(57)【要約】本発明は、調節剤の同定および試験、ならびに、神経原線維のもつれの形成に関連する神経変性病、特にアルツハイマー病、の治療法の確認に有用な方法およびインビボアッセイシステムを開示する。本発明は、Ｐ３０１Ｌ変異タウトランスジェニックマウスの脳へのβ−アミロイドＡβ42原線維の注射により、主に扁桃体内で、細胞体における神経原線維のもつれの数の数倍の増加および生成の促進が引き起こされたという、驚くべき発見に基づいている。誘発された神経原線維のもつれは、Ａβ42注射の１８日後にすぐ生じ、いくつかのヒトの神経変性病、特にアルツハイマー病の神経原線維のもつれの顕著な特徴を示した。
2005500076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物における神経原線維のもつれの数を増加させる方法であって、神経原線維のもつれの増加が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入によって誘発される、前記方法。
【請求項２】
タウ遺伝子をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物における神経原線維のもつれの生成を促進する方法であって、神経原線維のもつれの生成の促進が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入によって誘発される、前記方法。
【請求項３】
前記β−アミロイドがＡβ42である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ａβ42が、原線維状であるか、あらかじめ凝集しているか、または凝集している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスジェニック動物がマウスである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記マウスがヒトタウをコードする組み換え型遺伝子を発現する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記マウスがＰ３０１Ｌ変異タウをコードする組み換え型遺伝子を発現する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
β−アミロイドが、前記動物の脳への注射によって、特に、海馬または皮質への注射によって導入される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
β−アミロイド、またはＡＰＰのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体が、ＡＰＰをコードする組み換え型遺伝子を共発現することによって導入され、前記ＡＰＰが酵素的に処理されてβ−アミロイド、またはＡＰＰの前記フラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体が生成される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＰが変異ＡＰＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
神経原線維のもつれが、動物の脳の扁桃体において、特に、基底外側扁桃体において主に増加する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
神経原線維のもつれの増加が、ＡＰＰまたはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドが投与されなかった対照動物と比べて数倍、好ましくは少なくとも２倍である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
神経原線維のもつれの増加が、ＡＰＰまたはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドが投与されなかった対照動物と比べて少なくとも５倍である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
神経網スレッドおよび／または神経突起の変性を誘発するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、神経原線維のもつれを生成し得る、前記動物。
【請求項１６】
タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、神経原線維のもつれの数の増加をもたらし得る、前記動物。
【請求項１７】
タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、神経原線維のもつれの生成を促進し得る、前記動物。
【請求項１８】
ヒト神経変性病において一般的に見られるものに匹敵する神経原線維のもつれが生成される、請求項１５〜１７に記載の動物。
【請求項１９】
前記動物は、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドを、神経原線維のもつれの生成を引き起こすのに十分な量で含む、請求項１５〜１７に記載の動物。
【請求項２０】
神経原線維のもつれの増加および／または生成の促進が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入によって誘発される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の動物。
【請求項２１】
β−アミロイドが、前記動物の脳への注射によって、特に、海馬または皮質への注射によって導入される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の動物。
【請求項２２】
前記動物が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体をコードする組み換え型遺伝子を共発現し、前記ＡＰＰが酵素的に処理されて切断産物が生成され、前記切断産物は、好ましくはβ−アミロイドである、請求項１５〜２０のいずれかに記載の動物。
【請求項２３】
前記ＡＰＰは変異ＡＰＰである、請求項２２に記載の動物。
【請求項２４】
調節剤、または治療法、特にアミロイド低下治療法またはＮＦＴ低減治療法の効能を決定または確認するためのインビボアッセイとしての、請求項１５〜２３のいずれかに記載の動物の使用。
【請求項２５】
前記調節剤、または治療法が、神経変性病、特に、アルツハイマー病、フロントテンポラル・ディメンチア（ＦＴＤ）、および神経原線維のもつれの形成に伴う他の神経変性病のためのものである、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物における神経原線維のもつれ(neurofibrillary tangles)の形成の誘発方法、および、前記動物自体に関する。インビボアッセイが提供され、それにより、化合物および変性剤（modifying agents）を試験し、神経原線維のもつれに関連する病気、特にアルツハイマー病、および他のタウパチー(tauopathies)の治療に役立つものとしてのそれらの潜在的な効能を確認することができる。
【０００２】
神経変性病、特にアルツハイマー病は、患者の生命を激しく衰弱させる影響を有する。更に、これらの病気は、非常に大きな健康、社会、および経済的負担を与える。アルツハイマー病は、６５歳以上の人口の約１０％、８５歳以上の４５％までに影響を及ぼす、最も一般的な年齢に関連する神経変性状態である（近年の報告については、ビッカーズ(Vickers)ら、プログレス・イン・ニューロバイオロジー(Progress in Neurobiology) 2000, 60:139を参照）。現在、これは、ＵＳ、ヨーロッパ、および日本において、推定１２００万ケースに達する。この状況は、先進国における老人の人口増加（“ベビーブーマーの高齢化”）に伴い、必然的にいっそう悪くなるであろう。アルツハイマー病を患う人々の脳において起こる神経病の特徴は、アミロイド−β蛋白質からなる老人斑、ならびに、異常なフィラメント様構造物の出現および神経原線維のもつれの形成と同時に起こる、深刻な(profound)細胞骨格変化である。ＡＤは、記憶形成における早期欠陥(deficits)に関連し、より高い認知機能の完全な衰退を引き起こす、進行性疾患である。現在、ＡＤのための治療法はなく、ＡＤの進行を止める効果的な治療法もなく、高い確率で死の前の(ante-mortem)ＡＤを診断する方法さえない。神経変性病の遅い発症および複雑な病因は、治療剤および診断剤の開発への挑戦を難しくする。従って、神経変性病に適した動物モデルおよびインビボアッセイシステム（それらは、そのような治療剤および診断剤の開発およびその後の確認に有用であり得る）の開発は、非常に重要である。
【０００３】
アルツハイマー病の病状は、２つの特徴：β−アミロイドペプチドのタンパク性沈殿物からなる老人斑、および、タウ(tau)蛋白質からなる神経原線維のもつれを有する。現在、これらの組織病理学的特徴のどちらが、アルツハイマー病における神経変性の主な原因に、より密接に関連しているかが、依然として議論の的になっている。一般に、タウパチーは、ニューロナルおよび／またはグリアルタウ封入体、タウおよびタウ類似構造物を含む不溶性沈殿物、異常なフィラメント様ニューロナル構造物の出現、ストレートタウフィラメントの構造物、ならびに、対のヘリカルフィラメントからなる神経原線維のもつれの形成、を特徴とする。タウは、低分子量の微小管(microtubule)関連蛋白質であり、主としてＣＮＳの軸索において、末梢神経系の軸索中よりも少量で発現されるのに対して、星状細胞および乏突起膠細胞では、それらは、ほとんど発現されない。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングにより、大人のヒトの脳に存在する多くのイソ型が得られる。スプライシングイベントは、発展的に(developmentally)制御される。胎児の脳では、最も短いイソ型のみが発現されるのに対し、３５２から４４１までのアミノ酸長の６つのタウ−イソ型はすべて、出生後のヒト脳に存在する。それらは、Ｃ−末端領域における縦列反復配列の大きさが異なる。例えば、３Ｒ−タウおよび４Ｒ−タウイソ型は、それぞれ、３１および３２アミノ酸の３つまたは４つの繰り返し配列のどちらかからなる。タウ蛋白質は、微小管に結合して安定化し、それらの重合を促進する。タウによる微小管の結合は、蛋白質のカルボキシ末端部に局在する高度に保存された(highly conserved)アミノ酸モチーフによるものである。４Ｒ−タウイソ型は、３Ｒ−タウイソ型よりも、微小管に対する高い結合アフィニティーを有し、それらの集合(assembly)の促進において、より活性である。タウ蛋白質の最も顕著な特徴の１つは、７９位のセリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）リン酸化部位の約３０において起こる、リン酸化である。リン酸度は、年とともに衰える。従って、胎児のＣＮＳにおいて、タウ蛋白質は、大人のＣＮＳにおけるよりも、高度にリン酸化される。リン酸化部位のいくつかは、タウの微小管結合ドメイン内に局在し、タウリン酸化の増加は、微小管の結合をマイナスに(negatively)制御することが示された。これに関連して、例えば、微小管結合モチーフ内にあるか、またはそれに隣接するＳｅｒ２６２およびＳｅｒ３９６が、胎児のタウにおいてリン酸化され、ＡＤ患者の脳に存在する神経原線維のもつれ(NFT類)を形成する、異常な対のヘリカルフィラメント(PHF類)のタウ蛋白質において超リン酸化される(hyperphosphorylated)ことは、注目に値する。対のヘリカルフィラメントは、神経原線維のもつれ(NFT類)の超微形態的成分である。PHF類は、異常に超リン酸化され、特異的抗タウ抗体によって染色され光学顕微鏡によって検出され得るタウ蛋白質のフィラメント様凝集体である。同じことは、いわゆるストレートタウフィラメントにも当てはまる。ＰＨＦ類は、約８０ｎｍの周期でお互いに絡み合う２つのフィラメントからなる、ねじれたリボンを形成する。これらの病理学的特徴は、一般に、“タウ−パソロジー(au-pathology)”または“タ��関連パソロジー(tau-related pathology)”と呼ばれる。タウパシーの神経病理学的特徴のより詳細な説明については、リー(Lee)ら、Annu Rev Neurosci 2001, 24: 1121 およびゴーツ(Goetz) J, Brain Res Brain Res Rev 2001, 35: 266を参照のこと。アルツハイマー病のほかに、タウ遺伝子の変異(mutations)によって引き起こされる、染色体１７に関連するパーキンソニズム(Parkinsonism)によるフロントテンポラル・ディメンチア(frontotemporal dementia)（ＦＴＤＰ−１７）を含む、いくつかの他の神経変性病でも、ＮＦＴ類が豊富である(フットン(Hutton)ら、ネイチャー(Nature) 1998, 393: 702; ポルカジ(Poorkaj)ら、Ann Neurol 1998, 43: 815; スピランチニ(Spillantini)ら、Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 7737)。
【０００４】
ＮＦＴ類のほかに、β−アミロイドは、ＡＤの主要な組織病理学的特徴である。β−アミロイドは、様々なオリゴマーまたはフィラメント状態に凝集する傾向が強い、疎水性Ａβペプチドからなる。ＳＤＳ安定性オリゴマーおよびプロトフィブリル(protofibrils)は、特に神経毒性を示す(ハートレイ(Hartley)ら、J Neurosci 1999, 19:8876-8884)。フローシー(Frautschy)および同僚は、ラット脳にアミロイドコアを注射することにより、細胞外β−アミロイド沈殿物の重要性およびそれらのＡＤの病状への影響を研究した(フローシー(Frautschy)ら、Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88: 8362)。著者らは、アミロイドの神経毒性効果を報告し、そして、ミクログリア炎症性応答およびニューロン損失を観察したが、異常なタウ凝集のような、タウ関連の病状は観察されなかった。高齢のアカゲザルの脳へのＡβ42の注射後に、ＡＴ８および１２Ｅ８／Ａｂ３１エピトープにおける微小管関連タウリン酸化の誘発が観察されたが、ラット脳への注射後には観察されなかった(ゲウラ(Geula)ら、Nat Med 1998, 4: 827)。
【０００５】
β−アミロイド斑および神経原線維のもつれ（ＮＦＴ類）は、アルツハイマー病の決定的な神経病理学的特徴であるが、それらの病態生理学的関係は、今まで明らかではなかった。タウの原線維凝集体および神経原線維のもつれの形成のための動物モデルシステムを生み出すための以前の試みは、ヒトの病気で観察される特別な特徴による凝集体およびもつれの形成に関して成功しなかった。同様に、アミロイド前駆体蛋白質における変異に基づくトランスジェニックマウスモデルは、部分的なＡＤのような病状のみを示す。そのような動物は、超リン酸化タウに対して免疫反応性であり、ＡＤを患う脳におけるものと類似しているが、神経原線維またはもつれのような特徴を欠いている、アミロイド斑を示す(シュルツラー−ピエラット(Sturchler-Pierrat)ら、Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94: 13287)。これらのＡＰＰ動物モデルは、神経変性病の治療のための治療剤の試験のためのそれらの使用がクレームされている特許出願による(ソンマー(Sommer)およびスタウフェンビエル(Staufenbiel)、特許出願WO 9803644)。別の特許出願(フットン(Hutton)ら、WO 9957129)には、タウペプチドを発現するトランスジェニック動物モデルが記載されている。それらのトランスジェニック動物モデルを生み出すために使用されるタウ遺伝子配列は、ヒトにおけるタウパソロジーに関連する変異を有する。しかし、多数の神経原線維のもつれも、何らかの神経原線維のもつれも観察されなかった。よって、この動物モデルは、ＡＤのような、ＮＦＴ形成に関連する病理学的特徴を有する病気のためのモデルとしての使用に限られるようである。近年、病理学的なヒトのタウ変異を発現するトランスジェニックマウスが、脳において異常なタウ含有フィラメントを形成すること(ルイス(Lewis)ら、Nat Genet 2000, 25:402; ゴーツ(Goetz)ら、J Biol Chem 2001, 276:529)、および、これらのフィラメントが、アルツハイマー病（ＡＤ）や染色体１７に関連するパーキンソニズムによるフロントテンポラル・ディメンチア（ＦＴＤＰ−１７）を含む、いくつかのヒトの神経変性病の神経原線維のもつれ（ＮＴＦ類）との類似性を示すことが報告されたが、それらの数は、ヒトの病気において一般的に見られるものよりかなり少ない(ゴーツ(Goetz), Brain Res Brain Res Rev 2001, 35:266)。この量的な制限は、前記病気のためのモデルシステムとしての、これらのトランスジェニックマウスの使用を妨げる。よって、真のＮＦＴ類の形成に適した動物モデルシステムが緊急に必要とされている。
【０００６】
ここで、本発明について、ＮＦＴ類の生成の促進および増加、ならびに、ヒトＡＤ患者において見られるものと類似するＮＦＴ類の特異的特徴を特徴とする、動物モデルシステムを生み出すことができる。従って、本発明の目的は、神経原線維のもつれの形成に関連する神経変性病、特にアルツハイマー病の治療法、化合物、および調節剤の試験に有用な非ヒト動物モデルおよびインビボアッセイシステムを提供することである。本発明は、Ｐ３０１Ｌ変異(mutant)タウトランスジェニックマウスの脳へのβ−アミロイドＡβ42原線維の注射が、扁桃体（そこからニューロンが注射部位へ突き出す）内の細胞体におけるＮＦＴ類の数を数倍に増加させることを示す。本発明の別の特徴は、ＮＦＴ類の生成の促進である。
【０００７】
本明細書(herein)および請求項において使用される単数形“a”、“an”、および“the”は、特に断らない限り(unless the context dictates otherwise)、複数形も含む。例えば、“an animal”は、複数の動物も意味する。以下同様。本明細書において使用される“フラグメント”という語は、例えば、選択的スプライシングされた、または短小化された、または、別の方法で切断された(otherwise cleaved)転写産物または翻訳産物を含む意味である。本明細書において使用される“誘導体”という語は、変異体(mutant)、またはＲＮＡ修正(RNA-edited)、もしくは化学的変性、もしくは別の方法で変更された翻訳産物を意味する。例えば、“誘導体”は、変更されたリン酸化反応、もしくはグリコシル化反応、もしくはアセチル化反応、もしくは脂質付加反応(lipidation)、または、変更されたシグナルペプチド切断、または他の種類の成熟切断のようなプロセスによって生成され得る。これらのプロセスは、翻訳後に起こり得る。本明細書において使用される“変異体(variant)”という語は、本発明において開示されるポリペプチドおよび蛋白質に関して、何らかのポリペプチドまたは蛋白質を意味し、ここで、本発明の未変性(native)ポリペプチドまたは蛋白質のＮ末端および／もしくはＣ末端において、ならびに／または、未変性アミノ酸配列内に、１つ以上のアミノ酸が付加ならびに／または置換ならびに／または欠失ならびに／または挿入されている。更に、“変異体”という語には、より短いか、またはより長い形のポリペプチドまたは蛋白質も含まれる。変異体は、自然界から単離され得るか、または、組み換えおよび／もしくは合成手段によって生成され得る蛋白質またはポリペプチドを含む。未変性蛋白質またはポリペプチドは、自然発生的な短小化されたか、もしくは分泌された型、自然発生的な変異型（例えば、スプライスバリアント）、および自然発生的な対立遺伝子多型を意味する。“剤(agent)”、“調節剤(modulating agent)”、または“化合物(compound)”は、動物、細胞、組織、体液に、または何らかの生物学的システム、もしくは何らかの試験されるアッセイシステムの関連で(within the context of)、プラスまたはマイナスの生物学的効果を有する何らかの物質、化学物質、組成物、または抽出物を意味する。それらは、ターゲットのアゴニスト(agonists)、アンタゴニスト(antagonists)、部分アゴニストまたはインバースアゴニストであり得る。そのような剤、調節剤、または化合物は、核酸、天然もしくは合成ペプチド、または蛋白質複合体または融合蛋白質であり得る。それらは、抗体、有機もしくは無機分子または組成物、小分子、薬剤、およびいずれかの上記の剤の何らかの組み合わせでもあり得る。それらは、試験、診断、または治療目的のために使用され得る。
【０００８】
本発明による神経変性病または機能障害は、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソニズムによるフロントテンポラル・ディメンチア(fronto-temporal dementia with parkinsonism)(FTDP-17)、進行性核麻痺(progressive nuclear palsy)、大脳皮質基底核変性症(corticobasal degeneration)、グアム型パーキンソン痴呆症候群(parkinsonism-dementia complex of Guam)、および他のタウパチーを含む。神経変性プロセスを含む更なる状態は、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および他の運動ニューロン疾患、脳血管性痴呆(cerebro-vascular dementia)、多系統萎縮症(multi system atrophy)、および軽度認知障害である。タウに関連する病気および機能障害のリストは、リー(Lee)らによる刊行物に挙げられている（Annu Rev Neurosci, 2001, 24:1122）。
【０００９】
本発明は、タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物における神経原線維のもつれの数を増加させる方法であって、神経原線維のもつれの増加が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入(admission)によって誘発される、前記方法を特徴とする。別の態様では、本発明は、タウ遺伝子をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物における神経原線維のもつれの生成を促進する方法であって、神経原線維のもつれの生成の促進が、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入によって誘発される、前記方法を特徴とする。
【００１０】
特徴的な(featured)方法の好ましい態様において、前記導入されるβ−アミロイドは、Ａβ42である。導入されるＡβ42は、原線維状であるか、あらかじめ凝集しているか、または凝集していることが更に好ましい。
【００１１】
非ヒトトランスジェニック動物は、好ましくは哺乳動物であり、特に、マウス、テンジクネズミ(guinea pig)、またはラットのような齧歯類動物である。本発明によれば、神経原線維のもつれが生成されるトランスジェニック動物は、マウスであることが好ましい。特に好ましい態様において、前記トランスジェニックマウスは、ヒトのタウ、好ましくは、フォー・リピートイソ型(four-repeat isoform)とも呼ばれる、４つの微小管結合モチーフを含むタウ蛋白質イソ型をコードする組み換え型遺伝子を発現する。別の好ましい態様において、前記トランスジェニックマウスは、Ｐ３０１Ｌ変異タウをコードする組み換え型遺伝子を発現する。しかし、タウ・パソロジーに関連する変異を有する他のタウ遺伝子配列も、前記動物において、トランス遺伝子として発現され得る。
【００１２】
本発明の方法の好ましい態様において、β−アミロイドは、前記動物の脳への注射によって、特に、海馬または皮質への注射によって、導入または投与される。好ましい導入または投与方法は、定位固定注射によるものである(パキシノス(Paxinos), 定位固定位置中のマウス脳(The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates),アカデミック・プレス(Academic Press), サンディエゴ(San Diego), 1997)。しかし、β−アミロイドの導入または投与は、前記動物の脳への注射に限定されない。他のβ−アミロイドの投与手段は、例えば、鼻から(nasally)、全身的(systemically)、または皮下的(subcutaneously)であり得る。
【００１３】
本発明の別の好ましい態様において、β−アミロイド、または別のＡＰＰのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体が、ＡＰＰをコードする組み換え型遺伝子の共発現によって導入される。前記ＡＰＰは、酵素的に処理されて切断産物を生成し、前記切断産物は、好ましくは、β−アミロイドである。優先的には、前記共発現されるＡＰＰは、変異ＡＰＰであり、特に、アルツハイマー病の病状に関連する変異体である。共発現は、例えば、ＡＰＰをコードする組み換え型遺伝子配列の機械的マイクロインジェクションのような直接遺伝子導入技術、ならびに、組み換え型ベクター、特にレトロウイルスまたはアデノウイルスのような組み換え型ウイルスのような、生物学的ベクターを使用する間接的な技術を含む組み換え型発現法によって達成され得る。これらの方法は、当業者に知られており、詳細に説明されている(例えば、ベール(Behr), Acc Chem Res 1993, 26:274; ムリガン(Mulligan), サイエンス(Science) 1993, 260:926; ウォルフ(Wolff), Curr Opin Neurobiol 1993, 3:743)。ＡＰＰをコードする組み換え型遺伝子の共発現は、遺伝子組み換えによって(transgenically)、例えば、組み換え型タウ遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、ＡＰＰをコードする組み換え型遺伝子を発現する動物と交雑し(crossing)、バイジェニック(bigenic)またはダブルトランスジェニック動物を生成することによっても達成され得る。そのような動物の生成および構成のためのストラテジーおよび技術は、当業者に知られている（例えば、カペッチ(Capecchi), サイエンス(Science) 1989, 244:1288-1292 およびホガン(Hogan)ら、1994, マウス胚の操作(Manipulating the Mouse Embryo)：ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual), コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press), コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor), ニューヨークを参照）。
【００１４】
本発明の方法の１つの好ましい態様において、主に、動物の脳の扁桃体、特に、基底外側（basolateral）扁桃体において、神経原線維のもつれが増加するか、および／または、その生成が促進される。しかし、そのような神経原線維のもつれの増加および／または生成の促進は、扁桃体に限定されない。脳の他の領域、例えば、頭頂葉皮質も、所望の効果を示し得る。神経原線維のもつれの増加は、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドが投与されなかった対照動物と比べて、数倍、特に少なくとも２倍であることが好ましい。適当な対照動物は、例えば、シャムが注射されたか(sham-injected)、モックが注射されたか(mock-injected)、または対照が注射された(control-injected)動物、例えば、Ａβ42-1リバース・ペプチドが注射された動物であり得る。別の好ましい例において、神経原線維のもつれの増加は、ＡＰＰまたはそのフラグメント、特にβ−アミロイドが投与されなかった対照動物と比べて、少なくとも５倍である。
【００１５】
本明細書に記載の方法は、更に、神経網スレッド(neuropil threads)の形成および／または神経突起の変性(degeneration)のような、アルツハイマー病において観察される特徴に類似する他の神経病理学的特徴を誘発するために有用である。
【００１６】
本発明は、神経原線維のもつれを生成し得る、タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物を特徴とする。更に、本発明の特徴は、神経原線維のもつれの数の増加をもたらし得る、タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物である。更に、本発明の別の特徴は、神経原線維のもつれの生成を促進し得る、タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物である。
【００１７】
本発明の１つの特別な態様は、上記の特徴的な非ヒトトランスジェニック動物が、ヒトの神経変性病において一般に見られるものに匹敵する、神経原線維のもつれを生成することである。
【００１８】
好ましい態様において、本明細書に記載の動物は、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドを、神経原線維のもつれの生成を誘発するのに十分な量で含む。
【００１９】
好ましい態様において、本発明は、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体、特にβ−アミロイドの導入により、神経原線維のもつれの数の増加および／または神経原線維のもつれの生成の促進が誘発される、タウ蛋白質をコードする組み換え型遺伝子を発現する、非ヒトトランスジェニック動物を記載する(claims)。好ましくは、β−アミロイドの導入または投与は、前記動物の脳への注射によって、特に、海馬または皮質への注射によって達成される。または、前記導入は、ＡＰＰ、またはそのフラグメント、もしくは誘導体、もしくは変異体をコードする組み換え型遺伝子の共発現によって達成され得る。前記ＡＰＰは、酵素的に処理されて切断産物を生成し、前記切断産物は、好ましくは、β−アミロイドである。優先的には、前記共発現されるＡＰＰは、変異ＡＰＰであり、特に、アルツハイマー病の病状に関連する変異体である。共発現は、例えば、本発明に記載の組み換え型発現法によって行われ得る。
【００２０】
本発明によるトランスジェニック動物は、神経変性病、特に、アルツハイマー病、フロントテンポラル・ディメンチア（ＦＴＤ）、および、神経原線維のもつれの形成に伴う他の神経変性病、の治療のための治療法、または調節剤、または化合物の効能を決定または確認するためのインビボアッセイを提供する。本発明の好ましい態様において、前記インビボアッセイは、β−アミロイドワクチン接種のようなアミロイド低下治療法(amyloid-lowering therapies)、またはＮＦＴ−低減治療法(NFT-reducing therapies)の効能の決定または確認に有用である。
【００２１】
本発明によれば、インビボアッセイは、例えば、以下の段階を含む：(i)本発明の方法によって生成される、神経原線維のもつれを生成する非ヒトトランスジェニック動物の提供、(ii)化合物もしくは調節剤との前記動物の接触、または、前記動物における治療法の適用、ならびに、(iii)前記化合物もしくは調節剤、または前記治療法の、前記動物における神経原線維のもつれの形成、および／または、神経網スレッドの形成、および／または、神経突起の変性、または他のＡＤに関連する病状を調節する能力の評価。前記インビボアッセイにおける神経原線維のもつれの形成の決定は、様々な方法、例えば、免疫組織化学、および電子顕微鏡法によって達成することができ、かつ、それは、神経原線維のもつれに関連するタウ分子を認識し、他の状態の凝集体中に存在するタウ分子と区別することができる、構造依存性(conformation-dependent)抗体の利用を含む。好ましい態様において、前記構造依存性抗体は、光学的に標識され、好ましくは、蛍光標識され、そして、例えば、蛍光偏光顕微鏡法(fluorescence polarisation spectroscopy)、蛍光相関顕微鏡法、蛍光相互相関顕微鏡法（fluorescence cross-correlation spectroscopy）、蛍光強度分布分析、蛍光寿命測定、蛍光異方性測定、蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer)、またはそれらの組み合わせのような、多くの光学的な方法によって検出され得る。または、別の態様において、タウのリン酸化されたエピトープ、特に、そのリン酸化度が、アルツハイマー病において観察されるようなタウ凝集体および神経原線維のもつれの形成の状態と相関するエピトープ、特に、タウエピトープＡ４２２、を認識し得る抗体が使用され得る。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の図面および実施例の詳細な説明から明らかであるが、それらは、説明のためのものであり、請求項中の発明の開示または範囲の残りの部分を限定するものではない。
【００２３】
図１
マウス脳の一方の半球の体性感覚皮質、ならびに、反対側の半球の海馬のＣＡ１領域への、Ａβ42原線維またはＡβ42-1の懸濁液の定位固定注射。注射の部位を、象徴化したシリンジで示す。
【００２４】
図２
マウス脳の体性感覚皮質および海馬のＣＡ１領域へのＡβ42またはＡβ42-1原線維の定位固定注射。電子顕微鏡法によって、凝集した合成Ａβ42が原線維を形成したのに対し（Ａ）、リバース対照ペプチド、Ａβ42-1（Ｂ）は形成しなかったことを確認した。マウス脳を、注射の１８−６０日後に分析した。スケールバー：Ａ，Ｂ：０．４μｍ。
【００２５】
図３
Ａβ42原線維またはＡβ42-1の懸濁液を、マウス脳の一方の半球の体性感覚皮質、ならびに反対側の半球の海馬のＣＡ１領域に、定位固定して注射した。抗体６Ｅ１０により、少なくとも注射の４５日後に、注射部位にＡβ42原線維が存在することが示された（Ａ）。染色対照として、アミロイド斑含有ＡＰＰSWトランスジェニック(シャオ(Hsiao)ら、ニューロン(Neuron) 1995, 15: 1203)およびヒトＡＤ脳セクションが含まれていた。Ａβ42およびＡβ42-1は、注射部位周辺（Ｂ）、および扁桃体中（Ｃ）の両方で、反応性星状細胞の発生を増加させた。反応性星状細胞増加は、少なくとも４５日続いた。テキサスレッド結合デキストラン（Texas red-coupled dextran）の同じ位置(coordinates)への定位固定適用によって、扁桃体中のニューロンの一部を染色し、これらが、注射部位へ突出した(projected)ことを確認した（Ｄ）。Ａ−Ｄ：生後７ヶ月の雌のＰ３０１Ｌを、注射４５日後に分析した。スケールバー：Ａ−Ｄ：５０μｍ。
【００２６】
図４
Ａβ42原線維によって誘発されたＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウス中の神経原線維のもつれ（ＮＦＴ類）の存在。Ａβ42原線維は、注射の１８日後にすぐ、扁桃体において、しばしば、皮質において、多数のＮＦＴ類および神経網スレッドのガリアスポジティブ（Gallyas-positive）形成を誘発した。生後６ヶ月の雌のＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスの扁桃体を、注射の１８日後に分析した。スケールバー：２５μｍ。
【００２７】
図５
Ａβ42原線維は、注射の１８日後にすぐ、Ｐ３０１Ｌトランスジェニックマウスの扁桃体において、しばしば、皮質において、多数のガリアスポジティブＮＦＴ類および神経網スレッドの形成を引き起こす。Ａβ42−（Ａ，Ｃ）、およびＡβ42-1を注射した（Ｂ）Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスの扁桃体および頭頂葉皮質中のＮＦＴ類のガリアスシルバー含浸。ＮＦＴ類の一部も、チオフラビン−Ｓによって染色した（Ｄ）。Ａ：注射４０日後に分析に分析された生後８ヶ月の雄のＰ３０１Ｌ；Ｂ：注射４０日後に分析された生後６．５ヶ月の雌のＰ３０１Ｌ；Ｃ：注射１８日後に分析された生後６ヶ月の雌のＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス  Ｄ：注射４５日後に分析された生後６ヶ月の雌のＰ３０１Ｌ。スケールバー：Ａ，Ｂ：２５μｍ；Ｃ，Ｄ：１２．５μｍ
【００２８】
図６
Ａβ42原線維によって誘発されたＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにおける神経原線維のもつれ（ＮＦＴ類）。Ａβ42原線維は、Ｐ３０１Ｌトランスジェニックマウスの扁桃体において、しばしば皮質において、多数のガリアスポジティブＮＦＴ類および神経網スレッドの形成を引き起こす（Ａ）。誘発されたＮＦＴ類は、ＡＤ患者から得られる脳において見られるものと非常に類似していた（Ｂ）。両スライドを、同じプロトコルによって並行して染色した。Ａ：注射２１日後に分析された生後５．２５ヶ月の雄のＰ３０１Ｌ。Ｂ：ヒトの８６歳の女性のＡＤ患者。
【００２９】
図７
Ａβ42原線維は、Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにおいて、神経原線維のもつれ(ＮＦＴ類)の形成を引き起こす。扁桃体の薄片の免疫電子顕微鏡法(Immuno-electron microscopy)によって、ＡＤのようなタウフィラメントが見られる（抗体ＡＴ８を使用）。スケールバー：低倍率視野：８００μｍ（Ａ）；高倍率視野：１００μｍ（Ｂ）。
【００３０】
図８
扁桃体中のガリアスポジティブＮＦＴ類。Ａβ42、Ａβ42-1を注射したＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス、および注射していないＰ３０１Ｌトランスジェニックマウス、ならびに、非トランスジェニックな同腹子(litter mate)対照、ならびに、野生型ヒトタウを発現するトランスジェニックマウスにおいて、注射２２日後にＮＦＴ類を数えた（プロブスト（Probst）ら、Acta Neuropathol (Berl) 2000, 99: 469）。分析時の平均年齢（月）±ＳＤを示す。ガリアスポジティブＮＦＴ類を、本明細書に記載の方法に従って数え、同側および反対側の扁桃体の両方を含む２０個の標準化した前頭部(frontal sections)における合計を示す。マンホイットニーＵ検定（Mann-Whitney U-test）：Ｐ＝０．００７（両側の正確な有意性（2-tailed exact significance））、Ａβ42を注射したＰ３０１ＬマウスをＡβ42-1を注射したＰ３０１Ｌマウスと比較。
【００３１】
図９
Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ(phospho)−エピトープ。Ｒ１４５ｄエピトープＳ４２２は、海馬および皮質でリン酸化されなかったが（Ａ）、扁桃体においてＡβ42原線維によって特異的に誘発された（Ｂ、高倍率視野）。Ｒ１４５ｄおよびＡＴ１００とは対照的に、ＡＴ８エピトープは、海馬、皮質（Ｃ）、および扁桃体（Ｄ、高倍率視野）の多くのニューロンにおいてリン酸化された。Ａ−Ｄ：注射１８日後に分析された生後６ヶ月の雄のＰ３０１Ｌ。スケールバー：Ａ，Ｃ：１００μｍ；Ｂ，Ｄ：２５μｍ。関連する脳領域を示すマウス脳半球の概略地図（Ｅ）。
【００３２】
図１０
Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ−エピトープ。Ｒ１４５ｄ（タウホスホ−エピトープＳ４２２）およびＡＴ１００（ホスホ−エピトープＳ２１２／Ｔ２１４）による二重免疫蛍光染色によって、扁桃体中のＲ１４５ｄポジティブニューロンがＡＴ１００ポジティブであることが示された（Ａ、Ｂ、マージ(merge)：C）。スケールバー：４０μｍ。
【００３３】
図１１
Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ−エピトープ。Ｒ１４５ｄポジティブニューロンの約半分が（Ａ、Ｂ）、ガリアスポジティブな神経原線維のもつれを有しており（Ｃ、Ｄ）、一般に、これらは、Ｒ１４５ｄ（ホスホ−Ｓ４２２）によって最も濃く染色されたニューロンを含んでいた（ホスホ−Ｓ４２２）（矢印で示す）。Ａ−Ｄ：注射４５日後に分析された生後７ヶ月の雌のＰ３０１Ｌ。スケールバー：４０μｍ。
【００３４】
実施例
β−アミロイドがＮＦＴ形成を促進し得るかを決定するために、生後５〜６ヶ月のＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックな同腹子の体性感覚皮質および海馬内へ、合成Ａβ42原線維を注射した（(i)−(iii)欄の方法を参照）。対照ペプチドとして、同じ起源から得られた逆配列(reversed sequence)、Ａβ42-1、を使用した（(ii)欄の方法）。Ａβ42原線維を攪拌インキュベーションによって生成し、電子顕微鏡法によって確認した（図２Ａ、Ｂ）（(ii)および(iii)欄の方法）。Ａβ42原線維は、Ｐ３０１Ｌトランスジェニックマウスおよび野生型対照マウスのいずれにおいてもインビボで安定であり、少なくとも注射４５日後に容易に検出できた（図３Ａ）。注射部位（図３Ｂ）および扁桃体(図３Ｃ)の両方において、著しい反応性星状細胞増加に伴い、脳アミロイドが沈殿した（方法については(iv)欄参照）；これらの沈殿は、Aβ42を注射したトランスジェニックマウスおよび対照を注射したトランスジェニックマウスのいずれにおいても観察され、少なくとも注射後４５日間続いた。この反応は、体性感覚皮質中の注射部位から扁桃体中の細胞体への、テキサスレッド結合デキストランの逆行性移動（retrograde transport）によって示されるように、扁桃体中のニューロンが注射部位に突出するという事実と関連し得る（図３Ｄ）（(iv)欄の方法）。
【００３５】
Ａβ42の注射の１８日後、ガリアスシルバー含浸（(iv)欄）により、野生型マウスではなく、Ｐ３０１Ｌの扁桃体において、神経網スレッドおよび変性神経突起（図４）とともに、多数のＮＦＴ類（図５Ａ−Ｃ、図６Ａ）が示された。頭頂葉皮質にもＮＦＴ類が存在することがあった（図５Ｃ）。マウス中のＮＦＴ類（図６Ａ）は、同じプロトコルによって並行して染色されたＡＤ脳のものと非常に類似していた（図６Ｂ）。更に、神経網スレッドは、ＡＤにおいて知られているものと類似していた（ブラーク(Braak)ら、Neurosci Lett 1986, 65: 351; マクニー(McKee)ら、Ann Neurol 1989, 26: 652; ベラスコ(Velasco)ら、Brain Res 1998, 813: 329）。マウス中のガリアスポジティブな神経原線維のもつれの一部も、チオフラビン−Ｓによって染色したところ、ＡＤの組織変化と矛盾しなかった(consistent)（図５Ｄ）。フィラメントは、幅２０−２５ｎｍおよび周期９０ｎｍであり、最も良い表現をすると、ねじれたリボンであった（図７）。ヒトキャリアーでは、Ｐ３０１Ｌ変異は、少量の野生型３Ｒイソ型とともに、４リピート（４Ｒ）イソ型の優勢な発現を引き起こし、その結果、１３０ｎｍより大きな周期の１５ｎｍの幅広いねじれたフィラメントが得られる（スピランチニ(Spillantini)ら、Am J Pathol  1998, 153: 1359）。マウスは、４Ｒタウイソ型のみを内生的に発現し、かつ、トランス遺伝子が、４ＲヒトＰ３０１Ｌタウを発現するように設計されたので、ここで観察されたフィラメントは、３Ｒタウを含んでいなかった。重要なことには、３Ｒタウの形成を低減する、ヒトイントロニック(intronic)ＦＴＤＰ−１７変異も、主に４Ｒタウからなる、ねじれたリボンをもたらす。よって、３Ｒおよび４Ｒイソ型の相対量が、フィラメントの超微形態（ultrastructural morphology）に寄与し得る。
【００３６】
定量分析により、Ａβ42を注射したＰ３０１Ｌマウスにおいて、Ａβ42-1を注射したか、または注射していないＰ３０１Ｌマウスと比べて５倍多いガリアスポジティブＮＦＴ類が示された（図５Ａ、Ｂ；図８）。ＮＦＴ形成の横断経時変化分析（Cross-sectional time-course analyses）により、注射１８日後の初期ＮＦＴ類が、少なくとも注射６０日後までの更なる数の増加（ｎ＝５８）とともに示された。Ａβ42を注射したＰ３０１Ｌマウス中の両半球におけるＮＦＴ形成は、性別による違いはなかった（雌：２３±２１；雄：２３±４；ｎ＝７、Ｐ＝０．８６、マンホイットニーＵ検定）。対照的に、生後６〜８．５ヶ月では、Ａβ42-1を注射した雄のＰ３０１ＬはＮＦＴ類を少ししか発生せず、雌のＰ３０１ＬではＮＦＴ類は発生しなかった。この違いは、統計的に有意であった（雌：０；雄：５．８±１．９；ｎ＝７、Ｐ＜０．０１、マンホイットニーＵ検定）。タウ変異の存在は、ＮＦＴ形成の誘発のために好ましい。
【００３７】
驚くべき顕著な発見は、同側と反対側の扁桃体との間で大きな違いなく、Ａβ42注射の部位が空間的に分離し、扁桃体において離れて(remote)ＮＦＴが形成されることであった（１１．４±１０．１３および９．４±８．０；ｎ＝７、Ｐ＝０．０５８、ウイルコクソンの符号付き検定（Wilcoxon Signed Ranks Test））。このことは、各細胞体においてＮＦＴ形成によって引き起こされる注射部位に突出するニューロンのシナプス前末端または軸索へダメージを与える可能性を示唆する。よって、アミロイド沈殿の解剖学的分離およびＮＦＴ形成は、Ａβ42によって誘発された軸索ダメージ、および、おそらく、正常に機能しないタウの軸索移動と矛盾しない（バラダラジャン(Varadarajan)ら、J Struct Biol 2000, 130: 184）。我々は、注射部位から扁桃体へのテキサスレッド結合デキストランの逆行性移動を示すことにより、扁桃体中の影響を受けた(affected)ニューロン群が、皮質(cortical)注射部位に突出することを確認した（図３Ｄ）。タウの細胞体樹状突起蓄積（somatodendritic accumulation）の他のメカニズムは、あまりありそうではない：第一に、我々は、免疫組織化学によって、扁桃体中の細胞体のＡβ42原線維への直接的な露出を排除した。第二に、扁桃体ニューロン中に軸索拡張（axonal dilatations）または回転楕円体（spheroids）がないことによって示されるように、タウ蛋白質レベルの合成の増加はなさそうである。第三に、拡散性の毒性因子は、注射部位に隣接するニューロンがＮＦＴ類を発生できないことをとても説明できない。ヒトのＡＤ患者において、アミロイド斑およびＮＦＴ類の解剖学的分離がしばしばみられる；シナプス周辺のアミロイド沈殿および突出ニューロンの各細胞体におけるＮＦＴ類を伴う（プライス(Price)およびシソディア(Sisodia), Ann Rev Med 1994, 45: 435）。また、扁桃体は、ヒト患者においてＮＦＴ形成によって早期に影響を受ける範囲の中で、最も影響を受けやすい（vulnerable）範囲である（アーノルド(Arnold)ら、Cereb Cortex 1991, 1: 103）。我々のＰ３０１Ｌマウスにおいて、扁桃体が最も影響を受けやすいことは、扁桃体中のニューロンが、これらがＮＦＴ類を殆ど発生しなかったにもかかわらず、皮質または海馬の錐体神経と同様のレベルのトランス遺伝子を発現したという事実によって裏付けられる（ゴーツ(Goetz)ら、J Biol Chem 2001, 276: 529）。我々の実験は、ＮＦＴ形成への星状細胞および小膠細胞の関与について正式に検討はしなかったが、これらの細胞の活性化のみでは、ＮＦＴ形成には明らかに不十分であった。なぜなら、Ａβ42およびＡβ42-1は、注射部位周辺および扁桃体中のいずれにおいても、星状細胞および小膠細胞を同様に活性化したからである（図３Ｂ、Ｃ）。
【００３８】
ＡＤにおけるＮＦＴ類の形成は、タウの超リン酸化および構造変化に関連する（グルンドケ−イクバル(Grundke-Iqbal)ら、Proc Natl Acad Sci U S A 1986, 83: 4913; ブラーク(Braak)およびブラーク(Braak), Neurobiol Aging 1995, 16: 271; ジカ(Jicha)ら、J Neurosci Res 1997, 48: 128）。Ｐ３０１ＬマウスにおけるＡβ42によって誘発されるＮＦＴ形成が、タウの変更されたリン酸化および構造に関連していたかを決定するために、我々は、標準的な公表された工程を用いることによって、異常なホスホ−エピトープ(R145d, pS422、AT100、TG3) (ゴーダート(Goedert)ら、Biochem J 1994, 301:  871; ディクソン(Dickson)ら、Neurobiol Aging 1995, 16: 285; タナカ(Tanaka)ら、FEBS Lett 1998, 426: 248)、超リン酸化エピトープ (AT8、S199P、AT180、12E8、AD2、PHF1) (ゴーダート(Goedert)ら、Biochem J 1994, 301:  871; グリーンバーグ(Greenberg)ら、J Biol Chem 1992, 267: 564; ゴーダート（Goedert）ら、Neurosci Lett 1995, 189: 167; スーバート(Seubert)ら、J Biol Chem 1995, 270: 18917; ブエ−シェラー(Buee-Scherrer)ら、Brain Res Mol Brain Res 1996, 39: 79; デラコルテ(Delacourte)ら、Ann Neurol 1998, 43, 193;  サージャント(Sergeant)ら、J Neurochem 1999, 72: 1243) ADDIN ENRfu に対する抗体、ならびに、構造依存性抗体(TG3、MC1) (ジチャ(Jicha)ら、J Neurosci Res 1997, 48: 128;  ディクソン(Dickson)ら、Neurobiol Aging 1995, 16: 285)を使用した((iv)欄の方法およびゴーツ(Goetz)ら、Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 12370を参照)。
【００３９】
ＡＴ８を含む数種の抗体が、注射とは関係なく、Ｐ３０１Ｌマウスの脳全体にわたって、リン酸化されたタウを検出したのに対し、ホスホ−エピトープS422およびS212/T214に対するR145d/pS422およびAT100は、それぞれ、Ａβ42にのみ応答して、ＮＦＴ類およびニューロンを特異的に検出した（図９Ａ、Ｂ；図１０Ａ−Ｃ）。顕著なことには、これらの異常リン酸化型のタウの空間分布パターンは、ガリアス染色によって観察され、かつ、扁桃体においても主に発生したものと同じであった（図９Ａ、Ｂ）。共染色(Co-staining)により、Ｒ１４５ｄ／ｐＳ422によって染色されたニューロンは、ＡＴ１００によっても染色させることが示された（図１０Ａ−Ｃ）。Ｒ１４５ｄもＡＴ１００も、非トランスジェニック細胞中のどの細胞も免疫染色しなかった。Ａβ42に関連する異常リン酸化に対するＲ１４５ｄ、ｐＳ422、およびＡＴ１００免疫反応性の特異性は顕著であった。なぜなら、これらの抗血清は、注射していないか、またはＡβ42-1を注射したＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにおいてシグナルをほとんど示さず、野生型ヒトタウを発現するトランスジェニックマウスではシグナルを示さなかったからである。更に、連続免疫蛍光およびガリアスシルバー含浸プロトコルによって示されるように、すべてのガリアスポジティブなＮＦＴ類は、Ｒ１４５ｄによっても染色された。これにより、Ｐ３０１Ｌマウス中のＮＦＴ類がＳ４２２−リン酸化タウを含んでいたことが強く示唆される。半定量分析により、Ｒ１４５ｄポジティブニューロンの約半分（図１１Ａ、Ｂ）が、ガリアスポジティブであり、Ｒ１４５ｄは、一般に、これらのニューロンを、ＮＦＴ類なしの細胞よりも、より強く染色したことが示された。
【００４０】
同時に、我々の免疫染色の結果は、エピトープＳ２１２／Ｔ２１４およびＳ４２２のリン酸化がＮＦＴ形成に強く関連している可能性と矛盾しない。本明細書において開示されたデータは、Ａβ42が、ＡＴ８および１２Ｅ８／Ａｂ３１エピトープにおいて、インビトロおよびインビボでタウリン酸化を誘発したという、従来の知見を拡張する(extend)（ブシグリオ(Busciglio)ら、ニューロン(Neuron) 1995, 14: 879; ゲウラ(Geula)ら、Nat Med 1998, 4: 827）。我々のＰ３０１Ｌマウスでは、Ａβ42注射なしでも、これらエピトープにおいてタウがリン酸化された。よって、これらのエピトープは必要であり得るが、明らかに、Ｐ３０１ＬマウスにおいてＮＦＴを形成するために十分ではなかった。Ｒ１４５ｄ／ｐＳ422およびＡＴ１００を使用することによって、我々は、Ａβ42注射に続いてＳ２１２／Ｔ２１４およびＳ４２２においてタウのリン酸化が起こることを見出した。これにより、ＮＦＴ形成におけるこれらエピトープの役割が示唆された。
【００４１】
要約すると、本明細書に開示されたデータによって、Ａβ42原線維がＰ３０１ＬマウスにおいてＮＦＴ形成を著しく促進し得ることが立証される。本発明の方法によって生成される神経原線維のもつれは、ＡＤ患者の脳から抽出されるものと非常に類似し、その形成は、注射後１８日以内にすでに達成された。本明細書に開示されたデータは、トランスジェニックマウスにおいて、ＮＦＴ形成のためには、Ｐ３０１Ｌ変異体とβ−アミロイドとの相互作用が必要とされ、β−アミロイドだけでも変異体だけでも、多数のＮＦＴ類を生成するには十分ではなかったことを示す。本発明により生成されたマウスは、そのような、Ａβワクチン接種のようなアミロイド低下治療法が、ＮＦＴ形成をインビボで妨げるために有効であるかを決定するためのインビボアッセイを提供する。
【００４２】
方法
(i)トランスジェニックマウスの生成：トランスジェニックマウスを生成するために、ＰＣＲ介在型（PCR-mediated）アプローチによって、ヒト病原性タウ変異体Ｐ３０１Ｌを、最も長いヒト脳タウイソ型をコードするｃＤＮＡへ導入した。このイソ型は、エクソン２および３、ならびに４つの微小管結合の繰り返し(2+3+4R, htau40)を含んでいた。Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスを、野生型タウトランスジェニックマウスと区別することを可能にするために、サイレント変異体を、診断的ＳｍａＩ制限部位を破壊するＰ３０１Ｌ構成物(construct)に導入した。ｃＤＮＡに、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を与え(conferred with)、ネズミThy.1.2ゲノミック(genomic)発現ベクターにサブクローニングした。マイクロインジェクション前に、この構成物のベクター配列（ｐR5と呼ぶ）を除去した。B6D2F1 x B6D2F1胚の前核注射によって、トランスジェニックマウスを生成した。２つの異なるプライマー対を使用して、テールバイオプシー(tail biopsies)からの溶菌液のＰＣＲ分析によって、創始物(founders)を同定した。創始動物を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑し、系(lines)を得た。トランスジェニックマウスを、以下のオリゴヌクレオチドによってスクリーニングした：タウ−I: 5’−GGAGTTCGAAGTGATGGAAG−3’およびタウ−K: 5’−GGTTTTTGCTGGAATCCTGG−3’。増幅により、５００ｂｐの生成物を得た。ＳｍａＩによる増幅産物の制限消化によって、Ｐ３０１Ｌトランス遺伝子の存在を確認した。１０個の独立したトランスジェニック系の中で、４個は、免疫ブロット分析によって決定された発現レベルに匹敵する発現レベルを有していた。ｐＲ５−１８３系を、本研究において使用した。
【００４３】
(ii)Ａβ４２およびリバースＡβ４２−１原線維の生成：Ａβ４２（Bachem, No. H-1368, Lot No. 524548）、およびＡβ４２−１（Bachem, No. H-3976, Lot No. 536763）を、最終濃度２５０μＭでＰＢＳ中で再構成し、エッペンドルフサーモミキサー中で３７℃で８４時間、１０００ｒｐｍで振とうし、そして電子顕微鏡法によって分析した。調製物を、カーボンコートした３００メッシュグリッド上に置き、２％リンタングステン酸によって染色した。リバースペプチドＡβ42-1の調製物は、電子顕微鏡法におけるネガティブ・コントラスティング(negative contrasting)によっては容易に検出できなかった不溶性凝集体からなるものであった（図２Ｂ）。顕微鏡写真を、フィリップス(Philips)モデルCM12電子顕微鏡において、８０〜１００ｋＶの操作電圧および４０，０００倍の公称(nominal)倍率で記録した。
【００４４】
(iii)定位固定注射：パキシノス(Paxinos)のプロトコルに従って(パキシノス(Paxinos) KB, 定位固定位置におけるマウス脳(The mouse brain in stereotaxic coordinates), アカデミックプレス（Academic Press）, サンディエゴ（San Diego）, 1997)、マウス脳への定位固定注射を行った。２％キシラジンと１０％ケタミンとの混合物によって、マウスに麻酔をかけ、右半球の海馬体のＣＡ１領域（位置：ＡＰ ブレグマから−１．９ｍｍ、ＬＡＴ−１．０ｍｍ、ＤＶ+１．９ｍｍ）、および、左半球の皮質（位置: AP ブレグマから−1.9 mm、LAT +2.0 mm、DV +1.2 mm；体性感覚皮質１のトランク（trunk）領域を含む、S1Tr）に、ミニポンプによって運転される１０μｌのハミルトンシリンジを用いて（電動定位固定注射器、ストエルティング社(Stoelting Co.)）、０．１５μｌ／分の注射スピードで、１．５μｌのペプチド懸濁液を定位固定注射した。更に１０分間、注射部位に針を保持した後、ゆっくり取り除いた。操作された動物を、毎日コントロール下に置いた。実験中、感染するマウスや死亡するマウスはいなかった。注射されたマウスに、１８、２６、４５、および６０日目にそれぞれ、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４、をトランスカーディアルに(transcardially)灌流させ、免疫組織化学のために処理した。軸索摂取を決定するために、我々は、１２．５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中のテキサスレッド結合デキストラン（70,000 MW, モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)）を１．５μｌ注射し、５〜８日後にマウスを灌流させた。
【００４５】
(iv)免疫組織学的染色、免疫蛍光分析、および抗体：標準的な公表された工程を用いることにより、脳からの４μｍの冠状パラフィン切片において、免疫組織学的染色を行った。連続した前頭切片が採取され、ＡＤ患者および健康なヒトからの脳切片が、対照として含まれていた。いくつかの切片を、シグナルを高めるために、５μｇ／ｍｌのＴｒｉｓ緩衝処理生理食塩水またはＰＢＳ中のプロテイナーゼＫによって、３７℃で２．５分間前処理した。切片を、チオフラビン−Ｓによって染色し、ガリアスプロトコルによって銀を染み込ませた（silver-impregnated）（ガリアス(Gallyas) F, Acta Morphol Acad Sci Hung 1971, 19:1）。ガリアス染色のために、AP −1.5 mmからAP−2.4 mm（ブレグマから）の位置からの２０番目毎の切片を分析したのに対し、AP −1.8 mmからAP−2.0 mmの位置の注射部位（ＡＰ−１．９ｍｍ）周辺の５番目毎の切片を分析した。各マウスからの脳全体の２０個の標準化された前頭切片において、ガリアスポジティブＮＦＴ類を数えて足し合わせた。図８に示されたマウス数について、平均および標準偏差を決定した。ヒトタウを特異的に検出するために、タウ１４(ジメド社(Zymed Inc)、サウスサンフランシスコ(South San Francisco)、CA、アミノ酸83-120、１：２の希釈率で使用)、およびHT7(インノジェネティクス社(Innogenetics Inc)、ベルギー、アミノ酸159-163、1:200)を使用した。異なるタウホスホ−エピトープを検出するために、以下の抗体を使用した（括弧内）：AT270 (インノジェネティクス社(Innogenetics Inc.)、1:500、トレオニン181)、AT8 (インノジェネティクス社(Innogenetics Inc.)、1:50、セリン202/トレオニン205)、AT100 (インノジェネティクス社(Innogenetics Inc.)、1:100、セリン212/トレオニン214)、12E8 (Dr. ピーター・セウベルト(Peter Seubert)、1:100、セリン262/セリン356)、AT180およびTG3 (Dr. ピーター・デイビス(Peter Davies)、それぞれ1:100および1:20、231/セリン235)、 PHF1 (Dr. ピーター・デイビス(Peter Davies)、1:50); S199P (Dr. アンドレ・デラコルテ(Andre Delacourte)、1:100, セリン199)、R145d (Dr. ハーリド・イクバル(Khalid Iqbal)、1:30、セリン422)およびpS422 (バイオソース社(Biosource Inc.)、1:50、セリン422)、およびAD2 (Dr. チャンタル・モルテン−ギルス(Chantal Mourton-Gilles)、1:10.000, セリン396/セリン404)。ＭＣ１は、構造的Alz-50エピトープを検出した(Dr. ピーター・デイビス(Peter Davies)、1:20)。Ａβペプチドを検出するために、モノクローナル抗体６Ｅ１０（セロテック(Serotec)、1:500）を使用した。活性化星状細胞を検出するために、抗ＧＦＡＰポリクローナル抗体（シグマ(Sigma)、1:400）を使用し、小膠細胞を検出するために、イソレクチンＢ４（ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)、2μg/ml）を使用した。ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)からペルオキシダーゼ／ＤＡＢ染色のために(ベクタステインＡＢＣキット(Vectastain ABC kits) PK-6101およびPK-6102)、モレキュラープローブス(Molecular Probes)から免疫蛍光のために(ALEXA-FLUORシリーズ)、二次抗体を得た。
【００４６】
(v)透過電子顕微鏡法：４０μｍ厚のビブラトーム切片から、扁桃体を含む範囲を切除し、４％パラホルムアルデヒドおよび０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ中に固定した。ＯｓＯ４による固定後、通常の電子顕微鏡法のための組織試料を、エポキシ樹脂中に包埋した（エポン(Epon)、シグマ(Sigma)、ボルネム(Bornem)、ベルギー）。免疫金ラベリングのために、ホルムバール(formvar)コートされたニッケルグリッド上のエポキシ樹脂包埋組織からの超薄切片を、６％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで１０分間、５％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳによって３０分間処理した。この後、それら切片を、希釈率１：５０で２時間、１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で、モノクローナル抗体ＡＴ８とともにインキュベートした。洗浄後、Tris緩衝処理生理食塩水中の１０ｎｍのコロイダル金によってタグされた(tagged)二次抗体（ヤギ抗マウス；ブリティッシュ・バイオセル(British Biocell)、カーディフ(Cardiff)、UK）を、１時間適用した。その後、洗浄後、クエン酸銅および酢酸ウラニルによって切片を染色した。対照切片を同じ工程に従って染色したが、一次抗体は除いた。エポキシ包埋調製物の表面で切断されたフィラメントが、深い層よりも抗体に近づきやすかった(accessible)ため、ＡＴ８は、フィラメントの“末端”を頻繁にラベルしたようだった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】マウス脳の一方の半球の体性感覚皮質、ならびに、反対側の半球の海馬のＣＡ１領域への、Ａβ42原線維またはＡβ42-1の懸濁液の定位固定注射。
【図２】マウス脳の体性感覚皮質および海馬のＣＡ１領域へのＡβ42またはＡβ42-1原線維の定位固定注射。
【図３】Ａβ42原線維またはＡβ42-1の懸濁液を、マウス脳の一方の半球の体性感覚皮質、ならびに反対側の半球の海馬のＣＡ１領域に、定位固定して注射した。
【図４】Ａβ42原線維によって誘発されたＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウス中の神経原線維のもつれ（ＮＦＴ類）の存在。
【図５】Ａβ42原線維は、注射の１８日後にすぐ、Ｐ３０１Ｌトランスジェニックマウスの扁桃体において、しばしば、皮質において、多数のガリアスポジティブＮＦＴ類および神経網スレッドの形成を引き起こす。
【図６】Ａβ42原線維によって誘発されたＰ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにおける神経原線維のもつれ（ＮＦＴ類）。
【図７】Ａβ42原線維は、Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにおいて、神経原線維のもつれ(ＮＦＴ類)の形成を引き起こす。
【図８】扁桃体中のガリアスポジティブＮＦＴ類。
【図９】Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ−エピトープ。
【図１０】Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ−エピトープ。
【図１１】Ａβ42原線維によって誘発されたタウの異常なホスホ−エピトープ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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