(57)【要約】本発明は、市場向けの魚類および甲殻類の成長を促進するための化合物の合成に関する。本発明の目的は、成長ホルモン等の放出を直接的あるいは間接的に誘導し、魚類の血中における循環成長ホルモン量を増加させるためのＧＨＲＰ−６を提供することにある。このペプチドは、安定性、可溶性、生物学的活性を有する。さらにこのペプチドは、魚類および甲殻類である対象生物の成長促進、幼生の品質改良、病原物質に対する抵抗力の向上、乾燥重量の増加、筋肉中のタンパク質濃度およびＲＮＡ量の増加を促進することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
His D-Trp Ala Trp D-Phe Lys-NH2で表されるアミノ酸配列を有するペプチドＧＨＲＰ−６を用いることを特徴とする、魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気に対する抵抗力の向上のための方法。
【請求項２】
魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気への抵抗力の向上のための調合餌に、対象生物の湿重量１ｇ当たり０．０１〜５０μｇの量になるように該ＧＨＲＰ−６ペプチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気への抵抗力の向上のための定期的注射用の注射液に、対象生物の湿重量１ｇ当たり０．０１〜５０μｇの量になるように該ＧＨＲＰ−６ペプチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気への抵抗力の向上のための、対象生物を１〜７日おきに浸漬する淡水または海水からなる浸漬液に、淡水または海水１リットル当たり１０〜５００μｇの量になるように該ＧＨＲＰ−６ペプチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気への抵抗力の向上のための、対象生物に１〜７日おきに与える被包せしめた調合餌に、対象生物の湿重量１ｇ当たり０．０５〜１０μｇの量になるように該ＧＨＲＰ−６ペプチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対象生物が Oreochromis sp. のティラピアであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
対象生物が Salmon sp. であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象生物が Litopenaeus schmitti または Litopenaeus vanamei であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
対象生物が Panaeus sp. のエビであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
寄生生物感染やその他の病気の予防用および治療用であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Trichodina sp. および単生類である蠕虫による、寄生生物感染の予防用および治療用であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
シーライスによる、寄生生物感染の予防用および治療用であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
外部寄生虫による、寄生生物感染の予防用および治療用であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
His D-Trp Ala Trp D-Phe Lys-NH2で表されるアミノ酸配列を有するペプチドＧＨＲＰ−６を用いることを特徴とする、魚類および甲殻類である対象生物の成長促進および病気に対する抵抗力の向上のための獣医学的調合物。
【請求項１５】
注射液、経口物または浸漬液に用いることを特徴とする、請求項１４に記載の調合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、市場向け魚類および甲殻類の成長を促進するための化合物の合成に関する。従来、ｌｅｕ−エンケファリンおよびｍｅｔ−エンケファリンの各ペプチドアナログの合成に関する報告がなされており、いずれも動物において成長ホルモン（growth hormone）（以下、屡々「ＧＨ」と称す）の放出を促進することが示された（Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. 「脳下垂体に働きかけて成長ホルモンを特異的に放出させる新規な合成ヘキサペプチドの in vitro および in vivo における活性について（On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptide that acts on the Pituitary to specifically release growth hormone）」 Endocrinology. 114: 1537-45）。
【０００２】
ＧＨ放出ペプチド（GH releasing peptides）（以下、屡々「ＧＨＲＰ」と称す）の構造と活性との関係を解明するための研究が進んだ結果、ＧＨＲＰ−６（His D-Trp Ala Trp D-Phe Lys-NH2）が同定された。このペプチドはヒトを含む動物全般に対する非常に効果的且つ安全性の高いＧＨ放出促進因子（GH secretagogue）（以下、屡々「ＧＨＳ」と称す）であることが報告されているものの、この化合物を水生生物に対して用いた例は未だ報告されていない。
【０００３】
本発明者らは、甲殻類の成長促進を司るシグナルカスケード（視床下部−脳下垂体−標的器官）の存在に関する証拠が不足していることを念頭に置き、ＧＨＲＰ−６ペプチドは単独で哺乳類よりも甲殻類においてシグナルカスケードと同様の生物学的作用を及ぼすことができるという新事実を見出した。
【０００４】
淡水魚は水産養殖産業における主要産物であるにも関わらず、この１０年来は、海水藻類、軟体動物や甲殻類の養殖の増加が顕著である。養殖する生物の遺伝、繁殖、食餌および生理などに関する知識の向上が水産養殖産業の進歩のための第一歩である（Gomez-Chiarri M, Smith GJ, de la Fuente J and Powers DA. 1998. 「貝類および藻類における遺伝子転移（Gene transfer in shellfish and algae.）」； In de la Fuente J and Castro FO編集. 「水生生物における遺伝子転移（Gene transfer in aquatic organisms）」 Austin, Texas: RG Landes Company and Germany: Springer Verlag; p.107-125）。
【０００５】
市場向け魚類および甲殻類の成長メカニズムに関与するホルモンやペプチドの分子特性に関する研究を、水産養殖産業の進歩のために役立てることは非常に重要なことである。
【０００６】
そのことを理解するための例として、１９９９年に Silverstein et al. が行った、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadotropin releasing hormone）（以下、屡々「ＧｎＲＨ」と称す）およびドーパミン受容体に対する拮抗物を使用した、ナマズ（Ictalarus punctatus）の繁殖の調節および誘導に関する実験（Silverstein JT., Bosworth BG. and Wolters WR. 1999. 「養殖ブチナマズ Ictalarus punctatus の人工産卵における、ＬＨＲＨａおよびドーパミン受容体拮抗物質ピモジドの二重接種に関する評価（Evaluation of dual injection of LHRHa and the dopamine receptor antagonist pimozide in cage spawning of channel catfish Ictalarus punctatus）」 Journal of the World Aquaculture Society. Vol. 30, No. 2, June, 263-268）が挙げられる。このナマズの種は世界の水産養殖において非常に重要な位置を占めている。
【０００７】
Hashizume et al. は畜産農家の生産高増加のための合成ペプチドの用途について１９９７年に発表している（Hashizume T., Sasaki M., Tauchi S. and Masuda H. 1997. 「ヤギの成長ホルモン放出における新規な成長ホルモン放出ペプチド（ＫＰ１０２）の効果（The effect of new growth Hormone-releasing peptide (KP 102) on the release of growth hormone in goats）」 Animal Science and Technology. Vol. 68, No. 3, March, 247-256）。Hashizume et al. は新規な成長ホルモン放出合成ペプチドの注射がヤギの成長ホルモンを誘発することを示した。
【０００８】
コイにインシュリンを経口投与したところ、温度変化への順応に関与する受容体のシグナルとホルモンの変化が確認されている（Vera MI., Romero F., Figueroa J., Amthauer R., Leon G., Villanueva. and Krauskopf M. 1993. 「冬季環境に順応させたコイ(Cyprinus carpio)へのインシュリン経口投与は肝臓微細構造の変化を誘発する（Oral administration of insulin in winter-acclimatized carp (Cyprinus carpio) induces hepatic ultrastructural changes）」 Comp. Biochem. Physiol. Vol.106A, No.4, 677-682）。
【０００９】
一方哺乳類については、成長ホルモン放出ペプチドの合成変異体を用いた実験が１９９５年に Patchett et al. によって行われている。彼らは、イヌＧＨの強力な経口活性体であり、投与後にチロキシンレベルにもプロラクチンレベルにも影響を及ぼさない化合物として知られているＭＫ−０６７７ペプチドについて検討した（Patchett AA., Nargund RP., Tata JR., Chen MH., Barakat KJ., Johnston DBR., Cheng K., Chan WWS., Butler B., Hickey G., Jacks T., Schleim K., Pong SS., Chaung LYP., Chan HY., Frazier E., Leung KH., Chiu SHL. and Smith RG. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.92, 7001-7005）。
【００１０】
成長ホルモン放出ホルモンの他の用途としては、ウシの搾乳量増加のための用途が挙げられ、このケースでは、循環ＧＨレベルの上昇によって放乳量が増加することを念頭に置いている（Soliman EB., Hashizume T., Ohashi S. and Kanematsu S. 1997. 「培養ウシ腺下垂体細胞における、成長ホルモン（ＧＨ）放出ホルモンおよびそのアナログのＧＨ分泌作用に対する影響（Effects of Growth hormone (GH)-releasing hormone and its analogs on GH secretion from cultured adenohypophysial cells in cattle）」 Domestic animal endocrinology. Vol.14(1), 39-46）。
【００１１】
しかしながら、魚類および甲殻類に対してＧＨＲＰ−６ペプチドを用いた前例は存在しない。本明細書において開示した、魚類および甲殻類である対象生物の成長促進、幼生の品質改良、病原物質に対する抵抗力の向上、乾燥重量の増加、筋肉中のタンパク質濃度およびＲＮＡ量の増加を促進するためのＧＨＲＰ−６ペプチドの用途は、水生生物の養殖における生産高増加のための手段を包含するものである。
【００１２】
Penaeus japonicus や Litopenaeus vanname などのエビの種については、遺伝学的手法を用いて飼育した先行技術もあるが、このような生物の遺伝学および生化学に関する知識が不足しており、この技術は十分とは言えない（Benzie, J.A.H., 1998. 「クルマエビ類の遺伝学と生物工学（Penaeid genetics and biotechnology）」 Aquaculture 164, 23-47 and Fjalestadl, K.T., Carr, W.H., Lotz, J.L., Sweeney, J.N., 1999.；「太平洋白エビ Penaues Oannamei における遺伝的多様性および体重と病気に対する抵抗力における選択的応答（Genetic variation and selection response in body weight and diseases resistance in the Pacific White Shrimp Penaues Oannamei）」 Aquaculture 173, 10, 要約書のみ）。エビの養殖において生産高を増加するためには、生物工学、分子生物学、遺伝子工学および生化学を応用することが非常に重要である（Bachere, E., Mialhe, E., Noel, D., Boulo, V., Morvan, A., Rodriguez, J.(1995) 「海生軟体動物および甲殻類の免疫学に関する知識および研究の展望（Knowledge and research prospects in marine mollusc and crustacean immunology）」 Aquaculture. 132, 17-32）。
【００１３】
本発明は、ＧＨＲＰ−６ペプチドが単独で魚類および甲殻類である対象生物の成長促進、幼生の品質改良、病原物質に対する抵抗力の向上、乾燥重量の増加、筋肉中のタンパク質濃度およびＲＮＡ量の増加などを促進することができることを裏付けるものである。
【００１４】
発明の概要 
本発明の要点およびその新規性は、ＧＨＲＰ−６ペプチドが単独で魚類および甲殻類である対象生物の成長促進、幼生の品質改良、病原物質に対する抵抗力の向上、乾燥重量の増加、筋肉中のタンパク質濃度およびＲＮＡ量の増加などを促進することができることによって裏付けられている。ＧＨ放出促進因子であるＧＨＲＰ−６ペプチドは、経口、注射または浸漬で投与することにより、単独で魚類および甲殻類である対象生物の成長を促進することができる。
【００１５】
発明の詳細の説明 
初めに、His D-Trp Ala Trp D-Phe Lys-NH2で表されるアミノ酸配列を有するヘキサペプチドＧＨＲＰ−６（成長ホルモン放出ペプチド（Growth hormone release peptide））は、哺乳類や鳥類に見られる機能（Bowers C, Momany, G, Reynolds G and A. Hong. 1984. 「脳下垂体に働きかけて成長ホルモンを特異的に放出させる新規な合成ヘキサペプチドの in vitro および in vivo における活性について（On the in vitro and in vivo activity of a new synthetic hexapeptide that acts on the Pituitary to specifically release growth hormone）」  Endocrinology. 114: 1537-45）と同様に、ＧＨ放出を促進させるための生理活性を有することを示した。
【００１６】
硬骨魚類のＧＨ値は１日の変動が激しいため、血清のサンプルは、各魚につき処置前と処置後の両方で採取した。経時的変化を追う実験においては、ヘキサペプチドの腹腔内投与から１５分後には、血清ＧＨ値の上昇が認められた。他の脊椎動物と同様に、硬骨魚類においても、ＧＨの成長促進活性は主にＩＧＦの誘導によって仲介される。ＧＨＲＰ−６の腹腔内注射から３０分後には、肝臓ＩＧＦのｍＲＮＡ量が大幅に上昇したが、６時間後には正常値に戻った（実施例１参照）。
【００１７】
このことから、ＧＨＲＰ−６ペプチドは単独で、哺乳類や鳥類よりも魚類において効果的に生物学的作用を及ぼすことが判明した。これは、哺乳類や鳥類のメカニズムと魚類のメカニズムが類似していることを示唆している。
【００１８】
淡水ティラピアの稚魚の体の成長調節におけるＧＨＲＰ−６の役割を in vivo で評価した。種々の投与方法でＧＨＲＰ−６による処置を行ったところ、対照群と比べ大幅な成長促進が認められた。具体的には、投与を以下の３種のいずれかの方法で行い、実験開始から３週間後の成長速度の増加によって求めた結果である（実施例２参照）：ａ）腹腔内への注射、ｂ）経口およびｃ）浸漬。
【００１９】
１ｇのティラピアの幼生を用いて、浸漬により投与したヘキサペプチドＧＨＲＰ−６の、病原物質への抵抗力および肉質の向上における効果を示した（実施例３参照）。その結果、ＧＨＲＰ−６で処理したティラピア群においては、体重およびタンパク質濃度の増加が認められ、病原体の寄生頻度およびその蔓延率、ならびに筋肉中の水分含有量が減少することが判明した。これは、ヘキサペプチドのタンパク質合成におけるプラスの効果を示唆している。
【００２０】
以下の異なる投与方法を用いて、エビであるLitopenaeus schmittiにおけるＧＨＲＰ−６のアッセイを行ったところ、ＧＨＲＰ−６ペプチドは単独で甲殻類の成長を促進することが判明した（実施例４参照）：ａ）腹腔内への注射、ｂ）経口およびｃ）浸漬。
【００２１】
エビであるLitopenaeus schmitti を用いたアッセイは、４つの異なる成長段階の幼生に対して浸漬によってヘキサペプチドを投与することで行い、その結果、成長速度の上昇が認められた。また、養殖サイクルの最終段階にある幼生の質も向上していた。すなわち、幼生の体重、大きさ、鰓の分枝数、変化した吻側骨の数、筋肉中のタンパク質濃度とＲＮＡ量の大幅な増加が見られた。このことにより、幼生の代謝活動が活発になったことは明らかである。
【００２２】
エビの幼生における質の向上は成体においても維持され、エビ成体では、生物量が増加するとともにその体重や大きさの均一性が増した。ＧＨＲＰ−６は筋肉注射によってLitopenaeus schmitti のエビ成体の成長速度を上げることができた。ＧＨＲＰ−６の注射から１５日後には、実験動物郡は、対照群に比べて１００〜１５０％増加していた（実施例５参照）。
【００２３】
ＧＨ放出促進因子であるＧＨＲＰ−６を餌に配合するか Artemia salina に被包せしめて経口で投与することにより、エビである Litopenaeus schmitti の成長速度を、対照群に比べて３０〜４０％上昇することができた（実施例６参照）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
【実施例１】
【００２５】
ＧＨＲＰ−６の、魚類における生体活性の説明 
平均体重が７１±２８ｇである１５匹のティラピアを実験に用いた。ＧＨＲＰ−６の注射を、ヘキサペプチドとして０．１μｇ／ｇｂｗで行った。肝臓と血液のサンプルを、処置前と、ペプチド投与から１５分後、３０分後、６０分後および３６０分後に採取した（３匹で１群とした）。血清と肝臓のサンプルはそれぞれ回収し、全ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析またはＥＬＩＳＡによるＧＨ値の測定に使用するまで−７０℃で保管した。また、各魚の処置前の血清も採取した。
【００２６】
ペプチドを注射したティラピアにおける、相対ＩＧＦ ｍＲＮＡ量はノーザンブロット分析で測定した。全ＲＮＡは、Chomczynski と Sacchi の発表した方法（Chomczynski P, Sacchi N. 「チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離のための一工程からなる方法（Single step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）」 Anal. Biochem. 1987; 162:156-59）に従って、肝臓サンプルから精製した。２０μｇのＲＮＡを１％フォルムアルデヒド アガロースゲルで分画した後、ナイロン メンブレン（Hybond N）（Amersham UK社製）に転写し、ティラピアＩＧＦ−ＩのｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。続いて、シグナルを標準化するために、ヒトのグリセルアルデヒド３−リン酸脱水酵素（ＧＡＰＤＨ）のｃＤＮＡ（米国オハイオ州、クリーブランド ファウンデーション（Cleveland Foundation）のDr. Bryan Williamsより寄贈されたもの）を用いて再度ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションシグナルの定量化は、スキャナー（Scanjet Plus）（Hewlett Packard社製）でゲルをスキャンして得られたデータのデジタル画像処理で行った。画像処理はBandleaderコンピュータプログラム（Bandleader Computer Program）を使って行い、その結果をＲＮＡの任意単位で表した。
【００２７】
血清ＧＨ値は、ティラピアＧＨに対する２種のモノクローナル抗体（Munoz et al, 準備中）を用いたＥＬＩＳＡで測定した。
【００２８】
硬骨魚類のＧＨ値は１日の変動が激しいため、血清のサンプルは、各魚につき処置前と処置後の両方で採取した。図１に示したように、経時的変化を追う実験においては、ヘキサペプチドの腹腔内投与から１５分後には、血清ＧＨ値の上昇が認められた。他の脊椎動物と同様に、硬骨魚類においても、ＧＨの成長促進活性は主にＩＧＦの誘導によって仲介される。ＧＨＲＰ−６の腹腔内注射から３０分後には、肝臓ＩＧＦのｍＲＮＡ量が大幅に上昇したが、６時間後には正常値に戻った（図１参照）。
【実施例２】
【００２９】
ティラピア（Oreochromis sp.）の稚魚におけるＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
２．１  腹腔内注射 
ＧＨＲＰ−６（スイス国、BACHEM社製）をＰＢＳで希釈し、魚の体重１ｇ当たり（ｇｂｗ）、０．１μｇの投与量で１週間に２回ずつ、３週間に渡って注射した。平均体重が６１．４１±１４．３６ｇである８匹のオスのティラピアに上記のペプチドを注射して実験群とし、平均体重が６１．５８±２９．６７ｇである７匹のオスのティラピアにＰＢＳを注射して対照群とした。
【００３０】
魚の体重（ｇ）を毎週測定した。全ての実験において、魚はマイクロチップ（米国、ウッドデール、Stoelting Co.社製）で識別した。（図２参照）
【００３１】
２．２  経口投与 
別の投与方法によるペプチドのＧＨ放出活性を評価するために、ペプチドを挿管法で経口投与する実験（図３参照）と、被包せしめたペプチドを挿管法で経口投与する実験（図４参照）を行った。いずれの実験においても、対照群に比べ、成長速度の増加は統計学的に有意であり、後者の場合は、処置の最終段階まで体重に統計的差異が認められた。２つの経口挿管法を比較すると、被包せしめたペプチドを用いた実験においてより大きな体重増加が認められた。
【００３２】
２．２．１．  ペプチド溶液 
具体的には、ＧＨＲＰ−６をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、平均体重が８４．６６±１２．２ｇである７匹のオスのティラピアの咽頭部のくぼみに差し込んだプラスチックチューブを通じて上記のペプチドを投与した。同様に、平均体重が８６．３８±６．２６ｇである対照群（ｎ＝７，全てオスのティラピア）にＰＢＳを投与した。０．１μｇ／ｇｂｗの投与量で１週間に２回ずつ、３週間に渡って投与を行った。魚の体重（ｇ）は毎週測定した（図３参照）。
【００３３】
２．２．２．  被包せしめたペプチド 
ペプチドを被包するためのカプセルはKnorr et al.、1988に開示されている方法に従って調製し、キトサンとアルギン酸で被包したペプチドを用いて実験を行った。平均体重が８９．０９±８．３８ｇである７匹のオスのティラピアの咽頭部のくぼみに差し込んだプラスチックチューブを通じてヘキサペプチドＧＨＲＰ−６を投与した。同様に、対照群として平均体重が８９．８６±１３．５４ｇである７匹のオスのティラピアにペプチドを含まないポリマービーズを投与した。０．１μｇ／ｇｂｗの投与量で１週間に２回ずつ投与を行った（図４参照）。
【実施例３】
【００３４】
ティラピア（Oreochromis sp.）の稚魚における、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
平均体重が１．５ｇであるティラピア（Oreochromis aureus）を用い、ＧＨＲＰ−６の浸漬投与を２通りの用量（１０μｇ／１００ｍｌと１００μｇ／１００ｍｌ）で行った。また、同様な条件の対照群には生理食塩水を投与した。
【００３５】
実験では、体重（表１参照）、血液の生化学的パラメーター（表２参照）、鰓中の寄生生物の数（Trichodinicos （表３参照）および単生類である蠕虫（表４参照））および筋肉中の湿度とタンパク質濃度を測定した。
【００３６】
上記のアッセイのために、平均体重が１ｇのティラピア１５匹からなる１群を３つ選択した。実験は４０リットルの水槽を９台用いて行った。ペプチドの投与は、４５日間に渡り１週間に１回のペースで行った。
【００３７】
各群ごとの投与量を下記に示す。
第I群：１０μｇ／１００ｍｌ（処置１）
第II群：１００μｇ／１００ｍｌ（処置２）
第III群：対照群（生理食塩水）
【００３８】
表１ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群の平均体重
【００３９】
【表１】
2005519972.tif 000002
【００４０】
表２ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群のヘマトクリット値
【表２】
2005519972.tif 000003
【００４１】
表３ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群における、原生動物であるTrichodina sp.の寄生頻度（Ｉ）およびその蔓延率（Ｅ）
【表３】
2005519972.tif 000004
【００４２】
表４ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群における、各魚の鰓に見られる単生類である蠕虫の寄生頻度（Ｉ）およびその蔓延率（Ｅ）
【表４】
2005519972.tif 000005
【００４３】
表５ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群の筋肉中の平均湿度
【表５】
2005519972.tif 000006
【００４４】
表６ 
ＧＨＲＰ−６を浸漬で投与したティラピアからなる群の筋肉中の平均タンパク質濃度
【表６】
2005519972.tif 000007
【実施例４】
【００４５】
エビであるLitopenaeus schmittiにおける、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
エビの幼生からなる群に、３通りの異なる投与量でＧＨＲＰ−６を浸漬投与した。投与は３日に１回行った。各群に４回の投与を行い、そこにはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与する１つの対照群が含まれていた。処置は、以下の１リットル当たりのＧＨＲＰ−６濃度の海水に１時間浸漬することで行った。
第１群：０．００１ｍｇ／Ｌ
第２群：０．０１ｍｇ／Ｌ
第３群：０．１ｍｇ／Ｌ
第４群：１ｍｇのＢＳＡ／Ｌ
【００４６】
０．１ｍｇ／ＬのＧＨＲＰ−６で処置したエビの幼生群について、平均体重が１２５〜１５３％、体長が平均１５〜２６％、鰓の分枝数と変化した吻側骨の数もそれぞれ増加するという、質の向上が認められた。全ての実験で観測された変化は、統計学的に有意であった（図５参照）。
【００４７】
処置を受けた全てのエビにおいて、筋肉中の水分量が減少し、ＲＮＡ／ＤＮＡ比やタンパク質／ＤＮＡ比に対して筋肉量が増加した。これは、ＧＨＲＰ−６によって幼生の筋肉の代謝活動が活発になったことを示唆している（図６および図７参照）。
【００４８】
ここで得られた結果は、甲殻類の養殖における幼生の質の重要性を考慮すると非常に大きな意味がある。
【００４９】
実際に養殖が行われるときの条件下では、ＧＨＲＰ−６で処置した群の幼生の生存率は、処置していない群と比較して２０％増加した。同じアッセイにおいては、体重は１１５％、体長は３７％の増加が見られた。一方、動物の均一性については、ヘキサペプチドで処置した群においては高く、体重と体長のばらつきは低かった（図８参照）。処置群における体重と体長のばらつきはそれぞれ２４％と９％であり、一方、対照群のそれは７７％と３０％であった。
【実施例５】
【００５０】
エビであるLitopenaeus schmittiの成体における、筋肉注射で投与したＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
エビ成体の第二と第三体節の間に５０μｌのＧＨＲＰ−６溶液を注射した。エビの体重１ｇ当たり１μｇのＧＨＲＰ−６を３日毎に１回注射した。１つの対照群においては、同濃度のＢＳＡを投与した。１群につき１５匹のエビを用いた。各群について、体重と体長を変数として測定した。ＧＨＲＰ−６を投与した実験動物群においては、１００〜１５０％の範囲内の統計学的に有意な増加が認められた（ｐ＜０．００１）。
【００５１】
実験動物をネット（２ｍ × ２ｍ × １ｍ）に入れて、自然池で飼育した。水温は２５℃であり、光周期は自然条件とした。塩分濃度は３０ｇ／Ｌであった。
【実施例６】
【００５２】
エビであるLitopenaeus schmittiにおける、食餌に配合して投与したＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
エビであるLitopenaeus schmittiの後期幼生（post larvae）のための食餌中にＧＨＲＰ−６を１％の割合で配合した。ペプチドは、Knorrの発表した方法（Knorr D. and M. Daly. (1988)、「キトサンとアルギン酸の多層コアセルベートカプセルにおいて観察される力学と拡散変化（Mechanics and diffusional changes observed in multi-layer chitosan/alginate coacervate capsules）」 Process Biochemistry; 48-50）で被包した。１つの対照群には、ＢＳＡを１％配合した食餌を与えた。実験開始時と終了時の両方で平均体重と体長を測定した。実験期間は３０日とした。
【００５３】
エビの後期幼生の食餌に配合したＧＨＲＰ−６は、対照群と比較してエビの後期幼生の成長速度を３０〜４０％増加させた。これは統計学的に有意な差であった（ｐ＜０．００１）。
【００５４】
６．１  Artemia salina による被包 
エビであるLitopenaeus schmittiおよびLitopenaeus vanameiの後期幼生を給餌するために、ＧＨＲＰ−６をアルテミア（Artemia）で被包した。被包する際には、Artemia salinaにペプチドを１０ｍｇ／Ｌの濃度で１時間与え、その後アルテミアを採取し、生理食塩水で洗浄した。エビの後期幼生に、１ヶ月間に渡り、１日に４回、このアルテミアを食餌として与えた。一方、対照群については、同濃度のＢＳＡをアルテミアで被包せしめたものを食餌として与えた。
【００５５】
Artemia salinaに被包せしめて投与したＧＨＲＰ−６は、対照群と比較してエビの後期幼生の体重と体長を３０〜４０％増加させた。これは統計学的に有意な差であった（ｐ＜０．００１）。
【実施例７】
【００５６】
サケ（Salmon salar）の幼生における、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性 
サケ（Salmon salar）の３つの幼生群に対し６台の浸漬槽を用いた。浸漬処置は、３日に一度、種々の濃度のＧＨＲＰ−６を含有する浸漬液に１時間浸漬することで行い、２群にはそれぞれ異なる濃度のＧＨＲＰ−６を投与し、残りの１群は対照とした。使用したペプチドの濃度は、Ｉ群が０．０１ｍｇ／Ｌ、ＩＩ群が０．１ｍｇ／Ｌとし、対照群には１ｍｇ／ＬのＢＳＡを同様の頻度で投与した。
【００５７】
その結果、０．１ｍｇ／Ｌとより高濃度の浸漬液を用いた群では、対照を１００％とした場合、体重が１２０〜１４５％、体長が１５〜２６％増加していた。また、より軽微な結果としては、筋肉中の水分量が減少し、ＲＮＡ／ＤＮＡ比やタンパク質／ＤＮＡ比に対して筋肉量が増加した。これらの結果は、ペプチド投与を受けた幼生において筋肉の代謝活動が活発になったことを示唆している。
【００５８】
この段階でサケの幼生の成長を促進させると、養殖時の幼生段階における生存率を向上させることができることを示すこの実験結果は、世界中の漁業において大変重要なこの種の生産量を増加させるために重要な意義を持つ。
【実施例８】
【００５９】
外部寄生虫である「シーライス」、即ち Caligus sp.によるマス（Oncorhynchus mykiss）の寄生生物感染に対するペプチドＧＨＲＰ−６の効果 
マスの幼生に３日に一度の頻度で、６台の浸漬槽を用いてペプチドＧＨＲＰ−６の浸漬投与を行った。ペプチド濃度はそれぞれ０．０１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌおよび対照とした。浸漬処理を施したマスを外部寄生虫であるCaligus sp.で汚染された領域内に設けたケージに放した。全てのケージにおいて、１週間おきに２０匹のマスについて検査を５回行ったところ、幼生段階にペプチドＧＨＲＰ−６の投与を行った群では、カリムス期（Chalimus）の成体およびカリグス期（Caligus）の成体（これらは「シーライス」の２つの重要な種類である）のマスの体内への侵入が、対照群と比較して有意に減少しており（ｐ＜０．０５）、ＧＨＲＰ−６の投与を受けた群の間には差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ＧＨＲＰ−６ペプチドを注射したティラピアの稚魚におけるＩＧＦ ｍＲＮＡ量および血清ＧＨ値を示す。腹腔内注射を行った群は、いずれも３匹のティラピアからなる。肝臓と血清のサンプルはペプチド注射から１５分後、３０分後、６０分後および３６０分後に採取した。各魚の処置前の血清のサンプルも採取した。＊印は、対照群に比べて統計学的に有意な差が認められたことを示す（ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡとDuncan検定で分析）。標準誤差を示すエラーバーも表記した。
【図２】図２は、ティラピアの稚魚にＧＨＲＰ−６を３週間に渡って腹腔注射したときの、体重と成長速度に対する効果を示す。＊印は、対照群に比べて統計学的に有意な差が認められたことを示す（ｐ＜０．０２９； Student-ｔ検定で分析）。エラーバーは標準誤差を示す。三角形は平均成長速度を示す。
【図３】図３は、被包していないＧＨＲＰ−６をティラピアの稚魚に３週間に渡って挿管投与したときの、体重と成長速度に対する効果を示す。＊印は、対照群に比べて統計学的に有意な差が認められたことを示す（ｐ＝０．０１５；ｔ検定で分析）。エラーバーは標準誤差を示す。三角形は平均成長速度を示す。
【図４】図４は、被包したＧＨＲＰ−６をティラピアの稚魚に３週間に渡って経口投与したときの、体重と成長速度に対する効果を示す。＊印は、対照群に比べて統計学的に有意な差が認められたことを示す（＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ＝０．００７；ｔ検定で分析）。エラーバーは標準誤差を示す。三角形は平均成長速度を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、エビであるLitopenaeus schmittiにおける、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性を示す。ＧＨＲＰ−６を投与した３つの群と対照群の体重の増加をミリグラムで表した。「I」、「II」、「III」はそれぞれ異なる濃度のペプチドを投与した第１群、第２群、第３群を示し、「対照」はＢＳＡを投与した対照群を示す。＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。体重の変化の統計処理は、ＡＮＯＶＡおよびそれに続くDuncan検定で行った。
【図５Ｂ】図５Ｂは、エビであるLitopenaeus schmittiにおける、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性を示す。ＧＨＲＰ−６を投与した３つの群と対照群の体長の増加をミリメートルで表した。「I」、「II」、「III」及び「対照」はそれぞれ図５Ａの場合と同じである。＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。体長の変化の統計処理は、ＡＮＯＶＡおよびそれに続くDuncan検定で行った。
【図５Ｃ】図５Ｃは、エビであるLitopenaeus schmittiにおける、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性を示す。ＧＨＲＰ−６を投与した３つの群と対照群の鰓の分枝数の絶対度数の分布を示す。「I」、「II」、「III」及び「対照」はそれぞれ図５Ａの場合と同じである。＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。鰓の分枝数の統計処理は、Kolmogorov-Smirnov検定で行った。
【図５Ｄ】図５Ｄは、エビであるLitopenaeus schmittiにおける、浸漬投与によるＧＨＲＰ−６の成長促進活性を示す。ＧＨＲＰ−６を投与した３つの群と対照群の変化した吻側骨数の絶対度数の分布を示す。「I」、「II」、「III」及び「対照」はそれぞれ図５Ａの場合と同じである。＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。変化した吻側骨数の統計処理は、Kolmogorov-Smirnov検定によって行った。
【図６】図６は、ＧＨＲＰ−６を投与したエビとその対照群の乾燥重量を示す。ｔ検定（＊＊＊ｐ＜０．００１）を行った。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。
【図７】図７は、ＧＨＲＰ−６を投与したエビとその対照群の、ＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡの関係を示す。統計的差異は、対照群と比較したときに、ペプチドによって促進された肥大を示す。＊＊＊ｔ検定（ｐ＜０．００１）を行った。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。
【図８】図８は、実際の養殖条件下においてＧＨＲＰ−６を浸漬投与したエビ（Litopenaeus schmitti）の幼生の成長速度を示す。対照群にはＢＳＡを投与した。実験期間は６週間とした。ｔ検定（ｐ＜０．００１）を行った。エラーバーは標準偏差（±ＳＤ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号１    合成配列に関する記載： ＧＨＲＰ−６
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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