(57)【要約】当技術分野で認められているアッセイ及び特定に新規方法において、例えば、近接アッセイにおいて、蛍光色素、蛍光エネルギー転移色素のペア、多色色素のセットを用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
--L1-D1-FETL-D2---L2-          式(I)
[式中、
L1は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
L2は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
FETLは、蛍光エネルギー転移リンカーであり；
D1は、式：
【化１】
2005532434.tif 000047
［式中、
Xは、O又はC(R*R**)であり、その際、R*及びR**は独立して、低級アルキル又は-CH2-Zであり；
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、置換されているアリール、置換されているヘテロアリール又はZであり；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R4'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つ、R4"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R7'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つ、R7"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
且つ
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、
Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず；
Z2は、H、C1〜C8の場合により置換されていてもよい低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアリールである]
で表されるドナー色素であり；
且つ
D2は、式(D1)で表されるアクセプター/レポーター色素であるか、又は、下記群の式：
【化２】
2005532434.tif 000048
[式中、
R21〜R36の内の少なくとも1つはFETLに結合しており、
nは、ゼロ、1、2又は3であり；
R21及びR30は、独立して、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルであり；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-、若しくは、場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/若しくは、R28とR29は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
且つ
Yは、-O-又は-N(Y1)-であり、その際、Y1は、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルである]
で表されるアクセプター/レポーター色素であるが、
但し、R3〜R8の内の少なくとも1つはZであり、その際、Z*は、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールである]
で表される蛍光エネルギー転移色素、又は、そのプローブ-コンジュゲート、標的-コンジュゲート、及び/若しくは、支持体-コンジュゲート。
【請求項２】
以下の1つ以上を満足する、請求項1に記載の蛍光エネルギー転移色素：
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、5〜6員の単環式若しくは10〜12員の縮合環式の置換されているアリール若しくはヘテロアリールであるか、又は、Zである；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
XがC(R*R**)である場合、R4は、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")であり、且つ、R7は、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")である；
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず、Z2は、Hであるか、又は、場合によりSO3-、COOH、NH2、CH2NH2、SH若しくはSCH3で置換されていてもよいC1〜C8の低級アルキル又はアリールである；
FETLは、アミン、カルボニル、活性化されているカルボン酸エステル、ジスルフィド、チオール又はチオールエステルを介してD1及びD2に結合している、対称的、剛性又は立体障害性の二価部分構造を含んでいる；
R21又はR30は、カルボキシ-ナフチル-メチルであるか、オルト、メタ若しくはパラにカルボニル若しくは活性化基を有し且つモノ-オルト置換基若しくはジ-オルト置換基を有するベンジルであるか、又は、活性化されているC1〜C6の低級アルキルである；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-若しくは場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/又は、R28とR29は、一緒に、縮合スルホン化6員アリール環を形成している；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、縮合スルホン化6員炭素環式環若しくはヘテロ環式環を形成している；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は、一緒に、縮合スルホン化6員炭素環式環若しくはヘテロ環式環を形成している；
且つ/又は、
R22〜R29、又は、R33〜R36の内の少なくとも1つは、SO3-である。
【請求項３】
以下の1つ以上を満足する、請求項2に記載の蛍光エネルギー転移色素：
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、場合により置換されていてもよいオルト安息香酸、又は、Zである；
R2は、H、ハロ又はSO3-である；
R3は、ハロ又はZである；
R4は、=O又はOH、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")である；
R5は、H、ハロ又はZである；
R6は、H、ハロ又はZである；
R7は、=O又はOH、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")である；
R8は、Zである；
R9は、H、ハロ又はSO3-である；
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、フェニル、アダマンチル、ノルボラニル、ビフェニル、ナフチル、フラニル、ビフラニル、チオフェニル、ビチエニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエニル、クロメニル及びイソクロメニルからなる群の、場合により置換されていてもよいアリール又はヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(H)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-若しくは-CH2-N(H)-であるか、又は、Z1は存在しない；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-若しくは場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R24とR25、及び/若しくは、R26とR27は、一緒に、縮合スルホン化6員アリール環を形成している；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールである；
且つ/又は、
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールである。
【請求項４】
R1が、式(R1.1)：
【化３】
2005532434.tif 000049
[式中、
R1aは、H、ハロ又は-C(O)O-であり；
R1bは、H、ハロ又は-C(O)-(L1, L2又はFETL)であり；
R1cは、ハロであり；
且つ
rは、0、1、2又は3である]
で表される基である、請求項1、2又は3に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項５】
R3〜R8の内の少なくとも1つがZであり、その際、Z*は、フェニル、アダマンチル、ノルボラニル、ビフェニル及びナフチルから選択される、場合により置換されていてもよいアリールである、請求項1、2又は3に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項６】
Z*がフェニルであり、且つZ1が-C(O)-である、請求項5に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項７】
R1が、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、場合により置換されていてもよいオルト-安息香酸、又は、Zであり；
R2が、H、ハロ又はSO3-であり；
R3が、ハロ又はZであり；
R4が、=O又はOH、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")であり；
R5が、H、ハロ又はZであり；
R6が、H、ハロ又はZであり；
R7が、=O又はOH、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")であり；
R8が、Zであり；
R9が、H、ハロ又はSO3-であり；
Zが、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、フェニル、アダマンチル、ノルボラニル、ビフェニル、ナフチル、フラニル、ビフラニル、チオフェニル、ビチエニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエニル、クロメニル及びイソクロメニルからなる群の、場合により置換されていてもよいアリール又はヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(H)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-若しくは-CH2-N(H)-であるか、又は、Z1は存在せず；
R21又はR30が、カルボキシ-ナフチル-メチルであるか、オルト、メタ若しくはパラにカルボニル若しくは活性化基を有し且つモノ-オルト置換基若しくはジ-オルト置換基を有するベンジルであるか、又は、活性化されているC1〜C6の低級アルキルであり；
R22〜R29が、独立して、H、SO3-若しくは場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R24とR25、及び/若しくは、R26とR27は、一緒に、縮合スルホン化6員アリール環を形成しており；
R31及びR32が、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールであり；
且つ
R33〜R36が、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールである；
請求項1に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項８】
R3〜R8の内の少なくとも1つがZであり、その際、Z*は、フェニル、アダマンチル、ノルボラニル、ビフェニル及びナフチルから選択される、場合により置換されていてもよいアリールである、請求項7に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項９】
Z*がフェニルであり、且つZ1が-C(O)-である、請求項7に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項１０】
FETLが、下記群の式により表される、請求項1、2、3、7、8又は9に記載の蛍光エネルギー転移色素：
【化４−１】
2005532434.tif 000050
または
【化４−２】
2005532434.tif 000051
[式中、
R10は、D1-C(O)-、D1-N(H)-CH2-、D1-S-C(O)-、D1-O-C(S)-又はD1-S-CH2-であり；
且つ
R11は、-C(O)-D2、-CH2-N(H)-D2、-C(O)-S-D2、-C(S)-O-D2又はCH2-S-D2である]
【化５】
2005532434.tif 000052
[式中、pは、独立して、0、1、2又は3である]
及び
【化６】
2005532434.tif 000053
[式中、
qは、ゼロ又は1であり；
R12は、H、ハロ、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル若しくは場合により置換されていてもよいアリールであり；
R13は、H、SO3-、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、若しくは、場合により置換されていてもよいアリールであり；
且つ
R14は、第二級アミン若しくは第三級アミン又はヘテロシクリル、特に、N(H)又はピペラジンである]。
【請求項１１】
FETLが、FETL1であり；
R10が、D1-C(O)-又はD1-N(H)-CH2-であり；
且つ
R11が、-C(O)-D2又は-CH2-N(H)-D2である
請求項10に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項１２】
R1が、式(R1.1)：
【化７】
2005532434.tif 000054
[式中、
R1aは、H、ハロ又は-C(O)O-であり；
R1bは、H、ハロ又は-C(O)-(L1, L2又はFETL)であり；
R1cは、ハロであり；
且つ
rは、0、1、2又は3である]
で表される基である、請求項10に記載の蛍光エネルギー転移色素。
【請求項１３】
式：
【化８】
2005532434.tif 000055
［式中、
Xは、O又はC(R*R**)であり、その際、R*及びR**は独立して、低級アルキル又は-CH2-Zであり；
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、置換されているアリール、置換されているヘテロアリール又はZであり；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R4'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つR4"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R7'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つR7"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
且つ
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、
Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず；
Z2は、H、C1〜C8の場合により置換されていてもよい低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアリールであり；
L1は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
L2は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
且つ
FETLは、蛍光エネルギー転移リンカーであるが；
但し、R3〜R8の内の少なくとも1つはZであり、その際、Z*は、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールである]
で表される化合物、又は、そのFETL-コンジュゲート、プローブ-コンジュゲート、標的-コンジュゲート、及び/若しくは、支持体-コンジュゲート。
【請求項１４】
以下の1つ以上を満足する、請求項13に記載の化合物：
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、5〜6員の単環式若しくは10〜12員の縮合環式の置換されているアリール若しくはヘテロアリールであるか、又は、Zである；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
XがC(R*R**)である場合、R4は、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")であり、且つ、R7は、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")である；
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず、Z2は、Hであるか、又は、場合によりSO3-、COOH、NH2、CH2NH2、SH若しくはSCH3で置換されていてもよいC1〜C8の低級アルキル又はアリールである。
【請求項１５】
式(II)：
プローブ--L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)        式(II)
[式中、
プローブは、ポリヌクレオチド、抗体、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質又はレクチンであり；
L1は、プローブに付着するための結合であり；
FETLは、アミン、カルボニル、活性化されているカルボン酸エステル、ジスルフィド、チオール又はチオールエステルを介してD1及びD2に結合している、対称的、剛性又は立体障害性の二価部分構造を含んでいる蛍光エネルギー転移リンカーであり；
低親和性疑似標的は、該低親和性疑似標的がより高い親和性を有する真の標的と置き換わるまで、FETLが対応するD2又はD1にカップリングするのを非活性化、阻止又は防止するためにFETLに接して配置されている該プローブについてのアナライトであり；
D1は、式：
【化９】
2005532434.tif 000056
［式中、
Xは、O又はC(R*R**)であり、その際、R*及びR**は独立して、低級アルキル又は-CH2-Zであり；
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、置換されているアリール、置換されているヘテロアリール又はZであり；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R4'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つR4"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており、その際、R7'は、H、低級アルキル又はL1であり、且つR7"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
且つ
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、
Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず；
Z2は、H、C1〜C8の場合により置換されていてもよい低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアリールである]
で表されるドナー色素であり；
且つ
D2は、式(D1)で表されるアクセプター/レポーター色素であるか、又は、下記群の式：
【化１０】
2005532434.tif 000057
[式中、
R21〜R36の内の少なくとも1つはFETLに結合しており、
nは、ゼロ、1、2又は3であり；
R21及びR30は、独立して、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルであり；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-、若しくは、場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/若しくは、R28とR29は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環を形成しており；
且つ
Yは、-O-又は-N(Y1)-であり、その際、Y1は、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルである]
で表されるアクセプター/レポーター色素である]
で表される蛍光エネルギー転移色素。
【請求項１６】
非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイであって、
(a)  被検物質と、標的部位に特異的な請求項15に記載のプローブ-L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)コンジュゲートとを、適切なアッセイ容器内で、低親和性疑似標的ではなく該標的部位に該プローブを優先的に結合させるのに適切な条件下で接触させるステップ；
(b)  FETLにカップリングするための活性化されている部位を有するD2又はD1蛍光エネルギー転移色素を、FETLにカップリングするのに適切であるが、前記低親和性疑似標的は該プローブに結合しない条件下で、前記アッセイ容器内に導入するステップ；
(c)  D1にエネルギーを吸収させるステップ；
及び
(d)  D2発光のレベルを測定するステップ；
を含んでなる、前記アッセイ。
【請求項１７】
非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイであって、
(a)  適切なアッセイ容器内で、被検物質と、標的の第一のエピトープに対して部位特異的なプローブ1-L1-D1コンジュゲートとを接触させるステップ；
(b)  プローブ2-L2-D2コンジュゲートを前記アッセイ容器内に導入するステップ、ここで、該プローブ2は、結合したプローブ1に対して部位特異的であるか又は該第一のエピトープに空間的に近接している第二のエピトープに対して部位特異的であり；
(c)  D1にエネルギーを吸収させるステップ；
及び
(d)  D2発光のレベルを測定するステップ；
を含むか、又は、
(e)  被検物質と、標的部位に特異的なプローブ-L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)コンジュゲートとを、適切なアッセイ容器内で、低親和性疑似標的ではなく該標的部位に該プローブを優先的に結合させるのに適切な条件下で接触させるステップ；
(f)  FETLにカップリングするための活性化されている部位を有するD2又はD1蛍光エネルギー転移色素を、FETLにカップリングするのに適切であるが、前記低親和性疑似標的は該プローブに結合しない条件下で、前記アッセイ容器内に導入するステップ；
(g)  D1にエネルギーを吸収させるステップ；
及び
(h)  D2発光のレベルを測定するステップ；
を含んでなる、前記アッセイ。
【請求項１８】
(a)  適切なアッセイ容器内で、被検物質と標的部位特異的ドナー色素とを接触させるステップ；
(b)  前記アッセイ容器に標的部位特異的レポーター色素を導入するステップ、ここで、該レポーター色素の標的は、該ドナー色素の標的に空間的に近接しているか、又は、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される所与の標的に対して特異的であり、該レポーター色素のエネルギー吸収スペクトルは該ドナー色素の発光スペクトルと重複しており；
(c)  ドナー色素にエネルギーを吸収させるステップ；
及び、
(d)  レポーター色素発光のレベルを測定するステップ；
を含んでなる、近接アッセイ。
【請求項１９】
ステップ(b)が、さらに、2種以上の標的部位特異的レポーター色素を前記アッセイ容器内に導入することを含み、ここで、それらレポーター色素は、重複するエネルギー吸収スペクトル、異なった発光スペクトルを有し、また、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される異なった標的を有しており；
且つ
ステップ(d)が、さらに、それらレポーター色素に特有の波長におけるレポーター色素発光のレベルを測定することを含む、
請求項18に記載の近接アッセイ。
【請求項２０】
(a)  適切なアッセイ容器内で、被検物質と標的部位特異的ドナー色素とを接触させるステップ；
(b)  前記アッセイ容器に請求項1〜14のいずれかに記載の標的部位特異的蛍光エネルギー転移レポーター色素を導入するステップ、ここで、該レポーター色素の標的は、該ドナー色素の標的に空間的に近接しているか、又は、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される所与の標的に対して特異的であり、該レポーター色素のエネルギー吸収スペクトルは該ドナー色素の発光スペクトルと重複しており；
(c)  ドナー色素にエネルギーを吸収させるステップ；
及び、
(d)  レポーター色素発光のレベルを測定するステップ；
を含んでなる、近接アッセイ。
【請求項２１】
ステップ(b)が、さらに、2種以上の該標的部位特異的蛍光エネルギー転移レポーター色素を前記アッセイ容器内に導入することを含み、ここで、それらレポーター色素は、該ドナー色素の発光スペクトルに重複するエネルギー吸収スペクトル、異なった発光スペクトルを有し、また、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される異なった標的を有しており；
且つ
ステップ(d)が、さらに、それらレポーター色素に特有の波長におけるレポーター色素発光のレベルを測定することを含む、
請求項20に記載の近接アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素、蛍光エネルギー転移、特に、蛍光エネルギー転移色素のセット、ドナー色素、アクセプター/レポーター色素、リンカー、それらの組合せ、及び、それらの使用方法、例えば、フローサイトメトリー、DNA塩基配列決定法、プロテインアレイ、DNAアレイ、及び、顕微鏡検査法のマーカーなどにおける使用方法に関する。本発明の化合物は、単独で有用であり、特に、多重化について有用である。
【背景技術】
【０００２】
蛍光標識を用いて、生物学的なアナライトを放射能を使用せずに検出することは、現代の分析的バイオテクノロジーにおける重要な技術である。放射性標識の必要性を排除することにより、安全性が高まり、試薬の廃棄による環境への影響が大きく低減される。そのような蛍光検出法を用いる方法の例には、DNA塩基配列決定法、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出及びイムノアッセイなどがある。
【０００３】
蛍光色素を用いる分析装置の一例は、フローサイトメトリーであり、これは、生物細胞及び別の粒子(例えば、ウイルス又は特定の特性を示す分子など)などの種々のアナライトを検出、分類及び特性決定を行う方法である。フローサイトメーター内では、液体媒体中にアナライトを含んでいる液体流を照射領域に導く。放射線源(通常は、レーザーである)によりアナライトに照射し、光学的検出装置及び電子式検出装置並びにコンピューターを用いて、試料のスペクトル特性、例えば、光吸収、散乱、蛍光発光又はリン光発光などを測定して、アナライトの存在を検出する。
【０００４】
単純な蛍光マーカーの使用には、非結合の又は結合している群(測定されない)によるバックグランド干渉を受けることなく正確な測定を達成するために、典型的には、精製ステップが含まれていて、それによって、結合している蛍光マーカーと結合していない蛍光マーカーを分離する。そのような精製ステップは、迅速な自動的プロセスであるべきものに、望ましくない時間と費用を付け加えることとなる。
【０００５】
多くの重要な用途において、混合物中に存在している空間的に重複する複数のアナライトを独立に検出することが求められる。例えば、単一チューブ多重DNAプローブアッセイ(single-tube multiplex DNA probe assay)、イムノアッセイ及び多色DNA塩基配列決定法(multicolor DNA sequencing method)などである。多座DNAプローブアッセイ(multi-loci DNA probe assay)の場合は、スペクトル的に識別可能な複数の蛍光標識を用いることにより、反応管の数を低減することが可能であるが、それによって、実験プロトコルが単純になり、用途に特異的なキットの製造が容易になる。自動DNA配列決定法では、多色蛍光標識化によって単一のレーンで複数の塩基の分析が可能となるが、それにより、単色法(single-color method)に比較して流量が増大し、レーン間の電気泳動移動度の変動に関連する不確定性が低減する。
【０００６】
多色蛍光検出では、特に、単一の励起光源、電気泳動による分離及び/又は酵素による処理を必要とする用途、例えば、蛍光検出による自動DNA配列決定法などでは、色素標識の選定において5つの厳しい制約が課せられる。第一に、有機蛍光色素についての典型的な発光帯半値幅は約40〜80ナノメートル(nm)であって、利用可能なスペクトルの幅は励起光源により制限されるので、スペクトル的に分解される発光スペクトルを有する色素のセットを見いだすのが困難である。第二に、たとえ重複しない発光スペクトルを有する複数の色素が見いだされたとしても、そのような色素のセットは、それらの各々の蛍光効率が低すぎる場合は適切ではない。第三に、数種類の蛍光色素を同時に用いた場合、それら色素の吸収帯は広く離れているので、同時に励起することが困難となる。第四に、そのような色素の電荷、分子の寸法及びコンホメーションは、アナライトの電気泳動移動度に対して悪い影響を及ぼすようなものであってはならない。第五に、そのような蛍光色素は、アナライトを調製又は処理するための化学、例えば、DNA合成用溶媒及び試薬、バッファー、ポリメラーゼ酵素及びリガーゼ酵素などと適合性でなければならない。(例えば、米国特許第6,008,379号を参照されたい)。
【０００７】
そのような現在利用可能な技術についての1つの制限は、制限酵素の利用可能なプールに起因する。このような制限酵素の利用可能なプールに対応して、制限部位のプールも制限され、従って、検出対象のフラグメントも制限される。別の制限は、見いだすことが可能な情報の種類、即ち、同定された標的が存在しているかどうかや、その相対的な濃度に関する。しかしながら、固定された環境条件下又は変動する環境条件下で、複数の標的部位の互いに対する相対的な近接度を求めることは、容易に可能なことではない。
【０００８】
蛍光エネルギー転移(「FET」)及び蛍光共鳴エネルギー転移(「FRET」)は、1つの発蛍光団の発光が別の発蛍光団の励起に結びついている、距離に依存する励起状態の相互作用である。このようなプロセスでは、2種類の蛍光色素分子が使用される。蛍光色素分子の一方はドナー(D1)であり、これは、比較的短い励起波長及び発光スペクトルを有する。他方の色素は、アクセプター/レポーター(D2)であり、これは、比較的長い励起波長及び発光スペクトルを有する。適切な波長を有する光源によりD1が励起されると、その結果として、最終的には、D2に特徴的な波長でD2が発光することとなる。D1とD2は、エネルギー転移が容易に生起するのに充分に近接(約100Å以内)していなければならない。このことは、多くの方法(例えば、固体支持体に連結させることによる)により達成することが可能であるか、又は、蛍光エネルギーを直接的に転移させる特別のケースでは、D1とD2を互いに物理的に(例えば、共有結合的に連結された原子の鎖を介して)連結することが可能である。一般に、D1が(比較的短く、比較的高エネルギーの波長で)励起されると、D1は、(D1の発光スペクトルの範囲内で)比較的長い波長の光子を再放出する。この再放出された光子は、今度は、D2により吸収されて、D2は励起された状態になる。D2がその基底状態に戻るとき、D2は、そのスペクトルに特徴的な波長で発光する。無放射エネルギー転移においては、レポーターの双極子がドナーの双極子と相互作用又は共鳴し、その際、発蛍光団の間のエネルギーレベルの差は、励起エネルギーの量子に相当する。このプロセスでは、光子で励起されたドナー内の電子がその基底状態に戻るときに、量子(即ち、励起)が転移し、これが、レポーター内の電子を高エネルギー状態に引き上げる。D1は、光子を全く放出することなく、その励起エネルギーを、連結原子鎖を介して直接的にD2に伝える。D2がこのエネルギーを吸収した後、D2は、その基底状態に戻る際に、光子を放出する。必要な条件には、エネルギードナーの蛍光発光スペクトルがエネルギーレポーターの吸収スペクトルと重複していること、及び、ドナーとレポーターの遷移双極子の配向が、ほぼ平行でなければならないことなどがある。エネルギーの転移は、レポーター発光の増大又はドナー発光の低下に基づいて検出することができる。いずれの場合(直接的又は間接的)も、そのようなエネルギーが転移する結果、D2は誘起されて光子を放出することが可能となり、その際、該システムに入射された最初の励起光は、通常はD2を励起することがないような波長の光である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
蛍光色素が入手可能であり、また、それらが、単純な蛍光、FET及びFRETを包含する種々の分析方法に適用されているにもかかわらず、依然として、新規な改善された蛍光色素、FET及びFRET色素ペア、多色エネルギー転移のセット、並びに、それらの使用方法、特に、十分な検出シグナルを達成するのに、余分な蛍光マーカーを除去するための精製を必要としない方法を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、例えば式(I)：
--L1-D1-FETL-D2---L2-          式(I)
[式中、
L1は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
L2は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
FETLは、アミン、カルボニル、活性化されているカルボン酸エステル、ジスルフィド、チオール又はチオールエステルを介してD1及びD2に結合している、対称的、剛性又は立体障害性の二価部分構造を含んでいる蛍光エネルギー転移リンカーであり；
D1は、式：
【化１】
2005532434.tif 000002
【００１１】
［式中、
Xは、O又はC(R*R**)であり、その際、R*及びR**は独立して、低級アルキル又は-CH2-Zであり；
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、置換されているアリール(好ましくは、5〜6員の単環式アリール又は10〜12員の縮合環式アリール、特に、o-安息香酸)、置換されているヘテロアリール(5〜6員の単環式ヘテロアリール又は10〜12員の縮合環式ヘテロアリール)又はZであり；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員アリール環)を形成しており；
R3は、ハロ(好ましくは、クロロ)、若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており、その際、R4'は、H、低級アルキル又はL1であり、及び、R4"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており、その際、R7'は、H、低級アルキル又はL1であり、及び、R7"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R8は、ハロ(好ましくは、クロロ)、若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員アリール環)を形成しており；
及び、
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)(L1, L2 or FETL)で表される基であり、その際、
Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず；
Z2は、H、C1〜C8の場合により置換されていてもよい低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアリール(置換基は、好ましくは、SO3-、COOH、NH2、CH2NH2、SH、SCH3)である]
で表されるドナー色素であり；
及び、
D2は、式(D1)で表されるアクセプター/レポーター色素であるか、又は、下記群の式：
【化２】
2005532434.tif 000003
【００１２】
[式中、
R21〜R36の内の少なくとも1つはFETLに結合しており、
nは、ゼロ、1、2又は3であり；
R21及びR30は、独立して、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルであり；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-、若しくは、場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/若しくは、R28とR29は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化されたアリール環)を形成しており；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化された炭素環式環又はヘテロ環式環)を形成しており；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化された炭素環式環又はヘテロ環式環)を形成しており；
及び、
Yは、-O-又は-N(Y1)-であり、その際、Y1は、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルである]
で表されるアクセプター/レポーター色素である]
で表されるような、特定の蛍光色素、色素リンカー及び色素ペア(dye couples)(その単独の立体異性体、立体異性体の混合物、溶媒和物、プローブ-コンジュゲート、標的-コンジュゲート、及び/若しくは、支持体-コンジュゲートを包含する)を提供する。
【００１３】
式(I)の化合物及び/又は式(D2)の化合物の別の態様において、R21〜R36の内の少なくとも1つは、アリーレン部分構造又はアラルキレン部分構造(好ましくは、フェニレン、ベンジル、ナフタレン又はナフタレニル-メチル)を介して、L1、L2又はFETLに結合している。
【００１４】
本発明の蛍光エネルギー転移リンカー(FETL)には、下記式により表されるものなどがある：
【化３−１】
2005532434.tif 000004
【化３−２】
2005532434.tif 000005
[式中、
R10は、D1-C(O)-、D1-N(H)-CH2-、D1-S-C(O)-、D1-O-C(S)-又はD1-S-CH2-であり；
及び、
R11は、-C(O)-D2、-CH2-N(H)-D2、-C(O)-S-D2、-C(S)-O-D2又はCH2-S-D2である]
【化４】
2005532434.tif 000006
【００１５】
[式中、pは、独立して、0、1、2又は3である]
及び、
【化５】
2005532434.tif 000007
【００１６】
[式中、
qは、ゼロ又は1であり；
R12は、H、ハロ、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル若しくは場合により置換されていてもよいアリールであり；
R13は、H、SO3-、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、若しくは、場合により置換されていてもよいアリールであり；
及び、
R14は、第二級アミン若しくは第三級アミン又はヘテロシクリル、特に、N(H)又はピペラジンである]。
【００１７】
さらに別の態様は、式中のR21〜R36の内の少なくとも1つが、アリーレン部分構造又はアラルキレン部分構造(好ましくは、フェニレン、ベンジル、ナフタレン又はナフタレニル-メチル)を介して、L1、L2又はFETLに結合している、式(I)の化合物及び/又は式(D2)の化合物を包含する。
【００１８】
本発明化合物のさらに別の態様は、式(II)：
プローブ--L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)        式(II)
[式中、
プローブ、D1、D2及びFETLは、上記で定義されているとおりであり；
L1は、プローブに付着するための結合であり；
低親和性疑似標的は、該低親和性疑似標的がより高い親和性を有する真の標的と置き換わるまで、FETLが対応するD2又はD1にカップリングするのを非活性化、阻止又は防止するために配置されている該プローブについてのアナライトである]
で表される蛍光エネルギー転移色素に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、式：プローブ-L1-(D1又はD2)、プローブ-L1-(D1又はD2)-FETL、プローブ-L1-(D1又はD2)-FETL-(D2又はD1)-L2-固体支持体、及び、固体支持体-L1-(D1又はD2)-FETL-(D2又はD1)-L2-プローブの組成物に関し、ここで、
該プローブは、ポリヌクレオチド(場合により、細胞に透過するためのリポソーム製剤に入れて供給される、相補的DNA、DNAインターカレーター、RNA)、抗体、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質又はレクチンであり；
及び、
該プローブは、細胞、細胞断片、細胞表面マーカー(例えば、Ｔ細胞受容体)又はポリヌクレオチド配列(例えば、DNA配列又はRNA配列)などのような標的物質に向けられる。
【００２０】
本発明のさらに別の態様は、多色蛍光エネルギー転移色素のセットに関し、ここで、励起スペクトルは、互いに、約20nmの範囲内に入っているが、発光スペクトルは、約30〜60nm隔てられている。該多色蛍光エネルギー転移色素のセットは、例えば、GUAVA I、GUAVA V PD590、TAM-XY-GY5、及び、GUAVA III-5-カルボキシ GYZ760であり、これらは、いずれも、532nmで励起させることが可能であり、また、これらは、それぞれ、570nm、630nm、670nm、及び、760nmで発光する。
【００２１】
さらにまた、本発明は、非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイ及び近接アッセイなどを包含する新規アッセイを提供する。本発明の方法において、本発明化合物、並びに、別の蛍光色素及び色素ペアを用いることが可能である。
【００２２】
非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイは、
(a)  適切なアッセイ容器内で、被検物質を、標的の第一のエピトープに対して部位特異的なプローブ1-L1-D1コンジュゲートと接触させるステップ；
(b)  プローブ2-L2-D2コンジュゲートを前記アッセイ容器内に導入するステップ(ここで、該プローブ2は、結合したプローブ1に対して部位特異的であるか又は該第一のエピトープに空間的に近接している第二のエピトープに対して部位特異的である)；
(c)  D1にエネルギーを吸収させるステップ；
及び、
(d)  D2発光のレベルを測定するステップ；
を含むか、又は、
(e)  被検物質を、標的部位に特異的なプローブ-L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)コンジュゲートと、適切なアッセイ容器内で、低親和性疑似標的ではなく該標的部位に該プローブを優先的に結合させるのに適切な条件下で接触させるステップ；
(f)  FETLにカップリングするための活性化されている部位を有するD2又はD1蛍光エネルギー転移色素を、FETLにカップリングするのに適切な条件下(ここで、該条件下では、前記低親和性疑似標的は該プローブに結合しない)、前記アッセイ容器内に導入するステップ；
(g)  D1にエネルギーを吸収させるステップ；
及び、
(h)  D2発光のレベルを測定するステップ；
を含む。
【００２３】
対象の物質上にある2つの標的部位の間の近接度(proximity)を決定するアッセイは、
(a)  適切なアッセイ容器内で、被検物質を標的部位特異的ドナー色素と接触させるステップ；
(b)  前記アッセイ容器に標的部位特異的レポーター色素を導入するステップ(ここで、該レポーター色素の標的は、該ドナー色素の標的に空間的に近接しているか、又は、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される所与の標的に対して特異的であり、及び、該レポーター色素のエネルギー吸収スペクトルは該ドナー色素の発光スペクトルと重複している)；
(c)  ドナー色素にエネルギーを吸収させるステップ；
及び、
(d)  レポーター色素発光のレベルを測定するステップ；
を含む。
【００２４】
このアッセイの多重化実施形態では、
ステップ(b)が、さらに、2種以上の標的部位特異的レポーター色素を前記アッセイ容器内に導入することを含み(ここで、それらレポーター色素は、重複するエネルギー吸収スペクトル、異なった発光スペクトルを有し、また、該ドナー色素の標的に対する空間的な近接度に関して試験される異なった標的を有している)；
及び、
ステップ(d)が、さらに、それらレポーター色素に特有の波長におけるレポーター色素発光のレベルを測定することを含む。
【００２５】
以下に記載してある本発明の詳細な説明、実施例及び特許請求の範囲において、上記態様及び別の態様について、さらに詳細に記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
定義
本明細書において使用される場合、以下に示されている単語及び表現は、一般に、それらが用いられている文脈において特に別途示されている場合を除き、下記に記載されている意味を有するものである。以下の略語及び用語は、本明細書全体を通して、下記に示されている意味を有する：
Ac = アセチル
B = ビオチン
DIEA = ジイソプロピルエチルアミン
DMF = N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO = ジメチルスルホキシド
Et = エチル
Ph = フェニル
SA = ストレパビジン(strepavidin)
【００２７】
例えば、用語「基」、「アルキル基」又は「カルボン酸エステル」のいずれかに関連して使用される場合、用語「活性化されている(activated)」又は「活性化(activating)」は、別の分子(例えば、利用可能なアミノ基、ヒドロキシ基及び/又はスルフヒドリル基を有する別の分子)を標識する(又は、別の分子に付着する)のに有用な反応性部分構造を含んでいる前記基を意味する。反応性部分構造の例としては、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノハロゲン置換ピリジン若しくはジハロゲン置換ピリジン、モノハロゲン置換ジアジン若しくはジハロゲン置換ジアジン、マレイミド、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド、グリオキサール及びアルデヒドを含んでいるような基などを挙げることができる。
【００２８】
用語「アルケニル」は、約2〜20個の炭素原子、さらに好ましくは、約2〜10個の炭素原子を有する、分枝鎖又は非分枝鎖の不飽和又は多不飽和のモノラジカル炭化水素鎖を意味する。この用語の例は、エテニル及びブタ-2-エニルなどのような基である。
【００２９】
用語「アルキル」は、約1〜20個の炭素原子、さらに好ましくは、約1〜10個の炭素原子、さらに好ましくは、約1〜6個の炭素原子を有する、分枝鎖又は非分枝鎖の飽和モノラジカル炭化水素鎖を意味する。この用語の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、n-ヘキシル、n-デシル及びテトラデシルなどのような基である。「低級アルキル」は、特定の範囲の炭素原子に関連して別途挙げられている場合を除き、典型的には、約1〜8個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。
【００３０】
用語「置換アルキル(置換されているアルキル)」は、1個以上(約5以下、好ましくは、約3個以下)の水素原子が、=O、=S、アシル、アシルオキシ、場合により置換されていてもよいアルコキシ、場合により置換されていてもよいアミノ、アジド、カルボキシル、(場合により置換されていてもよいアルコキシ)カルボニル、(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル、シアノ、場合により置換されていてもよいシクロアルキル、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、スルファニル、スルフィニル及びスルホニルからなる群から独立して選択される置換基で置き換えられているアルキル基を意味する。
【００３１】
用語「アルキレン」は、上記で定義したモノラジカルであるアルキルから誘導されたジラジカルを意味する。この用語の例は、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2CH2-)、及び、プロピレン異性体[例えば、-CH2CH2CH2-、及び、-CH(CH3)CH2-]などのような基である。
【００３２】
用語「アミド」は、窒素に結合した1つ以上のアシル基を含んでいる化合物を意味する。炭素酸から誘導されたアミドは、「カルボキサミド」と称することができ、スルホン酸から誘導されたアミドは、「スルホンアミド」と称することができる。
【００３３】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び置換アミノ酸の両方を包含する。「天然アミノ酸」は、ペプチドの技術分野で一般に認められている20種の一般的なアミノ酸のいずれかを意味し、特に別途示されていない限り、L-アミノ酸を表す(但し、グリシンの様なアキラルなアミノ酸を除く)。「置換アミノ酸(置換されているアミノ酸)」は、通常はアミノ酸の一部ではない1以上の追加の化学的部分構造を含んでいるアミノ酸を意味する。そのような置換基は、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる選択的誘導体化剤(targeted deriviatizing agent)により導入することが可能であり、また、該技術分野で容認されている別の方法で導入することが可能である。例えば、システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα-ハロアセテート(及び、対応するアミン類)と反応させて、カルボキシメチル誘導体又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。さらにまた、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリ安息香酸塩、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、又は、クロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによっても、誘導体化することができる。カルボキシル側基(アスパルチル又はグルタミル)は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドのようなカルボジイミドと反応させることにより選択的に修飾することが可能である。アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンと反応させることにより、アスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換することができる。グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は、脱アミド化して、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基とすることができる。あるいは、これらの残基は、適度な酸性条件下で、脱アミド化することが可能である。別の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はテオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(例えば、以下の文献を参照されたい： T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983))、N-末端アミンのアセチル化、及び、C-末端カルボキシル基のアミド化などがある。
【００３４】
用語「抗体(antibody)」(複数の形態で交換可能に使用されている)は、免疫グロブリン分子内の種々の領域に位置している少なくとも1つの抗原認識部位を通して、炭水化物、ポリヌクレオチド又はポリペプチドのような標的に特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用される場合、該用語「抗体」は、完全なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のみではなく、それらの断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、単一鎖(ScFv)、その突然変異体、抗体部分を含んでいる融合蛋白質、ヒト化抗体、キメラ抗体、2価抗体、二重特異性抗体、及び、所要の特異性の抗原認識部位を含んでいる免疫グロブリン分子の任意の別の修飾された形態も包含する。該抗体には、哺乳動物重鎖(これは、マウス重鎖、ウサギ重鎖又はヒト重鎖であり得る)も含まれ得る。
【００３５】
「抗原」には、抗体分子が特異的に結合し得る任意の物質が包含される。用語「抗原」には生物分子(biologic molecule)が包含され、そのような生物分子には、限定するものではないが、単純中間代謝物、糖、脂質、オータコイド(autoacid)、ホルモン、並びに、複合糖質、リン脂質、核酸及び蛋白質のような巨大分子などがある。
【００３６】
用語「芳香族」は、非局在化π電子系と称されることもある共役不飽和(4n+2)π電子系(ここで、nは正の整数である)を有する環状部分構造又は多環状部分構造を意味する。
【００３７】
用語「アリール」は、単一の環(例えば、フェニル)又は複数の縮合した環(例えば、ナフチル又はアントリル)を有する、6〜20個の炭素原子からなる芳香族環状炭化水素基を意味する。好ましいアリールには、フェニル及びナフチルなどがある。
【００３８】
用語「置換アリール(置換されているアリール)」は、特に別途アリールの置換基について定義が与えられていない限り、=O、=S、アシル、アシルオキシ、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルコキシ、場合により置換されていてもよいアルキル(例えば、トリハロメチル)、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアミノ、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいアリールオキシ、アジド、カルボキシル、(場合により置換されていてもよいアルコキシ)カルボニル、(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル、シアノ、場合により置換されていてもよいシクロアルキル、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリールオキシ、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクロオキシ、ヒドロキシル、ニトロ、スルファニル、スルフィニル及びスルホニルからなる群から独立して選択される1〜5の置換基、好ましくは、1〜3の置換基により置換されている、上記で定義されたアリール基を意味する。アリールの好ましい置換基としては、アルキル、アルコキシ、アミノアルキル、カルボキシ、ハロ、トリハロメチル及びスルホネートなどを挙げることができる。
【００３９】
用語「アラルキル」は、部分構造「-アルキレン-アリール」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有する。そのようなアラルキル基の例は、ベンジル、フェネチル及び3-ナフチルプロペニルなどである。
【００４０】
用語「置換アラルキル(置換されているアラルキル)」は、部分構造「-(場合により置換されていてもよいアルキレン)-(場合により置換されていてもよいアリール)」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有するが、アリール基又はアルキレン基の少なくとも一方は置換されており、その例は、4-(N-メチル-ピロリル)ペンチレン、4-ニトロベンジル又は1-メトキシカルボニル-2-フェニル-エチルなどである。
【００４１】
用語「カルボニル」は、ジラジカル「-C(=O)-」を意味し、これは、「-C(O)-」としても表される。
【００４２】
用語「(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル」は、基「-C(O)-(場合により置換されていてもよいアミノ)」を意味する。この部分構造は、第一級カルボキサミド、第二級カルボキサミド又は第三級カルボキサミドとも称される。
【００４３】
用語「カルボキシ」、「カルボキシル」及び「カルボン酸」は、部分構造「-C(O)OH」を意味し、これは、「-COOH」としても表される。この用語は、さらにまた、イオン化形態が酸と平衡状態で存在していることが期待されるような構造においては、カルボン酸アニオン(即ち, 「-COO-」)と互いに交換可能であることも意図されている。同様に、用語「スルホネート」は、「スルホン酸」を包含することが意図されている。
【００４４】
用語「相補的配列」は、標的の核酸分子に由来する核酸の逆又は反対の配列を有する一本鎖核酸である。
【００４５】
用語「式(I)の化合物(式(I)で表される化合物)」は、開示されている、本発明の色素、色素-リンカー、及び、色素ペア(dye couple)、並びに/又は、そのような化合物の塩を包含するものである。さらに、本発明の化合物には、互変異性体、個々の立体化学的異性体(選択された置換基により生じる)、並びに、互変異性体及び/又は異性体の混合物が包含される。
【００４６】
用語「シクロアルキル」は、単一の環又は複数の縮合した環を有し、約3〜40個(好ましくは、約4〜15個)の炭素原子を有する非芳香族環状炭化水素基を意味する。そのようなシクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロオクチルなどのような単一の環構造、又は、アダマンタニル及びシクロペンタフェナントレンなどのような多環構造などがある。
【００４７】
用語「置換シクロアルキル(置換されているシクロアルキル)」は、=O、=S、アシル、アシルオキシ、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルコキシ、場合により置換されていてもよいアルキル(例えば、トリハロメチル)、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアミノ、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいアリールオキシ、アジド、カルボキシル、(場合により置換されていてもよいアルコキシ)カルボニル、(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル、シアノ、場合により置換されていてもよいシクロアルキル、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリールオキシ、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクロオキシ、ヒドロキシル、ニトロ、スルファニル、スルフィニル及びスルホニルからなる群から独立して選択される1〜5の置換基、好ましくは、1〜3の置換基により置換されているシクロアルキル基を意味する。
【００４８】
用語「DNA」には、塩基A、T、C及びGが含まれるのみではなく、それら塩基の類似体又は修飾形態、例えば、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電リンケージ及びチオエート、糖類似体の使用、並びに、修飾された及び/又は代替の骨格構造、例えば、ポリアミドなども包含される。
【００４９】
用語「エピトープ」は、抗体に対して特異的に結合する任意の化学的部分構造を意味する。「エピトープ」は、さらにまた、エピトープを含んでいる部分構造又は分子である抗原も包含し得る。この抗原自体も抗体に対して特異的に結合する。単一の抗原分子は、複数のエピトープを含み得る。
【００５０】
用語「蛍光エネルギー転移(fluorescence energy transfer)」(「FET」)及び「蛍光共鳴エネルギー転移(fluorescence resonance energy transfer)」(「FRET」)及び「エネルギー転移(energy transfer)」は、互いに交換可能に使用される。
【００５１】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【００５２】
用語「ヘテロアリール」は、少なくとも1つの環内に約1〜40個(好ましくは、約3〜15個)の炭素原子及び約1〜10個のヘテロ原子(好ましくは、窒素、硫黄、リン、セレン及び/又は酸素から選択される約1〜4個のヘテロ原子)を有する芳香族環状炭化水素基を意味する。そのようなヘテロアリール基は、単一の環(例えば、ピリジル又はフリル)又は複数の縮合した環(例えば、インドリジニル又はベンゾチエニル)を有し得る。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジル、ピロリル、フリル、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール及びベンゾセレナゾールなどを挙げることができる。
【００５３】
用語「置換ヘテロアリール(置換されているヘテロアリール)」は、特に別途ヘテロアリールの置換基について定義が与えられていない限り、=O、=S、アシル、アシルオキシ、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルコキシ、場合により置換されていてもよいアルキル(例えば、トリハロメチル)、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアミノ、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいアリールオキシ、アジド、カルボキシル、(場合により置換されていてもよいアルコキシ)カルボニル、(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル、シアノ、場合により置換されていてもよいシクロアルキル、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリールオキシ、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクロオキシ、ヒドロキシル、ニトロ、スルファニル、スルフィニル及びスルホニルからなる群から独立して選択される1〜5の置換基、好ましくは、1〜3の置換基により置換されている、上記で定義されたヘテロアリール基を意味する。
【００５４】
用語「ヘテロアラルキル」は、部分構造「-アルキレン-ヘテロアリール」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有する。
【００５５】
用語「置換ヘテロアラルキル(置換されているヘテロアラルキル)」は、部分構造「-(場合により置換されていてもよいアルキレン)-(場合により置換されていてもよいヘテロアリール)」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有する。
【００５６】
用語「ヘテロアリーレン」は、上記で定義されたヘテロアリール(これは、置換されているヘテロアリールを包含する)から誘導されたジラジカル基を意味し、その例は、2,6-ピリジレン基、2,4-ピリジレン基、1,2-キノリニレン基、1,8-キノリニレン基、1,4-ベンゾフラニレン基、2,5-ピリジニレン基及び2,5-インドレニレン基などである。
【００５７】
用語「ヘテロ環(heterocycle)」、「ヘテロ環式(heterocyclic)」及び「ヘテロシクリル(heterocyclyl)」は、環内に約1〜40個(好ましくは、約3〜15個)の炭素原子及び約1〜10個のヘテロ原子(好ましくは、窒素、硫黄、リン及び/又は酸素から選択される約1〜4個のヘテロ原子)を有する飽和又は不飽和の非芳香族環状モノラジカル炭化水素基を意味する。そのようなヘテロ環式基は、単一の環又は複数の縮合した環を有し得る。好ましいヘテロ環としては、モルホリノ及びピペリジニルなどを挙げることができる。
【００５８】
用語「置換ヘテロ環(置換されているヘテロ環)」、「置換ヘテロ環式(置換されているヘテロ環式)」及び「置換ヘテロシクリル(置換されているヘテロシクリル)」は、特に別途ヘテロ環について定義が与えられていない限り、=O、=S、アシル、アシルオキシ、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルコキシ、場合により置換されていてもよいアルキル(例えば、トリハロメチル)、場合により置換されていてもよいアルキニル、場合により置換されていてもよいアミノ、場合により置換されていてもよいアリール、場合により置換されていてもよいアリールオキシ、アジド、カルボキシル、(場合により置換されていてもよいアルコキシ)カルボニル、(場合により置換されていてもよいアミノ)カルボニル、シアノ、場合により置換されていてもよいシクロアルキル、場合により置換されていてもよいシクロアルケニル、ハロゲン、場合により置換されていてもよいヘテロアリール、場合により置換されていてもよいヘテロアリールオキシ、場合により置換されていてもよいヘテロシクリル、場合により置換されていてもよいヘテロシクロオキシ、ヒドロキシル、ニトロ、スルファニル、スルフィニル及びスルホニルからなる群から独立して選択される1〜5の置換基、好ましくは、1〜3の置換基により置換されている、上記で定義されたヘテロシクリル基を意味する。
【００５９】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、部分構造「-アルキレン-ヘテロ環」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有する。
【００６０】
用語「置換ヘテロシクロアルキル(置換されているヘテロシクロアルキル)」は、部分構造「-(場合により置換されていてもよいアルキレン)-(場合により置換されていてもよいヘテロ環)」を意味し、ここで、各々は本明細書中で定義されている意味を有する。
【００６１】
用語「場合による(optional)」又は「場合により(optionally)」は、当該用語の次に記載されている出来事又は事柄が起こってもよいし又は起こらなくてもよいことを意味し、そのような出来事又は事柄が起こる場合と起こらない場合を包含する。例えば、「場合により置換されていてもよいアルキル」は、以下で定義されている「アルキル」又は「置換アルキル」のいずれかを意味する。当業者は、1つ以上の置換基を含んでいる任意の基に関して、そのような基が立体的に存在し得ない及び/又は合成的に実現不可能な任意の置換又は置換パターンを導入することを意図していないことは理解するであろう(例えば、置換アルキルは、場合により置換されていてもよいシクロアルキル基で置換されているアルキルを包含し、ここで、該シクロアルキル基自体は場合により置換されていてもよいアルキルで置換されることができ、これは、潜在的に無限に続く)。
【００６２】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は本明細書では互いに交換可能に使用されるが、これらは、任意の長さのヌクレオチド(リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド)のポリマー形態を意味する。これらの用語は、一本鎖、二本鎖又は三本鎖のDNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッドなどを包含し、又は、プリン塩基及びピリミジン塩基又は別の天然ヌクレオチド塩基、化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。本明細書で記述されている二本鎖ポリヌクレオチド配列が本明細書で記述されている修飾も含むことは理解される。該ポリヌクレオチドの骨格は、(RNA又はDNAにおいて典型的に見られるように)糖及びリン酸基を含み得るか、又は、修飾若しくは置換された糖若しくはリン酸基を含み得る。あるいは、該ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートのような合成サブユニットのポリマーを含むことが可能であり、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート(P-NH2)、混合ホスホルアミデート-ホスホジエステルオリゴマー、又は、ペプチド骨格(PNA)であることが可能である。ホスホジエステルリンケージの代わりに、ホスホロチオエートリンケージを用いることができる。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成し、該鎖を適切な条件下でアニーリングするか、又は、適切なプライマーを使用し、DNAポリメラーゼを用いて、初めから相補鎖を合成することにより、化学的合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得ることができる。以下に示すものは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子若しくは遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド(branched polynucleotide)、プラスミド、ベクター、任意配列の単離DNA、任意配列の単離RNA、核酸プローブ、及び、プライマー。
【００６３】
用語「プローブ」(又は、「アナライトが結合する分子」)は、例えば、共有結合、イオン結合、分散力、水素結合又は抗体-抗原相互作用を介して、被検物質上の少なくとも1つの標的化部位に選択的に結合するための標的化部分構造を意味する。プローブの種類は、例えば炭水化物、核酸、ポリペプチド、脂質又はリン脂質などの被検物質の種類に依存する。該プローブは、標的又はアナライトの結合部位、及び、適用可能なドナー又はレポーター分子に結合可能な任意の分子であり得る。使用可能なプローブの例には、ポリヌクレオチド(場合により、細胞に透過するためのリポソーム製剤に入れて供給される、相補的DNA、DNAインターカレーター、RNA)、抗体、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質及びレクチンなどがある。
【００６４】
用語「空間的に近接している」は、ドナーからレポーターまでエネルギーが転移することを可能とする範囲内にあること、即ち、約100オングストローム(100Å)の範囲内、好ましくは、70オングストローム未満、さらに好ましくは、50オングストローム未満、さらに好ましくは、30オングストローム未満、さらに好ましくは、20オングストローム未満の範囲内にあることを意味する。
【００６５】
用語「被検物質(試験される物質)」は、本発明の化合物への結合を介して検出可能な生物学的又は化学的な実在、例えば、細胞、細胞断片、ポリヌクレオチド配列、抗原などを意味する。
【００６６】
用語「スルファニル」は、-S-(場合により置換されていてもよいアルキル)基、-S-(場合により置換されていてもよいアリール)基、-S-(場合により置換されていてもよいヘテロアリール)基、及び、-S-(場合により置換されていてもよいヘテロシクリル)基を意味する。
【００６７】
用語「スルフィニル」は、-S(O)-(場合により置換されていてもよいアルキル)基、-S(O)-場合により置換されていてもよいアリール)基、-S(O)-(場合により置換されていてもよいヘテロアリール)基、及び、-S(O)-(場合により置換されていてもよいヘテロシクリル)基を意味する。
【００６８】
用語「スルホニル」は、-S(O2)-(場合により置換されていてもよいアルキル)基、-S(O2)-場合により置換されていてもよいアリール)基、-S(O2)-(場合により置換されていてもよいヘテロアリール)基、及び、-S(O2)-(場合により置換されていてもよいヘテロシクリル)基を意味する。
【００６９】
用語「スルホン酸」は、そのイオン化形態「スルホネート」及びその塩(例えば、K、Na、及び、NH4)を包含することが意図されている。
【００７０】
用語「標的」又は「アナライト結合部位」は、細胞、細胞断片、細胞表面マーカー(例えば、Ｔ細胞受容体)又はポリヌクレオチド配列(例えば、DNA配列又はRNA配列)などのような被検物質に典型的且つ一意的に特有の該物質の部分を意味する。
【００７１】
本発明の化合物
本発明は、例えば式(I)：
--L1-D1-FETL-D2---L2-          式(I)
[式中、
L1は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
L2は、プローブ若しくは標的に付着するための結合であるか、又は、固体支持体に付着するための結合であるか、又は、存在せず；
FETLは、アミン、カルボニル、活性化されているカルボン酸エステル、ジスルフィド、チオール又はチオールエステルを介してD1及びD2に結合している対称的、剛性又は立体障害性の二価部分構造を含んでいる蛍光エネルギー転移リンカーであり；
D1は、式：
【化６】
2005532434.tif 000008
【００７２】
［式中、
Xは、O又はC(R*R**)であり、その際、R*及びR**は独立して、低級アルキル又は-CH2-Zであり；
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、置換されているアリール(好ましくは、5〜6員の単環式アリール又は10〜12員の縮合環式アリール、特に、o-安息香酸)、置換されているヘテロアリール(5〜6員の単環式ヘテロアリール又は10〜12員の縮合環式ヘテロアリール)又はZであり；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R2は、R3と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員アリール環)を形成しており；
R3は、ハロ(好ましくは、クロロ)、若しくはZであるか、又は、R3は、R2及び/又はR4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R4は、R3及び/又はR5と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており、その際、R4'は、H、低級アルキル又はL1であり、及び、R4"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R5は、R4と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R6は、R7と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R7は、R6及び/又はR8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており、その際、R7'は、H、低級アルキル又はL1であり、及び、R7"は、H、低級アルキル又はCH2-Zであり；
R8は、ハロ(好ましくは、クロロ)、若しくはZであるか、又は、R8は、R7及び/又はR9と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員環)を形成しており；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R9は、R8と一緒に、5〜7個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、6員アリール環)を形成しており；
及び、
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、
Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり；
Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず；
Z2は、H、C1〜C8の場合により置換されていてもよい低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアリール(置換基は、好ましくは、SO3-、COOH、NH2、CH2NH2、SH、SCH3)である]
で表されるドナー色素であり；
及び、
D2は、式(D1)で表されるアクセプター/レポーター色素であるか、又は、下記群の式：
【化７】
2005532434.tif 000009
【００７３】
[式中、
R21〜R36の内の少なくとも1つはFETLに結合しており、
nは、ゼロ、1、2又は3であり；
R21及びR30は、独立して、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルであり；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-、若しくは、場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/若しくは、R28とR29は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化されたアリール環)を形成しており；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化された炭素環式環又はヘテロ環式環)を形成しており；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は一緒に、6個の原子を有する場合により置換されていてもよい縮合環(好ましくは、スルホン化された炭素環式環又はヘテロ環式環)を形成しており；
及び、
Yは、-O-又は-N(Y1)-であり、その際、Y1は、-CH2-Z、活性化されている低級アルキル、又は、場合により置換されていてもよいアラルキルである]
で表されるアクセプター/レポーター色素である]
で表されるような、特定の蛍光色素、色素リンカー及び色素ペア(その単独の立体異性体、立体異性体の混合物、溶媒和物、プローブ-コンジュゲート、標的-コンジュゲート、及び/若しくは、支持体-コンジュゲートを包含する)を提供する。
【００７４】
上記のものに加えて、D2として、D2.4：
【化８】
2005532434.tif 000010
【００７５】
のような、公知の種々のアクセプター/レポーター色素を用いることが可能である。
【００７６】
その態様の1つでは、式(I)及び/又は式(D1)におけるR3〜R8の少なくとも1つはZであり、その際、Z*は、場合により置換されていてもよいアリール又は場合により置換されていてもよいヘテロアリール、例えば、下記群から選択される場合により置換されていてもよいアリール又は場合により置換されていてもよいヘテロアリールである：
【化９】
2005532434.tif 000011
【００７７】
本発明の蛍光エネルギー転移リンカー(FETL)には、下記式により表されるものなどがある：
【化１０】
2005532434.tif 000012
【００７８】
[式中、
R10は、D1-C(O)-、D1-N(H)-CH2-、D1-S-C(O)-、D1-O-C(S)-又はD1-S-CH2-であり；
及び、
R11は、-C(O)-D2、-CH2-N(H)-D2、-C(O)-S-D2、-C(S)-O-D2又はCH2-S-D2である]
【化１１】
2005532434.tif 000013
【００７９】
[式中、pは、独立して、0、1、2又は3である]
及び、
【化１２】
2005532434.tif 000014
【００８０】
[式中、
qは、ゼロ又は1であり；
R12は、H、ハロ、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル若しくは場合により置換されていてもよいアリールであり；
R13は、H、SO3-、又は、場合により置換されていてもよいアルキル、場合により置換されていてもよいアルケニル、場合により置換されていてもよいアルキニル、若しくは、場合により置換されていてもよいアリールであり；
及び、
R14は、第二級アミン若しくは第三級アミン又はヘテロシクリル、特に、N(H)又はピペラジンである]。
【００８１】
例えば、FETLがFETL3若しくはFETL4である本発明の新規方法若しくは本発明の新規化合物にかかる別の態様において、及び/又は、式中のR21〜R36の内の少なくとも1つが、アリーレン部分構造若しくはアラルキレン部分構造(好ましくは、フェニレン、ベンジル、ナフタレン又はナフタレニル-メチル)を介して、L1、L2若しくはFETLに結合している、式(I)の化合物及び/又は式(D2)の化合物において、各Z*は、さらに、
【化１３】
2005532434.tif 000015
【００８２】
から選択することが可能である。
【００８３】
さらに別の態様は、式中のR21〜R36の内の少なくとも1つが、アリーレン部分構造又はアラルキレン部分構造(好ましくは、フェニレン、ベンジル、ナフタレン又はナフタレニル-メチル)を介して、L1、L2又はFETLに結合している、式(I)及び/又は式(D2)の化合物を包含する。
【００８４】
本発明化合物のさらに別の態様は、式(II)：
プローブ--L1-(D1又はD2)-FETL-(低親和性疑似標的)        式(II)
[式中、
プローブ、D1、D2及びFETLは、上記で定義されているとおりであり；
L1は、プローブに付着するための結合であり；
低親和性疑似標的は、該低親和性疑似標的がより高い親和性を有する真の標的と置き換わるまで、FETLが対応するD2又はD1にカップリングするのを非活性化、阻止又は防止するために配置されている該プローブについてのアナライトである]
で表される蛍光エネルギー転移色素に関する。
【００８５】
本発明の別の態様は、式：プローブ-L1-(D1又はD2)、プローブ-L1-(D1又はD2)-FETL、プローブ-L1-(D1又はD2)-FETL-(D2又はD1)-L2-固体支持体、及び、固体支持体-L1-(D1又はD2)-FETL-(D2又はD1)-L2-プローブの組成物に関し、ここで、
該プローブは、ポリヌクレオチド(場合により、細胞に透過するためのリポソーム製剤に入れて供給される、相補的DNA、DNAインターカレーター、RNA)、抗体、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質又はレクチンであり；
及び、
該プローブは、細胞、細胞断片、細胞表面マーカー(例えば、Ｔ細胞受容体)又はポリヌクレオチド配列(例えば、DNA配列又はRNA配列)のような標的物質に向けられる。
【００８６】
本発明のさらに別の態様は、多色蛍光エネルギー転移色素のセットに関し、ここで、励起スペクトルは、互いに、約20nmの範囲内に入っているが、発光スペクトルは、約30〜60nm隔てられている。該多色蛍光エネルギー転移色素のセットは、例えば、下記に示されているGUAVA I色素、GUAVA V PD590色素、TAM-XY-GY5色素、及び、GUAVA III-5-カルボキシ GYZ760色素のセットであり、これらは、いずれも、532nmで励起させることが可能であり、また、これらは、それぞれ、570nm、630nm、670nm、及び、760nmで発光する。別のそのような色素のセットは、本発明の技術に照らして、当業者には明らかなように、本発明の化合物を用いて調製することができる。
【化１４−１】
2005532434.tif 000016
【化１４−２】
2005532434.tif 000017
命名法及び構造
本発明の化合物は、独立した存在として蛍光色素を含み、また、1種以上の連結基、別の色素、プローブ及び/又は標的と組み合わせて含む。分かり易くするために、例えば、Zが式「-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)」で表される基であるとして記載されている式(D1)に関連して上記で示されているように、明細書及び特許請求の範囲においてボールドイタリックを使用して、L1, L2又はFETLがZにこの位置で結合しているが、L1, L2又はFETLのいずれも、基「Z」の一部を形成してはいないことを示した。一部の例では、二価部分構造(例えば、メチレン、6-カルボキシ-ナフタレニル)は、それらの一価の親部分構造の名称(例えば、メチル、6-カルボキシ-ナフチル)によって示されているが、それが、置換基を形成している基を含んでいる化合物の名称において用いられている該基の命名に反映している(例えば、「-CH2-NH3」は、アミノ-メチレン基であるが、これは、化合物の名前の中では、名称「アミノ-メチル」をもたらし得る)。
【００８７】
該化合物は、下記に説明してあるように命名し、番号を付けることができる(例えば、ChemDraw 又は ISIS-DRAW における AutoNom version 2.1 を使用する)。例えば、以下の化合物：
【化１５】
2005532434.tif 000018
【００８８】
即ち、式(D1)[式中、Xは酸素であり、R1はテトラクロロ安息香酸であり、R2、R5、R6及びR9は水素であり、R3はクロロであり、R4はヒドロキシであり、R7は=Oであり、及び、R8はp-カルボキシフェニルである]で表される化合物は、2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸と命名することができる。この化合物は、慣用名「GUAVA I」によって同定することもできる。
【００８９】
合成反応パラメーター
特に別途指定されていない限り、本明細書中に記載されている反応は、大気圧下、5℃〜100℃の範囲の温度(好ましくは、10℃〜50℃；最も好ましくは、「室温」又は「周囲温度」、例えば、20℃)で行う。特に別途指定されていない限り、反応時間及び反応条件は、近似的であることが意図されており、例えば、「おおよそ大気圧下、約5℃〜約100℃の範囲の温度(好ましくは、約10℃〜約50℃；最も好ましくは、約20℃)で、約1時間〜約10時間(好ましくは、約5時間)にわたり、反応させる」などである。実施例において記載されているパラメーターは、特定的であって、近似的なものではない。
【００９０】
用語「溶媒」、「不活性有機溶媒」又は「不活性溶媒」は、関連して記載されている反応の条件下で不活性な溶媒を意味する[例えば、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(「THF」)、ジメチルホルムアミド(「DMF」)、クロロホルム、塩化メチレン(又は、ジクロロメタン)、ジエチルエーテル、メタノール及びピリジンなどを挙げることができる]。特に別途指定されていない限り、本発明の反応で用いられている溶媒は、不活性有機溶媒である。
【００９１】
用語「q.s.」は、記載されている作用を達成するのに十分な量を加えることを意味し、、例えば、「溶液を所望の容積(即ち, 100%)とする」などである。
【００９２】
本明細書中に記載されている化合物及び中間体の単離及び精製は、必要に応じ、任意の適切な分離又は精製法、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、分取用クロマトグラフィー(preparative layer chromatography)(「PLC」)又はこれら方法を組み合わせたものなどで行うことができる。適切な分離及び単離方法の具体的な説明については、下記実施例を参照することにより知ることができる。しかしながら、もちろんのこと、別の等価的な分離又は精製方法も用いることが可能である。
【００９３】
式(I)の化合物の合成
式(I)の化合物の合成について、反応スキーム１〜反応スキーム８を参照しながら以下に記述する。
【００９４】
反応スキーム１において、式(D1)[式中、Xは-O-である]の化合物の合成について説明する。
【００９５】
反応スキーム２において、式(D1)[式中、Xは-O-であり、R1は、場合により置換されていてもよいオルト-安息香酸である]の化合物の合成について説明する。
【００９６】
反応スキーム３において、式(D1)[式中、Xは-C(R*R**)-である]の化合物の合成について説明する。反応スキーム３は、R4及びR7が、それぞれ、-N(R4'R4")及び=N(R7'R7")である化合物の合成に特に適している。
【００９７】
反応スキーム４において、式：D1-FETL1の化合物の合成について説明する。
【００９８】
反応スキーム５において、D2の合成について説明する。
【００９９】
反応スキーム６において、FETL4の合成について説明する。
【０１００】
反応スキーム７において、D1、FETL及びD2のカップリングについて説明する。
【０１０１】
反応スキーム８において、本発明化合物のビオチニル化ビーズへの結合について説明する。
【０１０２】
出発物質
式(101)及び式(202)で表される置換フェノール、式(102)で表される安息香酸、式(201)で表される無水物、並びに、他の反応物は、市販されているか(例えば、Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI から)、又は、一般的に用いられている合成方法を使用して、当業者は容易に調製することができる。
【０１０３】
反応スキーム１
【化１６】
2005532434.tif 000019
【０１０４】
反応スキーム１において例示されているように、式(101)の置換フェノールを1当量の式(102)の置換オルト-ヒドロキシ安息香酸と接触させる。この反応は、例えば、メタンスルホン酸の存在下、昇温条件下(130℃)で撹拌しながら2時間にわたり行う。得られた反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水中に注ぐことによりクエンチする。粗生成物を抽出し(例えば、酢酸エチルで)、洗浄し、脱水し、濃縮し、及び、精製して、式(I)[式中、Xは-O-である]で表される対応する化合物を得る。
【０１０５】
反応スキーム２
【化１７】
2005532434.tif 000020
【０１０６】
反応スキーム２において例示されているように、式(201)の場合により置換されていてもよい無水フタル酸を各1モル当量の置換フェノール(101)及び(202)と接触させる(又は、対称な生成物を合成するために、2モル当量の(101)又は(202)と接触させる)。この反応は、例えば、メタンスルホン酸の存在下、昇温条件下(130℃)で撹拌しながら2時間にわたり行う。得られた反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水中に注ぐことによりクエンチする。粗生成物を抽出し(例えば、酢酸エチルで)、洗浄し、脱水し、濃縮し、及び、精製して、式(I)[式中、Xは-O-であり、R1は、場合により置換されていてもよいオルト-安息香酸である]で表される対応する化合物を得る。
【０１０７】
反応スキーム３
【化１８】
2005532434.tif 000021
【０１０８】
反応スキーム３において例示されているように、式(D1)[式中、Xは-C(R*R**)-である]の化合物(特に、R4及びR7がアミン類である化合物)は、式(301)[式中、R*'は、R*の前駆体である]で表される置換イソプロペニルフェニル化合物及び僅かにモル過剰量の式(302)の置換フェニルメタノールを、低温条件下(例えば、氷浴内で)、有機溶媒(例えば、DCM)に溶解させることにより得ることができる。三塩化ホウ素を滴下して加え、得られた反応混合物を室温で16時間撹拌し、次いで、-15℃まで冷却した後、濃硫酸を滴下して加える。溶媒を除去し、反応混合物を-4℃で16時間静置する。この溶液を破砕した氷に注ぎ、NaOHで中和して、対応する置換基を有する式(303)の9,10-ジヒドロ-アントラセンを残渣として得る。これを、さらに精製又は単離することなく、次の反応に付す。
【０１０９】
残渣(式(303))を低級アルカノール(例えば、エタノール)に入れた後、過塩素酸及び等モル量のテトラブチル-アンモニウム(メタ)ペルヨーデートを添加する。この反応混合物を30分間加熱還流し、次いで、室温まで冷却し、過塩素酸ナトリウムの溶液中に注ぎ入れ、16時間静置して、式(D1.2)の対応する2,9-ジヒドロ-アントラセン(即ち, 式中のR1がHである式(D1)の化合物)を固体沈澱物として得る。この沈澱物は、濾過により採集し、乾燥させることができる。
【０１１０】
例えばTHFに溶解させた式(D1.2)の化合物を、低温条件下(例えば、-78℃)、大過剰モル量のR1-ハライド(例えば、2-(4-ブロモフェニル)-4,4-ジメチル-2-オキサゾール)に適して加える。反応が完結するまで(例えば、TLCを用いた測定による)、-50℃〜-60℃で撹拌しながら反応させた後、クエンチし(例えば、飽和塩化アンモニウムによる)、抽出し(例えば、DCMによる)、精製して(例えば、カラムクロマトグラフィーによる)、式(D1.3)の対応するR1置換基を有する化合物(この化合物は、安息香酸R1基の場合は、エタノール中のHClで脱保護されるまで、オキサゾール基で保護されている状態にある)を得る。
【０１１１】
反応スキーム４
【化１９】
2005532434.tif 000022
【０１１２】
反応スキーム４において例示されているように、式(D1)[式中、R6(又は、R5)は水素である]の化合物を、還元的アミノ化条件下(例えば、H2SO4の存在下)、1モル当量の式(401)[式中、nは、独立して、0、1又は2であり、Rは、H又はアルキルである]の場合により置換されていてもよい活性化されているジアミノベンゼンと接触させて、対応する化合物(ここで、R5又はR6はZ-FETL(FETL1として示されている)である)を得る。
【０１１３】
反応スキーム５
【化２０】
2005532434.tif 000023
【０１１４】
反応スキーム５において例示されているように、式(502)のハロゲン化R21前駆体と接触させることにより、式(501)のインドール又はベンゾインドールをN-誘導体化することができる。この反応は、例えば、エタノール中で加熱しながら行う。次いで、R21で置換された式(503)のインドール又はベンゾインドールを、式(504)、式(505)又は式(506)の(アセチル-フェニル-アミノ)-アルケニル-インドール、(アセチル-フェニル-アミノ)-アルケニル-クロメン、又は、(アセチル-フェニル-アミノ)-アルケニル-キノリン(ここで、これらの化合物は、式(503)の調製と同様に、R30又はY1で置換することが可能である)と接触させて、それぞれ、式(D2.1)、式(D2.2)又は式(D2.3)の化合物を得る。
【０１１５】
反応スキーム６
【化２１】
2005532434.tif 000024
【０１１６】
反応スキーム６において例示されているように、式(FETL4)の化合物は、例えば、文献(Davol, J. J. Chem. Soc. 1960, 131, 及び, Lewis, A.F., Robins, R.K., Can. J. Chem. Soc. 1963, 41, 1807)に記載されているようにして調製することができる。上記に示されている例示的なスキームでは、4-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジンを、NaH/DMF中で、ブロモ-アセテート(例えば、2-ブロモ-t-ブチルアセテート又は4-ブロモメチル-安息香酸メチルエステル)と反応させて、式(602)の対応するエステルを得ている。このエステルに、DMF中の式(603)の化合物を添加することにより置換基(CH2)q-R14を付け加えることが可能である。この置換基を付け加えた式(602)のエステルをTFA/DCMで対応する酸に変換して、式(FETL4)の所望の化合物を得る。
【０１１７】
FETL3は、例えば米国特許第6,528,534号で例示されているようにして、合成することができる。
【０１１８】
反応スキーム７
【化２２−１】
2005532434.tif 000025
【化２２−２】
2005532434.tif 000026
反応スキーム７(上段)において例示されているように、DMF/DIEA溶媒中で、式(701)[即ち、ピロリジンジオン活性化基を有するD1]の化合物、式(702)[即ち、2つのアミン活性化基を有するFETL]の化合物及び式(703)[即ち、ピロリジンジオン活性化基を有するD2]の化合物を一緒に接触させて、式(I)の対応するFETL連結色素ペアを得る。この反応は、D1及び/又はD2がアミン活性化基を有し(下段の反応スキームに示されている)、Pre-FETL(これは、カップリングされている連結基FETLから識別する目的で、このように記載されている)が対応するピロリジンジオン活性化基を有していても実施することが可能である。
【０１１９】
反応スキーム８
【化２３】
2005532434.tif 000027
【０１２０】
反応スキーム８において例示されているように、L2に対する付着点としてのカルボン酸を有する式(I)の色素ペアを、DCC/HOBT、ストレパビジン(strepavidin)及びビオチニル化ビーズと接触させて、式：D1-FETL-D2-L2-ビオチニル化ビーズ(ここで、L2は、SA：Bである)に対応する標識化ビオチニル化ビーズを得る。
【０１２１】
好ましい調製方法及び最終ステップ
式(101)の置換フェノールを式(102)の置換オルト-ヒドロキシ安息香酸と接触させて、式(D1)[式中、XはOである]の対応する化合物を得る。
【０１２２】
DMF/DIEAの存在下、式(701)の化合物及び式(702)の化合物(及び、場合により、式(703)の化合物)を接触させて、式：D1-FETL、又は、式：D1-FETL-D2の対応する化合物を得る。
【０１２３】
DMF/DIEAの存在下、式(704)の化合物及び式(705)の化合物(及び、場合により、式(706)の化合物)を接触させて、式：D1-FETL、又は、式：D1-FETL-D2の対応する化合物を得る。
【０１２４】
D1-FETL-D2-COOHのような式(I)の化合物をストレパビジン及びビオチニル化ビーズと接触させて、式：D1-FETL-D2-L2-(固体支持体)[式中、L2は、ストレパビジンであり、固体支持体は、ビオチニル化ビーズである]の対応する化合物を得る。
【０１２５】
好ましい化合物
本発明の化合物、並びに、それらの調製方法及び使用方法に関して好ましいものは、以下に示してある置換基の組合せ及び順列である(亜群は、それぞれ、好ましさが増していく順である)。
【表２】
2005532434.tif 000028
【０１２６】
2005532434.tif 000029
【０１２７】
2005532434.tif 000030
【０１２８】
2005532434.tif 000031
【表３】
2005532434.tif 000032
【表４】
2005532434.tif 000033
【表５】
2005532434.tif 000034
【０１２９】
式(I)中のFETLがFETL1である一群の化合物に関して説明したように、上記で記載した群及び亜群は、それぞれが好ましいものであり、また、組み合わせることで、本発明のさらに好ましい態様を記述することができる。
【０１３０】
本発明の化合物の好ましい一亜群は、以下の置換基の1つ以上を有するものである：
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、5〜6員の単環式若しくは10〜12員の縮合環式の置換されているアリール若しくはヘテロアリールであるか、又は、Zである；
R2は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R3と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
R3は、ハロ若しくはZであるか、又は、R2及び/又はR4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R4は、=O若しくはOHであるか、-N(R4'R4")若しくは=N+(R4'R4")であるか、又は、R3及び/又はR5と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R5は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R4と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R6は、H、ハロ若しくはZであるか、又は、R7と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R7は、=O若しくはOHであるか、-N(R7'R7")若しくは=N+(R7'R7")であるか、又は、R6及び/又はR8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R8は、ハロ若しくはZであるか、又は、R7及び/又はR9と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員環を形成している；
R9は、H、ハロ若しくはSO3-であるか、又は、R8と一緒に、場合により置換されていてもよい縮合6員アリール環を形成している；
XがC(R*R**)である場合、R4は、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")であり、且つ、R7は、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")である；
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、メチレン、メトキシ、エトキシ、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピニル、アミノブチニル、カルボキシエテニル、カルボキシエチニル、場合により置換されていてもよいアリール、又は、場合により置換されていてもよいヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(Z2)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-、-CH2-N(Z2)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-若しくは-CH2-S(O2)-であるか、又は、Z1は存在せず、Z2は、Hであるか、又は、場合によりSO3-、COOH、NH2、CH2NH2、SH若しくはSCH3で置換されていてもよいC1〜C8の低級アルキル又はアリールである；
FETLは、アミン、カルボニル、活性化されているカルボン酸エステル、ジスルフィド、チオール又はチオールエステルを介してD1及びD2に結合している、対称的、剛性又は立体障害性の二価部分構造を含んでいる；
R21又はR30は、カルボキシ-ナフチル-メチルであるか、オルト、メタ若しくはパラにカルボニル若しくは活性化基を有し且つモノ-オルト置換基若しくはジ-オルト置換基を有するベンジルであるか、又は、活性化されているC1〜C6の低級アルキルである；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-若しくは場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R22とR23、R23とR24、R24とR25、R26とR27、R27とR28、及び/又は、R28とR29は、一緒に、縮合スルホン化6員アリール環を形成している；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R31とR32は一緒に、縮合スルホン化6員炭素環式環若しくはヘテロ環式環を形成している；
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル若しくはアリールであるか、又は、R33とR34、R34とR35、及び/若しくは、R35とR36は、一緒に、縮合スルホン化6員炭素環式環若しくはヘテロ環式環を形成している；
及び/又は、
R22〜R29、又は、R33〜R36の内の少なくとも1つは、SO3-である。
【０１３１】
さらに好ましいのは、以下の置換基の1つ以上を有する本発明化合物の亜群である：
R1は、H、CF3、ペルフルオロプロピル、低級アルキル酸、場合により置換されていてもよいオルト安息香酸、又は、Zである；
R2は、H、ハロ又はSO3-である；
R3は、ハロ又はZである；
R4は、=O又はOH、-N(R4'R4")又は=N+(R4'R4")である；
R5は、H、ハロ又はZである；
R6は、H、ハロ又はZである；
R7は、=O又はOH、-N(R7'R7")又は=N+(R7'R7")である；
R8は、Zである；
R9は、H、ハロ又はSO3-である；
Zは、式：-Z*-Z1-(L1, L2又はFETL)で表される基であり、その際、Z*は、フェニル、アダマンチル、ノルボラニル、ビフェニル、ナフチル、フラニル、ビフラニル、チオフェニル、ビチエニル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエニル、クロメニル及びイソクロメニルからなる群の、場合により置換されていてもよいアリール又はヘテロアリールであり、Z1は、-C(O)-、-N(H)-、-CH2-O-、-CH2-C(O)-若しくは-CH2-N(H)-であるか、又は、Z1は存在しない；
R22〜R29は、独立して、H、SO3-若しくは場合により置換されていてもよいアルキルであるか、又は、R24とR25、及び/若しくは、R26とR27は、一緒に、縮合スルホン化6員アリール環を形成している；
R31及びR32は、独立して、H、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールである；
及び/又は、
R33〜R36は、独立して、H、SO3-、場合により置換されていてもよいアルキル又はアリールである。
【０１３２】
一般的な有用性
本発明化合物は、さまざまな用途で用いられる。当業者には理解されるように、式(D1)及び式(D2)の色素は、個別的に使用することが可能であり、また、FETLで示されているような蛍光エネルギー転移リンカーを介して連結することが可能である(例：式(I))。本発明化合物に付着させることにより検出/試験することが可能な物質は、一般に、生物学的な実在、例えば、細胞、蛋白質、ペプチド、抗体及び糖などである。非生物学的な小分子も検出可能である。本発明化合物は、蛍光色素の使用が知られている任意の方法又は手順、例えば、フローサイトメトリー、DNA塩基配列決定法、プロテインアレイ、DNAアレイ、イムノアッセイ、キャピラリー電気泳動法及びHPLCなどにおいて、また、蛍光顕微鏡検査法のマーカーなどとして使用することが可能である。
【０１３３】
特に、本発明のドナー色素及びアブソーバー/レポーター色素は、非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイで使用可能である。さらに、本発明のドナー色素及びアブソーバー/レポーター色素を近接アッセイで用いて、数種類の近接する標的からなる標的のセットの存在を検出することが可能であり、また、本発明のドナー色素及びアブソーバー/レポーター色素を多重化して、数種類の標的のセットの相対的比率を検出することが可能である。
【０１３４】
キャラクタリゼーション及び試験
本発明の色素及び連結された色素ペアは、主に、それらが吸収及び放射する光の波長に関して特徴付けられる。これらの特性、並びに、例えば、溶解度、親水性と親油性及び安定性などのような別の物理的特性は、慣習的な方法(例えば、NMR及びHPLCなど)により測定することが可能である。本発明の方法で使用するための色素、連結された色素ペア及び標識されたアナライトの適合性については、例えば、蛍光分析、吸光分光分析及びクロマトグラフ分析、例えば、米国特許第5,268,486号に記述されている分析などにより決定することが可能である。
【０１３５】
本発明の方法
当業者には理解されるように、既存の装置及びアッセイにおいて、市販されている色素の代わりに本発明の色素及び連結されている色素ペアを使用するために、特定の指示は必要ではない。以下の記述は、非結合色素を除去するための分析前精製を必要としない慣習的なアッセイ技術についての適合性と、幾つかの近接アッセイへの適合性についてのものである。特定の用途に適合させるために、必要に応じて、種々のアッセイ要素を用いる順番が変更可能であることは理解されるべきである。
【０１３６】
非結合色素を除去するための分析前精製を必要としないアッセイは、適切なアッセイ容器内で、以下のようにして実施することが可能である： (a) 被検物質とプローブ1-L1-D1を、該プローブが該被検物質に関連する標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で接触させる； (b) 結合しているプローブ1(非結合プローブ1ではない)又は該標的部位内の第二のエピトープにプローブ2が優先的に結合するのに適切な条件下で、試験容器内にプローブ2-L2-D2を導入する(ここで、D2は、D1の発光スペクトル内のエネルギーを吸収し、D2は、任意の別のアッセイ要素による干渉(例えば、吸収又は発光D1)を受けることなく測定可能であるために、充分に除去される波長でエネルギーを放射する)； (c) D1にエネルギーを吸収させる；及び、(d) D2発光のレベルを測定する。非結合プローブ1-L1-D1とプローブ2-L2-D2は、溶液状態では遊離しているので、それらは、D2による蛍光発光を引き起こす程空間的に充分に近接している状態では保持されない。それによって、分析前の洗浄ステップで非結合色素を除去する必要性が排除される。
【０１３７】
非結合色素を除去するための分析前精製を必要としない別のアッセイは、本発明のプローブ-L1-(D1, 又は, D2)-FETL化合物を用いるが、その際、FETLは、プローブ1/標的の結合の非存在下では反応できないようにする。これは、例えば、プローブ1に対して低親和性の疑似標的を、FET色素ペアの第二の色素にカップリングするためのFETLの部位又はその近くに付着させ、それにより、低親和性疑似標的がより高い親和性を有する真の標的と置き換わるまで、該部位を非活性化するか、第二の色素にカップリングするのを立体的に遮断するか又は防止することにより達成することが可能である。低親和性疑似標的は、それがその一部であるプローブ-L1-(D1, 又は, D2)-FETL分子に結合することができるか、又は、溶液内で別の非結合プローブ-L1-(D1, 又は, D2)-FETL分子と複合体を形成することができる。手順： (a) プローブ-L1-(D1, 又は, D2)-FETL-(低親和性疑似標的)を適切なアッセイ容器内に導入し、プローブ1が被検物質に関連する標的部位に優先的に結合するか、又は、そのような標的の非存在下で低親和性疑似標的に結合するのに適切な条件下で、該被検物質と接触させる； (b) FETLにカップリングするための活性化されている部位を有する本発明のD2化合物又はD1化合物を導入する； (c) D1にエネルギーを吸収させる；及び、(d) D2発光のレベルを測定する。ここで再度述べるが、非結合プローブ-L1-(D1, 又は, D2)-FETLと相補的なD2又はD1は、溶液状態では遊離している。即ち、D2による蛍光発光を引き起こす程空間的に充分に近接している状態では保持されない。それによって、分析前の洗浄ステップで非結合色素を除去する必要性が排除される。
【０１３８】
一般に、近接アッセイは、アナライトを、第一の結合部位に付着可能なドナー色素分子及び第二の結合部位に付着可能なレポーター色素分子と接触させること、該ドナー分子を励起すること、及び、該レポーター分子の発光をモニターすることを含む。レポーター分子の発光が検出された場合、空間的に近接している第一結合部位と第二結合部位を有するアナライトが存在する。
【０１３９】
近接アッセイは、適切なアッセイ容器内で、以下のようにして実施することが可能である： (a) 被検物質とプローブ1-L1-D1コンジュゲート(又は、プローブ1-L1-D1-FETL-D2コンジュゲート)を、該プローブ1が該被検物質に関連する標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で接触させる； (b) プローブ2が第一の標的に対するその近接度に関して対象となる第二の標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で、試験容器内にプローブ2-L2-D2.1コンジュゲートを導入する(ここで、D2.1は、D1(又は、D2)の発光スペクトル内のエネルギーを吸収し、D2.1は、任意の別のアッセイ要素(例えば、D1又はD2)の発光による干渉を受けることなく測定可能であるために、D1(又は、D2)の発光スペクトルから充分に除去される波長でエネルギーを放射する)； (c) D1にエネルギーを吸収させる；及び、(d) D2.1発光のレベルを測定する。D2.1発光のレベルは、第二の標的部位が第一の標的部位に空間的に近接しているかどうか、及び、第二の標的部位が第一の標的部位に空間的にどの程度近接しているかに対応する。
【０１４０】
多標的近接アッセイは、適切なアッセイ容器内で、以下のようにして実施することが可能である： (a) 被検物質とプローブ1-L1-D1コンジュゲート(又は、プローブ1-L1-D1-FETL-D2コンジュゲート)を、該プローブ1が該被検物質に関連する標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で接触させる； (b) プローブ2及びプローブ3が第一の標的に対するそれらの近接度に関して対象となる第二及び第三の標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で、試験容器内にプローブ2-L2-D2.1コンジュゲート及びプローブ3-L2-D2.2コンジュゲートを導入する(ここで、D2.1及びD2.2は、D1(又は、D2)の発光スペクトル内のエネルギーを吸収し、D2.1及びD2.2は、任意の別のアッセイ要素による干渉を受けることなく測定可能であるために、D1(又は、D2)の発光スペクトル及び互いの発光スペクトルから充分に除去される波長でエネルギーを放射する)； (c) D1にエネルギーを吸収させる；及び、(d) D2.1発光のレベル及びD2.2発光のレベルを測定する。D2.1発光のレベル及びD2.2発光のレベルは、第二の標的部位及び第三の標的部位が第一の標的部位に空間的に近接しているかどうか、並びに、第二の標的部位及び第三の標的部位の相対的な比率に対応する。
【０１４１】
別法による多標的近接アッセイは、適切なアッセイ容器内で、以下のようにして実施することが可能である： (a) 被検物質と、プローブ1-L1-D1、プローブ2-L1-D1及びプローブ3-L1-D1のような一連のコンジュゲートを、該プローブ1、プローブ2及びプローブ3が該被検物質に関連する標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で接触させる； (b) プローブ4が第一、第二及び第三の標的に対するその近接度に関して対象となる第二の標的部位に優先的に結合するのに適切な条件下で、試験容器内に、プローブ4-L2-D2.1コンジュゲート、プローブ4-L2-D2.2コンジュゲート及びプローブ4-L2-D2.3コンジュゲートを導入する(ここで、D2.1、D2.2及びD2.3は、D1の発光スペクトル内のエネルギーを吸収し、D2.1、D2.2及びD2.3は、任意の別のアッセイ要素による干渉を受けることなく測定可能であるために、D1の発光スペクトル及び互いの発光スペクトルから充分に除去される波長でエネルギーを放射する)； (c) D1にエネルギーを吸収させる；及び、(d) D2.1発光のレベル、D2.2発光のレベル及びD2.3発光のレベルを測定する。D2.1発光のレベル、D2.2発光のレベル及びD2.3発光のレベルは、第一の標的部位、第二の標的部位及び第三の標的部位が第四の標的部位に空間的に近接しているかどうか、並びに、第一の標的部位、第二の標的部位及び第三の標的部位の相対的な比率に対応する。当業者は、上記方法において、一連のプローブ1-L1-D1-FETL-D2コンジュゲート、プローブ2-L1-D1-FETL-D2コンジュゲート及びプローブ3-L1-D1-FETL-D2コンジュゲートを使用することも可能であることを理解するであろう。
【実施例】
【０１４２】
以下の実施例は、上述した本発明の使用方法についてさらに充分に記述すると共に、本発明の種々の態様を実施するのに予期される最良の形態について説明するためのものである。以下の実施例は、本発明の真の範囲を決して限定するものではなく、例示することを目的として提供されているものである。
【０１４３】
実施例１
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸
【化２４】
2005532434.tif 000035
【０１４４】
１Ａ．
メタンスルホン酸(10mL)中の2,3,4,5-テトラクロロ-6-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-ベンゾイル)-安息香酸(0.43g, 1.0mmol)及び2',4'-ジヒドロキシ-ビフェニル-4-カルボン酸(３, 0.23g, 1.0mmol)を予め加熱しておいた油浴(T=130℃)内に置いて、2時間にわたり撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(200mL)に注ぎ入れることによりクエンチした。この溶液を2時間にわたり静置し、得られた粗生成物を酢酸エチル(EtOAc, 2×100mL)で抽出した。有機部分を合して水(1×100mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム(1×100mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、未精製の１を、暗褐色の固体として得た。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 100g, 1/1 EtOAc：ヘキサン 0.5% AcOH)により精製して、標題化合物(0.26g, 42%)を橙色の固体として得た。最大吸収(λmax 540nm, 1×PBS)、最大発光(λem 570nm, 1×PBS)。
【０１４５】
１Ｂ．
実施例１Ａの手順に従うが、2,3,4,5-テトラクロロ-6-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-ベンゾイル)-安息香酸を以下の：
・  2,3,4,5-テトラブロモ-6-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-ベンゾイル)-安息香酸；
及び、
・  4-カルボキシ-2,3,5-トリクロロ-6-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-ベンゾイル)-安息香酸；
に置き換えて、それぞれ、式(D1)の下記化合物を得た：
・  2,3,4,5-テトラブロモ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸；
及び、
・  4-カルボキシ-2,3,5-トリクロロ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸。
【０１４６】
実施例２
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2,7-ビス(4'-カルボキシフェニル)-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸
【化２５】
2005532434.tif 000036
【０１４７】
メタンスルホン酸(2mL)中のテトラクロロ無水フタル酸(31mg, 0.11mmol)及び2',4'-ジヒドロキシ-ビフェニル-4-カルボン酸(50mg, 0.22mmol)を予め加熱しておいた油浴(T=130℃)内に置いて、0.75時間にわたり撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(50mL)に注ぎ入れることによりクエンチした。この溶液を2時間にわたり静置し、得られた粗生成物を酢酸エチル(EtOAc, 3×25mL)で抽出した。有機部分を合して水(1×50mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム(1×50mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、未精製の１を、暗褐色の固体として得た。分取用クロマトグラフィー(シリカゲル RP-18, 1mm, 95/35 100mM TEAB：AcCN, ×2)により精製して、４を主要な生成物として得た。λmax 550nm, MeOH；λem 575nm, MeOH。
【０１４８】
実施例３
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(4-(4'-カルボキシフェニル)-5-ヒドロキシ-9-オキソ-9H-ベンゾ[a]キサンテン-12-イル)-安息香酸
【化２６】
2005532434.tif 000037
【０１４９】
メタンスルホン酸(4mL)中のテトラクロロ無水フタル酸(0.32g, 1.1mmol)、2',4'-ジヒドロキシ-ビフェニル-4-カルボン酸(0.26g, 1.1mmol)及び1,3-ジヒドロキシナフタレン(0.18g, 1.1mmol)を予め加熱しておいた油浴(T=110℃)内に置いて、17時間にわたり撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(100mL)に注ぎ入れることによりクエンチした。この溶液を2時間にわたり静置し、得られた粗生成物を酢酸エチル(EtOAc, 3×25mL)で抽出した。有機部分を合して水(1×50mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム(1×50mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、未精製の１を、暗褐色の固体として得た。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 50g, 4/1 EtOAc：ヘキサン 1% AcOH)により精製して、標題化合物を主要な生成物として得た。ABS λmax 540nm, 1×PBS； EM λem 570nm, 1×PBS。
【０１５０】
実施例４
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(4-(6'-カルボキシナフチル)-5-ヒドロキシ-9-オキソ-9H-ベンゾ[a]キサンテン-12-イル)-安息香酸
【化２７】
2005532434.tif 000038
【０１５１】
メタンスルホン酸(5mL)中のテトラクロロ無水フタル酸(0.32g, 1.1mmol)、6-(2',4'-ジヒドロキシフェニル)-2-ナフトエ酸(0.31g, 1.1mmol)及び1,3-ジヒドロキシナフタレン(0.18g, 1.1mmol)を予め加熱しておいた油浴(T=110℃)内に置いて、17時間にわたり撹拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(100mL)に注ぎ入れることによりクエンチした。この溶液を2時間にわたり静置し、得られた粗生成物を酢酸エチル(EtOAc, 2×100mL)で抽出した。有機部分を合して水(1×100mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム(1×100mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、未精製の６を、暗褐色の固体として得た。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 50g, 4/1 EtOAc：ヘキサン, 1% AcOH)により精製して、標題化合物を主要な生成物として得た。ABS λmax 541nm, 1×PBS； EM λem 574nm, 1×PBS。
【０１５２】
実施例５
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2-(6'-カルボキシナフチル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸
【化２８】
2005532434.tif 000039
【０１５３】
メタンスルホン酸(10mL)中の2,3,4,5-テトラクロロ-6-(5-クロロ-2,4-ジヒドロキシ-ベンゾイル)-安息香酸(0.43g, 1.0mmol)及び6-(2',4'-ジヒドロキシフェニル)-2-ナフトエ酸(0.28g, 1.0mmol)を予め加熱しておいた油浴(T=130℃)内に置いて、2時間にわたり撹拌する。この反応混合物を室温まで冷却し、氷冷水(200mL)に注ぎ入れることによりクエンチする。この溶液を2時間にわたり静置し、得られた粗生成物を酢酸エチル(EtOAc, 2×100mL)で抽出する。有機部分を合して水(1×100mL)で洗浄し、飽和塩化ナトリウム(1×100mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、未精製の７を、暗褐色の固体として得る。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 100g, 1/1 EtOAc：ヘキサン 0.5% AcOH)により精製して、標題化合物７を得る。予期される収量(0.26g, 42%)。予期される最大吸収(λmax 550nm, MeOH)、予期される最大発光(λem 576nm, MeOH)。
【０１５４】
実施例６
2,3,4,5-テトラクロロ-6-{2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-4-[(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-メチル]-3H-キサンテン-9-イル}-安息香酸
及び
2,3,4,5-テトラクロロ-6-{2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-5-[(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-メチル]-3H-キサンテン-9-イル}-安息香酸
【化２９】
2005532434.tif 000040
【０１５５】
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸(200mg, 0.32mmol, 実施例１で調製したもの)及びN-(ヒドロキシメチル)トリフルオロアセトアミド(44mg, 0.31mmol, Lancaster, Inc)を硫酸(3mL)に溶解させた溶液を室温で16時間にわたり撹拌し、次いで、破砕した氷(25g)に注いだ。得られた粗生成物をEtOAc(2×50mL)で抽出し、有機部分を合して水(1×50mL)及び飽和NaCl(1×50mL)で洗浄し、脱水し(MgSO4)、濃縮した。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 60g, 1/1 EtOAc/ヘキサン 1% AcOH)により精製して、標題化合物を混合物として得た(105mg, 62%)。
【０１５６】
実施例７
2-{7-[4-(5-カルボキシ-ペンチルカルバモイル)-フェニル]-2-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル}-3,4,5,6-テトラクロロ-安息香酸アニオン
【化３０】
2005532434.tif 000041
【０１５７】
2,3,4,5-テトラクロロ-6-(2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル)-安息香酸(50mg, 0.08mmol, 実施例１で調製したもの)及び6-アミノヘキサン酸(10mg, 0.084mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF, 1mL)に溶解させた溶液を撹拌しながら、それに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC, 17mg, 0.084mmol)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT, 10mg, 0.08mmol)添加した。この反応混合物を、窒素ガス下、室温で16時間にわたり撹拌した後、1/1のEtOAc：水(100mL)を添加した。有機部分を水(2×20mL)、HCl(2M, 1×20mL)及び飽和塩化ナトリウム(1×20mL)で洗浄し、脱水し(Na2SO4)、濃縮した。分取用クロマトグラフィー(PLC, シリカゲル, 1mm, 5/1 EtOAc/ヘキサン 1% AcOH)により精製して、標題化合物(40mg, 67%)を得た。ABS λmax 529nm, 1×PBS pH7.4。
【０１５８】
実施例８
2,3,4,5-テトラクロロ-6-{2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-4-[(5-メトキシカルボニル-ペンタノイルアミノ)-メチル]-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル}-安息香酸
【化３１】
2005532434.tif 000042
【０１５９】
2,3,4,5-テトラクロロ-6-{2-(4'-カルボキシフェニル)-7-クロロ-6-ヒドロキシ-3-オキソ-4-[(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-メチル]-3H-キサンテン-9-イル}-安息香酸(3mg, 4μmol)を、50℃で0.5時間かけて、濃水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、濃縮乾固した。得られた遊離アミンを、DMF：ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(100/15, 1.15mL)の溶液中で、ヘキサン二酸-1-スクシンイミジルエステル-6-メチルエステル(1当量)と反応させた。1時間経過した後、反応混合物を濃縮し、分取用クロマトグラフィー(シリカゲル, 1mm, 95/5 DCM：MeOH, 0.5 % AcOH)により精製して、標題化合物(2mg, 62%)を得た。
【０１６０】
実施例９
1-(4-メトキシカルボニル-ベンジル)-2-{5-[1-(4-メトキシカルボニル-ベンジル)-3,3-ジメチル-5-スルホ-1,3-ジヒドロ-インドール-2-イリデン]-ペンタ-1,3-ジエニル}-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム
【化３２】
2005532434.tif 000043
【０１６１】
1-(4-メトキシカルボニル-ベンジル)-2,3,3-トリメチル-5-スルホ-3H-インドリウム(0.2g, 0.4mmol)、テトラメトキシプロパン(33μL, 0.2mmol)、無水酢酸(230μL, 2.4mmol)、酢酸(23μL, 0.4mmol)及びN-メチルピロリドンの溶液を撹拌しながら、それを、16時間にわたり50℃に加熱した。この反応混合物を室温まで冷却した後、水(10mL)を添加した。水性部分をEtOAc(2×30mL)で洗浄することにより有機不純物を除去し、濃縮した。暗青色の濃縮物を分取用クロマトグラフィー(PLC, 1mm RP-C18, 25% アセトニトリル：水)により精製して、標題化合物を得た。ABS λmax 648, EM λem 670, 1×PBS。
【０１６２】
実施例１０
1-(4-カルボキシ-ベンジル)-2-{5-[1-(4-カルボキシ-ベンジル)-3,3-ジメチル-5-スルホ-1,3-ジヒドロ-インドール-2-イリデン]-ペンタ-1,3-ジエニル}-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム
【化３３】
2005532434.tif 000044
【０１６３】
精製した1-(4-メトキシカルボニル-ベンジル)-2-{5-[1-(4-メトキシカルボニル-ベンジル)-3,3-ジメチル-5-スルホ-1,3-ジヒドロ-インドール-2-イリデン]-ペンタ-1,3-ジエニル}-3,3-ジメチル-5-スルホ-3H-インドリウム(3mg, 3.4μmol)を水酸化カリウム(KOH, 8M, 340μL)及び水(60μL)に溶解させ、1時間にわたり50℃に加熱した。この反応混合物を濃HCl(28μL)で中和し、沈澱した標題生成物を濾過により採集した。ABS λmax 648nm, 1×PBS。
【０１６４】
実施例１１
(4-カルボキシ-ベンジル)-[10-(4-カルボキシ-フェニル)-7-ジメチルアミノ-9,9-ジメチル-9H-アントラセン-2-イリデン]-エチル-アンモニウム
【化３４】
2005532434.tif 000045
【０１６５】
4-{[(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-メチル-アミノ]-メチル}-安息香酸メチルエステル(0.5g, 1.8mmol)及び3-イソプロペニル-フェニル)-ジメチル-アミン(0.31g, 1.9mmol)を塩化メチレン(CH2Cl2, 25mL)に溶解させた溶液を氷冷し、それに、三塩化ホウ素の溶液(CH2Cl2中1M BCl3, 2mL)を滴下して加える。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、-15℃に冷却し(NaCl/水)、次いで、濃硫酸(12mL)を滴下して加える。塩化メチレンを除去し、得られた混合物を4℃で16時間にわたり静置する。得られた溶液を破砕した氷に注ぎ、2Nの水酸化ナトリウムで中和する。この水溶液を塩化メチレン(2×75mL)で抽出し、脱水し(Na2SO4)、濃縮して、9,10-ジヒドロ-アントラセンを残渣として得る。
【０１６６】
得られた残渣を、エタノール(100mL)中に入れた後、過塩素酸(60%, 1mL)及びテトラブチルアンモニウム(メタ)ペルヨーデート(0.078g, 0.18mmol)を添加する。得られた溶液を0.5時間にわたり還流する。この反応混合物を室温まで冷却し、過塩素酸ナトリウムの溶液(0.2M, NaClO4, 200mL)に注ぎ入れ、一晩静置する。固体沈澱物を濾過により採集し、乾燥させて、対応する2,9-ジヒドロ-アントラセン生成物を得る。予期される収量(0.4〜0.5g, 40〜50%)。
【０１６７】
2-(4-ブロモフェニル)-4,4-ジメチル-2-オキサゾール(10当量)及びt-ブチルリチウムをTHF(10mL)に溶解させた溶液を-78℃で撹拌しながら、それに、無水テトラヒドロフラン(THF, 2mL)中の2,9-ジヒドロ-アントラセン(0.1g, 0.23mmol)を滴下して加える。得られた反応混合物を、反応が完結するまで(TLC)、-50〜-60℃で撹拌する。飽和塩化アンモニウム(10mL)を添加することにより反応をクエンチし、生成物を塩化メチレンで抽出する。カラムクロマトグラフィー(シリカゲル, 40g, 90/10 塩化メチレン：MeOH)により精製して、オキサゾールで保護されている Guava pyronin 1-オキサゾール(GPO)を得る。
【０１６８】
GPOをエタノール中の3M HClで処理することにより、該オキサゾール保護基をカルボン酸に変換して、標題化合物の Guava pyronin 1 を得る。
【０１６９】
実施例１２
8-(6-エチルアミノ-3-エチルイミノ-2,7-ジメチル-3H-キサンテン-9-イル)ナフタレン-1-カルボン酸
【化３５】
2005532434.tif 000046
【０１７０】
硫酸(3mL)中の3-エチルアミノ-4-メチル-フェノール(0.3g, 2mmol)及びベンゾ[de]イソクロメン-1,3-ジオン(0.2g, 1mmol)を6時間にわたり150℃に加熱した。この反応混合物を破砕した氷に注ぎ、1時間にわたり静置し、沈澱物を濾過した。濾液を、濃水酸化アンモニウムで中和し、濃縮して、暗紫色の残渣を得た。分取用クロマトグラフィー(PLC, 1mm シリカゲル, 9/1 DCM：MeOH, 2% AcOH)により精製して、標題化合物(50mg)を得た。ABS λmax=527nm(EtOH)。
【０１７１】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、さまざまな変更が可能であること、及び、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく等価な置換が可能であることは、当業者には理解されるべきである。さらに、多くの修正が可能であり、それによって、特定の状態、材料、組成物、調製方法、調製ステップを本発明の目的、精神及び範囲に適合させることが可能である。そのような全ての修正は、本明細書に添付されている「特許請求の範囲」の範囲内にある。上記で引用した全ての特許及び刊行物は、参照により本明細書に組み入れる。
【国際調査報告】
2005532434.tif 000058
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