(57)【要約】本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、または成人型ラクターゼ欠乏症を示す、腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子であって、（ａ）配列番号１の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号１のその配列が、図4にも図示され、図８に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｂ）配列番号２の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号２のその配列が、図5にも図示され、図９に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−１３９１０ ５’位に相当する位置にシトシン残基を有する核酸分子；（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８ ５’位に相当する位置にグアニン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される、核酸分子に関する。本発明はさらに、上述の核酸分子に含まれるＳＮＰの解析に基づく、成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因について試験する方法に関する。さらに、本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因の検出に有用な診断組成物およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、または成人型ラクターゼ欠乏症を示す、腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子であって、
（ａ）配列番号１の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号１のその配列が、図4にも図示され、図８に図示される配列中にも含まれる核酸分子；
（ｂ）配列番号２の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号２のその配列が、図5にも図示され、図９に図示される配列中にも含まれる核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−１３９１０ ５’位に相当する位置にシトシン残基を有する核酸分子；
（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８ ５’位に相当する位置にグアニン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項２】
腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子であって、
（ａ）配列番号３の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号３のその配列が、図６に図示される核酸分子；
（ｂ）配列番号４の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号４のその配列が、図７にも図示される核酸分子；
（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−１３９１０位に相当する位置にチミジン残基を有する核酸分子；
（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と厳密な条件下にてハイブリダイズする核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８位に相当する位置にアデノシン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項３】
ゲノムＤＮＡである、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ゲノムＤＮＡが遺伝子の一部である、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
少なくとも１４ヌクレオチドを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子の断片であって、ＬＰＨ遺伝子のヌクレオチド位−１３９１０またはヌクレオチド位−２２０１８を含む、断片。
【請求項６】
請求項１および３から５のいずれか一項に記載の核酸分子に相補的である、核酸分子。
【請求項７】
請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸分子に相補的である、核酸分子。
【請求項８】
請求項１および３から５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項２から４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１０】
ＬＰＨ遺伝子のヌクレオチド位−１３９１０またはヌクレオチド位−２２０１８を含む、請求項１および３から５のいずれか一項に記載の核酸分子と、またはその相補鎖と、厳密な条件下でハイブリダイズする、プライマーまたはプライマー対。
【請求項１１】
ＬＰＨ遺伝子のヌクレオチド位−１３９１０またはヌクレオチド位−２２０１８を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸分子と、またはその相補鎖と、厳密な条件下でハイブリダイズする、プライマーまたはプライマー対。
【請求項１２】
請求項６に記載のベクターで形質転換された、非ヒト宿主。
【請求項１３】
請求項７に記載のベクターで形質転換された、非ヒト宿主。
【請求項１４】
細菌、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、遺伝子導入動物または遺伝子導入植物である、請求項１２または１３に記載の非ヒト宿主。
【請求項１５】
請求項１および３から６のいずれか一項に記載の野生型核酸分子とは特異的に結合するが、対応する野生型核酸分子とは特異的に結合しない、抗体またはアプタマーまたはファージ。
【請求項１６】
請求項２から５および７のいずれか一項に記載の野生型核酸分子とは特異的に結合するが、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、または成人型ラクターゼ欠乏症を示す、対応する変異配列とは特異的に結合しない、抗体またはアプタマーまたはファージ。
【請求項１７】
請求項２、３、４に記載の野生型核酸分子または請求項９に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８または９に記載のベクター、請求項１１または１２に記載のプライマーまたはプライマー対、および／または請求項１５または１６に記載の抗体アプタマーおよび／またはファージを含む、診断組成物。
【請求項１９】
成人型ラクターゼ欠乏症もしくはそれに関連する形質の存在または素因について試験する方法であって、ホモ接合またはヘテロ接合の状態における、請求項１および３から６のいずれか一項に記載の核酸分子の存在に関して、かかる素因を保有する将来の患者またはかかる素因を保有する疑いのあるヒトから採取された試料を試験することを含む方法。
【請求項２０】
成人型ラクターゼ欠乏症もしくはそれに関連する形質の存在または素因について試験する方法であって、ホモ接合またはヘテロ接合の状態における、請求項２から５および７のいずれか一項に記載の核酸分子の存在に関して、かかる素因を保有する将来の患者またはかかる素因を保有する疑いのあるヒトから採取された試料を試験することを含む方法。
【請求項２１】
前記試験が、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、または成人型ラクターゼ欠乏症を示す核酸分子に相補的な請求項６に記載の相補的核酸分子、またはプローブとしての野生型配列に相補的な請求項７に記載の核酸分子を、厳密な条件下にて前記試料に含まれる核酸分子とハイブリダイズさせる段階と、前記ハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハイブリダイゼーションの産物を制限エンドヌクレアーゼで消化するか、または前記ハイブリダイゼーションの産物を制限エンドヌクレアーゼを用いた消化にかける段階と、前記消化の産物を分析する段階とをさらに含む、請求項１９または２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブが検出可能に標識される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記試験が、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の核酸配列を決定する段階を含み、前記部分が、ＬＰＨ遺伝子のヌクレオチド位−１３９１０および／またはヌクレオチド位−２２０１８を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
核酸配列の前記決定が、固相ミニシーケンシング（minisequencing）によって行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸配列を決定する前に、前記核酸分子の少なくとも前記一部を増幅する段階をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験が、増幅反応を行う段階であって、前記増幅反応に用いられるプライマーの少なくとも１つが、請求項１０に記載のプライマーであるか、または請求項１０に記載のプライマー対に属する段階と、増幅産物をアッセイする段階とを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記試験が、増幅反応を行う段階であって、前記増幅反応に用いられるプライマーの少なくとも１つが、請求項１１に記載のプライマーであるか、または請求項１１に記載のプライマー対に属する段階と、増幅産物をアッセイする段階とを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われるか、または前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因について試験する方法であって、ヒトから採取された試料を、請求項１５に記載の抗体またはアプタマーまたはファージへの特異的結合についてアッセイする段階を含む方法。
【請求項３１】
成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因について試験する方法であって、ヒトから採取された試料を、請求項１６に記載の抗体またはアプタマーまたはファージへの特異的結合についてアッセイする段階を含む方法。
【請求項３２】
前記抗体またはアプタマーまたはファージが検出可能に標識される、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試験がイムノアッセイである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘膜組織、粘液、膣組織、膣から採取される胎児組織、皮膚、毛、毛嚢または他のヒト組織である、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料からの前記核酸分子が、固体担体に固定化される、請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法
【請求項３６】
前記固体担体が、チップ、シリカウエハー、ビーズまたはマイクロタイタープレートである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因を解析するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項３８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１１または１２に記載のプライマーまたはプライマー対、請求項８または９に記載のベクター、および／または請求項１５または１６に記載の抗体アプタマーおよび／またはファージを１つまたは複数の容器内に含むキット。
【請求項３９】
遺伝子治療における、請求項２から４のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項７に記載のベクターの使用。
【請求項４０】
前記遺伝子治療によって、成人型ラクターゼ欠乏症が治療または予防される、請求項３９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症（adult-type hypolactasia）の一因となる、またはそれを示す、腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子に関し、前記核酸分子は、（ａ）配列番号１の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号１のその配列が、図4にも図示され、図８に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｂ）配列番号２の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号２のその配列が、図5にも図示され、図９に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−１３９１０ ５’位に相当する位置にシトシン残基を有する核酸分子；（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８ ５’位に相当する位置にグアニン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される。本発明はさらに、成人型ラクターゼ欠乏症の存在、またはその素因について試験する方法であって、上記の核酸分子に含まれるＳＮＰの解析に基づく方法に関する。さらに、本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症の存在、またはその素因の検出に有用な診断組成物および診断キットに関する。
【０００２】
様々な試料が本明細書を通じて記載されている。製造元のマニュアルおよびカタログを含む、これらの試料の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
腸内上皮細胞によって主に発現される、ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）は、ラクトース、乳糖をグルコースおよびガラクトース1に加水分解する。ラクトースがもはや食事の必須成分ではない場合、ＬＰＨ酵素の発現は、哺乳動物において離乳期間に非常に低いレベルに劇的に低下する。ヒトにおいては、成人型ラクターゼ欠乏症またはラクターゼ非存続（lactase non-persistence）として知られる状態は、ほとんどの人種に発生し、乳糖不耐症のために、成人間での新鮮な乳の使用を厳しく制限するものである。ラクターゼ非存続状態の発症年齢は、タイ人における１〜２歳から、フィンランド人中の１０〜２０歳までの範囲にわたり、人種間で異なる2〜3。しかしながら、北欧人種および他の数種の人種群においては、ＬＰＨ活性は、成人の大部分で一生を通してラクターゼ存続として知られる状態を持続する。その表現型ラクターゼ存続／非存続は、遺伝的に決定されることが示されており、その存続状態は、非存続性状態4〜6と比較して優性である。
【０００４】
成人型ラクターゼ欠乏症の現況技術の診断は、乳糖負荷試験（ＬＴＴ）に基づく。一晩（１０時間）絶食させた後、ラクトース１ｇ／ｋｇを１２．５％溶液として投与する。最大投与量は５０ｇである。ラクトース摂取前およびラクトースを摂取して２０分および３０分後に、毛細管血試料を採取する。そのグルコース濃度は、グルコースオキシターゼ法によって決定される（イェルム（Hjelm）およびデ・ベルディエ（de Verdier）1963)。ＬＴＴの日の腹部症状を記録する。１．１ｍｍｏｌ／ｌ以上の血中グルコース濃度の最高上昇が、吸収不良の徴候とされる(ガッドマン（Gudman）-ホイヤー（Hoyer）およびハルマン（Harnum）1968,ジュッシラ（Jussila）1970,サヒ（Sahi）1972)。ＬＬＴは、偽陽性および偽陰性診断のリスクを１０％有し、つまり、ＬＴＴの感受性および特異性は約９０％である（イソコスキー（Isokoski）ら. 1972, ニューカマー（Newcomer）ら. 1975, Sahi 1983)。肝臓におけるガラクトースの代謝を阻害するエタノール０．３ｇ／ｋｇを投与し(Tygstrup およびLundqvist 1962)、１２．５％溶液でラクトース１ｇ／ｋｇを１５分後に投与することによって、ＬＬＴの精度を高めることができる。
【０００５】
最初の、または繰り返し行われたＬＴＴにおける０．２ｍｇ／１００ｍｌ未満の最高上昇を有する小児は、胃内視鏡によって行われる小腸生検に送られる。これは、専門知識が必要とされる観血的手順であり、通常、胃腸病学の専門家によってのみ大学病院で行われている。生検試料は、解剖顕微鏡を用いて組織学的に検査され、粘膜のマルターゼ、スクラーゼおよびラクターゼ活性が決定される(ラウニアラ（Launiala）ら. 1964)。小児におけるラクターゼ欠乏症の診断は、腸内生検の組織構造が正常であり、ラクターゼ活性がタンパク質２０Ｕ／ｇ未満であり、ラクターゼ/スクラーゼ比０．３０未満であれば、あるいは、エタノール投与を用いたＬＴＴにおいては、２０ｍｇ／１００ｍｌ未満の血中グルコース濃度の最高上昇および５ｍｇ／１００ｍｌ未満の血中ガラクトース濃度の最高上昇（サヒ（Sahi）ら, 1972)が示されれば、正しいとされる。上述のように、成人型ラクターゼ欠乏症を診断する現在の方法は手間がかかる。ＬＴＴは不正確であり、したがって、診断が確定される前に、観血的手順、胃鏡検査が必要である。成人型ラクターゼ欠乏症は一般的であり、非特異的な腹部症状（患者の３分の１が胃痛を訴える）の主な原因であることから、この一般的な健康上の問題の診断法を改善することが明らかに必要である。
【０００６】
それにもかかわらず、今までに取り扱い易く、それと同時に、迅速かつ正確な結果が得られる生化学的試験法は開発されていなかった。ゲノムＤＮＡ／発現レベルでの疾患原因の解明も同様に成功していない。このように、成人におけるＬＰＨ遺伝子のコード領域およびプロモーター領域のシーケンシングによって、ラクターゼ存続性／非存続性と相関するＤＮＡ変異は明らかにされておらず、この形質7〜8と関連するスプライスバリアントまたはｍＲＮＡ編集バリアントの証拠も現れていない。ラクターゼ存続性／非存続性の形質が、ラクターゼ遺伝子内にある、またはラクターゼ遺伝子に隣接するシス作用要素（１つまたは複数）によっておそらく制御されることが、以前の研究によって示されており、強い連鎖不平衡（ＬＤ）が、ラクターゼ遺伝子にわたる７０ｋｂハプロタイプ全体に認められている9,10。いくつかの研究によって、転写調節レベルでＬＰＨ遺伝子発現の主要な制御が働くという証明が報告されている11〜13。しかしながら、ＬＰＨ遺伝子の発現の転写および転写後制御の両方に影響を及ぼす変異が、成人型ラクターゼ欠乏症の病因に関係することが示唆されている14〜15。
【０００７】
上記の事項を考慮すると、本発明の根底にある技術的課題は、成人型ラクターゼ欠乏症、またはこの疾患に対する素因の正確かつ簡便な診断を可能にする、手段および方法を提供することである。
【０００８】
前記技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態によって達成される。
【０００９】
このように、本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示す、腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子に関するものであり、前記核酸分子は、（ａ）配列番号１の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号１の配列が、図4にも図示され、図８に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｂ）配列番号２の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号２のその配列が、図5にも図示され、図９に図示される配列中にも含まれる核酸分子；（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−１３９１０ ５’位に相当する位置にシトシン残基を有する核酸分子；（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする、少なくとも２０ヌクレオチドの核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８ ５’位に相当する位置にグアニン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される。
【００１０】
本発明に従って、「腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子」という用語は、ラクトースを、その成分、グルコースおよびガラクトースに加水分解する活性を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。その酵素は、Ｅ．Ｃ．３．２．１．２３．６２によって特徴付けられる。
【００１１】
「成人型ラクターゼ欠乏症」という用語は、全世界の人種にかなりの割合で、腸内細胞におけるラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）の酵素活性の「生理学的」減少から起こる常染色体劣性症状であり、乳糖不耐症としても知られる症状を意味する。
【００１２】
「成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示す」という用語は、ＳＮＰ、およびこのように見出された対応する核酸分子がその症状を指し示し、したがって、もしかすると原因にもなり得るという事実を意味する。したがって、この用語には、記載の５’位置が症状を指し示すということが必然的に必要とされる。一方、前記用語には、５’位置が症状の原因であるか、または一因であるということは必ずしも必要ではない。しかし、前記用語から、いずれかのＳＮＰまたは両方のＳＮＰの原因となる、または一因となる役割は除外されない。
【００１３】
「厳密な条件下でハイブリダイズする」という言葉は、当業者によく知られているが、または従来のプロトコールに従って当業者によって確立することができるハイブリダイゼーション条件を意味する。最も有利なことには、その言葉は、非常に厳密な条件を意味する。各配列に、適した、厳密な条件は、温度、核酸分子の組成、塩の条件等のよく知られているパラメーターに基づいて確立される：例えば、サンブルック(Sambrook）ら, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989またはヒギンズ（Higgins）およびヘイムズ（Hames）(編集者)，"Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford 1985 （参考文献５４）、特にブリテン（Britten）& デビッドソン（Davidson）による "Hybridization Strategy"の３〜１５章を参照のこと。通常の（非常に厳密な）条件は、０．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃でのハイブリダイゼーションまたは５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃でのハイブリダイゼーションを含む。通常、ハイブリダイゼーション後には洗浄して、非特異的シグナルを除去する。洗浄条件としては、６５℃、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳまたは０．３×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（２５〜６５℃にて）などの条件が挙げられる。
【００１４】
本明細書において上述されるように、本発明は、少なくとも２０ヌクレオチドのハイブリダイズする（hybridizing）核酸分子に関する；上記の（ｃ）および（ｄ）を参照のこと。さらに、本発明は、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、または少なくとも２００ヌクレオチドの核酸分子にも関する。前記ハイブリダイズ（hybridizing）断片は、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００ヌクレオチド、上記の（ｃ）に定義される−１３９１０位の、または上記の（ｄ）に定義される−２２０１８位の５’および３’を含むことが好ましい。
【００１５】
「核酸分子」という用語は、天然および非天然核酸分子のどちらも意味する。非天然核酸分子には、ｃＤＮＡならびにＰＮＡなどの誘導体が含まれる。
【００１６】
本明細書全体を通じて、「配列番号＿の核酸配列を含む核酸分子・・・」という言葉は、配列番号によって指定される核酸分子よりも少なくとも１ヌクレオチド長い核酸分子を意味する。それと同時に、これらの分子は、例えば配列番号２または１、３または４によって指定される本発明の核酸分子の５’および／または３’末端にわたり、最大で３００００ヌクレオチドに及ぶ。
【００１７】
驚くべきことに、本発明によれば、２つのラクターゼ欠乏症関連変異体が、ＭＣＭ６遺伝子の異なるイントロン中に位置付けられる、ＬＰＨ遺伝子からかなり離れて位置することが見出された。ＭＣＭ６は、遺伝子ファミリー（ＭＣＭ２〜７）のメンバーであり、確実に細胞周期中に１回だけ起こるようにＤＮＡ複製の開始に必要とされる31。ＬＰＨと異なり、ＭＣＭ６は、その組織分布において制限されず、ＭＣＭ６およびＬＰＨ転写物のレベルに相関性はない18。これらの発見により、これら２種類の遺伝子は、組織特異性または発生制御を提供する、機能的に有意なシス作用要素を全く共有しないことが示唆されるだろう18。最もおそらくは、同定される変異体は、ＬＰＨおよびＭＣＭ６遺伝子の発現に対して異なる機能的重要性を有する。さらに驚くべきことには、ラクターゼ欠乏症との完全な関連に基づいて、それら（またはそれらのうちの１種類）は、腸内上皮におけるＬＰＨ遺伝子の転写物レベルの年齢依存性ダウンレギュレーションに関連するが、ＭＣＭ６の転写にはほとんど、または全く効果を及ぼさない。
【００１８】
実験的に、９つの拡大されたフィンランド人家系において行われる、連鎖解析、対立遺伝子関連解析および拡大されたハプロタイプ解析を用いて、成人型ラクターゼ欠乏症の遺伝子座が、２ｑ２１上で４７ｋｂ区間に限定された。その領域の配列解析によって、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、すべてのフィンランド人家系において、および異なる４つの集団（人種）からの２３６個体の試料セットにおいて、成人型ラクターゼ欠乏症で完全に同時分離されるＣ／Ｔ-13910が明らかとなった。Ｃ／Ｔ-13910から８ｋｂのテロメア長にある他のＳＮＰ  Ｇ／Ａ-22018が７症例以外のすべてにおいて形質と関連した。１０４７ＤＮＡにおけるＣ／Ｔ-13910ＳＮＰの有病率は、３つの異なる集団における成人型ラクターゼ欠乏症の報告された有病率を反映し、形質のその重要性に更なる証拠を提供した。
【００１９】
上記で言及されている、驚くべき発見によって、初めて、ＬＰＨ遺伝子の上流にある記載の単一ヌクレオチド多型の分子解析に基づく試験システムを確立することが可能となる。どちらのＳＮＰも、成人型ラクターゼ欠乏症の診断、または成人型ラクターゼ欠乏症の素因の診断に堅固な基礎を提供するが、ヌクレオチド位−１３９１０が、単独で、またはヌクレオチド位−２２０１８と組み合わせて解析されることが好ましい。これは、−１３９１０位のＳＮＰが、解析される症例の１００％で疾患と関連したのに対して、−２２０１８位のＳＮＰは、すべての症例のうち９８％のみで成人型ラクターゼ欠乏症と関連したからである。にもかかわらず、ヌクレオチド位−２２０１８の単独での解析もまた通常、成人型ラクターゼ欠乏症に対する素因の診断に堅固な基盤を提供する。
【００２０】
ＳＮＰの存在をスクリーニングする確立された方法が豊富にあるために、現在は、便利に、短時間で、低コストで、高精度で、調査中のヒトに著しく迷惑をかけることなく、成人型ラクターゼ欠乏症に対する遺伝的素因を診断することが可能である。
【００２１】
本発明はさらに、腸内ラクターゼ・フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）遺伝子の５’部分を含む核酸分子に関し、前記核酸分子は、（ａ）配列番号３の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号３のその配列が図６に図示される、核酸分子；（ｂ）配列番号４の核酸配列を有する、または含む核酸分子であって、配列番号４のその配列が図７に図示される、核酸分子；（ｃ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子の−１３９１０位に相当する位置にチミジン残基を有する核酸分子；（ｄ）その相補鎖が（ａ）または（ｂ）の核酸分子と、厳密な条件下にてハイブリダイズする核酸分子であって、前記ポリヌクレオチド／核酸分子が、ＬＰＨ遺伝子から−２２０１８位に相当する位置にアデノシン残基を有する核酸分子；からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のこの実施形態は、ヒトが成人型ラクターゼ欠乏症に罹患していないこと、およびその素因を保持しないことを実証するために便利に用いることができる。さらに、ＬＰＨ遺伝子の上流にある−１３９１０位または−２２０１８位の「野生型」の状況を反映するこの核酸分子は、成人型ラクターゼ欠乏症の素因を試験する実験において対照手段として使用してもよい。試験のために、本明細書を通じて述べられている方法を用いてもよい。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、核酸分子はゲノムＤＮＡである。本発明のこの好ましい実施形態は、研究中のヒトから単離された体液、細胞または組織由来のゲノムＤＮＡに基づいて解析が行われるだろうという事実を反映するものである。
【００２４】
本発明の核酸分子のさらに好ましい実施形態において、前記ゲノムＤＮＡは遺伝子の一部である。本発明に従って、ＬＰＨ遺伝子に対して−１３９１０位または−２２０１８位を有するＭＣＭ６遺伝子のイントロンの少なくとも１つが解析されることが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明は、少なくとも１４ヌクレオチドを有する、本明細書において上述の核酸分子の断片に関し、前記断片は、ＬＰＨ遺伝子の（上流の）ヌクレオチド位−１３９１０またはヌクレオチド位−２２０１８を含む。
【００２６】
本発明の断片は、天然由来ならびに（半）合成由来であってもよい。このように、断片は例えば、有機化学の従来のプロトコールに従って合成された核酸分子であってもよい。重要なことには、本発明の核酸断片は、ＬＰＨ遺伝子の上流にあるヌクレオチド位−１３９１０または−２２０１８を含む。これらの位置において、断片は、野生型ヌクレオチド、あるいは成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示すヌクレオチド（「変異」配列とも呼ばれる）のいずれかを有し得る。したがって、本発明の断片は、たとえば野生型と変異配列とを区別するアッセイに使用してもよい。本発明の断片は、少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、例えば３０ヌクレオチドからなることがさらに好ましい。
【００２７】
さらに、本発明は、本明細書において上述の核酸分子と相補的な核酸分子に関する。少なくとも１４ヌクレオチドを含み、かつＬＰＨ遺伝子の上流にある配列の少なくとも−１３９１０位または−２２０１８位を網羅する、本発明のこの実施形態は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける記載の位置の遺伝子構成（genetic setup）の解析に特に有用である。このように、例えば、野生型配列（つまり、−１３９１０位のＴまたは−２２０１８位のＡ）、または成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、もしくはそれを示す変異（−１３９１０位のＣまたは−２２０１８位のＧ）に正確に相補的な１５ｍｅｒを使用して、多型変異間を区別することができる。これは、適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が選択されたとしても、解析される試料中のＤＮＡに正確に相補的ではない、検出可能な標識で標識された核酸分子は、検出可能なシグナルを生じないだろうと考えられるためである。
【００２８】
この点に関しては、本発明の核酸分子、その断片、ならびに相補的な核酸分子が検出可能に標識されることに留意することが重要である。検出可能な標識としては、３Ｈまたは３２Ｐなどの放射性標識、または蛍光標識が挙げられる。核酸の標識は、当技術分野において十分に理解されているが、例えばサンブルック（Sambrook）ら, 上記引用文に記述されている。
【００２９】
さらに、本発明は、本明細書で上述される核酸分子を含むベクターに関する。本発明のベクターは、野生型配列（１つまたは複数）を含む核酸分子を含有してもよいし、または変異配列（１つまたは複数）を含む核酸分子を含有してもよい。そのベクターは特に、本発明の核酸分子を含む、遺伝子工学に従来から使用されているプラスミド、コスミド、ウイルスまたはバクテリオファージであってもよい。前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくはターゲティングベクターであることが好ましい。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを、本発明の核酸分子を標的とされる細胞集団に送達するために使用してもよい。当業者によく知られている方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、サンブルック（Sambrook）ら, 上記引用文およびアウスベル（Ausubel）ら, Current Protocol in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に述べられている技術を参照のこと。一方、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞に送達するために、リポソームに再構成することができる。細胞宿主の種類に応じて異なる公知の方法によって、本発明の核酸分子を含有するベクターを宿主細胞に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般に、原核細胞に用いられているのに対して、例えば、リン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションまたは電気穿孔法は、他の細胞宿主に使用される；上記のサンブルック（Sambrook）を参照のこと。
【００３０】
かかるベクターはさらに、適切な宿主細胞における、適切な条件下での前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの遺伝子を含み得る。本発明の核酸分子は、原核細胞または真核細胞における発現が可能となるように、発現制御配列に作動可能に連結されることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を保証する調節因子は、当業者にはよく知られている。それらは通常、転写の開始を実現する調節配列、および任意に、転写の終結および転写物の安定化を保証するポリＡシグナル、および／または前記ポリヌクレオチドの発現をさらに高めるイントロンを含む。その他の調節因子は、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサー、および／または天然に関連する、または異種のプロモーター領域を含み得る。原核生物の宿主細胞中での発現を可能にする、可能性のある調節因子は、例えば、大腸菌におけるＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターを含み、真核生物の宿主細胞中での発現を可能にする調節因子の例としては、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、またはＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーまたは哺乳動物および他の動物細胞におけるグロブリンイントロンが挙げられる。転写開始を担う因子に加えて、かかる調節因子は、ポリヌクレオチドの下流にあるＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位などの転写終結シグナルも含み得る。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製を提供する、Ｃ末端もしくはＣ末端同定ペプチドペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。このコンテクストにおいて、適切な発現ベクターは、岡山（Okayama）-ベルク（Berg）のｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１(Pharmacia社)、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、Ｅｃｈｏ（登録商標）クローニングシステム(Invitroge社）、ｐＳＰＯＲＴ１(GIBCO BRL社)またはｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｎ／ｐＲｅｖＴｅｔ−ＯｆｆまたはｐＣＩ(Promega社)などの当技術分野で公知のベクターである。好ましくは、発現制御配列は、真核生物の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列を使用してもよい。
【００３１】
上述のように、本発明のベクターは、遺伝子導入またはターゲティングベクターであってもよい。ｅｘ−ｖｉｖｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏ技術による治療遺伝子の導入に基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な応用のうちの１つである。ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｉｎ−ｖｉｖｏでの遺伝子治療に用いられる適切なベクターおよび方法は、文献に記述されており、当業者には公知である；例えば、ジョルダーノ（Giordano）, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919;アンダーソン（Anderson）, Science 256 (1992), 808-813; Isner, ランセット（Lancet）348 (1996), 370-374; ミュールハウゼン（Muhlhauser）, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; ワング（Wang）, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO 97/00957, シャーパー （Schaper）, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, またはケイ（Kay）ら (2001) Nature Medicine, 7, 33-40）およびそれらに記載の参考文献を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、直接的に導入するために、またはリポソームもしくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して細胞に導入するために設計することができる。前記細胞は、生殖細胞系細胞、胚細胞、または卵細胞またはそれから誘導される細胞であることが好ましく、最も好ましくは、前記細胞は幹細胞である。遺伝子治療は、野生型核酸分子のみで考えられる。
【００３２】
本発明は、プライマーまたはプライマー対にも関し、そのプライマーまたはプライマー対は、ＬＰＨのヌクレオチド位−１３９１０または−２２０１８を含む上述の核酸と、またはそれの相補鎖と、（非常に）厳密な条件下にてハイブリダイズする。本発明のプライマーは、１７または２１ヌクレオチドなど、少なくとも１４ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。そのプライマーは、２４ヌクレオチドの最大長さを有することがさらに好ましい。伸長反応または増幅反応などの適切な検出方法と組み合わせられる、−１３９１０位または−２２０１８位のいずれかを含むゲノム配列との、適切な条件下でのプライマーのハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションの欠失を用いて、多型変異間を区別し、次いで、例えば成人型ラクターゼ欠乏症について研究中のヒトの素因に関して結論を導き出すことができる。本発明では、２種類のプライマー／プライマー対を取り上げる。一方の種類のプライマーは変異配列を含む配列とハイブリダイズする。言い換えると、そのプライマーは、−１３９１０位にＣまたは−２２０１８位にＧを含む配列に、またはその相補鎖に正確に相補的である。もう一方の種類のプライマーは、−１３９１０位にＴまたは−２２０１８位にＡを有する配列に、またはそれの相補鎖に正確に相補的である。ハイブリダイゼーション条件は好ましくは、十分厳密であるように選択されるであろうことから、例えば変異配列に正確に相補的なプライマーを野生型対立遺伝子と接触させても、結果としてミスマッチが形成するため、効率的なハイブリダイゼーションは行われない。洗浄後、プライマーが除去されるため、シグナルは検出されないだろう。
【００３３】
さらに、本発明は、本明細書において上述される本発明のベクターで形質転換された非ヒト宿主に関する。その宿主は、変異配列または野生型配列を保持し得る。育種などでは、宿主は、一方または両方のＳＮＰに対してヘテロ接合性またはホモ接合性であることができる。本発明の宿主は、ゲノムに一過的にまたは安定的に組み込まれた本発明のベクターを保持し得る。本発明の非ヒト宿主を作製する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、サンブルック（Sambrook）ら, 上記引用文に記載の従来のトランスフェクションのプロトコールを用いて、形質転換細菌（大腸菌など）または形質転換酵母を作製することができる。本発明の非ヒト宿主は、例えば成人型ラクターゼ欠乏症の発症を解明するために使用することができる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、非ヒト宿主は、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、遺伝子導入動物または遺伝子導入植物である。大腸菌が好ましい細菌であるのに対して、好ましい酵母細胞は、S. cerevisiaeまたはPichia pastoris細胞である。好ましい真菌細胞は、アスペルギルス属（Aspergillus）細胞であり、好ましい昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperda細胞が挙げられる。好ましい哺乳動物細胞は、ＬＰＨ酵素の発現を示す結腸癌細胞系であり、ＣａＣｏ２細胞が挙げられる。
【００３５】
遺伝子導入非ヒト動物、例えば遺伝子導入マウスの作製方法は、生殖細胞、胚細胞、幹細胞または卵細胞またはそれから誘導される細胞に上述のポリヌクレオチドまたはターゲティングベクターを導入することを含む。非ヒト動物は、本明細書に記載の本発明のスクリーニング法に従って使用することができる。遺伝子導入胚の作製およびそれらのスクリーニングは、例えばA. L. ジョイナー（Joyner）Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Pressによって記述されているように行うことができる。胚の胚細胞のＤＮＡは、例えば適切な相補的核酸分子でのサザンブロット法を用いて解析することができる；上記文献を参照のこと。遺伝子導入非ヒト動物を作製するための一般的な方法は、当技術分野において記述されており、例えばＷＯ９４／２４２７４を参照のこと。遺伝子導入非ヒト生物（相同的に標的とされる非ヒト動物を含む）を作製するには、胚幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。本質的に述べられているように(ロバートソン（Robertson）,E. J.（1987）in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), p. 71-112)、有糸分裂上不活性なＳＮＬ７６／７細胞のフィーダー層上で成長するＡＢ−１細胞系(マクマホン（McMahon）およびブラッドリー（Bradley）, Cell 62:1073-1085 (1990))などのマウスＥＳ細胞が、相同的遺伝子ターゲティングに用いられる。他の適切なＥＳ細胞系としては、限定されないが、Ｅ１４細胞系  (フーパー（Hooper）ら, Nature 326:292-295 (1987))、Ｄ３細胞系(ドッチマン（Doetschman）ら, J. Embryol. Exp. Morph. 87:27-45 (1985))、ＣＣＥ細胞系 (ロバートソン（Robertson）ら, Nature 323:445-448 (1986))、ＡＫ−７細胞系(チワン（Zhuang）ら, Cell 77:875-884 (1994))が挙げられる。特異的標的化変異を有するＥＳ細胞からのマウス系作製の成功は、ＥＳ細胞の多分化能（つまり、胚形成に関与し、得られた動物の胚細胞に寄与する胚盤胞または桑実胚など、胚を発生する宿主に注入された後のそれらの能力）に依存する。注入されたＥＳ細胞を含有する胚盤胞は、偽妊娠の非ヒトの雌の子宮内で発達させ、キメラマウスとして生まれる。目的の核酸分子を有する細胞のキメラである、得られた遺伝子導入マウスを戻し交配し、本発明の核酸分子にヘテロ接合性の遺伝子導入マウスを同定するために、子孫の尾(tail）の生検のＤＮＡについてＰＣＲまたはサザンブロット分析することによって、正しく標的化された導入遺伝子（１つまたは複数）の存在をスクリーニングする。
【００３６】
遺伝子導入非ヒト動物は、例えば遺伝子導入マウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル（類人猿）、ウサギ、ブタ、または雌ウシである。前記遺伝子導入非ヒト動物はマウスであることが好ましい。本発明の遺伝子導入動物は、特に、本発明の核酸およびベクターの表現型発現／結果を研究するのに有用である。さらに、本発明の遺伝子導入動物は、例えばげっ歯類の腸におけるＬＰＨ酵素の発達上の発現を研究するのに有用である。本発明の非ヒト遺伝子導入動物を用いて、成人型ラクターゼ欠乏症を改善するのに有用な治療薬／組成物または可能性のある他の治療法について試験することができることがさらに考えられる。
【００３７】
さらに、本発明は、本発明の変異核酸分子に特異的に結合するが、対応する野生型核酸分子には特異的に結合しない、抗体またはアプタマーまたはファージに関する。その抗体を、結合について試験し、当技術分野でよく知られているいずれかの血清学的技術、例えばチューブ、ゲルにおける凝集技術、２次抗体を用いる、または用いない固相および捕捉技術において、あるいは免疫蛍光増強（immunofluorescence enhancement）を用いる、または用いないフローサイトメトリーで使用してもよい(例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）"Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988 (参照番号５３)に記載の技術を参照のこと）。
【００３８】
本発明に従って、その抗体は、−１３９１０位（その位のヌクレオチドがＣ）または−２２０１８位（その位のヌクレオチドがＧ）を含むエピトープを特異的に認識する。それは、この位置にＴを有する−１３９１０位を含むエピトープとも、この位置にＧを有する−２２０１８位を含むエピトープとも交差反応しない、または本質的に交差反応しない。標準プロトコールに従って作製される抗体の特異性は、ＥＬＩＳＡアッセイなどにおいて、野生型および変異配列を保持するＤＮＡ分子と接触させることによって試験することができる。変異配列を有するバックグラウンドではシグナルを生じるが、野生型配列を有するバックグラウンドではシグナルを生じない抗体のみが選択されるだろう。
【００３９】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗血清に由来する、またはポリクローナル抗血清に含まれるモノクローナル抗体もしくは抗体であってもよい。本発明によって使用される「抗体」という用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、ＦｖもしくはｓｃＦｖ断片などの前記抗体の断片をさらに含む；例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）53，上記引用文を参照のこと。抗体またはその断片は天然由来であってもよいし、または（半）合成的に作製されたものであってもよい。かかる合成産物は、本発明の抗体と同じまたは本質的に同じ結合特異性を有する、半タンパク性（semi-proteinaceous）物質としての非タンパク性物質も含み得る。かかる産物は、例えば、ペプチドミメティックによって得ることができる。
【００４０】
「アプタマー」という用語は、当技術分野でよく知られており、例えばオズボーン（Osborne）ら, Curr. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9（参照番号５１）またはストール（Stall）およびショーカ（Szoka）, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483 (参照番号５２)に定義されている。
【００４１】
さらに、本発明は、本明細書において上述の野生型核酸分子に特異的に結合するが、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示す、対応する変異配列には特異的に結合しない、抗体またはアプタマーまたはファージに関する。変異配列に特異的な抗体に関して述べられた、特異性等に関する記述には、本明細書において必要に応じて変更が加えられる。
【００４２】
さらに、本発明は、本明細書において上述される野生型核酸分子を含む医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、遺伝子治療アプローチ、特に体細胞遺伝子治療に用いることができる。上記で示され、かつ本発明の医薬組成物に含有される野生型核酸分子は、薬学的に許容される担体および／または希釈剤と組み合わせてもよい。適切な薬剤担体の例は当技術分野でよく知られており、リン酸緩衝液、水、油／水（Ｏ／Ｗ）型エマルションなどのエマルション、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が挙げられる。かかる担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって調製することができる。これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができる。適切な組成物の投与は、様々な方法によって、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、皮内、鼻腔内または気管支内投与によって行うことができる。投与計画は、治療を行う医師および臨床因子によって決定されるだろう。医療分野においてよく知られているように、いずれか１人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、時間および投与経路、全身の健康状態、および同時に投与される他の薬物などの多くの因子によって異なる。通常の投与量は例えば、発現のために、または発現の抑制のために、核酸０．００１〜１０００μｇの範囲であることができる；しかしながら、この例示的な範囲を下回るまたは超える投与量が、特に上記の因子を考慮して考えられる。投与量はさまざまであるだろうが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投与量は、ＤＮＡ分子約１０6〜１０12コピーである。定期的な診断によって、経過がモニターされる。本発明の組成物は、局所的に投与してもよいし、または全身的に投与してもよい。投与は一般に、非経口的、例えば静脈内投与であるだろう；例えば内部標的もしくは外部標的へのパーティクルガンによる（biolistic）送達によって、または動脈における部位へのカテーテルによって、標的部位にＤＮＡを直接投与することもできる。非経口投与用の製剤は、滅菌水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液、例えば生理食塩水および緩衝培地が挙げられる。非経口用の賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖(Ringer's dextrose）、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油などが挙げられる。静脈内用の賦形剤としては、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルのブドウ糖をベースとするものなど）等が挙げられる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等の保存剤および他の添加剤もまた、存在してもよい。
【００４４】
さらに、本発明は、本明細書において上述される核酸分子、本明細書において上述されるベクター、本明細書において上述されるプライマーまたはプライマー対、および／または本明細書において上述される抗体アプタマーおよび／またはファージを含有する診断組成物に関する。その診断組成物は、成人型ラクターゼ欠乏症を発症する彼または彼女の素因に関して、またはその急性症状の診断に関して、ヒトの遺伝的体質を評価するのに有用である。診断組成物の可能な種々の成分は、溶媒中で、または凍結乾燥状態などの他の状態で１つまたは複数のバイアル中にパッケージされる。溶媒中に溶解される場合には、診断組成物は、少なくとも＋８℃〜＋４℃に冷却することが好ましい。他の場合には、凍結することが好ましい。
【００４５】
本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症もしくはそれに関連する形質の存在または素因について試験する方法であって、ホモ接合またはヘテロ接合の状態における、本明細書において上述される核酸分子の存在に対するかかる素因を保持する将来の患者またはかかる素因を保持する疑いのあるヒトから採取された試料を試験することを含む方法にも関する。様々な実施形態において、野生型配列（１つまたは複数）または変異配列（１つまたは複数）の存在について、それを試験することができる。
【００４６】
本発明の方法は、前記ヒト／患者の遺伝的構成（genetic set-up）を検出し、前記患者の有する症状が成人型ラクターゼ欠乏症かどうかの適切な結論を導き出すのに有用である。代替方法として、症状を有していないヒトが、成人型ラクターゼ欠乏症の素因を保有するかどうかを評価することもできる。ＬＰＨ遺伝子の上流にある−１３９１０位に関しては、シトシンがホモ接合の状態で見出される場合にのみ、その症状は成人型ラクターゼ欠乏症と診断されるか、または対応する素因が明白であるだろう。一方、チミジンがホモ接合の状態で見出された場合、または個体がヘテロ接合性（Ｃ／Ｔ）である場合、次いで、患者が患っている症状は、成人型ラクターゼ欠乏症に関連せず、さらに、その患者はこの症状を発症する素因を保有しないと結論づけられる。しかしながら、ヘテロ接合性遺伝子型を保有するヒトの子供は、Ｃ残基を有する染色体がもう一方の親からの対応する染色体と合致する場合に、その症状を発症する可能性があると結論づけられる。
【００４７】
その状況は同様であり、本質的に同じ結論が、−２２０１８位におけるＳＮＰの解析に当てはまる。ホモ接合的に存在するＧ残基は、急性成人型ラクターゼ欠乏症の素因またはその発生を表す。ヘテロ接合のＧ／Ａ状態は、その症状を発症しない高い可能性と相関する。ホモ接合状態でＡを保有する個体は、その症状を発症するとは予想されないだろう。同様に、ある症状を有する患者は、成人型ラクターゼ欠乏症を患っていないと診断されるだろう。
【００４８】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記試験は、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示す核酸分子と相補的な、本明細書において上述される相補的核酸分子、あるいはプローブとしての野生型配列に相補的な本明細書に上述される核酸分子を、前記試料に含まれる核酸分子と（非常に）厳密な条件下でハイブリダイズさせることと、前記ハイブリダイゼーションを検出することと、を含む。
【００４９】
さらにまた、使用する核酸プローブに応じて、野生型または変異配列（つまり、成人型ラクターゼ欠乏症の一因となる、またはそれを示す）のいずれかが検出されるだろう。ハイブリダイゼーション条件は、野生型配列に相補的な核酸分子が変異配列とハイブリダイズしない、または本質的にハイブリダイズしないように選択されるであろうことは理解されよう。同様に、変異配列に相補的な核酸分子は、野生型配列とハイブリダイズしない、または本質的にハイブリダイズしないだろう。本発明のハイブリダイゼーション法において、ホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子型から得られた結果を区別するために、例えば、ハイブリダイゼーション後のそれぞれの検出シグナルの強さ／強度をモニター／検出することができる。本発明のハイブリダイゼーション法において、ホモ接合性、ヘテロ接合性野生型対立遺伝子および／またはホモ接合性変異対立遺伝子の間を区別するために、対応する遺伝子型の内部コントロール試料が分析に含まれるだろう。
【００５０】
さらに好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、前記ハイブリダイゼーションの産物を制限エンドヌクレアーゼで消化するか、または前記ハイブリダイゼーションの産物を、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化にかけることと、前記消化の産物を分析することを含む。本発明のこの好ましい実施形態によって、簡便な手段を用いて、有効なハイブリダイゼーションと有効でないハイブリダイゼーションを区別することが可能となる。例えば、−１３９１０位または−２２０１８位に隣接するＤＮＡ配列がエンドヌクレアーゼ制限部位を含有する場合、ハイブリダイズ産物は、有効なハイブリダイゼーションでは、適切な制限酵素によって切断されるのに対して、ハイブリダイゼーションが不十分であると、二本鎖産物は得られないか、または認識可能な制限部位を含まず、したがって、切断されないだろう。特に、ＤＮＡ変異体Ｃ／Ｔ-13910の配列に特異的な制限酵素は、ＣｖｉＪ Ｉであり、ＤＮＡ変異体Ｇ／Ａ-22018の配列に特異的な制限酵素は、ＨｈａＩおよびＡｃｉ Ｉである。ｒｇ／ｃｙを切断する前記酵素は、Ｗｅｂｃｕｔｔｅｒプログラムを使用することによって見出される。消化産物の解析は、例えば臭化エチジウムでの核酸の染色と任意に併用されるゲル電気泳動などの、従来の手段によって行うことができる。サザンブロット法などの更なる技術との組み合わせもまた考えられる。
【００５１】
前記ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、抗ＤＮＡ二本鎖抗体によって、または標識されたオリゴヌクレオチドを用いることによって行うことができる。好都合なことに、本発明の方法は、サザンブロット法もしくはノーザンブロット法およびなどのブロット技術および関連する技術と共に用いられる。標識化は、例えば標準プロトコールによって行われ、放射性マーカー、蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、酵素標識等での標識化が含まれる（上記もまた参照のこと）。
【００５２】
上記に従って、本発明の方法の他の好ましい実施形態では、前記プローブは、例えば本明細書において上述される方法によって、および上述の標識で検出可能に標識される。
【００５３】
本発明の方法のさらに他の好ましい方法において、前記試験は、本明細書において記述される核酸分子の少なくとも一部の核酸配列を決定することを含み、前記部分は、ＬＰＨ遺伝子のヌクレオチド位−１３９１０および／またはヌクレオチド位−２２０１８を含む。核酸分子の決定は、サンガー（Sanger）法またはマクサム-ギルバート法（Maxam/Gilbert）のプロトコールなど、従来のプロトコールのうちの１つに従って行うことができる（更なる参考には、サンブルック（Sambrook）ら,上記引用文を参照のこと）。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、核酸の決定は、固相ミニシーケンシング（minisequencing）によって行われる。固相ミニシーケンシングは、溶液中の野生型および変異ヌクレオチドの定量分析に基づく。最初に、変異を含有するゲノム領域が、１つのビオチン化および非ビオチン化プライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。そのビオチン化プライマーは、ストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングプレートに結合されている。ＰＣＲ産物は一本鎖状に変性されて、変異部位のすぐ前にこの鎖にミスーシーケンシングプライマーが結合することが可能となる。非標識化ｄＮＴＰと共に、トリチウム（Ｈ３）または蛍光標識された変異および野生型ヌクレオチドは、ミニシーケンシング反応に添加され、Ｔａｑポリメラーゼを用いてシーケンスされる。その結果は、β計数器または蛍光光度計によって測定され、かつＲ比として表される、反応における野生型および変異ヌクレオチドの量に基づく。サイバネン（Syvanen） AC, サジャンティラ（Sajantila） A,ルッカ（Lukka）M. Am J Hum Genet  1993: 52,46-59およびスオマラニエン（Suomalainen） A およびサイバネン（Syvanen）AC. Methods Mol Biol 1996;65:73-79を参照のこと。本発明の方法の好ましい実施形態はさらに、前記核酸配列を決定する前に、前記核酸分子の少なくとも前記一部を増幅することを含む。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが好ましい。リガーゼ連鎖反応などの他の増幅方法を用いることもできる。
【００５５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記試験は、増幅反応を行う段階であって、前記増幅反応で使用されるプライマーの少なくとも１つが、本明細書において上述されるプライマーであるか、本明細書において上述されるプライマー対に属する段階と、増幅産物についてアッセイする段階と、を含む。この実施形態において、かつ研究者／医師が得たいと望む情報に応じて、野生型または変異配列のいずれかとハイブリダイズするプライマーが用いられる。
【００５６】
本発明の方法によって、前記標的配列が、ハイブリダイゼーションに用いられるプライマーに正確に相補的な配列を有するならば、標的配列のみが増幅されるだろう。これは、どの種類のプライマーが使用されるかに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは（非常に）厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、野生型／変異配列とハイブリダイズしないが（結果として、増幅産物は得られない）、正確に合致する配列のみにハイブリダイズするであろうためである。当然のことながら、両方のＳＮＰとハイブリダイズするプライマー対の組み合わせを用いることもできる。この場合には、期待される増幅産物の解析（２番目の非識別(non-differentiating）プライマーが各遺伝子座に対して同じである場合、増幅産物はゼロ、１種、２種、３種または４種であり得る）から、−１３９１０位および−２２０１８位の両方の遺伝的状態についての情報が得られるだろう。
【００５７】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われるか、または前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは当技術分野で十分に確立されている。本発明に従って使用される通常の条件は、例えば、９３℃で３分間の変性段階；５５℃で３０秒間のアニーリング段階；７２℃で７５秒間の伸長段階；および７２℃で１０分間の最終伸長段階；で例示される、体積合計５０μｌでの合計３５サイクルを含む。
【００５８】
本発明はさらに、成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因について試験する方法であって、本明細書において上述される抗体またはアプタマーまたはファージへの特異的結合に関して、ヒトから採取された試料をアッセイすることを含む方法に関する。このコンテクストにおいて、ホモ接合性の野生型対照試料（２つの存続性対立遺伝子を含む）と比較して、本発明の抗原の存在に対して弱い染色が、ヘテロ接合性野生型（一方は存続性対立遺伝子であり、もう一方はラクターゼ欠乏（hypolactasic）の対立遺伝子）に示されるのに対して、ホモ接合のラクターゼ欠乏（hypolactasic）の個体には、適切な抗体が使用されたとしても、染色は期待されない。本発明の方法は、内部コントロールとして、可能性のある３つすべての対立遺伝子の組み合わせに対応する対照試料の存在下にて行われることが好ましい。試験は、野生型配列に特異的な、または変異配列に特異的な抗体等を用いて行うことができる。さらにまた、結合についての試験は、ＥＬＩＳＡなどの標準技術の使用を含み得る；例えば、ハーロー（Harlow）およびレーン（Lane）53，上記引用文を参照のこと。
【００５９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記抗体またはアプタマーまたはファージは検出可能に標識される。そのアプタマーは好ましくは、3Ｈもしくは32Ｐで放射標識されるか、または上述の蛍光マーカーで標識されるのに対して、ファージまたは抗体は、それに対応する手法において（好ましい放射性標識として131Ｉで）標識するか、またはＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、またはｍｙｃタグなどのタグで標識することができる。
【００６０】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、その試験はイムノアッセイである。
【００６１】
本発明の方法の他の好ましい実施形態において、前記試料は、血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘膜組織、粘液、膣組織、膣から採取された胎児組織、皮膚、毛、毛嚢または他のヒト組織である。
【００６２】
本発明のその他の好ましい実施形態では、前記試料からの前記核酸分子は、固体担体に固定化される。
【００６３】
固体担体に核酸分子を固定化することによって、試験アッセイの扱いが容易になり、さらに、チップ、シリカウエハーまたはマイクロタイタープレートなどの少なくとも一部の固体担体によって、大量の試料を同時に分析することができる。理想的には、その固体担体によって、例えばロボット装置を用いた自動化試験が可能となる。
【００６４】
本発明の特に好ましい実施形態において、前記固体担体は、チップ、シリカウエハー、ビーズまたはマイクロタイタープレートである。
【００６５】
さらに、本発明は、成人型ラクターゼ欠乏症の存在または素因の解析のための、本明細書において上述される核酸分子の使用に関する。その核酸分子によって同時に、本明細書において詳細に述べられているように、その症状が存在しないこと、またはその症状の素因を解析することが可能となる。
【００６６】
さらに、本発明は、本明細書において上述される核酸分子、本明細書において上述されるプライマーまたはプライマー対、本明細書において上述されるベクター、および／または本明細書において上述される抗体アプタマーおよび／またはファージを１つまたは複数の容器中に含むキットに関する。
【００６７】
本発明は、本明細書において上述される核酸分子または本明細書において上述されるベクターの、遺伝子治療における使用にも関する。遺伝子治療アプローチは、本発明のベクターに関して本明細書において上述されており、同様に本明細書に当てはまる。本発明によれば、本明細書において上記に定義される、特に配列番号３ないし４で示される核酸分子の断片もまた、遺伝子治療アプローチに用いてもよいことに留意のこと。前記断片は、（ｃ）本明細書において上記で定義される（配列番号３でも示される）−１３９１０位のヌクレオチドまたは（ｄ）本明細書において上記で定義される（配列番号４でも示される）−２２０１８位のヌクレオチドを含む。前記断片は、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００および最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００６８】
本発明の使用の好ましい実施形態では、前記遺伝子治療により、成人型ラクターゼ欠乏症が治療または予防される。
【００６９】
以下の実施例により、本発明を説明する。
実施例１：連鎖および連鎖不平衡解析
２ｑ２１上のＬＰＨ遺伝子の両側にあるＤ２Ｓ１１４とＤ２Ｓ２３８５の間の７つの多型マイクロサテライトマーカーを、拡大された９つのフィンランド人ラクターゼ欠乏症家系において解析した（図１）。連鎖に関する有意な証拠が、マーカーＤ２Ｓ３１４、Ｄ２Ｓ４４２、Ｄ２Ｓ２１９６およびＤ２Ｓ１３３４で見出され、マーカーＤ２Ｓ２１９６で得られたθ＝０にて７．６７の最高ロッドスコアを有した（表１）。絶対的な組換え現象は、ラクターゼ存続性／非存続性遺伝子座の動原体の境界を定義する、マーカーＤ２Ｓ１１４で検出され（家系Ｂ、ＩＶ３）、その遺伝子座のテロメアの境界を定義する、マーカーＤ２Ｓ２３８５で検出された（家族Ｂ、ＩＶ１７）（図１、表１）。棄却域（critical region)を微細にマッピングするために、さらに９つの多型マーカーを解析した。対立遺伝子頻度および組換え率を攪乱母数として扱って、その領域に関する連鎖不平衡（ＬＤ）を、検出された連鎖について条件的にモニターした16〜17。２００ｋｂ区間に及ぶ、９つのマーカーのうち６つのマーカー（ＬＰＨ１３、ＬＰＨ２、ＬＰＨ１、ＡＣ３、ＡＣ４、およびＡＣ１０）は、ＬＤの非常に有意な証拠（ｐ＜１０-4）を示すのに対して、ＬＰＨ遺伝子からの他の３つのマーカーは、ＬＤの証拠を示さなかった（表１）。２つのマーカー、ＬＰＨおよびＡＣ３は、対立遺伝子のラクターゼ存続性において最も有意な連鎖不平衡を表した（ｐ＜１０-7）。
【００７０】
その家系材料は、本来サヒ（Sahi）5によって研究された９つの拡大されたフィンランド人家系からなる。１９７０年代に、すべての家系材料が成人型ラクターゼ欠乏症について試験された。この研究に用いられる家系材料は、若い世代における家族のＤＮＡを収集することによって拡大された。この研究における家系材料は、合計１９４個体からなった（図１）。すべての家族の表現型状態が、４９個体を除くすべてにおいて、エタノールを用いた乳糖耐性検査（ＬＴＴＥ）4〜5によって確認された。グルテン性腸症は、血清ＩｇＡ抗組織トランスグルタミナーゼの測定によってすべての罹患者において除外されている45。インフォームド・コンセントを得た後、標準プロトコール46に従って、関与しているすべての家族から採取した血液試料からＤＮＡを抽出した。症例対照研究として、空腸生検標本から単離された１９６個のランダムなＤＮＡ試料であって、その試料からの２糖類分解酵活性がヘルシンキ大学病院（Helsinki University Hospital）で測定されている４７試料をシーケンスした。標準プロトコール146に従って、腸内の生検からＤＮＡを単離した。これらの系列は、１３７個のラクターゼ存続性試料および５９個の非存続性試料を含んだ。さらに、M. ロッシ(Rossi), University of Naplesによって親切にも提供されたイタリア人９名からのＤＮＡ、M. レンツェ(Lentze), University of Bonnによって親切にも提供されたドイツ人９名のＤＮＡ試料、J.K. セオ（Seo），Seoul National Universityによって親切にも提供された韓国人２２名のＤＮＡ試料、腸内生検試料を分析した（表中：韓国人２３名、イタリア人９名、ドイツ人７名（ドイツからの症例のうち１つは、韓国が起源である））。その診断は、二糖類分解酵素活性の測定に基づくものであった。最終的に、フィンランド人集団におけるＣ／Ｔ-13910変異の頻度を決定するために、東フィンランドおよび西フィンランドの小さな州からの匿名フィンランド人血液ドナー９３８名のＤＮＡおよびＣＥＰＨ家系19に属する１０９名の親のＤＮＡを解析した。さらに、標準プロトコール48を用いて、肝生検から単離されたヒヒ（Papio hemedryas ussinus）由来のＤＮＡを解析した。この研究は、ヘルシンキ大学病院（Helsinki University Hospital）およびフィンランド赤十字輸血サービス（Finnish Red Cross Blood Transfusion Service）の倫理委員会（Ethical Committee）によって承認された。
【００７１】
実施例２：拡大されたハプロタイプ解析
第１段階において、２ｑ２１上のＬＰＨ遺伝子の両側にある極めて多型の１０個のマイクロサテライトマーカーが、他に記載されるように40,55解析された。簡単に言えば、The Genethon Resource Center55からのラクターゼ遺伝子付近にある、２ｑ上の極めて多型のマイクロサテライトマーカーを以下のような遺伝距離：ｃｅｎ−Ｄ２Ｓ１１４−１ｃＭ−Ｄ２Ｓ１３３４−０ｃＭ−Ｄ２Ｓ２１９６−０ｃＭ−Ｄ２Ｓ４４２−２ｃＭ−Ｄ２Ｓ３１４−２ｃＭ−Ｄ２Ｓ２３８５−１ｃＭ−Ｄ２Ｓ２２８８−１ｃＭ−Ｄ２Ｓ３９７−１ｃＭ−Ｄ２Ｓ１５０−１ｃＭ−Ｄ２Ｓ１３２で解析した。マーカーの順序は大部分、Genethonマップで補われる第２染色体の物理的ＹＡＣコンティグマップ（チューマコフ（Chumakov）ら，199556）から得られた。鋳型ＤＮＡ１２ｎｇ、プライマー５ｐｍｏｌ、各ヌクレオチド０．２ｍＭ、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１５ｍＭ（ＮＨ4）2Ｓ０4、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％ゼラチン、０．２５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Dynazyme, Finnzymes社）を含有する合計体積１５μｌ中でＰＣＲが行われた。32Ｐ−γＡＴＰを用いて、プライマーの１つを５’末端で放射標識した。その反応は、マルチウェル・マイクロタイタープレート中で、９４℃で３０秒間の変性段階；プライマーに応じて、様々な温度にて３０秒間アニーリングする段階；７２℃で３０秒間伸長する段階；３分間に設定された変性段階；および５分での最終伸長段階；を含む３５サイクル行われた。増幅された断片を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーを行った。第２段階では、ＬＰＨ遺伝子にわたり構築されたコンティグ内のその他の９個のマイクロサテライトマーカーを、Repeat Masker program (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)を用いて、ＢＡＣ（ＮＨ０３４Ｌ２３、ＮＨ０３１８Ｌ１３、ＮＨ０２１８Ｌ２２、およびＲＰ１１−３２９Ｉ１）の公開ゲノム配列から同定した。その反復配列の両側にあるプライマーを合成した。ＰＣＲ条件は、他に記載の通りである40。増幅された断片を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーを行った。
【００７２】
ＬＩＮＫＡＧＥプログラムパッケージ39のＭＬＩＮＫオプションを使用することによって、対をなすロッドスコアを計算した。完全浸透度を有し、組換え率の性差なく、疾患対立遺伝子頻度０．４を有する、成人型ラクターゼ欠乏症の常染色体劣性遺伝が推定された。その症状はフィンランド人集団5〜6のその年齢に現れたため、２０歳の年齢を超える個体のみが、研究に含まれた。ＬＴＴＥによって確認されていない個体の疾患状態は、未知であると見なされた。対立遺伝子頻度およびそのマーカーのヘテロ接合性が、パラメトリックな連鎖解析49の目的のために、Ｄｏｗｎｆｒｅｑプログラムを用いて、家系材料から推定された。さらに、常染色体劣性型の遺伝を想定して16、疑似マーカー（pseudomarker）連鎖および連鎖不平衡解析を行った。対立遺伝子頻度および組換え率を攪乱母数16,49として扱って、検出された連鎖についてＬＤの試験を条件的に行った。これらの解析から得られたＰ値を表１に示す。ハプロタイプは、この順序：ＬＰＨ１−ＬＰＨ２−ＬＰＨ１３−ＡＣ７−ＡＣ３−ＡＣ４−ＡＣ５（図３）でマイクロサテライトマーカーに対して手作業で構築された。本発明者らの家系材料における合計５４個の非存続性染色体および合計３３個の存続性染色体がハプロタイプ解析に利用可能であった。
【００７３】
密に連鎖するマーカーの順序は、棄却域における４つのＢＡＣクローン：ＮＨ００３４Ｌ２３、ＮＨ０２１８Ｌ２２、ＮＨ０３１８Ｌ１３および３２９Ｉ１０を１つの連続した配列セグメントに構築することによって確認された。このコンティグは、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＤＡＲＳ）遺伝子のマーカーＡＣ８からエクソン１０におよび、合計２２２．５ｋｂを網羅した（図２）。連鎖領域のこの物理地図に基づいて、１５０ｋｂ区間を網羅する、７つのマーカーを有する拡大されたハプロタイプ（ｃｅｎ−ＬＰＨ１３−ＬＰＨ２−ＬＰＨ１−ＡＣ７−ＡＣ３−ＡＣ４−ＡＣ５−ｔｅｌ）（図３）が構築された。１つの主要なハプロタイプが、非存続性対立遺伝子のうち３個（５％）に対して、存続性対立遺伝子２０個（６０％）中に存在し、ハプロタイプの広範な多様性が非存続性対立遺伝子で認められた。存続性対立遺伝子におけるハプロタイプの残り４０％は、歴史的組換え現象による名プロタイプの破壊と一致するように、祖先ハプロタイプと異なった。保存ハプロタイプ解析に基づいて、ラクターゼ存続性の遺伝子座は、マーカーＬＰＨ１とＡＣ３との間の４７ｋｂ区間に限定される可能性がある（図３）。
【００７４】
実施例３：成人型ラクターゼ欠乏症遺伝子座の配列解析
マーカーＬＰＨ１とＡＣ３との間の４７ｋｂ領域を、９つのラクターゼ欠乏症家系の家族数人のゲノムＤＮＡからの、オーバーラップＰＣＲ断片において増幅し、シーケンスした。その領域は、４７ｋｂ棄却域（critical region)の３６ｋｂを網羅する、微小染色体維持（ＭＣＭ６）遺伝子18を含有する（図２）。合計５２個の変異体を除いては、ＭＣＭ６遺伝子のコード領域では変異は検出されなかった；４３個のＳＮＰおよび９個の欠失／挿入多型が、４７ｋｂ棄却域（critical region)において同定された（表２）。変異体のうち２つだけ（Ｃ／Ｔ-13910、Ｇ／Ａ-22018）が、フィンランド人家系におけるラクターゼ存続性／非存続性形質と関連した（表２および３）。第１の関連する変異体、Ｃ／Ｔ-13910は、ＬＰＨ遺伝子の最初のＡＴＧコドンから−１３９１０ｂｐ位にあるＭＣＭ６遺伝子のイントロン１３に存在する。第２の関連する変異体、Ｇ／Ａ-22018は、ＬＰＨ遺伝子の最初のＡＴＧコドンから−２２０１８位にあるＭＣＭ６遺伝子のイントロン９に位置する。互いに８ｋｂ離れた、これらの２つの変異体は完全に、拡大された９つのフィンランド人家系における成人型ラクターゼ欠乏症で同時分離した。すべてのラクターゼ欠乏の（非存続性）家族は、Ｃ-13910とＧ-22018の両方にホモ接合であった（表３）。興味深いことに、これらのどちらの変異体も、反復要素中に存在し、Ｌ２誘導要素にはＣ／Ｔ-13910、Ａｌｕ要素にはＧ／Ａ-22018が存在する。
【００７５】
実験的に、本発明者らの家系材料からの、棄却域にわたり同様のハプロタイプを共有する、非存続性個体３名、ホモ接合の存続性個体２名およびヘテロ接合の存続性個体２名を、第１段階におけるシーケンシングに使用した（図１）。成人型ラクターゼ欠乏症の棄却域を網羅する、ＢＡＣ：ＮＨ００３４Ｌ２３、ＮＨ０２１８Ｌ２２、ＮＨ０３１８Ｌ２３、およびＲＰ−３２９Ｉ１０の公開ドラフトゲノム配列を用いて、Sequencher 4ソフトウェア（Gene Codes社）を使用して１つのコンティグに構築した。ＬＰＨ１とＡＣ３との間の棄却域に及ぶオリゴヌクレオチドプライマーを設計した（オリゴヌクレオチドプライマーのリストは本明細書において以下に記載される）。ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）、プライマー（各２０ｎｇ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ０．５Ｕ（Dynazyme, Finnzymes社）を有する合計体積５０μｌで、標準バッファー中にてＰＣＲ増幅が行われた。ＰＣＲ産物のサイズが、本発明者らがDynazyme extend kit（伸長キット）を用いた（条件は本明細書において以下に記述される）１ｋｂを超える場合を除いては、大部分のＰＣＲは、以下のＰＣＲサイクル条件：９４℃で３分間変性を行う初回、次いで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１．２５分の３５サイクル、７２℃で１０分間の最終伸長を用いて増幅された。精製されたＰＣＲ産物（１５〜４０ｎｇ）を、BigDye terminator chemistry（PE Biosystems社）を用いてサイクルシーケンスした。ABI Sequencing Analysis 3.3（PE Biosystems社）およびSequencher 4.1（Gene Codes社）を用いて、データを解析した。
【００７６】
シーケンシンによるラクターゼ変異体の検出：
ゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）、プライマー（各２０ｎｇ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、０．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Dynazyme, Finnzymes社）を有する合計体積５０μｌで、標準バッファー中にて、ＰＣＲ増幅を行った。どちらのＰＣＲも、以下のＰＣＲサイクル条件：９４℃で３分間変性を行う初回、次いで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１．２５分の３５サイクル、７２℃で１０分間の最終伸長を用いて増幅された。ＰＣＲは酵素反応によって精製された。精製されたＰＣＲ産物（１５〜４０ｎｇ）を、BigDye terminator chemistry (PE Biosystems社)を用いてサイクルシーケンスした。ABI Sequencing Analysis 3.3(PE Biosystems社）およびSequencher 4.1(Gene Codes社）を用いて、データを解析した。
【００７７】
固相ミニシーケンシングによるラクターゼ変異体のスクリーニング：
Ｃ／Ｔ-13910変異体にわたるＤＮＡ断片を、１つのビオチン化（５’−Ｂｉｏ−ＣＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡ−３’）プライマーおよび非ビオチン化（５’−ＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡ−３’）プライマーを用いて増幅した。Ｇ／Ａ-22018には、ビオチン化（５’−Ｂｉｏ−ＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡ−３’）および１つの非ビオチン化（５’−ＣＴＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＡ−３’）プライマーを上述の条件下で使用した。ＰＣＲ産物１０μｌをストレプトアビジンコーティングのマイクロタイターウェル（Lab systems社，フィンランド）中に捕捉した。そのウェルを洗浄し、サイバネン（Syvanen）ら（Am J Hum Genet. (1993), 52, 46-59)）およびサイバネン（Syvanen）およびランデグレン（Landegren) (Hum Mutat. (1994), 3, 172-9)によって記述されているように、結合したＤＮＡを変性させた。Ｃ／Ｔ-13915にミニシーケンシングプライマー（５’−ＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＡＧ−３’）１０ｐｍｏｌ、Ｇ／Ａ-22018にはミニシーケンシングプライマー（５’−ＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣ−３’）１０ｐｍｏｌ、およびラクターゼ非存続性対立遺伝子に対応するＨ−ｄＣＴＰ、Ｈ−ｄＧＴＰ（１１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ammersham社，英国）またはラクターゼ存続性対立遺伝子に対応するＨ−ｄＴＴＰ、Ｈ−ｓＡＴＰのいずれか０．１μｌ、およびＤＮＡポリメラーゼ０．０５Ｕ（Dynazyme II, Finnzymes社）をそのバッファー中に含有する、ミニシーケンシング反応混合物５０μｌを各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートを５０℃で２０分間インキュベートし、ウェルを洗浄した。検出用プライマーを溶出し、溶出された放射能を液体シンチレーション計数器（Rackbeta 1209, Wallac,フィンランド）で測定した。２つの並行なミニシーケンシング反応が各ＰＣＲ産物に対して行われた。
【００７８】
Ｃ／Ｔ-13910変異体に対するＰＣＲプライマーおよび検出プライマー：
フォワードＰＣＲプライマー：ＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡ  Ｔｍ５８  配列番号８
検出プライマー：ＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＡＧ  Ｔｍ５８  配列番号１０
Ｂｉｏ−リバースプライマー：Ｂｉｏ−ＣＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡ  Ｔｍ６２  配列番号９
またはＢｉｏ−ＴＡＧＧＴＣＡＧＴＧＧＧＴＡＴＴＡＡＣＧＡＧＧＴ  配列番号７
Ｇ／Ａ-22018変異体に対するＰＣＲプライマーおよび検出プライマー：
フォワードＰＣＲプライマー：ＣＴＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＣＣＴＡ  Ｔｍ  ５８  配列番号１２
検出プライマー：ＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣ  Ｔｍ６２  配列番号１４
Ｂｉｏ−リバースプライマー：Ｂｉｏ−ＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡ  Ｔｍ６２  配列番号１３
またはＢｉｏ−ＴＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＣＡ  配列番号１１
【００７９】
実施例４：症例対照研究試料におけるＤＮＡ変異体のモニタリング
ラクターゼ欠乏症の診断試験として二糖類分解酵素活性について解析された、合計１９６個の腸内生検標本から単離されたＤＮＡ試料において、Ｃ／Ｔ-13910およびＧ／Ａ-22018変異体の頻度を解析した。合計５９個の試料が、原発性ラクターゼ欠乏症（primary lactase deficiency）を示した。５９症例のうち６症例が（表３）、Ｇ／Ａ-22018変異体に対してヘテロ接合性ＧＡであり、残りの５３症例がＧ対立遺伝子にホモ接合性であった。５９試料すべてが、変異体Ｃ／Ｔ-13910のＣ対立遺伝子にホモ接合性であった。ラクターゼ存続性を示す１３７症例の中で、７４症例は、対立遺伝子ＴおよびＡにホモ接合性であることが見出され、残り６３症例は、ヘテロ接合性ＣＴおよびＧＡであり、Ｃ／Ｔ-13910およびＧ／Ａ-22018それぞれにおいて、対立遺伝子ＣおよびＧにホモ接合性である症例はなかった（表３）。
【００８０】
他の集団においてこれらの変異体を分析するために、確立された二糖類分解酵素欠損を有する非フィンランド人の４０症例：韓国人２３症例、イタリア人９症例、ドイツ人８症例から採取された腸内生検標本から単離したＤＮＡ試料をシーケンスした。イタリア人１症例がＧ／Ａ-22018にヘテロ接合性であったのに対して、残りの３９症例はすべて、Ｃ／Ｔ-13910およびＧ／Ａ-22018それぞれにホモ接合性ＣＣおよびＧＧであった（表３）。拡大された研究によって、６種類の異なる人種の４００個体において生化学的に検証されたラクターゼ欠乏症（ラクターゼ非存続性）とＣ／Ｔ-13910変異体の完全な関連のデータを表す、表７に提供されるデータが得られた。Ｇ／Ａ-22018変異体は、４０１症例のうち４００症例においてラクターゼ非存続性と関連した。
【００８１】
実施例５：ラクターゼ存続性変異体Ｃ／Ｔ-13910の分子疫学
フィンランド人集団におけるラクターゼ欠乏症に関連する変異体の有病率に関してモニターするために、固相ミニシーケンシング法19,20を用いて、早くに移住したフィンランド西領域または遅く移住したフィンランド東領域に端を発する匿名フィンランド人血液ドナー９３８名のＤＮＡ試料をスクリーニングした（表４）。実験的に、Ｃ／Ｔ-13910変異体にわたるＤＮＡ断片を、１つのオチン化（５’−ＣＣＴＣＧＴＴＡＡＴＡＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡ−３’）プライマーおよび非ビオチン化（５’−ＧＴＣＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＡ−３’）プライマーを用いて増幅した。Ｇ／Ａ-22018には、ビオチン化（５’−ＡＧＴＣＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＴＴＣＡＴＧ−３’）および１つの非ビオチン化（’５−ＴＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＴ−３’）プライマーを上述の条件下で使用した。ＰＣＲ産物１０μｌをストレプトアビジンコーティングのマイクロタイターウェル（Lab systems社，フィンランド）中に捕捉した。そのウェルを洗浄し、結合したＤＮＡを上述に記載のように19,20変性させ、Ｇ／Ａ-22005にはミニシーケンシングプライマー（５’−ＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＧ−３’）１０ｐｍｏｌ、Ｇ／Ａ-13915にはミニシーケンシングプライマー（５’−ＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＡＴＡＡＴＧＴＡＧ−３’）１０ｐｍｏｌ、およびラクターゼ非存続性対立遺伝子に対応するＨ−ｄＣＴＰ（１１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ammersham社，英国）またはラクターゼ存続性対立遺伝子に対応するＨ−ｄＴＴＰのいずれか０．１μｌ、およびＤＮＡポリメラーゼ０．０５Ｕ（Dynazyme II, Finnzymes社）を、そのバッファー中に含有するミニシーケンシング反応混合物５０μｌを各ウェルに添加した。マイクロタイタープレートを５０℃で２０分間インキュベートし、ウェルを洗浄した。検出用プライマーを溶出し、溶出された放射能を液体シンチレーション計数器（Rackbeta 1209, Wallac,フィンランド）で測定した。２つの並行なミニシーケンシング反応が各ＰＣＲ産物に対して行われた。推定されるラクターゼ欠乏症遺伝子型ＣＣ-13910の全体的な有病率（１７０症例）は１８．１％であり、東の試料よりも西の試料のほうが有病率が高かった（１６．８％に対して１８．９％）（表４）。これらの値は、フィンランド語を話すフィンランド人の間で１７％の有病率を報告する疫学的研究とよく一致しており、西から東へ勾配が高くなる。Ｇ／Ａ-22018多型に関して、同じセットの試料の遺伝子型も判定し、これらの２つのＳＮＰ間のＬＤを、Ｄ’統計量21を用いてモニターした。それらは、ほぼ完全に連鎖不平衡（ＬＤ）にあることが見出された（Ｄ’＝０．９８、ｐ＝７．６２×１０-11、表５）。
【００８２】
異なる集団におけるラクターゼ欠乏症の有病率は、５％未満からほぼ１００％と大きく異なることが知られている。ラクターゼ欠乏症有病率のこれらの変化が遺伝子型ＣＣ-13910の分布と相関するのかどうかを決定するために、ＣＥＰＨ家系22のＤＮＡを解析した。ＣＥＰＨ家系は主に、フランスおよびユタ州から集められ、フランスからの家系は報告されたラクターゼ欠乏症有病率約３７％23を有し、北ヨーロッパ由来のユタ州の集団は５％未満24のラクターゼ欠乏症有病率を有した。ＣＥＰＨ家系において親を遺伝子型判定することによって、フランス人家系の４１．２％（１７試料のうちの７）が遺伝子型ＣＣを有するのに対して、ユタ州家系の７．６％のみ（９２試料のうちの７）が遺伝子型ＣＣを有することが明らかとなった（表４）。さらにまた、解析された試料が少数であるのにもかかわらず、これらの数値は、これらの集団23,24におけるラクターゼ欠乏症の疫学的研究で得られた値と一致する。観察された変異体の有病率が、記述されている乳糖不耐の集団での頻度とよく一致していることが、表８に示されている。
【００８３】
実施例６：ラクターゼ存続性変異体Ｃ／Ｔ-13910の系統学
フィンランド人家系におけるハプロタイプ解析から、フィンランドにおけるラクターゼ存続性対立遺伝子のすべてではないが大部分が、ある共通の祖先に由来していることが示唆された。連鎖不平衡を利用して、存続性対立遺伝子のフィンランド人集団25への導入の時間を推定した。世代時間が２０年であると仮定すると、この推定から、創始者の変異がフィンランド人集団におよそ９０００〜１１４００年前に導入されたことが示されるだろう（表６）。これは、およそ８０００〜９０００年前26にフィンランド本土に移住した初期の徴候とよく一致し、理にかなって、紀元前８０００〜１０．０００年の酪農業の始まりとかなり一致するだろう。さらに重要なことには、異なる集団における存続性対立遺伝子中に同じＤＮＡ変異体が存在することから、この変異体はよりいっそう偶発的であり、かつその変異は、解析した集団の派生前に生じたことが示唆されるだろう。
【００８４】
ラクターゼ対立遺伝子の系統発生的起源を洞察するために、ヒヒ（Papio Hamadryas）のＭＣＭ６遺伝子のイントロン９およびイントロン１３の一部をシーケンスした。遺伝子型ＧＧおよびＣＣが、Ｇ／Ａ-22018およびＣ／Ｔ-13910の両方でヒヒＤＮＡに存在した。このことから、対立遺伝子ＧおよびＣはそれぞれ、非存続型を表す、祖先対立遺伝子の出現を反映しており、変異によりこの対立遺伝子が形質転換され、存続性対立遺伝子が生じたことが示唆される。この仮定は、非存続性対立遺伝子で見出される対立遺伝子の高い多様性に対して、存続性対立遺伝子におけるＬＤおよび共有されるハプロタイプを同定することによって支持される。
【００８５】
実施例７：Ｃ／ＴおよびＧ／Ａ変異体の対をなすＬＤ
Ｃ／Ｔ-13910とＧ／Ａ-22018との間の対のＬＤを、Ｄ’統計量21を用いて推定した。Ｄ’は、最大値（Ｄ／Ｄmax、Ｄ／Ｄmin）として計算される：不平衡測定法Ｄ＝ｈpq−ｐｑ（式中、ｈpqは、各遺伝子座に稀な対立遺伝子を有するハプロタイプの頻度であり、ｐおよびｑは、遺伝子座１および２における稀な対立遺伝子の頻度である）、Ｄmax＝ｍｉｎ ｐ（１−ｐ）、ｑ（１−ｑ）（Ｄ＞０の場合）、およびＤmin＝−ｍｉｎ ｐｑ，（１−ｐ）（１−ｑ）（Ｄ＜０の場合）。自由度（１ｄｆ）でχ2として分布する統計量：
【数１】
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を用いて、０からのＤ’の偏差ｆの有意性を決定した21。
【００８６】
遺伝子受入番号：ＢＡＣでは、ＮＨ０２１８Ｌ２２、Ｎ００３４Ｌ３４、ＮＨ０３１８Ｌ１３およびＲＰ１１−３２９Ｉ１０はそれぞれ、ＡＣ０１２５５１、ＡＣ０１１８９３、ＡＣ０１１９９９およびＣ０１６５１６である。ヒト多型の受入番号はＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ３９５６０７〜ＡＦ３９５６１５である。
【００８７】
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【００８８】
【表１】
2005502336.tif 000003
【００８９】
【表２】
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2005502336.tif 000006
【００９０】
【表３】
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【００９１】
【表４】
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【００９２】
【表５】
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【００９３】
【表６】
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【００９４】
【表７】
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【００９５】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】研究されたフィンランド人成人型ラクターゼ欠乏症家系。黒い印は、ラクターゼ欠乏（hypolactasic）の個体を示し、アスタリスク（＊）は、試料が入手できなかったことを示し、疑問符（？）は未知の疾患状態を示す。↑は、ＳＮＰを同定するためのシーケンシングに用いられる個体を示す（表２）。
【図２】成人型ラクターゼ欠乏症遺伝子座の物理地図。ＢＡＣクローンは、水平な線の上に示されている。３つの遺伝子、ＬＰＨ、ＭＣＭ６およびＤＡＲＳは、ブラックボックスより上にある、遺伝子の３’末端に対して向けられる先端を有する太い黒色の矢印によって示される。遺伝子座の微細なマッピングに使用される１０個の多型マイクロサテライトマーカーの位置が示されている。水平な線にあるバックスラッシュは、コンティグ配列の配列におけるギャップを示す。マーカーＤ２Ｓ２１６９の位置は、上述されているように40、ＰＡＣライブラリーから単離されたＰＡＣ１０６Ｏ２０でギャップを埋めることによって確認された。ＬＰＨの最初のＡＴＧの１３．９ｋｂおよび２２ｋｂ ５’に位置するイントロン９および１３におけるラクターゼ存続性表現型関連変異体の位置を含む、ＭＣＭ６遺伝子の構成が示される。
【図３】密に連鎖する７個のマイクロサテライトマーカーを用いた、フィンランド人の成人型ラクターゼ欠乏症家系に由来する存続性染色体の拡大されたハプロタイプ解析。祖先創始者の染色体を表すハプロタイプに陰影がつけられている。存続性染色体にも存在した非存続性染色体のハプロタイプのみが示されている。祖先の組み合わせに基づいて、成人型ラクターゼ欠乏症の遺伝子座は、マーカーＬＰＨ１およびＡＣ３の間の４７ｋｂ区間に限定することができる。
【図４】ラクターゼ存続性に特異的である、その中のＴがＣによって置換される、−１３９１０位にＳＮＰを含むＭＣＭ６遺伝子のイントロン１３の配列に含まれる配列（３２２０ｂｐ）。前記位置は、小文字で示されている。この配列は配列番号１を指す。
【図５】ラクターゼ存続型配列に特異的である、その中のＡがＧによって置換される、−２２０１８位にＳＮＰを含むＭＣＭ６遺伝子のイントロン９の配列に含まれる配列（１２９５ｂｐ）。前記位置は、小文字で示されている。この配列は配列番号２を指す。
【図６−１】−１３９１０位にＴを含む、ＭＣＭ６遺伝子のラクターゼ存続型イントロン１３の配列（３２２０ｂｐ）。前記位置は、小文字で示されている。この配列は配列番号３を指す。
【図６−２】−１３９１０位にＴを含む、ＭＣＭ６遺伝子のラクターゼ存続型イントロン１３の配列（３２２０ｂｐ）。前記位置は、小文字で示されている。この配列は配列番号３を指す。
【図７】−２２０１８位にＡを含む、ＭＣＭ６遺伝子のラクターゼ存続型イントロン９の配列（１２９５ｂｐ）。前記位置は、小文字で示される。この配列は配列番号４を指す。
【図８−１】ラクターゼ存続型配列に特異的である、その中のＴがＣによって置換される、−１３９１０位にＳＮＰを含むＭＣＭ６遺伝子のイントロン１３の配列（３２２０ｂｐ）。前記位置は、小文字で示される。この配列は配列番号５を指す。
【図８−２】ラクターゼ存続型配列に特異的である、その中のＴがＣによって置換される、−１３９１０位にＳＮＰを含むＭＣＭ６遺伝子のイントロン１３の配列（３２２０ｂｐ）。前記位置は、小文字で示される。この配列は配列番号５を指す。
【図９】ラクターゼ存続型配列に特異的である、その中のＡがＧによって置換される、−２２０１８位にＳＮＰを含むＭＣＭ６遺伝子のイントロン９の配列（１２９５ｂｐ）。前記位置は、小文字で示される。この配列は配列番号６を指す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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