(57)【要約】本発明は、インビトロまたはコクスビボの体細胞突然変異の誘発方法であって、（１）突然変異させる細胞へ、前記細胞に適した培養条件下および培地中で、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１９および／または抗−ＣＤ２１抗体の少なくとも１つの組合わせの付加を含み、一方で（２）前記抗−ＩｇＭ抗体がビオチン化され、支持体に共役されたストレプトアビジンによる特異的凝集に付される方法に関する。有利には、これらの突然変異を、ＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタを阻害し、再活性化し、および／または刺激して、制御および／または調節する。特にバーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の迅速かつ制御された誘発への適用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロの体細胞突然変異の誘発方法において、（１）突然変異させる細胞へ、前記細胞に適した培養条件下および培地中で、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１９抗体の組合わせ、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ２１抗体の組合わせ、および抗−ＩｇＭ、抗−ＣＤ１９、および抗−ＣＤ２１抗体の組合わせから選択された、抗−ＩｇＭ抗体を含んでいる抗体の少なくとも１つの組合わせの付加を含むこと、一方で（２）前記抗−ＩｇＭ抗体が、ビオチン化され、支持体に共役されたストレプトアビジンによる特異的凝集に付されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記支持体が、完全または一部、磁気球から構成されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
突然変異させる細胞のために、バーキットＢＬ２リンパ腫を利用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタ率を調節して、前記体細胞突然変異を制御することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
予め不活性化されたＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタを、ＣＭＶプロモーターの制御下に、完全ポル・イオタｃＤＮＡの発現を生じるｐＩＲＥＳベクターのトランスフェクションによって修復することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質および／または遺伝子レベルにおける超変異誘発のインビトロテストを実施するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項７】
Ｂリンパ腫、特にヒトＢリンパ腫へ適用されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
バーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発のためであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｇ０／Ｇ１期にあるバーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発を目的とすることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
そのほかに、特にＢリンパ腫、とりわけバーキットＢＬ２リンパ腫への、タンパク質および／または遺伝子レベルでの超変異誘発のインビトロテストにおける超変異誘発の調節のための、ＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタの使用を含むことを特徴とする、請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
改良された、すなわち天然アミノ酸の少なくとも１つの変更後に修復されたＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタを用いることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ポル・イオタの前記改良は、そこで少なくとも１つのアミノ酸を置換するための環状ＩＩ領域の無作為突然変異生成によって実施されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
体細胞突然変異の誘発用キットにおいて、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１９抗体の組合わせ、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ２１抗体の組合わせ、および抗−ＩｇＭ、抗−ＣＤ１９、および抗−ＣＤ２１抗体の組合わせから選択された、抗−ＩｇＭ抗体を含んでいる抗体の
少なくとも１つの組合わせを含んでいる体細胞突然変異を誘発するための手段を含むことを特徴とする、キット。
【請求項１４】
前記抗−ＩｇＭ抗体がビオチン化され、支持体、特に磁気球に共役されたストレプトアビジンによって特異的凝集に付されていることを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ポル・イオタ遺伝子の不活性化のため、および／またはポル・イオタｃＤＮＡの発現によるポル・イオタ遺伝子の修復のための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
改良された、すなわち天然アミノ酸の少なくとも１つの変更後に修復されたＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタを含むことを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼ・ポル・イオタが、そこで少なくとも１つのアミノ酸を置換するための環状ＩＩ領域の無作為突然変異生成によって改良されたポル・イオタ酵素であることを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施するための手段を含むことを特徴とする、体細胞突然変異の誘発用キット。
【請求項１９】
特にタンパク質の分析による、ムタソームの成分を定性的および／または定量的に同定するための、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項２０】
特に、誘発の間に出現するムタソームの成分、とりわけタンパク質成分の同定、単離、および分析による、誘発された翻訳後修飾の同定を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
突然変異を誘発することが望まれる少なくとも１つの遺伝子、特に該タンパク質についてコードする遺伝子の供給を含み、一方、前記遺伝子は、ＩｇＧの重鎖または軽鎖についてコードする遺伝子のプロモーターおよび活性化因子（エンハンサー）を含んでいるカセット中に含まれていること、および前記遺伝子がリンパ腫、特にバーキットＢＬ２リンパ腫の細胞中にトランスフェクションされることを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
なんらかの配列を突然変異させるために、Ｉｇのプロモーターおよび活性化因子によって突然変異させる配列を、好ましくは突然変異カセット中にはめこむことを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
なんらかの配列を突然変異させるために、２つの転位された座のＶ遺伝子の全部または一部の代わりに、免疫グロブリンの座へ相同的組換えによってこの配列を挿入することを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学に関する。より具体的には、生物界に特異的な指向性突然変異による適応の分野に関する。より詳しくは本発明は、インビトロ体細胞突然変異の誘発、ならびにこのような技術の改良によって今後可能にされる用途に関する。
【０００２】
特定の実施形態において、本発明は、バーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発に関する。
【背景技術】
【０００３】
単純化のために、以下ではバーキットＢＬ２リンパ腫が参照される。しかしながらこのことは、該技術および特許請求された発明の概念の開示を容易にすることのみが目的であって、本発明をこの点に関して限定するものではないと強調する必要がある。
【０００４】
ＩＢＬ２型バーキットリンパ腫の細胞系統は、胚中心Ｂ細胞の特徴を有する。この細胞系統は、胚中心の胚中心細胞の最も近い不死化された対応部分である。その胚中心起源は、バーキットリンパ腫の免疫グロブリンのＶH遺伝子中の体細胞突然変異の存在によって確認された。
【０００５】
適切な培養物中のＢＬ２細胞の均質性および安定性が強調された（ドネプー（Ｄｅｎｅｐｏｕｘ），Ｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第６巻、３５〜４６ページ、１９９７年）。胚中心細胞の表現型に応じて、ＢＬ２は、複数の体細胞突然変異段階を受けた胚中心の胚中心細胞の形質転換の結果生じると考えることが提案された。
【０００６】
さらには、Ｂ細胞が胚中心細胞の段階で超変異を受けると考えられている（パスキュアル（Ｐａｓｃｕａｌ），Ｖら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０、３２９〜３３９ページ（１９９４年））。
【０００７】
免疫グログリンの超変異現象は、Ｔ依存型抗原によるＢ細胞の刺激後、胚中心において発生する。
【０００８】
特にドネプー，Ｓら、（上記）は、リンパ腫細胞、特にＢＬ２細胞は、１週間の培養後、表面受容体の凝集およびＴヘルパー細胞または増殖性細胞との共培養後に、超変異プロセスを開始させうることを論証した。この論文において、突然変異の頻度を増すことができるのは、ＢＬ２細胞の反復活性化によってであると結論された。同様にこれらの研究者らは、ＢＬ２へインビトロで誘発された突然変異は、ＩｇＭの定常部に影響を与えず、抗原による指向性選択を出現させないことも強調した。
【０００９】
同様にイエラモス（Ｙｅｌａｍｏｓ），Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７６巻、２２５〜２２９ページ（１９９５年）は、免疫グロブリンのＶ遺伝子のフラグメントは、超変異にとって不可欠なものでなく、人工的突然変異基質の構成は単純化されていることがあることを証明することを目的とする実験について記載している。
【００１０】
これらの開発にもかかわらず、これらの現象を調査するための有効な手段、および特に診断および／または調査のため、ならびに満足すべき実用性および迅速性の条件下における腫瘍プロセスの処理のために、それから実際的な結果を引き出すための有効な手段は現在まで入手されていない。
【００１１】
したがって迅速かつ信頼しうる体細胞超変異テストを実施することができる手段へのニーズがあった。より詳しくは、Ｖ遺伝子に適用しうるが、同様に特にヒトにおける腫瘍プロセスに含まれる可能性のある他の遺伝子、例えばＢｃｌ−６およびＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）遺伝子にも適用しうる体細胞突然変異の誘発モデルを入手しうる手段へのニーズが存在した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところで、リンパ腫細胞、特にＢＬ２細胞は、先行技術のデータとは逆に、加速された超変異プロセスを開始させうることが今や発見された。以前のデータによれば、匹敵しうるプロセスは、利用するには時間がかかり、面倒なものであった。
【００１３】
より正確には、モデルとしてＢＬ２細胞を用いた場合、異例の迅速性および効率性の条件下で、前記細胞に適した培養条件および媒質中で、突然変異させる細胞に、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２１、および抗−ＩｇＭ抗体の少なくとも三成分の組合わせを付加し、適切な細胞中における体細胞突然変異の誘発をインビトロで実施しうることが、今や意外にも発見された。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって本発明は、インビトロまたは生体外での体細胞突然変異の誘発方法であって、（１）突然変異させる細胞へ、前記細胞に適した培養条件下および培地中で、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２１、および抗−ＩｇＭ抗体の少なくとも１つの三成分の組合わせの付加を含み、一方で（２）前記抗−ＩｇＭ抗体がビオチン化され、支持体、有利には全部または一部が磁気球から構成された支持体に共役されたストレプトアビジンによる特異的凝集に付される方法を、第一の目的とする。
【００１５】
１つの特徴によれば、本発明による体細胞突然変異の誘発は、短期間、実際には１時間３０分（１時間半）程度の期間にわたって実施される。
【００１６】
有利な特徴によれば、本発明による方法は、もう１つの細胞型の細胞、特にＴ細胞との共培養の利用を含んでいない。
【００１７】
実際、支持体、例えば好ましくは磁気球に共役されたストレプトアビジンによってビオチン化された抗−ＩｇＭ抗体の特異的凝集、ならびに抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２１、および抗−ＩｇＭの少なくとも３つの抗体の組合わせが実施される、本発明によって推奨される方法では、これらの抗体の存在下、先行技術によるインビトロ突然変異の獲得に対して示されている期間とは比べものにならないほど非常に短い時間で、培養された細胞の迅速な突然変異をインビトロで入手することができることが確認された。
【００１８】
１つの変形実施態様によれば、本発明による方法は、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１９抗体の組合わせ、抗−ＩｇＭおよび抗−ＣＤ２１抗体の組合わせ、およびあらゆる割合におけるこれらの混合物から選択される抗−ＩｇＭ抗体の組合わせを含んでいてもよい。
【００１９】
他の特徴によれば、本発明による方法は、バーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発のために利用される。
【００２０】
本発明はまた、タンパク質および／または遺伝子レベルでの超変異誘発のインビトロテストの実施のための体細胞突然変異のこの誘発方法の使用も目的とする。
【００２１】
１つの実施態様によれば、この使用は、Ｂリンパ腫、特にヒトＢリンパ腫、より詳しく
はバーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発に適用される。
【００２２】
特に好ましい実施態様によれば、本発明によるシステムは、Ｇ０／Ｇ１期にあるバーキットＢＬ２リンパ腫への突然変異の誘発に用いられる。
【００２３】
本発明はまた、体細胞突然変異の誘発用キットであって、上に規定されている体細胞突然変異の誘発系を含むことを特徴とするキットも目的とする。
【００２４】
本発明の他の目的は、特にタンパク質の分析による、ムタソームの成分の定性的および／または定量的同定のためのこのキットの使用である。
【００２５】
１つの実施形態において、本発明によるこのキットの使用は、同定の間に出現するムタソームの成分、特にタンパク質成分の同定、単離、および分析による、誘発された翻訳後修飾の同定を含んでいる。
【００２６】
好ましい実施特徴によれば、この使用は、突然変異を誘発することが望まれる少なくとも１つの遺伝子、特に該タンパク質についてコードする遺伝子の供給を含み、一方で、前記遺伝子は、ＩｇＧの重鎖または軽鎖についてコードする遺伝子のプロモーターおよび活性化因子（エンハンサー）を含んでいるカセット中に含まれ、かつ前記遺伝子が、リンパ腫、特にバーキットＢＬ２リンパ腫の細胞中にトランスフェクションされる。
【００２７】
有利な実施形態によれば、なんらかの配列を突然変異させるために、Ｉｇのプロモーターおよび活性化因子によって突然変異させる配列を好ましくは突然変異カセット中にはめこむ。
【００２８】
本発明は、以下において実施例を参照して記載されるが、実施例は、純粋に例証的なものであり、本発明の実施のための実際的な指示を当業者にもたらすことを目的とする。これらの指示および当業者の固有の知識に基づき、このようにして当業者は、本発明の枠から逸脱することなく、類似または同等のテストシステム、および本明細書に記載されている使用と異なるか、類似であるか、またはそうではない具体的な使用を考えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ＢＬ２細胞へのインビトロ体細胞突然変異の誘発のために、次のように実施した。
【００３０】
ＢＬ２細胞の培養条件
ＢＬ２細胞を供給し、３７℃で２４時間、５％のＣＯ2で、１ｍｌあたり１０5細胞の割合で完全培地中にこれらを維持した。
【００３１】
培養培地は、１０％のＦＣＳで補足されたＲＰＭＩ１６４０培地、ならびに１００Ｕ／ｍｌ（単位／ｍｌ）のペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンであった。
【００３２】
刺激
約１，５００回転／分で７分間、４〜１０℃の温度での遠心分離によって、血清のあらゆる痕跡を除去するために、ＲＰＭＩ培地中でこれらの細胞を洗浄した。
【００３３】
ＢＬ２細胞を、５００μｌに対して１０6細胞の割合でＲＰＭＩ培地中に再び取った。
【００３４】
１５ｍｌのフラスコにおいて、１０6細胞を氷中に導入し、次のものを添加した。
【００３５】
・ＦＩＴＣ（イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）によって供給されたもの）に共役された抗−ＣＤ１９を２０μｌ。
【００３６】
・ＰＥ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって供給されたもの）に共役された抗−ＣＤ２１を２０μｌ。
【００３７】
ビオチン（イムノテックによって供給されたもの）に共役された抗−ＩｇＭを４μｌ。
【００３８】
均質混合物が得られるまで攪拌した後、これを氷上に載せ、約２０分間放置した。
【００３９】
ついでこの混合物の細胞を、ＲＰＭＩ培地１０ｍｌ中で（４℃で）洗浄し、ついで１，５００回転／分で７分間遠心分離に付した。このように洗浄された細胞を、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）において、５００μｌのＲＰＭＩ中に再び取り、ストレプトアビジンが共役されている、ディナール（Ｄｙｎａｌ）という名称で販売されている磁気球２０μｌを添加した。このチューブに、約４℃で１５分間、ホイール上の回転（ｒｅｔｏｕｒｎｅｍｅｎｔ  ｓｕｒ  ｕｎｅ  ｒｏｕｅ）を受けさせた。
【００４０】
これらの細胞、およびこれらの細胞が固定されている球を、ＡＤＣＭ（フランス国リヨンのサントル・ド・トランスヒュジオン（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）から入手したもの）が添加された完全培地約４μｌ中に再び取り、ついで、このように処理された細胞を、細胞培養用の２４ウエルを含んでいる滴定プレート上に分配した（１ウエルあたり約２×１０5細胞の割合）。
【００４１】
これらの細胞を、３７℃で約１時間３０分インキュベートさせておいた。次いで１つのウエルの内容物全部を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに再び取り、２，０００回転／分で１０分間遠心分離した。
【００４２】
遠心分離生成物を再び取って、上澄み液を除去し、遠心分離残滓を液体窒素中に沈めた。
【００４３】
当業者によって一般に実施されている既知の従来の分子技術によって、ＤＮＡ中で突然変異をテストした。
【００４４】
得られた結果の分析、およびＶHの様々な遺伝子に対して平行して行なわれた調査、および／またはＢＬ２以外の細胞を用いた調査の結果の分析は、表面受容体群の刺激によって転位されたＶH遺伝子へ、このようにしてＢＬ２細胞中のインビトロ突然変異を誘発させることができることを証明している。
【００４５】
変形例として、Ｉｇ配列を、例えば原核生物配列、例えばネオマイシンへの耐性遺伝子と置換することができ、ＢＬ２を用いて同様な突然変異を得ることができる。
【００４６】
したがって本発明によって、次のことを明らかにすることができた：
・突然変異は、Ｔ細胞との共培養の不存在下に、抗原への受容体および補受容体群による刺激の約１時間３０分後に誘発することができる。
【００４７】
・平均してこれらの細胞の約１／３が、超変異のメカニズムを受ける。
【００４８】
・本発明によって誘発された突然変異は、Ｄアクチノマイシンの存在下に発生し、これは転写を完全に阻害する。
【００４９】
・突然変異は、これらの細胞がヒドロキシウレアによってＧ０／Ｇ１に維持される時に誘発される。
【００５０】
・突然変異はまた、これらの細胞がエルトリエーションによってＧ０／Ｇ１期に調製される時に約３０分後に誘発される。
【００５１】
これらの結果は、先行技術の教示とは矛盾し、これらは、超変異プロセスが転写および姉妹染色分体の不存在下に発生しうることを証明している。
【００５２】
実際、このようにしてタンパク質の喪失および出現を二次元でゲルにおいて調べることができるが、同様にこれらの翻訳後修飾も調べることができる。
【００５３】
そのほかに、本発明にしたがってこのように実施された体細胞突然変異は、適切な細胞、例えばバーキットＢＬ２リンパ腫中に、表面受容体の刺激によって再誘発することができた。この型の刺激は、生体内でも同様に生じる可能性が高い。
【００５４】
本発明による方法および手段によって、根本的により高性能で確実な条件下に、遺伝子、特に免疫グロブリンの遺伝子の超変異現象の決定の調査およびテストに取り掛かることができる。
【００５５】
本発明による手段の利用によって目指すことができるあるいくつかの開発およびあるいくつかの用途が、以下に要約される。この列挙は、限定的なものではなく、ほかの用途も同様に考えることができることは明らかである。
【００５６】
例えば、現在まで実施することができなかった条件下で、胚中心におけるＢ細胞の悪性形質転換における体細胞超変異の役割および重要性がどんなものであるかを、本発明にしたがって決定しうることは重要である。
【００５７】
本発明によって、体細胞突然変異の誘発の単純性および迅速性のユニークなモデルを入手し、超変異プロセスが転写および姉妹染色分体の不存在下に発生しうることを証明することができた。
【００５８】
同様に本発明によって、特にヒトＢリンパ腫に適用しうる単純なテストを入手しうることを目的として、タンパク質および遺伝子レベルで超変異サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の入手のための手段も得ることができる。
【００５９】
今日まで解決されていないほかの問題は特に、超変異の分子メカニズムの問題、および高度に突然変異誘発性のポリメラーゼの場合による存在の問題、ならびに存在する補因子の問題である。
【００６０】
実際、補因子、すなわち免疫応答の正確な段階で転位されたＶHおよびＶL遺伝子に対する超変異プロセスの標的設定を可能にするムタソームの成分は知られていないことを思い出す必要がある。本発明によるテストシステムによって、このような超変異プロセスの動力学を追跡するため、および当業者が本発明の記載によって明らかになった知識、および当業者の固有の知識に基づいて、特にヒトＢリンパ腫に適用しうる、迅速で経済的なテストを実施することができるように、信頼性のある迅速な手段を入手することができる。
【００６１】
したがって本発明のさらに他の目的は、超変異の誘発のため、およびこれに関連したテストの実施のための手段のキットまたはセットであって、迅速な超変異の誘発のための手
段が例えば上記されているような抗体の組合わせを含んでいるものである。
【００６２】
より一般的には本発明によって、ＤＮＡおよびタンパク質のレベルでの体細胞突然変異プロセスの第一分子工程の研究および調査を可能にする手段を入手することができる。
【００６３】
要するに、このようにして、本発明にしたがって実施される手段によって、相同的組換えにより遺伝子を修飾することができるか、または例えばＢＬ２細胞においてこれを不活性化することができる。これらの細胞、特にＢＬ２細胞においてこのようにして実施可能にされた本発明による技術によって、これらの細胞の突然変異誘発特性を改良することができるが、同様に、これらの分子が、Ｂ細胞およびバーキットリンパ腫の生理学において果たしうる役割をテストすることもできる。
【００６４】
本発明による手段を利用することによって、したがって非限定的な例として、ＢＬ２中のあるいくつかの遺伝子の過剰発現を得ることができ、したがってこの細胞の突然変異誘発性細胞の性能を改良することができ、一方で、このプロセス中に含まれるように見える分子のトランスフェクションは、とりわけＡＩＤ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、またはＲＡＤ３０Ａおよび／またはＲＡＤ３０Ｂ型の酵素に関することがある。
【００６５】
これらの突然変異は、細胞サイクルのＧ１期において誘発され、娘細胞の１つにおける複製によって可能な固定を伴なって、転位されたＶH遺伝子のＤＮＡ鎖（ｂｒｉｎ）上に生じる。
【００６６】
本発明者らはさらにまた、免疫グロブリンの遺伝子のこのような体細胞超変異（ＳＨＭ）プロセスにおいて、Ｙ族のＤＮＡポリメラーゼであるポル・イオタの決定的な役割を明らかにすることができた。
【００６７】
ポル・イオタ（これは、ＤＮＡの短い隙間の充填のエラーを非常に受けやすいポリメラーゼ活性を有するＲＡＤ３０酵母の２つのヒト相同体のうちの１つである）欠失ＢＬ２クローンを生成するために、ＡＩＤ（活性化によって誘発されたシチジンデアミナーゼ、または英語で「活性化誘発シチジンデアミナーゼ」）の遺伝子の不活性化のために開発されたものと同様な遺伝子の不活性化方法が用いられた。ＡＩＤ分子は、次の文献によって記載されている。特にムラマツ，Ｍら、「クラススイッチ組換えおよび超変異は、潜在的ＲＮＡ編集酵素である活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を必要とする（Ｃｌａｓｓ  Ｓｗｉｔｃｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ
Ｒｅｑｕｉｒｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ）、ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＲＮＡ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ）」、Ｃｅｌｌ  １０２、５５３〜６３ページ（２０００年）；およびレビー（Ｒｅｖｙ），Ｐ．ら、「活性化誘発シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）欠失は、高ＩｇＭ症候群（ＨＩＧＭ２）の常染色体劣性形態を引起こす（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ
Ｃｙｔｉｄｉｎｅ  Ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ）  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｃａｕｓｅｓ  ｔｈｅ  Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒ−ＩｇＭ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＨＩＧＭ２））」、Ｃｅｌｌ  １０２、５６５〜７５ページ（２０００年）である。
【００６８】
２つのポル・イオタ-/-クローン（５４および２６７）が、ポル・イオタの異型接合体クローンから発生させられた。適切な構成が、これらの２つの対立遺伝子を不活性化するために用いられた。２つのイオタ-/-クローンは、もとのＢＬ２細胞系統と同じ増殖速度を有しており、同様な分裂指数および細胞周期プロフィールを有し、染色体異常または転座を示さなかった。ヒトポル・イオタに対するウサギの高ポリクローナル抗体を用いた場合、イオタ-/-クローン５４および２６７の細胞抽出物のウエスタンブロットにおいて、
ポル・イオタの発現はまったく検出されなかった。ポル・イオタの発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下に、完全ヒトポル・イオタｃＤＮＡの発現を指令するｐＩＲＥＳベクターのトランスフェクションによって修復された。実施された実験において、発現率は、ウエスタンブロットによる定量化に固有の変動限度内において、正常ＢＬ２細胞の系統中に観察されるものに匹敵しうるものであった。いくつかの試みの後、正常なバックグラウンドでも、ポル・イオタ欠失のバックグラウンドでも、ポル・イオタを過剰発現するクローンを得ることは不可能であった。各標的細胞について修復された２つのクローンが、その後の分析のために選択された。
【００６９】
ＢＬ２細胞系統中に、その転位ＶＨ遺伝子の超変異を誘発するために、２つの異なる方法を用いることができる。第一方法は、ヘルパーＴクローン、またはヘルパーＴ細胞系統との共培養として、抗−ＩｇＭの交差結合または網状化を介入させる。この場合、突然変異は、生じるとすれば、培養の３日後に観察される（ドネプー，Ｓら、上記；およびポルトラツキー（Ｐｏｌｔｒａｔｓｋｙ），Ｖら、「Ｉｇ体細胞超変異のために活性化されたＢＬ２細胞における変異性ポリメラーゼの発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ＢＬ２  Ｃｅｌｌｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｉｇ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国９８、７６７６〜８１ページ（２００１年））。これらの試験において、ＳＨＭのこの誘発系は、ＣＢ１５細胞系統の使用によって適応させられた。これは、共培養のリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ）ヘルペスウイルス、およびＩｇＭの交差結合、ついでストレプトアビジン球によってビオチン化された抗−ＩｇＭ抗体の凝集によって形質転換されたヘルパーＴ細胞である。第二方法は、３つの表面受容体、ＩｇＭ、ＣＤ１９、およびＣＤ２１、またはＩｇＭ＋ＣＤ１９、および／またはＩｇＭ＋ＣＤ２１の組合わせの網状化または交差結合、ついでストレプトアビジン球によるビオチン化抗−ＩｇＭ抗体の同じ凝集しか介入させない。この場合、突然変異は、９０分のインキュベーション後にのみ観察された。単一ラウンドの突然変異生成の結果生じた突然変異の頻度は、これらの２つの方法にしたがった場合に同様であった。すなわち、１塩基対あたり４〜６×１０-4である（後の表１参照）。ＢＬ２細胞系統はまた、培養に維持される場合、非常に低い頻度の、その転位ＶH遺伝子を構成する突然変異を有する。実際に、２〜３ヶ月の培養後、１塩基対あたり１０-4突然変異を超えない。
【００７０】
Ｔ細胞の培養においても、上記３つの抗体を用いる試験においても、ポル・イオタ欠失クローン５４または２６７を超変異誘発した時、突然変異の頻度の検出可能な増加はまったく観察されなかった。刺激前の２２２配列のうちの５に対して、刺激後の２９８Ｖ配列のうちの７突然変異に上げただけである。これに対して、突然変異の誘発は、これらのクローン中のポル・イオタのｃＤＮＡの再発現によって、正常ＢＬ２が示したものに匹敵しうるレベル、すなわち、刺激前の５４７Ｖ配列中の６に対して、刺激後の５４７Ｖ配列中の８３突然変異に回復された。さらにはポル・イオタを発現するこれらのクローンにおいて修復された突然変異の図式は、ＢＬ２の突然変異の図式と同様であり、ＧＣ塩基対の高い標的設定、およびトランジションへの傾向を有する（表２参照）。正常ＢＬ２の場合のように、ポル−イオタの修復されたクローンのＣμ遺伝子は、誘発後、突然変異に対して標的されているようには思われなかった。
【００７１】
【表１】
2005527192.tif 000002
【００７２】
【表２】
2005527192.tif 000003
【００７３】
本発明の他の目的は、特にＢリンパ腫、とりわけバーキットＢＬ２リンパ腫へのタンパク質および／または遺伝子レベルでのインビトロ超変異誘発テストにおける超変異誘発の調節のための、ＤＮＡポリメラーゼポル・イオタの使用である。
【００７４】
本発明のさらに他の目的は、このようなテストにおける超変異誘発の増加のための、当業者に知られている技術によるその天然アミノ酸の少なくとも１つの変更後に改良された、特に修復された、ＤＮＡポリメラーゼポル・イオタの使用である。本発明によれば、ポル・イオタのこの改良は有利には、そこで少なくとも１つのアミノ酸を置換するための環状ＩＩ領域（「リングフィンガー（Ｒｉｎｇ  Ｆｉｎｇｅｒ）」の無作為突然変異生成、ついで酵素の機能性の回復によって実施される。
【００７５】
本発明はさらに、上記のような体細胞突然変異の誘発用のキットであって、さらにポル・イオタ遺伝子の不活性化のため、および／またはポル・イオタｃＤＮＡの発現によるこれの修復のための手段を含むキットを目的とする。
【００７６】
ポル・イオタのこの寄与の同定は、次の実験部分においてさらに詳細に例証される。
【００７７】
ＢＬ２細胞系統におけるＶ遺伝子の超変異の誘発
Ｖ遺伝子の超変異は、異なる２つの操作モードにしたがって誘発された。第一操作モードを用いて、上記のプロトコルにしたがって、ＩｇＭ、ＣＤ１９、およびＣＤ２１表面受容体の交差結合を実施した。第二活性化モードは、リスザルヘルペスウイルスによって形質転換されたヘルパーＴ細胞の系統である、ＣＢ１５細胞系との共培養に基づいていた。ＣＢ１５は、１０％胎児ウシ血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））、ペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、および５０単位／ｍｌのＩＬ２（シグマ）で補足された、ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン）中で培養さ
れた。ＣＢ１５は、４，０００ラッドで照射され、完全培地プラス２％のカリヨゼール（Ｃａｒｙｏｓｅｒ）（リヨンのＣＴＳ）中に再懸濁され、抗−ＣＤ３で一晩、被覆された２４個のウエルまたはくぼみを有するプレート中に１ウエルあたり５００，００細胞の割合で入れられた（ＯＫＴ３、ジャンセン−シラグ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）、２．５μｇ／ウエル）。氷上で２０分間、ビオチン化抗−ＩｇＭ抗体（０．６ｍｇ／ｍｌ、カルタグ・ラボラトリーズ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で、０．５ｍｌのＲＰＭＩ中で２×１０6細胞をインキュベートし、ついで低温で回転板上で２０分間、ストレプトアビジンに共役された磁気球（ディナールのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）Ｍ２８０）で網状化した。ＢＬ２は、２％のカリヨゼールで補足されたＲＰＭＩ培地中に１００，０００細胞／ｍｌの割合で再懸濁され、照射されたＣＢ１５および抗−ＣＤ３が入っている２４ウエルを有するプレートの１ウエルあたり０．５ｍｌを入れた（ＢＬ２：ＣＢ１５比１：１０において）。これらの細胞は、３７℃で３日間のインキュベーション後に採取され、ＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ組織キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））という名称の適切なキットを用いて抽出され、突然変異は、Ｖ４−３９−ＪＨ５遺伝子の増幅後に分析された。これらの突然変異は、電気泳動図の多重アラインメントおよびオートアセンブラー（ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ）（アプレラ（Ａｐｐｌｅｒａ））ソフトウエアの使用によって同定された。
【００７８】
ＢＬ２におけるポル・イオタ遺伝子の不活性化
ヒトポル・イオタゲノム配列が、すべてのコーディングエキソンを含んでいる、１８０ｋｂのＨＴＧＳクローンＡＣ０２１０３２５から収集された。標的構成を発生させるために用いられたＤＮＡのフラグメントは、ＢＬ２のゲノムＤＮＡから増幅され、まずＡＣＰ
ＴＯＰＯ−ＸＬ（インビトロン）用のクローニングキットでクローンされ、これらの部位がＡＣＰプライマーに付加されているならばＳａＩＩおよびＸｈｏＩを用いて、または制限部位が含まれていないならばＭｌｕＩ−ＮｏｔＩフラグメントの形態で切除され、ＳｆｉＩおよびＭｌｕＩがそのポリリンカー（ｐｏｌｙｌｅｕｒ）のＳａｃＩ部位中に付加されているｐＢＳＫベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の対応部位においてクローンされた。ネオマイシンまたはヒグロマイシンへの耐性遺伝子は、５’および３’はめこみフラグメント間に挿入された。次のＡＣＰプライマーが、増幅のために用いられた。
【００７９】
第一対立遺伝子：
フラグメント５’，５’−イオタ１−５’、ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＣＧＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧ、
および５’−イオタ１−３’、ＣＡＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＴＣ（３．１ｋｂ）；
フラグメント３’，３’−イオタ１−５’、ＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＡＧ、
および３’−イオタ１−３’、ＣＡＧＴＣＧＡＣＡＴＡＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＡＣＣＡＣＣ（２．５ｋｂ）。
【００８０】
第二対立遺伝子：
フラグメント５’，５’−イオタ−２−５’、ＣＡＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＧ、
および５’−イオタ２−３’、ＡＣＧＴＣＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＧ（１．８ｋｂ）；
フラグメント３’，３’−イオタ２−５’、ＣＴＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧＣＡＡＣＴＡＴＧ、
および３’−イオタ２−３’、ＣＣＡＡＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧ（３．８ｋｂ）。
【００８１】
第一構成の５’フラグメントの増幅のためにポリメラーゼＰｆｕターボ（ストラタジーン）、および第二構成の３’フラグメントのためにヘルキュラーゼ（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）（ストラタジーン）（９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、および６８℃で１２分、４０サイクル）、第一構成の３’フラグメントのためにＡＣＰエクスパンド・ロング・テンプレートＰＣＲシステム（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））（供給業者の条件にしたがって４０サイクル、経時的伸長インクリメントを含む）、および第二構成の５’フラグメントのために、ＡＣＰアドバンテージ２ＰＣＲキット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））（９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、および６８℃で４分）を用いた。ＮｏｔＩまたはＭｌｕｌによって線状化された構成物３０μｇのトランスフェクションは、ベルトッシ（Ｂｅｒｔｏｃｃｉ）、Ｂら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９、２５７〜６５ページ（１９９８年）によって記載されているように実施された。この遺伝子の標的クローンの標的設定は、この構成の外側、およびネオマイシンまたはヒグロマイシンへの耐性遺伝子の内側に位置する次のプライマーを用いて、１０クローンのプールに対するＡＣＰによって実施された。
【００８２】
第一対立遺伝子、イオタ−５’−テスト、ＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣ
およびネオ（登録商標）：５’におけるＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＴＧ、
および３’−イオタ２−３’および逆ネオ（登録商標）：３’におけるＣＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧ；
第二対立遺伝子、イオタ−５’−テスト
およびヒグロ（登録商標）：ＧＣＴＧＴＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＴＣＧＣＣ
（エクスパンド・ロング・テンプレートＰＣＲ系（ロシュ））。
【００８３】
第一対立遺伝子の場合、相同的組換えは、５１８トランスフェクション体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）のうちの１つのクローンにおいて得られた。
【００８４】
第二対立遺伝子の場合、５３５のうちの２クローンが正確に標的された。
【００８５】
このような低い頻度は、標的設定ベクターの構成における低い忠実度を有するＡＣＰ酵素の使用のせいであるとされた。相同的組換えに対する菌株の特異的多形性のこのような活性は、ネズミのＥＳ細胞中で観察された。この場合、０．６％の配列の差は、標的設定の効果を５０で割る結果になることが明らかになった。同様に、用いられた増幅条件下、１塩基対あたり１０-4未満のエラー頻度を有する酵素である、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕターボ（ストラタジーン）のみを用いて増幅された構成での、それ以後ＢＬ２に対して実施された遺伝子のその他の不活性化は、１％〜２％の範囲の標的頻度を生じた。
【００８６】
ポル・イオタ欠失ＢＬ２クローンのトランスフェクション
ポル・イオタ欠失ＢＬ２クローンが、ピュロ（ｐｕｒｏ）ｐＩＲＥＳベクター（インビトロンゲン）のＢａｍＨＩ部位において、次のプライマー：
５’−イオタ、ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧ、および
３’−イオタ、ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＣＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧ
（下線のＢａｍＨＩ部位）での全体の長さのヒトポル・イオタｃＤＮＡの増幅によって構成されたポル・イオタの発現ベクターでトランスフェクションされた（マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ），Ｊ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６０、２０〜３０ページ（１９９９年）。
【００８７】
ＲＴ−ＡＣＰおよびウエスタンブロットによるＢＬ２クローンの分析
ウエスタンブロットが、ポル・イオタに対するポリクローナル抗体（終末Ｃ末端における、ＫＬＨ−共役１５−母−ペプチド）を用いて従来の方法で実施された。
【００８８】
そのほかに、当業者に知られている技術にしたがって（特にプラカシュ（Ｐｒａｋａｓｈ）技術参照）ポル・イオタをさらに改良することができ、ポル・エータ酵素のために開発することができ、この酵素は、ポル・イオタのように、環状ＩＩ領域（「リングフィンガー」）を有し、ここにおいて、前記ＩＩ領域の無作為突然変異生成によって、この「リングフィンガー」領域中に存在する少なくとも１つのアミノ酸を突然変異させることができ、その結果として、このように突然変異された酵素の活性の有意な増加を伴なうことが明らかになった。
【００８９】
本発明はしたがってまた、上記のような体細胞突然変異の誘発用キットであって、そこで少なくとも１つのアミノ酸を変化させ、その結果としてこれらの性能を改良することができるようにするための、その環状ＩＩ領域の無作為突然変異生成、ついで上記のもののような手段による酵素の修復によってこのように改良されたポル・イオタ酵素を含むキットも目的とする。
【００９０】
上に開示されている様々な実施変形例におけるこのシステムによって、このようにして特に、該タンパク質の性能を改良するために必要な突然変異を同定することができる。例えば、ＢＬ２においてトランスフェクションされたプロモーター−活性化因子カセット中に入れられた、インシュリンについてコードする遺伝子の非限定的な例証の場合、ＢＬ２は多くの分子を生産することができ、これらの分子のうち、最良の性能を有するものは、優先的にその基質上に固定されるであろう。ついでこの優先的なタンパク質についてコードする突然変異された遺伝子の配列決定、およびこの性能の改良を可能にした修飾されたアミノ酸の既知の手段による同定を行なうことによって、本発明の方法にしたがって、より性能のよいインシュリンを得ることができる突然変異を非常に迅速に同定することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月15日(2005.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005527192000001.app
【国際調査報告】
2005527192.tif 000004
2005527192.tif 000005
2005527192.tif 000006
2005527192.tif 000007
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