(57)【要約】本発明はκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよび器官保護剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ−ＰＶＩＩＡ−結合部位に結合する化合物の有効量を、それを必要とする対象哺乳動物または器官に投与することを必要とする対象の哺乳動物の器官を阻止し、保護し、および／または維持する方法。
【請求項２】
該化合物がκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンがκ−ＰＶＩＩＡ、Ｅ６．２，Ｐ６．１、Ｐ６．３、その同族体、そのアナログおよびその誘導体よりなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
該器官が対象の体内で無傷であるか、あるいは摘出されたものである請求項１、２または３記載の方法。
【請求項５】
該器官が循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官、神経系器官、または体細胞よりなる群から選択される請求項１、２または３記載の方法。
【請求項６】
該循環器系器官が心臓である請求項５記載の方法。
【請求項７】
心臓切開手術、心停止法、血管形成術、弁手術、移植、狭心症または心血管病の間に、心血管介入の前、間または後に心臓損傷を低下させ、または正常な血流、栄養物および／または酸素が欠乏した心臓の部分を保護するように、心臓が阻止され、保護されまたは維持される請求項６記載の方法。
【請求項８】
該器官が、循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官、神経系器官、または体細胞よりなる群から選択される請求項４記載の方法。
【請求項９】
該循環器系器官が心臓である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
心臓切開手術、心停止法、血管形成術、弁手術、移植、狭心症または心血管病の間に、心血管介入の前、間または後に心臓損傷を低下させ、または正常な血流、栄養物および／または酸素が欠乏した心臓の部分を保護するように、心臓が阻止され、保護されまたは維持される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アデノシン受容体アゴニストが該対象に投与される請求項１ないし１０いずれか１記載の方法。
【請求項１２】
アデノシン受容体アゴニストがＣＰＡ、ＮＥＣＡ、ＣＧＣ−２１６８０、ＡＢ−ＭＥＣＡ、ＡＭＰ５７９、ｑＡＰＮＥＡ、ＣＨＡ、ＥＮＢＡ、Ｒ−ＰＩＡ、ＤＰＭＡ、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＡ１４６ｅ、ＣＣＰＡ、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＩＢ−ＭＥＣＡよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
局所麻酔剤が該対象に投与される請求項１ないし１２いずれか１記載の方法。
【請求項１４】
該局所麻酔剤がメキシリチン(mexilitine)、ジフェニルヒダントイン、プリロカイン、プロカイン、ミピビカイン(mipivicaine)、ブピビカイン(bupivicaine)、リドカイン、クラス１Ｂ抗−不整脈剤よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該クラス１Ｂ抗−不整脈剤がリグノカインである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
カリウムチャネルオープナーまたはアゴニストが該対象に投与される請求項１ないし１５いずれか１記載の方法。
【請求項１７】
カリウムチャネルオープナーまたはアゴニストがクロマカイン(cromakalin)、ピナシジル(pinancidil)、ニコランジル(nicorandil)、ＭＳ−１６１９，ジアゾキシドおよびミノキシジルよりなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
止血剤も対象に投与される請求項１ないし１７いずれか１記載の方法。
【請求項１９】
該止血剤が血餅破壊剤、血栓溶解剤、抗凝固剤、抗血小板凝集剤およびその組合せよりなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該血餅破壊剤がストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびＡＣＴＩＶＡＳＥよりなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該血栓溶解剤が、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ(alteplase)、レテプラーゼ(reteplase)およびテネクテプラーゼ(tenecteplase)よりなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
該抗凝固剤がヘパリン、エノキサパリンおよびダルテパリンよりなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該抗−血小板凝集剤がアスピリン、クロピドグレル(clopidogrel)、アビキシマブ(abciximab)、エピティフィバチド(eptifibatide)およびティロフィバン(tirofiban)よりなる群から選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
ＡＶブロッカーも対象に投与される請求項１ないし１２いずれか１記載の方法。
【請求項２５】
該ＡＶブロッカーがベラパミルである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
各剤または剤の組合せが経口、直腸、大脳室内、鞘内、硬膜外、静脈内、筋肉内、皮下、鼻孔内、経皮、経粘膜、舌下、灌漑、徐放ポンプまたは注入よりなる群から選択される経路によって投与される請求項１ないし２５いずれか１記載の方法。
【請求項２７】
該経路が静脈内であって、各剤または剤の組合せが連続的にまたは間欠的に投与される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
各剤または剤の組合せが剤の到達に先立ってドナーの血液と混合され、ただし、該ドナーの血液は対象の血液と適合するものとする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンと同一の機能性部位における、または部分的に同一の機能性部位におけるその作用、および該コノトキシンとしての同様の機能的応答を誘導するその能力につき、薬物候補をスクリーニングすることを特徴とする、器官の阻止、保護または維持剤として用いる薬物候補を同定する方法。
【請求項３０】
候補薬物剤によるその受容体または他の複合体からの標識されたκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの置き換えを用いて、適当な候補薬物を同定する請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
治療活性を特定するためのテスト化合物の生物学的アッセイを行い、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの生物学的アッセイから得られた結果と比較する請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの受容体に対する小分子結合親和性を測定し、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンのその受容体への結合親和性と比較する請求項２９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明はκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩、ならびに器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖器系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。また、これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。
【０００２】
本発明の背景を説明するのにここで用いる刊行物および他の資料、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合は引用により援用し、便宜には、以下のテキストでは著者および日付によって参照し、添付の文献目録には著者をアルファベット順にリストする。
【０００３】
紫色イモ貝Ｃｏｎｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓの毒液から元来は精製された２７個のアミノ酸のペプチドであるκ−ＰＶＩＩＡ（Ｔｅｒｌａｕら，  １９９６；米国特許第５，６７２，６８２号）は、以前には、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈ４カリウムチャネルの潜在的アンタゴニストとして同定された（ＩＣ５０〜６０ｎＮ）。同研究においては、電圧−ゲーテッドカリウムチャネルＫｖ１．１またはＫｖ１．４（Ｔｅｒｌａｕら，  １９９６）に対する検出可能な活性が認められていなかった。該Ｓｈａｋｅｒおよび該Ｋｖ１．１Ｋ＋チャネルから構築されたキメラは、トキシン感受性の部位としての第５および第６膜貫通領域の間の推定ポア−形成性領域として同定された（Ｓｈｏｎら，  １９９８）。κ−ＰＶＩＩＡはＳｈａｋｅｒチャネル上の外部テトラエチルアンモニウム結合部位と相互作用するようである。κ−ＰＶＩＩＡおよびカリブドトキシン(charybdotoxin)は共にＳｈａｋｅｒチャネルを阻害するが、それらは異なって相互作用するに違いない。Ｆ４２５Ｇ  Ｓｈａｋｅｒ突然変異は３桁の大きさだけカリブドトキシンの親和性を増加させるが、κ−ＰＶＩＩＡ感受性をなくしてしまう（Ｓｈｏｎら，  １９９８）。κ−ＰＶＩＩＡは１：１の化学量論にてイオンポアをブロックするように見え、開いたまたは閉じたチャネルへのその結合は非常に困難である（Ｔｅｒｌａｕら，  １９９９）。全卵母細胞または外部斑に慢性的に適用され、κ−ＰＶＩＩＡ阻害は、該チャネルを活性化するのに用いられる脱分極パルスに応答しての電圧−依存性緩和のように見える（Ｇａｒｃｉａら，  １９９９）。
【０００４】
カリウムチャネルは興奮性細胞において静止膜ポテンシャルを制御するにおいて能力があり、広く３つの電圧−ゲーテッドＫ＋チャネル、Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルおよびＡＴＰ−感受性Ｋ＋チャネル（ＫＡＴＰチャネル）にさらに分けることができる。ＡＴＰ−感受性カリウムチャネルは元来心臓組織で記載された（Ｎｏｍａ，  １９８３）。引き続いての数年に、それらは膵臓細胞、骨格、血管およびニューロン組織でも同定された。Ｋ＋チャネルのこの群は細胞内ＡＴＰレベルによって変調され、それ自体、細胞代謝を電気的活動にカップリングさせる。増強されたレベルのＡＴＰの結果、ＫＡＴＰチャネルが閉じられる。該ＫＡＴＰチャネルは、１：１の化学量論の２つの異なるサブユニット；チャネルのポアを形成すると考えられる弱い内向整流Ｋ＋チャネルＫｉｒ６．Ｘ（６．１または６．２）、およびスルホニル尿素（ＳＵＲ）サブユニットよりなる八量体複合体であると考えられる。これまでＳＵＲの３つの変種が同定されている：ＳＵＲ１、ＳＵＲ２ＡおよびＳＵＲ２Ｂ。該Ｋｉｒ６．２サブユニットは心臓、膵臓およびニューロン組織におけるＫＡＴＰチャネルに共通しており（Ｋｉｒ６．１は血管平滑筋組織で選択的に発現される）、ＳＵＲは異なって発現される。Ｋｉｒ６．２／ＳＵＲ１はニューロン／膵臓ベータ−細胞ＫＡＴＰチャネルを復元し、他方、Ｋｉｒ６．２／ＳＵＲ２Ａは心臓ＫＡＴＰチャネルを復元すると提案されている。
【０００５】
カリウムチャネルは、細胞膜ポテンシャルの維持を通じて、正常な生物学的機能において基本的な大きくかつ多様な群の蛋白質を含む。Ｋ＋チャネルを開ける化合物についての潜在的な治療適用は重要であり、これは、脳および心臓虚血症および喘息を含めた広い範囲の病気および負傷状態の治療を含む。最近、かなりの興味が、気道平滑筋の緩和を生じさせるＫ＋チャネルオープナーの能力に焦点が当てられ、それ自体、これらの化合物は気管支喘息の治療に対する新規なアプローチを提供し得る（Ｌｉｎら，  １９９８；  Ｍｕｌｌｅｒ−ＳｃｈｗｅｉｎｉｔｚｅｒおよびＦｏｚａｒｄ，  １９９７；  Ｍｏｒｌｅｙ，  １９９４；  Ｂａｒｎｅｓ，  １９９２）。さらに、Ｋ＋チャネルオープナーの心臓保護効果は心臓虚血症の実験動物モデルで現在よく確立されている（Ｇｒｏｖｅｒ，  １９９６；  Ｊｕｎｇら，  １９９８；  Ｋｏｕｃｈｉら，  １９９８）。脳虚血症から引き起こされるニューロン損傷を制限するこれらの化合物の能力についてはほとんど知られていない。脳虚血症の治療におけるほとんどの進歩は、ナトリウムおよびカルシウムイオンの流れを減少させる化合物の開発に焦点を当ててきた。静止膜ポテンシャルを回復させるＫ＋チャネルオープナーを用いて、ニューロン組織における虚血エピソードに関連する急性損傷（Ｒｅｓｈｅｆら，  １９９８；  Ｗｉｎｄら，  １９９７）を減少させ、ならびに、グルタミン酸−誘導興奮性毒性を低下させる（Ｌａｕｒｉｔｚｅｎら，  １９９７）。しかしながら、ＫＡＴＰオープナーの臨床的使用は、心血管副作用（すなわち、血圧の降下）のため幾分制限されてきた。
【０００６】
かくして、器官保護剤として用いることができるＡＴＰ−感受性カリウムチャネルを開けるための新しい剤を開発することが望まれる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩、ならびに器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。また、これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることもできる。
【０００８】
本発明によると、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンとはコノトキシンκ−ＰＶＩＩＡ、Ｅ６．２、Ｐ６．１、Ｐ６．３、その同族体、そのアナログまたはその誘導体をいう。これらのペプチドは器官保護活性を有することが判明した。
【０００９】
１つの具体例において、本発明は、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンまたはその医薬上許容される塩の治療上有効量を投与することにより器官を阻止し、維持しまたは保護する方法を提供する。本明細書中で用いるごとく、用語「阻止する」とは、心筋虚血症に由来する病理学的プロセスを停止させる行為におけるごとく停止させる行為を意味する。用語「維持する」とは、生存を維持し、または害または負傷から安全を維持する行為を意味する。用語「保護する」とは、心筋虚血症に由来する病理学的プロセスのごとき有害な影響に対して防御を提供する行為を意味する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、アデノシン受容体アゴニスト（Ａ１、Ａ２ａまたはＡ３）と組み合わせてκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンまたはその医薬上許容される塩の治療上有効量を投与することによって器官を阻止し、維持しまたは保護する方法を提供する。
【００１１】
第３の具体例において、本発明は、アデノシン受容体アゴニストおよび局所麻酔剤と組み合わせてκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンまたはその医薬上許容される塩の治療上有効量を投与することによって器官を阻止し、維持しまたは保護する方法を提供する。
【００１２】
第４の具体例において、本発明は、カリウムチャネルオープナーまたはアゴニスト、および所望により動脈室（ＡＶ）ブロッカーと組み合わせてκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンまたはその医薬上許容される塩の治療上有効量を投与することによって器官を阻止し、維持しまたは保護する方法を提供する。
【００１３】
第５の具体例において、前記治療のいずれかを受ける個体に止血剤も投与する。そのような止血剤は（血餅破壊）剤、血栓溶解剤、抗−凝固剤または抗−血小板凝集剤であり得る。
【００１４】
本発明によると、保護できる適当な器官は循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官を含む。また、本発明の方法によって体細胞を保護することもできる。その用法の文脈により特記しない限り、用語「保護する」は、本明細書中で用いるごとく「阻止する」および「維持する」を含むことを意図する。
【００１５】
特に好ましい具体例においては、器官は心臓である。該方法は、心臓切開手術、血管形成術、弁手術、移植または心血管病の間に心臓を阻止し、保護しまたは維持して、心血管介入前または間または後の心臓損傷を減少させまたは再灌流負傷のごとき血液、栄養物または酸素の正常な流れが欠乏した心臓の一部を損傷から保護することができる。
【００１６】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩または器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用に関する。これらのコノトキシンは循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官を阻止、保護、維持するのに用いる。これらのコノトキシンは体細胞を阻止し、保護し、または維持するのに用いることもできる。
【００１７】
本発明の目的では、κ−ＰＶＩＩＡとは、以下の一般式：
配列
（配列番号１）
（式中Ｘａａ１およびＸａａ３は独立してＡｒｇ、ホモアルギニン、オルニチン、Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓ、いずれかの合成塩基性アミノ酸、Ｈｉｓまたはハロ−Ｈｉｓであり；Ｘａａ２はＰｒｏまたはヒドロキシ−Ｐｒｏ（Ｈｙｐ）であり；Ｘａａ４はＰｈｅ、Ｔｙｒ、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ノル−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ，ニトロ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ（ＤまたはＬ），ネオ−Ｔｉｐ，ハロ−Ｔｒｐ（ＤまたはＬ）またはいずれかの合成芳香族アミノ酸であり；およびＸａａ５はＨｉｓまたはハロ−Ｈｉｓである）を有するペプチドを言う。Ｃ−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基を含むことができる。該ハロは好ましくは臭素、塩素またはヨウ素である。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ５がＨｉｓであるのが好ましい。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ３がＬｙｓであり、Ｘａａ４がＰｈｅであって、Ｘａａ５がＨｉｓであるのがより好ましい。Ｃ−末端が遊離カルボキシル基を含有するのがさらに好ましい。
【００１８】
本発明の目的では、Ｅ６．２は以下の一般式；
Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa2-Xaa3-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa,-Xaas-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Asn-Xaa3-Thr-Cys-Thr-Xaal-Ser-Xaa3-Cys-Xaa2（配列番号：２６）
（式中、Ｘａａ１，Ｘａａ２，Ｘａａ３、Ｘａａ４およびＸａａ５は前記定義の通りである。）を有するペプチドを言う。Ｃ−末端は遊離カルボキシル基またはアミノ基、好ましくは遊離カルボキシルを含むことができる。ＸａａがＡｒｇであり、Ｘａａ3がＬｙｓであり、Ｘａａ4がＰｈｅであって、Ｘａａ５がＨｉｓであるのが好ましい。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ2がＰｒｏであり、Ｘａａ3がＬｙｓであり、Ｘａａ4がＰｈｅであって、Ｘａａ５がＨｉｓであるのがより好ましい。
【００１９】
本発明の目的では、Ｐ６．１は以下の一般式：
Xaa2-Cys-Xaa3-Thr-Xaa2-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa2-Xaas-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Gly-Xaal-Ala-Cys-Ile-Ile-Tllr-Ile-Cys-Xaa2（配列番号：２７）
（式中、Ｘａａ１、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4およびＸａａ５は前記定義の通りである）を有するペプチドを言う。Ｃ−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基、好ましくは遊離カルボキシルを含むことができる。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ3がＬｙｓであり、Ｘａａ4がＰｈｅであって、Ｘａａ５がＨｉｓであるのが好ましい。Ｘａａ１がＡｒｇであり、ＰｒｏであるＣ−末端を例外としてＸａａ2がＨｙｐでありＸａａ3がＬｙｓであり、Ｘａａ4がＰｈｅであってＸａａ５がＨｉｓであるのがより好ましい。
【００２０】
本発明の目的では、Ｐ６．３は以下の一般式；
Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa3-Thr-Gly-Xaa,-Xaa3-Cys-Xaa4-Xaa2,-Xaa5-Gln-Xaa3-Asp-Cys-Cys-Gly-Xaal-Ala-Cys-Ile-Ile-Thr-Ile-Cys-Xaa2（配列番号：２８）（式中、Ｘａａ１、Ｘａａ2、Ｘａａ3、Ｘａａ4およびＸａａ5は前記定義の通りである）を有するペプチドを言う。Ｃ−末端は遊離カルボキシル基またはアミド基、好ましくは遊離カルボキシル基を含むことができる。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ3がＬｙｓであり、Ｘａａ4がＰｈｅであって、Ｘａａ５がＨｉｓであるのが好ましい。Ｘａａ１がＡｒｇであり、Ｘａａ2がＰｒｏであり、Xaa3がLysであり、Xaa4がPheであって、Xaa5がHisであるのがより好ましい。
【００２１】
κ−ＰＶＩＩＡアナログとは、以下の式を有するペプチドを言う。
κ−ＰＶＩＩＡ［Ｒ１８Ａ］:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Ala-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 2);
κ-PVIIA [R22A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Ala-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 3);
κ-PVIIA [I3A]: Cys-Arg-Ala-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 4); 
κ−ＰＶＩＩＡ［Ｋ１９Ａ］：Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Ala-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :5) ; 
κ-PVIIA [R2A]:Cys-Ala-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 6); 
κ-PVIIA [F9A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Ala-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 7);
κ-PVIIA[K25A] : Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Ala-Cys-Val (配列番号 : 8);
κ-PVIIA [R2K] :Cys-Lys-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 9);
κ-PVIIA [K7A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Ala-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :10) ;
κ-PVIIA [F9M]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Met-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 :11) ;
κ-PVIIA [F9Y]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Tyr-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 12);
κ-PVIIA[R2Q]: Cys-Gln-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 13);
κ-PVIIA[H11A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-Ala-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 14);
κ-PVIIA[D14A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Ala-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 15);
κ-PVIIA[Q6A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Ala-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 16);
κ-PVIIA[N21A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Ala-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 17);
κ-PVIIA[S17A] :Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ala-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 18);
κ-PVIIA[N24A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Ala-Lys-Cys-Val (配列番号 :19) ; 
κ-PVIIA[L12A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Ala-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 20);
κ-PVIIA[D13A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Ala-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 21);
κ-PVIIA[Q10A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 22);
κ-PVIIA [V27A]: Cys-Arg-Ile-Hyp-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Ala (配列番号 : 23);
κ-PVIIA[04A]:Cys-Arg-Ile-Ala-Asn-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 24); および
κ-PVIIA[N5A]:Cys-Arg-Ile-Hyp-Ala-Gln-Lys-Cys-Phe-Gln-His-Leu-Asp-Asp-Cys-Cys-Ser-Arg-Lys-Cys-Asn-Arg-Phe-Asn-Lys-Cys-Val (配列番号 : 25)
Ｃ−末端は遊離カルボキシル基を含むのが好ましい。
【００２２】
本発明は、さらに、前記ペプチドまたはアナログの誘導体に関する。本発明によると、誘導体は、Ｘｒｇ残基がＬｙｓ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換されていてよく；Ｘａａ１残基はＡｒｇ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓ、またはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換されていてよく；Ｔｙｒ残基がいずれかの合成ヒドロキシ含有アミノ酸で置換されていてよく、Ｓｅｒ残基がＴｈｒまたはいずれかの合成ヒドロキシ化アミノ酸で置換されていてよく、Ｔｈｒ残基がＳｅｒまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換されていてよく、ＴｈｅおよびＴｒｔ残基がいずれかの合成芳香族アミノ酸で置換されていてもよく；およびＡｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｙｐ残基がグリコシル化されていてもよいペプチドまたはアナログを含む。Ｃｙｓ残基はＤまたはＬ立体配置でよく、所望により、ホモシステイン（ＤまたはＬ）で置換されていてもよい。Ｔｙｒ残基は１２５Ｉ-Ｔｙｒあるいは３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（メタ−Ｔｙｒまたはオルト−Ｔｙｒ）および対応するＯ−スルホおよびＯ−スルホ誘導体で置換されていてもよい。酸性アミノ酸残基はいずれかの酸性合成アミノ酸、例えばＧｌｙまたはＡｌａで置換されていてもよい。脂肪族アミノ酸は、非天然の脂肪族のｎ＝８までおよびそれを含めた分岐または直鎖の側鎖ＣｎＨ２ｎ＋２を担う合成誘導体によって置換されていてもよい。Ｌｅｕ残基はＬｅｕ（Ｄ）で置換されていてもよい。Ｇｌａ残基はＧｌｕで置換されていてもよい。
【００２３】
本発明は、さらに、前記ペプチドの誘導体、および環状並べ換え体が天然トキシンの天然架橋パターンを保持する環状並換体であるペプチド誘導体に指向される。Craikら(2001)参照。
【００２４】
合成芳香族アミノ酸の例は、限定されるものではないが、ニトロ−Ｐｈｅ、４−置換−Ｐｈｅを含み、ここに、該置換基はＣ１−Ｃ３アルキル、カルボキシル、ヒドロキシメチル、スルホメチル、ハロ、フェニル、−ＣＨＯ，−ＣＮ，−ＳＯ３、ＨおよびＮＨＡｃである。合成ヒドロキシ含有アミノ酸の例は、限定されるものではないが、４−ヒロドロキシメチル、Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２，６−ジメチル、Ｔｙｒおよび５−アミノ−Ｔｙｒを含む。合成塩基性アミノ酸の例は、限定されるものではないが、Ｎ−１−（２−ピラゾリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙおよび２−（４−ピペリニル）Ａｌａ，２−［３−（２Ｓ） ピロリニニル−Ｇｌｙおよび２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル）−Ａｌａを含む。これらおよび他の合成塩基性アミノ酸、合成ヒドロキシ含有アミノ酸または合成芳香族アミノ酸は、RSP Amino Acid Analogues,Inc. Worcester, MA.による、そこから入手可能な、引用して援用するBuilding Block Index,バージョン3.0に記載されている(1999カタログ、ヒドロキシ含有アミノ酸および芳香族アミノ酸については4ないし47ページおよび塩基性アミノ酸については66-87ページ; http://www. amino-acids. com参照)。合成酸性アミノ酸の例は、各々、引用して援用する、Omsteinら(1993)およびin米国特許5,331,001号に記載されたカルボキシル、フォスフェート、スルホネート、合成テトラザリル誘導体を含めたおよび下記図式１ないし３に示されたごとき、酸性官能基を含む誘導体を含む。
【化１】
2005532260.tif 000002
【化２】
2005532260.tif 000003
【化３】
2005532260.tif 000004
【００２５】
所望により、前記したペプチドおよびアナログにおいては、Ａｓｎ残基は、Ｎ−グルカンを含むように修飾することができ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＨｙｐ残基は、Ｏ−グルカン（例えば、ｇ−Ｎ、ｇ−Ｓ、ｇ−Ｔおよびｇ−Ｈｙｐ）を含むように修飾することができる。本発明によると、グルカンは、当該分野で知られた合成または酵素方法によって天然または修飾されたアミノ酸のいずれかのヒドロキシ、アミノまたはチオール基に結合させることができるいずれのＮ−、Ｓ−またはＯ−結合モノ−、ジ−、トリ−、ポリ−またはオリゴ糖も意味する。グルカンを形成する単糖は、限定されるものではないが、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−フコースまたはＤ−アラビノースを含む。これらの糖は、構造的に、例えば、その組合せも含めたシアル酸のごとき１以上のＯ−スルフェート、Ｏ−ホスフェート、Ｏ−アセチルまたは酸性基で修飾させていてもよい。また、グルカンは、Ｄ−ペニシラミン２，５およびそのハロゲン化誘導体またはポリプロピレングリコール誘導体のごとき同様なポリヒドロキシ基を含むこともできる。グリコシド結合はベータであり、１→４または１→３、好ましくは１→３である。グルカンおよびアミノ酸の間の結合はアルファまたはベータ、好ましくはアルファであって、１→である。
【００２６】
コアＯ−グルカンは、ここに引用して援用するVan de Steenら(1998)によって記載されている。ムチンタイプのＯ−結合オリゴ糖はＧａｌＮＡｃ残基によってＳｅｒまたはＴｈｒ（または本発明の他のヒドロキシル化残基）に結合している。単糖形成ブロックおよびこの第１のＧａｌＮＡｃ残基に結合した結合はコアグルカンを規定し、そのうち８つが同定されている。ギリコシド結合のタイプ（配向および結合性）は各コアグリカンについて定義される。適当なグリカンおよびグリカンアナログは、さらに、各々引用して援用する１９９０年１０月１９日に出願された米国シリアル番号０９／４２０，７９７、および１９９９年１０月１９日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４３８０（ＰＣＴ公開ＷＯ  ００／２３０９２）に記載されている。好ましいグリカンはＧａｌ（β１→３）ＧａｌＮＡｃ（α１→）である。
【００２７】
所望により、前記ペプチドにおいては、Ｃｙｓ残基の対は、Ｓｅｒ／（ＧｌｕまたはＡｓｐ）、Ｌｙｓ／（ＧｌｕまたはＡｓｐ）またはＣｙｓ／Ａｌａ組合せのごとき、等電子状態ラクタムまたはエーテル−チオエーテル置換で対様式で置換することができる。公知の方法（Barnayら, 2000; Hrubyら, 1994; Bitanら, 1997）による順次のカップリングは、天然のＣｙｓブリッジのラクタムブリッジでの置換を可能とする。チオエーテルアナログは、RSP Amino Acid Analoguesから商業的に入手可能なハロ−Ala残基を用いて容易に合成することができる。加えて、個々のＣｙｓ残基は、ジスルフィドブリッジがＣｙｓ−ホモＣｙｓまたはＣｙｓ−ペニシラミン、またはホモＣｙｓ−ペニシラミン等の間に形成できるように、ホモＣｙｓ、セレノ−Ｃｙｓまたはペニシラミンで置換することができる。
【００２８】
本発明は、もう１つの態様において、有効量のκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンを含む医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤として作用することができる能力を有する。これらのコノトキシンは、循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官のごとき器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いることができる。
【００２９】
該κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンは、米国特許第５，６７２，６８２号に記載されているごときＣｏｎｕｓから単離することができるか、あるいはそれが米国特許第５，６７２，６８２号に記載されているごとき一般的な合成方法によって化学的に合成することができる。別法として天然ペプチドは、各々を引用により援用する、κ−ＰＶＩＩＡをコードするＤＮＡ（Shonら, 1998）または米国特許出願セリアル番号０９／９１０，０８２号および国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２３０４１に記載されているＥ６．２、Ｐ６．１またはＰ６．３をコードするＤＮＡのようなコノトキシンをコードするＤＮＡを用い、慣用的な組換えＤＮＡ技術によって合成することができる（Sambrookら, 1989）。また、該ペプチドは自動合成器を用いても合成される。アミノ酸は、Advanced Chem Tech357 自動ペプチド合成器を用い、Ｃ−末端で開始し、ＭＢＨＡ  Ｒｉｎｋ樹脂（典型的には、１００ｍｇの樹脂）に順次カップリングさせる。カップリングは、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中の１，３−ジイソプロピルカルボジイミドを用い、あるいは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジエチルイソプロピルエチルアミン（ＢＩＥＡ）によって行われる。ＦＭＯＣ保護基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のピペリジンの２０％溶液での処理によって除去される。樹脂を引き続いてＤＭＦで洗浄し（２回）、続いてメタノールおよびＮＭＰで洗浄する。
【００３０】
これまでのκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンペプチドのムテイン、アナログまたは活性断片もここでは考えられ得る。例えば、Hammerlandら(1992)参照。該コノトキシンペプチドの誘導体ムテイン、アナログまたは活性断片は、各々ここに引用して援用する、米国特許第５，５４５，７２３号（特に、第２欄第５０行ないし第３欄第８行参照）、第５，５３４，６１５号（特に、第１９欄第４５行ないし第２２欄第３３行参照）、および第５，３６４，７６９号（特に、第４欄第５５行ないし第７欄第２６行参照）に概説されたごとき、保存的アミノ酸置換を含めた公知の技術によって合成することができる。
【００３１】
本発明によると、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩は器官を阻止し、保護しまたは維持するのに用いられる。器官は対象中で無傷であるか、あるいは（移植用のごとき）摘出されたものでよい。該器官は循環器系器官、呼吸器系器官、泌尿器系器官、消化器系器官、生殖系器官、内分泌系器官または神経系器官であり得る。本発明は、特に、心臓切開手術、血管形成術、弁手術、バイパス手術、移植、心血管病の間に心臓を阻止し、保護しまたは維持して、心血管介入前、間または後に心臓損傷を低下させ、あるいは血液、栄養物および／または酸素の正常な流れが枯渇した（再灌流負傷）の部分を保護するのに用いられる。本発明は、特に、通常、冷カリウム添加溶液の注入を用い、心臓手術の間における心筋維持の技術である心停止法で特に有用である。また、温（体温）血を用いる技術の、本κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩で用いることもできる。
【００３２】
κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよび医薬上許容されるその塩は、本発明に従い、器官を阻止し、保護しまたは維持するための他の剤と組み合わせて用いることができる。かくして、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩はアデノシン受容体アゴニスト、局所麻酔剤、カリウムチャネルオープナーまたはアゴニスト、ＡＶブロッカーおよび／または止血剤と共に投与することができる。アデノシン受容体アゴニストの例は、は限定されるものではないが、Ａ１、Ａ２ａおよびＡ３剤を含む。Ａ１は、限定されるものではないが、ＣＰＡ、ＮＥＣＡ、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＢ−ＭＥＣＡ、ＡＭＰ５７９、９ＡＰＮＥＡ、ＣＨＡ、ＥＮＢＡを含む。Ａ２ａは、限定されるものではないが、Ｒ−ＰＩＡ、ＤＰＭＡ、ＣＧＳ−２１６８０、ＡＴＬ１４６ｅを含む。Ａ３剤は、限定されるものではないが、ＣＣＰＡ、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＩＢ−ＭＥＣＡを含む。適当な局所麻酔剤は、限定されるものではないが、メキシリチン、ジフェニルヒダントイン、プリロカイン、プロカイン、ミピビカイン、ブピビカイン、リドカインおよびクラス１Ｂ抗−不整脈剤、すなわち、リグノカインを含む。適当なカリウムチャネルオープナーまたはアゴニストは、限定されるものではないが、クロマカリン、ピナシジル、ニコランジル、ＮＳ−１６１９、ジアゾキシドおよびミノキシジルを含む。適当なＡＶブロッカーは、限定されるものではないが、ベラパミルを含む。止血剤は「血餅破壊剤」、血栓溶解剤、抗−凝固剤または抗−血小板凝集剤であり得る。適当な「血餅破壊剤」は、限定されるものではないが、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよびＥＣＰＩＶＡＳＥを含む。適当な血栓溶解剤は、限定されるものではないが、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼおよびテネクテプラーゼを含む。適当な抗−凝固剤は、限定されるものではないが、ヘパリン、エノキサパリンおよびダルテパリンを含む。適当な抗−血小板凝集剤は、限定されるものではないが、アスピリン、クロピドグレル、アブシキマブ、エピティフィバチドおよびチロフィバンを含む。
【００３３】
本明細書中で開示したκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩は、不整脈、尿失禁、狭心症、再灌流負傷、糖尿病、網膜障害、神経傷害、腎臓障害、末梢循環器障害、急性心不全、高血圧、くも膜下出血を伴う脳血管麻痺、不安、障害、脳虚血症、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）外科手術、虚血性心臓病、鬱血性心不全の治療で用いることもできる。また、本明細書中で開示したκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩は、心臓切開手術、バイパス手術、心臓移植手術および心停止法で用いることもできる。心停止法は、心筋繊維の阻止を達成し、その酸素消費をほとんどない状態まで低下させるために、時々は血液で固定された冷カリウム添加溶液の注入を用いる心臓手術の間の心筋保持の技術である。温（体温）血液を用いる技術も用いられる。
【００３４】
有効成分として本発明の化合物またはその医薬上許容される塩を含有する医薬組成物は、慣用的な医薬調合技術に従って調製することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences第１８版(1990, Mack Publishing Co. , Easton, PA)参照。典型的にはＡＴＰ−感受性カリウムチャネル開口量の有効成分を医薬上許容される担体と混合する。該担体は、投与に望まれる製剤の形態に依存して、広く種々の形態、例えば静脈内、経口または非経口の形態を取ることができる。該組成物は、さらに、抗酸化剤、安定化剤、保存剤などを含むことができる。送達方法の例については、ここに援用して引用する米国特許５，８４４，０７７号を参照されたし。
【００３５】
「医薬組成物」は、医療的投与に適した物理的に区別される統一のある部分を意味する。「投与単位形態の医薬組成物」とは、各々が、日用量または多数（４倍まで）または複数下（１／４０まで）の日用量の、担体と組み合わせたおよび／または包みに包まれた有効化合物を含有する医療的投与に適した物理的に区別される統一のある単位を意味する。
【００３６】
組成物は日用量または、例えば日用量の半分、１／３または１／４を含むか否かは医薬組成物を各々、１日につき１回、または２回または３回投与すべきかに依存する。
【００３７】
本明細書中で用いる「塩」は、無期または有機酸および／または塩基とで形成された酸性および／または塩基性塩、好ましくは塩基性塩を示す。医薬上許容される塩が好ましいが、特に、本発明の化合物を医薬として用いる場合、他の塩は、例えば、これらの化合物を処理する用途で、あるいは非−医薬タイプが考えられる場合にその用途を見出す。これらの化合物の塩は、当該分野で認められた技術によって調製することができる。
【００３８】
そのような医薬上許容される塩の例は、限定されるものではないが、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩および酢酸塩、トリフルオロ酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、テオフィリン酢酸塩、サリチル酸塩のごとき無機および有機付加塩を含む。低級アルキル第四級アンモニウム塩等は同様に適当である。
【００３９】
本明細書中で用いる用語「医薬上許容される担体」は、非毒性の不活性固体、半固体液体充填剤、希釈剤、カプセル化物質、いずれかのタイプの処方補助剤、または単純に生理食塩水のごとき滅菌水性媒体を意味する。医薬上許容される担体として働くことができる物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースのごとき糖、コーンスターチおよびジャガイモ澱粉のごとき澱粉、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸ナトリウムのごときセルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント、モルト、ゼラチン、タルク；カカオバターおよび坐薬ワックスのごとき賦形剤、落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびタイズ油のごとき油類；プロピレングリコールのごときグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのごときポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのごときエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのごとき緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液溶液、ならびに医薬処方で用いられる他の非毒性の適合性物質を含む。
【００４０】
湿潤剤、乳化剤、およびラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのごとき滑沢剤、着色剤、離形剤、コーティング剤、甘味剤、フレーバー剤および香料剤、防腐剤および抗酸化剤も処方者の判断に従って組成物に存在させることもできる。医薬上許容される抗酸化剤の例は、限定されるものではないが、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、のごとき水溶性抗酸化剤；パルミチン酸、アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールのごとき油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのごとき金属キレート化剤を含む。
【００４１】
経口投与では、化合物は、カプセル剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ、メルト、粉末、懸濁液またはエマルジョンのごとき固体または液体製剤に処方することができる。経口投与形態の組成物を調製するにおいて（例えば懸濁液、エリキシル剤および溶液のごとき）経口液体製剤の場合には、例えば、水、グリコール、油、アルコール、フレーバー剤、防腐剤、着色剤、懸濁化剤；または（例えば、粉末、カプセル剤および錠剤のごとき）経口固体製剤の場合には、澱粉、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのごとき担体のような、通常の医薬媒体のいずれを使用することもできる。投与のその容易性のため、錠剤およびカプセル剤は、最も有利な経口投与単位形態を表し、その場合、固体医薬担体が自明なことには使用される。所望であれば、錠剤は、標準的な技術によって糖被覆し、または腸溶被覆することもできる。活性剤は、それを胃腸管を通過するのに適したようにするために、カプセル化することができ、同時に脳−血液関門の通過を可能とする。たとえば、ＷＯ９６／１１６９８参照。
【００４２】
非経口投与では、化合物は医薬担体に溶解させ、溶液または懸濁液いずれかとして投与することができる。適当な担体の例は水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油である。該担体は、他の成分、例えば、防腐剤、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、緩衝液などを含むこともできる。１つの特に適当なここで考えられるコノトキシンペプチドについての安定化剤はカルボキシメチルセルロースである。この剤は、特に、考えられるコノトキシンペプチドの過剰な正の電荷のため効果的であろう。化合物を鞘内投与すべき場合、それは脳脊髄液に溶解させることもできる。
【００４３】
種々の投与経路が利用できる。選択された特別の態様は、もちろん、選択された特定の薬物、治療すべき病気状態の重症度、および治療効果必要な投与量に依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容されるいずれの投与形態を用いても実施することができ、臨床的に許容されない悪影響を引き起こすことなく活性化合物の効果的なレベルを生じさせるいずれの態様も意味する。そのような投与形態は経口、直腸、舌下、局所、鼻孔、経皮または非経口経路を含む。用語「非経口」は、皮下、静脈内、硬膜内、灌注、筋肉内、徐放ポンプまたは注入を含む。
【００４４】
例えば、本発明に従っての活性剤の投与は、
（ａ）ポンプ（例えば、Lauer & Hatton (1993), Zimmら(1984), Ettingerら(1978)およびMedtronic, Inc.の心停止法システム参照）；
（ｂ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；第４，３５３，８８８号；および第５，０８４，３５０号参照）；
（ｃ）連続的放出ポリマーインプラント（例えば、米国特許第４，８８３，６６６号参照）；
（ｄ）マクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号および第４，９６８，７３３号ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９２／１９１９５、ＷＯ  ９５／０５４５２参照）；
（ｅ）ＣＮＳへの裸のまたはカプセル化されていない細胞移植片（例えば、米国特許第５，０８２，６７０号および第５，６１８，５３１号参照）；
（ｆ）注射（皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、または他の適切な部位）；または
（ｇ）カプセル、液体、錠剤、丸剤、または延長放出処方の経口投与；
を含めたいずれかの適当な送達手段を用いて達成することができる。
【００４５】
本発明の１つの具体例において、活性剤は、ＣＮＳ、好ましくは脳室（例えば、i.c.v.）、脳実質、鞘内スペースまたは他の適当なＣＮＳ位置に、最も好ましくは鞘内に直接送達される。
【００４６】
別法として、標的化療法を用いて、活性剤を、抗体または細胞−特異的リガンドのごとき標的化システムを用いることによって、より特異的にあるタイプの細胞に送達することができる。標的化は、種々の理由で、例えば、もし剤が許容できないほど毒性である場合、もし余りにも高い用量が必要である場合、または、もし標的細胞に進入することができない場合に望ましいであろう。
【００４７】
ペプチドである活性な剤は細胞ベースの送達システムで投与することもでき、ここに、活性な剤をコードするＤＮＡ配列を、患者の身体、特に脊髄領域への移植のために設計された細胞に導入される。適当な送達系は米国特許第５，５５０，０５０号および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ  ９２／１９１９５、ＷＯ  ９４／２５５０３、ＷＯ  ９５／０１２０３、ＷＯ  ９５／０５４５２、ＷＯ  ９６／０２２８６、ＷＯ  ９６／０２６４６、ＷＯ  ９６／４０８７１、ＷＯ  ９６／４０９５９およびＷＯ  ９７／１２６３５に記載されている。適当なＤＮＡ配列は、開発された配列および公知の遺伝子暗号に基づいて各活性剤につき合成により調製することができる。
【００４８】
活性剤は、好ましくは、治療上有効量で投与される。活性化合物の「治療上有効量」または単に「有効量」とは、いずれかの医療処置に適用できる合理的な利点／危険性の比率にて器官を阻止し、維持しまたは保護する化合物の十分な量を意味する。投与される現実の量、および投与の速度および時間経過は治療すべき疾患の性質および重症度に依存するであろう。投与は連続的なものであっても、または間欠的なものであってもよい。治療の処方、例えば、投与量、タイミング等についての決定は一般的な実行者または専門家の責任の範囲内のものであり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および実行者に知られた他の因子を考慮する。技術およびプロトコルの例はRemington's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。
【００４９】
投与量は、適切には、所望の薬物レベルを局所的にまたは全身的に達成するように調整することができる。典型的には、本発明の活性な剤は、有効成分の約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約７５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲にてその効果を呈する。適切な用量は１日当たり複数のサブ−用量で投与することができる。典型的には、用量またはサブ−用量は、単位投与形態当たり約０．１ｍｇないし約５００ｍｇの有効成分を含むことができる。より好ましい投与量は単位投与形態当たり、約０．５ｍｇないし約１００ｍｇを含む。投与量は一般には、より低いレベルで開始し、所望の効果は達成されるまで増加させる。
【００５０】
有利には、化合物は投与単位として処方され、各単位は固定された用量の有効成分を供するように適合される。錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、アンプルおよび座薬は本発明による投与形態の例である。有効成分は有効量を構成すること、すなわち、適当な効果的な投与量が単一または複数の単位用量で使用される投与形態に合致することのみが必要である。正確な個々の投与量、ならびに毎日の投与量は、ヒトまたは動物で用いる医師または獣医の指令下で標準的な医学原理に従って決定される。
【００５１】
医薬組成物は、一般に、全組成物の約０．０００１ないし９９重量％、好ましくは約０．００１ないし５０重量％、より好ましくは約０．０１ないし１０重量％の有効成分を含む。活性な剤に加え、医薬組成物および医薬は他の医薬上許容される化合物を含むこともできる。他の医薬上活性な化合物の例は、限定されるものではないが、アデノシン受容体アゴニスト、局所麻酔剤、止血剤、カリウムチャネルオープナーまたはアゴニスト、ＡＶブロッカーおよび臨床医学の主な領域の全てにおける治療剤を含む。他の医薬活性化合物と共に用いる場合、本発明のコノトキシンペプチドは薬物カクテルの形態で送達することができる。カクテルは本発明で有用な化合物のいずれか１つともう１つの薬物もしくは剤との混合物である。この具体例においては、共通の投与ビヒクル（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、ポンプ、注射溶液等）は補助的な増強剤と組み合わせた本発明の組成物を含有するであろう。該カクテルの個々の薬物は、各々、治療上有効量にて投与される。治療上有効量は前記したパラメーターによって決定されるが、結局は、所望の効果を達成するのに効果的である時間を薬物が必要とする身体の領域において薬物のレベルを確立するその量である。
【００５２】
κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩および本明細書中に記載する器官を保護する剤、すなわち、器官保護剤としてのその使用は、ヒトまたは動物の治療において、すなわち、動物適用で用いることができる。これらのコノトキシンおよびそれらの使用は、小児および老人患者を含めたいずれの年齢の個体で利用することもできる。
【００５３】
本明細書中で開示したκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩は不整脈、尿失禁、狭心症、再灌流負傷、糖尿病、網膜障害、神経傷害、腎臓障害、末梢循環障害、急性心不全、高血圧、くも膜下出血を伴う脳血管麻痺、不安障害、脳虚血症、ＣＡＢＧ外科手術、虚血性心臓病および鬱血性心不全の治療で用いることもできる。本明細書中で開示したκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンおよびその医薬上許容される塩は心臓切開手術、バイパス手術、心臓移植手術および心停止法で用いることもできる。心停止法は、心筋繊維の阻止を達成し、その酸素消費をほとんどゼロまで低下させるために、時々は血液で固定された、冷カリウム添加溶液の注入を通常は使用する心臓手術の間の心筋維持の技術である。温（体温）血液を用いる技術も用いられる。
【００５４】
ＫＡＴＰチャネルのアクチベーターは、とりわけ、喘息、心臓虚血症および脳虚血症脳治療で治療的有用性を有する。
【００５５】
喘息：喘息は米国単独においてほぼ１２００万人のヒトを冒す深刻かつ通常の疾患である。この障害は特に子供においてひどく、最大数の喘息患者は１８歳以下の者であると推定されている（National Health Survey, National Center of Health Statistics, 1989）。該病気は気道の慢性炎症および過敏な応答性によって特徴付けられ、その結果、ぜん鳴の周期的な発作および呼吸の困難がもたらされる。発作は、トリガー物質への暴露の結果として、気道の平滑筋が炎症し、膨潤する場合に起こる。ひどい場合には、平滑筋の修飾の結果として気道はブロックされるか、または閉塞される。さらに問題を悪化させる問題は、気道をブロックするようにも作用する大量の粘液の放出である。慢性喘息者は吸入コルチコステロイドで予防的に処置され、吸入気管支拡張剤、通常はβ−２アゴニストで急性処置される。しかしながら、吸入されたコルチコステロイドでの慢性的治療は免疫系損傷、高血圧、骨粗鬆症、副腎機能不全および心筋感染への増大した微感性の危険が伴う（Rakel, 1997）。加えて、β−２アゴニストの使用は、振せん、頻拍、動悸および筋肉けいれんを含めた有害な反応を引き起こすといくつかのケースで報告されている（Rakel, 1997）。従って、より少ない副作用を持つ抗−喘息剤を開発する大きな必要性がある。
【００５６】
Ｋ＋チャネルオープナーは、無傷気道の過敏性誘導閉塞を低下させる気道平滑筋の効果的な弛緩剤であることが示されている。低温保持ヒト気管支（Muller-SchweinitzerおよびFozard, 1997）においては、および摘出されたモルモット気管調製物（Linら, 1998; Andoら, 1997; Nielson-Kudsk, 1996; Nagaiら, 1991）においては、筋肉がある範囲のスパスモーゲンによって自然に修飾するか、または誘導されるかを問わず、ＫＡＴＰオープナーは緩和を生じた。これらの条件下で、Ｋ＋チャネルオープナーはＫ＋イオン流出および結果としての膜過分極を生じるように作用すると考えられる。その結果、電圧−感受性Ｃａ２＋チャネルは閉じ、細胞内カルシウムレベルは降下し、筋肉の弛緩を生じさせる。新しくより特異的なＫＡＴＰオープナーの開発は、喘息の予防的および兆候的処置双方に対して新しいアプローチを提供することができる。
【００５７】
ＫＡＴＰチャネルは標的組織を超えて多くの組織タイプで存在し、従って、それらの活性化の結果、望まない副作用が起こり得る。特に、ＫＡＴＰチャネルは、血管平滑筋で見出されるので、ＫＡＴＰオープナーの有益な抗−喘息特性に加えて、血圧の関連する降下があり得る。直接的な気道平滑筋からの吸入剤中での化合物の送達は、化合物濃度をかなり低下させ、それにより、有害な反応を最小化する可能性がある。
【００５８】
心臓虚血症：心臓組織における多数のサブタイプのカリウムチャネルは未だ十分に特徴付けされていないので、ＫＡＴＰチャネルオープナーは心臓保護剤として大いに有望である。狭心症を持つ患者でのＫ＋チャネルオープナーによって供される有益な血管拡張効果は、今日よく確立されている（Chenら, 1997; Goldschmidtら, 1996; Yamabeら, 1995; Koikeら, 1995)。さらに、ＫＡＴＰチャネルの活性化は、短い虚血時間に続いての心筋層の急性必須条件に関与するようにも見え、再灌流梗塞の危険性（Pellら，1998）およびサイズ（Kouchiら,1998）を減少させるように作用する。
【００５９】
ＫＡＴＰチャネルの低温保護特性に対する直接的な証拠は、Jovanovicら（１９９８ａ）によって示されている。これらの研究において、Ｋｉｒ６．２／ＳＵＲ２Ａ（心臓ＫＡＴＰチャネル）につきコードするＤＮＡがＣＯＳ−７サル細胞にトランスフェクトされ、カルシウム負荷の程度がモニターされている。トランスフェクトされていない細胞は、低酸素症／再酸素添加後に観察される細胞内カルシウムの増加を受けやすいことが示された。しかしながら、該細胞のＫＡＴＰチャネルでのトランスフェクションは低酸素症／再酸素添加の潜在的損傷効果に対する抵抗性を付与した。かくして、心臓ＫＡＴＰチャネルは、再灌流負傷に対して心筋層を保護するにおいて重要な役割を演じているらしい。
【００６０】
脳虚血症：脳虚血症の治療は過去３０年間にわたりかなり進歩したが、脳虚血症（発作）は依然として合衆国の第３の主な死亡原因のままである。５００，０００を超える新しい発作／虚血症のケースが毎年報告されている。初期の死亡率は高い（３８％）が、合衆国では３００万人近くの生存者がおり、合衆国におけるこれらの患者のリハビリに対する毎年のコストは１７０億ドルに近い(Rakel,1997）。初期の細胞効果は虚血症エピソード後に非常に迅速に起こり（数分）、他方、急性の細胞破壊は、梗塞後数時間または数日までは起こらない。初期の効果は、生体エネルギー欠損による脱分極および、Ｎａ＋チャネルの不活性化を含む。電圧−ゲーテッドカルシウムチャネルは活性化され、その結果、細胞内カルシウムがかなり増加する。問題をさらに悪化するのは、それ自体がイオノトロフィーグルタミン酸受容体を介するＮａ＋およびＣａ２＋流入双方を増大させるグルタミンの大量の一時的放出である。グルタミン酸はメタボトロフィー受容体に結合し、この結果イノシトールリン酸経路が活性化される。これは、細胞内貯蔵からのカルシウムからのさらなる放出を含めた細胞内事象のカスケードを誘発する。今日、細胞内カルシウムのこの初期の過剰負荷は、最終的には、数時間または数日後に観察される遅延した細胞傷害に導くことがよく受け入れられている。最近、非常に短い低酸素攻撃に曝されたドーパミン作動性ニューロンは、ＫＡＴＰチャネルの開口を主として通じて過剰分極する。(Guatteoら,1998)。この刺激効果は、増大した代謝要求および細胞内ＡＴＰレベルの結果としての降下の直接的結果であると示唆された。さらに、Jovanovicら（１９９８ｂ）は、最近、Ｋｉｒ６．２／ＳＵＲ１（ニューロンＫＡＴＰチャネル）につきコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞が、低酸素−再酸素添加を通じてひき起こされた負傷に対する抵抗性の増大を示したことを報告している。従って、ＫＡＴＰの開口は、ニューロン組織における減少した酸素の短い期間の間に、生体低温保護役割を演じることができる。かくして、このカルシウム流入を予防的に妨げるように作用するのみならず、損傷した組織において正常な静止膜ポテンシャルを再確立するのを助ける化合物を開発するにおいて多大な治療的潜在能力がある。κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンでの処理は、ＫＡＴＰチャネルを開かせるように作用し、膜の過剰分極を誘導し、電圧−ゲーテッドＣＡ２＋チャネルの閉鎖を間接的に生じさせ、それにより、かなりのカルシウム流入の有害な降下を妨げるか、または低下させる。
【００６１】
本発明によると、イン・ビトロでの気管培養において最大過剰分極を生じさせるのに必要なよりもはるから高いκ−ＰＶＩＩＡの濃度の静脈内（ＩＶ）注射が、麻酔ラットにおいて血圧または心拍に何ら影響しないことが見出された。
【００６２】
我々の予備的なデータはκ−ＰＶＩＩＡが、かなり優れた様式にて筋肉細胞の一次培養においてグリベンクラミド−感受性電流を誘導することを示す。さらに、κ−ＰＶＩＩＡの存在下での初代筋肉細胞培養のインキュベーションは、低酸素−誘導脱分極に対する保護を付与する。さらなるデータは、κ−ＰＶＩＩＡが梗塞サイズを低下させ、かくして、再灌流負傷から器官に対して保護を提供することを示す。
【００６３】
また、本発明は、本明細書中に記載した目的で用いることができるさらなる薬物の同定のための合理的な薬物デザインに関する。合理的な薬物デザインの目標は、それと相互作用して（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤）、例えば、ポリペプチドのより活性なまたは安定な形態である、または例えばイン・ビボにてポリペプチドの機能を増強し、またはそれに干渉する薬物を作り出す、注目する、または小分子の生物学的に活性なポリペプチドの構造的アナログを得ることである。合理的薬物デザインで用いるいくつかのアプローチは、三次元構造、アラニンスキャン、分子モデリングの分析、および抗−ｉｄ抗体の使用を含む。これらの技術は当業者によく知られている。そのような技術は、該第１のポリペプチドおよび該第２のポリペプチドによって形成される蛋白質複合体の三次元構造を規定する原子座標を提供し、該原子座標に基づいて、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの間の相互作用に干渉できる化合物を設計し、または選択することを含む。
【００６４】
ポリペプチド活性を変調する、またはそれに影響する物質の同定の後、該物質はさらに調査することができる。さらに、それは製造しおよび／または調製、すなわち、製造または処方、あるいは医薬、医薬組成物、または薬物のごとき組成物で用いることができる。これらは個体に投与することができる。
【００６５】
ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定された物質は天然ではペプチドまたは非−ペプチドであり得る。非−ペプチド「小分子」は、しばしば、多くのイン・ビボ医薬用途で好ましい。従って、物質（特に、もしペプチドであれば）のミメティックまたはミミックが、医薬用途で設計することができる。
【００６６】
公知の医薬的に活性な化合物に対するミメティックスの剤は「リード」化合物に基づいての医薬の開発に対する公知のアプローチである。このアプローチは、活性化合物が合成するのに困難であるか、または高価である場合、あるいは投与の特定の方法に不適切である場合、例えば、純粋なペプチドが消化管中のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるので、それが経口組成物で不適当な活性剤である場合に望ましいであろう。ミメティックスデザイン、合成およびテストは、一般に、標的特性についての非常に多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するのに用いられる。
【００６７】
一旦ファルマコフォアーが見出されれば、その構造は、ある範囲の源、例えば、分光学的技術、ｘ−線回折データおよびＮＭＲからのデータを用い、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従ってモデリングすることができる。コンピューター解析、（原子間の結合よりはむしろ、ファルマコフォアーの電荷および／または容量をモデリングする）同様性マッピングおよび他の技術をこのモデリングプロセスで用いることができる。
【００６８】
次いで、鋳型分子を選択し、それに対してファルマコフォアーを模倣する化学基を移植することができる。鋳型分子およびそれに移植された化学基は、便宜には、リード化合物の生物学的活性を維持しつつ、ミメティックスが容易に合成され、薬理学的に許容され、イン・ビボで分解しないように選択することができる。別法として、ミメティックがペプチドに基づく場合、ペプチドを環化し、その剛性を増加させることによって、さらなる安定性を達成することができる。次いで、このアプローチによって見出されたミメティックまたはミメティックスをそれらが標的特性を有するか否かまたはどの程度までそれが示されるかにつきスクリーニングすることができる。次いで、さらなる最適化または修飾を行って、イン・ビボまたは臨床試験のために１以上の最終のミメティックスに到達することができる。
【００６９】
本発明は、さらに、天然トキシンと同一の機能的部位にて、または部分的にそこでその作用を発揮し、天然トキシンと同様の機能的応答を誘導できる。小分子の発見のために、イン・ビトロおよびイン・ビボ双方にて分子ツールとしての、本明細書中に記載するκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの標識された（例えば、放射性標識、フルオロフォアー、クロモフォアー等）アナログの使用に関する。１つの具体例において、候補薬物剤によるその受容体または他の複合体からの標識κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの置換を用いて、適当な候補薬物を同定する。第２の具体例において、治療活性を決定するためのテスト化合物について生物学的アッセイを行い、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシン生物学的アッセイから得られた結果と比較する。第３の具体例において、小分子のκ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンの受容体に対する結合親和性を測定し、κ−ＰＶＩＩＡ−関連コノトキシンのその受容体に対する結合親和性と比較する。
【実施例】
【００７０】
本発明を以下の実施例を参照して記載し、これは、説明のために記載するのであり、断じて本発明を限定する意図のものではない。当該分野でよく知られた標準的技術または後に具体的に記載する技術を利用した。
【００７１】
実施例１
実験方法
１．細胞培養プロトコル
ラット新生児皮質細胞、心室筋肉細胞、気管平滑筋細胞および海馬細胞の初代培養を調製した。皮質半球から骨髄膜を除去し、海馬を摘出し、２０Ｕ／ｍｌパパインを用いて別々に解離した。細胞は３７℃にて４５分間一定に撹拌しつつ解離した。１０ｍｌ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２±１０％胎児ウシ血清±Ｂ２７ニューロン補足物；Life Technologies）中の画分Ｖ  ｂｓａ（１．５ｍｇ／ｍｌ）およびトリプシン阻害剤（１．５ｍｇ／ｍｌ）で消化を停止した。細胞を軽くトリチュレートして、周囲の結合組織から細胞を分離した。流体を取り扱うロボット（Quadra96, Tomtec）を用い、細胞をプリマリア−処理９６ウェルプレート（Becton-Dickinson）に沈降させた。各ウェルにほぼ２５，０００細胞を負荷した。プレートを３７℃の湿潤５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、蛍光スクリーニング前に少なくとも５日間保持した。脳室を２ｍｍ角ピースにダイシングし、２０Ｕ／ｍｌパパインおよびトリプシン／ＥＤＴＡ  １×（Life Technologies）の存在下で消化した。気管の表面の平滑筋細胞は、同消化酵素を用いて培養した。培養技術は前記方法に従った。
【００７２】
２．フルオリメトリーアッセイ
フルオリメトリーアッセイで用いた生理食塩水は［ｍＭ単位で］１３７  ＮａＣｌ、５  ＫＣｌ、１０  ＨＥＰＥＳ、２５グルコース、３ＣａＣｌ２および１ＭｇＣｌ２を含有した。
【００７３】
ジ−８−ＡＮＥＰＰ：電圧−感受性色素：膜−ポテンシャルに対する化合物の効果は、電圧−感受性色素ジ−８−ＡＮＥＰＰを用いて調べた。該ジ−８−ＡＮＥＰＰ（２μＭ）をＤＭＳＯに溶解させ（最終浴濃度０．３％）、１０％プルロニン酸（pluronic acid)の存在下で細胞に負荷した。プレートを４０分間インキュベートし、次いで、実験を開始する前に生理食塩水で４回洗浄した。ジ−８−ＡＮＥＰＰはプルロニン酸の存在下で膜と交差し、色素の細胞質プールを生じた。ジ−８−ＡＮＥＰＰは原形質膜に挿入され、そこで、ポテンシャルが変化し、その結果分子が再編成される。過剰分極の間に、該色素は、細胞質の色素の貯蔵庫からの原形質膜の外部小葉にインターカレートする。過剰分極は正シフト、および蛍光レベルの負のシフトとしての脱分極として表される。ＡＮＥＰＰ色素は膜ポテンシャルの１００ｍＶ変化当たり蛍光強度のかなり均一な１０％変化を示し、それ自体、蛍光変化は膜ポテンシャルの変化と相関させることができる。
【００７４】
ＰＢＦＩ：Ｋ＋感受性色素：ＰＢＦＩ色素の脂溶性ＡＭエステルを用いて、細胞内カリウムレベルに対するκ−ＰＶＩＩＡの効果を調べた。２０％プルロニン酸を含む細胞質に色素を負荷し、そこで、エステラーゼは、該エステルから色素を切断し、細胞内に色素を効果的にトラップする。細胞内カリウムの増加（Ｋ＋ｉ）は蛍光の上昇として反映され、蛍光の降下としてＫ＋ｉの減少を反映する。スクリーニング先立って、細胞を、５μＭ  ＰＢＦＩ中で３ないし４時間プレインキュベートした。ジ−８−ＡＮＥＰＰ色素に関しては、実験の開始に先立って、プレートを生理食塩水で４回濯いだ。
【００７５】
フルオ−３−カルシウム−感受性色素：細胞内カルシウムの変化を調べるために、フルオ−３色素の脂溶性エステル（ＤＭＳＯ中２μＭ、ＤＭＳＯ０．３％の最終浴濃度）を、２０％プルロニン酸の存在下で細胞に負荷する。プレートを３５分間インキュベートし、実験を開始する前に生理食塩水で４回洗浄する。細胞内カルシウムの濃度の増加および減少は、各々、パーセント蛍光の正および負の変化として反映される。
【００７６】
エチジウムホモダイナー−１：細胞生存性色素：  細胞傷害剤によって生じた細胞損傷の程度は色素エチジウムホモダイナー−１（Molecular Probes)を用いて測定した。この色素は無傷原形質膜と交差しないが、容易に損傷した細胞に入ることができる。核酸への結合に際し、該色素は蛍光増強を受ける。かくして、細胞損傷の程度は、蛍光の量と相関させることができる。興奮毒性アッセイのための調製において、細胞を３回すすぎ、κ−ＰＶＩＩＡまたは等容量の生理食塩水で予備処理した。細胞を１５分間インキュベートし、グルタミン酸（５ないし５００ｕｍ）をプレートの適当なレーンに添加した。細胞をさらに３０分間インキュベートし、徹底的に４回洗浄した。エチジウム色素（４ｕＭ）を全てのウエルに負荷し、直ちに読みを採取した。次いで、１時間間隔で読みを採取した。
【００７７】
３．フルオリメトリープロトコル
フルオリメトリー測定は、９６ウエルプレートのウエル当たりほぼ２５，０００細胞からの細胞応答の平均である。皮質からの細胞の培養は少なくとも錐体ニューロン、二極性ニューロン、インターニューロンおよび神経膠星状細胞を含む。膜ポテンシャル（ジー８−ＡＮＥＰＰ）、細胞損傷（エチジウムホモダイマー−１）、細胞内Ｋ＋（ＰＢＦＩ）および細胞内Ｃａ２＋（Ｆｌｕｏ−３）の変化を、κ−ＰＶＩＩＡ単独で、あるいは特異的受容体／イオンチャネルアゴニストまたはアンタゴニスト存在下でのκ−ＰＶＩＩＡで誘導された応答の尺度として用いた。濃度−応答をκ−ＰＶＩＩＡに関して収集して、効果的な範囲を決定した。ウエル間の変動を最小化するために、予備処理における蛍光の程度を処理後におけるそれと比較することによって各ウエルをそれ自身の対照として作用させた。この正規化プロセスは、プレート間および培養間の相対的応答の比較を可能とする。各ウエルにおける混合細胞集団をフルオリメーターで測定し、個々の細胞シグナリング応答を平均化した。８つのウエルからの平均、および該平均の標準誤差を含めた統計処理は、処理の間の有意な差の比較を可能とした。結果を蛍光のパーセント変化として表した。プレートの初期の読みは生理食塩溶液にて採取した。ジ−８−ＡＮＥＰＰ、Ｆｌｕｏ−３またはＰＢＦＩ色素を用いる測定は１５秒、２分、５分、１０分、２０分および３０分間隔で、化合物の存在下で行った。エチジウムホモダイマー−１での読み取りは１時間間隔で行った。
【００７８】
４．気管平滑筋調製
頸部脱臼によってモルモットを犠牲とし、気管を切り出し、結合組織を除去した。気管を４または５のセクションに切断し、気管筋肉と反対側の軟骨のリングを通じての切断によって切開した。各セグメントを、（ｎｍ）ＮａＣｌ  １１８．２；  ＫＣｌ  ４．７；  ＭｇＳＯ４  １．２；  ＫＨ２ＰＯ４  １．２；  グルコース、１１．７；  ＣａＣｌ２  １．９およびＮａＨＣＯ３  ２５．０を含有する器官浴中に設置した。該浴を３７℃で維持し、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を通気した。調製物を１ｇの張力下に維持し、実験を開始する前に平衡化した。Ｇｒａｓｓポリグラフに連結した力−変位変換器を用い、収縮を等尺的に測定した。６０分の平衡期間の後に、気管を最大下濃度のヒスタミンに暴露した。スパスモーゲンに対する収縮応答が一定となるまでこの工程を反復した。κ−ＰＶＩＩＡの増大する濃度の弛緩効果を、ヒスタミンの不存在下および存在下で測定した。
【００７９】
５．パッチクランプ記録
全細胞パッチクランプ記録は、ポリオルニチン／ポリ−Ｄ−リシンで被覆した。カバーグラス上の皮質ニューロンから（培養５ないし２８日）および未被覆カバーグラス上の筋肉細胞から行った。パッチピペットを薄壁ホウケイ酸ガラスから引き出し、それは、４Ｍないし６Ｍの抵抗性を有した。電流をＥＰＣ９増幅器（ＨＥＫＡ）で記録し、ＭａｃｉｎｔｏｓｈパワーＰＣで作動させるソフトウエア（Ｐｕｌｓｅ，  ＨＥＫＡ）によって制御した。全細胞電流を１０ｋＨｚで低通過濾過し、ＶＲ−１０ｂデジタルデータレコーダを介してデジタル化して、９４ｋＨｚのサンプリング速度にてビデオテープに貯蔵した。細胞内ピペットは（ｍＭ単位）：１０７ＫＣｌ、３３ＫＯＨ、１０ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳを含有した。溶液をＮａＯＨでｐＨ７．２とし、０．１ないし０．５ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰおよび０．１ｍＭ  ＮａＡＤＰを実験直前に添加した。細胞該溶液は、（ｍＭ単位）：６０ＫＣｌ，８０ＮａＣｌ，１ＭｇＣｌ２、０．１ＣａＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳを含有した。外部溶液のｐＨをＮａＯＨでｐｈ７．４とした。高濃度のカリウムの結果、−２０ｍｖのカリウムについての逆転ポテンシャルが計算された。その結果、もし保持ポテンシャルが−２０ｍｖよりも負であれば、Ｋ＋チャネルの開口の結果Ｋ＋イオンの内向きフラックスおよび全細胞電流の下向き偏向がもたらされる。ＫＡＴＰチャネルは弱い内向き整流特性を有し、それ自体、より大きな内向き電流が予測されるので、これらの溶液を選択した。進行中の実験は、低いカリウムレベルの溶液中でのκ−ＰＶＩＩＡの降下を探るものである。
【００８０】
６．電気生理学溶液
２つの細胞外溶液を異なるＫ＋イオンおよびＮａ＋イオン濃度で用いた。溶液１は５ｍＭＫＣｌを含有し、−８４ｍＶのカリウム平衡ポテンシャル（Ｅｋ）を有し、溶液２は６０ｍＭを含有し、−２０ｍＶの対応するＥｋを有する。細胞外溶液１は（ｍＭ単位）：５  ＫＣｌ，１３５ＮａＣｌ，１ＭｇＣｌ２，０．１ＣａＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳを含有した。外部溶液のｐＨはＮａＯＨでｐＨ７．４に修正した。細胞外溶液２は（ｍＭ単位）：６０ＫＣｌ，８０ＮａＣｌ，１ＭｇＣ，０．１ＣａＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳを含有した。外部溶液のｐＨをＮａＯｈでｐＨ７．４に修正した。細胞内ピペットは（ｍＭ単位）：１０７ＫＬＣｌ，３ＫＯＨ，１０ＥＧＴＡ，１ＭｇＣｌ２，１ＣａＣｌ２および１０ＨＥＰＥＳを含有した。溶液をＮａＯＨでｐＨ７．２とし、実験直前に０．１ないし０．５ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰおよび０．１ｍＭ  ＮａＡＤＰを添加した。
【００８１】
７．電気生理学結果の解釈
低濃度の外部Ｋ＋イオン（溶液１）の存在下にて、かつ−８４ｍＶよりも脱分極した保持ポテンシャルにて、Ｋ＋チャネルの開口の結果、Ｋ＋イオンの外向き流れが生じる。高濃度のＫ＋（溶液２）の存在にて、Ｋ＋イオンの外向き移動が観察されるためには、膜ポテンシャルは−２０ｍＶよりも負でなければならないであろう。もし２つの異なる細胞外溶液においてκ−ＰＶＩＩＡによって誘起された電流の現実の逆転ポテンシャルが計算された値と同一であるならば、κ−ＰＶＩＩＡ−誘導電流はＫ＋イオンのフラックスの結果である。電流の逆転ポテンシャルは、細胞を計算されたＥｋに保持し、増大させる濃度のκ−ＰＶＩＩＡの存在下および不存在下双方にて、−１００ｍＶないし＋８０ｍＶの５００ミリ秒の電圧ランプを実行することによって計算した。４つの対照ランプの平均を、κ−ＰＶＩＩＡの存在下で誘起された４つのランプの平均から差し引いた。得られた追跡は当該化合物の存在によって誘導された現実の電流であった。これは多項式機能および計算された逆転ポテンシャルと合致した。
【００８２】
８．微速度共焦点Ｃａ２＋イメージング
皮質細胞培養に、イメージング実験から４０分前に、蛍光Ｃａ２＋インジケーターＦｌｕｏ３−ＡＭ  （Molecular Probes, Eugene OR; ０．１％プルロン酸を含む２ｍＭ最終濃度）を負荷した。細胞を含むカバーグラスを層流灌流チャンバー（Cornell-Bell設計；Warner Instruments, Hamden, CT）に設置し、少なくとも５分間生理食塩水（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および２０ｍＭソルビトール、ｐＨ７．３）中ですすいで、過剰のＦｌｕｏ−３ＡＭを除去した。微速度イメージを、Zeiss Axiovert135倒立顕微鏡（Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY）を備えたNikon PCM200（Melville, NY）共焦点走査レーザー顕微鏡で収集し、１．８秒毎に平均しつつフレームなくして光学メモリーディスクレコーダー（Panasonic TQ3031F, Secaucus NJ）（Kimら, 1994にさらに記載された方法参照）にダウンロードした。イメージ分析を、視野中の各神経膠星状細胞における細胞質の標準化された５×５画素領域で行って、データ解析における偏りを防止した。強度測定（蛍光の％変化）の時間プロットは、H.Sontheimer（Birmingham, AL）によって書かれたプログラムを用いて得られ、Origin（MicroCal Northampton, MA）を用いてプロットした。ルーチン分析は、少なくとも５回のトライアルで、視野当たり２００までの細胞についての時間プロットよりなり、かくして、しばしば、実験当たり数千の細胞からのデータ解析を得た。
【００８３】
実施例２
κ−ＰＶＩＩＡへの暴露は細胞内Ｋ＋の用量−依存性減少を生じる。
κ−ＰＶＩＩＡは元来紫色イモ貝（Conus purpurascens）から単離され、ショウジョウバエＨ４  ｓｈａｋｅｒ  Ｋ＋チャネルをブロックすることが判明している（ら, 1998）。同一実験において、ペプチドの効果は、哺乳動物ｓｈａｋｅｒ−様電圧−感受性Ｋ＋チャネルＫｖ１．１およびＫｖ１．３を発現する卵母細胞では観察されなかった。皮質の初代培養に存在する他の電圧−ゲーテッドＫ＋チャネルをブロックするペプチドの能力を本実験でテストした。９６−ウェルのフルオリメトリーアッセイを用いて、電圧−ゲーテッドカリウムチャネル（Ｋｖ）が活性化される脱分極条件下でカリウムレベルの変化を調べた。細胞にカリウムインジケーター式をＰＢＦＬを予め負荷した。もし化合物が脱分極環境中でＫｖチャネルをブロックするように活動すれば、細胞内Ｋ＋の増加が得られるであろう。しかしながら、該結果は、１００ｎＭまでの濃度において、未処理静止調製物において細胞内Ｋ＋濃度の減少があり（図１）、ならびにそれらの調製物が１０ないし１００ｕＭアコニチンで脱分極したことを示唆した。κ−ＰＶＩＩＡで誘起されたＰＢＦＩ色素での蛍光の変化は小さいが、それらは重要であり、反復可能であることを強調するのは重要である。
【００８４】
実施例３
κ−ＰＶＩＩＡへの暴露は用量−依存性過剰分極を生じさせる。
電圧−感受性ジ−８−ＡＮＥＰＰの存在下でフルオリメトリー実験を反復し、細胞内Ｋ＋レベルの降下が（蛍光の正のシフトによって表される、図２Ａ−２Ｂ）調製物の有意な過剰分極が伴って観察された。κ−ＰＶＩＩＡはこのアッセイにおいて極端に優れており、皮質において８×１０−１６Ｍ、筋肉細胞培養物において９×１０−１６Ｍ、および気管筋肉細胞の初代培養において９×１０−１８ＭのＥＣ５０を示した。
【００８５】
実施例４
κ−ＰＶＩＩＡ−誘導過剰分極はＫＡＴＰアンタゴニストへの暴露によってブロックされる。
κ−ＰＶＩＩＡ−誘導過剰分極における異なるＫ＋チャネルサブタイプの関与を決定するために、５つのよく記載されているＫ＋チャネルアンタゴニスト（４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、イベリオトキシン（ＩＢＴＸ）、アパミン、トルブタミドおよびグリベングラミド）の効果をテストした。皮質調製物においては、４−ＡＰ、ＩＢＴＸおよびアパミンの適用は１００ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡで観察された過剰分極に対して検出可能な効果がなかった。しかしながら、ＫＡＴＰチャネルのアンタゴニストであるトルブタミド（１ないし１００ｕＭ）およびグルベンクラミド（１０ｎＭ）双方は、κ−ＰＶＩＩＡ誘導過剰分極において有意な減少を生じさせた（図３Ｂ）。また、グリベングラミドは、筋肉細胞の培養においてκ−ＰＶＩＩＡ−誘導過剰分極の有意な減少を生じさせた（図３Ａ）。
【００８６】
実施例５
κ−ＰＶＩＩＡはトルブタミドまたはグリベンクラミド−感受性電流を誘導する。
ＫＡＴＰアンタゴニストに対する応答の感度は、全細胞パッチクランプ技術を用いて確認した。これらの実験において、細胞カリウム濃度を６０ｍＭまで増加させ、カリウムに対する逆転ポテンシャル（Ｅｋ）が−２０ｍＶとなるように溶液を計算した。かくして、膜ポテンシャルが−２０ｍＶよりも負である場合のＫ＋チャネルの開口の結果、Ｋ＋イオンの流入が起こる。皮質および心筋細胞の双方の初代培養において、１００ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡの注入は、−２０ｍＶ近くで逆転した正のイオンの内向き流れを誘導し、これはＫ＋イオンの関与を示す。−８０ｍＶの保持ポテンシャルにて、κ−ＰＶＩＩＡによって誘導された電流は、皮質調製物（２６．２±６．２ｐＡ、ｎ＝４）と比較して、筋肉細胞調製物（８７．７±５．９ｐＡ、ｎ＝８）よりも有意に大きかった。電流を細胞キャパシタンスについての補正した場合でさえ、筋肉細胞によって生じた応答は皮質調製物で観察されたものよりも大きかった（各々、４．６±０．４ｐＡ／ｐｆおよび２．４±０．７ｐＡ／ｐｆ）。
【００８７】
双方の場合、電流は、ＫＡＴＰアンタゴニストであるトルブタミド（１００ｕＭ）またはグルベンクラミド（１０ｎＭ）いずれに対しても感受性であった（図４ＡおよびＢ）。κ−ＰＶＩＩＡ誘導電流の逆転ポテンシャルは、−１００ないし＋６０ｍＶの電圧ランプを用い、結果を四次多項式に適合させることによって決定した（図４Ｃ）。実験的に決定されたＥｋ（−２３ｍＶ）は、これらの高いカリウム溶液についての−２０ｍＶの計算されたＥｋに近く、これはＫ＋チャネルの関与を示す。
【００８８】
実施例６
κ−ＰＶＩＩＡは細胞内カルシウムのゆっくりと発生する低下を生じる。
細胞内カルシウムレベルに対するκ−ＰＶＩＩＡの効果は、９６−ウェルフルオリメトリーアッセイプレートを用い、細胞にＣａ２＋インジケーター色素Ｆｌｕｏ−３を負荷することによって測定した。皮質ニューロンの初代培養において、κ−ＰＶＩＩＡは細胞内カルシウムの有利な低下を生じた。経時的を除き、１５秒においては１ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡではほとんど効果は認められず（−２．１５±０．９５％、２回のトライアル）、カルシウム濃度の降下はより顕著になった（３０分、−８．８±３．９％）。
【００８９】
実施例７
κ−ＰＶＩＩＡは低酸素症−誘導脱分極に対して保護する。
Ｎ２−誘導低酸素症の脱分極効果を、９６ウェルフルオリメトリーアッセイプレートにおいて電圧感受性色素ジ−８−ＡＮＥＰＰを用いて心臓心室筋肉細胞でモニターした。Ｎ２ガスを一定に通気することによって溶液から酸素を欠乏させ、対照未処理生理食塩水での結果と比較した。これらの条件下で、低酸素症は調製物の有意な脱分極を生じさせ（蛍光降下として反映される）、１０ｎＭのκ−ＰＶＩＩＡと共に調製物をインキュベートすると、膜ポテンシャルにおけるいずれの低酸素症−誘導変化も妨げた（図５）。
【００９０】
実施例８
κ−ＰＶＩＩＡはグルタミン酸−誘導興奮傷害性に対して保護する。
９６−ウェルフルオリメトリーアッセイおよびエチジウムホモダイマー−１死滅細胞色素を用い、グルタミン酸−誘導興奮傷害性に対するκ−ＰＶＩＩＡの保護効果をテストした。９６−ウェルプレートの５つのレーンを１００ｐＭのκ−ＰＶＩＩＡに予め暴露し、さらに５つを対照生理食塩水に暴露した。次いで、グルタミン酸を３０分間適用し、その時点で、全プレートを徹底的に洗浄して、全てのκ−ＰＶＩＩＡおよびグルタミン酸を除去した。エチジウム色素を負荷し、初期の読みを採取し、遅延した細胞傷害性の量を６時間モニターした。蛍光の増加は増大した細胞の破壊を表す。図６から分かるように、κ−ＰＶＩＩＡにおける皮質細胞のプレ−インキュベーションの結果、１００ｕＭグルタミン酸の遅延した（６時間）細胞傷害効果に対して非常に効果的な保護がもたらされた。この保護は１００ｕＭトルブタミドによってブロックされた（ＫＡＴＰアンタゴニスト）。
【００９１】
実施例９
κ−ＰＶＩＩＡの細胞傷害性
２００ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡと共に初代皮質培養を２０分間インキュベーションすると、検出可能なプロテアーゼ活性を誘導しなかった（３回のトライアル）。比較として５％トリトンでの２０分間インキュベーションは、Enzchekプロテアーゼ−感受性色素によって検出されるごとく、蛍光の〜１４％を増加を生じさせた。
【００９２】
実施例１０
低酸素症のイン・ビトロモデルにおけるκ−ＰＶＩＩＡの保護能力の評価
９６−ウェルフルオリメトリーアッセイ、電気生理学、および共焦点顕微鏡の組合せを用いて、初代培養において酸素を一過的に欠乏させる急性効果に対して保護するκ−ＰＶＩＩＡの能力を評価する。多チャンバー生理食塩水貯蔵器は、送達プレートの下半分が、Ｎ２を通気する生理食塩水で満たされるように構築した。個々のチャンバーは、酸素を減少させる効果が、異なる濃度のκ−ＰＶＩＩＡの存在下および不存在下でモニターできるようにする。電位差色素ジ−８−ＡＮＥＰＰを用いての心室筋肉細胞の初代培養における初期スクリーニングは、低酸素症誘導脱分極に対するκ−ＰＶＩＩＡの強力な保護効果を示す。同様の結果が皮質および気管で観察される。カルシウム−感受性色素fluo-3を用いて、低酸素症攻撃によって誘導された細胞内カルシウムレベルの変化を観察すると、κ−ＰＶＩＩＡは、全ての３つの組織調製物において低酸素症に対する保護を供することができるのが観察される。同様の結果が、低酸素症電気生理学によって誘導された膜ポテンシャルの変化をモニターするための全細胞パッチクランプ技術の電流−クランプモードを用いて得られる。この技術は非常に感度が良好で、単一の気管、ニューロンまたは筋肉細胞に対するκ−ＰＶＩＩＡの効果の調査を可能とする。
【００９３】
実施例１１
興奮傷害性のイン・ビトロモデルにおけるκ−ＰＶＩＩＡの保護能力の評価
高濃度のグルタミン酸に対する攻撃後に生じた遅延細胞死滅の程度をモニタリングする予備的フルオリメトリー実験を皮質の初代培養で行った。結果は、κ−ＰＶＩＩＡの存在が、用量−依存的にグルタミン酸−誘導興奮傷害性の程度を効果的に低下させることを示す。全−細胞パッチクランプ技術の電流−クランプモードを用い、膜ポテンシャルの現実の変化に対するフルオリメトリー結果の相関を調べる。κ−ＰＶＩＩＡの存在は初期グルタミン酸−誘導脱分極を妨げ、それにより、グルタミン酸−誘導カルシウム流入に対して保護を付与することが観察される。
【００９４】
実施例１２
梗塞サイズに対するκ−ＰＶＩＩＡの効果
最初に、摘出されたウサギ心臓における梗塞サイズに対するκ−ＰＶＩＩＡの効果を分析した。このモデルにおいては、梗塞は、冠動脈の３０分間の閉塞、続いての２時間の再灌流によって摘出された心臓で誘導される。１０ｎＭおよび１００ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡでの１０分間の灌流は梗塞のサイズを低下させることが判明した。また、１ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡでの１０分間の灌流は梗塞サイズに対して効果を有しないことも判明した。これらの結果を考慮して、イン・ビボモデルをさらなる分析で用いた。
【００９５】
この実験では、再灌流に先立って与えた心筋層を救出するκ−ＰＶＩＩＡの能力をテストした。この実験は、The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（National Academy Press, Washington, DC, 1996）に従って行った。
【００９６】
体重が１．６ないし２．７ｋｇの双方の性のNew Zealand Whiteウサギをペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ，静脈内）麻酔し、気管切開を通じてチューブを挿入し、正圧レスピレーターを介して１００％酸素を通気した。通気速度および１回換気量を調整して、動脈血液ガスを生理学的範囲に維持した。体温は３８ないし３９℃に維持した。血圧をモニタリングするためにカテーテルを左頸動脈に挿入した。薬物注入用にもう１つのカテーテルを右頸静脈に挿入した。左側気管切開を第４肋間膜で行い、心膜を開いて心臓を露出させた。曲面テーパー針上の２−１０絹縫合を左側冠動脈の主分岐周りの心筋層を通した。縫合の端部を柔軟なビニルチューブの小片を通してスネアを形成した。該スネアを引き、次いで、該チューブを小さな血管鉗子によって固定することによって誘導した。虚血症はチアノーゼの出現によって確認した。全ての動物に３０分の虚血性傷害を与えて（指標虚血症）梗塞を生じさせた。再灌流はスネアを開放することによって達成し、心室表面での目に見える充血によって確認した。
【００９７】
再灌流の３時間後に、ウサギに過剰容量のペントパルビタールを与え、胸から素早く心臓を摘出し、Langendorff装置に設置し、生理食塩水を灌流して血液を十分に洗浄する。次いで、冠動脈を再度閉塞し、５ｍｌの０．１％蛍光マイクロスフィア(１ないし１０μｍ直径、Duke Scientific Corp, Palo Alto, CA)を灌流物に注入して、蛍光のない組織の領域としての危険ゾーンの境界を定めた。心臓を秤量し、凍結し、２．５−ｒｏｍ−厚みのスライスに切断した。該スライスを３７℃にてリン酸ナトリウム緩衝液中の塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）中で２０分間インキュベートした。スライスを１０％ホルマリンに浸漬して、染色された（生きた）および染色されていない（壊死）組織の間のコントラストを増強させて、次いで、正確に２ｍｍ離したガラスプレートの間で圧搾した。危険な心筋層は、スライスに紫外線を照射することによって同定した。処理に対して知らされていない研究者によって、梗塞および危険ゾーン領域を明瞭なアセテートシート上で追跡し、デジタルプランメトリーで定量した。面積にスライスした厚みを乗ずることによって、面積を容量に変換した。梗塞サイズは危険ゾーンのパーセンテージとして表す。
【００９８】
プロトコルは以下の通りであった。グループＩは対照として供し、２０分間の安定化の後に、３０分間の閉塞、続いての３時間の灌流を与えた。グループ２には５分のプレコンディショニングＰＣを経験させ、既知の保護介入用の陽性対照として供した。グループ３には再灌流５分前に静脈内ボーラスとして１０μｇ／ｋｇ  κ−ＰＶＩＩＡを与えた。グループ４には再灌流５分前に１００μｇ／ｋｇ  κ−ＰＶＩＩＡを与えた。２つの他の群を含めた。新しい研究者をこのプロジェクトで用いたので、その者は指標虚血症１０分前にボーラスとして１０μｇ／ｋｇ  κ−ＰＶＩＩＡを与えた小さな群で行い、以前の研究者のデータと重複し得るかを判断させた。最後の群は、１００μｇ／ｋｇ  κ−ＰＶＩＩＡを再灌流から１０分後に与えた。これは、薬物が再灌流においてその保護を発揮したか否かをテストするものである。
【００９９】
図７は、危険ゾーンの％として表した得られた梗塞サイズを示す。ＰＣは我々の過去の経験のごとく梗塞サイズの劇的な低下を引き起こしたことに注意されたし。κ−ＰＶＩＩＡでの予備処理もまたＰＣとほとんど同程度に優れた保護効果を引き起こした。また、再灌流前に与えた１０μｇ／ｋｇ容量は同等に保護を示した。（ｐ＜０．００３  ｖｓ  対照，ＡＮＯＶＡ）。薬物を再灌流から１０分後に開始した場合には、保護は失われた（ｐ＝ＮＳ  ｖｓ．対照）。
【０１００】
図８は、危険な領域に対してプロットした梗塞サイズを示す。経験によると、梗塞のサイズは未処理ウサギにおける危険なゾーンサイズとは正確には比例していないが、通常、約０．３５ｃｍの危険サイズを持つゼロ梗塞サイズを有することを示す（Ｘｕら，2000）。非−ゼロ交点は、この特定の対照群では出現しないが、より大きな群を分析した場合には、それは起こることが示される。この関係の効果は、危険ゾーンが独立して、梗塞サイズが危険ゾーンのパーセンテージとして正規化した場合に梗塞サイズに影響しえることである。事実、保護されるように見える群は、保護されないかもしれないが、単純により小さな危険サイズを有する。我々は、この人工物につき、危険ゾーンサイズに対して梗塞をプロットすることによってテストする。該線は、対照心臓についての回帰を示す（黒色丸）。保護は、該関係の下方シフトによって示される。全ての保護された群における全ての心臓は、対照回帰下まで降下し、これは真実の保護を示す。
【０１０１】
κ−ＰＶＩＩＡは、いずれの容量においてもいずれの血液動力学効果のないことが判明した。全ての動物は、延長された外科手術手法のストレスのため、再灌流の後記段階で血圧降下を有する傾向がある。
【０１０２】
これらの結果は、それを予備処理として与えるので、再灌流前に投与した場合にκ−ＰＶＩＩＡは保護剤であることを明らかとする。過酸化水素ナトリウム交換阻害剤（カリポリド）およびアデノシンおよび他のＧｉ−結合受容体アゴニストを含むプレコンディショニングミメティックスのような予備処理、およびジアゾキシドのごときミトコンドリアＫＡＴＰオープナーとして与えた場合、多くの薬物は梗塞サイズを制限できる。あいにくと、もし一旦虚血症が開始したならば、これらの薬物のいずれも保護を示さない。予備処理は臨床環境ではほとんど選択されない。というのは、患者は冠動脈血栓が既に起こるまで示さないからである。必要とされるのは、虚血症が開始した後に投与される心筋層を吸収する薬物である。κ−ＰＶＩＩＡはその要件を満たすようである。我々は、κ−ＰＶＩＩＡが血栓形成および直接的血管形成術に対する協力体として急性心筋梗塞患者で用いられると考える。
【０１０３】
再灌流時に保護し得ることが突き止められた薬物は非常に少ない。１９８０年代においては、フリーラジカルスカベンジャーは、もしそれが再灌流の間に血漿中にあれば、梗塞サイズを制限し得ると提案されていた。あいにくと、それらの報告の実質的に全ては再現性がないことが判明しており、このクラスの剤が効果的であるようには見えない。我々は、現在、Ａｖｅｎｔｉｓよって開発されつつある薬物ＡＭＰ５７９（Ｘｕら，２００１ａ；Ｘｕら，２０００）を扱ってきた。ＡＭＰ５７９はアデノシンＡ１／Ａ２受容体アゴニストである、κ−ＰＶＩＩＡに対して同様の能力を有する。薬理学は、Ａ２Ａ受容体がＡＭＰ５７９の保護に関与することを明らかにしている。というのは、このサブタイプのブロッカーは保護を失うが、興味あるＡ２ａアゴニストまたはアデノシンそれ自体はＡＭＰ５７９の効果を模倣できないからである（Ｘｕら，２００１ｂ）。
【０１０４】
再灌流において保護するように見えるもう１つのクラスの薬物は成長因子受容体アゴニストである。ウロコルチンはこのクラスで最も研究されているものである(Latclunm,2001）、ＴＧＦ−β−１も保護することが報告されている（Baxterら，2001）。再灌流時に保護するこれらの薬物の全ての共通の特徴は、ＥＲＫ（細胞外受容体キナーゼ、ＡＫＡ：ｐ４２／ｐ４４／ＭＡＰキナーゼ）阻害剤であるＰＤ９８０５９が保護をブロックすることである。これは、ＥＲＫ活性化が関与し得ることを示唆する。（Baxterら，2001）。なぜＥＲＫ活性化が保護を示すかは未知であり、また、ＰＤ９８０５９が、いくつかの非特異的効果とは反対に、ＥＲＫをブロックすることによって保護をブロックすることも証明されていないからである。
【０１０５】
実施例１３
ＡＭＩのイヌモデルにおけるκ−ＰＶＩＩＡの効果
第２の種における活性を確認するために、κ−ＰＶＩＩＡの心臓保護効果をＡＭＩの開胸バルビタール麻酔イヌモデルで評価した。このモデルについての一般的な参照のためには、Mizumuraら（1995）を参照されたし。
【０１０６】
これらの実験のために、麻酔イヌ（〜１５ｋｇ）を、左前下降冠動脈（ＬＡＤ）を６０分間閉塞させ、３時間再灌流した。全てのイヌを血液動力学の測定のために設置した。放射性ミクロスフィアーを用いて、局所的血液流動を測定した。再灌流の後に、心臓を摘出し、ウサギモデル用のＴＴＺで染色して、梗塞損傷の程度を測定した。イヌの４つの群を、閉塞のスネア開放放出の５分前にＩＶボーラスとして３０、１００または３００μｇ／ｋｇとして与えるκ−ＰＶＩＩＡまたはビヒクルいずれかで処理した（閉塞後５５分）。
【０１０７】
図９から分かるように、１００μｇ／ｋｇおよび３００μｇ／ｋｇの用量でのκ−ＰＶＩＩＡの静脈内投与が、有意な保護を示し、梗塞サイズをほぼ６０％だけ減少させた。３０ｕｇ／ｋｇのより低い用量では有意な効果は観察されなかった。
【０１０８】
かくして、この実験は第２の種における心臓保護効果を確認したが、最低の有効投与量はウサギと比較したイヌではわずかにより高かった（１００μｇ／ｋｇ  ｖｓ．１０μｇ／ｋｇ）。
【０１０９】
ウサギ実験に関しては、血圧（図１０Ａ）または心拍（図１０Ｂ）の減少はκ−ＰＶＩＩＡのいずれの用量においても認められなかった。事実、３００μｇ／ｋｇ  κ−ＰＶＩＩＡの最高用量においては、現実には、このイヌモデルにおける再灌流で通常は観察される血圧降下を妨げた。
【０１１０】
このイヌモデルにおいては、閉塞スネアの開放直後の心室細動をイヌが経験するのは異常ではない。これは、通常、心臓を通常の血脈洞リズムに戻すのに電気ショッキングを必要とする。価値ある知見は、心室細動の発生が、対照と比較した場合に調べた用量の全てにおいてκ−ＰＶＩＩＡの投与の後には少ないことである（図１１）。この知見は統計学的に有意ではないが、おそらくは、小さな試料サイズ（ｎ＝６）のため、それが抗−不整脈効果を示す。
【０１１１】
本発明の方法および組成物は種々の具体例の形態に取り込むことができ、その少数のみをここに開示することが認識されよう。他の具体例が存在し、それは本発明の精神を逸脱しないことは当業者に明らかであおる。かくして、記載された具体例は説明的なものであって制限するものと解釈されるべきではない。
【表１−１】
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【表１−２】
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【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、心室筋肉細胞の初代培養において増大させる濃度のκ−ＰＶＩＩＡへの暴露の後の（ＰＢＦＩ色素で測定した）細胞内Ｋ＋のフルオリメトリー測定を示す。示されたデータは１つの試験からものであり、蛍光±標準偏差の平均的変化（※ｐ＜０．０５，片側ｔ−検定）として表す。
【図２】図２Ａないし２Ｂは、心室筋肉細胞（図２Ａ）または皮質（図２Ｂ）の初代培養において増大させる濃度のκ−ＰＶＩＩＡへの暴露後の（ジ−８−ＡＮＥＰＰ色素で測定した）膜ポテンシャルのフルオリメトリー測定を示す。実験の少なくとも６日前に細胞を９６ウェルプレートに負荷した。結果は平均±ＳＥＭとして表し、これは、２回および５回の間の個々の試験からの平均データを表す。
【図３】図３Ａないし３Ｂは、筋肉細胞の初代培養における１０ｎＭグリベンクラミド（Ｇｌｉｂ）での（図３Ａ）、または皮質の初代培養における５０ｕＭトルブタミド（Ｔｏｌｂ）での（図３Ｂ）κ−ＰＶＩＩＡ（１００ｎＭ）の阻害を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａないし４Ｃは、（図４Ａ）皮質細胞および（図４Ｂ）筋肉細胞においてκ−ＰＶＩＩＡによって誘導された電流を示す全細胞記録である。図４Ｃは、心筋細胞からのκ−ＰＶＩＩＡ−誘導電流のＩ−Ｖ関係を示す。
【図５】図５は、低酸素症誘導脱分極に対する１０ｎＭ  κ−ＰＶＩＩＡの保護効果を示す棒グラフである。棒線は平均±ＳＥＭを表す。
【図６】図６は、グルタミン酸洗浄から６時間後に測定したグルタミン酸−誘導（１００ｕＭ）興奮細胞傷害性に対する増大させる濃度のκ−ＰＶＩＩＡの効果を示す（３ないし６回の試験）。
【図７】図７は、実験した６つの群についてプロットして危険領域（虚血症ゾーン）の％としての梗塞サイズを示す。塗りつぶしていない記号は個々の実験を示し、塗りつぶした記号は群の平均を示す。三角形は、再灌流から５分後に薬物を摂取した動物を示し、および再灌流から１０分後に薬物を摂取した動物を示す。
【図８】図８は、梗塞サイズｖｓ．危険ゾーンのサイズのプロットである。塗りつぶした丸印は、未処理対照についてのプロットを示し、線はその群についての回帰である。保護された群は全て塗りつぶしていない記号によって示される下方にある。
【図９】図９は、イヌＡＭＩモデルにおける危険な領域のパーセンテージとして表した梗塞サイズのκ−ＰＶＩＩＡ（ＣＧＸ−１０５１）誘導低下を示すグラフである。データは用量当たり６匹のイヌからの平均±ＳＥＭを表す。ＣＯＮ−対照、閉塞３０分後のＯＣＣ（３０’）、薬物投与直後のＤＲＵＧ、再灌流から１、２および３時間後のＲＥＰ１、ＲＥＰ２、ＲＥＰ３。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、血圧（図１０Ａ）および心拍（図１０Ｂ）に対するκ−ＰＶＩＩＡ（ＣＧＸ−１０５１）の調べた用量のいずれかの効果の欠如を示すグラフである。
【図１１】図１１は、κ−ＰＶＩＩＡ（ＣＧＸ−１０５１）の投与後の心室細動の発生の低下を示すグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月4日(2004.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005532260000001.app
【国際調査報告】
2005532260.tif 000027
2005532260.tif 000028