(57)【要約】本発明は、骨形態形成タンパク質を用いて靭帯欠損を処置および修復するための方法および組成物を提供する。本発明は、靭帯欠損の処置、靭帯欠損の修復、靭帯組織の形成、靭帯組織の再生、および靱帯組織の成長促進を必要としている患者に対して、エキソビボで培養した靱帯細胞を移植することによって、それらをおこなう方法を提供する。この発明の方法は、以下の工程を含む。すなわち、（ａ）靱帯細胞を分離する工程と、（ｂ）該靱帯細胞をエキソビボで培養する工程と、（ｃ）培養された靱帯細胞を回収する工程と、（ｄ）回収された靱帯細胞を患者に移植する工程と、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の靭帯欠損を処置する方法であって、
（ａ）靱帯細胞を単離する工程、
（ｂ）エキソビボで該靱帯細胞を培養する工程、
（ｃ）該培養した靱帯細胞を回収する工程、および
（ｄ）該回収した靭帯細胞を該患者に移植する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
治療的有効量の骨形態形成タンパク質を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列で前記培養した靭帯細胞をトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
骨形態形成タンパク質で前記培養した靭帯細胞を処理する工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
靭帯細胞結合マトリックスの形成を可能にするのに十分な時間、前記靭帯細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記靭帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、前記靭帯欠損を処置可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
患者の靭帯欠損を修復する方法であって、
（ａ）靱帯細胞を単離する工程、
（ｂ）エキソビボで該靱帯細胞を培養する工程、
（ｃ）該培養された靱帯細胞を回収する工程、および
（ｄ）該回収された靭帯細胞を該患者に移植する工程、
を包含する方法。
【請求項１２】
治療的有効量の骨形態形成タンパク質を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列で前記培養した靭帯細胞をトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
骨形態形成タンパク質で前記培養した靭帯細胞を処理する工程をさらに包含する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
靭帯細胞結合マトリックスの形成を可能にするのに十分な時間、前記靭帯細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記靭帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、前記靭帯欠損を処置可能である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
患者の靭帯組織を再生する方法であって、
（ａ）靱帯細胞を単離する工程、
（ｂ）エキソビボで該靱帯細胞を培養する工程、
（ｃ）該培養した靱帯細胞を回収する工程、および
（ｄ）該回収した靭帯細胞を該患者に移植する工程、
を包含する方法。
【請求項２２】
治療的有効量の骨形態形成タンパク質を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列で前記培養した靭帯細胞をトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
骨形態形成タンパク質で前記培養した細胞を処理する工程をさらに包含する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
靭帯細胞結合マトリックスの形成を可能にするのに十分な時間、前記靭帯細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記靭帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、靭帯組織を再生可能である、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
患者において靭帯組織を形成する方法であって、
（ａ）靱帯細胞を単離する工程、
（ｂ）エキソビボで該靱帯細胞を培養する工程、
（ｃ）該培養した靱帯細胞を回収する工程、および
（ｄ）該回収した靭帯細胞を該患者に移植する工程、
を包含する方法。
【請求項３２】
治療的有効量の骨形態形成タンパク質を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列で前記培養した靭帯細胞をトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
骨形態形成タンパク質で前記培養した細胞を処理する工程をさらに包含する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
靭帯細胞結合マトリックスの形成を可能にするのに十分な時間、前記靭帯細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記靭帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、靭帯組織を形成可能である、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
患者において靭帯組織形成を促進する方法であって、
（ａ）靱帯細胞を単離する工程、
（ｂ）エキソビボで該靱帯細胞を培養する工程、
（ｃ）該培養した靱帯細胞を回収する工程、および
（ｄ）該回収した靭帯細胞を該患者に移植する工程、
を包含する方法。
【請求項４２】
治療的有効量の骨形態形成タンパク質を前記患者に投与する工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列で前記培養した靭帯細胞をトランスフェクションする工程をさらに包含する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
骨形態形成タンパク質で前記培養した細胞を処理する工程をさらに包含する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
靭帯細胞結合マトリックスの形成を可能にするのに十分な時間、前記靭帯細胞を培養する工程をさらに包含する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記靭帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、靭帯組織形成を促進可能である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記骨形態形成タンパク質が、キャリアを用いて処方される、請求項７、１７、２７、３７、または４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記キャリアが、コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、カルボキシメチルセルロース、リン酸三カルシウム、ポリ乳酸、ポリ酪酸、およびポリグリコール酸からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
培養した靭帯細胞および骨形態形成タンパク質を含む、組成物。
【請求項５４】
靱帯細胞結合マトリックスをさらに含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
靱帯細胞結合マトリックスが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、およびアグリカンからなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記骨形態形成タンパク質が、ヒトＯＰ−１の保存された７システインドメインを含むＣ末端の１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも７０％相同性を有するアミノ酸配列を含み、該骨形態形成タンパク質は、靭帯欠損を処置可能である、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５８】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７からなる群から選択される、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項５９】
前記骨形態形成タンパク質が、ＯＰ−１である、請求項５３または５４に記載の組成物。
【請求項６０】
前記靭帯細胞が、骨形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列でトランスフェクションされる、請求項５３または５４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、整形外科組織移植に関する。より詳しくは、ｅｘ−ｖｉｖｏ培養靱帯細胞を欠損部位に移植することで、靱帯組織の処置、修復、および再生をおこなう方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
靱帯は、関節をまたがって骨または軟骨を接続する役割を担う。靱帯は、白色線維組織が実質的に平行になった束から構成される。靱帯は、柔軟かつ弾力性に富み、実質的に自由に動くことが可能ではあるが、関節で相互に作用している骨の伸展過度を防ぐために非伸張性である。疾患または障害によって靭帯組織に欠陥があると、疼痛、不安定性、および運動の損失が生ずる。内側側副靭帯（「ＭＣＬ」および前十字靭帯（「ＡＣＬ」）が損傷することは、特に普通にみられる。
【０００３】
膝のＡＣＬは、大腿骨（大腿骨）の最下部と脛骨（腿節）の最上部とを接続する。ＡＣＬの作用は、大腿骨から脛骨への前方変位を妨げることである。また、ＡＣＬは膝にも作用してその過進展を防ぐ。ＭＣＬは、膝の内側にあって、大腿骨を脛骨に接続する。ＭＣＬは膝関節の内側不安定性を妨げることから、大腿骨上で脚が外側に動くことが妨げられる。
【０００４】
靱帯の修復は複雑なプロセスであり、細胞の増殖および移動はもちろんのこと、靱帯細胞構成要素の合成および沈着が含まれる。成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ））、インシュリン様成長因子−ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ならびにトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）は、細胞外タンパク質分子の合成および靱帯細胞の細胞増殖を刺激することが示されている（Ｂｅｎｊａｍｉｎら．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１９６：８５−１３０（２０００）；Ｗｏｏら，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，Ｓ：３１２−２３（１９９９）；Ｋｏｙａｂａｓｈｉら  Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ  Ａｒｔｈｒｏｓｃ．，５：１８９−９４（１９９７）；Ｍａｕｒａｉら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１５：１８−２３（１９９７）；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１３：１８４−９０（１９９５）；Ｗｏｏら，Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐｕｔ．，３６：３５９−６４（１９９８）；Ｓｃｈｅｒｐｉｎｇら，Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．，３６：１−８（１９９７）；Ｓｐｉｎｄｌｅｒら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１４：５４２−４６（１９９６）；Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１５：２５６−６２（１９９７）；Ｍｕｒｐｈｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，５８：１０３−０９（１９９７）；Ｎａｔｓｕ−ｕｍｅら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，１５：８３７−４３（１９９７）；Ｓｐｉｎｄｌｅｒら，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，２０：３１８−２４（２００２）；およびＫｕｒｏｄａら，Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ  Ａｒｔｈｒｏｓｃ．，８：１２０−２６（２０００）を見よ）。
【０００５】
骨形態形成タンパク質も、靭帯および腱形成での役割を担うことが実証されている。例えば、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３）、およびＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２）は、インビボで異所的部位に移植された場合、腱および靭帯形成を誘発することが示されている（例えば、Ａｓｐｅｎｂｅｒｇら，Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，７０：５１−５４（１９９９），Ｆｏｒｓｌｕｎｄら，Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ．，３３：６８５−７５（２００１），Ｔａｓｈｉｒｏら  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．，２４：３０１（１９９９），およびＷｏｌｆｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３２１−３０（１９９７）を見よ）。
【０００６】
靭帯組織は、血管が実質的に欠けていて、ほとんど自己再生特性を持たないか、全く自己再生特性を持たない。靱帯損傷の修復は、時には非外科的リハビリテーションによっておこなわれる。しかし、リハビリテーションが損傷を癒やすには不十分な場合、外科的修復術が必要である。破壊または損傷した靱帯組織の外科的修復術の方法は、骨の関節端に外科的に取り付けられる合成材料または自家移植を用いることのみに限定されている。しかし、一部の患者は移植の失敗がもとで、度重なる手術を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、靭帯欠陥を処置して修復するための、新たな方法および組成物がいまだ求められている。また、靱帯組織の形成および／または再生ならびに／あるいは靱帯組織の成長促進をおこなう方法および組成物もいまだ求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、骨形態形成タンパク質を用いて、靭帯欠損を処置するかまたは修復する方法および組成物を提供する。本発明は、靱帯欠損の処置、靱帯欠損の修復、靱帯組織の形成、靱帯組織の再生、および靱帯組織の成長促進を必要としている患者に対して、エキソビボで培養された靱帯細胞を移植し、骨形態形成タンパク質を投与することによって、靱帯欠損の処置、靱帯欠損の修復、靱帯組織の形成、靱帯組織の再生、および靱帯組織の成長促進をおこなう方法を提供する。この発明の方法は、以下の工程を含む。すなわち、
（ａ）靱帯細胞を分離する工程と、
（ｂ）該靱帯細胞をエキソビボで培養する工程と、
（ｃ）培養された靱帯細胞を回収する工程と、
（ｄ）回収された靱帯細胞を患者に移植する工程と、を含む。
【０００９】
本発明はまた、靱帯組織の処置、修復、および再生のための組成物、ならびに培養靱帯細胞および骨形態形成タンパク質を含有する靱帯組織の形成および促進のための組成物も提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語のすべては、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されている方法および材料と類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、適当な方法および材料を後述する。材料、方法、および実施例は、説明するだけのためのものであり、限定することを意図したものではない。本明細書で言及する刊行物、特許、および他の文献は、その全体が参考として援用される。
【００１１】
この明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変形例は、任意の他の整数または整数群の除外ではなく、所定の整数または整数群の包含を意味する。
【００１２】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が本明細書で使われる。
【００１３】
用語「靱帯（ｌｉｇａｍｅｎｔ）」は、関節をまたがって骨または軟骨を接続する結合組織が実質的に平行に束ねられたものをいう。靱帯の例として、限定されるものではないが、ＡＣＬおよびＭＣＬが挙げられる。
【００１４】
用語「靭帯細胞（ｌｉｇａｍｅｎｔ  ｃｅｌｌ）」とは、適当な刺激または複数の刺激にさらされた場合に、靱帯細胞に特有の構成要素を発現および分泌することが可能な任意の細胞をいう。靱帯細胞として、分化の異なる段階にある細胞が挙げられる。靱帯細胞は、本明細書に定義されるように、増殖可能であり、かつ適当な刺激または複数の刺激にさらされることで、分化が誘導される。靱帯細胞は、既存の靱帯組織または骨髄の間葉幹細胞から直接単離することが可能である。
【００１５】
用語「欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）」または「欠陥部位（ｄｅｆｅｃｔ  ｓｉｔｅ）」とは、修復を必要としている靱帯の破損をいう。欠陥は、「空隙（ｖｏｉｄ）」の構成を仮定することができ、この空隙は、三次元的欠陥、例えば隙間、空洞、穴、または靭帯構造の完全性の他の実質的な破損を意味するものと理解される。また、欠陥は、靱帯の付着部位から該靱帯が骨または軟骨に向けて分離することでもある。いくつかの実施形態では、欠陥は、内因性または自然発生的な修復ができないような欠陥である。欠陥は、事故、疾患および／または外科的処置によって生ずる。
【００１６】
用語「修復（ｒｅｐａｉｒ）」は、上記欠陥での空隙または構造的不連続性を少なくとも部分的に満たすのに十分な新規な靱帯形成をいう。しかし、修復は、欠陥を該欠陥前の生理的／構造的／機械的状態に回復する上で１００％効果的である完全な治癒または処置のプロセスを意味せず、その必要もない。
【００１７】
用語「治療的効果的量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、靭帯組織の修復、再生、活性化、または形成をおこなうのに効果的な量をいう。
【００１８】
用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」とは、ほ乳類動物（例えば、ヒト）等の動物をいう。
【００１９】
用語「形態形成タンパク質（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ」とは、形態形成活性を持つタンパク質をいう。好ましくは、この発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属している少なくとも１つのポリペプチドから構成される。形態形成タンパク質として、骨形成タンパク質が挙げられる。形態形成タンパク質は、前駆体細胞が増殖するように誘導すること、および／または該前駆体細胞が軟骨、骨、腱、靭帯、または局所環境的指示にもとづいた他の種類の組織形成に至る分化経路の開始を誘導することが可能であり、それによって、形態形成タンパク質は異なる環境下で異なる振る舞いをすることができる。例えば、形態形成タンパク質は、１つの処置部位で骨組織を誘導し、別の処置部位で靱帯組織を誘導するものであってもよい。
【００２０】
用語「骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）」とは、ＤＮＡおよびアミノ酸配列相同性にもとづいたＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリーに属するタンパク質（ＢＭＰファミリー）をいう。タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーを特徴づけるシステインが豊富なＣ末端保存ドメイン内の少なくとも１つの既知ＢＭＰファミリーメンバーとアミノ酸配列が少なくとも５０％同一である場合、この発明にもとづくＢＭＰファミリーに属する。好ましくは、タンパク質は、システインが豊富なＣ末端保存ドメイン内の少なくとも１つの既知ＢＭＰファミリーメンバーとアミノ酸配列が少なくとも７０％同一である。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体としてＤＮＡ配列またはアミノ酸配列の同一性が５０％未満である。
【００２１】
用語「アミノ酸配列相同性（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を包含すると理解される。相同配列は、同一および／または類似のアミノ酸残基を共有するもので、類似の残基は、位置合わせされた参照配列内の対応アミノ酸残基に対する保存的置換または該対応アミノ酸残基の「許容された点突然変異（ａｌｌｏｗｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」である。このように、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、参照配列内の対応残基と同一であるか、もしくは該対応配列の保守的置換のいずれかである。いくつかの特に好ましい形態形成ポリペプチドは、Ｃ末端１０２〜１０６アミノ酸と少なくとも６０％、好ましくは７０％のアミノ酸同一性を共有し、ヒトＯＰ−１の保存７システインドメインおよび関連タンパク質を定義する。
【００２２】
アミノ酸配列相同性は、当該分野で周知の方法によって決定される。例えば、上記７システインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列のパーセント相同性を測定するために、２つの配列を最初に並べる。この位置合わせは、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０）に記載されたダイナミックプログラミングアルゴリズムおよびアラインプログラム（Ａｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．が製造元である市販のソフトウェアパッケージ）によって行うことができる。本明細書では、これら両方のソースによる教示を参考として援用する。最初の位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、複数の関連タンパク質からなる１つのファミリーのマルチ配列位置合わせとの比較によって、改善することができる。一旦、位置合わせが行われ、改善されると、％相同性スコアの算出が行われる。位置合わせされた２本の配列のアミノ酸残基を、互いの類似性について連続的に比較した。類似性のファクターとして、類似の大きさ、形状、および電荷が挙げられる。アミノ酸類似性を決定する特に好ましい一つの方法は、本明細書で参考として援用されるＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８および補遺）に記載されたＰＡＭ２５０マトリックスである。類似性スコアを、位置合わせされたペアワイズアミノ酸類似性スコアの合計として、最初に計算する。挿入および欠失は、パーセント相同性および同一性を目的としているので、無視される。したがって、この計算では、ギャップペナルティは用いられない。次に、候補配列のスコアと７システインドメインのスコアとの幾何平均によって粗スコアを割ることで該粗スコアを標準化する。幾何平均は、これらのスコアの積の二乗根である。標準化された粗スコアは、パーセント相同性である。
【００２３】
用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、対応する参照残基に対して物理的または機能的に類似している残基をいう。すなわち、保存的置換およびその参照残基は、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合および水素結合を形成する能力を含む）等を有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ他（上掲）で許容点突然変異について定義された規準を満たす保存的置換である。保存的置換の例は、以下の群の範囲内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リシン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシンである。用語「保存的改変体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」または「保存的改変（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」は、所定の親のアミノ酸配列のアミノ酸残基のかわりに置換アミノ酸残基を用いることも包含するもので、親配列に対して特異的な抗体も、結果として生ずる置換ポリペプチド配列に対して特異的であり、すなわち「交差反応（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔ）」または「免疫反応（ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅａｃｔ）」する。
【００２４】
用語「骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＯＰ）」とは、始原細胞を誘導して軟骨および／または骨を形成することができる形態形成タンパク質のことをいう。上記骨は、膜性骨であっても軟骨性骨であってもよい。大部分の骨形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーであり、したがってＢＭＰでもある。本明細書の別のところで述べられるように、タンパク質の種類は、ヒト骨形成タンパク質（ｈＯＰ−１）によって代表される。本発明を実施する上で有用な他の骨形成タンパク質として、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、もしくはＮＥＵＲＡＬ、ならびにそれらのアミノ酸配列改変体の骨形成活性形態が挙げられる。出願人の発明による使用に適切な骨形成タンパク質は、ＲｅｄｄｉおよびＳａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４，ｐｐ．７１０９−１３、本明細書で参考として援用）によって記載される、当該技術分野で認められたバイオアッセイを用いる慣用的な実験により、同定することができる。
【００２５】
この発明に有用なタンパク質は、骨形成タンパク質として同定された真核生物タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号を参照せよ。この特許を本明細書では援用する）、例えば、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、およびＣＢＭＰ−２タンパク質、ならびにアミノ酸配列関連タンパク質（例えばＤＰＰ（ショウジョウバエ由来）、Ｖｇ１（アフリカツメガエル由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＧＤＦ−１（ヒト由来、Ｌｅｅ，ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．４２５０−４２５４（１９９１）参照）、６０Ａ（ショウジョウバエ由来、Ｗｈａｒｔｏｎら、ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．９２１４−９２１８参照）、ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）−１（ニワトリ由来、Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７３，ｐｐ．６８７−７０２（１９９３）およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号  Ｌ１２０３２を参照）、ＧＤＦ−５（マウス由来、Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３６８，ｐｐ．６３９−６４３（１９９４）参照）、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７）が挙げられる。上記参考文献の教示を本明細書で参考として援用する。ＢＭＰ−３もまた好ましい。さらなる有用なタンパク質としては、米国特許第５，０１１，６９１号（本明細書で参考として援用）に開示される生合成形態形成構築物（例えば、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７およびＣＯＰ−１６）ならびに当該分野で公知の他のタンパク質が挙げられる。さらに別のタンパク質として、ＢＭＰ−３ｂ（Ｔａｋａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２１９，ｐｐ．６５６−６６２（１９９６）参照）、ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０参照）、ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３５７１０参照）、ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５参照）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９４／１２８１４参照）、ＣＤＭＰ−２（ＷＯ９４／１２８１４参照）、ＢＭＰ−１０（Ｗ０９４／２６８９３参照）、ＧＤＦ−１（Ｗ０９２／００３８２参照）、ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９参照）、ＧＤＦ−３（Ｗ０９４／１５９６５参照）、およびＧＤＦ−７（Ｗ０９５／０１８０２参照）の骨形成活性形態が挙げられる。上記参照文献の教示を本明細書では援用する。
【００２６】
（靱帯の成長および修復のための方法および組成物）
本発明の方法および組成物は、患者における靱帯の成長および修復に使用され得る。この方法は、靱帯を修復するために、外科的手技の代わりに、または外科的手技と組み合わせて、用いることが可能である。例えば、外科的に移植された移植片組織の付着を助けるために、この発明の方法を用いてもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の靱帯欠損を処置する方法を提供するもので、該方法は、（ａ）靱帯細胞を単離するステップと、（ｂ）エキソビボで靱帯細胞を培養するステップと、（ｃ）培養靱帯細胞を回収するステップと、（ｄ）培養靱帯細胞を患者に移植するステップとを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の靱帯欠損を修復する方法を提供するもので、該方法は、（ａ）靱帯細胞を単離するステップと、（ｂ）エキソビボで靱帯細胞を培養するステップと、（ｃ）培養靱帯細胞を回収するステップと、（ｄ）培養靱帯細胞を患者に移植するステップとを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の靱帯欠損を再生する方法を提供するもので、該方法は、（ａ）靱帯細胞を単離するステップと、（ｂ）エキソビボで靱帯細胞を培養するステップと、（ｃ）培養靱帯細胞を回収するステップと、（ｄ）培養靱帯細胞を患者に移植するステップとを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は患者の靱帯組織を形成する方法を提供するもので、該方法は、（ａ）靱帯細胞を単離するステップと、（ｂ）エキソビボで靱帯細胞を培養するステップと、（ｃ）培養靱帯細胞を回収するステップと、（ｄ）培養靱帯細胞を患者に移植するステップとを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は患者の靱帯組織形成を促進する方法を提供するもので、該方法は、（ａ）靱帯細胞を単離するステップと、（ｂ）エキソビボで靱帯細胞を培養するステップと、（ｃ）培養靱帯細胞を回収するステップと、（ｄ）培養靱帯細胞を患者に移植するステップとを含む。
【００３２】
靱帯細胞を含む任意の組織から、靱帯細胞を単離してもよい。靱帯細胞は、既存の靱帯組織（例えば、ＡＣＬまたはＭＣＬ）から直接分離することができる。靱帯組織はまた、骨髄の間葉幹細胞から単離してもよい。靱帯組織は、例えば、靱帯細胞を移植すべき患者から外科的切除によって得ることができ、または別の患者から得てもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、単離された靱帯細胞を、靱帯組織の特徴的な構成要素を発現および分泌する能力を保つのに有効な条件下で、培養培地に再懸濁する。いくつかの実施形態では、靱帯細胞を、該細胞を分化させるのに有効な条件下で、培養培地中に再懸濁する。培養培地は、刺激因子をさらに含んでもよく、該刺激因子として、限定されるものではないが、ウシ胎仔血清、外因的に添加された成長因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６（その可溶性ＩＬ−６受容体と組み合わせて）、ＬＩＭ鉱物化タンパク質−１）、ホルモン（ＰＴＨ、インスリン、ビタミンＤ）、ギャップ結合タンパク質（例えば、コネキシン）、骨形態形成タンパク質（以下参照）、ならびに／あるいは他の因子（例えば、ノルエピネフィリン）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記骨形態形成タンパク質は、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびそれらのアミノ酸配列改変体からなる群から選択される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、靱帯細胞が成長因子および／または骨形態形成タンパク質をコードするＤＮＡによってトランスフェクトされる。好ましい実施形態では、靱帯細胞は、ＯＰ−１をコードする核酸配列（配列番号１０）によりトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、成長因子および骨形態形成タンパク質が構成的に発現される。他の実施形態では、成長因子および／または骨形態形成タンパク質が誘導可能である。所望のＤＮＡを持つ靱帯細胞をトランスフェクトさせて、対応するタンパク質を発現させる方法は、当業者に周知である（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９８）を参照せよ）。当業者はまた、他の因子を培養培地に添加して、靱帯細胞を培養物中で維持してもよいことを理解するだろう。
【００３５】
いくつかの実施形態では、靱帯細胞の培養は、インビボに存在するものと類似する細胞関連マトリックスの生産を可能とする条件下で、行われる。いくつかの実施形態では、靱帯細胞関連マトリックスは、限定されるものではないが、１型コラーゲン、エラスチン、デコリン、アグリカン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３６】
培養靱帯細胞を、当該分野で周知の方法を用いて培養培地から回収する。そのような方法の１つは、培養培地を除去し、培養プレートから靱帯細胞を検出するステップと、靱帯細胞を緩衝液または培養培地に再懸濁させ、細胞を遠心して緩衝液または培養培地を除去するステップと、患者への移植に適切な緩衝液または溶液に細胞を再懸濁するステップとを含む。いくつかの実施形態では、細胞をラバーポリスマンによりプレートから物理的に掻き取ることいより、培養プレートから該細胞を取り除くことができる。いくつかの実施形態では、室温で細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で消化し、血清でトリプシン活性を阻害し、さらに低速で細胞をかるく遠心することで、細胞の回収をおこなってもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、回収された靱帯細胞は、靱帯細胞結合マトリックスを含む。
【００３８】
回収された靱帯細胞を、欠損部位、あるいは靱帯組織を再生もしくは形成することまたはその成長を促進することが望まれる部位で、患者に移植する。いくつかの実施形態では、移植された靱帯細胞を、本明細書に記載した骨形態形成タンパク質および／または成長因子をコードする核酸配列によってトランスフェクトする。他の実施形態では、上記細胞のトランスフェクションを行わない。細胞を当該分野で認められている方法を用いて移植することができる。これらの方法として、限定されるものではないが、欠損部位への注射または欠損部位への細胞の充填が挙げられる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、靱帯細胞を移植した後、形態形成タンパク質を患者に投与してもよい。形態形成タンパク質は、薬学的組成物として処方することができる。この形態形成タンパク質は、本明細書に記載するキャリアとともに移植してもよい（以下を参照）。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質を欠損部位または靱帯形成／再生または修復が望まれる部位に、局所投与する。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質を靱帯細胞に投与する。いくつかの実施形態では、形態形成タンパク質をマトリックスとともに投与する。他の実施形態では、形態形成タンパク質をマットリックスなしで投与する。
【００４０】
（靱帯細胞およびＢＭＰの組成物）
本発明はまた、靱帯細胞と骨形態形成タンパク質とを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、本発明にもとづいて形態形成タンパク質または成長因子をコードする核酸配列により、上記靱帯細胞をトランスフェクトさせる。いくつかの実施形態では、上記組成物は、この発明にもとづく靱帯細胞結合マトリックスをさらに含む。
【００４１】
（骨形態形成タンパク質ファミリー）
ＢＭＰファミリー（その典型的な骨形態形成／骨形成タンパク質ファミリーメンバーに対して命名）は、ＴＧＦ−βタンパク質スーパーファミリーに属する。主に配列相同性にもとづいて単離された既報のＢＭＰ群（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）は、ＢＭＰ−１を除く全てが形態形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーであると分類されたままである（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−９３（１９９０））。
【００４２】
ＢＭＰファミリーは、他の構造的に関連したメンバーを含むもので、該メンバーは形態形成タンパク質である。該形態形成タンパク質として、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）遺伝子複合体（ＤＰＰ）産物、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）のＶｇ１産物およびそのマウスホモログ、Ｖｇｒ−１（例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．５９７−６４１（１９９０），本明細書で参考として援用）が挙げられる。
【００４３】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端ドメインは、ＢＭＰ−２のものと約６０％同一であり、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは８７％同一である。ＢＭＰ−６は、マウスＶｇｒ−１のヒトホモログであると思われる（Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．４５５４−５９（１９８９））。すなわち、２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベルで全体的に９２％同一である（米国特許第５，４５９，０４７号、本明細書で参考として援用）。ＢＭＰ−６は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ｖｇ−１産物と５８％同一である。
【００４４】
（ＢＭＰの生化学、構造、および機能特性）
天然の骨モルホゲンは、Ｃ末端領域（ドメイン）で実質的にアミノ酸配列相同性を共有する。一般に、上記の天然に生ずる骨形成タンパク質は、前駆体として翻訳され、概ね約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列を有し、それに続いて、切断により約９７〜１０６アミノ酸からなる成熟Ｃ末端ドメインを生ずる「プロ」ドメインを有する。シグナルペプチドは、翻訳の際、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，ｐｐ．４６８３−４６９１（１９８６）の方法を用いて、所定の配列で予測することができる切断部位で、迅速に切断される。プロドメインは、一般に、完全に処理された成熟Ｃ末端ドメインよりも約３倍大きい。
【００４５】
ＢＭＰタンパク質ファミリーメンバーの別の特徴は、二量体化する明らかな能力を持つことである。いくつかの骨誘導ＯＰおよびＢＭＰがそれらの活性形態でホモおよびヘテロの二量体を形成する。ヘテロ二量体を形成するＯＰおよびＢＭＰの能力は、形態形成タンパク質に対する追加の、または変えられた形態形成誘導能を与えるものであってもよい。ヘテロ二量体は、定性的または定量的に、ＯＰおよびＢＭＰ受容体分子に対するホモ二量体とは異なる結合親和性を示すことができる。変えられた結合親和性は、最終的には異なる生物学的活性または出力に至る異なるシグナル伝達経路を媒介する受容体の差次的活性化を次々に導くことが可能である。変えられた結合親和性はまた、組織または細胞特異的な様式で発現することで、固有の前駆細胞型のみを誘導して、増殖および／または分化を引き起こすことも可能である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、形態形成ポリペプチドの対は、複数のアミノ酸配列を有し、各々が参照モルフォゲンのアミノ酸配列と所定の関係を共有する配列を含む。ここで、好ましい骨形成ポリペプチドは、骨形成活性ヒトＯＰ−１（配列番号１）に存在する配列と所定の関係を共有する。しかし、本明細書に開示した天然に存在する配列または生合成配列のいずれか１種類以上が、同様に、参照配列として使用することができた。好ましい骨形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端６システインドメイン（配列番号１の残基３３５〜４３１）と所定の関係を共有する。好ましくは、骨形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の少なくともＣ末端７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）と所定の相互関係を共有する。従って、骨形態形成活性を有する二量体タンパク質での好ましいポリペプチドは、各々、参照配列に対応する配列または参照配列に対して機能的に等価な配列を含む。
【００４７】
機能的に等価な配列としては、参照配列に配置されたシステイン残基の機能的に等価な配列が挙げられ、これらの配列は、これらのシステインの線形配列を変えるが、二量体モルフォゲンタンパク質の折り畳み構造内でのそれらの関係を実質的に損なうことがないアミノ酸挿入または欠失を含み、形態形成活性にとって必要と思われる鎖間または鎖内ジスルフィド結合等を形成する能力を有する。機能的に等価な配列はさらに、違いが骨形態形成活性を破壊しない条件で、１種類以上のアミノ酸残基が参照配列の対応残基と異なる配列、例えばヒトＯＰ−１のＣ末端の７個のシステインドメイン（本明細書では保存７システイン骨格ともいう）を包含する。従って、参照配列の対応アミノ酸の保存的置換が好ましい。特に好ましい保存的置換は、それらがＤａｙｈｏｆｆ他（前出）で許容された点突然変異を定義した基準を満たすものであり、その教示は、本明細書中で参考として援用される。
【００４８】
骨形成タンパク質ＯＰ−１は、記載されている（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号を参照のこと。本明細書中で参考として援用される）。成熟天然形態にある天然由来の骨形成タンパク質は、グリコシル化された二量体であり、代表的に、該二量体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した見掛け上の分子量が約３０〜３６ｋＤａである。還元した場合、３０ｋＤａタンパク質が見掛け上の分子量が約１６ｋＤａおよび１８ｋＤａである２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態では、タンパク質は検出可能な骨形成活性を有さない。非グリコシル化タンパク質は、骨形成活性を有するとともに、見掛けの分子量が約２７ｋＤａである。還元型の場合、２７ｋＤａタンパク質は、分子量が約１４ｋＤａ〜１６ｋＤａである哺乳動物での軟骨内骨形成を誘導し得る非グリコシル化ポリペプチドを生じる。骨形成タンパク質は、異なるグリコシル化パターン、異なるＮ末端を有する形態、および天然タンパク質の活性な短縮形態または変異形態を含み得る。先に述べたように、特に有用な配列としては、ＤＰＰ（ショウジョウバエ由来）のＣ末端９６〜１０２アミノ酸配列、Ｖｇ１（アフリカツメガエル由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１およびＯＰ−２タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号およびＯｐｐｅｒｍａｎｎらを参照のこと。本明細書中で参考として援用される）、ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＷＯ８８／００２０５、米国特許第５，０１３，６４９号、およびＷＯ９１／１８０９８を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＷＯ９０／１１３６６、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０を参照のこと。本明細書中で参考として援用される）、ＢＭＰ−８、ならびにＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質を含むものが挙げられる。
【００４９】
この発明の好ましい骨形成タンパク質として、ＯＰ−１，ＯＰ−２，ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、  ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ならびにこれらの種ホモログを含むそれらのアミノ酸配列改変体およびホモログが挙げられる。より好ましい骨形成タンパク質としては、ＯＰ−１、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−７が挙げられる。最も好ましい骨形成タンパク質は、ＯＰ−１である。
【００５０】
これらの配列ならびにこれらの化学的および物理的特性を開示している文献としては、ＯＰ−１およびＯＰ−２（米国特許第５，０１１，６９１号、米国特許第５，２６６，６８３号、Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，ｐｐ．２０８５−２０９３（１９９０））、ＯＰ−３（ＷＯ９４／１０２０３（ＰＣＴ  ＵＳ９３／１０５２０））、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＷＯ８８／００２０５、Ｗｏｚｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，ｐｐ．１５２８−１５３４（１９８８））、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（Ｃｅｌｅｓｔｅら，ＰＮＡＳ，８７，９８４３−９８４７（１９９１））、Ｖｇｒ−１（（Ｌｙｏｎｓら，ＰＮＡＳ，８６，ｐｐ．４５５４−４５５８（１９８９））、ＤＰＰ（Ｐａｄｇｅｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，ｐｐ．８１−８４（１９８７））、Ｖｇ−１（Ｗｅｅｋｓ，Ｃｅｌｌ，５１，ｐｐ．８６１−８６７（１９８７））、ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７０８４）、ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９０）、ＢＭＰ−１１（ＷＯ９４／２６８９２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２８８）、ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）、ＢＭＰ−１３（ＷＯ９５／１６０３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０）、ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０９６）およびＬｅｅら，ＰＮＡＳ，８８，ｐｐ．４２５０−４２５４（１９９１）、ＧＤＦ−８（ＷＯ９４／２１６８１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０３０１９）、ＧＤＦ−９（ＷＯ９４／１５９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６８５）、ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４４０）、ＧＤＦ−１１（ＷＯ９６／０１８４５（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８５４３）、ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３６７１０（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０６５４０）、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ−１，ＭＰ５２）（ＷＯ９４／１５９４９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／００６５７）およびＷＯ９６／１４３３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２８１４）およびＷＯ９３／１６０９９（ＰＣＴ／ＥＰ９３／００３５０））、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２，ＢＭＰ１３）（ＷＯ９５／０１８０１（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７６２）およびＷＯ９６／１４３３５およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３，ＢＭＰ１２）（ＷＯ９５／１０８０２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０７７９９）およびＷＯ９５／１０６３５（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４０３０））が挙げられる。上記文献は、本明細書中で参考として援用される。
【００５１】
別の実施形態では、有用なタンパク質としては、新規生合成形態形成タンパク質、および２種類以上の公知のモルフォゲン由来の配列を用いて設計されたキメラタンパク質を含む生物学的に活性な生合成構築物が挙げられる。
【００５２】
合成的に調製された骨形成タンパク質は、天然タンパク質または非天然タンパク質（すなわち、天然では他に見出されないタンパク質）であってもよい。非天然骨形成タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を用いて合成されている（米国特許第５，３２４，８１９号、本明細書中で参考として援用される）。これらのコンセンサス配列は、天然の骨形成産物から得られる部分的なアミノ酸配列データに基いて、および推定または立証された発生学的機能を有する文献で報告される他の遺伝子とのそれらの観察された相同に基づいて、設計された。
【００５３】
生合成コンセンサス配列（コンセンサス骨形成タンパク質または「ＣＯＰｓ」と呼ばれる）のいくつかが、原核生物で融合タンパク質として発現された。精製融合タンパク質を、切断し、再び折りたたみ、少なくとも１つのＭＰＳＦ（任意に、マトリックスまたはデバイス内で）と結合させ、確立された動物モデルに移植した場合、骨および／または軟骨誘導活性を有することが示された。現在好ましい合成骨形成タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号２）およびＣＯＰ−７（配列番号３）と名付けられた２種類の合成アミノ酸配列を有する。
【００５４】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎらの米国特許第５，０１１，６９１号および第５，３２４，８１９号（これらは、本明細書中で参考として援用される）は、以下に示すようなＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記述している。
【００５５】
【化１】
2005533089.tif 000002
【００５６】
これらのアミノ酸配列では、ダッシュ（−）は、関連タンパク質の比較可能な配列を整列させるためのみに、つなぎ文字として使用する。並べられたアミノ酸間の違いを強調してある。
【００５７】
これらおよび他のＢＭＰファミリーメンバーのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、公表されており、新たに同定したタンパク質がＢＭＰファミリーに属するかどうか確定するために、当業者に使用され得る。新規のＢＭＰ関連遺伝子産物は、少なくとも１種類の形態形成活性を有することが類似性によって予測されるので、ＢＭＰとして分類される。
【００５８】
この発明の好ましい一実施形態では、形態形成タンパク質は、二量体種を生成するためにジスルフィド結合した一対のサブユニットを有し、該サブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属するポリペプチドを含む。この発明の別の好ましい実施形態では、形態形成タンパク質は、非共有結合性相互作用を介して形成された二量体種を生成する一対のサブユニットを有し、ここで、該サブユニットの少なくとも１つは、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属するポリペプチドを含む。非共有結合性相互作用としては、ファンデルワールス、水素結合、疎水性相互作用、および静電的相互作用が挙げられる。二量体種は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよく、細胞増殖および／または組織形成を誘導する能力を有する。
【００５９】
特定の好ましい実施形態では、本明細書で有用な骨形成タンパク質としては、アミノ酸配列が、前述の天然タンパク質から選択された参照形態形成タンパク質と少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性または「類似性」、好ましくは８０％の相同性または類似性を共有する配列を含む骨形成タンパク質が挙げられる。好ましくは、上記参照タンパク質は、ヒトＯＰ−１であって、その参照配列はヒトＯＰ−１の骨形成活性な形態、配列番号１の残基３３０〜４３１に存在するＣ末端７システインドメインである。いくつかの実施形態では、参照モルフォゲンポリペプチドと機能的に等価であると考えられるポリペプチドは、アライン（Ａｌｉｇｎ）プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）等のコンピュータ／プログラムによって好都合に実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎら（前出）の方法を用いて、それに並べられる。上記したように、候補配列の内部間隙およびアミノ酸挿入は、アミノ酸配列相同性または同一性のレベルとして、候補配列と参照配列との間で従来通りに発現された所定の関係を計算するために、無視される。好ましい実施形態では、上記参照配列はＯＰ−１である。従って、本明細書で有用な骨形成タンパク質としては、天然に生じたものであるか、生合成されたものであるかにかかわらず（例えば、「ムテイン」または「突然変異タンパク質」を含む）対立形質の系統発生的対応物および好ましい対照配列の他の変異体、ならびに、上に示したものおよび同定したものを含むタンパク質の一般的形態形成ファミリーの新規メンバーが挙げられる。いくつかの特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性、さらにより好ましくは少なくとも６５％のアミノ酸同一性、なおより好ましくは少なくとも７０％のアミノ酸同一性を共有する。
【００６０】
別の実施形態では、有用な骨形成タンパク質としては、本明細書に定義したように、保存的７システインドメインを共有し、またＣ末端活性ドメイン内に少なくとも７０％アミノ酸配列相同性（類似性）を共有するものが挙げられる。さらに別の実施形態では、本発明の骨形成タンパク質を、本明細書で定めたジェネリック（ｇｅｎｅｒｉｃ）配列のいずれか１つを有する骨形成活性タンパク質として定義することができ、該骨形成タンパク質としては、ＯＰＸ（配列番号４）、ならびにジェネリック配列７（配列番号５）およびジェネリック配列８（配列番号６）、またはジェネリック配列９（配列番号７）およびジェネリック配列１０（配列番号８）が挙げられる。
【００６１】
本発明に有用な骨形態形成ポリペプチドのファミリーおよびそのメンバーを、ジェネリックアミノ酸配列によって定義することができる。例えば、ジェネリック配列７（配列番号５）およびジェネリック配列８（配列番号６）は、それぞれ９６および１０２アミノ酸配列であり、現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーメンバー（少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇ１、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ−ｌを含む）間で共有される相同性を伴うものである。これらのタンパク質に対するアミノ酸配列は、上に要約したように、本明細書および／または当該技術分野で記載されている。ジェネリック配列としては、６つおよび７つのシステイン骨格（それぞれ、ジェネリック配列７およびジェネリック配列８）によって定義されたＣ末端ドメインのこれらの配列によって共有されるアミノ酸同一性ならびに上記配列内の可変位置の代替残基との両方が挙げられる。ジェネリック配列は、適切なシステイン骨格を与えるもので、分子内または分子間のジスルフィド結合が、折りたたみタンパク質の三次構造に影響を及ぼしやすいいくつかの重要なアミノ酸を形成および含有することができる。また、ジェネリック配列は、位置３６（ジェネリック配列７）または位置４１（ジェネリック配列８）にシステインを付加することを可能とすることで、ＯＰ−２およびＯＰ−３の形態形成的に活性化された配列を含む。
【００６２】
【化２】
2005533089.tif 000003
【００６３】
ここで、各Ｘａａは、以下のように定義された１つ以上の特定のアミノ酸からなる群から独立に選択される。すなわち、「ｒｅｓ．」とは、「残基」を意味し、ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３にあるＸａａ＝（ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，ＬｙｓまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７にあるＸａａ＝（ＡｓｐまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．８にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，ＶａｌまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．１１にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１２にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ａｒｇ，ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．１３にあるＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６にあるＸａａ（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１８にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，ＰｒｏまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１９にあるＸａａ＝（ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２０にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｍｅｔ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，ＬｅｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２３にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２６にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．２８にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｓｐ，ＧｌｎまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．３０にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｎ，ＩｌｅまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．３１にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３３にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．３４にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ａｌａ，ＴｈｒまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｅｕ，ＡｌａまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３６にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，ＳｅｒまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．３７にあるＸａａ＝（Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．３９にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４０にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４４にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４５にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４６にあるＸａａ＝（ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．４７にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．４８にあるＸａａ＝（ＬｅｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９にあるＸａａ＝（ＶａｌまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５０にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，ＡｓｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５１にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５２にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５３にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，ＧｌｙまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５４にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，ＳｅｒまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５５にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．５６にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｙｓ，Ａｓｐ，Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５７にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５８にあるＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５９にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６０にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．６３にあるＸａａ＝（ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６６にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６７にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，ＭｅｔまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｓｅｒ，ＡｓｐまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．６９にあるＸａａ＝（Ａｌａ，ＰｒｏまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７１にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７２にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ＭｅｔまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．７４にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．７５にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，ＬｅｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．７６にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，ＡｓｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．７７にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，ＡｒｇまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７８にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，ＴｙｒまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．７９にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，ＧｌｕまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８０にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，ＴｈｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８２にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，ＶａｌまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８４にあるＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８５にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．８７にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｇｌｎ，ＧｌｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．８８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｇｌｕ，ＴｒｐまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．９０にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．９２にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｖａｌ，Ａｓｐ，ＧｌｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．９３にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｇｌｙ，ＧｌｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．９５にあるＸａａ＝（ＧｌｙまたはＡｌａ）、ならびにｒｅｓ．９７にあるＸａａ＝（ＨｉｓまたはＡｒｇ）である。
【００６４】
ジェネリック配列８（配列番号６）は、ジェネリック配列７の全てを含み、さらにそのＮ末端で以下の配列（配列番号９）：
【００６５】
【化３】
2005533089.tif 000004
【００６６】
を含む。
【００６７】
従って、残基７で開始するジェネリック配列８の各「Ｘａａ」は、ジェネリック配列７に対して定義される特定のアミノ酸配列であり、ジェネリック配列７のために記載された各残基番号がジェネリック配列８で５つずれている点が異なる。従って、ジェネリック配列７のｒｅｓ．２にある「Ｘａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」とは、ジェネリック配列８のｒｅｓ．７にあるＸａａをいう。ジェネリック配列８では、ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，ＡｒｇまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，ＡｒｇまたはＧｌｎ）；およびｒｅｓ．５にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ｓｅｒ，Ｈｉｓ，Ｇｌｙ，Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ，またはＴｙｒ）である。
【００６８】
別の実施形態では、有用な骨形成タンパク質として、以下のように定義されるジェネリック配列９および１０に定義するものが挙げられる。
【００６９】
特に、ジェネリック配列９および１０は以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である。すなわち、該タンパク質は、ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ  １０、ヒトＢＭＰ−１１、ショウジョウバエ６０Ａ、アフリカツメガエルＶｇ−１、ウニＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−ｌ（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＣＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、ショウジョウバエＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１１、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５、およびラットＢＭＰ３ｂである。ジェネリック配列７と同様に、ジェネリック配列９は、９６アミノ酸配列であり、該配列はＣ末端６システイン骨格を伴い、また、ジェネリック配列８と同様に、ジェネリック配列１０は７システイン骨格を伴う１０２アミノ酸配列である。
【００７０】
（ジェネリック配列９（配列番号７））
【００７１】
【化４】
2005533089.tif 000005
【００７２】
ここで、各Ｘａａはそれぞれ別々に、以下のように定義された１つ以上の特定のアミノ酸からなる群から選択される。すなわち、「ｒｅｓ．」は、「残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）」を意味し、ｒｅｓ．１にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，ＬｅｕまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，ＶａｌまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．３にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｉｌｅ，ＬｅｕまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，ＡｓｎまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．５にあるＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．６にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，ＡｌａまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．７にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｅｕ，ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，ＩｌｅまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．９にあるＸａａ＝（Ｇｌｙ，ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１０にあるＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．１１にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，Ｌｅｕ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，ＳｅｒまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．１２にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，ＧｌｕまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．１３にあるＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．１４にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１５にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．１６にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，ＴｙｒまたはＴｒｐ）；ｒｅｓ．１８にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ａｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．１９にあるＸａａ＝（Ｇｌｙ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，Ｇｌｎ，ＡｒｇまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２０にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．２１にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，ＬｙｓまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．２２にあるＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．２３にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ａｓｎ，ＡｌａまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２４にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，ＰｈｅまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．２６にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，ＧｌｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２８にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｌｙｓ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．３０にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｉｌｅ，Ａｓｎ，Ｐｒｏ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｈｅ，ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．３１にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３２にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３３にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｇｌｕ，ＰｈｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．３４にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ａｒｇ，ＬｅｕまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．３５にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，ＧｌｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．３６にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．３７にあるＸａａ＝（Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．３８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，ＶａｌまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３９にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，ＰｒｏまたはＰｈｅ）；ｒｅｓ．４０にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，ＨｉｓまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．４１にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｖａｌ，ＴｈｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．４２にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，ＴｙｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．４３にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＬｅｕまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．４４にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，ＭｅｔまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．４５にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，ＩｌｅまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４６にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．４７にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，ＡｓｎまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．４８にあるＸａａ（Ｌｅｕ，ＡｓｎまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．４９にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，ＰｒｏまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．５０にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，ＴｙｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５１にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｓｅｒ，Ａｓｎ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｇｌｕ，ＧｌｙまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．５２にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，ＡｌａまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．５３にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｐｈｅ，Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．５４にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，ＶａｌまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．５５にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，ＰｒｏまたはＨｉｓ）；ｒｅｓ．５６にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，Ｈｉｓ，Ｔｙｒ，Ａｌａ，Ｉ１ｅ，Ｌｙｓ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，ＧｌｙまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．５７にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，Ａｌａ，ＬｅｕまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．５８にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．５９にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，ＡｒｇまたはＧｉｙ）；ｒｅｓ．６０にあるＸａａ＝（Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｖａｌ，ＴｈｒまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６１にあるＸａａ＝（Ｃｙｓ，ＶａｌまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．６３にあるＸａａ＝（Ａｌａ，ＶａｌまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．６５にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ｇｌｙ，ＡｓｐまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６６にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，ＡｒｇまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６７にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，ＴｈｒまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．６８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，Ｔｈｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，ＬｙｓまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６９にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｐｒｏ，ＧｌｙまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７０にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ｔｈｒ，ＬｅｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７１にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ｐｒｏ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＡｓｎまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｉｌｅ，ＬｅｕまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７４にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，ＴｙｒまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．７５にあるＸａａ＝（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，ＧｌｎまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．７６にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ｌｅｕ，ＡｓｎまたはＧｌｕ）；ｒｅｓ．７７にあるＸａａ＝（Ａｓｐ，Ｓｅｒ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，ＧｌｙまたはＰｒｏ）；ｒｅｓ．７８にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｔｙｒ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｇｌｎ，Ｍｅｔ，Ｇｌｕ，ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７９にあるＸａａ＝（Ｓｅｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｖａｌ，Ｌｙｓ，Ｇｌｙ，ＧｌｎまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．８０にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ｌｙｓ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ａｒｇ，ＳｅｒまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．８１にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｉｌｅ，ＴｈｒまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８２にあるＸａａ＝（Ｉｌｅ，Ａｓｎ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｔｙｒ，ＡｓｐまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．８３にあるＸａａ＝（Ｌｅｕ，Ｔｙｒ，ＬｙｓまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８４にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｔｈｒ，ＧｌｕまたはＧｌｙ）；ｒｅｓ．８５にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，ＧｌｕまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．８６にあるＸａａ＝（Ｔｙｒ，Ｈｉｓ，ＧｌｕまたはＩｌｅ）；ｒｅｓ．８７にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，ＰｒｏまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８８にあるＸａａ＝（Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，ＧｌｙまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．８９にあるＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９０にあるＸａａ＝（Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ａｌａ，Ｔｈｒ，ＳｅｒまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．９１にあるＸａａ＝（ＶａｌまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．９２にあるＸａａ＝（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｖａｌ，Ａｌａ，ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９３にあるＸａａ＝（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，ＡｒｇまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９５にあるＸａａ＝（Ｇｌｙ，ＡｌａまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．９７にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｙ，ＬｅｕまたはＳｅｒ）である。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０でｒｅｓ．５３の後、Ｉｌｅが存在し、ＧＤＦ−１でｒｅｓ．５４の後、Ｔが存在し、ＢＭＰ３でｒｅｓ．５４の後、Ｖが存在し、ＢＭＰ−８およびドルサリン（Ｄｏｒｓａｌｉｎ）でｒｅｓ．７８の後、Ｇが存在し、ｈＧＤＦ−１でｒｅｓ．３７の後、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏが存在する。
【００７３】
ジェネリック配列１０（配列番号８）は、ジェネリック配列９（配列番号７）の全てを含み、それに加えて、Ｎ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。
【００７４】
配列番号９
Ｃｙｓ        Ｘａａ        Ｘａａ        Ｘａａ        Ｘａａ  
１                                                      ５  
したがって、残基６で開始し、ジェネリック配列１０の各“Ｘａａ”は、ジェネリック配列９に定義される特定のアミノ酸配列であり、該ジェネリック配列９のために記載された各残基番号がジェネリック配列１０で５つずれている点が異なる。ジェネリック配列９でｒｅｓ．１にある“Ｘａａ＝（Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｔｈｒ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，ＶａｌまたはＧｌｕ）”は、ジェネリック配列１０で、ｒｅｓ．６にあるＸａａを意味する。したがって、ジェネリック配列１０で、ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ａｌａ，またはＣｙｓ）；ｒｅｓ．３にあるＸａａ＝（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｍｅｔ，Ｌｙｓ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｔｙｒ，またはＡｌａ）；ｒｅｓ．４にあるＸａａ＝（Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｔｈｒ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｐｒｏ，またはＴｙｒ）；およびｒｅｓ．５にあるＸａａ＝（Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｔｙｒ，Ｌｙｓ，Ａｓｐ，またはＬｅｕ）である。
【００７５】
上記したように、本発明に有用な特定の現在好ましい骨形態形成ポリペプチド配列は、ｈＯＰ−１の好ましい参照配列を定義するアミノ酸配列と、６０％を上回る同一性、好ましくは６５％を上回る同一性、より好ましくは７０％を上回る同一性を有する。これらの特に好ましい配列として、ＯＰ−１タンパク質およびＯＰ−２タンパク質の対立形質的および系統学的対応変異体が含まれ、例えばショウジョウバエ６０Ａタンパク質が挙げられる。したがって、特定の特に好ましい実施形態では、有用な形態形成タンパク質として、本明細書で“ＯＰＸ”（配列番号４）と呼ぶジェネリックアミノ酸配列内のポリペプチド鎖対を含む活性タンパク質が挙げられ、該ジェネリックアミノ酸配列は７システイン骨格を定義し、いくつかの同定されたＯＰ−１とＯＰ−２の変異体間に相同性を伴う。そこに記載されているように、それぞれ独立して所定の位置にあるＸａａは、マウスまたはヒトのＯＰ−１またはＯＰ−２のＣ末端配列にある対応位置で生ずる残基から選択される。
【００７６】
【化５】
2005533089.tif 000006
【００７７】
ここで、ｒｅｓ．２にあるＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．３にあるＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．１１にあるＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．１６にあるＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．１９にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．２３にあるＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）；ｒｅｓ．２６にあるＸａａ＝（Ａｌａ  またはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３５にあるＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．３９にあるＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）；ｒｅｓ．４１にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）；ｒｅｓ．５０にあるＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５２にあるＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．５６にあるＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）；ｒｅｓ．５７にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）；ｒｅｓ．５８にあるＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．６０にあるＸａａ＝（Ｇｌｕ，ＡｓｐまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．６１にあるＸａａ＝（Ｔｈｒ，ＡｌａまたはＶａｌ）；ｒｅｓ．６５にあるＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）；ｒｅｓ．７１にあるＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）；ｒｅｓ．７３にあるＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．７５にあるＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）；ｒｅｓ．８０にあるＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）；ｒｅｓ．８２にあるＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）；ｒｅｓ．８４にあるＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）；ｒｅｓ．８９にあるＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）；ｒｅｓ．９１にあるＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）；およびｒｅｓ．９７にあるＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）である。
【００７８】
さらに別の好ましい実施形態では、有用な骨形成活性タンパク質はポリペプチド鎖を有し、該ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、低、中、または高度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、参照モルフォゲン配列（例えば、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、その他の保存７システインドメインを定めるＣ末端配列）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡに対してハイブリダイズする核酸によってコードされる配列を含む。本明細書で用いられるように、高度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、公知の技術にもとづいて、４０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、および０．１％ＳＤＳ、３７℃一晩、その後に０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、５０℃で洗浄するハイブリダイゼーションとして、定義される。標準的ストリンジェント条件は、市販の標準的分子クローニングテキストに十分に特徴づけられている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照せよ。それらの開示内容を参考として本明細書で援用する。
【００７９】
上記したように、本発明で有用なタンパク質は、一般に二量体タンパク質であり、上記ポリペプチドの折り畳み対を含む。そのような形態形成タンパク質は、還元した場合不活性であるが、酸化ホモ二量体として活性を有し、本発明の他のものと一緒に酸化された場合にヘテロ二量体を生成する。したがって、形態形成活性タンパク質内の形態形成ポリペプチドの折り畳み対のメンバーは、上記した特定のポリペプチドのいずれかから、それぞれ別個に選択され得る。
【００８０】
本発明の材料および方法に有用な骨形態形成タンパク質として、天然のソースから単離、または組み換えＤＮＡもしくは他の合成技術によって生産されたものであるかにかかわらず、上記したポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質、またそれらのタンパク質の対立遺伝的または系統学的対応変異体、それらのムテイン、ならびに種々の短縮または融合構築物が挙げられる。欠失または付加突然変異体も活性があると考えられ、該突然変異体として、変化が折り畳み構造内のシステインの相互関係を機能的に邪魔することがないという条件のもとで、保護Ｃ末端６または７システインドメインを変化させ得るものが挙げられる。したがって、そのような活性形態は、本明細書に開示した具体的記載の構築物と等価なものと考えられる。タンパク質は、種々のグリコシル化パターン、種々のＮ末端、アミノ酸配列相同性の領域を持つ関連タンパク質のファミリー、および天然のタンパク質もしくは生合成タンパク質（宿主細胞の組み換えＤＮＡの発現によって生成）の短縮もしくは突然変異した活性形態が挙げられ得る。
【００８１】
本明細書で考察した骨形態形成タンパク質は、原核または真核宿主細胞で無傷または短縮したｃＤＮＡから、あるいは合成ＤＮＡから発現することができ、精製、切断、再折り畳み、および二量体化して、形態形成活性組成物が形成される。現在好ましい宿主細胞として、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む原核生物あるいは酵母またはほ乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、もしくはＢＳＣ細胞）を含む真核生物が挙げられる。当業者は、他の宿主細胞も有利に用いることができることを理解する。本発明を実施する上で有用な骨形態形成タンパク質の詳細な説明は、骨形成活性についてそれらをどのように作製し、使用し、さらに試験するかが含まれ、これらは、数々の文献に記載されており、該文献として、本明細書に参考として援用される米国特許第５，２６６，６８３号および第５，０１１，６９１号のみならず、本明細書に援用された刊行物のいずれも包含され、その開示内容を本明細書では参考として援用する。
【００８２】
したがって、この開示および当該技術分野で入手可能な知識とを鑑みて、熟練した遺伝子工学者は、種々の異なる生物学的種の、適当なアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから遺伝子を単離、あるいはオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築することができ、その後にそれらを種々のタイプの宿主細胞（真核生物および原核生物の両方を含む）で発現させることができ、それによってほ乳類動物の軟骨性骨形態形成を刺激することができる大量の活性タンパク質を生成する。
【００８３】
（医薬品組成物）
本発明で提供される医薬品組成物は、少なくとも１種類、必要に応じて２種類以上の形態形成タンパク質の組み合わせを含み、該組み合わせは患者に投与または移植されると組織形成を誘導することができる。本発明の組成物を有効量投与することで、対象とする特定の臨床状態にもとづいて選択される処置部位での靱帯組織形成が誘導される。所定の用途に対する好ましい薬学的製剤および治療上有効な投薬計画の決定は、例えば、投与モード、患者の状態および体重、所望の処置の範囲、および該処置に対する患者の寛容性を考慮に入れることで、当該技術分野での技術の範囲内に十分ある。
【００８４】
治療計画を最適化するための適当な開始点と考えられる用量は、インビトロアッセイ、およびエキソビボまたはインビボアッセイの結果にもとづいている。そのようなアッセイの結果にもとづいて、適当な形態形成タンパク質および／または成長因子濃度の範囲は、動物の処置部位での試験、さらにその後のヒトでの試験に対して、選択され得る。
【００８５】
形態形成タンパク質の投与（形態形成タンパク質複合体、それらの塩もしくは薬学的に許容される誘導体の単離および生成形態を含む）は、免疫抑制活性を示す薬剤投与の従来通り認められたモードのいずれかを用いて達成可能である。
【００８６】
形態形成タンパク質を含む医薬品組成物は、種々の形状のものであってもよい。これらものとして、例えば、固体、半固体、および液体の剤形（例えば、錠剤、ピル、粉、液体溶液、または懸濁液、坐薬、および注射液または輸液）が挙げられる。好ましい形態は、投与および治療用途の意図されたモードに依存し、当業者によって選択可能である。投与モードとして、経口、非経口、皮下、静脈内、病巣内、または局所投与を挙げることが可能である。多くの場合、医薬品組成物は靭帯再生または修復を必要とする処置部位近傍に投与される。
【００８７】
形態形成タンパク質から構成される医薬品組成物を、例えば、取り込みまたは安定性を高める補因子の有無にかかわらず、滅菌された等張性の製剤に入れてもよい。製剤は、好ましくは液体であり、または凍結乾燥させた粉末であり得る。例えば、形態形成タンパク質を、５．０ｍｇ／ｍｌクエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌクエン酸３ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌグリシン、および１ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０を含む製剤緩衝液によって希釈してもよい。この溶液を凍結乾燥させ得、冷凍下で保存し得、注射用滅菌水（ＵＳＰ）による投与に先立って再構築してもよい。
【００８８】
上記組成物はまた、好ましくは当該分野で周知の従来の薬学的に許容されるキャリアも含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）を参照せよ）。そのような薬学的に受容可能なキャリアとして、他の医薬剤、キャリア、遺伝子用キャリア、アジュバント、賦形剤、その他（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物を挙げ得る。組成物は、好ましくは単位服用量の形態であり、通常、特定の組織処置に依存する服用計画として投与される。
【００８９】
医薬品組成物は、例えば、冒された組織あるいは該組織が浸された血流内、近傍、さもなればこれらと連通するミクロスフェア、リポソーム、他のミクロ粒状送達系、または徐放製剤を用いて投与することも可能である。
【００９０】
形態形成タンパク質を含有するリポソームは、周知の方法によって調製することができる（例えば、ＤＥ  ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，ｐｐ．３６８８−９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，ｐｐ．４０３０−３４（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号を参照せよ）。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌ％コレステロールよりも大きい、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型である。コレステロールの比率を選択して、形態形成タンパク質放出の最適な速度を制御する。
【００９１】
形態形成タンパク質はまた、他の生物学的活性分子（例えば、免疫抑制剤、サイトカイン、その他）を含むリポソームに結合させて、組織誘導の速度および特性を調節することができる。形態学的タンパク質および／または成長因子をリポソームに結合させることは、任意の既知架橋剤（例えば、毒素または化学療法剤を標的送達に対する抗体に結合させるのに幅広く用いられているヘテロ二官能性架橋剤によって、達成することが可能である。リポソームに対する接合は、炭水化物誘導架橋試薬である４−（４−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）を使用して達成されることもできる（Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ  ７７（１９９２））。
【００９２】
（キャリア）
形態形成タンパク質を、上記化合物にとって適当な送達系または支持系として機能する移植可能な生体適合性キャリア物質に分散させ得る。除放性キャリアの適当な例として、坐薬またはカプセル等の形状で半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能なマトリックスまたはミクロカプセルの徐放性マトリックスはポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，ｐｐ．５４７−５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，ｐｐ．９８−１０５（１９８２））が挙げられる。
【００９３】
この発明の一実施形態では、キャリアは粒子または多孔性材料から作られた生体適合性マトリックスを含む。孔は、前駆細胞の移動ならびにそれに続く分化および増殖を可能にする寸法のものが好ましい。当業者に公知の種々のマトリックスを用いることができる（例えば、米国特許第４，９７５，５２６号；同第５，１６２，１１４号、同第５，１７１，５７４号、およびＷＯ  ９１／１８５５８（これらは本明細書で参考として援用される）を参照のこと）。
【００９４】
粒度は、７０μｍ〜８５０μｍ、好ましくは７０μｍ〜４２０μｍ、最も好ましくは１５０μｍ〜４２０μｍの範囲内とすべきである。マトリックスは、分散粒子を一定の形状に密閉することによって作られ得、該形状は処置すべき特定の組織欠損にまたがる。マトリックスは、分散粒子を一定の形状に密閉することによって作られ、該形状は処置すべき特定の組織欠損にまたがる。あるいは、生体適合性であり、好ましくはインビボで生物分解性である材料は、遊走性の始原細胞の補充のために一時的な足場および基層として、そして後に続く係留および増殖用のベースとして役立つために構築し得る。
【００９５】
有用なマトリックス材料は、例えば、コラーゲン；グリコール酸、乳酸、および酪酸（その誘導体を含める）のホモポリマーまたはコポリマーならびにセラミック（例えばヒドロキシルアパタイト、リン酸三カルシウム、および他のリン酸カルシウム）を含む。これら、または他の適当なマトリックス材料の種々の組み合わせがまた、本明細書で述べるアッセイによって決定されることから有用であり得る。
【００９６】
現在好ましいキャリアとしては、粒子、鉱質除去、グアニジン抽出、種特異的（同種異系）骨、および特異的に治療する粒子、抽出されるタンパク質、鉱質除去外因性骨が挙げられる。必要に応じて、そのような外因性骨粉パウダーマトリックスもまたトリプシン等のプロテアーゼで処理してもよい。好ましくは、外因性マトリックスは、粒子内侵入量（多孔性）と表面積とを増加させるために、一種類以上のフィブリル変性剤で処理される。有用な変性剤として、溶媒（例えばジクロロメタン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、および酸（例えばトリフルオロ酢酸とフッ化水素））が挙げられる。本発明のマトリックスを処方するのに有用な、現在のところ好ましいフィブリル変性剤は、加熱水性媒体、好ましくはｐＨ４．５未満のｐＨ、最も好ましくは、ｐＨが約２〜４の範囲内でｐＨを有する酸性の水性媒体である。現在好ましい加熱酸性水性媒体は、ｐＨが約３である０．１％酢酸である。一般に約１時間にわたって高温（例えば、約３７℃ないし６５℃の範囲、好ましくは約４５℃ないし６０℃の範囲）で、加熱による鉱質除去、脱脂、水性媒体でのグアニジン抽出骨コラーゲンが、所望の表面形態学を達成するために、十分である。メカニズムが不明であるにもかかわらず、熱処理がコラーゲン原繊維を変性させて粒子表面積の増加をもたらすと仮定する。
【００９７】
鉱質除去されたグアニジン抽出外因性牛骨は、標準的な生体分子精製技術をさらに用いて分画化可能な追加の材料の混合物を含む。例えば、抽出成分をクロマトグラフ分離した後、クロマトグラムのピークに対応した種々の抽出分画の活性マトリックスへ加え戻すことは、骨または組織誘導活性の阻害剤を分別することで、マトリックス特性の改善に用いることが可能である。
【００９８】
マトリックスはまた、残留重金属が実質的に減少する可能性もある。本明細書に開示したように処置することで、マトリックスに含まれる個々の重金属濃度を約１ｐｐｍ未満に減少させることができる。
【００９９】
当業者は、骨または他の組織の誘導、あるいは生分解性徐放移植を促進する形態形成タンパク質組成物の生産に有用である所望の多孔性または表面微構造を持つ最適な生体適合性マトリックスを生成することが可能である。さらに、本明細書に開示したように調製された、合成的に製剤化したマトリックスを用いてもよい。
【０１００】
（マトリックス特性の全般的な考察）
いくつかの実施形態では、キャリアは生分解性−合成マトリックスまたは合成−無機マトリックス（例えば、ヒロドキシアパタイト（ＨＡＰ）、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、リン酸三カルシウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、およびそれらの種々のコポリマー）であってもよい。
【０１０１】
マトリックスジオメトリー、粒度、表面電荷の存在、ならびに粒子内および粒子間の両方の多孔性の度合いは、良好なマトリックス性能にとって重要である。研究が明らかにしたことは、表面電荷、粒度、およびミネラルの存在、さらにマトリックスと形態形成タンパク質とを結合させるための方法論のすべてが、良好な組織導入を達成する役割を果たすということである。
【０１０２】
マトリックス／骨形成タンパク質移植の接合面で連続的な細胞性反応は、複雑である。多段階式カスケードは、移植マトリックスへのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、間葉細胞の移動および増殖、始原細胞の分化および靱帯形成を含む。
【０１０３】
形態形成タンパク質のための良好なキャリアは、いくつかの重要な機能を実行する必要がある。それは、形態形成タンパク質の徐放送達系として、非特異的タンパク質分解から形態形成タンパク質を保護するものとして、さらに組織発達の過程での始原細胞誘導に関わる細胞反応の各ステップに対応して、作用するべきである。
【０１０４】
また、選択物質は、インビボで生体適合性でなければならず、好ましくは生分解性である；キャリアは、好ましくは新規の骨または組織によって完全に置き換わるまで一時的な足場として作用する。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、および種々の組み合わせは、インビボで異なる溶解速度を持つ。
【０１０５】
外因性骨から調製し、本明細書の開示通りに処理したマトリックス材料は、種々の臨床設定に役立つ移植可能な材料を生産する。種々の整形、歯周、および再建的手順の骨形成のためのマトリックスとして使用することに加えて、マトリックスはまた、徐放キャリアとして、あるいは整形または一般歯科用インプラントのための膠原性のコーティングとしても有用であり得る。
【０１０６】
マトリックスの形状は、手術を見越して、所望されるように形作られるものであってもよいし、または手術の最中に医師または技術者によって形づけられるものであってもよい。組織欠損にまたがり、かつ新規組織を所望の形態を得るために、マトリックスを成形することが望ましい。したがって、上記材料を局所、皮下、腹膜内、または筋肉内移植に用いてもよい。靱帯形成手順では、材料を少しずつ体に吸収させ、そして移植組織の形状または移植片の形状にたいへん近似する靱帯細胞によって、置き換える。
【０１０７】
マトリックスは、ゆるく付着された分散粒子（例えばコラーゲン）でできている保形固体から構成されるものであってもよい。マトリックスは、多孔質の成形固体、または単に周辺組織によってその場に密閉された粒子の凝集体を含み得る。咀嚼筋または他の組織をまた、使ってもよい。マトリックスはまた、ペーストまたはヒドロゲルの形態を取ることも可能である。
【０１０８】
キャリア物質がヒドロゲルマトリックスを含む場合、それは水から実質的に構成されるゲルの形態にある架橋親水性ポリマーの３次元ネットワークについて言及したものであり、好ましくは、限定されるものではないが、ゲルの含水量は９０％を上回る。ヒドロゲルマトリックスは、正味の正電荷または正味の負電荷を運ぶことができるか、または中性であり得る。正味の負電荷を持つ典型的なマトリックスは、アルギン酸塩である。正味の正電荷を運ぶヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニン等の細胞外マトリックス成分によって、特徴が表され得る。市販の細胞外マトリックス成分の例として、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）ＴＭおよびビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＭが挙げられる。正味の中性ヒドロゲルの例は、高架橋ポリエチレンオキシド、またはポリビニルアルコールである。
【０１０９】
種々の成長因子、サイトカイン、ホルモン、栄養剤、および治療用組成物、例えば抗生物質および化学療法剤、酵素、酵素阻害剤、および他の生物活性剤もまた、形態形成タンパク質を含むキャリア材料上に吸着または分散可能であり、該マトリックス材料がゆっくりと吸着されることから移植部位でゆっくりと時間を追って放出される。
【０１１０】
（他の組織特異的マトリックス）
上述の天然由来骨マトリックスに加えて、有用なマトリックスもまた、適当に成形された複数の薬剤を一緒に加えることで、合成的に製剤化することも可能である。そのようなマトリックスの一例は、多孔性で生体適合性があり、インビボで生分解可能な合成マトリックスであり、該マトリックスはＷＯ９１／１８５５８に開示されている。その開示を本明細書では参考として援用する。
【０１１１】
簡潔には、マトリックスは組織特異的細胞付着性因子として生体適合性、生物分解可能なコラーゲン、最も好ましくは組織特異的コラーゲンと、適当な組織特異的グリコサミノグリカンの多孔性架橋構造ポリマーとを含む。多数の供給源に由来する骨組織特異的コラーゲン（例えばＩ型コラーゲン）は、それらの合成マトリックスでの使用に適し得、可溶性コラーゲン、酸可溶性コラーゲン、中性または塩基性水溶液に可溶なコラーゲン、さらに市販されているそれらのコラーゲンが挙げられる。さらに、ＩＩ型コラーゲンはまた、軟骨で見られることから、Ｉ型コラーゲンと組み合わせて用いることもできる。
【０１１２】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはムコ多糖は、グリコシド結合したヘキソアミンの残基から構成された多糖類であり、ヘキソウロン酸もまたはヘキソース部分のいずれかで多かれ少なかれ制御された様式で変化する。ＧＡＧは動物由来で、組織特異的分布を有する（例えば、Ｄｏｄｇｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｄｉｃｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９６８）を参照）。ＧＡＧによる反応もまた、他の有益な性質（すなわち、動物宿主の免疫反応（異物反応）が引き起こすことができないこと）をコラーゲンに与える。
【０１１３】
有用なＧＡＧとしては、硫酸基、例えばヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン６−硫酸塩、コンドロイチン４−硫酸塩、デルマタン硫酸塩、およびケラチン硫酸塩が挙げられる。骨形成装置にとっては、コンドロイチン６−硫酸塩が現在のところ好ましい。他のＧＡＧもまた、本明細書に記載したマトリックスを形成するのに適し得、当業者は決まりきった実験を超えるものを用いることなく、他の適当なＧＡＧを知るか、または確認することが可能である。ムコ多糖類に関するより詳しい説明は、Ａｓｐｉｎａｌｌ，Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７０）を参照のこと。
【０１１４】
コラーゲンを、酸性水溶液中、好ましくは希酢酸溶液中で、ＧＡＧと反応させることができる。ＧＡＧを水性コラーゲン分散に滴下することで、ＧＡＧで覆われた、もつれ合ったコラーゲン原線維の共沈物が、得られる。このようなもつれ合った線維の塊を、つぎにホモゲナイズすることで、細線維からなる均質な分散液を形成し得、続いて濾過および乾燥する。
【０１１５】
コラーゲンＧＡＧ製品の不溶性は、それらの物質が共有結合による架橋によって、望ましい程度に上昇し得、これらの物質の吸収に対する抵抗性を高める役割も果たす。一般に、コラーゲンを架橋させるのに適した任意の共有結合Ｇ６０架橋方法もまたそれらの複合材料を架橋させるのに適しているが、デヒドロサーマルプロセスによる架橋が好ましい。
【０１１６】
乾燥した場合、架橋粒子が基本的に直径が約５００μｍの球形である。走査電子顕微鏡は表面上に約２０μｍ、内部に４０μｍの孔を示す。内部は繊維およびシート状の両方の構造から作られており、細胞が付着する面を提供する。間隙は相互接続しており、粒子の内部の至るところへ細胞がアクセスできるようになっている。材料は、間隙容量が約９９．５％であるように見え、材料が微小キャリアの１グラムあたり成長することができる潜在的細胞量に関して非常に効率的である。
【０１１７】
別の有用な合成マトリックスは、生体適合性、インビボ生物分解可能合成ポリマーから調製したマトリックスであり、例えばグリコール酸、乳酸、および／または酪酸から構成され、それらのコポリマーおよび誘導体が含まれる。これらのポリマーは、当該分野で十分記載されており、そして市販されている。例えば、ポリ乳酸（例えば、ＭＷ１００Ｋａ）、８０％ポリ乳酸／２０％グリコシドまたはポリ３−ヒドロキシ酪酸（例えば、ＭＷ３０Ｋａ）から構成されるポリマーは、すべてポリサイエンス社（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入することができる。ポリマー組成物は一般に粒子状で得られ、形態形成装置は好ましくは非水条件下（例えば、エタノール／トリフルオロ酢酸溶液、ＥｔＯＨ／ＴＦＡ中）で作ることで、ポリマーの加水分解を回避する。さらに、粒状ポリマー組成物の形態を変えることができ、例えば当該分野で既知の特定の多数ある溶媒処理のいずれかを用いて、多孔性を増加させる。
【０１１８】
上記の天然、合成、および組み換え形態形成タンパク質は、他の構築物と同様に、記載されている方法のいずれかを用いて混合して適当なマトリックス試料に分散することができる。一般に、ラットバイオアッセイを目的として、約５００〜１，０００ｎｇの活性形態形成タンパク質を２５ｍｇの不活性キャリアマトリックスと混合する。大きな動物では、一般にキャリア１ｇあたり約０．８〜１ｍｇの活性形態形成タンパク質が用いられる。キャリアに対する形態形成タンパク質の最適比率は、特異的に組み合わせについて、本明細書に示した手順にもとづいて当業者は経験にもとづいて測定することが可能である。大きな移植組織に対して、より多くの量を用いることが可能である。
【実施例】
【０１１９】
（実施例１  対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞の細胞増殖）
Ｌｏｎｇ  ＥｖａｎｓラットのＭＣＬを、膝関節にある周辺の結合組織から外科的に切除し、ＨＢＳＳで洗浄し、小片に切断して、ゲンタマイシン３０μｇ／ｍｌを添加した１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞が該組織片から発生し始め、培養３日ないし４日目に培養皿の表面に付着した。６日ないし７日後に、組織片を除去し、付着した細胞を密集するまで新たな培地で培養した。その後、該細胞を密集するまで継代培養して、液体Ｎ２内で冷凍した。図１Ａおよび１Ｂは、時間関数として、対照細胞の形態を示す。靭帯片から拡散し組織培養皿に付着した細胞は、特徴的な伸張形状を示し、紡錘状の核およびその総形態は、経過１および２で類似であった。
【０１２０】
実験のために、１００ｍｍまたは１５０ｍｍ皿内で、冷凍ストックから取り出した細胞を密集するまで再生させ、細胞密度４×１０４細胞／ｍｌで継代培養した。
【０１２１】
テトラゾリウム比色測定法（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ．Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって細胞増殖を評価した。要約すると、細胞を密集するまで９６ウェルプレートで培養し、その後、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）内でＯＰ−１を０、１００、２００、３００、および４００ｎｇ／ｍｌで２４時間処理した。培地を除去した後、培養物を無菌ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡおよび９６ＡＱ試薬２０μｌを含有する培地１００μｌを各ウェルに添加して、３７℃で４時間インキュベートし、発色させた。ＭＲＸマイクロプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ  ＶＡ）を用いて、発色した色を４９０ｎｍで測定した。無血清培内での異なる濃度のＯＰ−１を用いたＭＣＬ細胞の処理によって、適用量に依存して増加する細胞増殖が生じ、ＯＰ−１の４００ｎｇ／ｍｌで処理した細胞に対する増加は約４０％に及ぶ（図２参照）。
【０１２２】
（実施例２  対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞でのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性）
実施例１と同様に、実験のために若年成体雄ラットのＭＣＬを切除し、細胞を培養した。４８ウェルプレート中で増殖した密集細胞を、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地内で、ＯＰ−１の０、５０、１００、２００、３００、４００、および５００ｎｇ／ｍｌを用いて４８時間処理した。対照細胞を等量の溶媒ビヒクルで処理した。ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００内で、室温で５分間、超音波処理により該細胞を溶解した。Ｙｅｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：１９２１−３１（１９９６）に記載されるように、市販のアッセイキット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて、全細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を測定した。０．５Ｎ  ＮａＯＨを添加して反応を終了した。ＭＲＸマクロプレートリーダーを用いて、反応混合物の吸光度を４０５ｎｍで測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−５４（１９７６）に記載される方法にしたがって、標準としてＢＳＡを用いてタンパク質を測定した。全細胞タンパク質１μｇ当たりの遊離ｐ−ニトロフェノールのナノモルとしてＡＰ活性を表した。ＯＰ−１は、適用量依存様式で、ラットＭＣＬ細胞の初代培養物のＡＰ活性を増加させ、対照未処理細胞に比べて、ＯＰ−１の５００ｎｇ／ｍｌを用いて処理した細胞に対する増加は約７０％に及んだ（図３参照）。
【０１２３】
（実施例３  対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞中のＳｉｘ１、スクレラキシス、Ｒｕｎ２ｘ／Ｃｂｆａ、Ｉ型コラーゲン、およびＢＭＰ受容体群の発現）
ノーザンブロット分析によって、対照およびＯＰ−１処理細胞内のＳｉｘ１、スクレラキシス、Ｒｕｎ２ｘ／Ｃｂｆａ１、Ｉ型コラーゲン、ならびにＢＭＰ受容体のＡｃｔＲ−１、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、およびＢＭＰＲ−ＩＩのメッセンジャーＲＮＡ発現レベルを測定した。新規マウスホメオボックス含有遺伝子Ｓｉｘ１は、肢腱および靭帯に特異的な分子マーカーであるとして示唆されている（Ｏｌｉｖｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：７９３−８０５（１９９５））。ヘリックスループヘリックス転写因子スクレラキシスは、中胚葉形成および軟骨形成で複数の役割を果たすとして示唆されている（Ｂｒｏｗｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２６：４３１７−２９（１９９９）；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８：３８５５−６６（２００１））。Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１は、骨疾患特異的転写因子である。
【０１２４】
実施例１と同様に、実験のために若年成体雄ラットのＭＣＬを切除し、細胞を培養した。ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を用いて、製造元の指示に従い全ＲＮＡを単離した。Ｓｉｘ１のプローブは、ＡＴＣＣから購入した。スクレラキシス、Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１、およびＩ型コラーゲン用のプローブは、ＰＣＲによって得た。ＡｃｔＲ−Ｉ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、およびＢＭＰＲ−ＩＩ用のｃＤＮＡプローブは、Ｙｅｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８５：８７−９７（２０００）に従い適切な制限エンドヌクレアーゼを用いた対応するプラスミドの消化によって得た。Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）製のＳｔｒｉｐ−ＥＺ標識キットを用いて、該ｃＤＮＡプローブを３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識した。Ｙｅｈ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：４１８１−９０（１９９７）に記載されるようにノーザン分析をおこなった。
【０１２５】
対照細胞と、ＯＰ−１の２００ｎｇ／ｍｌで処理した細胞とのメッセンジャーＲＮＡ発現を１６日にわたって測定した。全ＲＮＡ（２０μｇ）を変性し、２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１％ＧＴＧアガロースゲル上で分画した。Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔ装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を用いて、分画したＲＮＡを「Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓ」膜に移し、ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、該膜に共有結合させた。該膜をｃＤＮＡプローブとともに一晩４２℃でインキュベートし、洗浄し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）用のスクリーンにさらし、分析した。別のプローブを用いてプロービングする前に、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、製造元のプロトコールに従いブロットを６８℃で取り除いて、放射能レベルがバックグラウンドまで低下しているかどうかを確認した。該ブロットも１８Ｓ  ｒＲＮＡオリゴヌクレオチドでプロービングして、充填のばらつきを矯正した。
【０１２６】
対照ＭＣＬ細胞は、時間依存様式でＳｉｘ１  ｍＲＮＡを発現し、ピーク発現は８日目に生じ、その後対照値に戻った。ＯＰ−１処理は、発現パターンを変化させなかった（図４Ａおよび４Ｂ参照）。
【０１２７】
対照ＭＣＬ細胞は、時間依存様式でスクレラキシス遺伝子を構成的に発現した。発現レベルは、初期位相に対して変化しないままであったが、１２日目に始まって劇的に増加した。ＯＰ−１処理は、その発現パターンを変化させなかった（図４Ａおよび４Ｃ参照）。
【０１２８】
Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１をコードするメッセンジャーＲＮＡは、対照ＭＣＬ細胞内で検出され、そのレベルは、培養の全１６日間低かった。ＯＰ−１処理は、最初の８日間はＲｕｎ２ｘ／Ｃｂｆａ１  ｍＲＮＡレベルを変化させなかったが、その後、約１．５倍に増加させた（図５参照）。
【０１２９】
対照ＭＣＬ細胞は、高レベルのＩ型コラーゲンｍＲＮＡを発現した。基礎ｍＲＮＡレベルは、約４日目に始まって増加し、培養の１６日目まで増加したままであった。ＯＰ−１処理ＭＣＬ細胞は、時間依存様式で、穏やかに増加した定常状態のｍＲＮＡ発現レベルを示し、約８日目にピークに達し、増加は約３０％であった。該レベルは、徐々に減少したが、１６日目では対照細胞よりも有意に高かった（図６参照）。
【０１３０】
ノーザンブロット分析から、ＭＣＬ細胞が培養１６日の間でＡｃｔＲ−Ｉ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、およびＢＭＰＲ−ＩＩをコードする遺伝子を発現することが実証された。対照細胞では、ＡｃｔＲ−Ｉ  ｍＲＮＡレベルは、時間関数として、わずかに増加した（図９参照）。対照細胞中のＢＭＰＲ−ＩＡおよびＢＭＰＲ−ＩＢ  ｍＲＮＡレベルは、徐々に増加し、ＡｃｔＲ−Ｉ  ｍＲＮＡレベルより大幅に増加した（図８および９参照）。ＢＭＰＲ−ＩＩ  ｍＲＮＡレベルは、培養の最初の４日の間、基礎レベルのままであったが、その後、有意に増加した（図８および９）。ＯＰ−１処理は、ＡｃｔＲ−Ｉ  または  ＢＭＰＲ−ＩＢ  ｍＲＮＡレベルに有意に影響を及ぼさなかった。ＯＰ−１処理は、ＢＭＰＲ−ＩＡ  ｍＲＮＡレベルを増加させ、８日目に最大増加は対照より約６０％上回った（図８および９参照）。ＯＰ−１処理は、ＢＭＰＲ−ＩＩ  ｍＲＮＡレベルを増加させ、最大増加は対照より約１００％上回った（図８および９参照）。
【０１３１】
（実施例４  Ｉ型コラーゲン対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞のプロモーター活性）
実施例１と同様に、実験のために若年成体雄ラットのＭＣＬを切除し、細胞を培養した。ラットＩ型コラーゲン遺伝子の転写開始部位（＋１）から−１２６３ｂｐ上流〜＋１０９ｂｐ下流範囲のヌクレオチドで構成される１．３７２ｋｂＤＮＡフラグメントを、ラット肝臓から単離したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによって生成した。無プロモータールシフェラーゼレポート遺伝子（Ｌｕｃ）を含有するｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）中に、（−１２６３／＋１０９）（配列番号：１１）プロモーターフラグメントをサブクローニングした。固有の制限酵素Ｂａｌ  Ｉ（Ｍｓｃ  Ｉ）で親プラスミドを消化した後の再ライゲーションによって、欠失クローン（−１２６３（Δ−１０２６／−４１１）／＋１０９）（配列番号：１２）も生成した。制限酵素マッピングおよび二本鎖ＤＮＡシーケンシングによって、両クローンを確認した。ラットＭＣＬ細胞の初代培養物を、一過的に、Ｉ型コラーゲンプロモーター構築物でトランスフェクションし、ＯＰ−１の５０または２００ｎｇ／ｍｌで６日間処理した。その後、ルシフェラーゼ活性を測定し、Ｄｕａｌ測定キット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性に標準化した。
【０１３２】
ＯＰ−１は、適用量依存様式でＩ型コラーゲンのプロモーター活性を刺激した。ＯＰ−１は、基礎ルシフェラーゼ活性を約１５％刺激した。ＯＰ−１の５０ｎｇ／ｍｌで処理した−１２６３／＋１０９および−１２６３（Δ−１０２６／−４１１）／＋１０９プロモーター配列を含有するクローンは、プロモーター活性での−８０％増加を示した。ＯＰ−１の２００ｎｇ／ｍｌで処理したものは、プロモーター活性での約１４０％増加を示した（図７参照）。
【０１３３】
（実施例５  対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞中のＢＭＰ  ｍＲＮＡ発現）
実施例１と同様に、実験のために若年成体雄ラットのＭＣＬを切除し、細胞を培養した。
【０１３４】
ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＭｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔｓを含むＲｉｂｏＱｕａｎｔ  ＲＮａｓｅ保護分析（「ＲＰＡ」）キットを用いて、対照およびＯＰ−１処理ＭＣＬ培養物中の複数のＢＭＰのｍＲＮＡ発現を１６日にわたって測定した。ｍＢＭＰ−１  Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔは、ＢＭＰ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８Ａ、および−８Ｂに対するｍＲＮＡの検出を可能にする。ＢＭＰ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８Ａ、および−８Ｂに対する保護されたフラグメントは、それぞれ１４８、１６０、１８１、２２６、２５３、２８３、３１６、３５３、および１３３ヌクレオチド長であった。該Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔは、サンプリングまたは技術誤差の標準化を可能にするリボソームタンパク質Ｌ３２およびＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡを検出できる。ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＲｉｂｏＱｕａｎｔインビトロ転写キットを用いて、アンチセンスＲＮＡプローブを３２Ｐ−ＵＴＰで標識した。８Ｍ尿素を含有する５％ポリアクリルアミドゲル上で、保護されたフラグメントを分析し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて検出し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を用いて定量した。
【０１３５】
対照ＭＣＬ培養物中で、有意なレベルのＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−６のｍＲＮＡが検出された。図１０および１１に示すように、ＢＭＰ−１およびＢＭＰ−４のｍＲＮＡレベルは、対照細胞中で、時間関数として増加した。ＢＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、培養１６日目に、最大で０日のレベルの約３倍に達した。ＢＭＰ−４  ｍＲＮＡレベルは、時間関数として劇的に増加し、培養１６日目に、最大で０日のレベルの約７倍に達した。ＯＰ−１処理細胞中のＢＭＰ−１  ｍＲＮＡレベルは、全１６日を通して対照の０日目のレベルまでほぼ低下した。ＢＭＰ−４  ｍＲＮＡレベルは、ＯＰ−１処理細胞では変化しなかった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６  ｍＲＮＡレベルは、１６日の間で、対照細胞中で、時間依存的な周期的様式でわずかに変化した。ＯＰ−１処理によって、対照と比較して、ＢＭＰ−２  ｍＲＮＡレベルの２０ないし４０％の減少が生じた。ＯＰ−１処理は、対照と比べて、ＢＭＰ−６  ｍＲＮＡ発現を５０％も減少させた（図１０および１１参照）。
【０１３６】
（実施例６  対照およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞中のＧＤＦ  ｍＲＮＡ発現）
実施例１と同様に、実験のために若年成体雄ラットのＭＣＬを切除し、細胞を培養した。
【０１３７】
実施例５に記載されるように、ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＭｏｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔｓを含むＲｉｂｏＱｕａｎｔ  ＲＰＡキットを用いて、ＧＤＦレベルを１６日にわたって測定した。ｍＧＤＦ−１  Ｍｕｌｔｉ−Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔは、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−９の検出を可能にする。ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−９に対する保護されたフラグメントは、それぞれ１４８、１６０、１８１、２２６、２５３、２８３、および３１６ヌクレオチド長であった。該Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｅｔは、サンプリングまたは技術誤差の標準化を可能にするリボソームタンパク質Ｌ３２およびＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡを検出できる。ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＲｉｂｏＱｕａｎｔインビトロ転写キットを用いて、アンチセンスＲＮＡプローブを３２Ｐ−ＵＴＰで標識した。８Ｍ尿素を含有する５％ポリアクリルアミドゲル上で、保護されたフラグメントを分析し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて検出し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を用いて定量した。
【０１３８】
１６日間の培養の間、ＧＤＦ−１  ｍＲＮＡレベルは、対照およびＯＰ−１処理細胞両方で、時間関数として増加し、それぞれ最大で０日目対照の５倍および３倍に達した。同様に、対照細胞中のＧＤＰ−３、ＧＤＰ−６、およびＧＤＰ−８のｍＲＮＡレベルは、時間関数として増加し、それぞれ最大で０日目対照に比べて７倍、３倍、および１．７倍に達した。ＯＰ−１処理は、時間依存変化を消滅させることなく増加程度を低下させ、それぞれ最大で０日目対照と比べて４倍、２倍、および１．５倍であった。対照培養物中のＧＤＦ−５  ｍＲＮＡレベルは、８日目に、０日目対照と比べて約１．７倍に増加した。ＯＰ−１は、４日目以外は、増加を抑制した（図１２および１３参照）。
【０１３９】
（実施例７  エキソビボでの靭帯組織の培養）
患者の膝関節にある周辺の結合組織からＭＣＬを外科的に無菌条件下で切除する。ＭＣＬをＨＢＳＳおよびペニシリンストレプトマイシン（ペニシリン１００単位／ｍｌおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ）で洗浄し、小片に切断する。
【０１４０】
ゲンタマイシン３０μｇ／ｍｌを添加した１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地で、３７℃、５％ＣＯ２で靭帯片を培養する。細胞が該組織片から発生し始め、培養３日ないし４日目に培養皿の表面に付着する。６日ないし７日後に、組織片を除去し、付着した細胞を密集するまで新たな培地で培養する。
【０１４１】
１ないし２分間または全ての細胞が剥離されるまで、トリプシン−ＥＤＴＡ混合物を用いた処理によって靭帯細胞を培養皿から剥離する。細胞を密集するまで継代培養し、液体Ｎ２内で冷凍し、処理のために再生する。１００ｍｍまたは１５０ｍｍ皿内で、冷凍ストックから取り出した細胞を密集するまで再生させ、細胞密度４×１０４細胞／ｍｌで継代培養する。
【０１４２】
無血清培地内で、骨形成タンパク質（例えば、ＯＰ−１）を用いて培養靭帯細胞を所定の時間処理し、トリプシンＥＤＴＡ処理によって回収し、培地で洗浄し、患者への移植のために無菌ＨＢＳＳに懸濁する。
【０１４３】
（実施例８  動物への移植）
雄ラットに外科手術を施す。通常の麻酔の後に、該ラットを仰臥位に置き、膝関節を露出させる。完全な厚さの靭帯欠損をＡＣＬで生成する。該動物を４つの群に分類する。動物の第１群（対照群）の欠損を緩衝剤またはビヒクルで処理する。動物の第２群の欠損をＯＰ−１（５ないし５０００ｎｇ／ｍｌ）で処理する。エキソビボで培養した靭帯細胞で動物の第３群の欠損を処理し、ＯＰ−１（５ないし５０００ｎｇ／ｍｌ）で処理する。ＯＰ−１（５ないし５０００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でエキソビボで培養した靭帯細胞で動物の第４群の欠損を処理し、ＯＰ−１（５ないし５０００ｎｇ／ｍｌ）で処理する。全ての場合で、その後、関節を閉じ、縫合する。該動物を麻酔から回復せる。４、８、および１２週後に、動物を安楽死させ、ＡＣＬ検査する。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、ラットＭＣＬ細胞初代培養の細胞形態を示す。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。培地の交換を３日毎におこなった。細胞形態は、ＣＣＤカメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ２倒立顕微鏡により時間の関数として観察した。継代１回目の細胞（図１Ａ）および継代２回目の細胞（図１Ｂ）の典型的な画像（１００倍の位相差画像）を表した。
【図２】図２は、ラットＭＣＬ細胞増殖に対するＯＰ−１の効果を示すグラフである。ＭＣＬ細胞を増殖させて密集させ、種々の量のＯＰ−１で２４時間処理した。細胞増殖の定量は、比色測定法によっておこなった。賦形剤対照群（１として）に対して値を規準化し、７回の独立した測定の平均値±ＳＥＭで表した。
【図３】図３は、ラットＭＣＬ細胞初代培養でのアルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）活性に対するＯＰ−１の効果を示めすグラフである。ＭＬＣ細胞を増殖させて密集させ、種々の濃度のＯＰ−１（５０、１００、２００、３００、４００、および５００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。細胞ライセートの全ＡＰ活性を４８時間後に測定した。溶媒対照群（１として）に対して値を規準化し、２種類のＭＣＬ細胞試料に対して３通りの測定をおこない、それらを平均値±ＳＥＭで表した。
【図４】図４は、対照ラットＭＣＬ細胞およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞の長期培養でのＳｉｘ１およびスクレラキシス（ｓｃｌｅｒａｘｉｓ）ｍＲＮＡの発現レベルを示す。図４Ａは、Ｓｉｘ１およびスクレラキシスｍＲＮＡのノーザンブロットである。集密的なＭＣＬ細胞を、異なる期間、溶媒ビヒクルまたは２００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１で処理した。全ＲＮＡを、指定日に単離し、ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで変性および分離をおこない、Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓ膜上に移した。ブロットに対して、Ｓｉｘ１、スクレラキシスのｃＤＮＡプローブ、または１８ＳＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせた。適当な条件下で洗浄した後、ブロットを蛍光像（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ）スクリーンにさらした。図４Ｂは、図４Ａに示したＭＣＬ細胞でのＳｉｘ１  ｍＲＮＡレベルの定量分析である。図４Ａに示すハイブリダイズしたＲＮＡの強度をイメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）ソフトウェアで分析した。１８ＳのｒＲＮＡレベルに対してｍＲＮＡレベルを規準化させた。つぎに、規準化ｍＲＮＡレベルを、０日目（処置が開始された日）の対照値を１としてこれと比較した。図４Ｃは、図４Ａに示すＭＣＬ細胞のスクレラキシスｍＲＮＡレベルの定量分析である。値は、独立した測定を２回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図５】図５は、ノーザンブロット分析で測定したとおりに、ラットＭＣＬ細胞の長期培養でのＲｕｎ２ｘ／Ｃｂｆａ１  ｍＲＮＡ発現に対するＯＰ−１の効果をグラフで表したものである。図４に示すように、集密的なＭＣＬ細胞を処理した。ブロットをＲｕｎ２ｘ／Ｃｂｆａ１のｃＤＮＡプローブを用いて調べた。値は、独立した測定を２回おこなった際の平均値±ＳＥＭで表される。
【図６】図６は、ノーザンブロット分析で測定したとおりの、ラットＭＣＬ細胞の長期培養でのＩ型コラーゲンの定常ｍＲＮＡレベルに対するＯＰ−１の効果を示すグラフである。図４に示すように、集密的なＭＣＬ細胞を処理した。ブロットをＩ型コラーゲンのｃＤＮＡプローブで調べた。値は、独立した測定を２回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図７】図７は、ラットＭＣＬ細胞内に過渡的にトランスフェクトされたＩ型コラーゲンのプロモーター活性に対するＯＰ−１の効果を示すグラフである。ラットＭＣＬ細胞の初代培養を、実施例４に示したＩ型コラーゲンプロモーター構築物によりトランスフェクトし、溶媒（５０ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１）で６日間にわたり処理した。次に、ルシフェラーゼ活性を測定し、デュアル（Ｄｕａｌ）アッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、βガラクトシダーゼ活性に対して規準化した。値は、独立した測定を２回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図８】図８は、対照ラットＭＣＬ細胞およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞の長期培養でのＡｃｔＲ−Ｉ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、および１８Ｓの典型的なノーザンブロットである。ＭＣＬ細胞を、示した時間にわたって２００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１で処理した。培地を３日毎に新しくした。全ＲＮＡを分離し、図４に示すように処理した。ブロットを、ＡｃｔＲ−Ｉ、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢ、およびＢＭＰＲ−ＩＩの各々のｃＤＮＡプローブまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。
【図９】図９は、図８に示したノーザンブロットを示すグラフである。図８に示した結果を図４に記載したようにして定量化した。値は、独立した測定を２回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図１０】図１０は、対照ラットＭＣＬ細胞およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞でのＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−６のｍＲＮＡ発現を示す典型的なＲＮアーゼ保護分析ブロットである。集密的な培養物を、所定の日数にわたってビヒクルまたは２００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１で処置した。全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬を用いて分離した。２０μｇの完全ＲＮＡを、ＲＮアーゼ保護分析でのＢＭＰ  ｍＲＮＡ測定に用いた。保護ＲＮＡフラグメントを、８Ｍ尿素含有５％ポリアクリルアミドゲル上で分画化し、蛍光像形成（ｐｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｉｎｇ）によって検出した。異なるＢＭＰおよび２種類のハウスキーピング遺伝子対照群（リボゾームタンパク質Ｌ３２およびＧＡＰＤＨ）に対する標識プローブの位置は、像の左側である。保護フラグメントは、右側に示されている。
【図１１】図１１は、図１０に示したＲＮアーゼ保護分析を示すグラフである。図１０に示す保護フラグメントの強度を、イメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）ソフトウェアを用いて、分析および定量化した。値は、異なる測定を２〜３回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図１２】図１２は、対照ラットＭＣＬ細胞およびＯＰ−１処理ラットＭＣＬ細胞でのＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、およびＧＤＦ−８のｍＲＮＡ発現を示す典型的なＲＮアーゼ保護分析ブロットである。集密的な培養物を、所定の日数にわたってビヒクルまたは２００ｎｇ／ｍｌのＯＰ−１で処理した。全ＲＮＡを、図１０に示したとおりに分析した。異なるＧＤＦおよび２種類のハウスキーピング遺伝子対照群（リボゾームタンパク質Ｌ３２およびＧＡＰＤＨ）に対する標識プローブの位置は、像の左側である。保護フラグメントは、右側に示されている。
【図１３】図１３は、図１２に示したＲＮアーゼ保護分析を示すグラフである。図１２に示す保護フラグメントの強度を、イメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）ソフトウェアを用いて、分析および定量化した。値は、異なる測定を２〜３回おこなった際の平均値±ＳＥＭを表す。
【図１】
2005533089.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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