(57)【要約】本発明は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定する方法を提供する。
2005529590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定する方法であって、
（ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形を用意すること（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
（ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡを用意すること、
（ｃ）候補化合物を用意すること、
（ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つが標識されている）、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）を、（ｃ）の存在下および（ｃ）の非存在下で、（ａ）および（ｂ）が複合体を形成するのに十分な時間、混合すること、
（ｅ）段階（ｆ）で形成された複合体の量を検出すること、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を検出すること、
（ｆ）形成された複合体の量、および／または見出された非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を、（ｃ）の存在下と非存在下で比較すること、および
（ｇ）段階（ｆ）で検出された複合体形成に影響する薬物を選択すること、
を含む、方法。
【請求項２】
ＨｕＲタンパク質が同種供給源として用意されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨｕＲが、組換え全長タンパク質または変異体の可溶性形、または全長タンパク質の可溶性形の変異型であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｍＲＮＡフラグメントが蛍光標識されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
検出方法が、１分子分光法、蛍光相関分光法、蛍光強度分布分析法、定常状態蛍光強度法、蛍光異方性測定、およびエネルギー転移法からなる群から選択される蛍光分光法であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質の複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定するためのスクリーニングアッセイ（キット）であって、主な要素として
ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ、および
ｃ）必要に応じて、該ＨｕＲタンパク質と該ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ間で形成された複合体の量の検出、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種の検出の手段、
を含む、アッセイ（キット）。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により同定される薬物を少なくとも１つの医薬賦形剤と共に含む、医薬組成物。
【請求項８】
好ましくは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓ、およびｃ−ｍｙｃからなる群から選択される、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質からなる群から選択される物質の産生と関係する病因を有する疾患の処置のための、請求項７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
位置３２６のＣ末端アミノ酸がエステル化されている、配列番号：１または配列番号：２の全長ＨｕＲタンパク質。
【請求項１０】
ＨｕＲの結合部位である、単離ＲＮＡ配列モチーフ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、化合物スクリーニング方法、例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質の複合体形成に対する阻害作用を有する候補化合物を同定するためのアッセイ、および方法に関する。
【０００２】
ｍＲＮＡの安定性の制御は、真核生物の遺伝子発現を転写後レベルでコントロールする重要機序として認識されている。長時間存続するｍＲＮＡは、特定の遺伝子産物の産生に関する急激な変化を和らげるが、半減期の短かいｍＲＮＡは、変化する生理条件、および細胞（大抵、受容体介在性）シグナルの調節を適時可能とするための本質である。炎症性サイトカイン、成長因子、およびいくつかのプロトオンコジーン由来のメッセージの半減期は、大抵、ＡＲＥにより介在される厳重なコントロール機序の影響を受けやすいことが見出された。
【０００３】
多くの疾患関連初期応答遺伝子（ＥＲＧ）由来のｍＲＮＡは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のＡＲＥの存在により、特異的分解の標的とされる。ＡＲＥ含有ｍＲＮＡによりコード化されるタンパク質の関連性のため、該エレメントは、抗炎症治療の中枢的標的だけでなく、プロトオンコジーン（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ならびにｂｃｌ−２）様の本質的には異なる関連性の標的と見なされ得る。具体的には、サイトカインおよびプロトオンコジーンのｍＲＮＡは、トランス作用因子、またはそれと結合するタンパク質により介在される、その３’ＵＴＲ中のＡＲＥにより、分解のシス（ｃｉｓ）での標的とされる。
【０００４】
ＡＲＥは、５つの部分からなる一致モチーフＡＵＵＵＡの存在により、基本的に特徴付けられる。しかしながら、ＡＲＥ配列は、該５ヌクレオチドの配列および数により、互いに異なる。さらに、３’ＵＴＲ中のＡＲＥの数、長さ、および位置は非常に変動する。近接またはＡＵリッチな領域の多数のＡＵＵＵＡ配列は、ｍＲＮＡの不安定性と関係するが、単離ＡＵＵＵＡ配列は対照的に、例えば、翻訳およびｍＲＮＡ局在化での他の制御機能を有する。ＡＲＥ指揮性ｍＲＮＡ減少（分解）は、ポリ（Ａ）テールの迅速な除去により開始され、メッセージ本体（message corpus）の分解が続く（例えば、Chen C.Y et al., Trends Biochem. Sci. 1995, 20(11):465-70を参照）。
【０００５】
現在までに、いくつかの細胞質ｍＲＮＡ結合タンパク質が、ＡＲＥと特異的に相互作用するとして同定されたが一方で、その結合は、安定化、不安定化のいずれか、あるいは双方向作用を示す。これらのうち、ヒトＥＬＡＶ（胚致死的異常視覚）タンパク質であるＨｕＲ（Ｈｕ抗原Ｒ）は、ＡＲＥ介在性ｍＲＮＡ分解経路に関与する中心的ｍＲＮＡ安定化タンパク質であるとされる（例えば、Peng S.S. et al., EMBO J. 1998, 17(12):3461-70を参照）。
【０００６】
ＨｕＲ（Ｈｕ抗原Ｒ）は、ＲＲＭ（ＲＮＡ認識モチーフ）スーパーファミリーの３６ｋＤのタンパク質であり、３’ＵＴＲ中のそのＡＲＥ結合活性による、短時間存続するｍＲＮＡの安定化に加えて、核と細胞質間を再配分することが示された。それ故、それは、核においてその同族ｍＲＮＡと結合し、次に、それを核孔からエスコートすると想定されている。それは、細胞質への輸送中、および輸送後の分解から保護し、これにより、対応する遺伝子の即時アップレギュレーションを生じる。ＨｕＲ介在性制御と関係する、ＡＵリッチ含有ｍＲＮＡの大ファミリーは、例えば、ＩＬ−３、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／単球コロニー刺激因子）、ＡＴ−Ｒ１（アンジオテンシン受容体１）、Ｃｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ２）、ＩＬ−８、またはＴＮＦ−αを含む（例えば、Hel Z. et al., Nucleic Acids Res. 1998, 26 (11): 2803-12を参照）。
【０００７】
ＩＬ−２、Ｃｏｘ−２、またはＴＮＦ−α様免疫メディエーターのアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを介在する過程は、免疫応答での鍵となる機序であり、免疫処置および抗炎症治療の重要な標的を表している。
【０００８】
広範な種類のｍＲＮＡが、該遺伝子型の制御エレメントを用いる事実にも関わらず、先行研究は、特定のｍＲＮＡのＡＲＥが、細胞シグナル伝達に対する顕著に特異的な応答を鎮める証拠を提供してきた。従って、個々のＡＲＥを標的とすることにより、ｍＲＮＡ特異的機能的インヒビターを同定することが可能となると思われる。これは、プロトオンコジーン、炎症性サイトカイン、およびウイルスタンパク質を含む、疾患関連メディエーターの優れた多様性が、ＡＲＥかつＨｕＲ介在性ｍＲＮＡ安定化および核輸送の共通制御原理に基づき、アッセイされ得ることを示唆する。
【０００９】
本発明は、特に、ＡＲＥとタンパク質であるＨｕＲにより介在されるＥＲＧ特異的ｍＲＮＡ減少に焦点をおく、新規スクリーニングコンセプトを提供し、そしてこれは、該分解を阻害する。
【００１０】
我々は、ＩＬ−２（インターロイキン２）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、Ｃｏｘ−２（シクロオキシゲナーゼ２）、および他の標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中のＡＲＥとＨｕＲとの相互作用が、本発明の方法に従い、決定され得ることを見出した。ＨｕＲのその同族ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ配列との相互作用は、炎症性疾患を標的とする新規アプローチとしての炎症処置を指揮する、可能性のある抗ＩＬ−２、抗Ｃｏｘ−２、抗ＴＮＦ−αなどのための興味深い標的を表す。
【００１１】
本発明のアッセイコンセプトは、選択されたＨｕＲ−ＡＲＥ標的相互作用に対する阻害性作用を有する化合物を同定する可能性を提供する。さらにそれは、対応するｍＲＮＡの安定性アッセイのアレイでの直接的特異性クロスチェックの可能性を生じる。これは、第１の場合で、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−４、またはＡＴ−Ｒ１由来のＡＲＥを含む炎症性標的を含むだけでなく、他のＡＲＥ制御標的ファミリーへとアプローチをさらに拡大する可能性も大抵含む。例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、またはｃ−ｆｏｓ様プロトオンコジーンが、スクリーニング可能であると予測される。従って、本発明の該アッセイコンセプトは、新規ｍＲＮＡ標的アプローチに基づく治療上の処置の基礎となる。
【００１２】
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡのＨｕＲタンパク質との複合体形成は、その結果、様々な疾患誘発／介在物質、例えば、炎症性薬物（例えば、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質）の発現を誘導する。従って、該複合体形成を阻害する薬物（agent）は、該物質の発現を妨げる（例えば、該薬物は、炎症介在物質の発現を妨げる（阻害する）か、または低減する）。それ故、該薬物（インヒビター）は、様々な疾患、例えば、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質により介在される疾患の処置で用いられる。
【００１３】
我々は、ここで、該薬物のスクリーニングの単純かつ迅速なＨＴＳ法を可能とする、全長ＨｕＲの可溶性形を見出した。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質の複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定する方法を提供し、これは、
（ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形を用意すること（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
（ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡを用意すること、
（ｃ）候補化合物を用意すること、
（ここで、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の少なくとも１つが、標識されている）、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）を、（ｃ）の存在下および（ｃ）の非存在下で、（ａ）および（ｂ）が複合体を形成するのに十分な時間、混合すること、
（ｅ）段階（ｄ）で形成された複合体の量を検出すること、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を検出すること、
（ｆ）形成された複合体の量および／または見出された非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種を、（ｃ）の存在下と非存在下で比較すること、および
（ｇ）段階（ｆ）で検出された複合体形成に影響する薬物を選択すること、
を含む。
【００１５】
全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は、ＵＳ２００２／０１６５１８６（この内容は、引用により本明細書に取り込まれる）に開示されている。
【００１６】
ＨｕＲタンパク質の可溶性形は、該ＨｕＲタンパク質が、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによりコントロールされるように、水性溶媒、例えば、分光法に適合し、かつ適した条件の生理的ｐＨの水性緩衝液中、すなわち、ミセル形成洗剤、グリセロールなどの非存在下、かつ０．５μＭより、好ましくは、５μＭより高いタンパク質濃度で凝集および沈殿を示さないことを意味する。これとは対照的に、野生型全長ＨｕＲは、該条件で高度合いの凝集、および沈殿の傾向を示す（すなわち、それは、類似条件下で実質的に不溶性である）。
【００１７】
本発明のアッセイで用いられるタンパク質の濃度は、特定のｍＲＮＡ（フラグメント）とＨｕＲとの結合親和性に依存する（例えば、本発明のアッセイで用いられるタンパク質濃度は、２種間の結合親和性が高い場合低く、あるいはその逆も同様である）。
溶媒は、水性溶媒、例えば、緩衝溶液、例えば、水性生理緩衝溶液を含む。
【００１８】
我々は、ＨｕＲタンパク質、すなわち、配列番号：３または配列番号：４のＡＲＥ−ｍＲＮＡに対する、全長ＨｕＲの生理的結合活性を含む特定のフラグメント；および、なおさらに驚くべきことには、配列番号：１または配列番号：２の全長ＨｕＲタンパク質（ここで、ただ１個のアミノ酸のカルボン酸（すなわち、Ｃ末端アミノ酸Ｋ）が、野生型と比較してエステル化されている）の可溶性形を見出した。好ましくは、Ｃ末端アミノ酸の該カルボン酸は、例えば、２−メルカプトエタンスルホン酸、またはその塩（例えば、ナトリウム）の使用により、アルキルメルカプト基でエステル化され、チオエステル形の、配列番号：１または配列番号：２の対応するエステル化ＨｕＲタンパク質を生じる。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：１または配列番号：２（配列番号：１に対応するが、位置１のアミノ酸は含まない）の全長ＨｕＲタンパク質（ここで、位置３２６のＣ末端アミノ酸は、エステル化されている（例えば、チオエステル形の、配列番号：１または配列番号：２の全長ＨｕＲタンパク質）を提供する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：３または配列番号：４のＨｕＲタンパク質フラグメントを提供する。
【００２１】
配列番号：３または配列番号：４のＨｕＲタンパク質フラグメントは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡに対する全長ＨｕＲの擬似生理的結合活性を含む、ｍＲＮＡ認識モティーフ１および２、すなわち、配列番号：１のアミノ酸１〜１８９、または配列番号：１のアミノ酸２〜１８９を含む。「擬似生理的」は、本発明のアッセイ条件下での結合親和性を意味する。結合親和性の証拠は、例えば、表１に示される。
【００２２】
本発明の別の態様において、ＨｕＲタンパク質は、同種供給源として提供される。
ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡフラグメントは、合成方法、または試験管内転写により製造される。ｍＲＮＡフラグメントの合成製造のため、オリゴヌクレオチドが、例えば、通常の補法に従い（例えば、類似して）（例えば、（保護）ホスホラミダイト、および適当な溶媒中の結合試薬の使用により）、合成される。より長いフラグメントは、好ましくは、試験管内転写により、製造される。好ましくは、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡフラグメントは、５から８０ヌクレオチド長を有する。
【００２３】
我々は、ＨｕＲが認識するのに最小限９ヌクレオチドを必要とすることも見出した。ＨｕＲは、９つの部分からなるＲＮＡ配列モチーフＮＮＵＵＮＮＵＵＵ（ここで、Ｕはウラシルであり、そしてＮは、ＲＮＡヌクレオチド、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）の任意の１つであり得る）と高親和性で結合する。該ＲＮＡ配列モチーフは、ＨｕＲの結合部位である。ＨｕＲの該モチーフとの結合Ｋｄは一定（基礎となるＫｄ）であり、０．９７ｎＭ±０．２４である。
別の態様において、従って、本発明は、ＨｕＲの結合部位である単離ＲＮＡ配列モティーフを提供する。
【００２４】
候補化合物は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対するその影響が、本発明に従い、予測されるもの由来の化合物（ライブラリー）を含み、例えば、（ｍ）ＲＮＡフラグメント、ＤＮＡフラグメント、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ミメティックス、低分子（例えば、低分子量化合物（ＬＭＷ）、好ましくは、ＬＭＷ）を含む。
薬物は、複合体形成に対する影響が証明されたため、選択された候補化合物の１つである。
【００２５】
検出の目的上、物質（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の少なくとも１つは、検出可能な標識、例えば、固有の標識タンパク質を生じる。標識は、必要に応じて、通常の方法に従い（例えば、類似して）（例えば、任意の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の反応基の、標識物質の反応基との化学反応により）、実行される。該反応基は、アミノ酸残基、例えば、システイン残基、チオエステル、アルデヒド、マレイミド、マレイミドカルボン酸、ビニル、ハロアルキルカルボニル、ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含む。好ましくは、それは、標識されたｍＲＮＡフラグメントであり、好ましくは、それは蛍光標識されている。
【００２６】
ＨｕＲタンパク質とＡＲＥ含有ｍＲＮＡフラグメントとの間で形成された複合体、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種の検出の適当な方法は、単分子感度の応用に特に焦点を当てた蛍光分光法、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布分析法（ＦＩＤＡ）、または蛍光異方性の検出、または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）（例えば、Kask P. et al, Biophys. J. (2000) 78 (4), 1703-1713に記載）に基づく応用法を含む。
【００２７】
好ましい実施態様において、本発明のアッセイは、２次元ＦＩＤＡ異方性分析法（ここで、ｍＲＮＡとＨｕＲ間の複合体の蛍光異方性は、２つの偏光チャンネルに対して設定された、顕微鏡共焦点検出の拡大により、１分子の感度で決定される）の使用により、行われる。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、ＡＲＥ含有ｍＲＮＡとＨｕＲタンパク質との複合体形成に対する阻害作用を有する薬物を同定するスクリーニングアッセイを提供し、これは、次の要素
ａ）ＨｕＲタンパク質の可溶性形（ただし、全長ＨｕＲ・グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質は除外される）、
ｂ）ＡＲＥ含有ｍＲＮＡ、および
ｃ）必要に応じて、該ＡＲＥ含有ｍＲＮＡと該ＨｕＲタンパク質間で形成された複合体の量、および／または非複合体形成ｍＲＮＡ／タンパク質種の量を検出する手段、
を含む。
【００２９】
該キットは、例えば、試験されるべき試料の適当な環境を含む、実質的物質、および例えば、試験されるべき試料中の候補化合物の作用を測定する適当な手段をさらにふくんでもよい。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、本発明による方法で同定された薬物を有効成分として、少なくとも１つの医薬賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
医薬としての使用のため、薬物は、１以上の薬物、例えば、薬物の組合せを含む。
【００３１】
本発明による医薬組成物は、サイトカイン、成長因子、プロトオンコジーン、またはウイルスタンパク質からなる群から選択される、物質、例えば、炎症作用（誘発／増強）物質の産生と関係する病因を有する疾患の処置のために用いられる。
【００３２】
好ましくは、該物質は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＡＴ−Ｒ１、Ｃｏｘ−２、ｃ−ｆｏｓ、およびｃ−ｍｙｃからなる群から選択される。
処置は、処置および予防を含む。
【００３３】
以下の実施例において、温度は全て摂氏で示され、そして未補正である。
次の略語が用いられる。
【表１】
2005529590.tif 000003
【００３４】
実施例１：
全長ヒトＨｕＲの可溶性形（＝ｓｆｌ−ＨｕＲ）
アミノ酸１〜３２６を包含する（＝配列番号：１）か、または位置１のアミノ酸Ｍのない（＝配列番号：２）、組換え全長ヒトＨｕＲ：
ＭＳＮＧＹＥＤＨＭＡＥＤＣＲＧＤＩＧＲＴＮＬＩＶＮＹＬＰＱＮＭＴＱＤＥＬＲＳＬＦＳＳＩＧＥＶＥＳＡＫＬＩＲＤＫＶＡＧＨＳＬＧＹＧＦＶＮＹＶＴＡＫＤＡＥＲＡＩＮＴＬＮＧＬＲＬＱＳＫＴＩＫＶＳＹＡＲＰＳＳＥＶＩＫＤＡＮＬＹＩＳＧＬＰＲＴＭＴＱＫＤＶＥＤＭＦＳＲＦＧＲＩＩＮＳＲＶＬＶＤＱＴＴＧＬＳＲＧＶＡＦＩＲＦＤＫＲＳＥＡＥＥＡＩＴＳＦＮＧＨＫＰＰＧＳＳＥＰＩＡＶＫＦＡＡＮＰＮＱＮＫＮＶＡＬＬＳＱＬＹＨＳＰＡＲＲＦＧＧＰＶＨＨＱＡＱＲＦＲＦＳＰＭＧＶＤＨＭＳＧＬＳＧＶＮＶＰＧＮＡＳＳＧＷＣＩＦＩＹＮＬＧＱＤＡＤＥＧＩＬＷＱＭＦＧＰＦＧＡＶＴＮＶＫＶＩＲＤＦＮＴＮＫＣＫＧＦＧＦＶＴＭＴＮＹＥＥＡＡＭＡＩＡＳＬＮＧＹＲＬＧＤＫＩＬＱＶＳＦＫＴＮＫＳＨＫ３２６
の調製を、ＩＭＰＡＣＴ［登録商標］−ＣＮシステム（New England Biolabs）を用いて、次のように行った。
【００３５】
ａ）クローニング
活性化ヒトＴリンパ球、ならびにヒト単球由来樹状細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーから、全長ヒトＨｕＲをＰＣＲ増幅し、ベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１（New England Biolabs）のＮｄｅＩとＳａｐＩ部位向きでクローン化し、これにより、さらにアミノ酸を挿入することなく、インテインＣＢＤタグとのＣ末端融合が可能となる。
【００３６】
ｃＤＮＡ
活性化ヒトＴリンパ球由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、およびＬＰＳ刺激性単球由来樹状細胞のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのｃＤＮＡを、Thermoscript［登録商標］ＲＴ−ＰＣＲシステム（GIBCO/LIFE TECHNOLOGIES）を用いて、両ＲＮＡ供給源から調製する。生じたｃＤＮＡを、ヒトＨｕＲのＰＣＲ増幅のために用いる。
【００３７】
ＰＣＲ
ベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１のＮｄｅＩとＳａｐＩ制限酵素部位向きにクローン化するための適当な制限酵素部位を含有するオーバーハングを有する、完全コード配列（ＣＤＳ）（アミノ酸１〜３２６を包含）フランキングプライマーを設計する。
フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴ−３’
リバースプライマー：５’−ＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧ−３’
下線のヌクレオチドは、向き指定のクローニングのため、ＰＣＲ産物に付加した制限酵素部位を示す。
【００３８】
それぞれのｃＤＮＡ供給源について、標準的ＰＣＲ条件を用いて、７回、同一のＰＣＲ反応を行う。０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル（１５×１５×０．８ｃｍ）上、１０μｇ／ｍｌ  エチジウムブロマイド含有ＴＡＥ緩衝液中、８０Ｖ（一定電圧）での９０分間の製造的アガロース電気泳動により、ＰＣＲ反応産物を精製する。４８０ｎｍのトランスイルミネーションの下、Dark Reader上で、滅菌済みメスでバンドを切り出す。
アガロースゲルスライスから、NucleoSpin Extract 2in1 Kit（Machery&Nagel）を用いて、製造元のプロトコールに従い、試料を抽出する。
【００３９】
配列決定
ＰＣＲ後、増幅物の配列を自動ＤＮＡシークエンサーにより確認する。それぞれのｃＤＮＡ供給源由来の、２つのＰＣＲ試料のＤＮＡ配列を分析する。ABI PRISM［登録商標］BigDye［登録商標］Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（PE APPLIED BIOSYSTEMS）を用いて、製造元のプロトコールに従い、配列決定反応を行う。キャピラリー電気泳動を、ABI［登録商標］ PRISM 310 GENETIC ANALYZER（PE APPLIED BIOSYSTEMS）で、標準的プロトコールに従い行う。データをABI［登録商標］PRISM 310ソフトウエア（PE APPLIED BIOSYSTEMS）で処理する。
【００４０】
制限酵素切断
両ｃＤＮＡ供給源由来のＰＣＲ産物、およびベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１をＮｄｅＩおよびＳａｐＩで２重切断後、ベクターＤＮＡおよびＰＣＲ産物を、製造的アガロースＳＧＥ（スラブゲル電気泳動）により、分離する。適当なサイズ（ｐＴＸＢ１／ＮｄｅＩ−ＳａｐＩについては６４５８ｂｐ；ｐＴＹＢ１／ＮｄｅＩ−ＳａｐＩについては７４２６ｂｐ；ＰＣＲ産物については９８５ｂｐ）のバンドを、トランスイルミネーション下、Dark Reader（４８０ｎｍ）上で滅菌済みのメスで切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて、製造元のプロトコールに従い抽出する。LKB Biochrom II分光光度計にて、５０μｌのＵＶ石英セル（LKB Biochrom Ultrospec ＵＶ石英セル、P/N 4001-088）を用いて、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより、溶出したＤＮＡを定量する。
【００４１】
ライゲーション
１：１および３：１（インサート：ベクター）モル比で、両ｃＤＮＡ供給源由来のＮｄｅＩ／ＳａｐＩ切断ＰＣＲ産物を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、ベクターｐＴＸＢ１およびｐＴＹＢ１にライゲーションし、プラスミドｐＴＸＢ１／ＨｕＲおよびｐＴＹＢ１／ＨｕＲをそれぞれ得る。
【００４２】
形質転換
化学的なコンピテント細胞のヒートショック形質転換のための標準的プロトコールから若干変更した条件を用いて、ライゲーション反応液由来のプラスミドｐＴＸＢ１／ＨｕＲおよびｐＴＹＢ１／ＨｕＲ（両ｃＤＮＡ供給源由来のＨｕＲインサート）で、自家製ＣａＣｌ２コンピテント細胞（E.coliＥＲ２５６６）を形質転換する。形質転換細菌をＬＢ−Ａｍｐプレートにまき、コロニーを３７℃で一晩成長させる。シングルコロニーをピックアップし、対数増殖期後期まで液体培地中で成長させる。回収した細菌細胞から、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）を用いて、製造元のプロトコールに従い、組換えプラスミドＤＮＡを単離し、ＮｄｅＩでの制限酵素切断、対それぞれ、ＮｄｅＩかつＰｓｔＩ（ｐＴＸＢ１／ＨｕＲに対して）またはＮｄｅＩかつＫｐｎＩ（ｐＴＹＢ１／ＨｕＲに対して）での２重切断により、正しいインサートサイズの存在についてチェックする。
【００４３】
生じた組換えプラスミド全ての配列を、上で示したように、自動ＤＮＡ配列決定により確かめる。ベクターＤＮＡにはない結合部位を有する、ＮｄｅＩ部位の上流およびＳａｐＩ部位の下流の一致配列に対して相補的なプライマーを用いて、ＤＮＡ配列を生成する。
【００４４】
ｂ）発現および精製
ＬＢブロス培地中で対数増殖期後期まで成長した、細菌培養液への１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により、クローン化ＨｕＲ−インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質の発現を誘導し、２８℃で６時間おく。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ（ｐＨ８．０）、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．２％  Pluronic F-127（Molecular Probes）緩衝液中での連続凍結／解凍サイクルにより、該細菌細胞を溶解する。ＤＮＡ切断後、細菌ライセートを超遠心分離法により透明にし、該融合タンパク質を、ＣＢＤによるキチンアガロースビーズ（New England Biolabs）上で捕獲する。溶解緩衝液でビーズを広範囲に洗浄した後、Ｎａ−２−ＭＥＳＮＡを添加し（最終濃度５０ｍＭ）、そして４℃で１２時間インキュベーションすることで、チオール誘導性カラム上でのインテインのセルフスプライスにより、該組換えタンパク質を回収する。任意の同時に溶出した、インテインタグおよび非切断融合タンパク質を、第２の親和性減少段階での溶出物から取り出す。最後に、該タンパク質を、標的緩衝液（２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Pluronic F-127）で事前に平衡化した、ゲル濾過カラム（DG-10、Bio-Rad）により溶出し、適当な貯蔵緩衝液に移し、液体窒素中で少量ずつ瞬時に凍結し、−８０℃で保存する。
【００４５】
Ｎａ−２−ＭＥＳＮＡによりエステル化されている全長ＨｕＲタンパク質を、チオエステルとして得る。生じたチオエステルは、生理的ｐＨ（例えば、分光法に適合した条件）の水性緩衝液中で凝集および沈殿（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはＵＶ分光法によりコントロールされる）共に示さず、かつ０．５μＭより、好ましくは、５μＭより高い濃度を示す。
【００４６】
ｃ）特徴付け
変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＵＶ分光法、分析的サイズ排除クロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ分析法、およびＣＤ分光法により、実施例２に記載の標準的プロトコールに従い精製タンパク質の質をコントロールする。記載の条件で、全長ＨｕＲは、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼの様な親水性融合タグを必要とすることなく、溶解する。ＵＶ分光法の結果は、３３０ｎｍより上での吸収は示さず、かつ分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＨｕＲは、２４．２ｋＤを最大とするシグナルピークとして溶出する）は、該タンパク質の高凝集状態は所定の緩衝液濃度で存在しないという証拠を提供する。
【００４７】
実施例２：
配列番号：１の最初の２つのＲＲＭのみ（配列番号：１のアミノ酸１〜１８９＝配列番号：３）または配列番号：１のアミノ酸２〜１８９（＝配列番号：４）を包含するＨｕＲ変異体（ＨｕＲ１２）
上記のアミノ酸を包含するヒトＨｕＲの短い可溶性変異体を、ＩＭＰＡＣＴ−ＴＷＩＮシステム（New England Biolabs）を用いて、制限酵素部位ＮｄｅＩおよびＳａｐＩの向きにクローニングすることにより調製する。最近の研究において、該最初の２つのフラグメントを、効率的ＲＮＡ結合に重要かつ十分であると同定し、そして関係タンパク質（ＨｕＤ、Ｓｘｌ）に関する匹敵する発見は、ほぼ、該短い構造物がリガンド結合での十分な特異性を保つという結論を導く。可溶性組換えタンパク質を、細菌培養液から調製する。
【００４８】
ａ）クローニング
クローニングを実施例１に記載のように行うが、アミノ酸１〜１８９由来のヒトＨｕＲ（以下、ＨｕＲ１２として言及する）の完全コード配列フランキングプライマーを適宜設計する。
【００４９】
ｂ）発現
E.coliＥＲ２５６６−ｐＴＷＩＮ１／ＨｕＲ１２を、組換えヒトＨｕＲ１２の大スケール精製のための発現システムとして用いる。培養を実施例１に記載のように行う。ＩＰＴＧによる発現の誘導の際の粗細菌細胞ライセートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、クローン化ＨｕＲ１２−Ｍｘｅ−インテイン−ＣＢＤ融合タンパク質の予測サイズに対応する、〜４８ｋＤの新生タンパク質を現す。
ｃ）精製
アフィニティークロマトグラフィーを、実施例１に記載のように行う。
ＨｕＲ１２の製造的ＨＰＬＣ−精製
第２のキチンカラムから溶出した溶液を、製造的ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製する。概略、溶液中の全タンパク質濃度を、Bradfordタンパク質アッセイ（Bio-Rad）を用いて、製造元のプロトコールに従い評価する。それぞれの製造的実施において、タンパク質１から５ｍｇに対応する量を、DeltaPak［登録商標］Ｃ４、１５μｍ、３００Å、２５０×１０ｍｍ  ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（WATERS）に注入する。溶出を、１００％  Ａ（５％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）から１００％  Ｂ（９５％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ、０．１％  ＴＦＡ）の直線的勾配、５０分間、一定流速１０ｍｌ／分で行う。２３０ｎｍでのＵＶ吸収、およびλｅｘ＝２８０ｎｍ／λｅｍ＝３４０ｎｍでの蛍光を測定することにより、検出を行う。ＨｕＲ１２は、典型的には、〜６０％  Ｂ（〜５９％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮに対応）により溶出する。分画３ｍｌを集め、変性非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＨｕＲ１２含有分画を集める。溶液を最終的に液体Ｎ２中で容器凍結し、タンパク質を−５９℃、０．００５ｍｂａｒで３６時間凍結乾燥する。凍結乾燥ＨｕＲ１２含有フラスコをアルゴンで洗い流し、連続する精製段階のため−２０℃で貯蔵する。
【００５０】
イオン交換クロマトグラフィーによるリホールディング
凍結乾燥ＨｕＲ１２（理論的ｐＩ＝７．８４）を、イオン交換カラム上でリホールディングする。概略、それぞれのクロマトグラフィーの実施に対して、凍結乾燥ＨｕＲ１２  １〜１．５ｍｇをアルゴン下で計量し、８Ｍ  尿素含有５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ３／Ｎａ２ＨＰＯ３緩衝液（ｐＨ５．５０）に溶解し、そして、ＳセファロースＦＦ（AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）でパックした１０ｍｍ（内径）×９０ｍｍカラムのベッドに直接添加する。ＬＫＢ−ＬＣＣ  ５００装置にカラムを装着後、タンパク質を、増加ＮａＣｌ濃度の勾配で溶出する。勾配中、分画１ｍｌを集める。等量を変性非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、タンパク質バンドを銀染色で可視化する。ＨｕＲ１２は典型的には、濃度２５０ｍＭおよび３５０ｍＭ  ＮａＣｌ（最大値は、２８５ｍＭ  ＮａＣｌのとき）で溶出する。ＨｕＲ１２含有分画を集め、因子５によるAMICON CENTRIPREPS（ＹＭ−３、ＭＷＣＯ＝３０００Ｄａ）での遠心により濃縮し、貯蔵緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ３／Ｎａ２ＨＰＯ３、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．００）で透析し、液体窒素中、小滴で瞬時に凍結し、−８０℃で貯蔵する。
【００５１】
ｄ）生化学的特徴付け
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
精製ＨｕＲ１２  ３０μｇを、Zorbax DuPont GF-250、９．４ｍｍ（内径）×２５ｃｍカラム（ＨＰ、Ｐ／Ｎ  ８８４９７３９０１）に注入し、貯蔵緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ３／Ｎａ２ＨＰＯ３、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．００）で、一定流速１ｍｌ／分、一定組成で溶出する。２８０ｎｍでのＵＶ吸収、および連続的に配置した２つの検出器でのλｅｘ＝２８０ｎｍおよびλｅｍ＝３４０ｎｍ（ゲイン＝１０、、減衰＝８）での蛍光を測定することにより、検出を行う。試料の保持時間を、同一条件のサイズ検量線から得たクロマトグラムと比較する。ＨｕＲ１２は、最大ピーク２０．４１ｋＤ（ベース範囲＝８．３３ｋＤ〜３６．１４ｋＤ）のシグナルピークとして溶出し、これは、該タンパク質の高い凝集状態がないことが、所定の緩衝液濃度で推定され得るという証拠を提供する。
【００５２】
Ｎ末端配列決定
凍結乾燥ＨｕＲ１２  ５００ｐｍｏｌを、Ｎ末端のEdman配列分析（タンパク質配列決定機ＨＰ−Ｇ１０００Ａ）にかける。試料は、予測アミノ酸配列（ＳＮＧＹＥＤＨＭＡＥＤＣＲＧＤＩＧＲＴＮ）を生じる同種Ｎ末端を示すが、Ｎ末端Ｍｅｔを量的に欠く。配列分析から測定した試料の純度は９７％より高い。
【００５３】
質量分析
凍結乾燥ＨｕＲ１２  ５００ｎｇを、ＬＣ−ＥＳＩ／ＴＯＦ（液体クロマトグラフィーイオン化／フライト時間）質量分析にかける。ＭＳ−スペクトルは、４つの主なピークを生じる。
Ａ．．．２０８４９．５Ｄａ                          （＜５％）
Ｂ．．．２０９７４．３Ｄａ，＝Ａ＋１２４．９Ｄａ    （＞９５％）
【００５４】
Ａは、Ｍｅｔを欠くＮ末端を有する（Ｎ末端配列決定により示す）、アミノ酸配列配列番号：２
Ｓ位置２ＮＧＹＥＤＨＭＡＥＤＣＲＧＤＩＧＲＴＮＬＩＶＮＹＬＰＱＮＭＴＱＤＥＬＲＳＬＦＳＳＩＧＥＶＥＳＡＫＬＩＲＤＫＶＡＧＨＳＬＧＹＧＦＶＮＹＶＴＡＫＤＡＥＲＡＩＮＴＬＮＧＬＲＬＱＳＫＴＩＫＶＳＹＡＲＰＳＳＥＶＩＫＤＡＮＬＹＩＳＧＬＰＲＴＭＴＱＫＤＶＥＤＭＦＳＲＦＧＲＩＩＮＳＲＶＬＶＤＱＴＴＧＬＳＲＧＶＡＦＩＲＦＤＫＲＳＥＡＥＥＡＩＴＳＦＮＧＨＫＰＰＧＳＳＥＰＩＴＶＫＦＡＡＮＰＮＱ１８９の予想質量に正確に対応する。Ｂの質量は、同一アミノ酸配列に対応するが、Ｃ末端２−ＭＥＳＮＡ−チオエステルを有する。
【００５５】
ウェスタンブロッティング
精製タンパク質５００ｎｇを、変性還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次に、標準的半乾燥条件を用いて、ＰＶＤＦ膜にタンパク質バンドを移す。１次抗体としてマウスモノクローナル抗ＨｕＲ  １９Ｆ１２（Ｎ末端ペプチドに対して生じたもの、MOLECULAR PROBES）、２次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（PIERCE）を用いて、タンパク質バンドを検出し、ＨＲＰ基質（ＥＣＬ［登録商標］ウエスタンブロッティング検出キット、AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH）とインキュベーション後、Ｘ線フィルムにブロットを曝露して、可視化する。展開フィルムは、ＨｕＲ１２（２１ｋＤ）のバンドに対応するサイズの抗ＨｕＲ抗体の強力シグナル、およびＨｕＲ２量体の存在を示す、約４２ｋＤに対応するバンドの弱シグナルを現す。試料中の少量のＨｕＲ１２  ３量体を示す、より弱いシグナルを〜７０ｋＤのサイズで検出する。
【００５６】
ＣＤ−分光法
精製方法後のタンパク質ホールディング、ならびに蛍光標識をＣＤ−分光法によりモニターする。集めたデータは、上記のように精製したＨｕＲをホールディングし、βシートおよびαらせん体含有量（〜３０％）を有する第２の構造を示す。さらに連続する実験は、ＲＮＡ結合の際の該タンパク質の第２の構造は、任意の相当な変化を鎮めないが、ＲＮＡの第２の構造での顕著な変化は、ＨｕＲ１２結合の際生じるという証拠を提供する。生じたタンパク質は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／またはＵＶ分光法によりコントロールするように、例えば、分光法適合条件の生理的ｐＨの水性緩衝液中での凝集および沈殿を示さず、かつ濃度＞１００μＭを示す。
【００５７】
実施例３：
ＨｕＲ１２の蛍光標識
調製タンパク質ＨｕＲ１２の部位特異的蛍光標識については、既に先に記載したいくつかの方法に従い得る。１つの例として、マレイミド活性化蛍光ダイの２重結合とのチオール基の結合により、ＨｕＲのより短い変異体中の１システイン残基のみの存在（位置１３）を部位特異的標識に理論的に適合させる。最も安定かつ上手く特徴付けるダイの１つとして、５−カルボキシ−ＴＭＲ−マレイミドを選択し、ＨｕＲ１２と結合させる。
【００５８】
実施例４： 
ｍＲＮＡフラグメントの調製
ＨｕＲ−ｍＲＮＡ結合と関係するＲＮＡ安定化の特異的過程を、分解の標的であるメッセンジャーの３’ＵＴＲ中のシス作用配列エレメントによりコントロールする。該責任のあるエレメントは、５つの部分からなるＡＵＵＵＡのいくつかの繰り返しの存在を本質的に特徴とする、ＡおよびＵのリッチな配列（ＡＵリッチエレメント、ＡＲＥと命名）である。特徴として、これらを、大抵、オーバーラップする９つからなるＵＵＡＵＵＵＡＵＵの形のＵのリッチな領域内でクラスター形成する。該エレメントは、サイズ９から約１００ｎｔの範囲にあり、典型的には、化学合成に理論的に適した〜３０ｎｔの長さである。しかしながら、ＡＲＥ単独の可能性のある生体内不安定化は、全３’ＵＴＲの環境内に取り込まれた同一ＡＲＥのものより、顕著に弱いという証拠が存在する。従って、ＡＲＥ自体だけでなく、興味あるメッセンジャーのＡＲＥ周囲の増加するサイズのフラグメント、ならびに、可能な限り、全長３’ＵＴＲは本発明のアッセイコンセプトで適用可能であろう。
【００５９】
酵素的方法は、ｍＲＮＡ配列中の特定の位置での単一標識の誘導を可能としないので、５０〜７０ｎｔの全フラグメントについての選択方法は、Applied Biosystem 394A合成機でトータルに化学合成することである。例えば、Auer M. et al., in: Schroeder & R Wallis M, editors. RNA-Binding Antibioitics:Molecular Biology Intelligence Unit 13. Georgetown, Texas: Landes Bioscience, 2001:164-180のプロトコールを参考とし、かつ適用して、２つの異なる種類の２’保護基を有する、ｎｔホスホラミダイトで化学合成を行う。合成反応後に異なる範囲のダイとの結合を可能とするために、合成中にアミノリンカーを導入する。該リンカーを、例えば、全合成フラグメントの５’末端で導入する。
【００６０】
合成ＯＲＮを脱保護し、製造的ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）により、精製し、次に、切り出したゲルスライスから抽出し、そして電気溶出する。２６０ｎｍでの吸収を測定することにより、濃度を決定する。フラグメントの純度を、分析的ＨＰＬＣによりコントロールする。
【００６１】
ａ）化学合成
ＲＮＡ  ＯＲＮを、それぞれ、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’Ｏ−ｔＢｄＭＳ−保護β−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−）ホスホラミダイト、または５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’Ｏ−ＴＯＭ−保護ｎｔホスホラミダイト溶液［無水ＣＨ３ＣＮ中０．１Ｍ］、および２’−ｔＢＤＭＳ、または２’−ＴＯＭ−保護ｎｔにより合成し、公開方法（例えば、Chaix C. et al., Nucleic Acids Symp Ser. 1989 (21) 45-6; Scaringe S.A. et al., Nucleic Acids Res. 1990 Sep.25; 18 (18):5433-41）、および製造元のプロトコールを適用し、１μｍｏｌのスケールでApplied Biosystem 394A合成機のＣＰＧ上に固定化する。１５秒間おき、結合試薬を２カ所の連続する位置に添加する。結合段階のホスホラミダイトの活性化を、テトラゾール（無水ＣＨ３ＣＮ中０．５Ｍ）により行う。それぞれ、１１分間（２’−ｔＢｄＭＳ−保護ｎｔ−ホスホラミダイト用）または７分間（２’−ＴＯＭ−保護ｎｔ−ホスホラミダイト用）の結合中、試薬溶液の０．１秒「アップおよびダウン」パルスにより、ＣＰＧ支持体を定期的に攪拌する。無水酢酸／ＴＨＦとの結合を２０秒間、Ｉ２／ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏでの酸化を１分間、ＣＨ３ＣＮでの洗浄段階を４０秒間行う。ジメトキシトリチル脱保護を、３％（ｗ／ｖ）  ＴＣＡ／ＣＨ２Ｃｌ２により、４０秒間４回、そして計反応時間５分間行う。６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイトを、合成中のオリゴヌクレオチドの５’位置で、１５分間、ルアー注射器送達により、アルゴン雰囲気下の活性化溶液２００μｌに直接溶解した試薬１１μｍｏｌを用いて、手動で結合させる。溶解試薬を乾燥した注射器に引き入れ、針を除去後、カートリッジにより押し出し、別の注射器の第２のルアー濃度に近づける。１５分間の結合時間中、２本の注射器の非同調的攪拌により、定期的に溶液を攪拌する。合成サイクルの残りの段階を、装置上で行う。アミノリンカー取り込みの効率を、収集脱トリエチル基溶液の色調強度に基づき、評価する。
【００６２】
ｂ）合成ｍＲＮＡの精製
支持体からの切断、塩基およびリン酸塩脱保護
１．０または０．５μｍｏｌ  スケール合成由来の粗ＲＮＡ産物を、ＣＰＧ支持体から切断し、飽和エタノール中のＮＨ３により塩基およびリン酸塩脱保護する。４０℃で１７時間インキュベーション後、該支持体を集める。ＣＰＧをさらに、エタノールで３回洗浄し、次に、エタノール／Ｈ２Ｏ（１：１）およびＨ２Ｏで洗浄する。洗浄溶液を切断溶液と合併し、溶媒を蒸発させる。
【００６３】
２’−脱シリル化
粗ＯＲＮの２’脱保護のため、乾燥産物を、１．１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液１．８ｍｌに溶解し、ボルテックスミキサー上、ＲＴで少なくとも１５時間インキュベーションする。反応を、０．５Ｍ  ＮＨ４Ａｃ溶液４００μｌの添加により終結させ、氷上で１０分間インキュベーションする。該溶液を、Ｈ２Ｏ１．４ｍｌの添加により、最終濃度５０％（ｖ／ｖ）まで希釈し、一部分、２．５ｍｌ以下まで蒸発させる。溶液を脱塩し、２６０ｎｍでの吸収を測定することにより決定した、ＯＲＮ含有分画を合併し、そして溶媒を蒸発させる。
【００６４】
粗ＲＮＡ産物のＰＡＧＥ精製
ＲＮＡ試料の乾燥分画をＨ２Ｏに溶解し、エタノールで沈殿させ、そして遠心によりペレット化する。該ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏに溶解し、ゲルローディングバッファー（９５％（ｖ／ｖ）  脱イオン化ホルムアミド、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２５％（ｖ／ｖ）キシレンシアノールブルー、０．０２５％（ｗ／ｖ）  ブロモフェノールブルー、０．０２５％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ）と１：１希釈する。ＲＮＡを８５℃で２分間変性し、氷上ですぐに冷却し、電気泳動する。試料を、変性１２％  ポリアクリルアミドゲル（６Ｍ  尿素、１２％（ｗ／ｖ）  アクリルアミド／ビスアクリルアミド（４０：１）、Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー；４００×２００×１．５ｍｍ）の電気泳動により精製する。電気泳動を、４５Ｗ（一定出力）で４時間、ブロムフェノールブルーが底方向の４／５まで移動するまで、行う。電気泳動後、ゲルをプレートから取り出し、サランラップで覆う。バンドを、２５４ｎｍ（携帯用ＵＶランプ）で蛍光ＴＬＣプレートをＵＶ照射することにより可視化し、Polaroid PoloPan 52 Iso400（Kodak UV Wrattenフィルター、ｆ．３．５）により、２０秒間撮影する。
【００６５】
ポリアクリルアミドゲルからのＲＮＡフラグメントの回収
主要産物のゲルスライスを切り出し、ＲＮＡをポリアクリルアミドゲルスライス（それを小片に切り、５０ｍＭ  ＮＨ４Ａｃと共に、室温で少なくとも９時間インキュベーションすることにより）から抽出し、電気泳動する。さらに、Schleicher and Schuell Elutraps 100、少なくとも３×１時間３０分間、２００Ｖ（一定電圧）、ＴＡＥ緩衝液中での電気泳動により、ゲル中の任意の残りのＲＮＡを回収する。溶液を脱塩し、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することにより決定した、ＯＲＮ含有分画を合併し、溶媒を蒸発させる。
【００６６】
ｃ）特徴付け
ＨＰＬＣ分析を、ＵＶ検出装置（Beckman System Gold Programable Detection Mode）、および蛍光検出器（Waters［登録商標］471 Scanning Fluorescence Detector）の装着したBeckman System Gold機械（Beckman System Gold Programable Solvent Module）で行う。データ分析を、Beckman System Gold MDQソフトウエアにより行う。タンパク質／ペプチド精製カラム（すなわち、VYDAC［登録商標］Protein & Peptide Column（４．６×２５０ｍｍ、３００Å−Ｃ１８−５μ））上、１００％  溶媒Ａ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡｃ、ｐＨ６．５／ＣＨ３ＣＮ、９５：５）の５分間の洗浄段階、および１００％  溶媒Ａから１００％  溶媒Ｂ［Ａ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡｃ、ｐＨ６．５／ＣＨ３ＣＮ、５０：５０］の連続的勾配による室温での４５分間の溶出により、クロマトグラフィーを行う。分析的実施のため、精製ＲＮＡ１．５から３０μｇを、８５℃での２分間の変性し、氷上で５分間インキュベーションした後、注入する。
【００６７】
この方法に基づき、ヒトＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２、ＴＮＦ−α、ＡＴ−Ｒ１、ならびに様々な戦略的に設計した比較配列のＡＵリッチエレメントから選択した、５〜５８ｎｔ長の２９の異なるフラグメントを合成する。２９の合成配列中２５の５’末端に、アミノ−Ｃ６修飾因子（Glen Research）を取り込む。該修飾により、スクシンイミジルエステル活性化蛍光ダイの誘導が可能となる（実施例６参照）。
【００６８】
実施例５：
アッセイの実行
増加濃度の組換え全長ＨｕＲまたはＨｕＲ１２の可溶性形に対して、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、Ｃｏｘ−２、ＩＬ−１β、またはＴＮＦ−αのＡＲＥに対応する蛍光標識ＲＮＡフラグメント（カルボキシ−ＴＭＲにより５’末端標識し、そしてそれぞれ、３３、５８、２６、３５、３３、および３４ｎｔ長である）のタイトレーションを行う。ＨｕＲ（分子量〜３６０９１２）またはＨｕＲ１２（分子量〜２０９７４）との複合体の遊離ＯＲＮ（分子量約６０００〜１２０００Ｄａ）についてのサイズ、およびそれ故異方性の予測増加は、異方性シグナルの変化が、必要な正確さで検出されるのに十分であることを示す。
【００６９】
表１に示すように、データは、個々のＡＲＥに対するタンパク質親和性の実質的かつ再現可能な変動をはっきりと示す。試験管内において、個々のＡＵリッチエレメントを、ＨｕＲ介在性制御と関係すると分かっているｍＲＮＡ安定化の特異性標的からもたらされるため、高親和性のＨｕＲと結合させる。ＨｕＲ１２の場合と同様、第３のＲＲＭ、ならびにヒンジ領域を欠いている場合も、該フラグメント選択性を維持する。このことは、最初の２つのＲＲＭ単独で介在される認識機序を示唆し、これは先行研究の知見と非常に一致する。しかしながら、全長タンパク質は、高親和性の全フラグメントと結合する。Ｋｄは、ほぼ一定の因子５０より低い。対照的に、低親和性フラグメント（ＨｕＲ１２に対するＫｄ＞１μＭ）を、全長タンパク質はもはや全く認識しない（表１参照）。このことは、すなわち、ＲＮＡ複合体形成を増強し、かつ非特異的ＲＮＡリガンドに対する寛容性を低減させ、増加したレベルの特異性を導く、第３のＲＲＭのさらなる役割を示唆する。
【００７０】
ＴＮＦ−α  ＡＲＥに対するＨｕＲの親和性（Ｋｄ＝０．１２ｎＭ＋／−０．０２）は、例えば、Ｃｏｘ−２  ＡＲＥに対するもの（Ｋｄ＝１３．６３ｎＭ＋／−１．０７）より有意に高い。この作用は、配列が著しく異ならないが、同一ではないとき、特に驚くべきことである（表１を参照）。我々は、特に配列依存性、かつＨｕＲ結合に関与する非常に特異的な機序が存在すると結論づける。その結果、我々は、認識は、さらに、１つのＡＵＵＵＡエレメントに対する一般的親和性には基づかないが、該５ヌクレオチドコアの周囲の配列が、実質的に重要であると結論づける。実験を全長ＨｕＲおよびＨｕＲ１２（全長ＨｕＲを短くした変異体）により行い、我々は、ＨｕＲ介在性ｍＲＮＡ安定化の特異性が、第３のＲＲＭに起因しないとさらに判断する。ＨｕＲ介在性ｍＲＮＡ安定化の特異性は、２作用：ＨｕＲの第３ドメインが、他の制御タンパク質との特異的相互作用に関与すること、しかし最初の２ドメインは、配列特異性、または少なくとも選択性を示すこと、の組合せに基づく。このことは、最終的には、個々のＨｕＲ−ＡＲＥ標的、またはすでに、ＲＮＡ認識レベルでの標的ファミリーに対して特異的なインヒビターの可能な同定を示唆する。
【００７１】
表１：
記載の２Ｄ−ＦＩＤＡ−ｒアッセイで決定した、ＡＲＥ配列およびＫｄ値
【表２】
2005529590.tif 000004
【００７２】
実施例６：
ＯＲＮの蛍光標識
標識反応
蛍光ダイを５’末端リンカーと共に導入したアミノ基と、安定カルボキサミドの形成を導く、第１のアミンのスクシンイミジルエステル活性化分子との標準的反応により、結合させ得る。該目的上、Ｈ２Ｏ最大２０μｌ中の精製ＲＮＡ５〜１０ｎｍｏｌを、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ９．０）ストック溶液と混合し、最終緩衝液濃度１５０〜３００ｍＭとする。１つの例として、ＴＭＲ−ＮＨＳ（５−カルボキシ−ＴＭＲ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルエステル）を、アルゴン雰囲気下、無水ＤＭＳＯに溶解し、ＲＮＡに添加して２５倍Ｍを超えるものとするが、標識反応物中の最終ＤＭＳＯ濃度は、３０％（ｖ／ｖ）を超えない。インキュベーションを、室温で少なくとも２時間、ライトから保護したボルテックスミキサー上で行う。非反応ダイを、１．５Ｍ  ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌの添加（５０倍Ｍを超える）、および室温で３０分間、ライトから保護したボルテックスミキサー上でのインキュベーションにより加水分解する。
【００７３】
標識ＲＮＡの精製
標識後、ＲＮＡを遊離ダイから分離し、分画０．５ｍｌを集め、上記のＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。２６０ｎｍでのＵＶ吸収、ならびに、ＴＭＲの励起／放出最大波長に対応する、λｅｘ＝５４１ｎｍ、λｅｘ＝５６７ｎｍでの蛍光を測定することにより、標識および非標識ＲＮＡの検出、および遊離ダイの検出を行う。ＲＮＡ含有分画を、類似の条件での製造的ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製する。両標識および非標識ＲＮＡのピークを、先のとがったフラスコに別々に集め、該溶液量を、Rotavapor上で蒸発させて減少させりる。該溶液をエッペンドルフチューブに定量的に移し、Ｈ２Ｏ／エタノールと共に５〜７回、共蒸発させ、任意の残存ＴＥＡＡｃを除去する。乾燥ＲＮＡをＨ２Ｏに溶解し、濃度２０〜５０μＭとし、さらなる使用のため−２０℃で貯蔵する。
【００７４】
実施例７：
試験管内転写により調製したＲＮＡフラグメント
ａ）ＤＮＡ鋳型の調製
化学的に合成するには長すぎる、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲフラグメントの生化学的調製のため、第１の段階において、それぞれのｍＲＮＡの全長３’ＵＴＲ（または対象領域）を含有する組換えプラスミドを入手する必要がある。該プラスミドは、次に、選択したサブフラグメントの試験管内転写の鋳型となる。ヒトＩＬ−２、ＩＬ−１βの全長３’ＵＴＲ、およびＴＮＦ−βの３’ＵＴＲ由来の最初の６００ｂｐの鋳型を調製する。
【００７５】
ＴＮＦ−α
完全コード配列、ならびにＴＮＦ−αの３’ＵＴＲの最初の６００ｂｐを含有する組換えプラスミドを、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection、＃３９９１８、構造物：ｐＡＷ７１１）から購入する。
【００７６】
ＩＬ−２
ヒトＩＬ−２の全長３’ＵＴＲを含有する組換えプラスミドを、実施例１に記載の類似の方法に従い、調製する。概略、ヒトＩＬ−２の全長３’ＵＴＲを、ヒトＴリンパ球から調製したｃＤＮＡライブラリーから、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８（New England Biolabs）のＫｐｎＩおよびＳｐｅＩ制限酵素部位の向きでクローン化するための適当な制限酵素部位を含有するオーバーハングを有するよう設計したプライマーで増幅する。ＰＣＲ増幅およびベクターＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＳｐｅＩで２重切断し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、標準的ヒートショックプロトコールを用いて、ＣａＣｌ２コンピテントE.coli  ＩＮＶαＦ’に形質転換する。選択ＬＢ寒天プレートに播種後、組換えプラスミドＤＮＡ含有シングルコロニー（ブルー・ホワイトセレクションにより決定）をピックアップし、液体ＬＢ−Ａｍｐ培地中で対数増殖期後期まで成長させる。３つのシングルコロニーから単離した組換えプラスミドの配列を、上記の自動ＤＮＡ配列決定により確かめ、アラインメントし、ヒトＩＬ−２の３’ＵＴＲに対して１００％同一性とする（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ２５６７６）。
【００７７】
試験管内転写
１つの例として、ＴＮＦ−α  ３’ＵＴＲの最初の６９７ｎｔに対応する転写物を、次のように試験管内転写により調製する。５’末端のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列を取り込んでいる、ＴＮＦ−αの３’ＵＴＲのｎｔ１〜６９７フランキングプライマーから、ＰＣＲ産物を調製する。次に、流出転写物を、MEGASCRIPT  Ｔ７試験管内転写キット（AMBION）を用いて、製造元のプロトコールに従い調製する。転写後、ＤＮＡ鋳型を、ＲＮＡｓｅフリーのＤＮＡｓｅＩで切断し、そして混合物を、酸性フェノール・クロロホルムによる抽出段階を繰り返すことにより、さらに精製する。ＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏに溶解し、−８０℃で保存する。該産物を、可視化するためにエチジウムブロマイド染色したＰＡＧＥにより、さらに分析し、これは、１つのバンド移動を予測分子量にて現している。さらに、２６０ｎｍでのＵＶ吸収のＲＰ−ＨＰＬＣ（実施例２参照）分析物は、従って、ＲＮＡ転写物に対する単一ピークを示す。
【００７８】
実施例８：
ＨｕＲ結合部位の推測
ポリＵはＨｕＲと高親和性で結合するという、我々の事前の知見に基づき、Ｕ８伸長の影響を試験した。個々のＲＮＡフラグメントを合成し、全長ＨｕＲに対する親和性（Ｋｄ値として与える）を決定する（表２参照）。Ｕ８モチーフ（フラグメント番号１）の最も単純な変異体をＨｕＲは認識しないが、１ヌクレオチド伸長Ｕ９（フラグメント番号２）は、十分に高い結合を示す。非標識ＲＮＡフラグメントとの競合的実験により、蛍光ダイの影響を排除する。９ｍｅｒのフラグメント（フラグメント番号３）は、ＨｕＤモチーフ、および３’末端にさらにヌクレオチドを含有するが、ＨｕＲと非結合である。しかしながら、フラグメント４の高親和性結合は、非Ｕヌクレオチドを、ＨｕＲ結合モチーフ内ではなく、ある種の位置でのみ寛容することを示す。我々は、９ヌクレオチドが、ＨｕＲの結合にとって十分であることを見出し、そして（ＡＵＵＵ）３Ａ内の４つの異なる９ｍｅｒのフレームを試験した（フラグメント番号４ａ）から４ｄ）の太字を参照）。４つの対応するフラグメント内のＨｕＲによる、フラグメント４ｂに限定した認識は、ＨｕＲが、（ＡＵＵＵ）３Ａ内のフレーム２と結合することを示す。該フレームは、ＨｕＤモチーフと一致するが、１ウラシル残基が５’末端で伸長し、これが予備的結合モチーフＮＮ（Ｕ／Ｃ）ＵＮＮ（Ｕ／Ｃ）Ｕ（Ｕ／Ｃ）をしめす。フラグメント５、６、７ａ〜７ｄ、および８ａ〜８ｃは、示した（太字および下線）位置で、それぞれ非ウラシル（Ａ＝アデニンにより証明する）およびＣに対する寛容性試験となる。結果として、我々は、ＨｕＲ配列結合モチーフがＮＮＵＵＮＮＵＵＵであることを見出した。該相互作用は、絶対的な機序に従うようである。シングルミスマッチを有する配列を認識しないが、該モチーフを充足した配列と高親和性かつ不変Ｋｄ、Ｋｄ発見０．９９ｎＭで結合する。
【００７９】
表２：
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００８０】
（原文に記載なし）
【配列表】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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