(57)【要約】無毒性HSVと、HSV粒子を特定の標的細胞に感染させてそれを溶解させる標的化剤とを含むHSV複合体を提供する。本発明者らは、抗体結合ドメインを1以上のウイルス糖タンパク質に組み込むことにより、無毒性HSVが疾患細胞（例えば、癌細胞）を標的とし得る方法を見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞型を標的とすることができるHSV複合体であって、神経毒力を消失するようにBamH1 s内のRLの末端部分(0-0.02および0.81-0.83mu)において改変されたHSVと、前記改変型HSVに連結された標的化剤とを含んでなるHSV複合体。
【請求項２】
前記標的化剤が抗体結合ドメインを含む、請求項1に記載のHSV複合体。
【請求項３】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項1または2に記載のHSV複合体。
【請求項４】
前記標的化剤が抗体である、請求項1または2に記載のHSV複合体。
【請求項５】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項６】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項5に記載のHSV複合体。
【請求項７】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項6に記載のHSV複合体。
【請求項８】
標的化剤がウイルスのエンベロープタンパク質を介して改変型ウイルスに連結されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項９】
標的化剤とウイルスエンベロープタンパク質が融合タンパク質を形成している、請求項8に記載のHSV複合体。
【請求項１０】
ウイルスエンベロープタンパク質がHSV糖タンパク質である、請求項8または9に記載のHSV複合体。
【請求項１１】
遺伝子34.5が機能的な産物を発現できないようにHSVが改変されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１２】
HSV-1である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１３】
HSV-1の17株である、請求項1〜12のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１４】
1716である、請求項1〜13のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１５】
特定の細胞型を標的とすることができるHSVであって、神経毒力を消失するように発現可能なγ34.5遺伝子を欠失しており、かつ標的化剤を発現するHSV。
【請求項１６】
前記標的化剤がウイルスの糖タンパク質との融合タンパク質として発現される、請求項15に記載のHSV。
【請求項１７】
さらに1以上の別のウイルス糖タンパク質の改変を含む、請求項15または16に記載のHSV。
【請求項１８】
1以上の別のウイルス糖タンパク質が欠失されている、請求項17に記載のHSV。
【請求項１９】
1以上の別のウイルス糖タンパク質が標的化剤の組込みにより改変されている、請求項17に記載のHSV。
【請求項２０】
別の糖タンパク質がgD、gC、および／またはgBである、請求項17〜19のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２１】
前記標的化剤が抗体結合ドメインを含む、請求項15〜20のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２２】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項21に記載のHSV。
【請求項２３】
前記標的化剤が抗体である、請求項14〜22のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２４】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項14〜23のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２５】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項24に記載のHSV。
【請求項２６】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項25に記載のHSV。
【請求項２７】
HSV-1である、請求項14〜26のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２８】
HSV-1の17株である、請求項14〜27のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２９】
1716である、請求項14〜28のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項３０】
請求項14〜29のいずれか1項に記載のHSVの生産方法であって、
(a)  γ34.5遺伝子が機能的な産物を発現するのを妨げるようにHSVゲノムを改変し、
(b)  標的化剤をコードする核酸を組み込むことによりHSVゲノムを改変して、結果的に前記標的化剤がウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質として発現されるようになし、
(c)  改変された前記HSVを細胞内で発現させる、
各ステップを含んでなる方法。
【請求項３１】
前記標的化剤が抗体結合ドメインを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的化剤が抗体である、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３４】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項30〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
標的化剤がウイルスのエンベロープタンパク質を介して改変型ウイルスに連結される、請求項30〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
標的化剤とウイルスエンベロープタンパク質が融合タンパク質を形成する、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
ウイルスエンベロープタンパク質がHSV糖タンパク質である、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
前記HSVがHSV-1である、請求項30〜39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
前記HSVがHSV-1 17株である、請求項30〜40のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
前記HSVがHSV 1716である、請求項30〜41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
医学的処置方法において使用するための請求項1〜14のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項４４】
医学的処置方法において使用するための請求項15〜29のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項４５】
細胞増殖を伴う疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1〜14のいずれか1項に記載のHSV複合体の使用。
【請求項４６】
細胞増殖を伴う疾患を治療するための医薬の製造における、請求項15〜29のいずれか1項に記載のHSVの使用。
【請求項４７】
前記疾患が癌である、請求項45または46に記載の使用。
【請求項４８】
請求項1〜14のいずれか1項に記載のHSV複合体または請求項15〜29のいずれか1項に記載のHSV、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス(HSV)複合体、ならびにその生産方法および使用に関するものである。特に、本発明は、限定するものではないが、細胞（特に癌細胞）を標的化するための抗体結合ドメインを組み込んでいるHSV 1型に関する。
【背景技術】
【０００２】
HSVはエンベロープをもつ正二十面体の二本鎖DNAウイルスであって、ヒトをはじめとする哺乳動物に感染する。野生型HSVは最終的に分化した細胞と分裂細胞の両方に感染して複製する。野生型HSVは神経毒力があり、末梢神経系に進入するが、そこでは活発なウイルス複製が抑えられて、ウイルスはニューロンに潜伏感染する。HSVは潜伏状態から再活性化することがあり、感染障害を引き起こす。HSVの神経毒遺伝子ICP34.5は、ウイルス複製のために有糸分裂後の細胞（特にニューロン）を条件付けると考えられている（Thompsonら, Virology 172, 435-450 (1989); MacLeanら, J. Gen Virol. 72, 631-639 (1991); HarlandおよびBrown, J. Gen Virol. 66, 1305-1321 (1985); ならびにTahaら, J. Gen Virol. 70, 705-716 (1989)）。ICP34.5欠失変異体は最終的に分化した細胞内では複製することができないが、分裂細胞には細胞溶解的に感染することができる（Brown, S.M.ら、75, 2367-2377 (1994)）。HSV-1の突然変異株1716は、HSV 1型17株のICP34.5欠失変異体(EP-B-0 571,410)であり、マウスにおいては毒性が低下していて死亡率も非常に低いが、活発に分裂している組織培養細胞内では野生型ウイルスと同様に効率よく複製する（Maclean, A. R.ら, J. Gen Virol. 72, 631-639 (1991), Brown, S. M.ら, J. Gen Virol. 75, 2367-2377 (1994)）。分裂細胞を特異的に標的として溶解するが、有糸分裂後の細胞に対してはそのように作用しないICP34.5欠失変異体の能力により、それらは癌治療用の魅力的な治療剤となる。急速に分裂している癌細胞へのHSV感染は細胞溶解による細胞死をもたらす。1716突然変異株は組織培養下の腫瘍細胞系を死滅させ、ある範囲のin vivoモデル癌においては、このウイルスが腫瘍の後退と長期の生存を可能にすることが示された（Kesari, S., Randazzo, B. P.およびValyi-Nagy, T. Lab Invest. 73, 636-648 (1995), MacKie E. A.ら, Br J. Cancer 74, 745-752 (1996), Randazzo, B. P.ら, J. Invest Dermatol. 108, 933-937 (1997)）。臨床試験では、1716の直接注入が再発性グリオーマ（Rampling, R.ら、Gene Therapy 7 (10) 859-866 (2000)）および転移性メラノーマ（MacKie, R. M., Stewart, B.およびBrown, S. M. The Lancet 357, 525-526 (2001)）の患者を治療するのに効果的であった。
【０００３】
注目すべき点として、これらの試験の両方において、1716が周囲の正常組織に伝播したという証拠はなかった。2番目のHSV-1 ICP34.5欠失変異体であるG207は、ウイルスのリボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットをコードするUL39遺伝子をさらに欠失している変異体であるが、この変異体も安全で、悪性グリオーマ患者に有効であることが示されている (Markert, J. M.ら, Gene Therapy 7 (10), 867-874 (2000))。
【０００４】
1716やG207のようなウイルス株は、神経毒力が弱められており、かつ分裂細胞に選択的に感染するため、ヒト悪性疾患の治療に使用できる可能性が高いが、本発明者らによれば、それらの使用にはいくつかの制限が予想される。1716は組織培養下の種々の腫瘍細胞に感染してそれらを死滅させる能力があるものの、in vivoでのその許容範囲はもっと制限される。例えば、BまたはT細胞リンパ腫への1716感染は報告されていない。加えて、in vivoにおいて、このウイルスは細胞培養下ほどには効率よく腫瘍細胞に感染しない。本発明者らは、改変型HSVがin vivo治療としてより広範に、より効率的に、より安全に適用され得るように、いくつかの細胞型に対する制限をなくし、腫瘍細胞への感染効率を高めることが望ましいと考えた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
広くは、本発明は、特定の範囲の細胞型を標的とすることができるように、HSVのトロピズム（tropism：細胞親和性）を変更または改変する手段を提供する。
【０００６】
最も一般的には、本発明は、改変型HSVと標的化剤からなるHSV複合体を提供し、前記標的化剤は前記改変型HSVを特定の細胞型（好ましくは、癌細胞のような増殖性細胞）に向かわせることができるものである。本発明はさらに、HSV複合体の生産方法、ならびに癌などの疾病の治療における前記複合体の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、第1の態様において、本発明は、特定の細胞型を標的とすることができる、標的化剤に連結されたHSVからなるHSV複合体を提供し、前記HSVのゲノムは、BamH1 s内のRLの末端部分(0-0.02および0.81-0.83mu)において改変されている。
【０００８】
標的化剤は抗体または抗体の成分（例えば、抗体結合ドメイン）とすることが有利である。抗体は、好ましくは、標的となる細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができるものである。これについては以下で述べる。好ましくは、標的化剤をウイルスのエンベロープタンパク質を介して改変型ウイルスに連結させて、標的化剤がウイルスの表面に展示されるようにする。これを達成するための便利な方法は、標的化剤とウイルスエンベロープタンパク質（例えば、糖タンパク質）とからなる融合タンパク質を形成させることである。あるいはまた、標的化剤をウイルス粒子に化学的手段により（例えば、共有結合で）結合させたり、結合剤（例えば、アビジン／ストレプトアビジンとビオチン）を用いて結合させることも可能である。
【０００９】
好ましい実施形態においては、標的化剤をコードする核酸をウイルスゲノムに組み入れて、標的化剤がウイルスエンベロープタンパク質（例えば、糖タンパク質）との融合タンパク質として発現され、その結果、ウイルス粒子の表面に展示されるようにする。
【００１０】
こうして、本発明は、神経毒力を消失するように発現可能なγ34.5遺伝子を欠失しかつ標的化剤を発現する、特定の細胞型を標的とすることができるHSVを提供する。
【００１１】
抗体結合ドメインは本発明の好ましい実施形態を構成するので、以下の説明は抗体の使用に焦点を当てることにする。しかし、当業者には、他の標的化剤、例えばレセプターとそのリガンドといった特異的結合対のメンバー、を使用できることが明らかだろう。
【００１２】
ウイルスエンベロープに組み込まれた抗体または抗体成分は、1以上の特定の細胞型へのウイルス感染の効率を高めることによって、ウイルスの選択性に影響を及ぼす。HSVの感染過程は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質と標的細胞膜の糖タンパク質との接触を介して開始される。本発明においては、所定の細胞型の膜タンパク質に対して特異的な親和性を有する抗体がHSVウイルスエンベロープに組み込まれるが、これにより、所定の標的細胞に対するHSVの親和性が、抗体と細胞表面タンパク質とのさらなる相互作用により高まる。抗体結合ドメインが細胞表面上のその標的抗原に結合すると、ウイルス粒子と細胞膜とが緊密に接近するようになり、ウイルスエンベロープの糖タンパク質が膜の融合を開始させて、細胞への侵入を引き起こす。
【００１３】
HSV-1ビリオンのエンベロープは少なくとも10種の内在性膜糖タンパク質を含んでおり、そのうちのいくつかが哺乳動物細胞への進入を媒介する。ウイルスと細胞との初期の相互作用は、ウイルス糖タンパク質gBおよび／またはgCと細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの間で起こるが、この相互作用はウイルスの侵入にとって十分ではない。ウイルスと細胞膜との融合には、gD、gBおよびgH/gL複合体が必要とされ、これらのタンパク質は協力して作用すると予想される。HSV-1の特異的レセプター介在進入には、gDとHVEM/HveA（ヘルペスウイルス進入媒介因子A；リンホトキシンレセプターであって、TNFレセプターファミリーのメンバー）との相互作用が必要である。通常はウイルス侵入に抵抗するCHO細胞においてHveAを発現させると、該細胞は許容性(permissive)となった。非許容性CHO細胞を用いて数種の他のレセプター、例えばポリオウイルスレセプター関連タンパク質1および2（今日では、それぞれHvecCおよびHvecBと改名されている）が同定されている。本研究において、本発明者らは、通常は感染に抵抗する細胞系をHSV-1進入に対して許容性とすることができた。
【００１４】
本発明は、最終的に分化した非分裂細胞に感染して、該細胞内で複製したりまたは該細胞を溶解する能力が損なわれているHSVを使用する。この形態において、該ウイルスは増殖性細胞と関連した疾患、例えば癌および非癌性疾患（クローン病など）を治療するための治療剤として使用するのに特に適している。本発明者らの考えでは、本発明による改変型ウイルスは癌または非癌状態における増殖性T細胞を標的とするのに特に有用である。
【００１５】
好ましい実施形態において、HSVは、ICP 34.5をコードする遺伝子（遺伝子γ34.5）が機能的な遺伝子産物を発現できないように改変されている。
【００１６】
改変型ウイルスは、好ましくは、野生型ウイルスに対して、内部リピートRLのBam HI s 領域(0.81-0.83mu)内および末端RLの対応領域(0-0.02mu)内に改変を含み、結果的に改変型ウイルス（変異体）は神経毒力を消失している。
【００１７】
ウイルスゲノムの改変は、1個以上のヌクレオチドの欠失、追加のヌクレオチドの挿入、または再編成や置換といったその他のヌクレオチド配列の変更により達成することができる。好ましくは、1個以上のヌクレオチドの欠失によりHSVゲノムを改変する。
【００１８】
HSVは自然発生的に分離された野生型の欠失変異体であってもよいし、所望の改変が導入されている野生型株であってもよい。このようなHSVの改変は遺伝子操作により行うことができ、例えば、部位特異的突然変異誘発を行うか、または必要な改変を組み込むように予め調製したDNAカセットとの置換を用いて、もしくは用いないで、ゲノムの一部を切除することにより行う。
【００１９】
好ましくは、HSVはHSV 1型(HSV-1)であり、さらに好ましくは、HSV-1 17株である。ある実施形態において、HSV-1株は125074 nbおよび125972 nbのAlu I部位間のBam HI s'領域内およびTRL中のその対応配列内に少なくとも100ヌクレオチドの欠失を有する。
【００２０】
さらに好ましくは、Bam HI s'領域およびTRL中のその対応領域の0.5〜3 kbが欠失される。さらに一層好ましくは、約0.7〜2.5 kbが欠失される。
【００２１】
適当な改変型HSVには、HSV-1突然変異体1716またはG207が含まれる。HSV1716の作製方法はEP 571,410-Bに記載されており、これを参照により本明細書中に含めるものとする。
【００２２】
上記に加えて、本発明者らは、様々な腫瘍を治療するために、本発明によるHSV複合体を理想的には患者の循環系に投与しなければならないことを認識している。しかしながら、ウイルスは腫瘍細胞を見つけ出さなければならないばかりか（ウイルスは多くの異なる細胞型に結合および吸着する）、ウイルスを排除するように設計されている既存の免疫防御（例えば、中和抗体）とも戦わなければならない。たいていの人々はHSV-1にすでに曝されているので、既存の免疫防御は普通にみられることである。このことを考慮して、本発明者らは、免疫学的に見つけ出されるのを回避し、かつ特異的に腫瘍細胞を標的とすることができる「ステルス」(stealth：秘密)ウイルスを開発する必要があることを痛感した。したがって、本発明者らは、ステルスウイルスを作製するにあたって、細胞吸着を媒介する通常のウイルス糖タンパク質を排除し、それらを、抗体指向性進入を媒介する糖タンパク質（ビリオン構造に組み込まれる）で置き換えた。また、細胞進入に関与する主なウイルス糖タンパク質は主要な中和エピトープを提供することから、それらの除去は当該ウイルスに対する免疫学的活性を最小限に抑えると考えられる。こうして、循環系に導入された腫瘍抗原指向性HSV（例えば、HSV1716）は、近づくことができなかったり、直接注入するには数が多すぎたり、あまりに小さすぎて検出できないといった、多くのタイプの腫瘍（散在性の癌を含む）を標的とすることができる。
【００２３】
したがって、本発明の第1の態様に従う、腫瘍特異的な標的化抗体を展示する上記のHSV複合体（例えば、HSV1716）を改変して、通常の細胞進入に必須のウイルス糖タンパク質（例えば、主にgDであるが、gCおよび／またはgBでもよい；下記参照）をコードする遺伝子が欠失または不活性化されるようにすることができる。その結果として得られるウイルスは細胞感染の主な経路として腫瘍抗原／抗体相互作用に依存するようになる。ウイルス粒子からのこうした糖タンパク質の欠失は主要な中和エピトープをも除去することとなり、それゆえ、全身的に投与したときの免疫防御を大幅に低減させることができる。
【００２４】
したがって、本発明の第1の態様に従うHSV複合体をさらに改変して、1種以上のウイルス糖タンパク質（例えば、gD、gCおよび／またはgB）が不活性化または欠失されるようにし、結果的にそれらがウイルス粒子の細胞への進入を媒介できなくすることができる。1種以上の糖タンパク質は、それらが発現されないかまたは機能的な形態では発現されないように、ゲノムレベルで改変することが望ましい。最も望ましいのは、1種以上の糖タンパク質が全く発現されないようにHSVゲノムを改変することである。これにより、in vivoで既存の免疫防御から逃避できるというさらなる利点を有するHSV変異体が得られる。
【００２５】
上述したように、種々の糖タンパク質を、好ましくは核酸レベルで、改変したり、またはウイルス粒子から欠失させたりすることができる。改変には、標的化剤をコードする核酸を組み込んで、ウイルス粒子の表面にその標的化剤を発現させることも含まれる。したがって、HSVゲノムは、γ34.5遺伝子に加えて、1種以上の糖タンパク質（例えば、gD、gCおよび／またはgB）が標的化剤（例えば、抗体結合ドメイン）を展示するように改変することができる。
【００２６】
好ましくは、抗体または抗体成分は腫瘍表面抗原に特異的である。この腫瘍表面抗原は、すなわち、腫瘍細胞の表面に存在しかつ該細胞と結合しており、腫瘍細胞にユニークであるか、または全部ではないにしても大部分の非腫瘍細胞上よりも腫瘍細胞上により豊富に存在する抗原である。腫瘍細胞では正常タンパク質の新形態または非定型的な形態が数多く発現されており、こうしたタンパク質に対する抗体は腫瘍標的化ストラテジーを提供する。例えば、癌胎児性抗原(CEA)は多くの腫瘍細胞上の重要なマーカーであり、遺伝子工学的に作製されたCEAに対する抗体は臨床試験に供されている (Mayer, A.ら, J. Immunol. Methods 231, 261-273 (1999))。Her2/neu増殖因子に対する抗体（Trastuzamab：トラスツズマブ）およびCD20に対する抗体（rituximab：リツキシマブ）はそれぞれ乳癌および非ホジキンリンパ腫の治療のために販売が認可されている（Holliger, P.およびHoogenboom, H. (1998), Nature Biotechnology 16, 1015）。CD55（崩壊促進因子）は腫瘍細胞により過剰発現されて補体活性化を阻止するが、このCD55に対する抗体は治療効力をもつ可能性がある (Li, L.ら、B. J. Cancer 84 (1) 80-86 (2001))。CEA、Her2、CD20およびCD55のような腫瘍抗原を特異的に標的とする抗体結合ドメインをHSVのエンベロープに組み込むと、その細胞親和性を変えることができると考えられ、こうして、非許容性の腫瘍細胞への感染が可能となり、おそらく他の腫瘍細胞に感染する能力が高まるであろう。例えば、CD20に特異的な抗体結合ドメインを展示する1716ビリオンは、B細胞リンパ腫に感染して、それを死滅させることができると考えられる。
【００２７】
さらに、腫瘍標的化抗体を展示しかつ正常なHSV-1進入糖タンパク質が欠失されたHSV、例えばHSV1716ビリオンは標的腫瘍細胞にしか感染しないと考えられる。
【００２８】
抗体結合ドメインは、腫瘍の発生源となる細胞型に存在する細胞表面タンパク質に対して特異的な親和性を有し、例えばグリオーマの場合には、HSVウイルスエンベロープに組み込まれた抗体または抗体成分がグリア細胞に通常存在する抗原に対して特異的であろだろう。したがって、分裂細胞に感染することに対する無毒性HSV株の特異性は、ウイルスが他の型の分裂細胞よりも優先的にグリア細胞に感染するように、さらに改変されるだろう。分裂しているグリア細胞を標的とすることにより、HSVは他のどのような細胞よりも効率的にグリオーマ細胞に感染して、それを溶解するはずである。特定の細胞型に対する抗体または抗体成分の使用は、HSVが効率よく感染しない細胞型へのHSVのトロピズムを拡大するためにも使用することができる。例えば、B細胞上に存在する抗原に特異的な抗体または抗体成分を使用すると、B細胞に対するHSVのトロピズムが広がると予想される。異なる特異性の抗体または抗体成分を一緒に1つのHSVウイルスエンベロープ内に組み込むことも可能である。こうした特異性の組合せにより、所望の細胞型を標的とするより大きな特異性が得られると期待される。
【００２９】
抗体結合ドメインは、ウイルスエンベロープの内在性膜タンパク質（好ましくは、HSV糖タンパク質）に融合させることが好ましい。好適なHSV-1およびHSV-2糖タンパク質はgB、gCおよびgDである。
【００３０】
好ましい実施形態において、抗体結合ドメインは一本鎖可変フラグメント(scFv)の形をしている。
【００３１】
第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従う改変型HSV複合体の作製方法を包含し、この方法は、前記融合タンパク質を構成的に発現している細胞系にHSV、好ましくは改変型HSV、さらに好ましくは改変型HSV-1を感染させるステップを含んでなる。
【００３２】
第3の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従う改変型HSV複合体の作製方法を包含し、この方法は、前記融合タンパク質をコードするDNAを改変型HSVのウイルスゲノムに組み込むステップを含んでなる。
【００３３】
第4の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従う改変型HSV複合体の、医学的処置方法における使用を包含する。
【００３４】
好ましくは、上記方法は、細胞増殖を伴う疾患（例えば、癌）にかかった患者に改変型HSV複合体を投与することを含んでなり、その際、前記HSV複合体が分裂細胞を選択的に溶解する。
【００３５】
さらに、本発明による改変型HSVおよび製薬上許容される担体を含有する医薬組成物も提供される。
【００３６】
改変型HSVを含む医薬組成物は静脈内に投与してもよいし、腫瘍または感染部位に直接注入してもよい。
【００３７】
以下、本発明の態様および実施形態について、添付の図面を参考にしながら、例を用いて説明することにする。当業者には、さらに他の態様および実施形態も明白であろう。本文中で挙げた全ての文献を参照により本明細書中に含めるものとする。
【００３８】
図１は、(a)プロトタイプ配向でのHSV-1ゲノム（マップユニット(mu)で示してある）；および(b) BamHI k(s + g)の拡大部分を示す。1714/1716中の欠失部分の両側にあるBamHI (B)およびAlu (A)部位が示してある。すべての座標はMcGeochら (1988)の番号付けに基づくものである。また、IE1の5’末端、「a」配列、「a」配列のDR1/Ub境界、HSV-1とHSV-2の間で保存された189bpのオープンリーディングフレーム(RL ORF)、および1714/1716中の759bp欠失の終点も示される。欠失はDR1/Ub境界から延びてRL ORFの5’側の107bpを取り除く。
【００３９】
図２は、ベクターpEL4の構築を示す。a) scFv DNAをPCR増幅すると同時に、IgG VHリーダー配列を挿入するために使用した5’99-merオリゴヌクレオチドの配列。EcoRI部位には赤色の下線、SfiI部位には紫色の下線が引いてある。これら2つの部位に挟まれた配列は、発現されたタンパク質を細胞の分泌経路に向かわせるIgG VHリーダー配列をコードする。SfiI部位の下流の配列はIgG VHに由来する。3’プライマーはIgG VLに由来し、NotI部位を挿入して、5’SfiI部位と3’NotI部位をそれぞれ有するscFV DNAのPCR増幅を可能にする。PCR後、IgG VHリーダーをもつscFV DNAをプラスミドpcDNA4Aにクローニングすると、pEL4が得られる。
【００４０】
図３は、PCRで作製したHSV-1 gCのN末端欠失体のスケール図である。全長gCタンパク質はシグナルペプチド(sp)および膜貫通ドメイン(tm)を含めて上段に示してある。その下に示す14のgC欠失体はそれらの新しいN末端のアミノ酸により命名されている。こうして、Δ164gCは、そのN末端から163個のアミノ酸が欠失されることにより、アミノ酸164-511に相当するgCフラグメントを与える。
【００４１】
図４は、連続的に欠失されたgC DNAのPCR増幅を示す1%アガロースゲル（レーン1〜14）を示す。M＝200bpおよび1000bpバンドの位置を示したDNAラダー。共通の3’PCRプライマーは、gCのC末端に対応するが停止コドンを含まないプライマーであって、XbaI部位を挿入し、ベクターのmycおよび6-hisタグとのin-frameでのクローニングを可能にする。5’プライマーは、6〜90ヌクレオチドの連続欠失体を与えるように、gCコード配列からランダムに選択した。5’プライマーは、NotI制限部位を挿入し、gC DNAをscFv DNAとin-frameでpEL4にクローニングすることを可能にする。NotI/XbaIで消化したPCR増幅DNAを、同様にこれらの酵素で消化したpEL4にクローニングすると、scFv/gC融合タンパク質発現構築物が得られる。
【００４２】
図５は、全細胞抽出物中のscFv/gC融合タンパク質の発現およびHSV1716ウイルス粒子へのそれらの組込みを示すウェスタンブロットを示す。レーン5〜8、9〜11、16および17は全細胞抽出物である。レーン1〜4、12〜15および18はウイルス調製物である。レーン1および5 = Δ193gC、レーン2および6 = Δ215gC、レーン3および7 = Δ251gC、レーン4および8 = Δ328gC、レーン9および13 = Δ410gC、レーン10および14 = Δ424gC、レーン11および15 = Δ362gC、レーン12 = Δ457gC、レーン16〜18 = Δ227gC。レーン19および20は、それぞれΔ227gCおよびΔ424gCを発現する細胞系からの模擬ウイルス調製物を示し、これらのサンプルにおいてはバンドがまったく検出されなかった。Δ215gCを発現する細胞系は、細胞抽出物では強いバンド（レーン7）をもたらしたのに、ウイルス調製物では弱いバンド（レーン3）しか与えないことに留意されたい。これに対して、Δ328gCは細胞系では中間レベルで発現されるのに、そのウイルス調製物では強いバンドが生じる。これらの結果のすべてを表１にまとめて示す。
【実施例】
【００４３】
実施例１−抗腫瘍scFvとエンベロープ糖タンパク質B、CおよびDとの融合タンパク質がビリオンエンベロープに組み込まれているHSV-1 1716株の作製方法
CD55の異なる細胞外エピトープと結合するモノクローナル抗体の組換えscFv変異体を標準プロトコル（Pope, A.R., Embleton, M.J.およびMernaugh, R. (1996) In Antibody Engineering (McCafferty, HoogenboomおよびChiswell編) Practical Approach Series, Oxford University Press Inc., New York. 1-40参照）により誘導する。scFvは、単一のヌクレオチド配列によりコードされるため、融合タンパク質に組み入れるのに特に適している。scFvは組換え抗体技法(Hoogenboom, H.R.およびChames, P. Immunology Today 21 (8) 371-377 (2000))を用いて都合よく遺伝子工学的に作製することができる。組換え抗体は、主として、ハイブリドーマから、または免疫動物の脾臓もしくはヒト末梢血から分離したリンパ球の集団から、単離されたmRNAを用いて生産される。免疫グロブリン重鎖(VH)および軽鎖(VL)結合部位をコードするDNAフラグメントをRT-PCRにより別々に増幅し、融合させると、一本鎖抗体分子(scFv)をコードするフラグメントが生じる。scFvポリペプチドは高い親和性結合を保持する抗原認識部位を単一のタンパク質中に効果的に再生する。クローニングしたscFvは他のタンパク質のドメインと簡単に遺伝的に融合させることができ、例えば、ファージディスプレイのためにはM13 gIIIコートタンパク質と、抗原指向性酵素プロドラッグ療法（antigen directed enzyme prodrug therapy: ADEPT）のためには酵素カルボキシペプチダーゼG2と融合させる。
【００４４】
各モノクローナル抗体について抗体VHおよびVLのRT-PCR、クローニング、配列決定および連結を行った後、ファージミドベクターpHEN2へのクローニングのため、または融合タンパク質の構築のため、scFvをコードするDNAを、5’末端と3’末端にそれぞれSfiIおよびNotI制限酵素部位を組み入れるPCRプライマーを用いて増幅する。制限酵素部位の選択は用いるscFvと糖タンパク質の配列により変わるだろう。大腸菌HB2151を前記ファージミドベクターで形質転換し、IPTG誘導によりscFvを発現させる。pHEN2から発現されたscFvは、精製／検出用にc-mycと6-hisタグをもっている。組換えscFvの活性をそのモノクローナル対応物と比較するが、これは、その標的抗原を発現するプラスミドで安定にトランスフェクトされたCHO細胞を用いて、ウェスタンブロッティングおよびFACS分析により行う。
【００４５】
IgG VHリーダー配列を含むscFvをコードするDNAをプラスミドpCDNA4 (Invitrogen)にクローニングして、ベクターpEL4（図2）を作製する。scFv DNAの増幅に使用した5’プライマーはIgG VHリーダー配列を組み込むが、このリーダー配列はSfiI部位でscFv DNAに連結される。このプライマーはまた、IgG VHリーダー配列の5’側にEcoRI部位を挿入する。SfiI/NotI消化を用いて、scFv DNAを取り出し、別のscFv DNAと置き換えることができる。リーダー配列をEcoRI/SfiI消化により取り出して、他のリーダー配列（例えば、gCシグナルペプチド配列）と置き換えてもよい。EcoRI/SfiI制限部位を有するこのようなリーダー配列は、適切なプライマーを用いたPCRにより、あるいは化学合成した相補的オリゴヌクレオチドを用いることにより、取得することができる。
【００４６】
いくつかのHSV-1 17+株のgB、gCおよびgDのDNAフラグメントをウイルスゲノムからPCR-クローニングするが、その際には、他のヘルペスウイルスタンパク質で以前に成功を収めている方法を使用する（Sun, Y.およびConner, J. (1999)「ヒトヘルペスウイルス-7のU28 ORFは機能的なリボヌクレオチドレダクターゼR1サブユニットをコードしない」Journal of General Virology 80: 2713-2718; Sun, Y.およびConner, J. (2000)「単純ヘルペスウイルス1型およびウマヘルペスウイルス4型のリボヌクレオチドレダクターゼR1およびR2サブユニットにより形成されたヘテロサブユニット複合体の特性決定」Biochem J. 347, No 1: 97-104; 参照により本明細書中に含めるものとする）。DNAの増幅に使用するプライマーは、scFv DNAへの融合およびpEL4へのクローニングに適した制限酵素部位を組み込むようにする。糖タンパク質DNA増幅用のPCRプライマーは、一連のランダムな、連続的に欠失させたN末端切断タンパク質（各欠失は約2〜30アミノ酸から、最大で膜貫通ドメインをコードする領域までを除去する）が発現されるように設計する。例えば、gCは511個のアミノ酸からなり、アミノ酸479の下流に膜貫通領域が位置している。scFvに融合させるために、14の連続的に欠失させたN末端切断ポリペプチド（図3）をクローニングした。PCRにより増幅したgC DNAの例を図4に示す。gC DNAフラグメントのPCR増幅に用いたプライマーは、5’末端と3’末端にそれぞれNotI部位とXbaI部位を組み込んだ。PCR増幅DNAを適切な酵素（すなわち、gCフラグメントの場合はNotI/XbaI）で直接消化し、同様にこれらの酵素で消化したpEL4にクローニングした。得られた構築物は、CMV IEプロモーターの制御下で、C末端mycおよび6-hisタグを有するscFv/gC融合タンパク質を発現する。プロモーターとタグはpEL4のpCDNA4骨格によりもたらされ、抗生物質選択により安定な細胞系の作製を可能にするゼオシン耐性遺伝子も同様である。また、DNAフラグメントはPCRクローニングベクターpGEM-T Easyにもクローニングし、配列決定を行って、PCRにより誘導される突然変異体が組み込まれていないことを確認した。
【００４７】
それぞれのpEL4構築物を用いてBHK細胞をリポフェクタミンにより一過性にトランスフェクトし、48時間後ゼオシン選択(10ug/ml)を開始した。約21日間ゼオシンにより細胞を選択し、ウェスタンブロッティング用に抽出物を調製した。各細胞系について、scFv/gC融合タンパク質にふさわしい分子サイズのポリペプチドを、抗mycタグモノクローナル抗体9B11 (New England Biolabs)で検出した。
【００４８】
発現の例を図5に示し、ウェスタンブロットデータを用いて概算した各細胞系での発現レベルを表１に示す。9B11および抗マウスIgG/FITCコンジュゲートを用いた免疫蛍光により、発現された融合タンパク質はすべて核周辺／ゴルジに局在することが実証された。安定にトランスフェクトされたBHK発現細胞系を用いたHSV1716エンベロープへのscFv／糖タンパク質融合タンパク質の組込みは、9B11を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。10pfu/細胞のHSV1716を用いて各細胞系に感染させ、24〜28時間後に培地から回収されたウイルスを、9B11を用いるウェスタンブロッティングにより分析した。例を図5に示し、結果を表１にまとめた。模擬感染細胞からの同様の調製物には、mycタグを付けたタンパク質がまったく検出されなかった。ほとんどのscFv/gC融合タンパク質はウイルスに組み込まれた（表１）。一部は他のものより効率よく組み込まれた（例えば、Δ328gCとΔ457gCはそれぞれの細胞系において中間レベルで発現されるにもかかわらず、そのウイルス調製物中には強いバンドとして存在する）が、細胞系で高レベルに発現された別のもののウイルスへの組込みは低かった（例えば、Δ251gC）。
【００４９】
最も適切なscFv／糖タンパク質融合タンパク質を発現する組換えウイルスは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する1716の変異体を用いて作製される。scFv／糖タンパク質融合タンパク質の組込みは上記のように確認する。
【００５０】
実施例２−scFv／糖タンパク質融合タンパク質を組み込んでいるHSV-1によるBHK細胞の感染
scFv／糖タンパク質融合タンパク質を組み込んでいるウイルス（実施例１で作製したもの）がBHK細胞に感染する能力を1段階増殖実験により分析し、1716と比較する。これらのscFv／糖タンパク質融合タンパク質を組み込んでいるウイルスのトロピズムは、CD55を構成的に発現しているCHO細胞を用いて検証する。CHO細胞へのウイルスの侵入はGFPリポーター遺伝子分析により確認する。
【００５１】
CHO細胞における結果から、抗体媒介ウイルス感染を可能にする因子を同定することができ、また、適切なscFv／糖タンパク質DNAをウイルスゲノムにクローニングすることにより組換えウイルスを作製することができる。これらのウイルスのゲノムは、例えば相同的組換えを用いて、gD、gCおよびgBのような糖タンパク質の欠失または不活性化によりさらに改変することが可能である。
【００５２】
CEAやCD20のような腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体を開発して蓄積することにより、その後、所定の腫瘍を標的とする能力が改善された一連の腫瘍溶解性ヘルペスウイルスを構築することが可能となる。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】(a)プロトタイプ配向でのHSV-1ゲノム（マップユニット(mu)で示す）；および(b) BamHI k(s + g)の拡大部分を示す。
【図２】ベクターpEL4の構築を示す。
【図３】PCRで作製したHSV-1 gCのN末端欠失体のスケール図である。
【図４】連続的に欠失されたgC DNAのPCR増幅を示す1%アガロースゲル（レーン1〜14）を示す。
【図５】全細胞抽出物中のscFv/gC融合タンパク質の発現およびHSV1716ウイルス粒子へのそれらの組込みを示すウェスタンブロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年4月23日(2004.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞型を標的とすることができるHSV複合体であって、神経毒力を消失するようにBamH1 s内のRLの末端部分(0-0.02および0.81-0.83mu)において改変されたHSVと、前記改変型HSVに連結された標的化剤とを含んでなり、前記標的化剤が抗体結合ドメインを含むものである、上記HSV複合体。
【請求項２】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項1に記載のHSV複合体。
【請求項３】
前記標的化剤が抗体である、請求項1または2に記載のHSV複合体。
【請求項４】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項５】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項4に記載のHSV複合体。
【請求項６】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項5に記載のHSV複合体。
【請求項７】
標的化剤がウイルスのエンベロープタンパク質を介して改変型ウイルスに連結されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項８】
標的化剤とウイルスエンベロープタンパク質が融合タンパク質を形成している、請求項7に記載のHSV複合体。
【請求項９】
ウイルスエンベロープタンパク質がHSV糖タンパク質である、請求項7または8に記載のHSV複合体。
【請求項１０】
遺伝子γ34.5が機能的な産物を発現できないようにHSVが改変されている、請求項1〜9のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１１】
前記HSVがHSV-1である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１２】
前記HSVがHSV-1 17株である、請求項1〜11のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１３】
前記HSVがHSV1716である、請求項1〜12のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項１４】
特定の細胞型を標的とすることができるHSVであって、神経毒力を消失するように発現可能なγ34.5遺伝子を欠失しており、かつ抗体結合ドメインを含む標的化剤を発現するHSV。
【請求項１５】
前記標的化剤がウイルスの糖タンパク質との融合タンパク質として発現される、請求項14に記載のHSV。
【請求項１６】
1以上のウイルス糖タンパク質のさらなる改変をさらに含む、請求項14または15に記載のHSV。
【請求項１７】
1以上の別のウイルス糖タンパク質が欠失されている、請求項16に記載のHSV。
【請求項１８】
1以上の別のウイルス糖タンパク質が標的化剤の組込みにより改変されている、請求項16に記載のHSV。
【請求項１９】
別の糖タンパク質がgD、gC、および／またはgBである、請求項16〜18のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２０】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項14〜19のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２１】
前記標的化剤が抗体である、請求項14〜20のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２２】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項14〜21のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２３】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項22に記載のHSV。
【請求項２４】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項23に記載のHSV。
【請求項２５】
前記HSVがHSV-1である、請求項14〜24のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２６】
前記HSVがHSV-1 17株である、請求項14〜25のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２７】
前記HSVがHSV1716である、請求項14〜26のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項２８】
請求項14〜27のいずれか1項に記載のHSVの生産方法であって、
(a)  γ34.5遺伝子が機能的な産物を発現するのを妨げるようにHSVゲノムを改変し、
(b)  抗体結合ドメインを含む標的化剤をコードする核酸を組み込むことによりHSVゲノムを改変して、結果的に前記標的化剤がウイルスのコートタンパク質との融合タンパク質として発現されるようになし、
(c)  前記改変されたHSVを細胞内で発現させる、
各ステップを含んでなる方法。
【請求項２９】
前記抗体結合ドメインが一本鎖可変フラグメント(ScFv)の形態である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的化剤が抗体である、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
標的化剤が標的細胞型の細胞表面タンパク質と特異的に結合することができる、請求項28〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞表面タンパク質が腫瘍関連抗原である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍関連抗原がCEA、Her2、CD20、またはCD55である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
標的化剤がウイルスのエンベロープタンパク質を介して改変型ウイルスに連結される、請求項28〜33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
標的化剤とウイルスエンベロープタンパク質が融合タンパク質を形成する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスエンベロープタンパク質がHSV糖タンパク質である、請求項34または35に記載の方法。
【請求項３７】
前記HSVがHSV-1である、請求項28〜36のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３８】
前記HSVがHSV-1 17株である、請求項28〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
前記HSVがHSV1716である、請求項28〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
医学的処置方法において使用するための請求項1〜13のいずれか1項に記載のHSV複合体。
【請求項４１】
医学的処置方法において使用するための請求項14〜27のいずれか1項に記載のHSV。
【請求項４２】
細胞増殖を伴う疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1〜13のいずれか1項に記載のHSV複合体の使用。
【請求項４３】
細胞増殖を伴う疾患を治療するための医薬の製造における、請求項14〜27のいずれか1項に記載のHSVの使用。
【請求項４４】
前記疾患が癌である、請求項42または43に記載の使用。
【請求項４５】
請求項1〜13のいずれか1項に記載のHSV複合体または請求項14〜27のいずれか1項に記載のHSV、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【国際調査報告】
2005532039.tif 000008
2005532039.tif 000009
2005532039.tif 000010