(57)【要約】遺伝子は、イソプレノイド生合成経路をコードするメチロモナス１６ａ  ｓｐ．から単離されてきた。遺伝子および遺伝子生成物はまず、エネルギー源として単一の炭素（Ｃ１）基質を利用可能なメチロモナス菌株から単離される。本発明の遺伝子および遺伝子生成物は、様々な生物においてイソプレノイド化合物の生成に様々なやり方で用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２４からなる群より選択されるアミノ酸シークエンスをコードする単離核酸分子と、
（ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄に０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的な単離核酸分子
とからなる群より選択されるイソプレノイド生合成酵素をコードすることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および２３からなる群より選択される、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項３】
請求項１記載の単離核酸分子によりコードされたことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群より選択される、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも６０％の同一性を有する少なくとも６２０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも５５％の同一性を有する少なくとも３９４個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも５２％の同一性を有する少なくとも２３１個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも５０％の同一性を有する少なくとも２８５個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも６９％の同一性を有する少なくとも１５７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも６７％の同一性を有する少なくとも５４４個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも５７％の同一性を有する少なくとも２９７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも３４％の同一性を有する少なくとも５１１個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも４９％の同一性を有する少なくとも４９７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に規定されたシークエンスを有するポリペプチドと比較したとき、スミス・ウォーターマン法のアラインメントに基づいて少なくとも６５％の同一性を有する少なくとも３１８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチドシークエンス、または前記第１のヌクレオチドシークエンスの相補物を含む第２のヌクレオチドシークエンスを含むことを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１５】
好適な調節シークエンスに操作可能に結合した、請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の単離核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項１６】
請求項１５記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、バクテリア、酵母、糸状真菌および緑色植物からなる群より選択される、請求項１６記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピチア、カンジダ、ハンセニューラ、サルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ロドコッカス、ストレプトミセス、エシェリキア、シュードモナス、メチロモナス、メチロバクター、アルカリゲネス、シネコシスティス、アナベナ、チオバチルス、メタノバクテリウムおよびクレブシエラからなる群より選択される、請求項１７記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、大豆、菜種、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オート麦、モロコシ類、米、アラビドプシス、アブラナ科野菜、メロン、人参、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、グレープ、草種穀物、シュガービート、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、硬材木、軟材木および飼料牧草からなる群より選択される、請求項１７記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングする工程と、
（ｂ）請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子でハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で同定された前記クローンを含むゲノムフラグメントをシークエンシングする工程とを有し、
前記シークエンスされたゲノムフラグメントがイソプレノイド生合成酵素をコードする、イソプレノイド化合物生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項２１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および２３からなる群より選択されるシークエンスの一部に対応する少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いてクローニングベクターに存在する挿入物を増幅する工程とを有し、
前記増幅された挿入物が、イソプレノイド生合成酵素をコードするアミノ酸シークエンスの一部をコードする、イソプレノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載の方法の生成物。
【請求項２３】
形質転換宿主細胞を、有効量の炭素源と、好適な成長条件下で接触させて、イソプレノイド化合物を生成する工程を有し、前記形質転換宿主細胞が、好適な調節シークエンスの制御下にあるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２４をコードする一組の核酸分子を含むことを特徴とするイソプレノイド化合物の生成方法。
【請求項２４】
前記形質転換宿主細胞が、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピチア、カンジダ、ハンセニューラ、サルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ロドコッカス、ストレプトミセス、エシェリキア、シュードモナス、メチロモナス、メチロバクター、アルカリゲネス、シネコシスティス、アナベナ、チオバチルス、メチノバクテリウムおよびクレブシエラからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記メタノトロフィックバクテリアが、
（ａ）メタンおよびメタノールからなる群より選択されるＣ１炭素基質により成長し、
（ｂ）機能的エムデン・マイヤーホフ炭素経路を有し、前記経路がピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記メタノトロフィックバクテリアが、メチロモナス１６ａＡＴＣＣ  ＰＴＡ２４０２である請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、大豆、菜種、ヒマワリ、綿、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オート麦、モロコシ類、米、アラビドプシス、アブラナ科野菜、メロン、人参、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、グレープ、草種穀物、シュガービート、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、硬材木、軟材木および飼料牧草からなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記炭素源が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、メタン、ホルムアルデヒド、ホルメートおよび炭素含有アミンからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記形質転換宿主がメチロモナス、メチロバクターおよびメタノバクテリウムからなる群より選択され、前記炭素源がメタンおよびメタノールからなる群より選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および２３からなる群より選択される少なくとも１個のイソプレノイド遺伝子を生物中で過剰発現させて、イソプレノイド生合成が前記生物中で変化することを特徴とする、前記生物中のイソプレノイド生合成を調節する方法。
【請求項３１】
前記イソプレノイド遺伝子が多コピープラスミド上で過剰発現される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記イソプレノイド遺伝子が誘導または調節プロモータに操作可能に結合されている、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記イソプレノイド遺伝子がアンチセンス方向で発現している、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記イソプレノイド遺伝子が外来ＤＮＡのコーディング領域への挿入により中断されている、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
（ｉ）天然イソプレノイド遺伝子ａ）と、
前記天然イソプレノイド遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団ｂ）と、
前記天然イソプレノイド遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチドフラグメントの第２の集団ｃ）と
を含むヌクレオチドシークエンス混合物を、制限エンドヌクレアーゼで消化して制限フラグメントの混合物を生成する工程と、
（ｉｉ）前記制限フラグメントの混合物を変性する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で変性した前記制限フラグメントの混合物をポリメラーゼとインキュベートする工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返して、変化した生物活性を有するタンパク質をコードする突然変異イソプレノイド遺伝子を生成する工程とを含む方法により生成される、変化した生物活性を有するイソプレノイド酵素をコードする突然変異遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年９月１日出願の米国特許仮出願第６０／２２９，９０７号遡及の特典を請求するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は微生物学の分野である。特に、本発明は、イソプレノイド化合物の微生物生成に有用な酵素をコードする核酸セグメントに係る。
【０００３】
発明の背景
イソプレノイドは、一般的な生合成起源、例えば、単一代謝前駆体、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）を有する天然生成物の非常の大きな分岐した属である。イソプレノイドとして知られている天然生成物の属は、５−炭素化合物イソペンテニルジホスフェートから生合成されて誘導される全ての物質を含む。イソプレノイド化合物はまた、「テルペン」や「テルペノイド」と呼ばれており、これは、様々な部類のこれらの例の指示に用いられる用語である（ＳｐｕｒｇｅｏｎおよびＰｏｒｔｅｒ、イソプレノイド化合物の生合成、３〜４６頁、Ａ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８１年））。
【０００４】
イソプレノイドは全ての有機体にある汎存化合物である。イソプレノイドの周知の例をいくつか挙げると、ステロイド（トリテルペン）、カロテノイド（テトラテルペン）およびスクアレンがある。
【０００５】
長年にわたって、ＩＰＰが周知の酢酸／メバロネート経路により合成することが受け入れられてきた。しかしながら、最近の研究によれば、メバロネート依存経路が全ての有機体で作用しないことが分かった。ＩＰＰ生合成の代替のメバロネート独立経路は、最初、バクテリア中で特定され、後に緑藻類および高次植物でも特定された（Ｈｏｒｂａｃｈら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０（１９９３年）、Ｒｏｈｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７−５２４（１９９３年）、Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３−８０（１９９６年）、Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１−６４３６（１９９６年））。
【０００６】
メバロネート独立およびメバロネート依存イソプレノイド経路の両方において多くの工程が知られている。例えば、代替経路の最初の工程には、３−炭素分子（ピルベートおよびＣ１アルデヒド基、Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート）を縮合して、５−炭素化合物Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートを生成することが含まれる。Ｌｏｉｓらは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ（ＤＸＳ）をコードし、Ｄ−１デオキシキシルロース−５−ホスフェートの合成をＥ．ｃｏｌｉ中で触媒する遺伝子、ｄｘｓを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：２１０５−２１１０（１９９８年））。
【０００７】
次に、Ｄ−１−ドデキシキシルロース−５−ホスフェートの異性化および還元により２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートを生成する。異性化および還元プロセスに含まれる酵素の一つがＤ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートリダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、ｄｘｒ遺伝子生成物が２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートの形成をＥ．ｃｏｌｉの代替経路で触媒することを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：９８７９−９８８４（１９９８年））。
【０００８】
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートをイソペンテニルモノホスフェートに変換する工程は十分に特定されていないが、いくつかの工程は知られている。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−ホスフェートは、ＣＴＰ依存反応において、注記されていない遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素により４−ジホスフォシチリジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールへ変換される。Ｒｏｈｄｉｃｈらは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＹｇｂＰタンパク質が上述の反応を触媒することを報告している。最近、ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＃Ｑ４６８９３）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１１７５８−１１７６３（１９９９年））。
【０００９】
４−ジホスフォシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールの２位の水酸基は、ｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる酵素によるＡＴＰ依存反応においてリン酸化できる。Ｌｕｔｔｇｅｎらは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＹｃｈＢタンパク質が４−ジホスフォシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールをリン酸化すると、４−ジホスフォシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−ホスフェートが得られることを報告した。最近、ｙｃｈＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＃Ｐ２４２０９）（Ｌｕｔｔｇｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１０６２−１０６７（２０００年））。
【００１０】
Ｈｅｒｚらは、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｙｇｂＢ遺伝子生成物が、４−ジホスフォシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２−ホスフェートを２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートに変換することを報告した。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートはさらに、カロテノイド生合成経路によりカロテノイドに変換することができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：２４８６−２４９０（２０００年））。最近、ｙｇｂＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスタの一部としてｉｓｐＦと改名された（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＃Ｐ３６６６３）。
【００１１】
ＹｇｂＰ酵素により触媒される反応は、ＣＴＰ依存のやり方で実施される。このように、ＣＴＰシンターゼは、イソプレノイド経路において重要な役割を果たす。Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐｙｒＧ遺伝子によりコードされるＰｙｒＧを判定して、ＣＴＰシンターゼをコードする（Ｗｅｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：５５６８−５５７４（１９８６年））。
【００１２】
未だ特定されていないいくつかの反応の後、イソペンテニルモノホスフェートが形成される。イソペンテニルモノホスフェートは、ｉｐｋ遺伝子によりコードされ、上述のｙｈｃＢ（ｉｓｐＥ）遺伝子と同一の、イソペンテニルモノホスフェートキナーゼによりイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）に変換される（ＬａｎｇｅおよびＣｒｏｔｅａｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１３７１４−１３７１９（１９９９年））。
【００１３】
Ｃｕｎｎｉｇｈａｍら（Ｊ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：５８４１−５８４８（２０００年））は、経路が分岐してＩＰＰおよびジメチルアリルジホスフェートを形成する工程で、またはこれに続いて触媒するデオキシキシルロース−５−ホスフェート経路の酵素をコードすると考えられるＥ．ｃｏｌｉ中のｌｙｔＢ遺伝子を報告した。ＬｙｔＢ遺伝子はまた、アシネトバクターおよびシネコシスティス（夫々、ジーンバンク受入番号ＡＦ０２７１８９およびＵ３８９１５）のようなその他の微生物中にも見出された。
【００１４】
プレニルトランスフェラーゼは、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）の連続縮合を触媒し、その結果、様々な鎖長のプレニルジホスフェートを形成する広範な部類の酵素を構成している。プレニルトランスフェラーゼの相同遺伝子はそのアミノ酸シークエンスに高次保存領域を有している。Ｏｈｔｏらは、シアノバクテリウムシネココッカスエロンガタス中の３個のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子を報告した（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：３０７−３２１（１９９９年））。様々な長さの５個のプレニルジホスフェートの合成を触媒することのできるゲラニルゲラニル（Ｃ２０）ジホスフェートシンターゼ、ファルネシル（Ｃ１５）ジホスフェートシンターゼおよびその他プレニルトランスフェラーゼである。
【００１５】
更にイソプレノイド生合成経路まで下りると、特定のイソプレノイドの合成にはさらに多くの遺伝子が含まれる。一例を挙げると、ｃｒｔＮ遺伝子が、カロテノイド生合成経路の一部であるジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードするヘリオバチルスモビリス（Ｘｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１４８５１−１４８５６（１９９８年））に見出された。
【００１６】
イソプレノイド経路に含まれる遺伝子の大半が知られているが、メタノトロフィックバクテリアのイソプレノイド経路に含まれる遺伝子は既存の文献には記載されていない。しかしながら、多くの着色メチロトロフィックおよびメタノトロフィックバクテリアがあり、このことは、カロテノイド顔料を生成する能力がこれらのバクテリア中に広がり、従って遺伝子がこれらのバクテリア中に広がるに違いないことを示している。出願人は、メチロモナスｓｐ．からイソプレノイド生合成経路の酵素をコードする数多くの固有転写解読枠を単離した。
【００１７】
出願人は、イソプレノイド合成に係る９個の転写解読枠（ＯＲＦ）コーディング酵素を含有する遺伝子を単離することにより上述の問題を解決した。
【００１８】
発明の概要
本発明は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２４からなる群より選択されるアミノ酸シークエンスをコードする単離核酸分子と、（ｂ）０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄に０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが続く、ハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離核酸分子と、（ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補的な単離核酸分子とからなる群より選択されるイソプレノイド生合成酵素をコードする単離核酸分子を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、適切な調節シークエンスの制御下にある本発明の遺伝子およびキメラによりコードされるポリペプチドを提供する。同様に、本発明は、本発明の遺伝子および遺伝子生成物のうち一つ以上を発現するバクテリア、酵母、糸状真菌および緑色植物を含む形質転換有機体を提供する。
【００２０】
本発明は、本発明の遺伝子の全てまたは大部分を遺伝子増幅またはハイブリダイゼーション法により得る方法を提供する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、形質転換宿主細胞を、有効量の炭素源と、好適な成長条件下で接触させて、イソプレノイド化合物を生成する工程を有し、前記形質転換宿主細胞が、好適な調節シークエンスの制御下にあるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２４をコードする一組の核酸分子を含むイソプレノイド化合物の生成方法を提供する。
【００２２】
同様に、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および２３からなる群より選択される少なくとも１個のイソプレノイド遺伝子を生物中で過剰発現させて、イソプレノイド生合成が生物中で変化する生物中のイソプレノイド生合成を調節する方法を提供する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は
（ｉ）天然イソプレノイド遺伝子ａ）と、
天然イソプレノイド遺伝子とハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団ｂ）と、
天然イソプレノイド遺伝子とハイブリダイズしないヌクレオチドフラグメントの第２の集団ｃ）と
を含むヌクレオチドシークエンスを、制限エンドヌクレアーゼで消化して、制限フラグメントの混合物を生成する工程と、
（ｉｉ）制限フラグメントの混合物を変性する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で変性した制限フラグメントの混合物をポリメラーゼとインキュベートする工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返して、変化した生物活性を有するタンパク質をコードする突然変異イソプレノイド遺伝子を生成する工程とを含む方法により生成される、変化した生物活性を有するイソプレノイド酵素をコードする突然変異遺伝子を提供する。
【００２４】
シークエンスの説明および生物委託
本発明は、本出願の一部をなす、以下の詳細な説明および添付のシークエンスの説明からより完全に理解される。
【００２５】
以下のシークエンスは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチドシークエンスおよび／またはアミノ酸シークエンスの開示を含む特許出願の要件−シークエンス規則」）に適合しており、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）規則ＳＴ．２５（１９９８年）およびＥＰＯおよびＰＣＴのシークエンス一覧要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）および管理指示のセクション２０８および付録Ｃ）に従っている。ヌクレオチドおよびアミノ酸シークエンスデータに用いる記号およびフォーマットは３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定された規則に従っている。
【００２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１はｄｘｓ遺伝子をコードするＯＲＦ１のヌクレオチドシークエンスである。
【００２７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はＯＲＦ１によりコード化されたｄｘｓの推定アミノ酸シークエンスである。
【００２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３はｄｘｒ遺伝子をコードするＯＲＦ２のヌクレオチドシークエンスである。
【００２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４はＯＲＦ２によりコードされたｄｘｒの推定アミノ酸シークエンスである。
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５はｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）遺伝子をコードするＯＲＦ３のヌクレオチドシークエンスである。
【００３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６はＯＲＦ３によりコードされたｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）遺伝子の推定アミノ酸シークエンスである。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７はｙｇｃＢ（ｉｓｐＥ）遺伝子をコードするＯＲＦ４のヌクレオチドシークエンスである。
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８はＯＲＦ４によりコードされたｙｃｈＢ（ｉｓｐＥ）の推定アミノ酸シークエンスである。
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９はｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）遺伝子をコードするＯＲＦ５のヌクレオチドシークエンスである。
【００３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０はＯＲＦ５によりコードされたｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）の推定アミノ酸シークエンスである。
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１はｐｙｒＧ遺伝子をコードするＯＲＦ６のヌクレオチドシークエンスである。
【００３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２はＯＲＦ６によりコードされたｐｙｒＧの推定アミノ酸シークエンスである。
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３はｉｓｐＡ遺伝子をコードするＯＲＦ７のヌクレオチドシークエンスである。
【００３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４はＯＲＦ７によりコードされたｉｓｐＡ遺伝子の推定アミノ酸シークエンスである。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５はｃｒｔＮ遺伝子、コピー１をコードするＯＲＦ８のヌクレオチドシークエンスである。
【００４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６はＯＲＦ８によりコードされたｃｒｔＮ遺伝子コピー１の推定アミノ酸シークエンスである。
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７はｃｒｔＮ遺伝子、コピー２をコードするＯＲＦ９のヌクレオチドシークエンスである。
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８はＯＲＦ９によりコードされたｃｒｔＮ遺伝子コピー２の推定アミノ酸シークエンスである。
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０はｄｘｓ遺伝子を増幅するのに用いるプライマーシークエンスである。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２はｄｘｒ遺伝子を増幅するのに用いるプライマーシークエンスである。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３はｌｙｔＢ遺伝子をコードするＯＲＦ１０のヌクレオチドシークエンスである。
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４はＯＲＦ１０によりコードされたｌｙｔＢ遺伝子の推定アミノ酸シークエンスである。
【００４８】
出願人は、特許手続きの目的での微生物寄託の国際認識についてのブダペスト条約の条項にしたがって、以下の生物寄託を行った。
【００４９】
【表１】
2005500804.tif 000002
【００５０】
本発明の詳細な説明
遺伝子およびその発現生成物は、様々なイソプレノイド化合物を生成する能力を有する組換え型有機体の作成に有用である。上述の酵素をコードする核酸フラグメントは、メチロモナス１６ａの菌株から単離され、当業者に周知のＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ヌクレオチドおよびタンパク質シークエンスを含む公的なデータベースとの比較により同定されてきた。
【００５１】
本発明の遺伝子および遺伝子生成物は、イソプレノイド化合物のエンハンスメントおよびマニピュレーションに様々なやり方で用いることができる。
【００５２】
微生物イソプレノイド経路は、カロテノイド、キノン、スクアレンおよびビタミンのような化合物生成についての天然の多生成物プラットフォームである。これらの天然生成物は５炭素単位から５５を超える炭素単位の鎖長である。カロテノイド化合物は化学的に作成するのが非常に難しいため、これらの化合物にとって微生物イソプレノイド生成は実際的に有用である（ＮｅｌｉｓおよびＬｅｅｎｈｅｅｒ、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１−１９１（１９９１年））。たいていのカロテノイドは強い色を有しており、天然顔料または着色剤と見なすことができる。さらに、多くのカロテノイドは、潜在的な酸化防止特性を有しており、ダイエット中にこれらの化合物を摂ることは健康的と考えられている。周知の例としてはβ−カロテンおよびアスタキサンチンがある。
【００５３】
メチロモナス１６ａの場合には、カロテノイドを作成する元来の能力が特に有用である。このため、メタントロフィックバクテリアが単細胞タンパク質の商業的な生成に用いられてきており、これらのバクテリアからのタンパク質は家畜飼料として有効であることが知られている（Ｇｒｅｅｎ，メチロトロフィックバクテリアの分類学：メタンおよびメタノール利用（バイオテクノロジーハンドブック５）Ｊ．Ｃｏｌｉｎ  ＭｕｒｒｅｌｌおよびＨｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ編、１９９２年Ｐｌｅａｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ．２３−８４頁、バイオプロテイン製造１９８９年、Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄシリーズ、応用科学と工業技術ＮＹ：Ｈａｌｓｔｅａｄ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００５４】
本明細書に記載した遺伝子および遺伝子シークエンスによって、健康的なカロテノイドの製造を、メチロモナス１６ａから誘導された単細胞タンパク質へ直接組み込むことができる。この態様によって、飼料を望ましく着色し、健康上の利点を与えることが知られているカロテノイドが存在することにより、これらの遺伝子が組み込まれるこの菌株またはメタノトロフィック菌株が、家畜飼料にとってより望ましい生成ホストとなる。サケおよびエビ水産養殖が、カロテノイド着色がこれらの有機体の価値にとって非常に重要であることから、本発明に特に有用な用途である。（Ｆ．Ｓｈａｈｉｄｉ、Ｊ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ、シーフードおよび水産養殖重要総括、食品化学３８（１）：１−６７（１９９８年））。
【００５５】
添加剤を供給することに加えて、遺伝子はカロテノイドおよびその誘導体、イソプレノイド中間体およびその誘導体の製造に、そして顔料、フレーバーおよびフレグランスとして有用な純生成物として有用である。
【００５６】
この開示において、数多くの用語および略号を用いている。以下の定義を定める。
【００５７】
「転写解読枠」はＯＲＦと略す。
【００５８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略す。
【００５９】
本明細書において用いる「単離核酸フラグメント」は、任意で合成、非天然または変化ヌクレオチド基質を含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成されていてよい。
【００６０】
「イソプレノイド」または「テルペノイド」という用語は、カロテノイドやキサントフィルのような１０−炭素テルペノイドおよびその誘導体を含むイソプレノイド経路から誘導された分子のことを指す。
【００６１】
「メチロモナス１６ａ」および「メチロモナス１６ａ  ｓｐ．」という用語は同じ意味で用いられ、本発明において用いるメチロモナス菌株のことを指す。
【００６２】
「Ｄｘｓ」という用語は、ＯＦＲ１で表されるｄｘｓ遺伝子によりコードされた１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートシンターゼ酵素のことを指す。
【００６３】
「Ｄｘｒ」という用語は、ＯＲＦ２で表されるｄｘｒ遺伝子によりコードされた１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートレダクトイソメラーゼ酵素のことを指す。
【００６４】
「ＹｇｂＰ」または「ＩｓｐＤ」という用語は、ＯＲＦ３で表されるｙｇｂＰまたはｉｓｐＤ遺伝子によりコードされた２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシチジルトランスフェラーゼ酵素のことを指す。遺伝子の名前、ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤは本明細書においては同じ意味で用いられる。遺伝子生成物の名前、ＹｇｂＰまたはＩｓｐＤは本明細書においては同じ意味で用いられる。
【００６５】
「ＹｃｈＢ」または「ＩｓｐＥ」という用語は、ＯＲＦ４で表されるｙｃｈＰまたはｉｓｐＥ遺伝子によりコードされた４−ジホスフォシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ酵素のことを指す。遺伝子の名前、ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥは本明細書においては同じ意味で用いられる。遺伝子生成物の名前、ＹｃｈＢまたはＩｓｐＥは本明細書においては同じ意味で用いられる。
【００６６】
「ＹｇｂＢ」または「ＩｓｐＦ」という用語は、ＯＲＦ５で表されるｙｇｂＢまたはｉｓｐＦ遺伝子によりコードされた２Ｃ−メチル−ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートシンターゼ酵素のことを指す。遺伝子の名前、ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦは本明細書においては同じ意味で用いられる。遺伝子生成物の名前、ＹｇｂＢまたはＩｓｐＦは本明細書においては同じ意味で用いられる。
【００６７】
「ＰｙｒＧ」という用語は、ＯＲＦ６で表されるｐｙｒＧ遺伝子によりコードされたＣＴＰシンターゼ酵素のことを指す。
【００６８】
「ＩｓｐＡ」という用語は、ＯＲＦ７で表されるｉｓｐＡ遺伝子によりコードされたプレニルトランスフェラーゼ系列の一つとしてのゲラニルトランスフェラーゼまたはファルネシルジホスフェートシンターゼ酵素のことを指す。
【００６９】
「ＣｒｔＮ１」または「ＣｒｔＮ、コピー１」という用語は、ＯＲＦ８で表されるｃｒｔＮ１遺伝子によりコードされたジアポフィトエンデヒドロゲナーゼ酵素のコピー１のことを指す。
【００７０】
「ＣｒｔＮ２」または「ＣｒｔＮ、コピー２」という用語は、ＯＲＦ９で表されるｃｒｔＮ２遺伝子によりコードされたジアポフィトエンデヒドロゲナーゼ酵素のコピー２のことを指す。
【００７１】
「ＬｙｔＢ」という用語は、ＯＲＦ１０で表されるｌｙｔＢ遺伝子によりコードされるタンパク質のことを指し、イソプレノイド経路においてＩＰＰおよびジメチルアリルジホスフェートを形成する機能を有する。
【００７２】
「エムデン・マイヤーホフ経路」という用語は、グリセルアルデヒド３ホスフェート、ジヒドロキシアセトンホスフェート、ホスホエノールピルベートおよびピルベートのような細胞様３−炭素中間体に重要なグルコースやフルクトースのようなヘキソースの変換のための一連の生化学的反応のことを指す。これらの反応は、一般的に、ＡＴＰの形成に生化学的に有用なエネルギーを正味で得ながら進む。エムデン・マイヤーホフ経路に固有の主要な酵素は、ホスフォフルクトキナーゼおよびフルクトース１，６ビスホスフェートアルドラーゼである。
【００７３】
「エントナー・ドゥドロフ経路」という用語は、生化学的に有用なエネルギーを正味で生成しない、３炭素細胞様中間体ピルベートおよびグリセルアルデヒド３ホスフェートに重要なグルコースやフルクトースのようなヘキソースの変換のための一連の生化学的反応のことを指す。エントナー・ドゥドロフ経路に固有の主要な酵素は、６ホスフォグルコネートデヒドラターゼおよびケトデオキシホスフォグルコネートアルドラーゼである。
【００７４】
「高成長メタノトロフィックバクテリア菌株」という用語は、唯一の炭素およびエネルギー源としてメタンまたはメタノールで成長可能で、機能的エムデン・マイヤーホフ炭素フラックス経路を有していて、その結果、代謝Ｃ１基質１グラム当たり細胞質量の高速成長および収率であるバクテリアのことを指す。本明細書において、特定の「高成長メタノトロフィックバクテリア菌株」とは、同じ意味で用いられる「メチロモナス１６ａ」または「１６ａ」のことを指す。
【００７５】
「メタノトロフ」または「メタノトロフィックバクテリア」という用語は、メタンを主な炭素およびエネルギー源として利用することのできる原核微生物のことを指す。
【００７６】
本明細書において、「実質的に類似」とは、１つ以上のヌクレオチド基質における変化の結果、１つ以上のアミノ酸が置換するが、ＤＮＡシークエンスによりコードされるタンパク質の機能的特性には影響しない核酸フラグメントのことを指す。「実質的に類似」とはまた、アンチセンスまたは共抑制技術により発現される遺伝子の変化を媒介する、１つ以上のヌクレオチド基質の変化が核酸フラグメントの能力に影響しない核酸フラグメントのことも指す。「実質的に類似」とはまた、得られる転写産物の機能的特性に実質的に影響しない１つ以上のヌクレオチド基質の削除や挿入といった本発明の核酸フラグメントの修正のことも指す。従って、本発明は特定の例示のシークエンス以外も含むものと考えられる。
【００７７】
例えば、与えられた部位に化学的に等量のアミノ酸が生成されるが、コードされたタンパク質の機能的特性に影響しない遺伝子の変化は一般的なことであることは当業者に周知である。本発明について、置換基とは、次の５つの群のうち一つとの交換と定義される。
１．小さな脂肪族、非極性またはやや極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．極性の負に帯電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、および
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００７８】
このように、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のコドンを、他の疎水性の小さい残基（例えば、グリシン）やより疎水性の残基（例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）をコードするコドンにより置換してもよい。同様に、ある負に帯電した残基が他のものに置換されたり（例えば、アスパラギン酸がグルタル酸に）、ある正に帯電した残基が他のものに置換されたり（リジンがアルギニンに）する変化が、機能的に等価な生成物を生成することも予測される。
【００７９】
多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部の変化となるヌクレオチドの変化がタンパク質の活性を変化させることも予想されない。
【００８０】
提案された修正の夫々は、コードされた生成物の生物活性の保持を判断する当業者の日常業務に十分含まれるものである。さらに、当業者であれば、本発明に包含される実質的に類似のシークエンスがまた、縮重条件下（０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの後、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄）で、ここに例証されたシークエンスにより、ハイブリダイズする能力によっても定義される。本発明の好ましい実質的に類似の核酸フラグメントは、ＤＮＡシークエンスがここに報告した核酸フラグメントのＤＮＡシークエンスと少なくとも８０％同一である核酸フラグメントである。より好ましい核酸フラグメントは、ここに報告した核酸フラグメントのＤＮＡシークエンスと少なくとも９０％同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントのＤＮＡシークエンスと少なくとも９５％同一である。
【００８１】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態を、適正な条件の温度および溶液イオン強度で、他の核酸分子をアニールすることができるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような他の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）、特に１１章、表１１．１（全体がここに参考文献として組み込まれる）に例証されている。温度およびイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「縮重度」を決める。縮重条件を調節すると、遠位関係の有機体からの相同シークエンスのような中程度に類似のフラグメントから、近接関係の有機体からの機能的酵素を複製する遺伝子のような極めて類似のフラグメントまでをスクリーニングすることができる。後ハイブリダイゼーション洗浄が縮重条件を決める。一組の好ましい条件では、まず６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間洗浄し、続いて、２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間繰り替えしてから０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましい組の縮重条件では、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳでの最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃まで増大させた以外は上述と同じ洗浄で高温を用いる。その他の好ましい組の高縮重条件は、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で最後に２回洗浄するものである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的シークエンスを含有している必要がある。ただし、ハイブリダイゼーションの縮重度に応じて、基質間にミスマッチが生じる可能性がある。核酸ハイブリダイジングの適正な縮重度は、核酸の長さおよび相補性の程度、当業者に周知の変数に応じて異なる。２つのヌクレオチドシークエンス間の類似性または相同性の程度が大きくなればなるほど、これらのシークエンスを有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（高いＴｍに対応する）はＲＮＡ：ＲＡＮ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順番で減少する。長さが１００個を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導かれている（前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、９．５０−９．５１を参照のこと）。短めの核酸、例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決める（前出のＳａｍｂｒｏｏｋら、１１．７−１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも１０個のヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸についての最低長さは、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは約２０個のヌクレオチド、最も好ましくは長さは少なくとも３０個のヌクレオチドである。さらに、温度および洗浄液塩濃度を、プローブの長さのような因子によって適宜調整できることは当業��であれば理解されよう。
【００８２】
アミノ酸またはヌクレオチドシークエンスの「大部分」は、当業者によるシークエンスの手動評価か、あるいは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照のこと）のようなアルゴリズムを用いたコンピュータ自動シークエンス比較および同定によりポリペプチドまたは遺伝子を推定で同定するための、十分なポリペプチドのアミノ酸シークエンスまたは遺伝子のヌクレオチドシークエンスを含む。一般に、公知のタンパク質または遺伝子と相同であるとポリペプチドまたは核酸シークエンスを推定で同定するためには、１０個以上の隣接アミノ酸のシークエンスまたは３０個以上のヌクレオチドが必要である。さらに、ヌクレオチドシークエンスに関して、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子特異性のオリゴヌクレオチドプローブを遺伝子の同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、バクテリアコロニーまたはバクテリオファージプラークのイン・サイチュでのハイブリダイゼーション）のシークエンス依存方法で用いてもよい。さらに、１２〜１５個の基質の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいて増幅プライマーとして用いて、そのプライマーを含む特定の核酸フラグメントを与えてもよい。従って、ヌクレオチドシークエンスの「大部分」は、そのシークエンスを含む核酸フラグメントを特定的に同定および／または単離するための十分なシークエンスを含んでいる。本明細書は、１個以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分または完全アミノ酸およびヌクレオチドシークエンスを教示している。本明細書に報告したシークエンスの利点により、当業者であれば、当業者に公知の目的で、開示されたシークエンスの全てまたは大部分を用いることができる。従って、本発明は、添付のシークエンスリストに報告された完全なシークエンス、および上に定義されたシークエンスの大部分を含むものである。
【００８３】
「相補的」という用語を用いて、互いにハイブリダイズすることのできるヌクレオチド基質間の関係を説明する。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、添付のシークエンスリストに報告された完全なシークエンスおよび実質的に類似の核酸シークエンスである単離核酸フラグメントも含む。
【００８４】
業界で知られた「パーセント同一性」という用語は、シークエンスを比較することにより求められる、２つ以上のポリペプチドシークエンスまたは２つ以上のポリヌクレオチドシークエンス間の関係である。業界において、「同定する」とは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドシークエンス間のシークエンス関連性の程度も意味し、ケースバイケースで、かかるシークエンスのストリング間のマッチにより決まる。「同一性」および「類似性」は、これらに限られるものではないが、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）オックスフォード大学プレス、ＮＹ（１９８８年）；バイオコンピューティング：インフォマティックスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．  Ｗ．編）アカデミックプレス、ＮＹ（１９９３年）；シークエンスデータのコンピュータ分析、パートＩ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ）（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）ヒューマンプレス、ＮＪ（１９９４年）；分子生物学におけるシークエンス分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）アカデミックプレス（１９８７年）；およびシークエンス分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）ストックトンプレス、ＮＹ（１９９１年）をはじめとする公知の方法により容易に計算することができる。アイデンティティを求める好ましい方法を設計して、試験するシークエンス間の最良のマッチを与える。同一性および類似性を求める方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムとなっている。シークエンス配列およびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティング一式のＭｅｇａｌｉａｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行うことができる。シークエンスの多配列は、デフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）により配列のＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を用いて実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いた対の配列についてのデフォルトパラメータはＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００８５】
好適な核酸フラグメント（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、ここに報告したアミノ酸シークエンスと少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、ここに報告したアミノ酸シークエンスと約８５％同一のアミノ酸シークエンスをコードする。より好ましい核酸フラグメントは、ここに報告したアミノ酸シークエンスと少なくとも約９０％同一のアミノ酸シークエンスをコードする。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸シークエンスと少なくとも約９５％同一のアミノ酸シークエンスをコードする核酸フラグメントである。好適な核酸フラグメントは、上記の相同性を有しているばかりでなく、通常、少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８６】
「コドン縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸シークエンスに影響することなく、ヌクレオチドシークエンスを変化させる遺伝暗号の性質のことを指す。従って、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯで規定された本発明の微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸シークエンスの全てまたは大部分をコードする核酸フラグメントに関する。当業者であれば、与えられたアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンを用いた特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」をよく知っている。従って、宿主細胞において発現を改善するために遺伝子を合成するときは、コドン使用のその頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に達するように遺伝子を設計するのが望ましい。
【００８７】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構築ブロックから組み立てることができる。これらの構築ブロックは結合されアニールされて、遺伝子セグメントを形成し、酵素により組み立てられて全体の遺伝子が構築される。ＤＮＡのシークエンスに関して「化学的に合成」とは、成分ヌクレオチドを試験管で組み立てたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は、十分に確立された手順を用いて行われる。自動化化学合成は、数多くある市販の機械の一つを用いて行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチドシークエンスの最適化に基づいた最良の遺伝子発現のために作り上げることができる。当業者であれば、宿主に好まれるコドンに対してコドン使用にバイアスをかける場合、遺伝子発現成功の確度が分かる。好ましいコドンの判定は、シークエンス情報が利用可能な宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づく。
【００８８】
「遺伝子」とは、コードシークエンスより先（５’非コードシークエンス）および後（３’非コードシークエンス）の規則的シークエンスを含む特定のタンパク質を発現させる核酸フラグメントのことを指す。「天然遺伝子」とは、自身の規則的なシークエンスで天然に見出される遺伝子のことを指す。「キメラ遺伝子」とは、天然には見出されない規則的なコードシークエンスを含む天然の遺伝子ではない遺伝子のことを指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源から誘導された規則的なシークエンスおよびコードシークエンス、または同じ源から誘導されているが、天然に見出されるのとは異なるやり方で配置された規則的シークエンスおよびコードシークエンスを含んでいてもよい。「内因性遺伝子」とは、有機体のゲノム中自然の位置にある天然遺伝子のことを指す。「外来」遺伝子とは、宿主有機体に通常見出されないが、遺伝子転写により宿主有機体に導入される遺伝子のことを指す。外来遺伝子は、非天然有機体またはキメラ遺伝子へ挿入された天然遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００８９】
「コードシークエンス」とは、特定のアミノ酸シークエンスについてコードするＤＮＡシークエンスのことを指す。「好適な規則的シークエンス」とは、コードシークエンスの上流（５’非コードシークエンス）、その中または下流（３’非コードシークエンス）に位置するヌクレオチドシークエンスのことを指し、関連コードシークエンスの転写、ＲＮＡ処理または安定性または翻訳に影響する。規則的シークエンスは、プロモータ、翻訳リーダシークエンス、イントロン、ポリアデニル化認識シークエンス、ＲＮＡ処理部位、エフェクタ結合部位およびステムループ構造を含んでいてもよい。
【００９０】
「プロモータ」とは、コードシークエンスまたは機能的ＲＮＡの発現を制御することのできるＤＮＡシークエンスのことを指す。通常、コードシークエンスは３’からプロモータシークエンスに位置している。プロモータは、天然の遺伝子から全体に誘導されたり、天然に見出される異なるプロモータから誘導された異なる元素から構成されたり、さらには合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当業者であれば、異なるプロモータが、異なる組織または細胞種類における遺伝子の発現に、発現の異なる段階で、または異なる環境や生理学的条件に応じて、関わっていてもよいことが分かる。多くの場合、たいていの細胞種類で遺伝子を発現させるプロモータは、一般的に「構成的プロモータ」と呼ばれている。さらに、たいていの場合、規則的シークエンスの正確な境界は完全には定義されておらず、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモータ活性を有していてもよいことが認識されている。
【００９１】
「３’非コードシークエンス」とは、コードシークエンスの下流に位置するＤＮＡシークエンスのことを指し、ポリアデニル化認識シークエンスおよびｍＲＮＡ処理または遺伝子発現に影響可能な規則的シグナルをコードするその他のシークエンスを含む。ポリアデニル化シグナルには、通常、ポリアデニル酸トラクトのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に影響するという特徴がある。
【００９２】
「ＲＮＡ転写」とは、ＤＮＡシークエンスのＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から得られる生成物のことを指す。ＲＮＡ転写がＤＮＡシークエンスの完全に相補的なコピーであるとき、第一次転写と呼ばれたり、第一次転写の後転写処理から誘導されたＲＮＡシークエンスで成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンがなく、細胞によりタンパク質へ翻訳できるＲＮＡのことを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補的でｍＲＮＡから誘導された二本鎖ＤＮＡのことを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写のことを指し、細胞によりタンパク質へ翻訳できる。「アンチセンスＲＮＡ」とは、ターゲットの第一次転写またはｍＲＮＡの全てまたは一部と相補的で、ターゲット遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ転写のことを指す（米国特許第５，１０７，０６５号、ＷＯ９９２８５０８）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写のいずれの部分に、例えば、５’非コードシークエンス、３’非コードシークエンスまたはコードシークエンスにあってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳されていないが、細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボゾームＲＮＡまたはその他ＲＮＡのことを指す。
【００９３】
「操作可能に結合した」という用語は、核酸シークエンスの単一核酸フラグメントへの関わりのことを指し、一方の機能が他方へ影響する。例えば、コードシークエンスの発現に影響し得るとき、プロモータはコードシークエンスと操作可能に結合している（例えば、コードシークエンスがプロモータの転写制御下にある）。コードシークエンスは、センチまたはアンチセンス方位に規則的シークエンスに操作可能に結合することができる。
【００９４】
本明細書で用いる「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメントから誘導されたセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定蓄積のことを指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳のことも指す。
【００９５】
「成熟」プロテインとは、後翻訳処理ポリペプチド、例えば、第一次翻訳生成物中に存在するプレまたはプロペプチドから除去されたものである。「前駆体」タンパク質とは、プレおよびプロペプチドが未だ存在する、ｍＲＮＡの翻訳の第一次生成物のことを指す。プレおよびプロペプチドは細胞内局在シグナルであるがこれに限られるものではない。
【００９６】
「シグナルペプチド」という用語は、分泌成熟タンパク質の前のアミノ末端ポリペプチドのことを指す。シグナルペプチドは成熟タンパク質から分裂したものであるため、成熟タンパク質には存在しない。シグナルペプチドは、細胞膜を超えて分泌タンパク質を配向および転座する機能を有している。シグナルペプチドはまたシグナルタンパク質とも呼ばれる。
【００９７】
「形質転換」とは、核酸フラグメントが宿主有機体のゲノムへ転写して、遺伝的に安定な遺伝となることを指す。形質転換核酸フラグメントを含有する宿主有機体は、「トランスジェニック」または「組換え体」または「形質転換」有機体と呼ばれる。
【００９８】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央新陳代謝の一部でない遺伝子を頻繁に運搬し、通常、円形の二本鎖ＤＮＡフラグメントの形態である特別な染色体要素のことを指す。かかる要素は、任意の源から誘導された自立的複製シークエンス、ゲノム統合シークエンス、ファージまたはヌクレオチドシークエンス、鎖状または円形の一本−または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。選択した遺伝子生成物についてのプロモータフラグメントおよびＤＮＡシークエンスを、適正な３’非翻訳シークエンスと共に細胞に導入することのできる唯一の構造へ数多くのヌクレオチドシークエンスが結合または組換えられる。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促す要素を有する特定のベクターのことを指す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて外来の宿主において遺伝子の発現を向上させる要素を有する特定のベクターのことを指す。
【００９９】
「変化した生化学活性」という用語は、活性が、天然の微生物シークエンス関連の活性より大きいか、または小さい、アッセイ法により測定できる微生物ヌクレオチドによりコードされるタンパク質関連の活性のことを指す。「向上した生化学活性」とは、天然のシークエンスに関連するものよりも大きく変化した活性のことを指す。「減少した生化学活性」とは、天然のシークエンスに関連するものよりも小さく変化した活性のことを指す。
【０１００】
「シークエンス分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸シークエンスの分析に有用なコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムのことを指す。「シークエンス分析ソフトウェア」は、市販されているものもあるが、独自に開発してもよい。代表的なシークエンス分析ソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８、Ｓ．Ｐａｒｋ、Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１５ＵＳＡ）およびスミス・ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日時１９９２年、１１１−２０．編者：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）が挙げられるがこれらに限られるものではない。本出願の内容には、シークエンス分析ソフトウェアを分析に用い、特に断りのない限り、分析結果が参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本明細書で用いる「デフォルト値」は、最初に初期化したときにソフトウェアにより元々ロードされている値またはパラメータの組を意味する。
【０１０１】
ここで用いた標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は業界に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）（以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）およびＳｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．，遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（１９８７年）に記載されている。
【０１０２】
シークエンス同定
様々なヌクレオチドシークエンスは、イソプレノイド生成経路に含まれる遺伝子生成物をコードするメチロモナス１６ａから単離されてきた。例えば、ＯＲＦ１〜６は、全イソプレノイド化合物の前駆体であるＩＰＰへ進むイソプレノイド経路（図１）において早期に酵素をコードする。ＯＲＦ７はＩＰＰ前駆体を凝縮することによる延長に含まれるＩｓｐＡ酵素をコードする。ＯＲＦ８およびＯＲＦ９はより具体的にはカロテノイド生成に含まれる。
【０１０３】
ｄｘｓヌクレオチドベースおよび推定アミノ酸シークエンス（ＯＲＦ１）を公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスでも、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズムを用いて６２０個のアミノ酸の長さを超えるとここに報告されたアミノ酸シークエンスとの同一性が約６０％と離れていることが分かる（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日時１９９２年、１１１−２０．編者：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．出版社：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＤｘｓは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＤｘｓ核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＤｘｓ核酸フラグメントである。
【０１０４】
Ｄｘｒベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた３９４個のアミノ酸（ＯＲＦ２）の長さを超えるアミノ酸レベルで５５％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＤｘｒは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＤｘｒ核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＤｘｒ核酸フラグメントである。
【０１０５】
ＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）ベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた２３１個のアミノ酸（ＯＲＦ３）の長さを超えるアミノ酸レベルで約５２％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）は、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）核酸フラグメントである。
【０１０６】
ＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）ベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた２８５個のアミノ酸（ＯＲＦ４）の長さを超えるアミノ酸レベルで約５０％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）は、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）核酸フラグメントである。
【０１０７】
ＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）ベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた１５７個のアミノ酸（ＯＲＦ５）の長さを超えるアミノ酸レベルで約６９％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）は、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）核酸フラグメントである。
【０１０８】
ＰｙｒＧベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた５４４個のアミノ酸（ＯＲＦ６）の長さを超えるアミノ酸レベルで約６７％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＰｙｒＧは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＰｙｒＧ核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＰｙｒＧ核酸フラグメントである。
【０１０９】
ＩｓｐＡベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた２９７個のアミノ酸（ＯＲＦ７）の長さを超えるアミノ酸レベルで約５７％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましいＩｓｐＡは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましいＩｓｐＡ核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一のＩｓｐＡ核酸フラグメントである。
【０１１０】
ＣｒｔＮベースのコピー１および推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた５１１個のアミノ酸（ＯＲＦ８）の長さを超えるアミノ酸レベルで約３４％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましい核酸シークエンスは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましい核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。
【０１１１】
ＣｒｔＮベースのコピー２および推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた４９７個のアミノ酸（ＯＲＦ９）の長さを超えるアミノ酸レベルで約３４％同一であるということが分かる。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましい核酸シークエンスは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましい核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。
【０１１２】
ＬｙｔＢベースおよび推定アミノ酸シークエンスを公のデータベースと比較すると、最も類似した公知のシークエンスは、スミス・ウォーターマンアラインメントアルゴリズム（前出のＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）を用いた３１８個のアミノ酸（ＯＲＦ１０）の長さを超えるアミノ酸レベルで約６５％同一であるということが分かる。Ｅ．ｃｏｌｉ中のｌｙｔＢ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉがカロテノイドを発現するように設計されていたとき、カロテノイドの蓄積を大幅に向上したことが報告されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｊ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：５８４１−５８４８（２０００年））。より好ましいアミノ酸フラグメントは少なくとも約８０％〜９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告したアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。同様に、本発明のＯＲＦに対応する核酸シークエンスをコードする好ましい核酸シークエンスは、活性タンパク質をコードするものであり、ここに報告した核酸シークエンスと少なくとも８０％同一である。より好ましい核酸フラグメントは少なくとも９０％がここのシークエンスと同一である。最も好ましいのは、ここに報告した核酸フラグメントと少なくとも９５％同一の核酸フラグメントである。
【０１１３】
相同体の単離
本発明の核酸フラグメントを用いて、同一またはその他の微生物種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。シークエンス依存プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は業界に周知である。シークエンス依存プロトコルとしては、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸増幅技術を様々に用いることにより例証されたＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、）、米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ、Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，１０７４、（１９８５年））または連鎖移動増幅（ＳＤＡ、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，３９２、（１９９２年）が例示されるがこれらに限られるものではない。
【０１１４】
例えば、本発明のものと同様のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本発明の核酸フラグメントの全てまたは一部を用いることにより、当業者に周知の方法論を用いて所望のバクテリアからライブラリーをスクリーニングすることにより直接単離することができる。本発明の核酸シークエンスに基づいた特定のオリゴヌクレオチドプローブは、業界に公知の方法により設計および合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。さらに、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーションまたはエンドラベリング技術または利用可能な試験管転写システムを用いたＲＮＡプローブのような当業者に知られた方法により、全シークエンスを用いて直接ＤＮＡプローブを合成することができる。さらに、特定のプライマーを設計し用いて、本発明のシークエンスの一部または全長を増幅することができる。得られる増幅生成物は、増幅反応中に直接ラベリングしたり、増幅反応後にラベリングして、プローブとして用いて、適正なストリンジェンシーな条件下で全長ＤＮＡフラグメントを単離することができる。
【０１１５】
一般的に、ＰＣＲタイプの増幅技術において、プライマーは異なるシークエンスを有しており、互いに相補的ではない。所望の試験条件に応じて、プライマーのシークエンスは、ターゲットの核酸の効率的かつ忠実な複製を与えるように設計しなければならない。ＰＣＲプライマー設計法は、一般的なものであり、業界に周知である。（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「遺伝子疾患の診断における特定のハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用」、人間の遺伝子疾患：実際のアプローチ、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編（１９８６年）、３３−５０頁、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．（１９９３年）Ｉｎ  Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．（編）、分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１５巻、３１−３９頁、ＰＣＲプロトコル：現在の方法および応用、Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１１６】
通常、本発明のシークエンスの２つの短セグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルに用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードする長い核酸フラグメントを増幅してもよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンの核酸フラグメントのライブラリーで行われてもよく、一つのプライマーのシークエンスが本発明の核酸フラグメントから誘導されており、他のプライマーのシークエンスは、微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの存在を利用している。
【０１１７】
この代わりに、第２のプライマーシークエンスはクローニングベクターから誘導されたシークエンスに基づいていてもよい。例えば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを用いて転写の単一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することによりｃＤＮＡを生成することができる。３’および５’方向に配向されたプライマーは本発明のシークエンスから設計することができる。商業的に利用可能な３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ）を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Ｏｈａｒａら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１１８】
この代わりに、本発明のシークエンスを相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素としては、プローブ、当該の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑われる試料、特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、一般的に、検出される核酸シークエンスに相補的な一本鎖核酸シークエンスである。プローブは検出される核酸シークエンスに対して「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長さは、５つの基質から数十から数千の基質まで変えることができ、実施する特定の試験に応じて異なる。一般的に、約１５個の基質〜約３０個の基質のプローブ長さが好適である。プローブ分子のわずか一部分だけが、検出される核酸シークエンスと相補的である必要がある。さらに、プローブとターゲットシークエンス間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全に相補的な分子間で生じ、その結果、ハイブリダイズ領域における基質の特定のフラクションは適正な相補基質と対をなさない。
【０１１９】
ハイブリダイゼーション法は明確に定められている。一般的に、プローブおよび試料は核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下で混合されなければならない。これには、無機または有機塩を存在させて、適正な濃度および温度条件下でプローブと試料を接触させることが含まれる。プローブと試料の核酸は、プローブと試料の核酸間に起こり得るハイブリダイゼーションが生じるよう十分に長い時間にわたって接触させなければならない。混合物中のプローブまたはターゲットの濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決める。プローブまたはターゲット濃度が高くなればなるほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間を短くする必要がある。任意で、カオトロピック試薬を添加してもよい。カオトロピック試薬は、ヌクレアーゼ活性を阻害することにより、核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック試薬は、室温での短鎖オリゴヌクレオチドプローブに感度があり、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする［Ｖａｎ  ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ（１９９１年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１］。好適なカオトロピック試薬としては、特に、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。一般に、カオトロピック試薬は最終濃度約３Ｍで存在させる。所望であれば、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に、一般に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加することができる。
【０１２０】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。一般に、これらは約２０〜６０容積％、好ましくは３０％の極性有機溶剤を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍのバッファ、例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）、約０．０５〜０．２％の洗剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムまたは０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを用いる。同様に、一般的なハイブリダイゼーション溶液に含まれるのは、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬのラベリングされていない担体核酸、フラグメント化核ＤＮＡ、例えば、ウシ胸腺またはサケ精液ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡと、任意で約０．５〜２％ｗｔ．／ｖｏｌ．グリシンである。様々な極性水溶性または膨潤剤を含む体積排除剤、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアクリレートやポリメチルアクリレートのようなアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランのようなアニオン性単糖類ポリマーのようなその他の添加剤も含めてよい。
【０１２１】
核酸ハイブリダイゼーションは様々なアッセイフォーマットに適用可能である。最も好適なものの一つはサンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適用可能である。サンドイッチタイプのアッセイの主成分は固体の担体である。固体の担体は、ラベリングされておらず、シークエンスの一部と相補的な固定化核酸プローブに吸着または共有結合されている。
【０１２２】
本発明のヌクレオチドおよび推定アミノ酸シークエンスの利用可能性が、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫スクリーニングを促す。本発明のアミノ酸シークエンスの部分を代表する合成ペプチドを合成してよい。これらのペプチドを用いて動物に免疫を与えて、アミノ酸シークエンスを含むペプチドまたはタンパク質に対して特異性を備えたポリクローン性またはモノクローン性抗体を生成する。これらの抗体を用いて、ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングして、当該の全長ＤＮＡクローンを単離することができる（Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ．Ａ．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１（１９８４年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ）。
【０１２３】
組換え発現−微生物
本発明のシークエンスの遺伝子および遺伝子生成物を、非相同の宿主細胞、特に、微生物宿主の細胞中に生成してもよい。組換え微生物宿主における発現は、様々な経路の中間体の発現に、または、これまで宿主を用いることのできなかった新規な生成物の合成のために宿主に既に存在している経路の調整に有用である。
【０１２４】
本発明の遺伝子および核酸フラグメントの発現に好ましい非相同の宿主細胞は、菌類またはバクテリア系列内に広く見られ、広い範囲の温度、ｐＨ値および溶剤許容量で成長する微生物宿主である。例えば、如何なるバクテリア、酵母および糸状真菌も本発明の核酸フラグメントの発現の好適な宿主となることが予測される。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞供給原料に関わらず同じであることから、機能的遺伝子は、細胞バイオマスを生成するのに用いられる炭素供給原料に関わらず発現される。大規模微生物成長および機能的遺伝子発現は、広い範囲の単純または複雑炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または光合成または化学的自己栄養宿主の場合には、メタンや二酸化炭素のような飽和炭化水素を利用してもよい。しかしながら、機能性遺伝子は、特定の成長条件により調節、制御または抑制してもよく、これには、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または小さな無機イオンを含む微量の微量要素の形態および量が含まれる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養に添加され、一般的には栄養素またはエネルギー源と考えられていない特定の調節分子の有無により達成される。成長速度も、遺伝子発現の重要な調節因子である。宿主菌株としては、アスペルギルス、トリコデルマ、サッカロミセス、ピチア、カンジダ、ハンセニューラのような菌類または酵母種、サルモネラ、バチルス、アシネトバクター、ロドコッカス、ストレプトミセス、エシェリキア、シュードモナス、メチロモナス、メチロバクター、アルカリゲネス、シネコシスティス、アナベナ、チオバチルス、メチノバクテリウムおよびクレブシエラのようなバクテリア種が挙げられるがこれらに限られるものではない。
【０１２５】
本発明において特に当てはまるのは、エネルギー好適な炭素フラックス経路を有する高成長偏性メタノトロフである。例えば、出願人は、炭素フラックスマニピュレーションに特に有用とされるいくつかの経路特徴を有する特定の菌株のメタノトロフを発見した。この種類の菌株は、本出願においては宿主として作用し、メチロモナス１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ２４０２）として知られている。
【０１２６】
本発明の菌株には、炭素利用経路においていくつかの変則が含まれる。例えば、ゲノムシークエンスデータに基づくと、菌株はヘキソース新陳代謝の２つの経路について遺伝子を含有していることを示している。ケト−デオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ酵素を利用するエントナー・ドゥドロフ経路がこの菌株中に存在する。これは、偏性メタノトロフにおける作用経路であることが一般に完全に受け入れられている。しかしながら、フルクトースビスホスフェートアルドラーゼ酵素を利用するエムデン・マイヤーホフ経路も存在する。この経路は、偏性メタノトロフにおいて存在しないか、あるいは作用するかのいずれかであることがよく知られている。エネルギー的に、後者の経路が最も好ましく、生物学的に有用な大量のエネルギーが得られ、最終的に、メチロモナス１６ａ中に細胞塊およびその他の細胞塊依存生成物が大量に生成される。本発明の１６ａ菌株中のこの経路の活性は、ＡＴＰの還元を測定するマイクロアレイデータおよび生化学の証拠を通して確認されている。１６ａ菌株は、エムデン・マイヤーホフおよびエントナー・ドゥドロフ経路酵素の両方を有することが示されているが、データによれば、エムデン・マイヤーホフ経路酵素は、エントナー・ドゥドロフ経路酵素よりより強固に発現されることが示されている。この結果は意外なものであり、メタノトロフィックバクテリアの解糖新陳代謝に関わる既存の概念に抗するものである。出願人は、例えば、メチロモナスクラーラおよびメチロシナススポーリウムをはじめとする、この特性を有する他のメタノトロフィックバクテリアを発見した。たいていのバクテリア系における酵素についての一般的なホスホリルドナーである、ＡＴＰを備えた酵素の活性がないために、この活性はメタノトロフ内では発見されないままであったようである。
【０１２７】
菌株１６ａ中のエムデン・マイヤーホフ経路の特に新規で有用な特徴は、主要なホスホフルクトキナーゼ工程がＡＴＰ依存の代わりにピロホスフェート依存であることである。この特徴が、ＡＴＰの代わりにピロホスフェートを用いることにより、経路のエネルギー収量を与える。菌株にエネルギー上の利点を与えるその重要性のために、炭素フラックス経路のこの遺伝子は本発明の菌株の診断に役立つと考えられる。
【０１２８】
メタノトロフィックバクテリアにおいて、メタンは、リブロースモノホスフェート経路またはＲｕＭＰサイクルとして知られた反応のサイクリックセットを介してバイオ分子に変換される。この経路は、３つの期から構成されており、各期は一連の酵素工程である。第１の工程は「固着」またはＣ−１（ホルムアルデヒド）のペントースへの組み込みにより、ヘキソースまたは６炭素糖を形成する。これは、５炭素糖（ペントース）とホルムアルデヒドの間の縮合反応を介して生じ、ヘキソースモノホスフェートシンターゼにより触媒される。第２の期は「分裂」と呼ばれ、そのヘキソースが２つの３炭素分子に分離する。これら３炭素分子の一つは、ＲｕＭＰ経路を介して再生して戻り、他の３炭素フラグメントは細胞成長に利用される。メタノトロフおよびメチロトロフにおいて、ＲｕＭＰ経路は３つの変異株の一つとして生じる。しかしながら、これらの変異株のうち僅か２つのみが見出されている。ＦＢＰ／ＴＡ（フルクトースビスホスホターゼ／トランスアルドラーゼ）またはＫＤＰＧ／ＴＡ（ケトデオキシホスホグルコネート／トランスアルドラーゼ）経路である（Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，Ｇ．Ｅ．Ｄｅｖｒｉｅｓ、好気性メタノール利用グラム陰性およびグラム陽性バクテリアの生理学および生化学。メタンおよびメタノール利用法、１９９２年、Ｃｏｌｉｎ  Ｍｕｒｒｅｌｌ編、Ｈｏｗａｒｄ  Ｄａｌｔｏｎ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ）。
【０１２９】
本発明の菌株は、遺伝子が、主要な中間体としてフルクトースビスホスフェートを介したこの変換を実施することを見出された「分裂」工程を扱う点で独特である。フルクトースビスホスフェートアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの遺伝子は、ＤＮＡの一片に集まることが分かった。第２に、ケトデオキシホスホグルコネート中間体を含むその他の変異体のための遺伝子もまた集まることが分かった。利用可能な文献によれば、これらの有機体（変性メチロトロフおよびメタノトロフ）が、ＫＤＰＧ経路にのみ頼っており、ＦＢＰ依存固定経路が通性メチロトロフにより利用されていることが教示されている（前出のＤｉｊｋｈｕｉｚｅｎら）。従って、後者の観察は予測されるが、前者はされない。バクテリアを利用する偏性メタン中にＦＢＰが見出されたことは意外でもあり、有用性も暗示している。ＦＢＰ経路は、ＫＤＰＧ経路において利用されるよりもより多くのエネルギー（ＡＴＰ）が利用されるという事実のために、宿主微生物にとってエネルギー的に好ましい。このように、ＦＢＰ経路を利用する有機体は、ＫＤＰＧ経路を利用するものよりもエネルギー上の利点および成長上の利点がある。この利点はまた、菌株におけるエネルギーを必要とする生成経路にとっても有用である。この経路を用いることにより、メタンを利用するバクテリアは、単一細胞タンパク質にとって、あるいはＲｕＭＰ経路を通して炭素のフローから誘導されたその他の生成物にとって、生成プラットフォームとして他のメタンを利用する有機体より利点を有する。
【０１３０】
従って、本発明は、
（ａ）メタンおよびメタノールからなる群より選択されるＣ１炭素基質により成長し、
（ｂ）機能的エムデン・マイヤーホフ炭素経路を有し、前記経路がピロリン酸依存ホスホフルクトキナーゼ酵素をコードする遺伝子を含む、高成長エネルギー的に好ましいメチロモナス菌株中のイソプレノイド化合物を生成する方法を提供するものである。
【０１３１】
外来タンパク質の高レベルの発現に係る規則的シークエンスを含有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれかを用いて、本発明のシークエンスの遺伝子生成物を製造するためにキメラ遺伝子を構築することができる。これらのキメラ遺伝子を形質転換により適正な微生物へ導入して、酵素の高レベルの発現を行うことができる。
【０１３２】
従って、例えば、適正なプロモータの制御下で、本発明のバクテリア酵素をコードするキメラ遺伝子の導入が、イソプレノイド生成の増大を示すということが予測される。本発明の遺伝子を天然宿主細胞と非相同宿主の両方において発現させるのに有用であることが予測される。本発明の遺伝子を天然宿主に導入すると、既存のイソプレノイド生成のレベルが上がる。さらに、本発明の遺伝子はまた、天然でない宿主バクテリアに導入してもよく、そこにはメタノトロフに存在しないイソプレノイド化合物の生成をマニピュレートするという利点がある。
【０１３３】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは業界に周知である。一般に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子、選択可能なマーカ、自立的複製または染色体統合を可能とするシークエンスの転写および翻訳に関連するシークエンスを含有している。好適なベクターは、転写開始制御を行う遺伝子の領域５’および転写終了を制御するＤＮＡフラグメントの領域３’を含む。両制御領域が、形質転換宿主細胞と相同の遺伝子から誘導されるときが最も好ましい。ただし、かかる領域は、生成宿主として選ばれた特定の種類に対して天然の遺伝子から誘導されている必要はないものと考えられる。
【０１３４】
所望の宿主細胞において本発明のＯＲＦの発現を行うのに有用な開始制御領域またはプロモータは数多くなり、当業者によく知られている。これらの遺伝子を駆動することのできる事実上全てのプロモータが本発明に好適であり、これらに限られるものではないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチアにおける発現に有用）およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃｘｘ（大腸菌における発現に有用）およびａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモータおよびバチルスにおける発現に有用な様々なファージプロモータが挙げられる。
【０１３５】
終了制御領域もまた、好ましい宿主に天然な様々な遺伝子から誘導されてもよい。任意で、終了部位は必要ないが、もし含めれば最も好ましい。
【０１３６】
経路エンジニアリング
本発明の遺伝子のシークエンスの理解は、経路を有する有機体、特にメタノトロフにおけるイソプレノイド生合成経路をマニュピュレートするのに有用である。遺伝子経路をマニュピュレートする方法は一般的なものであり、業界に周知である。特定の経路において選択した遺伝子を、様々な方法によりアップまたはダウンレギュレートしてもよい。さらに、競合する経路有機体を、遺伝子中断および同様の技術により排除または昇華してもよい。
【０１３７】
主要な遺伝子経路が同定されたら、シークエンスされた特定の遺伝子をアップレギュレートして、経路の出力を増大させてもよい。例えば、ターゲット遺伝子の追加のコピーをｐＢＲ３２２のような多コピープラスミド上の宿主細胞に導入してもよい。この代わりに、ターゲット遺伝子を修正して、非天然プロモータの制御下としてもよい。細胞サイクルの特定の点で、または発酵操作中に経路を実行するのが望ましい場合には、制御または誘導プロモータを用いてターゲット遺伝子の天然プロモータを置換してもよい。同様に、場合によっては、天然または内因性プロモータを修正して遺伝子発現を増大してもよい。例えば、内因性プロモータを、変異、欠失および／または昇華により生体内で変化させることができる（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号、Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと）。
【０１３８】
この代わりに、ターゲット経路中、またはエネルギーまたは炭素のための競合シンクとして作用する競合経路中の特定の遺伝子の発現を減少または排除するのが必要な場合もある。この目的で遺伝子をダウンレギュレートする方法が調べられてきた。中断される遺伝子のシークエンスが知られている場合には、遺伝子ダウンレギュレーションの最も有効な方法の一つは、外来ＤＮＡを構造遺伝子に挿入して転写を中断するターゲット遺伝子中断である。これは、中断される遺伝子の一部と高度の相同性を有するシークエンスにより側面に接して、挿入されるＤＮＡ（遺伝子マーカであることが多い）を含む遺伝子カセットの作成に影響される。カセットの宿主細胞への導入の結果、細胞の天然ＤＮＡ複製機構を介して、外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される。（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２、Ｂａｌｂａｓら（１９９３年）遺伝子１３６：２１１−２１３、Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら（１９９６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４、およびＳｍｉｔｈら（１９９６年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０−２７７）を参照のこと。）
【０１３９】
アンチセンス技術は、ターゲット遺伝子のシークエンスが知られている場合の遺伝子のダウンレギュレートの他の方法である。これを実施するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンスストランドを転記するようにプロモータに操作可能に結合する。この構造を宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンスストランドを生成する。アンチセンスＲＮＡは、当該のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を防ぐことによって遺伝子の発現を阻害する。当業者であれば、特定の遺伝子の発現を減じるために、アンチセンス技術を用いるのに特別な要件が係っていることを知っているはずである。例えば、アンチセンス遺伝子の適正なレベルの発現には、当業者に知られた異なる制御構成要素を利用する異なるキメラ遺伝子を用いる必要がある。
【０１４０】
ターゲット遺伝子中断およびアンチセンス技術はシークエンスが知られた遺伝子をダウンレギュレートする有効な手段を与えるが、シークエンスベースでないこれ以外のあまり特別でない方法論も開発されてきた。例えば、細胞をＵＶ放射線に露光させて、所望の表現型にスクリーニングさせる。化学薬品による突然変異誘発もまた、変異体を生成するのに有効であり、一般的に用いられている基質としては、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨのようなＤＮＡの非複製に影響する化学薬品、およびフレームシフト突然変異を生じることで知られたアクリジン染料のようなＤＮＡの複製に影響する薬剤が挙げられる。放射線または化学薬品を用いて変異体を作成する特定の方法は業界において文書化されている。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６、２２７（１９９２年）を参照のこと。
【０１４１】
遺伝子中断のその他の特別でない方法は、転置要素またはトランスポゾンを用いるものである。トランスポゾンは、ＤＮＡに不規則に挿入される遺伝子要素であるが、後にシークエンスに基づいて検索して、どこで挿入が生じたか判断することができる。生体内と試験管内の両方の転位法が知られている。両方法に、トランスポゼース酵素と組み合わせて転置要素を用いることが含まれる。転置要素またはトランスポゾンを、トランスポゼースを存在させて核酸フラグメントと接触させると、転置要素は核酸フラグメントに不規則に導入される。この技術は、不規則突然変異誘発および遺伝子単離に有用である。というのは、中断遺伝子は、転置要素のシークエンスに基づいて同定されるからである。試験管での転位のためのキットは、商業的に入手可能である（例えば、プライマーアイランド転位キット、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ、酵母Ｔｙ１要素ベース、ゲノムプライミングシステム、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡより入手可能、バクテリアトランスポゾンＴｎ７ベース、およびＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩより入手可能、Ｔｎ５バクテリア転置要素ベース、を参照のこと。
【０１４２】
本発明において、同定されたイソプレノイド経路の発現を上述の方法のいずれかにより調整するのが有用である。例えば、本発明は、顔料および小さなイソプレノイド化合物の生成に結びつくテルペノイド経路において主要な酵素をコードする数多くの遺伝子を提供する。単離遺伝子としては、ｄｘｓおよびｄｓｒ遺伝子、ｉｓｐＡ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子およびｃｒｔＮ遺伝子が挙げられる。特に、３−炭素化合物（ピルベートおよびＣ１アルデヒド基、Ｄ−グリセルアルデヒド３−ホスフェート）の初期縮合をアップレギュレートして、ｄｘｓ遺伝子により媒介される５−炭素化合物Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−ホスフェートを生成するのに有用である。この代わりに、特定の非顔料イソプレノイドを生成するのが望ましい場合には、経路の下流端で様々な遺伝子を中断するのが望ましい。例えば、ｃｒｔＮ遺伝子は、カロテノイド生合成経路の一部であるジアポフィトエンデヒドロゲナーゼをコードすることが知られている。小さな上流テルペノイドが経路の所望の生成物である場合には、遺伝子中断またはこの遺伝子のアンチセンス阻害を用いるのが望ましい。
【０１４３】
工業生産
本発明のタンパク質の商業的な生産が望ましい場合には、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子生成物の大規模生産は、バッチまたは連続培養方法論の両方によりなされてもよい。
【０１４４】
古典的なバッチ培養方法は、媒体の組成物を培養の初期に設定し、培養プロセス中に人工的な変化を受けない閉鎖系である。このように、培養プロセスの開始時に、媒体を所望の有機体で接種したり、成長や代謝活性により系に何も添加しないようにする。しかしながら、一般的に、「バッチ」培養は、炭素源を付加する点でバッチであり、ｐＨや酸素濃度のような制御因子で試みられることが多い。バッチ系において、系の代謝物質およびバイオマス組成物は、培養が終了する時間まで一定に変化する。バッチ培養中に、高成長ログ期まで、最終的には成長速度が減じたり、停止する静止期まで、静的誘導期を通じて細胞は落ち着く。未処理の場合、静止期の細胞は最終的には死ぬ。ログ相中の細胞は、ある系における最終生成物または中間体の生産のバルクを行うことが多い。静止または後指数相生成は、他の系で得ることができる。
【０１４５】
標準バッチ系を変化させたものはフェッド・バッチ系である。フェッド・バッチ培養プロセスもまた、本発明に好適であり、培養が進むにつれて基質を増分で加える以外は、一般的なバッチ系を含む。フェッド・バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の新陳代謝を阻害しがちなとき、そして媒体中に限られた量の基質を有するのが望ましい場合は有用である。フェッド・バッチ系における実際の基質の濃度の測定は難しいため、ｐＨ、溶融酸素およびＣＯ２のような廃ガスの部分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよびフェッド・バッチ培養法は一般的であり、業界に周知である。例えば、ここに参考文献として組み込まれるＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト（Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６、２２７（１９９２年）を参照のこと。
【０１４６】
本発明のタンパク質の商業的な生産はまた、連続培養によっても行うことができる。連続培養は、定義された培養媒体をバイオリアクターに連続的に加える開放系であり、等量の調整済み媒体を処理のために同時に除去する。連続培養は通常、細胞が主にログ期成長の場合、一定の高液体期密度で細胞を維持する。この代わりに、炭素および栄養素が連続的に添加され、役に立つ生成物、副生成物または老廃物が細胞塊から連続的に除去される場合、連続培養は固定細胞で実施してもよい。細胞固定は、天然および／または合成材料から構成される広い範囲の固体担体を用いて実施してよい。
【０１４７】
連続または半連続培養によって、細胞成長または最終生成物濃度に影響する一つの因子または任意の数の因子を調整することができる。例えば、一つの方法は、炭素源や窒素レベルのような限定された栄養素を固定レートで維持し、その他の全てのパラメータを加減するものである。他の系において、成長に影響する数多くの因子は、連続的に変えることができ、一方、媒体濁度により測定される細胞濃度は一定に保つ。連続系は、定常状態成長条件を維持しようとするため、流出した媒体のために細胞損失を、培養中の細胞成長速度に対してバランスを取らなければならない。連続培養プロセスについての栄養素および成長因子を調整する方法、および生成物形成の速度を最大にする技術は、工業微生物学の業界に周知であり、様々な方法が前出のＢｒｏｃｋに記載されている。
【０１４８】
本発明の発酵媒体は好適な炭素基質を含有していなければならない。好適な基質としては、グルコースやフルクトースのような単糖類、ラクトースやスクロースのようなオリゴ糖類、でんぷんやセルロースのような多糖類またはこれらの混合物、チーズホエー透過物、コーンスティープ液体、ビート糖みつおよび大麦モルトのような再復可能の供給原料からの未精製混合物が挙げられるがこれらに限られるものではない。さらに、炭素基質はまた、主要な生化学中間体への代謝性変換が示されている、二酸化炭素、メタンまたはメタノールのような１−炭素基質であってもよい。１つおよび２つの炭素基質に加えて、メチロトロフィック有機体はまた、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸のような化合物を含有する数多くのその他の炭素を利用することも知られている。例えば、メチロトロフィック酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、７ｔｈ（１９９３年）、４１５−３２．編者：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、様々な種のカンジダは、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０年））。従って、本発明に用いる炭素源は、様々な炭素含有基質を含んでいてもよく、有機体の選択によってのみ制限されるものと考えられる。
【０１４９】
組替え体発現−植物
植物や藻類もイソプレノイド化合物を生成することが知られている。本発明の核酸フラグメントを用いて、微生物タンパク質を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作成することができる。好ましい植物宿主は、高生産レベルの本発明のタンパク質を担持する様々なものである。好適な緑色植物としては、大豆、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，  Ｂ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、オート麦（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，  Ｌ）、モロコシ類（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アラビドプシス、アブラナ科野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ等）、メロン、人参、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、グレープ、草種穀物、シュガービート、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、亜麻、硬材木、軟材木および飼料牧草が挙げられるがこれらに限られるものではない。藻類種としては、ＳｐｉｒｕｌｉｎａおよびＤｕｎａｌｌｉｅｌａのような商業的に重要な宿主が挙げられるがこれらに限られるものではない。イソプレノイド化合物の過剰発現は、まず、コーディング領域が、発現の所望の段階で所望の組織において遺伝子の発現に係ることのできるプロモータと操作可能に結合している、本発明のキメラ遺伝子を構築することにより行われる。簡単にするために、キメラ遺伝子は、プロモータシークエンスと、同じ遺伝子から誘導された翻訳リーダーシークエンスを含んでいてもよい。転写終了信号をコードする３’非コードシークエンスもまた提供されなければならない。本発明のキメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を促すために１個以上のイントロンを含んでいてもよい。
【０１５０】
コーディング領域の発現を誘引することのできるプロモータおよびターミネータの組合わせをキメラ遺伝子シークエンスに用いてもよい。プロモータおよびターミネータの好適な例をいくつか挙げると、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）遺伝子がある。用いることのできる効果的な植物プロモータの一つの種類は高レベル植物プロモータである。遺伝子シークエンスまたは本発明と操作可能に結合するかかるプロモータは、本発明の遺伝子生成物の発現を促進することができなければならない。本発明に用いられる高レベルの植物プロモータとしては、例えば、大豆からのリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモータ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．  Ｇｅｎ．，１：４８３−４９８、１９８２年））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモータを含む。これらの２つのプロモータは、植物細胞に光誘引されることが知られている（例えば、植物の遺伝子エンジニアリング、農業的見地（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）、Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ、ＮＹ（１９８３年）、２９−３８頁、Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３年）およびＤｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３年）を参照のこと）。
【０１５１】
本発明のキメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するのに用いられる方法に応じて異なる。当業者であれば、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞の形質転換、選択および伝播を成功させるためにプラスミドベクトルに存在させなければならない遺伝子要素がよく分かっている。当業者であればまた、異なる独立した形質転換イベントの結果、異なるレベルおよびパターンの発現となり（Ｊｏｎｅｓら、（１９８５年）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら、（１９８９年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２１８：７８−８６）、所望の発現レベルおよびパターンを表すラインを得るために複数のイベントはスクリーニングされなければならないことも認識しているはずである。かかるスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析により実施してもよい（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３，（１９７５年））。ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）（１９９３年）１３３−１４５）、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析。
【０１５２】
ある用途については、本発明のタンパク質を異なる細胞区画に向けるのに有用である。このように、上述したキメラ遺伝子はさらに、コードシークエンスを変化させることにより補われて、通過シークエンス（Ｋｅｅｇｓｔｒａ、Ｋ．，Ｃｅｌｌ５６：２４７−２５３（１９８９年））、シグナルシークエンスまたは小胞体局在化（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３（１９９１年））、または既に存在し除去されたターゲットシークエンスを加えた、かつ／またはこれを備えた核局在化シグナル（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２（１９９２年））のような適正な細胞内ターゲットシークエンスで酵素をコードすることが予測される。引用した参考文献はこれらの夫々の例を与えるものであるが、リストは網羅的なものではなく、本発明に有用なターゲットシグナルの更なる効用は将来発見されるであろう。
【０１５３】
タンパク質エンジニアリング
本発明のヌクレオチドを用いて、向上した、または変化した活性を有する遺伝子生成物を生成することができるものと考えられる。これに限られるものではないが、誤りがちのＰＣＲをはじめとする、異なった、または向上した活性を備えた遺伝子生成物を生成する天然遺伝子シークエンスを変異させる様々な方法が知られている（Ｍｅｌｎｉｋｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９年２月１５日）、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．４、１０５６−１０６２頁）；部位局所突然変異誘発（Ｃｏｏｍｂｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８年）、２５９−３１１、１  ｐｌａｔｅ．編者：Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および「遺伝子シャフリング（ここに参考文献として組み込まれる米国特許第５，６０５，７９３号；同５，８１１，２３８号；同５，８３０，７２１号；および同５，８３７，４５８号）。
【０１５４】
遺伝子シャフリング法は、実施が容易であること、突然変異誘発の高レートおよびスクリーニングのし易さのため特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスには、当該の遺伝子と同一または相違する両方の追加の集団ＤＮＡ領域を存在させた、特定のサイズのフラグメントへの、当該の遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ分裂が含まれる。このフラグメントのプールを変性およびリアニールすると、変異遺伝子が作成される。活性を変えるために変異遺伝子をスクリーニングする。
【０１５５】
本発明の微生物シークエンスは、この方法により活性を変化または向上させるために変異およびスクリーニングさせてもよい。シークエンスは、二本鎖でなければならず、フォーム５０ｂｐ〜１０ｋｂにわたる様々な長さとすることができる。シークエンスは、業界に周知の制限エンドヌクレアーゼを用いて約１０ｂｐ〜１０００ｂｐにわたるフラグメントへと不規則に消化される（前出のＭａｎｉａｔｉｓ）。本発明の微生物シークエンスに加えて、微生物シークエンスの全てまたは一部へハイブリダイズされるフラグメント集団を添加してもよい。同様に、本発明のシークエンスへハイブリダイズされないフラグメントの集団を添加してもよい。一般に、これらの追加のフラグメント集団は、総核酸と比較して重量基準で約１０〜２０倍過剰で添加される。通常、このプロセスを続ける場合、混合物中の異なる特定の核酸フラグメントの数は約１００〜約１０００となる。不規則核酸フラグメントの混合集団は変性されて、一本鎖核酸フラグメントを形成して、リアニールされる。その他の一本鎖核酸フラグメントと相同の領域を有するこれらの一本鎖核酸フラグメントのみがリアニールする。不規則核酸フラグメントは加熱により変性してもよい。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を決めることができる。好ましくは温度は８０℃〜１００℃である。核酸フラグメントは冷却によりリアニールしてもよい。好ましくは温度は２０℃〜７５℃である。復元は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を添加することにより促進することができる。好適な塩濃度は０ｍＭ〜２００ｍＭである。アニールされた核酸フラグメントを、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を存在させてインキュベートする。核酸ポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼまたは業界に公知のその他のＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、アニーリング前、アニーリングと同時、またはアニーリング後に不規則核酸フラグメントに添加してよい。ポリメラーゼを存在させた変性、再変性およびインキュベーションのサイクルを所望の回数繰り返す。サイクルは好ましくは２〜５０回繰り返す、より好ましくはシークエンスは１０〜４０回繰り返す。得られた核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋｂの大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、スクリーニングして発現させ、標準クローニングおよび発現プロトコルにより活性を変化させてもよい（前出のＭａｎａｔｉｓ）。
【０１５６】
さらに、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を用いて機能的ドメインの溶融によりハイブリッドタンパク質を組み立てることができる（Ｎｉｘｏｎら、ＰＮＡＳ，９４：１０６９−１０７３（１９９７年））。本発明の遺伝子の機能的ドメインは、他の遺伝子の機能的ドメインと組合わせて、所望の触媒機能を備えた新規な酵素を作成することができる。ハイブリッド酵素は、ＰＣＲオーバーラップ伸張法を用いて構築し、当業者に周知の技術を用いて様々な発現ベクターにクローニングしてよい。
【０１５７】
遺伝子発現プロファリング
本発明の核酸フラグメントの全てまたは一部を、遺伝子発現をモニタリングし、遺伝子発現をプロファイリングするプローブとして用いてもよい。成長条件の変化、化学薬品への露出のような多くの外的変化によって、細胞中の遺伝子を誘導または抑制させることができる。遺伝子の誘導または抑制をスクリーニング系に用いて、生成有機体にとって最良の生成条件を決めることができる。一方、遺伝子の増幅または中断によって、大量の細胞生成物の生成および適時性をマニュピュレートすることができる。遺伝子は、発現および酸素による発現の制御についてモニターされる。所望の生成物または所望の収量を得るために、調節要素をノックアウトしたり、調節要素を過剰発現させることにより、これらの遺伝子を抑制解除または抑制除去するのが望ましい。
【０１５８】
例えば、本発明の核酸フラグメントの全てまたは一部をナイロン膜またはガラススライドに固定してもよい。ＩＩ世代ＤＮＡスポッタ（分子力学）は、ＤＮＡ試料をコートガラススライドに並べるための利用可能な技術の一つである。その他の配列法もまた利用可能であり、業界に周知である。細胞が様々な成長条件で成長した後または細胞を可能性のある候補により処理した後、細胞ＲＮＡを精製する。蛍光または放射性ラベリングされたターゲットｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ逆転写により作成することができる。ターゲット混合物をプローブに対してハイブリダイズして、業界に周知の条件を用いて洗う。ターゲット遺伝子発現の量は、放射線の強度または蛍光ラベルにより定量化する（例えば、共焦レーザー顕微鏡：分子力学）。固定プローブでの放射線または蛍光ラベルの強度は、業界に周知の技術を用いて測定される。２色の蛍光検出スキーム（例えば、Ｃｙ３とＣｙ５）は、独立した試料の即時および同時微分発現分析を可能とする点で、放射線ラベルターゲットより利点がある。さらに、比率測定を用いると、ＤＮＡ濃度およびハイブリダイゼーション効率によるプローブ間の強度偏差を補う。蛍光ラベリングの場合には、適正な励起およびエミッションフィルタにより得られた２つの蛍光画像が生データを構成し、ここから微分遺伝子発現比率の値が計算される。画像の強度は、業界に周知の利用可能なソフトウェア（例えば、Ａｒｒａｙ  Ｖｉｓｉｏｎ  ４．０：Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて分析され、正規化されて、ラベリングの微分効率およびラベル検出を補う。シグナルを正規化するには、業界に周知の多くの異なるやり方がある。シグナルを正規化する方法の一つは、内部制御に対してシグナルを収集することによるものである。他のやり方は、ラベリングされたゲノム駆動ＤＮＡにより分離アレイを実施し、ｍＲＮＡ駆動シグナルによりシグナルを比べるものである。この方法によってまた、転写存在度を測定することができる。個々の遺伝子の配列データを調査および評価して、試験条件下で遺伝子の誘導または抑制を決める。
【０１５９】
好ましい実施形態の説明
メチロモナス１６ａを含有する元の環境試料は池堆積物から得た。池堆積物は、空気中メタン２５％で、定義された鉱物媒体へ直接接種した。メタンは炭素およびエネルギーの単独の源として用いた。６６０ｎｍで光学密度が安定するまで成長を続けてから、培養は新たな媒体へ移され、１：１００の希釈が得られるようにした。メタンを単独の炭素およびエネルギー源とした、３回の連続した転写の後、培養を定義された最小媒体寒天培地へ置き、空気中メタン２５％でインキュベートした。
【０１６０】
本発明の遺伝子および遺伝子生成物の活性は、源菌株、メチロモナス１６ａにおけるカロテノイド生成物の増大を示す研究により確認された。イソプレノイド経路において早い遺伝子、ｄｘｒおよびｄｘｓを過剰発現することにより、カロテノイド生成における増大がメチロモナス１６ａ細胞において観察された。まとめると、遺伝子ｄｘｒおよびｄｘｓは、低コピー、広い宿主範囲のプラスミドｐＴＪＳ７５：：ｌａｃＺ：Ｔｎ５Ｋｎへクローニングすることによりメチロモナス１６ａにおいて過剰発現される（ＳｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒおよびＨｅｌｉｎｓｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１６４：４４６−４５５（１９８５年））。遺伝子を宿主プラスミドへクローニングする方法は業界に周知である。遺伝子はメチロモナス１６ａゲノムからＰＣＲを介して以下のプライマーにより増幅された。
【０１６１】
Ｄｘｓプライマー
Ｄｘｓ：正反応のためのプライマー：ａａｇｇａｔｃｃｇｃｇｔａｔｔｃｇｔａｃｔｃ（Ｂａｍ  ＨＩ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
【０１６２】
Ｄｘｓ：逆反応のためのプライマー：ｃｔｇｇａｔｃｃｇａｔｃｔａｇａａａｔａｇｇｃｔｃｇａｇｔｔｇｔｃｇｔｔｃａｇｇ（Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
【０１６３】
Ｄｘｒプライマー：
正反応：ａａｇｇａｔｃｃｔａｃｔｃｇａｇｃｔｇａｃａｔｃａｇｔｇｃｔ（Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
【０１６４】
逆反応：ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃａａｃｃａｇａａｔｃｇ（Ｘｂａ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
【０１６５】
遺伝子の天然プロモータが存在していたことを確実にするために、予測されたｄｘｓのＰＣＲ生成物は、出発コドンの３２３ｂｐシークエンス上流を含んでおり、予測されたｄｘｒのＰＣＲ生成物は、出発コドンの４２０ｂｐシークエンス上流を含んでいる。第１に、ｄｘｓ遺伝子をＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。これは、ｐＴＪＳ７５：：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎのｌａｃＺ遺伝子およびＴｎ５Ｋｎカセット間に位置していた。得られたプラスミドを、カナマイシンによりＬＢ上で成長するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体から単離した（５０μｇ／ｍＬ）。Ｋｎ−耐性遺伝子の方向に挿入物を含むプラスミド（制限分析により確認）を更なるクローニングのために選んだ。ｄｘｒ遺伝子をｄｘｓとＴｎ５Ｋｎカセット間で、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ部位を用いてクローニングした。得られたプラスミドを図３ｂに示す。プラスミドを、業界に周知のエレクトロポレーション法を用いてＥ．ｃｏｌｉへ形質転換した。ｄｘｓおよびｄｘｒがプラスミド中に存在することは、制限分析およびシークエンスにより確認した。
【０１６６】
業界に周知の３点接合法によりプラスミドｐＴＪＳ７５：：ｄｘｓ：ｄｘｒ：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎはＥ．ｃｏｌｉからメチロモナス１６ａに転写された（Ｒａｉｎｅｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７年）、２５６（１）、８４−８７）。菌株メチロモナス１６ａの自生リファンピン（Ｒｉｆ）耐性体を、受容体として用いて、交配後のＥ．ｃｏｌｉを含有するメタノトロフの単離を加速した。ｐＴＪＳ７５：：ｄｘｓ：ｄｘｒ：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎプラスミドにあるＥ．ｃｏｌｉは供与体であり、プラスミドｐＲＫ２０１３にあるＥ．ｃｏｌｉはヘルパーとして作用した（ＦｉｇｕｒｓｋｉおよびＨｅｌｉｎｓｋｉ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１６４８−１６５２（１９７９））。６個の別個に単離されたカナマイシン耐性メチロモナス１６ａトランス接合体を単離し、カロテノイド含量の判断に用いた。プラスミドのない野生型の菌株およびＲｉｆ耐性誘導体を負の制御として用いた。６個のトランス接合体のカロテノイド濃度を試験した。抽出中、上澄み液にピンク色の着色が観察された。細胞様カロテノイドを分光光度分析した。負の制御とトランス接合の間のスペクトルに量的な差は認められなかった。４つの負の制御の間に量的な差はなかった。６つのトランス接合の間に量的な差はなかった。トランス接合は、負の制御と比較すると、カロテノイド濃度が約２８％増大している（表３）。トランス接合中のｄｘｒおよびｄｘｓ遺伝子過剰生成が、トランス接合のカロテノイド生成の増大の原因と考えられる。メチロモナス細胞に生成されたカロテノイドは、ケン化抽出物のＨＰＣＬ分析に見られるような参照菌株メチロバクテリアロジナムの構造と同様であった。
【０１６７】
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、例証のためのみのものと考えられる。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神や範囲から逸脱することなしに、本発明の様々な変更や修正を行って、様々な用途および条件に適合させることができる。
【０１６８】
一般的方法
実施例で用いた標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業界に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．ＢｅｎｎａｎおよびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ刊（１９８７年）に記載されている。
【０１６９】
バクテリア培養の維持および成長に好適な材料および方法は当業界に周知である。以下の実施例において用いるのに好適な技術としては、一般細菌学法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、米国微生物協会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４年））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ（１９８９年）に規定されているものがある。バクテリア細胞の成長および維持に用いる試薬、制限酵素および材料は全て、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。
【０１７０】
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）より入手可能なプログラム一式を用いて遺伝子シークエンスのマニピュレーションを実施した。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」を用いた場合は、ギャップ作成デフォルト値１２およびギャップ伸張デフォルト値４を用いた。ＣＧＣ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを用いた場合は、デフォルトギャップ作成ペナルティ５０およびデフォルトギャップ伸張ペナルティ３を用いた。スミス・ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラムを用いて複数のアラインメントを作成した（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日時１９９２年、１１１−２０．編者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ））。いずれにしてもプログラムパラメータがこれらまたはその他のプログラムにおいて指示を出さなければ、デフォルト値を用いた。
【０１７１】
略称の意味は次の通りである。「ｈ」は時間、「ｍｉｎ」は分、「ｓｅｃ」は秒、「ｄ」は日、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットルである。
【０１７２】
実施例１
メチロモナス１６ａの単離
単離物を含有する元の環境試料は池堆積物から得た。池堆積物は、空気中メタン２５％で、窒素源としてアンモニウムを含む成長媒体へ直接接種した。メタンが炭素およびエネルギーの単独の源であった。６６０ｎｍで光学密度が安定するまで成長を続けてから、培養は新たな媒体へ移され、１：１００の希釈が得られるようにした。メタンを単独の炭素およびエネルギー源とした、３回の連続した転写の後、培養を窒素源としてアンモニウムを含む成長寒天培地へ置き、空気中メタン２５％でインキュベートした。多くのメタロトロフィックバクテリア種がこのやり方で単離された。しかしながら、コロニーの成長が早く、コロニーサイズが大きく、最小の媒体上で成長する能力があり、ピンク色の着色がカロテノイドの活性生合成経路を示すことから、メチロモナス１６ａを調べる有機体として選択した。
【０１７３】
実施例２
シークエンシングおよびシークエンス生成のためのゲノムＤＮＡの作成
ゲノムＤＮＡを、標準プロトコルに従ってメチロモナスから単離した。
【０１７４】
ゲノムＤＮＡおよびライブラリー構造を、出版されているプロトコルに従って作成した（Ｆｒｉｓｅｕｒら、マイコプラズマゲンチアリウムの最小遺伝子相補物（Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、１９９５年）。細胞ペレットを１００ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する溶液中で再懸濁させた。
【０１７５】
ゲノムＤＮＡ作成。再懸濁後、細胞を１０％ＳＤＳ中で穏やかに溶解して、３０分間５５℃でインキュベートした。室温でのインキュベーション後、プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍＬまで加え、３７℃で懸濁液が透明になるまでインキュベートした。ＤＮＡを、トリス−平衡フェノールで２回およびクロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡを７０％エタノールで沈殿させ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）ｐＨ７．５を含有する溶液中で再懸濁した。ＤＮＡ溶液をＲＮＡａｓｅの混合物で処理し、トリス平衡フェノールで２回およびクロロホルム２回で抽出した。これに続いて、エタノール中で沈殿し、ＴＥ中で再懸濁させた。
【０１７６】
ライブラリー構造。２００〜５００μｇの染色体ＤＮＡを３００ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡおよび３０％のグリセロールの溶液中で再懸濁し、Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒチャンバー（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）中で、１２ｐｓｉで６０秒剪断した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁させ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理した。サイズ分別後、フラクション（２．０ｋｂまたは５．０ｋｂ）を励起させ、清浄にし、２工程連結反応手順を用いて９９％を超える単一挿入部を備えた高力価ライブラリーを生成した。
【０１７７】
シークエンシング。ショットガンシークエンシングストラテジーアプローチを、総微生物ゲノムのシークエンシングに採用した（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ、Ｒｏｂｅｒｔら、総ゲノム不規則シークエンスおよびインフルエンザ菌の組立、Ｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１９９５年）。
【０１７８】
シークエンスを、ベクターと挿入特異的なプライマーの組合わせを用いて、染色ターミネータ技術（米国特許第５３６６８６０号；ＥＰ２７２００７）を用いてＡＢＩ自動シーケンサ上に生成した。シークエンスエディティングをＤＮＡＳｔａｒ（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）またはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧプログラム（ウィスコンシンパッケージバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＣＯＮＳＥＤパッケージ（バージョン７．０）のいずれかで実施した。全シークエンスは、両方向について少なくとも２回カバレージを表す。
【０１７９】
実施例３
バクテリアＯＲＦの同定および特定
ＯＲＦコード１−９を、まず、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質シークエンスデータベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースから誘導された、全非固定（ｎｒ）ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、シークエンスを含む）に含まれるシークエンスとの類似性を求めて、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）を実施することにより同定した。実施例２で得られたシークエンスの、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて「ｎｒ」データベースに含まれる公に利用可能な全ＤＮＡシークエンスとの類似性について分析した。ＤＮＡシークエンスを全読み枠において翻訳し、ＮＣＢＩにより提供されたＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）（１９９７年）を用いて「ｎｒ」データベースに含まれる公に利用可能な全タンパク質シークエンスとの類似性について比較した。
【０１８０】
全ての初期の比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＰｎｒアルゴリズムのいずれかを用いて行った。正確な類似性は、デフォルトパラメータ設定（ＢＬＯＳＵＭ５０スコアリングマトリックス、ワードサイズｋｔｕｐ＝２、第１の残基についてのギャップペナルティ＝−１２、ギャップにおける各追加の残基については−２）のＦＡＳＴＡ（バーション３．２）を用いて求めた。ＦＡＳＴＡ比較の結果を表１に示す。最も類似性を有するシークエンスをまとめてある。表１に、ＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいたデータを示す。値は期待値である。期待値は、マッチの統計上の重要性を見積もるものであり、絶対的に偶然のこのサイズのデータベースのサーチに見込まれる、与えられたスコアでマッチの数を指定する。
【０１８１】
ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦおよびｐｙｒＧの遺伝子クラスタ、および遺伝子ｃｒｔＮ１およびｃｒｔＮ２の他の遺伝子クラスタを図２に示す。
【０１８２】
【表２】
2005500804.tif 000003
【０１８３】
【表３】
2005500804.tif 000004
【０１８４】
実施例４
ｄｘｓおよびｄｘｒ遺伝子のアップレギュレーション
クローニングについては、低コピー、広い宿主範囲のプラスミドｐＴＪＳ７５：：ｌａｃＺ：Ｔｎ５Ｋｎを用いた（ＳｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒおよびＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１６４：４４６−４５５（１９８５年））。遺伝子ｄｘｓおよびｄｘｒはメチロモナス１６ａゲノムからＰＣＲを用いて以下のプライマーにより増幅された。
【０１８５】
Ｄｘｓプライマー：
正反応：ａａｇｇａｔｃｃｇｃｇｔａｔｔｃｇｔａｃｔｃ（Ｂａｍ  ＨＩ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
【０１８６】
逆反応：ｃｔｇｇａｔｃｃｇａｔｃｔａｇａａａｔａｇｇｃｔｃｇａｇｔｔｇｔｃｇｔｔｃａｇｇ（Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
【０１８７】
Ｄｘｒプライマー：
正反応：ａａｇｇａｔｃｃｔａｃｔｃｇａｇｃｔｇａｃａｔｃａｇｔｇｃｔ（Ｂａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
【０１８８】
逆反応：ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃａａｃｃａｇａａｔｃｇ（Ｘｂａ  Ｉ部位を含有している：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
【０１８９】
遺伝子の天然プロモータが存在していたことを確実にするために、予測されたｄｘｓおよびｄｘｒ遺伝子の予測されたＰＣＲ生成物は、それぞれ各遺伝子の出発コドンの上流、３２３ｂｐおよび４２０ｂｐのシークエンスを含んでいた。
【０１９０】
【表４】
2005500804.tif 000005
【０１９１】
【表５】
2005500804.tif 000006
【０１９２】
ｄｘｓおよびｄｘｒをｐＴＪＳ７５：：ｌａｃＺ：Ｔｎ５Ｋｎ：へクローニングするために、標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９年）を用いた。
【０１９３】
ＤＮＡの単離、濃度および精製については、Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いた。クローニングのための酵素はＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）またはＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より購入した。プラスミドをＥ．ｃｏｌｉに転写するために、標準設定のＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、キュベット（０．２ｃｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩＩ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）をエレクトロポレーションに用いた。
【０１９４】
【表６】
2005500804.tif 000007
【０１９５】
【表７】
2005500804.tif 000008
【０１９６】
第１に、ｄｘｓをＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。これは、ｐＴＪＳ７５：：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎのｌａｃＺ遺伝子およびＴｎ５Ｋｎカセット間に位置していた。得られたプラスミドを、ＬＢ＋カナマイシン（Ｋｎ、５０μｇ／ｍＬ）上で成長するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体から単離した。Ｋｎ−耐性遺伝子の方向に挿入物を含むプラスミド（制限分析により確認）を更なるクローニングのために選んだ。ｄｘｒ遺伝子をｄｘｓとＴｎ５Ｋｎカセット間で、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ部位を用いてクローニングした。予測されたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ形質転換体から単離した。ｄｘｓおよびｄｘｒがプラスミド中に存在することは、制限分析およびシークエンシングにより確認した。得られたプラスミド、ｐＴＪＳ７５：：ｄｘｓ：ｄｘｒ：ｌａｃＺ：Ｔｎ５Ｋｎを図３ｂに示す。
【０１９７】
１６ａトランス接合体
業界に周知の３点接合法によりプラスミドｐＴＪＳ７５：：ｄｘｓ：ｄｘｒ：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎはＥ．ｃｏｌｉからメチロモナス１６ａに転写された（Ｒａｉｎｅｙら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７年）、２５６（１）、８４−８７）。
【０１９８】
菌株メチロモナス１６ａの自生リファンピン（Ｒｉｆ）耐性体を、受容体として用いて、交配後、汚染するＥ．ｃｏｌｉからのメタノトロフの単離を加速した。ｐＴＪＳ７５：：ｄｘｓ：ｄｘｒ：ｌａｃＺ：Ｔｎ５ＫｎプラスミドにあるＥ．ｃｏｌｉは供与体であり、プラスミドｐＲＫ２０１３（ＦｉｇｕｒｓｋｉおよびＨｅｌｉｎｓｋｉ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：１６４８−１６５２（１９７９））にあるＥ．ｃｏｌｉはヘルパーとして作用した。プレート上の凡その比較細胞濃度は受容体：供与体：ヘルパー＝２：１：１であった。
【０１９９】
対応のＬＢプレートをメタン（２５％）中３０℃で一晩インキュベートした。次に、交配混合物をプレートから擦り落とし、ＢＴＺ媒体１ｍＬ中で再懸濁させ（表２）、Ｒｉｆ（２５μｇ／ｍＬ）およびＫｎ（５０μｇ／ｍＬ）を補給したＢＴＺプレートに置いた。プレートをメタン（２５％）中で７日間３０℃でインキュベートして、メチロモナス１６ａトランス接合体について選択した。現れたコロニーを取り、更なる精製のために新たな選択プレートに移した。６個の別個に単離されたカナマイシン耐性メチロモナス１６ａトランス接合体をカロテノイド含量の判断に用いた。
【０２００】
カロテノイドの判断については、６個の１００ｍＬのトランス接合体の培養（ＢＴＺ＋５０μｇ／ｍＬ  Ｋｎ）をメタン（２５％）中で週末にわたって固定成長期で成長させた。２つの培養、野生型菌株およびプラスミドのないそのＲｉｆ耐性誘導体の各々は、異なるカロテノイド含量がこれらの菌株にあるかどうか判断し、カロテノイド判断の標準偏差を得るためのコントロールとして機能した。細胞を回し、蒸留水で洗浄し、乾燥重量を求めるために２４時間にわたってフリーズドライした（凍結乾燥機：Ｖｉｒｔｉｓ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）。各培養の乾燥重量を求めた後、細胞を抽出した。まず、細胞を０．４ｍＬの水に浸し、１５分間静置させた。１５分後、４ｍＬのアセトンを加え、完全に攪拌し、試料を均一にした。試料を３０℃で１時間振とうした。１時間後、細胞を遠心分離した。上澄み液にピンク色の着色が観察された。上澄み液を集め、ペレットを０．３ｍＬの水および３ｍＬのアセトンで再び抽出した。第２の抽出液からの上澄み液は明るいピンク色であった。両抽出物の上澄み液を併せ、容積を測定し、分光分析した。負の制御とトランス接合の試料間のスペクトルに量的な差は認められなかった。アセトン抽出物において、以下の観察結果が主に分光光度計により測定された（肩４６０ｎｍ、最大４９１および５２２ｎｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。カロテノイド含量の計算については、４９１ｎｍでの吸収が読み取られ、バクテリオルベリンのモル吸光係数（１８８，０００）およびＭＷ５５２を用いた。カロテノイド（５５２ｇ／モル）のＭＷを、精製試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳにより求めた（シリカ／Ｍｇ吸着の後、シリカカラムクロマトグラフィー、参考文献：Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｇ．，Ｌｉａａｅｎ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｓ．，Ｐｆａｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  Ｖｏｌ．１ａ；単離と分析（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９５年））。
【０２０１】
メチロモナス１６ａ細胞からの粗アセトン抽出物は、一般的な吸収スペクトルを有している（４６０ｎｍで屈折、４９１ｎｍおよび５２２ｎｍで最大）。アセトン抽出物のＨＰＬＣ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ；条件：１２５ｘ４ｍｍ  ＲＰ８（５μｍ粒子）カラム）、対応のガードカラム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ）を備えている、フロー１ｍＬ／分、溶剤プログラム：０−１０分１５％水／８５％メタノールの後１００％メタノール）によれば、上述の吸収スペクトルを有するある主要なカロテノイド（約６ｍＬでの正味の保持容積）が、野生型およびトランス接合メチロモナス１６ａ細胞をピンクに着色させるということが確認された。抽出物中に４９１ｎｍで吸収されるものは何もないため、カロテノイド含量は、分光光度計によりアセトン中で抽出物を直接測定できた（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【０２０２】
バクテリオルベリンのモル吸光係数（１８８，０００）を量の計算に用いた。
【０２０３】
以下の式（ランベルト・ベールの法則）を用いてカロテノイドの量を求めた。
Ｃａ＝Ａ４９１ｎｍ／（ｄｘｅｘｖｘＭＷ）
Ｃａ：カロテノイド量（ｇ）
Ａ４９１ｎｍ：４９１ｎｍでのアセトン抽出物の吸収（−）
ｄ：キュベット中のライトパス（１ｃｍ）
ｅ：モル吸光係数（Ｌ／（モル×ｃｍ））
ＭＷ：分子量（ｇ／ｍｏｌ）
ｖ：抽出物の容積（Ｌ）
【０２０４】
カロテノイド含量を得るために、計算されたカロテノイド量は、対応の細胞乾燥重量で割らなければならない。
【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
４つの負の制御の間に大きな差はなかった。同様に、６つのトランス接合の間に大きな差はなかった。しかしながら、負の制御中の平均カロテノイド生成に比べて、平均のカロテノイド生成に約２８％の増大がトランス接合に観察された（表３）。
【０２０７】
構造を確認するために、Ｃ３０−カロテノイドが同定されたメチロバクテリウムロジナム（以前のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ：ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４８２１）を参照菌株として用いた（Ｋｌｅｉｎｉｇら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３４ｃ，１８１−１８５（１９７９年）、ＫｌｅｉｎｉｇおよびＳｃｈｍｉｔｔ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３７ｃ，７５８−７６０（１９８２年））。メチロバクテリウムロジナムおよびメチロモナス１６ａのケン化抽出物を、上述したのと同じ条件下でＨＰＬＣ分析により比べた。結果は次の通りである。
【０２０８】
ケン化Ｍ．ロジナム：４６０ｎｍで屈折、４８７ｎｍおよび５１７ｎｍで最大  正味保持容積＝１．９ｍＬ
ケン化メチロモナス１６ａ：４６０ｎｍで屈折、４８８ｎｍおよび５１８ｎｍで最大
正味保持容積＝２．０ｍＬ
【図面の簡単な説明】
【図１】イソプレノイド経路。
【図２】イソプレノイド経路における遺伝子を含有する２つの遺伝子クラスタ。一方のクラスタはｉｓｐＤ、ｉｓｐＦおよびｐｙｒＧ遺伝子を含有しており、他方のクラスタはｃｒｔＮ１およびｃｒｔＮ２遺伝子を含有している。
【図３ａ】カロテノイド生合成に影響する遺伝子。メチロモナス１６ａの天然菌株の２つの培養物１６ａおよび２つの天然菌株のｒｉｆ−耐性変異体１６ａ−ｒｉｆ（プラスミドなし）は天然対照例として用いた。６個の単離トランス接合体はＤＸＰ−１〜ＤＰＸ−６とした。
【図３ｂ】ｄｘｓおよびｄｘｒ遺伝子を含有するプラスミド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500804.tif 000097
【国際調査報告】
2005500804.tif 000098
2005500804.tif 000099
2005500804.tif 000100
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