免疫蛍光をバイオラド社Radiance2000共焦点顕微鏡で視覚化した。
【０４６５】
stella相同体の同定
Ensemblサーバ(http://www.ensembl.org)を利用し、マウスStellaタンパク質配列を翻訳化ヒトゲノム配列に対し検索をかけ、ヒトSTELLAを同定した。マウス遺伝子と同じイントロン-エクソン構造を示している唯一のヒットは、シンテニー領域(図15m、n)に座位しており、したがってヒトのオーソログ遺伝子であると見なした(イントロンのないヒットは擬似遺伝子と見なした)。このゲノム領域に整列させた3つのIMAGE-ESTクローン(ジェンバンク番号: AA927342、AI066520、AA564230; ユニジーンクラスターHs.131358)は予想配列を確証するために本発明者らが全配列決定を行った。
【０４６６】
推定ラットstella配列は、上記と同様にマッピングし、マウスcDNA配列とそのシンテニーであるラットゲノム配列を整列し決定した。
【０４６７】
ヒト組織のRT-PCR分析
各ヒト組織の1μgのトータルRNA(ソース: Ambion、謝辞参照)を、スーパースクリプトII逆転写酵素(ギブコ社)を用い、第一鎖cDNAに37℃で1時間逆転写した。このcDNA 1μgを、ヒトSTELLAのためのプライマー(5'-CAATTTGAGGCTCTGTCATCAG-3'、5'-TTCATCTCACTGACTTTGGGC-3')またはリボソームタンパク質L32のためのプライマー(5'-AGTTCCTGGTCCACAACGTC-3'、5'-TGCACATGAGCTGCCTACTC-3')を使用し、30サイクルのPCR反応で増幅した。
【０４６８】
ES細胞操作とノックアウトの証明
標的コンストラクトは、stellaの2番目のエクソンに隣接する上流1.5kbおよび下流4.1kbのゲノム配列から構成される。5'側アームはエクソン2の最初の32塩基対後で終止するが、IRES lacZレポーターに融合させ、プロモーター化ネオ選択マーカーが続く。コンストラクトを直線化し、CCBマウス胚性幹細胞に電気穿孔法で導入し、選択を行った。独立したG418耐性クローンを採取し、ベクタープライマーと5'アームへの外部プライマーを使用したPCRにより、標的コンストラクトが正しく組み込まれているかスクリーニングした。288個のクローンをスクリーニングし、2個のクローンがPCRで予想される大きさのバンドを示した。NcoIとEcoRIで消化したゲノムDNAの5'、3'およびネオプローブを使用したサザンブロットにより、相同組換えも確認した。正しく標的されたES細胞クローンF4を、MF1およびC57BL/6の胚盤胞に注入し、キメラマウスを産生した。オスキメラを129Sv/Evメスマウスと交配させることにより、生殖系列を伝達した。分析はすべて近交系129Sv/Evをバックグラウンドとして行った。stella遺伝子が正しく失活したことを確かめるため、上記と同様にマウスの遺伝子型をサザンブロットで同定した(図16b)。さらに、エクソン2特異的プライマー(5'-AGACGTCCTACAACCAGAAAC-3'、5'-CCGAACAAGTCTTCTCATCTT-3')を使用し、野生型、異型接合型、および同型接合型マウスの精巣および卵巣のRNAについて、RT-PCR(ヒト組織と同じ手順、上記参照)を実行した(図16c)。
【０４６９】
始原生殖細胞の計数
stellaの異種接合性胚をE8.5に解剖し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、既報20,26と同様に、αナフチルリン酸/ファストレッドTR溶液(シグマ社)を用いてTNAP陽性PGCを染色した。当該胚の後方部はカバーグラスで押しつぶしPGC計数用に使用し、前方部はPCRによる遺伝子型の決定に使用した。
【０４７０】
組織学
成体マウス由来の精巣および卵巣を、ブアン固定液を用い4℃で一晩固定し、そして80%エタノールで完全に洗浄した。エタノールで段階脱水後、キシレンに移しパラプラストプラスワックス(シグマ社)に包埋した。8μm切片を切り出し再水和し、エールリッヒのヘマトキシリン(BDH社)および1%エオシン(シグマ社)を用い染色した。脱水後、スライドグラスをDPX(BDH社)を用いマウントした。
【０４７１】
交配およびin vitro培養
受胎および胚発生の実験はすべて、自然交配を用いて行った。マウスは一定の明暗サイクルに置かれ、交尾は膣栓が検出される(E0.5=膣栓日の中央時)前の暗時間の中央時に起こったと想定した。観察期(E0.5〜E3.5)に、または培養した場合にはE1.5に、卵管/子宮洗浄により胚を回収した。培養はKSOM培地で5%CO2の下で行った。
【０４７２】
動物実験は内務省プロジェクト認可番号PPL80/1280およびPPL80/1706の下で行われた。
【０４７３】
stellaGFPマウスの生成
stellacDNAをプローブとして使用し、stella遺伝子座を宿しているクローンを同定するため、グリッド化129pBeloBACゲノムライブラリー(ゲノムシステムズ社、ミズーリ州セントルイス)をスクリーニングした。約8.5kbの上流配列とエクソン1、イントロン1、およびエクソン2の開始部分を含む、11.5kbのゲノム配列をサブクローン化し、eGFP(クローンテック社)およびSV40ポリアデニル化シグナルにフレームで融合した。次にこの配列をB6CBA F2接合子の前核に注入し、トランスジェニックマウスを生成した。この導入遺伝子は同じ遺伝的背景で管理され、stellaGFP遺伝子組換えオスと非組換えメスを交配させることにより、父性対立遺伝子の発現開始を観察した。
【０４７４】
この実験で言及したStella相同体cDNAは以下のジェンバンクアクセス番号で登録されている。マウスStella(AY082485)、ラットStella(BK001414、保留中)、ヒトSTELLA(AY317075、保留中)。
【０４７５】
(実施例23)
Stella相同体
stella相同体をラットおよびヒトゲノムで同定した。それらは同じエクソン-イントロン構造を示し、染色体のシンテニー領域内に座位している(図15m、n参照)。マウスの遺伝子は第6染色体のF2位置に、ラットの遺伝子は第4染色体のq42に、そしてヒトの遺伝子は第12染色体のp13.31にある。ラットでは発現配列タグ(EST)が1つだけ見つかったが(BI289609、大動脈プール)、ヒトESTは主に生殖細胞腫瘍ライブラリーの数個が(ユニジーンクラスターHs.131358)、ゲノム配列に一致した。マウスとラットのタンパク質の全長アミノ酸配列(図15o)は70%の同一性(84%の類似性)を示したが、マウスとヒトのタンパク質は35%の同一性(53%の類似性)を共有するにとどまった。齧歯類とヒトのStellaのオーソログは明らかに分化しているが、保存配列領域はこれらのタンパク質の中央部とC末端に見出される。これらのモチーフの生化学的機能はまだ発見されていないが、核内移行および核外移行シグナルと予想される配列の一部が高保存領域に存在している。
【０４７６】
(実施例24)
Stellaの発現
ヒトSTELLAの発現を調べるため、多能性細胞株および生殖器官についてRT-PCR分析を行った(図15p)。ヒト胚性幹(ES)細胞と胚性癌(EC)細胞、ならびに正常な精巣と卵巣に、STELLAを検出した。最も強い発現は精巣生殖細胞腫瘍で見出され、多能性の特徴を示している11。他の腫瘍および体細胞組織でのSTELLAの発現は、大変低いか検出できないレベルだった(データ略)。これらの知見は、STELLA(7.1断片と命名された)がヒト卵母細胞とEC細胞で検出され、そこではSTELLAはレチノイン酸誘導分化後に下方制御されたという最近の研究10と、同時に得られた。これらの知見は、STELLAはヒトにおいてもマウスと同様の役割を担っている可能性があるという仮説を、強固にするものである。さらに、STELLAが座位する第12染色体短腕(12p)は、精巣生殖細胞腫瘍で一貫して過剰発現される11。Stella/STELLAは、多能性や生殖細胞腫瘍に関係のあるnanog/NANOG12,13およびgdf3/GDF314(図15n)から成る、保存遺伝子クラスターに存在する。マウスとヒトでの保存された近接性、またこれらの遺伝子の重複発現パターンから、転写レベルでの共通の制御機構が存在する可能性が示唆される15。明らかなことだが、これらの知見により、マウスおよびヒトでのstellaおよびその隣接遺伝子の機能を、注意深く分析することが促される。
【０４７７】
(実施例25)
Stellaノックアウトマウス
stellaの機能解明に取り組むため、stellaノックアウト(stella-/-)マウスを生成した(図16)。129/SvEvをバックグラウンドとし、異型接合マウス(stella+/-)交配させ192個体の子が出生したが、その構成は56(29.2%)野生型、81(42.2%)stella+/-、そして55(28.6%)stella-/-マウスであり、ほぼ1:2:1のメンデル比であった。したがって、stella-/-欠損マウスは生存可能であり、正常速度で成長する。
【０４７８】
stellaが創始PGCで検出されることから、生殖細胞の発生への影響についてstella-/-マウスを調べた。PGCマーカーである組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ(TNAP)活性によりE8.5の変異胚での生殖細胞を調べると16、野性型の胚と比較してPGC数には有意な違いのないことが明らかになった(図17a)。同様に、生殖細胞マーカーSSEA1を用いた検出から、ノックアウト胚の早期性腺PGC(E11.5)には影響は認められなかった17(図17b)。さらに、成体マウスの精巣と卵巣の組織学的検査では、stella変異動物の配偶子の発生において、顕著な異常は認められなかった(図3h〜m)。実際、野性型または異型接合メスと交配させたとき、stella-/-オスは正常な受胎能を示した。変異メスでは、すべての発生段階の卵母細胞を検出し、また対照動物と比較して排卵された卵母細胞の数は同程度 (stella-/- 8.6±1.0、n=9;野性型またはstella+/- 9.0±0.4、n=19) であることがわかったが、これはstellaの欠損は生殖細胞決定にも発生にも顕著な影響は与えないことを示唆する。
【０４７９】
次に、Stellaの母性遺伝を欠くstella-/-メス卵母細胞から、発生が正常に進行するかを調査した。メスのstella-/-マウスは、Stella欠損卵母細胞を正常数排卵するにもかかわらず、著しく減少した受胎率を示した。stella-/-メスを野性型オスと交配させると、低割合(24%、図18a)の交配(膣栓により検出)のみが完全な妊娠そして生存した仔に至った。妊娠に失敗したメスは、約10日後に再び交尾したが、これはこれらのメスにおいて胚が着床せず、その結果擬似妊娠期間後に発情周期が再開したことを反映する18。対照的に、80%の野性型メス(同腹仔対照)が交尾後妊娠し仔を出産した(図18a)。さらに、妊娠に至ったstella-/-メスでも、野性型メスと比較して、出産した仔は著しく小さかった(図18b)。予備調査結果でも、非近交系(129SvEv / C57BL/6)での受胎率の低下が示される。ただしこの影響は近交系129Sv/Evマウスの方が大きい。この結果は、遺伝的背景はノックアウトの表現型の症状の程度を変化させ得るという既報19と一致する。その症状には生殖細胞発生の欠損も含まれる20,21。以上の知見から、Stellaが欠乏した卵母細胞由来の胚は発生に影響があり、また、卵母細胞は野性型オスの正常な精子で受精したから、stellaは母性効果遺伝子であることが実証される。
【０４８０】
次に、着床前胚(図15)8のStellaタンパク質は完全に母性遺伝的であり、したがってstella-/-メス由来の胚には存在しないか、あるいは、野性型の精子による受精後、父性対立遺伝子からstellaの発現が開始されるか、を明らかにしたかった。この目的のため、stella-GFPレポーター導入遺伝子を使用したトランスジェニックマウスを作製した(図18c〜i)。stella-GFP遺伝子組換えオスと非組換えメスとを交配させると、胚内での大量の転写および翻訳が開始する時期である2細胞期という早期に、この導入遺伝子の発現を検出した22(E1.5、図18e、h)。このことは着床前発生期のかなり早期にstella遺伝子は転写されることを示す。この結果を、野性型オスとstella-/-メスとの交配由来E2.5胚の抗Stella抗体染色により確認した (図18j〜l)。したがってStellaは、stella-/-メスと野性型オスとの交配により生まれた早期胚で明らかに生成される。これは事実であるが、Stella欠損卵母細胞の大多数は発生を正常に終えず、2細胞期という早期における父性対立遺伝子によるstellaの発現開始は、観察される母性効果表現型を完全に救済するには十分でないことが実証される。対照的に、母性遺伝のStellaは正常発生に十分であり、それは異型接合オスと交配させた異型接合メスから、Stella-/-マウスが野性型マウスと同頻度で生まれることからわかる(上記参照)。
【０４８１】
次に、Stellaの不在が発生に影響を及ぼす胚発生段階についての疑問に取り組んだ。Stella-/-オスとStella-/-メスとの交配から生存した仔がこれまで全く得らなかったため、これらの交配による胚を調べ、野性型またはStella-/-オスと、野性型またはStella+/-メスとの交配による胚と比較した(図19)。Stella-/-メス由来の卵母細胞で受胎は正常に進行するようだが、各時点の検査で正常な発生を示す胚が段々少なくなるとこから、Stellaを欠いている影響はすぐに明確になる(図19a)。累積的に明らかになる発生異常はE3.5で際立ち、この時点で対照胚の大部分(69%)は胚盤胞期に達するが、stella-/-母の胚は6%だけがそうである(図19a〜c)。この結果は、in vitroでE4.5まで3日間培養した同様な胚の検査結果によりさらに支持される。E4.5に変異卵母細胞由来胚の15%が胚盤胞期に達したが、対照では69%であった。49%の変異胚はまだ単細胞期にあり、断片化あるいは非対称すなわち異常な卵割を示していた。残りは様々な段階にあり、10%が2細胞期、27%が桑実期であった(図5d〜f)。胚盤胞着床に対する子宮の受容性は、E3.5後期からE4.5早期に限られるため、この時期までに胚盤胞期に達した胚のみが着床できる23,24。これは、stella-/-メスが妊娠することは稀であり、もし妊娠した時は、大変小さい子を出産するという知見と一致する。いくつかの場合には、stella-/-メスは擬似妊娠だけになり、10日後に交尾を再開するが、これらのメスでは胚盤胞着床を欠いていることの表れである18。
【０４８２】
結論として、Stellaの母性遺伝が正常な胚発生に必要であることを実証した。卵母細胞でのStellaの欠乏はこの過程を損ない、胚盤胞数が進行的に減少し、着床がほとんど起こらず、生存可能な仔の出生率は低いという結果となる。StellaはSAPに類似したドメイン２５とスプライシング因子に類似したモチーフを備えた塩基性タンパク質であり、したがって染色体組織化またはRNA代謝においてある役割を担っているであろうと考えられる。初期発生におけるStellaの役割を解明するため、Stella保存ドメインの相互作用の対象と生化学的活性を研究することを提言する。stella-/-マウスでは生殖細胞発生における顕著な異常は認められないが、微妙な影響が存在することは排除できない。ひとつの可能性は、stella関連遺伝子による補償を通じての機能重複である。マウスゲノムには、擬似遺伝子であろうと考えられるが、stella類似配列がいくつか存在する(データ略)。STELLAはヒト卵母細胞でも発現され10、初期発生においてマウスにおいてと同様の役割を果たしていると考えられる。STELLAが最も高いレベルで発現されるのはヒト精巣生殖細胞腫瘍であるから、これは将来診断マーカーとして役立つ、すなわち治療において有益である可能性がある。染色体12p上でNANOGおよびGDF3と共にSTELLAが座位している染色体のシンテニー領域の保存性は、多能性、奇形癌、およびヒト生殖細胞腫瘍に関連していることから、注目に価する。この領域において重要な遺伝子すべてをおそらく協調的に制御する役割により、生殖細胞の発生や生殖細胞腫瘍また多能性や母性効果遺伝子について、進化の立場からの洞察が得られる可能性がある。
［参考文献］
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【０４８３】
本文書で述べたそれぞれの出願および特許、および要求中のそれぞれの出願および特許(「出願引用文書」)を含めた、それぞれの前述の出願および特許中に引用または参照したそれぞれの文書、およびそれぞれの出願および特許中、および任意の出願引用文書中に、引用されたかあるいは述べられた、任意の製品に関する任意の製造者の教示書またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、本文中に引用したすべての文書、および本文中に引用した文書中に引用または参照したすべての文書、ならびに本文中に引用されたかあるいは述べられた、任意の製品に関する、任意の製造者の教示書またはカタログは、参照によりここに組み込まれている。
【０４８４】
本発明の記載した方法およびシステムの様々な変更形態および変形形態は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載してきたが、特許請求する本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際、分子生物学または関連分野の当業者には明らかな、本発明を実施するための記載した形態の様々な変更形態は、特許請求の範囲内のものであるとする。
【図面の簡単な説明】
【０４８５】
【図１】マウスFragilis(配列番号1)のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す図である。2つの膜貫通ドメイン(TMIおよびTMII)の予想位置には下線を引き、太字によって示す。ポリ(A)シグナルに下線を引く。
【図２】マウスStella(配列番号2)のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す図である。3つの核内移行シグナルに下線を引く。考えられる核外移行シグナルには二回下線を引き、疎水性残基は太字で示す。SAPドメイン(a.a.28〜a.a.63)と類似性があるモチーフ中のらせん構造は赤色で下線を引き、保存残基は青色によって示す。スプライシング要素様モチーフには下線を引き、保存残基は緑色で示す。ポリ(A)シグナルにも下線を引く。
【図３】胚性幹(ES)細胞におけるマウスFragilisの発現を示す図である。ES細胞を4%パラホルムアルデヒドPBS中で10分間室温で固定し、Saitou他、(1998).J Cell Biol 141、397〜408(1998)により記載されたのと同様に、免疫組織化学法用に処理する。Fragilisの発現は、生殖細胞反応能細胞である、E6.5隣接エピブラスト細胞中、および新たに特定された生殖細胞中でも同様に検出される。生殖細胞の運命の特定が終了した後のE8.5で、発現は低下する。
【図４】PGCにおけるマウスStellaの発現を示す図である。E12.5生殖隆起由来のPGCを4%パラホルムアルデヒドPBS中で10分間室温で固定し、Saitou他、(1998).J Cell Biol 141、397〜408(1998)により記載されたのと同様に、免疫組織化学法用に処理する。Stellaは、E7.25-13.5由来のPGC中、および多能性ES細胞中、ならびにEG細胞で検出される。Stellaは、全能性卵母細胞、接合体中、および着床前発生中の全能性および多能性卵割球中、発生中の配偶子でも検出される。EG細胞がPGCに由来するとき(Labosky他、(1994)Development 120:3197〜3204)、Fragilis発現が、ES細胞中と同様に、多能性EG細胞中でも検出される。したがって、FragilisおよびStellaは、多能性幹細胞のマーカーでもある。
【図５】E7.2マウス胚のホールマウントin situハイブリッド形成による、マウスFragilisの発現を示す図である。
【図６】E7.2マウス胚のホールマウントin situハイブリッド形成による、マウスStellaの発現を示す図である。
【図７】E9.0胚中の生殖腺への移動のプロセス中のPGC中でのマウスStellaの発現を示す図である。
【図８】単一細胞cDNAのPCR分析によって検出される、単一細胞中でのマウスFragilisおよびマウスStellaの発現を示す図である。8b中で記号*によって示される数はPGCである。Stellaの発現を示す細胞と比較して、Fragilisの発現を示すより多数の単一細胞が存在することを記す。Fragilisの発現が最高レベルである細胞のみが、Stellaを発現し生殖細胞の運命を得ることが見出された。Stellaを発現する細胞は、Hoxb1の発現を示さないことが見出された。低レベルのFragilisを示しStellaは示さない細胞が、体細胞になりHoxb1の発現を示した。PGCの創始群も、高レベルのTnapを示す。創始群PGCと体細胞の両方が、Oct4、T(Brachyury)、およびFgf8の発現を示す。
【図９】マウスChr7上のFragilisファミリーのクラスター、および染色体11上の同じ領域のヒト相同体を示す図である。このマウスでは、5つのFragilis遺伝子が、70kbの領域内でクラスター形成している。すべての遺伝子は2つのエクソンによってコードされており、fragilis 2と離れて、それらはマイナス鎖上に位置する。ヒトでは、4つの相同的遺伝子、ENSG142056およびIfitm1(9-27)、Ifitm2(1-8D)およびIfitm3(1〜8U)が、25kbの伸長部内でクラスター形成している。この4つのヒト相同体は、2つのエクソンによってそれぞれコードされているが、Ifitm1およびIfitm3のイントロン配列の長さは知られていない。Ifitm2以外、すべてのヒト遺伝子は、マイナス鎖上にコードされている。緑色の円は、ISREコンセンサス配列を表す。
【図１０】Fragilisファミリー、およびヒト、ウシおよびラットのその相同体のタンパク質配列を示す図である。緑色のバーは、2つの予想膜貫通ドメインの位置を示し、その第一のドメインおよび内側ドメイン伸長部は、4つの哺乳動物種全体で充分保存されているようである。同一のアミノ酸はダークグレーで、類似のアミノ酸はライトグレーで強調する。アラインメントはClust1Wを使用して行った。
【図１１】ホールマウントin situハイブリッド形成による、fragilis(a〜f)、fragilis 2(g〜1)およびfragilis 3(m〜r)の発現の分析を示す図である。これらの写真は、他に述べない限りは、左前右後の側面図とみなす。fragilisは、E5.5胚中のエピブラスト全体(a)、およびE7.5の初発および初期尿膜の底部において、生殖細胞特定の領域中で発現される(b、b'背面図、c)。E8.5では、尿のうの底部および隣接第三位、ならびに脳の側前方面中において、シグナルが検出される(d、上面図、e、前面図)。E9.5では、fragilisは、陥入後腸初期の細胞集団中(f中の矢印)、および咽頭部のアーチ(f)中で、発現されるようである。fragilis 2は、E5.5のエピブラスト中で検出される(g)。発現は後に下方制御されるようであるが、後中胚葉中、およびE7.0およびE7.5胚の初発および成長尿膜の底部において、再度検出可能になる(h、i、i'、背面図)。E8.5では、発現は尾部中胚葉で見られ(j、k、背面図)、一方E9.5では、発現は終末芽、尾部中胚葉から12番目の体節、および肺始原細胞で見られる(矢印、l)。fragilis 3は、E6.5のエピブラスト全体中(m)、およびE7.5周辺、追加的にPGC特定の領域中で発現される(n、n'、背面図、o)。E8.5では、fragilis 2発現は、発達中の心臓を除いた胚全体中で見られ、単一細胞中(背面図q中の矢印)、尿のうの底部および隣接領域内で強烈であるようである(p、背面図、q、r)。星印:尿のう;黒色の矢じり:尿膜;白色の矢じり:発達中の心臓;バーのスケール:100μm(a、b、g〜i、m、n);200μm(c〜e、o〜q);400μM(f、j〜1、r)。
【図１２】切片上でのin situハイブリッド形成による、fragilis 2の発現の分析を示す図である。(a〜d)累進的に低下するレベルでのE9.5の胚(約25の体節)の尾部領域の横断面図。大部分の尾部レベルでは、fragilis 2の発現は、神経管の細胞中、前原体節中胚葉中、後腸中の単一細胞(矢じり)中、および体壁で見られる。(b)第23付近の体節レベルにおける染色が、形成される体節、体壁中胚葉、および後腸中の細胞、ならびに底板中に存在する。(c)第21付近の体節レベルにおいて、分化中の体節における発現は低下し、一方、底板中および後腸中の細胞はfragilis 2mRNA陽性の状態である。(d)第13付近の体節レベルにおいて、fragilis 2の発現は、壁側中胚葉、および神経管には存在しない。(e)E10.5胚中の矢印断面は、分化中の肺組織(星印;f中に高倍率)、および後腸前部から背側大動脈に沿って移動する細胞(矢印)で、fragilis 2の発現を示す。(g)は、fragilis 2mRNAを発現し、移動する細胞の拡大図を示す。da:背側大動脈;fp:底板;g:腸管;h:発達中の心臓;nt:神経管;s:体節;bw:体壁;バーのスケール:150μm(a〜d);1mm(e);400μm(f、g)。
【図１３Ａ】E7.5胚の生殖細胞特定の領域由来の単一細胞における、Fragilisファミリーの遺伝子の発現の分析を示す図である。(a)は、3つの新生stella陽性PGC、および3つの周囲のstella陰性体細胞由来のcDNAのPCR分析を示す。fragilis、fragilis 2およびfragilis 3はPGCおよび体細胞中で発現され、一方fragilis 4およびfragilis 5は、これらの細胞のいずれにおいても検出されないことを記す。
【図１３Ｂ】E7.5胚の生殖細胞特定の領域由来の単一細胞における、Fragilisファミリーの遺伝子の発現の分析を示す図である。(b)は、サザンブロット分析を使用する、単一細胞cDNAのfragilis、fragilis 2およびfragilis 3の発現を示す。GAPDHを、ブロッティング対照として使用した。
【図１３Ｃ】E7.5胚の生殖細胞特定の領域由来の単一細胞における、Fragilisファミリーの遺伝子の発現の分析を示す図である。(c)サザンブロットデータの半定量的発現分析によって、すべての3つのFragilis遺伝子は、領域中の体細胞と比較して、新生PGC中で主に発現されることが示される。
【図１４】in situハイブリッド形成による、生殖隆起由来の単一細胞のE11.5/E12.5における、fragilis、fragilis 2およびfragilis 3の発現分析を示す図である。(a)は、3つの性腺stella陽性生殖細胞、および3つの周囲のstella陰性体細胞由来のcDNAのPCR分析を示す。fragilisは3つの生殖細胞のクローン中でのみ検出されるが、fragilis 2およびfragilis 3は、生殖細胞および体細胞中で発現される。(b)は、E11.5/E12.5胚の尿生殖腺隆起のin situハイブリッド形成を示す。fragilis 3は、中腎および生殖隆起中で発現されるが、fragilisおよびfragilis 2は生殖隆起に限られる。fragilisの染色パターンは中断し、生殖細胞特異的stella遺伝子に関して見られるパターンを模倣する単一細胞に限られるようである。星印:生殖隆起;黒色の矢じり:中腎;バーのスケール:400μm。
【図１５】着床前の発生および進化保存中のStellaの発現を示す図である。a〜lは、抗stella(a、d、g、j)およびヨウ化プロピジウム(b、e、h、k)、染色胚(c、f、i、l合成像)の共焦点像である。母性stellaは未受精卵中に蓄えられており(a〜c)(矢印、凝縮中期染色体由来のStellaは除く)、受精後の細胞質と前核(PN)の両方に局在する(d〜f;PB、極体)。後期段階中にも(2細胞、g〜i;4細胞、j〜l)、それを細胞質と核の両方で見ることができる。バーのスケール:20μm。マウス、ラットおよびヒトのstella遺伝子のシンテニィ(m)、ならびにマウスおよびヒトのstellaおよびその隣接遺伝子の拡大図(n)。矢印は転写の方向を示す。o、Stellaタンパク質配列のアラインメント。同一のアミノ酸は黒いバックグラウンドを有し、類似のアミノ酸はグレーのバックグラウンドを有する。推定の核外移行および核内移行シグナルを、それぞれ赤線および黒線によって示す。赤い星印は、保存された疎水性アミノ酸を示し、これらは核外移行シグナル27に典型的である。p、ヒト多能性細胞および生殖器官中のSTELLA発現のRT-PCR分析。RPL32を対照として使用した。ES、胚性幹細胞;EC、胚癌細胞(nTera2);tet、精巣腫瘍;te、正常な精巣;ov、正常な卵巣;-Rt、逆転写酵素なし;0、水対照。
【図１６】サザンブロットおよびRT-PCRによる、stellaのノックアウト戦略および正しい標的化の確認を示す図である。a、標的ベクターを設計して、エクソン2を欠失させ、それをIRES-LacZ/MC-neoレポーター選択カセットと交換した。HSV-TKを、非相同的組換えに対する陰性選択用に使用した。5'、3'およびneo-プローブを使用して、ES細胞の正しい標的化を確認した。b、stella+/-交雑種から生まれた、同腹仔マウス由来のゲノムDNAのサザンブロット分析。この例は3'プローブとハイブリッド形成したNcoI消化物を示し、stella-/-マウス中の野生型対立遺伝子の不在が示される。c、エクソン2特異的プライマーを使用する、それぞれオスまたはメスマウス由来の精巣(te)または卵巣(ov)RNAのRT-PCR。野生型stellaの転写産物は、stella+/+マウスと比較してstella+/-マウス中では減少し、stella-/-マウス中には存在しない。同等の質および量のRNA用に、Gapdhを対照として使用した。-Rt、逆転写酵素なし;0、水対照。
【図１７】stellaノックアウトマウスにおける、生殖細胞の分化を示す図である。a、野生型(wt、n=9)、stella+/-(n=14)およびstella-/-(n=7)胚中のPGCの数は、E8.5(0〜8体節)で著しく異なることはない。これらの結果は、平均値±SEMとして表す。b〜g、抗stella(b、e)および抗SSEA1(c、f)抗体(d、g、DNA染色物質としてToto3(青色)を含む結合体)で染色した性腺のPGC(E11.5)。PGC-マーカーSSEA117は、野生型PGC(b〜d)中でstellaと同時発現し、stella-/-動物(e〜g)中でも検出可能であり、PGCがノックアウトマウス中に存在することが示される。バーのスケール:10μm。成体の野生型(h、k)、stella+/-(i、l)、およびstella-/-(j、m)マウスの精巣(h〜J)および卵巣(k〜m)の切片。ノックアウトされたオスは、精子の正常な分化を示し(矢じり)、ノックアウトされたメスは、異なる段階の卵母細胞を含む、ろ胞を有する正常な卵巣形態を示す(矢印)。j(h〜jに関して)、m(k〜mに関して)におけるバーのスケール=100μm。
【図１８Ａ】着床前の発生中のstellaノックアウトおよびstellaの親の発現の開始の母性効果を示す図である。a、野生型のオスとの交配によって、野生型のメスの80%の妊娠率がもたらされ、一方わずか24%のplugs stella-/-のメスが妊娠した。b、これらの妊娠率から、同腹仔の大きさは、野生型のメスと比較して、ノックアウトにおいて大幅に低下した。c〜i、stella-GFPレポーター構築体(c)を使用して、stellaの親の対立遺伝子がいつ発現され始めるかを決定した。
【図１８Ｂ】着床前の発生中のstellaノックアウトおよびstellaの親の発現の開始の母性効果を示す図である。c〜i、stella-GFPレポーター構築体(c)を使用して、stellaの親の対立遺伝子がいつ発現され始めるかを決定した。stella-GFP導入遺伝子の接合体の発現は、2細胞段階で始まり(E1.5;e、h)、後期段階(E2.5、4〜8細胞;f、i)中続く。d〜f、GFP-蛍光;g〜i、GFP-像と結び付いた明るい部分;矢じり、非トランスジェニック胚;矢印、トランスジェニック胚。d(d〜iに関して)におけるバーのスケール=100μm。
【図１８Ｃ】着床前の発生中のstellaノックアウトおよびstellaの親の発現の開始の母性効果を示す図である。j〜l、野生型のオスと、抗stella抗体(j)およびヨウ化プロピジウム(k)(l、合成)で染色したstella-/-メスの交配由来の桑実胚(E3.5)の共焦点像。Stellaタンパク質は親の対立遺伝子から作製されるが、観察された表現型を取り戻すには不充分である。l(j〜lに関して)におけるバーのスケール=20μm。
【図１９Ａ】Stellaなしの着床前の分化は乱れることを示す図である。a、様々な段階にin vivoで分化する胚の割合を、stella-/-(白いバー)および野生型またはstella+/-(黒いバー)母に関してそれぞれ与える。それぞれの時間地点で調べた胚の合計数は、括弧内に与える。ノックアウト由来の胚の分化は、E1.5前(2細胞段階)から影響を受け始め、わずかな割合のもののみが、野生型由来の胚(c)と比較して、E3.5(b)までに胚盤胞段階に達する。
【図１９Ｂ】Stellaなしの着床前の分化は乱れることを示す図である。a、様々な段階にin vivoで分化する胚の割合を、stella-/-(白いバー)および野生型またはstella+/-(黒いバー)母に関してそれぞれ与える。それぞれの時間地点で調べた胚の合計数は、括弧内に与える。ノックアウト由来の胚の分化は、E1.5前(2細胞段階)から影響を受け始め、わずかな割合のもののみが、野生型由来の胚(c)と比較して、E3.5(b)までに胚盤胞段階に達する。d〜f、E4.5(移植の時間地点)までのE1.5由来のin vitroで培養した、胚の段階の分布。in vivoと同様に、野生型の母由来の大部分の胚(黒いバー)が、胚盤胞に分化し(f)、一方、stellaノックアウト母の多くの胚(白いバー)は成長が遅れ、異常な形態を示す(e)。調べた胚の合計数は、d:-/-母:41、野生型または+/-母:36であった。バーのスケール=100μm。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１９Ａ】
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【国際調査報告】
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