(57)【要約】本発明は、ＣｐＧモチーフを含む免疫刺激性核酸、および免疫刺激におけるそれらの使用法を提供する。本発明は、既知の核酸よりも高いレベルの免疫刺激を誘導する核酸の新たなファミリーの驚くべき発見に、部分的にもとづいている。この知見は、本明細書に開示した核酸配列の発見以前に１００を上回る数の核酸配列がスクリーニングされたことも理由の一つとして、驚くべきことである。これらのＣｐＧモチーフを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって、細菌ＤＮＡの免疫刺激効果を模倣することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列を含む免疫刺激性（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）核酸分子を含む、組成物。
【請求項２】
前記免疫刺激性核酸分子が、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗原をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原が、微生物抗原、癌抗原、およびアレルゲンからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記微生物抗原が、微生物抗原、ウイルス抗原、真菌抗原および寄生虫抗原からなる群より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原が、核酸ベクターによってコードされる、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸ベクターが、前記免疫刺激性核酸から分離される、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原が、ペプチド抗原である、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントが、粘膜アジュバントである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
サイトカインをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗菌剤（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗癌剤、アレルギー／喘息医薬（ａｌｌｅｒｇｙ／ａｓｔｈｍａ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）からなる群より選択される治療剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗菌剤が、抗細菌剤（ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗癌剤が、化学療法剤、癌ワクチン、および免疫治療剤からなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アレルギー／喘息医薬が、ＰＤＥ−４インヒビター、気管支拡張薬（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｏｒ）／β−２アゴニスト、Ｋ＋チャネルオープナー（ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｐｅｎｅｒ）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロシン（ｎｅｕｒｏｌｃｉｎ）アンタゴニスト、ＴＸＡ２合成インヒビター、キサンタニン（ｘａｎｔｈａｎｉｎｅ）、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼインヒビター、トロンボキシン（ｔｈｒｏｍｂｏｘｉｎ）Ａ２レセプターアンタゴニスト、トロンボキサン（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ）Ａ２アンタゴニスト、５−リポックス活性化タンパク質（５−ｌｉｐｏｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のインヒビター、およびプロテアーゼインヒビターからなる群より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫刺激性核酸が、少なくとも１つの骨格修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むヌクレオチド骨格を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド骨格が、キメラである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド骨格が、完全に修飾されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫刺激性核酸が、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記免疫刺激性核酸が、少なくとも４つのＣｐＧ部分を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫刺激性核酸が、Ｔリッチである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫刺激性核酸が、ポリＴ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫刺激性核酸が、ポリＧ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫刺激性核酸が、経口投与用に処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫刺激性核酸が、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫補助剤が、カプセル、錠剤、または舌下錠として処方される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記免疫刺激性核酸が、局所投与用に処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記免疫刺激性核酸が、非経口投与用に処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記免疫刺激性核酸が、徐放性デバイス（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｅｖｉｃｅ）において放出される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫刺激性核酸が、粘膜表面に送達されるように処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記粘膜表面が、口腔、鼻、直腸、膣、および眼の表面からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫刺激性核酸が、粘膜免疫応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記免疫刺激性核酸が、全身性免疫応答を刺激する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記免疫刺激性核酸が、粘膜免疫応答を刺激するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記免疫刺激性核酸が、全身性免疫応答を刺激するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記免疫刺激性核酸が、先天性免疫応答（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を刺激するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記免疫刺激性核酸が、感染性疾患を処置または予防するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記免疫刺激性核酸が、アレルギーを処置または予防するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記免疫刺激性核酸が、喘息を処置または予防するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記免疫刺激性核酸が、癌を処置または予防するのに有効な量で提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記徐放性デバイスが、微粒子である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記感染性疾患が、単純ヘルペスウイルス感染症である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４６】
免疫応答を刺激することを必要とする被験体において、免疫応答を刺激する方法であって、該方法は、免疫応答を刺激するのに有効な量で、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列を含む免疫刺激性核酸分子を被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記被験体が、感染を有するか、または感染を発症する危険性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記感染が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染および寄生虫感染からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルス感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、Ｉ型ヒトＴリンパ栄養ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒトＴリンパ栄養ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（多重型）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＤ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルスおよび伝染性軟属腫ウイルスからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス感染である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記被験体が、アレルギーを有するか、アレルギーを発症する危険性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が、喘息を有するか、喘息を発症する危険性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体が、癌を有するか、癌を発症する危険性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記被験体に抗原を投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗原が、微生物抗原、癌抗原、自己抗原およびアレルゲンからなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記微生物抗原が、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原および寄生虫抗原からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗原が、ヘルペスウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソ科、トキソプラズマ科、ヘモフィルス属、カンピロバクター、クロストリジウム属、Ｅ．ｃｏｌｉおよびブドウ球菌からなる群より選択される微生物から誘導される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫応答が、抗原特異的免疫応答である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗原が、核酸ベクターによってコードされる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸ベクターが、免疫刺激性核酸から分離される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗原が、ペプチド抗原である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記被験体に、アジュバントを投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
前記アジュバントが、粘膜アジュバントである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記被験体に、第二の治療剤を投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
前記第二の治療剤が、抗菌剤である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗菌剤が、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤からなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第二の治療剤が、抗癌剤である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗癌剤が、化学療法剤、癌ワクチン、および免疫治療剤からなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第二の治療剤が、アレルギー／喘息医薬である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記アレルギー／喘息医薬が、ＰＤＥ−４インヒビター、気管支拡張薬／β−２アゴニスト、Ｋ＋チャネルオープナー、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロシンアンタゴニスト、ＴＸＡ２合成インヒビター、ザンサニン、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼインヒビター、トロンボシンＡ２レセプターアンタゴニスト、トロンボキサンＡ２アンタゴニスト、５−リポックス活性化タンパク質のインヒビター、およびプロテアーゼインヒビターからなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫刺激性核酸が、少なくとも１つの骨格修飾を含むヌクレオチド骨格を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項７２】
前記骨格修飾が、ホスホロチオエート修飾である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ヌクレオチド骨格が、キメラである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ヌクレオチド骨格が、完全に修飾されている、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫刺激性核酸が、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含まない、請求項４６に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫刺激性核酸が、ポリＧ配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫刺激性核酸が、経口投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫刺激性核酸が、局所投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫刺激性核酸が、非経口投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫刺激性核酸が、徐放性デバイスにおいて投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項８１】
前記免疫刺激性核酸が、粘膜表面に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
前記免疫応答が、粘膜免疫応答である、請求項４６に記載の方法。
【請求項８３】
前記免疫応答が、全身性免疫応答である、請求項４６に記載の方法。
【請求項８４】
前記粘膜表面が、口腔、鼻、直腸、膣、および眼の表面からなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
請求項４６に記載の方法であって、該方法は、以下：
前記被験体から免疫細胞を単利する工程、
該免疫細胞を活性化するのに有効な量の前記免疫刺激性核酸と、該免疫細胞とを接触させる工程、および
該被験体に、該活性化された免疫細胞を再投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
前記免疫細胞が、白血球である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記免疫細胞が、樹状細胞である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記免疫細胞と、前記抗原とを接触させる工程をさらに包含する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記被験体が、ヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項９０】
前記被験体が、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、サル、および魚類からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項９１】
前記被験体が、感染性疾患を有するか、または感染性疾患を発症する危険性を有し、ここで、該方法が、該免疫性疾患を処置または予防する方法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項９２】
前記被験体が、喘息を有するか、喘息を発症する危険性を有し、ここで、該方法が、前記被験体における該喘息を処置または予防する方法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項９３】
前記被験体が、アレルギーを有するか、アレルギーを発症する危険性を有し、ここで、該方法が、該アレルギーを処置または予防する方法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項９４】
前記被験体が、癌を有するか、癌を発症する危険性を有し、ここで、該方法が、該癌を処置または予防する方法である、請求項４６に記載の方法。
【請求項９５】
請求項９４に記載の方法であって、前記癌が、胆道癌；骨肉腫；脳およびＣＮＳの癌；乳癌；頸部癌；絨毛癌；結腸癌；結合組織癌；子宮内膜癌；食道癌；眼の癌；胃癌；ホジキンリンパ腫；上皮内新生物；喉頭癌；リンパ腫；肝癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌からなる群より選択される、方法。
【請求項９６】
細胞表面抗原に対して特異的な抗体を投与する工程をさらに包含する、請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記免疫応答が、抗原依存性細胞障害（ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ））を引き起こす、方法。
【請求項９７】
被験体における疾患を予防する方法であって、該方法は、該被験体における疾患を予防するための標準量（ｒｅｇｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ）で、免疫刺激性核酸を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該免疫刺激性核酸は、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項９８】
先天性免疫応答を誘導する方法であって、該方法は、先天性免疫応答を刺激するのに有効な量で、免疫刺激性核酸を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該免疫刺激性核酸は、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列を有する、方法。
【請求項９９】
免疫刺激性核酸を同定する方法であって、該方法は、
免疫刺激性核酸と接触させた免疫細胞集団の活性化のコントロールレベルを測定する工程であって、該免疫刺激性核酸が、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８または配列番号１４１のヌクレオチド配列を含む、工程、
試験核酸と接触させた接触させた免疫細胞集団の活性化の試験レベルを測定する工程、および
活性化のコントロールレベルと活性化の試験レベルとを比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールレベル以上である試験レベルが、免疫刺激性核酸の指標である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、免疫活性化核酸、その組成物、および該免疫活性化核酸を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細菌ＤＮＡは、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化させるために免疫刺激効果を有するが、脊椎動物のＤＮＡはそのような効果を持たない（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、１９８８．Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：６８２−６８６；Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ら、１９８４，ＪＮＣＩ  ７２：９５５−９６２；Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９−１７６４；およびＫｒｉｅｇ，１９９８，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．４３１−４４８の総説）。現在、細菌ＤＮＡのこれらの免疫刺激効果は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチド、特に細菌ＤＮＡでは共通の塩基対含有量（ＣｐＧモチーフ）が存在するが、脊椎動物ＤＮＡではメチル化され、かつ不十分なＣｐＧジヌクレオチドが存在することが理解されている（Ｋｒｉｅｇら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｋｒｉｅｇ，１９９９  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９３３２１：１−１０）。
【０００３】
これらのＣｐＧモチーフを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によって、細菌ＤＮＡの免疫刺激効果を模倣することができる。そのようなＣｐＧ−ＯＤＮは、ヒトおよびマウスの白血球に対して、高い刺激効果を及ぼすもので、該効果としてＢ細胞の増殖、サイトカインおよび免疫グロブリンの分泌、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解活性およびＩＦＮ−γ分泌、ならびに樹状細胞（ＤＣｓ）の活性化および他の抗原提示細胞が挙げられ、同時刺激分子を発現し、サイトカイン（特にＴｈｌ様細胞応答の発現を促進する際に重要であるＴｈｌ様サイトカイン）を分泌する。
【０００４】
天然リン酸ジエステル骨格ＣｐＧ−ＯＤＮの免疫刺激効果は、ＣｐＧモチーフのメチル化、ＧｐＣへの変化、さもなけば該ＣｐＧモチーフの除去または改変をおこなう場合、該効果が本質的に除去される点で、ＣｐＧ特異性が高い（Ｋｒｉｅｇら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３０５−１０）。リン酸ジエステルＣｐＧ−ＯＤＮは、免疫効果を高めるために貯留特性または改善された細胞取り込みを持つ脂質、ミョウバン、または他のビヒクルで処方され得る（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：８３１−８３６；Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉら、１９９８  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４：１０９−１１８）。
【０００５】
初期の研究では、免疫刺激性ＣｐＧモチーフが式；プリン−プリン−ＣｐＧ−ピリミジン−ピリミジンに従うと考えられた（Ｋｒｉｅｇら、１９９５  Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ，１９９６  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２１−４２３；Ｈａｃｋｅｒら、１９９８  ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：６２３０−６２４０；Ｌｉｐｆｏｒｄら、１９９８  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４９６−５００）。しかし、マウス・リンパ球がこの「式」に従わないリン酸ジエステルＣｐＧに対して、かなり良好に反応すること（Ｙｉら、１９９８  Ｊ．Ｉｎｕｎｕｎｏｌ．１６０：５８９８−５９０６）、また同じことがヒトのＢ細胞および樹状細胞にも当てはまること（Ｈａｒｔｍａｎｎら、１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：９３０５−１０；Ｌｉａｎｇ，１９９６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１１１９−１１２９）が現在明らかにされている。
【０００６】
幾人かの過去の研究者は、ＯＤＮのヌクレオチド含有量が該ＯＤＮの配列とは無関係な効果を有するかどうかを調べた。面白いことに、アンチセンスＯＤＮが、通常、ＧＧ、ＣＣＣ、ＣＣ、ＣＡＣ、およびＣＧ配列の含有量が高く、その一方で、塩基の使用がランダムであると予想されるものと比較した場合に、ＴＴまたはＴＣＣヌクレオチド配列の頻度が低下しているという知見が得られている（Ｓｍｅｔｓｅｒｓら、１９９６  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｃｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．６：６３−６７）。このことは、過剰に表された配列が、アンチセンス・オリゴヌクレオチドに対する好ましい標的要素を含むものであってもよく、またその逆であってもよい。アンチセンス実験に対するチミジン・リッチのＯＤＮの使用を避ける１つの理由は、細胞に存在するヌクレアーゼによってＯＤＮが分解し、細胞の増殖を評価する実験にしばしば用いられる３Ｈ−チミジンと競争する遊離のチミジンを放出することである（（Ｍａｔｓｏｎら、１９９２  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２：３２５−３３０）．）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、既知の核酸よりも高いレベルの免疫刺激を誘導する核酸の新たなファミリーの驚くべき発見に、部分的にもとづいている。この知見は、本明細書に開示した核酸配列の発見以前に１００を上回る数の核酸配列がスクリーニングされたことも理由の一つとして、驚くべきことである。
【０００８】
本発明の一態様は、配列番号１（ＯＤＮ  １０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）、または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）のヌクレオチド配列を持つ免疫刺激性核酸分子を含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、免疫応答を必要とする被験体での該免疫応答を刺激する方法であって、免疫応答を刺激するのに有効な量の配列番号１（ＯＤＮ  １０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）、または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）のヌクレオチド配列を含む免疫活性化核酸分子を、被験体に対して投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明の種々の実施形態は、本明細書に記載された態様に等しくあてはまるものであり、そのいくつかを以下に述べる。
【００１１】
一実施形態では、免疫活性化核酸分子は、配列番号１（ＯＤＮ１０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）、または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）のヌクレオチド配列からなる。
【００１２】
別の実施形態では、上記組成物は、さらに抗原を含む。あるいは、処置すべき被験体は、さらに抗原が投与される。この抗原は、微生物抗原、自己抗原、癌抗原、およびアレルゲンからなる群から選択することができる。しかし、それに限定されるものではない。一実施形態では、微生物抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、および寄生虫抗原からなる群から選択される。別の実施形態では、抗原は核酸ベクターによってコードされる。関連した実施形態では、核酸ベクターは免疫活性化核酸から分離される。抗原はペプチド抗原であってもよい。
【００１３】
別の実施形態では、組成物がさらにアジュバンドを含み、または被験体がさらにアジュバンドを投与される。アジュバンドは、粘膜アジュバンドであってもよいが、それに限定されるものではない。
【００１４】
別の実施形態では、組成物はさらにサイトカインを含むか、または被験体がさらにサイトカインを投与される。
【００１５】
さらに別の実施形態では、組成物はさらに、抗細菌剤、抗癌剤、アレルギー／喘息薬からなる群から選択される治療薬を含むか、または被験体はさらに同一の群から選択される治療薬が投与される。関連した実施形態では、抗菌剤は、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生虫剤からなる群から選択される。別の実施形態では、抗癌剤は、化学療法薬、癌ワクチン、および免疫療法薬からなる群から選択される。さらに別の関連した実施形態では、アレルギー／喘息薬は、ＰＤＥ−４インヒビター、気管支拡張薬（ｂｒｏｎｃｈｏｄｉｌａｔｏｒ）／β２アゴニスト、Ｋ＋チャネルオープナー（ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｐｅｎｅｒ）、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロキン（ｎｅｕｒｏｌｃｉｎ）アンタゴニスト、ＴＸＡ２合成インヒビター、キサンタニン（ｘａｎｔｈａｎｉｎｅ）、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼインヒビター、トロンボキシン（ｔｈｒｏｍｂｏｘｉｎ）Ａ２レセプターアンタゴニスト、トロンボキサン（ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ）Ａ２アンタゴニスト、５−リポックス活性化タンパク質（５−ｌｉｐｏｘ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のインヒビター、およびプロテアーゼインヒビターからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、免疫活性化核酸は、少なくとも１つの骨格修飾を含むヌクレオチド骨格を持つことができる。一実施形態では、骨格修飾はホスホロチオエート修飾である。別の実施形態では、ヌクレオチド骨格はキメラである。１つの実施形態において、ヌクレオチド骨格は、完全に修飾される。
【００１７】
一実施形態では、上記組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含む。
【００１８】
一実施形態では、免疫活性化核酸はメチル化ＣｐＧ  ジヌクレオチドを含まない。別の実施形態では、免疫活性化核酸は少なくとも４つのＣｐＧのモティーフを含む。さらに別の実施例では、免疫活性化核酸はＴが豊富である。関連した実施形態では、免疫活性化核酸はポリＴ配列を含む。別の実施形態では、免疫活性化核酸はポリＧ配列を含む。
【００１９】
ある種の実施形態では、免疫活性化核酸はさまざまな方法で処方される。一実施形態では、免疫活性化核酸を経口投与用に処方する。免疫活性化核酸は、栄養補給剤として処方してもよい。関連した実施形態では、栄養補給剤はカプセル、錠剤（ｐｉｌｌ）、または舌下錠（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ  ｔａｂｌｅｔ）として処方される。別の実施形態では、免疫活性化剤を局所投与用に処方する。免疫活性化核酸を非経口投与用に処方したり、あるいは徐放性デバイス（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｅｖｉｃｅ）内に処方してもよい。徐放性デバイスを微小粒子とすることができるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、免疫活性化核酸を粘膜表面への送達用に処方する。粘膜表面は、口腔面、鼻腔面、膣面、および眼球面からなる群から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
一実施形態では、免疫活性化核酸は、粘膜免疫応答を刺激する。他の実施形態では、免疫活性化核酸は全身免疫応答を刺激する。重要な実施形態では、免疫活性化核酸は粘膜免疫応答と全身免疫応答との両方を刺激する。いくつかの実施形態では、免疫応答は抗原特異性免疫応答である。関連した実施形態では、粘膜免疫応答を刺激するのに有効な量で免疫活性化核酸が与えられる。他の実施形態では、全身免疫応答を刺激するのに有効な量で免疫活性化核酸が与えられる。さらに他の実施形態では、生来の免疫応答を刺激するために有効な量で免疫活性化核酸が与えられる。
【００２１】
多くの実施形態において、免疫活性化核酸は、種々の疾患の処置または予防を目的とする。したがって、一実施形態では、免疫活性化核酸は、感染症を処置または予防するのに有効な量で与えられる。別の実施形態では、免疫活性化核酸はアレルギーを処置または予防するのに有効な量で与えられる。さらに別の実施例では、免疫活性化核酸は喘息を処置または予防するために有効な量で与えられる。さらに別の実施形態では、免疫活性化核酸は癌を処置または予防するのに有効な量で与えられる。
【００２２】
関連した実施形態では、感染症は単純ヘルペスウイルス感染症である。別の実施形態では、免疫活性化核酸は、感染症に罹っている被験体または感染症を発症する危険性のある被験体に対して投与することを目的とする。感染症は、細菌感染、ウィルス感染、真菌感染、および寄生虫感染からなる群から選択することができる。１つの実施形態において、ウィルス感染はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトＩ型Ｔリンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＩＩ型Ｔリンパ増殖性ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）、ヒト・パピローマ・ウイルス（マルチプル型）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＤ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス、ならびにＭｏｌｌｕｓｃｕｍ伝染性ウイルスからなる群から選択される。重要な実施形態では、ウイルス感染は、単純ヘルペスウイルス感染である。
【００２３】
別の実施形態では、感染症は、ヘルペスウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、トキソプラズマ、ヘモフィルス、カンピロバクター、クロストリジウム、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびブドウ球菌からなる群から選択される微生物種による感染症である。関連した実施形態において、被験体に投与される抗原または組成物中に含まれる抗原は、前述の種のうちの１種に由来する。
【００２４】
ある種の実施形態では、感染症はＳＡＲＳ感染症またはサルポックス感染症である。
【００２５】
別の実施形態では、免疫刺激性核酸は、アレルギーを呈するか、またはアレルギーを発症する危険性がある被験体、喘息を呈するか、または喘息を発症する危険性がある被験体、または癌に罹っているか、または癌になる危険性がある被験体に対する投与を目的とする。
【００２６】
被験体に対する処置に関連する実施形態では、上記方法は、さらに、該被験体から免疫細胞を単離し、該免疫細胞を活性化させるのに有効な量の免疫活性化核酸とその免疫細胞とを接触させ、該活性化免疫細胞を被験体に再び投与することを、さらに含むものであってもよい。一実施形態では、免疫細胞は白血球である。別の実施形態では、免疫細胞は樹状細胞である。別の実施形態では、上記方法は、免疫細胞と抗原とを接触させることを、さらに含む。
【００２７】
重要な実施形態では、被験体はヒトである。別の実施形態では、被験体はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、トリ、サル、および魚類からなる群から選択される。
【００２８】
したがって、本明細書に提供される方法は、感染症に罹っている被験体または感染症を発症する危険性がある被験体に対して用いることができ、該方法は被験体における感染症を処置または予防するための方法である。また、この方法は喘息に罹っている被験体または喘息を発症する危険性がある被験体に対して用いることができ、該方法は喘息を処置または予防するための方法である。この方法はアレルギーに罹っている被験体またはアレルギーを発症する危険性がある被験体に対して用いることができ、該方法はアレルギーを処置または予防するための方法である。さらに、この方法は癌に罹っている被験体または癌を発症する危険性がある被験体に対して用いることができ、該方法は癌を処置または予防するための方法である。一実施形態では、癌は、胆道癌、骨癌、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、大腸癌、結合組織癌、子宮内膜癌、食道癌、目癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、上皮内癌新生物、喉頭癌、リンパ腫、肝癌、肺癌（例えば小細胞および非小細胞）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌からなる群から選択される。
【００２９】
本明細書で提供される治療または予防のための方法のさらに別の実施形態では、この方法は、細胞表面抗原に対して特異的な抗体を投与することをさらに含み、免疫応答が抗原依存型細胞障害活性（ＡＤＣＣ）をもたらす。
【００３０】
本発明の別の態様では、被験体での疾患予防の方法は、定期的に被験体に対して免疫活性化核酸を投与することで、該被験体の疾患を防ぐことが含まれ、この免疫活性化核酸は、配列番号１（ＯＤＮ  １０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）を含むヌクレオチド配列を有する。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、先天性免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、先天性免疫応答を活性化するのに有効な量の免疫活性化核酸を、被験体に投与することを含み、該免疫活性化核酸は、配列番号１（ＯＤＮ  １０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）を含むヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は免疫活性化核酸を同定する方法を提供するもので、該方法は、配列番号１（ＯＤＮ  １０１０２）、配列番号１９（ＯＤＮ  １０１０３）、配列番号４５（ＯＤＮ  １０１０４）、配列番号１１８（ＯＤＮ  １０１０５）または配列番号１４１（ＯＤＮ  １０１０６）のヌクレオチド配列を含む免疫活性化核酸と接触させた免疫細胞集団の活性化対照水準を測定するステップと、試験核酸と接触させた免疫細胞集団の活性化試験水準を測定するステップと、活性化対照水準と活性化試験水準とを比較するステップとを有し、上記対照水準と等しいか、またはそれを上回る試験水準が、免疫活性化核酸を示す。
【００３３】
本発明のこれらの態様および他の態様ならびに実施形態を、本明細書でさらに詳細に説明する。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
ＣｐＧ含有核酸が免疫系を刺激し、それによって、癌、感染症、アレルギー、喘息、および他の障害の処理および癌化学療法の後に易感染症に対する保護を助けるために使用することができることが、先行分野で知られていた。ＣｐＧ刺激から生ずる強力でありながらバランスのとれた細胞性免疫応答および液性免疫応答は、侵入病原微生物およびガン細胞に対する身体自体の自然防御系を反映する。ヒトＤＮＡでは相対的にまれなＣｐＧ配列は、細菌等の感染性微生物のＤＮＡに共通して見いだされる。ヒト免疫系は、明らかにＣｐＧ配列を感染の初期警告兆候として認識するように、また他の免疫刺激剤でたびたび見られる副作用を生ずることなく侵入病原微生物に対して迅速かつ強力な免疫応答を起こすように、進化した。したがって、この不活性免疫防御機構に依存したＣｐＧ含有核酸は、免疫治療のためにユニークかつ自然な経路を利用することができる。
【００３５】
免疫修飾に対するＣｐＧ核酸の効果は、本特許出願の発明者らによって発見され、同時係属特許出願の中で広範囲に説明されている。このような同時係属出願として、米国特許出願番号第０８／３８６，０６３号（出願日  ０２／０７／９５）（および関連ＰＣＴ  ＵＳ９５／０１５７０）、第０８／７３８，６５２号（出願日１０／３０／９６）、第０８／９６０，７７４号（出願日１０／３０／９７）（および関連ＰＣＴ出願／米国９７／１９７９１、ＷＯ  ９８／１８８１０）、第０９／１９１，１７０号（出願日１１／１３／９８）、第０９／０３０，７０１号（出願日０２／２５／９８）（および関連ＰＣ／ＵＳ９８／０３６７８、第０９／０８２，６４９号（出願日０５／２０／９８）（および関連ＰＣ／ＵＳ９８／１０４０８）、第０９／３２５，１９３号（出願日０６／０３／９９）（および関連ＰＣ／ＵＳ９８／０４７０３）、第０９／２８６，０９８号（出願日０４／０２／９９）（および関連ＰＣ／ＵＳ９９／０７３３５）、第０９／３０６，２８１号（出願日０５／０６／９９）（および関連ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３）が挙げられる。これらの特許および特許出願の各々の内容全体を、本明細書で参考として援用する。
【００３６】
本発明は、部分的に、既に報告されたＣｐＧ核酸よりも免疫刺激性が高い核酸のいくつかのファミリーの思いがけない発見にもとづいている。各ファミリーは、特に免疫刺激性のある核酸によって表される。これらの核酸ファミリーとそれらの代表的なメンバーは、下で更に詳細に記載される。
ＯＤＮ１０１０２ファミリー
この核酸ファミリーは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７  ＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号３）の式を持つヌクレオチド配列から構成され、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ７は、それぞれ独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。そのような核酸は、５’ＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４）のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ１；Ｘ１とＸ２；Ｘ１、Ｘ２、とＸ３；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３とＸ４；もしくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４とＸ５を欠如し得るか、またはＸ１からＸ６までを欠如し得るか、またはＸ１からＸ７までが欠如し得る。
【００３８】
一実施形態では、Ｘ１はチミジン、および／またはＸ２はシトシン、および／またはＸ３はグアノシン、および／またはＸ４はチミジン、および／またはＸ５はシトシン、および／またはＸ６はグアノシン、および／またはＸ１はチミジンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００３９】
このファミリーの核酸は、一般に、少なくとも１７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長を超える。例としては、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上である核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１７〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００４０】
この第１のファミリーの核酸すべてが、少なくとも３つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、４または５つ以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接、または交互に、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、互いに離間したものであってもよい。
【００４１】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、６０％を上回る、または６０％を下回り、あるいは５５％を下回るチミジンを含むものであってもよい。
【００４２】
本発明は、一つには、以前報告されたＣｐＧ核酸よりも免疫刺激性が高い別の核酸ファミリーを予想外にも発見したことを、さらに前提とする。この核酸ファミリーは、式５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６３’（配列番号５）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は、独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。そのような核酸は、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ３’（配列番号６）のヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ６の欠如、Ｘ６およびＸ５の欠如、またはＸ６、Ｘ５、およびＸ４の欠如、Ｘ６からＸ３までの欠如、Ｘ６からＸ２までの欠如、もしくはＸ６からＸ１までの欠如が生じたものであってもよい。。
【００４４】
一実施形態では、Ｘ１はシトシンである。別の実施形態では、Ｘ２はグアノシンである。別の実施形態では、Ｘ３はチミジンである。別の実施形態では、Ｘ４はチミジンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００４５】
この後者のファミリーの核酸は、一般に、少なくとも１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２３、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長を超える。例としては、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれより長い核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１８〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００４６】
この第２のファミリーの核酸すべてが、少なくとも４つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、実施形態に依存して、５つ以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接、または交互に、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、互いに離間したものであってもよい。
【００４７】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、６０％を上回る、または６０％を下回り、あるいは５５％を下回るチミジンを含むものであってもよい。
【００４８】
別の局面では、本発明は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号１）（ＯＤＮ  １０１０２）のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。実施例にさらに詳しく記載したように、この核酸は、既に同定された免疫刺激性核酸と類似またはそれを上回る免疫刺激活性を有する核酸について多数の核酸をスクリーニングした後のみに、同定された。より具体的には、この核酸を、免疫刺激性であることが既に示されているＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号２）のヌクレオチド配列を有する核酸と比較した。配列番号１を含む核酸を、配列番号２を含む核酸のものよりも大きい免疫刺激能を有するものについて、約１６５核酸をスクリーニングした後のみに同定した。活性の違いは驚くべきことである。なぜなら、配列暗号１と配列番号２とのあいだに最小限の違い（すなわち、２つのヌクレオチド間の違い）しかないからである。そのような配列内の最小の変化によって、統計学的に有意な免疫刺激の上昇をもたらすことは、予期されなかった。
【００４９】
本発明のさらに他の局面では、以下のヌクレオチド配列を有する核酸が提供される。すなわち、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴ３’（配列番号７）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  Ｇ３’（配列番号８）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ３’（配列番号９）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴ３’（配列番号１０）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  Ｇ３’（配列番号１１）、５’ＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号ｌ２）、５’Ｇ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１３）、５’ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１４）、５’ＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１５）、５’Ｇ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１６）、５’ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１７）、および５’ＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１８）である。
【００５０】
本発明の核酸は、配列番号４および配列番号６のコア配列が存在するという条件で、ポリＴモチーフ、ポリＧモチーフ、ＴＧモチーフ、ポリＡモチーフ、ポリＣモチーフ等の他の免疫刺激性モチーフをさらに含むことができる。これらの免疫刺激性モチーフは、後述の記載または米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）に、より詳細に記載されている。
【００５１】
（ＯＤＮ１０１０３ファミリー）
この核酸ファミリーは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４Ｘ５Ｘ６  Ｘ７Ｘ８Ｘ９  Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号２０）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。このような核酸は、５’ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ３’（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ１の欠如、Ｘ１およびＸ２の欠如、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の欠如、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の欠如、または、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５の欠如、Ｘ１からＸ６までの欠如、Ｘ１からＸ７までの欠如、Ｘ１からＸ８までの欠如、Ｘ１からＸ９までの欠如、Ｘ１からＸ１０までの欠如、Ｘ１からＸ１１までの欠如、ならびにＸ１からＸ１２までの欠如をともなうものであってもよい。
【００５３】
種々の実施形態では、Ｘ１はチミジン、および／またはＸ２はシトシン、および／またはＸ３はグアノシン、および／またはＸ４はチミジン、および／またはＸ５はシトシン、および／またはＸ６はグアノシン、および／またはＸ７はチミジン、および／またはＸ８はチミジン、および／またはＸ９はチミジン、および／またはＸ１０はチミジン、および／またはＸ１１はチミジン、および／またはＸ１２はシトシンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００５４】
このファミリーの核酸は、一般に、少なくとも９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、および少なくとも２１ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２１ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、核酸は、２１ヌクレオチド長を超える。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれより長い核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は９〜１００、より好ましくは２１〜１００ヌクレオチド長である。
【００５５】
この第１のファミリーの核酸すべてが、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、２、３、４、またはそれより多いＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接していてもよく、あるいは、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【００５６】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％のチミジンを含むことができる。
【００５７】
本発明は、一つには、以前報告されたＣｐＧ核酸と同等の免疫刺激性である別の核酸ファミリーを予想外にも発見したことを、さらに前提とする。この核酸ファミリーは、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４Ｘ５Ｘ６  Ｘ７Ｘ８Ｘ９３’（配列番号２２）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１からＸ９は、それぞれ独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。例としては、この核酸は、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ３’（配列番号２３）のヌクレオチド配列を含み得る。
【００５８】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ９の欠如、Ｘ９およびＸ８の欠如、Ｘ９、Ｘ８、およびＸ７の欠如、Ｘ９からＸ６までの欠如、Ｘ９からＸ５での欠如、Ｘ９からＸ４までの欠如、Ｘ９からＸ３までの欠如、Ｘ９からＸ２までの欠如、およびＸ９からＸ１までの欠如をともなうものであってもよい。
【００５９】
種々の実施形態では、Ｘ１はグアノシン、および／またはＸ２はグアノシン、および／またはＸ３はチミジン、および／またはＸ４はシトシン、および／またはＸ５はグアノシン、および／またはＸ６はチミジン、および／またはＸ７はチミジン、および／またはＸ８はチミジン、および／またはＸ９はチミジンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００６０】
このファミリーの核酸は、一般的に、少なくとも１２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、その核酸は少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２１ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は、２１ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は２１ヌクレオチド長を上回る。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上である核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１２〜１００、より好ましくは２１〜１００ヌクレオチド長である。
【００６１】
この第２のファミリーの核酸すべてが、少なくとも２つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、３もしくは４、またはそれより多いＣｐＧモチーフを含み得るが、これは、実施形態に依存する。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接していてもよく、あるいは、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、互いに離間したものであってもよい。
【００６２】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％のチミジンを含むことができる。
【００６３】
別の局面では、本発明は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ（配列番号１９）（ＯＤＮ  １０１０３）のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。実施例にさらに詳しく記載したように、この核酸は、以前に同定された免疫刺激性核酸と類似またはそれを上回る免疫刺激性活性を有する核酸について多数の核酸をスクリーニングした後のみに、同定された。より具体的には、この核酸を、免疫刺激性であることが以前に示されているＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号２）のヌクレオチド配列を有する核酸と比較した。配列番号１９を含む核酸を、配列番号２を含む核酸のものと類似、またはそれより大きい免疫刺激能を有するものについて、約１６５核酸をスクリーニングした後のみに同定した。活性の違いは驚くべきことである。なぜなら、配列暗号１９と配列番号２との間は、最小限の違い（すなわち、配列番号２と比較して配列番号１９は、３つのさらなる内部ヌクレオチド（すなわち、ＴＣＧ）を含み、６個の３’ヌクレオチドを欠失する）のみだからである。このような配列内の変化が、免疫刺激の上昇をもたらすことは、予想外のことであった。
【００６４】
本発明のなお他の局面では、以下のヌクレオチド配列を有する核酸が提供される。すなわち、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴ３’（配列番号２４）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  Ｔ３’（配列番号２５）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ３’（配列番号２６）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧ３’（配列番号２７）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  Ｃ３’（配列番号２８）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ３’（配列番号２９）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧ３’（配列番号３０）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  Ｇ３’（配列番号４４）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ３’（配列番号３１）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３２）、５’ＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３３）、５’Ｇ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３４）、５’ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３５）、５’ＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３６）５’Ｇ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３７）、５’ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３８）、５’ＴＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号３９）、５’Ｔ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ３’（配列番号４０）、５’ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号４１）、５’ＴＣ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号４２）、５’Ｃ  ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号４３）、５’ＧＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ３’（配列番号２１）である。
【００６５】
これらの免疫刺激性核酸は、先天性免疫系を活性化させる能力を有し、肝炎Ｂ表面抗原等の抗原が同時投与された場合に、液性および細胞性の両方の抗原特異的反応を増強させる能力を有する。本明細書で提供される例は、これらの核酸が、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト免疫細胞を刺激することができ、また生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でマウス細胞を刺激することができることを示す。強力なアジュバントであることを知られている配列と比較した場合、配列番号１９の核酸は、ワクチンアジュバンドとして少なくとも１０〜１５％である。
【００６６】
本発明の核酸は、配列番号２１および配列番号２３のコア配列が存在するという条件で、ポリＴモチーフ、ポリＧモチーフ、ＴＧモチーフ、ポリＡモチーフ、ポリＣモチーフ等の他の免疫刺激性モチーフをさらに含むことができる。これらの免疫刺激性モチーフは、後述の記載または米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）により詳細に記載されている。
【００６７】
（ＯＤＮ  １０１０４  ファミリー）
この核酸ファミリーは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４６）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、およびＸ６は、独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。このような核酸は、５’ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４７）のヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ１の欠如、Ｘ１およびＸ２の欠如、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の欠如、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の欠如、またはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５の欠如をともなうものであってもよい。したがって、本発明は以下のヌクレオチド配列を有する核酸を包含することを意図している。すなわち、５’Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４８）、５’Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４９）、５’Ｘ４Ｘ５Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号５０）、５’Ｘ５Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号５１）、５’Ｘ６  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号５２）である。
【００６９】
一実施形態では、Ｘ１はチミジンである。別の実施形態では、Ｘ２はシトシンである。別の実施形態では、Ｘ３はグアノシンである。別の実施形態では、Ｘ４はチミジンである。なお別の実施形態では、Ｘ５はシトシンである。さらに別の実施形態では、Ｘ６はグアノシンである。本発明は、以下のように複数のフランキング残基の組み合わせを、さらに包含する（空白のセルはＮ残基、すなわち、本明細書に記した、または当該分野で公知の、天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチドのいずれかであり得る）。
【００７０】
【表１−１】
2005532067.tif 000002
【００７１】
【表１−２】
2005532067.tif 000003
【００７２】
表１は、第１の核酸ファミリーのメンバーである、可能な核酸の一部のみを表している。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸の配列を決定することが可能である。
【００７３】
このファミリーの核酸は、一般的に、少なくとも１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、その核酸は少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、この核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長を上回る。例としては、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれより長い核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１８〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００７４】
この第１のファミリーの核酸すべてが、少なくとも３つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、４もしくは５、またはそれより多いＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接していてもよく、あるいは、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【００７５】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、６０％を上回るか６０％未満であるか、または５５％未満のチミジンを含むことができる。
【００７６】
本発明は、一つには、従来報告されたＣｐＧ核酸よりも免疫刺激性が高い別の核酸ファミリーを予想外にも発見したことを、さらに前提とする。この核酸ファミリーは、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４３’（配列番号９５）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、独立して選択された残基であり、該残基はアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。例として、核酸は、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ、ＣＧＴ、ＴＴＴ  ＧＴ３’（配列番号９６）のヌクレオチド配列を含む。
【００７７】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ４の欠如、Ｘ４およびＸ３の欠如、Ｘ４およびＸ３の欠如、またはＸ４、Ｘ３、およびＸ２の欠如が生じたものであってもよい。したがって、本発明は以下のヌクレオチド配列を有する核酸を包含することを意図している。すなわち、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴ  Ｘ１Ｘ２Ｘ３３’（配列番号９７）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴ  Ｘ１Ｘ２３’（配列番号９８）、および５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴ  Ｘ１３’（配列番号９９）である。
【００７８】
一実施形態では、Ｘ１はシトシンである。別の実施形態では、Ｘ２はグアノシンである。別の実施形態では、Ｘ３はチミジンである。別の実施形態では、Ｘ４はチミジンである。本発明は、以下のように複数のフランキング残基の組み合わせを、さらに包含する（空白のセルはＮ残基、すなわち、本明細書に記した、または公知の、天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオチドのいずれかであり得る）。
【００７９】
【表２】
2005532067.tif 000004
【００８０】
表２は、第２の核酸ファミリーのメンバーである、可能な核酸の一部のみを表している。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸の配列を決定することが可能である。
【００８１】
この後者のファミリーの核酸は、一般的に、少なくとも２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長を上回る。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれより長い核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は２０〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００８２】
この第２のファミリーの核酸すべてが、少なくとも４つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、５つ以上のＣｐＧモチーフを含み得るが、これは、実施形態に依存する。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接していてもよく、あるいは、それらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【００８３】
このファミリーの核酸は、チミジンヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、６０％を上回るか６０％未満、または５５％未満のチミジンを含むことができる。
【００８４】
別の局面では、本発明は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号４５）（ＯＤＮ  １０１０４）のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。実施例にさらに詳しく記載したように、この核酸は、以前に同定された免疫刺激性核酸と類似またはそれを上回る免疫刺激活性を有する核酸について多数の核酸をスクリーニングした後のみに、同定された。より具体的には、この核酸を、免疫刺激性であることが以前に示されているＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号２）のヌクレオチド配列を有する核酸と比較した。配列番号４５を含む核酸を、配列番号２を含む核酸の免疫刺激能よりも大きい免疫刺激能を有する核酸について、約１６５核酸をスクリーニングした後のみに同定した。活性の違いは驚くべきことである。なぜなら、配列番号４５と配列番号２とのあいだに最小限の違い（すなわち、シトシン（配列番号４５）によるチミジン（配列番号２）の置換）しかないからである。このような配列内の最小の変化によって、統計学的に有意な免疫刺激性の上昇をもたらすことは、予想外のことであった。
【００８５】
本発明のなお他の局面では、以下のヌクレオチド配列を有する核酸が提供される。すなわち、５’ＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１１０）、５’Ｇ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１１１）、５’ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１１２）、５’ＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１１３）、５’Ｇ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号１１４）、５’ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ３’（配列番号４７）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴ  ３’（配列番号１１５）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  Ｇ３’（配列番号１１６）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ３’（配列番号１１７）、５’ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴ３’（配列番号９６）である。
【００８６】
本発明の核酸は、配列番号４７および配列番号９６のコア配列が存在するという条件で、ポリＴモチーフ、ポリＧモチーフ、ＴＧモチーフ、ポリＡモチーフ、ポリＣモチーフ等の他の免疫刺激性モチーフをさらに含むことができる。これらの免疫刺激性モチーフは、後述の記載または米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）に、より詳細に記載されている。
【００８７】
（ＯＤＮ  １０１０５  ファミリー）
この核酸ファミリーは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３  Ｘ４Ｘ５Ｘ６  Ｘ７Ｘ８Ｘ９  Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２  Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ３’（配列番号１１９）の式を有するヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、およびＸ１５は、独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。このような核酸は、５’ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ３’（配列番号１２０）のヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ１の欠如、Ｘ１およびＸ２の欠如、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３の欠如、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４の欠如、もしくはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５の欠如、Ｘ１からＸ６までの欠如、Ｘ１からＸ７までの欠如、Ｘ１からＸ８までの欠如、Ｘ１からＸ９までの欠如、Ｘ１からＸ１０までの欠如、Ｘ１からＸ１１までの欠如、Ｘ１からＸ１２までの欠如、Ｘ１からＸ１３までの欠如、Ｘ１からＸ１４までの欠如、ならびにＸ１からＸ１５までの欠如をともなうものであってもよい。
【００８９】
種々の実施形態では、Ｘ１はチミジン、および／またはＸ２はシトシン、および／またはＸ３はグアノシン、および／またはＸ４はチミジン、および／またはＸ５はシトシン、および／またはＸ６はグアノシン、および／またはＸ７はチミジン、および／またはＸ８はチミジン、および／またはＸ９はチミジン、および／またはＸ１０はチミジン、および／またはＸ１１はグアノシン、および／またはＸ１２はチミジン、および／またはＸ１３はシトシン、および／またはＸ１４はグアノシン、および／またはＸ１５はチミジンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００９０】
このファミリーの核酸は、一般に、少なくとも９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長を超える。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上の核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は９〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００９１】
この第１のファミリーの核酸すべてが、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、２、３、４またはそれ以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接するか、またはそれらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【００９２】
このファミリーの核酸はまた、チミジン・ヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％のチミジンを含むことができる。
【００９３】
本発明は、一つには、従来報告されたＣｐＧ核酸と同様に免疫刺激性である別の核酸ファミリーを予想外にも発見したことを、さらに前提とする。この核酸ファミリーは、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＸ１Ｘ２  Ｘ３Ｘ４Ｘ５  ３’（配列番号１２１）の式を持つヌクレオチド配列から構成され、該式中、Ｘ１ないしＸ９は、それぞれ独立して選択された残基であり、該残基をアデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択することができる。いくつかの実施形態では、フランキング残基が存在しなくてもよい。例として、そのような核酸は、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  Ｔ  ３’  （配列番号１２２）のヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
他の実施形態では、核酸は、Ｘ５の欠如、Ｘ５およびＸ４の欠如、Ｘ５、Ｘ４、およびＸ３の欠如、Ｘ５からＸ２までの欠如、およびＸ５からＸ１までの欠如が生じたものであってもよい。
【００９５】
種々の実施形態では、Ｘ１はチミジンであり、および／またはＸ２はチミジンであり、および／またはＸ３はシトシンであり、および／またはＸ４はグアノシンであり、および／またはＸ５はアデニンである。当業者は、このファミリーに属する残りの核酸配列を決定することができる。
【００９６】
このファミリーの核酸は、一般に、少なくとも１９ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この核酸は、少なくとも２０、少なくとも２２、および少なくとも２４ヌクレオチド長である。好ましい実施形態では、核酸は２４ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は、２４ヌクレオチド長を超える。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上の核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１９〜１００、より好ましくは２４〜１００ヌクレオチド長である。
【００９７】
この第２のファミリーの核酸すべてが、少なくとも３つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、実施形態に依存して、４以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接するか、またはそれらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【００９８】
このファミリーの核酸はまた、チミジン・ヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％のチミジンを含むことができる。
【００９９】
別の態様では、本発明は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ（配列番号１１８）（ＯＤＮ  １０１０５）の式を持つヌクレオチド配列から構成される核酸を提供する。実施例でより詳細に説明するように、この核酸は、既に同定された免疫刺激性核酸と類似またはそれを上回る免疫刺激活性を持つ核酸について多数の核酸をスクリーニングした後のみに、同定された。より具体的には、この核酸を、免疫刺激性であることが既に示されているＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号２）のヌクレオチド配列を持つ核酸と比較した。配列番号１１８を含む核酸を、配列番号２を含む核酸のものと類似またはそれよりも大きい免疫刺激能を有するものについて、約１６５核酸をスクリーニングした後のみに同定された。活性の違いは驚くべきことである。なぜなら、配列暗号１１８と配列番号２とのあいだに７９％同一性（すなわち、３’側の５つのヌクレオチドが配列番号１１８と配列番号２とのあいだで異なる）があるからである。配列内の変化によって、免疫刺激の上昇がもたらせられるとは予想外であった。
【０１００】
本発明のさらに別の態様では、以下のヌクレオチド配列を持つ核酸が得られる。すなわち、
５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧ  ３’（配列番号１２３）、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  Ｃ  ３’（配列番号１２４）、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ３’（配列番号１２５）、５’  ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴ  ３’（配列番号１２６）、５’  ＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１２７）、５’  Ｇ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１２８）、５’  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１２９）、５’  ＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３０）、５’  Ｇ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３１）、５’  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３２）、５’  ＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３３）、５’  Ｔ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３４）、５’  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３５）、５’  ＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３６）、５’  Ｔ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３７）、５’  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３８）、５’  ＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１３９）、および５’  Ｔ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＡ  ３’（配列番号１４０）である。
【０１０１】
これらの免疫刺激性核酸は、先天性免疫系を活性化させ、肝炎Ｂ表面抗原等の抗原が同時投与された場合に、液性および細胞性の両方の抗原特異的反応を増強させる能力を有する。本明細書で提供される例は、これらの核酸は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でヒト免疫細胞を刺激することができ、また生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でマウス細胞を刺激することができることを実証する。強力なアジュバントであることを知られている配列と比較した場合、配列番号１１８の核酸が、ワクチン・アジュバンドとして同等またはそれ以上に作用するということがわかる。
【０１０２】
本発明の核酸は、配列番号１２０および配列番号１２２のコア配列が存在するという条件で、ポリＴモチーフ、ポリＧモチーフ、ＴＧモチーフ、ポリＡモチーフ、ポリＣモチーフ等の別の免疫刺激性モチーフをさらに含むことができる。これらの免疫刺激性モチーフは、後述の記載または米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）により詳細に記載されている。
【０１０３】
（ＯＤＮ  １０１０６  ファミリー）
この核酸は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  Ｔ（配列番号１４１）（ＯＤＮ  １０１０６）の式を有する核酸配列を含む。
【０１０４】
上記配列を、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびシトシンからなるヌクレオチド群から選択され得る、別個に選択された多数のヌクレオチド残基によってフランキングすることができる。
【０１０５】
このファミリーの核酸は、少なくとも２２核酸長である。好ましい実施形態では、核酸は２２ヌクレオチド長である。なおさらなる実施形態では、核酸は２２ヌクレオチド長を上回る。例として、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００ヌクレオチド長、またはそれ以上の核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は１２〜１００である。
【０１０６】
この第１のファミリーの核酸すべてが、少なくとも４つのＣｐＧモチーフを含む。これらの核酸は、５つ以上のＣｐＧモチーフを含むものであってもよい。ＣｐＧモチーフは、互いに隣接するか、またはそれらが互いに一定の距離もしくは任意の距離で、離間したものであってもよい。
【０１０７】
このファミリーの核酸はまた、チミジン・ヌクレオチドの過剰発現も含む。これらの核酸は、６０％を上回るか、６０％を下回るか、または５５％未満のチミジンを含むことができる。
【０１０８】
別の態様では、本発明はＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＧＴＧ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  Ｔ（配列番号１４１）のヌクレオチド配列からなる核酸を提供する。実施例でさらに詳細に説明するように、この核酸は、既に同定された免疫刺激性核酸と類似またはそれを上回る免疫刺激活性を持つ核酸について多数の核酸をスクリーニングした後のみに、同定された。より具体的には、この核酸を、免疫刺激性であることが既に示されているＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号２）のヌクレオチド配列を持つ核酸と比較した。配列番号１４１を含む核酸を、配列番号２を含む核酸のものよりも大きい免疫刺激能を有するものについて、約１６５核酸をスクリーニングした後のみに同定された。活性の違いは驚くべきことである。なぜなら、配列暗号１４１と配列番号２とのあいだに最小限の違いのみが存在するからである。そのような配列の最小の変化が統計学的に有意な免疫刺激の増加をもたらすことは予想外であった。
【０１０９】
本発明の核酸は、配列番号１４１のコア配列が存在するという条件で、ポリＴモチーフ、ポリＧモチーフ、ＴＧモチーフ、ポリＡモチーフ、ポリＣモチーフ等の別の免疫刺激性モチーフをさらに含むことができる。これらの免疫刺激性モチーフは、後述の記載または米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）により詳細に記載されている。
【０１１０】
本明細書中で詳述されるいかなるも実施形態でも等しく、本明細書中で提供される核酸に適用されると理解される。したがって、例えば、実施形態が配列番号１に言及する場合、それが等しく配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８、および配列番号１４１に適用されると理解される。
【０１１１】
本明細書に記載した核酸のＣｐＧモチーフは、好ましくはメチル化されていない。非メチル化ＣｐＧモチーフは、非メチル化シトシン−グアニン・ジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが後に続き、リン酸結合によって結合された非メチル化５’シトシン）である。本明細書に記載した核酸のすべてが免疫刺激性である。本発明のいくつかの実施形態では、ＣｐＧモチーフがメチル化されている。メチル化ＣｐＧモチーフは、メチル化シトシン−グアニン・ジヌクレオチド配列（すなわち、３’グアノシンが後に続き、リン酸結合によって結合されたメチル化５’シトシン）である。
【０１１２】
ＣｐＧ核酸は、式：
５’  Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４  ３’
を含む核酸であり、式中、Ｃはメチル化されておらず、Ｘ１Ｘ２およびＸ３Ｘ４はヌクレオチドである。関連実施形態では、５’  Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４  ３’配列は、非パリンドローム配列である。ある種の実施形態では、Ｘ１Ｘ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ならびにＸ３Ｘ４はＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドである。より具体的な実施形態において、Ｘ１Ｘ２は、ＧｐＡおよびＧｐＴからなる群から選択されるヌクレオチドであり、ならびにＸ３Ｘ４はＴｐＴである。さらに別の実施形態では、Ｘ１Ｘ２は、共にプリンであり、またＸ３Ｘ４は共にピリミジンである。別の実施形態では、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はピリミジンである。ＣｐＧ核酸の例は、米国本出願第０９／６６９，１８７号（２０００年９月２５日出願）および公開ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２６３８３（公開番号ＷＯ０１／２２９７２）に記載されている。
【０１１３】
Ｔリッチ核酸は、少なくとも１つのポリＴ配列を含み、そして／あるいはＴヌクレオチド残基が２５％を上回るヌクレオチド組成を有する核酸である。ポリＴ配列を持つ核酸は、連続して少なくとも４つのＴを含むもので、例えば５’ＴＴＴＴ３’である。好ましくは、Ｔリッチ核酸は、ポリＴ配列が１つ以上含まれる。好ましい実施形態では、Ｔリッチ核酸は、２つ、３つ、４つ、またはその他の数のポリＴ配列を有するものであってもよい。本発明にもとづく他のＴリッチ核酸は、Ｔヌクレオチド残基が２５％を上回るヌクレオチド組成を有するが、ポリＴ配列を含むことは必須ではない。これらのＴリッチ核酸では、他の種類のヌクレオチド残基（すなわち、Ｇ、Ｃ、およびＡ）によって、Ｔヌクレオチド残基が互いに分離される。いくつかの実施形態では、Ｔリッチ核酸は、Ｔヌクレオチド残基が３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および９９％、ならびに中間にあるあらゆる整数％を上回るヌクレオチド組成を有する。好ましくは、Ｔリッチ核酸は、少なくとも１つのポリＴ配列と、Ｔヌクレオチド残基が２５％を上回るヌクレオチド組成とを有する。
【０１１４】
ポリＧ核酸は、好ましくは以下の式を有する核酸である。すなわち、
５’  Ｘ１Ｘ２ＧＧＧＸ３Ｘ４  ３’
式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つは、Ｇである。他の実施形態では、Ｘ３、およびＸ４の両方は、Ｇである。さらに別の実施形態では、好ましい式は５’  ＧＧＧＮＧＧＧ  ３’、または５’  ＧＧＧＮＧＧＧＮＧＧＧ  ３’であり、Ｎは０と２０との間のヌクレオチドを表す。
【０１１５】
Ｃリッチ核酸は、少なくとも１つもしくは好ましくは少なくとも２つのポリＣ領域を持ち、あるいは少なくとも５０％のＣヌクレオチドから構成される核酸分子である。ポリＣ領域は、連続した少なくとも４つのＣ残基である。したがって、ポリＣ領域は、式５’ＣＣＣＣ３’に含まれる。いくつかの実施形態では、ポリＣ領域が式５’ＣＣＣＣＣＣ３’を有することが好ましい。本発明にもとづく他のＣリッチ核酸は、Ｃヌクレオチド残基が５０％を上回るヌクレオチド組成を有するが、ポリＣ配列を含むことは必須ではない。これらのＣリッチ核酸では、他の種類のヌクレオチド残基（すなわち、Ｇ、Ｔ、およびＡ）によって、Ｃヌクレオチド残基は互いに分離され得る。いくつかの実施形態では、Ｃリッチ核酸は、Ｃヌクレオチド残基が６０％、７０％、８０％、９０％、および９９％、ならびに中間にあるあらゆる整数％を上回るヌクレオチド組成を有する。好ましくは、Ｃリッチ核酸は、少なくとも１つのポリＣ配列と、Ｃヌクレオチド残基が５０％を上回るヌクレオチド組成とを有し、いくつかの実施形態ではＴリッチでもある。
【０１１６】
免疫刺激性核酸は、二本鎖または一本鎖である。通常、二本鎖分子は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でよりいっそう安定である一方で、一本鎖分子は高い免疫活性を有する。したがって、本発明のいくつかの態様では、核酸が一本鎖であることが好ましく、また他の態様では核酸が二本鎖であることが好ましい。
【０１１７】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では互いに言い換え可能に用いられ、リン酸基に結合し、かつ置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ））あるいは置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に結合する複数のヌクレオチド（すなわち、糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書で用いられるように、上記用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチドのみならずオリゴリボヌクレオチドのことをいう。また、上記用語は、ポリヌクレオシド（例えば、リン酸塩が除かれたポリヌクレオチド）および他の有機塩基含有ポリマーも包含する。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から得ることができるが、好ましくは合成（例えば、核酸合成により生成）したものである。
【０１１８】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、種々の化学的修飾および置換を包含するもので、リン酸ジエステルによるヌクレオシド間架橋、β−Ｄ−リボース単位、および／または天然ヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）が含まれる。化学修飾の例は、当業者に知られており、例えばＵｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＆  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら（１９９６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７−１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら（１９９５）Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１−４１７に記載されている。本発明にもとづくオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾を有するものであってもよく、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のリン酸ジエステル・ヌクレオシド間架橋および／またはβ−Ｄ−リボース単位および／または特定の天然ヌクレオシド塩基位置に位置する。
【０１１９】
例えば、上記オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾を含むものであってもよく、各々の修飾が独立して、
ａ）  修飾ヌクレオシド間架橋によるヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したリン酸ジエステル・ヌクレオシド間架橋の置換、
ｂ）  脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）架橋によるヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したリン酸ジエステル架橋の置換。
【０１２０】
ｃ）糖リン酸単位を別の単位によって糖リン酸骨格から置換、
ｄ）修飾糖単位による特定のβ−Ｄ−リボース単位の置換、および
ｅ）修飾ヌクレオシド塩基による天然ヌクレオシド塩基の置換、
から選択される。
【０１２１】
オリゴヌクレオチドの化学修飾についてのより詳細な例は、以下の通りである。
【０１２２】
核酸も、置換プリンおよびピリミジン（例えばＣ−５プロピン・ピリミジンおよび７−デアザ−７を置換プリン修飾塩基）を含む。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０−４。プリンおよびピリミジンとしては、限定されるものではないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、および他の天然および非天然に存在するヌクレオシド塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）、置換および非置換芳香族部分が挙げられる。他のそのような修飾は当業者に周知である。上記実施形態のすべてにおいて、Ｘ残基もまた、本明細書に記載したような非天然由来のヌクレオシド、またはヌクレオチドアナログである。
【０１２３】
修飾塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵ等、ＤＮＡおよびＲＮＡで通常見いだされる天然由来の塩基とは化学的に異なる任意の塩基ではるが、それらの天然由来の塩基と塩基性化学構造を共有する。修飾ヌクレオシド塩基を、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、疑ウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７−置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えばＮ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシチジン、例えばＮ４−エチルデオキシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、ならびにジアミノプリン（例えば、２，６−ジアミノプリン）、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、または天然ヌクレオシド塩基の他の修飾から選択することができる。このリストは典型的なものを意味しており、限定するものとして解釈されない。
【０１２４】
本明細書に記載した特定の式では、一組の修飾塩基を定義する。例えば、文字Ｙはシトシンまたは修飾シトシンを含むヌクレオシドを言及するのに用いられる。本明細書で使用される修飾シトシンは、オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基と置換することができる天然由来または非天然由来のシトシンのピリミジン塩基アナログである。修飾シトシンとしては、限定されるものではないが、５−置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、擬イソシトシン、縮合環系を有するシトシンアナログ（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレン・シトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）が挙げられる。好ましいシトシンのいくつかとして、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、シトシン塩基は、一般的な塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香族環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって、置換される。文字Ｚは、グアニンまたは修飾グアニン塩基を言及するために用いられる。本明細書で用いられる修飾グアニンは、天然由来または非天然由来のグアニンのプリン塩基アナログであり、該アナログはオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基と置き換わることができる。修飾グアニンとして、限定されるものではないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換  グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、ならびに６−チオグアニンが挙げられる。本発明の別の実施形態では、グアニン塩基は、一般的な塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、およびＫ塩基）、芳香族環系（例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボキシル酸アミド）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）によって、置換される。
【０１２５】
オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間結合、例えば上記（ａ）または（ｂ）に記載したものが挙げられ得る。これらの修飾結合は、部分的に耐分解性である（例えば、安定化されている）。「安定化核酸分子」は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）分解（例えば、エクソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）に対して相対的に耐性である。安定化は、長さまたは二次構造の関数である。数十キロ塩基から数百キロ塩基の長さである核酸は、相対的に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）分解に対して、相対的に耐性である。より短い核酸に対して、二次構造は該核酸の効果を安定化および増大させ得る。例えば、核酸の３’末端が上流領域に対して自己相補性を有するならば、折り畳まれて一種のステム・ループ構造を形成し、次いで核酸が安定化し始め、それによってより高い活性を示す。
【０１２６】
核酸安定化は、リン酸塩骨格修飾を介して達成することもできる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、最大活性を与え、細胞内エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護することができる。
【０１２７】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で投与した際に、核酸骨格の修飾が核酸の活性を高めることが証明された。ホスホロチオエート結合を持つコンストラクトは、最大活性を持ち、核酸を細胞内エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解から保護する。他の修飾核酸として、リン酸ジエステル修飾核酸、リン酸ジエステルとホスホロチオエート核酸との組みあわせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ｐ−エトキシ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせおよび免疫細胞に対する該組み合わせの特定の効果は、ＰＣＴ公開特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０（ＷＯ９６／０２２５５５）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１（ＷＯ９８／１８８１０）ならびに米国特許第６、１９４，３８８Ｂ１（２００１年２月２７日発行）、ならびに米国特許第６，２３９，１１６号Ｂ１（２００１年５月２９日発行）で、ＣｐＧ核酸に対して議論されている。本明細書ではこれらの文献の内容全体を援用する。
【０１２８】
こららの修飾核酸が、ヌクレアーゼ耐性の強化、細胞内取り込みの増加、タンパク質結合の増加、タンパク質結合の増加、および／または細胞内局在化の変化によるより刺激性の活性を示すものであってもよいと考えられる。
【０１２９】
他の安定化核酸として以下のものが挙げられる。すなわち、非イオン性ＤＮＡアナログ、例えばアルキルおよびアリール−リン酸塩（電荷を帯びたホスホナート酵素は、アルキルまたはアリール基によって置き換えられる）、ホスホジエステル、および帯電した酸素部分がアルキル化されるアルキルホスホトリエステル。ヌクレアーゼ消化に対して実質的に耐性を示す核酸として、一方の末端または他の末端で、テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコール等のジオールを含む核酸も挙げられる。
【０１３０】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を含むものであってもよい。例えば、３’−３’結合を介して、２つのオリゴヌクレオチドを結合させて、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を持つオリゴヌクレオチドを生成することで、そのような５’末端を２つ持つ修飾オリゴヌクレオチドを生成することが可能である。３’−３’結合は、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、または他のいかなる修飾ヌクレオシド間架橋であってもよい。そのような結合を達成する方法は、当該分野で公知である。例えば、そのような結合は、Ｓｅｌｉｇｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ３’−３’−  ａｎｄ  ５’−５’−ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｓｅｎｃｅ  ｉｎｈｉｂｏｔｏｒｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９１），１０（１−３），４６９−７７  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｅｕｄｏ−ｃｙｃｌｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９），７（１２），２７２７−２７３５  に記載されている。
【０１３１】
さらに、３’末端ヌクレオシド間の結合がホスホジエステル、ホスホロチオエート、または他の修飾架橋ではない３’−３’結合ＯＤＮを、追加のスペーサー（例えば、トリ−またはテトラ−エチレングリコール・ホスフェート部分）を用いることで調製することができる（Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｎｅ（ｄＡ）１２  ａｎｄ  ｔｗｏ（ｄＴ）１２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｂｙ  ｔｗｏ  ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｃｈａｉｎｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２），３１（３８），９１９７−２０４、米国特許第５６５８７３８号、および米国特許第５６６８２６５号）。あるいは、非ヌクレオチド・リンカーは、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて、エタンジオール、プロパンジオールから、または無塩基性デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位（Ｆｏｎｔａｎｅｌ，Ｍａｒｉｅ  Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｒｉｃａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ  ５’−ａｔｔａｃｈｅｄ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４），２２（１１），２０２２−７）から、誘導される。非ヌクレオチド・リンカーの取り込みは、１回または複数回にわたって、または互いに組み合わせておこなうことができ、結合すべき２つのＯＤＮ３’末端間の任意の所望の距離が可能となる。
【０１３２】
ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置したホスホジエステル・ヌクレシチド間架橋を、修飾ヌクレオシド間架橋によって置換することができる。ここで、修飾ヌクレオシド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホルアミダイト、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６−Ｃ１２）アリール−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルホスホネート、および／または（Ｃ６−Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７−Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ９５／０１３６３に開示）から選択され、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ１４）アリールが、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノによって任意に置換され、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１８）アルキル、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ１４）アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、好ましくは水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、好ましくは（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、および／またはメトキシエチル、あるいはＲ１およびＲ２は、それらを有する窒素原子とともに、Ｏ、Ｓ、およびＮの群からのさらなるヘテロ原子をさらに含み得る５−６員複素環を形成する。
【０１３３】
デホスホ架橋（デホスホ架橋については、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ａ  ｉｎ  「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｖｏｌ．  ２０，  「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」，  Ｓ．  Ａｇｒａｗａｌ，  Ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ  １９９３，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，  ｐｐ．  ３５５  ｆｆに記載）によるヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルの置換、デホスホ架橋は、例えば、デホスホ架橋ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン、および／またはシリル基から選択される。
【０１３４】
本発明の組成物は、キメラ骨格を任意に有するものであってもよい。本明細書で用いられるように、キメラ骨格は、二種類以上の結合を含む骨格である。一実施形態では、キメラ骨格を式：５’Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２３’によって表すことができる。Ｙ１およびＹ２は、１〜１０ヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｙ１および／またはＹ２は、それぞれ、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。キメラ・オリゴヌクレオチドの少なくとも２ヌクレオチドが骨格修飾を含むことから、それらの核酸は、「安定化した免疫刺激性核酸」の一種類の一例である。
【０１３５】
キメラ・オリゴヌクレオチドに関して、Ｙ１およびＹ２は、互いに独立していると考えられる。このことは、Ｙ１およびＹ２の各々が、同一分子内で互いに異なる配列および異なる骨格結合を持っていても持たなくてもよいことを意味する。いくつかの実施形態では、Ｙ１およびＹ２は、３〜８ヌクレオチドを有する。Ｎ１およびＮ２は、Ｎ１ＺＮ２が全体で少なくとも６ヌクレオチドを有する限り、０〜５ヌクレオチドを有する核酸分子である。Ｎ１ＺＮ２のヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有し、修飾骨格を持つ核酸は含まれない。Ｚは、免疫刺激性核酸モチーフであり、好ましくは本明細書に示したものから選択される。
【０１３６】
式Ｙ１Ｎ１ＺＮ２Ｙ２の中央のヌクレオチド（Ｎ１ＺＮ２）は、リン酸ジエステル・ヌクレオチド間結合を有し、Ｙ１およびＹ２は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有するが、１つより多くのまたは全て修飾ヌクレオチド間結合を有してもよい。好ましい実施形態では、Ｙ１および／またはＹ２は、少なくとも２つの、または２つ〜５つの修飾ヌクレオチド間結合を有し、Ｙ１は、２つの修飾ヌクレオチド間結合を有し、Ｙ２は、５つの修飾ヌクレオチド間結合を有するか、あるいはＹ１は、５つの修飾ヌクレオチド間結合を有し、Ｙ２は、２つの修飾ヌクレオチド間結合を有する。該修飾ヌクレオチド間結合は、いくつかの実施形態で、ホスホロチオエート修飾結合、ホスホロジチオエート修飾結合、またはｐ−エトキシ修飾結合である。
【０１３７】
核酸は、骨格糖を有する核酸も含み、該骨格糖は、ヒドロキシル基以外の低分子量有機基に２’位で、リン酸基以外の低分子量有機基に５’位で共有結合する。したがって、修飾核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでよい。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりに、アラビノースまたは２’−フルオロアラビノース等の糖を含んでよい。したがって、核酸は、骨格組成において異種であり得るため、ペプチド−核酸（核酸塩基とともにアミノ酸骨格を有する）等の互いに結合するポリマー・ユニットの任意の可能な組合せを含有する。いくつかの実施形態では、核酸は、骨格組成において同種である。他の例については、下記により詳細に記載する。
【０１３８】
糖リン酸骨格（すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸ユニットから構成される）由来の糖リン酸ユニット（すなわち、まとまって糖リン酸ユニットを形成するβ−Ｄ−リボースおよびリン酸ジエステル・ヌクレオシド間架橋）を別のユニットで置換することができ、この際、その他のユニットは、例えば、「モルホリノ誘導体（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」オリゴマーを構築する（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＥＰ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：６１２９−４１に記載されるように）こと（すなわち、例えば、モルホリノ誘導体ユニットでの置換）、またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」）を構築する（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３−７に記載されるように）こと、すなわち、例えば２−アミノエチルグリシンによる、例えばＰＮＡ骨格ユニットでの置換に適している。オリゴヌクレオチドは、他の糖質骨格修飾および置換（例えば、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびあるアルキル・リンカーまたはアミノ・リンカーを持つ骨格部分を有するオリゴヌクレオチド）を有してよい。該アルキル・リンカーは、分岐状または非分岐状でもよく、置換または非置換されていてもよく、かつキラル的に純粋であるかまたはラセミ混合物でもよい。
【０１３９】
β−リボース・ユニットまたはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース・ユニットを修飾糖ユニットで置換することができ、この際、該修飾糖ユニットは、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボース（好ましくは、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースは２’−Ｏ−メチルリボースである）、２’−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環式糖アナログ（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｊ  （１９９２）  Ａｍ  Ｃｈｅｍｎ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載）および／または非環式糖アナログ（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載）および／またはビシクロ糖アナログ（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載）から選択される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、糖は、２’−Ｏ−メチルリボースであり、特に、リン酸ジエステルまたはリン酸ジエステル様ヌクレオシド間結合によって結合された１個または両方のヌクレオチドに対するものである。
【０１４１】
本発明で使用するためには、当該技術分野で周知の多数の方法のうち任意のものを用いて、本発明のオリゴヌクレオチドを新規に合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９，１９８１）、ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４，１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７，１９８６，；Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２，１９８８）である。市販されている種々の自動核酸合成機によって、これらの化学を実行することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと言及される。あるいは、Ｔ−リッチおよび／またはＴＧジヌクレオチドをプラスミド中で大量に生成し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照せよ）、より小片に分離するか、または全体として投与することができる。制限酵素、エキソヌクレーアゼ、またはエンドヌクレアーゼを用いる技術等の既知の技術を用いて、既存の核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）から核酸を調製することができる。
【０１４２】
ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート化学のいずれかを利用した自動化技術を用いて、ホスホロチオエート等の修飾骨格を合成することができる。例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように、アリール−ホスホネートおよびアルキル−ホスホネートを生成することができる。市販の試薬を用いた自動化固相合成によって、アルキルホスホトリエステル（米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるように、荷電酸素部分がアルキル化されている）を調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を生成する方法について記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【０１４３】
この方法で調製された核酸は、単離された核酸と言及される。一般に、「単離された核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」とは、天然で核酸が通常関連する成分から分離された核酸を指す。一例としては、単離された核酸は、細胞から、核から、ミトコンドリアから、またはクロマチンから分離されたものでありうる。
【０１４４】
核酸ベクター中でコードされる抗原と組み合わせて核酸を投与する場合（本明細書に記載されるように）、該核酸の骨格は、リン酸ジエステルおよびホスホロチオエート（または他のリン酸エステル修飾）のキメラ的な組合せであるのが好ましい。細胞は、完全なホスホロチオエート核酸の存在下でプラスミド・ベクターを取り込む上で問題があるかもしれない。したがって、ベクターおよび核酸両方を被験体に送達する際は、該核酸は、キメラ骨格を有するか、またはホスホロチオエート骨格を有すことが好ましいが、プラスミドを直接細胞に送達する担体と該プラスミドを関連させることによって、細胞内取り込みの必要性を無くすことが好ましい。このような担体は、当該技術分野で公知であり、例えば、リポソームおよび遺伝子銃が挙げられる。
【０１４５】
本発明は、上述のこれらの核酸の任意のものを本明細書で列挙した方法で用いることと、先に記載され、かつ既知であるように免疫刺激性核酸を用いることの全てとをさらに包括する。
【０１４６】
該免疫刺激性核酸は免疫刺激効果を驚くほど増加させることが本発明により発見された。例えば、本明細書に記載される核酸は、恐らく免疫系を概ね刺激することによって、感染に対する保護を与えることができることが実証された。実施例では、配列番号１、配列番号１９、配列番号４５、配列番号１１８、または配列番号１４１のヌクレオチド配列を有する核酸の、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）に攻撃されたマウス被験体を保護する能力を例証する。ウイルス攻撃の前にまたはウイルス攻撃と同時に、該核酸を投与することができる。
【０１４７】
免疫刺激を誘導すると実証されたこれらの核酸の能力は、該核酸が、ヒトおよび他の被験体で、ワクチン接種と、癌免疫療法と、喘息免疫療法と、免疫機能の全面的な増強と、放射線または化学療法後の造血回復の増強と、他の免疫調節処理とに効果的な治療薬であることの証拠である。
【０１４８】
本発明の核酸を独立型の療法として用いることができる。独立型の療法は、単一の薬剤または組成物の投与から予防的または治療的に有用な結果を達成することができる療法である。したがって、感染症、癌、ならびに喘息およびアレルギーの予防または処置で、本明細書に記載される核酸を単独で用いることができる。この理由は、該核酸は、これらの疾患の治療成果に有用な免疫応答を誘導することができるためである。本明細書に記載される方法のいくつかは、独立型の療法としての核酸の使用に関し、一方で、他の方法は、他の治療薬と組み合わせた核酸の使用に関連する。
【０１４９】
ワクチン中で使用される際、核酸は抗原とともに投与される。好ましくは、該抗原は、予防または処置を要する障害に特異的である。例えば、障害が感染症である場合、抗原は、好ましくは、感染性生物（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌類等）に由来する。障害が癌である場合、抗原は、好ましくは、癌抗原である。
【０１５０】
免疫刺激性核酸は、感染（すなわち、感染症）、癌、アレルギー、または喘息の予防のための予防ワクチンとして本発明のいくつかの態様で有用である。好ましくは、これらの症状の１つに罹っていると診断されていない被験体に、より好ましくは、これらの症状の１つを発症する危険性があると考えられる被験体に、予防的ワクチン接種を用いる。例えば、被験体は、感染性生物による感染症を発症する危険性のあるものか、特異的な癌抗原が特定された癌を発症する危険性のあるものか、アレルゲンが既知であるアレルギーを発症する危険性のあるものか、喘息になりやすい素因が既知である喘息を発症する危険性のあるものかでありうる。
【０１５１】
本明細書で使用するように、危険性のある被験体は、感染原因病原体、発癌物質、またはアレルゲンにさらされる何らかの危険性を有する被験体である。危険性のある被験体は、そのような障害を発症しやすい素因を有する被験体も含む。いくつかの素因は遺伝性でありうる（したがって、遺伝分析または家族歴のいずれかによって同定されうる）。いくつかの素因は、環境性である（例えば、発癌物質に事前にさらされること等）。感染症を発症する危険性のある被験体の例としては、特定種類の感染因子が検出される、もしくは検出された地域に住んでいるか、または旅行すると予期される被験体、あるいは感染性生物を含有する可能性のある体液と接触することによって、生活様式または医療処置を介して生物に直接的または間接的にさらされる被験体でありうる。感染症を発症する危険性のある被験体は、医療機関により特定の感染性生物に対するワクチン接種を推奨された一般集団も含む。
【０１５２】
抗原がアレルゲンであり、かつ被験体がその特定の抗原にアレルギー応答を発症し、かつ被験体が抗原にさらされる可能性がある（すなわち、花粉の季節に）場合、その被験体は、抗原にさらされる危険性がある。喘息へのアレルギーを発症する危険性のある被験体としては、アレルギーまたは喘息に罹っていると特定されたが、免疫刺激性核酸処置中には活性疾患がない被験体と、遺伝的または環境的要因のためにこれらの疾患を発症する危険性があると考えられる被験体とが挙げられる。
【０１５３】
免疫刺激性核酸は、感染症、アレルギー、または癌に対するより短期の保護のために、抗原またはアレルゲン無しで与えることもでき、この場合、繰り返される投与量によって、より長期の保護が可能になる。
【０１５４】
癌を発症する危険性のある被験体は、癌を発症する可能性が高い（例えば、一般大衆内での可能性より高い可能性）ものである。これらの被験体としては、例えば、遺伝的異常を有する被験体（該遺伝的異常の存在は、一般大衆内での可能性より高い癌発症の可能性に相関関係を有すると実証されている）、タバコ、アスベスト、または他の化学的毒素等の癌原因因子（すなわち、発癌物質）にさらされた被験体、あるいは以前に癌を処置し、かつ表面上は寛解状態である被験体が挙げられる。癌を発症する危険性のある被験体が、該被験体が発症する危険性のある癌の種類に特異的な抗原と、免疫刺激性核酸とで処置される際、該被験体は、癌細胞が発達するにつれて該癌細胞を殺滅することができるかもしれない。腫瘍が被験体内で形成され始めると、該被験体は、腫瘍抗原に対して特異的な免疫応答を発生させる。
【０１５５】
予防策として免疫刺激性核酸を用いることに加えて、本発明は、感染症、アレルギー、喘息、または癌に罹っている被験体の処置のために免疫刺激性核酸を用いることも包括する。
【０１５６】
感染症に罹っている被験体は、感染性病原体にさらされ、かつ体内または排泄物中で、急性または慢性的に検出可能なレベルの病原体を有する被験体である。治療的に用いられる場合、免疫刺激性核酸を独立型として、または別の治療薬と組み合わせて用いることができる。例えば、感染性病原体のレベルを減少させるか、または感染性病原体を除去することができる抗原特異的全身性または粘膜性免疫応答を高める抗原とともに、免疫刺激性核酸を治療的に用いることができる。
【０１５７】
本明細書で使用するように、感染症は、体内の外来微生物の存在によって生じる疾患である。効果的なワクチン戦略と、主な病原体侵入部位である体の粘膜表面を保護する処置とを展開することが特に重要である。
【０１５８】
本明細書で使用するように、感染症に関して用いられる際の処置する（ｔｒｅａｔ）、処置される（ｔｒｅａｔｅｄ）、または処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）という用語は、病原体の感染への被験体（感染の危険性のある被験体）の耐性を増加させる予防的処置を指し、または別の言い方をすれば、被験体が病原体に感染する可能性を減少させる予防的処置と、感染と闘う（例えば、感染を低減もしくは除去するか、または悪化することを防ぐ）ための被験体（感染した被験体）が感染した後の処置とを指す。
【０１５９】
アレルギーに罹っている被験体は、アレルゲンに応答したアレルギー反応を有するか、またはアレルギー反応を発症する危険性のある被験体である。アレルギーとは、物質（アレルゲン）への後天性の過敏症を指す。アレルギー症状としては、限定はされないが、湿疹、アレルギー性鼻炎またはコリーザ、枯草熱、結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹（じんましん）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性症状が挙げられる。
【０１６０】
現在、アレルギー性疾患は、一般に、少量の抗原の注射後に、続いて、抗原の投与量を増加させることによって処置される。この方法は、アレルゲンへの寛容化を誘導し、更なるアレルギー反応を防ぐと考えられている。しかし、これらの方法は、効果的になるまでに数年かかる可能性があり、アナフィラキシー・ショック等の副作用の危険性と関連する。本発明の方法は、これらの問題を回避する。
【０１６１】
アレルギーは、一般に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体生成によって引き起こされる。免疫刺激性核酸の全身または粘膜投与によって誘導されるサイトカインは、大部分は、Ｔｈ１（例としては、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γがある）と呼ばれるクラスのサイトカインであり、これらは、体液性および細胞性免疫応答両方を誘導する。Ｔｈ１応答に関連する抗体の種類は、高中和能力およびオプソニン作用能力を有するため、一般に、より保護的である。免疫応答の他の主要な種類は、ＩＬ−４，ＩＬ−５、およびＩＬ−１０サイトカインの生成に関連しており、Ｔｈ２免疫応答と称される。Ｔｈ２応答は、大部分は、抗体を伴い、感染に対する保護的な効果は少なく、いくつかのＴｈ２アイソタイプ（例えば、ＩｇＥ）は、アレルギーに関連する。一般に、アレルギー性疾患は、Ｔｈ２型免疫応答によって媒介され、一方で、過剰なＴｈ１応答は自己免疫疾患に関連するが、Ｔｈ１応答は、感染に対する最善の保護を与えるようである。Ｔｈ２（ＩｇＥ抗体およびアレルギーの生成に関連する）からＴｈ１応答（アレルギー反応に対して保護的である）へ被験体の免疫応答を移行させる免疫刺激性核酸の能力にもとづいて、免疫刺激性核酸の免疫応答を誘導するのに有効な投与量を被験体に投与して、アレルギーを処置または予防することができる。
【０１６２】
したがって、免疫刺激性核酸は、喘息等のアレルギー性および非アレルギー性症状の処置で有意な治療的有用性を有する。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息被験体の気道で増加する。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソトープ・スイッチング、好中球遊走および活性化、ならびにマスト細胞増殖を含む喘息性炎症応答の重要な態様を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの生成を抑制することができる。喘息とは、炎症、気道の狭小化、および吸入した因子への気道の反応性の増加に特徴付けられる呼吸器系の障害を指す。喘息は、しばしば、限定はされないがアトピーまたはアレルギー症状と関連する。
【０１６３】
癌に罹っている被験体は、検出可能な癌細胞を有する被験体である。癌は、悪性または非悪性癌でありうる。癌または腫瘍としては、限定はされないが、胆道癌、脳癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結腸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、上皮内癌新生物、リンパ腫、肝癌、肺癌（例えば小細胞と非小細胞）、黒色腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎癌と、他の癌腫および肉腫とが挙げられる。一実施形態では、癌は、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、有棘細胞癌、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、膀胱細胞癌腫、または結腸癌腫である。
【０１６４】
いくつかの癌細胞は、抗原性であるため、免疫系の標的となり得る。一局面では、免疫刺激性核酸と制癌剤、特に癌免疫療法として分類されるものとを組み合わせた投与は、癌抗原に対する特異的な免疫応答を刺激するために有用である。
【０１６５】
免疫監視の理論は、免疫系の主要な機能が腫瘍形成前に新生物細胞を検出および除去するということである。この理論の基本原理は、癌細胞が正常細胞と抗原的に異なるので、免疫学的に不適合な同種移植片の拒絶を引き起こす免疫反応と類似の免疫反応を誘発するということである。研究によって、腫瘍細胞は、それらの抗原発現が、定性的または定量的に異なるということが確認された。そのような抗原は、交換可能に、腫瘍抗原または癌抗原と言及される。次いで、これらの抗原のうちいくつかは、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原であり得る。「腫瘍特異的抗原（ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、腫瘍細胞に特異的に存在するが正常細胞には存在しない抗原である。主要特異的抗原の例は、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスによって誘導される腫瘍中のウイルス抗原である。「腫瘍関連（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」抗原は、腫瘍細胞および正常細胞両方に存在するが、腫瘍細胞では異なる量または異なる形態で存在する。そのような抗原の例は、腫瘍胎児性抗原（例えば、癌胎児性抗原）、分化抗原（例えば、Ｔ抗原およびＴｎ抗原）および癌遺伝子産物（例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０１６６】
インビトロおよびインビボで腫瘍標的を殺滅することができる種々の種類の細胞が同定されている：ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、および活性化マクロファージである。ＮＫ細胞は、予め特異的な抗原に感作されることなく腫瘍細胞を殺滅することができ、その活性は、標的細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるクラスＩ抗原の存在を必要としない。ＮＫ細胞は、新生腫瘍の制御と、転移性増殖の制御とに関与すると考えられる。ＮＫ細胞と対照的に、ＣＴＬは、腫瘍抗原に感作された後で、かつ標的抗原が、ＭＨＣクラスＩも発現する腫瘍細胞上で発現するときのみに、腫瘍細胞を殺滅することができる。ＣＴＬは、移植腫瘍およびＤＮＡウイルスが原因の腫瘍の拒絶でのエフェクター細胞であると考えられる。ＬＡＫ細胞は、ＮＫ集団およびＣＴＬ集団とは異なる、ヌルのリンパ球のサブセットである。活性化マクロファージは、一旦活性化されたら、抗原依存性でなく、ＭＣＨに限定的でもない様式で腫瘍細胞を殺滅することができる。活性化マクロファージは、それらが浸潤した腫瘍の増殖速度を減少させると考えられる。インビトロアッセイにより、抗体および補体によって、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害性反応および溶解等の他の免疫機構が同定された。しかし、これらの免疫エフェクター機構は、インビボでのＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫ、およびマクロファージの機能ほどにはインビボでは重要ではないと考えられる（概説については、Ｐｉｅｓｓｅｎｓ，Ｗ．Ｆ．，およびＤａｖｉｄ，Ｊ．，「Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第２巻，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎ．Ｙ．，１−１３頁，１９９６を参照のこと）。
【０１６７】
免疫療法の目標は、樹立された腫瘍への患者の免疫応答を増大させることである。免疫療法の一方法としては、アジュバントの使用が挙げられる。カルメット−ゲラン杆菌等の微生物に由来するアジュバント物質は、動物内で、免疫応答を高め、腫瘍への耐性を増強する。
【０１６８】
本明細書で使用する場合、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、免疫応答を誘発することができる分子である。抗原としては、限定はされないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、低分子、脂質、糖脂質、糖質、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに寄生虫およびアレルゲン等の多細胞生物が挙げられる。抗原という用語には、大まかに言って、宿主の免疫系に外来であると認識される任意の種類の分子が含まれる。抗原としては、限定はされないが、癌抗原、微生物抗原、およびアレルゲンが挙げられる。
【０１６９】
本明細書で使用する場合、「微生物抗原（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、微生物の抗原であり、限定はされないが、ウイルス、細菌、寄生虫、および真菌類が挙げられる。そのような抗原としては、インタクトな微生物と、その天然の単離物およびフラグメントまたは誘導体とが挙げられ、天然の微生物抗原と同一または類似であり、かつその微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物も挙げられる。化合物は、天然の微生物抗原への免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、天然の微生物抗原に類似である。そのような抗原は、当該技術分野で慣用的に用いられており、当業者には周知である。
【０１７０】
本明細書で使用する場合、「癌抗原（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、腫瘍または癌細胞に存在するペプチドまたはタンパク質等の化合物であって、ＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞の表面上に発現する際、免疫応答を誘発することができる化合物である。癌細胞の粗抽出物を調製する（例えば、Ｃｏｈｅｎら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５５に記載されるように）ことによってか、抗原を部分的に精製することによってか、組み換え技術によってか、または既知の抗原の新規合成によって癌細胞から癌抗原を調製することができる。癌抗原としては、限定はされないが、組み換え的に発現する抗原、腫瘍または癌の免疫原性部分、あるいは腫瘍または癌全体が挙げられる。組み換え的に、または当該技術分野で公知の他の手段の任意のものによって、そのような抗原を単離または調製することができる。
【０１７１】
癌細胞によって癌または腫瘍抗原を差次的に発現させることによって、癌細胞をターゲティングするために該癌または腫瘍抗原を利用することができる。これらの抗原のうちいくつかは、必ずしも発現するわけではないが、正常細胞によってコードされる。正常細胞中で正常にはサイレント（すなわち、発現しない）なもの、分化の特定の段階のみで発現するもの、ならびに胚性および胎児性抗原等の一時的に発現するものとしてこれらの抗原を特徴づけることができる。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、変異ｐ５３）、内部欠失または染色体転座に起因する融合タンパク質等の変異細胞遺伝子にコードされる。さらに他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上で保持されるもの等のウイルス遺伝子によってコードされ得る。
【０１７２】
本発明のいくつかの局面では、被験体は、抗原「にさらされる（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ）」。本明細書で使用する場合、用語「〜にさらされる（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ）」とは、抗原に被験体を接触させる能動的な工程か、またはインビボで抗原に被験体を受動的にさらすことのいずれかを指す。抗原に被験体を能動的にさらす方法は、当該技術分野で周知である。一般に、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、経皮投与、粘膜投与、鼻腔内投与、気管内投与または皮下投与等の任意の手段によって、抗原を被験体に直接投与する。抗原を全身的または局所的に投与することができる。抗原および免疫刺激性核酸を投与する方法については、下記により詳細に記載する。体内の免疫細胞への曝露に抗原が利用可能である場合は、被験体を抗原に受動的にさらす。例えば、体内へ外来病原体を侵入させることによってか、または細胞表面上に外来抗原を発現する腫瘍細胞を発生させることによって、被験体を抗原に受動的にさらし得る。
【０１７３】
被験体を抗原に受動的にさらす方法は、免疫刺激性核酸の投与のタイミングに特に依存し得る。例えば、癌または感染症またはアレルギーもしくは喘息性応答を発症する危険性のある被験体では、危険性が最大のとき、すなわち、アレルギーの季節中または癌原因因子にさらされた後に、該被験体に免疫刺激性核酸を定期的に投与することができる。さらに、感染因子にさらされる危険性のある外国に旅行する前に、旅行者に免疫刺激性核酸を投与することができる。同様に、生物戦争にさらされる危険性のある兵士または市民に免疫刺激性核酸を投与し、被験体が生物戦争にさらされるとき、または仮にさらされるとすれば、抗原への全身性または粘膜性免疫応答を誘導することができる。
【０１７４】
いくつかの好ましい実施形態では、投与が局所的であるが、核酸および他の治療剤を全身的に投与することができる。局所的投与は、口、膣、肛門、および陰茎の粘膜表面等の粘膜表面への局所的な塗布を含んでよい。投与が局所的、特に膣、肛門、および口の粘膜表面に対してである実施形態では、核酸は、ＣｐＧ核酸以外のものであることが好ましい。
【０１７５】
特定の実施形態では、本発明は、非メチル化ＣｐＧ核酸の局所的粘膜投与を用いて、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１型および２型、パピローマウイルス、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ならびにＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが原因のヒト性感染病（ＳＴＤ）を予防または処置することを意図する。
【０１７６】
本明細書で使用する場合、ＳＴＤは、限定はされないが、性交を介して主に伝染する感染症である。感染した被験体との性的接触を介して伝染することに加えて、いくつかのＳＴＤは、感染した被験体の体液との接触を介しても伝染し得る。本明細書で使用する場合、「体液（ｂｏｄｉｌｙ  ｆｌｕｉｄ）」としては、血液、唾液、精液、膣液、尿、糞便、および涙が挙げられる。ＳＴＤは、最も一般的には、血液、唾液、精液、および膣液を介して伝染する。一例としては、血液および血液製剤輸血は、ＨＩＶおよび肝炎ウイルスを含む多くの性病病原体に共通の伝染様式である。
【０１７７】
性病病原体は、一般に、事実上、細菌性、ウイルス性、寄生虫性、または真菌性である。ＳＴＤを引き起こす生物としては、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、およびＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ等の細菌と、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、単純疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（複数型）、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、および伝染性軟属腫ウイルス等のウイルスと、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓおよびＰｈｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ等の寄生虫と、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等の真菌類とが挙げられる。
【０１７８】
他の感染症は、性的伝染がそれらの主要な伝染様式でないとしても性的に伝染することが知られている。この後者のカテゴリーとしては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、およびＢ群溶連菌等の細菌と、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、Ｃ型およびＤ型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）等のウイルスと、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ等の寄生虫とが原因の感染症が挙げられる。
【０１７９】
本発明は、経口および糞便曝露を含む性的接触によって伝染するＳＴＤを包括することも意図する。これらのＳＴＤは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．等の細菌と、Ａ型肝炎等のウイルスと、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａおよびＥｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ等の寄生虫とが原因である。
【０１８０】
「その必要がある被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」とは、ＳＴＤを発症する危険性のある被験体またはＳＴＤに罹っているもの（すなわち、ＳＴＤに罹っている被験体）であり得る。
【０１８１】
核酸は、ＳＴＤを発症する危険性のある被験体のＳＴＤを予防するための予防策としていくつかの局面で有用である。本明細書で使用する場合、「ＳＴＤを発症する危険性のある被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ  ａｔ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎ  ＳＴＤ）」とは、感染した被験体との接触によってか、または感染した被験体由来の体液との接触によって、ＳＴＤを発症する何らかの危険性を有する被験体である。例えば、危険性のある被験体は、ＳＴＤ原因病原体に感染した性交渉相手が現在いる、または将来いる予定であるものである。危険性のある被験体としてはまた、自身が、またはその相手が既存の感染症に気づいているかどうかに関わらず、コンドーム（すなわち、男性用または女性用コンドーム）を使わずに、口、肛門、または膣のいずれかでの性交を持つこと等の無防備な性的行為に関与したものが挙げられる。複数の性交渉の相手を持つ被験体（例えば、売春婦または頻繁に売春をしているもの）あるいは複数の性交渉相手がいる１人の性交渉相手を持つ被験体でさえも危険性にあると考えられる。ＳＴＤを発症する危険性のある他の被験体は、皮下針の共有等の危険性の高い伝染行為の他の形態に関与した被験体である。血液製剤を受けている被験体も、特に血液供給システムの監視が厳しくない場合、危険性にあると考えられ得る。この後者のカテゴリーの被験体の例は、ＳＴＤ原因病原体（例えば、ＨＩＶ）に部分的または完全に汚染された血液供給システムを有するサハラ以南のアフリカ諸国にいる被験体である。危険性のある被験体は、１つ以上のＳＴＤ原因病原体が一般的な地域への旅行を計画しているもの（特に、該地域の血液供給システムにそのような病原体が存在することが知られている場合）でもあり得る。危険性のある別の被験体は、他人の体液との潜在的な接触を含む職業を持つものである。この後者のカテゴリーの例としては、限定はされないが、看護士、医者、歯医者、および救急隊員（例えば、救急車の隊員、救急医療士、消防士、および警察官）が挙げられる。危険性のある被験体としては、ＳＴＤ原因病原体に感染した母親から生まれる胎児および新生児も挙げられる。
【０１８２】
ＳＴＤ原因病原体の伝染に関連する前述の活動の全ては、「危険性の高い活動（ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とも言及される。被験体の危険性の高い活動への関与時の前、関与時中、または関与時の後に、組み合わせて用いられる核酸および他の潜在的な予防または治療薬を投与することができる。性的行為に関与する前に核酸を投与される被験体は、例えば、性交を持つ前少なくとも１ヶ月、少なくとも１週間、少なくとも４８時間、少なくとも２４時間、少なくとも１２時間、少なくとも６時間、少なくとも４時間、少なくとも２時間（または本明細書で時間を明確に列挙した時間の間の任意の時間）、核酸を受けることができる。好ましくは、危険性の高い活動に関与する前の投与の時間は、被験体の体内に感染因子が存在している間活性であるように免疫系を活性化するのに十分な時間である。危険性の高い活動に関与した後に核酸を投与される被験体は、危険性の高い活動に関与した後２時間以内、４時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、３、４、５、６、７、１４、２８日以内またはそれより長い日数以内（または本明細書で時間を明確に列挙した時間の間の任意の時間）に核酸を受けることができる。
【０１８３】
好ましくは、被験体は、非げっ歯類被験体である。非げっ歯類被験体とは、限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、霊長類（例えば、サル）、魚（水産養殖種、例えばサーモン）を含み、かつ特にラットおよびマウス等のげっ歯類を除くヒトまたは脊椎動物を意味する。
【０１８４】
抗原は、腫瘍、非腫瘍癌、アレルゲン、感染性病原体を含む種々のソースに由来することができる。本明細書に列挙したリストのそれぞれは限定することを意図するものではない。
【０１８５】
ヒトで見出されるウイルスの例としては、限定はされないが、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ−１等のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、またはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも言及される）およびＨＩＶ−ＬＰ等の他の単離体と、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオ・ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）と、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎の原因となる株）と、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）と、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デング・ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）と、Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）と、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）と、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）と、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラ・ウイルス）と、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、ムンプス・ウイルス、はしかウイルス、呼吸系発疹ウイルス）と、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザ・ウイルス）と、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタン・ウイルス、ブンヤ・ウイルス、フレボウイルス、およびナイロ・ウイルス）と、Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウィルス）と、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）と、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅと、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）と、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイウルス）と、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス）と、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）と、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペス（ＨＳＶ）１型および２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペス・ウイルス）と、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックス・ウイルス）と、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイルス）と、未分類ウイルス（例えば、海綿状脳障害の病因因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎の欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ型および非Ｂ型肝炎の因子（クラス１は、内部伝染性、クラス２は、非経口的伝染性（すなわち、Ｃ型肝炎））、ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）とが挙げられる。
【０１８６】
微生物抗原の多くについて、ヒト疾患と関連させて本明細書で記載したが、本発明は、他の非ヒト疾患を処置するためにも有用である。非ヒト脊椎動物も、本明細書に記載する免疫刺激性核酸で予防または処置できる感染症を発症しうる。例えば、感染性ヒト疾患の処置に加えて、本発明の方法は、動物の感染症を処置するために有用である。
【０１８７】
グラム陰性およびグラム陽性細菌両方は、脊椎動物中で抗原として機能する。そのようなグラム陽性細菌としては、限定はされないが、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げられる。グラム陰性細菌としては、限定はされないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の特定の例としては、限定はされないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｒｕｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられる。
【０１８８】
細菌病原体のポリペプチドとしては、限定はされないが、フルンケル症の原因となる鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク（ＯＭＰ）、およびＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのＡタンパク質と、細菌性腎疾患（ＢＫＤ）の原因となるＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍのｐ５７タンパク質と、エルシニア症の主要表面関連抗原（ｍａｊｏｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ（ｍｓａ））と、表面発現細胞毒素（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ（ｍｐｒ））、表面発現溶血素（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｉｓｈ））、および鞭毛抗原と、パツスレラ症の細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、および構造タンパク質と、Ｖｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよびＶ．  ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰおよび鞭毛タンパク質と、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ、およびｐｕｒＡと、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原と、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造および調節タンパク質と、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造および調節タンパク質とが挙げられる。
【０１８９】
寄生虫性病原体のポリペプチドとしては、限定はされないが、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原が挙げられる。
【０１９０】
真菌類の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ等のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種と、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉとが挙げられる。血液由来および／または組織寄生虫としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ（アフリカ睡眠病）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（シャガス病）、ならびにＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉとが挙げられる。他の医学的に関連する微生物については、文献に広範に記載されている。例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照し、該文献の全内容を本明細書で援用する。
【０１９１】
非ヒト脊椎動物の処置用の多くのワクチンについては、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ．，１９９５に記載されている。上述のように、抗原としては、天然のソースに由来するか、または合成されたウイルス、寄生虫、細菌、および真菌類等の微生物と、それらのフラグメントとが挙げられる。ヒトおよび非ヒト脊椎動物の感染性ウイルスとしては、レトロウイルス、ＲＮＡウイルス、およびＤＮＡウイルスが挙げられる。この群のレトロウイルスとしては、単一レトロウイルスおよび複合ウイルス両方が挙げられる。単一レトロウイルスとしては、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイルスのサブグループが挙げられる。Ｂ型レトロウイルスの例としては、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）がある。Ｃ型レトロウイルスとしては、Ｃ型Ａ群（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）を含む）と、Ｃ型Ｂ群（ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、テナガザル白血病（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、およびサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）とのサブグループが挙げられる。Ｄ型レトロウイルスとしては、メーソン−ファイザー・モンキー・ウイルス（ＭＰＭＶ）およびサル・レトロウイルス１型（ＳＲＶ−１）が挙げられる。複合レトロウイルスとしては、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、およびフォーミー・ウイルスのサブグループが挙げられる。レンチウイルスとしては、ＨＩＶ−１が挙げられるが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）も挙げられる。Ｔ細胞白血病ウイルスとしては、ＨＴＬＶ−  １、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）が挙げられる。フォーミー・ウイルスとしては、ヒト・フォーミー・ウイルス（ＨＦＶ）、サル・フォーミー・ウイルス（ＳＦＶ）、およびウシ・フォーミー・ウイルス（ＢＦＶ）が挙げられる。
【０１９２】
脊椎動物中の抗原である他のＲＮＡウイルスの例としては、限定はされないが、Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属（哺乳類および鳥類両方のレトロウイルスの複数の血清型）、Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ属（ブルータング・ウイルス、Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅウイルス、ケメロヴォ・ウイルス、アフリカウマ病ウイルス、およびコロラド・ダニ熱ウイルス）、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ属（ヒト・ロタウイルス、ネブラスカ仔牛下痢ウイルス、サル・ロタウイルス、ウシまたはヒツジ・ロタウイルス、トリ・ロタウイルス）を含むＲｅｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのメンバーと、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ属（ポリオウイルス、コクサッキー・ウイルスＡ型およびＢ型、腸細胞壊死性ヒト孤児（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、サル・エンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルス・ムリス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｒｉｓ）、ウシ・エンテロウイルス、ブタ・エンテロウイルス）、Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ属（少なくとも１１３個のサブタイプを含むヒト・ライノウイルス、他のライノウイルス）、Ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含むＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーと、ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミグエルアザラシ・ウイルス、ネコ・ピコルナウイルス、およびノーウォーク・ウイルスを含むＣａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅと、Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビス・ウイルス、チクングニア・ウイルス、オニョンニョン・ウイルス、ロス・リバー・ウイルス、ベネズエラ・ウマ脳炎ウイルス、西洋ウマ脳炎ウイルス）、Ｆｌａｖｉｒｉｕｓ属（蚊媒介黄熱ウイルス、デング・ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー・バレー脳炎ウイルス、西ナイル・ウイルス、クンジン・ウイルス、中欧ダニ媒介ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キィアサヌア・フォレスト・ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサン・ウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ属（風疹ウイルス）、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ属（粘膜病ウイルス、ブタ・コレラ・ウイルス、ボーダー病ウイルス）を含むＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ属（ブニヤンベラおよび関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属（シシリア・サシチョウバエ・ウイルス、リフト・バレー熱ウイルス）、Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ属（クリミア‐コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびＵｕｋｕｖｉｒｕｓ属（ウウクニエミ（Ｕｕｌｃｕｎｉｅｍｉ）および関連ウイルス）を含むＢｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａウイルス属（インフルエンザ・ウイルスＡ型、多くのヒト・サブタイプ）、ブタ・インフルエンザ・ウイルス、トリ・インフルエンザ・ウイルス、およびウマ・インフルエンザ・ウイルス、インフルエンザＢ型（多くのヒト・サブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（恐らく別の属）を含むＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ属（パラインフルエンザ・ウイルス１型、センダイ・ウイルス、赤血球吸���ウイルス、パラインフルエンザ・ウイルス２型ないし５型、ニューカッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス）、Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ属（はしかウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属（呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器系合胞体ウイルス、および肺炎ウイルス）を含むｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ属（ＶＳＶ）（ウイルス性脳炎（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルス、フランダース・ハート・パーク（Ｆｌａｎｄｅｒｓ−Ｈａｒｔ  Ｐａｒｋ）ウイルス）、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属（狂犬病ウイルス）、魚Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、および２種類の可能なＲｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ（マールブルグ・ウィルスとエボラ・ウイルス）を含むＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベ・ウイルス複合体、およびラッサ熱ウイルスを含むＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーと、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、肝炎ウイルス、ヒト腸コロナ・ウイルス、およびネコ伝染性腹膜炎（ネコ・コロナウイルス）を含むＣｏｒｏｎｏａｖｉｒｉｄａｅファミリーとが挙げられる。脊椎動物中の抗原である例証的なＤＮＡウイルスとしては、限定はされないが、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘瘡ワクシニア、牛痘、バッファロー痘、ウサギ痘、エクトロメリア）、Ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（粘液腫、線維腫）、Ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（鶏痘、他のトリ・ポックスウイルス）、Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、Ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓ属（豚痘）、Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ属（伝染膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口炎ウイルス）を含むＰｏｘｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅファミリー（アフリカ豚コレラウイルス、カエル・ウイルス２型および３型、魚のリンパ嚢腫ウイルス）と、ａｌｐｈａ−Ｉｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ（単純ヘルペス１型および２型、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマ・ヘルペス・ウイルス２型および３型、仮性狂犬病ウイルス、ウシ伝染性角結膜炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス）、Ｂｅｔａ−ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ（ヒト・サイトメガロウイルスならびにブタおよびサルのサイトメガロウイルス）、ｇａｍｍａ−ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ（エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス、リスザル・ヘルペス、クモザル・ヘルペスウイルス、ワタオウサギ・ヘルペスウイルス、モルモット・ヘルペスウイルス、リューケ癌ウイルス）を含むＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ属（ヒトのサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および未分類、サル・アデノウイルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、ならびにウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよび多くの他の種のアデノウイルス）、Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ属（トリ・アデノウイルス）、および非培養可能アデノウイルスを含むＡｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ属（ヒト・パピ��ーマ・ウイルス、ウシ・パピローマ・ウイルス、ウサギ・ショープ・パピローマ・ウイルス、他の種の種々の病原性パピローマ・ウイルス）、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ属（ポリオーマウイルス、サル空胞化病原体（ＳＶ−４０）、ラビット空胞化病原体（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、およびリンパ増殖性パピローマ・ウイルス等の他の霊長類ポリオーマ・ウイルス）を含むＰａｐｏｖｉｒｉｄａｅファミリーと、Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ属、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシ・パルボウィルス、イヌ・パルボウィルス、アリューシャンミンク病ウイルス等）を含むＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーとが挙げられる。最後に、ＤＮＡウイルスは、クールーおよびクロイツフェルトヤコブ病ウイルス、ならびに慢性の伝染性の神経障害性因子（ＣＨＩＮＡウイルス）等の上記のファミリーに適合しないウイルスを含んでよい。
【０１９３】
免疫刺激性核酸を用いて、雌鶏、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ、ウズラ、およびキジ等の鳥類の抗原特異的免疫応答等の免疫応答を誘導することもできる。鳥類は、感染症の多くの種類に対する主要な標的である。  
【０１９４】
孵化した鳥は、出生の直後に病原性微生物にさらされる。これらの鳥は、最初は、母親由来の抗体によって病原体に対して保護されるが、この保護は一時的であり、鳥自体の免疫系が病原体に対して該鳥を保護し始めなければならない。最も感染しやすい時期の若年の鳥で感染を保護することが望ましい。鳥が閉鎖された地区に居住しており疾患が急速に広まる際は、より年齢の大きい鳥でも感染を予防することが望ましい。したがって、本発明の免疫刺激性核酸および非核酸アジュバントを鳥に投与して、抗原が存在する際は抗原特異的免疫応答を増強することが望ましい。
【０１９５】
ニワトリで共通の感染症の例には、ニワトリ感染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）がある。ＣＩＡＶは、マレック病ワクチン接種調査の中断中に１９７９年に日本で始めて単離された（Ｙｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２３：３６６−３８５）。その時以来、ＣＩＡＶは、家禽を生産している主な国の全てで、商業的家禽中で検出されてきた（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ｐｐ．６９０−６９９）、Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１９６】
ＣＩＡＶ感染によって、若年の感染しやすいニワトリで、貧血症、出血、および免疫抑制によって特徴づけられる臨床的疾患を生じる。胸腺および骨髄の萎縮と、ＣＩＡＶ感染ニワトリの一貫した病変もＣＩＡＶ感染の特徴である。胸腺内およびしばしばファブリキウス嚢内のリンパ球涸渇によって、免疫抑制が生じ、２次的なウイルス、細菌、または真菌感染への感染しやすさが増加し、その後、このことによって疾患の経過が悪化する。免疫抑制は、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、またはレオウイルスのうちの１種類以上への感染後に疾患の悪化を引き起こすかもしれない。ＭＤＶの病因は、ＣＩＡＶによって増強されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｐ．２８  Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３８ｔｈ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｅｍｐｅ，Ａｒｉｚ．）。さらに、ＣＩＡＶは、感染性ブルザ病の徴候を悪化させることが報告されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３３：７０７−７１３）。ニワトリは、ＣＡＡによって実験的に誘導された疾患への経年耐性を発展させる。このことは、２週齢までに本質的に完全なものになるが、より年齢の大きい鳥は、依然として感染しやすい（Ｙｕａｓａ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９（上掲）；Ｙｕａｓａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２４，２０２−２０９，１９８０）。しかし、ニワトリがＣＡＡおよび免疫抑制剤（ＩＢＤＶ，ＭＤＶ等）に二重に感染している場合、疾患に対する経年耐性は遅くなる（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９７９および１９８０（上掲）；Ｂｕｌｏｗ  ｖｏｎ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３，９３−１１６，１９８６）。疾患伝染を強めうるＣＩＡＶの特性としては、環境的な不活性化およびいくつかの共通の殺菌剤への高耐性が挙げられる。家禽業に対するＣＩＡＶ感染の経済的影響は、感染した鳥の１０％ないし３０％が疾患発症で死亡するという事実から明らかである。
【０１９７】
他の脊椎動物と同様に、鳥のワクチン接種もまた、、任意の年齢で、をおこなうことができる。通常、生存微生物に対しては１２週齢までに、不活性化微生物または他の種類のワクチンに対しては１４ないし１８週齢に、ワクチン接種をおこなう。卵内（ｉｎ  ｏｖｏ）ワクチン接種については、胚成長の最後の四半期でワクチン接種をおこなう。皮下的に、スプレーで、経口的に、眼内で、気管内で、経鼻的に、または本明細書に記載される他の粘膜送達方法によってワクチンを投与することができる。したがって、通常のワクチン接種スケジュールを用いて、鳥および他の非ヒト脊椎動物に本発明の免疫刺激性核酸を投与することができ、適当な期間の後に、本明細書に記載されるように抗原を投与することができる。
【０１９８】
ウシおよび家畜類も感染しやすい。これらの動物が発症する疾患は、特にウシで、重大な経済損失を生む。本発明の方法を用いて、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ等の家畜での感染を予防することができる。
【０１９９】
ウシは、ウシ・ウイルスに感染されうる。ウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）は、エンベロープを持つ小さいプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ブタ・コレラ・ウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジ・ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）とともに、ぺスチウイルス属に分類される。ペスチウイルスは、以前はＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーに分類されていたが、いくつかの研究で、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）群とともに、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリー内の再分類が示唆された（Ｆｒａｎｃｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。
【０２００】
細胞培養分析にもとづいて、ウシの重大な病原体であるＢＶＤＶを、細胞変性（ＣＰ）細胞型と非細胞変性（ＮＣＰ）細胞型とに区別することができる。ＮＣＰ細胞型は、より広範にわたるが、ウシでは両細胞型が見られる。妊娠中のウシがＮＣＰ株に感染した場合、該ウシは、持続的に感染し、かつ特異的に免疫寛容性の仔牛を生み、該仔牛は、その生涯でウイルスを広めるであろう。持続的に感染したウシは、粘膜病のために死亡し、その後、両生物型を該動物から単離することができる。臨床的徴候としては、流産、奇形形成、および呼吸系疾患、粘膜病、ならびに軽度の下痢を挙げることができる。さらに、動物の死亡に至る可能性のある、群れの伝染病発生に関連する血小板減少症について記載されており、この疾患に関連する株は、従来のＢＶＤＶよりビルレントであると思われる。
【０２０１】
ウマ・ヘルペス・ウイルス（ＥＨＶ）は、無症状性疾患から致死性疾患に範囲が及ぶウマの種々の感染症を引き起こす、抗原性に異なる生物学的因子の群を含む。これらには、ウマでの偏在性の病原体であるウマ・ヘルペス・ウイルス１型（ＥＨＶ−１）が含まれる。ＥＨＶ−１は、流産、呼吸器疾患、および中枢神経系障害の伝染病に関連する。若年のウマの上気道の初感染によって、８日ないし１０日続く熱性の疾患を生じる。免疫学的に経験した雌ウマは、疾患が識別できないうちに、気道を介して再感染する可能性があるため、通常、前兆無しに流産が起こる。神経病学的症候群は、呼吸器疾患または流産に関連し、いずれの年齢ででも、いずれの性の動物も冒し、失調、虚弱、および臀部の麻痺に至る（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９，３０４−３１６，１９９２）。他のＥＨＶのものとしては、ＥＨＶ−２、または以前はＥＨＶ−１のサブタイプ２として分類されていたウマ・サイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウイルス、およびＥＨＶ−４が挙げられる。
【０２０２】
ヒツジおよびヤギは、マエディ・ビスナを含む種々の危険な微生物に感染されうる。
【０２０３】
サル、類人猿、およびマカク等の霊長類は、サル免疫不全症ウイルスに感染されうる。不活性化細胞ウイルスおよび無細胞全サル免疫不全症ワクチンは、マカクでの保護を可能にすることが報告されている（Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ  ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２９３−１２９７；およびＣａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：１２３９−１２４６）。組み換え型ＨＩＶ  ｇｐｌ２０ワクチンは、チンパンジーでの保護を可能にすることが報告されている（Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：６２２−６２５）。
【０２０４】
ネコ（ペット用ネコおよび野生ネコ両方）は、種々の微生物に感染しやすい。例えば、ネコ伝染性腹膜炎は、家畜ネコおよび野生ネコ（例えばライオン、ヒョウ、チータ、およびジャガー）両方で生じる疾患である。この種類および他の種類の病原性生物の感染をネコで予防することが所望される際、本発明の方法を用いて、ネコにワクチン接種し、感染から保護することができる。
【０２０５】
家畜ネコは、限定はされないが、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）、内因性型Ｃｏｎｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ（ＲＤ−１１４）、ネコ合胞体形成ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含む複数のレトロウイルスに感染しうる。これらのうち、ＦｅＬＶは、最も有意な病原体であり、リンパ網および骨髄新生物、貧血症、免疫性媒介障害、ならびにヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と類似している免疫不全症を含む多様な症状を引き起こす。近年では、ＦｅＬＶ−ＡＩＤＳと命名される特定の複製欠損ＦｅＬＶ変異体が免疫抑制特性に特に関連していた。
【０２０６】
ネコＴリンパ指向性レンチウイルス（ネコ免疫不全症とも称される）の発見は、最初に、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：７９０−７９３に記載された。ＦＩＶの特性については、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２：２０４５−２１５５；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５６５２−５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニングおよび配列分析については、Ｏｌｍｓｔｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０に報告されている。
【０２０７】
ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、家畜および野生のネコ科で予測不可能に生じる散発性の疾患である。ＦＩＰは、主に、家畜ネコの疾患である一方で、ライオン、アメリカライオン、ヒョウ、チータ、およびジャガーで診断されている。ＦＩＰに罹患するより小型の野生ネコとしては、オオヤマネコおよびカラカル、スナネコ、ならびにマヌルネコが挙げられる。家畜ネコでは、該疾患は、主に若年の動物で生じるが、全ての年齢のネコが感染しやすい。ピークの発生率は、６ないし１２月齢で起こる。５ないし１３年齢で発生率の減少が示されており、その後１４ないし１５年齢のネコで発生率が増加する。
【０２０８】
魚、甲殻類、または他の水生生物形態でのウイルス性、細菌性、および寄生虫性疾患は、水産養殖業に深刻な問題を呈する。孵化場タンクまたは囲われた海洋生物養殖領域での動物の高密度のために、感染症は、例えば、魚、甲殻類、または他の水生生物形態施設で大多数の貯蔵物を根絶する可能性がある。一旦疾患が発生したら、疾患の予防は、介入より望ましい対応策である。魚のワクチン接種は、免疫を介して長期の保護を与えうる唯一の予防法である。核酸ベースのワクチン接種については、Ｄａｖｉｓに発行されている米国特許第５，７８０，４４８号に記載されている。
【０２０９】
魚免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、および免疫グロブリンの存在等のほ乳類免疫系に類似の多くの特徴を有する。魚は、ほ乳類のＢ細胞およびＴ細胞の役割と多くの点で類似するとみられる役割を持つリンパ球サブクラスを有する。液浸によって、または経口的にワクチンを投与することができる。
【０２１０】
水産養殖種としては、限定はされないが、魚、甲殻類、および他の水生動物が挙げられる。魚としては、全ての脊椎魚が挙げられ、硬骨魚類または軟骨魚類（例えばサケ科、コイ、ナマズ、イエローテール、タイ科、およびハタ科）でありうる。サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サーモン、およびアルプスイワナを含む魚のファミリーである。甲殻類の例としては、限定はされないが、ハマグリ、ロブスター、エビ、カニ、およびカキが挙げられる。他の養殖水性動物としては、限定はされないが、ウナギ、イカ、およびタコが挙げられる。
【０２１１】
ウイルス性水産養殖病原体のポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルス出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ）または核タンパク質（Ｎ）と、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）のＧまたはＮタンパク質と、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはＮ構造タンパク質と、コイの春ウイルス血症（ＳＶＣ）のＧタンパク質と、ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、テグミン（ｔｅｇｕｍｉｎ）またはカプシドタンパク質または糖タンパク質とが挙げられる。
【０２１２】
ウマに感染する典型的な寄生虫は、Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ種と、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｌｅｕｃｋａｒｔｉ、Ｇｉａｒｄｉａ種と、Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｅｑｕｉと、Ｂａｂｅｓｉａ種（ＲＢＣ）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｅｑｕｉと、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種と、Ｋｌｏｓｓｉｅｌｌａ  ｅｑｕｉと、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種とである。
【０２１３】
ブタに感染する典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｅｂｌｉｅｃｋｉ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｃａｂｒａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ  ｓｕｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａ種と、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａと、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉおよびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、ならびにＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓとが挙げられる。
【０２１４】
乳牛および肉牛の主な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ種と、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉと、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ（ＲＢＣ）、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血漿）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（ＲＢＣ）と、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ（リンパ球）と、Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｆｏｅｔｕｓと、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種とが挙げられる。
【０２１５】
猛禽類の主な寄生虫としては、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｅと、Ｃｏｃｃｉｄｉａ（Ｅｉｍｅｒｉａ種）と、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｒｅｌｉｃｔｕｍ、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ  ｄａｎｉｌｅｗｓｋｙｉ（フクロウ）、Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種と、Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓと、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｂａｉｌｅｙｉ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａと、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａとが挙げられる。
【０２１６】
ヒツジおよびヤギに感染する典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐ．と、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉと、Ｂａｂｅｓｉａ種（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血漿）、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（ＲＢＣ）と、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種とが挙げられる。
【０２１７】
家禽での典型的な寄生虫性感染症としては、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種、およびＥｉｍｅｒｉａ  ｔｒｕｎｃａｔａが原因のコクシジウム症と、Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓおよびＨｉｓｔｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍが原因のヒストモナス症と、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｅが原因のトリコモナス症と、Ｈｅｘａｍｉｔａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓが原因のヘキサミタ症とが挙げられる。家禽は、Ｅｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ、Ｅｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅｍｅｒｉａ  ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ種、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、およびＳａｒｃｏｃｙｓｔｉｓにも感染しうる。
【０２１８】
本発明の方法は、イヌ、ネコ、トリ、魚、およびフェレットでの寄生虫性感染の処置および／または予防に適用することもできる。トリの典型的な寄生虫としては、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｌｌｉｎａｅと、Ｅｉｍｅｒｉａ種、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種、Ｇｉａｒｄｉａと、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍと、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ／Ｐａｒａｈａｅｍｏｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｚｏｏｎ／Ａｋｉｂａ、Ａｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種とが挙げられる。イヌに感染する典型的な寄生虫としては、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓと、Ｉｓｏｐｏｒａ種、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ種、Ｇｉａｒｄｉａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ（イヌ属）と、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａと、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓと、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉと、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｎｉｓと、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｓｔｉｇｏｔｅｓと、Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｎｕｍとが挙げられる。
【０２１９】
ネコ種に感染する典型的な寄生虫としては、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ  ｈａｍｍｏｎｄｉ、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ種、Ｇｉａｒｄｉａ種と、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａと、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ  ｃａｎｉｓ、Ｃｙｔａｕｘｚｏｏｎ  ｓｐ．、Ｃｙｔａｕｘｚｏｏｎ  ｓｐ．、Ｃｙｔａｕｘｚｏｏｎ  ｓｐ．（赤血球、ＲＥ細胞）とが挙げられる。
【０２２０】
魚に感染する典型的な寄生虫としては、Ｈｅｘａｍｉｔａ種、Ｅｉｍｅｒｉａ種と、Ｃｒｙｐｔｏｂｉａ種、Ｎｏｓｅｍａ種、Ｍｙｘｏｓｏｍａ種、Ｃｈｉｌｏｄｏｎｅｌｌａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｉｎａ種と、Ｐｌｉｓｔｏｐｈｏｒａ種、Ｍｙｘｏｓｏｍａ  Ｈｅｎｎｅｇｕｙａと、Ｃｏｓｔｉａ種、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｉｔｈｉｒｉｕｓ種、Ｏｏｄｉｎｉｕｍ種とが挙げられる。
【０２２１】
野生ほ乳類の典型的な寄生虫としては、Ｇｉａｒｄｉａ種（肉食動物、草食動物）、Ｉｓｏｓｐｏｒａ種（肉食動物）、Ｅｉｍｅｒｉａ  種（肉食動物、草食動物）と、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ種（草食動物）、Ｂａｂｅｓｉａ種（肉食動物、草食動物）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（肉食動物、草食動物）と、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種（草食動物）と、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ（草食動物）、Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ  ｍａｇｎａ（草食動物）、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ（草食動物）、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ（肉食動物、草食動物）とが挙げられる。
【０２２２】
動物園での寄生虫性感染症も深刻な問題を呈する。ウシ科ファミリー（ブレスボック、アンテロープ、バンテン、エランド、ガウア、インパラ、クリップスプリンガー、クーズー、ガゼル）の典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種が挙げられる。鰭脚亜目ファミリー（アザラシ、アシカ）の典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｐｈｏｃａｅが挙げられる。ラクダ科ファミリー（ラクダ、ラマ）の典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種が挙げられる。キリン科ファミリー（キリン）の典型的な寄生虫としては、Ｅｉｍｅｒｉａ種が挙げられる。ゾウ科（アフリカゾウおよびアジアゾウ）の典型的な寄生虫としては、Ｆａｓｃｉｏｌａ種が挙げられる。下等霊長類（チンパンジー、オランウータン、類人猿、ヒヒ、マカク、サル）の典型的な寄生虫としては、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐ．と、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉと、Ｐｌａｓｍｏｄｉｍ種（ＲＢＣ）、Ｂａｂｅｓｉａ種（ＲＢＣ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種（血漿）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種（マクロファージ）とが挙げられる。
【０２２３】
癌は、コンパニオンアニマル（すなわち、ネコおよびイヌ）の主な死亡原因のうちの１つである。癌は、通常、家庭用ペットの場合より年齢の大きい動物を襲い、そのファミリー中に組み込まれる。１０歳より上の年齢のイヌのうち４５％が該疾患のために死ぬと考えられる。最も一般的な処置選択肢としては、外科手術、化学療法、および放射線療法が挙げられる。何らかの成果を挙げる、用いられる他の処置モダリティーは、レーザー療法、寒冷療法、温熱療法、および免疫療法である。処置の選択は、癌の種類と転移の度合いに依存する。悪性腫瘍が体内の孤立した領域に限定されない限り、正常細胞に影響を及ぼさずに、悪性組織だけを除去することは困難である。
【０２２４】
イヌおよびネコに共通で診断される悪性疾患は、限定はされないが、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムの腫瘍、バーキットリンパ腫、小神経膠細胞腫、神経芽細胞腫、骨巨細胞腫、口腔新形成、線維肉腫、骨肉腫、および横紋筋肉腫が挙げられる。イヌでの他の新形成としては、生殖有棘細胞癌、トランスミス暗黒の性病の腫瘍、睾丸腫瘍、セミノーム、セルトーリ細胞腫、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜有棘細胞癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫、胸腺腫、胃腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫、および嚢腺腫が挙げられる。ネコで診断される更なる悪性疾患としては、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫、および肺有棘細胞癌が挙げられる。以前より人気の家庭用ペットであるフェレットは、膵島細胞腺腫、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵臓ランゲルハンス島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫、および胃腺癌を発症することが知られている。
【０２２５】
農業家畜を冒す新形成としては、白血病、血管周囲細胞腫、およびウシ眼新形成（ウシ）と、包皮線維肉腫、潰瘍性有棘細胞癌、包皮癌、結合組織新形成、および肥満細胞腫（ウマ）と、肝癌（ブタ）と、リンパ腫および肺腺腫症（ヒツジ）と、肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、網状内皮症、線維肉腫、腎芽腫、Ｂ細胞性リンパ腫、およびリンパ様白血症（鳥類種）と、網膜芽細胞腫、肝性新形成、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞様白血病、および鰾肉腫（魚）、乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）と、細菌ヒツジ偽結核菌が原因のヒツジおよびヤギの慢性、伝染性、接触感染性の疾患、ならびにヒツジ肺腺症が原因のヒツジの接触感染性の肺腫瘍とが挙げられる。
【０２２６】
アレルゲンとは、罹患しやすい被験体中で、アレルギーまたは喘息応答を誘導しうる物質（抗原）を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物性鱗屑塵、真菌胞子、および薬剤（例えば、ペニシリン）を挙げることができる。天然の動物および植物アレルゲンの例としては、限定はされないが、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる。すなわち、Ｃａｎｉｎｅ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）、Ｆｅｌｉｓ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、Ａｍｂｒｏｓｉａ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ）、Ｌｏｌｉｕｍ（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）、Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）、Ａｌｄｅｒ、Ａｌｎｕｓ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏａｓａ）、Ｂｅｔｕｌａ（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）、Ｑｕｅｒｃｕｓ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）、Ｏｌｅａ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｐｌａｎｔａｇｏ（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）、Ａｐｉｓ（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ、およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ）、Ｔｈｕｙａ（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）、Ｓｅｃａｌｅ（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、Ｄａｃｔｙｌｉｓ（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）、Ｆｅｓｔｕｃａ（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）、Ｐｏａ（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓまたはＰｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）、Ａｖｅｎａ（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、Ｈｏｌｃｕｓ（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ）、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ）、Ａｇｒｏｓｔｉｓ（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）、Ｐｈｌｅｕｍ（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、Ｐｈａｌａｒｉｓ（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、Ｐａｓｐａｌｕｍ（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）、およびＢｒｏｍｕｓ（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）が挙げられる。  
【０２２７】
抗原は、核酸ベクターにコードされる核酸でもよく、核酸ベクター中でコードされなくてもよい。前者の場合は、核酸ベクターを被験体に投与して、抗原を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現させる。後者の場合は、抗原を被験体に直接投与することができる。本明細書で使用するように、核酸ベクター中でコードされていない抗原とは、核酸ではない任意の種類の抗原を指す。例えば、本発明のいくつかの態様では、核酸ベクター中でコードされていない抗原は、ポリペプチドである。ポリペプチド抗原の１次的なアミノ酸配列の微量の改変によって、非改変の相当ポリペプチドと比べて、実質的に等価な抗原活性を有するポリペプチドも生じうる。そのような改変は、部位指向的突然変異生成として計画的であるか、または自然発生的でありうる。これらの改変によって生成されるポリペプチドの全ては、抗原性が依然として存在する限り本明細書に包括される。該ポリペプチドは、例えば、ウイルスポリペプチドでありうる。
【０２２８】
本明細書で使用するように、用語「実質的に精製された（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、ポリペプチドが天然に関連する他のタンパク質、脂質、糖質、または他の物質を実質的に持たないポリペプチドを指す。当業者は、タンパク質精製のための標準的技術を用いて、ウイルスまたは細菌ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、しばしば、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要なバンドを生成するであろう。部分的にグリコシル化されたポリペプチドまたは複数の開始コドンを有するものの場合、非還元ポリアクリルアミドゲル上に複数のバンドがありうるが、これらは、ポリペプチドに特有なパターンを形成する。アミノ末端アミノ酸配列分析によって、ウイルスまたは細菌ポリペプチドの純度を測定することもできる。多糖、小分子、模倣体等の核酸ベクターにコードされない他の種類の抗原については、上記に記載されており、本発明内に包括される。
【０２２９】
本発明は、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも用いる。抗原は、抗原が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現されるように抗原をコードする核酸分子内で、被験体に送達されうることが構想される。核酸ベクター中で被験体に送達されるそのような抗原は、核酸ベクターにコードされる抗原と言及される。真核細胞内で抗原核酸の発現を導く遺伝子発現配列に、抗原をコードする核酸を作用自在に結合させる。遺伝子発現配列は、プロモーター配列またはプロモーターエンハンサー組合せ等の任意の調節ヌクレオチド配列であり、該遺伝子発現配列が作用自在に結合する抗原核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする。遺伝子発現配列は、例えば、構成性または誘導性プロモーター等のほ乳類またはウイルスプロモーターでありうる。構成性ほ乳類プロモーターとしては、限定はされないが、以下の遺伝子に対するプロモーターが挙げられる。すなわち、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ｂ−アクチンプロモーター、および他の構成性プロモーターである。真核細胞で構成性に機能する好例のウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター由来のプロモーターが挙げられる。他の構成性プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターを誘導して、特定の金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進する。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０２３０】
一般に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等の転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、そのような５’非転写配列は、作用自在に結合した抗原核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、任意で、所望されるように、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含む。
【０２３１】
抗原核酸は、遺伝子発現配列に作用自在に結合する。本明細書で使用するように、抗原コーディング配列の発現または転写および／もしくは翻訳を遺伝子発現配列の影響または制御下に置くように抗原核酸配列および遺伝子発現配列が共有結合する際に、該抗原核酸配列および遺伝子発現配列は、作用自在に結合すると言われる。５’遺伝子発現配列中のプロモーターによって抗原配列の転写が生じる場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の結合の性質によって（１）フレームシフト突然変異の誘導を生じないか、（２）プロモーター領域の抗原配列の転写を導く能力に干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写物のタンパク質に翻訳される能力に干渉しない場合に、該２つのＤＮＡ配列は、作用自在に結合すると言われる。したがって、得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように遺伝子発現配列が抗原核酸配列の転写をおこなうことができる場合、該遺伝子発現配列は、該抗原核酸配列に作用自在に結合する。
【０２３２】
本発明の抗原核酸を単独で、またはベクターと組み合わせて免疫系に送達することができる。広義では、ベクターとは、抗原が免疫細胞表面上で発現および提示されうるように免疫系の細胞への抗原核酸の送達を容易にすることができる任意の担体である。ベクターは、一般に、ベクターの不在を生じる分解の程度を基準にして減少された分解を有する免疫細胞に核酸を輸送する。ベクターは、任意で、上述の遺伝子発現配列を含んで、免疫細胞中で抗原核酸の発現を増強する。一般に、本発明で有用なベクターとしては、限定はされないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、あるいは抗原核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌ソース由来の他の担体が挙げられる。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、限定はされないが、以下のウイルス由来の核酸配列を含む。すなわち、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルスと、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスと、ＳＶ４０型ウイルスと、ポリオーマウイルスと、エプスタインバーウイルスと、パピローマウイルスと、ヘルペスウイルスと、ワクシニアウイルスと、ポリオウイルスと、レトロウイルス等のＲＮＡウイルスとである。記載されていないが当該技術分野で公知の他のベクターを容易に用いることができる。
【０２３３】
好ましいウイルスベクターは、非細胞変性真核生物ウイルスであり、この際、可欠遺伝子が対象の遺伝子と置換されている。非細胞変性ウイルスとしては、レトロウイルスが挙げられ、その生活環は、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写を伴い、その後、宿主の細胞ＤＮＡへのプロウイルス取り込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法での試用が認められた。最も有用なものは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を導くことができるが、感染性粒子の生産はできない）レトロウイウイルスである。そのような遺伝子組み換えレトロウイルス発現ベクターは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での遺伝子の高効率形質導入に対して汎用性がある。複製欠損レトロウイルスを生産するための標準的プロトコール（プラスミドへ外因性遺伝物質を組み込むステップと、該プラスミドでパッケージング細胞系をトランスフェクションするステップと、該パッケージング細胞系によって組み換え型レトロウイルスを生産するステップと、組織培養培地からウイルス粒子を回収するステップと、標的細胞をウイルス粒子に感染させるステップとを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ．Ｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｌｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  （１９９１）内のＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄとに提供されている。
【０２３４】
特定の適用に好ましいウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスを操作して、複製欠損ウイルスにすることができ、該アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することができる。該アデノ随伴ウイルスは、さらに、熱および脂質溶媒安定性と、造血細胞を含む多様な系統の細胞での高い形質導入頻度と、重感染阻害を持たないために複数回の連続の形質導入を可能にすることとのような利点を持つ。伝えられるところによると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡに組み込まれうるために、挿入突然変異の可能性およびレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の可変性を最小限にする。さらに、野生型のアデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の不在下で、組織培養で１００より多い継代が続き、該アデノ随伴ウイルスゲノム組み込みが比較的安定な事象であることが示唆される。アデノ随伴ウイルスは、染色体外様式で機能することもできる。
【０２３５】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターについては、当該技術分野で広範に記載されており、当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照せよ。最近の数年間で、プラスミドベクターは、それらの宿主ゲノム内で複製する能力および宿主ゲノムに組み込まれる能力のために、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で細胞に遺伝子を送達するために特に有利であることが判明した。しかし、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、該プラスミド内で作用自在にコードされる遺伝子からペプチドを発現しうる。いくつかの一般的に用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、制限酵素およびライゲーション反応を用いて、ＤＮＡの特異的なフラグメントを除去および付加することによって、プラスミドをカスタム設計することができる。
【０２３６】
細菌を用いて、遺伝子を保持するプラスミドを免疫系に送達することができることが近年発見された。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）等の改変形態の細菌をプラスミドでトランスフェクションして、送達担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として用いることができる。経口的に、または他の投与手段によって、細菌送達担体を宿主被験体に投与することができる。細菌は、恐らく腸壁を通過することによって、プラスミドを免疫系（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞）に送達する。この方法論を用いて、高レベルの免疫保護が確立された。そのような送達方法は、抗原、免疫刺激性核酸、および／または他の治療薬の全身的送達を用いる本発明の態様に有用である。
【０２３７】
したがって、独立型の薬剤として適していることに加えて、免疫刺激性核酸は、特に、ワクチンアジュバントとして有用である。ＣｐＧオリゴヌクレオチドが優良なワクチンアジュバントであることが以前に確証された。ヒトおよび他の非げっ歯類動物でワクチンアジュバントとして用いるための最善の免疫刺激性核酸を同定するために、この目的のための異なる核酸の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）スクリーニングをおこなった。複数の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのアジュバント活性のそれらの予測値についてマウスで評価した。この研究の経過中に、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での有効性の予測となる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験を特定した。それどころか驚くべきことに、Ｂ細胞およびＮＫ細胞両方の活性化が、免疫刺激性核酸の抗原に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）免疫応答を増強する能力と特に相関することを発見した。
【０２３８】
該核酸は、樹状細胞の生存、分化、活性化、および成熟を改良するためにも有用である。免疫刺激性核酸は、樹状細胞の細胞生存、分化、活性化、および成熟を促進する特有の能力を有する。免疫磁気細胞ソーティングによって血液から単離された樹状前駆細胞は、ＧＭ−ＣＳＦとの２日間のインキュベーション中に、樹状細胞の形態的および機能的特性を発生する。ＧＭ−ＣＳＦ無しでは、これらの細胞はアポトーシスを受ける。免疫刺激性核酸は、樹状細胞の生存および分化を促進する上ではＧＭ−ＣＳＦより優位である（ＭＨＣ  ＩＩ発現、細胞の大きさ、粒度）。免疫刺激性核酸は、樹状細胞の成熟も誘導する。樹上細胞は、抗原を提示することによって、かつそれらの局所環境でＬＰＳ等の細菌分子を検出するパターン認識レセプターの発現を介して、先天性免疫系と後天的免疫系とのリンクを形成するので、免疫刺激性核酸で樹状細胞を活性化する能力は、癌およびアレルギー疾患または感染症等の障害に対する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｅｘ−ｖｉｖｏ）免疫療法のためのこれらの免疫刺激性核酸ベースの戦略の使用をサポートする。免疫刺激性核酸は、樹状細胞の成熟を活性化および誘導するためにも有用である。
【０２３９】
免疫刺激性核酸はまた、ナチュラルキラー細胞溶解活性および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加する。ＡＤＣＣは、免疫刺激性核酸を癌細胞のような細胞標的に特異的な抗体と組み合わせて用いて実施され得る。免疫刺激性核酸が、抗体とともに被験体に投与されるとき、被験体の免疫系が誘導されて腫瘍細胞を殺傷する。このＡＤＣＣ手順で有用な抗体は、身体中の細胞と相互作用する抗体を含む。多くのこのような細胞標的に特異的な抗体は、当該技術分野で記載され、そして多くは市販され入手可能である。これら抗体の例は、癌免疫治療のリストの中で以下に列挙される。
【０２４０】
上記核酸はまた、Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答に免疫応答を再惹起するために有用である。Ｔｈ２免疫応答からＴｈ１免疫応答への免疫応答を再惹起は、この核酸に応答して生成されたサイトカインのレベルを測定することにより評価され得る（例えば、単球細胞およびその他の細胞を誘導することにより、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを含むＴｈ１サイトカインを生成する）。Ｔｈ２からＴｈ１の応答への免疫応答の再惹起または再平衡化は、喘息の処置または予防に特に有用である。例えば、喘息を処置するための有効量は、喘息に関連しているＴｈ２タイプの免疫応答をＴｈ１タイプの応答に再惹起するために有効なその量であり得る。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息被験体の気道で高められる。これらのサイトカインは、ＩｇＥアイソタイプスイッチング、好酸球走化性および活性化、および肥満細胞成長を含む、喘息炎症応答の重要な局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカインの産生を抑制し得る。本発明の免疫刺激性核酸は、免疫系を再平衡化することを補助するＴｈ１サイトカインにおける増加を引き起こし、主に、Ｔｈ２免疫応答にともなう副作用を防ぐか、または減少する。
【０２４１】
本発明はまた、免疫刺激性核酸を用いて、抗原非特異的で生得的な免疫活性化および感染性チャレンジへの広範なスペクトル耐性を誘導するための方法を含む。本明細書で用いるとき、用語抗原非特異的で生得的な免疫活性化は、Ｂ細胞以外の免疫細胞の活性化をいい、そして例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞または抗原独立様式で応答し得るその他の免疫細胞またはこれらの細胞のいくらかの組み合わせの活性化を含み得る。感染性チャレンジへの広範なスペクトル耐性は、免疫細胞が活性形態にあり、そしてプライムされて任意の侵入化合物または微生物に応答するために誘導される。これら細胞は、特定の抗原に対して特異的にプライムされる必要はない。これは得に細菌戦、および旅行者のような上記に記載のその他の状況で有用である。
【０２４２】
本発明の核酸は、抗菌剤、アジュバント、サイトカイン、抗癌治療、アレルギー医薬、喘息医薬などを含むその他の治療剤と組み合わせて用いられ得る。
【０２４３】
本発明の核酸は、抗菌剤とともに被験体に投与され得る。本明細書で用いられるとき、抗菌剤は、感染性微生物を殺傷または阻害し得る天然に存在するか、または合成化合物をいう。本発明による有用な抗菌剤のタイプは、被験体が感染しているか、または感染されるようになるリスクにある微生物のタイプに依存する。抗菌剤は、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤および抗寄生虫剤を含むがこれらに制限されるわけではない。「抗感染剤」、「抗細菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生虫剤」および「殺寄生虫薬」のような語句は、当業者には良く確立された意味を有し、そして標準的な医療教科書で規定されている。要約すれば、抗細菌薬は、細菌を殺傷または阻害し、そして抗生物質および類似の機能を有するその他の合成または天然化合物を含む。
【０２４４】
抗生物質は、微生物のような細胞により二次代謝物として産生される低分子量分子である。一般に、抗生物質は、微生物に特異的であり、そして宿主細胞に存在しない、１つ以上の細菌の機能または構造を妨害する。抗ウイルス剤は、天然供給源から単離されるか、または合成され得、そしてウイルスを殺傷または阻害するために有用である。抗真菌剤は、表在性の真菌感染および日和見性および原発性全身性真菌感染を処置するたに用いられる。抗寄生虫剤は、寄生虫を殺傷または阻害する。
【０２４５】
抗細菌剤は、細菌殺傷または細菌の成長または機能を阻害する。抗細菌剤の大きなクラスは抗生物質である。広い範囲の細菌を殺傷または阻害するために有効である抗生物質は、広域スペクトル抗生物質と称される。その他のタイプの抗生物質は、グラム陽性またはグラム陰性のクラスの細菌に対して優先的に有効である。これらのタイプの抗生物質は、狭域スペクトル抗生物質と称される。
【０２４６】
単一の微生物または疾患に対して有効であり、そしてその他のタイプの細菌には有効ででないその他の抗生物質は、限定スペクトル抗生物質と称される。抗細菌剤は、しばしば、それらの主要な作用モードを基に分類されている。一般に、抗細菌剤は、細胞壁合成インヒビター、細胞膜インヒビター、タンパク質合成インヒビター、核酸合成インヒビターまたは機能的インヒビター、および競争インヒビターである。
【０２４７】
本発明で有用な抗細菌剤は、制限されないで以下を含む。天然ペニシリン、半合成ペニシリン、クラブラン酸、セファロスポリン、バシトラシン、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン、メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロール、セファゾリン、セフロキシン、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セフェタメット、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジン、モキサラクタム、カルバペネム、イミペネム、モノバクテム、オイズトレオナム、バンコマイシン、ポリミキシン、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、イミダゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、リファムピン、エタムブトール、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、アミノグリコシド、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドロマイシン、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、キノロン、コトリモキサゾール、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジキシン酸、テマフロキサシン、スルホンアミド、ガントリシン、およびトリメトプリム；アセダプソン；ナトリウムアセトスルホン；アラメシン；アレキシジン；アムディノシリン；アムディノシリンピポキシル；アミサイクリン；アミフロキサシン；アミフロキサシンメシレート；アミカシン；アミカシンスルフェート；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アムホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；アストロミシンスルフェート；アビラマシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；バカムピシリン塩酸；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチレート；バシトラシン亜鉛；バムベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；ベンタミシンスルフェート；ビアペネム；ビニラマイシン；ビフェナミド塩酸；ビスピリチオンマグスルフェックス；ブチカシン；ブチロシンスルフェート；カプレオマイシンスルフェート；カルバドックス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロール；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナフェート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフラールナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニール；セフェパイム；セフェパイム塩酸；セフェテコール；セフィキシム；セメノキシム塩酸；セフメタゾール；セフメタゾール塩酸；セフォニシドモノナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；セフォチアム塩酸；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；セフピロムスルフェート；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジディム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；セファレキシン塩酸；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セファラジン；セトサイクリン塩酸；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミテート；クロラムフェニコールパントテネート複合体；クロラムフェニコールナトリウムスクシネート；クロルヘキシシジンホスファニレート；クロロキシレノール；クロルテトラサイクリンビスルフェート；クロルテトラサイクリン塩酸；シノキサシン；シプロフロキサシン；シプロフロキサシン塩酸；シロレマイシン；クラリスロマイシン；クリナフロキサシン塩酸；クリダマイシン；クリダマイシン塩酸；クリダマイシンパルミテート塩酸；クリンダマイシンリン酸；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン；コリスチメテートナトリウム；コリスチンスルフェート；クーメルマイシン；クーメルマイシンナトリウム；シクラシリン；シクロセリン；ダルフォプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；デメクロサイクリン塩酸；デメサイクリン；デノファンギン；ダイアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；ジヒドロストレプトマイシンスルフェート；ジピリチオン；ジチスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス；ドキシサイクリンハイクレート；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；エピテトラサイクリン塩酸；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストレート；エリスロマイシンエストレート；エリスロマシインエチルスクシネート；エリスロマイシングルセプテート；エリスロマイシンラクトビオネート；エリスロマイシンプロピオネート；エリスロマイシンステアレート；エタムブトール塩酸；エチオンアミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；フォスフォマイシン；フォスフォマイシントロメタミン；フモキシシリン；フラゾリウムクロライド；フラゾリウムタートレート；フシデートナトリウム：フシジン酸；ゲンタマイシンスルフェート；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロギン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパミシン；イソシアニジド；ジョサマイシン；カナマイシンスルフェート；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；リンコマイシン塩酸；ロメフロキサシン；ロメフロキサシン塩酸；ロメフロキサシンメシレート；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；メクロサイクリンスルホサリチル酸；メガロマイシンカリウムリン酸；メキドックス；メロペネム；メタサイクリン；メタサイクリン塩酸；メテンアミン；メテンアミン馬尿酸；メテンアミンマンデル酸；メチシリンナトリウム；メチオプリム；メトメニダゾール塩酸；メトロニダゾールリン酸；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；ミノサイクリン塩酸；ミリノカマイシン塩酸；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジキセートナトリウム；ナリジキシン酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；ネオマシインパルミテート；ネオマイシンスルフェート；ネオマイシンウンデシレネート；ネチルミシンスルフェート；ノイトラマイシン；ニフラデン；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフルピリノール；ニフルキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オルメトプリム；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；オキシテトラサイクリン塩酸；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；フェニルアミノサリチル酸；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；ピルリマイシン塩酸；ピバムピシリン塩酸；ピバムピシリンパモエート；ピバムピシリンプロベネート；ポリミキシンＢスルフェート；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジンアミド；ピリチオン亜鉛；キンデカミン酢酸；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；ラニマイシン；レロマイシン；レプロミシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファムピシン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；ロリテトラサイクリン硝酸；ロサラミシン；ロサラミシン酪酸；ロサラミシンプロピオン酸；ロサラミシンナトリウムリン酸；ロサラミシンステアリン酸；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンジン；シソミシン；シソミシンスルフェート；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン塩酸；スピラマイシン；スタリノマイシン塩酸；ステフィノマイシン；ストレプトマイシンスルフェート；ストレプトニコジド；スルファベンズ；スルファベンズアミド；スルフアセトアミド；スルフアセトアミドナトリウム；スルファチシン；スルファジアゾン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメトール；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトメトキシン；スルファモキソール；スルファニレート亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメット；スルフィソキサゾール；スルフィソキサゾールアセチル；スルフィソキサゾールジオールアミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；タラムピシン塩酸；テイコプラニン；テマフロキサシン塩酸；テモシリン；テトラサイクリン；テトラサイクリン塩酸；テトラサイクリンリン酸複合体；テトロキソプリム；チアムフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリンモノナトリウム；チクラトン；チオドニウムクロライド；トブラマイシン；トブラマイシンスルフェート；トスフロキサシン；トリメトプリム；トリメトプリムスルフェート；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；トロスペクトマイシンスルフェート；チロスリシン；バンコマシイン；バンコマシイン塩酸；ビルギニアマイシン；およびゾルバマイシン。
【０２４８】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染または細胞内のウイルスの複製を防ぐ化合物である。多くの抗ウイルス薬剤があるが抗細菌剤よりは少ない。ウイルス複製のプロセスは、宿主細胞内のＤＮＡ複製に緊密に関係しており、非特異的な抗ウイルス剤は、しばしば宿主に毒性であるからである。抗ウイルス剤によりブロックまたは阻害され得るウイルス感染のプロセス内のいくつかのプロセスがある。これらのステージは、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンまたは結合性ペプチド）、ウイルスの脱コーティング（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成または翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシドアナログ）、新規ウイルスタンパク質の成熟（例えば、プロテアーゼインヒビター）、およびウイルスの出芽および放出を含む。
【０２４９】
ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドに類似している合成化合物であるが、不完全または異常なデオキシリボースまたはリボース基を有している。一旦、ヌクレオチドアナログが細胞内にあると、それらは、リン酸化され、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ中への取り込みについて正常ヌクレオチドと競争する、形成された三リン酸を生成する。一旦、ヌクレオチドアナログの三リン酸形態が伸長する核酸鎖中に取り込まれると、それは、ウイルスポリメラーゼとの不可逆的に会合し、そしてそれ故鎖停止を引き起こす。ヌクレオチドアナログは、制限されずに、アシクロビル（単純ヘルペスウイルスおよび水痘‐帯状疱疹ウイルスの処置に用いられる）、ガンシクロビル（サイトメガロウイルスの処置に有用である）、イドックスウリジン、リバビリン（ＲＳウイルスの処置に有用）、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、およびジドブジン（アジドチミジン）を含む。インターフェロンは、ウイルス感染細胞および免疫細胞により分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞上の特異的レセプターに結合することによって機能し、細胞においてそれをウイルス感染から保護する変化を引き起こす。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンはまた、感染細胞の表面上のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の発現を誘導し、免疫細胞認識のための増加した抗原提示を引き起こす。α−インターフェロンおよびβ−インターフェロンは、組換え形態として入手可能であり、そして慢性Ｂ型およびＣ型肝炎感染の処置のために用いられている。抗ウイルス治療のために有効である投薬量で、インターフェロンは、発熱、倦怠感および体重減少のような重篤な副作用を有している。
【０２５０】
免疫グロブリン治療が、ウイルス感染の防止のために用いられている。ウイルス感染に対する免疫グロブリン治療は、細菌感染とは異なる。なぜなら、抗原特異的であるよりはむしろ、この免疫グロブリン治療は、細胞外ビリオンに結合すること、および、それらを、ウイルス感染を受けやすい細胞に付着しそして侵入することから防ぐことにより機能する。この治療は、宿主中に抗体が存在する期間の間ウイルス感染を防ぐために有用である。一般に、２つのタイプの免疫グロブリン治療、正常免疫グロブリン治療およびハイパー免疫グロブリン治療がある。正常免疫グロブリン治療は、正常血液ドナーの血清から調製され、かつプールされた抗体産物を利用する。このプールされた産物は、Ａ型肝炎、パルボウイルス、エンテロウイルス（特に、新生児において）のような広範な範囲のヒトウイルスに対する低力価の抗体を含む。ハイパー免疫グロブリン治療は、特定のウイルスに対する高力価の抗体を有する個体の血清から調製される抗体を利用する。これらの抗体は、次いで、特定のウイルスに対して用いられる。ハイパー免疫グロブリンの例は、帯状疱疹免疫グロブリン（免疫寛容幼児および新生児における水痘の予防に有用）、ヒト狂犬病免疫グロブリン（凶暴動物によって噛まれた被験体の曝露後の予防で有用）、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（Ｂ型肝炎ウイルスの予防、特にこのウイルスに曝された被験体において有用）、およびＲＳＶ免疫グロブリン（ＲＳウイスル感染の処置において有用）を含む。
【０２５１】
別のタイプの免疫グロブリン治療は、能動的免疫化である。これは、ウイルス表面タンパク質への抗体または抗体フラグメントの投与を含む。Ｂ型肝炎の能動的免疫化に利用可能である２つのタイプのワクチンは、血清由来Ｂ型肝炎抗体および組換えＢ型肝炎抗体を含む。両者は、ＨＢｓＡｇから調製される。これら抗体は、ヘルスケア作業者、慢性キャリヤーの性的パートナー、および幼児のような、Ｂ型肝炎ウイルスの感染の高リスクにある被験体に３つの用量で投与される。
【０２５２】
従って、本発明で有用な高ウイルス剤は、制限されずに、免疫グロブリン、アマンタジン、インターフェロン、ヌクレオシドアナログ、およびプロテアーゼインヒビターを含む。抗ウイルス剤の詳細な例は、制限されずに以下を含む：アセマンナン；アシクロビル；アシクロビルナトリウム；アデフォビル；アロブジン；アルビルセプトスドトックス；アナンタジン塩酸；アラノチン；アリルドン；アテビルジンメシレート；アブリジン；シドフォビル；シパムフィリン；シタラビン塩酸；デラビリジンメシレート；デスシクロビル；ジダノシン；ジソキサリル；エドックスウジン；エンビラデン；エンビロキシム；ファムシクロビル；ファモチン塩酸；フィアシタビン；フィアルリジン；フォサリレート；フォスカーネットナトリウム；フォスフォネットナトリウム；ガンシクロビル；ガンシクロビルナトリウム；アイドックスウリジン；ケトキサール；ラミブウジン；ロブカビル；メモチン塩酸；メチサゾン；ネビラピン；ペンシクロビル；ピロダビル；リバビリン；リマンタジン塩酸；サキナビルメシレート；ソマンタジン塩酸；ソリブウジン；スタトロン；スタブウジン；チロロン塩酸；トリフルリジン；バラシクロビル塩酸；ビダラビン；ビダラビンリン酸；ビダラビンナトリウムリン酸；ビロキサム；ザルシタビン；ジドブジン；およびジンビロキシム。
【０２５３】
抗真菌剤は、感染性真菌の処置および予防に有用である。抗真菌剤は、時に、それらの作用機構によって分類される。いくつかの抗真菌剤は、グルコース合成を阻害することによって、細胞壁インヒビターとして機能する。これらとしては、バシウンギン／ＥＣＢが挙げられる（しかし、これに限定されない）。他の抗真菌剤は、膜の統合性を不安定化させることによって機能する。これらとしては、クロトリマゾール、セルタコンゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびボリコナゾールのようなイミダゾール、ならびにＦＫ４６３、アンホテリシンＢ，ＢＡＹ  ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラジミシン、ＵＫ２９２，ブテナフィン、およびテルビナフィンが挙げられる（しかし、これに限定されない）。他の抗真菌剤は、キチンを分解することによって（例えば、キチナーゼ）、もしくは免疫抑制によって（５０１クリーム）、機能する。市販の薬剤のいくつかの例は、表３に示される。
【０２５４】
【表３−１】
2005532067.tif 000005
【０２５５】
【表３−２】
2005532067.tif 000006
【０２５６】
したがって、本発明において有用な抗真菌剤としては、イミダゾール、ＦＫ４６３、アンホテリシンＢ，ＢＡＹ  ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラジミシン、ＵＫ２９２，ブテナフィン、キチナーゼ、５０１クリーム、アクリゾルシン；アンブルチシン；アモロルフィン、アンホテリシンＢ；アザコナゾール；アザセリン；バシフンギン；ビフォナゾール；塩酸ビフェナミン；ビスピリチオンマグスルフェクス；硝酸ブトコナゾール；ウンデシレン酸カルシウム；カンジシジン；石炭酸フクシン；クロルダントイン；シクロピロックス；シクロピロックスオラミン；シロフンギン；シスコナゾール；クロトリマゾール；クプリミキシン；デノフンギン；ジピリチオン；デコナゾール；エコナゾール；硝酸エコナゾール；エニルコナゾール；硝酸エトナム；硝酸フェンチコナゾール；フィリピン；フルコナゾール；フルシトシン；フンギマイシン；グリセオフルビン；ハマイシン；イソコナゾール；イトラコナゾール；カラフンギン；ケトコナゾール；ロモフンギン；リジマイシン；メパルトリシン；ミコナゾール；硝酸ミコナゾール；モネンシン；モネンシンナトリウム；塩酸ナフチフィン；ウンデシレン酸ネオマイシン；ニフラテル；ニフルメロン；塩酸ニトララミン；ニスタチン；オクタン酸；硝酸オルコナゾール；硝酸オキシコナゾール；塩酸オキシフンギン；塩酸パルコナゾール；パルトリシン；ヨウ化カリウム；プロクロノール；ピリチオン亜鉛；ピロルニトリン；ルタマイシン；塩化サンギナリウム；サペルコナゾール；スコパフンギン；硫化セレン；シネフンギン；硝酸スルコナゾール；テルビナフィン；テルコナゾール；チラム；チクラトン；チオコナゾール；トルシクレート；トリンデート；トルナフテート；トリアセチン；トリアフンギン；ウンデシレン酸；ビリドフルギン；ウンデシレン酸亜鉛；および塩酸ジノコナゾールが挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０２５７】
ヒトへの投与に有用な殺寄生生物薬とも呼ばれる抗寄生虫剤の例としては、アルベンダゾール、アンホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート（ｆｕｒｏａｔｅ）、エフロルニチン、フラゾリダオン、糖質コルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、アイバメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタミンスルホンアミド、ピリメタミンスルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニン、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｒｏｐｒｉｍ）−スルファメトキサゾール，およびトリパルサミド（これらのいくつかは、単独で使用されるか、もしくは他と組み合わせて使用される）が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０２５８】
非ヒト被験体に使用される殺寄生生物薬としては、ピペラジン、ジエチルカルバマジンン、チアベンダゾール、フェンベンダゾール、アルベンダゾール、オキシフェンダゾール、オキシベンダゾール、フェバンテル、レバミソール、酒石酸ピランテル、ピランテルパモエート、ジクロルボス、アイバメクチン、ドラメクティク、ミルベマイシンオキシム、イプリノメクチン、モキシデクチン、塩化Ｎ−ブチル、トルエン、ハイグロマイシンＢチアセタルセミドナトリウム、メラルソミン、プラジカンテル、エプシプランテル、ベンズイミダゾール（例えば、フェンベンダゾール、アルベンダゾール、オキシフェンダゾール、クロルスロン、アルベンダゾール、アンプロリウム）、デコキネート、ラサロシド、モネンシン、スルファジメトキシン、スルファメタジン、スルファキノキサリンン、メトロニダゾール、が挙げられる。
【０２５９】
ウマに使用される殺寄生生物薬としては、メベンダゾール、オキシフェンダゾール、フェバンテル、ピランテル、ジクロルボス、トリクロルフォン、アイバメクチン、ピペラジン；Ｓ．ｗｅｓｔｅｒｉに対しては：アイバメクチン、ベンズイミダゾール（例えば、チアベンダゾール、カンベンダゾール、オキシベンダゾール、およびフェンベンダゾール）、が挙げられる。イヌに有用な殺寄生生物薬としては、ミルベマイシンオキシム（ｏｘｉｎｅ）、アイバメクチン、ピランテルパモエート、およびアイバメクチンとピランテルとの組み合わせ、が挙げられる。ブタでの寄生生物の処置としては、レバミソール、ピペラジン、ピランテル、チアベンダゾール、ジクロルボス、およびフェンベンダゾールの使用が挙げられ得る。ヒツジおよびヤギにおいて、駆虫剤としては、レバミソールもしくはアイバメクチンが挙げられる。カパルソレートは、ネコのＤ．ｉｍｍｉｔｉｓ（イヌ糸状虫）の処置においていくらかの効力を示している。
【０２６０】
免疫刺激性核酸はまた、抗癌治療と組み合わせて投与され得る。抗癌治療としては、癌治療薬（ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）、放射線、および外科的手順が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「癌治療薬」とは、癌を処置する目的で被験体に投与される薬剤を指す。本明細書中で使用される場合、「癌の処置」とは、癌の発生を予防すること、癌の症状を減少させること、および／もしくは発生した癌の成長を阻害すること、を含む。他の局面において、癌治療薬は、癌を発生する危険を有する被験体に、その癌を発生する危険を減少させる目的で投与される。癌の処置のための種々の医薬が、本明細書中に記載される。本明細書の目的のため、癌治療薬は、化学療法剤、免疫治療剤、癌ワクチン、ホルモン治療、および生物学的反応修飾因子として分類される。
【０２６１】
本明細書中で使用される場合、「癌治療薬」とは、癌を処置する目的で被験体に投与される薬剤を指す。明細書中で使用される場合、「癌の処置」とは、癌の発生を予防すること、癌の症状を減少させること、および／もしくは発生した癌の成長を阻害すること、を含む。他の局面において、癌治療薬は、癌を発生する危険を有する被験体に、その癌を発生する危険を減少させる目的で投与される。癌の処置のための種々の医薬が、本明細書中に記載される。本明細書の目的のため、癌治療薬は、化学療法剤、免疫治療剤、癌ワクチン、ホルモン治療、および生物学的反応修飾因子として分類される。加えて、本発明の方法は、免疫刺激性核酸とともに１種より多くの癌治療薬をの使用を含むことが意図される。一例として、適切な場合、免疫刺激性核酸は、化学療法剤および免疫治療剤の両方とともに投与され得る。あるいは癌治療薬は、癌を有するか、もしくは癌を発生する危険を有する被験体を処置する目的で一人の被験体に全て投与される、免疫治療剤および癌ワクチン、または化学療法剤および癌ワクチン、または化学療法剤、免疫治療剤、および癌ワクチンを含み得る。
【０２６２】
癌治療薬は、種々の方法で機能し得る。いくつかの癌治療薬は、腫瘍細胞に特異的な生理学的機構を標的とすることよって作用する。例として、癌で変異される特定の遺伝子、およびそれらの遺伝子の産物（すなわち、主にタンパク質）を標的することが挙げられるこのような遺伝子としては、癌遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｈｅｒ２、ｂｃｌ−２）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＥＧＦ、ｐ５３、Ｒｂ）、および細胞周期標的（例えば、ＣＤＫ４、ｐ２１、テロメラーゼ）、が挙げられる（しかし、これらに限定されない）。癌治療薬は、あるいは、シグナル伝達経路、および癌細胞で変化される分子機構を標的し得る。癌細胞を、それらの細胞表面に発現されるエピトープを介して標的とすることは、モノクローナル抗体の使用を通じて実現される。この後者のタイプの癌治療薬は、本明細書中において、一般に、免疫治療と呼ばれる。
【０２６３】
他の癌治療薬は、癌細胞以外の細胞を標的する。例えば、いくつかの医薬は、腫瘍細胞を攻撃するように、免疫系を刺激する（すなわち、癌ワクチン）。さらに他の医薬は、血管新生インヒビターと呼ばれ、固形腫瘍の血液供給を攻撃することによって機能する。ほとんどの悪性の癌は転移し得る（すなわち、原発性腫瘍部位に存在し、かつ遠位の組織に播種して二次性腫瘍を形成する）ので、この転移を妨害する医薬もまた、癌の処置に有用である。血管新生媒介因子としては、塩基性ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジオポイエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＦα、ＴＮＰ−４７０、トロンボスポンジン−１、血小板第４因子、ＣＡＩ、およびインテグリンファミリータンパク質の特定のメンバー、が挙げられる。このタイプの医薬の１つの部類は、メタロプロテアーゼインヒビターであり、これは、癌細胞によって使用される酵素が、原発腫瘍部位に存在し、かつ別の組織中に溢出するのを阻害する。
【０２６４】
免疫治療剤とは、癌抗原に特異的に結合するかもしくは癌抗原を特異的に認識する、抗体または抗体フラグメントに由来する、医薬である。本明細書中で使用される場合、癌抗原は、癌細胞によって発現される抗原として、広範に定義される。好ましくは、この抗原は、癌細胞の細胞表面に発現される。さらにより好ましくは、この抗原は、正常細胞には発現されないか、または少なくとも癌細胞と同じレベルでは発現されない抗原である。抗体に基づく免疫治療は、癌細胞の細胞表面に結合し、それによって内在する免疫系を刺激して癌細胞を攻撃することによって機能し得る。抗体に基づく免疫治療が機能する他の方法は、癌細胞への有毒物質の特異的標的のための送達系としてである。抗体は、通常、リシン（例えば、ヒマの実に由来する）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）およびマイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）のような毒素、ヨウ素１３１およびイットリウム９０のような放射性同位体、（本明細書中で記載されるような）化学療法剤、または生物学的反応修飾因子と結合体化される。このように、毒性物質は、癌領域で濃縮され得、そして正常細胞への非特異的毒性は、最小化され得る。癌抗原に対して特異的な抗体の使用に加えて、血管系に結合する抗体（例えば、内皮細胞に結合する抗体）もまた、本発明において有用である。これは、一般に、固形腫瘍が新たに形成される血管に依存して生存するからであり、そのためほとんどの腫瘍が、新しい血管の増殖を補強および刺激し得るからである。結果として、多くの癌機構の１つの戦略は、腫瘍に栄養供給する血管を攻撃すること、および／またはこのような血管を支持する結合組織（もしくは支質）を攻撃することである。
【０２６５】
免疫治療剤（例えば、モノクローナル抗体）に組み合わせられた免疫刺激性核酸の使用は、ＡＤＣＣの有意な増強を含む多くの機構（上記で議論される）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、およびＩＦＮαレベルの増加を通じて、長期生存を延長し得る。モノクローナル抗体と組み合わせて使用される核酸は、生物学的結果を達成するのに必要とされる抗体の用量を減少させるように作用する。
【０２６６】
現在使用されているか、または開発中である癌免疫治療の例が、表４に記載される。
【０２６７】
【表４−１】
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【０２６８】
【表４−２】
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【０２６９】
【表４−３】
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【０２７０】
【表４−４】
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【０２７１】
本発明に従って使用され得るなお他のタイプの化学療法剤としては、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロロンブシル、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フロオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトーテン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトザントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アンサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポイエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、および硫酸ビンデシン、が挙げられる。
【０２７２】
癌ワクチンは、癌細胞に対する内因性の免疫応答を刺激するように意図される医薬である。現在生成されるワクチンは、体液性免疫系（すなわち、抗体依存性免疫応答）を主に活性化する。現在開発中の他のワクチンは、細胞媒介性免疫系（腫瘍細胞を殺し得る細胞傷害性Ｔ細胞を含む）の活性化に焦点がおかれる。癌ワクチンは、一般に、抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）および／または他の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）への癌抗原の提示を増強する。
【０２７３】
癌ワクチンは、下記で議論されるように、複数の形態の１つを取り得るが、これらの目的は、ＡＰＣによる、およびＭＨＣクラスＩ分子に関連する細胞表面上の抗原提示の最終的提示による、このような抗原の内在プロセシングを促進するため、癌抗原および／もしくは癌関連抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ送達することである。癌ワクチンの１つの形態は、全細胞ワクチンであり、これは被験体から取り出さされ、生体外で処理され、次いでこの被験体へ全細胞として再導入される、癌細胞の調製物である。腫瘍細胞の溶解物もまた、癌ワクチンとして使用され、免疫応答を誘発し得る。癌ワクチンの他の形態は、ペプチドワクチンであり、これは、癌特異的小タンパク質もしくは癌関連小タンパク質を用いて、Ｔ細胞を活性化させる。癌関連タンパク質は、癌細胞によって独占的に発現されないタンパク質である（すなわち、他の正常細胞も、やはりこれらの抗原を発現し得る）。しかし、癌関連抗原の発現は、一般的に、特定のタイプの癌によって、一貫してアップレギュレートされる。癌ワクチンのなお別の形態は、樹状細胞ワクチンであり、これは、インビボで癌抗原もしくは癌関連抗原に曝露された樹状細胞全体を含む。樹状細胞の溶解物もしくは膜画分もまた、癌ワクチンとして使用され得る。樹状細胞ワクチンは、抗原提示細胞を直接的に活性化し得る。他の癌ワクチンとしては、ガングリオシドワクチン、熱ショックタンパク質ワクチン、ウイルスワクチンおよび細菌ワクチン、および核酸ワクチン、が挙げられる。
【０２７４】
癌ワクチンと組み合わせられる免疫刺激性核酸の使用は、ＮＫ細胞および内在性樹状細胞を活性化させること、およびＩＦＮαレベルを増加させることに加えて、改善された、抗原特異的な体液性免疫応答および抗原特異的細胞媒介性免疫応答を提供する。この増強は、減少した抗原用量を含むワクチンを用いて、同じ有効な効果を実現することを可能にする。いくつかの場合において、癌ワクチンは、上記に記載されるようなアジュバントとともに使用され得る。
【０２７５】
他のワクチンは、樹状細胞の形態を取る（これは、インビトロで癌抗原に曝露されて、その抗原を処理しており、その細胞表面に、他の免疫系細胞への有効な抗原提示のためにＭＨＣ分子に関連した癌抗原を発現し得る）。
【０２７６】
免疫刺激性核酸は、樹状細胞を基にする癌ワクチンと組み合わせて、本発明の１つの局面で使用される。樹状細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞である。樹状細胞は、抗原を提示することによって、およびその局所環境においてＬＰＳのような微生物分子を検出する、パターン認識レセプターの発現を通じて、先来性免疫系と後天性免疫系との間の関連を形成する。樹状細胞は、効率的に内部移行し、処理し、そしてそれが曝露される可溶性特異的抗原を提示する。内部移行および抗原提示のプロセスは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）および副刺激分子の発現の迅速なアップレギュレーション、サイトカインの生成、および、それらがＴ細胞の活性化に関与すると考えられる場所であるリンパ器官への移行、を引き起こす。
【０２７７】
表５は、現在使用されているか、もしくは開発中である種々の癌ワクチンを記載する。
【０２７８】
【表５−１】
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【０２７９】
【表５−２】
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【０２８０】
本明細書中で使用される場合、化学治療剤は、免疫治療剤および癌ワクチンの分類に入らない他の全ての形態の癌治療薬を含む。本明細書中で使用される場合、化学治療剤は、化学的薬剤および生物学的薬剤の両方を含む。これらの薬剤は、癌細胞が継続的な生存のために依存する細胞活性を阻害するように機能する。化学治療剤の分類としては、アルキル化剤、アルカロイド剤、代謝拮抗剤、ホルモンもしくはホルモンアナログ、および種々の抗腫瘍性薬物、が挙げられる。これらの薬剤の、全てではないとしてもほとんどは、癌細胞に対して直接的に有毒であり、そして免疫応答を必要としない。化学療法と免疫刺激性核酸投与との組み合わせは、化学療法の最大許容用量を増加させる。
【０２８１】
現在開発中であるか、もしくは臨床現場で使用中である化学治療剤が、表６に示される。
【０２８２】
【表６−１】
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【０２８３】
【表６−２】
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【０２８４】
【表６−３】
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【０２８５】
【表６−４】
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【０２８６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、癌の処置において、ＩＦＮα治療の使用の代わりに免疫刺激性核酸を使用する。現在、いくつかの処置プロトコールは、ＩＦＮαの使用を必要とする。ＩＦＮαは、いくつかの免疫刺激性核酸の投与に続いて生成されるので、これらの核酸は、ＩＦＮαを内因的に生成するのに使用され得る。
【０２８７】
別の実施形態において、喘息医薬／アレルギー医薬は、ＰＤＥ−４インヒビター、気管支拡張剤／β−２アゴニスト、Ｋ＋チャネルオープナー、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロキンアンタゴニスト、ＴＸＡ２合成インヒビター、キサンサニン、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼインヒビター、トロンボシンＡ２レセプターアンタゴニスト、トロンボキサンＡ２アンタゴニスト、５−ｌｉｐｏｘ活性化タンパク質インヒビター、およびプロテアーゼインヒビター、からなる群から選択される（しかし、これらに限定されない）医薬である。いくつかの重要な実施形態において、喘息医薬／アレルギー医薬は、サルメテロール、サルブタモール、テルブタリン、Ｄ２５２２／フォルモテロール、フェノテロール、およびオルシプレナリンからなる群から選択される、気管支拡張剤／β−２アゴニストである。
【０２８８】
別の実施形態において、喘息医薬／アレルギー医薬は、抗ヒスタミン剤およびプロスタグランジン誘導物質からなる群から選択される、医薬である。１つの実施形態において、抗ヒスタミン剤は、ロラチジン、セチリジン、ブクリジン、セテリジンアナログ、フェクソフェナジン、テルフェナジン、デスロラタジン、ノルアステミゾール、エピナスチン、エバスチン、エバスチン、アステミゾール、レボカバスチン、アゼラスチン、トラニラスト、テルフェナジン、ミゾラスチン、ベタタスチン、ＣＳ５６０、ＨＳＲ６０９、からなる群から選択される。別の実施形態において、プロスタグランジン誘導物質は、Ｓ−５７５１である。
【０２８９】
なお別の実施形態において、喘息医薬／アレルギー医薬は、ステロイドおよび免疫調節剤からなる群から選択される。免疫調節剤は、抗炎症剤、ロイコトリエンアンタゴニスト、ＩＬ−４ムテイン、可溶性ＩＬ−４レセプター、免疫抑制剤、抗ＩＬ−４抗体、ＩＬ−４アンタゴニスト、抗ＩＬ−５抗体、可溶性ＩＬ−１３レセプター−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＩＬ−９抗体、ＣＣＲ３アンタゴニスト、ＣＣＲ５アンタゴニスト、ＶＬＡ−４インヒビター、およびＩｇＥのダウンレギュレーター、からなる群から選択され得る（しかし、これらに限定されない）。１つの実施形態において、ＩｇＥのダウンレギュレーターは、抗ＩｇＥである。
【０２９０】
別の実施形態において、ステロイドは、ベクロメタゾン、フルチカゾン、トランキノロン、ブデゾニド、およびブデゾニドからなる群から選択される。なおさらなる実施形態において、免疫抑制剤は、寛容化されたペプチドワクチンである。
【０２９１】
１つの実施形態において、免疫刺激性核酸は、喘息医薬／アレルギー医薬と同時に投与される。別の実施形態において、被験体は、免疫無防備状態にある被験体である。
【０２９２】
免疫刺激性核酸は、さらに他の治療剤（例えば、アジュバント）と組み合わせられて、免疫応答を増強し得る。免疫刺激性核酸、および他の治療剤は、同時にもしくは逐次的に投与され得る。他の治療剤が同時に投与される場合、これらは、同じもしくは別個の処方物として投与され得るが、同時に投与される。他の治療剤および免疫刺激性核酸の投与が、時間的に分離される場合、他の治療剤は、互いに逐次的に、そして免疫刺激性核酸とともに投与される。これらの化合物の投与の間の時間の分離は、分単位であり得るか、またはより長いものであり得る。他の治療剤としては、アジュバント、サイトカイン、抗体、抗原、などが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。
【０２９３】
本発明の組成物はまた、非核酸アジュバントを含み得る。非核酸アジュバントは、本明細書中に記載される免疫刺激性核酸以外の、体液性免疫応答および／もしくは細胞性免疫応答を刺激し得る、任意の分子もしくは化合物である。非核酸アジュバントとしては、例えば、貯留作用を引き起こすアジュバント、免疫刺激性アジュバント、および貯留作用を引き起こし、かつ免疫系を刺激するアジュバント、が挙げられる。
【０２９４】
本明細書中で使用される場合、貯留作用を引き起こすアジュバントとは、抗原を体内にゆっくりと放出させ、それによって抗原への免疫細胞の曝露を延長させるアジュバントである。この分類のアジュバントとしては、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；もしくは乳剤を基礎とする処方物（ミネラルオイル、非ミネラルオイル、油中水型乳剤もしくは油中水中油型乳剤、ＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントのＳｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズ（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０、ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）のような水中油型乳剤、が挙げられる）；ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０で安定化された、水中スクワレン型乳剤；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）；およびＰＲＯＶＡＸ（安定化界面活性剤およびミセル形成剤を含む水中油型乳剤；ＩＤＥＣ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０２９５】
免疫刺激性アジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすアジュバントである。これは、例えば、免疫細胞にサイトカインを生成および分泌させる。このクラスのアジュバントとしては、Ｑ．ｓａｐｏｎａｒｉａの木の樹皮から精製されるサポニン（例えば、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画で２１番目のピーク中に溶出する糖脂質；Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）；リポポリサッカライドの誘導体（例えば、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）、およびスレオニルムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ））；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミンジサッカライド；ＯＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；および、リューシュマニア伸長因子（精製Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０２９６】
貯留作用を引き起こしかつ免疫系を刺激するアジュバントは、上記に同定された機能の両方を有する化合物である。この種類のアジュバントとしては、ＩＳＣＯＭＳ（混合されたサポニン、脂質を含み、そして抗原を保持し得る孔を有するウイルスサイズの粒子を形成する、免疫刺激性複合体；ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ＳＢ−ＡＳ２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍアジュバントシステム＃２（ＭＰＬおよびＱＳ２１を含む水中油型乳剤である）：ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ［ＳＢＢ］、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＳＢ−ＡＳ４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈｅｍアジュバントシステム＃４（ミョウバンおよびＭＰＬを含む）：ＳＢＢ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー（例えば、ＣＲＬ１００５）、これは、ポリオキシエチレンの鎖に挟まれた疎水性ポリオキシプロピレンの直鎖を含む；Ｖａｘｃｅｌ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）；および、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ、Ｔｗｅｅｎ８０および非イオン性ブロックコポリマーを含む水中油型乳剤；Ｓｙｎｔｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）、が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０２９７】
免疫刺激性核酸は、それ自身で体液性免疫応答を誘導するアジュバントとして有用である。したがって、それらは、抗原に曝露された被験体へ送達され、抗原への免疫応答の増強を生じ得る。
【０２９８】
免疫刺激性核酸は、粘膜アジュバントとして有用である。全身性免疫および粘膜免疫の両方がＣｐＧ核酸の粘膜送達によって誘導されることが、既に発見されている。このＣｐＧ核酸に応答して誘導される全身性免疫は、粘膜に単独で投与される場合に全身性免疫を誘導し得なかった特定抗原への体液性応答および細胞媒介性応答の両方を含んだ。さらに、ＣｐＧ核酸およびコレラ毒（ＣＴ、Ｔｈ２様応答を誘導する粘膜アジュバント）の両方は、ＣＴＬを誘導した。全身性免疫化によって、Ｔｈ２様抗体の存在は、通常ＣＴＬの欠乏に関連する（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、１９９５）ので、このことは驚くべきことであった。本明細書中で提示される結果に基づいて、免疫刺激性核酸が同様の様式で機能することが予測される。
【０２９９】
加えて、免疫刺激性核酸は、局所的粘膜部位（例えば、肺）および遠隔の粘膜部位（例えば、消化管下部）の両方で、粘液応答を誘導する。有意なレベルのＩｇＡ抗体が、免疫刺激性核酸によって、離れた粘膜部位で誘導される。ＣＴは、一般的に、非常に有効な粘膜アジュバントであると考えられる。既に報告されているように（Ｓｎｉｄｅｒ、１９９５）、ＣＴは、ＩｇＧ１アイソタイプの抗体を主に誘導し、これはＴｈ２型応答を示す。反対に、免疫刺激性核酸は、主にＩｇＧ２抗体によって、特に、追加免疫後、もしくは２つのアジュバントが組み合わせられる場合に、よりＴｈ１的である。ＴＨ１型抗体は、一般に、より高い中和能を有し、そしてさらに、肺でのＴｈ２応答は、喘息と関連するので非常に望ましくない（Ｋａｙ、１９９６、Ｈｏｇｇ、１９９７）。したがって、粘膜アジュバントとしての免疫刺激性核酸の使用は、他の粘膜アジュバントが達成し得ない利点を有する。本発明の免疫刺激性核酸はまた、全身性免疫応答と粘膜免疫応答との両方を誘導する粘膜アジュバントとして有用である。
【０３００】
非核酸粘膜アジュバントと呼ばれる粘膜アジュバントはまた、免疫刺激性核酸とともに投与され得る。本明細書中で使用される場合、非核酸粘膜アジュバントとは、抗原と組み合わせて粘膜表面に投与される場合に被験体において粘膜免疫応答を誘導し得る、免疫刺激性核酸以外のアジュバントである。粘膜アジュバントとしては、細菌毒素（例えば、コレラ毒（ＣＴ）、ＣＴ誘導体（以下：ＣＴ  Ｂサブユニット（ＣＴＢ）（Ｗｕら、１９９８、Ｔｏｃｈｉｋｕｂｏら、１９９８）；ＣＴＤ５３（Ｖａｌ→Ａｓｐ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＫ９７（Ｖａｌ→Ｌｙｓ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＫ１０４（Ｔｒｙ→Ｌｙｓ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＤ５３／Ｋ６３（Ｖａｌ→Ａｓｐ、Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＨ５４（Ａｒｇ→Ｈｉｓ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＮ１０７（Ｈｉｓ→Ａｓｎ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＥ１１４（Ｓｅｒ→Ｇｌｕ）（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＥ１１２Ｋ（Ｇｌｕ→Ｌｙｓ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７ａ）；ＣＴＳ６１Ｆ（Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９７ａ、１９９７ｂ）；ＣＴＳ１０６（Ｐｒｏ→Ｌｙｓ）（Ｄｏｕｃｅら、１９９７、Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）；ＣＴＫ６３（Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）（Ｄｏｕｃｅら、１９９７、Ｆｏｎｔａｎａら、１９９５）を含む（が、これに限定されない））、閉鎖帯毒素、ｚｏｔ、大腸菌易熱性エンテロトキシン、不安定毒（Ｌａｂｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ）（ＬＴ）、ＬＴ誘導体（以下：ＬＴ  Ｂサブユニット（ＬＴＢ）（Ｖｅｒｗｅｉｊら、１９９８）；ＬＴ７Ｋ（Ａｒｇ→Ｌｙｓ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８、Ｄｏｕｃｅら、１９９５）；ＬＴ６１Ｆ（Ｓｅｒ→Ｐｈｅ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１１２Ｋ（Ｇｌｕ→Ｌｙｓ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１１８Ｅ（Ｇｌｙ→Ｇｌｕ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１４６Ｅ（Ａｒｇ→Ｇｌｕ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴ１９２Ｇ（Ａｒｇ→Ｇｌｙ）（Ｋｏｍａｓｅら、１９９８）；ＬＴＫ６３（Ｓｅｒ→Ｌｙｓ）（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、１９９８、Ｄｏｕｃｅら、１９９７、１９９８、Ｄｉ  Ｔｏｍｍａｓｏら、１９９６）；および、ＬＴＲ７２（Ａｌａ→Ａｒｇ）（Ｇｉｕｌｉａｎｉら、１９９８）を含む（が、これに限定されない））、百日咳毒素（ＰＴ）（Ｌｙｃｋｅら、１９９２、Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ＢＤ、１９９２、ＦｒｅｙｔａｇおよびＣｌｅｍｍｅｎｔｓ、１９９９、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９５、Ｗｉｌｓｏｎら、１９９５）（これはＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９５、Ｃｒｏｐｌｅｙら、１９９５）を含む）；毒素誘導体（以下参照）（Ｈｏｌｍｇｒｅｎら、１９９３、Ｖｅｒｗｅｉｊら、１９９８、Ｒａｐｐｕｏｌｉら、１９９５、ＦｒｅｙｔａｇおよびＣｌｅｍｅｎｔｓ、１９９９）；脂質Ａ誘導体（例えば、モノホスホリルリピドＡ、ＭＰＬ）（Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８；ムラニルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａら、１９９６、Ｏｇａｗａら、１９８９、Ｍｉｃｈａｌｅｋら、１９８３，Ｍｏｒｉｓａｋｉら、１９８３）；細��外膜タンパク質（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの外膜タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）リポタンパク質、髄膜炎菌の外膜タンパク質）（Ｍａｒｉｎａｒｏら、１９９９、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｒｇら、１９９６）；水中油型乳剤（例えば、ＭＦ５９）（Ｂａｒｃｈｆｉｅｌｄら、１９９９、Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒら、１９９９、Ｏ’Ｈａｇａｎ、１９９８）；アルミニウム塩（Ｉｓａｋａら、１９９８、１９９９）；およびサポニン（例えば、ＱＳ２１）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）（Ｓａｓａｋｉら、１９９８、ＭａｃＮｅａｌら、１９９８）、ＩＳＣＯＭＳ、ＭＦ−５９（Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８０で安定化された水中スクワレン型乳剤；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）；ＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントのＳｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズ（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０；ＡｉｒＬｉｑｕｉｄｅ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）；ＰＲＯＶＡＸ（安定化界面活性剤およびミセル形成剤を含む水中油型乳剤；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ；Ｓｙｎｔｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）；ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）およびリューシュマニア伸長因子（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、が挙げられる（しかし、これに限定されない）。
【０３０１】
免疫応答はまた、サイトカイン（Ｂｕｅｌｅｒ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９６；Ｃｈｏｗら，１９９７；Ｇｅｉｓｓｌｅｒら，１９９７；Ｉｗａｓａｋｉら，１９９７；Ｋｉｍら，１９９７）またはＢ−７同時刺激性分子（Ｉｗａｓａｋｉら；１９９７；Ｔｓｕｊｉら，１９９７）と免疫刺激性核酸との同時投与または同一線形（ｃｏｌｉｎｅａｒ）発現によって誘導または増強され得る。サイトカインは、免疫刺激性核酸とともに直接的に投与され得るか、またはサイトカインをコードする核酸ベクターの形態で投与され得、その結果、このサイトカインは、インビボで発現され得る。１つの実施形態において、サイトカインは、プラスミド発現ベクターの形態で投与される。用語サイトカインは、ナノモル濃度またはピコモル濃度で体液性調節因子として作用し、そして通常の条件または生理学的条件のいずれかにおいて、個々の細胞および組織の機能的活性を調節する可溶性タンパク質およびペプチドの様々な群についての一般的な名称として使用される。これらのタンパク質はまた、直接的に細胞間の相互作用を媒介し、そして細胞外環境で行われるプロセスを調節する。
【０３０２】
サイトカインの例としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（γ−ＩＦＮ）、ＩＦＮ−α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＧＦ−β、ＦＬＴ−３リガンド、およびＣＤ４０リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０３】
サイトカインは、Ｔ細胞応答を方向付ける役割を果たす。ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞は、他の免疫系細胞（他のＴ細胞を含む）に対して作用する可溶性因子の産生を介して、哺乳動物の免疫応答を調整する。大部分の成熟ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、２つのサイトカインプロフィール（Ｔｈ１またはＴｈ２）のうちの１つを発現する。Ｔｈ１サブセットは、遅延型過敏症、細胞媒介免疫、およびＩｇＧ２ａへの免疫グロブリンクラススイッチを促進する。Ｔｈ２サブセットは、Ｂ細胞を活性化し、抗体産生を促進し、そしてＩｇＧ１およびＩｇＥへのクラススイッチを誘導することによって、体液性免疫を誘導する。いくつかの実施形態において、サイトカインはＴｈ１サイトカインであることが好ましい。
【０３０４】
免疫刺激性核酸は、被験体に直接的に投与され得るか、または核酸送達複合体とともに投与され得る。核酸送達複合体とは、標的化手段（例えば、標的細胞へのより高い結合親和性を生じる分子（例えば、Ｂ細胞表面および／または標的細胞による増加した細胞の取り込み））と関連する（例えば、イオン結合もしくは共有結合；または中にカプセル化される）核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合剤（例えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内部移行の前に、有意な脱共役を妨げるのに十分にインビボで安定であり得る。しかし、この複合体は、核酸が機能性形態で放出されるように、細胞内で適切な条件下で切断可能であり得る。
【０３０５】
抗原および核酸を表面に送達するための送達ビヒクルまたは送達デバイスが記載されている。免疫刺激性核酸および／または抗原および／または他の治療剤は、単独で（例えば、生理食塩水中でまたは緩衝液中で）、あるいは当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用して投与され得る。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている：コキレート（Ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら，１９９４，１９９６）；エマルソーム（Ｅｍｕｌｓｏｍｅｓ）（Ｖａｎｃｏｔｔら，１９９８，Ｌｏｗｅｌｌら，１９９７）；ＩＳＣＯＭｓ（Ｍｏｗａｔら，１９９３，Ｃａｒｌｓｓｏｎら，１９９１，Ｈｕら，１９９８，Ｍｏｒｅｉｎら，１９９９）；リポソーム（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら，１９９９，Ｍｉｃｈａｌｅｋら，１９８９，１９９２，ｄｅ  Ｈａａｎ  １９９５ａ，１９９５ｂ）；生きた細菌ベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ，Ｓｈｉｇｅｌｌａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｈｏｎｅら，１９９６，Ｐｏｕｗｅｌｓら，１９９８，Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら，１９９３，Ｓｔｏｖｅｒら，１９９１，Ｎｕｇｅｎｔら，１９９８）；生きたウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス）（Ｇａｌｌｉｃｈａｎら，１９９３，１９９５，Ｍｏｓｓら，１９９６，Ｎｕｇｅｎｔら，１９９８，Ｆｌｅｘｎｅｒら，１９８８，Ｍｏｒｒｏｗら，１９９９）；ミクロスフェア（Ｇｕｐｔａら，１９９８，Ｊｏｎｅｓら，１９９６，Ｍａｌｏｙら，１９９４，Ｍｏｏｒｅら，１９９５，Ｏ’Ｈａｇａｎら，１９９４，Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，１９８９）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎら，１９９３，Ｋｕｋｌｉｎら，１９９７，Ｓａｓａｋｉら，１９９８，Ｏｋａｄａら，１９９７，Ｉｓｈｉｉら，１９９７）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａら，１９９８，Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌら，１９９８）；ポリマー環（Ｗｙａｔｔら，１９９８）；Ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅｓ（Ｖａｎｃｏｔｔら，１９９８，Ｌｏｗｅｌｌら、１９８８，１９９６，１９９７）；フッ化ナトリウム（Ｈａｓｈｉら，１９９８）；トランスジェニック植物（Ｔａｃｋｅｔら，１９９８，Ｍａｓｏｎら，１９９８，Ｈａｑら，１９９５）；ビロソーム（Ｇｌｕｃｋら，１９９２，  Ｍｅｎｇｉａｒｄｉら，１９９５，Ｃｒｙｚら，１９９８）；ウイルス様粒子（Ｊｉａｎｇら，１９９９，Ｌｅｉｂｌら，１９９８）。他の送達ビヒクルは、当該分野で公知であり、いくつかのさらなる例が、ベクターについての考察において以下に提供される。
【０３０６】
特定の免疫刺激性核酸の刺激指数は、種々の免疫細胞アッセイにおいて試験され得る。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関して免疫刺激性核酸の刺激指数は、マウスＢ細胞培養物中での３Ｈウリジンの取り込みによって決定される場合、少なくとも約５、好ましくは、少なくとも約１０、より好ましくは、少なくとも約１５、最も好ましくは少なくとも約２０である。このマウスＢ細胞培養物は、２０時間、３７℃で２０μＭの核酸と接触され、そして１μＣｉの３Ｈウリジンでパルスされており；そして４時間後に収集および計数される（これは、それぞれ、１９９５年２月７日および１９９７年１０月３０日に出願された、米国出願番号０８／３８６，０６３および０８／９６０，７７４，に対して優先権を主張する、ＰＣＴ公開特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０（ＷＯ  ９６／０２５５５）およびＰＣＴ／ＵＳ９７／ｌ９７９１（ＷＯ  ９８／１８８１０）に詳細に記載されている）。例えば、免疫刺激性核酸が、インビボでの使用のために、免疫応答（例えば、抗体産生）を効果的に誘導し得ることが重要である。
【０３０７】
免疫刺激性核酸は、非齧歯類脊椎動物において有効である。異なる免疫刺激性核酸が、被験体のタイプおよび免疫刺激性核酸の配列に依存して、最適な免疫刺激を引き起こし得る。多くの脊椎動物が、同一のクラスの免疫刺激性核酸（ときどき、ヒト特異的免疫刺激性核酸と呼ばれる）に応答することが、本発明に従って見出されている。しかし、齧歯類は、異なる核酸に応答する。本明細書中で示されるように、ヒトにおいて最適な刺激を引き起こす免疫刺激性核酸は、一般的に、マウスにおいて最適な刺激を引き起こさず、その逆もまた同様である。しかし、ヒトにおいて最適な刺激を引き起こす免疫刺激性核酸は、他の動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジなど）において最適な刺激を引き起こす。当業者は、本明細書中に供給されるガイダンスを使用して、本明細書中に記載される慣習的なアッセイおよび／または当該分野で公知な慣習的なアッセイを使用して、目的の特定の種について有用な最適な核酸配列を同定し得る。
【０３０８】
用語、免疫刺激性核酸の有効量とは、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量をいう。例えば、粘液性免疫を誘導するための免疫刺激性核酸の有効量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してＩｇＡの発生を引き起こすのに必要な量であるのに対して、全身性免疫を誘導するために必要とされる量は、抗原に曝露した際に、抗原に応答してＩｇＧの発生を引き起こすのに必要な量である。本明細書中に提供される技術と組み合わせて、種々の活性化合物を選択し、そして因子（例えば、効力、相対的バイオアベイラビリティー、患者体重、有害な副作用の重篤度および投与の好ましい様式）を比較検討することによって、有効な処置レジメンまたは治療処置レジメン（実質的な毒性を引き起こさず、特定の被験体を処置するのに全体的に有効である）が計画され得る。任意の特定の適用についての有効量は、処置される疾患または状態、投与される特定の免疫刺激性核酸、抗原、被験体の大きさ、または疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存して変動し得る。当業者は、過度な実験を必要とすることなく、特定の免疫刺激性核酸および／または抗原および／または他の治療剤の有効量を経験的に決定し得る。
【０３０９】
粘膜送達または局所送達のために本明細書中に記載される化合物の被験体用量は、代表的に、投与当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、これは、毎日、毎週、または毎月およびそれらの間の任意の他の時間の量で与えられ得る適用に依存する。より代表的には、粘膜用量または局所用量は、投与当たり１０μｇ〜５ｍｇ、最も代表的には、約１００μｇ〜１ｍｇの範囲であり、２〜４回の投与が、日または週の間隔をおかれてなされる。より代表的には、免疫刺激用量は、投与当たり１μｇ〜１０ｍｇ、最も代表的には、１０μｇ〜１ｍｇの範囲で、毎日または毎週の投与である。化合物の被験体用量が、抗原特異的免疫応答を誘導するための非経口送達について、本明細書中に記載され、ここで、この化合物が、抗原とともに送達されるが、別の治療剤が、代表的には、ワクチンアジュバントまたは免疫刺激性適用のために有効な粘膜用量よりも５〜１０，０００倍高く、より代表的には、１０〜１，０００倍高く、最も代表的には、２０〜１００倍高い。免疫刺激性核酸が他の治療剤と組み合わせてまたは特定の送達ビヒクルにおいて投与される場合、先天性免疫応答を誘導するため、またはＡＤＣＣを増加させるため、または抗原特異的免疫応答を誘導するために、非経口的送達のための本明細書中に記載される化合物の用量は、代表的に、投与当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲であり、これは、毎日、毎週、または毎月およびそれらの間の任意の他の時間の量で与えられ得る適用に依存する。より代表的には、これらの目的のための非経口用量は、投与当たり約１０μｇ〜５ｍｇ、最も代表的には、約１００μｇ〜１ｍｇの範囲であり、２〜４回の投与が、日または週の間隔をおかれてなされる。しかし、ある実施形態において、これらの目的のための非経口用量は、上記の代表的な用量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で使用され得る。
【０３１０】
本明細書中に記載される任意の化合物について、治療有効量は、動物モデルから最初に決定され得る。治療有効用量はまた、ヒトにおいて試験されているＣｐＧオリゴヌクレオチド（ヒト臨床試験が開始されている）について、および類似の薬理学的活性を示すことが公知である化合物（例えば、他の粘膜アジュバント（例えば、ＬＴおよびワクチン接種目的の他の抗原）について、粘膜投与または局所投与について、ヒトデータから最初に決定され得る。より多い用量は、非経口投与のために必要とされる。適用される用量は、投与される化合物の相対的なバイオアベイラビリティーおよび効力に基づいて調節され得る。上記の方法および当該分野において周知の他の方法に基づいて、最大の効力を達成するための用量を調節することは、当業者の能力の十分に範囲内である。
【０３１１】
本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液で投与され、これは、慣用的には、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性キャリア、アジュバント、および必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【０３１２】
治療において使用するために、有効量の免疫刺激性核酸が、核酸を消耗の表面（例えば、粘膜、全身）に送達する任意の様式によって、被験体に投与され得る。本発明の薬学的組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。好ましい投与経路としては、経口、非経口、筋肉内、鼻内、鞘内、吸入、眼、膣および直腸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１３】
経口投与のために、化合物（すなわち、免疫刺激性核酸、抗原および他の治療剤）は、活性化合物と当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアによって、本発明の化合物が、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、錠剤（ｐｉｌｌ）、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、処置される被験体による経口摂取のために、処方され得る。経口使用のための薬学的調製物は、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、そして錠剤または糖剤コアを得るために、所望の場合、適切な補助剤を添加した後に、顆粒の混合物を処理して、固体賦形剤として得られ得る。適切な賦形剤は、特に、充填剤（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望の場合、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）が添加され得る。必要に応じて、経口処方物はまた、内部酸条件を中和するために生理食塩水または緩衝液で処方され得るか、あるいは、いかなるキャリアもなしで投与され得る。
【０３１４】
糖剤コアは、適切なコーティングを与えられる。この目的のために、濃縮糖溶液が使用され得、これは、必要に応じて、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。染料または顔料は、同定するため、または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【０３１５】
経口的に使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作製されたプッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟質密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、および／または滑沢剤（例えば、滑石またはステアリン酸マグネシウム）および必要に応じて安定化剤と混合されて、活性成分を含み得る。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定化剤が添加され得る。経口投与のために処方されるミクロスフェアもまた使用され得る。このようなミクロスフェアは、当該分野において十分に規定されている。経口投与のための全ての処方物は、このような投与のために適切な投薬量であるべきである。
【０３１６】
口腔（ｂｕｃｃａｌ）投与のために、この組成物は、従来の様式で処方される錠剤またはロゼンジの形態を採り得る。
【０３１７】
吸入による投与のために、本発明に従う使用のための化合物は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザからのエアロゾルスプレー提示の形態で、従来のように送達され得る。加圧エアロゾルの場合、その投与単位は、測定した量を送達するためのバルブを提供することによって、決定され得る。吸入器または注入器において使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、上記化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含んで、処方され得る。
【０３１８】
上記化合物は、全身に送達することが望ましい場合には、注入によって（例えば、ボーラス注射または連続注入によって）、非経口投与のために処方され得る。注射用の処方物は、単位投与形態（例えば、アンプル中）または多回投与用器中で、保存剤を添加して、提示され得る。上記組成物は、油状ビヒクルもしくは水性ビヒクル中の、懸濁物、溶液または乳濁物のような形態を採り得る。上記組成物は、処方剤（例えば、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤）を含み得る。
【０３１９】
非経口投与のための薬学的処方物は、水溶性形態で活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁物が、適切な油状注射懸濁物として、調製され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁物は、その懸濁物の粘性を増加する物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含み得る。必要に応じて、その懸濁物はまた、適切な安定化剤、または上記化合物の溶解度を増加して高濃縮溶液の調製を可能にする薬剤も含み得る。
【０３２０】
あるいは、その活性化合物は、適切なビヒクル（例えば、発熱性物質を含まない滅菌水）を用いて使用前に構成するために、粉末形態であり得る。
【０３２１】
上記化合物はまた、直腸組成物または膣組成物（例えば、坐剤または保持浣腸）の状態で、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含んで、処方され得る。
【０３２２】
上記の処方物に加えて、上記化合物はまた、デポー（ｄｅｐｏｔ）調製物として処方され得る。そのような長期作用性処方物は、適切なポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば、受容可能な油中の乳濁物として）またはイオン交換樹脂を用いて、または発泡溶解性誘導体（例えば、発泡溶解性塩）として、処方され得る。
【０３２３】
上記薬学的組成物はまた、適切な固体もしくはゲル相の、キャリアまたは賦形剤を含み得る。そのようなキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２４】
適切な液体もしくは固体の薬学的調製物形態は、例えば、吸入用の水溶液もしくは生理食塩水溶液であるか、微小カプセル化されているか、渦巻き状になっているか、顕微的金粒子上にコーティングされている、リポソーム中に含まれるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚移植用のペレットであるか、または皮膚中に引っ掻くべき鋭利な物体上に乾燥されている。上記薬学的組成物はまた、顆粒、散剤、錠剤、コーティングされた状態、（微小）カプセル、坐剤、シロップ、乳濁物、顕濁物、クリーム、活性化合物を長期放出するドロップもしくは調製物を包含し、その調製賦形剤および添加剤および／または補助剤（例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、甘味剤または溶解剤）は、上記のように慣習的に使用される。上記薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用するために適切である。薬物送達のための方法の簡略な概説について、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３、１９９０（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０３２５】
上記免疫刺激核酸と、必要に応じて、他の治療剤および／または薬剤とが、それ自体が（ニートで）投与され得るか、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、それらの塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために従来通り使用され得る。そのような塩としては、以下の酸から調製した塩が挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩）として、調製され得る。
【０３２６】
適切な緩衝剤としては、酢酸と塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸と塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸と塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸と塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０３２７】
本明細書中により詳細に記載されるように、本発明の薬学的組成物は、有効量の免疫刺激核酸と、必要に応じて抗原および／または他の治療剤とを、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリア中に含んで、含む。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、ヒトまたは他の脊椎動物に投与するために適切な、１種以上の適合性の固体もしくは液体の、充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」とは、適用を容易にするために活性成分が混合される、有機成分または無機成分（天然でも、または合成でも）を意味する。上記薬学的組成物の成分はまた、望ましい薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の化合物と混合可能であり、そして互いに混合可能である。
【０３２８】
本発明において有用な免疫刺激核酸は、さらなるアジュバント、他の治療剤、または抗原との混合物の状態で、送達され得る。混合物は、上記免疫刺激核酸またはいくつかの抗原もしくは他の治療剤に加えて、いくつかのアジュバントからなり得る。
【０３２９】
種々の投与経路が、利用可能である。選択される特定の様式は、当然、選択される特定のアジュバントもしくは抗原、処置される特定の状態、および治療効力のために必要な投与量に依存する。本発明の方法は、一般的に言うと、医学的に受容可能な任意の投与様式を使用して実施され得る。この様式は、臨床的に受容可能でない有害な効果を引き起こすことなく、有効な免疫応答レベルを生じる任意の様式を意味する。好ましい投与様式は、上記で考察される。
【０３３０】
上記組成物は、単位投与形態で従来通り提示され得、そして薬学の分野において周囲の方法のいずれかによって、調製され得る。全ての方法は、上記化合物を、１種以上の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、上記組成物は、上記化合物を、液体キャリア、微細分割された固体キャリア、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、その後、必要な場合はその生成物を成形することによって、調製される。液体用量単位は、バイアルまたはアンプルである。適切な用量単位は、錠剤、カプセル剤、および坐剤である。患者の処置のために、上記化合物の活性に依存して、投与様式、免疫の目的（すなわち、予防的または治療的）、障害の性質および重篤度、患者の年齢および体重に依存して、種々の用量が、必要であり得る。所定の用量の投与は、個別の用量単位の単回投与、またはいくつかのより小さい用量単位の両方によって、実行され得る。
【０３３１】
他の送達系は、時限放出送達系、遅延放出送達系、または徐放送達系を包含する。そのような系は、上記化合物の反復投与を回避し得、それによって、被験体および医師に対する簡便さを増加し得る。多くの型の放出送達系が、利用可能であり、そして当業者にとって公知である。それらとしては、ポリマーベースの系（例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物）が挙げられる。
【０３３２】
薬物を含む上記ポリマーの微小カプセルが、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載される。送達系としてはまた、非ポリマー系も挙げられ、これは、脂質（ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）、および脂肪酸もしくは天然脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）が挙げられる）；ヒドロゲル放出系；シラスチック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドベースの系；ロウコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分融合した移植物などである。具体例としては、（ａ）本発明の薬剤がマトリックス中にある形態で含まれる、侵食系（米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６７５，１８９号および同第５，７３６，１５２号に記載される系）；ならびに（ｂ）ポリマーから制御された速度で活性成分が浸透する、拡散系（米国特許第３，８５４，４８０号、同第５，１３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載される）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得、そのうちのいくつかは、移植のために適合される。
【０３３３】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。以下の実施例は、さらなる限定としては決して解釈されるべきではない。本明細書全体を通して引用された参考文献（文献参照物、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願）のすべての内容全体が、本明細書中に参考として明示的に援用される。
【実施例】
【０３３４】
（実施例１（ＯＤＮ  １０１０２）
（要旨）
本報告は、ヒト細胞を用いたインビトロデータを要約する。このデータは、ＯＤＮ  １０１０２（配列番号１）が、ＯＤＮ  ７９０９（配列番号２）と同様に、そしていくつかの局面ではより優れた様式で、挙動することを示す。マウスにおけるインビトロデータおよびインビボデータは、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０２は、先天性免疫系の活性化について、および上記抗原と同時投与した場合にマウスにおいてＨＢｓＡｇ特異的な体液性応答および細胞性応答を増強することについて、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９と同様の特性を有し、そして時にはそれよりも良好な特性を有することを示す。
【０３３５】
実施したアッセイは、レセプター結合（ＴＬＲ９）、Ｂ細胞活性化（細胞表面活性化マーカーの発現およびＢ細胞増殖）およびサイトカイン分泌（ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−α）であった。すべてのアッセイは、ＯＤＮ  １０１０２が、ＯＤＮ  ７９０９より良好ではないとしてもほぼ同一である特性を有することを、示した。
【０３３６】
インビトロ研究（すなわち、Ｂ細胞増殖アッセイ、ＮＫ溶解活性、サイトカイン分泌プロフィール）を、未刺激ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞を使用して実行した。インビボ比較研究を、これらの２つのＯＤＮがＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗原特異的免疫応答を増強する能力を試験することによって、実行した。
【０３３７】
（材料および方法）
（ヒト研究）
（オリゴデオキシヌクレオチド）  すべてのＯＤＮは、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＧｍｂＨ（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から提供された。コントロールＯＤＮは、刺激性ＣｐＧモチーフを何も含まなかった。ＯＤＮを、リン酸緩衝化生理食塩水中に希釈し、−２０℃で保存した。すべての希釈を、発熱物質を含まない試薬を使用して実行した。
【０３３８】
（ＴＬ９アッセイ）  このアッセイのために使用した細胞は、ヒトＴＬＲ９レセプターを発現し、レポーター遺伝子構築物を含んだ。細胞を、ＯＤＮとともに１６時間インキュベートした。各データ点は、３連で行った。細胞を溶解し、レポーター遺伝子活性についてアッセイした。刺激指数を、ＯＤＮを添加しない培地のレポーター遺伝子活性を参照して計算した。
【０３３９】
（細胞純化）  健常ヒトドナー由来の末梢血軟膜調製物を、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ（Ｒａｔｈｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、これらから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対する遠心分離によって、ＰＢＭＣを精製した。この精製したＰＢＭＣを、新しいまま使用したか、または凍結媒体中に顕濁して−７０℃で保存した。必要な場合、これらの細胞のアリコートを、融解し、洗浄し、そして１０％（ｖ／ｖ）熱非働体化ＦＣＳと、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に再懸濁した。
【０３４０】
（サイトカイン検出）  融解したＰＢＭＣまたは新しいＰＢＭＣを、濃度５×１０６／ｍｌで再懸濁し、４８ウェル平底プレート（１ｍｌ／ウェル）に添加した。このプレートには、その前に、何も添加していないか、または種々の濃度のＯＤＮを添加しておいた。この細胞を、３７℃にて加湿インキュベーター中で培養した。培養上清を、指定時点の後に収集した。すぐ使用しなかった場合、上清を、必要になるまで−２０℃で凍結した。上清中の一定のサイトカインを、市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０；Ｄｉａｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）またはインハウス（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）ＥＬＩＳＡ（ＩＰ−１９およびＩＦＮ−α）を使用して評価し、市販の抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙまたはＰＢＬ，ＵＳＡ）を使用して発色させた。
【０３４１】
（Ｂ細胞活性化のフローサイトメトリー分析のための培養）  ＣＤ１９に対するモノクローナル抗体およびＣＤ８６に対するモノクローナル抗体を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＰＢＭＣを、種々の濃度のＯＤＮを添加してかまたは添加せずに、４８時間インキュベートした。Ｂ細胞を、フローサイトメトリーによって、ＣＤ１９の発現によって同定した。フローサイトメトリーのデータは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて得た。データを、コンピュータープログラムＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。増殖中のＣＤ１９陽性Ｂ細胞を、ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（ＣＦＳＥは、すべての細胞表面に結合する蛍光色素である）を培養した後に、フローサイトメトリー方法（上記を参照のこと）を使用して、ＣＦＳＥ含量の減少によって同定した。
【０３４２】
（マウスでのインビトロ研究／インビボ研究）
（オリゴデオキシヌクレオチド）  ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＧＭＰ品質）は、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）によって供給された。すべてのＯＤＮを、エンドトキシンを含まない滅菌したＴＥ（ｐＨ８．０）（ＯｍｎｉＰｅｒ（登録商標）；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中に再懸濁し、保存し、そして無菌条件下で取り扱って、微生物混入およびエンドトキシン混入を長方とも防止した。アッセイ用のＯＤＮの希釈を、エンドトキシンを含まない滅菌したＰＢＳ（ｐＨ７．２）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において実行した。
【０３４３】
（動物）  雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、すべての実験のために使用した。動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、Ｏｔｔａｗａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｉｖｉｃ  Ｓｉｔｅの動物世話施設において、微小隔離飼育器中で飼育した。
【０３４４】
（採集した脾細胞および培養物）  未刺激ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、全てのインビトロアッセイのために使用した。動物に、イソフルランで麻酔し、そして頸部脱臼によって安楽死させた。脾臓を無菌条件下で取り出し、ＰＢＳ＋０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）中に配置した。その後、脾臓をホモジナイズし、脾細胞を、２％正常マウス血清（最終濃度１００Ｕ／ｍｌ；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）および５×１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を補充した、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）組織培養培地中に再懸濁した。
【０３４５】
Ｂ細胞増殖アッセイ：脾臓細胞懸濁液を、完全ＲＰＭＩ  １６４０中の１ｍｌあたり最終濃度５×１０６細胞まで調製し、そして調節した。脾細胞懸濁液を、１００μｌの刺激薬と共に９６ウェルＵ底部組織培養プレート（１００μｌ／ウェル）に注ぎ、完全ＲＰＭＩ  １６４０中で適切な濃度まで希釈した。使用した刺激物は、ＣｐＧ  ＯＤＮ（１、３、１０μｇ／ｍｌで）７９０９および１０１０２、１０１０３、１０１０４、１０１０５または１０１０６であった。コンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、ポジティブコントロールとして使用し、そして培地単独で培養した細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。各脾細胞サンプルを、三つ組みでプレーティングし、そして細胞を、３７℃にて９６時間、加湿された５％  ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、細胞を、インキュベーションの９６時間後、３Ｈ−チミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）で１６時間パルスし、回収し、そして放射活性を測定した。
【０３４６】
サイトカイン分泌プロファイル：脾臓細胞懸濁液を調製し、そしてＢ細胞増殖アッセイについて記載されるように、９６ウェルＵ底部組織培養プレート中にプレーティングした。各脾細胞サンプルを、三つ組みでプレーティングし、そして細胞を、３７℃にて６時間、１２時間または４８時間、加湿した５％  ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。インキュベートの期間の最後に、９６ウェルプレートを、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして培養懸濁液を回収し、アッセイまで−８０℃で保存した。市販のアッセイキット（マウスＯｐｔＥＩＡキット；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を製造者の指示書に従って使用し、６時間（ＴＮＦ−α）、２４時間（ＩＬ−１２）および４８時間（ＩＬ−６およびＩＬ−１０）で取り出した培養懸濁液のサイトカインレベルをアッセイした。
【０３４７】
ＮＫアッセイ：脾細胞懸濁液を上記のように調製し、そして完全ＲＰＭＩ  １６４０中１ｍｌあたり３×１０６細胞の最終濃度まで調製した。脾細胞懸濁液（１０ｍｌ；３０×１０６細胞）を、ＣｐＧ  ＯＤＮ（１、３、１０μｇ／ｍｌで）７９０９と１０１０２、１０１０３、１０１０４、１０１０５または１０１０６のいずれかと共に、Ｔ−２５組織培養フラスコ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ）中にプレーティングした。培地単独で培養された脾細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。各脾細胞培養物を、３７℃にて２４時間、加湿した５％  ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。インキュベート期間の最後に、細胞を異なるエフェクターでプレーティングした：５×１０４細胞／ｍｌで１００μｌの５１Ｃｒ標識化標的細胞と共に９６ウェルＵ底部組織培養プレート（１００μｌ／ウェル）の標的比。ＮＫ感受性マウスリンパ球細胞株ＹＡＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１６０、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、標的細胞株として使用した。各サンプルを、三つ組みでプレーティングし、そして細胞を、３７℃にて４時間、加湿した５％  ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。標的細胞を、培地単独または２Ｎ  ＨＣＬを含む培地でインキュベートし、それぞれ自発性放出および最大放出を決定した。インキュベーション期間の最後に、上清を回収し、そして放射活性レベルを、ガンマカウンターを使用して測定した。溶解％を、以下の式を使用して決定した；
特異的放出％＝（実験的放出−自発性放出）／（最大放出−自発性放出）×１００
。
【０３４８】
マウスの免疫化：ＢＡＬＡ／ｃマウス（ｎ＝１０／グループ）を、１μｇ  ＨＢｓＡｇ  サブタイプａｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＣＡ）単独または１０μｇ  ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９またはＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０２、１０１０３、１０１０４、１０１０５もしくは１０１０６のいずれかと組み合わせて免疫化した。動物から採血し、そして一次免疫の４週間後に追加免疫した。追加免疫の１週間後に、各グループから５匹の動物を安楽死させ、そしてＣＴＬアッセイのために脾臓を取り出した。
【０３４９】
抗体応答の決定：ＨＢｓＡｇ（抗−ＨＢｓ）に対して特異的な抗体（ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの全て）を検出し、終点希釈（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡアッセイによって定量化し、このアッセイを、個々の動物に由来するサンプルに対して三つ組みで行った。終点力価を、０．０５のカットオフ値を有する非免疫血漿の吸光度よりも２倍大きい吸光度（ＯＤ  ４５０）を生じる最も高い血漿希釈として規定した。これらを、グループ平均力価±ＳＥＭとして報告した。
【０３５０】
統計学的分析：統計学的分析を、ＩｎＳｔａｔプログラム（Ｇｒａｐｈ  ＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して実行した。グループ間の統計学的差異を、生データもしくは変換したデータ（ｌｏｇ１０、異分散集団について）についてスチューデントｔ検定（２グループについて）またはＴｕｋｅｙ’ｓ検定（３つ以上のグループについて）に次ぐ１−因子ＡＮＯＶＡによって検定した。
【０３５１】
結果：
ＴＬＲ９結合：ＣｐＧ配列の認識のためのレセプターを最近同定し、そしてＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）ファミリー（Ｈｅｍｍｉら、２０００）のメンバーであることを示した。このレセプター、ＴＬＲ９は、最適な免疫刺激ＣｐＧ配列を含むＯＤＮによって容易に活性化される。発明者らは、異なる濃度のＯＤＮ  ７９０９および１０１０２ならびにコントロールＯＤＮとヒトＴＬＲ９を安定に発現する細胞株をインキュベートした（図１）。
【０３５２】
結果は、これらのＯＤＮ  １０１０２が、７９０９と同じかまたはそれ以上にＴＬＲ９を活性化したことを示す。両方のＯＤＮが、用量応答曲線を示し、そして同じ濃度で最大活性に達した。使用されたコントロールＯＤＮは、１２μｇ／ｍｌの最も高い濃度でさえＴＬＲ９活性を誘導しなかった。
【０３５３】
ヒトＢ細胞：Ｂ型ＯＤＮの１つの特徴は、Ｂ細胞を非常に効率的に活性化するそれらの能力である（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。Ｂ細胞およびプラズマ細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣが、現在のところＴＬＲ９を発現することが公知である唯一の免疫細胞型である（Ｋｒｕｇら、２００１；Ｂａｕｅｒら、２００１）。従って、発明者らは、ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２によって誘導されるＢ細胞の直接的な活性を以下によって測定した：ａ．細胞表面マーカーＣＤ８６の上方制御（図２）およびｂ．Ｂ細胞の増殖の測定（図３）。ヒトＢ細胞のＣＤ８６発現について、健全な血液ドナーのＰＢＭＣを、材料および方法に記載されるように、異なるＯＤＮと共にインキュベートし、そしてＢ細胞活性化を測定した。
【０３５４】
両方の結果は、１０１０２ならびに７９０９が、ヒトＢ細胞の非常に重要な刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）であることを示す。図２は、これらのＣｐＧ  ＯＤＮが、インビトロで０．４μｇ／ｍｌの濃度でのみＢ細胞を刺激し得ることを示す。プラトーに、約１．６μｇ／ｍｌで達した。同様の結果は、Ｂ細胞増殖のインキュベーションについて得られ（図３）、ここで、刺激指数は、約１．６μｇ／ｍｌで最大に達した。
【０３５５】
サイトカイン分泌：ＢクラスのＯＤＮは、インビボならびにインビトロでＴｈ１優性免疫応答を導く。これらは、代表的にＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−およびＩＦＮ−）ならびにＴｈ１関連サイトカイン（例えば、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０）を誘導し得ることが見出された。さらに、炎症促進性サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−の低い分泌ならびにネガティブ制御因子ＩＬ−１０の分泌を観察し得る。従って、本発明者らは、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−、ケモカインＩＰ−１０の分泌ならびに制御因子サイトカインＩＬ−１０および炎症促進性サイトカインＴＮＦ−を測定した。図４は、インビトロでのＩＦＮ−分泌を測定するために、０．２、０．４、１．６および５μｇ／ｍｌでの異なるドナーを用いて行われた実験についての結果を示す。
【０３５６】
ＣｐＧ  ＯＤＮ（７９０９ならびに１０１０２）の両方は、０．４（７９０９）または１．６μｇ／ｍｌ（１０１０２）で達した最大の高いレベルのＩＦＮ−αを誘導した。しかし、ＩＦＮ−α分泌の最大の増加は、７９０９と比較して１０１０２での刺激の後、より明白であった。対照的に、コントロールＯＤＮは、５．０μｇ／ｍｌでのみ開始する低量のＩＦＮ−αを誘導した。さらに、コノトロールＯＤＮと対照的に、ＯＤＮ７９０９および１０１０２は、図５に示されるように高い量のケモカインＩＰ−１０を誘導した。
【０３５７】
非常に類似する実験を、ＩＬ−１０分泌について行った（図６）。再び、ＩＦＮ−αについて上で示されるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２の両方が、ほぼ同一の特性を示し、１０１０２が、これらのアッセイにおけるいくつかの場合において、より働く。比較すると、コントロールＯＤＮが、最も高い濃度でのみＩＬ−１０分泌を誘導する。
【０３５８】
図７に示されるように、ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２の両方ならびにコントロールＯＤＮが、ＬＰＳと比較して炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの弱い分泌プロファイルを示した。再び、２つのＯＤＮが、このアッセイにおいてまた非常に類似する特性を有することが見出された。
【０３５９】
実験の第１のセットにおいて、マウス脾臓細胞の増殖の誘導を調査した。図８において示されるデータによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０２は、試験された全ての濃度でマウスＢ細胞増殖の誘導に関してＣｐＧ  ＯＤＮと等しく強力である。
【０３６０】
実験の次のセットにおいて、１０１０１２、７９０９およびコントロール２１３７との脾臓細胞のインキュベーションの際、種々のサイトカインの分泌を試験した。図９に示されるデータによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２の両方は、マウス脾細胞によるサイトカイン分泌の増大に関して基本的に等しい作用強度を有する。
【０３６１】
図１０におけるデータによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２の両方は、マウス脾細胞培養物におけるＮＫ細胞の溶解活性の増大に関して基本的に等しい作用強度を有する。
【０３６２】
この研究の結果（図１１）によると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９または１０１０２のいずれかの使用は、抗原単独と比較して、ＨＢｓＡｇに対する抗体力価を有意に増大したが（ｐ＜０．００１）、コントロールＯＤＮを、ＨＢｓＡｇと組み合わせて使用する場合、抗ＨＢｓ応答は有意に増加しなかった（ｐ＝０．８６）。
【０３６３】
全ＩｇＧレベルの増加は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０２が使用される場合と比較してＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９が使用される場合、僅かであるが有意に増加する（ｐ＝０．０４）。
【０３６４】
マウスＩｇＧアイソタイプにおいて、分配は、高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比がＴｈ１バイアス免疫応答を示す免疫応答の性質の指標として広範に使用される（ＣｏｎｓｔａｎｔおよびＢｏｔｔｏｍｌｙ，１９９７）。本研究において、ＣｐＧ  ＯＤＮの使用は、抗原が単独またはコントロールＯＤＮ  ２１３７と組み合わせて使用された場合と比較して、ＩｇＧ２ａ力価を有意に増大した（Ａｇ対７９０９もしくは１０１０２またはＡｇ対Ａｇ＋２１３７についてｐ＜０．００１）。しかし、ＩｇＧ２ａ応答のレベルは、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９または１０１０２のいずれかが、ＨＢｓＡｇと組み合わせて使用された場合に類似した（ｐ＞０．０５）。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２の両方は、ＩｇＧ１を超えるＩｇＧ２ａの増加レベルによって測定されるように、Ｔｈ１バイアス免疫応答を誘導するそれらの能力に関して等しく強力である。
【０３６５】
結論：
ヒト細胞を用いるインビトロデータは、ＯＤＮ  １０１０２が、実行された種々のアッセイにおいて、以前に同定されたＯＤＮ  ７９０９と類似するかまたはまたはより良く行動することを示した。
【０３６６】
マウスのインビボ研究およびインビトロ研究の結果に従って、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０２が、抗原と共に投与される場合、不活性な免疫応答に対するインビトロ効果ならびにインビボでの抗原特異的応答を増強する能力の両方について、ＯＤＮ  ７９０９と類似するかそれよりも良い免疫増強特性を有する。
【０３６７】
（実施例２（ＯＤＮ  １０１０３））
要約：ＯＤＮ  １０１０３（配列番号１９）が、ヒトＰＢＭＣを刺激するインビトロでの能力を、ＯＤＮ  ７９０９（配列番号２）の能力と比較した。免疫刺激を、レセプター（すなわち、ＴＬＲ９）結合、Ｂ細胞活性化（例えば、細胞表面活性化マーカーの発現およびＢ細胞増殖）およびサイトカイン分泌（例えば、ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの分泌）の点で分析した。全てのアッセイは、ＯＤＮ  １０１０３が、ＯＤＮ  ７９０９の特性に類似するかまたはこれらより優れた特性を有することを示した。
【０３６８】
ＯＤＮ  １０１０３がマウス免疫細胞をインビトロおよびインビボで刺激する能力を、ＯＤＮ  ７９０９と比較した。インビトロでの研究（例えば、Ｂ細胞増殖アッセイ、ＮＫ溶解活性およびサイトカイン分泌プロファイル）を、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞を使用して行った。インビボ研究を、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗原特異的免疫応答を増強するようなこれらの２つのＯＤＮの強度を試験することによって行い、体液（抗体）および細胞媒介免疫応答（ＣＴＬ活性）を分析した。さらに、誘導された免疫応答のＴｈバイアスを、ＣＴＬ応答の強度ならびにＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を決定することによって試験した。
【０３６９】
材料および方法：
ヒト研究に関して、オリゴデオキシヌクレオチド、ＴＬＲ９アッセイ、ヒト細胞増殖、サイトカイン検出およびＢ細胞活性化のフローサイトメトリー分析のための細胞培養物の説明についての実施例１を参照のこと。
【０３７０】
マウスのインビトロおよびインビボ研究に関して、オリゴデオキシヌクレオチド、動物、脾細胞の回収および培養、Ｂ細胞増殖アッセイ、サイトカイン分泌プロファイル、ＮＫアッセイ、マウスの免疫化、抗体応答の測定および統計学的分析のの説明についての実施例１を参照のこと。
【０３７１】
（マウスのインビトロ／インビボ研究：）
ＣＴＬ応答の評価：ＣＴｌアッセイを、Ｄａｖｉｓらによって以前に記載されるように行った。結果は、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比での特異的溶解％として示す。
【０３７２】
（結果：）
ＴＬＲ９結合：発明者らは、異なる濃度のＯＤＮ  ７９０９および１０１０３ならびにコントロールＯＤＮと共にヒトＴＬＲ９を安定に発現する細胞株をインキュベートした（図１３）。両方のＯＤＮは、同じ濃度でそれらの最大活性に達成する濃度依存性用量−応答曲線を示した。コントロールＯＤＮは、最も高い濃度の２４μｇ／ｍｌでさえＴＬＲ９活性化を誘導しなかった。ＯＤＮ  １０１０３は、ＯＤＮ  ７９０９を示すよりも低い用量（例えば、６ｇ／ｍｌおよび１２ｇ／ｍｌ）でより高い刺激能力を示し、このことはＯＤＮ  １０１０３が、類似の免疫刺激指数に達成するようなより低い用量で使用され得、それによって潜在的な毒性を減少させることを示唆する。
【０３７３】
ヒトＢ細胞：Ｂ型  ＯＤＮの１つの特性は、Ｂ細胞を非常に効果的に活性化するそれらの能力である（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。Ｂ細胞および血漿細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣは、現在のところＴＬＲ９を発現することが公知である免疫細胞型のみである（Ｋｒｕｇら、２００１；Ｂａｕｅｒら、２００１）。従って、本発明者らは、細胞表面マーカーＣＤ８６の上方制御によってＯＤＮ  ７９０９および１０１０３によって誘導されるＢ細胞の直接的な活性を測定し（図１４）、そしてＢ細胞の増殖を測定した（図１５）。ヒトＢ細胞でのＣＤ８６発現について、健康な血液ドナーのＰＢＭＣを、異なるＯＤＮと共にインキュベートし、そしてＢ細胞活性を材料および方法に記載されるように測定した。
【０３７４】
両方の結果から、１０１０３は、ヒトＢ細胞の刺激因子としての７９０９と少なくとも同等であることが示される。図１４は、これらのＣｐＧ  ＯＤＮは、インビトロでの濃度（０．４μｇ／ｍｌでのみ）で開始するＢ細胞を刺激し得ることを示す。プラトーは、約１．６μｇ／ｍｌで達成され、そして同じ濃度で非常に小さい影響であるコントロールと比較して、６０％を超えるＢ細胞が、ＣＤ８６を上方制御することを見出した。この結果は、ＯＤＮ  １０１０３が、試験した３つ全てのドナーにおけるＯＤＮ  ７９０９の用量よりも低い用量（例えば、０．４μｇ／ｍｌ）でより高いレベルまでＣＤ８６発現を刺激することを示す。再び、このことは、より小さい用量のＯＤＮ  １０１０３を使用して、所望のレベルの免疫刺激に達成し得ることを示唆する。類似の結果が、Ｂ細胞増殖の誘導について得られた（図１５）。
【０３７５】
サイトカイン分泌：ＢクラスのＯＤＮは、インビボならびにインビトロでのＴｈ１優性免疫応答を導く。これらは、代表的にＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−α）ならびにケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０）を誘導し得ることが見出された。さらに、炎症促進性サイトカインＩｌ−６ならびにＴＦＮ−αの低い分泌および負の調節因子ＩＬ−１０の分泌が観察された。従って、本発明者らは、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−α、ケモカインＩＰ−１０ならびに調節サイトカインＩｌ−１０および炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの分泌を測定した。
【０３７６】
図１６は、インビトロでのＩＦＮ−α分泌を測定するために、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌおよび１．６μｇ／ｍｌにて６人の異なるドナーを用いて実施した実験についての結果を示す。いずれのＣｐＧ  ＯＤＮ（７９０９ならびに１０１０３）も、異なるドナーにおいて有意な量のＩＦＮ−αを誘導した。対照的に、コントロールＯＤＮは、ＩＦＮ−αを全く誘導しないか、または１人のドナーにおいて少量のＩＦＮ−αを誘導した。このデータは、患者の可変性が存在し得、いく人かの患者は、ＯＤＮ７９０９と比較した場合、１０１０３のようなＯＤＮにより良く応答することを示唆する。この知見は、ＯＤＮが、高い応答者でありそうな被験体の観点から分類され得ることを示す。
【０３７７】
ＩＦＮ−αに加えて、ＯＤＮ７９０９および１０１０３は、図１７に示したようにケモカインＩＰ−１０を誘導した。ＯＤＮ１０１０３は、試験したすべての用量で、ＯＤＮ７９０９と同レベルかまたはＯＤＮ７９０９よりも高いレベルのＩＰ−１０を誘導した。特に、０．４μｇ／ｍｌの濃度で、ＯＤＮ１０１０３は、ＯＤＮ７９０９が生成したよりも多量のＩＰ−１０を生成した。１．６μｇ／ｍｌの濃度では、ＯＤＮ１０１０３は、ＯＤＮ７９０９が誘導したよりも約２５％多いＩＰ−１０を誘導した。
【０３７８】
図１８に示したように、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９および１０１０３は、ほぼ同一のＩＬ−１０誘導能力を示した。
【０３７９】
図１９に示したように、ＯＤＮ７９０９および１０１０３の両方、ならびにコントロールＯＤＮは、ＬＰＳと比較して、試験したすべての濃度において炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αの低分泌プロフィールを示した。試験した最も多い用量（すなわち、６μｇ／ｍｌ）では、ＯＤＮ１０１０３は、ＯＤＮ７９０９が刺激したよりも高いレベルのＩＬ−１０の分泌を刺激した。その用量応答を、図２１に示す。
【０３８０】
インビトロマウス研究：データによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９および１０１０３の両方は、マウスＢ細胞増殖を誘導することにおいて、同等に強力であり、マウス脾細胞によるサイトカイン分泌を増強することにおいて本質的に同一の効力を有し、そしてマウス脾細胞培養物におけるＮＫ細胞の溶解活性を増強することにおいて本質的に同一の効力を有する（図２２）。ＯＤＮ１０１０３は、特に試験したより少ない用量で、ＩＬ−６およびＴＮＦ−の分泌を刺激することについてより高い能力を有するようである。同様に、これらのＯＤＮの溶解活性プロフィールは、濃度によって異なる。
【０３８１】
インビボマウス研究：この研究の結果によると、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９または１０１０３のいずれかの使用は、抗原単独と比較して、ＨＢｓＡｇに対する抗体力価を有意に増強した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）が、コントロールＯＤＮをＨＢｓＡｇと組み合わせて使用した場合、抗ＨＢｓ応答における有意な増加は存在しなかった（ｐ＝０．８５）。（図２３および２４を参照のこと）。
【０３８２】
さらに、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９および１０１０３の両方は、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９およびＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ１０１０３で免疫したマウスにおいて、抗ＨＢｓ応答における有意な相違が存在しなかった（ｐ＝０．１３）という点で、ＨＢｓＡｇに対する抗体応答を増強することにおいて同等に強力であった。
【０３８３】
マウスＩｇＧにおいて、アイソタイプ分布は、免疫応答の性質の指標として広範に使用され、ここで、高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示す（１）。本研究において、ＣｐＧ  ＯＤＮの使用は、抗原を単独で使用した場合、または抗原をコントロールＯＤＮ２１３７と組み合わせて使用した場合と比較して、ＩｇＧ２ａ力価を有意に増強した（Ａｇ  対  ７９０９またはＡｇ  対  １０１０３についてｐ＜０．００１、そしてＡｇ＋７９０９  対  Ａｇ＋２１３７についてｐ＜０．０１、そしてＡｇ＋１０１０３  対  Ａｇ＋２１３７についてｐ＜０．０５）。しかし、ＩｇＧ２ａ応答のレベルは、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９または１０１０３のいずれかをＨＢｓＡｇと組み合わせて使用した場合には、同様であった（ｐ＞０．０５）。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９および１０１０３は両方とも、ＩｇＧ１に対する増加したレベルのＩｇＧ２ａによって測定したように、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘導するというそれらの能力において、同等に強力である。
【０３８４】
図２５に示したように、ＯＤＮ１０１０３を使用してＨＢｓＡｇで免疫した動物におけるＣＴＬ応答は、ＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９を誘導したＣＴＬ応答よりも大きいようである。
【０３８５】
結論：ヒトＰＢＭＣにおけるインビトロデータは、実施したすべてのアッセイにおいて、Ｂクラスの分子（７９０９および１０１０３）は同様に振舞うが、同一ではないことを実証する。特に重要なことは、試験したアッセイおよび相関性のいくつかについて、ＯＤＮ１０１０３が、先に同定したＯＤＮ７９０９が誘導したよりも大きい免疫刺激を誘導したという観察である。この相違は、ＣｐＧヌクレオチドが被験体における使用のために合わせられ得、そしてまた、より低いレベルのＣｐＧ  ＯＤＮが、潜在的により低い毒性事象で所望の治療的終点を達成し得ることを示唆する。
【０３８６】
（実施例３（ＯＤＮ  １０１０４））：
（インビボ効果）：
概要：
メチル化していないＣｐＧジヌクレオチドを含む合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、感染剤に対して強力な先天免疫応答を誘導し、Ｔｈ１様免疫活性化を引き起こすことが示されている。生殖器粘膜に塗布したＣｐＧ  ＯＤＮの経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）送達の、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）での膣内（ＩＶＡＧ）感染から守るかまたは膣内感染を処置する能力を試験した。
【０３８７】
材料および方法：
すべてのＯＤＮは、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供され、Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって測定された検出不可能な内毒素レベル（＜０．１ＥＵ／ｍｌ）を有した。ＯＤＮを、無菌の内毒素を含まないＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に懸濁させ、無菌状態下で保管および処理して、微生物汚染および内毒素汚染の両方を予防した。すべての希釈を、発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。
【０３８８】
ＣｐＧ  ＯＤＮおよび非ＣｐＧ  ＯＤＮを、ＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染前またはＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染後の種々の時点で、雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスの膣に塗布した。マウスを、チャレンジの後に、生殖器病理学、生存率、および生殖器ウイルス力価について毎日モニターした。
【０３８９】
結果：
ＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２チャレンジの２４時間前に生殖管においてＣｐＧ  ＯＤＮで処置した雌性マウスは、感染を生き延び、最小限の生殖器病理学を示し、そして実質的には感染後の最初の６日間にわたって膣洗浄液中にウイルスを有さなかった。重要なことには、感染前の生殖管へのＣｐＧ  ＯＤＮの経粘膜送達は、ＣｐＧ  ＯＤＮの筋内送達と比較して、局所的ＩＶＡＧチャレンジに対する優れた保護を与えた。対照的に、コントロールＯＤＮ単独で前処理したマウスは、保護されず、重篤な病理学を示し、そして膣洗浄液中に高い力価のＨＳＶ−２を有した。ＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染の直後にＣｐＧ  ＯＤＮで処理したマウスは保護され、低い膣ウイルス力価を有したが、ＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染の２４時間後および７２時間後にＣｐＧ  ＯＤＮで処理したマウスは保護されなかった（図２６および２７を参照のこと）。
【０３９０】
結論：
これらの結果は、生殖器のＨＳＶ−２チャレンジの前または直後の生殖管へのＣｐＧ  ＯＤＮの局所的経粘膜送達が、性感染ウイルスによる感染の予防に非常に有効であったことを示し、そして局所的ＣｐＧ誘導先天免疫が関与することを示唆する。
【０３９１】
（インビトロ効果）：
材料および方法：
健常なヒトのドナー由来の末梢血軟膜調製物を、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ（Ｒａｔｈｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、そしてこれらから、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に対する遠心分離によって精製した。精製したＰＢＭＣは、そのまま使用するか、または冷凍培地に懸濁させ、−７０℃で保管したかのいずれかであった。必要な場合に、これらの細胞のアリコートを解凍し、洗浄し、そして１０％（ｖ／ｖ）の熱失活ＦＣＳ、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培養培地に再懸濁した。
【０３９２】
解凍したＰＢＭＣまたはそのままのＰＢＭＣを、５×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁させ、予め何も与えていないかまたは種々の濃度のＯＤＮを与えた４８ウェルの平底プレートに加えた（１ｍｌ／ウェル）。この細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃にて培養した。培養上清を、４８時間後に収集した。すぐに使用しない場合には、必要とするまで上清を−２０℃で冷凍した。上清中のサイトカインの量を、市販の抗体（それぞれ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製またはＰＢＬ製；ＧｅｒｍａｎｙまたはＵＳＡ）を使用して改良した市販のＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０；Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）または自社のＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−α）を使用して評価した。
【０３９３】
結果：
ＢクラスのＯＤＮは、インビボならびにインビトロでのＴｈ１優勢の免疫応答をもたらす。これらは、代表的なＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）ならびにＴｈ１関連ケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０）を誘導し得ることを見出した。さらに、炎症誘発性のサイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−αの少ない分泌、ならびにネガティブな調節因子ＩＬ−１０の分泌が観察され得る。従って、本発明者らは、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−αおよび調節性サイトカインＩＬ−１０の分泌を測定した。図２８は、インビトロでのＩＦＮ−α分泌を測定するために、０．０２μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび１．０μｇ／ｍｌの１０１０４またはコントロール核酸で、３人の異なるドナーを用いて実施した実験についての結果を示す。
【０３９４】
核酸１０１０４は、０．１μｇ／ｍｌの１０１０４核酸でピーク誘導を有する用量依存性の様式で、高いレベルのＩＦＮ−αを誘導した。対照的に、コントロール核酸は、低い量のＩＦＮ−αを誘導し、これは培地単独の存在下で誘導されたＩＦＮ−αの量に匹敵した（図２８）。
【０３９５】
同様の実験を、ＩＬ−１０分泌について実施した（図４）。この場合もまた、ＩＦＮ−αについて上記で示したように、核酸１０１０４は、０．２μｇ／ｍｌの１０１０４核酸でピーク誘導を有する用量依存性の様式で、ＩＬ−１０を誘導した。コントロール核酸は、同様であるがより低い誘導プロフィールを示したが、そのピークは０．５μｇ／ｍｌコントロール核酸にシフトした。この場合、コントロールレベルは、培地レベルよりも大きかった（図２９）。
【０３９６】
（ＴＬＲ９関与）：
材料および方法：
ヒトＴＬＲ９を発現する安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、以前に記載された（Ｂａｕｅｒら；ＰＮＡＳ；２００１）。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＴＬＲ９を発現するベクターおよび６ｘＮＦκＢルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。安定なトランスフェクト体（３×１０４細胞／ウェル）を、加湿インキュベーター中で３７℃にて１６時間、ＯＤＮと共にインキュベートした。各々のデータポイントを三連で行った。細胞を溶解させ、（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｕｅｂｅｒｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＢｒｉｇｈｔｌｉｔｅキットを使用して）ルシフェラーゼ遺伝子活性についてアッセイした。刺激指数を、ＯＤＮを添加しない培地のレポーター遺伝子活性に関して算出した。
【０３９７】
結果：
最近、ＣｐＧ配列の認識のためのレセプターが同定され、そしてＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）ファミリーのメンバーであることが示された（Ｈｅｍｍｉら、２０００）。このレセプターＴＬＲ９は、最適な免疫刺激性ＣｐＧ配列を含むＯＤＮによって容易に活性化される。本発明者らは、ヒトＴＬＲ９を安定に発現する細胞株を、様々な濃度の１０１０４およびコントロールＯＤＮと共にインキュベートした（図３０）。
【０３９８】
この結果は、１０１０４ＯＤＮが、０．６２５μｇ／ｍｌで最大刺激を有する用量依存性の様式で、ＴＬＲ９を活性化したことを実証する。一方、コントロールＯＤＮは、唯一１０μｇ／ｍｌで刺激し、その上その刺激は１０１０４核酸を用いて観察された刺激よりも非常に低かった。
【０３９９】
（送達ビヒクルに無関係なＣｐＧ１０１０４効果）：
図６１Ａおよび６１Ｂは、ＨＳＶ−２での膣内チャレンジ後の、マウスの局所病理学における、ＢＥＭＡディスクを使用する局所的ＣｐＧ送達の効果、または生理食塩水中の局所的ＣｐＧ送達の効果を示す。雌性Ｃ５７／Ｂ１６マウスに、１匹のマウス当たり２ｍｇのプロゲステロンと共にＳＣを注射した（ウイルスチャレンジの４日前）。生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４（１ｍｇ、１０ｍｇまたは１００ｍｇ）または生物侵食性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粘膜付着性ディスク（ＢＥＭＡ）上に含浸させたＣｐＧ１０１０４（１ｍｇ、１０ｍｇまたは１００ｍｇ）を、ウイルスチャレンジの２４時間前に膣腔中（ＩＶＡＧ）に点滴注入した。ウイルスチャレンジのために、マウスに綿の塗布具を用いてＩＶＡＧを塗布し、仰向けにし、ハロタン麻酔を保った状態の１時間の間、１０４  ＰＦＵ  ＨＳＶ−２（株３３３）を含む１０ｍｌのＩＶＡＧ点滴注入によって感染させた。生殖器病理学を、ＨＳＶ−２チャレンジ後に毎日モニターし、スコアリングを盲目状態で実施した。病理学を５点の尺度で記録した：０、明確な感染なし；１、外部膣のわずかな赤み；２、外部膣の赤みおよび腫れ；３、外部膣および周辺組織の重篤な赤みおよび腫れ；４、生殖組織および周辺組織の重篤な赤み、腫れおよび脱毛を伴う生殖器の潰瘍化；５、周辺組織に及ぶ重篤な生殖器の潰瘍化。マウスを、段階５に達した際に屠殺した。グラフは、ＢＥＭＡディスクにおけるＣｐＧについての感染後の時間（日）に関する平均病理学値（図６１Ａ）、または生理食塩水中のＣｐＧについての感染後の時間（日）に関する平均病理学値（図６１Ｂ）を示す。
【０４００】
この結果は、生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４またはＢＥＭＡディスク上のＣｐＧ１０１０４の、マウスへのＩＶＡＧ送達が、その後のＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染に関連する膣の病理学を減少させ得ることを示す。
【０４０１】
図６２Ａおよび６２Ｂは、ＨＳＶ−２での膣内チャレンジ後のマウスの生存率における、ＢＥＭＡディスクを使用する局所的ＣｐＧ送達の効果、または生理食塩水中の局所的ＣｐＧ送達の効果を示す。マウスを、基本的に上記のように処理した。マウスを毎日モニターし、周辺組織に及ぶ重篤な生殖器の潰瘍化が認められた場合に屠殺した。グラフは、ＢＥＭＡディスクにおけるＣｐＧについての感染後の時間（日）に関する％生存率（図６２Ａ）、または生理食塩水中のＣｐＧについての感染後の時間（日）に関する％生存率（図６２Ｂ）を示す。
【０４０２】
この結果は、生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４またはＢＥＭＡディスク上のＣｐＧ１０１０４の、マウスへのＩＶＡＧ送達が、その後のＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染の後の生存率を増強し得ることを実証する。
【０４０３】
（ＣｐＧ１０１０４の非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与）：
図６３および６４は、マウスの血漿中のＩＰ−１０レベルおよびＩＦＮ−γレベルに対する、非経口的なＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００ｎｍｏｌの生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４、生理食塩水中のＣｐＧ７９０９またはレジキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）と共にＳＣを注射した。注射後の種々の時点（１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間）で、マウスから採血し、血漿を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０レベルを決定した。
【０４０４】
この結果は、ＣｐＧ１０１０４が、ＳＣ注射後に血漿中で有意な量のＩＰ−１０およびＩＦＮ−γを誘導し得、その達したレベルがＲ−８４８でのレベルよりも大きいことを示す。
【０４０５】
（ＣｐＧ１０１０４の粘膜投与）：
図６５は、マウスの血漿中のＩＰ−１０レベルに対する、膣内ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、膣腔中に点滴注入した１００ｎｍｏｌの生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４、生理食塩水中のＣｐＧ７９０９またはレジキモド（Ｒ−８４８）を与えた。注射後の種々の時点（１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間）で、マウスから採血し、血漿を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＰ−１０レベルを決定した。この結果は、ＣｐＧ１０１０４が、ＩＶＡＧ点滴注入後に血漿中で有意な量のＩＰ−１０を誘導し得ることを示す。
【０４０６】
図６９は、マウスの膣洗浄液中のＩＰ−１０レベルに対する、膣内ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、膣腔中に点滴注入した１００ｎｍｏｌの生理食塩水中のＣｐＧ１０１０４、生理食塩水中のＣｐＧ７９０９またはレジキモド（Ｒ−８４８）を与えた。注射後の種々の時点（１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間）で、マウスの膣腔を７５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。膣洗浄液中のＩＰ−１０レベルをＥＬＩＳＡによって決定した。この結果は、ＣｐＧ１０１０４が、ＩＶＡＧ点滴注入後に膣腔中でＩＰ−１０の有意な局所生成を誘導し得ることを示す。
【０４０７】
（ＣｐＧ  １０１０４の局所投与）
図６７は、ＨＳＶ−２を用いた膣内曝露後のマウスの局所病理における局所ＣｐＧ送達の効果を示す。メスＣ５７／Ｂ１６マウスに、マウス１匹あたりプロゲステロン２ｍｇのＳＣを注射した（ウイルス曝露４日前）。ウイルス曝露の２４時間前に、生理食塩水中ＣｐＧ１０１０４（１、１０または１００ｍｇ）あるいはＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（１、１０または１００ｍｇ）を、膣腔（ＩＶＡＧ）に注入した。ウイルス曝露のために、ハロタン麻酔を１時間の間維持させながら、綿塗布器を用いてマウスのＩＶＡＧを拭き、マウスを仰向けにして、そして１０４ＰＦＵ  ＨＳＶ−２（３３３株）を含む１０ｍｌを１時間にわたるＩＶＡＧ注入によりマウスに感染させた。ＨＳＶ−２曝露後、毎日生殖器病理をモニターし、スコア付けを盲目的に実施した。病理を、以下：０、感染見られず；１、外部膣の軽度の発赤；２、外部膣の発赤および腫れ；３、外部膣および周辺組織の重度の発赤および腫れ；４、生殖器および周辺組織の重度の発赤、腫れおよび脱毛を伴う生殖器潰瘍形成；５、周辺組織にまで及ぶ重度の生殖器潰瘍形成の５段階でスコア付けをした。段階５に達したとき、マウスを屠殺した。
【０４０８】
このグラフは、生理食塩中ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０４またはＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄについて、感染後時間（日）に対して平均病理スコアを示す。この結果は、マウスに対するＣｐＧ  １０１０４のＩＶＡＧ送達により、その後のＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染に付随する膣病理が減少し得ること、およびＣｐＧ  １０１０４は、Ｒ−８４８の１０倍用量よりも高い効力があり得ることを説明する。
【０４０９】
図６８は、ＨＳＶ−２の膣内曝露後のマウス生存について局所ＣｐＧ送達の効果を示す。本質的に、上記のようにマウスを処置した。マウスを毎日モニターし、周辺組織にまで及ぶ重度の生殖器潰瘍形成がみられたとき、マウスを屠殺した。グラフは、生理食塩中ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０４およびＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄについて、感染後時間（日）に対する生存％を示す。
【０４１０】
この結果は、マウスに対するＣｐＧ  １０１０４のＩＶＡＧ送達により、その後のＩＶＡＧ  ＨＳＶ−２感染後の生存を高め得ること、およびＣｐＧ  １０１０４は、Ｒ−８４８の１０倍用量よりも高い効力があり得ることを説明する。
【０４１１】
図７０Ａおよび７０Ｂは、ＨＳＶ−２の膣内曝露後のマウスの生存および局所病理について局所ＣｐＧ送達の効果を示す。本質的に、上記のようにマウスを処置した。生理食塩中または水中油クリーム中のＣｐＧ  １０１０４（１００ｍｇ）を、ウイルス感染４時間後に単回適用か、１日に一回５日間の複数回適用かのいずれかで膣腔（ＩＶＡＧ）に注入した。
ＨＳＶ−２曝露後、毎日生殖器病理をモニターし、スコア付けを盲目的に実施した。病理を、以下：０、感染見られず；１、外部膣の軽度の発赤；２、外部膣の発赤および腫れ；３、外部膣および周辺組織の重度の発赤および腫れ；４、生殖器および周辺組織の重度の発赤、腫れおよび脱毛を伴う生殖器潰瘍形成；５、周辺組織にまで及ぶ重度の生殖器潰瘍形成の５段階でスコア付けした。段階５に達したとき、マウスを屠殺した。このグラフは、生理食塩水中ＣｐＧ  １０１０４について感染後時間（日）に対する生存％（図７０Ａ）および局所病理スコア（図７０Ｂ）を示す。
【０４１２】
この結果は、生理食塩中または水中油クリーム中のＣｐＧ  １０１０４のＩＶＡＧ送達により、ＨＳＶ−２の致死量で前もって感染させたマウスの病理が減少して生存が高まり得ることを説明する。
【０４１３】
（マウスの免疫）
図７１Ａおよび図７１Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＢｓＡｇに対して体液性免疫応答を促進する場合に、ＣｐＧ  １０１０４がＣｐＧ  ７９０９と同様にすぐれていることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＨＢｓＡｇ  １ｍｇ単独か、あるいはＯＤＮ１０ｍｇおよび／またはミョウバン（２５ｍｇＡＬ３＋）と共に左前脛骨筋への筋内注射により免疫した。最初の免疫後４週間で動物をブーストした。エンドポイントＥＬＩＳＡを使用してブースト後２週間で抗体力価を決定した。図７１Ａは、ミョウバンなしで行なった実験を示し、図７１Ｂは、ミョウバンありで行なった実験を示す。
【０４１４】
図７２Ａおよび図７２Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＢｓＡｇに対してＴｈ１誘導免疫応答（ＩｇＧ１力価と比べた高ＩｇＧ２ａにより決定される）を促進する場合に、ＣｐＧ  １０１０４がＣｐＧ  ７９０９と同様にすぐれていることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＨＢｓＡｇ１ｍｇ単独か、あるいはＯＤＮ１０ｍｇおよび／またはミョウバン（２５ｍｇＡＬ３＋）と共に、左前脛骨筋へ筋内注射によって免疫した。最初の免疫後４週間に動物をブースとした。エンドポイントＥＬＩＳＡを使用してブースト後２週間で、ＩｇＧアイソタイプレベルを決定した。
【０４１５】
（実施例４（ＯＤＮ  １０１０５））
（要旨）：
この報告は、ヒト細胞を用いたインビトロデータを要約し、ヒト細胞アッセイにおいて、ＯＤＮ  １０１０５は、ＯＤＮ  ７９０９と同様かあるいはそれよりすぐれた性能を示すことを説明する。さらに、ＯＤＮ  １０１０５は、マウスのインビトロおよびインビボデータにおいて、ＯＤＮ  ７９０９と同様かあるいはそれよりすぐれた性能を示し、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０５が、生天性免疫系の活性化ならびに抗原を同時投与したマウスの体液性および細胞性のＨＢｓＡｇ特異的応答を増強するのに有用であることを、説明する。
【０４１６】
実施されたアッセイは、レセプター結合（ＴＬＲ９）、Ｂ細胞活性化（細胞表面活性化マーカーの発現およびＢ細胞増殖）およびサイトカイン分泌（ＩＬ−１０、ＩＰ−１０およびＩＦＮ−α）であった。全てのアッセイは、ＯＤＮ  １０１０５が、ＯＤＮ  ７９０９と同様か、またはＯＤＮ  ７９０９よりすぐれた特性を有することを説明した。インビトロでの研究（すなわち、Ｂ細胞増殖アッセイ、ＮＫ溶解活性、サイトカイン分泌プロフィール）を、未処理（ｎａｉｖｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞を使用して行なった。インビボでの比較研究を、これら２つのＯＤＮがＢ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗原特異的免疫応答を高める潜在性を比較することにより行なった。
【０４１７】
（材料および方法）：
ヒト研究に関して、オリゴデオキシヌクレオチド、ＴＬＲ９アッセイ、ヒト細胞精製、サイトカイン検出およびＢ細胞活性化のフローサイトメトリー分析のための培養の記載について、実施例１を参照のこと。
【０４１８】
インビトロおよびインビボ研究におけるマウスに関して、オリゴデオキシヌクレオチド、動物、脾細胞の採取および培養、Ｂ細胞増殖アッセイ、サイトカイン分泌プロフィール、ＮＫアッセイ、マウスの免疫、抗体応答の決定および統計分析の記載について、実施例１を参照のこと。
【０４１９】
（結果）：
（ＴＬＲ９結合）：  安定してヒトＴＬＲ９を発現する細胞株を、異なる濃度のＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０５ならびにコントロールＯＤＮを用いてインキュベートした（図３１）。この結果は、ＴＬＲ９を活性化させた場合に２つのＢクラスＯＤＮの間で統計学的に有意な差が無かったことを説明する。両方のＯＤＮは、同じ用量−応答曲線を示し、そして同じ濃度で最大活性化に達した。使用したコントロールＯＤＮは、最高濃度２４μｇ／ｍｌのときでさえ、ＴＬＲ９活性化を誘導しなかった。
【０４２０】
（ヒトＢ細胞）：Ｂ型ＯＤＮの１つの特徴は、きわめて有効的にＢ細胞を活性化させる能力である（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。Ｂ細胞および形質細胞様（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ）ＤＣは、現在、ＴＬＲ９を発現することが公知である唯一の免疫細胞型である（Ｋｒｕｇら、２００１；Ｂａｕｅｒら、２００１）。ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０５により誘導されたＢ細胞の直接活性を、細胞表面マーカーＣＤ８６の上方制御（図３２）およびＢ細胞の増殖（図３３）により測定した。ヒトＢ細胞のＣＤ８６発現のために、健康な血液ドナー由来のＰＢＭＣを異なるＯＤＮとともにインキュベートし、Ｂ細胞活性を、材料および方法に記載した通りに測定した。
【０４２１】
この結果は、ＯＤＮ  １０１０５ならびにＯＤＮ  ７９０９が、極めて強力なヒトＢ細胞刺激物質であることを説明する。図３２は、これらのＣｐＧ  ＯＤＮが、インビトロで濃度０．４μｇ／ｍｌのみでＢ細胞を刺激することができたことを示す。約１．６μｇ／ｍｌでプラトーに到達し、そしてＢ細胞の７０％以上が、ずっと強力さに欠けるコントロールとは対照的に、ＣＤ８６が上方制御されたことがわかった。ＯＤＮ  １０１０５は、６μｇ／ｍｌの最大試験用量でさえ、Ｂ細胞増殖を誘導することが出来たが、一方ＯＤＮ  ７９０９は、１．６〜３．０μｇ／ｍｌ用量でプラトーに達したことを除いて、Ｂ細胞増殖誘導について同様の結果が得られた（図３３）。
【０４２２】
（サイトカイン分泌）：  ＢクラスのＯＤＮは、インビボならびにインビトロでのＴｈ１優位な免疫応答を誘導する。それらは、代表的なＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−α）ならびにケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０）を誘導することが可能であると分かった。さらに、前炎症サイトカインＩＬ−６ならびにＴＮＦ−αの低分泌および負の調節因子ＩＬ−１０が、観察され得る。ＯＤＮ  １０１０５およびＯＤＮ  ７９０９の投与後に、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−α、ケモカインＩＰ−１０ならびに調節サイトカインＩＬ−１０および前炎症サイトカインＴＮＦ−αの分泌を測定した。図３４は、インビトロでのＩＦＮ−α分泌を測定するために、０．２、０．４および１．６μｇ／ｍｌで、６体の異なるドナーを用いて行なわれた実験結果を示す。
【０４２３】
両方のＣｐＧ  ＯＤＮは、０．４〜１．６μｇ／ｍｌで最大となる高レベルのＩＮＦ−αを誘導した。対照的に、コントロールＯＤＮは、５．０μｇ／ｍｌでしか発現し始めない低量のＩＮＦ−αを誘導した。ＯＤＮ  ７９０９と比較すると、ＯＤＮ  １０１０５は、１．６μｇ／ｍｌ用量および５．０μｇ／ｍｌ用量の両方で、ＩＮＦ−αよりも高いレベルを誘導した。コントロールＯＤＮと対照的に、ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０５は、図３５に示されるようにケモカインＩＰ−１０を誘導し、この場合もＯＤＮ  １０１０５は、０．４μｇ／ｍｌ用量でより高いレベルを誘導した。
【０４２４】
異なるサイトカインにおける時間に依存した効果をまた、分析した。それゆえ、異なるドナー由来のＰＢＭＣを、８時間、２４時間、３６時間および／または４８時間インキュベートして、ＩＬ−１０またはＩＦＮ−αの分泌を測定した。図３６および図３７は、２つの異なるドナーを用いて、８時間および２４時間インキュベート（図３６）または３６時間および４８時間インキュベート（図３７）した場合のＩＦＮ−αについて得られた結果を説明する。ＣｐＧ  ＯＤＮを用いてインキュベートした場合にＩＮＦ−αは、早くも８時間には最初に分泌され、２４時間で最大量に達し、この量は、２４時間と４８時間の間でこのレベルのままか、または増加さえした。ＬＰＳは、ＩＦＮ−αを全く誘導しなかった。両方のドナーについて、ＯＤＮ  １０１０５は、１．６μｇ／ｍｌ濃度にて、８時間の時点でより高レベルのＩＦＮ−αを刺激した。
【０４２５】
極めて類似した実験を、ＩＬ−１０分泌について行なった（図３８および図３９）。このサイトカインは、ＩＮＦ−αに対して類似した特徴を示したが、その最大量は、４８時間で得られた。この場合も、ＩＮＦ−αについて上記に説明したように、ＣｐＧ  ＯＤＮ  
７９０９およびＯＤＮ  １０１０５の両方は、行われた全ての他のアッセイと同様にこれらのアッセイにおいて、ほとんど同一の特性を示した。
【０４２６】
（インビトロでのマウス研究）：  図４０に示されるように、ＯＤＮ  １０１０５は、全試験濃度でＯＤＮ  ７９０９よりも高レベルのＢ細胞増殖を刺激することが可能である。図４１に示されるデータに従うと、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０５の両方は、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２，ＩＬ−６およびＴＮＦ−  分泌を刺激することが可能である。ＩＬ−１２およびＴＮＦ−  分泌について、ＯＤＮ  １０１０５は、全試験濃度で７９０９よりも多くの因子分泌を誘発する。
【０４２７】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、マウス脾細胞培養において、ＮＫ細胞の溶解活性を高めるのに本質的に同じ効力を有する（図４２）。
【０４２８】
図４３に示されるように、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９またはＯＤＮ  １０１０５のいずれかは、抗原単独の場合と比べると、ＨＢｓＡｇに対する抗体力価を有意に高めたが（ｐ＜０．０００１）、一方コントロールＯＤＮをＨＢｓＡｇと組み合わせて使用したときには、抗ＨＢｓ応答の有意な増加はなかった（ｐ＝０．８５）。
【０４２９】
図４４に示されるように、全ＩｇＧレベルの増加は、両方のＣｐＧ  ＯＤＮと類似する。マウスにおいて、ＩｇＧアイソタイプ分布は、免疫応答の性質の指標として広く使用され、ここでＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１高レベルは、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示す（ＣｏｎｓｔａｎｔおよびＢｏｔｔｏｍｌｙ、１９９７）。現在の研究において、ＣｐＧ  ＯＤＮの使用は、抗原単独が使用される場合またはコントロールＯＤＮ  ２１３７と組み合わせて使用される場合と比べると、ＩｇＧ２ａ力価を有意に高めた（Ａｇ  対  ＯＤＮ  ７９０９または１０１０５についてｐ＜０．００１およびＡｇ＋７９０９  対  Ａｇ＋２１３７についてｐ＜０．０１およびＡｇ＋１０１０５  対  Ａｇ＋２１３７についてｐ＜０．０５）。しかしながら、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９または１０１０５のいずれかをＨＢｓＡｇと組み合わせて使用する場合、ＩｇＧ２ａ応答レベルは類似した（ｐ＞０．０５）。それゆえ、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５の両方は、ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２の増加レベルにより測定されるＴｈ１に偏った免疫応答の誘導能力において、同様に強力である。
【０４３０】
（結び）：
ＯＤＮ  １０１０５は、ＯＤＮ  ７９０９と同様に、そしてある場合にはより優れて挙動することを示す、ヒト細胞を用いたインビトロデータを示す。マウス研究の結果に従うと、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５は、インビトロでの生天性免疫応答に対する効果ならびに抗原を一緒に投与した場合のインビボでの抗原特異的応答を増強する能力の両方に対して、類似した免疫増強特性を有する。
【０４３１】
（実施例５（ＯＤＮ  １０１０６））：
（ＨＣＶ研究）：
（要旨）：
この実験は、正常で健康な成人被験体および慢性的にＨＣＶに感染した成人被験体から単離されたＰＢＭＣにおいて、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０６とＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９を、その免疫活性特性について比較して行なわれた。ＯＤＮが、Ｂ細胞増殖、サイトカイン分泌（ＩＬ−１０およびＴＦＮ−α）ならびにケモカイン分泌（ＩＰ−１０）を刺激する能力を評価した。全てのアッセイから、ＯＤＮ  １０１０６が、ＯＤＮ  ７９０９とほとんど同等の特性かまたはより優れた特性を有することが示され、類似した結果が、正常で、健康な成人被験体および慢性的にＨＣＶに感染した成人被験体から単離されたＰＢＭＣを用いて観察された。
【０４３２】
（材料および方法）：
（ヒト（ＨＣＶ）研究）：
（オリゴデオキシヌクレオチド）：  ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９、１０１０６およびコントロールＯＤＮ  ４０１０を、Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐと契約して製造した。全ＯＤＮを、滅菌したエンドトキシンのないＴＥ（ｐＨ８．０）（ＯｍｎｉＰｅｒＲ；ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）に再懸濁して、微生物およびエンドトキシンの両方の混入を妨げるために無菌条件下で保存および操作した。コントロールＯＤＮ  ４０１０は、刺激性ＣｐＧモチーフを含まない。ＯＤＮの希釈を、使用直前に１０％正常ヒトＡＢ血清（Ｗｉｓｅｎｔ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｂｒｕｎｏ，ＱＣ）（熱非働化）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｌａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地中で行なった。使用されるＯＤＮ配列を、以下の表に示す。
【表Ａ】
2005532067.tif 000017
【０４３３】
表１：これらの実験において使用されるＯＤＮ配列。
【０４３４】
ＰＢＭＣ単離：  １０名の正常で健康な成人被験体および１０名のＩＦＮ−αに基づく処置による前６ヶ月過程が失敗した、ＨＣＶに慢性的に感染した成人被験体から、全血２００ｍＬを、静脈穿刺によりヘパリン添加したグリーントップバキュテイナーに集めた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、４００×ｇで３５分間、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｃｑｕｅに対する遠心分離により精製した。１０％正常ヒトＡＢ血清（熱非働化）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ完全培地中に、１０×１０６／ｍｌ濃度で細胞を再懸濁した。
【０４３５】
Ｂ細胞増殖アッセイ：ＯＤＮを、１０％正常ヒトＡＢ血清（熱不活化）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地内で、以下の濃度：２μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌならびに１２μｇ／ｍｌまで希釈した。希釈したＯＤＮ  １００μＬを、９６ウェル丸底プレートのウェルに加えた。新たに単離したＰＢＭＣを、１０％正常ヒトＡＢ血清（熱不活化）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む完全ＲＰＭＩ培地内で、１×１０６／ｍｌとなるまで再懸濁し、次いで細胞懸濁液を、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬおよび６μｇ／ｍＬの最終ＯＤＮ濃度となるように各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加えた。細胞を、５日間培養し、そして次いで３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を用いて１６時間〜１８時間、パルス（ｐｕｌｓｅ）した。インキューベーションに続いて、細胞を濾紙上に収集し、そして放射能の量を測定した。結果を、未処理の培地コントロールに対する刺激指数（ＳＩ）として報告した。
【０４３６】
サイトカインの検出：ＯＤＮを、１０％正常ヒトＡＢ血清（熱不活化）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地内で、以下の濃度：２μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌならびに１２μｇ／ｍｌまで希釈した。希釈したＯＤＮ  １００μＬを、９６ウェル平底プレートのウェルに加えた。１０×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した新たに単離したＰＢＭＣを、１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬおよび６μｇ／ｍＬの最終ＯＤＮ濃度となるように各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加えた。細胞を、５％ＣＯ２を用いて３７℃で４８時間、インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞の上澄みを、各ウェルから収集し、そしてアッセイするまで−８０℃で凍結した。
【０４３７】
上澄み中のＩＦＮαおよびＩＬ−１０およびＩＰ−１０のレベルを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから市販されるＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（カタログ番号それぞれ４１１０５，Ｄ１０００ならびにＤＩＰ１００）を製造者の指示に基づいて使用して測定した。
【０４３８】
統計分析：統計分析を、ＩｎＳｔａｔ（Ｇｒａｐｈ  ＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して実施した。群の間の統計学的な差異を、生データまたは変換したデータ（ｌｏｇ１０）に対する一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびその後のテューキー・クレーマー多重比較検定により決定した。データの変換後の場合、標準偏差の間の差異が、有意なノンパラメトリックなＡＮＯＶＡであることを示すバートレットの検定（Ｋｕｒｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）を、使用した。
【０４３９】
（結果）
Ｂ細胞の増殖：Ｂ型ＯＤＮの一つの特徴は、非常に効率的にＢ細胞を活性化するこれらの能力である（Ｋｒｉｅｇら，１９９５）。二つのＢクラスのＯＤＮ（７９０９および１０１０６）がＢ細胞の増殖を刺激する能力を、以下の図４５に示す。
【０４４０】
ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９と比較した場合、１０１０６は、Ｂ細胞の増殖を刺激するに際し、等しく効果的であった。さらに、正常で健常な被験者または慢性的にＨＣＶに感染している被験者のいずれかの群に由来するＰＢＭＣをこれらが刺激する能力において、有意な差異はなかった。
【０４４１】
サイトカイン／ケモカイン分泌：ＢクラスのＯＤＮは、インビボおよびインビトロでＴｈｌ優勢免疫反応を生じる。ＢクラスのＯＤＮは、ＩＦＮαおよびＩＦＮ−αのような代表的なＴｈｌサイトカイン、ならびにＭＣＰ−１およびＩＰ−１０のようなケモカインを誘導し得るものであるということが見出された。さらに、炎症促進性サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−αの低分泌、ならびにネガティブレギュレーターＩＬ−１０の分泌が、観察され得る。図４６、４７、および４８は、ＢクラスのＯＤＮが、ＴｈｌサイトカインＩＦＮα、ケモカインＩＰ−１０および調節サイトカインＩＬ−１０の分泌を刺激する能力を例示する。
【０４４２】
ＢクラスのＯＤＮ（７９０９および１０１０６）は、同等の濃度のＩＦＮαの分泌を誘導した。
【０４４３】
７９０９または１０１０６のいずれかのＢクラスのＯＤＮを用いたＰＢＭＣの刺激の後、同等の濃度のＩＰ−１０が、分泌された。正常で健常な被験者から単離されたＰＢＭＣまたは、慢性的にＨＣＶに感染している被験者から単離されたＰＢＭＣからのＩＰ−１０の分泌をこれらのＯＤＮが、刺激する能力に差異は見られなかった。ＩＰ−１０の最大濃度は、７９０９および１０１０６共に３μｇ／ｍｌのＯＤＮ濃度で得られた。同じ分析を、ＩＬ−１０の分泌に対して実施した（図４８）。
【０４４４】
ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０６は、両成体集団から単離されたＰＢＭＣからの同等の濃度のＩＬ−１０の分泌を引き起こし得た。両ＯＤＮについての最大のＩＬ−１０の誘導は、６μｇ／ｍｌで観察された。
【０４４５】
（結論）
（１）正常で健常な被験者および（２）ＩＦＮ−α治療に以前失敗した慢性的にＨＣＶに感染した被験者という二つの異なる成人集団から単離されたヒト末梢血単核球細胞を用いたインビトロデータは、ＢクラスのＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９および１０１０６がＢ細胞の増殖ならびに同一の集団内でＩＦＮ−α、ＩＬ−１０とＩＰ−１０の分泌を刺激することが等しく可能であることは、そしてさらにこの効果は、二つの集団に対して同一であったことを示す。
【０４４６】
（非ＨＣＶの研究）
（要約）
ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０６は、クラスＢの核酸である。これらの実験は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０６の免疫活性化の性質とＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９の免疫活性化の性質を比較する。インビトロおよびインビボの免疫学的パラメーターを、この評価のために使用した。
【０４４７】
インビトロデータは、ヒトＰＢＭＣについてのＯＤＮ  １０１０６およびＯＤＮ  ７９０９とを比較することにより得られた。実施されたアッセイは、レセプター結合（ＴＬＲ９）、Ｂ細胞の活性化（細胞表面活性化マーカーの発現およびＢ細胞の増殖）ならびにサイトカインの分泌（ＩＬ−１０、ＩＰ−１０、ＩＦＮ−αならびにＴＮＦ−α）を含んだ。全てのアッセイは、ＯＤＮ  １０１０６が、ＯＤＮ  ７９０９とほとんど同一である性質を有することを示した。
【０４４８】
インビトロの研究（つまり、Ｂ細胞増殖アッセイ、ＮＫ溶解活性、サイトカイン分泌プロフィール）をまた、未処置のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を使用することにより実施した。インビボ比較研究を、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗原特異的免疫反応を高めるこれら二つのＯＤＮの能力を調べることにより実施した。インビボ比較研究において、体液性反応（抗体）および細胞媒介性免疫応答（ＣＴＬ活性）の両者の向上について調べた。さらに、引き起こされた免疫応答の性質（つまり、Ｔｈｌ対Ｔｈ２）を、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比およびＣＴＬ応答の強度を決定することにより調べた。
【０４４９】
（材料および方法）
ヒトでの研究に関して、オリゴデオキシヌクレオチド、ＴＬＲ９アッセイ、ヒト細胞精製、サイトカイン検出、およびＢ細胞活性化のフローサイトメトリー分析のための培養の記載については、実施例１を参照する。
【０４５０】
マウスのインビトロおよびインビボでの研究に関して、オリゴデオキシヌクレオチド、動物、脾細胞の採取および培養、Ｂ細胞増殖分析、サイトカイン分泌プロフィール、ＮＫアッセイ、マウスの免疫化、抗体応答の定量、および統計学的分析の記載については、実施例１を参照する。
【０４５１】
（結果）
（ＴＬＲ９結合）
本発明者らは、ヒトＴＬＲ９を安定して発現する細胞株を、異なる濃度のＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６、ならびにコントロールＯＤＮとともにインキュベートした（図４９）。この結果は、ＴＬＲ９を活性化することに関して、２つのＢクラスＯＤＮの間に有意な差がなかったことを示す。両方のＯＤＮは、同じ用量応答曲線を示した。使用されたコントロールＯＤＮは、１２μｇ／ｍｌの最も高い濃度においてさえ、ＴＬＲ９活性を誘導しなかった。
【０４５２】
（ヒトＢ細胞の活性化）
タイプＢのＯＤＮの１つの特徴は、非常に効率よくＢ細胞を活性化するその能力である（Ｋｒｉｅｇら、１９９５）。現在のところ、Ｂ細胞およびプラズマ細胞様ＤＣのみが、ＴＬＲ９を発現することで知られる免疫細胞タイプである（Ｋｒｕｇら、２００１；Ｂａｕｅｒら、２００１）。したがって本発明者らは、ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６によって誘導されるＢ細胞の直接的な活性化を、細胞表面マーカーＣＤ８６のアップレギュレーションによって（図５０）、およびＢ細胞の増殖によって（図５１）測定した。ヒトＢ細胞上でのＣＤ８６の発現のため、健康な血液ドナーのＰＢＭＣを別々のＯＤＮとともにインキュベートし、そして材料および方法に記載されるようにＢ細胞活性化を測定した。
【０４５３】
（Ｂ細胞の増殖）
両方の結果は、１０１０６および７９０９が非常に効力のあるヒトＢ細胞の刺激因子であることを示す。図５０は、これらのＣｐＧ  ＯＤＮが、わずか０．４μｇ／ｍｌのインビトロでの濃度でＢ細胞を非常に強力に刺激し得たことを示す。プラトーには、約１．６μｇ／ｍｌで達した。同様の結果がＢ細胞増殖の誘導に関して得られ（図５１）、ここで、刺激指数は約０．８μｇ／ｍｌで最大に達した。
【０４５４】
（サイトカイン分泌）
ＢクラスＯＤＮは、インビボおよびインビトロにおけるＴｈ１優性免疫応答をもたらす。これらは、代表的なＴｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−α）、ならびにケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１およびＩＰ−１０）を誘導し得る。加えて、炎症促進性サイトカインＩＬ−６およびＴＮＦ−αの低い分泌、ならびに負の調節因子ＩＬ−１０の分泌が観察され得る。本研究者らは、したがって、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−α、ケモカインＩＰ−１０、ならびに調節因子ＩＬ−１０および炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの分泌を測定した。
【０４５５】
図５２は、インビトロでのＩＦＮ−α分泌を測定するために、０．２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌで、３つの異なるドナーを用いて実施された実験の結果を示す。両方のＣｐＧ  ＯＤＮ（７９０９および１０１０６）は、高レベルのＩＦＮ−αを誘導し、０．４μｇ／ｍｌ（７９０９）もしくは１．６μｇ／ｍｌ（１０１０６）で最大に達した。しかし、ＩＦＮ−α分泌の最大上昇は、１０１０６の刺激後では７９０９と比較して、約３倍より高く現れた。
【０４５６】
加えて、ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６は、コントロールＯＤＮと対照的に、図５３に示されるように、より大量のサイトカインＩＰ−１０を誘導した。この実験では、約０．２μｇ／ｍｌで既にプラトーに達した。
【０４５７】
非常に類似した実験を、ＩＬ−１０分泌に対して実施した（図５４）。ここでもまた、ＩＦＮ−αに関して上記で記載されたように、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６の両方は、実施した他の全てのアッセイと同様に、このアッセイにおいてほぼ同一の特性を示した。比較すると、コントロールＯＤＮは、最も高い濃度でのみＩＬ−１０分泌を誘導する。
【０４５８】
図５５に示すように、ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６の両方、ならびにコントロールＯＤＮは、ＬＰＳと比較して、全ての試験された濃度において炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αの低い分泌プロフィールを示した。ここでもまた、これら２つのＯＤＮによる刺激の後、同様の特徴を観察し得る。
【０４５９】
このデータによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６の両方は、マウス脾細胞によるサイトカイン分泌の増強に対して、実質的に同等の効力を有する（図５７）。
【０４６０】
（Ｂ細胞増殖）
データによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０６は、試験された全ての濃度において、マウスＢ細胞増殖の誘導に対して、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９よりも上でないとしても同等に効力がある（図５６）。
【０４６１】
（ＮＫアッセイ）
データによると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６の両方は、マウス脾細胞培養物におけるＮＫ細胞の溶解活性の増強に対して、実質的に同等の効力を有する（図５８）。
【０４６２】
（総ＩｇＧ応答）
本研究の結果によると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９もしくはＯＤＮ  １０１０６のいずれかの使用は、ＨＢｓＡｇに対する抗体力価を、抗原単独と比較して有意に増強したが（ｐ＜０．０００１）、他方Ａｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９もしくはＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０１０６によって免疫化された動物においては抗体力価に有意差はなかった（ｐ＝０．８６）。さらに、コントロールＯＤＮは、ＨＢｓＡｇと組み合わせて使用された場合、抗ＨＢ応答を有意には増強しなかった（ｐ＝０．８６）（図５９）。総ＩｇＧレベルの増加は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９が使用された場合には、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １０６０６が使用された場合と比較して、わずかに、しかし有意に（ｐ＝０．０４）大きい。
【０４６３】
（体液性応答の性質（ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ比））
マウスにおいて、ＩｇＧアイソタイプ分布は、免疫応答の性質の指標として広範に使用され、ここで、高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ｔｈ１に偏った免疫応答を示す（ＣｏｎｓｔａｎｔおよびＢｏｔｔｏｍｌｙ、１９９７）。本研究において、ＣｐＧ  ＯＤＮの使用は、抗原が単独で使用された場合、または抗原がコントロールＯＤＮ  ２１３７と組み合わせて使用された場合と比較して、ＩｇＧ２ａ力価を有意に増強した（Ａｇ対７９０９に関してｐ＜０．０１、Ａｇ対１０１０６に関してｐ＜０．００１、およびＡｇ＋７９０９対Ａｇ＋２１３７に関してｐ＜０．００１、およびＡｇ＋１０１０６対Ａｇ＋２１３７に関してｐ＜０．０１）。しかし、ＩｇＧ２ａ応答のレベルは、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９もしくはＯＤＮ  １０１０６のいずれかがＨＢｓＡｇと組み合わせて使用された場合、同様であった（ｐ＞０．０５）。したがって、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６の両方は、ＩｇＧ１を超えたＩｇＧ２ａの増加レベルによって測定されるように、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘導するその能力において同等の効力がある（図６０）。
【０４６４】
（結論）
ヒト末梢単核細胞を用いたインビトロデータは、Ｂクラスの２つの分子（７９０９および１０１０６）が、実施した種々のアッセイにおいて、同一でないとしても非常に類似して振舞うことを示す。いくつかのアッセイでは、ＯＤＮ  １０１０６はＯＤＮ  ７９０９よりも良好に働いた。
【０４６５】
上記マウスの研究の結果によると、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９およびＯＤＮ  １０１０６は、先天性免疫応答に対するそのインビトロでの効果、および抗原とともに投与される場合にインビボにおいて抗原特異的応答を増強するその能力の両方に関して、同様の免疫増強特性を有する。
【０４６６】
【化１】
2005532067.tif 000018
【０４６７】
（等価物）
以上に記載される明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であるとみなされる。本発明は、提供される実施例によって範囲を限定されるべきではない。なぜなら、この実施例は本発明の１つの局面の単なる説明として意図され、そして他の機能的に同等な実施形態が本発明の範囲内にあるからである。本明細書中に示されかつ記載される内容に加えて、本発明の種々の改変は、以上の記載から当業者にとって明らかになり、そして添付の特許請求の範囲内に収まる。本発明の利点および目的は、必ずしも本発明の各実施形態によって含まれない。
【図面の簡単な説明】
【０４６８】
【図１】ＯＤＮ７９０９および１０１０２によるＴＬＲ９エンゲージメント。実施例１に記載通りに、ＴＬＲ９発現培養細胞株を指示濃度のＯＤＮとインキュベートした。培地対照上の平均刺激インデックスが図示されている。ＩＬ−１を、レポーター遺伝子の陽性対照として用いた。
【図２】ＣｐＧ  ＯＤＮとのＰＢＭＣのインキュベーションで活性マーカーＣＤ８６を、Ｂ細胞が上流制御する。指示濃度で４８時間、ヒトＰＢＭＣをＯＤＮ７９０９および１０１０２とインキュベートした。３通りの異なるドナーのＣＤ８６発現ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の平均割合（フローサイトメトリーで測定）が図示されている。
【図３】ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２によって誘発されるＢ細胞の増殖。染料ＣＦＳＥとともにプレ・インキュベートされたＰＢＭＣを、指示ＯＤＮ濃度の存在下または非存在下で、５日間培養した。細胞を回収し、増殖ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するＣＦＳＥ株の減少を、３通りの異なるドナーに対するフロー・サイトメトリーで測定した（実施例１も参照）。
【図４】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２によって誘発されるＩＮＦα分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡ（実施例１参照）によって測定した。各濃度について、３通りの異なるドナーから得られたＩＮＦαの平均、最小、および最大量を図示する。
【図５】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２によって誘発されるＩＰ−１０分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＰ−１０をＥＬＩＳＡ（実施例１参照）によって測定した。各濃度について、３通りの異なるドナーから得られたＩＰ−１０の平均、最小、および最大量を図示する。
【図６】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２によって誘発されるＩＬ−１０分泌。３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ７９０７、１０１０２または対照ＯＤＮとともに、インキュベーションした。上清を回収し、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した。各濃度について、３通りの異なるドナーから得られたＩ−１０の平均、最小、および最大量を図示する。
【図７】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０２への応答におけるＴＮＦα分泌。３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ７９０７、１０１０２または対照ＯＤＮとともに、２４時間インキュベーションした。上清を回収し、ＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって測定した。各濃度について、３通りの異なるドナーからの平均、最小、および最大量を図示する。
【図８】未処理ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌまたは２．５×１０６／ｍ１）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ  １０１０２とインキュベートした。細胞を、インキュベーション９６時間後に、１６時間にわたって３Ｈチミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）によりパルスし、回収し、放射活性を測定した。各バーは、刺激インデックス（インキュベートした細胞のカウント／分（ＣＰＭ）／培地でインキュベートした細胞のＣＭＰ）を示す。
【図９】未処理ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９、１０１０２、または対照ＯＤＮ２１３７とインキュベートした。上清の回収を、６時間（ＴＮＦα、パネルＤ）、２４時間（ＩＬ−１２、パネルＢ）、または４８時間（ＩＬ−６、パネルＣ、およびＩＬ−１０、パネルＡ）で、おこなった。
【図１０】未処理ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（３０×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９、１０１０２とインキュベートした。ＮＫ活性を５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。
【図１１】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）１０１０２、７９０９、もしくは対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対する全ＩｇＧレベル（抗ＨＢｓ）について血漿をアッセイした。各バーは、群全体（ｎ＝１０）に対するＥＬＩＳＡ終点希釈力価の幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。力価は、区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度が得られる最高希釈として規定した。
【図１２】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）７９０９、１０１０２または対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（抗体ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、ＥＬＩＳＡ週末点希釈の群全体（ｎ＝１０）に対するＥＬＩＳＡ終点希釈力価の幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。力価は、区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度が得られる最高希釈として規定した。
【図１３】ＯＤＮ７９０９および１０１０３によるＴＬＲ９エンゲージメント。ＴＬＲ−９発現細胞株を、実施例２に記載したように指示濃度のＯＤＮとインキュベートした。４つの独立した実験について、培地対照上の平均刺激インデックスが図示されている。ＩＬ−１は、レポーター遺伝子の陽性対照として用いた。
【図１４】ＣｐＧ  ＯＤＮとのＰＢＭＣのインキュベーションで活性マーカーＣＤ８６を、Ｂ細胞が上流制御する。指示濃度で４８時間、ヒトＰＢＭＣをＯＤＮ７９０９および１０１０３ならびに対照ＯＤＮとインキュベートした。３通りの異なるドナーのＣＤ８６発現ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の平均割合（フローサイトメトリーで測定）が図示されている。
【図１５】ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０３によって誘発されるＢ細胞の増殖。染料ＣＦＳＥとともにプレ・インキュベートされたＰＢＭＣを、指示ＯＤＮ濃度の存在下または非存在下で、５日間培養した。細胞を回収し、増殖ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するＣＦＳＥ株の減少を、フロー・サイトメトリーで測定した（実施例２も参照）。
【図１６】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０３によって誘発されるＩＮＦ−α分泌。６通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡ（実施例２参照）によって測定した。各濃度について、６通りの異なるドナーから得られたＩＮＦαの量を図示する。
【図１７】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０３によって誘発されるＩＰ−１０分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＰ−１０をＥＬＩＳＡ（実施例２参照）によって測定した。各濃度について、３通りの異なるドナーから得られたＩＰ−１０の平均量を図示する。
【図１８】７９０９、１０１０３、および対照ＯＤＮの異なる濃度によるインキュベーションに対するＩＬ−１０分泌。４８時間にわたるインキュベーションによって得た３通りの異なるドナーからの手段を図示する。
【図１９】ＴＮＦ−α分泌：３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、４８時間にわたって、指示濃度のＯＤＮ  ７９０９、１０１０３、または対照とインキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＴＮＦ−αを測定した。３通りのドナーに対する平均値を示す。
【図２０】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌまたは２．５×１０６／ｍ１）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ  ＯＤＮ７９０９（白色のバー）、１０１０３（黒色のバー）とインキュベートした。細胞を、インキュベーションの９６時間後、１６時間にわたって３Ｈチミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）によりパルスし、回収し、放射活性を測定した。各バーは、刺激インデックス（インキュベートした細胞のカウント／分（ＣＰＭ）／培地でインキュベートした細胞のＣＭＰ）を示す。
【図２１】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９、１０１０３、または対照ＯＤＮ２１３７とインキュベートした。上清の回収を、６時間（ＴＮＦ−α、パネルＤ）、２４時間（ＩＬ−１２、パネルＢ）、または４８時間（ＩＬ−６、パネルＣ、およびＩＬ−１０、パネルＡ）で、おこなった。
【図２２】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（３０×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ  ７９０９および１０１０３とインキュベートした。ＮＫ活性を５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。
【図２３】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）１０１０３、７９０９、もしくは対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対する全ＩｇＧレベル（抗ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、群全体（ｎ＝５）に対するＥＬＩＳＡ終点希釈力価の幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。力価は、区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度を生じる最大希釈として規定された。
【図２４】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１ｍｇＨＢｓＡｇ単独と、または１０ｍｇのＣｐＧＯＤＮ７９０９、１０１０３、または対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（抗体ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、ＥＬＩＳＡ終末点希釈力価の群全体（ｎ＝５）に対する幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。力価は、区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度を生じる最大希釈として規定された。
【図２５】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）７９０９または１０１０３のいずれかと組み合わせて１ｍｇのＨＢｓＡｇで、免疫化した。免疫後４週目で、脾臓を取り、脾細胞を５１Ｃｒ放出アッセイによるＣＴＬ活性の測定に用いた。ＣＴＬ活性を、異なるエフェクター：標的比で、動物の群（ｎ＝５）に対する平均％特異的細胞溶解（±ＳＥＭ）として、示した。
【図２６】ＨＳＶ−２による抗原投与を受け、かつ核酸１０１０４を投与されたマウスでの感染後の日数の関数として、平均病理学的スコアを示すグラフである。
【図２７】ＨＳＶ−２による抗原投与を受け、かつ核酸１０１０４を投与されたマウスにおける感染後の日数の関数として、生存率を示すグラフである。
【図２８】核酸１０１０４または対照による４８時間後のヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＦＮ−α誘導を示す棒グラフである。ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡで測定し、その結果を３通りの血液ドナーからの平均値±ＳＥＭとして示す。
【図２９】核酸１０１０４または対照による４８時間後のヒトＰＢＭＣにおけるヒトＩＬ−１０誘導を示す棒グラフである。ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡで測定し、その結果を３通りの血液ドナーからの平均値±ＳＥＭとして示す。
【図３０】核酸１０１０４または対照に１６時間さらした後のヒトＴＬＲ９媒介ＮＦｋＢ刺激を示す棒グラフである。刺激は、レポーター遺伝子上流アッセイを用いて測定した。
【図３１】ＯＤＮ７９０９および１０１０５によるＴＬＲ９エンゲージメント。ＴＬＲ９発現細胞株を、実施例４に記載した指示濃度のＯＤＮとインキュベートした。４つの独立した実験について、培地対照上の平均刺激インデックスが図示されている。ＩＬ−１は、レポーター遺伝子の陽性対照として用いた。
【図３２】ＣｐＧ−ＯＤＮとのＰＢＭＣのインキュベーションの際、活性マーカーＣＤ８６を、Ｂ細胞が上流制御する。指示濃度で４８時間、対照ＯＤＮと同様に、ヒトＰＢＭＣをＯＤＮ７９０９および１０１０５とインキュベートした。図に示すものは、３通りの異なるドナーのＣＤ８６発現ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の平均割合（フローサイトメトリーで測定）が図示されている。
【図３３】ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５によって誘発されるＢ細胞の増殖。染料ＣＦＳＥとともにプレインキュベートされたＰＢＭＣを、指示ＯＤＮ濃度の存在下または非存在下で、５日間培養した。細胞を回収し、増殖ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するＣＦＳＥ株の減少を、フローサイトメトリーで測定した（実施例４もまた参照のこと）。
【図３４】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５によって誘発されるＩＦＮ−α分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡによって測定した（実施例４参照）。各濃度での３通りの異なるドナーについて、得られたＩＦＮ−αの平均量を図示する。
【図３５】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５によって誘発されるＩＰ−１０分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＰ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した（実施例４参照）。各濃度での３通りの異なるドナーについて、得られたＩＰ−１０の平均量を図示する。
【図３６】ＩＦＮ−α分泌の時間カイネティックス。２通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ７９０９、１０１０５または対照ＯＤＮとともに、８時間または２４時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−αを測定した。２通りのドナーについて、異なる時間で得た個々のＩＦＮ−α量を示す。
【図３７】ＩＦＮ−α分泌の時間カイネティックス。異なる２通りの血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ  ７９０９、１０１０５、または対照と、３６時間または４８時間にわたって、インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ−αを測定した。２つのドナーに対して、異なる時間点で得た個々のＩＦＮ−α量を示す。
【図３８】ＩＬ−１０分泌の時間カイネティックス。３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ７９０９、１０１０５または対照ＯＤＮとともに、８時間、２４時間、または４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−１０を測定した。３通りのドナーについて、異なる時間点で得た個々のＩＬ−１０量を示す。
【図３９】ＩＬ−１０分泌の時間カイネティックス。実施例８と同一の実験が示される。３通りのドナー間での各濃度および時間点でのＩＬ−１０の平均量を計算した。
【図４０】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌまたは２．５×１０６／ｍ１）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ７９０９および１０１０５とインキュベートした。細胞を、インキュベーションの９６時間後、１６時間にわたって３Ｈチミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）によりパルス化し、回収し、放射活性を測定した。各バーは、刺激インデックス（インキュベートした細胞のカウント／分（ＣＭＰ）／培地でインキュベートした細胞のＣＭＰ）を示す。
【図４１】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ  ７９０９、１０１０５、または対照ＯＤＮ２１３７とインキュベートした。上清の回収を、６時間（ＴＮＦ−α、パネルＤ）、２４時間（ＩＬ−１２、パネルＢ）、または４８時間（ＩＬ−６、パネルＣ、およびＩＬ−１０、パネルＡ）で、おこなった。
【図４２】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（３０×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）  または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ  ７９０９および１０１０５とインキュベートした。ＮＫ活性は５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。
【図４３】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）１０１０５、７９０９、もしくは対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対する全ＩｇＧレベル（抗ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、群全体（ｎ＝１０）に対するＥＬＩＳＡ終点希釈力価の幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度をもたらす最大希釈として、力価を定義した。
【図４４】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独と、または１０μｇのＣｐＧＯＤＮ７９０９、１０１０５、または対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（抗体ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、ＥＬＩＳＡ終末点希釈力価の群全体（ｎ＝１０）に対する幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度をあたえる最大希釈として、力価を定義した。
【図４５】ＣｐＧＯＤＮによって誘導されたＢ細胞の増殖。正常かつ健康的な被験体（ｎ＝１０）または０．５×１０６／ｍｌの濃度でＨＣＶ（ｎ＝１０）に慢性的に感染した被験体由来のＰＢＭＣを、培地（負の対照）または６μｇ／ｍＬで増加量のＣｐＧＯＤＮ７９０９および１０１０６または４０１０とインキュベートした。細胞をインキュベーションの５日目後に、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）で１６〜１８時間パルスし、回収し、そして放射活性を測定した。各バーは、平均刺激インデックス（ＯＤＮでインキュベートした細胞のカウント／分（ＣＰＭ）／培地でインキュベートした細胞のＣＰＭ）を示す。
【図４６】ＣｐＧＯＤＮによって誘導されたＩＦＮ−αの分泌。正常かつ健康的な被験体およびＨＣＶに慢性的に感染した被験体由来のヒトＰＢＭＣを、１〜６μｇ／ｍＬの範囲内の濃度で、対照ＯＤＮ４０１０、７９０９、または１０１０６とインキュベートした。上清を回収し、ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡによって測定した（実施例５参照）。このアッセイの検出限界は、３１．２ｐｇ／ｍＬであり、検出限界を下回るＩＦＮ−αの結果を持つ被験体は、グラフ上では表されない。直線で示した平均値は、これらの被験体について、検出可能なＩＦＮ−αによって決定された。
【図４７】ＣｐＧＯＤＮによって誘導されたＩＰ−１０分泌。１０人の正常かつ健康な被験体および１０人のＨＣＶ慢性罹患被験体に由来するヒトＰＢＭＣを、濃度範囲１〜６μｇ／ｍＬで対照ＯＤＮ４０１０、７９０９、または１０１０６でインキュベートした。上清を回収し、ＩＰ−１０をＥＬＩＳＡで測定した（検出限界１５．６ｐｇ／ｍＬ）（実施例５参照）。
【図４８】ＣｐＧＯＤＮによって誘導されるＩＬ−１０分泌。１０人の正常かつ健康な被験体および１０人のＨＣＶ慢性罹患被験体に由来するヒトＰＢＭＣを、濃度範囲１〜６μｇ／ｍＬで対照ＯＤＮ４０１０、７９０９、または１０１０６でインキュベートした。上清を回収し、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ（実施例５参照）で測定した。ＥＬＩＳＡアッセイための検出限界は、２３．４ｐｇ／ｍＬである。処置グループが検出不可能なＩＬ−１０濃度の被験体を有する場合、検出可能なＩＬ−１０を持つ被験体の数は、評価した患者の総数に占める比率として、グラフ上に示される。決定された平均値および標準偏差は、検出可能なＩＬ−１０を持つ患者のためにある。
【図４９】ＯＤＮ７９０９および１０１０６によるＴＬＲ９エンゲージメント。ＴＬＲ９発現細胞株を、実施例５に記載した指示濃度のＯＤＮとインキュベートした。培地対照上の平均刺激インデックスが図示されている。ＩＬ−１は、レポーター遺伝子の陽性対照として用いた。
【図５０】ＣｐＧ−ＯＤＮとのＰＢＭＣのインキュベーションの際に活性マーカーＣＤ８６を、Ｂ細胞が上流制御する。指示濃度で４８時間、ヒトＰＢＭＣをＯＤＮ７９０９および１０１０６とインキュベートした。３通りの異なるドナーのＣＤ８６発現ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の平均割合（フローサイトメトリーで測定）が図示されている。
【図５１】ＣｐＧ−ＯＤＮ  ７９０９および１０１０６によって誘発されるＢ細胞の増殖。染料ＣＦＳＥとともにプレインキュベートされたＰＢＭＣを、指示ＯＤＮ濃度の存在下または非存在下で、５日間培養した。細胞を回収し、増殖ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するＣＦＳＥ株の減少を、３通りの異なるドナーについてフロー・サイトメトリーで測定した（実施例５も参照）。
【図５２】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０６によって誘発されるＩＮＦ−α分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＦＮ−αをＥＬＩＳＡ（実施例５参照）によって測定した。各濃度での３通りの異なるドナーについて、得られたＩＦＮ−αの平均、最小、および最大量を図示する。
【図５３】ＯＤＮ  ７９０９および１０１０６によって誘発されるＩＰ−１０分泌。３通りの異なるドナーのヒトＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮとともに、４８時間にわたってインキュベーションした。上清を回収し、ＩＰ−１０をＥＬＩＳＡ（材料と方法参照）によって測定した。各濃度での３通りの異なるドナーについて、得られたＩＰ−１０の平均、最小、および最大量を図示する。
【図５４】ＩＬ−１０分泌。３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを、指示濃度のＯＤＮ７９０９、１０１０６または対照とともにインキュベーションした。上清を回収し、ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した。３人のドナーから得たＩＬ−１０の平均、最小、および最大量を図示する。
【図５５】ＴＮＦ−α分泌：３通りの異なる血液ドナーのＰＢＭＣを指示濃度のＯＤＮ７９０９、１０１０６または対照と１６時間インキュベートした。上清を回収し、ＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡによって測定した。３通りのドナーの平均、最小、および最大量を図示する。
【図５６】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌまたは２．５×１０６／ｍ１）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ７９０９および１０１０６とインキュベートした。細胞を、インキュベーションの９６時間後、１６時間にわたって３Ｈチミジン（２０μＣｉ／ｍｌ）によりパルス化し、回収し、放射活性を測定した。各バーは、刺激インデックス（インキュベートした細胞のカウント／分（ＣＰＭ）／培地でインキュベートした細胞のＣＰＭ）を示す。
【図５７】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（５×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ−ＯＤＮ  ７９０９、１０１０６、または対照ＯＤＮ２１３７とインキュベートした。上清の回収を、６時間（ＴＮＦ−α、パネルＤ）、２４時間（ＩＬ−１２、パネルＢ）、または４８時間（ＩＬ−６、パネルＣ、およびＩＬ−１０、パネルＡ）で、おこなった。
【図５８】ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞（３０×１０６／ｍｌ）を培地（負の対照）または異なる量のＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９および１０１０６とインキュベートした。ＮＫ活性を５１Ｃｒ放出アッセイを用いて測定した。
【図５９】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独、またはＣｐＧ−ＯＤＮ（１０μｇ）１０１０６、７９０９、もしくは対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対する全ＩｇＧレベル（抗ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、群全体（ｎ＝１０）に対するＥＬＩＳＡ終点希釈力価の幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度をもたらす最大希釈として、力価を定義した。
【図６０】成体（６〜８週）ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１μｇＨＢｓＡｇ単独と、または  １０μｇのＣｐＧＯＤＮ７９０９、１０１０６、または対照ＯＤＮ（１０μｇ）２１３７と組み合わせて免疫化した。動物を免疫後４週目で採血し、ＨＢｓＡｇに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベル（抗体ＨＢｓ）ついて血漿をアッセイした。各バーは、ＥＬＩＳＡ終点希釈力価の群全体（ｎ＝１０）に対する幾何学的平均値（±ＳＥＭ）を示す。区分値０．０５で非免疫血漿の吸光度の２倍の吸光度をあたえる最大希釈として、力価を定義した。
【図６１】図６１Ａは、ＨＳＶ−２による膣内抗原投与（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後にマウスの局所病理学上に対するＢＥＭＡディスクを用いた局所ＣｐＧ送達の効果を示す。図６１Ｂは、ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウスの局所病理学上に対する生理食塩液での局所ＣｐＧ送達の効果を示す。
【図６２】図６２Ａは、ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウスの生存に対するＢＥＭＡディスクを用いた局所ＣｐＧ送達の効果を示す。図６２Ｂは、ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウスの生存に対する生理食塩液での局所ＣｐＧ送達の効果を示す。
【図６３】マウス血漿中ＩＰ−１０レベルに対する非経口ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。
【図６４】マウス血漿中ＩＦＮ−ｇレベルに対する非経口ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。
【図６５】マウス血漿中ＩＰ−１０レベルに対する膣内ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。
【図６６】ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウス局所病理学に対する局所ＣｐＧ送達の効果を示す。
【図６７】ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウスの生存に対する局所ＣｐＧ送達の効果を示す。
【図６８】マウス膣洗浄のＩＰ−１０レベルに対する膣内ＣｐＧ１０１０４送達の効果を示す。
【図６９】図６９Ａ：ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウス局所病理学に対する局所ＣｐＧ送達の効果を示す。図６９Ｂ：ＨＳＶ−２による膣内抗原投与後にマウスの生存に対する局所ＣｐＧ送達の効果を示す。
【図７０】図７０Ａは、ミョウバン非存在下でのＢＡＬＢ／ＣマウスのＨＢｓＡｇに対する液性応答の増大にとってＣｐＧ７９０９と同様にＣｐＧ１０１０４が良好であることを示す。図７０Ｂは、ミョウバン存在下でのＢＡＬＢ／ＣマウスのＨＢｓＡｇに対する液性応答の増大にとってＣｐＧ７９０９と同様にＣｐＧ１０１０４が良好であることを示す。
【図７１】図７１Ａは、ミョウバンの非存在下で、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＨＢｓＡｇに対するＴｈ１介在免疫応答の促進（ＩｇＧ１力価と比較した高ＩｇＧ２ａによる測定）でＣｐＧ７９０９と同様にＣｐＧ１０１０４が良好であることを示す。図７１Ｂは、ミョウバンの存在下で、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＨＢｓＡｇに対するＴｈ１介在免疫応答の促進（ＩｇＧ１力価と比較した高ＩｇＧ２ａによる測定）でＣｐＧ７９０９と同様にＣｐＧ１０１０４が良好であることを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月27日(2005.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005532067000001.app
【国際調査報告】
2005532067.tif 000130
2005532067.tif 000131
2005532067.tif 000132