(57)【要約】  白血球数の質量的測定方法は保持体によって流体サンプルからの白血球数の捕獲、洗浄溶液による赤血球、その他の妨害物質の除去、および白血球中に存在するエステルが色原体基質を分解し、水不溶性色素を生成する色素反応の結果の読み取りを含む。本方法に用いる装置は、白血球を保持する保持体を含み、その中に固定化された色素基質、およびサンプルを通って流れる全過剰の洗浄溶液を毛管作用で運び取り出す吸収層を任意に有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程からなるサンプル中の白血球数を測定する方法。
ａ．サンプルからの白血球を保持体に捕獲し；
ｂ．洗浄溶液を用いて保持体を洗浄して保持体に捕獲された白血球からの妨害物質を除去し；
ｃ．白血球に存在する酵素によって分解されて水不溶性色素を生成する色素原基質とサンプルを接触させ、前記基質は膜に固定化されているかまたは洗浄溶液の一部からなり；そして
ｄ．白血球中に存在する酵素に起因する色彩変化を読み取る。
【請求項２】
酵素がエステラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
サンプルが血液、ミルク、尿、唾液、および汗からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
洗浄溶液が緩衝液、任意の反応促進剤、および任意の基質を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
緩衝液が約８から約１１のｐＨ範囲である請求項４記載の方法。
【請求項６】
緩衝液が約９から約１０．５のｐＨ範囲である請求項５記載の方法。
【請求項７】
洗浄溶液が水および極性有機溶媒の両方を含む請求項４記載の方法。
【請求項８】
洗浄溶液が非イオン性界面活性物質を含む請求項４記載の方法。
【請求項９】
白血球がＣＤ４成分を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
次の工程からなるミルクのサンプル中の白血球数を測定することからなる乳腺炎を検出する方法。
ａ．サンプルからの白血球を保持体に捕獲し；
ｂ．洗浄溶液を用いて保持体を洗浄して保持体に捕獲された白血球からの妨害物質を除去し；
ｃ．白血球に存在する酵素によって分解されて水不溶性色素を生成する色素原基質とサンプルを接触させ、前記基質は膜に固定化されているかまたは洗浄溶液の一部からなり；そして
ｄ．白血球中に存在する酵素から得られた色彩変化を読み取る。
【請求項１１】
酵素がエステラーゼである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
次の構成からなる白血球数を測定するデバイス。
ａ．色素基質を任意に固定化した白血球捕獲保持体および
ｂ．サンプルを通って流れる過剰の洗浄溶液を毛管作用で運び取り出す吸収層。
【請求項１３】
保持体が約３から約１５ミクロンの範囲のポアサイズおよび負正荷電を有する請求項１２記載のデバイス。
【請求項１４】
保持体が有孔膜である請求項１３記載のデバイス。
【請求項１５】
さらにサンプルと洗浄溶液を適用するための開口を有するプラスチックカバーを含む請求項１２記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は妨害物質の存在で生物体液中の白血球数を確立するための方法と装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球（ＷＢＣ）数は臨床研究室において最も普通に試験されるパラメーターの一つである。実験室ＷＢＣは通常静脈血５−１０ｍｌが必要であり、患者は研究室の結果がでるまで３日以上待つことになる。一般に、生物体液中のＷＢＣを測定する方法は自動化細胞をカウントする技術に基づき、資料を希釈し、異なる大きさと形の細胞を流動セル中でカウントする（米国特許２，６５６，５０８；３，５０２，９７３；６，１５９，７４０）。流動技術に基づく機器は高価であり、臨床研究室環境では操行のための職業訓練を受けた人が必要である。流動細胞のために微小工学を用いる新しい分析機器は従来の細胞カウント機器よりも遥かに小さいが、まだ開発段階にある。また、複雑な機械的ポンプおよび必要なバルブ系はコストの低い機器を提供するために製造業者のためにオプションを制限する。
【０００３】
白血球数の迅速な測定は重要な場合が多い。白血球数の迅速な測定は医師のオフィスでは有用であり、臨床医はこれらの測定を用い治療薬、細胞増殖抑制薬物および確定した感染症の効果を測定することができる。化学療法中の患者はまた白血球数をチェックして、臨床医または病院から遠くに住む場合には問題となる次の治療に好適であることを確認する必要がある。クロザピンを服用する精神分裂病患者は毎週白血球数をモニターしなければならない。慢性の感染症に罹っている患者はマイクロリットル当り１０，０００個の過剰な白血球数を有するので、モニターしなければならない。放射線事故またはテロ攻撃後の多数の住民をモニターできることは医療資源の最上の用途のための選別や計画を容易にする。
【０００４】
乳腺炎は動物の乳腺の炎症であり、酪農産業で失った収益は年間２０億ドルに近い。酪農動物が臨床の乳腺炎に罹るとき、乳腺は視覚的にも腫れているか、ミルクは水か、濃いか、粘着性である。不幸にも、明らかに健康な動物は無症状の乳腺炎を隠しており、酪農牛群に約７０％までの乳腺炎の説明となる。研究者はこの眼で見える乳腺炎感染のためのテストを考案する多くの試みが行われている。ミルクの体細胞数（ＳＣＣ）は９０％以上の白血球からなり、乳腺炎の測定として一般的に採用されてきた。現在までのところ、カリフォルニア乳腺炎テスト（ＣＭＴ）は現場用の最も一般的なテストである。しかし、ＣＭＴは非常に骨の折れるテストであり、各ユーザーによって主観的解釈や容認できない間違いの多いネガチブな割合を受ける。なお無症状の乳腺炎の結果ＷＢＣ数の増加を測定できる適当な現場テストはまだない。
【０００５】
本発明の目的のために、酪農動物はミルクが得られる任意の動物を意味する。酪農動物の例は制限されないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、およびバッファロウ（バイソン）である。ウシの白血球のためのテストは同様に他のタイプの酪農動物に用いられる。従って、本明細書は一例としてウシを用いるとき、プロセスはウシに限られず、あらゆるタイプの酪農動物に応用できる。
【０００６】
農業の分野では、白血球数のための正確なウシ側のミルクテストは潜在的に農民の労力を大きく減らし、プールする前に乳腺炎のウシからのミルクを捨てることができ、従って、感染していないウシからのミルクを汚染することはない。比色法を用いるＷＢＣの測定は無症状の乳腺炎には非常に望ましい。
【０００７】
白血球の壁にある酵素はエステル分解性の活性を有する。この技術分野で既知の種々の無色の発色体のエステルはこの酵素加水分解で開裂でき、無色の酸成分と色彩形成アルコールまたはフェノール成分を形成する。色彩強度は量的に比色計または準量的に目で見る色チャートを用いて測定することができる。ベルガーらは、米国特許４，２７８，７６３で、このエステラーゼの性質の利点をとり、ヒトの尿中マイクロリットル当り少ない２００個の細胞を検出することができる。この最初の報告に続いて多くの特許が発行され（米国特許４，６３７，９７９；４，６５７，８５５；４，７１６，２３６；４，８０６，４２３）、白血球数のための尿計量棒は何年間も発売されてきた。
【０００８】
不幸にも、生物学的流体サンプルの分析物のためのアッセイの有効性は妨害物質の存在で減らされる。例えば、ヒトの尿のために開発された比色定量ＷＢＡ計量棒技術は他の生物学的流体、例えば全血および乳には応用できない。全血のサンプル中の赤血球の濃い赤い背景色は酵素反応中に現れた色彩をマスクする。同様に、ミルクサンプルのコンプレックスマトリックスは酵素反応を劇的に阻害する妨害物質を含む。尿サンプルに関しては、テスト時間の短縮および感度の増加を含め、妨害物質の不都合な影響を回避することによって、計量棒の動作を改良することが望まれる。
【０００９】
米国特許５，４６３，７４５および６，０１０，８６６は分析物のためのアッセイを妨害する物質の存在で生物学的流体中の分析物を決定する方法を記載している。しかし、この方法は分析物特異的抗体を用いて実施しなければならず、分離法は高価である。
【００１０】
多数の研究者は、米国特許６，３３７，０２６、６，２２１，２６４、５，９３８，９４０、５，７９５，４８３、５，７８３，０９４、４，８８０，５４８、５２５８，１２７、５，７２８，３０６、および４，９３６，９９８に記載されたものを含む、サンプルから白血球を除去または減少させるフィルターを開発した。これらフィルターのどれも白血球数測定に関連して用いることは記載されていない。
【００１１】
白血球を数える診断キットや方法も報告された。米国特許６，０４６，０１９は細胞溶解、濾過、基質添加、インキュベーション、および読みを行う多数の工程を含む方法およびデバイスを開示している。半定量的結果が報告されたが、このデバイスは使用することが難しい。
【００１２】
特許文献１はミルクその他の生物学的サンプルから細胞を分離し濃縮する方法を教示している。この特許は、感度を上げて種々のアッセイのための細菌細胞を分離するように、細胞を濃縮する必要性を書いている。しかし、この特許にはミルク中の白血球数を測定することについては何も記載されていない。
【００１３】
従って、白血球の比色検出の認められた利点を用い、背景色および妨害物質の不利な影響を除去するための手段を提供する方法やデバイスを開発することが必要である。
【特許文献１】米国特許５，７００，６４５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は引用文献における前記欠点を解決することである。
【００１５】
本発明の他の目的は生物学的流体中の白血球数を測定する方法を提供することである。
【００１６】
さらに本発明の目的は生物学的流体中の白血球数を測定するデバイスを提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は乳腺炎を診断するための方法およびデバイスを提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は呈色反応を用いて白血球数を測定する方法を提供することである。
【００１９】
本発明によれば、妨害物質を含む生物学的流体サンプル中の白血球数は、膜を用いて標的細胞を捕獲し、測定工程前に妨害物質を洗浄することによって得られる。この方法とデバイスは広範囲の生物学的サンプル、例えば血液、ミルク、尿、唾液、および汗をアッセイするために用いられる。唾液は、歯茎や口の関連部分での感染を含む歯科の問題を検出するために白血球レベルをモニターすることができる。さらに、発汗、または汗は白血球を含み、従って存在する白血球のレベルをモニターすることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の方法は次の工程からなる：
ａ．生物学的流体サンプルからの妨害物質から白血球を、白血球を選択的に保持する保持体を用いて分離する；
ｂ．妨害物質、例えば赤血球、酵素、酵素インヒビター、タンパク質、およびリピドを、水中に緩衝液およびオプションの添加物を含むかまたは極性有機液の水溶液を含む洗浄溶液を用いて洗浄して保持体から除去し、白血球のみを残す。
ｃ．白血球中にある酵素が水不溶性色素を生成する色素基質を切断する色素反応の結果を、眼または機器によって読む。
【００２１】
色素基質は膜に固定化するか洗浄溶液の成分として用いられる。
【００２２】
好適例では、酵素はエステラーゼであり、色素基質はエステルである。
【００２３】
本発明のデバイスは次のものからなる。
ａ．サンプルおよび洗浄溶液を用いるための開放部を有するカバー；
ｂ．固定化された色素を任意に有する白血球保持体；
ｃ．サンプルを通って流れる過剰の洗浄溶液をすべて運び集める吸着層；
ｄ．緩衝液、任意の反応促進剤、および任意の色素基質を含む洗浄溶液。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は妨害物質に存在する全血、尿、乳、汗、および唾液のような生物学的流体における白血球数を測定するために用いられる。白血球を分離される妨害物質の中には、赤血球、酵素、酵素インヒビター、還元剤、タンパク質、脂質等がある。この方法はサンプルが迅速に移動できる保持体を用い、保持体はすばやく白血球を捕獲し、赤血球その他の妨害物質を洗浄した後に白血球に保持する。
【００２５】
白血球を迅速に捕獲し洗浄中にそれらを膜に保持する市販品として入手できる保持体の例は、膜Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ  ＡおよびＢ（Ｐａｌｌ Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含み、これらは輸血のための血液から白血球を濾過するために設計され、良く制御された表面チャージとポアサイズによって全血から白血球を３０−８０％捕獲できる。保持体はポアサイズ（またはメッシュサイズ）が約３ないし１５ミクロンの範囲にあり、正味の正の表面チャージを有する。ポア（またはメッシュ）サイズと正味の正の表面チャージの組合せは保持体がその表面に白血球を捕獲することができ、他の物質、例えば赤血球、脂質、タンパク質等は保持体を通過する。白血球が保持体に保持されるとき、保持体の正味の正の表面チャージは負の表面チャージを有する白血球を保持し、洗浄溶液で洗浄除去する。驚くべきことには、約５ないし約１３ミクロンリットルの全血からなるサンプルがこれら保持体に適用されるとき、ほぼ１００％の白血球が殆ど瞬時に保持体により捕獲された。従って、これら膜は定量的に白血球測定デバイスを開発するために有用であることが見出された。一定のグレードのセルロース紙のような、正にチャージした表面を有する他の保持体材料は、白血球に関し同じ挙動を示し、これら材料は本発明の方法に保持体として首尾よく用いられることが見出された。
【００２６】
可視色素を生成するように色素基質を触媒することにより流体中の白血球の存在と量を検出するために用いられる白血球の表面に酵素がある。エステラーゼを検出するために入手できる多くの市販のテストがあり、当業者には良く知られていることである。好ましい基質はインドキシルエステル族のひとつ、例えば３−アセチルインドキシルおよび３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルオキシ）−インドールである。しかし、白血球上のエステラーゼによって加水分解される呈色色素を形成する既知の基質が用いられるこのような色素の例はＣｏｒｅｙら、米国特許４，６５７，８５５に与えられ、これらは参考文献によって組み込まれる。当業者はどの色素がこの目的に適しているか容易に決定できる。基質は乾燥試薬として保持体に固定化することができるか、または洗浄溶液に混入することができる。
【００２７】
洗浄溶液はすべて保持体によって捕獲されなかった物質、例えば、酵素活性に基づく白血球の迅速な保持を妨害する物質を全部除去する。洗浄溶液は水または水と極性有機溶媒、緩衝液、および他のオプションの成分の混合物のいずれかに基づく。制限するものではないが、極性有機溶媒としてメタノール、エタノール、アセトン等を含む。
【００２８】
ポイントオブケアを適用するために、１回のアッセイで５分以下の反応時間にスピードアップすることが望ましい。一定の複素環式化合物およびアルコールのような促進剤は白血球のアッセイ時間を早めるために役立つことが示された、米国特許４，２９９，９１７号に記載されていることを参考文献としてここに組み込む。また驚くべきことに、約８から約１１のｐＨを維持した緩衝液がアッセイ時間を短縮する際の促進剤よりも有効であることが見出された。さらに特に、約９．５から約１０．５のｐＨでの約５ｍＭないし約２００ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液が有意に背景色を増加することなく最速反応速度を与える際にもっとも効果があることが見出された。大抵の妨害物質が捕獲膜から吸収パッドに瞬間的に流されるように洗浄溶液は選択されなければならない。
【００２９】
吸収パッドは任意の従来の吸収材から作ることができる。Ｓｃｈｌｉｅｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ  ９００フィルター紙のような高価でないセルロース材がこのために適当である。この紙は瞬時に捕獲膜から洗浄液３００マイクロリットルまで処理する空隙率と容量をもつ。
【００３０】
図１は本発明のデバイスを示す。デバイス１０は３個の主ピースからなる。頂部ピース１は厚さ約５−１０マイクロメートルのプラスチック材で底部に感圧接着性をもち、真ん中に約３−１０ｍｍの穿孔された穴２がある。その下の白血球捕獲膜３はその構造によって固定化されたオプションの色素エステル基質をもつ。三番目の層４はセルロース繊維製の厚い水吸収層である。
【００３１】
図１Ｂに示されるように、白血球を含む生物学的流体サンプルは先ずデバイスの頂部の開口１に導かれる。白血球捕獲膜３は非常に親水性で素早くサンプルを吸収する。膜は瞬時にサンプル中の白血球を捕獲する。図１Ｃに見られるように、次いで約３ないし４滴の洗浄溶液を開口から吸収層４に導き、赤血球および／または他の妨害物質の大部分または全部を洗浄する。最初の層で捕獲された白血球は色素基質の加水分解を触媒し、着色することになる。
【００３２】
３−アセチルインドキシルおよび色素基質としてニトロブルーテトラゾリウムクロリドを用いる実際の反応機構は図２に示される。生成した着色色素は水不溶性であり、膜の頂部に発現した色彩は洗い流されない。色彩は最初の層に捕獲された白血球数に直接比例している事が見出された。任意の赤血球および／または他の妨害物質は既に洗浄溶液で洗い流されているので、得られた暗青緑色はカラースケールと眼で比較して半定量的に読めとれる。定量的な読みに対し、反射計が用いられる。図３はカラー形成が時間に対しプロットされる反応速度を示す。次に本発明をさらに説明するが、これに限るものではない。
【実施例１】
【００３３】
全血ＷＢＣテスト
５ミリグラムの３−アセチル−インドキシル基質は無水エタノールに溶解し、基質を用いてＷＢＣ捕獲膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ  Ｂ，Ｐａｌｌ，Ｉｎｃ，ＮＹ）に含浸させた。膜を次に１５分間４０ＥＣでオーブンで乾燥させた。洗浄溶液は生理的食塩水ｍＬあたり５ｍｇのＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウムクロリド一水和物）を溶解して調製した。デバイスは図１Ａに示したように集めた。マイクロリットル当り８０００個の白血球をもつクエン酸化した全血サンプルを食塩水で連続して希釈しマイクロリットル当り８，６，４，２および０．８千のＷＢＣのものを用意した。３０マイクロリットルの各サンプルをデバイスの頂部にピペットで取った。サンプルを各々添加後、２５０マイクロリットルの洗浄溶液をデバイスにピペットで取り、赤血球を洗浄し酵素反応を開始した。１０分後に発現した色強度はデバイスの頭開口によってミノルタＣＲ３２１クロモメーターで測定した。マイクロリットル当りの８００ないし８０００の範囲の機器により得られた白血球数に対する色測定のプロットは図４に示される。この製剤はマイクロリットル当り少なくとも８００個の細胞の検出限度を示した。
【実施例２】
【００３４】
ミルクに対するＷＢＣ数テスト
ミルクはエステラーゼ活性を示す物質を含み、白血球数のためのエステラーゼテストの感度はこれら妨害物質の分量に従って変化する。ミルク中のエステラーゼ活性は、ミルク中にあるタンパク質、酵素インヒビター等によって、ミルクに実際にあるエステラーゼの量が約１０％ないし９０％の範囲である。従って、ミルク中の白血球数を数える前に妨害物質を除去することが重要である。表１はミルク中のエステラーゼ活性が減少した例を示す。
【００３５】
テストデバイスは１００％エタノールに先ず１０ｍｇ／ｍＬの３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルオキシ）−インドールを溶解することによって作成した。この溶液を用いてホワットマン濾紙に含浸させた。洗浄溶液は１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ＝１０）であった。ミルクサンプル４０マイクロリットルをテストデバイスのサンプルウェルに入れ、すぐに１６０マイクロリットルの洗浄溶液を入れた。テストデバイスを１０分後にミノルタＣＲ３２１色度計を用いて読み取った。
【００３６】
１１個の新鮮なミルクサンプルを地方の酪農場から入手した。これらサンプルを分割した。体細胞数をフローサイトメトリーで関連実験室にて測定し、白血球数をテストデバイスで評価した。テストデバイスはミクロリットル当り１００個の細胞の低検出限界を示した。体細胞数に対する色彩発現の関係は図５に示す。テストデバイスはフローサイトメーターを用いる参照細胞数法で良い相関関係を示し、相関係数は０．９６５であった。
【００３７】
【表１】
2005526513.tif 000003
【実施例３】
【００３８】
人尿のためのＷＢＣテスト
実施例２に従ってテストデバイスを作成した。尿路感染の患者からの４個のサンプルをテストデバイスを用いて、同じ試薬を用いる尿試験紙法によってアッセイした。表２は同じ製剤を用いる尿試験紙バージョンよりも、テストデバイスが尿中の白血球に遥かに感受性が高かったことを示している。
表２
ミノルタ色度計による呈色の読み
尿（マイクロリットル当りの細胞）２００   ６００   １５００  ２０００
テストデバイスの読み            ４．０  １０．７  ２６．８   ３７．８
尿試験紙の読み                  ６．３   ７．１    ８．０    １０．２
【００３９】
従って本発明は血液、尿、またはミルクのような生理的流体中の白血球数を計測するための方法とデバイスを提供する。デバイスは種々の医薬、農業および災害時の在宅治療に用いられる。デバイスは例えば、医院での白血球数の迅速な測定のために、または患者の家で白血球数をモニタするために用いられる。その方法およびデバイスはまた乳腺炎について酪農動物をモニターする際に有用である。
【００４０】
本発明の方法とデバイスは、白血球の成分であるＣＤ４をモニターするために用いられる。これは特にカクテル薬治療によりＡＩＤＳ患者を治療する際に重要である。ＡＩＤＳを治療するために現在入手できるカクテルは６０種類以上あり、ＣＤ４ならびにウイルス荷重をモニターすることによって薬品の有効性をモニターすることが重要であるからである。今まで、フローサイトメーターはＣＤ４をモニターするために必要であり、その機器は一般に良く装備された病院や営利主義の研究所で入手できるだけであった。
【００４１】
ＣＤ４をモニターするために、ＣＤ４に標識をつけた抗体をサンプルと共にインキュベーションする。次いでサンプルを本発明のデバイスに適用し、任意のＣＤ４−抗体共役体を保持体に保持する。保持体は洗浄し妨害物質を除去し、抗体の標識を読む。サンプルにごく少量またはＣＤ４がない場合、標識を付けた抗体全部は他の妨害物質と共に洗い流される。しかし、ＣＤ４はサンプルに存在していても保持体に保持され、標識を読み取りＣＤ４が示される。
【００４２】
ここに参照した全参考文献は、従来の応用法や特許を含め、ここにその全体が参考のために組み込まれる。
【００４３】
前述の特定の実施例は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにして、他の者が、当業者の通常の知識を適用することにより、本発明の一般的な概念から離れることなく、特定の実施のための種々の応用に容易に修正および／または適応することができる。このため、このような適用および修正は、ここで示された教示およびガイダンスに基づき、開示した実施例の同等物の意味するところおよび範囲のなかにある。ここでの表現または用語は、記載の目的のためであって制限のためではないと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】Ａは本発明のデバイスの分解組立図である。Ｂはデバイスへの流体サンプルの添加を示す図である。Ｃはデバイスの洗浄を示す図である。
【図２】色素の反応機構を示す図である。
【図３】エステラーゼと基質の反応率を示す図である。
【図４】白血球数と呈色の読みの相関関係を算定する図である。
【図５】生体細胞数と呈色の読みの相関関係を算定する図である。
【符号の説明】
【００４５】
１０      白血球数を測定する装置
１        デバイスの頂部ピース
２        デバイスの頂部ピースの入口穴
３        白血球捕獲膜
４        水吸収剤相
【図１】
2005526513.tif 000004
【図２】
2005526513.tif 000005
【図３】
2005526513.tif 000006
【図４】
2005526513.tif 000007
【図５】
2005526513.tif 000008
【国際調査報告】
2005526513.tif 000009
2005526513.tif 000010