(57)【要約】本発明は、S-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を発現する細菌を使用して、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを発酵により製造するための方法に関する。
2005533490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させる工程、ここにおいて、該コリネ型細菌は、改変されたS-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現するものであること、
b）該培地内および／または該細菌細胞内の硫黄含有ファインケミカルを濃縮する工程、
c）硫黄含有ファインケミカルを単離する工程、
を含んでなる、少なくとも1つの硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法。
【請求項２】
硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1記載の製造方法。
【請求項３】
非突然変異野生型と比較してmetK活性が減少した突然変異コリネ型細菌を使用する、請求項1または2記載の製造方法。
【請求項４】
突然変異コリネ型細菌が更に、非突然変異野生型と比較して改良されたmetY活性および／または増加したL-メチオニン量を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項５】
metKコード配列が、野生型タンパク質の少なくとも1つのシステイン残基が置換されている減少したmetK活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項６】
metKコード配列が、以下のアミノ酸部分配列：
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
（ここで、X1およびX2は、互いに独立して、任意のアミノ酸を表し、X3はCys以外のアミノ酸を表す）
を有するmetK活性のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項5記載の製造方法。
【請求項７】
metKコード配列が、metK活性を有するタンパク質をコードし、該タンパク質が、配列番号22に示すVal1からAla407までのアミノ酸配列、またはそれに相同でありかつ機能的に等価なタンパク質を表すアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項８】
metKコード配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるか又は染色体内に安定に組み込まれるDNA、またはRNAである、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項９】
a）プラスミドベクターで形質転換されており、調節配列の制御下で突然変異metK配列の少なくとも1つのコピーを保持する細菌株を使用する、または
b）突然変異metK配列が細菌染色体内に組み込まれている株を使用する、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１０】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の少なくとも1つの別の遺伝子が更に増強されている細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１１】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生成を減少させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１２】
a）アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
b）アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
c）グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
d）3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
e）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
f）トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
g）ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
h）シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB、
i）シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC、
j）メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
k）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
l）O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
m）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
n）ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
o）ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
p）セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、
q）システインシンターゼをコードする遺伝子cysK、
r）ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる、および／または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して低い程度に代謝産物により影響されるか若しくはもはや影響されない、あるいはその比活性が増強しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１３】
a）ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b）トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c）トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d）メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e）ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f）グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g）ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h）ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、または
j）ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に弱められているコリネ型細菌を発酵させる、および／または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の酵素活性が部分的もしくは完全に減少しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１５】
a）請求項1〜14のいずれか1項に定義されるL-メチオニン産生微生物を発酵培地内で培養し、発酵させる工程、
b）L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去する工程、
c）発酵中に生成したバイオマスの0〜100重量％を除去する工程、
d）工程b）および／またはc）により得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得る工程、
を含んでなる、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の製造方法。
【請求項１６】
減少したmetK活性を有するポリペプチドをコードする、請求項5〜7のいずれか1項に定義される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項16記載のポリヌクレオチドによりコードされる、減少した活性を有するmetK突然変異体。
【請求項１８】
請求項5〜7のいずれか1項に定義されるポリヌクレオチド配列を含む突然変異metK遺伝子を発現する組換えコリネ型細菌。
【請求項１９】
もはやmetK野生型酵素を発現しない、請求項18記載の組換えコリネ型細菌。
【請求項２０】
対応する野生型株と比較して、以下の形質：
a）より低い細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b）より低い細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度、または
c）S-アデノシルメチオニン生成の速度に関して測定した場合の、より低いS-アデノシルメチオニンシンターゼ活性、
の少なくとも1つ、さらに、適当な場合には、以下の形質：
d）改善されたmetY活性、または
e）増加したL-メチオニン量、
の少なくとも1つを有する、請求項19記載の組換えコリネ型細菌。
【請求項２１】
請求項5〜7のいずれか1項に定義されるmetK突然変異体のコード配列を調節ヌクレオチド配列の制御下で含有する発現構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、S-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）（E.C.2.5.1.6）の突然変異体をコードするヌクレオチド配列を発現する細菌を使用した、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンおよびL-システインの発酵による新規製造方法、前記突然変異体をコードするヌクレオチド配列、それにより形質転換された組換え微生物、および改変された酵素活性を有する新規metK突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
硫黄含有ファインケミカル、例えばメチオニン、ホモシステイン、S-アデノシルメチオニン、グルタチオン、システイン、ビオチン、チアミンおよびリポ酸は天然代謝過程により細胞内で産生され、食品、飼料、化粧品および医薬品産業を含む非常に多くの産業において使用されている。これらの物質は、「硫黄含有ファインケミカル」と総称され、有機酸、タンパク質原性および非タンパク質原性のアミノ酸、ビタミンならびに補因子を包含する。最も簡便には、それらは、大量の所望の対象物質を産生し分泌するよう開発された細菌を培養することにより工業的規模で製造される。この目的に特に適した生物はグラム陽性非病原性コリネ型細菌である。
【０００３】
コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）菌株を発酵させることによりアミノ酸が製造されることは公知である。その高い重要性のため、その製造方法は絶えず改良されている。製造方法における改良は発酵技術の側面、例えば、発酵中の攪拌および窒素供給、または栄養培地の組成、例えば糖濃度、あるいは例えばイオン交換クロマトグラフィーによる下流処理、あるいは微生物自体の固有の性能パラメーターに関連したものでありうる。
【０００４】
一連の硫黄含有ファインケミカルから所望の化合物群を産生する一連の突然変異株が、菌株の選択により得られた。個々の分子の産生に関するこれらの微生物の性能パラメーターを改良するために用いる方法は突然変異誘発、突然変異体の選択および選別である。しかし、これは時間のかかる困難な方法である。このようにして、例えば代謝拮抗物質、例えばメチオニン類似体、α-メチルメチオニン、エチオニン、ノルロイシン、N-アセチルノルロイシン、S-トリフルオロメチルホモシステイン、2-アミノ-5-ヘプテン酸、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシミン、メトキシンまたは1-アミノシクロペンタンカルボン酸に耐性であるか又は調節上重要な代謝産物に対して栄養要求性であり、かつ硫黄含有ファインケミカル、例えばL-メチオニンを産生する菌株が得られる。
【０００５】
また、L-アミノ酸産生コリネバクテリウム（Corynebacterium）株の株改良のために組換えDNA技術の方法が数年前から用いられており、この場合には、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅して、アミノ酸産生に対するその影響が調べられる。
【０００６】
JP-A-06-020809は、コリネ型細菌であるブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233に由来する、S-アデノシルメチオニンをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。対応するアミノ酸配列は412アミノ酸を含む。非常に多くの他のコリネ型細菌の対応酵素において保存されている特に24位および94位のそれぞれにおいて、該タンパク質はシステイン残基を有する。開示されているアミノ酸配列は特徴的な配列セグメントを残基137〜157に有する。突然変異体の作製および硫黄含有ファインケミカルの発酵製造におけるその使用はこれには記載されていない。
【０００７】
WO-A-01/00843は、配列番号16に示す配列を有し407アミノ酸のタンパク質をコードする、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）のmetK遺伝子を開示している。
【０００８】
一般に、ファインケミカルの発酵製造における改良は物質の流れ（fluxes）および収量の改良と相関する。合成に重要な酵素が中間体により阻害されたり最終産物により阻害されたりするのを防ぎ又は軽減することが重要である。同様に、望ましくない産物または副産物へと炭素の流れが分流するのを防ぎ又は軽減することが有利である。
【０００９】
代謝酵素の酵素活性に対する代謝産物の影響を調べることは可能である。そのような酵素の例としては、metA、metB、metC、MetY、metH、metE、metFおよび微生物の代謝における他の酵素が挙げられる。メチオニンの重要な代謝産物、それ故に重要な分流物質はS-アデノシルメチオニンである。
【００１０】
しかし、S-アデノシルメチオニンは同時に、メチオニン生合成の決定的に重要な調節物質でもある。例えば、大腸菌（E. coli）内でのL-メチオニンの生合成はS-アデノシルメチオニンにより抑制されることが公知である。この系においては、S-アデノシルメチオニンはリプレッサーmetJのコリプレッサーとして作用する（Weissbach, H. Brot, N. (1991) Mol Microbiol. 5 (7), 1593-1597）。
【００１１】
同時に、S-アデノシルメチオニンの合成は、所望の目的産物であるL-メチオニンからの重大な分流である。したがって、いくつかの理由により、S-アデノシルメチオニンの生成量の減少が望ましい。すなわち、それにより
a）L-メチオニンの生成量が増加する；
b）メチオニン生合成の遺伝子の抑制が軽減される；および
c）メチオニン生合成の酵素のフィードバック阻害が軽減される；
と考えられる。
【００１２】
metK遺伝子の欠失は、S-アデノシルメチオニンの生成を妨げるための最も単純な方法であろう。しかし、Wei, Y.およびNewman, E.B. (2002) Mol. Microbiol. 43 (6), 1651-1656には、metKが必須遺伝子として記載されており、したがって硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの発酵製造法の改良のための出発点として当業者には認識される。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、発酵による硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの改良された新規製造方法を提供することである。
【００１４】
驚くべきことに、野生型酵素と比較して改変された（好ましくは減少した）活性を有するS-アデノシルメチオニンシンターゼ突然変異体をコードするmetKヌクレオチド配列を発現させることを含んでなる、発酵による硫黄含有ファインケミカルの製造方法を提供することにより、この目的が達成されることが見出された。例えば、S-アデノシルメチオニンシンターゼ突然変異体はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に由来し、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）における測定では、野生型酵素より弱い活性を示す。
【００１５】
本発明の第1の主題は、
a）目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させる工程、ここにおいて、該コリネ型細菌は、改変されたS-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現するものであること、
b）該培地内および／または該細菌細胞内の硫黄含有ファインケミカルを濃縮する工程、
c）好ましくはL-メチオニンを含む硫黄含有ファインケミカルを単離する工程、
を含んでなる、少なくとも1つの硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法に関する。
【００１６】
好ましい実施形態においては、突然変異コリネ型細菌は更に、非突然変異野生型と比較して改良されたmetY活性および／または増加したL-メチオニン量（例えば、g/l(発酵液)で表した場合）を有する。
【００１７】
特に本発明の方法において使用するmetKコード配列は、減少したmetK活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、この場合、野生型タンパク質のシステイン残基の少なくとも1つが置換されている。
【００１８】
好ましくは、metKコード配列は、配列番号23に示す以下のアミノ酸部分配列を有するmetK活性のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である：
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
（ここで、X1およびX2は、互いに独立して、任意のアミノ酸を表し、X3はCys以外のアミノ酸を表す）。
【００１９】
特に好ましいのは、metKコード配列が、metK活性を有するタンパク質をコードし、該タンパク質が、配列番号22に示すVal1からAla407までのアミノ酸配列、またはそれに相同でありかつ機能的に等価なタンパク質を表すアミノ酸配列を含む前記方法である。
【００２０】
本発明で使用するmetKコード配列は、好ましくは、配列番号21に示すコード配列、またはそれに相同でありかつmetK活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
metKコード配列は、好ましくは、コリネ型細菌内で複製可能であるか又は染色体内に安定に組み込まれるDNA、またはRNAである。
【００２２】
好ましい実施形態においては、本発明の方法は、
a）プラスミドベクターで形質転換されており、調節配列の制御下でmetKコード配列の少なくとも1つのコピーを保持する細菌株を使用する、または
b）metKコード配列が該細菌染色体内に組み込まれている株を使用する、
ことにより行う。
【００２３】
特に好ましいのは、さらにmetK野生型酵素の活性の全部または一部が例えば野生型酵素のコード配列の欠失により除去されている前記の株である。
【００２４】
さらに、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の別の遺伝子の少なくとも1つが更に増強された及び／又は目的の硫黄含有ファインケミカルの生成を減少させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的に排除された細菌を発酵させることが望ましい場合もある。
【００２５】
したがって、本発明の方法のもう1つの実施形態においては、
1）アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
2）アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
3）グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
4）3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
5）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
6）トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
7）ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
8）シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB、
9）シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC、
10）メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
11）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
12）O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
13）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
14）ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
15）ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
16）セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、
17）システインシンターゼをコードする遺伝子cysK、
18）ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる。
【００２６】
本発明の方法のもう1つの実施形態においては、前記群1）〜18）の遺伝子から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応タンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して低い程度に代謝産物により影響されるか又は影響されない、特に本発明のファインケミカルの製造が悪影響を受けない、あるいはそれらの比酵素活性が増大しているコリネ型細菌を発酵させる。
【００２７】
本発明の方法のもう1つの実施形態においては、
19）ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
20）トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
21）トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
22）メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
23）ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
24）グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
25）ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
26）ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
27）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、または
28）ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に、特に対応遺伝子の発現率を減少させることにより、弱められているコリネ型細菌を発酵させる。
【００２８】
本発明の方法のもう1つの実施形態においては、前記群19）〜28）の遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応タンパク質の酵素活性が部分的または完全に減少しているコリネ型細菌を発酵させる。
【００２９】
本発明の方法において好ましく使用される微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種の微生物である。
【００３０】
本発明は更に、
a）L-メチオニン産生微生物（好ましくは、前記の定義に従う減少したmetkを有するもの）を発酵培地内で培養し、発酵させる工程、
b）L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去する工程、
c）発酵中に生成したバイオマスの0〜100重量％を除去する工程、
d）工程b）および／またはc）により得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態で動物飼料添加物を得る工程、
を含んでなる、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の製造方法に関する。
【００３１】
本発明は更に、前記の定義に従う減少したmetK活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドにコードされる減少した活性を有するmetK突然変異体に関する。
【００３２】
さらに、本発明は、前記定義に従う突然変異metK遺伝子を発現する組換えコリネ型細菌、特に、もはやmetK野生型酵素を発現しない組換えコリネ型細菌に関する。
【００３３】
対応野生型株と比較して、好ましい組換えコリネ型細菌は以下の形質：
a）より低い細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b）より低い細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度、または
c）S-アデノシルメチオニン生成の速度に関して測定した場合の、より低いS-アデノシルメチオニンシンターゼ活性、
の少なくとも1つを示し、さらに、適当な場合には、以下の形質：
d）改善されたmetY活性、または
e）増加したL-メチオニン量、
の少なくとも1つを示す。
【００３４】
発明の詳細な説明
a）一般的用語
「S-アデノシルメチオニンシンターゼ」の生物活性を有するタンパク質なる語は、metK（E.C.2.5.1.6）とも略称され、L-メチオニンおよびATPをS-アデノシルメチオニンに変換しうるタンパク質を意味する。metKタンパク質のその他の詳細は当業者によく知られている。metKの酵素活性は酵素アッセイにより検出することが可能であり、そのプロトコールはMarkham, G.D.ら (1983) Methods in Enzymology 94:219-222に記載されている。
【００３５】
本発明の範囲内では、「硫黄含有ファインケミカル」なる語は、本発明の発酵法により得られる、共有結合した少なくとも1つの硫黄原子を含有する化合物を包含する。非限定的な具体例としては、メチオニン、ホモシステイン、S-アデノシルメチオニン、システイン、特に、メチオニンおよびS-アデノシルメチオニンが挙げられる。
【００３６】
本発明の範囲内では、「L-メチオニン」、「メチオニン」、「ホモシステイン」および「S-アデノシルメチオニン」なる語は、例えばメチオニン塩酸塩またはメチオニン硫酸塩のような対応する塩をも包含する。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」は、一般には、未修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAの形態をとりうるポリリボヌクレオチド（RNA）およびポリデオキシリボヌクレオチド（DNA）を意味する。
【００３８】
「ポリペプチド」は、本発明においては、ペプチド結合を介して結合している2個以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質を意味すると理解される。
【００３９】
「代謝産物」なる語は、生物の代謝において中間体または他の最終産物として生じる、化学単位としてのそれらの特性のほかに、酵素およびその触媒活性に対して調節作用を及ぼしうる化合物を意味する。そのような代謝産物は酵素の活性に対して抑制作用および促進作用の両方を及ぼしうることが文献から公知である（Biochemistry, Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York）。文献はまた、代謝産物による影響が改変されている酵素を、生物においてUV照射、イオン照射または突然変異誘発性物質によりゲノムDNAを突然変異させ、ついで特異的表現型を選択するような手段により産生させることが可能であると記載している（Sahm H., Eggeling L., de Graaf A. A. Biological Chemistry 381(9-10):899-910, 2000; Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94）。これらの改変された特性は標的化された方法によっても得ることができる。この場合、酵素遺伝子において、該タンパク質をコードするDNAの特定のヌクレオチドを特異的に改変して、発現されるDNA配列から生じるタンパク質に特異的新規特性を持たせることが当業者に公知である。例えば、これは、未改変タンパク質と比較して改変された代謝産物の調節効果をもたらしうる。また、酵素の活性は、反応速度の減少または基質に対する親和性の変化が生じるように影響を受けうる。
【００４０】
本発明の場合においては、「発現」または「増強」または「過剰発現」なる語は、関心のあるDNAにコードされる1以上の微生物内酵素の産生または細胞内活性の増加を意味する。この目的には、例えば、遺伝子を生物内に導入し、既存の遺伝子を別の遺伝子で置換し、遺伝子のコピー数を増加させ、強力なプロモーターを使用し、または高い活性を有する対象酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、適当な場合には、これらの手段を組合わせることが可能である。
【００４１】
本発明の場合においては、「減弱」および「減少（軽減）」は、関心のあるDNAにコードされる1以上の微生物内酵素の細胞内活性の減弱または減少を意味する。この目的には、例えば、生物内の遺伝子を欠失させ、既存の遺伝子を別の遺伝子と置換し、遺伝子の転写産物のコピー数を減少させ、弱いプロモーターを使用し、または低い活性を有する対応酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、適当な場合には、これらの手段を組合わせることが可能である。
【００４２】
本発明のS-アデノシルメチオニンシンターゼ突然変異体または機能的等価体の「減少した活性」は、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）野生型ATCC 13032に由来する天然S-アデノシルメチオニンシンターゼの活性との比較により測定することができる。この目的には、適切には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）内で複製されかつS-アデノシルメチオニンシンターゼ突然変異体の遺伝子を保持するプラスミドを、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）野生型ATCC 13032内への形質転換により導入する。さらに、野生型酵素S-アデノシルメチオニンシンターゼを発現する適当なプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）野生型ATCC 13032内に導入する。このようにして得られたコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）形質転換体を適当な培地内で増殖させ、同じOD600の対数増殖期中に回収する。ついで、公知プロトコールに従い、それらの2つの形質転換体の回収細胞からタンパク質抽出物を得る。ついで同じ量のこれらのタンパク質抽出物を（タンパク質の同定後）、Markham, G.D.ら (1983) Methods in Enzymology 94: 219-222の方法によるS-アデノシルメチオニンシンターゼアッセイにおいて使用する。生成したS-アデノシルメチオニンの放射能をシンチレーションカウンターで計測する。放射性L-メチオニンの比活性および使用したタンパク質の量を考慮して、単位時間当たりの取込み放射能の増加からS-アデノシルメチオニンの生成速度を求めることができる。それは単位としてμmol S-アデノシルメチオニン/分*mgタンパク質を有する。この速度を野生型酵素と突然変異型酵素との間で比較することが可能である。同じ原理により、S-アデノシルメチオニンシンターゼ活性を有する他の野生型酵素から出発して、本発明において有用な突然変異体を製造することができる。
【００４３】
「減少した活性」は、本発明においては、特に、突然変異体の比活性が野生型活性の約1〜90％、好ましくは3〜70％、例えば5〜10％の残留活性にまで減少した場合に見出される。
【００４４】
b）本発明のmetKタンパク質
本発明のポリヌクレオチド配列は、前記のとおりの改変された（特に減少した）S-アデノシルメチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする。
【００４５】
本発明で有用な突然変異体は、好ましくは、グラム陽性および／またはグラム陰性、特にコリネ型細菌のmetKアミノ酸配列内の1以上の保存システイン残基を置換することにより得られる。保存システイン残基は配列アライメントにより容易に同定することができる。細菌S-アデノシルメチオニンシンターゼにおける保存Cys残基の非限定的な具体例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）由来の該酵素のCys24およびCys94が挙げられ、これらは多数の細菌において見出される。
【００４６】
本発明の好ましい突然変異体群においては、Cys24および／またはCys94（コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC 13032 metKの場合）がCys以外のアミノ酸、好ましくはアラニンにより置換されていて、それにより、前記のように酵素活性が減少している。
【００４７】
具体的に開示されているポリペプチドの「機能的等価体」または類似体は、本発明の範囲内では、それらとは異なるが、例えば基質特異性のような所望の生物活性を尚も保持するポリペプチドである。
【００４８】
本発明においては、「機能的等価体」は、特に、前記配列位置の少なくとも1つにおいて具体的に挙げられているアミノ酸以外の別のアミノ酸を有するが、前記生物活性の1つを尚も保持する突然変異体を意味すると理解される。したがって、「機能的等価体」は、1以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位により得られる突然変異体を包含し、前記修飾は、それが本発明の特性プロフィールを有する突然変異体を与える限り、任意の配列位置に位置づけることが可能である。特に、機能的等価体は、突然変異型と非改変型ポリペプチドの反応性パターンが質的に合致する場合、すなわち、例えば異なる速度で同一基質が変換される場合にも見出される。
【００４９】
もちろん、「機能的等価体」は、他の生物から得られるポリペプチドおよび天然に存在する変異体をも包含する。例えば、ある範囲の相同配列領域を配列により同定し、本発明の特定の目的のために等価酵素を決定することが可能である。
【００５０】
同様に、「機能的等価体」は、例えば所望の生物機能を有する本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを包含する。
【００５１】
さらに、「機能的等価体」は、前記ポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価体の1つと、少なくとも1つの別の機能的に異なる非相同配列とを有し、それらが機能的なNまたはC末端連結で連結された（すなわち、それらの融合タンパク質部分が互いに実質的に機能的に悪影響を及ぼし合っていない）融合タンパク質である。そのような非相同配列の非限定的な具体例としては、例えばシグナルペプチド、酵素、免疫グロブリン、表面抗原、受容体または受容体リガンドが挙げられる。
【００５２】
同様に本発明に包含される「機能的等価体」としては、具体的に開示されているタンパク質のホモログが挙げられる。これらのホモログは、PearsonおよびLipmanのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448）を用いて計算した場合に、具体的に開示されている配列の1つに対して少なくとも20％、30％、または例えば40％、50％、好ましくは少なくとも約60％、65％、70％または75％、特に少なくとも85％、例えば90％、95％または99％の相同性を有する。
【００５３】
特に好ましい突然変異体および機能的類似体は、前記のとおりの特徴的な部分配列
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
を含有するものである。ここにおいて、X3は、突然変異により導入された、Cys以外のアミノ酸、特にアラニンである。X3は、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）のmetK野生型配列（配列番号16）のCys94に対応する。X2は、好ましくは、Ala、Glu、Asp、AsnまたはArgを表し、X1は、好ましくは、Gly、Cys、SerまたはAlaを表す。
【００５４】
本発明のタンパク質またはポリペプチドのホモログは、該タンパク質の突然変異誘発により、例えば点突然変異またはトランケーションにより製造することができる。本発明の場合に用いる「ホモログ」なる語は、該タンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する該タンパク質の変異体を意味する。
【００５５】
本発明のタンパク質のホモログは、例えばトランケート型突然変異体のような突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。タンパク質変異体の多様なライブラリーは、例えば、核酸レベルでの組合せ突然変異誘発により、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素により連結することにより作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的ホモログのライブラリーを作製するために使用しうる多数の方法が利用可能である。縮重遺伝子配列をDNA合成装置により化学的に合成し、ついで適当な発現ベクター内に連結することができる。縮重遺伝子のセットの使用は、混合物中に、所望のセットの潜在的タンパク質配列をコードするすべての配列を与えることを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である（例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら, (1984) Science 198:1056; Ikeら (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【００５６】
さらに、タンパク質コドンの断片のライブラリーを使用してタンパク質断片の多様な集団を得てスクリーニングに付し、ついで本発明のタンパク質のホモログを選択することが可能である。1つの実施形態においては、1分子当たり約1回だけ切れ目が生じる条件下でコード配列の二本鎖PCR断片をヌクレアーゼで処理し、該二本鎖DNAを変性させ、切れ目入りの種々の産物のセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖DNAの生成によりDNAを再生させ、新たに生成した二本鎖からS1ヌクレアーゼでの処理により一本鎖セグメントを除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクター内に連結することにより、コード配列断片のライブラリーを作製することができる。この方法は、本発明のタンパク質の種々のサイズを有するN末端断片、C末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーの作製を可能にする。
【００５７】
遺伝子の突然変異誘発のための多数の技術が従来技術において公知である（Coco, WMら 2001. DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nature Biotechnol. 19:354-359; DE 19953854; Leung DWら 1989. A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction. Technique 1:11-15; Stemmer WPC 1994. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:10747-10751;および米国特許第5811238号）。これらの方法は、本発明において有用な突然変異体を得るために用いることができる。
【００５８】
点突然変異またはトランケーションにより作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための及び選択された特性を有する遺伝子産物に関してcDNAライブラリーをスクリーニングするための多数の技術が従来技術において公知である。これらの技術は、本発明のホモログの組合せ突然変異誘発により作製した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに応用することが可能である。ハイスループット分析に付す大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も頻繁に用いられる技術は、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローニングし、得られたベクターライブラリーで適当な細胞を形質転換し、産物が検出されている遺伝子をコードするベクターの単離が所望の活性の検出により促進される条件下で該組合せ遺伝子を発現させることを含む。該ライブラリー内の機能的突然変異体の頻度を増加させる技術である反復的アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis (REM)）を、ホモログを同定するためのスクリーニングアッセイと組合せて使用することが可能である（ArkinおよびYourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００５９】
c）本発明のポリヌクレオチド
同様に、本発明は、例えばとりわけ合成ヌクレオチド類似体を使用して得られる、本発明のmetK酵素およびその機能的等価体をコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA）に関する。
【００６０】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはこれらの生物活性セグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明のコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用しうる核酸断片との両方に関する。
【００６１】
さらに、本発明の核酸分子は遺伝子のコード領域の3'および／または5'末端非翻訳配列を含有しうる。
【００６２】
「単離（された）」核酸分子は、該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されており、そしてそれが組換え技術により製造された場合には、さらに、他の細胞物質または培地を実質的に含有しないもの、あるいはそれが化学合成された場合には、化学前駆体または他の化学物質を含有しないものでありうる。
【００６３】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列を同定および／またはクローニングするために使用しうるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。そのようなプローブおよびプライマーは、通常、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応アンチセンス鎖の少なくとも約12、好ましくは少なくとも約25、例えば約40、50または75個の連続したヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００６４】
本発明の更なる核酸配列は配列番号21から誘導され、単一または数個のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によりそれとは異なっているが、所望の特性プロフィールを有するポリペプチドを尚もコードしている。それらは、該配列位置の少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、80％または90％、好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％または99％において前記配列と同一であるポリヌクレオチドの形態をとりうる。
【００６５】
本発明はまた、具体的な起源生物または宿主生物のコドン使用頻度に従い、具体的に記載されている配列と比較して改変された又はいわゆるサイレント突然変異を含む核酸配列、および天然に存在するそれらの変異体、例えば対立遺伝子変異体を含む。もう1つの対象は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、関心のあるアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸により置換されている）により入手可能な配列である。
【００６６】
本発明のもう1つの対象は、具体的に開示されている核酸から、配列多型を介して誘導された分子である。これらの遺伝的多型は自然変異により集団内の個体間で生じうる。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列における1〜5％の分散を与える。
【００６７】
さらに、本発明は、前記コード配列にハイブリダイズする又はそれに相補的である核酸配列も含む。ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーのスクリーニングの際にこれらのポリヌクレオチドを見出し、適当な場合には、PCRにより適当なプライマーでそれから増幅し、ついで適当なプローブを使用して単離することが可能である。もう1つの可能性は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで適当な微生物を形質転換し、該微生物を増殖させ、それにより該ポリヌクレオチドを増幅し、ついでそれを単離することである。さらに、本発明のポリヌクレオチドは化学合成することが可能である。
【００６８】
ポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」しうるという特性は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、実質的に相補的な配列にはストリンジェントな条件下で結合しうるが、これらの条件下、非相補的相手との非特異的結合は生じないことを意味すると理解される。この目的には、該配列は70〜100％、好ましくは90〜100％の相補性を示すべきである。互いに特異的に結合しうる相補的配列の特性は、例えば、ノーザンまたはサザンブロット技術において、あるいはPCRまたはRT-PCRにおけるプライマーハイブリダイゼーションにおいて利用される。通常、30塩基対以上の長さのオリゴヌクレオチドが使用される。ストリンジェントな条件は、例えばノーザンブロット技術においては、非特異的にハイブリダイズしたcDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出するために、洗浄溶液、好ましくは、0.1％ SDSを含有する0.1×SSCバッファー（20×SSC: 3M NaCl, 0.3M クエン酸Na, pH 7.0）を50〜70℃、好ましくは60〜65℃で使用することを意味すると理解される。前記のとおり、高度の相補性を示す核酸だけが互いに結合したままとなる。ストリンジェントな条件の設定は当業者に公知であり、例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００６９】
d）コード化metK遺伝子の及び他の遺伝子の単離
酵素S-アデノシルメチオニンシンターゼをコードするmetK遺伝子（EC 2.5.1.6）は自体公知の方法で単離することができる。
【００７０】
他の生物のmetK遺伝子または他の遺伝子を単離するためには、第1工程として大腸菌（E. coli）におけるこの生物の遺伝子ライブラリーを作製する。遺伝子ライブラリーの作製は、一般に知られている教本および参考書に詳細に記載されている。具体例としては、Winnackerによる教本（Gene and Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie [Genes and clones, An introduction to genetic engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990)）またはSambrookらによる参考書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)）が挙げられうる。非常によく知られた遺伝子ライブラリーは、Koharaら（Cell 50, 495-508 (198)）によりλベクター中に作製された大腸菌（E. coli）K-12株W3110のものである。
【００７１】
コスミド、例えばコスミドベクターSuperCos I（Wahlら (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164）のほかに、プラスミド、例えばpBR322（Bolivar; Life Sciences, 25, 807-818 (1979)）またはpUC9（Vieiraら, 1982, Gene, 19: 259-268）も、大腸菌（E. coli）における遺伝子ライブラリーの作製に使用することができる。宿主として特に適した大腸菌（E. coli）株は制限欠損および組換え欠損型のものである。一例としては株DH5αmcrが挙げられ、これはGrantら Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649に記載されている。コスミドを使用してクローニングされた長いDNA断片を次いで、配列決定に適した通常のベクター内にサブクローニングし、ついで、例えばSangerら Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977に記載されているとおりに配列決定することができる。
【００７２】
ついで、得られたDNA配列を公知アルゴリズムまたは配列解析プログラム、例えばStadenによるプログラム（Nucleic Acids Research (1986) 14,217-232）、Marckによるプログラム（Nucleic Acids Research (1988) 16, 1829-1836）またはButlerのGCGプログラム（Methods of Biochemical Analysis (1998) 39, 74-97）で調べることが可能である。
【００７３】
ハイブリダイゼーションによりDNA配列を同定するためのプロトコールについては、当業者は、とりわけ、Boehringer Mannheim GmbH（Mannheim, Germany, 1993）による参考書“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”およびLieblら, International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260を参照することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりDNA配列を増幅するためのプロトコールについては、当業者は、とりわけ、Gaitによる参考書Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach（IRL Press, Oxford, UK, 1984）ならびにNewtonおよびGraham: PCR（Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994）を参照することができる。
【００７４】
さらに、タンパク質のNおよび／またはC末端の修飾はタンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさないことが公知である。それどころか、該修飾はそれを安定化することさえ可能である。これに関する情報については、当業者は、とりわけ、Ben-Bassatら (1987) Journal of Bacteriology 169: 751-757、O’Reganら (1989) Gene 77: 237-251、Sahin-Tothら (1994) Protein Sciences 3: 240-247、Hochuliら (1988) Biotechnology 6: 1321-1325ならびに遺伝および分子生物学の公知の教本を参照することができる。
【００７５】
e）本発明で使用する宿主細胞
本発明の方法に使用する宿主細胞は、好ましくは、減少したmetK活性が以下の特性の少なくとも1つにより検出されうるコリネ型細菌である：
a）野生型株と比較して減少した細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b）減少した細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度（全タンパク質に対して、より少ないS-アデノシルメチオニンシンターゼ）、または
c）減少した細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ活性（S-アデノシルメチオニンシンターゼタンパク質含量に対して、より少ないS-アデノシルメチオニンシンターゼ酵素活性）。
【００７６】
これらの特性のすべては、適当な場合には前記を考慮して、簡単な方法で当業者により測定されうる。
【００７７】
本発明は更に、特に、宿主細胞として働く微生物、特に、本発明で定義されるとおりの少なくとも1つのmetK遺伝子を保持するベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドを含有するコリネ型細菌、あるいは減少した活性を有する本発明のmetK遺伝子を発現するコリネ型細菌に関する。
【００７８】
これらの微生物は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから又はグリセロールおよびエタノールから硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを産生しうる。それらは、好ましくは、コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム（Corynebacterium）属の細菌である。コリネバクテリウム（Corynebacterium）属のなかでは、L-アミノ酸を産生しうることが当業者に公知であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種を特に挙げる必要がある。
【００７９】
コリネ型細菌の適当な株の具体例としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属のもの、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種のもの、例えば、
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ATCC 15806、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC 13870、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）FERM BP-1539、
コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）ATCC 17965、
または
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属のもの、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ATCC 14067、
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869および
ブレビバクテリウム・ジバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020、
または、それらに由来する株、例えば、
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）KFCC10065、
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC21608、
（これらは同様に、所望のファインケミカルまたはその前駆体を産生する）を挙げる必要がある（KFCC = Korean Federation of Culture Collection; ATCC = American Type Culture Collection）。
【００８０】
f）本発明の発酵の実施
コリネ型細菌は、本発明のmetK遺伝子を発現した後、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを有利に産生することが、本発明において判明した。
【００８１】
酵素、例えばS-アデノシルメチオニンシンターゼmetKの活性または量を減少させるためには、種々の手段を単独で又は組合わせて用いることが当業者にとって可能である。関心のあるタンパク質の濃度は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の転写頻度を減少させることにより低下させることができる。これは、コード遺伝子のプロモーター領域、調節領域またはリボソーム結合部位を修飾または置換することにより当業者により達成されうる。コード領域の下流では、転写産物の安定性の低下をもたらすインサート配列またはターミネーターを改変することが当業者には可能である。mRNAの寿命を短くするこれらの手段は、対応タンパク質の発現を減少させてその濃度を低下させることを可能にする。
【００８２】
発現酵素のレベルでは、融合配列は分解速度の増加を招いて、同様に該タンパク質の濃度の低下を招きうる。さらに、コード遺伝子を特異的または非特異的突然変異誘発に付すことにより活性、基質親和性および基質特異性を改変することが当業者には可能である。酵素の活性は、酵素反応の反応速度の或る程度の又は完全な減少が生じるよう対応遺伝子内の突然変異により影響されうる。そのような突然変異の具体例は当業者に公知である（Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa H. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001, Eikmanns BJ. Eggeling L. Sahm H. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94）。該タンパク質の突然変異体は酵素複合体のホモまたはヘテロ多量体化の減少または阻害を招いて、この場合も酵素特性の劣化をもたらす。
【００８３】
そのようにして改変された遺伝子はプラスミド内に存在することができ、あるいは、好ましくは、染色体内に組み込まれうる。このようにして修飾されていない元の遺伝子が更に尚も存在することが可能であるが、好ましくは、該遺伝子は改変遺伝子で置換されている。
【００８４】
コリネ型細菌内で測定される、酵素、例えばS-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）の活性を減少させるためには、人工的に作製された突然変異体または他の生物に由来する天然ホモログのような機能的等価体をコードする遺伝子を発現させることで十分かもしれない。元の遺伝子が更に存在することが可能ではあるが、好ましくは、該遺伝子は改変または相同遺伝子により置換されている。
【００８５】
さらに、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンをコリネ型細菌内で発酵により産生させる場合には、本発明のmetK遺伝子を発現させるだけでなく、関心のある生合成経路、システイン代謝経路、アスパラギン酸セミアルデヒド合成、解糖系、補充（アナプレロティックス）、ペントースリン酸代謝、クエン酸回路またはアミノ酸輸出の酵素の1以上を増強することが有利であろう。
【００８６】
したがって、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの製造には、以下の遺伝子の1以上を増強することが可能である。
【００８７】
・アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号281）、
・アスパラギン酸-セミアルデヒドをコードする遺伝子asd（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号282）、
・グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、
・3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、
・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、
・トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、
・ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725）、
・シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491）、
・シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061）、
・メチオニンシンターゼをコードする遺伝子mett（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1663）、
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110）、
・O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726）、
・メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379）、
・ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928）、
・ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767）、
・セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818）、
・システインシンターゼをコードする遺伝子cysK（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2817）、
・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306）。
【００８８】
したがって、コリネ型細菌内での硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの製造には、以下の遺伝子の少なくとも1つを同時に突然変異させて、対応タンパク質がそれらの活性に関して、非突然変異タンパク質の場合と比較して低い程度に代謝産物により影響されるか又は全く影響されないようにし、あるいはそれらの比酵素活性を増強させることが有利であろう。
【００８９】
・アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号281）、
・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、
・ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725）、
・シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491）、
・シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061）、
・メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1663）、
・セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110）、
・O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726）、
・メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379）、
・ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928）、
・ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767）、
・セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818）、
・システインシンターゼをコードする遺伝子cysK（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2817）、
・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306）。
【００９０】
さらに、本発明のmetk遺伝子の1つの発現に加えて硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの製造には、以下の遺伝子の1以上を減弱させること、特に、それらの発現を減少させる又はそれらの発現のスイッチを切ることが有利であろう。
【００９１】
・ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3453）、
・トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328）、
・トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486）、
・メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494）、
・ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157）、
・グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950）、
・ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873）、
・ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476）、
・ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477）、
・ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451）。
【００９２】
さらに、コリネ型細菌内での本発明のmetK遺伝子の1つの発現に加えて硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの製造には、少なくとも1つの以下の遺伝子を同時に突然変異させて、対応タンパク質の酵素活性を或る程度または完全に減少させることが有利であろう。
【００９３】
・ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3453）、
・トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328）、
・トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486）、
・メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494）、
・ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157）、
・グルコース-6-リン酸6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950）、
・ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873）、
・ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476）、
・ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477）、
・ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA（EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451）。
【００９４】
さらに、本発明のmetK遺伝子の発現に加えて硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの製造には、望ましくない二次反応を排除することが有利であろう（Nakayama: “Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００９５】
過剰発現を達成するために、種々の手段を単独で又は組合わせて用いることが当業者には可能である。例えば、関心のある遺伝子のコピー数を増加させることが可能であり、あるいは構造遺伝子の上流に位置するプロモーター領域および調節領域またはリボソーム結合部位を突然変異させることが可能である。構造遺伝子の上流に導入される発現カセットも同様に機能する。また、誘導性プロモーターは、発酵によるL-メチオニンの産生中の発現を増強することを可能にする。発現は、mRNAの寿命を延長させる手段によっても改善される。さらに、該酵素活性は、酵素タンパク質の分解を防ぐことによっても増強される。遺伝子または遺伝子構築物は、種々のコピー数を有するプラスミド内で存在することが可能であり、あるいは染色体内に組み込まれ増幅されうる。あるいは、関心のある遺伝子の過剰発現は更に、培地組成および発酵法を改変することにより達成されうる。
【００９６】
これに関する情報については、当業者は、とりわけ、Martinら（Biotechnology 5, 137-146 (1987)、Guerreroら（Gene 138, 35-41 (1994)）、TsuchiyaおよびMorinaga（Bio/Technology 6, 428-430 (1988)）、Eikmannsら（Gene 102, 93-98 (1991)）、EP 0472869、米国特許第4,601,893号、SchwarzerおよびPuhler（Biotechnology 9, 84-87 (1991)）、Remscheidら（Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)）、LaBarreら（Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)）、WO 96/15246、Malumbresら（Gene 134, 15-24 (1993)）、JP-A-10-229891、JensenおよびHammer（Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)）、Makrides（Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)）ならびに遺伝および分子生物学の公知の教本を参照することができる。
【００９７】
したがって、本発明は、調節核酸配列の遺伝的制御下で本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる発現構築物、およびこれらの発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。好ましくは、本発明のそのような構築物は、関心のあるコード配列の5'上流のプロモーター、および3'下流の終結配列、および適当な場合には更に通常の調節要素を含み、それらのそれぞれはコード配列に機能しうる形で連結されている。「機能しうる形で連結」は、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適当な場合には更に他の調節要素が連続的に配置されていて、該調節要素のそれぞれが、該コード配列の発現に際してその意図された機能を満たしうることを意味すると理解される。機能しうる形で連結されうる配列の具体例としては、活性化配列およびエンハンサーなどが挙げられる。他の調節要素には、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００９８】
人工調節配列に加えて、天然調節配列が尚も、実際の構造遺伝子の前に存在することが可能である。適宜に、この天然調節は遺伝的修飾により排除してもよく、遺伝子発現が増強または減弱されうる。しかし、該遺伝子構築物が、より単純な構造を有すること、すなわち、構造遺伝子の前に追加的な調節シグナルが挿入されておらず、その調節を行う天然プロモーターが除去されていないことも可能である。その代わりに、もはや調節が行われず遺伝子発現が増強または減弱されるよう、天然調節配列が突然変異している。遺伝子構築物中に1コピー以上の核酸配列が存在してもよい。
【００９９】
有用なプロモーターの具体例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来のddh、amy、lysC、dpaA、lysAだけでなく、Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L.,Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, Washington and Patek M. Eikmanns BJ. Patek J. Sahm H. Microbiology. 142 1297-309, 1996に記載されるようなグラム陽性菌プロモーターSPO2、またはグラム陰性菌において有利に使用されるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、I-PRまたはI-PLプロモーターが挙げられる。また、誘導プロモーター、例えば光誘導性、および特に温度誘導性プロモーター、例えばPrPlプロモーターの使用が好ましい。基本的には、すべての天然プロモーターをそれらの調節配列と共に使用することが可能である。また、合成プロモーターも有利に使用されうる。
【０１００】
前記調節配列は核酸配列およびタンパク質発現の標的化発現を可能にするものである。このことは、宿主生物に応じて、例えば、遺伝子が誘導後においてのみ発現または過剰発現されること、あるいは遺伝子が直ちに発現および／または過剰発現されることを意味する。
【０１０１】
これに関連して、調節配列または因子は、好ましくは、発現に対して不利な影響を及ぼして、それを減弱しうる。したがって、弱い転写シグナル（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を使用することにより、転写レベルで減弱が生じうる。しかし、例えば、mRNAの安定性を減少させることにより、翻訳の減弱も可能である。
【０１０２】
これに関連して、調節配列または因子は、好ましくは、発現に対して有益な影響を及ぼして、それを増強または減弱しうる。したがって、強力な転写シグナル（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を使用することにより、調節要素の増強が転写レベルで有利に生じうる。しかし、例えば、mRNAの安定性を向上させることにより、翻訳の増強も可能である。
【０１０３】
発現カセットは、適当なプロモーター、適当なシャイン・ダルガルノ配列をmetKヌクレオチド配列および適当な終結シグナルに融合させることにより製造される。この目的には、通常の組換え及びクローニング技術、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York New York、PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sinsky, John J. 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego、PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa. T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)ならびにAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている技術が用いられる。
【０１０４】
適当な宿主生物における発現のためには、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、宿主内での遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクター内に挿入するのが好都合である。ベクターは当業者によく知られており、例えば、“Cloning Vectors”（Pouwels P. H.ら編, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）に記載されている。また、ベクターは、プラスミドのほかに、当業者によく知られている他のすべてのベクター、例えばファージ、トランスポゾン、IS要素、ファスミド、コスミド、および直鎖状または環状DNAをも意味すると理解される。これらのベクターは宿主生物内での自律複製が可能であり、あるいは染色体に組み込まれて複製されうる。
【０１０５】
本発明のmetK遺伝子は、例えばエピソームプラスミドを使用して発現される。適当なプラスミドは、コリネ型細菌内で複製されうるプラスミドである。非常に多くの公知のプラスミドベクター、例えばpZ1（Menkelら, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554）、pEKEx1（Eikmannsら, Gene 102: 93-98 (1991)）またはpHS2-1（Sonnenら, Gene 107: 69-74 (1991)）は潜在プラスミドpHM1519、pBL1またはpGA1に基づいている。他のプラスミドベクター、例えばpCLiK5MCS（配列番号9）、またはpCG4（米国特許第4,489,160号）もしくはpNG2（Serwold-Davisら, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)）もしくはpAG1（米国特許第5,158,891号）に基づくベクターも同様に使用することができる。
【０１０６】
他の適当なプラスミドベクターは、例えば、hom-thrBオペロンを複製または増幅するための、Remscheidら（Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)）に記載されているもののような、染色体内への組込みによる遺伝子増幅法と共に使用されるものである。この方法においては、宿主（典型的には大腸菌（E. coli））内では複製されうるがコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）内では複製され得ないプラスミドベクター内に完全な遺伝子をクローニングする。適当なベクターとしては、例えばpSUP301（Sirnonら, Bio/ Technology 1,784-791 (1983)）、pK18mobもしくはpK19mob（Schaferら, Gene 145,69-73 (1994)、Bernardら, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)）、pEM1（Schrumpfら 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516）またはpBGS8（Sprattら,1986, Gene 41: 337-342）が挙げられる。他のプラスミドベクター、例えばpCLiK5MCS組込み型sacB（配列番号12）も同様に使用することができる。
【０１０７】
ついで、増幅すべき遺伝子を含有するプラスミドベクターを、形質転換により所望のコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）株内に導入する。形質転換方法は、例えばThierbachら（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)）、DunicanおよびShivnan（Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)）ならびにTauchら（FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)）に記載されている。
【０１０８】
本発明に従い作製された微生物は、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを製造するために、回分法、流加回分法または反復流加回分法により連続的または不連続的に培養することができる。公知の培養方法の概説は、Chmielによる教本（Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはStorhasによる教本（Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Units] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)）に見られる。
【０１０９】
使用する培地は、関心のある菌株の要求を適切に満たすものでなければならない。種々の微生物用の培地の説明は米国細菌学会（Washington D. C., USA, 1981）の“Manual of Methods fur General Bacteriology”に見られる。
【０１１０】
本発明において使用しうるこれらの培地は、通常、1種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０１１１】
好ましい炭素源としては、糖類、例えば単糖類、二糖類または多糖類が挙げられる。非常に優れた炭素源はグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類を、糖蜜または糖精製の他の副産物のような複合化合物として培地に添加することも可能である。また、種々の炭素源の混合物を添加することも有利であろう。他の可能な炭素源としては、油脂、例えば大豆油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびヤシ脂肪；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸；アルコール、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール；ならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸が挙げられる。
【０１１２】
窒素源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の具体例には、アンモニアガス、またはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム；尿素、アミノ酸または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粕、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなどが含まれる。窒素源は単独で又は混合物として使用することができる。
【０１１３】
培地内に存在しうる無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が含まれる。
【０１１４】
無機硫黄含有化合物、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物に加えて、有機硫黄化合物、例えばメルカプタンおよびチオールも、硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンの製造のための硫黄源として使用することができる。
【０１１５】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応ナトリウム含有塩を使用することができる。
【０１１６】
金属イオンを溶解状態で維持するために、金属イオン封鎖剤を培地に加えることができる。特に適した金属イオン封鎖剤には、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコールもしくはプロトカテキン酸、または有機酸、例えばクエン酸が含まれる。
【０１１７】
通常、本発明で使用する発酵培地は、他の成長因子、例えばビタミン、または成長促進物質、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンなどをも含む。成長因子および塩は、しばしば、複合培地成分、例えば酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどから得られる。さらに、適当な前駆体を培地に添加することができる。培地内の化合物の厳密な組成は、関心のある実験によって大きく左右され、各場合ごとに個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教本“Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach”（P.M. Rhodes, P.F. Stanbury編, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3）に記載されている。増殖培地は市販のもの、例えばStandard 1（Merck）またはBHI（脳心臓浸出液、DIFCO）から得ることが可能である。
【０１１８】
培地のすべての成分は、加熱（1.5バール、121℃で20分間）または濾過滅菌により滅菌する。各成分は一緒にまたは適当な場合には別々に滅菌することができる。培地の成分のすべては発酵開始時に存在することが可能であり、あるいは、所望により、連続的に又は回分式に加えることが可能である。
【０１１９】
培養温度は、通常、15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、実験中は一定に保つことが可能であり、あるいは変化させることが可能である。培地のpHは5〜8.5、好ましくは約7.0であるべきである。発酵のためのpHは、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸の添加により、発酵中に制御することができる。泡の発生を抑制するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的に作用する適当な物質、例えば抗生物質を培地に加えることができる。好気的条件を維持するためには、酸素または酸素含有気体混合物、例えば空気を培養物内に通気する。培養温度は、通常、20℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃である。発酵は、所望の産物が最大限に生成するまで継続する。この目的は、通常、10時間〜160時間以内に達成される。
【０１２０】
このようにして得られた発酵ブロス、特に、L-メチオニンを含む発酵ブロスは、通常、7.5〜25重量％の乾燥バイオマスを含有する。
【０１２１】
さらに、発酵時間の少なくとも終了時に（特に、発酵時間の少なくとも30％にわたり）糖制限条件下で発酵を行うのが有利である。これは、この時間中に、発酵培地内の利用可能な糖の濃度が＞0〜3g/lに維持されるか又は低下することを意味する。
【０１２２】
ついで発酵ブロスを更に処理する。要件に応じて、分離方法、例えば遠心分離、濾過、デカントまたはこれらの方法の組合せにより、バイオマスの全部または一部を発酵ブロスから除去することが可能であり、あるいは該ブロス内に完全に残すことが可能である。
【０１２３】
ついでロータリーエバポレーター、薄膜エバポレーター、薄膜降下式エバポレーター、逆浸透またはナノ濾過のような公知方法により発酵ブロスを濃厚化または濃縮する。ついでこの濃縮された発酵ブロスを凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧顆粒化または他の方法により後処理することができる。
【０１２４】
しかし、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを更に精製することも可能である。この目的には、産物含有ブロスを、バイオマスの除去の後、適当な樹脂を使用するクロマトグラフィーに付す。この場合、所望の産物または混入物の全部または一部がクロマトグラフィー樹脂上に保持される。必要に応じて、同じ又は他のクロマトグラフィー樹脂を使用してこれらのクロマトグラフィー工程を繰返すことができる。適当なクロマトグラフィー樹脂の選択およびその最も有効な使用は当業者によく知られている。精製された産物を濾過または限外濾過により濃縮し、産物の安定性が最大となる温度で保存することができる。
【０１２５】
単離された化合物の種類および純度は当分野における技術により決定することができる。これらには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光光度法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素アッセイまたは微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析方法はPatekら (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhovaら (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; およびSchmidtら (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581およびpp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A.ら (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 17に概説されている。
【０１２６】
本発明は以下の非限定的な実施例により更に詳しく説明される。
【０１２７】
図1は、それぞれ野生型酵素およびC94A突然変異体を使用する放射性metKアッセイの結果を示す。
【実施例１】
【０１２８】
ベクターpCLiK5MCSの構築
まず、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号1および配列番号2を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、ベクターpBR322のアンピシリン耐性配列および複製起点を増幅した。  
配列番号1
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’
配列番号2
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’
【０１２９】
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号1は、pBR322に相補的な配列に加えて、5'-3'方向に制限エンドヌクレアーゼSmaI、BamHI、NheIおよびAscIの切断部位を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号2は5'-3'方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、XhoI、NotIおよびDraIの切断部位を含有する。Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）に記載されているような標準的な方法に従い、PfuTurboポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を使用してPCR反応を行った。GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して、得られた約2.1kbのサイズのDNA断片を精製した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、DNA断片の平滑末端を互いに連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。アンピシリン（50μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１３０】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK1と命名した。
【０１３１】
PCR反応用の鋳型としてのプラスミドpWLT1（Lieblら, 1992）から、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号3および配列番号4を使用してカナマイシン耐性カセットを増幅した。  
配列番号3：
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’
配列番号4：
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’
【０１３２】
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号3は、pWLT1に相補的な配列に加えて、5'-3'方向に制限エンドヌクレアーゼXbaI、SmaI、BamHI、NheIの切断部位を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号4は5'-3'方向に制限エンドヌクレアーゼAscIおよびNheIの切断部位を含有する。Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）に記載されているような標準的な方法に従い、PfuTurboポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を使用してPCR反応を行った。GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して、得られた約1.3kbのサイズのDNA断片を精製した。該DNA断片を制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびAscI（New England Biolabs, Beverly, USA）で切断し、その後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して再び精製した。ベクターpCLiK1を同様に制限エンドヌクレアーゼXbaIおよびAscIで切断し、アルカリホスファターゼI（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して脱リン酸化した。0.8％の濃度のアガロースゲルでの電気泳動後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して線状化ベクター（約2.1kb）を単離した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、このベクター断片を切断したPCR断片に連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。アンピシリン（50μg/ml）およびカナマイシン（20μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１３３】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK2と命名した。
【０１３４】
ベクターpCLiK2を制限エンドヌクレアーゼDraI（New England Biolabs, Beverly, USA）で切断した。0.8％の濃度のアガロースゲルでの電気泳動後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して約2.3kbのベクター断片を単離した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、このベクター断片を再連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。カナマイシン（20μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１３５】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK3と命名した。
【０１３６】
PCR反応用の鋳型としてのプラスミドpWLQ2（Lieblら, 1992）から、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号5および配列番号6を使用して複製起点pHM1519を増幅した。  
配列番号5：
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’
配列番号6：
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’
【０１３７】
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号5および配列番号6は、pWLQ2に相補的な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含有する。Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）に記載されているような標準的な方法に従い、PfuTurboポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を使用してPCR反応を行った。GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して、得られた約2.7kbのサイズのDNA断片を精製した。該DNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI（New England Biolabs, Beverly, USA）で切断し、その後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して再び精製した。ベクターpCLiK3を同様に制限エンドヌクレアーゼNotIで切断し、アルカリホスファターゼI（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して脱リン酸化した。0.8％の濃度のアガロースゲルでの電気泳動後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して線状化ベクター（約2.3kb）を単離した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、このベクター断片を切断したPCR断片に連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。カナマイシン（20μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１３８】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5と命名した。
【０１３９】
pCLiK5をマルチクローニングサイト（MCS）だけ伸長させるために、制限エンドヌクレアーゼSwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaIおよびSmaIの切断部位を含有する実質的に相補的な2つの合成オリゴヌクレオチド配列番号7および配列番号8を一緒に95℃に加熱し、ついで徐々に冷却することによりそれらを合体させて二本鎖DNA断片を得た。  
配列番号7：
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
配列番号8：
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’
【０１４０】
ベクターpCLiK5を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI（New England Biolabs, Beverly, USA）で切断し、アルカリホスファターゼI（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して脱リン酸化した。0.8％の濃度のアガロースゲルでの電気泳動後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して線状化ベクター（約5.0kb）を単離した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、このベクター断片を該合成二本鎖DNA断片に連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。カナマイシン（20μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１４１】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5MCSと命名した。
【０１４２】
配列決定反応をSangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従い行った。配列決定反応物を分画化し、ABI Prism 377（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）により分析した。
【０１４３】
得られたプラスミドpCLiK5MCSを配列番号9に記載する。
【実施例２】
【０１４４】
ベクターpCLiK5MCS組込みsacBの構築
PCR反応用の鋳型としてのプラスミドpK19mob（Schaferら, Gene 145,69-73(1994)）から、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号10および配列番号11を使用して枯草菌（Bacillus subtilis）sacB遺伝子を増幅した。  
配列番号10：
5'-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3’
配列番号11：
5'-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3’
【０１４５】
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号10および配列番号11は、pK19mobsacに相補的な配列に加えて、制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含有する。Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）に記載されているような標準的な方法に従い、PfuTurboポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を使用してPCR反応を行った。GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して、得られた約1.9kbのサイズのDNA断片を精製した。該DNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI（New England Biolabs, Beverly, USA）で切断し、その後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して再び精製した。ベクターpCLiK5MCSを同様に制限エンドヌクレアーゼNotIで切断し、アルカリホスファターゼI（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して脱リン酸化した。0.8％の濃度のアガロースゲルでの電気泳動後、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造業者の指示に従い使用して約2.4kbのサイズのベクター断片を単離した。高速DNA連結キット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して、このベクター断片を切断したPCR断片に連結し、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)）に記載の標準的な方法に従い連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene, La Jolla, USA）内に形質転換した。カナマイシン（20μg/ml）含有LB寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上でのプレーティングにより、プラスミド含有細胞を選択した。
【０１４６】
個々のクローンのプラスミドDNAを、Qiaprep遠心ミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造業者の指示に従い使用して単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5MCS integrativ sacBと命名した。
【０１４７】
配列決定反応をSangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従い行った。該配列決定反応を分画化し、ABI Prism 377（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）により分析した。
【０１４８】
得られたプラスミドpCLiK5MCS integrativ sacBを配列番号12に記載する。
【実施例３】
【０１４９】
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）からのmetK遺伝子の単離およびクローニング
Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828の方法を用いて、染色体コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC 13032 DNAを調製した。Grossmannら (2000) FEMS Microbiology Letters 193:99-103のmetK配列から出発して、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。  
配列番号13
5'-GAGAGCCCGGGAAGAAGGGCTGCGACCTCCTCAT-3’
および
配列番号14
5'-CTCTCACGCGTCATATGCAGGTGAGGTAACCCCA-3’
【０１５０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびPfu Turboポリメラーゼ（Stratagene）を使用して、Innisら (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Pressに記載の標準的な方法を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ゲノムDNAから1640塩基対のDNA断片を増幅した。
【０１５１】
該断片を、該PCRオリゴヌクレオチドプライマーにより導入された部位において制限酵素MluIおよびSmaI（Roche Diagnostics, Mannheim）で切断し、ゲル電気泳動により分離した。ついで、GFX（商標）PCR, DNAおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を使用して、該DNA断片をアガロースから単離した。
【０１５２】
ベクターpCLiK5MCS（配列番号9）を同様に制限酵素SmaIおよびMluIで切断し、アルカリホスファターゼI（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造業者の指示に従い使用して脱リン酸化した。該ベクターと該DNA断片とをT4 DNAリガーゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg）で連結し、Sambrookら (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harborに記載の標準的な方法を用いて大腸菌（E. coli）XL-1 Blue（Stratagene）内に形質転換した。
【０１５３】
プラスミドDNAはQuiagenの方法および材料により調製した。配列決定反応はSangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従い行った。該配列決定反応物を分画化し、ABI Prism 377（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）により評価した。
【０１５４】
得られたプラスミドpCLiK5MCS/metKwtを配列番号15に記載する。
【実施例４】
【０１５５】
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）metK遺伝子の突然変異誘発
QuickChangeキット（Stratagene）を製造業者の指示に従い使用して、コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）metK遺伝子の特異的突然変異誘発を行った。突然変異誘発は、プラスミドpCLiK5MCS/metKwt（配列番号15）において行った。配列番号16のシステイン94をアラニン94に置換するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。  
配列番号17
5'- GATTCGACGGACGCACCGCTGGCGTCTCAGTATCCATC-3’
および
配列番号18
5'-GATGGATACTGAGACGCCAGCGGTGCGTCCGTCGAATC-3’
【０１５６】
これらのオリゴヌクレオチドプライマーの使用は、配列番号15において、1056位のヌクレオチド置換（CがGにより置換された）および1057位のヌクレオチド置換（AがCにより置換された）をもたらした。形質転換およびプラスミド調製の後、metk遺伝子内で生じたアミノ酸置換Cys94Alaを配列決定反応により確認した。このプラスミドをpCLiK5MCS/metKC94Aと命名し、配列番号19に記載する。
【実施例５】
【０１５７】
SAMシンターゼ（metK）アッセイ
プラスミドpCLiK5MCS/metKwt（配列番号15）またはプラスミドpCLiK5MCS/metKC94A（配列番号19）で形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）株を、BHI/グルコース培地（37g/l調製された脳心臓浸出液培地, Difco, 10 mM (NH4)2SO4, 4％グルコース）内で30℃で、OD600が20になるまで増殖させた。該細胞を4℃で遠心沈降させ、ペレットを冷生理食塩水で洗浄した。再遠心分離後、0.25gの湿潤細胞ペレットを4℃で1mlの破砕バッファー（50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 50 mM KCl, 1 mM DTT）に再懸濁させた。この細菌懸濁液をHybaidのRibolyser中およびHybaidの青色Ribolyserチューブ中、回転設定6.0で3回（各回、30秒間）細胞溶解した。溶解産物をEppendorf遠心機による13000rpmでの遠心分離により45分間清澄化し、上清を水で1：10希釈した。Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254に記載の方法によりタンパク質含量を測定した。
【０１５８】
以下のとおりに改変したMarkham, G.D.ら (1983) Methods in Enzymology 94: 219-222の方法により、SAMシンターゼの酵素活性を測定した。
【０１５９】
100 mM Tris pH 8.0、100 mM KCl、20 mM MgCl2、1.2 mM L-メチオニン、10 mM ATP、15.15μCiに相当する1μl 35S-L-メチオニン（Amersham SJ204, 比活性1 Ci/μmol）およびH2O（100μlに調整）を含有する100μlの反応混合物を、関心のある100μgのタンパク質溶解産物により開始させ、37℃でインキュベートした。0、5、10、20、30および60分後、反応混合物の10μl アリコートを取り出し、20μlの50 mM EDTAを使用して氷上で反応停止させた。
【０１６０】
停止反応液の30μlをホスホセルロースフィルターユニット（Pierce, No. 29520）上に配置し、Eppendorf遠心機中で6000rpmで1分間遠心沈降させた。フィルターを500μlの75 mM リン酸で2回洗浄し、ついで、シンチレーション液を含有する計数管内に配置した。生成したS-アデノシルメチオニンの放射能はシンチレーションカウンター（Beckman）で測定する。
【０１６１】
データを添付の図1に示す。
【０１６２】
放射性L-メチオニンの比活性および使用したタンパク質の量を考慮して、単位時間当たりの取込み放射能の増加からS-アデノシルメチオニンの生成速度を求めることができる。その単位はμmol S-アデノシルメチオニン/分*mgタンパク質である。この速度を野生型酵素と突然変異型酵素との間で比較することが可能である。
【実施例６】
【０１６３】
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）における細胞性S-アデノシルメチオニン力価の測定
pCLiK5MCS/metKwt（配列番号15）またはpCLiK5MCS/metKC94A（配列番号19）で形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）株における細胞性S-アデノシルメチオニン力価を測定するためには、以下の方法を用いた。実施例5に記載のとおりに得て、氷冷生理食塩水で洗浄した細胞ペレットをトリクロロ酢酸（0.1gの湿潤ペレット当たり200μlのTCA）に再懸濁させた。氷上で5分後、懸濁液をEppendorf遠心機中、4℃、13 000rpmで5分間清澄化した。上清中のS-アデノシルメチオニン含量をHPLCにより測定した（Ionospher 5C陽イオン交換カラム、注入容量10μl、移動相: 70％ vol/vol 0.2M ギ酸アンモニウム pH 4.0、30％ vol/vol メタノール; UV検出 260nm; 40℃; 保持時間8.5分）。
【表１】
2005533490.tif 000003
【実施例７】
【０１６４】
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）におけるmetK wt遺伝子のmetK C94Aによる置換
コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）KFCC10065におけるmetK野生型遺伝子の、突然変異型metK C94Aによる対立遺伝子置換のために、まず、配列番号19からのmetK C94A配列をpCLiK5MCS integrativ sacB（配列番号12）内にクローニングした。この目的には、プラスミドpCLiK5MCS/metKC94A（配列番号19）を制限エンドヌクレアーゼBglIIおよびXhoI（NEB, Schwalbach）で切断した。得られた1962塩基対の断片を実施例3に記載のとおりに精製した。ベクターpCLiK5MCS integrativ sacBを同様にBglIIおよびXhoIで切断し、実施例3に記載のとおりに精製した。実施例3に記載のとおりに、ベクターと断片とを連結し、大腸菌（E. coli）XL-1 Blue内に形質転換した。該プラスミドを精製し、配列決定後に確認した。得られたプラスミドpCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94Aを配列番号20に記載する。
【０１６５】
プラスミドpCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94Aを、Lieblら, (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載のエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）KFCC10065内に形質転換した。このプロトコールの変法がDE 10046870に記載されている。Sambrookら (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harborに記載されている、サザンブロットおよびハイブリダイゼーションによる標準的な方法により、個々の形質転換体のmetK遺伝子座の染色体配置を確認した。それにより、形質転換体は、相同組換えによりmetK遺伝子座に組込まれた形質転換プラスミドを有するものであることが確認された。そのようなコロニーを、抗生物質を含有しない培地内で一晩増殖させた後、これらの形質転換体をショ糖CM寒天培地（10％ショ糖）上でプレーティングし、30℃で24時間インキュベートした。
【０１６６】
ベクターpCLiK5MCS integrativ sacB/metKC94A内に存在するsacB遺伝子はショ糖を毒性産物に変換するため、野生型metK遺伝子と突然変異型metKC94A遺伝子との間の第2の相同組換え過程によりsacB遺伝子が欠失したコロニーのみが成長しうる。相同組換えが生じる際に、野生型遺伝子または突然変異型遺伝子がsacB遺伝子と共に欠失することがある。sacB遺伝子が野生型遺伝子と共に除去されると、突然変異型の形質転換体が生じる。
【０１６７】
増殖しているコロニーを選び出し、それらのゲノムDNAを調製し、metK遺伝子を2つの方法により分析した。まず、実施例4に記載されるような2個のヌクレオチドの置換を用いた。それらの2つの対立遺伝子を3'末端において区別しうる特異的PCRオリゴヌクレオチドプライマーと第2のmetK特異的オリゴヌクレオチドプライマーとを使用して、特徴的（diagnostic）PCR断片を作製した。つぎに、該突然変異の上流または下流に結合するPCRオリゴヌクレオチドプライマーでPCR増幅した後、約100個の形質転換体のmetK遺伝子座を配列決定した。いくつかの突然変異metKクローンを取得した。1つのそのようなクローンをKFCC10065metKC94Aと命名した。突然変異体C94Aのアミノ酸配列は配列番号22に対応する。
【実施例８】
【０１６８】
株KFCC10065metKC94Aを使用するメチオニンの製造
実施例6で得た株KFCC10065metKC94Aを、BHI培地（Difco）を含有する寒天プレート上で30℃で2日間増殖させた。増殖した細胞を該寒天プレートから食塩水に懸濁させ、1.5のOD 600nmにおいて培地IIに移した。培地IIは以下の組成を有していた。
【０１６９】
培地 IIA：
0.6g/l KH2PO4
0.4g/l MgSO4*7H2O
25g/l (NH4)2SO4
40g/l 粗糖
60g/l 糖蜜
このようにして調製した培地をNH4OHでpH 7.8にし、120℃で30分間滅菌した。
【０１７０】
培地IIB：
0.3mg/l チアミン*HCl
1mg/l ビオチン
2mg/l FeSO4
2mg/l MnSO4
0.1mg/l ビタミンB12
培地IIBは別個に調製し、濾過滅菌し、培地IIAに加えた。それらの2つの成分IIAおよびIIBは一緒になって培地IIを構成する。
【０１７１】
10mlの培地II（= IIA+B）を、0.5gの滅菌CaCO3を含有する100ml エーレンマイヤーフラスコ中、前記株の細胞で処理し、回転（orbital）振とう機上、30℃、200rpmで72時間インキュベートした。
【０１７２】
培養ブロス内の生成されたメチオニンを、Agilentによる、Agilent 1100 Series LC System HPLCでのアミノ酸決定法により測定した。オルト-フタルアルデヒドでのプレカラム誘導体化は、アミノ酸混合物をHypersil AAカラム（Agilent）上で分離しながら、生成されたアミノ酸の定量を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】それぞれ野生型酵素およびC94A突然変異体を使用する放射性metKアッセイの結果を示す。
【配列表】
2005533490.tif 000004
2005533490.tif 000005
2005533490.tif 000006
2005533490.tif 000007
2005533490.tif 000008
2005533490.tif 000009
2005533490.tif 000010
2005533490.tif 000011
2005533490.tif 000012
2005533490.tif 000013
2005533490.tif 000014
2005533490.tif 000015
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2005533490.tif 000018
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2005533490.tif 000020
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2005533490.tif 000022
2005533490.tif 000023
2005533490.tif 000024
2005533490.tif 000025
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2005533490.tif 000027
2005533490.tif 000028
2005533490.tif 000029
2005533490.tif 000030
2005533490.tif 000031
2005533490.tif 000032
【図１】
2005533490.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月6日(2004.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させる工程、ここにおいて、該コリネ型細菌は、改変されたS-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現するものであること、
b）該培地内および／または該細菌細胞内の硫黄含有ファインケミカルを濃縮する工程、
c）硫黄含有ファインケミカルを単離する工程、
を含んでなる、少なくとも1つの硫黄含有ファインケミカルの発酵による製造方法。
【請求項２】
硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1記載の製造方法。
【請求項３】
非突然変異野生型と比較してmetK活性が減少した突然変異コリネ型細菌を使用する、請求項1または2記載の製造方法。
【請求項４】
突然変異コリネ型細菌が更に、非突然変異野生型と比較して改良されたmetY活性および／または増加したL-メチオニン量を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項５】
metKコード配列が、野生型タンパク質の少なくとも1つのシステイン残基が置換されている減少したmetK活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項６】
metKコード配列が、以下のアミノ酸部分配列：
G(F/Y)(D/S)X1X2(S/T)X3(G/A)V
（ここで、X1およびX2は、互いに独立して、任意のアミノ酸を表し、X3はCys以外のアミノ酸を表す）
を有するmetK活性のあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項5記載の製造方法。
【請求項７】
metKコード配列が、metK活性を有するタンパク質をコードし、該タンパク質が、配列番号22に示すVal1からAla407までのアミノ酸配列、またはそれに相同でありかつ機能的に等価なタンパク質を表すアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項８】
metKコード配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるか又は染色体内に安定に組み込まれるDNA、またはRNAである、請求項1〜7のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項９】
a）プラスミドベクターで形質転換されており、調節配列の制御下で突然変異metK配列の少なくとも1つのコピーを保持する細菌株を使用する、または
b）突然変異metK配列が細菌染色体内に組み込まれている株を使用する、請求項1〜8のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１０】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の少なくとも1つの別の遺伝子が更に増強されている細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１１】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生成を減少させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１２】
a）アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
b）アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
c）グリセリンアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
d）3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
e）ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
f）トリオース-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
g）ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
h）シスタチオニン-γシンターゼをコードする遺伝子metB、
i）シスタチオニン-γリアーゼをコードする遺伝子metC、
j）メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
k）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
l）O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
m）メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
n）ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
o）ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
p）セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、
q）システインシンターゼをコードする遺伝子cysK、
r）ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる、および／または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して低い程度に代謝産物により影響されるか若しくはもはや影響されない、あるいはその比活性が増強しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１３】
a）ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b）トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c）トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d）メソ-ジアミノピメリン酸Dデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e）ホスホエノール-ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f）グルコース-6-リン酸-6イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g）ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h）ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、または
j）ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
から選ばれる遺伝子の少なくとも1つが同時に弱められているコリネ型細菌を発酵させる、および／または、これらの遺伝子の少なくとも1つが同時に突然変異していて、結果的に対応するタンパク質の酵素活性が部分的もしくは完全に減少しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１５】
a）請求項1〜14のいずれか1項に定義されるL-メチオニン産生微生物を発酵培地内で培養し、発酵させる工程、
b）L-メチオニン含有発酵ブロスから水を除去する工程、
c）発酵中に生成したバイオマスの0〜100重量％を除去する工程、
d）工程b）および／またはc）により得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得る工程、
を含んでなる、発酵ブロスからのL-メチオニン含有動物飼料添加物の製造方法。
【請求項１６】
減少したmetK活性を有するポリペプチドをコードする、コリネ型細菌由来の請求項5〜7のいずれか1項に定義される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項16記載のポリヌクレオチドによりコードされる、減少した活性を有するmetK突然変異体。
【請求項１８】
請求項5〜7のいずれか1項に定義されるポリヌクレオチド配列を含む突然変異metK遺伝子を発現する組換えコリネ型細菌。
【請求項１９】
もはやmetK野生型酵素を発現しない、請求項18記載の組換えコリネ型細菌。
【請求項２０】
対応する野生型株と比較して、以下の形質：
a）より低い細胞内S-アデノシルメチオニン力価、
b）より低い細胞内S-アデノシルメチオニンシンターゼ濃度、または
c）S-アデノシルメチオニン生成の速度に関して測定した場合の、より低いS-アデノシルメチオニンシンターゼ活性、
の少なくとも1つ、さらに、適当な場合には、以下の形質：
d）改善されたmetY活性、または
e）増加したL-メチオニン量、
の少なくとも1つを有する、請求項19記載の組換えコリネ型細菌。
【請求項２１】
請求項5〜7のいずれか1項に定義されるコリネ型細菌由来のmetK突然変異体のコード配列を調節ヌクレオチド配列の制御下で含有する発現構築物。
【国際調査報告】
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