(57)【要約】  本発明は、磁気応答性粒子の例えば常磁性ビーズを洗浄する装置及び方法を特徴とする。１模範的な装置は、入口及び出口を有するフローチャンバ；並びに少なくとも第１の磁場インデューサーを含む。第１の磁場をフローチャンバ中で選択的に適用できるように、本装置を構成する。本装置はまた、磁場の選択的な適用と連係して、流体の流れをチャンバに適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気応答性粒子を洗浄する方法であって：
第１の帯域中で第１の磁場によって捕獲された磁気応答性粒子を含むフローチャンバを通して液体を流すことと；
前記第１の磁場を消散させることと；
前記磁気応答性粒子を撹拌することと；
を含む方法。
【請求項２】
前記消散の前に液体流れを低減するかまたは停止させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流すことから前記撹拌までを１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記撹拌は、前記第１の磁場を周期的に再適用することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記撹拌は、第２の磁場を適用することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記撹拌は、前記第２及び第１の磁場を選択して適用することによって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１及び第２の磁場は、連係して調節される第１及び第２の永久磁石によって適用される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記フローチャンバはガラス円筒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１及び第２の磁石は、第１と第２の位置との間で並進運動して、前記第１及び第２の磁場を選択して適用する一般的なフレームに取り付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記気応答性粒子は標的を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記磁気応答性粒子は、前記液体中で結合したままである第１の化合物及び前記液体を解離する第２の化合物によって結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体は細胞増殖用の培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体は、前記第１の化合物の結合に関して前記標的と拮抗する拮抗剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記流すこと、消散、及び撹拌の間中、前記磁気応答性粒子は前記フローチャンバ中に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
フローチャンバ、第１の磁場インデューサー、及び該チャンバ中に配置され、標的と物理的に会合する磁気応答性粒子を用意することと；
前記フローチャンバ中で、前記第１の磁場インデューサーによって適用された第１の磁場中で前記磁気応答性粒子を捕獲することと；
溶液を前記フローチャンバを通して流すことと；
前記磁気応答性粒子を前記フローチャンバ中に保持するように、前記磁気応答性粒子を前記フローチャンバの第１の帯域から前記フローチャンバの１つ以上の他の領域に移送することと；
を含む方法。
【請求項１６】
前記移送は、前記第１の磁場インデューサーの位置を前記フローチャンバに対して変更することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記移送は、第２の磁場を適用して、前記磁気応答性粒子を第２の帯域に移送することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の磁場インデューサーは永久磁石を備える、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的は細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的は精製済みポリペプチドを含む、請求項１０または１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的は、液体中で結合したままである第１の化合物及び前記液体を解離する第２の化合物によって結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の化合物を前記第２の化合物から単離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１及び第２の化合物はディスプレイライブラリーメンバーである、請求項２２に記載の方法
【請求項２４】
前記粒子は、溶液流れの方向に対して実質的に垂直な方向に移送される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）標的が付着した磁気応答性粒子をフローチャンバ中に配置することと；
ｂ）第１の磁場を前記フローチャンバに適用することと；
ｃ）前記磁気応答性粒子を化合物の混合物と接触させることと；
ｄ）液体を前記チャンバを通して流すことと；
ｅ）前記第１の磁場及び第２の磁場を選択して適用することによって前記磁気応答性粒子を撹拌することと；
を含む方法。
【請求項２６】
ｃ）はａ）の前に達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｃ）はｂ）の前に達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
順序は逐次である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合物は細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記混合物はディスプレイライブラリーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ディスプレイライブラリーはファージディスプレイライブラリーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ディスプレイライブラリーは細胞ディスプレイライブラリーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記フローチャンバは、前記ディスプレイライブラリーの細胞の少なくとも幾つかが分裂するような条件下で維持される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
プログラム可能なプロセッサは前記液体の流れ及び前記第１及び第２の磁場の適用を制御する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
標的化合物が付着した磁気応答性粒子及びディスプレイライブラリーのメンバーを含む混合物を含むフローチャンバを用意することと；
（ｉ）第１の溶液を前記フローチャンバを通して流し、同時に、前記粒子を磁場によって捕獲し、（ｉｉ）１つ以上の磁場を選択的に適用することによって前記粒子を撹拌することを含む１つ以上のサイクルを達成することによって、前記メンバーの少なくとも幾つかを前記粒子から洗い流すことと；
を含む方法。
【請求項３６】
（ｉ）第２の溶液を前記フローチャンバを通して流し、同時に前記粒子を磁場によって捕獲し、（ｉｉ）前記磁場を選択的に適用することによって前記粒子を撹拌することを含む１つ以上のサイクルを達成することによって、前記メンバーの少なくとも他のいずれかを前記粒子から洗い流すことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１及び第２の溶液は、異なるイオン強度を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１及び第２の溶液は、異なるpHを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の溶液はプロテアーゼを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の溶液はジスルフィド結合を維持し、前記第２の溶液はジスルフィド結合を低減する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の溶液は拮抗剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の溶液中でディスプレイライブラリーメンバーの少なくとも幾つかを増幅することと、前記方法を繰り返すことをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１または第２の溶液は細胞増殖を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
入口、出口及び中に配置された磁気応答性粒子を有するフローチャンバを用意することと；
第１及び第２の磁場インデューサーを含むフレームを第１の位置に並進運動させ、前記第１の位置は第１の磁場が前記フローチャンバに適用されるように前記第１の磁場インデューサーを配設し、第２の磁場が前記フローチャンバに適用されないように前記第２の磁場インデューサーを配設することと；
液体を前記フローチャンバを通して流すことと；
フレームを第２の位置に並進運動させ、前記第２の位置は第１の磁場が前記フローチャンバに適用されないように前記第１の磁場インデューサーを配設し、第２の磁場が前記フローチャンバに適用されるように前記第２の磁場インデューサーを配設することと；
を含む方法。
【請求項４５】
流れは流体ドライバによって制御され、フレームの並進運動はレギュレータによって制御され、前記流体ドライバ及び前記レギュレータは信号通信している、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記流れは流体ドライバによって制御され、前記フレームの並進運動はレギュレータによって制御され、前記流体ドライバ及び前記レギュレータはプログラム可能なプロセッサによって制御される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
入口及び出口を有するフローチャンバと；
少なくとも第１の磁場インデューサーと；を備える装置において、該装置は、第１及び第２の磁場を前記フローチャンバ中で選択的に適用できるように構成される、装置。
【請求項４８】
入口及び出口を有し磁気応答性粒子を含むフローチャンバと；
第１の磁場を選択的に適用する少なくとも第１の磁場インデューサーと；を備える装置において、前記磁気応答性粒子は前記第１の磁場の無い状態で前記フローチャンバ中に保持される、装置。
【請求項４９】
入口及び出口を有するフローチャンバと；
第１及び第２の磁場インデューサーと；を備え、各磁場インデューサーは、前記フローチャンバの帯域中で選択的に発生する磁場を適用するように制御可能である、装置。
【請求項５０】
第２の磁場を選択的に適用する第２の磁場インデューサーをさらに備える、請求項４８に記載の装置。
【請求項５１】
前記第１の磁場インデューサーは永久磁石である、請求項４８に記載の装置。
【請求項５２】
前記第１及び第２の磁場インデューサーは、フローチャンバ中で磁場を選択して発生させるように結合する、請求項５０に記載の装置。
【請求項５３】
前記第１及び第２の磁場インデューサーは強固に接続される、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記フローチャンバは、長径２mm未満を有するガラス円筒を含む、請求項４８に記載の装置。
【請求項５５】
フローチャンバを取り付けるために適合させた取付け具を有する支持体と；
少なくとも第１及び第２の磁場インデューサーと；
前記磁場インデューサーに取り付けた並進運動可能なフレームと；
制御信号に応答して前記フレームを並進運動させるアクチュエータと；を備える装置において、前記並進運動は、フローチャンバ（取り付けた場合）に対して前記磁場インデューサーを移動させる、装置。
【請求項５６】
前記アクチュエータは、フレームに取り付けられ偏心して駆動するカムを含む、請求項５５に記載の装置。
【請求項５７】
請求項４８に記載の装置と；
フローチャンバに流体連通している流体制御ユニットと；
命令を実行するように構成されたプロセッサを備える機械と；を備え、前記命令は前記機械に、
利用者命令を検出させることと；
該命令に応答して前記装置及び前記流体制御ユニットに制御を送って、
（１）前記流体制御ユニットを作動することによって液体の流れを起動し；
（２）前記装置を起動して、少なくとも第１の磁場を交互に適用することによって磁気応答性粒子を撹拌する；
という１つ以上のサイクルを達成させることと；
を含む方法を達成させる、システム。
【請求項５８】
（ａ）磁気応答性粒子、（ｂ）該粒子に付着するかまたは付着可能な標的、ｃ）異種タンパク質成分をディスプレイする複製可能な実体を含む容器中で複合体を形成することと；前記容器中に前記複合体を保持する磁場を適用することと；流体を前記容器から除去することと；前記複製可能な実体の複製を支持する溶液を前記容器に供給するとと；複製の１つ以上のサイクルによって第１の複製可能な実体を複製することと；を含む方法。
【請求項５９】
複製可能なディスプレイ実体を選択する方法であって：
ａ）各々はそれぞれの複製可能な実体に物理的に付着する異種タンパク質成分を有する複製可能な実体のライブラリーを用意し、各タンパク質成分は多様な組の異なるタンパク質のメンバーであることと；
ｂ）前記ライブラリーの複製可能な実体を標的と接触させることと；
ｃ）ｉ）複製可能な実体−固定化標的複合体を形成し、この各々が（１）その異種タンパク質成分によって標的と結合する複製可能な実体及び（２）支持体に固定化した前記標的を含み；
ｉｉ）前記標的と結合しない複製可能な実体を前記複製可能な実体−固定化標的複合体から分離し；
ｉｉｉ）前記標的の存在下で複製可能な実体のコピーを生産し、生産されたコピーは前記標的と結合する複製可能な実体の複製であるという１つ以上のサイクル実行することと；
ｄ）前記標的と結合する１つ以上の生産された複製可能な実体の異種タンパク質成分を符号付けする核酸を回収し、それによって、前記標的のための結合タンパク質を符号付けする核酸を選択することと；
を含む方法。
【請求項６０】
前記複製可能な実体は酵母ディスプレイ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記複製可能な実体はファージディスプレイ粒子である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
複製可能なディスプレイ実体を増幅する方法であって：
異種タンパク質成分及び標的を含む複数の複製可能な実体を含む容器を用意することと；
複数の複製可能な実体の第１のサブセットを前記標的と結合させることと；
複数の複製可能な実体の第２のサブセットを前記第１のサブセットから分離し、前記第２のサブセットの複製可能な実体は前記標的と結合しないことと；
前記第１のサブセットのメンバーは前記標的によって捕獲されつつ、複製及び溶液交換の反復サイクルを達成することと；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００１年１２月７日に出願された米国仮特許出願第60/337,755号及び２００２年９月５日に出願された第60/408,624号の優先権の恩典を請求し、この両方の内容を、参考のためにその全体を引用する。
【０００２】
１つの化合物と別の化合物との結合は、単離方法において常用して使用されている。例えば、多くのタイプのクロマトグラフィーの例えばイオン交換、親和性、疎水性相互作用、及び固定化金属クロマトグラフィーは、考察の対象となっている化合物と他の化合物との間のクロマトグラフィーマトリックスに対する示差的な親和性に依存する。しかしながら、分離工程は、他の化合物を除去するためにしばしばマトリックスの注意深い洗浄を必要とする。
【０００３】
他の常用して実施されている分離は、示差的な沈降または沈殿特性を利用する。例えば、適切な溶液及び遠心分離条件を使用して、考察の対象となっている化合物を混合物からペレットにすることができ、一方、混合物中の他の化合物は上澄み中に残る。
【０００４】
表面に標的が存在する磁気応答性ビーズの出現は、クロマトグラフィー及び沈降の両方の多くの利点を有する分離プロセスに対処するものとなった。磁気応答性ビーズを典型的に管中の緩衝液と混合する。管を撹拌してビーズを有効に洗浄する。ビーズを次に磁場に局在化し、一方、例えば液体を管から吸引することによって緩衝液を交換する。このような工程は、１gでの遠心分離工程またはベンチトップ沈降よりも高速となり得る。クロマトグラフのマトリックスと同様、磁気応答性ビーズの表面は、親和性固定化金属、抗体、及び細胞を含む多くのタイプの接着性表面に適応可能である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、部分的には、磁気応答粒子を効果的に洗浄及び保持する方法並びに少なくとも１つの磁場をフローチャンバに選択的に適用する装置を提供する。本装置を本方法と組み合わせて使用して、磁気応答性粒子を効果的に洗浄することができる。さらに、本方法及び本装置の両方を互いに独立に使用できる。幾つかの具体例においては、これらを使用して（独立して、または組み合わせて）、特定の特性に関してディスプレイライブラリーのメンバーを単離する。
【０００６】
１態様においては、本発明は、入口及び出口を有するフローチャンバ；並びに少なくとも第１の磁場インデューサーを含む装置を特徴とする。第１及び第２の磁場をフローチャンバ中で選択的に適用できるように、本装置を構成する。第１及び第２の磁場は空間的に別個である。これらは重なり合わないかまたは部分的に重なり合うことができる。
【０００７】
“フローチャンバ”は、液体が入口から出口へ容器を通って流れることができるように少なくとも入口及び出口を含む容器を指す。容器は、入口及び出口、または開口を除いては密閉することができる（例えば、入口及び出口は側面に沿うことができ、上面は被覆しないとすることができる）。流れを制御及び／または監視することができるように、かつ
、洗浄または流れ手順が妥当な長さの時間でチャンバ中の少なくとも幾らかの（例えば、大きな比率の）流体を交換または取り替えることができるように、入口及び出口を構成することができる。
【０００８】
１好適な具体例においては、本装置は、単一の磁場インデューサー、例えば、永久磁石を含む。磁場インデューサーは第１の位置から第２の位置に移動することができ、それによって第１及び第２の磁場を適用する。磁場インデューサーはまた、例えば、第３の位置に移動して、例えば、第３の磁場を適用することができる。
【０００９】
別の好適な具体例においては、本装置は、少なくとも第１及び第２の磁場インデューサーを含む。インデューサーは永久磁石とすることができる。第１の磁場インデューサーは、フローチャンバ内部に磁場を適用する第１の位置からフローチャンバ内部に磁場を適用しない第２の位置に動くことができる。同様に、第２の磁場インデューサーは第３の位置から第４の位置に動いて、第２の磁場を選択的に適用することができる。第１及び第２の磁場インデューサーの動きを同期させることができ、例えば、第１及び第２の磁場インデューサーを同じアクチュエータに取り付けることができる。例えば、これらを互いに強固に接続することができる。
【００１０】
別の具体例においては、本装置はさらに、制御可能な少なくとも第３の磁場インデューサーを含む。第３の磁場インデューサーは第３の磁場を適用できる。
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【００１１】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。
【００１２】
流体または空気が入口及び出口を経てのみシステムに入り、システムから出ることができるように、典型的にフローチャンバを閉じる。１具体例においては、フローチャンバは少なくとも第３のポート（例えば、第２の入口及び／または出口）を含む。
【００１３】
１具体例においては、本装置はさらに、フローチャンバ中に水溶液及び複数の磁気応答性粒子、例えば、常磁性粒子を含む。磁気応答性粒子は、付着した標的分子を有することができる。付着した標的分子は全ての粒子に関して同じとすることができる。別の具体例においては、１を超える標的を磁気応答性粒子に付着することができる。例えば、２、３、４以上の標的を付着する。標的同士は関連があるかまたは関連が無いとすることができる。さらに別の具体例においては、唯一の標的を磁気応答性粒子に付着する。
【００１４】
１具体例においては、標的または複数の標的は、磁気応答性粒子に付着する脂質二重層の表面にディスプレイされる。脂質二重層は細胞のリポソームまたは形質膜とすることができ、すなわち、細胞は磁気応答性粒子に付着する。
【００１５】
フローチャンバ中の標的分子の平均濃度は約１mM、１μM、１００nM、１０nM、１nM、または０．１nM未満とすることができる。
１具体例においては、磁場のうちの１つ以上は、少なくとも約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、０．６、０．７、１．０テスラ及び／または約１．６、１．５、１．２、１．０、０．７、０．５、０．３、０．２、または０．１テスラ以下である。１具体例においては、磁場インデューサーは永久磁石である。例えば、磁石のうちの１つ以上とフローチャンバとの間の距離を変更することによって、またはさもなければ磁場インデューサーの位置をチャンバに対して変化させることによって、磁石を制御することができる。例えば、第１と第２の位置との間で磁石を並進運動させる機構によって、またはフローチャンバを磁石に対して並進運動させる機構によって、磁石を制御することができる。好適な具体例においては、第１及び第２の磁場インデューサーは、フローチャンバを挟んで向かい合う側、例えば、直径方向に向かい合う側に配設される。別の好適な具体例においては、機構は、流体流れの方向とは異なる軸上で、例えば、流体流れの方向に対して垂直な軸上で磁石を並進運動させる。
【００１６】
別の具体例においては、磁場インデューサーは、電磁石、例えば、伝導性コイルまたは超伝導電子通路によって形成された磁石である。電磁石は、直径方向に向かい合うかまたは交互の環として配置することができる。電流は、磁場を選択的に適用するように制御可能である。１つの好ましい電磁石は、金属棒を囲繞する伝導性ワイヤコイルである。金属棒は、流れ通路と平行とすることができ、例えば、フローチャンバに隣接する。電磁石は、ワイヤコイルを通って流れる電流を制御することによって調節される。
【００１７】
本装置はさらに、第１及び第２の磁場インデューサーに取り付けたフレームを含むことができる。好適な具体例においては、フレームは第１と第２の位置との間で並進運動可能である。第１及び第２の位置は約０．３〜３cmまたは０．５〜１cm離すことができる。１具体例においては、フレームは、フローチャンバ直径と平行な軸に少なくとも沿って並進運動可能である。フレームは、フレームが直線的に並進運動することを可能にする機構、例えば、カム（例えば、レギュレータモータによって駆動されるカム）、駆動トレーン、またはピストンに取り付けることができる。別の具体例においては、フレームを人手で並進運動させる。好適な具体例においては、フレームは、回転の軸に対して偏心して位置決めされたスピンドルによってカムに取り付けられる。
【００１８】
別の具体例においては、フレームを回転させ、それによって第１及び第２の磁場インデューサーをフローチャンバに対して移動させる。
好適な具体例においては、フレームは第１及び第２のプレートを備える。第１のプレートは、フレームを移動させる（例えば、並進運動させるかまたは回転させる）ことができる機構に取り付けることができる。例えば、プレートはカム上のスピンドルに取り付けることができる。例えば、第１のプレートは、スピンドルを第１の軸に沿って（例えば、垂直に）すべらせることができるスロット（例えば、凹型の溝または開口部）を含むことができる。カムが回転するにつれて、スピンドルは偏心して駆動され、第１のプレートは第２の軸に沿って（例えば、水平に）往復運動する。第２のプレートは、例えば、ブラケットによって、磁場インデューサー及び第１のプレートに取り付けられる。
【００１９】
本装置はさらに、フローチャンバを受け入れるための取付け具を有する支持体を含むことができる。支持体はまた、フレームの移動を導く機構、例えば、フレームの並進運動を導くための軌道を含むことができる。例えば、フレームが第１及び第２のプレートを備える場合、支持体は、２本の平行な軌道を含むことができる。軌道のうちの１つの上を並進運動するように、各プレートを位置決めする。
【００２０】
別の具体例においては、フローチャンバをフレームに対して並進運動させ、それによって磁場インデューサーを制御する。
本装置はさらに、流体リザーバ及び／または流体ドライバ、例えば、ポンプを含むことができる。流体ドライバは、制御された速度及び／または圧力（例えば、少なくとも０．０１、０．１、または０．５MPa）で流体をリザーバからフローチャンバ中に移動させる。流体ドライバは、液体の流れを例えば少なくとも約１μl、５０μl、０．２ml、０．３ml、０．５ml、１ml、または２ml／分の速度で調節するように適応可能であるとすることができる。１具体例においては、本装置は、少なくとも２つの流体リザーバを含む。
【００２１】
１具体例においては、本装置は、流体をフローチャンバ中にまたはフローチャンバから移送するためのポンプを含む。好適な具体例においては、ポンプは正圧を使用する。好適な具体例においては、ポンプは臑動ポンプである。別の好適な具体例においては、ポンプは２チャンバ交互ポンプである。例えば、ポンプは液体を１つのチャンバから吐き出し、一方第２のチャンバに補給する。本装置は、２つの２チャンバ交互ポンプ及び混合チャンバを含んで、第１及び第２の溶液の制御された混合物（例えば、勾配）を提供することができる。
【００２２】
本装置はさらに、温度コントローラを含むことができる。１具体例においては、フローチャンバを、温度制御に接続したジャケットで包囲する。別の具体例においては、フローチャンバを、温度制御ユニットに接続した小室内部に配設する。
【００２３】
好適な具体例においては、フローチャンバは、流体ドライバまたは流体リザーバに流体連通している流体ラインに取り付けられる。はるかに好適な具体例においては、フローチャンバを垂直に位置決めし、入口として役立つ底部ポートに流体ラインを接続する。別のはるかに好適な具体例においては、フローチャンバを再度垂直に位置決めし、入口として役立つ最上部ポートに流体ラインを接続する。
【００２４】
本装置はさらに、フローチャンバに取り付け可能な供給または流出液ラインを含むことができる。ラインは、チュービング、例えば、プラスチック、タイゴンTM（TygonTM）、または他の不活性のポリマーチュービングとすることができる。チュービング内壁をシラン化することができる。ラインは使い捨てとすることができる。
【００２５】
好適な具体例においては、本装置は、調節された流体ドライバ及びコントローラを含む。コントローラは、流体ドライバの調節と同時に、第１及び第２の磁場の選択的な適用を連係させる。好適な具体例においては、コントローラはクロックまたはタイミング機構を含む。別の好適な具体例においては、コントローラは、命令を実行するように構成されるかまたは構成可能なプロセッサを含む。
【００２６】
１好適な具体例においては、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、第１の磁場を交互に生じるかまたは除去し、第２の磁場を増大させるかまたは適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、流体ドライバの停止とフレーム並進運動の起動との間の遅延及びフレーム並進運動の終了と流体ドライバの再起動との間の遅延を課すことができる。達成された作動はさらに、第２の磁場を交互に生じるかまたは除去することを含むことができる。例えば、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、多数のサブサイクルの間第１及び次に第２の磁場を交互に適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、例えば、１組のスイッチ（例えば、機械的スイッチ、タイマー回路、または集積回路）、埋込み型プロセッサ、またはプログラム可能なプロセッサ（例えば、コンピュータ）とすることができる。
【００２７】
別の好適な具体例においては、コントローラはさらに、インターフェース、例えば、利用者インターフェースまたは検出器へのインターフェースを含む。インターフェースは、事象（例えば、利用者命令、利用者要求、及び例外）を検出することができる。例えば、インターフェースは、例えば、しきい値を超えているかどうか決定するために、パラメータに関して検出器を監視することができる。
【００２８】
本装置はさらに、物理的検出器を含むことができる。物理的検出器は、入口の前または出口の後の通路位置で流体のパラメータを監視するように適応させることができる。物理的検出器は、吸光度、例えば、分光光度測定の例えば吸光度（例えば、Ａ260、Ａ280、Ａ340、Ａ480、Ａ560）、光散乱、伝導率、温度、及び圧力に関する情報を監視及び／または記録することができる。１具体例においては、物理的検出器は、空気、例えば、流体通路中の泡または破壊を検出する。好適な具体例においては、分光光度計は、励起ビーム及び例えばビームに対して垂直でありかつ光学フィルターを有し励起ビームから生じる蛍光を検出することができる検出器を含む。
【００２９】
本装置はさらに、例えば、流体を出口ポートから受け入れ、受け入れた流体を１組の容器、例えば、管または穴中に吐出するように適応させたフラクションコレクターを含むことができる。例えば、フラクションコレクターは、マイクロタイタープレート用のホルダーを含むことができる。１具体例においては、本装置はさらに、ロボットアームを含む。容器、例えば、マイクロタイタープレートは、ロボットアームに接近可能である。好適な具体例においては、フラクションコレクターは、フローチャンバ出口ポートから現れる流体が容器のうちの１つに直接に入るように、１組みの容器を選択的に位置決めする。この構成によって、流出液ライン中でのプラスチックまたは他のチュービングの使用を避けることができる。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、第１及び第２のポート（例えば、入口及び出口）を有するフローチャンバ；並びに第１及び第２の磁場インデューサーを含み、各磁場インデューサーは、フローチャンバ中の帯域中で磁場を選択的に発生するように制御可能である装置を特徴とする。第１の磁場インデューサーは第１の磁場を誘導し（例えば、第１の帯域中で）、第２の磁場インデューサーは第２の磁場を誘導する（例えば、第２の帯域中で）。第１及び第２の磁場は空間的に別個であるが、部分的に重なり合うことができる。
【００３１】
インデューサーは永久磁石とすることができる。第１の磁場インデューサーは、フローチャンバ内部に磁場を適用する第１の位置からフローチャンバ内部に磁場を適用しない第２の位置に動くことができる。同様に、第２の磁場インデューサーは第３の位置から第４の位置に動いて、第２の磁場を選択的に適用することができる。第１及び第２の磁場インデューサーの動きを同期させることができ、例えば、第１及び第２の磁場インデューサーを同じアクチュエータに取り付けることができる。例えば、これらを互いに強固に接続することができる。
【００３２】
別の具体例においては、本装置はさらに、制御可能な少なくとも第３の磁場インデューサーを含む。第３の磁場インデューサーは第３の磁場を適用できる。
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【００３３】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。
【００３４】
流体または空気が入口及び出口を経てのみシステムに入り、システムから出ることができるように、典型的にフローチャンバを閉じる。１具体例においては、フローチャンバは少なくとも第３のポート（例えば、第２の入口及び／または出口）を含む。
【００３５】
１具体例においては、本装置はさらに、フローチャンバ中に水溶液及び複数の磁気応答性粒子、例えば、常磁性粒子を含む。磁気応答性粒子は、付着した標的分子を有することができる。付着した標的分子は全ての粒子に関して同じとすることができる。別の具体例においては、１を超える標的を磁気応答性粒子に付着することができる。例えば、２、３、４以上の標的を付着する。標的同士は関連があるかまたは関連が無いとすることができる。さらに別の具体例においては、唯一の標的を磁気応答性粒子に付着する。
【００３６】
１具体例においては、標的または複数の標的は、磁気応答性粒子に付着する脂質二重層の表面にディスプレイされる。脂質二重層は細胞のリポソームまたは形質膜とすることができ、すなわち、細胞は磁気応答性粒子に付着する。
【００３７】
フローチャンバ中の標的分子の平均濃度は約１mM、１μM、１００nM、１０nM、１nM、または０．１nM未満とすることができる。
１具体例においては、磁場のうちの１つ以上は、少なくとも約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、０．６、０．７、１．０テスラ及び／または約１．６、１．５、１．２、１．０、０．７、０．５、０．３、０．２、または０．１テスラ以下である。１具体例においては、磁場インデューサーは永久磁石である。例えば、磁石のうちの１つ以上とフローチャンバとの間の距離を変更することによって、またはさもなければ磁場インデューサーの位置をチャンバに対して変化させることによって、磁石を制御することができる。例えば、第１と第２の位置との間で磁石を並進運動させる機構によって、またはフローチャンバを磁石に対して並進運動させる機構によって、磁石を制御することができる。好適な具体例においては、第１及び第２の磁場インデューサーは、フローチャンバを挟んで向かい合う側、例えば、直径方向に向かい合う側に配設される。別の好適な具体例においては、機構は、流体流れの方向とは異なる軸上で、例えば、流体流れの方向に対して垂直な軸上で磁石を並進運動させる。
【００３８】
別の具体例においては、磁場インデューサーは、電磁石、例えば、伝導性コイルまたは超伝導電子通路によって形成された磁石である。電磁石は、直径方向に向かい合うかまたは交互の環として配置することができる。電流は、磁場を選択的に適用するように制御可能である。１つの好ましい電磁石は、金属棒を囲繞する伝導性ワイヤコイルである。金属棒は、流れ通路と平行とすることができ、例えば、フローチャンバに隣接する。電磁石は、ワイヤコイルを通って流れる電流を制御することによって調節される。
【００３９】
本装置はさらに、第１及び第２の磁場インデューサーに取り付けたフレームを含むことができる。好適な具体例においては、フレームは第１と第２の位置との間で並進運動可能である。第１及び第２の位置は約０．３〜３cmまたは０．５〜１cm離すことができる。１具体例においては、フレームは、フローチャンバ直径と平行な軸に少なくとも沿って並進運動可能である。フレームは、フレームが直線的に並進運動することを可能にする機構、例えば、カム（例えば、レギュレータモータによって駆動されるカム）、駆動トレーン、またはピストンに取り付けることができる。別の具体例においては、フレームを人手で並進運動させる。好適な具体例においては、フレームは、回転の軸に対して偏心して位置決めされたスピンドルによってカムに取り付けられる。２
別の具体例においては、フレームを回転させ、それによって第１及び第２の磁場インデューサーをフローチャンバに対して移動させる。
【００４０】
好適な具体例においては、フレームは第１及び第２のプレートを備える。第１のプレートは、フレームを移動させる（例えば、並進運動させるかまたは回転させる）ことができる機構に取り付けることができる。例えば、プレートはカム上のスピンドルに取り付けることができる。例えば、第１のプレートは、スピンドルを第１の軸に沿って（例えば、垂直に）すべらせることができるスロット（例えば、凹型の溝または開口部）を含むことができる。カムが回転するにつれて、スピンドルは偏心して駆動され、第１のプレートは第２の軸に沿って（例えば、水平に）往復運動する。第２のプレートは、例えば、ブラケットによって、磁場インデューサー及び第１のプレートに取り付けられる。
【００４１】
本装置はさらに、フローチャンバを受け入れるための取付け具を有する支持体を含むことができる。支持体はまた、フレームの移動を導く機構、例えば、フレームの並進運動を導くための軌道を含むことができる。例えば、フレームが第１及び第２のプレートを備える場合、支持体は、２本の平行な軌道を含むことができる。軌道のうちの１つの上を並進運動するように、各プレートを位置決めする。
【００４２】
別の具体例においては、フローチャンバをフレームに対して並進運動させ、それによって磁場インデューサーを制御する。
本装置はさらに、流体リザーバ及び／または流体ドライバ、例えば、ポンプを含むことができる。流体ドライバは、制御された速度及び／または圧力（例えば、少なくとも０．０１、０．１、または０．５MPa）で流体をリザーバからフローチャンバ中に移動させる。流体ドライバは、液体の流れを例えば少なくとも約１μl、５０μl、０．２ml、０．３ml、０．５ml、１ml、または２ml／分の速度で調節するように適応可能であるとすることができる。１具体例においては、本装置は、少なくとも２つの流体リザーバを含む。
【００４３】
１具体例においては、本装置は、流体をフローチャンバ中にまたはフローチャンバから移送するためのポンプを含む。好適な具体例においては、ポンプは正圧を使用する。好適な具体例においては、ポンプは臑動ポンプである。別の好適な具体例においては、ポンプは２チャンバ交互ポンプである。例えば、ポンプは液体を１つのチャンバから吐き出し、一方第２のチャンバに補給する。本装置は、２つの２チャンバ交互ポンプ及び混合チャンバを含んで、第１及び第２の溶液の制御された混合物（例えば、勾配）を提供することができる。
【００４４】
本装置はさらに、温度コントローラを含むことができる。１具体例においては、フローチャンバを、温度制御に接続したジャケットで包囲する。別の具体例においては、フローチャンバを、温度制御ユニットに接続した小室内部に配設する。
【００４５】
好適な具体例においては、フローチャンバは、流体ドライバまたは流体リザーバに流体連通している流体ラインに取り付けられる。はるかに好適な具体例においては、フローチャンバを垂直に位置決めし、入口として役立つ底部ポートに流体ラインを接続する。別のはるかに好適な具体例においては、フローチャンバを再度垂直に位置決めし、入口として役立つ最上部ポートに流体ラインを接続する。
【００４６】
本装置はさらに、フローチャンバに取り付け可能な供給または流出液ラインを含むことができる。ラインは、チュービング、例えば、プラスチック、タイゴンTM、または他の不活性のポリマーチュービングとすることができる。チュービング内壁をシラン化することができる。ラインは使い捨てとすることができる。
【００４７】
好適な具体例においては、本装置は、調節された流体ドライバ及びコントローラを含む。コントローラは、流体ドライバの調節と同時に、第１及び第２の磁場の選択的な適用を連係させる。好適な具体例においては、コントローラはクロックまたはタイミング機構を含む。別の好適な具体例においては、コントローラは、命令を実行するように構成されるかまたは構成可能なプロセッサを含む。
【００４８】
１好適な具体例においては、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、第１の磁場を交互に生じるかまたは除去し、第２の磁場を増大させるかまたは適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、流体ドライバの停止とフレーム並進運動の起動との間の遅延及びフレーム並進運動の終了と流体ドライバの再起動との間の遅延を課すことができる。達成された作動はさらに、第２の磁場を交互に生じるかまたは除去することを含むことができる。例えば、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、多数のサブサイクルの間第１及び次に第２の磁場を交互に適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、例えば、１組のスイッチ（例えば、機械的スイッチ、タイマー回路、または集積回路）、埋込み型プロセッサ、またはプログラム可能なプロセッサ（例えば、コンピュータ）とすることができる。
【００４９】
別の好適な具体例においては、コントローラはさらに、インターフェース、例えば、利用者インターフェースまたは検出器へのインターフェースを含む。インターフェースは、事象（例えば、利用者命令、利用者要求、及び例外）を検出することができる。例えば、インターフェースは、例えば、しきい値を超えているかどうか決定するために、パラメータに関して検出器を監視することができる。
【００５０】
本装置はさらに、物理的検出器を含むことができる。物理的検出器は、入口の前または出口の後の通路位置で流体のパラメータを監視するように適応させることができる。物理的検出器は、吸光度、例えば、分光光度測定の例えば吸光度（例えば、Ａ260、Ａ280、Ａ340、Ａ480、Ａ560）、光散乱、伝導率、温度、及び圧力に関する情報を監視及び／または記録することができる。１具体例においては、物理的検出器は、空気、例えば、流体通路中の泡または破壊を検出する。好適な具体例においては、分光光度計は、励起ビーム及び例えばビームに対して垂直でありかつ光学フィルターを有し励起ビームから生じる蛍光を検出することができる検出器を含む。
【００５１】
本装置はさらに、例えば、流体を出口ポートから受け入れ、受け入れた流体を１組の容器、例えば、管または穴中に吐出するように適応させたフラクションコレクターを含むことができる。例えば、フラクションコレクターは、マイクロタイタープレート用のホルダーを含むことができる。１具体例においては、本装置はさらに、ロボットアームを含む。容器、例えば、マイクロタイタープレートは、ロボットアームに接近可能である。好適な具体例においては、フラクションコレクターは、フローチャンバ出口ポートから現れる流体が容器のうちの１つに直接に入るように、１組みの容器を選択的に位置決めする。この構成によって、流出液ライン中でのプラスチックまたは他のチュービングの使用を避けることができる。
【００５２】
さらに別の態様においては、本発明は、フローチャンバを取り付けるために適合させた取付け具を有する支持体；少なくとも第１及び第２の磁場インデューサー；磁場インデューサーに取り付けた並進運動可能なフレーム；並びに制御信号に応答してフレームを並進運動させるアクチュエータを含む装置を特徴とし、ここで、並進運動は、フローチャンバ（取り付けた場合）に対して磁場インデューサーを移動させる。
【００５３】
インデューサーは永久磁石とすることができる。第１の磁場インデューサーは、フローチャンバ内部に磁場を適用する第１の位置からフローチャンバ内部に磁場を適用しない第２の位置に動くことができる。同様に、第２の磁場インデューサーは第３の位置から第４の位置に動いて、第２の磁場を選択的に適用することができる。第１及び第２の磁場インデューサーの動きを同期させることができ、例えば、第１及び第２の磁場インデューサーを同じアクチュエータに取り付けることができる。例えば、これらを互いに強固に接続することができる。
【００５４】
別の具体例においては、本装置はさらに、制御可能な少なくとも第３の磁場インデューサーを含む。第３の磁場インデューサーは第３の磁場を適用できる。
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【００５５】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。
【００５６】
流体または空気が入口及び出口を経てのみシステムに入り、システムから出ることができるように、典型的にフローチャンバを閉じる。１具体例においては、フローチャンバは少なくとも第３のポート（例えば、第２の入口及び／または出口）を含む。
【００５７】
１具体例においては、本装置はさらに、フローチャンバ中に水溶液及び複数の磁気応答性粒子、例えば、常磁性粒子を含む。磁気応答性粒子は、付着した標的分子を有することができる。付着した標的分子は全ての粒子に関して同じとすることができる。別の具体例においては、１を超える標的を磁気応答性粒子に付着することができる。例えば、２、３、４以上の標的を付着する。標的同士は関連があるかまたは関連が無いとすることができる。さらに別の具体例においては、唯一の標的を磁気応答性粒子に付着する。
【００５８】
１具体例においては、標的または複数の標的は、磁気応答性粒子に付着する脂質二重層の表面にディスプレイされる。脂質二重層は細胞のリポソームまたは形質膜とすることができ、すなわち、細胞は磁気応答性粒子に付着する。
【００５９】
フローチャンバ中の標的分子の平均濃度は約１mM、１μM、１００nM、１０nM、１nM、または０．１nM未満とすることができる。
１具体例においては、磁場のうちの１つ以上は、少なくとも約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．５、０．６、０．７、１．０テスラ及び／または約１．６、１．５、１．２、１．０、０．７、０．５、０．３、０．２、または０．１テスラ以下である。１具体例においては、磁場インデューサーは永久磁石である。例えば、磁石のうちの１つ以上とフローチャンバとの間の距離を変更することによって、またはさもなければ磁場インデューサーの位置をチャンバに対して変化させることによって、磁石を制御することができる。例えば、第１と第２の位置との間で磁石を並進運動させる機構によって、またはフローチャンバを磁石に対して並進運動させる機構によって、磁石を制御することができる。好適な具体例においては、第１及び第２の磁場インデューサーは、フローチャンバを挟んで向かい合う側、例えば、直径方向に向かい合う側に配設される。別の好適な具体例においては、機構は、流体流れの方向とは異なる軸上で、例えば、流体流れの方向に対して垂直な軸上で磁石を並進運動させる。
【００６０】
別の具体例においては、磁場インデューサーは、電磁石、例えば、伝導性コイルまたは超伝導電子通路によって形成された磁石である。電磁石は、直径方向に向かい合うかまたは交互の環として配置することができる。電流は、磁場を選択的に適用するように制御可能である。１つの好ましい電磁石は、金属棒を囲繞する伝導性ワイヤコイルである。金属棒は、流れ通路と平行とすることができ、例えば、フローチャンバに隣接する。電磁石は、ワイヤコイルを通って流れる電流を制御することによって調節される。
【００６１】
１具体例においては、フレームは第１と第２の位置との間で並進運動可能である。第１及び第２の位置は約０．３〜３cmまたは０．５〜１cm離すことができる。１具体例においては、フレームは、フローチャンバ直径と平行な軸に少なくとも沿って並進運動可能である。フレームは、フレームが直線的に並進運動することを可能にするアクチュエータ、例えば、カム（例えば、レギュレータモータによって駆動されるカム）、駆動トレーン、またはピストンに取り付けることができる。別の具体例においては、フレームを人手で並進運動させる。好適な具体例においては、フレームは、回転の軸に対して偏心して位置決めされたスピンドルによってカムに取り付けられる。
【００６２】
別の具体例においては、フレームを回転させ、それによって第１及び第２の磁場インデューサーをフローチャンバに対して移動させる。
好適な具体例においては、フレームは第１及び第２のプレートを備える。第１のプレートは、フレームを移動させる（例えば、並進運動させるかまたは回転させる）ことができる機構に取り付けることができる。例えば、プレートはカム上のスピンドルに取り付けることができる。例えば、第１のプレートは、スピンドルを第１の軸に沿って（例えば、垂直に）すべらせることができるスロット（例えば、凹型の溝または開口部）を含むことができる。カムが回転するにつれて、スピンドルは偏心して駆動され、第１のプレートは第２の軸に沿って（例えば、水平に）往復運動する。第２のプレートは、例えば、ブラケットによって、磁場インデューサー及び第１のプレートに取り付けられる。
【００６３】
支持体はまた、フレームの移動を導く機構、例えば、フレームの並進運動を導くための軌道を含むことができる。例えば、フレームが第１及び第２のプレートを備える場合、支持体は、２本の平行な軌道を含むことができる。軌道のうちの１つの上を並進運動するように、各プレートを位置決めする。
【００６４】
別の具体例においては、フローチャンバをフレームに対して並進運動させ、それによって磁場インデューサーを制御する。
本装置はさらに、流体リザーバ及び／または流体ドライバ、例えば、ポンプを含むことができる。流体ドライバは、制御された速度及び／または圧力（例えば、少なくとも０．０１、０．１、または０．５MPa）で流体をリザーバからフローチャンバ中に移動させる。流体ドライバは、液体の流れを例えば少なくとも約１μl、５０μl、０．２ml、０．３ml、０．５ml、１ml、または２ml／分の速度で調節するように適応可能であるとすることができる。１具体例においては、本装置は、少なくとも２つの流体リザーバを含む。
【００６５】
１具体例においては、本装置は、流体をフローチャンバ中にまたはフローチャンバから移送するためのポンプを含む。好適な具体例においては、ポンプは正圧を使用する。好適な具体例においては、ポンプは臑動ポンプである。別の好適な具体例においては、ポンプは２チャンバ交互ポンプである。例えば、ポンプは液体を１つのチャンバから吐き出し、一方第２のチャンバに補給する。本装置は、２つの２チャンバ交互ポンプ及び混合チャンバを含んで、第１及び第２の溶液の制御された混合物（例えば、勾配）を提供することができる。
【００６６】
本装置はさらに、温度コントローラを含むことができる。１具体例においては、フローチャンバを、温度制御に接続したジャケットで包囲する。別の具体例においては、フローチャンバを、温度制御ユニットに接続した小室内部に配設する。
【００６７】
好適な具体例においては、フローチャンバは、流体ドライバまたは流体リザーバに流体連通している流体ラインに取り付けられる。はるかに好適な具体例においては、フローチャンバを垂直に位置決めし、入口として役立つ底部ポートに流体ラインを接続する。別のはるかに好適な具体例においては、フローチャンバを再度垂直に位置決めし、入口として役立つ最上部ポートに流体ラインを接続する。
【００６８】
本装置はさらに、フローチャンバに取り付け可能な供給または流出液ラインを含むことができる。ラインは、チュービング、例えば、プラスチック、タイゴンTM、または他の不活性のポリマーチュービングとすることができる。チュービング内壁をシラン化することができる。ラインは使い捨てとすることができる。
【００６９】
好適な具体例においては、本装置は、調節された流体ドライバ及びコントローラを含む。コントローラは、流体ドライバの調節と同時に、第１及び第２の磁場の選択的な適用を連係させる。好適な具体例においては、コントローラはクロックまたはタイミング機構を含む。別の好適な具体例においては、コントローラは、命令を実行するように構成されるかまたは構成可能なプロセッサを含む。
【００７０】
１好適な具体例においては、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、第１の磁場を交互に生じるかまたは除去し、第２の磁場を増大させるかまたは適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、流体ドライバの停止とフレーム並進運動の起動との間の遅延及びフレーム並進運動の終了と流体ドライバの再起動との間の遅延を課すことができる。達成された作動はさらに、第２の磁場を交互に生じるかまたは除去することを含むことができる。例えば、コントローラは以下のものを周期的に達成する：流体ドライバを減速するかまたは停止させ、多数のサブサイクルの間第１及び次に第２の磁場を交互に適用し、流体ドライバを加速するかまたは再起動する。コントローラは、例えば、１組のスイッチ（例えば、機械的スイッチ、タイマー回路、または集積回路）、埋込み型プロセッサ、またはプログラム可能なプロセッサ（例えば、コンピュータ）とすることができる。
【００７１】
別の好適な具体例においては、コントローラはさらに、インターフェース、例えば、利用者インターフェースまたは検出器へのインターフェースを含む。インターフェースは、事象（例えば、利用者命令、利用者要求、及び例外）を検出することができる。例えば、インターフェースは、例えば、しきい値を超えているかどうか決定するために、パラメータに関して検出器を監視することができる。
【００７２】
本装置はさらに、物理的検出器を含むことができる。物理的検出器は、入口の前または出口の後の通路位置で流体のパラメータを監視するように適応させることができる。物理的検出器は、吸光度、例えば、分光光度測定の例えば吸光度（例えば、Ａ260、Ａ280、Ａ340、Ａ480、Ａ560）、光散乱、伝導率、温度、及び圧力に関する情報を監視及び／または記録することができる。１具体例においては、物理的検出器は、空気、例えば、流体通路中の泡または破壊を検出する。好適な具体例においては、分光光度計は、励起ビーム及び例えばビームに対して垂直でありかつ光学フィルターを有し励起ビームから生じる蛍光を検出することができる検出器を含む。
【００７３】
本装置はさらに、例えば、流体を出口ポートから受け入れ、受け入れた流体を１組の容器、例えば、管または穴中に吐出するように適応させたフラクションコレクターを含むことができる。例えば、フラクションコレクターは、マイクロタイタープレート用のホルダーを含むことができる。１具体例においては、本装置はさらに、ロボットアームを含む。容器、例えば、マイクロタイタープレートは、ロボットアームに接近可能である。好適な具体例においては、フラクションコレクターは、フローチャンバ出口ポートから現れる流体が容器のうちの１つに直接に入るように、１組みの容器を選択的に位置決めする。この構成によって、流出液ライン中でのプラスチックまたは他のチュービングの使用を避けることができる。
【００７４】
好適な具体例においては、支持体は、複数の取付け具を有し、各々フローチャンバを取り付けるために適合させてある。本装置は、フレームに取り付けた少なくとも第３の磁場インデューサーを含む。磁場インデューサーは、フレーム表面に規則的な間隔を置いて配置することができる。好適な具体例においては、間隔は、長さがフローチャンバの直径の少なくとも１．５倍である。好適な具体例においては、全ての磁場インデューサーの北極は同じ方向を向く。
【００７５】
１具体例においては、フレームは、取り付けたフローチャンバの流れ通路に対して実質的に垂直な軸上を並進運動可能である。１具体例においては、本装置はさらに、フローチャンバを含む。１具体例においては、本装置は、例えば、第１の支持体と平行な第２の支持体を含む。支持体は平坦な棚とすることができる。
【００７６】
別の態様においては、本発明は、例えば、フローチャンバ及び少なくとも第１の磁場インデューサーを有する本明細書において説明する装置；例えば、フローチャンバに流体連通している流体ドライバ；並びに流体ドライバの調節と同時に、フローチャンバ中での第１及び第２の磁場の選択的な適用を連係させるように構成されたコントローラを含むシステムを特徴とする。
【００７７】
好適な具体例においては、コントローラは、本装置との通信のためのインターフェースを含む。コントローラはまた、流体制御ユニットとの通信のためのインターフェースを含むことができる。通信は電気、光、または無線とすることができる。例えば、コントローラ、装置及び流体ドライバをデータ交換ネットワークによって接続することができる。
【００７８】
別の好適な具体例においては、コントローラは情報記憶媒体を含む。命令、検出されたパラメータ、または事象を記憶するように、コントローラをさらに構成することができる。
【００７９】
別の具体例においては、本システムはロボットアームまたはロボットを含む。ロボットは磁気応答性粒子をフローチャンバ中に配置し、フローチャンバを装置中に組立てる。ロボットはまた、例えば、コントローラによって達成される１つ以上の工程の前に、最中に、または後に、必要な流体接続または他の操作を行うことができる。
【００８０】
さらに別の具体例においては、本システムは、試料追跡検出器、例えば、バーコードスキャナまたはトランスポンダシステムを含む。予め組立てたフローチャンバは、装置中に挿入時及び装置からの除去時に印をつけ、追跡することができる。収集容器、例えば、マイクロタイタープレートは、印をつけ、追跡することができる。追跡事象に関する情報を、コントローラまたはサーバーに通信することができる。
【００８１】
別の態様においては、本発明は、本明細書において説明する装置；流体制御ユニット；命令を実行するように構成されたプロセッサを備える機械；を含むシステムを特徴とする。命令はプロセッサに、利用者命令を検出させ；並びに本装置及び流体制御ユニットに制御を送って、（１）流体制御ユニットを作動することによって液体の流れを起動し；（２）任意に、間隔の後に、液体の流れを停止させ；（３）本装置を起動して、少なくとも第１及び第２の磁場を交互に適用することによって磁気応答性粒子を撹拌する；という１つ以上のサイクルを達成させる。
【００８２】
本装置を起動して、磁場の適用を制御することによって、例えば、磁場インデューサーを制御することによって、磁気応答性粒子を撹拌することができる。好適な具体例においては、命令はさらに、サイクルを停止させるための条件のための利用者命令、事前設定シーケンス、または演算パラメータを監視することを含む。
【００８３】
１具体例においては、プロセッサは、事前設定シーケンス、例えば、時限事象のシーケンスを監視する。別の具体例においては、プロセッサは、利用者命令を監視して、グラフィカルユーザーインターフェース上のポインタ（例えば、カーソル）の利用者の制御を検出する。さらに別の具体例においては、プロセッサは、演算パラメータの例えば背圧、Ａ２６０、及び伝導率を監視して、サイクルを停止させるかどうか決定する。
【００８４】
さらに別の態様においては、本発明は、機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア）を記憶する機械可読媒体を含む物品を特徴とする。命令は機械に装置を起動させて、第１及び第２の磁場をフローチャンバに選択的に適用する。１具体例においては、第３の磁場を適用する。
【００８５】
好適な具体例においては、命令は機械に、（１）流体制御ユニットを作動することによって液体の流れを起動し；（２）任意に、間隔の後に、液体の流れを停止させ；（３）本装置を起動して、第１及び第２の磁場を交互に選択的に適用することによって磁気応答性粒子を撹拌する；という１つ以上のサイクルを達成させる。他の好適な具体例においては、命令は機械に、本明細書において、例えば、下文で説明する方法を達成させる。
【００８６】
本発明はまた、フローチャンバ中での常磁性粒子の自動化洗浄を可能にするシステムを特徴とする。本システムは、チャンバ中の粒子の移動及びフローチャンバを通る液体の流れを制御する。粒子は、フローチャンバ内部の少なくとも第１と第２の帯域との間に移動する。
【００８７】
１態様においては、本発明は、磁気応答性粒子を洗浄する方法を特徴とする。本方法は、第１の帯域中で第１の磁場によって捕獲された磁気応答性粒子を含むフローチャンバを通して液体を流すことと；第１の磁場を消散させることと；磁気応答性粒子を撹拌することと；を含む。撹拌は消散の結果とすることができる。
【００８８】
１具体例においては、本方法はさらに、消散の前に液体流れを低減するかまたは停止させることを含む。１例においては、流れは停止しないが減弱し、例えば、元の流量の５０、４０、３０、２５、２０、１０、５、４、３、１、または０．１％未満の割合に減少する。さらに別の具体例においては、いかなる程度でも流れは停止しない。液体流れは第１の磁場を除去する前に低減するかまたは停止させることができ、撹拌の後に回復させることができる。例えば、液体が流れずかつ第１の磁場が所定の位置に保持されるように、低減または停止と消散との間に遅延時間が存在できる。遅延は、流れによって引き起こされる圧力または乱れを消散させる時間を提供することができる。好適な具体例においては、本方法はさらに、流すことから撹拌までを１回以上繰り返すことを含む。例えば、撹拌は、第１の磁場を周期的に再適用することによって達成される。流すこと、消散、及び撹拌の間中、磁気応答性粒子をフローチャンバ中に保持する。１具体例においては、粒子は、例えば、溶液流れの方向に対して実質的に垂直な方向に移送される。
【００８９】
別の具体例においては、撹拌は、例えば、第２の帯域中で磁気応答性粒子を捕獲するために第２の磁場を適用することによって達成される。別の具体例においては、第１の磁場を除去する前に第２の磁場を適用する。さらに別の具体例においては、例えば連係して、第１の磁場を除去する間に第２の磁場を適用する。別の具体例においては、本方法は、第１の磁場の除去の前にまたは最中に流れを低減するかまたは停止させ、第２の磁場を適用した後に流すことを再開することを含む。
【００９０】
撹拌は、第２及び第１の磁場を周期的にかつ選択して適用することを含むことができる。１具体例においては、連係して調節される第１及び第２の永久磁石によって第１及び第２の磁場を適用する。別の具体例においては、撹拌は、フローチャンバを振動または音波処理することを含む。さらに別の具体例においては、撹拌は、流体乱れまたは流体撹拌をフローチャンバ内部に発生させることを含む。一般に、粒子がチャンバの下部領域に沈降するのを防ぐように、撹拌及び磁場適用を構成する。
【００９１】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。１具体例においては、フローチャンバは発酵槽である。
【００９２】
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【００９３】
第１及び第２の磁石を、例えば、フレームに強固に取り付けることができ、第１と第２の位置との間で並進運動させて、第１及び第２の磁場を選択して適用する。１具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることは、流体ドライバと信号通信したレギュレータによって制御される。別の具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることはレギュレータによって制御され、流体ドライバ及びレギュレータはプログラム可能なプロセッサによって制御される。
【００９４】
１具体例においては、磁気応答性粒子は、粒子の内部または外部位置にある生体分子のような分子を含む。分子は標的分子とすることができるかまたは標的分子に付着可能とすることができる。
【００９５】
粒子は、共有結合でまたは非共有結合で付着した標的分子（例えば、核酸、タンパク質、多糖等）を含むことができる。１具体例においては、磁気応答性粒子はディスプレイライブラリーメンバー（例えば、細胞、バクテリオファージ、ＲＮＡ−ポリペプチド融合物）によって結合する。１具体例においては、標的は細胞、例えば、生細胞を含む。別の具体例においては、標的は、精製済みポリペプチド、例えば、ヒトポリペプチドまたは病原性ポリペプチドを含む。場合によっては、精製済みポリペプチドは細胞外タンパク質である。タンパク質は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、タンパク質分解による切断、ユビキチン化、メチル化、またはアシル化）を含むことができる。
【００９６】
例えば、特定の条件下で、例えば洗浄溶液を用いて洗浄することによって第２の化合物を第１の化合物から分離することができるように、磁気応答性粒子は、第２の化合物と比較して差のある程度に第１の化合物によって結合することができる。洗浄溶液は、例えば、細胞増殖用の培地、洗剤、または第１の化合物の結合に関して標的と拮抗する拮抗剤を含むことができる。本方法は、第１の化合物を第２の化合物から単離することを含むことができる。本方法はまた、第１または第２の化合物を、例えば、核酸配列決定、タンパク質配列決定、質量分析、増幅、表面プラズモン共鳴、または蛍光分析のうちの１つ以上によって分析することを含むことができる。第１及び第２の化合物は、例えば、ディスプレイライブラリーメンバーとしてディスプレイポリペプチドを含むことができる。第１及び第２の化合物は、少なくとも５０、６０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列を有する非同一なポリペプチドを含むことができる。
【００９７】
別の好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、実質的に垂直であるかまたは垂直である。液体は上向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、洗浄溶液）とすることができる。さらに別の好適な具体例においては、液体は下向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、溶離溶液）とすることができる。
【００９８】
１具体例においては、本方法はさらに、（ｃ）、（ｄ）の後に第２の磁場を除去することと第１の磁場を適用することとを含む。本方法は、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）という１、２、３、４、５、７、１０、１２以上のサイクルを含むことができる。磁気応答性粒子は第１から第２の帯域に移動する。第１及び第２の磁場及び／または第１及び第２の帯域は、フローチャンバ内部に別個の位置を有し、しかもなお重なり合ってよい。
【００９９】
１具体例においては、流れは少なくとも約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５cm／分及び／または０．７、０．５、０．２、０．１、０．０５、または０．０２cm／分以下である。
【０１００】
好適な具体例においては、本方法は機械（すなわちコントローラ）によって少なくとも部分的に達成される。はるかに好適な具体例においては、本方法を自動化する。別の具体例においては、本方法は人手で少なくとも部分的に達成される。
【０１０１】
好適な具体例においては、本方法を本明細書において説明する装置を用いて実施する。
別の態様においては、本発明は、フローチャンバ、第１の磁場インデューサー、及びチャンバ中に配置された磁気応答性粒子を用意することと；粒子の少なくとも幾つかを標的と物理的に会合（または標的に付着可能）することと；フローチャンバ中で、第１の磁場インデューサーによって適用された第１の磁場中で磁気応答性粒子を捕獲することと；溶液をフローチャンバを通して流すことと；磁気応答性粒子をフローチャンバ中に保持するように、磁気応答性粒子をフローチャンバの第１の帯域からフローチャンバの他の領域に移送することと；を含む方法を特徴とする。
【０１０２】
移送は、第１の磁場インデューサーの位置をフローチャンバに対して変更することを含むことができる。１具体例においては、磁気応答性粒子を第２の帯域に移送する。例えば、移送は、第２の磁場を適用して、磁気応答性粒子を第２の帯域に移送することを含むことができる。
【０１０３】
１具体例においては、本方法はさらに、消散の前に液体流れを低減するかまたは停止させることを含む。１例においては、流れは停止しないが減弱し、例えば、元の流量の５０、４０、３０、２５、２０、１０、５、４、３、１、または０．１％未満の割合に減少する。さらに別の具体例においては、いかなる程度でも流れは停止しない。液体流れは第１の磁場を除去する前に低減するかまたは停止させることができ、撹拌の後に回復させることができる。例えば、液体が流れずかつ第１の磁場が所定の位置に保持されるように、低減または停止と消散との間に遅延時間が存在できる。遅延は、流れによって引き起こされる圧力または乱れを消散させる時間を提供することができる。好適な具体例においては、本方法はさらに、流すことから撹拌までを１回以上繰り返すことを含む。例えば、撹拌は、第１の磁場を周期的に再適用することによって達成される。流すこと、消散、及び撹拌の間中、磁気応答性粒子をフローチャンバ中に保持する。１具体例においては、粒子は、例えば、溶液流れの方向に対して実質的に垂直な方向に移送される。
【０１０４】
別の具体例においては、撹拌は、例えば、第２の帯域中で磁気応答性粒子を捕獲するために第２の磁場を適用することによって達成される。別の具体例においては、粒子を移送する前に第２の磁場を適用する。さらに別の具体例においては、例えば連係して、第１の磁場を除去する間に第２の磁場を適用する。別の具体例においては、本方法は、第１の磁場の除去の前にまたは最中に流れを低減するかまたは停止させ、第２の磁場を適用した後に流すことを再開することを含む。第１及び／または第２の磁場インデューサーは永久磁石または電磁石とすることができる。
【０１０５】
撹拌は、第２及び第１の磁場を周期的にかつ選択して適用することを含むことができる。連係して調節される第１及び第２の永久磁石によって第１及び第２の磁場を適用する。別の具体例においては、撹拌は、フローチャンバを振動または音波処理することを含む。さらに別の具体例においては、撹拌は、流体乱れまたは流体撹拌をフローチャンバ内部に発生させることを含む。
【０１０６】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。１具体例においては、フローチャンバは発酵槽である。
【０１０７】
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【０１０８】
第１及び第２の磁石を、例えば、フレームに強固に取り付けることができ、第１と第２の位置との間で並進運動させて、第１及び第２の磁場を選択して適用する。フレームを第２の位置に並進運動させる前に液体の流れを停止させることができる。フレームを並進運動させた後に流れを再開することができる。フローチャンバを第１及び任意に第２の棚によって支持することができる。第１及び／または第２の棚中の凹型の軌道に沿ってフレームを並進運動させることができる。フレームは、モータによって制御されるカムによって並進運動させることができる。１具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることは、流体ドライバと信号通信したレギュレータによって制御される。別の具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることはレギュレータによって制御され、流体ドライバ及びレギュレータはプログラム可能なプロセッサによって制御される。
【０１０９】
１具体例においては、磁気応答性粒子は、粒子の内部または外部位置にある生体分子のような分子を含む。分子は標的分子とすることができるかまたは標的分子に付着可能とすることができる。
【０１１０】
粒子は、共有結合でまたは非共有結合で付着した標的分子（例えば、核酸、タンパク質、多糖等）を含む。１具体例においては、磁気応答性粒子はディスプレイライブラリーメンバー（例えば、細胞、バクテリオファージ、ＲＮＡ−ポリペプチド融合物）によって結合する。１具体例においては、標的は細胞、例えば、生細胞を含む。別の具体例においては、標的は、精製済みポリペプチド、例えば、ヒトポリペプチドまたは病原性ポリペプチドを含む。場合によっては、精製済みポリペプチドは細胞外タンパク質である。タンパク質は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、タンパク質分解による切断、ユビキチン化、メチル化、またはアシル化）を含むことができる。
【０１１１】
例えば、特定の条件下で、例えば洗浄溶液を用いて洗浄することによって第２の化合物を第１の化合物から分離することができるように、磁気応答性粒子は、第２の化合物と比較して差のある程度に第１の化合物によって結合することができる。洗浄溶液は、例えば、細胞増殖用の培地、洗剤、または第１の化合物の結合に関して標的と拮抗する拮抗剤を含むことができる。本方法は、第１の化合物を第２の化合物から単離することを含むことができる。本方法はまた、第１または第２の化合物を、例えば、核酸配列決定、タンパク質配列決定、質量分析、増幅、表面プラズモン共鳴、または蛍光分析のうちの１つ以上によって分析することを含むことができる。第１及び第２の化合物は、例えば、ディスプレイライブラリーメンバーとしてディスプレイポリペプチドを含むことができる。第１及び第２の化合物は、少なくとも５０、６０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列を有する非同一なポリペプチドを含むことができる。
【０１１２】
別の好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、実質的に垂直であるかまたは垂直である。液体は上向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、洗浄溶液）とすることができる。さらに別の好適な具体例においては、液体は下向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、溶離溶液）とすることができる。
【０１１３】
１具体例においては、本方法はさらに、（ｃ）、（ｄ）の後に第２の磁場を除去することと第１の磁場を適用することとを含む。本方法は、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）という１、２、３、４、５、７、１０、１２以上のサイクルを含むことができる。磁気応答性粒子は第１から第２の帯域に移動する。第１及び第２の磁場及び／または第１及び第２の帯域は、フローチャンバ内部に別個の位置を有し、しかもなお重なり合ってよい。
【０１１４】
１具体例においては、流れは少なくとも約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５cm／分及び／または０．７、０．５、０．２、０．１、０．０５、または０．０２cm／分以下である。
【０１１５】
好適な具体例においては、本方法は機械（すなわちコントローラ）によって少なくとも部分的に達成される。はるかに好適な具体例においては、本方法を自動化する。別の具体例においては、本方法は人手で少なくとも部分的に達成される。
【０１１６】
好適な具体例においては、本方法を本明細書において説明する装置を用いて実施する。
別の態様においては、本発明は、フローチャンバ、少なくとも第１の磁場インデューサー、及びチャンバ中に配置された磁気応答性粒子を用意することと；フローチャンバ中の第１の帯域中で磁気応答性粒子を捕獲することと；溶液をフローチャンバを通して流すことと；フローチャンバ中で磁気応答性粒子を第１の帯域から第２の帯域に移送することと；を含む方法を特徴とする。粒子の少なくとも幾つかは、標的と物理的に会合し（または会合可能）、例えば、標的と共有結合でまたは非共有結合で結合する。
【０１１７】
１具体例においては、各粒子は同じ標的と会合する。別の具体例においては、粒子の少なくとも幾つかは異なる標的と会合する。標的は、粒子に共有結合で付着するかまたは非共有結合で付着することができる。標的は、例えば、結合対、例えば特異的結合対によって形成された例えばブリッジによって付着することができる。捕獲及び／または流すことの前に、最中に、または後に、粒子は標的と会合することができる。
【０１１８】
磁気応答性粒子は直径約１〜１０μm、例えば、直径約２〜５μmとすることができる。これらは、標的と物理的に会合した修飾表面（外部または内部表面）を有することができる。模範的な標的は、分子の例えばハプテン、遷移状態類似体、及びタンパク質を含む。標的は、例えば、多量体タンパク質複合体とすることができる。他の模範的な標的は、細胞、例えば、癌細胞、形質転換細胞、血液細胞、細菌細胞、真菌細胞、及び植物細胞を含む。特異的結合対の模範的なメンバーは、固定化金属（例えば、ヘキサ−ヒスチジンによって結合する）、ビオチン（例えば、アビジンによって結合する）、他の小さな有機分子、及び抗体（例えば、それぞれの抗原によって結合する）を含む。
【０１１９】
好適な具体例においては、細胞は、例えば、抗体、例えば、マーカーへの抗体によって磁気応答性粒子と間接的に結合する。マーカーは細胞に特異的なものとすることができ、例えば、癌細胞表面に存在するが正常な細胞には存在しないものである。
【０１２０】
標的は、標的に対する示差的な親和性、特異性または結合活性を有する第１及び第２の化合物によって結合することができる。例えば、第１の化合物と比較して第２の化合物を優先的に標的（例えば、粒子と結合した標的）から洗い流すような条件下で流すことを行うことができる。本方法は、第１及び第２の化合物を分離することを含むことができる。１具体例においては、第１及び第２の化合物は、核酸、タンパク質、炭水化物、代謝物、細胞、またはウイルスを含む。好適な具体例においては、第１及び第２の化合物は、例えば、ウイルス（例えば、ファージ）、細胞、ｍＲＮＡ−タンパク質融合物、またはリボソームディスプレイフォーマット（例えば、本明細書において説明するような）中のディスプレイ実体である。
【０１２１】
本方法はさらに、第１の化合物及び／または第２の化合物を分析することを含むことができる。分析は、例えば、増幅（例えば、核酸増幅、クローニング、または増殖（例えば、細胞及びウイルスのための））、核酸ハイブリダイゼーション（例えば、溶液中、または支持体の例えばアレイへの）、質量分析法、表面プラズモン共鳴、光学的監視（例えば、蛍光分析）、及び生理活性アッセイを含むことができる。
【０１２２】
第１または第２の化合物は、分析の前に任意の数の追加の工程によって処理することができる。例えば、第１または第２の化合物はバクテリオファージとすることができる。バクテリオファージは細胞に感染、増殖し、処理されて、バクテリオファージ核酸が単離し、配列決定される。バクテリオファージ核酸の関連のある断片を、例えば、ベクター中でサブクローニングし、発現することができ、または断片の配列を解明し、使用して、ペプチドまたは新たな核酸の化学合成を指示することができる。
【０１２３】
１具体例においては、第１及び第２の化合物は、標的に対する結合親和性が５、４、３、または２桁未満異なる。好適な具体例においては、第１及び第２の化合物は、少なくとも５０％同一（例えば、少なくとも５５、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％同一）の核酸またはポリペプチドである。第１及び第２の化合物は、１つ以上のセグメントが同一であるとすることができる。ポリペプチド化合物の場合、第１及び第２の化合物は同一のまたは非同一のスカフォールド構造を有することができる。第１及び／または第２の化合物は、ライブラリー、例えば、ディスプレイライブラリーのメンバーである。
【０１２４】
移送は、第１の磁場インデューサーの位置をフローチャンバに対して変更することを含むことができる。１具体例においては、磁気応答性粒子を第２の帯域に移送する。例えば、移送は、第２の磁場を適用して、磁気応答性粒子を第２の帯域に移送することを含むことができる。好適な具体例においては、例えば、磁場を第２の帯域に適用する前に、最中に、または後に、磁場を第１の帯域から除去する。
【０１２５】
１具体例においては、本方法はさらに、消散の前に液体流れを低減するかまたは停止させることを含む。１例においては、流れは停止しないが減弱し、例えば、元の流量の５０、４０、３０、２５、２０、１０、５、４、３、１、または０．１％未満の割合に減少する。さらに別の具体例においては、いかなる程度でも流れは停止しない。液体流れは第１の磁場を除去する前に低減するかまたは停止させることができ、撹拌の後に回復させることができる。例えば、液体が流れずかつ第１の磁場が所定の位置に保持されるように、低減または停止と消散との間に遅延時間が存在できる。遅延は、流れによって引き起こされる圧力または乱れを消散させる時間を提供することができる。好適な具体例においては、本方法はさらに、流すことから撹拌までを１回以上繰り返すことを含む。例えば、撹拌は、第１の磁場を周期的に再適用することによって達成される。流すこと、消散、及び撹拌の間中、磁気応答性粒子をフローチャンバ中に保持する。１具体例においては、粒子は、例えば、溶液流れの方向に対して実質的に垂直な方向に移送される。
【０１２６】
別の具体例においては、撹拌は、例えば、第２の帯域中で磁気応答性粒子を捕獲するために第２の磁場を適用することによって達成される。別の具体例においては、粒子を移送する前に第２の磁場を適用する。さらに別の具体例においては、例えば連係して、第１の磁場を除去する間に第２の磁場を適用する。別の具体例においては、本方法は、第１の磁場の除去の前にまたは最中に流れを低減するかまたは停止させ、第２の磁場を適用した後に流すことを再開することを含む。第１及び／または第２の磁場インデューサーは永久磁石または電磁石とすることができる。
【０１２７】
撹拌は、第２及び第１の磁場を周期的にかつ選択して適用することを含むことができる。１具体例においては、連係して調節される第１及び第２の永久磁石によって第１及び第２の磁場を適用する。別の具体例においては、撹拌は、フローチャンバを振動または音波処理することを含む。さらに別の具体例においては、撹拌は、流体乱れまたは流体撹拌をフローチャンバ内部に発生させることを含む。
【０１２８】
フローチャンバを、例えば、金属、プラスチック（例えば、ポリスチレン若しくはポリプロピレンまたは任意の誘導体）、またはガラスで構成することができる。１具体例においては、フローチャンバは非磁化可能であり、例えば、非金属である。別の具体例においては、フローチャンバの最も狭い横断面は矩形である。好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、垂直である。別の具体例においては、フローチャンバは非垂直であり、例えば、水平である。１具体例においては、フローチャンバは滅菌されるかまたは滅菌可能である（例えば、有機溶媒を用いた処理に対する耐性があるかまたは高圧滅菌に対する耐性がある）。１具体例においては、フローチャンバは発酵槽である。
【０１２９】
好適な具体例においては、チャンバの体積は少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．５、５、または５０mlであり、好ましくは１００、５０、１０、５、２、１、０．５、０．３、または０．２ml未満、例えば、０．０５〜０．５mlである。１具体例においては、フローチャンバは円筒であり、例えば、内径約０．１〜５mm、３〜１０、または５〜２０mmを有する円筒である。好適な具体例においては、直径は十分に細いので、水性流体は毛管作用によって入る。
【０１３０】
第１及び第２の磁石を、例えば、フレームに強固に取り付けることができ、第１と第２の位置との間で並進運動させて、第１及び第２の磁場を選択して適用する。フレームを第２の位置に並進運動させる前に液体の流れを停止させることができる。フレームを並進運動させた後に流れを再開することができる。フローチャンバを第１及び任意に第２の棚によって支持することができる。第１及び／または第２の棚中の凹型の軌道に沿ってフレームを並進運動させることができる。フレームは、モータによって制御されるカムによって並進運動させることができる。１具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることは、流体ドライバと信号通信したレギュレータによって制御される。別の具体例においては、流れは流体ドライバによって制御され、第１の磁場を消散させることはレギュレータによって制御され、流体ドライバ及びレギュレータはプログラム可能なプロセッサによって制御される。
【０１３１】
１具体例においては、磁気応答性粒子は、粒子の内部または外部位置にある生体分子のような分子を含む。分子は標的分子とすることができるかまたは標的分子に付着可能とすることができる。
【０１３２】
粒子は、共有結合でまたは非共有結合で付着した標的分子（例えば、核酸、タンパク質、多糖等）を含む。１具体例においては、磁気応答性粒子はディスプレイライブラリーメンバー（例えば、細胞、バクテリオファージ、ＲＮＡ−ポリペプチド融合物）によって結合する。１具体例においては、標的は細胞、例えば、生細胞を含む。別の具体例においては、標的は、精製済みポリペプチド、例えば、ヒトポリペプチドまたは病原性ポリペプチドを含む。場合によっては、精製済みポリペプチドは細胞外タンパク質である。タンパク質は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、タンパク質分解による切断、ユビキチン化、メチル化、またはアシル化）を含むことができる。
【０１３３】
例えば、特定の条件下で、例えば洗浄溶液を用いて洗浄することによって第２の化合物を第１の化合物から分離することができるように、磁気応答性粒子は、第２の化合物と比較して差のある程度に第１の化合物によって結合することができる。洗浄溶液は、例えば、細胞増殖用の培地、洗剤、または第１の化合物の結合に関して標的と拮抗する拮抗剤を含むことができる。本方法は、第１の化合物を第２の化合物から単離することを含むことができる。本方法はまた、第１または第２の化合物を、例えば、核酸配列決定、タンパク質配列決定、質量分析、増幅、表面プラズモン共鳴、または蛍光分析のうちの１つ以上によって分析することを含むことができる。第１及び第２の化合物は、例えば、ディスプレイライブラリーメンバーとしてディスプレイポリペプチドを含むことができる。第１及び第２の化合物は、少なくとも５０、６０、８０、９０、９５、９７、９８、または９９％同一のアミノ酸配列を有する非同一なポリペプチドを含むことができる。
【０１３４】
別の好適な具体例においては、フローチャンバは非水平であり、例えば、実質的に垂直であるかまたは垂直である。液体は上向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、洗浄溶液）とすることができる。さらに別の好適な具体例においては、液体は下向きに流れる。液体は、磁気応答性粒子と非特異的に結合した化合物が磁気応答性粒子から解離するような溶液（例えば、溶離溶液）とすることができる。
【０１３５】
１具体例においては、本方法はさらに、（ｃ）、（ｄ）の後に第２の磁場を除去することと第１の磁場を適用することとを含む。本方法は、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）という１、２、３、４、５、７、１０、１２以上のサイクルを含むことができる。磁気応答性粒子は第１から第２の帯域に移動する。第１及び第２の磁場及び／または第１及び第２の帯域は、フローチャンバ内部に別個の位置を有し、しかもなお重なり合ってよい。
【０１３６】
１具体例においては、流れは少なくとも約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、または０．５cm／分及び／または０．７、０．５、０．２、０．１、０．０５、または０．０２cm／分以下である。
【０１３７】
好適な具体例においては、本方法は機械（すなわちコントローラ）によって少なくとも部分的に達成される。はるかに好適な具体例においては、本方法を自動化する。別の具体例においては、本方法は人手で少なくとも部分的に達成される。
【０１３８】
好適な具体例においては、本方法を本明細書において説明する装置を用いて実施する。
別の態様においては、本発明は、ａ）磁気応答性粒子をフローチャンバ中に配置することと；ｂ）磁気応答性粒子を混合物と接触させることと；ｃ）第１の磁場をフローチャンバに適用することと；ｄ）液体をチャンバを通して流すことと；ｅ）第１の磁場及び第２の磁場を選択して適用することによって磁気応答性粒子を撹拌することと；を含む方法を特徴とする。磁気応答性粒子は、その表面に付着した標的を有する。
【０１３９】
順序は逐次である必要はない。例えば、ａ）をｂ）の前に、ｃ）をｂ）の前に等で達成することができる。好適な具体例においては、工程を逐次実行する。
好適な具体例においては、混合物は、ディスプレイライブラリー、例えば、本明細書において説明するディスプレイライブラリーの例えばファージ、細胞、ｍＲＮＡ−タンパク質融合物、またはリボソームディスプレイライブラリーである。ライブラリーは高い多様性の、例えば、少なくとも１０6、１０7、１０8、１０9、１０10のメンバー、または限定された多様性の、例えば、１０6、１０5、１０4、または１０3以下のメンバーを有することができる。
【０１４０】
別の具体例においては、混合物は、核酸、タンパク質、炭水化物、または代謝物を含む。さらに別の具体例においては、混合物は、細胞抽出物、組織のホモジネート、血清、または細胞集団、例えば、血液細胞の集団、解離した組織細胞、または微生物（例えば、細菌細胞及び真菌細胞）を含む。
【０１４１】
１具体例においては、本方法はさらに、ｄ）及び／またはｅ）の後に粒子と結合するかまたは結合しない複合体混合物のメンバーの定性的なまたは定量的測定を決定することを含む。
【０１４２】
好適な具体例においては、本方法はさらに、（ｆ）複合体混合物のサブセット、例えば、標的から解離するか若しくは標的によって結合しないサブセット、または標的に結合するサブセットを分析することを含む。
【０１４３】
液体は水性緩衝液とすることができる。例えば、液体はイオン強度約１５０mM未満を有する低塩緩衝液、例えば、生理学的緩衝液の例えばＰＢＳとすることができる。緩衝液は、pH安定化緩衝剤の例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、または別の緩衝液を含むことができる。緩衝液のpHは、５〜１０、６〜９、または６．５〜８．５の範囲内とすることができる。液体は高塩溶液とすることができ、例えば、イオン強度少なくとも２００mMを有する。緩衝液は、還元試薬、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールを含むことができる。緩衝液は、洗剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（例えば、０．１％未満の量で）、トリトン−Ｘ−１００、トゥイーン−２０等を含むことができる。別の具体例においては、液体は酸または塩基を含み、例えば、液体はpH６、５、４、または３．５未満を有するかまたは液体はpH少なくとも８、９、１０、１０．５、または１１を有する。さらに別の具体例においては、液体はカオトロープ、例えば、グアニジンまたは尿素を含む。
【０１４４】
本方法は、もちろん、本明細書において説明する装置及び／または本明細書において説明する特徴の任意の選択を用いて実施することができる。
別の態様においては、本発明は、磁気応答性粒子を洗浄する方法を特徴とする。本方法は、（１）磁気応答性粒子を試料と接触させることと；（２）磁気応答性粒子を、第１及び第２のポートを有するフローチャンバ中に配置することと；（３）第１のポートに接続する洗浄溶液の源を用意することと；（４）（２）の後であるが（３）の前に、最中に、または後に、磁気応答性粒子を第１の磁場中に固定化することと；（５）洗浄溶液をフローチャンバを通して流すことと；（６）任意に、洗浄溶液の流れを停止させるかまたは減弱させることと；（７）第１の磁場を除去し、第２の磁場を適用し、第２の磁場を除去し、第１の磁場を適用するという１つ以上の完全なまたは部分的なサイクルを適用することによって磁気応答性粒子を撹拌することと；（８）任意に洗浄溶液の流れを回復させること；を含む。
【０１４５】
好適な具体例においては、本方法はさらに、：（９）第１のポートを洗浄溶液源から切り離すことと；（１０）第２のポートに接続する溶離溶液の源を用意することと；（１１）溶離溶液をフローチャンバを通して流すことと；１２）溶出液を第１のポートから集めることと；を含む。
【０１４６】
順序は逐次である必要はない。例えば、例えば、（２）を（１）の前に達成することができる。
特に、磁気応答性粒子をフローチャンバ中、例えば、緩衝液中に配置することができ、次に試料と接触させる。好適な具体例においては、工程を逐次実行する。
【０１４７】
好適な具体例においては、本方法は、例えば、流体コネクタ、例えば、チュービングまたは他のアダプターと接触することなく、溶離溶液は直接に第１のポートから収集チャンバ中に流れるようなものである。収集チャンバ、例えば、管またはマイクロタイター穴を、第１のポートの真下に配置することができる。例えば、第１のポートと収集チャンバとの間にエアギャップを提供することができる。
【０１４８】
別の好適な具体例においては、工程（５）〜（８）（例えば、（５）及び（７）または（５）、（６）、（７）、及び（８））を１回以上繰り返して、磁気応答性粒子を洗浄する。
【０１４９】
１具体例においては、溶離溶液は修飾または拮抗剤を含む。修飾剤はプロテアーゼ、例えば、部位特異的プロテアーゼ、例えば、トロンビンまたは第ＶＩＩＩ因子とすることができる。プロテアーゼは、試料のメンバーを切断して、例えば、結合したディスプレイライブラリーメンバーの核酸成分を溶離するかまたは磁気応答性粒子に付着したタンパク質を切断することができ、例えば、それによって断片を放出するかまたは立体配座の変化を引き起こす（例えば、ウイルス表面タンパク質の例えば赤血球凝集素を切断する）。拮抗剤は、磁気応答性粒子に付着した標的と同一とすることができる。
【０１５０】
別の具体例においては、溶離溶液は、洗浄溶液よりも高いイオン強度を有する。さらに別の具体例においては、溶離溶液は、洗浄溶液よりも低いイオン強度を有する。別の関連具体例においては、溶離溶液の条件は、洗浄溶液の条件と比較して疎水性効果を変更する。
【０１５１】
好適な具体例においては、溶離溶液は、可変の濃度の成分を有する。例えば、溶離溶液は、階段または連続勾配として流れることができる。塩の量またはpHは、勾配の端から端まで変化させることができる。別の好適な具体例においては、溶離溶液の少なくとも一部分を、例えば、一定体積のまたは規則的な時間間隔に対応するフラクションで集める。例えば、拮抗剤を使用して溶離と組み合わせて分画した場合に、その溶離した成分を、標的と結合するための解離定数を基準として分離することができる。
【０１５２】
１具体例においては、洗浄溶液は修飾または拮抗剤を含む。さらに別の具体例においては、例えば、磁気応答性粒子の前に、後に、または同時に試料に加えた修飾または拮抗剤の存在下で、磁気応答性粒子を試料と接触する。
【０１５３】
本方法は、もちろん、本明細書において説明する装置及び／または本明細書において説明する特徴の任意の選択を用いて実施することができる。
別の態様においては、本発明は、磁気応答性粒子を洗浄する方法を特徴とする。本方法は、（１）磁気応答性粒子を試料と接触させることと；（２）磁気応答性粒子をフローチャンバ中に挿入することと；（３）磁気応答性粒子を第１の磁場中に固定化することと；（４）液体をフローチャンバを通して第１の方向に流すことと；（５）第１の磁場を除去する（または消散させる）ことと；（６）磁気応答性粒子を第２の磁場中に固定化することと；を含む。
【０１５４】
本方法はさらに、（７）第２の磁場を除去することと；（８）磁気応答性粒子を第１の磁場中に固定化することと；（９）工程（５）〜（８）を少なくとも２回繰り返すことと；を含む。順序は逐次である必要はない。例えば、（２）を（１）の前に達成することができる。好適な具体例においては、工程を逐次実行する。
【０１５５】
別の態様においては、本発明は、ディスプレイライブラリーメンバーを単離する方法を特徴とする。本方法は、本明細書において説明する装置を用意して、本明細書において説明する方法を適用して、例えば、それによってディスプレイライブラリーメンバーを単離することを含む。
【０１５６】
好適な具体例においては、本方法は、（ａ）磁気応答性粒子、（ｂ）磁気応答性粒子が付着したディスプレイライブラリーのメンバー、（Ｃ）標的化合物、粒子、ディスプレイライブラリーのメンバーの少なくとも幾つかは複合体を形成するように、磁気応答性粒子に付着するかまたは付着可能な標的化合物を含む混合物を含むフローチャンバを用意することと；（ｉ）第１の溶液をフローチャンバを通して流し、同時に粒子を磁場によって捕獲し、（ｉｉ）磁場を選択的に適用することによって粒子を撹拌することを含む１つ以上のサイクルを達成することによって、メンバーの少なくとも幾つかを粒子から洗い流すことと；を含む。
【０１５７】
例えば、用意することは、標的化合物をディスプレイライブラリーメンバーのサブセットと結合し、それに続いて、標的化合物を磁気応答性粒子に付着することを含むことができる。流すことは、流すことの条件下で標的化合物と結合しないディスプレイライブラリーメンバーのサブセットを除去することができる。
【０１５８】
１具体例においては、本方法はさらに、流すことの条件下で標的化合物と結合しないディスプレイライブラリーメンバーのサブセットを単離することを含む。
別の具体例においては、本方法はさらに、（ｉｉｉ）第２の溶液をフローチャンバを通して流し、同時に粒子を磁場によって捕獲し、（ｉｖ）磁場を選択的に適用することによって粒子を撹拌することを含む１つ以上のサイクルを達成することによって、メンバーの少なくとも他のいずれかを粒子から洗い流す（例えば、“溶離する”）ことを含む。粒子から洗い流したメンバーを集め、分析することができる。第１及び第２の溶液は、異なるイオン強度、異なるpH、または異なる試剤を有することができる。例えば、第２の溶液は、プロテアーゼを含むことができる。別の例においては、第１の溶液はジスルフィド結合を維持し、第２の溶液はジスルフィド結合を低減する。さらに別の例においては、第２の溶液は、拮抗剤、例えば、標的と同一の試剤を含む。
【０１５９】
１具体例においては、第２の溶液は、可変の濃度の成分を有し、例えば、第２の溶液を、階段または連続勾配のような勾配として供給する。
第１の溶液及び／または第２の溶液をフラクションで集めることができる。
【０１６０】
１具体例においては、本方法は、第２の溶液中でディスプレイライブラリーメンバーの少なくとも幾つかを増幅することと、本方法を繰り返すこととを含む。
第１及び／または第２の溶液は、細胞増殖用の培地、例えば、増殖因子、糖、または他の栄養素を含むことができる。本方法は、もちろん、本明細書において説明する装置及び／または本明細書において説明する特徴の任意の選択を用いて実施することができる。
【０１６１】
別の好適な具体例においては、本方法は、本明細書において説明する装置及び試料にさらした磁気応答性粒子を用意することと；第１の溶液を第１の方向に（例えば、垂直に上向きに）流して、粒子を洗浄し、次に第２の溶液を、第１の方向と向かい合う第２の方向に（例えば、垂直に下向きに）流すことと；を含む。好適な具体例においては、第２の溶液を、流体コネクタ、例えば、チュービング、例えば、プラスチックチュービングと接触することなく集める。本方法は、もちろん、本明細書において説明する装置及び／または本明細書において説明する特徴の任意の選択を用いて実施することができる。
【０１６２】
別の態様においては、本発明は、ディスプレイライブラリーを精製する方法を特徴とする。（例えば、様々な厳しさで非標的に結合するメンバーを除去する）。本方法は、非標的化合物に付着した磁気応答性粒子及びディスプレイライブラリーのメンバーを溶液中で組み合わせることと；溶液をフローチャンバ中に配置することと；第１及び第２の磁場を選択的に適用することによって磁気応答性粒子を撹拌することと；流体をフローチャンバの第１のポート中に流すことと；流出液をフローチャンバの第２のポートから集めることと；を含む。集めた流出液は、非標的化合物と結合しないディスプレイライブラリーのメンバーを含むことができる。流体は磁気応答性粒子及びディスプレイライブラリーを組み合わせる溶液の平衡結合条件よりも厳しい平衡結合条件を有することができる。別の具体例においては、流体は、非標的化合物に対する少なくとも幾つかのライブラリーメンバーの解離速度を、溶液中の解離速度と比較して増大させる。
【０１６３】
１具体例においては、流出液をフラクションで集める。別の具体例においては、初めの流出液を、例えば、破棄する。流体が流れる間隔の後に流出液を集める。別の具体例においては、溶液中で化合物と拮抗するディスプレイライブラリーのメンバーのサブセットを集める。
【０１６４】
本明細書において説明する方法を使用して、例えば、考察の対象となっている化合物を別の化合物または混合物から分離すること、化合物を製造または修飾すること、細胞を分離すること、磁気応答性粒子を製造する（例えば、前洗浄または修飾）ことができる。
【０１６５】
別の態様においては、本発明は、（ａ）磁気応答性粒子、（ｂ）粒子に付着するかまたは付着可能な標的、ｃ）第１の複製可能な実体を含む容器中で複合体を形成することと；容器中に複合体を保持する磁場を適用することと；流体を容器から除去することと；複製を支持する溶液を容器に供給するとと；複製の１つ以上のサイクルによって第１の複製可能な実体を複製することと；を含む方法を特徴とする。複製は標的の存在下で起きる。第１の複製可能な実体は、核酸、細胞またはウイルス粒子とすることができる。適切に、複製は、（ｉ）核酸増幅、（ｉｉ）細胞分裂または（ｉｉｉ）ウイルス感染及び放出を含むことができる。“ウイルス粒子”は、核酸を細胞中に送達することができるウイルスまたはウイルスタンパクコーテッド構造を指し、例えば、ファージミドベクターである。ファージミドベクターを宿主細胞中に複製することができる。任意に、ファージミドベクターを封入するより多くのウイルス粒子を生産するために、ヘルパーファージを提供することができる。ウイルス粒子は、ウイルス及び哺乳類細胞に感染するウイルスのウイルス様粒子、例えば、レトロウイルスを含む。
【０１６６】
関連態様においては、本発明は、（ａ）標的が付着する（または付着可能な）磁気応答性粒子、（ｂ）複製可能な実体を含む容器を用意することと；複製可能な実体の第１のサブセットを標的と結合させることと；磁場を適用して、粒子及び複製可能な実体の第１のサブセットを捕獲することと；複製可能な実体の第２のサブセットを第１のサブセットから分離し、第２のサブセットの複製可能な実体は標的と結合しないことと；例えば、核酸増幅、細胞またはウイルス増殖のための条件下で、第１のサブセットの複製可能な実体を複製することと；を含む方法を特徴とする。複製可能な実体は、核酸、細胞またはウイルス粒子とすることができる。
【０１６７】
本方法はさらに、磁場を消散させることを含むことができる。例えば、容器の外部に位置決めされた磁場インデューサーによって磁場を適用する。別の例においては、磁場インデューサー（例えば、磁気棒）を容器中に挿入することによって、磁場インデューサーを適用する。挿入した磁場インデューサーは、シースを含むことができる。
【０１６８】
１具体例においては、分離は、磁場インデューサーを挿入すること、第１のサブセットを第２の容器中に捕獲することとを含む。第２の容器は、増殖培地を含むことができる。分離は、流体の少なくとも幾らかを容器からフラッシングし、同時に、第１のサブセットの実体を捕獲することを含むことができる。
【０１６９】
本方法は、結合したメンバーを磁気応答性粒子によって捕獲しつつ、増殖及び溶液交換の反復サイクルを含むことができる。例えば、回収した複製可能な実体を溶液から単離し、容器から除去することができる。別の例においては、磁気応答性粒子を単離し、結合したメンバーを分析する。
【０１７０】
複製可能な実体の例としては、核酸（例えば、核酸−ペプチド融合物、リボソームディスプレイポリペプチド）、細胞（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイする酵母細胞、免疫細胞、別の哺乳類細胞、異種ポリペプチドをディスプレイする細菌細胞）、ウイルス（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイするバクテリオファージ、または修飾哺乳類ウイルス）が挙げられる。
【０１７１】
１具体例においては、容器はフローチャンバである。別の具体例においては、容器は単一のポートのみを有する。
別の態様においては、本発明は、（ａ）不溶性支持体、（ｂ）標的は不溶性支持体に付着するかまたは付着可能であり、（Ｃ）第１の複製可能な実体を含む容器中で複合体を形成することと；標的の存在下で、複製の１つ以上のサイクルによって第１の複製可能な実体を複製することと；を含む方法を特徴とする。第１の複製可能な実体は、核酸、細胞またはウイルス粒子とすることができる。適切に、複製は、（ｉ）核酸増幅、（ｉｉ）細胞分裂または（ｉｉｉ）ウイルス感染及び放出を含むことができる。“ウイルス粒子”は、核酸を細胞中に送達することができるウイルスまたはウイルスタンパクコーテッド構造を指し、例えば、ファージミドベクターである。ファージミドベクターを宿主細胞中に複製することができる。任意に、ファージミドベクターを封入するより多くのウイルス粒子を生産するために、ヘルパーファージを提供することができる。ウイルス粒子は、ウイルス及び哺乳類細胞に感染するウイルスのウイルス様粒子、例えば、レトロウイルスを含む。
【０１７２】
分離は、流体の少なくとも幾らかを容器からフラッシングし（例えば、不溶性支持体中に流体を流すか、または不溶性支持体と接触した状態になっている流体を交換する）、同時に、第１のサブセットの実体を捕獲することを含むことができる。
【０１７３】
本方法は、結合したメンバーを不溶性支持体にによって捕獲しつつ、増殖及び溶液交換の反復サイクルを含むことができる。例えば、回収した複製可能な実体を溶液から単離し、容器から除去することができる。別の例においては、不溶性支持体と結合した実体を分析する。
【０１７４】
複製可能な実体の例としては、核酸（例えば、核酸−ペプチド融合物、リボソームディスプレイポリペプチド）、細胞（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイする酵母細胞、免疫細胞、別の哺乳類細胞、異種ポリペプチドをディスプレイする細菌細胞）、ウイルス（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイするバクテリオファージ、または修飾哺乳類ウイルス）が挙げられる。
【０１７５】
１具体例においては、容器はフローチャンバである。別の具体例においては、容器は単一のポートのみを有する。
１態様においては、本発明は、
ａ）多様な複製可能な実体、標的、及び支持体を含む混合物を形成し、複数の各複製可能な実体は、複製可能な実体とは異種のタンパク質成分をディスプレイし、各複製可能な実体は異種タンパク質成分を符号付けする核酸を含み、異種タンパク質成分は１組の多様なタンパク質成分のメンバーであることと；
ｂ）複製可能な実体−固定化標的複合体を形成し、この各々は、標的に結合する複数から得られる複製可能な実体を含み、標的は支持体に固定化していることと；
ｃ）標的と結合しない多様な複製可能な実体を複製可能な実体−固定化標的複合体から分離することと；
ｄ）標的の存在下で複製可能な実体のコピーを生産し、それによって、コピーされた実体−固定化標的複合体を形成することと；
ｅ）標的と結合しない複製可能な実体のコピーをコピー−実体−固定化標的複合体から分離すること；を含む方法を特徴とする。
【０１７６】
本方法を使用して、標的結合タンパク質を符号付けする複製可能な実体（例えば、ディスプレイファージまたはディスプレイ細胞）をライブラリーから選択することができる。
複製可能な実体がバクテリオファージである１具体例においては、生産の工程ｄ）は、複製可能な実体−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体によって宿主細胞が感染するように、ファージ−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体を宿主細胞と接触させることを含むことができる。複製可能な実体がファージである具体例においては、本方法はさらに、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる：宿主細胞のうちの１つに感染する各ファージにつき、５０００、４０００、２０００、１０００、７００、５００、または３００より少ない後代ファージが生産される；生産は４、３、２１．５、１、または０．５時間未満で完了する；宿主細胞は７、６、５、４または３回未満分裂する；耐性が各ファージ内部の核酸によって符号付けされる抗生物質は存在するかまたは存在しない。接触ｄ）と分離ｅ）との間の時間は２４０、１２０、９０、８０、６０、４５、４０、または３０分未満とすることができ、少なくとも３０、４５、６０、８０、または９０分としてよい。
【０１７７】
別の態様においては、本発明は、
ａ）各々はそれぞれの複製可能な実体に物理的に付着する異種タンパク質成分を有する複製可能な実体のライブラリーを用意し、各タンパク質成分は多様な組の異なるタンパク質のメンバーであることと；
ｂ）ライブラリーの複製可能な実体を標的と接触させることと；
ｃ）ｉ）複製可能な実体−固定化標的複合体を形成し、この各々が（１）その異種タンパク質成分によって標的と結合する複製可能な実体及び（２）支持体に固定化した標的を含み；ｉｉ）標的と結合しない複製可能な実体を複製可能な実体−固定化標的複合体から分離し；ｉｉｉ）標的の存在下で複製可能な実体のコピーを生産し、生産されたコピーは標的と結合する複製可能な実体の複製であるという１つ以上のサイクル実行することと；
ｄ）標的と結合する１つ以上の生産された複製可能な実体の異種タンパク質成分を符号付けする核酸を回収し、それによって、標的のための結合タンパク質を符号付けする核酸を選択することと；を含む方法を特徴とする。
【０１７８】
本方法を使用して、結合タンパク質を符号付けする核酸をディスプレイタンパク質のライブラリーから選択することができる。複製可能な実体の例としては、核酸（例えば、核酸−ペプチド融合物、リボソームディスプレイポリペプチド）、細胞（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイする酵母細胞、免疫細胞、別の哺乳類細胞、異種ポリペプチドをディスプレイする細菌細胞）、ウイルス（例えば、異種ポリペプチドをディスプレイするバクテリオファージ、または修飾哺乳類ウイルス）が挙げられる。
【０１７９】
複製可能な実体がバクテリオファージである１具体例においては、生産の工程ｉｉｉ）は、複製可能な実体−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体によって宿主細胞が感染するように、ファージ−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体を宿主細胞と接触させることを含むことができる。複製可能な実体がバクテリオファージである１具体例においては、生産の工程は、複製可能な実体−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体によって宿主細胞が感染するように、ファージ−固定化標的複合体から得られる複製可能な実体を宿主細胞と接触させることを含むことができる。複製可能な実体がファージである具体例においては、本方法はさらに、以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる：宿主細胞のうちの１つに感染する各ファージにつき、５０００、４０００、２０００、１０００、７００、５００、または３００より少ない後代ファージが生産される；生産は４、３、２１．５、１、または０．５時間未満で完了する；宿主細胞は７、６、５、４または３回未満分裂する；耐性が各ファージ内部の核酸によって符号付けされる抗生物質は存在するかまたは存在しない。接触と分離との間の時間は２４０、１２０、９０、８０、６０、４５、４０、または３０分未満とすることができ、少なくとも３０、４５、６０、８０、または９０分としてよい。
【０１８０】
別の態様においては、本発明は、複数のディスプレイライブラリーメンバーを増幅する方法を特徴とする。本方法は、標的（例えば、標的化合物または標的細胞）の存在下で複数のディスプレイライブラリーメンバーを増幅して、増幅したディスプレイライブラリーメンバーの集団（例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリーメンバーまたは細胞ディスプレイライブラリーメンバー）を与えることを含む。１具体例においては、増幅の最中または後に、増幅したディスプレイライブラリーメンバーの少なくともサブセットは標的化合物と物理的に相互作用する。１具体例においては、増幅したディスプレイライブラリーメンバーの少なくともサブセットは標的化合物と結合する。本方法はさらに、標的化合物と結合する増幅したディスプレイライブラリーメンバーのサブセットを含むことができる。本方法は、本明細書において説明する他の特徴を含むことができる。
【０１８１】
別の態様においては、本発明は、（ａ）（１）増殖培地、（２）ディスプレイライブラリーメンバーである細胞またはこのようなもの（例えば、バクテリオファージディスプレイライブラリーメンバー）によって感染可能な細胞、及び（３）標的化合物が付着した（または付着可能な）磁気応答性粒子を含む容器；（ｂ）容器中で増殖培地が補給される時に粒子を捕獲するように構成された磁場インデューサー；を含む装置を特徴とする。
【０１８２】
さらに別の態様においては、本発明は、（ａ）（１）ＤＮＡ合成のための試薬、（２）核酸ライブラリーメンバーである実体、及び（３）標的化合物が付着した（または付着可能な）磁気応答性粒子を含む容器；（ｂ）容器中でＤＮＡ合成にとって必要な成分が補給される時に粒子を捕獲するように構成された磁場インデューサー；を含む装置を特徴とする。実体は、例えば、ペプチドまたはポリペプチドを符号付けすることができる。ペプチドまたはタンパク質は、例えば、これを符号付けする核酸に付着するかまたは付着可能である（例えば、共有結合または非共有結合付着によって、または封入によって、例えば、細胞膜またはウイルス壁によって）。容器はさらに、タンパク質合成にとって必要な試薬を含むことができる。
【０１８３】
さらに別の態様においては、本発明は、磁気ビーズ及び毛細管を含むキットを特徴とする。キットはまた、本明細書において説明する装置、チュービング（本明細書において説明する装置または毛細管に合致するように適応させた）、及び／またはディスプレイライブラリーを含むことができる。磁気ビーズは、ペプチドタグと結合する試薬を含む表面を有することができる。例えば、試薬は、固定化金属（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ−Ｎｉ2+）及び他のＮＴＡ−結合金属）、特異的なエピトープを認識する抗体、またはポリペプチドのためのリガンドの例えばグルタチオン、ビオチン、キチン、及びマルトースとすることができる。
【０１８４】
本明細書において使用する“ポリペプチド”は３個を超える任意の長さのアミノ酸のポリマーであり、ペプチドまたはタンパク質を含む。“短いペプチド”は、３０個未満のアミノ酸のポリペプチドである。“タンパク質”は、１つ以上のポリペプチドサブユニットを含むことができる。
【０１８５】
本明細書において使用する“ディスプレイ実体”は、接近可能なポリペプチド成分、及びポリペプチド成分を符号付けするかまたは識別する回収可能な核酸成分を含む実体である。１具体例においては、ディスプレイ分子を核酸成分に付着する。例えば、ポリペプチド成分は、核酸成分を封入するウイルコートに付着する。別の例においては、ポリペプチド成分は核酸成分に共有結合で結合する。さらに別の具体例においては、ディスプレイ分子は、核酸成分に付着しないが、ポリペプチド成分を符号付けする核酸配列を識別するための用途に関連して十分な情報を含むタグ（例えば、それ自体がポリペプチドまたは核酸配列または非生物学的タグであり得るタグ）に付着する。例えば、タグは、ポリペプチド成分のポリペプチド配列を示すデータ列に関連する識別子を含む無線周波数トランスポンダとすることができる。核酸成分はデータ列からその配列を推定することができ、これから合成することができるので、“回収可能”である。
【０１８６】
“ディスプレイライブラリー”は、少なくとも３つのディスプレイ実体のコレクションである。ライブラリーの核酸成分（従って、ポリペプチド成分）は、多様なセグメント（例えば、少なくともヌクレオチド）を含むことができる。セグメントの多様性は、ランダム、部分的にランダム、設計されたもの、または天然とすることができる。ランダムセグメントの例は、変性オリゴヌクレオチドから合成されたセグメントである。部分的にランダムなライブラリーの例は、メンバーは、例えば、バイアスされたヌクレオチドプール、または選択されたかまたはバイアスされたトリヌクレオチドユニットを使用してオリゴヌクレオチドの部分的にランダムなプールから合成されたセグメントを含むライブラリーである。設計されたライブラリーの例は、特定の周知の個々のメンバーから形成されたライブラリー、例えば、ランダムライブラリーのアレイ化された個々のメンバーまたはコンピュータプログラムによって設計されたメンバーのサブセットである。天然の多様性を含むライブラリーの例は、天然に存在する配列セグメント（例えば、未使用（naive）免疫グロブリン可変ドメインを符号付けする配列）から構成されたライブラリーである。ディスプレイライブラリーのための様々なフォーマットは従来技術において周知であり、例えば、Li et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:1251-1255を参照されたい。幾つかの好ましいディスプレイフォーマットを本明細書において説明する。１つの好ましいディスプレイフォーマットはファージディスプレイである。１つの他の好ましいフォーマットは酵母ディスプレイである。
【０１８７】
“磁気応答性粒子”は、存在する場合、粒子は磁場中に移動する程度に磁化されるかまたは磁化可能な磁気または常磁性粒子である。粒子は、一時的にのみ、例えば、磁場が存在する場合のみ磁化可能とすることができる。粒子は、任意の便利な形状、例えば、球形、楕円形、平坦等とすることができる。
【０１８８】
本明細書において使用する“キャピラリー”または“キャピラリーフローチャンバ”は、内径が４mm未満であるチャンバを指す。キャピラリーの例は、内径１．８mm未満のガラスキャピラリーである。
【０１８９】
本発明の１つ以上の具体例の詳細を、添付図面及び下記の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から並びに請求の範囲から明瞭であろう。２００１年１２月７日に出願された米国仮特許出願第60/337,755号及び２００２年９月５日に出願された第60/408,624号を含む本明細書において引用する全ての特許及び参考文献を、全ての目的で参考のためにその全体を引用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９０】
本発明は、磁気応答性粒子を洗浄する装置及び方法を提供する。一般に、特定の表面特性を有する磁気応答性粒子は、生物学的分子の試料にさらされる。粒子を次に、本明細書において説明する方法及び／または装置を使用して洗浄する。
【０１９１】
第１の１模範的な磁気応答性粒子洗浄装置を説明する。
洗浄装置
図１及び２に表す例を参照すると、磁気ビーズ洗浄装置は、磁気ビーズ２１０を収納するためのチャンバ１１０を含む。液体は、チャンバ１１０を通って通路１８０または通路１８２に沿って流れることができる。チャンバ１００は、例えば、直径約１．４mm及び長さ約１４０mmのガラス毛細管とすることができる。
【０１９２】
チャンバ１１０を第１の磁石１２２と第２の磁石１２４との間に配設する。磁石１２２及び１２４をフレーム１２０に取り付ける。フレームは第１の位置から第２の位置に動くことができる。フレームが動く時に、第１の磁石１２２は第２の位置１３２に動き、第２の磁石１２４は第２の位置１３４に動く。
【０１９３】
第１の位置１２６において、第１の磁石１２２はチャンバ１１０の第１の帯域２１０中に磁場を生成する。第２の位置１３６において、第２の磁石１２４は、チャンバ１１０の第２の帯域２２０中に磁場を生成する。フレームの動きはまた、磁場を第１の帯域２１０から除去する。この例においては、第１及び第２の帯域は直径方向に向かい合う。磁場の変更は、第１の帯域２１０から第２の帯域２２０への磁気ビーズの移動をもたらす。
【０１９４】
また図３を参照すると、チャンバ１１０は流体コネクタ３１０及び３２０に取り付けることができる。洗浄工程の間中、チャンバ１１０を流体コネクタ３１０及び３２０の両方に取り付けることができる。流体は底部コネクタ３１０からチャンバに入り、最上部コネクタ３２０を経て出ることができる。洗浄は上向きの方向１８０に行う。
【０１９５】
溶離工程の間中、チャンバ１１０を最上部流体コネクタ３２０のみに取り付けてよい。流体、例えば、溶離溶液は最上部からチャンバに入り、底部で出る。例えば、コネクタの例えばチュービング、フリット、または他のアダプターと接触することなく、溶離溶液を直接に収集容器中に吐出することができる。
【０１９６】
図４〜８の例を参照すると、装置４００は水平の基部４０１及び垂直なスタンド４７０を含む。スタンド４７０は下部棚４０５及び上部棚４０７を含む。棚４０５及び４０７はキャピラリーフローチャンバのための支持体である。
【０１９７】
棚は毛細管１１０を保持するための取付け具を含む。こうした取付け具は、ブラケット４１０及び４１２によって補強されたボアである。他の取付け具は、クランプ、止め金等を含むことができる。
【０１９８】
棚４０５及び４０７は、フレーム４２０をすべらせることができる２つの平行な凹型の軌道４５０及び４５２を含む。フレームは、前方プレート６１０及び後方プレート６２０を含むことができる。つまみ４３２によって締めることができるブラケット４３０によって、後方プレート６２０を前方プレート６１０に固定する。２枚のプレート６１０及び６２０は、凹型の軌道４５０及び４５２中で平行にすべるように位置決めされる。最上部棚４０７の脱着式ねじ４４５はプレートを軌道上で保持する。
【０１９９】
前方プレート６１０は基部４４０を支持し、これに複数の磁場インデューサーを取り付ける。この例においては、磁場インデューサーは、規則的な間隔を置いて配置された磁石（例えば、６５１、６５２、及び６５３）である。
【０２００】
後方プレート６２０は、楕円形の開口部６２２を含むことができる。回転カム４６２のスピンドル４６４を開口部６２２中に配設する。カムを回転させると、スピンドル４６４は偏心して駆動する。カムを回転させると、後方プレート６２０、それによってフレーム４２０は、軌道４５０及び４５２に沿って往復運動する。
【０２０１】
フローチャンバ．例えば、チャンバの長さ及び断面積の慎重な設計によって、任意の容量を得るためにフローチャンバを設計することができる。１具体例においては、フローチャンバは断面積４mm2未満を有する。垂直に位置決めされるこのような細いフローチャンバにおいては、粒子がチャンバの下部領域に沈降することなく磁気応答性粒子をチャンバ１つの帯域から別の帯域に移送することができる。
【０２０２】
非ガラスフローチャンバの内部表面はコーティングすることができ、例えば、シラン化、またはさもなければ修飾して、生物学的化合物の例えばファージ、細胞、タンパク質、及び核酸との結合を低減する。
【０２０３】
１模範的なフローチャンバはガラス管である。例えば、ガラス管は内径０．４〜１．３mm、例えば、１．４mm±０．０５mm及び長さ約１４０mmを有することができる。このような管の体積は約２００μlである。管は最小のテーパー、例えば、テーパー０．０２mm未満を有することができる。管を、ホウケイ酸ガラスで形成できる。幾つかのこのような管はガラス毛細管として市販されている（例えば、血液を引抜くためにに販売されている）。
【０２０４】
フローチャンバの内部表面は滑らかいまたは粗いとすることができる。粗い内部表面は、常磁性粒子がフローチャンバの内壁に当って捕獲される時に、常磁性粒子表面の露出した表面積増大させ得る。
【０２０５】
小さな体積を有する細いフローチャンバの使用は、多数の利点を提供することができる。例えば、小さな体積の結果として、妥当な流量で、新たに適用される溶液は、フローチャンバの底部の粒子とほぼ同時にフローチャンバの最上部で粒子と接触する。一方、チャンバは細いので、層間の過度の混合無しに溶液の勾配を適用できる。
【０２０６】
装置の追加の特徴
装置４００は、様々な追加の特徴を含むことができる。非限定例は以下のものを含む。
［分光光度計］流出液ラインは、光学的フローセル、例えば、アマシャム−ファルマシア  ＵＶ−ＩＩモデル（Amersham-Pharmacia UV-II model）に合致させることができる。光学的フローセルは、例えば、波長２６０nm、２８０nm、または３４０nmの光源を含む。光学的フローセルはまた、フローセル中の流体によって吸収される光の量を測定する検出器を含む。検出器からの出力を、チャート式記録計によってまたは検出器とインターフェースで連結され、検出器からの情報を記憶するコンピュータによって監視することができる。利用者はチャート式記録計またはコンピュータを監視して、フローチャンバ１１０から出るＵＶ−吸収材料の量を決定することができる。タンパク質及び核酸の両方がＵＶ−光を吸収するので、利用者は、フローチャンバ１１０から出るタンパク質及び核酸の程度に関する表示を得ることができる。このような情報を使用して、洗浄または溶離手順の必要な長さを人手でまたは自動で決定できる。自動モードにおいては、コンピュータにプログラミングして、しきい吸光度値を検出し、従って事象を引き起こす。例えば、流出液ラインが洗浄溶液と等しいＵＶ−吸光度を達成し、維持してから２０分後に、コンピュータは、流体ドライバを洗浄溶液の送達から溶離溶液の送達に転換することができる、。
【０２０７】
幾つかの具体例においては、光学的フローセルは可視光または蛍光の散乱を監視する。溶液中の細胞の密度は、例えば、溶液によって散乱する光の量に比例する。細胞及びウイルスが内部的にまたは外部的に蛍光で検出可能な（例えば、標識された）実現においては、フローチャンバ１１０から出る細胞またはウイルスの数は、光学的フローセル中の蛍光を監視することによって測定することができる。
【０２０８】
細胞は、蛍光タンパク質、例えば、グリーン蛍光タンパク質またはこの変異体を発現する場合、蛍光で検出可能となり得る。細胞表面タンパク質を、蛍光染料、例えば、Ｃｙ３で修飾することによって、細胞をまた蛍光で標識することができる。例えば、細胞表面タンパク質をビオチン化し、次にＣｙ３−標識アビジンと結合することができる。さらに、膜透過性であり、エステル化すると、安定な細胞質発蛍光団（例えば、モレキュラープローブス、ユージーン、ＯＲ（Molecular Probes, Eugene OR）から入手可能なカルシエン−ＡＭ（calcien-AM））として維持される蛍光染料を細胞に負荷することができる。加えて、細胞を、親油性発蛍光団で直接に（例えば、モレキュラープローブスから入手可能なＤｉＩ）または代謝的にピレン標識脂肪酸（例えば、モレキュラープローブスから入手可能な１−ピレンデカン酸）（脂質二重層中に取り入れられる）を使用して標識することができる。
【０２０９】
例えば、蛍光染料を外部ウイルスコートタンパク質に化学的に結合することによって、または蛍光タンパク質をウイルス粒子中に取り入れることによって、ウイルスを標識することができる。例えば、蛍光標識抗体を、ウイルスコートタンパク質、例えば、メジャーまたはマイナーコートタンパク質、好ましくはウイルス感染価にとって必要ではないコートタンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩ以外のコートタンパク質と結合することができる。
【０２１０】
［流出液ライン中のセンサー］本装置は、流出液ライン中の追加のセンサーを含むことができる。こうしたものを使用して、流出液材料の他のパラメータを監視できる。例えば、導電率計を使用して、流出液のイオン強度を監視できる。このような情報は、勾配溶離の最中の流出液の試料と緩衝液の濃度との間の関連を作成するために特に有用である。上記に説明したように、このような情報はコンピュータに通信することができ、またはチャート式記録計によって表示することができる。同様に、pHセンサーを使用できる。フローチャンバ１１０の体積が小さい（例えば、フローチャンバ１１０が毛細管である）場合、pHセンサー及び導電率計もまた入力ラインに合致させることができる。
【０２１１】
［フラクションコレクター］フローチャンバ１１０から現れる材料を集めるために、洗浄期の最中であろうとまたは溶離期の最中であろうと、試料を人手でまたは自動で集めることができる。好適な具体例においては、試料をフローチャンバのポートのうちの１つから直接に集める。例えば、管を毛細管フローチャンバの真下に位置決めすることができる。この構成においては、流出液は、流出液からの生体分子を非特異的に吸収することがあり得るかまたは前に吸収した生体分子を放出することがあり得るプラスチックまたはポリマーチュービングと接触しない。低レベル非特異的吸収が当然ではないかまたは故意でない実現の場合、チュービング、例えば、使い捨てチュービングを使用して、フローチャンバからの流体流れをフラクションコレクターにまたはより詳細にはフラクションコレクターによって操作される容器に接続できる。
【０２１２】
［入力ライン中のセンサー］様々なセンサーを入力ライン中に位置決めすることができる。例えば、圧力センサーを使用して、フローチャンバ１１０の前方の背圧を監視できる。圧力センサーは、流体ドライバを停止するように構成することができる。別の有用なセンサーは、入力ライン中の空気を検出する空気検出器である。空気は、例えば、流体リザーバがからである場合、または流体接続中の取付け具若しくはジョイントに欠陥が生じている場合にラインに入り得る。
【０２１３】
［流体ドライバ］流体ドライバの例としては、臑動ポンプ及び２チャンバピストン被駆動ポンプ、例えば、アマシャム−ファルマシア  Ｐ−５００またはＰ−９０３が挙げられる。ポンプは電子制御され、正圧下で非常に正確な流量で流体を送達するように調節することができる。例えば、Ｐ−９０３は、速度０．００１〜１０ml／分でわずか２％の偏差で定常流を提供する。
【０２１４】
臑動ポンプを使用して、流体を正圧下でフローチャンバ中に駆動できる。臑動ポンプをまた流出液ライン中に位置決めして、例えば、負圧を使用して流体をフローチャンバから引く。この構成を、例えば洗浄期の間中使用できる。１模範的な臑動ポンプは、ワトソン−マーロータイプ  ２０５４（Watson-Marlow Type 2054）８−チャネル臑動ポンプである。このポンプはコントローラに電子的にインターフェースで連結され、ソフトウェア生成命令を使用して動作することができる。バイオ−ラド  ＥＰ−１  エコノポンプ（バイオ−ラド・ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、ＣＡ）（Bio- Rad EP-1 Econo pump (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)）は、０．０１〜２０ml／分の制御された流量を提供することができる別の模範的な臑動ポンプである。内径０．８〜３．２mmのチュービングをポンプに合致させることができる。適切なサイズのチュービングを、所望の流量によって選択する。
【０２１５】
装置４００はまた、緩衝液、例えば様々な比率で組み合わせることができる緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂを保持するためのリザーバを含むことができる。例えば、アマシャム−ファルマシア・グラディエント・プログラマ  ＧＰ−２５０プラス（Amersham-Pharmacia Gradient Programmer GP-250 Plus）及び２つのアマシャム−ファルマシア高精密Ｐ−５００（Amersham-Pharmacia High Precision P-500）ポンプを、フローチャンバへの緩衝液Ａ及びＢの勾配を提供するように構成できる。緩衝液Ａは、低塩緩衝液、例えば、５０mMＴｒｉｓＨＣｌ、５０mMＫＣｌでpH７．５とすることができる。緩衝液Ｂは高塩緩衝液、例えば、５０mMＴｒｉｓＨＣｌ、８００mMＫＣｌでpH７．５とすることができる。緩衝液を、階段、線形、または非線形勾配で混合することができる。例えば、Scopes (1994) Protein Purification : Principles and Practice, New York: Springer-Verlagを参照されたい。
【０２１６】
［磁場または磁石位置センサー］本装置はまた、磁場の存在を検出するかまたは磁石の位置を検出する（例えば、直接にまたは間接的に、磁石または磁石に取り付けた指標、例えばフレームの位置を決定することによって）センサーを含むことができる。センサーは磁石の移送かまたは磁場の起動を制御するプロセッサに情報を送ることができる。このような情報を使用して、装置によって命令が正しく実行されたことを実証できる。
【０２１７】
［温度センサー］本装置は、フローチャンバ中の流体の温度を決定するかまたは推定するための温度センサーを含むことができる。例えば、フローチャンバがジャケット付きである場合、センサーはジャケットの温度を測定することができる。フローチャンバが冷却したハウジング中にある場合、センサーはハウジング中の空気温度を測定することができる。１具体例においては、センサーはフローチャンバ中の流体（フローチャンバに入る流体、またはフローチャンバから出る流体）の温度を直接に測定する。
【０２１８】
本装置の他の具体例
本装置の多数の他の具体例を使用できる。１模範的な具体例は、複数のチャネル、例えば、４チャネルを含むカートリッジを含む。
【０２１９】
各チャネルは、常磁性粒子を負荷することができるフローチャンバとして機能する。カートリッジは、カートリッジを支持しかつ流体を送達するハウジング中にはまる。ハウジングは、カートリッジを、従って全てのチャネルを、第１と第２の磁場インデューサーとの間に位置決めする。カートリッジを使い捨て及び／または常磁性粒子を前負荷して提供されるように構成することができる。
【０２２０】
別の模範的な具体例においては、フローチャンバを水平に位置決めする。単一の磁場をチャンバの最上部に適用して、常磁性粒子をチャンバの最上部内壁に当てて固定化する。流体はチャンバを通って流れることができる。粒子を撹拌するために、流れを停止させ、磁場を除去する。粒子はチャンバの下部内壁に沈降する。磁場を次に適用する。この構成においては、粒子がチャンバの下部内壁に十分に沈降する時間が与えられる。この方法は、２つの磁場インデューサーを有する方法と比較してさらに時間を必要とするかもしれないが、これは、幾つかの材料、例えば、生細胞に必要なことがある粒子の特に穏やかな撹拌を可能にするs。
【０２２１】
さらに別の模範的な具体例においては、多数のフローチャンバをカルーセルに取り付ける。カルーセルは様々な位置の間で、例えば、（１）新たなチャンバを取り付ける、（２）試料と接触した磁気粒子をチャンバに負荷する、（３）チャンバを溶液を用いて洗浄して、非特異的にまたは弱く結合した分子を除去する、（４）分子をチャンバから溶離する、（５）使用済みチャンバを処分するための位置でチャンバを回転させる。位置３及び４はチャンバを第１と第２の磁場インデューサーとの間に位置決めして、洗浄工程の間中磁気粒子を撹拌することができる。
【０２２２】
さらに別の具体例である連続的な増殖及び選択のための発酵槽を下記に説明する。
本明細書における装置及び方法を、高スループット用途、例えば、連係して動作する多数のチャンバを使用して分子を単離する用途に適応させることができる。高スループット用途は、診断学（例えば、多数の患者からの試料を分析する）、ゲノム学（例えば、遺伝子マッピング及び遺伝子配列決定計画のために核酸を単離する）、及びプロテオーム学（proteomics）（例えば、プロテオーム中の多数のポリペプチドのためのリガンドを識別するためにライブラリー対ライブラリースクリーニングを実行する）を含むことができる。
【０２２３】
磁気応答性粒子
例えば、本明細書において使用する磁気応答性粒子は、１つ以上の生体分子を調べるるかまたは溶液から単離するために使用する付着した標的分子または結合剤を含むことができる。
【０２２４】
磁気応答性粒子は常磁性粒子またはビーズを含む。常磁性ビーズの例は、米国特許第4,554,088号（paramagnetic bead with a metal oxide core and polymeric silane coat）；米国特許第5,356,713号（magnetizable microsphere with a core of magnetizable particles and a hydrophobic vinylaromatic monomer casing）；米国特許第5,395,688号（particle with a polymer core coated with a mixed paramagnetic metal oxide-polymer layer）；及び米国特許第4,774,265号（paramagnetic bead with a polymer core adsorbed with metal oxide）において説明されている。
【０２２５】
別の模範的な磁気応答性粒子は、ダイナル・バイオテク（オスロ、ノルウェー）（Dynal Biotech (Oslo, Norway).）から入手可能なダイナビード（登録商標）（Dynabead（登録商標））である。ダイナビーズ（登録商標）は均一なサイズ、例えば、直径２μm、４．５μm、及び５．０μmの球面を提供する。ビーズは、ガンマＦｅ2Ｏ3及びＦｅ3Ｏ4磁性材料をとして含む。ビーズは、磁場中で磁性を有するが場の外では残留磁気を欠くので超常磁性である。ビーズは、様々な表面を有して入手可能であり、例えば、カルボキシル化表面を有して親水性であり、トシル活性化表面を有して疎水性である。ビーズは１．１〜１．８、例えば、１．２〜１．５の範囲内の比重を有することができる。ビーズを米国特許第4,336,173号、同第4,459,378号、及び同第4,654,267号において説明されているように製造することができる。
【０２２６】
適切なビーズを、ビーズと結合する試剤の電荷及び疎水性によって選択することができる。ビーズ表面のゼータポテンシャルを測定して、ビーズがどのように所定の試剤と静電的相互作用をできるか決定することができる。ビーズをまた、ブロッキング剤の例えばＢＳＡまたはカゼインでブロックすることができる。
【０２２７】
標的を直接にまたは間接的に常磁性粒子に付着する。様々な標的分子を常磁性ビーズに結合した形態でを購入することができる。１例においては、標的は、反応性基、例えば、架橋剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル）またはチオールを含むビーズに化学的に結合する。
【０２２８】
別の例においては、標的を、特異的結合対のメンバーを使用してビーズに結合する。例えば、標的をビオチンに結合することができる。標的をに、ストレプタビジン（streptavidin）（例えば、ダイナル・バイオテク、オスロ、ノルウェーから入手可能なＭ−２７０及びＭ−２８０  ストレプタビジンダイナビーズ（登録商標））でコーティングした常磁性粒子と結合させる。１具体例においては、標的は、標的が常磁性粒子に付着する前に試料と接触する。分子に特異的に結合する小さな有機分子及びポリペプチドを含む他の特異的結合対を表１に列記する。
【０２２９】
【表１】
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【０２３０】
別のクラスの特異的結合対はペプチドエピトープ及びこれに特異的なモノクローナル抗体である（例えば、エピトープタグを提供する一般法に関してはKolodziej and Young (1991) Methods Enz. 194: 508-51を参照されたい。）。模範的なエピトープタグはＨＡ（インフルエンザ赤血球凝集素；Wilson et al. (1984) Cell 37: 767）、ｍｙｃ（例えば、Ｍｙｃｌ−９Ｅ１０, Evan et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3610-3616）、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＡＧ、及び６−スチジン（例えば、ドイツ特許第19507 166号を参照されたい。）を含む。
【０２３１】
別の模範的な特異的結合対は、細胞表面タンパク質及びこれと結合する抗体を含む。細胞表面タンパク質は、特定の細胞タイプまたは特定の特性、挙動または障害を有する細胞に特異的とすることができる。例えば、細胞は癌細胞とすることができ、抗体はヒポグリコシル化（hypoglycosylated）ＭＵＣ１、メラノーマ分化抗原ｇｐ１００、またはＣＥＡと特異的に結合することができる。
【０２３２】
磁気応答性粒子の洗浄
本明細書において説明する装置を、磁気応答性粒子の制御された洗浄のために設計する。“洗浄”という用語は最も一般的な意味で使用され、すなわち、液体流れの適用である。例えば、この用語は、イオン交換クロマトグラフィーの最中の緩衝液“洗浄”という概念に限定されるものではない。粒子を、試料を粒子に送達するために試料を含む溶液を用いて、粒子と非特異的に若しくは弱く結合した分子を除去する溶液を用いて、または粒子と特異的に若しくはしっかり結合する分子を除去する溶液を用いて洗浄することができる。
【０２３３】
図４に表す本装置に関連して、以下の模範的な方法に従って洗浄を実行することができる。磁場を、フローチャンバである毛細管の第１の帯域に適用する。粒子は毛細管の第１の帯域中の側壁に接着する。緩衝液の流れを毛細管に施す。磁場は常磁性粒子を液体流れの間中固定化された状態に保つ。
【０２３４】
ビーズを移送するために、液体流れを停止する。磁場を第１の帯域から除去し、磁場を第２の帯域に適用する。毛細管１１０の直径が細いので、常磁性粒子は、フローチャンバの底部に沈降することなく第１の帯域から第２の帯域に水平に移動する。第２の帯域に適用する磁場は、ビーズを第２の帯域の側壁に当てた状態で維持することができる。さらに幾つかの手順の間中、液体流れは上向きの方向である。この方向性はさらに、常磁性粒子がフローチャンバの底部にまたはフローチャンバから沈降することを最小にする。
【０２３５】
移送プロセスを任意の回数繰り返すことができる。１つ以上の移送工程の後に液体流れを再開することができる。移送工程によって引き起こされる撹拌は、ビーズを洗浄する速度及び効率を増大させる。例えば、撹拌は、フローチャンバ内壁に対して、互いに対して、及び液体流れの方向に対して粒子を再配向する。撹拌は、フローチャンバに入ったかもしれないかまたは例えば、凝集、細胞溶解等によってフローチャンバ中で生成したかもしれないデブリまたは不溶性材料を追い出すことができる。さらに、撹拌自体のプロセスが、結合した、例えば、非特異的に結合した分子を粒子から除去する剪断力を生成し得る。
【０２３６】
本装置はまた、前処理する（例えば、濯ぐかまたは修飾する）ために、前溶離するために、及び／または粒子が試料と接触する前に常磁性粒子を平衡化するために使用することができる。
【０２３７】
本方法をさらに、様々な液体を送達するように適応させることができる。１模範的な適応させた方法は、（１）常磁性粒子の負荷；（２）考察の対象となっていない分子を除去するために溶液を流す；及び（３）考察の対象となっている分子を除去するために溶離溶液を流すためのセグメントを含む。こうしたセグメントを次の通り説明する：
［キャピラリーフローチャンバ中での常磁性粒子の負荷］１具体例においては、常磁性粒子を管、例えば、エッペンドルフTM（eppendorfTM）管中の試料と混合する。粒子を管中の試料と共に例えば穏やかに回転しながら、平衡結合条件を達成するまでインキュベートすることができる。キャピラリーフローチャンバ中に配置する前に粒子を管中で洗浄することができる。
【０２３８】
結合条件を所望の厳しさまたは特異性に適応させることができる。一般に、最小の親和性で標的に結合する生体分子を単離するために、常磁性粒子に付着する標的の量を、所望の親和性常数未満の濃度で維持する。同様であるがしかもなお標的と異なる拮抗分子を含めることによって特異性を与えることができる。拮抗分子は、標的よりも約少なくとも１０、１００、または１０００倍多いとすることができる。拮抗分子の存在は、拮抗分子よりも大きな程度で標的に結合する生体分子の単離に好都合である。
【０２３９】
次に、例えば、ポンプ送圧、正圧、または毛管作用によって、粒子をキャピラリーフローチャンバ中に配置する。粒子を、フローチャンバの体積よりも小さな体積で加えることができる。好ましくは、粒子をキャピラリーフローチャンバ中に直接に引いて、例えば、チュービングまたは取付け具と試料（例えば、ディスプレイライブラリーのメンバー）との間の接触を避ける。キャピラリーフローチャンバを、負荷の前に、最中に、または後に、図４に表す装置中に取り付けることができる。粒子を負荷した後に、第１の磁場を適用して固定化する。
【０２４０】
別の具体例においては、常磁性粒子をキャピラリー中に負荷し、同時に試料を含まない緩衝液中に懸濁させる。第１の磁場を使用して粒子をキャピラリー中に固定化する。次に試料はキャピラリーを通って流れる。粒子及び試料を、キャピラリー中で制御された長さの時間一緒にインキュベートすることができる。例えば、試料を迅速に流すことによってインキュベーションを非常に簡単にできる。簡単なインキュベーションは、粒子に付着する標的の大きな会合速度（Ｋon）を有する試料中での生体分子の選択を向上させることができる。別の例においては、インキュベーションを延長する。試料はキャピラリー中に流れ、次に流れを停止させる。インキュベーション時間の間中、粒子をピラリー中で定期的に撹拌することができる。
【０２４１】
［非特異的にまたは弱く結合した生体分子の洗浄］任意の継続時間でのインキュベーションに続いてまたは試料と接触した常磁性粒子を毛細管に負荷することに続いて、濯ぎ溶液をフローチャンバを通して流して、非特異的にまたは弱く結合した生体分子を除去する。
【０２４２】
様々な条件を使用して、非特異的にまたは弱く結合した生体分子を常磁性粒子から除去できる。所定の用途に従って、こうした条件を慎重に選択することができる。生体分子の試料を粒子と結合するために使用する緩衝液と同様かまたは同一の第１の洗浄溶液を使用できる。
【０２４３】
より後の洗浄溶液では厳しさがより増大し得る。例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌ濃度を増大させることによって、洗浄溶液のイオン強度を増大させることができる。別の具体例においては、例えば、硫酸アンモニウムの濃度を変化させることによって、疎水性効果を調節することができる。
【０２４４】
［溶離］溶離溶液はチャンバを通って流れて、常磁性粒子表面の標的と結合した生体分子を除去する。溶離溶液は一般に、洗浄溶液とは異なる特性を有する。例えば、溶離溶液は、異なる温度、pH、イオン強度、または溶質の濃度を有することができる。例えば、溶離溶液は、洗浄溶液と比較して酸性または塩基性とすることができる。溶離溶液はまた、二価陽イオン、キレート化剤、還元または酸化剤、洗剤、及びカオトロープの増大した濃度を有することができる。
【０２４５】
標的と結合する生体分子に関して標的と拮抗する特異的な溶質を使用して、考察の対象となっている生体分子を選択的に溶離できる。また下記の“オフレート選択”を参照されたい。
【０２４６】
別の具体例においては、溶離は標的分子を常磁性粒子から分離することによって達成される。例えば、標的分子は、これが特異的プロテアーゼ部位を含むリンカーペプチドによって付着される場合、常磁性粒子から切断されることがあり得る。別の例においては、標的分子が、常磁性粒子表面に固定化した金属と結合したヘキサ−ヒスチジンタグを含む場合、イミダゾール、金属キレーター、または還元剤を加えることによって標的分子を粒子から放出することができる。
【０２４７】
１具体例においては、酵素を使用して、常磁性粒子に付着する標的または標的と結合する生体分子のコレクションを修飾する。例えば、プロテアーゼを特定の濃度及び流量でチャンバを通して流すことができる。プロテアーゼは、プロテアーゼによって認識される特異的部位を含む生体分子を切断することができる。切断した生体分子を次に回収する。生体分子がディスプレイライブラリーのフォーマットである場合、その配列を推定することができる。生体分子がポリペプチド、例えば、遊離のポリペプチドである場合、質量分析もまた使用して、切断したポリペプチドに関する情報を得ることができる。このような情報を使用して、切断部位を推定することができる。
【０２４８】
酵素、例えば、プロテアーゼは、ディスプレイライブラリーメンバーを支持体から除去することができる酵素である（例えば、米国特許第5,432,018号を参照されたい。）。
オフレート選択
特にポリペプチドとその標的との間の相互作用に関して、小さな解離速度は高い親和性を予示することができるので、常磁性粒子表面に固定化した標的に対する結合相互作用のために選択された速度論的解離速度を用いて生体分子を単離するために方法を使用できる。
【０２４９】
本明細書において説明する装置を使用して、まず、非特異的にまたは弱く結合した生体分子を除去する第１の溶液を用いて常磁性粒子を洗浄する。撹拌工程は、第１の溶液を用いた洗浄の最中に含められる。
【０２５０】
次に粒子を、飽和量の標的、すなわち、粒子に付着しない標的の複製を含む第２の溶液を用いて洗浄する（すなわち、溶離する）。遊離の標的は、常磁性粒子に付着する標的分子から解離する生体分子と結合する。粒子に付着した標的のはるかに低い濃度と比較して、飽和量の遊離の標的によって再結合を有効に防ぐことができる。
【０２５１】
第２の溶液は実質的に生理学的かまたは厳しい溶液条件を有することができる。典型的に、第２の溶液の溶液条件は第１の溶液の溶液条件と同一である。撹拌工程はまた、溶離、すなわち、第２の溶液を用いた洗浄の最中に含められる。
【０２５２】
溶離の最中のフローチャンバからの流出液を、例えば、フラクションコレクターを使用してまたは人手でフラクションで集める。フラクションに時間順序で番号を付与して、最初のフラクションから後のフラクションまで識別する。より後のフラクションは、初めのフラクション中の生体分子よりも小さな速度で標的から解離する生体分子を含む。
【０２５３】
流量と比較して小さな体積を有するキャピラリーフローチャンバの使用はさらに、異なる解離速度を有する生体分子の分離を促進し、というのは生体分子は解離の後にチャンバから出て収集管中に迅速に至るからである。頻繁で迅速な撹拌工程を溶離の間中に適用して、溶離した材料の非特異的な捕捉を最小にする。このような工程は、解離速度に関して生体分子を分離する能力を改良する。
【０２５４】
１具体例においては、溶離の間中の流量は時間と共に変更される。初めに大きな流量を使用して、比較的に大きな解離速度を有する結合した生体分子の大きなフラクションを迅速に除去する。次にしっかり結合した生体分子の、残存しているより小さなフラクションを溶離するために、流量を低下させ、流れの無い延長したインキュベーションと組み合わせることさえもする。
【０２５５】
別の好適な具体例においては、標的に結合する全ての可能な相互作用分子を選択するように、流量を小さくし、洗浄時間を低減する。こうした初めに選択された分子を増幅し、より厳しいその後の選択（例えば、より大きな流量またはより長い洗浄時間を有する選択）にさらすことができる。
【０２５６】
さらに別の具体例においては、磁気応答性粒子を厳しい洗浄（例えば、長時間の“溶離条件”）にさらす。次に、結合したままの相互作用分子をビーズから回収する。相互作用分子が、例えば、ディスプレイライブラリーメンバーである場合、これをビーズから増幅することができ、またはその核酸成分を増幅することができる。
【０２５７】
溶液条件
溶液を慎重に選択することができる。上記のScopesは、溶液に加えことができる化合物の様々な特性に関する一般的な指針を提供する。緩衝剤を使用して、安定なpHを維持することができる。緩衝剤の例としては、“グッドの”緩衝液の例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、及びＰＩＰＥＳが挙げられる。使用できる追加の緩衝としてはリン酸塩、クエン酸塩、及びグリシンが挙げられる。
【０２５８】
イオン強度を制御するために、様々な塩を含むことができる。塩の例としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸カリウム、硫酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、及び硫酸アンモニウムが挙げられる。陰イオンはホフマイスター系列から選択されることができ、次の通りである：ＳＣＮ-、ＣＩＯ4-、ＮＯ3-、Ｂｒ-、Ｃｌ-、アセテート-、ＳＯ42-、及びＰＯ43-。陽イオンは、ＮＨ4+、Ｋ+、及びＮａ+から選択されることができる。硫酸アンモニウムを使用して、疎水性効果を制御できる。高硫酸アンモニウム条件は疎水性相互作用を向上することができるが、低硫酸アンモニウム条件は弱めることができる。
【０２５９】
カオトロピック剤を加えて、結合相互作用を崩壊させるかまたはタンパク質安定性を調節する。幾つかの模範的なカオトロープとしては、グアニジニウムヒドロクロリド及び尿素が挙げられる。多くの洗剤もまたカオトロピックである。
【０２６０】
模範的な洗剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＮＰ−４０、トゥイーン、及び非イオン性剤が挙げられる。非イオン性剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、トリトン（登録商標）Ｘ−１１４、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、及び３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。洗剤をその臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の濃度で使用することは有利である。
【０２６１】
溶液の酸化還元電位もまた、例えば、還元または酸化剤を使用して制御することができる。模範的な還元剤としては、β−メルカプトエタノール及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。例えば、既知の濃度の酸化型及び還元型グルタチオンを加えることによって、酸化を制御することができる。
【０２６２】
溶液はまた、タンパク質または細胞−安定化試薬、例えば、グリセロールを含むことができる。幾つか用途の場合、例えば、核酸の場合、有機溶媒の例えばアセトニトリル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びホルムアミドを使用できる。
【０２６３】
溶液はまた、二価陽イオン、例えば、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、及びＭｎ2+；金属、例えば、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｆｅ；及びキレーターの例えばＥＤＴＡを含むことができる。
細胞、例えば、生細胞を使用する用途のための溶液は、様々な栄養素及び増殖因子を含むことができる。
【０２６４】
酵素を使用する用途または酵素の選択のための溶液は、酵素基質またはコファクター、例えば、ＮＡＤ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、デオキシヌクレオチド、及びリボヌクレオチドを含むことができる。
【０２６５】
用途
本明細書において説明する装置及び方法を様々な用途のために利用することができ、同様に任意の特定の適切な用途に適応させることができる。幾つかの模範的な方法を本明細書において説明する。こうしたものは、ディスプレイライブラリーをスクリーニングする、ディスプレイライブラリーを精製する、生体分子を単離する、細胞または細胞集団を単離する、磁気応答性粒子を修飾する、例えば、化学修飾する、及び触媒を単離することを含む。
【０２６６】
一般に、試料は、付着した標的分子を有する磁気応答性粒子と接触する。本明細書において説明する方法に従ってフローチャンバ中で粒子を洗浄する。次に、洗浄によって除去するかまたは保持する試料のフラクションを提供する。分析及びスクリーニング手順においては、フラクションを分析または処理する。例えば、溶離したタンパク質を質量分析によって分析することができる。溶離した細胞、核酸、及びディスプレイライブラリーメンバーを増幅することができる。準備手順の場合、考察の対象となっているフラクションは、下流用途で使用するのに十分な濃度及び／または十分な純度を有することができる。
【０２６７】
［試料］試料はしばしば複合体混合物であり、用途によって変化させることができる。試料の非限定例は、ディスプレイライブラリーのメンバー；細胞の集団、例えば、組織細胞、血液細胞、または微生物；タンパク質の集団、例えば、血清タンパク質、細胞抽出物、またはインビトロ合成タンパク質；核酸の集団、及び有機分子の集団（例えば、非ポリマー有機分子）を含む試料である。試料を、天然源または人工源、例えば、組換え若しくは合成源からから得ることができる。
【０２６８】
好適な具体例においては、試料は下記に説明するディスプレイライブラリーである。
別の好適な具体例においては、例えば、標的と接触する前に、試料の成分分子を検出可能な物質で標識する。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、生物発光材料、及び放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族の例は、ビオチンであり；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【０２６９】
１具体例においては、試料は均一であり、例えば、単一の種、または少数の種、例えば、２、３、または約１０の種の組合せである。このような試料を本明細書において説明する方法と組み合わせて使用して、例えば、種のうちの１つが、粒子と結合した標的に付着するか、または少数の種の場合には、標的の結合に関して１つの種が別のものと拮抗するかを決定できる。
【０２７０】
［標的］一般に、任意の分子種を標的として使用できる。幾つかの具体例においては、１を超える種が標的として使用され、例えば、試料を複数の標的にさらす。標的は小さな分子（例えば、小さな有機または無機分子）、ポリペプチド、核酸、細胞等とすることができる。
【０２７１】
１つのクラスの標的はポリペプチドを含む。このような標的の例としては、小さなペプチド（例えば、長さが約３〜３０個のアミノ酸）、単一のポリペプチド鎖、及び多量体ポリペプチド（例えば、タンパク質複合体）が挙げられる。
【０２７２】
ポリペプチド標的を修飾することができ、例えば、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、切断、ジスルフィド結合等である。好ましくは、ポリペプチドは特異的な立体配座、天然の状態または非天然の状態を有する。１具体例においては、ポリペプチドは１を超える特異的な立体配座を有する。例えば、プリオンは１を超える立体配座を取ることができる。例えば、天然立体配座を安定化するかまたは病的立体配座を識別するかまたは標的にする試剤を単離するために、天然または病的立体配座は望ましい標的であるとすることができる。
【０２７３】
しかしながら、場合によっては、ポリペプチドはは非構造化されており、例えば、ランダムコイル立体配座を取るかまたは単一の安定な立体配座を欠く。非構造化ポリペプチドと結合する試剤を使用して、ポリペプチドを識別し、これは例えば、ポリペプチドを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で変性する場合に、または例えば、準備精製プロセスにおいてポリペプチドの正しく折りたたんだアイソフォームに対して非構造化アイソフォームを分離するために行う。
【０２７４】
幾つかの模範的なポリペプチド標的は、細胞表面タンパク質（例えば、グリコシル化表面タンパク質またはヒポグリコシル化変異体）、癌関連タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、神経伝達物質、細胞表面受容体（例えば、細胞表面受容体キナーゼ、７膜貫通型受容体、ウイルス受容体及び共受容体、細胞外マトリックス結合タンパク質の例えばインテグリン、細胞−結合タンパク質（例えば、細胞接着分子または“ＣＡＭ”の例えばカドヘリン、セレクチン、Ｎ−ＣＡＭ、Ｅ−ＣＡＭ、Ｕ−ＣＡＭ、Ｉ−ＣＡＭ等）、または細胞表面タンパク質（例えば、哺乳類癌細胞または病原体）を含む。幾つかの具体例においては、ポリペプチドは、疾患、例えば、癌と関連する。
【０２７５】
標的ポリペプチドは好ましくは可溶である。例えば、タンパク質の可溶のドメインまたは断片を使用できる。この選択肢は、膜貫通型タンパク質の例えば細胞表面受容体及びレトロウイルス表面タンパク質と結合する分子を識別するために特に有用である。
【０２７６】
［標的としての細胞］別のクラスの標的は細胞、例えば、固定または生細胞を含む。細胞は、常磁性粒子に共有結合で付着するまたは間接的に付着する（例えば、別の抗体を経て）抗体と結合することができる。例えば、ビオチン化ウサギ抗−マウスＩｇ抗体はストレプタビジン常磁性ビーズと結合し、考察の対象となっている細胞表面タンパク質に特異的なマウス抗体はウサギ抗体と結合する。
【０２７７】
１具体例においては、細胞は組換え細胞、例えば、異種遺伝子を発現するまたは内因性遺伝子の発現を崩壊または変更する異種核酸を用いて形質転換される細胞である。別の具体例においては、細胞は、被験者、例えば、患者、例えば、癌患者から単離する初代培養細胞である。さらに別の具体例においては、細胞は、形質転換細胞、例えば、細胞増殖症、例えば、腫瘍性障害を有する哺乳類細胞である。さらに別の具体例においては、細胞は、病原体の細胞、例えば、微生物の例えば病原性細菌、病原性真菌、若しくは病原性原生生物（例えば、プラスモジウム属細胞）または多細胞病原体に由来する細胞である。
【０２７８】
細胞を、例えば、洗浄工程の特定の段階で処理することができる。処理は薬剤または異種プロモーター−被験者遺伝子構成体のインデューサーとすることができる。処理は、細胞挙動、形態等の変化を引き起こすことができる。処理によって細胞から解離する分子を集め、分析する。
【０２７９】
細胞の例としては、癌細胞、造血細胞、ＢａｌＩ細胞、初代培養細胞、悪性細胞、神経細胞、胚性細胞、胎盤細胞、及び非哺乳類細胞（例えば、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞）等が挙げられる。癌細胞は、例えば、細胞表面のマーカー、例えば、ＣＤ１９または細胞表面癌特異的抗原に特異的な抗体を使用して磁気応答性粒子に付着される。
【０２８０】
好適な具体例においては、細胞は組換え細胞である。細胞を、（例えば、誘導可能または構成プロモーターの制御下で）考察の対象となっている細胞−表面タンパク質を発現するプラスミドを用いて形質転換することができる。プラスミドはまた、例えば、形質転換細胞を磁気応答性粒子と結合させる際に使用するためのマーカータンパク質を発現することができる。別の具体例においては、細胞は細胞内タンパク質、例えば、癌遺伝子、転写因子、または細胞−シグナリングタンパク質を発現する。細胞内タンパク質は、細胞挙動または細胞表面の分子のレパトアを変更することができる。さらに別の具体例においては、細胞を処理して（例えば、薬剤または遺伝子変更を使用して）、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、エキソサイトーシス、及び／または細胞分泌の割合を変更する。
【０２８１】
［核酸標的］追加の模範的な標的は、核酸、例えば、二本鎖、一本鎖、及び部分二本鎖ＤＮＡの例えば調節領域における部位、コーディング領域における部位、三次構造の例えば、Ｇ−カルテット若しくはテロメア；ＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム；またはこれらの組合せを含む。例えば、部位を含む二本鎖核酸を使用して、部位と結合するＤＮＡ−結合ドメインを識別する。ＤＮＡ−結合領域を細胞中に使用して、機能し得るように部位に結合した遺伝子を調節できる。例えば、装置を使用して、標的部位に結合する多ドメインジンクフィンガータンパク質を識別できる。
【０２８２】
さらにより模範的な標的は有機分子を含む。１具体例においては、有機分子は遷移状態類似体であり、これを使用して、類似体の構造と同様の遷移状態構造を安定化する触媒に関して選択することができる。別の具体例においては、有機分子は、触媒反応の結果として触媒に共有結合で付着する自殺基質である。
【０２８３】
標的は薬剤とすることができ、これは例えば、例えば、化学反応、バイオリアクター、培地、乳、または細胞抽出物からの薬剤の精製を改良するためのリガンドを必要とする薬剤である。薬剤は、ペプチド、例えば、ポリペプチドまたは非ペプチド官能性を含むことができる。
【０２８４】
幾つかの模範的な標的は、細胞表面タンパク質（例えば、グリコシル化表面タンパク質またはヒポグリコシル化変異体）、癌関連タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、神経伝達物質、細胞表面受容体（例えば、細胞表面受容体キナーゼ、７膜貫通型受容体、ウイルス受容体及び共受容体、細胞外マトリックス結合タンパク質、細胞−結合タンパク質、病原体の抗原（例えば、細菌抗原、マラリア抗原等）を含む。
【０２８５】
より具体的な例は、インテグリン、細胞接着分子または“ＣＡＭＳ”の例えばカドヘリン、セレクション、Ｎ−ＣＡＭ、Ｅ−ＣＡＭ、Ｕ−ＣＡＭ、Ｉ−ＣＡＭ等；プロテアーゼ、例えば、ズブチリシン、トリプシン、キモトリプシン；プラスミノゲンアクチベータの例えばウロキナーゼまたはヒト組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；第ＩＸ因子、トロンビン；ＣＤ−４；ＣＤ−１９；ＣＤ２０；血小板由来増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉ及び−ＩＩ；神経成長因子；線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ、例えば、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；エリスロポエチン；トロンボポエチン；ムチン；ヒト血清アルブミン；成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）；プロインスリン、インスリンＡ−鎖、インスリンＢ−鎖；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；サイロキシン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；心房性ナトリウム利尿ペプチドＡ、ＢまたはＣ；リューティナイジングホルモン（leutinizing hormon）；グルカゴン；第ＶＩＩＩ因子；造血増殖因子；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β）；エンケファリナーゼ；ミュラー管抑制物質；ゴナドトロピン関連ペプチド；組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；ホルモンまたは増殖因子用受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；骨誘導因子（osteoinductive factor）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、β、γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン）（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４等；解離促進因子；免疫グロブリン（定常または可変ドメイン）；及び上記に列記したポリペプチドの任意のものの断片を含む。幾つかの具体例においては、標的は疾患、例えば、癌と関連する。
【０２８６】
他の標的は、例えば、実験室用に有用な分子を発生させるために、バイオテクノロジー用途に関連があるかもしれない。例えば、ストレプタビジン、グリーン蛍光タンパク質、または核酸ポリメラーゼを標的とすることができる。
【０２８７】
装置制御のためのシステム
１具体例においては、洗浄システム６００を、柔軟性及び最小のオペレータ“手動操作”時間（"hands-on" time）を可能にするように構成する。ここから図９の例を参照すると、システム６００は、装置４００、制御された流体ドライバ６０５、様々なセンサー、フラクションコレクター６１０、及び中央コントローラ６２０を含むことができる。この具体例においては、装置は、多数のキャピラリーフローチャンバを含む。
【０２８８】
中央コントローラ６２０は、回路またはプログラム可能な装置とすることができる。典型的にコントローラは、コンピュータの例えばＰＣランニング・ウインドウズ（登録商標）（PC running Windows(登録商標））、例えば、ウインドウズ１９９８（登録商標）（マイクロソフトＣｏｒｐ．、レドモンド、ＷＡ）（Windows（登録商標） 1998, (Microsoft Corp. , Redmond WA) ）オペレーティングシステムである。コンピュータをネットワーク化するかまたはシステムの他の構成要素に直接に接続する。コンピュータは、ビデオモニター、サウンドスピーカー、プリンター、及び情報を記憶するための装置（例えば内部ＲＡＭ、読取り−書込みＣＤ−Ｒｏｍ、フラッシュメモリ、またはデータベースサーバー）を含むことができるかまたはこれらに連結することができる。
【０２８９】
コンピュータは、例えば、３モードの動作を有するグラフィカルユーザーインターフェースを含むことができる。３モードは、プログラミングモード；ランタイムモード；及びデータ解析モードを含むことができる。
【０２９０】
［プログラミング−モード］磁気粒子の自動化洗浄を促進するために、コントローラ６２０は、コンソール上に表示されるグラフィカルユーザーインターフェースを使用して利用者と通信することができる。インターフェースは、洗浄方法のプログラミングを促進するアイコン及び他のツールを含むことができる。
【０２９１】
例えば、インターフェースは、利用者の便宜上、プリセット値、スライダーバー、及びポップアップ質問ウインドウを表示することができる。このような制御または他の質問を使用して、インターフェースは、装置中の制御すべきキャピラリーフローチャンバ；非特異的にまたは弱く結合した材料を洗浄するための及び溶離のための溶液の組成、体積、及び流量（またはこの勾配）；並びにフラクション収集のサイズ、頻度、及びタイミングに関する情報を得ることができる。インターフェースはまた、磁気ビーズ移送工程の頻度、継続時間、及び速度を決定するためのパラメータを得ることができる。模範的なパラメータを表２に列記する。
【０２９２】
【表２】
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【０２９３】
［ランタイムモード］ランタイムモードにおいては、コントローラ６２０は、事前プログラム式命令を送出して、流体ドライバ６０５を調節して、流体を指定の流量で指定のキャピラリーに送達するかまたは流体流れを停止させる。事前プログラム式命令は、プログラミングモードにおけるパラメータセットに基づくことができる。コントローラ６２０はまた、装置中の磁石１２０及び１２２の移動に連係する。上記に説明したように、液体が流れる間は磁石は移動しないが、流れを停止した時に移動する
コントローラ６２０は、インターフェースで連結されたセンサーからの１つ以上のパラメータを表示するコンソールを含むことができる。パラメータを、時間に対してグラフにすることができる。加えて、コントローラ６２０はパラメータを監視することができる。例えば、圧力が特定のレベルを超た場合、音響アラームが発生し、流れを停止する。別の例においては、流出液のＵＶ−吸光度が長時間十分に低い場合、コントローラ６２０は、プログラムモジュール、例えば、フローチャンバからの材料の溶離を指示するモジュールを起動することができる。
【０２９４】
コントローラ６２０もまた利用者命令に応答して、例えば、溶離モジュールを起動して、または特にフラクションコレクターを起動して、例えば、洗浄及び特定の溶離期の試料を集めることができる。
【０２９５】
［データ解析モード］コントローラはまた、前のランタイムの間中に記憶した情報にアクセスして、利用者が情報を分析するかまたはさもなければ情報にアクセスすることを可能にする。インターフェースは情報を利用者に、例えば、図形で表示するように設けられる。例えば、インターフェースは流出液ラインのＵＶ−吸光度のグラフを時間に対して表示することができる。インターフェースはまた、ランに関する基本情報、例えば、標的、磁気粒子、緩衝液の性質、及びプログラミングされた事象のシーケンスを表示することができる。インターフェースはまた、ランタイムデータに対する選択の後処理から発生した情報と連係して、例えば、利用者がランの成功を評価することを可能にすることができる。
【０２９６】
［コンピュータシステム］本明細書において説明するコントローラ６２０、その命令、及び他の命令セットを、プログラム可能な機械の例えば各々はプロセッサ、プロセッサによって可読な記媒媒体、及び１つ以上の出力装置を含む移動型または据置き型コンピュータ、並びに同様の装置上でプログラムとして実行してよい。各プログラムを、機械システムと通信するために高レベル手順向きまたはオブジェクト指向プログラミング言語で実現してよい。幾つかの単なる例示であるコンピュータ言語の例としては、Ｃ、ジャバ、及びビジュアルベーシックが挙げられる。各このようなプログラムを、プロセッサを構成及び動作させるための汎用または特殊プログラム可能な機械によって可読な媒体上で記憶してよい。
【０２９７】
コンピュータシステムを内部または外部ネットワークに接続することができる。例えば、コンピュータシステムは、例えば、ＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、またはＸＭＬプロトコルを使用して、離れて位置するクライアントシステムからの要求を受け入れることができる。要求は、予め定められたプログラムを指定するかまたは事象のシーケンスを詳述することができ、すなわち、カスタムプログラムである。
【０２９８】
［ロボット工学］本システムはロボット、例えば、ロボットアーム及び所望によるセンサーを有する装置を制御して、収集容器、例えば、溶離工程から得た多数の集めたフラクションを保持するマイクロタイタープレートを物理的に検索することができる。ロボットは、マイクロタイタープレートをデッキまたは搬送システムに移動することによって、コンピュータシステムからの信号に応答することができる。プレートを、後処理ステーションの例えばサーモサイクラー、インキュベーター、保管区域（例えば、プレートホテル）、または流体取り扱いシステムに指向することができる。様々な後処理操作を本明細書において説明する。
【０２９９】
ディスプレイライブラリー
ディスプレイライブラリーは実体のコレクションであり；各実体はポリペプチド成分に接近可能であり、ペプチド成分を符号付けするかまたは識別する回収可能な成分を含む。ポリペプチド成分は任意の長さとすることができ、例えば３個のアミノ酸から３００個を超えるアミノ酸である。
【０３００】
本明細書において説明する装置及び方法を使用して、標的と相互作用するディスプレイライブラリーのメンバーを識別することができる。
典型的に、キャピラリーフローチャンバ中に入れる前に、付着した標的を有する常磁性粒子を管中のディスプレイライブラリーのメンバーと混合する。管を、穏やかに、例えば、１℃〜４２℃の温度で管の所望の時間回転させることができる。任意に、粒子をキャピラリー中に入れる前に、管中の粒子を固定化することによって粒子を洗浄して、未結合ライブラリーメンバーの大部分を除去する。しかしながら、この工程もまた省略して、管中の溶液を吸引する表面張力効果による粒子の脱水またはタンパク質変性を防ぐことができる。
【０３０１】
内容物、または内容物のアリコートを、新たなキャピラリー中に入れることができ、これを次に装置、例えば、図４の装置に取り付ける。第１の磁場を適用して、常磁性粒子をフローチャンバ内部に固定化する。次に、液体を流体リザーバから送達するチュービングをキャピラリーに取り付ける。１具体例においては、チュービングをキャピラリーの底部に取り付けて、キャピラリーを通る流体流れを上向きに指向する。
【０３０２】
任意に、新しい緩衝液を人手でフローチャンバ中にピペットで分注して、チュービングの取り付けの前に未結合ディスプレイライブラリーメンバーをフラッシングすることができる。
【０３０３】
好ましくは、ディスプレイライブラリーのメンバーは、チュービングまたは取付け具と決して接触した状態にならない。このような接触を避ける構成は、所定のセッション内及びその後のセッション（例えば、別個の選択）の最中の汚染を低減する。ディスプレイライブラリーメンバーの選択は特に汚染を受けやすく、というのは、各選択ラウンドは、希望通り標的に結合しない汚染ライブラリーメンバーを増幅する増幅工程を含むを含み得るからである。ディスプレイライブラリーメンバーが、フローチャンバ中に至る供給ライン中で非特異的に接着する場合、このような非特異的ライブラリーメンバーは、考察の対象となっているフラクション中、例えば、溶離フラクションこ中に少しずつ流れることがある。
【０３０４】
典型的な選択プロセスにおいては、キャピラリーを、非特異的に及び弱く結合したライブラリーメンバーを除去する緩衝液を用いて洗浄する。洗浄プロセスは、上記に説明したような緩衝液流れ、停止、及び撹拌のサイクルを含む。キャピラリーの最上部から現れる緩衝液を流出液ラインによって指向して廃棄する。例えば、前の選択の間中ディスプレイライブラリーメンバーの流出液のフラクションをアッセイすることによって、または、例えば、ＵＶ−吸収材料または放射能（ライブラリーに放射能標識メンバーを加える場合）に関して流出液を能動的に監視することによって、非特異的に及び弱く結合したライブラリーメンバーを洗浄するために必要とする時間の長さを経験的に決定することができる。
【０３０５】
非特異的に及び弱く結合したメンバーを洗浄した後に、粒子を固定化し、流れを停止させ、例えば、溶離溶液を含む容器をキャピラリーフローチャンバの真下に置くことによって、溶離溶液をキャピラリーフローチャンバ中に直接に引く。粒子を撹拌する。次に、容器を除去し、収集管をフローチャンバの下に置く。流れを逆にして、溶離溶液及び任意の溶離したライブラリーメンバーを収集管中に送達する。
【０３０６】
フラクションコレクターまたは収集容器をキャピラリーの真下に置いて、溶離したライブラリーメンバーを集める。収集容器は、溶離の前に溶液を備えることができる。例えば、溶液は高濃度の衝剤を含んで、例えば酸溶離の場合に酸を中和する。別の例においては、溶液はグリセロールを含んで、溶離した材料を凍結保存の間中安定化する。
【０３０７】
一旦構成したら、溶離溶液はキャピラリーを通って流れる。本明細書において説明するように、溶離は、撹拌の頻繁で迅速なサイクルを含むことができる。様々な溶離方法を使用でき、これは、例えば、工程溶離、勾配溶離を含み、例えば、直線的に増大するpHまたはイオン強度を使用し、または“オフレート選択”して上記に説明した溶離方法を含む。
【０３０８】
溶離したライブラリーメンバーはキャラクタリゼーションまたは増幅することができる。例えば、溶離したメンバーをプールとしてフォーマットに関して適切に増幅することができ、別の選択プロセスに適用することができる。別の例においては、溶離したメンバーを個々に単離し、保管し、キャラクタリゼーション及び／または配列決定する。各個々のメンバーをキャラクタリゼーションして、そのポリペプチド成分の標的への結合親和性を評価する。
自動化高スループットＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ配列決定システムを使用して、溶離したプールの全てのメンバーを個々にキャラクタリゼーションできる。
【０３０９】
様々なフォーマットをディスプレイのために使用できる。以下のものは幾つかの例である。
［ファージディスプレイ］１フォーマットはウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットを“ファージディスプレイ”と呼ぶ。ペプチド成分は典型的にバクテリオファージコートタンパク質に共有結合で結合する。結合は、コートタンパク質に融合したペプチド成分を符号付けする核酸の翻訳から生じる、結合は、可撓性ペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンの抑制の結果として取り入れられたアミノ酸を含むことができる。ファージディスプレイは、例えば、Ladner et al., 米国特許第5,223,409号; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; WO 00/70023; WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 ; WO 90/02809 ; WO 00/70023; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982において説明されている。
【０３１０】
“バクテリオファージライブラリーメンバー”及び“ファージ”という用語は、両方のタイプのライブラリーのメンバーを包含する。“バクテリオファージ粒子”という用語は、核酸をパッケージングするバクテリオファージコートタンパク質で形成された粒子を指す。パッケージングされた核酸は修飾バクテリオファージゲノム、またはファージミドとすることができ、例えば、バクテリオファージ複製起点を含むが不可欠のファージ遺伝子を欠き、“ヘルパーファージ”の助け無しにまたはトランスで供給されるファージ遺伝子無しには大腸菌中で増殖できない核酸である。
【０３１１】
ファージディスプレイシステムは、線維状ファージ（ファージｆｌ、ｆｄ、及びＭ１３）並びに他のバクテリオファージのために開発された（例えばＴ７バクテリオファージ及びラムドイドファージ；例えば、Santini (1998) J. Mol. Biol. 282: 125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6: 1-6; Houshmand et al. (1999) Anal Biochem 268:363-370を参照されたい）。線維状ファージディスプレイシステムは典型的に、マイナーコートタンパク質の例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質、及び遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、メジャーコートタンパク質への融合を使用するが、他のコートタンパク質の例えば遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質、またはこれらのドメインへの融合もまた使用することができる（例えば、WO 00/71694を参照されたい。）。好適な具体例においては、融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えば、アンカードメインまたは“スタンプ（stump）”である。
【０３１２】
ペプチド成分の原子価もまた制御することができる。ペプチドを成分を符号付けする配列を完全なファージゲノムにクローニングすることは、多変異体ディスプレイをもたらし、というのは遺伝子ＩＩＩタンパク質の全ての複製をペプチド成分に融合するからである。低減した原子価の場合、ファージミドシステムを利用することができる。このシステムにおいては、遺伝子ＩＩＩに融合したペプチド成分を符号付けする核酸は、プラスミド表面に、典型的に長さ７００ヌクレオチド未満で得られる。プラスミドを帯びる細菌細胞がヘルパーファージ、例えばＭ１３Ｋ０１に感染した場合に、プラスミドがバクテリオファージ粒子中に取り入れられるように、プラスミドはファージ複製起点を含む。ヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩ並びにファージ複製及び組立にとって必要な他のファージ遺伝子の完全なコピーを提供する。ヘルパーファージゲノムが、野性型起点を有するプラスミドと比較してファージ粒子中に効果的に取り入れられないように、ヘルパーファージは欠陥のある起点を有する。
【０３１３】
標準的なファージ作製方法、例えば殖培地からのＰＥＧ沈殿を使用して、ペプチド成分をディスプレイするバクテリオファージを増殖し、集めることができる。
個々のディスプレイファージの選択の後に、選択されたペプチド成分を符号付けする核酸を、選択されたファージを使用して細胞に感染させる。個々のコロニーまたはプラークを、選び、核酸を単離し、配列決定することができる。
【０３１４】
［ペプチド−核酸融合物］別のフォーマットはペプチド−核酸融合物を利用する。ポリペプチド−核酸融合物を、共有結合で付着したピューロマイシン群を含むｍＲＮＡのインビトロ翻訳によって発生させ、例えば、Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302、及び米国特許第6,207,446号において説明されている。ｍＲＮＡを次にＤＮＡ中に逆転写し、ポリペプチドに架橋する。
【０３１５】
［細胞に基づくディスプレイ］さらに別のフォーマットにおいては、ライブラリーは細胞−ディスプレイライブラリーである。タンパク質は細胞、例えば、真核細胞または原核細胞の表面にディスプレイされる。模範的な原核細胞としては大腸菌細胞、枯草菌細胞、胞子（例えば、Lu et al. (1995) Biotechnology 13: 366)を参照されたい。）が挙げられる。模範的な真核細胞としては、酵母（例えば、出芽酵母、シゾサッカロミセス＝ポンベ、ハンセウラ（Hanseula）、またピチアパストリス（Pichia pastors））が挙げられる。酵母表面ディスプレイは、例えば、Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557及び２００１年１０月１日に出願された米国仮特許出願第60/326,320号において説明されている。
【０３１６】
１具体例においては、多彩性核酸配列を、酵母ディスプレイのためにベクター中にクローニングする。クローニングは、ドメイン（または完全な）酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ａｇａ２、Ａｇａ１、Ｆｌｏ１、またはＧａｓ１を多彩な配列と結合する。こうしたタンパク質のドメインは、膜貫通型ドメイン（例えば、Ｆｌｏ１）によってまたはリン脂質二重層への共有結合（例えば、Ｇａｓ１）によって、多彩な核酸配列によって符号付けされるポリペプチドを固定することができる。鎖のうちの１つは酵母細胞表面タンパク質に結合するように、ベクターを構成して、２つのポリペプチド鎖を細胞表面に発現することができる。例えば、２つの鎖は免疫グロブリン鎖とすることができる。
【０３１７】
［リボソームディスプレイ］ＲＮＡ及びＲＮＡによって符号付けされるポリペプチドは、ＲＮＡを翻訳するリボソームを安定化することによって物理的に会合することができ、初期のポリペプチドは依然として付着している。典型的に、高二価Ｍｇ2+濃度及び低温を使用する。例えば、Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30. and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1-2):119-35を参照されたい。
【０３１８】
［他のディスプレイフォーマット］さらに別のディスプレイフォーマットは、ポリペプチド成分がポリペプチドを識別する非核酸タグに付着するような非生物学的ディスプレイである。例えば、タグは、ポリペプチドまたは無線周波数タグをディスプレイするビーズに付着する化学的タグとすることができる（例えば、米国特許第5,874,214号を参照されたい）。
【０３１９】
［スカフォールド］ディスプレイのためのスカフォールドは、抗体（例えば、Ｆａｂ断片、単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体、キャメリド（camelid）抗体、及びキャメライズド（camelized）抗体）；Ｔ−細胞受容体；ＭＨＣタンパク質；細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンタイプＩＩＩ反復、ＥＧＦ反復）；プロテアーゼインヒビター（例えば、クニッツドメイン（Kunitz domain）、エコチン（ecotin）、ＢＰＴＩ等）；ＴＰＲ反復；トリフォイル（trifoil）構造；ジンクフィンガードメイン；ＤＮＡ−結合タンパク質；特に単量体ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、プロテアーゼ（特に失活プロテアーゼ）、ＲＮアーゼ；シャペロン、例えば、チオレドキシン、及び熱ショックタンパク質を含むことができる。
【０３２０】
スカフォールディングドメインを評価するための適切な判定基準は、（１）アミノ酸配列、（２）幾つかの相同ドメインの配列、（３）三次元構造、及び／または（４）pH、温度、塩分、有機溶媒、酸化剤濃度のある範囲にわたる安定性データを含むことができる。１具体例においては、スカフォールディングドメインは小さく安定なタンパク質ドメインであり、例えば、１００、７０、５０、４０または３０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。ドメインは、１つ以上のジスルフィド結合またはキレートをつくる金属、例えば、亜鉛を含んでよい。
【０３２１】
小さなスカフォールディングドメインの例としては、クニッツドメイン（５８個のアミノ酸、３個のジスルフィド結合）、ククルビダマキシマ（Cucurbida maxima）トリプシンインヒビタードメイン（３１個のアミノ酸、３個のジスルフィド結合）、グアニリンに関連するドメイン（１４個のアミノ酸、２個のジスルフィド結合）、グラム陰性菌から得られる耐熱性エンテロトキシンＩＡに関連するドメイン（１８個のアミノ酸、３個のジスルフィド結合）、ＥＧＦドメイン（５０個のアミノ酸、３個のジスルフィド結合）、クリングルドメイン（６０個のアミノ酸、３個のジスルフィド結合）、真菌炭水化物−結合領域（３５個のアミノ酸、２個のジスルフィド結合）、エンドセリンドメイン（１８個のアミノ酸、２個のジスルフィド結合）、連鎖球菌ＧＩｇＧ−結合領域（３５個のアミノ酸、ジスルフィド結合無し）及び小さな細胞内シグナリングドメインの例えばＳＨ２、ＳＨ３、及びＥＶＨドメインが挙げられる。一般に、任意のモジュラードメイン（細胞内または細胞外）を使用できる。
【０３２２】
別の有用なタイプのスカフォールディングドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＩｇスーパーファミリードメインである。Ｉｇドメインは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインから得られるドメインを指す。Ｉｇスーパーファミリードメインは、Ｉｇドメインに関連する三次元構造を有するドメインを指すが非免疫グロブリン分子から得られる。Ｉｇドメイン及びＩｇスーパーファミリードメインは典型的に、約７のβ−鎖で形成される２つのβ−シート及び保存された（conserved）ジスルフィド結合を含む（例えば、Williams and Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6: 381-405を参照されたい。）。Ｉｇスーパーファミリードメインのドメインを含むタンパク質は、ＣＤ４、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）を含む。
【０３２３】
Ｉｇスカフォールドの好適な具体例は、抗体、特に抗体の抗原結合性フラグメントである。本明細書において使用する“抗体”という用語は、免疫グロブリン分子またはその抗原結合性部分を指す。典型的な抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨとして略号で示す）、及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬとして略号で示す）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、“相補性決定領域”（“ＣＤＲ”）と呼ぶ超可変性の領域に細分され、これには、より保存された“枠組み構造領域”（ＦＲ）と呼ぶ領域が点在している。枠組み構造領域及びＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, and Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917を参照されたい。）。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、これは以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列する：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０３２４】
抗体はまた、軽または重鎖の一部分として定常領域を含むことができる。軽鎖は、カッパまたはラムダ定常領域遺伝子をＣＯＯＨ−末端で含むことができる。重鎖は、例えば、ガンマ定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；約３３０個のアミノ酸を符号付けする）を含むことができる。
【０３２５】
本明細書において使用する抗体の“抗原結合性フラグメント”という用語は（または簡単に“抗体部分、”または“断片”）は、標的と特異的に結合する能力を保持する完全な長さの抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合性フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィドブリッジによって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）2断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546）；及び（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その上、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコーディングされるが、これらは、ＶＬ及びＶＨ領域対が一価の分子を形成する単一タンパク質鎖になることをを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用して結合することができる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として周知である；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. SCI. USA 85: 5879-5883を参照されたい。）。このような単一鎖抗体もまた、抗体の“抗原結合性フラグメント”という用語内に包含することができる。
【０３２６】
ディスプレイ技術は、自己抗原、例えば、生物の免疫系によって自己として認識するタンパク質と結合する抗体を生産するために特に有用である。ヒト自己抗原を認識するヒト抗体を治療薬として使用できる。抗体の定常及び枠組み構造領域はヒトなので、このような治療抗体は、自己が抗原として認識され標的になることを避けることができる。さらに、ヒト免疫系のエフェクター機能を回復するように定常領域を最適化する。
【０３２７】
抗体治療薬を、例えば、毒素、例えば、ポリペプチド毒素（例えば、リシンまたはジフテリア毒素またはその活性な断片）、放射性原子核、またはイメージング剤（例えば放射性の、酵素の、またはＮＭＲコントラスト剤）に付着するように修飾することができる。
【０３２８】
ディスプレイ技術もまた使用して、リガンド、例えば、抗体リガンド、標的の特定のエピトープを得ることができる。これは、例えば、特定のエピトープを欠くかまたは例えばアラニンを用いてエピトープ内部に突然変異を起こした拮抗非標的分子を使用することによって行うことができる。このような非標的分子を、ディスプレイライブラリーが標的と結合する場合に拮抗分子として、または、例えば、標的に特異的ではないディスプレイライブラリーメンバーを解離する洗浄溶液中で捕獲するために予備溶離試剤として、下記に説明するように負の選択手順において使用できる。
【０３２９】
［反復選択］１好適な具体例においては、ディスプレイライブラリー技術を反復モードにおいて使用する。第１のディスプレイライブラリーを使用して、標的のための１つ以上のリガンドを識別する。こうした識別されたリガンドを次に突然変異させて、第２のディスプレイライブラリーを形成する。より高親和性のリガンドを次に、例えば、より高い厳しさまたはより拮抗する結合及び洗浄条件を使用することによって第２のライブラリーから選択する。
【０３３０】
多数の技術を使用して、識別されたリガンドを突然変異させることができる。こうした技術は：誤りがちなＰＣＲ（Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15）、組換え、ランダム切断を使用したＤＮＡシャッフル（(Stemmer (1994) Nature 389- 391）、ラチットＴTM（RACHITTTM）（Coco et al. (2001) Nature Biotech. 19: 354)）、部位指定突然変異誘発（Zooler et al. (1987) Nucl Acids Res 10 : 6487-6504）、カセット式変異誘発（Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208: 564-586）及び変性オリゴヌクレオチドの取り入れ（Griffiths et al. (1994) EMBO J 13 : 3245）を含む。
【０３３１】
例えば、識別されたリガンドが抗体である場合、突然変異誘発を、重または軽鎖のＣＤＲ領域に指定することができる。さらに、突然変異誘発を、ＣＤＲの近くまたは隣接する枠組み構造領域に指定することができる。同様に、識別されたリガンドが酵素である場合、突然変異誘発を、活性部位の近傍に指定することができる。
【０３３２】
核酸アプタマー
核酸配列のランダムプール（ＤＮＡ及びＲＮＡの両方）を人工リガンド及び触媒の豊富な源として使用できる（例えば、Ellington and Szostak (1990) Nature 346: 818 ; and (1992) Nature 355: 850; and Tuerk and Gold ( (1990) Science 249: 505 and (1991) J. Mol. Biol. 222: 739；米国特許第5,910,408号を参照されたい。）。このような人工核酸をアプタマーと呼ぶ。一般に、合成オリゴヌクレオチドを使用して、ランダム核酸配列のプールを組立てる。配列は、プライマー結合部位として役立つことができる定常領域またはタグを含むことができる。プールを、付着した標的分子を有する磁気粒子にさらす。標的は、所定のリガンドまたは遷移状態類似体とすることができる。標的に結合するプール中の核酸を本明細書において説明する本方法及び装置を使用して選択する。溶離した核酸を増幅する。増幅の後に、溶離した核酸を選択のその後のラウンドにおいて使用できまたはキャラクタリゼーションできる。
【０３３３】
触媒核酸を発生させるために、標的は、遷移状態類似体または自殺基質、例えば、潜在的な触媒と反応し、触媒反応の結果として共有結合で付着する基質とすることができる。
【０３３４】
負の選択
試料はまず非標的分子、例えば、標的に関連するがしかもなお別個である分子と接触することができる。例えば、ポリペプチド及び核酸の場合には、非標的及び標的分子は少なくとも３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、または９５％互いに同一とすることができる。非標的及び標的分子は同一とすることができるが、異なる立体配座または修飾（例えば、ポリペプチドの場合の翻訳後修飾；核酸の場合のメチル化または塩基付加物）を有することができる。１例においては、標的は少なくとも２つのポリペプチドの複合体であり（複合体を特異的に認識する抗体の例としては、Brekken et al. (2001) J Control Release. 74: 173-81を参照されたい。）、非標的は複合体状態にある成分ポリペプチドである。非標的に結合しない試料のメンバーを集めることができ、標的分子と結合させるためにその後の選択のためにまたはその後の負の選択のためにさえも使用する。この手順は、非標的ではなく標的と結合するメンバーの識別に対処する。
【０３３５】
１具体例においては、非標的は定常領域、例えば、ペプチドタグ、精製ハンドル、また、標的分子の選択の間中存在する付着部分である。
負の選択方法は有用であり、例えば、標的との結合の選択の前にディスプレイライブラリーを修飾する。
【０３３６】
磁気ビーズを使用した細胞の単離
本明細書において説明する装置を使用して、細胞、例えば、特異的な細胞タイプを単離するか、または特異的な細胞を試料から枯渇させることができる。単離手順を、準備または分析のために使用できる（例えば、診断学）。例えば、単離することができる細胞の非限定例としては、胎児有核細胞、幹細胞、腫瘍細胞、リンパ系細胞、及び細胞に基づくディスプレイライブラリー細胞が挙げられる。
【０３３７】
単核細胞の例えばＴ細胞、単球、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を、全血、骨髄、及びバッフィコートから単離することができる。バッフィコートは、抗凝血血液の遠心分離の後に赤血球と血漿との間の形成される白血球の層である。特異的な抗体を、例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇをブリッジング実体として使用して、磁気応答性粒子に付着する。例えば、粒子をフローチャンバ中に配置する前にまたはの後に、粒子を細胞の混合物と結合する。フローチャンバ中の粒子の撹拌が特に穏やかで、例えば、剪断力を最小にするように、方法をまた修正することができる。
【０３３８】
常磁性粒子表面の細胞を単離するために有用な抗体は、例えば、抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ５及び抗−ＣＤ８（細胞傷害性Ｔリンパ球に特異的）、抗−ＣＤ１２、抗−ＣＤ１９及び抗−ＣＤ２０（Ｂ細胞に特異的）；抗−ＣＤ１４（単球に特異的）；抗−ＣＤ１６及び抗−ＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞に特異的）；抗−ＣＤ４１（血小板用）；抗−ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）；抗−ＣＤ３４（造血前駆細胞用）を含む。腫瘍細胞を特異的に認識をする抗体を使用して、このような細胞を単離することができる。このような抗体は、ヒポグリコシル化ＭＵＣ１（例えば、de Haard et al. (1999) J Biol Chem. 274: 18218-30を参照されたい。）、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、及びＥｐＣＡＭを認識する抗体を含む。
【０３３９】
抗体以外の結合剤もまた使用して、細胞を単離することができる。このような結合剤の例としては、レクチン（例えば、リシン、小麦胚凝集素、及び大豆凝集素）、増殖因子、サイトカイン、及び細胞外マトリックス分子が挙げられる。
【０３４０】
単離した細胞を培養及び／または分析することができる。例えば、ｍＲＮＡを、単離した細胞から集め、次に核酸マイクロアレイを使用してプロフィルすることができ、例えば、Golub et al. (1999) Science 286: 531-537において説明されている通りである。プロフィルからの情報を使用して、例えば、参照プロフィルと比較して細胞中の調節が変更されている遺伝子を識別する、障害を診断する、または細胞を分類することができる。別の例においては、単離した細胞を、例えば、特異的な抗体を使用して標識し、次に蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用してプロフィルする。さらに別の例においては、例えば、タンパク質試料をキャラクタリゼーションできるプローブのアレイを使用するかまたは質量分析（下記を参照されたい）を使用して、タンパク質を細胞からまたはそのフラクションから抽出し、分析する。
【０３４１】
好適な具体例においては、単離した細胞をディスプレイライブラリーと接触させて、例えば、細胞に特異的な高親和性リガンドを符号付けするメンバーを識別する。
処理及び分析
フローチャンバから、例えば、溶離工程の最中にチャンバから出る溶液から得たフラクションを、任意の適切な方法を使用して処理するかまたは分析することができる。溶離したフラクションに関連して幾つかの模範的な方法を下記に説明する。しかしながら、これらは、任意の材料、例えば、対照試料及び非特異的に及び弱く結合した分子を除去するための洗浄から集めたフラクションに適用できる。
【０３４２】
好適な具体例においては、フラクションを自動または半自動でフローチャンバから得、処理する。例えば、ロボットアーム、マイクロタイタープレートホールダー、デッキ、及び自動式の流体ハンドラを、溶離したフラクションを自動的に処理するシステムとして構成することができる。処理に関連する事象を、例えば、コンピュータシステムを使用して追跡することができる。試料プロセッサ及び他の装置、例えば、蛍光光度計、質量分析計、ＤＮＡシークエンサー、サーマルサイクラー、及びＢＩＡコアを粒子洗浄装置と“インライン”で配設することができる。
【０３４３】
［増幅］溶離した核酸及び細胞を増幅することができる。例えば、溶離した細胞を培養及び増殖することができる。細胞を個々のコロニーとして増殖することができる場合、増殖の後に、個々のコロニーを選び、指標付きマイクロタイタープレートの穴中に堆積させる。各個々のクローンを次にキャラクタリゼーションすることができる。
【０３４４】
任意の適切な核酸増幅技術によって核酸を増幅することができる。幾つかの模範的な核酸増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Saiki, et al. (1985) Science 230,1350-1354）；転写に基づく方法（例えば、米国特許第6,066,457号；米国特許第6,132,997号；米国特許第5,716,785号；Sarkar et al., Science (1989) 244: 331-34; Stofler et al., Science (1988) 239: 491を参照されたい。）；ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第5,130,238号、同第5,409,818号、及び同第5,554,517号を参照されたい。）；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；例えば、米国特許第5,854,033号、及び同第6,143,495号を参照されたい。）及び鎖移送増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ；例えば、米国特許第5,455,166号、及び同第5,624,825号を参照されたい。）を含む。
【０３４５】
増幅した核酸を、例えば、発現ベクターまたは一般的なクローニングベクター中にクローニングさせることができる。増幅した核酸を、例えば、高スループット配列決定装置を使用してまた配列決定することができる。さらに、例えば、選択された核酸アプタマーに関して説明したように、増幅した核酸を、追加のラウンドの選択のための試料として使用できる。
【０３４６】
［ＭＳ（質量分析）］溶離したフラクション中の分子を質量分析によって、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス介助レーザーデソープションイオン化飛行時間型）またはエレクトロスプレーＭＳによって分析することができる。例えば、溶離したフラクションを、特異的アミノ酸または部位を認識するプロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、及びパパインを使用して完全に消化することができる。タンパク質加水分解試料をマトリックス及び溶媒と組み合わせ、ＭＳプレート上で乾燥する。プレートを次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計中に挿入し、プレート表面の特定のスポットを励起して、試料をイオン化する（例えば、米国特許第6,281,493号を参照されたい。）。イオンが検出器に移動するのに要する時間を測定することによって、イオンはその質量−電荷比に従って分離する。測定は、分析したフラクション中の各タンパク質分解断片につき分子量を非常に正確に決定する。コンピュータシステムを使用して、試料中に存在することがあり得るアミノ酸配列のデータベースにアクセスすることができ、分析したフラクション中のポリペプチドのアイデンティティーをしばしば推定することができる。さらに、翻訳後修飾もまた識別することができる。
【０３４７】
［タンパク質アレイ］分析するべきフラクション中の核酸またはポリペプチドはポリペプチドアレイと接触することができる。ポリペプチドアレイを製造する方法は従来技術において、例えば、De Wildt et al. (2000) Nature Biotech. 18: 989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270: 103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII ; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289: 1760-1763；及びWO 99/51773 A1において説明されている。フラクションを標識し、次にアレイと接触させて、フラクションが結合するアレイのアドレスを識別することができる。例えば、アレイは抗体のアレイとすることができ、例えば、上記のDe Wildtにおいて説明されている。アレイの各アドレスで結合する程度に関する情報をプロフィルとして記憶することができる。プロフィルを、例えば、クラスター分析によって分析して、多数のフラクション全体のアレイのアドレスを比較するかまたはフラクションをキャラクタリゼーションできる。
【０３４８】
［核酸アレイ］例えば、核酸アレイを使用してフラクションを分析して、フラクション中に存在する核酸を識別することができる。例えば、フラクションは細胞を含むことができ、核酸アレイを使用して、フラクション中の細胞によって発現する遺伝子を識別することができる。別の例においては、フラクションはｃＤＮＡのディスプレイライブラリーのメンバーを含む。アレイは、多数のｃＤＮＡのためのプローブを有するアドレスを含むことができ、ハイブリダイゼーション後に、ライブラリーによってディスプレイされるどのｃＤＮＡがフラクション中に存在するか示すことができる。
【０３４９】
核酸アレイを、様々な方法によって、例えば、フォトリソグラフィ方法（例えば、米国特許第5,143,854号、同第5,510,270号、及び同第5,527,681号を参照されたい。）、機械的方法（例えば、米国特許第5,384,261号において説明されている指向性流れ方法）、ピンに基づく方法（例えば、米国特許第5,288,514号）、及びビーズに基づく技術（例えば、PCT US/93/04145において説明されている）によって構成することができる。
【０３５０】
［インビトロ機能アッセイ］溶離したフラクション中の分子を、機能活性、例えば、インビトロ活性に関してさらにキャラクタリゼーションすることができる。１模範的なインビトロアッセイは化学反応の触媒作用に関するアッセイである。反応の基質を分子の存在下で及び無い状態で供給し、生成物形成を測定する。測定は、アッセイにおける触媒活性を反映する。アッセイにおける触媒剤は分子自体または所定の酵素とすることができる。触媒剤が所定の酵素である場合、分子の存在は酵素の触媒効率を向上するかまたは阻害し得、例えば、分子は酵素の活性化剤または阻害剤である。
【０３５１】
溶離したフラクション中の分子をまた、機能活性、例えば、培養（またはインビボまたはエクスビボ）中の細胞分化または細胞増殖に影響する能力に関してキャラクタリゼーションすることができる。分化及び増殖に関する多数の細胞培養アッセイは従来技術において周知である。幾つかの例は次の通りである。
【０３５２】
胚性幹細胞分化に関するアッセイ（胚性分化造血に影響を与えるタンパク質を特に識別する）は、例えば、Johansson et al. (1995) Cellular Biology 15: 141-151 ; Keller et al.(1993) Molecular and Cellular Biology 13: 473-486; McClanahan et al. (1993) Blood 81: 2903-2915において説明されていることを含む。
【０３５３】
リンパ球寿命／アポトーシスに関するアッセイ（超抗原誘導の後にアポトーシスを防ぐタンパク質及びリンパ球恒常性を調節するタンパク質を特に識別する）は、例えば、Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808,1992 ; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670,1993 ; Gorczyca et al. , Cancer Research 53: 1945-1951,1993 ; Itoh et al., Cell 66: 233 243,1991 ; Zacharchuk, Journal of  Immunology 145: 4037 4045,1990 ; Zamai et al. , Cytometry 14: 891-897,1993 ; Gorczyca et al., International Journal of  Oncology 1: 639-648,1992において説明されていることを含む。
【０３５４】
Ｔ−細胞依託及び開発の初期の段階に影響を与えたタンパク質に関するアッセイは、限定するものではなく、Antica et al., Blood 84: 111-117,1994 ; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111-122,1994 ; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al. , Proc. Nat. Acad. SCI. USA 88: 7548-7551,1991において説明されていることを含む。
【０３５５】
［ＥＬＩＳＡ］溶離した分子の標的に対する結合相互作用をＥＬＩＳＡアッセイを使用して分析することができる。例えば、分子は、底面が標的、例えば限定された量の標的でコーティングされたマイクロタイタープレートと接触する。分子はプレートと接触する。プレートを緩衝液を用いて洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。次にプレートと結合した分子の量を、分子に特異的な抗体を用いてプレートを調べることで決定する。抗体を酵素の例えばアルカリホスファターゼに結合して、適切な基質を提供すると、比色用生成物を与える。ディスプレイライブラリーメンバーの場合には、抗体は、全てのディスプレイライブラリーメンバーの中で一定の領域を認識することができ、例えば、ファージディスプレイライブラリーメンバーの場合、メジャーファージコートタンパク質である。
【０３５６】
［均一アッセイ］フラクション中で分子が識別された後に、標的とのその結合相互作用を均一アッセイを使用して分析することができる、すなわち、アッセイの全ての成分を加えた後には、追加の流体操作を必要としない。例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）を均一アッセイとして使用できる（例えば、 Lakowicz et al.、米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulos, et al.、米国特許第4,868,103号を参照されたい。）。第２の分子が第１の分子に接近している場合、第２の分子表面の蛍光標識（例えば、標的）によってその放出された蛍光エネルギーを吸収することができるように、第１の分子表面の発蛍光団標識（例えば、フラクション中で識別された分子）を選択する。第２の分子表面の蛍光標識、移動したエネルギーを吸収する場合は蛍光を発する。標識間のエネルギー移動の効率は、分子を分離する距離に関連するので、分子間の空間的関係を評価することができる。結合が分子間で起きるような状況では、アッセイにおける“アクセプター”分子標識の蛍光放出は最大となるはずである。ＦＥＴ結合事象を、従来技術において周知の標準的な蛍光検出手段によって（例えば、蛍光光度計を使用して）便利に測定することができる。第１または第２の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作成して、平衡結合定数を推定することができる。
【０３５７】
［表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）］フラクション中で分子が識別された後に、標的とのその結合相互作用をＳＰＲを使用して分析することができる。例えば、試料中に存在するディスプレイライブラリーメンバーの配列決定し、例えば、ＥＬＩＳＡによって任意に実証した後に、ディスプレイポリペプチドを多量に生産し、標的への結合に関してＳＰＲを使用してアッセイすることができる。ＳＰＲまたはリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、生体特異的な相互作用を、相互作用体（nteractant）ののいずれにも標識せずにリアルタイムで検出する（例えば、ＢＩＡコア）。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象を示す）は、表面近くの光の屈折率の変更をもたらす（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は検出可能な信号発生させる、生物学的分子間の、リアルタイム反応を示すものとして測定される。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、ｉ米国特許第5,641,640号；Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chez. 63: 2338-2345 ; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705 and http ://www. biacore. com/において説明されている。
【０３５８】
ＳＰＲからの情報を使用して、生体分子の標的との結合に関するＫon及びＫoffを含む平衡解離定数（Ｋd）及び速度論的パラメーターの正確で定量的な測定を提供できる。このようなデータを使用して、様々な生体分子を比較する。例えば、ディスプレイライブラリーから選択されるタンパク質を比較wして、標的に対する高親和性を有するまたは小さなＫoffを有する個人を識別することができる。この情報をまた使用して、生体分子が関連する場合、構造−活性相関（ＳＡＲ）を開発することができる。例えば、タンパク質が全て、単一の親抗体または１組の既知の親抗体の突然変異した変異体である場合、所定の位置での変異体アミノ酸を、特定の結合パラメータ、例えば、高親和性及び小さなＫoffと相関すると識別することができる。
【０３５９】
結合親和性を測定する追加の方法は蛍光偏向（ＦＰ）（例えば、米国特許第5,800,989号を参照されたい。）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び結合滴定（例えば、蛍光エネルギー移動を使用して）を含む。
【０３６０】
［保管］フローチャンバから現れるフラクションを、例えば、４℃、−２０℃、及び−８０℃で貯蔵することができる。フラクションを凍結する予定である場合、フラクションは、凍結保護物質、例えば、ポリオールの例えばグリセロールまたはソルビトール、スクロース、またはＤＭＳＯを含むことができる。フラクションが凍結乾燥に対して安定な場合、フラクションを凍結し、真空下で空気乾燥することができる。
【０３６１】
細胞増殖及び選択のための発酵槽
発酵槽は、生物の増殖を支持するように構成された容器である。
図１０をの例を参照すると、細胞増殖及び選択のためのフローチャンバ７００が表されている。フローチャンバは、細胞増殖のための培地及び洗浄溶液を流すための入口７２０、及び培地の処分のため及び考察の対象となっている試料を例えば溶離から集めるための出口７３０を含む。もちろん、別の具体例においては、ポート７３０は入口、及びポート７２０は出口とすることができる。フローチャンバ７００は、シース７６０のための開口部７５０を含む。磁場インデューサー７１０をフローチャンバ中に挿入して、シース７６０を囲繞する帯域中で磁気応答性粒子を捕獲することができる。
【０３６２】
フローチャンバ７００はさらに、例えば、回転して増殖培地及び洗浄溶液をチャンバを通して循環させるスターラー（図示せず；好ましくは非磁性）を含む。磁場インデューサー７１０を除去する時に、スターラーを使用して、磁気応答性粒子を撹拌する。
【０３６３】
フローチャンバ７００はまた、酸素添加システム、温度コントローラ、及びグルコース、pH及びＣＯ2監視装置（図示せず）を含むことができる。
フローチャンバを使用して、細胞−ディスプレイライブラリーのメンバーを選択することができる。例えば、免疫グロブリン分子をディスプレイする酵母細胞ディスプレイライブラリーを、標的化合物を含む磁気応答性粒子とフローチャンバ中で混合する。磁場インデューサー７１０をシース７６０中に挿入して、粒子を捕獲する。ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）または別の洗浄溶液をチャンバを通してフラッシングする。流れを停止させ、磁場を放出して、粒子を撹拌する。次に磁場を適用する。多数のサイクルの間この洗方法を繰り返すことができる。
【０３６４】
洗浄の後に、培地、例えば、ＹＥＰＤまたは最小培地を、細胞が増殖し、繁殖することを可能にする条件下でチャンバを通して流すことができる。所望の数の細胞分裂が起きるのに十分な間隔の後に、洗浄方法を、例えば、より厳しい洗浄溶液を用いて繰り返すことができる。
【０３６５】
本システムは、細胞の繰り返し洗浄及び増殖を必要に応じて含むことができる。細胞増殖及び繁殖のためのフローチャンバの使用は、磁気応答性粒子と結合する細胞の即時型増幅に対処し、多数の選択サイクルにとって必要な外部操作の幾つかを不要にすることができる。この結果、細胞は、磁気応答性粒子に付着する標的の存在下で増幅する。同様に、標的化合物の存在下で複製可能な実体を増幅することができるように、他の複製可能な実体をフローチャンバ中（または本明細書における任意のフローチャンバ）で増殖することができる。例えば、宿主細胞（ファージミドの場合にはヘルパーファージ）を加えることによって、バーストが形成されるのに十分な時間、ファージディスプレイライブラリーメンバーを増幅することができる。
【０３６６】
フローチャンバから現れる溶液のフラクション（例えば、培地または洗浄溶液）を集めることができる。特に、フラクションは、任意の洗浄工程のの最中、及び最も厳しい洗浄工程、すなわち、溶離工程の最中に採取するいことができる。フラクションを、例えば、寒天プレートの上に酵母培地を用いて平板培養して、フラクション中に存在する個々の細胞からコロニーを形成することができる。フラクションをまた液体培地中で希釈して、細胞を増幅することができる。
【０３６７】
別の具体例においては、フローチャンバは単一のポートを有し、例えば、密閉可能な上部開口部を有するフラスコである。流体を除去し、単一のポートから得る。さらに他の具体例においては、フローチャンバは多数のポート、例えば、３以上のポートを有する。
【０３６８】
幾つかの実現を以下の実施例によってより詳細に説明する。しかしながら、こうした実施例は限定するものではないことに注意されたい。
【実施例１】
【０３６９】
実施例
Ｆａｂ断片をディスプレイする２タイプの酵母細胞を、キャピラリーフローチャンバを有する装置を使用して分離した。第１の酵母細胞はＦａｂ（ＰＨ１）をディスプレイするｔｈａｔＭＵＣ１抗原と結合し、ＴＲＰ１+ｌｅｕ２-として遺伝学的に印をつけられた。第２の酵母細胞は、Ｆａｂ（α−ストレプ（α-strep））をディスプレイするストレプタビジンと結合し、ｔｒｐ１-ＬＥＵ２+として遺伝学的に印をつけた。２タイプの酵母細胞を１００μlのストレプタビジンビーズと共に１時間インキュベートした。
【０３７０】
混合物を２００μl毛細管中で装置中に配置した。流量１ml／分を使用して、流体を管に送達した。磁石を１０秒毎に撹拌した。撹拌の間中に、流体流れは０ml／分に低減した。管を、１３分間２％ＭＰＢＢＳを用い、次にＰＢＳを用いて２分間洗浄した。
【０３７１】
ビーズ及び任意の結合した酵母細胞をキャピラリーから回収し、ロイシンまたはトリプトファンを欠く最小培地プレートの上に平板培養した。表３に示すように、Ｆａｂ（α−ストレプ）をディスプレイする酵母細胞の場合に手順は少なくとも７６，０００倍の増菌ををもたらした。
【０３７２】
【表３】
2005511066.tif 000004
【０３７３】
実施例
以下の手順を使用して、ＣＤ１９Ｐａｎ−Ｂ常磁性ビーズで捕獲したＢＡｌｌ１細胞に対して“パンニング”したファージディスプレイライブラリーメンバーの増菌を評価した。
【０３７４】
以下の試験ファージを選択のために使用した。非特異的ファージ（ｆｄ−ｔｅｔ、テトラサイクリン耐性）が特異的結合ファージ（アンピシリン耐性）に対して２０００倍過剰となる（１×１０11：５×１０7）ような比で、標的に結合すると予想された特異的結合ファージ及び非特異的ファージを混合した。詩的したおように、２つのファージを、異なる抗生物質耐性マーカーで遺伝学的に印をつけた。小さなアリコートを使用して、滴定（入力）を実行した。
【０３７５】
まず、全ての関連のある材料をブロックした。Ｕ底９６穴プレート（コスター（Costar））を２％マーベルＰＢＳ（ＭＢＰＳ）でブロックした。１×１０6ＢＡｌｌ１細胞（Ｂ−細胞系）／選択を２００μl２％ＭＰＢＳ中でブロックした。１０μlＣＤ１９パン−Ｂ常磁性ビーズ（ダイナルＭ−４５０）を２００μl２％ＭＰＢＳ中でブロックし（ビーズを１サイクル２％ＭＰＢＳを用いて洗浄）、キャピラリーを２％ＭＰＢＳでブロックした。ファージ混合物もまた、１００μl４％ＭＰＢＳ／０．１％ＮａＮ3を１００μlファージに加えることによってブロックした。ブロッキング時間は、９６穴プレート、細胞、ビーズ、キャピラリー及びファージで０．５〜１時間だった。
【０３７６】
ブロッキングの後に、抗−ＣＤ１９含有常磁性ビーズを、特殊な磁石（ダイナル（登録商標））によってエッペンドルフ管の１部位に引いた。上澄みを除去した。常磁性ビーズを、ブロック済みＢＡｌｌ１細胞を含む２００μl溶液を用いて再懸濁し、１５分間室温で穏やかに回転させて、ビーズを細胞と結合させた。細胞−ビーズ複合体を１サイクルの間洗浄して、未結合細胞を除去した。
【０３７７】
次に２００μl予備ブロック済みファージ混合物を細胞−ビーズ複合体に加え（再度磁石の使用によって前の上澄みをエッペンドルフ管から除去した）、１時間室温で穏やかに振とうしながらインキュベートした。ファージを細胞−ビーズ複合体と共にインキュベーションした後に、混合物を予備ブロック済み９６穴プレートに移し、キャピラリー洗浄装置のキャピラリー中に導入し（例えば、図４〜８を参照されたい。）（キャピラリーは９６穴プレートフォーマット中に配設して、キャピラリーの容易な負荷を可能にした）、１５分間２％ＭＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ3を用いて流量１１５μl／分で洗浄した。洗浄の最中に、磁石は第１から第２の位置に１０秒毎に移動した（１５分間の洗浄時間の間に９０回の並進運動）。洗浄の間中、ポンプは作動しつづけて流量１１５μl／分（すなわち、流体流れ停止を使用しない）を維持した。１５分の２％ＭＰＢＳ／０．０５ＮａＮ3の洗浄の後に、磁石をキャピラリーの片面に適用することによってビーズをキャピラリーの片面表面に捕獲した。洗浄緩衝液をＰＢＳで交換し、次に５分間の追加の洗浄を同様の条件下で実行する。
【０３７８】
キャピラリーに２００μlＴＥＡ１００mM（トリエチルアミン）を充填することによっ結合したファージを溶離した。ＴＥＡをキャピラリーに導入し、洗浄緩衝液とＴＥＡ溶液との間に気泡が存在した。この処理の間中、磁石をキャピラリーの片面に適用することによってビーズを再度停止させた。溶離の間中、磁石は片面からもう一方の面に全溶離時間５分間の間１分毎に移動した。キャピラリーが永久磁石の中央になる位置に磁石が移動することによってビーズ表面の磁力を除いて、ＴＥＡを中和する１００μl１MＴｒｉｓ−ＨＣＬpH７．４を含む管中で、溶離した材料を集めた。
【０３７９】
混合物を簡単に混合した。細胞デブリ及び残存しているビーズを、１４０００RPMで５分の短い遠心分離工程によって遠心沈殿した。。上澄みを新たな管に移した（出力と呼ぶ）。入力及び出力試料の希釈系列を作製し、使用して、指数増殖する（ＯＤ６００＝０．５）Ｔｇ１細胞に感染させた。感染は、３０分間３７℃で撹拌せずに行った。希釈物を、アンピシリンまたはテトラサイクリンを含む寒天プレート表面で平板培養して、非特異的及び特異的結合ファージの集団のサイズを記録した。増殖の後に、コロニー形成単位を寒天プレート表面で計数した。
【０３８０】
【表４】
2005511066.tif 000005
【０３８１】
結果は、キャピラリー洗浄装置を使用して細胞に対して選択した場合、アミノ酸は少なくとも特異的結合ファージの２００倍の増菌を示す。
実施例
以下の手順は、様々な流れ条件下でキャピラリーフローチャンバを使用して特定のファージディスプレイライブラリーメンバーの選択を証明する。特に、本方法を使用して、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の表面に存在する細胞表面抗原に対するより強力な結合剤とより弱い結合剤との間を区別をする。手順は６つのキャラクタリゼーションしたファージ単離物を使用し、各々は、遺伝子ＩＩＩバクテリオファージ表面タンパク質に融合したＦａｂをディスプレイする。こうした６つのファージは各々、ＨＵＶＥＣの表面に発現する抗原（標的Ｘ）と結合するＦａｂをディスプレイするｔ。ファージは、ＤＮＡフットプリント及び配列決定ことによって互いに区別可能である。
【０３８２】
手順のために、６つのＨＵＶＥＣ−結合Ｆａｂ−ディスプレイファージクローンを同一の量で（１０7ファージ／クローン）１０10ｆｄ−ｔｅｔ−ｄｏｇファージ（非特異的ファージ）と混合して、７つの異なるタイプのファージ（６つのＨＵＶＥＣ−結合、及び１つのｆｄ−ｔｅｔ−ｄｏｇファージ）を有する混合物を形成した。６つのＦａｂディスプレイファージ対バックグラウンドＦｄ−ｔｅｔ−ｄｏｇ１ファージの増菌は、選択手順の前及びの後に回収したファージの数を計数することによって決定した。Ｆａｂディスプレイファージは、大腸菌細胞中に感染した時には、アンピシリンに対する耐性があり、一方Ｆｄ−Ｔｅｔ−ｄｏｇ１ファージは、大腸菌細胞中に感染した時に、テトラサイクリンに対する耐性があった。開始混合物の小さなアリコートを使用して、滴定（入力）を実行した。
【０３８３】
手順の前に、全ての関連のある材料をブロックした。Ｕ底９６穴プレート（コスター（Costar））を２％マーベルＰＢＳ（ＭＢＰＳ）でブロックした。１×１０6ＨＵＶＢＣ／選択を２００μl２％ＭＰＢＳ／１０％ＦＣＳ／０．０１％ＮａＮ3中でブロックした。１０μlＣＤ１９パン−Ｂ常磁性ビーズ（ダイナルＭ−４５０）を２００μl２％ＭＰＢＳ中でブロックし（ビーズを１サイクル２％ＭＰＢＳを用いて洗浄）、キャピラリーを２％ＭＰＢＳでブロックした。ファージ混合物もまた、１００μl４％ＭＰＢＳ／０．１％ＮａＮ3を１００μlファージに加えることによってブロックした。ブロッキング時間は、９６穴プレート、細胞、ビーズ、キャピラリー及びファージで５時間だった。
【０３８４】
ブロッキングの後に、抗−ＣＤ３１含有常磁性ビーズを、磁石（ダイナル（登録商標））によってエッペンドルフ管の１部位に引いた。上澄みを除去した。常磁性ビーズを、ブロック済みＨＵＶＢＣ細胞を含む２００μl溶液を用いて再懸濁し、３０分間室温で穏やかに回転させて、ビーズを細胞と結合させた。細胞−ビーズ複合体を２サイクルの間洗浄して、未結合細胞を除去した。次に２００μl予備ブロック済みファージ混合物を細胞−ビーズ複合体に加え（再度磁石の使用によって前の上澄みをエッペンドルフ管から除去した）、１時間室温で穏やかに振とうしながらインキュベートした。ファージを細胞−ビーズ複合体と共にインキュベーションした後に、混合物を予備ブロック済み９６穴プレートに移し、キャピラリー洗浄装置のキャピラリー中に導入し（キャピラリーは９６穴プレートフォーマット中に配設して、キャピラリーの容易な負荷を可能にした）、１０分間２％ＭＰＢＳ／１０％ＦＣＳ／０．０１％ＮａＮ3を用いて手順Ｉの場合１００μl／分及び手順ＩＩの場合２００μl／分の流量で洗浄した。
【０３８５】
キャピラリー洗浄作業は、以下の値（時間は分及び秒単位）を受け入れたグラフィカルインターフェースにパラメータを入力することによって制御された。
間隔時間：第１の位置から第２の位置への磁石の１回の移動の時間
ポンプ遅延時間：間隔時間内のポンプの遅延時間
全ランタイム：キャピラリー中での洗浄の全時
モータオン時間：磁石を移動させるモータがオンになっている時間（磁石の速度によって決まる）
こうした実現においては、間隔時間を１０秒、ポンプ遅延時間０秒、全ランタイム１０分間、及びモータオン時間１秒に設定した。
【０３８６】
フローチャンバ及び流体ポンプに接続するソフトウェアを使用して、以下のパラメータを  独立し設定することができる。インターフェースはまた処理状態を（例えば、アイドル状態で“モータ＝オフ／ポンプ＝オフ／方向＝左／処理回数＝０“）。インターフェースはまた、作動を開始するためのボタン、例えば、始動、停止、ロード、保存を含むことができる。
【０３８７】
１０分の２％ＭＰＢＳ／１０％ＦＣＳ／０．０１％ＮａＮ3の洗浄の後に、磁石をキャピラリーの１部位に適用することによってビーズをキャピラリーの片面表面に捕獲した。洗浄緩衝液をＰＢＳで交換した。次に５分間の追加の洗浄を同様の条件下で実行する。
【０３８８】
キャピラリーに２００μlＴＥＡ１００mM（トリエチルアミン）を充填することによっ結合したファージを溶離した。ＴＥＡをキャピラリー中に導入し、洗浄緩衝液とＴＥＡ溶液との間に気泡が存在した。この処理の間中、磁石をキャピラリーの１部位に適用することによってビーズを再度停止させた。結合したファージを５分間同様の条件下で溶離した（流れ無し）。
【０３８９】
キャピラリーが２つの永久磁石の中央になる中央位置に磁石が移動することによってビーズ表面の磁力を除いて、新たな管で、溶離した材料を集めた。この溶離の場合、ポンプの方向を逆にした。
【０３９０】
混合物を簡単に混合した。細胞デブリ及び残存しているビーズを、１４０００RPMで５分の短い遠心分離工程によって遠心沈殿した。上澄みを、１００μl１MＴｒｉｓ−ＨＣｌpH７．４を含む新たな管に移した（出力と呼ぶ）。入力及び出力試料の希釈系列を作製し、使用して、指数増殖する（ＯＤ６００＝０．５）Ｔｇ１大腸菌細胞に感染させた。感染は、３０分間３７℃で撹拌せずに行った。希釈物を、アンピシリンまたはテトラサイクリンを含む寒天プレート表面で平板培養して、非特異的（ｆｄ−Ｔｅｔ−ｄｏｇ１）及び特異的結合ファージ（標的Ｘと結合するＦａｂディスプレイファージ）の集団を記録した。増殖の後に、コロニー形成単位を寒天プレート表面で計数した。加えて、アンピシリン入力及び出力プレートから得た４１のコロニー／選択を使用して、ＢｓｔＮＩ制限酵素を用いてＰＣＲ生成物（コロニーＰＣＲ）を消化することによってＤＮＡフィンガープリント分析を実行した。これを行って、標的Ｘと結合する類のないクローンを識別した。フィンガープリントパターンを選択の前及びの後に比較して、特定の厳しさを用いて洗浄した後の６つのクローンの頻度及び分布を推定した。６つの異なるクローンは標的Ｘに対する異なるな親和性を有すると予想され、及び従って異なる条件下での増菌は異なると予想された。
【０３９１】
キャピラリー洗浄を用いた２つの選択を上記に説明したように実行したが、次第に厳しさを増大させた。流量の影響（洗浄の厳しさ）を増菌及びＤＮＡフィンガープリントパターンの分析によって調べた。
【０３９２】
【表５】
2005511066.tif 000006
【０３９３】
【表６】
2005511066.tif 000007
【０３９４】
【表７】
2005511066.tif 000008
【０３９５】
【表８】
2005511066.tif 000009
【０３９６】
選択（ＤＮＡフィンガープリントデータ）の後に見い出された頻度とクローンの結合活性／親和性とを相関させるために、こうした６つのクローンの各々から得たファージの希釈物を用いて標準的なファージＥＬＩＳＡを実行した。使用したファージの量は１ｅ１０、１ｅ９、１ｅ８、１ｅ７、１ｅ６及び１ｅ５だった。ＥＬＩＳＡために使用した条件下でファージクローンは半ＯＤ450最大で最低のファージタイター量を与、標的と最も強く結合と予想された。
【０３９７】
ＥＬＩＳＡプレートを、一晩ａｔ４℃で標的タンパク質（５μg/ml）でコーティングした。翌日プレートを２サイクルＰＢＳ／０．１％トゥイーンを用い、及び１サイクルＰＢＳを用いて洗浄した。ファージの希釈物を作製し、ファージ及びＥＬＩＳＡプレートの両方を３０分間２％マーベル／ＰＢＳでブロックした。ブロッキングの後にプレートを２サイクルＰＢＳ／０．１％トゥイーンを用い、１サイクルＰＢＳを用いて洗浄した。ファージ希釈物を対応する穴に加え、１．５時間振とうしてＲＴでインキュベートした。ファージインキュベーションの後にＥＬＩＳＡプレートを５サイクルＰＢＳ／０．０１％トゥイーンを用い、及び１サイクルＰＢＳを用いて洗浄した。抗Ｍ１３−ＨＲＰ（２％マーベル／ＰＢＳ中で１：５０００に希釈した）を各穴（１００μl／穴）に加え、インキュベートする１時間振とうｉｎｇａｔＲＴで。ＥＬＩＳＡプレートを再度５サイクルＰＢＳ／０．０１％トゥイーンを用い、及び１サイクルｗｉｔｈＰＢＳを用いて洗浄した。１００μlＴＭＢ溶液を各穴に加えた。１０分後に５０μl２ＮＨ2ＳＯ4を加えることによって反応を停止させた。４５０nmでプレートリーダで色を測定した。表９を参照されたい。
【０３９８】
【表９】
2005511066.tif 000010
【０３９９】
値は、結合したファージに関してＥＬＩＳＡから得たＯＤ４５０である。
［結論］表５及び６の結果は、標的Ｘと結合した特異的ファージの増菌対バックグラウンドファージの増菌は、より高い流量条件を使用した場合により高いことを（２５５対１３０）を示す。
【０４００】
表７及び８に示す選択の前及び後のクローンのＤＮＡフィンガープリント分析は、両方の実験条件下で、入力対出力を比較して他のクローンよりも特定のクローンを選択することを示す。例えば、表７及び８のクローンＡ１２を参照されたい。表７及び８はまた、流れ条件の差は選択の出力に確かに影響を有することを示す。例えばクローンＣ６（表７、１００μl/ml流れ）は入力で８倍であり、出力で３倍であり、同時に同じクローンＣ６は高い流れ条件下（２００μl/ml、表８）で出力で全く見い出されなかった（入力Ｃ６；表８）。これはる、高流れ条件下で幾つかの低親和性クローンが選択されたが幾つかの高親和性クローンが増菌したことを証明する。
【０４０１】
最後に、こうした結果がディスプレイされたＦａｂの標的Ｘとの結合の親和性（及び結合活性）と一致するか識別するために、様々な濃度のファージを用いた特異性ＥＬＩＳＡを実行した。
【０４０２】
表９の結果は、組換え標的Ｘと結合することに幾らかの差が存在することを示す。例えば両方の選択条件下で強く増菌したクローンＡ１２は、標的Ｘと最も強く結合することを示す。
【０４０３】
幾つかの強力結合クローン（表９に示す）が劇的に増菌されない（例えばクローンＡ２）という事実は、エピトープ認識及びＨＵＶＥＣ細胞表面に発現するタンパク質の立体配座の差に関連があるかもしれない。
【０４０４】
第２のタイプの手順においては、上記の手順を実行し、ただしファージの溶離を実行しなかった。その代わりに、洗浄（溶離無し）の後に全混合物を使用して、大腸菌細胞に感染させた。
【０４０５】
実施例
以下のものは、標的化合物の存在下でディスプレイライブラリーメンバーを増幅する方法の例であり；この方法は磁気ビーズ洗浄装置を必要としない。約１００μlのダイナルＳｖコーテッド磁気ビーズ（ダイナルＭ２８０）をＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中の５００μlの２％乳で３０分間ブロックした。洗浄工程に続いて、過剰の乳を除去するために、ＭＰＢＳ中でＦａｂ−断片ファージディスプレイライブラリーから希釈した３・１０11Ｆａｂ−ディスプレイファージを、ブロック済みＳｖビーズと共に全体積５００μlで１時間室温でインキュベートした。Ｓｖ磁気ビーズを集め、吸引によって未結合ファージを除去した。ビーズを３回１×ＰＢＳ中で洗浄し、続いて５００μlのＸＬ１Ｂｌｕｅ−ＭＲＦ’細胞（ストラタジーン（Stratagene）を２ｘＹＴ中のＯＤ600０．５０で加える。混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、この時点で５μlの１００mMＩＰＴＧを加えて、最終濃度１mMＩＰＴＧを実現した。２０分で、細菌を、追加の２５分間３０℃の空気振とう機に移し、全インキュベーション時間は４５分だった。細菌を除去し、ビーズを３回５００μlの０．０１％トゥイーン−２０ＰＢＳを用いて洗浄した。追加の５００μＦＸＬ１ＢＬＵＥ−ＭＲＦ’細胞をビーズに補って、インキュベーション及び洗浄プロセスを合計３ラウンド繰り返した。各ラウンドから得た５００μlのファージ感染細菌をアンピシリン−含有プレート表面で滴定し、並びに一晩１mMＩＰＴＧを含む１０ml２ｘＹＴ中３０℃で増殖した。得られたファージを標準的なＰＥＧ沈殿によって精製した。
【０４０６】
３つの平行実験を実行した。第１の実験では、温度を３７℃で２０分間保持し、次に３０℃に２５分間低下させた。第２の実験では、インキュベーションの温度を３７℃で４５分間一定に保持した。第３の実験では、温度を３０℃で保持一定に保持した。
【０４０７】
様々なラウンドのタイターを表１０に示す。見出の“３７×２０＋３０×２５”は、最初の２０分のインキュベーションは３７℃であり、最後の２５分は３０℃である実験であることを意味し、“３７×４５”は、３７℃を４５分間使用した実験であることを意味し、“３０×４５”は３０℃を４５分間使用した実験であることを意味する
【０４０８】
【表１０】
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【０４０９】
実施例
以下のものは、標的化合物の存在下でァージミドのディスプレイライブラリーを増幅する方法の例であり；この方法は磁気ビーズ洗浄装置を必要としない。この方法は以下の工程を含む。
１）ファージミドライブラリーをビオチン化標的と混合する
２）標的を捕獲し、Ｓｖビーズ表面のファージと結合する
３）非結合ファージミドを洗い流す（限定された時間低温標的を使用して、弱い結合剤を溶離；必要なだけの洗浄を実行することができる）
４）Ｆ＋細胞及び増殖培地を加える
５）時間Ｔ１インキュベートする（３０分〜１２０分、任意に、感染した細胞を選択するための時間Ｔ２の後に加える可能性がある抗生物質と共にインキュベートする）
６）細胞をバイアル中に分取し（１／標的）、ラウンド１として平板培養する
７）ラウンドカウンターをＲ＝１に設定する
８）各バイアル中に、ヘルパーファージ及びＳｖビーズ表面の標的を加える（必要ならば追加の標的をヘルパーファージの後に加える可能性があり、ヘルパーファージを加えてから３０〜４５分後ファージミドのバーストが予想される）
９）時刻Ｔ３で、細胞及び非結合ファージを洗い流す（任意に限定された時間低温標的−洗浄を使用して、弱い結合を溶離することができる）
１０）Ａｓ及びＧＭを加える
１１）時間Ｔ４インキュベートする（例えば、３０分〜１２０分；恐らく＝Ｔ１）（感染した細胞を選択するための時間Ｔ５（恐らく＝Ｔ２）の後に抗生物質を加えることができる）
１２）ラウンドカウンターをＲ＝Ｒ＋１にする
１３）細胞のアリコートを新たなカウンターに移す
１４）コロニーを得るためにラウンド“Ｒ”（２、３、．．．）として細胞のアリコートを平板培養する
１５）必要に応じて工程８に戻る。
【０４１０】
他の具体例
当業者であれば、単なる常用の実験を使用して、本明細書において説明する本発明の特定の具体例に加えて多くの具体例を認識できようし、または確認することができる。このような具体例は、請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０４１１】
【図１】フローチャンバ及び２つの磁場インデューサーを含む模範的な装置の概略である。
【図２】フローチャンバ及び２つの磁場インデューサーを含む模範的な装置の概略である。
【図３】フローチャンバ及び２つの磁場インデューサーを含む模範的な装置の概略である。
【図４】模範的な装置の線図である。
【図５】模範的な装置の線図である。
【図６】模範的な装置の線図である。
【図７】模範的な装置の線図である。
【図８】模範的な装置の線図である。
【図９】模範的なシステムの概略である。
【図１０】模範的な発酵槽の概略である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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