(57)【要約】  本発明は新規抗体、医薬品、医薬用パック、医薬品の製造方法、および微生物感染の治療、とりわけブドウ球菌、例えば、ＭＲＳＡ感染などのＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の治療のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２の配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトまたは動物体の治療または診断の方法において使用するための配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体。
【請求項３】
感染の治療のための医薬品の製造の方法における配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体の使用。
【請求項４】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質およびＧｒｆＡに特異的な抗体を含んでなる医薬品。
【請求項５】
ヒトまたは動物体の治療または診断に使用するための請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
グラム陽性細菌による感染の治療のためである請求項４に記載の医薬品。
【請求項７】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質およびＧｒｆＡに特異的な抗体の使用を特徴とする感染の治療のための医薬品の製造方法。
【請求項８】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質およびＧｒｆＡに特異的な抗体を含んでなる感染の治療のための医薬用パック。
【請求項９】
同一物を必要とする患者に治療上有効量の糖ペプチド抗生物質およびＧｒｆＡに特異的な抗体を投与する工程を含んでなる感染の治療方法。
【請求項１０】
前記抗体が配列番号：２の配列を有する請求項４および７から９のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１１】
前記抗体が配列番号：３のエピトープに特異的である請求項４および７から１０のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１２】
前記糖ペプチド抗生物質がバンコマイシン、テイコプラニンおよびダプトマイシンからなる群から選択される請求項４および７から１１のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１３】
前記感染がグラム陽性細菌によるものである請求項４および７から１２のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１４】
前記細菌がブドウ球菌である請求項１３に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１５】
前記細菌がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌である請求項１４に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１６】
前記ブドウ球菌がＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される請求項１５に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１７】
前記細菌がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌である請求項１４に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１８】
前記ブドウ球菌がＳ．ａｕｒｅｕｓである請求項１７に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項１９】
前記細菌がエンテロコッカス属菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、コリネバクテリウム属菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓからなる群から選択される請求項１３に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【請求項２０】
前記細菌が前記糖ペプチド抗生物質単独による治療に耐性である請求項１３に記載の医薬品、製造方法、医薬用パックまたは治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ、とりわけ生物の抗生物質抵抗性株、例えばＭＲＳＡによるヒトまたは動物体の感染の治療に関する。微生物、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓによる感染の治療のための医薬品、感染の治療のための医薬品の製造方法、感染の治療のための医薬品を含有する医薬用パック、および前記微生物による感染のためのヒトまたは動物体の治療方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性細菌の間の多剤耐性（ＭＤＲ）はとりわけ病院において増加しつつある問題である（Ｂａｎｅｒｇｅｅ，Ｓ．Ｎ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９１：８６５−８９５（１９９１）；Ｓｈａｂｅｒｇ，Ｄ．Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．（補冊）８８：７２−７５（１９９１）；Ｇａｙｎｅｓ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．６：４５２−４５５（１９９４））。とりわけメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣＮＳ）、特にメチシリン耐性ＣＮＳは問題であることが解っており、全てのペニシリンおよびセファロスポリンに対して耐性である。その他の作用物質、例えばキノロンに対する耐性が広がっている（Ｍａｌａｂａｒｔａ，Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２：４５９−４７８（１９９７）；Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．、ＴＩＢＳ  １９：１１９−１２３（１９９４）；Ｔｒａｕｂ，Ｗ．Ｈ．ら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｐｙ  ４２：１１８−１３２（１９９６））。治療はバンコマイシンまたはテイコプラニンを用いて典型的に行われる。しかしながら、これらの作用物質に対する耐性が広がっており、そして新しい治療が必要とされている。例えば、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｓ．Ｋ．ら、（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１１）：３５９０−３５９３（１９９９年１１月）；ＰＭＩＤ：１０５２３５５８）はバンコマイシンおよびテイコプラニンに対する感受性が低下しているＳ．ａｕｒｅｕｓ分離株について論じている。ＥＭＲＳＡ−１５（ｗｗｗ．ｐｈｌｓ．ｏｒｇ．ｕｋ、公衆保健研究所、Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ、英国）などのＭＲＳＡの特定の伝染性株は、バンコマイシンに対する抵抗性が上昇したサブクローンを生じさせることができる（Ｂｕｒｎｉｅ，Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３１（３）：６８４−６８９（２０００年９月）；ＰＭＩＤ：１１０１７８１６）。リネゾリドは現行の治療に代わる多くの必要性を提供するであろうと期待されているが、Ｔｓｉｏｄｒａｓ，Ｓ．ら（Ｌａｎｃｅｔ．３５８（９２７７）：２０７−２０８（２００１年７月２１日）；ＰＭＩＤ：１１４７６８３９）は透析に随伴される腹膜炎に関してこの抗生物質で治療した患者における、リネゾリドに耐性であるＭＲＳＡの臨床分離株をについて報告している。
【０００３】
加えて、感染の治療、とりわけ（複数の）抗生物質に耐性を示す感染の治療を行うためのかかる抗生物質の患者への大量投与は細胞毒性および腎毒性となることもあり、また患者の生命を救うための助けではあるが重篤な副作用に至り得る。
【０００４】
ブドウ球菌感染の治療および診断は先行技術で広く論じられており、またとりわけ関連する文献には国際公開公報第９８／０１１５４号、国際公開公報第９９／５０４１８号および欧州特許第０７８６５１９号などがある。抗生物質耐性の原因もまた刊行物、例えばＡｌｌｉｇｎｅｔ，Ｊ．（Ｇｅｎｅ  ２０２（１−２）：１３３−１３８（１９９７年１１月２０日）；ＰＭＩＤ：９４２７５５６）にて論じられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、新たなおよび増強された、微生物、とりわけＳ．ａｕｒｅｕｓ感染のための治療が明らかに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は目下、作用物質の特定の組み合わせ、すなわち新規抗原結合部分を有する抗体（以下で詳記する）および糖ペプチド抗生物質（例えばバンコマイシンおよびテイコプラニン）は非常に驚くべき相乗治療効果を有しており、糖ペプチド抗生物質の治療効率は、単独で使用した場合のその治療効率と比較した場合、実質的に増強されることを見出した。これはとりわけ、治療される微生物が糖ペプチド抗生物質に対して耐性である場合である。重要なことに、本発明はバンコマイシンを配列番号：２の抗体と一緒に用いることにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの完全なバンコマイシン耐性株および中程度のバンコマイシン耐性株の治療を行うことができる。先行技術にはこれを達成できることを示唆するものはない。糖ペプチド抗生物質は細菌細胞壁に影響することにより作用する。その他の抗生物質、例えばペニシリンもまた細菌細胞壁に影響する。しかしながら、本発明者は配列番号：２の抗体をそれと一緒に用いることにより、その効率が改善されないことを見出した。とりわけ、フルクロキサシリンの効率は配列番号：２の抗体をそれと一緒に用いることにより改善されないことが実験で示されている。フルクロキサシリンに耐性である細菌は配列番号：２の抗体を使用することによりその耐性が低減されなかった。
【０００７】
本発明に従って、配列番号：２の配列を有する抗体、またはそのフラグメントに結合する抗原が提供される。抗体は配列番号：１のヌクレオチド配列によりコードされるが、もちろんヌクレオチド配列を容易に修飾して、例えばそれを合成するために用いられた特定の微生物に関して、または望まれるその他の理由に関してコドンを最適化することができる。
【０００８】
配列番号：２の抗体（「Ａｕｒｏｇｒａｂ」ＲＴＭとも称する）はヒト遺伝子組換え抗体である。これはブドウ球菌ＡＢＣトランスポータータンパク質（国際公開公報第９９／５０４１８号；Ｂｕｒｎｉｅ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（６）：３２００−３２０９（２０００年６月）；ＰＭＩＤ：１０８１６４６４）である免疫優性細胞表面抗原、ＧｒｆＡに結合する。これは元来Ｓ．ａｕｒｅｕｓ敗血症から回復した患者に由来し、そしてＧｒｆＡに対する抗体を産生していた。これは固有の抗ブドウ球菌活性を有し、そしてＭＲＳＡおよびバンコマイシン耐性ＭＲＳＡなどの広範な種類のＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対して、インビトロおよびインビボの双方でバンコマイシンおよびその他の糖ペプチド抗生物質と相乗効果を示す。配列番号：２の抗体の抗細菌活性は単独、および糖ペプチド抗生物質との組み合わせの双方で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染の治療に有意に利点がある。
【０００９】
ヒト血漿由来の免疫グロブリン（Ｒａｍｉｓｓｅ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８（４）：１０３０−１０３３（１９９３年１０月）；ＰＭＩＤ：８３７６８１５）およびＧｒｆＡに対して上昇させたウサギ過剰免疫抗血清の双方がブドウ球菌感染のモデルで保護性である（以下の「実験」セクション参照）。ＧｒｆＡに特異的であるヒト組換え抗体はＭＲＳＡ感染のマウスモデルにおいて保護性である。ＧｒｆＡの特定のアミノ酸配列、配列番号：３のエピトープはＳ．ａｕｒｅｕｓ敗血症から回復した患者の体液性免疫応答によりしばしば標的化されることが見出されている（Ｂｕｒｎｉｅ，Ｊ．Ｐ．ら、（２０００）前出）。
【００１０】
しかしながら、糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシン、テイコプラニンおよびダプトマイシンと、とりわけ配列番号：３のエピトープに特異的な抗体でなく、およびさらにとりわけ配列番号：２の配列を有する抗体でない、抗ＧｒｆＡ抗体との組み合わせを用いて、微生物、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の改善された治療を行うことができることを示唆した先行技術はどこにもない。
【００１１】
従って本発明によれば、治療上有効量の糖ペプチド抗生物質およびＧｒｆＡに特異的な抗体、とりわけ配列番号：３のエピトープに対して特異的な抗体を含んでなる医薬品が提供される。同一物を全て含んでなるかまたは使用する医薬品の製造方法、医薬用パックおよび治療方法もまた提供される。医薬品はＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を治療するためのものでよい。本明細書で用いる「治療」なる用語は、例えば感染の症状を治癒、緩和、除去もしくは軽減するか、または感染する可能性を防御もしくは低減するように構成されたいずれかの治療を意味し、予防を含む。
【００１２】
ＡＢＣトランスポータータンパク質であるＧｒｆＡタンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓから単離および精製されているが、別の生物で同一の機能を実施する相同体が存在し、これらを治療の標的として用いることができる。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外の微生物により産生されるＧｒｆＡの相同体に対して抗体を調製することができ、そしてこれを糖ペプチド抗生物質と一緒に用いて、患者の微生物による感染の治療を行うことができる。治療を行うことができるその他の微生物の実例は、その他のブドウ球菌、とりわけコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、例えばＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓである。エンテロコッカス、とりわけＥ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍもまた治療でき、コリネバクテリア、例えばＣ．ｊｅｉｋｅｉｕｍおよびＣ．ｘｅｒｏｓｉｓによる感染も同様に治療できる。
【００１３】
ＧｒｆＡの相同体は少なくとも６０％、例えば少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または９９．５％のＧｒｆＡとの配列相同性を有することができる。配列相同性はＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＩＮ（ヌクレオチド配列比較）またはＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド比較）プログラム、バージョン２．１．２をデフォルトパラメーターと共に用いて決定する。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＩＮプログラムはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／で見出すことができる。本明細書で用いる配列同一性なる用語は対応する相対位置で正確に対合する、最適に整列化された配列におけるアミノ酸残基を意味する。
【００１４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ以外の生物、とりわけその他のブドウ球菌で、抗体を上昇させ、そして治療の基礎として用いられるエピトープ（配列番号：３）も同一でよい。
【００１５】
従って本発明によれば、治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる、感染、とりわけＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を治療するための医薬品が提供される。
【００１６】
感染の治療のための医薬品の製造方法において使用するための、糖ペプチド抗生物質および配列番号：２の抗体またはその抗原結合フラグメントもまた提供される。
【００１７】
感染、とりわけＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する治療を行うときに、糖ペプチド抗生物質および抗体またはその抗原結合フラグメントを患者に別個にまたは連続的に投与することができる。本発明によれば、治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：２の抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬用パックもまた提供される。
【００１８】
本発明によれば、感染、とりわけＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の治療のための医薬品を製造するための糖ペプチド抗生物質および配列番号：２の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用もまた提供される。
【００１９】
本発明によれば、患者に治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：２の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含んでなる、前記患者における感染、とりわけＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を治療する方法もまた提供される。
【００２０】
本発明において特に有用な糖ペプチド抗生物質はバンコマイシン、テイコプラニンおよびダプトマイシンであるが、もちろん本発明は糖ペプチド抗生物質のファミリーの別のメンバーにも拡大適用される。
【００２１】
本明細書で用いるその種々の文法的形態の「抗体」なる用語は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含有する分子を意味する。かかる分子を免疫グロブリン分子の「抗原結合フラグメント」とも称する。
【００２２】
抗体分子の実例は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦ（ｖ）として技術分野で公知の、これらの部分を含むパラトープを含有する免疫グロブリン分子のこれらの部分である。
【００２３】
「抗体結合部位」なる用語は、抗原と特異的に結合（免疫反応）する重鎖および軽鎖可変および超可変領域を含んでなる抗体分子のその構造部分を意味する。
【００２４】
配列番号：２の抗体に関しては、そのアミノ酸配列を変化させるが、同一のパラトープを提示し、そしてその抗原結合特異性を保持しているように容易に修飾することができる。一般に、リンカーにより一緒に共有結合しており、そしてＨｉｓカルボキシ末端配列を有しているヒト免疫グロブリン可変重鎖領域（ＶＨ）および可変軽鎖（Ｖκ）としてその構造を配列（アミノからカルボキシ末端配列まで）させる。
【００２５】
各々の可変領域は相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなり、そしてこれらは抗体の抗原結合特異性、すなわちパラトープの定義における基礎である。本発明者はこれらの領域の中でＶＨ領域のＣＤＲ３部分が抗原特異性に定義において最も重要であることを見出した。抗体についてのさらなる教示は技術分野において、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）で広く利用可能である。抗体結合部位のパラトープ定義部分についての共通する一般的な知識および前記の教示を用いて、技術分野の技術者は配列番号：２の配列を容易に修飾して同一のパラトープを伴う代替の抗体を産生することができ、そしてこれは同一のまたは類似する治療効果を達成させることができる。
【００２６】
例えば１つまたはそれ以上のカルボキシ末端Ｈｉｓ残基を単純に除去することにより、配列番号：２の抗体の抗原結合フラグメントを容易に調製することができる。修飾のその他の実例には、配列番号：２の抗体の超可変領域（相補性決定領域）の、配列番号：２のものとは異なる可変フレームワーク領域への移植を含み、得られた抗体は依然同一のパラトープを有している（例えば欧州特許第２３９４００号および同様のものを参照）。
【００２７】
「改善された治療」とは、規定量の糖ペプチド抗生物質を本発明の抗体と一緒に患者に投与した場合、単独で投与した場合よりもより大きな治療効果を有することを意味する。同様に、より少ない用量の糖ペプチド抗生物質を本発明の抗体と一緒に患者に投与した場合、糖ペプチド抗生物質を単独で投与した場合よりも望ましい治療効果を達成できる。これはとりわけ微生物、例えばＳ．ａｕｒｅｕｓが糖ペプチド抗生物質に耐性である場合である。これは治療のいずれかの副作用を低減させるのに非常に有用である。
【００２８】
既存の糖ペプチド抗生物質を「一旦の回復」で提供し、そしてこれらを例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓがこれらに耐性である場合でさえ、治療上有効にすることにより、本発明はその安全性および有効性を容易に評価でき、そして新しいクラスの物質に関係しない、すなわち糖ペプチド抗生物質に関する安全性パラメーターが既に十分知られており、そして本発明に適用できる医薬品および治療を提供する。同様に、本発明のその他の活性成分としての抗生物質の使用は比較的単純で安全な課題である。とりわけ、抗体がヒト抗体配列に由来する組換え抗体フラグメントの形態である場合、その免疫原性は非常に低い。加えて、抗体を非常に短時間（例えば数日間）で投与する治療計画の使用は、患者の免疫系がそれに対して免疫応答を発達させる機会がほとんどないことを意味する。従って、本発明の抗体に対する抗体の産生により引き起こされる不都合な過敏性型反応および免疫複合体の形成／沈殿は非常に小規模である。
【００２９】
配列番号：２の抗体もまた多くの具体的な利点を有する、すなわちこれは補体沈殿およびマクロファージ結合を誘起し得るＦｃ部分を有しておらず、そして従って、炎症および組織損傷を引き起こし得る補体カスケードの不適切な活性化を引き起こす可能性が低い。
【００３０】
動物由来の産生物を用いないで本発明の抗体を産生することにより、ヒトまたは動物感染性疾患作用物質またはオンコジーンを患者に導入する可能性を回避することができる。
【００３１】
本発明の医薬品の治療計画および投与量を以下に記載し、そしてそれらの修飾は技術分野の技術者、とりわけ糖ペプチド抗生物質で用いる治療計画を認識し、そしてそれらを適当に修飾できる技術者には容易に明らかになろう。例えば簡単な投与量−応答アッセイを容易に用いて、哺乳動物モデル、例えばネズミモデルにおける治療の結果を簡単にヒトに当てはめることができる。
【００３２】
本発明はＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の治療の形態のみを実例として示す添付の図面を参照して以下の記載からさらに明らかになろう。
【００３３】
(実    験)
以下に詳記する実験は、ＧｒｆＡに特異的な本発明のヒト組換え抗体フラグメントであるＡｕｒｏｇｒａｂ（すなわち配列番号：１および２）がインビトロおよびネズミブドウ球菌感染において固有の抗ブドウ球菌活性を有し、そしてこれは糖ペプチド抗生物質、とりわけ広域スペクトル糖ペプチド抗生物質、バンコマイシンと相乗活性を示すことを示している。
【００３４】
糖ペプチド抗生物質との相乗効活性は：
（１）インビトロでＡｕｒｏｇｒａｂの存在下、バンコマイシンの最低阻止濃度の低下；
（２）Ｓ．ａｕｒｅｕｓで誘発した後の、Ａｕｒｏｇｒａｂの１回投与（２ｍｇ／ｋｇ）をバンコマイシン（６ｍｇ／ｋｇ）の１回投与と組み合わせて行う場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のネズミモデルにおける器官コロニー数の低下；
により明白である。
【００３５】
特記しない場合、本明細書に詳記する全ての手順を標準的なプロトコルおよび適用できるところでは以下の製造者の指示書を用いて実施した。ＰＣＲ、分子クローニング、操作およびシークエンシング、抗体の製造、エピトープマッピングおよびミモトープ構成、細胞培養およびファージ呈示などの種々の技術のための標準的なプロトコルは参考書、例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら（ＰＣＲ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１））、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、ＨｕｙｎｈおよびＤａｖｉｅｓ（「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＶｏｌＩ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編（１９８５））、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７４（１２）：５４６３−５４６７（１９７７））、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８））、Ｊｕｎｇ，Ｇ．およびＢｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｇ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，３１：３６７−４８６（１９９２））、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．およびＲａｅ，Ｉ．Ｆ．（「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０５２１  ５７３６４５（１９９７））、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９６）、ＩＳＢＮ  ０−１２−４０２３８０−０）に記載されている。
【００３６】
とりわけ本明細書で詳記する方法において有用な試薬および装置はＡｍｅｒｓｈａｍ（ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍ．ｃｏ．ｕｋ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ｗｗｗ．ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｉｎｇｅｌｔｈｅｉｍ．ｃｏｍ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｏｓｙｓ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（ｗｗｗ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｃｉａ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）、Ｑｉａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｓｉｇｍａ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）等から入手可能である。
【００３７】
出版物に関して「ＰＭＩＤ」参照番号が与えられている場合、これらは米国国立医学図書館（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によりそれらに割り当てられたＰｕｂＭｅｄ識別番号であり、そこからの完全な書誌情報および各出版物に関する要旨がｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で入手可能である。これはまた、とりわけ例えばＰＮＡＳ、ＪＢＣおよびＭＢＣ出版物の場合、完全な出版物の電子コピーへの直接的なアクセスをも提供することができる。
【００３８】
本明細書で論じる参照文献の各々の内容は、そこに引用される参照文献を含めて、その全てを出展明示により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
１．ヒト研究
この研究に関しては、Ａｕｒｏｇｒａｂをバンコマイシンと組み合わせて与えて、培養確認された深在性ＭＲＳＡ感染の患者の死亡率および／または罹患率を低減させる。この研究を３パートで実施する。
【００４０】
ｉ）ＭＲＳＡ感染の３人の患者の群に段階的増加用量のＡｕｒｏｇｒａｂを与え、補助治療用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で出発し、そして１ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｄ．まで上昇させ、その間、各々の患者を何らかの副作用に関して注意深くモニター観察する耐容性および用量範囲研究。
【００４１】
ｉｉ）ＭＲＳＡ感染の５人の患者にＡｕｒｏｇｒａｂの予測される治療コース、すなわち１ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｄ．を７日間与え、そして耐容性および薬物動態に関して注意深くモニター観察する暫定的なオープンラベル試験。ヒストリカルコントロールに基づいて、効果の初期評価がなされる。
【００４２】
ｉｉｉ）予期される無作為二重盲検第ＩＩ相試験。
【００４３】
２．物理的、化学的および薬学的特性
【００４４】
【表１】
2005511645.tif 000002
３．処方、組成物、取り扱いおよび保存
３．１  処方および組成物
Ａｕｒｏｇｒａｂの完全な組成を以下の表２で提示する。これはバイアルあたり１０ｍｇで提供された凍結乾燥（フリーズ・ドライ）粉末から成る。静脈内注射の直前に粉末を５ｍｌの滅菌注射用水に再懸濁することにより薬物を投与する。ＡｕｒｏｇｒａｂはｐＨの変動に鋭敏であり、そして特に水で再懸濁するように処方されているので、その他の溶媒を水に代用すべきではない。
【００４５】
【表２】
2005511645.tif 000003
Ｌ−アルギニンおよび尿素は処方のｐＨバランスを維持し、そしてＡｕｒｏｇｒａｂの溶解性を確実にするために存在する。双方共に臨床静脈内投与に関して安全であると考えられる用量で存在する。例えば、１回用量のＡｕｒｏｇｒａｂ（患者体重７５ｋｇで３７．５ｍｌ）はアルギニン  ７．５ミリモルを含有する。これは子供の成長ホルモンレベルの測定の間に投与する場合のＬ−アルギニンの最大許容１日用量（ＡＢＰＩ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（１９９８−１９９９））よりも２６倍少ない。尿素に関しては、Ａｕｒｏｇｒａｂの１回用量３５ｍｌは尿素  １．１２５ｇを含有する。これもまた、尿素の最大許容１日用量である１５０ｇ（これは静脈内分配による急性頭蓋内圧の治療用に指示された最大用量である（ＡＢＰＩ  ｃｏｍｐｅｍｄｉｕｍ（１９９８−１９９９）））よりもかなり少ない。
【００４６】
３．２  保存
凍結乾燥薬物をガラスバイアル中暗所で４℃で保存する。環境温度で一晩輸送するのは許容できる。明るい光または過湿に長時間暴露することを避ける。４℃で保存（３か月）した後、Ａｕｒｏｇｒａｂ活性に変化は観察されなかった。
【００４７】
水で再構成した後、Ａｕｒｏｇｒａｂを４℃で保存しなければならず、そして１４時間以内に使用すべきである。室温で放置すると活性はゆるやかに劣化する。
【００４８】
３．３  調製物および投与
バイアルあたり１０ｍｇで提供されたＡｕｒｏｇｒａｂを静脈内（ｉｖ）注射の直前に粉末を５ｍｌの滅菌注射用水に再懸濁することにより投与する。ヒト用量の実例は１ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｄ．である。滅菌水を注射により皮下注射器／針でラバーキャップを通して直接バイアルに導入する。
【００４９】
再構成するために：
最終用量の半量の水（バイアルあたり２．５ｍｌ）を加え、そして攪拌して溶解し、（必要な場合）濾過して何らかの不溶性材料を除去し、残りの水を加える。
【００５０】
注意：投与が遅れる場合、４℃で保存すること（１４時間まで）。
【００５１】
ＡｕｒｏｇｒａｂはｐＨの変動に鋭敏であり、そして特に水で再懸濁するように処方されているので、その他の溶媒を水に代用すべきではない。
【００５２】
Ａｕｒｏｇｒａｂを、例えばｉｖ  ｇｉｖｉｎｇセットにより、緩徐な静脈内ボーラス注射により投与すべきであり、ｉｖ  ｇｉｖｉｎｇセットを最初に生理食塩水で洗い流して、微量のその他いずれのｉｖ液をも除去し、そして次に薬物投与の後に再度洗い流すべきである。
【００５３】
漏出の清浄、または廃棄物処理に特別の予防措置は必要ではない。
【００５４】
ｉｖ使用のための生理食塩水は再構成されたＡｕｒｏｇｒａｂ（５０：５０希釈）に適合する。ＥＬＩＳＡ活性の低下により示されるように、これは２０％グルコースおよび炭酸水素ナトリウムバッファーとはあまり適合せず、そして従って、これらのまたはその他の液と同一のｉｖ  ｇｉｖｉｎｇセットにより投与する場合、Ａｕｒｏｇｒａｂの投与の前および後に生理食塩水を通して注射ポートを洗い流さなければならない。
【００５５】
４．非臨床試験
Ａｕｒｏｇｒａｂは広範なＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対してインビトロおよびインビボの双方で抗細菌活性を示す。加えて、Ａｕｒｏｇｒａｂは、バンコマイシンと組み合わせて用いる場合、相乗的な抗細菌効果を奏することが示されている。
【００５６】
４．１  非臨床効果試験：インビトロデータ
Ａｕｒｏｇｒａｂは、バンコマイシンに対して中程度の耐性を有するＥＭＲＳＡの株などの広範なＭＲＳＡ株に対して、バンコマイシンとの組み合わせで相乗活性を示す。
（「ＶＩＳＡ」−バンコマイシン非感受性ＭＲＳＡ）
通常抗生物質に適用される同一のＭＩＣ方法を用いてこれらのデータを準備した。
【００５７】
目標：広範なＭＲＳＡの伝染性株に対して、バンコマイシンとの組み合わせで用いる場合の相乗性を実証すること。
【００５８】
方針：Ａｕｒｏｇｒａｂを組み合わせで用いた場合のバンコマイシンのＭＩＣの低下により相乗性を実証する。
【００５９】
導入
漸増濃度のバンコマイシンを含む栄養ブロス中で連続継代することにより、ＭＲＳＡの伝染性株は容易に、バンコマイシンに対して中程度の耐性（すなわちＭＩＣ  ４または８μｇ／ｍｌ）のサブ集団を生じる（Ｂｕｒｎｉｅ，Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３１（３）：６８４−６８９（２０００年９月）；ＰＭＩＤ：１１０１７８１６）。これらは恐らくバンコマイシン治療に随伴される多くの治療の不成功の原因である。この研究では、これらのＶＩＳＡおよび完全なバンコマイシン感受性親ＥＭＲＳＡ−１５株の双方に対してＡｕｒｏｇｒａｂ活性を試験した。
【００６０】
方法
ＭＲＳＡの株を栄養ブロス中で一晩成長させ、そしてｍｌあたり１×１０３セルの接種材料が得られるまで希釈した。培養物の１００μｌアリコートを平底マイクロタイタープレートに載せ、そしてバンコマイシンを０．１２５から２５０μｇ／ｍｌの範囲で添加した。培養物をさらに２日間インキュベートした。最低成長阻止濃度（ＭＩＣ）を、細菌成長を生じない抗生物質の最高濃度として定義し、そして培養物中の濁度（成長）の欠如の分光学的評価により決定する。外来性Ａｕｒｏｇｒａｂの存在下、またはＡｕｒｏｇｒａｂ処方バッファーの存在下（陰性対照）でＭＩＣを決定した。
【００６１】
結果：（表３）
【００６２】
【表３】
2005511645.tif 000004
活性スペクトル：試験した全株で抗生物質活性が増強されるのは明らかであり、これはＭＲＳＡの株に対する活性の広域スペクトルを実証している。
【００６３】
相乗性：Ａｕｒｏｇｒａｂは、バンコマイシンに対する感受性が低下しているＭＲＳＡを含めて、ＭＲＳＡのバンコマイシンに対する感受性を増加させる能力を有している。
【００６４】
別の実験を、多くのＭＲＳＡ株に関するバンコマイシンのＭＩＣおよびＭＩＣに及ぼすＡｕｒｏｇｒａｂ抗体の効果を決定するために行った。また、ペニシリン型抗生物質の効率がＡｕｒｏｇｒａｂによりどのように影響されるかを調査するために、バンコマイシンの代わりにフルクロキサシリンを用いて実験を行った。結果を表３ａに提示する。
【００６５】
【表３ａ】
2005511645.tif 000005
フルクロキサシリンで得られた結果は、全てのＥＭＲＳＡ株に関して得られたＭＩＣは＞２５６μｇ／ｍｌであったことを示した。フルクロキサシリン＋Ａｕｒｏｇｒａｂにより同一の結果が得られ、そしてフルクロキサシリンのＭＩＣの低下は示されなかった。
【００６６】
結論：バンコマイシンと組み合わせたＡｕｒｏｇｒａｂの使用により、治療効果が上昇し、そしてその上バンコマイシン耐性株の発生を妨げるはずである。標的分子に関する抗体の構造および機能により、その他の糖ペプチド抗生物質、例えばテイコプラニンを用いた類似の結果を予期することができ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにより用いられるそれに対する耐性メカニズムはバンコマイシンに関するものと同一であり、また、従って、抗体に関する標的でもあり、そしてそれを用いる治療に対して感受性がある。
【００６７】
４．２  非臨床効果研究：インビボデータ
ブドウ球菌感染のネズミモデルは広く用いられており、また抗微生物薬の評価に日常的に用いられる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓを静脈内に導入して菌血症を生み出し、そこから病原体が、腎臓、肝臓および脾臓などのその他の器官に広がるので、これは感染したヒトにおける効果の良好な予測判断材料である。従って、感染の特性（敗血症）は感染した患者における状況と類似している。また、動物モデルに用いられた（データを以下に提示する）、Ａｕｒｏｇｒａｂの投与の静脈内経路は患者において典型的に用いられるのと同一の経路であり、薬物動態、薬物生体利用性および効果を比較できる可能性が改善される。
【００６８】
データセット１：Ａｕｒｏｇｒａｂ：ＥＭＲＳＡ−１５に対する固有の抗細菌活性。
【００６９】
目標：ＭＲＳＡ、ＥＭＲＳＡ−１５のバンコマイシン感受性株に感染したマウスに単独で与えた場合、Ａｕｒｏｇｒａｂが治療用であることを実証する。
【００７０】
方針：Ａｕｒｏｇｒａｂの存在下、死亡率の低下または腎臓、肝臓または脾臓における細菌負荷（コロニー形成単位）の低下により、抗ブドウ球菌活性を実証する。
【００７１】
方法：ｉｖボーラス（全てのｉｖ注射は側方尾静脈を介して与えた）１００μｌ中、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性、バンコマイシン感受性株（ＥＭＲＳＡ−１５、Ｔｙｐｅｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｓｏｌａｔｅ、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｔｒｕｓｔ）の亜致死性誘発量（１．３×１０７ｃｆｕ）を２０匹の雌ＣＤ−１マウスに与えた。１時間後、２群の１０匹はｉｖボーラス  １００μｌを投与された：
１．陰性対照として処方バッファー（アルギニン−尿素）または
２．処方バッファー中Ａｕｒｏｇｒａｂ（２．０ｍｇ／ｋｇ）。
【００７２】
さらに４８時間後に全ての動物を剖検し、そして器官のグラムあたりの生存ｃｆｕを決定した。
【００７３】
結果：（表４）
【００７４】
【表４】
2005511645.tif 000006
結論：
抗細菌活性：生存ブドウ球菌を腎臓、肝臓および脾臓に見出し、腎臓に優先的に局在した。Ａｕｒｏｇｒａｂの投与の結果、３つ全ての器官に見出された生存生物の対数関数的（１０倍）減少に至った。これはＡｕｒｏｇｒａｂがマウスの実験的感染において、その他のいかなる外来性抗菌薬もの不在下で、深在性感染のネズミモデルを用いてＳ．ａｕｒｅｕｓの生存性を低減させることを示唆している。
【００７５】
データセット２：Ａｕｒｏｇｒａｂ用量範囲研究
目標：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＥＭＲＳＡ−１５株に対するＡｕｒｏｇｒａｂの使用に関する用量範囲研究。
【００７６】
方針：単一の作用物質としてＡｕｒｏｇｒａｂを与えた場合、プラセボ対照と比較して、腎臓、肝臓または脾臓における細菌負荷（器官ｃｆｕ）の大きな低下により抗細菌活性を実証する。異なる用量で異なる器官に関するｃｆｕ（組織のグラムあたりのｃｆｕの対数として表す）と比較して用量範囲を決定する。
【００７７】
方法：４０匹の雌ＣＤ−１マウス（２４−２６ｇ）をＳ．ａｕｒｅｕｓのｉｖボーラスで誘発し、続いて２時間後にプラセボまたはＡｕｒｏｇｒａｂ（２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）を１回ｉｖ投与した。全てのマウスを４８時間の屠殺し、腎臓、肝臓および脾臓を培養して器官生存数を決定した。
【００７８】
結果：組織のグラムあたりの対数として表す。
【００７９】
実験１：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（１．５×１０７ｃｆｕ）：ＥＭＲＳＡ−１５（表５）
【００８０】
【表５】
2005511645.tif 000007
実験２：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（９×１０６ｃｆｕ）：臨床分離株  ＥＭＲＳＡ−１５（低用量Ａｕｒｏｇｒａｂ）（表６）
【００８１】
【表６】
2005511645.tif 000008
１ＧｒｆＡの非保護性エピトープに特異的な陰性対照抗体（ＷＣ７）
実験１：肝臓および脾臓に関する生存細菌の１０から１００倍低下が１．０から２．０ｍｇ／ｋｇの範囲のＡｕｒｏｇｒａｂで達成された。０．２ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂで、脾臓からの清掃率は依然良好であるが、肝臓では低下している。高用量の結果、腎臓細菌数は０．８対数の低下に至ったが、低用量では低下しなかった。
【００８２】
実験２：０．２ｍｇほどの低用量では、生存ブドウ球菌の低下は腎臓では明らかではないが、肝臓および脾臓では細菌死滅の証拠がある。
【００８３】
結論：２ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂの投与の結果、３つ全ての器官、とりわけ脾臓および肝臓で見出される生存生物の低下に至る。１ｍｇ／ｋｇの用量のＡｕｒｏｇｒａｂによっても、脾臓および肝臓で有意な抗細菌活性が示されたが、腎臓では活性が喪失した。０．２ｍｇ／ｋｇほどの低用量によって、脾臓、およびより低い程度であるが肝臓で依然抗細菌活性が示された。
【００８４】
ヒトでの推定：マウスにおける２．０ｍｇ／ｋｇの１回投与により、肝臓および脾臓の計数でおよそ２．０対数低下し、そして腎臓の計数で０．８対数低下した。これは、体重を基盤にすると、ヒトに１ｍｇ／ｋｇを１日２回投与するのと等しい。
【００８５】
データセット３：Ａｕｒｏｇｒａｂ抗細菌活性およびバンコマイシンとの相乗性：亜致死性モデル
目標：亜致死用量のＳ．ａｕｒｅｕｓで感染したマウスにＡｕｒｏｇｒａｂを単独で投与した場合、抗細菌性であり、そしてバンコマイシンと組み合わせて投与した場合、相乗性であることを実証すること。
【００８６】
方針：Ａｕｒｏｇｒａｂ単独の存在下での腎臓、肝臓または脾臓における細菌負荷（コロニー形成単位）の低下により抗細菌活性を実証する。Ａｕｒｏｇｒａｂおよびバンコマイシンを一緒に与えた場合、いずれかの抗細菌性が単独で得られた場合よりも、器官コロニー数における大きな低下により相乗性を実証する。
【００８７】
方法：６０匹の雌ＣＤ−１マウス（２２−２４ｇ）にｉｖボーラス  １００μｌとしてＥＭＳＲＡ−１５  １×１０７ｃｆｕを与えた。２時間後に１０匹の群で、１回ｉｖボーラス  １００μｌとして受けた：
グループ１−６．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン＋２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ２−６．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン＋０．２ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ３−６．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン＋プラセボ（処方バッファー）
グループ４−プラセボ＋２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ５−プラセボ＋０．２ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ６−プラセボ＋２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
全てのマウスを４８時間に屠殺し、腎臓、肝臓および脾臓を培養した。
【００８８】
結果：大部分のマウス（＞５）が清掃された（すなわち器官が培養−陰性であった）場合を除いて、組織のグラムあたり対数ｃｆｕとして表す。Ｎ／Ａ＝不適用（表７）
【００８９】
【表７】
2005511645.tif 000009
単独：２．０ｍｇ／ｋｇを単独投与されたＡｕｒｏｇｒａｂ（グループ４）により、バンコマイシン単独（グループ３）に匹敵する結果が得られ、陰性対照群（グループ６）の肝臓および脾臓が清掃される１匹のマウスに比較して、各々８匹のマウスの肝臓および４および５匹のマウスの脾臓が清掃された。腎臓の清掃率はＡｕｒｏｇｒａｂよりもバンコマイシンでより良好であったが、腎臓感染が清掃されたマウスはなかった。
【００９０】
Ａｕｒｏｇｒａｂまたはバンコマイシン単独により清掃された４から５匹、および未治療群で清掃された１匹に比較して、２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ＋バンコマイシン（６．０ｍｇ／ｋｇ）を受けた相乗性マウス（グループ１）は１０匹全てのマウスの肝臓からのブドウ球菌の完全な清掃率を示し、そして脾臓からの清掃率を上昇させ、９匹のマウスでは培養陰性であった。これらの組み合わせ治療（グループ１）を受けたマウスの腎臓コロニー数は、バンコマイシン単独（グループ３）を受けたマウスに比較してさらに０．５対数まで低下し、そして陰性対照マウス（グループ６）に比較して１．６対数まで低下した。これはＡｕｒｏｇｒａｂとバンコマイシンの間の相乗性を実証している。
【００９１】
データセット４：Ａｕｒｏｇｒａｂのバンコマイシンとの相乗性：致死モデル。
【００９２】
目標：致死用量のＳ．ａｕｒｅｕｓで感染したマウスにＡｕｒｏｇｒａｂを単独で投与した場合、抗細菌性であり、そしてバンコマイシンとの組み合わせで投与した場合、相乗性であることを実証すること。
【００９３】
方針：Ａｕｒｏｇｒａｂ単独での致死率の低下により抗細菌活性を実証する。Ａｕｒｏｇｒａｂをバンコマイシンと組み合わせて与えた場合、バンコマイシン単独よりもむしろ、致死率が大きく低下することにより相乗性を実証する。
【００９４】
方法：６０匹の雌ＣＤ−１マウス（２２−２４ｇ）にｉｖボーラス  １００μｌ中Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＥＭＳＲＡ−１５の新たな臨床分離株）を８×１０７ｃｆｕで与えた。２時間後に１０匹の群で、１回ｉｖボーラス  １００μｌとして受けた：
グループ１−４．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン＋２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ２−４．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン
グループ３−２．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン＋２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ４−２．０ｍｇ／ｋｇ  バンコマイシン
グループ５−２．０ｍｇ／ｋｇ  Ａｕｒｏｇｒａｂ
グループ６−プラセボ
全てのマウスを４８時間で屠殺し、腎臓、肝臓および脾臓を培養した。４８時間の間引きの前のマウス死亡数は器官コロニー数に供しなかった。
【００９５】
結果：大部分のマウス（＞５）が死亡した場合を除いて、組織のグラムあたり対数ｃｆｕとして表す（表８）。
【００９６】
【表８】
2005511645.tif 000010
死亡率：Ｓ．ａｕｒｅｕｓのこの株は、恐らくこれが新たな臨床分離株であったために、以前に用いたＥＭＳＲＡ−１５の研究室株よりもマウスモデルにおいてより毒性が強く、また高率の死亡率が観察された。Ａｕｒｏｇｒａｂ単独の投与（２．０ｍｇ／ｋｇ）は、未治療群（死亡数７）に比較して、死亡率の低下に随伴され（死亡数４）、バンコマイシン単独の死亡率（死亡数６および５）に匹敵した。これは、Ａｕｒｏｇｒａｂが４．０ｍｇ／ｋｇのバンコマイシンに匹敵する固有の抗ブドウ球菌活性を有していることを示唆している。
【００９７】
相乗性：組み合わせ治療を受けているマウス（Ａｕｒｏｇｒａｂ  ２．０ｍｇ／ｋｇおよびバンコマイシン  ４．０ｍｇ／ｋｇ）はバンコマイシンまたはＡｕｒｏｇｒａｂ単独よりも高い生存率を有し、これは２つの薬物の相乗効果を示唆している。
【００９８】
５．動物における薬物動態および代謝産物
５．１  薬物動態
Ａｕｒｏｇｒａｂの薬物動態（ＰＫ）特性がマウスにおいて研究されている。効果および用量範囲研究をネズミにおいて実施したので、ネズミモデルを用いて反復投与毒性試験を行った。マウスにｉｖボーラスとして１回高用量を与え、そして次に血中レベルおよび器官分布に関して２検体ずつで試験した。ネズミサンプルもまた分析した。ＥＬＩＳＡ（血液サンプルのみ）により測定される機能的活性および薬物濃度（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ／イムノブロット）に関してサンプルを分析した。
【００９９】
結果：結果を図１に示す。Ａｕｒｏｇｒａｂの１回静脈内ボーラス注射（１０ｍｇ／ｋｇ）を与えたマウスにより満足できる血中レベルが示された。
【０１００】
全ての器官（肺、脳、肝臓、脾臓、心臓、腎臓および血液）は２４時間以内に清掃された。
【０１０１】
６．２  血液適合性研究
静脈内投与のためのＡｕｒｏｇｒａｂの適合性を評価するために、Ｉｎｖｅｒｅｓｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｃｏｔｌａｎｄの生化学薬理学部門によりこの研究が実施された。
【０１０２】
健常なヒトのボランティアから血液サンプルを採取し、Ａｕｒｏｇｒａｂ、Ａｕｒｏｇｒａｂベヒクル、サポニンまたは生理食塩水が入ったチューブに移し、そして３７℃で１時間インキュベートした。遠心後、次いで上澄のヘモグロビン量を検定して溶血を決定した。米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）の分類システム（ＡＳＴＭ  Ｆ７５６−９３（１９９３））に従って、データにより０．１ｍｇ／ｋｇ  ＡｕｒｏｇｒａｂおよびＡｕｒｏｇｒａｂベヒクルは非溶血性であることが示された。これを、非溶血性である生理学的食塩水と比較し、そして重篤な溶血性であることが見出された陽性参照化合物（サポニン）と全体で対比した。
【０１０３】
７．Ａｕｒｏｇｒａｂ抗体の製造
７．１  導入
Ａｕｒｏｇｒａｂを封入体の形態で大腸菌で生成する。封入体の単離、可溶化、変性およびリフォールディングは以前に十分に文献化されている（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；「封入体および生物学的活性形態のタンパク質の精製（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｏｒｍｓ）」、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：６１−１０９（１９９７）参照）。本出願でかかる手順の実例の概要を示す。簡単には、封入体を細胞集団から抽出し、可溶化／変性、リフォールディングし、そしてクロマトグラフィーを用いて精製した。Ａｕｒｏｇｒａｂの過剰発現はベクターｐＥＴ２９ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の強力なＴ７プロモーターに由来する。動物生成物不含の培地を用いて、滅菌発酵槽（１０００ｌ）で調製された、品質管理され、純粋培養された細胞集団を生成する。使用した大腸菌株は遺伝的に無能性（コロニー形成／環境での生存ができない）であり、そして無毒性である。従って後処理プロセスの間に除去された不純物は、（１）大腸菌宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）；（２）大腸菌パイロジェン（主に内毒素）；（３）発酵添加物（抗生物質）；（４）後処理プロセス添加物（バッファーおよびＮｉＳＯ４）である。
【０１０４】
大腸菌由来の大量の夾雑物および実質的に全ての発酵培地由来の夾雑物を封入体からのタンパク質抽出過程の間に除去する。このために、細胞集団を遠心により単離し、そしてマイクロフルイダイザーを用いて破壊した。それにより封入体を十分に洗浄する遠心・再懸濁・マイクロフルイダイゼーションの３工程により細胞集団からＡｕｒｏｇｒａｂ封入体を分離する。封入体を可溶化し、そして酸化触媒として提供された塩化銅の存在下、２日間かけてリフォールディングし、従ってＡｕｒｏｇｒａｂ分子の正確で、そして生物学的に活性な構造を確立する。十分なダイアフィルトレーションを実施してリフォールディング反応物から小型分子および微量の残留カナマイシンを（発酵反応から）除去する。残留宿主タンパク質を固定化ニッケル金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびアニオン交換により除去する。とりわけ大腸菌から製造された薬物に関する重要な安全性項目である内毒素は、デオキシコール酸を添加することによりＩＭＡＣの間に効率的に除去される。最後の微量の大腸菌ＨＣＰをアニオン交換工程の間に除去する。ＩＭＡＣ工程からの微量のニッケルを、ニッケルアフィニティカラムを用いて除去する。最後に、クロマトグラフィーバッファー系に由来する小型分子を処方バッファーに対するダイアフィルトレーションを用いて除去する。患者使用のためにバルク生成物をバイアル中で凍結乾燥する。以下の番号を付したパラグラフはＡｕｒｏｇｒａｂ抗体の製造について具体的に詳記する。
【０１０５】
７．２  Ａｕｒｏｇｒａｂ製造プロトコル
発酵および後処理プロセスを以下のとおりの全部で９つの工程を用いて実施した：
１．発酵
２．封入体の収集および単離
３．リフォールディング
４．濃縮およびダイアフィルトレーション
５．濾過および滅菌濾過
６．精製−固定化ニッケル（Ｎｉ２＋）金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
７．精製−キレーティング・セファロース・クロマトグラフィーによるニッケル除去
８．精製−アニオン交換クロマトグラフィー
９．ダイアフィルトレーションおよびバルク充填
７．３  発酵
Ａｕｒｏｇｒａｂ発現大腸菌（Ｃｌｏｎｅ  ＪＭ１０９（ＤＥ３）（ｐＳａＡＢＣ４））の凍結貯蔵物を４×５００ｍｌ  ガラスコニカルフラスコに接種し、接種材料を調製した後、１０００ｌの攪拌発酵器（ＭＢＲ）に移した。予備培養（カナマイシン補充）を振盪しながら３７℃で１５から２０時間、予備培養物のＯＤ５７８＝４．０−８．０になり、７−８細胞分割を示すまでインキュベートした。生成スケールでは、予備培養物を栄養ブロス１０００ｌの入った１０００ｌ  発酵器（ＭＢＨ）に移した。生成培養物を３７℃で、全部で１４から１８時間インキュベーションし、７細胞分割を示した。接種後およそ１０から１３時間、ＯＤ５７８＝５−８のときに、ＩＰＴＧ（１００μＭ）２３．８ｇの添加により生成培養を誘導した。
【０１０６】
７．４  封入体の収集および単離
Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  ＢＴＰＸ  ２０５遠心分離機中流速４００ｌ／時で１２，８００ｇで遠心することにより（誘導後４時間）細胞を収集した。収集した大腸菌細胞ペーストをＰＥバッグ（Ｋｅｎｄｒｏ）中−５０℃で保存した。−５０℃で保存した単一の発酵バッチに由来する１００％細胞ペーストの後処理プロセスは単一の精製バッチから構成された。細胞ペーストを解凍し、そして溶解バッファー  １０００ｌに再懸濁した。再懸濁された細菌細胞を流速約５００ｌ／時、約１０００バール（１５，０００ｐｓｉ）で高圧均質化（ＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ  ＭＣ１５）に供した。流速約４００ｌ／時、約１２．８００ｇの遠心により封入体を沈殿させた。次いで封入体を溶解バッファー  ４００ｌで洗浄し、そして流速約４００ｌ／時、約１２．８００ｇの遠心により、全部で３回封入体を沈殿させた。リフォールディング工程の前に洗浄された封入体をスラリーとして−７０℃で保存した。６Ｍ  尿素／１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  １２．５）４０ｌ中室温で５から１０分間、強く攪拌して封入体を可溶化した。
【０１０７】
７．５  リフォールディング
リフォールディングのために、封入体溶液をリフォールディング・バッファーで５６０ｌにし、そしてＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを最終濃度１００μＭまで加えた。調製物を２から８℃で４８時間、強く攪拌しながらインキュベートした。封入体を濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＧＦ  ３０”、３．０／０．８μｍ）し、そして次に滅菌濾過（Ｓｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａｄｉｓｃ  ＳＤＰＥＫ  １、デプス・フィルター）した。
【０１０８】
７．６  濃縮およびダイアフィルトレーション
「Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ」ステンレススチール・ホルダー（Ｐａｌｌ）に内蔵された１０ｋＤａカットオフのオメガ・スクリーン・チャネルのカセット（１５ｍ２）（Ｐａｌｌ）を用いて、１０００メンブラン・ピストン・ポンプ（ポンプ・クアトロ（ｑｕａｔｔｒｏ））の調節下で濃縮およびダイアフィルトレーション工程を実施した。リフォールディングしたタンパク質調製物を１５０ｌまで濃縮し、続いて１０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ９．５）３０００ｌでダイアフィルトレーションを行った。調製物を６Ｍ  尿素、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＤＣＡ、１Ｍ  ＮａＣｌに調整し、そしてＲＯ水で最終容量３００ｌにした。ダイアフィルトレートし、リフォールディングしたものを２から８℃で一晩保存した。次いでＨＣｌの添加によりｐＨを８．０に調整した。
【０１０９】
７．７  濾過工程および滅菌濾過
ダイアフィルトレートし、リフォールディングしたものを濾過（Ｓｅｉｔｚ  Ｓｕｐｒａｄｉｓｃ  ＳＤＰＥＫ  １、デプス・フィルター）し、そして次に滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  １０”、０．２μｍ）した。滅菌生成物を２から８℃で保存した。
【０１１０】
７．８  固定化ニッケル（Ｎｉ２＋）金属アフィニティー・クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
ＩＭＡＣ工程をＢＰＧ３００／５００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で実施した。クロマトグラフィーカラムの滅菌は樹脂の定置洗浄（ＣＩＰ）の間に行われた。ＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂（１８ｌ）を最初に２カラム容量（ＣＶ）の１００ｍＭ  ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏで装填した。クロマトグラフィーは５．５（ＣＶ）平衡バッファー（ＩＭＡＣ  Ａ）；５．５ＣＶ  洗浄バッファーＩ（ＩＭＡＣ  Ｂ）；３．３ＣＶ  洗浄バッファーＩＩ（ＩＭＡＣ  Ｃ）；５．５ＣＶ  溶出バッファー（ＩＭＡＣ  Ｄ）を利用した。溶出液から収集された分画を滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  １０”、０．２μｍ）し、そして２から８℃で一晩保存した。
【０１１１】
７．９  ニッケル除去クロマトグラフィー
ＢＰＧ１４０／５００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、キレーティング・セファロース樹脂  ２ｌを用いてニッケル除去クロマトグラフィーを実施した。カラムを平衡にし、そして５ＣＶ  バッファー（ＩＭＡＣ  Ｄ）で洗浄し、そしてＡｕｒｏｇｒａｂ抗体含有溶液を適用し、カラムを２ＣＶ  アニオン／コンディショニング・バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６Ｍ  尿素、ｐＨ８．７）で洗浄し、そしてアニオン交換クロマトグラフィーの前に溶出液を保持した。
【０１１２】
７．１０  アニオン交換クロマトグラフィー
ＢＰＧ３００／５００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で、樹脂（Ｑ−セファロースＦＦ）１８ｌを用いてアニオン交換クロマトグラフィー工程を実施した。平衡バッファー、そして次にアニオン／コンディショニング・バッファーを用いてカラムを平衡にした。Ａｕｒｏｇｒａｂ抗体含有溶液を適用し、２ＣＶ  アニオン／コンディショニング・バッファーで洗浄し、そして流れを滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  １０”、０．２μｍ）し、そして２から８℃で一晩保存した。
【０１１３】
７．１１  ダイアフィルトレーションおよびバルク充填
滅菌した流動物（Ａｕｒｏｇｒａｂ抗体を含有する）のｐＨを９．５に調整し、そして次に１０ｍＭ  酢酸アンモニウム；０．５Ｍ  尿素（ｐＨ９．５）  １０交換容量（ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｖｏｌｕｍｅｓ（ＴＯＶ））に対してダイアフィルトレーションを行った。０．５Ｍ  尿素、０．２Ｍ  アルギニン（ｐＨ９．５）  ５ＴＯＶに対して別のダイアフィルトレーション工程を続けた。タンパク質を２ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、Ｓｔｅｄｉｍバッグに滅菌濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  １０”、０．２μｍ）し、そして２から８℃で保存した。
【０１１４】
７．１２  バッファー、培地および溶液の組成
成長培地：
接種の前に微生物夾雑物に関して培地をモニター観察した。
【０１１５】
予備培養物  ２．５ｌに関して：
大豆由来のペプトンＡ３（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）            ６７．５ｇ
酵母自己分解物質（ＫＡＶ；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｈｅｆｅｗｅｒｋｅ）３５．０ｇ
塩化ナトリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                  １２．５ｇ
グリセロール（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                    ７５．０ｇ
リン酸水素二カリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）            １１．５ｇ
リン酸二水素カリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）              ７．５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）          １．２５ｇ
硫酸カナマイシン（Ｓｉｇｍａ）                                  ６２．５ｍｇ
ＲＯ  Ｉ水                                                        ２．５ｌ
ｐＨ                                                          ７．１±０．１
前記の表の予め重量測定した物質をＲＯ  Ｉ水  ２．５ｌに溶解する。ブロス  １０ｍｌを滅菌した後、硫酸カナマイシン（ＷＦＩ  ５０ｍｌ中６２．５ｍｇ）を添加した。
【０１１６】
培養物１０００ｌのための組成：
大豆由来のペプトンＡ３（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）            ２７．０ｋｇ
酵母自己分解物質（ＫＡＶ；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｈｅｆｅｗｅｒｋｅ）１４．０ｋｇ
塩化ナトリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                    ５．０ｋｇ
グリセロール（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                    ３０．０ｋｇ
リン酸水素二ナトリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）            ４．６ｋｇ
リン酸二水素ナトリウム（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）            ３．０ｋｇ
硫酸マグネシウム七水和物（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）          ０．５ｋｇ
Ｓｔｒｕｋｔｏｌ（消泡剤、Ｓｉｃｈｌｅｒ）                        ６００ｍｌ
硫酸カナマイシン（ＵＳＰ、Ｓｉｇｍａ）                          ２５．０ｇ
ＲＯ  Ｉ水                                                        １０００ｌ
ｐＨ                                                          ７．０±０．２
１０００ｌ発酵器を１２１℃で３０分間滅菌した。
【０１１７】
ＩＰＴＧ：
ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）２３．８ｇをＷＦＩ  ２００ｍｌに溶解し、そして滅菌濾過（０．２μｍ）した。
【０１１８】
細胞溶解バッファー：
Ｔｒｉｓ（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                        ６．０６ｇｌ-1
ＥＤＴＡ（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                        ０．３７ｇｌ-1
塩化カリウム（ＤＡＢ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                          ７．４６ｇｌ-1
ＲＯ  Ｉ水                                                      １０００ｌ
ｐＨ                                                          ８．０±０．１
リフォールディング・バッファー：
Ｔｒｉｓ（ＤＡＢ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                              ５．９６ｇｌ-1
塩化第２銅（ｐ．ａ．、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                        ０．０１８ｇｌ-1
ＲＯ  Ｉ水                                                        ６００ｌ
ｐＨ                                                          ９．０±０．１
ダイアフィルトレーション・バッファー：
酢酸アンモニウム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）                            ０．７７ｇｌ-1
ＲＯ  Ｉ水                                                      １０００ｌ
ｐＨ                                                          ９．０±０．１
ＩＭＡＣバッファー：
サンプル調製物
Ｔｒｉｓ                                                      １．８２ｋｇ
尿素                                                            １０８ｋｇ
塩化ナトリウム                                                １７．５ｋｇ
デオキシコール酸、ナトリウム塩                                １．３０ｋｇ
ダイアフィルトレートしたリフォールディング反応物  １５０ｌの組成物を前記試薬で調整した。
【０１１９】
ＩＭＡＣクロマトグラフィーバッファー：
ニッケル溶液：１００ｍＭ  ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（２ＣＶ）
ＩＭＡＣ  Ａ／平衡バッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；１Ｍ  ＮａＣｌ；
１０ｍＭ  ＤＣＡ、ｐＨ８．０
ＩＭＡＣ  Ｂ／洗浄バッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；１Ｍ  ＮａＣｌ；
５０ｍＭ  イミダゾール；１０ｍＭ  ＤＣＡ、
ｐＨ８．０
ＩＭＡＣ  Ｃ／溶出バッファーＩ：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；１Ｍ  
ＮａＣｌ；１５０ｍＭ  イミダゾール；
ｐＨ８．０（１０−１５ＣＶ）
ＩＭＡＣ  Ｄ／溶出ＩＩ：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；１Ｍ  ＮａＣｌ；
３００ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ８．０（７ＣＶ）
ＣＩＰ：１Ｍ  ＮａＯＨ（３カラム容量、インキュベーション時間：１時間）
Ｔｒｉｓ（ＵＳＰ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）、尿素（ＵＳＰ、Ｅ．ＭｅｒｃｋまたはＲｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ）ＮａＣｌ（Ｐｈ．Ｅｕｒ、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）、イミダゾール（ｐ．ａ．、Ｅ．Ｆｌｕｋａ）、ＤＣＡ（デオキシコール酸、ナトリウム塩一水和物、Ｍｉｃｒｏｓｅｌｅｃｔ、Ｆｌｕｋａ）、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（ｐ．ａ．、Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）を用いてバッファーを調製した
Ｎｉ２＋除去クロマトグラフィーバッファー：
平衡バッファー：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；
３００ｍＭ  イミダゾール；ｐＨ８．０（５ＣＶ）
アニオン交換クロマトグラフィーバッファー：
平衡：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ；６Ｍ  尿素；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；３００ｍＭ  
イミダゾール；ｐＨ８．７
ＣＩＰ：１Ｍ  ＮａＯＨ（３ＣＶ、インキュベーション時間：１時間）
ダイアフィルトレーションおよび処方バッファー
滅菌および保存のために、ダイアフィルトレーション・カセットをＲＯ水で洗い流し、０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いて少なくとも４５分間再循環し、そして０．１Ｍ  ＮａＯＨと共に保存した。
【０１２０】
ダイアフィルトレーション・バッファー：０．５Ｍ  尿素；１０ｍＭ  
酢酸アンモニウム、ｐＨ９．５
ダイアフィルトレーション（処方）バッファー：０．５Ｍ  尿素；０．２Ｍ  
アルギニン、ｐＨ９．５
ダイアフィルトレーションおよび濃度（２カセット、Ｏｍｅｇａスクリーン・チャネル、１０ＫＤ、Ｐａｌｌ）
８．Ａｕｒｏｇｒａｂのバンコマイシンとの相乗効果の決定
８．１  方法
最低阻止濃度（ＭＩＣ）、相乗効果測定（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＦＩＣ）およびＦＩＸ（ＦＩＣインデックス）を決定するために以下の方法を用いた。
【０１２１】
最も一般的なＥＭＲＳＡ株の各々の代表例、多くのバンコマイシン耐性サブ集団、および３つのＬｉｎｚｏｌｉｄ耐性株を栄養ブロス中で成長させた。細胞をＩｓｏｓｅｎｓｉｔｅｓｔ  Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ、英国）中に希釈し、１×１０３セル／ｍｌの最終接種材料が得られた。培養物の１００μｌアリコートを平底マイクロタイタープレートに載せ、そしてバンコマイシンを０．１２５から２５０μｇ／ｍｌの範囲で添加した。これに外因性Ａｕｒｏｇｒａｂを０．３から２５μｇ／ｍｌの範囲で交差力価測定の構成で添加した。Ａｕｒｏｇｒａｂ処方バッファーのみを含有する一連の陰性対照をも調製した。培養物を３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１２２】
最低阻止濃度（ＭＩＣ）を、細菌成長を生じない最低の作用物質濃度として定義し、そして培養物中の濁度（成長）の欠如の分光学的評価により決定した。この光学的な清掃は＞９９％  ブドウ球菌死滅と等価であった。
【０１２３】
８．２  結果
バンコマイシンおよびＡｕｒｏｇｒａｂ（ＲＴＭ）単独および組み合わせに関するＭＩＣ値が得られた。相乗効果測定（ＦＩＣ）およびＦＩＸ値を算出した。２つの作用物質間の相乗活性をＦＩＸ値≦０．５として定義した。０．５から４の値を無関係な活性として定義し、≧４の値を拮抗作用として定義した。
【０１２４】
実験の結果を以下の表９および１０に提示する。ＶＡＮはバンコマイシンを示す。ＭＩＣ（単独）の縦列は単独で投与した場合の作用物質の最低阻止濃度を示す。ＭＩＣ（組み合わせ）の縦列は組み合わせで用いた場合の各薬物の最低阻止濃度を示す。
【０１２５】
８．３  結論
表９および１０で認められるように、Ａｕｒｏｇｒａｂをバンコマイシンと共に投与すると結果的に、ＭＩＣレベルの実質的な低下を伴う相乗的な治療効果が達成され、今度は、低用量の抗生物質でそしてより大きな治療効果を伴う患者の治療を行うことができ、抗生物質の結果である起こり得る副作用の予想通りの低下を伴うことが示される。結果は、患者がバンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓに感染している場合でさえ、患者を本発明の抗体で治療して成功することができ、それを抗生物質、例えばバンコマイシンと組み合わせて使用することにより、以前は効果のない無毒性の抗体用量レベルでの有効な治療が可能になり得る。
【０１２６】
【表９】
2005511645.tif 000011
【０１２７】
【表１０】
2005511645.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】高用量のＡｕｒｏｇｒａｂの薬物動態を示す。Ｘ軸は分で表す時間である。Ｙ軸は血液サンプル中のＡｕｒｏｇｒａｂのμｇ／ｍｌである。
【配列表】
2005511645.tif 000013
2005511645.tif 000014
2005511645.tif 000015
2005511645.tif 000016
【図１】
2005511645.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月12日(2004.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２の配列を有する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ブドウ球菌による感染を除く感染の治療のための医薬品の製造の方法における配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体の使用。
【請求項３】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体を含んでなる医薬品。
【請求項４】
ヒトまたは動物体の治療または診断に使用するための請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
グラム陽性細菌による感染の治療のための請求項３に記載の医薬品。
【請求項６】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体の使用を特徴とする感染の治療のための医薬品の製造方法。
【請求項７】
治療上有効量の糖ペプチド抗生物質および配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドにより呈示されるエピトープに特異的な抗体を含んでなる感染の治療のための医薬用パック。
【請求項８】
前記抗体が配列番号：２の配列を有する請求項３および６、７のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項９】
前記糖ペプチド抗生物質がバンコマイシン、テイコプラニンおよびダプトマイシンからなる群から選択される請求項３および６から８のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１０】
前記感染がグラム陽性細菌によるものである請求項３および６から９のいずれか１項に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１１】
前記細菌がブドウ球菌である請求項１０に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１２】
前記細菌がコアグラーゼ陰性ブドウ球菌である請求項１１に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１３】
前記ブドウ球菌がＳ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される請求項１２に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１４】
前記細菌がコアグラーゼ陽性ブドウ球菌である請求項１１に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１５】
前記ブドウ球菌がＳ．ａｕｒｅｕｓである請求項１４に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１６】
前記細菌がエンテロコッカス属菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、コリネバクテリウム属菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓからなる群から選択される請求項１０に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【請求項１７】
前記細菌が前記糖ペプチド抗生物質単独による治療に耐性である請求項１０に記載の医薬品、製造方法または医薬用パック。
【国際調査報告】
2005511645.tif 000018
2005511645.tif 000019
2005511645.tif 000020
2005511645.tif 000021