(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための方法に関する。好ましくは、該阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
c-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法。
【請求項４】
c-kit阻害剤が非毒性で選択的かつ強力なc-kit阻害剤である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
阻害剤が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が以下からなる群より選択される、請求項4記載の方法：
-ピリミジン誘導体、より詳細にはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
-インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン、
-単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、
-ならびにキナゾリン誘導体。
【請求項７】
阻害剤が、以下の式IIを有するN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体からなる群より選択される、請求項4記載の方法：
2005511596.tif 000013
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、または環状基もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、該少なくとも一つの置換基はアミノ基、好ましくは以下の基のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する：
2005511596.tif 000014
【請求項８】
阻害剤が、4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
c-kit阻害剤が、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項3から6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
c-kit阻害剤が活性化c-kitの阻害剤である、請求項3から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
活性化c-kit阻害剤がSCF-活性化c-kitを阻害することができる、請求項3から9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤が構成的に活性化された変異体c-kitを阻害することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含むスクリーニング法によって得ることができる、活性化c-kitの選択的で強力かつ非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法：
a）（i）活性化c-kitと、（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、成分（i）および成分（ii）が複合体を形成することができる条件下で、接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【請求項１４】
スクリーニング法が、SCF活性化野生型c-kitをも阻害することができる変異体活性化c-kitの阻害剤である、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
活性化c-kitが、段階a）のSCF活性化野生型c-kitである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
推定の阻害剤が、段階a）において10μMより高い濃度で試験される、請求項13から15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
IL-3が、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地中に0.5ng/mlから10ng/ml、好ましくは1ng/mlから5ng/mlの濃度で存在する、請求項13から16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
IL-3依存的細胞が、肥満細胞、トランスフェクト肥満細胞、BaF3、およびIC-2からなる群より選択される、請求項13から16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度を、インビトロまたはインビボで測定する、請求項13から18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を試験して選択する段階をさらに含む、請求項13から19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
試験がインビトロまたはインビボで行われる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害が、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学的技術を用いて測定される、請求項13から21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
c-kitリン酸化の量が測定される、請求項13から22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
同定および選択された化合物が、強力で選択的かつ非毒性の野生型c-kit阻害剤である、請求項13から23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
以下の段階を含むスクリーニング法によって得ることができるc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法：
a）永続的に活性化されたc-kitである変異体c-kitを（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）発現する細胞を用いて、活性化c-kitを標的とし、それぞれがIC50＜10μMを有する候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することにより同定するために、複数の被験化合物を用いて増殖アッセイ法を行う段階、
b）c-kitを特異的に標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階（a）において同定された候補化合物のサブセットに増殖アッセイ法を行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイ法を行い、それぞれがIC50＜10μMを有する、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【請求項２６】
細胞死の程度が、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ヒトの皮膚を白くするため、ならびに黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス、母斑、および悪性黒色腫を含む黒色腫などのメラノサイト機能不全に起因するハイパーメラノーシスを含むメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための、請求項1から26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
ヒトの皮膚を白くするため、ならびに黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス、母斑、および悪性黒色腫などのメラノサイト機能不全に起因するハイパーメラノーシスを含むメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための、医薬品または化粧品組成物の製造を目的とするc-kit阻害剤の使用。
【請求項２９】
ヒトの皮膚を白くするため、ならびに黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス、母斑、および悪性黒色腫などのメラノサイト機能不全に起因するハイパーメラノーシスを含むメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細にはc-kit阻害剤を含む経口または局所投与に適した組成物。
【請求項３０】
局所適用に適した、請求項29記載の薬学的または化粧品組成物。
【請求項３１】
ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、水性懸濁液、水性アルコール溶液もしくは油性溶液、ローション型もしくは血清型の分散剤、無水もしくは親油性ゲル、水相に脂肪相を分散させるかもしくはその逆によって得られる乳状の液体もしくは半固体粘度の乳液、軟らかい半固体粘度のクリームもしくはゲル型の懸濁液もしくは乳液、またはマイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微粒子、もしくはイオンおよび/もしくは非イオン性型への小胞性分散剤の形状である、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
親水性もしくは親油性ゲル化剤、親水性もしくは親油性活性剤、皮膚軟化薬、粘度増強ポリマー、湿潤剤、界面活性剤、保存料、抗酸化薬、溶媒、および充填剤から選択される少なくとも一つの成分を含む、請求項30記載の組成物。
【請求項３３】
皮膚へチロシンキナーゼ阻害剤を送達するよう処方された、請求項30記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳細には非毒性で強力かつ選択的なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための方法に関する。好ましくは、該阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、基底膜で隔てられた表皮とその下にある真皮の２層から成る。メラノサイトは基底層に見られ、概して多数の樹状分枝を有する球状の細胞形態を示す。これらの非常に分化した細胞は、基底層の周辺のケラチノサイトを通過する。メラノサイトは、メラニン色素を産生するメラノソームを有する。メラノソームは、メラノサイト樹状突起から周辺の隣接した細胞に放出され、それにより皮膚全体に色素沈着が広がる。
【０００３】
メラノソームは、メラニン前駆体であるL-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-ドーパ)へのL-チロシンの変換を触媒するチロシナーゼによりメラニンを産生する。メラノソームは、メラニンを蓄積する過程において、細胞体を通してゴルジ体から樹状突起へと移動する。最後に、メラニンは、皮膚の角質層を通過するUV照射の90％を上回る量を吸収し、それによってUVにより誘起される改変からDNAを保護する天然のソーラー・フィルタとして機能する。
【０００４】
皮膚の色素沈着は、皮膚中のメラノサイトの量に直接比例する。色素過剰パターンは、正確に増殖しているメラノサイトの濃度または不適当な増殖の結果を反映しうる。色素過剰症の前者の範疇には、雀斑、肝斑(ホルモン因子により誘導される、および太陽の影響により増幅されるメラニンの過剰分泌)、およびハイパーメラノーシスの様々な形態が含まれる。メラノサイト機能不全に起因する他の過剰な色素沈着には、黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス(前癌状態)、母斑、および悪性黒色腫が含まれる。
【０００５】
アジアおよび世界の他の地域では、白肌が高貴さと美を表すという伝統的な思想のため女性はより白い肌を望む場合がある。従って近年では、皮膚中のメラニンの量を減少させ、その結果皮膚を白くする化粧品組成物が開発されている。
【０００６】
その結果、皮膚を白くするための化粧品および臨床的治療法の開発が真に必要とされている。
【０００７】
過去には、過酸化水素、塩素酸水銀アミド(mercurialized amide chlorate)、メルカプトアミン、および皮膚に刺激を与えるハイドロキノンなどのフェノール誘導体などの化学物質が皮膚を白くするために用いられた。現代の組成物は、それらの効果において、より選択的であり、より良好に許容される。実際、メラニンの生合成に主要な役割を果たすチロシナーゼの活性を阻害する美白剤に研究の焦点が当てられている。例えば、ハイドロキノン、ビタミンCおよびその誘導体、コウジ酸、アルブチン、グルタチオン、システイン、ならびに植物抽出物などのチロシナーゼ阻害剤を化粧品組成物に組み込むことが提唱されている(米国特許第5,773,014号および米国特許第5,980,904号)。
【０００８】
しかし、コウジ酸、アスコルビン酸、およびそれらの誘導体などのチロシナーゼ阻害剤は化粧品製剤において不安定であり、それらの急速な酸化によりチロシナーゼ阻害作用が減少し、その結果、製剤の黒色化が生じる。さらに、フェノール誘導体よりも細胞毒性が低いとはいえ、チロシナーゼ阻害剤は望ましくない副作用を示す。
【０００９】
その結果、表皮およびその下の真皮に刺激や毒性を引き起こさない、ヒトの皮膚を白くするための代替となる溶液が必要とされる。好都合なことに、色素過剰症へと至るメラノサイト機能不全関連疾病の治療に有効な組成物を提供することが特に興味深い。
【００１０】
Grichnikらは、SCF/KIT経路が正常なヒトのメラノサイトホメオスタシスの制御に関与していることを実証した(J Invest Dermatol 1998 Aug; 111(2):233-8)。組織学的評価において、SCF注入により、メラノサイトの数、大きさ、および樹状性が増大した。
【発明の開示】
【００１１】
本発明に関して、メラノサイトの増殖に寄与するSCF/KIT経路を阻害する特異的なキナーゼ阻害剤を使用することが提唱される。チロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤がこの目的を達成するのに特に適していることが見出された。さらに、c-kit受容体における変異の活性化が、黒色腫の形成へと至るメラノサイトの異常な増殖を誘起すると仮定される。
【００１２】
そのような阻害剤は、皮膚を白くするのに有用なだけでなく、メラノサイト機能不全に起因し、黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス、母斑、ならびに悪性黒色腫を含むハイパーメラノーシスを治療するための良い候補物質である。
【００１３】
説明
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与することを含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための方法に関する。
【００１４】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導体（国際公開公報第94/14808号）、および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、セレオインドール（seleoindole）およびセレニド（国際公開公報第94/03427号）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際公開公報第91/15495号）、ピリミジン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）から選択される。
【００１５】
好ましくは、このチロシンキナーゼ阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明は、c-kit阻害剤をそのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法に向けられる。
【００１７】
好ましくは、c-kit阻害剤は非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である。そのような阻害剤は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択することができる。
【００１８】
好ましい化合物の中でも、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）のようなピリミジン誘導体、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、4-アミノ置換キナゾリン（米国特許第3,470,182号）、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン（米国特許第3,800,039号）、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）、4-アニリノキナゾリン化合物（米国特許第4,464,375号）、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン（米国特許第3,551,427号）に注目することは興味深い。
【００１９】
そのため、好ましくは本発明は、ピリミジン誘導体、より詳細には式IのN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体である、非毒性の強力かつ選択的なc-kit阻害剤を投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法に関する：
2005511596.tif 000002
式中、R1、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の説明に組み入れられる、欧州特許第564 409 B1号に記載される意味を有する。
【００２０】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式IIに対応する化合物から選択される：
2005511596.tif 000003
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキルまたは環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２１】
好ましくはR7は以下の基である：
2005511596.tif 000004
これらの化合物において、以下のように定義されることが好ましい：
R1は、複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4はC1-C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、かつ
R7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基、例えば以下の基：
2005511596.tif 000005
のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２２】
したがって好ましい態様において、本発明は、以下の式に対応するCGP57148B：4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドとして当技術分野で公知である化合物の有効量を投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法に関する：
2005511596.tif 000006
【００２３】
本化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載され、特に有用であるβ型は国際公開公報第99/03854号に記載されている。
【００２４】
または、c-kit阻害剤は以下から選択することができる：
インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン；
単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、キナゾリン誘導体；ならびに
2-フェニル-キナキソリン誘導体、例えば2-フェニル-6,7-ジメトキシキナキソリンのようなキナキソリン。
【００２５】
好ましい局面において、本発明は、c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、上記の方法を意図する。
【００２６】
さらなる態様において、上記のc-kit阻害剤は、活性化c-kitの阻害剤である。本発明の枠組みにおいて、「活性化c-kit」という表現は、点突然変異、欠失、挿入から選択される少なくとも一つの変異を含む、構成的に活性化された変異体c-kitを意味するが、天然のc-kit配列（配列番号：1）の改変および変化型も意味する。そのような変異、欠失、挿入、改変および変化は、トランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、ならびにc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインにおいて起こりうる。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitを意味する。c-kitを活性化するために好ましい、選択的なSCF濃度は、5×10-7 M〜5×10-6 Mを含み、好ましくは2×10-6 M付近である。好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kitの自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位に、少なくとも一つの変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を有する。もう一つの好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。そのような欠失は、例えば、c-kit d(573-579)と呼ばれるコドン573と579の間にある。c-kitの膜近傍ドメインに近位の点突然変異V559Gもまた重要である。
【００２７】
この点において、本発明は、以下を含むスクリーニング法によって得ることができる活性化c-kitの、選択的で強力な非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する段階を含む、ヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法を意図する：
a）（i）活性化c-kitと（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、（i）と（ii）の成分が複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）で同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【００２８】
本スクリーニング法はさらに、SCF活性化野生型c-kitを阻害することもできる、活性化変異体c-kitの阻害剤（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）である段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階からなる段階を含みうる。または、段階a）において活性化c-kitは、SCF活性化野生型c-kitである。
【００２９】
本発明を実施するための最良の様式は、段階a）において10μMを超える濃度で推定の阻害剤を試験する段階からなる。適切な濃度は、例えば10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、または40μMである。
【００３０】
段階c）において、IL-3は、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地において、0.5 ng/ml〜10 ng/mlの濃度で、好ましくは1 ng/ml〜5 ng/mlの濃度で存在する。
【００３１】
IL-3依存的細胞の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
増殖および生存に関して、c-kitを本来発現してそれに依存している細胞株。そのような細胞において、以下の技法を用いてヒト肥満細胞株を確立することができる：正常なヒト肥満細胞を、c-kitシグナルペプチドとTAG配列とを含む変異体c-kitをコードする配列を含むレトロウイルスベクターに感染させることができ、それによって変異体c-kitおよび造血細胞において発現された野生型c-kitを、抗体によって区別することができる。
【００３２】
この技術は、細胞の死を誘導せず、遺伝子移入が安定であり満足できる収率（約20％）を生じることから都合がよい。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られた血液に由来する前駆細胞を培養することによって、日常的に得ることができる。この点において、他の血液成分から単核球を分離するために、臍帯静脈からのヘパリン処置（heparinated）血をフィコール勾配上で遠心する。次に、免疫磁気選択系MACS（Miltenyi biotech）を用いて、上記の単離細胞からCD34+前駆細胞を精製する。次に、CD34+細胞をMCCM培地（L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5×10-5 M β-メルカプトエタノール、20％仔ウシ胎児血清、1％ウシ血清アルブミン、および100 ng/ml組換え型ヒトSCFを添加したα-MEM）において、105個/mlの細胞濃度で5％CO2大気中、37℃で培養する。培地を5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合（％）は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはトルイジンブルー染色を用いて毎週評価する。抗トリプターゼ抗体も同様に、培養物における肥満細胞を検出するために用いることができる。培養10週間後、肥満細胞の純粋な細胞集団（＞98％）が得られる。
【００３３】
標準的な技法を用いて、上記のように確立された細胞株をトランスフェクトするために、c-kitを発現するベクターを調製することが可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenら（1987）EMBO J. 6（11）、3341〜3351に記載されている。c-kitのコード部分（3000 bp）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅することができ、かつクローニングすることができる：
2005511596.tif 000007
【００３４】
NotIおよびXhoIによって消化したPCR産物を、T4リガーゼを用いてpFlag-CMVベクター（SIGMA）に挿入して、ベクターをNotIおよびXhoIによって消化して、CIP（Biolabs）を用いて脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを用いて細菌クローンXL1-blueを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを用いて確認する：
2005511596.tif 000008
適切なカセットを用いて、当技術分野において日常的で一般的な技法によって部位特異的変異誘発を行う。
【００３５】
ベクターMigr-1（ABC）は、成熟肥満細胞をトランスフェクトするために用いられるレトロウイルスベクターを構築するための基礎として用いることができる。このベクターは、IRESの3'末端でGFPをコードする配列を含むことから都合がよい。これらの特徴によって、蛍光血球計算器による直接分析を用いてレトロウイルスに感染した細胞を選択することができる。先に述べたように、c-kit cDNAのN末端配列は、異種のc-kitを内因性のc-kitと区別するために有用であるFlag配列を導入するために、改変することができる。
【００３６】
用いることができる他のIL-3依存的細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：
‐c-kitの野生型または変異型（膜近傍および触媒部位において）を発現するBaF3マウス細胞は、Kitayamaら（1996）、Blood 88：995〜1004、およびTsujimuraら（1999）、Blood 93：1319〜1329に記述される。
‐c-kitWTまたはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14665〜14669に示される。
【００３７】
IL-3非依存的細胞株は以下の通りである：
‐HMC-1、肥満細胞白血病患者に由来する因子非依存的細胞株は、構成的キナーゼ活性を有する膜近傍変異体c-kitポリペプチドを発現する（Furitsu Tら、J. Clin. Invest. 1993、92：1736〜1744；Butterfieldら、「Establishment of immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia.」、Leuk Res. 1988、12：345〜355、およびNagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92：10560〜10564）。
‐P815細胞株（814位でc-kit変異を本来発現する肥満細胞腫）は、Tsujimuraら（1994）、Blood、83：2619〜2626に記述されている。
【００３８】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。インビボで測定する場合、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位の間に、少なくとも一つの変異を有する活性化変異体c-kit、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を発現する細胞株が好ましい。活性化変異体c-kitを発現する細胞株の例は先に述べた通りである。
【００３９】
もう一つの好ましい態様において、方法はさらに、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階を含む。これは、インビトロまたはインビボで測定することができる。
【００４０】
したがって、上記の方法に従って同定および選択された化合物は、強力で選択的な非毒性の野生型c-kit阻害剤である。
【００４１】
または、上記のスクリーニング法はインビトロで実施することができる。この点において、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学技術を用いて、活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量を測定する。
【００４２】
なおさらなる態様において、本発明はスクリーニングが以下を含む、先に記載したヒトの皮膚を白くし、且つメラノサイト機能不全関連疾病を治療する方法を意図する：
a）それぞれがIC50＜10μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって同定するために、永続的な活性化c-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）を発現する細胞を用いて、複数の被験化合物によって増殖アッセイを行う段階、
b）特にc-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階a）において同定された候補化合物のサブセットによって増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイを行い、それぞれがIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【００４３】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される一般的な技術である。
【００４４】
「メラノサイト機能不全関連疾病」という用語は、メラノサイトの機能不全に起因し、黒子、老年性日光黒子、Dubreuilhメラノーシス、母斑、ならびに悪性黒色腫を包含するメラノーマを含むハイパーメラノーシスとして本明細書では理解される。
【００４５】
したがって、本発明は、ヒトの皮膚を白くするためおよび上記で定義したようなメラノサイト機能不全関連疾病を治療するための医薬品および化粧品組成物の製造を目的とする、上記で定義された化合物の使用を包含する。
【００４６】
本発明で用いられる薬学的組成物または化粧品組成物は、経口および局所を含むいくつもの経路によって投与してもよい。
【００４７】
活性成分の他に、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適切な薬学的に許容される担体を含んでもよい。製剤および投与に関する技術についてのさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）の最新版において見いだされる。
【００４８】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調剤することができる。そのような担体によって、患者が摂取するために薬学的組成物を錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調剤することができる。
【００４９】
本発明の使用に適した薬学的組成物には、c-kit阻害剤が意図した目的を達成するのに有効な量で含有される組成物が含まれる。有効用量の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。治療的に有効な用量とは、症状または状態を改善する有効成分の量を指す。例えばED50(集団の50％において治療的に有効な用量)およびLD50(集団の50％に対して致死的な用量)といった、治療的有効性および毒性は、培養細胞または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比として表される。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。上述したように、本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤およびより詳細にはc-kit阻害剤は、IL-3存在下で培養されたIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００５０】
好ましくは、本発明に係る方法は、上記で示したような有効量のチロシンキナーゼ阻害剤と外用のために許容される担体とを含む組成物を皮膚に適用することを含む。
【００５１】
したがって、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤と、選択的に、上述したようなチロシナーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一つの化合物とを含む、局所投与用の薬学的組成物または化粧品組成物にも関する。
【００５２】
本発明に係る組成物は、局所適用に通常用いられるすべての形状で、特に、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、水性懸濁液、水性アルコール溶液もしくは油性溶液、ローションもしくは血清型の分散剤、無水もしくは親油性ゲル、水相に脂肪相を分散させるかもしくはその逆によって得られる乳状の液体もしくは半固体粘度の乳液、軟らかい半固体粘度のクリームもしくはゲル型の懸濁液もしくは乳液、またはマイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微粒子、イオン性および/もしくは非イオン性型の小胞性分散剤の形状で提供されうる。これらの組成物は標準的な方法にしたがって調製される。
【００５３】
本発明に係る組成物は、皮膚病学および化粧品に通常用いられる任意の成分を含む。親水性もしくは親油性ゲル化剤、親水性もしくは親油性活性剤、保存料、皮膚軟化薬、粘度増強ポリマー、湿潤剤、界面活性剤、抗酸化薬、溶媒、充填剤、香料、スクリーニング剤、殺菌剤、匂い吸収剤、および着色剤から選択される少なくとも一つの成分を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明で用いられる油としては、鉱油(流動パラフィン)、植物油(シアバターの液体画分、ひまわり油)、動物油、合成油、シリコン油(シクロメチコン)、ならびにフッ素化油が挙げられる。脂肪アルコール、脂肪酸(ステアリン酸)、およびワックス(パラフィン、カルナバ、蜜蝋)も脂肪物質として用いられうる。
【００５５】
本発明で用いられる乳化剤としては、ポリソルベート60およびPEG-6/PEG-32/ステアリン酸グリコール混合物が考えられる。
【００５６】
親水性ゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリル酸/アルキルアクリル酸コポリマーなどのアクリル系コポリマー、ポリアクリルアミド、ハイドロキシプロピルセルロースなどの多糖類、粘土、および天然ゴムが挙げられ、親油性ゲル化剤としては、ベントン(bentones)などの改変された粘土、ステアリン酸アルミニウムおよび疎水性シリカなどの脂肪酸の金属塩、またはエチルセルロースおよびポリエチレンが挙げられる。
【００５７】
親水性活性剤としては、タンパク質もしくはタンパク質加水分解物、アミノ酸、ポリオール、尿素、アラントイン、糖および糖誘導体、ビタミン、デンプン、ならびに植物抽出物、特にアロエベラの抽出物が用いられうる。
【００５８】
親油性活性剤としては、レチノール(ビタミンA)およびその誘導体、トコフェロール(ビタミンE)およびその誘導体、必須脂肪酸、セラミド、ならびに精油が用いられうる。これらの物質を使用すると、さらに潤いを与えるまたは皮膚を軟化させる特性が加えられる。
【００５９】
必要に応じて、公知のゲル化剤を本発明の組成物に加えてもよい。適当なゲル化剤には、アクリル酸の合成高分子量架橋ポリマー、より具体的には、たとえば商標名CARBOMER 1342として入手可能なアクリル酸/C.sub.10-30アルキルアクリル酸コポリマーが含まれる。他の適当なゲル化剤には、セルロース、およびジヒドロキシエチルセルロース(商標名ULTRAGEL)などのセルロース誘導体が含まれる。
【００６０】
さらに、成分およびチロシンキナーゼ阻害剤の浸透性をより深くするために、界面活性剤を組成物に含めることができる。
【００６１】
考えられる成分の中でも、本発明は、例えば鉱油、水、エタノール、トリアセチン、およびプロピレングリコールからなる群より選択される浸透性増強剤、例えばポリイソブチレン、ポリビニルアセテート、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される結合剤、ならびに増粘剤を包含する。
【００６２】
薬物の局所的吸収を増強させる化学的方法は当技術分野では周知である。例えば、浸透性増強特性を有する化合物には、ラウリル硫酸ナトリウム(Dugard, P.H.およびSheuplein, R.J.、「Effects of Ionic Surfactants on the Permeability of Human Epidermis: An Electrometric Study」、J. Invest. Dermatol., 60巻、263-69頁、1973)、ラウリルアミンオキシド(Johnsonら、米国特許第4,411,893号)、アゾン(azone)(Rajadhyaksha、米国特許4,405,616号および同第3,989,816号)、ならびにデシルメチルスルフォキシド(Sekura, D.L.およびScala, J.、「The Percutaneous Absorption of Alkylmethyl Sulfides」、Pharmacology of the Skin, Advances In Biolocy of Skin, (Appleton-Century Craft) 12巻、257-69頁、1972)が含まれる。両性分子のヘッドグループの極性を増加させると、浸透性増強特性が増加するが、それらの皮膚刺激特性の増加は抑えられることが観察された(Cooper, E.R.およびBerner, B.、「Interaction of Surfactants with Epidermal Tissues: Physiochemical Aspects」、Surfactant Science Series、16巻、Reiger, M.M.編(Marcel Dekker Inc.)195-210頁、1987) 。
【００６３】
適当な溶媒には、脂肪酸のアルキルエステル、好ましくはC.sub.1-12、より好ましくは8〜22個の炭素原子を含む飽和もしくは不飽和脂肪酸のアルキルエステルであるC.sub.3-10が含まれる。特に好ましい溶媒には、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、WIKENOL 161(エステルの混合物)などが含まれる。エタノール、プロパノール、イソプロパノール、プロピレングリコールなどのアルコール、ならびにこれらのアルコールの水性混合物も用いることができる。
【００６４】
第二のクラスの化学的増強剤は一般的に、共溶媒と呼ばれる。これらの材料は、比較的容易に局所吸収され、多様なメカニズムによって、いくつかの薬物に関して浸透を増強させる。エタノール（Galeら、米国特許第4,615,699号、およびCampbellら、米国特許第4,460,372号および同第4,379,454号）、ジメチルスルフォキシド（米国特許第3,740,420号、同第3,743,727号、および同第4,575,515号）、ならびにグリセリン誘導体（米国特許第4,322,433号）は、様々な化合物の吸収を増加させることができることが示されている化合物のいくつかの例である。
【００６５】
本発明は、化粧品組成物であろうと皮膚用組成物であろうと、皮膚へチロシンキナーゼ阻害剤を送達するよう処方された組成物を目的とする。
【配列表】
2005511596.tif 000009
2005511596.tif 000010
2005511596.tif 000011
2005511596.tif 000012
【国際調査報告】
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