(57)【要約】生きている有機的組織を成長させるための方法および構造物であって、ここでは足場が提供され、この上で該組織の細胞が播種されてもよく、およびこの上で該組織が成長され、複数の膜キャピラリーが栄養液を運ぶために提供され、この複数の膜キャピラリーは、該足場を通じて散在され、栄養および酸素に対して透過性である膜を持ち、それで該組織は、該足場に亘って成長されてもよく、これにより in vivo 移植時に、支える栄養の組織への供給が急速に確立する。
2005502351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている有機的組織を成長させるための構造物であって：
この上で該組織の細胞が播種されてもよく、およびこの上で該組織が成長されてもよい足場；および
複数の膜キャピラリーであって、該足場からは離れており、各膜キャピラリーが、栄養液を運ぶための内部通路を定めるそれぞれの膜壁を包含し、ここで該膜壁は、栄養および酸素に対して透過性であり、これらの複数の膜キャピラリーは、自由に選ばれる通路に沿った該足場を通じて散在され、それで該足場の形状は、該組織が該足場に亘って成長されることを可能にするために、該足場に亘って散在される複数の膜キャピラリーと共に自由に選ばれる複数の膜キャピラリー
を包含する構造物。
【請求項２】
前記足場が、前記の複数の膜キャピラリーに比較して、相対的に小さな直径を有する複数の繊維を含む、請求項１に記載の構造物。
【請求項３】
前記膜キャピラリーが、層状シート層内にのみ含有される通路を伴わない、請求項１または２に記載の構造物。
【請求項４】
少なくとも１つの前記膜キャピラリーが、もう１つ別の前記膜キャピラリーの通路が横たわる前記層状シート層中にもなく、これと平行でもない通路を伴う、請求項１、２または３に記載の構造物。
【請求項５】
少なくとも１つの前記膜キャピラリーが、層状シート層内に含有されない渦巻き状の通路を伴う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項６】
前記膜キャピラリーが全方向を向いた、請求項１〜５のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項７】
前記足場が、３つの相互に直交する方向に相対的に大きく延びている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項８】
少なくとも幾つかの前記膜キャピラリーが、栄養液が前記組織へ栄養を提供するために、該組織を通じた栄養液の流れのための通路を各々が提供するように、反対側末端にて開口している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項９】
少なくとも幾つかの前記膜キャピラリーが、栄養液が前記組織へ栄養を提供するために前記開口末端へ供給されるように、１末端にて塞がれている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１０】
少なくとも幾つかの前記膜キャピラリーが、両末端にて塞がれている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１１】
少なくとも幾つかの前記複数の膜キャピラリーが、代謝老廃物に対して透過性の膜壁を持ち、代謝老廃物を含有する液を前記組織から運び去るに適している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１２】
前記足場から離れた追加の複数の膜キャピラリーを更に含み、代謝老廃物に対して透過性であり、代謝老廃液を前記組織から運び去るために、自由に選ばれる通路に沿った該足場を通じて散在される膜壁を持つ、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１３】
少なくとも幾つかの追加の複数の膜キャピラリーが、代謝老廃液が前記開口末端から出て前記組織から引き出されるように、反対側末端の１つにて塞がれている、請求項１２に記載の構造物。
【請求項１４】
前記の追加の複数の膜キャピラリーから、代謝老廃液を引き出すための老廃物抽出器を更に包含する、請求項１２または１３に記載の構造物。
【請求項１５】
前記膜キャピラリーが、生分解性または生体再吸収性である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１６】
前記膜キャピラリーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−共−グリコール酸、およびポリカプロラクトンの内の１つから構成される、請求項１５に記載の構造物。
【請求項１７】
前記膜キャピラリーが、前記組織への栄養液の増大した供給を提供するために、前記膜キャピラリーが分解するに連れ、大きさにおいて増大する孔を持つ材料から構成される、請求項１５または１６に記載の構造物。
【請求項１８】
前記膜キャピラリーが、実質的に直径１０μｍ〜２ｍｍ、好ましくは０．１ｍｍ〜１ｍｍである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項１９】
前記膜キャピラリーが、実質的に０．５ｍｍ以上離れて空間配置される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２０】
前記膜キャピラリーが、約１ｍｍ以上離れている、請求項１９に記載の構造物。
【請求項２１】
少なくとも幾つかの前記膜キャピラリーが、お互いに平行な前記足場を通じて延びる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２２】
少なくとも幾つかの前記膜キャピラリーが、前記足場を通じたそれぞれの環状通路を伴う、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２３】
前記の複数の膜キャピラリーへ栄養液を提供するための栄養液供給を更に包含する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の構造物。
【請求項２４】
生きている有機的組織；および
複数の人工膜キャピラリーであって、各膜キャピラリーが、栄養液を運ぶための内部通路を定めるそれぞれの膜壁を包含し、ここで該膜壁は、栄養および酸素に対して透過性であり、これらの複数の膜キャピラリーは、自由に選ばれる通路に沿った該組織を通じて散在され、それで該組織の形状は、該組織の生存を支えるために、該組織に亘って散在される複数の膜キャピラリーと共に自由に選ばれる複数の膜キャピラリー
を包含する組織構造物。
【請求項２５】
生きている有機的組織を成長させるための方法であって：
所望の形状および大きさの空間を自由に定義し；
該空間を通じて散在された、自由に選択可能な通路に沿った複数の膜キャピラリーを提供し、各膜キャピラリーは、栄養および酸素に対して透過性であり、栄養液を運ぶための内部通路を定義するそれぞれの膜壁を包含し；
これらの複数の膜キャピラリーの周りの該空間中に足場を形成し、該足場は組織細胞の播種および組織成長に適しており；
該足場中に該組織の細胞を播種し；および
これらの複数の膜キャピラリーを通じて栄養液の流れを提供すること
を包含する方法。
【請求項２６】
前記膜キャピラリーに比較して、相対的に小さな直径の複数の繊維で前記足場を形成することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記膜キャピラリーが、層状シート層内に通路を伴うようには拘束されない、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
もう１つ別の前記膜キャピラリーの通路が横たわる前記層状シート層中にもなく、これと平行でもない通路に沿った少なくとも１つの前記膜キャピラリーを提供することを更に包含する、請求項２５、２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
層状シート層中にない渦巻き状の通路に沿った少なくとも１つの前記膜キャピラリーを提供することを更に包含する、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
全方向を向いた通路に沿った前記の複数の膜キャピラリーを提供することを包含する、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記空間が成型品のために所望の形状および大きさを選ぶことにより定義される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記成型品において前記の複数の膜キャピラリーを提供することを更に包含する、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記の複数の膜キャピラリーの周りの前記成型品中へ足場材料を導入することを更に包含する、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記足場材料を前記成型品中へ導入する前に、該足場材料と細胞を混合することを更に包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上皮細胞を前記膜キャピラリー中へ導入し、該膜キャピラリーの代わりの血管の成長を刺激することを更に包含する、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きている有機的組織を成長させるための方法および構造物、特にこの上で該組織の細胞が播種されてもよい足場が提供され、栄養液が該組織を成長させるために提供される場合に関する。
【背景技術】
【０００２】
工学的に操作された組織は、適切な細胞の足場（マトリックスとしても知られる）中への播種を含み、バイオ構成物を形成する。該バイオ構成物はその後、ある期間の時間、定義された条件で培養される。特に、このようにして小さな切片の皮膚組織を成長させることが知られている。
【０００３】
該組織は、一般に平面状の形態で成長され、栄養および酸素が該組織の全ての細胞へ拡散するように、栄養液中に浸される。
【０００４】
種々のタイプの足場またはマトリックスがよく知られており、コラーゲンゲルを包含する。足場またはマトリックスとして有効に機能させるために、該足場またはマトリックスは、細胞の付着のための適切な空隙率および表面積を持っていることが不可欠である。該足場の性質が繊維状である場合、この繊維はそれらが大きな表面積を提供するように相対的に小さな直径を持つことが重要である一方、相対的に小さな体積を採る。該繊維はその後、密度／空隙率で調整され、該繊維間で細胞が付着および成長するようにする。
【０００５】
足場の繊維がそれら自体空洞を有し、これにより該細胞間の該繊維の内側に沿って、栄養液が拡散するようにする足場を提供することも知られている。このことは、固体繊維を使用する足場を凌駕する幾つかの利点を提供するが、液体の輸送は、組織が一般に層状シート層としてのみまだ成長されるように、まだ相対的に限られている。
【０００６】
より３次元様の構造を持つ組織を成長させるためには、米国特許第４，６６１，４５８号および英国特許第２，１７８，４４７Ａ号のような文書が、１つをもう１つの上にして２次元の層構造を整えることを提案している。しかしながら、足場の層がこのように要求される場合、構造は相対的に複雑化され、３次元的組織成長の全体の形成および形状に対して深刻な限界がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記の観点では、他の所望される形状および大きさを持つ工学的に操作された組織構造の準備を可能にすることが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、生きている有機的組織を成長させる方法が提供され、該方法は：
所望の形状および大きさの空間を自由に定義し；
該空間を通じて散在された、自由に選択可能な通路に沿った複数の膜キャピラリーを提供し、各膜キャピラリーは、栄養および酸素に対して透過性であり、栄養液を運ぶための内部通路を定義するそれぞれの膜壁を包含し；
これらの複数の膜キャピラリーの周りの該空間中に足場を形成し、該足場は組織細胞の播種および組織成長に適しており；
該足場中に該組織の細胞を播種し；および
これらの複数の膜キャピラリーを通じて栄養液の流れを提供すること
を包含する。
【０００９】
本発明によれば、生きている有機的組織を成長させるための構造物も提供され、該構造物は：
該組織の細胞がこの上で播種されてもよく、該組織がこの上で成長されてもよい足場；および
複数の膜キャピラリーであって、該足場から離れており、各膜キャピラリーは栄養液を運ぶための内部通路を定義するそれぞれの膜壁を包含し、ここで該膜壁は、栄養および酸素に対して透過性であり、これらの複数の膜キャピラリーは、該組織が該足場に亘って成長されることを可能とするために、該足場に亘って散在されるこれらの複数の膜キャピラリーと共に、該足場の形状が自由に選択されるように、これらの複数の膜キャピラリーは、自由に選択された通路に沿って該足場を通じて散在される、複数の膜キャピラリー
を包含する。
【００１０】
このようにして、組織構造物が更に提供されてもよく、該組織構造物は：
生きている有機的組織；および
複数の人工膜キャピラリーであって、各膜キャピラリーは栄養液を運ぶための内部通路を定義するそれぞれの膜壁を包含し、ここで該膜壁は、栄養および酸素に対して透過性であり、これらの複数の膜キャピラリーは、該組織の生存を支えるために、該組織に亘って散在されるこれらの複数の膜キャピラリーと共に、該組織の形状が自由に選択されるように、これらの複数の膜キャピラリーは、自由に選択された通路に沿って該組織を通じて散在される、複数の膜キャピラリー
を包含する。
【００１１】
このようにして、該組織は、如何なる所望の形状および大きさの足場上でも成長されてもよい。本発明によれば、以前に知られている薄い切片の皮膚組織は、実質的に２次元であると見なされ得たが、対照的に、３次元の足場および組織構造物が提供されてもよい。前記膜キャピラリーの長所により、該組織構造の内部深くの細胞への栄養の供給は、もはやその外側表面からの該足場を通じた拡散により限定されない。天然の組織が依存する血液循環ネットワークは、工学的に操作された組織中には正常には存在しない。以前には、該組織内部の細胞への栄養の供給拡散は、限定要因であった。しかしながら、該組織内部の細胞へ栄養を提供するために、該足場中に膜キャピラリーのネットワークを包埋することにより、足場および組織は、如何なる所望の形状および大きさで提供されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
用語「組織」は、軟骨、骨、血管、骨髄、筋肉、神経および器官のような、全ての形態の生きている有機的材料を包含することが意図されることが、認められるであろう。
【００１３】
好ましくは、該足場は、該膜キャピラリーに比較して、相対的に小さな直径の複数の繊維または粒子で形成される。
【００１４】
このようにして、該足場は、この内部で該細胞が播種されて成長されてもよい大きな表面積および構造を提供するが、一方該膜キャピラリーは、栄養および酸素用の相対的に大きなチャネルを提供する。結果として、栄養および酸素は、相対的に厚い組織が成長されるようにするために、該足場内部深くへ運ばれてもよい。
【００１５】
このようにして、該足場および／または組織は、３つの相互に直交する方向において、相対的に大きく拡張してもよい。
【００１６】
勿論、相対的に大きな直径の膜キャピラリーは、それらに接続される生理学的なキャピラリーの大きさに近づくより小さな直径の膜キャピラリーにより伴われてもよい。
【００１７】
好ましくは、該膜キャピラリーは、層状シート層内に通路を伴うようには拘束されない。この点では、層状シート層への言及は、平面状および曲面状の層両方を包含する。
【００１８】
既知の技術によれば、栄養および酸素の供給は、相対的に薄い層の足場を通じた、または該足場を作り上げる相対的に小さな直径の繊維に沿った拡散に依存している。これらの層を巻くことにより、またはこれらの層を、１つをもう１つの上にして提供することにより、３次元構造と見なされるものを構築することが可能であるだけである。
【００１９】
本発明によれば、該膜キャピラリーが、自由に選択される通路に沿って間に置かれ、層状シート層内に通路を伴うように拘束されない場合、該足場および組織は、如何なる形状でも形成されてもよい。
【００２０】
好ましくは、少なくとも１つの該膜キャピラリーが、もう１つ別の膜キャピラリーの通路がその中に横たわる層状シート層中でもなく、これと平行でもない通路を伴うように提供される。
【００２１】
換言すれば、該膜キャピラリーは、既知の積層構造物を伴う必要はない。１つのキャピラリーが層状シート層中に横たわると見なされ得る特定の方向を向いている場合、もう１つ別のキャピラリーは、無関係の方向を向いた、例えば第１のキャピラリーとはねじれた通路を伴ってもよい。それで、該キャピラリーのこれらの通路においては大きなフレキシビリティがあり、それで、足場および組織の形状は、これらの膜キャピラリーにより給され得る。
【００２２】
好ましくは、少なくとも１つの膜キャピラリーが、層状シート層内で拘束されない渦巻き状の通路に沿って提供される。
【００２３】
換言すれば、各膜キャピラリーは、該足場および組織を通じた如何なる所望の通路を伴ってもよく、以前の場合のような層状構造を伴う必要はない。
【００２４】
好ましくは、これらの複数の膜キャピラリーが、全方向を向いた通路と共に提供される。
【００２５】
これ故に、該キャピラリーは各々、それらが支持すべき組織の必要性によってのみ決定される通路を持ってもよい。
【００２６】
異なる直径の膜キャピラリーは、前記の同じ構造物中で使用されてもよい。
【００２７】
好ましくは、これらの生きている有機的組織を成長させる方法において、前記空間は、成型にとって望まれる形状および大きさを選ぶことにより定義される。
【００２８】
それで、要求されるどんな形状および大きさの組織に関しても、適切な成型品が形成される。
【００２９】
好ましくは、本方法は、該成型品中に、複数の膜キャピラリーを提供する段階を包含する。
【００３０】
これ故に、要求される組織の形状および大きさを決定し、適切な成型品を提供してしまえば、該膜キャピラリーは、その空間に亘った該組織の成長を支えるに適切な通路に沿って、該成型品内に位置され得る。
【００３１】
好ましくは、この足場材料は、これらの複数の膜キャピラリーの周りの成型品中へ導入される。
【００３２】
該足場はこれ故に、所望の空間配置およびパターンで、それを通じて散在される膜キャピラリーを伴った成型品の所望の形状に形成される。細胞を該足場材料と、それが該成型品中へ導入される前に混合することが可能である。このようにして、これらの細胞は、成長が開始される前に、該足場に亘って容易かつ充分に散在される。
【００３３】
好ましくは、少なくとも幾つかの膜キャピラリーが、栄養液が該組織に栄養を提供するように、該組織を通じて栄養の流れのための流路を各々が提供するために、反対末端にて開口している。
【００３４】
このようにして、該膜キャピラリーは、該組織を通じて栄養液を運ぶ。新鮮な液体は１末端にて入り、一方栄養がここから該細胞へと拡散する液体は、もう１つの末端から流れ出る。
【００３５】
少なくとも幾つかの該膜キャピラリーは、栄養液が該組織へ栄養を提供するためにこの開口末端へ供給されるように、１末端にて塞がれてもよい。
【００３６】
このようにして、栄養液は該膜キャピラリーを通じて流れないが、該膜キャピラリー中へ提供され、該キャピラリー内を該組織中へと流れ、その後これらの組織細胞中へ、これらのキャピラリー壁を通じて分布される。
【００３７】
少なくとも幾つかの該膜キャピラリーは、、両末端にて塞がれてもよい。
【００３８】
このようにして、該キャピラリー内部の液体は、より少ない抵抗を有する拡散通路を提供する。
【００３９】
少なくとも幾つかの該膜キャピラリーは、代謝老廃物に対して透過性の膜を持ち、該組織から代謝老廃物を含有する液体を運ぶに適していてもよい。
【００４０】
このようにして、膜キャピラリーの１末端からその反対側末端へ栄養液が流れる場合、栄養は、該液から該組織を取り囲む細胞へ拡散および分散してもよいが、一方代謝老廃物は、該液中へ吸収され、このために該膜キャピラリーから抽出され、廃棄されてもよい。
【００４１】
更に複数の膜キャピラリーが提供されてもよく、これは代謝老廃物に対して透過性の膜を持ち、代謝老廃液を該組織から運び去るために、前記足場を通じて散在される。
【００４２】
それで、膜キャピラリーは、膜キャピラリーが栄養を供給するように位置されるのと同様に、代謝老廃物を除去するように提供されてもよい。
【００４３】
少なくとも幾つかの更に複数の膜キャピラリーが、代謝老廃液が前記開口末端から、該組織から引き離されるように、反対側末端の１つにおいて塞がれてもよい。
【００４４】
これは、塞がれた末端を有する膜キャピラリーが栄養を供給するために提供される場合、特に適用可能である。特に、一式の膜キャピラリーは、該細胞へ栄養を供給し、もう１つ別の一式の膜キャピラリーは、該細胞から代謝老廃物を抽出する。
【００４５】
これらの有機的組織を成長させるための構造物は、これらの更なる複数の膜キャピラリーから代謝老廃液を引き出すための老廃物抽出器と共に提供されてもよい。
【００４６】
同様に、該構造物は、該膜キャピラリーへ栄養液を提供するための栄養液供給を包含してもよい。
【００４７】
好ましくは、該膜キャピラリーは生分解性または生体再吸収性である。
【００４８】
このようにして、一旦該組織が成長されると、それは、必要とされるような動物またはヒトの中へ移植されてもよい。該組織の要求性および適用に依存して、該膜キャピラリーは、それらの人工的な成長の間または移植された後に分解するように、または吸収されるように整えられてもよい。
【００４９】
該膜キャピラリーは、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−共−グリコール酸（ＰＬＧＡ）またはポリカプロラクトンのような、如何なる適切な材料から構成されてもよい。
【００５０】
好ましくは、該膜キャピラリーは、孔を持つ有孔性の壁を有し、例えば、該膜キャピラリーが分解するように、該組織への栄養液の増大した供給を提供するために大きさにおいて増大する孔を持つ材料から構成される。
【００５１】
このようにして、この培養が進行し、該組織内部の細胞密度が増加する程、より大きな孔の大きさが、該組織へ栄養をより多く輸送するようにし、これ故に栄養に対しての増大した需要を叶えるのを助けるであろう。
【００５２】
好ましくは、該膜キャピラリーの代わりに血管の成長を刺激する所望の生化学的信号伝達と共に、該膜キャピラリー中へ上皮細胞が導入されてもよい。
【００５３】
正常には、しかし除外するのではないが、これらの上皮細胞はより遅い段階にて導入され得る。
【００５４】
該上皮細胞は該膜キャピラリー内で付着し、それら自体初期に成長して、単層を形成する。これ故に、該膜キャピラリーが分解するに連れ、それらは血管の成長により置き換えられる。
【００５５】
勿論、該膜キャピラリーにより取り上げられる前記空間中への組織の成長は、一旦それらが分解／吸収してしまうと、相対的にゆっくりになり、それでこの結果得られるチャネルは、栄養液が流れるようにするであろう。これ故に、該組織構造物を移植し、血管が移植に引き続いて自然に発達するようにすることも可能である。
【００５６】
好ましくは、該膜キャピラリーは実質的に１０μｍ〜２ｍｍ、より好ましくは０．１ｍｍ〜１ｍｍの直径である。
【００５７】
このようにして、該キャピラリーは、液体を良く流れるように運ぶに充分な断面積を有し、該組織構造物中の不適当な量の空間をまだ取り上げていない。有機的な成長に関しては、５ｍｍまでの直径が必要であるかも知れないが、他の組織成長に関しては、２ｍｍまでの直径が充分であるかも知れない。
【００５８】
好ましくは、該膜キャピラリーは、実質的に５ｍｍ以下離されて空間配置される。
【００５９】
栄養および代謝老廃物は、該細胞および該膜キャピラリーの間に拡散しなければならないことが認められるであろう。それで、該細胞が膜キャピラリーから遠すぎる場合、不充分な栄養の受け取りおよび老廃物の除去があるであろう。
【００６０】
好ましくは、該膜キャピラリーは、隣接するそれぞれの壁から０．５ｍｍ以上離されて、空間配置される。
【００６１】
好ましくは、少なくとも幾つかの該膜キャピラリーが、お互いに平行な前記足場を通じて延びる。
【００６２】
これ故に、該キャピラリーは、該組織を通じて整えられて、例えば該組織の２つの反対の側の間に延びて、整えられてもよい。
【００６３】
あるいは、少なくとも幾つかの該膜キャピラリーが、該足場を通じてそれぞれの環状通路を伴ってもよい。
【００６４】
このようにして、該膜は該組織の形状を伴い、該組織に関連する任意の地点にて始まって終わってもよい。該環状通路は、組織化された全体の形態の一部であってもよく、または該組織の空間内でランダムであってもよい。これとは無関係に、該組織に適切な生存補佐を提供するために、該組織のどの部分も、予め決められた距離よりも大きく膜キャピラリーから離れているべきではない。これは、予め決められた組織化された様式で該膜キャピラリーを整えること、または充分な数／長さの膜キャピラリーを、最小距離が達成されるであろうように提供することにより、達成され得るであろう。
【００６５】
本発明は、添付の図面に言及しながら、例示のためのみ与えられる以下の記載からより明確に理解されるであろう。
【００６６】
予め定義された条件下に培養されてもよいバイオ構成物を形成するために、その中で細胞が播種されてもよい足場を提供することも、既に知られている。このような足場は、例えば R. L. Lanza, R. Langer および J. Vacanti により編集された R. C. Thompson et al, Polymer Scaffold Processing; Principle of Tissue Engimeering 2nd Edition (2000) に記載されている。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態と共に、適切なポリマー材料、好ましくは生分解性または生体再吸収性であって、ユーザーの必要性により選ばれた生分解／再吸収速度を有する適切なポリマー材料が、成型品中へ注がれてもよい溶液中で提供される。該溶液は、その中で組織が成長されてもよい有孔性の相互接続されたネットワークを形成するゲルを形成し続ける。
【００６８】
図１にスキームで例証されるように、この成型段階の間に、膜キャピラリー２がこの成型品を通じて提供されてもよく、この場合２つの切片４および６により提供される。
【００６９】
図２は、該膜キャピラリー２の内の１つに沿った、図１の組み立てられた成型品を通った断面である。矢印により例証されるように、該足場用の材料は、この成型品の開口部８を通じて提供されてもよい。
【００７０】
結果として、足場１０は、それを貫通する数多くの膜キャピラリー２を持ち、図３に例証されるように提供されてもよい。該キャピラリー２は、以下に更に記載されるが、栄養および酸素に対して透過性である。それで、１末端からもう１つの末端まで、該膜キャピラリー２を通じて栄養液を提供、例えばポンプで送ることにより、栄養は該足場１０の内部空間へ提供されてもよい。例証されるように、該足場１０は、成型品４、６から除去されてしまった。しかしながら、該成型品から該足場を除去することが必要はないことが、述べられるべきである。該成型品はそれ自体で該「バイオリアクター」の一部を形成して前記ゲルを保持し、組織の成長を支え続けることが出来た。
【００７１】
前記のように、該足場１０は、有孔性で相互接続されたネットワークから作り上げられた構造を形成する。これは、図４にスキームで例証される。この相互接続された構造を形成するストランド１２は、相対的に小さな直径を持ち、この中で細胞１４が播種されてもよい空間を残す。特に、該ストランド１２は、この播種された細胞１４のための支持体を提供し、該細胞１４はその後、該足場の該構造物により支えられて、分裂および成長することが出来る。
【００７２】
以前の技術によれば、該細胞１４への栄養の供給は、該構造物を通じた栄養の流れに依り、あるいは空洞足場繊維が使用される場合は、この相対的に狭い通路は、該足場繊維により提供される。しかしながら勿論、この中で該細胞が該構造物を満たすより大きな体積の組織については、充分な栄養がそれらの該細胞への経路を見出しその要求される距離を拡散することが、不可能になる。該膜キャピラリー２は、該足場および組織の中央領域中への液体用のチャネルを提供する。
【００７３】
該膜キャピラリー自体が、栄養が該キャピラリー内部から該組織の細胞へ、および１つの位置からもう１つ別の位置へと移動するように、該栄養に対して透過性である。
【００７４】
図５は、有孔性であるキャピラリー２をスキームで例証する。栄養液は、栄養がキャピラリー壁１８の孔１６を通じて拡散（またはポンプで送られることさえ）出来るように、矢印により例証されるように、キャピラリー２中へ提供されてもよい。膜キャピラリー２はそれら自体、該組織の細胞がキャピラリー２の外側表面上で成長するように、該組織用の足場の一部を形成してもよい。この点では勿論、栄養は孔１６から流れてもよいが、この組織細胞は、該細胞および孔１６の相対的な大きさにより、該孔を通じてキャピラリー２中へと成長することは出来ない。好ましくは、該孔は少なくとも１μｍ未満、または実際０．１μｍの断面で始まる。
【００７５】
幾つかの実施形態において、該細胞は、膜キャピラリー２自体の上で播種または成長しないことが好ましいことがある。これは、必要な場合、該キャピラリー除去することをより容易にする。
【００７６】
実験室の作業については、該膜キャピラリーが該組織中に包埋されたままである場合、キャピラリー２に関して、非生分解性および生体に相容れる材料を使用することが可能である。該キャピラリーに適した材料は、ポリスルホンおよびポリエーテルスルホンを包含する。該組織が動物またはヒトの体の中に移植される場合は勿論、必要な場合は、膜キャピラリー２に関して、該組織から除去されることが好ましい。好ましい実施形態では、これは、生分解性材料から該膜キャピラリーを構成することにより達成される。このような材料の例は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリカプロラクトンを包含する。実際、ＰＬＡの空洞繊維は、Chinese J Reparative and Reconstructive Surgery, 2000 Vol 14(2), page 40, Materials Fabrication of Tissue Engineered Peripheral Nerve in Vitro/WANG Guang-lin, YANG Zhi-ming, XIE Hui-qi et al から既知である。
【００７７】
この孔の大きさの長所により適切な透過性を持つ該キャピラリーの生産は、既知の技術を使用し、該組織の成長の要求性に従って該キャピラリーおよび該孔の大きさを調整して達成されてもよい。
【００７８】
キャピラリー膜２の材料特性も、生分解速度を変動させるように調整され得る。この点では、より大きな組織構造物の成長は、より長い期間の発達を要求するであろうということが認められるであろう。この場合、該膜キャピラリーは、より長い期間損なわれないままであることが要求されるであろう。同様に、幾つかの適用においてユーザーは、該組織構造物が宿主動物またはヒトの体の中へ移植されてしまう後まで、膜キャピラリー２が損なわれないままであることを要求してもよい。再びこの場合では、該膜キャピラリー２は、それらがより長く損なわれないままであるように、材料特性を要求するであろう。
【００７９】
前記分解速度を変動させるために、膜キャピラリー２の、組成を包含する該材料特性を代えることが可能である。あるいは、または追加的に、膜キャピラリー２の壁１８の厚さは変動され得る。特に、より厚い壁１８を持つ膜キャピラリー２は勿論、より長い期間の時間、損なわれないままであろう。
【００８０】
成長されている該組織構造物に関する特別な理由で、同じ足場および組織構造物内に、異なる相対的分解速度を持つ膜キャピラリー２を提供することが可能である。これは、以下に記載されるように、天然の血管が該組織中で発達される場合に、特別な適用を持つことがあるかも知れない。
【００８１】
膜キャピラリー２が生分解性である場合、それは、それが分解するに連れ孔１６が大きくされるように、整えられ得る。このように膜キャピラリー２を整えることにより、それらは、その取り囲む組織へ栄養の増大した流れを引き続いて提供する。これは、勿論時間を過ぎて該組織が成長し、それで栄養に対するその要求が増大するであろうから、非常に有利である。正常な組織の再構築が、in vivo での移植後に最適な組織栄養摂取を与えるであろうことが目論まれる。
【００８２】
図３中の足場１０のような基本的な足場が、その適用に依存して如何なる形状または大きさで成型されてもよいことが、認められるであろう。その後は、その足場の中で該膜キャピラリー２が整えられてもよい種々のやり方がある。これらの調整は、種々の群で広く考えられ得る。
【００８３】
図６に例証されるように、各膜キャピラリー２は、両末端において開いており、該組織および足場１０を通じて延びる。酸素化された（酸素が取り込まれた）栄養液が、例証されるように各膜キャピラリー２を通じて流れる。該組織および足場１０を通じてのその通過の際、栄養および酸素が、膜キャピラリー２からその周囲の組織へと拡散する。
【００８４】
この時点で勿論、該組織の生存細胞が、乳酸塩および二酸化炭素を包含する代謝老廃物を産生することが、述べられるに値する。これ故に、好ましい実施形態では、この代謝老廃物は、該組織から除去されるべきである。該代謝老廃物に対して透過性であるべき膜キャピラリー２の内の少なくとも幾つかの材料特性を整えることにより、これらの膜キャピラリー２を、該組織から該老廃物を除去するのに使用することが可能である。実際に殆どの場合、膜キャピラリー２は、栄養に関して透過性である場合、該代謝老廃物に関して透過性であろう。
【００８５】
これ故に、図６に再び言及して、該液が膜キャピラリー２を通じて流れるので、栄養および酸素は、該液からその周囲の細胞へと通過する一方、老廃物は、該液中へ吸収／溶解／拡散され、それで該構造物から除去される。
【００８６】
あるいは、幾つかの膜キャピラリー２が、栄養液を運ぶために使用され得る一方、他の膜キャピラリー２は、該代謝老廃物を拾い上げ除去するために意図された中性液を運び得る。
【００８７】
図７は、代わりの調整を例証し、この中で膜キャピラリー２は、１末端にて塞がれ、もう１つの末端にて開いている。この調整で、栄養液は、該組織の細胞に給餌するために、幾つかの膜キャピラリー２ａの開口末端において提供されてもよい。一方、液は、該組織および足場から、他の膜キャピラリー２ｂ中へと抽出され、該構造物から除去されてもよい。
【００８８】
勿論、図６および７の調整が、特別な組織成長の特別な必要性に従って、開口末端化された、および末端を閉じられた膜キャピラリー２を使い、組み合わせられ得ることが、認められるべきである。
【００８９】
図６および７の調整に関し、膜キャピラリー２は、１つの側から栄養液を供され、もう１つの側から代謝老廃物を除去されるだけである必要はないことがも、述べられるべきである。この入口および出口を同じ側に、また実は、成長されている組織の特別な必要性に従って、如何なる適切な位置にも設置することが可能である。実際、キャピラリーは、如何なる適切なパターン、例えば図８に例証されるようなグリッド中に、整えられてもよい。
【００９０】
図６、７および８は特定の配置を例証し、ここでは、膜キャピラリー２は、予め決められた組織化されたパターンで、該足場中で形成される。特に、該膜キャピラリーは、均等な空間配置を伴って、お互いに平行に配置される。明らかにこのことは、栄養および代謝老廃物の流れの均等な分布が達成され得ることにおいて、幾つかの利点を持っている。
【００９１】
該膜キャピラリー２は、真っ直ぐな通路のみを伴う必要はないことが、認められるべきである。特にそれらは、該足場および組織を通じて如何なる所望の環状通路を伴ってもよい。これは、図９にスキームで例証される。
【００９２】
このような配置は、膜キャピラリー２への入口および出口が一緒にグループ化されてもよく、より少ない膜キャピラリー２だけが、栄養を供給し、組織の所与の空間から代謝老廃物を除去するのに提供される必要があるという利点を持っている。しかしながら、特定の環状通路が、特定のタイプの組織成長の特別な必要性に従って提供されてもよい。開口末端および閉鎖末端を有する膜キャピラリー２が、図６、７および８への言及と共に記載されたように使用され、組み合わされてもよく、実際、真っ直ぐおよび曲がった形状の膜キャピラリー２が、要求に従って混合されてもよい。
【００９３】
細胞が、栄養を受け取り代謝老廃物を廃棄する膜キャピラリー２に充分近ければ、膜キャピラリー２のパターンは重要ではないことがあることも、述べられるべきである。それで、充分な数および／または長さの膜キャピラリー２を所与の体積の足場および組織中で提供することにより、該組織の全細胞が、生存および成長するために適切な膜キャピラリー２に充分近くなるであろうということを決定することが出来る。
【００９４】
それで、膜キャピラリー２が、例えば成型により、ランダムな配置で足場１０中へ包埋されてもよい。この場合、該膜キャピラリーが、開口末端化され、閉鎖末端化され、またはこれら２者の混合であることが、尚可能である。同様に勿論、ランダムおよび予め決められたパターンの膜キャピラリー２も、混合されてもよい。
【００９５】
両末端にて塞がれたキャピラリーを使用することも可能である。これは、図１０に例証される。
【００９６】
該キャピラリー内部の液は、この成長している組織構造物に比較して、抑えられた抵抗を有する拡散通路を提供する。それで、該キャピラリーは、該構造物を通じての老廃物および栄養の移動を改善する。それらも、血管の中での成長のための空間を取っておく。
【００９７】
両末端にて塞がれているこれらのキャピラリーは、前記キャピラリーと共役して好ましくは使用されてもよく、組織化された、またはランダムのパターンで真っ直ぐまたは環状の通路を持つことが出来る。しかしながら、塞がれたキャピラリーのみを使用することも可能であろう。この場合、栄養および老廃物は、該構造物の表面および該表面の領域中の該キャピラリーの一部の間に拡散されるであろう。
【００９８】
足場を作る１つの方法は、ポリマーメッシュを使用することであり、これは交絡されたポリマー繊維からなる。例えば、人工軟骨の足場は、足場としてＰＬＡ繊維メッシュを使用し得るであろう。
【００９９】
この空洞膜キャピラリーは、該足場の材料を補うように使用され得る。該キャピラリー（約０．１〜０．３ｍｍの直径と言う）は、整えられ得、またはランダムにパックされ得る。該足場の加工の間、該キャピラリーの末端は塞がれてもよい。栄養は、濃度勾配に依存して、該膜キャピラリー中へ、および外へ拡散し得る。栄養は、１つまたは両方の末端が開いていて、圧力勾配が存在する場合、該キャピラリー内部を流れ得、あるいは両末端が塞がれている場合は、該キャピラリーの内側の液体を通じて拡散し得るだけである。該キャピラリー内部の拡散速度は、この形成されている組織を通じてよりも遙かに速いであろう（少なくとも２の要因により、該キャピラリー内部には細胞およびＥＣＭが全くないので）。この機構は、この３次元組織内での栄養の一様な分布および老廃物の除去を維持するのを助けるであろう。
【０１００】
図１１は、図６〜１０の配置に対しての更なるバリエーションを例証する。
【０１０１】
該キャピラリーは、ネットワークを形成するように相互接続されてもよい。例証されるように、これは、異なる直径の相互接続されたキャピラリーの樹状構造の形態を採る。好ましい実施形態では、主要な大きな直径のキャピラリー２００ａは、更により小さな直径のキャピラリー２００ｂへ接続され、それら自体、副キャピラリー２００ｃへ接続される。
【０１０２】
前記のように、この配置は、前記のものと混合され得、予め決められた、ランダムな、真っ直ぐな、環状の、開口末端化された、または閉鎖末端化された形態を採り得る。
【０１０３】
該組織中で細胞の生存を支える膜キャピラリー２の間の最小距離は、該組織の性質によって明らかに変動するであろう。しかしながら、動物およびヒトの組織のような有機的組織に関する正常な場合では、膜キャピラリー２は、５ｍｍ以下、好ましくは約０．５〜１ｍｍ離れているべきである。好ましくは、該膜キャピラリーは、隣接するそれぞれの壁間で０．５ｍｍ以上を有して位置される。
【０１０４】
この拡散距離は、該足場および細胞密度に依存するであろう。一式だけのキャピラリーが栄養を提供し老廃物を除去する場合は、該距離は約１〜３ｍｍであろう。異なるキャピラリーが栄養および老廃物のために使用される場合は、該距離は約１〜５ｍｍであるべきである。栄養を供給する２つのキャピラリーは、それらの間に老廃物を除去するキャピラリーを伴って、（おおまかに）２ｍｍ（または第３のキャピラリーも場所を取る場合はもっと）離れているべきである。これらの数は、単に指標的なものである。それらは該キャピラリーの２つの外側表面間の距離であり、該キャピラリーの直径は、前記のようにｍｍまたはより大きな範囲中であってもよい。
【０１０５】
キャピラリーの大きさの選択も、成長されている組織の性質、ならびに成長されている組織の形状および大きさに依存する。より大きな直径のキャピラリーは、これを通じて液が分散または吸収されてもよいキャピラリーにつき、液のより大きな流れおよびより大きな表面積を提供する。一方、より大きな直径のキャピラリーは明らかに、該組織中でより多くの空間を占め、それでキャピラリーの数は限られる。
【０１０６】
殆どの適用に関してはこれ故に、該膜キャピラリーは、直径１０μｍ〜２ｍｍ、好ましくは０．１ｍｍ〜１ｍｍであるべきである。
【０１０７】
前記のように、上皮細胞をキャピラリー２の中へ、または上へ導入する可能性がある。
【０１０８】
組織構造物が成長され、膜キャピラリー２が分解すると、該組織構造は開いたチャネルと共に残されることが、認められるであろう。これらのチャネルは、それら自体と共に、ある時間の間、栄養および老廃物を運ぶ。しかしながら、該組織が成長し続けて行くに連れ、該チャネルは、栄養および老廃物の不充分な移動が起きるまで、より小さくなるであろう。
【０１０９】
該組織構造が、早い段階にて適切な動物またはヒトの中へ移植される場合、該組織試料が、この宿主の体により生成される血管を発達させることが可能である。しかしながら、これの代わりとして、上皮細胞を該膜キャピラリー中へ、または上へ導入することが可能である。これらの細胞は、該膜キャピラリーが分解するに連れ、血管中へと発達し得るであろう。
【０１１０】
図１２は、該組織を成長させるための全体の系を例証する。これは、前記構造物用のハウジング（housing）５０（これにより温度および他の環境条件も制御され得る）、栄養供給装置５２、および老廃物廃棄装置５４を包含する。制御器５６はその後、該供給装置５２を制御して、該ハウジング５０中の該足場および組織構造物へ栄養液を供給し、該ハウジング５０の環境条件を制御し、ならびに該老廃物廃棄装置５４を制御して、この代謝老廃物を抽出する。
【実施例】
【０１１１】
［実験結果］
［方法］
［細胞培養］
ラット骨髄線維芽細胞が、３ヶ月齢の雌ＬＯＵ／ＣＮラットの大腿骨髄から採集され、５分間１０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化された。この細胞ペレットは、１０ｍＬのα−ＭＥＭ（最小必須培地）中に再懸濁され、細胞を真っ直ぐにする器械を通過された。細胞懸濁の試料は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中２％酢酸で希釈され、有核細胞の数および生存率が決定された。細胞は２５ｃｍ２のフラスコ中１×１０６〜５×１０６にて置かれ、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％の抗生物質、および１％の Fungizone を補った２０ｍＭの緩衝化されたＭＥＭ中で培養された。
【０１１２】
副合流状態に到達した後、細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％ｗ／ｖ）により回収され、接種前の日に Cytodex 1 microcarrier を用いて培養された。
【０１１３】
［Microcarrier ビーズ培養］
ラット骨髄線維芽細胞はアンカー依存性細胞なので、microcarrier beads Cytodex 1 が、該細胞が付着するための基質として使用された。
【０１１４】
Cytodex 1 microcarrier は、プラスに荷電されたＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基で置換される架橋されたデキストラン・マトリックスを主体としている。Cytodex 1 上での細胞培養は、この製造器により提供されるプロトコルを伴って行われた。
【０１１５】
［細胞を用いたコラーゲンゲルの調製］
＊要求数のフラスコの細胞をトリプシン化し、回転させて落とし（すなわち遠心分離）、細胞を数える。要求されるであろう細胞数、および必要な希釈を計算する。
＊該細胞が遠心分離中にいる間、そのフード中に氷を置き、該氷上に以下の溶液を伴う容器を置く：１０×α−ＭＥＭ、コラーゲン、および０．４Ｍ水酸化ナトリウム。
＊該細胞を再懸濁し、氷上にこのチューブを置く。
＊コラーゲンポリマー化溶液を調製するために、指し示された順序で以下の構成分を配合する。各成分の添加後、穏やかに掻き混ぜることにより混合する。
２ｍＬの蒸留水
１ｍＬの１０×α−ＭＥＭ
５ｍＬのコラーゲン
＊添加および掻き混ぜた時に該溶液がオレンジ色になるまで、パスツール・ピペットを使用して０．４ＭのＮａＯＨを滴下させて加える。
＊２ｍＬのこの細胞懸濁を加え、穏やかに掻き混ぜて完全に混合させる。
【０１１６】
［空洞繊維バイオリアクター］
図１３は、該空洞繊維バイオリアクターのスキーム表示であり、図１４は、これらの実験に使用される実際の配置を例証する。
【０１１７】
２群の膜キャピラリーが、該組織の足場中へ包埋される。このキャピラリーまたは空洞繊維膜は、直径０．３ｍｍ〜１ｍｍである。これらのキャピラリーの壁は、有孔性で半透性である。キャピラリーの第１群は、動脈の機能を提供する。酸素が豊富でもあるこの培養培地は、この群のキャピラリー内部を流れる。これらの繊維内部を流れる栄養および酸素は、該膜の孔を通じて出て来、該組織内に殆ど均等に分布される。
【０１１８】
第１の群のキャピラリーから流れ出る栄養は、外側にある細胞中へ入り、該細胞は栄養を消費し、除去される必要のある代謝物を産生する。
【０１１９】
第２の群のキャピラリーは、細静脈として作用し、該組織中へ包埋され、第１の群のキャピラリーと交絡もされる。この消費される培地および代謝老廃物は、この第２の群のキャピラリー中へ浸透し、該組織から流れ出る。これ故に、このキャピラリー系に似た、天然の組織中の栄養循環系が作り出される。
【０１２０】
この膜の孔の大きさは、該細胞がこの膜の壁を突き抜けるほど充分に大きくはない。この２セットのキャピラリー間で、天然生体高分子または合成高分子のような該足場材料は使用され得、細胞付着用の足場を提供する。幾つかの細胞も、該膜に付着してもよい。
【０１２１】
細胞および組織の培養の初期段階では、この膜の孔は、該膜を突き抜けようとする細胞を食い止めるであろう。該膜は、生分解性ポリマーで作られ得るでろうし、時間が経過するに連れ分解し得るであろう。これ故に、これらの膜の正常な孔の大きさは、時間と共に増大し得るであろう。このことは、２つの機能を提供する：
１．該培養が進むに連れ、該組織中の細胞密度は大きく上昇するであろうし、それで栄養の該組織への高い移動が要求される。より大きな孔の大きさが、栄養に対するこの増大した需要を叶えるのを助けるであろう。
２．該培養のより後期の段階では、上皮細胞が、第１の群（すなわち動脈群）および第２の群（すなわち静脈群）両方におけるキャピラリー系中へ導入され得る。これは、この流れが、栄養を提供するように第２の群で、代謝老廃物を収集するように第１の群で容易に反転され得るからである。この導入された上皮細胞は、これらのキャピラリーの表面にて付着し、ついにはキャピラリー血管を形成し得るであろう。該膜が元から導入される場合のこの特別に本当のものは、分解される。包埋されたキャピラリー系を有する嵩高い組織が、このような手順により生産されてもよいことが期待される。
【０１２２】
［空洞繊維バイオリアクターの作製］
１．カートリッジ（寸法は１３ｍｍＩＤ×２２ｍｍＯＤ×４０ｍｍＬ）および側ポートが、実験室において加工された。両末端のカートリッジおよびスクリューキャップは、ポリカーボネートで出来ていた。培地用のポート（３０２）は、臨床用の雄型ルアー接続器であり、細胞の接種用の側ポート（３０３）は、臨床用の雌型ルアー接続器であり、該カートリッジの胴体上へ膠着された。
２．酢酸セルロースの空洞繊維膜が、正常な血液透析器から切り出され、該カートリッジの両末端にて、シリコンラバーにより固定された。
【０１２３】
［灌流系］
この灌流系は、４つの主要な成分からなっていた：空洞繊維バイオリアクター、ポンプ・ステーション、培養培地貯蔵器およびガス・シリンダー（図１５）。細胞は、該空洞繊維バイオリアクターのＥＣＳ中へ接種された。培養培地が、この蠕動ポンプによりこの培地貯蔵器から引いて来られ、キャピラリー内の空間に入れられ、そしてその後該貯蔵器に戻された。通常通りに、１４ｍＬ／ｈの培地流速が使用された。
【０１２４】
［コントロール］
培地の流れを伴わない空洞繊維バイオリアクターが、コントロールとして働いた。該培地は、該コントロールの系において日毎に変化された。
【０１２５】
［バイオリアクターの維持（メンテナンス）］
１５０ｍＬの培養培地が、各バイオリアクターについて使用され、４日目に変えられた。該コントロールの系に関しては、培地は毎日変えられた。
【０１２６】
該培養培地のｐＨ値、ＣＯ２およびＯ２の分圧、ならびにＨＣＯ３−、Ｃａ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋およびＣｌ−の濃度が、血液ガス分析器上で毎日測定された。該バイオリアクター中の細胞の乳酸産生は、乳酸試薬シグマにより測定された。
【０１２７】
［細胞増殖］
細胞増殖が、アラマー・ブルーアッセイを使用して測定された。このアラマー・ブルー染料は、この培養された細胞の代謝活性により、非蛍光形態から蛍光産物へと還元された。
【０１２８】
１、４および７日目に、この培地循環は停止された。該バイオリアクター中で維持された培地を除去した後、５％アラマー・ブルーを有する新鮮培地が、該バイオリアクター中へ注入された。３７℃のインキュベーター中で２時間後、各バイオリアクターからの２００μＬの培地が、９６穴プレート中へ設置された。この相対的な蛍光単位は、５３０ｎｍ（励起）および５９０ｎｍ（発光）の波長にて、蛍光マイクロプレート読み取り器により測定された。やはり２時間インキュベートしておいた、培地およびアラマー・ブルー試薬のみを含有するコントロールも、測定された。
【０１２９】
［細胞生存率］
細胞生存率が、生／死生存率アッセイキットにより決定された。該バイオリアクターを採集後、この試料はＰＢＳ中で濯がれ、２４穴プレート中に置かれた。０．５ｍＬの作業溶液（ＰＢＳ中２μＭのカルセインおよび４μＭのＥｔｈＤ−１）が各穴に加えられ、４５分間３７℃にてインキュベートされた。インキュベーション後、数滴のＰＢＳが、清浄な顕微鏡スライドへ加えられた。試料は２４穴プレートから該顕微鏡スライドへ移動され、蛍光顕微鏡下に（励起／発光：カルセイン４９４／５１７ｎｍ；ＥｔｈＤ−１  ５２８／６１７ｎｍ）観察された。各試料の写真が撮影された。
【０１３０】
［Ｈ−Ｅ染色］
該バイオリアクターを採集後、この試料はＰＢＳ中で濯がれ、１５分間１０％ホルムアルデヒド中で固定された。該試料は２％アガロース、そしてその後パラフィン中に包埋され、４μｍの切片が得られた。
【０１３１】
この切片をキシレン中１５分間脱蝋化し、１００％、７０％そして４０％のアルコールで順に濯ぐ。５分間、流水中で濯ぐ。２０分間マイヤー・ヘマトキシリンで染色し、５分間流水中で洗い青くする。エオシンで５分間染色し、１分間流水中で洗う。４０％、７０％および１００％のアルコール中で脱水し、キシレン中で洗浄する。ＤＰＸ堆積物中マウントさせる。
【０１３２】
［ＳＥＭ］
該試料は、３％グルタルアルデヒドおよび１％オスミウム酸を使用することによってＳＥＭ用に固定され、異なる濃度（２０％〜１００％）のアセトンを使用することによって脱水された。試料は、酢酸イソアミルを使用し、その後金でコーティングされて臨界点までの乾燥に付された。該試料はその後、１５ｋＶの加速電圧にて走査電子顕微鏡により観察され、写真が撮影された。
【０１３３】
［結果］
［細胞増殖］
細胞増殖に関してのアラマー・ブルーアッセイが、図１６に示される。１日目には、そのコントロールおよびその灌流されたものの間に差はない。このコントロール群中のアラマー・ブルーのＲＦＵは、この灌流された群中での約５倍の上昇に比較して、４日目および７日目に減少したが、これは統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１３４】
［培地の乳酸濃度］
２つの群での培養培地での乳酸産生の結果は、図１７に示される。コントロール群の細胞により産生された乳酸は、全ての時点において（０．０００９７（０．０００５８）〜０．００４４（０．０００４）ｍｍｏｌ）安定である。しかしながら、灌流されたバイオリアクターでは、培養培地中の乳酸はコントロール群よりもより高い（０．０３２（０．００９１）〜０．０６５（０．０１２９）、４日目および６日目において有意（ｐ＜０．０５））。
【０１３５】
［培地ガスおよび電解質分析］
２つの群での培地のｐＨ値は、図１８に示される。灌流された群でのｐＨ値は、７．３〜７．４にて安定であるが、７．４８（０．０５３）まで僅かに上昇した。しかしながら、この灌流された群に比較して、該コントロール群でのｐＨ値は、６日目および７日目に、７．４４（０．００８）および７．６（０．０３）まで上昇した（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。
【０１３６】
これらの２つの群中のＯ２およびＣＯ２分圧が、図１９に示される。この灌流された群での結果は相対的に安定であるが、該コントロール群は、１日目〜７日目にＯ２分圧において僅かに上昇し、ＣＯ２分圧において下落する傾向を示した。
【０１３７】
これらの２つの群の培地中のＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ＋＋、Ｃｌ−濃度が変動し得るが、全て生理学的範囲内である（図２０）。
【０１３８】
［細胞生存率］
生／死細胞染色が、図２１に示される。光学顕微鏡による空洞繊維、コラーゲンゲルおよび細胞キャリアーは、図２１Ａに例証される。生／死染色後に、蛍光顕微鏡検査によりこの生存細胞は緑色であり、死んだ細胞は赤色である。この灌流された群において、細胞はコラーゲンゲルマトリックス上に均等に分布され、マイクロキャリアーは高密度であった。組織様の構造物が形成された。該コントロール中よりも、遙かに多くの生存細胞がこの灌流された群中にいた。該コントロール群では、細胞密度はより低く、灌流された群中よりも多くの死んだ細胞があった（図２１Ｂ）。
【０１３９】
［Ｈ＆Ｅ染色］
図２２は、空洞繊維バイオリアクター中の採集された細胞および組織のＨ＆Ｅ染色を示す。コントロール群は、図２２ａおよびｂにおいて示される。細胞は、細胞キャリアーの表面から引き剥がされた。殆どの細胞は、該コラーゲンマトリックス中で生き残らなかった。灌流された群は、図２２ｃおよびｄに示される。マイクロキャリアーは、細胞により覆われた。細胞は該コラーゲンマトリックス中に均等に分布し、幾つかの３次元組織様構造物が形成された。
【０１４０】
［ＳＥＭ観察］
両群において、該マイクロキャリアーが、該空洞繊維を覆い、合わさった構造を形成するコラーゲンゲルマトリックス中へ、部分的に包埋された（図２３ａ）。該空洞繊維の表面は、付着された細胞もコラーゲンマトリックスも伴わず、滑らかであった。幾つかの細胞は該マイクロキャリアー上で成長したが、それらは拡がらなかった。
【０１４１】
この灌流された群において、細胞は該コラーゲンマトリックスの外側表面に亘って単一層を形成し、ある領域においては多層であった。該細胞は、延長された細胞の過程を伴って非常に活性で、コラーゲンマトリックス中へと統合され、細胞の間で細胞接合を形成した（図２２ｂ）。幾つかの細胞は、新しいコラーゲンマトリックスを形成していた（図２３ｃ）。細胞が空洞繊維およびコラーゲンマトリックスの間で成長することを示す証拠はなかった（図２３ｄ）。
【０１４２】
該コントロール群において、該コラーゲンマトリックスは、細胞により覆われなかった。幾つかの細胞は検出され得なかったが、それらは乏しい条件中にあり、それらは灌流された群中の細胞のように拡がらなかった。死んだ細胞および細胞の屑が、該コラーゲンマトリックスおよびマイクロキャリアー中に残っていた（図２３ｅ）。細胞の過程の方向を向いた、組織化された細いコラーゲン繊維と比較して（図２２ｃ）、該コントロール群中のコラーゲン繊維は、細胞との如何なる関連もなく粗く非組織化されており、細胞の干渉の徴候もなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１は、本発明による構造物のための成型品をスキームで例証する。
【図２】図２は、図１の組み立てられた成型品を通じた断面を例証する。
【図３】図３は、図１の成型品から生産された本発明によるバイオ構成物を例証する。
【図４】図４は、１つのタイプの足場の構造物を例証する。
【図５】図５は、本発明と共に使用するための膜キャピラリーを例証する。
【図６】図６は、本発明による構造物中の膜キャピラリーの配置を例証する。
【図７】図７は、本発明による構造物中の膜キャピラリーの配置を例証する。
【図８】図８は、本発明による構造物中の膜キャピラリーの配置を例証する。
【図９】図９は、本発明による、構造物中の両末端において塞がれた膜キャピラリーの配置を例証する。
【図１０】図１０は、本発明による構造物中の膜キャピラリーの配置を例証する。
【図１１】図１１は、本発明による構造物中の、相互接続された膜キャピラリーを例証する。
【図１２】図１２は、生きている有機的組織を成長させるための全体の系を例証する。
【図１３】図１３は、バイオリアクターをスキームで例証する。
【図１４】図１４は、実験に使用されたバイオリアクターを例証する。
【図１５】図１５は、バイオリアクターの灌流系を例証する。
【図１６】図１６は、アラマー・ブルーアッセイの結果を例証する。
【図１７】図１７は、乳酸塩産生の結果を例証する。
【図１８】図１８は、ｐＨ値の結果を例証する。
【図１９】図１９ａおよび１９ｂは、ＣＯ２およびＯ２分圧の結果を例証する。
【図２０】図２０ａ〜２０ｄは、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃａ＋＋およびＣｌ−濃度の結果を例証する。
【図２１】図２１は、生／死の細胞染色結果を例証する。
【図２２】図２２ａ〜２２ｄは、採集された細胞および組織のＨ＆Ｅ染色を例証する。
【図２３】図２３は、ＳＥＭ写真を例証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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