(57)【要約】バクテリオファージの表面に提示された抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための標的として可溶性二量体型の受容体タンパク質チロシンキナーゼ用いるスクリーニング法によって、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（繊維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ３）など）の構成的活性化及び／又はリガンド依存性活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子を見出した。構成的活性化を遮断する本発明の分子は、受容体タンパク質チロシンキナーゼの構成的活性化に関連した、骨格形成異常、頭蓋骨癒合症、細胞増殖性の疾患若しくは障害、又は腫瘍進行を治療又は抑制するために投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する特異的結合親和性を有し、前記受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化を遮断する、単離された抗体の抗原結合部分を含む分子。
【請求項２】
前記分子が受容体型プロテインチロシンキナーゼの細胞外ドメインへ結合する請求項１記載の分子。
【請求項３】
抗体が二量体型の受容体に結合する請求項１記載の分子。
【請求項４】
受容体型プロテインチロシンキナーゼが、
EGFR/ErbB1,ErbB2/HER2/Neu,ErbB/HER3,ErbB4/HER4,IGF-1R,PDGFR-α,PDGFR-β,CSF-1R,kit/SCFR,Flk2/FH3,Flk1/VEGFR1,Flk1/VEGFR2,Flt4/VEGFR3,FGFR1,FGFR2/K-SAM,FGFR3,FGFR4,TrkA,TrkC,HGFR,RON,EphA2,EphB2,EphB4,Axl,TIE/TIE1,Tek/TIE2,Ret,ROS,Alk,Ryk,DDR,LTK及びMUSK並びにそのヘテロ二量体型化合物からなる群から選択される、
請求項１記載の分子。
【請求項５】
前記受容体型プロテインチロシンキナーゼが繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）である請求項４記載の分子。
【請求項６】
前記ＦＧＦＲがＦＧＦＲ３である請求項５記載の分子。
【請求項７】
有効成分として、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子及び、薬剤として許容可能な担体、賦形剤又は補助剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に対する特異的結合親和性を有し、前記ＦＧＦＲのリガンド依存性活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子。
【請求項９】
前記分子がＦＧＦＲの細胞外ドメインへ結合する請求項８記載の分子。
【請求項１０】
ＦＧＦＲがＦＧＦＲ３である請求項９記載の分子。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の分子及び、薬剤として許容可能な担体、賦形剤又は補助剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６及び８〜１０のいずれか一項に記載の分子及び、前記受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合した場合に前記分子の存在を検出するのに適した少なくとも１種の試薬、及び取扱い説明書を含むキット。
【請求項１３】
請求項７又は１１に記載の治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、骨及び軟骨に関連した疾患の治療方法。
【請求項１４】
骨障害が骨格形成異常又は頭蓋骨癒合症である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記頭蓋骨癒合症が、ミュンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）前頭頭蓋骨癒合症又は黒色表皮肥厚症を伴うクルゾン症候群である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
骨格形成異常が、軟骨発育不全症、致死性骨異形成症（ＴＤ）、低軟骨形成症、発育遅延のある重度の軟骨発育不全症及び黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）異形成症から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
骨格形成異常が軟骨発育不全症である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
異常ＲＰＴＫ活性に関連した悪性細胞の増殖性疾患又は障害を治療又は抑制するための請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
悪性細胞増殖性疾患又は障害が造血系悪性腫瘍である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
造血系悪性腫瘍が多発性骨髄腫である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
固形腫瘍を治療又は抑制するための請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
固形腫瘍が、乳癌、結腸癌、子宮頚癌、膀胱癌、結腸直腸癌、軟骨肉腫又は骨肉腫である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍形成、原発腫瘍、腫瘍進行又は腫瘍転移を治療又は抑制するための請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍進行が移行上皮癌の進行である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
障害が構成的に活性化された受容体型プロテインチロシンキナーゼの作用に関係しており、投与される医薬組成物が請求項７記載の医薬組成物である請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項１１記載の医薬組成物である請求項１９記載の方法。
【請求項２７】
繊維芽細胞増殖因子受容体のリガンド依存性シグナル伝達に関連した過剰増殖性疾患及び障害を治療するための請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
過剰増殖性疾患及び障害が、血管新生緑内障、黄斑変性、及び糖尿病性網膜症を含む増殖性網膜症などの視覚障害である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
過剰増殖性疾患が、血管腫、線維血管腫及び乾癬などの非腫瘍性血管形成の病態である請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項７記載の医薬組成物である請求項１８記載の方法。
【請求項３１】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項１１記載の医薬組成物である請求項１８記載の方法。
【請求項３２】
請求項７又は１１に記載の治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、細胞増殖性疾患又は障害を治療又は抑制する方法。
【請求項３３】
細胞増殖性疾患又は障害が腫瘍進行である請求項１９記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍進行が移行上皮癌の進行である請求項２０記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍進行が骨肉腫又は軟骨肉腫の進行である請求項２０記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍進行が多発性骨髄腫の進行である請求項２０記載の方法。
【請求項３７】
受容体型プロテインチロシンキナーゼがＦＧＦＲ３であり、腫瘍進行が乳癌の進行である請求項１９記載の方法。
【請求項３８】
受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子をスクリーニングする方法であって、
二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合する抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングし、
受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化を遮断する候補分子として、二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合する抗体フラグメントを同定し、及び
候補分子が細胞の受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化を遮断することができるか否かを検出する、
ことを含む上記方法。
【請求項３９】
受容体型プロテインチロシンキナーゼが繊維芽細胞増殖因子受容体である請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
繊維芽細胞増殖因子受容体がＦＧＦＲ３である請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
配列番号８及び配列番号９、配列番号１２及び配列番号１３、並びに配列番号２４及び配列番号２５からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ３及びＶL−ＣＤＲ３領域を含む請求項１記載の分子。
【請求項４２】
配列番号９２及び配列番号１０３、配列番号９４及び配列番号１０５、並びに配列番号１０２及び配列番号１１３からなる群から選択されるＶL領域及びＶH領域を含む請求項４１記載の分子。
【請求項４３】
有効成分として、請求項４１又は４２に記載の分子及び、薬剤として許容可能な担体、賦形剤又は補助剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
配列番号３０、３１、３４、３５、５０又は５１から選択される配列、あるいは高ストリンジェンシー条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４５】
配列番号７４、７５、７６、８４、８９又は９１、及び８７から選択される配列、あるいは高ストリンジェンシー条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４６】
配列番号３０及び配列番号３１、配列番号３４及び配列番号３５、配列番号５０及び配列番号５１からなる群からそれぞれ選択されるＶL−ＣＤＲ３  ＤＮＡ領域及びＶH−ＣＤＲ３  ＤＮＡ領域をコードするヌクレオチドを含む請求項４４記載の単離された核酸分子。
【請求項４７】
配列番号７４及び配列番号８４、配列番号７５及び配列番号８９、並びに配列番号７６及び配列番号９１からなる群からそれぞれ選択されるＶL領域及びＶH領域をコードするヌクレオチドを含む請求項４５記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
請求項４６又は４７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４９】
ベクターが発現ベクターである請求項４８記載のベクター。
【請求項５０】
請求項４８又は４９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５１】
配列番号１０及び配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３、配列番号２６及び配列番号２７、又は配列番号２８及び配列番号２９からなる群から選択されるＶH−ＣＤＲ３及びＶL−ＣＤＲ３のアミノ酸配列の組合せを含む請求項８記載の分子。
【請求項５２】
配列番号９２及び配列番号１０３、配列番号９３及び配列番号１０４、配列番号９４及び配列番号１０５、配列番号９５及び配列番号１０６、配列番号９６及び配列番号１０７、配列番号９７及び配列番号１０８、配列番号９８及び配列番号１０９、配列番号９９及び配列番号１１０、配列番号１００及び１１１、配列番号１０１及び１１２、配列番号１０２及び配列番号１０３からなる群からそれぞれ選択されるＶL領域及びＶH領域を含む請求項５１記載の分子。
【請求項５３】
請求項５１又は５２に記載の分子及び、薬剤として許容可能な担体、賦形剤又は補助剤とを含む医薬組成物。
【請求項５４】
配列番号３２、３３、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８及び４９、又は高ストリンジェンシー条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５５】
配列番号６２、６４、６５、６７、６９、７０、７６、７８、７９、８０、８３、８５、８６及び８７、又は高ストリンジェンシー条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５６】
配列番号３２及び配列番号３３、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３、配列番号４４及び配列番号４５、配列番号４８及び配列番号４９からなる群からそれぞれ選択されるＶL−ＣＤＲ３ＤＮＡ領域及びＶH−ＣＤＲ３ＤＮＡ領域をコードするヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項５７】
配列番号７０及び配列番号８５、配列番号６７及び配列番号７８、配列番号６４及び配列番号７９、配列番号７１及び配列番号８６、配列番号６２及び配列番号８０、配列番号６５及び配列番号８７、配列番号６９及び配列番号８３からなる群からそれぞれ選択されるＶL領域及びＶH領域をコードするヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項５８】
請求項５６又は５７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５９】
発現ベクターである請求項５８記載のベクター。
【請求項６０】
請求項５８又は５９に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６１】
請求項４３又は５３に記載の治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、骨及び軟骨に関連した障害を治療する方法。
【請求項６２】
骨障害が、骨格形成異常又は頭蓋骨癒合症である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記頭蓋骨癒合症が、ミュンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）冠頭蓋骨癒合症又は黒色表皮腫を伴ったクルゾン症候群である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
骨格形成異常が、軟骨発育不全症、致死性骨異形成症（ＴＤ）、低軟骨形成症、発育遅延のある重度の軟骨発育不全症、及び黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）異形成症から選択される請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
骨格形成異常が軟骨発育不全症である請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
異常ＲＰＴＫ活性に関連した悪性細胞増殖性疾患又は障害を治療又は抑制するための請求項６１記載の方法。
【請求項６７】
悪性細胞増殖性疾患又は障害が造血系悪性腫瘍である請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
造血系悪性腫瘍が多発性骨髄腫である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
固形腫瘍を治療又は抑制するための請求項６１記載の方法。
【請求項７０】
固形腫瘍が、乳癌、結腸癌、子宮頚癌、膀胱癌、結腸直腸癌、軟骨肉腫又は骨肉腫から選択される請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
腫瘍形成、原発腫瘍、腫瘍進行又は腫瘍転移を治療又は抑制するための請求項６１記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍進行が移行上皮癌の進行である請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
障害が、構成的に活性化された受容体型プロテインチロシンキナーゼの作用に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項４３記載の医薬組成物である請求項６１記載の方法。
【請求項７４】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項５３記載の医薬組成物である請求項６１記載の方法。
【請求項７５】
繊維芽細胞増殖因子受容体のリガンド依存性シグナル伝達に関連した過剰増殖性疾患及び障害を治療するための請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
過剰増殖性疾患及び障害が、血管新生緑内障、黄斑変性及び糖尿病性網膜症を含む増殖性網膜症などの視覚障害である請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
過剰増殖性疾患が、血管腫、線維血管腫及び乾癬などの非腫瘍性血管形成の病態である請求項７５記載の方法。
【請求項７８】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項４３記載の医薬組成物である請求項７３記載の方法。
【請求項７９】
障害が、受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化に関係しており、投与される医薬組成物が、請求項５３記載の医薬組成物である請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
請求項４３又は５３に記載の治療上有効な量の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、細胞増殖性疾患又は障害を治療する方法。
【請求項８１】
細胞増殖性疾患又は障害が腫瘍進行である請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
腫瘍進行が移行上皮癌の進行である請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
腫瘍進行が骨肉腫又は軟骨肉腫の進行である請求項８１記載の方法。
【請求項８４】
腫瘍進行が多発性骨髄腫の進行である請求項８１記載の方法。
【請求項８５】
受容体型プロテインチロシンキナーゼがＦＧＦＲ３であり、腫瘍進行が乳癌の進行である請求項８１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体型タンパク質チロシンキナーゼの活性化を遮断するのに有用な免疫グロブリン（及びその機能性フラグメント）、かかる免疫グロブリンをスクリーニングする方法、前記免疫グロブリンを含む組成物、並びに、骨格形成異常、頭蓋骨癒合症、細胞増殖性疾患若しくは障害、又は腫瘍進行などの疾病を治療又は抑制するために前記組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物学的プロセスは、複雑な細胞性伝達機構を含んでいる。細胞とそれらの内部環境及び外部環境の間の情報を連続的に交換する主な手段の１つは、ペプチド増殖因子の分泌と特異的結合による。増殖因子は多面的作用を及ぼし、腫瘍形成と、細胞成長、分化及び遊走を調節する多細胞生物の発育に重要な役割を果たす。増殖因子の多くは、特異的細胞表面受容体に結合することにより多面的作用をもたらす。そのリガンド活性化受容体によって、細胞膜から細胞核へ酵素的シグナル伝達カスケードが開始され、その結果、特異的遺伝子調節と種々の細胞反応が生じる。
【０００３】
プロテインキナーゼ
シグナル伝達の重要な生化学的機構のうちの１つに、タンパク質の可逆的リン酸化が挙げられる。可逆的リン酸化は、タンパク質の構造と機能を改変することにより成熟タンパク質の活性の調節を可能にする。
【０００４】
プロテインキナーゼ（「ＰＫ」）は、タンパク質のチロシン、セリン及びスレオニン残基上の水酸基のリン酸化を触媒する酵素である。この一見して単純な活性の影響は驚異的であり、細胞成長、分化及び増殖、例えば、何らかの形でＰＫ活性に依存する細胞寿命の事実上すべての局面に影響する。さらに、異常ＰＫ活性は、乾癬などの比較的生命を脅かすことのない疾患から膠芽腫などの極度に悪性の疾患にわたって、多数の疾患と関係している。
【０００５】
キナーゼは、大きく２つの群、すなわち、セリン及びスレオニンのリン酸化に特異的な群と、チロシンのリン酸化に特異的な群とに分かれる。一部のキナーゼ（「二重特異性」キナーゼと称する）は、セリン／スレオニン残基ばかりでなくチロシンもリン酸化することができる。また、プロテインキナーゼは、細胞内のそれらの位置によって特徴づけることができる。一部のキナーゼは、細胞膜の外側のリガンドに結合可能な膜貫通受容体タンパク質である。リガンドとの結合により、受容体タンパク質キナーゼの触媒活性は改変する。他のキナーゼは、膜貫通ドメインを欠いている非受容体タンパク質である。さらに他のキナーゼは、膜貫通タンパク質の細胞外（エクト）部分に触媒ドメインを有するエクトキナーゼであるか、あるいは、キナーゼが可溶性細胞外タンパク質として分泌される。
【０００６】
多くのキナーゼは調節カスケードに関係しており、その場合、それらの基質には、活性がそれらのリン酸化状態によって調節される他のキナーゼが含まれていてもよい。したがって、下流のエフェクターの活性は、経路の活性化により生じたリン酸化によって調節される。
【０００７】
受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）は、内因性のリガンドによる刺激可能なチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通受容体のサブクラスである。ＲＰＴＫ活性は、厳密に調節される。ＲＰＴＫは、構造的に変化又は改変された場合、強力な腫瘍性タンパク質になり、その結果、細胞形質転換が生じ得る。基本的に、癌に関与しているすべてのＲＰＴＫにおいては、触媒ドメインの正常な抑制を確実なものにする１つ又は複数の自動制御機構の変更又は混乱により発癌の調節解除が生じる。既知のＲＰＴＫのうち半分以上は、ヒト悪性腫瘍に関連した変異型又は過剰発現型として何度も発見されてきた（孤発性のケースを含む；Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＲＰＴＫ過剰発現は、その二量体の濃度の上昇による構成的キナーゼ活性化によってもたらされる。例としては、Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２及び表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）があり、それらは、乳癌及び肺癌、並びに繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）関連の骨格系障害及び増殖性障害で増幅することが多い（Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００８】
繊維芽細胞増殖因子
組織修復及び再構築だけでなく正常な成長も、増殖因子とそれらの受容体を活性化する特異的かつ微妙な制御を必要とする。繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、発達上で調節され、種々の組織で発現される、２０種以上の構造的に関係のあるポリペプチドのファミリーを構成する。ＦＧＦは増殖、細胞遊走及び分化を刺激し、骨格及び手足の発達、創傷治癒、組織修復、造血、血管形成及び腫瘍形成に主な役割を果たす（Ｏｒｎｉｔｚ  ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，２００１に報告されている）。
【０００９】
ＦＧＦの生物学的作用は、プロテインキナーゼのＲＰＴＫファミリーに属している特定の細胞表面受容体により仲介される。これらのタンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜貫通ドメイン、及びＦＧＦ結合の際にリン酸化する細胞内のチロシンキナーゼドメインから成る。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）細胞外領域には、３種類の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ループ又はドメイン（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）、酸性ボックス、並びにヘパリン結合ドメインが含まれる。複数の受容体タンパク質変異体をコードする５種類のＦＧＦＲ遺伝子がこれまで同定されている。
【００１０】
細胞表面結合部位の別の主なクラスは、ＦＧＦファミリーすべてのメンバーの高親和性相互作用と活性化に必要な、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対する結合部位を含んでいる。ヘパラン硫酸構造変異体が組織特異的に発現すると、ＦＧＦのリガンド受容体特異性及び活性が生じる。
【００１１】
ＦＧＦＲに関連した疾患
最近、増加の一途をたどる骨格異常（軟骨発育不全症をはじめとし、最も一般的な状態はヒト小人症）は、ＦＧＦＲの突然変異に起因することが発見された。ＦＧＦＲ３の異なるドメインの特定の点突然変異は、低軟骨形成症、発育遅延を伴う重度軟骨発育不全症、黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）及び致死性骨異形成症（ＴＤ）をはじめとする、常染色体優性ヒト骨障害に関係している（Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｗｅｂｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｔａｖｏｒｍｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。また、ＦＧＦＲ３突然変異体について、２種類の頭蓋骨癒合症表現型、すなわち、ミュンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）前頭頭蓋骨癒合症（Ｂｅｌｌｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍｕｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及び黒色表皮腫を伴うクルゾン症候群（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が記載されている。クルゾン症候群はＦＧＦＲ２の特定の点突然変異に関係しており、プファイファー症候群の家族性及び孤発性の形態はＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２の突然変異に関係している（Ｇａｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＦＧＦＲの突然変異により、変異型受容体の構成的活性化と、受容体型プロテインチロシンキナーゼ活性の上昇が起こり、その結果、細胞及び組織は分化することができなくなる。特に、軟骨発育不全症突然変異は、変異型受容体の安定性を高め、受容体活性化をダウンレギュレーションから切り離すことにより、軟骨細胞成熟を抑制し、かつ骨成長を抑制する（Ｖａｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００に報告されている）。
【００１２】
様々なタイプの癌について、ＦＧＦＲ３を活性化する突然変異に関する証拠が増えてきている。多発性骨髄腫だけでなく、２種類の代表的な上皮癌（膀胱癌と子宮頚癌）の大部分における構成的活性化ＦＧＦＲ３は、細胞癌でのＦＧＦＲ３の腫瘍形成性の役割を示す最初の証拠である。ＦＧＦＲ３は、現在、膀胱癌において最も高頻度に突然変異された腫瘍誘発遺伝子であると考えられ、その場合、膀胱癌の症例の約５０％で、再発性表在膀胱癌の症例の約７０％で変異されている（Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ，１９９９；ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，ｅｔ  ａｌ，２００１；Ｂｉｌｌｅｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ，２００１）。また、構成的活性化を引き起こす点突然変異が直接腫瘍発達と進行をもたらす多発性骨髄腫症例の１５〜２０％でＦＧＦＲ３突然変異が確認されている（Ｃｈｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ，１９９７；Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ，２００１）。
【００１３】
この状況では、ＦＧＦＲ３シグナル伝達の結果は細胞型に特異的であるように思われる。軟骨細胞では、ＦＧＦＲ３過剰活性化により成長阻害が生じる（Ｏｒｎｉｔｚ，２００１で報告されている）が、ミエローマ細胞では、ＦＧＦＲ３過剰活性化により腫瘍進行が生じる（Ｃｈｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１４】
ＲＰＴＫに関連している細胞活性と多数のヒト疾患との間の関連性を鑑みて、治療上、受容体及び／又はその変異体を標的とするために様々な方法が用いられている。一部の方法には、例えば、突然変異体リガンド（米国特許第４，９６６，８４９号）、可溶性受容体及び抗体（ＷＯ９４／１０２０２号、米国特許第６，３４２，２１９号）、ＲＮＡリガンド（米国特許第５，４５９，０１５号）及びチロシンキナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／１４８０８号、米国特許第５，３３０，９９２号）などの、細胞のプロセスに関与するものを模倣して作られた巨大分子を用いた生物模倣手法が含まれている。
【００１５】
抗体療法
増殖因子及びそれらの対応する細胞表面受容体に関連している癌及び他の疾患を治療する新しい療法が探索され、受容体機能の抑制が可能なヒト化抗体が開発された。例えば、米国特許第５，９４２，６０２号及び第６，３６５，１５７号には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＶＥＧＦ受容体に特異的な単クローン抗体がそれぞれ記載されている。米国特許第５，８４０，３０１号には、ＶＥＧＦの細胞外ドメインへ結合し、かつリガンド依存性活性化を無効化する、キメラのヒト化単クローン抗体が記載されている。
【００１６】
異常の構成的受容体型プロテインチロシンキナーゼ活性（特に、ＦＧＦＲ活性）を遮断し、それによって、前述の突然変異に関連している臨床症状に対応し、様々な生物学的機能を調節することが可能な高選択的分子についてのニーズは未だ満たされていない。
【００１７】
本明細書中のすべての文献の引用は、かかる文献が関連の先行技術であるということの承認を意味するものではなく、かつ、本出願のすべての請求項の特許性についての資料と考えるものではない。すべての文献の内容又は日付に関するすべての記述は、出願時に出願人が利用可能な情報に基づいており、かかる記述の正確性について承認するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）活性を遮断することができる分子を提供することである。
【００１９】
また、本発明の目的は、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）活性、さらに好ましくは、繊維芽細胞増殖因子受容体３（ＦＧＦＲ３）活性を遮断することができる分子を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、前記受容体活性を遮断することができる分子をスクリーニングする方法を提供することである。
【００２１】
さらに本発明の別の目的は、骨格系及び増殖性の疾病及び障害を治療又は予防するのに有用である本発明の分子を有効成分として含む医薬組成物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、受容体型プロテインチロシンキナーゼ、好ましくは繊維芽細胞増殖因子受容体、さらに好ましくはＦＧＦＲ３のリガンド依存性又は構成的活性化に関連している腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供することである。
【００２３】
さらに、本発明のさらなる目的は、受容体型プロテインチロシンキナーゼ、好ましくは繊維芽細胞増殖因子受容体、さらに好ましくはＦＧＦＲ３のリガンド依存性又は構成的活性化に関連している骨障害を治療する方法を提供することである。
【００２４】
さらに、本発明のさらなる目的は、受容体型プロテインチロシンキナーゼ機能を阻害することが可能な分子を用いた治療により、必要とされる患者の細胞中の受容体型プロテインチロシンキナーゼ活性化を遮断する方法を提供することである。
【００２５】
さらに、本発明の別の目的は、腫瘍成長、腫瘍進行又は転移を抑制する方法を提供することである。
【００２６】
また、さらなる目的は、病態のｉｎ  ｖｉｖｏでの画像診断に有用な分子を提供することである。
【００２７】
また、さらなる本発明の目的は、本発明の分子を含有するキットを提供することである。
【００２８】
これらの目的及び他の目的は、本明細書に記載された本発明により達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する特異的結合親和性を有し、かつ、前記受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子を提供する。さらに、本発明は、受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する特定の親和性を有し、かつ、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ３を含む繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）のリガンド依存性活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子を提供する。
【００３０】
本発明のある分子では、ＦＧＦＲ３の構成的活性化又はリガンド非依存性活性化を阻害又は遮断することが見出された。阻害性分子の生成は、受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化に関連している骨格系及び増殖性疾患及び障害を治療又は予防する際に用いる薬剤の開発に有用である。
【００３１】
受容体型プロテインチロシンキナーゼの遺伝子内にある突然変異が生じると、リガンドの存在に依存することなく受容体が活性化される。かかるリガンド非依存性又は構成的受容体型プロテインチロシンキナーゼが活性化されると受容体活性が高まる。ある突然変異の臨床症状は、軟骨発育不全症及び種々の癌を含む、骨格系及び増殖性障害及び疾患である。
【００３２】
さらに、本発明は、受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合し、前記受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化を遮断する抗原結合ドメインを含む新規の分子を教示する。本発明の分子は、抗体又はその抗原結合フラグメントであってもよい。
【００３３】
本発明の一般に好ましい実施形態は、受容体型プロテインチロシンキナーゼの細胞外ドメインへ結合し、受容体の構成的活性化及びリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００３４】
本発明の一般により好ましい実施形態は、ＦＧＦ受容体の細胞外ドメインへ結合し、受容体の構成的活性化及びリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００３５】
本発明の一般に最も好ましい実施形態は、配列番号２５及び配列番号２４と、それぞれに対応するポリヌクレオチド配列、配列番号５１及び配列番号５０を有するＶL−ＣＤＲ３及びＶH−ＣＤＲ３領域を含む、ＦＧＦＲ３に結合し、受容体の構成的活性化及びリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００３６】
また、本発明の一般に最も好ましい実施形態は、配列番号１３及び配列番号１２、又は配列番号９及び配列番号８と、それぞれに対応するポリヌクレオチド配列、配列番号３５及び配列番号３４、又は配列番号３１及び配列番号３０を有するＶL−ＣＤＲ３及びＶH−ＣＤＲ３領域を含む、ＦＧＦＲ３に結合し、受容体の構成的活性化及びリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００３７】
本発明の別の一般に好ましい実施形態は、配列番号９４を有する軽鎖及び配列番号１０５を有する重鎖、並びに、それぞれ配列番号７５及び配列番号８９を有する、対応するポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に明示されている分子、ＭＳＰＲＯ１２を提供する。
【００３８】
本発明の別の一般に好ましい実施形態は、配列番号９２を有する軽鎖及び配列番号１０３を有する重鎖、並びに、配列番号７４及び配列番号８６を有する、対応するポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に明示されている分子、ＭＳＰＲＯ２を提供する。
【００３９】
本発明の別の一般に好ましい実施形態は、配列番号１０２を有する軽鎖及び配列番号１１３を有する重鎖、並びに、それぞれ配列番号７６及び配列番号９１を有する、対応するポリヌクレオチド配列を含む、本明細書に明示されている分子、ＭＳＰＲＯ５９を提供する。
【００４０】
本発明の原理によれば、ＦＧＦＲを結合し、リガンド依存性受容体活性化を遮断する分子を提供する。これらの分子は、ある種の骨障害、過剰増殖性疾患又は障害、並びに血管新生緑内障、黄斑変性、血管腫、線維血管腫、乾癬、及び増殖性糖尿病性網膜症をはじめとする増殖性網膜症などの非腫瘍性血管形成性病態を含む、リガンド依存性形態で活性化されるＦＧＦＲに関連の障害及び疾患を治療するのに有用である。
【００４１】
本発明の一般に最も好ましい実施形態は、配列番号２０及び配列番号２１と、それぞれに対応するポリヌクレオチド配列、配列番号４４及び配列番号４５を有するＶL−ＣＤＲ３及びＶH−ＣＤＲ３領域を含む、ＦＧＦＲ３に結合し、かつ受容体のリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００４２】
他の本発明の一般により好ましい実施形態は、配列番号１０及び配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１、配列番号２６及び配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９と、表１Ｂに記載の対応するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、ＶL−ＣＤＲ３及びＶH−ＣＤＲ３領域を含む、ＦＧＦＲ３に結合し、かつ受容体のリガンド依存性活性化を遮断する分子を提供する。
【００４３】
本発明の一般により好ましい実施形態は、配列番号９２及び配列番号１０３、配列番号９３及び配列番号１０４、配列番号９４及び配列番号１０５、配列番号９５及び配列番号１０６、配列番号９６及び配列番号１０７、配列番号９７及び配列番号１０８、配列番号９８及び配列番号１０９、配列番号９９及び配列番号１１０、配列番号１０１及び１１２、並びに配列番号１０２及び配列番号１１３からなる群からそれぞれ選択される、ＶＬ及びＶＨ領域を含む、抗原結合ドメインを含む分子を提供する。
【００４４】
本発明の一般に好ましい実施形態は、ＦＧＦＲ１に対する特異的親和性を有し、かつ、ＦＧＦＲ１のリガンド依存性活性化を遮断する、配列番号２２及び配列番号２３と、配列番号４６及び配列番号４７を有する対応するポリヌクレオチドとを有するＶH−ＣＤＲ３ドメイン及びＶL−ＣＤＲ３ドメインとを含む分子を提供する。
【００４５】
本発明の一般に好ましい実施形態は、ＦＧＦＲ１に対する特異的親和性を有し、かつ、ＦＧＦＲ１のリガンド依存性活性化を遮断する、配列番号１００及び配列番号１１１と、配列番号７３及び配列番号８２を有する対応するポリヌクレオチドとを有するドメインを含む分子を提供する。
【００４６】
また、さらに、本発明は、抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための標的として二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼを用いることにより、本発明による分子をスクリーニングする方法に関する。
【００４７】
ある一般に好ましい実施形態によれば、スクリーニング法は、
二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合する抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするステップと、
受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化を遮断する候補分子として二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼに結合する抗体フラグメントを同定するステップと、
候補分子が細胞の受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化又はリガンド依存性活性化を遮断するかどうかを検出するステップと、
を含む。
【００４８】
別の一般に好ましい実施形態によれば、二量体型のＲＰＴＫは受容体型プロテインチロシンキナーゼの可溶性細胞外ドメインである。Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている受容体型プロテインチロシンキナーゼの例（これに限定されない）としては、
EGFR/ErbB1,ErbB2/HER2/Neu,ErbB/HER3,ErbB4/HER4,IGF-1R,PDGFR-α,PDGFR-β,CSF-1R,kit/SCFR,Flk2/FH3,Flk1/VEGFR1,Flk1/VEGFR2,Flt4/VEGFR3,FGFR1,FGFR2/K-SAM,FGFR3,FGFR4,TrkA,TrkC,HGFR,RON,EphA2,EphB2,EphB4,Axl,TIE/TIE1,Tek/TIE2,Ret,ROS,Alk,Ryk,DDR,LTK及びMUSK
が挙げられる。
【００４９】
スクリーニングで二量体型のＲＰＴＫをベイトとして用いることによって、二量体型の受容体に結合する分子を同定した。これは、構成的に活性化されたＲＰＴＫ（種々の障害及び疾患に関連しているものなど）への結合能力を有する抗体又はそのフラグメントのスクリーニングについて、新規な概念を示すものである。また、これは、ヘテロダイマーＲＰＴＫに結合する分子のスクリーニングの可能性について示すものである。本発明のさらなる態様は、骨格系疾患若しくは障害又は軟骨疾患若しくは障害、及び受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化又はリガンド依存性活性化に関連している頭蓋骨癒合症の予防又は治療に有用な本発明の分子を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【００５０】
一般に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、軟骨発育不全症、致死性骨異形成症、アペール症候群又はプファイファー症候群、及び関連した頭蓋骨癒合症をはじめとする異常ＦＧＦＲシグナル伝達に関連した骨障害の治療又は予防に用いることができる。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、受容体型プロテインチロシンキナーゼの構成的活性化又はリガンド依存性活性化に関連した、細胞増殖性疾患若しくは障害、又は腫瘍進行の防止又は治療に有用な本発明の分子を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【００５２】
一般に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、多発性骨髄腫、膀胱癌、乳癌及び子宮頚癌の移行上皮癌、慢性骨髄白血病、並びに骨肉腫又は軟骨肉腫をはじめとする異常ＦＧＦＲシグナル伝達に関連した増殖性疾患の治療又は予防に用いることができる。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、前記抗原を発現している細胞をターゲッティングするのに有用な細胞毒に結合することができる抗原結合ドメインを含む分子を提供する。
【００５４】
本発明の別の一般に好ましい態様は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍画像診断に有用な、好適かつ検出可能な画像診断成分に結合することができる抗原結合ドメインを含む分子を提供する。
【００５５】
また、本発明のさらなる態様は、本発明の分子を含む治療上有効な量の医薬組成物をそれを必要とする被験体へ投与することにより、前述の疾患及び障害を治療又は抑制する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は、二量体型のＦＧＦＲ３の細胞外部分に対する抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、繊維芽細胞増殖因子３（ＦＧＦＲ３）のリガンド依存性及びリガンド非依存性活性化を遮断する中和抗体、受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）を得ることができるとの知見に基づいている。本発明まで、本発明者らは、ＦＧＦＲ又はリガンド依存性ＦＧＦＲの活性化を含む任意のＲＰＴＫの構成的活性化を遮断する中和抗体取得に関する成功については全く知らない。
【００５７】
本明細書及び請求項で用いられている「受容体タンパク質チロシンキナーゼ」又は「ＲＰＴＫ」という用語は、内因性のリガンドによる刺激可能なチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通受容体のサブクラスを意味する。ＲＰＴＫには、様々な態様の成長と発達を制御する、空間的かつ時間的に調節されたタンパク質の大ファミリーが含まれる。ＲＰＴＫが構造的に変異又は改変された場合、調節解除を受け、リガンド非依存的方法又は構成的方法で活性化され得る。ある場合には、それらが有力な腫瘍性タンパク質になり、その結果、細胞形質転換が生じる。
【００５８】
本明細書と請求項で用いられている「繊維芽細胞増殖因子受容体」又は「ＦＧＦＲ」という用語は、一般には、細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜貫通ヘリックス、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインを含む、ＦＧＦによって及ぼされたシグナルを細胞内部へ伝達するのに必要なＦＧＦに特異的な受容体を示す。ＦＧＦＲ細胞外ドメインは、３種類の免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）、ヘパリン結合ドメイン並びに酸性ボックスからなる。ＦＧＦ受容体ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、受容体の異なる変異体が生じる。
【００５９】
受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する抗原結合ドメインを含む抗体及びそのフラグメントをはじめとする分子は、種々の病的状態を治療するのに非常に必要である。
【００６０】
過去に、本発明者らの研究所は、ＦＧＦＲ３に対する中和抗体を産生する際、困難に直面した。マウスを可溶性モノマーのＦＧＦＲ３受容体で免疫した場合、抗体価が上昇し始めるまでにはマウスは死亡していた。マウスでの抗ＦＧＦＲ３中和抗体の取得に失敗した本発明者らの研究所において行われた実験を実施例で示す。
【００６１】
抗体（例えば、Ｆａｂ、ファージディスプレイ抗体ライブラリーからの結合する抗体）をスクリーニングするために、ＦＧＦＲ３受容体の可溶性二量体型の細胞外ドメインを用いることによって、本発明者らは、まだ解決されていなかった先行技術における問題を克服し、ＦＧＦＲ３に結合し、リガンド結合に干渉し、その結果、ＦＧＦＲ３シグナル伝達のリガンド依存性活性化を遮断する多数の高親和性（ＫD＜１０ｎＭ）抗体（Ｆａｂ）を得ることができた。非常に驚いたことには、構成的二量体化のＦＧＦＲ３によって生じたシグナル伝達の遮断により、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性（構成的）活性化をも遮断するＦａｂ抗体が、リガンド依存性活性化を遮断するＦａｂの群の中から同定された。本発明者らの認識に間違いがないとすれば、得られた、ＦＧＦＲ３の構成的活性化を遮断するＦａｂ抗体は、構成的リガンド非依存性活性化シグナル伝達を遮断する、すべての受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する最初の抗体である。
【００６２】
トラスツズマブ（抗ヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）抗体）は、治療用途に承認された最初のヒト化単クローン抗体である。その作用様式は、ＨＥＲ２ダウンレギュレーション、ヘテロダイマー形成の防止、ＨＥＲ２開裂の防止等をはじめとして、多種多様であると思われる（Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ａｌｂａｎｅｌｌ，２００１）。米国特許第５，６７７，１７１号、同第５，７７２，９９７号、同第６，１６５，４６４号、及び同第６，３９９，０６３号には、抗ＨＥＲ２の発明は記載されているが、その抗体がリガンド非依存性の受容体活性化を遮断することは教示されておらず、また示唆もされていない。
【００６３】
本発明の一態様は、中和抗体を、より一般には、受容体型プロテインチロシンキナーゼ、好ましくはＦＧＦＲ、さらに好ましくはＦＧＦＲ３のリガンド依存性活性化及び構成的リガンド非依存性の活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含む分子を教示する。
【００６４】
本発明の別の態様は、ＦＧＦＲ、さらに好ましくはＦＧＦＲ３のリガンド依存性活性化を遮断する抗原結合ドメインを含む分子を教示する。
【００６５】
本発明による抗体の抗原結合部分を有する分子は、ＦＧＦＲ３のリガンド依存性活性化及び／又はリガンド非依存性（構成的）活性化を遮断する方法で用いることができる。ＨｕＣＡＬ（登録商標）（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ）クローンと呼称されている抗体ライブラリーから得られた、かかる抗体／分子の好ましい実施形態を、得られた特有のＶＨ−ＣＤＲ３配列及びＶＬ−ＣＤＲ３配列とともに表１に示す。
【００６６】
クローンの配列決定に加えて、各受容体に対する分子の親和性及び特異性を検出するために一連の生化学のアッセイを行った。
【００６７】
【表１】
2005500034.tif 000002
ＶＨは可変重鎖を表し、ＶＬは可変軽鎖を表す。Ｌはλ軽鎖を表し、ｋはκ軽鎖を表す。表１Ｂには、ＣＤＲドメインの対応するポリヌクレオチド配列を挙げている。
【００６８】
【表２】
2005500034.tif 000003
【００６９】
図３０は、本発明の好ましい実施形態のポリヌクレオチド配列を示す。以下に、本発明の一般に好ましい実施形態のＶＨドメインとＶＬドメインのアミノ酸配列を示す。
2005500034.tif 000004
2005500034.tif 000005
2005500034.tif 000006
【００７０】
クローンの配列決定に加えて、各受容体に対する分子の親和性及び特異性を検出するために、一連の生化学のアッセイを行った。表１Ｃには、Ｂｉａｃｏｒｅ及び／又はＦＡＣＳによって測定した場合のＦＧＦＲ３とＦＧＦＲ１に対する各分子の親和性を挙げている。ＦＧＦＲ３を発現する細胞の結合アッセイでは、分子のＩＣ50を算出した（実施例６）。ドメイン特異性は、実施例９の記載のようにして検出した。ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性阻害（中和活性）は、実施例１１の記載のようにして検出した。最後に、Ｆａｂ、ミニ抗体（Ｆａｂ−ｄＨＬＸ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＩｇＧ３、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）をはじめとする多数の異なるフォーマットで分子を合成した。
【００７１】
【表３】
2005500034.tif 000007
【００７２】
ある分子についてのＢｉａＣｏｒｅの結果
表１Ｄの数値は、ＦＧＦ９を用いて行ったＦＤＣＰ−ＦＧＦＲ３増殖アッセイにおける、ある結合剤（抗原結合部位を有する分子）の二量体ｄＨＬＸフォーマットのＩＣ50を示す。括弧内の数は、同一アッセイにおける単量体ＦａｂのＩＣ50である。表１Ｅは、Ｂｉａｃｏｒｅで検出したように、ミニ抗体形態のあるＭＳＰＲＯ分子のＫＤ値を示す。
【００７３】
【表４】
2005500034.tif 000008
【００７４】
【表５】
2005500034.tif 000009
【００７５】
ＦＧＦＲ３の構成的（リガンド非依存性）活性化を遮断する、本発明による分子の好ましい（しかしこれに限定されるものではない）実施形態は、配列番号８及び配列番号９、配列番号１２及び配列番号１３、並びに配列番号２４及び配列番号２５をそれぞれ有するＶＨ−ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ−ＣＤＲ３ドメインを含む、ＭＳＰＲＯ２、ＭＳＰＲＯ１２及びＭＳＰＲＯ５９を本明細書に紹介している。ＦＧＦＲ３のリガンド依存性活性化を遮断する、本発明による分子の好ましい（しかしこれに限定されなるものではない）実施形態は、配列番号１０及び配列番号１１、配列番号１４及び配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２１及び配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４をそれぞれ有するＶＨ−ＣＤＲ３ドメイン及びＶＬ−ＣＤＲ３ドメインを含む、ＭＳＰＲＯ１１、ＭＳＰＲＯ２１、ＭＳＰＲＯ２４、ＭＳＰＲＯ２６、ＭＳＰＲＯ２９及びＭＳＰＲＯ５４を本明細書に紹介している。本発明の抗体又は分子は、親和性についてのＢＩＡｃｏｒｅチップアッセイ、ＦＡＣＳスキャチャード解析又は当技術分野で知られている他の方法によって検出した場合、約５０ｎＭ未満、好ましくは約３０ｎＭ未満、さらに好ましくは１０ｎＭ未満の可溶性二量体型のＦＧＦＲ３を結合する親和性（ＫD）を有しているのが好ましい。構成的活性化を遮断する抗体／分子の具体的な発見は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーをスクリーニングするために、可溶性二量体型のＦＧＦＲ３を用いてＦＧＦＲ３について行われたが、同様に、すべての、又はほとんどすべての受容体型プロテインチロシンキナーゼについて、可溶性二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼの対応する細胞外ドメインを用いて構成的活性化を遮断する抗体／分子を得ることができると考えられる。Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている受容体型プロテインチロシンキナーゼ（これに限定されるものではない）例としては、
EGFR/ErbB1,ErbB2/HER2/Neu,ErbB/HER3,ErbB4/HER4,IGF-1R,PDGFR-α,PDGFR-β,CSF-1R,kit/SCFR,Flk2/FH3,Flk1/VEGFR1,Flk1/VEGFR2,Flt4/VEGFR3,FGFR1,FGFR2/K-SAM,FGFR3,FGFR4,TrkA,TrkC,HGFR,RON,EphA2,EphB2,EphB4,Axl,TIE/TIE1,Tek/TIE2,Ret,ROS,Alk,Ryk,DDR,LTK及びMUSK
が含まれる。
【００７６】
さらに、ヘテロダイマー受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化又はリガンド非依存性活性化を遮断する抗体／分子は、本発明の範囲内に含まれるものとする。受容体型プロテインチロシンキナーゼ等のＥＧＦＲサブファミリーメンバーについて、ヘテロダイマー化は十分に報告されている。例としては、これに限定されるものではないが、ＥＧＦＲ／ＰＤＧＦβ、Ｆｌｔ１／ＫＤＲ及びＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２ヘテロダイマーが挙げられる。ＥＧＦＲヘテロダイマーとＰＤＧＦＲヘテロダイマーは、ラット血管平滑筋細胞におけるＰＤＧＦシグナル伝達の機構として確認されており（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、Ｆｌｔ−１／ＫＤＲヘテロダイマーには、ＶＥＧＦシグナル伝達に反応した局所的接着でのビンキュリン構築が必要である（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。また、本発明は、ＦＧＦＲなどの受容体型プロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）の二量体型の細胞外部分に結合し、ＲＰＴＫのリガンド非依存性（構成的）活性化及び／又はリガンド依存性活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を有する分子を教示する。
【００７７】
抗体
抗体、すなわち免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって互いに結合した２本の重鎖と、ジスルフィド結合によってそれぞれの重鎖に「Ｙ型構造」で結合している２本の軽鎖とを含む。抗体をタンパク分解的に消化すると、Ｆｖ（フラグメント可変領域）とＦｃ（フラグメント定常領域）ドメインが得られる。抗原結合ドメイン（Ｆａｂ’）は、ポリペプチド配列が異なる領域を含んでいる。Ｆ（ａｂ’）2という用語は、ジスルフィド結合によって互いに結合した２個のＦａｂ’腕を意味する。抗体の中心軸はＦｃフラグメントと称する。各重鎖は、一端に可変末端ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて複数の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメイン（ＣＬ）を有し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインに一致しており、軽鎖定常ドメインは重鎖（ＣＨ１）の第１定常ドメインと一致している。
【００７８】
軽鎖及び重鎖の各ペアの可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上のドメインは同一の一般的構造を有しており、各ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）として知られている３種類の超可変ドメインによって結合された４つのフレームワーク領域（その配列は相対的に保存されている）を含んでいる。これらのドメインにより、抗原結合部位の特異性及び親和性が付与される。
【００７９】
重鎖のアイソタイプ（γ、α、δ、ε又はμ）により、免疫グロブリンクラス（それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ）が決定される。軽鎖は、すべての抗体クラスで発見された２種類のアイソタイプ（カッパ、κ又はラムダ、λ）のいずれかである。
【００８０】
「抗体」（１種又は複数の抗体）という用語を用いる場合、Ｆａｂフラグメント又はＦ（ａｂ’）2フラグメントなどのタンパク分解性フラグメントだけでなく、完全な抗体（多クローン抗体又は単クローン抗体（ｍＡｂｓ）など）も含むものとすると理解すべきである。さらに、本発明の範囲内には、キメラ抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体、組換え抗体及び遺伝子操作抗体、並びにそのフラグメントが含まれる。さらに、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを他の抗体をコードするＤＮＡに挿入し、キメラ抗体を産生することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。単鎖抗体は、本発明の範囲以内にある。単鎖抗体は、抗原結合能力を有し、かつ、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域に相同の又は類似のアミノ酸配列を含む、単鎖合成ポリペプチドであり得る（結合したＶＨ−ＶＬ又は単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ））。ＶＨとＶＬの両方は天然の単クローン抗体配列をコピーしてもよく、あるいは、前記両鎖のうちの１つ又は両鎖は、米国特許第５，０９１，５１３号（この全内容は、引用により本明細書に援用する）に記載されているタイプのＣＤＲ−ＦＲ構築物を含んでもよい。軽鎖及び重鎖の可変領域と類似している個々のポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって互いに結合される。かかる単鎖抗体を産生する方法（特に、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが知られている場合）は、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，０９１、５１３号及び同第５，０９６，８１５号（各特許の全内容は、引用によって本明細書に援用する）に記載されている方法に従って行うことができる。
【００８１】
さらに、親和性又は特異性を含む抗体分子のある特性を改変するには、ＣＤＲ移植を行ってもよい。ＣＤＲ移植の例（これに限定されるものではない）は、米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。
【００８２】
本明細書に用いられる「抗体の抗原結合部分を有する分子」には、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン分子及び任意の動物細胞系又は微生物によって産生された完全な免疫グロブリン分子だけでなく、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、それらの重鎖及び／又は軽鎖の可変部分、Ｆａｂミニ抗体（ＷＯ９３／１５２１０号、米国特許出願第０８／２５６，７９０号、ＷＯ９６／１３５８３号、米国特許出願第０８／８１７，７８８号、ＷＯ９６／３７６２１号、及び米国特許出願第０８／９９９，５５４号（これらの全内容は本明細書に援用する）を参照されたい）、かかる反応性画分を組込んでいるキメラ抗体又は単鎖抗体、並びに、キメラＴ細胞受容体又はかかる受容体を有するＴ細胞などの、かかる抗体反応性画分が物理的に挿入された他のタイプの分子又は細胞、あるいは、かかる反応性画分を含有する分子の一部分により治療成分を送達するように開発された分子をはじめとする（しかしこれらに限定されるものではない）、抗原結合反応性画分もまた含むものとする。かかる分子は、酵素による切断、ペプチド合成、又は組換え技術をはじめとする（しかしこれらに限定されるものではない）、任意の既知の技術によって得ることができる。
【００８３】
本明細書で用いられる「Ｆｃ」という用語は、食細胞運動を仲介し、炎症を引き起こし、特定の組織に対するＩｇを標的にする、免疫グロブリン分子の一部分（定常可能フラグメント）であることを意味し、さらに、Ｆｃ部分は補体活性化において重要である。
【００８４】
本発明の一実施形態では、受容体に対するリガンドをアッセイするのに有用である、また、抗体及びそのフラグメントをスクリーニングするのに有用である、ＲＰＴＫの細胞外ドメイン及び免疫グロブリン不変ドメインの融合物を含むキメラを構築することができる。
【００８５】
本明細書で用いられる「細胞外ドメイン」とは、通常細胞の外部に位置する、本明細書に記載されているＲＰＴＫのポリペプチド配列を意味する。細胞外ドメインには、隣接している（Ｃ末端）疎水性の膜貫通の一部分又は全部及び成熟ＲＰＴＫの細胞内配列が欠失しているポリペプチド配列が含まれる。したがって、細胞外ドメイン含有ポリペプチドは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの一部とを含み得る。あるいは、好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ＲＰＴＫの細胞外ドメインのみを含む。短縮型細胞外ドメインは、一般に可溶性である。当業者は、これらのドメインが詳述されている既知のＲＰＴＫアミノ酸配列を用いて目的のＲＰＴＫを配列比較することにより、ＲＰＴＫの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを容易に決定することができる。あるいは、疎水性膜貫通ドメインは、ポリペプチド配列の疎水性プロットに基づいて容易に表すことができる。細胞外ドメインは、Ｎ末端から膜貫通ドメインまでである。
【００８６】
「エピトープ」という用語は、抗体又はそのフラグメント（その抗体によってまた認識され得るもの）に結合され得るすべての分子の一部を意味するものである。エピトープ又は抗原決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面群からなり、特異的な電荷特性だけでなく、特定の三次元構造上の特性も有している。
【００８７】
「抗原」は、抗体に結合され得る分子又は分子の一部であり、さらに、それにより、抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生するように動物を誘導することができる。抗原は、１個又は複数個のエピトープを有していてよい。上に記載した特異的反応とは、抗原がその対応する抗体と高選択的機序により反応することを意味するものであり、他の抗原によって誘発され得る他の多数の抗体との反応を意味するものではない。
【００８８】
本明細書に用いられている「中和抗体」とは、明細書のとおり、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって検出した場合、受容体を介した活性又はシグナル伝達を低下又は阻害（遮断）することが可能な特定の受容体に対する抗原結合部位を有する分子を意味する。
【００８９】
単クローン抗体（ｍＡｂ）は、特定抗原に対する抗体の実質的に均質な群である。ＭＡｂは当業者に知られている方法によって得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７５）、米国特許第４，３７６，１１０号、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８７−１９９９）、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）、及びＣｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）を参照されたい。なお、それらの内容は引用により本明細書に完全に援用する。本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びその任意のサブクラスをはじめとするいずれの免疫グロブリンクラスであってもよい。ｍＡｂ産生ハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。高力価のｍＡｂは、初回抗原刺激を受けた新しいＢａｌｂ／ｃマウスに個々のハイブリドーマ由来の細胞を腹腔内注射し、高濃度の所望のｍＡｂを含有する腹水を産生することによるｉｎ  ｖｉｖｏでの産生によって得ることができる。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのＭＡｂは、当業者によく知られているカラムクロマトグラフイー法を用いて、かかる腹水から、あるいは培養液上清から精製することができる。
【００９０】
キメラ抗体は分子であり、それらの異なる部分は異なる動物種に由来する（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど）。また、ヒト抗体（受容体抗体と称する）から実質的に由来す可変領域フレームワーク残基と、マウス抗体（ドナー抗体と称する）から実質的に由来する相補性決定領域とを有する抗体は、ヒト化抗体と呼ばれる。キメラ抗体は、主として、用途において免疫原性を低下させ、産生において収量を高めるために用いられる。例えば、マウスｍＡｂはハイブリドーマから高収量で得られるが、ヒトでは高免疫原性を有しているため、ヒト／マウスキメラｍＡｂが用いられる。それらの産生のためのキメラ抗体及び方法は、当技術分野で知られている（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８８；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，１９８８；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，１９８７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８５；Ｓａｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８７；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ；ヨーロッパ特許出願第１２５０２３号、同第１７１４９６号、同第１７３４９４号、同第１８４１８７号、同第１７３４９４号、ＰＣＴ特許出願、ＷＯ８６／０１５３３号、ＷＯ９７／０２６７１号、ＷＯ９０／０７８６１号、ＷＯ９２／２２６５３号、並びに、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号及び同第５，２２５，５３９号）。これにより、これらの文献は、引用により本明細書に援用する。
【００９１】
抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで産生する従来法の他に、ファージディスプレイ技術を用いて、抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。かかる組換え抗体の産生は、従来の抗体産生と比べて非常に速く、膨大な数の抗原に対して抗体を産生することができる。一方、従来法では、多くの抗原が非免疫原であるか、又は極めて有毒であることが判明し、したがって、それらを用いて動物で抗体を産生することはできない。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち、親和性と特異性の増加）は非常に簡単で、比較的速い。最後に、特定抗原に対する多数の異なる抗体は、ある選択方法で得ることができる。組換え単クローン抗体を産生するには、ファージディスプレイライブラリーに基づいたすべての種々の方法を用い、異なる抗原識別部位を有する抗体の大規模なプールを得ることができる。かかるライブラリーは、いくつかの方法によって作製することができる。すなわち、重鎖生殖細胞系列遺伝子のプール中の合成ＣＤＲ３領域をクローニングし、それによって、大規模な抗体レパートリー（種々の特異性を有する組換え抗体フラグメントをこのレパートリーから選択することができる）を産生することにより、合成レパートリーを産生することができる。抗体ライブラリーの構築には、出発物質としてヒトリンパ球プールを用いることができる。実験未使用のヒトＩｇＭ抗体レパートリーを構築し、したがって、大規模な多様性のヒトライブラリーを作製することができる。この方法は、異なる抗原に対する多数の抗体を選択するために広く首尾よく用いられてきている。バクテリオファージライブラリーを構築するためのプロトコルと組換え抗体の選択については、よく知られている参考テキスト、「免疫学最新プロトコル」（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２−２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．１に報告されている。
【００９２】
本発明の別の態様は、可溶性二量体型の受容体型プロテインチロシンキナーゼに対する結合について、バクテリオファージの表面上に提示された抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングすること（本明細書の実施例に記載されているような方法、並びにＷＯ９７／０８３２０号、米国特許第６，３００，０６４号及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載されているような方法）によって、本発明の抗体又は分子をスクリーニングする方法を教示する。スクリーニングに用いられる可溶性二量体型のＲＰＴＫに結合する抗体フラグメントは、細胞中のＲＰＴＫのリガンド依存性活性化及び／又は構成的活性化を遮断する候補分子であると同定される。可溶性二量体型がスクリーニング法で用いられるＲＰＴＫは、繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）が好ましく、最も好ましくはＦＧＦＲ３である。
【００９３】
第１のスクリーニング法として、可溶性二量体型の受容体チロシンキナーゼは、複数の異なる方法によって構築し、調製することができる。例えば、ＲＰＴＫの細胞外ドメインはＦｃに結合し、ＲＰＴＫ−Ｆｃ融合物のＦｃ部分によって自然に二量化する融合ポリペプチドとして発現した。他の好適なＦＧＦＲ３の構築物のタイプ（他のＲＰＴＫに対する誘導として作用する）は、本明細書に示した実施例に記載されている。
【００９４】
また、抗体フラグメントのＦＧＦＲ３への結合を検出するアッセイ、結合親和性、細胞増殖の阻害等も以下の本明細書の実施例に記載されている。
【００９５】
「細胞増殖」という用語は、一群の細胞が分裂する率を意味する。通常の光学顕微鏡を用いて当業者が定められた容量中の細胞数を視覚的に数える場合、当業者は容器中で増殖している細胞数を計ることができる。あるいは、細胞増殖率は、適当な培地中で細胞の密度を光学的又は伝導的に測定する研究用装置により計ることができる。
【００９６】
候補分子としての抗体フラグメントの第２のスクリーニングは、ＲＰＴＫの非常に過剰発現を有する細胞（例えば、ＲＣＪ−Ｍ１５細胞過剰発現突然変異体（軟骨発育不全症）ＦＧＦＲ３など）を用いて行うことができる。受容体を極端に過剰発現する細胞では、構成的活性化突然変異などの突然変異の存在がなくともリガンド非依存性の活性化が生じることがある。ＲＰＴＫの過剰発現は、リガンドが存在しない状態であっても、ＲＰＴＫに二量化させ、かつシグナル伝達させると考えられる。これらの細胞は、細胞表面に存在する二量体の受容体だけでなく、単量体の受容体も有している。この種の細胞を用いて、当業者は、すべての異なる種類（すなわち、リガンド依存性活性化の遮断、構成的活性化の遮断、活性化の遮断、及び単量体の形態だけへの結合、等）の抗体を同定することができる。
【００９７】
第３のスクリーニングは、突然変異を保有するＲＰＴＫを発現する細胞系（ＦＧＦＲ３軟骨発育不全症突然変異を発現するＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ系など）で実施することができる。この系の受容体は構成的に活性になり、例えば、ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）リン酸化、すなわち、下流エフェクターによって検出した場合、リガンドが存在しない状態でシグナル伝達することができる。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、本発明の分子をそれを必要とする被験体に投与することを含む、ＲＰＴＫの構成的活性化に関連している骨格形成異常又は頭蓋骨癒合症を治療又は抑制する方法に関する。骨格形成異常の例（これに限定されるものではない）としては、軟骨発育不全症、致死性骨異形成症（ＴＤＩ若しくはＴＤＩＩ）、低軟骨形成症及び発育遅延を伴う重度の軟骨発育不全症並びに黒色表皮腫（ＳＡＤＤＡＮ）異形成症が挙げられる。頭蓋骨癒合症の例（これに限定されるものではない）としては、ミュンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）前頭頭蓋骨癒合症及び黒色表皮腫を伴うクルゾン症候群がある。これらの疾患及び障害の徴候と病因については、Ｖａｊｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｊｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００）に報告されている。
【００９９】
また、本発明は、異常な構成的活性化ＲＰＴＫの作用に関連している細胞増殖性疾患又は障害（例えば、腫瘍形成、原発腫瘍、腫瘍進行又は腫瘍転移）を治療又は抑制する方法を提供する。ＲＰＴＫの構成的活性化を遮断する抗体の抗原結合部分を含有する分子は、かかる細胞増殖性疾患又は障害を治療又は抑制するために、それを必要とする被験体に投与される。
【０１００】
「増殖性疾患又は障害を治療又は抑制すること」あるいは「腫瘍を治療又は抑制すること」という用語は、腫瘍形成、原発腫瘍、腫瘍進行又は腫瘍転移を包含するために本明細書及び請求項で用いられる。
【０１０１】
腫瘍形成又は腫瘍成長には、固形腫瘍及び非固形腫瘍が含まれるものとする。固形腫瘍としては、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、乳頭様甲状腺癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸直腸癌、黒色腫癌、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌、肉芽腫形成細胞癌腫、移行上皮癌、血管腫瘍、すべてのタイプの肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、膠芽腫）が挙げられる。
【０１０２】
非固形腫瘍としては、例えば、すべてのタイプの白血病、例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肥胖細胞性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、並びに多発性骨髄腫（ＭＭ）などの造血性悪性腫瘍が挙げられる。
【０１０３】
腫瘍進行は、時間とともに癌が悪性化する現象である。腫瘍進行は、連続的成長の間に起こり得るか、あるいは、腫瘍が治療後に再発する場合に起こり得る。また、腫瘍進行には、移行上皮癌、骨肉腫又は軟骨肉腫、多発性骨髄腫及び乳癌（乳癌に関係している既知のＲＰＴＫの１つはＥｒｂＢ３である）の進行が含まれる。
【０１０４】
最近、移行上皮癌と多発性骨髄腫に関連の腫瘍進行におけるＦＧＦＲ３の役割が解明された（Ｃａｐｐｅｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ，１９９９；Ｃｈｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ，２００１）。本発明の別の態様では、ＦＧＦＲ、さらに好ましくはＦＧＦＲ３と結合し、リガンド依存性受容体活性化を遮断する分子を提供する。これらの分子は、過剰増殖性疾患又は障害、及び非腫瘍性血管形成病態（血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖性網膜症、黄斑変性、血管腫、線維血管腫及び乾癬など）を治療するのに有用である。新血管新生及び過剰血管新生におけるＦＧＦの役割とその受容体は、十分に報告されている（Ｆｒａｎｋ，１９９７；Ｇｅｒｗｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。
【０１０５】
本発明の別の態様では、本発明による医薬組成物は、他の抗体によるヒトの受動免疫化に用いられているものに似ている。一般には、抗体の抗原結合部分を含む本発明の分子は、治療用途において滅菌食塩水中に懸濁する。あるいは、本医薬組成物は、有効成分（抗体の抗原結合部分を含む分子）の放出を制御するように、又は患者の系においてその存在を延長するように処方してもよい。好適な薬剤送達システムの多くが知られており、例えば、埋込式薬剤放出系、ヒドロゲル、ヒドロキシメチルセルロース、マイクロカプセル、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミクロスフェア等が挙げられる。放出制御型製剤は、本発明による分子を複合体形成するか、吸着するためにポリマーを用いて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、エチレン酢酸ビニル共重合体のマトリックス、並びに、ステアリン酸二量体及びセバル酸のポリ無水物共重合体のマトリックス（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）が挙げられる。かかるマトリックスからの本発明による放出分子（すなわち、抗体又は抗体フラグメント）の速度は、その分子の分子量、マトリックス内の分子量、及び分散粒子の大きさに左右される（Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、及びＳｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、及びＧｅｎｎａｒｏ，１９９０に記載されている。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、経口投与、鼻腔内投与、皮下投与、筋内投与、静脈内投与、動脈内投与、病変内局注投与、又は非経口投与などの任意の好適な手段によって投与することができる。通常、静脈内投与（ｉ．ｖ．）又は非経口投与が好ましい。
【０１０７】
本発明による分子の治療上有効な量が、とりわけ、投与スケジュール、投与される分子の単位投与量、他の治療薬と組み合わせて分子を投与するか否か、患者の免疫状態及び健康、投与される分子の治療活性、並びに治療する医師の判断に基づくことは、当業者には明らかである。本明細書では、「治療上有効な量」とは、ある期間にわたって治療されている障害に関連している１種又は複数種の症状を緩和するのに必要な分子の量を意味する。
【０１０８】
本発明の分子の適当な投与量は、投与経路、年齢、体重、性別又は患者の状態に基づいて変わり、医師によって結局決定されるべきであるが、経口投与の場合には、一般に、１日投与量がｋｇ体重につき、約０．０１〜２００ｍｇ、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ、さらに好ましくは約０．１〜１０ｍｇの間であり得る。非経口投与の場合には、１日投与量は、一般に、ｋｇ体重につき、約０．００１〜１００ｍｇの間、好ましくは約０．００１〜１ｍｇ、さらに好ましくは約０．０１〜１ｍｇであり得る。１日投与量は、例えば、毎日１〜４回の個別投与の典型的な投薬計画において投与することができる、有効な量に到達する種々の考察は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載されている。
【０１０９】
有効成分としての本発明の分子は、よく知られているように、薬剤として許容可能であり、かつ有効成分と適合性のある賦形剤中に溶解、分散、又は混合する。好適な添加剤は、例えば、水、食塩水、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合せである。他の好適な担体は、当技術分野でそれらについてよく知られている（例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、及びＧｅｎｎａｒｏ，１９９０を参照されたい）。さらに、所望であれば、組成物は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含んでいてもよい。
【０１１０】
併用療法
本発明の１種又は複数種の分子と抗悪性腫瘍薬又は抗化学療法薬（アドリアマイシン、シスプラチン若しくはタキソールなど）との併用治療により、分子を単独で使用する場合に比べて、腫瘍細胞の成長を抑制するより効率的な治療法が得られる。一実施形態では、医薬組成物は、抗体と抗化学療法薬を有する担体とを含む。
【０１１１】
また、本発明は、ＦＧＦＲ３などの受容体型プロテインチロシンキナーゼのリガンド依存性活性化及び／又は構成的活性化を遮断する、抗体の抗原結合部分を有する分子をコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子と、この核酸分子で形質転換した宿主細胞とを提供する。さらに、当業者によって十分に理解されるように、上記のコード化ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは約９５％、さらに好ましくは約９７％の配列相同性があるヌクレオチド配列を含有する核酸分子も本発明の範囲内である。
【０１１２】
また、本発明は、配列番号８から配列番号２９、及び配列番号６２、６４〜６５、６７、６９〜７１、７３〜７６、７８〜８０、８２〜８７、８９、９０〜９１、又はそれらの相補物を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸も提供する。本明細書で高ストリンジェントな条件とは、約５〜２０％、好ましくは約５〜１０％以内の配列相違を許容するものである。これに限定されるものではないが、高ストリンジェントな（ハイブリッドの算出Ｔｍ値より１０℃低い）条件の例では、ハイブリッドの算出Ｔｍ値より低い適当なＴｉで、０．１×ＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）及び０．５％ＳＤＳの洗浄液を用いる。条件の最終的なストリンジェンシーは、主として洗浄条件による（特に、用いられるハイブリダイゼーション条件が、安定性のあるハイブリッドと共に安定性の低いハイブリッドが形成されてしまう場合）。次いで、高ストリンジェンシーの洗浄条件で安定性の低いハイブリッドを除去する。上に記載した高ストリンジェンシーから中ストリンジェンシーの洗浄条件を用いることができる一般のハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（又は６×ＳＳＰＥ）、５×デンハート剤、０．５％ＳＤＳ、断片化した変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの溶液の適当なインキュベーション温度Ｔｉにおけるハイブリダイゼーションである。好適な高ストリンジェンシーな条件に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」（第二版）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を一般に参照されたい。
【０１１３】
ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験及び洗浄液で用いる温度の機能、ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄液中の１価陽イオンのモル濃度、及びハイブリダイゼーション溶液でのホルムアミドの割合である。一般に、プローブを用いたハイブリダイゼーションによる感度は、プローブの量及び比活性、標的核酸の量、標識の検出力、ハイブリダイゼーション速度、並びにハイブリダイゼーション時間に影響を受ける。ハイブリダイゼーション率は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍより２０〜２５℃下のＴｉ（インキュベーション温度）で、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてはＴｍより１０〜１５℃の下のＴｉで最大限になる。また、ハイブリダイゼーション率は、約１．５ＭのＮａ+イオン強度によって最大限になる。速度は二本鎖の長さに正比例し、ミスマッチの程度に反比例する。
【０１１４】
しかし、ハイブリダイゼーションにおける特異性は、所望のハイブリッドと「バックグラウンド」ハイブリッドの間の安定性の相違によるものである。ハイブリッドの安定性は、二本鎖長、塩基組成、イオン強度、ミスマッチ、及び不安定化剤（所望による）と関係する。
【０１１５】
完全ハイブリッドのＴｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら（１９８４）の方程式を用いて、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについては、
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ  として、
また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについては、
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇＭ）＋０．５８（％ＧＣ）−１１．８（％ＧＣ）２−０．５６（％ｆｏｒｍ）−８２０／Ｌ  として求めることができる。上記式中、Ｍは１価の陽イオンのモル濃度、０．０１〜０．４ＭのＮａＣｌであり、％ＧＣ、ＤＮＡ中のＧヌクレオチド及びＣヌクレオチドの割合、３０％〜７５％であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対中のハイブリッド長である。
【０１１６】
Ｔｍは、各１％のミスマッチについて、０．５〜１．５℃（計算を容易にするために平均１℃を用いることができる）ずつ低くする。
【０１１７】
また、Ｔｍは実験的に決定することもできる。上記の方程式中のハイブリッドの長さ（Ｌ）が長くなるとＴｍも上昇し、安定性が高まるので、完全長のラット遺伝子配列をプローブとして用いることができる。
【０１１８】
フィルターハイブリダイゼーションは、一般には、６８℃、高イオン強度（例えば、５〜６×ＳＳＣ）（これはストリンジェントな条件ではない）で行い、続いて、ストリンジェンシーを高めた１回又は複数回の洗浄を行い、最後に、所望の高ストリンジェンシー条件の洗浄を行う。最終洗浄における適当なＴｉを算出するには、Ｔｍの方程式を用いることができる。あるいは、完全二本鎖のＴｍを実験的に決定し、次いで、Ｔｉをそれに応じて調節することができる。
【０１１９】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、又は例えば、遺伝子工学で従来用いられている他のベクターであってよく、好適な宿主細胞中で、かつ好適な条件下で前記ベクターを選択することができる標識遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでいてもよい。
【０１２０】
さらに、本発明のベクターは、本発明の核酸配列の他に、好適な宿主中のコード領域を適切に発現させる発現調節エレメントを含んでいてもよい。かかる調節エレメントは当業者に知られており、それには、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ベクターへ挿入断片を導入するための翻訳及び挿入部位が含まれていてもよい。
【０１２１】
本発明の核酸分子は、真核細胞又は原核細胞での発現を可能にする前記発現調節配列に効果的に結合させるのが好ましい。
【０１２２】
真核細胞又は原核細胞での発現を確実にする調節エレメントは、当業者によく知られている。本明細書の上に記載のとおり、それらには、通常、転写開始を確実にする制御配列と、場合によっては、転写の終結と転写情報の安定化を確実にするポリＡシグナルが含まれる。
【０１２３】
本発明による核酸分子を構築する方法、前記核酸分子を含むベクターを構築する方法、適切に選択された宿主細胞へ前記ベクターを導入する方法、発現を生じさせる方法又は発現を達成する方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照されたい）。
【０１２４】
また、本発明は、本発明の分子の保存的アミノ酸変異体を提供する。また、本発明に従って、コードされたタンパク質の全体的な分子構造を保存する変異体を作製することもできる。記載されているタンパク質産物を含む個々のアミノ酸の特性が得られれば、いくつかの合理的な置換は当業者により理解される。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、含まれている残基の極性、荷電性、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて作製することができる。
【０１２５】
例えば、（ａ）無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、（ｂ）極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、（ｃ）正荷電（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、（ｄ）負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。置換は、一般に（ａ）〜（ｄ）群内で作製することができる。さらに、グリシンとプロリンのα−ヘリックスを壊す能力に基づいて、それらを相互に置換させることができる。同様に、あるアミノ酸（アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン及びリジンなど）は、α−ヘリックス中に広く見出されており、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びスレオニンは、β−プリーツシートで広く見出されている。そしてまた、グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン及びプロリンも広く見出されている。いくつかの好ましい置換は、次の群、すなわち、（ｉ）ＳとＴ、（ｉｉ）ＰとＧ、（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌと１、の中から作製することができる。既知の遺伝暗号、並びに組換えＤＮＡ技術及び合成ＤＮＡ技術が得られたならば、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１２６】
本明細書では、２本のポリペプチド配列間の「配列相同性」は、配列間で同一であるアミノ酸の割合を意味する。「配列類似性」は、同一であるアミノ酸又は保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸の割合を意味する。
【０１２７】
複合体
本発明の一実施形態は、細胞毒に結合した本発明の分子を提供する。抗体の細胞毒性成分は、細胞毒又は酵素的に活性のある毒素、あるいは細菌起源又は植物起源、あるいは酵素的に活性のあるかかる毒素の活性フラグメントであってよく、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、オオアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、クルシン、クロチン、サポニン、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、及びエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明の分子は、小分子抗癌剤に結合する。抗体とかかる細胞毒性成分の複合体は、種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。かかる試薬の例としては、ＳＰＤＰ、ＩＴ、ジメチルアジプイミデートＨＣｌなどのイミドエステルの二機能性誘導体、ジスクシンイミジルスベレートなどの活性エステル、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビスアジド化合物、ビスジアゾニウム誘導体、ジイソシアネート及びビス活性フッ素化合物が挙げられる。毒素の溶解処理部分は、抗体のＦａｂフラグメントに結合され得る。
【０１２８】
さらに、本発明の分子は、画像診断（例えば、腫瘍進行をしている細胞又は転移した細胞の画像診断）によってｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。ＲＰＴＫのｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断用の抗体標識又はマーカーとしては、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＰＥＴ又はＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影については、好適な標識にはバリウム又はセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。前記元素は検出可能な照射線を放射するが、被験体にとっては明らかに有害ではない。ＮＭＲとＥＳＲに好適なマーカーは、ジューテリウムなどの検出可能な特有のスピンを有するものが挙げられ、抗体にそれを組み入れることができる。
【０１２９】
ラジオアイソトープ（例えば、131Ｉ、111Ｉｎ、99Ｔｃ）、放射線不透性物質、又は核磁気共鳴によって検出可能な材料などの検出可能な好適画像診断成分で標識化されている特異抗体又は抗体部分は、例えば、非経口、皮下、又は腹腔内投与により、障害について試験する哺乳動物に導入される。対象の大きさ及び用いられる画像システムにより、診断の画像を得るために必要とされる画像診断成分の量が決定されることは当業者には理解されよう。放射性同位元素成分の場合には、ヒト被験体については、注入される放射能の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識抗体又は標識抗体部分は、特定のＲＰＴＫを含む細胞の位置に優先的に蓄積する。ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍画像診断は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）に記載されている。
【０１３０】
本明細書に記載されている方法と組成物は、例えば、１個又は複数個の包装容器に（ｉ）本発明の少なくとも１種の免疫グロブリンと、（ｉｉ）標的に結合した場合、前記免疫グロブリンの存在を検出するのに好適な試薬とを含む、予め包装された診断テストキットの利用によって実施することができる。好ましくは、キットは、例えば、疾患（例えば、骨格形成異常、頭蓋骨癒合症障害、細胞増殖性疾患若しくは障害、又は腫瘍進行）を示す患者を診断し、かかる障害に素因を示すそれらの個体をスクリーニングし同定するために、臨床環境又は家庭環境で用いることができる。また、本発明の組成物は、その標的に結合した場合、前記免疫グロブリンの存在を検出するのに好適な試薬と、本発明の１種又は複数種の方法を実施するための取扱い説明書とを共に用いることができる。
【０１３１】
ここに本発明を一般的に記載したが、同じ内容が以下の実施例の記載（実例を提供するが、本発明を限定することを意図するものではない）を通して容易に理解されよう。
【実施例】
【０１３２】
ＦＧＦＲ３活性を調節する重要な方法は、受容体シグナル伝達を遮断する試薬を創出することである。理論によって束縛されるものではないが、受容体の細胞外ドメインに結合する分子は、ＦＧＦ又はヘパリン結合と競合することによって、あるいは、受容体二量体化を防止することによって受容体を抑制することができる。さらに、細胞外ドメインに結合することにより、受容体インターナリゼーション及びターンオーバーが促進され得る。ヒト化抗体は、抑制作用／中和作用を有していると予想され、かつ、それらはげっ歯類抗体で頻繁に観察されているヒト抗マウス抗体反応を回避して、治療の用途に価値があると考えられるので特に興味深い。以下に、完全合成のヒト抗体ライブラリー（種々の抗原に対して非常に特異的なバインダーを発見するためのもの）及びＦＧＦＲ３細胞外ドメインを用いて、中和抗体をスクリーニングし、同定し、得る実験を記載する。
【０１３３】
実施例１：抗ＦＧＦＲ３抗体産生試験
可溶性ＦＧＦＲ３を溶解した完全フロインドアジュバント１００マイクログラムを実験未使用のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３マウス（９匹）に注射した。１週間の間隔で２０マイクログラムの２回反復投与を行った。２回目の追加免疫注射の１０日後に、血液を動物から採取し、多クローン性抗体の存在について、１：５０の稀釈液にて中和活性だけでなく受容体に対する結合もモニターすることによりその血清を試験した。有意な中和活性は試験した血清では認められなかった（一部の動物で多くとも２０％）。１〜２日後に可溶性受容体２０マイクログラムを灌流投与したが、中和抗体の若干の活性があったマウスはすべて死んだ。この実験は２度繰り返し、同一の結果であった。
【０１３４】
実施例２：ＦＧＦＲ３抗原の作製
２種類の二量体型のヒトＦＧＦＲ３細胞外ドメインを抗原として使用するために調製した。第１のドメインは、二量体化を促進するために、セリン３７１のシステイン（Ｓ３７１Ｃ）置換（致死性骨異形成症（ＴＤ）変異）を有するヒスチジン標識化ドメインであり、第２のドメインは、Ｆｃ融合物である。Ｓ３７１Ｃ変異体は、ヘパリンとＦＧＦ９をコートしたプレートに結合し、かつＦＧＦ９依存性ＦＤＣＰ−ＦＲ３増殖の抑制を示した。Ｆｃ融合は、ＦＧＦＲ機能の抑制剤として、かつＦＧＦＲ３抑制性分子を選択するための標的として、その可能性を示す結合アッセイにおいて同様に有効であった。中和ヒト組換え抗体を選択するために両可溶性受容体を用いた。
【０１３５】
ＦＧＦＲ３細胞外ドメインの２種類の変異体は以下のように調製した。
【０１３６】
１．Ｈｉｓ標識（ヒスチジン標識）に結合した二量体形成を促進するために、致死性骨異形成症（ＴＤ）変異のあるＦＧＦＲ３の細胞外部分を含有する構築物を作製した。ヒトＦＧＦＲ３遺伝子（ｐＢＳ−ｈＦＧＦＲ３）を含有するブルースクリプトプラスミドを、次のプライマー、
2005500034.tif 000010
を用いたＰＣＲのテンプレートとして用いた。配列中、Ｓｅｒ３７１Ｃｙｓ（Ｓ３７１Ｃ）置換については、太字にし、下線を付してある。
【０１３７】
ＴＤ置換を有するＦＧＦＲ３の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に以下の配列番号７として記載する。
2005500034.tif 000011
【０１３８】
ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで消化したｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔへライゲートした。得られたプラスミドのｐＢｓＦＲ３23-374ＴｄｈｉｓをＮｄｅＩとＸｈｏＩ切断し、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインをコードするそのＤＮＡ断片をｐＣＥＰ−Ｐｕ／Ａｃ７（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｏｈｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）中の同一制限部位へライゲートし、ｐＣＥＰ−ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓプラスミド構築物を得た。
【０１３９】
このＦＧＦＲ３変異体を発現させるため、２９３Ｅ細胞（ＥＢＮＡウイルスをトランスフェクトした２９３細胞）を前述のプラスミド（ｐＣＥＰ−ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ）でトランスフェクトし、クローンを同定し、増殖させた。抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した細胞上清は、可溶性受容体を高発現した。次いで、ラージスケールの調製物から得た上清をＮｉ−ＮＴＡビーズを用いたバッチ親和性精製に供し、標識化可溶性受容体を２０ｍＭから５００ｍＭ範囲のイミダゾールのステップ勾配により溶出した。各溶離液から得たサンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加し、ＧｅｌＣｏｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した。抗Ｈｉｓ抗体を用いて平行ウェスタンブロット解析を行い、分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）及びイムノブロット（図示せず）分析では、第２の（２）５０ｍＭイミダゾール画分中の精製細胞外ＦＧＦＲ３がピーク量を示した。純タンパク質約０．５ｍｇがこの一段階精製後に得られた。図１中、Ｔは全タンパク質であり、Ｄは透析したタンパク質であり、Ｕは未結合の画分である。
【０１４０】
ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ（ｈＦＲ３−ＴＤｈｉｓ）がヘパリン及びヘパリンＦＧＦ複合体に関連する能力を保持しているか否かを評価するために、ヘパリンをコートしたウェルを、ＦＧＦ９（２００ｎｇ／ウェル、斜線棒）を含む、若しくはＦＧＦ９を含まない（格子模様棒）、精製ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ（２、４又は１０μｇ、図２中、それぞれＦＲ３  ２、ＦＲ３  ４又はＦＲ３  １０として表示）、又は、未精製（ＦＲ３  ｓｕｐ）ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓとともにインキュベートした。各ウェルのｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓの結合は、抗Ｈｉｓ抗体により検出した。模擬上清（Ｍ  ｓｕｐ）、ＰＢＳ及び未精製マウスＦＲ３ＡＰ（ＦＧＦＲ３アルカリフォスファターゼ、ＦＲＡＰ  ｓｕｐとして表示）を対照とした。これにより、野生型受容体について報告されている内容と同じく、ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓはヘパリンに結合し、ＦＧＦ９の存在によってこの相互作用が増大されることが示された（図２）。最後に、ｈＦＲ３23―374ＴＤｈｉｓがＦＤＣＰ−ＦＲ３のＦＧＦ依存性増殖を投与量依存的に抑制することを示した。ＦＤＣＰ−ＦＲ３細胞がＩＬ−３の存在下で増殖した場合、ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓは増殖における抑制作用を有していなかった。総合すれば、ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓは、ＦＧＦＲ３中和抗体をスクリーニングするための標的抗原として良好な候補であることが分かった。
【０１４１】
２．Ｆｃ融合物（ＦＲ３ｅｘＦｃ及びＦＲ１ｅｘＦｃ）として、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ１の細胞外ドメインを調製した。ＦＧＦＲ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＰ０００１３３）を本明細書に配列番号１として記載する。
2005500034.tif 000012
【０１４２】
ＦＲ３ｅｘＦｃ融合物を構築するため、ｐＣＸＦｃ（配列番号５）のＫｐｎＩ部位とＢａｍＨＩ部位へ挿入するための末端ＫｐｎＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位を含むように、ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号４）をＰＣＲ増幅した。この挿入は、Ｆｃアミノ酸配列（配列番号６）を有する融合物として発現されるＦＧＦＲ３の細胞外ドメインに配置する。
2005500034.tif 000013
2005500034.tif 000014
2005500034.tif 000015
2005500034.tif 000016
2005500034.tif 000017
【０１４３】
ＦＲ３ｅｘＦｃ及びＦＲ１ｅｘＦｃの両可溶性受容体は、一時的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（Ｔ細胞抗原を感染されたヒト胚腎臓２９３細胞）で高レベルに発現されることが確認された。本発明者らの研究所には、市販のヘパリンセファロース（商標）樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてタンパク質を精製しようと多数回の洗浄をさせた後であっても、両可溶性受容体がヘパリンをコートしたウェルへの結合を維持するという所見があった。１００ｍｌ容量の上清（ＦＲ３ｅｘＦｃコードプラスミド又はＦＲ１ｅｘＦｃコードプラスミドのいずれかによるトランスフェクションの４８時間後に回収されたもの）を１ｍｌのヘパリンセファロース（商標）樹脂を用いて４℃にて一晩インキュベートした。樹脂を洗浄し、次いで、濃度を高めていくＮａＣｌを補充したＰＢＳに供した。各画分のアリコートをＧｅｌＣｏｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色した７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、９０％を越える均一性の精製プロファイルと、４００ｍＭのＮａＣｌでＦＲ３ｅｘＦｃについてピーク溶出が示された（図３中、Ｔは全タンパク質であり、Ｕは未結合画分であり、Ｗは洗浄である）。一方、ＦＲ１ｅｘＦｃは樹脂上にほとんど保持されなかった。この結果は、抗ＦＧＦＲ１ｅｘ抗体を用いた同一画分のウェスタン分析によって確認され、ほとんどのＦＲ１ｅｘＦｃが未結合画分にあることが示された（図示せず）。
【０１４４】
ＦＲ３ｅｘＦｃとＦＲ１ｅｘＦｃの機能分析によれば、ＦＲ３ｅｘＦｃとＦＲ１ｅｘＦｃは、ＦＧＦ９結合とＦＧＦＲ３の刺激に対して効率的に競合しており、したがって、ＦＧＦＲ機能の抑制剤として、かつＦＧＦＲ３抑制性分子を選択するための標的（ＦＲ３ｅｘＦｃ）として、それらの可能性が示差された。
【０１４５】
可溶性受容体の中和作用
ＦＧＦ依存性ＦＤＣＰ−Ｒ３細胞増殖を抑制するｈＦＲ３−ＴＤｈｉｓ及びＦＲ３ｅｘＦｃの能力を比較した。両可溶性受容体はＦＤＣＰ−Ｒ３細胞増殖を抑制したが、ＦＲ３ｅｘＦｃはｈＦＲ３ＴＤｈｉｓよりも約６０倍効力があった（図４中、凡例：◆は、ＦＤＣＰ−ＦＲ３細胞＋ＦＧＦ９におけるＦＤＣＰ−ＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓを示し、■はＦＤＣＰ−ＦＲ３細胞＋ＦＧＦ９におけるＦＲ３ｅｘＦｃを示し、▲はＦＤＣＰ−ＦＲ３細胞＋ＩＬにおけるＦＤＣＰ−ＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓを示し、ＸはＦＤＣＰ−ＦＲ３細胞＋ＩＬ３におけるＦＲ３ｅｘＦｃを示す）。どちらも、ＩＬ３により刺激されたＦＤＣＰ細胞において効果はなかった。この違いは、ＦＲ３ｅｘＦｃは完全に二量体型であるが、ｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓはごく一部（１／１０）が二量体型であるという事実によって、少なくともある程度説明できるかもしれない。
【０１４６】
実施例３：抗体のスクリーニング
抗体結合特徴のパニングと第１スクリーニング
ＦＧＦＲ３受容体の可溶性二量体型の細胞外ドメインを用いた、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ（登録商標））からＦａｂを同定するスクリーニング戦略は、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙで開発されており、ＷＯ９７／０８３２０号、米国特許第６，３００，０６４号、及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）（これらの全内容は引用により本明細書に援用する）に記載されているが、それを表２に示した。
【０１４７】
【表６】
2005500034.tif 000018
【０１４８】
スクリーニングは、例えばスクリーニング１では、９６ウェルプレートをｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ（ＦＲ３−ＴＤｈｉｓ）でコートし、バクテリオファージライブラリーでパニングし、陽性クローンを選択することによって実施した。次いで、内因性ＦＧＦＲ３を発現するＨＥＫ２９３（２９３、ヒト胚腎臓）細胞で陽性クローンを試験した。陽性クローンをＦＲ３−ＴＤｈｉｓについて選択し、リスクリーニングした。表２に示すように、さらに２種類の同様のスクリーニングを実施した。スクリーニング２では、第１パニングと第３パニングをＦＲ３ｅｘＦｃ抗原で実施し、第２パニングは、ＦＧＦＲ３の突然変異体（軟骨発育不全症）形態を示すＲＣＪ細胞で実施した。
【０１４９】
表３に、最初のヒット数と候補クローンの数の概要を示す。
【０１５０】
【表７】
2005500034.tif 000019
【０１５１】
配列とベクターデータ
図２８Ａ及び図２８Ｂに、ｄＨＬＸ−ＭＨベクターのプラスミド地図及び配列（配列番号５２）を示す。
【０１５２】
図２９Ａは、本発明に従って用いられるファージディスプレイベクターのプラスミド地図を示す。図２９Ｂは、対応する配列と制限消化地図（配列番号５３）である。
【０１５３】
図３０は、
2005500034.tif 000020
で表される特定のＶＬ及びＶＨドメインのポリヌクレオチド配列を示す。配列には、フレームワークドメイン１〜４とＣＤＲドメイン１〜３が含まれる。配列番号６１、６３、６６、６８及び７３は、親ＶＬ（κ又はλ）鎖のポリヌクレオチド配列を示す。配列番号７７、８１、８８及び９０は、ＶＨ親鎖のポリヌクレオチド配列を示す。
【０１５４】
実施例４：第１のスクリーニングによって同定されたＦａｂの分析
抗体認識の特異性
第１のスクリーニングによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ細胞表面でＦＧＦＲ３を特異的に認識する、１５種類の異なるＦａｂが得られた。これらのうち１４種類を産生し、詳しい分析のためにＰｒｏＣｈｏｎに送った。ＬＹ６．３（抗リソザイム抗体）を同一のライブラリーから単離し、対照として用いる。以下のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ分析を行い、ＦＧＦＲ３又はＦＧＦＲ１について単離したＦａｂの特異性を決定した。
【０１５５】
Ｆａｂ−ＦＲ３／Ｆｃ結合アッセイ
４℃で一晩、１００μｌの抗ヒトＦｃ（１０μｇ／ｍｌ）を溶解した重炭酸塩でＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートをコートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）で連続して５回、ウェルを洗浄した。３７℃で１時間、２５０μｌのＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）でウェル表面をブロックした。これに続いて、室温で１時間、ＦＧＦＲ／Ｆｃ１μｇを捕捉した。捕捉されたＦＧＦＲ／Ｆｃに結合する抗体を評価するため、室温にて１時間、試験Ｆａｂの各１μｇを１ウェル当たり１００μｌのブロッキング溶液中でインキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを５回洗浄した。０．８μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰのブロッキング溶液による希釈液１００μｌを添加して反応を開始し、続いて洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した。吸光度は４５０ｎｍで測定した。本発明者の研究所（Ｐｒｏｃｈｏｎ）とＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社で行われたＥＬＩＳＡ分析の組成物を次の表４に示す。
【０１５６】
【表８】
2005500034.tif 000021
【０１５７】
ほとんどの事例で、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで得られたデータと本発明者らの研究所で得られたデータは一致している。しかし、一部のＦａｂは異なって作用する。例えば、ＭＳ−ＰＲＯ３及び１０は、特定のＭｏｒｐｈｏｓｙｓの条件下では完全にＦＧＦＲ３に特異的であることが分かった。本発明者らの研究所では、両方ともＦＧＦＲ１とかなりの交差反応を示している。Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで行われたＦＡＣＳ分析は、ＭＳ−ＰＲＯ３についてのＰｒｏｃｈｏｎの結果を支持するが、ＭＳ−ＰＲＯ１０についての結果は支持しない。Ｆａｂの効果及び特異性を考慮すると、ＭＳ−ＰＲＯ２がこれらの予備データによる最も高いスコアを有する。
【０１５８】
実施例５：ＦＧＦＲ３に対するＦａｂの親和性
親和性測定は、業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって推奨されている標準的な手順に従って、ＢＩＡｃｏｒｅにより実施した。抗Ｆｃ抗体をチップにＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応によって結合させ、続いて、ＦＧＦＲ３を捕捉した。次いで、本発明のＦａｂをこの表面に結合させた。
【０１５９】
表５に、ＢＩＡｃｏｒｅ及びＦＡＣＳ−ｓｃａｔｃｈａｒｄによって検出した、ＦＧＦＲ３に対するＦａｂ候補の親和性の比較を示す。
【０１６０】
【表９】
2005500034.tif 000022
【０１６１】
表１Ｅは、Ｆａｂミニ抗体フォーマット（Ｆａｂ−ｄＨＬＸ−ＭＨ）へ変換された表５に示すＦａｂ候補をＢＩＡｃｏｒｅによって検出した親和性の結果を示す。Ｆａｂモノマーの二量体は、融合タンパク質として発現ベクターへ挿入した後に産生される。
【０１６２】
表６は、５００ｎＭ又は１，０００ｎＭの濃度でＭＳＰＲＯ  ＦａｂをそれぞれＦＧＦＲ３に結合し、他のＭＳＰＲＯ  Ｆａｂとペアで同時注入した、競合アッセイの結果を示す。（−）は、同一又は近傍のエピトープへの結合を示し、（＋）は、異なるエピトープへの結合を示す。その結果、ＭＳＰＲＯ２と１２は同一又は近傍のエピトープに結合していたが、ＭＳＰＲＯ１１、２１、２４、２６、２８及び２９は、ＭＳＰＲＯ２又は１２の結果と異なるエピトープに結合していることを示した。
【０１６３】
実施例６：抗体の特異的中和活性
Ａ：ＦＤＣＰ細胞増殖アッセイ
ＦＤＣＰ細胞系は不死化されたマウスの細胞系（骨髄球性骨髄起源のインターロイキン３（ＩＬ３）依存性細胞系）であり、内因性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を発現しない。ＦＧＦＲ  ｃＤＮＡでトランスフェクションすると、ＦＤＣＰ細胞系は、ＩＬ３依存性に代わり得るＦＧＦ投与依存性増殖反応を示す。したがって、ＦＧＦＲ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＦＤＣＰ細胞系は、ＦＧＦＲシグナル伝達の分析だけでなく、ＦＧＦＲの特異的抑制剤又は賦活剤をスクリーニングするために用いることができる。種々のリガンドに対するＦＤＣＰ細胞応答は、ＸＴＴ剤（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｃｏ．）を用いた細胞増殖アッセイによって定量化した。前記方法は、テトラゾリウム塩を可溶性有色フォルマザン化合物へ還元するミトコンドリア酵素の機能に基づいており、定量化可能か、又は細胞生存度の表示が可能である。特に、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ又はＦＧＦＲ１を発現するＦＤＣＰ細胞は、５μｇ／ｍｌヘパリン及び１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９を補充した「完全培地」（グルタミン２ｍｌ、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＩｓｃｏｖｅ培地）において増殖した。３日毎に細胞を分け、それを１カ月以内培地中に維持した。実験の１日前に、細胞を分けた。実験前に、完全培地で細胞を３回洗浄した（１０００ｒｐｍ、６分間）。その後、細胞を再懸濁し、トリパンブルーでカウントした。５μｇ／ｍｌヘパリンを含有する完全培地５０μｌを入れた９６ウェルプレートに、１ウェル当たり２万個の細胞を添加した。最終容量１００μｌに各種濃度でＦＧＦ９を含有する完全培地追加容量５０μｌ中に調整培地を添加した。抗体（又はＦａｂ）の最初の原液（通常、２×より高濃度）は、５μｇ／ｍｌのヘパリン及び２．５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９又はＩＬ−３（最終濃度１．２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ＋＋＋中で調製した。０．２μｍシリンジニトロセルロースフィルター中で稀釈液をろ過し、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで最初にブロックし、次いで、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ＋＋＋で洗浄した。要求された連続稀釈液のアリコートを調製した。使用まで稀釈液を氷上に置いた。各ウェルに対応する２×最終濃度５０μｌを添加し、そのプレートを４０時間又は６４時間、３７℃にてインキュベートした。インキュベーション後、以下のようにして反応を行った。活性剤溶液１００μｌをＸＴＴ剤５ｍｌに添加し、ゆるやかに混合した。各ウェルに混合物５０μｌを添加した。４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）はこの時点でゼロ時間を読み取った。次いで、３７℃で４時間（４０時間のインキュベーションの場合）又は２時間（６４時間のインキュベーションの場合）、細胞をインキュベートし、増殖を４９０ｎｍでのＯ．Ｄ．値（Ａ４９０）により測定した。
【０１６４】
飽和量のＦＧＦ（１０及び２０ｎｇ／ｍｌ）で増殖する未処理の対照のＯ．Ｄ．が、少なくとも１．３Ｏ．Ｄ．ユニットである場合、アッセイは成功していることに注意されたい。さらに、細胞を含まないウェルのバックグラウンド吸光度は０．２〜０．３５Ｏ．Ｄ．ユニットであり、１．２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９のＯ．Ｄ．吸光度は、飽和ＦＧＦ９濃度（１０及び２０ｎｇ／ｍｌ）で達したＯ．Ｄ．吸光度の４０％未満であってはならないことに注意されたい。ＦＧＦ及びＦＧＦ受容体が介在する増殖の特異阻害は、常に、同一抗体濃度によるＩＬ−３依存性細胞増殖の阻害を全く伴わないで行わねばならない。
【０１６５】
以下のＦＤＣＰ細胞系を用いた：
＊ＦＤＣＰ−Ｃ１０：ヒト野生型ＦＧＦ受容体３ＩＩＩｃでトランスフェクトしたＦＤＣＰ細胞。
＊ＦＤＣＰ−Ｒ３：ヒト野生型ＦＧＦ受容体３ＩＩＩｂでトランスフェクトしたＦＤＣＰ細胞。
＊ＦＤＣＰ−Ｒ１：ヒト野生型ＦＧＦＲ１でトランスフェクトしたＦＤＣＰ細胞。
＊ＦＤＣＰ−Ｆ３Ａｃｈ：アミノ酸グリシン３８０をアルギニンに突然変異させた（Ｇ３８０Ｒ）ヒトＦＧＦＲ３に感染させたＦＤＣＰ細胞（最も一般的なヒト軟骨発育不全症突然変異に類似）。
【０１６６】
Ｂ：中和活性
抗体の中和活性は、ＦＤＣＰ−ＦＲ３及びＦＤＣＰ−ＦＲ１細胞系で前述の細胞増殖分析によって測定した。ＦＧＦ９の存在下で増殖させたＦＤＣＰ−ＦＲ３（黒塗り三角形印▲（２）、星印＊（３）、及び丸印●（４））又はＦＤＣＰ−ＦＲ１（菱形印◆（２）、四角形印■（３）及び白塗り三角形印△（４））に、示したＦａｂ（ＭＳＰＲＯ  ２、３及び４）の増加量を添加した（図５）。２日後、ＸＴＴ増殖アッセイを行った。ＦａｂはいずれもＦＤＣＰ−ＦＲ１の細胞増殖を抑制しなかったが、ＭＳＰＲＯ２及びＭＳＰＲＯ３は、約１．０μｇ／ｍｌの類似のＩＣ５０でＦＤＣＰ−ＦＲ３増殖を抑制した（図５）。一方、ＭＳ−ＰＲＯ４は、ＦＤＣＰ−ＦＲ３増殖に対し抑制作用はなかった。これらのデータは、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで作成されたデータに一致している。ＦＤＣＰ−ＦＲ３発現細胞について、残りのＦａｂを同様に分析した。ＦＧＦ９の存在下で増殖させたＦＤＣＰ−ＦＲ３に示したＦａｂの増加量を添加した（図６）。表６に、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓとＰｒｏｃｈｏｎとで行われた増殖アッセイの結果を比較する（ＮＡは検出不可能なデータ）。
【０１６７】
【表１０】
2005500034.tif 000023
【０１６８】
表６に示すように、ＰｒｏｃｈｏｎとＭｏｒｐｈｏｓｙｓのデータが見事に一致している。Ｆａｂの約半分がかなりの中和活性を示し、ＭＳＰＲＯ１２が最も活性が高かった。結合アッセイにおいて良好な抑制を行った抑制性Ｆａｂの大部分は（表４）は、ＭＳＰＲＯ１１及びＭＳＰＲＯ１２の例外を除いて、開発をすすめるにあたって明らかに良好な候補として残る。ＦＧＦ依存性ＦＤＣＰ−ＦＲ１増殖については、Ｆａｂはいずれも（ＦＧＦＲ１と交差反応するものを含む）抑制しなかった。さらに、ＩＬ３の存在下で増殖されたＦＤＣＰ−ＦＲ３は、いずれのＦａｂによっても影響を受けなかった。
【０１６９】
Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで行われた第２のパニングから、さらに２０種類の新しいＦａｂを選択した。これらの新しいＦａｂ（ＭＳＰＲＯ５２、ＭＳＰＲＯ５４及びＭＳＰＲＯ５５）のうち、３種類をＦＤＣＰ細胞増殖試験に供し、そのすべてが受容体を中和することが分かった（図７Ａ）。興味深いことに（また、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ親和性データと一致して）、１種類のＦａｂ（ＭＳＰＲＯ５４）がＦＧＦＲ１に対して強力な中和活性を示した（図７Ｂ）。
【０１７０】
実施例７：ＲＣＪ細胞における受容体発現と活性化
ＲＣＪ細胞アッセイ
ＲＣＪ細胞（間葉細胞由来の胎児ラット頭蓋冠、ＲＣＪ  ３．１Ｃ５．１８；Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８８）を作製し、テトラサイクリンの非存在下、誘導法で種々のＦＧＦ受容体を発現させた。ＲＣＪ−Ｍ１４細胞系（ＲＣＪ−ＦＲ３ａｃｈ）は、テトラサイクリンを除去することによって、誘導時にＦＧＦＲ３−ａｃｈ３８０突然変異体を発現する。受容体機能及びシグナル伝達を刺激するためにＦＧＦを添加した後、低血清中で細胞をインキュベートした。細胞を溶解し受容体レベル、受容体活性化及びシグナル伝達をそれぞれ、抗ＦＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ホスホチロシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び抗活性ＥＲＫ（又はＪＮＫ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたウェスタンによって評価した。
【０１７１】
１５％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／ナイスタチン、１×グルタミン、６００μｇ／ｍｌネオマイシン、２μｇ／ｍｌテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢを補充したＭＥＭ中でＲＣＪ−Ｍ１４細胞をサブコンフルエンスまで増殖させた。培地を吸引除去し、１ｍｌ／１０ｃｍ皿のトリプシンを用いて細胞を洗浄し、次いで、０．５ｍｌ／１０ｃｍ皿にてトリプシン処理した。１５％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／ナイスタチン、１×グルタミン、６００μｇ／ｍｌネオマイシン及び２μｇ／ｍｌテトラサイクリンを補充した１０ｍｌのα−ＭＥＭ中に細胞を再懸濁した。
【０１７２】
１ウェル当たり６万個の細胞（６×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を６枚のウェル皿中に播種した。あるいは、その数の細胞を２回播種してもよい。２４時間後（又は２回細胞量を播種した場合には８時間後）、その細胞を１ｍｌのα−ＭＥＭで３回洗浄し、次いで、１６時間、１５％ウシ胎仔血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／ナイスタチン、及び１×グルタミンを補充したα−ＭＥＭ（誘導培地）でインキュベートした。１ｍｌのα−ＭＥＭで３回細胞を洗浄し、０．５％枯渇血清（α−ＭＥＭで誘導培地を×３０希釈して調製したもの）１ｍｌ中でさらに４時間増殖させた。
【０１７３】
５分間ＦＧＦ９（１ｎｇ／ｍｌ）を添加し、次いで、細胞を氷上に置いた。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、０．５ｍｌの溶解バッファーで溶解させた。エッペンドルフチューブに細胞を掻き集め、一度ボルテックスし、１０分間氷上に置いた。４℃にて溶解物を１０分間微量遠心し、透明溶解液を新しいエッペンドルフチューブへ移した。
【０１７４】
タンパク質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ又はＤＣタンパク質アッセイによって検出した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｃａｔ＃５００−０１１６、製品取扱説明書を参照されたい）。全タンパク質アリコート（１／５容量の５×サンプルバッファーを追加したもの）を５分間煮沸し、ゲルに添加することができるように−２０℃で保存した。並行して、免疫沈降（ＩＰ）アッセイを行い、抗ＦＧＦＲ３抗体１０μｌを溶解物の残りに添加し、４℃で４時間インキュベートした。４０μｌプロテインＡセファロースを添加し、連続的に振盪を行いながら、４℃で１時間インキュベートした。その後、その混合物を１５秒間微量遠心機にかけ、液体を吸引除去し、ビーズ上に３０μｌ以下の容量を注意深く置いておいた。ビーズを溶解バッファー１ｍｌで３回洗浄した。このステップでは、プロテアーゼ阻害剤混合物をバッファーから除いた。
【０１７５】
最終洗浄後、５×サンプルバッファー１５μｌを添加し、サンプルを５分間沸騰し、ゲルへの添加ができるように−２０℃で保存した。サンプルを７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに担持し、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＩ電気泳動セル上に流延し、上部ゲルから１００Ｖ、下部ゲルから１５０Ｖ印加して泳動させた。Ｍｉｎｉ  ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌを用いて、１００Ｖにて７５分間、又は１５Ｖで一晩、ニトロセルロースシート上にタンパク質を転写した。全溶解物ウェスタンブロットの下部部分は、抗活性ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）でプローブし、上部部分は抗ホスホチロシンでプローブし、ともに５×１０3まで希釈した。ＩＰ溶解物ウェスタンブロットは抗ホスホチロシン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でプローブした。ハイブリダイゼーションは、メーカーの取扱説明書に従ってＥＣＬによって検出した。
【０１７６】
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓで行われたＢＩＡｃｏｒｅと増殖の分析により、新しいＦａｂのうち、ＭＳ−ＰＲＯ５４がＦＧＦＲ１との高い交差反応性を示すことがわかった。さらに新しいＦａｂの交差反応性を試験するために、ＦＧＦＲ３ａｃｈ（ＲＣＪ−Ｍ１４；図９ＡのＭ１４）、ＦＧＦＲ３野生型（図９ＢのＷ１１）、ＦＧＦＲ１（図９Ｃの上のＲ１−１）、又はＦＧＦＲ２（図９ＤのＲ２−２）のいずれかを発現するＲＣＪ細胞を増加量のＭＳ−ＰＲＯ５４及びＭＳ−ＰＲＯ５９と１時間インキュベートした。５分間ＦＧＦ９を添加し、ｐＥＲＫ活性化について細胞溶解物をウェスタンによって分析した（図８Ａ〜Ｂ、９Ａ〜９Ｄ）。図８Ａは、ＭＳＰＲＯ２とＭＳＰＲＯ１２は、Ｗ１１及びＲＣＪ−ＦＲ３ａｃｈ発現細胞でＦＧＦＲ３受容体活性化を遮断することを示している。さらに、ＭＳＰＲＯ１３はＦＧＦＲ１活性化を遮断することができたが、いずれのＦａｂもＦＧＦＲ２活性化は遮断しなかった。図８Ｂ及び図９Ａ〜９Ｄは、野生型ＦＧＦＲ３（８Ｂ）を発現するＲＣＪ又は異なるＦＧＦＲタイプにおける数種類のＦａｂの結果を示すものである。ＭＳＰＲＯ２９が最良のＦＧＦＲ３遮断薬と思われ、さらに、ＦＧＦＲ１を遮断するのに有効であった（図９ｃ）。しかし、ＭＳＰＲＯ５４がＦＧＦＲ１に対する最も有効なＦａｂであった。いずれのＦａｂも有意にＦＧＦＲ２活性は阻害しなかった。第３番目のＩｇドメイン内には、ＦＲ２によってではなくＦＧＦＲ３とＦＲ１によって共有される、わずかに少数のアミノ酸残基がある。
【０１７７】
これらの部位で突然変異体を作製することにより、Ｆａｂと受容体との結合におけるそれらの役割が明確にされるはずである。図８Ｂは、ＦＧＦ９によって刺激され、抗ＥＲＫ抗体を用いてウェスタンブロットにより分析したＭＳ−ＰＲＯ１２、２９及び１３の投与量効果を示す。ＭＳＰＲＯ２９はＦＧＦＲ３活性化を強く阻害した（５μｇ）。一方、ＭＳＰＲＯ１２は阻害作用を有するが、その作用は高濃度（５０μｇ）においてであった。
【０１７８】
実施例９：選択したＦａｂのエピトープマッピング
ＦＧＦＲ３の細胞外ドメインのセグメントをコードするｃＤＮＡを含有する構築物を作製した（図１０）。Ｄ２はＩｇドメイン２を含み、Ｄ２〜３はＩｇドメイン２及び３を含み、Ｄ１〜３はＩｇドメイン１、２及び３を含む。これらは、ＦＧＦＲ３のＩｇ様ドメイン２をコードするｐＣｈＦＲ３D2Ｆｃとドメイン２及び３をコードするｐＣｈＦＲ３D2,3ＦｃをともにヒトＦｃ融合物として含んでいる。対照ｈＦＲ３ｅｘＦｃ（ドメイン１、２及び３を含有）とともに、対応するキメラタンパク質をαヒトＦｃ抗体でコートしたＥＬＩＳＡプレートに固着させた。８種類の良好なＦａｂのパネル、ＭＳＰＲＯ２、１１、１２、２１、２４、２６、２８及び２９を添加し、結合したＦａｂをＨＲＰ−αヒトＦａｂで検出した（図１１）。図１１の結果は、ＭＳＰＲＯ２（斑点の入った棒）とＭＳＰＲＯ１２（斜線の棒）は他の試験したＦａｂと異なることを示している。両方ともＩｇ様ドメイン２に結合するが、他のものは結合にドメイン３を必要とする。次いで、第２の群に属するＦａｂが、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃアイソフォームとＦＧＦＲＩＩＩｂフォームとに区別があるかどうかを試験した。１．２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９の存在下、増加投与量のＭＳＰＲＯ１２又はＭＳＰＲＯ２９とともにＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｂ細胞又はＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｃ細胞をインキュベートした。対照としてＬｙ６．３を含めた。培養２日後、細胞増殖についてＸＴＴ剤を用いて測定した。明らかに、ＭＳＰＲＯ２９（白抜き三角形）は、ＩＩＩｂアイソフォームに対して全く効果がなかった（図１２）。一方、ＭＳＰＲＯ１２（破線又は実線上の正方形）は、両アイソフォームに対して等しく効果があった。これらのデータは、２つのアイソフォーム間で異なる残基は、ＭＳＰＲＯ２９（恐らくさらに同じグループ中の他のＦａｂのための）ＦＧＦＲ３結合にとって重要であることを示している。
【０１７９】
新しいＦａｂによって認識されたＦＧＦＲ３中のドメイン
Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで生成されたデータに一致して、ＭＳＰＲＯを２つの群に分けることができる。第１の群は、ＦＧＦＲ３  Ｉｇ  ＩＩドメインを結合するＦａｂを含むもの（ＭＳＰＲＯ２及び１２）であり、第２の群は、結合にＩｇ  ＩＩＩドメインを必要とするメンバーを含むもの（ＭＳＰＲＯ１１、２１、２４、２６、２８及び２９）である。分類するために、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓで行われた最後のスクリーニングから得た新しいＦａｂと、一部の以前に得られたＦａｂとを分類するために、ＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＲ３ＩＩＩｃのいずれかを発現するＦＤＣＰ細胞の増殖反応測定法を行った。１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＩＩｂ）又は５ｎｇ／ｍｌ（ＩＩＩｃ）のＦＧＦ９の存在下、示した増加投与量のＦａｂとともに細胞をインキュベートした。培養２日後、細胞増殖についてＸＴＴ試薬を用いて測定した。Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓデータと一致して、ＭＳＰＲＯ５９は効率的にＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｂ細胞（図１３Ａ）及びＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｃ細胞（図１３Ｂ）の両方を阻害したが、ＭＳＰＲＯ２１、２４、２６、２８、２９及び５４はＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｃ増殖のみを阻害した。
【０１８０】
実施例１０：骨培養
放射標識化ＭＳＰＲＯ２９を用いて、ＭＳＰＲＯ  Ｆａｂが骨成長プレートに入ることができるかどうか検出した。
【０１８１】
Ｆａｂ活性に対するヨウ素化の影響を検出するために、まず、ＰｉｅｒｃｅのＩｏｄｏＧｅｎをコートしたチューブを用いて、５０μｇのＭＳＰＲＯ２９を冷却ヨウ素で標識付けした。その方法は、ヨウ素未使用、あるいは、０．０４ｍＭ又は１ｍＭのＮａＩを用いて行った。次いで、セファデックスＧ−５０カラムによりＭＳＰＲＯ２９を精製した。修飾ＦａｂのＦＧＦＲ３結合能力は、ＥＬＩＳＡによって検出した。ＭａｘｉＳｏｒｐのウェルを抗ヒトＦｃでコートした。次いで、ＦＧＦＲ３／Ｆｃ（格子縞の棒）をウェルに固着させた。並行して、同一セットのウェルをブロッキングバッファーのみの中に置いた（ＦＲ３／Ｆｃ無し、斜線の棒）。未修飾（Ｉ無し）又は修飾ＭＳＰＲＯ２９（０．０４ｍＭのＮａＩ（低）で標識化したものを低とし、１ｍＭのＮａＩ（高）で標識化したものを高とし、各２つのＧ−５０分画）を約５μｇ／ウェルで添加し、抗ヒトＦａｂにより結合を測定した。対照として、新鮮ＭＳＰＲＯ２９とバッファーのみを含めた（図１４）。
【０１８２】
０．０４ｍＭのＮａＩの存在下で標識化したＭＳＰＲＯ２９は、対照の未修飾Ｆａｂと比較した場合、レセプターへの等しい結合を示した。１ｍＭのＮａＩ（高Ｉ）の存在下で標識化したＭＳＰＲＯ２９もまたレセプターを結合したが、このサンプルのノイズレベルは、シグナル自身と同程度に高く、このことは、高ヨウ化物濃度では、Ｆａｂは不活性化されたことを示唆している。
【０１８３】
修飾Ｆａｂの中和活性は、ＦＤＣＰ−ＦＲ３（Ｃ１０）を用いて増殖アッセイにて試験した（図１５）。ＦＤＣＰ−ＦＲ３（Ｃ１０）細胞は、示した量の標識化又は未標識（Ｉ無し）ＭＳＰＲＯ２９で処理した。細胞の増殖率は、ＸＴＴ分析によって検出した。Ｆａｂは、０．０４ｍＭ（低）又は１ｍＭ（高）のＮａＩのいずれかで標識化した。２つのＧ−５０分画（Ｉ及びＩＩ）を分析した。対照として、新鮮ＭＳＰＲＯ２９とバッファーのみ（模倣品）を含めた。
【０１８４】
この実験により、０．０４ｍＭのＮａＩで標識化したＭＳＰＲＯ２９は、その活性をほとんど完全に維持していたが、１ｍＭのＮａＩで標識化したものはその活性が完全に失われたことがわかった。ＭＳ−ＰＲＯ２９は、１ミリキュリーの125Ｉで標識化した。Ｆａｂの比活性は１７μＣｉ／μｇであった。
【０１８５】
骨培養における125Ｉ  ＭＳＰＲＯ２９のＥｘ  ｖｉｖｏ分布
１、３又は５日間、培養液中、２μｇの125Ｉ−ＭＳＰＲＯ２９（１７μＣｉ／μｇ）又は125Ｉ−Ｌｙ６．３（２０μＣｉ／μｇ）とともに新生仔マウスから調製した大腿骨をインキュベートした。次いで、放射顕微鏡法を行うために切片を処理した。培養３日後、ＭＳＰＲＯ２９について、高い異常発達のゾーンを、かつ程度の低い第２次骨化地域を主として視覚化した（図１６Ａ〜１６Ｆ）。増殖プレートのヘマトキシリン−エオシン染色は、×１００倍率にて放射標識したＭＳ−ＰＲＯ２９又はＬｙ６．３（それぞれ図１６Ａ及び１６Ｄ）で処理した。増殖プレートの放射顕微鏡法の切片は、×１００倍率にて、放射標識したＭＳ−ＰＲＯ２９又はＬｙ６．３（図１６Ｂ及び１６Ｅ）で処理した。図１６Ｃ及び１６Ｆは、図１６Ｂ及び１６Ｅと同じであるが、×４００倍率である。図１６Ｃ中の矢印は、増殖プレートの高い異常発達ゾーンへ放射標識したＭＳ−ＰＲＯ２９が特異的結合した位置を示す。
【０１８６】
ＭＳＰＲＯ２９と比較すると、対照のＬｙ６．３  Ｆａｂは弱く、増殖プレート全体にわたって均等に分布していた。培養１日では、シグナルは弱かったが、同様の分布パターンがあった。さらに、この分布は、培養５日間では、あまり好ましくないシグナルノイズ比があった（データは示さず）。このことは、明らかに、ＭＳＰＲＯ２９がこの標的器官中のＦＧＦＲ３と結合することを証明している。
【０１８７】
実施例１１：常時活性レセプターにおける中和活性
ＦＧＦＲ３軟骨形成不全突然変異を発現するリガンド依存性及びリガンド非依存性ＦＤＣＰ増殖におけるＭＳＰＲＯ抗体の阻害活性を試験した。
【０１８８】
増殖アッセイは、１．２５ｎｇ／ｍｌ又は５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９でそれぞれインキュベートされたＦＤＣＰ−ＦＲ３ｗｔ（Ｃ１０）又はＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈの細胞を増加量のＭＳＰＲＯ５４又はＭＳＰＲＯ５９ともに用いて実施した。図１７に示すように、ＭＳＰＲＯ５４（菱形）及び５９（正方形）の両抗体は変異体受容体を中和する。ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈではほとんど、ＦＧＦＲ３ａｃｈ変異の高発現によって、リガンド非依存性細胞増殖はなかった。
【０１８９】
軟骨発育不全症ＦＧＦＲ３（ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ）を発現し、リガンドに非依存的に増殖するＦＤＣＰ細胞は、示した量のＭＳＰＲＯ１２、２９、５９又は対照Ｌｙ６．３とともにインキュベートした。２日後、細胞増殖をＸＴＴ分析により検出した。ＭＳ−ＰＲＯ１２、２９、５４及び５９による細胞増殖の阻害を試験した場合、抗体１２及び５９（Ｄ２ドメインを認識した唯一のＡｂ）のみがリガンド非依存性細胞増殖を阻害した（図１８Ａ及び１８Ｂ）。ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ細胞のＸＴＴ分析によって、第１次及び第２次スクリーニング（それぞれ、ＭＳＰＲＯ１〜１５及びＭＳＰＲＯ２１〜３１）で得られたＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの活性は、予め試験した。これらの細胞が得られた場合、リガンド依存性増殖を示す。しかし、それらの細胞は、時間の経過とともに、増殖に対するリガンド非依存性能力を獲得していった。したがって、中和Ｆａｂは、これらの細胞のリガンド依存的増殖は遮断することができるが、リガンド非依存的増殖は遮断することはできなかった。さらに、これがＦａｂの新しいバッチに当てはまるかどうか示すために、ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ細胞（構成的ＦＧＦＲ３−Ｇ３８０Ｒ（Ａｃｈ）を発現するＦＤＣＰ由来細胞系）をＭＳＰＲＯ５９及びＭＳＰＲＯ２９の存在下、ＸＴＴ分析に供した。驚いたことに、効果がないＭＳＰＲＯ２９（三角形）とは対照的に、ＭＳＰＲＯ５９（菱形）は細胞増殖を完全に遮断した（図１８Ｂ）。また、第２のＩｇ様ドメインに結合する他のＦａｂがＭＳＰＲＯ５９と同じくＦＤＣ−ＦＲ３ａｃｈ細胞増殖を阻害するか否かについて次に試験した。確かに、ＭＳＰＲＯ１２が構成的細胞増殖を強く阻害することが確認された。しかしながら、このファミリーの第３のメンバー（ＭＳＰＲＯ２）には、構成的細胞増殖又はリガンド依存性細胞増殖に効果がなく、そのＦａｂがその中和活性を喪失したことを示す（データは示さず）。
【０１９０】
実施例１２：ＲＣＳ軟骨細胞培養
ＲＣＳ軟骨細胞の成長停止におけるＦａｂの効果
ＲＣＳは、高レベルのＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ３と低レベルのＦＧＦＲ１を優先的に発現するラット軟骨肉腫誘導型細胞系である（Ｓａｈｎｉ，１９９９）。この細胞系では、ＦＧＦＲは、軟骨発育不全症表現型でその期待される役割に類似する細胞増殖の抑制剤として機能する。本発明の異なる分子の添加によって仲介されるＲＣＳ細胞増殖の分析により、ＭＳＰＲＯ５４とＭＳＰＲＯ５９が細胞増殖を回復することができたことが明らかになった。スクリーニングは、９６ウェルプレート中のＲＣＳ親細胞において行われた。細胞は、２，０００個／ウェルの濃度で播種した。翌日、細胞に１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−９及び５μｇ／ｍｌのヘパリンを添加した。抗体５０μｇ／ｍｌを添加した。細胞増殖についての陽性対照及び陰性対照は、試験した分子と同一濃度でこのアッセイに含まれている。インキュベーションの４日目に、顕微鏡でプレートを観察した。細胞がすべて生存細胞であった場合、変異体の効果を測定する量的アッセイを行わなかった。細胞死が確認された場合、Ｃｙ−Ｑｕａｎｔアッセイキットを用いて細胞の量を測定した。蛍光ＥＬＩＳＡリーダーで結果を測定した。図１９にＥＬＩＳＡの結果を棒グラフ形式で示す。未処理細胞は斑点のある棒で示し、リガンド処理細胞は灰色の棒で示し、対照抗体（ＬＹ６．３）処理細胞は、黒の棒で示し、ＭＳＰＲＯ５４処理細胞とＭＳＰＲＯ５９処理細胞はそれぞれ斜線の棒又は格子縞模様の棒で示している。
【０１９１】
実施例１３：Ｅｘ  ｖｉｖｏ骨培養
大腿部骨培養は、３６９マウス（軟骨発育不全症Ｇ３６９Ｃ変異のヘテロ接合性マウス又はホモ接合性マウス（年齢Ｐ０））の後ろ足の切除により行った。周囲組織（皮膚及び筋肉）並びに露出させた大腿骨から肢を注意深くきれいにした。大腿骨を取り出し、さらに、組織残存物及び靭帯から除いた。接眼鏡のマイクロメータールーラー付き双眼鏡を用いて、それらの初期長について大腿骨を測定した。骨は、１ｍｌの培地を入れた２４ウェル組織培養皿で増殖させた。成長培地は、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びナイスタチン（１２．５単位／ｍｌ）を補充したα−ＭＥＭであった。さらに、ＢＳＡ（０．２％）、α−グリセロ燐酸塩（１ｍＭ）及び新しく調製したアスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を培地に含有させた。骨は１５日間培養した。３日毎に骨長の測定と培地交換を行った。
【０１９２】
実験の終了時に、骨の成長率を測定した。３〜９日で得られた長さの測定に基づいて、線形回帰適合の傾斜から骨の成長率を計算した。
【０１９３】
図２０に示した結果では、関連のない対照ＬＹ６．３Ｆａｂと比較して、ＭＳ−ＰＲＯ５９で処理した骨の成長率には投与依存性増加が明らかであった。ＬＹ６．３処理の対照大腿骨（円により示す）の成長率は最も遅かった。ＭＳＰＲＯ５９処理大腿骨は、高い成長率を示し、１００μｇ／ｍｌのＭＳＰＲＯ５９濃度（正方形）で最適の成長率が達成されたが、より高濃度（４００μｇ／ｍｌ、三角形）では阻害を示した。さらに、その成長率は、対照Ａｂに比較して２倍である４００マイクログラム／ｍｌのＭＳＰＲＯ５９によって達成された（それぞれ１．８８Ｕ／日に対して３．５５Ｕ／日）。この実験により、ｅｘ  ｖｉｖｏモデルでは、構成的活性のＦＧＦＲ３に対するＭＳＰＲＯ５９抗体の中和作用が明らかである。
【０１９４】
実施例１４：Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ヌードマウスに注射した場合、ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ細胞は腫瘍を形成するが、ＦＤＣＰ（対照）細胞では形成されないことが分かっている。異なる量のトランスフェクト細胞を各々９匹のマウスに２回皮下注射した。注射の１４日後、ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ注射の部位で明らかに次第に腫瘍が大きくなり始めたが、ＦＤＣＰ注射部位ではそれはみられなかった。腫瘍の外部検査により、高い血管性被膜が確認された。ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ誘導型腫瘍を持っているヌードマウスへ125Ｉ標識化ＭＳＰＲＯ５９及びＬＹ６．３を注射（腹腔内）した。４時間後及び２４時間後に腫瘍を切り出し、放射能を測定した。ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ誘導型腫瘍中のＭＳＰＲＯ５９  Ａｂｓの濃度を図２２に示す。
【０１９５】
実施例１５：膀胱癌の動物モデル
最近の研究によって、ＦＧＦＲ３のＩＩＩｂアイソフォーム、特に、セリン２４９がシステインによって置換されている（Ｓ２４９Ｃ）アミノ酸置換があるＦＧＦＲ３が膀胱癌で発現されている唯一の型であることが示された。癌の進行は、このアミノ酸置換に起因する構成的活性化の結果であると考えられる。ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｂ型を形成するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞からＦＧＦＲ３のＩＩＩｂ領域を単離し、ｐＬＸＳＮ中の完全長ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂアイソフォームを作製した。正常なＦＧＦＲ３（ＦＲ３ｗｔ）又は変異体ＦＧＦＲ３（ＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ）のいずれかを発現するレトロウイルスを調製し、それをＦＤＣＰ細胞に感染させるために用いた。安定したプールを生成し、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用した。
【０１９６】
Ａ．ＭＳＰＲＯ５９は、マウス中の腫瘍サイズを縮小する。
２×１０6個のＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃ細胞を１２匹のヌードマウスの２箇所（各横腹上に１箇所）に皮下注射した。１週間後、マウス（計３匹のマウス）１匹当たり４００μｇのＭＳＰＲＯ５９を投与（腹腔内）し、続いて、２〜３日の間隔で、３回各２７５μｇを注射した。２４日及び２６日後、腫瘍サイズを測定した。図２３はＭＳＰＲＯ５９の腫瘍サイズに対する阻害効果を示す。
【０１９７】
Ｂ．ＭＳＰＲＯ５９によるＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃ誘導型腫瘍の処置
２×１０6個のＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃ細胞をそれぞれヌードマウス（各群３匹）の２箇所（各横腹上に１箇所）に皮下注射した。１週間後、４００μｇ又は８０μｇのＭＳＰＲＯ５９を注射（腹腔内）した。３日後、４００μｇのＭＳＰＲＯ５９を、続いて、３又は４日毎に、５回２７５μｇのＭＳＰＲＯ５９をマウスに追加注射した。最初に８０μｇのＭＳＰＲＯ５９で処理されたマウスに同様に８０μｇのＭＳＰＲＯ５９を追加投与し、続けて、同じスケジュールで５０μｇのＭＳＰＲＯ５９を５回注射した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として用いた。腫瘍は、一般に、細胞注射後３週間で出現した。腫瘍容積は、細胞注射後１６、２０、２３又は３２日に３次元で測定して算出した。
【０１９８】
図２４に示すように、処置したマウスでは、腫瘍出現の遅延と腫瘍進行上の抑制作用の両方が見られた。このことから、これらのＦＧＦＲ３抑制剤はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて効果があることが明らかである。
【０１９９】
また、これらのデータは、Ｓ２４９Ｃ誘導型腫瘍が成長するメカニズムを理解する一助となるかもしれない。本発明者らは細胞のプールを用いているので、ＭＳＰＲＯ５９による処置が感受性細胞を阻害し、それにより腫瘍出現が遅延した。しかし、時間とともに、耐性細胞は残存し、かつ増殖し、固形腫瘍を発生させた。
【０２００】
Ｃ．ＭＳＰＲＯ５９は、ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ３８０誘導型腫瘍成長を抑制する。
２×１０6個のＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ３８０細胞をそれぞれヌードマウスの横腹に皮下注射した。ＭＳＰＲＯ５９による処置は、腫瘍出現の日に開始した。マウス３匹に対し、既知のチロシンキナーゼ抑制剤（ＴＫＩ、５０ｍｇ／ｋｇ／注射）と、４００μｇのＭＳＰＲＯ５９注射、続いて、３日又は４日毎に、３００μｇのＭＳＰＲＯ５９の３回追加注射により処置した。３匹のマウスを対照としてＰＢＳのみで処置した。細胞注射後の示した日に、前に記載したようにして腫瘍サイズを算出した。下記の表７に投与スケジュールを示す。
【０２０１】
【表１１】
2005500034.tif 000024
図２５Ａにその結果を棒グラフ様式で示す。
【０２０２】
Ｄ．ＭＳＰＲＯ５９はＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃ誘導型腫瘍の成長を抑制する。
ＦＤＣＰにより誘導したプールの不安定性を克服するため、各プールＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃからクローン（クローン＃２）を単離し、特徴化した。これらのクローンをＸＴＴ増殖アッセイで試験したところ、ＭＳＰＲＯ５９によって抑制されることが明らかになった。ヌードマウスに各クローンの２×１０6個の細胞を注射した。腫瘍は、注射後１８〜３０日で出現した。
【０２０３】
横腹上にＦＤＣＰ−Ｓ２４９Ｃクローン＃２を皮下注射した。１週間後、毎日、２８０μｇのＭＳＰＲＯ５９単鎖（ＳＣ）をマウスに注射（腹腔内）した。ＰＢＳを注射したマウスを対照として用いた。腫瘍容積は、細胞注射後１８日又は２４日に３次元での測定から算出した。ＭＳＰＲＯ５９（ＳＣ）による腫瘍成長の明らかな抑制がクローン２由来の腫瘍で確認された（図２６）。図２５Ｂには、対照と比較した、ＭＳＰＲＯ５９ｓｃＦｖ及びＭＳＰＲＯ５９  Ｆａｂによってもたらされた抑制を示す。それらはともに、構成的活性化細胞に起因する腫瘍の成長を抑制する。
【０２０４】
本発明をここに完全に記載したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、かつ、過度の実験を行うことなく、広範囲の等価のパラメーター、濃度及び条件内で同じことを実施することができることは当業者には理解されよう。
【０２０５】
本発明はその特定の実施形態に関して記載しているが、それはさらに変更可能であることが理解されよう。本出願は、一般に、本発明の原理を受けて、また、本発明が関係する技術分野のすでに知られている方法又は慣用の方法の範囲内にある場合、また、上記に記載された本質的な特徴が下記の添付した請求項の範囲のとおり適用され得る場合の本明細書からの逸脱を含む本発明のすべての変更、利用、又は修正をカバーするものである。
【０２０６】
本明細書に引用したすべて文献（公表されている雑誌論文又は抄録、あるいは対応する米国又は外国特許出願、発行された米国又は外国特許、あるいは他の文献）は、引用文献中のすべてのデータ、表、図及び本文をはじめとして、引用により本明細書に完全に援用する。さらに、本明細書で引用した文献中で引用された文献の全内容もまた引用により完全に援用する。
【０２０７】
既知の方法ステップ、従来法ステップ、既知の方法若しくは従来法についての言及は、決して、本発明の任意の態様、記載又は実施形態が関連する技術の中に記載されていること、教示されていること、又は示唆されていることを承認するものではない。
【０２０８】
特定の実施形態についての上記記載は、他者が、本明細書に引用された文献の内容をはじめとする、当技術分野の技術内の知見を適用することによって、本発明の一般的な概念から外れずに、過度の実験を行うことなく、種々の用途にかかる特定の実施形態を容易に変更し、又は適応させすることができる本発明の一般的な性質を十分に明らかにする。したがって、かかる適用及び変更は、本明細書に示した教示及び指針に基づいて、記載した実施形態の等価物の意味及び範囲内にあることを意図する。本明細書の表現又は用語は、記載の目的のためであり、限定する目的のものではなく、本明細書の用語又は表現は、本明細書に示した教示及び指針に照らし合わせ、当業者各自の知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるようになっていることを理解されたい。
【０２０９】
（参考文献）
2005500034.tif 000025
【０２１０】
2005500034.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ精製を示す図である。
【図２】ヘパリン及びＦＧＦ９に結合するｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓを示す図である。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのＦＲ３ｅｘＦｃ及びＦＲ１ｅｘＦｃの精製を示す図である。
【図４】リガンド依存性増殖アッセイにおけるｈＦＲ３23-374ＴＤｈｉｓ及びＦＲ３ｅｘＦｃ可溶性受容体の中和作用を示す図である。
【図５】ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ３発現細胞の増殖に対するＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの効果を示す図である。
【図６】ＦＧＦＲ３発現細胞の増殖に対するＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの効果を示す図である。
【図７Ａ】ＦＤＣＰ−ＦＲ３（Ｃ１０）細胞を用いて増殖アッセイにおける数種類のＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの中和活性を示す図である。
【図７Ｂ】ＦＤＣＰ−ＦＲ１細胞を用いて増殖アッセイにおける数種類のＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの中和活性を示す図である。
【図８】抗Ｐ−ＥＲＫ抗体を用いたウェスタンブロットによってＲＣＪ−ＦＲ３細胞におけるＭＳＰＲＯ  Ｆａｂの受容体特異性を示す図である。図８Ａは異なるＭＳＰＲＯ  Ｆａｂを示す図であり、図８Ｂは、ＲＣＪ−ＦＲ３細胞におけるＭＳＰＲＯ  １２、２９及び１３の用量反応を示す図である。
【図９】抗Ｐ−ＥＲＫ抗体を用いたウェスタンブロットによってＭＳ−ＰＲＯ  Ｆａｂの特異性及び効果を示す図である。
【図１０】ＦＧＦＲ３の、及びＦＧＦＲ３切断型（Ｄ２〜３、Ｄ２）並びにアイソフォーム（ＩＩＩｂ、ＩＩＩｃ）の図表示を示す図である。アイソフォームＩＩＩｂは、点線で示したようなＩｇＩＩＩドメインのカルボキシ末端でＩＩＩｃとは異なる。
【図１１】ＦＧＦＲ３中和ＦａｂがＦＧＦＲ３の細胞外の領域のＩｇＩＩ又はＩｇＩＩ及びＩＩＩを認識することを示す図である。
【図１２】ＭＳＰＲＯ２９がＦＧＦＲ３のＩＩＩｃアイソフォームを特異的に認識することを示す図である。
【図１３】示した増加する投与量のＦａｂとともにインキュベーションされたＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＤＣＰ−ＦＲ３ＩＩＩｃ細胞の増殖アッセイの結果を示す図である。
【図１４】ＦＧＦＲ３に結合する、ヨウ素化ＭＳＰＲＯ２９を示す図である。
【図１５】ヨウ素化ＭＳＰＲＯ２９がＦＧＦＲ３に対してその活性を保持している、増殖アッセイの結果を示すグラフである。
【図１６】組織学的な成長プレートに対する放射性標識したＭＳ−ＰＲＯ２９の選択的結合を示す図である。
【図１７】ＦＧＦ９及び増加する投与量の示したＦａｂとともにインキュベーションしたＦＤＣＰ−ＦＲ３（Ｃ１０）及びＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ細胞の増殖アッセイを示す図である。
【図１８Ｂ】ＭＳＰＲＯ１２及びＭＳＰＲＯ５９がＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ細胞のリガンド非依存性増殖を抑制することを示す図である。
【図１８Ａ】リガンド依存性ＦＤＣＰ−ＦＲ３ｗｔ細胞の分析を示す図である。
【図１９】ＭＳ−ＰＲＯ５４及びＭＳＰＲＯ５９によるＲＣＳ細胞の細胞増殖の回復を示す図である。
【図２０】ＭＳ−ＰＲＯ５９で処置した骨の成長率を表す図である。
【図２１】受容体活性化及びシグナル伝達を評価するための実験のプロトコルのフローチャートを示す図である。
【図２２】ＦＤＣＰ−ＦＲ３ａｃｈ誘導型腫瘍への125Ｉ標識化ＭＳＰＲＯ５９局在化を示す図である。
【図２３】２４日及び２６日後のリガンド非依存性腫瘍成長の抑制におけるＭＳＰＲＯ５９の効果を示す図である。
【図２４】リガンド非依存性腫瘍成長の抑制におけるＭＳＰＲＯ５９の効果を示す図である。
【図２５Ａ】リガンド非依存性腫瘍成長の抑制におけるＭＳＰＲＯ５９の効果を示す図である。
【図２５Ｂ】ＦＤＣＰ−ＦＲ３（Ｓ３７５Ｃ）細胞の増殖を遮断するｓｃＦｖ  ＭＳＰＲＯ５９を示す図である。
【図２６】リガンド非依存性腫瘍成長の抑制におけるＭＳＰＲＯ５９単鎖抗体の効果を示す図である。
【図２７】ＦＧＦＲ３−Ｆｃ及びＦＧＦＲ１−ＦｃへのＦａｂミニ抗体の結合（ＥＬＩＳＡ）を示す図である。
【図２８Ａ】本発明による使用のためのＦａｂ発現ベクターの一例を示す図である。
【図２８Ｂ】図２８ＡによるベクターのＤＮＡ配列を示す図である。
【図２９Ａ】本発明による使用のためのファージディスプレイベクターの一例である。
【図２９Ｂ】図２９ＡによるベクターのＤＮＡ配列を示す図である。
【図３０】本発明のＭＳＰＲＯ抗体のＶＬ及びＶＨのポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１】
2005500034.tif 000027
【図４】
2005500034.tif 000028
【図５】
2005500034.tif 000029
【図７Ａ】
2005500034.tif 000030
【図７Ｂ】
2005500034.tif 000031
【図１０】
2005500034.tif 000032
【図１４】
2005500034.tif 000033
【図１５】
2005500034.tif 000034
【図１８Ａ】
2005500034.tif 000035
【図１８Ｂ】
2005500034.tif 000036
【図１９】
2005500034.tif 000037
【図２０】
2005500034.tif 000038
【図２１】
2005500034.tif 000039
【図２２】
2005500034.tif 000040
【図２３】
2005500034.tif 000041
【図２４】
2005500034.tif 000042
【図２５Ａ】
2005500034.tif 000043
【図２５Ｂ】
2005500034.tif 000044
【図２６】
2005500034.tif 000045
【図２８Ａ】
2005500034.tif 000046
【図２８Ｂ−１】
2005500034.tif 000047
【図２８Ｂ−２】
2005500034.tif 000048
【図２８Ｂ−３】
2005500034.tif 000049
【図２８Ｂ−４】
2005500034.tif 000050
【図２８Ｂ−５】
2005500034.tif 000051
【図２８Ｂ−６】
2005500034.tif 000052
【図２８Ｂ−７】
2005500034.tif 000053
【図２９Ａ】
2005500034.tif 000054
【図２９Ｂ−１】
2005500034.tif 000055
【図２９Ｂ−２】
2005500034.tif 000056
【図２９Ｂ−３】
2005500034.tif 000057
【図２９Ｂ−４】
2005500034.tif 000058
【図２９Ｂ−５】
2005500034.tif 000059
【図２９Ｂ−６】
2005500034.tif 000060
【図２９Ｂ−７】
2005500034.tif 000061
【図２９Ｂ−８】
2005500034.tif 000062
【図３０−１】
2005500034.tif 000063
【図３０−２】
2005500034.tif 000064
【図３０−３】
2005500034.tif 000065
【図３０−４】
2005500034.tif 000066
【図３０−５】
2005500034.tif 000067
【図３０−６】
2005500034.tif 000068
【国際公開パンフレット】
2005500034.tif 000069
2005500034.tif 000070
2005500034.tif 000071
2005500034.tif 000072
2005500034.tif 000073
2005500034.tif 000074
2005500034.tif 000075
2005500034.tif 000076
2005500034.tif 000077
2005500034.tif 000078
2005500034.tif 000079
2005500034.tif 000080
2005500034.tif 000081
2005500034.tif 000082
2005500034.tif 000083
2005500034.tif 000084
2005500034.tif 000085
2005500034.tif 000086
2005500034.tif 000087
2005500034.tif 000088
2005500034.tif 000089
2005500034.tif 000090
2005500034.tif 000091
2005500034.tif 000092
2005500034.tif 000093
2005500034.tif 000094
2005500034.tif 000095
2005500034.tif 000096
2005500034.tif 000097
2005500034.tif 000098
2005500034.tif 000099
2005500034.tif 000100
2005500034.tif 000101
2005500034.tif 000102
2005500034.tif 000103
2005500034.tif 000104
2005500034.tif 000105
2005500034.tif 000106
2005500034.tif 000107
2005500034.tif 000108
2005500034.tif 000109
2005500034.tif 000110
2005500034.tif 000111
2005500034.tif 000112
2005500034.tif 000113
2005500034.tif 000114
2005500034.tif 000115
2005500034.tif 000116
2005500034.tif 000117
2005500034.tif 000118
2005500034.tif 000119
2005500034.tif 000120
2005500034.tif 000121
2005500034.tif 000122
2005500034.tif 000123
2005500034.tif 000124
2005500034.tif 000125
2005500034.tif 000126
2005500034.tif 000127
2005500034.tif 000128
2005500034.tif 000129
2005500034.tif 000130
2005500034.tif 000131
2005500034.tif 000132
2005500034.tif 000133
2005500034.tif 000134
2005500034.tif 000135
2005500034.tif 000136
2005500034.tif 000137
2005500034.tif 000138
2005500034.tif 000139
2005500034.tif 000140
2005500034.tif 000141
2005500034.tif 000142
2005500034.tif 000143
2005500034.tif 000144
2005500034.tif 000145
2005500034.tif 000146
2005500034.tif 000147
2005500034.tif 000148
2005500034.tif 000149
2005500034.tif 000150
2005500034.tif 000151
2005500034.tif 000152
2005500034.tif 000153
2005500034.tif 000154
2005500034.tif 000155
2005500034.tif 000156
2005500034.tif 000157
2005500034.tif 000158
2005500034.tif 000159
2005500034.tif 000160
2005500034.tif 000161
2005500034.tif 000162
2005500034.tif 000163
2005500034.tif 000164
2005500034.tif 000165
2005500034.tif 000166
2005500034.tif 000167
2005500034.tif 000168
2005500034.tif 000169
2005500034.tif 000170
2005500034.tif 000171
2005500034.tif 000172
2005500034.tif 000173
2005500034.tif 000174
2005500034.tif 000175
2005500034.tif 000176
2005500034.tif 000177
2005500034.tif 000178
2005500034.tif 000179
2005500034.tif 000180
2005500034.tif 000181
2005500034.tif 000182
2005500034.tif 000183
2005500034.tif 000184
2005500034.tif 000185
2005500034.tif 000186
2005500034.tif 000187
2005500034.tif 000188
2005500034.tif 000189
2005500034.tif 000190
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500034.tif 000191
【国際調査報告】
2005500034.tif 000192
2005500034.tif 000193
2005500034.tif 000194