(57)【要約】  本明細書中で開示される発明は、様々なヒト癌に存在する、抗原ＣＤ４６（膜補因子タンパク質としても知られる）に対する抗体に関連する。よって、１つの局面において、本発明は、本明細書中以下で「Ａｇ−ＰＡ７」またはＣＤ４６として知られる抗原に選択的に結合する抗体またはポリペプチド（それは抗体であり得る、またはそうでないかもしれない）であり、ここでＣＤ４６は４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（すなわち変性勾配）ゲルにおいて、約５５ｋＤａ＋／−１０％である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体ｍＰＡ７が優先的に結合するのと同じＣＤ４６上のエピトープに優先的に結合する、抗体。
【請求項２】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫により産生される抗体ｍＰＡ７。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体ｍＰＡ７の軽鎖および重鎖の可変領域由来の可変領域、ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖の定常領域由来の定常領域を含む、キメラ抗体。
【請求項４】
請求項２に記載の抗体ｍＰＡ７のヒト化抗体。
【請求項５】
前記抗体が、治療剤に連結される、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、治療剤に連結される、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、治療剤に連結される、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
宿主細胞株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６）またはその子孫。
【請求項９】
ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫により産生される抗体ｍＰＡ７、または該抗体ｍＰＡ７が優先的に結合するのと同じＣＤ４６上のエピトープに優先的に結合する抗体によって結合されるＣＤ４６の複合体。
【請求項１０】
前記ＣＤ４６が、癌細胞上にある、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記癌細胞が、乳房である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記癌細胞が、結腸である。請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
前記癌細胞が、肺である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１４】
前記癌細胞が、卵巣である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１５】
前記癌細胞が、膵臓である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１６】
前記癌細胞が、前立腺である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１７】
前記癌細胞が、腎臓である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１８】
前記抗体ｍＰＡ７または、該抗体ｍＰＡ７が優先的に結合するのと同じＣＤ４６上のエピトープに優先的に結合する抗体が、治療剤に結合される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１９】
請求項１に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項３に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項４に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項６に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項７に記載の抗体および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１、３および４のいずれか１項に記載の抗体を含有する、癌細胞を検出するためのキット。
【請求項２６】
請求項１、３および４のいずれか１項に記載の抗体を含有する、癌細胞の増殖を阻害するためのキット。
【請求項２７】
前記抗体が、治療剤に結合されている、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
請求項１に記載の抗体を作製する方法であって、請求項１に記載の抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現する工程、および該抗体を精製する工程、を包含する、方法。
【請求項２９】
個体における癌細胞の存在および非存在を検出する方法であって、該個体由来の細胞と、請求項１、２、３および４のいずれか１項に記載の抗体を接触させる工程、および該癌細胞由来のＣＤ３６と該抗体との複合体を、存在する場合に、検出する工程、を包含する、方法。
【請求項３０】
検出される前記癌細胞が、乳房である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
検出される前記癌細胞が、結腸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
検出される前記癌細胞が、肺である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
検出される前記癌細胞が、卵巣である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
検出される前記癌細胞が、膵臓である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
検出される前記癌細胞が、前立腺である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
検出される前記癌細胞が、腎臓である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
個体における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該個体に、有効量の請求項１９、２０または２１のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項３８】
前記抗体が、治療剤に結合される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌細胞が、前立腺である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
個体において、治療剤を癌細胞に送達する方法であって、該個体に、有効量の請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項４１】
個体において、治療剤を癌細胞中に送達する方法であって、該個体に、有効量の請求項２２、２３または２４のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項４２】
前記癌細胞が、前立腺である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌細胞が、卵巣である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌細胞が、乳房である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌細胞が、結腸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療剤が、サポリンである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００１年１０月１６日に出願された、米国仮出願番号６０／３２９，６４４号の利益を主張する。この出願は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、癌生物学および免疫療法の分野である。より具体的には、本発明は様々なヒト癌に存在する、ＣＤ４６（膜補因子タンパク質）に結合する抗体の発見、およびそのような癌を診断および／または治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫療法、または治療目的のための抗体の使用が、近年癌を治療するために使用されている。受動免疫療法は、癌治療におけるモノクローナル抗体の使用を含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第６版（２００１）第２０章４９５−５０８頁を参照のこと。これらの抗体は、腫瘍細胞の成長または生存の直接的阻害、および身体の免疫系のナチュラル細胞破壊活性を動員する能力の両方による、内在する治療的生物学的活性を有し得る。これらの薬剤を、単独で、または照射または化学療法剤と組み合せて施し得る。リンパ腫および乳癌の治療のために認可された、それぞれ、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、このような療法の２つの例である。あるいは、抗体を使用して抗体結合体を作成し得、ここで抗体は毒性薬剤に連結され、そして腫瘍へ特異的に結合することによってその薬剤を腫瘍へ向ける。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）は、白血病の治療のために使用される、認可された抗体結合物の例である。癌細胞に結合し、そして診断および治療への潜在的な用途を有するモノクローナル抗体が、刊行物に開示されている。例えば、特に標的タンパク質の分子量を開示する、以下の特許出願を参照のこと：米国特許第６，０５４，５６１号（２００ＫＤ  ｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２）、および大きさが４０−２００ＫＤの他の未知抗原）および米国特許第５，６５６，４４４号（５０ＫＤおよび５５ＫＤ、腫瘍胎児性タンパク質）。臨床試験中および／または固形腫瘍の治療に認可された抗体の例としては、以下が挙げられる：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗原：１８０ｋＤ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（抗原：４０−５０ｋＤ、Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＨＭＦＧ１（抗原＞２００ｋＤ、ＨＭＷムチン）、Ｃ２２５（抗原：１５０ｋＤおよび１７０ｋＤ、ＥＧＦ受容体）、Ｃａｍｐａｔｈ（抗原：２１−２８ｋＤ、ＣＤ５２）、およびＲｉｔｕｘａｎ（抗原：３５ｋＤ、ＣＤ２０）。
【０００４】
別の型の免疫療法は、能動免疫療法、またはワクチン接種であり、ここで特定の癌に存在する抗原が、患者において免疫応答を引き起こす、すなわち患者がそれ自身の癌に対する抗体を活発に産生するよう誘導する。能動免疫は、受動免疫療法または免疫毒素ほど多くは使用されていない。
【０００５】
理想的な診断的および／または治療的抗体は、多数の癌に存在するが、あらゆる成人組織に存在しないか、または低レベルでのみ存在する抗原に特異的である。癌と特異的に関連する新規抗原の発見、特徴付け、および単離は、多くの方法で有用である。まず、抗原を使用して、その抗原に対するモノクローナル抗体を作製し得る。抗体は、理想的には癌細胞に対する生物学的活性を有し、そして外来性抗原に対する免疫系の反応を動員し得る。抗体を、治療薬として単独で、または現在の治療と組み合せて投与し得るか、または毒性薬剤と連結した免疫結合体を調製するために使用し得る。単独で投与した場合に同じ特異性を有するが生物学的活性を有さない抗体も、放射性同位体、毒素、または化学療法剤または化学療法剤を含むリポソームとの免疫結合物を調製するために使用し得て有用であり、結合した形式は、抗体が毒素を、抗原を含む細胞へ向けることによって生物学的に活性である。
【０００６】
理想的な診断的および／または治療的抗体に必要な１つの局面は、様々な癌に関連する抗原の発見および特徴付けである。非癌細胞に限られた発現を有し、多くの型の癌に発現する（例えば「汎癌（ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ）」抗原）抗原は、少数しか存在しない。そのような抗原の単離および精製は、抗原を標的化する抗体（例えば診断的または治療的）の作成に有用である。１つの特定の型の癌にのみ関連する抗原に対する抗体と対照的に、「汎癌（ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ）」抗原に結合する抗体は、異なる組織において見出される様々な癌を標的化し得る。その抗原は、薬剤の発見（例えば低分子）、ならびに細胞調節、成長、および分化のさらなる特徴付けのためにも有用である。
【０００７】
ＣＤ４６（膜補因子タンパク質またはＭＣＰとしても知られる）に対する抗体が報告されている。例えば、Ｓｐａｒｒｏｗら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１（１９８３）；Ｈｓｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：２１（１９８８）；Ｃｈｏら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：２５７（１９９１）；Ｓｅｙａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：２３８（１９９０）を参照のこと。ＣＤ４６の発現は、乳癌（Ｔｈｏｒｓｅｉｎｓｓｏｎら、ＡＰＭＩＳ  １０６：８６９−７８（１９９８）；Ｈｏｆｍａｎら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３２：２１３−９（１９９４））；結腸／結腸直腸癌（Ａｎｄｒｅｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：５２２５−３０（１９９０）；Ｋｏｒｅｔｚら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８：９２６−３１（１９９３）；Ｊｕｈｌら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２−３０（１９９７）；Ｂｊｏｒｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４２：１８５−９２（１９９６））；肺癌（Ｖａｒｓａｎｏら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：１７３−８２（１９９８）；Ｖａｒｓａｎｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：５２２−９（１９９８））；卵巣癌（Ｂｊｏｒｇｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：１４−２５（１９９７））；腎臓癌（Ｂｌｏｋら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８０：３３５−４４（２０００）；Ｇｏｒｔｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：１０３９−４９（１９９６））；膵臓癌（Ｊｕｈｌら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２−３０（１９９７））；および前立腺癌（Ｊａｒｖｉｓら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９９（Ｎｏ．１、Ｐａｒｔ２）：Ｓ２１５（１９９７）；Ｌｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３４２９−３４３４（２０００））のような、特定の型の癌で報告されている。ＰＣＴ  ＷＯ０２／１８９４８；ＰＣＴ  ＷＯ０１／８８５３７も参照のこと。
【０００８】
本明細書中で開示される全ての参考文献、刊行物、および特許出願は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（本発明の要旨）
本明細書中で開示される発明は、様々なヒト癌に存在する、抗原ＣＤ４６（膜補因子タンパク質としても知られる）に対する抗体に関連する。よって、１つの局面において、本発明は、本明細書中以下で「Ａｇ−ＰＡ７」またはＣＤ４６として知られる抗原に選択的に結合する抗体またはポリペプチド（それは抗体であり得る、またはそうでないかもしれない）であり、ここでＣＤ４６は４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（すなわち変性勾配）ゲルにおいて、約５５ｋＤａ＋／−１０％である。
【００１０】
別の局面において、本発明は、宿主細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６）によって産生される抗体ｍＰＡ７である。ｍＰＡ７が結合するＣＤ４６上のエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ｍＰＡ７が選択的に結合するのと同じ、ＣＤ４６上のエピトープに選択的に結合する抗体またはポリペプチド（それは抗体であり得る、またはそうでないかもしれない）である。その抗体またはポリペプチドが結合するＣＤ４６上のエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７の断片または領域を含む抗体である。１つの実施態様において、その断片は抗体ｍＰＡ７の軽鎖である。別の実施態様において、その断片は抗体ｍＰＡ７の重鎖である。さらに別の実施態様において、その断片は抗体ｍＰＡ７の軽鎖および／または重鎖由来の、１つまたはそれ以上の可変領域を含む。さらに別の実施態様において、その断片は抗体ｍＰＡ７の軽鎖および／または重鎖由来の、１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１３】
別の局面において、本発明は以下のもののいずれかを含むポリペプチド（それは抗体であり得る、またはそうでないかもしれない）を提供する：抗体ｍＰＡ７の、ａ）１つまたはそれ以上のＣＤＲ；ｂ）軽鎖由来の３つのＣＤＲ；ｃ）重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｄ）軽鎖由来の３つのＣＤＲおよび重鎖由来の３つのＣＤＲ；ｅ）軽鎖可変領域；ｆ）重鎖可変領域。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ｍＰＡ７由来のヒト化抗体である。ある実施態様において、ヒト化抗体は、抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上のＣＤＲを含む。別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７と同じエピトープに結合するヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体が結合するエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。一般的に、本発明のヒト化抗体は、抗体ｍＰＡ７のＣＤＲと同じおよび／またはそれ由来の、１つまたはそれ以上の（１、２、３、４、５、６）ＣＤＲを含む。別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７と同じＣＤ４６上のエピトープに結合するヒト抗体を提供する。ヒト抗体が結合するエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。
【００１５】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７の重鎖および軽鎖の可変領域由来の可変領域、およびヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域由来の定常領域を含む、キメラ抗体である。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、モノクローナル抗体ｍＰＡ７を産生する宿主細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６）またはその子孫である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＰＡ７をコードする単離ポリヌクレオチドである。別の局面において、本発明は、任意の抗体（抗体断片を含む）および本明細書中で記載した任意の他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載した任意の抗体またはポリペプチドと結合した、ＣＤ４６の複合体である。ある実施態様において、ＣＤ４６は、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌細胞に存在する。１つの実施態様において、本発明は、本明細書中で記載した任意の抗体またはポリペプチドと結合した、前立腺癌細胞上のＣＤ４６の複合体である。ある実施態様において、本発明は、抗体ｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合する抗体と結合した、ＣＤ４６の複合体である。このエピトープはジスルフィド結合依存性である。１つの実施態様において、抗体ｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合する任意の抗体が、治療薬（毒素のような）に連結される。
【００１９】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載した任意の抗体またはポリペプチドと結合した、ＣＤ４６を発現する癌細胞の複合体である。ある実施態様において、癌細胞は、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌細胞である。ある実施態様において、抗体はｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合する任意の抗体である。このエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。ある実施態様において、抗体ｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合する任意の抗体が、治療薬（毒素のような）に連結する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、本明細書中で任意の記載した抗体またはポリペプチドと結合した、ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープの複合体である。ある実施態様において、そのエピトープは、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌細胞上にある。ある実施態様において、その抗体は、ｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合する任意の抗体である。このエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。ある実施態様において、抗体ｍＰＡ７または抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合するあらゆる抗体を、治療薬（毒素のような）に連結する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載したポリペプチド（抗体ｍＰＡ７のようなあらゆる抗体を含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬品組成物である（例えば、抗体ｍＰＡ７、治療薬と連結した抗体ｍＰＡ７、抗体ｍＰＡ７の断片を含む抗体、抗体ｍＰＡ７のヒト化抗体、抗体ｍＰＡ７の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の性質を有するヒト抗体、および薬剤学的に許容できる賦形剤を含む医薬品組成物）。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、非癌細胞よりも癌細胞により高い親和性を有するモノクローナル抗体を産生する方法である：（ａ）インタクトなヒト胎児膵臓上皮前駆（ｈＰＥＤ）細胞で宿主哺乳類を免疫する；（ｂ）その哺乳類からリンパ球を得る；（ｃ）リンパ球を骨髄腫細胞系統と融合してハイブリドーマを産生する；（ｄ）モノクローナル抗体を産生するのに十分な条件下でハイブリドーマを培養する；（ｅ）ｈＰＥＤ細胞に選択的に結合する抗体を選択する；（ｆ）工程（ｅ）で得られた抗体から、非癌細胞よりも癌細胞に高い親和性で結合する抗体を選択する。その方法は、癌細胞または癌細胞系統に結合するが、非癌細胞または細胞系統に結合しない抗体を選択する工程をさらに含み得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、宿主細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６）またはその子孫を、抗体ｍＰＡ７の産生を可能にする条件下で培養すること、および抗体ｍＰＡ７を精製することを含む、抗体ｍＰＡ７を産生する方法である。
【００２４】
別の局面において、本発明は、適当な細胞において抗体をコードする（１本の軽鎖または重鎖として別々に発現し得るか、または軽鎖および重鎖の両方を１つのベクターから発現する）１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを発現することによって、一般的には続いて関心のある抗体またはポリペプチドを回収および／または単離することによって、本明細書中で記載した任意の抗体（またはポリペプチド）を産生する方法を提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載した抗体ｍＰＡ７または任意のＣＤ４６結合部分（様々な抗体および抗体誘導体を含むがこれに限らないポリペプチド）を用いて、個体由来の細胞上にＣＤ４６を検出することによって、個体において癌を診断する方法である。ある実施態様において、癌は、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、および腎臓癌である。ある実施態様において、その方法は細胞由来のＣＤ４６のレベルを検出することである。ＣＤ４６の存在は、ＣＤ４６およびＣＤ４６結合部分の間の複合体を検出することによって検出される。本明細書中で使用される「検出」という用語は、コントロールを参照するまたはしない、定性的および／または定量的検出（レベルを測定する）を含む。
【００２６】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７、または治療薬と結合した抗体ｍＰＡ７、抗体ｍＰＡ７の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般的に、抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上のＣＤＲを含むが必ずしもその必要はない）、抗体ｍＰＡ７の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の性質を有するヒト抗体を含むがこれに限らない、本明細書中で記載した任意の抗体（ポリペプチドを含む）またはポリヌクレオチド実施態様を含む組成物を、癌細胞の成長を抑制するのに十分有効な量投与することによって、癌を治療する方法である。ある実施態様において、癌は乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌である。
【００２７】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７、または治療薬と結合した抗体ｍＰＡ７、抗体ｍＰＡ７の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般的に、抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上のＣＤＲを含むが必ずしもその必要はない）、抗体ｍＰＡ７の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の性質を有するヒト抗体を含むがこれに限らない、本明細書中で記載した任意の抗体（ポリペプチドを含む）またはポリヌクレオチド実施態様を含む組成物を、癌細胞の成長を抑制するのに十分に有効な量を個体に投与することによって、個体において癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法である。ある実施態様において、癌は乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌である。
【００２８】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＰＡ７、または治療薬と結合した抗体ｍＰＡ７、抗体ｍＰＡ７の断片または領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般的に、抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上のＣＤＲを含むが必ずしもその必要はない）、抗体ｍＰＡ７の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の性質を有するヒト抗体を含むがこれに限らない、本明細書中で記載した任意の抗体（ポリペプチドを含む）またはポリヌクレオチド実施態様を含む組成物を、癌細胞の成長を抑制するのに十分有効な量を投与することによって、癌を有する個体において転移の発現を遅らせる方法である。ある実施態様において、癌は乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌である。
【００２９】
別の局面において、本発明は、個体に有効な量の、本明細書中で記載した、治療薬（毒素または放射活性分子のような）に連結したＣＤ４６結合抗体または任意のＣＤ４６結合部分（抗体または抗体誘導体を含むがこれに限らないポリペプチド）を投与することによって、治療薬（毒素または放射活性分子のような）を個体において癌細胞に伝達する方法である。ＣＤ４６結合部分は、抗体ｍＰＡ７、抗体ｍＰＡ７の断片または領域を含む抗体、またはヒト化抗体（一般的に、抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上のＣＤＲを含むが必ずしもその必要はない）、抗体ｍＰＡ７の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の性質を有するヒト抗体を含むがこれに限らない。ある実施態様において、癌細胞は乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌由来である。別の実施態様において、治療薬（毒素または放射活性分子のような）は、癌細胞内に送達される（内在化される）。別の実施態様において、治療薬は前立腺、卵巣、乳房、または結腸癌細胞内に送達される。よって、本発明は、治療薬がそれらの癌細胞内に送達されるように、前立腺、卵巣、乳房、または結腸癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法を提供する。別の実施態様において、治療薬はサポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）である。
【００３０】
別の局面において、本発明は、本明細書中で記載した１つまたはそれ以上の組成物のいずれかを含むキットを提供する。これらのキットは、一般的に適当なパッケージング中で、および適当な説明書と共に提供され、本明細書中で記載したあらゆる方法に有用である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で開示される本発明は、抗原ＣＤ４６に結合する抗体およびポリペプチド、およびＣＤ４６に結合するこれらの抗体およびポリペプチドを作成および使用する方法を提供する。ＣＤ４６は、様々なヒト癌に存在し、そしてその発現が増加することが示された。ジスルフィド結合依存性であるＣＤ４６エピトープに優先的に結合する抗体ｍＰＡ７は、インビトロおよびインビボモデルにおいて前立腺癌細胞の成長を抑制することが見出され、そして癌細胞内に治療薬を内在化する能力を示した。
【００３２】
（一般的な技術）
本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の伝統的な技術を採用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９８８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏ���ｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）のような文献において完全に説明される。
【００３３】
（定義）
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のような標的に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される場合、その用語は、そのままのポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された構成も含む。
【００３４】
「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を指し、ここでモノクローナル抗体は、抗原の優先的結合に関与するアミノ酸（天然に存在するおよび天然に存在しない）から成る。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、そのままのモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのような）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、および必要な特異性の抗原認識部位および抗原に結合する能力を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された構成も含む。抗体の供給源またはそれが作成された様式（例えばハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、トランスジェニック動物等によって）に関して制限することを意図しない。
【００３５】
「ヒト化」抗体は、実質的に非ヒト種からの免疫グロブリン由来の抗原結合部位を有し、そして分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインか、または可変ドメインの適当なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含み得る。抗原結合部位は、野生型または１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る、例えばヒト免疫グロブリンにより近く類似するように修飾され得る。ヒト化抗体のある形式は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体由来の６つのＣＤＲを全て含む、ヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の別の形式は、もとの抗体に関して変化した、１つまたはそれ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６）を有し、それはまた、ｍＰＡ７からの１つまたはそれ以上のＣＤＲ「由来の」１つまたはそれ以上のＣＤＲと呼ばれる。
【００３６】
「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列それぞれの一部が、特定の種由来の抗体における対応する配列と相同的であるか、または特定の種類に属し、一方鎖の残りの部分は別の対応する配列と相同的である抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、１種の哺乳類由来の抗体の可変領域を模倣し、一方定常部分は別の種由来の抗体における配列と相同的である。そのようなキメラ形式の１つの明らかな利点は、例えば、例えばヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合せて、非ヒト宿主有機体から容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を用いて、可変領域を現在公知の供給源から簡便に得ることができることである。可変領域は調製の容易さという利点を有し、そして特異性はその供給源によって影響されないが、定常領域はヒトであり、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、抗体が注射された場合にヒト患者から免疫応答を誘発する可能性が低い。しかし、その定義はこの特定の例に制限されない。
【００３７】
抗体またはポリペプチドに対して「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書中で交換可能に使用される）エピトープは、当該分野においてよく理解された用語であり、そしてそのような特異的または優先的結合を決定する方法も、当該分野で周知である。分子が、特定の細胞または物質と、別の細胞または物質とよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い時間および／またはより高い親和性で反応または結合する場合、それは「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体が、他の物質に結合するよりも、より高い親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い時間結合するなら、それは標的に「特異的に結合」または「優先的に結合」する。例えば、ＣＤ４６エピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それが他のＣＤ４６エピトープまたは非ＣＤ４６エピトープに結合するよりも、より高い親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い時間このＣＤ４６エピトープに結合する抗体である。この定義を読むことによって、例えば、１番目の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、２番目の標的に特異的にまたは優先的に結合し得る、またはしないかもしれないことも理解される。そうであるので、「特異的結合」または「優先的結合」は、独占的な結合を（それを含み得るが）必要とするわけではない。一般的に、結合に対する言及は優先的結合を意味するが、必ずしもそうではない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「ｍＰＡ７」、「抗体ｍＰＡ７」および「モノクローナル抗体ｍＰＡ７」という用語は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生された免疫グロブリンを指して交換可能に使用される。ｍＰＡ７の産生および特徴付けは、実施例で記載する。ＣＤ４６に結合する能力；ジスルフィド結合依存性であるＣＤ４６エピトープに優先的に結合する能力；前立腺癌細胞のようなＣＤ４６を発現する癌細胞の成長を阻害する能力；ＣＤ４６を発現する癌細胞を有する個体において転移の発現を遅らせる能力；毒素または放射活性化合物のような治療薬を、ＣＤ４６を発現する癌細胞に伝達する能力；前立腺、卵巣、乳房、または結腸癌細胞のような、ＣＤ４６を発現する癌細胞内に治療薬を伝達する能力；血管内皮細胞（静脈内皮細胞のような）の成長および／または増殖を阻害する能力；ＣＤ４６を発現する増殖中の血管内皮細胞（静脈内皮細胞のような）内に治療薬を伝達する能力；血管新生を阻害する能力を含むがこれに限らない、異なる生物学的機能がｍＰＡ７に関連する。本明細書中で議論されるように、本発明のポリペプチド（抗体を含む）は、いずれか１つまたはそれ以上のこれらの特徴を有し得る。
【００３９】
「ｍＰＡ７と等価な抗体」または「ｍＰＡ７と等価なポリペプチド」は、ｍＰＡ７と関連する１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する抗体またはポリペプチドを指す。
【００４０】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能に使用されて、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直線状または分岐し得、それは修飾アミノ酸を含み得、そしてこれは、非アミノ酸によって中断され得る。その用語はまた、自然にまたは介入によって、例えばジスルフィド結合形成、糖鎖付加、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成成分との結合のような、あらゆる他の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを含む。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸等を含む）および当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドもその定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づくので、そのポリペプチドは一本鎖または結合した鎖として存在し得ることが理解される。
【００４１】
抗体の「可変領域」は、単独または組み合せて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。
【００４２】
抗体の「定常領域」は、単独または組み合せて、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％の純度（すなわち混入物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、より好ましくは少なくとも９８％の純度、より好ましくは少なくとも９９％の純度である物質を指す。
【００４４】
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクターのレシピエントであり得る、またはそうであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、天然、偶然の、または故意の変異に起因して、必ずしももとの親細胞と完全に同一でないかもしれない（形態学において、またはゲノムＤＮＡ全量において）。宿主細胞は、インビボで本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００４５】
「有効な量」の薬剤、化合物、または医薬品組成物は、腫瘍サイズの減少、癌細胞成長の遅延、疾患によって生ずる１つまたはそれ以上の症状の減少、疾患に罹患している人々の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の医薬品の投与量の減少、標的化および／または内在化によるような別の医薬品の効果の増強、疾患の進行の遅延、および／または患者の生存の延長のような、臨床的結果を含む、有利なまたは望ましい結果を得るために十分な量である。有効な量を、１回またはそれ以上の投与で投与し得る。本発明の目的のために、有効な量の薬剤、化合物、または医薬品組成物は、直接的または間接的のいずれかで、新生物細胞の増殖を抑制する（または破壊する）、および／または新生物細胞の転移の発現、または成長を抑制および／または遅延するのに十分な量である。癌臨床の文脈において理解されるように、有効な量の薬剤、化合物、または医薬品組成物は、別の薬剤、化合物、または医薬品組成物と組み合せて達成されても達成されなくてもよい。従って、「有効な量」を、１つまたはそれ以上の治療薬を投与する文脈において考慮し得、そしてもし１つまたはそれ以上の他の薬剤と組み合せて、望ましい結果を達成し得る、または達成するなら、単一の薬剤は有効な量で与えられると考え得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床的結果を含み、そして好ましくはそうである、有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床的結果は、１つまたはそれ以上の以下のものを含むがこれに限らない：新生物細胞の増殖を抑制する（または破壊する）、癌において見出される新生物細胞の転移を抑制する、腫瘍サイズを減少させる、疾患によって生ずる症状を減少させる、疾患に罹患している人々の生活の質を向上させる、疾患を治療するために必要な他の医薬品の投与量を減少させる、疾患の進行を遅らせる、および／または患者の生存を延長する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「転移の発現を遅らせる」は、転移の発現を延期する（ｄｅｆｅｒ）、妨げる、遅くする、遅らせる、安定化させる、および／または延期する（ｐｏｓｔｐｏｎｅ）ことを意味する。この遅延は、その癌の病歴および／または治療される個体によって、様々な時間の長さであり得る。当業者に明らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、事実上、予防を含み得、ここでその個体は転移を発現しない。
【００４８】
「生物学的試料」は、個体から得られた様々な試料の型を含み、そして診断またはモニタリングアッセイにおいて使用し得る。その定義は、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検標本もしくは組織培養またはそれ由来の細胞、およびその子孫のような固体組織試料を含む。その定義はまた、試薬による処理、可溶化、またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドのようなある成分について濃縮、または薄片に切る目的のために半固体または固体マトリックス中への包埋のような、その獲得の後いずれかの方法で操作された試料も含む。「生物学的試料」という用語は、臨床的試料を含み、そして培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料も含む。
【００４９】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、農場動物、スポーツ動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマのような）、霊長類、マウスおよびラットを含むがこれに限らない。
【００５０】
「毒素」または「細胞毒素」は、細胞に有害な反応を引き起こすあらゆる物質を指す。例えば、癌細胞に向けられた毒素は、癌細胞に対して有害な（ａｄｖｅｒｓｅ）、時々有害（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）な効果を有する。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「薬剤」は、生物学的、医薬品、または化学的化合物を指す。制限しない例は、単純なまたは複雑な有機分子または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、または抗体断片を含む。様々な化合物、例えば低分子およびオリゴマー（例えばオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づいた合成有機化合物を合成し得る。それに加えて、植物または動物抽出物等のような、様々な天然の供給源が、スクリーニングのための化合物を提供し得る。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「治療薬」は、抗腫瘍薬、毒素または細胞毒素、細胞毒薬剤、および放射活性薬剤を含む、治療（ここでは一般的に癌の文脈において）に有用なあらゆる薬剤を意味する。
【００５３】
「活性免疫応答」は、アジュバントありまたは無しで、静脈内、筋肉内、皮下または他の投与方式による、宿主哺乳類に対する抗原またはその抗原をコードするＤＮＡベクターの投与に応答した、インビボにおけるその抗原に対する抗体の発現、および進行中のその産生を指す。活性免疫応答はまた、細胞性免疫応答のような、免疫応答の別の局面も含み得る。
【００５４】
（組成物および組成物の作製方法）
本発明は、ＣＤ４６（膜補助因子タンパク質、またはＭＣＰとしても知られる）に結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにＣＤ４６に結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、医薬品組成物を含む組成物を含む。本明細書中で使用される場合、組成物は、ＣＤ４６に結合する１つまたはそれ以上の抗体、ポリペプチドおよび／またはタンパク質、ならびに／あるいはＣＤ４６に結合する１つまたはそれ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物はさらに、当該分野で周知の、緩衝液を含む薬剤学的に受容可能な賦形剤のような適当な賦形剤を含み得る。
【００５５】
本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質はさらに、以下の基準のいずれか（１つまたはそれ以上の）によって同定および特徴付けされる：（ａ）ＣＤ４６に結合する能力；（ｂ）ジスルフィド結合依存性である、ｍＰＡ７が選択的に結合するＣＤ４６エピトープに選択的に結合する能力；（ｃ）胸部、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓癌細胞のような癌細胞上のＣＤ４６に結合する能力；（ｄ）前立腺、肺、胸部、卵巣、膵臓、結腸、または腎臓癌細胞のような、ＣＤ４６を発現する癌細胞の成長および／または増殖を阻害する能力；（ｅ）ＣＤ４６を発現する癌細胞を有する個体において転移の発現を遅らせる能力；（ｆ）毒素または放射活性化合物のような治療薬を、ＣＤ４６を発現する癌細胞へ伝達する能力；（ｇ）前立腺、卵巣、胸部、または結腸の癌細胞のような、ＣＤ４６を発現する癌細胞中へ治療薬を伝達する能力；（ｈ）血管内皮細胞（静脈内皮細胞のような）の成長および／または増殖を阻害する能力；（ｉ）ＣＤ４６を発現する増殖している血管内皮細胞（静脈内皮細胞のような）中へ治療薬を伝達する能力；（ｊ）血管新生を阻害する能力。
【００５６】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＰＡ７である。本発明はまた、ｍＰＡ７の様々な処方および等価な抗体またはポリペプチド断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、等）、キメラ抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要な特異性の抗原（Ａｇ−ＰＡ７；ＣＤ４６）認識部位を含む、ｍＰＡ７のあらゆる他の修飾された構成も含む。本発明はまた、ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の生物学的特徴を示すヒト抗体も提供する。ｍＰＡ７の等価な抗体（ヒト化抗体およびヒト抗体を含む）、ｍＰＡ７のポリペプチド断片、およびこれらの断片のいずれかを含むポリペプチドは、上記で記載した１０個の基準のいずれか（１つまたはそれ以上の）によって同定および特徴付けされる。
【００５７】
いくつかの実施態様において、本発明のＣＤ４６に結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するのと同じＣＤ４６のエピトープに選択的に結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質である。
【００５８】
よって、本発明は、以下のもののいずれかを含む、以下のもののいずれか（または医薬品組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＰＡ７；（ｂ）抗体ｍＰＡ７のヒト化形態；（ｃ）抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の軽鎖および／または重鎖可変領域を含む抗体；（ｄ）抗体ｍＰＡ７の重鎖および軽鎖の可変領域に相同的なまたはそれ由来の可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域に相同的なまたはそれ由来の定常領域を含むキメラ抗体；（ｅ）ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ（少なくとも１、２、３、４、５、または６）を含む抗体；（ｆ）ｍＰＡ７の重鎖および／または軽鎖を含む抗体；（ｇ）ｍＰＡ７に等価なヒト抗体。抗体のヒト化形態は、ｍＰＡ７、またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞によって産生される抗体と同一のＣＤＲを有し得る、または有さないかもしれない。ＣＤＲ領域の決定は、当該分野の技術の範囲内である。いくつかの実施態様において、本発明は、ｍＰＡ７、またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞によって産生される抗体の、少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つのＣＤＲと実質的に相同的な（または、いくつかの実施態様において、ｍＰＡ７の６つのＣＤＲ全てと実質的に相同的な、またはｍＰＡ７由来の）、少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を提供する。他の実施態様は、ｍＰＡ７の少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲと実質的に相同的な、あるいはｍＰＡ７、またはＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７０６の寄託番号を有する宿主細胞によって産生される抗体由来の、少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲを有する抗体を含む。本発明の目的のために、結合特異性および／または全体の活性（それは癌細胞の成長および／または増殖の抑制、癌細胞におけるアポトーシス細胞死の誘導、転移の発現の遅延、および／または軽減するための治療のためであり得る）は、一般的に保持されるが、活性の程度はｍＰＡ７と比較して変化し得る（より高くまたは低くあり得る）ことが理解される。本発明はまた、これらの抗体のいずれかを作製する方法も提供する。抗体の作製方法は、当該分野で公知であり、そして本明細書中で記載される。
【００５９】
本発明はまた、ｍＰＡ７のような本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施態様において、そのポリペプチドは抗体ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の軽鎖および／または重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様において、そのポリペプチドは、ｍＰＡ７の１つまたはそれ以上の軽鎖および／または重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施態様において、そのポリペプチドはｍＰＡ７の軽鎖および／または重鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施態様において、そのポリペプチドは、以下のもののいずれかを有するｍＰＡ７のアミノ酸配列を含む：ｍＰＡ７配列の少なくとも５つの連続するアミノ酸、少なくとも８つの連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、ここで少なくとも３つのアミノ酸はｍＰＡ７の可変領域由来である。１つの実施態様において、可変領域は、ｍＰＡ７の軽鎖由来である。別の実施態様において、可変領域は、ｍＰＡ７の重鎖由来である。別の実施態様において、５つ（またはそれ以上）の連続するアミノ酸は、ｍＰＡ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来である。
【００６０】
抗体は、ポリクローナル（例えば、均一でない）またはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体の作製方法は、当該分野で公知である。採用し得る１つの方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の方法またはその改変である。一般的に、マウスまたはラットを免疫のために使用するが、他の動物も使用し得る。免疫源は、一次細胞、培養細胞系統、癌細胞、核酸、組織、またはペプチドであり得るが、これに限らない。１つの実施態様において、ヒト胎児膵臓上皮細胞（ｈＰＥＤ）を使用する。ヒト膵臓上皮前駆細胞（下に「ｈＰＥＤ」として知られる）の単離および培養方法は、実施例の節に詳述される。免疫源のために使用される細胞、例えばｈＰＥＤ細胞を、それを免疫源として使用する前に、ある期間（少なくとも２４時間）培養し得る。細胞（例えばｈＰＥＤ細胞）を、それ自身で、またはＲｉｂｉのような非変性アジュバントと組み合せて、免疫源として使用し得る。一般的に、細胞（例えばｈＰＥＤ細胞）を、免疫源として使用する場合に、インタクトで、そして好ましくは生存能力があるままに保たなければならない。インタクトな細胞は、破壊された細胞よりも、抗原がよりよく検出されることを可能にし得る。変性されているかまたはきついアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、ｈＰＥＤ細胞を破壊し得、従ってすすめられない。別の実施態様において、全長ＣＤ４６またはＣＤ４６のあらゆる断片、またはＣＤ４６発現癌細胞を免疫源として使用する。免疫源を、隔週、または毎週のような周期的な間隔で、複数回投与し得るか、または動物における（例えば組織組換え体における）生存能力を維持するような方法で投与し得る。
【００６１】
抗体応答をモニターするために、少量の生物学的試料（例えば血液）を動物から得て、そして免疫源に対する抗体力価について試験し得る。脾臓および／またはいくつかの大きなリンパ節を除去し、そして単一細胞に分離し得る。もし望ましいなら、細胞懸濁液を抗原でコートしたプレートまたはウェルへ加えることによって、（非特異的な接着細胞を除去した後に）脾臓細胞をスクリーニングし得る。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、そして懸濁液の残りと共に洗い流されない。得られたＢ細胞、または全ての分離脾臓細胞を、次いで骨髄腫細胞（例えばＸ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡからのもの）と融合し得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、脾臓またはリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを形成し得る。次いでハイブリドーマを選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、さもなければ「ＨＡＴ培地」として知られる）で培養する。得られたハイブリドーマを次いで制限希釈によってプレートし、そしてＦＡＣＳまたは免疫組織化学（ＩＨＣスクリーニング）を用いて、免疫源（例えば、ｈＰＥＤ細胞の表面、癌細胞系統の表面、胎児卵巣切片、ＣＤ４６等）に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイする。選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを次いでインビトロ（例えば組織培養ボトルまたは中空線維反応器において）またはインビボ（例えばマウスの腹水として）のいずれかで培養する。実施例が、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）に結合する抗体ｍＰＡ７を得る、スクリーニングする、そして特徴付けするために利用される方法をさらに詳述する。抗体ｍＰＡ７を産生する状況下でハイブリドーマを培養する方法、および抗体を精製する方法は、当該分野で公知であり、そして実施例２および３でさらに詳述される。
【００６２】
上記で記載したモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するＣＤ４６上のエピトープに選択的に結合する抗体の産生について選択し得る。そのような抗体を選択する方法は、当該分野で公知である。例えば、結合競合アッセイを使用して、抗体がｍＰＡ７と同じエピトープに結合するかどうか決定し得る。ＣＤ４６への結合に対する、抗体のｍＰＡ７との競合は、その抗体が、ｍＰＡ７が結合するエピトープへ選択的に結合することを示す。結合競合アッセイは、当該分野で周知である。抗体が、ｍＰＡ７が選択的に結合するエピトープに選択的に結合することの別の徴候は、その抗体が結合するエピトープがまたジスルフィド結合依存性であることである。抗体ｍＰＡ７が選択的に結合するＣＤ４６上のエピトープに選択的に結合するポリペプチドをまた、同様の方法を用いて試験および同定し得る。
【００６３】
細胞融合技術の別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を用いて、本発明のモノクローナル抗体を産生し得る。ハイブリドーマを、もし望ましいなら増殖およびサブクローニングし、そして上清を伝統的なアッセイ手順（例えばＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等）によって、抗免疫源活性についてアッセイする。
【００６４】
別の選択肢において、抗体を組換え的に作製し得る。組換え抗体を作製する方法は、当該分野で周知である。モノクローナル抗体ｍＰＡ７およびあらゆる他の等価な抗体を、配列決定し、そしてインビトロで組換え的に産生し得る。１つの実施態様において、ｍＰＡ７を配列決定し、そしてポリヌクレオチド配列を次いで発現または増殖のためにベクターにクローニングする。目的の抗体をコードする配列を、宿主細胞中のベクターに維持し得、そして宿主細胞を次いで増殖およびさらなる使用のために凍結し得る。別の選択肢において、抗体を、ファージディスプレイ技術によって組換え的に作製し得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２；５，５８０，７１７；５，７３３，７４３；６，２６５，１５０号、およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３−４５５を参照のこと。
【００６５】
別の選択肢において、抗体ｍＰＡ７または目的のあらゆる他の抗体もしくはタンパク質を、当業者に周知である、エドマン分解による配列決定に供し得る。質量分析またはエドマン分解から産生されたペプチド情報を使用して、目的のタンパク質をクローニングするために使用するプローブまたはプライマーを設計し得る。
【００６６】
目的のタンパク質をクローニングする代替方法は、目的の抗体またはタンパク質を発現する細胞について、ＣＤ４６を用いた「パンニング」によるものである。「パンニング」手順は、目的の抗体またはタンパク質を発現する組織または細胞からｃＤＮＡライブラリーを得て、２番目の細胞型においてｃＤＮＡを過剰発現し、そしてＣＤ４６への特異的結合についてのこの２番目の細胞型のトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって行なわれる。「パンニング」による、細胞表面タンパク質をコードする哺乳類遺伝子のクローニングで使用される方法の詳細な記載は、当該分野で見出し得る。例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、８５７３−８５７７（１９８７）およびＳｔｅｐｈａｎ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５８５４（１９９９）を参照のこと。
【００６７】
当該分野における標準的な方法によって、特定の細胞型からのｍＲＮＡを逆転写することによって、ｃＤＮＡを得ることができる。具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において述べられた手順によって様々な細胞溶解酵素または化学的溶液を用いてｍＲＮＡを単離し得るか、あるいは製造会社（例えばＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって提供された付随する指示に従って、市販の核酸結合樹脂によって抽出し得る。合成ｃＤＮＡを次いで発現ベクターに導入し、２番目の型の細胞において目的の抗体またはタンパク質を産生する。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体化した一部分としてのいずれかで、宿主細胞において複製可能でなければならないことを意味する。適当な発現ベクターは、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびコスミドを含むウイルスベクターを含むがこれに限らない。
【００６８】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターを、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を採用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えばベクターがワクシニアウイルスのような感染性因子の場合）を含む、多くの適当な手段のいずれかによって、宿主細胞に導入し得る。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば宿主細胞の特徴に依存する。
【００６９】
異種ＤＮＡを過剰発現し得るあらゆる宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用し得る。哺乳類宿主細胞の制限しない例は、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞を含むがこれに限らない。好ましくは、宿主細胞は、もし存在するなら、宿主細胞において対応する内因性の目的の抗体またはタンパク質のものより、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＣＤ４６への特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって行なわれる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定し得る。
【００７０】
本発明は、ｍＰＡ７のような本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドを、当該分野で公知の手順によって作製し得る。そのポリペプチドを、抗体のタンパク質分解または他の分解によって、上記のような組換え方法によって（すなわち単一または融合ポリペプチド）、あるいは化学的合成によって産生し得る。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までの短いポリペプチドは、化学的合成によって簡便に作製される。化学的合成の方法は、当該分野で公知であり、そして市販されている。例えば、ｍＰＡ７ポリペプチドを、固相法を採用する自動化ポリペプチド合成機によって産生し得る。
【００７１】
本発明はまた、ｍＰＡ７のような本発明の抗体の、単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）を含む。単鎖可変領域断片を、短い連結ペプチドを用いて、軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することによって作成する。Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６。連結ペプチドの１つの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号第１番）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端間の約３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計され、そして使用されている。Ｂｉｒｄら（１９８８）。リンカーを次に、薬剤の結合または固体支持体への結合のような、さらなる機能のために修飾し得る。単鎖異型を、組換え的または合成的のいずれかで産生し得る。ｓｃＦＶの合成的産生のために、自動化合成機を使用し得る。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳類細胞のような真核細胞、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞のいずれかに導入し得る。関心のあるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的な操作によって作成し得る。できたｓｃＦｖを、当該分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離し得る。
【００７２】
本発明は、その性質に有意な影響を与えないｍＰＡ７の機能的に等価な抗体およびポリペプチド、ならびに増強されたまたは減少した活性を有する変異体を含む、抗体ｍＰＡ７のような抗体への修飾を含む。ポリペプチドの修飾は、当該分野において日常的な実施であり、そして本明細書中で詳細に記載する必要はない。修飾ポリペプチドの例は、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を有意に有害に変化させないアミノ酸の１つまたはそれ以上の欠失または付加、または化学的アナログの使用を含む。お互いに保存的に置換し得るアミノ酸残基は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシンを含むがこれに限らない。これらのポリペプチドはまた、糖鎖付加した、および糖鎖付加していないポリペプチド、ならびに例えば異なる糖による糖鎖付加、アセチル化、およびリン酸化のような、他の翻訳後修飾を有するポリペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸置換は保存的である、すなわち置換アミノ酸はもとのアミノ酸と同様の化学的性質を有する。そのような保存的置換は、当該分野で公知であり、そして例が上記で提供される。アミノ酸修飾は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域のような領域の完全な再設計までの範囲であり得る。可変領域における変化は、結合親和性および／または特異性を変化させ得る。修飾の他の方法は、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化を含むがこれに限らない、当該分野で公知の結合技術の使用を含む。例えば、修飾を、ラジオイムノアッセイのための放射活性部分の結合のような、イムノアッセイのための標識の結合のために使用し得る。修飾ｍＰＡ７ポリペプチドを、当該分野で確立された手順を用いて作成し、そして当該分野で公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングし得、それらのいくつかを下記および実施例で記載する。
【００７３】
本発明はまた、ｍＰＡ７のような本発明の抗体由来の、１つまたはそれ以上の断片または領域を含む融合タンパク質を含む。１つの実施態様において、軽鎖可変領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸および重鎖可変領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施態様において、融合ポリペプチドは、異種由来免疫グロブリン定常領域を含む。別の実施態様において、融合ポリペプチドはｍＰＡ７の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本発明の目的のために、ｍＰＡ７融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のｍＰＡ７ポリペプチド、および天然分子においては結合していない別のアミノ酸配列、例えば異種由来配列または別の領域由来の同種配列を含む。ｍＰＡ７ポリペプチドを、当該分野で公知の方法によって、例えば合成的にまたは組換え的に作成し得る。
【００７４】
別の実施態様において、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質である、ｍＰＡ７キメラが提供される。ある実施態様において、鎖の定常ドメインは１つの特定の種および／または種類由来であり、そして可変ドメインは異なる種および／または種類由来である。例えば、キメラ抗体（ある実施態様において）は、定常領域はヒト起源由来であり、そして可変領域はｍＰＡ７と相同的またはそれ由来（すなわちマウス）であるものである。（ある実施態様において）ＣＤＲ領域がｍＰＡ７アミノ酸配列を含み、一方フレームワーク領域はヒト配列由来である、ヒト化可変領域を有する抗体も、本発明において具体化される。ヒト化抗体の他の形式が、当該分野で公知であり、そして本明細書中で記載される。キメラの機能的断片もまた具体化される。例は、ヒトヒンジ領域、ヒトの最初の定常領域、ヒトκ軽鎖または重鎖定常領域、ならびにｍＰＡ７由来の軽鎖および／または重鎖の可変領域を含む、ヒト化Ｆａｂ断片である。ヒト化ｍＰＡ７  Ｆａｂ断片を次に、Ｆａｂダイマーを形成するために作成し得る。典型的には、本発明のｍＰＡ７融合タンパク質およびｍＰＡ７キメラを、本明細書中で記載した組換え方法を用いて、それらをコードするポリヌクレオチドを発現するものを調製することによって作成するが、それらを例えば化学的合成を含む、当該分野で公知の他の手段によっても調製し得る。例えば、米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号を参照のこと。
【００７５】
本発明はまた、ヒト化抗体を含む。ｍＰＡ７または他の等価な抗体のような抗体のポリヌクレオチド配列を、遺伝的操作のために使用して、「ヒト化」抗体を産生し得るか、または抗体の親和性または他の特徴を改良し得る。抗体のヒト化における一般的な原理は、抗体の抗原結合部分の基本的な配列を保持し、一方で非ヒトの抗体の残りをヒト抗体配列と交換することを含む。モノクローナル抗体をヒト化するために、４つの一般的な工程が存在する。これらは、（１）開始抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を決定する工程、（２）ヒト化抗体を設計する工程、すなわちヒト化過程の間にどの抗体フレームワーク領域を使用するか決定する工程、（３）実際のヒト化方法論／技術、および（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現、である。例えば、抗体が臨床試験およびヒトにおける治療において使用されるなら、免疫応答を避けるために、定常領域を、ヒト定常領域により似せるために遺伝子操作し得る。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照のこと。
【００７６】
ヒト定常ドメインに融合した、げっ歯類Ｖ領域およびその関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）；およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７）を参照のこと。他の参考文献が、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に移植されたげっ歯類ＣＤＲを記載する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）を参照のこと。別の参考文献が、組換え的に化粧張りした（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲを記載する。例えば、欧州特許公開第５１９，５９６号を参照のこと。これらの「ヒト化」分子を、ヒトレシピエントにおいてそれら部分の治療的適用の期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的反応を最小限にするために設計し得る。抗体をヒト化する利用され得る他の方法が、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６（１９９１）によって、および米国特許第６，１８０，３７７号；同第６，０５４，２９７号；同第５，９９７，８６７号；同第５，８６６，６９２号；同第６，２１０，６７１号；同第６，３５０，８６１号、およびＰＣＴ  ＷＯ０１／２７１６０において開示される。
【００７７】
さらに別の選択肢において、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子操作された、市販で入手可能なマウスを用いることによって、完全なヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば、完全なヒト抗体）またはより強い免疫応答を産生するよう設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体を産生するために使用し得る。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭおよびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  ＭｏｕｓｅＴＭである。
【００７８】
本発明はまた、放射活性分子、毒素（例えばカリーチアマイシン）、または化学療法分子のような治療薬と、あるいは化学療法化合物を含むリポソームまたは他の小胞に結合した（例えば連結した）、ｍＰＡ７またはｍＰＡ７と等価な抗体もしくはポリペプチドを含む組成物を提供する。その組成物は、個体に投与された場合に、これらの薬剤を、抗体またはポリペプチドによって認識されるＣＤ４６を発現する癌細胞に標的化し得、そして従って、例えば癌細胞を除去、そして／または癌細胞の増殖および／もしくは成長を抑制し得る。単純さのために、これらの方法は、本明細書中で記載されたＣＤ４６結合実施態様のいずれにも適用されるという理解で、ｍＰＡ７または抗体へ一般的に言及がなされる。これらの結合は、一般的に本明細書中で記載されたようなこれらの成分の連結を指す。その連結（これは一般的に、これらの成分を、少なくとも投与の間、最も近い関係に固定することである）は、下記で記載するような多数の方法で達成し得る。
【００７９】
本発明の放射活性分子は、癌細胞を破壊するのに有効なあらゆる放射性同位体を含む。例は、コバルト−６０およびＸ線を含むがこれに限らない。さらに、典型的には放射性同位体の混合物を表す、ウラン、ラジウム、およびトリウムのような、天然に存在する放射活性元素が、放射活性分子の適切な例である。
【００８０】
本発明の毒素は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそのアナログもしくはホモログを含むがこれらに限らない。本発明の抗体は、それらが結合する癌細胞内に内在化され得、そして従って、治療的適用のために、例えばその有害な活性のために内在化される必要がある毒素を細胞内に伝達するのに、特に有用である。そのような毒素の例は、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、カリーチアマイシン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）を含むがこれに限らない。
【００８１】
本発明の抗体またはポリペプチドを、放射活性分子、毒素、または他の治療薬に、あるいは治療薬を含むリポソームまたは他の小胞に、共有結合的にまたは非共有結合的に、直接的にまたは間接的に、結合（連結）し得る。抗体がその標的ＣＤ４６に結合し得る限り、抗体のあらゆる位置において、その抗体を放射活性分子、毒素、または治療的分子と連結し得る。
【００８２】
毒素または治療薬を、直接的または間接的（例えばリンカー基によって、またはあるいは、米国特許第５，５５２，３９１号で記載されたようなプラットホーム分子のような、適切な結合部位を有する連結分子によって）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合（例えば共有結合）し得る。本発明の毒素および治療薬を、当該分野で公知の方法を用いて、特定の標的化タンパク質に直接的に結合し得る。例えば、それぞれがもう１つと反応し得る置換基を有している場合、薬剤と抗体との間の直接反応が可能である。例えば、１つにおけるアミノ基またはメルカプト基のような求核性基は、もう１つにおける無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニルを含む基、または良好な脱離基（例えばハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することが可能であり得る。
【００８３】
抗体またはポリペプチドはまた、マイクロキャリアによって治療薬と連結し得る。マイクロキャリアは、水に不溶性であり、そして大きさが約１５０、１２０または１００μｍより小さく、より通常には約５０〜６０μｍより小さく、好ましくは約１０、５、２．５、２または１．５μｍより小さい、生物分解性の、または非生物分解性の粒子を指す。マイクロキャリアは、約１μｍより小さい、好ましくは約５００ｎｍより小さいサイズを有するマイクロキャリアである、「ナノキャリア」を含む。そのような粒子は当該分野で公知である。固相マイクロキャリアは、生体適合性の天然に存在するポリマー、合成ポリマーまたは合成コポリマーから形成された粒子であり得、それはアガロースまたは架橋アガロース、および当該分野で公知の他の生物分解性材料から形成されたマイクロキャリアを含み得る、または除外し得る。生物分解性の固相マイクロキャリアを、哺乳類の生理学的条件下で分解性（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそのコポリマー）または侵食性（例えば、３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）のようなポリ（オルトエステル）、セバシン酸のポリ（無水物）のようなポリ（無水物））であるポリマーから形成し得る。マイクロキャリアはまた、その液相マイクロキャリアが生物分解性なら、リポソーム、抗原無しのｉｓｃｏｍ（免疫刺激複合体であり、これはコレステロール、およびリン脂質、アジュバント活性サポニンの安定な複合体である）、水中油型または油中水型エマルションで見出される小滴またはミセルのような液相（例えば油または脂質に基づく）であり得る。生物分解性液相マイクロキャリアは、典型的には生物分解性油を含み、それらの多くは当該分野で公知であり、スクアレンおよび植物油を含む。マイクロキャリアは典型的には形が球形であるが、球形からはずれたマイクロキャリアも許容可能である（例えば、楕円、棒状等）。その不溶性の性質（水に関して）のために、マイクロキャリアは、水および水に基づく（水性）溶液からろ過可能である。
【００８４】
本発明の抗体またはポリペプチド結合物は、毒性薬剤または治療薬と結合し得る基および抗体と結合し得る基を両方含む、二官能性リンカーを含み得る。リンカーは、結合能力の干渉を避けるために、薬剤から抗体まで間隔をおくスペーサーとして機能し得る。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。リンカーはまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために、そして従って結合効率を増加させるために作用し得る。化学的反応性の増加はまた、そうでなければ可能でない、薬剤、または薬剤上の官能基の使用を促進し得る。二官能性リンカーを、当該分野で公知の手段によって抗体に結合し得る。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシインイミドエステルのような、活性なエステル部分を含むリンカーを、アミド結合による抗体のリジン残基への結合に使用し得る。別の例において、求核性アミン残基またはヒドラジン残基を含むリンカーを、抗体炭水化物残基の解糖的酸化によって産生されるアルデヒド基に結合し得る。これらの直接的な結合方法に加えて、リンカーを、アミノデキストランのような中間のキャリアによって、抗体に間接的に結合し得る。これらの実施態様において、修飾された結合は、リジン、炭水化物、または中間のキャリアのいずれかを介する。１つの実施態様において、リンカーは、タンパク質の遊離チオール残基に、部位選択的に結合する。タンパク質のチオール基への選択的結合に適切な部分は、当該分野で周知である。例は、ジスルフィド化合物、α−ハロカルボニルおよびα−ハロカルボキシル化合物、およびマレイミドを含む。求核性アミン官能基が、α−ハロカルボニルまたはカルボキシル基として同じ分子に存在する場合、アミンの分子内アルキル化によって環状化が起こる可能性が存在する。この問題を防止する方法は、当業者に周知であり、例えば望ましくない環状化を立体化学的に不利にする、アリル基またはトランスアルケンのような柔軟性を欠く基によって、アミンおよびα−ハロ官能基を分離させた分子の調製による。例えば、ジスルフィド部分によるメイタンシノイドと抗体との結合物の調製に関して、米国特許第６，４４１，１６３号を参照のこと。
【００８５】
抗体−薬剤結合物の調製に使用し得る切断可能なリンカーの１つは、受容体により媒介されるエンドサイトーシスの間に出会うエンドソームおよびリソソームのような、異なる細胞内区画の酸性環境を利用する、シス−アコニット酸に基づく酸不安定なリンカーである。例えば、ダウノルビシンの高分子キャリアとの結合物の調製に関して、Ｓｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８−１０５４（１９８１）；ダウノルビシンの抗黒色腫抗体への結合物の調製に関して、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０：１１５４−１１５９（１９８８）；ダウノルビシンの抗Ｔ細胞抗体との結合物を調製するのと同様の様式における酸不安定なリンカーの使用に関して、Ｄｉｌｌｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：６０９７−６１０２（１９８８）；ペプチドスペーサーアームによるダウノルビシンの抗体への連結に関して、Ｔｒｏｕｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６２６−６２９（１９８２）を参照のこと。
【００８６】
本発明の抗体（またはポリペプチド）を、当該分野で公知のあらゆる方法によって、放射活性分子に結合（連結）し得る。抗体の放射性標識方法の議論に関して、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴ」、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９５）を参照のこと。
【００８７】
本発明の抗体（またはポリペプチド）を、蛍光分子、放射活性分子、または当該分野で公知のあらゆる他の標識のような標識化薬剤（あるいは「標識」と呼ばれる）と連結し得る。標識は当該分野で公知であり、それは一般的に（直接的または間接的のいずれかで）シグナルを提供する。
【００８８】
ＣＤ４６を発現する癌細胞の成長を阻害する能力、ＣＤ４６を発現する癌を有する個体において転移の発生を遅らせる能力、ＣＤ４６を発現する癌細胞内に治療薬を送達する能力を含む、ＣＤ４６を発現する癌細胞に、毒素または放射活性化合物のような治療薬を送達する能力のような、本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質の能力を、当該分野で公知の方法を用いて試験し得、それらのいくつかは実施例で記載される。
【００８９】
本発明はまた、抗体ｍＰＡ７またはｍＰＡ７と等価な抗体（それは、本開示が明らかにするように、本明細書中で記載された全ての抗体を含む）またはポリペプチドおよび治療薬を含む組成物（医薬品組成物を含む）を提供する。
【００９０】
（モノクローナル抗体をスクリーニングする方法）
Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）に結合するモノクローナル抗体をスクリーニングするために、いくつかの方法を使用し得る。採用し得る１つの方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。標準的な免疫組織化学的技術は、当業者に公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤ．Ｂａｒｎｅｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第５７巻、第１８および１９章、３１４−３５０頁、１９９８）を参照のこと。生物学的試料（例えば組織）を、生検、解剖、または検死から得ることができる。Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）が癌細胞にのみ存在するかどうかを確かめるために、ｍＰＡ７を使用して、癌に罹患した個体由来の他の非癌組織または癌を有さない個体由来の組織をコントロールとして使用しながら、癌を有する個体由来の組織におけるＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の存在を検出し得る。その組織を、凍結中の損傷を予防する固体または半固体物質（例えばアガロースゲルまたはＯＣＴ）に包埋し、そして次いで染色のために薄片にし得る。異なる臓器および異なる進行度の癌を使用して、モノクローナル抗体をスクリーニングし得る。スクリーニング目的のために使用し得る組織の例は、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓を含むがこれに限らない。スクリーニング目的のために使用し得る、異なる癌の型の例は、癌腫、腺癌、肉腫、腺肉腫、リンパ腫、および白血病を含むがこれに限らない。
【００９１】
さらに別の選択肢において、ＳＫ−Ｏｖ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ７７）、ＬｎＣａｐ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）、ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１８５）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４６９）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３０）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５８）、ＨＴ−２９（ＨＴＢ−３８）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２８）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６８２）、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ７９）、ＣＦＰＡＣ−１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１９１８）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９９７）、ＨＳ−７００Ｔ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ１４７）、Ｄｕ−１４５（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−８１）、ＣａＬｕ−１（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−５４）、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１９３２）、ＣａＫｉ−２（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４７）、Ａ４９８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４４）、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２０）、およびＰＣ−３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５）のような癌細胞系統、およびそのそれぞれの組織由来の正常細胞を使用して、癌組織に特異的なモノクローナル抗体をスクリーニングし得る。卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、大動脈平滑筋、および内皮細胞を含むがこれに限らない、異なる臓器からの正常組織由来の、初代、または低い継代の細胞培養物を、ネガティブコントロールとして使用し得る。癌細胞または非癌細胞を、ガラススライドまたはカバーグラス上に、またはプラスチック表面上に増殖させ得るか、またはＷＯ０１／４３８６９において記載されたようにＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭ中で調製し、そして組織に関して上記で記載したように、ＩＨＣを用いて抗体の結合に関してスクリーニングし得る。あるいは、細胞を、非タンパク質分解手段を用いて増殖表面から除去し、そして遠心してペレットにし得、それを次いで上記で記載したようにＩＨＣ分析のための組織として包埋及び処理する。別の選択肢において、一次抗体、蛍光分子に結合した２次「リポーター」抗体とインキュベートし、そして次いで蛍光標示式細胞分類（ＦＡＣＳ）の機械を用いて分析することによって、単一の細胞をスクリーニングし得る。
【００９２】
いくつかの異なる検出システムを、組織切片に対する抗体の結合を検出するために利用し得る。典型的には免疫組織化学は、一次抗体の組織への結合を含み、そして次いで一次抗体の種に対して反応性の２次抗体を産生し、そして検出可能なマーカー（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ、またはジアミノベンジジン、ＤＡＢ）に結合する。使用し得る１つの代替方法は、ポリクローナル鏡像相補的抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｍｉｒｒｏｒ  ｉｍａｇｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）すなわちｐｏｌｙＭＩＣＡである。Ｄ．Ｃ．ＭａｎｇｈａｍおよびＰ．Ｇ．Ｉｓａａｃｓｏｎ（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９９）３５（２）：１２９−３３）によって記載された、ｐｏｌｙＭＩＣＡ（ポリクローナル鏡像相補的抗体）技術を使用して、正常組織および癌組織に対する１次抗体（例えばｍＰＡ７）の結合を試験し得る。いくつかの種類のｐｏｌｙＭＩＣＡＴＭ検出キットが、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ４０７３  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｂ２９  ６ＡＴ  Ｅｎｇｌａｎｄ）から市販で入手可能である。製品番号ＨＫ００４．Ｄは、ＤＡＢ色素原を使用するｐｏｌｙＭＩＣＡＴＭ検出キットである。製品番号ＨＫ００４．Ａは、ＡＥＣ色素原を使用するｐｏｌｙＭＩＣＡＴＭ検出キットである。あるいは、１次抗体を、検出可能なマーカーで直接標識し得る。
【００９３】
適切な抗体を選択するためのＩＨＣスクリーニングにおける最初の工程は、１つまたはそれ以上の免疫源（例えば細胞または組織試料）に対する、マウスにおいて産生された１次抗体（例えばｍＰＡ７）の結合である。１つの実施形態において、組織試料は、異なる臓器由来の凍結組織の切片である。細胞または組織試料は、癌性または非癌性のいずれかであり得る。
【００９４】
凍結組織を、固定ありまたはなしで、調製、薄片にし得、そしてＩＨＣを当業者に公知の多くの方法のいずれかによって行なう。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２：２６４−２７７（１９９９）、およびＳｔｅｐｈａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５４（１９９９）を参照のこと。
【００９５】
ヒト細胞と交差反応性であり、そして癌細胞または組織に結合するが正常細胞または組織には同じ程度に結合しないモノクローナル抗体を選択する。１つまたはそれ以上の癌の型に発現する抗原に結合するが、正常細胞には結合しないモノクローナル抗体もまた選択する。ｍＰＡ７は、多くの異なる癌に存在する抗原に結合するが、正常組織には限られた結合しか有さない抗体の例である。Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙによって、ｍＰＡ７を産生するハイブリドーマを、ＰＴＡ−３７０６の特許寄託指定で、２００１年９月１８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した。
【００９６】
抗体をさらに特徴付けるために、エピトープマッピングを使用し得る。市販のサービス（例えばＰｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ２０９８、８２０３  ＡＢ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、ｍＰＡ７のような抗体が結合する抗原のエピトープを決定し得る。
【００９７】
（Ａｇ−ＰＡ７、ＣＤ４６を同定および特徴付けする方法）
ｍＰＡ７の抗原を同定するためにいくつかの方法を採用し得、そのいくつかは実施例で記載される。１つの方法は、アフィニティー精製のための抗体の利用である。細胞溶解物／抽出物または組織ホモジネート／抽出物を、抗体ｍＰＡ７を固体支持体に結合させた、アフィニティー樹脂に適用し得る。抽出する試料を、正常または癌組織、癌または別の疾患状態を有する個体由来の生物学的試料、市販の供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、または細胞系統を含むがこれらに限らない、多くの供給源から得ることができる。アフィニティー精製のために使用される抗体を、下記で詳細に議論する様々な方法で得ることができる。一旦、抗原が支持体に結合したら、抗原を異なる試薬を用いて溶出し得る。これらの試薬としては、低ｐＨ試薬および化学的変性剤（例えば尿素またはグアニジンＨＣｌ）が挙げられるがこれらに限らない。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第２巻、１９９１、８．２．１−８．２．９）を参照のこと。この方法を、実施例５でさらに詳述する。
【００９８】
当該分野で公知の標準的な配列決定方法（例えばエドマン分解）を用いた配列決定のために、精製抗原を使用し得る。ペプチド配列が得られたら、次いでそのペプチド配列から縮重プライマーまたはプローブを作製し得る。プローブを次いで、研究中のタンパク質をコードするＤＮＡを含む挿入を含む細菌を同定するために、ｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズし得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、またはＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと。抗体ｍＰＡ７の抗原は、ＣＤ４６（膜補因子タンパク質、ＭＣＰ）であると決定された。ＣＤ４６の配列は、米国特許第５，５１４，７８７号、同第５，８４６，７１５号、同第５，５５２，３８１号、同第５，７０３，０４６号、同第６，２１８，５２０号で開示される。
【００９９】
ｍＰＡ７が結合する抗原を同定および特徴付けするために使用された別の方法は、ウェスタンブロッティング技術の使用である。Ａｇ−ＰＡ７は、１つの局面において、様々なヒト癌由来の細胞溶解物およびモノクローナル抗体ｍＰＡ７を用いたウェスタンブロッティングによって同定され、この抗体を産生するハイブリドーマを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に、２００１年の９月１８日、ＰＴＡ−３７０６の特許寄託指定で寄託した。当業者に公知であるように、ウェスタンブロッティングは、細胞溶解物および／または細胞画分を、変性または非変性ゲルに流す工程、タンパク質をニトロセルロース紙に移す工程、そして次いでブロットを抗体（例えばｍＰＡ７）でプローブして、どのタンパク質に抗体が結合するか調べる工程を含み得る。この手順を、実施例４でさらに詳述する。抗原を、実施例５で記載するように、さらなる特徴付けのために精製した。
【０１００】
ｍＰＡ７が結合する抗原を特徴付けするために使用し得る別の方法は、質量分析である。いくつかの型の質量分析を行ない得る。１つのアプローチにおいて、タンパク質のトリプシン消化物の質量を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって測定し、そして得られたペプチド質量のリストを、配列データベース検索においてタンパク質の「指紋」として使用する。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）において、ペプチドを、大過剰の光吸収マトリックスと共に共結晶化する。パルスレーザービームによる結晶の照射は、マトリックスおよび埋め込まれたペプチド分子の迅速な昇華およびインタクトなガス相イオンの生成を生じる。ペプチドに関しては、プロトン化された、単独に荷電した分子イオンが通常形成される。質量／荷電比（ｍ／ｚ）を、必要に応じて、遅延−抽出および／または反射を採用して、高質量精度（ｈｉｇｈ  ｍａｓｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ）飛行時間型分析において測定する。酸化、システインのアクリルアミド化、および誤切断のような一般的な改変および２次的な情報（見かけの等電点および／または分子量）の使用を考慮した後、ＭＡＬＤＩスペクトルにおけるペプチド質量を適合させるペプチドの質量分析によって、回収した配列を分析する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる同定についてまだあいまいさが存在する場合、その結果を質量分析ペプチド配列決定によって検証し得る。これらおよび公知のタンパク質を同定するために質量分析を用いる他の手順が、Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ（Ａ．Ｐａｎｄｅｙ、Ｊ．Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ、およびＭ．Ｍａｎｎ；２０００）において概説される。
【０１０１】
本発明のモノクローナル抗体によって認識される表面抗原を、最初に上記で記載したいずれかの方法によって単離し、あるいは、当業者に公知のあらゆる方法によって単離し得る。抗体ｍＰＡ７が結合したタンパク質のバンドを、最初にプロテアーゼで精製タンパク質を消化することによって特徴付けし、それはペプチドの混合物を生ずる。次いでペプチドをＭＡＬＤＩ質量分析によって分析し、そしてその質量分析パターンを他のタンパク質のパターンと比較した。実施例６でさらに記載するように、この方式において、ｍＰＡ７の抗原、Ａｇ−ＰＡ７は、ＣＤ４６であると決定された。
【０１０２】
使用し得る別の質量分析方法は、ナノエレクトロスプレータンデム型質量分析である。この方法において、ペプチド分子の溶液が、高い電位に維持された針を通過する。針の末端において、溶液は、ペプチド分子を含む小さい、高度に荷電した小滴の細かい霧に分散される。これらの小さい小滴は、迅速に蒸発し、複数の荷電した分子イオンのガス相への放出を引き起こす。一旦、ペプチドがガス相になったら、それらは開口部を通って質量分析計に運ばれ、そこでそれらは分離され、そしてその質量／荷電（ｍ／ｚ）比によって検出される。ナノエレクトロスプレーは、エレクトロスプレーの精密化バージョンを指し、ここで非常に細い針が、１分あたりナノリットルの範囲の流速で試料を分散する。これは小滴の直径を非常に減少し、そしてペプチドの検出の感受性を増強する。エレクトロスプレーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳよりも、塩の存在に対してより感受性である傾向がある。従って、当業者に公知の方法によって、試料を最初に脱塩する。エレクトロスプレーイオン供給源は、ペプチド配列決定を可能にする質量分析計（最も一般的なものは、三重四極（ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）、イオントラップ（ｉｏｎ  ｔｒａｐ）、または四極（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）飛行時間型質量分析計である）と適合性である。低レベルのタンパク質同定において、ペプチドシグナルは多くの場合、化学的バックグラウンドまたは混入物由来のシグナルによって混乱する。高分解能の装置（例えば四極（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）飛行時間型装置）は、化学的バックグラウンドからペプチドを分離するのを補助する。あるいは、三重四極装置において、前駆体イオンスキャンが、非ペプチド混入物の存在下でペプチドの選択的検出を可能にする。
【０１０３】
Ａｇ−ＰＡ７を、細胞内でのその位置によってさらに特徴付けし得る。理論に拘束されることなく、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）は、少なくとも細胞の表面に発現する細胞関連抗原である。モノクローナル抗体ｍＰＡ７を産生する方法は、インタクトな細胞を免疫源として使用することを含んでいたので、産生されたモノクローナル抗体は、細胞表面の抗原決定基に対する可能性が高かった。しかし、そのような細胞表面タンパク質はまた、細胞表面に存在することに加えて、細胞内に存在し得る、または細胞表面から分泌または放出され得る。抗原が細胞表面または内部に存在するか、または細胞から放出されるかは、細胞の型によって異なり得、またはあるいは、細胞周期の異なる段階、異なる発達段階、または病的でない（すなわち正常な）細胞と比較して病的な細胞におけることに依存し得る。
【０１０４】
抗原のさらなる特徴付けは、異なる組織または細胞における発現パターン、細胞および／または組織におけるコピー数を決定することによって、およびそれに結合する抗体によって達成し得る。１つの局面において、発現パターンを、生物学的試料を用いた免疫組織化学的技術を使用して決定した。抗原の発現パターンを、癌を有するまたは有さない、またはあるいは別の疾患状態の個体において評価し得る。抗原のコピー数を、標準的なＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いることによって決定し得る。Ａｇ−ＰＡ７の発現パターンの決定を、実施例８−１１でさらに詳細に記載した。
【０１０５】
（Ａｇ−ＰＡ７、ＣＤ４６の使用方法）
一旦、抗原（例えばＡｇ−ＰＡ７）が同定および特徴付けされたら、その抗原についての情報（例えば配列）を、様々な目的のために使用し得る。抗体ｍＰＡ７の抗原は、ＣＤ４６であると決定された。ＣＤ４６の配列は、米国特許第５，８４６，７１５号、同第５，５１４，７８７号、同第５，５５２，３８１号、同第５，７０３，０４６号、および同第６，２１８，５２０号において開示された。１つの局面において、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の配列を、それに結合する抗体を作製するために使用し得る。例えば、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）配列を、発現ベクターにクローニングし、そして適当な宿主細胞に発現させて、動物への注入および続くハイブリドーマ産生のための免疫源を作製し得る。抗体の作製方法は以下で記載する。別の局面において、抗体ｍＰＡ７の配列を使用して、抗体を組換え的に作製し得る。組換え抗体の作製方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）および米国特許第５，６６５，５７０号；同第５，６７７，４２５号；同第５，７６０，１８５号；同第５，７７３，２４７号；および同第５，９２９，２１２号を参照のこと。さらに別の局面において、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）を使用して、本明細書中で記載したような抗体を作製し得、そしてＡｇ−ＰＡ７に結合する抗体を、新規で潜在的な生物学的に機能的なエピトープを発見するために、エピトープマッピングおよび／または他の抗体との交差競合のために使用し得る。
【０１０６】
Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の別の使用は、タンパク質、ペプチド、または低分子リガンドの可能性のあるレセプターとして、薬物スクリーニング目的についてである。薬物、化合物、タンパク質、低分子、および医薬品組成物を、Ａｇ−ＰＡ７単独に、または抗体ｍＰＡ７および本明細書中で記載されたあらゆる他のＣＤ４６結合部分と組み合せて結合する能力、およびそのような結合によって生じるあらゆる効果または増強された効果に関して試験し得る。Ａｇ−ＰＡ７を基質に結合し、そして効果をモニターし得る。そのような効果は、細胞内経路調節、アポトーシス、細胞活性化、細胞代謝、または細胞アネルギーの変化を含み得るがこれらに限らない。Ａｇ−ＰＡ７の結合は、その生物学的役割（例えば、調節タンパク質、成長、分化、または発達に関連するタンパク質等）を解明し得る。
【０１０７】
Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の別の使用は、Ａｇ−ＰＡ７に対する抗体の精製についてである。１つの実施形態において、哺乳類をあらゆる免疫源（例えば癌細胞）で免疫し得、そしてそれらの脾臓細胞を除去し、そしてハイブリドーマを作製するために使用し得る。ハイブリドーマ上清を、Ａｇ−ＰＡ７が固定化されたアフィニティーカラムに通し得る。
【０１０８】
タンパク質または核酸としてのＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）を、ワクチン接種の目的（例えば活性免疫）に使用し得る。ある場合において、Ａｇ−ＰＡ７をアジュバントと共にワクチン接種のために投与し得る。他の場合において、アジュバントは使用せず、そしてＡｇ−ＰＡ７をニートで投与する。投与経路はワクチン接種によって異なるが、標準的なワクチン接種の経路は、注射および経口摂取である。例えば、米国特許第６，２２１，６４４号；同第６，１１７，６５３号；同第６，１１０，７２４号；および同第５，９３２，２２５号を参照のこと。
【０１０９】
Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）のさらに別の使用は、ハイスループットスクリーニングのためにＡｇ−ＰＡ７またはその一部を使用することである。例えば、Ａｇ−ＰＡ７のＤＮＡ配列を固体または半固体基板に固定化し得、そして個体のパネル由来の生物学的試料から単離したＤＮＡを使用して、ハイブリダイゼーションが起こるかどうか決定し得る。１つの実施形態において、核酸の相補鎖を使用してハイブリダイゼーションを最適化する。このアプローチは、癌細胞またはＡｇ−ＰＡ７を発現する他の細胞に関して個体をスクリーニングするのに有用であり得る。
【０１１０】
（ｍＰＡ７、ｍＰＡ７と等価な抗体またはＣＤ４６に結合するポリペプチドを用いて癌を診断する方法）
モノクローナル抗体ｍＰＡ７および等価な抗体または本明細書中で開示された方法によって作製されたＣＤ４６に結合するｍＰＡ７のポリペプチド誘導体を、診断目的のために、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓を含むがこれらに限らない、様々な組織における癌細胞の存在または非存在を同定または検出するために使用し得る。単純さのために、これらの方法は、本明細書中で記載されたＣＤ４６結合実施形態のいずれにも適用されるという理解で、一般的にｍＰＡ７または抗体に言及する。検出は、一般的に細胞を抗体またはＣＤ４６に結合する本明細書中で記載したポリペプチドと接触させること、およびＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）とＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）に特異的に結合する抗体（例えばｍＰＡ７、ｍＰＡ７のヒト化抗体、ヒト抗体またはあらゆる他のＣＤ４６結合部分）との間の複合体形成を含む。そのような複合体の形成は、インビトロまたはインビボであり得る。理論に拘束されることなく、モノクローナル抗体ｍＰＡ７は、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の細胞外ドメインによってＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）に結合し得る。
【０１１１】
ある実施形態において、細胞由来のＣＤ４６を検出することによって、前立腺癌細胞の存在または非存在を検出する方法が提供される。前立腺癌細胞由来のＣＤ４６を、ＣＤ４６  ｍＲＮＡの検出、およびＣＤ４６タンパク質の検出を含むがこれらに限らない、あらゆる方法を用いて検出し得る。本明細書中で記載したもののような、あらゆるＣＤ４６結合部分を使用し得る（例えば、ｍＰＡ７、ｍＰＡ７と同じエピトープに結合するもののような、ｍＰＡ７と等価な抗体）。本明細書中で使用される場合、検出は定性的および／または定量的検出を含み得、そして癌細胞におけるＣＤ４６発現の増加したレベルに関して、測定したレベルを正常前立腺細胞と比較する工程を含み得る。
【０１１２】
診断のために抗体を使用する１つの方法は、抗体を標識部分（例えば蛍光剤、放射活性または放射線不透過性の薬剤）に連結し、抗体を患者に投与し、そしてＸ線または他の画像化機械を使用して抗原を発現する癌細胞の表面における標識抗体の局在化を視覚化することによる、インビボ腫瘍画像化である。標識部分は当該分野で公知である。
【０１１３】
他の方法において、癌細胞を除去し、そして組織を当該分野で周知の方法（例えば、凍結化合物への包埋、固定化ありまたはなしでの凍結および薄片作製；抗原回復および対比染色の様々な方法ありまたは無しでの固定およびパラフィン包埋）によって免疫組織化学のために調製する。モノクローナル抗体も、発達の異なる段階における新生物を同定するために使用し得る。抗体をまた、どの患者の腫瘍が抗原をその表面に前もって決定したレベルで発現しているか、そして従ってその抗原に特異的な抗体を用いた免疫療法の候補であるか決定するために使用し得る。
【０１１４】
抗原を認識する抗体（またはポリペプチド）をまた、生きているまたは死につつある癌細胞から、血液、唾液、尿、肺液（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、または腹水を含むがこれらに限らない体液へ放出または分泌された抗原を検出する、診断的イムノアッセイを作製するために使用し得る。実施例でさらに詳細に議論するように、ｍＰＡ７は、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、および膵臓を含むがこれらに限らない組織由来の、異なる段階における様々な型の癌に結合し得る。診断的目的のためにｍＰＡ７を用いる方法は、どの腫瘍が所定の治療に反応する可能性が高いか、患者の予後、腫瘍のサブタイプまたは転移疾患の起源、および疾患の進行または治療に対する反応を決定するために、あらゆる形式の抗癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）の前および後両方に有用である。
【０１１５】
（治療的目的のためにｍＰＡ７、ｍＰＡ７と等価な抗体、またはポリペプチドを使用する方法）
モノクローナル抗体ｍＰＡ７および本明細書中で開示された方法によって作製された等価な抗体（および本発明の他のポリペプチド実施形態）を、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓または膵臓の癌を含むがこれらに限らない、癌を有する個体において治療目的のために使用し得る。ある実施形態において、その癌は前立腺である（ただし、その前立腺癌は、抗体またはポリペプチドに結合する）。これらの治療方法はまた、上記で記載した連結した実施形態にも適用される。単純さのために、これらの方法は、連結した実施形態を含む本明細書中で記載したヒト化抗体およびヒト抗体を含むがこれらに限らない、本明細書中で記載したあらゆるＣＤ４６結合実施形態に適用されるという理解で、一般的にｍＰＡ７または抗体に言及する。ｍＰＡ７による治療は、上記のように、インビトロおよび／またはインビボの両方で、ｍＰＡ７およびＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）の複合体の形成を含み得る。１つの実施形態において、モノクローナル抗体ｍＰＡ７は、癌細胞（例えば前立腺癌細胞）に結合し、そして成長および／または増殖を抑制し得る。別の実施形態において、モノクローナル抗体ｍＰＡ７は、癌細胞に結合し、そしてアポトーシス細胞死を誘導し得る。別の実施形態において、モノクローナル抗体ｍＰＡ７は、癌細胞に結合し、そして転移の発生を遅らせ得る。別の実施形態において、モノクローナル抗体ｍＰＡ７は、癌細胞に結合し、そしてｍＰＡ７に連結した治療剤（毒素、または放射活性化合物のような）を癌細胞へ伝達し得る。ある実施形態に関して、治療剤（例えば、毒素）は細胞内に導入される（すなわち、内在化される）。これらの方法に特に適当な薬剤は、細胞内で活性な薬剤を含む。そのような薬剤の例としては、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、カリーチアマイシン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）が挙げられるがこれらに限らない。ある実施形態において、これらの薬剤はｍＰＡ７に連結され、そして前立腺、卵巣、乳房、または結腸の癌細胞に内在化される。一般的に、これらの実施形態において、有効量（治療剤を標的癌細胞におよび／またはその中に送達するのに十分な量）が個体に投与される。さらに別の実施形態において、癌を有する個体に、ｍＰＡ７を用いた緩和治療を与える。癌患者の緩和治療は、癌の進行に直接影響を与えずに、疾患の有害な症状、または疾患のために与えられた他の治療によって生じる医原性の症状を治療または軽減することを含む。これは、痛みの緩和、栄養的な維持、性的な問題、心理学的苦痛、うつ、疲労、精神障害、嘔気、嘔吐等の治療を含む。
【０１１６】
本発明はまた、ＣＤ４６に結合する抗体または他の実施形態を用いて、前立腺、肺、乳房、卵巣、膵臓、腎臓の癌細胞の成長および／または増殖を阻害する方法を提供する。ＣＤ４６に結合する抗体が記載されている。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ０２／１８９４８；Ｓｐａｒｒｏｗら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１（１９８３）；Ｓｅｙａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：８３７（１９８６）；Ｈｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：２１（１９８８）を参照のこと。癌細胞の成長および／または増殖の阻害における、抗体の活性を試験する方法は、当該分野で公知であり、そして実施例１２および１３で詳細に記載する。
【０１１７】
本発明はまた、ｍＰＡ７抗体またはｍＰＡ７が優先的に結合する同じエピトープに優先的に結合する抗体を用いた、癌細胞（例えば、前立腺、肺、乳房、結腸、卵巣、膵臓、腎臓の癌細胞）の成長および／または増殖を阻害する方法を提供する。
【０１１８】
本発明はまた、ｍＰＡ７またはｍＰＡ７と等価な抗体または本明細書中で記載されたポリペプチドを用いた、ＣＤ４６を発現する血管内皮細胞（例えば、静脈内皮細胞）の成長および／または増殖を阻害する方法を提供する。実施例１４を参照のこと。本発明はまた、ｍＰＡ７またはｍＰＡ７と等価な抗体または本明細書中で記載されたポリペプチドを用いた、血管新生を阻害する方法を提供する。これらの方法（成長および／または増殖および／または血管新生の阻害）のある実施形態において、抗体は治療剤に連結する。その治療剤は、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、カリーチアマイシン、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、またはメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）を含むがこれらに限らない、本明細書中で記載したあらゆる治療剤であり得る。
【０１１９】
さらに別の実施形態において、ｍＰＡ７または本明細書中で記載したあらゆるＣＤ４６実施形態は、ＣＤ４６を発現する癌細胞に結合し、そしてＡｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）を発現する癌細胞に対して活性免疫応答を誘導し得る。ある場合において、活性免疫応答は、癌細胞の死を引き起こし得る（例えば、ｍＰＡ７の癌細胞への結合がアポトーシス細胞死を誘導する）、または癌細胞の成長を阻害し得る（例えば、細胞周期の進行を阻害する）。別の場合において、ｍＰＡ７または本明細書中で記載したあらゆるＣＤ４６抗体は、癌細胞に結合し得、そして抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が、ｍＰＡ７が結合する癌細胞を排除し得る。よって、本発明は、本明細書中で記載したあらゆる組成物を投与することを含む、免疫応答を刺激する方法を提供する。
【０１２０】
ある場合において、ｍＰＡ７の結合はまた、細胞性および体液性免疫応答をどちらも活性化し得、そしてより多くのナチュラルキラー細胞を回復するか、またはサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等）の産生を増加させ、それは個体の免疫系をさらに活性化して癌細胞を破壊する。さらに別の実施形態において、ｍＰＡ７は、癌細胞に結合し得、そしてマクロファージまたは他の食細胞が、癌細胞にオプソニン作用を与え得る。
【０１２１】
ある実施形態において、本発明は、本明細書中で記載したあらゆる組成物を投与することを含む、受動免疫を与える方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、本明細書中で記載したあらゆる組成物（結合物を含む）を、ＣＤ４６を発現する癌細胞のような、ＣＤ４６を発現する細胞に送達する方法を提供する。これらの方法は、本明細書中で記載した組成物（結合物を含む）を個体へ投与することを伴う。ある実施形態において、例えば結合物を標的細胞内へ導入する方法が提供される。さらに別の実施形態において、ｍＰＡ７を治療薬（放射活性分子、毒素、例えばサポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、カリーチアマイシン、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、またはメイタンシノド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）または他の化学療法分子のような）に、または化学療法化合物を含むリポソームまたは他の小胞に結合し、そして抗体によって認識される抗原を含む癌細胞にこれらの化合物を標的化し、そして従って癌細胞を除去するために個体に投与し得る。さらに別の実施形態において、転移の発現を遅らせるために、その抗原を発現する癌の外科的除去の際に、アジュバント治療としてその抗体を採用し得る。腫瘍の大きさを減少させるために、そして従って手術を可能にするまたは単純化する、手術中に組織を残す、および／または生じる傷を減少させるために、その抗原を発現する腫瘍を有する患者において、手術の前にその抗体を投与し得る（ネオアジュバント治療）。
【０１２３】
キメラ抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要な特異性の抗原Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）認識部位を含むｍＰＡ７のあらゆる他の修飾された構成のような、ｍＰＡ７および等価な抗体または断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）の様々な処方を、投与のために使用し得る。ある実施形態において、ｍＰＡ７抗体およびそのｍＰＡ７の様々な処方を、そのままで投与し得る。他の実施形態において、ｍＰＡ７またはそのｍＰＡ７の様々な処方（本明細書中で記載したあらゆる組成物実施形態を含む）および薬剤学的に許容できる賦形剤を投与し、そして様々な処方であり得る。薬剤学的に許容できる賦形剤は、当該分野で公知であり、そして薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形または堅さ（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を与え得る、または希釈剤として作用し得る。適当な賦形剤は、安定化剤、湿潤および乳化剤、容量オスモル濃度を変化させる塩、カプセル封入剤、緩衝液、および皮膚透過増強剤を含むがこれらに限らない。賦形剤および非経口および非経口でない（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬剤送達のための処方が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）において述べられる。
【０１２４】
一般的に、これらの薬剤は注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等）による投与のために処方されるが、他の投与形式（例えば経口、粘膜等）も使用し得る。よって、ｍＰＡ７抗体およびそれと等価なものを、好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等のような薬剤学的に許容できる担体と組み合せる。特定の投与レジメ、すなわち、投与量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の医療歴に依存する。一般的に、以下の投与量のいずれかを使用し得る：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、またはより多くの投与量が投与される。半減期のような、経験的な考察が、一般的に投与量の決定に寄与する。ヒト化抗体、または完全なヒト抗体のような、ヒト免疫系と適合性の抗体を、抗体の半減期を延長するために、および宿主の免疫系によって抗体が攻撃されるのを防ぐために使用し得る。
【０１２５】
ある個体において、１回以上の投与が必要であり得る。投与の頻度を、治療の進行にかけて決定および調整し得、そして癌細胞の数の抑制、癌細胞の抑制の維持、癌細胞の成長および／または増殖の抑制、または転移の発現の遅延に基づく。癌細胞の存在を、当業者に公知の、または本明細書中で議論された多くの方法のいずれか（例えば、生検または生物学的試料の免疫組織化学またはフローサイトメトリーによる検出）によって同定し得る。ある場合において、ｍＰＡ７抗体の持続連続放出処方が適当であり得る。持続放出を達成する様々な処方および装置が当該分野で公知である。
【０１２６】
１つの実施形態において、ｍＰＡ７抗体の投与量を、１回またはそれ以上の投与を受けた個体において経験的に決定し得る。個体にｍＰＡ７の増加する投与量を与える。ｍＰＡ７または他の等価な抗体の効果を評価するために、特定の癌疾患状態のマーカーをモニターし得る。これらのマーカーは、触診または視覚的観察による腫瘍サイズの直接的測定；Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定；直接的腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡検査によって評価されるような改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌に関してはＰＳＡ）の測定、痛みまたは麻痺の減少；言語、視覚、呼吸または腫瘍に関連する他の制約の改善；食欲の増加；または受け入れられた試験によって測定された生活の質の増加または生存の延長を含む。投与量は、その個体、癌の型、癌の段階、癌がその個体の他の位置に転移し始めたかどうか、および使用される過去および現在の治療に依存して変化することが、当業者に明らかである。
【０１２７】
他の処方は、リポソームのようなキャリアを含むがこれに限らない、当該分野で公知の適当な送達形式を含む。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照のこと。リポソーム調製物は、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎｓ）、多重膜ベシクル、および単膜ベシクルを含むがこれに限らない。
【０１２８】
ある実施形態において、1つより多くの抗体が存在し得る。その抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。そのような組成物は、癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの異なる抗体を含み得る。ｍＰＡ７抗体を、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、骨、上部消化管、および膵臓を含むがこれに限らない臓器における癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の、１つまたはそれ以上の抗体と混合し得る。抗体の混合物は、それらは当該分野において多くの場合に意味されるように、個体のより広い範囲の集団を治療するのに特に有用であり得る。
【０１２９】
疾患の評価を、画像化方法および適当なマーカーのモニタリングのような、当該分野で標準的な方法を用いて行なう。
【０１３０】
（Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）に結合する、本発明の抗体およびポリペプチドを含むキット）
本発明はまた、診断および／または治療において使用するために、ＣＤ４６に結合する、抗体または本明細書中で記載した組成物のいずれかを含むキットを提供する。よって、キットは、ＣＤ４６に選択的に結合し得る、および／またはＣＤ４６と複合体を形成し得る抗体を含む（例えば、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓の癌細胞を検出するのに有用である）。ある実施形態において、そのキットは抗体ｍＰＡ７またはｍＰＡ７が選択的に結合するのと同じエピトープに選択的に結合する抗体を含む。ある実施形態において、そのキットは、治療薬または標識薬剤に連結した、抗体ｍＰＡ７またはｍＰＡ７が選択的に結合するのと同じエピトープに選択的に結合する抗体を含む。これらのキットはさらに、抗体または本明細書中で記載したあらゆる抗体またはポリペプチド実施形態を、治療薬または標識薬剤に連結するための、指示および／または試薬を含み得る。ある局面において、抗体（例えばモノクローナル、ポリクローナル、ヒト、ヒト化等）のＣＤ４６への結合を、個体において癌を診断するために使用する、例えば癌細胞の存在または欠如を検出するためのキット、および乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または腎臓の癌細胞の存在または欠如を検出するキットである。他の局面において、そのキットを、例えば癌を有する、または癌の家族歴を有する個体を治療するために使用し得る。癌を有する個体を治療するキットは、前立腺癌のような癌細胞の成長および／または増殖を阻害するためのキット、癌細胞に治療薬を送達するためのキット、前立腺、卵巣、乳房、または結腸の癌細胞のような癌細胞内に治療薬を送達するキットを含むがこれに限らない。本発明のキットは、適当なパッケージング内にあり、そして任意で、緩衝液のようなさらなる成分、および捕獲試薬、展開試薬、標識、反応表面、検出の手段、コントロール試料、および説明的情報のような、Ａｇ−ＰＡ７（ＣＤ４６）への結合を決定するための指示を提供し得る。その指示は、本明細書中で記載したそれらのアッセイを含むがこれに限らない、抗原の結合のあらゆる測定に関するものであり得る。他の実施形態において、その指示は、前立腺癌のような癌細胞の成長および／または増殖を阻害すること、癌細胞に治療薬を送達すること、前立腺、卵巣、乳房、または結腸の癌細胞のような癌細胞内に治療薬を送達することに関する指示を含む、本明細書中で記載したあらゆる方法に関するものであり得る。ある実施形態において、上記で記載した試薬を、時間をかけて同じ個体における、または複数の個体における測定を可能にするような、複数の測定を行い得るように供給する。標識抗ヒト抗体のような、抗体の結合を検出するあらゆる適当な手段を採用し得（およびキット中で提供し得る）、ここでその標識は酵素、蛍光団、化学発光物質、放射性同位元素または補酵素であり得る。一般的に、使用される標識は酵素である。
【０１３１】
以下の実施例を、本発明を制限するためでなく、説明するために提供する。
【０１３２】
実施例
（実施例１  免疫源としてのヒト膵臓上皮前駆（ｈＰＥＤ）細胞の調製）
胎児膵臓（妊娠１４−２２週齢）を、酵素的分解の前に、立体顕微鏡下で顕微解剖によって機械的にばらばらにした。酵素処理は、部分的に分解した組織を、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ−４、１ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ、および５０μｇ／ｍｌのＤＮＡアーゼを含むＣａフリーおよびＭｇフリーのＰＢＳに、摂氏３７℃で１５分間置くことからなっていた。
【０１３３】
細胞凝集物を、５％（容量によって）のＢＳＡ勾配の上に重ね、そして１１００ｒｐｍで６分間、遠心によって洗浄した。まだ凝集した形式のペレット化した細胞を、以下の因子を含むＣＭＲＬ１０６６栄養培地からなる増殖培地中に再懸濁した：
【０１３４】
【数１】
2005511525.tif 000002
再懸濁した細胞凝集物を、２４穴皿のフィブロネクチンでコートしたウェル（６−１２）にアリコートに分け、そして加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて摂氏３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、上皮細胞凝集物を、Ｆ１２／ＤＭＥＭプラス上記の因子中で、フィブロネクチンでコートした皿に移した。凝集物は接着し、そして接着した単層を形成した。凝集物および接着した単層をどちらも、継代５回まで、モノクローナル抗体を産生するために免疫源として使用した。
【０１３５】
（実施例２  ｈＰＥＤに対するモノクローナル抗体の産生）
非変性アジュバント（Ｒｉｂｉ、Ｒ７３０、Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＴ）をリン酸緩衝化生理食塩水中で４ｍｌに再水和した。１００μｌのこの再水和アジュバントを、次いで４００μｌのハンクスの平衡塩類溶液で希釈し、そしてこれを続いて免疫に使用する細胞ペレットと静かに混合した。マウスあたり約１０６のｈＰＥＤ細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１週間に１度足蹠に注射した。毎週の注射の６週間後に、各免疫動物の尾から１滴の血液を取り、ＦＡＣＳ分析を用いてｈＰＥＤに対する抗体の力価を試験した。力価が少なくとも１：２０００に達した時、マウスをＣＯ２室内で屠殺し頸部脱臼した。ハイブリドーマ調製のために、リンパ節を回収した。
【０１３６】
最も高い力価を有するマウス由来のリンパ球を、３５％ポリエチレングリコール４０００を用いて、マウス骨髄腫系統Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。融合の後１０日目に、ハイブリドーマ上清を、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、ｈＰＥＤ特異的モノクローナル抗体の存在に関してスクリーニングした。各ハイブリドーマ由来のならし培地を、ＰＣ３、Ｃｏｌｏ−２０５、ＬｎＣａｐ、またはＰａｎｃ−１細胞の組み合せたアリコートと３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞試料を洗浄し、０．１ｍｌの希釈剤に再懸濁し、そして１μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧのＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）２断片と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎ細胞分析器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析した。ハイブリドーマクローンを、ＦＡＣＳによって評価したように、１つまたはそれ以上の細胞系統の表面への結合に基づいて、さらなる増殖、クローニング、および特徴付けのために選択した。Ａｇ−ＰＡ７と呼ばれる抗原、およびＡｇ−ＰＡ７．１と呼ばれるその抗原上のエピトープに結合する、ｍＰＡ７と呼ばれるモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを選択した。
【０１３７】
（実施例３  抗原供給源に対する抗体のパネルのスクリーニング）
ｈＰＥＤ細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡの存在下で組織培養フラスコから分離し、１４００ｒｐｍで５分間遠心し、そして１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ希釈剤）に再懸濁した。細胞を計測し、そして１０７細胞／ｍｌに調整した。細胞の約０．１ｍｌを、１００μｌのハイブリドーマ上清または１００μｌのＦＡＣＳ希釈剤中１μｇの精製モノクローナル抗体と、３７℃で３０分間インキュベートした。モノクローナル抗体を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて組織培養上清から精製した。抗体精製過程に以下の材料を使用した：ハイブリドーマ組織培養上清、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１０１１、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  ＩｇＧ  溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１００９）、濃縮ＨＣｌ（ｐＨの調整のため）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  １リットルＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、０．２２μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３１０９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧｒａｄｉＦｒａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ＃１７−０６１８−０２）、３ＭのＫＳＣＮ／５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．８であるＳｔｒｉｐｐｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、およびＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）３Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０。
【０１３８】
ｍＰＡ７抗体を精製するために、上清の容量を測定し、そして同じ容量の結合緩衝液を上清に加えた。混合物を、室温で平衡化させた。上清を、０．２２μｍのフィルターを通すことによって透明にした。上清を、ＧｒａｄｉＦｒａｃシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、プロテインＧカラムにかけた。カラムを、５−１０カラム容量の結合緩衝液で洗浄した。モノクローナル抗体を、溶出緩衝液によって溶出し、そして２ｍｌの画分を回収した。その画分のＯＤ２８０の測定値を得て、そしてモノクローナル抗体を含む画分をプールした。溶出されたモノクローナル抗体画分を、１／２０容量の３Ｍ  Ｔｒｉｓを加えることによって中和した。試料を、１×ＰＢＳ中４℃で透析した（交換あたり少なくとも３時間、３回緩衝液を交換した）。精製モノクローナル抗体を、滅菌ろ過し（０．２μＭ）、そして２〜８℃で保存した。
【０１３９】
ハイブリドーマ上清からｍＰＡ７モノクローナル抗体を精製した後、それをｈＰＥＤ細胞への結合に関して再試験した。細胞試料を上記の実施例６において記載したように調製し、そして精製抗体と様々な濃度でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、０．１ｍｌの希釈剤に再懸濁し、そして１μｇのヤギ抗マウスＩｇＧのＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）２断片と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎ細胞分取器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて分析した。ＦＡＣＳｃａｎヒストグラムにおける右へのシフトは、精製抗体がまだｈＰＥＤ細胞に結合していることを示した。
【０１４０】
（実施例４  抗原Ａｇ−ＰＡ７の同定および特徴付け）
ＬｎＣａｐ細胞系統（ＡＴＣＣから市販で入手可能）の約２５μｌのパックセル容積（ｐａｃｋｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｏｌｕｍｅ）の細胞ペレットを、最初に細胞を水中で０．５ｍｌに希釈すること、続いて３回凍結および解凍することによって溶解した。その溶液を１４，０００ｒｐｍで遠心した。細胞膜断片を含む、できたペレットを、５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に再懸濁した。その試料を８０℃で５分間加熱し、そして次いで１４，０００ｒｐｍで２分間遠心してあらゆる不溶性の物質を除去した。Ａｇ−ＰＡ７を発現し、そして精製に使用し得る他の細胞系統は、ＨＰＡＦ、Ｃｏｌｏ−２０５およびＰａｎｃ−１、または表３に示すようなｍＰＡ７に結合する他の細胞系統を含む。
【０１４１】
その試料を、製造会社に指示に従って、４から２０％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてウェスタンブロットによって分析した。１０μｌの膜試料を、ポリアクリルアミドゲルの１つのレーンにアプライした。別の１０μｌの試料を、最初に８０℃で２分間加熱して２μＬのジチオトレイトール（１００ｍＭ）を加えることによって還元し、そして次いで別のレーンにかけた。前染色した分子量マーカーＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてゲルにおける分子量を評価した。ゲルタンパク質を、１４．４ｇ／ｌのグリシン、３ｇ／ｌのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、１０％のメタノール、および０．０５％のＳＤＳの転移緩衝液を用いて、ニトロセルロース膜に転移させた。その膜を固定し、抗体ｍＰＡ７で（０．５μｇ／ｍｌの濃度で）プローブし、そして製造会社の指示によって、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｋｉｔ−ＡｎｔｉＭｏｕｓｅを用いて展開した。膵臓腫瘍細胞膜試料の還元試料において、約５５ｋＤａ±１０％に移動する顕著なバンドが観察された。
【０１４２】
（実施例５  抗原Ａｇ−ＰＡ７の単離）
精製抗体ｍＰＡ７を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ３０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号４２０８番）を用いて、約１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。約１ｍｇのｍＰＡ７を、製造会社の指示によって、０．３５グラムの臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号１７−０４３０−０１番）に共有結合的に結合させた。新規に増殖させたＨＰＡＦ、Ｃｏｌｏ−２０５、ＬｎＣａｐ、またはＰａｎｃ−１細胞（約２×１０９細胞）を、スピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋ）から回収した。細胞を遠心してペレット化し、次いで１００μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号第Ｐ８３４０番）を含む全体で１５ｍＬの脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）に再懸濁した。
【０１４３】
細胞懸濁液を、−８０℃で凍結し、次いで解凍した。この過程を、細胞を破壊するために５回繰り返した。細胞膜を、エッペンドルフ微量遠心機で、１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心することによって回収した。
【０１４４】
細胞膜ペレットを、２％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ  界面活性剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号３２４６９０番）、および５０μｌのＳｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｐＨ７．０を含む、２ｍｌのハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、カタログ番号１４１７５−０７９番）に再懸濁した。細胞膜調製物を次いで４℃で一晩、回転器（ｒｏｔａｔｏｒ）に置いた。
【０１４５】
細胞膜調製物を、１％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢの最終濃度までＨＢＳＳで希釈した。不溶性の細胞破片を、エッペンドルフ微量遠心機で、１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心することによって除去した。可溶性膜タンパク質を含む上清を回収し、そしてアフィニティー精製で使用するまで、−８０℃で保存した。
【０１４６】
細胞膜抽出物を解凍し、次いで前に調製したｍＰＡ７アフィニティーゲルと混合し、そして４℃で２時間回転させた。インキュベーション後、アフィニティーゲルを以下のように徹底的に洗浄した：血清−および添加剤−フリーのＨＢＳＳ＋１．０％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで５回→血清−および添加剤−フリーのＨＢＳＳ＋０．５％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで３回→血清−および添加剤−フリーのＨＢＳＳ＋０．２５％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで３回→血清−および添加剤−フリーのＨＢＳＳ＋０．１２５％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで２回→血清−および添加剤−フリーのＨＢＳＳ単独で２回→ｄＨ２Ｏ中０．５ＭのＮａＣｌで１回→ＰＢＳで１回。
【０１４７】
各洗浄は、１．５ｍｌであった０．５ＭのＮａＣｌ洗浄を除いて、５．０ｍＬからなっていた。次いで抗原をアフィニティーゲルから１．５ｍｌのｄＨ２Ｏ中２％の酢酸で２分間溶出した。０．５ＭのＮａＣｌ洗浄および酸溶出抗原を保持し、そして中温で約２．５時間ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ  カタログ番号ＩＳＳ１１０番）を用いて、各試料の容量を約１００μｌに減少させた。
【０１４８】
試料を次いで沈殿させ、そして４００μｌのメタノールおよび１００μｌのクロロホルムを加えることによって抽出した。試料をボルテックスし、次いで３００μｌのｄＨ２Ｏを加えて、そして静かに混合した。試料をエッペンドルフ微量遠心機において、１４，０００ｒｐｍで４分間、室温で遠心した。タンパク質は液相の界面に局在するので、上の層のほとんどを廃棄した。４００μｌのメタノールを試料の残りに加え、そして静かに混合した。試料を再び１４，０００ｒｐｍで４分間、室温で遠心した。上清を廃棄し、そしてＳｐｅｅｄＶａｃを使用して試料を完全に乾燥させた。
【０１４９】
乾燥試料を、電気泳動の準備のために、２８μｌの１×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ００７番）を加えることによって再構成した。試料を７５℃で１０分間加熱し、次いで微量遠心機において遠心し、そしてボルテックスして混合した。各試料の２５μｌを、続く抗原同定のために、成形済みＮｕＰＡＧＥ４−１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２２番）の単一のレーンにかけた。ウェスタンブロット分析のために、２μｌを別のレーンにかけた。アフィニティー樹脂とのインキュベーション前および後の細胞膜タンパク質抽出物の試料と同様に、適当な分子量標準もゲルに含んだ。電気泳動を、製造会社の指示によって行った。ゲルを１０％の酢酸を含む５０％のメタノール中で３０分間固定し、次いでＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号第ＬＣ６０２５番）を用いて、製造会社の指示に従って染色した。ゲルの非固定部分を、再び製造会社の指示に従って、ウェスタンブロッティングのためにニトロセルロースシート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号第ＬＣ２０００番）に転移させた。ブロットを次いでｍＰＡ７でプローブし、そして抗原認識を確認するために、ウェスタンブロッティングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号第ＷＢ７１０３番）を用いて展開した。
【０１５０】
ＮｕＰＡＧＥゲルからの染色されたタンパク質のバンドを、清潔な外科用メス刃を用いて摘出し、そして清潔なエッペンドルフチューブに置いた。摘出したバンドを、質量分析によるタンパク質同定に使用するまで、−２０℃で保存した。
【０１５１】
（実施例６  ＭＡＬＤＩ質量分析を用いた、ｍＰＡ７が結合する抗原の特徴付け）
ｍＰＡ７が結合する抗原を、実施例５で記載したように単離し、そしてＭＡＬＤＩ質量分析にかけた。イムノアフィニティーカラムの溶出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてバンドを摘出および抽出した。ゲル切片を、典型的には「ゲルにおいて」消化した（Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉ，Ｆ．、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｒ．、Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｉｍａｉ，Ｂ．Ｓ．およびＭｉｓｃｈｅ，Ｓ．Ｍ．（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０、６０１−６０５）。抽出したペプチドを、Ｋｒａｔｏｓ、ＡＸＩＭＡ  ＣＲＦにおいてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）によって分析した。ペプチド質量を１００ｐｐｍ内で決定し、そしてカーブドフィールドリフレクトロン（ｃｕｒｖｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）を有するタイムイオンゲート（ｔｉｍｅ  ｉｏｎ  ｇａｔｅ）を、ペプチドの単離およびポスト−ソース−ディケイ（ｐｏｓｔ−ｓｏｕｒｃｅ−ｄｅｃａｙ）（ＰＳＤ）による断片化のために採用した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｃｌａｕｓｅｒ，Ｋ．Ｒ．、Ｂａｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．、およびＢｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ａ．Ｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７１、２８７１−（１９９９）ＭＳＦｉｔおよびＭＳＴａｇ）によって検索を行なった。抗原はＣＤ４６であると同定された。
【０１５２】
（実施例７  ｍＰＡ７に結合するＣＤ４６上のエピトープの特徴付け）
ｍＰＡ７が結合するＣＤ４６上のエピトープがジスルフィド結合依存性であるかどうかを試験するために、免疫沈降およびウェスタンブロッティング技術を使用した。ヒト結腸癌細胞系統、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３８）を、溶解緩衝液（ＨＢＳＳ＋２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭのＰＭＳＦ、０．１％のアジ化ナトリウム、および溶解緩衝液５ｍｌあたり１錠のＥＤＴＡフリー完全ミニプロテアーゼカクテルを含む（ＥＤＴＡフリー完全ミニプロテアーゼカクテルはＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た；全ての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た））中、氷上で５分間インキュベートすることによって溶解した。細胞を溶解緩衝液中でこすって、そして溶解物を回収した。溶解物を、２４，０００×ｇで１時間、４℃で遠心することによって透明にした。透明になった溶解物を、最初に５μｌのマウスＩｇＧ／ＢＳＡ結合（１ｍｇ／ｍｌ）ＣＮＢｒ  ４ＭＢセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、４℃で２時間、予備清澄化（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）した。マウスＩｇＧ／ＢＳＡビーズを除去し、そして予備清澄化溶解物を次いで１０μｇのｍＰＡ７と４℃で２時間インキュベートした。抗原およびｍＰＡ７複合体を、１０μｌのプロテインＧセファロースビーズとインキュベートした。ビーズを次いで個々に１ｍｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、続いて１ｍｌのＨＢＳＳ＋で３回洗浄した。洗浄したビーズを、２０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下または非存在下で、３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を加え、そして９９℃で５分間沸騰させることによって溶出した。試料を、４−２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転移させ、そして５μｇ／ブロットのｍＰＡ７でウェスタンブロットした。ｍＰＡ７によるウェスタンブロッティングのために、ニトロセルロースを、固定化緩衝液で１時間固定化した。ニトロセルロースを次いで、固定化緩衝液に希釈した１ｍｌの５μｇ／ｍｌのｍＰＡ７を含む、熱密閉プラスチックパウチ中でインキュベートした。ニトロセルロースを、１０ｍｌの１μｇ／ｍｌＨＲＰ結合ロバ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的、ウシ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ゴールデンハムスター、ウマ、ヒト、ウサギ、ヒツジの血清タンパク質に対して交差吸収される）と室温で１時間インキュベーションする前に、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ニトロセルロースを、最終的にＰＢＳＴで３回洗浄し、そしてＤＡＢ基質を用いた色素展開によって視覚化した。
【０１５３】
図４に示すように、ｍＰＡ７は非還元（ＮＲ）ＣＤ４６（ＤＴＴの非存在下）のみに結合するが、還元（Ｒ）ＣＤ４６（ＤＴＴの存在下）には結合せず、ｍＰＡ７が結合するエピトープはジスルフィド結合依存性であることを示す。
【０１５４】
（実施例８  免疫組織化学的方法）
癌患者由来の凍結組織試料を、ＯＣＴ化合物に包埋して、そしてドライアイスによってイソペンタン中で急速冷凍した。凍結切片を、Ｌｅｉｃａ  ３０５０ＣＭミクロトームで、５μｍの厚さに切断し、そしてベクタバウンド（ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄ）でコートしたスライドに解凍−固定した。切片を−２０℃でエタノールを用いて固定し、そして室温で一晩空気乾燥させた。固定した切片を、使用まで−８０℃で保存した。免疫組織化学のために、組織切片を回収し、そして最初に固定化緩衝液（ＰＢＳ、５％の正常ヤギ血清、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）中、室温で３０分インキュベートし、そして次いで固定化緩衝液で希釈したｍＰＡ７およびコントロールモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）と１２０分間インキュベートした。切片を次いで固定化緩衝液で３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０５および０．００３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ１００９番）中で、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼ結合物およびペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｄ５６３７番）によって検出した。染色したスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、そしてＮｉｋｏｎ顕微鏡下で検査した。凍結手術組織を用いたいくつかの実験の結果のまとめを、下記の表１に示す。ｍＰＡ７に結合する腫瘍の割合を列挙し、そして結合した数／試験した全体の数をカッコ内に示す。
【０１５５】
【表１】
2005511525.tif 000003
（実施例９  ＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭからの免疫組織学的結果）
モノクローナル抗体ｍＰＡ７を使用して、異なる型の組織由来の様々な細胞株との反応性を試験した。異なる確立した細胞株からの細胞を、プロテアーゼを使用せずに増殖表面から除去し、詰め、そしてＯＣＴ化合物に包埋した。細胞を凍結し、そして切片にし、次いで標準的なＩＨＣプロトコールを用いて染色した。ＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭ技術が、ＷＯ０１／４３８６９において記載されている。ＣｅｌｌＡｒｒａｙ結合実験からの結果を、表３にまとめる。各細胞株を、反応性（＋）または非反応性（−）として記録する。
【０１５６】
【表３】
2005511525.tif 000004
（実施例１０  ｍＰＡ７の正常組織への結合）
外科的切除によって得られた正常組織（ヒト）を、実施例８のように凍結および固定した。凍結切片を、Ｌｅｉｃａ  ３０５０ＣＭミクロトームで５μｍの厚さに切断し、そしてベクタバウンドでコートしたスライドに解凍−固定した。切片を、−２０℃でエタノールによって固定し、そして室温で一晩空気乾燥させた。ＰｏｌｙＭＩＣＡＴＭ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキットを用いて、ｍＰＡ７の正常組織への結合を決定した。１次抗体ｍＰＡ７を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。正常組織のｍＰＡ７による染色の結果を、表４に示す。
【０１５７】
【表４】
2005511525.tif 000005
（実施例１１  ヒト肺癌の染色）
図１は、ヒト肺癌のｍＰＡ７染色の写真を示す。腫瘍試料を包埋し、そして凍結切片を調製し、エタノール固定し、そしてＩＨＣを凍結切片に関して記載したように行なった。管腔上皮の先端表面における染色（茶色）は、ｍＰＡ７の腫瘍への結合を示した。形態の同定を助けるために、ｍＰＡ７を結合しない隣接する正常組織を、ヘマトキシリンで対比染色し、そして薄い青色になった。
【０１５８】
（実施例１２  前立腺癌細胞株に対するｍＰＡ７の効果）
抗癌抗体の望ましい性質は、腫瘍細胞の成長を阻害する能力である。そのような評価の１つの方法論は、抗体への曝露時の、インビトロにおける細胞の成長の減少である。単層として増殖させた場合にインビトロで細胞数を減少させる抗体の能力を、様々な量の精製試験抗体またはコントロール抗体の存在下または非存在下で増殖させた細胞単層を使用して評価し得、そして細胞数の変化を、クリスタルバイオレットを用いて評価する。クリスタルバイオレットは、非特異的タンパク質染色であり、従って相対的細胞数と関連する。
【０１５９】
関心のある細胞を、９６穴プレートで、１０％の胎児ウシ血清を補充したＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１）増殖培地にまき、そして増殖させた。２つのヒト前立腺癌由来細胞株を、９６穴皿の２連のウェルに以下の濃度でまいた：ＬｎＣａｐ（１×１０４細胞／ウェル）およびＰＣ３（５×１０３細胞／ウェル）。まいた２４時間後に、示した抗体を、図２のｘ軸に示す最終濃度まで加えた。細胞を、５％のＣＯ２／空気で加湿インキュベーターにおいて、摂氏３７℃で５日間インキュベートした。実験の最後に、培地を除去し、そしてクリスタルバイオレット溶液（メタノールおよびホルムアルデヒド中０．５％ｗｔ／ｖｏｌ）を加え、そしてプレートを室温で２０分間インキュベートした。この手順は、細胞を同時に固定および染色する。クリスタルバイオレット溶液を、プレートをはたくことによって除去した。次いでプレートを、水を充満させることによって３回洗浄した。プレートが完全に乾いた後、プレートリーダーで５４０ｎｍにおいて測定した。あるいは、色素を５０／５０の０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）およびエタノール、２００μｌ／ウェル中で可溶化し得る。プレートを次いでプラスチックフィルムで密閉し、そして色素が溶解するまで振とうする。１．５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間の濃度におけるｍＰＡ７の追加が、ＬＮ−ＣａＰ細胞の成長を９０％まで阻害した。ｍＰＡ７に結合しないＰＣ３細胞の成長には影響がみられなかった。
【０１６０】
（実施例１３  前立腺癌に対するｍＰＡ７の効果）
ヒト前立腺癌のマウスモデルを使用して、ヒト前立腺癌に対するｍＰＡ７の効力を評価した。ＬＮ−ＣａＰ（ヒト前立腺癌細胞）およびＷＩ３８（ヒト線維芽細胞）を、細胞培養から得た。各細胞型の１×１０５細胞を、コラーゲンゲルにキャスト（ｃａｓｔ）し、それを次いでＣＤ１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）の腎臓被膜下に移植した。１０日間増殖させた後、治療およびコントロールグループの各動物の宿主腎臓を、腫瘍の成長を観察および記録するために露出させた。次いで動物に最初の抗体治療またはＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）賦形剤を投与した。治療グループにおいて、１００μｌのＰＢＳ中、４回用量のｍＰＡ７抗体（１００μｇ／宿主の体重ｇ／用量）を、３日の間隔で腹腔内に投与した。コントロールグループには、同じ間隔で１００μｌのＰＢＳを注射した。宿主を、最終投薬量を投与した２日後に屠殺した。腫瘍サイズを記録し、そして腫瘍を組織学のために１０％の中性ホルマリン中で固定した。図３は、固定およびパラフィンに包埋し、次いで５μｍの切片に切断し、そしてヘマトキシリンおよびエオジンで染色した、ＬＮ−Ｃａｐ腫瘍の写真を示す。上のパネルは、ＰＢＳコントロールグループ由来の未治療前立腺癌組織を示し、そして下のパネルは、上記で開示した方法に従ってｍＰＡ７で治療した前立腺癌組織を示す。ｍＰＡ７で治療したＬＮ−Ｃａｐ腫瘍は、かなりの壊死および溶血を示し、残った少数の腫瘍細胞は異常およびアポトーシス的に見える。ＷＩ−３８細胞は、ｍＰＡ７治療によって影響を受けなかった。続く実験において、ｍＰＡ７の用量を５０μｇ／ｇ体重の４回用量、５０μｇ／ｇ体重の３回用量、または５μｇ／ｇ体重の３回用量に減少した場合でも、ＬＮ−Ｃａｐ腫瘍に対する同様の効果が見られた。
【０１６１】
続く実験において、ＰＣ３前立腺癌細胞株由来の腫瘍を、ＬＮ−Ｃａｐ細胞株に関して記載したように増殖させた。ｍＰＡ７に結合しないＰＣ３腫瘍は、ｍＰＡ７の５または５０μｇ／ｇ体重の３回用量による治療によって影響を受けなかった。これらのデータは、ｍＰＡ７は、ｍＰＡ７抗体に結合する細胞由来の腫瘍のインビボ異種移植片に対して活性であるが、ｍＰＡ７に結合しない腫瘍または正常細胞に対して影響を有さないことを示す。
【０１６２】
（実施例１４  ｍＰＡ７および毒素結合抗マウスＩｇＧの内在化）
Ｍａｂ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、タンパク質合成を阻害する毒素であるサポリンに結合した抗マウスＩｇＧである。この毒素は細胞膜に対して非透過性である。モノクローナル抗体が、内在化する細胞表面抗原に結合するなら、毒素結合物が、結合したモノクローナル（抗体）に結合し、そして内在化し、最終的には細胞を殺し得る。毒性活性を示すための内在化に依存するので、Ｍａｂ−ＺＡＰは、当該表面抗原が、細胞毒性効果を発現するために内在化に依存するあらゆる毒素の適当な標的として役立つかどうかを評価するために役立ち得る。そうであるので、Ｍａｂ−ＺＡＰは、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）およびカリーチアマイシンのような、そのような内在化依存性毒素のモデルとして役立つ。
【０１６３】
腫瘍細胞によるｍＰＡ７およびサポリン結合抗マウスＩｇＧの内在化、およびサポリンの内在化後に腫瘍細胞を殺す効果を試験するために、ヒト前立腺腫瘍細胞、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１７４０）を、ストックフラスコから１０ｍＭのＥＤＴＡによって除去し、そして遠心した。細胞を適当な培地中で５０，０００／ｍｌで再懸濁し、そして９６穴プレートにウェルあたり１００μｌをまいた。抗体ｍＰＡ７を、適当なウェルに１０×濃縮物としてすぐに加え、１０μｇ／ｍｌの最終濃度にした。室温で１５分後、Ｍａｂ−ＺＡＰ（カタログ番号ＩＴ−０４番、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、適当なウェルに１０×濃縮物として加え、０．００１ｐＭから１０４ｐＭの最終濃度にした。４日間増殖させた後、ＭＴＴ（ストック５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、ウェル中で１：１０希釈）を３７℃で４時間加えた。次いで培地を全てのウェルから除去し、そして１００μｌ／ウェルのＤＭＳＯを加えた。プレートを静かに回転させ、青色のＭＴＴ沈殿物を可溶化し、そしてプレートをプレートリーダーで５４０ｎｍにおいて読み取った。
【０１６４】
図５に示すように、Ｍａｂ−ＺＡＰを１００ｐＭより多く加えた場合に、ｍＰＡ７の非存在下における染色と比較して、ｍＰＡ７の存在下でＬＮＣａＰのＭＴＴ染色が減少し、ヒト前立腺腫瘍細胞ＬＮＣａＰの成長が、ｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰの存在下で阻害されたこと、ならびにｍＰＡ７および毒素結合抗マウスＩｇＧがＬＮＣａＰ内に内在化されたことを示す。Ｍａｂ−ＺＡＰを１０４ｐＭで使用した場合、ｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰの結合によって、ＭＴＴ染色が５０％を超えて減少し、これは、ＬＮＣａＰの成長の５０％を超える阻害に対応した。
【０１６５】
ヒト前立腺癌細胞、２２ＲＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５０５）；ヒト卵巣癌細胞、ＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ７７）；ヒト乳癌細胞、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ３０）；ヒト結腸癌細胞、ＣＯＬＯ２０５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２２）において、同様の試験を行なった。試験した上記の癌細胞全てにおいて、ｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰは内在化され、そしてこれらの細胞の成長を阻害した。
【０１６６】
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  カタログ番号第Ｃ２５１９Ａ）においても同様の試験を行なった。ＨＵＶＥＣ細胞を、コンフルエントでない状態で培養した場合、すなわち細胞が分裂および成長することが可能な場合、ｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰは内在化され、そしてこれらの細胞の成長を阻害した。しかし、ＨＵＶＥＣ細胞をコンフルエントな状態で培養した場合、すなわち細胞が一般的には分裂していない場合、ｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰは内在化されないか、または使用した条件下でこれらの細胞に対して毒性でなかった。この結果は、非分裂ＨＵＶＥＣ（それはヒトにおける正常な状態と同様である）に対する、治療薬に連結したｍＰＡ７の結合は、これらの細胞に対して毒性ではないことを示唆する。この結果はまた、治療薬に連結したｍＰＡ７を、抗血管新生薬剤として使用し得ることも示唆する。
【０１６７】
本明細書中で記載した実施例および実施態様は、説明的目的のみのためであること、およびその観点からの様々な改変または変化が当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲内に含まれることが理解される。本明細書中で引用した全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、特許または特許出願の各々が、特におよび個々に参考文献に組み込まれると示されたように同じ程度まで、本明細書によって全ての目的のためにその全体として参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、ｍＰＡ７染色ヒト肺癌を示す写真である。
【図２】図２は、ｍＰＡ７による、単層におけるＬｎＣａＰ前立腺癌細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおいて増殖させた、ＬｎＣａＰ細胞系統由来ヒト前立腺腫瘍異種移植片に対するｍＰＡ７の効果を示す写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスにおいて増殖させた、ＬｎＣａＰ細胞系統由来ヒト前立腺腫瘍異種移植片に対するｍＰＡ７の効果を示す写真である。
【図４】図４は、ｍＰＡ７が結合するエピトープは、ジスルフィド結合依存性であることを示すグラフである。
【図５】図５は、ヒト前立腺腫瘍細胞ＬＮＣａＰに対するｍＰＡ７およびＭａｂ−ＺＡＰ（ｓａｐｏｒｉｎとの抗ＩｇＧ結合物）の効果を示すグラフである。
【図１】
2005511525.tif 000006
【図２】
2005511525.tif 000007
【図３Ａ】
2005511525.tif 000008
【図３Ｂ】
2005511525.tif 000009
【図４】
2005511525.tif 000010
【図５】
2005511525.tif 000011
【国際調査報告】
2005511525.tif 000012
2005511525.tif 000013
2005511525.tif 000014
2005511525.tif 000015
2005511525.tif 000016