(57)【要約】分子データベースの検索および指向性分子ライブラリの設計において、蛋白質表面の共通の三次元の構造の表記を利用しながら、これらの共通構造の特徴を決定する方法が提供される。その方法は、特に、βターン、ループおよび接触面などの蛋白質表面の解析および表記に関する。１つの形態において、その方法は、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化されたアミノ酸側鎖の共通の位置および配向を同定する。別の形態において、その方法は、三次元空間内の格子点によって表わされる表面電荷の共通領域を同定する。更に、蛋白質の共通の三次元構造の特徴にマッチする分子を同定する目的で分子データベースを検索するために使用可能な、これらの共通の三次元構造の特徴が提供される。共通の三次元構造の特徴を用いて、新たな分子生成に取り組み、これらの共通の三次元構造の特徴を有する分子を含むライブラリを生成することもできる。その後、薬物を発見する目的で、これらの構造上関連する分子のライブラリを生成してもよい。
2005529382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の共通の三次元の表面形状を記述する方法であって、
（ｉ）複数の蛋白質それぞれの三次元の表面形状を同定する工程と、
（ｉｉ）それぞれが前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の共通の表面形状を表すような記述子を１つ以上作成する工程と
を含む方法を提供する。
【請求項２】
工程（ｉ）が、前記蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の側鎖の位置および配向を同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）において、前記記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質それぞれについて３以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、３以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の各側鎖の位置および配向が、三次元（３Ｄ）空間にある、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖が、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）が、前記２以上の蛋白質の表面の荷電領域それぞれを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）において、前記記述子のそれぞれが、前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の表面の共通の荷電領域を表す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
表面の荷電領域それぞれが、少なくとも４個の格子点によって表される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記格子点のそれぞれが、三次元（３Ｄ）空間において０．２〜２．０オングストローム離れている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記格子点のそれぞれが、三次元（３Ｄ）空間において０．５〜１．５オングストローム離れている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、３以上の蛋白質について共通の荷電した蛋白質の表面形状を表す、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記の三次元の表面形状が、前記２以上の蛋白質それぞれの構造上の特徴の少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造上の特徴が、βターン、ループもしくは接触面であるか、またはβターン、ループもしくは接触面を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記構造上の特徴が、ループもしくは接触面であるか、またはループもしくは接触面を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触面が、不連続面および連続面のうち少なくともいずれかを１つ以上含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記記述子が、βターンまたはループの４個のアミノ酸の側鎖の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記記述子が、接触面の少なくとも３個のアミノ酸の側鎖の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記記述子が、接触面の４、５、６または７個のアミノ酸側鎖についての側鎖の位置および配向を表す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛋白質の共通の三次元の表面形状を備えた１以上の分子を同定する方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す記述子を１以上用いてクエリを作成する工程と、
（ｉｉ）前記クエリを用いてデータベースを検索し、それによってそれぞれが前記記述子にマッチする１以上の分子に対応する前記データベース内の１以上のエントリーを同定する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通するアミノ酸側鎖の位置および配向を表す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）において、クエリが、
（ａ）２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通する側鎖の位置および配向を表す記述子と、
（ｂ）前記２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す記述子と、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖が、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記クエリのＣα‐Ｃβベクトルが、距離マトリックスとして表わされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分子のライブラリを作成する方法であって、
（ｉ）データベースを検索して、それぞれが蛋白質の共通の表面形状にマッチする１以上の分子に対応する１以上のエントリーを同定する工程と、
（ｉｉ）分子のライブラリを作成するために、工程（ｉ）で同定された１以上の分子のうち少なくとも１つを用いる工程と
を含む方法。
【請求項２８】
前記分子のライブラリがバーチャルライブラリである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記分子のライブラリが合成化学ライブラリである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１以上の分子を工学的に設計する方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す１以上の記述子を作成する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の記述子または記述子のそれぞれに従って、１以上の構造上の特徴をそれぞれ含む１以上の分子を工学的に設計する工程と
を含む方法。
【請求項３１】
記述子または記述子のそれぞれが、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通する側鎖の位置および配向を表す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
記述子または記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質の共通する蛋白質表面の電荷の形状を表す、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の三次元構造の共通の特徴を決定する方法、ならびに分子データベース検索、分子工学、および指向性分子ライブラリ（focussed molecular libraries）の設計において、これらの共通構造の表記を使用することに関する。特に本発明は、βターン、ループおよび接触面などの蛋白質表面の同定および表記、ならびに表面の電荷を記述する格子点の決定、またはＣα‐Ｃβベクトルとして簡素化されたアミノ酸側鎖の共通の位置および配向の決定に関する。これらの蛋白質表面は、一般に、他の蛋白質、核酸、金属イオン、抗原、薬物および毒物など（これらに限定されない）の他の分子との相互作用に関与する。従って本発明は、三次元構造の共通の特徴にマッチする（適合する）分子を同定する目的で分子データベースを検索するために利用可能な三次元構造の共通の特徴を提供する。三次元構造の共通の特徴を利用して、三次元構造について１つ以上の共通の特徴を有する新規な分子または分子ライブラリを工学的に設計することもできる。分子および分子ライブラリは、薬物を発見する上で有用となり得る。
【背景技術】
【０００２】
１０１８０種の考えられる潜在的薬物様分子の間で可能な化学的多様性は計り知れず、ある１つのコンビナトリアルライブラリは、この多様性の広がりの断片を捕らえ得るに過ぎない。分子ライブラリの設計戦略では、ライブラリ合成のための多様な分子セットを選択するために化学情報学的（ケモインフォマティクス）技術が用いられる。分子選択方法には、多数の化学記述子を用いてライブラリの各メンバーの化学的特性を計算することが含まれる。従って、分子が記述子で表現される空間（ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ  ｓｐａｃｅ）において互いに可能な限り大きく異なる「多様な（ｄｉｖｅｒｓｅ）」ライブラリ、または分子が記述子で表現される空間において既知の活性分子に類似している「指向性（ｆｏｃｕｓｓｅｄ）」ライブラリを得ることができる。多数の潜在的記述子があるため、生物学的活性を記述するために重要または不可欠な記述子を知ることは困難である。これらの手法は、結果として化学領域においてライブラリを最適化するが、生物学的機能を調節し得る分子を同定するわけではない。
【０００３】
大きなコンビナトリアルライブラリの合成は、サウンドライブラリ（ｓｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｙ）の設計原理によって誘導される場合のみ、意味を成すことが明らかとなりつつある。一般には、指向性ライブラリが、「ヒット」（即ち候補分子またはリード分子）の発見を１０〜１００倍増加させ得ると考えられている。
【０００４】
非常に多数の医薬品ターゲットが、蛋白質の他の分子との相互作用の模倣または阻害に関与する。ヒトゲノムプロジェクトの急速な進歩によって、より多くの蛋白質相互作用のターゲットが同定されると思われる。
【０００５】
蛋白質は、球状構造に折りたたまれたアミノ酸ポリマーである。この球状構造は、一般に内部が疎水性となっている。蛋白質の構造は、骨格のポリマーの性質によって定義され、へリックス、シート、ループおよびターンなどの二次構造要素を含む。蛋白質の構造について該構造のポリマー骨格（構造の「骨組」）の性質により記述することは、ある蛋白質を別のものと比較するのには有用であるが、蛋白質の様々な分子認識事象について構造上の要素を記述する場合には有用ではない。これは、分子認識が表面の現象であり、蛋白質が、平均的には５２個のアミノ酸残基に由来する２１１個の原子を含む１１５０〜４６６０Å２の範囲の大きく平坦な表面領域を使用するためである。これらの結合表面は、１〜１１個のセグメント（この場合のセグメントは少なくとも５個のアミノ酸残基で区切られ、異なる二次構造に由来するものであってもよい）を含み、相互作用面あたり平均５個
のセグメントを含む、連続面（βターンおよびループなど）でもよいし、または不連続面でもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、蛋白質表面の共通の構造要素を模倣する指向性の化合物ライブラリを作成することによって、蛋白質‐分子相互作用を模倣または阻害する分子を含むライブラリを得られる可能性が高まると考えた。
【０００７】
それ故、本発明の目的は、蛋白質表面の共通の要素を同定することにある。
更に本発明の目的は、蛋白質表面の共通の要素にマッチする１以上の分子を同定する、または新たに工学的に設計する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それ故、本発明は、分子設計、分子の工学的設計（分子エンジニアリング）および分子スクリーニングにおいて使用する蛋白質表面の記述子として、共通の蛋白質表面要素を同定することに関する。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、蛋白質の共通の三次元の表面形状を記述する方法であって、
（ｉ）複数の蛋白質それぞれの三次元の表面形状を同定する工程と、
（ｉｉ）それぞれが前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の共通の表面形状を表すような記述子を１つ以上作成する工程と
を含む方法を提供する。
【００１０】
１つの実施形態において、３つの三次元の表面形状は、前記蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の各アミノ酸側鎖の位置および配向として同定される。
この実施形態によれば、工程（ｉｉ）において前記記述子のそれぞれが、各アミノ酸側鎖の共通の位置および配向を表す。
【００１１】
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖は、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化されることが好ましい。
別の実施形態において、３つの三次元の表面形状は、各々の前記蛋白質の表面における電荷の分布として同定される。
【００１２】
この実施形態によれば、工程（ｉｉ）において前記記述子のそれぞれが、前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の表面の共通の荷電領域を表す。
表面の荷電領域それぞれは、少なくとも４個の格子点によって表されることが好ましい。
【００１３】
本発明によれば、前記２以上のアミノ酸は、前記２以上の蛋白質それぞれの構造上の特徴の少なくとも一部を形成する。
前記構造上の特徴は、βターン、ループもしくは接触面であるか、またはβターン、ループもしくは接触面を含むことが好ましい。
【００１４】
第２の態様において、本発明は、蛋白質の共通の三次元の表面形状を備えた１以上の分子を同定する方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す記述子を１以上用いてクエリを作成する工程と、
（ｉｉ）前記クエリを用いてデータベースを検索し、それによってそれぞれが前記記述
子にマッチする１以上の分子に対応する前記データベース内の１以上のエントリーを同定する工程と
を含む方法を提供する。
【００１５】
１つの実施形態では、工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通するアミノ酸側鎖の位置および配向を表す。
別の実施形態では、工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す。
【００１６】
更に別の実施形態において、クエリは、
（ａ）２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通するアミノ酸側鎖の位置および配向を表す記述子と、
（ｂ）前記２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す記述子と
を含む。
【００１７】
適切には、第２の態様に従い、前記クエリを用いて複数のエントリーを含むコンピュータ検索可能なデータベースを検索する。
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖は、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化されることが好ましい。
【００１８】
データベース検索の目的で、Ｃα‐Ｃβベクトルおよび／または表面電荷格子点を距離マトリックスとして表すことが好ましい。
第３の態様において、本発明は、分子のライブラリを作成する方法であって、
（ｉ）データベースを検索して、それぞれが蛋白質の共通の表面形状にマッチする１以上の分子に対応する１以上のエントリーを同定する工程と、
（ｉｉ）分子のライブラリを作成するために、工程（ｉ）で同定された１以上の分子のうち少なくとも１つを用いる工程と
を含む方法を提供する。
【００１９】
特別な実施形態において、この第３の態様は、同定された１以上の分子から分子のライブラリを作成する工程を工程（ｉｉ）として含む。
前記分子のライブラリは、「バーチャル」ライブラリでも合成化学ライブラリでもよい。
【００２０】
第４の態様において、本発明は、１以上の分子を工学的に設計する方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す１以上の記述子を作成する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の記述子または各記述子に従って、１以上の構造上の特徴をそれぞれ含む１以上の分子を工学的に設計する工程と
を含む方法を提供する。
【００２１】
本明細書全体を通して、他に断りがなければ、「含む」および「含んでいる」は、排他的にではなく包括的に用いられ、よって記載された整数または整数群は、他の記載されていない整数または整数群を１以上包含してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、蛋白質表面の荷電したパッチまたは領域をクラスタリングすること、ならびに蛋白質の連続面および不連続面の側鎖をクラスタリングして個別のモチーフにすることを記載している。これらのモチーフを「記述子」として用いて、蛋白質の特異的な共通の形状を模倣する分子を設計する。これは、これらの共通の蛋白質モチーフを、バーチャル
ライブラリのバーチャルスクリーニング、ならびに新たな分子設計および分子の工学的設計におけるスクリーンとして用いることによって実行される。このアプローチによって、蛋白質の共通な形状を模倣する分子が発見される。蛋白質の形状を模倣する個々の分子または分子ライブラリの合成によって、蛋白質の機能を調節し得る生物学的活性を有する分子の発見につながることになろう。これに関連して、これらのモチーフまたは記述子を用いて、広大な化学領域から蛋白質の共通な形状にマッチする分子を選択する。
【００２３】
分子認識に用いられる蛋白質の共通の構造上の特徴を定義するために、本発明者らは、側鎖の位置および配向に基づき、そして蛋白質間相互作用の領域など蛋白質表面の荷電したパッチまたは領域の形状に基づいて、蛋白質構造を記述する新しい分類システムを導き出した。特に本発明者らは、βターンおよびループの側鎖の配置（これらは分子認識に主に関与する）だけでなく、接触面の側鎖の配置を定義することにも注力してきた。
【００２４】
それ故、本発明によって、蛋白質の共通モチーフが同定され、同モチーフが分子設計において記述子として使用される。蛋白質の形状を模倣する分子のライブラリは、ハイスループットスクリーニング法を用いた生物学的活性を有する分子の発見に有用なはずである。これらのライブラリは、新規薬物の発見の基盤をなすであろう。
【００２５】
本明細書で用いられる「蛋白質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野でよく理解されているとおり、Ｄ‐またはＬ‐アミノ酸でも、天然および非天然アミノ酸でもよい。化学的に修飾および誘導されたアミノ酸も、当該技術分野でよく理解されているとおり、本発明によって考慮される。
【００２６】
「ペプチド」は、５０個未満のアミノ酸を含む蛋白質である。
「ポリペプチド」は、５０個以上のアミノ酸を含む蛋白質である。
本明細書で用いられる「蛋白質の表面形状」とは、アミノ酸側鎖の位置および配向によって、または表面の電荷分布によって記述され得るような、蛋白質表面の任意の三次元の特性または特徴である。
【００２７】
１つの特別な実施形態において、特性および特徴とは、ある蛋白質の２以上のアミノ酸それぞれについての三次元の側鎖の位置および配向である。
別の特別な実施形態において、特性または特徴とは、ある蛋白質の１以上の表面領域についての三次元の電荷分布である。
【００２８】
適切には、蛋白質の表面形状とは、蛋白質の構造上の特徴であるか、蛋白質の構造上の特徴を含むか、または蛋白質の構造上の特徴から誘導されたものである。そのような構造上の特徴は、例えば、他の蛋白質や、あるいは核酸、ヌクレオチドもしくはヌクレオシド（例えばＡＴＰまたはＧＴＰ）、炭水化物、糖蛋白質、脂質、糖脂質または小さな有機分子（例えば薬物または毒物）など（これらに限定されない）他の分子と相互作用する接触面であってもよい。それ故、例をあげれば、ドメインは、レセプターのリガンド結合ドメイン、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、蛋白質キナーゼのＡＴＰ結合ドメイン、シャペロニンまたは他の蛋白質折りたたみ酵素および／もしくは転位酵素、レセプター二量体化ドメイン、あるいはＳＨ２、ＳＨ３およびＰＤＢドメインなどの他の蛋白質相互作用ドメインであってもよいが、当業者には理解されるとおり、本発明はこれらの特定の例に限定されない。
【００２９】
蛋白質の構造上の特徴には、ループ、βターンまたは他の接触面、へリックス領域、伸長領域（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）および他の蛋白質ドメインが含まれうる。
好ましい構造上の特徴は、ループ、βターンまたは他の接触面の形態である。
【００３０】
より好ましい構造上の特徴は、ループおよび接触面である。
本明細書で用いられる「接触面」は、他の蛋白質など他の分子と接触または相互作用するアミノ酸残基を有する蛋白質表面である。接触面の例は、サイトカインレセプターのリガンド結合表面であるが、これに限定されない。
【００３１】
接触面は、１以上の不連続面および／または連続面で構成されていてもよい。
「不連続な蛋白質表面（蛋白質の不連続面）」とは、アミノ酸残基が非連続的である蛋白質表面、または連続するアミノ酸残基のグループの隣接しないグループ内に存在するような蛋白質表面を意味する。
【００３２】
これに関して、当然ながらβターンおよびループは「連続した蛋白質表面（蛋白質の連続面）」の例である。即ち、連続的なアミノ酸配列を含む蛋白質表面である。
本発明によれば、各アミノ酸側鎖の３Ｄ空間での位置および配向がＣα‐Ｃβベクトルとして簡素化されることが好ましい。
【００３３】
１つの実施形態において、「記述子」は、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸に由来する、３Ｄ空間における共通または少なくともトポグラフィックに関連するアミノ酸側鎖の位置および配向の表記である。典型的には、記述子は、２以上のβターン、ループ、蛋白質接触面、ヘリックスまたは他の構造上の特徴から得られるＣα‐Ｃβベクトルのクラスタに相当する。クラスタは、本質的には共通の３Ｄトポグラフィを備えたβターン、ループまたは蛋白質接触面のグループ化である。クラスタは、βターン、ループまたは蛋白質接触面の構成的Ｃα‐Ｃβベクトル間の類似性および／または非類似性を比較する任意のアルゴリズムによって作成されうる。クラスタリングアルゴリズムの例は、本明細書において後に詳細に示す。
【００３４】
別の実施形態において、「記述子」は、２以上の蛋白質の１以上の表面領域にわたる、１以上の共通の三次元電荷分布の表記である。
この実施形態によれば、前記記述子が４個以上の格子点を表すことが好ましい。
【００３５】
各格子点は、三次元（３Ｄ）空間で０．２〜２．０オングストローム離れていることが好ましい。
特別な実施形態において、各格子点は、三次元（３Ｄ）空間で０．２、０．５、１．０、１．２、１．５または２．０オングストローム離れている。
【００３６】
同様に当然のことであるが、格子点の寸法を必要に応じて先に引用した範囲内で修正してもよい。例えば、蛋白質間相互作用に著しく影響する蛋白質領域を、比較的詰まった、空間的により近接した格子点で表してもよい。逆に、蛋白質間相互作用への影響が少ない蛋白質表面領域を、比較的少ない（ｌｏｓｓｅｒ）空間的により離れた格子点によって表してもよい。
【００３７】
さらに当然のことであるが、特定の実施形態において、共通の表面形状の記述子は、表面形状の「平均値（ｍｅａｎ）」、「メディアン」および「モード」を含む、表面形状の「平均（ａｖｅｒａｇｅ）」の形態であってもよい。
【００３８】
共通の表面形状は、表面形状の「平均値」であることが好ましい。
本明細書で既に記載したとおり、好ましくはＣα‐Ｃβベクトルとして簡素化される３Ｄ空間における側鎖の位置および配向には、前記βターン、ループまたは接触面それぞれについて少なくとも２個のアミノ酸を必要とする。
【００３９】
１つの実施形態において、βターンまたはループの４個のアミノ酸の側鎖の位置および
配向が必要である。
別の実施形態において、接触面には、少なくとも３個のアミノ酸の側鎖の位置および配向が必要である。
【００４０】
特別な実施形態において、接触面には、４、５、６または７個のアミノ酸の側鎖の位置および配向が必要である。
場合によっては、記述子は、プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）などのソースデータベースから抽出された蛋白質の構造情報から作成される。そのような場合、他の蛋白質に対する相同性が比較的低い（例えば２５％以下の）非相同的な蛋白質鎖のみが用いられることが好ましい。これによって、相互に軽微な変形物である複数の構造体がソースデータベース内に存在することに起因する偏った標本抽出が減少する。
【００４１】
別の場合において、記述子は、新たに生じた蛋白質の構造情報から作成されても、またはＸ線結晶学もしくはＮＭＲによる蛋白質３Ｄ構造の測定から作成されてもよい。
前述の観点から、本発明は、共通のアミノ酸側鎖の位置および配向に従って蛋白質を分類し、それによって蛋白質表面の共通する空間的要素の表記を得るものと理解されよう。
【００４２】
以後に一層詳細に記載するとおり、本発明者らは今日までに、高頻度で生じ分子データベースのスクリーニングおよびライブラリの設計に有用となり得る少なくとも９個のβターン、３９個のループ、および２４０個の蛋白質接触面を同定した。
【００４３】
データベース検索の目的では、データベースのエントリーとしてであれクエリとして、つまり
（Ａ）距離マトリックスとして；
（Ｂ）各Ｃα‐Ｃβベクトル間に形成される二面角（δ）として；
（Ｃ）各Ｃα‐Ｃβベクトル間に形成される角ａ１およびａ２として
であれ、Ｃα‐Ｃβベクトルの適切な表記のために多数のオプションが用いられる。
【００４４】
これらの表記の説明は、ラウリおよびバートレット（Ｌａｕｒｉ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ）５６の文献によって、そして国際公開第００／２３４７４号パンフレットに示されている。
【００４５】
Ｃα‐Ｃβベクトルの好ましい表記は、距離マトリックスとしての表記である。
表面電荷の格子点の好ましい表記も、距離マトリックス表記であることも理解されよう。
【００４６】
コンピュータ検索可能なデータベースは、プロテインデータバンク、ケンブリッジ結晶構造データベース（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、ブルックヘブンデータベース（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）など既存のデータベースであってもよいし、または新たに構築されたデータベースであってもよい。データベース検索の目的においては、エントリーは、蛋白質、ペプチド、または他の有機分子を表す形態であってもよい。検索可能な蛋白質データベースのエントリーは、構成的アミノ酸側鎖の荷電表面またはＣα‐Ｃβ簡素化の形態であることが好ましい。検索可能なデータベースが非蛋白質の有機分子を含む場合（ケンブリッジ結晶構造データベースなど）には、エントリーは典型的には、特定の原子または原子団（例えば、特定の炭素、窒素および酸素原子など）の電荷表面または３Ｄ座標によって表されてもよい。
【００４７】
適切には、コンピュータプログラムがデータベース検索に用いられる。
前記コンピュータプログラムは、国際公開第００／２３４７４号パンフレットに記載の
ようなＶＥＣＴＲＩＸプログラムであることが好ましい。
【００４８】
それ故、当然ながら本発明のデータベース検索法は、蛋白質の共通の表面形状を模倣する１以上の分子、または前記分子の一部の同定を可能にするものである。その後、これらの分子を用いて、蛋白質の共通の表面形状を模倣するのにより適した分子を選択することによって、着目してきたバーチャル化学ライブラリまたは合成化学ライブラリを構築してもよい。
【００４９】
本発明がより適切に理解され、実践効果が得られるように、当業者を対象として以下の非限定的実施例を示す。
【実施例】
【００５０】
１．βターンのクラスタリング
１．１  背景
蛋白質構造は、鎖の方向を逆転させ得るターンによって連結された、二次構造（ヘリックスまたはβシート）のストレッチを含む。これらのターンは通常蛋白質の表面に位置し、球状の蛋白質内部の形成を可能にする１。βターン２〜４は、よりきつく巻かれたγターンやより緩く巻かれたαターンよりも一般的であり、ｃαｉとｃαｉ＋３との距離が７Å未満で、中央の残基がヘリックス状でない、ポリペプチドの４残基セグメントとして定義された５。βターンは、蛋白質中の残基の２５％を含み６、蛋白質およびペプチドの機能にとって重要であり２、７〜９、蛋白質の折りたたみの際の重要な駆動力である２、１０、１１。その結果、βターン擬似物質の設計および開発に関する数多くの研究が行われてきた７、１２〜２２。
【００５１】
分子認識において側鎖の空間的配置が重要であるにも関わらず、βターンのコンホメーションは、現在のところ、主鎖の二面角φおよびψに関して分類されている３、５、２３〜２５。βターンのこの分類は極めて有用であり、ペプチド擬似物質を設計するために広く用いられてきたが、ほとんど機能的意味をなさない。現在の分類における各タイプのβターンは、側鎖の空間的配置の２以上のクラスタを有することができ、異なる種類のβターンが同じ側鎖の空間的配置を有することができる。側鎖の配置に基づくβターンの分類に関する報告が２例あった２６。ボール（Ｂａｌｌ）らの文献のβ記述子は、ターンについて幾つかの全体的な構造上の特性を定義しているが、側鎖の潜在的な４つの位置のうち２つしか考慮しておらず、１５４の実験で得られたβターンのごく小規模なデータセットしか用いられていないため、明らかに単純化しすぎている。ガーランドおよびディーン（Ｇａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｄｅａｎ）２８、２９は、側鎖のコンホメーションを階層的にクラスタリングすることによって、βターンの４つのサブセットであるｃα原子ダブレット（ｃα  ａｔｏｍ  ｄｏｕｂｌｅｔ）、ｃα原子トリプレット（ｃα  ａｔｏｍ  ｔｒｉｐｌｅｔ）、ｃα‐ｃβベクトルダブレットおよびｃα‐ｃβベクトルトリプレットについて共通モチーフを発見した。しかし、このクラスタリングは実験データに基づいておらず、１１個の理想的βターンのタイプそれぞれからダブレットまたはトリプレットを選択する全ての可能な組合せに基づくものであった。その上、ガーランドおよびディーン２８、２９が実施したように、模倣のためにβターンのサブセットを明確に同定する必要はない。これは、その後ガーランドおよびディーンによって考案されたより洗練された検索アルゴリズム３０を用いれば、これらのサブセットをβターン全体から得ることが可能なためである。
【００５２】
１．２  方法
１．２．１  βターンのクラスタリング
１．２．１．１  プロテインデータバンク（ＰＤＢ）からのβターンの抽出
蛋白質に存在するβターンの共通モチーフを決定するには、高分解能かつ冗長でないβ
ターンのデータベースが必要である。高品質データを保証するために、１９９７年にリリースされたプロテインデータバンク３１から分解能≦２Å、Ｒ係数（Ｒ  ｆａｃｔｏｒ）≦２％の高分解能の構造のみを抽出した。更に、特定の蛋白質鎖の軽微な変形物である複数の構造が存在することに起因するＰＤＢ内の偏った標本抽出をなくすために、他の蛋白質鎖との相同性が≦２５％の非相同的な蛋白質鎖のみを用いた。その結果得られた、３９８４個のヘリックスでもβシートでもない４残基セグメントのｃα１‐ｃα４間距離の分布を図１にプロットしているが、ｃα１‐ｃα４間距離が５．５Åのときに大きなピークが観察される。１９７３年、ルイス（Ｌｅｗｉｓ）２４は、Ｘ線回折により測定したわずか８個の構造に関するｃα１‐ｃα４間距離の分布に基づいて、βターンのｃα１‐ｃα４間距離は≦７Åであると結論付けた。ノイズのあるデータによって生じ得るあらゆる偏りを除去するために、ｃα１‐ｃα４間距離が５Å未満または６．２Åを超えるターンを排除することによって、５．５Åの主ピークの外縁（ｏｕｔｌｉｎｅｒｓ）を除去すると、データベースのβターンが２６７５個となった。
【００５３】
１．２．１．２  データの表記
本発明者らは、ｃα‐ｃβベクトルを用いたクラスタリングに非常に力を入れている。ｃα‐ｃβベクトルは、側鎖の幾何学的構造（ジオメトリー）の開始を表しており、側鎖が骨格につながれていることが実験的に十分定義されている。これは、端から２番目のよりフレキシブルな側鎖原子とは対照的である。重要なこととしては、最も模倣的な戦略には、ｃα‐ｃβ結合を非ペプチドのスカフォールドにつなぎ、側鎖の余分な原子が分子認識においてある程度のフレキシビリティを付与するようにすることがある。それ故、同定されたモチーフを用いて特定のモチーフにマッチする分子を設計する目的においては、ｃα‐ｃβベクトルによるクラスタリングが機能的に重要であると考えられる。
【００５４】
グリシン以外の２０種の天然アミノ酸それぞれは、中心のα炭素と側鎖のβ炭素との共有結合によるｃα‐ｃβベクトルを有している。グリシンを含むβターンについては、グリシン残基をアラニンに変異させて必要なｃα‐ｃβベクトルを生じる。これは、仮想のアラニン構造をグリシン残基のｎ、ｃαおよびｃ’原子に重ね合わせることによって実行される。
【００５５】
カルテシアン空間３０、３２よりもむしろ距離空間に位置する原子間の関連性について３Ｄ構造を表すことによって、データベース検索が大きく進歩した。距離空間における位置は原子間距離によって定義され、距離マトリックスの形式で表される。それ故、距離マトリックスは座標とは独立しており、カルテシアン座標の使用が必要であるなど、特定の基準系に制約されることなく、距離マトリックス間を比較することができる。重要なことは、原子の配置とその鏡像が同一の距離マトリックスによって記載されることを強調することである。根二乗平均変位（ＲＭＳＤ）を用いて、このあいまいさを軽減することができる。各βターンの４つのｃα‐ｃβベクトルは、カルテシアン座標系よりもむしろ距離マトリックスによって表わされる。ｃα‐ｃβベクトルの各組の間に４つの距離対があり（ｃα１‐ｃα２、ｃα１‐ｃβ２、ｃβ１‐ｃα２およびｃβ１‐ｃβ２）、ｃα‐ｃβベクトルの考えられる組が６組（１‐２、１‐３、１‐４、２‐３、２‐４および３‐４）あるため、βターンの３Ｄトポグラフィを表すには２４個の距離が必要である。ｃαi ‐ｃβｉ間の結合距離は、用いた非結合距離に比較するとβターン間では比較的不変であるため、これらの距離は含めなかった。
【００５６】
１．２．１．３．  ｋth最短距離法
βターンをクラスタリングするためにここで用いたｋth最短距離クラスタリングアルゴリズム３３、３４は、基本的に単連結クラスタリングアルゴリズム３５であり、同アルゴリズムでは最初に各メンバーを異なるクラスタに割り当て、次にあるクラスタのメンバーと別のクラスタのメンバーとの間の最小距離がある閾値よりも小さければクラスタをマー
ジする。ｋth最短距離クラスタリングアルゴリズム３３、３４は、メンバー間の距離を以下に定義する非類似度（ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅａｓｕｒｅ）で置き換えるという点において単連結クラスタリングアルゴリズムとは異なる。
【００５７】
ｄｋ（ｘ）を、観察点ｘからｋth最短観察点までのユークリッド距離と定義する。ｖｋ（ｘ）を、観察点ｘを中心とし、ｄｋ（ｘ）を半径とする球に囲まれた容積と定義する。観察点ｘでの密度ｆ（ｘ）を、ｋ／ｖｋ（ｘ）／Ｎ（ここで、Ｎは観察点の総数である）と定義する。観察点ｘｉとｘｊとの非類似度Ｄ（ｘｉ，ｘｊ）は、以下の定義から計算することができる。最初に、ｘｉとｘｊとのユークリッド距離がｄｋ（ｘｉ）またはｄｋ（ｘｊ）よりも小さい場合、ｘｉとｘｊは隣接しているとする。観察点ｘｉと観察点ｘｊとが隣接していなければ、非類似度Ｄ（ｘｉ，ｘｊ）を無限大と設定する。あるいはＤ（ｘｉ，ｘｊ）を、その密度の逆数の平均、即ちＤ（ｘｉ，ｘｊ）＝（１／ｆ（ｘｉ）＋１／ｆ（ｘｊ））／２と定義する。クラスタリングにより、低密度の領域によって分離された高密度の領域を同じグループに分類しなければならない。有効には、非類似度をその密度の逆数と定義することによって、このアルゴリズムは、隣接する点または高密度のクラスタを第１に同じグループに分類する。
【００５８】
市販のＳＡＳ／ＳＴＡＴプログラム３６のｋth最短距離アルゴリズムを用いて、βターンのｃα−ｃβベクトルのトポグラフィを表す距離マトリックスをクラスタリングした。オプション「ｋ」は、平滑化パラメータと呼ばれている。「ｋ」の値が小さいとばらつきのある（ｊａｇｇｅｄ）密度推定値となりクラスタが多くなるが、「ｋ」の値が大きいと滑らかな密度推定値となりクラスタ数が少なくなる。ここではクラスタの大まかな推定のみが必要なので、「ｋ」値２を用いた。ここで得られたクラスタを、以下に記載する最短距離重心ソートフィルタアルゴリズム（filtered nearest centroid-sorting algorithm ）の初期シードとして用いている。
【００５９】
１．２．１．４  最短距離重心ソートクラスタリングフィルタアルゴリズム
フォルギー（Ｆｏｒｇｙ）による最短距離重心ソートクラスタリングアルゴリズム３７、３８は、幾つかの初期シードの予備推定を必要とする。アルゴリズムによって各観察点を最短距離初期シードに割り当てて、仮のクラスタを形成させる。その後、シードを仮のクラスタの平均値に置き換え、その工程をクラスタの変動が生じなくなるまで繰り返す。βターンをｋth最短距離法でクラスタリングした後、最短距離重心ソートアルゴリズム３７の改良形態である最短距離重心ソートクラスタリングフィルタアルゴリズムを用いて、クラスタリングの精度を上げる。この方法をカルテシアン座標空間での観察に重ね合わせ、それによってｋth最短距離平均クラスタリングアルゴリズムにおける距離マトリックス表記に由来する鏡像の問題を取り除く。このように２段階のクラスタリング方法とする理由は：１）観察点の数がＳＡＳ／ＳＴＡＴプログラム３６により設定された限界よりも多いため、ＲＭＳＤに基づく階層的クラスタリングを最初の部分で用いることができないこと、ならびに、２）最短距離重心ソート法３７、３８またはＫ平均クラスタリングアルゴリズム３９などのより迅速かつ無駄のない近似法は、初期シードの予備推定を行わずに用いることができないこと、である。
【００６０】
平均構造に対するβターンの最小ＲＭＳＤが、何らかの定義可能な閾値を超えていると、そのターンがあまりに離れていると判断されて仮のクラスタに割り当てられないことを除けば、最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムは、最短距離重心ソートアルゴリズムと基本的に同じである。最短距離重心ソートアルゴリズムを繰り返す際、これらの当てはまらなかったターンを新しい仮のクラスタの新しい平均構造に重ね合わせ、最小ＲＭＳＤが閾値未満ならばそれらを新しい仮クラスタに割り当てる。このフィルタリングの目的は、平均が偏らないように、平均構造と非常に異なるターンを除去することにある。更に、βターンの１００％がクラスタリングを必要とするのではなく、大部分が必要としている
ということにすぎない。最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムは、「ｆｎｃｓａ＿ｃｌｕｓｔｅｒ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｐｐ」という名のＣ＋＋プログラムで実行した。
【００６１】
１．２．２  クラスタ解析
１．２．２．１  βターンのベクトルプロット
βターンのトポグラフィを表現する２４個の距離を視覚化するのは困難である。ベクトルプロットを用いれば、４個のねじり角θ１、θ２、θ３およびθ４により２４個の距離を近似化することによって視覚化が促される（図２参照）。θ１を、ｃβ１、ｃα１、ｃα２およびｃβ２の間のねじり角と定義する。θ２をｃβ２、ｃα２、ｃα３およびｃβ３の間のねじり角と定義し、θ３をｃβ３、ｃα３、ｃα４およびｃβ４の間のねじり角と定義し、θ４をｃβ１、ｃα１、ｃα４およびｃβ４の間のねじり角と定義する。βターン内で隣接するｃα原子間の距離はペプチド結合の性質により比較的一定しているため、４つのねじり角はβターンのコンホメーション上の本質的な特徴を表しているはずである。４つのねじり角を、（θ１，θ２）（記号「ｘ」で表す）から（θ３，θ４）までのベクトルとしてプロットする。有効には、このプロットによりβターンの２４個の距離が４つのねじり角（θ１、θ２、θ３およびθ４）に近似され、それらが２Ｄグラフ上のベクトルとしてプロットされる。ねじり角は、周期性がある。ｘの値は、ｘ−３６０、ｘ＋３６０などとなる。ねじり角の周期性という性質に関連するグラフ化の問題を除くために、各ねじり値を最初のβターンのねじり角に最も近い周期に変換する。
【００６２】
１．２．２．２．  βターンクラスタの視覚化
βターンのクラスタを視覚化する別の方法は、全てのターンの３Ｄ構造を１つのクラスタに重ね合わせることである。βターンの４つのｃα‐ｃβベクトルからクラスタの平均構造の４つのｃα−ｃβベクトルに重ね合わせる。グリシンについては、標準的なアラニン残基をグリシン残基の骨格のｎ、ｃαおよびｃ’原子に重ね合わせることによって、ｃα−ｃβベクトルを得る。「ｆｎｃｓａ＿ｃｌｕｓｔｅｒ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｐｐ」プログラムは、重ね合わせた構造の座標を多重構造ｐｄｂファイル形式（ｍｕｌｔｉ‐ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｄｂ  ｆｉｌｅ  ｆｏｒｍａｔ）で出力し、該形式はモレキュラー・シミュレーション社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ）のＩｎｓｉｇｈｔＩＩというプログラムを用いて視覚化される。
【００６３】
カルテシアン座標空間におけるクラスタの平均の計算には、数段階ある。最初に、クラスタの初期の平均構造を、グリシンまたはプロリン残基を含まない最初のβターンになるように設定する。その後、各βターンを、ｃα‐ｃβベクトルの座標に基づいてこの仮の平均構造に重ね合わせる。重ね合わせた後、ｘ、ｙおよびｚ座標を平均することによって、新しい仮の平均構造を算出する。連続的な平均構造の違いが任意の閾値よりも小さくなるまで、後の２段階を繰り返す。
【００６４】
１．２．２．３  クラスタ全てのＲＭＳＤマトリックスの計算
ＲＭＳＤマトリックスを計算して、クラスタ内およびクラスタ間の非類似度を評価することによってクラスタリングのパフォーマンスを検討する。各クラスタを別のクラスタそれぞれと比較し、マトリックスの行および列の番号でクラスタ番号を表す。クラスタｘ内のβターン全てをクラスタｙの平均構造に重ね合わせる場合、行ｘおよび列ｙのセルの値は、平均ＲＭＳＤを表す。行ｘおよび列ｘのマトリックスの項はクラスタ内ＲＭＳＤを表し、他のセルはクラスタ間ＲＭＳＤを表す。行ｘおよび列ｙの値は、クラスタｙの平均構造に重ね合わせたクラスタｘ内のβターンの平均ＲＭＳＤを表し、行ｙおよび列ｘの値は、クラスタｘの平均構造に重ね合わせたクラスタｙ内のβターンの平均ＲＭＳＤを表すため、行ｘおよび列ｙの値が必ずしも行ｙおよび列ｘの値に類似しているわけではない。しかし、２つの数値は非常に類似している。
【００６５】
１．３  結果
１．３．１  クラスタリング
ｋth最短距離クラスタリングアルゴリズムを用いて、データベースの２６７５個のβターンをクラスタリングした。βターンのトポグラフィを表す２４個の距離それぞれを平均化することによって、得られた５７０個のクラスタそれぞれの平均構造（シード）を計算した。２回目のサイクルで、これらの５７０個のシードのｋth最短距離クラスタリングを実施し、１１７個のシードを得た。ｋth最短距離クラスタリングの３回目のサイクルで、２５個のシードを作成し、４回目のサイクルで７個のシードを作成した。最終的なβターンクラスタを選択する前に、その７個と２５個の両方のシードを詳細に検討した。
【００６６】
最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムで用いた閾値の妥当な値を決定するために、４つの異なる閾値、ＲＭＳＤ＝０．６、０．６５、０．７および無限大（閾値が全くない）を用いた重心ソートフィルタアルゴリズムを用いて、ｋth最短距離クラスタリングから得た７個のシードを詳細に調べた。結果は、閾値が低くなるほど、棄却される（クラスタに割り当てられない）βターンの割合が高くなることを示している。４つの閾値における棄却の割合は、それぞれ１９％、１４％、８％および０％である。結果のＲＭＳＤマトリックスを計算すると、平均クラスタ間ＲＭＳＤの平均値はそれぞれ、１．０５、０．９５、１．０３および１．１５である。理想的には、できる限り大きく異なるクラスタ、つまりクラスタ間ＲＭＳＤが高いクラスタを得たい。平均クラスタ間ＲＭＳＤは、閾値が無限大から０．７に、さらに０．６５になるに従って低下したが、０．６５から０．６になるに従って上昇した。平均クラスタ内ＲＭＳＤの平均値はそれぞれ、０．３６、０．３６、０．４および０．４４である。この例では、低いクラスタ内ＲＭＳＤが好ましく、つまり各クラスタ内での観察が類似していることが強調される。閾値が無限大から０．７に、そして０．７から０．６５になるに従ってクラスタ内ＲＭＳＤが改善された。しかし、閾値が０．６５から０．６になる際には改善されなかった。棄却の割合、クラスタ間ＲＭＳＤおよびクラスタ内ＲＭＳＤという対立する問題の妥協点として、０．６５というフィルタ閾値を選択した。
【００６７】
ｋth最短距離クラスタリングの３回目のサイクルの２５個のシード、または４回目のサイクルの７個のシードが、βターンの側鎖空間配置を最良に表しているかどうかを判定するために、両方の結果を重心ソートフィルタアルゴリズムにかけてからＲＭＳＤマトリックスを計算した。７個のクラスタのＲＭＳＤマトリックスを、表１に示している。クラスタリング処理は、高いクラスタ間ＲＭＳＤによって分離された低いクラスタ内ＲＭＳＤを有するクラスタを定義するためのものである。２５個のクラスタでは、平均クラスタ内ＲＭＳＤの平均値は０．３１、平均クラスタ間ＲＭＳＤの平均値は１．１１、最大平均クラスタ内ＲＭＳＤは０．４２である。７個のクラスタでは（表１）、平均クラスタ内ＲＭＳＤの平均値は０．３６、平均クラスタ間ＲＭＳＤの平均値は０．９５、最大平均クラスタ内ＲＭＳＤは０．４９とわずかに高い。結果から、７個のクラスタへのクラスタリングは２５個のクラスタへのクラスタリングほど良好でなく、クラスタ内ＲＭＳＤがより大きく（０．３１に比較して０．３６）、クラスタ間ＲＭＳＤがより小さかった（１．１１に比較して０．９５）ことが示されている。しかし、これは大幅な違いではなく、７個のクラスタはなお妥当なクラスタ内ＲＭＳＤを与えるため、２５個のクラスタ結果よりも扱いやすい７個のクラスタ結果が好適とした。
【００６８】
１．３．２  クラスタリングの微調整
方法の節に記載したとおり、ベクトルのグラフを用いて、７個のクラスタの結果を視覚化した（図３）。この図は、クラスタ３を除く全てのクラスタが単一モードの妥当な均一分布を有することが示している。しかし、クラスタ３は、２つのモードを有しているようである。１つのモードはθ４≧７０°であり、もう一方のモードはθ４＜７０°である。その上、表１のＲＭＳＤマトリックスは、クラスタ３が０．４９という最も変動したクラ
スタ内ＲＭＳＤを有することを示している。クラスタ３を１つのクラスタとして残すべきか、あるいは２個のクラスタに分割すべきかを決定するために、クラスタ３を２個のクラスタ（θ４≧７０°の１つのクラスタと、θ４＜７０°のもう一方のクラスタ）に実際に分割する工程を用いて、新たな結果を元の結果と比較して評価した。最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムを用いて、得られた８個のクラスタを再度微調整した。新しい８個のクラスタのＲＭＳＤマトリックスおよびベクトルプロットを計算して、結果をそれぞれ表２および図４に示している。クラスタ３を２個のクラスタに分割する際に、平均クラスタ内ＲＭＳＤは有意に変動せず（０．３６から０．３５へ）、最大クラスタ内ＲＭＳＤは０．４９から０．４３に改善され、最小クラスタ内ＲＭＳＤは０．３１から０．２９に改善され、平均クラスタ間ＲＭＳＤは０．９５から０．９３に変動し、最終的にクラスタによって表されたターンの割合は同じ８６％のままであった。図４のベクトルプロットは、各クラスタのβターンが、ほぼ単一モードの狭い範囲内に分布することを示している。これらの結果から、８個のクラスタ系は、７個のクラスタ系に比較してβターンモチーフをより良好に表現することが示唆された。
【００６９】
タイプＩ’のβターンは８個のクラスタのいずれにも含まれないことが観察され、最短距離重心ソートフィルタクラスタリング（filtered nearest centroid sorting clustering）で棄却された。というのも、８個のクラスタの平均でのＲＭＳＤは、閾値０．６５を超えていたためである。ｋth最短距離平均アルゴリズムは低頻度のタイプＩ’のβターン近隣のシードを同定しないため、この観察は、ｋth最短距離クラスタリングアルゴリズムの弱点を反映している。図９は、タイプＩ’のβターンの近隣にクラスタが存在することを示しているため、タイプＩ’の平均を計算して、結果を最短距離重心ソートフィルタクラスタリングのために他の８個の初期シードと一緒に含めた。新たな９個のクラスタのＲＭＳＤマトリックスおよびベクトルプロットを計算して、結果をそれぞれ表３および図５に示している。タイプＩ’の平均構造を初期シードに付加することによって、平均クラスタ内ＲＭＳＤは有意に変化せず（０．３５から０．３６へ）、最小および最大クラスタ内ＲＭＳＤが同一のままで、平均クラスタ間の値は悪化し（１．２５から１．１へ）、分類されたβターンの割合は８６％から９０％に改善した。図５のベクトルプロットによって、各クラスタ内のβターンが、ほぼ単一モードの狭い範囲内に分布することが示される。これらの結果から、９個のクラスタ系がβターンモチーフの妥当な表現であることが示唆される。
【００７０】
１．３．３  平均構造
クラスタ内の各βターンをクラスタの平均構造に重ね合せることによって、最終的な９個のクラスタの結果も視覚化した（図６）。視覚的結果は、表３の各クラスタの平均クラスタ内ＲＭＳＤ値と一致していた。ｃα‐ｃβベクトルの広がり（ｓｐｒｅａｄ）が最も小さいクラスタ（クラスタ２、図６）は、最小平均クラスタ内ＲＭＳＤに相当する。骨格構造が有意に変動し得るがｃα‐ｃβベクトルがクラスタ内で均一であることは興味深い。最も均質なクラスタ、例えばクラスタ２の上面図は、異なる骨格コンホメーションが類似のｃα‐ｃβベクトル空間配置を有し得ることを示している（図７）。この例では、タイプＩおよびタイプＩＩのβターンが同じｃα‐ｃβベクトル空間配置を表している。クラスタ間の差を評価するために、各クラスタの平均構造を、ｃα１、ｃα２およびｃα３原子を基にして重ね合わせた。この重ね合わせの結果を、図８に示している。図３の最も低いクラスタ間ＲＭＳＤ（０．５９）は、クラスタ２とクラスタ４の間にある。図８の結果も、クラスタ２（赤色）とクラスタ４（緑色）が最も類似していることを示しており、さらに、クラスタ間ＲＭＳＤ値が０．５９であることの意味を理解することについての視覚的助けとなっている。最高のクラスタ間ＲＭＳＤ（２．３８）は、クラスタ６および９の間に存在する。図８の結果も、クラスタ６（紺青色）およびクラスタ９（灰色）が有意に異なることを示している。
【００７１】
そうして、各クラスタの平均項目が、データベース検索方法のクエリになる。これは、第４節に更に詳しく記載している。
２  蛋白質のループのクラスタリング
２．１  背景
ループは、二次構造の要素（ヘリックスおよびシート）を連結する任意の連続アミノ酸配列と定義される。従って、ｃα１‐ｃα４の距離についての制約はない（先に記載した通り）ので、ループはβターンの上位集合である。リガンド結合４０、ＤＮＡ結合４１、毒性蛋白質への結合４２、酵素活性部位の形成４３、金属イオンの結合４４、免疫グロブリンによる抗原の結合４５、モノヌクレオチドの結合４６およびセリンプロテアーゼによる基質蛋白質の結合４７における役割に例示されるとおり、ループは重要な機能を果たすことが多い。共通のループモチーフを同定し、その後バーチャルライブラリのバーチャルスクリーニングの戦略におけるクエリとしてこれらを用いることによって、生物活性分子の設計および合成について新規で強力な戦略が得られるであろう。
【００７２】
２．２  方法と結果
２．２．１  プロテインデータバンクからのループの抽出
最初に、プロテインデータバンクの１９９９年リリース版３１から、十分に微調整され（分解能≦２．０ÅおよびＲ係数≦２０％）、非相同的な（≦２５％）蛋白質鎖４８、４９を抽出することによって、ループのデータベースを作成した。その後、プログラムＳＴＲＩＤＥ５０を用いて、これらの鎖の二次構造の要素（ヘリックスおよびシート）を同定した。これらの二次構造の要素または蛋白質の末端を連結する残りの残基として定義される連結領域を用いて、更に分析した。４個以上のアミノ酸残基で構成された連結領域を、４残基のセグメントに分割すると、総数２３６５０個の４残基ループが得られた。骨格原子ｎ、ｃαおよびｃ’間の距離が適切でない（≦０．８または≧２．０Å）という理由で、それらのループのうちの３１９個を外した。その後、残りの２３３３１個のループそれぞれを、４つのｃα‐ｃβベクトルに簡素化した（図２ａ）。我々は、ｃα‐ｃβベクトルを用いたクラスタリングに非常に力を入れている。ｃα‐ｃβベクトルは、側鎖の幾何学的構造（ジオメトリー）の開始を表しており、骨格につながれていることが実験的に確証されている。これは、端から２番目のよりフレキシブルな側鎖原子とは対照的である。その上、最も模倣的な戦略には、ｃα‐ｃβ結合を非ペプチドのスカフォールドにつなぎ、側鎖の余分な原子が分子認識においてある程度のフレキシビリティを付与するようにすることがある。それ故、特に同定された共通モチーフを用いてペプチド擬似物質を直接開発する場合には、ｃα‐ｃβベクトルによるクラスタリングが機能的に重要であると考えられる５１。
【００７３】
２．２．２  密集しているコンホメーション（シード）の系統的同定
本発明者らは、蛋白質のループをクラスタリングするための適切なシードポイントを同定した。本節において本発明者らは、これらのシードを同定する方法について述べる。２３３３１個のループそれぞれを他の全てのループと比較することによって定数ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ（近隣限界）未満のＲＭＳＤ値を有する類似のループ（「近隣」）全てを同定して、ループごとに計数した。様々なＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴを用いた近隣ループの数を頻度（この数の近隣が見出される回数）に対してプロットしたものを、図１０に示す。ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴのほとんどの値で、近隣ループの数が増加するほど頻度が低下し、近隣ループの数が減少するほど頻度が上昇している。しかし、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ（０．６および０．７）を用いると、最大頻度は、近隣ループの数が少ないほうの近くに存在するのではなく、近隣ループが２００〜６００のところに存在する。このことは、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが大きい場合、０〜１００よりも２００〜６００の近隣を有することが多いことを意味している。この図は、特定のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴについての近隣ループの最大数も示しており、それによってループ間の類似度の指標を与えている。例えば、近隣ループの最大数は、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿
ＬＩＭＩＴ０．７では１７６３、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ０．４では５２６、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ０．２５では１４６である。
【００７４】
ここで、近隣ループの数をループごとに決定し、次の工程で最大の近隣数（ピーク）を有するループを同定した（特有のループとその近隣を与えた）。即ち、近隣ループの全てが同数以下の近隣ループ数を有する場合に、そのループをピークとして記録する。様々なＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴについてのピークの数を、図１１に示す。この図は、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが０．２５から０．７まで変動するにつれて、ピークの数が７８１８から１３まで変動したことを示している。しかし、任意に選択した２０という低いＳＥＡ＿ＬＥＶＥＬ未満の近隣数を持つピークは、有意に密集していないため該当しないので、プロットは近隣のＳＥＡ＿ＬＥＶＥＬ数を超えるピーク数も示している。ＳＥＡ＿ＬＥＶＥＬ２０を超えるピーク数は、５６〜３の範囲内であり、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴの増加に伴って減少する。
【００７５】
幾つかのピークは互いにほとんど同じになり得るため、フィルタ処理を行ってデータを表す固有ピーク組を同定した。２つのピーク間で共有されたループの部分が、２つのピーク内の総ループ数の２０％と設定されたＯＶＥＲＬＡＰ＿ＬＩＭＩＴ値を超える場合、２つのピークは十分に固有であるとはみなされない。ピークがそれまで選択した固有ピーク全てと比較した時に十分に固有でなければ、最大数の近隣を有するピークから最低数の近隣を有するピークにいたるまでピークをフィルタ処理した。オーバーラップ（部分的に一致する）部分に基づくこの定義は、ピークの平均構造間のＲＭＳＤ距離に基づく定義よりも明敏である。図１１も、固有ピークの数をＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴの関数として示している。ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが０．４以上では、ピークは全て固有であった。しかし、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが０．４未満では、ピークは全て固有というわけではなかった。
【００７６】
ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴの値の選択に関して、一般原理は、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ値が大きくなるほどデータがより「汎化」される、ということである。本発明者らは、２０（ＳＥＡ＿ＬＥＶＥＬ＝２０）を超える近隣を有する固有ピークの数を減らさずに最大の汎化を見出そうとしている。図１１は、２０を超える近隣を有する固有ピークの数が、３〜４０の範囲内であり、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ値の増加に伴って減少することを示している。ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが０．２５から０．３に増加する時、図１１は、固有ピークの数が有意に減少しないことを示している。このことは、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴにおける他の全ての増加に反している。結論として、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴが０．３のとき、固有ピーク数が保持されつつデータの「汎化」を増大する。
【００７７】
ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴとして０．３を選択する場合の影響を検討するために、高値のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴを用いて得られた固有ピークが、０．３という低値のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴを用いて得られたピークのサブセットであるかどうかを判定した。例えば、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ  ０．４での固有ピークがＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ  ０．３で見出された固有ピークのサブセットである（類似している）場合、両方のデータセットに構造的に類似した固有ピークが見出されると予測した。これを実行するために、高値のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴを用いて得られた固有ピークそれぞれを、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ  ０．３を用いて得られた最も構造的に類似する固有ピークと系統的にペアリングした。ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ  ０．３を用いて得られた３９個の固有ピークを、０．４、０．５、０．６および０．７というより高値のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴを用いて得られた固有ピーク全てとペアリングした結果を、表４に示している。全ての比較についての固有ピークのペア間のＲＭＳＤは、０．０〜０．８８の範囲内であった。ＲＭＳＤが０．３未満のデータセット間では、かなりの
数のピークが存在する。これは、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ  ０．３から同定された固有ピークと比較すると、より高値のＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴになるほど、類似の固有ピークが見出されることを示している。このことは、高頻度の固有ピークの場合に特に当てはまる。表の下の列になるにつれ、固有ピークの頻度は低下する。低頻度の固有ピークで認められるように、データセット間の構造的一致がうまくいかない場合もありうる。本発明者らは、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴとして０．３を選択することが、「汎化」と正確さ（固有ピークの数）との間の合理的な妥協点であり、その結果得られる固有モチーフが、更にクラスタリングするためのシードとして用いられると結論づけた。
【００７８】
２．２．３  重心ソートフィルタクラスタリング
２０を超える近隣を有する固有ピークの系統的同定の後、１．２．１．４節に記載した最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムを利用して、クラスタリングを微調整した。２０を超える近隣を有する固有ピーク３９個を、様々なＴＯＬＥＲＡＮＣＥ（許容値）を用いる本発明者らの重心ソートフィルタアルゴリズムの初期シードとして使用した。クラスタリングされたデータの割合、平均クラスタ内ＲＭＳＤ、平均クラスタ間ＲＭＳＤおよび後２者の比率を、ＴＯＬＥＲＡＮＣＥの関数として図１２にプロットしている。図は、ＴＯＬＥＲＡＮＣＥの増加につれ、クラスタリングされたデータの割合およびクラスタ内‐クラスタ間ＲＭＳＤ比が増加することを示している。ＴＯＬＥＲＡＮＣＥ  ０．３では、クラスタリングされたデータの割合、平均クラスタ内ＲＭＳＤ、平均クラスタ間ＲＭＳＤおよび後２者の比率は、それぞれ１２％、０．２２、０．９５および０．１１であり；ＴＯＬＥＲＡＮＣＥが０．６ＲＭＳＤでは、それぞれ７１％、０．４２、１．９４および０．２１であり；ＴＯＬＥＲＡＮＣＥが０．９では、それぞれ１００％、０．５１、１．９０および０．２７である。従って、許容値の選択に対抗する力が存在する。高い許容値では、クラスタリングされるデータの割合が高くなるために好まれるが、クラスタ内‐クラスタ間ＲＭＳＤ比が高いので嫌われる。低い許容値では、クラスタ内‐クラスタ間ＲＭＳＤ比が低いので好まれるが、クラスタリングされるデータの割合が低いので嫌われる。擬似物質という観点では、クラスタリングされる割合が高いことよりも合理的なクラスタ内類似度（クラスタ内ＲＭＳＤ）を有していることが重要である。クラスタ内ＲＭＳＤの選択を支援し、ＴＯＬＥＲＡＮＣＥの選択を間接的に支援するために、様々な許容値を用いて定式化されたクラスタ１内のループ全てのプロットを、図１３に示している。同図は、ＴＯＬＥＲＡＮＣＥ  ０．７でクラスタリングされるデータ８９％に対応する平均クラスタ内ＲＭＳＤ０．４７では、クラスタ内のメンバーがループ擬似物質として十分に類似していることを示している。許容値０．７を用いて得られた３９個のクラスタそれぞれのループ数を、図１４にプロットする。最も低密度のクラスタではループが３０７個あり、最も高密度のクラスタではループが１０４８個ある。
【００７９】
２．２．４  ループのベクトルプロット
３９個のクラスタ全てに関する、１．２．２．１に記載したベクトルグラフ（図１５）は、クラスタ内のループが合理的に類似したコンホメーションを有することを示している。
【００８０】
２．２．５  クラスタ全てのＲＭＳＤマトリックスの計算
ＲＭＳＤマトリックスを計算し、クラスタ内の類似度およびクラスタ間の非類似度を評価することによってクラスタリングのパフォーマンスを検証する（第１．２．２．３節）。３９個のクラスタ全ての平均クラスタ内ＲＭＳＤおよびクラスタ間ＲＭＳＤを示すＲＭＳＤマトリックスを、表５に示す。平均クラスタ内ＲＭＳＤ０．４７および図１５のクラスタ全てのベクトルグラフは、クラスタ内のループが類似のコンホメーションを有していることを示している。平均クラスタ間ＲＭＳＤは１．９１であるため、クラスタ間のループは、類似していない。
【００８１】
２．２．６  平均連結クラスタリングアルゴリズム
上述のＲＭＳＤマトリックスに基づいて、本発明者らは、平均連結クラスタリングアルゴリズム３６、５２、５３を適用して、３９個のクラスタ間の構造的関連性を測定した。平均連結クラスタリングアルゴリズム３６、５２、５３において、最初に各構造をサイズ１の自身のクラスタに割り当てる。次に、２個のクラスタ内の全構造間の平均距離がある程度の閾値に含まれれば、クラスタをマージする。３９個のクラスタの平均連結クラスタリングアルゴリズムを適用することによって得られた階層ツリーを、図１６に示す。この文書で用いられたクラスタ数全てが、この階層ツリーの左から右の順序になっている。
【００８２】
２．２．７  互いに異なるクラスタ
各クラスタが固有のループ組を含む（２以上のクラスタ内にあるループはない）場合、３９個のクラスタは連続的広がりに由来するオーバーラップした変動を表すであろうか、あるいは超空間でオーバーラップしない互いに異なるクラスタを表すであろうか。この疑問に答えるために、本発明者らは、１個のクラスタ内で最大の８０％のデータが、他のクラスタ内で最大の８０％のデータとオーバーラップしていない場合に、２個のクラスタが「互いに異なる」と定義した。ループのコンホメーションの以下の３２の記述子それぞれについて、オーバーラップを算定した。各ｃα‐ｃβベクトル対は４つの距離を有し（ｃα１‐ｃα２、ｃα１‐ｃβ２、ｃβ１‐ｃα２、ｃβ２‐ｃβ２）、そのためループ内の４個のｃα‐ｃβベクトルの６個の可能なｃα‐ｃβベクトル対（１‐２、１‐３、１‐４、２‐３、２‐４、３‐４）によって、２４個の距離記述子が得られる。更に、４個のｃα‐ｃβベクトル間の可能な６個のねじり角記述子全てと、２個のねじり記述子ｃα２‐ｃα２‐ｃα３‐ｃα４およびｃβ２‐ｃβ２‐ｃβ３‐ｃβ４も利用した。以上３２個の記述子それぞれを基にして識別を実施した。
【００８３】
広がりが必ずしも「正規」分布ではないものもあったため、各分布の最大の８０％を線引きする最大値および最小値は、平均±標準偏差を用いて算定しなかった。最大値および最小値は、先に述べた３２個の記述子それぞれに関するデータを最初に「ビンニング」することによって算定した。その後、各記述子のビンを、頻度を基に最多から最少までソートした。プログラムがビンをトラバースするにつれて、記述子の最大値および最小値が保存される。プログラムがデータの少なくとも８０％をトラバースしたら、トラバーサルを停止する。結果として、保存された最大値および最小値が、分布の上位８０％を線引きする値を表している。最大値および最小値を見出すこの方法は、単一ピーク分布とともに良好に機能する。２個以上のピークを含む分布では、最大値および最小値による範囲の広がりは、過大評価される。そのような場合、互いに異なるかどうかの判定は、過小評価される。
【００８４】
特定の記述子については、クラスタＸの最大値および最小値がクラスタＹの最大値および最小値にオーバーラップしていれば、クラスタＸとクラスタＹとが、オーバーラップしているとみなされる。その一方で、クラスタＸの最大値および最小値がクラスタＹの最大値および最小値とオーバーラップしていなければ、クラスタＸはクラスタＹと互いに異なるとみなされる。この解析によって、総数７４１個のクラスタの組合せのうち７３７個（９９％）が、互いに異なるとされている。解析は個々の記述子に基づくものとしたため、記述子の組合せを含むように解析を拡張すれば、それらの互いに異なっていないクラスタはオーバーラップする、または互いに異なるものとなり得る。
【００８５】
同定したこれらの共通蛋白質ループモチーフをデータベース検索戦略に用いて、同定したこれらのモチーフの形状にマッチする分子を同定することが可能である。これは、第５節に更に詳細に記載されている。
【００８６】
３  蛋白質接触面のクラスタリング
３．１  背景
蛋白質接触面は、アミノ酸残基の連続配列だけでなくアミノ酸残基の非連続配列からも構成されている。これまでの２つの節では、蛋白質結合部位の連続ループをクラスタリングした。本節では、蛋白質接触面の側鎖のクラスタリングについて述べる。
【００８７】
３．２  方法
３．２．１  蛋白質間インターフェースの残基の定義
本文献では、蛋白質間インターフェースに含まれる残基を定義するために少なくとも４つの基準が用いられてきた。２個の異なる鎖にある２個の残基が蛋白質間インターフェース内にあるとみなされるのは、（１）残基のｃα原子の距離が９．０Å未満である場合、または（２）一方の残基内の任意の原子が他方の残基の任意の原子の５Å以内にある場合、または（３）一方の残基の任意の原子と他方の残基内の任意の原子との距離が、それらの対応するファンデルワールス半径＋０．５Åの合計よりも小さい場合、そして（４）残基間のファンデルワールスエネルギーが−０．５ｋｃａｌ/ モル未満である場合である。結果は４つの基準の間ではほとんど均一である５４。ここでは、基準３を用いる。更に、インターフェースの残基数が１０個未満である場合、この蛋白質間相互作用が結晶パッキングの結果である確率が高いため、そのインターフェースは不採用とする。
【００８８】
３．２．２  非冗長データセット
ツァイ（Ｔｓａｉ）５４は、ＰＤＢデータベース１９９４年９月リリース版３１の２８１４個のＰＤＢエントリーをスキャンして、１６２９個の二鎖間のインターフェースを見出している。ツァイら５４は、１６２９個の二鎖間のインターフェースから、構造比較アルゴリズムの使用、類似度の測定、および構造をファミリーへとクラスタリングすることによって３５１個の非冗長ファミリーを抽出した（http://protein3d.ncifcrf.gov/tsai/frame/dataset.html）。
【００８９】
ｃ＋＋プログラムであるｐ‐ｐ＿ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．ｃｐｐを作成して蛋白質間インターフェース内の残基のｃα‐ｃβベクトルの座標を抽出した。グリシン残基については、理想的アラニンのｎ、ｃα、ｃ’原子をグリシンのｎ、ｃαおよびｃ’原子に重ね合せることによって、ｃβ原子の座標を得た。ｃβ原子の座標を含まない非グリシン残基は、データベースに含めなかった。３５０の非冗長ファミリーから、単鎖内で接触を形成する最大１５０の残基から構成された７００の蛋白質鎖が得られた。これは、非常に大きなデータセットになる。例えば、３残基の群から共通モチーフを同定するためには（これは、本発明者らが擬似物質という観点から考える最小サイズである）、
【００９０】
【数１】
2005529382.tif 000003
もの多量の残基の比較ということになる。ほとんどのクラスタリングアルゴリズムは、そのような大きな問題に関してはコンピュータ処理に費用がかかりすぎる。結果として本発明者らは蛋白質接触面のクラスタリングに取り組む新しいアプローチを開発した。
【００９１】
３．２．３  クラスタリングのためのシードの同定
蛋白質接触面の共通構造を同定することは、重要な挑戦である。残基群のマッチング頻度を決定する際の最初の工程は、それらを比較する方法を開発することである。大きなサイズのデータベースは、コンピュータ処理に費用がかかる根平均二乗変位（ＲＭＳＤ）アルゴリズムを使用できない。化学および生物学において一般に用いられるより簡便な方法は、ディスタンスジオメトリー法による比較である。
【００９２】
このディスタンスジオメトリー法は簡便なので、迅速な幾何学的構造（ジオメトリー）の比較が可能である。しかし、ジオメトリーの比較では、２つのジオメトリーがどれほど密接に関連するかという値（ＲＭＳＤ値のような値）は得られず、代わりにそれらの距離が特定の許容値内で同一であるかどうかというマッチ（一致度）が得られる。２つの残基間の幾何学的関連性は、４つの「ボウタイ状の」距離によって表すことができる（図１７）。許容値つまりＴＯＬは、マッチを記録するためにこれらの距離間で許容される差の最大値を表す。そして、２つの残基群｛Ａ，Ｂ｝および｛Ｃ，Ｄ｝（図１７）がＴＯＬ内でマッチするのは、
【００９３】
【数２】
2005529382.tif 000004
（式中、ｄ（ｘ，ｙ）は、三次元空間内での点ｘおよびｙの間のユークリッド距離である）である時かつその時に限る。一般にＴＯＬ∈［０．２，１．０］Åである。
【００９４】
２残基を超える群に拡張することは簡単である。一般則は、群内の２残基の組合せそれぞれの間に、ボウタイを形成させなければならない、ということである。サイズＮの群は、厳密には
【００９５】
【数３】
2005529382.tif 000005
のボウタイを含む。Ｎ残基の２群がマッチするかどうかを確認するためには、その群について可能な全てのローテーション（全てについての下式）
【００９６】
【数４】
2005529382.tif 000006
（またはボウタイ間の全ての比較）を考慮することができる。例えば、３残基の２群｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝および｛Ｄ，Ｅ，Ｆ｝は、６個の可能な残基の比較（ｍａｔｃｈｕｐ）
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｅ，Ｆ｝
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｆ，Ｅ｝
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｄ，Ｆ｝
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｆ，Ｄ｝
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｄ，Ｅ｝
｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｅ，Ｄ｝
を含む。
【００９７】
そして、これら２つの３モチーフがマッチするのは
（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｄ，Ｅ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｆ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｆ｝）または（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｄ，Ｆ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｅ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｅ｝）または（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｅ，Ｄ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｆ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｆ｝）または（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｅ，Ｆ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｄ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｄ｝）または（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｆ，Ｄ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｅ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｄ，Ｅ｝）または（｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｆ，Ｅ｝と｛Ａ，Ｃ｝⇔｛Ｆ，Ｄ｝と｛Ｂ，Ｃ｝⇔｛Ｅ，Ｄ｝）または（式中、｛Ａ，Ｂ｝⇔｛Ｄ，Ｅ｝は、モチーフ｛Ａ，Ｂ｝および｛Ｄ，Ｅ｝が許容値内で等しいことを示している）である場合である。
【００９８】
３．２．４  モチーフのマッチング頻度の抽出
最も共通するモチーフをデータセットから抽出するために、各モチーフを他の全てと比較する。「ファミリー許容値」（ＴＯＬ）と呼ばれる許容値内で特定のモチーフにマッチする全てのモチーフのセットを、そのモチーフのファミリーと呼ぶ。そのファミリーの濃度が、そのモチーフの「マッチング頻度」である。マッチング頻度の高い共通モチーフは、シードポイントの良好な候補となる。
【００９９】
各モチーフのマッチング頻度を決定する汎用アルゴリズムの擬似コードを、図１８に示している。このアルゴリズムにより全てのモチーフおよびそれらのボウタイ距離を得て、次いでデータセット内の全てに対してそれぞれを網羅的に比較する。
【０１００】
最初に、各鎖内の３残基の実行可能な組合せを単に考えることによって、３‐モチーフを形成させた。しかし、本発明者らは２５Åのサイズの共通表面パッチのみに関心があるため、実行可能なモチーフの組から、２５Åを超えるボウタイ距離を含むものをすべて除外する。非常に大きなデータセットが生成するが、このアルゴリズムなら依然として管理可能である。この方法で４‐モチーフについて形成させたデータセットは、大きすぎる。３‐モチーフの情報を用いると、４−モチーフのデータセットのサイズを大きく縮小させることができる。各４‐モチーフが４個の３‐モチーフによって形成される。例えば群｛Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ｝は、４群｛Ａ，Ｂ，Ｃ｝、｛Ａ，Ｂ，Ｄ｝、｛Ａ，Ｃ，Ｄ｝および｛Ｂ，Ｃ，Ｄ｝によって形成される。これらの３‐モチーフのいずれかがデータベース内に頻繁に生じなければ、モチーフ｛Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ｝が共通性の高い共通モチーフであるチャンスもありえない。これは、データセットのサイズを大きく縮小させ、より高次の群の構築にとって不可欠である。この同じ方法をより高次のモチーフに用いる。
【０１０１】
３．２．５  ピークマッチング頻度の発見
今やマッチング頻度の数が各モチーフについて決定されたので、次の工程でマッチング頻度の「ピーク」数を用いてモチーフを同定した。モチーフは、該モチーフのファミリー内の他のモチーフ全てが同じもしくはそれ以下のマッチング頻度を有する場合に、ピークとして記される。データセット内のピークの検索用アルゴリズムを、図１９に示す。最初に該アルゴリズムが全てのモチーフをピークとしてタグ付けする。次に、データセット内の全モチーフＡについて、モチーフＡのファミリー内のいずれかのモチーフが低いマッチング頻度を有する場合、そのモチーフを非ピークとしてタグ付けする。
【０１０２】
３．２．６  モチーフをクラスタリングするためのアルゴリズム
本節におけるクラスタリング法の目的は、データセット内のモチーフ全てをクラスタリングする必要はないものとして、幾つかのピークモチーフについて関連するモチーフ全てを回収することにある。
【０１０３】
モチーフをクラスタリングするための最も簡単な方法は、本来のマッチングアルゴリズムに関してデータセットを逆にスキャンすることである。マッチングされる各モチーフを
クラスタ内に受け入れたら、この方法をデータセットに通過させる。この手法は、ＰＡＭ非階層法５５に非常に類似している。このアルゴリズムは「ワンパスアルゴリズム」と呼ばれ、図２０に概略が示されている。あるランドスケープのモチーフのワンパスアルゴリズムのスパンを、図２１に例示している。全てのヒル（ｈｉｌｌ）がピークモチーフに関して対称であることも仮定する。許容値ＯＴＯＬは、各ヒルの幅が同一であると仮定している。許容値の範囲がアルゴリズム全体を通して一定であるため、ヒル全体が回収されることはほとんどない。回収された幾つかのモチーフが異なるヒルに属する可能性がある。
【０１０４】
これらの問題を部分的に克服するアルゴリズムが、「グリーディアルゴリズム」である（図２２）。このアルゴリズムは、単連結階層法に非常に類似している。各クラスタをシードポイントとして初期化する。モチーフが許容範囲内で現行のクラスタ内のいずれのモチーフともマッチするならば、該モチーフは各クラスタに加えられる。データセット内の他のどのモチーフもクラスタ内のいずれのモチーフにマッチしなくなるまで、アルゴリズムが各ピークを移動する。このスパンを、図２３に例示する。グリーディアルゴリズムの欠点は、（ＧＴＯＬ内で）クラスタ内のモチーフにマッチする他のモチーフがなくなるまで、モチーフを回収し続けることである。別のピークに属するモチーフを回収する（ＧＴＯＬが大きすぎる場合）危険性か、あるいは十分に回収できない（ＧＴＯＬが小さすぎる場合）危険性がある。各ヒルの下にあるモチーフの分布が一貫している、または均等であるという保証もない。ＧＴＯＬが大き過ぎる場合データベース内の全てのモチーフが回収されるまでアルゴリズムが停止しない可能性もある。
【０１０５】
この問題を克服する簡単な方法が、グリーディアルゴリズムに別の許容値を適用することである。「ワンパス・グリーディ併用アルゴリズム」は、ワンパスの許容値ＯＴＯＬをグリーディアルゴリズムに適用してスパンを限定する。該アルゴリズムは、各クラスタ内のあらゆるモチーフが、シードモチーフのＯＴＯＬ範囲内になければならないという追加の制約を適用する。このアルゴリズムについて、図２４に概要を示す。
【０１０６】
モチーフの（ジオメトリーではなく）マッチング頻度に関する許容値「シーレベル（ｓｅａｌｅｖｅｌ）」も、グリーディアルゴリズムのスパンを限定するのに有効である。シーレベル未満のマッチング頻度を有するモチーフ全てをデータセットから棄却する。図２５は、シーレベルを単連結アルゴリズムに適用する方法を示している。該アルゴリズムの可能なスパンの例を、図２６に示している。しかし、正しいシーレベルを選択するのは、必ずしも容易ではない。設定が低すぎると、アルゴリズムのスパンを限定する効果がほとんどなくなる。設定が高すぎると、一部のピーク（およびヒル）がセットデータから一緒に排除されることになる。例として、図２６左の最初のピークはデータセットから全て除去され、３番目のピークは、２番目よりも限定された。ピークの全てがほぼ同じ高さにならなければ、シーレベルの適用により一部のヒルが他のヒルよりも不利になる。
【０１０７】
この問題を克服するために、各ピークのシーレベルを、図２７に示すとおり「適応させて」設定することができる。これは、アルゴリズムのスパンを限定するより適切な方法である。各シーレベルを、ピークモチーフの頻度に従って計測することができる。
【０１０８】
本節で論じた方法は全て、モチーフをシードモチーフに重ね合わせるために変更することができる。図２８は、このような調整をＰＡＭ法について実施する方法を示している。このような新たな許容値により各クラスタのＲＭＳＤ値が最小化されたにもかかわらず、各シードについてのピークの回収という点では何ら実際的意味はない。これらのアルゴリズムは、ディスタンスジオメトリー法よりもわずかに費用がかかる。
【０１０９】
３．２．７  二次構造解析
モチーフ内の各残基の二次構造の解析を、ＤＳＳＰ（Dictionary of Protein Secondar
y Structure ）ソフトウエア４を用いて実施した。このソフトウエアは、蛋白質の形状を形式にかなった二次構造に分類するためにあらゆる文献で広く利用されてきた。ＤＳＳＰは、蛋白質内の残基の３Ｄ座標を与えて、その改良された専門システムを基にして形状を分類する。ＤＳＳＰによって判断された異なる二次構造分類は８種存在する。それらを、この文書で使用されことになる略語と一緒に、表１４に記載している。分類「割り当てなし」は、定義された他の分類のいずれにも適合しない形状を指す。
【０１１０】
３．３  クラスタリングの結果
３．３．１  シードポイントの決定
クラスタリングのシードポイントを決定する最初の工程は、データセット内の各３‐モチーフのマッチング頻度を計算することであった。これは、計算上実行可能な最高次のモチーフであった。３‐モチーフの網羅的組合せによって、９，２１５，４２４個のモチーフが生成したが、４‐モチーフでは１９７，７１２，９４９個であった。
【０１１１】
０．２５、０．５および０．７５Åの３つのファミリー許容値（ＴＯＬ）を、多数のサンプルの計算に基づいて選択した。０．２５Åは、データセット内の構造に関する意味のある汎化を生じた最低許容値であり、０．７５Åは、特にクラスタリングされる残基の数が増えるにつれ、計算上実行可能な最高許容値であった。
【０１１２】
３種のＴＯＬ全てについて３‐モチーフのマッチング頻度を計算した後、４‐モチーフを構築した。方法の節であらかじめ論じたとおり、これらのモチーフは、共通の３‐モチーフを基にして構築した。この時点で、「マッチング頻度シーレベル」未満のマッチング頻度を有する全てのモチーフを除去することによって、共通でないモチーフを排除した。例えば、４‐モチーフを作成する前に、マッチング頻度が３０未満の３‐モチーフ全てを排除した。この水準は、データセット内で認められた傾向を基に選択した。３０というマッチング頻度シーレベルは、最高マッチング頻度（ＴＯＬが０．２５Åのときの４３４）と比較すると有意ではない。３‐モチーフから４‐モチーフを形成した場合の２０というマッチング頻度シーレベルも検査し、マッチング頻度シーレベルを低下させてもシードポイントの頻度に影響を与えないことを見出した。３‐モチーフについて３０、４‐モチーフについて５、より高次のモチーフについては０のシーレベルを与えた場合の、各Ｎ‐モチーフ（３≦Ｎ≦７）についての各許容値における最高マッチング頻度を、図３０に示す。図２９は、作成されたＮ‐モチーフの数を示している。許容値が大きくなると、マッチング頻度が高くなるため排除されるデータセットが少なくなるので、モチーフ数が大きくなる。
【０１１３】
データセット内のモチーフ全てのマッチング頻度を計算した後、ピークモチーフジオメトリーをデータセットから抽出することができる（図１９）。ピークモチーフのデータセットから、マッチング頻度が最大の３０個のモチーフを選択して、クラスタリングの段階でのシードポイントとした。この値は、全てのモチーフサイズおよび許容値に関して一定に保たれる。任意に選択したにもかかわらず、この値はそのデータセットの最高値の半分までのマッチング頻度を有する固有モチーフ全てをほとんど常に含んでいる。同時に、クラスタ内の重大なオーバーラップを得るために、あまり多くのシードポイントは存在しない。わずか３０のシードポイントを選択する場合、クラスタリングアルゴリズムに大きな許容値が適用された場合にのみ、このオーバーラップが生じる。加えて、データセットのヒストグラムをプロットすれば、元々のデータのかなり量が最も共通する３０個の固有モチーフの範囲内にあることが明らかである。
【０１１４】
３．３．２  クラスタ
シードモチーフの決定の後、最終的に２種のクラスタリング法：（１）初期のファミリー許容値と同じ許容値を用い、シーレベルを適用しないワンパスアルゴリズム（図２０）
、（２）ピーク（またはシード）のマッチング頻度に比例する適応シーレベルのグリーディアルゴリズム（図２７）、を適用した。クラスタの緊密性を可能な限り大きな範囲で実現する試みにおいて、多数の異なるグリーディ許容値（ＧＴＯＬ）を適用した。シードの頻度の０．１２５、０．２５、０．５および０．７５という様々な適応シーレベルについて、クラスタリングの際に追跡した。
【０１１５】
各クラスタリングアルゴリズムの成功度を、３種の情報：クラスタサイズ、クラスタ内ＲＭＳＤ、およびクラスタ間ＲＭＳＤによって決定する。その目的は、可能な限り多くのモチーフをクラスタリングすることであるが、得られたクラスタは類似のモチーフを含んでいなければならず（クラスタ内ＲＭＳＤを最小限に抑える）、各クラスタが、可能な限り大きく異なっていなければならない（クラスタ間ＲＭＳＤを増大させる）。
【０１１６】
４‐モチーフ、５‐モチーフ、６‐モチーフおよび７‐モチーフについて概要を示す表を、それぞれ表６、８、１０、および１２に示す。検討した３種の異なるファミリー許容値０．２５、０．５、および０．７は、概要を示す各表の２列目に示されている。ファミリー許容値０．２５Åでのクラスタリングに関する情報は、データセットが小さ過ぎて意味のあるクラスタを抽出できなかったため、６‐モチーフ以上では示されていない。概要を示す表には、クラスタのサイズの合計と、それらのクラスタ内の固有モチーフ数の合計とが示されている。クラスタサイズの合計と、クラスタ内の固有モチーフ数の合計との違いから、２以上のクラスタ内で生じるモチーフの数が得られる。クラスタ内およびクラスタ間ＲＭＳＤは、各アルゴリズムの平均である。
【０１１７】
表７、９、１１および１３は、クラスタ内ＲＭＳＤと、クラスタの平均モチーフ上に重ね合わせたクラスタ内の各モチーフの平均ＲＭＳＤ（主対角線上にある）と、他のクラスタの平均モチーフに対する全モチーフの平均ＲＭＳＤ（主対角線からはずれている）とを含む。表の最上部に、各クラスタのサイズを示している。
【０１１８】
各Ｎ‐モチーフの代表的クラスタを、簡単な基準を基にして選択する。つまり小さなクラスタ内ＲＭＳＤと大きなクラスタ間ＲＭＳＤを有しながら最大量のデータを生成するクラスタリング技法を選択する。小さなクラスタ内ＲＭＳＤとは０．５Å未満であり、大きなクラスタ間ＲＭＳＤとは２．０Å超である。これらの値は、得られたクラスタの視覚化に基づいて決定した。加えて、これらのクラスタは、相対的に異なっていなければならない、つまり２以上のクラスタ内に生じるモチーフがあまり多すぎてはならない。
【０１１９】
４‐モチーフのクラスタリングの結果の概要を表６に示す。最大のクラスタ組を生成するパラメータは、グリーディ法、ファミリー許容値０．７５Å、アルゴリズム許容値０．５Å、およびシードマッチング頻度のシーレベル０．１２５であった。しかし、この方法での０．６７Åという平均クラスタ内ＲＭＳＤは、余りにも高すぎる。次に大きいデータセットのスパンは、シードマッチング頻度のシーレベル０．２５を用いる同じ方法で実現した。この方法は、一層許容されやすい平均クラスタ内ＲＭＳＤ０．５１のクラスタを生成した。そしてこの方法で生成したクラスタを、４‐モチーフのデータセットの代表として選択した。選択した４‐モチーフクラスタに関する特有の情報を表７に示す。主対角線上のＲＭＳＤ値は、表中の他の値よりもかなり小さい。２．２．３節に既に記載したとおり、重心ソートフィルタアルゴリズムを用いることにより、同定されたクラスタが更に微調整されることが見込まれる。これらのクラスタの１つ（Ｃ２９）の図を、図３１に示す。
【０１２０】
５‐モチーフの結果の概要を表８に示す。この例で選択された代表的クラスタは、グリーディアルゴリズム、ファミリー許容値０．７５、グリーディ許容値０．７Å、およびシードマッチング頻度のシーレベル０．１２５であった。５残基モチーフで選択されたクラ
スタに関する特有の情報を表９に示す。５残基モチーフのあるクラスタ（Ｃ３０）の例を、図３２に示す。
【０１２１】
６‐モチーフのクラスタリングの平均的な結果を表１０に示す。この例で選択した方法は、グリーディアルゴリズム、ファミリー許容値０．７５Å、グリーディ許容値０．７Å、およびピークマッチング頻度の０１２５倍のシーレベルであった。この方法に関する特有のクラスタ情報を表１１に示す。選択したクラスタリングアルゴリズムの代表的クラスタＣ１を図３３に示す。
【０１２２】
７‐モチーフの結果の概要を表１２に示す。この例で選択した代表的クラスタは、グリーディアルゴリズム、ファミリー許容値０．７５Å、グリーディ許容値０．９Å、およびシードマッチング頻度のシーレベル０１２５であった。特有のクラスタに関する情報を表１３に示す。視覚化された７‐モチーフのクラスタ（Ｃ１０）の例を図３４に示す。
【０１２３】
３．３．３  クラスタの二次構造
各クラスタのシードの二次構造の解析を、方法の節で記載したとおりに行った。その結果から、４つの残基が伸長したβ鎖として分類された４‐モチーフのクラスタＣ２のシードを除けば、各シードの残基全てがαヘリックスとして分類されたことが示されている。しかし、シードのこの二次構造分類法は、各クラスタの平均モチーフの分類と一致していない可能性があった。表１５、表１６、表１７および表１８は、それぞれ４、５、６、および７残基の各モチーフクラスタ全体を通した二次構造の分布を示している。これらの表の結果から、シードの二次構造が、クラスタ内のモチーフの二次構造にほとんど常に一致していることが確認される。これに対する唯一の例外として考えられるのが、モチーフのわずか５６％がシードと二次構造を共有していた４‐モチーフのクラスタＣ２である。他のほとんど（全てαヘリックス）は、モチーフの全てのサイズについて９０％超がシードと一致している。
【０１２４】
シードまたはクラスタ内の残基全てがαヘリックスだとしても、モチーフ内の残基間に並んでいる残基はαヘリックスでない可能性があるので、シードまたはクラスタは必ずしも単一のαヘリックスに属するとは限らない。ＤＳＳＰ分類では不確実な可能性があるため、２つ以上の連続したαヘリックスでない残基が並んでいる場合には、αヘリックスが壊れているとみなされる。表１９は、単一のαヘリックスではない各クラスタ内のモチーフの割合を記録している。（９９％が非ヘリックスである）４‐モチーフのクラスタＣ２を除いて、他のほとんど全てのモチーフが、単一のαヘリックスである。
【０１２５】
３．３．４  単一ではないαヘリックスのクラスタ
上述のクラスタのほとんど全てが単一のαヘリックスの一部であると仮定して、単一ではないαヘリックスのクラスタを抽出しながら進めた。最初の工程は、単一のαヘリックスでなく最大のマッチング頻度のシードを見出すことであった。これらのシードの二次構造を表２０に示す。その結果から、モチーフのサイズが増加すると各モチーフ内の二次構造がより均一になることが示される。
【０１２６】
表２１は、新しいシードにより様々な方法を用いて取り出されたクラスタの概要を含んでいる。これまでの解析の中で最も成功したクラスタリング法を、この解析の出発点として適用した。これらの結果から、モチーフのサイズが大きくなるにつれてクラスタが互いに異なってくる傾向が強いことが示されている。４残基モチーフでは、かなり大きなクラスタ内ＲＭＳＤを有するクラスタ間でモチーフを著しく共有している。しかし、モチーフのサイズが大きくなると、得られるクラスタの組成を変えずに有意に大きな許容値を適用することができる。クラスタ内ＲＭＳＤを非常に低くしたまま、グリーディ許容値を６残基モチーフについて１．１Åに拡大することができた。これは、元のシード組で適用可能
であった０．７Åの最高許容値とは対照的である。
【０１２７】
各サイズのモチーフについて代表的クラスタを選択する基準は、これまでのクラスタリング研究と同様であり、クラスタ内ＲＭＳＤを低く（約０．５Å未満）、クラスタ間ＲＭＳＤを高く（２．０Å超）保ちながら、可能な限り大きなクラスタを選択することである。４残基モチーフについて得られたこれらのクラスタ間のＲＭＳＤ比較を、表２２に示す。
【０１２８】
表２３は、新しい４残基モチーフクラスタに関する異なるタイプの二次構造の分布を示している。これらのクラスタそれぞれのシードが「単一ではないαヘリックス」と分類されたとしても、３つのクラスタ内のモチーフの大部分がαヘリックスである。表２４は、単一のαヘリックスでない新しいクラスタそれぞれのモチーフの割合を示している。クラスタＣ５、Ｃ１７およびＣ２５のモチーフの２０％未満が単一のαヘリックスではなく、これらのクラスタの残基の９０％超がαヘリックスと分類されている。Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ１０、Ｃ１２およびＣ１６など、正式な二次構造へは割り当てられないモチーフの割合が高いクラスタは、サイズが比較的小さく（最大でちょうど２６のメンバーを有する）、クラスタ内ＲＭＳＤは比較的低い。この群内では、平均クラスタ内ＲＭＳＤは０．２８Åであるのに対し、セット全体では平均クラスタ内ＲＭＳＤは０．５２Åである。
【０１２９】
この関連性は、大きなサイズのモチーフでも一貫している。表２５は、７残基モチーフに関する二次構造の分類の分布を示している。クラスタＣ１、Ｃ２およびＣ３だけは、成分の残基が完全には分類されない「割り当てなし」であるモチーフを有している。これらの３個のクラスタは、平均クラスタ内ＲＭＳＤが０．４１Åであり、これはセット全体の平均クラスタ内ＲＭＳＤである０．２６Åよりもかなり大きい。この相関関係から、正式な二次構造の割り当てのないモチーフを含むこれらのクラスタが、データセット内の他のいずれのモチーフに対しても非常に独特な形状であることが示唆される。
【０１３０】
４  表面パッチのクラスタリング
表面パッチのクラスタリングの基本的アルゴリズムは、不連続な蛋白質表面をクラスタリングするためのアルゴリズムに類似している。最初に、「パッチモチーフ」と呼ばれる蛋白質表面のスナップショット（断片）を生成させる。Ｎ個の格子点を含むパッチモチーフを、Ｎ‐パッチと呼ぶ。この研究で考慮されることになる最小パッチサイズは、３‐パッチである。３‐パッチを構築するアルゴリズムを図３６に示す。
【０１３１】
図３５は、各パッチモチーフのマッチング頻度を決定するアルゴリズムを記載している。ここでも、これらのモチーフのＲＭＳＤの重ね合わせは、パッチのサイズおよび数が原因でコンピュータ処理に費用がかかりすぎる。パッチの形状を容易に比較できるように距離マトリックスを構築する。頂点が格子点であり、辺が各頂点間のユークリッド距離によって加重されている完全グラフＫＮを作成することによって、距離マトリックスをＮ‐パッチについて計算する。９‐パッチで構築した完全グラフＫ９の例示を、図３８に示す。
【０１３２】
２つのＮ‐パッチの形状が等しいかどうかを判定するためにＮ！比較の合計が必要である。全ての頂点‐頂点マッチアップについて熟慮する必要がある。これは、コンピュータ処理では非常に費用のかかる計算になる。例えばＮ＝４であれば、２つのパッチがマッチするジオメトリー構造を有していないかどうかを判定するために、１４４の辺の距離を比較しながら２４の配向を試みる必要がある。Ｎ＝９であれば、距離の比較は１３０６３６８０で配向の数は３６２８８０となる！  この問題を実行可能にするには、多くの改善がなされる必要がある。
【０１３３】
網羅的にチェックを行う前に、パッチ対の間で多数の迅速で簡便な比較を行うことがで
きる。これは、この問題の計算上の実行性の改善である。最初に、距離の比較の前に各格子点の電荷を比較する。電荷が電荷許容値以内でマッチしていなければ、辺の距離がマッチするかどうかをチェックする必要はない。これはかなり容易な計算である。他にも、パッチ対の最長の辺の距離と最短の辺の距離がマッチするかどうかをチェックする。それらがマッチしていなければ、パッチのジオメトリー構造は異なっている。最後に、格子が初めに構築された方法のために、全てのパッチで一定のままの距離マトリックスである距離がいくつか存在する場合がある。これによって、比較の際にパッチの特定の配向を考慮する必要がなくなる場合がある。
【０１３４】
Ｎ＋１パッチは、先に記載した不連続面の高次モチーフの組立て手順と類似の方法でＮ‐パッチに基づいて構築される。定義されたマッチング頻度のシーレベル未満のパッチを、データベースから除去する。これによって、作成される冗長な高次パッチの数が減少する。高次パッチを作成するアルゴリズムを図３７に示す。このアルゴリズムでは、新しいＮ−パッチそれぞれを、（Ｎ−１）（Ｎ−１）‐パッチから作成する。
【０１３５】
マッチング頻度が決定されれば、前の節に記載したとおりにシードおよびクラスタを得ることができる。
５  スカフォールド
先に記載したとおり、本発明者らは、βターン、ループおよび蛋白質接触面の側鎖の位置をクラスタリングした。これによって、それぞれβターン、ループおよび蛋白質接触面についてそれぞれ９、３９および２４０の高密度モチーフが同定された。例として、これらのモチーフ全ての中で５番目に少ないクラスタの座標を表２６に示す。これらのモチーフは、蛋白質表面の共通する空間的要素を定義する。目的は、これらのモチーフを用いて、分子のライブラリを設計することにある。従って、ライブラリ設計における生物学的記述子としてこれらのモチーフを使用し、得られたライブラリは共通の蛋白質の形状を模倣していることになる。ハイスループットスクリーニングでは、そのようなライブラリは、新しいリード化合物の開発にとって貴重な供給源になる。
【０１３６】
この目的に向けて、本発明者らは、モチーフのサブセットを用い、ケンブリッジ結晶構造データベースに由来するバーチャル分子ライブラリをスクリーニングして、モチーフの空間的要素にマッチする分子を同定した。バーチャルライブラリプログラムＶＥＣＴＲＩＸの自家製バーチャルスクリーニングを用いて、データベースを検索した。図３９ａは、βターンコンホメーションにマッチするスカフォールドの幾つかを示しており、図３９ｂは、共通のループコンホメーションにマッチするスカフォールドの幾つかを示しており、図３９ｃは、共通の６残基の蛋白質間相互作用面にマッチするスカフォールドの幾つかを示している。
【０１３７】
図３９に例示されるとおり、共通モチーフの形状にマッチする分子が同定される。この情報によって、共通の蛋白質の形状にマッチする分子の設計に至るであろう。
この明細書全体を通して、本発明の好ましい実施形態を説明することをねらいとしてきており、本発明をいずれかの実施形態に限定するものでなく、また特徴を特定して収集することに限定するものでもない。本発明の広範な思想および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載および例示した実施形態に様々な変更および改良をなすことが可能である。
【０１３８】
本明細書中で参照される全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は、その全体が本明細書に援用される。
【０１３９】
【表１】
2005529382.tif 000007
【０１４０】
【表２】
2005529382.tif 000008
【０１４１】
【表３】
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【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
【表５】
2005529382.tif 000011
【０１４４】
【表６】
2005529382.tif 000012
【０１４５】
【表７】
2005529382.tif 000013
【０１４６】
【表８】
2005529382.tif 000014
【０１４７】
【表９】
2005529382.tif 000015
【０１４８】
【表１０】
2005529382.tif 000016
【０１４９】
【表１１】
2005529382.tif 000017
【０１５０】
【表１２】
2005529382.tif 000018
【０１５１】
【表１３】
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【０１５２】
【表１４】
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【０１５３】
【表１５】
2005529382.tif 000021
【０１５４】
【表１６】
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【０１５５】
【表１７】
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【０１５６】
【表１８】
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【０１５７】
【表１９】
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【０１５８】
【表２０】
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【０１５９】
【表２１】
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【０１６０】
【表２２】
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【０１６１】
【表２３】
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【０１６２】
【表２４】
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【０１６３】
【表２５】
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【０１６４】
【表２６】
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【０１６５】
【表２７】
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【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ヘリックスでもβシートでもなく、プロテインデータバンク３１中の高分解能かつ非相同的な構造において見出される４残基セグメント全てのＣα１‐Ｃα４距離の分布を示すグラフ。
【図２】ａ）  黒三角によって強調した４個のＣα‐Ｃβベクトルによって各βターンを表す図。  ｂ）  クラスタリング後のターンの空間的配置の視覚化を助けるために、４つのねじり角θ１、θ２、θ３およびθ４を２４個の距離の近似として用いる図。  ｃ）  ４つのねじり角を、（θ１，θ２）（記号「ｘ」で表す）から（θ３，θ４）までのベクトルとしてプロットする図。
【図３】ｋth最短距離の近隣クラスタおよび最短距離重心ソートフィルタアルゴリズムから得られた７個のクラスタのベクトルプロットの図。０．６５ＲＭＳＤの閾値を用いた。
【図４】クラスタリングアルゴリズムおよびクラスタ３の２個のクラスタへの明示的な分割から形成された８個のクラスタのベクトルプロットの図。
【図５】クラスタリングアルゴリズムおよびクラスタ３の２個のクラスタへの明示的な分割ならびに初期シード内のタイプＩ’の平均構造を含めて形成された９個のクラスタのベクトルプロットの図。最後のグラフは棄却された形態を表し、最初の９個のグラフは９個のクラスタを表す。
【図６】９個の各クラスタ内のβターンを、クラスタの平均構造に重ね合わせた図。
【図７】クラスタ２のβターン構造を該クラスタの平均構造に重ね合わせた上面図。この図は、Ｃα‐Ｃβベクトルが均一に分布しているとしても、骨格構造が著しく変動し得ることを示している。
【図８】９個のクラスタの平均構造を重ね合わせた図。３つの原子Ｃα１、Ｃα２およびＣα３に基づいて重ね合わせている。
【図９】ハッチンソン（Hutchinson）およびソーントン（Thornton）２５によって定義された９タイプの各βターンのベクトルプロットの図。プロットの順番は、タイプ（Ｔｙｐｅ）Ｉ、ＩＩ、Ｉ’、ＩＶ、ＩＩ’、ＶＩａ１、ＶＩａ２、ＶＩＩＩおよびＶＩｂである。
【図１０】様々なＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴ値（近隣限界）について近隣ループの数とその頻度を示すグラフ。
【図１１】（１）ピークの数、（２）近隣が２０個を超えるピークの数、（３）近隣が２０個を超える固有ピークの数を、ＮＥＩＧＨＢＯＲ＿ＬＩＭＩＴの関数としてプロットしたグラフ。
【図１２】様々なＴＯＬＥＲＡＮＣＥ値（許容値）を用いて重心ソートフィルタアルゴリズムを使用し３９個のクラスタを得て、表記される割合、クラスタ内ＲＭＳＤ、クラスタ間ＲＭＳＤおよびクラスタ内ＲＭＳＤとクラスタ間ＲＭＳＤとの比を計算し、ＴＯＬＥＲＡＮＣＥの関数としてプロットしたグラフ。
【図１３】重心ソートフィルタアルゴリズムにおいて様々なＴＯＬＥＲＡＮＣＥ値を使用し、ループを３９個のシードのうちの１つに割り当て、クラスタ１に得られたループを重ね合わせて立体的に表し、許容値の選択の効果を示す図。各線は、白色で示すＣα原子の位置と、灰色で示すＣβ原子の位置とを繋いでいる。ＴＯＬＥＲＡＮＣＥ＝Ａ）０．３、Ｂ）０．５、Ｃ）０．７およびＤ）０．９
【図１４】３９個の各クラスタにおけるループの数を示すヒストグラム。
【図１５】３９個のクラスタのベクトルプロットの図。クラスタ番号１から開始して横列に沿って数えてから次の行になる。最後のクラスタであるクラスタ４０は、本発明者らの重心ソートフィルタアルゴリズムによってクラスタリングされなかったループ全てを表している。
【図１６】３９個のクラスタの平均結合クラスタリングから得られた樹形図。
【図１７】ボウタイの例を示す図。関数ｄ（ｘ，ｙ）は、点ｘと点ｙの間のユークリッド距離を表す（Ｈ＝ヘッド、Ｔ＝テール）。
【図１８】モチーフのマッチング頻度を見出すアルゴリズム。
【図１９】ピークモチーフを見出すアルゴリズム。
【図２０】モチーフをクラスタリングするワンパスアルゴリズム。
【図２１】ワンパスアルゴリズムのスパンの図。
【図２２】モチーフをクラスタリングするグリーディアルゴリズム。
【図２３】モチーフをクラスタリングするグリーディアルゴリズムのスパンの図。
【図２４】モチーフをクラスタリングするワンパスアルゴリズムとグリーディアルゴリズムを組合せたアルゴリズム。
【図２５】モチーフをクラスタリングするシーレベルを備えたグリーディアルゴリズム。
【図２６】シーレベルを備えたグリーディアルゴリズムのスパン。
【図２７】グリーディアルゴリズムと組合せて適用した適応シーレベル。
【図２８】ＲＭＳＤ許容値を備えたワンパスアルゴリズム。
【図２９】モチーフのサイズに対するモチーフの数を示すグラフ。
【図３０】各ファミリー許容値についての最高マッチング頻度を示すグラフ。
【図３１】代表的４‐モチーフＣ２９を示す図。
【図３２】代表的５‐モチーフＣ３０を示す図。
【図３３】代表的６‐モチーフＣ１を示す図。
【図３４】代表的７‐モチーフＣ１０を示す図。
【図３５】表面パッチのマッチング頻度を見出す擬似コード。
【図３６】初期パッチの作成のための擬似コード。
【図３７】より高次のＮ‐パッチを作成するための擬似コード
【図３８】９‐パッチの完全なグラフＫ９の図。
【図３９】ａ）共通のβターンモチーフにマッチする幾つかのスカフォールドの図。  ｂ）共通のループモチーフにマッチする幾つかのスカフォールドの図。  ｃ）共通の６残基の蛋白質間相互作用面にマッチするスカフォールドの図。クエリの共通モチーフを、セクションａ、ｂ、ｃ中の太線で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月17日(2004.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の共通の三次元の表面形状を記述する、コンピュータで実施される方法であって、
（ｉ）複数の蛋白質それぞれの三次元の表面形状を同定する工程と、
（ｉｉ）それぞれが前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の前記三次元の表面形状に由来する共通の表面形状を表すような記述子を１つ以上作成する工程と
を含む方法を提供する。
【請求項２】
工程（ｉ）において同定される三次元の表面形状それぞれが、各表面について２以上のアミノ酸の側鎖の位置および配向によって表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｉ）において、前記記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質それぞれについて３以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、３以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の各側鎖の共通の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の各側鎖の位置および配向が、三次元（３Ｄ）空間にある、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖が、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）において同定される三次元の表面形状それぞれが、前記蛋白質それぞれの表面の荷電領域として表される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）において、前記記述子のそれぞれが、前記複数の蛋白質のうち２以上の蛋白質の表面の共通の荷電領域を表す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
表面の荷電領域それぞれが、少なくとも４個の格子点によって表される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記格子点のそれぞれが、三次元（３Ｄ）空間において０．２〜２．０オングストローム離れている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記格子点のそれぞれが、三次元（３Ｄ）空間において０．５〜１．５オングストローム離れている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記記述子または前記記述子のそれぞれが、３以上の蛋白質について共通の荷電した蛋白質の表面形状を表す、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記の三次元の表面形状が、前記２以上の蛋白質それぞれの構造上の特徴の少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造上の特徴が、βターン、ループもしくは接触面であるか、またはβターン、ループもしくは接触面を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記構造上の特徴が、ループもしくは接触面であるか、またはループもしくは接触面を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触面が、不連続面および連続面のうち少なくともいずれかを１つ以上含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記記述子が、βターンまたはループの４個のアミノ酸の側鎖の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
前記記述子が、接触面の少なくとも３個のアミノ酸の側鎖の位置および配向を表す、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記記述子が、接触面の４、５、６または７個のアミノ酸側鎖についての側鎖の位置および配向を表す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛋白質の共通の三次元の表面形状を備えた１以上の分子を同定する、コンピュータで実施される方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す記述子を１以上用いてクエリを作成する工程と、
（ｉｉ）前記クエリを用いてデータベースを検索し、それによってそれぞれが前記記述子にマッチする１以上の分子に対応する前記データベース内の１以上のエントリーを同定する工程と
を含む方法。
【請求項２２】
工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通するアミノ酸側鎖の位置および配向を表す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）において、記述子は、２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｉ）において、クエリが、
（ａ）２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通する側鎖の位置および配向を表す記述子と、
（ｂ）前記２以上の蛋白質について共通の蛋白質表面の電荷の形状を表す記述子と、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記記述子を作成するために用いられる各アミノ酸側鎖が、Ｃα‐Ｃβベクトルとして簡素化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記クエリのＣα‐Ｃβベクトルが、距離マトリックスとして表わされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分子のライブラリを作成する、コンピュータで実施される方法であって、
（ｉ）データベースを検索して、それぞれが蛋白質の共通の表面形状にマッチする１以上の分子に対応する１以上のエントリーを同定する工程と、
（ｉｉ）分子のライブラリを作成するために、工程（ｉ）で同定された１以上の分子のうち少なくとも１つを用いる工程と
を含む方法。
【請求項２８】
前記分子のライブラリがバーチャルライブラリである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記分子のライブラリが合成化学ライブラリである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
１以上の分子を工学的に設計する方法であって、
（ｉ）それぞれが蛋白質の共通の三次元の表面形状を表す１以上の記述子を作成する工程と、
（ｉｉ）（ｉ）の記述子または記述子のそれぞれに従って、１以上の構造上の特徴をそれぞれ含む１以上の分子を工学的に設計する工程と
を含む方法。
【請求項３１】
記述子または記述子のそれぞれが、２以上の蛋白質それぞれについて２以上のアミノ酸の共通する側鎖の位置および配向を表す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
記述子または記述子のそれぞれが、前記２以上の蛋白質の共通する蛋白質表面の電荷の形状を表す、請求項３０に記載の方法。
【国際調査報告】
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