(57)【要約】【課題】ＰＩＴ−１及びカッパ−カゼイン遺伝子の多型の分析による良好な乳生産資質の可能性を有する動物の同定方法【解決手段】本発明は、Pit-1及びΚ−カゼイン遺伝子の多型の分析によって、動物の乳生産潜在能力を判定するための方法及びキットに関連する。特に、本発明は有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定する方法に関し、該方法において、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ａ及び/又はＴ、及びΚ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定するための方法であって、
ａ）前記哺乳類のＤＮＡを含む生物学的サンプルを得る工程；
ｂ）前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析する工程、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ａ及び/又はＴ並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す；
を具備する方法。
【請求項２】
有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定するための方法であって、前記ウシからの生物学的サンプルにおいて、前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析することを具備し、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ａ及び/又はＴ並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す方法。
【請求項３】
前記哺乳類はウシである、請求項１または２に記載の同定方法。
【請求項４】
請求項１〜３に記載の同定方法であって、前記κ-カゼインの対立遺伝子Ｂの存在が、チーズの生産に有利であるラクトダイナモグラフィー的な乳品質をも示す方法。
【請求項５】
前記工程ａ）が動物の毛嚢由来からの細胞を用いて行われる、請求項１〜４に記載の同定方法。
【請求項６】
前記工程ｂ）が、κ-カゼイン遺伝子について、前記κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５を含む断片を増幅させることと、該増幅産物を制限酵素Hinflで消化させることとによる制限断片長多型（ＲＦＬＰ）によって行われる、請求項１〜５に記載の同定方法。
【請求項７】
前記ヌクレオチド５３４５を含むκ-カゼイン遺伝子断片が、次のプライマーで増幅されることを特徴とする、請求項６に記載の同定方法：
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3' (配列番号：1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3' (配列番号：2)。
【請求項８】
前記工程ｂ）が、κ-カゼイン遺伝子について、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によって行われる、請求項１〜５の何れかに記載の同定方法。
【請求項９】
κ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子特異的増幅が、次のプライマー：
5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号：3)；
5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号：4)；
及び次のプローブ：
Vic：5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号：5)；
Fam：5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号：6)；
を用いて行われる、請求項８に記載の同定方法。
【請求項１０】
前記工程ｂ）が、Pit-1遺伝子について、前記Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅させることと、該増幅産物を制限酵素Hinflで消化させることとによる制限断片長多型分析（ＲＦＬＰ）によって行われる、請求項１〜９の何れか一項に記載の同定方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド１１７８を含むPit-1遺伝子断片が、次のプライマーで増幅される請求項１０に記載の同定方法：
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号：7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号：8)。
【請求項１２】
前記工程ｂ）が、Pit-1遺伝子について、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によって行われる、請求項１〜９の何れか一項に記載の同定方法。
【請求項１３】
前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー：
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号：9)；対立遺伝子Ｂに特異的；
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号：10)；対立遺伝子Ａに特異的；及び、
逆プライマーとして5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG -3' (配列番号：11)； 
を用いてエクソン６において行われる、請求項１２に記載の同定方法。
【請求項１４】
前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー：
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C -3'(配列番号：12),対立遺伝子Ｃに特異的；
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T -3'(配列番号：13),対立遺伝子Ｔに特異的；及び、
逆プライマーとして5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号：14)；
を用いて、エクソン２において行われる、請求項１２に記載の同定方法。
【請求項１５】
前記Pit-1遺伝子の対立遺伝子特異的増幅は、次のプライマー：
PIT-1 F プライマー: 5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA -3' (配列番号：15)；
PIT-1 R プライマー: 5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA -3' (配列番号：16)；
PIT-1MGB FAMプローブ: 5'-AACTCTGATTTAGGCTTG -3' (対立遺伝子A用)(配列番号：17)；及び、
PIT-1MGB VICプローブ: 5'-AACTCTGATTCAGGCTT -3' (対立遺伝子B用)( 配列番号：18)；
を用いてエクソン６において行われる、請求項１２に記載の同定方法。
【請求項１６】
ウシにおける有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットであって、Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅するためのオリゴヌクレオチド、κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５を含む断片を増幅させるためのオリゴヌクレオチド、及び制限酵素Hinflを具備するキット。
【請求項１７】
前記Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅させるための前記オリゴヌクレオチドは、次のプライマー：
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' (配列番号：7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (配列番号：8)
から成り、前記κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５を含む断片を増幅させるための前記オリゴヌクレオチドは、次のプライマー：
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号：1) 
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号：2)
から成ることを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ウシにおいて有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットであって、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を行うためのオリゴヌクレオチド、及び、κ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を行うためのオリゴヌクレオチドを具備するキット。
【請求項１９】
前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマーである、請求項１８に記載のキット：
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号：9)；対立遺伝子Ｂに特異的；
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号：10)；対立遺伝子Ａに特異的；及び、
逆プライマーとして5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号：11)。
【請求項２０】
前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマーである、請求項１８に記載のキット：
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号：12)；対立遺伝子Ｃに特異的；
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号：13)；対立遺伝子Ｔに特異的；及び、
逆プライマーとして5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号：14)。
【請求項２１】
前記Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマー：
PIT-1Fプライマー:5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA-3'(配列番号：15)；
PIT-1Rプライマー:5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA-3'(配列番号：16)；
及び次のプローブ：
PIT-1MGB FAMプローブ:5'-AACTCTGATTTAGGCTTG-3'(対立遺伝子A用)(配列番号：17)；及び
PIT-1MGB VICプローブ:5'-AACTCTGATTCAGGCTT-3'(対立遺伝子B用)(配列番号：18)；
である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記κ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドは、次のプライマー：
5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号：3)；
5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号：4)；
及び次のプローブ：
Vic：5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号：5)；
Fam：5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号：6)；
である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
ウシの乳又は肉生産能力を判定する遺伝子マーカーであって、前記Pit-1遺伝子の１９５位置のアデニンが、良好な乳生産の特徴を示し、また、Pit-1遺伝子の１９５位置のグアニンが良好な肉生産の特徴を示す、遺伝子マーカー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、乳生産及び育種の分野に関連する。特に、Pit-1及びκ−カゼイン遺伝子の多型の分析によって、動物の乳生産潜在能力を判定するための方法及びキットに関連する。
【０００２】
現在のところ、動物の特定の形質の選択には時間と経費がかかる。該選択は、ある部分は、その体重、サイズ、色などの異なるタイプの測定によって動物を観察することに基づいており、またある部分はその系統の研究に基づいている。  
前記選択は、同じ形質を有する動物を交配させ、その形質が次世代に優勢になることを期待することによって、数世代にわたって行われる。  
この種の選択は、必要とする時間の長さ故の数々の不利益を有し、またその分野の熟練した飼育者による判定を必要とする。  
この飼育者による判定は、観察と仮定に基づいており、それ故に経験に関連したある程度の主観を含んでいる。さらに、ある世代においてそのような方法により選択された形質が、次世代に伝えられるとは限らない。
【０００３】
上述した不利益を克服するために、遺伝分野における科学的進歩に基づいた新規の方法が開発されている。
【０００４】
特に有望なアプローチは、大きな固体効果を有する遺伝子の研究と、それらが動物におけるある望ましい形質と関連する可能性から成る。そのような遺伝子は、問題の動物における系統を選択する分子マーカーとして用いることができる。この方法は、大きな固体効果を有する遺伝子または所望の形質に関連する遺伝子マーカーを同定する必要がある。それ故に、このアプローチの成功は、捜し求める表現型の形質と、問題の遺伝子の確かな多型性との間の相関の証明にかかっている。
【０００５】
乳生産分野において、多くの遺伝子が乳生産に影響を及ぼすことが確認されており、
生産量（例えばソマトトロピン中枢の遺伝子）及び乳品質（例えばタンパク質の変動に関する遺伝子）の両方に関する。
【０００６】
乳のラクトダイナモグラフィー的な特性に関する多くの遺伝子、特にカッパ−カゼイン遺伝子（Formaggioniら,1999による総説記事を参照）が確認されている。とりわけ、ホルスタイン乳牛の乳生産形質におけるκ-カゼイン遺伝子の多型の影響は、広く文献に示されている（Van Eenennaam et Medrano, 1991 ; Bovenhuis et al., 1992 ; Mao et al., 1992 ; Ron et al., 1994)。前記遺伝子の対立遺伝子Ｂは、チーズ生成に有利な、これは凝乳が堅く、凝乳形成時間が短く、より多くのチーズが生成可能であることを意味するが、乳ラクトダイナモグラフィー的品質と関連する（Martinet et Houdebine, 1993）。
【０００７】
また、乳生産におけるソマトトロピン中枢の異なる遺伝子の影響も記述されている。例えば、成長ホルモンの供給は、乳生産を刺激することが知られている（Chilliardらによる記事を参照）。さらなるソマトトロピン遺伝子、Pit-1遺伝子もまた、乳生産量に影響することが確認されている。１９９６年７月２２日に出願のＰＣＴ特許出願ＷＯ-Ａ-９８/０３６７７において、発明者らは、Ｐｉｔ-１遺伝子の対立遺伝子Ａが有利な乳生産形質に関連し、一方で対立遺伝子Ｂはよりよい肉の生産に関連することを示した。これら二つの対立遺伝子は、１１７８位置におけるアデニン（対立遺伝子Ａ）のグアニン（対立遺伝子Ｂ）による置換によって相違する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定するための方法を提供することである。この方法は、哺乳類における乳生産及び乳中のタンパク質生産の高い潜在能力の同定を可能にし、周知の従来技術方法よりも優れている。残りの本文において、κ-カゼイン遺伝子の異なる対立遺伝子は、従来技術の科学的文献と同様の方法で、ホルマギオーニ（Formaggioni）らによる記事（上記参照）の表４に記載されているのと同様の方法で命名する。κ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ａ及びＢの存在を証明する方法の例は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び対立遺伝子特異的検出による下記のそれぞれの実施例１及び２に記載されている。
【０００９】
Ｐｉｔ-１遺伝子の対立遺伝子Ａ及びＢは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ-Ａ-９８/０３６７７に記載されている。また、発明者らは、Pit-1遺伝子のエクソン２におけるさらなる多型を示している（実施例５）。この対応する対立遺伝子Ｃ及びＴは、セリン６５のコドンにおけるアデニン（対立遺伝子Ｃ）のグアニン（対立遺伝子Ｔ）による置換によって相違する。この変異は、沈黙変異であるが、乳生産形質に関連する分子マーカーとして作用し得る。本発明者らは、試験された雄牛（５００以上のホルスタインの雄牛のサンプル中）の９７.８％において、エクソン６のＡＡ遺伝子型がエクソン２のＴＴ遺伝子型と関連し、また、エクソン６のＢＢ遺伝子型がエクソン２のＣＣ遺伝子型に相関していることを観察している。前記変異の観察された遺伝子型と乳生産性能との間の関連は、エクソン６に関しては同じ程度である。
【００１０】
Pit-1遺伝子及びκ-カゼイン遺伝子は、同じ代謝連鎖に属していない。従って、先験的に、それらが相互作用する根拠が全くない。
【００１１】
それにも関わらず、本発明者らは、有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定する方法を開発し、これにおいてPit-1遺伝子及びカッパ-カゼイン遺伝子は共に遺伝子マーカーとして用いられる。この方法は、Pit-1マーカーの単独使用、またはカッパ-カゼインマーカーの単独使用に基づく従来周知の方法よりもより効果的であることが示されている。
【００１２】
第一の側面において、本発明は有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定する方法に関し、次の工程を具備する：
ａ）前記哺乳類のＤＮＡを含む生物学的サンプル（または組織）を得る工程；
ｂ）前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析する工程、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ａ及び/又はＴ並びにκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す。
【００１３】
本方法の好ましい実行において、哺乳類はウシである。
【００１４】
以下の実施例６において記載した詳細な統計学的方法を使用することによって、本発明者らは、ＡＡPit-1及びＢＢκ-カゼイン遺伝子型を有する動物が、ウシＢＢPit-1ＡＡκ-カゼイン遺伝子型のものよりもはるかに優れた乳生産性能を有することを証明した。特に表３に概要を述べたように、ＡＡPit-1及びＢＢκ-カゼインと検定された雌牛は、３０５日間の催乳に基づいて、ＢＢPit-1ＡＡκ-カゼインと検定された雌牛よりも平均で約２３７ｋｇ多く乳を生産する。この効果は、二つの遺伝子のそれぞれについて観察される効果の和よりも大きい（Pit-1で46.3ｋｇ及びκ-カゼインで72.2）。同様に、二つの好ましい対立遺伝子の関連の非常に大きな効果が、タンパク質生産において観察され、この効果は二つの遺伝子のそれぞれの効果の和よりも大きい。
【００１５】
実施例７に示された結果は、動物のより小さなサンプルで観察されたものであり、Pit-1遺伝子多型の分析がエクソン２でも実行され得ることを示しており、この場合、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ｔとκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、その試験された動物における高い乳生産及びタンパク質生産潜在能力を示す。
【００１６】
キリアルド（Chilliard）ら（2001）によって公開された結果によって、多量の成長ホルモンの投与は、乳中に生産されたタンパク質の量を著しくは改変しないことが示された。Pit-1及び成長ホルモンが同じ代謝中枢に属することから、キリアルド（Chilliard）の結果は、Pit-1は乳腺で生成されるタンパク質量に直接影響を及ぼさないことが示唆された。しかしながら、全催乳に対するｋｇで表されるタンパク質の総量は変化し、さらに生産された乳の量も変化する。
【００１７】
本発明の方法において、κ-カゼインの対立遺伝子Ｂの存在もまた、チーズ生産に有利であるラクトダイナモグラフィー的な乳の品質を表す。
【００１８】
本発明の方法の最初の工程、即ち、試験されるべき動物のＤＮＡを含む生物学的サンプルの採取は、技術者に周知の任意の技術、例えば、生検、または血液サンプルの除去または任意の他の生物学的サンプルによって実行され得る。この工程は、動物から数本の毛を引き抜いて得た毛嚢に由来する細胞を用いて実行されることが好ましい。
【００１９】
当然ながら、上記工程１及び２は、二人の異なる人間によって実行されることもできる。例えば、サンプルを飼育者が得、そして分析を実行する研究室に送ってもよい。従って、本発明は、有利な乳生産形質を表す遺伝子型を有する哺乳類を同定する方法にも関し、前記ウシの生物学的サンプルにおいて、前記哺乳類のPit-1及びκ-カゼイン遺伝子の多型を分析することを含み、ここで、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ａ及び/又はＴとκ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂが同時に存在することが、前記哺乳類における乳生産及びタンパク質生産の高い潜在能力を示す。
【００２０】
本発明の方法において、κ-カゼイン遺伝子における多型は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）によって分析されることができ、これはアレクサンダー（Alexander）ら（1988）によって記載されたκ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５の配列（対立遺伝子ＡにおけるＡ及び対立遺伝子ＢにおけるＣに対応する）を含む断片の増幅、及び、この増幅産物の制限酵素Hinflを用いた消化による。下記の実施例１に開示されたように、そのような断片は、次のプライマーを用いて増幅できる：
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号：1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号：2)。
【００２１】
或いは好ましくは、該分析は、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によってκ-カゼイン遺伝子について実行される。実施例２は、次のプライマー及びプローブを用いて実行した対立遺伝子検出技術を詳述する：
カッパＦプライマー：5'-CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG-3'(配列番号:3)
カッパＲプライマー：5'-TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT-3'(配列番号:4)
カッパＶｉｃプローブ：5'-TACTCTAGAAGATTCTC-3'(配列番号:5)
カッパＦａｍプローブ：5'-TACTCTAGAAGCTTCTC-3'(配列番号:6)。
【００２２】
同様に、本発明の方法において、Pit-1遺伝子についての分析は、制限断片長多型分析（ＲＦＬＰ）によって実行されてよく、これは下記の実施例３に示したように、Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅させることと、該増幅産物を制限酵素Hinflで消化することによる。この終わりに、次のプライマーを用いることができる：
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号：7)
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3' (配列番号：8)。
【００２３】
本発明の方法において、分析は、Pit-1遺伝子について、対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出によっても実行することもできる。下記の実施例４及び５は、Pit-1遺伝子断片の、それぞれエクソン６及び２の対立遺伝子特異的増幅を詳述しており、次のプライマーを用いている：
・エクソン６における対立遺伝子特異的増幅用：
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号:9)；対立遺伝子Ｂに特異的；
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10)；対立遺伝子Ａに特異的；及び
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号：11)；逆プライマーとして；
・エクソン２における対立遺伝子特異的増幅用：
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号:12),対立遺伝子Ｃに特異的；
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号:13),対立遺伝子Ｔに特異的；及び
5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号:14)逆プライマーとして。
【００２４】
Pit-1遺伝子の多型はまた、前記遺伝子の増幅断片の対立遺伝子特異的検出によっても決定でき、例えばエクソン６において、次のプローブ及びプライマーを用いる：
PIT-1 Fプライマー:5'-CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA-3'(配列番号:15)；
PIT-1Rプライマー:5'-GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA-3'(配列番号:16)；
PIT-1MGB FAMプローブ:5'-AACTCTGATTTAGGCTTG-3'(対立遺伝子A用)(配列番号:17)；及び
PIT-1MGB VICプローブ:5'-AACTCTGATTCAGGCTT-3'(対立遺伝子B用)(配列番号:18)。
【００２５】
実施例１〜５に記載された実験条件は、単なる例示として提供されたことは明らかであり、技術者によって改変することができる。これは特に、増幅反応を実行するのに用いられた試薬及び温度条件に関する場合であるが、プライマー配列についても同様である。検出されるべき多型の位置が既知であれば、問題の対立遺伝子に関する断片を増幅し同定するのに用いられる他のプライマー又はプローブを決定することは容易である。前記プライマーの決定は、該多型サイトの周囲の配列を解読することで行え、必要であれば、GeneScan（登録商標）型（Applied Biosystems）のソフトウェアを用いる。
【００２６】
さらに、検討中の遺伝子の多型を決定するために他の技術を使用することができ、例えば、ＳＳＣＰ（一本鎖形成多型）、ＤＧＧＥ（変性剤勾配ゲル電気泳動）及びＣＦＬＰ（切断断片長多型）などのような既知の技術を使用することができる。ここに記載したものは、例えばサンブロック（Sambrook）ら（Molecular Cloning-A laboratory manual Third Edition-Cold Spring Harbor Laboratory Press）によって開示されている。
【００２７】
また、本発明は、ウシにおける有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットに関し、Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅するためのオリゴヌクレオチド、κ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５を含む断片を増幅するためのオリゴヌクレオチド、及び制限酵素Hinflを含む。
【００２８】
例として、そのようなキットは、Pit-1遺伝子のヌクレオチド１１７８を含む断片を増幅するための次のプレイマー：
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号：7)；及び
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号：8)；
及びκ-カゼイン遺伝子のヌクレオチド５３４５を含む断片を増幅するための次のプライマー：
5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'(配列番号：1)及び
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'(配列番号：2)
を具備してよい：
さらなる側面において、本発明は、ウシにおける有利な乳生産形質を表す遺伝子型を同定するためのキットに関し、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を実行するためのオリゴヌクレオチド、及びκ-カゼイン遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅及び/又は検出を実行するためのオリゴヌクレオチドを具備する。
【００２９】
そのようなキットの好ましい実施において、次のプライマーは、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドを構成する：
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3' (配列番号:9)；対立遺伝子Ｂに特異的；
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号:10)；対立遺伝子Ａに特異的；及び
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号:11)；逆プライマーとして。
【００３０】
或いはそのようなキットの他の実施において、次のプライマーが、エクソン２を標的にするPit-1遺伝子断片の対立遺伝子特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドを構成する：
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3'(配列番号：12),対立遺伝子Ｃに特異的；
5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3'(配列番号：13),対立遺伝子Ｔに特異的；及び
5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T -3'(配列番号：14)逆プライマーとして。
【００３１】
本発明のキットのさらなる実施において、次のプライマー及びプローブがκ-カゼインの遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを構成する：
カッパFプライマー:CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG(配列番号：3)；
カッパRプライマー:TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT(配列番号：4)；
カッパVicプローブ:TACTCTAGAAGATTCTC(配列番号：5)；
カッパFamプローブ:TACTCTAGAAGCTTCTC(配列番号：6)； 
また、次のプライマー及びプローブが、Pit-1遺伝子の断片の対立遺伝子特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを構成する：
PIT-1 Fプライマー:CATTCGAGATGCTCCTTAGAAATAGTAA(配列番号：15)；
PIT-1Rプライマー:GTTTTGTAACCGAAGGCAGAGAGA(配列番号：16)；
PIT-1MGB FAMプローブ:AACTCTGATTTAGGCTTG(対立遺伝子A用)(配列番号：17)；及び
PIT-1MGB VICプローブ:AACTCTGATTCAGGCTT(対立遺伝子B用)(配列番号：18)。
【００３２】
κ-カゼイン及びPit-1遺伝子の断片の増幅のためであるか、またはそれらの検出のためであるかに関わらず、他のヌクレオチド配列が使用可能であることは、技術者には明らかである。同様に、本発明の範囲から外れることなく、用いられるプローブの標識を改変しうることは、技術者には明らかである。
【００３３】
また、本発明は、乳又は肉の能力のウシを決定するための遺伝子マーカーに関し、これはPit-1遺伝子の１９５位置のアデニンが、良好な乳生産の特徴を決定し、またPit-1の１９５位置のグアニンが良好な肉生産の特徴を決定する。
【００３４】
以下の実施例及び図は、本発明のある側面の例証及び詳述を提供するが、これらに制限されるものではない。
【実施例】
【００３５】
[実施例１]
ＲＦＬＰ分析によるカッパ−カゼインのＡ及びＢ対立遺伝子の判定
反応混合物は、Ｈ2Ｏ，１０×バッファー、2ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｐmolのプライマー、0.2ｍＭのdNTPs、100ng/25μｌのＤＮＡ、及び0.6Ｕ/25μｌのポリメラーゼ[Goldstar DNA Polymerase, EUROGENTEC]で構成される。ＰＣＲ反応サイクルは、最初に、９６℃で３分間の変性期間、続いて９４℃で１分間、６６℃で１分間、及び７２℃で１分間を４０サイクルで構成した。末端伸長期間は７２℃で１０分間行った。
【００３６】
次いで、ＰＣＲ産物を２０ＵのHinfl酵素と共に３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、２μｌの停止（ＳＴＯＰ）溶液（５０％グリセロール、２０ｍＭのＥＤＴＡ、0.25％のブロモフェノールブルー）を加え、この混合物を２％アガロースゲル電気泳動で分離した。
【００３７】
プライマー：5'-ATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3'
5'-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3'。
【００３８】
科学的文献において任意に「Ａ」と命名された対立遺伝子はHinfl酵素によって切断され、「Ｂ」対立遺伝子はHinfl酵素によって消化されなかった。
【００３９】
[実施例２]
対立遺伝子特異的検出によるカッパ-カゼインのＡ及びＢ対立遺伝子の判定
反応混合物は、プライマー及びプローブの存在下、Taq Man Univesal PCR master mix（Applied Biosystems Inc）から構成した。
【００４０】
カッパＦプライマー          2.5μｌ
カッパＲプライマー          900ｎＭ
Ｆａｍ  カッパプローブ      200ｎＭ
Ｖｉｃ  カッパプローブ      200ｎＭ
水で容積を５μｌにした。
【００４１】
増幅は、Applied Biosystemsのモデル７９００ＨＴ装置を用いてリアルタイムで測定した。
【００４２】
ＰＣＲ反応サイクルは、最初の期間に５０℃で２分間を１サイクル、続いて９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルで構成した。
【００４３】
結果は、装置によって自動的に解読された。
【００４４】
使用プライマー：
Ｆプライマー：CCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAG(配列番号：3)；及び
Ｒプライマー：TCTCAGGTGGGCTCTCAATAACTT(配列番号：4)；
プローブ：
Ｖｉｃプローブ：TACTCTAGAAGATTCTC(配列番号：5)；及び
Ｆａｍプローブ：TACTCTAGAAGCTTCTC(配列番号：6)。
【００４５】
文献中で任意にＡと名付けられた対立遺伝子は、５３４５位置にヌクレオチドＡを有するものであり、対立遺伝子Ｂは５３４５位置にヌクレオチドＣを有するものであった。
【００４６】
[実施例３]
ＲＦＬＰ分析によるPit-1遺伝子のＡ及びＢ対立遺伝子の判定
ヌクレオチド１１７８におけるPit-1遺伝子の多型を次のプライマーを用いて分析した：
5'-AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'(配列番号：7)；及び
5'-AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'(配列番号：8)。
【００４７】
ＰＣＲ増幅は、実施例１で記載されたものと実質的に同一の条件で行った。  
該増幅の産物は、４５１塩基対の断片であった。この断片を、制限酵素Hinf1と共にインキュベーションすることで、二つの対立遺伝子を識別することができた：対立遺伝子ＡはHinf1によって切断されず、対立遺伝子ＢはHinf1の制限サイトを含み、これは２４４及び２０７塩基対を有する二つの断片を生じさせる。
【００４８】
[実施例４]
対立遺伝子特異的増幅によるPit-1遺伝子のエクソン６のＡ及びＢ対立遺伝子の判定
この方法は、ＰＣＲのために、３´末端に位置するヌクレオチドが異なる二つのプライマーを用いることに基づく。この相違は、遺伝子の二つの対立遺伝子のうちの一つに関するプライマーの特異性に起因する。従ってこの方法は、それぞれの対立遺伝子に特異的プライマーを用い、制限酵素の使用は必要としない。
【００４９】
増幅反応は、Ｈ2Ｏ、１０×バッファー、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｐmol/50μｌの特異的プライマー（Ａ又はＢ）、400μｍのdNTP、100ng/50μｌのＤＮＡ、及び1.2Ｕ/50μｌのポリメラーゼ[Goldstar DNA Polymerase, EUROGENTEC]の溶液中で行った。ＰＣＲ反応は、最初に変性工程を９６℃で３分間行い、続いて９５℃で１分、65.2度で１分、そして７２℃で１分を約３５サイクル行った。最後の工程は、７２℃で１０分間行った。
【００５０】
この方法で用いたプライマーは次の通りである：
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATG-3'(配列番号：9)；対立遺伝子Ｂに特異的；
5'-CAGAGAGAAAAACGGGTGAAGACAAGCATA-3'(配列番号：10)；対立遺伝子Ａに特異的；
5'-AGATAGAGGGAAAGATATAGTGAAAGGGACAG-3'(配列番号：11)；逆プライマーとして。
【００５１】
増幅反応の後、得られた産物を図１に示したようにアガロースゲル上で明らかにした。この実験において、それぞれのサンプルは、それぞれプライマーＡ又はプライマーＢの存在によってもたらされた。ＰＣＲ増幅された320bpの断片はそれぞれ、チューブＡだけに存在するか（従って動物の遺伝子型はＡＡ）、またはチューブＢのみに存在するか（従って動物はＢＢホモ接合）、或いは両方のチューブに存在した（動物はＡＢヘテロ接合）。
【００５２】
[実施例５]
対立遺伝子特異的増幅によるPit-1遺伝子のエクソン２のＣ及びＴ対立遺伝子の判定
第二の多型サイトを、Pit-1遺伝子における一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を用いて判定した。遺伝子の多型部分の配列が、同定されるべき原因変異を生じさせる。これはタンパク質トランス活性化領域のセリンのコドン６５でのＡ→Ｇ移行であった。アミノ酸はこの変異によっては改変されなかった。この変異に起因する二つの対立遺伝子は、ＳＳＣＰにおいて三つの多型プロフィールが存在することの原因である。
【００５３】
ホルスタイン牛のサンプルにおけるこの点変異の研究は、容易に実行される迅速な分析方法の開発を必要とし、これはＳＳＣＰ方法を用いる事例ではない。
【００５４】
従って、対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応は、この変異を研究するために開発された。プライマーの一つ、PitＣは、対立遺伝子Ｃに特異的であった。もうひとつのPitＴは、対立遺伝子Ｔに特異的であった。PitＲ対立遺伝子は逆プライマーとして用いた。反応の特異性を増強させるため、二つの特異的プライマーの３´-ＯＨ末端の上流の３番目の塩基に追加の変異を導入した（図２）。
【００５５】
Pit-C : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT C-3' (配列番号：12)
Pit-T : 5'-C TGC CAT CAC GCC ATA GTT T-3' (配列番号：13)
Pit-R : 5'-CA ACA GGA CTT CAT TAT TCT GTT CCT CAT TAT TCT GTT CCT T-3' (配列番号：14)。
【００５６】
[実施例６]
Pit-1遺伝子（エクソン６）の影響とκ-カゼイン遺伝子の影響の組合せ
１１００のホルスタインの雄牛のサンプルについて、ヌクレオチド５３４５の点変異でのκ-カゼインの遺伝子の遺伝子型が、変異Ｂを変異Ａと区別したAlexanderら（１９８８）によって決定された。遺伝子型ＡＡ、ＡＢ及びＢＢの頻度は次の通り：それぞれ、７５％、２３％及び２％であり、対立遺伝子Ａの８６.５％及び対立遺伝子Ｂの１３.５％に対応している。それらはハーディー・ワインベルグの法則に従う。これらの頻度は、Van Eenennaam及びMedrano（1991）が１１５２のホルスタイン雌牛から得たもの（８２％Ａ及び１８％Ｂ）及びRonら（1994）が１１９のホルスタイン雄牛から得たもの（７８．６％ＡＡ，２０.５％ＡＢ、及び０.９％ＢＢ）と類似している。
【００５７】
下記の表（表１）は、同様の研究で得られたκ-カゼイン遺伝子の多型と乳生産形質との関係の統計学的研究の結果を示し、Van Eenennaamら（1991）及びRonら（1994）によって得られた結果と比較している。
【表１】
2005519609.tif 000002
【００５８】
３つの研究において、対立遺伝子Ｂは、脂肪及びタンパク質の割合を変化させることなく、乳の生産、脂肪及びタンパク質生産に陽性の影響を有する。影響の大きさの比較から、これらは全体的に類似しているとみなすことができることが示される。
【００５９】
[サンプル]
異なる遺伝子で研究された対立遺伝子の置換の影響は、１１００のカナディアンホルスタイン雄牛の109443の娘の総量2397037催乳から算出した。公式の催乳データは、「カナディアンデイリーネットワーク」による。表２は、平均値、標準偏差、３０５日間の催乳を基本に生産された乳、脂肪、及びタンパク質の量の計算された最大及び最小値を示す。比較的高い標準偏差及び比較的広い最大-最小幅は、このサンプルの乳生産性に関する多様性を示している。これらの値は、高い性能の雌牛及びそれより劣る他の雌牛を含む非選択サンプルの特徴である。
【表２】
2005519609.tif 000003
【００６０】
[遺伝子モデル]
対立遺伝子の確率は、カナダの動物モデルを単純化したバージョンに導入した。
【００６１】
カナダの動物モデル：
ｙ＝Ｘｈ＋Ｔｔ＋Ｑｒ＋Ｚｐ＋Ｚ*ａ＋ｅ
ここで：
ｙ＝３０５日間の催乳生産のベクトル（乳、脂肪、またはタンパク質）；
ｈ＝固定された群れ-年-季節（１０月〜２月及び３月〜９月）−パリティ（早いまたは高い）効果のベクトル；
ｔ＝固定された催乳（１〜６またはそれ以上）−歳分類−催乳月の影響のベクトル；
ｒ＝転換された対立遺伝子確率での２回帰係数のベクトル；
ｐ＝無作為な持続的環境効果のベクトル；
ａ＝無作為な多遺伝子効果のベクトル；
ｅ＝無作為な残りの効果のベクトル；
Ｘ,Ｔ，Ｚ及びＺ*＝ｈ,ｔ,ｐ及びａ〜ｙに関連した出現率マトリックス；及び
Ｑ＝２-カラム回帰可変マトリックス、それぞれの対立遺伝子確率につき１カラム（Pit-1、Κ-カゼイン）。
【００６２】
用いられた変動成分は、カナダで用いられたものである。それらは0.33の遺伝率及び0.54の繰り返し率であった。式は、集束が非常に緩慢であるような「前条件づけられた接合体勾配」を用いて解いた。通常３００より多い繰り返しが必要であった。
【００６３】
二つの係数の間の相違は、２×対立遺伝子置換効果に比例した。これは、回帰変数の逆正弦変換を用いて計算して得られた。脂肪及びタンパク質の割合の結果は、個体群の平均を用いて間接的に得られた：
【化１】
2005519609.tif 000004
【００６４】
[結果]
表３は、１１０カナダディアンホルスタインの雄牛の乳生産形質に及ぼす推定相加的影響を示す。
【表３】
2005519609.tif 000005
【００６５】
このように、Pit-1（対立遺伝子Ａ）及びκ-カゼイン（対立遺伝子Ｂ）遺伝子の最良の対立遺伝子の選択は、乳中のタンパク質及び脂肪の割合を変化させることなく、乳量、脂肪及び乳タンパク質を実質的に上昇させることができた。
【００６６】
[実施例７]
動物モデル及び統計学的モデルは、前述の実施例で記載されたものと同一である。  
表４に得られた結果を要約する：
【表４】
2005519609.tif 000006
【００６７】
本発明に従って、Pit-1遺伝子の対立遺伝子Ｔ、及びカッパ-カゼイン遺伝子の対立遺伝子Ｂを同時に用いることによって、乳中のタンパク質及び脂肪の割合を変化させることなく、乳、脂肪及び乳タンパク質の量を実質的に増加させることが示されたといえる。
【参考文献】
【００６８】
2005519609.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＡＡホモ接合動物（サンプル１）、ＢＢホモ接合動物（サンプル２）及びＡＢヘテロ接合動物（サンプル３）のゲノムＤＮＡ由来の、Pit-1遺伝子のエクソン６の対立遺伝子特異的増幅の結果を示す。
【図２】Pit-1遺伝子のエクソン２に適用された対立遺伝子特異的増幅に用いられたプライマーを示す。遺伝子配列はイタリックで示されている。
【図３】ＣＣホモ接合動物（サンプル１）、ＴＴホモ接合動物（サンプル２）及びＣＴヘテロ接合動物（サンプル３）のゲノムＤＮＡ由来の、Pit-1遺伝子のエクソン２の対立遺伝子特異的増幅の結果を示す。
【図１】
2005519609.tif 000008
【図２】
2005519609.tif 000009
【図３】
2005519609.tif 000010
【配列表】
2005519609000001.app
【国際調査報告】
2005519609.tif 000011
2005519609.tif 000012
2005519609.tif 000013
2005519609.tif 000014
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