(57)【要約】本発明は、融合タンパク質とサポニンアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。この融合タンパク質は、コアポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に融合する異種疎水性ペプチドを含む。コアポリペプチドは少なくとも１個の防御エピトープを含む。この組成物中のサポニンアジュバントは遊離した形で存在する。免疫原性組成物を含み、場合によっては追加の免疫活性成分を含んでいてもよいワクチンも提供する。このようなワクチンを調製する方法、及びワクチンの製造への免疫原性組成物の使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質が、コアポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に融合する異種疎水性ペプチドを含み、前記コアポリペプチドが少なくとも１個の防御エピトープを含み、サポニンアジュバントが遊離型であることを特徴とする、融合タンパク質とサポニンアジュバントとを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記コアポリペプチドがアピコンプレックス門生物のタンパク質成分であることを特徴とする請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記コアポリペプチドがピロプラズマ目又はコクシジウム亜綱の生物のタンパク質成分であることを特徴とする請求項２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記コアポリペプチドがアイメリア属又はバベシア属の生物のタンパク質成分であることを特徴とする請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記異種疎水性ペプチドがＮ末端の疎水性配列に由来することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記異種疎水性ペプチドが内部の疎水性配列に由来することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記異種疎水性ペプチドがＣ末端疎水性配列に由来することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記Ｃ末端疎水性配列が崩壊促進因子（ＤＡＦ）に由来することを特徴とする請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記サポニンアジュバントがキラヤサポニンであることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と薬剤として許容される担体とを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項１１】
少なくとも１個の追加の免疫活性成分を含むことを特徴とする請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
凍結乾燥型であることを特徴とする請求項１０又は１１のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と薬剤として許容される担体とを混合することを含むことを特徴とする請求項１０に記載のワクチンの調製方法。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のワクチン製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質とサポニンアジュバントとを含む免疫原性組成物に関する。ワクチン、ワクチン調製方法、及び免疫原性組成物の使用にも関する。
【０００２】
現代のヒト用薬物及び動物用薬物においては、多かれ少なかれ身体を衰弱させる疾患若しくは感染を予防し、又はある程度の収益性を確保するために定期的にヒト及び動物にワクチンを接種している。２０００年時点で、動物ワクチン接種用生物学的製剤単独の世界市場は２５億米ドルであった（Ｗｏｏｄ−Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ、２００１）。あらゆるワクチン接種戦略の目標は、感染又は疾患（の症状）に対する防御免疫系の活性化状態を受療者に獲得させることである。この免疫防御作用を生じさせるために、免疫系が防御応答を準備できるように感染体（の一部）を受療者に与える。免疫記憶現象によって、このワクチン接種が標的とする本当の感染が将来発生したときに、受療者の免疫系が誘発されてより迅速かつ強力に反応する。
【０００３】
このため、ワクチンは、通常、感染性微生物の生体、弱毒化生体又は死体、タンパク質サブユニット又はその核酸などを使用して、標的感染体又はその一部から調製される。これらすべてが、ヒト又は動物標的において所望の防御免疫応答を誘導する抗原性構造体を含む（又はコードする）ことが理想的である。
【０００４】
安全のためにはサブユニットワクチンが好ましい。次いで、発現系の細胞によって、（組換え）核酸分子からの発現を介してサブユニットを産生することができる。
【０００５】
抗原が、感染又は疾患の徴候を抑制する免疫応答を誘発できるときにのみ、その抗原を感染防御抗原又は免疫原と称する。
【０００６】
したがって、サブユニットワクチンの分野では、発現タンパク質が抗原性であっても免疫原性ではないことが多い。現場条件下で有効であり経済的に見合うワクチンの製造に十分な免疫原性でないことは言うまでもない。
【０００７】
しかし、サブユニットの免疫原性の最適化は、十分な発現収率を得ることとは相容れないことがある。これは、タンパク質を発現する細胞装置の過負荷及び崩壊が過剰発現によってもたらされることがあり、或いはタンパク質を自然に発現する細胞内で起こるのと同じ翻訳後修飾を異種タンパク質の発現に用いられる発現系がほとんど起こさないことによると考えられる。例えば、分泌又は表面露出（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）をもたらす疎水性シグナル配列のプロセシングは、細胞小器官又は外膜との相互作用を通して発現系細胞に問題を生じることがある。したがって、細胞発現系においてＣ末端疎水性アンカーシグナルなしでタンパク質サブユニットを産生させること、及びＮ末端シグナル配列を欠失させ又は修飾することが一般に行われている。しかし、この手法の欠点は、免疫原性が一般に低いことである。
【０００８】
このような方法で産生されるタンパク質の低免疫原性の問題を解決するために、アジュバントのサブユニット抗原（免疫刺激性物質）が一般に添加される。このような物質は比較的安価であり、極めて効率的な場合がある。頻繁に使用されるアジュバントは、例えば、アルミニウム塩、オイルエマルジョン、脂質Ａ及びサポニンである。しかし、これらの物質のほとんどは、適用部位の組織炎症としてある種の局所的反応を引き起こす。これは、受療者に不快感を与え、動物用の場合には、生産性（例えば、乳又は卵の生産、飼料要求率）の低下、屠殺場での肉又は屠殺体の不適をもたらす恐れがある。
【０００９】
有効濃度で細胞障害性のあることが判明したこれらのアジュバントの１つは、キラヤサポニンである。サポニンの使用による局所的反応のタイプ及び強度は、適用量に依存することはもちろんであるが、使用材料又は特定のバッチの純度にも左右される。Ｂ．Ｒｏｎｎｂｅｒｇ等（１９９５、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻、１３７５〜１３８２ページ）は、様々なキラヤサポニン画分の溶血性細胞障害性について述べている。様々な画分の毒性濃度は５〜１００μｇ／ｍｌである。膨潤から皮膚変質、さらには実験に使用したマウスの死亡にまで及ぶ局所的反応が認められた。Ｐｉｌｌｉｏｎ等（１９９６、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８５巻、５１８〜５２４ページ）は類似の研究で、濃度０．００６〜１．５ｍＭのキラヤサポニン誘導体による赤血球溶血について述べている。Ｌｅｕｎｇ等（１９９７、ＢＢＡ  １３２５巻、３１８〜３２８ページ）は、細胞溶解原因が遊離サポニンと細胞膜中のコレステロールの反応であると述べている。
【００１０】
そのアジュバント活性を上回るサポニンの毒性を抑える常法は、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）中に導入することである（国際公開第９６１１７１１号）。免疫刺激性複合体は、サポニン、リン脂質及びコレステロールを混合して形成される。条件が適正であれば、かご状構造をした粒子が形成される。抗原性タンパク質を組み込むと、表面にこれらの抗原を提示し、それによって感染細胞上の「自然な」抗原提示を模倣する粒子構造を生成させることができる（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．＆Ｋ．Ｌ．Ｂｅｎｇｔｓｏｎ、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９巻、９４〜１０２ページ、及び欧州特許第１０９．９４２号に概説されている）。
【００１１】
或いは、ＩＳＣＯＭ−マトリックス粒子を生成させることができる。これは、サブユニット抗原が組み込まれていないが後で添加されるＩＳＣＯＭ様粒子である。
【００１２】
どちらの場合でもキラヤサポニンの細胞障害作用が中和される。Ｈｓｕ等（１９９６、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４巻、１１５９〜１１６６ページ）は、エピトープを含む融合ペプチドをＩＳＣＯＭ中に組み込むことによってこのような手法を選択した。
【００１３】
残念ながら、ＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭ−マトリックスの生成は複雑で費用がかかり、例えば動物用薬物に一般に適用するには不経済である。遊離サポニン、すなわちＩＳＣＯＭに組み込まれていないサポニンの使用はそれよりも簡単で安価である。しかし、アジュバントとして通常有効な濃度では、上述したように、サポニンの有害な細胞障害性が現れる恐れがある。
【００１４】
本発明の一目的は、大きな局所的有害作用がない有効な免疫刺激を与え、サポニンで補強されたタンパク質抗原の免疫原性組成物を費用効果の高い生成レベルで初めて提供することである。
【００１５】
今回、驚くべきことに、疎水性ペプチドを免疫原性タンパク質のコアに融合させることによって、この融合タンパク質が、効率的免疫応答を依然として誘導しながら、得られる組成物が局所的有害反応を引き起こさないような低濃度の遊離サポニンと結合（ｃｏｍｂｉｎｅ）することができることを見出した。
【００１６】
これは、サポニンをＩＳＣＯＭ又はＩＳＣＯＭ−マトリックス粒子に組み入れて細胞障害性を抑える一般的な傾向とは対照的である。また、これは、異種発現系において発現されるサブユニットタンパク質から伸びる疎水性アミノ酸（ａａ）を常法に従い除去することとは反対である。発現系から得られる融合タンパク質の収率が低下したとしても、遊離サポニンとしての免疫原性の増大、及び局所的有害反応の減少によって補われる。
【００１７】
したがって、本発明は、十分に安全で免疫学的に有効であり、経済性に見合うサポニン補強されたサブユニットワクチンを初めて提供するものである。
【００１８】
したがって、第１の側面において本発明は、融合タンパク質が、コアポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に融合する異種疎水性ペプチドを含み、コアポリペプチドが少なくとも１個の防御エピトープを含み、サポニンアジュバントが遊離型であることを特徴とする、融合タンパク質とサポニンアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１９】
免疫原性組成物とは、受療者に投与すると感染又は疾患を抑える免疫応答をその受療者に誘発させる組成物であると理解される。これは、免疫系成分が刺激されることを意味する。これらの免疫系成分は、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、キラー細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの細胞成分、又は抗体、サイトカイン（例えば、インターフェロン又はインターロイキン）などの免疫系体液成分とすることができる。
【００２０】
本発明では、「タンパク質」という用語はアミノ酸分子鎖を意味する。タンパク質は、一定の長さに限定されるものではなく、必要に応じて、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によってインビボ又はインビトロで修飾することができる。とりわけ、ペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドがこの定義に含まれる。タンパク質又はペプチドは、天然由来でも合成由来でもよい。
【００２１】
融合タンパク質とは、天然には存在しない２本以上のアミノ酸鎖の集合体である。これらの鎖は長さが同じでもよいが、通常は長さが異なり、異種疎水性ペプチドはコアポリペプチドより短くするのが好ましい。これらの鎖の結合は、いくつかの手段、例えば
−アミノ酸配列の直接的な又は中間体構造を経由した脱水、エステル化などによるカップリング、共役又は架橋によって化学的に、
−巨大分子構造中又は構造上での捕獲によるカップリングによって物理的に、
−２本の鎖の各々をコードすることができる各核酸断片を含む各組換え核酸分子の結合によって単一の連続した発現産物が最終的に産生される分子生物学的融合によって、実施することができる。
【００２２】
サポニンは、植物から抽出して得られる界面活性グリコシドである。よく知られているサポニンは、南アメリカシャボンノキ（Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏａｐ  ｔｒｅｅ）キラヤ  サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）［モリナ（Ｍｏｌｉｎａ）］の樹皮から抽出されるキラヤサポニンである（Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｋ．、１９７４、Ａｒｃｈ．Ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．４４巻、２４３〜２５４ページ）。抽出方法に応じて様々なサポニン製品が得られる。スウェーデンＩｓｃｏｔｅｃ  ＡＢ社のＳｐｉｋｏｓｉｄｅ（商標）、デンマークＳｕｐｅｒｆｏｓ  ＡＳ社のＱｕｉｌ  Ａ（商標）、デンマークＮｏｒ−Ｖｅｔ社のＱ−ｖａｃ（商標）、米国Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ社のＱＳ−２１（商標）、チリＤｅｓｅｒｔ  Ｋｉｎｇ社のＶａｘ−Ｓａｐ（商標）などいくつかのキラヤサポニン製品が市販されている。粗製品もあれば精製品もある。
【００２３】
本発明では、サポニンは、コレステロール及びリン脂質と意図的に混合してＩＳＣＯＭ又はＩＳＣＯＭ−マトリックス粒子を生成させるのでなければ、遊離した形をしている。
【００２４】
アジュバントは、一般に、受療者の免疫応答を非特異的に増強する物質である。
【００２５】
疎水性ペプチドに結合するコアポリペプチドは、そのタンパク質の天然体には存在するＮ末端又はＣ末端疎水性領域を含まないポリペプチドに関係する。すなわち、本発明のコアタンパク質は、病原体又は生物から得られるタンパク質成分である。その天然体中に疎水性末端を含まないタンパク質は、その天然組成物をさらに修飾しなくても「コア」として働くことができる。
【００２６】
これらの疎水性領域は、化学的処置又は酵素による処置によってタンパク質から切り離すことができる。このようなタンパク質をコードする核酸配列は、これらの疎水性領域がもはや発現されないように遺伝子工学技術によって修飾されるのが好ましい。
【００２７】
原則的には、医学上重要なあらゆるタンパク質が、本発明のコアポリペプチドとして働くことができる。コアポリペプチドは、ヒト又は動物に疾患を起こすことが知られている又は予測される感染体又は生物学的要素の成分であることが好ましい。例えば、癌、ＨＩＶ若しくはＡＩＤＳ、（自己）免疫疾患、神経系疾患、神経変性病、呼吸器疾患又は皮膚病を引き起こす感染体若しくは感染要素。
【００２８】
より好ましくは、コアポリペプチドは、例えば、感染体から単離された後に、発現系において発現された後に、生きた組換えキャリア微生物（ＬＲＣＭ）中の挿入断片として使用することによって、又はＤＮＡワクチンとして使用した後に、ワクチン接種試験において免疫原性の効力を示すタンパク質成分である。
【００２９】
本発明のコアポリペプチドとして働き得るこのようなタンパク質の例は、エンベロープ、マトリックス、細胞小器官又は核から得られるタンパク質、或いは寄生虫、細菌又はウイルス由来の非構造又は糖タンパク質、及びそれらの宿主中でそれらが誘導又は相互作用するタンパク質である。
【００３０】
さらに好ましくは、コアポリペプチドは、
・寄生虫タンパク質：例えば、アイメリア属寄生虫の（可溶性又は内部の）酵素、又はバベシア属由来の外抗原、メロゾイト表面抗原などの可溶性感染防御抗原、
・ウイルスタンパク質：例えば、レトロウイルス由来のタンパク質；エンベロープタンパク質ｇｐ２０、ｇｐ４０、ｇｐ１２０、ｒｅｖ、ｔａｔ又はｎｅｆタンパク質、レトロウイルス群特異抗原；ニューカッスル病ウイルス融合又は赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質；インフルエンザウイルス赤血球凝集素又はノイラミニダーゼタンパク質；ビルナウイルスＶＰ２；コロナウイルスのスパイク又はマトリックスタンパク質；ペスチウイルスのエンベロープタンパク質Ｅｍｓ、Ｅ１又はＥ２；ブタの生殖及び呼吸器疾患ウイルスのウイルスタンパク質、
・細菌タンパク質：毒素、付着因子、繊維タンパク質、フィムブリエ（ｆｉｍｂｒｉａｅ）タンパク質、ピラム（ｐｉｌｕｍ）タンパク質、外膜タンパク質など。
【００３１】
・誘導タンパク質：インターロイキン；インターフェロン；ｐ５３カスケード、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ、癌胎児抗原などの癌抗原；フィブロネクチン又はガングリオシドなどの腫瘍性血管新生因子；受容体分子など、の成分である。
【００３２】
異種という用語は、本発明では、結合するコアポリペプチドに関して、疎水性ペプチドの起源を指す。したがって、あるペプチドが、特定の種の生物又は病原体においてコアポリペプチドが由来するのと同じタンパク質の一部でない場合には、そのペプチドは異種起源である。例えば、バベシア  ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）由来のＢｄ３７タンパク質のＣ末端疎水性ペプチドは、バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）由来のＢｄ３７タンパク質相同体のコアポリペプチドに融合するものであれば、異種ペプチドとして適格である。
【００３３】
一般に、疎水性ペプチドは、非極性環境を好むアミノ酸鎖であると理解される。このようなペプチドは、当分野では親油性又は水不溶性としても知られる。ペプチドの疎水性を評価することができるコンピュータアルゴリズムがいくつか開発されている。本発明では、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのヒドロパシーアルゴリズム（Ｊ．Ｋｙｔｅ及びＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７巻、１０５〜１３２ページ）を使用する。この広範に用いられているプログラムは、あるアミノ酸ウィンドウにわたって自由移動エネルギー（ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ）の移動平均を計算して、データ点の表、又はグラフとして表すことができる疎水性プロファイルを作成する。表では正の移動平均数は疎水性アミノ酸を示し、疎水性プロファイルのグラフ表示では中央値よりも低い部分は疎水性である。
【００３４】
このアルゴリズムは、タンパク質分析又はタンパク質構造予測用ソフトウエアパッケージのほとんどで利用可能であり、インターネットを通してほとんどのバイオインフォマティクス研究機関のウェブページから入手できる。
【００３５】
本発明では、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性分析から得られるデータ点の６０％以上が疎水性の値を示す場合にはペプチドを疎水性と考える。疎水性は、５個のアミノ酸のウィンドウを用いて計算されなければならない。疎水性百分率は、このような分析から得られるデータ表から計算される。すなわち、疎水性データ点の数（正の移動平均数）をペプチドのａａの総数で割る。好ましくは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性分析から得られるデータ点の７０％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％が疎水性であり、数値が大きい方が好ましい。
【００３６】
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロファイルを説明すると、表１は、本発明の融合タンパク質を産生するために使用することができる様々な出所からの疎水性ペプチドであり、それらに付随する疎水性プロファイルを図１に示す。この図には疎水性百分率も記載してある。
【００３７】
本発明の疎水性ペプチドは、３〜２００アミノ酸の配列、より好ましくは４〜１５０、さらにより好ましくは４〜１００、さらにより好ましくは５〜７５、最も好ましくは６〜５０アミノ酸の配列を含む。
【００３８】
本発明の融合タンパク質を産生するために使用することができる疎水性ペプチドは、それらが由来するドナータンパク質の様々な領域から取得することができる。例えば、
・Ｎ末端：
シグナル配列などのＮ末端疎水性ペプチドは、メリチン（ミツバチ毒液）、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、酵母接合フェロモンアルファ因子、バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６７、仮性狂犬病ウイルスｇＸなどの多様なタンパク質から誘導することができる。これらのシグナル配列は、Ｉｚａｒｄ＆Ｋｅｎｄａｌｌ（１９９４、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３巻、７６５〜７７３ページ）、Ｃｌａｒｏｓ等（１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７巻、３９４〜３９８ページ）、及びＬａｍｍｅｒｔｙｎ＆Ａｎｎｅ（１９９８、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１巻、１〜１０ページ）によって概説されている。
【００３９】
・内部：
内部疎水性ペプチド配列は、例えば、膜貫通領域（ＴＭＲ）である。これらは、タンパク質のＮ末端又はＣ末端の近くに位置することができるが、例えば、膜貫通セグメントを含むタンパク質の場合にはさらに内部に位置することができる。例えば、麻疹ウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼから得られる膜アンカー、「７回膜貫通ドメイン」受容体のような膜貫通シグナル伝達受容体、膜チャネル、細胞の細孔及びポンプなどである。このようなシグナルは、Ｇｏｄｅｒ＆Ｓｐｉｅｓｓ（２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３１巻、８７〜９３ページ）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ＆Ｍａｎｏｉｌ（１９９０、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、４巻、１０９〜１１２ページ）、及びＡｌｂｅｒｔｓ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（２００２、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｐｕｂｌ．、ＩＳＢＮ：０８１５３４０７２９）のような一般テキストに概説されている。
【００４０】
・Ｃ末端：
Ｃ末端疎水性ペプチドは、例えば、ヒトＣＤ１４（単球分化抗原（ＮＣＢＩタンパク質データベース受託番号Ｐ０８５７１）、ニワトリＴＧＦ−β神経栄養因子受容体１（ＮＣＢＩ受託番号Ｏ１３１５６）、及びサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞壁タンパク質１（表１及び図１参照）のＣ末端由来の、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーシグナルである。このようなＧＰＩアンカーの諸特性は、Ｐ．Ｅｎｇｌｕｎｄ（１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＢｉｏＣｈｅｍ．、６２巻、１２１〜１３８ページ）及びＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ＆Ｍａｙｏｒ（２００１、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、５８巻、１９６９〜１９８７ページ）によって概説されている。
【００４１】
ＮＢ：ＮＣＢＩタンパク質及び核酸配列データベースは、インターネット上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでアクセスすることができ、なかでも核酸配列又はタンパク質配列を得るためのそれらの使用は当分野でよく知られている。
【００４２】
【表１】
2005532405.tif 000002
【００４３】
図１に示す疎水性プロファイルの計算に使用されるコンピュータパッケージ（Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ、ＳｅｉＥｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＵＳＡ）は、０を超える値を疎水性アミノ酸配列に帰属させ、親水性配列には負の値を与える。移動平均は、５個のａａのウィンドウにわたって計算される。
【００４４】
このようなプロファイルを計算する様々なコンピュータパッケージを使用するときには、わずかな違いがあり得ることは言うまでもない。しかし、疎水性アミノ酸領域と親水性アミノ酸領域の差は依然として明確である。
【００４５】
文献では、融合タンパク質は、一般に、下流のプロセシング中に容易に精製されると述べられている。しかし、この目的に使用される融合ペプチドは、本発明の疎水性ペプチドとしては不適である。
【００４６】
エピトープとは、Ｔ細胞受容体が応答する抗原性分子、又はＢ細胞が抗体を産生する抗原性分子の一部と理解される。したがって、本発明の防御エピトープは、特異的Ｔ細胞を誘導し、或いはＢ細胞を活性化して、これらの細胞又は抗体が感染又は疾患過程を阻む免疫反応を生じるように特異的抗体を産生する。したがって、このような防御エピトープによって、防御免疫応答を生じさせることができる。
【００４７】
防御エピトープは、本発明の融合タンパク質のコアポリペプチド部分に含まれる。
【００４８】
コアポリペプチドに結合した異種疎水性ペプチドもエピトープを含むことができる。融合タンパク質中に２個以上のエピトープが存在すると、本発明の融合タンパク質の免疫有効性をさらに高くすることができる。
【００４９】
今日、タンパク質エピトープを容易に特定する様々な技術が利用可能である。Ｂ細胞エピトープを検出するのに特に適切な１つの経験的方法はいわゆるＰＥＰＳＣＡＮ法である。これは、Ｇｅｙｓｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、３９９８〜４００２ページ（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１０２巻、２５９〜２７４ページ（１９８７）、国際公開第８４／０３５６４号、国際公開第８６／０６４８７号、及び米国特許第４，８３３，０９２号に記載されている。ＰＥＰＳＣＡＮ法は、実施が容易な迅速で定評のあるエピトープ検出方法である。この方法は、対象タンパク質に連続的に重複する一連のペプチド断片の合成、及びその後のタンパク質特異的抗体を用いたこれらのポリペプチドの試験を含む。
【００５０】
また、タンパク質のアミノ酸（又は核酸）配列（又は、それをコードする遺伝子）が与えられると、現在知られているエピトープとそれらの配列及び／又は構造上の一致に基づいて、特定のタンパク質領域を免疫学的に重要なエピトープとして指定することができるコンピュータアルゴリズムを利用することができる。これらの領域は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ（Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ及びＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻、３８２４〜３８２８ページ）による親水性判定基準と、Ｃｈｏｕ及びＦａｓｍａｎ（Ａｄｖ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４７巻、４５〜１４８ページ（１９８７）、及び米国特許第４，５５４，１０１号）による２次構造との組み合わせに基づいて求められる。このようなアルゴリズムの組み合わせを使用するプログラムの例はＰｅｐＰｌｏｔ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等、１９８６、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４巻、３２７〜３３４ページ）である。
【００５１】
Ｔ細胞エピトープは、通常、（一般に、Ｂ細胞エピトープが位置する）極性親水性外面から離れて折りたたまれたタンパク質の疎水性領域中に隠れているので、コアポリペプチドに融合する異種ペプチドの疎水性は、Ｔ細胞エピトープを組み込むのに特に適している。
【００５２】
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ等（１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、９８巻、９〜５２ページ）によって概説されたように、Ｔ細胞エピトープは、短い線状アミノ酸配列からなり、ＡＰＣによるそれらのプロセシングの後にのみＭＨＣ−Ｉとして免疫系に提示することができる。
【００５３】
多数ある例のうちの１つは、ヒトヘルペスウイルス４に由来するＥＢＮＡ−３Ｃ核抗原（ＮＣＢＩ受託番号Ｓ２７９２２）であり、表１及び図１にも記載されている。
【００５４】
Ｔ細胞エピトープは、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙの両親媒性基準を用いて、Ｂ細胞エピトープのようにコンピュータによって配列から予測することができる（１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、１０５９〜１０６２ページ）。これは、Ｌｕ等（１９９２、Ｖａｃｃｉｎｅ  １０巻、３〜７ページ）に概説されている。これらの方法を使用する有効性は、Ｈ．Ｍａｒｇａｌｉｔ等（１９８７、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻、２２１３〜２２２９ページ）に説明されており、このような方法を用いたＴ細胞エピトープの予測の成功率は７５％と述べられている。
【００５５】
異種疎水性ペプチド及び／又はコアポリペプチドは、他の免疫活性化サインも含むことができる。このようなサインは、ケモカイン、免疫毒素などからの免疫賦活性シグナルを含むことができる。
【００５６】
本発明の融合タンパク質を産生する好ましい方法は、遺伝子工学技術及び組換え発現系を使用するものである。これらは、（組換え）核酸配列、ＬＲＣＭ及び宿主細胞の使用を含むことができる。
【００５７】
本発明の融合タンパク質をコードするのに使用することができる核酸配列は、当業者に周知の標準分子生物学技術によって取得し、操作して、発現させることができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２０００、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）などの標準テキストに極めて詳細に説明されている。
【００５８】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸を構築するために、ＤＮＡプラスミドを使用することが好ましい。このようなプラスミドは、例えば、ＤＮＡ挿入断片量の増加、プローブとしての使用、及びさらなる操作のためのツールとしての使用に有用である。このようなクローニング用プラスミドの例は、ｐＢＲ、ｐＵＣ及びｐＧＥＭシリーズのプラスミドであり、これらすべてが複数の業者から入手可能である。
【００５９】
ポリペプチドコア及び疎水性ペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、別個のプラスミドにクローン化し、改変して所望のコンホメーションにし、次に１個の組換えプラスミドに合体させることができる。ペプチド及びコアの読み枠は、単一の連続融合タンパク質を発現することができるように並べられる。
【００６０】
本発明の疎水性ペプチド及び／又はコアポリペプチドをコードすることができる核酸配列は、例えば、制限酵素消化技術、部位特異的突然変異技術、又はポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって修飾することができる。ＰＣＲを実施する標準技術及び手順は、例えば、Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９９５、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ８７９６９４４７３）に広範に記載されている。
【００６１】
タンパク質精製、検出、又は発現レベルの改善のために、追加の配列を加えることができる。これによって、疎水性ペプチドとコアポリペプチドの融合体をコードする配列よりも大きい組換え核酸分子又はプラスミド中の最終挿入断片を得ることができる。このような追加の要素をインフレームに挿入すると、これらは、本発明の融合タンパク質と一体になる。
【００６２】
組換え核酸分子からの核酸配列の発現に必須なのは、核酸配列の転写を制御できるように核酸が転写制御配列に作動可能に結合されていることである。転写制御配列は、当分野で周知であり、とりわけプロモーター及びエンハンサーを含む。使用している発現系においてプロモーターが機能的である限り、プロモーターは、遺伝子転写を誘導することができるあらゆる真核生物、原核生物又はウイルスのプロモーターから選択されることは当業者には明白である。
【００６３】
細菌、酵母、真菌、昆虫及び脊椎動物細胞発現系が極めて頻繁に使用される。このような発現系は当分野では周知であり、一般に、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（オランダ）から市販されている。
【００６４】
本発明の融合タンパク質の発現に使用される宿主細胞は、融合タンパク質をコードする配列を発現する細菌由来のプラスミド又はバクテリオファージと併用される細菌起源の細胞、例えば、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス  サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種又はカウロバクター  クレセンツ（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｓ）とすることができる。宿主細胞は、真核生物起源、例えば、酵母特異的ベクター分子と組み合わせた酵母細胞、又はベクター若しくは組換えバキュロウイルスと組み合わせた昆虫細胞のようなより高度の真核細胞（Ｌｕｃｋｏｗ等；Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７〜５５（１９８８））；例えば、Ｔｉプラスミドに基づくベクター若しくは植物ウイルスベクターと組み合わせた植物細胞（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．等；Ｃｅｌｌ  ３２巻、１０３３ページ（１９８３））；又はやはり適切なベクター若しくは組換えウイルスと組み合わせたＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）若しくはＣｒａｎｄｅｌｌ−Ｒｅｅｓネコ腎細胞のような哺乳動物細胞とすることもできる。
【００６５】
本発明の発現融合タンパク質の例は、異種疎水性配列が融合し、バキュロウイルス発現ベクター系中で発現される（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＣ２８１３１から誘導可能な）トリインフルエンザウイルスＨ５  ＨＡタンパク質コアである。実施例４を参照されたい。
【００６６】
これらの発現系に次いで、植物細胞、又は寄生虫に基づく発現系が興味のある発現系である。寄生虫発現系は、例えば、仏国特許出願公開第２  ７１４  ０７４号、及び米国ＮＴＩＳ番号ＵＳ  ０８／０４３１０９（Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．及びＲｏｇｅｒｓ，Ｗ．、１９９３）に記載されている。生物学的に利用されるポリペプチドの植物細胞発現系は、例えば、Ｒ．Ｆｉｓｃｈｅｒ等（１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６２巻、８１０〜８１６ページ）、及びＪ．Ｌａｒｒｉｃｋ等（２００１、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎ．１８巻、８７〜９４ページ）に考察されている。
【００６７】
発現はいわゆる無細胞発現系においても実施することができる。このような系は、特定の系において機能するプロモーターに作動可能に結合された適切な組換え核酸からの発現に必須のすべての因子を含む。例は、エシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解系（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はウサギ網状赤血球溶解系（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）である。
【００６８】
本発明のこの側面の好ましい形態においては、本発明による免疫原性組成物は、コアポリペプチドがアピコンプレックス門生物のタンパク質成分であることを特徴とする。
【００６９】
アピコンプレックス門には、（獣医学）医学的に関連するメンバーを含むいくつかの分類群、例えば、ピロプラズマ目、コクシジウム亜綱及び住血胞子虫目が属する。本発明は、例えば、異種疎水性ペプチドに融合したプラスモディウム  ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）ＭＳＰ−１１９コア（Ｌｉｎｇ等、１９９４、Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻、６３〜６７ページ）を含む融合タンパク質を産生するために極めてうまく使用される。
【００７０】
より好ましい形態では、本発明による免疫原性組成物は、コアポリペプチドがピロプラズマ目又はコクシジウム亜綱の生物のタンパク質成分であることを特徴とする。
【００７１】
ピロプラズマ目には、いくつかの関連する分類群、例えば、それぞれ関連するバベシア属及びタイレリア属を含むバベシア科及びタイレリア科が属する。
【００７２】
コクシジウム亜綱には、なかでも、アイメリア、クリプトスポリジウム、ネオスポラ、トキソプラズマなどの関連する属を含むアイメリア科、クリプトスポリジウム科及びウマニクホウシムシ科が属する。
【００７３】
この側面のさらにより好ましい形態においては、本発明の免疫原性組成物は、コアポリペプチドがアイメリア属又はバベシア属の生物のタンパク質成分であることを特徴とする。
【００７４】
上で概説したように、本発明の融合タンパク質を生成するために使用することができる疎水性ペプチドは、それらの疎水性ペプチドが由来するドナータンパク質の異なる領域、例えば、Ｎ末端、内部又はＣ末端から得ることができる。
【００７５】
したがって、本発明の第１の側面の別の好ましい実施形態においては、異種疎水性ペプチドはＮ末端の疎水性配列に由来する。
【００７６】
本発明の第１の側面の別の好ましい実施形態においては、異種疎水性ペプチドは内部の疎水性配列に由来する。
【００７７】
本発明の第１の側面のさらに別の好ましい実施形態においては、異種疎水性ペプチドはＣ末端の疎水性配列に由来する。
【００７８】
好ましい実施形態においては、Ｃ末端疎水性配列は崩壊促進因子（ＤＡＦ）に由来する。
【００７９】
ＣＤ  ５５としても知られる崩壊促進因子は、そのＣ末端に疎水性アミノ酸領域を有する。これは、ＧＰＩアンカーとして機能する（なかでも、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅｌｌｅｒ＆Ｗａｎｇ、１９９４、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２３巻、４８５〜４９１ページによって概説されている）。疎水性プロファイルを図１に示す。表１に示すように、使用したＤＡＦ  Ｃ末端のアミノ酸配列は、アミノ酸Ｔｈｒ−３５２からペプチド配列の最後のａａであるＴｈｒ−３８１までに対応する（ＮＣＢＩ受託番号：Ｂ２６３５９）。
【００８０】
融合タンパク質構築体にＤＡＦ  Ｃ末端疎水性領域を使用することはすでに報告されている（例えば、Ｆｉｅｌｄ等、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．８巻、１０８３０〜１０８３７ページ）。しかし、これは、常に、表面タンパク質の投錨及び遊離の機序を研究することを目的としていた。
【００８１】
本発明の融合タンパク質のクローニング及び発現の例は、実施例１及び２に記載するバベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）Ｂｄ３７コアポリペプチドへのヒトＤＡＦ  Ｃ末端の融合である。この融合タンパク質に基づく免疫原性組成物を用いたワクチン接種を実施例３に記載する。
【００８２】
本発明の第１の側面のさらに別の好ましい実施形態においては、サポニンアジュバントはキラヤサポニンである。
【００８３】
サポニンについては先に詳述した。
【００８４】
本発明の第１の側面の最も好ましい実施形態においては、本発明による免疫原性組成物は、融合タンパク質が、ＤＡＦ由来のＣ末端疎水性配列のＣ末端融合を有するバベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）Ｂｄ３７コアポリペプチドを含み、サポニンアジュバントがＱｕｉｌ  Ａであることを特徴とする。
【００８５】
節足動物宿主を介して移る寄生虫バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）は、ウシのバベシア症を引き起こし、ヒトの既知の動物原性感染症である。これは、Ｋｕｔｔｌｅｒ，Ｋ．Ｌ．によって概説されている（「Ｂａｂｅｓｉｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  ｍａｎ」、Ｍ．Ｒｉｓｔｉｃ編、１９８８、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＩ、ＵＳＡ。
【００８６】
バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）の分離株Ｒｏｕｅｎ  １９８７はヒトバベシア症患者に由来し、Ｂ．Ｃａｒｃｙ等によって述べられたＢｄ３７外抗原を研究するために使用された（１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍｕｎ．、６３巻、８１１〜８１７ページ）。対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩデータベースから受託番号ＡＪ４２２２１４として利用可能である。本発明のコアポリペプチドとして利用することができるＢｄ３７のコアポリペプチドは、ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＤ１９５６３として利用可能なタンパク質配列であるＮ末端及びＣ末端疎水性配列がないＢｄ３７配列を含む。例えば、Ｂｄ３７−コアは、ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＤ１９５６３のＳｅｒ−２５からＳｅｒ−３１６までからなる（Ｓｅｒ−３１６を含む）。
【００８７】
Ｂｄ３７コアポリペプチドを用いたワクチン接種実験が公表されている。Ｎ．Ｇｒａｎｄｅ等（１９９８、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔ．、４７巻、２６９〜２７９ページ）は、遊離Ｑｕｉｌ  Ａ中の（とりわけ、コアポリペプチドに類似した可溶性Ｂｄ３７を含む）バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）外抗原を用いてワクチン接種実験を実施した。しかし、本発明の融合タンパク質は使用されておらず、企図されてもいない。
【００８８】
本発明の別の側面は、ワクチンに使用される免疫原性組成物に関係する。
【００８９】
本発明の別の側面は、本発明による免疫原性組成物及び薬剤として許容される担体を含むことを特徴とするワクチンに関する。
【００９０】
薬剤として許容される担体は、ワクチンを接種した受療者にワクチン接種しないときに認められる作用よりも軽度の有害作用しか受療者の健康に及ぼさない化合物であると理解される。
【００９１】
薬剤として許容される担体は、例えば、滅菌水又は無菌の生理学的塩溶液とすることができる。より複雑な形態の担体は、例えば、緩衝剤とすることができる。
【００９２】
本発明によるワクチン、又は追加の免疫活性成分を含むワクチンは、いわゆる「ビヒクル」をさらに含むことができる。ビヒクルは、融合タンパク質が共有結合的に結合せずに付着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけ、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギン酸（ｍｉｃｒｏ−ａｌｇｉｎａｔｅｓ）、リポソーム及びマクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌｓ）であり、すべて当分野で既知である。また、ワクチンは、１個以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えば、Ｓｐａｎ（商標）又はＴｗｅｅｎ（商標）を含むことができる。
【００９３】
ワクチンは、例えば、分解し易いタンパク質を分解から保護する安定剤を混合して、ワクチンの品質保持期間を延長し、又は凍結乾燥効率を改善することが多い。有用な安定剤は、とりわけ、ＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋ等、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、５９巻、５０９ページ）、炭水化物、例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース、アルブミン、カゼインなどのタンパク質、或いはその分解生成物、及びアルカリ金属リン酸塩などの緩衝剤である。また、ワクチンは、使用前に、生理学的に許容される希釈剤に懸濁させることができる。免疫反応を高める他の方法、ビヒクル化合物又は希釈剤を添加する他の方法、タンパク質を乳化又は安定化する他の方法も本発明において実施できることは言うまでもない。
【００９４】
本発明によるワクチンの好ましい実施形態は、少なくとも１個の追加の免疫活性成分を含むことを特徴とするワクチンに関係する。
【００９５】
追加の免疫活性成分は、抗原、免疫促進物質及び／又はワクチンとすることができ、これらのいずれもがアジュバントを含むことができる。
【００９６】
追加の免疫活性成分は、抗原の形である場合には、ヒト又は動物に重要なあらゆる抗原体からなることができる。追加の免疫活性成分は、例えば、タンパク質、炭水化物、リポ多糖、タンパク質抗原をコードする核酸、転写制御配列に作動可能に結合された核酸を含む組換え核酸分子などの生物学的分子又は合成分子を含むことができる。このような核酸を含む宿主細胞、組換え核酸分子、又はこのような核酸を含むＬＲＣＭも、核酸や追加の抗原を送達する方法とすることができる。或いは、追加の免疫活性成分は、寄生虫、細菌、ウイルスなどの細分された（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）又は死んだ微生物を含むことができる。
【００９７】
免疫促進物質の形の追加の免疫活性成分は、例えば、ケモカイン及び／又は免疫活性化配列（例えば、ＣｐＧモチーフ）を含むことができる。
【００９８】
或いは、免疫原性組成物又は本発明によるワクチン自体を、ワクチンに添加することができる。
【００９９】
本発明によるワクチンは、防御すべき特定の疾患に応じて、当分野で既知の方法によって受療者に投与することができる。
【０１００】
このような方法は、例えば、皮膚中又は経皮のすべての注射経路、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、皮下などの非経口投与を含む。また、それらは、目、鼻、口、肛門又は膣の粘膜上皮、或いは体のあらゆる部分の外皮の表皮に液滴剤、噴霧剤、ゲル剤、軟膏剤として局所投与することができる。他の可能な投与経路は、噴霧、エアゾール、又は気道吸入による散剤投与によるものである。この最後のケースでは、使用する粒径によって粒子の気道侵入深さが決まる。或いは、例えば、散剤、液剤又は錠剤として食物、餌又は飲料水と混合して、或いは液剤、ゲル剤、錠剤又はカプセル剤として口に、或いは坐剤として肛門に直接投与することによって、消化経路を経て投与することができる。
【０１０１】
最適な投与経路が、予防又は改善すべき感染又は疾患の特殊性、及び使用する免疫原性組成物又はワクチンの特性によって決まることは言うまでもない。
【０１０２】
本発明によるワクチンの標的となる対象はヒトでも動物でもよい。動物は、魚類、両生類、は虫類、鳥類又は哺乳類とすることができる。これらの標的は、健康でも病気でもよく、血清陽性でも血清陰性でもよい。標的対象は、ワクチン接種及び／又は防御すべき感染若しくは疾患に感受性が高いあらゆる年齢とすることができる。
【０１０３】
本発明の融合タンパク質に基づくワクチンは、受療者当たり０．１〜１００マイクログラムのタンパク質を含む量を極めて適切に投与することができるが、これよりも少ない用量でも多い用量でも原則的には使用することができる。
【０１０４】
受療者にワクチン又は薬剤化合物を適用する部位において認められることがある有害作用は、「局所的」又は「有害」反応として当分野で一般に既知であり、様々な方法によって観察し、評価することができる。
【０１０５】
・観察：受療者の不快感又は嗜眠、体温上昇、歩行障害、摂食減退、例えば乳、卵の生産又は飼料要求率の低下。
【０１０６】
・巨視的：腫脹サイズ、色、出血又は浮腫の存在、組織の一貫性、膿瘍形成又は壊死。
【０１０７】
・微視的：特定の組織又は細胞タイプへの病変部の局在化、病変部タイプ、重篤度など
サポニンアジュバントを、このような局所的反応の徴候があまり発生しない低濃度の遊離した形で使用できることが本発明の利点の１つである。
【０１０８】
本発明では、特定の組成物及び標的種に応じて、用量当たり１μｇ〜５ｍｇのサポニン濃度を使用することができる。
【０１０９】
サポニンミセルが意図的に形成されないようなサポニン濃度を使用することが好ましい。例えば、これは、Ｑｕｉｌ  Ａの場合には３００μｇ／ｍｌ（０．０３％）の臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）未満の濃度を使用することを意味し（Ｍｏｒｅｉｎ，Ｂ．等、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３０８巻、４５７〜４６０ページ）、ＱＳ−２１の場合には２６μＭのｃｍｃ未満の濃度を使用することを意味する（Ｃ．Ｒ．Ｋｅｎｓｉｌ、「Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｄ．Ｔ．Ｏ’Ｈａｇａｎ編１５章、Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ  ２０００、ＩＳＢＮ：０８９６０３７３５５）。ｃｍｃで形成されるミセルの概念は当業者には周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ」（２１章、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ＵＳＡ、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）に記載されている。
【０１１０】
本発明による免疫原性組成物に基づくワクチンは、マーカーワクチンとしても極めて適切である。
【０１１１】
例えば安定性又は経済性のために、本発明のワクチン、又は追加の免疫活性成分を含むワクチンを凍結乾燥させることができる。一般に、これによって、０℃を超える温度での保存期間を延ばすことができる。
【０１１２】
凍結乾燥手順は当業者には既知であり、あらゆる規模の凍結乾燥装置が市販されている。
【０１１３】
したがって、より好ましい一実施形態においては、本発明によるワクチンは、凍結乾燥された形であることを特徴とする。
【０１１４】
本発明の別の側面は、本発明による免疫原性組成物と薬剤として許容される担体とを混合することを含むことを特徴とする本発明によるワクチン調製方法である。
【０１１５】
免疫原性組成物と薬剤として許容される担体は、いくつかの方法、例えば、混合によって組み合わせてワクチンにすることができる。得られたワクチンは、標的に対する所望の投与方法に応じて、いくつかの剤形、例えば、液剤、ゲル剤、軟膏剤、散剤、錠剤又はカプセル剤とすることができる。
【０１１６】
本発明の別の側面は、ワクチン製造のための本発明による免疫原性組成物の使用を含む。
【０１１７】
以下、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例
【実施例１】
【０１１８】
組換え構築体のクローニング
Ｂｄ３７  ｃＤＮＡ：
寄生虫バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、Ｒｏｕｅｎ  １９８７系統に由来するＢｄ３７遺伝子の単離及びクローニングは、欧州特許第１０５０５４１号、実施例１に広範に記載されている。手短に述べると、バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、Ｒｏｕｅｎ  １９８７系統に感染したヒト赤血球のｍＲＮＡからｃＤＮＡ発現ライブラリを調製した。このライブラリを、抗Ｂｄ３７ポリクローナル抗血清を用いてスクリーニングした。陽性クローンから、挿入断片を回収し、サブクローニングしてプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ−Ｂｄ３７を作製した。
【０１１９】
Ｈｉｓ＋Ｂｄ３７−コア
ｐＢＫ−ＣＭＶ−Ｂｄ３７プラスミド（欧州特許第１０５０５４１号、実施例１）をテンプレートとして使用して、プライマーｐＱＥＵｐ及びｐＱＥＤｏｗｎ（表２参照）を用いて、９４℃１分間、５５℃１分間及び７２℃１分間の２０サイクルで、各ｄＮＴＰ２００μＭ、各プライマー２００ｎＭ、ＴｕｒｂｏＰｆｕ（商標）ポリメラーゼ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５Ｕを用いて、最終体積５０μｌで、Ｎ末端又はＣ末端疎水性配列Ｂｄ３７挿入断片を含まないＢｄ３７遺伝子の中心部を増幅した。所望の収率に応じてテンプレートＤＮＡを５０ｎｇ〜１μｇの量で使用した。
【０１２０】
プライマーｐＱＥＵｐはインフレームＢａｍＨＩ部位を生じ、一方、プライマーｐＱＥＤｏｗｎは  ＨｉｎｄＩＩＩ部位を生じる。ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、（ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＤ１９５６３からの）Ｓｅｒ−２５からＳｅｒ−３１６までのＢｄ３７タンパク質コアをコードする部分を含む核酸を得た。
【０１２１】
Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によってプライマーを合成した。
【０１２２】
ＰＣＲ産物を、ｒｕｎ−Ｏｎｅ（商標）電気泳動システム（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ、Ｆｒａｎｃｅ）中で、０．８％アガロースゲル（電気泳動グレード、Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）上に載せ、（２５ｘＴＡＥ原液、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘから調製した）０．５ｘＴＡ中１００Ｖで泳動させるアガロースゲル電気泳動によって精製した。所望の産物に対応するバンドをゲルから切り取り、ゲル抽出Ｓｐｉｎキット（商標）（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ）を用いてそのゲルスライスからＤＮＡを単離した。ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲルを再度精製した。
【０１２３】
得られた断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いたライゲーションによって、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に、２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を補充した１ｘリガーゼ緩衝剤（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）中で室温で３時間連結した。ベクター：挿入断片比は通常１：３であり、使用した消化ベクターの量は０．５〜１μｇであった。
【０１２４】
消化後、ライゲーション前に、プラスミドを、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ、Ｐｒｏｍｅｇａ）の１ｘＣＩＡＰ緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）溶液を用いて３７℃で１時間ホスファターゼ処理した。
【０１２５】
ライゲーション混合物をＪＭ１０９  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ（商標）エシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）に形質転換した。これらの細胞をアンピシリン含有寒天板上に蒔き、Ｂｄ３７タンパク質が発現されていないかどうかタンパク質ミニ発現によってコロニーを調べた。手短に述べると、終夜培養物を１０倍希釈することによってＬＢ培地中の少量（５ｍｌ）の細菌培養を開始し、振とうしながら３７℃で２時間インキュベーションした後に、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を添加して組換えタンパク質を発現させた。３時間の誘導後に、遠心分離（１５分間、４０００ｘｇ）して細胞を収集し、変性溶解緩衝剤（８Ｍウレア、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８）１ｍｌに溶解した。２秒間休止サイクルで２分間溶解物を氷上で超音波処理し、遠心分離した（１５０００ｘｇ、１０分間）。不純物を除いた溶解物を、ＮｉＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）５０μｌの存在下で２０分間氷上で時折振とうしながらインキュベートした。タンパク質の詰まった樹脂を洗浄緩衝剤１ｍｌ（８Ｍウレア、１％ｖ／ｖ  ＴＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝６．３）で３回洗浄し、タンパク質を溶出緩衝剤（８Ｍウレア、１％ｖ／ｖ  ＴＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝４．５）で溶出させた。クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した１２％ポリアクリルアミドゲル中でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロットによって、組換えタンパク質の有無を評価した。
【０１２６】
Ｂｄ３７発現が陽性な１個のアンピシリン耐性コロニーから、ＬＢ培地５ｍｌ中、３７℃で振とうしながら終夜インキュベーションして細菌培養物を生成させ、終夜培養物２ｍｌを用いたＪｅｔＱｕｉｃｋ（商標）ミニプレップキット（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてプラスミドｐＱＥ−Ｈｉｓ−Ｂｄ３７を単離した。
【０１２７】
ｐＱＥ−３０ベクターを使用して、６ａａヒスチジンリンカーをインフレームでＢｄ３７コアポリペプチドに融合させる。
【０１２８】
Ｈｉｓ＋ＧＳＴ
上記６ｘＨｉｓ−Ｂｄ３７−コア構築体と類似した手順によってｐＱＥ−Ｈｉｓ−ＧＳＴを作製した。プラスミドｐＧＥＸ  ４Ｔ１（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をプライマーｐＱＥＧＳＴＵｐ及びｐＱＥＧＳＴＤｏｗｎ（表２参照）のテンプレートとして使用した。こうして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化された脱リン酸化ｐＱＥ−３０ベクターに連結した。こうして、６ｘヒスチジンポリペプチドとＧＳＴペプチドをインフレームで融合させた。
【０１２９】
Ｈｉｓ＋Ｂｄ３７−コア＋ＤＡＦ
３ラウンドのＰＣＲ後に６ｘＨｉｓ−Ｂｄ３７−ＤＡＦタンパク質をコードするＤＮＡ断片を構築した。第１ラウンドでは、ｐＢＫ−ＣＭＶ−Ｂｄ３７プラスミドをプライマーＴ３及びＢｄ３７ｒｅｃｕｒｓＵｐ（表２参照）用テンプレートとして使用した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、第２ラウンドのＰＣＲ用テンプレートとして使用した。プライマーＢｄ３７ｒｅｃｕｒｓＥｎｄ  ５０ｎＭと、プライマーＴ３及びＢｄ３７ＤＡＦｃの各４００ｎＭとを用いてＰＣＲ産物１００ｎｇを増幅した。得られたＰＣＲ産物は、その未変性Ｎ末端疎水性配列、及びＤＡＦ  Ｃ末端疎水性領域のＣ末端融合を有するＢｄ３７コアを含んでいた。このＰＣＲ産物をゲル精製し、１ｍＭ  ＡＴＰを含む増幅緩衝剤中にて７２℃で３０分間Ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベーションして３’デオキシアデノシンオーバーハングを付け、次いで、ＴＯＰＯ  ＴＡ（商標）クローニングキット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプラスミドｐＣＲ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。最後に、この構築体をプライマーｐＱＥＵｐ及びｐＱＥＢｄ３７ＤＡＦ用テンプレートとして使用して、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位を導入し、Ｎ末端シグナル配列を除去した。この断片を、上述したように、消化された脱リン酸化ｐＱＥ−３０ベクターにクローン化した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーター法を用いたＧｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓ．Ａ．（Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって実施されるＤＮＡ配列決定によって、完成した構築体を検証した。得られた挿入断片は、Ｎ末端が６ｘＨｉｓに融合し、Ｃ末端がＤＡＦ−Ｃ末端疎水性領域に融合したＢｄ３７−コアを含んでいた。
【０１３０】
ＧＳＴ＋Ｂｄ３７−コア
上で概説したのと類似の手順を用いて、ＧＳＴペプチドとＢｄ３７コアポリペプチドのインフレーム融合体を発現可能なプラスミドを構築した。このために、ｐＢＫ−ＣＭＶ−Ｂｄ３７プラスミドをプライマーｐＱＥＵｐ及びｐＱＥ７０Ｎ用テンプレートとして使用した。これらのプライマーによって、インフレームＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有する増幅断片が得られる。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ消化された脱リン酸化ｐＧＥＸベクターに連結した。（溶解緩衝剤が１ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び１％ｖ／ｖ  ＴＸ−１００を含有するＰＢＳであり、洗浄緩衝剤が溶解緩衝剤と同じであり、４５ｍＭグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８で溶出させる以外は）上述したように、ライゲーション産物をＪＭ１０９細胞に形質移入し、細胞を培養し、ｐＧＥＸ−ＧＳＴ−Ｂｄ３７プラスミドを単離し、タンパク質ミニ発現法によって組換えタンパク質発現を確認した。
【０１３１】
図２に、これらのプラスミド挿入断片から発現され得る様々な組換え（ｒｅｃ）タンパク質を図示した。
【０１３２】
【表２】
2005532405.tif 000003
【実施例２】
【０１３３】
ｒｅｃタンパク質の発現
細菌タンパク質発現：
細菌形質移入（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）：
各組換えタンパク質を発現させるために、エシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の終夜前培養物（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）をエレクトロポレーションによって形質移入した。ｐＱＥプラスミド中の構築体をエシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）系統Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（Ｑｉａｇｅｎ）に形質移入し、ｐＧＥＸ−ＧＳＴ−Ｂｄ３７プラスミドをエシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ  ２１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質移入した。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  ＩＩ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の原核生物モジュールを用いて、２７２ｍＭグルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１０％（ｖ／ｖ）グリセリンの水溶液のエレクトロポレーション媒体の１ｍｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中でエレクトロポレーションを実施した。電気パルスを１．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦに設定した。次に、細胞をＳＯＣ培地中で３７℃で１時間インキュベートし、アンピシリン含有ＬＢ寒天板に蒔いた。翌日、ＪｅｔＱｕｉｃｋミニプレップキット（Ｑ−Ｂｉｏ−Ｇｅｎｅ）を用いたプラスミド−ミニプレップによって個々のコロニーが正しいプラスミドを含んでいるかを検査し、これらのいくつかについて、上述したように、所望のｒｅｃタンパク質を正確に発現しているかどうかをタンパク質ミニ発現によって試験した。
【０１３４】
細菌発現：
ｐＱＥ構築体：
異なるｐＱＥプラスミド構築体を含むエシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍ１５［ｐＲＥ４］細胞の各々を、１００μｇアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン及び０．０１％ｖ／ｖ消泡剤２０９（Ｓｉｇｍａ）を含有する３７℃のＬＢ培地中で終夜培養した。翌朝、新しい培地で培養物を１：１０希釈し、さらに１時間培養した。次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して挿入断片の発現を誘導した。培養をさらに４時間続けた。次に、細胞を遠心分離（４０００ｘｇ、２０分間）してペレット化し、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）、１ｍｇ／ｍｌリゾシーム（ｌｙｓｏｓｙｍｅ）及び１ｍＭフェニルメチル−スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨｉｓタグ溶解緩衝剤に再懸濁させた。使用するまで溶解物を−８０℃で保存した。
【０１３５】
解凍後に、ＤＮＡｓｅ  Ｉ酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５００Ｕを添加し、氷上で２０分間インキュベートし、次いで、懸濁液を氷上で２秒間休止サイクルで２分間超音波処理した。超音波処理物を９０００ｘｇで２０分間遠心分離した。上清を、１．２、０．４５及び最後に０．２２μｍフィルター（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を通して順次ろ過した。最後に、ＦＰＬＣ  Ｎｉ２＋  ＨｉＴｒａｐ（商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によってろ液を分離した。タンパク質の詰まったカラムを、２０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）を補充したＨｉｓタグ溶解緩衝剤で洗浄した。最後に、２００ｍＭイミダゾールを含有するＨｉｓタグ溶解緩衝剤でｒｅｃタンパク質を溶出させた。
【０１３６】
ｐＧｅｘ構築体：
ｐＧＥＸプラスミド構築体を含有するエシェリキア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞の各々を、１００μｇアンピシリン及び０．０１％ｖ／ｖ消泡剤２０９（Ｓｉｇｍａ）を含有する３７℃のＬＢ培地中で終夜培養した。培養物を新しい培地で１：１０希釈し、培養を１時間続けた。０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加してタンパク質発現を誘導し、培養をさらに３時間続けた。上述したように、細胞をペレット化し、１％ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）、１ｍｇ／ｍｌリゾシーム及び１ｍＭ  ＰＭＳＦを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。上述したように、溶解物を−８０℃で保存し、解凍し、ＤＮＡｓｅ  Ｉと混合し、超音波処理し、遠心分離した。グルタチオン−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いて上清を精製した。ＰＢＳ／１％ＴＸ−１００（商標）でビーズを洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８）と４５ｍＭグルタチオン（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝剤でｒｅｃタンパク質を溶出させた。
【０１３７】
ＳＰＡ−Ｒｏｕｅｎ  １９８７
可溶性寄生虫抗原（ＳＰＡ）は、バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）に感染した赤血球培養物の培養上清である。Ｃａｒｃｙ等によって述べられた（１９９５、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．６３巻、８１１〜８１７ページ）。Ｂｄ３７疎水性末端領域の切断のコンピュータ予測に基づいて、このＳＰＡ体は、組換え構築体に使用されるＢｄ３７−コアポリペプチドよりもＮ末端側がわずかに大きいＢｄ３７−コアポリペプチドを含む。これは、Ａｓｎ−２０からＳｅｒ−３１６までのＢｄ３７タンパク質からなると予測される。また、赤血球と細菌宿主細胞の翻訳後プロセシングに違いがあってもよい。
【０１３８】
手短に述べると、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５ｇ／ｌ  Ａｌｂｕｍａｘ（精製ウシ血清アルブミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気でヒト赤血球を培養した。この培養物を、フランスのヒト分離株Ｒｏｕｅｎ  １９８７に由来するバベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）寄生虫に初期寄生虫血１％、ヘマトクリット値５％で感染させた。寄生虫血が３０〜４０％になるまで培地を毎日交換した。その時点で、培地を使用してＱｕｉｌ  Ａを含む対照ワクチンを調製した。
【０１３９】
図３に、いくつかのｒｅｃタンパク質を可視化したＣＢＢ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。標準条件でゲル泳動させた。手短に述べると、上述したように細菌培養物から得たｒｅｃタンパク質試料を試料緩衝剤中で煮沸し、１２％ポリアクリルアミドゲル上に載せ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤に含まれるブロモフェノールバンドがゲル底部に達するまでＴｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ泳動緩衝剤中１４０Ｖで泳動させた。次に、ゲルを染色し、メタノール−酢酸−ＣＢＢで固定し、終夜脱染した。ゲルを８０℃で１時間減圧乾燥させ、最後に走査してデジタル保存した。
【０１４０】
各レーンでは等量の細菌試料を使用したので、バンド強度の相対差は、疎水性ペプチドを含む構築体の換算発現効率を反映している。例えば、レーン２と３を比較すると、６ｘＨｉｓ＋Ｂｄ３７−コアは、６ｘＨｉｓ＋Ｂｄ３７−コア＋ＤＡＦよりも効率的に発現される。
【実施例３】
【０１４１】
ワクチン接種負荷実験：
実験ワクチン：
クーマシーを利用したタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、精製された細菌発現ｒｅｃタンパク質を標準試料とともに分光測定によって定量した。次いで、ＲＰＭＩ体積２５０μｌ中で最終タンパク質濃度が１μｇになるように無血清ＲＰＭＩ培地で細菌発現ｒｅｃタンパク質を希釈して、（１２匹のスナネズミに十分な）ワクチン３ｍｌを調製した。
【０１４２】
ＳＰＡワクチンの場合には、バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）Ｒｏｕｅｎ  １９８７  Ａｌｂｕｍａｘ培地３ｍｌを同様に使用した。
【０１４３】
新しいサポニンＱｕｉｌ  Ａ、バッチＬ７７−１６３（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）原液のＲＰＭＩ培地溶液を１０ｍｇ／ｍｌで調製し、この溶液９０μｌをワクチン溶液３ｍｌに添加し、チューブを（３〜４回、室温で）叩いて混合した。したがって、各ワクチン用量２５０μｌ中のサポニン最終量は７５μｇであった。
【０１４４】
スナネズミの免疫化：
ｒｅｃタンパク質ワクチンの各々を、１つの檻の中で飼育した８〜９週齡の１０匹のスナネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）のグループに投与した。個体識別のために各動物に印をつけた。２５０μｌを３週間隔で２回皮下注射した。
【０１４５】
対照として、２５０μｌ／用量のＳＰＡ（バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）Ｒｏｕｅｎ  １９８７の培養上清）を含めた。
【０１４６】
１グループのスナネズミをワクチン接種せずに負荷対照とした。
【０１４７】
２回目のワクチン接種から３週間後に、バベシア  ダイバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）ミュンヘン系統に感染した１０００個のスナネズミ赤血球を腹腔内注射する攻撃感染を行った。攻撃寄生虫は、スナネズミで３回継代してその病原性を確認済みである。
【０１４８】
負荷前後の血液試料を数回採取して、貧血及び寄生虫血症の発生をモニターした。動物のストレスを減少させるために、各試料採取日に半数のスナネズミからこれらの値を求め、その後はサブグループを交替させた。ある試料採取日の血液試料をプールした各実験グループについて、ヘマトクリットを％パック細胞容積（％ＰＣＶ）として表し、寄生虫血を血液の薄層塗抹から顕微鏡で読み取った。
【０１４９】
結果と考察：
【０１５０】
【表３】
2005532405.tif 000004
【０１５１】
１匹を除いて、ワクチン接種しなかった対照動物のすべてが攻撃感染後に死亡した。これは、負荷が、ワクチン効力を決定するのに十分な過酷さであることを示している。６ｘＨｉｓ＋ＧＳＴ融合タンパク質及び６ｘＨｉｓ＋Ｂｄ３７−コア融合タンパク質で免疫したスナネズミでも類似した結果が得られた。これらのグループでは、全身の寄生虫血症及び重度の貧血（ヘマトクリット値が３０％を超えて減少）によってすべての動物が死亡した。これは、６ｘＨｉｓ又はＧＳＴペプチド成分では有効な防御作用を得ることができず、Ｂｄ３７−コアポリペプチド自体でも得ることができないことを示している。予想通り、６ｘＨｉｓは本発明の異種疎水性ペプチドとして不適である。
【０１５２】
ＧＳＴ＋Ｂｄ３７−コア融合タンパク質ワクチンを投与した動物では、負荷に対するいくらかの防御作用が認められた。おそらく、これは、融合タンパク質のサイズ（ＧＳＴ：２８＋Ｂｄ３７−コア：３２ｋＤａ）のためであろう。
【０１５３】
しかし、この防御作用レベルは、Ｈｉｓ＋Ｂｄ３７−コア＋ＤＡＦ融合タンパク質ワクチンから得られるものよりもはるかに低かった。Ｑｕｉｌ  Ａ中の疎水性Ｃ末端を含むこの融合タンパク質によって、１匹を除くすべてのワクチン接種動物が生存し、感染（寄生虫血症及び貧血）の徴候すら見られなかった。この生存率の差は、対照と比較して統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、Ｘ２検定）。
【０１５４】
欧州特許第１０５０５４１号に記載されたように、Ｑｕｉｌ  Ａ中の未変性Ｂｄ３７  ＳＰＡ  Ｒｏｕｅｎ  １９８７は、異種攻撃感染からスナネズミを防御する。しかし、本実験では、異種攻撃が過酷であるために１０匹のうちわずか６匹のスナネズミしか生存せず、７匹は貧血となった。
【０１５５】
使用した攻撃系統（ミュンヘン）が、Ｂｄ３７−コアポリペプチド及びＳＰＡタンパク質（Ｒｏｕｅｎ  １９８７）を得るために使用されたものとは異なるので、異種攻撃と称される。当分野で周知のとおり、このような異種攻撃に対する防御作用は、相同の攻撃に対するものよりもはるかに得にくい。
【０１５６】
重大な負の局所的反応は、これらのワクチン接種に使用されたＱｕｉｌ  Ａ量（７５μｇ／用量）では認められなかった。
【０１５７】
結論：
これらのワクチン接種負荷実験によれば、Ｂｄ３７−コアに融合した異種疎水性配列が存在することによって、Ｑｕｉｌ  Ａ中のこの融合タンパク質は、１０匹の非ワクチン接種動物のうち９匹を死亡させる過酷な異種攻撃感染に対して１０匹の動物のうち９匹を救うことができる。Ｑｕｉｔ  Ａ中の対照融合タンパク質や非融合Ｂｄ３７−コアポリペプチドのワクチンでは防御作用はほどんど認められなかった。Ｑｕｉｌ  Ａ中の「未変性Ｂｄ３７−コア」ポリペプチド（ＳＰＡ）によるワクチン接種では中程度の防御作用が誘導された。
【実施例４】
【０１５８】
異種疎水性Ｃ末端融合を有するＡＩＶ  Ｈ５タンパク質の構築、発現、及びワクチン接種における使用
疎水性Ｃ末端融合を有するＡＩＶ  ＨＡ５遺伝子の構築：
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）系統Ａ／ヒヨコ／イタリア／８／９８（Ｈ５Ｎ２）に由来するＨＡ５遺伝子をｃＤＮＡとして利用可能であった。バキュロウイルス発現系Ｂａｃ−２−Ｂａｃ（商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターにこれをクローン化した。次に、この構築体をＣｌａＩ及びＲｓｒＩＩ制限酵素で消化して、Ｃ末端の４２個のアミノ酸を含む断片をＨＡ５遺伝子から除去し、それによって、対応するＨ５タンパク質の膜貫通領域の完全なコード領域を欠失させた。
【０１５９】
２個のリンカー、すなわち、アミノ酸配列：ＦＡＡＶＰＳＳＬＳＡＩＶＦＧＩＩＶＳＭＦを含む疎水性領域であるＢｄ３７遺伝子のＣ末端の２０個のアミノ酸をコードするＢｄ３７ＨＧ３’−ｆｏｒｗ及びＢｄ３７ＨＧ３’−ｒｅｖ（表２参照）を設計した。２個のリンカーは、２個のリンカーをアニールすると形成される制限酵素切断部位、すなわち、５’ＣｌａＩ部位及び３’ＲｓｒＩＩ部位も含む。
【０１６０】
２個のリンカーをアニールし、ＣｌａＩ−ＲｓｒＩＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃＨＡ５プラスミドに連結して、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＡ５−Ｂｄ３７を構築した。このＨＡ５−Ｂｄ３７構築体は、Ｂｄ３７タンパク質に由来する疎水性Ｃ末端のＣ末端融合を含むＡＩＶ  Ｈ５タンパク質をコードした。このＨＡ５−Ｂｄ３７構築体のＣ末端アミノ酸配列は、（ＡＩＶ−Ｈ５アミノ酸５１６から開始される）ＥＩＳＧＶＫＬＥＦＡＡＶＰＳＳＬＳＡＩＶＦＧＩＩＶＳＭＦである。
【０１６１】
バキュロウイルス中での発現：
製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃＨＡ５から組換えバキュロウイルスを生成させた。発現に使用した細胞はＳｆ９及びＳｆ１５８細胞であった。これらを１００及び２５０ｍｌ  Ｂｅｌｉｃｏマイクロキャリアスピナーフラスコ中で培養した。使用した培地は、無血清培地ＣＣＭ３（商標）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びＳＦ９００−ＩＩ（商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。細胞をｍ．ｏ．ｉ．０．１〜０．５で感染させ、３〜４日間培養した。感染昆虫細胞を収集し、免疫蛍光及びウエスタンブロット法によってＨ５タンパク質の有無を試験した。
【０１６２】
ＨＡ５−Ｂｄ３７タンパク質含有昆虫細胞を精製し、Ｈ５タンパク質を標準Ｈ５−抗原Ｅｌｉｓａで定量する。ワクチン１ｍｌ当たりＨＡ５−Ｂｄ３７  ２μｇ及びＱｕｉｌ  Ａ  ３０μｇが含まれるように、タンパク質含有昆虫細胞をＱｕｉｌ  Ａサポニンアジュバントとともにヒヨコのワクチン接種用に処方する。
【０１６３】
バキュロウイルス発現ＨＡ５−Ｂｄ３７によるヒヨコのワクチン接種：
ヒヨコにＱｕｉｌ  Ａ中のＨＡ５−Ｂｄ３７タンパク質含有昆虫細胞を接種し、セロコンバージョンを測定する。このために、隔離飼育器に入れた１５匹の３週齢ＳＰＦ白色レグホーンヒヨコの足に（ＨＡ５−Ｂｄ３７  ５ｇ／用量を含む）ＨＡ５−Ｂｄ３７／ＱｕｉｌＡワクチン０．２５ｍｌを筋肉内注射する。ワクチン接種から３、４及び５週後に血液試料を抜き取る。凝固血液から血清を収集し、５６℃で不活化し、標準Ｈ５−抗体Ｅｌｉｓａを用いてＨ５抗体を検査する。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシーアルゴリズムによる疎水性プロファイル。横軸はアミノ酸数である。縦軸は親水性／疎水性の相対値であり、中央値（横軸）よりも下の正の値は疎水性アミノ酸と相関がある。ウィンドウサイズは５ａａであった。  グラフの右側に、疎水性データ点数、及びペプチド中のａａの総数に対するそれらの割合を示す。（表１にも記載した）表示したペプチドは、・メリチン、Ｎ末端・ＤＡＦ、Ｃ末端・ＣＷＰ  １：サッカロミセス（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）細胞壁タンパク質１、Ｃ末端・ＭＶ  ＨＮ：麻疹ウイルス赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ、内部領域・ＨＨＶ−４  ＥＢＮＡ−３Ｃ：ヒトヘルペスウイルス４  ＥＢＮＡ−３Ｃ核抗原、内部領域である。
【図２】実験に使用する組換えタンパク質の図。
【図３】スナネズミワクチン接種に使用するｒｅｃＢｄ３７タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの図。ｒｅｃＢｄ３７タンパク質を細菌中で発現させ、Ｎｉ−カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せた。電気泳動後、ゲルを染色し、乾燥し、走査した。レーンは以下のとおりである。  Ｍ：分子量マーカー  １：６ｘＨｉｓ＋ＧＳＴ  ２：６ｘＨｉｓ＋Ｂｄ３７−コア  ３：６ｘＨｉｓ＋Ｂｄ３７−コア＋ＤＡＦ
【配列表】
2005532405.tif 000005
2005532405.tif 000006
2005532405.tif 000007
【図１】
2005532405.tif 000008
【図２】
2005532405.tif 000009
【図３】
2005532405.tif 000010
【国際調査報告】
2005532405.tif 000011
2005532405.tif 000012
2005532405.tif 000013