(57)【要約】【課題】免疫抑制を誘発せずにHPV-16パピロマウイルス（Papillomavirus）天然Ｅ7蛋白に対する免疫応答を誘発する免疫ワクチン組成物。【解決方法】活性成分としてＮ末端からＣ末端に向かって（i）配列番号No.3の1-19のアミノ酸配列；（ii）(a)配列番号No.3の20-29に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも一つのアミノ酸が置換されるか、（b）配列番号No.3の20-29に対応したアミノ酸配列に対して少なくとも４つの連続したアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；および（iii）配列番号No.3の30-98のアミノ酸配列のアミノ酸配列を有する非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白を含むワクチン組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピロマウイルス（Papillomavirus）の感染に起因する癌の予防または治療のための、免疫抑制特性の無いワクチン組成物であって、活性成分としてＮ末端からＣ末端に向かって下記：
（i）  配列番号No.3の1-19のアミノ酸配列；
（ii）  (a)配列番号No.3の20-29の対応アミノ酸配列に対して少なくとも一つのアミノ酸が置換されるか、（b）配列番号No.3の20-29の対応アミノ酸配列に対して少なくとも４つの連続したアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；および
（iii）  配列番号No.3の30-98のアミノ酸配列、
のアミノ酸配列を有する非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白を含み、且つ、一種または複数の生理学的に許容される免疫アジュバントを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
上記の突然変異したE7蛋白のアミノ酸領域(ii)が天然蛋白の配列番号No.3の配列のペプチド領域20-29に対応するアミノ酸に対して少なくとも2つのアミノ酸が置換されたものから成る請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
上記の突然変異したE7蛋白のアミノ酸領域(ii)が天然蛋白の配列番号No.3のペプチド領域20-29に対応するアミノ酸に対して3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸が置換されたものから成る請求項2に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
突然変異したE7蛋白が位置24のCys残基と位置26のGluの残基が別のアミノ酸残基で置換されたものから成る請求項2に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
突然変異したE7蛋白が（CYS24GLY、GLU26GLN）Ｅ7蛋白である請求項4に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
突然変異したE7蛋白が（CYS24SER、GLU26GLN）E7蛋白である請求項4に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
上記の突然変異したＥ7蛋白のアミノ酸領域(ii)が配列番号No.3の対応する20-29のアミノ酸配列に対して5、6、7、8、9または10個の連続したアミノ酸が欠失したものから成ることを特徴とする請求項1に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
上記の突然変異したＥ7蛋白のアミノ酸の領域(ii)が配列番号No.3の対応する20-29のアミノ酸配列に対して6つの連続したアミノ酸が欠失したものから成ることを特徴とする請求項7に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
突然変異したE7蛋白が、天然のE7蛋白の配列番号No.3に対応するアミノ酸21〜26を欠失したのアミノ酸の配列を有する突然変異したE7蛋白から成る請求項8に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
上記の突然変異したＥ7蛋白のアミノ酸の領域(ii)が配列番号 No.3の対応す20-29のアミノ酸配列に対して5つの連続したアミノ酸が欠失したものから成る請求項7に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
突然変異したE7蛋白が、配列番号No.3の配列の対応するアミノ酸21〜25が欠失したものから成るアミノ酸配列を有する突然変異したＥ7蛋白からなる請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
天然のE7蛋白の免疫抑制活性を中和する抗体が作られる免疫応答に適した少なくとも一種のアジュバントを含むことを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
免疫グロブリンAのアイソタイプの抗体が作られる免疫応答をする少なくとも一種のアジュバントを含むる請求項12に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
免疫グロブリンGのアイソタイプの抗体が作られる免疫応答をする少なくとも一種のアジュバントを含む請求項12に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
(i)免疫グロブリンAのアイソタイプの抗体が作られる免疫応答をする少なくとも一種のアジュバントと、(ii)免疫グロブリンGのアイソタイプの抗体が作られる免疫応答をする少なくとも一種のアジュバントとを組み合わせた請求項12に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
液性および細胞性の免疫応答を誘発する少なくとも一種の免疫アジュバントを含む請求項15に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
細胞性応答がCD8抗原の発現するリンパ球の増殖および野生のE7蛋白の特異的認識によって特徴付けられる請求項7に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
免疫抑制を誘発せずに、パピロマウイルス（Papillomavirus）ＨＰＶ-16の天然のＥ7蛋白に対する免疫応答を誘発する免疫組成物であって、活性成分としてＮ末端からＣ末端に向かって下記：
（i）  配列番号No.3の1-19アミノ酸配列；
（ii）  (a)配列番号No.3の20-29の対応するアミノ酸配列に対して少なくとも一つのアミノ酸が置換されるか、（b）配列番号No.3の20-29の対応するアミノ酸配列に対して少なくとも4つの連続したアミノ酸が欠失したアミノ酸配列：および
（iii）  配列番号No.3の30-98のアミノ酸配列
を有するアミノ酸配列からなる非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白を含み、且つ、一種または複数の生理学的に許容される佐薬または免疫アジュバントを含む免疫組成物。
【請求項１９】
免疫有効量の請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異したE7蛋白をコードする核酸と、この核酸から成る発現カセットまたはこの発現カセットから成る組換え型ベクターとからなるＨＰＶ-16感染に起因する癌の予防または治療用ワクチン組成物。
【請求項２０】
天然Ｅ7蛋白の免疫抑制活性を中和する抗体の生産を誘発する非免疫抑制性の免疫組成物またはワクチン組成物の製造での、請求項1〜11のいずれか一項に記載の非免疫抑制性の突然変異したＥ7蛋白の使用。
【請求項２１】
請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物に対する中和抗体。
【請求項２２】
請求項21に記載の抗体を含むＨＰＶ-16感染に対する予防接種用組成物。
【請求項２３】
活性成分として患者の個体の自己由来の樹状細またはアロジェニック樹状細胞の所定量を含み、自己由来の樹状細胞は請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異したＥ7と一緒に培養してＴ細胞に突然変異したＥ7を含むものであることを特徴とする、パピロマウイルス（Papillomavirus）の感染に起因する癌に呈して予防または治療時に免疫抑制性の応答を生じないワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＰＶ−１６タイプのパピロマウイルス（Papillomavirus）の感染に関連する癌の予防および治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ある種のヒトパピロマウイルス（パピロマウイルス、Papillomavirus）すなわちＨＰＶは癌の原因物質であるとみなされている。特に、タイプ16、18、31、33、51のＨＰＶは女性の子宮頸癌を含む肛門性器癌（anogenital cancers）に関連している。子宮頸癌（カルチノーマ）の50％以上はＨＰＶ-16タイプのパピロマウイルスに関連している。
【０００３】
ＨＰＶE6およびE7のウイルス性腫瘍性タンパクは分子機構に強く関係しており、これらウィルスは上記癌の成長に大きく関与している。この２つの腫瘍性タンパクはp53タンパクが作る細胞サイクルレギュレータの機能と網膜芽細胞腫蛋白を不活性化して癌に到る多段階のステップを開始させる。
【０００４】
一般に、悪性腫瘍は付随抗原(TAA)または特異性抗原（TSA）と特定のストローマ微細環境と有する癌腫細胞からなり、血管過多化（hypervascularization）または新生血管形成（neoangiogenesis）によって特徴づけられ、免疫細胞の麻痺すなわち免疫抑制（immunosuppressive）状態を伴う。この免疫抑制状態は最初は腫瘍位置に留まっており、それによって個体は感染のような外からの攻撃に対して身を守ることができる。
しかし、転移が広がると免疫抑制が拡大し、一般化する。事実、末期癌患者は感染に対して弱くなる。こうした免疫抑制には癌細胞またはその周囲の細胞によって生産される麻痺ファクターが含まれるため、免疫系細胞の局所的麻痺すなわち免疫抑制が癌細胞の主要な武器となり、癌細胞はホストの免疫系から逃げることができるようになる。
【０００５】
ＨＰＶ-16に起因する癌においても上記のような免疫抑制条件が観測されており、この免疫抑制作用がＨＰＶ-16に起因する癌の予防および治療用ワクチン組成物の開発の主要な技術的障害になっている。事実、現在の抗ＨＰＶ-16ワクチン戦略はＨＰＶ-16の特にE6とE7蛋白が生産するある種の抗原を特異的に認識する細胞毒性Ｔ細胞を、感染癌細胞の表層膜の組織適合性主コンプレックス（IVIIHC）のクラスI抗原と組み合わせて、増殖されるものである。
【０００６】
何人かの著者はＨＰＶ-16に起因する癌で観測される免疫抑制と子宮頸癌の細胞表面で観察されるMHCクラスＩの分子の発現レベルの減少を関連付けており(非特許文献１）、また、患者の新生物発生前形成異常症発現におけるＴ細胞レセプタ（TCR）のデルタ鎖の減少を関連付けている（非特許文献２）。
【非特許文献１】Cruz et al., 1999
【非特許文献２】Muderspach et aL（2000）
【０００７】
別の著者は免疫抑制条件とＴ細胞から腫瘍細胞によって生産されて免疫細胞に伝達される信号への無応答と、それによるアポプトーシス、例えばFas/Fas-リガンド相互作用によるアポプトーシスとを関連づけている。
【非特許文献３】Schoellほか（1999）
【０００８】
さらに別の著者は、ＨＰＶ感染に起因する癌での免疫抑制はIL-lOおよびTGF-beta-1の増加、さらには上皮下のIFN-ガンマの減少に付随物するということを観察している（非特許文献４、５、６）。
【非特許文献４】El Sherifet al., 2001; Giannini et al. 1998; Giannini et al. 2002
【非特許文献５】Giannini et al. 1998
【非特許文献６】El Sherif et al, 2001
【０００９】
本出願人は先の特許出願（特許文献１）においてＨＰＶに起因する子宮頸癌の場合にはパピロマウイルス（Papillomavirus）のE7蛋白が腫瘍または感染細胞での局所的免疫抑制に関係していることを示した。
【特許文献１】国際特許第WO 00／03732号公報
【００１０】
E7蛋白により誘導される免疫抑制性はPPDまたは破傷風トキソイドによって刺激されるＴ細胞の増殖の阻害と、アロジェニック細胞によって刺激されるＴ細胞の増殖の阻害と、抗原（APC）出す細胞によるα-IFNの過剰生産（免疫抑制薬サイトカイン）とによって特徴付けられる。
【００１１】
ＨＰＶ可溶性E7蛋白によって誘発される免疫抑制を減少またはブロックするために細胞外のE7蛋白に対して特異な抗体を誘発するための抗原としてE7蛋白の非毒性誘導体を使用することが提案されている。天然蛋白の欠失作用無しにP7誘導免疫化合物を作るために、天然のE7蛋白を化学的修飾またはアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を含む遺伝的改質によって変更して天然蛋白の有害な官能性サイトを減少または抑制することが提案されている。この場合には、グルタルアルデヒドで天然のE7蛋白を処理すると、改質したE7蛋白は免疫抑制活性を無くすことが示された。
【００１２】
天然のE7蛋白の免疫抑制特性を減少またはブロックするために提案されている従来の化学的修飾法の目的はE7蛋白の一次構造を実質的に変えず、また、天然蛋白のアミノ酸配列を変えずに、天然のE7蛋白のアミノ酸の一つの反応性官能基にアルデヒド、カルボアミドまたはマレイミドのような官能基をカップリングして天然のE7蛋白の炭素骨格に化学基を付加することである。
【００１３】
すなわち、ＨＰＶ-16感染に起因する癌に対する予防または治療用ワクチンを製造するための従来の各種抗E7免疫組成物の目的は全て感染細胞の表面で発現されるE7蛋白に対する特異細胞障害性リンパ球（ＣＬＴ）を生産させて免疫応答を誘発させることにあり、抗原としては完全なE7蛋白またはE7蛋白に由来するペプチドを含み、必要に応じて化学的な変性する(非特許文献７、８)。
【非特許文献７】Gerard et al., 2001
【非特許文献８】Muderspach et al., 2000; Schoell, 1999
【００１４】
いずれの場合でも、天然のE7蛋白に由来するペプチドを用いた場合は、天然蛋白のアミノ酸配列に変更はなく、従って、アミノ酸の初期一次構造に変化はない。これは、天然のE7蛋白で重要なエピトープを変化させないで、感染細胞によって生産される天然のE7蛋白を効率的かつ特異的に認識できるようにすることが免疫応答の誘導、特にCTL細胞の生産に有利となると単に考えた結果の現れである。
【００１５】
発癌性および転移性を減らした免疫蛋白の生産を目的としてE7蛋白のアミノ酸の一次構造の再配置も考えられたが、その関心は免疫化合物中に天然のE7蛋白のエピトープを完全に維持し、再配置後の免疫化合物中のE7蛋白のアミノ酸配列に少なくとも一つの完全なコピーを維持することであった。
【００１６】
下記文献（非特許文献９）には、免疫ペプチド化合物直接ではなくDNAを用いた抗ＨＰＶワクチン戦略において、ＨＰＶ-16感染した癌細胞の表面で発現される天然のE7蛋白を特異的に認識する細胞障害性リンパ球（CTL）の生産を誘発する免疫原性化合物をコードするDNAの構築方法が開示されている。
【非特許文献９】Osen et al. (2001）
【００１７】
この著者は天然のE7蛋白が過剰に生産されるのを避け、少なくとも天然のE7蛋白の発癌性蛋白との再結合を避けるために、天然のE7蛋白の全てのエピトープが発現される免疫蛋白をコードするDNAを作っている。しかし、(i) 領域1-10、(ii) 領域11-40、(iii) 領域41-70および(iv) 領域71-98の各ペプチド領域は最終的な免疫ペプチド化合物で逆である。この著者は天然のE7蛋白の全てのCTLエピトープを維持した免疫ペプチド化合物を生産するのが必要であることに固執している。その一方で細胞の癌性変形特性は失っている。さらに、この著者は発癌性力に関しては再配置後の免疫ペプチド化合物の無害性を増加させることによって天然のE7蛋白の非発癌性活性に関与するE7蛋白のアミノ酸21からアミノ酸26の領域での網膜芽細胞腫とpRB蛋白との結合を抑制することを提案している。しかし、こうした非発癌性免疫ペプチド化合物を具体的に作ることはできていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明者は、驚いたことに、天然のE7蛋白をコードするDNAに突然変異を誘発させることによって、天然E7蛋白に特異的な免疫応答を誘発させる能力が同じか、より優れた突然変異蛋白を得ることができ、しかも、天然のE7蛋白の免疫抑制特性はブロックされるということを見出した。
すなわち、本発明者は上記蛋白の免疫抑制活性を支配するものはＨＰＶ-16パピロマウイルス（Papillomavirus）の天然E7蛋白の位置20（ThrまたはT）のアミノ酸から位置29（AsnまたはN）のアミノ酸までの領域に位置したペプチド断片であるという事実を偶然に見出した。
本明細書では、配列番号 No.3の天然E7蛋白を有するＨＰＶ-16に比較して少なくとも一つのアミノ酸が異なる蛋白を「突然変異した」E7蛋白とよび、このアミノ酸の違いは配列番号 No.3の天然E7蛋白の位置20〜29のペプチド領域に対応した位置にある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、E7は天然のE7蛋白の配列番号No.3と比較して少なくとも一つのアミノ酸、好ましくは少なくとも2つのアミノ酸が置換された蛋白からなる突然変異したは、天然E7蛋白で報告されている免疫抑制を誘発特性を失っているということを見出したものである。すなわち、天然E7蛋白の配列番号No.3と比較して位置24のシステイン酸残基をグリシン残基（CYS24GLY）で置換し、位置26のグルタミン酸残基をグルタミン酸残基（GLU26GLN）で置換した突然変異したE7蛋白は、天然のE7蛋白の免疫抑制特性を失うことを見出した。同様に、天然E7蛋白の配列番号No.3と比較して位置24のシステイン残基をセリン残基（CYS24SER）で置換し、位置26のグルタミン酸残基をグルタミン残基（GLU26GLN）で置換した突然変異したE7蛋白は天然のE7蛋白の免疫抑制特性を失っていることを見出した。
【００２０】
さらに、天然のE7蛋白の配列番号No.3のアミノ酸配列と比較して、配列番号No.3の対応する位置20のアミノ酸から位置29のアミノ酸までの範囲のポリペプチド領域の少なくとも４つを欠失、好ましくは4、5、6、7、8、9または10つの連続したアミノ酸を欠失したものからなる突然変異したE7蛋白は、配列番号No.3の天然のE7蛋白で観測される免疫抑制特性を失うということを本発明は示した。特に、配列番号No.3の数え方で21（AspまたはD）から26（GluまたはE）までのペプチドを欠失した突然変異したE7蛋白は、天然E7蛋白で観測される免疫抑制特性を失うことを示した。
【００２１】
本発明では、天然E7蛋白のアミノ酸の21〜26に対応する部位を欠失した突然変異したE7蛋白を「E7Δ21-26蛋白」とよぶ。
遺伝子組換えによって生産されたE7Δ21-26蛋白は下記文献に記載されている。
【非特許文献１０】D'Anna et al. (2001, J. Nati. Cancer Inst. Vol. 93 (24):1843-185l
【００２２】
同様に、配列番号No.3の数え方で21（AspまたはD）から25（TyrまたはY））までのペプチドを欠失した突然変異したE7蛋白は、天然E7蛋白で観測される免疫抑制特性を失うことを示した。本発明では、天然E7蛋白のアミノ酸の21〜25に対応する部位を欠失した突然変異したE7蛋白を「E7Δ21-25蛋白」とよぶ。
【００２３】
本発明は、天然E7蛋白のペプチド部位20-29のアミノ酸を単に置換することでこの蛋白で観測される免疫抑制活性をブロックすることができるということを示したものである。すなわち、天然のE7蛋白の一次構造すなわちペプチド部位20-29をマイナー変更することで天然E7蛋白に典型的な免疫抑制特性が破壊されるということを示した。
【００２４】
本発明で蛋白が「免疫抑制性（immunosuppressive）」であるとは、強縮（トキソイド強縮抗原）および／またはジフテリア（ツベルクリン-精製蛋白誘導体、PPD）タイプの抗原を接種した対象者の抹消血液の単核化した細胞の試験管内増殖でその蛋白が少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％抑制されることを意味する。この単核した細胞の増殖は細胞を以下で予備培養することで誘導される：
(i) PPD抗原、
(ii) トキソイド強縮抗原、
(iii) PPD抗原とトキソイド強縮抗原、または、
(iv) 単核した細胞に対応するアロジェニックの細胞
【００２５】
このテストでは免疫抑制蛋白候補を用い、効果-投与量曲線で最大増殖阻害値となる誘発濃度を求めた。テスト結果は実施例6に示してある。
また、蛋白が「免疫抑制性」であるとは、その蛋白が免疫抑制性サイトカイン（各々抹消血液の単核した細胞によるIL-10および抗原（APC）を有する細胞によるα-IFNまたはIL-10）のインビトロでの異常な生産レベルを誘発することを意味する。
【００２６】
さらに、後で詳細に説明し、実施例で示されるように、突然変異したE7蛋白は免疫抑制性の他に、天然のE7蛋白に対する「中和」抗体の生産を刺激する能力、すなわち天然のE7蛋白を認識し、免疫系の細胞に有害である天然E7蛋白の免疫抑制活性をブロックする抗体の生産能力を共通して有している。本発明では、γ-IFNで予め処理したヒトマクロファージによるα-IFNの生産を刺激する天然E7蛋白の能力をブロックする場合も含めて、抗E7抗体はいわゆる「中和」であるという。この点は実施例1のテストでさらに詳細に説明する。
以上の結果から、天然E7のアミノ酸配列と比較した時にアミノ酸の突然変異、置換または欠失を全てに共通して有する突然変異したE7蛋白のファミリーを定義することができる。
【００２７】
より一般的には、本発明の非免疫抑制の突然変異したE7蛋白は、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下のアミノ酸配列から成る蛋白である：
（i）  配列番号No.3の1-19アミノ酸配列；
（ii）  (a)配列番号No.3の対応20-29のアミノ酸配列と比較して少なくとも一つ、好ましくは少なくとも2つのアミノ酸が置換した配列または（b）配列番号No.3の対応20-29アミノ酸配列と比較して少なくとも4つの連続したアミノ酸を欠失した配列を有するアミノ酸配列：
（iii)  配列番号No.3の30-98アミノ酸配列。
【００２８】
本発明の上記定義のアミノ酸配列から「成る」突然変異したE7蛋白は、アミノ酸配列が上記のアミノ酸配列から「実質的に成る」蛋白である。換言すれば、本発明の突然変異したE7蛋白は上記アミノ酸配列のほかに最大で20、好まくは15、さらに好ましくは10、最も好ましくは6つのアミノ酸からなる１つまたは２つの追加のアミノ酸配列を含むことができる。この追加のアミノ酸配列は領域(i)のＮ末端か領域(ii)のＣ末端に位置し、場合によっては領域(i)のＮ末端および領域(ii)のＣ末端に位置する。後者の場合、領域(i)のＮ末端に位置する追加の配列はＣ末端に位置する追加の配列とは別にすることができ、逆に、両方の追加の配列を同一にすることもできる。一般に、本発明による突然変異したE7蛋白は上記定義のアミノ酸配列に比較して単一の追加のアミノ酸配列、例えばポリ（ヒスチジン)アミノ酸配列、例えば6つのヒスチジン残基ポリマーからなる配列を有する。
【００２９】
本発明による突然変異したE7蛋白は、上記の定義から配列No.3の対応するペプチド部位に2つの全く同じアミノ酸領域を有し、アミノ酸領域(i)は天然のE7蛋白の1-19ペプチド領域と全く同じであり、アミノ酸部位(iii)は天然のE7蛋白の配列No.3の30-98ペプチド領域と全く同じである。突然変異したE7蛋白の中央のアミノ酸領域(ii)は一つのアミノ酸が一つまたは複数個置換したものから成るか、上記配列No.3の対応する20-29ペプチド領域に比較して少なくとも4つのアミノ酸の一つが欠失したものから成る。
【００３０】
本発明の第１の変形例では、突然変異したE7蛋白のアミノ酸領域(ii)は天然蛋白の配列番号No.3の20-29ペプチド領域の対応するアミノ酸と比較して少なくとも2つのヌクレオチド置換から成るのが好ましく、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸置換から成ることもできる。突然変異したE7蛋白のアミノ酸領域(ii)が10個のアミノ酸置換から成る場合には、突然変異したE7蛋白のアミノ酸領域(ii)は配列番号 No.3の天然のE7蛋白の対応する20-29ペプチド領域とは完全に異なる配列である。
【００３１】
本発明の突然変異したE7蛋白を得るための天然のE7蛋白の20-29領域でのアミノ酸の各置換は、突然変異したE7蛋白の置換されたアミノ酸が天然のE7蛋白の対応するアミノ酸とは明確に異なる「クラス」に属するように行うのが好ましく、芳香性、疎水性、極性、塩基性、酸性のアミノ酸クラスの中または小さなアミノ酸の中で、以下のようなように置換するのが好ましい：
(1)  位置20のThr残基をAla、Ser、MetおよびGly以外の残基で置換；
(2)  Glu以外の残基によって置き換えられる位置21のAsp残基；
(3)  TieとVal以外の残基によって置き換えられる位置22のLeu残基；
(4)  PheとTrp以外の残基によって置き換えられる位置23のTyr残基；
(5)  いかなるはっきりしたアミノ酸残基によっても置き換えられる位置24のCys残基；
(6)  PheとTrp以外の残基によって置換位置25のTyr残基；
(7)  位置26のGlu残基をAsp以外の残基で置換；
(8)  位置27のGin残基をAsn以外の残基で置換；
(9)  位置28のLeu残基をIleおよびVab以外の残基で置換；
(10)  位置29のAsn残基をGin以外の残基で置換。
【００３２】
アミノ酸セットは以下のアミノ酸で作られる：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrおよびValと、本発明の突然変異したE7蛋白の配列の他のアミノ酸との結合に関与しないこれらの一つまたは複数の化学基での化学的に編成された誘導体。
【００３３】
好しい突然変異したE7蛋白のファミリーは位置24のCys残基および位置26のGlu残基が置換された蛋白のグループである。
第１の好ましい突然変異したE7蛋白は一つのヌクレオチドの2つの置換を有するE7蛋白である（CYS24GLY、GLTJ26GLN）。
第２の好ましい突然変異したE7蛋白は、一つのヌクレオチドの2つの置換を有する突然変異したE7蛋白である（CYS24SER、GLU26GLN）。
【００３４】
本発明の第２の変形例では、配列番号No.3の対応する20-29アミノ酸配列と比較して、アミノ酸領域(ii)が5、6、7、8、9または10個の連続したアミノ酸が欠失したものから成る。アミノ酸領域(ii)が10個のアミノ酸の欠失から成る場合、上記領域(ii)はアミノ酸を有せず、得られた突然変異したE7蛋白はＮ末端からＣ末端に向かって配列番号No.3の1-19領域(i)を有し、これは配列No.3の30-98領域(iii)に結合したペプチドに直接連結している。
突然変異したE7蛋白の第１の好しいファミリーは配列番号 No.3の20-29のアミノ酸の対応配列と比較してアミノ酸領域(ii)の6つの連続したアミノ酸が欠失した蛋白のファミリーである。
【００３５】
本発明の第３の好しい突然変異したE7蛋白は、天然E7蛋白の配列番号No.3の対応する21〜26のアミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有する蛋白である。本明細書ではこの突然変異したE7蛋白もE7Δ21-26とよび、アミノ酸配列番号No.1を有し、配列番号 No.2の核酸によってコードされる。E7Δ21-26蛋白の領域(ii)は配列番号No.3の20-29アミノ酸の対応配列と比較して6つの連続したアミノ酸を欠失している。
【００３６】
本発明の突然変異したE7蛋白の第２の好ましいファミリーは、配列番号No.3の20-29アミノ酸の対応配列と比較して領域(ii)の5つの連続したアミノ酸が欠失した蛋白からなる。
【００３７】
本発明の第４の好しい突然変異したE7蛋白は、天然E7蛋白の配列番号No.3の対応する21〜25のアミノ酸が欠失したのアミノ酸配列を有する蛋白からなる。本明細書ではこの突然変異したE7蛋白もE7Δ21-25とよぶ。E7Δ21-25蛋白の領域(ii)は配列番号No.3の20-29のアミノ酸の対応配列と比較して5つの連続したアミノ酸が欠失している。
【００３８】
本発明では、上記定義のHIPV-16突然変異E7蛋白ををコードするDNAの発現産物を適当な免疫アジュバントと組み合わせたときにマウスにおいて特異的な液性および細胞性応答を誘導でき、それによって、天然E7蛋白によって誘導されるものよりは低い抗腫瘍保護免疫を誘発することができる。
【００３９】
突然変異したE7蛋白をコードするDNAの「発現産物」とは、宿主細胞において上記定義の突然変異したE7蛋白をコードするDNA（または対応するRNAメッセンジャ）の転写で得られる蛋白を意味する。
本発明のＨＰＶ-16突然変異E7蛋白をコードする発現産物は天然のE7蛋白よりも高いか、それと同じ抗腫瘍治療活性を有する。
【００４０】
さらに、本発明の突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物の基本的特徴は直接的な免疫抑制活性が無いことと、癌細胞が分泌する天然のE7蛋白によって誘導される免疫抑制の遮断を誘導することにある。
【００４１】
本発明の目的は、活性成分として上記定義の非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白と、必要に応じて用いられる免疫生理的に許容される一種以上の佐薬またはアジュバントとを含む、免疫抑制を誘発せずに、ＨＰＶ-16パピロマウイルス（Papillomavirus）の天然E7蛋白に対して免疫応答を誘発できる免疫組成物を提供することにある。
【００４２】
本発明はさらに、活性成分として上記定義の非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白と、免疫生理的に許容される一種以上の佐薬またはアジュバントとを含むパピロマウイルス（Papillomavirus）感染に起因する癌に対する予防または治療用の、免疫抑制特性のないワクチン組成物を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、非免疫抑制性の免疫組成物またはワクチン組成物の製造と、天然E7蛋白の免疫抑制活性を中和する抗体の生産における、上記定義の非免疫抑制性の突然変異したE7蛋白の使用に関するものである。
【００４４】
実施例で示すように、本発明の免疫組成物またはワクチン組成物は天然E7蛋白または天然E7蛋白から生じるペプチドを発現する細胞に対して細胞毒性の細胞免疫反応を誘発する。特に、実施例で示すように、本発明の免疫組成物またはワクチン組成物は天然のE7蛋白または天然のE7蛋白から生しるペプチドを発現する腫瘍細胞に対して細胞毒細胞免疫反応を誘発する。
【００４５】
ＨＰＶ-16天然E7蛋白の基準アミノ酸配列は例えば下記文献に開示の配列（Swissprotデータベースでのアクセス番号P03129）であり、本願明細書では配列番号 No.3として記載してある。このＨＰＶ-16天然E7蛋白をコードする核酸配列は配列番号 No.4から成る。
【非特許文献１１】Seedorf et al.(1985）
【００４６】
本明細書に定義の突然変異したE7蛋白は当業者に周知の任意の蛋白合成技術によって製造できる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって後者をコードする核酸を組換え細菌細胞系、例えば大腸菌細胞系で過剰発現させて突然変異したE7蛋白を製造することができる（下記文献参照）。
【非特許文献１２】Kieder et al. (1996)
【非特許文献１３】Tucker et al. (1996)
【００４７】
同様に、突然変異したＥ7蛋白を均一溶液中または固相で化学合成で製造することもできる。この化学合成技術は例えば下記文献に開示されている。
【非特許文献１４】Houben Weyl (1974)
【００４８】
また、突然変異したＥ7蛋白を溶液中または固相で各アミノ酸残基を順次カップリクする化学合成技術（鎖を予め保護基でブロックし、液相ではＮ末端からＣ末端へ、また、固相ではＣ末端からＮ末端へアミノ酸残基を付けていく合成技術）によって製造することもできる。
【００４９】
突然変異したＥ7蛋白を合成する技術は例えば下記文献に記載されている。
【非特許文献１５】Merrifield (l965a; 1965b）
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本発明で使用される核酸
本発明の然変異したE7蛋白はこの突然変異したＥ7蛋白をコードする核酸、例えば、配列番号 No.1の突然変異したE7蛋白をコードする核酸の転写で生産できる。
本発明では核酸またはポリペプチドは分離された形でも精製された形でもよい。
【００５１】
「精製された」という用語は他の化合物が在しない絶対的に純粋な形の原料という意味ではなく、むしろ相対的な定義である。出発原料または自然原料を少なくとも一桁、好ましくは2桁または3桁、さらに好ましくは4〜5桁精製した場合、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは精製された状態であるといえる。
【００５２】
「核酸」「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」という用語にはＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡの配列、少なくとも2つのヌクレオチドのRNA/DNAハイブリッド、一本鎖、2本鎖下の配列が含まれる。
【００５３】
「ヌクレオチド」という用語は自然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のほかに少なくとも一つが特全変異したヌクレオチド、例えば(i)プリン類似体、(ii)ピリミジン類似体または(iii)糖類似体、例えば国際特許出願第WO 95/04064に開示の突然変異したヌクレオチド）の両方を意味する。
【００５４】
本発明で、最初のヌクレオチドの各塩基が向きが逆の配列を有する第2のポリヌクレオチドの相補塩基にカップリングされる時、最初のヌクレオチドを第2のポリヌクレオチドに「相補」であると考える。相補な塩基はAとT（またはAとU）およびCとGである。
【００５５】
好しい実施例では、配列番号 No.1の突然変異したE7蛋白をコードする核酸は配列番号 No.2のヌクレオチド配列から成る。
上記定義の核酸は主として対応する発現産物を生産する上で有用である。
【００５６】
従って、突然変異したＥ7蛋白をコードする核酸は成熟前または成熟核宿主細胞の突然変異したE7蛋白の発現を制御する調節ポリヌクレオチドから成るのが好ましい。
この調節ポリヌクレオチドは選択した宿主細胞で突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの転写を開始させることができる少なくとも一つのプロモータ配列から成る。この調節ポリヌクレオチドは突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現に適した他のヌクレオチド配列、例えば当業者に周知の転写活性配列から成ることもできる。
【００５７】
いわゆる「誘導性」プロモータ、すなわち誘導プロモータの存在下に応答するプロモータを選択するのが好ましい。このプロモータは誘導プロモータの存在下のみでその制御下のDNAの転写をする。
LacZプロモータは、この種の誘導性のプロモータの実例となる実施例である。
本発明による、いかなる分子生物学も、微生物学と組換えＤＮＡ従来の技術、技術のヒトにとって公知のウエルが、以下に例えば定義される核酸を製造するために使われてもよい。
【００５８】
例えば、この種の技術は非特許文献１１に開示されている。
【非特許文献１６】Sambrook et al. (1989), Glover (1985), Gait (1984) and Ausubel et al. (1989)
【００５９】
上記定義の調節ポリヌクレオチドの制御下にある本発明の突然変異したE7蛋白をコードするDNAから成る核酸は発現カセット中に含まれる。
【００６０】
発現カセット
この発現カセットは、突然変異したE7蛋白をコードするDNAを調節するポリヌクレオチドのほかに、オープンリーディングフレーム、いわゆる「リーダー」配列の5'側にある発現産物の転写を増加させる非転写配列、いわゆる「リーダー」または当業者に「ターミネータ」配列とよばれる配列を含む。
【００６１】
上記定義の発現カセットは、シグナルペプチドと突然変異したE7蛋白との間、例えばシグナルペプチドとE7Δ21−26蛋白と間に融合ポリペプチドを生産するためにのシグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでいて、突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物の分泌して主として細胞外、例えば細胞培養上清中に発現産物が得られるようにするのが最も好ましい。突然変異したE7蛋白をコードするヌクレオチド配列はシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の直ぐ5'側に位置するのが好ましい。
【００６２】
一般に、発現カセットは以下で定義するようにトランスホームされた宿主細胞を選択するために、選択マーカのポリヌクレオチドをさらに含む。
【００６３】
組換え型ベクター
上記定義の突然変異したＥ7蛋白をコードする核酸は、必要な場合には発現カセットに挿入された後に例えば上記定義の核酸または前記発現カセットから成るクローニングおよび／または発現組換え型ベクターに導入されているのが好ましい。
【００６４】
「ベクター」という用語は環状または直鎖のDNAまたはRNA分子で、一本鎖でも二本鎖でもよい。組換えベクターはクローニングベクタでも発現ベクトルでもよく、細菌またはウイルス起源のベクターにすることができる。
【００６５】
本発明で好しい細菌ベクトルは例えばPbr322ベクター（ATCC37OI7）、PAA223-3のようなベクター（Pharmacia, Uppsala, Sweden)およびpGEM1 （Promega Biotech, Madison, WI, USA）である。
【００６６】
他の市販のベクターの例としてはpQE7O、pQE6O、pWE9（Qiagen）、psiXl74、pBluescriptＳＡ、pNH8A、pNH16A、pNHJ8A、pNH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG（Stratagene）ベクターがある。
【００６７】
本発明の第１実施例では上記定義の組換えベクターをトランスホーメーションまたは所望の細胞宿主へトランスフェクションした後に核酸またはそこに挿入される発現カセットを増幅するのに用いる。
【００６８】
本発明の第2実施例では、本発明の突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物を生産するために選択した宿主細胞のトランスフォーメーションをするために、上記定義の核酸または発現カセットから成る発現ベクトルにすることができる。
【００６９】
上記定義の組換えベクターはさらに適当な転写を有する開始配列および停止配列を含むのが好ましい。
上記定義の発現カセットは本発明の組換えベクターの特殊な例である。
本発明の突然変異したＥ7蛋白をコードする核酸を発現させるためには核酸、発現カセットまたは上記定義の組換えベクターは宿主細胞に導入しなければならない。
【００７０】
組換え宿主細胞
上記定義の突然変異したＥ7蛋白のいくらかの生産モデルを実現するためには、上記定義の核酸、発現カセットまたは組換えベクターによってトランスホームされた宿主細胞を使用するのが好ましい。
【００７１】
このトランスホームした宿主細胞は大腸菌細胞、イースト細胞、例えばSaccharomyces cerevisiae細胞のような菌体であるのが好ましい。
【００７２】
この種のトランスホームした宿主細胞は真核細胞であるのが好ましい。好しい組換え宿主細胞のカテゴリには核酸、発現カセットおよび本発明の組換えベクターによってトランスホームされたハツカネズミ細胞のような哺乳動物の細胞である。
【００７３】
E7Δ21-26蛋白をコードする核酸の入手方法
本発明はさらに、上記定義の本明細書の突然変異したＥ7蛋白をコードする核酸の生産方法を開示する。本発明方法は次の工程から成る：
【００７４】
(a)  天然のＥ7蛋白をコードする核酸の突然変異を誘発させ、天然E7蛋白をコードするDNAの3‘端にハイブリッド化する第１ヌクレオチドプライマおよび第2のヌクレオチドプライマを用いて核酸を増幅させ、
(b)  増幅されたDNAを回収する。
【００７５】
第１のヌクレオチドプライマの配列は天然Ｅ7蛋白のアミノ酸配列に挿入される突然変異のためのコードン配列を含む。
【００７６】
すなわち、領域(ii)に一つまたは複数の置換アミノ酸を含む突然変異したE7蛋白を製造する場合の第１プライマの配列は置換されるアミノ酸をコードするコードンを含む。
【００７７】
あるいは、配列番号 No.3の20-29アミノ酸の対応配列に比較して4、5、6、8、9または10個の連続したアミノ酸が欠失した領域(ii)を有する突然変異したＥ7蛋白を製造する場合には、第１プライマの配列は、削除されるペプチド断片の直ぐN−末端側のアミノ酸をコードする第１コードンを含み、この第１コードンは第2コードンの直ぐ前にあり、この第2コードンは削除されるペプチド断片の直ぐＮ末端側にあるアミノ酸をコードするコードンを含む。
【００７８】
第１プライマを使用することで生産すべき最終産物を増幅することができ、所望コードンは変更され、所望の突然変異したＥ7蛋白をコードする最終生産物が増幅できる。
【００７９】
増幅段階(a)で使用される第２のヌクレオチドプライマは、天然E7蛋白をコードするDNAの３‘端とハイブリッドする配列のほかに、エンドヌクレアーゼによる認識のための一つまたは複数のサイトを有することができる。
【００８０】
突然変異したE7蛋白をコードする核酸は所定の挿入領域で、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いて好ましくはクローニングポリサイトの所でヌクレオチドを切断して宿主ベクターを開いた後に例えばベクターの核酸で核酸をリゲートすることによって、クローニングベクタまたは発現ベクトルに挿入される。
【００８１】
本発明の一つの目的は、上記定義の突然変異したＥ7蛋白から成る組成物、好ましくは突然変異したE7蛋白から成る免疫組成物またはワクチン組成物を提供することにある。
【００８２】
本発明の突然変異したE7蛋白からなる非免疫抑性組成物
本発明の目的は、本発明のＥ7蛋白、例えば配列番号 No.1のアミノ酸配列から成る突然変異したE7蛋白を含む非免疫抑制性の組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、配列番号 No.2のE7A21-26蛋白のような本発明の突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物から成る組成物を提供することにある。
【００８３】
本発明は、本明細書で定義した本発明の突然変異したE7蛋白は免疫抑制特性を欠いていることを明らかにしたものである。
特に、E7Δ21-26蛋白は適当な免疫アジュバントと一緒に哺乳動物に投与した場合、免疫抑制は全く誘発しないことが示された。
【００８４】
また、突然変異したＥ7蛋白であるE7蛋白（CYS24GLY、GLU26GLN）およびE7蛋白（CYS24SER、GLU26GLN）は適当な免疫アジュバントと一緒に哺乳動物に投与したときに免疫抑制は全く誘発しなかった。
【００８５】
上記で簡単に説明したように、突然変異したＥ7蛋白をコードする配列番号No.1のDNAの発現産物は天然Ｅ7蛋白自体による免疫応答との同じ最少の天然Ｅ7蛋白に対する免疫応答を誘発するが、本発明の突然変異したＥ7蛋白は、天然Ｅ7蛋白を特徴づける免疫抑制特性をヒト免疫細胞で欠如している。
【００８６】
従って、本発明の別の目的は、活性成分として上記定義の突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物と、必要に応じて用いられる一種または複数の生理的に許容される佐薬とから成ることを特徴とする、PHV-16感染、特にPHV-16による癌の予防または治療用医薬組成物を提供することにある。
【００８７】
この医薬組成物は突然変異したＥ7蛋白またはこれをコードするDNAの発現産物を10〜1000μgの量で毎週投与するのに適した形にするのが好ましい。
【００８８】
本発明の突然変異したＥ7蛋白をコードする配列番号No.1のDNAの発現産物を適当な免疫アジュバントと一緒に投与すると、天然のＥ7蛋白に対する液性および細胞免疫応答を生じ、腫瘍の予防免疫を誘発することができる。さらに、突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物を投与して得られる抗腫瘍抵抗状態を誘発する保護免疫は、天然E7蛋白で以前に免疫化した後に得られたものとおなじか、それより高いものである。
【００８９】
また、既に腫瘍ができている個体へ適当な免疫アジュバントと一緒に投与した時には、配列番号 No.1の突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物は治療に有用な抗腫瘍免疫を誘発することを明らかにした。突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物による治療に有効な抗腫瘍免疫応答は天然E7蛋白を投与したときに得らるものよりはるかに大きい。
【００９０】
この結果は実施例3に示してある。この実施例３では突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物による治療に有効な抗腫瘍特性によって、マウスモデルでは天然Ｅ7蛋白を投与した動物の平均寿命に比較して動物の平均寿命を1.5倍に延すことができた。
【００９１】
また、突然変異したE7蛋白をコード化するDNAの発現産物によって誘発される治療に有効な抗腫瘍特性は特定の液性および細胞性の免疫応答と同時に誘導されることも明らかにした。
【００９２】
これらの実施例の結果は、本明細書で定義した突然変異したE7蛋白は天然のＥ7蛋白に対して全身性の液性応答を誘発することを示している。特に、主としてにIgG2bおよびIgG1のアイソタイプ抗体のIgGアイソタイプの抗E7抗体が高レベルで生産されることが示されている。
【００９３】
さらに、実施例3に記載のようにIg Aアイソタイプの抗体応答が高レベルであることから、本発明の突然変異したE7蛋白を適当な条件で個体に投与することで粘膜タイプの免疫も誘発することが証明された。
【００９４】
また、本発明の突然変異したＥ7蛋白はそれ自身では天然のE7蛋白の直接的な免疫抑制活性がなく、突然変異したE7蛋白で免疫化後に生産される抗体の中和特性によって癌細胞が分泌する可溶性E7蛋白の免疫抑制活性をブロックすることができるというこを実施例2の結果は証明している。
【００９５】
上記実施例の結果は、本発明の突然変異したE7蛋白は天然のＥ7蛋白を認識するCD4+およびCD8+ Ｔ細胞を増殖させ、この細胞増殖はγ-ＩＦＮサイトカインの過剰生産を伴うことを示している。
【００９６】
本発明はさらに、免疫抑制を誘発せずにＨＰＶ-16パピロマウイルス天然E7蛋白に対して免疫応答を誘発する免疫組成物に関するものである。この組成物は、非免疫抑制性の突然変異Ｅ7蛋白の活性成分として、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下：
（i）  配列番号 No.3の1-19アミノ酸配列；
（ii）  (a) 配列番号 No.3の20-29に対応するアミノ酸配列と比較したときに少なくとも一つのアミノ酸が置換されるか、（b）配列番号 No.3の20-29に対応するアミノ酸配列と比較したときに少なくとも4つの連続したアミノ酸が欠失したアミノ酸配列； 
（iii）  配列番号 No.3の30-98のアミノ酸配列
のアミノ酸配列を有し、かつ、一種または複数の生理学的に許容される免疫佐薬または免疫アジュバントとからなる。
【００９７】
この免疫組成物はＨＰＶ-16感染に対して抗腫瘍保護免疫を誘発するための予防に使用できる。
この免疫組成物はさらに、ＨＰＶ-16感染の治療、特にＨＰＶ-16感染に起因する癌の治療に使用できる。
【００９８】
本発明はさらに、本明細書で定義した突然変異したＥ7蛋白の医薬組成物の製造での使用、または、上記免疫組成物の製造での使用に関するものである。
【００９９】
本発明のさらに他の目的は、天然E7蛋白によって誘導される免疫抑制条件をブロックしながら、ＨＰＶ-16感染に起因する癌に対して予防的保護免疫または治療的な免疫を誘発する、上記定義の突然変異したE7蛋白と、一種または複数の生理学的に許容される免疫アジュバントとを組み合わせたことを特徴とする、医薬組成物または免疫組成物の製造方法を提供することにある。
【０１００】
本発明はさらに、ピロマウイルス（Papillomavirus）感染に起因する癌の予防用または治療用ワクチン組成物に関するものである。このワクチン組成物の特徴は非免疫抑制性の突然変異Ｅ7蛋白の活性成分として、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下：
（i）  配列番号 No.3の1-19アミノ酸配列；
（ii）  (a) 配列番号 No.3の20-29に対応するアミノ酸配列と比較したときに少なくとも一つのアミノ酸が置換されるか、（b）配列番号 No.3の20-29に対応するアミノ酸配列と比較したときに少なくとも4つの連続したアミノ酸が欠失したアミノ酸配列； 
（iii）  配列番号 No.3の30-98のアミノ酸配列
のアミノ酸配列を有し、かつ、一種または複数の生理学的に許容される免疫佐薬または免疫アジュバントを含む点にある。
【０１０１】
細胞外Ｅ7蛋白によって誘導されるＨＰＶ-16感染した癌細胞の所で局所的免疫抑制と戦い、表層膜に天然E7蛋白またはMECクラスI抗原と一緒になって熟成した天然Ｅ7蛋白に由来するペプチド細胞を有する癌細胞に対して効果的な免疫応答を刺激するためには、ＨＰＶ-16ウィルスに感染した癌細胞が分泌する可溶性Ｅ7蛋白の免疫抑制効果を中和できる抗体、特にＩｇＧアイソタイプ抗体の産生を誘発することが重要である。
【０１０２】
さらに、癌細胞の表層膜に露出して細胞を破壊する天然のＥ7蛋白を認識する細胞障害性リンパ球（CTh）またはそれから誘導されるペプチドの保護を誘発することも重要である。この目的を達成するためには全身（systemic）タイプの免疫応答を誘発することが必要である。
【０１０３】
さらに、主として粘膜癌、特に女性の子宮頸癌を含む肛門性器癌で検出されるヒトのパピロマウイルスでは、粘膜タイプの免疫応答を誘導することによって全身タイプの免疫応答の誘導、特に、粘膜に局所レベルでＩｇAアイソタイプ抗体の生産を刺激して予防または治療効果を補うことが重要である。
【０１０４】
目的とする免疫応答が全身免疫か粘膜免疫かに応じて免疫アジュバントを使う。
全身免疫用のアジュバントの中ではIFAタイプ・アジュバント（不完全フロイントアジュバント）、リン酸カルシウムまたは水酸化アルミナ物が好ましく使用てきる。Bremitay Biosector（デンマーク）から市販のQuilAアジュバントも使用できる。粘膜免疫用アジュバントとしては当業者に周知のcholeratoxin B（CTB）、LT毒突然変異（LTμ）が好ましく使用できる。
【０１０５】
全身タイプおよび／または粘膜タイプの免疫応答は本発明のワクチン組成物の投与経路によっても影響される。すなわち、全身免疫応答にはワクチン組成物の腸管外、皮下または皮内経路による投与が適し、必要に応じて粘膜免疫経路を兼用する。粘膜タイプの免疫応答の誘導には本発明ワクチンの組成物を例えば鼻での滴下、局部塗布によって粘膜表面へ局所レベルで投与するのが適している。
【０１０６】
本発明のさらに他の目的は、上記定義のワクチン組成物の免疫有効量を患者に投与することを特徴とする、ＨＰＶ-16感染に起因する癌の予防および治療方法を提供することにある。
【０１０７】
患者には予防または治療に有効な量の本発明のワクチン組成物を治療の必要に応じて全身および／または粘膜投与するのが好ましい。突然変異したＥ7蛋白または突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物の投与量は、例えば2ヵ月間、腸管外ルートで毎週投与した場合、10〜1000μgであり、その後は、誘導された細胞応答または液性応答のレベルに応じて、例えば２〜6ヵ月間投与する。
【０１０８】
第１の観点から、本発明のワクチン組成物は野生のE7蛋白の免疫抑制活性を中和する抗体を生産する方向へ好ましく免疫応答を向けることが可能な少なくとも一種のアジュバントを含む。
【０１０９】
本発明の第１の特殊実施例では、本発明ワクチン組成物はIgAアイソタイプ抗体を生産する方向へ優先して免疫応答を向けることが可能な少なくとも一種のアジュバントを含むことを特徴としている。
【０１１０】
本発明の第2の好しい実施例では、本発明ワクチン組成物はIgGアイソタイプ抗体を生産する方向へ優先して免疫応答を向けることが可能な少なくとも一種のアジュバントを含むことを特徴としている。
【０１１１】
本発明のさらに他の好しい実施例では、本発明ワクチン組成物は (i)IgAアイソタイプ抗体生産を優先する免疫応答を指向するアジュバントと(ii)IgGアイソタイプ抗体産生を優先する免疫応答を指向するアジュバントとを組み合わせた点に特徴がある。
【０１１２】
本発明のワクチン組成物は液性と細胞性の両方の免疫応答を誘発する少なくとも一種の免疫アジュバントから成るのが好ましい。
【０１１３】
細胞性応答の誘導では特にCD8抗原、特にHIvICクラスI抗原と一緒に癌細胞の表面に見られるような野生のＥ7蛋白を特異的に認識する抗原を発現するＴリンパ球の増殖を探すのが好ましい。
【０１１４】
本発明のワクチン組成物の他の特殊実施例では、ワクチン組成物がＨＰＶ以外の一種以上の他の抗原性または免疫性化合物を含むことができる。例えば、本発明のワクチン組成物は突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物に、一種以上のＨＰＶ-16キャプシド蛋白またはこのキャプシド蛋白から得られるペプチド、特に当業者に周知のBPV-16のLlおよびL2蛋白を組み合わせることができる。
【０１１５】
本発明のさらに他の特殊実施例では、本発明のワクチン組成物はＨＰＶ-16とは別のI-IPVタイプ、好ましくは癌の原因となるＨＰＶタイプ、例えばＨＰＶ-18、31、33および51に対して細胞性または液性免疫応答を誘発することが可能な一種以上の抗原性または免疫性化合物を含むことができる。
【０１１６】
本発明のワクチン調整物のさらに他の特殊実施例では，突然変異したE7蛋白をコードするDNAの発現産物と、αIFN、βTGF、αTNFまたはVEGFのような免疫抑制作用または血脈形成特性を有する可溶なファクターに対する抗体の生産を誘発することが可能な一種以上の抗原性または免疫性化合物とを組み合わせることができる。そうした抗原性または免疫性化合物は免疫抑制特性を誘発するか、および／または、それを安定させるように化学的に変性したαIFN、βTGF、αTNFまたはVEGFであるのが好ましい。この化学的変性は例えばカルボキシメチル化で行うことができ、当業者に周知の方法で、下記文献に記載されている。
【非特許文献１７】Frankel et al. (1988）
【０１１７】
本発明のワクチン組成物の上記特殊実施例の好しい観点では、突然変異したＥ7蛋白をコードするDNAの発現産物と少なくとも一種の抗原性または免疫性化合物とが化学的に結合して超免疫原（superimmunogen）化合物を形成する。これは本出願人（NBOVACS社）名の2001年8月10日のフランスの特許出願第01/10751号に開示されている。
【０１１８】
複合超免疫原（Composite superimmunogens）
この複合超免疫原（Composite superimmunogens）は、各々が以下から成る互いに物理的に結合した２つの別の免疫ポリペプチドで構成される：
(a)  ＨＰＶ-16細胞の病原性抗原構造に対して細胞免疫反応または細胞性と液性の免疫反応を誘発する第１の免疫ポリペプチド、
(b)  癌細胞またはストローマ細胞が生産するＴリンパ球と抗原（APC）を有する細胞を含む、免疫毒性または免疫原特性を有するサイトカイン因子または細胞調節因子の中から選択されるストローマの局所循環性蛋白に対する中和またはブロッキング抗体の生産を誘発する第２の免疫ポリペプチド、
【０１１９】
本発明で使用可能なこの複合超免疫原はその基本部分が(a)と（b）の２つのポリペプチドで構成され、２つのターゲットの病原の抗原構造およびストローマの局所循環蛋白のそれぞれに対して同時に免疫反応を誘導するので「２価性」とよばれる。しかし、本発明の２価の複合超免疫原はポリペプチド(a)および／またはポリペプチド（b）の複数のコピーをその構造中に含んでいてもよい。
【０１２０】
本発明の複合超免疫原化合物を構成するポリペプチド(a)およびポリペプチド（b）は互いに「物理的に連結」し、同じ物理構造、分子または粒子（ミクロ粒子またはナノパーティクル）中では互いに離れている。複合超免複合原中で互いに物理的に結合しているので、ポリペプチド(a)とポリペプチド（b）は同じ免疫担当細胞およびクロファージにTまたはＢリンパ球として提供される。
【０１２１】
本発明の複合超免疫原の第１の好しい実施例では、ポリペプチド(a)および（b）が以下の中から選択される：
(1)  ポリペプチド(a)：  蛋白の免疫断片またはそこから誘導される免疫蛋白の必要に応じて無毒化または安定されたHPV-l6 パピロマウイルス蛋白の免疫断片のL1およびL2蛋白 (Le Buanec et al., 1999)；
(2)  ポリペプチド（b）：  本発明の突然変異したE7蛋白、例えば配列番号 No.1の突然変異したE7蛋白。
【０１２２】
本発明の複合超免疫原の第２の好しい実施例では、ポリペプチド(a)および（b）が以下の中から選択される：
(1)  ポリペプチド(a)：  本発明の突然変異したE7蛋白、例えば配列番号No.1の突然変異したＥ7蛋白、
(2)  ポリペプチド(b）：  蛋白の免疫断片またはそこから誘導される免疫蛋白の必要に応じて無毒化または安定されたIFNα、TGFβ、TNFαとVEGF蛋白
【０１２３】
本発明の有利な実施例ではば、本発明はさらに、突然変異したE7蛋白（複合超免疫原のタイプに応じたポリペプチド(a)またはポリペプチド（b））の同一性によって区別される複数の複合超免疫原からなることを特徴とする組成物に関するものである。
【０１２４】
本発明のこの複合超免疫原を製造する場合には、ポリペプチド(a)とポリペプチド（b）とを化学的経路または遺伝子組換えによってカップリングさせる。
本発明の免疫ペプチド接合体（コンジュゲート）の特殊実施例では、ポリペプチド(a)と（b）を例えば他の共有結合、例えばペプチド-CO-NH結合によって直接連結させる。
【０１２５】
しかし、免疫ペプチド接合体構造を可撓性にするために、特に、ポリペプチド(a)と（b）の空間中の免疫ペプチドに相互移動性を与えるために、ポリペプチド(a)と（b）は接合体内のでスペーサ鎖によって互いに離されているのが好ましい。
本発明の第１の好適な実施例の免疫ペプチド接合体では、ポリペプチド(a)と（b）がSMCCまたはSTAB（両方とも二官能性化合物である）から選択されるスペーサ鎖によって接合体内で互いに離れている。
【０１２６】
このSTAB化合物は下記文献に記載された下記の式(I)の化合物である：
【非特許文献１８】Hermanson G.T （1996、Bioconjugatettechnique、San  Diego; Academic Press、pp 239-242）、：
【０１２７】
【化１】
2005532298.tif 000002
【０１２８】
このSTAB化合物は2つの反応基（ヨード酢酸基とスルホ-NRSエステル基）から成り、これらの基はそれぞれアミノ基およびスルフジル基と反応する。
SMCC化合物は下記文献に記載の下記の式（II）の化合物である：
【非特許文献１９】Samoszuk M.K. et al. (1989, Antibody, Immunocortjugates Radiopharm.,２(l）: 37-46：
【０１２９】
【化２】
2005532298.tif 000003
【０１３０】
このSMCC化合物は2つの反応基（スルホ-NHSエステル基とマレイミド基）を有し、これらはそれぞれアミノ基およびスルホヒドリル基と反応する。
【０１３１】
本発明の第２の実施例では、複合超免疫原が直鎖スペーサーペプチドから成るスペーサ鎖を有するのが好しい。この直鎖スペーサーペプチドは鎖長が3〜30のアミノ酸、好ましくは5〜20のアミノ酸、さらに好ましくは7〜15のアミノ酸の中から選択するのが好ましい。
【０１３２】
好ましい直鎖スペーサーペプチドは複合超免疫原全体の親水を増加させるためにpHが7.0の正または負に帯電したアミノ酸のみからなるものにするのが好ましい。疎水性のアミノ酸から成るスペーサーペプチドを使用することは避けなければならないことは理解できよう。好ましいスペーサペプチドは鎖長が3〜30、好ましくは5〜20のリジン残基を有するポリ（リジン)であり、リジン残基は7〜15であるのが好ましい。
【０１３３】
本発明の複合超免疫原の他の実施例では、ポリペプチド(a)と（b）がペプチド接合体内で一つの分岐スペーサーペプチドによって互いに分離している。このスペーサ鎖は下記文献に基のようなポリ（リシン）オリゴデンドリック構造を有するのが好ましい。
【非特許文献２０】Basak et al. (1995）
【０１３４】
本発明の複合超免疫原の最後の実施例では、ペプチド接合体が各接合体分子で、ポリペプチド(a)と（b）の複数のコピーから成り、好ましくはポリペプチド(a)と（b）の2〜8つのコピー、より好ましくは各ポリペプチド分子当りポリペプチド(a)と（b）の4つのコピーだけからなる。
【０１３５】
ポリペプチド(a)と（b）の両方は単一物理構造中に存在できる。例えば10〜500ナノメータ、好ましくは102000のナノメータ、さらに好ましくは10〜100ナノメータの直径を有するナノパーティクル、例えば下記文献に記載のIMSナノパーティクル上に存在することができる。
【非特許文献２１】Aucouturier et al. (2001）
【０１３６】
また、下記文献に記載のキトサン上に存在することができる。
【非特許文献２２】Skaugrud et al. (1999）
【０１３７】
まこ、下記文献に記載のリポソームまたは生体分解性粒子、例えば酸性ポリラクチド（PLA）、ポリ−ε-カプロラクタム（PLC）またはポリ（ラクチド−コグリコリド)（PLG）上に存在することができる。
【非特許文献２３】Baras et al. (1999）
【０１３８】
本発明のさらに他の実施例では、ポリペプチド(a)と（b）が単一のキャリヤ構造内に物理的に連結して、免疫系の細胞に同時に提示する。そうしたポリペプチド(a)および（b）の例としては、ナノパーティクル、例えばキトサン、IMS（フランスのSeppic社から入手可能な100〜300ナノメータの直径を有するナノパーティクル、Inimunomodulator）またはリポソーム上に固定されたものが挙げられる。
【０１３９】
このナノパーティクルは、同じ分子内で共有結合で連結されているかのように、細胞にポリペプチド(a)と（b）を同時に提供可能な程度に小型であるのが好ましい。このナノパーティクルは10〜1000ナノメートル、好ましくは10〜500ナノメートル、より好ましくは10〜300ナノメートル、最も好ましくは10〜200ナノメートルの直径を有するのが好ましい。
【０１４０】
本発明の別の目的は、免疫有効量の本発明の突然変異したE7蛋白をコードする核酸と、発現カセットまたは本明細書に定義の組換え型ベクターとを含むことを特徴とする、パピロマウイルス（Papillomavirus）感染に起因する癌に対する、免疫抑制特性の無い、予防または治療用のワクチン組成物または免疫組成物を提供することにある。
【０１４１】
このワクチン組成物では発現ベクトルとしてレトロウイルスベクターまたはアデノ-付随ベクター（AAV）が好ましい。アデノ-付随ベクターは例えば下記文献に記載されている
【非特許文献２４】Flotte et al. (1992)、
【非特許文献２５】Samulski et al. (1989）、
【非特許文献２６】McLaughlin et al. (1996）
【０１４２】
宿主細胞へ核酸、発現カセットまたはベクターを導入する技術は当業者に周知の各種の方法が使用でき、例としては下記文献が挙げられる：
【非特許文献２７】Graham et al, （1973）（リン酸カルシウム沈殿法）、
【非特許文献２８】Chen et al. （1987）
【非特許文献２９】Gopal（1985）（デキストランDEAE）
【非特許文献３０】Turkaspa、1986、Potter et al. （1984）(電気泳動）
【非特許文献３１】Harland et al （1985）（直接マイクロインジェクション）
【非特許文献３２】Nicolau et al（1987；Fraley et al（1980）（DNA付きリポソーム）
【０１４３】
本発明のさらに特殊な実施例では、宿主細胞、特に哺乳動物起源の宿主細胞へインビボで核酸または発現カセットを導入する方法が核酸または発現カセットを薬学的に許容されるキャリヤ中に含んだ調整物を選択された組織の所、、例えば平滑筋組織または粘膜組織へ局所注入で導入する段階を含む。核酸および発現カセットは上記組織の細胞中に吸収される。
【０１４４】
インビトロまたはインビボで使用される組成物は例えば下記文献に記載の「裸」の核酸または発現カセットを含むことができる。
【特許文献５】国際特許出願第WO 95/11307号公報
【非特許文献３３】Tacson et al. (1996)
【非特許文献３４】Huygen et al. (1996）
【０１４５】
また、ヒトアデノウイルスのタイプ2または5のようなアデノウイルスベクターでもよい。
【０１４６】
選択された宿主生物に注射されるベクター量は注射部位に応じて変化する。例としては本発明の突然変異したE7蛋白をコードする核酸または発現カセットの約10〜1000μｇを注射することができる。
【０１４７】
抗腫瘍予防接種に適した組成物
本明細書で明らかに示したように、HIPV-16感染した癌細胞が分泌するE7蛋白の免疫抑制特性をブロックするためには全身性または粘膜性の抗体産生が必須である。
【０１４８】
本発明の突然変異したE7蛋白から成るワクチン組成物または突然変異したE7蛋白をコードする核酸、発現カセットまたは組換え型ベクターからなるワクチンな組成物を治療で使用する場合、すなわち、HPV−16に感染したときには、ワクチン組成物による液性および細胞性の迅速な免疫応答を誘導するために、癌細胞が分泌、生産するE7蛋白の免疫抑制効果を迅速にブロックして、ワクチン効率を更に増加させることが有利である。
【０１４９】
感染細胞が生産するE7蛋白の免疫抑制効果を迅速にブロッキングすることによって、抗原性または免疫化合物として本発明の突然変異したE7蛋白を適当な一種以上の免疫アジュバントと一緒に患者を投与してえられる天然のE7蛋白に対するヒトまたは動物の免疫化後に有効量の中和抗体を投与することができる。
【０１５０】
本発明はさらに、ヒトを含む哺乳類を本発明の突然変異したE7蛋白を使用して免疫化し、得られた抗体を回収する段階からなることを特徴とする、ＨＰＶ-16の天然E7蛋白の免疫抑制効果を中和する抗体を分離する方法に関するものである。
【０１５１】
本発明はさらに、本発明の突然変異したE7蛋白にに対する抗体に関するものである。この抗体は中和、特に天然のE7蛋白の免疫抑制効果を中和する点に特徴がある。
【０１５２】
本発明はさらに他の対象は、HPV-l6の天然E7蛋白、特にＨＰＶ-16に感染した細胞が分泌するE7蛋白の免疫抑制効果を中和する抗体を含む医薬組成物にある。この抗体は本発明の突然変異したE7蛋白に対するものである。
【０１５３】
本発明はさらに、ＨＰＶ-16、感染に起因する癌を含むＨＰＶ-16感染に対する受動的な予防接種のための、上記定義の抗体を含む組成物に関するものである。
【０１５４】
本発明による抗体の中和能を調べるために当業者は天然のE7蛋白に曝したヒト・マクロファージが生産するα-IFNまたはα-TNFの阻害率を定量化する実施例1に記載のテストを参照することができる。
【０１５５】
本発明のさらに別の対象は、上記定義の突然変異したE7蛋白ヒトまたは動物の免疫化した後に得られる抗体の中和量を患者に投与することを特徴とする、ＨＰＶ-16ウィルス感染細胞が生産するE7蛋白の免疫抑制効果をブロックする方法にある。
【０１５６】
上記の患者に投与される抗体の「中和量」はＨＰＶの感染程度に応じて変化する。一般に、実施例1に記載される免疫抑制テストでは、天然のE7蛋白の免疫抑制をブロックするのに要求される中和抗体の量に対応する中和抗体量である100ng〜1mgの量を患者に投与する。
【０１５７】
抗体はＩｇAアイソタイプまたはＩｇGアイソタイプ抗体にするとができ、これはポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
本発明の抗体はF(ab‘)2またはF(ab)断片を含む。
【０１５８】
本発明の突然変異したE7蛋白で処理した樹状細胞から成るワクチン組成物
樹状細胞はT細胞性免疫の開始に特化された抗原提示細胞（APC）である。樹状細胞とＴ細胞との間の物理的接触にはＴ細胞の免疫応答の誘導が必要である。樹状細胞が所定抗原の特異的免疫応答を活性化するには２つの信号化（signalisation）段階が必要である。最初の信号化段階には抗原性ペプチド-MHC/T細胞受容体（TCR）相互作用が関与する。第2の信号化段階には細胞表面マーカとサイトカインのような共刺激分子が関与する。
【０１５９】
樹状細胞は抗原をＴ細胞に提示したときに種々のサイトカインを生産し、サイトカインのマクロ環境に影響を与え、免疫応答を生じる。
より詳しくいうと、樹状細胞を用いたワクチン接種は主用細胞に対する免疫系の免疫寛容を破壊し、少なくとも腫瘍成長と一緒に免疫抑制が同時に存在しないような癌の場合には、Th１タイプのT細胞免疫反応の刺激作用を介して宿主生物の腫瘍の溶解を誘発するということが知られている。
【０１６０】
本発明は、本明細書で定義の突然変異したE7蛋白の適当な量と、個体の樹状細胞の個体群とをインビトロで培養すると、樹状細胞が同じ固体に由来する単核された細胞の個体群中に存在するＴ細胞に突然変異したE7蛋白を提示することができ、E7蛋白の特異Ｔ細胞の活性化を誘発でき、これはＴ細胞の増殖によって視覚化できることを示した。このＴ細胞の活性化は例えば実施例に示すように、[3H]チミジンの菌体内取込みの量で測定することもできる。
【０１６１】
樹状細胞を天然E7蛋白と一緒に予めインビトロで培養する類似の実験では、外因抗原無しに培養した対照の個体群の樹状細胞と同様に、Ｔ細胞の活性化は観測されない。こうした系においても天然E7蛋白の免疫抑制活性は観測される。
これに対して、本発明で突然変異したE7蛋白は免疫抑制活性を全く欠いており、しかも、天然E7蛋白に対して有効な特異的T細胞免疫反応を誘導する。
【０１６２】
本発明はさらに他の目的は、活性成分として、適当量な患者の個体に対して自己由来またはアロジェニックな樹状細胞、すなわち本発明で定義した突然変異したE7蛋白と一緒に培養して、突然変異したE7蛋白をＴ細胞に提示し、それを特異的に認識させることができる自己由来樹状細胞を含むことを特徴とする、パピロマウイルス感染に起因する癌に対する、免疫抑制特性が無い、予防または治療用のワクチン組成物を提供することにある。
【０１６３】
本発明のさらに別の目的は、個体へ投与する前に、本明細書で定義の突然変異したE7蛋白ト一緒に培養して、突然変異したE7蛋白をＴ細胞に提示し、それを特異的に認識させることができる自己由来の（アイソジェニック）樹状細胞またはアロジェニック細胞の適当な量を患者の個体の方へ投与することを特徴とする、パピロマウイルス感染に起因する癌の予防または治療方法を提供することにある。
【０１６４】
樹状細胞はヒト末しょう血液（患者の血液またはを患者と主要な組織適合性コンプレックスのハプロタイプが共通、例えばHLA-A2ハプロタイプが共通である個体からの血液）からエラトリエーションによって調整した単核細胞の分化で得るのが好ましい。
【０１６５】
患者から採取した樹状細胞はHL1倍地（バイオ・ホイッテカー社）のような哺乳類の細胞の培養に適した培地で培養する。この倍地には必要に応じてグルタミンを加え、さらに、必要に応じてストレプトマイシンのような一種または複数の抗生物質を加えることができる。培養はでインキュベータ中で、5％（V/V）のCO2と湿った雰囲気中で37℃で行うのが好ましい。
【０１６６】
次いで、倍地中の樹状細胞を所定量、好ましくは5〜50μg/mｌのの突然変異したE7蛋白と一緒に培養する。
樹状細胞は突然変異したE7蛋白と一緒に培養する際には、106個の樹状細胞当り突然変異したE7蛋白の量を１〜50μgにするのが好ましい。
【０１６７】
患者には本発明の突然変異したE7蛋白で処理した101〜500×106細胞の量の樹状細胞を投与するのが好ましい。
【０１６８】
本発明の突然変異したE7蛋白で処理した樹状細胞を腸管外経路で注射によって患者に一回で投与するのが好ましい。必要な場合には、患者に多数の注射をすることができる。これの投与回数は抗E7免疫応答の強さに応じ決めることができ、例えば、処理された樹状細胞を毎月、隔月、年４回または年2回投与することができる。
【０１６９】
以下、本発明を図と実施例で更に説明するが、本発明が以下の例示に限定されるものではない。
【実施例】
【０１７０】
実施例1
全身性（液性および細胞性）免疫応答
実施例1.1
フロインドの完全アジュバント（ACF）および不完全アジュバント（AIF）の存在下でのE7Δ21-26蛋白の免疫活性
ACFおよびAlP存在下でのE7Δ21-26調整物の免疫活性（液性および細胞性）をチャールリバーから購入した6週齢のCS7BL/6（H−2b）雌マウスで研究した。
【０１７１】
A.  原料と方法
0日に6匹のマウス群に0.2ml（50μg）のACFエマルションを筋注注射した。21日および60日に5μgのAIFをブースター注射した。
最初の免疫前の−２日と最後の免疫後の12日に各マウスから血液サンプルを眼窩後部の所で採取した。
8匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
3匹のマウスには100μgの調整物を与えて、注射後7日間、疾患徴候の有無を調べた。
マウスには最後の免疫化から12日後にC3細胞を抗原投与した。このC3細胞はC57BL/6起源の胚細胞で、完全なＨＰＶ16ゲノムとラス癌遺伝子オンコジーンでトランスホームしたものである（下記文献）。
【非特許文献３５】Feltkamp, M.C., H.L. Smits, M.P. Vierboom, R.P. Minnaar, B.M. de Jongh, J.W. Drijhout, J. ter Schegget, C.J. Melief, and W.M. Kast. 1993
【０１７２】
細胞毒Ｔリンパ球エピトープを含むペプチドで予防接種することでヒトのPapillomavirusタイプ16の形質転換細胞によって誘導される腫瘍から守られる（下記文献）。
【非特許文献３６】Eur. J. Immunol. 23:2242-2249
【０１７３】
これは10％のFCSと、50μgのU/mlのペニシリンと、50μg/mlのストレプトマイシンと、250ng/mlのフォンジゾン（fongizone）とを加えたDMEM倍地（バイオ-ホイッテカー）で7％のCO2を含む湿った雰囲気中で37℃で培養した。マウスに注射する細胞はトリプシンを用いてプラスチックから除去された後に血清を含まない倍地で洗浄した。
調整物中に毒性がないことは臨床的徴候（挙動、毛、重量）がないことと剖検後の解剖で確認した。
【０１７４】
B.  結果
ACFおよびAIFの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。100μgの調整物で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる疾患徴候も示さない。
【０１７５】
免疫応答性は以下で測定した：
1.  液性応答
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図1］
ACFおよびAlPの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を示す。
【０１７６】
この抗体の中和活性を以下の免疫抑制テストを用いて測定する。-2日および72日に採取した血清の1/50希釈液を50ng/mlの天然E7と一緒に2時間培養する。この希釈液をγIFNで予め16時間処理したヒト  マクロファージに塗る。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、生産されたα-TNFの量をELISAテスト（DTA5O DuoSet（Ｒ＆Ｄ））で測定する。中和した血清はE7蛋白がα-TNFの発現を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのサイトカインの合成を許す。
結果は中和％で示した。
［図2］
ACFおよびAIFの存在下でE7Δ21-26調整物で誘導される抗体は極めて高い中和能を有する。
【０１７７】
2.  細胞の応答
2.1  細胞増殖
免疫化ｓたマウスおよび対照マウスから脾臓細胞を分離し、天然のE7の存在下でミクロ培養プレートの丸底ウエルで100,000細胞/ウエルで培養した。細胞培養は5％CO2を含む湿った雰囲気中で37℃で6時間連続して行った。培養終了18時間前に0.5μCiのトリチウムチミジン/ウエルを加える。免疫応答強さはIp増殖指数に比例する。
Ip＝所定抗原のspm（ストローク／分）／対照spm
［図3］
ACFとAJFの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスの脾臓細胞は、天然E7蛋白でインビトロで活性化された時に増殖する。
【０１７８】
2.2  γ-IFNの生産
10μg/mlの天然E7の存在下で培養した脾臓細胞中の培養上清のγ−IFNの存在を72時間の培養後にELISAテスト（LO-IMEX、ベルギー）を用いて上記と同様に測定した（下記文献）：
【非特許文献３７】De Smedt, T., B. Pajak, E. Muraille, L. Lespagnard, B. Heinen, P. De Baetselier, J. Urbain, 0. Leo and M. Moser. 1996、樹状細胞数の規制およびリポポリサッカリドによるインビボ熟成（J.Ex.Med. 184:1413-1424）
【０１７９】
結果はlU/mlで示す。
［図4］
ACFの存在下、次いでA1Fの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスの脾臓細胞は天然E7蛋白でインビトロで活性化されたときにγ−IFNを多量に生産する。
【０１８０】
実施例1.2
フロインドの不完全アジュバンド（AIF）存在下でのE7Δ21-26蛋白の免疫活性
AIFの存在下でのE7Δ21-26調整物の免疫活性（液性）をチャールズリバーから購入した6週齢のC57BL/6（H-2b）雌マウスで研究した。
【０１８１】
A.  原料と方法
0日に6匹のマウスで群に0.2ml（50μg）のAIFエマルションを1μgのネズミGM-CSFと、1.5μgのネズミIL-2の存在下で筋肉注射し、ブースター注射は5μgのAlFを21日と60日に与えた。最初の注射前-2日と最後の免疫から12日後に血液サンプルを眼窩後部の所で各マウスから採取した。
6匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
3匹のマウスには100μgの調整物を与えて、注射後7日間、疾患徴候の有無を調べた。
調整物中に毒性がないことは臨床的徴候（挙動、毛、重量）がないことと剖検後の解剖で確認した。
【０１８２】
B.  結果
AlPの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。
100μgの調整物で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる疾患徴候も示さない。
マウスのどれも、注射後いる7つの日中の間に、いかなる疾患徴候も示さない。
免疫応答は下記のようにして測定した：
【０１８３】
1.  液性応答
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図５］
AIFの存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を示す。
【０１８４】
この抗体の中和活性を以下の免疫抑制テストを用いて測定する。-2日および72日に採取した血清の1/50希釈液を50ng/mlの天然E7と一緒に2時間培養する。この希釈液をγIFNで予め16時間処理したヒト  マクロファージに塗る。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、生産されたα-TNFの量をELISAテスト（DTA5O DuoSet（Ｒ＆Ｄ））で測定する。中和した血清はE7蛋白がα-TNFの発現を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのサイトカインの合成を許す。
結果は中和％で示した。
［図６］
AIFの存在下でE7Δ21-26調整物で誘導される抗体は極めて高い中和能を有する。
【０１８５】
実施例1.3
フロインドの不完全アジュバンド（AIF）の存在下でキトサン・ナノパーティクル中に埋込んだE7Δ21-26蛋白の免疫活性
AIFの存在下でのキトサン・ナノパーティクル中に包埋されたE7Δ2l-26調整物の免疫（液性）活性をチャールズリバーから購入した6週齢のC57BL/6（H−2b）雌マウスで研究した。
【０１８６】
A.  原料と方法
0日に6匹のマウスで群に0.2ml（50μg）のAIFエマルションを1μgのネズミGM-CSFと、1.5μgのネズミIL-2の存在下で筋肉注射し、ブースター注射は5μgのAlFを21日と60日に与えた。
最初の注射前-2日と最後の免疫から12日後に血液サンプルを眼窩後部の所で各マウスから採取した。
6匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
3匹のマウスには100μgの調整物を与えて、注射後7日間、疾患徴候の有無を調べた。
調整物中に毒性がないことは臨床的徴候（挙動、毛、重量）がないことと剖検後の解剖で確認した。
【０１８７】
B.  結果
AlPの存在下でキトサン・ナノパーティクル中に包埋されたE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。
100μgの調整物で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる疾患徴候も示さない。
マウスのどれも、注射後いる7つの日中の間に、いかなる疾患徴候も示さない。
免疫応答は下記のようにして測定した：
【０１８８】
1.  液性応答
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図７］
AIFの存在下でキトサン・ナノパーティクル中に埋込んだE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を有する。
この抗体の中和活性を以下の免疫抑制テストを用いて測定する。-2日および72日に採取した血清の1/50希釈液を50ng/mlの天然E7と一緒に2時間培養する。この希釈液をγIFNで予め16時間処理したヒト  マクロファージに塗る。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、生産されたα-TNFの量をELISAテスト（DTA5O DuoSet（Ｒ＆Ｄ））で測定する。中和した血清はE7蛋白がα-TNFの発現を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのサイトカインの合成を許す。
結果は中和％で示した。
［図８］
AIFの存在下でキトサン・ナノパーティクルに埋め込んだE7Δ21-26調整物で誘導される抗体は極めて高い中和能を有する。
【０１８９】
実施例2
全身性粘膜免疫応答
実施例2.1
IMS 1113（SEPPIC）の存在下でのE7Δ21-26蛋白の免疫活性
IMS 1113（SEPPIC）の存在下でのE7Δ21-26調整物の免疫（液性）活性をチャールズリバーから購入した6週齢のC57BL/6（H−2b）雌マウスで研究した。
【０１９０】
A.  原料と方法
0日に6匹のマウスで群に0.2ml（50μg）のAIFエマルションを1μgのネズミのGM-CSF と、1.5μgのネズミIL-2の存在下で50μgのE7Δ21-26を含む0.2mlの注射液んで筋肉注射し、20μgの同じ調整物を鼻腔経路で投与した。
7日、14日および21日にマウスには鼻腔経路で20μlすなわち20μgのIMS 1113調整物を与えた。
60日にマウスには5μgのIMS 1113調整物を含む0.2mlの注射液および20μgの同じ調整物を含む20μlを鼻腔経路で与えた。
最初の注射前-2日と最後の免疫から12日後に血液サンプルを眼窩後部の所で各マウスから採取し、膣分泌物サンプルを各マウスから採取した。
6匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
3匹のマウスには100μgの調整物を与えて、注射後7日間、疾患徴候の有無を調べた。
調整物中に毒性がないことは臨床的徴候（挙動、毛、重量）がないことと剖検後の解剖で確認した。
【０１９１】
B.  結果
IMS 1113の存在下でＥ7Δ21-26調整物で免疫化されたマウスは臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。
100μgの調整物で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる疾患徴候も示さない。
免疫応答は下記のようにして測定した：
【０１９２】
1.  液性応答
1.1  血清中でのGアイソタイプ抗体の生産
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図９］
IMS 1113の存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を有する。
この抗体の中和活性を以下の免疫抑制テストを用いて測定する。-2日および72日に採取した血清の1/50希釈液を50ng/mlの天然E7と一緒に2時間培養する。この希釈液をγIFNで予め16時間処理したヒト  マクロファージに塗る。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、生産されたα-TNFの量をELISAテスト（DTA5O DuoSet（Ｒ＆Ｄ））で測定する。中和した血清はE7蛋白がα-TNFの発現を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのサイトカインの合成を許す。
結果は中和％で示した。
［図１０］
【０１９３】
1.2  膣分泌物のアイソタイプA抗体の生産
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図１１］
IMS 1113の存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を有する。
IMS 1113の存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgＡタイプの抗体価を有する。
【０１９４】
実施例2.2
AIF（全身経路）の存在下またはPBS（鼻の経路）の存在下でのキトサン中に埋込んだE7Δ21-26蛋白の免疫活性
キトサン中に埋込んだE7Δ2l-26調整物の免疫（液性）活性をチャールズリバーから購入した6週齢のC57BL/6（H−2b）雌マウスで研究した。
【０１９５】
A.  原料と方法
0日に6匹のマウスで群に1μgのネズミのGM-CSF と、1.5μgのネズミIL-2を含む0.2ml（50μg）のAIFの存在下で50μgのキトサンに埋め込んだE7Δ21-26を含む0.2mlの注射液を筋肉注射し、1μgのネズミのGM-CSF と、1.5μgのネズミIL-2を加えたPBSの存在下で20μgの同じ調整物を鼻腔経路で投与した。
7日、14日および21日にマウスには鼻腔経路で20μlすなわち20μgのキトサンに埋め込んだE7Δ21-26を与えた。
最初の注射前-2日と最後の免疫から12日後に血液サンプルを眼窩後部の所で各マウスから採取し、膣分泌物サンプルを各マウスから採取した。
6匹の対照マウスには免疫原を含まない同じ調整物を与えた。
3匹のマウスには100μgの調整物を与えて、注射後7日間、疾患徴候の有無を調べた。
調整物中に毒性がないことは臨床的徴候（挙動、毛、重量）がないことと剖検後の解剖で確認した。
【０１９６】
B.  結果
キトサン中に埋込んだE7Δ2l-26調整物で免疫化されたマウスは臨床徴候がなく、解剖学的な変化も示さない。
100μgの調整物で免疫化した3匹のマウスは注射後7日間いかなる疾患徴候も示さない。
【０１９７】
免疫応答は下記のようにして測定した：
1.  液性応答1.1
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図１２］
キトサン中に埋込んだE7Δ2l-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を有する。
この抗体の中和活性を以下の免疫抑制テストを用いて測定する。-2日および72日に採取した血清の1/50希釈液を50ng/mlの天然E7と一緒に2時間培養する。この希釈液をγIFNで予め16時間処理したヒト  マクロファージに塗る。24時間培養した後、培養上澄みを回収し、生産されたα-TNFの量をELISAテスト（DTA5O DuoSet（Ｒ＆Ｄ））で測定する。中和した血清はE7蛋白がα-TNFの発現を誘発するのを防止し、中和していない血清はこのサイトカインの合成を許す。
結果は中和％で示した。
［図１３］
【０１９８】
1.2  膣分泌物のアイソタイプA抗体の生産
天然E7の組換え蛋白に対するIgGタイプの抗体の血清中の存在をエリザ（ELISA）で測定し、抗体価で示した（0.3以上の光学濃度を与える希釈度の逆数）。
［図１４］
IMS 1113の存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgGタイプの抗体価を有する。
IMS 1113の存在下でE7Δ21-26調整物で免疫化したマウスは極めて高い抗E7IgＡタイプの抗体価を有する。
［図14］
キトサン中に埋込んだE7Δ2l-26で免疫化されたウスは極めて高い抗E7IgAタイプ抗体価を有する。
【０１９９】
実施例3
抗腫瘍保護応答
実施例3.1
ACFの存在下、次いでAIFの存在下でE7AΔ21-26蛋白を注射すると腫瘍抵抗性が生まれる
ACFの存在下、次いでAIFの存在下（実施例1.1）でE7AΔ21-26調整物で免疫化したマウスの抗腫瘍応答性をいかのようにして測定した。
最後の免疫から12日後に側腹部の皮下経路（sc）でマウスに500,000個のC3細胞を注射した。このC3細胞はC57BL/６起源の胚細胞で、完全なＨＰＶ-16ゲノムとラス癌遺伝子オンコジーンでトランスホームしたものである。腫瘍の成長は週に一度、腫瘍表面を測定して評価した。
［図15］
【０２００】
アジュバントだけで処理した対照マウスには全て腫瘍が成長した。ACFの存在下、次にAIFの存在下でE7AΔ21-26調整物で免疫化した6匹のマウスの中で、
4匹のマウスには腫瘍は全くなかった。
1匹のマウスでは腫瘍が成長し、安定した。
1匹のマウスでは腫瘍が成長した。
ACFおよびAIFの存在下ではE7AΔ21-26はタイプ16のヒトパピロマウイルス（Papillomavirus）により誘導される腫瘍を防ぐ特殊な免疫応答特性を生じる。
【０２０１】
実施例４
治療的抗腫瘍応答
予め生じさせたC3腫瘍に対するA1F存在下でのE7Δ21-26の拒否反応を誘発する能力をC57BL16（H-2b）マウスでテストした。
実施例4.1
治療モデルの調整
【０２０２】
Ａ．  原料と方法
マウス（8群）に異なる数（0；5.102；5.1O3 5.1O4と5.105）のC3細胞をs.c.で側腹部に注射した。腫瘍の成長は週に一度、腫瘍表面を測定して評価した。
【０２０３】
結果
【表１】
2005532298.tif 000004
【０２０４】
5.1O5の細胞を与えたマウスは細胞注射後12日で全て（8/8）腫瘍が成長した。
5.1O4の細胞を与えたマウスの中では、8匹中4匹のマウスに細胞注射後、21日までに腫瘍が成長した。
5. 1O3の細胞を与えたマウスの中では、8匹中１匹のマウスに細胞注射後、35日までに腫瘍が成長し、8匹中３匹のマウスに細胞注射後、42〜60日までに腫瘍が成長した。残りのマウスはいかなる腫瘍も示さなかった。
5.1O2の細胞を与えたマウスの中では、8匹中１匹のマウスに細胞注射後、35日までに腫瘍が成長した。残りのマウスはいかなる腫瘍も示さなかった。
【０２０５】
実施例4.2
E7蛋白を発現するC3細胞を7.1O3および9.1O3の量で投与したマウスの抗腫瘍応答
Ａ．  原料と方法
最初（０日）にマウスにs.c.で側腹部に7,000または9,000個のC3細胞を注射した。2日、9日、16日および23日にマウスはAIFと1μgのGM-CSFとネズミの1L2を含む10μgのE７Δ21-26調整物を筋肉注射した。9日、16日、23日および60日にマウスにAIF中に10μgのE７Δ21-26調整物を含む注射液を筋肉注射した。実施例4.1に記載と同様にして腫瘍の寸法を週に２回正確に計った。
【０２０６】
B.  結果
［図16］および［図17］は得られた結果を示す。
対照マウスはC3細胞の注射の後10〜20日で全く腫瘍（8/8）が成長した。一方、免疫したマウスは80％（7,000個の細胞を注射−［図16］）および75％（9,000個の細胞を注射−［図17］）に腫瘍の成長がなかった。
【０２０７】
実施例5
E7Δ21-26突然変異したE7蛋白で予め処理した樹状細胞でのリンパ球混合反応刺激
一方向性自己混合リンパ球反応は共晩用した個体の単核化細胞（エフェクタ細胞または応答細胞）とその抗原支持樹状細胞（刺激細胞）とから成る。刺激細胞に支持された抗原特異的レセプタを有するエフェクタ細胞が増殖する。この増殖はトリチウムチミジン取込みテストで測定される。
樹状細胞はドナーの抹消血液からのPBMCからエラトリエーションして得られる単核細胞の分化で開始される(下記文献)。
【非特許文献３８】Sallusto et al., Journal of Experimental Medicine, 1994, 179, 1109-18
【０２０８】
2.5.106 細胞/mlの単核細胞をSAB（10％）、GMC-SF（50ng/ml）および1L4（1,000単位/mI）が豊富なRPMI 1640のテフロン（登録商標）袋中で培養した。6日間培養した後にこの細胞には分化した樹状細胞の表現型が認められた。
【０２０９】
得られた樹状細胞を3μg/m1の投天然P7またはE7Δ21-26および／または培地で処理した後、丸底の96ウエルのプレート上で同じドナーのPBMC（比率： 1/10；3/10および10/10）で共培養した。反応終了より18時間前に0,5μCiのトリチウムチミジン/ウエルを加えた。結果（ストローク／分）は［図18］に示してある。
樹状細胞を天然E7蛋白と予備培養し、応答細胞と一緒に培養すると増殖は観測されない（天然E7蛋白の免疫抑制活性のため）。樹状細胞を突然変異したE7蛋白と一緒に培養すると刺激的増殖が観測される（天然蛋白の免疫抑制活性が不足するため）。
【０２１０】
実施例6
突然変異したE7蛋白の免疫抑制活性喪失
インビトロでの免疫抑制活性喪失を細胞増殖テストを用いて測定した。ヒト抹消血液の単核化した細胞を分離し、3μg/m1の各種天然P7蛋白、その突然変異種、または、MP Kienyから提供されたE7 ＨＰＶ16（Δ21-25）ワクチン倍地の上澄み（SN）、トランスジエン（Transgene）およびブースタ抗原（PPD＋TT）の存在下で150,000細胞/ウエルの割合で丸底ウエルで培養した。細胞培養は5％のCO2を含む湿った雰囲気中で37℃で6日間連続して行った。細胞増殖はトリチウムチミジン取込みテストで測定した。結果（ストローク／分）は［表２］にまとめて示してある。
【０２１１】
【表２】
2005532298.tif 000005
【０２１２】
得られた結果は突然変異によって無毒化されることを示している（天然蛋白の免疫抑制活性の喪失）。
【０２１３】
引用文献
1)  AUSTJBEL F M, Brent R. Kingstone Re, Moore DD, Seidaman JO, Smith JA Struhi K editors, (1989),Current protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
2)  AUCOU1'URIER et al., 2001, Vaccine, 19: 2666-2672
3)  BARAS et al., 1999, Infect. Immun., 67: 2643-2648
4)  BASAK et al., 1995, J. Pept. Sci., 1(6): 3 83-395
5)  CHEN et al., 1987, Mol. Cell. Biol. Vol. 7: 2745-2752
6)  CRUZ , I. et al., 1999, Br. J. Cancer, vol. 81; 881-889
7)  De SIvIEDT, T., B. Pajak, E. Muraille, L. Lespagnard, B. Heinen, P. De Baetselier, J. Urbain, 0.Leo andM.Moser. 1996.  Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo.J.Exp.Med. 184:1413-1424
8)  EL SHERIF AM et al., 2001, J. Pathol, 195(2):179-185
9)  FRANKEL et al., 1988, Cell, vol. 55
【０２１４】
10)  FELTKA1vIIP, M.C., H.L. Smits, M.P. Vierboom, R.P. Minnaar, B.M. de Jongh, J.W. Drijfhout, S. ter Schegget, C.J. Melief and W.M. Kast. 1993.  Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16- transformed cells.
Bum. J. Immunol. 23 :2242-2249
11)  FRALEY 1980, J. Biol. Chem., vol.255:10431
12)  FLOTTE et al., 1992, Am. J. Respir. cell Mol. Biol., vol. 7: 349-356
13)  GAIT (ed.), 1984, Nucleic acid hybridization
14)  GERARD CM, 2001, Vaccine, vol. 19: 2583-2589
15)  GIANNINIetaI., 1998, Clin. EXPJmmunol, 113(2): 183-189
16)  GIANNThII ET al., 2002, mt. J. CANCER, 97(5): 654-65 9
17)  GOPAL 1985, Mol. Cell. Biol., vol. 5:1188-1190
18)  GLOVER (ed.), 1985, DNA Cloning: A practical approach, vol. I and IT. Oligonuclotide synthesis, MRL Press, Ltd, Oxford, U.K.
19)  GRAHAM et al., 1973, Virology, vol. 52: 456-457
【０２１５】
20)  HOUBEN WEYL, 1974, In Methode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volumes 15-I et 15-11, Thieme, Stuttgart
21)  HI.JYGEN et al., 1996, Nature Medicine, vol. 2 (8):893-898
22)  HARLAND et al. , 1985, S. Cell. Biol. vol. 101:1094-1095
23)  KIIEFERIH. et al., 1996, Biochemistry, vol. 35(50):16077-16084
24)  MCLAUGHLIN B A et al. , 1996, Am. J. Hum. Genet, vol. 59:561-569
25)  ERRIFIELD RB, 1965a, Nature, vol. 207(996):522-523
26)  MERRIFIELD, 1 965b, Science, vol. 150(693): 178-185
27)  MLJDERSPACH L. et al., 2000, Clinical Cancer Research, vol. 6:
3406-3416
28)  NICOLAU et al., 1987, Methods enzymol., vol. 149:157-176
29)  OSEN W et al., 2001, Vaccine, vol. 19: 4276-4286
【０２１６】
30)  POTTER et al., 1984, Proc. Nati. Acad. sci. USA, vol. 81 (22):7161-7165
31)  TUCKER J., GRISSHAMMER R., Biochem J., 1996, vol., 317(Pt3):891-899
32)  SAMBROOK S FRTTSCH B F et MANIATIS T, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor , New York 
33)  SAMULSKI et al. 1989, S. Virol. ,vol. 63:3 822-3828
34)  SCHOELL W M 5, 1999, Gynecologic Oncology, vol. 74: 448-45 5
35)  SEEDORF K, 1985, Virology, vol. 145 (l):181-185
36)  SKAUGRUD et al. 1999, Bioteclmol. Genet. Eng. Rev., 23-40
37)  TACSON et al., 1996, Nature Medicine, vol. 2 (8):888-892
38)  TUR-KASPA, 1986, Mol. Cell. Biol., vol. 6:716-718
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後のマウスの血清抗E7IgG抗体価のグラフ。
【図２】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG抗体の中和化率のグラフ。
【図３】天然マウスおよびE7蛋白の存在下で培養したE7ΔAΔ21-26調整物で免疫化されたマウスの脾細胞Ip増殖指数のグラフ。
【図４】天然マウスおよびE7蛋白の存在下で培養したE7ΔAΔ21-26調整物で免疫化されたマウスの脾細胞γ-IFN率のグラフ。
【図５】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図６】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図７】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図８】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図９】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図１０】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図１１】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウスの膣分泌物中に存在するIgAの割合を示すグラフ。
【図１２】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図１３】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウス血清抗E7IgG価とマウス血清抗E7 IgG抗体の中和率のグラフ。
【図１４】E7ΔΔ21-26調整物で免疫化する前および後でのマウスの膣分泌物中に存在するIgAの割合を示すグラフ。
【図１５】図15は、マウスに注射されるC3細胞の腫瘍成長を示しているグラフであるEThΔ21-26調整物については免疫化したかどうか；
【図１６】HPV-16 E7を発現している7×103のC3細胞を入れたマウスのC3腫瘍の成長を示すグラフで、［図16A］は対照マウスを表し、［図16B］はE7ΔΔ21-26調整物で処理したマウスを表し、横軸はC3細胞注射後日数を表し、縦座標は腫瘍の表面を表す。
【図１７】HPV-16 E7を発現している9×103のC3細胞を入れたマウスのC3腫瘍の成長を示すグラフ。
【図１８】対照の樹状細胞（菱形）と、天然E7蛋白（円）またはびE7ΔΔ21-26調整物（ハッチ正方形）で予め処理したものによって刺激したエフェクタの単核細胞の増殖レベルによって測定される混合リンパ球反応レベルを示すグラフ。縦座標は[3H]チミジンを取り込んで視覚化したエフェクタ単核細胞の増殖率、横軸は刺激細胞数（樹状細胞）とエフェクタ細胞数（Ｔ細胞）の比を表す。
【０２１８】
配列表
2005532298.tif 000006
2005532298.tif 000007
【配列表】
2005532298.tif 000008
2005532298.tif 000009
【図１】
2005532298.tif 000010
【図２】
2005532298.tif 000011
【図３】
2005532298.tif 000012
【図４】
2005532298.tif 000013
【図５】
2005532298.tif 000014
【図６】
2005532298.tif 000015
【図７】
2005532298.tif 000016
【図８】
2005532298.tif 000017
【図９】
2005532298.tif 000018
【図１０】
2005532298.tif 000019
【図１１】
2005532298.tif 000020
【図１２】
2005532298.tif 000021
【図１３】
2005532298.tif 000022
【図１４】
2005532298.tif 000023
【図１５】
2005532298.tif 000024
【図１６Ａ】
2005532298.tif 000025
【図１６Ｂ】
2005532298.tif 000026
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2005532298.tif 000028
【図１８】
2005532298.tif 000029
【国際調査報告】
2005532298.tif 000030
2005532298.tif 000031
2005532298.tif 000032
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