(57)【要約】  本発明は、代謝研究の分野に関する。肥満症などの代謝疾患は、深刻かつ広範な公衆衛生問題である。同定されているＧＺＩＰポリペプチドは、代謝疾患の治療に有益であると考えられる。これらの化合物は、体重を減らすのに、および代謝関連疾患および障害を治療するのに有効であるはずである。これらの代謝関連疾患および障害としては、高脂質血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および高血圧症が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において循環遊離脂肪酸レベルを下げる方法であって、担体と、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸を含むポリペプチド配列とを含む組成物を前記個体に投与することからなる方法。
【請求項２】
前記方法がさらに体重を減らす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
完全長ＧＺＩＰポリペプチドの単離されたポリペプチド断片であって、前記ポリペプチド断片の配列が、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸からなる断片。
【請求項４】
担体と、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、もしくは１８〜２４７位の連続するアミノ酸を含むポリペプチド断片配列とからなる組成物。
【請求項５】
配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその補体。
【請求項６】
担体と、請求項５に記載の単離ポリヌクレオチドとからなる組成物。
【請求項７】
配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸をコードする単離ポリヌクレオチド配列からなるベクター。
【請求項８】
担体と、請求項７に記載のベクターとを含む組成物。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターからなる形質転換宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝研究の分野、特に体重を減らすのに有効であり、かつ代謝関連疾患および障害を治療するのに有用である、化合物の発見に関する。本発明の方法によって治療されると考えられる代謝関連疾患または障害としては、限定されないが、高脂質血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および高血圧症が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、本発明の理解を助けることを意図するものであり、本発明に対して従来技術であることを意図するものでもないし、認めるものでもない。
【０００３】
肥満症は、深刻であり、広範な、かつ増加しつつある公衆衛生問題である。米国では、人口の２０％が肥満であり、欧州では、それよりわずかに低い割合が肥満である (Friedman (2000) Nature 404: 632-634)。肥満症は、高血圧症、循環器疾患、糖尿病および癌ならびに呼吸器合併症および変形性関節症のリスクの増大と関連する(Kopelman (2000) Nature 404: 635-643)。少し体重を減らすだけでも、これらの関連する病状が改善される。
【０００４】
環境、食事、年齢および運動を含む生活習慣因子が肥満症において役割を果たすことは今もなお認められているが、双生児研究、家族集積性の分析および養子研究すべてから、肥満症は大部分、遺伝因子によるところが大きい(Barsh et al (2000) Nature 404: 644-651)。ますます多くの代謝関連遺伝子が同定されているという事実が、これらの研究と一致している。さらに広範に研究されている遺伝子の一部としては、レプチン（ｏｂ）およびその受容体（ｄｂ）、プロオピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）、メラノコルチン−４−受容体（Ｍｃ４ｒ）、アグーチタンパク質（Ａy）、カルボキシペプチダーゼＥ（ｆａｔ）、５−ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ（Ｈｔｒ２ｃ）、ｎｅｓｃｉｅｎｔベースのヘリックス・ループ・ヘリックス２（Ｎｈｌｈ２)、プロホルモンコンバターゼ１(ＰＣＳＫ１)、およびｔｕｂｂｙタンパク質(ｔｕｂｂｙ)をコードする遺伝子が挙げられる (rev'd in Barsh et al (2000) Nature 404: 644-651)。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、ＧＥＮＳＥＴＺＡＧ相互作用タンパク質(ＧＺＩＰ)に基づく。本発明は、ＧＺＩＰポリペプチドおよび生物活性を有するその断片をコードする、ＧＺＩＰポリヌクレオチドおよびその断片を包含する。本発明は、前記ＧＺＩＰポリペプチドおよびその断片もまた包含する。ＧＺＩＰ生物活性ポリペプチド断片は、ＡＰＭ１結合部位（ＡＢＳ）のすべてまたは一部を含むことが好ましい。ＡＢＳのすべてまたは一部を含有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ相同性領域（ｇＡＰＭ１）と結合する。ヒトおよび他の動物における体重減少、体重増加の予防および血中グルコースレベルの制御に対する有用性を含む、本明細書に述べられるそれらの増加した生物活性の点から、生物活性ＧＺＩＰポリペプチドは単独で、またはｇＡＰＭ１ポリペプチドと組み合わせて、インビトロおよびインビボでの予想外の効果を有する。さらに詳細には、ＧＺＩＰポリペプチドとｇＡＰＭ１ポリペプチドとの組み合わせでの生物活性は、この２種類のポリペプチド単独で期待される効果よりも大きな効果を有する。これらの効果には、エピネフリンの投与、「イントラリピッド（intralipid）」の静脈内注射、または高脂肪試験食の投与によって生じる高い遊離脂肪酸レベルの減少、ならびに筋細胞における脂肪酸酸化の増加、グルコースレベルの減少、エネルギー消費の調節、インスリンに対する抵抗性および高脂肪／高ショ糖食を摂取する哺乳動物における体重減少が含まれる。
【０００６】
ＧＺＩＰは、ＨＬＡクラスＩ重鎖との相同性を有する４２ｋＤａ糖タンパク質である。ＧＺＩＰのゲノム構造は、ＨＬＡクラスＩ重鎖の構造と類似しており、Ｚｎ−α２糖タンパク質（ＺＡＧ）ポリペプチドのドメイン構造を反映する。ＧＺＩＰポリペプチドは、ドメイン構造：（シグナルペプチド）−（α１ドメイン）−（α２ドメイン）−（α３ドメイン）を有する。ＧＺＩＰのα１およびα２ドメインは、脂肪酸に対する結合溝を確立する。ＧＺＩＰのα３ドメインは、ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ相同性領域（ｇＡＰＭ１）に対する結合部位を含有する。このＡＰＭ１結合部位（ＡＢＳ）は、ベイト（bait）としてｇＡＰＭ１を用いた２ハイブリッドスクリーニングアッセイにおいて、プレイ（prey）として取り出される重複ＧＺＩＰ ｃＤＮＡクローンによって表された（実施例１５参照）。これらの結果に基づいて、ＧＺＩＰは直接または間接的に、２つのシグナル（たった１つだけでなく）をその標的細胞に送達し、例えば一方は結合した脂肪酸を介して送達され、もう一方は結合したｇＡＰＭ１を介して送達されると考えられる。ＧＺＩＰポリペプチドまたはポリペプチド断片およびＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片は共に合わせて、個々のポリペプチドまたはポリペプチド断片のみによって示される効果に基づいて予想外の生物学的効果を有する。
【０００７】
このように、本発明は、ＧＺＩＰポリペプチド、多量体（例えば、ヘテロ多量体またはホモ多量体）をインビトロもしくはインビボで形成するＧＺＩＰポリペプチド、前記ＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＧＺＩＰポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ＧＺＩＰポリヌクレオチドの細胞組換え体に、ならびに前記ＧＺＩＰポリペプチドを含む薬学的かつ生理学的に許容される組成物、および体重を減らすため、または代謝関連疾患および障害を治療するために前記薬学的かつ生理学的に許容されるＧＺＩＰ組成物を投与する方法に関する。代謝関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのアッセイもまた、本発明の一部である。
【０００８】
第１の態様において、本発明は、脂質分配（lipid partitioning）、脂質代謝、およびインスリン様活性を有する精製、単離、または組換えＧＺＩＰポリペプチドを特徴とする。好ましいＧＺＩＰポリペプチド断片は、完全長ＧＺＩＰポリペプチドと同じまたはそれよりも高い活性を有し、前記活性は、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性からなる群からも選択される。
【０００９】
好ましい実施形態において、前記ポリペプチド断片は、配列番号：２の、少なくとも６個から２９８個以下の連続するアミノ酸、または配列番号：３の少なくとも６個から２９５個以下の連続するアミノ酸を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００１０】
他の好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、１８０〜２５１、１９２〜２５１、２０４〜２５１、２２１〜２５１、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。
【００１１】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１７７〜２４８、１８９〜２４８、２０１〜２４８、２１８〜２４８、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。
【００１２】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。
【００１３】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。
【００１４】
他のさらに好ましい実施形態において、前記ポリペプチド断片は、配列番号：２または３における同定されたポリペプチド配列の相当する連続するアミノ酸と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明はさらに：（ａ）配列番号：２または３の完全長ＧＺＩＰポリペプチド；（ｂ）Ｎ末端のＭｅｔが存在しない、配列番号：２または３の完全長ＧＺＩＰポリペプチド；（ｃ）シグナルペプチドを欠く、配列番号：２または３の成熟ＧＺＩＰポリペプチド；（ｄ）配列番号：２または３のＧＺＩＰポリペプチドであって、配列番号：２または３それぞれの、６〜２９８または２９５（完全長）のうちのいずれか１つの整数個の長さであるＧＺＩＰポリペプチド；（ｅ）配列番号：２または３のＧＺＩＰポリペプチドの、エピトープ保有断片；（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異ポリペプチド；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、からなる、またはから本質的になる、精製または単離ポリペプチドを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、生物活性を有する、または生物機能性ドメイン（１つまたは複数）を含む断片など、上記の（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドの断片を提供する。
【００１７】
他の非常に好ましい実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチドは、ＡＰＭ１結合部位の一部または全部で構成される精製、単離、または組換えＧＺＩＰ断片を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００１８】
前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の２１５〜２４８位のアミノ酸の少なくとも６個の連続するアミノ酸、または配列番号：３の２１２〜２４５位のアミノ酸の少なくとも６個の連続するアミノ酸を含む、から本質的になる、またはからなることが好ましい。
【００１９】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、１８０〜２５１、１９２〜２５１、２０４〜２５１、２２１〜２５１、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。
【００２０】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１７７〜２４８、１８９〜２４８、２０１〜２４８、２１８〜２４８、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。
【００２１】
他の好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２のおよそ１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。
【００２２】
他の好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。一方、前記ＧＺＩＰ断片は、配列番号：２の２１〜２５０位の相当するアミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、または配列番号：３の１８〜２４７位の相当するアミノ酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【００２３】
関連する実施形態において、本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、ＡＰＭ１ポリペプチドと結合することができる。前記ＡＰＭ１ポリペプチドは、配列番号：４の少なくとも６個から２４４個以下の連続するアミノ酸を含む、から本質的になる、またはからなることが好ましい。
【００２４】
さらに好ましくは、本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、本明細書において「ｇＡＰＭ１」と呼ばれる、ＡＰＭ１ポリペプチドの球状Ｃｌｑ相同性領域と結合することができる。
【００２５】
他の好ましい実施形態では、ＧＺＩＰと結合することができるＡＰＭ１ポリペプチド断片は、配列番号：４の１８〜２４４、９３〜２４４、１０１〜２４４、１０８〜２４４位のアミノ酸から選択される。ＡＰＭ１およびｇＡＰＭ１ポリペプチド、およびその断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５に記述されている。
【００２６】
さらに好ましい実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチドは：（ｉ）遊離脂肪酸、（ｉｉ）グルコース、または（ｉｉｉ）トリグリセリドの循環（血中、血清中または血漿中）レベル（濃度）を下げることができる。遊離脂肪酸レベルを下げる活性、グルコースレベルを下げる活性、またはトリグリセリドレベルを下げる活性を示す、本発明のさらに好ましいポリペプチドは、同じモル濃度で完全長ＧＺＩＰポリペプチドと同じまたはそれより高い活性を有し、同じ一過性活性およびそれより高い一過性活性を有するか、または持続活性を有する。
【００２７】
さらに好ましい実施形態では、生物活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、（ｉ）遊離脂肪酸、（ｉｉ）グルコース、または（ｉｉｉ）トリグリセリドの循環（血中、血清中または血漿中）レベル（濃度）を下げることができ、ＡＰＭ１ポリペプチド断片と組み合わせて用いられる前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、ＧＺＩＰポリペプチド断片またはＡＰＭ１ポリペプチド断片を単独で含む組成物の予想される効果よりも高い生物学的効果（例えば、遊離脂肪酸レベルを下げる活性）を生じる。前記ＡＰＭ１断片は、Ｃｌｑ相同性領域の全部または一部を含有することが好ましい。
【００２８】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化を有意に促進するポリペプチドである。さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化を有意に促進するポリペプチドである。
【００２９】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、前記ポリペプチドの存在下にて分化されたＣ２Ｃ１２細胞に、未処理細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、または４０％を超えるオレイン酸エステル（oleate)の酸化を生じさせるポリペプチドである。
【００３０】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、肝細胞系（好ましくは、ＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１７））におけるレプチンの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３１】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、高脂肪食が原因の、食後の血漿遊離脂肪酸の増加を有意に低減するポリペプチドである。
【００３２】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、高脂肪食の結果として、ケトンの体内産生を有意に低減するか、または無くすポリペプチドである。
【００３３】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、骨格筋細胞におけるグルコースの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３４】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３５】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、神経細胞におけるグルコースの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３６】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、赤血球におけるグルコースの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３７】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、脳におけるグルコースの取り込みを増加させるポリペプチドである。
【００３８】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、食事の後、特に高糖質食後の血漿グルコースの食後増加を有意に低減するポリペプチドである。
【００３９】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、食事の後、特に高脂肪食または高糖質食後の血漿グルコースの食後増加を有意に防ぐポリペプチドである。
【００４０】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、インスリン感受性を高めるポリペプチドである。
【００４１】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチド断片は、耐糖能障害からインスリン抵抗性への進行を阻害するポリペプチドである。
【００４２】
さらに好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、インビトロまたはインビボで多量体（例えば、ヘテロ多量体またはホモ多量体）を形成するポリペプチドである。好ましい多量体はホモ二量体またはホモ三量体である。他の好ましい多量体は、少なくとも４、６、８、９、１０または１２個のＧＺＩＰポリペプチドサブユニットを含むホモ多量体である。他の好ましい多量体は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドを含むヘテロ多量体である。さらに他の好ましい多量体は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドおよびＡＰＭ１ポリペプチドを含むヘテロ多量体である。
【００４３】
さらに好ましい実施形態は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの１つを含む、異種ポリペプチドを包含する。
【００４４】
第２の態様において、本発明は、本明細書に記載の前記ＧＺＩＰポリペプチドをコードする、精製、単離、または組換えポリヌクレオチド、またはその補体（complement）を特徴とする。本発明のさらに好ましい実施形態は、哺乳動物ゲノム配列、遺伝子、またはその断片を含む、またはからなる組換え、精製または単離ポリヌクレオチドである。一態様において、その配列は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物に由来する。
【００４５】
好ましい態様において、ゲノム配列は、配列番号：１に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか１つの、少なくとも１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、または１６００ヌクレオチドの隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチド、あるいはその補体を含み、前記隣接スパンは、配列番号：１のＣｌｑ相同性領域の相当するヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、一本鎖、および二本鎖である。
【００４６】
第３の態様において、本発明は、第２の態様に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、から本質的になる、またはからなる、組換えベクターを特徴とする。
【００４７】
第４の態様において、本発明は、第３の態様に記載の前記組換えベクターを含む、から本質的になる、またはからなる、組換え細胞を特徴とする。さらなる実施形態は、本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞組換え体を包含する。
【００４８】
第５の態様において、本発明は、本明細書に記載される前記ＧＺＩＰポリペプチド、および、二者択一的に薬学的または生理学的に許容される賦形剤を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。関連する実施形態において、本発明は、本明細書に記載の前記ＧＺＩＰポリペプチド、本明細書に記載の前記ＡＰＭ１ポリペプチド、代わりに、薬学的または生理学的に許容される賦形剤を含む、から本質的になる、またはからなる、薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。
【００４９】
第６の態様において、本発明は、体重を減らす、体脂肪量を下げる、または除脂肪筋肉を増加させる方法であって、体重を減らす必要のある個体に、本明細書に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を提供または投与することを含む方法を特徴とする。
【００５０】
好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で処置される、体重を減らす、体脂肪量を下げる、または除脂肪筋肉を増加させる必要がある前記個体の同定は、前記個体由来の臨床試料におけるＧＺＩＰ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。
【００５１】
他の好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で処置される、体重を減らす必要がある前記個体の同定は、前記個体由来の臨床試料におけるＧＺＩＰ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型判定し、ＡＰＭ１ ＳＮＰを遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰおよびＡＰＭ１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。前記臨床試料は、血漿、尿、および唾液からなる群から選択されることが好ましい。好ましくは、本発明のＧＺＩＰポリペプチド断片が個体に投与され、健康な、非肥満の患者と比較して、完全長のいずれか１つまたはすべてのＧＺＩＰポリペプチドまたは自然にタンパク分解性切断されたＧＺＩＰ断片の血中、血清中または血漿中レベルが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減される。
【００５２】
第７の態様において、本発明は、代謝関連疾患または障害を予防または治療する方法であって、かかる治療が必要な個体に、本発明の前記薬学的または生理学的に許容される組成物を提供または投与することを含む方法を特徴とする。
【００５３】
好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で処置される、かかる治療が必要な前記個体の同定は、前記個体由来の臨床試料におけるＧＺＩＰ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。
【００５４】
その他の好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で処置される、かかる治療が必要な前記個体の同定は、ＧＺＩＰ ＳＮＰおよびＡＰＭ１ ＳＮＰを遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰポリペプチドおよびＡＰＭ１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群から選択されることが好ましい。前記代謝関連疾患または障害は、肥満症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病、およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法によって治療されるＩＩ型糖尿病に関連する合併症としては、微小血管障害（microangiopathic lesions）、眼球病変および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の代謝関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。好ましい実施形態において、前記個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００５５】
好ましい態様において、本発明の実施形態は、ＧＺＩＰポリペプチドを含む組成物を個体に提供または投与する工程を含む、個体において目的の生物学的応答を引き起こす、または誘導する方法であって、前記生物学的応答が：
（ａ）遊離脂肪酸の循環（血中、血清中または血漿中）レベル（濃度）を調節する応答であって、前記調節が好ましくは低下させることである応答；
（ｂ）グルコースの循環（血中、血清中または血漿中）レベル（濃度）を調節する応答であって、前記調節が好ましくは低下させることである応答；
（ｃ）トリグリセリドの循環（血中、血清中または血漿中）レベル（濃度）を調節する応答であって、前記調節が好ましくは低下させることである応答；
（ｄ）筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化を促進する応答；
（ｃ）肝臓または肝細胞におけるレプチンの取り込みを調節する応答であって、前記調節が好ましくは増加させることである応答；
（ｅ）高脂肪食が原因の血漿遊離脂肪酸の食後増加を調節する応答であって、前記調節が好ましくは減少させることである応答；
（ｆ）高脂肪食の結果としてケトンの体内産生を調節する応答であって、前記調節が好ましくは、減少または無くすことである応答；
（ｇ）インスリンに対する細胞または組織感受性、特に筋肉、脂肪、肝臓もしくは脳の感受性を増加させる応答；
（ｈ）耐糖能障害からインスリン抵抗性への進行を抑制する応答；からなる群から選択され、かつさらに、前記生物学的応答が、同じモル濃度でインスリンのみで引き起こされる、もしくは誘導される生物学的応答よりも有意に高い、または少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、１００％または５００％高い、方法を包含する。
【００５６】
さらに好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として用いることができる。本発明の実施形態はさらに、個体において目的の生物学的応答を引き起こす、または誘導する方法であって：本発明のＧＺＩＰポリペプチドおよび本発明のＡＰＭＩポリペプチドを含有する組成物を個体に提供または投与する工程を含む方法を包含する。
【００５７】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
【００５８】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて体重を制御する方法として用いることができる。
【００５９】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて体重を制御する方法として用いることができる。
【００６０】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、単独で、インスリン治療と組み合わせることなく、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
【００６１】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、単独で、インスリン治療と組み合わせることなく、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
【００６２】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、単独で、インスリン治療と組み合わせることなく、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて体重を制御する方法として用いることができる。
【００６３】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、単独で、インスリン治療と組み合わせることなく、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいて体重を制御する方法として用いることができる。
【００６４】
さらなる好ましい実施形態において、インスリン分泌促進薬（好ましくは、経口型）またはインスリン感受性改善薬（好ましくは経口型）と組み合わせて、患者の体重またはグルコース制御を改善するために、本発明をＮＩＤＤＭ患者の補足的治療で用いることができる。その経口用インスリン分泌促進薬は、１、１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）、またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジド（glidazide）から選択されるスルホニル尿素であることが好ましい。そのインスリン感受性改善薬は、メトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択されることが好ましい。
【００６５】
本発明はさらに、単独で、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬なしで、ＮＩＤＤＭ患者の体重またはグルコースの制御を改善する方法を提供する。
【００６６】
さらなる好ましい実施形態において、インスリン分泌促進薬（好ましくは、経口型）またはインスリン感受性改善薬（好ましくは経口型）と組み合わせて、患者の体重またはグルコース制御を改善するために、本発明をＩＤＤＭ患者の補足的治療に用いることができる。そのインスリン分泌促進薬は、１，１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）、またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジド（glidazide）から選択されるスルホニル尿素であることが好ましい。そのインスリン感受性改善薬は、メトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択されることが好ましい。
【００６７】
本発明は、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬なしで、単独で、ＩＤＤＭ患者の体重またはグルコース制御を改善する方法を提供する。
【００６８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、例えば同時に、別々に、もしくは逐次に使用される個々の投与量単位の形でインスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬と共に、付随的にまたは同時に投与される（分泌促進薬の前もしくは後、または感受性改善薬の前もしくは後）。したがって、本発明はさらに、第５の態様に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物の組成物と、ＮＩＤＤＭまたはＩＤＤＭ患者における体重またはグルコース制御の改善のために、同時に、別々に、または逐次に使用するための併用製剤（combined preparation）としてのインスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬とを提供する。
【００６９】
さらなる好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明はさらに、インスリン感受性改善薬として使用する方法を提供する。
【００７０】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用することができる。
【００７１】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用することができる。
【００７２】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療なしで、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を有する一部のヒトにおいてインスリン感受性を改善する方法として使用することができる。
【００７３】
第８の態様において、本発明は、本明細書に記載のＧＺＩＰポリペプチドを作製する方法であって、タンパク分解切断、組換え方法論および人工合成からなる群から選択される方法を特徴とする。
【００７４】
第９の態様において、本発明は、組換えＧＺＩＰポリペプチド断片または完全長ＧＺＩＰポリペプチドを作製する方法であって、その乳が前記組換えＧＺＩＰポリペプチド断片または完全長タンパク質を含有する、遺伝子導入、非ヒト哺乳動物を提供する工程と、前記非ヒト哺乳動物の乳から、前記組換えＧＺＩＰポリペプチド断片または前記完全長ＧＺＩＰポリペプチドを精製する工程とを含む方法を提供する。一実施形態において、前記非ヒト哺乳動物は、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、またはマウスである。他の実施形態では、その方法は、前記乳から組換え完全長ＧＺＩＰポリペプチドを精製する工程を含み、前記タンパク質をインビトロで切断して、目的のＧＺＩＰポリペプチド断片を得る工程をさらに含む。
【００７５】
第１０の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる、精製または単離された抗体を特徴とする。この実施形態の一態様において、その抗体は、配列番号：２または３に記載のポリペプチド配列の１つの配列の、少なくとも６個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、または少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチドに結合することができる。この実施形態の第２の態様において、その抗体は、配列番号：４に記載のポリペプチド配列の１つの配列の、少なくとも６個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、または少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むＡＰＭ１ポリペプチドに結合することができる。
【００７６】
第１１の態様において、本発明は、代謝関連疾患および障害の治療のための、あるいは体重を減少または増加させるための、本明細書に記載のポリペプチドの使用を特徴とする。前記代謝関連疾患および障害は、肥満症、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病、およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択されることが好ましい。本発明の方法によって治療されるＩＩ型糖尿病に関連する合併症としては、微小血管障害、眼球病変および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の代謝関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。好ましい実施形態において、前記個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。関連する実施形態において、本発明は、代謝関連疾患および障害の治療のための、あるいは体重を減少または増加させるための、本明細書に記載のポリペプチドの使用を特徴とし、本発明のポリペプチドのいずれも、前記治療のためのいずれかの組み合わせに包含または除外されることが可能である。
【００７７】
第１２の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の体を治療する方法において使用される、本明細書に記載のポリペプチドを提供する。関連する実施形態において、本発明は、ヒトまたは動物の体を治療する方法において使用される、本明細書に記載のポリペプチドを提供し、本発明のポリペプチドのいずれも、前記治療のためのいずれかの組み合わせに包含または除外されることが可能である。
【００７８】
第１３の態様では、本発明は、本発明の前記薬学的または生理学的に許容される組成物または本明細書に記載のポリペプチドを、個体に提供する工程を含む、美容の目的で体重を減少させる方法を特徴とする。前記のように体重を減少させるためには、前記個体は、少なくとも２０から２５以下のＢＭＩを有することが好ましい。あるいは、体重を増加させるために、前記個体は、少なくとも１５から２０以下のＢＭＩを有することが好ましい。
【００７９】
第１４の態様において、本発明は、体重を減少させるため、あるいは代謝関連疾患もしくは障害の治療または予防のために用いられる、第５の態様に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。前記代謝関連疾患および障害は、肥満症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病、およびＩＩ型糖尿病からなる群から選択されることが好ましい。本発明の方法によって治療されるＩＩ型糖尿病に関連する合併症としては、微小血管障害、眼球病変および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の代謝関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害としては、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。
【００８０】
好ましい実施形態において、前記個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００８１】
好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で治療すべき前記個体の同定は、前記個体由来の臨床試料におけるＧＺＩＰ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。
【００８２】
他の好ましい実施形態では、前記薬学的または生理学的に許容される組成物で治療すべき前記個体の同定は、前記個体由来の臨床試料における、ＧＺＩＰ単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびＡＰＭ１単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子型判定するか、またはＧＺＩＰポリペプチドおよびＡＰＭ１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルを測定することを含む。前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群から選択されることが好ましい。
【００８３】
第１５の態様において、本発明は、美容の目的で、体重を減らすため、体脂肪量を下げるため、除脂肪体重を増加させるために使用される、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。
【００８４】
第１６の態様では、本発明は、本明細書に記載の前記薬学的または生理学的に許容される組成物、または本明細書に記載のポリペプチドを個体に提供する工程を含む、インスリン抵抗性を治療する方法を特徴とする。
【００８５】
第１７の態様において、本発明は、肥満であるか、または空腹時高インスリン血症であるか、その両方である、正常耐糖能（ＮＧＴ）を有する個体を治療する方法における本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。
【００８６】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、妊娠糖尿病の個体を治療する方法における、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。妊娠糖尿病とは、妊娠期間、通常妊娠の２番目もしくは３番目の三半期中に発症する糖尿病を意味する。
【００８７】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）の個体を治療する方法における、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。空腹時血糖異常（ＩＦＧ）とは、個体における空腹時血漿グルコースレベルが高いが、顕性糖尿病とは診断されない、つまり血漿グルコースレベルが１２６ｍｇ／ｄｌ未満および１１０ｍｇ／ｄｌ以下である症状である。
【００８８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、個体において耐糖能障害（ＩＧＴ）を治療および予防する方法における、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。ＩＧＴを低減または予防する、つまりインスリン抵抗性を正常化するための療法および方法を提供することによって、ＮＩＤＤＭの進行を遅らせる、または防ぐことができる。さらに、インスリン抵抗性を低減または防ぐための療法および方法を提供することによって、本発明は、インスリン抵抗性症候群の発症を低減または予防する方法を提供する。
【００８９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を有する対象を治療する方法において、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。ＰＣＯＳは、閉経前の女性の最も多い疾患の中の１つであり、この集団の５〜１０％が罹患している。インスリン感受性改善薬、例えばトログリタゾンは、ＰＣＯＳに有効であることが示されており、特にインスリン作用、インスリン分泌の障害、卵巣のステロイド産生および線維素溶解が、インスリン抵抗性のヒトなどにおいて改善される(Ehrman et al. (1997) J Clin Invest 100: 1230)。したがって、本発明は、インスリン抵抗性を低減し、血中グルコースを正常化する方法であって、したがって、ＰＣＯＳを治療または予防する方法を提供する。
【００９０】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、インスリン抵抗性を有する対象を治療する方法において、本明細書に記載の薬学的または生理学的に許容される組成物を特徴とする。
【００９１】
さらなる好ましい実施形態において、インスリン抵抗性を有する対象は、インスリン抵抗性を低減または治癒するために本発明の方法によって治療される。インスリン抵抗性は感染症および癌と関連する場合も多いため、本発明の方法によるインスリン抵抗性の予防または低減によって、感染症および癌を予防または低減することができる。
【００９２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の方法を用いて、例えばインスリン抵抗性を発症するリスクが高いことが分かっている対象においてインスリン抵抗性の発症が予防される。
【００９３】
このように、上述の試験または当技術分野で公知の他の試験のいずれかを用いて、対象がインスリン抵抗性であるかどうかを決定することが可能であり、次いで、その患者を本発明の方法に従って治療し、インスリン抵抗性を低減または治癒させることができる。あるいは、本発明の方法は、例えばインスリン抵抗性を発症するリスクが高いことが分かっている対象において、インスリン抵抗性の発症を防ぐために用いることもできる。
【００９４】
第１８の態様において、本発明は、本発明のＡＰＭ１ポリペプチドの、本発明のＧＺＩＰポリペプチドへの結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニストについて、化合物をスクリーニングする方法において、ＧＺＩＰポリペプチド断片を使用する方法を特徴とする。
【００９５】
好ましい実施形態では、前記化合物は、限定されないが、低分子量の有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択される。任意に、前記化合物は、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸または配列番号：３の２１８〜２３９位のアミノ酸から選択されるＧＺＩＰポリペプチド断片である。
【００９６】
第１９の態様において、本発明は、ＧＺＩＰ活性の１種または複数種のアンタゴニストについて、化合物をスクリーニングする方法において、ＧＺＩＰポリペプチド断片を使用する方法を特徴とし、前記活性は、限定されないが、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性から選択される。
【００９７】
好ましい実施形態において、前記化合物は、制限されないが、低分子量の有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択される。任意に、前記化合物は、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸または配列番号：３の２１８〜２３９位のアミノ酸から選択されるＧＺＩＰポリペプチド断片である。
【００９８】
第２０の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを付加する方法であって、前記シグナルペプチドが前記ポリペプチドの分泌を促進する役割を果たす方法を特徴とする。前記シグナルペプチドは、配列番号：２の１〜２０位のアミノ酸または配列番号：３の１〜１７位のアミノ酸から選択されることが好ましい。
【００９９】
上記のおよび本明細書に開示される方法の好ましい態様において、個体に投与されるＧＺＩＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量は、ＧＺＩＰポリペプチドの循環（血中、血清中、または血漿中）レベル（濃度）をそれらの正常レベル（非肥満個体でのレベル）に導くのに十分な量である。「正常レベル」は、すべての循環ＧＺＩＰポリペプチド(完全長ＧＺＩＰタンパク質およびその断片）の総濃度、またはすべての循環タンパク分解性切断されたＧＺＩＰポリペプチドのみの濃度として特定することができる。
【０１００】
上記のおよび本明細書に開示される方法のさらなる好ましい態様において、減量は、部分的または全体的に、ａ）皮下脂肪組織、またはｂ）内臓（大網）脂肪組織のいずれかの量の減少によるものである。
【０１０１】
上記のおよび本明細書に開示される組成物の好ましい態様では、その組成物が、ＧＺＩＰポリペプチドが単独で投与された場合に予想される効果よりも、ＡＰＭ１ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬のいずれか１つと組み合わせた場合のほうが高い生物学的効果を生じるように、本発明の組成物はさらに、ＡＰＭ１ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬を含み得る。
【０１０２】
上記のおよび本明細書に開示される組成物の好ましい態様では、本明細書に記載のＧＺＩＰポリペプチド断片で構成される組成物はさらに、ＧＺＩＰポリペプチドが単独で投与された場合に予想される効果よりも、ＡＰＭ１ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬のいずれか１つと組み合わせた場合のほうが、生物学的効果が高くなるように、ＡＰＭ１ポリペプチド断片、インスリン、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬で構成することができる。さらなる実施形態において、前記生物学的機能としては、限定されないが、遊離脂肪酸レベルを下げる活性、グルコースレベルを下げる活性、トリグリセリドレベルを下げる活性、脂肪分解の促進、筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化の促進、肝細胞系におけるレプチン取り込みの増加、高脂肪食が原因の血漿遊離脂肪酸またはグルコースの食後増加の有意な低減、高脂肪食の結果としてのケトンの体内産生の有意な低減または解消、骨格筋細胞、脂肪細胞、赤血球もしくは脳におけるグルコースの取り込みの増加、インスリン感受性の増加、耐糖能障害からインスリン抵抗性への進行の抑制、体重の減少、体脂肪量の低下、除脂肪筋量の増加、代謝関連疾患もしくは障害の予防または治療、インスリン依存性糖尿病もしくはインスリン非依存性糖尿病の一部のヒトにおける血中グルコースの制御、インスリン抵抗性の治療またはインスリン抵抗性の発症の予防が挙げられる。
本発明の詳細な説明
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書において本発明を説明するために用いられる用語の意味および範囲を説明かつ定義するために、以下に定義を示す。
【０１０３】
本明細書において同義で用いられる、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」および核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または単鎖もしくは二重鎖状の複数のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる。その用語は、少なくとも１つの修飾：例としてであり、限定されないが（ａ）交互（alternative）結合基、（ｂ）プリンの類似体、（ｃ）ピリミジンの類似体、または（ｄ）類似糖を含む、「修飾ヌクレオチド」を包含する。類似の結合基の例としては、プリン、ピリミジン、および糖が挙げられる。例えば、国際公開番号：ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エクスビボ産生、またはそれらの組み合わせを含む、公知のいずれかの方法によって、ならびに当技術分野で公知のいずれかの精製方法を用いて作製することができる。
【０１０４】
ポリヌクレオチドコンストラクト、組換えポリヌクレオチドおよび組換えポリペプチドという用語は、当技術分野でのそれらの使用と一貫して、本明細書において用いられる。「上流」および「下流」という用語もまた、当技術分野でのそれらの使用と一貫して使用される。「塩基対」および「ワトソン−クリック型塩基対」という用語は、本明細書において同義で、かつ当技術分野でのそれらの使用と一貫して使用される。同様に、「相補的」、「その補体」、「補体」、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において同義で、かつ当技術分野でのそれらの使用と一貫して使用される。
【０１０５】
「精製（された）」という用語は、限定されないが、他の核酸、炭水化物、脂質およびタンパク質（ポリヌクレオチドの合成に使用される酵素など）を含む他の化合物から分離された、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドベクターを説明するために本明細書において使用される。「精製（された）」という用語は、例えば、共有結合で閉環したポリヌクレオチドの、線状ポリヌクレオチドからの分離、またはその逆もまた意味し得る。試料の少なくとも約５０％、６０％、７５％、または９０％が単一ポリヌクレオチド配列を含有する場合に、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。場合によっては、これは、コンフォメーション（線状に対して共有結合閉環）間の決定を含む。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは通常、核酸試料の約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％重量／重量を構成する。ポリヌクレオチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野で公知の数多くの手段によって、続いて、ゲルを染色し、単一のポリヌクレオチドバンドを可視化することによって示すことができる。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当技術分野でよく知られている他の手段によって、高い分解能を得ることができる。
【０１０６】
同様に、「精製（された）」という用語は、限定されないが、核酸、脂質、炭水化物および他のタンパク質を含む他の化合物から単離された、本発明のポリペプチドを説明するために本明細書において使用される。いくつかの好ましい実施形態において、試料のポリペプチド分子の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％が単一アミノ酸配列を有する場合に、ポリペプチドは実質的に純粋である。いくつかの好ましい実施形態において、実質的に純粋なポリペプチドは通常、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％重量／重量を構成する。ポリペプチドの純度または均一性は、試料のアガロースゲルもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野で公知の数多くの手段によって、続いて、ゲルを染色し、単一のポリヌクレオチドバンドを可視化することによって示される。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当技術分野でよく知られている他の手段によって、高い分解能を得ることができる。
【０１０７】
さらに、本明細書で使用される「精製（された）」」という用語は、完全な精製を必要とするわけではなく；むしろ、それらは相対的な定義として意図される。少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、さらに好ましくは４桁または５桁のオーダーに、出発物質または天然物質を精製することが特に企図される。あるいは、精製は、異種ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方）またはポリペプチドに対する「最低」純度％として表される。好ましい実施形態として、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異種ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対してそれぞれ、少なくとも；純度１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％である。さらに好ましい実施形態として、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、任意の位〜小数点以下第３位の範囲の「最低」純度、９０％〜１００％（例えば、少なくとも９９．９９５％の純度）を有する。さらに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度は、担体溶液以外のすべての物質および化合物に対するパーセンテージ（上述のように）で表される。小数点以下第３位までの各数字は、純度の個々の種類として主張することが可能である。
【０１０８】
「単離（された）」という用語は、その物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然体系において共存する物質の一部またはすべてから区別される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であることが可能であり、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であることが可能であり、さらにベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないという点から単離することが可能である。
【０１０９】
具体的には、「単離（された）」の定義から：天然の染色体（染色体拡散など）、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、および核酸のインビトロ標本として、あるいはその宿主細胞が異質インビトロ標本であるか、または単一コロニーの異質集団としてプレーティングされた、トランスフェクト／形質転換された宿主細胞標本として存在するｃＤＮＡライブラリーは除外される。具体的には、５’ＥＳＴが、ベクター分子中の核酸インサート数の５％未満（またはその代わりに、１％、２％、３％、４％、１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％、９５％、または９９％）を占める、上記のライブラリーも除外される。さらに具体的には、全細胞のゲノムＤＮＡまたは全細胞のＲＮＡ標本（機械的に切断または酵素で消化される前記全細胞標本を含む）は除外される。さらに具体的には、インビトロ標本としての、または電気泳動（それのブロットトランスファーを含む）によって分離された異種混合物としての上記全細胞標本は除外され、本発明のポリヌクレオチドは、電気泳動媒体において異種ポリヌクレオチドからさらに分離されていない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットにおいて異種バンド集合から単一バンドを切り出すことによるさらなる分離）。
【０１１０】
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、かつ標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるために使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合の開始点として働く。
【０１１１】
「プローブ」という用語は、試料に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するのに使用することができる、定義された核酸セグメント（またはヌクレオチド類似体セグメント、例えば以下に定義されるＰＮＡ）を示し、前記核酸セグメントは、同定されるべき特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さに無関係に、アミノ酸のポリマーを意味する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾を指定しない、または除外する。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドは、「ポリペプチド」という用語によって特別に包含される。アミノ酸の１種または複数種の類似体（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生体系に天然にのみ存在するアミノ酸、哺乳類系からの修飾アミノ酸など）を含有するポリペプチド、置換結合ならびに当技術分野で公知の他の修飾を有するポリペプチド、天然と非天然のどちらも定義内に含まれる。
【０１１３】
理論によって制限されることなく、本発明の化合物／ポリペプチドは、肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配（partitioning）を調節することができ、したがって、肝臓および末梢組織間の食事性脂質の分配に関わる疾患が治療されると考えられる。「末梢組織」という用語は、筋肉および脂肪組織を含むことを意味する。好ましい実施形態において、本発明の化合物／ポリペプチドは、食事性脂質を筋肉へ分配する。代わりの好ましい実施形態では、食事性脂質は脂肪組織に分配される。他の好ましい実施形態では、食事性脂質は肝臓に分配される。さらに他の好ましい実施形態において、本発明の化合物／ポリペプチドは、筋肉による食事性脂質、好ましくは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増加または減少させる。食事性脂質としては、限定されないが、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸が挙げられる。
【０１１４】
食事性脂質の分配に関わると考えられる好ましい疾患としては、肥満症および肥満症関連疾患および障害、例えば、肥満症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）が挙げられる。本発明の方法によって治療されるはずの糖尿病関連合併症としては、微小血管障害、眼球病変、網膜症、神経障害、および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の肥満症関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の肥満症関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするＧＺＩＰポリペプチドまたはポリヌクレオチド以外のいずれかのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを示すことが意図される。
【０１１６】
「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」という用語は、それらの標準的な意味に従って定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に示される定義された意味は、当技術分野における定義された意味を統制し、統制連邦巡回（controlling Federal Circuit）の判例法に示される定義された意味は、Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に示される意味を統制する。これを念頭において、本出願全体にわたり、それぞれの用語と関連する特定の意味を付けるために、用語を互いに置き換えることができる。
【０１１７】
本発明の特定のポリヌクレオチドの「宿主細胞組換え体」という用語は、前記細胞中に天然に見出されない、ある方法で前記ポリヌクレオチドを含有するように人工的に改変された宿主細胞を意味する。例えば、前記宿主細胞に、本発明の前記ポリヌクレオチドを一過的または安定的にトランスフェクトまたは形質導入することができる。
【０１１８】
本明細書において使用される、「生物活性」、「生物学的応答」および「生物学的効果」という用語には、限定されないが、遊離脂肪酸レベルを下げる活性、グルコースレベルを下げる活性、トリグリセリドレベルを下げる活性、脂肪分解の促進、筋肉脂質または遊離脂肪酸の酸化の促進、肝細胞系におけるレプチン取り込みの増加、高脂肪食が原因の血漿遊離脂肪酸またはグルコースの食後増加の有意な低減、高脂肪食の結果としてのケトンの体内産生の有意な低減または解消、骨格筋細胞、脂肪細胞、赤血球もしくは脳におけるグルコースの取り込みの増加、インスリン感受性の増加、耐糖能障害からインスリン抵抗性への進行の抑制、体重の減少、体脂肪量の低下、除脂肪筋量の増加、代謝関連疾患もしくは障害の予防または治療、インスリン非依存性糖尿病もしくはインスリン依存性糖尿病の一部のヒトにおける血中グルコースの制御、インスリン抵抗性の治療、インスリン抵抗性発症の予防、および本明細書で述べられる他の活性が含まれる。
【０１１９】
本明細書において使用される、「肥満（症）」という用語は、体重のＷＨＯ分類で定義されている(Kopelman (2000) Nature 404: 635643)。標準以下はＢＭＩ １８．５未満であり（細い）；健康なのはＢＭＩ １８．５〜２４．９（標準）であり；グレード１の過体重は、ＢＭＩ ２５．０〜２９．９であり（太り過ぎ）；グレード２の過体重は、ＢＭＩ ３０．０〜３９．０（肥満）であり；グレード３の過体重は、ＢＭＩ ４０．０以上である。ＢＭＩは、肥満度指数（病的肥満）であり、ｋｇ／ｍ2である。腹囲を用いて代謝合併症のリスクを示すことも可能であり、男性の場合には、腹囲９４ｃｍ以上であれば、リスクが高く、１０２ｃｍ以上であれば、かなりリスクが高いことを示す。女性の場合も同様に、腹囲８８ｃｍ以上であれば、リスクが高く、８８ｃｍ以上であれば、かなりリスクが高いことを示す。腹囲（ｃｍ）は、肋骨下線と骨盤上線の中間点で測定される。肥満のほかの測定としては、限定されないが、キャリパーを用いた皮下脂肪厚（ｃｍ）の測定である皮下脂肪厚測定、および除脂肪部分が本来電解質溶液であることから、体脂肪部分よりも良く電流を流すという原理に基づく、バイオインピーダンスが挙げられ；末端にわたりかけられる弱電流（インピーダンス）に対する抵抗の測定によって、経験的に導き出された式を用いて、体脂肪の推定値が得られる。
【０１２０】
本明細書において使用される、「糖尿病」という用語は、限定されないが、以下のリスト：糖尿病の症状（例えば、多尿、多飲、多食）に加えて、２００ｍｇ／ｄｌ以上の随時血漿グルコースレベル（随時血漿グルコースレベルは、飲食のタイミングにかかわらず、１日の任意の時点で定義される）；１２６ｍｇ／ｄｌ以下の８時間空腹時血漿グルコースレベル；水に溶解した無水グルコース７５ｇを経口投与して２時間後の、２００ｍｇ／ｄｌ以上の血漿グルコースレベル；が含まれる方法のうちのいずれかで行われる糖尿病の通常の診断を包含するように意図される。
【０１２１】
本明細書において使用される、「耐糖能障害（ＩＧＴ）」という用語は、明白なＮＩＤＤＭと正常耐糖能（ＮＧＴ）との中間であるインスリン抵抗性と関連する病状を示すように意図される。ＩＧＴ集団は、耐糖能正常のヒトと比べて、高い割合で、ＮＩＤＤＭに進行することが知られている(Sad et al., New Engl J Med 1988; 319: 1500-6)。したがって、ＩＧＴを低減または防ぐ、つまりインスリン抵抗性を正常化する治療法および方法を提供することによって、ＮＩＤＤＭへの進行を遅らせるか、または防ぐことができる。ＩＧＴは、食後２時間後の血漿グルコースレベルにより評価される、罹患患者の食後グルコース応答が異常であることが、決定される手順によって診断される。この試験では、一定量のグルコースが患者に与えられ、血中グルコースレベルが、一定の間隔で、通常最初の２時間は３０分毎、その後は１時間毎に測定される。「正常」または非ＩＧＴ個体において、グルコースレベルは、最初の２時間の間に１４０ｍｇ／ｄｌ未満のレベルに上昇し、次いで急速に低下する。ＩＧＴ個体においては、血中グルコースレベルはより高く、低下レベルはより遅い速度である。
【０１２２】
本明細書において使用される、「インスリン抵抗性症候群」という用語は、早発性アテローム硬化型血管疾患などの高血圧症および冠動脈疾患（ＣＡＤ）両方の発症において重要な役割を果たす一連の現象を開始させるインスリン抵抗性を補おうとする試みから生じる異常性のクラスターを包含するように意図される。上昇した血漿トリグリセリドおよび低下したＨＤＬ−コレステロール濃度、ＣＡＤと関連することが知られている症状もまた、インスリン抵抗性と関連することが報告されている。したがって、インスリン抵抗性を低減または予防するための治療法および方法を提供することによって、本発明は、インスリン抵抗性症候群の出現を低減または予防する方法を提供する。
【０１２３】
本明細書において使用される、「多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）」という用語は、アンドロゲン過剰症、慢性無排卵症、インスリン作用の障害、インスリン分泌の障害、卵巣のステロイド産生および線維素溶解によって特徴付けられる、閉経前の女性の病原学的に指定されていない疾患であり、この集団の５〜１０％が発症する疾患を意味するように意図される。ＰＣＯＳの女性はインスリン抵抗性である場合が多く、３０代および４０代でグルコース不耐性またはＮＩＤＤＭを発症するリスクが高い(Dunaif et al. (1996) J Clin Endocrinol Metab 81: 3299)。アンドロゲン過剰症もまた、妖精症および脂肪萎縮性糖尿病によるＡ型症候群から、これらの症状が閉経前の女性に生じた場合のＢ型症候群まで、多種多様の異なるインスリン抵抗性状態の特徴である。高インスリン血症はそれ自体が、アンドロゲン過剰症を生じさせることが示唆されている。インスリン感受性改善薬、例えばトログリタゾンはＰＣＯＳに有効であり、特に、インスリン抵抗性のヒトなどにおいて、インスリン作用の障害、インスリン分泌の障害、卵巣のステロイド産生および線維素溶解が改善される(Ehrman et al. (1997) J Clin Invest 100: 1230)ことが示されている。
【０１２４】
本明細書において使用される、「インスリン抵抗性」という用語は、限定されないが：静脈内の耐糖能試験または空腹時インスリンレベルの測定を含む、数多くの方法のいずれかによって行われるインスリン抵抗性の通常の診断を包含するように意図される。空腹時インスリンレベルの高さとインスリン抵抗性の程度との間には格別の相関性があることがよく知られている。したがって、正常耐糖能（ＮＧＴ）の個体がインスリン抵抗性を有するかどうかを同定する目的のために、インスリン抵抗性の代理マーカーとして高い空腹時インスリンレベルを用いることが可能である。これを行うためのもう１つの方法は、The New England Journal of Medicine, No. 3, pp. 1188 (1995)に開示されているアプローチに従うこと、つまり治療群に入れるための最初の基準として肥満の対象を選択することである。一部の肥満の対象は耐糖能障害（ＩＧＴ）を有するが、他の対象は正常耐糖能（ＮＧＴ）を有する。本質的にすべての肥満の対象はインスリン抵抗性である、つまりＮＧＴの肥満の対象でさえインスリン抵抗性であることから、それらは空腹時高インスリン血症を有する。したがって、本発明による治療の標的は、肥満であるか、または空腹時高インスリン血症を有する、またはその両方である、ＮＧＴ個体として定義することができる。
【０１２５】
インスリン抵抗性の診断は、オイグリセミック・グルコースクランプ試験法を用いて行うこともできる。この試験は、一定のインスリン注入および可変速度のグルコース注入の同時投与を伴う。３〜４時間継続する試験中、血漿グルコース濃度は、５〜１０分毎にグルコースレベルを測定し、次いで血漿グルコースレベルが変化しないように可変速度のグルコース注入を調節することによって、正常血糖レベルで一定に保たれる。これらの環境下にて、血流へのグルコース流入速度は、体内の全体的なグルコース処理速度に等しい。基本状態でのグルコース処理速度（インスリン注入なし）とインスリン注入状態でのグルコース処理速度との差は、インスリンにより仲介されるグルコース取り込みを表す。正常な個体において、インスリンは、全体的な体内グルコース処理を活発かつ大きく増加させるが、ＮＩＤＤＭ対象においては、インスリンのこの効果は大きく鈍り、通常のわずか２０〜３０％である。ＩＧＴまたはＮＧＴを有するインスリン抵抗性の対象において、インスリンにより促進されたグルコース処理の速度は、正常とＮＩＤＤＭとのほぼ半分である。例えば、安定状態の血漿インスリン濃度約１００ｕＵ／ｍｌ（生理学的レベル）では、正常な個体におけるグルコース処理速度は約７ｍｇ／ｋｇ／分である。ＮＩＤＤＭの対象では、約２．５ｍｇ／ｋｇ／分であり、ＩＧＴを有する患者（またはＮＧＴを有するインスリン抵抗性の対象）では、約４〜５ｍｇ／ｋｇ／分である。これは再現性が高く、正確な試験であり、これらの分類内で患者を区別することができる。対象のインスリン抵抗性が高くなるにつれて、空腹時インスリンレベルが上昇することも知られている。空腹時インスリンレベルの高さと、オイグリセミック・グルコースクランプ試験法によって測定されるインスリン抵抗性の程度との間には格別の正の相関性があり、したがって、これによって、インスリン抵抗性の代わりの測定として、空腹時インスリンレベルを使用することが理由付けされる。
【０１２６】
「肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配に作用する物質」という言い方は、上述のように肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配を調節する、本発明の化合物またはポリペプチドを意味する。その作用物質は、筋肉による、食事性脂質、好ましくは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増加または減少させることが好ましい。好ましくは、その作用物質は、個体の重量を減少または増加させるか、あるいは肥満症関連疾患および障害、例えば、肥満症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）を治療または予防するために使用される。本発明の方法によって治療される糖尿病関連合併症としては、微小血管障害、眼球病変、網膜症、神経障害、腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の肥満症関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の肥満症関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。
【０１２７】
「肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配に作用する物質に対する応答」という言い方は、限定されないが、個体における、化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、および薬物の薬物動態（吸収、分布、排泄）および薬力学（受容体関連）を含む、薬効性を意味する。
【０１２８】
「肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配に作用する物質に対する副作用」という言い方は、薬物の主な薬理作用の拡大から生じる治療の有害作用、または固有宿主因子との薬物の相互作用から生じる特異体質の有害反応を意味する。「肝臓組織と末梢組織との間の食事性脂質の分配に作用する物質に対する副作用」には、制限されないが、皮膚科学的、血液学的もしくは肝臓学的毒性などの有害反応が含まれ、さらに、胃および腸管の潰瘍化、血小板機能障害、腎損傷、腎炎、大量の水様性鼻漏が分泌される血管運動神経性鼻炎、血管神経性浮腫、および気管支喘息ないし喉頭浮腫、および気管支収縮、低血圧、およびショックが含まれる。
【０１２９】
本明細書において使用される、「ＧＺＩＰ関連疾患および障害」という用語は、ＧＺＩＰの異常機能を含む、またはＧＺＩＰレベルもしくは活性を調節することにより治療または予防することが可能である、いずれかの疾患または障害を意味する。「ＧＺＩＰの異常機能」には、限定されないが、ＧＺＩＰの発現の異常なレベル（増加または減少したレベルではあるが、好ましくは増加したレベル）、ＧＺＩＰの異常な活性（増加または減少）、およびリガンドもしくは結合パートナーとの異常な相互作用（増加または減少）が含まれる。「異常」とは、正常細胞、組織、または患者において見られる、あるいは疾患発症前に細胞、組織、または患者に既に見られる活性のタイプまたはレベルからの変化を意味する。好ましい実施形態では、これらのＧＺＩＰ関連疾患および障害としては、上述の肥満症および代謝関連疾患および障害が挙げられる。
【０１３０】
「美容的な処置」という用語は、その個体が臨床的に肥満でない、または臨床的に細い場合に、個体の体重を増加または減少させる本発明の化合物またはポリペプチドでの処置を含む。したがって、これらの個体は、臨床的に肥満のカットオフ値未満（２５ｋｇ／ｍ2未満）であり、臨床的に細いカットオフ値を超える（１８．５ｋｇ／ｍ2を超える）肥満度指数（ＢＭＩ）を有する。さらに、これらの個体は健康である（例えば、本発明の代謝関連疾患または障害を持たない）ことが好ましい。「美容的な処置」とは、状況によっては、脂肪組織のさらに局在的な増加、例えば、具体的にはウエストもしくはヒップ周り、またはヒップおよび太腿周りの増加または減少を包含することも意味する。脂肪組織のこれらの局在的な増加または減少は、例えば、ウエストまたはヒップサイズの増加または減少によって同定することができる。
【０１３１】
本明細書において使用される、「予防（防ぐ）」という用語は、肥満症に関連する異常性の物理的な発現を防ぐために、疾患または病状の臨床症状の発症前に化合物、またはＧＺＩＰを投与することを意味する。
【０１３２】
本明細書において使用される、「治療（処置）」という用語は、臨床症状の発症後に化合物を投与することを意味する。
【０１３３】
本明細書において使用される、「治療（処置）の必要のある」という用語は、介護者（例えば、ヒトの場合には、医師、看護師、ナースプラクティショナー等；非ヒト哺乳動物などの動物の場合には獣医師）により下される、個体または動物が治療からの恩恵を必要とするか、または治療からの恩恵を受けるであろうという判断を意味する。この判断は、介護者の専門知識の域にあるが、本発明の化合物によって治療可能である病状の結果として、個体または動物が病気である、または病気であるだろうという知識を含む、様々な因子に基づいて下される。
【０１３４】
「治療（処置）が必要であると考える」という用語は、個体が上記の「美容的な治療（処置）」で記述される美容的な理由のために体重を減らすことを望むという亜臨床的な決定を意味する。他の実施形態において「治療（処置）が必要であると考える」という用語は、動物の飼い主が動物の美容的な治療に対して下す決定を意味し得る。
【０１３５】
本明細書において使用される、「個体」または「患者」は、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、もしくは霊長類、最も好ましくはヒトを含む、いずれかの動物を意味する。
【０１３６】
本明細書において使用される、「非ヒト動物」とは、鳥類、さらに一般的には哺乳動物、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギもしくはげっ歯類、さらに好ましくはラットもしくはマウスを含む、いずれかの非ヒト脊椎動物を意味する。「動物」と「哺乳動物」のどちらも、「非ヒト」という用語が前述されていない限り、特にヒトの対象を含む。
【０１３７】
本発明者らは、ＧＺＩＰポリペプチドは、レプチン、インスリンまたはグルカゴンには影響しないが、高脂肪／高ショ糖食を与えたマウスにおいて、血漿遊離脂肪酸、グルコース、およびトリグリセリドの食後応答を有意に低減することができると考える。さらに、ＧＺＩＰポリペプチドは、インビトロおよびエクスビボで筋肉の遊離脂肪酸の酸化を調節し、好ましくは酸化を高めると考えられる。さらに、本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、高脂肪／高ショ糖食を与えられたマウスにおいて体重増加を調節すると考えられる。またさらに、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをＡＰＭ１ポリペプチド断片と組み合わせて使用して、ＧＺＩＰポリペプチド断片またはＡＰＭ１ポリペプチド断片を単独で含有する組成物の予想される効果よりも高い生物学的効果（例えば、遊離脂肪酸レベルを下げる活性）を得ることができる。
【０１３８】
本発明は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の分配における、およびエネルギー・ホメオスタシスを制御する重要な新しいツールとしての、ＧＺＩＰポリペプチドの使用を包含する。循環から脂質を有意に除去し、ＦＦＡ酸化を生じさせることができる組織の中で、量的に筋肉が最も重要であると考えられる。
本発明の好ましい実施形態
Ｉ．本発明のＧＺＩＰポリペプチド
インビトロおよびインビボで測定可能な活性を有するＧＺＩＰポリペプチドが同定されている。これらの活性には、限定されないが、高脂肪／高ショ糖食を与えたマウスにおける血漿遊離脂肪酸、グルコース、およびトリグリセリドの調節、好ましくは低減（実施例６）、インビトロおよびエクスビボでの筋肉の遊離脂肪酸酸化の変化、好ましくは増加（実施例１０）、高脂肪／高ショ糖食のマウスの持続的な体重減少が含まれる。インビトロおよびインビボでのＧＺＩＰポリペプチド活性についての他のアッセイもまた、提供され（例えば、実施例２〜１４）、当業者によって同等なアッセイを設計することができる。
【０１３９】
「ＧＺＩＰポリペプチド」という用語は、「完全長」ポリペプチドと「完全長」ＧＺＩＰポリペプチド断片のどちらも含む（上記の種それぞれは特に指定されているが）。
【０１４０】
本明細書において使用される、「インタクトな」または「完全長」ＧＺＩＰポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンからＣ末端終止コドンまでのＧＺＩＰポリペプチドの完全長ポリペプチ配列を意味する。インタクトな、または完全長ＧＺＩＰポリペプチドの例は、配列表に記載されている。
【０１４１】
本明細書において使用される、「代謝関連活性」という用語は、ＧＺＩＰポリペプチドに関する、本明細書に記載の活性の少なくとも１種、好ましくはすべてを意味する。これらの活性を決定するアッセイは、本明細書に提供されており（例えば、実施例２〜１４）、同等なアッセイを当業者により設計することができる。任意に、「代謝関連活性」は、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性、またはこれらの分類のうちの１つに入る活性からなる群から選択することができる。「脂質分配」活性とは、脂肪組織、肝臓、および筋肉を含む主な組織群の中での食事性脂質の位置に影響を及ぼす能力を意味する。本発明者らは、本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、筋肉、肝臓または脂肪組織への脂質の分配において役割を果たすと考える。「脂質代謝」活性とは、脂質の代謝に影響を及ぼす能力を意味する。本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、血漿中の遊離脂肪酸のレベルに影響を及ぼす能力、ならびに遊離脂肪酸酸化の実験による筋肉における脂質代謝を調節する、好ましくは増加する能力、かつ血漿および筋肉中のトリグリセリドのレベルに一過的に影響を及ぼす能力を有すると本発明者らは考える。「インスリン様」活性とは、血漿中のグルコースレベルを調節するポリペプチドの能力を意味する。ＧＺＩＰポリペプチドはインスリンレベルに有意に影響を与えないが、インスリンの効果と同様にグルコースレベルには影響を与えると、本発明者らは考える。これらの効果は、インタクトな(完全長)ＧＺＩＰポリペプチドの存在下では様々であり、または完全長ＧＺＩＰポリペプチドと比較して、ＧＺＩＰポリペプチド断片の存在下では有意に高い。
【０１４２】
本明細書に使用される「有意に高い」とは、同じアッセイにおける未処理細胞と比較して、代謝関連アッセイにおけるＧＺＩＰポリペプチドの活性の比較を意味する。本明細書に使用される「有意に高い」とは、当業者によって通常決定されるように統計学的に有意であることを意味する。例えば、データは通常、平均±ＳＥＭとして計算され、ｐ値＜０．０５は、統計学的に有意であると見なされる。統計的解析は通常、各研究において適切な、対応のないスチューデントｔ検定または対応のあるスチューデントｔ検定を用いて行われる。未処理細胞と比較して、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの存在の結果としての活性の有意な変化の例には、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％の、所定のパラメーターの増加または減少が含まれる。測定可能なパラメーターの必ずしもすべてではなく、１つまたは複数が、未処理細胞と比較して、ＧＺＩＰポリペプチドの存在下にて有意に変化するだろう。
【０１４３】
代表的な「代謝関連アッセイ」を実施例に示す。これらのアッセイとしては、限定されないが、食後応答を測定する方法、遊離脂肪酸の酸化を測定する方法、および体重調節（weight modulation）を測定する方法が挙げられる。好ましい実施形態において、食後の応答が、非ヒト動物、好ましくはマウスにおいて測定される。好ましい実施形態では、食事性脂質、好ましくは遊離脂肪酸またはトリグリセリドの変化が測定される。他の実施形態において、他の生理学的パラメーター、限定されないが、グルコース、インスリン、およびレプチンのレベルなどが測定される。他の好ましい実施形態では、遊離脂肪酸の酸化は、インビトロまたはエクスビボにて細胞において、好ましくは、非ヒト動物、好ましくはマウスの筋細胞または組織において測定される。さらに他の好ましい実施形態において、体重調節は、高脂肪／高ショ糖食のヒトもしくは非ヒト動物、好ましくはげっ歯類（ラットもしくはマウス）、霊長類、イヌ、ネコまたはブタにおいて測定される。任意に、「代謝関連活性」には、本明細書において明確に同定されていない他の活性が含まれる。一般に、肥満症および代謝研究の分野に関連する「測定可能なパラメーター」は、遊離脂肪酸レベル、遊離脂肪酸の酸化、トリグリセリドレベル、グルコースレベル、インスリンレベル、レプチンレベル、食物摂取、体重、レプチンおよびリポタンパク質結合、取り込みおよび分解および脂肪分解促進受容体（ＬＳＲ）の発現からなる群から選択される。
【０１４４】
これらの代謝関連アッセイにおいて、好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、食後高脂血症、遊離脂肪酸レベル、リグリセリドレベル、グルコースレベル、遊離脂肪酸の酸化、および体重からなる群から選択される測定可能なパラメーターのうちの少なくとも１つの有意な変化を生じさせるだろう。一方、好ましいＧＺＩＰポリペプチドは、ＬＳＲ活性の増加、レプチン活性の増加およびリポタンパク質活性の増加からなる群から選択される測定可能なパラメーターのうちの少なくとも１つの有意な変化を生じさせるだろう。「ＬＳＲ」活性とは、細胞表面上の、または特定のコンフォメーションにおけるＬＳＲの発現、ならびにレプチンおよびリポタンパク質に結合し、それらを取り込み、分解するその能力を意味する。「レプチン」活性とは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解、ならびに血液脳関門を通過するその輸送、およびＬＳＲが必ずしも仲介因子ではない、または単なる仲介因子である場合の、潜在的なこれらの存在を意味する。同様に、「リポタンパク質」活性とは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解、ならびにＬＳＲが必ずしも仲介因子ではない、または単なる仲介因子である場合の、これらの存在を意味する。
【０１４５】
本発明は、特に単離、精製または組換えＧＺＩＰポリペプチドに関する。本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、美容的処置として、または代謝関連疾患および障害の治療もしくは予防に、体重を減少または増加させるのに（ＧＺＩＰポリペプチドのアンタゴニストを用いて）有効である。ＧＺＩＰポリペプチドは、特に、ＧＺＩＰポリペプチド活性のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングアッセイにおいても有用である。そのＧＺＩＰポリペプチド活性は、ＡＰＭ１ポリペプチド、特にｇＡＰＭ１ポリペプチドに結合するＧＺＩＰの能力であることが好ましい。
【０１４６】
完全長ＧＺＩＰポリペプチドは、
１．配列番号：２の１〜２０位または配列番号：３の１〜１７位のアミノ酸からのＮ末端の推定シグナル配列；
２．α２ドメインと共に、遊離脂肪酸の結合溝を構成する、配列番号：２のおよそ２１〜１１２位または配列番号：３のおよそ１８〜１０９位のアミノ酸からのα１ドメイン；
３．α２ドメインと共に、遊離脂肪酸の結合溝を構成する、配列番号：２のおよそ１１３〜２０４位または配列番号：３のおよそ１１０〜２０１位のアミノ酸からのα２ドメイン；
４．ＡＰＭ１結合部位を含む、配列番号：２のおよそ２０５〜２９８位または配列番号：３のおよそ２０２〜２９５位のアミノ酸からのα３ドメイン；を含む、少なくとも４つの異なる領域で構成される。
【０１４７】
本発明は特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５に記載の、本発明のＧＺＩＰポリペプチドと結合することができる、単離、精製、または組換えＡＰＭ１ポリペプチドに関する。
【０１４８】
完全長ＡＰＭ１ポリペプチドは、
１．配列番号４の１〜１７位のアミノ酸からのＮ末端の推定シグナル配列；
２．配列番号：４の１８〜４１位のアミノ酸からの非反復領域；
３．配列番号：４の４２〜１０７位のアミノ酸からのコラーゲン様領域；
４．配列番号：４の１０８〜２４４位のアミノ酸からの球状領域；を含む、少なくとも４つの異なる領域で構成される。
【０１４９】
本明細書において使用される、「ＡＰＭ１ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端メチオニンからＣ末端終止コドンまでの、いずれかのＡＰＭ１ポリペプチの完全長ポリペプチド配列を意味する。インタクトな、または完全長ＡＰＭ１ポリペプチドの例は、配列番号：４に示されている。本明細書において使用される、「ＡＰＭ１ポリペプチド断片」という用語は、「肥満症関連活性」を有する「インタクトな」または「完全長」ＡＰＭ１ポリペプチドの断片を意味する。「ｇＡＰＭ１ポリペプチド」および「ｇＡＰＭ１ポリペプチド断片」という用語は同義で使用され、球状領域のみのポリペプチド断片を意味し、したがって、「ＡＰＭ１ポリペプチド断片」よりも狭い意味の用語である。
【０１５０】
本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、単離状態で提供されることが好ましく、一部または実質的に精製される。ＧＺＩＰポリペプチドのいずれか１つの組換えにより作製された種類は、Smithら((1988) Gene 67 (1) : 31-40)によって記述されている一工程法によって、または本明細書に記載されている、もしくは当技術分野で公知の方法によって実質的に精製することができる。本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知のタンパク質精製方法によって本発明のポリペプチドに対して作られた抗体を用いて、天然源または組換え源から精製することもできる。
【０１５１】
ＧＺＩＰポリペプチドの部分的精製またはＧＺＩＰポリペプチドの選択を含む、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの作製もまた、具体的に企図される。これらの未精製調製物は、断片を完全に精製する前であるが、おそらくさらに数回の精製工程を用いた、ＧＺＩＰポリペプチドを発現する細胞の濃縮の結果であると考えられる。ＧＺＩＰポリペプチドを発現する細胞は、ペレット中に存在し、例えばそれらは溶解されるか、または未精製ポリペプチドは凍結乾燥される。
【０１５２】
ＧＺＩＰポリペプチド断片は、少なくとも６個の連続するアミノ酸から、完全長ＧＺＩＰポリペプチドより１アミノ酸短い長さまでの、任意の整数のアミノ酸数の長さであり得る。このように、配列番号：２のポリペプチドに関しては、ＧＺＩＰポリペプチドは、例えば任意の整数個の６〜２９７位の連続するアミノ酸であり得る。「整数」という用語は、本明細書においてその数学的意味で使用され、したがって、代表的な整数としては、限定されないが：６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６または２９７が挙げられる。
【０１５３】
上述の各ＧＺＩＰポリペプチド断片はさらに、Ｎ末端およびＣ末端位置の点から指定することができる。例えば、少なくとも６個の連続するアミノ酸から、配列番号：２の完全長ポリペプチドより１アミノ酸短い断片が、配列番号：２の任意のインタクトなかつ連続する完全長ポリペプチド配列上で占め得るＮ末端およびＣ末端位置のあらゆる組み合わせが、本発明に包含される。したがって、６個の連続するアミノ酸の断片は、配列番号：２の１〜６、２〜７、３〜８、４〜９、５〜１０、６〜１１、７〜１２、８〜１３、９〜１４、１０〜１５、１１〜１６、１２〜１７、１３〜１８、１４〜１９、１５〜２０、１６〜２１、１７〜２２、１８〜２３、１９〜２４、２０〜２５、２１〜２６、２２〜２７、２３〜２８、２４〜２９、２５〜３０、２６〜３１、２７〜３２、２８〜３３、２９〜３４、３０〜３５、３１〜３６、３２〜３７、３３〜３８、３４〜３９、３５〜４０、３６〜４１、３７〜４２、３８〜４３、３９〜４４、４０〜４５、４１〜４６、４２〜４７、４３〜４８、４４〜４９、４５〜５０、４６〜５１、４７〜５２、４８〜５３、４９〜５４、５０〜５５、５１〜５６、５２〜５７、５３〜５８、５４〜５９、５５〜６０、５６〜６１、５７〜６２、５８〜６３、５９〜６４、６０〜６５、６１〜６６、６２〜６７、６３〜６８、６４〜６９、６５〜７０、６６〜７１、６７〜７２、６８〜７３、６９〜７４、７０〜７５、７１〜７６、７２〜７７、７３〜７８、７４〜７９、７５〜８０、７６〜８１、７７〜８２、７８〜８３、７９〜８４、８０〜８５、８１〜８６、８２〜８７、８３〜８８、８４〜８９、８５〜９０、８６〜９１、８７〜９２、８８〜９３、８９〜９４、９０〜９５、９１〜９６、９２〜９７、９３〜９８、９４〜９９、９５〜１００、９６〜１０１、９７〜１０２、９８〜１０３、９９〜１０４、１００〜１０５、１０１〜１０６、１０２〜１０７、１０３〜１０８、１０４〜１０９、１０５〜１１０、１０６〜１１１、１０７〜１１２、１０８〜１１３、１０９〜１１４、１１０〜１１５、１１１〜１１６、１１２〜１１７、１１３〜１１８、１１４〜１１９、１１５〜１２０、１１６〜１２１、１１７〜１２２、１１８〜１２３、１１９〜１２４、１２０〜１２５、１２１〜１２６、１２２〜１２７、１２３〜１２８、１２４〜１２９、１２５〜１３０、１２６〜１３１、１２７〜１３２、１２８〜１３３、１２９〜１３４、１３０〜１３５、１３１〜１３６、１３２〜１３７、１３３〜１３８、１３４〜１３９、１３５〜１４０、１３６〜１４１、１３７〜１４２、１３８〜１４３、１３９〜１４４、１４０〜１４５、１４１〜１４６、１４２〜１４７、１４３〜１４８、１４４〜１４９、１４５〜１５０、１４６〜１５１、１４７〜１５２、１４８〜１５３、１４９〜１５４、１５０〜１５５、１５１〜１５６、１５２〜１５７、１５３〜１５８、１５４〜１５９、１５５〜１６０、１５６〜１６１、１５７〜１６２、１５８〜１６３、１５９〜１６４、１６０〜１６５、１６１〜１６６、１６２〜１６７、１６３〜１６８、１６４〜１６９、１６５〜１７０、１６６〜１７１、１６７〜１７２、１６８〜１７３、１６９〜１７４、１７０〜１７５、１７１〜１７６、１７２〜１７７、１７３〜１７８、１７４〜１７９、１７５〜１８０、１７６〜１８１、１７７〜１８２、１７８〜１８３、１７９〜１８４、１８０〜１８５、１８１〜１８６、１８２〜１８７、１８３〜１８８、１８４〜１８９、１８５〜１９０、１８６〜１９１、１８７〜１９２、１８８〜１９３、１８９〜１９４、１９０〜１９５、１９１〜１９６、１９２〜１９７、１９３〜１９８、１９４〜１９９、１９５〜２００、１９６〜２０１、１９７〜２０２、１９８〜２０３、１９９〜２０４、２００〜２０５、２０１〜２０６、２０２〜２０７、２０３〜２０８、２０４〜２０９、２０５〜２１０、２０６〜２１１、２０７〜２１２、２０８〜２１３、２０９〜２１４、２１０〜２１５、２１１〜２１６、２１２〜２１７、２１３〜２１８、２１４〜２１９、２１５〜２２０、２１６〜２２１、２１７〜２２２、２１８〜２２３、２１９〜２２４、２２０〜２２５、２２１〜２２６、２２２〜２２７、２２３〜２２８、２２４〜２２９、２２５〜２３０、２２６〜２３１、２２７〜２３２、２２８〜２３３、２２９〜２３４、２３０〜２３５、２３１〜２３６、２３２〜２３７、２３３〜２３８、２３４〜２３９、２３５〜２４０、２３６〜２４１、２３７〜２４２、２３８〜２４３、２３９〜２４４、２４０〜２４５、２４１〜２４６、２４２〜２４７、２４３〜２４８、２４４〜２４９、２４５〜２５０、２４６〜２５１、２４７〜２５２、２４８〜２５３、２４９〜２５４、２５０〜２５５、２５１〜２５６、２５２〜２５７、２５３〜２５８、２５４〜２５９、２５５〜２６０、２５６〜２６１、２５７〜２６２、２５８〜２６３、２５９〜２６４、２６０〜２６５、２６１〜２６６、２６２〜２６７、２６３〜２６８、２６４〜２６９、２６５〜２７０、２６６〜２７１、２６７〜２７２、２６８〜２７３、２６９〜２７４、２７０〜２７５、２７１〜２７６、２７２〜２７７、２７３〜２７８、２７４〜２７９、２７５〜２８０、２７６〜２８１、２７７〜２８２、２７８〜２８３、２７９〜２８４、２８０〜２８５、２８１〜２８６、２８２〜２８７、２８３〜２８８、２８４〜２８９、２８５〜２９０、２８６〜２９１、２８７〜２９２、２８８〜２９３、２８９〜２９４、２９０〜２９５、２９１〜２９６、２９２〜２９７、２９３〜２９８位からなる群から選択される位置を占め得る。
【０１５４】
同様に、配列番号：２における１２個のアミノ酸から２９８個のアミノ酸のサイズの他の断片すべてによって占められる位置が、本発明に包含される。したがって、１２個の連続するアミノ酸の断片は、配列番号：２の１〜１２、２〜１３、３〜１４、４〜１５、５〜１６、６〜１７、７〜１８、８〜１９、９〜２０、１０〜２１、１１〜２２、１２〜２３、１３〜２４、１４〜２５、１５〜２６、１６〜２７、１７〜２８、１８〜２９、１９〜３０、２０〜３１、２１〜３２、２２〜３３、２３〜３４、２４〜３５、２５〜３６、２６〜３７、２７〜３８、２８〜３９、２９〜４０、３０〜４１、３１〜４２、３２〜４３、３３〜４４、３４〜４５、３５〜４６、３６〜４７、３７〜４８、３８〜４９、３９〜５０、４０〜５１、４１〜５２、４２〜５３、４３〜５４、４４〜５５、４５〜５６、４６〜５７、４７〜５８、４８〜５９、４９〜６０、５０〜６１、５１〜６２、５２〜６３、５３〜６４、５４〜６５、５５〜６６、５６〜６７、５７〜６８、５８〜６９、５９〜７０、６０〜７１、６１〜７２、６２〜７３、６３〜７４、６４〜７５、６５〜７６、６６〜７７、６７〜７８、６８〜７９、６９〜８０、７０〜８１、７１〜８２、７２〜８３、７３〜８４、７４〜８５、７５〜８６、７６〜８７、７７〜８８、７８〜８９、７９〜９０、８０〜９１、８１〜９２、８２〜９３、８３〜９４、８４〜９５、８５〜９６、８６〜９７、８７〜９８、８８〜９９、８９〜１００、９０〜１０１、９１〜１０２、９２〜１０３、９３〜１０４、９４〜１０５、９５〜１０６、９６〜１０７、９７〜１０８、９８〜１０９、９９〜１１０、１００〜１１１、１０１〜１１２、１０２〜１１３、１０３〜１１４、１０４〜１１５、１０５〜１１６、１０６〜１１７、１０７〜１１８、１０８〜１１９、１０９〜１２０、１１０〜１２１、１１１〜１２２、１１２〜１２３、１１３〜１２４、１１４〜１２５、１１５〜１２６、１１６〜１２７、１１７〜１２８、１１８〜１２９、１１９〜１３０、１２０〜１３１、１２１〜１３２、１２２〜１３３、１２３〜１３４、１２４〜１３５、１２５〜１３６、１２６〜１３７、１２７〜１３８、１２８〜１３９、１２９〜１４０、１３０〜１４１、１３１〜１４２、１３２〜１４３、１３３〜１４４、１３４〜１４５、１３５〜１４６、１３６〜１４７、１３７〜１４８、１３８〜１４９、１３９〜１５０、１４０〜１５１、１４１〜１５２、１４２〜１５３、１４３〜１５４、１４４〜１５５、１４５〜１５６、１４６〜１５７、１４７〜１５８、１４８〜１５９、１４９〜１６０、１５０〜１６１、１５１〜１６２、１５２〜１６３、１５３〜１６４、１５４〜１６５、１５５〜１６６、１５６〜１６７、１５７〜１６８、１５８〜１６９、１５９〜１７０、１６０〜１７１、１６１〜１７２、１６２〜１７３、１６３〜１７４、１６４〜１７５、１６５〜１７６、１６６〜１７７、１６７〜１７８、１６８〜１７９、１６９〜１８０、１７０〜１８１、１７１〜１８２、１７２〜１８３、１７３〜１８４、１７４〜１８５、１７５〜１８６、１７６〜１８７、１７７〜１８８、１７８〜１８９、１７９〜１９０、１８０〜１９１、１８１〜１９２、１８２〜１９３、１８３〜１９４、１８４〜１９５、１８５〜１９６、１８６〜１９７、１８７〜１９８、１８８〜１９９、１８９〜２００、１９０〜２０１、１９１〜２０２、１９２〜２０３、１９３〜２０４、１９４〜２０５、１９５〜２０６、１９６〜２０７、１９７〜２０８、１９８〜２０９、１９９〜２１０、２００〜２１１、２０１〜２１２、２０２〜２１３、２０３〜２１４、２０４〜２１５、２０５〜２１６、２０６〜２１７、２０７〜２１８、２０８〜２１９、２０９〜２２０、２１０〜２２１、２１１〜２２２、２１２〜２２３、２１３〜２２４、２１４〜２２５、２１５〜２２６、２１６〜２２７、２１７〜２２８、２１８〜２２９、２１９〜２３０、２２０〜２３１、２２１〜２３２、２２２〜２３３、２２３〜２３４、２２４〜２３５、２２５〜２３６、２２６〜２３７、２２７〜２３８、２２８〜２３９、２２９〜２４０、２３０〜２４１、２３１〜２４２、２３２〜２４３、２３３〜２４４、２３４〜２４５、２３５〜２４６、２３６〜２４７、２３７〜２４８、２３８〜２４９、２３９〜２５０、２４０〜２５１、２４１〜２５２、２４２〜２５３、２４３〜２５４、２４４〜２５５、２４５〜２５６、２４６〜２５７、２４７〜２５８、２４８〜２５９、２４９〜２６０、２５０〜２６１、２５１〜２６２、２５２〜２６３、２５３〜２６４、２５４〜２６５、２５５〜２６６、２５６〜２６７、２５７〜２６８、２５８〜２６９、２５９〜２７０、２６０〜２７１、２６１〜２７２、２６２〜２７３、２６３〜２７４、２６４〜２７５、２６５〜２７６、２６６〜２７７、２６７〜２７８、２６８〜２７９、２６９〜２８０、２７０〜２８１、２７１〜２８２、２７２〜２８３、２７３〜２８４、２７４〜２８５、２７５〜２８６、２７６〜２８７、２７７〜２８８、２７８〜２８９、２７９〜２９０、２８０〜２９１、２８１〜２９２、２８２〜２９３、２８３〜２９４、２８４〜２９５、２８５〜２９６、２８６〜２９７、２８７〜２９８位からなる群から選択される位置を占め得る。
【０１５５】
同様に、配列番号：２における５０個のアミノ酸から２９８個のアミノ酸のサイズの他の断片すべてによって占められる位置が、本発明に包含される。したがって、５０個の連続するアミノ酸の断片は、配列番号：２の１〜５０、２〜５１、３〜５２、４〜５３、５〜５４、６〜５５、７〜５６、８〜５７、９〜５８、１０〜５９、１１〜６０、１２〜６１、１３〜６２、１４〜６３、１５〜６４、１６〜６５、１７〜６６、１８〜６７、１９〜６８、２０〜６９、２１〜７０、２２〜７１、２３〜７２、２４〜７３、２５〜７４、２６〜７５、２７〜７６、２８〜７７、２９〜７８、３０〜７９、３１〜８０、３２〜８１、３３〜８２、３４〜８３、３５〜８４、３６〜８５、３７〜８６、３８〜８７、３９〜８８、４０〜８９、４１〜９０、４２〜９１、４３〜９２、４４〜９３、４５〜９４、４６〜９５、４７〜９６、４８〜９７、４９〜９８、５０〜９９、５１〜１００、５２〜１０１、５３〜１０２、５４〜１０３、５５〜１０４、５６〜１０５、５７〜１０６、５８〜１０７、５９〜１０８、６０〜１０９、６１〜１１０、６２〜１１１、６３〜１１２、６４〜１１３、６５〜１１４、６６〜１１５、６７〜１１６、６８〜１１７、６９〜１１８、７０〜１１９、７１〜１２０、７２〜１２１、７３〜１２２、７４〜１２３、７５〜１２４、７６〜１２５、７７〜１２６、７８〜１２７、７９〜１２８、８０〜１２９、８１〜１３０、８２〜１３１、８３〜１３２、８４〜１３３、８５〜１３４、８６〜１３５、８７〜１３６、８８〜１３７、８９〜１３８、９０〜１３９、９１〜１４０、９２〜１４１、９３〜１４２、９４〜１４３、９５〜１４４、９６〜１４５、９７〜１４６、９８〜１４７、９９〜１４８、１００〜１４９、１０１〜１５０、１０２〜１５１、１０３〜１５２、１０４〜１５３、１０５〜１５４、１０６〜１５５、１０７〜１５６、１０８〜１５７、１０９〜１５８、１１０〜１５９、１１１〜１６０、１１２〜１６１、１１３〜１６２、１１４〜１６３、１１５〜１６４、１１６〜１６５、１１７〜１６６、１１８〜１６７、１１９〜１６８、１２０〜１６９、１２１〜１７０、１２２〜１７１、１２３〜１７２、１２４〜１７３、１２５〜１７４、１２６〜１７５、１２７〜１７６、１２８〜１７７、１２９〜１７８、１３０〜１７９、１３１〜１８０、１３２〜１８１、１３３〜１８２、１３４〜１８３、１３５〜１８４、１３６〜１８５、１３７〜１８６、１３８〜１８７、１３９〜１８８、１４０〜１８９、１４１〜１９０、１４２〜１９１、１４３〜１９２、１４４〜１９３、１４５〜１９４、１４６〜１９５、１４７〜１９６、１４８〜１９７、１４９〜１９８、１５０〜１９９、１５１〜２００、１５２〜２０１、１５３〜２０２、１５４〜２０３、１５５〜２０４、１５６〜２０５、１５７〜２０６、１５８〜２０７、１５９〜２０８、１６０〜２０９、１６１〜２１０、１６２〜２１１、１６３〜２１２、１６４〜２１３、１６５〜２１４、１６６〜２１５、１６７〜２１６、１６８〜２１７、１６９〜２１８、１７０〜２１９、１７１〜２２０、１７２〜２２１、１７３〜２２２、１７４〜２２３、１７５〜２２４、１７６〜２２５、１７７〜２２６、１７８〜２２７、１７９〜２２８、１８０〜２２９、１８１〜２３０、１８２〜２３１、１８３〜２３２、１８４〜２３３、１８５〜２３４、１８６〜２３５、１８７〜２３６、１８８〜２３７、１８９〜２３８、１９０〜２３９、１９１〜２４０、１９２〜２４１、１９３〜２４２、１９４〜２４３、１９５〜２４４、１９６〜２４５、１９７〜２４６、１９８〜２４７、１９９〜２４８、２００〜２４９、２０１〜２５０、２０２〜２５１、２０３〜２５２、２０４〜２５３、２０５〜２５４、２０６〜２５５、２０７〜２５６、２０８〜２５７、２０９〜２５８、２１０〜２５９、２１１〜２６０、２１２〜２６１、２１３〜２６２、２１４〜２６３、２１５〜２６４、２１６〜２６５、２１７〜２６６、２１８〜２６７、２１９〜２６８、２２０〜２６９、２２１〜２７０、２２２〜２７１、２２３〜２７２、２２４〜２７３、２２５〜２７４、２２６〜２７５、２２７〜２７６、２２８〜２７７、２２９〜２７８、２３０〜２７９、２３１〜２８０、２３２〜２８１、２３３〜２８２、２３４〜２８３、２３５〜２８４、２３６〜２８５、２３７〜２８６、２３８〜２８７、２３９〜２８８、２４０〜２８９、２４１〜２９０、２４２〜２９１、２４３〜２９２、２４４〜２９３、２４５〜２９４、２４６〜２９５、２４７〜２９６、２４８〜２９７、２４９〜２９８位からなる群から選択される位置を占め得る。
【０１５６】
同様に、配列番号：２における１００個のアミノ酸から２９８個のアミノ酸のサイズの他の断片すべてによって占められる位置が、本発明に包含される。したがって、１００個の連続するアミノ酸の断片は、配列番号：２の１〜１００、２〜１０１、３〜１０２、４〜１０３、５〜１０４、６〜１０５、７〜１０６、８〜１０７、９〜１０８、１０〜１０９、１１〜１１０、１２〜１１１、１３〜１１２、１４〜１１３、１５〜１１４、１６〜１１５、１７〜１１６、１８〜１１７、１９〜１１８、２０〜１１９、２１〜１２０、２２〜１２１、２３〜１２２、２４〜１２３、２５〜１２４、２６〜１２５、２７〜１２６、２８〜１２７、２９〜１２８、３０〜１２９、３１〜１３０、３２〜１３１、３３〜１３２、３４〜１３３、３５〜１３４、３６〜１３５、３７〜１３６、３８〜１３７、３９〜１３８、４０〜１３９、４１〜１４０、４２〜１４１、４３〜１４２、４４〜１４３、４５〜１４４、４６〜１４５、４７〜１４６、４８〜１４７、４９〜１４８、５０〜１４９、５１〜１５０、５２〜１５１、５３〜１５２、５４〜１５３、５５〜１５４、５６〜１５５、５７〜１５６、５８〜１５７、５９〜１５８、６０〜１５９、６１〜１６０、６２〜１６１、６３〜１６２、６４〜１６３、６５〜１６４、６６〜１６５、６７〜１６６、６８〜１６７、６９〜１６８、７０〜１６９、７１〜１７０、７２〜１７１、７３〜１７２、７４〜１７３、７５〜１７４、７６〜１７５、７７〜１７６、７８〜１７７、７９〜１７８、８０〜１７９、８１〜１８０、８２〜１８１、８３〜１８２、８４〜１８３、８５〜１８４、８６〜１８５、８７〜１８６、８８〜１８７、８９〜１８８、９０〜１８９、９１〜１９０、９２〜１９１、９３〜１９２、９４〜１９３、９５〜１９４、９６〜１９５、９７〜１９６、９８〜１９７、９９〜１９８、１００〜１９９、１０１〜２００、１０２〜２０１、１０３〜２０２、１０４〜２０３、１０５〜２０４、１０６〜２０５、１０７〜２０６、１０８〜２０７、１０９〜２０８、１１０〜２０９、１１１〜２１０、１１２〜２１１、１１３〜２１２、１１４〜２１３、１１５〜２１４、１１６〜２１５、１１７〜２１６、１１８〜２１７、１１９〜２１８、１２０〜２１９、１２１〜２２０、１２２〜２２１、１２３〜２２２、１２４〜２２３、１２５〜２２４、１２６〜２２５、１２７〜２２６、１２８〜２２７、１２９〜２２８、１３０〜２２９、１３１〜２３０、１３２〜２３１、１３３〜２３２、１３４〜２３３、１３５〜２３４、１３６〜２３５、１３７〜２３６、１３８〜２３７、１３９〜２３８、１４０〜２３９、１４１〜２４０、１４２〜２４１、１４３〜２４２、１４４〜２４３、１４５〜２４４、１４６〜２４５、１４７〜２４６、１４８〜２４７、１４９〜２４８、１５０〜２４９、１５１〜２５０、１５２〜２５１、１５３〜２５２、１５４〜２５３、１５５〜２５４、１５６〜２５５、１５７〜２５６、１５８〜２５７、１５９〜２５８、１６０〜２５９、１６１〜２６０、１６２〜２６１、１６３〜２６２、１６４〜２６３、１６５〜２６４、１６６〜２６５、１６７〜２６６、１６８〜２６７、１６９〜２６８、１７０〜２６９、１７１〜２７０、１７２〜２７１、１７３〜２７２、１７４〜２７３、１７５〜２７４、１７６〜２７５、１７７〜２７６、１７８〜２７７、１７９〜２７８、１８０〜２７９、１８１〜２８０、１８２〜２８１、１８３〜２８２、１８４〜２８３、１８５〜２８４、１８６〜２８５、１８７〜２８６、１８８〜２８７、１８９〜２８８、１９０〜２８９、１９１〜２９０、１９２〜２９１、１９３〜２９２、１９４〜２９３、１９５〜２９４、１９６〜２９５、１９７〜２９６、１９８〜２９７、１９９〜２９８位からなる群から選択される位置を占め得る。
【０１５７】
さらに、配列番号：３における、６番目のアミノ酸〜最後から２番目のアミノ酸の連続するアミノ酸の断片によって占められる位置、または１２番目のアミノ酸〜最後から２番目のアミノ酸の連続するアミノ酸の断片によって占められる位置、または５０番目のアミノ酸〜最後から２番目のアミノ酸の連続するアミノ酸の断片によって占められる位置、または１００番目の〜最後から２番目のアミノ酸の連続するアミノ酸の断片によって占められる位置もまた本発明に包含され、本明細書における実施例に基づいてすぐに考えることもでき、したがって、不必要に明細書を長くするためだけにそれぞれに列挙しない。
【０１５８】
代わりとして、本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、式「ｎ〜ｃ」（ｎおよびｃを含む）によって示され；「ｎ」は、ポリペプチドのＮ末端最高アミノ酸位置に等しく（配列表によって定義される）、「ｃ」は、ポリペプチドのＣ末端最高アミノ酸位置に等しく（配列表によって定義される）、さらに「ｎ」は、１から、本発明の完全長ポリペプチド配列のアミノ酸数−６の間の整数に等しく；「ｃ」は、７から、完全長ポリペプチド配列のアミノ酸数の間の整数に等しく；「ｎ」は、「ｃ」より少なくとも６小さい整数である。したがって、配列番号：２において提供される配列の場合、「ｎ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２からなる群から選択される任意の整数であり；「ｃ」は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７または２９８からなる群から選択される任意の整数である。「ｎ」および「ｃ」位置のあらゆる組み合わせが、本発明の特定の実施形態として包含される。さらに、式「ｎ」〜「ｃ」は、「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ１〜ｃ２」と変更することが可能であり、「ｎ１〜ｎ２」および「ｃ１〜ｃ２」は、配列表のアミノ酸位置を表す上記の任意の２つの整数から選択される位置範囲を表す。代替の式は、「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ」および「ｎ」〜「ｃ１〜ｃ２」を含む。好ましい実施形態において、ＧＺＩＰのα１およびα２ドメインを含むポリペプチド断片は、上記の式（配列番号：２において、ｎ１＝２１、ｎ２＝３３、およびｃ１＝１８２、ｃ２＝２０４）によって；または上記の式（配列番号：３において、��１＝１８、ｎ２＝３０、およびｃ１＝１７９、ｃ２＝２０１）によって示すことができる。
【０１５９】
他の好ましい実施形態において、本発明のＧＺＩＰポリペプチド断片のα３ドメインは、上記の式（配列番号：２において、ｎ１＝２０５、ｎ２＝２２０、およびｃ１＝２４３、ｃ２＝２９８）によって；または上記の式（配列番号：３において、ｎ１＝２０２、ｎ２＝２１７、およびｃ１＝２４０、ｃ２＝２９５）によって示すことができる。
【０１６０】
好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、１８０〜２５１、１９２〜２５１、２０４〜２５１、２２１〜２５１、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。
【０１６１】
他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１７７〜２４８、１８９〜２４８、２０１〜２４８、２１８〜２４８、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。
【０１６２】
これらの特定の実施形態、および本明細書に記載の他のポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片は、「少なくとも」、「等しい」、「以下」、「未満」、「少なくとも＿であるが、＿以下」または「＿から（〜）＿」の指定のサイズまたは指定のＮ末端もしくはＣ末端位置であるように修正される。本発明のいずれかの実施形態を説明するために使用されるすべての範囲は、別段の指定がない限り包含的であることに留意する。
【０１６３】
本発明は、上述のように、アミノ酸残基のＮ末端およびＣ末端位置によって指定される個々の任意の断片、またはアミノ酸残基のサイズによって指定される任意の断片の除外もまた提供される。さらに、上述のように、アミノ酸残基のＮ末端およびＣ末端位置によって、またはアミノ酸残基のサイズによって指定される任意の数の断片を個々の種として除外することが可能である。さらに、上述のように、アミノ酸残基のＮ末端およびＣ末端位置によって、またはアミノ酸残基のサイズによって指定される任意の数の断片は、任意の組み合わせでポリペプチド断片を構成することが可能であり、任意に、非ＧＺＩＰポリペプチド配列も含み得る。
【０１６４】
好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、１８０〜２５１、１９２〜２５１、２０４〜２５１、２２１〜２５１、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。他の好ましい実施形態において、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１７７〜２４８、１８９〜２４８、２０１〜２４８、２１８〜２４８、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。さらに好ましい実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸から選択される。他の好ましい実施形態では、予想外の活性を有するＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸から選択される。
【０１６５】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド断片のＮ末端にシグナルペプチドを付加する方法であって、前記シグナルペプチドが前記ポリペプチドの分泌を促進する働きをする方法を特徴とする。前記シグナルペプチドは、配列番号：２の１〜２０位のアミノ酸（ＭＶＲＭＶＰＶＬＬＳＬＬＬＬＬＧＰＡＶＰ）または配列番号：３の１〜１７位のアミノ酸（ＭＶＰＶＬＬＳＬＬＬＬＬＧＰＡＶＰ）から選択されることが好ましい。
【０１６６】
本発明のＧＺＩＰポリペプチド、およびその断片には、変異体、断片、上述のＧＺＩＰポリペプチド断片の類似体および誘導体、例えば修飾ＧＺＩＰポリペプチド断片などが含まれる。
変異体（variant）
タンパク質の構造または機能に著しく影響を及ぼすことなく、本発明のＧＺＩＰポリペプチド配列の一部のアミノ酸を変えることができ；活性を決定する配列中の重要なアミノ酸が存在することは、当業者であれば理解されよう。したがって、本発明はさらに、上述の代謝関連活性を有するＧＺＩＰポリペプチドの変異体を包含する。かかる変異体は、自然突然変異による、あるいは活性にほとんど影響を及ぼさないように、当技術分野で公知の一般的な規則に従って選択されるヒトの操作による、１つまたは複数のアミノ酸欠失、挿入、転化、反復、および置換を有するＧＺＩＰポリペプチド配列を含む。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を行う方法に関する指標は以下に示す。
【０１６７】
変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究するための主な２つのアプローチがある(Bowie, et al. (1990) Science, 247,1306-10参照)。第１の方法は、突然変異が受け入れられるか、または自然淘汰によって排除される、進化の過程に基づく。第２のアプローチでは、機能を保持する配列を同定するために、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入する遺伝子操作、および選択またはスクリーニングが用いられる。
【０１６８】
これらの研究から、タンパク質はアミノ酸の置換に対して驚くほど耐性であることが明らかとなっており、そのタンパク質の特定位置でどのアミノ酸変化が許容性であるらしいかが示されている。例えば、大部分の埋もれているアミノ酸残基が非極性側鎖を必要とするのに対して、一般的に表面側鎖の特徴はほとんど保存されない。他のかかる表現型的にサイレントな置換は、Bowie et al. (上記) によって記述されており、参考文献がそれに記載されている。
【０１６９】
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の場合には、１つまたは複数のアミノ酸を「同等な」アミノ酸によって置き換えることができる。「同等な」アミノ酸という表現は、ペプチド化学の当業者であれば、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないことは予想されるように、同様な特性を有するアミノ酸のうちの１つと置き換えられるいずれかのアミノ酸を示す。
【０１７０】
特定の実施形態において、好ましい置換という表題のもとに、対象の保存的置換を表１に示す。かかる置換によって生物活性の変化が生じた場合、次いで、表４における例示的置換と呼ばれる、またはアミノ酸の分類を参照して以下でさらに述べられる、さらに実質的な変化が導入され、その産物がスクリーニングされる。
【０１７１】
【表１】
2005511088.tif 000002
ＧＺＩＰポリペプチドの機能または免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス構造としての、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク；の保持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然の残基は、一般的な側鎖の特性：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ； 
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
に基づく基に分けられる。
【０１７２】
非保存的置換には、これらの分類のうちの１つのメンバーを他の分類に交換する必要があるだろう。置換されたかかる残基は、保存的置換部位に、またはさらに好ましくは残りの（非保存）部位に導入することもできる。
【０１７３】
オリゴヌクレオチド仲介(部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャン、およびＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野で公知の方法を用いて、変異を生じさせることができる。部位特異的突然変異誘発[Carter et aL, Nucl. Acids Res. , 13: 4331 (1986) ; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987) ]、カセット突然変異誘発 [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)]、制限選択（restriction selection）突然変異誘発 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London 血清, 317: 415 (1986) ] または他の公知の技術をクローン化ＤＮＡに実施して、ＧＺＩＰ変異ＤＮＡを作製することができる。
【０１７４】
スキャンによるアミノ酸解析を用いて、隣接する配列に沿って１つまたは複数のアミノ酸を同定することもできる。好ましいスキャン用アミノ酸としては、比較的小さな、中性アミノ酸が挙げられる。かかるアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。このグループの中では、β炭素を超える側鎖を除去し、かつ変異体の主鎖構造を変える可能性が低いため、アラニンが一般に好ましいスキャン用アミノ酸である［Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989) ]。アラニンは最も一般的なアミノ酸であることからも、一般に好ましい。さらに、それは包埋および露出部分の両方でしばしば見出される[Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co. , N. Y. ) ; Chothia, J. Mol. Biol. , 150: 1 (1976) ]。アラニンの置換によって、適切な量の変異が得られない場合、イソスター（isoteric）のアミノ酸を用いることができる。
【０１７５】
機能に必須である、本発明のＧＺＩＰポリペプチド配列におけるアミノ酸もまた、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンによる突然変異誘発などの当技術分野で公知の方法によって同定することができる（例えば、Cunningham, et al. (1989) Science 244 (4908) : 1081-5）。後者の手順によって、分子中のあらゆる残基で単一アラニン突然変異が誘導される。次いで、上述のアッセイを用いて、得られた突然変異分子を代謝関連活性について試験する。凝集が少ないなどの、非常に望ましい改善された特性を有するタンパク質を生成することが可能な、他の荷電もしくは中性アミノ酸での荷電アミノ酸の置換は特に興味深い。凝集塊は免疫原性であり得ることから、薬学的または生理学的に許容される製剤を調製する場合、凝集は活性を低減するだけでなく、問題もある（Pinckard, et al. , (1967) Clin. Exp. Immunol 2: 331-340; Robbins, et al. , (1987) Diabetes Ju1 ; 36 (7): 838-41 ; and Cleland, et al. , (1993) Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 10 (4): 307-77）。
【０１７６】
このように、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの断片、誘導体、類似体またはホモログとしては、例えば：（ｉ）そのアミノ酸残基の１つまたは複数が保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、かかる置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるものである、またはそうではない（つまり、非天然アミノ酸である）；または（ｉｉ）そのアミノ酸残基の１つまたは複数が置換基を含むもの；または（ｉｉｉ）ＧＺＩＰポリペプチドが、その断片の半減期を増加させる化合物などの他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されるもの；または（ｉｖ）その他のアミノ酸が、断片の上記の形、例えばＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列もしくは分泌配列、または断片の上記の形の精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列に融合されるもの；などが挙げられる。かかる断片、誘導体および類似体は、本明細書における教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１７７】
本発明のさらなる実施形態は、５０個以下の保存的アミノ酸置換、４０個以下の保存的アミノ酸、３０個以下の保存的アミノ酸、および２０個以下の保存的アミノ酸置換であるが、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含有するアミノ酸配列を有する、ＧＺＩＰポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の保存的アミノ酸置換であるが、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、ＧＺＩＰ断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた提供する。
【０１７８】
さらに、アミノ酸は、Ｌ体またはＤ体いずれかのうちのキラリティーを有する。一部の実施形態において、キラル体内で半減期を延ばすために、本発明のＧＺＩＰポリペプチド断片におけるアミノ酸のキラリティーを変化させることが好ましい。このように、一部の実施形態では、アミノ酸の１つまたは複数が、Ｌ立体配置にあることが好ましい。他の実施形態では、アミノ酸の１つまたは複数が、Ｄ立体配置にあることが好ましい。
同一性割合
本発明のポリペプチドには、上述のＧＺＩＰポリペプチドと、少なくとも５０％同一の、少なくとも６０％同一の、または７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。ＧＺＩＰポリペプチドと、少なくとも、例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのアミノ酸配列が、ＧＺＩＰポリペプチドアミノ酸配列のアミノ酸１００個それぞれにつき、５個までのアミノ酸の変化を含み得ることを除いては、ＧＺＩＰポリペプチド配列と同一であることを意味する。参照配列は、配列番号：２または３に提供される配列に相当する配列を有するＧＺＩＰポリペプチドである。このように、ＧＺＩＰポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、配列中のアミノ酸残基の５％まで（１００個のうち５個）が、ＧＺＩＰポリペプチド配列と比較して、挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換される。これらの変化は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端で、またはそれらの末端位置間で生じ、配列中の残基の間に個々に、または配列内の１つまたは複数の隣接基に散在し得る。
【０１７９】
実際問題として、特定のいずれかのポリペプチドが、ＧＺＩＰポリペプチドと何パーセント同一であるかを、公知のコンピューター・プログラムを用いて従来の方法で決定することができる。かかるアルゴリズムおよびプログラムとしては、決して限定されないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷが挙げられる(Pearson and Lipman, (1988) Proc Natl Acad Sci USA Apr; 85 (8): 2444-8; Altschul et al. , (1990) J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410; Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673- 4680; Higgins et al. , (1996) Meth. Enzymol. 266: 383-402; Altschul et al. , (1997) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul et al. , (1993) Nature Genetics 3: 266-272)。特に好ましい実施形態において、タンパク質および核酸配列の相同性は、当技術分野でよく知られているベーシック・ローカル・アライメント検索ツール(「ＢＬＡＳＴ」) を用いて評価される（Karlin and Altschul (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar; 87 (6): 2264-8; Altschul et al. , 1990,1993, 1997（すべて上記の）を参照のこと）。特定の５つのＢＬＡＳＴプログラムを使用して、特に以下のタスクが実行される：
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３により、アミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮにより、ヌクレオチド問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸにより、問い合わせヌクレオチド配列（両方の鎖）の６つの枠の概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮにより、問い合わせタンパク質配列を、６つすべての読み枠で翻訳されたヌクレオチド配列（両方の鎖）データベースと比較する；
（５）ＴＢＬＡＳＴＸにより、ヌクレオチド問い合わせ配列の６つの枠の翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６つの枠の翻訳と比較する。
【０１８０】
ＢＬＡＳＴプログラムは、問い合わせアミノ酸もしくは核酸配列と、タンパク質もしくは核酸配列データベースから得られることが好ましい試験配列との間の、本明細書において「高スコアのセグメント対」と呼ばれる類似セグメントを同定することによって相同配列を同定する。その多くが当技術分野で公知であるスコアリングマトリックスを用いることによって、高スコアのセグメント対を同定（つまり、アライメント）することが好ましい。使用するスコアマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス(Gonnet et al., (1992), Science 256: 1443-1445; Henikoff and Henikoff, (1993), Proteins 17: 49-61)であることが好ましい。好ましさは低いが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用することができる（例えば、Schwartz and Dayhoff, (1978), eds., Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National 生物医学的 Research Foundation参照)。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された高スコアのすべてのセグメント対の統計的有意性を評価し、好ましくはユーザーによって指定された相同性割合など、ユーザーによって指定された有意性の閾値を満たすそれらのセグメントを選択する。高スコアのセグメント対の統計的有意性は、カーリンの統計的有意性の式（例えば、Karlin and Altschul, (1990) Proc Natl Acad Sci USA Mar; 87 (6): 2264-8参照）を用いて評価することが好ましい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ユーザーによって提供されるデフォルトパラメーターを用いて、または変更されたパラメーターを用いて使用することが可能である。パラメーターはデフォルトパラメーターであることが好ましい。
【０１８１】
大域的配列アライメントとも呼ばれる、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列（本発明の配列）と対象の配列との最高の全体的マッチを決定する他の好ましい方法は、Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6: 237-245のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピューター・プログラムを用いて決定することができる。配列アライメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列はどちらもＤＮＡまたはアミノ酸配列である。前記大域的配列アライメントの結果は、同一性割合で示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸のアライメントに使用される好ましいパラメーターは：マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ（Joining Penalty）＝２０、無作為化群＝２５、長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７、または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれか短いほう）。
【０１８２】
内部の欠失のためではなく、Ｎ末端もしくはＣ末端欠失のために、対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合には、手作業でその結果に補正を加えなければならない。というのは、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、同一性割合を計算する場合に対象配列のＮ末端もしくはＣ末端切断を計算に入れていないからである。Ｎ末端もしくはＣ末端で切断された対象配列では、問い合わせ配列に対して、同一性割合は、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして、相当する対象の残基とマッチ／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基数を計算することによって補正される。残基がマッチ／アラインされているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、指定のパラメーターを用いて、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントからこのパーセンテージを減算し、最終的な同一性スコア割合が得られる。この最終の同一性スコア％は、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列とマッチ／アラインされない、対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基のみが、同一性割合スコアを手作業で調整する目的のために考慮される。つまり、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基外の問い合わせアミノ酸残基のみである。
【０１８３】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を１００残基の問い合わせ配列とアライメントし、同一性割合を決定する。欠失は、対象配列のＮ末端で生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアライメントは、Ｎ末端の最初の残基とマッチ／アラインしない。１０個の不対残基は、配列の１０％（マッチしていないＮ末端およびＣ末端の残基数／問い合わせ配列における残基の総数）であり、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性スコア割合から１０％が減算される。残りの９０残基が完全にマッチする場合、最終同一性割合は９０％であるだろう。
【０１８４】
他の実施例において、９０残基の対象配列が１００残基の問い合わせ配列と比較される。この時、欠失が内部であり、そのため、問い合わせ配列とマッチ／アラインしない対象配列のＮ末端もしくはＣ末端の残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性割合は手作業で補正されない。再度、問い合わせ配列とマッチ／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアライメントに示される対象配列のＮ末端およびＣ末端外の残基位置のみが、手作業で補正される。本発明の目的のために、手作業での他の補正は加えられない。
産生
開示内容全体にわたり、ＧＺＩＰポリペプチドがどこに記述されていようとも、ＧＺＩＰ断片、変異体および誘導体が、ＧＺＩＰポリペプチドの好ましいサブセットとして包含されることが特に意図されることに留意されたい。
【０１８５】
ＧＺＩＰポリペプチドは、ヒトもしくは哺乳動物組織から単離されるか、またはヒトまたは哺乳動物細胞においてヒトまたは哺乳動物遺伝子から発現されることが好ましい。本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、当技術分野で公知の通常の発現方法を用いて作製することができる。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、簡便ないずれかの宿主に適した発現ベクターに連結される。真核生物および原核生物の宿主系のどちらも、組換えポリペプチドの形成に使用される。次いで、そのポリペプチドを溶解細胞または培地から単離し、その目的の用途に必要とされる程度まで精製する。いずれかの本発明のポリヌクレオチドを使用して、ＧＥＮＳＥＴポリペプチドを発現させることができる。次いで、そのポリペプチドを溶解細胞または培地から単離し、その目的の用途に必要とされる程度まで精製する。当技術分野で公知のいずれかの技術、例えば、差次的抽出、塩分画、クロマトグラフィー、遠心分離等による精製である。例えば、タンパク質を精製するための様々な方法についてのMethods in Enzymology（酵素学における方法）を参照のこと。
【０１８６】
代替の実施形態において、本発明のポリペプチドは乳から単離される。本発明のポリペプチドは、完全長ＧＺＩＰポリペプチドとして精製することが可能であり、次いでしかるべき場合にインビトロで切断して、ＧＺＩＰ断片を作製することが可能であり、または代替方法として、ＧＺＩＰ断片自体を乳から精製することができる。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる：Protein Purification Applications, A Practical Approach (New Edition), Edited by Simon Roe, AEA Technology Products and Systems, Biosciences, Harwell; Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3: 337-50; Wilkins and Velander (1992) 49: 333-8; 米国特許第６，１４０，５５２号；同第６，０２５，５４０号; Hennighausen, Protein Expression and Purification, vol. 1, pp. 3-8 (1990); Harris et al. (1997) Bioseparation 7: 31-7; Degener et al. (1998) J. Chromatog. 799: 125-37; Wilkins (1993) J. Cell. Biochem. Suppl. 0 (17 part A):に教示されている方法を含む、多数の方法のいずれかを用いて、本発明のポリペプチドを乳から精製することができる。通常の実施形態において、例えば比較的低い速度で乳を遠心分離して、脂質画分を分離し、次いで水性上清を高速で遠心分離して、乳中のカゼインを残りの「乳清」画分から分離する。この乳清画分中に生物医学的タンパク質が見出されることが多く、例えば本出願の他で記述されているように、タンパク質精製に一般に使用される標準クロマトグラフィーまたは他の手順を用いて、そのタンパク質をこの画分から単離することができる。
【０１８７】
好ましい一実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチドは、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ＧＺＩＰポリペプチドに特異的な抗体を使用して精製される。さらに、例えば、特定サイズのタンパク質を単離する電気泳動法または他の方法を用いて、特定のＧＺＩＰ断片を単離することができる。これらの方法を用いて単離されるＧＺＩＰポリペプチドは、ＧＺＩＰポリペプチドは哺乳類の乳に天然に存在することが発見されていることから天然であるか、あるいは、以下に記述するように非ヒト哺乳動物の乳腺中のタンパク質の組換えによる産生の結果であり得る。かかる一実施形態において、ＧＺＩＰは、異種の抗原ポリペプチド配列との融合タンパク質として産生される。その抗原配列は、例えば標準のイムノアフィニティー方法論を用いて、タンパク質を精製するために用いることができる。
【０１８８】
さらに、短いタンパク質断片を化学合成によって作製することが可能である。代替方法としては、本発明のタンパク質は、ヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出される。タンパク質を精製する方法は当技術分野で公知であり、洗浄剤またはカオトロピック剤を使用して粒子を乱し、続いてポリペプチドの差次的抽出（differential extraction）およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる分離を行い、密度によって沈降させ、ゲル電気泳動を行うことを含む。
【０１８９】
配列番号：２または３におけるｃＤＮＡを含む、いずれかのＧＺＩＰ ｃＤＮＡを使用して、ＧＺＩＰポリペプチドを発現させることができる。発現されるＧＺＩＰをコードする核酸は、従来のクローニング技術を用いて、発現ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結される。発現ベクター中のＧＺＩＰ ｃＤＮＡインサートは：完全長ＧＺＩＰポリペプチド（後に修飾される）；６個のアミノ酸から、完全長ＧＺＩＰポリペプチドよりも６アミノ酸短い、任意の整数個のアミノ酸；ＧＺＩＰ断片；または変異体および類似性（％）のポリペプチド；のコード配列を含み得る。
【０１９０】
発現ベクターは、当技術分野で公知の哺乳動物、酵母、昆虫または細菌の発現系のいずれかであり、そのいくつかは本明細書に記述されている。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社 (マサチューセッツ州ケンブリッジ)、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 (カリフォルニア州ラ・ホーヤ)、Ｐｒｏｍｅｇａ社 (ウィスコンシン州マディソン)、およびＩｎｖｉｋｏｇｅｎ社 (カリフォルニア州サンディエゴ)などの様々な供給業者から入手可能である。所望の場合には、発現を高め、かつ適切なタンパク質の折り畳みを促進するために、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hatfieldらの米国特許第５，０８２，７６７号によって説明されているように、発現ベクターが導入される特定の発現生物に対して、配列のコドンのコンテクストおよびコドン対形成（codon pairing）を最適化することができる。
【０１９１】
ＧＺＩＰポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸が開始部位として働くメチオニンを欠く場合、従来の技術を用いて、核酸の最初のコドンの次に、開始メチオニンを導入することができる。同様に、ＧＺＩＰポリペプチドｃＤＮＡからのインサートがポリＡシグナルを欠く場合には、例えば、ＢｇｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からポリＡシグナルをスプライシングし、哺乳動物発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に組み込むことによって、この配列をコンストラクトに付加することができる。ｐＸＴｌは、ＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウイルス由来のｇａｇ遺伝子の一部を含有する。コンストラクトにおけるＬＴＲの位置によって、効率的な、安定なトランスフェクションが可能となる。そのベクターとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子が挙げられる。
【０１９２】
ＧＺＩＰをコードする配列がポリＡシグナルに対して適切に位置付けられるように注意して、目的のＧＺＩＰ ｃＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＧＺＩＰヌクレオチド配列を含有し、かつ５’プライマーに組み込まれるＰｓｔ Ｉおよび相当するｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端のＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ配列を含有するベクターから、ＰＣＲによって、ＧＺＩＰをコードする核酸が得られる。ＰＣＲ反応から得られる精製ポリヌクレオチドは、ＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端化され、ＢｇｌＩＩで消化され、精製され、ｐＸＴ１に連結され、ここでポリＡシグナルを含有し、ＢｇｌＩＩで消化される。
【０１９３】
マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞へのＧＺＩＰ発現ベクターのトランスフェクションは、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入の一実施形態である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、カチオン性脂質仲介トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染、または他の方法によって行うことができる。かかる方法は、Davisら( (1986) Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co. , Inc. , Amsterdam)などの多くの標準的実験マニュアルに記述されている。本発明のポリペプチドを実際に、組換えベクターを欠く宿主細胞によって発現させることが具体的に企図される。
【０１９４】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどのよく知られている方法によって組換え細胞培養物から回収かつ精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いられることが最も好ましい。本発明のポリペプチド、好ましくは、分泌型は：直接単離されていようと、または培養されていようと、天然源から精製された産物、例えば体液、組織および細胞；化学合成手順の産物；および原核生物または真核生物宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞などから、組み換え技術によって産生された産物；から回収することもできる。
【０１９５】
組換えによる作製手順に用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、グリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドは非グリコシル化ポリペプチドであることが好ましい。さらに、本発明のポリペプチドは、場合によっては、宿主仲介プロセスの結果として、修飾メチオニン残基も含み得る。このように、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは一般に、すべての真核細胞における翻訳後に、いずれかのタンパク質から高効率で除去されることは当技術分野でよく知られている 。大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンもまた、大部分の原核生物において効率的に除去されるが、一部のタンパク質に関しては、原核生物のこの除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合されるアミノ酸の性質に応じて不十分である。
【０１９６】
本明細書に記述されるベクターコンストラクトを含有する宿主細胞の包含に加えて、内因性遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失または置換するために、または本発明のポリヌクレオチドと作動可能に結び付けられ、かつ内因性ポリヌクレオチドを活性化、変更および／または増幅する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含ませるために操作された、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の一次、二次、および不死化宿主細胞も包含する。例えば、当技術分野で公知の技術を用いて、異種制御領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）および内因性ポリヌクレオチド配列を相同的組換えにより作動可能に結び付けることが可能である。例えば、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、１９９７年６月１４日発行の米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開番号：ＷＯ９６/２９４１１;１９９４年８月４日公開の国際公開番号：ＷＯ９４/１２６５０; Koller et al. , (1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov; 86 (22): 8932-5; Koller et al. , (1989) Proc Natl Acad Sci USA Nov; 86 (22): 8927-31 ; and Zijlstra et al. (1989) Nature Nov 23; 342 (6248) : 435-8；参照のこと。
修飾
さらに、本発明のポリペプチドは、当技術分野で公知の技術を用いて化学的に合成することができる（例えば、Creighton, 1983 Proteins. New York, New York: W. H. Freeman and Company; andHunkapilleretal., (1984) Nature Jul 12-18; 310 (5973): 105-11参照）。例えば、本発明の比較的短い断片は、ペプチド合成装置を使用して合成することができる。さらに、所望の場合には、非古典的アミノ酸または化学アミノ酸類自体を、断片配列中に置換または付加で導入することができる。非古典的アミノ酸には、限定されないが、一般的アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナー・アミノ酸、例えばｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体全体が含まれる。さらに、そのアミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることが可能である。
【０１９７】
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合等により、翻訳中または翻訳後に差次的に修飾されるポリペプチドを包含する。数多くの化学修飾のいずれも、公知の技術、限定されないが例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などによって行うことができる。
【０１９８】
本発明により包含されるその他の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ−結合型またはＯ−結合型糖鎖、Ｎ−末端またはＣ-末端の処理、アミノ酸主鎖への化学部位の結合、Ｎ−結合型またはＯ−結合型糖鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞の発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる。ポリペプチドを検出かつ単離することできるように、ポリペプチドを検出可能な標識、例えば酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識で修飾することもできる。
【０１９９】
さらなる利点、例えばポリペプチドの増大した溶解性、安定性および循環時間、または減少した免疫原性を提供する、本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体も本発明によって提供される。米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。誘導体化のための化学部位は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。ポリペプチドは、分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾され、１つ、２つ、３つ以上の結合化学部位を含む。
【０２００】
そのポリマーは、任意の分子量であり、分枝鎖または枝なし鎖である。ポリエチレングリコールの場合には、取り扱いおよび製造を容易にするために、好ましい分子量は約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａである（「約」という言葉は、ポリエチレングリコールの製造において、一部の分子が、記載の分子量よりもいくらか多い、少ない重さであるだろうことを示している）。目的の治療プロファイル（例えば、所望の徐放期間、たとえあったとして生物活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療用タンパク質もしくは類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いることもできる。
【０２０１】
ポリペプチドの機能ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮して、ポリエチレングリコール分子（または他の化学部位）をポリペプチドに結合させるべきである。当業者には利用可能な多くの結合法が存在する。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ ０ ４０１ ３８４（ＰＥＧとＧ−ＣＳＦとの共役）、Malik et al. (1992) Exp Hematol. Sep ; 20 (8): 1028-35（塩化トレシル（Tresyl Chloride）を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告している）も参照のこと。例えばポリエチレングリコールは、遊離アミノ基またはカルボキシル基などの反応性基を介してアミノ酸残基により二重結合される。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子がそれに結合することができる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が含まれ；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基には、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が含まれる。ポリエチレングリコール分子を結合させるために、反応性基として、スルフヒドリル基も用いることができる。治療の目的に好ましいのは、アミノ基での結合、例えばＮ末端もしくはリジン基での結合である。
【０２０２】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に望ましい。本発明の組成物の例証としてポリエチレングリコールを用いて、様々なポリエチレングリコール分子から（分子量、分岐等によって）、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子とタンパク質（ポリペプチド)分子の割合、行われるペグ化反応の種類、および選択されたＮ末端ペグ化（N-terminally pegylated）タンパク質を得る方法を選択することが可能である。Ｎ末端ペグ化調製物を得る方法（必要であれば、他のモノペグ化部位からこの部位を分離する）は、ペグ化タンパク質分子の集団から、Ｎ末端ペグ化物質を精製することによる方法であり得る。Ｎ末端で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用することが可能な、異なる種類の一級アミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の差次的反応性を利用する、還元アルキル化によって達成される。適切な反応条件下にて、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
多量体
本発明のポリペプチドは、単量体または多量体（つまり、二量体、三量体、四量体以上の）形であることが可能である。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの単量体または多量体、それらの製造、およびそれらを含有する組成物（好ましくは、薬学的または生理学的に許容される組成物）に関する。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。その他の実施形態において、本発明の多量体は、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
【０２０３】
本発明によって包含される多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであることが可能である。本明細書で使用される「ホモマー」という用語は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドに対応するポリペプチドのみ（ポリペプチド断片、変異体、スプライスバリアント、および本明細書に記載されるこれらのポリペプチド断片に対応する融合タンパク質）を含有する多量体を意味する。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含有し得る。特定の実施形態において、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド断片のみを含有する多量体である。他の特定の実施形態において、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含有する多量体である。特定の実施形態では、本発明の多量体は、ホモ二量体 （例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する）またはホモ三量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する）である。その他の実施形態では、本発明のホモ多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
【０２０４】
本明細書において使用される、ヘテロマーという用語は、本発明のポリペプチドに加えて、１種または複数種の異種ポリペプチド（つまり、異なるタンパク質またはそのポリペプチドに相当する）を含有する多量体である。特定の実施形態において、本発明の多量体は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体である。その他の実施形態では、本発明のヘテロ多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体、または少なくともヘテロ四量体である。その他の特定の実施形態では、本発明のヘテロ多量体は、ＧＺＩＰポリペプチド断片およびＡＰＭ１ポリペプチド断片を含有し、好ましくは、前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片はｇＡＰＭ１ポリペプチド断片である。
【０２０５】
本発明の多量体は、疎水結合、親水結合、イオン結合および／または共有結合の結果であるか、または例えばリポソーム形成によって間接的に連結される。このように、一実施形態において、本発明の多量体、例えばホモ二量体またはホモ三量体などは、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触すると形成される。別の実施形態では、本発明のヘテロ多量体、例えばヘテロ三量体またはヘテロ四量体などは、本発明のポリペプチドが溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触すると形成される。他の実施形態において、本発明の多量体は、本発明のポリペプチドとの共有結合または本発明のポリペプチド間の共有結合によって形成される。かかる共有結合は、ポリペプチド配列に含まれる１つまたは複数のアミノ酸残基（例えば、配列表に記載されている、または寄託クローンによってコードされるポリペプチドに含まれる）を要する。一例において、その共有結合は、天然（つまり、天然に存在する）ポリペプチにおいて相互作用する、ポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。その他の例では、その共有結合は、化学的または組換え操作の結果である。その代わりとしては、かかる共有結合は、本発明の融合タンパク質における異種ポリペプチド配列に含まれる１つまたは複数のアミノ酸残基を要する。
【０２０６】
一実施形態において、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。特定の例において、その共有結合は、本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（本明細書に記述されるように）。その他の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、例えば破骨細胞形成阻害因子（osteoprotegerin）などの共有結合した多量体を形成することができる他のタンパク質からの異種ポリペプチド配列間にある（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開番号：ＷＯ９８／４９３０５参照）。他の実施形態において、本発明の２種類以上のポリペプチドはペプチドリンカーによって連結される。その例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分けられる本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて作製することが可能である。
【０２０７】
本発明の多量体ポリペプチドを作製する他の方法は、ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合される本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは最初に、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され、それ以来、様々なタンパク質で見出されている(Landschulz et al., (1988) Genes Dev. Jul ; 2 (7): 786-800)。公知のロイシンジッパーの中では、二量体化または三量体化する、天然ペプチドおよびその誘導体が挙げられる。本発明の可溶性多量体タンパク質を作製するのに適したロイシンジッパードメインの例としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開番号：ＷＯ９４／１０３０８に記載のドメインが挙げられる。溶解状態で二量体化または三量体化するポリペプチド配列に融合される本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、その結果得られた可溶性多量体融合タンパク質は、当技術分野で公知の技術を用いて、培養上清から回収される。
【０２０８】
本発明の三量体のポリペプチドは、向上した生物活性の利点を提供する。好ましいロイシンジッパー部位およびイソロイシン部位は、三量体を優先的に形成する部位である。一例は、参照により本明細書に組み込まれる、Hoppe et al. FEBS Letters (1994) May 16 ; 344 (2-3): 191-5および米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載の肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。本発明の三量体ポリペプチドの製造において、天然の三量体タンパク質に由来する他のペプチドを用いることもできる。別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列を含有する本発明の融合タンパク質に含まれる、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド間の相互作用によって結び付けられる。さらなる実施形態において、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と、Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結び付けられる。
【０２０９】
本発明の多量体は、当技術分野で公知の化学技術を用いて作製することが可能である。例えば、リンカー分子および当技術分野で公知のリンカー分子長さ最適化技術を用いて、本発明の多量体に含まれることが望ましいポリペプチドを化学的に架橋することができる（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、本発明の多量体を作製し、多量体に含まれることが望ましいポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間で１つまたは複数の分子間架橋を形成することができる（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステインまたはビオチンを付加することによって、通常通り修飾することが可能であり、当技術分野で公知の技術を適用し、これらの修飾ポリペプチドの１種または複数種を含有する多量体を作製することができる（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。さらに、当技術分野で公知の少なくとも３０種類の技術を適用し、本発明の多量体に含まれることが望ましいポリペプチド成分を含有するリポソームを作製することができる（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。
【０２１０】
代替方法としては、当技術分野で公知の遺伝子工学技術を用いて、本発明の多量体を作製することができる。一実施形態において、本発明の多量体中に含まれるポリペプチドは、明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換えにより作製される（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。特定の実施形態において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをリンカーポリペプチドに連結し、次いで、さらに元のＣ末端からＮ末端の逆向きにポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連結することによって作製される（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。他の実施形態において、明細書に記載の、またはそうでなければ当技術分野で公知の組換え技術を適用し、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含有し、かつ膜再構成技術によってリポソーム中に組み込むことができる、組換えポリペプチドが作製される（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７８，９２５号参照）。
ＩＩ．本発明のＧＺＩＰポリヌクレオチド
好ましいポリヌクレオチドは、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ＧＺＩＰポリヌクレオチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、限定されないが、その活性のアンタゴニストおよびアゴニストについてのスクリーニングアッセイで使用される組換え細胞中のポリペプチドの発現を含む様々な方法において、ならびに限定されないが、その活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイを含む様々な方法で用いられるその精製を容易にするため、診断スクリーニングおよび抗体の産生、ならびに代謝関連疾患および障害の治療または予防または体重減少のために用いることができる。
【０２１１】
本発明は、本明細書に記載の、ＧＺＩＰポリペプチドおよびその変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、精製、単離、または組換えポリヌクレオチドであり得る。すべての場合において、本発明の目的のＧＺＩＰポリヌクレオチドは、本明細書に記載かつ記述されているように代謝関連活性を有する、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
断片
ポリヌクレオチド断片は、完全長ＧＺＩＰポリペプチドのすべてではないが一部と完全に同一の配列、または指定のＧＺＩＰポリペプチドのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。かかる断片は「独立」しており、つまり他のポリヌクレオチドの一部ではない、または他のポリヌクレオチドに融合していない、あるいは、それらがその一部または領域を形成する別の非ＧＺＩＰ（異種）ポリヌクレオチド内に含まれる。しかしながら、いくつかのＧＺＩＰポリヌクレオチド断片は、単一ポリヌクレオチド内に含まれる。
【０２１２】
本発明のＧＺＩＰポリヌクレオチドは、１８個の連続した塩基から、インタクトなＧＺＩＰポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチド配列、例えば配列番号：１における完全長ＧＺＩＰポリペプチドのポリヌクレオチド配列よりも１８個の連続した塩基分短い数の塩基を含む。この実施形態の一態様において、そのポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７４０、７７０、８００、８５０、または８９７個の連続するヌクレオチドを含む。
【０２１３】
上記の好ましい核酸サイズの他に、さらに好ましい核酸は、少なくとも１８ヌクレオチドを含み、「少なくとも１８」とは、１８と、配列番号：１または本明細書の他で示されるインタクトなＧＺＩＰポリペプチドｃＤＮＡの３’最高ヌクレオチド位置より低い１８ヌクレオチドを表す整数と、の間の任意の整数として定義される。
【０２１４】
好ましい本発明のポリヌクレオチドとして、それらの５'および３'位置に関してさらに指定される、上述のような少なくとも１８ヌクレオチド長さの核酸断片がさらに包含される。５’または３’位置は、以下の配列表に示される位置番号によって表される。対立遺伝子および退化（degenerate）および他の変異体に関して、１位は、ＯＲＦの５’最高ヌクレオチド、つまり開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」として定義され、残りのヌクレオチドは通し番号が付けられる。したがって、少なくとも１８隣接ヌクレオチド長さのポリヌクレオチド断片が、インタクトなＧＺＩＰポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド上で占める５’および３’ヌクレオチド位置のあらゆる組み合わせが、個々の種として本発明に包含される。５’および３’位置によって指定されるポリヌクレオチド断片はすぐに考えられ、したがって、不必要に明細書を長くするためだけにそれぞれに列挙しない。
【０２１５】
その代わりに、本発明のポリヌクレオチドの上記の種は、式「ｘ〜ｙ」によって示され；「ｘ」は、ポリヌクレオチドの５’最高ヌクレオチド位置に等しく、「ｙ」は、ポリヌクレオチドの３’最高ヌクレオチド位置に等しく；さらに、「ｘ」は、１と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数−１８との間の整数に等しく、「ｙ」は、１９と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数−１８との間の整数に等しく；「ｘ」は、「ｙ」よりも少なくとも１８小さい整数であることに留意のこと。
【０２１６】
本発明はまた、上述のように、５’および３’位置によって指定される本発明のポリヌクレオチド断片またはヌクレオチドのサイズによって指定されるポリヌクレオチドのいずれかの種を除外する。上述のように、５’および３’位置によって、またはヌクレオチドのサイズによって指定される任意の数の断片が除外され得る。
【０２１７】
本発明のＧＺＩＰポリヌクレオチド断片は、１８個の連続する塩基から、本明細書に記載のＧＺＩＰ断片をコードする完全長ポリヌクレオチド配列を含む。この実施形態の一態様において、そのポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７４０、７７０、８００、８５０、または８９７個の連続するヌクレオチドを含む。
【０２１８】
上記の好ましい核酸サイズの他に、さらに好ましい核酸は、少なくとも１８ヌクレオチドを含み、「少なくとも１８」とは、１８と、本明細書におけるＧＺＩＰ断片ｃＤＮＡの３’最高ヌクレオチド位置に相当する整数と、の間の任意の整数として定義される。
【０２１９】
本発明の好ましいポリヌクレオチドとして、それらの５'および３'位置に関してさらに指定される、上述のような少なくとも１８ヌクレオチド長さの核酸断片がさらに包含される。５’または３’位置は、以下の配列表に示される位置番号によって表される。対立遺伝子および退化（degenerate）および他の変異体に関して、１位は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’最高ヌクレオチド、つまり開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」として定義され、残りのヌクレオチドは通し番号が付けられている。したがって、少なくとも１８隣接ヌクレオチド長さの本発明のポリヌクレオチド断片が、本発明のＧＺＩＰ断片ポリヌクレオチド上で占め得る５’および３’ヌクレオチド位置のあらゆる組み合わせが、個々の種として本発明に包含される。５’および３’位置によって指定されるポリヌクレオチド断片はすぐに考えることができ、したがって、不必要に明細書を長くするためだけにそれぞれに列挙しない。
【０２２０】
その代わりとして、本発明のポリヌクレオチドの上記の種は、式「ｘ〜ｙ」によって示され；「ｘ」は、ポリヌクレオチドの５’最高ヌクレオチド位置に等しく、「ｙ」は、ポリヌクレオチドの３’最高ヌクレオチド位置に等しく；さらに、「ｘ」は、１と、本発明のＧＺＩＰポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数−１８との間の整数に等しく、「ｙ」は、９と、本発明のＧＺＩＰポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数との間の整数に等しく；「ｘ」は、「ｙ」よりも少なくとも１８小さい整数であることに留意されたい。「ｘ」および「ｙ」位置のあらゆる組み合わせが、本発明の特定の実施形態として包含される。さらに、式「ｘ」〜「ｙ」は、「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ１−ｙ２」と変更することが可能であり、「ｘ１−ｘ２」および「ｙ１−ｙ２」は、配列表のいずれか２つのヌクレオチド位置から選択される位置範囲を表す。代わりの式には、「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ」および「ｘ」〜「ｙ１−ｙ２」が含まれる。
【０２２１】
これらの特定の実施形態、および本明細書に記載の他のポリヌクレオチド断片は、「少なくとも」、「等しい」、「以下」、「未満」、「少なくとも＿であるが、＿以下」または「＿から（〜）＿」の指定のサイズまたは指定の５’もしくは３’位置であるように変更される。上述のように、５’および３’位置によって、またはヌクレオチドのサイズによって指定される任意の数の断片が除外され得る。
変異体
他の好ましい実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチドをコードするＧＺＩＰポリヌクレオチドの変異体が考えられる。本明細書で使用される用語としてのポリヌクレオチドの変異体は、その配列が参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド変異体は、自然発生する対立遺伝子変異体などの自然発生変異体であるか、または自然に発生することが知られていない変異体であり得る。ポリヌクレオチドの自然発生しないかかる変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用される技術を含む、突然変異誘発技術によって作製することが可能である。一般に、参照および変異体のヌクレオチド配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域においては、同一であるように、差異は限定されている。
【０２２２】
遺伝暗号の退化のために本発明のＧＺＩＰポリペプチドをまだコードするが、上述のものと実質的に異なる配列を含むポリヌクレオチド変異体もまた、具体的に考えられる。上述の退化変異体を作製すること、例えば特定の宿主に対するコドンの発現を最適化する（例えば、他の哺乳動物または細菌宿主細胞により、ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、好ましいコドンに変える）こともまた、当業者には公知であるだろう。
【０２２３】
上述のように、自然突然変異体などの変異ポリヌクレオチドは、自然に発生するか、または組換え法により作製される。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの他の形のうちの１つが意図される（例えば、B. Lewin, (1990) Genes IV, Oxford University Press, New York参照）。自然発生変異体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を用いて作製することができる。かかる核酸変異体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって作製された変異体が含まれる。その置換、欠失、または付加には、１つまたは複数のヌクレオチドが関与する。コード領域における変化によって、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加が引き起こされる。これらの中で特に好ましいのは、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの特性および活性を変化させない、サイレントな置換、付加および欠失である。この点から、保存的置換もまた好ましい。
【０２２４】
変異ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化は、サイレントであることが好ましく、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸をそれらが変化させないことを意味する。しかし、ヌクレオチドの変化によって、参照配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断もまた生じる場合がある。
【０２２５】
ヌクレオチドの置換によって１つまたは複数のアミノ酸の変化が生じる場合には、好ましいＧＺＩＰポリペプチドとしては、本発明の好ましい実施形態のセクションＩに記述されている、１種または複数種の代謝関連活性を保持するポリペプチドが挙げられる。
【０２２６】
「同じ活性を保持する」とは、変異ＧＺＩＰポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて、アッセイで測定された活性が、本明細書における実施例のセクションで記述されているＧＺＩＰポリペプチドを用いて測定された活性の、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり、かつ１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％または１２５％以下であることを意味する。
【０２２７】
活性が「増加」したとは、変異ＧＺＩＰポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて、アッセイで測定された活性が、本明細書における実施例のセクションで記述されているＧＺＩＰポリペプチドを用いて測定された活性の、少なくとも１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％、または５００％であることを意味する。
【０２２８】
活性が「減少」したとは、変異ＧＺＩＰポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを用いて、アッセイで測定された活性が、本明細書における実施例のセクションで記述されているＧＺＩＰポリペプチドを用いて測定された活性の、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、７５％、８０％、９０％または９５％であることを意味する。
同一性割合
本発明はさらに、本発明の好ましい実施形態のセクションＩに記載のように代謝関連活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：１のポリヌクレオチド配列またはその断片と、少なくとも０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する核酸分子に関する。当然のことながら、遺伝暗号の退化のために、配列番号：１に示される核酸またはその断片と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の多数の核酸分子が、生物活性を有するポリペプチドをコードするであろうことは、当業者であれば認識されよう。実際に、これらのヌクレオチド配列の退化変異体がすべて、同じポリペプチドをコードすることから、このことは、上述の比較アッセイを行わずとも、当業者には明らかであるだろう。退化変異体ではないかかる核酸分子については、適切な数が生物活性を有するポリペプチドをコードするであろうことは、当技術分野においてさらに認識されるだろう。これは、本発明の好ましい実施形態のセクションＩにさらに記述されているように、タンパク質の機能に著しく影響を及ぼす可能性が低い、または影響を及ぼしそうにない、アミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を２番目の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者は完全に認識しているからである。
【０２２９】
ポリヌクレオチド配列が、ＧＺＩＰポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドそれぞれにつき５つまでの点突然変異を含み得ることを除いては、本発明の参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチドを得るために、参照配列におけるヌクレオチドの５％までが欠失、挿入、または他のヌクレオチドで置換されてもよい。問い合わせ配列は全配列であるか、または本明細書に記載のように指定されるいずれかの断片である。
【０２３０】
いずれかの特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかを決定かつ定義する方法は、公知のコンピューター・プログラムを用いて行うことができる。大域的配列アライメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との最高の全体的マッチを決定する他の好ましい方法は、Brutlag et al. ( (1990) Comput Appl Biosci. Jul ; 6 (3): 23745)のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピューター・プログラムを用いて決定することができる。配列アライメントにおいて、問い合わせ配列および対象配列はどちらもＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、最初にＵ’をＴ’に変換することによって比較することができる。前記大域的配列アライメントの結果は、同一性割合で示される。同一性割合を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントに使用される好ましいパラメーターは：マトリックス＝ユニタリー、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ（Joining Penalty）＝３０、無作為化群長さ＝０、カットオフ・スコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短いほうである。
【０２３１】
内部の欠失のためではなく、５’もしくは３’欠失のために、対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合には、手作業でその結果に補正を加えなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、同一性割合を計算する場合に対象配列の５’および３’の切断を計算に入れていないからである。手作業での訂正は、対象配列における切断のためにアラインされていない全問い合わせ配列のパーセントを決定することと、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントからこのパーセントを減算することを含む。この訂正されたスコアは、本発明の目的のために使用される。本発明の目的のために、他の手作業での訂正は加えられない。５’または３’末端で切断された対象配列に関して、問い合わせ配列に対してその同一性割合は、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして、マッチ／アラインしていない、対象配列の５’および３’末端である問い合わせ配列の塩基数を計算することによって補正される。ヌクレオチドがマッチ／アラインしているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アライメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、同一性割合から減算され、指定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算され、最終的な同一性割合スコアが得られる。この補正スコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列とマッチ／アラインしない、ＦＡＳＴＤＢアライメントによって示される、対象配列の５’および３’末端ヌクレオチド以外のヌクレオチドのみが、同一性割合スコアを手作業で調整する目的のために計算される。
【０２３２】
例えば、９０ヌクレオチドの対象配列が１００ヌクレオチドの問い合わせ配列とアラインされ、同一性割合が決定される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、したがってＦＡＳＴＤＢアライメントによって、５’末端の最初の１０ヌクレオチドのマッチ／アライメントは示されない。１０個の不対ヌクレオチドは、配列の１０％（マッチしていない５’末端および３’末端のヌクレオチド数／問い合わせ配列におけるヌクレオチドの総数）であり、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性スコア％から１０％が減算される。残りの９０ヌクレオチドが完全にマッチする場合、最終的な同一性割合は９０％となるだろう。
【０２３３】
他の実施例において、９０ヌクレオチドの対象配列が１００ヌクレオチドの問い合わせ配列と比較される。この時、欠失は内部であり、そのため、問い合わせ配列とマッチ／アラインしない対象配列の５’もしくは３’末端にヌクレオチドはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性割合は手作業で補正されない。再度、問い合わせ配列とマッチ／アラインしない対象配列の５’または３’末端のヌクレオチドのみが、手作業で補正される。本発明の目的のために、手作業での他の補正は加えられない。
融合
さらなる異種アミノ酸配列のコード配列にインフレームで融合される、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがさらに本発明に包含される。さらなる非コード配列、限定されないが、例えば非コード５’および３’配列、ベクター配列、精製、プロービング、もしくはプライミングに使用される配列と共に、本発明のポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明に包含される。例えば、異種配列には、リボゾーム結合およびｍＲＮＡの安定性など、転写およびｍＲＮＡプロセッシングにおいて役割を果たす、転写、非翻訳配列が含まれる。あるいは、異種配列は、さらなる機能性を提供する、さらなるコード配列を含み得る。このように、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列などのタグ配列に融合される。本発明のこの態様の特定の好ましい実施形態において、タグアミノ酸配列は、例えば市販されている多くの中でも特に、ｐＱＥベクター(ＱＩＡＧＥＮ社（9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）)において提供されるタグなどのヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）ペプチドである。例えば、Ｈｉｓ６は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する（Gentz et al. , (1989) Proc Natl Acad Sci USA Feb; 86 (3): 821-4参照）。「ＨＡ」タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当する、精製に有用なもう１つのペプチドである（Wilson et al. , (1984) Cell 37 (3): 767-78参照）。上述のように、他のかかる融合タンパク質には、ＮまたはＣ末端でＦｃに融合されたＧＺＩＰ ｃＤＮＡが含まれる。
ＩＩＩ．  本発明の組換えベクター
「ベクター」という用語は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、かつ単細胞もしくは多細胞宿主生物に導入されることが求められる対象の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、環状もしくは直鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を示すために本明細書で用いられる。
【０２３４】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つを含む組換えベクターに関する。
【０２３５】
本発明は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを包含する。
【０２３６】
第１の好ましい実施形態において、本発明の組換えベクターを用いて、挿入されたポリヌクレオチドが適切な細胞宿主において増幅される。このポリヌクレオチドは、組換えベクターが複製するたびに増幅される。挿入されたポリヌクレオチドは、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが可能である。
【０２３７】
本発明による組換えベクターの第２の好ましい実施形態は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる。特定の実施形態内で、発現ベクターを用いて、本発明のＧＺＩＰポリペプチド、好ましくは本発明において述べられる修飾ＧＺＩＰを発現させ、次いでそれを精製し、例えば代謝関連疾患の治療に、または個体の体重を単に減らすために用いることができる。
【０２３８】
発現には、ベクターにおいて適切なシグナルが提供されることが必要であり、前記シグナルには、宿主細胞において対象の遺伝子の発現を誘導する、ウイルスおよび哺乳動物両方由来のエンハンサー／プロモーターなど、種々の調節因子が含まれる。ポリペプチドの発現に薬物選択マーカーの発現を結び付ける因子であることから、産物を発現する永久的な、安定な、細胞クローンを確立するためのドミナントな薬物選択マーカーが一般に、本発明の発現ベクター中に含まれる。
【０２３９】
特に、本発明は、ＧＺＩＰポリペプチドの中で選択される調節配列の制御下にて、またはその代わりとしては外来性調節配列の制御下にて、本発明のＧＺＩＰポリペプチド、または本明細書に記載の修飾ＧＺＩＰ、またはその変異体もしくは断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【０２４０】
その結果として、本発明の好ましいベクターは：（ａ）それに作動可能に連結されるコードポリヌクレオチドの発現を誘導する、ＧＺＩＰ調節配列；（ｂ）適切な宿主または宿主生物中でのその発現を可能にする調節配列に作動可能に連結される、本発明のＧＺＩＰコード配列；からなる群から選択される。
【０２４１】
本発明のベクターにおいて見出すことができる因子のいくつかは、以下のセクションでさらに詳細に記述する。
１）本発明の発現ベクターの一般的な特徴:
本発明による組換えベクターは、限定されないが、ＹＡＣ(酵母人工染色体)、ＢＡＣ(細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド、および染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ、半合成もしくは合成ＤＮＡからなり得る直鎖状ＤＮＡを含む。かかる組換えベクターは：
（１）遺伝因子または遺伝子発現において調節的役割を有する因子、例えばプロモーターまたはエンハンサー。エンハンサーは、転写を増加するようにプロモーターに作用する、通常長さ約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用因子である；
（２）ｍＲＮＡに転写され、最終的にポリヌクレオチドに翻訳される、構造またはコード配列であり、前記構造またはコード配列は（１）に記載の調節因子に作動可能に連結される；
（３）適切な転写開始および終結配列；
のアセンブリーを含む転写単位を含み得る。酵母または真核生物発現系での使用が意図される構造単位は好ましくは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌をコードするリーダー配列を含む。その代わりとして、組換えタンパク質が、リーダーもしくは輸送配列なしに発現される場合、それは、Ｎ末端残基を含み得る。この残基は、最終産物を得るために、発現された組換えタンパク質から続いて切断されてもよいし、または切断されなくてもよい。
【０２４２】
一般的に、組換え発現ベクターは、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、および下流の構造配列の転写を指示する、高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むだろう。その異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは、翻訳タンパク質の分泌を指示することができるリーダー配列と集合して、細胞膜周辺腔または細胞外媒体が形成される。ベクターが、哺乳動物宿主細胞において目的の配列をトランスフェクトおよび発現させるために適応される特定の実施形態において、好ましいベクターは、目的の宿主において複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、いずれかの必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列もまた含むだろう。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０起源に由来するＤＮＡ配列、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位およびポリアデニル化部位を用いて、必要とされる非転写遺伝因子を提供することができる。
２）調節因子
プロモーター
本発明の発現ベクターにおいて用いられる適切なプロモーター領域は、異種遺伝子が発現される細胞宿主を考慮に入れて選択される。対象の核酸配列の発現を制御するのに用いられる特定のプロモーターは、それが、標的細胞における核酸の発現を指示することができるかぎり、重要であるとは考えられない。このように、ヒト細胞が標的化される場合、例えばヒトもしくはウイルスプロモーターなど、ヒト細胞において発現させることができるプロモーターに隣接して、かつプロモーターの制御下に、核酸コード領域を位置付けることが好ましい。
【０２４３】
適切なプロモーターは、それが発現を制御する核酸に対して異種であるか、またはその代わりとして、発現されるコード配列を含有する天然ポリヌクレオチドに内因性であり得る。さらに、そのプロモーターは、コンストラクトのプロモーター／コード配列が挿入されている組換えベクター配列に対して一般に異種である。プロモーター領域は、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、さらに好ましくはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７ベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。好ましい細菌プロモーターとしては、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモーター(ＥＰ ００３６７７６)、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のｐ１０タンパク質プロモーター(Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ)(Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165; O'Reilly et al. (1992))、λＰＲプロモーター、またはｔｒｃプロモータも挙げられる。
【０２４４】
真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｌが挙げられる。さらに、脂肪組織、筋肉組織、または肝臓における発現を促進するプロモーターなど、特定の細胞型に特異的なプロモーターを選択することが可能である。簡便なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内に十分ある。
【０２４５】
プロモーターの選択は、遺伝子工学の分野における当業者の能力内に十分ある。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2, 3 (1989)または、Fuller et al. (1996) Immunology in Current Protocols in Molecular Biologyに記載の手順もまた参照することができる。
他の調節因子
ｃＤＮＡインサートを用いる場合、通常、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるポリアデニル化シグナルを含むことが望ましいだろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実行の成功に重要であるとは考えられず、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどの、かかるいずれかの配列が用いられる。発現カセットの因子として、ターミネーターもまた企図される。これらの因子は、メッセージレベルを高め、かつカセットから他の配列へのリードスルー（読み過ごし）を最小限にする役割を果たすことができる。
【０２４６】
上述のような適切なＤＮＡ配列を含有するベクターを用いて、適切な宿主を形質転換し、目的のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現させることができる。
３）選択マーカー
かかるマーカーは、細胞に同定可能な変化を与え、その結果、発現コンストラクトを含有する細胞を容易に同定することが可能となるだろう。形質転換宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子は、真核細胞培養に対してジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対してＴＲＰ１または大腸菌においてテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン耐性、ミコバクテリアに対してレバンスクラーゼ（levan saccharase）であることが好ましく、この後者のマーカーは天然選択マーカーである。
４）好ましいベクター
細菌ベクター
限定されないが、代表的なものとして、細菌の用途に有用な発現ベクターは、選択マーカー、およびｐＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝因子を含む市販のプラスミドから誘導される細菌複製起点を含み得る。かかる市販のベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３(Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン、ウプサラ）)、ｐＧＥＭ１(Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社（米国、ウィスコンシン州マディソン）)が挙げられる。
【０２４７】
以下の細菌ベクター：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；ｐＱＥ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ社）など、他の多数の適切なベクターが当業者に知られており、かつ市販されている。
バキュロウイルスベクター
本発明のポリペプチドの発現に適したベクターは、昆虫細胞および昆虫細胞系で増殖することができるバキュロウイルスベクターである。他の特定の適切な宿主ベクター系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳＦ９細胞系(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７１１)をトランスフェクトするために使用される、ｐＶＬ１３９２/１３９３バキュロウイルス導入ベクター(Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)である。
【０２４８】
バキュロウイルス発現におけるＡｐｍ１球状ヘッド（head）ポリペプチドの発現に適した他のベクターとしては、Chai et al. (1993; Biotechnol Appl Biochem. Dec; 18 (Pt 3): 259-73) ; Vlasak et al. (1983 ; Eur J Biochem Sep 1; 135 (1): 123-6); およびLenhard et al. (1996; Gene Mar 9; 169 (2): 187-90)によって記述されているベクターが挙げられる。
ウイルスベクター
特定の一実施形態において、そのベクターはアデノウイルスに由来するベクターである。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、FeldmanおよびSteg (1996; Semin Interv Cardiol Sep; 1 (3): 203-8)またはOhno et al. (1994; Science Aug 5; 265 (5173): 781-4)によって記述されているベクターである。本発明のこの特定の実施形態による他の好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス２型もしくは５型（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物由来のアデノウイルスである（仏国特許出願番号ＦＲ−９３．０５９５４参照)。
【０２４９】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般に、特にヒトを含む動物に、インビボで外来性ポリヌクレオチドを導入するための選り抜きの組換え遺伝子送達系であると理解されている。これらのベクターは、細胞中に遺伝子を効率的に送達し、導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定的に組み込まれる。
【０２５０】
本発明のレトロウイルスのインビトロまたはインビボ遺伝子送達媒体の作製または構築に特に好ましいレトロウイルスには、ミンク細胞増殖巣誘導ウイルス（Mink-Cell Focus Inducing Virus）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが含まれる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９)、Ｆｒｉｅｎｄ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５)、Ｇｒｏｓｓ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０)、Ｒａｕｓｃｈｅｒ(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８)およびモロニーマウス白血病ウイルス(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０；国際公開番号：ＷＯ９４/２４２９８)が挙げられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、ブライアン（Bryan）高力価ウイルス(ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８)が挙げられる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Roth et al., (1996)、国際特許出願公開番号：ＷＯ９３/２５２３４、国際特許出願公開番号：ＷＯ９４/０６９２０、Roux et al., ( (1989) Proc Natl Acad Sci U S A Dec; 86 (23): 9079-83)、Julan et al. , (1992) J. Gen. Virol. 3: 3251-3255およびNeda et al., ( (1991) J Biol Chem Aug 5; 266 (22): 14143-6)に記載されているベクターである。
【０２５１】
本発明によって企図されるさらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)からなる。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖的生活環のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのその他のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである(Muzyczka, et al., Curr. Top. Micro. Immunol. (1992) 158: 97-129参照)。それは、非分裂細胞にそのＤＮＡを組み込むことができ、高頻度で安定的な組込みを示すわずかなウイルスのうちの１つでもある(Flotte et al. , (1992) Am J Respir Cell Mol Biol Sep; 7 (3): 349-56; Samulski et al. , (1989) J Virol Sep; 63 (9): 3822-8; McLaughlin et al., (1989) Am. J. Hum. Genet. 59: 561-569)。ＡＡＶの有利な特徴は、形質転換細胞に対して、一時細胞を形質導入する、その低下した有効性から得られる。
５）組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドの発現を生じさせるために、これらのコンストラクトは、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞系を形質転換する実験手順の場合と同様にインビトロで、または特定の疾患状態の治療の場合と同様にインビボまたはエクスビボで達成される。
【０２５２】
発現コンストラクトが感染性ウイルス粒子中に封入されるあるメカニズムは、ウイルス感染である。
【０２５３】
培養哺乳動物細胞中にポリヌクレオチドを導入する数種類の非ウイルス的方法もまた本発明によって企図され、その方法としては、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿法 (Graham et al. , (1973) Virology Aug; 54 (2): 536-9; Chen et al. , (1987) Mol Cell Biol Aug; 7 (8): 2745-52)、ＤＥＡＥ−デキストラン (Gopal, (1985) Mol Cell Biol May; 5 (5): 1188-90)、電気穿孔法 (Tur-Kaspa et al. , (1986) Mol Cell Biol Feb; 6 (2): 716-8 ; Potter et al. , (1984) Proc Natl Acad Sci USA Nov; 81 (22): 7161-5. )、直接微量注入 (Harland et al. , (1985) J Cell Biol Sep; 101 (3): 1094-9)、ＤＮＡ添加リポソーム (Nicolau et al. , (1982) Biochim Biophys Acta Oct 11; 721 (2): 185-90; Fraley et al. , (1979) Proc Natl Acad Sci USA Ju1 ; 76 (7): 3348-52)、および受容体仲介トランスフェクション (Wu and Wu, (1987) J Biol Chem Apr 5; 262 (10): 4429-32; Wu and Wu (1988) Biochemistry Feb 9; 27 (3): 887-92)が挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボ用途にうまく適応される。
【０２５４】
発現ポリペプチドが細胞中に送達されたら、それは安定的に、レシピエント細胞のゲノムに組み込まれる。この組み込みは、相同的組換えにより同起源（cognate）の位置および向きにあるか（遺伝子置換）、またはそれは、ランダムな、非特定位置で組み込まれる（遺伝子増強）。さらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして細胞中で安定的に維持される。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期に無関係な、または宿主細胞周期と同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。
【０２５５】
インビボで脊椎動物細胞の内部にタンパク質またはペプチドを送達する方法の特定の一実施形態は、生理学的に許容される担体と、対象のポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチドとを含む調製物を、細胞を含有する組織の間質空間中に導入し、それによって、その裸のポリヌクレオチドが細胞の内部に取り込まれ、生理学的効果を有する工程を含む。これは、特にインビトロでの導入に適用可能であるが、インビボにも適用することができる。
【０２５６】
「裸の」ポリヌクレオチドを含む、インビトロおよびインビボで使用される組成物が、国際特許出願公開番号：ＷＯ９０／１１０９２（Ｖｉｃａｌ社）および国際特許出願公開番号：ＷＯ９５／１１３０７(パスツール研究所, ＩＮＳＥＲＭ, Universit d'Ottawa)ならびにTascon et al. (1996) Nature Medicine. 2 (8): 888-892およびHuygen et al. ( (1996) Nat Med Aug; 2 (8) : 893-8)の論文に記載されている。
【０２５７】
本発明のさらに他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを含む、本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞への導入は、微粒子銃（遺伝子銃）を用いて行うことが可能であり、前記粒子は、Klein et al. ( (1990) Curr Genet Feb; 17 (2): 97-103)によって記述されているように、それらを殺すことなく細胞膜を突き抜け、細胞に入ることが可能となる高速度に加速されるＤＮＡ被覆微粒子である。
【０２５８】
さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、リポソーム中に閉じ込められる(Ghosh and Bacchawat, (1991) Targeted Diagn Ther; 4: 87-103; Wong et al. , (1980) Gene 10: 87-94; Nicolau et al. , (1987) Methods Enzymol.; 149: 157-76)。これらのリポソームはさらに、レプチン、トリグリセリド、ＡＣＲＰ３０、または他の公知のＬＳＲリガンドをリポソーム膜中に組み込むことによって、ＬＳＲを発現する細胞に標的化することができる。
【０２５９】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＧＺＩＰ球状ヘッドポリペプチドのインビボでの作製のための組成物を提供する。それは、このポリペプチドを作動可能にコードし、かつ組織細胞に前記ポリペプチドの発現を生じさせるための組織への導入に適した、裸のポリヌクレオチドを生理学的に許容される担体中に溶解状態で含む。
【０２６０】
所望の宿主細胞に注入されるベクターの量は、注入部位に応じて異なる。指示用量としては、動物の体内、好ましくは哺乳動物の体内、例えばマウス体内にベクター０．１〜１００μｇが注入されるだろう。
【０２６１】
本発明によるベクターの他の実施形態において、それは宿主細胞に、好ましくは治療すべき動物から事前に採取された宿主細胞に、さらに好ましくは筋細胞などの体細胞に導入される。次の工程では、組換えタンパク質を局所的または全身的に体内に送達するために、目的の球状ヘッドポリペプチドまたは目的のその断片をコードするベクターで形質転換された細胞が、動物の体内に再び導入される。
ＩＶ．本発明の組換え細胞
本発明の他の目的は、つまり本明細書に記載のポリヌクレオチドのうちの１つ、さらに正確には、「本発明のポリヌクレオチド」に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つなど、本発明のＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドで形質転換されている、またはそれをトランスフェクトされている、宿主細胞組換え体からなる。これらのポリヌクレオチドは、一過性または安定なトランスフェクションの結果として、細胞中に存在し得る。本発明は、「本発明の組換えベクター」で記載のベクターのいずれか１つなどの組換えベクターで形質転換される宿主細胞(原核細胞)、またはそれをトランスフェクトされる宿主細胞(真核細胞)を包含する。
【０２６２】
一般に、本発明の組換え宿主細胞は、本明細書において記述される本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１つまたは組換えベクターの少なくとも１つを含む。
【０２６３】
本発明の組換えベクターのレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞は、以下の：
ａ）原核生物の宿主細胞：大腸菌株（Ｉ．Ｅ．ＤＨ５−α株）、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびブドウ球菌属などの種からの株、および
ｂ）真核生物の宿主細胞：ヒーラ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２；番号ＣＣＬ２．１；番号ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞(ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０；番号ＣＲＬ１６５１)、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）、ヒト腎臓２９３（ＡＴＣＣ番号４５５０４；番号ＣＲＬ−１５７３）、ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ番号８４１００５０１；番号８４１１１３０１）、ＰＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂである。
【０２６４】
宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で使用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を作製することができる。
【０２６５】
適切な宿主を形質転換し、その宿主を適切な細胞密度に成長させた後、選択されたプロモーターは、温度シフトまたは化学的誘導などの適切な手段によって誘導され、細胞はさらなる期間培養される。
【０２６６】
細胞は通常、遠心分離によって収集され、物理的もしくは化学的手段によって破壊され、得られた未精製抽出物は、さらに精製するために保持される。
【０２６７】
タンパク質の発現で用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いずれかの簡便な方法によって破壊することができる。かかる方法は当業者によく知られている。
【０２６８】
さらに、本発明に従って、これらの組換え細胞は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、およびヒトを含まない霊長類からなる群から選択される動物においてインビトロまたはインビボで作製することができる。インビトロで作製された組換え細胞は後に、動物に外科的に移植することもできる。動物においてインビボで組換え細胞を作製する方法は当技術分野でよく知られている。
【０２６９】
本発明は、ａ）標的遺伝子の内因性染色体ＤＮＡに外来性（異種）ポリヌクレオチドを挿入し、ｂ）内因性染色体ＤＮＡを欠失させる、またはｃ）内因性染色体ＤＮＡを外来性ポリヌクレオチドと置き換えるために操作された、脊椎動物起源、好ましくは哺乳動物および特にヒト起源の一次、二次、および不死化相同的組換え宿主細胞も包含する。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失または置換は、標的遺伝子のコード配列に、または標的遺伝子と作動可能に結び付けられるプロモーターおよびエンハンサー配列などの調節領域に対するものである。
【０２７０】
本発明はさらに、相同的組換え宿主細胞をインビトロまたはインビボで作製する方法であって、細胞中で通常発現されない標的遺伝子の発現を変化させる方法に関する。その変化によって、通常の成長条件下または標的遺伝子によりコードされるポリペプチドを作製するのに適した条件下にて、標的遺伝子の発現が起こることが好ましい。
【０２７１】
その方法は：（ａ）ポリヌクレオチドコンストラクトをインビトロまたはインビボで細胞にトランスフェクトし、その結果、トランスフェクト細胞が作製される工程であって、そのポリヌクレオチドコンストラクトが；（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）調節配列またはコード配列；（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位；を含む工程と、（ｂ）相同的組換えに適した条件下にて、インビトロまたはインビボで移入細胞を維持する工程と、を含む。
【０２７２】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボで細胞において標的遺伝子の発現を変化させる方法であって、（ａ）インビトロまたはインビボで細胞にポリヌクレオチドコンストラクトをトランスフェクトし、その結果、トランスフェクト細胞が作製される工程であって、そのポリヌクレオチドコンストラクトが；（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）調節配列またはコード配列；（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位；を含む工程と、（ｂ）相同的組換えに適した条件下にて、インビトロまたはインビボでトランスフェクト細胞を維持する工程と、（ｃ）遺伝子の発現に適した条件下にて、インビトロまたはインビボで相同的組換え細胞を維持する工程とを含む方法に関する。
【０２７３】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボで細胞において、通常その細胞で発現されない標的内因性遺伝子の発現を変化させることによって、本発明のポリペプチドを製造する方法であって：（ａ）インビトロで細胞にポリヌクレオチドコンストラクトをトランスフェクトし、その結果、トランスフェクト細胞が作製される工程であって、そのポリヌクレオチドコンストラクトが；（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）調節配列またはコード配列；（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位；を含む工程と、（ｂ）相同的組換えに適した条件下にて、インビトロまたはインビボでトランスフェクト細胞を維持する工程と、（ｃ）遺伝子の発現に適した条件下にて、インビトロまたはインビボで相同的組換え細胞を維持し、その結果、ポリペプチドが作製される工程とを含む方法に関する。
【０２７４】
本発明はさらに、その遺伝子が通常発現されない、細胞型における標的遺伝子の発現を変化させるポリヌクレオチドコンストラクトに関する。これは、ポリヌクレオチドコンストラクトが標的細胞の染色体ＤＮＡに挿入された場合に生じ、そのポリヌクレオチドコンストラクトは：（ａ）ターゲティング配列；（ｂ）調節配列またはコード配列；（ｃ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位；を含む。上述のようなポリヌクレオチドコンストラクトがさらに包含され、そのコンストラクトはさらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ染色体ＤＮＡとの相同的組換え後、標的内因性遺伝子とインフレームである。
【０２７５】
当技術分野で公知の技術、例えば、米国特許第：６，０５４，２８８号；６，０４８，７２９号；６，０４８，７２４号；６，０４８，５２４号；５，９９４，１２７号；５，９６８，５０２号；５，９６５，１２５号；５，８６９，２３９号；５，８１７，７８９号；５，７８３，３８５号；５，７３３，７６１号；５，６４１，６７０号；５，５８０，７３４号；国際公開番号：Ｗ０９６／２９４１１、ＷＯ９４／１２６５０；およびKoller et al. , (1994) Annu. Rev. Immunol. 10: 705-73により記述されている科学文献（そのそれぞれの開示内容全体が参照により組み込まれる）に記載の技術などによって、組成物が製造され、方法が行われる。
【０２７６】
哺乳動物、通常ヒトの細胞におけるＧＺＩＰの発現は、欠損の状態にされるか、またはその代わりとして、ＧＺＩＰゲノムもしくはｃＤＮＡ配列の挿入で、本発明によるＧＺＩＰポリヌクレオチドによる動物細胞のゲノム中のＧＺＩＰ遺伝子対応物の置換で、高められる。これらの遺伝的改変は、既に述べられている特定のＤＮＡコンストラクトを用いた相同的組換え現象によって生じる。
【０２７７】
使用することができる宿主細胞の種類は、哺乳動物の接合体、例えばマウス接合体である。マウス接合体に、対象の精製ＤＮＡ分子、例えば、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５０μＭ ＥＤＴＡ、３０μＭスペルミン、および７０μＭスペルミジン中、ＢＡＣインサートの場合には１ｎｇ／μｌ−Ｐ１バクテリオファージインサートの場合には３ｎｇ／μｌの濃度範囲に予め調節された精製ＤＮＡ分子が微量注入される。微量注入されるＤＮＡが大きなサイズである場合、このＤＮＡの機械的な破損を避けるために、Schedl et al ( (1993) Nature Mar 18 ; 362 (6417): 258-61)によって述べられているように、ポリアミンおよび高い塩濃度が用いられる。
【０２７８】
本明細書に記載のＤＮＡコンストラクトを含む、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つが、胚幹（ＥＳ）細胞系、好ましくはマウスＥＳ細胞系に導入される。ＥＳ細胞系は、着床前胚盤胞の内部細胞塊の多能性、中立の細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞系は、以下の：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１９３４および番号ＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１１１６）である。中立状態でＥＳ細胞を維持するために、この胚の表現型を保存し、かつＥＳ細胞接着のマトリックスとして働くように、適切なシグナルを提供する成長抑制フィーダー細胞の存在下でそれらを培養する。好ましいフィーダー細胞は、実質的にいずれかのマウス株の１３日〜１４日目の胚の組織から確立され、 Abbondanzo et al. (1993; Methods Enzymol ; 225: 803-23)によって記述されているように、培養状態で維持され、かつ Robertson ( (1987) Embryo-derived Embryo-derived stem lines. In: E. J. Robertson Ed. Teratocarcinomas and embrionic stem cells: a practical approach. IRL Press, Oxford)によって記述されているように照射によって、またはPease and Williams (1990; Exp Cell Res. Oct; 190 (2): 209- 11)によって記述されているようにＬＩＦの抑制濃度の存在によって成長を抑制されている、一次胚線維芽細胞である。
【０２７９】
宿主細胞中のコンストラクトを従来の方法で使用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を作製することができる。
【０２８０】
適切な宿主を形質転換し、その宿主を適切な細胞密度に成長させた後、選択されたプロモーターは、温度シフトまたは化学的誘導などの適切な手段によって誘導され、細胞はさらなる期間培養される。細胞は通常、遠心分離によって収集され、物理的もしくは化学的手段によって破壊され、得られた粗抽出物は、さらに精製するために保持される。タンパク質の発現で用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いずれかの簡便な方法によって破壊することができる。かかる方法は当業者によく知られている。
ＩＶ．遺伝子導入動物
本発明は、本発明の組換えＧＺＩＰポリペプチドを発現する、非ヒト動物および植物を作製する方法および組成物もまた提供する。その動物または植物は、遺伝子導入動物または遺伝子導入植物であることが可能であり、すなわちそれらの細胞それぞれが、ＧＺＩＰポリペプチドをコードする遺伝子を含有するか、またはその代わりとして、ＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、動物または植物の体細胞に、例えば哺乳動物の乳腺分泌上皮細胞に導入することができる。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはウサギなどの哺乳動物である。
【０２８１】
哺乳動物などの遺伝子導入動物を作製する方法は当業者にはよく知られており、かかる方法は本発明で使用することができる。簡単に言えば、遺伝子導入動物は、例えば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＥＳ細胞などの多能性幹細胞にトランスフェクトすることによって作製することができる。次いで、形質転換ＥＳ細胞は、同じ種類の哺乳動物の子宮に次いで移植される初期胚にうまく導入することができる。特定のケースでは、形質転換（「遺伝子導入」）細胞は、得られた動物の生殖細胞系の一部を含み、生殖細胞系中の遺伝子導入細胞を含む成体の動物を次いで、他の動物と交配させて、その結果、それらの細胞のそれぞれにおける導入遺伝子を有する遺伝子導入動物の集団が最終的に作製され、導入遺伝子をそれらの子孫それぞれに安定的に伝達することができる。ポリヌクレオチドを導入する他の方法、例えば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを微量注入により受精卵または初期胚に導入する方法を用いることができる。代替方法としては、導入遺伝子を含有するレトロウイルスに接合体を感染させることによって、導入遺伝子を動物に導入することが可能である(Jaenisch, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73,1260-1264)。遺伝子導入哺乳動物を作製する方法は、例えば、Wall et al. (1992) J Cell Biochem 1992 Jun; 49 (2): 113-20; Hogan, et al. (1986) in Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.；ＷＯ９１／０８２１６、または米国特許第４，７３６，８６６号に記載されている。
【０２８２】
好ましい方法において、ポリヌクレオチドは、受精卵母細胞に微量注入される。通常、受精卵母細胞は、標準技術を用いて微量注入され、次いで、「着床前胚」が得られるまで、インビトロで培養される。かかる着床前胚は、約１６〜１５０個の細胞を含有することが好ましい。着床前期まで受精卵母細胞を培養する方法は、例えば、Gordon, et al. ((1984) Methods in Enzymology, 101, 414); Hogan, et al. ((1986) in Manipulating the mouse embryo, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y (マウス胚について)) ; Hammer, et al. ((1985) Nature, 315,680 (ウサギおよびブタの胚について)) ; Gandolfi, et al. ((1987) J. Reprod. Fert. 81,23-28) ; Rexroad, et al. ((1988) J. Anim. Sci. 66,947-953) (ヒツジの胚について)) ;およびEyestone, et al. ((1989) J. Reprod. Fert. 85,715-720) ; Camous et al. ((1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785); およびHeyman, et al. ((1987) Theriogenology 27,5968 (ウシの胚について))に記述されており、それらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。次いで、標準法によって着床前胚を適切なメスに導入し、導入遺伝子が導入される際の発育工程に応じて、遺伝子導入またはキメラ動物を誕生させることが可能となる。
【０２８３】
導入遺伝子の組込みの頻度が低い場合が多いことから、着床前胚における導入遺伝子組込みの検出を、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて行うことが望ましい場合が多い。数多くの方法のいずれかを用いて、着床前胚における導入遺伝子の存在を検出することができる。例えば、着床前胚から１種または複数種の細胞を除去し、除去した細胞（１種または複数種）における導入遺伝子の有無を、いずれかの標準法、例えばＰＣＲを用いて検出することができる。代替方法としては、導入遺伝子の存在は、子宮中で、または分娩後に、標準法を用いて検出することができる。
【０２８４】
本発明の特に好ましい実施形態において、それらの乳中に組換えＧＺＩＰポリペプチドを分泌する遺伝子導入哺乳動物が作製される。乳腺は非常に効率的にタンパク質を産生する器官であることから、かかる方法を用いて、グラム／リットルの範囲内の濃度で、しばしばそれより有意に高い濃度でタンパク質を産生することができる。乳腺中での発現は、ＧＺＩＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的なプロモーターおよび任意に他の調節因子に作動可能に連結することによって達成されることが好ましい。適切なプロモーターおよび他の因子としては、限定されないが、哺乳動物の短いおよび長いＷＡＰ、α、β、およびκ、カゼイン、αおよびβラクトグロブリン、β−ＣＮ５’遺伝子に由来するもの、ならびにマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターなどが挙げられる。かかるプロモーターおよび他の因子は、限定されないが、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、およびモルモットなどのいずれかの哺乳動物に由来するものである。プロモーターおよび他の調節配列、ベクターおよび他の関連する教示は、例えば、Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3: 337-50 ; Jost et al. (1999) Nat. Biotechnol 17: 160-4; 米国特許第５，９９４，６１６号；６，１４０，５５２号；６，０１３，８５７号; Sohn et al. (1999) DNA Cell Biol. 18: 845-52; Kim et al. (1999) J. Biochem. (Japan) 126: 320-5; Soulier et al. (1999) Euro. J. Biochem. 260: 533-9; Zhang et al. (1997) Chin. J. Biotech. 13: 271-6; Rijnkels et al. (1998) Transgen. Res. 7: 5-14; Korhonen et al. (1997) Euro. J. Biochem. 245: 482-9; Uusi-Oukari et al. (1997) Transgen. Res. 6: 75-84; Hitchin et al. (1996) Prot. Expr. Purif. 7: 247-52; Platenburg et al. (1994) Transgen. Res. 3: 99-108; Heng-Cherl et al. (1993) Animal Biotech. 4: 89-107; および Christa et al. (2000) Euro. J. Biochem. 267: 1665-71によって提供されており、それぞれの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８５】
その他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビボで乳腺の体細胞中に、例えば、プラスミドＤＮＡは、例えばＤＥＡＥ−デキストランと結合して（例えば、Hens, et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1523: 161-171参照)、コンストラクトの受容体仲介エンドサイトーシスを導くことができるリガンドと結合して（例えば、Sobolev, et al. (1998) 273: 7928-33参照)、またはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、例えばテナガザル白血病ウイルス中で（例えば、 Archer, et al. (1994) PNAS 91: 6840-6844)参照）、乳頭管を通して注入することができる。これらの実施形態のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドは、上述のように乳腺特異的なプロモーターに作動可能に連結するか、またはその代わりとして、ＣＭＶまたはＭｏＭＬＶ ＬＴＲなどの強く発現するいずれかのプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０２８６】
本発明において使用される、いずれかのベクター、プロモーター、調節因子等の適性は、哺乳動物上皮細胞、例えばＭａｃＴ細胞（ウシの哺乳動物上皮細胞）またはＧＭＥ細胞（ヤギの哺乳動物上皮細胞）などの細胞をインビトロでトランスフェクトし、細胞中の導入遺伝子のトランスフェクションおよび発現の効率を評価することによって事前に評価することができる。
【０２８７】
インビボでの投与では、ポリヌクレオチドは、いずれかの適切な剤形で、いずれかの濃度範囲で（例えば、１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｌ）、いずれかの容量（例えば１〜１００ｍｌ、１〜２０ｍｌ）で投与され、任意の回数（例えば、１、２、３、５、または１０回）、任意の頻度（例えば、１、２、３、５、１０日または任意の日数ごと）に投与される。適切な投与濃度、投与頻度、投与方法等は、特定のポリヌクレオチド、ベクター、動物等に応じて異なり、当業者によって容易に決定することができる。
【０２８８】
好ましい実施形態において、Archer et al. ( (1994) PNAS 91: 6840-6844)に記載のように、テナガザル白血病ウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターが用いられる。レトロウイルス感染には通常、細胞分裂が必要であり、乳腺における細胞分裂は、安息香酸エストラジオール、プロゲステロン、レセルピン、またはデキサメタゾンなどの因子を用いて、ベクターの投与と組み合わせて促進することができる。さらに、感染のレトロウイルスによる方法および他の方法は、ポリブレンなどのアクセサリー（accessory）化合物を用いて容易にすることができる。
【０２８９】
乳からＧＺＩＰポリペプチを得るための本明細書に記載の方法のいずれかにおいて、得られる乳の量、その結果産生されるＧＺＩＰポリペプチドの量は、例えばヘキセストロール、エストロゲン、またはプロゲステロンを用いた、泌乳誘発（lactation induction）のいずれかの標準法によって高めることができる。
【０２９０】
かかる実施形態で使用されるポリヌクレオチドは、完全長ＧＺＩＰポリペプチドまたはＧＺＩＰ断片をコードする。通常、コードされるポリペプチドは、乳中へのタンパク質の分泌を確実にする、シグナル配列を含むだろう。完全長ＧＺＩＰ配列が用いられる場合、完全長タンパク質は例えば、乳から単離し、適切なプロテアーゼを用いてインビトロで切断することができる。代替方法としては、プロテアーゼをコードする第２ポリヌクレオチドを動物に、または乳腺細胞に導入することができ、それによって、プロテアーゼが発現した結果、ＧＺＩＰポリペプチドがインビボで切断され、そのため、乳からＧＺＩＰ断片を直接単離することが可能となる。
Ｖ．本発明の薬学的または生理学的に許容される組成物
本発明のＧＺＩＰポリペプチドは、非ヒト動物またはヒトに、単独で、またはそれらが適切な担体または賦形剤（１種または複数種）と混合される、薬学的または生理学的に許容される組成物中で、投与することができる。次いで、薬学的または生理学的に許容される組成物は、治療上有効な用量で提供される。治療上有効な用量とは、本明細書に記載の方法によって決定される代謝関連疾患または障害の症状または生理学的状態を予防または改善するのに十分なＧＺＩＰポリペプチドの量を意味する。治療上有効な用量とは、美容的理由のためにこの効果を望むヒトにおける体重の減少に、または体重の増加の予防に、または体重増加速度の増加の予防に必要なＧＺＩＰポリペプチドの量も意味し得る。本発明のＧＺＩＰポリペプチドの治療上有効な用量は、連続的な定期的な使用または投与で体重減少または体重増加を促進するのに適切である用量である。ＧＺＩＰポリペプチドの調合および投与の技術は、"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co. , Easton, PA, latest editionに記述されている。
【０２９１】
本発明のＧＺＩＰポリペプチドを用いて、治療または予防することが可能な他の疾患または障害としては、限定されないが、肥満症および肥満症関連疾患および障害、例えば肥満症、耐糖能障害、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、アテローム性疾患、心疾患、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭまたはＩＩ型糖尿病）およびインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）が挙げられる。本発明の方法によって治療される糖尿病関連合併症としては、微小血管障害、眼球病変、網膜症、神経障害、腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の肥満症関連障害としては、高脂質血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の肥満症関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。ＧＺＩＰポリペプチドを用いて、作業または運動中の身体的機能を高める、または一般的な快適さの感情を高めることもできる。身体的機能活動には、歩行、ジャンプ、持ち上げまたは登ることが含まれる。
【０２９２】
ＧＺＩＰポリペプチドまたはそのアンタゴニストを用いて、失読症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、および精神分裂病などの精神疾患を、脂肪酸代謝、さらに詳細には特定の長鎖多価不飽和脂肪酸の生成を調節することによって治療することも可能である。
【０２９３】
本発明のＧＺＩＰポリペプチドが、単独で、または他の薬学的または生理学的に許容される化合物と組み合わせて提供することができることは明白に考えられる。肥満症および他の疾患および障害の治療に有用な他の化合物は現在、当技術分野でよく知られている。
【０２９４】
好ましい実施形態において、ＧＺＩＰポリペプチドは、本明細書に記載されており、かつ当技術分野で公知の方法を用いたインスリン抵抗性および糖尿病の治療に有用であり、使用される。特に、好ましい実施形態は、動物またはヒトの対象においてグルコース代謝を治療的に変更および調節する方法であって、治療が必要な対象にＧＺＩＰポリペプチド（前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、前記動物またはヒト対象において血漿グルコースレベルを低減するのに十分な用量および期間で（その代わりとしては、毎日定時に）投与することを含む方法に関する。
【０２９５】
さらなる好ましい実施形態は、治療が必要な対象にＧＺＩＰポリペプチド（前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、前記動物またはヒト対象において血漿グルコースレベルを低減するのに十分な用量および期間で（あるいは毎日定時に）投与することを含む、糖尿病を予防または治療する方法に関する。
投与経路
適切な投与経路としては、当技術分野で公知の方法を用いた、経口、経鼻、経直腸、経粘膜、または経腸投与、非経口送達、例えば筋肉内、皮下、髄内注入、ならびに髄腔内、直接的脳室内注入、静脈内、腹腔内、鼻腔内、肺内（吸入）または眼内注入が挙げられる。体重減少を促進する化合物を投与するのに特に有用な方法は、例えば、長期間にわたってＧＺＩＰポリペプチドを送達する装置をレシピエントの腹腔に外科的に埋め込むことを含む。他の特に好ましい投与経路は、エアロゾルおよび徐放性製剤である。発明された薬物の徐放性製剤、特にデポ製剤が特に企図される。
組成物／製剤
本発明に従って使用される、薬学的または生理学的に許容される組成物および薬剤は、賦形剤および補助剤を含む、１種または複数種の生理学的に許容される担体を用いて、従来の方法で製造することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０２９６】
本明細書に記載の特定の薬剤は、薬学的または生理学的に許容される担体と、本発明のＧＺＩＰポリペプチドである少なくとも１つのポリペプチドとを含有するだろう。関連する実施形態において、本明細書に記載の特定の薬物は、薬学的または生理学的に許容される担体と、ＧＺＩＰポリペプチド、ＡＰＭ１ポリペプチド、インスリン、インスリン分泌促進薬およびインスリン感受性改善薬からなる群から選択される少なくとも１種類のポリペプチドと、を含むだろう。注入用には、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性のバッファー、またはリン酸もしくは重炭酸バッファーなどの生理食塩水バッファー中で調合される。経粘膜投与に関しては、透過される特定のバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は一般に、当技術分野で公知である。
【０２９７】
経口で服用することができる薬学的または生理学的に許容される製剤は、ゼラチンで作られた押込み嵌め（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールもしくはソルビトールなどの可塑剤で作られた密封軟カプセルを含む。押込み嵌めカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤との混合物中に活性成分を含有し得る。軟カプセル中では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁される。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は、かかる投与に適した用量であるべきである。
【０２９８】
口腔投与用に、その組成物は、従来の手法で調合される錠剤またはトローチ剤の形をとることが可能である。
【０２９９】
吸入による投与用に、本発明に従って使用される化合物は、適切な気体噴射剤、つまり二酸化炭素を使用して加圧したパックまたは噴霧器からエアゾールスプレー状で簡便に送達される。加圧されたエアゾールの場合には、用量単位は、計量された量を、送達する値を求めることによって決定される。化合物の粉末混合物およびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、吸入器または注入器で使用される、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが配合される。化合物の粉末混合物およびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、吸入器または注入器で使用される、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが配合される。
【０３００】
その化合物は、注入、例えば静脈内ボーラスもしくは持続注入による非経口投与用に配合することが可能である。注入用の製剤は、添加された保存剤と共に、単位用量の形で、例えばアンプルまたは多用量容器の形で提供される。その組成物は、水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液としてかかる形状を取り、懸濁剤、安定剤または分散剤などの配合剤（formulatory agent）を含有することが可能である。
【０３０１】
非経口投与に用いられる薬学的または生理学的に許容される製剤は、水溶性状態の活性化合物の水溶液を含む。水性懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。任意に、懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能とする、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤または物質を含有することも可能である。
【０３０２】
あるいは、活性成分は、使用前に、発熱物質を含有しない滅菌水などの適切な媒体と構成するために粉末状または凍結乾燥状であることが可能である。
【０３０３】
前述の製剤の他に、その化合物はデポ製剤として配合することも可能である。かかる長時間作用性製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えばその化合物は、適切な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と、またはやや可溶性の誘導体、例えばやや可溶性の塩として配合することが可能である。
【０３０４】
さらに、その化合物は、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放システムを用いて送達することが可能である。種々の徐放性材料が確立されており、当業者にはよく知られている。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、数週間から１００日を超える期間まで化合物を放出することができる。
【０３０５】
治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質を安定化するための他の方法を用いることも可能である。
【０３０６】
その薬学的または生理学的に許容される組成物は、適切な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含有してもよい。かかる担体または賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
有効用量
本発明で使用するのに適した、薬学的または生理学的に許容される組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量で活性成分が含まれている組成物が含まれる。さらに詳細には、治療有効量とは、治療される対象の発症を予防する、または現在の症状を軽減するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容に照らして、当業者の能力内に十分にある。
【０３０７】
本発明の方法において用いられるいずれかの化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量を動物モデルにおいて表し、インビトロシステムにおいてレプチンもしくはリポタンパク質の取り込みまたは結合を増加することが示される濃度ポイントまたは範囲を含むまたは包含する循環濃度範囲を達成することができる。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【０３０８】
治療有効用量とは、患者において症状の改善をもたらす化合物の量を意味する。かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（試験集団の５０％に致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準製薬手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０３０９】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を決定するのに使用することができる。かかる組成物に含まれる投薬量は、ほとんど、または全く毒性を持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。その投薬量は、この範囲内で、用いられる剤形、および用いられる投与経路によって異なる。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択することができる（例えば、Finglet al., 1975,「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Ch. 1参照)。
【０３１０】
投薬量および投与の間隔は、特定の状況に応じて、体重減少もしくは増加を維持または予防するのに十分な、活性化合物の血漿レベルが得られるように、個々に調節することが可能である。これらの効果を達成するのに必要な投薬量は、個々の特性および投与経路によって異なるだろう。投与の間隔は、最小有効濃度の値を用いて決定することもできる。化合物は、その時点の１０〜９０％、さらに好ましくは３０〜９０％、さらに好ましくは５０〜９０％の、最小有効濃度を超える血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである。局所投与または選択的取り込みの場合には、薬物の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連しない場合がある。
【０３１１】
投与される組成物の量は当然、治療される対象、対象の体重、疾患の重症度、投与方法および処方する医師の判断に依存するだろう。
【０３１２】
目的の結果を達成するために毎日または定期的に投与される、本発明のＧＺＩＰポリペプチドの量の好ましい投薬量範囲は、０．０５〜１．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲である。さらに好ましい投薬量範囲は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。さらに好ましい用量は、０．２５〜２．５ｍｇ／ｋｇである。当然のことながら、これらの１日量は、一日の間に一定間隔をあけて少量で送達または投与することができる。これらの投薬量範囲は単に好ましい範囲であり、本発明に制限的であることを意味するものではないことに留意されたい。
ＶＩ．治療方法
本発明は、特に、代謝関連疾患および障害を予防または治療する方法であって、かかる治療の必要がある個体に本発明のＧＺＩＰポリペプチドを与えることを含む方法に関する。ＧＺＩＰポリペプチドは、インビトロまたはインビボで代謝関連活性を有することが好ましい。ＧＺＩＰポリペプチドは、経口で摂取されることが好ましい医薬組成物中で個体に与えられることが好ましい。その個体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい実施形態において、代謝関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、耐糖能、インスリン抵抗性、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および脂肪萎縮性糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法によって治療される糖尿病関連合併症としては、微小血管障害、眼球病変、網膜症、神経障害、および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の代謝関連障害としては、高脂質血症、高トリグリセリド血症および高尿酸血症が挙げられる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪液質、るいそう、ＡＩＤＳに関連する体重減少、癌に関連する体重減少、新形成に関連する体重減少、食欲不振および食欲亢進が挙げられる。好ましい実施形態において、医薬組成物においてＧＺＩＰポリペプチドは、美容的理由から健康な個体の体重を調節するために使用される。
【０３１３】
本発明は、代謝関連疾患および障害を予防または治療する方法であって、かかる治療が必要な個体に、本発明のアッセイ（実施例における本発明の好ましい実施形態のセクションＶＩに記載されている）により同定された化合物を投与することを含む方法も特徴とする。これらの化合物は、インビトロで細胞において、エクスビボで筋肉において、または動物モデルにおいて、ＧＺＩＰポリペプチドの作用に拮抗作用または作動作用することが好ましい。その代わりとして、これらの化合物は、レプチンまたはリポタンパク質の取り込みまたは結合に対するＧＺＩＰポリペプチドの作用に拮抗作用または作動作用する。任意に、これらの化合物は、インビトロまたはインビボで、ＬＳＲとのＧＺＩＰポリペプチドの相互作用、結合、または取り込みを防ぐ。その化合物は、薬剤中で個体に投与されることが好ましい。個体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい実施形態において、代謝関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、心疾患、インスリン抵抗性、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および脂肪萎縮性糖尿病からなる群から選択される。本発明の方法によって治療される糖尿病関連合併症としては、微小血管障害、眼球病変、網膜症、神経障害、および腎臓障害が挙げられる。心疾患としては、限定されないが、心不全、冠状動脈不、および高血圧症が挙げられる。本発明の化合物によって治療される、他の代謝関連障害としては、高脂質血症、高トリグリセリド血症および高尿酸血症が挙げられる。
【０３１４】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体において血中グルコースを調節する方法として用いることができる。
【０３１５】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体において体重を調節する方法として用いることができる。
【０３１６】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせることなく、単独で、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体において血中グルコースを調節する方法として用いることができる。
【０３１７】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせることなく、単独で、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体において体重を調節する方法として用いることができる。またさらなる好ましい実施形態では、体重の調節は、部分的または全体的に、ａ）皮下脂肪組織、またはｂ）内臓（大網）脂肪組織の量の減少によるものである。
【０３１８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、インスリン分泌促進物薬またはインスリン感受性改善薬と組み合わせて、それらの体重またはグルコース制御を改善するために、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体において補足的治療に用いることができる。そのインスリン分泌促進薬は、１，１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）、またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジドから選択されるスルホニル尿素であることが好ましい。インスリン感受性改善薬は、メトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択されることが好ましい。
【０３１９】
本発明はさらに、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬なしで、単独で、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体の体重またはグルコース制御を改善する方法を提供する。
【０３２０】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、例えば同時に、別々に、もしくは逐次に使用される個々の投与量単位の形でインスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬と共に、付随的にまたは同時に投与される（分泌促進薬の前もしくは後、または感受性改善薬の前もしくは後）。したがって、本発明はさらに、薬学的または生理学的に許容される組成物と、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体の体重またはグルコース制御の改善のために、同時に、別々に、または逐次に使用するための併用製剤（combined preparation）としての経口用インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬との組成物を提供する。
【０３２１】
さらなる好ましい実施形において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明はさらに、インスリン感受性改善薬として使用する方法を提供する。
【０３２２】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせて、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体においてインスリン感受性を改善する方法として使用することができる。
【０３２３】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明は、インスリン治療と組み合わせることなく、一部の個体、特にＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインスリン抵抗性を有する個体におけるインスリン感受性を改善する方法として使用することができる。
【０３２４】
さらなる好ましい実施形態において、前記薬学的または生理学的に許容される組成物の本発明はさらに、耐糖能障害からインスリン抵抗性への進行の抑制剤として使用する方法を提供する。
ＶＩＩ．ＧＺＩＰポリペプチド活性の修飾因子を同定するためのアッセイ
本発明は、細胞におけるＧＺＩＰの活性を調節する１種または複数種の化合物についてスクリーニングする方法であって、細胞に対して試験される潜在的な化合物を提供することを含む方法を特徴とする。用いることができる例示的なアッセイが、実施例のセクションに記述されている。ＧＺＩＰポリペプチドの単独での作用と比較して、それらの抑制または促進活性について試験される化合物がこれらのアッセイに加えられるだろう。ＧＺＩＰポリペプチドの添加に基づいて作用が観察される、他のアッセイを用いて、ＧＺＩＰポリペプチド活性の修飾因子またはＧＺＩＰポリペプチドの存在の細胞への作用についてスクリーニングすることもできる。必須の工程は、未知の化合物を適用し、ＧＺＩＰポリペプチドのみが細胞に適用された場合に見られるものからの変化についてアッセイをモニターする工程である。その変化は、単独でのＧＺＩＰポリペプチド比較して、ＧＺＩＰポリペプチドに加えて化合物の存在下で有意に異なる何かとして定義される。この場合、有意に異なるとは、測定可能な作用の、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％の「増加」または「減少」となるだろう。
【０３２５】
本明細書で使用される「調節（modulation）」という用語は、活性の測定可能な変化を意味する。例としては、限定されないが、脂肪分解促進受容体（ＬＳＲ）調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、血漿ＦＦＡレベル、ＦＦＡ酸化、ＴＧレベル、グルコースレベル、および体重が挙げられる。これらの作用は、インビトロ、好ましくはインビボであり得る。活性の調節は、活性の増加または減少のいずれかである。このように、ＬＳＲ活性を減少または増加させること、レプチン活性を減少または増加させること、リポタンパク質活性を減少または増加させることができる。同様に、ＦＦＡ、ＴＧ、グルコースレベルおよび体重は、インビボで増加または減少させることができる。遊離脂肪酸の酸化は、インビボまたはエクスビボで増加または減少させることができる。
【０３２６】
「ＬＳＲ」活性とは、細胞表面上の、または特定のコンフォメーションにおけるＬＳＲの発現、ならびにレプチンおよびリポタンパク質に結合し、それらを取り込み、分解するその能力を意味する。「レプチン」活性とは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解、ならびに血液脳関門を通過するその輸送、およびＬＳＲが必ずしも仲介因子ではない、または単なる仲介因子である場合の、潜在的なこれらの存在を意味する。同様に、「リポタンパク質」活性とは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解、ならびにＬＳＲが必ずしも仲介因子ではない、または単なる仲介因子である場合の、これらの存在を意味する。例示的なアッセイを実施例で示す。これらのアッセイおよび他の同等のアッセイを用いて、ＧＺＩＰポリペプチド活性を調節する化合物を決定／同定することができる。場合によっては、好ましくはすべての活性が修飾されるが、ＧＺＩＰポリペプチド活性のすべてではなく一部を調節する化合物を同定することが重要である場合がある。
【０３２７】
本明細書において使用される「増加（する）」という用語は、その非存在下でのＧＺＩＰポリペプチドの作用と比較される、測定可能な何らかの意味で、ＧＺＩＰポリペプチドの活性を増加する化合物の能力を意味する。化合物が存在した結果として、レプチンの結合または取り込みが、例えばＧＺＩＰポリペプチド単独の存在下での制御と比較して増加し得る。活性の増加は、ＧＺＩＰポリペプチドの存在下での活性レベルと比較して、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％であることが好ましい。
【０３２８】
同様に、本明細書において使用される「減少（する）」という用語は、その非存在下でのＧＺＩＰポリペプチドの作用と比較される、測定可能な何らかの意味で、活性を減少させる化合物の能力を意味する。例えば、化合物が存在すると、マウスにおけるＦＦＡ、ＴＧ、およびグルコースの血漿濃度が減少する。化合物が存在した結果として、レプチンの結合または取り込みが、例えばＧＺＩＰポリペプチド単独の存在下での制御と比較して減少し得る。活性の減少は、ＧＺＩＰポリペプチド単独の存在下での活性レベルと比較して、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％であることが好ましい。
【０３２９】
本発明は、体重を減少させる必要のある個体において体重を減少させる潜在的化合物を同定する方法であって：ａ）ＧＺＩＰポリペプチドおよび候補化合物と細胞を接触させる工程；ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、グルコース取り込みまたは酸化の増加、血中脂質またはトリグリセリドレベルの減少、リポタンパク質の結合、取り込みまたは分解の増加；ＦＦＡ酸化の増加；からなる群から選択される結果を検出する工程；ｃ）前記結果が、前記細胞がＧＺＩＰポリペプチドのみと接触された場合の前記結果と異なる場合に、前記潜在的化合物が前記結果により同定される工程；を含む方法を特徴とする。
【０３３０】
代替方法としては、本発明は、体重を増加する必要のある個体において体重を増加させる潜在的化合物を同定する方法であって：ａ）ＧＺＩＰポリペプチドおよび候補化合物と細胞を接触させる工程；ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、グルコース取り込みまたは酸化の減少、血中脂質またはトリグリセリドレベルの増加、リポタンパク質の結合、取り込みまたは分解の減少；ＦＦＡ酸化の減少；からなる群から選択される結果を検出する工程；ｃ）前記結果が、前記細胞がＧＺＩＰポリペプチドのみと接触された場合の前記結果と異なる場合に、前記潜在的化合物が前記結果により同定される工程；を含む方法を特徴とする。
【０３３１】
さらに他の好ましい実施形態において、前記潜在的化合物は、ペプチド、ペプチドライブラリー、非ペプチドライブラリー、ペプトイド、脂肪酸、リポタンパク質、薬物、抗体、小分子、プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。
ＶＩＩＩ．エピトープおよび抗体の融合
本発明の好ましい実施形態は、エピトープ保有ポリペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチド断片に関する。これらのエピトープは、「抗原エピトープ」または「抗原エピトープ」と「免疫原性エピトープ」の両方である。「免疫原性エピトープ」は、ポリペプチドが免疫原である場合、インビボで抗体応答を誘導するタンパク質の一部として定義される。一方、抗体が結合するポリペプチドの領域は、「抗原決定基」または「抗原エピトープ」として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は一般に、抗原エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 39984002参照のこと。特定のエピトープは免疫原性ではないが、それにもかかわらず、抗体をいずれかのエピトープに対してインビトロで作製することができることから、それは有用であることを特に留意のこと。
【０３３２】
エピトープは、エピトープに固有な空間的コンフォメーションにおいて３個と少ないアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも６個のかかるアミノ酸、さらにしばしば、少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、抗原エピトープは、３〜５０の間のいずれかの整数個の、いくつかのアミノ酸を含む。エピトープとして機能する断片は、いずれかの従来の手段によって作製することが可能である。例えば、Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)、さらに米国特許第４，６３１，２１号を参照のこと。免疫原性エピトープを構成するアミノ酸を決定する方法としては、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング、例えばH. Mario Geysen et al. (1984) ; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 3998-4002; 国際公開番号：ＷＯ８４／０３５６４；および国際公開番号：ＷＯ８４／０３５０６に記載のペプスカン（Pepscan）法などが挙げられる。その他の例としては、Jameson and Wolf, Comp. Appl. Biosci. 4: 181-186 (1988)のアルゴリズムが挙げられる（前記参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原解析は例えば、ＰＲＯＴＥＡＮコンピューター・プログラムを使用して、デフォルトパラメーター(Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ４．０，ＤＮＡＳＴＡＲ社（ウィスコンシン州マディソン,サウスパークストリート１２２８））を用いて行われる。
【０３３３】
本発明のエピトープ保有断片は、本発明のポリペプチドの６〜５０（つまり、６から５０までの間のいずれかの整数）個のアミノ酸を含むことが好ましい。配列表の６の整数から完全長の配列までの抗原断片もまた、本発明に含まれる。６の整数から本発明のポリペプチドの完全長配列までの配列のすべての組み合わせが包含される。エピトープ保有断片は、隣接アミノ酸残基の数（亜属として）によって、または本発明のポリペプチドについて上述される特定のＮ末端およびＣ末端位置（種として）によって指定される。本発明の任意の数のエピトープ保有断片もまた、同じ方法で除外され得る。
【０３３４】
抗原エピトープは、例えば、エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を産生するのに有用である（Wilson et al., 1984 ; and Sutcliffe, J. G. et al., 1983参照）。次いで、その抗体は、本明細書に記載の診断および組織／細胞同定技術などの種々の技術において、および精製方法において使用される。
【０３３５】
同様に、当技術分野でよく知られている方法に従って、免疫原性エピトープを用いて、抗体を誘導することができる（Sutcliffe et al. , supra; Wilson et al. , supra; Chow, M. et al.; (1985) and Bittle, F. J. et al. , (1985)参照）。好ましい免疫原性エピトープとしては、配列表のポリペプチドが挙げられる。免疫原性エピトープは、必要な場合には、動物系（ウサギまたはマウスなど）に、アルブミンなどの担体タンパク質と共に提示される。８〜１０個と少ないアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、最低限でも、変性ポリペプチドにおける線状エピトープに結合することができる抗体を産生するのに十分であることが示されている（例えば、ウエスタンブロット法において）。
【０３３６】
当技術分野でよく知られている方法、限定されないが、例えばインビボでの免疫化、インビトロでの免疫化、ファージディスプレイ法（例えば、上記のSutcliffe, et al.; 上記のWilson, et al.および上記のBittle, et al., 1985参照)などに従って、本発明のエピトープ保有ポリペプチドを使用して、抗体が誘導される。インビボ免疫化を用いる場合、動物を遊離ペプチドで免疫することができる；しかし、抗ペプチドの抗体価は、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドなどの巨大分子担体にペプチドを結合することによって高められる。例えば、システイン残基を含有するペプチドが、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミエステル（ＭＢＳ）などのリンカーを用いて担体に結合され、他のペプチドは、グルタルアルデヒドなどのさらに一般的な結合剤（linking agent）を用いて担体に結合される。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物が、例えば、ペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントアジュバント約１００μｇを含有するエマルションを腹腔内または皮内注射することによって、遊離もしくは担体結合ペプチドのいずれかで免疫される。例えば固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いたＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる、抗ペプチド抗体の有用な抗体価を得るために、例えば約２週間間隔に数回のブースター注射が必要とされる場合がある。免疫動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の抗体価は、当技術分野でよく知られている方法に従って、抗ペプチド抗体の選択によって、例えば、固体担体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶離によって高められる。
【０３３７】
当業者であれば、上述される本発明のポリペプチド、限定されないが、免疫原性または抗原エピトープを含むポリペプチドなどを、異種ポリペプチド配列に融合することができることは理解されよう。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンの一部を含む定常領域(ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ)、または定常領域の一部(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、全ドメインおよびその一部の両方を含むそのいずれかの組み合わせ）と融合することが可能であり、その結果キメラポリペプチドが生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、かつインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の種種のドメインからなるキメラタンパク質に関して示されている（ＥＰＡ ０，３９４，８２７;Traunecker et al. , 1988参照）。ＩｇＧ部分のために、ジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質もまた、単量体ポリペプチドまたはその断片のみよりも、他の分子に結合および中和するのに効率的である（例えば、Fountoulakis et al. , 1995参照）。上記エピトープをコードする核酸は、発現したポリペプチドの検出および精製において助けとなるエピトープタグとして、対象の遺伝子と再結合することもできる。
【０３３８】
本発明のその他の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、またはコドンシャッフリングの技術によって作製することが可能である（総称して「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）。ＤＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節することが可能であり、それによって、ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストが効果的に作製される。例えば、米国特許第：５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３４，２５２号；同第５，８３７，４５８号;およびPatten, P. A. , et al., (1997); Harayama, S. , (1998); Hansson, L. O. , et al (1999); and Lorenzo, M. M. and Blasco, R., (1998)（これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。一実施形態において、本発明のコードポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片等、またはそれによってコードされるポリペプチドは、１種または複数種の異種分子の１つまたは複数の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片等と再結合することができる。
抗体
本発明はさらに、本発明のペプチドに、さらに具体的には本発明のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む)、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹが挙げられる。本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、単鎖全抗体を含む全抗体、およびその抗原結合断片を包含することを意味するものである。好ましい実施形態において、抗体は本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'Ｆ(ａｂ)２およびＦ(ａｂ')２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、およびＶLもしくはＶHドメインのいずれかを含む断片が含まれる。その抗体は、鳥類および哺乳動物を含むいずれかの動物に由来する抗体であることが可能である。その抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来の抗体であることが好ましい。
【０３３９】
単鎖抗体を含む抗原結合抗体断片は、単独で、または以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部との組み合わせで、可変領域（１つまたは複数）を含み得る。可変領域（１つまたは複数）およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのいずれかの組み合わせも、本発明に包含される。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合するキメラ、ヒト化およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプの抗体を含む。
【０３４０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、および三重特異性であるか、またはそれ以上の多重特異性を有することが可能である。多重特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または本発明のポリペプチドならびに異種組成物、例えば異種ポリペプチドまたは固体担体材料のどちらにも特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt, et al., (1991)；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Kostelny et al., (1992)を参照のこと。
【０３４１】
本発明の抗体は、抗体によって認識または特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープ（１種または複数種）またはエピトープ保有部分（１種または複数種）に関して記述されるか、または指定される。本発明のタンパク質、分泌タンパク質の場合には、その抗体は、本発明の核酸によってコードされる完全長タンパク質、本発明の核酸によってコードされる成熟タンパク質（つまり、シグナルペプチドの切断により産生されるタンパク質）、本発明の核酸によってコードされるシグナルペプチド、または本発明の他のいずれかのポリペプチドに特異的に結合することができる。したがって、エピトープ（１種または複数種）またはエピトープ保有部分（１種または複数種）は、本明細書に記載のように、例えばＮ末端およびＣ末端部分によって、隣接アミノ酸残基のサイズによって、またはそうでなければ本明細書において述べられるように指定される。本発明のいずれかのエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体は、個々の種として除外される場合もある。したがって、本発明は、本発明の指定のポリペプチドに特異的に結合する抗体を包含し、それの除外も考慮される。
【０３４２】
本発明の抗体は、それらの交叉反応性の面から説明または指定することが可能である。本発明のポリペプチドの他のいずれかの類似体、オルソログ、またはホモログに特異的に結合しない抗体が包含される。本発明のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満の同一性（当技術分野で公知の方法および本明細書の記載の方法を用いて、例えば、ＦＡＳＴＤＢおよび本明細書に示されるパラメーターを用いて計算された）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に包含される。厳密なハイブリダイゼーション条件（本明細書に記載の）下にて本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに単に結合する抗体が、本発明にさらに包含される。本発明の抗体はまた、それらの結合親和性に関して説明または指定される。好ましい結合親和性としては、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-1lＭ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-l3Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-l4Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが挙げられる。
【０３４３】
本発明の抗体は、限定されないが、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化するための当技術分野で公知の方法、例えばインビトロおよびインビボ診断および治療法を含む用途を有する。例えば、その抗体は、生体試料において、本発明のポリペプチドのレベルを定性的かつ定量的に測定するイムノアッセイでの用途を有する（例えば、Harlow et al., 1988参照）。
【０３４４】
本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。その抗体はさらに、ＮもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え融合するか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、または毒素などのエフェクター分子に組換え融合するか、または結合させることが可能である。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ０ ３９６ ３８７参照のこと。
【０３４５】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の適切な方法によって作製することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原断片は、ポリクローナル抗体を含有する血清の生成を誘導するために、動物に投与することができる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により作製された抗体に限定されない。「抗体」という用語は、少なくとも１つの結合ドメインで構成されるポリペプチドまたはポリペプチドの群を意味し、結合ドメインは抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成されて、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形状および電荷分布を有する三次元結合空間が形成され、それによって抗原との免疫反応が可能となる。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物の、原核生物のクローン、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を意味し、それが作製される方法を意味するものではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて作製することができる。
【０３４６】
ハイブリドーマ技術としては、当技術分野で公知の技術 (例えば、Harlow et al. 1988 ; Hammerling, et al, 1981参照)（前記参考文献はその開示内容全体が参照により組み込まれる）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、例えばハイブリドーマにより産生された抗体から、パパイン（Ｆａｂ断片の作製のため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片の作製のため）などの酵素を用いて、タンパク分解切断により作製することができる。
【０３４７】
代替方法としては、当技術分野で公知の方法を用いて、組換えＤＮＡ技術の適用によって、または合成化学によって、本発明の抗体を作製することができる。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて作製することができる。ファージディスプレイ法において、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面上に、機能性抗体ドメインが提示される。目的の結合特性を有するファージが、抗原で、通常固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原で直接選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法で用いられるファージは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換え融合される、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkman et al., (1995) ; Ames et al., (1995); Kettleborough et al., (1994)；Persic et al., (1997); Burton, D. R. et al. (1994)；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７，５号、同第５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号に開示されている方法が挙げられる。
【０３４８】
上記の参考文献に記載のように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを用いて、ヒト抗体を含む全抗体、または他のいずれかの目的の抗原結合断片を作製することが可能であり、いずれかの目的の宿主、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌などにおいて発現させることができる。例えば、ＷＯ９２／２２３２４； Mullinax et al., (1992);  Sawai et al., (1995);Better et al., (1988)に開示されているような当技術分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製する技術を利用することもできる。
【０３４９】
単鎖Ｆｖおよび抗体を作製するために使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，２５８，４９８号; Huston et al. (1991) ; Shu, L. et al. (1993);およびSkerra, A. et al. (1988)に記載の技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含む一部の用途では、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Morrison, (1985); Oi et al. , (1986); Gillies, S. D. et al. (1989);および米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。ＣＤＲグラフティング（ＥＰ ０ ２３９ ４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（ＥＰ ０ ５９２ １０６；ＥＰ ０ ５１９ ５９６；Padlan E.A., (1991); Studnicka G.M.et al. (1994)；Roguska M.A. et al.(1994))、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む様々な技術を用いて、抗体をヒト化することができる。ヒト抗体は、上述のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号；ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１を参照のこと（前記参考文献はその全体が参照により組み込まれる）。
【０３５０】
ヒト抗体は、上述のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号；ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと。
【０３５１】
本発明のポリペプチドに組換え融合される、または化学結合（共有および非共有結合のどちらも含む）される抗体がさらに、本発明に包含される。その抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であってもよい。例えば、抗体を使用して、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または結合させることによって、インビトロまたはインビボで特定の細胞型に対して本発明のポリペプチドを標的化することが可能である。本発明のポリペプチドに融合または結合した抗体は、インビトロでの免疫アッセイおよび当技術分野で公知の方法を用いた精製法において使用することも可能である（例えば、上記のHarbor 等；ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ ０ ４３９ ０９５； Naramura, M. et al. (1994)；米国特許第５，４７４，９８１号；Gillies, S.O. et al. (1992); Fell, H. Petal., 1991参照）。
【０３５２】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合した本発明のポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその一部に融合または結合することが可能である。本発明のポリペプチドに融合される抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、または全ドメインもしくはその一部のいずれかの組み合わせを含む。本発明のポリペプチドを上記の抗体部分に融合または結合させて、ポリペプチドのインビボでの半減期を増大するか、あるいは当技術分野で公知の方法を用いた免疫アッセイで使用することができる。そのポリペプチドを上記の抗体部分に融合または結合させて、多量体を形成することも可能である。例えば、本発明のポリペプチドに融合されるＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。三量体以上の多量体形は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合させることによって生成することができる。本発明のポリペプチドを抗体に融合または結合させる方法は、当技術分野では公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ０ ３０７ ４３４、ＥＰ ０ ３６７ １６６；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０； Ashkenazi, A. et al. (1991); Zheng, X.X. et al.(1995);Vil, H. et al. (1992)を参照のこと。
【０３５３】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を一部または完全に阻害する抗体を含む。受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体のどちらも包含される。リガンド結合を妨げないが、受容体活性化を妨げる受容体特異的抗体が包含される。受容体活性化（つまり、シグナル伝達）は、本明細書に記述されるか、またはそうでなければ当技術分野で公知の技術によって決定することができる。リガンド結合および受容体活性化のどちらも妨げる受容体特異的抗体もまた包含される。同様に、リガンドに結合し、リガンドの受容体への結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによって受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合するのを妨げない抗体が包含される。受容体を活性化する抗体がさらに包含される。これらの抗体は、リガンドによって仲介される受容体活性化によって影響を受ける、すべてのまたはすべてとは限らない生物活性に対してアゴニストとして作用する。その抗体は、本明細書で開示される特定の活性を含む生物活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして指定される。上記の抗体アゴニストは当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７；Deng, B. et al. (1998); Chen, Z. et al. (1998); Harrop, J.A. et al. (1998); Zhu, Z. et al. (1998); Yoon, D.Y. et al. (1998); Prat, M. et al. (1998); Pitard, V. et al.(1997); Liautard, J. et al.(1997); Carlson, N.G. et al. (1997); Taryman, R.E. et al. (1995); Muller, Y.A. et al. (1998); Bartunek, P. et al. (1996)を参照のこと。
【０３５４】
上述のように、本発明のポリペプチドの抗体は次に、当業者によく知られている技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣」する、抗イディオタイプ抗体を作製するのに使用することができる（例えば、GreenspanおよびBona, (1989); Nissinoff, (1991)参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合し、かつ本発明のポリペプチドのポリペプチド多重体化または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に抑制する抗体を使用して、ポリペプチド多重体化または結合ドメインを模倣し、結果として、ポリペプチドもしくはそのリガンドに結合かつ中和する抗イディオタイプを産生することができる。かかる中和抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドに結合させるか、またはそのリガンド／受容体に結合させて、それによってその生物活性をブロックすることができる。
【０３５５】
本発明は、本発明の突然変異完全長もしくは成熟ポリペプチドまたは突然変異ポリペプチドのエピトープを含むその断片または変異体に、特異的に結合することができる精製または単離抗体にも関する。他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、かつ突然変異を生じる形質によってコードされ得るアミノ酸の少なくとも１つを含むポリペプチドに結合することができる抗体に関する。
【０３５６】
野生型であろうと遺伝子導入動物であろうと、抗体結合が望まれるものと異なる種類の本発明のポリペプチドを発現する非ヒト動物または哺乳動物、および本発明のポリペプチドを発現しない動物（つまり、ノックアウト動物）は、特に抗体の作製に有用である。遺伝子ノックアウト動物は、本発明のポリペプチドの露出領域のすべてまたは大部分を外来抗原として認識し、したがってエピトープのより広いアレイを有する抗体を産生するであろう。さらに、わずか１０〜３０個のアミノ酸を有する小さなポリペプチドが、本発明のポリペプチドのいずれか１つへの特異的な結合を得るのに有用である。さらに、抗原配列に類似する本発明のポリペプチドの種を産生する、動物の体液性免疫系は、動物の天然ポリペプチド種と抗原配列との間の差異を選択的に認識し、抗原配列におけるこれらの固有の部位に対して抗体を産生するだろう。かかる技術は、本発明のポリペプチドのいずれか１つに特異的に結合する抗体を得るのに、特に有用であるだろう。
【０３５７】
いずれかのプロトコルに従って作製される抗体は、生体試料における抗原保有物質の濃度を決定する、定量的イムノアッセイにおいて有用であり；それらは、生体試料における抗原の存在を同定するために半定量的または定性的にも使用される。その抗体は、タンパク質を発現する細胞を殺す、または体内におけるタンパク質のレベルを低減する、治療用組成物においても使用することができる。
【０３５８】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の放射性標識、蛍光標識、または酵素標識のいずれか１つによって標識化することができる。
【０３５９】
その結果として、本発明は、本発明に従って、生体試料における本発明のポリペプチドの存在を特異的に検出する方法にも関し、前記方法は、以下の工程：
ａ）本発明のポリペプチドを含有すると思われる生体試料を入手する工程；
ｂ）抗原−抗体結合に適切な条件下にて、その生体試料を、本発明のポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させる工程；
ｃ）形成された抗原−抗体複合体を検出する工程；を含む。
【０３６０】
本発明は、生体試料における本発明のポリペプチドの存在をインビトロで検出するための診断キットにも関し、前記キットは：
ａ）本発明のポリペプチドに特異的に結合する、任意に標識されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体；
ｂ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、任意に標識を有するか、または特に、上述のモノクローナルまたはポリクローナル抗体が単独で標識されていない場合に、標識化試薬によってそれ自体を認識することができる試薬；を備える。
Ａ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の作製
上述のように同定かつ単離されるペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体を、Kohler, G.およびMilstein, C. , Nature 256: 495 (1975)の伝統的方法またはその派生的方法に従って、マウスハイブリドーマから作製することができる。簡潔には、数週間にわたって、それに由来する選択されたタンパク質またはペプチド数マイクログラムをマウスに繰り返し接種する。次いで、そのマウスを屠殺し、抗体を産生する脾臓細胞を単離する。ポリエチレングリコールを使用して、その脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、融合していない余分な細胞を、アミノプテリンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）上でその系の成長によって破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、その希釈液のアリコートを、培養物の成長が続けられるマイクロタイタープレートのウェルに入れる。抗体産生クローンは、最初にEngvall, E. , Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)によって記述されているようにＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ法、およびその派生的方法によって、ウェルの上清液中の抗体を検出することによって同定される。選択されたポジティブクローンは拡大され、それらのモノクローナル抗体産物は、使用するために収集される。モノクローナル抗体作製の詳細な手順は、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記述されている。
【０３６１】
ＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が特に、本発明に包含される。最も特に、配列番号：２の２０９〜２５４、２１５〜２４８、２２１〜２４２位のアミノ酸、または配列番号：３の２０６〜２５１、２１２〜２４５、２１８〜２３９位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体が本発明に包含される。さらに最も特に、配列番号：２の２１〜２０２、２１〜２０８位のアミノ酸、または配列番号：３の１８〜１９９、１８〜２０５位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体が本発明に包含される。
【０３６２】
さらに特には、ＡＰＭ１ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が本発明に包含される。最も特には、配列番号：４の１６５〜２０５、１７１〜１９９、１７７〜１９３、または１７９〜１９０位のアミノ酸を含むＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体が本発明に包含される。さらに、配列番号：４の９１〜２４４、１０１〜２４４または１０８〜２４４位のアミノ酸を含む球状Ｃｌｑ相同性領域を含有するＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体が最も特に好ましい。
Ｂ．免疫化によるポリクローナル抗体の作製
未修飾であるか、または修飾して免疫原性を高めることができる、上述のそれに由来の発現タンパク質またはペプチドで適切な動物を免疫化することによって、単一タンパク質の異種性エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を作製することができる。有効なポリクローナル抗体の作製は、抗原および宿主種の両方に関係する多くの因子によって影響を受ける。例えば、小分子は他のものよりも免疫原性が低い傾向があり、担体およびアジュバントの使用が必要である。また、宿主動物は、接種部位および用量に応じて異なり、不適切な用量または過剰用量の抗原によって、血清の力価が低くなる。複数の皮内部位に投与された少用量（ｎｇレベル）の抗原が、最も信頼性が高いと思われる。ウサギに関する有効な免疫化プロトコルが、Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-991 (1971)に見出すことができる。
【０３６３】
一定間隔を空けてブースター注射をし、例えば抗原の既知濃度に対する寒天中での二重免疫拡散によって半定量的に決定される、その抗体力価が下がり始めた時に、抗血清が収集される。例えば、Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)を参照のこと。抗体のプラトー濃度は通常、血清の０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲にある（約１２μＭ）。抗原に対する抗血清の親和性は、例えばFisher, D. , Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds. ) Amer. Soc. For Microbiol. , Washington, D. C. (1980)に記述されているように、競合的結合曲線を作成することによって決定される。
【０３６４】
いずれかのプロトコルに従って作製された抗体製剤は、生体における抗原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用であり；それらはまた、生体試料における抗原の存在を同定するために半定量的または定性的に使用される。その抗体は、タンパク質を発現する細胞を殺すため、または体内のタンパク質レベルを低減するための治療用組成物において使用することも可能である。
【０３６５】
ＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体も特に、本発明に包含される。最も特には、配列番号：２の２０９〜２５４、２１５〜２４８、２２１〜２４２位のアミノ酸、または配列番号：３の２０６〜２５１、２１２〜２４５、２１８〜２３９位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合するポリクローナル抗体が本発明に包含される。さらに最も特には、配列番号：２の２１〜２０２、２１〜２０８位のアミノ酸、または配列番号：３の１８〜１９９、１８〜２０５位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合するポリクローナル抗体が本発明に包含される。
【０３６６】
さらに特には、ＡＰＭ１ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体が本発明に包含される。最も特には、配列番号：４の１６５〜２０５、１７１〜１９９、１７７〜１９３、または１７９〜１９０位のアミノ酸を含むＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合するポリクローナル抗体が本発明に包含される。さらに、配列番号：４の９１〜２４４、１０１〜２４４または１０８〜２４４位のアミノ酸を含む球状Ｃｌｑ相同性領域を含有するＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合するポリクローナル抗体が最も特に好ましい。
ＩＸ．ＧＺＩＰに結合するＡＰＭ１のアンタゴニストを同定するためのアッセイ
本発明は、ＧＺＩＰポリペプチド断片への、ＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニスト化合物についてスクリーニングする方法を特徴とする。好ましい前記 ＡＰＭ１ポリペプチド断片は、ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ相同性領域のすべてまたは一部を含有する（国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５参照）。さらに好ましいＡＰＭ１ポリペプチド断片は、本発明のＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合する、配列番号：４の１８〜２４４、９３〜２４４、１０１〜２４４または１０８〜２４４位のアミノ酸を含む球状Ｃｌｑ相同性領域のすべてまたは一部を含有する前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片である。好ましい前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、シグナルペプチドを欠く成熟ＧＺＩＰポリペプチドであり、シグナルペプチドを欠く前記成熟ＧＺＩＰポリペプチドは、配列番号：２の２１〜２９８位のアミノ酸または配列番号：３の１８〜２９５位のアミノ酸を含む。
【０３６７】
好ましい前記化合物はポリペプチドである。
【０３６８】
他の好ましい前記化合物は、ポリペプチド断片である。好ましい前記ポリペプチド断片は、ＧＺＩＰポリペプチド断片である。特に好ましい前記ポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸を含む、ＧＺＩＰポリペプチド断片である。他の好ましい前記ポリペプチド断片は、ＡＰＭ１ポリペプチド断片である。さらに特に好ましい断片は、配列番号：４の１７７〜１９３または１７９〜１９０位のアミノ酸を含むＡＰＭ１ポリペプチド断片である。
【０３６９】
他の好ましい前記化合物は、ペプチドである。
【０３７０】
他の好ましい前記化合物は、タンパク質である。
【０３７１】
他の好ましい前記化合物は、抗体である。好ましい前記抗体は、ＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合する抗体である。特に好ましい抗体は、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸または配列番号：３の２１８〜２３９位のアミノ酸で構成されるＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合する抗体である。他の好ましい前記抗体は、ＡＰＭ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。さらに特に好ましい抗体は、配列番号：４の１７７〜１９３位のアミノ酸で構成されるＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合する抗体である。他の特に好ましい抗体は、配列番号４：の９３〜２４４、１０１〜２４４または１０８〜２４４位のアミノ酸で構成されるＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合する抗体である。他の好ましい前記化合物は炭水化物である。他の好ましい前記化合物は脂質である。他の好ましい前記化合物は低分子量有機化合物である。他の好ましい前記化合物は低分子量無機化合物である。
【０３７２】
ＧＺＩＰポリペプチド断片へのＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニスト化合物についてスクリーニングする前記方法の一例としては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられ、その方法は、ａ）候補化合物と共に、またはなしに、固定化ＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片をインキュベートし、それによって候補化合物と接触させる工程；ｂ）前記候補化合物と接触されている前記固定化ＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を、さらにＧＺＩＰポリペプチド断片と接触させる工程；ｃ）前記固定化ＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片に結合されたＧＺＩＰポリペプチド断片を、ビオチン化抗ＧＺＩＰ抗体と接触させる工程；ｄ）結合したビオチン化抗ＧＺＩＰ抗体を、ストレプトアビジン結合酵素と接触させる工程；ｅ）結合したストレプトアビジン結合酵素を前記酵素の基質と接触させる工程であって、前記基質に対して前記酵素が作用した結果、色の変化が生じる工程；ｆ）前記固定化ＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を前記化合物と共にインキュベートすると、色の変化の程度が低減されるかどうかの結果を検出し、前記結果から、前記化合物をアンタゴニストとして同定する工程；を含む。
【０３７３】
ＧＺＩＰポリペプチド断片へのＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニスト化合物についてスクリーニングする前記方法の他の例としては、ａ）候補化合物と共に、またはなしに、固定化ＧＺＩＰポリペプチド断片をインキュベートし、それによって候補化合物と接触させる工程；ｂ）前記候補化合物と接触されている前記固定化ＧＺＩＰポリペプチド断片を、さらにＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる工程；ｃ）前記固定化ＧＺＩＰポリペプチド断片に結合されたＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を、ビオチン化抗ＡＰＭ１抗体と接触させる（国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５参照）工程；ｄ）結合したビオチン化抗ＡＰＭ１抗体を、ストレプトアビジン結合酵素と接触させる工程；ｅ）結合したストレプトアビジン結合酵素を、前記酵素の基質と接触させる工程であって、前記基質に対して前記酵素が作用した結果、色の変化が生じる工程；ｆ）前記固定化ＧＺＩＰポリペプチド断片を前記化合物と共にインキュベートすると、色の変化の程度が低減されるかどうかの結果を検出し、前記結果から、前記化合物をアンタゴニストとして同定する工程；を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【０３７４】
ＧＺＩＰポリペプチド断片へのＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニスト化合物をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする前記例は、当業者にはよく知られている。当業者であれば、ＧＺＩＰポリペプチド断片へのＡＰＭ１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の結合をブロックする１種または複数種のアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするための代替のアッセイをさらに考案することができる。
Ｘ．ＧＺＩＰポリペプチド断片によって現れる活性のアンタゴニストを同定するためのアッセイ
本発明は、ＧＺＩＰポリペプチド断片によって現れる活性の１種または複数種のアンタゴニストについて化合物をスクリーニングする方法を特徴とし、前記活性は、限定されないが、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性から選択される。好ましい前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、シグナルペプチドを欠く成熟ＧＺＩＰポリペプチドであり、シグナルペプチドを欠く前記成熟ＧＺＩＰポリペプチドは、配列番号：２の２１〜２９８位のアミノ酸または配列番号：３の１８〜２９５位のアミノ酸を含む。
【０３７５】
好ましい前記化合物はポリペプチドである。
【０３７６】
他の好ましい前記化合物はポリペプチド断片である。好ましい前記ポリペプチド断片はＧＺＩＰポリペプチド断片である。特に好ましい前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片である。
【０３７７】
他の好ましい前記化合物はペプチドである。
【０３７８】
他の好ましい前記化合物はタンパク質である。
【０３７９】
他の好ましい前記化合物は抗体である。好ましい前記抗体は、ＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合する抗体である。特に好ましい前記抗体は、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸、または配列番号：３の２１８〜２３９位のアミノ酸で構成されるＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合する抗体である。
【０３８０】
他の好ましい前記化合物は炭水化物である。
【０３８１】
他の好ましい前記化合物は脂質である。
【０３８２】
他の好ましい前記化合物は低分子量有機化合物である。
【０３８３】
他の好ましい前記化合物は低分子量無機化合物である。
【０３８４】
本発明はさらに、ＧＺＩＰポリペプチド断片によって現れる活性の前記アンタゴニストについて化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）前記ＧＺＩＰポリペプチド断片を前記化合物と接触させる、または前記化合物と接触させない工程；ｂ）活性に基づく結果を検出する工程であって、前記活性が、限定されないが、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性から選択される工程；ｃ）前記化合物を用いた前記結果が、前記化合物を用いていない前記結果と対立するかどうかの前記結果から、前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する工程；を含む、方法を特徴とする。用いることが可能な例示的なアッセイを実施例２および１０に示す。
ＸＩ．ＧＺＩＰポリペプチド断片とＡＰＭ１ポリペプチド断片との組み合わせによって現れる活性のアンタゴニストを同定するためのアッセイ
本発明は、ＧＺＩＰポリペプチド断片とＡＰＭ１ポリペプチド断片との組み合わせによって現れる活性の１種または複数種のアンタゴニストについて化合物をスクリーニングする方法であって、前記活性が、限定されないが、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性から選択される方法を特徴とする。好ましい前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、シグナルペプチドを欠く成熟ＧＺＩＰポリペプチドであり、シグナルペプチドを欠く前記成熟ＧＺＩＰポリペプチドは、配列番号：２の２１〜２９８位のアミノ酸、または配列番号：３の１８〜２９５位のアミノ酸を含む。
【０３８５】
好ましい前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片は、ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ相同性領域で構成される。特に好ましい前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片は、配列番号：４の１０１〜２４４位のアミノ酸で構成される前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片である。他の特に好ましい前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片は、見掛け分子量２７ｋＤａを有する、血漿中の前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片である（国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５）。
【０３８６】
好ましい前記化合物はポリペプチドである。
【０３８７】
他の好ましい前記化合物はポリペプチド断片である。好ましい前記ポリペプチド断片は、ＧＺＩＰポリペプチド断片である。特に好ましい前記ＧＺＩＰポリペプチド断片は、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位のアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位のアミノ酸を含むＧＺＩＰポリペプチド断片である。他の好ましい前記ポリペプチド断片は、ＡＰＭ１ポリペプチド断片である。特に好ましい前記ＡＰＭ１ポリペプチド断片は、配列番号：４の１７７〜１９３または１７９〜１９０位のアミノ酸を含むＡＰＭ１ポリペプチド断片である。
【０３８８】
他の好ましい前記化合物はペプチドである。
【０３８９】
他の好ましい前記化合物はタンパク質である。
【０３９０】
他の好ましい前記化合物は抗体である。好ましい前記抗体は、ＧＺＩＰポリペプチドに特異的に結合する抗体である。ＧＺＩＰポリペプチド断片に特異的に結合する、特に好ましい前記抗体は、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸、または配列番号：３の２１８〜２３９位のアミノ酸、または配列番号２：の２１〜２０２、２１〜２０８位のアミノ酸、または配列番号：３の１８〜１９９、１８〜２０５位のアミノ酸で構成されるＧＺＩＰポリペプチド断片に対して作られる前記抗体である。他の好ましい前記抗体は、ＡＰＭ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。ＡＰＭ１に対して作られる、特に好ましい前記抗体は、配列番号：４の１７７〜１９３位のアミノ酸で構成されるＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合する前記抗体である。他の特に好ましい抗体は、配列番号：４の９３〜２４４、１０１〜２４４または１０８〜２４４位のアミノ酸で構成されるＡＰＭ１ポリペプチド断片に特異的に結合する抗体である。
【０３９１】
他の好ましい前記化合物は炭水化物である。
【０３９２】
他の好ましい前記化合物は脂質である。
【０３９３】
他の好ましい前記化合物は低分子量有機化合物である。
【０３９４】
他の好ましい前記化合物は低分子量無機化合物である。
【０３９５】
本発明はさらに、ＧＺＩＰポリペプチド断片とＡＰＭ１ポリペプチド断片との組み合わせによって現れる前記アンタゴニスト活性について化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）ＧＺＩＰポリペプチド断片とＡＰＭ１ポリペプチド断片との前記組み合わせを前記化合物と接触させる、または接触させない工程；ｂ）活性に基づく結果を検出する工程であって、前記活性が、限定されないが、脂質分配、脂質代謝、およびインスリン様活性から選択される工程；ｃ）前記化合物を用いた前記結果が、前記化合物を用いていない前記結果と対立するかどうかの前記結果から、前記化合物を前記アンタゴニストとして同定する工程；を含む、方法を特徴とする。用いることが可能な例示的なアッセイを実施例２および１０に示す。
【０３９６】
本発明の他の特徴および利点は、図および実施例の簡単な説明に記述されている。これらは、単に例示的なものであり、決して本発明を制限するものではない。本出願全体にわたり、種々の出版物、特許および公開特許出願が記載されている。本出願において参照される、これらの出版物、特許および公開特許明細書の開示内容は、本発明の開示内容に参照により組み込まれる。
【実施例】
【０３９７】
以下の実施例は、実例としての目的で記載するものであり、制限的な意味ではない。当業者であれば、そのすべてが本発明の一部を形成する、本明細書における開示内容に基づく同等のアッセイおよび方法を設計することができるだろう。
実施例１：ＧＺＩＰ ＤＮＡのノーザン分析
発達の異なる段階での、異なるヒト組織（成人および胎児の）および細胞系、ならびにマウス胚におけるＧＺＩＰ発現の分析は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したポリＡ+ＲＮＡブロット（例えば、Ｎｏ．７７８０−１、７７５７−１、７７５６−１、７７６８−１および７７６３−１）を使用することによって行われる。ＲＮＡプローブの標識化は、製造元の説明書の通りに、Ａｍｂｉｏｎ社から市販のＲＮＡストリップ−ＥＺキット（RNA Strip-EZ kit）を用いて行われる。ＲＮＡブロットとのＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、Ｕｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して行われる。
【０３９８】
簡単に言うと、ブロットは、５０℃（低い厳密度）または６５℃（高い厳密度）で３０分間プレハイブリダイズされる。標識プローブ（２×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）を加えた後、ブロットを一晩（１４〜２４時間）ハイブリダイズし、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５０℃にて２×２０分間（低い厳密度）、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５８℃にて２×２０分間（中程度の厳密度）、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃にて２×２０分間（高い厳密度）洗浄する。洗浄後、完了したブロットは、ホスホイメージャー（Phosphoimager）（分子動力学）に１〜３日間かけられる。
実施例２：代謝関連活性のインビトロでの試験
ＧＺＩＰポリペプチドの種々の製剤および種々の配列変異体の活性は、以下に示すアッセイを含む様々なインビトロアッセイを用いて評価される。これらのアッセイもまた、ＧＺＩＰポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを作り出すために使用することができるアッセイの例である。それをするために、候補分子存在下での、上記のアッセイにおける、例えばレプチンまたはＬＳＲ活性に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果は、候補分子の非存在下での、アッセイにおけるＧＺＩＰポリペプチドの効果と比較されるだろう。ＧＺＩＰポリペプチドは、高カフェテリア食（high-cafeteria diet）（実施例５）のマウスの体重を減少させると考えられることから、これらのアッセイは、体重を減少する（または増加する）候補治療法を同定するのにも役立つ。
肝細胞系：
ＬＳＲに対するＧＺＩＰポリペプチドの有効性の試験は、例えば、ＰＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂ（ヒト）、Ｈｅｐａ １−６、ＢＰＲＣＬ（マウス）、またはＭＣＡ−ＲＨ７７７、ＭＣＡ−ＲＨ８９９４（ラット）などの肝細胞系を用いて行うことができる。
【０３９９】
グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（高グルコース）中のＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣレポジトリー（Repository））を、３００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングする（０日目）(Bihain & Yen, 1992)。２日目に培地を取り替える。３日目に、コンフルエントな単層をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で１回洗浄する。０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、重炭酸ナトリウム３．７ｇ／Ｌを含有するＤＭＥＭ（ｐＨ７．５）中で、増加する濃度の組換えＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ）または球状ＡｄｉｐｏＱ（ＡＱ−ＧＨ）と共に、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。125Ｉ−マウスレプチン（比活性、２２１００ｃｐｍ／ｎｇ）１０ｎｇ／ｍＬを添加した後、インキュベーションを３７℃で３時間続ける。０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで、単層を連続して２回洗浄し、続いてＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、次いでＰＢＳで連続して２回洗浄する。０．２４ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｎ ＮａＯＨで細胞を溶解する。ライセートをチューブに回収し、γ線計数器で計数する。
血液脳関門モデル：
脳に由来する細胞を使用して、脳におけるレプチン輸送に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を決定することができる。考えられる１つの方法は、Dehouck, et al (J Neurochem 54: 1798-801,1990；図、表、もしくは図面を含むその開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記述されている血液／脳関門モデルを使用する方法であって、脳の毛細管内皮細胞および星状膠細胞の共培養を用いて、ＬＳＲまたは他の受容体によるレプチン（または他の分子）輸送に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を試験する方法である。
【０４００】
このアッセイは、脳へのレプチン輸送に対するＧＺＩＰポリペプチドの潜在的な効果の指標となると考えられ、このアッセイを用いて、脳におけるＬＳＲまたは他の受容体を介したレプチン輸送を調節するそれらの能力について、ＧＺＩＰポリペプチド変異体をスクリーニングすることが可能である。さらに、ＬＳＲまたは他の受容体を介したレプチン輸送に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果の、推定されるアゴニストおよびアンタゴニストもまた、このアッセイを用いてスクリーニングすることが可能である。血液／脳関門を通過するレプチンの輸送が増加すると、満腹因子としてのその作用がおそらく増加するだろう。
ＬＳＲ発現のＦＡＣＳ解析
ＬＳＲに対するポリペプチドの効果は、抗ＬＳＲ抗体および蛍光二次抗体を用いて、フローサーフェイスサイトメトリー（flow surface cytometry）により、細胞表面でのＬＳＲの発現レベルを測定することによっても決定することができる。フローサイトメトリーは、生体粒子の特性を測定するために使用される、レーザーに基づく技術である。フローサイトメトリーの根本的な原理は、光を散乱し、励起源からの光が動いている粒子に当たると蛍光が発せられる。
【０４０１】
これは、ＧＺＩＰポリペプチドおよび変異体ならびにＧＺＩＰポリペプチドの推定アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために容易に適合させることができるハイスループットアッセイである。２種類のアッセイを以下に示す。抗体、細胞系およびＧＺＩＰポリペプチド類似体は、実験によって異なるだろうが、ヒト抗ＬＳＲ抗体および球状ＡＰＭ１を用いて、ヒトを治療するために使用される変異体、アゴニスト、およびアンタゴニストについてスクリーニングすることができる。
アッセイ：１
収集およびＦＡＣＳによる解析の前に、インタクトなＧＺＩＰポリペプチド（または未処理のＧＺＩＰポリペプチド）で細胞を前処理する。非酵素的解離溶液（Ｓｉｇｍａ社）を用いて細胞を収集し、次いで、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１：２００希釈の抗ＬＳＲ ８１Ｂまたは無関係の抗血清と共に、４℃で１時間インキュベートする。同じバッファーで２回洗浄した後、ヤギの抗ウサギＦＩＴＣ結合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社，ペンシルヴェニア州Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ）を細胞に添加し、４℃でさらに４０分間インキュベートする。洗浄後、２％ホルマリン中に細胞を固定化する。フローサイトメトリー解析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（ベクトン・ディキンソン社，ニュージャージー州フランクリン・レイクス）で行う。
アッセイ：２
製造元の説明書に従って、解析前の４８時間、細胞をＴ１７５フラスコ中で培養する。
【０４０２】
細胞をＦＡＣＳバッファー（１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、フィルター滅菌）で１回洗浄し、フラスコから手作業で取り出し、ＦＡＣＳバッファー１０ｍＬに入れる。その細胞浮遊液を１５ｍＬコニカルチューブに移し、４℃にて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を捨て、４℃に冷却されたＦＡＣＳバッファー１０ｍＬに再懸濁する。細胞の計数を行い、細胞密度をＦＡＣＳバッファーで１×１０6細胞／ｍＬの濃度に調節する。解析のために、細胞浮遊液１ｍＬを４８ウェルプレートの各ウェルに加える。４℃にて１２００ｒｐｍで５分間、細胞を遠心分離する。プレートをチェックして、細胞がペレット化されているかを確認し、上清を除去し、プレートをボルテックスミキサーにかけることによって、細胞を再懸濁する。ＦＡＣＳバッファー１ｍＬを各ウェルに添加し、続いて４℃にて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。記述されているこの細胞洗浄は、合計３回行った。
【０４０３】
適切な作業希釈（working dilution）（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００、または１：１００００）を決定するために、スクリーニング実験で力価測定された一次抗体を、全容積５０μＬのＦＡＣＳバッファー中の細胞に添加する。プレートを４℃で１時間インキュベートし、光から保護する。インキュベーション後、上述のように細胞を３回洗浄する。適切な作業希釈（working dilution）（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００、または１：１００００）を決定するために、スクリーニング実験で力価測定された適切な二次抗体を、全容積５０μＬのＦＡＣＳバッファー中の細胞に添加する。プレートを４℃で１時間インキュベートし、光から保護する。インキュベーション後、上述のように細胞を３回洗浄する。最後の洗浄が終わったら、細胞をＦＡＣＳバッファー５００μｌに再懸濁し、ＦＡＣＳ収集チューブに移す。光から保護された氷上に試料を置き、１時間以内に分析する。
蛍光顕微鏡検査法により検出されるＧＺＩＰポリペプチドの細胞結合および取り込み
濃度１ｍｇ／ｍＬでのＧＺＩＰポリペプチド：精製ＧＺＩＰタンパク質のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合は、Ｓｉｇｍａ社のフルオロタグＦＩＴＣコンジュゲーション・キット（FluoroTag FITC conjugation kit）（ストック番号ＦＩＴＣ−１）を用いてＦＩＴＣで標識化される。小規模の結合についてはＳｉｇｍａ社の手引書に概説されているプロトコルが、ＧＺＩＰタンパク質の標識化に従っている。
【０４０４】
細胞培養：Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）およびＨｅｐａ−１−６マウス肝細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）を、２×１０5細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレート中に播種する。製造元の説明書に従って、Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐａ−１−６細胞を、分析前の２４〜４８時間培養する。細胞が８０％コンフルエントな場合に、アッセイを行う。
【０４０５】
顕微鏡検査法を用いた、ＦＴＣＣ標識化ＧＺＩＰタンパク質の細胞結合および取り込み：Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐａ−１−６細胞を、ヒトＬＳＲ（８１Ｂ：ヒトＬＳＲのＮ末端配列；マウスＬＳＲおよび９３Ａと交差反応しない：Ｃ末端配列はマウスＬＳＲと交差反応する）に対して作られる抗体またはｇＣ１ｑｒ（９５３）に対する抗血清の存在／非存在下にて、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。２μｇ／ｍＬの濃度でＬＳＲ抗体を培地に添加する。抗ｇＣ１ｑｒ抗血清を、未希釈の血清２．５μｌの容積（高濃度）で、または１：１００の希釈（低濃度）で培地に添加する。指定の抗体と共にインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ＧＺＩＰポリペプチド（５０ｎＭ／ｍＬ）を各細胞培養液に添加する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で再び１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞をウェルから掻き取り、ＰＢＳ１ｍＬに加える。細胞浮遊液をエッペンドルフチューブに移し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を除去し、ＰＢＳ２００μｌに細胞を再懸濁する。ＦＩＴＣ−ＧＺＩＰポリペプチドの結合および取り込みは、４０倍の倍率で螢光顕微鏡により分析される。
【０４０６】
このアッセイは、ＧＺＩＰポリペプチドの細胞への取り込みまたは結合を促進する、または防ぐ、作用物質を同定するのに有用であり得る。
リポタンパク受容体としてのＬＳＲに対する効果
ＬＳＲのリポタンパク質結合、取り込み（internalizing）、および分解活性に対するＧＺＩＰタンパク質の効果もまた、試験することができる。リポタンパク質受容体としてのＬＳＲの測定は、 Bihain & Yen, ( (1992) Biochemistry May 19; 31 (19): 4628-36（図、表、および図面を含む、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＬＳＲのリポタンパク質結合、取り込み、および分解活性に対するＧＺＩＰタンパク質の効果は、その他の対照として未処理細胞でのインタクトなＧＺＩＰタンパク質の効果と比較することができる。このアッセイを用いて、ＧＺＩＰタンパク質の活性および抑制性変異体、ならびに代謝関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてスクリーニングすることもできる。
【０４０７】
グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（高グルコース）中のヒト肝臓ＰＬＣ細胞（ＡＴＣＣレポジトリー）を、３００，０００細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートにプレーティングする（０日目）(Bihain & Yen, 1992)。２日目に培地を取り替える。３日目に、コンフルエントな単層をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で１回洗浄する。０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、重炭酸ナトリウム３．７ｇ／Ｌを含有するＤＭＥＭ（ｐＨ７．５）中のヒト組換えレプチン１０ｎｇ／ｍＬと共に、細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて増加する濃度のＧＺＩＰポリペプチドと共にさらに３０分間インキュベートする。０．８ｍＭオレイン酸エステルおよび125Ｉ−ＬＤＬ２０μｇ／ｍＬを添加した後、インキュベーションを３７℃で３時間続ける。０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで、単層を連続して２回洗浄し、続いてＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、次いでＰＢＳで連続して２回洗浄する。125Ｉ−ＬＤＬの、オレイン酸エステル誘導結合、取り込みおよび分解の量は、上述のように測定される（上記のBihain & Yen, 1992）。３回繰り返しの測定の平均として結果を示す。
【０４０８】
ＧＺＩＰタンパク質の添加によって、リポタンパク質受容体としてのＬＳＲの活性が増加すると考えられる。ＬＤＬのオレイン酸エステル誘導結合、および取り込みは、分解と比較して、ＧＺＩＰタンパク質によってさらに影響を受けると考えられるだろう。このようにＬＳＲ活性が増加すると、潜在的に、食後状態時のトリグリセリドリッチなリポタンパク質のクリアランスが上昇するだろう。このように、脂肪組織中に蓄積されるのではなく、肝臓によってさらなる食事脂肪が除去されるだろう。
【０４０９】
このアッセイを用いて、ＬＳＲ活性（または他の受容体を介したリポタンパク質の取り込み、結合および分解）を増加または減少し、したがって、トリグリセリドリッチなリポタンパク質のクリアランス速度に影響を及ぼす化合物（またはアゴニストもしくはアンタゴニスト）の効率を決定することができる。
筋分化に対する効果
完全ＤＭＥＭ（ｗ／グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ等）＋１０％ＦＣＳ中のＣ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞系；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７７２、メリーランド州ロックビル）を低密度（約１５〜２０％）に播種する。２日後、それらは８０〜９０％コンフルエントとなる。この時点で、分化が可能となるように、培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清に交換する。培地を毎日交換する。２％ウマ血清中で３〜４日後、大量の筋管形成が起こるが、Ｃ２Ｃ１２分化の正確な時間経過は、特に、それらがどれくらいの期間継代されているか、およびどのように維持されているかに応じて異なる。
【０４１０】
筋分化に対するＧＺＩＰタンパク質の存在の効果を試験するために、細胞がまだＤＭＥＭ  ｗ／１０％ＦＣＳ中にある場合に播種の翌日に、ｇＡＣＲＰ３０（１〜２．５μｇ／ｍＬ）を添加する。細胞をプレーティングした２日後（ｇＡＣＲＰ３０を最初に添加して１日後）に、約８０〜９０％コンフルエントで、培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清＋ｇＡＣＲＰ３０に交換する。
筋細胞の脂肪酸酸化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞をＧＺＩＰタンパク質２μｇ／ｍＬの存在下または非存在下にて４日間分化させる。４日目に、オレイン酸エステルの酸化速度を、１−14Ｃ−オレイン酸エステル（０．２ｍＭ）から14ＣＯ2への転換を９０分間測定することによって決定する。この実験を用いて、活性ポリペプチドおよびペプチドならびにＧＺＩＰポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストまたは活性化因子および阻害剤についてスクリーニングすることができる。
【０４１１】
オレイン酸エステルの酸化速度に対するｇＡＣＲＰ３０の効果を、分化Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）および肝細胞系（Ｈｅｐａ１−６；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）において比較することができる。製造元の説明書に従って、培養細胞を維持する。オレイン酸エステルの酸化のアッセイは、上述のように行われる(Muoio et al (1999) Biochem J 338; 783-791)。簡単に言えば、ほぼコンフルエントな筋細胞を、低血清分化培地（ＤＭＥＭ、２．５％ウマ血清）中で４日間維持し、その時点で筋管の形成が最大となった。１０％ＦＣＳが補充された同じＤＭＥＭ培地中で肝細胞を２日間維持する。実験の１時間前に、培地を除去し、プレインキュベーション培地（ＭＥＭ、２．５％ウマ血清、３ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＦＦＡ不含ＢＳＡ、０．２５ｍＭオレイン酸エステル、５μｇ／ｍＬゲンタマイシン）１ｍＬを添加する。酸化実験の初めに、14Ｃ−オレイン酸（１μＣｉ／ｍＬ、ミズーリ州セントルイスのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、ｇＡＣＲＰ３０ ２．５μｇ／ｍＬの存在／非存在下にて３７℃で、細胞を９０分間インキュベートする。インキュベーション期間後、培地０．７５ｍＬを除去し、筋肉ＦＡＡ酸化実験に関して以下に記述するように14Ｃ−酸化生成物についてアッセイする。
培養細胞におけるオレイン酸エステルの酸化に続く、トリグリセリドおよびタンパク質の分析
オレイン酸エステル酸化アッセイのために培地を移した後、細胞を氷上に置く。トリグリセリドおよびタンパク質の含有率を決定するために、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄し、残りの培地を除去する。細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ社）３００μＬを各ウェルに添加し、３７℃で１０分間インキュベートする。プレートを軽く叩き、細胞を離し、１×ＰＢＳ０．５ｍＬを添加した。細胞浮遊液をエッペンドルフチューブに移し、さらに０．５ｍＬの１×ＰＢＳで各ウェルをすすぎ、適切なエッペンドルフチューブに移す。試料を室温で１０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する。上清を捨て、７５０μＬの１×ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを細胞ペレットに添加する。細胞浮遊液をボルテックスし、氷上に１時間置く。次いで、４℃で１３０００ｒｐｍにて試料を２０分間遠心分離する。上清を新しいチューブに移し、分析するまで−２０℃で凍結しておく。各試料におけるトリグリセリドの定量的な測定値は、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧＰＯ−ＴＲＩＮＤＥＲ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｋｉｔを用いて決定する。アッセイが４８ウェルプレートで行われ、試料容積３５０μｌがアッセイされ、コントロールブランクが３５０μＬのＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓからなり、標準が、キットにおいて提供される標準１０μＬ＋６９０μＬのＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを含有することを除いては、マニュアルに記載の手順に従う。試料の分析は、波長５５０ｎｍにてＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔで行われる。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、製造元の説明書に従って、各上清試料２５μＬでタンパク質の分析が行われる。試料の分析は、波長５５０ｎｍにてＰａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔで行われる。
筋細胞によるインビトロでのグルコース取り込み
Ｌ６筋細胞を、欧州菌株保存機関（European Culture Collection）（ポートンダウン）から入手し、継代７〜１１で使用する。標準組織培養培地ＤＭＥＭ中で細胞を維持し、前述のように、インスリン（１０-8Ｍ）の存在または非存在下にてＧＺＩＰポリペプチド断片と共に、またはなしに、［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて、グルコースの取り込みを評価する（Walker, P. S. et al. (1990) ）。Ｌ６筋細胞におけるグルコース輸送活性は、細胞下のグルコース輸送体分布、生合成、およびｍＲＮＡ転写の協調的な制御によって調節される（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、JBC 265 (3): 1516-1523; およびKilp, A. et al. (1992) Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle cells in culture. Endocrinology 130 (5): 2535-2544）。２ＤＧの取り込みは、対照（インスリンまたはＧＺＩＰポリペプチド断片を添加されていない）と比較した変化％として表される。値は、１実験につき４ウェルのセットの平均±ＳＥＭとして示される。ウェルのセット間の差は、スチューデントｔ検定によって求められ、確率値ｐ＜０．０５が有意であると見なされる。
実施例３：高脂肪食を与えられたマウスに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
約６週齢のＣ５７Ｂ１／６マウスを用いて、実験を行う（１グループにつき８匹）。すべてのマウスが個別に収容される。各実験全体にわたって、マウスに高脂肪食を与え続ける。その高脂肪食（カフェテリア食；リサーチダイエット社からの市販のＤ１２３３１）は以下の組成：タンパク質ｋｃａｌ  １６％、ショ糖ｋｃａｌ  ２６％、脂肪ｋｃａｌ  ５８％を有する。脂肪は主に、硬化ヤシ油で構成される。
【０４１２】
マウスに高脂肪食を６日間与えた後、イソフルラン麻酔を用いて、マイクロ浸透圧ポンプを挿入し、それを用いて、完全長ＧＺＩＰポリペプチド、ＧＺＩＰポリペプチド断片、生理食塩水および無関係のペプチドをマウスに１８日間皮下投与（ｓ．ｃ．）する。１００、５０、２５、および２．５μｇ／日の用量でＧＺＩＰポリペプチドを投与し、１０μｇ／日で無関係のペプチドを投与する。高脂肪食を与えて１日目、３日目および５日目に体重を測定し、次いで、治療の開始後には毎日測定する。最終的な血液試料を心臓穿刺によって採取し、その試料を用いて、トリグリセリド（ＴＧ）、全コレステロール（ＴＣ）、グルコース、レプチン、およびインスリンレベルを決定する。１日当たりに摂取される食餌の量もまた、各グループに対して決定される。
実施例４：ヒトにおける代謝関連活性の試験
ヒトにおけるＧＺＩＰポリペプチの有効性についての試験を、医師の推薦および確立された指針に従って行う。マウスで試験されるパラメーターが、ヒトにおいても試験される（例えば、食物摂取、体重、ＴＧ、ＴＣ、グルコース、インスリン、レプチン、ＦＦＡ）。生理学的因子は短期間で変化を示すであろうことが予想される。体重増加の変化には、長い期間が必要とされる場合がある。さらに、食事制限（diet）は注意してモニターする必要があるだろう。ＧＺＩＰポリペプチド、好ましくはＣ１ｑ相同性領域を含むＧＺＩＰポリペプチドは、７０ｋｇのヒトに対してタンパク質約６ｍｇの１日量または約１０ｍｇ／日で投与されるだろう。他の用量、例えば１日につき１ｍｇまたは５ｍｇの用量、２０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇ／日までの用量も、試験されるだろう。
実施例５：マウス脂肪萎縮性糖尿病モデルにおける代謝関連活性の試験
以前に、レプチンは、先天性リポジストロフィーを有するマウスにおいてインスリン抵抗性および糖尿病を転換することが報告された（Shimomura et al. Nature 401: 73-76 (1999); 図面、図、または表を含む、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。レプチンは、脂肪萎縮性糖尿病のリポジストロフィーの異なるマウスモデルにおいて効果が低いことが見出された(Gavrilova et al Nature 403: 850 (2000); 図面、図または表を含む、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
【０４１３】
本発明は、このモデルにおいてインスリン抵抗性および高血糖を低減するための、単独での、またはレプチン、レプチンペプチド（米国特許仮出願第６０／１５５，５０６号）もしくは他の化合物と組み合わせての、ＧＺＩＰポリペプチドの使用を包含する。
【０４１４】
アッセイには、ＧＺＩＰポリペプチドが、実施例３（または実施例６〜８）に前述の方法を用いて投与されるであろうことを除いては、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、Gavrilova et al. ( (2000) Diabetes Nov; 49 (11) : 1910-6; (2000) Nature Feb 24; 403 (6772): 850)で既に述べられているアッセイが含まれる。マウスのグルコースおよびインスリンレベルが試験され、かつ食物摂取および肝臓重量がモニターされ、ならびに、レプチン、ＦＦＡ、およびＴＧレベルなどの他の因子が通常、本発明者らの実験で測定されるだろう（上記の実施例３、または実施例６〜８参照）。
実施例６：Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおける血漿遊離脂肪酸に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
正常なＣ５７ ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後の脂肪血症（ＰＰＬ）に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を試験する。
【０４１５】
この実験に使用されるマウスは、実験前に２時間絶食させ、その後、基準（baseline）の血液試料を採取する。すべての血液試料が、ＥＤＴＡコーティングされたキャピラリーチューブを用いて尾から採取される（各時点で５０μＬ）。０時点（８：３０ＡＭ）では、標準高脂肪食（バター６ｇ、ヒマワリ油６ｇ、脱脂粉乳１０ｇ、ショ糖１０ｇ、Ｎｂ番号６，ＪＦ，ｐｇ．１に従って製造された新鮮な蒸留水１２ｍＬ）をすべての動物に経管栄養法により与える（容積＝体重の１％）。
【０４１６】
高脂肪食を与えた直後に、生理食塩水１００μＬに溶解したＧＺＩＰポリペプチド２５μｇを腹腔内に注入する。同じ投与量（１００μＬ中に２５μｇ／ｍＬ）を再度、４５分および１時間４５分の時点で注入する。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注入する。無処置動物および処置動物は、交互に取り扱う。
【０４１７】
血液試料を１時間ごとに採取し、すぐに氷の上に置く。各時点の後に、遠心分離によって血漿が製造される。血漿を−２０℃に維持し、標準試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ社）を用いて、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）およびグルコースを２４時間以内に測定する。利用可能な血漿の量が制限されるため、グルコースは、プールされた試料を用いて二重測定される。各時点について、１つの処置群につき、８匹すべての動物から等量の血漿がプールされる。
実施例７：Ｃ５７ ＢＬ/６マウスにおける血漿レプチンおよびインスリンに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
正常なＣ５７ ＢＬ/６マウスにおいて食後脂肪血症（ＰＰＬ）時の血漿レプチンおよびインスリンレベルに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を試験する。ＲＩＡによるレプチンおよびインスリンの測定により多くの血液試料が必要とされることを考慮して、１、２および４時間の時点でのみ血液を採取したことを除いては、その実験手順は、実施例６に記載の手順と同じである。
【０４１８】
簡潔には、マウス１６匹を実験前に２時間絶食させ、その後基準の血液試料を採取する。すべての血液試料が、ＥＤＴＡコーティングされたキャピラリーチューブを用いて尾から採取される（各時点で１００μＬ）。０時点（９：３０ＡＭ）では、標準高脂肪食（実施例６参照）をすべての動物に経管栄養法により与える（容積＝体重の１％）。高脂肪食を与えた直後に、生理食塩水１００μＬに溶解したＧＺＩＰポリペプチド２５μｇを腹腔内に注入する。同じ投与量（１００μＬ中に２５μｇ）を再度、４５分および１時間４５分の時点で注入する（処置群）。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注入する。無処置動物および処置動物は、交互に取り扱う。
【０４１９】
血液試料をすぐに氷の上に置き、各時点の後に、遠心分離によって血漿を製造する。血漿は−２０℃に維持し、標準試験キット（Ｗａｋｏ社）を用いて、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を２４時間以内に測定する。レプチンおよびインスリンは、製造元のプロトコルに従ってＲＩＡ（ＭＬ−８２ＫおよびＳＲＩ−１３Ｋ，ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社，ミズーリ州セント・チャールズ）によって測定する。しかしながら、血漿２０μｇのみを使用する。各測定は、二重測定で行われる。利用可能な血漿の量が制限されるため、レプチンおよびインスリンは、両方の処置群においてそれぞれ、２匹の動物の４プールにおいて測定される。
実施例８：Ｃ５７ ＢＬ/６マウスにおける血漿ＦＦＡ、ＴＧおよびグルコースに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
正常なＣ５７ ＢＬ/６マウスにおける食後脂肪血症（ＰＰＬ）時の血漿ＦＦＡ、ＴＧ、グルコース、レプチンおよびインスリンレベルに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果が記述されている。高脂肪食が与えられた正常なＣ５７ ＢＬ/６マウスに投与されるＧＺＩＰポリペプチド（２．５μｇ／日）から得られる体重減少もまた示されている（実施例３）。
【０４２０】
この実験手順は実施例６に記載の手順と同様である。簡潔には、マウス１４匹を実験前に２時間絶食させ、その後基準の血液試料を採取する。すべての血液試料が、ＥＤＴＡコーティングされたキャピラリーチューブを用いて尾から採取される（各時点で５０μＬ）。０時点（９：００ＡＭ）では、標準高脂肪食（実施例６参照）をすべての動物に経管栄養法により与える（容積＝体重の１％）。高脂肪食を与えた直後に、生理食塩水１００μＬに溶解したＧＺＩＰポリペプチド２５μｇをマウス４匹に腹腔内注入する。同じ投与量（１００μＬ中に２５μｇ）を再度、４５分および１時間４５分の時点で注入する。第２処置群には、同じ間隔でＧＺＩＰポリペプチド５０μｇを３回投与する。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注入する。無処置動物および処置動物は、交互に取り扱う。
【０４２１】
血液試料をすぐに氷の上に置く。各時点の後に、遠心分離によって血漿を製造する。血漿を−２０℃に維持し、標準試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ社）を用いて、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）およびグルコースを２４時間以内に測定する。
実施例９：エピネフリン注射後のＦＦＡに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
マウスにおいて、高脂肪／ショ糖試験食を胃内投与した後、血漿遊離脂肪酸が増加する。これらの遊離脂肪酸は主に、脂肪分解酵素、つまりリポタンパク質リパーゼ（ＩＰＬ）および肝性リパーゼ（ＨＬ）の活性によって生成される。この種において、これらの酵素は、内皮に結合した状態と、血漿中で遊離して循環した状態の両方で、有意な量で見出される。血漿遊離脂肪酸の他の源は、β−アドレナリン刺激後に脂肪組織から遊離脂肪酸を放出するホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）である。ＧＺＩＰポリペプチドが、ＨＳＬによって放出される遊離脂肪酸の代謝もまた調節するかどうかを試験するために、マウスにエピネフリンを注射する。
【０４２２】
マウスの２つの群に、腹腔内注入によってエピネフリン（５μｇ）を投与する。処置群には１時間前に、再びエピネフリンと共にＧＺＩＰポリペプチド（２５μｇ）を注入し、対照動物には生理食塩水を投与する。血漿を単離し、遊離脂肪酸およびグルコースを上述のように測定する（実施例８）。
実施例１０：筋肉のＦＦＡ酸化に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
筋肉のＦＦＡ酸化に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからインタクトな後肢筋肉を単離し、基質としてオレイン酸エステルを用いてＦＦＡの酸化を測定する(Clee, S. M. et al. Plasma and vessel wall lipoprotein lipase have different roles in atherosclerosis. JLipid Res 41,521-531 (2000); Muoio, D. M. , Dohm, G. L. , Tapscott, E. B. & Coleman, R. A. Leptin opposes insulin's effects on fatty acid partitioning in muscles isolated from obese ob/ob mice. Ain JPAzysiol 276, E913-921 (1999))。上述のように、単離された筋肉におけるオレイン酸エステルの酸化を測定する (Cuendet et al (1976) J Clin Invest 58: 1078-1088; Le Marchand- Brustel, Y., Jeanrenaud, B. & Freychet, P. insulin binding and effects in isolated soleus muscle of lean and obese mice. Am J Plysiol 234, E348-E358 (1978))。簡潔には、マウスを脊椎脱臼により屠殺し、ヒラメ筋およびＥＤＬ筋を後肢から迅速に単離する。異なる培地の間での移動を容易にするために、各筋肉の遠位腱を１本の縫合糸に結び付ける。４％ＦＦＡ不含ウシ血清アルブミン（画分Ｖ、ＲＩＡグレード、Ｓｉｇｍａ社）および５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ社）が補充された、クレブス−ヘンゼライト重炭酸バッファー（１１８．６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７６ｍＭ ＫＣｌ、１．１９ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．５４ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）１．５ｍＬ中にて、すべてのインキュベーションを３０℃で行う。実験全体を通して、オレイン酸エステル（Ｓｉｇｍａ社）の総濃度は０．２５ｍＭである。インキュベーション前に、すべての培地を酸素添加する（Ｏ2９５％;ＣＯ2 ５％）。ガス洗浄器（gas washer）（Ｋｏｎｔｅｓ社，ニュージャージー州バインランド）によって泡立てることによって、実験全体にわたり気体混合物を水和する。
【０４２３】
酸素添加されたインキュベーション培地において筋肉を３０分間すすぐ。次いで、その筋肉を新たな培地（１．５ｍＬ）に移し、１μＣｉ／ｍＬ［１−l4Ｃ］オレイン酸 (Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社)の存在下にて３０℃でインキュベートする。この培地を含有するインキュベーションバイアルをゴム製セプタムで密閉し、そこから、１枚のワットマン紙（１．５ｃｍ×１１．５ｃｍ）を保持する中央のウェルを吊るす。
【０４２４】
一定に酸素添加された、１０分間の最初のインキュベーション期間後、ガスの循環を除去して、外部環境からそのシステムを遮断し、筋肉を３０℃で９０分間インキュベートする。この期間の最後に、Ｓｏｌｖａｂｌｅ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，コネチカット州メリデン）０．４５ｍＬを、中央ウェルにおけるワットマン紙上に注入し、筋肉によるオレイン酸エステルの酸化を、バイアルを氷上に移すことによって止める。
【０４２５】
５分後、培地から筋肉を除去し、培地０．５ｍＬのアリコートもまた除去する。バイアルを再び密閉し、ゴム製セプタムに穴を開けることによってシリンジで、３５％過塩素酸１ｍＬを培地に注入する。酸性化培地から放出されるＣＯ2を、中央ウェルにおけるＳｏｌｖａｂｌｅによって回収する。３０℃で９０分間の回収期間後、ワットマン紙を中央ウェルから除去し、シンチレーション液（ＨｉｏｎｉｃＦｌｏｕｒ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社，コネチカット州メリデン）１５ｍＬを含有するシンチレーションバイアル内に入れる。14Ｃ放射能の量は、液体シンチレーション計数によって定量化される。オレイン酸エステルの酸化速度は、９０分／筋肉ｇで生成されるオレイン酸エステル（ｎｍｏｌ）として表される。
【０４２６】
オレイン酸エステルの酸化に対するｇＡＣＲＰ３０またはＡＣＲＰ３０の効果を試験するために、これらのタンパク質を最終濃度２．５μｇ／ｍＬで培地に添加し、手順全体にわたって培地中に維持する。
実施例１１：マウスから単離された筋肉および肝臓におけるトリグリセリドに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
ＧＺＩＰポリペプチドによって誘導される増加されたＦＦＡ酸化が、筋肉または肝臓へのＦＦＡ送達の増加によっても達成されるかどうかを測定するために、後肢筋肉および肝臓のトリグリセリド含有率を、マウスをＧＺＩＰポリペプチドで処置した後に測定する。処置および無処置動物から、後肢筋肉ならびに肝臓試料を取り出し、標準脂質抽出法(Shimabukuro, M. et al. Direct antidiabetic effect of leptin through triglyceride depletion of tissues. Proc Natl Acad Sci USA 94,4637-4641 (1997) ) に従い、標準試験キットを用いたＴＧおよびＦＦＡ分析によって、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸濃度を測定する。
実施例１２：イントラリピッド注入後のＦＦＡに対するＧＺＩＰポリペプチドの効果
マウスの２つの群に、イントラリピッド−２０％（Ｃｌｉｎｔｅｃ社）３０μＬを静脈（尾静脈）内にボーラス注入し、血漿ＦＦＡが急激に上昇し、このため腸管吸収が回避される（イントラリピッドは、栄養治療で用いられる静脈内脂肪乳剤である）。処置群（ＧＺＩＰポリペプチドで処置された）には、イントラリピッドを与える前の３０分および６０分の時点でＧＺＩＰポリペプチド（２５μｇ）を注入し、対照動物（対照）には生理食塩水を投与する。血漿を単離し、前述のようにＦＦＡを測定する。次いで、イントラリピッドの注入により誘導されるピーク後の、血漿ＦＦＡの減衰に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果をモニターする。
実施例１３：筋細胞による、インビトロでのグルコースの取り込み
欧州菌株保存機関（European Culture Collection）（ポートンダウン）からＬ６筋細胞を入手し、継代７〜１１で使用する。標準組織培養培地ＤＭＥＭ中で細胞を維持し、前述のように、インスリン（１０-8Ｍ）の存在または非存在下にてＧＺＩＰポリペプチドと共に、またはなしに、［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を用いて、グルコースの取り込みを評価する（Walker, P. S. et al. (1990) ）。Ｌ６筋細胞におけるグルコース輸送活性は、細胞下のグルコース輸送体分布、生合成、およびｍＲＮＡ転写の協調的な制御によって調節される（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、JBC 265 (3): 1516-1523; およびKilp, A. et al. (1992) Stimulation of hexose transport by metformin in L6 muscle cells in culture. Endocrinology 130 (5): 2535-2544）。２ＤＧの取り込みは、対照（インスリンまたはＧＺＩＰポリペプチドを添加されていない）と比較した変化％として表される。値は、１実験につき４ウェルのセットの平均±ＳＥＭとして示される。ウェルのセット間の差は、スチューデントｔ検定によって求められ、確率値ｐ＜０．０５が有意であると見なされる。
実施例１４：げっ歯類の糖尿病モデルにおける代謝関連活性についてのインビボでの試験
代謝プロファイルは、肥満症および糖尿病の種々の動物モデルの間で異なるため、高血糖、高インスリン血症、高脂質血症および肥満症に対するＧＺＩＰポリペプチドの効果を区別するために、多数種のモデルの分析が実施される。実験動物のコロニーにおける突然変異および食事療法に対する異なる感受性が、肥満症およびインスリン抵抗性に関連する非インスリン依存性糖尿病の動物モデルの発達を可能にしている。マウスにおけるｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂ（Diagetes, (1982) 31 (1) : 1-6)参照）およびｚｕｃｋｅｒラットにおけるｆａ／ｆａなどの遺伝モデルが、疾患の病態生理を理解し、かつ新規な抗糖尿病化合物(Diagentes, (1983) 32: 830-838; Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. (1994). 46: 1-57)の有効性を試験することによって、様々な研究所によって開発されている。ホモ接合性動物、ジャクソン研究所（Jackson Laboratory，米国）によって開発されたＣ５７ ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは、高血糖性、高インシュリン性およびインスリン抵抗性であるのに対して(J. Clin. Invest., (1990) 85: 962-967)、ヘテロ接合性動物は、痩せており、かつ血糖正常である。ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、マウスは進行的に、年と共にインスリン不足（insulinopenia）を発症し、血糖レベルの制御が不十分な場合に、ヒトＩＩ型糖尿病の末期で一般に認められる特徴が生じる。膵臓の状態およびその経過はモデルによって異なる。このモデルがＩＩ型糖尿病のモデルに似ていることから、血糖およびトリグリセリド低下活性について、本発明の化合物が試験される。Ｚｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラットは重度の肥満、高インシュリン性、およびインスリン抵抗性であり(Coleman, Diabetes 31: 1, 1982 ; E. Shafrir, in Diabetes; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co. , Inc. , New York, ed. 4,1990), pp. 299-340)、ｆａ／ｆａ突然変異は、マウスｄｂ突然変異に相当するラットである(Friedman et al., Cell 69: 217-220,1992 ; Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7806, 1991)。Ｔｕｂｂｙ（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは、著しい高血糖のない、肥満症、中程度のインスリン抵抗性および高インスリン血症を特徴とする (Coleman et al., J. Heredity 81 : 424,1990)。
【０４２７】
以前に、レプチンが、先天性リポジストロフィーを有するマウスにおいてインスリン抵抗性および糖尿病を転換することが報告された（Shimomura et al. Nature 401: 73-76 (1999)）。レプチンは、脂肪萎縮性糖尿病の異なるリポジストロフィーのマウスモデルにおいて効果が低いことが見出されている(Gavrilova et al Nature 403: 850 (2000); 図面、図または表を含む、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
【０４２８】
化学的に誘導された糖尿病についてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルを試験し、肥満症の非存在下での高血糖の効果を調べる。ＳＴＺ処置動物は、インスリンが不足し、重度の高血糖性である(Coleman, Diabetes 31: 1, 1982 ; E. Shafrir, in Diabetes ; H. Rifkin and D. Porte, Jr. Eds. (Elsevier Science Publishing Co. , Inc. , New York, ed. 4,1990), pp. 299-340)。 化学的に誘導された肥満症について、グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）モデル(Olney, Science 164: 719, 1969; Cameron et al. , Cli. Exp. Pharmacol. Physiol. 5: 41,1978)も調べる。そのモデルにおける肥満症は、遺伝モデルにおける肥満症よりも重症度が低く、過食症、高インスリン血症およびインスリン抵抗性なく発症する。最後に、肥満症の誘導のための非化学的、非遺伝モデルとしては、高脂肪／高炭水化物食（カフェテリア食）を自由に与えられているげっ歯類が挙げられる。
【０４２９】
本発明は、上記のげっ歯類糖尿病モデルのいずれかもしくはすべてにおいて、またはＩ型もしくはＩＩ型糖尿病または上述の他の好ましい代謝疾患を有するヒト、または他の哺乳動物に基づくモデルにおいて、インスリン抵抗性および高血糖を低減するためのポリペプチドの使用を包含する。本発明の組成物において、所望の場合には、ＧＳＳＰ４ポリペプチドは、単独で、あるいは他の適合性の薬理学的活性抗糖尿病薬、例えばインスリン、レプチン（米国仮出願第６０／１５５，５０６号）またはトログリタゾンと組み合わせて、使用される。 アッセイには、ＧＳＳＰ４ポリペプチドが腹腔内に、皮下に、筋肉内に、または静脈内に投与されることを除いては、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いた、Gavrilova et al. ( (2000) Diabetes Nov; 49 (11) : 1910-6 ; (2000) Nature Feb 24; 403 (6772): 850) に先に記載されているアッセイが含まれる。マウスのグルコースおよびインスリンレベルが試験され、かつ食物摂取および肝臓重量がモニターされ、ならびに、レプチン、ＦＦＡ、およびＴＧレベルなどの他の因子が通常、本発明者らの実験で測定されるだろう。
ＧＺＩＰポリペプチドの抗高血糖活性についてのインビボアッセイ
遺伝子改変された肥満の糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（雄、７〜９週齢）を、２２℃および相対湿度５０％で標準実験室条件下にて収容し（７〜９匹のマウス／ケージ）、固形飼料でピュリナ（Purina）の食事および水を自由にげっ歯類に与え続ける。処置前に、各動物の尾静脈から血液を採取し、血中グルコース濃度をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ ＢａｓｉｃＧｌｕｃｏｓｅモニターシステム（Ｌｉｆｅｓｃａｎ社）を用いて決定する。血漿グルコース２５０〜５００ｍｇ／ｄｌを有するマウスを使用する。各処置群は、研究の初めに、平均グルコースレベルが各群において等しくなるように分配される７匹のマウスからなる。ｄｂ／ｄｂマウスに、イソフルラン麻酔を用いて挿入されたマイクロ浸透圧ポンプによって、完全長ＧＺＩＰポリペプチド、生理食塩水、および無関係のペプチドを皮下投与（ｓ．ｃ．）する。４時間の間、１時間ごとに、かつ投与後２４時間、３０時間の時点で、尾静脈から血液を採取し、血中グルコース濃度を分析する。投与後０〜４時間は食事を引っ込め、その後再び与える。個々の体重および平均摂食量（各ケージ）もまた２４時間後に測定する。群の間での有意な差（生理食塩水で処置された群に対してＧＺＩＰで処置された群を比較して）が、スチューデントｔ検定を用いて評価される。
インビボでのインスリン感受性アッセイ
インビボでのインスリン感受性は、以下のプロトコルに従って２工程の高インシュリン性−正常血糖クランプ試験を用いて調べられる。実施例２に記載の種々のモデルのいずれかまたはすべてからのげっ歯類を、実験手順前の少なくとも１週間収容する。ケタミンおよびキシラジン（筋肉内投与）麻酔を用いて無菌条件下にて、頚静脈および頚動脈カテーテルの挿入のための手術を行う。手術後、すべてのげっ歯類に意識を取り戻させ、個々のケージに入れる。完全に回復した後および２日後に、頚静脈を通じて、ＧＺＩＰポリペプチドまたは賦形剤を投与する。最後の処置の６時間後、高インシュリン性−正常血糖クランプ試験を行う。げっ歯類を固定具（restrainer）に固定し、４μＣｉ[３−3Ｈ]グルコース（ＮＥＮ）をボーラス投与し、続いて投与量０．２μＣｉ／分（２０μｌ／分）の投与量でトレーサーの持続注入を行う。トレーサーの注入開始から２時間後、３つの血液試料（各０．３ｍｌ）を、基礎測定のために１０分間隔（−２０−０分）で採取する。次いで、インスリンの注入を開始し（５ｍＵ／ｋｇ／分）、血液試料１００μｌを１０分ごとに採取し、血漿グルコースをモニターする。正常血糖に到達させ、かつ維持するために、血漿グルコースレベルに基づいて、第２ポンプを用いて、３０％グルコース溶液を注入する。定常状態がインスリン５ｍＵ／ｋｇ／分で確立されたら（安定なグルコース注入速度および血漿グルコース）、グルコース、[３−3Ｈ]グルコースおよびインスリンの測定のために、さらに３つの血液試料（各０．３ｍｌ）を採取する（１００〜１２０分）。さらに高い投与量のインスリン（２５ｍＵ／ｋｇ／分）を投与し、グルコース注入速度を第２正常血糖クランプに対して調節し、血液試料を２２０〜２４０分で採取する。グルコース特異的活性は、除タンパクされた血漿において決定され、記述されるように(Lang et al., Endocrinology 130: 43,1992)、Ｒｄおよび肝グルコース排出量（ＨＧＯ）の計算を行う。次いで、基礎期間での、ならびに５ｍＵ／ｋｇ／分および２５ｍＵ／ｋｇ／分の注入後の血漿インスリンレベルを決定し、ＧＺＩＰ処置および賦形剤処置されたげっ歯類の間で比較する。
【０４３０】
グルコースのホメオスタシスのインスリン調節は、２つの主要な構成要素：末梢のグルコース取り込みの刺激および肝臓のグルコース排出の抑制を有する。グルコースクランプ法においてトレーサー調査を用いて、インスリン反応のどの部分がＧＺＩＰポリペプチドによって影響を受けるかを決定することが可能である。
実施例１５：２ハイブリッド・スクリーニングアッセイによる、ｇＡＰＭ１ポリペプチド断片に対する、ＧＺＩＰポリペプチドのα３ドメイン内の結合部位の同定
酵母２ハイブリッド系は、インビボでタンパク質間相互作用を研究するためにデザインされ（Fields and Song, 1989）、酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへのベイトタンパク質の融合に依拠する。この技術は、米国特許第５，６６７，９７３号および米国特許第５，２８３，１７３号（Fields et al.）にも記述されており、どちらの特許の技術的な教示も参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３１】
２ハイブリッド・アッセイによるライブラリースクリーニングの一般手順は、Harper et al. (1993)、またはCho et al. (1998)によって記述されているように、またはFromont-Racine et al. (1997)によっても記述されているように行うことができる。
【０４３２】
ベイトタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０または２００個のアミノ酸の隣接スパンを含む、ポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む、から本質的になる、からなる。
【０４３３】
さらに正確には、ポリペプチドまたはポリペプチド断片またはその変異体をコードするヌクレオチド配列が、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合され、その融合されたヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、例えばｐＡＳ２またはｐＭ３に挿入される。
【０４３４】
次いで、ＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクターにおけるヌクレオチド配列に、ヒトｃＤＮＡインサートが融合されるように、特別に設計されたベクターにおいてヒトｃＤＮＡライブラリーが構築される。使用されるベクターはｐＡＣＴベクターであることが好ましい。ヒトｃＤＮＡライブラリーのヌクレオチドインサートによってコードされるポリペプチドは、「プレイ」ポリペプチドと呼ばれる。
【０４３５】
第３ベクターは、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインのどちらも含有する完全なＧａＬ４タンパク質の結合に応答性の調節配列の制御下に置かれる、βガラクトシダーゼ遺伝子またはＣＡＴ遺伝子などの検出可能なマーカー遺伝子を含有する。例えば、ｐＧ５ＥＣベクターを用いることができる。
【０４３６】
２種類の異なる酵母菌株も使用される。実例としてであり、限定されない例としての、２種類の異なる酵母菌株は以下の：
−その表現型が（ＭＡＴａ、Ｌｅｕ２−３、１１２ｕｒａ３−１２、ｔｒｐ１−９０１、ｈｉｓ３−Ｄ２００、ａｄｅ２−１０１、ｇａｌ４Ｄｇａｌ１８０Ｄ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ＬａｃＺ、ＬＹＳ ＧＡＬ−ＨＩＳ３、ｃｙｈ’）である、Ｙ１９０；
−その表現型が、Ｙ１９０の逆の交配型である（ＭＡＴａ ｇａｌ４ ｇａｌ８０ ｈｉｓ３ ｔｒｐ１−９０１ ａｄｅ２−１０１ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−３、−１１２ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ｌａｃＺｍｅｔ’）である、Ｙ１８７；である。
【０４３７】
簡潔には、ｐＡＳ２／ｇＡＰＭ１ ２０μｇおよびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリー ２０μｇを酵母菌株Ｙ１９０に同時形質転換する。ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠くが、ヒスチジン合成阻害剤３−ＡＴ（５０ｍＭ）を含有する最少培地で増殖させるために、形質転換体を選択する。フィルターリフト（filter lift）・アッセイによって、βガラクトシダーゼに対してポジティブコロニーをスクリーニングする。次いで、ヒスチジン、ロイシンを欠くが、トリプトファンおよびシクロヘキシミド（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するプレート上でダブルポジティブ コロニー（Ｈｉｓ+、β−ｇａｌ+）を増殖させ、ｐＡＳ２／ｇＡＰＭ１プラスミドの減少およびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリープラスミドの保持を選択する。Harper et al. (1993) およびBram et al. (Bram RJ et al. , 1993)によって記述されているように、Ｇａｌ４融合として、ｇＡＰＭ１または無関係の対照タンパク質；例えば、サイクロフィリンＢ、ラミン、もしくはＳＮＦ１を発現するＹ１８７株と、得られたＹ１９０株を交配し、フィルターリフト・アッセイによってβガラクトシダーゼに対してスクリーニングする。対照Ｇａｌ４融合との交配後のβｇａｌである酵母クローンは、偽陽性であると見なされる。
【０４３８】
本発明による２ハイブリッドの他の実施形態において、ｇＡＰＭ１またはその断片または変異体と細胞タンパク質との相互作用が、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ２ハイブリッド系２（Matchmaker Two Hybrid System 2）（カタログＮｏ．Ｋ１６０４−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて評価される。その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ２ハイブリッド系２（Matchmaker Two Hybrid System 2）（カタログＮｏ．Ｋ１６０４−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に添付されているマニュアルに記載のように、酵母転写活性化因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、ｇＡＰＭ１タンパク質またはその一部をコードする核酸が発現ベクター中に挿入される。目的のｃＤＮＡ、好ましくはヒトｃＤＮＡが、ＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、第２発現ベクター中に挿入される。２種類の発現プラスミドが酵母に形質転換され、発現ベクターのそれぞれでの選択マーカーの発現ならびにＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現を選択する選択培地上にその酵母をプレーティングする。ヒスチジンを欠く培地上で増殖させることができる形質転換体を、ＧＡＬ４依存性ｌａｃＺ発現に対してスクリーニングする。ヒスチジン選択およびｌａｃＺアッセイの両方でポジティブな細胞は、ｇＡＰＭ１と、最初に選択されたｃＤＮＡインサートによりコードされるタンパク質もしくはペプチドとの間の相互作用を含む。
【０４３９】
２ハイブリッドスクリーニング・アッセイを本明細書に記載のように本質的に使用し、ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ−相同性領域に対する結合部位を有する１種または複数種のポリペプチドを同定した。２種類の異なるｇＡＰＭ１（国際公開番号：ＷＯ０１／５１６４５参照）の構築物をベイトとして使用した。あるセットの２ハイブリッド実験において、ＡＰＭ１球状Ｃｌｑ−相同性領域を単独で、ベイトとして使用した。第２のセットの２ハイブリッド実験では、ＡＰＭ１球状Ｃｌｑ−相同性領域の他に、二塩基性プロテアーゼプロセッシングの潜在的部位を含有するコラーゲン様反復をコードする１５個の隣接するアミノ酸をベイトとして使用した。骨格筋、肝臓、および脳からの３つのヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｇＡＰＭ１構築物をベイトとして用いて、重複するＧＺＩＰポリペプチド断片をコードする、５つの無関係のｃＤＮＡクローンをプレイとして単離した。ＡＰＭ１の球状Ｃｌｑ−相同性領域に対するＧＺＩＰポリペプチド上の結合部位は、５つのＧＺＩＰプレイｃＤＮＡによってコードされる５つのＧＺＩＰポリペプチド断片の間で最大アミノ酸配列重複部分（ＡＢＳ）の領域内にあると推論される。ＡＢＳは、配列番号：２の２２１〜２４２位のアミノ酸または配列番号：３の２１７〜２３９位のアミノ酸で構成される。
【配列表】
2005511088000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月10日(2004.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
完全長ＧＺＩＰポリペプチドの単離されたポリペプチド断片であって、前記ポリペプチド断片の配列が、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸から本質的になる断片。
【請求項２】
担体と、配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：１の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、もしくは１８〜２４７位の連続するアミノ酸から本質的になるポリペプチド断片配列とからなる組成物。
【請求項３】
配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸をコードする単離ポリヌクレオチドまたはその補体。
【請求項４】
担体と、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチドとからなる組成物。
【請求項５】
配列番号：２の１０１〜２７２、１２１〜２９８、５９〜２４２、２２１〜２９８、１４５〜２９８、２２１〜２４２、２１〜２９８、２１〜２０２、２１〜２０８、２０３〜２９８、２０９〜２９８、２１〜２４６、２１〜２５０位の連続するアミノ酸、または配列番号：３の９８〜２６９、１１８〜２９５、５６〜２３９、２１８〜２９５、１４２〜２９５、２１８〜２３９、１８〜２９５、１８〜１９９、１８〜２０５、２００〜２９５、２０６〜２９５、１８〜２４３、１８〜２４７位の連続するアミノ酸をコードする単離ポリヌクレオチド配列からなるベクター。
【請求項６】
担体と、請求項５に記載のベクターとを含む組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のベクターからなる形質転換宿主細胞。
【請求項８】
ＡＰＭ１ポリペプチドのＧＺＩＰポリペプチドへの結合をブロックするアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
試験化合物の存在下又は非存在下で、ＡＰＭ１ポリペプチドをＧＺＩＰポリペプチドと接触させ、試験化合物の存在下又は非存在下でＧＺＩＰポリペプチドのＡＰＭ１ポリペプチドへの結合を検出することからなる方法。
【請求項９】
ＧＺＩＰポリペプチドのアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、
ＧＺＩＰポリペプチドを試験化合物と接触させ、前記試験化合物の存在下又は非存在下でＧＺＩＰポリペプチドの脂質分配、脂質代謝およびインスリン様活性を検出し、前記試験化合物は、該化合物を用いていない結果と対立する場合にＧＺＩＰのアンタゴニストとして同定される方法。
【請求項１０】
体重を減少させる方法であって、請求項２、４又は６に記載の組成物を、体重減少を必要とする個体に投与して体重を減少させる方法。
【請求項１１】
体重を増加させる方法であって、ＧＺＩＰポリペプチドのアンタゴニストを体重増加を必要とする個体に投与して体重を増加させる方法。
【請求項１２】
個体において循環遊離脂肪酸レベルを下げる方法であって、請求項２、４又は６に記載の組成物からなる組成物を前記個体に投与することからなる方法。
【国際調査報告】
2005511088.tif 000003
2005511088.tif 000004
2005511088.tif 000005
2005511088.tif 000006
2005511088.tif 000007
2005511088.tif 000008