(57)【要約】本発明は、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法に関する。眼障害の治療または予防に使用する方法および物質、眼障害の診断方法および関連キット、ならびに本方法で使用する物質のスクリーニング方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合組織増殖因子（CTGF）またはその断片の発現または活性を低下させる物質を投与することを含んでなる、被験体におけるCTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法。
【請求項２】
前記投与がin vivoにおけるものである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記投与がin vitroにおけるものである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
被験体が細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験体が動物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記物質が、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および小分子よりなる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記物質が眼に送達される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記物質が眼表面に送達される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記物質が点眼剤として送達される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
眼プロセスが更に眼細胞に関連している、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
眼細胞が、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
眼プロセスが更に眼構造体に関連している、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
眼構造体が、網膜、網膜色素上皮層、脈絡膜、黄斑、角膜、水晶体、虹彩、強膜、線維柱帯網、眼房水、眼房、硝子体、毛様体、視神経乳頭、乳頭および中心窩よりなる群から選ばれる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
眼プロセスが更に眼障害に関連している、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
眼障害が、緑内障、白内障、脈絡膜血管新生、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、黄斑変性、糖尿病網膜症、角膜瘢痕および角膜混濁よりなる群から選ばれる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
眼プロセスが更に眼線維形成に関連している、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼の細胞外マトリックスの産生または沈着の抑制または予防方法。
【請求項１９】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼の血管新生の抑制または予防方法。
【請求項２０】
血管新生が網膜血管新生、脈絡膜血管新生、虹彩の血管新生、または線維柱帯血管新生である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼の炎症の抑制または予防方法。
【請求項２２】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞増殖の抑制または予防方法。
【請求項２３】
眼細胞増殖が、上皮細胞増殖、内皮細胞増殖、網膜色素上皮細胞増殖および脈絡膜内皮細胞増殖よりなる群から選ばれる、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞遊走の抑制または予防方法。
【請求項２５】
眼細胞遊走が、上皮細胞遊走、網膜色素上皮細胞遊走、内皮細胞遊走および脈絡膜内皮細胞遊走よりなる群から選ばれる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼瘢痕形成の抑制または予防方法。
【請求項２７】
眼プロセスが更に手術に関連している、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
前記手術が、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、LASIK、網膜剥離手術、角膜移植、緑内障濾過手術、白内障摘出術、水晶体交換手術、硝子体切除術、網膜下手術および網膜交換手術よりなる群から選ばれる、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼障害の治療または予防方法。
【請求項３０】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼線維症の治療または予防方法。
【請求項３１】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、血管新生を伴う眼障害の治療または予防方法。
【請求項３２】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞外マトリックスの産生または沈着を伴う眼障害の治療または予防方法。
【請求項３３】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、炎症を伴う眼障害の治療または予防方法。
【請求項３４】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞増殖を伴う眼障害の治療または予防方法。
【請求項３５】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞遊走を伴う眼障害の治療または予防方法。
【請求項３６】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼膜の形成または変化を伴う障害の治療または予防方法。
【請求項３７】
眼膜が、網膜前膜、網膜下膜、硝子体膜、細胞性膜、脈絡膜新生血管膜および線維性膜よりなる群から選ばれる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質の有効量を被験体に投与することを含んでなる、被験体における視力の維持または改善方法。
【請求項３９】
（a）被験体からサンプルを取得し、
（b）該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを定量し、
（c）該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを標準レベルと比較する、
ことを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の量の増加が眼障害の存在または眼障害を発生する素因を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害を診断するための又は眼障害を発生する素因を同定するための方法。
【請求項４０】
（a）サンプル中のCTGFのレベルを検出するための手段、および
（b）該サンプル中のCTGFのレベルを測定するための手段、
を含んでなる、CTGFに関連した眼障害の診断に使用するための又はCTGFに関連した眼障害を発生する素因の同定に使用するための診断キット。
【請求項４１】
（a）サンプル中のCTGFのレベルを検出するための手段、および
（b）該サンプル中のCTGFのレベルを測定するための手段、
を含んでなる、眼線維症の診断に使用するための又は眼線維症を発生する素因の同定に使用するための診断キット。
【請求項４２】
（a）候補物質をCTGFまたはその断片と接触させ、
（b）サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現または活性のレベルを検出し、
（c）該サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現または活性のレベルを、CTGFまたはCTGF断片の発現または活性の標準レベルと比較する、
ことを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現および活性の低下が、CTGFに関連した眼プロセスを抑制または予防する物質を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防に使用するための物質の同定方法。
【請求項４３】
（a）候補物質をCTGFまたはCTGF断片と接触させ、
（b）サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現または活性のレベルを検出し、
（c）該サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現または活性のレベルを、CTGFまたはCTGF断片の発現または活性の標準レベルと比較する、
ことを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の発現および活性の低下が、CTGFに関連した眼障害を治療または予防する物質を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害の治療または予防に使用するための物質の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年12月11日付け出願の米国仮特許出願第60/339,547号の恩恵を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０００２】
本発明は、全般的には、眼における細胞外マトリックスの産生および／または沈着、血管新生、炎症、細胞増殖、細胞遊走などを含む眼プロセスの抑制または予防方法、ならびに眼障害の予防および治療に使用する方法および物質に関する。
【背景技術】
【０００３】
眼は複雑な器官であり、高度に専門化された細胞型を含む種々のタイプの構造体を含有する多数の機能層を有する。網膜は、眼の後背部を裏打ちする光感受性層である。黄斑は、眼の光軸上に位置する網膜部分である。黄斑は細部にわたる視覚を与え、中心視野における微妙な細部を見分ける。健康な眼では、外網膜は、網膜下方に位置する網膜色素上皮（RPE）細胞の単層である網膜色素上皮と称される隣接層により栄養供給され維持される。網膜色素上皮の背後には脈絡膜があり、これは、栄養を網膜に輸送し老廃物を網膜から排出する血管を含有する高血管性領域である。眼の他の重要な構造体には、水晶体、虹彩、角膜、線維柱帯網および硝子体が含まれる。
【０００４】
眼障害は、眼の正常な生理学および機能のなんらかの変化である。眼障害は、損傷、発作または外傷；疾患；手術などを含む広範な急性または慢性の状態および事象から生じうる。眼障害は眼明瞭度の低下、失明および盲を招くことがあり、生活の質を著しく低下させうる。
【０００５】
眼障害の大多数は或る生理的プロセスに関連している。細胞増殖、細胞遊走、炎症、血管新生および線維形成（細胞外マトリックス成分の過剰産生および沈着）は、眼の形態学および機能の変化ならびに多数の眼の疾患および症状に応答または付随して生じたり、眼の形態学および機能の変化ならびに多数の眼の疾患および状態を招く。眼におけるいずれの創傷治癒応答も、これらのプロセスの1以上を含むことが多い。
【０００６】
眼障害、およびそれらに共通した眼プロセスの具体例には以下のものが含まれる。
【０００７】
増殖性硝子体網膜症
増殖性硝子体網膜症（PVR）は、例えば穿孔性外傷、裂孔原性網膜剥離、貫通性外傷、眼内異物、挫傷などを含むいずれかの眼損傷または外傷から生じる眼障害である（Cardilloら (1997) Ophthalmology 104:1166-1173）。PVRは、網膜歪曲、網膜裂孔および再発性剥離に関連した、裂孔原性網膜剥離の治療不良の最も一般的な原因である（Girardら (1994) Retina 14:417-424）。PVRは、硝子体腔内（硝子体膜）および網膜の内外両表面上（網膜前膜）の細胞性および線維性膜の形成、成長および収縮、および細胞増殖に関連している。RPE細胞の増殖および遊走がこの障害の主な特徴である。
【０００８】
網膜前膜および硝子体膜は主としてRPE細胞を含有するが、線維芽細胞、グリア細胞（ミュラー細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリアなど）および炎症細胞（マクロファージ、リンパ球など）をも含有しうる。細胞成分に加えて、網膜前膜および硝子体膜、例えば、PVRに関連した膜は、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン（コラーゲンI、IIおよびIV型など）およびフィブロネクチンを含有し、ヘパラン硫酸、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジンなどをも含有しうる。PVRに関連した網膜前膜および硝子体膜は、時間経過と共に次第に少数細胞性（paucicellular）および線維性となる（Hiscottら (1985) Br J Ophthalmol 11:810-823）。PVR、および眼膜の発生または変化に関連した他の状態は、眼を冒す多数の疾患（例えば、糖尿病）の合併症として生じうる。
【０００９】
黄斑変性
加齢性黄斑変性を含む黄斑変性は、視力低下ならびに読取り及び微細拡大視（fine close-up vision）の異常の主原因である。一般に、黄斑変性は、黄斑として公知の網膜の中心部分の変性により特徴づけられ、罹患眼の中心視の喪失を引き起こす。黄斑変性は、少なくとも部分的には網膜色素上皮から生じる。黄斑変性は、網膜色素上皮と血管性脈絡膜との間に見出される基底膜（ブルッフ膜）における細胞外マトリックスの異常沈着を伴う。黄斑変性における細胞外マトリックスの沈着はドルーゼンと称される。黄斑変性の２つの主要形態（すなわち、非滲出型退縮性萎縮性黄斑変性または地図状萎縮としても公知の萎縮型の黄斑変性、および滲出型血管新生性または円板状黄斑変性としても公知の滲出型の黄斑変性）が特徴づけられている。
【００１０】
脈絡膜血管新生
脈絡膜血管新生（CNV）は、増強（亢進）した脈絡膜内皮細胞（CEC）の接着、遊走および増殖；細胞外マトリックスの過剰産生；ならびに線維血管性網膜下膜の発生を伴う、しばしば黄斑変性に付随する重篤な状態である（D'Amore (1994) IOVS 35:3974-3979; Hintonら (1998) Arch Ophthalmol 116:203-209）。網膜色素上皮がCNVの発生において中心的役割を果たしていること、ならびにRPE細胞の脱分化、増殖、遊走および血管新生因子の産生がCNVの発生をモジュレーションすることが、証拠から示唆されている（Grossniklausら (1992) Am J Ophthamol 114:464-472; Dasら (1992) Ophthamology 99:1368-1376）。CNVは黄斑変性において最も多く見られるが、それは、40種を超える他の眼障害の合併症として確認されている。
【００１１】
創傷治癒
急性または慢性の損傷、外傷、疾患などに応答した創傷治癒は長期化したり無調節になることがあり、それにより、より重篤な眼組織の損傷および失明を招きうる。創傷治癒カスケードは、例えば、炎症反応の開始、炎症細胞の動員および活性化、増殖因子およびサイトカインの放出、種々の眼細胞の活性化、増殖、遊走および分化、毛細血管透過性の上昇、基底膜マトリックス組成の変化、ならびに種々の眼細胞による細胞外マトリックスの分泌および沈着の増強、線維形成、血管新生、組織リモデリングおよび組織修復を含みうる（Cordeiroら (1999) Br J Ophthalmol 83:1219-1224）。
【００１２】
前記の説明により例示されるとおり、広範囲の眼障害が相互に関連しており、それらは共通のプロセスを含んでいる。例えば糖尿病網膜症および緑内障を含む前記の及び他の症状は、これらの共通の眼プロセス、例えば眼血管新生および眼瘢痕形成（すなわち、眼線維形成）と、重篤な眼の症状との関連性を示している。
【００１３】
前記のような共通の生理的プロセスが大多数の眼障害に関与しているにもかかわらず、現在の療法は眼疾患のこれらの普遍的メカニズムに焦点をあてたものではないため、応用面で限定されうる。特に、現在の療法は、多数の眼障害に共通したプロセス、例えば眼線維形成、瘢痕形成および眼膜形成、例えば網膜前膜形成の治療に向けられたものではない。
【００１４】
例えば糖尿病網膜症に利用可能な治療方法は、新たな血管形成の退縮ならびに硝子体出血および牽引性網膜剥離の予防に向けられている点で幾分かは効果的である。しかし、この治療法は、抑制されなければ様々な重症度の視力低下、さらには失明をも招きうる種々のプロセス（例えば、細胞増殖、細胞遊走、眼線維形成など）の発生および進行に対処したものではなく、そのようなプロセスの発生および進行を予防したり、可能な限り抑制するものではない。PVRの現在の治療方法には、網膜表面からの硝子体および膜の除去を伴う硝子体切除術が含まれるが、そのような治療の結果として眼の炎症が誘発され、PVRに関連した病的プロセスの再活性化が生じる。CNVに関連した黄斑変性の治療においては、活性化脈絡膜血管の閉塞に対する光線力学／レーザー凝固療法は付随的な眼線維形成に対処したものではなく、実際には、さらなる合併症を招きうる創傷治癒応答を誘発しさえしうる。眼障害に対する他の多数の現在の治療方法は、膜または異常な眼組織を除去または切除するレーザー手術を含む手術のような機械的手段を用いることが多く、これらは、増殖因子、および眼プロセスを媒介する他の病理学的分子に向けられたものではない。
【００１５】
要するに、現在の治療方法は、例えば血管新生、線維形成、細胞増殖、細胞遊走、炎症などを含むプロセスを伴う眼疾患の更なる発生および進行の予防または抑制に成功裏に対処したものではない。したがって、起源または発生には無関係に多数の眼障害に広く適用しうる治療法が必要とされている。さらに、眼疾患の発生および進行に普遍的な眼プロセスに向けられた治療法が必要とされている。特に、黄斑変性、糖尿病網膜症、白内障および角膜線維症（角膜瘢痕形成または混濁を含む）、および緑内障において非常によく見られる線維形成プロセスおよび眼瘢痕形成を標的とした療法が必要とされている。
【００１６】
本発明以前においては、種々の眼プロセスおよび関連障害における結合組織増殖因子（connective tissue growth factor：CTGF）の役割は不明のままであった。培養血管性網膜内皮細胞、水晶体上皮細胞およびウサギ角膜線維芽細胞におけるCTGFの発現が報告されている（例えば、Suzumaら (2000) J Biol Chem 275:40725-40731; LeeおよびJoo (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci 40:2025-2032; Parkら (2001) Biochem Biophys Res Commun 284:966-971; Folgerら (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 42:2534-2541）。角膜瘢痕組織および角膜後膜において、ならびにヒト前嚢下白内障および後発白内障の膜において、ならびに網膜前および網膜下線維血管性膜において、CTGF mRNAの発現が観察された（Wunderlichら (2000) Ophthalmologica 214:341-346; Wunderlichら (2000) Curr Eye Res 21:627-636; Meyerら (2002) Ophthalmologica 216:284-291）。これらの予備的観察は、眼障害におけるCTGFの役割の、より完全な理解および特徴づけが当技術分野において必要とされていることを示唆している。
【００１７】
要約すると、これらの症状に応答または関連して発生しうる眼障害および種々の生理的プロセスの予防または治療に適用可能な治療法が必要とされている。さらに、眼障害全般における及びこれらの障害の多くに共通の生理的経路におけるCTGFの役割を理解することが必要とされている。本発明は、眼疾患の発生および進行に関連した種々のプロセスにおけるCTGFの役割を同定することにより、ならびにこれらのプロセスの抑制および予防方法を提供することにより、これらの要求を満足させるものである。本発明は更に、眼疾患および関連状態の治療、前治療および予防に適用可能な方法および物質を提供することにより、存在する要求に対処するものである。
【発明の開示】
【００１８】
本発明は、眼プロセスの抑制または予防方法に関する。眼障害の治療または予防に使用する方法および物質、眼障害の診断方法および関連キット、ならびに本方法で使用する物質のスクリーニング方法も提供する。
【００１９】
1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を投与することを含んでなる、被験体におけるCTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法を提供する。これらの方法はin vivoまたはin vitroで適用することができる。種々の実施形態においては、被験体は細胞または動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００２０】
1つの態様においては、該物質は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび小分子よりなる群から選ばれる。もう1つの態様においては、該物質は眼に送達送達される。該物質が眼表面に送達送達される方法が特に意図される。好ましい態様においては、該物質は点眼剤として送達送達される。
【００２１】
好ましい実施形態においては、眼プロセスは更に、眼細胞に関連している。ある実施形態においては、眼細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。
【００２２】
もう1つの実施形態においては、眼プロセスは更に、眼構造体に関連している。本発明が提供する種々の実施形態において、眼構造体は、網膜、網膜色素上皮層、脈絡膜、黄斑、角膜、水晶体、虹彩、強膜、線維柱帯網、眼房水、眼房、硝子体、毛様体、視神経乳頭、乳頭および中心窩よりなる群から選ばれる。
【００２３】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法であって、眼プロセスが更に眼障害に関連していることを特徴とする方法が、特に意図される。任意のCTGF関連眼障害への本方法の適用が特に意図される。特定の実施形態においては、眼障害は、緑内障、白内障、脈絡膜血管新生、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、黄斑変性、糖尿病網膜症、角膜瘢痕形成および角膜混濁よりなる群から選ばれる。好ましい実施形態においては、眼プロセスは更に、眼線維形成に関連している。
【００２４】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞外マトリックスの産生または沈着の抑制または予防方法が、本発明において特に提供される。CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼瘢痕形成の抑制または予防方法が、特に提供される。1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼血管新生の抑制または予防方法を提供する。さらなる実施形態においては、血管新生は網膜血管新生、脈絡膜血管新生、虹彩の血管新生、または線維柱帯血管新生である。CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼炎症の抑制または予防方法も提供する。
【００２５】
本発明は更に、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞増殖の抑制または予防方法を含む。種々の実施形態においては、眼細胞増殖は、上皮細胞増殖、内皮細胞増殖、網膜色素上皮細胞増殖および脈絡膜内皮細胞増殖よりなる群から選ばれる。
【００２６】
1つの態様においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞遊走の抑制または予防方法を提供する。特定の態様においては、眼細胞遊走は、上皮細胞遊走、網膜色素上皮細胞遊走、内皮細胞遊走および脈絡膜内皮細胞遊走よりなる群から選ばれる。
【００２７】
本発明は更に、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を投与することを含んでなる、被験体におけるCTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法であって、眼プロセスが更に手術に関連していることを特徴とする方法を提供する。種々の態様において、該手術は、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、LASIK、網膜剥離手術、角膜移植、緑内障濾過手術、白内障摘出術、水晶体交換手術、硝子体切除術、網膜下手術および網膜交換手術よりなる群から選ばれる。
【００２８】
眼障害の治療または予防方法が、本発明により特に提供される。1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼障害の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼線維症（眼線維形成）の治療または予防方法が特に意図される。
【００２９】
1つの態様においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、血管新生に関連した眼障害の治療または予防方法を提供する。種々の態様において、血管新生は網膜血管新生、脈絡膜血管新生、虹彩の血管新生、または線維柱帯血管新生である。特定の態様においては、黄斑変性に関連した脈絡膜血管新生の治療または予防方法が特に意図される。
【００３０】
さらに、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞外マトリックスの産生または沈着に関連した眼障害の治療または予防方法が提供され、また、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、炎症に関連した眼障害の治療または予防方法も提供される。
【００３１】
1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞増殖に関連した眼障害の治療または予防方法を含む。種々の実施形態においては、該細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。
【００３２】
もう1つの実施形態においては、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞遊走に関連した眼障害の治療または予防方法が提供される。ある実施形態においては、該細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。ある態様においては、本発明は、変化した眼細胞遊走、走化性、増殖または付着に関連した眼障害の治療または予防方法を提供する。
【００３３】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼膜の形成または変化に関連した障害の治療または予防方法が特に意図される。種々の態様においては、眼膜は、網膜前膜、網膜下膜、硝子体膜、細胞性（cellular）膜、脈絡膜新生血管膜および線維性（fibrotic）膜よりなる群から選ばれる。
【００３４】
ある実施形態においては、手術イベントに関連して発生しうる眼障害の発生を治療または予防するために、眼障害の治療または予防方法における投与を、手術の前または手術時または手術と密接に関連づけて行う。種々の態様においては、該手術は、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、LASIK、網膜剥離手術、角膜移植、緑内障濾過手術、白内障摘出術、水晶体交換手術、硝子体切除術、網膜下手術および網膜交換手術よりなる群から選ばれる。
【００３５】
本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質の有効量を被験体に投与することを含んでなる、被験体における視力の維持または改善方法を提供する。
【００３６】
眼障害の診断方法が特に意図される。1つの実施形態においては、本発明は、被験体からサンプルを取得し、該サンプル中のCTGFまたはCTGFの断片のレベルを測定し、該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の量の増加が眼障害の存在を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害の診断方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は、被験体からサンプルを取得し、該サンプル中のCTGFまたはCTGFの断片のレベルを測定し、該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の量の増加が、眼障害を発生する素因を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害を発生する素因の同定方法を提供する。
【００３７】
本発明はまた、CTGFに関連した眼障害の診断に使用する診断キットを提供する。本発明の診断キットは、サンプル中のCTGFのレベルを検出するための手段と、サンプル中のCTGFのレベルを測定するための手段とを含む。1つの態様においては、診断キットは、CTGFに関連した眼障害の診断に有用である。もう1つの態様においては、該診断キットは、CTGFに関連した眼障害を発生する素因の同定に有用である。好ましい実施形態においては、本発明の診断キットは眼線維症（眼線維形成）の診断に有用である。もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の診断キットは、眼線維症（眼線維形成）を発生する素因の同定に有用である。
【００３８】
本発明は、眼プロセスの抑制または予防に有用な物質の同定方法も提供する。
【００３９】
1つの実施形態においては、本発明は、候補物質をCTGFまたはその断片と接触させ、サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルを検出し、該サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルをCTGFの発現または活性の標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の発現および活性の低下が、CTGFに関連した眼プロセスを抑制または予防する物質を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防に使用する物質の同定方法を提供する。
【００４０】
もう1つの実施形態においては、本発明は、候補物質をCTGFまたはその断片と接触させ、サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルを検出し、該サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルをCTGFの発現または活性の標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の発現および活性の低下が、CTGFに関連した眼障害を治療または予防する物質を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害の治療または予防に使用する物質の同定方法を提供する。
【００４１】
本発明は、黄斑変性の治療または予防方法を提供する。本発明において記載する方法はいずれも、あらゆる形態の黄斑変性［加齢性黄斑変性、萎縮型の黄斑変性（非滲出型退縮性萎縮性黄斑変性、そして重度の場合には地図状萎縮としても公知である）、および滲出型の黄斑変性（滲出型血管新生性または円板状黄斑変性としても公知である）を含む］の治療または予防に適用することができる。好ましい実施形態においては、本発明は、黄斑変性に関連した脈絡膜血管新生の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は糖尿病網膜症（増殖糖尿病網膜症および非増殖糖尿病網膜症を含む）の治療または予防方法を提供する。好ましい実施形態においては、本発明は増殖性硝子体網膜症の治療または予防方法を提供する。もう1つの態様においては、本発明は網膜剥離の治療または予防方法を提供する。さらにもう1つの態様においては、本発明は緑内障の治療または予防方法を提供する。さらにもう1つの態様においては、本発明は白内障の治療または予防方法を提供する。1つの実施形態においては、本発明は角膜瘢痕形成の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は角膜混濁の治療または予防方法を提供する。
【００４２】
本発明のこれらの及び他の実施形態は、本明細書の開示を考慮すれば当業者に容易に見出され、すべてのそのような実施形態が特に意図される。
【００４３】
図面の説明
図1Aおよび1Bは、それぞれ網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞における結合組織増殖因子mRNAの発現を示す。
【００４４】
図2Aおよび2Bは、トランスフォーミング増殖因子βまたは血管内皮細胞増殖因子での処理の後の網膜色素上皮細胞における結合組織増殖因子の発現を示す。
【００４５】
図3Aおよび3Bは、血管内皮細胞増殖因子またはトランスフォーミング増殖因子βでの処理の後の脈絡膜内皮細胞における結合組織増殖因子の発現を示す。
【００４６】
図4Aおよび4Bは、フィブロネクチンへの網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞の付着に対する結合組織増殖因子の効果を示す。
【００４７】
図5Aおよび5Bは、網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞の走化性遊走に対する結合組織増殖因子の効果を示す。
【００４８】
図6Aおよび6Bは、結合組織増殖因子と結合組織増殖因子のN末端断片とによる網膜色素上皮細胞の遊走の用量依存的刺激を示す。
【００４９】
図7は、網膜色素上皮細胞の増殖の、結合組織増殖因子による刺激を示す。
【００５０】
図8Aおよび8Bは、脈絡膜内皮細胞の管形成の、結合組織増殖因子による刺激を示す。
【００５１】
図9は、トランスフォーミング増殖因子βで処理された網膜色素上皮細胞における、結合組織増殖因子による、エクストラ（extra）ドメインAを含有するフィブロネクチンの発現の刺激を示す。
【００５２】
図10は、網膜色素上皮細胞における結合組織増殖因子の発現をフィブロネクチンが刺激することを示す。
【００５３】
図11は、網膜色素上皮細胞において、フィブロネクチンにより誘導された結合組織増殖因子の発現が抗α5β1インテグリン抗体により抑制されることを示す。
【００５４】
図12は、ヒト増殖性硝子体網膜症膜における結合組織増殖因子の発現を示す。
【００５５】
図13A、13B、13Cおよび13Dは、加齢性黄斑変性の患者からのヒト脈絡膜新生血管膜における結合組織増殖因子の発現を示す。
【００５６】
図14は、増殖性硝子体網膜症の個体から切り出された硝子体液中の結合組織増殖因子および結合組織増殖因子の断片を示す。
【００５７】
図15は、脈絡膜血管新生および網膜血管新生を有する個体から外科的に切り出された硝子体液中の結合組織増殖因子および結合組織増殖因子の断片を示す。
【００５８】
図16Aおよび16Bは、増殖性硝子体網膜症の実験モデルにおける線維形成の、結合組織増殖因子による誘導を示す。
【００５９】
図17は、種々の実験的増殖性硝子体網膜症モデルを有するウサギの硝子体液中の結合組織増殖因子の発現を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法を説明する前提として、本発明は、説明されている様々に変更可能な特定の方法論、プロトコール、細胞系、ベクターおよび試薬に限定されるものではないと理解される。また、本明細書中で用いる用語は、特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、添付の特許請求の範囲のみにより限定される本発明の範囲を限定するものではないと理解される。
【００６１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数表現は、文脈と明らかに矛盾しない限り、複数物に対する言及をも含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「宿主細胞」に対する言及は、複数のそのような宿主細胞を含み、「抗体」に対する言及は、1以上の抗体および当業者に公知のその等価体を指すなどである。
【００６２】
特に示さない限り、本明細書中で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等のどのような方法および材料も本発明の実施または試験において使用することが可能であるが、以下においては、好ましい方法、装置および材料（物質）を記載する。本明細書に記載のすべての刊行物は、刊行物に報告されており本発明において使用しうる細胞系、ベクターおよび方法を記載し開示する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書に記載のいずれの刊行物も、本発明が先行発明としてそのような開示に先行するものではないと認めることを示すものではない。本明細書中で引用されている各参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００６３】
本発明の実施においては、特に示さない限り、当分野の技術の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の通常の方法を用いる。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Gennaro, A.R.編, (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Colowickら Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell編, (1986) Blackwell Scientific Publications); Maniatisら (1989) Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubelら (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Reamら編, (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham編, (1997), Springer Verlag)を参照されたい。
【００６４】
定義
「眼障害」または「眼疾患」なる語は包括的に用いられ、正常状態から逸脱したどのような状態をも意味する。特に、「眼障害」または「眼疾患」は、あらゆる眼の異常を意味する。眼障害は、損傷、外傷、疾患、手術などを含む、眼を冒す急性もしくは慢性状態または事象から生じうる。眼障害は、例えば網膜、黄斑、硝子体液、眼房水、水晶体、角膜、強膜、脈絡膜、毛様体、虹彩、視神経乳頭、乳頭、中心窩または他の眼部分のような眼の種々の構造体に関連していることがある。また、眼障害は、種々の眼細胞、例えばRPE細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、線維柱帯網細胞、線維芽細胞、角膜線維芽細胞、グリア細胞、ミュラー細胞、上皮細胞、例えば水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞などに関連していることがある。
【００６５】
眼障害または眼疾患は、例えば血管新生、細胞増殖、細胞遊走、炎症、細胞外マトリックスの産生および沈着（例えば、線維形成）などを含む種々の眼プロセスの1以上に関連していることがある。眼障害の具体例には、例えば、増殖性硝子体網膜症、非増殖糖尿病網膜症、増殖糖尿病網膜、糖尿病黄斑浮腫、萎縮型黄斑変性、滲出型黄斑変性、加齢性黄斑変性、黄斑変性に関連した色素上皮剥離、シュタルガルト病（若年性黄斑変性）、緑内障、例えば原発開放隅および続発緑内障、増殖糖尿病網膜症を伴う血管新生緑内障、緑内障濾過手術に関連した創傷治癒、特発性網膜前線維症、網膜下線維症、ぶどう膜障害、例えばぶどう膜炎症候群およびぶどう膜の炎症、眼窩の特発性硬化性炎症、眼窩を冒す多発性線維硬化症、眼に発現した瘢痕性類天疱瘡、中心性漿液性脈絡網膜症を伴う全身性ループス、第一次硝子体過形成を伴うコーツ病、フォークト-小柳-原田病、黄斑浮腫、網膜剥離および関連合併症、例えば網膜剥離手術による合併症、白内障、黄斑孔、網膜裂孔、急性網膜壊死症候群、外傷性脈絡網膜症、プルチェル網膜症（挫傷）、網膜浮腫、角膜上皮創傷、角膜瘢痕、角膜混濁（レーザー角膜切削形成術（LASIK）に合併するもの）、シェーグレン症候群、角膜血管新生、虹彩血管新生、脈絡膜血管新生、硝子体血管新生、眼血管新生、眼炎症、網膜変性、網膜虚血、硝子体網膜障害、未知の病因の眼線維症（眼線維形成）、鎌状赤血球網膜症、未熟児網膜症、網膜剥離、眼虚血、眼外傷ならびに放射線網膜症が含まれる。
【００６６】
「線維形成（線維症）」は、本明細書中ではその最も広い意味で用いられており、細胞外マトリックスタンパク質の過剰な産生または沈着を意味する。線維形成は、線維組織の異常なプロセッシング、線維性変性または線維変性を含む。線維形成は種々の損傷または疾患から生じる可能性があり、典型的には、細胞外マトリックス成分の異常な産生、蓄積または沈着、例えばコラーゲンおよびフィブロネクチンの過剰産生および沈着増強などを伴う。「眼線維形成（眼線維症）」なる語は、眼またはその何らかの部分を冒す線維形成を意味する。
【００６７】
「眼細胞」は、眼の内部または外部の眼構造体に関連した細胞であり、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞、双極細胞などを含む。
【００６８】
「結合組織増殖因子」または「CTGF」は、任意の種、好ましくは哺乳動物種、例えばラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウスおよびウマ種、最も好ましくはヒト種に由来し、天然物、合成物、半合成物または組換え体などの任意の起源に由来するCTGFを意味する。結合組織増殖因子は既に報告され記載されている（例えば、米国特許第5,408,040号; Bradhamら 1991, J. Cell Biology 114:1285-1294を参照されたい）。1つの態様においては、「結合組織増殖因子」または「CTGF」は、CTGFのN末端断片の少なくとも一部を含むポリペプチド配列を意味する。もう1つの態様においては、「結合組織増殖因子」または「CTGF」は、CTGFのC末端断片の少なくとも一部を含むポリペプチド配列を意味する。CTGFに関して用いる「N末端断片」なる語は、CTGFポリペプチドのアミノ末端部分に由来する配列を含む任意のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片を意味する。CTGFに関して用いる「C末端断片」なる語は、CTGFポリペプチドのカルボキシ末端部分に由来する配列を含む任意のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片を意味する（例えば、国際公開番号WO 00/35939; 国際公開番号WO 00/35936; および米国特許出願第10/245,977号を参照されたい）。
【００６９】
本明細書中で用いる「CTGF関連眼障害」なる語は、CTGFまたはその断片の異常または不適当な発現または活性に関連した眼の状態および疾患を意味する。この用語は、特に、眼細胞増殖、眼細胞遊走、眼における細胞外マトリックスの産生または沈着（眼線維形成および瘢痕形成を含む）に関連した疾患および障害、眼における炎症、眼血管新生および新血管形成に関連した疾患および障害を意味する。
【００７０】
本明細書に記載の増殖プロセスおよび障害には、組織内の細胞集団の過剰増殖を引き起こす細胞の継続的増殖により特徴づけられる病的状態が含まれる。該細胞集団は、必ずしも、形質転換細胞、腫瘍化細胞または悪性細胞である必要はなく、正常細胞をも含みうる。例えば、CTGFは、網膜の種々の細胞（例えば、網膜色素上皮細胞）において増殖応答を誘導することにより、または血管新生を刺激することにより、病理学的に関与しうる。
【００７１】
「血管新生」および「新血管形成」なる語は、新たな又は既存の毛細管または血管の形成または成長を意味する。
【００７２】
CTGFに関して用いる「アゴニスト」なる語は、特定の分子、例えばCTGFまたはCTGFの断片の生物学的または免疫学的活性または発現の効果の度合または持続時間を増加または延長させる分子を意味する。アゴニストには、CTGFまたはその断片の効果を増強するタンパク質、核酸、炭水化物、抗体、小分子または他の分子が含まれうる。
【００７３】
CTGFに関して用いる「アンタゴニスト」なる語は、特定の分子、例えばCTGFまたはCTGFの断片の生物学的または免疫学的活性または発現の効果の度合または持続時間を減少させる分子を意味する。アンタゴニストには、CTGFまたはその断片の効果を減少させるタンパク質、核酸、炭水化物、抗体、小分子または他の分子が含まれうる。
【００７４】
「抗体」なる語は、任意の起源から得られた免疫グロブリンまたはモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を意味する。そのような起源には、細胞系、または動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ、ウマ、ヒトなどが含まれうる。抗体は、遺伝的に修飾された細胞、または宿主に内因性ではない抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック植物もしくは動物から得ることも可能である。抗体は、例えばIgA、IgD、IgE、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4またはIgMなどを含む任意のアイソタイプのものでありうる。本明細書中で用いる「抗体」には、インタクトな分子およびそのフラグメント、例えばFab、F(ab')2およびFvフラグメント（エピトープ決定基に結合しうるも）、キメラ抗体、例えば二価および三価抗体（1以上の特異抗原に結合するもの）が含まれる。
【００７５】
「アンチセンス」なる語は、特定の核酸配列の「センス」鎖に相補的な核酸配列を含有するどのような組成をも意味する。アンチセンス分子は、合成または転写による方法を含む当技術分野で利用可能な任意の方法により製造することができる。相補的ヌクレオチドは、細胞内に導入されたら、該細胞により産生された天然配列と一緒になって二本鎖を形成し、対応する天然配列の転写または翻訳を遮断しうる。
【００７６】
本明細書中で用いる「アミノ酸配列」または「ポリペプチド」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列およびそれらの断片、ならびに天然に存在する分子または合成分子を意味する。ポリペプチドまたはアミノ酸断片は、該ポリペプチドの構造的および／または機能的特徴の少なくとも1つを保有するポリペプチドの任意の部分である。CTGF断片には、CTGFの構造的または機能的特徴の少なくとも1つを保有するCTGFポリペプチド配列の任意の部分が含まれる。「アミノ酸配列」が、天然に存在するタンパク質分子のポリペプチド配列を意味する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語は、該アミノ酸配列を、問題のタンパク質分子に関連した完全な天然配列に限定するものではない。
【００７７】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」なる語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチドまたはそれらの任意の断片、ならびに一本鎖または二本鎖でありうる及びセンスまたはアンチセンス鎖に相当しうる天然または合成由来のDNAまたはRNA、ペプチド核酸（PNA）、あるいは天然または合成由来の任意のDNA様もしくはRNA様物質を意味する。ポリヌクレオチド断片は、該ポリヌクレオチドの構造的または機能的特徴の少なくとも1つを保有するポリヌクレオチド配列の任意の部分である。ポリヌクレオチド断片は、様々な長さ、例えば、60ヌクレオチド長以上、少なくとも100ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド長または少なくとも10,000ヌクレオチド長のものでありうる。
【００７８】
「改変」ポリヌクレオチドには、同じ又は機能的に同等のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを与える種々のヌクレオチドの欠失、挿入または置換を含有するポリヌクレオチドが含まれる。この定義には多型を示す配列も含まれ、かかる配列は、特定のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、あるいは対象ポリヌクレオチド配列の正常な染色体遺伝子座以外の遺伝子座を有する対立遺伝子への不適切なまたは予想外のハイブリダイゼーションの欠如により、容易に検出されるものでも、容易に検出されないものでもよい。
【００７９】
「改変」ポリペプチドは、サイレントな変化を引き起こして機能的に同等なポリペプチドを与える、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含有しうる。意図的なアミノ酸置換は、コードされるポリペプチドの生物学的または免疫学的活性が保有される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行うことが可能である。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれうる。正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれうる。類似した親水性値を有する非荷電極性ヘッド基を含有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびトレオニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンが含まれうる。
【００８０】
ポリペプチドまたはアミノ酸「変異体」は、特定のアミノ酸配列から、1以上のアミノ酸により改変されたアミノ酸配列である。ポリペプチド変異体は保存的変化を有しうる。この場合、置換後のアミノ酸は、置換前のアミノ酸に類似した構造的または化学的特徴を有する（例えば、ロイシンからイソロイシンへの置換）。変異体は非保存的変化をも有しうる。この場合、置換後のアミノ酸は、置換前のアミノ酸とは異なる物理的特性を有する（例えば、グリシンからトリプトファンへの置換）。また、類似した小さな変化には、アミノ酸の欠失または挿入またはそれらの両方が含まれうる。好ましくは、アミノ酸変異体は、特定のポリペプチドの或る構造的または機能的特徴を保有する。どのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失しうるのかを決定する際の指針は、例えば、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR Inc., Madison, WI）のような当技術分野でよく知られたコンピュータープログラムを使用して見出されうる。
【００８１】
ポリヌクレオチド変異体は、特定のポリヌクレオチド配列に対して好ましくは少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％のポリヌクレオチド配列類似性を有する特定のポリヌクレオチド配列の変異体である。遺伝暗号の縮重の結果として、ある特定のタンパク質をコードする多数の変異体ポリヌクレオチド配列（いくつかは、既知の天然遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する）が生じうると当業者には理解されるであろう。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することにより製造しうるポリヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異体を含む。これらの組合せは、標準的なコドン三文字遺伝暗号に従って行われ、すべてのそのような変異体が具体的に開示されているとみなされるべきである。
【００８２】
「欠失」は、1以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの欠如をもたらす、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化である。
【００８３】
「挿入」または「付加」なる語は、天然に存在する分子と比較した場合に1以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加をもたらす、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の変化を意味する。
【００８４】
本明細書中で用いる「機能的等価体」なる語は、特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能的または構造的特徴の少なくとも1つを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。機能的等価体は、特定の機能の発現を可能にする修飾を含有しうる。「機能的等価体」なる語は、分子の断片、突然変異体、ハイブリッド、変異体、類似体または化学的誘導体を含むと意図される。
【００８５】
「サンプル」なる語は、その最も広い意味で用いられている。サンプルは、任意の起源、例えば体液、分泌物、組織、細胞または培養細胞（例えば、硝子体液、眼房水、涙、唾液、血液、尿、血清、血漿、滑液、脳脊髄液、羊水および器官組織（例：生検組織）を含むが、それらに限定されるものではない）；染色体、オルガネラ、または細胞から単離された他の膜；ゲノムDNA、cDNA、RNA、mRNAなど；ならびに清澄化細胞もしくは組織、またはそのような細胞または組織由来のブロットもしくはインプリントに由来しうる。サンプルは、任意の起源、例えば細胞、ヒト被験体、非ヒト哺乳動物被験体などに由来しうる。また、疾患の動物モデルに由来するサンプルが意図される。サンプルは溶解していることが可能であり、また、例えば基体に固定もしくは結合していることが可能である。サンプルは、CTGFもしくはCTGFの断片の存在を試験するのに適した物質、またはCTGFもしくはその断片に結合する分子をスクリーニングするのに適した物質を意味しうる。そのようなサンプルの取得方法は当技術分野の技術水準の範囲内である。
【００８６】
本明細書中で用いる「細胞外マトリックス」および「細胞外マトリックスタンパク質」なる語は、広義には、非細胞性マトリックス、典型的には、タンパク質、糖タンパク質、複合糖質および他の巨大分子から構成される非細胞性マトリックスを意味する。細胞外マトリックスタンパク質には、例えば、コラーゲン（コラーゲンIおよびIV型など）、フィブロネクチン、ラミニンならびにトロンボスポンジンが含まれる。
【００８７】
「マイクロアレイ」なる語は、分子、例えば核酸、アミノ酸、抗体などの、基体上の任意の配置を意味する。基体は、適当な支持体、例えばビーズ、ガラス、紙、ニトロセルロース、ナイロンまたは任意の適当な膜などでありうる。基体は、硬質または半硬質支持体、例えば膜、フィルター、ウェハー、チップ、スライド、繊維、ビーズ、例えば磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、高分子、微粒子、毛管など（これらに限定されるものではない）でありうる。基体は、コーティング用の表面を提供することが可能であり、かつ／または、核酸、アミノ酸などが結合しうるウェル、ピン、トレンチ、チャンネルおよび孔のような種々の表面形態を有することが可能である。
【００８８】
「増殖性硝子体網膜症」または「PVR」なる語は、網膜前膜、網膜下スタンド（stands）など、および星状皺襞、硝子体牽引、前ループ牽引（anterior loop traction）などを伴う網膜剥離を含む種々の眼内病変を意味する。PVRはまた、なんらかの程度の網膜剥離に関連した眼内細胞増殖を含む。
【００８９】
本発明
本発明は、例えば細胞増殖、細胞遊走、血管新生、炎症、線維形成などに関連した眼プロセスの抑制または予防方法に関する。眼障害の予防および治療方法も提供される。
【００９０】
急性または慢性の状態および事象、例えば損傷、外傷、疾患、手術などは、眼内の種々の構造的、病理学的、生理的および細胞性変化を招きうる1以上の眼プロセスの発生および進行に関連している。そのようなプロセスには、例えば、基底膜マトリックス組成の変化；繊維症および瘢痕形成を招く種々の眼細胞による細胞外マトリックスの産生および沈着の増強；血管新生；毛細血管透過性の上昇；眼細胞過形成；眼細胞増殖、眼細胞遊走；眼膜、例えば細胞性膜、線維性膜、網膜下膜、網膜前膜、硝子体膜、脈絡膜新生血管膜などの発生が含まれる。
【００９１】
これらの眼プロセスは多数の眼の障害および疾患に関連しており、互いに関連しあって頻繁に生じうる。複数の眼プロセスの相互関連性は、例えばPVRにおいて明らかであり、この場合、RPE細胞増殖およびRPE細胞遊走が硝子体内（硝子体膜）または網膜の内部もしくは外部表面上（網膜前膜）の細胞性および線維性膜形成に関連している。糖尿病網膜症は網膜の内部血管内の損傷または変化に関連しており、それは、出血および腫脹、網膜内への流体の漏れ、ならびに網膜表面上の及び硝子体内への血管の新たな成長を引き起こす。CNVは、増強した脈絡膜内皮細胞の接着、遊走および増殖；細胞外マトリックスの過剰産生；ならびに線維血管性網膜下膜の発生に関連している。したがって、種々の眼プロセスは相互関連していて、眼を冒す多種多様な障害および疾患に共通した治療経路となる。したがって、これらのプロセスを抑制し予防する及び関連障害を予防する有効な方法は広範な用途を有する。
【００９２】
本発明は、CTGFが種々の眼プロセスの開始、発生および進行における中心的な因子であるという知見に関する。さらに、本発明は、CTGFの発現および活性が眼障害全般の開始および程度（特に、先に列挙したプロセスに関連した障害）に関連していることを実証する。
【００９３】
眼プロセスにおける及び眼障害におけるCTGF
眼プロセスおよび眼障害におけるCTGFの関与
本発明は、種々の眼プロセスならびに関連した疾患および状態におけるCTGFの発現の増強を実証する。例えば、CTGFの発現は、ある眼疾患を有すると診断された患者の硝子体において及び眼障害の動物モデルにおいて上昇していた（例えば、実施例14、15および22を参照されたい）。CTGFのレベルは、創傷治癒に共通に関連している眼プロセス（例えば、血管新生および線維形成）を有する患者から採取された硝子体サンプルにおいて最高であった（例えば、実施例14および15を参照されたい）。PVRを伴わない網膜剥離、PVRを伴う網膜剥離、網膜前膜、黄斑孔、CNV、網膜血管新生、増殖糖尿病網膜症および加齢性黄斑変性を有する患者から得た硝子体サンプルにおいて、CTGFの発現の増強が観察された（例えば、実施例14を参照されたい）。
【００９４】
また、本発明者らは、PVR、糖尿病網膜症およびCNV（黄斑変性に関連したCNVを含む）のような眼障害を有する個体から得た眼組織においてCTGFの発現が上昇することを見出した。例えば、免疫組織化学的データは、網膜剥離を有する患者から外科的に摘出されたPVR膜においてCTGFが発現されたことを示している（例えば、実施例12を参照されたい）。臨床的に診断された加齢性黄斑変性を有する患者から得たCNV膜においてCTGFの発現の増強が観察された（例えば、実施例13を参照されたい）。単離されたCNV膜においては、CTGFは、主として新生血管膜に局在しており、血管を包囲する細胞に付随していた。したがって、CTGFは血管新生、眼線維形成および眼膜形成に関連している。
【００９５】
本発明者らは更に、例えばRPE細胞、CECおよび網膜ミュラー細胞を含む種々の眼細胞におけるCTGFの発現を示した。本発明は、種々の眼細胞におけるCTGF発現は、種々の眼障害および眼プロセスに関連した種々の増殖因子および細胞外マトリックス成分により様々に調節されていることを示している。特に、TGFβはRPE細胞においてCTGF発現を刺激し、VEGFはCECにおいてCTGF発現を刺激した（例えば、実施例2を参照されたい）。眼細胞の遊走および増殖に関連している細胞外マトリックス成分であるフィブロネクチンは、RPE細胞においてCTGF発現を刺激した（例えば、実施例10を参照されたい）。
【００９６】
CTGFは眼線維形成を誘発する
本発明は、CTGFが眼線維形成（細胞外マトリックスの産生および沈着の増強）を誘発するという初めての実例を提供する。本発明者らは、CTGFが眼疾患の有効動物モデルにおいてin vivoで病的眼線維形成を誘発すること、および硝子体へのCTGFの添加が眼線維形成の発生および進行を刺激することを見出した（例えば、実施例17および19を参照されたい）。CTGFにより誘発される眼線維形成は、少数細胞性（paucicellular）、筋原線維芽細胞性および密線維性（densely fibrotic）網膜前膜内への網膜前RPE膜の形質転換に関連していた。軽度のPVRを有するウサギの硝子体内に注入（注射）されたCTGFは、密線維性膜の形成ならびに眼線維形成の発生および進行を引き起こした（例えば、実施例17および19を参照されたい）。さらに、本発明者らは、細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンのRPE細胞内での発現をCTGFが誘発することを示すことにより、細胞外マトリックスの産生をCTGFが刺激することを示した（例えば、実施例9を参照されたい）。これらの結果は、CTGFが眼線維形成を誘発するという直接的な証拠をもたらすものであり、したがって、CTGFは、眼内の線維形成プロセス（すなわち、眼線維形成）および関連疾患・障害の発生および進行の抑制のための標的に相当する。
【００９７】
本発明は、眼細胞内の細胞外マトリックスの産生（これは眼線維形成の特徴である）をCTGFが刺激したことを示す。特に、本発明者らは、CTGFがRPE細胞内でフィブロネクチンの発現を誘発することを示した（例えば、実施例9を参照されたい）。
【００９８】
CTGFは眼血管新生および眼新血管形成を誘発する
本発明者らはまた、CTGFが眼血管新生および眼新血管形成を誘発するという証拠を提供する。血管新生は、例えば眼膜の発生および進行、増殖性血管新生、および脈絡膜血管新生を含む種々の眼障害および眼プロセスに関連している。
【００９９】
内皮細胞が増殖、遊走および分化にさらされるin vitro管形成アッセイを用いて、本発明者らは、CTGFに応答した管形成の増強をCECの単層培養が示すことを証明し、それにより、CTGFが眼血管新生および新血管形成に関与することを確認した（例えば、実施例8を参照されたい）。
【０１００】
さらなる知見は、CTGFがCNV膜において主として新生血管膜に局在し、血管包囲細胞に付随することを示した（例えば、実施例13を参照されたい）。このように、本発明者らは、CTGFが眼血管新生および新血管形成ならびに新生血管膜形成に関与することを確認することができた。
【０１０１】
CTGFは眼細胞の増殖および遊走を刺激する
多数の眼障害においては、眼細胞の増殖および遊走は種々の眼プロセスの発生および進行ならびに関連疾患および障害に関連している。本発明は、例えば細胞増殖、細胞遊走、血管新生および線維形成のような眼プロセスの発生および進行に決定的に関与している眼細胞の増殖および遊走をCTGFが刺激することを示す。例えば、RPE細胞の増殖はCTGFにより刺激された（例えば、実施例7を参照されたい）。また、CTGFは、RPE細胞、CECおよび網膜ミュラー細胞の遊走を刺激した（例えば、実施例6および11を参照されたい）。
【０１０２】
眼プロセスおよび眼障害の抑制または予防方法
本発明は、眼プロセスの抑制または予防方法に関する。眼障害の治療または予防に使用する方法および物質、眼障害の診断方法および関連キット、ならびに本方法で使用する物質のスクリーニング方法も提供する。
【０１０３】
1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を投与することを含んでなる、被験体におけるCTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法を提供する。これらの方法はin vivoまたはin vitroで適用することができる。種々の実施形態においては、被験体は細胞または動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１０４】
1つの態様においては、該物質は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび小分子よりなる群から選ばれる。もう1つの態様においては、該物質は眼に送達される。該物質を眼表面に送達する方法が特に意図される。好ましい態様においては、該物質は点眼剤として送達される。もう1つの態様においては、該物質は軟膏として送達される。
【０１０５】
好ましい実施形態においては、眼プロセスは更に、眼細胞に関連している。ある実施形態においては、眼細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。
【０１０６】
もう1つの実施形態においては、眼プロセスは更に、眼構造体に関連している。本発明が提供する種々の実施形態において、眼構造体は、網膜、網膜色素上皮層、脈絡膜、黄斑、角膜、水晶体、虹彩、強膜、線維柱帯網、眼房水、眼房、硝子体、毛様体、視神経乳頭、乳頭および中心窩よりなる群から選ばれる。
【０１０７】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法であって、該眼プロセスが更に眼障害に関連していることを特徴とする方法が、特に意図される。任意のCTGF関連眼障害への本方法の適用が特に意図される。特定の実施形態においては、該眼障害は、緑内障、白内障、脈絡膜血管新生、網膜剥離、増殖性硝子体網膜症、黄斑変性、糖尿病網膜症、角膜瘢痕形成および角膜混濁よりなる群から選ばれる。好ましい実施形態においては、眼プロセスは更に、眼線維形成に関連している。
【０１０８】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞外マトリックスの産生または沈着の抑制または予防方法が、本発明において特に提供される。CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼瘢痕形成の抑制または予防方法が、特に提供される。1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼血管新生の抑制または予防方法を提供する。さらなる実施形態においては、該血管新生は網膜血管新生、脈絡膜血管新生、虹彩の血管新生、または線維柱帯血管新生である。CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼炎症の抑制または予防方法も提供する。
【０１０９】
本発明は更に、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞増殖の抑制または予防方法を含む。種々の実施形態においては、眼細胞増殖は、上皮細胞増殖、内皮細胞増殖、網膜色素上皮細胞増殖および脈絡膜内皮細胞増殖よりなる群から選ばれる。
【０１１０】
1つの態様においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼細胞遊走の抑制または予防方法を提供する。特定の態様においては、眼細胞遊走は、上皮細胞遊走、網膜色素上皮細胞遊走、内皮細胞遊走および脈絡膜内皮細胞遊走よりなる群から選ばれる。
【０１１１】
本発明は更に、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を投与することを含んでなる、被験体におけるCTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防方法であって、該眼プロセスが更に手術に関連していることを特徴とする方法を提供する。種々の態様において、該手術は、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、LASIK、網膜剥離手術、角膜移植、緑内障濾過手術、白内障摘出術、水晶体交換手術、硝子体切除術、網膜下手術および網膜交換手術よりなる群から選ばれる。
【０１１２】
眼プロセスおよび眼障害の治療および予防方法
眼障害の治療または予防方法が、本発明により特に提供される。1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼障害の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼線維症（眼線維形成）の治療または予防方法が特に意図される。
【０１１３】
1つの態様においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、血管新生を伴う眼障害の治療または予防方法を提供する。種々の態様において、該血管新生は網膜血管新生、脈絡膜血管新生、虹彩の血管新生、または線維柱帯血管新生である。特定の態様においては、黄斑変性に関連した脈絡膜血管新生の治療または予防方法が特に意図される。
【０１１４】
さらに、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞外マトリックスの産生または沈着を伴う眼障害の治療または予防方法が提供され、また、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、炎症を伴う眼障害の治療または予防方法も提供される。
【０１１５】
1つの実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞増殖を伴う眼障害の治療または予防方法を含む。種々の実施形態においては、該細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。
【０１１６】
もう1つの実施形態においては、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、細胞遊走を伴う眼障害の治療または予防方法が提供される。ある実施形態においては、該細胞は、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、網膜色素上皮細胞、網膜内皮細胞、脈絡膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、角膜上皮細胞、線維柱帯網細胞、周細胞、アストロサイト、小グリア細胞、血管周囲グリア細胞、ミュラー細胞、血管周囲アストロサイト、杆体、錐体、神経節細胞および双極細胞よりなる群から選ばれる。ある態様においては、本発明は、変化した眼細胞遊走、増殖、走化性または付着を伴う眼障害の治療または予防方法を提供する。
【０１１７】
CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質を被験体に投与することを含んでなる、眼膜の形成または変化に関連した障害の治療または予防方法が特に意図される。種々の態様においては、眼膜は、網膜前膜、網膜下膜、硝子体膜、細胞性（cellular）膜、脈絡膜新生血管膜および線維性（fibrotic）膜よりなる群から選ばれる。特定の実施形態においては、本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質の有効量を被験体に投与することを含んでなる、該被験体における視力の維持または改善方法を提供する。
【０１１８】
ある実施形態においては、手術事象（手術イベント）に関連して発生しうる眼障害の発生を治療または予防するために、眼障害の治療または予防方法における投与を、手術の前または手術時または手術と密接に関連づけて行う。種々の態様においては、該手術は、屈折矯正手術、放射状角膜切開術、LASIK、網膜剥離手術、角膜移植、緑内障濾過手術、白内障摘出術、水晶体交換手術、硝子体切除術、網膜下手術および網膜交換手術よりなる群から選ばれる。
【０１１９】
本発明は、黄斑変性の治療または予防方法を提供する。本発明において記載する方法はいずれも、あらゆる形態の黄斑変性［加齢性黄斑変性、萎縮型の黄斑変性（非滲出型退縮性萎縮性黄斑変性、そして重度の場合には地図状萎縮としても公知である）、および滲出型の黄斑変性（滲出型血管新生性または円板状黄斑変性としても公知である）を含む］の治療または予防に適用することができる。好ましい実施形態においては、本発明は、黄斑変性に関連した脈絡膜血管新生の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は糖尿病網膜症（増殖糖尿病網膜症および非増殖糖尿病網膜症を含む）の治療または予防方法を提供する。好ましい実施形態においては、本発明は増殖性硝子体網膜症の治療または予防方法を提供する。もう1つの態様においては、本発明は網膜剥離の治療または予防方法を提供する。さらにもう1つの態様においては、本発明は緑内障の治療または予防方法を提供する。さらにもう1つの態様においては、本発明は白内障の治療または予防方法を提供する。1つの実施形態においては、本発明は角膜瘢痕形成の治療または予防方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は角膜混濁の治療または予防方法を提供する。
【０１２０】
本発明は、CTGFまたはその断片の発現または活性を低下させる物質の有効量を被験体に投与することを含んでなる、該被験体における視力の維持または改善方法を提供する。
【０１２１】
診断方法
眼障害の診断方法が特に意図される。1つの実施形態においては、本発明は、被験体からサンプルを得、該サンプル中のCTGFまたはCTGFの断片のレベルを測定し、該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の量の増加が眼障害の存在を示すことを特徴とする、CTGFまたはその断片に関連した眼障害の診断方法を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明は、被験体からサンプルを得、該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを測定し、該サンプル中のCTGFまたはその断片のレベルを標準レベルと比較することを含んでなり、該サンプル中のCTGFまたはその断片の量の増加が、眼障害を発生する素因を示すことを特徴とする、CTGFに関連した眼障害を発生する素因の同定方法を提供する。
【０１２２】
本発明はまた、CTGFに関連した眼障害の診断に使用する診断キットを提供する。本発明の診断キットは、サンプル中のCTGFのレベルを検出するための手段と、該サンプル中のCTGFのレベルを測定するための手段とを含む。1つの態様においては、診断キットは、CTGFに関連した眼障害の診断に有用である。もう1つの態様においては、診断キットは、CTGFに関連した眼障害を発生する素因の同定に有用である。好ましい実施形態においては、本発明の診断キットは眼線維症（眼線維形成）の診断に有用である。もう1つの好ましい実施形態においては、本発明の診断キットは、眼線維症（眼線維形成）を発生する素因の同定に有用である。
【０１２３】
本発明のもう1つの態様は、眼障害（例えば、PVR、糖尿病網膜症、黄斑変性、あるいはCTGFまたはその断片の発現または活性に関連したあらゆる眼の症状）の診断方法を提供する。
【０１２４】
好ましい実施形態においては、眼障害の診断は、被験体から得たサンプル中のCTGFまたはCTGFの断片のレベルを定量することにより達成される。1つの実施形態においては、被験体はヒト被験体である。もう1つの実施形態においては、該方法は、組織生検サンプル中のCTGFまたはCTGFの断片のレベルを測定し、このレベルを、正常な組織またはサンプル（すなわち、CTGFに関連した眼障害のない被験体からのサンプル）中の組織生検中のCTGFまたはCTGF断片のレベルと比較することを含む。第1サンプル中のCTGFまたはCTGF断片のレベルの上昇は、問題の病的状態を示す（例えば、2002年9月18日付け出願の米国特許出願第10/245,977号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【０１２５】
より一般的には、CTGFまたはCTGF断片の検出は、例えばELISA、RIA、またはタンパク質マーカーの存在を検出するために抗体を使用する他のアッセイを用いるイムノアッセイ法により行うことができる。ELISAおよびRIA法が好ましく、例えば、CTGFまたはCTGFのレベルを検出するために本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体と共に用いることが可能である。第1標準サンプル中のCTGFまたはCTGF断片のレベルを、例えばイムノアッセイにより測定し、第2サンプル（第2サンプルは、CTGF関連眼障害を有することが知られている患者から又はいずれのCTGF関連眼障害も有しないことが知られている患者から取得する）中のCTGFまたはCTGF断片のレベルと比較して、そのような障害の存在または進行を判定する。
【０１２６】
より一般的には、CTGF関連眼障害の診断のためには、標的ポリペプチドに特異的な抗体（例えば、CTGFまたはその断片に特異的な抗体）が本発明において有用である。本診断アッセイは、CTGF関連眼障害を有する疑いのある患者からのサンプル中のCTGFまたはその断片を検出するための標識と抗体とを使用する方法を含む。該サンプルは、例えば、体液（例えば、硝子体液）、細胞、組織、またはそのような組織の抽出物（例えば、生検材料から顕微解剖された細胞を含む）を含みうるであろう。また、所望の特異性を有する抗体に関してスクリーニングし該抗体を同定するためのプロトコールを、サンプル中のCTGFまたはその断片の検出に用いることも可能である。
【０１２７】
好ましくは、本発明の診断方法においては、CTGF関連眼障害またはCTGF関連眼障害に対する素因の存在の診断の基準を得るために、CTGFまたはCTGF断片の発現または活性に関する正常または標準値を確認する。本発明の1つの方法においては、これは、正常な被験体から採取した体液（例えば、硝子体液）、組織生検材料、または細胞抽出物を、複合体の形成に適した条件下、CTGFまたはCTGF断片に対する抗体と一緒にすることにより達成される。そのような条件は当技術分野でよく知られている。既知量の抗体が既知濃度の精製CTGFまたはその断片と組合された陽性対照の系列希釈と、正常なサンプル中の抗体-標的複合体のレベルとを比較することにより、標準複合体形成の量を定量することができる。特定の実施形態においては、正常サンプルから得た標準値を、例えば、CTGF関連眼障害を有する疑いのある又はCTGF関連眼障害に対する素因を有する疑いのある被験体のサンプルからの値と比較することができる。標準値と被験体の値との偏差が、病的状態の存在またはそれに対する素因を示す。本発明の診断方法は、例えばPVR、糖尿病網膜症または黄斑変性のような眼障害に対する素因または感受性の検出のために行うことも可能である。
【０１２８】
本発明は、サンプル（特に、液体サンプルまたは組織生検サンプル）中のCTGFまたはCTGF断片を検出するためのキットを提供する。特定の実施形態においては、このキットは、CTGFまたはCTGFの断片に特異的であり支持体に結合したモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体と、異なるCTGFまたはCTGF断片エピトープに特異的であり酵素標識された第2モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体とを含む。該キットは更に、酵素標識モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を検出するための試薬を含む。該試薬キットは、サンプル中のCTGFまたはその断片の測定の際に免疫学的方法を利用して眼障害（特に、CTGF関連眼障害）の検出および診断を可能にするものである。もう1つの実施形態においては、該キットは、該酵素標識抗体の代わりに放射能標識またはフルオレセイン標識抗体を含む。
【０１２９】
1つの実施形態においては、本発明の診断キットは、免疫組織化学的技術を用いる組織サンプル中のCTGFまたはCTGF断片の検出に有用な要素を含む。該キットは、例えば、イメージ解析または他の比較技術による組織サンプル中のCTGFまたはCTGF断片のレベルの定量的測定を可能にするソフトウェアプログラムと共に使用することが可能であろう。もう1つの実施形態は、組織サンプル中のCTGF mRNAのレベルを検出し測定するための診断キットを提供する。1つの実施形態においては、該キットは、CTGF mRNAをDNAに逆転写するために使用する試薬を含む。該キットは更に、CTGF特異的DNAを増幅するのに必要な試薬（CTGFまたはその断片をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーを含む）を含みうる。該キットはまた、サンプル中に存在するCTGF mRNAのレベルの定量に使用する競合的な模擬cDNAまたは突然変異cDNAを含みうる。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、本発明の診断キットは、例えば、該キットの必要な要素ならびに該診断キットの使用に関する指示書および説明書を含む箱または容器内に収納してラベルを貼る。
【０１３１】
スクリーニング方法
本発明は、眼プロセスの抑制または予防に有用な物質の同定方法も提供する。
【０１３２】
1つの実施形態においては、本発明は、候補物質をCTGFまたはその断片と接触させ、サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルを検出し、該サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルをCTGFの発現または活性の標準レベルと比較することを含んでなる、CTGFに関連した眼プロセスの抑制または予防に使用する物質の同定方法であって、該サンプル中のCTGFまたはその断片の発現および活性の低下が、CTGFに関連した眼プロセスを抑制または予防する物質を示すこと特徴とする方法を提供する。
【０１３３】
もう1つの実施形態においては、本発明は、候補物質をCTGFまたはその断片と接触させ、サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルを検出し、該サンプル中のCTGFの発現または活性のレベルをCTGFの発現または活性の標準レベルと比較することを含んでなる、CTGFに関連した眼障害の治療または予防に使用する物質の同定方法であって、該サンプル中のCTGFまたはその断片の発現および活性の低下が、CTGFまたはその断片に関連した眼障害を治療または予防する物質を示すこと特徴とする方法を提供する。
【０１３４】
本発明は、眼プロセスおよび関連眼障害の治療または予防方法において使用しうる物質のスクリーニングまたは同定方法を提供する。本スクリーニング方法を用いて同定された化合物を、所望の効果（例えば、CTGFまたはCTGF断片の発現または活性の低下）を得るために被験体に投与することができる。また、本発明は、特定の眼細胞（例えば、RPE細胞、CECなど）においてCTGFまたはCTGF断片の発現または活性を低下させる物質の同定方法を提供する。
【０１３５】
本発明は、CTGFまたはCTGFの断片を特異的に認識しうる有用な物質（アゴニストまたはアンタゴニストを含む）のスクリーニングまたは同定方法を含む。CTGFまたはCTGFの断片に結合する物質はこれらのポリペプチドの活性を抑制しうる。該物質には、例えば、抗体およびそのフラグメント、小分子、ポリペプチド（合成物、天然物、または酵素的もしくは組換え的に産生されたもの）ならびにアプタマーが含まれうる。本発明は更に、CTGFまたはその断片の活性または発現を低下させることによる眼障害の治療または予防に使用する物質を同定するのに有用な方法を含む。
【０１３６】
1つの態様においては、本発明のスクリーニングアッセイは、CTGFまたはCTGFの断片を候補物質と接触させ、CTGFの活性または発現のレベルを検出し、その活性または発現のレベルを、当技術分野で公知の方法により得られた標準レベルと比較することを含む。これらの方法においては、例えば、固体支持体に固定化されたCTGFまたはCTGFの断片、無細胞調製物、または天然もしくは合成産物混合物を使用することが可能であろう。モノクローナルまたはポリクローナル抗体がCTGFまたはCTGFの断片に直接的または間接的に結合する或いは結合に関してCTGFまたはCTGFの断片と競合するELISAのようなアッセイを設計することが可能である。
【０１３７】
CTGFまたはCTGF断片に対する或いはCTGFまたはCTGF断片の発現または活性のモジュレーション、調節または抑制に有用な別の標的ポリペプチドに対する適当な結合親和性を有する物質のハイスループットスクリーニングをもたらすスクリーニングのための他の技術が、当技術分野で公知である。例えば、試験化合物を担持するマイクロアレイを、当技術分野における利用可能な方法により製造し、使用し、分析することが可能である（例えば、国際公開番号WO95/35505; 国際公開番号WO95/251116; 米国特許第5,474,796号; 米国特許第5,605,662号を参照されたい）。
【０１３８】
また、CTGFまたはCTGF断片と相互作用し本方法における薬物および治療剤として使用しうる抗体および他の物質の同定に役立ちうる他の種々のスクリーニング技術により、CTGFの活性または発現を低下させる小さな物質の同定を行うことができる（例えば、Ennaら (1998) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sonsを参照されたい）。アッセイは、典型的には、タンパク質または細胞性標的への化合物の結合に伴う検出可能なシグナルを与える。結合は、例えば、発蛍光団、酵素コンジュゲート、および当技術分野でよく知られた他の検出可能な標識により検出することができる（同誌）。その結果は定性的または定量的でありうる。
【０１３９】
医薬製剤および投与経路
本発明は、CTGFの活性または発現をモジュレーションする化合物または物質を例えばin vivoで投与してCTGFの活性に影響を与えることを含む治療方法を包含する。これらの物質は、直接的に、または当技術分野でよく知られた適当な担体もしくは賦形剤と共に医薬組成物として送達することができる。本治療方法は、CTGFまたはCTGFの断片の活性または発現を抑制する物質の有効量を、治療を要する被験体に投与することを含みうる。好ましい実施形態においては、該被験体は哺乳動物被験体であり、最も好ましい実施形態においては、該被験体はヒト被験体である。種々の製剤および薬物送達系が当技術分野で利用可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（前掲）を参照されたい）。1つの態様においては、該物質は、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび小分子よりなる群から選ばれる。もう1つの態様においては、該物質を眼に送達する。該物質を眼表面に送達することによる方法が特に意図される。好ましい態様においては、該物質を点眼剤として送達する。もう1つの態様においては、該物質を軟膏剤として送達する。
【０１４０】
適当な投与経路には、例えば経口、直腸内、経粘膜、鼻腔内または腸内投与、ならびに非経口送達、例えば筋肉内、皮下、髄内注射、および鞘内、直接的な心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内または眼内注射が含まれうる。該物質は局所的または全身的に投与することができる。例えば、適当な物質を注射により、または標的化ドラッグデリバリーシステム、例えばデポー剤、カテーテルまたは徐放剤により送達することができる。局所眼投与には、例えば、眼内、硝子体内、網膜下、強膜下、結膜下、テノン嚢下もしくは強膜内注射または塗布が含まれうる。適当な物質を直接的に角膜または強膜に塗布することも可能である。
【０１４１】
本治療方法において使用する任意の組成物または物質の治療的に有効な量は、まず、当技術分野でよく知られた種々の技術を用いて推定することが可能である。例えば、細胞培養アッセイにおいては、細胞培養において決定されたIC50を含む循環濃度範囲を得るために、用量を動物モデルにおいて系統化（formulate）する。CTGFの発現または活性の抑制が望しい場合には、例えば、CTGF活性の半最大抑制を与える試験物質の濃度を決定することが可能である。ヒト被験体に適した投与量範囲は、例えば、細胞培養アッセイおよび他の動物研究から得たデータを用いて決定することができる。物質の治療的に有効な量は、被験体における症状の改善または生存の延長をもたらす該物質の量を意味する。
【０１４２】
抗体
CTGFまたはCTGFの断片に対する抗体は、当技術分野でよく知られた方法を用いて産生させることが可能である。そのような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよび一本鎖抗体、ならびにFabフラグメント、例えばF(ab')2およびFvフラグメントが含まれうるが、これらに限定されるものではない。フラグメントは、例えば、Fab発現ライブラリーにより得ることが可能である。中和抗体、すなわち、CTGF活性を抑制する抗体が、治療用途に特に好ましい。
【０１４３】
抗体の製造方法は当技術分野でよく知られている。例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒトなどを含む種々の宿主を、標的ポリペプチドまたはその任意の免疫原性断片もしくはペプチドで、注射により免疫することができる。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のin vivoおよびin vitro製造技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Pound (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ; HarlowおよびLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd Edition, Academic Press; Schook (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.を参照されたい）。
【０１４４】
サンプル（例えば、血液、生検組織、硝子体、涙など）中のCTGFまたはその断片もしくはサブユニットを同定するために、前記の抗体を使用することも可能である。CTGFまたはCTGFの断片の存在量は、例えば、定量的イメージ分析、ELISAまたは免疫組織化学的技術により測定することが可能であろう。また、CTGF mRNAレベルは、例えば、生検組織の一部を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、または当技術分野でよく知られた他の方法により測定することが可能であろう。特に、この方法においては、組織サンプルからの全mRNA、あるいはCTGFまたはその断片もしくはサブユニットに特異的なmRNAをDNAに転写し、ついで、特異的プライマー配列を使用するPCRにより増幅することが可能であろう。CTGFに対応するmRNAの定量は、例えば、一連の漸減既知濃度の例えば模擬または突然変異cDNA断片に対して行う等体積の患者のサンプルを使用する競合反応により行うことが可能であろう。
【０１４５】
本発明は、CTGFまたはCTGFの断片の生物活性を中和する、CTGFまたはその断片もしくはサブユニットと特異的に反応する抗体の使用を含む。該方法において投与する抗体は、インタクト抗体またはその抗原結合性フラグメント、例えばFab、F(ab')2およびFvフラグメント（ただし、エピトープ決定基に結合しうるもの）でありうる。本方法において使用する抗体はポリクローナル抗体でありうるが、より好ましくは、モノクローナル抗体である。種々のエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体は、当技術分野でよく知られた方法により、該タンパク質の抗原含有フラグメントから製造される（Ausubelら, 前掲を参照されたい）。
【０１４６】
本発明における治療用途には、CTGFまたはその断片に対する「ヒト」または「ヒト化」抗体を使用する治療用途が含まれる。ヒト化抗体は、親抗体（すなわち、典型的にはマウス由来のもの）と同じ結合特異性および増強されたヒト特性を有する抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、例えば、鎖シャフリング（chain shuffling）により又はファージディスプレイ技術を用いることにより得ることができる。例えば、CTGFに特異的な非ヒト抗体の重または軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドを、ヒト相補性（軽または重）鎖可変ドメインのレパートリーと組合せる。関心のある抗原に特異的なハイブリッドペアを選択する。ついで、選択したペアからのヒト鎖をヒト相補性可変ドメイン（重または軽）のレパートリーと組合せ、ヒト化抗体ポリペプチド二量体を抗原に対する結合特異性に関して選択することが可能である。本発明の方法において使用しうるヒト化抗体の製造に関して記載されている技術は、例えば、米国特許第5,565,332号、第5,585,089号、第5,694,761号および第5,693,762号に開示されている。さらに、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の製造に関して記載されている技術は、例えば、米国特許第5,545,806号および第5,569,825号に記載されている。
アンチセンス
【０１４７】
本発明は、CTGFまたはその断片の発現および活性を抑制するためにアンチセンス技術を用いる治療アプローチを提供する。特に、CTGFをコードするDNAの転写またはCTGF mRNAの翻訳を直接的に妨げる治療アプローチを用いて、CTGFおよびCTGFの断片の発現および活性を改変することが可能であろう。
【０１４８】
アンチセンス技術は、標的タンパク質をコードする又はその発現を指令する標的配列へのアンチセンス配列の特異的結合による、標的タンパク質の発現のモジュレーションに基づくものである（例えば、Agrawal, S.編, (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ; Alamaら (1997) Pharmacol Res 36(3):171-178; Crooke (1997) Adv Pharmacol 40:1-49; Lavroskyら (1997) Biochem Mol Med 62(1):11-22を参照されたい）。
【０１４９】
アンチセンス配列の送達は、例えば、発現ベクターを使用する細胞内送達またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの直接投与のような種々の方法により達成することができる。
【０１５０】
標的タンパク質をコードする細胞性配列の少なくとも一部に相補的な配列を転写後に与える組換え発現ベクター、例えばキメラウイルスまたはコロイド分散系を使用することにより、アンチセンス療法などにおける送達を細胞内に行うことが可能である（例えば、Slaterら (1998) J Allergy Cli Immunol 102(3):469-475を参照されたい）。アンチセンス配列の送達は、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターを含む種々のウイルスベクターによっても達成することが可能である（例えば、Miller (1990) Blood 76:271; UckertおよびWalther (1994) Pharacol Ther 63(3):323-347を参照されたい）。本明細書に記載のアンチセンス遺伝子治療に使用しうるベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたは好ましくはRNAウイルス、例えばレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
標的細胞へのアンチセンス配列の送達に用いうる他の遺伝子送達メカニズムには、コロイド分散およびリポソーム由来系、人工ウイルスエンベロープ、および当業者に利用可能な他の系が含まれる（例えば、Rossi (1995) Br Med Bull 51(1):217-225; Morrisら (1997) Nucl Acids Res 25(14):2730-2736; Boadoら (1998) J Pharm Sci 87(11):1308-1315を参照されたい）。例えば、送達系は、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質に基づく系、例えば水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを利用するものでありうる。
【０１５２】
以下の実施例により、本発明を更に詳しく説明することとする。以下の製造例および実施例は、当業者が本発明をより明らかに理解し実施しうるように記載されている。しかし、本発明の個々の態様の単なる例示を目的とした、例示されている実施形態により本発明の範囲は限定されるものではなく、機能的に同等な方法も本発明の範囲内である。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、本明細書の説明および添付図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものである。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：  RPE細胞およびCECはCTGF mRNAを発現する
ヒトRPE細胞を以下のとおりに誘導した。ヒト胎児眼（妊娠18〜26週）をAnatomic Gift Foundation（Woodbine, GA）から入手した。既に記載されている方法（Jinら (2000) IOVS 41:4324-4332）を用いて、ヒト胎児眼からRPE細胞を単離した。継代2〜4のRPE細胞をすべての研究に使用した。10％ ウシ胎仔血清（Gibco/BRL, Gathersbery, MD）、2 mM グルタミン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび100μg/ml ペニシリン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で補足されたダルベッコ・イーグル培地（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）内で、RPE細胞を培養した。サイトケラチンに対する抗体（カタログ番号M0821, Dako, Carpinteria, CA）、内皮細胞抗原フォンビルブラント因子（カタログ番号M0616, Dako）およびマクロファージ抗原CD11c（カタログ番号M0732, Dako）を使用する免疫細胞化学染色により、培養RPE細胞の純度を評価した。これらの研究に使用した培養RPE細胞は、典型的には、これらの細胞型特異的マーカーを使用して行った免疫細胞化学染色に基づけば純度99％であった。
【０１５４】
既に記載されている方法（Hoffmannら (1998) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 236:779-784）を用いて、ウシ眼からCECを単離した。簡潔に説明すると、特異的内皮細胞マーカーであるLycopersicon esculentum（Sigma Chemical Co.）でコーティングされた磁性ビーズ（Dynabeads）を使用して、ウシ眼からCECを単離した。ウシ眼から単離したCECは、フォンビルブラント因子に対するポジティブ免疫染色により及びジアセチル化低密度リポタンパク質への単離CECの結合能により血管内皮細胞であることが確認された（Hoffmanら, 前掲）。
【０１５５】
CTGF mRNAの発現を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いて培養ヒトRPE細胞および培養ウシCECにおいて調べた。FastTrack Kit（Invitrogen, San Diego, CA）を製造業者が記載している方法に従い使用して、ポリ(A)+ RNAをRPE細胞およびCECから単離した。オリゴ-d(T)プライマー（カタログ番号C110A, Promega, Madison, WI）と共にM-MLV逆転写酵素（Gibco/BRL）を使用して、第1鎖cDNAを42℃で合成した。ヒトCTGFまたはウシCTGFに特異的なオリゴヌクレオチド配列プライマーを使用して、PCRを行った。RPE細胞由来のヒトCTGF配列の増幅のためのPCRに使用したプライマー配列は、5'-gcatccgtactcccaaaatc-3'（配列番号1）および5'-cttcttcatgacctcgccgt-3'（配列番号2）であった。CEC由来のウシCTGF配列のPCR増幅に使用したプライマー配列は、5'-gatcataggactgtattagtgc-3'（配列番号3）および5'-ctgacttagagacgaacttg-3'（配列番号4）であった。PCRは、以下の条件を用いるPerkin-Elmer/Centur DNAサーマルサイクラーを使用して行った：94℃で1分間の変性、60℃で1分間のアニーリング、および72℃で45秒間の伸長。30サイクルのPCRの後、増幅産物を1.2％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムでのゲルの染色により可視化した。予想どおり、これらのプライマーの使用は、210塩基対（ヒトCTGF）および220塩基対（ウシCTGF）のサイズのCTGF特異的DNA増幅産物を与えた。
【０１５６】
CTGF mRNAを培養RPE細胞およびCECにおいて検出した。図1Aおよび図1B（右レーン）に示すとおり、予想された210塩基対および220塩基対のCTGF RT-PCR増幅産物の存在から明らかなとおり、RPE細胞およびCECは共に、CTGF mRNAの発現に関して陽性であった。図1Aおよび図1B（左レーン）に示す分子量マーカーは100塩基対のDNAラダー（Gibco/BRL）である。CTGF mRNAは成人RPE細胞においては観察されなかった（データ非表示）。これらの結果は、多数の眼障害の病理発生（PVRおよびCNVの発生を含む）に関与するRPE細胞およびCECがCTGF mRNAを発現することを示した。したがって、種々の眼細胞はCTGF mRNAを発現する能力を有する。
【０１５７】
実施例２：  RPE細胞およびCECはCTGFポリペプチドを発現する
RPE細胞およびCECによるCTGFポリペプチドの発現を調べた。RPE細胞およびCECを前記実施例1に記載のとおりに単離し、6ウェル組織培養プレート内で培養した。培養RPE細胞を無血清DMEM内で24時間にわたり飢餓状態に付した。培養CECを、0.1％ ウシ血清アルブミンを含有する無血清必須基礎培地（Essential Basal Medium）（EBM）（BioWhittaker, Walkersville, MD）内で24時間にわたり飢餓状態に付した。無血清RPE細胞培地を、トランスフォーミング増殖因子β2（TGFβ2）（1〜30ng/ml）または血管内皮増殖因子（VEGF）（10〜50ng/ml）を含有する新鮮な無血清培地と交換した。無血清CEC培地を、組換えVEGF（10〜50ng/ml）またはTGFβ2（1〜30ng/ml）を含有する1％ ウシ胎仔血清を含有する新鮮な培地と交換した。両方の細胞型を、増殖因子の存在下、更に24時間インキュベートした。細胞ライセートを集め、TRIS-HCl 10％ ポリアクリルアミドゲル（Ready Gel, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）上で電気泳動し、該タンパク質を該ゲルからPVDFブロッティングメンブレン（Millipore, Bedford, MA）にトランスファーした。細胞ライセート中のCTGFの存在をウエスタンブロット分析により調べた。当技術分野で公知の標準的な方法により調製したポリクローナルウサギ抗CTGF抗体を使用し、ついでHRP結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を使用して、標準的な方法により、該メンブレンをCTGFに関してプローブした。ECL化学発光検出溶液（Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH）を加え、Hyperfilm（Amersham Pharmacia Biotech）にさらすことより、イメージの現像を行った。
【０１５８】
培養RPE細胞はCTGFポリペプチドを発現した。図2Aおよび図2Bのウエスタンブロットが示すとおり、TGFβ2またはVEGFの添加の非存在下では、検出可能なレベルのCTGFタンパク質が未処理RPE細胞ライセートにおいて観察された。RPE細胞を無血清培地内で種々の濃度（1〜30ng/ml）のTGFβ2で48時間刺激すると、未処理対照細胞と比べてCTGFタンパク質の発現の増強がもたらされた（図2A）。図2Aに示すとおり、RPE細胞内でのTGFβ2によるCTGF発現の刺激は用量依存的であった。増強されたCTGF発現（対照の発現を上回るもの）は、僅か1ng/mlの濃度のTGFβ2で処理されたRPE細胞において観察された。これらの結果は、RPE細胞がCTGFポリペプチドを合成すること、およびRPE細胞によるCTGF発現がTGFβ2により用量依存的にアップレギュレーションされることを示した。VEGFで処理されたRPE細胞においては、CTGF発現の増強は何ら検出されなかった（図2B）。
【０１５９】
培養CECもCTGFタンパク質を発現することが判明した。図3Aおよび図3Bのウエスタンブロットは、検出可能なレベルのCTGFタンパク質が未処理CEC由来のライセートにおいて観察されたことを示している。CECを低血清培地内で種々の濃度（10〜50ng/ml）のVEGFで48時間刺激すると、未処理対照細胞と比べてCTGFタンパク質の発現の増強がもたらされた。図3Bに示すとおり、CEC内でのVEGFによるCTGF発現の刺激は用量依存的であった。TGFβ2で処理されたCECにおいては、CTGF発現の増強は何ら検出されなかった（図3A）。総合すると、これらの結果は、多数の眼障害（例えば、PVRおよびCNV）の病理発生において重要な役割を果たしているRPE細胞およびCECがCTGFポリペプチドを発現すること、ならびにこれらの細胞におけるCTGF発現が、TGFβ2およびVEGFにより、互いに異なって調節されることを示した。
【０１６０】
これらの結果は、眼細胞がCTGFタンパク質を発現することに加えて、眼細胞内でのCTGF発現が、眼内に存在する種々の増殖因子およびサイトカインにより調節されることも示した。また、これらの結果は、CTGF発現の異なった調節が種々の眼細胞内で生じることを示した。特に、TGFβ2はRPE細胞内でのCTGF発現の増強を刺激した。眼内では、硝子体は高レベルのTGFβを含有する（Limbら (1991) Eye 5: 686-693）。種々の眼障害が硝子体へのRPE細胞の曝露に関連している。したがって、種々の眼障害の開始、進行または維持は眼細胞（例えば、RPE）内でのTGFβによるCTGF発現の刺激から生じうる。眼血管新生におけるVEGF発現の増強が報告されている（Lopezら (1996) Invest Ophthalmol Vis Sci 37:855-868; Simoら (2002) Am J Ophthalmol 134: 376-382）。したがって、VEGF発現の増強に関連した種々の眼障害は、脈絡膜または網膜内皮がVEGFにさらされるとCTGFの増強を示す。
【０１６１】
培養RPE細胞の上清内のCTGFレベルをELISA分析により測定した。培養ヒトRPE細胞を、前記のとおり、TGFβ2（20ng/ml）で又はそれを伴わずに、48時間処理した。細胞上清を集め、5,000rpmで5分間の遠心分離により清澄化した。ELISAアッセイを行うまで、サンプルを-70℃で保存した。ELISAデータは、未処理対照RPE細胞がCTGF（9ng/ml）を分泌することを示した。TGFβ2で処理されたRPE細胞は、増加したレベルのCTGF（47ng/ml）を分泌した。総合すると、これらの結果は、眼細胞がCTGFを合成し分泌することを示した。また、これらの結果は、眼細胞により合成されたCTGFが定性的および定量的に測定されうることを示した。
【０１６２】
実施例３：  組換えヒトCTGFの生産
組換えヒトCTGF（rhCTGF）を以下のとおりに調製した。完全長ヒトCTGF cDNA（DB60R32）をGary Grotendorst博士（University of Miami Medical School）から入手した（Bradhamら (1991) J Cell Biol 114:1285-1294）。増幅産物の末端のいずれかにBamHI制限酵素部位（下線部）を付加するプライマー（5'-gctccgcccgcagtgggatccatgaccgccgcc-3'（配列番号5）および5'-ggatccggatcctcatgccatgtctccgta-3'（配列番号6））および鋳型としてのDB60R32 DNAを使用するポリメラーゼ連鎖反応により、オープンリーディングフレームのみを含むCTGF cDNAを作製した。得られた増幅DNA断片をBamHIで消化し、アガロースゲル上で精製し、バキュロウイルス（供与）発現プラスミドpFastBac1（Invitrogen, Carlsbad, CA）のBamHI部位内に直接的にサブクローニングした。pFastBac1/CTGF cDNAベクター構築物をbacmid DNA内に転移（transpose）させ、BAC-TO-BAC Baculovirus Expression Systemマニュアル（Invitrogen）に概説されている製造業者のプロトコールに従い、組換えバキュロウイルスを作製した。Sf9昆虫細胞における組換えバキュロウイルス力価の増強を、当技術分野で公知の標準的な方法（MurphyおよびPiwnica-Worms, (1984) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Ausubelら編) John Wiley & Sons, Inc.）を用いて行った。
【０１６３】
rhCTGFの発現および生産を以下のとおりに行った。浮遊培養に順化されたHIGH FIVE昆虫細胞をSF900II培地（Invitrogen）内で1.0x106細胞/mlの細胞密度まで増殖させた。ついで、CTGFを含有するバキュロウイルスを10:1の感染多重度で該細胞に感染させた。感染後、該細胞を27℃で40時間インキュベートした。ついで該細胞を遠心分離によりペレット化し、CTGF含有馴化培地を集め、0.22μmフィルターで濾過した。ついで該馴化培地を、50mM Tris（pH 7.2）で予め平衡化された5ml Hi-Trapヘパリンカラム（Amersham Biosciences Corp., Piscataway NJ）に直接的にアプライした。ついで該ヘパリンカラムを100mlの350mM NaCl/50mM Tris（pH 7.2）で洗浄し、結合rhCTGFを350mM NaClから1200mM NaClまでの直線勾配で15カラム容量にわたり溶出した。画分をSDS-PAGEによりrhCTGFの存在に関して分析した。
【０１６４】
rhCTGFを含有する画分をプールし、50mM Tris（pH 7.5）で1:4に希釈した。rhCTGFプールを、10カラム容量の50mM Tris（pH 7.5）で予め平衡化されたカルボキシメチル（CM）イオン交換カラム（POROS CMカラム, PerSeptive Biosystems, Framingham, MA）にローディングした。該CMカラムを350mM NaCl/50mM Tris（pH 7.2）で洗浄し、結合rhCTGFを350mM NaClから1200mM NaClまでの直線勾配で15カラム容量にわたり溶出した。該画分をSDS-PAGEによりCTGFの存在に関して分析した。rhCTGFを含有する画分をプールし、rhCTGF材料として使用した。
【０１６５】
実施例４：  rhCTGFのN末端およびC末端断片の製造
rhCTGFのN末端断片およびC末端断片を以下のとおりに製造した。前記のとおりに製造し精製した組換えヒトCTGFを、キモトリプシンン1単位当たり1.5mgのrhCTGFを使用して、キモトリプシンビーズ（Sigma Chemical Co., St. Louis MO）での処理により消化した。rhCTGFのキモトリプシン処理は室温で6時間進行させた。消化産物およびキモトリプシンビーズを遠心分離し、キモトリプシンビーズを廃棄し、酵素により切断されたrhCTGFを含有する上清を50mM Tris（pH 7.5）で1:5に希釈した。この希釈上清をHi-Trapヘパリンカラムにアプライした。通り抜け画分（flow-through）を集めた。それはrhCTGFのN末端断片を含有していた。該ヘパリンカラムを350mM NaClで洗浄し、rhCTGFの結合C末端断片および未消化rhCTGFを、前記のとおりの350mMから1200mMまでのNaClの直線勾配で溶出した。該画分をSDS-PAGEによりrhCTGFのC末端断片の存在に関して分析した。rhCTGFのC末端断片を含有する画分を、C末端rhCTGFの観察純度に従いプールした。
【０１６６】
rhCTGFのN末端断片を含有する該ヘパリンカラム通り抜け画分を、0.5M 硫酸アンモニウム/50mM Tris（pH 7.5）を含有するよう調節した。ついで、rhCTGFのN末端断片を含有するサンプルを、0.5M 硫酸アンモニウム/50mM Tris（pH 7.5）で予め平衡化された15mlのフェニルセファロースHPカラム（Amersham Pharmacia Biotech）上にローディングした。ついで該フェニルセファロースHPカラムを15カラム容量の0.5M 硫酸アンモニウム/50mM Tris（pH 7.5）で洗浄した。rhCTGFの結合N末端断片を0.5Mから0.0Mまでの硫酸アンモニウム/50mM Tris（pH 7.5）の直線勾配で約15カラム容量にわたり溶出した。画分をSDS-PAGEによりrhCTGFのN末端断片の存在に関して分析した。rhCTGFのN末端断片を含有する画分をプールした。rhCTGFのN末端断片を含有するこのプールを濃縮し、該バッファーを、Amicon限外濾過YM10膜を使用して、50mM Tris、400mM NaCl（pH 7.2）と交換した。
【０１６７】
実施例５：  CTGFはフィブロネクチンへのRPE細胞およびCECの付着を刺激する
細胞外マトリックス分子は、眼細胞の分化、付着、遊走および増殖を含む眼細胞の種々の活性を媒介するうえで決定的に重要な役割を果たしている。眼細胞における細胞外マトリックス産生および眼障害にCTGFが果たす役割を調べるために、フィブロネクチンへのRPE細胞およびCECの付着に及ぼすCTGFの影響を、以下のアッセイを行うことにより調べた。
【０１６８】
前記実施例1に記載のとおりに単離し培養したRPE細胞またはCEC（1×105細胞/ml）をトリプシン処理により組織培養プレートから取り出した。RPE細胞を、0.4％ ウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地に懸濁させて該プレートに付着させ、種々の濃度（10〜100ng/ml）のrhCTGFと共に37℃で48時間インキュベートした。RPE細胞を該プレートから脱離させ、ついで1×104細胞（100マイクロリットル中）を、フィブロネクチン（50μg/ml）で予めコーティングされた96ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson Labware, Bedford, MA）に加えた。該細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに37℃で60分間にわたり付着させた。ついで該プレートのウェルをリン酸緩衝食塩水（PBS）で穏やかに2回洗浄して、未付着細胞を除去した。MTT（3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H テトラゾリウム ブロミド, Sigma Chemical Co.）の5mg/ml 溶液（20μl）を含有する新鮮な培地（150μl）を各ウェルに加え、付着細胞を含有する該プレートを37℃で5時間インキュベートした。該ウェルから上清を取り出し、付着細胞に関連したホルマザン沈殿物を100μlの100％ DMSO（Sigma Chemical Co.）で可溶化し、ついで該プレートをシェーカー上に10分間配置した。Dynatech MR 600マイクロプレートリーダーを使用して、550mmの吸光度を測定した。このMTTアッセイは、該フィブロネクチンコーティング組織培養プレートに付着したままの細胞の数の測定の定量分析をもたらす。このアッセイは、該プレートの振とう後に行う。したがって、このアッセイはフィブロネクチンへの該細胞の付着の強度に相関される。付着細胞数は、記載されるMTTアッセイにおいて測定された吸光度に比例した。
【０１６９】
RPE細胞（図4A）およびCEC（図4B）は共に、rhCTGFでの処理後には、未処理対照細胞の場合に比べて、フィブロネクチンへの付着の増強を示した。図4Aおよび図4Bに示すとおり、フィブロネクチンへのRPE細胞およびCECの付着に対するrhCTGFの効果は用量依存的であった。RPE細胞およびCECのどちらにおいても、rhCTGF処理細胞においては、50ng/mlまたは100ng/mlのrhCTGF濃度で（図4Aおよび図4Bにおいて、アステリスク（P<0.05）により示されている）、対照細胞と比べて、フィブロネクチンへの細胞の付着における顕著な増強が観察された。これらの結果は、CTGFが、少なくとも部分的にはRPE細胞およびCECにおけるフィブロネクチンの産生を刺激することにより、眼細胞での細胞外マトリックスの産生に影響を及ぼすことを示した。
【０１７０】
実施例６：  CTGFはRPE細胞およびCECの走化性を刺激する
眼細胞の遊走および走化性は、脈絡膜血管新生およびPVRを含む多数の眼障害に関連している。RPE細胞およびCECの走化性に及ぼすCTGFの影響を調べた。走化性を調べるために、既に記載されている改変ボイデン・チェンバーアッセイ（Heら (1998) Biochem Biophys Res Commun 249:253-257）を用いて、細胞遊走アッセイを行った。RPE細胞およびCECを前記実施例1に記載のとおりに単離し、24ウェルのボイデン・チェンバープレートのフィブロネクチンコーティングインサート（50μg/ml）上、0.4％ ウシ胎仔血清を含有する培地内で培養した。種々の濃度（1〜50ng/ml）のrhCTGFを該アッセイプレートの下方ウェルに加えて、RPE細胞およびCECに関するCTGFの走化性活性を調べた。ついで該細胞を5時間インキュベートし、その後該チェンバーインサートをPBSで3回洗浄し、氷冷100％ メタノールで10分間固定し、ヘマトキシリンで20分間にわたり対比染色した。位相差顕微鏡検査（320倍）により、遊走細胞数を計数した。遊走細胞数は、インサートあたり4つの無作為に選択した視野（field）において測定した。
【０１７１】
図5Aおよび図5Bは、rhCTGFがRPE細胞およびCECの遊走および走化性を用量依存的に刺激したことを示している。図5Aに示すとおり、RPE細胞遊走における、対照を上回る顕著な増強は、30ng/mlまたは50ng/ml rhCTGFの添加後に生じた（図5Aにおいて、アステリスク（P<0.01）により示されている）。50ng/ml rhCTGFの添加の場合、RPE細胞遊走の度合は、RPE細胞に対する強力な化学誘引因子であり陽性化学誘引因子対照として使用した血小板由来増殖因子（PDGF）（20ng/ml）で観察されたものに匹敵していた。したがって、rhCTGFは、RPE細胞に対する強力な走化性活性を示し、走化性の刺激において、強力な公知化学誘引因子であるPDGFと同等に有効あった。
【０１７２】
図5Bに示すとおり、rhCTGFはCECの遊走および走化性を、未処理対照細胞において観察されたものより強く刺激した。10ng/ml、30ng/mlおよび50ng/mlの濃度のrhCTGFの添加は、未処理対照と比べてCECの遊走における顕著な増強をもたらした（図5Bにおいて、アステリスク（P<0.05）により示されている）。30ng/mlおよび50ng/mlの濃度のrhCTGFの添加は、CECの遊走の刺激において、CECに対する強力な公知化学誘引因子であるVEGF（10ng/ml）と少なくとも同程度に有効であった。したがって、rhCTGFはCECに対する強力な走化性活性を示し、CECにおける走化性の刺激において、強力な公知化学誘引因子であるVEGFと同等に有効であった。総合すると、これらの結果は、CTGFが種々の眼細胞に対する強力な走化性因子であることを示している。
【０１７３】
RPE細胞の走化性に対するCTGF断片の効果も調べた。種々の濃度の組換えヒトCTGFのN末端断片（10〜100ng/ml）およびC末端断片（5〜30ng/ml）を、前記のとおりの細胞遊走アッセイにおいて試験した。図6Aに示すとおり、rhCTGFのC末端断片はRPE細胞の遊走および走化性を用量依存的に刺激した。20ng/ml rhCTGF C末端断片を加えた場合に、RPE細胞におけるCTGF断片の最大走化性効果が観察された。20ng/ml rhCTGF C末端断片を加えた場合には、RPE細胞遊走の度合は、PDGFで観察されるものに類似していた。また、20ng/ml rhCTGF C末端断片でRPE細胞において観察された走化性応答は、30ng/ml rhCTGFを使用した場合に観察されたものと実質的に同等であった（前記の本実施例および図5Aを参照されたい）。CTGFのN末端断片で処理したRPE細胞においては、対照と比べた場合、細胞遊走の若干の増強が観察されたに過ぎなかった（図6B）。
【０１７４】
総合すると、これらの結果は、CTGFおよびCTGF断片が眼細胞の走化性および遊走を刺激することを示した。したがって、CTGFおよびCTGF断片は、種々の眼障害に関連した眼細胞遊走を抑制するための新規治療標的となる。
【０１７５】
実施例７：  CTGFはRPE細胞の増殖を刺激する
健康な眼での正常な条件下では、RPE細胞は静止状態にあり、したがって増殖しない。しかし、多数の眼障害においては、RPE細胞増殖を含む眼細胞増殖が観察され、それは種々の眼障害の発生および進行に関連している。したがって、眼細胞増殖に対するCTGFの効果を以下のとおりに調べた。
【０１７６】
3H-チミジン取込み／摂取アッセイを用いて、RPE細胞増殖を測定した。ヒトRPE細胞を前記実施例1に記載のとおりに単離し、種々の濃度（1〜100ng/ml）のrhCTGFの存在下または非存在下、24ウェル組織培養プレート中、1％ ウシ胎仔血清を含有するDMEM内で48時間インキュベートした。ついでRPE細胞培養物を、インキュベーションの最後の16時間にわたり3H-チミジン（1μCi/ウェル, Amersham）でパルス標識した。ついで培養物への3H-チミジンの取込みを、既に記載されているとおりに測定した（Heら, 前掲）。
【０１７７】
図7は、rhCTGFがRPE細胞に対して分裂活性を示したことを表している。特に、rhCTGFは、rhCTGF処理の48時間後に、RPE細胞内への3H-チミジン取込みの用量依存的増加を刺激した。50ng/mlおよび100ng/mlのrhCTGF濃度においては、rhCTGFはRPE細胞内への3H-チミジン取込みにおける約20％の増加を刺激し、これは、対照と比べて統計的に有意な増加である（図7において、アステリスク（P<0.05）により示されている）。これらの結果は、RPE細胞増殖がCTGFにより誘導されることを示した。したがって、CTGFは眼細胞の増殖を刺激する。
【０１７８】
実施例８：  CEC管形成のCTGF誘導
血管新生および新血管形成は、複雑且つ高度に組織化された一連の細胞イベントおよび内皮細胞機能の変化（増殖、遊走および分化を含む）を伴う。眼の内皮細胞の機能および血管形成に対するCTGFの効果をアッセイするために、以下の管形成アッセイをCECに対して行った。管形成アッセイは、原始的な血管構造体または血管を培養下で形成する内皮細胞の能力を調べる複雑な三次元アッセイである。このアッセイを用いた場合に原始的血管が形成するためには、内皮細胞は、増殖、遊走、分化、および三次元構造体への組織化を受ける。したがって、このアッセイを用いて、CEC管形成に対するCTGFの効果を調べた。
【０１７９】
ウシCECを前記実施例1に記載のとおりに単離した。CECの単層培養物をフィブロネクチンコーティング6ウェルプレート上で成長させた。増殖培地を除去し、1％ ウシ胎仔血清を含有する新鮮なEGM培地と交換した。組換えヒトCTGF（20ng/ml）を該培養物に加え、該CECを更に9日間インキュベートした。位相差顕微鏡検査により、管形成を毎日モニターし、写真撮影した。
【０１８０】
CECの単層培養物は、rhCTGFの添加に応答した管形成の増強を示した。図8Aに示すとおり、rhCTGFの添加の非存在下では、CECは単層培養物のままであった。図8Bに示すとおり、rhCTGFの存在下では、付着内皮細胞が伸長し、細胞-細胞接触を形成し、管様構造体の分枝網構造を形成した（図8Bの矢印を参照されたい）。これらの結果は、内皮細胞管形成に対するVEGF（公知血管新生因子）の効果を示す既に報告されているもの（Murataら (2000) Invest Ophthalmol Vis Sci 41:2309-2317）に類似していた。したがって、これらの結果は、培養CECにおいてrhCTGFが管形成を誘導したことを示しており、このことは、CTGFが眼-内皮細胞の分化、増殖および遊走を刺激したことを示している。また、これらの結果は、種々の眼障害に関連した血管新生を含む眼内の血管新生をCTGFが誘導しうることを示唆している。
【０１８１】
実施例９：  CTGFはRPE細胞におけるエクストラ（extra）ドメインAフィブロネクチンの発現を誘導する
エクストラ（extra）ドメインAフィブロネクチン（EDA(+)FN）の発現の増強は、眼組織損傷を含む組織損傷に関連している。特に、PVRおよびCNVを有する患者から得た組織サンプルにおいて、細胞フィブロネクチン発現が同定されている。眼細胞における細胞フィブロネクチン発現に対するCTGFの効果を調べるために、以下の実験を行った。
【０１８２】
ヒト胎児RPE細胞（継代2〜4）の培養物を、実施例1に記載のとおりに、サブコンフルエントになるまで成長させた。RPE細胞を24時間にわたり血清飢餓に付し、ついで無血清培地内でrhCTGF（30ng/ml）、TGFβ2（30ng/ml）またはそれらの両方の増殖因子で48時間処理した。ついでRPE細胞を集め、細胞溶解バッファーを使用して細胞溶解した。得られた細胞ホモジネートを、DNAをせん断するために25G針に通し、氷上で30分間インキュベートし、ついで12,000rpm、4℃で10分間遠心分離した。FN EDA特異的モノクローナル抗体（Clone IST-9; Accurate Chemicals, Westbury, NY）を使用するウエスタンブロット分析により、サンプルを細胞フィブロネクチン発現（EDA(+)FNアイソフォーム）に関して調べた。図9に示すとおり、rhCTGFのみの添加は、検出可能なEDA(+)FN発現をRPE細胞において引き起こさなかった。TGFβ2のみの添加は、弱いEDA(+)FN発現をRPE細胞において引き起こした。CTGFとTGFβ2の両方を培養RPE細胞に加えた場合には、EDA(+)FN発現の著しい増強が観察された。これらの結果は、眼細胞内での細胞外マトリックスの産生を刺激するTGFβの能力をCTGFが増強することを示した。
【０１８３】
実施例１０：  フィブロネクチンはRPE細胞におけるCTGFの発現を誘導する
フィブロネクチンは、PVRにおいて及び網膜または脈絡膜血管新生に関連した状態において豊富に発現される。眼細胞におけるフィブロネクチンの発現に対するCTGFの効果を調べるために、以下の実験を行った。前記実施例1に記載のとおりに単離したRPE細胞を、種々の量（10ng〜5μg）のフィブロネクチンで予めコーティングされた6ウェルプレート中のプラスチック上に播いた。24時間後、上清をCTGF発現に関してELISAにより試験した。細胞ホモジネートをCTGF発現に関してウエスタンブロット分析により試験した。図10に示すとおり、フィブロネクチン上でプレーティングしたRPE細胞は、細胞ホモジネートのウエスタンブロット分析のデンシトメトリー分析による測定で、CTGF発現の用量依存的増強を示した。僅か10ngのフィブロネクチン上でプレーティングされたRPE細胞は、0.1％ BSA上でプレーティングされた対照RPE細胞において観察されたものと比べて、CTGF発現の増強を示した。フィブロネクチンは、フィブロネクチン上でプレーティングされたRPE細胞の細胞ホモジネート中でのCTGF発現において対照と比べて80％の増加を誘導した。ELISA分析は、これらの細胞の上清中のCTGFおよびCTGF N末端断片の両方のレベルの倍加を示した（データ非表示）。RPE細胞は、フィブロネクチンを含有する種々の眼環境内に遊走する（これは種々の眼障害において生じる）ため、これらの結果は、フィブロネクチンがRPE細胞におけるCTGF発現を刺激するという証拠を提供するものである。
【０１８４】
平行実験において、フィブロネクチン特異的インテグリンであるα5β1インテグリンに対する中和抗体での細胞の前処理は、細胞ホモジネートおよび上清の両方で観察されたCTGF発現の増強を有意に遮断した（図11）。αvβ3インテグリンおよびαvβ1インテグリンに対する抗体の添加は、フィブロネクチン誘導性CTGF発現に対して有意な効果を及ぼさなかった。α5β1インテグリンはフィブロネクチンへのRPE細胞の付着に関連しているため、これらの結果は、眼細胞内でのCTGF産生の刺激におけるフィブロネクチンの役割を更に裏付けるものであった。
【０１８５】
実施例１１：  CTGF発現および網膜ミュラー細胞遊走に対するその効果
ラット網膜ミュラー細胞を樹立細胞系（Sarthyら (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci 39(1):212-6）から得、実施例1に記載のRPE細胞培養物と同じ培地内で培養した。培養網膜ミュラー細胞において、RT-PCRを用いてCTGF mRNAの発現を調べた。ミュラー細胞の場合の単離、mRNAおよびcDNA合成のための方法はRPEの場合と同じであった（詳しくは実施例1を参照されたい）。該細胞内でのCTGF mRNA発現の検出のために、ラットCTGFに特異的なオリゴヌクレオチド配列プライマーを使用してPCR増幅を行った。ラットCTGFのプライマー配列は5'-ctccagtctgcagaaggtattc-3'（配列番号7）および5'-caaccgcaagattggagtgt-3'（配列番号8）であり、これらは480塩基対のラットCTGF DNA断片の増幅をもたらした。PCR増幅に用いた条件は以下のとおりであった：94℃で1分間、60℃で1分間および72℃で2分間の伸長、合計35サイクル。ラット網膜ミュラー細胞CTGFのPCR産物をアガロースゲルにおいて分離した。予想されたサイズのPCR増幅産物が観察され（データ非表示）、このことは、ラット網膜ミュラー細胞がCTGFを発現することを示している。
【０１８６】
前記実施例6に記載の修飾されたボイデン・チェンバーアッセイを用いて、ミュラー細胞遊走をアッセイした。CTGFはミュラー細胞遊走を用量依存的に誘導した。30ng/mlおよび50ng/mlの用量では、rhCTGFはフィブロネクチンへのミュラー細胞の遊走の有意な増強を刺激した（データ非表示）。これらの結果は、CTGFがミュラー細胞の走化性誘導因子であることを示した。PVR膜内にはミュラー細胞が存在するため、これらの結果は、PVRの発生におけるミュラー細胞遊走に対するCTGFの役割を示した。
【０１８７】
実施例１２：  ヒトPVR膜組織におけるCTGF発現
眼障害を有する個体から得たヒトPVR膜におけるCTGFの発現を免疫組織化学的分析により調べた。眼に対する外傷または網膜剥離の結果として形成されたPVR膜を患者から外科的に摘出した。単離されたPVR膜を免疫染色用に以下のとおりに調製した。単離されたPVR膜をスナップ凍結（snap-frozen）し、クリオスタットを使用して6μmに切片化した。解凍組織切片を風乾し、PBS（pH 7.4）で再水和させ、5％ 正常ヤギ血清で15分間ブロッキングした。切片をウサギ抗CTGFポリクローナル抗体（当技術分野で公知の標準的な方法を用いて調製した一次抗体）と共に60分間インキュベートした。ついで切片をPBSで3回洗浄（各洗浄は5分間）して、未結合抗CTGF抗体を除去した。ついで切片をビオチン化抗ウサギ抗体（1:400希釈された二次検出抗体, Burlingame, CA）と共にインキュベートし、PBSで5分間洗浄した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼを加え、AECキット（Zymed）を使用して発色を行った。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、グリセリン-ゼラチン媒体でマウントした。
【０１８８】
免疫組織化学検査から明らかなとおり、検査した全10個の単離PVR膜がCTGF発現に関して陽性に染色された。図12に示すとおり、PVR膜内では、CTGFは細胞外腔に又は線維性PVR膜内の細胞に局在していた。正常な非疾患RPEの切片においては、CTGFに対する免疫染色は検出されなかった（データ非表示）。これらの結果は、CTGFが眼障害において発現されることを示した。
【０１８９】
単離されたヒトPVR膜に対して、二重イムノペルオキシダーゼおよびアルカリペルオキシダーゼ染色も行った。解凍した凍結切片を10％ 中性緩衝化ホルマリン（Polyscience, Inc., Warrington, PA）で10分間固定し、Tris-HCl（pH 7.4）で3回洗浄（各洗浄は5分間）し、5％ ヤギ血清で15分間ブロッキングした。前記のとおり抗CTGF抗体を使用して該切片をCTGFに対して免疫染色した後、該スライドをTris-HClバッファーで3回洗浄した。サイトケラチン（網膜においては、サイトケラチンはRPE細胞の特異的マーカーである）に特異的な一次抗体およびCD31（内皮細胞特異的マーカー）に特異的な一次抗体を加え、該スライドを室温で1時間インキュベートした。該スライドをTris-HClバッファーで3回洗浄した。該切片をアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体（Vector, 1:500希釈物）と共に30分間インキュベートした。該スライドを再度、Tris-HClバッファーで3回洗浄した。ついで、発色のために15分間にわたり該スライドにVector Blueを加えた。
【０１９０】
免疫組織化学的分析（図12）から明らかなとおり、単離されたヒトPVR膜においてCTGFが発現された。単離されたヒトPVR膜切片の二重標識は、多数のCTGF陽性細胞が、網膜におけるRPE細胞特異的マーカーであるサイトケラチンに対しても陽性に染色されることを示した。これらの結果は、PVR膜内のRPE細胞がCTGFを発現することを示した。
【０１９１】
実施例１３：  CNV膜におけるCTGF発現
CNV膜におけるCTGFの発現を免疫組織化学的染色により調べた。加齢性黄斑変性と臨床的に診断された患者から、CNV膜を外科的に摘出した。PVR膜のCTGF免疫染色に関して前記実施例12に記載されている方法を用いた免疫染色によるCTGF発現の分析のために、その単離されたCNV膜を調製した。
【０１９２】
調べたCNV膜はCTGF発現に関して陽性に染色された。図13Aに矢印で示されているとおり、該膜の血管化領域において、最も顕著なCTGF染色が生じた。図13AはCTGF陽性細胞の細胞質染色を示す（矢印で示されている）。細胞の核はヘモトキシリンで染色される。種々の眼障害においては、活発な血管新生を示す膜もあれば、血管新生をほとんど伴わない線維性瘢痕を示す膜もある。該結果が示すところによれば、CNVにおいては、CTGFは主として新生血管膜に局在したが、いくつかのCTGF染色は非新生血管膜においても見出された。CNV膜内のCTGF染色の強度および度合は、非血管膜および線維性膜において観察されたものと比べて、血管領域においては数倍大きかった。また、CTGF陽性細胞はCNV膜内で血管を包囲していることが判明した。
【０１９３】
ある単離CNV膜において、部分的に無傷なRPE単層が観察された。図13Bに矢印で示されているとおり、RPE単層を伴う領域はCTGFに関して強陽性に染色された。図13Cに矢印で示されているとおり、該無傷RPE単層内のCTGF陽性細胞の二重染色は、多数のCTGF陽性細胞がサイトケラチン免疫反応性に関して陽性であることを示した。図13Bに示す矢じりは、RPE単層から遊走する細胞がCTGFに関して陽性に染色されたことを示している。これらの結果は、単離されたCNV膜において観察されたCTGF陽性細胞が分化転換RPE細胞（これは、典型的な網膜色素上皮細胞から、より線維芽細胞様の外観への形態学的変化を示す）であることを示した。内皮細胞マーカーCD-31およびCTGFでの二重染色から明らかなとおり、図13Dの矢印は、CNV膜内の他のCTGF陽性細胞が内皮細胞を含んでいたことを示している。また、正常な成人網膜をCTGF発現に関して調べたが、これらのサンプルのRPEまたはCECにおいてはCTGF免疫反応性は検出されなかった（データ非表示）。
【０１９４】
総合すると、これらの結果は、眼障害に関連したCNV膜においてCTGFが発現されることを示した。CNV膜におけるCTGF発現は該膜の血管領域において最も顕著であった。CTGFの発現は実質RPEおよびCECならびに残存単層内のRPEに局在していた。残存RPE単層内のCTGFの存在は、CTGFが正常な下層内皮を活性化して、部分的にはCEC機能を調節することにより脈絡膜血管新生および新血管形成の刺激を招きうることを示唆した。
【０１９５】
実施例１４：  PVRにおけるCTGF発現
PVRを有すると臨床的に診断された患者の硝子体におけるCTGFおよびCTGFの断片の発現を調べた。PVRを伴う網膜剥離（RD+PVR）、PVRを伴わない網膜剥離（RD）、網膜前膜（ERM）および黄斑孔（MH）を含む種々の眼障害を有する種々の患者から、硝子体サンプルを得た。CTGFおよびCTGFの断片の検出に特異的なELISAアッセイを用いて、これらの硝子体液中のCTGFおよびCTGFの断片のレベルを測定した。
【０１９６】
図14に示すとおり、MH、ERM、RDおよびRD+PVRを含む種々の眼障害を有する患者から得た硝子体液において、CTGF（白い棒線）およびCTGFのN末端断片（黒い棒線）が検出された。試験したすべてのサンプルにおいて、CTGF N末端断片の検出可能レベルはCTGFのものより高かった。PVRを有する患者から得た硝子体においては、PVRを伴わない眼疾患（例えば、MH）を有する患者から得た硝子体で見られるものと比べて有意に高いレベルのCTGF N末端断片が観察された（図14）。特に、RDを有する患者の硝子体におけるCTGF N末端断片のレベルは約10ng/mlであったのに対して、PVRと合併したRDを有する患者の硝子体におけるCTGF N末端断片のレベルは約20ng/mlであった（図14）。したがって、RDは単独ではCTGFのN末端断片のレベルの顕著な増加に関連していない。しかし、PVRを伴うRDにおいては、CTGFのN末端断片が上昇し、このことは、RDの際のPVRの発生におけるCTGFの役割を示唆している。
【０１９７】
これらの結果は、CTGFおよびCTGF断片のレベルが無細胞硝子体サンプルから定量的に測定されうることを示した。これらの結果は、線維形成（線維性）に関連した眼障害（例えば、PVR）を有する患者の硝子体においてはCTGFレベルが著しく上昇し、線維性態様を有しない眼障害（例えば、MH）においては、その上昇はより軽度であることも示した。
【０１９８】
実施例１５：  CNVおよび網膜血管新生におけるCTGF発現
種々の形態の眼血管新生を有すると臨床的に診断された患者の硝子体におけるCTGFの発現を調べた。臨床的に診断されたCNVおよび網膜血管新生（RNV）を有する患者から、硝子体サンプルを得た。CNVを表すサンプルは、加齢性黄斑変性（AMD）、およびAMDを伴わないCNV（CNVM非AMD）を含むものであった。RNVを表すサンプルは、増殖糖尿病網膜症（PDR）、硝子体出血を伴うPDR（PDR+VH）、およびPDRを伴わないVH（VH非PDR）を含むものであった。CTGFおよびCTGFの断片の検出に特異的なELISAアッセイを用いて、これらの硝子体液中のCTGFおよびCTGFの断片のレベルを測定した。
【０１９９】
図15に示すとおり、AMD、CNVM非AMD、PDR、PDR+VH、およびVH非PDRを含む種々の眼障害を有する患者から得た硝子体液において、CTGF（白い棒線）およびCTGFのN末端断片（黒い棒線）が検出された。試験したすべてのサンプルにおいて、CTGFのN末端断片の検出可能レベルはCTGFのものより高かった。CTGF N末端断片レベルは、PDRを有すると診断された患者から得た硝子体サンプルにおいて最高であった。これらの結果は、PDRを有する患者の硝子体においてはCTGFレベルが著しく上昇することを示した。また、これらの結果は、CTGF発現が、血管新生および眼細胞増殖を伴う眼障害に関連していることを示した。
【０２００】
実施例１６：  PDGFと共にRPE細胞を注入することを伴うPVRの動物モデル
眼疾患の動物モデル（色素沈着ラット）を使用する実験を行った。眼疾患のこれらの動物モデルにおいては、各動物の片眼（典型的には右眼）を実験的に使用し、他方の眼は未処理対照として使用する。in vivo動物モデル実験に固有のばらつきのため、各実験群には典型的には6匹のウサギを加えて、統計的に妥当な結果を得るのに十分な数が得られるようにした。PVRのこの確立されたウサギモデルにおいては、単離されたRPE細胞およびPDGFをウサギの眼に注入する。このモデルにおいては、RPEおよびPDGFが注入された眼の94％が該注入の1週間以内に網膜局部的牽引（retinal focal traction）を現し、該注入眼の92％が注入の2週間以内に網膜剥離を現した。
【０２０１】
ウサギRPE細胞を成体ウサギ（該研究において使用したウサギは体重2.5kg〜3.5kgであった）の眼から単離し、10％ ウシ胎仔血清を補足したDMEM内で培養した。後続のすべての注入には、ウサギRPE細胞（典型的には継代2〜3）のサブコンフルエント培養物を使用した。培養ウサギRPE細胞をトリプシン処理により培養プレートから取り出し、PBSに再懸濁させた（0.1ml当たり250,000細胞）。ウサギの眼へのRPE細胞の注入の前に、25ゲージ針を使用して0.2mlの眼房水を各眼から除去した。倒像検眼鏡で制御しながら、RPE細胞を含有するツベルクリンシリンジに装着した27ゲージ針を、縁から3mm後方の位置（視神経乳頭の丁度上部の位置）で強膜に貫通させた。RPE細胞の注入後、RPE細胞の注入に関して記載したのと同じ技術を用いて、0.1mlのPBS中の150ngのPDGF-BBを同じ進入部位に注入した。該注入の後、倒像検眼鏡検査により動物を時間経過と共に検査した。PVRの発生および度合を時間経過と共にモニターし、Fastenbergにより記載されているパラメーター（Fastenbergら (1982) Am J Ophthalmol 93:565-572）に従い、臨床所見に基づき5段階のうちの1つに分類した。このウサギモデルにおけるPVR発生の段階を以下の表1に大まかに示す。
【表１】
2005519881.tif 000002
【０２０２】
PVRのこの動物モデルにおける罹患眼の組織学的検査は、中等度の線維形成を伴う中等度に細胞性の膜の存在を示した。注入したRPE細胞の数を前記の250,000細胞から100,000細胞に減少させると、生じたPVRは軽度であり、脆くて少数細胞性（paucicellular）で非線維性の膜のみが発生した。また、少ない数（すなわち、100,000細胞）のRPE細胞を注入した眼において発生した膜は局部的かつ限局性であり、網膜剥離は全く観察されなかった。
【０２０３】
実施例１７：  CTGFはPVRの動物モデルにおいてPVRを誘導する
前記実施例16に記載のPVRのウサギモデルの改変体を用いて、PVRの発生に対するCTGFの効果を調べた。まず、種々の量のrhCTGFをラットの眼に注入した。RPEに対する硝子体内rhCTGF注入のみの効果、および生じうるPVRの発生を調べた。表2に示すとおり、健康なウサギの眼への200ngまたは400ngのrhCTGFの硝子体注入は、検出可能な影響をRPEに与えなかった。しかし、200ngのrhCTGFの網膜下注入は、RPE単層の軽度の局部的破壊を含む若干のRPE変化を引き起こした。有意な細胞増殖も膜形成も観察されなかった（以下の表2を参照されたい）。
【表２】
2005519881.tif 000003
【０２０４】
前記実施例16に記載のPVRのウサギモデルにおいては、PDGFと共にウサギの眼に注入されたRPE細胞は、中等度の線維形成を伴う細胞性膜の形成により特徴づけられる軽度のPVRの発生を、注入の2週間以内に引き起こした。軽度のPVRのこのウサギモデルにおけるCTGFの効果を調べるために、PDGF注入を行うことなく、前記のとおり、RPE細胞を種々の量のrhCTGFと共にウサギの眼に注入した。以下の表3に示すとおり、RPE細胞を200ngのrhCTGFと共にウサギの眼に注入した場合には、3週間後に段階1のPVRが発生した。該注入眼の組織学的検査は網膜前膜または網膜剥離の存在を示さなかった。
【０２０５】
RPE細胞を400ngのrhCTGFと共にウサギの眼に注入した場合には、3週間後に段階2のPVRが発生した。該注入眼の組織学的検査による判定では、小さく薄い膜が発生した。RPE細胞と共に種々の量のrhCTGFをウサギの眼に注入した場合の結果を以下の表3に要約する。総合すると、これらの結果は、rhCTGFが、硝子体内に注入されると、RPEに最小の効果を与えることを示した。
【表３】
2005519881.tif 000004
【０２０６】
この動物モデルにおけるPVRの発生の陽性対照は、50ngのPDGFの存在下の100,000個のRPE細胞の硝子体内注入であった。そのような注射の3週間後、該注入眼において、薄い少数細胞性膜を伴う牽引性網膜剥離が観察された（以下の表4を参照されたい）。平行実験において、50ngのPDGFの存在下の100,000個のRPE細胞の注入の1週間後、200ngのrhCTGFを硝子体内に注入した。2週間後、いずれかの変化に関して眼を検査した。これらの実験条件下、PVRの段階3に相当する厚い線維性の膜が発生した。これらの結果が示すところによると、軽度のPVRを有するウサギの硝子体内にCTGFを注入した場合には、該膜は稠密に線維性となった。したがって、軽度のPVRの動物モデルにおいては、硝子体内へのCTGFの添加は眼内線維形成の発生を刺激し増強した。また、これらの結果は、CTGFが眼疾患の動物モデルにおいてin vivoで病的線維形成を誘導するという直接的な証拠を示した。これらの結果はまた、CTGFが眼細胞増殖を誘導し、少なくとも部分的には、眼障害に関連した他の増殖因子と関連して、眼線維形成を誘導するよう作用することを示した。
【表４】
2005519881.tif 000005
【０２０７】
実施例１８：  アデノウイルス-CTGF発現ベクターの構築
種々のin vivoおよびin vitro実験で使用するCTGFおよびCTGFの断片のアデノウイルス媒介性発現のために、アデノウイルス発現ベクターを設計し、構築した。Qbiogene（Montreal, Canada）から商業的に入手可能なAdEasy系を使用して、CTGF含有アデノウイルス発現ベクター構築物（pAd-CTGF）を調製した。該系の成分には、pAdEasy-1（ウイルスバックボーン, カタログ番号AES1010）およびpShuttle-CMV（カタログ番号AES1021）が含まれる。完全長ヒトCTGF cDNA（DB60R32, GenBankアクセッション番号M92934, GI:180923）をGary Grotendorst博士（University of Miami Medical School）から入手した（Bradhamら (1991) J Cell Biol 114:1285-1294）。CTGF cDNAを制限酵素BamHI（これはpBluescript II KSを689位で切断する）およびSwaI（これはCTGF cDNAを5'末端の1277bp下流（すなわち、3'方向）で切断する）でpBluescript II KS（DB60R32）から切り出した。ついで、標準的な分子クローニング技術を用いて、該CTGF cDNA断片を、制限酵素BglIIおよびEcoRVで予め消化されたpShuttle-CMV内に挿入した。得られたpShuttle-CMV-CTGF構築物からのCTGFの発現を、標準的な方法を用いて、発現タンパク質の一過性発現およびウエスタンブロット分析により確認した。
【０２０８】
pShuttle-CMV-CTGF発現プラスミドを使用して、製造業者の方法に従いpAdEasy-1との細菌組換えにより組換えアデノウイルスを作製した。簡潔に説明すると、pShuttle-CMV-CTGFを線状化し、ついでpAdEasy-1と共にコンピテント大腸菌（E. coli）BJ-5183細胞内にコトランスフェクトした（エレクトロポレーションによる）。得られたクローンをLB-KM培地内で16時間培養し、該組換えpAd-CTGFプラスミドをアルカリ抽出法により抽出した。対照プラスミドpAd-GFP（緑色蛍光タンパク質を含有する）およびpAd-e1E3del.pSCMV（インサートを含有しない対照アデノウイルスプラスミド）も調製した。該組換えプラスミド配列を、いくつかの制限酵素を使用する制限酵素マッピングにより確認した。さらに、ABI prism 310自動DNA配列決定装置を使用する自動DNA配列決定により、pAd-CTGF中のCTGF cDNA配列を確認した。単離されたプラスミドを安定な大腸菌（E. coli）JM109細胞に形質転換した。ついで組換えプラスミドを制限酵素PacIで線状化し、E1およびE3遺伝子を含有する293パッケージング細胞内にLipofectamine（GIBCO/BRL, Grand Island, NY）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、該細胞を集め、3ラウンドの凍結-融解に付した。上清を集めた。10mM Tris-HCl（pH 7.4）中の1.30重力CsCl溶液を使用するCsCl勾配超遠心により、ウイルス粒子を精製した。該ウイルスの力価をPFUアッセイにより測定した。
【０２０９】
ヒトCTGF N末端断片またはC末端断片をコードするcDNA断片を含有する複製欠損組換えアデノウイルス遺伝子を以下のとおりに構築する。FastTrack Kit（Invitrogen, San Diego, CA）を製造業者が記載している方法に従い使用して、ポリ(A)+ RNAを培養ヒトRPE細胞から単離する。第1鎖cDNAをM-MLV逆転写酵素（Gibco/BRL）で42℃で合成する。ヒトN末端CTGFおよびC末端CTGFに特異的なオリゴヌクレオチド配列プライマーを使用してPCRを行い、標準的な方法による選択を行うことが可能である。これらのプライマーの使用は、ヒトCTGFのN末端断片およびCTGFのC末端断片をコードするCTGF特異的DNA増幅産物を与える。
【０２１０】
例えば以下の条件を用いるPerkin-Elmer/Centur DNAサーマルサイクラーを使用して、PCRを行った：94℃で1分間の変性、60℃で1分間のアニーリング、および72℃で45秒間の伸長。30サイクルのPCRを行う。得られた増幅産物を単離し、ベクターpCR2.1（Invitrogen Corp.）内にサブクローニングした。該CTGF N末端およびC末端断片cDNAのDNA配列を、ABI prism 310自動配列決定装置（ABI, USA）を使用する配列決定により確認する。CTGF N末端断片cDNAおよびC末端断片cDNAを、制限酵素Xba1およびXho1を使用する消化によりpCR2.1ベクター構築物から切り出す。得られた制限断片を単離し、pAdTrack-CMVシャトルベクター（ADENO-QUEST, Quantum Biolab Inc., Montreal, Canada）のXbaI-XhoIクローニング部位内にサブクローニングする。pAdTrack-CMVは、相同組換えに有用なシャトルプラスミドであり、以下の要素を含む：アデノウイルス5型、大腸菌（E. coli）複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、eGFP遺伝子（ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサーにより発現が駆動される増強型緑色蛍光タンパク質（Clontech, Palo Alto, CA））、およびDNAがサブクローニングされCMVプロモーターから発現されるマルチクローニング部位。CTGF N末端断片cDNAまたはCTGF C末端断片cDNAを含む該pAdTrack-CMVベクターを制限酵素Pme1により線状化し、ついでエレクトロポレーションによりコンピテント大腸菌（E. coli）BJ-518細胞内にpAdEasy-1（ADENO-QUEST, Quantum Biolab Inc.）と共にコトランスフェクトする。
【０２１１】
得られたクローンをLB-KM培地内で16時間培養し、該組換えプラスミド（pAdEasy-CTGF-N, pAdEasy-GFP）をアルカリ抽出法により抽出した。CTGF cDNAの挿入を行わずに前記方法を用いて、対照プラスミドpAdEasy-GFPを構築した。該組換えプラスミド配列を、いくつかの制限酵素（例えば、EcoR1、Xho1、Sal1、BamH1およびPac1）を使用する制限酵素マッピングにより確認した。単離されたプラスミドを安定な大腸菌（E. coli）JM109細胞に形質転換した。ついで組換えプラスミドを制限酵素PacIで線状化し、E1およびE3遺伝子を含有する293パッケージング細胞内にLipofectamine（GIBCO/BRL, Grand Island, NY）でトランスフェクトした。ABI prism 310自動DNA配列決定装置を使用する自動DNA配列決定により、該ベクター中のCTGF cDNAの配列を確認した。トランスフェクション後、該細胞を集め、凍結-融解を3回行った。上清を集めた。10mM Tris-HCl（pH 7.4）中の1.30重力CsCl溶液を使用するCsCl勾配超遠心により、ウイルス粒子を精製した。該ウイルスの力価をPFUアッセイにより測定した。
【０２１２】
実施例１９：  pAd-CTGF感染RPE細胞を有するPVRの動物モデル
前記実施例に示すとおり、本発明は、RPE細胞がCTGFを発現しそれに応答すること、およびヒトPVR膜に関連したRPE細胞がCTGFタンパク質発現に関して陽性であることを確認した。これらのデータは、種々の眼障害に関連したPVRおよびPVR膜の開始、形成、発生および維持におけるCTGFの役割を示した。前記実施例17に記載の実験においては、RPE細胞を外的添加rhCTGFと共にウサギの眼に注入した。観察された効果は比較的小さく（表3を参照されたい）、これはおそらく、眼環境中の持続的なCTGFの曝露または存在の欠如によるものであろう。
【０２１３】
発生中の眼障害において観察される眼内のCTGFの継続的発現および曝露の結果を調べるために、前記のPVRのウサギ眼モデルを、眼内で継続的なCTGF発現が得られるように改変した。該改変は、以下のとおり、rhCTGFを発現するように設計されたアデノウイルス構築物に予め感染させたRPE細胞の注入を含むものであった。
【０２１４】
ウサギRPE細胞のコンフルエント培養物を無血清増殖培地で洗浄し、前記実施例18に記載のとおりに構築された、CTGFを含有する複製欠損アデノウイルスベクター（Ad-CTGF）（107 PFU）を該培養物に感染させた。60分後、該培地を、2％ ウシ胎仔血清を含有する新鮮な培地と交換した。ついで該感染細胞を37℃で48〜72時間インキュベートし、ついで該細胞をトリプシン消化により該プレートから取り出し、洗浄し、PBS中に1×107 細胞/mlで再懸濁させた。この方法を用いて、該培養RPE細胞の80％以上がAd-CTGFアデノウイルスに感染した。
【０２１５】
3群の動物を以下の研究において評価した。陰性対照動物には、アデノウイルスに感染していないRPE細胞を注入した。実験群動物には、Ad-CTGFに感染したRPE細胞を注入した。第3群の動物には、Ad-GFPに感染したRPE細胞を注入し、これをアデノウイルス対照として使用した。また、Ad-GFP感染細胞は緑色蛍光タンパク質を発現し、これは緑色蛍光タンパク質マーカーにより感染細胞の成り行きのモニターを可能にする。RPE細胞（アデノウイルス感染RPE細胞または対照RPE細胞）を色素沈着ウサギ眼内に注入する前に、まず、23ゲージ針を使用して0.2mlの眼房水を除去することにより該ウサギ眼の眼圧を低下させた。手術用顕微鏡を使用して、0.1mlのPBS中に100,000個のアデノウイルス感染RPE細胞を含有するツベルクリンシリンジに接続された27ゲージ針を、縁から3mm後方の位置で強膜に貫通させて該針を挿入することにより、硝子体内に注入した。
【０２１６】
Ad-CTGFに感染した100,000個のRPE細胞の硝子体内注入は、視神経から発生し硝子体内に伸長する厚い膜の形成を引き起こした（図16Aおよび16B）。組織学的分析は細胞性および線維性の網膜前膜の存在を示した。硝子体混濁は注射の14日後まで明らかであり、該眼の前房は透明なままであった。
【０２１７】
Ad-CTGFを注入した眼においては、PVRが発生した。網膜裂孔は観察されなかった。PVRの証拠は、網膜前膜の出現、有髄線維および網膜血管の歪曲、固定網膜皺襞、ならびに牽引網膜剥離を含むものであった。また、線維性組織塊が陥凹に存在した。組織学的分析は稠密な線維性網膜前膜を示した。生理食塩水注入対照動物、対照アデノウイルスを注入した動物および対照非アデノウイルス感染RPE細胞を注入した動物のいずれにおいても、PVRも線維性網膜前膜の形成も発生しなかった。
【０２１８】
総合すると、これらの結果は、rhCTGFを過剰発現するRPE細胞の硝子体内注入が眼線維形成を誘導することを示した。特に、活性化RPEまたは細胞性RPE膜が存在する眼へのCTGFの添加は、細胞性RPE膜から少数細胞性、筋原線維芽細胞性、稠密線維性網膜前膜への形質転換を含む眼内線維形成を刺激した。また、これらの結果は、CTGFの過剰発現が、PVR膜において典型的に見出される外因性増殖因子またはサイトカイン（例えば、PDGF、TNFα、TGFβ、HGF、VEGF、IL-1およびIL-6）の添加を伴わなくてもPVRの発生を開始させることを示した。したがって、眼障害のこの動物モデルにおいて、CTGFは、発生中の非線維性細胞性網膜前膜内の線維形成につながる初期誘導事象をもたらした。これらの結果は、CTGFが眼疾患の動物モデルにおいてin vivoで線維形成を誘導するという直接的な証拠を示した。
【０２１９】
実施例２０：  アデノウイルスモデルの網膜下-硝子体内注入
色素沈着ウサギにおいて、短刀刃（stiletto blade）を使用して、縁の3mm後方の位置で毛様体扁平部切開を行う。手術用顕微鏡を使用する視覚による制御下、マイクロシリンジに接続したガラスマイクロピペットを挿入し、コンタクトレンズを挿入する。視神経乳頭から2〜3乳頭径の距離の位置で該マイクロピペットを穏やかに網膜に接触させて、小さな網膜孔を形成させる。この操作により出血を引き起こした眼は、以後の研究から排除する。本研究においては、2群の動物を評価する。実験群動物には、50μlのAd-CTGFを注入する。第2群の動物には、Ad-GFPを注入し、これを対照ベクターとして使用し、また、どの細胞がトランスフェクトされたかを緑色蛍光タンパク質マーカーの発現のモニターにより決定するための手段として使用する。
【０２２０】
実施例２１：  PVRのディスパーゼモデル
既に記載されているもの（Frenzelら (1998) Invest Ophthamol Vis Sci 39:2157-2164）を応用したモデルおよび方法を用いて、ディスパーゼの網膜下注入により、ウサギの眼においてPVRを誘導した。PBS中の50μl（0.05U）のディスパーゼ（Sigma Chemical Co.）を使用して、前記のとおりに網膜下濾過胞を形成させた。手術の1週間後には注入ウサギの約75％において、そして手術の2週間後には注入動物の約100％において、網膜剥離が誘導された。網膜前膜は中等度の線維形成を示した。後記実施例22に記載のとおりに、これらの動物の硝子体吸引物に対してウエスタンブロット分析を行った。図17のレーン4に示すとおり、これらの動物の硝子体は、対照条件の場合（図17、レーン1）と比べてCTGFおよびCTGF断片の発現の増強を示した。
【０２２１】
実施例２２：  PVRの動物モデルからの硝子体吸引物のウエスタンブロット
PVRの種々の動物モデルのウサギ硝子体の吸引物を、免疫ブロット分析によりCTGF発現に関して検査した。PVRを有するウサギの硝子体内にCTGFまたはCTGF断片が蓄積したかどうかを判定するために、アッセイを行った。これらの実験の結果を図17に示す。図17では、CTGFおよびCTGF断片の位置が矢印で示されている。正常ウサギ硝子体（図17、レーン1）は低レベルのCTGFを含有していた。前記実施例19に記載のとおりにAd-CTGFに予め感染させたウサギRPE細胞の硝子体内注入により、PVRを誘導した。これらの動物においては、PVRは最初は1週間後に発生し（図17、レーン3）、2週間後に次第に線維性になった（図17、レーン2）。これらの動物の硝子体においては、CTGF断片（約18kDa）の顕著な発現が認められる。
【０２２２】
実施例２３：  マウス器官培養PVRモデルにおけるグリア増殖の進行に対するCTGFの効果
眼グリア増殖は眼グリア細胞の肥大および増殖に関連している。ミュラー細胞およびアストロサイトを含む眼グリア細胞は物理的環境を維持し、網膜に構造的支持を与える。眼グリア増殖は網膜の収縮に影響を及ぼし、網膜剥離の発生を増加させうる。
【０２２３】
マウス系統c57Bl/6の眼を使用した。眼を赤道において切り、角膜および水晶体を除去した。24ウェル培養プレート内の、10％ FBSを含有する神経基礎（Nneurobasal）培地内に、後部陥凹を配置した。器官培養の第2日に、該培地にCTGF（50ng/ml）を加えた。網膜ひだの発生および網膜縁の巻き上がりを含む変化に関して、培養物を7日間追跡した。写真の検査および組織学的検査により判定を行った。CTGFは、対照培養物と比べて網膜ひだと網膜縁の巻き上がりとの両方の形成を刺激した。グリア細胞線維性酸性タンパク質（GFAP）抗体を使用する免疫組織化学的染色は、病的領域においてGFAP+グリア細胞の増殖が認められることを示した。これらの結果は、CTGFが血管周囲アストロサイトにおけるグリア増殖を誘導することを示した。また、これらの外植片培養物で得られた結果は、CTGFが、網膜グリア増殖および収縮を刺激することによりPVRの発生病理において重要な役割を果たしていることを示唆した。
【０２２４】
本明細書に示され記載されているものに加えて、本発明の種々の修飾が、以上の説明から当業者に明らかとなろう。そのような修飾は添付の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０２２５】
本明細書に引用するすべての参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】図1Aおよび1Bは、それぞれ網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞における結合組織増殖因子mRNAの発現を示す。
【図２】図2Aおよび2Bは、トランスフォーミング増殖因子βまたは血管内皮細胞増殖因子での処理の後の網膜色素上皮細胞における結合組織増殖因子の発現を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、血管内皮細胞増殖因子またはトランスフォーミング増殖因子βでの処理の後の脈絡膜内皮細胞における結合組織増殖因子の発現を示す。
【図４】図4Aおよび4Bは、フィブロネクチンへの網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞の付着に対する結合組織増殖因子の効果を示す。
【図５】図5Aおよび5Bは、網膜色素上皮細胞および脈絡膜内皮細胞の走化性遊走に対する結合組織増殖因子の効果を示す。
【図６】図6Aおよび6Bは、結合組織増殖因子と結合組織増殖因子のN末端断片とによる網膜色素上皮細胞の遊走の用量依存的刺激を示す。
【図７】図7は、網膜色素上皮細胞の増殖の、結合組織増殖因子による刺激を示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、脈絡膜内皮細胞の管形成の、結合組織増殖因子による刺激を示す。
【図９】図9は、トランスフォーミング増殖因子βで処理された網膜色素上皮細胞における、結合組織増殖因子によるエクストラ（extra）ドメインA含有フィブロネクチンの発現の刺激を示す。
【図１０】図10は、網膜色素上皮細胞における結合組織増殖因子の発現をフィブロネクチンが刺激することを示す。
【図１１】図11は、網膜色素上皮細胞において、フィブロネクチンにより誘導された結合組織増殖因子の発現が抗α5β1インテグリン抗体により抑制されることを示す。
【図１２】図12は、ヒト増殖性硝子体網膜症膜における結合組織増殖因子の発現を示す。
【図１３】図13A、13B、13Cおよび13Dは、加齢性黄斑変性の患者からのヒト脈絡膜新生血管膜における結合組織増殖因子の発現を示す。
【図１４】図14は、増殖性硝子体網膜症の個体から切り出された硝子体液中の結合組織増殖因子および結合組織増殖因子の断片を示す。
【図１５】図15は、脈絡膜血管新生および網膜血管新生を有する個体から外科的に切り出された硝子体液中の結合組織増殖因子および結合組織増殖因子の断片を示す。
【図１６】図16Aおよび16Bは、増殖性硝子体網膜症の実験モデルにおける線維形成の、結合組織増殖因子による誘導を示す。
【図１７】図17は、種々の実験的増殖性硝子体網膜症モデルを有するウサギの硝子体液中の結合組織増殖因子の発現を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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