(57)【要約】本発明は、ヒト嗅覚環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）チャンネルサブユニットをコードする単離核酸配列及び対応するポリペプチドに関する。本発明はさらに、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを調節する化合物をプロファイルし、スクリーニングし、特定するためのヒトＣＮＧチャンネルの使用に関する。より具体的には、本発明は、細胞、好ましくは哺乳類細胞におけるヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルの発現及びヒト嗅覚ＣＮＧ機能を増強又は阻害する化合物を特定するための細胞を用いる高処理能力のアッセイにおけるこれらの細胞の使用に関する。嗅覚器ＣＮＧチャンネルを活性化する化合物は、嗅覚を増強するので、嗅覚機能が低下した個人にとって食物をより味の良いものとすることができる。逆に、嗅覚器ＣＮＧチャンネルを阻害する化合物は嗅覚を阻害するので、悪臭を阻害するのに用いることができる。さらに、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）及び環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質を同定するための細胞を用いる嗅覚器ＣＮＧチャンネルアッセイの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有する、又は、配列番号１によりコードされるポリペプチドと少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、ヒトＯＣＮＣ１嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項２】
システインのトリプトファンへの変化をもたらす位置１３７４における突然変異及び／又はグルタミン酸のメチオニンへの変化をもたらす１７４１及び１７４２における突然変異を含む請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記置換突然変異をいずれも含む請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号４に含まれている、又は、配列番号４によりコードされる同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４に記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されている請求項１、２、３又は４に記載のヌクレオチド配列を含む単離された発現配列。
【請求項７】
請求項１、２、３又は４に記載の少なくとも１つの配列を含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
配列番号２と少なくとも約９５％の相同性を有する、又は、配列番号２によりコードされるポリペプチドと少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、ヒトＯＣＮＣ２嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項９に記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されている請求項９に記載のヌクレオチド配列を含む単離された発現配列。
【請求項１２】
請求項９又は１１に記載の配列を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号３と少なくとも約９５％の相同性を有する、又は、配列番号３によりコードされるポリペプチドと少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードする、ヒトβ１ｂ嗅覚ＣＮＣ２チャンネルサブユニットをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項１６】
転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されている請求項１４に記載のヌクレオチド配列を含む単離された発現配列。
【請求項１７】
請求項１４又は１６に記載の配列を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項７に記載の発現ベクター（ＯＣＮＣ１）及び請求項１２に記載の発現ベクター（ＯＣＮＣ２）を含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項７に記載の発現ベクター（ＯＣＮＣ１）及び請求項１７に記載の発現ベクター（β１ｂ）を含む宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１２に記載の発現ベクター（ＯＣＮＣ２）及び請求項１７に記載の発現ベクター（β１ｂ）を含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項７、１２及び１７に記載の発現ベクター（ＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂ）を含む宿主細胞。
【請求項２３】
ＭＤＣＫ、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＷＩＳＳ３Ｔ３及びＣＨＯからなる群から選択される請求項８、１３、１８、１９、２１又は２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
少なくとも１つのヒト嗅覚ＣＮＧサブユニットを安定的又は一時的に発現する請求項８、１３、１８、１９、２１又は２２に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂを安定的又は一時的に発現する請求項２５に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ヒト嗅覚環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）チャンネルの推定上の調節物質のプロファイリング及びスクリーニングを行なうための哺乳類細胞によるハイスループットアッセイであって、
ヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ及び／又はβ１ｂ、あるいはこれら３種のサブユニットのそれぞれの変異体、フラグメント又は機能的同等物を発現し、膜電位蛍光色素をあらかじめ負荷した試験細胞を、少なくとも１種の推定上の調節化合物と接触させ、
該調節物質の非存在下での変化との比較により、該推定上の調節化合物の存在下での試験細胞の蛍光の変化をモニターして、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルの調節の程度を決定することを含む、ハイスループットアッセイ。
【請求項２８】
前記試験細胞が、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＷＩＳＳ３Ｔ３及びＣＨＯからなる群から選択される請求項２７に記載のアッセイ方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である請求項２７に記載のアッセイ。
【請求項３０】
前記ＨＥＫ２９３細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である請求項２９に記載のアッセイ方法。
【請求項３１】
前記方法を、蛍光の検出可能な変化に基づき、ＣＮＧ活性を特に調節する化合物であることを同定するために用いる請求項２７に記載のアッセイ方法。
【請求項３２】
前記試験細胞を、マルチウェル試験プレートのウェルに播種する請求項３０に記載のアッセイ方法。
【請求項３３】
前記推定上の調節物質を、前記マルチウェル試験プレートのウェルに加えることにより、前記試験細胞を前記推定上の調節物質と接触させる請求項３２に記載のアッセイ方法。
【請求項３４】
前記試験細胞に、検出される蛍光の変化を可能にする膜電位色素を負荷する請求項３３に記載のアッセイ方法。
【請求項３５】
前記試験細胞が、ヒトＯＣＮＣ１、ヒトＯＣＮＣ２及びヒトβ１ｂサブユニットのそれぞれを発現する請求項３４に記載のアッセイ方法。
【請求項３６】
前記サブユニットが、配列番号１若しくは４、２及び３、又はそれらのフラグメント、あるいはそれらとハイブリッドを形成し機能的ＣＮＧサブユニットをコードするＤＮＡ、によりそれぞれコードされる請求項３２に記載のアッセイ方法。
【請求項３７】
前記サブユニットが、配列番号１又は４よりコードされる請求項３６に記載のアッセイ。
【請求項３８】
蛍光プレートリーダーを用いて蛍光の変化をモニターする請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３９】
電圧画像化プレートリーダーを用いて蛍光の変化をモニターする請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項４０】
前記膜電位色素が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌキット（カタログ番号８０３４）、Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ（ピリジニウム、４−（２−（６−（ジブチルアミノ）−２−ナフタレニル）エテニル）−１−（３−スルホプロピル））−、ヒドロキシド、分子内塩）、ＤｉＳＢＡＣＣ４（２）（ビス−（１，２−ジバルビツール酸）トリメチンオキサノール）、ＤｉＳＢＡＣ４（３）（ビス−（１，３−（１，２−ジバルビツール酸）−トリメチンオキサノール）、ＣＣ−２−ＤＭＰＥ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標）、１，２−ジエトラデカノイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホエタノールアミントリエチルアンモニウム塩）及びＳＢＦＩ−ＡＭ（１，３−ベンゼンジカルボン酸、４，４’−［１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン−７，１３−ジイルビス（５−メトキシ−６，１２−ベンゾフランジイル）］ビス−、テトラキス［（アセチルオキシ）メチル］エステル）；（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）からなる群から選択される請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項４１】
前記蛍光色素が、カルシウム感受性蛍光色素である請求項３４に記載のアッセイ。
【請求項４２】
前記アッセイが、自動画像化機器を用いて行われる請求項４１に記載のアッセイ。
【請求項４３】
前記機器が、蛍光プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）である請求項４２に記載のアッセイ。
【請求項４４】
前記機器が、電圧画像化プレートリーダー（ＶＩＰＲ）である請求項４２に記載のアッセイ。
【請求項４５】
前記色素が、ｆｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）又は「ｍｉｘ  ａｎｄ  ｒｅａｄ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）である請求項４２に記載のアッセイ。
【請求項４６】
前記膜電位蛍光色素が、蛍光ナトリウム色素である請求項３４に記載のアッセイ。
【請求項４７】
請求項８、１３、１８又は２２のいずれか一項に記載の試験細胞を、ＣＮＧチャンネル活性の推定上の調節物質と接触させ、
全細胞又は細胞膜の電気生理学的測定値の検出可能な変化に基づいて調節物質を同定することを含む、嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性を調節する化合物を同定するアッセイ。
【請求項４８】
前記細胞が、真核細胞である請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項４９】
単離された試験細胞膜を用いる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５０】
アデニル酸シクラーゼ活性化物質を用いて、細胞内ｃＡＭＰを上昇させる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５１】
グアニル酸シクラーゼ活性化物質を用いて、細胞内ｃＧＭＰを上昇させる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５２】
ホスホジエステラーゼ阻害物質を用いて、細胞内ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを上昇させる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５３】
膜透過性環状ヌクレオチド類似体を用いて、嗅覚器ＣＮＧチャンネルを活性化する請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５４】
Ｇタンパク質結合受容体、アデニル酸もしくはグアニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質を用いて、細胞内ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを上昇又は減少させる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５５】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを活性化する分子を同定するために用いられる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５６】
Ｇタンパク質結合受容体、アデニル酸もしくはグアニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質を同定するために用いられる請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５７】
前記ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル調節物質を用いて、ヒト及び他の哺乳類における嗅覚を調節する請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５８】
前記化合物を用いて、ヒト及び他の哺乳類における他のＣＮＧチャンネルを調節する請求項４７に記載のアッセイ。
【請求項５９】
配列番号１又は配列番号４と少なくとも９５％の配列相同性を有するヒトＯＣＮＧ１嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット、配列番号２と少なくとも９５％の配列相同性を有するヒトＯＣＮＧ２嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット、及び配列番号３と少なくとも９５％の配列相同性を有するヒトβ１ｂ嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする１つ又は複数の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６０】
前記発現が、安定的である請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記ＯＣＮＣ１配列が、配列番号４に含まれている請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
前記発現が、安定的である請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項６３】
前記細胞が、真核細胞である請求項６１又は６２に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
前記細胞が、哺乳類細胞である請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
前記細胞が、ヒト細胞である請求項６４に記載の宿主細胞。
【請求項６６】
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
ａ）請求項５９又は６１に記載の細胞を、細胞内環状ヌクレオチドを上昇させる化合物と接触させ、
ｂ）細胞内イオン濃度の変化をモニタリングする
こととを含む、環状ヌクレオチド活性化イオン輸送をモニタリングする方法。
【請求項６８】
前記環状ヌクレオチドが、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰからなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記化合物が、アデニル酸シクラーゼの活性化物質である請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記化合物が、フォルスコリンである請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記化合物が、Ｇタンパク質の活性化物質である請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物が、イソプロテレノールである請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記モニタリングが、カチオン濃度のモニタリングである請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記イオンが、カルシウム又はナトリウムからなる群から選択される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ａ）請求項５９又は６１に記載の細胞を、受容体に結合してＧタンパク質を活性化する化合物と接触させ、
ｂ）細胞内イオン濃度の変化をモニタリングする
ことを含む、受容体媒介性環状ヌクレオチド活性化イオン輸送をモニタリングする方法。
【請求項７６】
前記受容体を、内因的に発現させる請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記受容体が、β２アドレナリン受容体である請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記受容体を、一時的トランスフェクションにより前記細胞に導入する請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記受容体を、安定的に発現させる請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記受容体が、嗅覚受容体である請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記受容体が、嗅覚受容体である請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記受容体が、ｍＯＲＥＧである請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記受容体が、ｍＯＲＥＧである請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル調節物質を、細胞中のＣＮＧチャンネルの量及び組成物を特徴付けるための「薬理学的プローブ」として用いる請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年７月６日に出願の米国仮特許出願第６０／３０３，１４０号及び２００１年１２月１０日に出願の米国仮特許出願第６０／３３７，１５４号に対する優先権の利益を主張するものであり、両出願とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（本発明の技術分野）
本発明は、ヒト嗅覚器環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）チャンネルサブユニットをコードする分離された核酸配列及びそれに対応するポリペプチドに関する。本発明はさらに、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを調節する化合物をプロファイルし、スクリーニングし、特定するためのヒトＣＮＧチャンネルの使用に関する。より具体的には、本発明は、細胞、好ましくは哺乳類又は昆虫の細胞におけるヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルの発現及びヒト嗅覚器ＣＮＧ機能を増強又は阻害する化合物を特定するための細胞を用いる高処理能力のアッセイにおけるこれらの細胞の使用に関する。嗅覚器ＣＮＧチャンネルを活性化する化合物は、嗅覚を増強するので、嗅覚機能が低下した個人にとって食物をより味の良いものとするのに用いることができる。逆に、嗅覚器ＣＮＧチャンネルを阻害する化合物は、嗅覚を阻害するので、悪臭を抑えるのに用いることができる。さらに、本発明は、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）及び環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質の調節物質を同定するための、細胞を用いる嗅覚器ＣＮＧチャンネルアッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（本発明の背景技術）
臭気物質と嗅覚ニューロンの先端の繊毛にある嗅覚受容体との相互作用は、においの知覚の最初の段階である。嗅覚受容体として機能するオプシン様ＧＰＣＲの数の多さ（たとえば、ヒトにおいて約４００）並びに構造的な多様性は、多種の揮発性化合物を検出し、識別する我々の能力を明示する（Ｂｕｃｋ  ａｎｄ  Ａｘｅｌ、１９９１年、Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１年）。ヒトにおいて数百種もの嗅覚ニューロン細胞種（それぞれが異なる嗅覚受容体遺伝子を発現する（Ｃｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４年、Ｍａｌｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ、１９９９年、Ｔｏｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年）が存在すると思われるが、いくつかの系列の証拠の中には、嗅覚ニューロンにおけるシグナル変換が、２次メッセンジャーｃＡＭＰを含む共通の下流シグナリング経路を必要とすると主張するものがある。多くの臭気物質が、嗅覚ニューロンにおけるｃＡＭＰの増加を誘発することが示されている（Ｂｒｅｅｒ、１９９３年）。さらに、ＧＳ様Ｇタンパク質Ｇｏｌｆ（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ、１９８９年、Ｂｅｌｌｕｓｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年）、ＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼ（Ｂａｋａｌｙａｒ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ、１９９０年、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０００年）及び嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット（Ｄｈａｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年、Ｂｒｕｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６年）に関するマウスノックアウト試験で、これらのシグナリング分子が、嗅覚シグナル変換に必須の役割を果たしていることが実証された。要約すると、嗅覚シグナル変換は、次の段階を含むと考えられる。即ち、（１）嗅覚刺激物質が嗅覚受容体を活性化し、（２）活性化された嗅覚受容体がＧｏｌｆを活性化し、（３）ＩＩＩ型アデニル酸シクラーゼがＧｏｌｆにより活性化されて、ｃＡＭＰ合成を触媒し、（４）嗅覚器ＣＮＧチャンネルがｃＡＭＰにより活性化され、（４）活性化された嗅覚器ＣＮＧチャンネルを通してのイオン流出が嗅覚ニューロンを脱分極させ、活動電位の発生を開始させる（Ｇｏｌｄ、１９９９年）段階である。
【０００４】
ＣＮＧチャンネルは、６種の膜貫通セグメント及びＣ末端ヌクレオチド結合ドメインを持つ構造的に関連するサブユニットで構成されている（Ｚａｇｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｓｉｅｇｅｌｂａｕｍ、１９９６年）。同定すべき嗅覚ニューロン特異的ＣＮＧチャンネルにおける第１のサブユニット、ＯＣＮＣ１は、その網膜ＣＮＧチャンネルサブユニットとの相同性に基づいて、ラット嗅覚器のｃＤＮＡからクローン化された（Ｄｈａｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０年）。天然嗅覚器ＣＮＧチャンネルの伝達性並びにｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する感受性とそれに対応せずに発現するＯＣＮＣ１チャンネルの特性との矛盾が、更なるＣＮＧチャンネルサブユニットを探索する契機となった。２つの別のサブユニットＯＣＮＣ２及びβ１ｂ（桿状光受容体ＣＮＧチャンネルサブユニットのスプライス変異体）が、その後、げっ歯類の嗅覚器ｃＤＮＡから、相同性に基づくクローニングにより同定された（Ｌｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋ、１９９４年、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４年、Ｓａｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年、Ｂｏｎｉｇｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年）。組織化学的実験で、これらの分子が、嗅覚ニューロンの先端にある繊毛において選択的に発現することが示された。そして、嗅覚ＣＮＧサブユニットの非対応性同時発現により、天然のチャンネルに類似した特性を有するチャンネルが得られた（Ｓａｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年、Ｂｏｎｉｇｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年）。したがって、嗅覚器ＣＮＧチャンネルは、３種のサブユニットから構成されていると思われる。（ＯＣＮＣ１は、ＣＮＧ２、ＣＮＧＣ４、ＣＮＣα３及び嗅覚器ＣＮＧチャンネルαとも呼ばれており、ＯＣＮＣ２は、ＣＮＧ５、ＣＮＣα４及び嗅覚器ＣＮＧチャンネルβとも呼ばれており、β１ｂは、ＣＮＣβ１ｂ及びＣＮＧ４．３とも呼ばれている。）
【０００５】
嗅覚器ＣＮＧチャンネルは、嗅覚調節物質にとって競合的な標的である。第１に、これらのチャンネルは、嗅覚ニューロンの先端にある繊毛に局在化しており、嗅上皮の外面に露出している。したがって、チャンネル活性化物質は細胞膜を通過する必要がない。第２に、嗅覚器ＣＮＧチャンネルは、異種細胞において機能的に発現することができる（Ｓａｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年、Ｂｏｎｉｇｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０００年）。第３に、自動蛍光定量機器を用いる高処理能力スクリーニングに対応可能な、カルシウム画像化によるアッセイを、ＣＮＧチャンネル活性を測定するために用いることができる。その理由は、これらのチャンネルがＣａ２＋に対して透過性があるためである。実際、カルシウム画像化は、初代培養における嗅覚ニューロンの臭気物質依存性の活性化を記録するために用いられており（Ｈｉｒｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２年、Ｍａ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、２０００年）、最近では、カルシウム色素によるアッセイが、異種細胞において発現させるラットＯＣＮＣ１に対して開発された（Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１年）。第４に、これらのチャンネルは、環状ヌクレオチドにより制御される。すなわち、これらのチャンネルは、小分子によりアロステリック的に活性化される。最後に、ＣＮＧチャンネル活性を直接阻害することにより嗅覚を調節するいくつかの小分子が同定されている（Ｋｕｒａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４年）。そして、Ｌ型Ｃａ２＋チャンネルのジヒドロピリジンアゴニストなど、非イオンチャンネル型受容体のイオンチャンネルを活性化する小分子については十分な先例が存在する（Ｈｏｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
げっ歯類嗅覚器ＣＮＧチャンネルを、アフリカツメガエル卵母細胞及びＨＥＫ−２９３細胞において発現させ、それらについて、ＣＮＧチャンネルを含む膜の電気的特性を直接測定することにより、機能的な特性が検討された（Ｓａｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８年、Ｂｏｎｉｇｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０００年）。しかし、電気生理学的アッセイは、高処理能力スクリーニングに対応することができない。このような限界を克服するために、本発明は、嗅覚器ＣＮＧチャンネル調節物質の自動高処理能力スクリーニングに対応可能な、細胞による蛍光定量アッセイを述べるものである。このアッセイは、アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンによって引き起こされたｃＡＭＰ濃度の上昇に随伴する、ＨＥＫ−２９３細胞において発現した嗅覚器ＣＮＧチャンネルを通るイオン流を定量するために、蛍光カルシウム色素又は膜電位色素を用いる。さらに、本発明は、本発明の前には同定されていなかったヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸配列を同定する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本発明の概要）
本発明は、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルの単離されたＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂサブユニットのポリペプチド並びにそれらをコードする核酸配列を包含する。本発明はまた、そのような核酸配列を含有するベクター及びそのようなベクターを含有する宿主細胞を含む、そのような核酸配列を発現させる手段を包含する。本発明はさらに、そのような核酸、ベクター及び宿主細胞を使用して、嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性を調節することにより嗅覚を調節する化合物を特定する方法を包含する。また、本発明において述べるアッセイは、ＧＰＣＲ及び環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質の活性を定量するために適用することができる。
【０００８】
好ましい実施形態においては、まず、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを発現する宿主細胞を、アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンのようなｃＡＭＰを増加させる物質、ホスホジエステラーゼ阻害物質ＩＢＭＸ、又は膜透過性環状ヌクレオチド類似体で刺激する。次いで、ｆｕｒａ−２のような蛍光カルシウムキレート化剤（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２年）、ナトリウムグリーンテトラ酢酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）やＮａ＋感受性色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のような蛍光ナトリウムキレート化剤、または膜電位色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）やオキサノール−クマリンキット（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような膜電位色素を用いて、処理細胞へのイオン流をモニターすることにより、嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性化を定量する。次いで、嗅覚増強性嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性化物質は、ｃＡＭＰの増加に対して蛍光応答を増強する能力により同定することができ、嗅覚阻害性のチャンネルアンタゴニストは、蛍光応答を減弱させる能力により同定することができる。そのようなアッセイは、蛍光定量画像化プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及び電圧イオンプローブリーダー（Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＶＩＰＲ、Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような自動蛍光定量機器を用いる化合物ライブラリーの高処理スクリーニングに適用できる。
【０００９】
（本発明の目的及び好ましい実施の形態）
本発明の目的は、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルのＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂサブユニットをコードする単離された核酸配列、組換え又は化学的手段により調製される、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰＳ）及び突然変異性変異体等を含む、その変異体及び機能的フラグメント、突然変異体、並びにキメラを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルの単離されたＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂサブユニットポリペプチド、並びに化学的方法又は組換え法により調製される、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、ＳＮＰＳ突然変異体を含む、その機能的フラグメント、キメラ及び変異体、並びにヒト以外の霊長類におけるそのオーソログを提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、機能的ヒトＣＮＧチャンネルポリペプチドサブユニット又はサブユニットの組合せを発現する細胞系を生産することである。
【００１２】
本発明の好ましい目的は、ヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂサブユニットポリペプチド（好ましくは、それぞれ配列番号１、２及び３に含まれるアミノ酸配列を有する）のそれぞれ、または、当該各サブユニットポリペプチドのＤＮＡ配列又はフラグメントによりコードされる機能的キメラ又は突然変異体を機能的に発現する細胞系を生産することである。
【００１３】
本発明のより好ましい目的は、機能的なヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを発現する、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、キメラハムスター、卵巣細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＬｔＫ細胞及びＢＨＫ細胞等の哺乳類細胞系を提供することである。
【００１４】
本発明の他の好ましい目的は、嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性を調節することにより嗅覚を調節する化合物を特定するために、そのような細胞系を使用することである。
【００１５】
本発明の目的はまた、ＧＰＣＲ及び環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質の活性を定量するために、そのような細胞系を使用することである。
【００１６】
本発明のより具体的な目的は、最初に、アデニル酸シクラーゼ活性化物質（たとえば、フォルスコリン）、又はホスホジエステラーゼ阻害物質（たとえば、ＩＢＭＸ）、又は膜透過性環状ヌクレオチド類似体、といったｃＡＭＰを増加させる物質でＣＮＧチャンネルを刺激し、次いで、たとえば、蛍光カルシウムキレート化剤又は蛍光ナトリウムキレート化剤を用いて細胞へのイオンの流入を測定することによりＣＮＧチャンネル活性化を定量する、アッセイにおいて、機能的ヒトＣＮＧチャンネルを安定的又は一時的に発現する細胞系を使用することである。
【００１７】
本発明の他の具体的な目的は、蛍光定量画像化プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及び電圧イオンプローブリーダー（Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＶＩＰＲ、Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような自動蛍光定量機器を用いた化合物ライブラリーの高処理スクリーニングのために、機能的ヒトＣＮＧチャンネルを安定的又は一時的に発現する細胞系を使用することである。
【００１８】
特に、本発明の目的は、カルシウム画像化アッセイを用いて、機能的ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを発現するＨＥＫ−２９３細胞系に対する化合物の影響を測定することにより、嗅覚を調節する化合物を特定することである。
【００１９】
本発明の他の具体的な目的は、ヒトＣＮＧチャンネルを細胞透過性ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ（フラッシュ光分解により放出）を用いて活性化し、活性化されたＣＮＧチャンネルを用いて嗅覚を調節する化合物を特定する、ＣＮＧプレートによるハイスループットアッセイを提供することである。
【００２０】
本発明のさらに具体的な目的は、機能的なヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを発現する、ＨＥＫ−２９３、昆虫細胞又はアフリカツメガエル卵母細胞を生産することである。
【００２１】
本発明の他の具体的な目的は、ラットＯＣＮＣ１、ラットＯＣＮＣ２及びラットβ１ｂ遺伝子の少なくとも１つ、及び好ましくは３つすべてのヒトオーソログを発現するＨＥＫ−２９３又は昆虫細胞又はアフリカツメガエル卵母細胞を生産することである。
【００２２】
本発明の他の具体的な目的は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する高い感受性を有するβ１ｂタンパク質の変異体を発現するＨＥＫ−２９３又は昆虫細胞又はアフリカツメガエル卵母細胞を生産することである。
【００２３】
本発明の他の具体的な目的は、
（ｉ）機能的なヒトＣＮＧチャンネルを発現する哺乳類又は昆虫の細胞を得、
（ｉｉ）当該細胞を刺激して、細胞内ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ濃度を増加させることにより、ＣＮＧチャンネルを活性化し、
（ｉｉｉ）化合物の存在下又は非存在下で、そのＣＮＧ活性に対する調節効果を調べるために、陽イオンの流入を比較し、
（ｉｖ）嗅覚に対する調節化合物の効果を試験することを含む、
嗅覚を調節する化合物を選択するためのプレートを用いるアッセイを提供することである。
【００２４】
（本発明の詳細な説明）
本発明をさらに詳細に論じる前に、以下に定義を記載する。他の場合において、語及び句は、当業者により解釈される通常の意味に一致するものとする。
【００２５】
（定義）
「機能的ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル」とは、少なくとも１種のヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット、その変異体又はフラグメントから構成される嗅覚ニューロン特異的ＣＮＧユニットを指す。そのようなＣＮＧサブユニットとしては、ＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂなどがある。機能的チャンネルは、細胞外陽イオンに対して十分透過性であり、膜電位感受性蛍光色素又はカルシウム感受性蛍光色素の何れかを用いて、細胞内陽イオンの検出可能な変化を生じる。
【００２６】
「ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット」とは、ラットＯＣＮＣ１、ラットＯＣＮＣ２及びラットβ１ｂから選択されるラット嗅覚ポリペプチドのヒトオーソログ、あるいは、野生型ヒトＯＣＮＣ１、ヒトＯＣＮＣ２及びヒトβ１ｂと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０〜９０％、さらにより好ましくは少なくとも９０〜９９％の配列相同性を示すＤＮＡを指す。好ましい実施形態において、ヒトオーソログは、図１に示す配列、もしくは、それと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５〜９９％の相同性を示す、そのフラグメント又は変異体を含む。さらに、変異体又はフラグメントを、単独又は他のＣＮＧサブユニットと組合せたときのそれらの発現能に基づいて選択して、機能的嗅覚（カルシウム透過性）ＣＮＧサブユニットを産生することができる。
【００２７】
本明細書で用いる「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」という用語は、本発明の化合物が通常その自然の状態では会合している他の異なる化合物が含まれない状態を指し、そのため、「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」対象は、所与のサンプルの全体に対して、少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％又は２０重量％、最も好ましくは、少なくとも５０重量％又は７５重量％を含む。好ましい一実施形態において、これらの用語は、所与のサンプルの全体に対して、少なくとも９５重量％を含む本発明の化合物を指す。本明細書で用いているように、「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質について言うとき、哺乳類、特にヒトの体内に自然に存在する場合と異なった精製又は濃度の状態も指す。（１）他の会合した構造又は化合物からの精製、または（２）通常、哺乳類、特にヒトの体内で会合しない構造又は化合物との会合を含む、哺乳類、特にヒトの体内に自然に存在するよりも大きい精製又は濃度の程度は、「単離された」の意味の範囲内にある。本明細書に記載の核酸又はタンパク質あるいは核酸又はタンパク質のクラスは、当業者に知られているさまざまな方法又は工程により、単離することができ、さもなくば、それらが通常自然では会合しない構造又は化合物と結合させることができる。
【００２８】
「増幅する」及び「増幅」という用語は、以下に詳細に述べるように、組換え体又は自然に発現される核酸を産生又は検出するための適切な増幅法の使用を指す。たとえば、本発明は、本発明の自然に発現する（たとえば、ゲノム又はｍＲＮＡ）又は組換え（たとえば、ｃＤＮＡ）核酸（たとえば、本発明の感覚刺激物質結合配列）をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅する（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲにより）ための方法及び試薬（たとえば、縮重オリゴヌクレオチドプライマー対）を提供する。
【００２９】
「発現ベクター」という用語は、原核、酵母、真菌、植物、昆虫又は哺乳類細胞を含む任意の細胞中で、本発明の核酸配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで構成的に又は誘導的に発現させる目的で、組換え発現系において用いられる伝達体を指す。この用語は、線状又は環状の発現系を含む。この用語は、エピソームのままの又は宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現システムを含む。発現システムは、自己複製する能力を持つものでも、持たないものでもよい。すなわち、細胞中で一時的発現のみを誘導するものでもよい。この用語は、組換え核酸の転写に必要な最小限の要素のみを含む組換え発現カセットを含む。
【００３０】
「ライブラリー」という用語は、組換えにより発生させた感覚、特に、嗅覚又は味覚の、縮重プライマー対を用いた核酸の増幅により発生させた受容体リガンド結合ドメインのライブラリーのような異なる核酸又はポリペプチド分子の混合物、あるいは、増幅された感覚刺激物質結合ドメインを組み込んでいるベクターの単離された集合、あるいは、感覚受容体をコードする少なくとも１つのベクターをそれぞれランダムにトランスフェクトした細胞の混合物、である調製物を意味する。
【００３１】
「核酸」又は「核酸配列」という用語は、１本又は２本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを指す。この用語は、核酸、すなわち、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含むオリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造を含む。たとえば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６００巻、Ｂａｓｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．編（ＮＹＡＳ１９９２年）、Ｍｉｌｌｉｇａｎ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３６巻、１９２３〜１９３７頁（１９９３年）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、国際公開第９７／０３２１１号、国際公開第９６／３９１５４号、Ｍａｔａ、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第１４４巻、１８９〜１９７頁（１９９７年）、Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、８６９２〜８６９８頁（１９９７年）、Ｓａｍｓｔａｇ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ、第６巻、１５３〜１５６頁（１９９６年）を参照のこと。
【００３２】
「保守的変異体」又は「類似体」又は「擬似体」という用語は、本明細書で定義したように、その変化が、実質的にポリペプチドの（保守的変異体の）構造及び／又は活性を変化させないような修飾アミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。これらは、アミノ酸配列の保守的に修飾された変異体、すなわち、タンパク質活性にとって重要でない残基のアミノ酸置換、付加又は欠失、あるいは、重要なアミノ酸の置換であっても、構造及び／又は活性を実質的に変化させないような類似の特性（たとえば、酸性、塩基性、正又は負に荷電、極性又は非極性等）を有する残基によるアミノ酸の置換を含む。機能的に類似のアミノ酸を記載した同類置換表は、当技術分野においてよく知られている。
【００３３】
たとえば、保守的置換を選択するための一具体例としてのガイドラインは、以下の通りである（オリジナル残基に続いて置換例を示す）：
Ａｌａ／Ｇｌｙ又はＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｇｌｎ又はＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／Ａｌａ又はＰｒｏ；Ｈｉｓ／Ａｓｎ又はＧｌｎ；Ｉｌｅ／Ｌｅｕ又はＶａｌ；Ｌｅｕ／Ｉｌｅ又はｖａｌ；Ｌｙｓ／Ａｒｇ又はＧｌｎ又はＧｌｕ；Ｍｅｔ／Ｌｅｕ又はＴｙｒ又はＩｌｅ；Ｐｈｅ／Ｍｅｔ又はＬｅｕ又はＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／Ｔｒｐ又はＰｈｅ；Ｖａｌ／Ｉｌｅ又はＬｅｕ。
別の具体例としてのガイドラインは、それぞれが互いに保守的置換であるアミノ酸を含む次の６群を用いる：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｉ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（１９８４年）、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９７９年）も参照のこと）。
当業者は、上記の置換が唯一の可能な保守的置換ではないことを理解するであろう。たとえば、いくつかの目的では、すべての荷電アミノ酸を、正であるか負であるかにかかわりなく、互いに保守的置換とみなすことができる。さらに、コードされた配列において単一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変化させ、加え、又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加も「保守的に修飾された変異体」とみなすことができる。
【００３４】
「擬似体」及び「ペプチド擬似体」という用語は、ポリペプチド、たとえば、本発明の転移ドメイン、感覚刺激物質結合ドメイン又はキメラ受容体、の実質的に同じ構造的及び／又は機能的な特性を有する合成化合物を指す。擬似体は、アミノ酸の合成による非天然類似体から完全に構成されるか、あるいは、部分的に天然ペプチドアミノ酸及び部分的にアミノ酸の非天然類似体からなるキメラ分子とすることができる。擬似体はまた、置換が擬似体の構造及び／又は活性をも実質的に変化させない限り、任意の量の天然アミノ酸同類置換を組み込むことができる。保守的変異体である本発明のポリペプチドの場合と同様に、通常の実験により、擬似体が本発明の範囲内にあるかどうか、すなわち、その構造及び／又は機能が実質的に変化していないかどうかを判定できるであろう。ポリペプチド擬似組成物は、一般的に次の３構造群に属する天然に存在しない構造成分の任意の組合せを含むことができる。すなわち、ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結群、ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基、又はｃ）２次構造擬似体を誘導、すなわち２次構造、たとえば、βターン、γターン、βシート、αらせんコンフォーメーション等を誘導又は安定化する残基である。
ポリペプチドは、その残基のすべて又は一部が天然ペプチド結合以外の化学的手段により連結されているとき、擬似体と特徴付けることができる。個々のペプチド疑似体残基は、ペプチド結合、他の化学結合又はカップリング手段、たとえば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により連結させることができる。伝統的アミド結合（「ペプチド結合」）連結の代わりとなり得る結合基は、たとえば、ケトメチレン（たとえば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−の代わりの−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステルなどである（たとえば、Ｓｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第７巻、２６７〜３５７頁、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ（１９８３年）を参照）。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基の代わりにすべて又は一部の非天然残基を含むことによっても、擬似体と特徴付けることができる。非天然残基については、科学及び特許文献に十分に記載されている。
【００３５】
本明細書で用いているように、「組換え」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成又は他の方法で操作されたポリヌクレオチド（たとえば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞又は他の生物学的系において遺伝子産物を生産するために組換えポリヌクレオチドを用いる方法、あるいは、組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。「組換え手段」とは、異なる起源のさまざまなコード領域もしくはドメイン又はプロモーター配列を有する核酸を、発現、例えば、本発明の転移ドメイン及び本発明のプライマーを用いて増幅される核酸配列を含む融合タンパク質の誘導性又は構成性の発現のために、発現カセット又はベクターへ結合させることを包含する。
【００３６】
「膜貫通ドメイン」という用語は、原形質膜に完全にまたがることができるポリペプチドドメインを意味する。膜貫通ドメイン、特に、嗅覚受容体のような７膜貫通受容体の７種の膜貫通ドメインの一般的な２次及び３次構造は、当技術分野でよく知られている。したがって、以下で詳細に記載するように、１次構造配列は、既知の膜貫通ドメイン配列に基づいて設計又は予測することができる。
【００３７】
「ＣＮＧチャンネル」サブユニットタンパク質又はそのフラグメント、あるいは、「ＣＮＧチャンネル」タンパク質又はそのフラグメントの３種のサブユニットの１つをコードする核酸は、（１）配列番号１、２又は３に含まれているｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約２５、５０、１００、２００又は５００又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたり約８０％より大きいアミノ酸配列相同性、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいは（２）配列番号１、２又は３によりコードされるアミノ酸配列又はその免疫原性フラグメント、及びそれらの保守的に修飾された変異体を含む免疫原に対して産生させた抗体、たとえば、ポリクローナル抗体に特異的に結合するか、あるいは（３）ヒトＣＮＧタンパク質をコードする核酸配列、たとえば、配列番号１、２、３又はそれらの相補体、及びそれらの保守的に修飾された変異体に対応するアンチセンス鎖と、緊縮ハイブリッド条件下で特異的にハイブリッド形成するか、あるいは（４）配列番号１、２若しくは３又はそれらの相補体と、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００又はそれ以上のヌクレオチドの領域にわたり約８０％より大きい配列相同性、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれより高いヌクレオチド配列相同性を有する核酸配列を有するか、あるいは（５）たとえば、陽イオンに応答する膜電位色素の測定可能な蛍光により決定される、本明細書に記載のヒトＣＮＧと機能的に同等である、核酸及びポリペプチド、多形性変異体、対立遺伝子並びに種間同族体を指す。
【００３８】
機能的に同等のＣＮＧチャンネルタンパク質は、下記で同定されたものと異なる１次配列を有するサブユニット含むが、機能アッセイにより測定した際に同等の機能を有する。「機能的効果を測定すること」は、ＣＮＧチャンネルポリペプチドの間接的又は直接的な影響下にあるパラメーターを増加又は減少させる化合物の効果、たとえば、機能的、物理的及び化学的な効果を測定することを指す。そのような機能的効果としては、イオン流入、膜電位、電流振幅及び電圧ゲートの変化、並びにマーカー遺伝子の遺伝子発現の変化といった他の生物学的効果などがあるが、これらに限定されるものではない。イオン流入は、たとえば、ナトリウム又はリチウム、及び放射性同位元素のようなそれらの類似体などのチャンネルを通過するイオンを含む。そのような機能的効果は、当業者に知られているいずれかの手段、たとえば、２電極電気生理学又は電圧感受性色素を用いて、あるいは、分光学的特徴（たとえば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的特性（たとえば、形状）、クロマトグラフィック特性又は溶解性特性のようなパラメーターの変化を測定することにより、測定することができる。
【００３９】
ＣＮＧチャンネルポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の「阻害物質」、「活性化物質」及び「調節物質」は、ＣＮＧチャンネルポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の細胞によるアッセイを用いて同定される、活性化分子、阻害分子又は調節分子を指すのに用いられる。阻害物質は、たとえば、結合し、活性を部分的又は完全に阻害し、ＣＮＧチャンネルタンパク質の活性又は発現を、減少、妨害、遅延、不活性化、脱感作化、又は下方制御する化合物、たとえば、拮抗物質である。「活性化物質」は、ＣＮＧチャンネルタンパク質活性を、増加させ、開放し、活性化し、促進し、活性化を増強し、増感し、作動させ、又は上方制御する化合物である。阻害物質、活性化物質又は調節物質は、ＣＮＧチャンネルタンパク質の遺伝的に修飾された変異型、たとえば、活性の変化を有する変異型、並びに、天然及び合成リガンド、拮抗物質、作動物質、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、小有機分子等も含む。阻害物質及び活性化物質についてのそのようなアッセイは、たとえば、細胞、細胞抽出物又は細胞膜においてＣＮＧチャンネルタンパク質を発現させ、推定される調節化合物を適用し、次いで、上記のようにして、活性に対する機能的効果を測定することを含む。
【００４０】
潜在的な活性化物質、阻害物質又は調節物質で処理されているＣＮＧチャンネルタンパク質を含むサンプル又はアッセイを、阻害物質、活性化物質又は調節物質を含まない対照サンプルと比較して、活性化、阻害又は調節の程度を検討する。
【００４１】
本明細書で用いているように、「試験化合物」又は「試験候補物」又は「調節物質」という用語あるいはその文法的に同等な用語は、例えば、ＣＮＧチャンネル活性を調節する能力について試験する、天然に存在又は合成による分子、たとえば、タンパク質、オリゴペプチド（たとえば、長さが約５〜約２５アミノ酸、好ましくは長さが約１０〜２０又は１２〜１８アミノ酸、好ましくは長さが１２、１５又は１８アミノ酸である）、小有機分子、多糖、脂質（たとえば、スフィンゴ脂質）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等を述べる。試験化合物は、十分な範囲の多様性を提供するコンビナトリアル又はランダムなライブラリーといった試験化合物のライブラリーの形態とすることができる。試験化合物は、任意に、融合パートナー、たとえば、ターゲッティング化合物、レスキュー化合物、２量体化化合物、安定化化合物、アドレス可能な化合物及び他の機能部分と結合することができる。通常、有用な特性を有する新規化学物質は、たとえば、活性を増強させ、リード化合物の変異体を作製し、それらの変異体化合物の特性及び活性を評価して、望ましい特性又は活性を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定することにより産生する。そのような分析のためには、高処理能力のスクリーニング（ＨＴＳ）法を用いることが好ましい。
【００４２】
「小有機分子」は、約５０ダルトン以上で、約２５００ダルトン未満、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１００〜約１００ダルトン、より好ましくは約２００〜約５００ダルトンの分子量を有する天然に存在する又は合成による有機分子を指す。
【００４３】
「生物学的サンプル」は、生検及び剖検サンプルのような組織の切片並びに組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。そのようなサンプルとしては、血液、痰、組織、培養細胞（たとえば、初代培養、体外移植細胞及び形質転換細胞）、便、尿等がある。生物学的サンプルは、一般的に真核生物、最も好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー又はヒト）、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類（たとえば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ）のような哺乳類、鳥、爬虫類、魚等から得られる。
【００４４】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する「相同」又は「相同性」の割合という語は、下記のデフォルトパラメーターを有するＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、又はマニュアル照合及び目視検査（たとえば、ＮＣＢＩウェブサイト等を参照のこと）により測定した際、同じ２つ以上の配列又はサブ配列であるか、同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを特定の割合で有する（比較ウインドウ又は指定の領域にわたって比較し、最大の対応を得るようにアライメントしたとき、明記されている領域（たとえば、ヌクレオチド配列番号１、２又は３のヌクレオチド配列）にわたって同じであるかあるいは明記されている割合の相同性（約８０％の相同性、好ましくは、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の相同性）ことを指す。そのような配列は、「実質的に同じ」であると言われる。この定義は、試験配列の相補体を指すこともあり、又はこれに適用できる。この定義には、欠失及び／又は付加を有する配列並びに置換を有する配列も含まれる。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を説明することができる。長さが少なくとも約２５アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたり、あるいは、より好ましくは長さが５０〜１００アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたり相同性が存在することが好ましい。
【００４５】
配列の比較のために、一般的に１つの配列が、試験配列を比較する対照標準配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び対照標準配列をコンピュータに入力し、必要な場合、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができるか、又は代替パラメーターを指定することが好ましい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、対照標準配列に対する試験配列の配列相同性の割合を計算する。
【００４６】
「比較ウインドウ」は、本明細書において用いているように、２つの配列を任意に整列させた後に、配列を連続位置の同じ数の対照標準配列と比較することができる、２０〜６００、通常、約５０〜約２００、より通常、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントの対照標準を含む。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適なアライメントは、たとえば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．第２巻、４８２頁（１９８１年）の局所相同アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻、４４３頁（１９７０年）の相同アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、２４４４頁（１９８８年）の類似性の検索方法により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行により、あるいは、マニュアルアライメント及び目視検査（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編、１９９５年増刊）を参照）により行うことができる。
【００４７】
配列相同性の割合及び配列類似性の決定に適したアルゴリズムの好ましい例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、３３８９〜３４０２頁（１９７７年）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０は、本発明の核酸及びタンパク質における配列相同性の割合を決定するために、本明細書に記載するパラメーターとともに用いられる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さの語とアライメントしたとき、いくつかの陽性値の閾スコアＴと合致又は満たす目的の配列において、長さＷの短い語を特定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰｓ）を同定することを含む。Ｔは、近傍語スコア閾と称されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出）。これらの最初の近傍語ｈｉｔｓは、それらを含むより長いＨＳＰｓを発見するための検索を開始するためのシードとして働く。語ｈｉｔｓは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（合致残基の対に対する報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対する罰スコア、常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。語ｈｉｔｓの各方向への延長は、累積アライメントスコアがその最大達成値からＸ減少した場合、１つ又は複数の負のスコアの残基アライメントの累積のため、累積スコアが０以下になる場合、あるいは、いずれかの配列の終結に達した場合に停止したＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、語長（Ｗ）として１１、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較をデフォルトとして用いている。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、語長として３、期待値（Ｅ）として１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０９１５頁（１９８９年）を参照）、アライメント（Ｂ）として５０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較をデフォルトとして用いている。
【００４８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換可能に用い、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーのみならず、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学的擬似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００４９】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する又は合成のアミノ酸並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸疑似体を指す。天然に存在するアミノ酸には、遺伝コードによりコードされるものであり、また、後に修飾されたもの、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩及びＯ−ホスホセリンなどがある。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合しているα−炭素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基、たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を指す。そのような類似体は、修飾Ｒ基（たとえば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸疑似体は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【００５０】
アミノ酸は、一般的に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号により本明細書において表す。ヌクレオチドも同様に一般的に受け入れられている１文字コードにより表すことができる。
【００５１】
「保守的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保守的に修飾された変異体は、同じ又は本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同じ配列を指す。遺伝コードの縮重のゆえに、多数の機能的に同じ核酸が所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるすべての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく記述される対応するコドンのいずれかに変化し得る。そのような核酸変異体は、保守的に修飾された変異体の１つの種である「サイレント変異体」である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるすべての核酸配列は、核酸のすべての可能なサイレント変異体も記述する。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が修飾されて、機能的に同じ分子が生じることがあり得ることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体は、発現産物に関しては、記述された各配列に内在するが、実際のプローブ配列に関しては、そうでない。
【００５２】
アミノ酸配列に関しては、当業者なら、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、コードされる配列における単一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変化させ、付加し、欠失させたものは、その変化が、あるアミノ酸の化学的に類似したアミノ酸への置換をもたらす「保守的に修飾された変異体」であることを理解するであろう。機能的に類似のアミノ酸を記載した同類置換表は、当技術分野においてよく知られている。そのような保守的に修飾された変異体は、本発明の多形性変異体、種間同族体及び対立遺伝子に加えられるものであり、それらを除外するものではない。
【００５３】
以下の８群は、それぞれが互いに同類置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（たとえば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照のこと）。
前記のように、本発明は、適切なアッセイ、たとえば、以下で詳細に記載する全細胞ナトリウムコンダクタンスアッセイを用いた場合、機能的に同等な、本願に開示されているものと異なる１次配列を有するＥＮａＣサブユニットポリペプチドを発現する細胞を含む。
【００５４】
ポリペプチド構造のような巨大分子構造は、種々のレベルの構成の点から記述することができる。この構成の議論については、たとえば、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４年）及びＣａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０年）を参照のこと。「１次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「２次構造」は、ポリペプチド内の局所的に配列した３次元構造を指す。これらの構造は、一般的にドメイン、たとえば、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン及び細胞質テイルドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトユニットを形成するポリペプチドの部分であり、長さが一般的に１５〜３５０アミノ酸である。具体例としてのドメインとしては、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインなどがある。一般的なドメインは、β−シートやα−らせんといった区切り等の小さな構成区画からなっている。「３次構造」は、ポリペプチド単量体の３次元構造を指す。「４次構造」は、独立した３次構造の非共有結合により形成されている３次元構造を指す。異方性項は、エネルギー項としても知られている。
【００５５】
特定の核酸配列は、潜在的に「スプライス変異体」も包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、潜在的に当核酸のスプライス変異体によりコードされるすべてのタンパク質を包含する。「スプライス変異体」は、その名称が示唆するように、遺伝子の選択的なスプライシングの産物である。転写後、異なる（選択的な）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするように、最初の核酸転写物がスプライスされる。スプライス変異体の生成のメカニズムは、多様であるが、エキソンの選択的スプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸から得られる代替ポリペプチドもこの定義により含まれる。スプライス産物の組換え形を含むスプライシング反応のあらゆる産物は、この定義に含まれる。
【００５６】
ＣＮＧチャンネル核酸配列も、適切なアッセイ、たとえば、本明細書に記載する蛍光アッセイを用いて定量したとき、本明細書に開示するヒトＣＮＧチャンネルポリペプチドと機能的に同等であるＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単一ヌクレオチド多形を含む。
【００５７】
膜電位色素又は電圧感受性色素は、膜脱分極時に蛍光特性を変化させる分子又は分子の組合せを指す。
【００５８】
「標識」又は「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又は他の物理的手段により検出可能な組成物である。たとえば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度が高い試薬、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡに一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、あるいは、たとえば放射性標識をペプチドに組み込むことにより検出可能にすることができる又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられる、ハプテン又はタンパク質などがある。
【００５９】
たとえば、細胞、あるいは核酸、タンパク質又はベクターに関して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種の核酸またはタンパク質の導入により、または本来の核酸またはタンパク質の変化により修飾されたこと、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞から得られることを示している。したがって、たとえば、組換え細胞は、発現する又は全く発現しない状態で、天然（非組換え）型の細胞で認められない遺伝子を発現するか、さもなくば、異常な発現を示す天然遺伝子を発現する。本発明では、これは一般的に、１つ又は複数のヒトＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸配列をトランスフェクトした細胞を指す。
【００６０】
核酸の部分に関して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が自然では互いに同じ関係で認められない２つ以上のサブ配列を含むことを示している。たとえば、核酸は、新規の機能の核酸を作るために配列させた無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、たとえば、１つの源からのプロモーターと他の源からのコード領域を有する核酸を一般的に組換えにより生成させる。同様に、異種タンパク質は、自然では互いに同じ関係で認められない２つ以上のサブ配列を含むタンパク質（たとえば、融合タンパク質）を示す。遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質の細胞発現に関して用いる場合、「異種」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質が通常では細胞内で発現しないこと、あるいは、細胞の元の起源以外の他の種由来のものであることを示す。
【００６１】
「緊縮ハイブリッド形成条件」という句は、プローブが、一般的には核酸の複数の混合物中でその標的サブ配列とハイブリッド形成するが、他の配列とはハイブリッド形成しない条件を指す。緊縮条件は、配列依存性であり、異なる環境中では異なる。配列が長いほど、高温度で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリッド形成に関する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）に見出される。一般的に、緊縮条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い温度とすることを選択する。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡において標的配列とハイブリッド形成する温度（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下）である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍでは平衡においてプローブの５０％が占有される）。緊縮条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。選択的又は特異的なハイブリッド形成の場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、好ましくはバックグラウンドハイブリッド形成の１０倍である。具体例としての緊縮ハイブリッド形成条件は次の通りである。
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中４２℃でインキュベート、又は、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄。
【００６２】
緊縮条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸であっても、それらがコードするポリペプチドが実質的に同じである場合、依然として実質的に同じである。これは、たとえば、核酸のコピーが遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を用いて造られるときに起こる。そのような場合、核酸は一般的に中程度に緊縮なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。具体例としての「中程度に緊縮なハイブリッド形成条件」としては、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリッド形成及び１×ＳＳＣで４５℃で洗浄などである。陽性ハイブリッド形成は、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者なら、別のハイブリッド形成及び洗浄条件を用いて同様の緊縮性の条件を得ることができることを容易に理解するであろう。ハイブリッド形成パラメーターを決定する追加の指針は、多くの参考文献、たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編に記載されている。
【００６３】
ＰＣＲについては、アニール温度はプライマーの長さによって約３２℃〜４８℃の範囲内で異なることがあるが、低い緊縮性の増幅には約３６℃の温度が一般的である。高い緊縮性のＰＣＲ増幅のためには、高い緊縮性のアニール温度はプライマーの長さ及び特異性によって約５０℃〜約６５℃の範囲内で異なり得るが、約６２℃の温度が一般的である。高及び低緊縮性増幅の一般的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間のアニール相及び約７２℃で１〜２分間の延長相などである。低及び高緊縮性増幅反応のプロトコル及びガイドラインは、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０年）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）に記載されている。
【００６４】
「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントから得られ、抗原に特異的に結合しそれを認識する、フレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常部遺伝子並びにミリアド免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλと分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ又はεと分類され、それらはさらにそれぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。一般的に、抗体の抗原結合領域が結合の特異性及び親和性に最も重要である。
【００６５】
特に、そのような抗体は、本明細書に開示するヒトＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドに特異的に結合する抗体、又は、そのようなＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドに特異的に結合する抗体の混合物などを含む。
【００６６】
タンパク質又はペプチドについて言及する場合、抗体に「特異的に（又は選択的に）結合する」、または「と特異的に（又は選択的に）免疫反応性な」という句は、しばしば、異種の群におけるタンパク質又は他の生物学的物質において、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、指定の抗体は、特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも２倍、また、より一般的にバックグラウンドの１０〜１００倍以上結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。たとえば、ＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質、あるいはその多形性変異体、対立遺伝子、オーソログ及び保守的に修飾された変異体又はスプライス変異体又はその一部、に対して産生させたポリクローナル抗体は、ＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質、すなわち、配列番号１、２及び３に含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂと、特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質とはそうでない、ポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を除外することにより達成することができる。さまざまなイムノアッセイ方式を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。たとえば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを常法により用いてタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択する（特異的免疫反応性を検討するために用いることができるイムノアッセイの種類と条件の記述については、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）を参照のこと）。
【００６７】
したがって、本発明は、配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有し、ヒトＯＣＮＣ１嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単離ヌクレオチド配列、配列番号２と少なくとも約９５％の相同性を有し、ヒトＯＣＮＣ２嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単離ヌクレオチド配列、及び配列番号３と少なくとも約９５％の相同性を有し、ヒトβ１ｂ嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする単離ヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
より好ましくは、本発明は、高緊縮性条件下で配列番号１〜３とハイブリッド形成する単離ヌクレオチド配列を含む。「ヌクレオチド配列」という用語は、あらゆる本数の鎖、たとえば、１本鎖及び２本鎖を有するＲＮＡ及びＤＮＡを含むことを意図するものである。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質の修飾句としての「単離された」又は「精製された」という用語の本明細書及び特許請求の範囲における使用は、そのように指定されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質がそれらの天然細胞環境から単離され、人工的に、すなわち組換えにより随意にそのような形態で生成させることができることを意味する。高緊縮性条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１ｍＭピロリン酸ナトリウム中６５℃でのハイブリッド形成の後に０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する。
【００６９】
（ポリペプチド）
本発明はまた、個別に、並びに相互及び他のタンパク質と組合せて、嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドを含む、本発明のヌクレチド配列によりコードされる単離されたポリペプチドを含む。３文字暗号スキームの縮重のため、同じポリペプチドが異なるヌクレオチド配列によりコードされる可能性があることは、当業者にとって明白である。したがって、本明細書に開示する同じタンパク質をコードする縮重核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００７０】
（ポリヌクレオチド及びタンパク質の変異体）
本発明はまた、本明細書に開示するヌクレオチド及びタンパク質サブユニット配列の変異体及び突然変異体、特に、そのようなサブユニットから形成されているＣＮＧチャンネルの活性を変化させる突然変異体を含む配列を包含する。ＯＣＮＣ１の特に好ましい突然変異体は、突然変異体Ｃ４５８Ｗ及びＥ５８１Ｍを含むので配列番号１と異なる配列番号４により表される。
【００７１】
（発現配列）
本発明はまた、本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む単離された発現配列であって、ＣＮＧチャンネルサブユニットのコード配列が、転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結された配列を含む。そのような発現配列は、天然プロモーター領域とともに天然コード配列を含むことができるであろう。あるいは、発現構成体は、たとえば、特定の宿主細胞中での発現のために、コード配列を、異種プロモーター領域に作動可能に連結するように構成することができるであろう。また、コード配列が選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするリポーター配列に部分的又は完全に融合した組換えリポーター構成体も想定される。「発現配列」又は構成体は、ベクターの非存在下で宿主細胞にトランスフェクトし、宿主細胞の染色体に組み込むことができるであろう。
【００７２】
（発現ベクター）
本発明はまた、本明細書に開示する配列を含む発現ベクター及びそのようなベクターを含む宿主細胞を含む。「発現ベクター」は、ベクターが、それが含む遺伝子の配列を発現することを意味する。しかし、本明細書に開示するヌクレオチド配列であれば、必ずしも「発現」ベクターではなく、コード配列を含むものの、たとえば、ベクターを増殖させ、又は遺伝子の配列決定する手段として、ポリペプチドを発現しないような他のベクター（及び宿主細胞）も本発明に含まれる。
【００７３】
（宿主細胞）
本発明はまた、他のＣＮＧチャンネルサブユニットを発現する発現構成体又はベクターに加え、本発明の少なくとも１つの発現構成体又はベクターを含む宿主細胞であって、発現ポリペプチドが、当該細胞の表面にある機能的ＣＮＧチャンネルの一部もしくは全体を、会合させ、形成する宿主細胞も包含する。本発明に使用するのに適した宿主細胞としては、ヒト胚腎臓細胞（好ましくはＨＥＫ−２９３）、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｌｔｋ細胞及びＢＨＫ細胞などがある。個々の宿主細胞における発現のために必要な配列、すなわち、プロモーター、上流非翻訳領域、転写終結配列、ベクター増殖配列等は、用いる宿主細胞によって異なるが、当技術分野で既知の利用可能な分子ツールから容易に選択できることは、当業者に明らかである。
【００７４】
（嗅覚器ＣＮＧチャンネルアッセイ）
本発明はまた、本明細書に開示する核酸、タンパク質、ベクター及び宿主細胞を用いるアッセイを包含する。そのようなアッセイは、ＣＮＧチャンネル活性、又はＣＮＧチャンネル活性に関連するタンパク質若しくは２次メッセンジャーの活性の変化を測定するために、換言すれば、嗅覚シグナリングを阻害又は増強する際に用いられる、リガンドを特定し、又は小分子をスクリーニングする目的で設計されたアッセイを含む。たとえば、本発明は、（１）機能的ＣＮＧチャンネルを形成している、少なくとも１つのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードし発現する１つ又は複数の核酸を宿主細胞に導入し、（２）種々の刺激物質の存在下及び非存在下で、前記ＣＮＧチャンネルの活性化の量の変化を、１つ又は複数の細胞内陽イオンの濃度の変化を介して測定することを含むＣＮＧチャンネルの活性化の変化をモニターする、陽イオンに基づくアッセイを含む。本明細書に記載するように、機能的ＣＮＧチャンネルは、３種のサブユニットすべての発現により、又はＯＮＣＮ１及びＯＮＣＮ２の発現により、又はＯＮＣＮ１単独の発現により形成することができる。この意味において、「機能的」とは、細胞外陽イオンが通過することができ、ＣＮＧ刺激又は阻害に起因する細胞内陽イオンの濃度の変化を測定し、定量できるチャンネルを形成することを意味する。
【００７５】
そのようなアッセイにおいて、少なくとも１つの機能的ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットは、高緊縮性条件下で配列番号１とハイブリッドを形成する配列からなる群から選択される配列によりコードされるものが好ましい。このサブユニットは、単独又は他の嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットと共に発現して、機能的ＣＮＧチャンネル、すなわち、環状ヌクレオチドにより制御される陽イオンチャンネルを形成することができる。たとえば、ＯＣＮＣ１サブユニットを、高緊縮性条件下で配列番号２及び３とそれぞれハイブリッド形成する本発明の核酸により特にコードされるＯＣＮＣ２及び／又はβ１ｂサブユニットと共に発現させることができる。ＣＮＧチャンネルサブユニットのオーソログ、すなわち、他の動物種のＯＣＮＣ２及び／又はβ１ｂサブユニットも本発明のアッセイにおいてヒトＣＮＧチャンネルサブユニット、たとえば、ヒトＯＣＮＣ１サブユニットと共に発現させることができ、そのようなサブユニットの同時発現により、機能的キメラＣＮＧチャンネルが形成される。
【００７６】
本発明のそのようなアッセイは、嗅覚を調節する嗅覚器ＣＮＧチャンネルの調節物質を特定するのに用いることができる。そのようなアッセイにおいては、まず、宿主細胞を、フォルスコリン（又はアデニル酸シクラーゼの他の活性化物質）、ＩＢＭＸ（又はｃＡＭＰホスホジエステラーゼの他の阻害物質）、ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの膜透過性類似体のような基礎レベルのＣＮＧ活性化を誘導する物質で刺激する。Ｓ−ニトロシル化によりチャンネルを活性化する酸化窒素を発生する化合物のような、嗅覚器ＣＮＧチャンネルを直接活性化する試薬（Ｂｒｏｉｌｌｅｔ、２０００年）も用いることができる。次いで、ｆｕｒａ−２のような蛍光カルシウムキレート化剤（Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２年）、ナトリウムグリーンテトラ酢酸のような蛍光ナトリウムキレート化剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及びＮａ＋感受性色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）あるいは膜電位色素キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）やオキサノール−クマリンキット（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のような膜電位色素を用いて処理細胞へのイオンの流入をモニターすることにより、嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性化を定量する。嗅覚増強性嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性化物質は、ｃＡＭＰの増加に対する蛍光応答を増強するそれらの能力により同定することができ、嗅覚阻害性のチャンネルアンタゴニストは、蛍光応答を減弱させるそれらの能力により同定することができる。嗅覚器ＣＮＧチャンネルは、他のＣＮＧチャンネルの調節物質の特定のための代用としても用いることができると思われる。
【００７７】
（ＧＰＣＲ及びｃＡＭＰ濃度を制御する他のタンパク質のアッセイ）
本発明はまた、環状ヌクレオチド濃度を制御するタンパク質のアッセイを包含する。そのようなアッセイとしては、環状ヌクレオチド濃度の変化で生じるＣＮＧチャンネル活性の変化を測定するように設計されたアッセイが挙げられる。好ましくは、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］（配列番号４）のようなサブユニット変異体を利用する増感嗅覚器ＣＮＧチャンネルを用いて、これらのアッセイの感度を増加させることができる。このようなアッセイを用いて、アデニル酸シクラーゼ又はホスホジエステラーゼを制御するＧタンパク質に結合するＧＰＣＲの活性を定量し、高処理能力スクリーニングによりＧＰＣＲ調節物質を特定することができる。
【００７８】
たとえば、Ｇタンパク質結合受容体をコードする核酸も、必要に応じ、１つ又は複数のＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸及びＧタンパク質をコードする核酸に加え、本発明のアッセイに用いる宿主細胞に導入することができる。適切なＧタンパク質結合受容体としては、少し例を挙げると、臭気受容体、味覚受容体、鋤鼻器（ＶＮＯ）受容体、ミューオピエート受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体、アドレナリン受容体、セロトニン受容体、ドーパミン受容体、アンギオテンシン受容体、アデノシン受容体、ブラジキニン受容体、メタボトロピック興奮性アミノ酸受容体等がある。このようなアッセイにおいて、刺激物質を、ＣＮＧチャンネル活性に対する２次的な環状ヌクレオチド濃度の影響によって、Ｇタンパク質結合受容体活性の調節物質かどうかについてスクリーニングできる。
【００７９】
本発明のアッセイの細胞においてＧタンパク質結合受容体も発現させる場合、Ｇタンパク質結合受容体が嗅覚受容体であることが好ましい。そのような細胞は、Ｇタンパク質受容体の活性化をもたらす刺激物質、すなわち、臭気物質受容体と相互作用し、それによりＣＮＧの活性化を引き起こす臭気リガンドについて、スクリーニングすることができる。また、最初にＧタンパク質結合受容体をリガンドに曝露させて活性化して、当該受容体の活性化を増大することにより、ＣＮＧの活性化の増大をもたらす刺激物質（すなわち臭気増強物質）について前記細胞をスクリーニングするアッセイを企図する。そのような増強物質は、受容体又はＣＮＧチャンネルのレベルで作用して、ＣＮＧチャンネルの活性化を増大させることができる。そのような増強物質はまた、アデニル酸あるいはグアニル酸シクラーゼ、ホスホジエステラーゼ又は環状ヌクレオチド濃度を制御する他のタンパク質に対して作用することができると思われる。
また、そのような細胞は、受容体の活性化、又は受容体を介するＣＮＧチャンネル活性の活性化を減少させることにより、ＣＮＧの活性化の減少をもたらす刺激物質（すなわち、臭気阻害物質）についてスクリーニングすることができる。
【００８０】
本発明はまた、対照細胞の使用をさらに含む本明細書に記載するアッセイの変形形態を含む。たとえば、所望のＧタンパク質結合受容体の発現を含むアッセイは、さらに（ａ）機能的ＣＮＧチャンネルを形成するが、前記Ｇタンパク質結合受容体を発現しないように前記の少なくとも１つのＣＮＧチャンネルサブユニットを発現する第２の宿主細胞を供給する段階と、（ｂ）異なる刺激物質の存在下及び非存在下で前記第２宿主細胞におけるＣＮＧチャンネルの活性化の量の変化を測定する段階と、（ｃ）前記第２宿主における前記ＣＮＧチャンネルの活性化の量の前記変化を、前記Ｇタンパク質結合受容体を発現する前記細胞における前記ＣＮＧチャンネルの活性化の量と比較する段階とを含むことができる。
【００８１】
（感覚シグナリングに関与するタンパク質をコードする核酸を特定するためのアッセイ）
以下により詳細に述べるように、本発明は、感覚応答に関与するタンパク質、特に、ＣＮＧチャンネルと共に作用するタンパク質を特定する方法も含む。たとえば、（１）少なくとも１つのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードし発現する１つ又は複数の核酸を宿主細胞に導入して、当該少なくとも１つのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットに機能的ＣＮＧチャンネルを形成させ、（２）対象の感覚細胞から単離したｃＤＮＡｓ又はＲＮＡｓのライブラリーを前記哺乳類又はアフリカツメガエル宿主細胞に導入し、（３）トランスフェクトされた宿主細胞を既知感覚リガンドに曝露させて、リガンドに結合するＧタンパク質結合受容体を発現するトランスフェクトされた宿主細胞を特定することにより、特定の感覚シグナルに応答する細胞のＧタンパク質結合受容体をコードする核酸を同定することができる。
【００８２】
（ハイスループットアッセイ）
本発明のアッセイは、特にハイスループットスクリーニングアッセイを含む。多数のサンプルの測定を同時に行う装置は、当技術分野で知られている。たとえば、蛍光画像化プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）（ＦＬＩＰＲ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから入手可能であり、細胞内カルシウム若しくはナトリウム、膜電位及びｐＨの変化の単一波長検出に用いることができる。装置及びリーダーは、マイクロプレートの９６ウェルに化合物を同時に噴出して、１秒以内にすべてのウェルについて画像化することができるため、高処理方式に対応することができる。アルゴンレーザーは、特異的変化を測定するのに適する蛍光指示色素を励起し、放射された光を、関連光学系を用いて検出する。カメラシステムがプレート全体の画像を造り、ユーザにより指定された時間間隔でデータを取り込む。
【００８３】
また、Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの電圧イオンプローブリーダー（ＶＩＰＲ）のような装置を、２蛍光分子間の蛍光共鳴エネルギー伝達（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）の２波長検出に用いることができる。ＦＲＥＴは、２つの色素分子の電子の励起状態の間の距離依存性相互作用であり、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−、Ｃａ２＋及びリガンドゲートイオンチャンネルの活性を含む、分子の近接の変化をもたらすさまざまな生物学的活性を調べるのに用いることができる。Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の電圧センサープローブ技術は、膜結合ドナー分子と可動の電圧感受性アクセプター分子との間のＦＲＥＴを用いて、膜電位を検出する。ＶＩＰＲリーダーは、９６及び３８４ウェル方式に適用できる。
【００８４】
本発明のハイスループットアッセイには、さまざまな方式がある。たとえば、少なくとも２つ以上の個々の区画中にある少なくとも２つ以上の試験化合物に応答するＣＮＧチャンネルの活性を同時に検出又は測定するためのハイスループットアッセイの一の態様は、（１）少なくとも１つの嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードし発現する１つ又は複数の核酸を適切な宿主細胞に導入して、当該少なくとも１つのＣＮＧチャンネルサブユニットに、直接又は間接的に活性化されたときに、予め測定された細胞内イオン濃度に変化をもたらすように、機能的ＣＮＧチャンネルを形成させ、（２）前記宿主細胞を整列された個々の区画を有する分割培養容器に移し（トランスフェクションの前又は後に）、（３）前記宿主細胞に予め測定したイオンの濃度の変化を検出するのに十分なイオン感受性蛍光指示薬を負荷し、（４）前記の少なくとも２つ以上の個々の区画に、前記ＣＮＧチャンネルを直接又は間接的に活性化する能力を有する１つ又は複数の種類の試験化合物を加え、（５）少なくとも２つの前記区画におけるイオン感受性指示薬により放射される蛍光を検出又は測定して、前記ＣＮＧチャンネルの活性化に応答する予め測定したイオンの濃度の変化を検出することを含む。上記のように、アッセイは、少なくとも２つのサンプルを同時に測定するために用いることができるが、好ましい高処理能力方式は、少なくとも５、より好ましくは１０、より好ましくは５０、より好ましくは１００、できれば数百又は数千のサンプルを同時にスクリーニングすることが可能であることが好ましい。１回の処理でスクリーニングされるサンプルの数は、用いる個々のプレートにおける個々の区画の数、すなわち、２４、９６、３８４等に依存する。
【００８５】
本発明のハイスループットアッセイの変形形態において、前記の少なくとも２つの区画を前記試験化合物に曝露させるのと同時に、アレイにおける少なくとも１つの個々の区画を、ＣＮＧチャンネルの既知の活性化物質に曝露させることができる。そのような付加的な区画は、ＣＮＧチャンネル活性の検出のための陽性対照とすることができよう。適切な陰性対照を含む区画も含めることができよう。陽性対照に用いることができるＣＮＧチャンネルの既知の活性化物質としては、フォルスコリン、ＩＢＭＸ、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの透過性類似体並びに酸化窒素（ＮＯ）発生化合物（Ｓ−ニトロソシステイン−ＳＮＣなど）がある。
【００８６】
高処理能力方式に適用できる細胞は、本発明のアッセイで用いることができる。単層で成長する細胞は、蛍光プレートリーダーにおいて用いるときに、より一貫した結果が得られるので、特に好ましい。好適な細胞としては、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｌｔｋ細胞及びＢＨＫ細胞などがある。
【００８７】
（ＣＮＧチャンネルサブユニットの単離及び発現）
本発明の嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットまたはそのフラグメント若しくは変異体の単離及び発現は、下記のように実施することができる。
ＰＣＲプライマーを、図１に含まれる配列に基づいて嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸を増幅するために用いることができ、これにより、これらの核酸のライブラリーを、作製することができ。次いで、発現ベクターのライブラリーを用いて、これらライブラリーの機能的発現のための宿主細胞に感染又は移入させることができる。これらの遺伝子及びベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで調製し、発現させることができる。当業者は、核酸の発現を変化させ、制御するための所望の表現型が、本発明のベクター内の遺伝子及び核酸（たとえば、プロモーター、エンハンサー等）の発現又は活性を調節することにより得られることを理解するであろう。発現又は活性を増加又は減少させることを記載する、既知の方法を用いることができる。本発明は、科学及び特許文献に十分に記載されている、当技術分野で知られている方法又はプロトコルを考慮して実施することができる。
【００８８】
本発明の核酸配列及び本発明を実施するために用いる他の核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス又はその雑種であるかを問わず、遺伝子工学的に処理し、増幅し、かつ／又は組換えにより発現させたさまざまな起源から単離することができる。哺乳類細胞に加えて、たとえば、細菌、酵母、昆虫又は植物系などの組換え発現系を用いることができる。
【００８９】
また、これらの核酸は、たとえば以下に記載されているように、よく知られている化学合成法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができる。Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第４７巻、４１１〜４１８頁（１９８２年）、Ａｄａｍｓ、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１０５巻、６６１頁（１９８３年）、  Ｂｅｌｏｕｓｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、３４４０〜３４４４頁（１９９７年）、Ｆｒｅｎｋｅｌ、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．第１９巻、３７３〜３８０頁（１９９５年）、Ｂｌｏｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、７８８６〜７８９６頁（１９９４年）、Ｎａｒａｎｇ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻、９０頁（１９７９年）、Ｂｒｏｗｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第６８巻、１０９頁（１９７９年）、Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．第２２巻、１８５９頁（１９８１年）、米国特許第４，４５８，０６６号。２本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングして、あるいは、適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することにより得ることができる。
【００９０】
たとえば、配列中の突然変異体を得るためのサブクローニング、標識プローブ、配列決定、ハイブリッド形成等の核酸の操作のための技術は、科学及び特許文献に十分に記載されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、編、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７年）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）を参照のこと。
【００９１】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチド等は、当業者によく知られているいくつかの一般的手段のいずれかにより分析し、定量することができる。これらは、たとえば、ＮＭＲ、分光光度法、ラジオグラフィ、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィなどの分析生化学的方法、さまざまな免疫学的方法、たとえば、液体若しくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸若しくは標的若しくはシグナル増幅法、放射性標識法、シンチレーション計数法及びアフィニティクロマトグラフィなどである。
【００９２】
オリゴヌクレオチドプライマーは、嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸を増幅するために用いられる。本明細書に記載する核酸はまた、増幅技術を用いてクローン化又は定量的に測定することができる。また、典型的な縮重プライマー対配列を用いることにより、当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。増幅法も当技術分野でよく知られており、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９０年）、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９５年））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（たとえば、Ｗｕ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４巻、５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４１巻、１０７７頁、（１９８８年）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ、第８９巻、１１７頁（１９９０年）を参照）、転写増幅（たとえば、Ｋｗｏｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、１１７３頁（１９８９年）を参照）、自己持続配列複製（たとえば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、１８７４頁（１９９０年）を参照）、Ｑベータレプリカーゼ増幅（たとえば、Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３５巻、１４７７頁（１９９７年）を参照）、自動Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（たとえば、Ｂｕｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、第１０巻、２５７頁（１９９６年）を参照）及び他のＲＮＡポリメラーゼを用いる手法（たとえば、ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）などがある。また、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１５２巻、３０７頁（１９８７年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、Ｓｏｏｋｎａｎａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１３巻、５６３頁（１９９５年）も参照。
【００９３】
一旦増幅されたならば、核酸は、個別に、又はライブラリーとして、当技術分野で知られている方法に従って、所望ならば、通常の分子生物学的方法を用いてさまざまなベクターにクローン化することができる。増幅核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏでクローンする方法は、たとえば、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。増幅配列のクローニングを促進するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む」ことができる。
【００９４】
縮重プライマー対の設計のパラダイムは、当技術分野においてよく知られている。たとえば、共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯｎｓｅｎｓｕｓ−ＤＥｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ）（ＣＯＤＥＨＯＰ）戦略コンピュータプログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌでアクセスでき、一連の関連タンパク質配列から始まるハイブリッドプライマー予測のために、ＢｌｏｃｋＭａｋｅｒ多重配列アライメントサイトから直接連結されている（たとえば、Ｒｏｓｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２６巻、１６２８頁（１９９８年）、Ｓｉｎｇｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２４巻、３１８頁（１９９８年）を参照）。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプライマー対を合成する手段は、当技術分野でよく知られている。「天然」塩基対又は合成塩基対を用いることができる。たとえば、人工核酸塩基の使用は、プライマー配列を操作する汎用性のあるアプローチを提供し、増幅産物のより複雑な混合物を産生する。人工核酸塩基の種々のファミリーは、内部結合回転による多重水素結合配向を推定して、縮重分子を認識する手段を提供することができる。これら類似体のＰＣＲプライマーの単一位置への組込みにより、増幅産物の複雑なライブラリーを得ることができる。たとえば、Ｈｏｏｐｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、４８６６頁（１９９７年）を参照のこと。非極性分子も天然ＤＮＡ塩基の形状を模擬するために用いることができる。アデニンの非水素結合形状模擬は、チミンの非極性形状模擬に反して効率的かつ選択的に再現することができる（たとえば、Ｍｏｒａｌｅｓ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第５巻、９５０頁（１９９８年）を参照）。たとえば、２つの縮重塩基は、ピリミジン塩基６Ｈ、８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン又はプリン塩基Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンとすることができる（たとえば、Ｈｉｌｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻、４２５８頁（１９９８年）を参照）。本発明の典型的縮重プライマーは、ヌクレオチド類似体５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシ−シチジン，３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトを組み込んでいる（配列中の「Ｐ」については、上記を参照）。このピリミジン類似体水素は、Ａ及びＧ残基を含むプリンと結合する。
【００９６】
嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをコードする核酸は、縮重プライマー対を用いる適切な核酸配列の増幅（たとえば、ＰＣＲ）により得られる。増幅核酸は、細胞又は組織からのゲノムＤＮＡ、あるいは嗅覚受容体発現細胞、たとえば、嗅覚ニューロン又は嗅上皮由来のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとすることができる。
【００９７】
嗅覚細胞からのＤＮＡの単離は、上記のように当技術分野でよく知られている。（対象ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを構成的又は誘導的に発現する細胞を用いて嗅覚受容体を阻害又は調節する化合物をスクリーニングすることができる。）たとえば、細胞を、成熟嗅覚ニューロンにおいてほぼ専ら発現する豊富な細胞質タンパク質である嗅覚マーカータンパク質（ＯＭＰ）により同定することができる（たとえば、Ｂｕｉａｋｏｖａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、９８５８頁（１９９６年）を参照）。Ｓｈｉｒｌｅｙ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３２巻、４８５頁（１９８３年）は、嗅覚メカニズムに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生化学的試験に適したラット嗅覚製剤を記載している。成体ラット嗅覚受容体ニューロンの培養がＶａｒｇａｓ、Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ、第２４巻、２１１頁（１９９９年）に記載されている。また、米国特許第５，８６９，２６６号は、神経毒性試験及びスクリーニング用のヒト嗅覚ニューロンの培養を記載している。Ｍｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第１９巻、８２６０頁（１９９９年）は、カルシウムの流入により測定される臭気物質に応答する培養中分化嗅覚受容体発現細胞を記載している。
【００９８】
対象ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットを含むハイブリッドタンパク質コード配列も転移配列に融合させることができる。また、これらの核酸配列は、転写又は翻訳制御要素、たとえば、転写又は翻訳開始配列、プロモーター及びエンハンサー、転写又は翻訳終止配列、ポリアデニル化配列並びにＤＮＡのＲＮＡへの転写に有用な他の配列に、作動可能に連結させることができる。組換え発現カセットの構成体において、ベクター、形質転換体及びプロモーターフラグメントを用いて、すべての組織における所望の核酸の発現を誘導することができる。嗅覚細胞特異的転写要素も、たとえば、Ｍ４嗅覚受容体コード領域の上流６．７ｋｂ領域を含む融合ポリペプチド受容体を発現させるために用いることができる。この領域は、野生型ゾーン制限及び内因性嗅覚受容体の分散ニューロン発現を伴う嗅上皮における発現を行わせるために十分なものである（Ｑａｓｂａ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第１８巻、２２７頁、１９９８年）。受容体遺伝子は、通常、感覚上皮のゾーン制限領域の至る所にあるニューロンの小サブセットにおいて発現する。転写又は翻訳制御要素は、ＡＴＣＣ又はＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような起源から得られる天然起源から単離することができ、あるいは、合成又は組換え法により調製することができる。
【００９９】
Ｃ末端、又はより好ましくは、Ｎ末端移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）配列を有する融合タンパク質は、本明細書に記載する移動モチーフを含むこともできる。但し、これらの融合タンパク質は、たとえば、タンパク質の検出、精製又は他の適用例のための追加の要素を含むことができる。検出及び精製促進ドメインは、たとえば、固定化金属の精製を可能にするポリヒスチジン系又はヒスチジン−トリプトファンモジュール又は他のドメインのような金属キレート化ペプチド；マルトース結合タンパク質；固定化免疫グロブリンの精製を可能にするタンパク質Ａドメイン；またはＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、ワシントン州シアトル）に用いられるドメインなどである。
【０１００】
ファクターＸａ（たとえば、Ｏｔｔａｖｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、第８０巻、２８９頁（１９９８年）を参照）、ズブチリシンプロテアーゼ認識モチーフ（たとえば、Ｐｏｌｙａｋ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．第１０巻、６１５頁（１９９７年）を参照）等の切断可能なリンカー配列；及びエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）等を、転移ドメイン（効率のよい形質膜発現のため）と残りの新たに翻訳されたポリペプチドとの間に含めることは、精製の促進に有用である。たとえば、一の構築体において、チオレドキシンの前の６ヒスチジン残基に結合するポリペプチドをコードする核酸配列と、エンテロキナーゼ切断部位（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｔｒｙ第３４巻、１７８７頁（１９９５年）を参照）と、アミノ末端移動ドメインとを含むことができる。ヒスチジン残基は、検出と精製を促進し、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分の所望のタンパク質の精製の手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターに関する技術及び融合タンパク質の適用例は、科学及び特許文献に十分に記載されている。たとえば、Ｋｒｏｌｌ、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１２巻、４４１頁（１９９３年）を参照のこと。
【０１０１】
個々の発現ベクター又は発現ベクターのライブラリーとしての発現ベクターは、嗅覚結合ドメインをコードする配列を含むが、当該発現ベクターは、科学及び特許文献に十分に記載されているさまざまな従来の技術により、ゲノムまたは細胞質若しくは細胞核に導入し、発現させることができる。たとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ、第３２８巻、７３１頁（１９８７年）、Ｂｅｒｇｅｒ、前出、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．第６４３５巻、１０頁（１９９５年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ａｕｓｕｂｅｌを参照のこと。生物学的試薬及び実験装置の製造業者からの製品情報も既知の生物学的方法に関する情報を提供する。ベクターは、天然源から単離することができ、ＡＴＣＣ又はＧｅｎＢａｎｋライブラリーといった起源から得られ、合成又は組換え法により調製することができる。
【０１０２】
核酸は、細胞中で安定に又は一時的に発現させた発現カセット、ベクター又はウイルスを用いて発現させることができる（たとえば、エピソーム発現システム）。形質転換細胞及び配列に選択可能な表現型を付与するために、選択マーカーを発現カセット及びベクターに組み込むことができる。たとえば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの組み込みが必要ないように、エピソームの維持及び複製のためにコードすることができる。たとえば、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の選択を可能にするために、マーカーは抗生物質耐性（たとえば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）又は除草剤耐性（たとえば、クロロスルフロン又はＢａｓｔａ）をコードすることができる（たとえば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ、Ｇｅｎｅ、第１９０巻、３１５頁（１９９７年）、Ａｕｂｒｅｃｈｔ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２８１巻、９９２頁（１９９７年）を参照）。ネオマイシン又はハイグロマシシン様基質に耐性を付与する選択マーカー遺伝子は、組織培養中でのみ使用することができるので、化学耐性遺伝子もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで選択マーカーとして用いられる。
【０１０３】
本発明はまた、特定の核酸及びアミノ酸配列を有するＤＮＡ及びタンパク質だけでなく、ＤＮＡフラグメント、特に、たとえば、４０、６０、８０、１００、１５０、２００又は２５０ヌクレオチドもしくはそれ以上のフラグメント並びにたとえば、１０、２０、３０、５０、７０、１００又は１５０アミノ酸もしくはそれ以上のタンパク質フラグメントも含む。
【０１０４】
少なくとも１０、２０、３０、５０、７０、１００又は１５０以上のアミノ酸からなる、少なくとも１つの本明細書に記載する感覚受容体ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットと、任意に他のペプチド、たとえば、他の受容体サブユニット又は受容体ポリペプチドとを含む、キメラタンパク質も企図する。キメラ受容体は当技術分野でよく知られており、それらを造る技術並びに異なる受容体のドメイン又はフラグメントの選択及び境界もよく知られている。したがって、当業者のこの知識を用いてそのようなキメラ受容体を容易に造ることができる。そのようなキメラ受容体を用いることにより、たとえば、本明細書に具体的に開示する受容体の１つの嗅覚選択特性と、従来技術のアッセイ系で用いられるよく知られている受容体のような他の受容体のシグナル変換特性とを結合させることができる。
【０１０５】
本明細書に開示するヒト嗅覚ＣＮＧサブユニットと実質的に同じである多形性変異体、対立遺伝子、種間同族体は、図１に含まれる配列に基づいて構成された核酸プローブを用いて単離することができる。または、感覚受容体同族体も認識し選択的に結合する感覚受容体由来のポリペプチドに対して産生させた抗血清又は精製抗体を用いて、発現同族体を免疫学的に検出することにより、発現ライブラリーを用いて、感覚受容体並びにその多形性変異体、対立遺伝子及びその種間同族体を単離することができる。
【０１０６】
本発明のヒトＣＮＧチャンネルサブユニットフラグメント又は変異体を発現させるための宿主細胞も本発明の範囲内である。ＣＮＧサブユニットフラグメント又はその変異体をコードするｃＤＮＡのようなクローン遺伝子又は核酸の高レベルの発現を得るためには、目的の核酸配列を、転写を誘導するための強いプロモーター、転写／翻訳終結区、及び（核酸がタンパク質をコードする場合には、）翻訳開始のためのリボソーム結合部位、を含む発現ベクターにサブクローンする。適切な原核及び真核発現システムは、当技術分野でよく知られており、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０１０７】
異種ヌクレオド配列を、宿主細胞に導入するためのよく知られている方法を用いることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、並びに宿主細胞にクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の異種遺伝物質を導入するための他のよく知られている方法（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）などである。用いる特定の遺伝子工学的方法は、目的の嗅覚受容体、フラグメント又は変異体を発現させることができる宿主細胞へ、少なくとも１つの遺伝子を有効に導入することができることのみが必要とされる。
【０１０８】
発現ベクターを細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を目的の受容体、フラグンメント又は変異体の発現に有利な条件下で培養し、次いで、標準的技法を用いて培養から回収する。そのような技法の例は当技術分野でよく知られている。この開示と一致した方法で参照により本明細書に組み込まれる、たとえば、国際公開第００／０６５９３号を参照のこと。
【０１０９】
（感覚受容体ポリペプチドの免疫学的検出）
核酸ハイブリッド形成法を用いるヒト嗅覚ＣＮＧサブユニット遺伝子及び遺伝子発現の検出に加えて、感覚受容体を検出するために、たとえば、嗅覚受容体細胞並びに感覚受容体ファミリーメンバーの変異体を同定するためにイムノアッセイも用いることができる。イムノアッセイを用いて、感覚受容体を定性的又は定量的に分析することができる。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）に見いだすことができる。
【０１１０】
（ヒト嗅覚ＣＮＧサブユニットに対する抗体）
ヒト嗅覚ＣＮＧサブユニットファミリーメンバーと特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当業者に知られている（たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）及びＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５頁（１９７５年）を参照）。そのような技術は、ファージ又は類似のベクターにおいて組換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製、並びにウサギ又はマウスを免疫することによるポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製などがある（たとえば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５頁（１９８９年）、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３４１巻、５４４頁（１９８９年）を参照）。
【０１１１】
特定の嗅覚ＣＮＧサブユニットファミリーメンバーと特異的に反応する抗体を生産するために、多くの免疫原を用いることができる。たとえば、組換えＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質又はその抗原性フラグメントを本明細書に記載のように単離することができる。組換えタンパク質は、上記のように真核又は原核細胞中で発現させることができ、一般的に上記のように精製することができる。組換えタンパク質は、モノクローナル又はポリクローナル抗体の生産のための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示した配列から得られ、担体タンパク質に結合させた合成ペプチドを免疫原として用いることができる。天然に存在するタンパク質も純粋又は不純な形態で使用することができる。次に、生産物を、抗体を産生することができる動物に注射する。産生したモノクローナル又はポリクローナル抗体は、後でタンパク質を測定するためのイムノアッセイにおいて使用することができる。
【０１１２】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、当業者に知られている。マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ又はニワトリをアジュバント（たとえば、フロイントのアジュバント）及び定期的ブーストを伴う標準免疫化プロトコルを用いてタンパク質で免疫化することができる。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、検査用採血を行って、感覚受容体に対する反応性の力価を測定することによりモニターする。免疫原に対して適切に高い力価の抗体が得られた時に、動物から血液を採集して抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に対して反応性の抗体が豊富な抗血清の分画を更に行うことができる（Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出を参照）。
【０１１３】
モノクローナル抗体は、当業者に知られているさまざまな手法により得ることができる。簡単に述べると、所望の抗原で免疫化した動物の脾臓細胞を一般的に骨髄腫細胞との融合により固定化することができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻、５１１頁（１９７６年）を参照）。固定化の別の方法は、エプスタインバールウイルス、腫瘍遺伝子又はレトロウイルスによる形質転換もしくは当技術分野でよく知られている他の方法である。固定化細胞の単一クローンから生じたコロニーを、抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の生産についてスクリーニングし、そのような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含むさまざまな手法により増加させることができる。または、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５頁（１９８９年）により略述された一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体又はその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
【０１１４】
モノクローナル抗体及びポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、たとえば、固形担体に固定化した免疫原を用いる固相イムノアッセイにおいて抗原に対して力価測定する。一般的に、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清を選択し、非感覚受容体タンパク質、又は他の感覚受容体ファミリーメンバー若しくは他の生物の他の関連タンパク質に対するそれらの交差反応性について、競合的結合イムノアッセイを用いて試験する。特異的ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約０．１ｍＭ、より通常には少なくとも約１ｐＭ、任意に少なくとも約０．１ｐＭ又はより良好な値、また任意に０．０１ｐＭ又はより良好な値のＫｄで結合する。一旦ヒトＣＮＧサブユニット特異抗体が得られれば、個々の嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質をさまざまなイムノアッセイ方法により検出することができる。免疫学的及びイムノアッセイ方法のレビューについては、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ編、第７版、１９９１年）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０年）及びＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、前出、において広範にレビューされている、いくつかの構成で実施することができる。
【０１１５】
（免疫学的結合アッセイ）
ＣＮＧサブユニットタンパク質は、多くのよく認識されている免疫学的結合アッセイのいずれかを用いて検出し、かつ／又は定量することができる（たとえば、米国特許第４，３６６，２４１号、第４，３７６，１１０号、第４，５１７，２８８号及び第４，８３７，１６８号を参照）。一般的イムノアッセイのレビューについては、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３年）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ編、第７版、１９９１年）も参照のこと。免疫学的結合アッセイ（又はイムノアッセイ）では、一般的に最適のタンパク質又は抗原（この場合、感覚受容体ファミリーメンバー又はその抗原性サブ配列）に対して特異的に結合する抗体を用いる。抗体（たとえば、抗感覚受容体）は、当業者によく知られている多くの手段のいずれかにより、及び上記のようにして生産することができる。
【０１１６】
イムノアッセイはまた、抗体と抗原により形成される複合体に特異的に結合し、標識するための標識物質をしばしば用いる。標識物質は、それ自体を、抗体／抗原複合体の一部としてもよい。したがって、標識物質は、標識感覚受容体ポリペプチド又は標識抗感覚受容体抗体とすることができる。または、標識物質は、抗体／感覚受容体複合体に特異的に結合する第２抗体のような第３の部分とすることができる（第２抗体は、第１抗体が得られる動物種の抗体に対して一般的に特異的である）。プロテインＡ又はプロテインＧのような免疫グロブリン定常部に特異的に結合することができる他のタンパク質も標識物質として用いることができる。これらのタンパク質は、さまざまな動物種の免疫グロブリン定常部と強い非免疫原性反応を示す（たとえば、Ｋｒｏｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１１１巻、１４０１頁（１９７３年）、Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３５巻、２５８９頁（１９８５年）を参照）。標識物質は、ストレプトアビジンのような他の分子が特異的に結合することができるビオチンのような検出可能な部分で修飾することができる。さまざまな検出可能な部分は、当業者によく知られている。
【０１１７】
アッセイを通じて、インキュベーション及び／又は洗浄段階が、それぞれの試薬混合後に必要である。インキュベーション段階は、約５秒から数時間まで、任意に約５分から約２４時間まで変えることができる。もっとも、インキュベーション時間は、アッセイ方式、抗原、溶液の量、濃度等に依存する。アッセイは、１０℃〜４０℃のような温度範囲で行うことができるが、通常、周囲温度で実施される。
【０１１８】
（非競合的アッセイ方式）
サンプル中のタンパク質を検出するためのイムノアッセイは、競合的なものでも非競合的なものでもよい。非競合的イムノアッセイは、抗原の量を直接測定するアッセイである。一の好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、たとえば、抗感覚受容体抗体を、それらが固定化される固形基体に直接結合させる。次いでこれらの固定化抗体が試験サンプル中に存在するＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質を捕捉する。次いで、そのようにして固定化された嗅覚チャンネルサブユニットタンパク質は、標識を有する第２抗嗅覚チャンネルサブユニット抗体のような標識物質により結合される。または、第２抗体は、標識を欠いてもよいが、次に、第２抗体が得られる動物種の抗体に対して特異的な標識第３抗体により結合される。第２又は第３抗体は一般的に、検出可能な部分を得るために、たとえば、ストレプトアビジンのような他の分子が特異的に結合することができるビオチンのような検出可能な部分で修飾されている。
【０１１９】
（競合的アッセイ方式）
競合的アッセイでは、サンプル中に存在するＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質の量を、サンプル中に存在する未知の嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質により抗ＣＮＧチャンネルサブユニット抗体からはずれた（競合脱離した）既知の添加（外因性）感覚受容体タンパク質の量を測定することにより間接的に測定する。一の競合的アッセイにおいて、既知量のＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質をサンプルに加え、次いで、サンプルをそのタンパク質サブユニットに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体に結合する外因性チャンネルサブユニットタンパク質の量は、サンプル中に存在するチャンネルサブユニットタンパク質の濃度に逆比例する。特に好ましい実施形態においては、抗体が固形基体に固定化されている。抗体に結合したタンパク質の量は、サブユニット／抗体複合体に存在するタンパク質の量を測定するか、あるいは、残りの複合体化していないタンパク質の量を測定して決定する。タンパク質の量は、標識された感覚受容体分子を供給することによって検出することができる。
【０１２０】
他の好ましい競合的アッセイとしては、ハプテン阻害アッセイがある。このアッセイでは、既知のチャンネルサブユニットタンパク質を固形基体に固定化する。既知量の抗感覚受容体抗体をサンプルに加え、次いで、サンプルを固定化された感覚受容体と接触させる。既知の固定化ＣＮＧサブユニットタンパク質に結合した抗ＣＮＧチャンネルサブユニット抗体の量は、サンプル中に存在するＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質の量に逆比例する。繰り返しになるが、固定化された抗体の量は、抗体の固定化された画分又は溶液中に残っている抗体の画分を検出することにより検出することができる。検出は、抗体が標識されている場合には直接に行うことができ、又は上記のように抗体に特異的に結合する標識部分の後の添加により間接的に行うことができる。
【０１２１】
（交差反応性の測定）
競合的結合方式のイムノアッセイは、交差反応性の測定にも用いることができる。たとえば、本明細書に開示する核酸配列により少なくとも部分的にコードされたタンパク質を固形担体に固定化することができる。固定化抗原への抗血清の結合に対して競合するタンパク質（たとえば、ＣＮＧサブユニットタンパク質及び同族体）をアッセイに加える。固定化タンパク質への抗血清の結合に対して競合する添加タンパク質の能力を、それ自体と競合する本明細書に開示する核酸配列によりコードされたＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドの能力と比較する。上記のタンパク質の交差反応性の割合を標準計算法により計算する。上記の添加タンパク質のそれぞれと１０％未満の交差反応性を示す抗血清を選択し、プールする。交差反応性抗体は、任意に、考慮した添加タンパク質、たとえば、関連性が小さい同族体を用いる免疫吸収により、プールした抗血清から除去する。さらに、感覚受容体ファミリーのメンバーを同定するのに用いられる保存モチーフを表すアミノ酸配列を含むペプチドは、交差反応性の判定に用いることができる。
【０１２２】
次いで、免疫吸収してプールした抗血清を、上記の競合的結合免疫アッセイに用いて、嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットファミリーメンバーのおそらく対立遺伝子又は多形性変異体と考えられる第２のタンパク質を、免疫原性タンパク質（すなわち、本明細書に開示する核酸配列によりコードされたＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質）と比較する。この比較を行うために、２つのタンパク質をそれぞれ広範囲の濃度で分析し、固定化されたタンパク質への抗血清の結合の５０％を阻害するのに必要な各タンパク質の量を測定する。結合の５０％を阻害するのに必要な第２のタンパク質の量が、結合の５０％を阻害するのに必要な本明細書に開示する核酸配列によりコードされたタンパク質の量の１０倍未満の場合、第２のタンパク質は、感覚受容体免疫原に対して発生したポリクローナル抗体に特異的に結合するとされる。
【０１２３】
（他のアッセイ方式）
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を用いて、サンプル中の嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質の存在を検出し、定量する。この手法は一般的に、分子量に基づきゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離し、分離したタンパク質を適切な固形担体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルター）に移し、サンプルを感覚受容体タンパク質に特異的に結合する抗体とともにインキュベートすることを含む。抗ＣＧＮチャンネルサブユニットポリペプチド抗体は、固形担体上のＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドに特異的に結合する。これらの抗体は、抗ＣＮＧチャンネルサブユニット抗体に特異的に結合する標識抗体（たとえば、標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いて直接標識することができるか、あるいは後に検出することができる。
【０１２４】
他のアッセイ方式としては、特定の分子（たとえば、抗体）に結合するように設計されたリポソーム及びカプセル封入された試薬若しくはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用いるリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられる。放出された化学物質を標準的手法により検出する（Ｍｏｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．第５巻、３４頁（１９８６年）を参照）。
【０１２５】
（非特異的結合の低減）
当業者は、イムノアッセイにおける非特異的結合を最小限にすることがしばしば望ましいことを認識している。特に、アッセイが固形基体に固定化されている抗原又は抗体を用いるものである場合、基体への非特異的結合の量を最小限にすることが望ましい。そのような非特異的結合を低減する手段は、当業者によく知られている。一般的に、この手法は、タンパク質性組成物で基体をコーティングすることを含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳及びゼラチンのようなタンパク質組成物が広く使用されており、粉乳が最も好ましい。
【０１２６】
（標識）
アッセイに用いられる特定の標識又は検出可能な基は、アッセイに用いる抗体の特異的結合を有意に妨げない限り、本発明の重要な点ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する物質とすることができる。そのような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に発達しており、一般的に、そのような方法において有用なほとんどの標識は、本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能なあらゆる組成物である。本発明における有用な標識としては、磁気ビーズ（たとえば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン等）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３３Ｐ又は３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビ、リン酸アルカリ及びＥＬＩＳＡに一般的に用いられている他のもの）、コロイド金又は着色ガラス又はプラスチックビーズ（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）のような測色標識などがある。
【０１２７】
標識は、当技術分野で知られている方法によりアッセイの所望の成分に直接又は間接的に結合させることができる。上記のように、広範囲の標識を用いることができるが、必要とする感度、化合物との複合の容易さ、安定性要件、利用可能な機器及び廃棄規定に応じて標識を選択する。
【０１２８】
非放射性標識は、間接的な手段により結合させることが多い。一般的に、リガンド分子（たとえば、ビオチン）をその分子に共有結合させる。次いで、リガンドは、検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物のような本質的に検出可能又はシグナルシステムに共有結合する他の分子（たとえば、ストレプトアビジン）に結合する。リガンド及びそれらの標識は、感覚受容体タンパク質を認識する抗体又は抗感覚受容体を認識する第２抗体と適切に組み合わせて用いることができる。
【０１２９】
分子は、たとえば、酵素又は蛍光団との複合など、シグナル発生化合物に直接的に結合させることもできる。標識としての対象酵素は、主としてヒドロラーゼ、特に、ホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ又はオキシドターゼ、特に、ペルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等がある。化学発光化合物としては、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、たとえば、ルミノールなどがある。用いることができる種々の標識又はシグナル発生システムに関するレビューについては、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。標識を検出する手段は、よく知られている。したがって、たとえば、標識が放射性標識である場合、検出手段は、シンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィにおけるような写真フィルムなどである。標識が蛍光標識である場合、標識は適切な波長の光で蛍光色素を励起し、発生した蛍光を検出することにより検出することができる。蛍光は、写真フィルムにより、あるいは電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光電子倍増管等の電子的検出器の使用により、視覚的に検出することができる。同様に、酵素標識は、酵素の適切な基質を用い、得られた反応生成物を検出することにより検出することができる。最後に、単純な測色標識は、標識に付随する色を単に観察して検出することができる。したがって、さまざまなディップステックアッセイにおいては、結合した金が、しばしばピンク色を示し、さまざまな複合ビーズが、そのビーズの色を示す。
【０１３０】
一部のアッセイ方式は、標識化合物の使用を必要としない。たとえば、凝集アッセイを用いて、標的抗体の存在を検出することができる。この場合、抗原被覆粒子を標的抗体を含むサンプルにより凝集させる。この方式では、いずれの化合物も標識する必要がなく、標的抗体の存在は簡単な目視検査により検出される。
【０１３１】
（蛍光偏光アッセイ）
他の実施形態において、蛍光偏光（「ＦＰ」）に基づくアッセイを用いて結合を検出し、モニターすることができる。蛍光偏光は、平衡結合、核酸ハイブリッド形成及び酵素活性を測定するための汎用性のある実験室技術である。蛍光偏光アッセイは、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィ、沈殿又は電気泳動のような分離段階を必要としない点で同質である。これらのアッセイは、リアルタイムで、溶液中で直接的に行われ、固定化相を必要としない。偏光の測定は迅速で、サンプルを破壊しないので、偏光値を、繰り返し且つ試薬の添加後に測定することができる。一般的に、この手法を用いて、低いピコモルからマイクロモルまでの蛍光団の偏光値を測定することができる。この項では、受容体への臭気物質の結合を単純かつ定量的方法で測定するのに、どのようにして蛍光偏光を用いることができるかを述べる。
【０１３２】
蛍光標識分子を平面偏光により励起させたとき、その分子は、その分子旋光度に逆比例する偏光の程度を有する光を放射する。大きい蛍光標識分子は、励起状態の間（フルオレセインの場合、４ナノ秒）、相対的に静止した状態を保持し、光の偏光は、励起と放射との間で、相対的に一定の状態を保持する。小さい蛍光標識分子は、励起状態時に速やかに回転し、偏光は励起と放射との間で有意に変化する。したがって、小分子は低い偏光値を有し、大分子は高い偏光値を有する。たとえば、１本鎖フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドは、比較的低い偏光値を有するが、相補鎖とハイブリド形成したとき、より高い偏光値を有する。本発明の感覚受容体を活性化又は阻害する臭気物質結合を検出し、モニターするためにＦＰを用いる場合、蛍光標識知覚刺激物質又は自己蛍光知覚刺激物質を用いることができる。
１．蛍光偏光（Ｐ）は次のように定義される。
【０１３３】
【数１】
2005500836.tif 000002
【０１３４】
ここで、ＩｎｔΠは励起光面に平行な放射光の強度であり、Ｉｎｔ⊥は励起光面に垂直な放射光の強度であり、Ｐは光の強度の比で、無次元数である。たとえば、Ｂｅａｃｏｎ（商標登録）及びＢｅａｃｏｎ  ２０００（商標）システムをこれらのアッセイに関連して用いることができる。そのようなシステムは、一般的に偏光をミリ偏光単位（１偏光単位＝１０００ｍＰ単位）で表す。
【０１３５】
分子旋光度とサイズとの関係は、Ｐｅｒｒｉｎ式により記述される。読者は、この式の十分な説明が記載されている、Ｊｏｌｌｅｙ、Ｊ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第５巻、２３６頁、１９８１年を参照のこと。要約すると、Ｐｅｒｒｉｎ式は、偏光が、分子が約６８．５゜の角度を回転するのに必要な時間である回転緩和時間に比例することを記述している。回転緩和時間は、粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子容（Ｖ）及び気体定数（Ｒ）に次の式により関連づけられる。
【０１３６】
【数２】
2005500836.tif 000003
【０１３７】
回転緩和時間は、小分子（たとえば、フルオレセイン）では小さく（約１ナノ秒）、大分子（たとえば、免疫グロブリン）では大きい（約１００ナノ秒）。粘度及び温度を一定に保持するならば、回転緩和時間、したがって、偏光は、分子容に直接関係づけられる。分子容の変化は、蛍光標識分子の他の分子との相互作用、解離、重合、分解、ハイブリッド形成又はコンフォーメーションの変化に起因する可能性がある。たとえば、蛍光偏光は、プロテアーゼ、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼによる大きい蛍光標識ポリマーの酵素切断を測定するために用いられている。蛍光偏光はまた、タンパク質／タンパク質相互作用、抗体／抗原結合及びタンパク質／ＤＮＡ結合における平衡結合を測定するために用いられている。
【０１３８】
（可溶及び固相状態ハイスループットアッセイ）
ハイスループットアッセイでは、１日に最大数千種の調節物質又はリガンドをスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択された潜在的調節物質に対して独立したアッセイを行うことができ、もし濃度又はインキュベーション時間による影響を観察する場合には、５〜１０ウェルを用いて１つの調節物質を試験することができる。したがって、１枚の標準マイクロタイタープレートで約１００種（たとえば、９６種）の調節物質についてアッセイを行うことができる。１５３６ウェルプレートを用いる場合、１枚のプレートで約１０００種から約１５００種の化合物についてアッセイを容易に行うことができる。１日当たり数枚の異なるプレートを用いてアッセイを行うことが可能であり、本発明の統合システムを用いて、最大約６，０００〜２０，０００種の化合物のアッセイによるスクリーニングが可能である。最近では、試薬操作に対するマイクロ流体アプローチが開発されている。
【０１３９】
目的の分子は、固体状態構成要素に直接又は間接的に、たとえばタグを介して共有結合又は非共有結合により結合させることができる。タグはさまざまな構成要素とすることができる。一般的に、タグに結合する分子（タグバインダー）を固形担体に結合させ、タグをつけた目的の分子（たとえば、目的の味覚変換分子）を、タグとタグバインダーとの相互作用により固形担体に結合させる。
【０１４０】
文献に十分に記載されている既知の分子相互作用に基づいて、多数のタグ及びタグバインダーを用いることができる。たとえば、タグが、たとえば、ビオチン、プロテインＡ又はプロテインＧのような天然バインダーを備えている場合、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ部等）とともに用いることができる。ビオチンのような天然バインダーを有する分子に対する抗体も広く利用可能であり、適切なタグバインダーである（ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１９９８年カタログ、ＳＩＧＭＡ（ミズーリ州セントルイス）を参照）。
【０１４１】
同様に、ハプテン性又は抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて、タグ／タグバインダー対を形成させることができる。何千もの特異抗体が市販されており、他の多くの抗体が文献に記載されている。たとえば、１つの一般的な形態において、タグは第１抗体であり、タグバインダーは第１抗体を認識する第２抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もタグ及びタグバインダー対として適切である。たとえば、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト（たとえば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体及び抗体のような細胞受容体−リガンド相互作用、並びにカドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等、たとえば、Ｐｉｇｏｔｔ  ＆  Ｐｏｗｅｒ、Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｉｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３年）を参照）である。
同様に、トキシン及び毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（たとえば、オピエート、ステロイド等）、細胞内受容体（たとえば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤを含むさまざまな小リガンドの作用を媒介する；ペプチド）、薬物、レクチン、糖、核酸（線状及び環状ポリマーの形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質及び抗体はすべて種々の細胞受容体と相互作用することができる。
【０１４２】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド及びポリアセテートのような合成ポリマーも適切なタグ又はタグバインダーを形成し得る。この開示の検討に際して明らかなように、他の多くのタグ／タグバインダー対も本明細書に記載のアッセイシステムに有用である。
【０１４３】
ペプチド、ポリエーテル等の一般的なリンカーも、タグとなり得るものであり、約５〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列のようなポリペプチド配列などが挙げられる。そのようなフレキシブルなリンカーは、当業者に知られている。たとえば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（アラバマ州ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ））から入手可能である。これらのリンカーは、任意に、アミド結合、スルフヒドリル結合又は異種官能基結合を有することができる。
【０１４４】
タグバインダーを、現在利用可能な種々の方法を用いて固形基体に固定する。固形基体は一般的に、タグバインダーの一部との反応性を有する化学基を表面に固定する化学試薬に基体の全部又は一部を曝露することにより、誘導体化又は官能基化する。たとえば、より長い鎖部分への結合に適した基は、アミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基などである。アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランを用いて、ガラス表面のようなさまざまな表面を官能基化することができる。そのような固相生体高分子アレイの構成は、文献に十分に記載されている。たとえば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第８５巻、２１４９頁（１９６３年）（たとえば、ペプチドの固相合成を記載）、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．第１０２巻、２５９頁（１９８７年）（ピン上の固相成分の合成を記載）、Ｆｒａｎｋ  ＆  Ｄｏｒｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第４４巻、６０３１頁（１９８８年）（セルロースディスク上の種々のペプチド配列の合成を記載）、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻、７６７頁（１９９１年）、Ｓｈｅｌｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３９巻、７１８頁（１９９３年）及びＫｏｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、７５３頁（１９９６年）（すべて、固形基体に固定された生体高分子のアレイを記載）を参照のこと。基体にタグバインダーを固定する非化学的アプローチとしては、熱、ＵＶ光による架橋等の他の一般的な方法がある。
【０１４５】
上記のようにして、ｃＡＭＰまたはｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰの類似体の増加による臭気物質刺激に追随して活性化される、本発明による機能的ＣＮＧチャンネルを発現する細胞系を、構成する。たとえば、一の実施形態において、高処理能力のＣＮＧプレートを用いるアッセイが構築され、ウェルへの刺激物質の添加により活性化される。その例としては、フォルスコリンのようなアデニル酸シクラーゼを刺激する化合物、ＩＭＢＸのようなホスホジエステラーゼを阻害する化合物、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの膜透過性類似体の使用などがある。
【０１４６】
他の高処理能力スクリーニングプロトコルにおいて、細胞透過性ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを、内部ＶＶ照射によるフラッシュ光分解により供給して変化を起こさせる。
【０１４７】
（細胞による機能アッセイ）
好ましい実施形態において、少なくとも１つのＣＮＧチャンネルサブユニットポリペプチドを真核細胞中で発現させる。そのようなＣＮＧチャンネルは、ＨＥＫ−２９３細胞のようなあらゆる真核細胞中で発現させることができる。そのような細胞中のそのようなチャンネルの活性化は、たとえば、細胞内Ｃａ２＋の変化に基づいて検出することができる。
【０１４８】
潜在的な阻害物質又は活性化物質で処理するサンプル又はアッセイを、試験化合物を含まない対照サンプルと比較して、調節の程度を検討する。そのようなアッセイは、細胞内ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ濃度を増加させることによりＣＮＧチャンネルを活性化することが知られている臭気物質の存在下で行い、臭気物質依存性活性化の調節をモニターすることができる。対照サンプル（活性化物質又は阻害物質で処理していない）には、１００の相対的な感覚受容体活性値が割り当てられる。対照に対して感覚受容体活性値が相対的に約９０％、任意に５０％、任意に２５〜０％であるとき、阻害が達成されている。対照に対してチャンネル活性値が、相対的に１１０％、任意に１５０％、２００〜５００％又は１０００〜２０００％であるとき、活性化が達成されている。
【０１４９】
イオンの流入の変化は、感覚受容体タンパク質を発現する細胞又は膜の分極（すなわち、電位）の変化を測定することにより評価することができる。細胞分極の変化を測定する１つの手段は、電圧固定法及びパッチ固定法により電流の変化を測定することにより、たとえば、「細胞接着」モード、「内外反転」モード及び「全細胞」モードで分極の変化を測定することである（たとえば、Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ．第３３６巻、１５７５頁（１９９７年）を参照）。全細胞電流は、通常、標準的方法を用いて測定される。他の既知のアッセイとしては、電圧感受性色素（たとえば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ．第８８巻、６７頁（１９８８年）、Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ＆  Ｔｓｉｅｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．第４巻、２６９頁（１９９７年）、Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．第２５巻、１８５頁（１９９１年）、Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１３７巻、５９頁（１９９４年）を参照）またはｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４若しくはｆｕｒａ−２などのカルシウム感受性色素のような、放射性プローブ又は蛍光性プローブを用いるイオンの流入を測定するためのアッセイなどがある。一般的に、試験化合物は、１ｐＭ〜１００ｍＭの範囲で存在する。
【０１５０】
他の実施形態において、転写レベルを測定して、シグナル変換に対する試験化合物の影響を評価することができる。目的のＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質を含む宿主細胞を、相互作用をもたらすのに十分な時間試験化合物と接触させ、次いで遺伝子発現のレベルを測定する。そのような相互作用をもたらす時間の長さは、時間を経過させて、転写のレベルを時間の関数として測定するなどにより、実験的に決定することができる。転写の量は、当業者に適切であることが知られている方法を用いて測定することができる。たとえば、目的のチャンネルサブユニットタンパク質のｍＲＮＡ発現を、ノーザンブロットを用いて検出してもよく、あるいは、それらのポリペプチド産物をイムノアッセイを用いて同定してもよい。あるいは、リポーター遺伝子を用いる転写に基づくアッセイを、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４３６，１２８号に記載のように用いることができる。リポーター遺伝子は、たとえば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、’３−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼのものとすることができる。さらに、目的のチャンネルサブユニットタンパク質を、緑色蛍光タンパク質のような第２のリポーターへの付着により、間接的リポーターとして用いることができる。（たとえば、Ｍｉｓｔｉｌｉ  ＆  Ｓｐｅｃｔｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１５巻、９６１頁（１９９７年）を参照）。
【０１５１】
次いで、転写の量を、試験化合物の非存在下における同じ細胞中の転写の量と比較するか、目的のチャンネルサブユニットタンパク質を含まない実質的に同じ細胞中の転写の量と比較する。実質的に同じ細胞は、組換え細胞を調製したものの、異種ＤＮＡの導入により修飾されなかった同じ細胞から得ることができる。転写の量の差は、試験化合物がＣＮＧチャンネルの活性をなんらかの方法で変化させたことを示している。
【０１５２】
（ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットを発現する非ヒトトランスジェニック動物）
本発明の１つ又は複数のＣＮＧチャンネルサブユニット配列、特に、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル配列を発現する非ヒト動物も、アッセイに用いることができる。そのような発現は、嗅覚器ＣＮＧチャンネルをコードする核酸を安定的又は一時的にトランスフェクトした非ヒト動物を試験化合物と接触させ、その動物がＣＮＧチャンネルの阻害又は活性化で試験化合物に対して反応するかどうかを測定することにより、試験化合物が哺乳類嗅覚器ＣＮＧチャンネルをｉｎ  ｖｉｖｏで特異的に活性化するかどうかを測定するために用いることができる。
【０１５３】
個別に又はライブラリーとして核酸及びベクターを感染／発現させる手段は、当技術分野でよく知られている。さまざまな個別の細胞、器官又は動物全体のパラメーターをさまざまな手段により測定することができる。たとえば、主嗅球又は副嗅球からの刺激誘発波（延髄反応）の記録は、定量的安定嗅覚応答を測定する有用なツールである。電極を嗅球表面に設置すると、数日間にわたる安定な応答を記録することが可能である（たとえば、Ｋａｓｈｉｗａｙａｎａｇｉ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．第１巻、２８７頁（１９９７年）を参照）。この研究では、鼻中隔に面する内鼻甲介骨の上にある嗅上皮から４電極アセンブリを用いて嗅電図記録を行った。４電極は、１つの鼻甲介骨の背−腹軸に沿って固定するか、又は４つの鼻甲介骨上の対応する位置に置き、骨の上部に向けて共に移動させた。Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．第７７巻、１９５０頁（１９９７年）、Ｓｃｏｔｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−ｐｈｙｓｉｏｌ．第７５巻、２０３６頁（１９９６年）、Ｅｚｅｈ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．第７３巻、２２０７頁（１９９５年）も参照のこと。他のシステムでは、ラットの鼻中隔及び鼻甲介の内側表面に適用した色素ジ−４−ＡＮＥＰＰＳを用いて鼻上皮における蛍光の変化を測定することができる（たとえば、Ｙｏｕｎｇｅｎｔｏｂ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−ｐｈｙｓｉｏｌ．第７３巻、３８７頁（１９９５年）を参照）。細胞外カリウム活性（ａＫ）測定もｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。鼻上皮の粘膜及び近位部におけるａＫの増加を測定することができる（たとえば、Ｋｈａｙａｒｉ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．第５３９巻、１頁（１９９１年）を参照）。
【０１５４】
本発明の嗅覚器ＣＮＧチャンネル配列は、たとえば、感染因子、たとえばアデノウイルス発現ベクターを用いて送達することにより動物鼻上皮において発現させることができる。緑色蛍光タンパク質をマーカーとして用いた嗅上皮における組換え遺伝子の組換えアデノウイルス媒介発現が、たとえば、Ｔｏｕｈａｒａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９６巻、４０４０頁（１９９９年）に記載されている。内因性ＣＮＧチャンネルは、依然として機能を果たすことができ、野生型（天然）の活性が依然として存在することができる。他の状況において、すべての内因性ＣＮＧチャンネル活性が、導入された外因性ハイブリッド受容体によるものであることが望ましい場合、ノックアウト系の使用が好ましい。非ヒトトランスジェニック動物、特に、トランスジェニックマウスを構築する方法、並びに形質転換細胞を産生するための組換え構成体を選択、調製する方法は、当技術分野においてよく知られている。
【０１５５】
「ノックアウト」細胞及び動物の構築は、抑制する遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を遮断する役割を果たす新しいＤＮＡ配列をゲノムに導入することにより、哺乳類細胞中の特定の遺伝子の発現のレベルを、減少又は完全になくすことができるという前提に基づいている。また、「遺伝子トラップ挿入」を用いて宿主遺伝子を中断させることができ、マウス胚幹細胞（ＥＳ）を用いてノックアウトトランスジェニック動物を生産することができる（たとえば、Ｈｏｌｚｓｃｈｕ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ、第６巻、９７頁（１９９７年）を参照）。外因性配列の挿入は、一般的に相補的核酸配列間の相同的組換えによる。外因性配列は、エキソン、イントロン又は転写調節配列のような修飾されるべき標的遺伝子のある部分、または標的遺伝子の発現のレベルに影響を及ぼすことができるゲノム配列、あるいはそれらの組合せである。多能性胚幹細胞（ＥＳ）における相同的組換えによる遺伝子ターゲッティングにより、目的のゲノム配列を精密に修飾することが可能となる。あらゆる手法を用いて、ノックアウト動物を造り、スクリーニングし、増殖させることができる。たとえば、Ｂｉｊｖｏｅｔ、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．第７巻、５３頁（１９９８年）、Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７５巻、２０８頁（１９９７年）、Ｔｏｊｏ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１９巻、１６１頁（１９９５年）、Ｍｕｄｇｅｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻、１６７頁（１９９５年）、Ｌｏｎｇｏ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．第６巻、３２１頁（１９９７年）、米国特許第５，６１６，４９１号、第５，４６４，７６４号、５，６３１，１５３号、第５，４８７，９９２号、第５，６２７，０５９号、第５，２７２，０７１号、国際公開第９１／０９９５５号、国際公開第９３／０９２２２号、国際公開第９６／２９４１１号、国際公開第９５／３１５６０号、国際公開第９１／１２６５０号を参照のこと。
【０１５６】
核酸ライブラリーは、「ノックアウト」ヒト細胞及びそれらの子孫を生産するための試薬としても用いることができる。
【０１５７】
（調節物質）
嗅覚器ＣＮＧチャンネルの調節物質として試験される化合物は、小化合物またはタンパク質、糖、核酸又は脂質のような生物学的物質とすることができる。一般的に、試験化合物は小化学分子又はペプチドであろう。水溶液又は有機（特に、ＤＭＳＯを主剤とする）溶液に溶解させることができる化合物を用いることが多いが、本質的にあらゆる化合物を本発明のアッセイにおいて可能性のある調節物質又はリガンドとして用いることができる。アッセイ段階を自動化し、適当な起源から（たとえば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマットで）通常並行して実施されるアッセイに化合物を供給することにより、大きい化学ライブラリーをスクリーニングするためのアッセイを設計することができる。Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（スイス、ブックス）等の化合物の多くの供給業者が存在することが認識されよう。
【０１５８】
一の好ましい実施形態において、高処理能力スクリーニング法は、多数の可能な治療用化合物（可能な調節物質又はリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学又はペプチドライブラリーを提供することを含む。次いで、そのような「コンビナトリアル化学ライブラリー」又は「リガンドライブラリー」を本明細書に記載するように１つ又は複数のアッセイにおいてスクリーニングして、所望の特有の活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種又はサブクラス）を特定する。そのようにして特定された化合物は、通常の「リード化合物」とすることができ、あるいは、それら自体、潜在的な又は実際の治療用物質として用いることができる。
【０１５９】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多数の化学的「構築ブロック」を組み合わせることにより、化学合成又は生物学的合成により産生された種々の化合物の集合である。たとえば、ポリペプチドライブラリーのような線状コンビナトリアル化学ライブラリーは、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）について、あらゆる可能な方法で一連の化学的構築ブロック（アミノ酸）を組み合わせることにより形成される。化学的構築ブロックのそのようなコンビナトリアルミキシングにより、数百万の化合物を合成することができる。
【０１６０】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製及びスクリーニングは、当業者に知られている。そのようなコンビナトリアル化学ライブラリーは、ペプチドライブラリーを含むが、これらに限定されない（たとえば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．第３７巻、４８７頁（１９９１年）及びＨｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３５４巻、８４頁（１９９１年）を参照）。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学も用いることができる。そのような化学は、非限定的に、ペプトイド（たとえば、国際公開第９１／１９７３５号）、コードされたペプチド（たとえば、国際公開第９３／２０２４２号）、ランダム生体オリゴマー（たとえば、国際公開第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（たとえば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９０巻、６９０９頁（１９９３年））、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１４巻、６５６８頁（１９９２年））、グルコースの足場を有する非ペプチド擬似体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１４巻、９２１７頁（１９９２年））、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１６巻、２６６１頁（１９９４年））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６１巻、１３０３頁（１９９３年））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第５９巻、６５８頁（１９９４年））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、すべて前出）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第５，５３９，０８３号）、抗体ライブラリー（Ｖａｕｇｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、３０９頁（１９９６年）及び国際公開第９７／００２７１号）、炭水化物ライブラリー（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、１５２０頁（１９９６年）及び米国特許第５，５９３，８５３号）、小有機分子ライブラリー（ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ、Ｃ＆ＥＮ、３３頁、１月１８日（１９９３年）；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピンロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号及び第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号等）を含む。
【０１６１】
コンビナトリアルライブラリーの調製用装置は、市販されている（たとえば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、ケンタッキー州ルイスビル）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｒａｉｎｉｎ、マサチューセッツ州ウォーバーン）、４３３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）、９０５０Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベッドフォード）。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（たとえば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、ニュージャージー州プリンストン；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス；３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ペンシルバニア州エックストン；Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メリーランド州コロンビア等）。
【０１６２】
（新規の嗅覚調節物質（増強物質又は阻害物質）組成物の投与）
感覚調節物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの感覚の調節のために哺乳類（たとえば、ヒト）に直接投与することができる。投与は、調節化合物を治療する組織（たとえば、鼻又は舌）との最終的接触に導くために通常用いられる経路のいずれかによる。嗅覚調節物質をいずれかの適切な方法で、任意に許容できる担体とともに投与する。そのような調節物質を投与する適切な方法は、利用可能であり、当業者によく知られており、特定の化合物を投与するために複数の経路を用いることができるが、特定の経路がしばしば他の経路よりも即時的かつ効率のよい反応をもたらすことがある。許容できる担体は、少なくとも一部は投与する組成物の特定の成分（たとえば、感覚刺激物質を安定化させる）並びに組成物を投与するために用いられる特定の方法により決定される。したがって、本発明の医薬組成物にとって適当な処方は、非常に多様な処方が存在する（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９８５年）を参照）。
【０１６３】
感覚調節物質は、単独又は他の適切な成分と組み合わせてエアゾール製剤（すなわち、それらは「噴霧」することができる）として、吸入により投与することができる。エアゾール製剤は、感覚に寄与する、又は寄与しないジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容できる加圧噴射剤に入れることができる。他の可能な製剤としては、乾燥製剤又は液剤、散剤又は錠剤、極性（たとえば、水）又は非極性（たとえば、アルコール）溶媒の溶液、乳剤又は懸濁剤、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤及びシロップ剤などがある。
【０１６４】
投与に適した製剤としては、水性又は非水性溶液、酸化防止剤を含めることができる等張性滅菌溶液、製剤を等張性にする緩衝剤、静菌薬及び溶質、並びに懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定剤及び保存料を含めることができる水性又は非水性滅菌懸濁剤などがある。本発明の実施に際して、組成物は、たとえば、経口、局所、静脈内、腹腔内、嚢内又は髄腔内投与することができる。任意選択で、組成物を経口又は経鼻投与する。組成物の製剤は、アンプル又はバイアルのような１回用量分又は複数回の用量分を入れた密封容器入りで提供することができる。溶液及び懸濁剤は、前述の種類の無菌の散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。調節物質は、調製済み薬剤、食物又は化粧品の一部として投与することができる。特に、不快なにおい又は味（たとえば、それぞれ硫黄様又は苦味）は、同族リガンドと受容体との結合を阻害する競合リガンドを加えて感覚刺激物リガンドと感覚受容体との結合を阻害するか、あるいは、シグナル変換を阻害又は減少させることにより、それ自体知覚されないように、かつ／又はその効果を減少させることができる。これに反して、快いにおい又は味は、模擬又は増強させることができる。活性化細胞のサブセットは小さく保たれ、その効果は脳の特定の領域への放射に限定されているため、一次感覚刺激物が好ましい。しかし、少数の嗅覚受容体のみ（たとえば、５種より少ないリガンド結合ドメインを有する）に結合する新規の嗅覚物質（olfactants）又はその組合せも有用であろう。
【０１６５】
哺乳類（たとえば、ヒト）に投与する量は、対象における有用な応答をある時間にわたってもたらすのに十分なものでなければならない。用量は、用いる個々の感覚調節物質の有効性及び対象の状態並びに体重又は治療する部位の表面積によって決定する。用量はまた、特定の対象における化合物又はベクターの投与に伴う有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。医師が投与する調節物質の有効な量を決定する際、感覚調節物質の循環血漿中濃度、調節物質の毒性及び抗調節物質抗体の産生を評価するとよい。一般的に、調節物質の投与当量は、一般的哺乳類について約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与において、感覚調節物質は、該調節物質のＥＤ５０、並びにほ乳類の集団及び全般的健康のために適用される種々の濃度での阻害物質の副作用によって決定される割合で投与することができる。投与は、１回又は分割投与により行うことができる。
【０１６６】
（キット）
ヒト嗅覚ＣＮＧ遺伝子あるいはそのフラグメント又は変異体は、法医学的決定及び父性決定のためのチャンネルを発現する細胞を特定する有用なツールであり、単離された細胞におけるシグナル変換を試験する有用なツールである。ｏＣＮＧチャンネル核酸と特異的にハイブリッド形成する嗅覚器ＣＮＧチャンネルファミリーメンバー特異試薬、並びにＣＮＧチャンネルサブユニットタンパク質に特異的に結合する特異試薬、たとえば、抗ＣＮＧチャンネルサブユニット抗体は、細胞における発現及びシグナル変換の制御を検討するために用いられる。たとえば、１つ又は複数のファミリーメンバー特異的試薬は、遺伝的無嗅覚に関連する多形性の検出又は対立遺伝子排除の検出に用いることができる。
【０１６７】
サンプル中のｏＣＮＧチャンネルファミリーメンバーのＤＮＡ及びＲＮＡの存在の有無についての核酸アッセイとしては、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮアーゼ保護、Ｓ１分析、ＰＣＲのような増幅法及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成のような当業者に知られている多くの技術がある。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成において、たとえば、標的核酸は、後の解釈と分析のために細胞形態を保存ししつ、細胞内でのハイブリッド形成に利用可能なようにその細胞環境から放出させる。以下の論文にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成の技術の概要が記載されている。Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第４巻、２３０〜２５０頁（１９８６年）、Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＶＩＩ巻、１８９〜２２６頁（１９８４年）及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．編、１９８７年）。さらに、チャンネルサブユニットタンパク質は、上記のさまざまなイムノアッセイ技術により検出することができる。試験サンプルは、一般的に陽性対照（たとえば、組換え感覚受容体タンパク質を発現するサンプル）及び陰性対照と比較する。
【０１６８】
本発明はまた、嗅覚器ＣＮＧチャンネルの新規の調節物質をスクリーニングするためのキットを提供する。そのようなキットは、容易に入手可能な材料及び試薬並びに前記の生成物から調製することができる。たとえば、そのようなキットは、ＣＮＧチャンネルをコードする核酸又はタンパク質、反応管及びＣＮＧチャンネル活性試験の指示書のいずれか１つ又は複数を含めることができる。キットの所期のユーザ及びユーザの特定のニーズに応じて、本発明によりさまざまなキット及び構成要素を調製することができる。
【０１６９】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、どんな意味でも本発明の適用可能範囲を限定すると解釈すべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【０１７０】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットのクローニング
【０１７１】
本発明の前には、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットの配列は知られていなかった。しかし、ヒト嗅覚ニューロンの電気生理学的分析から、ラットチャンネルとの機能の類似性が示唆され（Ｔｈｕｒａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６年）、我々は、ヒトＤＮＡデータバンクにおける３つのラットサブユニットのオーソログを同定した（図１〜４）。我々は、ＲＴ−ＰＣＲによりヒト嗅上皮ｍＲＮＡにおけるＯＣＮＣ１及びＯＣＮＣ２の存在を立証し、これらの２つのサブユニットの完全鎖ｃＤＮＡを、市販のｃＤＮＡのＰＣＲとゲノムＤＮＡからの５’コーディングエキソンのＰＣＲとの併用によりクローン化した。ヒトＯＣＮＣ１コード配列の両端に隣接させて、末端５’Ａｓｃｌ及び３’Ｎｏｔｌ部位を付加し、ＯＣＮＣ１  Ａｓｃｌ−Ｎｏｔｌフラグメントを、ｐＥＡＫ１０発現ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にクローンし、プラスミドＳＡＶ１９３１を生成させた。５’Ａｓｃｌ部位は、最適化翻訳開始部位：ＧＧＣＧＣＧＣＣｇｃｃＡＴＧ（配列番号８）を導入するために３ヌクレオチドリンカー配列を組み込んでおり、このＡｓｃｌ部位及び開始ＡＴＧはＵＰＰＥＲＣＡＳＥに存在し、３ヌクレオチドリンカーはｌｏｗｅｒｃａｓｅに存在する。
【０１７２】
３’Ｎｏｔｌ部位は、停止コドンの後に直接付加した。ヒトＯＣＮＣ２を同様にクローンして、プラスミドＳＡＶ１９７６を生成させた。ヒトβ１ｂを同様にクローンして、プラスミドＳＡＶ２４９８を生成させた。しかし、５’Ａｓｃｌ部位と開始ＡＴＧとを隔てている３ヌクレオチドリンカーは省略した。
【実施例２】
【０１７３】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル用のハイスループットアッセイの開発
【０１７４】
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にクローンヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットを、脂質ベースプロトコルを用いて一時的にトランスフェクトした。ＲＦＰ発現ベクターのコトランスフェクションによりモニターしたトランスフェクション効率は、一般的に７０％より大きかった。２４時間後に、細胞を収集し、９６ウェルプレートに移した。さらに２４時間後に、細胞に蛍光カルシウム又は膜電位色素を１時間負荷し、洗浄し、オンボードフルイディックス（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）を備えたＦＬＩＰＲ自動蛍光定量プレートリーダーに移した。
【０１７５】
ｍｏｃｋトランスフェクト細胞と対照的に、嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトした細胞は、フォルスコリン刺激後の蛍光の増加を示した。さらに、フォルスコリン応答の大きさは、サブユニットに依存し、ＯＣＮＣ１単独で活性なＣＮＧチャンネルを生じ、ＯＣＮＣ２（程度がより小さい）及びβ１ｂ（程度がより大きい）は、ＯＣＮＣ１活性を増強した（図５）。膜電位色素はカルシウム色素よりも良好なシグナル／ノイズ比をもたらしたが、いずれかの色素を用いたアッセイは、高処理能力スクーニング用として十分に頑強である（図６及び７）。
【実施例３】
【０１７６】
ＧＰＣＲ用のＣＮＧチャンネルを用いる蛍光アッセイの開発
【０１７７】
Ｒｉｃｈら（２００１年）は、高いｃＡＭＰ感受性を有するラットＯＣＮＣ１  ＣＮＧチャンネルの突然変異体を構築し、特徴付けを行った。我々は、対応するｈＯＣＮＣ１［Ｃ４６０Ｗ／Ｅ５８３Ｍ］突然変異体（配列番号４）を産生させ、プラスミドＳＡＶ２４８０に移入したところ、それがβ１ｂと共に高いｃＡＭＰ感受性と頑強な活性を有することが認められた（図８）。この高い感受性は、このヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル変異体がｃＡＭＰバイオセンサーとして機能することと、ＧＰＣＲ及びｃＡＭＰ濃度を制御する他のタンパク質用の全細胞を用いる蛍光アッセイの開発を可能にするものであることを示唆している。
【０１７８】
ＨＥＫ−２９３細胞に、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１ＦＭ］、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂ、並びにオイゲノールにより活性化される（Ｋａｊｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００１年）マウス嗅覚受容体ｍＯＲＥＧをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をマルチウェルプレートで培養した。４８時間後に、細胞にカルシウム色素を１時間負荷し、次いで、洗浄し、オイゲノール刺激に対するそれらの応答を蛍光顕微鏡によりモニターした。オイゲノールはトランスフェクトした細胞中の蛍光の増加を誘発した。この応答は、ｍＯＲＥＧによる内因性ＧＳ及びアデニル酸シクラーゼのオイゲノール依存性活性化を反映しているようであった。その理由は、ＣＮＧチャンネル単独又はｍＯＲＥＧ単独をトランスフェクトした細胞との比較により、これらの応答はＣＮＧチャンネル依存性及びｍＯＲＥＧ依存性であることが確証されたからである（図９）。
【実施例４】
【０１７９】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂを安定に発現する細胞系の開発
【０１８０】
ＨＥＫ−２９３細胞に３種のヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットを脂質ベースプロトコルを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に適切な選択抗体を加え、選択処置の後の３〜５週間の期間中に単一コロニーを回収した。ｍＯＲＥＧ遺伝子を一時的にトランスフェクトし、ｍＯＲＥＧリガンドオイゲノールで刺激した後、カルシウムの流入をモニターして、コロニーの活性をスクリーニングした。
【０１８１】
カルシウム画像化アッセイにより、オイゲノールに対して応答性であった、ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトした細胞のいくつかのクローンが存在することが明らかになった。これに対して、ｍｏｃｋをトランスフェクトした細胞は検出可能なオイゲノール応答を有さなかった。２０継代以上後にも、発現及び活性は安定のままであった。さらに、ヒト嗅覚ＣＮＧサブユニットを安定に発現している細胞は、オイゲノール刺激に対して感受性がより高い（図１０）。したがって、開発した細胞系は、ＣＮＧ媒介性カルシウム輸送の細胞を用いるアッセイに適している。
【実施例５】
【０１８２】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂを安定に発現する細胞系の開発
【０１８３】
ＨＥＫ−２９３細胞に、２種のヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットＯＣＮＧ１及びβ１ｂを、脂質ベースプロトコルを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に適切な選択抗体を加え、選択処置の後の３〜５週間の期間中に単一コロニーを回収した。ｍＯＲＥＧ遺伝子を細胞に一時的にトランスフェクトし、ｍＯＲＥＧリガンドオイゲノールで細胞を刺激したときのカルシウムの流入をモニターして、コロニーの活性をスクリーニングした。
【０１８４】
カルシウム画像化アッセイにより、オイゲノールに対して応答性である、ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトした細胞のいくつかのクローンが明示された。これに対して、ｍｏｃｋをトランスフェクトした細胞では、検出可能なオイゲノール応答を有さなかった。２０継代以上後にも、発現及び活性は安定したままであった。野生型ＣＮＧサブユニットをトランスフェクトした細胞と対照的に、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］をトランスフェクトした細胞は、オイゲノールに対して有意に高い応答を示した。したがって、開発した細胞系は、ＣＮＧ媒介性カルシウム輸送の細胞を用いるアッセイに適している。さらに、この細胞系は、感受性が高いため、親和性が低いアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングに対して適用可能である。
【実施例６】
【０１８５】
安定的に発現したヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニット用のハイスループットアッセイプラットフォームの開発
【０１８６】
ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を実験の２４時間前に、ｍａｔｒｉｇｅｌであらかじめ被覆したプレート上のＦＬＩＰＲ画像化プレート上に播種した。細胞に蛍光カルシウム色素を１時間負荷し、洗浄し、オンボードフルイディックス（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）を備えたＦＬＩＰＲ自動蛍光定量プレートリーダーに移した。親細胞と異なり、ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットを安定的に発現している細胞は、イソペテラノールを用いたβ２受容体の刺激後に蛍光の増加を示した（図１１ａ）。さらに、これらの細胞は、アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンで刺激した後にも蛍光の増加を示した（図１１ｂ）。したがって、この細胞を用いるアッセイは、ハイスループットアッセイに適用可能である。
【実施例７】
【０１８７】
安定的に発現した活性増強ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネル用のハイスループットアッセイプラットフォームの開発
【０１８８】
活性増強ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを安定的に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を実験の２４時間前に、ｍａｔｒｉｇｅｌであらかじめ被覆したプレート上のＦＬＩＰＲ画像化プレート上に播種した。細胞に蛍光カルシウム色素を１時間負荷し、洗浄し、オンボードフルイディックス（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）を備えたＦＬＩＰＲ自動蛍光定量プレートリーダーに移した。親細胞及び野生型ＣＨＧサブユニットをトランスフェクトした細胞と異なり、活性増強ヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルを安定的に発現している細胞は、アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンで刺激した後に蛍光の増加を示した（図１１ｂ）。さらに、これらの細胞は、イソペテラノールを用いたβ２受容体の刺激後に、野生型ＣＮＧサブユニットで認められたのと同様な蛍光を示した（図１１ａ）。したがって、この細胞を用いるアッセイは、特に、親和性が低い作動物質又は拮抗物質に関するハイスループットアッセイに適用可能である。
【０１８９】
本発明を例としての実施形態により記述したが、本明細書で用いた文言は、制限の文言ではなく、説明の文言であることが了解される。より広い態様における本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、添付した特許請求の範囲内の変更を行うことはできる。本明細書においては本発明を特定の手段、材料及び実施形態に関して説明したが、本発明は開示した特定の事項に限定されるものでないことが了解される。本発明は、添付した特許請求の範囲内にあるすべての同等の構造、手段及び使用に及ぶ。
【０１９０】
（参考文献）
2005500836.tif 000004
2005500836.tif 000005
2005500836.tif 000006
2005500836.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】ヒトゲノムは３種のラット嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットのオーソログを含む。対配列の相同性は、パラログで３０〜５０％、オーソログで８４〜９０％である。ラット及びヒトＣＮＧチャンネルサブユニットのＣ末端環状ヌクレオチド結合ドメインに対応する配列を示す。本発明のヒトＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂ嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットは、それぞれ配列番号１〜３であり、ラットＣＮＧチャンネルサブユニットＯＣＮＣ１、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂのデータベース配列は、それぞれ受入番号ＮＭ＿０１２９２８、ＮＭ＿０５３４９６及びＡＪ０００５１５（それぞれ配列番号５〜７）である。
【図２】ｈＯＣＮＣ１の配列（配列番号１）。このｃＤＮＡ配列は、クローンゲノム区分ＨＳＡＦ００２９９２に含まれているｈＯＣＮＣ１対立遺伝子に対応する。
【図３】ｈＯＣＮＣ２の配列（配列番号２）。このｃＤＮＡ配列は、クローンゲノム区分ＡＣ０２２７６２に含まれているｈＯＣＮＣ２対立遺伝子に対応する。
【図４】ｈβ１ｂの配列（配列番号３）。このｃＤＮＡ配列は、新規の対立遺伝子に相当する。
【図５】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性はサブユニット構成に依存する。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、カルシウム色素を負荷した細胞について、５０μＭフォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図６】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性の膜電位に基づく蛍光アッセイは、頑強である。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０及びＺ因子値を２つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図７】嗅覚器ＣＮＧチャンネル活性のカルシウムに基づく蛍光アッセイは、頑強である。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素（黒色）又はカルシウム色素（灰色）を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌ又はイオノマイシンの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０値を４つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図８】ヒトＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂは、増感ＣＮＧチャンネルを形成する。種々の組合せのヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルサブユニットをトランスフェクトし、膜電位色素を負荷した細胞について、フォルスコリン添加の６分後の蛍光の増加を測定した。活性は、８つの独立した応答の平均値±ｓ．ｅ．を表し、ＫＣｌの添加の６分後の蛍光増加に対して標準化した。ＥＣ５０及びＺ因子値を２つの用量反応曲線について示す。ＯＣＮＣ１を「１」、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］を「１＊」、ＯＣＮＣ２を「２」、β１ｂを「Ｂ」と略記する。
【図９】嗅覚受容体活性は、異種細胞におけるヒト嗅覚器ＣＮＧチャンネルに連結させることができる。ＨＥＫ−２９３細胞にマウス嗅覚受容体ｍＯＲＥＧ、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂをトランスフェクトし、カルシウム色素を負荷し、嗅覚刺激物質オイゲノールで刺激した。応答細胞の数を蛍光顕微鏡法により測定し、Ｇα１５及びｍＯＲＥＧをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞、ｍＯＲＥＧをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞、ＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］、ＯＣＮＣ２及びβ１ｂをトランスフェクトした応答ＨＥＫ−２９３細胞の数と比較した。
【図１０】安定に発現しているヒトＣＮＧチャンネルサブユニットは、一時的にトランスフェクトされたサブユニットよりもオイゲノールに対して感受性が高い。ＨＥＫ−２９３細胞がヒトＣＮＧサブユニットｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂを安定的又は一時的に発現しており、ｍＯＲＥＧを一時的にトランスフェクトした。細胞を種々の濃度のオイゲノールで刺激し、Ｆｌｕｏ−４を用いた蛍光顕微鏡法を用いてカルシウム流入を測定した。ｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂサブユニットについて同様な結果が得られた（データは示さず）。
【図１１】安定に発現している野生型又は増強ヒトＣＮＧチャンネルサブユニットは、受容体媒介性活性化及びアデニル酸シクラーゼ活性化化合物に対して応答する。（図１１ａ）ｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂもしくはｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を種々の濃度のβ２受容体リガンドイソプロテラノールで刺激し、カルシウムの流入をＦｌｕｏ−４を用いてＦＬＩＰＲ−１で測定した。（図１１ｂ）ｈＯＣＮＣ１、ｈＯＣＮＣ２及びｈβ１ｂもしくはｈＯＣＮＣ１［Ｃ４５８Ｗ／Ｅ５８１Ｍ］及びβ１ｂを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞を種々の濃度アデニル酸シクラーゼ活性化物質フォルスコリンで刺激し、カルシウムの流入をＦｌｕｏ−４を用いてＦＬＩＰＲ−１で測定した。
【図５】
2005500836.tif 000008
【図６】
2005500836.tif 000009
【図７】
2005500836.tif 000010
【図８】
2005500836.tif 000011
【図９】
2005500836.tif 000012
【図１０】
2005500836.tif 000013
【図１１】
2005500836.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2005500836.tif 000015
2005500836.tif 000016
2005500836.tif 000017
2005500836.tif 000018
2005500836.tif 000019
2005500836.tif 000020
2005500836.tif 000021
2005500836.tif 000022
2005500836.tif 000023
2005500836.tif 000024
2005500836.tif 000025
2005500836.tif 000026
2005500836.tif 000027
2005500836.tif 000028
2005500836.tif 000029
2005500836.tif 000030
2005500836.tif 000031
2005500836.tif 000032
2005500836.tif 000033
2005500836.tif 000034
2005500836.tif 000035
2005500836.tif 000036
2005500836.tif 000037
2005500836.tif 000038
2005500836.tif 000039
2005500836.tif 000040
2005500836.tif 000041
2005500836.tif 000042
2005500836.tif 000043
2005500836.tif 000044
2005500836.tif 000045
2005500836.tif 000046
2005500836.tif 000047
2005500836.tif 000048
2005500836.tif 000049
2005500836.tif 000050
2005500836.tif 000051
2005500836.tif 000052
2005500836.tif 000053
2005500836.tif 000054
2005500836.tif 000055
2005500836.tif 000056
2005500836.tif 000057
2005500836.tif 000058
2005500836.tif 000059
2005500836.tif 000060
2005500836.tif 000061
2005500836.tif 000062
2005500836.tif 000063
2005500836.tif 000064
2005500836.tif 000065
2005500836.tif 000066
2005500836.tif 000067
2005500836.tif 000068
2005500836.tif 000069
2005500836.tif 000070
2005500836.tif 000071
2005500836.tif 000072
2005500836.tif 000073
2005500836.tif 000074
2005500836.tif 000075
2005500836.tif 000076
2005500836.tif 000077
2005500836.tif 000078
2005500836.tif 000079
2005500836.tif 000080
2005500836.tif 000081
2005500836.tif 000082
2005500836.tif 000083
2005500836.tif 000084
2005500836.tif 000085
2005500836.tif 000086
2005500836.tif 000087
2005500836.tif 000088
2005500836.tif 000089
2005500836.tif 000090
2005500836.tif 000091
2005500836.tif 000092
2005500836.tif 000093
2005500836.tif 000094
2005500836.tif 000095
2005500836.tif 000096
2005500836.tif 000097
2005500836.tif 000098
2005500836.tif 000099
2005500836.tif 000100
2005500836.tif 000101
2005500836.tif 000102
2005500836.tif 000103
2005500836.tif 000104
2005500836.tif 000105
2005500836.tif 000106
2005500836.tif 000107
2005500836.tif 000108
2005500836.tif 000109
2005500836.tif 000110
2005500836.tif 000111
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005500836.tif 000112
【国際調査報告】
2005500836.tif 000113
2005500836.tif 000114
2005500836.tif 000115