(57)【要約】定量的及び定性的分析を通して、リポタンパク質を異常、特にプロトロンビナーゼ増強に関して検査することにより、止血機能不全、重症感染及び全身性炎症反応症候群について被験者を診断し、監視するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）患者の試料を得ること；（ｂ）前記試料からのリポタンパク質分画を異常に関して測定すること；及び（ｃ）前記リポタンパク質測定を、重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全を有する患者において認められる異常に相関させることを含む、感染、ＳＩＲＳあるいはセプシスに対する宿主反応を診断し、監視するための方法。
【請求項２】
前記リポタンパク質異常が、重症感染、ＳＩＲＳ及び／又はセプシスを有する患者のプロトロンビナーゼ活性を支持する高い能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポタンパク質分画がβリポタンパク質を含み、前記のプロトロンビナーゼ活性を支持する高い能力が正常試料と比較してプロトロンビナーゼ活性の少なくとも２倍の上昇を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記段階（ｂ）を、トロンビン生成速度を測定することによって実施し、前記βリポタンパク質がリポタンパク質を含有するアポＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定段階を、前記βリポタンパク質とＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）との間での複合体形成の不在下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）患者の試料を得ること；（ｂ）前記試料からのリポタンパク質分画をＰＴアーゼに関して測定すること；（ｃ）前記試料のプロトロンビン活性化を正常患者試料又は異常患者試料の標準品と比較すること；及び（ｄ）前記患者の死亡率を予測するために前記比較を利用することを含み、システム不全又は死亡の可能性が高い患者に関しては、ＰＴアーゼを支持する前記リポタンパク質が正常試料と比較してＰＴアーゼ活性の少なくとも２倍の上昇を示す、患者においてシステム不全又は死亡の高い可能性を予測する方法。
【請求項７】
（ａ）患者から超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の試料を得ること；及び（ｂ）プロトロンビンを活性化するための前記血漿又は血清試料中のＶＬＤＬの活性を測定することを含み、プロトロンビンを活性化するための前記ＶＬＤＬのより高い活性が前記患者における感染の高い可能性を指示する、患者において感染の高い可能性を予測するための方法。
【請求項８】
前記患者が二相性波形を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＶＬＤＬの活性の測定を直接又は間接的に実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＬＤＬの前記活性を、トロンビン生成の速度を測定することを含む方法によって実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）患者の試料を得ること；（ｂ）該患者試料を二相性波形スクリーニング試験に供して、正常又は二相性波形結果を得ること；（ｃ）前記二相性波形結果を示す前記患者試料をリポタンパク質のＰＴアーゼ測定に供すること；及び（ｄ）高いＰＴアーゼ活性を示す患者と重症感染、ＳＩＲＳ又はセプシスの診断との関係を判定することを含む、重症感染、ＳＩＲＳ又はセプシスを診断するための方法。
【請求項１２】
前記感染がセプシスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記関係が、該患者がＤＩＣを有することを指示する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）患者から血液試料又は血清試料を得ること；（ｂ）ＮＭＲを含む分析を用いて前記試料のリポタンパク質分画をリポタンパク質の定性的又は定量的特性に関して測定すること；（ｃ）前記試料のリポタンパク質の前記特性を正常患者試料又は異常患者試料の標準品と比較すること；及び（ｄ）前記比較を、感染、ＳＩＲＳ及びセプシスに対する宿主反応を診断する及び／又は監視するために使用することを含む、感染、ＳＩＲＳ及びセプシスに対する宿主反応を診断し、監視するための方法。
【請求項１５】
（ａ）患者から試料を得ること；（ｂ）前記試料を、異常を含むリポタンパク質を捕獲するために特異的結合剤と接触させること；（ｃ）前記の捕獲した異常リポタンパク質を定量的又は定性的に分析して結果を得ること；及び（ｄ）前記結果を、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者において認められる異常リポタンパク質と相関させることを含む、重症感染、ＳＩＲＳ及びセプシスを有する患者を診断し、監視する特異的結合アッセイ。
【請求項１６】
前記特異的結合剤がアネキシン５（Ａｎｎｅｘｉｎ  ５）である、請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記特異的結合剤がアネキシン５に特異的な抗体である、請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
プロトロンビナーゼ構築を阻止するためにアネキシン５の有効量を投与することを含む、重症感染、ＳＩＲＳ又はセプシスに関して患者を治療するため方法。
【請求項１９】
前記患者がＤＩＣを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）患者からリポタンパク質の試料を得ること；（ｂ）該リポタンパク質が正常患者試料からのリポタンパク質と比較して異常であるかどうかを判定すること；及び（ｃ）検出した異常リポタンパク質に基づいて該患者におけるセプシスの存在を予測することを含む、患者においてセプシスの存在を予測するための方法。
【請求項２１】
該異常リポタンパク質が、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＬＤＬから成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）患者からリポタンパク質の試料を得ること；（ｂ）該リポタンパク質が正常患者試料からのリポタンパク質と比較して異常であるかどうかを判定すること；及び（ｃ）検出した異常リポタンパク質に基づいて該患者における止血機能不全の存在を予測することを含む、患者において止血機能不全の存在を予測するための方法。
【請求項２３】
前記段階（ｂ）を、修正ＡＰＴＴアッセイにおいて凝固時間の短縮を測定すること又は希釈組織因子に基づくアッセイにおいて血栓形成の加速の速度上昇を測定することにより、二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬの凝血促進性局面の増強を検出することによって実施する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）患者試料を得ること；（ｂ）前記試料からのリポタンパク質分画を総表面積に関して測定すること；及び（ｃ）前記リポタンパク質測定を、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者において認められる高い表面積のリポタンパク質異常と相関させることを含む、感染、ＳＩＲＳ及びセプシスに対する宿主反応を診断し、監視するための方法。
【請求項２５】
前記リポタンパク質表面積が、正常患者試料と比較して少なくとも約４５％高い、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本出願は、米国特許仮出願第ＳＮ６０／３５９，９３２号（２００２年２月２７日出願）、第ＳＮ６０／３６３，０７３号（２００２年３月１１日出願）、第ＳＮ６０／３９６，３９２号（２００２年７月１７日出願）及び第ＳＮ６０／４０４，６５２号（２００２年８月２０日出願）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
重症感染及びセプシスは罹病及び死亡の一般的な原因である。セプシスは、多くの形態をとる極めて広い臨床的実体である。感染に対する宿主反応の病態生理学は複雑であり、全身性炎症の徴候及び症状は、感染性又は非感染性の病因を有することがあり、特異的ではない。全身感染症を有する患者はしばしば、感染を伴わない類似した臨床徴候及び検査所見を有する患者と識別することが困難である。感染は、細菌、真菌、寄生生物及びウイルスによって引き起こされるものを含む数多くの原因を有する。
【０００３】
感染の細菌学的証拠は、窮迫の臨床徴候と同時には発現しないことがある。さらに、感染性細菌の存在を確認するために血液試料からの生物の培養を増殖させるには時間がかかり、またその結果は汚染、等々のために正確ではないことがありうる。ここで使用するとき、重症感染は、セプシス、重症セプシス、敗血症及び敗血症性ショックならびに汎発性血管内凝固（「ＤＩＣ」）の診断を包含しうる。また、全身性炎症反応症候群「ＳＩＲＳ」も、感染性ならびに非感染性由来を有しうるが（どちらもここに包含される）、感染の定義に包含される。ＳＩＲＳは、最終的に多臓器機能不全症候群へと至る全身性炎症を示す又は全身性炎症へと進行することがある。ＳＩＲＳを有する患者は、感染、外傷、熱傷、膵炎、等々からの症候群を発現しうる。
【０００４】
ここで使用するとき止血機能不全は、凝固の障害と定義しうる。ＤＩＣ及びセプシスの両方に関して、炎症と凝固を結びつける共通且つ重複する病態生理学的経路の認識が高まりつつある。特に、失敗に終わった数え切れないほどの戦略の後に、最近、重症セプシスにおいて組換えヒト活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）が治療上の成功を収めたことはこれをさらに裏付けるであろう。ＡＰＣは、凝固補因子である第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子の不活化を通してトロンビン生成を抑制し、同時に抗炎症特性も有すると思われる。
【０００５】
現在の診断方法には特異性がないため、感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全の早期インジケーター又はマーカーを見出すことが引き続き必要とされている。早期診断は患者の回復を大きく上昇させ、この患者群に関連する罹病率及び死亡率を低下させると考えられる。また、感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全に対する宿主反応の治療効果を監視する診断マーカー又は試験も求められている。
【０００６】
凝固スクリーニングアッセイの時間依存的測定プロフィールは、Ｇｉｖｅｎｓら、国際公開公報第ＷＯ９６／４１２９１号及びＴｏｈら、国際公開公報第ＷＯ００／４６６０３号に述べられているように先天性及び後天性平衡失調及び止血機能不全の予測に結び付けられてきた。かつては血栓形成前の血漿光透過率低下を有するそのようなプロフィールは、活性化部分トロンボプラスチン時間（「ＡＰＴＴ」）アッセイのものであったが、現在は一般に二相性波形（ここではＢＰＷとも称する）と称される。このＢＰＷは、セプシスを含む多くの原発性疾患において一般的であるＤＩＣを有する危険な状態の疾病患者に結び付けられてきた。凝固機器での二相性波形は、ＤＩＣを含む止血機能不全の早期診断のための簡単で迅速な試験を提供する。
【０００７】
国際公開公報第ＷＯ０１／９６８６４号（２００１年１２月２０日）に述べられているように、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）とリポタンパク質（特に超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ））との間のカルシウム依存性複合体が、二相性波形の基礎となる分子機構として特定されている。この複合体は、出血又はＤＩＣを含む血栓症を導きうる他の止血機能不全を有する患者に加えて、セプシス、ＳＩＲＳ及び敗血症を有する患者を特定するために使用しうる。さらに、国際公開公報第ＷＯ０１／９６８６４号は、凝固アッセイ、ラテックス凝集反応又は金ゾルアッセイ、及び使用する試薬に依存して、血栓形成の前に又は血栓形成が存在しない場合に沈殿物が形成される免疫測定法によって、該複合体を検出することを述べている。
【０００８】
二相性波形及びＣＲＰ−リポタンパク質複合体は様々な種類の重症感染及び止血機能不全（ＤＩＣ及びセプシスを含む）の早期診断における進歩を提供するが、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全の早期診断手段、特にマーカーをさらに特定することが引き続き求められている。
【０００９】
（発明の要約）
重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全に対する宿主反応の診断及び監視が、正常な健常者試料において認められるリポタンパク質と比較してこの個体群のリポタンパク質との間で定性的及び定量的な相違を検出することによって実現されうることが発見された。
【００１０】
１つの好ましい実施形態では、（ａ）患者の試料を得ること；（ｂ）上記試料からのリポタンパク質分画を異常に関して測定すること；及び（ｃ）上記リポタンパク質測定を、重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全を有する患者において認められる異常に相関させることを含む、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を診断し、監視するための方法が見出された。さらに、上記方法は、上記患者においてシステム不全又は死亡の高い可能性を予測するために利用できる。
【００１１】
本発明のもう１つの局面は、（ａ）患者から超大密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の試料を得ること；及び（ｂ）プロトロンビンを活性化するための上記試料中のＶＬＤＬの活性を測定することを含み、プロトロンビンを活性化するための上記ＶＬＤＬのより高い活性が上記患者における感染の高い可能性を指示する、患者において感染（特にセプシス）の高い可能性を予測するための方法である。その測定段階は、トロンビン生成の速度を測定することなどの何らかの適切な手段によって直接又は間接的に実施しうる。
【００１２】
本発明のさらにもう１つの局面では、重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全を診断するための方法は、（ａ）患者の試料を得ること；（ｂ）該患者試料を二相性波形スクリーニング試験に供して、正常又は二相性波形結果を得ること；（ｃ）上記二相性波形結果を示す上記患者試料をリポタンパク質分析に供すること；及び（ｄ）上記リポタンパク質分析を正常試料のものと比較して、重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全を診断することを含む段階によって実施される。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの局面では、重症感染を診断するための方法は、（ａ）患者から試料を得ること；（ｂ）上記試料のリポタンパク質分画をアネキシンＶとの結合特異性に関して測定すること；及び（ｃ）上記結合特異性プロトロンビン活性を、ＳＩＲＳ、ＤＩＣ及びセプシスを含む重症感染に対する宿主反応の診断及び／又は監視と相関させることを含む段階によって実施される。さらに、上記方法は、上記患者においてシステム不全又は死亡の高い可能性を予測するために利用できる。
【００１４】
（詳細な説明）
インビボで形成されるリポタンパク質−急性期タンパク質複合体（典型的にはＣＲＰ−ＶＬＤＬと称される）が感染及びセプシスを有する患者において記述されているが、該複合体基質から分離したリポタンパク質亜分画を定量的及び定性的に識別する測定は、これまで感染、ＳＩＲＳ、セプシス又は止血機能不全と結び付けられていなかった。重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者のリポタンパク質分画は正常患者のものと識別可能であり、それ故リポタンパク質自体を、これらの疾患状態を診断し、監視するためのバイオマーカーとして使用しうることが発見された。この患者群のリポタンパク質における相違は、単に複合体を形成するリポタンパク質だけに限定されない。これらのリポタンパク質サブクラスにおける障害は複合体形成に影響を及ぼし、同時に臨床的結果の決定因子でもありうる。
【００１５】
患者試料からリポタンパク質を得る段階は、患者から血液試料を採集し、その後重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者において認められる異常リポタンパク質を（定量的又は定性的に）検査するための手段を用いることなどの、適切な手段によって実施しうる。
【００１６】
さらに、特異的結合アッセイを使用すれば、異常リポタンパク質を分離する必要はないと考えられ、上記アッセイは競合的又は非競合的のいずれでもよい。そのようなアッセイでは、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全、特にセプシス及びＤＩＣを有する患者において認められるリポタンパク質異常の一部又は全部に直接又は間接的に結合する成分を設計することができ、それ故患者試料（試料はここでは血漿、全血試料、血清、等々を包含すると定義される）を、リポタンパク質に関連する異常に関して直接分析しうる。より好ましくは、該アッセイは、凝固アッセイ、ラテックス凝集反応又は金ゾルアッセイ、リガンドアッセイ、タンパク質結合アッセイ又は免疫測定法でありうる。より好ましくは血清又は血漿を患者試料として使用し、血漿が最も好ましい。１つの好ましいアッセイでは、異常リポタンパク質の表面変化を、直接又は間接的に、アネキシン５（Ａｎｎｅｘｉｎ  ５）（又は陰イオンリン脂質を認識する別の特異的リガンド）へのリポタンパク質結合によって測定する。好ましくは、該リポタンパク質をＶＬＤＬ、ＩＤＬ及びＬＤＬに細分しうる。さらに、アネキシン５に特異的な抗体（又はそのフラグメント）を作製し、特異的結合アッセイにおいて、異常リポタンパク質を検出し、その後重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全、特にＤＩＣ又はセプシスを有する患者と相関させるように使用しうる。
【００１７】
特に、本発明によれば、感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全、より好ましくはセプシス及びＤＩＣに対する宿主反応についての診断方法が提供され、それによってリポタンパク質のインビボでの循環複合体が異常と特定される。好ましくは、該方法はβリポタンパク質（リポタンパク質を含有するアポＢ）、特に超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）を含む同じ浮遊密度のものに特異的である。より好ましくは、陰イオンリン脂質を異常に関して検査し、最も好ましくはＶＬＤＬを検査する。該方法は、ひとたび治療が開始された後、患者の予後を予測し、患者を監視するために使用しうる。リポタンパク質の試験は手動又は自動のいずれでもよく、ＮＭＲ分析を含みうる。特に、コレステロール及びトリグリセリド（ＴＧ）を測定するための現在の化学試験は粒子濃度には無関係である。ＮＭＲテクノロジーを使用することにより、コア脂質（ＴＧ又はコレステロールエステル）は粒子濃度測定に影響を及ぼさない。ＮＭＲは一定の大きさの粒子の総数を与え、それ故総表面積の算定を可能にするが、現在の化学試験は、ＴＧがＶＬＤＬサイズの粒子中にのみ認められると仮定しており、またＬＤＬサイズの粒子は主としてコレステロールエステルを含むと仮定される。リポタンパク質についての伝統的な化学試験は粒子数及び表面積に関する情報を提供しない。本発明の実施形態の１つによれば、リポタンパク質の粒子数及び表面積のこれらの差は、ＤＩＣ及びセプシスを含む重症感染に関連すると考えられる。
【００１８】
特に、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全に罹患している患者は、ここでは「異常」リポタンパク質と称する凝固促進性リポタンパク質を有することが発見されている。リポタンパク質の変化は、それらの代謝のゆえに異常であると考えられる。本発明によれば、リポタンパク質の変化は、物理的特性の変化ならびに凝固促進活性の上昇及び高いプロトロンビナーゼ活性を含む定性的機能変化として発現しうる。異常患者試料（重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全、特にセプシス及びＤＩＣを有する患者から）と正常患者試料の間の関係を明らかにするために測定されうるリポタンパク質変化は次のものを含む：ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ又は高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のタンパク質レベルのシフト；陰イオンリン脂質（より好ましくはリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ））の露出表面の上昇；ＶＬＤＬサイズのシフト；ＶＬＤＬ脂質（コア及び表面）のシフト；ＶＬＤＬ電荷の変化；凝固促進性リポタンパク質の出現；リポタンパク質カスケード破壊の指標（すべてのリポタンパク質濃度の低下）；軽度に高い又は低いＶＬＤＬレベル；低いＬＤＬレベル；ＳＡＡ−ＨＤＬの出現；翻訳後変化；リポタンパク質構築成分の変化；リポタンパク質の運動性の変化；分泌の変化；灌流；リポタンパク質酵素の変化（ＣＥＴＰ、ＬＣＡＴ、等々）；リポタンパク質受容体の変化；リポタンパク質酸化のインジケーター、及び内毒素の取り込み。１つの好ましい実施形態では、検出される、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全、より好ましくはセプシス及びＤＩＣに関連する異常リポタンパク質は、プロトロンビナーゼ活性を支持する高い能力を有するリポタンパク質（特にＶＬＤＬ）である。さらに、１つの好ましい実施形態では、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全（より好ましくはセプシス又はＤＩＣ）を有する患者の異常リポタンパク質を、特異的アポリポタンパク質、粒子の大きさ、数又は脂質を測定することを含む様々な方法を用いることによって特定しうる。特に、正常者のと比較したリポタンパク質の総表面積を含む。
【００１９】
インビボでのトロンビンの生成はＤＩＣにおける重要な過程であるとみなされ、疾患の進行中はその生成のマーカーが上昇する。プロトロンビンのトロンビンへの酵素的変換が生理的に適切な速度で起こるためには、その成分が適切な表面に局在しなければならない。インビボに関しては、これは活性化血小板、単核及び不安定内皮細胞（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）によって供給されると推定される。生理的レベルのＶＬＤＬも、トロンビン生成の適切な速度を支持することができ、これは、トリグリセリドの重要な予測を心臓血管事象に結びつけると思われる。本発明によれば、ＣＲＰ−ＶＬＤＬは単なるＤＩＣのマーカー又は予測因子ではないこと、及びそれが、トロンビンの生成を増強し、維持する能力を通して可能な病原的役割を担ってインビボで存在することが発見された。
【００２０】
トロンビンは、凝固カスケードの主要エフェクタープロテアーゼとして、ＤＩＣの病因において中枢的重要性を持つ。フィブリノゲンをフィブリンに変換する上でのその凝固促進作用、及び内皮トロンボモジュリンに結合してプロテインＣを活性化することによるその凝固阻止作用の促進が、ＤＩＣでは調節不全となりうる。本発明によれば、二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬのこの高い凝固促進性局面が、修正ＡＰＴＴアッセイにおける凝固時間の有意の短縮を通して明らかにされうることが発見されている。また、添加された正常又は患者ＶＬＤＬが、凝固反応のためのリン脂質表面を提供する唯一の識別ソースを提供することも認めらている。理論に縛られるのは望むところではないが、この証明はまた、一般的な病院環境においてより短いＡＰＴＴ凝固時間は好ましくない結果に結びつくという所見の１つの説明にもなりうる。
【００２１】
さらに、本発明は、速度及び／又は加速などの波形テクノロジーのＡＰＴＴパラメータを利用して実施しうる。また、国際公開公報第ＷＯ０２／３４１１０号が教示する包括的な凝固能力アッセイや方法も、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者においてリポタンパク質異常を捕獲するために使用しうる。例えば、異常リポタンパク質の検出段階は、修正ＡＰＴＴアッセイにおける凝固時間の短縮を測定すること又は希釈組織因子に基づくアッセイにおいて血栓形成の測定または血栓形成の加速の速度上昇を測定することにより、二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬの高い抗凝固性局面を検出することによって実施しうる。
【００２２】
本発明の１つの好ましい実施形態では、止血機能不全及びＳＩＲＳを有する患者及び重症感染に対する宿主反応は、トロンビン生成を有意に増強することができるＶＬＤＬを有することが発見されている。さらに、セプシス及びＤＩＣを有する患者の連続試料におけるＶＬＤＬの定量的及び定性的変化からの総トロンビン生成能力の算定は、臨床的進行と直接の正相関を示す。これは、トロンビンをセプシスの病態生理学における主要作用因子とすることの妥当性を裏付ける。その主たる役割は急性期の防護初期応答の一部であると考えられるが、ＶＬＤＬの凝固促進性表面によって供給される持続的な又は増強された応答は有害な結果を導きうる。
【００２３】
本発明によれば、重症セプシスにおける組換えヒトＡＰＣなどの抗凝固薬ベースの治療をよりよく標的する高いプロトロンビナーゼ潜在能のバイオマーカーが提供される。さらに、インビボで疾患状態においてトロンビン生成を増強し、異常な状態に維持することができる、微粒子及び細胞表面以外の機構についての見識が提供される。理論に縛られるのは望むところではないが、トロンビン生成の定性的上昇は、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全、特にセプシス及び炎症に応答したリポタンパク質組成物の変化に結びつくと考えられる。
【００２４】
１つの好ましい実施形態では、ＶＬＤＬのプロトロンビナーゼ活性を支持する能力を測定する。ここで使用するとき、プロトロンビナーゼ活性を支持する能力はまた、プロトロンビナーゼ活性（ＰＴアーゼ）を指し、この語と交換可能に使用され、二相性波形を有する患者では変化していることが認められている。二相性波形は、凝固アッセイ、及び定められた正常及び異常パラメータに関するプロフィールを提供するための経時的に前凝固相（勾配−１）（ｓｌｏｐｅ−１）を測定する手段を用いて当業者に既知の適切な方法によって特定し、測定しうる。好ましくは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを、ＭＤＡ  １８０（登録商標）（ビオメリュー社（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ））などの光透過型凝固分析器と共に使用しうる。例えば、Ｓ字状波形パターンを有する５８０ｎｍでの正常波形は、図１のパネルＡに示すように正しい血栓形成に先立つ初期１００％光透過相を特徴とする。これに対し、二相性波形（ＢＰＷ）を有する患者は、曲線の初期部分に影響を及ぼして、図１のパネルＢに示すような二相性プロフィールを生じさせる、前凝固相でも起こる即時的で漸進的な光透過度の低下を有する。二相性波形を有する患者群は、それぞれ図２及び３に示すように高い死亡率とセプシスの高い発生率に結びつけらている。
【００２５】
本発明によれば、二相性波形を有する患者は、二相性波形患者（例えば急性期宿主反応中の患者）からのリポタンパク質（特にＶＬＤＬ）におけるＰＴアーゼ比活性が少なくとも約２倍上昇していることが認められる。重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者の異常リポタンパク質（特にＶＬＤＬ）のＰＴアーゼ比活性（トロンビン生成能力）の異常又は上昇の範囲は、正常な健常個体群からのリポタンパク質（特にＶＬＤＬ）のＰＴアーゼ活性と比較して約２−約８倍、より好ましくは３−４倍の範囲をとりうる。総ＰＴアーゼはＡＰＴＴ波形（ＷＦ）の変化を反映することが認められている。理論に縛られるのは望むところではないが、高いＰＴアーゼ活性は高い陰イオンリン脂質の露出によるものと考えられる。さらに、高いＰＴアーゼは、血小板又は内皮微粒子によるものではないと考えられる。ＶＬＤＬ上のアポＢの存在はＰＴアーゼ活性にとって重要であると考えられる。好ましくは、該ＰＴアーゼ活性は修正されて検出され、より好ましくはＡＰＴＴなどの修正凝固アッセイ又は修正組織ベースアッセイによって検出されうる。好ましくは、リポタンパク質異常を検出するためのアッセイは、ＣＲＰ−リポタンパク質複合体、より好ましくはＣＲＰ−ＶＬＤＬ複合体を形成することなく、実施される。
【００２６】
本発明のもう１つの実施形態では、重症感染、ＳＩＲＳ及びセプシス（最も好ましくはＤＩＣ）を有する患者は、負に荷電した（陰イオン性）リン脂質表面、特にリン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）の表面積増加の特定によって診断しうることが発見されている。理論に縛られるのは望むところではないが、陰イオンリン脂質は、セプシスの患者では、証明可能な凝固促進活性を有する血小板微粒子から放出されると考えられる。同様に、陰イオンリン脂質は、膜の陰イオンリン脂質の転位又は初期内皮機能不全における流出又は多臓器不全及びＤＩＣに関連するアポトーシスから、肝臓で（ｈｅｐａｔｉｃａｌｌｙ）誘導されうる。さらに、ＶＬＤＬ粒子内でのアポリポタンパク質Ｅの低発現は、残存粒子組成物の取り込みに実質的に影響を及ぼし、それらのアテローム形成性及びトロンビン生成を支持する能力に関連すると考えられる。
【００２７】
既知のように、細胞膜ＰＳは、マクロファージの認識及び食作用を仲介するアポトーシスの初期段階の１つとして膜の外層に転位する。ＰＳはまた、プロトロンビナーゼ構築などの凝固反応にとって非常に重要である。それ故、ＣＲＰ−ＶＬＤＬ複合体を有する患者からのＶＬＤＬ粒子の高いトロンビン生成能力は、アポトーシス細胞からＶＬＤＬ表面に潜在的に吸収された、粒子表面上の露出陰イオンリン脂質（ＰＳを含む）部位の増加、又は粒子内のコンフォメーションの変化によって引き起こされると考えられる。
【００２８】
アネキシンＡ５（Ａ５）は、負に荷電したリン脂質表面に高い親和性を有し、ＰＳに対して他の陰イオンリン脂質よりも高い特異性を有する、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。先に述べたように、特異的結合アッセイは、重症感染、ＳＩＲＳ及び止血機能不全を有する患者の異常リポタンパク質が、異常リポタンパク質を直接又は間接的に検出するために標識結合タンパク質としてのＡ５、Ａ５に対する抗体、等々を利用して測定できるように、この結合親和性を利用して調製しうる。
【００２９】
本発明の別の実施形態によれば、Ａ５結合能力は露出陰イオンリン脂質部位を特定し、陰イオンリン脂質依存性反応を阻止しうることが認められている。図８Ｂに示すように、Ａ５はプロトロンビナーゼ構築を阻害する。図８Ｂに示すように、最初のバーはＡ５で処置した正常患者を示し、２番目のバーは様々な濃度のＡ５で処置した二相性患者を示す。好ましくは、重症感染、ＤＩＣ又はセプシスを有する二相性患者の止血系を再平衡させるためにＡ５を有効量（好ましくは少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１００−５０００ｎｇ／ｍｌの範囲内）で投与する。Ａ５はインビトロで明らかにしうる凝固阻止特性を有しており、それ故露出ＰＳの周囲に抗血栓シールドを形成して、機能性凝固促進複合体の形成を予防すると思われる。抗リン脂質抗体は、推定上このシールドを破壊し、それ故これらの患者において認められるプロトロンビン傾向を説明する。本発明によれば、この治療処置が、止血系を再平衡させて、この患者群の高い死亡率に影響を及ぼしうることから、Ａ５は、ＤＩＣに関連する臨床状態を有する患者のための治療法として提供されうる。
【００３０】
（実施例）
下記の非制限的実施例は本発明を例示するものである。
【００３１】
（実施例１）
方法
臨床試験
２４ヶ月の前向き試験において、ロイヤルリバプール大学病院（ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）のＩＴＵへの連続的な成人入院患者全員に毎日のようにＡＰＴＴ波形分析を実施した。この試験は、ＣＲＰ−ＶＬＤＬ複合体形成が最大になる時から、臨床疾患に関する病態生理学的及び機械的見識を得るために実施した。興味ある関連性は、各個体の患者のエピソードについてその個々の成分（ＣＲＰ又はＶＬＤＬ）と比較したとき、最小ＴＬ１８値、すなわち最大複合体形成を検出する上での最も異常な波形とＤＩＣの診断との関係である。ＤＩＣは、国際血栓止血学会標準化小委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｅｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｕｂ−Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によれば、血小板数、プロトロンビン時間（ＰＴ）、フィブリノゲン及びＤ−二量体レベルの変化から導かれる累積スコアが５又はそれ以上と定義された（Ｔａｙｌｏｒ，Ｆ．Ｂ．，Ｔｏｈ，Ｃ．Ｈ．，Ｈｏｏｔｓ，Ｗ．Ｋ．，Ｗａｄａ，Ｈ．，Ｌｅｖｉ，Ｍ．２００１。定義のための、汎発性血管内凝固症候群に関する臨床及び検査判定基準と採点システム（Ｔｏｗａｒｄｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａ  ｓｃｏｒｅｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｅｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）。Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８６：１３２７−１３３０）。ＰＴ、フィブリノゲン及びＤ−二量体を、シムプラスチンＳ（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｓ）、フィブリクィック（Ｆｉｂｒｉｑｕｉｋ）及びＭＤＡ（登録商標）（米国ノースカロライナ州ビオメリュー社（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ  ＵＳＡ））Ｄ−二量体ラテックス粒子ベースの免疫測定法を用いて、それぞれ自動光学的凝固分析器、ＭＤＡ  １８０（登録商標）で０．１０５Ｍ  クエン酸三ナトリウムに収集した血漿（クエン酸三ナトリウム１に対し血液９の割合）に関して測定した。ＤｉａＭｅｄ  ＡＧ  ＣＲＰ  ＥＬＩＳＡ（Ｃｒｅｓｓｉｅｒ  ｓｕｒ  Ｍｏｒａｔ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、ＶＬＤＬのマーカーとして血漿トリグリセリド（ＴＧ）を、シグマ・インフィニティー・リエージェント（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）システムを用いて測定した。波形分析の結果を公開せずにＤＩＣの診断を行った。
【００３２】
ＡＰＴＴ波形分析
新鮮クエン酸添加血漿に関する、Ｐｌａｔｅｌｉｎ  ＬＳ試薬を用いた５８０ｎｍのＭＤＡ  １８０（登録商標）での波形分析は広く記述されている（例えば、Ｄｏｗｎｅｙ，Ｃ．，Ｋａｚｍｉ，Ｒ．，Ｔｏｈ，Ｃ．Ｈ．１９９７より、汎発性血管内凝固における血液凝固の光学的波形分析からの新しく診断適用可能な情報（Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｗａｖｅｆｏｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９８：６８−７３、及びＤｏｗｎｅｙ，Ｃ．，Ｋａｚｕｍｉ，Ｒ．，Ｔｏｈ，Ｃ．Ｈ．１９９８より、透過波形分析を通しての汎発性血管内凝固における早期特定と予後の意味（Ｅａｒｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ  ｗａｖｅｆｏｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ．）Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．８０：６５−６９）。二相性波形異常の程度の数量化は、ＡＰＴＴ反応への１８秒目の光透過レベル（ＴＬ１８）によって行い、正常波形は１００％（９９．４３−１００．６９）の平均ＴＬ１８及び０．１５％の平均変動係数を有していた。
【００３３】
材料
ヒト第Ｘ因子（ＦＸ）、第Ｖ因子（ＦＶ）及びプロトロンビン（ＦＩＩ）を血漿から生成し、先に述べたようにＦＸａ及びＦＶａに変換した。トロンビン色素形成基質、Ｓ−２２３８をイタリア、ミラノのクロモジェニックス社（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）より入手した。ヒト組換えＣＲＰは英国ノッチンガムのカルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）より入手し、アネキシンＶはカリフォルニア州サンディエゴのＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、またそのフルオレセイン標識形態をドイツ、ワークベンツバーグのベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｗｅｒｋ  Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。アポリポタンパク質（アポ）Ｂ及びＥ標準品、インフィニティーコレステロール／トリグリセリド試薬、それぞれの標準品及び乾式シリカは、ミズーリ州セントルイスのシグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。ヤギ抗ヒトアポＢ−１００及びヤギ抗ヒトアポＥは英国ケンブリッジのアブカム社（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）より入手した。ウサギ抗ヒトアポＢ−１００、ウサギ抗ヒトアポＥ及びモノクローナルマウス抗ヒト糖タンパク質ＩＢは、デンマーク、グロストラップのダコー社（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より入手した。マウス抗αｖβ３インテグリン複合体及びマウス抗ＩｇＧ１／Ｇ２ａはカリフォルニア州サンディエゴのＢＤファーミンゲン社（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手した。ＨＲＰに複合したヤギ抗ウサギＩｇＧは米国カリフォルニアのサンタ・クルーズ・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳ）より入手した。プロテインＧセファロースはカリフォルニア州サンフランシスコのザイムド・ラボラトリー社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）より入手した。リン脂質標準品はミズーリ州セントルイスのシグマ社（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手した。他のすべての試薬は分析用グレードのものであった。
【００３４】
クロマトグラフィー試験
トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ８、２．２ｍＭ  ＣａＣｌ２で平衡させた英国アマーシャムのアマーシャム・ファーマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）のハイプレップ・セファクリルＳ−３００（ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００）カラム（１８０ｃｍ３）を用いて室温（ＲＴ）でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。被験血清５ｍｌをカラムに適用し、１．５ｍｌ／分のぜん動ポンプ速度で２分ごとに９０分間にわたって分画を収集した。作動と作動の間に０．２Ｍ水酸化ナトリウム約５００ｍｌでカラムを洗った。試験した種々の血清は、二相性波形を有していない正常個体２名（それぞれＣＲＰ＝５及び８μｇ／ｍｌ）、二相性波形を有していないＩＴＵ患者３名（ＣＲＰ＝１２５、１５０及び１５０μｇ／ｍｌ）及び二相性波形を有するＩＴＵ患者４名（ＣＲＰ＝１２０、１３０、１４５及び１６５μｇ／ｍｌ）であった。最後の群からの２名には、同じ血清を、但し全二価陽イオン依存性複合体を破壊する１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で、反復してクロマトグラフィーにかけた。分画を４℃に保持し、ＥＬＩＳＡによってＣＲＰ、アポＢ及びＥに関して定量した。アポＢ／Ｅの定量のために、９６ウェルプレートを、各々のウェルについて、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５中５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトアポＢ／Ｅ  １００μｌにより、４℃で一晩被覆した。２％ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗った後、プレートをＰＢＳ−２％ＢＳＡによりＲＴで１時間遮断した。標準品（アポＢについてはＡ４１８３及びアポＥについてはＡ２６７３−Ａ２４５６）／試料分画  １００μｌを適用し、ＲＴで２時間インキュベートした。２μｇ／ｍｌのウサギ−α−ヒトアポＢ／Ｅ  １００μｌ、次いで洗浄緩衝液中１：２００００のヤギ抗ウサギＨＲＰ複合体  １００μｌで検出を行った。脱イオン水６ｍｌ中２．９％Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド１００μｌと３０％過酸化水素２．５μｌ（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｔｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳ））でシグナルを生成し、０．５Ｍ硫酸５０μｌで反応を停止させた。４９０ｎｍのスペクトラマックス・プラス（Ｓｐｅｃｔｒｍａｘ  Ｐｌｕｓ）（カリフォルニア州スタンフォードのモレキュラー・デバイシズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ））でプレートを読み取った。
【００３５】
ＶｉｔｉｅｌｌｏとＺａｎｅｔｔａ（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ｆ．，Ｚａｎｅｔｔａ，Ｊ．Ｐ．１９７８。リン脂質の薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）。Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１６６：６３７−４０）の方法によって二次元薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を実施した。簡単に述べると、ＴＬＣプレート（オレゴン州ヒルズボロのワットマンラブセールス社（Ｗｈａｔｍａｎ  ＬａｂＳａｌｅｓ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ））を１２５℃で３０分間活性化した。試料をプレートの縁から１５ｍｍの位置にスポットし、十分に飽和したタンクを用いて酢酸メチル：ｎ−プロパノール：クロロホルム：メタノール：０．２５％塩化カリウム（２５：２５：２５：１０：９）中で１４０ｍｍ移動させた。次にプレートを窒素下で乾燥した後、同じ飽和条件を用いて、クロロホルム：メタノール：アセトン：酢酸：水（７５：１５：３０：１５：７．５）中で垂直方向に移動させた。その後、ニンヒドリン（メタノールと１０％酢酸水溶液５ｍｌ中０．２％ニンヒドリン９５ｍｌ）、次いで５０％硫酸水溶液をプレートに噴霧した後、１５分間１２０℃に加熱した。使用した標準品は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びセレブロシドであった。
【００３６】
ＶＬＤＬの単離と定量
これは、被験血漿を１０℃で１０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離してカイロミクロンを除去した後、先に述べたとおりであった（１）。ＶＬＤＬ分画（密度＜１．０１９ｇ／ｍＬ）を４℃で保存し、単離から新鮮な状態で４日以内に使用した。
【００３７】
プロトロンビナーゼ支持活性
先に述べたように調製した、単離ＶＬＤＬ（１００、３００及び５００μＭ  ＴＧ）又は５０μｍｏｌ／Ｌ／リン酸のＰＣ／ＰＳ小胞（７５：２５）を最初にＴＢＳ（ｐＨ７．４）、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２に希釈し、１５ｎＭ  ＦＶａ、１μＭ  ＩＩと共にインキュベートした。０．１ｎｍｏｌ／Ｌ  ＦＸａを添加して反応を開始させた。あらかじめ定められた時間間隔で、１０μｌアリコートをＴＢＳ  ９０μｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ中にとった。次に１０μｌを９６ウェルプレートに分配し、そこにＳ−２２３８  １９０μｌ（最終濃度４００μｍｏｌ／Ｌ）を加えた。４０５ｎｍでの色素形成性遊離をスペクトラマックスプレートリーダーで測定した。既知のヒトトロンビン標準品から作成した検量線と比較することによってトロンビン生成の速度を確認した。プロトロンビナーゼ構築へのＣＲＰの寄与を評価する実験では、ＴＧ  ＶＬＤＬ  ５００μＭを１００μｇ／ｍｌ  ＣＲＰと共にＲＴで１５分間インキュベートした後、凝固タンパク質を反応に導入した。
【００３８】
チオバルビツール酸反応物質に基づく方法によってＶＬＤＬの酸化状態を調べた（Ｗａｌｌｉｎ，Ｂ．，Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ，Ｂ．，Ｓｈｅｒｔｚｅｒ，Ｈ．Ｇ．，Ｃａｍｅｊｏ，Ｇ．１９９３．単一マイクロタイタープレートにおけるリポタンパク質の酸化及びチオバルビツール酸反応物質形成の測定：抗酸化薬の評価のためのその使用（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅａｃｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ：ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１０−５）。１．３％チオバルビツール酸（０．３％ＮａＯＨ中）７５μｌ、トリクロロ酢酸５０μｌ、ＴＢＳ緩衝液４０μｌ及びＶＬＤＬ２５μｌを６０℃で４０分間インキュベートし、その後氷上で冷却した。２０％ＳＤＳ１０μｌを加えた後、スペクトラマックスリーダーでＡ５３０−Ａ６００ｎｍの吸光度を検査した。
【００３９】
リン脂質表面の寄与を明らかにするため、ＨＥＰＥＳ結合緩衝液に懸濁したＶＬＤＬ（最終濃度５００μＭ  ＴＧ）、５０ｍＭカルシウムと共にインキュベートしたフルオレセイン標識アネキシンＶにより、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを用いてベクトンディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のフローサイトメーターでＦＡＣＳを実施した。プロトロンビナーゼ生成へのアネキシンＶの添加の影響を、ＴＢＳ／５ｍＭ  ＣａＣｌ２中３００μＭ  ＴＧ  ＶＬＤＬと漸増濃度のアネキシンＶの事前インキュベーション（０−１００μｇ／ｍｌ、室温で１５分間）によって評価した。別の実験では、ＴＢＳ／５ｍＭ  ＣａＣｌ２中５００μｍｏｌ／ｌ  ＴＧ  ＶＬＤＬを漸増濃度（０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌ）のアネキシンＶ又はリン脂質特異的抗体９Ｄ２（Ｓ  Ｒａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ）と共に室温で１５分間プレインキュベートした後、プロトロンビナーゼ活性を比較した。
【００４０】
単離ＶＬＤＬにおける血小板又は内皮微粒子汚染の可能性を、確立された血小板及び微粒子ゲートを用いたＦＡＣＳによって判定した。ＶＬＤＬ（最終濃度５００μＭ  ＴＧ）を、血小板糖タンパク質１ｂに特異的なフルオレセイン複合モノクローナル抗体１００μｇ／ｍｌ及び内皮細胞−αｖβ３インテグリン複合体（１０μｌ）と共にインキュベートした。それぞれのアイソタイプ対照を同時に使用した。ＶＬＤＬ中の結合凝固タンパク質の評価を、標準色素形成性プロトロンビナーゼアッセイのための第Ｖａ因子、第ＩＩ因子又は第Ｘａ因子を欠損する特異的反応混合物を用いて実施した。トロンビン生成が存在しないことは、評価した凝固因子の欠損を示した。
【００４１】
免疫吸着分析
ウサギ抗ヒトアポＢ／Ｅ（１ｍｇ）をプロテインＧセファロースビーズ１５０μｌに結合した。抗体を添加していない対照セファロースを同様に調製した。ＴＧに対して標準化したＶＬＤＬ２５０μｌをエンド・オーバー・エンド回転によって混合し、４℃で一晩インキュベートした。採集した上清を、上述したようにプロトロンビナーゼ支持構築物及びアポＢ／Ｅ定量に関して、及びウエスタンブロット法によって分析した。後者は、４％濃縮用ゲル、及びアポＥ及びアポＢに関してそれぞれ５％又は１５％泳動用ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実施した。二倍力価の試料緩衝液中のＶＬＤＬ２５μｌを充填し、４５ｍＡで約１時間泳動させた。イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）膜（マサチューセッツ州ビレリカのミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））への転移を４００ｍＡで１時間実施し、５％乳−ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中で一晩遮断した。最初に３％乳−ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中１ｍｇ／ｍｌの抗体アポＢ／Ｅと共にＲＴで１時間インキュベートし、洗浄した後、次に３％乳−ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中抗ウサギＨＲＰ（６０００中１）と共にＲＴで４０分間インキュベートした。ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ中でさらに洗浄した後、化学発光（ＥＣＬ、英国、アマーシャムのアマーシャム・ファーマシア社）及びＸ線フィルムへの露光によって検出を行った。
【００４２】
凝固促進性補因子凝固アッセイ
血漿媒質中のＶＬＤＬの凝固促進活性を測定するため、スペクトラマックスマイクロタイタープレートリーダーで修正ＡＰＴＴを実施した。一晩絶食した正常個体からの血小板欠乏血漿２５μｌをイミダゾール緩衝液中０．１７５％シリカ２５μｌと共に３７℃でインキュベートした。１８０秒後、ＶＬＤＬ（等しいＴＧレベルの正常個体又は二相性波形異常を有する患者から）と２５ｍＭ  ＣａＣｌ２の間での５０：５０混合物５０μｌを加え、血栓形成までの時間を記録した。これを、半値最大吸光度変化の時点と定義した。すべてのサンプルに関して２回ずつ実施した各々の検査を、正常個体からのＶＬＤＬと同じ正常血漿に添加した二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬと比較した。
【００４３】
統計
臨床試験において、３パラメータロジスティックモデルによる非線形回帰分析を、最も異常な波形結果、それぞれ対応するＣＲＰ及びＴＧレベルと、ＤＩＣの診断との間の関係のデータに適合させた（Ｔｏｈ，Ｃ．Ｈ．，Ｔｉｃｋｎｏｒ，Ｌ．Ｏ．，Ｄｏｗｎｅｙ，Ｃ．，Ｇｉｌｅｓ，Ａ．Ｒ．，Ｐａｔｏｎ，Ｒ．，Ｗｅｎｓｔｏｎｅ，Ｒ．２００３．簡単で迅速な凝固−波形分析を通してのセプシス及び死亡危険度の早期特定（Ｅａｒｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｒｉｓｋｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ  ｃｌｏｔ−ｗａｖｅｆｏｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ）。Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２９：５５−６１及びＲａｔｋｏｗｓｋｙ，Ｄ．Ａ．１９８３．非線形回帰モデリング（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ）。（ニューヨーク州、マーセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）））。これらの算定はすべてＳ−ＰＬＵＳ２０００（ワシントン州シアトルのマスソフト社（ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））を用いて実施した。実験作業からの結果は平均＋／−ＳＥＭとして算定した。その平均を、一変量ＡＮＯＶＡ（プロトロンビナーゼ）又はスチューデントｔ検定による分散分析のいずれかを用いて比較した。データの分布について仮定を含まないようにｔ検定を補足するためノンパラメトリック検定も使用した。統計的有意性を定義するためにｐ＜０．０５の値を使用した。
【００４４】
結果
ＤＩＣとの相関の程度
２４ヶ月の試験期間にわたってＩＴＵに連続的に入院した合計１１８７名の患者のうち、７５８名（６４％）が二相性波形を有していた；すなわち集中治療室で治療を受けた期間中にいずれかの時点でＴＬ１８＜９９％であった。図４Ａに示すデータは、ＣＲＰ−ＶＬＤＬ形成の程度を反映する波形異常の度合とＤＩＣの診断との高い結びつきを明らかにしている。正常波形を有する患者では、１０−１５％がＤＩＣについての判定基準を満たし、ＴＬ１８が２０％低下したときにはこの可能性が６０％に上昇した。６０％又はそれ以下のＴＬ１８値を有する患者では、ＤＩＣと事実上１００％の結びつきでプラトーに達した。比較すると、二相性波形の基礎となる複合体の個々の成分は、それぞれ図４Ｂ及びＣに示すようにＤＩＣとの結びつきがより弱かった。ＶＬＤＬのマーカーとして、ＣＲＰ及びトリグリセリドの最高レベルは、それぞれ症例の約６０％及び７０％においてＤＩＣと結びついていた。大部分の数値と比較して、ロジスティック曲線への適合において高い影響を及ぼす、いくつかの比較的大きなトリグリセリド読取り値が存在したが、それらは、これらの大きな数値でＤＩＣの上昇傾向を反映するために示されている。これらの結果は、確実に、高いレベルのＣＲＰ−ＶＬＤＬ複合体形成を臨床的ＤＩＣの存在に結びつけており、またこれが複合体及び／又はその個々の成分の各々の関数であることを示している。
【００４５】
インビボでのＬＣＣＲＰのクロマトグラフィーによる証拠
図５Ａは、大部分のクラスのリポタンパク質中に存在することの結果として、初期分画全体に広く溶出するアポＢに関する、正常絶食個体の血清からのクロマトグラフィープロフィールを示す。より低密度のリポタンパク質のマーカーであるアポＥは、個体間での変動はあるが、一般にそれより後で検出される。一貫する所見は、しかしながら、集中治療患者における急性期反応の一部として、大きく増幅された溶出プロフィールの中央付近での単一ピークとしてのＣＲＰの出現であろう。二相性波形を持たない患者では（図５Ｂ）、これは単一ピークのままであるが、二相性波形を有する患者では、アポＢ及びＥと同時溶出する、第二のより小さく、より早期のＣＲＰピークも検出される（図５Ｃ）。空隙容量内の「重い」形態のこの早期ＣＲＰピークはまた、アポＢのピーク濃度も含む。そのプロフィールはカルシウム依存性であり、ＥＤＴＡの存在下では単一ＣＲＰピークの容量内に消失する。
【００４６】
二相性波形を有する患者における定性的及び定量的ＶＬＤＬ変化はプロトロンビナーゼ活性を増強する
トロンビン生成へのＶＬＤＬの速度論的寄与をＰＣＰＳ小胞と比較した。図６Ａは、ＰＣＰＳ小胞による即時反応を明らかにしており、３０秒以内に半値最大反応を示す。比較すると、二相性ＶＬＤＬについての半値最大反応は、正常ＶＬＤＬについての８分と２５分である。トロンビン生成を支持する能力のこの変動の証拠を、同じく種々の患者群においてＶＬＤＬの差を検討した大きな標本セットにおいてさらに評価した。トロンビン形成の速度を、正常ＶＬＤＬ（ｎ＝２４）、及び二相性波形を有する（ｎ＝２５）及び二相性波形を有していない（ｎ＝２２）ＩＣＵ患者からのＶＬＤＬの数多くの濃度で測定した。図６Ｂに示す関係の勾配は、二相性波形患者は正常ＶＬＤＬ及び波形異常のないＩＴＵ患者からのＶＬＤＬよりも２．５倍強力であることを示している（ｐ＜０．０００１）。正常者からのＶＬＤＬと二相性波形を有していない患者からのＶＬＤＬの間でトロンビン生成の速度には差がなかった（ｐ＝０．２３）。漸増濃度のＣＲＰの含有は、試験した種々のＶＬＤＬ群からのトロンビン生成の速度を有意に変化させなかった。
【００４７】
同じ標本において、ＶＬＤＬの分離の前に総トリグリセリド含量を定量した。図７Ａは、二相性波形を有する患者においてのみしばしば総トリグリセリドレベルが高く、波形異常の上昇と正の相関傾向が存在することを示している。ＶＬＤＬの定性的及び定量的変化の両方がトロンビン生成の潜在能に関連するので、総血漿トリグリセリドとプロトロンビナーゼ比活性［ＩＩａ（ｓｅｃ−１）／ｍＭ  ＴＧ］の積を調べた。この関係は、図７Ｂ及びＣにおいて数日間にわたる標本からの個々の患者のシリーズで明らかにされており、それぞれ治療して消散した例と最終的に死亡に至った重症セプシスの例を示している。
【００４８】
二相性波形を有する患者におけるトロンビン生成のＶＬＤＬ表面増強
リン脂質表面は凝固反応にとって欠くことのできない部分であるので、ＶＬＤＬ表面上の高まる効用が高いプロトロンビナーゼ活性を説明しうるかどうかを評価した。凝固剤活性リン脂質に特異的なカルシウム依存性結合タンパク質である蛍光標識アネキシンＶ（Ｍｅｅｒｓ，Ｐ．，Ｍｅａｌｙ，Ｔ．１９９３．リン脂質へのカルシウム依存性アネキシンＶの結合：化学量論、特異性、及び負電荷の役割（Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ：ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２：１１７１１−２１及びＴａｉｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．１９９２．アネキシンＶのリン脂質結合：カルシウム及び膜ホスファチジルセリン含量の作用（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ）。Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９８：１８７−９１）を使用して、二相性波形を有する１６名の患者からのＶＬＤＬを正常個体からの対応する数と、ＦＡＣＳによって比較した。二相性患者から単離したＶＬＤＬからのより強いシグナル（幾何平均蛍光５８．０２対１９．２５）は、凝固剤活性脂質の高い露出を示唆する。図８Ａは典型的な実験所見を示す。これはＣＲＰとのインキュベーションによって影響されなかった（データは示していない）。プロトロンビナーゼ活性を阻害するアネキシンＶの能力は、正常者４名と二相性波形を有する患者４名からのＶＬＤＬのデータを示す図８Ｂにおいて明らかにされている。１００ｎｇ／ｍｌのアネキシンＶで二相性ＶＬＤＬに関してトロンビン生成の有意の阻害が存在した（ｐ＝０．００３）。正常者と比較したときＣＲＰ−ＶＬＤＬ複合体を有する患者からのＶＬＤＬに関してはプロトロンビナーゼ活性の阻害の程度がはるかに大きく、高いトロンビン生成が二相性波形患者からのＶＬＤＬにおける凝固剤活性リン脂質の高い露出によるものであることを示唆した。
【００４９】
この高い凝固促進潜在能は、インビボ及び／又はエクスビボでの血小板又は内皮微粒子による汚染によって説明されうる。これは、内皮細胞及び血小板に特異的な分画を特定することができなかったリポタンパク質微粒子のフローサイトメトリーによって排除された。さらに、収集したＶＬＤＬへの結合プロトロンビナーゼタンパク質の寄与の可能性も検討した。プロトロンビナーゼアッセイを用いて、精製第Ｖａ因子、第ＩＩ因子又は第Ｘａ因子の不在下では有意のトロンビンが生成されず、ＶＬＤＬと関連凝固タンパク質の結びつきが存在しないことを示唆した。
【００５０】
この高い凝固活性が二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬにおける高いＰＳ露出によるものであるかどうかを評価するため、３つの別々の実験において９Ｄ２モノクローナル抗体（Ｄｒ  Ｒａｎ，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｔｅｘａｓ）を使用した。これは、ＰＳ、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルグリセロールに対して十分に特性付けられた特異性を有し、ＰＣ、ＰＥ及びＳＭには反応性がない（Ｒａｎ，Ｓ．，Ｄｏｗｎｅｓ，Ａ．，Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．２００２．腫瘍血管の表面での陰イオンリン脂質の高い露出（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｐｈｏｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ）。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６１３２−６１４０）。図８Ｂは、これがプロトロンビナーゼ活性を支持するＶＬＤＬの表面能力に有意の阻害作用を及ぼさないことを示している。これは、ＰＳの変化がプロトロンビナーゼ増強の原因ではないことを示唆する。
【００５１】
二相性波形患者からのＶＬＤＬはＰＥを欠くが、ＰＣ、ＳＭ及びセレブロシドを含有する
上記の所見を確認し、関与するリン脂質部分をさらに検討するため、ＴＬＣを実施した。アミノ含有リン脂質０．２５μｇの検出限界まで感受性であるこの方法は、正常個体（ｎ＝５）及び患者（ｎ＝１０）からの両方のＶＬＤＬにおいてＰＳの欠如を確認した。ＰＣ、ＳＭ及びセレブロシドはすべてのＶＬＤＬ中に存在し、それ故９Ｄ２抗体によるトロンビン生成の排除が相対的に欠如していることを説明する（図９Ａ）。組成上の唯一の相違は二相性波形患者だけにおけるＰＥの欠如であった（図９Ｂ）。波形異常を有していないＩＣＵ患者は正常者と同様のＴＬＣ所見を有していたので、これは二相性波形を有する患者に特異的な再現可能所見であった。
【００５２】
ＶＬＤＬからのアポリポタンパク質Ｂの免疫吸着は粒子構造及びトロンビン生成を支持する能力を破壊する
ＶＬＤＬタンパク質の寄与を定義するために、アポＢ−１００又はアポＥに対する固定化抗体を、プロトロンビナーゼ活性を吸着する能力に関して試験した。抗アポＢ  ＩｇＧは、対照セファロースビーズと比較してプロトロンビナーゼ活性の８０％を吸着した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリー分析に基づき、固定化抗アポＢ抗体は標的抗原を吸着した；すなわち、吸着上清中の染色アポＢタンパク質バンドは、対照セファロースビーズからのものの５％であった。吸着工程自体はプロトロンビナーゼ潜在能の喪失を導くが、特異的アポＢ除去は、３つの異なる出発ＶＬＤＬにおいて活性の有意の喪失（ｐ＝０．０００２）を導く（図１０）。アポＢ免疫吸着後のＶＬＤＬの構造完全性を評価するためのさらなるフローサイトメトリー分析は特定しうる粒子を示さなかった。これは、アポＢが、プロトロンビナーゼ構築を高めるために必要な脂質のコンフォメーションを構造的に支持することによって、二相性波形患者からのＶＬＤＬの高いトロンビン生成に寄与することを示唆する。
【００５３】
これに対し、対照吸着と比較して５％未満という低いレベルのアポＥの免疫吸着は、ＦＡＣにより、プロトロンビナーゼ活性（図１０）あるいはその構造完全性を低下させなかった。アポＥは、それ故、トロンビン増強を最適化する表面立体配置において必須ではない。
【００５４】
二相性波形患者からのＶＬＤＬは正常血漿の凝固アッセイにおいて凝固促進活性を示す
上記のプロトロンビナーゼ所見に続いて、我々は修正ＡＰＴＴ凝固アッセイを用いて血漿媒質中でのＶＬＤＬの凝固促進性補因子活性を検討した。図１０に示すように、二相性波形患者からの単離ＶＬＤＬの正常血漿への添加は、同じ血漿への正常個体からの等容量ＶＬＤＬの添加と比較して、凝固時間の有意の短縮を示した（ｐ＝０．０００）。平均凝固時間は、７名の正常な無関係のドナーからのＶＬＤＬについては２０３秒（ＳＥＭ０．９５）であり、二相性波形（ＴＬ１８  ７７−８５）を有する７名の患者からのＶＬＤＬについてはこれが１７８秒（ＳＥＭ３．０２）に低下した。図１０のボックスプロットは、正常又は二相性ＶＬＤＬ添加についての２５−７５百分位の四分位区間及びそれぞれ２０５秒と１７９秒の凝固時間中央値を示す。この明らかな差は、正常者（０．４−１．５ｍＭの範囲）と二相性波形患者（０．５−１．８ｍＭの範囲）の間でかなり重複する総ＴＧ含量の差によっては説明できなかった。それ故、二相性波形を示す患者からのＶＬＤＬは有意の凝固促進性補因子活性を示す。
【００５５】
この試験において、我々は二相性波形からのＶＬＤＬが正常ＶＬＤＬの少なくとも２倍のトロンビン生成能力を有すること及びこれは脂質酸化あるいは微粒子汚染によるものではないことを明らかにすることができた。これまでの試験は、正常ＶＬＤＬが、ドナーによるかなりの変動性を伴うけれども、生理的レベルのトロンビンを生成しうることを確立した（Ｍｏｙｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｒａｃｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｒａｃｙ，Ｐ．Ｂ．，ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，Ｃ．，Ｓｐａｒｋｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．１９９８．血漿リポタンパク質はプロトロンビナーゼ及び他の凝固促進性酵素複合体を支持する（Ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｃｏａｇｌａｎｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：４５８−４６５及びＲｏｔａ，Ｓ．，ＭｃＷｉｌｌｉａｍ，Ｎ．Ａ．，Ｂａｇｌｉｎ，Ｔ．Ｐ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｃ．Ｄ．１９９８．アテローム形成性リポタンパク質はプロトロンビナーゼ複合体の構築及びトロンビン生成を支持する：酸化及びビタミンＥによる調節（Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ）。Ｂｌｏｏｄ．９１：５０８−１５）、この識別的な上昇は、検討した大きな標本セット内の二相性波形を有する患者において一貫しており、インビボでトロンビン生成を支持する重要な役割を果たしたと考えられる。
【００５６】
我々は最初に、二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬにおける高いトロンビン生成能力は高い陰イオンリン脂質の効用によるものであるという仮説を立てたが、これが高いホスファチジルセリンによるものであることを示すことはできなかった。これは２つの別々の系統の証拠に基づいていた。第一に、ＰＳに関して十分に特性付けられた特異性を有する９Ｄ２阻止抗体からのデータはプロトロンビナーゼ活性の阻害を示さなかった。第二に、０．２５μｇのＰＳを検出する感受性があるＴＬＣ試験は、二相性波形患者からのＶＬＤＬにおいても高いプロトロンビナーゼ支持活性の証拠を示さなかった。Ｄｅｇｕｃｈｉらは、正常ＶＬＤＬにおいて小量のＰＳ（０．４％）を見出しており（Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．，Ｂａｎｋａ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｈ．２０００．カルジオリピンはヒト血漿リポタンパク質の正常成分である（Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：１７４３−１７４８）、極微量がプロトロンビナーゼ活性を支持することができたとも考えられる（Ｍｏｙｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｔｒａｃｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｒａｃｙ，Ｐ．Ｂ．，ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，Ｃ．，Ｓｐａｒｋｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．１９９８．血漿リポタンパク質はプロトロンビナーゼ及び他の凝固促進性酵素複合体を支持する（Ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｃｏａｇｌａｎｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：４５８−４６５）。しかし、特にインビボでプロトロンビン複合体を活性化するためのリン脂質の最も適切な組成物がまだ論議の対象であるので、これに代る説明もありえよう。ＰＳの重要性は、３：１というＰＣ：ＰＳ組成比が活性化血小板の凝固促進作用に最も類似すると思われる静的条件下でのインビトロ試験から導かれる（Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｆｅｒｎａｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，Ｈａｃｋｅｎｇ，Ｔ．Ｍ．，Ｂａｎｋａ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊ．Ｈ．２０００．カルジオリピンはヒト血漿リポタンパク質の正常成分である（Ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：１７４３−１７４８）。これに対し、ＰＣだけを含む小胞は、フィブリン沈着によって測定するとき、凝固促進活性の最大上昇を引き起こしうる（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｌ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ，Ｆ．Ｇ．，Ｎｅｓｈｅｉｍ，Ｍ．Ｅ．，Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．１９８５．プロトロンビナーゼ複合体の構築及び活性の発現における脂質運動性（Ｌｉｐｉｄ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３６０４−３６１２）。ＰＣは我々の所見を解釈する上で特に適切であると考えられ、Ｒｏｓｉｎｇらも、正に荷電した膜がプロトロンビンの活性化を増強する能力を示している（Ｇａｌａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍ．Ｒ．，Ｂｏｚｚｏ，Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｅｓｔｅｌｒｉｃｈ，Ｊ．，Ｒｏｙ，Ｔ．，Ｍａｚｚａｒａ，Ｒ．，Ｏｒｄｉｎａｓ，Ａ．，Ｅｓｃｏｌａｒ，Ｇ．１９９８．合成リン脂質の製剤は損傷した血管の凝固促進活性を促進する：流動条件下での試験（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｄａｍａｇｅｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．３８：１００４−１０１０）。ＰＥが特に二相性波形を有する患者のＶＬＤＬには存在しないという所見はまた、特に血漿凝固時間を短縮する作用においても重要であると考えられる。ＰＥは主として凝固阻止経路を増強するとみなされ、抗リン脂質抗体によるその遮断はトロンビンの凝固促進活性を促進する（Ｒｏｓｉｎｇ，Ｊ．，Ｓｐｅｉｊｅｒ，Ｈ．，Ｚｗａａｌ，Ｒ．Ｆ．１９８８．正の静電ポテンシャルを有するリン脂質膜上でのプロトロンビン活性化（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７：８−１１）。しかし、組成物の相違に加えて、凝固反応にとって適切な表面形状のコンフォメーションも考慮する必要がある。リポタンパク質の完全性を破壊する上でのアポＢ免疫吸着を通してのプロトロンビナーゼ活性の喪失は、この特定局面を強調する。
【００５７】
上記に示すように、二相性波形を示す患者からのＶＬＤＬはトロンビン生成を有意に増強することができる。さらに、セプシス及びＤＩＣを有する患者の連続的試料におけるＶＬＤＬの定量的及び定性的変化からの総トロンビン生成能力の算定は、臨床上の進行と直接の正相関を示す。これは、セプシスの病態生理学における主要因子としてのトロンビンの関連性を裏付ける。その主たる役割は急性期防護初期反応の一部であると考えられるが、ＶＬＤＬの凝固促進表面によって提供される持続的な又は増強された反応は有害な結果を導きうる。
【００５８】
（実施例２）
ＣＲＰ及びＶＬＤＬの測定
二相性波形を示す１５名の患者の血漿において、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＴＬ−１００卓上超遠心機を用いてポリカーボネート遠心分離管中（１１×３４ｍｍ、カリフォルニア州パロ・アルトのベックマン・インストルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）１０℃で２時間、３５６，０００ｘｇで初期遠心分離してＶＬＤＬ測定を得た。上部ＶＬＤＬ分画を収集し、その容量を記録した。Ｇａｂｅｌ．Ｂ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８、３７：７８９２−７８９８及びＷａｎｇ，Ｘら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２００、２０：１３０１−１３０８が述べたように単離したＬＤＬを、アポＢ−１００  ＥＬＩＳＡのための標準品として使用した。コレステロール・インフィニティー試薬（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ）及びコレステロール検量器（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）を用いて二相性患者及び正常血漿試料からの単離ＶＬＤＬ分画において５００ｎｍでの比色定量によってコレステロール濃度を測定した。回収したＶＬＤＬ分画中の総タンパク質濃度を、ＢＳＡを標準品として用いてブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイによって測定した。ＣＲＰレベルは、捕獲のためにウサギ抗ヒトＣＲＰ  ＩｇＧを使用し、Ｔｉｊｓｓｅｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８４、１３６：４５１−４５７が述べた方法でＨＲＰに複合した同じ抗体によって検出するＥＬＩＳＡによって測定した。ＣＲＰはまた、１１８７名の臨床試験患者においても測定し、レベルをユーロジェネティクス（Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）キットを使用して照合した。ＶＬＤＬレベルのマーカーとして、同じコホートにおいてトリグリセリド濃度も測定した。
【００５９】
患者血清からの単離ＶＬＤＬ分画におけるＣＲＰの検出
様々な度合のＢＰＷを有する４名の患者からの血清を得た。これらの各々を０．９ｍｌずつの３つのアリコートに分けた。最初のアリコートは収集したときの状態のままに残した。０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  ０．１ｍｌを第二のアリコートに加えて、キレートを形成し、存在する可能性のある複合体を破壊した。０．２５Ｍ  ＣａＣｌ  ０．１ｍｌを第三のアリコートに加え、複合体形成を最適化した。次にすべての試料を、ＶＬＤＬの単離について上述したように遠心分離した。単離した分画をＣＲＰ及びトリグリセリド（シグマ・ダイアゴノースティックス・インフィニティー・リエージェント）に関して測定し、値を測定されたＶＬＤＬトリグリセリドｍＭ当りのＣＲＰとして表わした。
【００６０】
単離ＶＬＤＬのプロトロンビナーゼ支持活性
ＢＰＷを有する３名の患者の単離ＶＬＤＬを、２０名の健常志願者のプールから単離した試料と共に、プロトロンビン活性化においてリン脂質成分に取って代わる能力に関して分析した。ＶＬＤＬ濃度を１００、２００及び３００μＭ（コレステロール）に調整し、トロンビン形成の初期速度を、一般的にＮｅｓｈｅｉｍ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７９，２５４：１０９５２−１０９５６により説明される手順に従って蛍光マイクロタイタープレートリーダーでの蛍光によって測定した。
【００６１】
二相性波形を有する患者の血清におけるＣＲＰ／ＶＬＤＬ複合体の存在の証拠
血漿Ｃａ２＋の存在によりＣＲＰ／ＶＬＤＬ複合体が循環中に存在するという推論を引き出すことができたが、その複合体が、カルシウム再添加の前に血漿試料を調製するために使用した抗凝血薬への初期暴露によって形成した可能性を検討した。抗凝固薬に暴露されていない血液の血清において複合体を特定することを目指して実験を実施した。下記の表Ｉに示すように、ＢＰＷを有する患者の未処理血清から単離したＶＬＤＬにおいてＥＬＩＳＡによってＣＲＰを検出した。
【表１】
2005519267.tif 000002
【００６２】
ＣＲＰとＶＬＤＬの間の相互作用はＣａ２＋依存性であるので、試料の事前のキレート化は、検査したすべての患者において検出可能なＣＲＰの喪失を導いた。同様に、ＣＲＰとＶＬＤＬの間の複合体形成を促進する付加的なＣａ２＋との事前のインキュベーションは、ＶＬＤＬ分画内のＣＲＰの高い検出を導いた。正常患者からのＶＬＤＬは検出可能なＣＲＰを有しておらず、ＢＰＷのない、高いＣＲＰを有する患者は回収可能なＶＬＤＬを有していなかった。これらの観察から、該複合体は、その血漿がＢＰＷを示す患者の血液中に測定可能な度合で存在すると結論された。
【００６３】
（実施例３）
高いレベルのＩＬ−６、ＣＲＰ、フィブリノゲン及び／又はＳＡＡによって証明される急性期反応を経験した患者からの２０の試料を検査した。２０名の患者全員がある程度の凝固活性化を示し、リポタンパク質プロフィールの著明な破壊を明らかにすると共に、すべての患者が低コレステロール、しばしば低トリグリセリドレベルの形態の低脂血症を経験した。２０名の患者のうち１６名は、ＩＣＵ入院中又は入院の前に感染があったと判定された。リポタンパク質プロフィール及びＶＬＤＬ特性を下記に述べるように検討した。
【００６４】
リポタンパク質プロフィール
現在臨床検査室で一般的に使用されている古典的脂質化学では見出されない付加的な情報を得るために、各々の血漿の一部を、ＮＭＲ分析によってリポタンパク質プロフィールを測定するべく送付した。ＮＭＲ分析は、粒子の脂質化学に関わりなく、所与の大きさのリポタンパク質粒子の数の定量的分析を提供した。この分析から、２つの観察がすべての被験者について共通していた。ＨＤＬサイズの粒子は、量的に正常粒子濃度から５０％以上低下していた。ＶＬＤＬサイズの粒子も、プロトコールの血液検査中すべての被験者において低下した。ＶＬＤＬ量の低下は血液検査の日に依存して変化した。
【００６５】
ＬＤＬサイズの粒子の量は血液検査の日に依存して多少の変動を示したが、ＶＬＤＬ及びＨＤＬサイズの粒子で見られたよりも変動は小さかった。４つの試料が、ＩＣＵ試験期間中に非常に低いＬＤＬレベルを示した。
【００６６】
すべてのリポタンパク質クラスにおける全体的変化についての概念を得るために、すべてのリポタンパク質クラスから総表面積を求める算定を行った。この算定を実施することは、リポタンパク質が潜在的に担いうる総コア脂質の量の間接的インジケーターとなる。２０名の被験者のうち６名は６７％以上のリポタンパク質レベルの総低下（表面積による）を示し、２０名のうち１３名は５０％以上の低下を示した。これを下記の表ＩＩに要約する。
【表２】
2005519267.tif 000003
【００６７】
ＶＬＤＬ特性
２０名の患者試料のＶＬＤＬを、１．００６ｇ／ｃｃの密度（未調整密度）の超遠心分離によって各々の標本から単離した。次にこの浮遊密度サブクラスを、初期血漿と平行してアガロース電気泳動によって分析した。正常血清から単離した、この浮遊密度からのリポタンパク質（ＶＬＤＬと称される）は通常、非変性アガロースゲルでの電気泳動でプレβ移動パターンを示した。典型的なパターンは単離と分画時に出現し、すべての患者がプレβ移動からある程度のβ移動への電気泳動シフトを経験した。しばしば、ＩＣＵ血液検査の少なくとも１日又はほぼまる１週間にわたるβ移動への完全なシフトのＶＬＤＬにおける証拠が認められた。
【００６８】
アガロースゲルでの全血漿の泳動から、ＨＤＬ移動パターンの変化も認められた。正常ドナーでは、ＨＤＬはα領域で移動する。すべてのＩＣＵ患者（２０名）について、ＨＤＬの移動は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の取り込みの指標であるポストα／プレβへと変化した。
【００６９】
単離ＶＬＤＬの一部を還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。ＶＬＤＬは通常５以上のタンパク質を含むリポタンパク質である：アポＢ、アポＥ、アポＣＩ、アポＣＩＩ、アポＣＩＩＩは正常ＶＬＤＬにおいて最も一般的に認められるタンパク質である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、患者のＩＣＵ入院中に分析したときタンパク質に変化があったと思われた。アポＢは常に存在した。アポＣはそのサイズが小さいため分析が困難であったが、患者のＩＣＵ入院中に多少の変化が起こったと思われた。アポＥの変化は最も一般的であり、２０名のＩＣＵ患者で明らかな変化が見られた。患者のＩＣＵ滞在中に、時々アポＥバンドが消失した。図１２Ａは、患者２０として特定した患者からの連続的な試料の二相性勾配−１のデータを示す。図１２Ｂは、患者図１２ＡについてのＶＬＤＬの移動性のシフトを例示する、対応するアガロースゲルを示す。リポタンパク質のシフトは異常波形パターンの出現と一致した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、５８０ｎｍでの正常波形（パネルＡ）、及び二相性波形プロフィールを生じる、正しい血栓形成前の光透過率低下（パネルＢ）を示しており、点線は、定量的指数として１８秒目の透過レベル（ＴＬ１８）を表わし、ＡではＴＬ１８＝１００及びＢではＴＬ１８＝６３である。
【図２】図２は、死亡率が、正常波形を有する患者での０．２６から、Ｔ１８値が２５−３５％低下すると０．６１まで上昇することを示す、ＴＬ１８データのロジスティック回帰評価を表わしており、白丸＝観察された割合；点線＝９５％信頼限界である。
【図３】図３は、同じコホートの患者におけるセプシスとの結びつきについてのＴＬ１８データのロジスティック回帰評価を示しており、白丸＝観察された割合；点線＝９５％信頼限界である。
【図４】図４Ａ−Ｃは、（Ａ）ＡＰＴＴ−ＴＬ１８値、（Ｂ）ＣＲＰ及び（Ｃ）トリグリセリド測定からのＤＩＣ予測についてのロジスティックモデルを例示する。白丸は観察された割合であり、点線は９５％信頼限界を表わす。
【図５】図５Ａ−Ｃは、（Ａ）正常個体、（Ｂ）二相性波形を有していない集中治療患者、及び（Ｃ）二相性波形を有する集中治療患者からの血清のサイズ排除クロマトグラフィーを例示する。分画は、ＣＲＰ（太線）、アポＢ（細線）及びアポＥ（点線）に関して測定した。
【図６】図６Ａ−Ｂは、プロトロンビナーゼ支持活性を例示する。（Ａ）は、ＰＣＰＳ（●）、正常個体からのＶＬＤＬ（□）及び二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬ（◆）によって生じる比較活性を示す。（Ｂ）は、正常ＶＬＤＬ（□）、二相性波形を有する（◆）及び二相性波形を有していない（△）集中治療患者からの８１試料における差を示す。
【図７】図７Ａ−Ｃは総トリグリセリドレベルを例示しており、（Ａ）は正常個体（ｘ）、正常波形を有する患者（＋）及び種々のＡＰＴＴ−ＴＬ１８値で二相性波形を有する患者（◇）の間での血漿トリグリセリド濃度の差を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれセプシスから回復した患者と死亡した患者の合計２名からの、血漿トリグリセリドとプロトロンビナーゼ比活性／ｍＭトリグリセリドの積によって算定した総プロトロンビナーゼ活性（◆）、及びＡＰＴＴ−ＴＬ１８値（●）についての時間経過を示す。
【図８】図８Ａ−ＣはアネキシンＶ試験を例示する。（Ａ）は、蛍光複合アネキシンＶの添加後の正常及び二相性波形を有する患者（矢印）からのＶＬＤＬを比較したＦＡＣＳプロットを示す。（Ｂ）は、漸増濃度のアネキシンＶを正常個体（白いバー）及び二相性波形を有する患者（影付きバー）からのＶＬＤＬと共にインキュベートすることによる、プロトロンビナーゼ活性への作用を例示している。データは平均±ＳＥＭであり、各々の群でｎ＝４である（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００２）。（Ｃ）は、正常（□）対二相性波形を有する患者（◆）からのＶＬＤＬにおけるプロトロンビナーゼ活性への、漸増アネキシンＶ（実線）又は９Ｄ２抗体（点線）の比較作用を示している。
【図９】図９Ａ−Ｂは、ホスファチジルコリンを表わすＰＣ；ホスファチジルエタノールアミンを表わすＰＥ；スフィンゴミエリンを表わすＳＭ；セレブロシドを表わすＣｅｒに関しての（Ａ）正常患者と（Ｂ）二相性波形患者のＶＬＤＬの二次元薄層クロマトグラフィー比較を示す。
【図１０】図１０は、平均±ＳＥＭ（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００２）として表わした、対照、アポＢ及びアポＥの免疫吸着の前及び後の二相性波形患者（ｎ＝３）からのＶＬＤＬのプロトロンビナーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、修正ＡＰＴＴ凝固アッセイにおける７名の正常患者対７名の二相性波形を有する患者からのＶＬＤＬの比較凝固促進性補因子活性を示す。箱のプロットは、生じた凝固時間（秒）の２５−７５百分位の四分位区間を表わす。太線は中央値を表わし、上端及び下端データ点は四分位区間の外側に示されている。
【図１２Ａ】図１２Ａは、代表的患者についての勾配−１値の連続的試料プロフィールを提供する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、患者の血漿と単離ＶＬＤＬの対応するアガロースゲル電気泳動を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月27日(2004.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者試料からのリポタンパク質分画を、プロトロンビナーゼ活性を支持する高い能力を含む異常に関して測定すること、及び上記測定を、重症感染、ＳＩＲＳ又は止血機能不全を有する患者の既知のリポタンパク質測定に相関させることを含む、上記患者試料の感染、ＳＩＲＳ及びセプシスに対する宿主反応を診断し、監視するための方法。
【国際調査報告】
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