(57)【要約】定性的及び定量的プロテオーム分析用の方法及び装置が提供されている。該方法及び装置は、ペプチドの複合混合物からペプチドのサブセットを単離できるようにする。該単離は、１以上のペプチドタイプの特異的な化学的及び／又は酵素的改変に基づいている。この改変は、影響を受けるペプチドタイプの生物理学的、化学的又はその他の何らかの生化学的特性（例えば正味電荷及び／又は疎水性）を、改変されたペプチドを未改変ペプチドから分離できるような形で修飾する。
2005500990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離するための方法において、
（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと分離する工程；（ｂ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を、化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させて、改変されたペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）クロマトグラフィーによって各フラクションから前記改変されたか又はいわゆるフラグを立てたペプチドを単離する工程を含み、工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィーが同じタイプのクロマトグラフィーで実施される方法。
【請求項２】
工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
改変を受けるアミノ酸がアルギニン、プロリン、システイン、メチオニン、トリプトファン、リシン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニン及びこれらのうちの２つ又は３つの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
改変を受けるアミノ酸がメチオニンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改変を受けるアミノ酸がシステインである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
改変を受けるアミノ酸がメチオニン及びシステインである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
改変を受けるアミノ酸が翻訳と同時に又は翻訳後に修飾されたアミノ酸である、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項９】
翻訳と同時又は翻訳後の修飾が、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、硫酸化、ユビキチン化、アルキル化、ニトロシル化、酸化、ヒドロキシル化、及びメチル化及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
翻訳と同時に又は翻訳の後に修飾されたアミノ酸がリン酸化されたアミノ酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
翻訳と同時に又は翻訳の後に修飾されたアミノ酸がグリコシル化されたアミノ酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
翻訳と同時に又は翻訳の後に修飾されたアミノ酸がε−Ｎ−アセチル化されたアミノ酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程をさらに含む、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定工程が、データベース検索と組合せた形でタンデム質量分析計によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定工程が、データベース検索と組合せたポストソース分解分析によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記同定工程が、データベース検索と組合せてペプチドの質量を測定することによって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記同定工程がさらに、（ａ）改変されたアミノ酸の存在；（ｂ）フラグを立てたペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｃ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｄ）ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均の１つ以上に基づいている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質を含む１を越えるサンプルの中の少なくとも１つのタンパク質の相対量を決定する方法において、（ａ）第１の同位体を用いて第１のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｂ）第２の同位体で第２のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｃ）第２のサンプルのタンパク質ペプチド混合物と第１のサンプルのタンパク質ペプチド混合物を混ぜ合わせる工程；（ｄ）組合わされたタンパク質ペプチド混合物をクロマトグラフィーによってペプチドのフラクションへと分離させる工程；（ｅ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を、化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｆ）クロマトグラフィーによって各フラクションからのフラグを立てたペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｄ）と同じタイプのクロマトグラフィーを用いて実施される工程；（ｇ）単離されたフラグを立てたペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｈ）同一であるもののディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドのピークの高さを比較することにより、各サンプル中のフラグを立てたペプチドの相対量を計算する工程、及び（ｉ）前記フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程を含む方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｄ）及び（ｆ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似している、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
フラグを立てたペプチドの同一性の決定が、データベース検索と組合せたタンデム質量分析法、ポストソース分解分析、ペプチドの質量の測定及びアミノ末端ペプチドの質量の測定からなる群より選択された方法によって実施される、請求項１８、１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
フラグを立てたぺプチドの同一性を決定する工程がさらに、（ａ）改変されたアミノ酸の存在；（ｂ）フラグを立てたペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｃ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｄ）ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均のうちの１以上のものに基づいている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
サンプル中に存在する少なくとも１つのタンパク質の量を決定するための方法において、（ａ）タンパク質ペプチド混合物を調製する工程；（ｂ）その基準ペプチド対応物と比較してディファレンシャルに同位体により標識づけされた少なくとも１つの合成基準ペプチドを既知の量だけ混合物に添加し、それによって前記合成基準ペプチド及び前記基準ペプチド対応物が工程（ｄ）で改変されることになる工程；（ｃ）クロマトグラフィーによって混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｄ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させる工程；（ｅ）クロマトグラフィーによって各フラクションからのフラグを立てたペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｃ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｆ）フラグを立てたペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｇ）合成基準ペプチドのピーク高さをその基準ペプチドと比較することによってサンプル中に存在するタンパク質の量を計算する工程、及び（ｈ）前記基準ペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程を含む方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）及び（ｅ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似している、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
基準ペプチドの同一性の決定が、データベース検索と組合せたタンデム質量分析法、ポストソース分解分析、ペプチドの質量の測定及びアミノ末端ペプチドの質量の測定からなる群より選択された方法によって実施される、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
基準ぺプチドの同一性を決定する工程がさらに、（ａ）改変されたアミノ酸の存在；（ｂ）基準ペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｃ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｄ）ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均のうちの１以上のものに基づいている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離するための方法において、
（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｂ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させて、未改変ペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）クロマトグラフィーによって各フラクションから前記未改変の又はいわゆる同定ペプチドを単離する工程を含み、工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィーが同じタイプのクロマトグラフィーで実施される方法。
【請求項２９】
工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似したのである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ａ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
同定ペプチドは、アミノ末端がブロックされたペプチドである、請求項２８、２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
同定ペプチドがアミノ末端ペプチドである、請求項２８、２９又は３０に記載の方法。
【請求項３３】
同定ペプチドがカルボキシ末端ペプチドである、請求項２８、２９又は３０に記載の方法。
【請求項３４】
同定ペプチドが、内部的に、タンパク質分解により処理されたペプチドである、請求項２８、２９又は３０に記載の方法。
【請求項３５】
インビボでブロックされたアミノ末端ペプチドとインビボでブロックされない遊離のアミノ末端ペプチドとを区別する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
同定ペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程をさらに含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記同定工程が、データベース検索と組合せた形でタンデム質量分析計によって支援される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記同定工程が、データベース検索と組合せてポストソース分解分析によって支援される請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記同定工程が、データベース検索と組合せてペプチドの質量を測定することによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記同定工程がさらに、（ａ）同定ペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｂ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｃ）ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均のうちの１以上のものに基づいている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質を含む複数のサンプルの中の少なくとも１つのタンパク質の相対量を決定する方法において、（ａ）第１の同位体を用いた第１のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｂ）第２の同位体で第２のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｃ）第２のサンプルのタンパク質ペプチド混合物と第１のサンプルのタンパク質ペプチド混合物を混ぜ合わせる工程；（ｄ）組合わされたタンパク質ペプチド混合物をクロマトグラフィーによってペプチドのフラクションへと分離させる工程；（ｅ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｆ）クロマトグラフィーによって各フラクションからの同定ペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｄ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｇ）単離された同定ペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｈ）同一であるもののディファレンシャルに同位体で標識づけされた同定ペプチドのピーク高さを比較することにより、各サンプル中の同定ペプチドの相対量を計算する工程、及び（ｉ）前記同定ペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程を含む方法。
【請求項４２】
工程（ｄ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ｄ）及び（ｆ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似している、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
同定ペプチドの同一性の決定が、データベース検索と組合せたタンデム質量分析法、ポストソース分解分析、ペプチドの質量の測定及びアミノ末端ペプチドの質量の測定からなる群より選択された方法によって実施される、請求項４１、４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
同定ぺプチドの同一性を決定する工程がさらに、（ａ）同定ペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｂ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｃ）ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均のうちの１以上のものに基づいている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
サンプル中に存在する少なくとも１つのタンパク質の量を決定するための方法において、（ａ）タンパク質ペプチド混合物を調製する工程；（ｂ）その基準ペプチド対応物と比較してディファレンシャルに同位体により標識づけされた少なくとも１つの合成基準ペプチドを既知の量だけ混合物に添加し、それによって前記合成基準ペプチド及び前記基準ペプチド対応物が工程（ｄ）で改変されることになる工程；（ｃ）クロマトグラフィーによって混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｄ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に、又は酵素的に、又は化学的かつ酵素的に改変させる工程；（ｅ）クロマトグラフィーによって各フラクションからの同定ペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｃ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｆ）同定ペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｇ）合成基準ペプチドのピーク高さをその基準ペプチド対応物と比較することによってサンプル中に存在するタンパク質の量を計算する工程及び（ｈ）前記基準ペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程を含む方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）の前に１以上の前処理工程が存在する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ｃ）及び（ｅ）のクロマトグラフィー条件が同じか又は実質的に類似している、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
基準ペプチドの同一性の決定が、データベース検索と組合せたタンデム質量分析法、ポストソース分解分析、ペプチドの質量の測定及びアミノ末端ペプチドの質量の測定からなる群より選択された方法によって実施される、請求項４６、４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
基準ぺプチドの同一性を決定する工程がさらに、（ａ）基準ペプチド内の遊離アミノ基の数の決定；（ｂ）タンパク質ペプチド混合物を生成するのに用いられるプロテアーゼの分割特異性についての知識；及び（ｃ）基準ペプチドのハイドロフォビシティーの大平均のうちの１以上のものに基づいている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
疾病又は疾病に対する素因を診断するために使用される、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
規定の条件セットの下でタンパク質ペプチド混合物を複数のフラクションへと分離するための一次クロマトグラフィーカラムであって、それによって各フラクションがその後少なくとも１つのアミノ酸の改変を受けてフラグを立てたペプチドを生成し、かつ改変されたフラクションはプールされたフラクションのセットにプールされ、各々のプールされたフラクションが少なくとも２つの改変されたフラクションを含んでいる一次クロマトグラフィーカラム；及び第１のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラムと並列に配置された少なくとも第２の二次クロマトグラフィーカラムを含む二次クロマトグラフィーカラムセットであって、規定の条件セットと実質的に同一である条件の下でフラグを立てたペプチドの単離を行ない、それによって（ｉ）１つのプール内又はプール間での異なるフラクションからのフラグを立てたペプチドの間及び（ii）フラグを立てたペプチドと未改変ペプチドの間で溶出オーバラップが全く存在しない二次クロマトグラフィーカラムセット、を含む、ペプチドをソーティングするためのシステム。
【請求項５３】
規定の条件セットの下でタンパク質ペプチド混合物を複数のフラクションへと分離するための一次クロマトグラフィーカラムであって、それによって各フラクションがその後少なくとも１つのアミノ酸の改変を受けて改変されたペプチドと未改変ペプチドを生成し、かつ改変されたフラクションはプールされたフラクションのセットにプールされ、各々のプールされたフラクションが少なくとも２つの改変されたフラクションを含んでいる一次クロマトグラフィーカラム；及び第１のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラムと並列に配置された少なくとも第２の二次クロマトグラフィーカラムを含む二次クロマトグラフィーカラムセットであって、規定の条件セットと実質的に同一である条件の下で同定ペプチドの単離を行ない、それによって（ｉ）１つのプール内又はプール間での異なるフラクションからの同定ペプチドの間及び（ii）同定ペプチドと改変されたペプチドの間で溶出オーバラップが全く存在しない二次クロマトグラフィーカラムセット、を含む、ペプチドをソーティングするためのシステム。
【請求項５４】
第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２の二次クロマトグラフィーカラムからの溶出物を回収するための第２のクロマトグラフィーカラムセットに対する出口をさらに含む、請求項５２〜５３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５５】
出口に連結された分析装置をさらに含む、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
二次クロマトグラフィーカラムセットから廃棄物を回収するための出口に連結された廃棄物容器をさらに含む、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５７】
第１の二次カラム及び第２の二次カラムのうちの１つの中にプールされたフラクションを注入するため二次クロマトグラフィーカラムセットに結合されたサンプルインジェクターをさらに含む、請求項５２〜５３に記載のシステム。
【請求項５８】
サンプルインジェクターから、第１の二次カラム及び第２の二次カラムのうちの１つまでプールされたフラクションを導くためのサンプル注入バルブセットをさらに含む、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
二次クロマトグラフィーカラムセットに対し溶媒勾配を提供するための溶媒システムをさらに含む、請求項５２〜５３に記載のシステム。
【請求項６０】
溶媒システムが、第１の二次クロマトグラフィーカラムに対して溶媒勾配を提供するための第１の溶媒ポンプ及び第２の二次クロマトグラフィーカラムに対して溶媒勾配を提供するための第２の溶媒ポンプを含む、請求項５９に記載のシステム。
【請求項６１】
溶媒システムが、第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２の二次クロマトグラフィーカラムに連結された溶媒ポンプ；第１の二次クロマトグラフィーカラムへの溶媒流量を調節するための第１の流速調節器及び第２の二次クロマトグラフィーカラムへの溶媒流量を調節するための第２の流速調節器が含まれている、請求項５９に記載のシステム。
【請求項６２】
二次クロマトグラフィーカラムセットから溶出物を回収するためのフラクションコレクターをさらに含む、請求項５２〜５３に記載のシステム。
【請求項６３】
サンプル注入バルブセットを制御するためのバルブ制御システムをさらに含む、請求項５８に記載のシステム。
【請求項６４】
第１及び第２の二次クロマトグラフィーカラムが、一次カラムと実質的に同一である、請求項５２〜５３に記載のシステム。
【請求項６５】
第１の溶媒勾配が一次カラムに適用され、タンパク質ペプチド混合物の分離をもたらし、第１の溶媒勾配と実質的に同一のものである第２の溶媒勾配が二次カラムに適用され、プールされたフラクションの分離をもたらされる、請求項５２〜５３に記載のシステム。
【請求項６６】
第１のクロマトグラフィーカラム及び第１のクロマトグラフィーカラムと実質的に並列に配置された第２のクロマトグラフィーカラムを含む第１のクロマトグラフィーカラムセット、第１のクロマトグラフィーカラムセットにサンプルを提供するための第１のサンプルインジェクター、第１の予め定められた時点で第１のクロマトグラフィーカラムに対し予め定められた溶媒勾配を提供するための第１の溶媒システム、第３のクロマトグラフィーカラム及び第３のクロマトグラフィーカラムと実質的に並列に配置された第４のクロマトグラフィーカラムを含む第２のクロマトグラフィーカラムセット、第２のクロマトグラフィーカラムセットにサンプルを提供するための第２のサンプルインジェクター、及び第１の予め定められた時点に続く第２の予め定められた時点で第２のクロマトグラフィーカラムに対し予め定められた溶媒勾配を提供するため第２の溶媒システムを含むペプチドをソーティングするためのシステム。
【請求項６７】
クロマトグラフィーカラムから廃棄物を回収するため、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムセットの出力端に連結された廃棄物容器をさらに含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
カラムから溶出物を回収するため、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムセットの出力端に連結されているフラクションコレクターをさらに含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６９】
第１及び第２のクロマトグラフィーカラムの出力端に連結された分析装置をさらに含む請求項６６に記載のシステム。
【請求項７０】
クロマトグラフィーカラムの入口を制御するためクロマトグラフィーカラムの入口に連結された入口バルブセットをさらに含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項７１】
カラムから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つにまで溶出物を導くためクロマトグラフィーカラムの出口に連結された出口バルブセットをさらに含む、請求項７０に記載のシステム。
【請求項７２】
入口バルブセット及び出口バルブセットを制御するためのバルブ制御システムをさらに含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７３】
タンパク質ペプチド混合物のフラクションセットを提供する工程；第１の並列なクロマトグラフィーカラムセット及び第２の並列なクロマトグラフィーカラムセットを含むペプチドをソーティングするためのシステムを提供し、タンパク質ペプチド混合物の第１のフラクションセットを第１のカラムセットにかける工程；タンパク質ペプチド混合物の第２のフラクションセットを第２のカラムセットにかける工程；第１の予め定められた時間に第１のカラムセット内に溶媒勾配を提供し、第１のフラクションセットの分離を初期化する工程；及び第１の予め定められた時間に続く第２の予め定められた時間に第２のカラムセット内に溶媒勾配を提供し、第２のフラクションセットの分離を初期化する工程を含む、ペプチド分離方法。
【請求項７４】
第１のカラムセットから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つにまで溶出物を導く工程をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
第２のカラムセットから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つにまで溶出物を導く工程をさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ａ）タンパク質ペプチド混合物を分離するための一次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；（ｂ）規定の条件セット下でタンパク質ペプチド混合物を１セットのフラクションへと分離するべく一次クロマトグラフィーカラム内にタンパク質ペプチド混合物を注入する工程；（ｃ）フラクションセット内のフラクションのうちの少なくとも１つを改変させて１セットの改変されたフラクションを形成する工程であって、改変されたフラクションがフラグを立てたペプチドのサブセット及び未改変ペプチドのサブセットを含む工程；（ｄ）第１の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションをプールして第１のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第１及び第２の改変されたフラクションからのフラグを立てたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの未改変ペプチドとフラグを立てたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｅ）第３の改変されたフラクションと第４の改変されたフラクションをプールして第２のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第３及び第４の改変されたフラクションからのフラグを立てたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの未改変ペプチドとフラグを立てたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｆ）未改変ペプチドのサブセットからフラグを立てたペプチドのサブセットを分離するため第１の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｇ）規定の条件セット下で二次クロマトグラフィーカラムを用いて第１のプールされたフラクションを分離し、第１の改変されたフラクション及び第２の改変されたフラクション内のフラグを立てたペプチドのサブセットを単離する工程を含む、タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチドを単離する方法。
【請求項７７】
（ａ）タンパク質ペプチド混合物を分離するための一次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；（ｂ）一次クロマトグラフィーカラム内にタンパク質ペプチド混合物を注入し、規定の条件セット下でタンパク質ペプチド混合物を１セットのフラクションへと分離する工程；（ｃ）フラクションセット内のフラクションのうちの少なくとも１つを改変させて１セットの改変されたフラクションを形成する工程であって、改変されたフラクションが改変されたペプチドのサブセット及び同定ペプチドのサブセットを含む工程；（ｄ）第１の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションをプールして第１のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第１及び第２の改変されたフラクションからの改変されたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの同定ペプチドと改変されたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｅ）第３の改変されたフラクションと第４の改変されたフラクションをプールして第２のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第３及び第４の改変されたフラクションからの同定ペプチドの間及び、ii）前記フラクションの同定ペプチドと改変されたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｆ）同定ペプチドのサブセットから改変されたペプチドのサブセットを分離するため第１の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｇ）規定の条件セット下で二次クロマトグラフィーカラムを用いて第１のプールされたフラクションを分離し、第１の改変されたフラクションを第２の改変されたフラクション内の同定ペプチドのサブセットを単離する工程を含む、タンパク質ペプチド混合物中の同定ペプチドを単離する方法。
【請求項７８】
規定の条件セット下で第１の二次クロマトグラフィーカラムを用いて第２のプールされたフラクションを分離し、第３の改変されたフラクション及び第４の改変されたフラクション内のフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのサブセットを単離する工程をさらに含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
【請求項７９】
（ｈ）フラクション内の未改変ペプチドのサブセットから改変されたペプチドサブセットを分離するための、第１の二次クロマトグラフィーカラムと実質的に並列して配置された第２の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｉ）規定の条件セット下で第２の二次クロマトグラフィーカラムを用いて第２のプールされたフラクションを分離し、第３の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションの中の改変されたペプチドのサブセットを単離する工程をさらに含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
【請求項８０】
フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを分析装置まで導く工程をさらに含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
【請求項８１】
データベース検索と組合せて、分析装置を用いて同定ペプチド又はフラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の要約
定性及び定量的プロテオーム分析のための方法及び装置が提供されている。該方法及び装置は、ペプチドの複合混合物の中からペプチドサブセットを単離することを可能にする。該単離は、１以上のタイプのペプチドの特異的な化学的及び／又は酵素的改変に基づいている。この改変は、改変されたペプチドを未改変ペプチドから分離できるような方法で、影響を受けたタイプのペプチドの生物理学的、化学的又はその他のあらゆる生化学的特性（例えば正味の電荷及び／又はハイドロフォビシティ）を修飾する。
【０００２】
１実施態様においては、この改変は、第１及び第２の分離中で同じタイプのクロマトグラフィー分離を用いて、複合ペプチド混合物の第１のクロマトグラフィー分離と改変された複合混合物の間で適用される。「同じタイプのクロマトグラフィー分離」というのは、第１及び第２の両方のクロマトグラフィー分離が疎水性に基づいているか又は両方がイオン交換に基づいていることを意味する。したがって、本発明の方法では、その溶出又は移動パターンに基づいて複合ペプチド混合物をフラクションに分離する第１の分離工程が利用される。その後、各々のフラクションは、化学的又は酵素的にか又は化学的かつ酵素的に駆動され得る特異的改変反応に付される。このとき各フラクションは第２の分離に再度付される。ｉ）改変のタイプ及びii）分離条件に基づき、各フラクション内のペプチドの改変されたサブセットは、未改変ペプチドから分離した状態で溶出又は移動することになる。さらに本発明は、並列のみ、直列のみ又は直列／並列組合せモードのいずれかで実施することができる単一カラムシステム又は同一又は類似のカラムの多重カラムシステムのいずれかを用いて、選択的にかつ効率良く該方法を実施するための装置を提供する。単離されたペプチドを、その後漸進的かつ逐次的に放出させ、同定のため分析システムに移行させることができる。
【０００３】
発明の背景
プロテオームは、細胞、組織型又は生体により発現されるタンパク質の全体の補足として定義づけされてきており、プロテオミクスというのは、一定の与えられた時点で又はある種の環境条件下で発現されるこの補足の研究である。このような包括的分析には、何千ものタンパク質が単一のサンプルから日常的に同定され特徴づけされることが必要となる。２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）は、２Ｄゲル上で最高数千ものタンパク質スポットを表示する分離を生み出す、プロテオミクスにとって重要なツールであるものとみなされている。ゲル内のタンパク質は、異なるサンプルからのゲルの間での定量化及び比較を可能にするさまざまな染色液を使用することによってある程度までは検出可能である。タンパク質の同定は、例えば、タンパク質スポットを切除し、周知の特異性をもつプロテアーゼでスポットを消化することによって可能である。かかる切断からもたらされるペプチドは、質量分析法によりその後決定され得る特定の質量を有する。これらのデータは、データベース内のペプチドの質量と比較される。後者の質量は、例えば、ＤＮＡ配列データから出発して各タンパク質及びその分割フラグメントの分子量を計算することによって得られる、インシリコ（in silico）でのデータである。分光分析的に精確に決定されたペプチドの質量が、コンピュータ内でのペプチドの質量と整合した場合、往々にして、これだけでそのペプチドをその親タンパク質に対し注釈付けするのに充分である。あるいはまた、逆に、サンプル中の特定のタンパク質を、その成分であるペプチドフラグメントのうちの１以上のものを同定することによって同定することが可能である（いわゆるペプチドマスフィンガープリンティング）。
【０００４】
しかしながら、２Ｄ−ＰＡＧＥは、逐次的で労働集約的であり、自動化が困難である。さらに、膜タンパク質、非常に大きい及び小さいタンパク質及びきわめて酸性又は塩基性の高いタンパク質といったような特定のクラスのタンパク質は、この方法を用いて分析するのが困難である。もう１つの重要な欠点は、全細胞溶解物の分析時に存在度が比較的低い調節タンパク質（例えば転写因子及びタンパク質キナーゼ）が、検出されることはまれであることから、分析がきわめて豊富なタンパク質の方へと偏向するという点にある。
【０００５】
このような欠点のため、科学者達は、各タンパク質を均質に到るまで精製する必要がないプロテオームを分析するための代替的アプローチを探し求めてきた。これらの技術はここでは「ゲルフリーシステム」と呼ばれ、ゲル分離工程を使用しない。ペプチド質量フィンガープリントアプローチは、タンパク質をその構成ペプチドのうちの１以上のものの質量に基づいて同定できるということを我々に教示した。生体サンプル内のタンパク質を分析する１つのアプローチは、タンパク質をタンパク質分解し、結果として得たペプチドの質量を決定することであった。サンプルが少量の異なるタンパク質しか含有しないかぎり、結果として得られるペプチドの数は少なく、ペプチドをクロマトグラフィーにより分離しその後質量分析法で分析することによって同定され得る。大部分の複合生体サンプルでは、タンパク質のタンパク質分解は何千個ものペプチドを産生することになり、これは、あらゆる既知のクロマトグラフィーシステムの分解能力を超える。その結果、個々のペプチドの同時溶出ひいては不充分な分離及び単離がもたらされる。さらに、このようなクロマトグラフィーと結合させた質量分析法の分解能は、個々のペプチドの質量を適切に決定するのに充分なものではない。ペプチドの複雑な混合物の分解能を改善する１つのアプローチは、大型タンパク質複合体の直接的分析（ＤＡＬＰＣ）という最近記述されたプロセスのような多次元クロマトグラフィーを使用することにある（Link et al.(1999)）。ＤＡＬＰＣプロセスは、強いカチオン交換と逆相クロマトグラフィーの組合せによって複合ペプチド混合物を解像するために電荷の独立した物理的特性及び疎水性を使用する。この方法は、複合混合物のその個々の成分への分離を改善するものの、このアプローチの分解能は、生体サンプル中の成分ペプチドを再現性ある形で同定するのになおも大いに不充分なものである。ＤＡＬＰＣ方法のさらなる欠点は、低い存在度のタンパク質の分析との非相溶性及び、定量的に使用できないという点にある。
【０００６】
最近記述された第２のアプローチ、ＩＣＡＴ−方法は、同位体コード化親和力タグ（ＩＣＡＴＳ）と呼ばれる新しい化学的試薬とタンデム質量分析法（Gygi et al(1999)）の組合せの使用に基づいている。ＩＣＡＴ−方法は、ビオチン標識を担持するヨードアセテート誘導体によるシステイン含有タンパク質の修飾に基づいている。修飾されたタンパク質を酵素によりペプチドへと分割した後、システイン修飾された標識づけされたペプチドのみが、親和力精製工程で、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズで引き下ろされる。親和力精製工程は、もとのペプチド混合物の複合体を削減し、質量分析法と組合せた液体クロマトグラフィーによる成分ペプチドの分離を、より実現可能な現実的目標にする。しかしながら、欠点は、親和力精製工程が一般に、精製工程中の材料損失のためより大量の出発材料が必要となるという点にある。さらにＩＣＡＴ標識は、ＭＳ分析全体を通して各ペプチド上にとどまり、特に小型ペプチドについてのデータベース検索アルゴリズムを複雑なものにする比較的大きな修飾（〜５００Da）である。該方法は同様に、いかなるシステイン残基も含有しないタンパク質については役立たない。その上、親和力精製工程のため、修飾されたペプチドは一度に生成され、いわゆる圧縮混合物の形で放出される。このことはすなわち、最適なクロマトグラフィー分離が全く存在せず、修飾されたペプチドの質量分析法による検出の効率が比較的低いものであることを意味している。同様に、２つのその他の刊行物（Geng et al., 2000及びJi et al., 2000）では、ペプチドサブセットを選択するために親和力クロマトグラフィーが使用され、対応する親タンパク質を同定するのに単離された署名ペプチド（signature peptide）が使用されている。
【０００７】
本発明は、多次元クロマトグラフィーを必要とせずかつ親和力タグを使用しない定性的及び定量的プロテオーム分析用の新規のゲルフリーの方法を記述するものである。この方法はきわめて適応性があり、大量の異なるペプチドクラスに適用でき、少数の細胞しか含まない生体サンプルにさえ適用可能である。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、複合ペプチド混合物からのペプチドのサブセットの単離及び同定のための方法及び装置を提供する。
【０００９】
該方法は、第２のクロマトグラフィー分離における改変されたペプチドのクロマトグラフィーの作用がその未改変バージョンのクロマトグラフィーの作用と異なっているような形で、選択されたペプチド集団が改変される工程によって分離された、同じタイプの２つのクロマトグラフィー分離の組合せを利用するものである。
【００１０】
タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離するために、本発明は、２つの作用モードで応用可能である。第１のモードでは、タンパク質ペプチド混合物中の少数のペプチドが改変され、改変されたペプチドのサブセットが単離される。この作用モードでは、改変されたペプチドはフラグを立てたペプチドと呼ばれる。第２のモードでは、タンパク質ペプチド混合物中の多数のペプチドが改変され、未改変ペプチドのサブセットが単離される。この作用モードでは、未改変ペプチドは、同定ペプチドと呼ばれる。
【００１１】
１つの実施態様において本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離するための方法において、（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｂ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させて、改変されたペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）クロマトグラフィーによって各フラクションから前記改変された又はいわゆるフラグを立てたペプチドを単離する工程を含み、工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィーが同じタイプのクロマトグラフィーで実施される方法を提供している。
【００１２】
もう１つの実施態様において、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離するための方法において、
（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと最初に分離させる工程；（ｂ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させて、未改変ペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）第２のクロマトグラフィーによって前記未改変の又はいわゆる同定ペプチドを単離する工程を含み、最初の及び第２の分離工程のクロマトグラフィーが同じタイプのクロマトグラフィーで実施される方法を提供している。
【００１３】
同じタイプのクロマトグラフィーというのは、クロマトグラフィータイプが最初の分離と第２の分離において同じであることを意味する。クロマトグラフィーのタイプは、例えば両方の分離においてペプチドの疎水性に基づくものである。同様にして、クロマトグラフィーのタイプは、両方の工程において、ペプチドの電荷及びイオン交換クロマトグラフィーの利用に基づくものであり得る。さらにもう１つの変形態様では、クロマトグラフィー分離は、両方の工程において、サイズ排除クロマトグラフィー又はその他のあらゆるタイプのクロマトグラフィーに基づいている。
【００１４】
改変の前の第１のクロマトグラフィー分離は、以下では「一次ラン」又は「一次クロマトグラフィー工程」又は「一次クロマトグラフィー分離」又は「ラン１」と呼ばれている。改変されたフラクションの第２のクロマトグラフィー分離は、以下では「二次ラン」又は「二次クロマトグラフィー工程」又は「二次クロマトグラフィー分離」又は「ラン２」と呼ばれる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様においては、一次ラン及び二次ランのクロマトグラフィー条件は同一であるか；又は当業者にとっては実質的に類似している。実質的に類似したというのは、例えば、そのクロマトグラフィー条件が、一次ランから回収されたすべてのフラクションについて非改変ペプチドとは予測可能な形で全く異なっている改変されたペプチドの溶出を導くものであるかぎり、一次ランと二次ランの間で流量及び／又は勾配及び／又は温度及び／又は圧力及び／又はクロマトグラフィー用ビーズ及び／又は溶媒組成のわずかな変更が許容されるということを意味する。
【００１６】
ここで使用される「タンパク質ペプチド混合物」というのは、標準的には、タンパク質を含むサンプルの解裂の結果として得られる複合ペプチド混合物である。かかるサンプルは、標準的には、制限的な意味無く、原核細胞又は真核細胞溶解物といったタンパク質のあらゆる複合混合物又は１つの細胞、又は特定の細胞小器官フラクション、生検、レーザー捕捉切開細胞から単離されたタンパク質のあらゆる複合混合物又はリボソーム、ウイルスなどといったあらゆる大型タンパク質複合体である。かかるタンパク質サンプルがペプチドに分割された場合、それらは、最高１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、１００，０００以上の異なるペプチドを含有しうるということが予想できる。しかしながら、特定のケースでは、「タンパク質ペプチド混合物」は同様に、直接体液から又はより一般的に生体起源のあらゆる溶液に由来していてもよい。例えば、尿はタンパク質以外に、腎臓によってペプチドが除去される体内タンパク質のタンパク質分解による分解の結果としてもたらされる非常に複合度の高いペプチド混合物を含有している。タンパク質ペプチド混合物のさらにもう１つの例としては、脳脊髄液中に存在するペプチドの混合物がある。
【００１７】
さらに一般的に言うと、本発明は、あらゆる複合ペプチド混合物に適用される。本願で使用される、「複合ペプチド混合物」というのは、１００以上、標準的には５００以上、さらに標準的には１０００以上の異なるペプチドの混合物を意味している。本発明では、「タンパク質ペプチド混合物」及び「複合ペプチド混合物」という語は、互換的に使用される。
同様に本願で使用されるように、タンパク質ペプチド混合物からの「ペプチドのサブセット」というのは、タンパク質ペプチド混合物内に存在する全ペプチド数のうちのあるフラクションを意味する。かかるフラクションは、確実に初期ペプチド数の５０％未満であり、標準的に２０％未満、さらに標準的にはタンパク質ペプチド混合物中の初期ペプチド数の１０％未満を占めることになる。
【００１８】
本願でペプチドに関して使用されているような「改変する」又は「改変された」又は「改変」という語は、修飾されたアミノ酸を含有するペプチドのクロマトグラフィー挙動を変えるという明確な意図をもって、ペプチドのアミノ酸の中に特異的修飾を導入することを意味する。本願で使用される「改変されたペプチド」という語は、改変の結果として修飾されているアミノ酸を含有するペプチドである。
【００１９】
かかる改変は、安定した化学的又は酵素的修飾でありうる。またかかる改変は、アミノ酸との一時的相互作用を導入することもできる。標準的には、１つの改変は共有結合反応となるが、改変は、複合体がクロマトグラフィー工程中充分安定していることを条件とし、複合体形成から成っていてもよい。
【００２０】
標準的には、改変は、その未改変バージョンと異なり、改変されたペプチドが疎水性クロマトグラフィーにおいて移動するような形で、疎水性の変化を結果としてもたらす。代替的には、改変は、その未改変バージョンと異なり、改変されたペプチドがイオン交換クロマトグラフィー例えばアニオン交換又はカチオン交換クロマトグラフィー内で移動するような形で、ペプチドの正味電荷の変化を結果としてもたらす。同様に、改変は、改変されたペプチドがその未改変バージョンとは異なってクロマトグラフィー分離内で移動するような形で、ペプチド内のその他のあらゆる生化学、化学又は生物物理学的変化を結果としてもたらす可能性がある。「異って移動する」という語は、特定の改変されたペプチドが、同じ非改変ペプチドの溶出時間に比べて異なる溶出時間で溶出することを意味する。
【００２１】
改変は、化学的及び酵素的反応又はそれらの組合せによって得ることができる。化学的反応の制限的意味のないリストとしては、アルキル化、アセチル化、ニトロシル化、酸化、水酸化、メチル化、還元などが含まれる。酵素的反応の制限的意味のないリストには、ペプチド上に存在する翻訳と同時又は翻訳後修飾を修飾するホスファターゼ、アセチラーゼ、グリコシダーゼ又はその他の酵素でのペプチドの処理が含まれる。化学的改変は、１つの化学的反応を含むことができるが、同様に、例えば改変効率を増大するための２つの連続的反応といったような複数の反応（例えばβ−脱離反応及び酸化）を含むこともできる。同様にして、酵素的改変は、１以上の酵素的反応を含むことができる。
【００２２】
本発明の中の改変のもう１つの不可欠な特徴は、改変により、タンパク質ペプチド混合物からのペプチドサブセットの単離が可能となるという点にある。タンパク質ペプチド混合物内の全てのペプチドの全体的修飾を結果としてもたらす化学的及び／又は酵素的反応は、ペプチドサブセットの単離を可能にすることがない。したがって改変は、それが同じタイプの２つのクロマトグラフィー分離の間に適用された場合に、ペプチドのサブセットの単離を可能にするべくタンパク質ペプチド混合物内の特定のペプチド集団を改変しなければならない。
【００２３】
フラグを立てたペプチドから成るペプチドサブセットを単離することができるための１つのアプローチは、希アミノ酸にその改変をターゲティングすることにある。希アミノ酸は、複合ペプチド混合物内に過度に豊富に存在しないアミノ酸としてみなされている。例えば、特異的アミノ酸がペプチド混合物の中の過度に豊富な部分を占めているとすると（例えばペプチドの５０％以上）、過度に多くのペプチドが選択されることになり、フラグを立てたペプチドの効率の良い分離及び単離は再び不可能となるだろう。好ましくは、複合ペプチドからのペプチドの３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満又はそれ以上に低い割合が選択される。
【００２４】
好ましい１実施態様においては、改変のために選択された特異的アミノ酸は、以下のアミノ酸のうちの１つを含む：すなわち、メチオニン（Ｍｅｔ）、システイン（Ｃｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、リシン（Ｌｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）又はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）。
【００２５】
代替的には、改変は特異的に、翻訳と同時又は翻訳後修飾を担持するアミノ酸集団にターゲティングされる。かかる翻訳と同時又は翻訳後修飾の例としては、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ホルミル化、ユビキチン化、ピログルタミル化、水酸化、ニトロシル化、ε−Ｎ−アセチル化、硫酸化、ＮＨ2−末端ブロック化がある。本発明に従ってペプチドサブセットを単離するために改変された修飾済みアミノ酸の例としては、ホスホセリン（phospho-Ser）、ホスホ−トレオニン（phospho-Thr）、ホスホ−アスパラギン酸塩（phospho-Asp）、又はアセチル−リシンがある。
【００２６】
改変可能でかつペプチドサブセットを選択するために使用できるアミノ酸の制限的な意味のないさらなるリストとしては、その他の修飾済みアミノ酸（例えばグリコシル化アミノ酸）、人工的に取込まれたＤ−アミノ酸、セレノアミノ酸、非天然同位体を担持するアミノ酸などがある。改変は同様に、インビトロで或る種のアミノ酸に付加された１以上のアミノ酸又は修飾上の特定の残基（例えばフリーＮＨ2−末端基）をターゲティングすることもできる。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様においては、選択された改変対象アミノ酸は、希であるもののそれでもタンパク質を含むサンプル中の大部分のタンパク質内に存在していなければならない。この実施態様は、サンプルのタンパク質の大部分を占めるフラグを立てたペプチドの単離を可能にする。大部分のタンパク質は、少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ又は制限された数の選択されたアミノ酸の残基を含有しているべきである。例えば、システインは、希アミノ酸であり、E. coliゲノム配列からの読取り枠及び／又はタンパク質のわずか１４．５５％だけがＣｙｓを含有していない。これらの数字はそれぞれ、Ｔｒｐについては１１．３４％、Ｈｉｓについては４．１２％、Ｍｅｔについては０．３２％である。後者の数字は、頻繁にプロセスされる、イニシエータメチオニンの削除後３．１７％まで増大する。Swiss-Protデータベース（リリース３９．０）内に記憶されているその他のゲノム配列を用いた類似の理論的分析が表Ｉにまとめられている。これらの研究は、希アミノ酸の中でも、メチオニンが、哺乳動物、酵母及びE. coliといった多様な種の中でのすぐれたタンパク質代表性を表わしていることを明らかにしている。タンパク質の９６％以上が少なくとも１つの内部メチオニンを含有している。この数は、生体に応じて、予測されたタンパク質の８５％〜９５％の中に存在するシステインについては一貫してさらに低いものである。これらの値は、２．３％のタンパク質がＭｅｔを含まず、一方１２．８％のタンパク質にＣｙｓが欠如していたということを示す７２，１０１の配列を用いたフラグメント補正されたＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＳＷＩＳＳ−ＮＥＷ注釈付きデータベースに基づく早期研究の結果と合致した（Vuong et al., 2000）。さらにこれらの研究は、異なるタンパク質上でＣｙｓよりもＭｅｔの方がより均質に分布していることを明らかにした。
【００２８】
メチオニンは、本発明では好ましくは改変のためにターゲティングされているアミノ酸である。システイン、ヒスチジン及びトリプトファンは、同様に好ましいアミノ酸である。リシン、フェニルアリニン及びチロシンといったようなその他のさほど頻繁に見られないアミノ酸もまた、本発明において使用可能である。改変すべきアミノ酸の選択は同様に、サンプルタンパク質の複合体及び由来（例えば植物、動物、細菌又はウイルス）によっても左右される。例えば、植物では、メチオニンは、代表性の低いアミノ酸であり、したがって改変すべき特異的アミノ酸としてシステインといったアミノ酸を選択することがより適切である。
【００２９】
代替的には、特異的化学的及び／又は酵素的反応は、１つ以上のアミノ酸残基（例えばホスホセリン及びホスホトレオニン又はメチオニンとシステインの組合せの両方）に対する特異性をもち、タンパク質ペプチド混合物からのペプチドサブセットの分離を可能にする。しかしながら標準的には、改変すべき選択されたアミノ酸の数は、１、２又は３となる。もう１つの態様では、タンパク質ペプチド混合物内で２つの異なるタイプの選択されたアミノ酸を改変させることができ、また、１つの又は両方の改変されたアミノ酸を含有するフラグを立てたペプチドのサブセットを単離することができる。さらにもう１つの態様では、同じペプチド混合物をまず最初に１つのアミノ酸上で改変させ、フラグを立てたペプチドのサブセットを単離させ、第２の改変を以前に改変された残りのサンプルについて行ない、フラグを立てたペプチドのもう１つのサブセットを単離させることができる。
【００３０】
本発明は、一次ランからのペプチドフラクションの各々について改変が有効であることを必要とする。それによって、一次クロマトグラフィー工程から得られた各々のフラクション内で、フラグを立てたペプチドは、二次クロマトグラフィー工程において未改変ペプチドから全く異なって移動しなければならない。フラグを立てたペプチド内の１つのアミノ酸の改変は、前記フラグを立てたペプチドの溶出においてシフトを誘発する。適用される改変のタイプに応じて、シフトはフラグを立てたペプチドのリガンド（例えば金属イオン）に対する親和性及び／又は正味電荷、疎水性の変化によってひき起こされる可能性がある。このシフトはδｐと呼ばれ、全ての個々のフラグを立てたペプチドについて特異的である。疎水性の変化の例においては、δｐ値は疎水性モーメントの変化としてか、又はクロマトグラフィーランにおける有機溶媒の百分率として表現されうるが、最も実用的には、一定の与えられたクロマトグラフィー／電気泳動条件下での時間単位で表現できる。それによって、δｐは全てのフラグを立てたペプチドについて必ずしも同一ではなく、δmaxとδminの間に存在する（図１参照）。δｐは、誘発された改変の性質、カラム固定相の性質、移動相（緩衝液、溶媒）、温度その他といったような一定数の要因により影響される。全てのδｐ値を合わせて考慮すると、δmaxとδminの極値が限定される（図１参照）。ｔ1及びｔ2をシフトしたフラグを立てたペプチドの間隔の始めと終わりを限定する時間とし、ｔ3−ｔ4を一次ランから取ったフラクションを囲む時間とすると、ｔ3−ｔ2でδmin（最小シフト）が決定され、一方、δmax（最大シフト）はｔ4−ｔ1により決定される。ウインドウｗ1は一次ランから取られたフラクションである（ｗ1＝ｔ4−ｔ3）。ウインドウｗ2は、ＦＧがその中で溶出することになるウインドウである（ｗ2＝ｔ2−ｔ1）。それによって、δmin＝ｔ3−ｔ2；δmax＝ｔ4−ｔ1；ｗ1＝δmax＋ｔ1−δmin−ｔ2及びｗ2＝ｔ2−ｔ1＝δmax−δmin−ｗ1である。ソーティングプロセスにおける重要な要素は、一定の与えられたフラクション内のフラグを立てたペプチドのうち最もシフトが少ないものと未改変のものの間の距離を限定するδmin及び、フラグを立てた成分が溶出される時間ウインドウであるｗ2である。「ソートされた」という語は、本発明では、「単離された」という語と等価である。
【００３１】
δminは、フラグを立てたペプチドがウインドウｗ1内で溶出する（そしてこのようにして未改変ペプチドとオーバラップする）ことを回避するのに充分でなくてはならず、この法則は、一次ランから回収された全てのフラクションについて適用されるべきである。優先的に、δminは、フラグを立てたペプチドと未改変ペプチドの間のオーバラップを最小限におさえるためｗ1又はそれ以上であるべきである。例えばｗ1＝１分であるならば、δminは、できれば１分以上であるべきである。
【００３２】
フラグを立てたペプチドのオーバラップ又は同時溶出を回避することで、最適な数の個々のペプチドを同定する可能性が改善される。この観点から、ウインドウｗ2のサイズは、同定可能なペプチドの数に影響を及ぼす。ｗ2の値が大きくなると、フラグを立てたペプチドの溶出時間の復元が結果として得られ、フラグを立てたペプチドのより優れた単離、そして質量分析計などの分析装置に対し固定用化合物を漸進的に提示することによる分析のためのより優れた機会を提供する。ウインドウｗ2はｗ1よりも小さいものでありうるが、好ましい実施態様においては、ｗ2はｗ1よりも大きくなる。例えばｗ1＝１分である場合、ｗ2は１分以上でありうる。ｗ2のサイズ及びδmin及びδmaxの値は、一次ランから回収された全てのフラクションについて同一であるか又は非常に類似していることが好ましい。しかしながら、フラグを立てたペプチドの溶出ウインドウ内の未改変ペプチドのわずかな夾雑は好ましくないが許容可能である、ということは自明である。
【００３３】
各々の一次ランフラクション内の未改変ペプチドからのフラグを立てたペプチドの最適な分離を得るためのδmin、δmax及びｗ2の値の操作は、本発明の一部であり、なかでも、改変のために選択されたアミノ酸（単複）、改変のタイプ及びクロマトグラフィー条件（カラムタイプ、緩衝液、溶媒など）の正しい組合せを含む。
【００３４】
親水性シフトの態様が以上で実施されてきたが、非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離させるために疎水性シフトが誘発される類似の記述も同様に提供することができた。ここでｔ3及びｔ4は、非改変ペプチドが溶出するウインドウｗ1を規定するが、一方ｔ5及びｔ6は、フラグを立てたペプチドが溶出するウインドウｗ2を規定している。最大の疎水性シフトδmax＝ｔ6−ｔ3、最小のシフト＝ｔ5−ｔ4（図１ｃ）。フラクションをプールする条件についての類似の計算を使用できるということがわかるだろう。
【００３５】
当業者にとっては、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はその他のタイプのクロマトグラフィーでフラグを立てたペプチドを単離するために同じアプローチを適用できるということは明白である。
【００３６】
１実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からメチオニン含有ペプチドを単離するための方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各々のペプチドフラクションのペプチドの中でメチオニンを化学的に改変する工程及び（ｃ）二次ランによってフラグを立てたメチオニン含有ペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。特定の実施態様においては、一次ラン及び二次ランは、疎水性に基づくクロマトグラフィー分離であり、メチオニンの改変は、フラグを立てたメチオニン含有ペプチドの親水性シフトを誘発する。さらなる特定の実施態様においては、疎水性クロマトグラフィーは、逆相カラムで実施され、メチオニンの改変は、穏やかな酸化で得られる。さらにもう１つの実施態様では、一次ラン及び二次ランは、イオン交換クロマトグラフィーに基づいており、メチオニンの改変は、メチルヨウ化物といったアルキルハロゲン化物との化学的反応である。この反応は、フラグを立てたペプチド上の電荷の変化を誘発し、イオン交換カラム上の二次ラン内でフラグを立てたペプチドを分離できるようにする。
【００３７】
もう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からホスホリル化されたペプチドを単離するための方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各々のフラクションの中のホスホペプチドを酵素的にかつ／又は化学的に改変する工程及び（ｃ）二次ランによってフラグを立てたホスホペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。特定の実施態様においては、一次ラン及び二次ランは、疎水性に基づくクロマトグラフィー分離であり、ホスホペプチドの改変は、ホスファターゼでの処理である。脱リン酸化されたフラグを立てたペプチドは、疎水性シフトを受け、したがって、疎水性カラム上での二次ランによって各フラクション中の大部分の未改変ペプチドから単離され得る。特異的ホスホペプチドを単離するためには特異的ホスファターゼを利用できるということがわかるだろう。リン酸化されたチロシンを含有するペプチドを単離するためには、ホスホチロシンについて特異的なホスファターゼを使用することができる。
【００３８】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からメチオニン及び／又はシステイン上で改変されたフラグを立てたペプチドを単離するための方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各々のフラクション内に存在するペプチドの中でメチオニン及びシステイン残基を化学的に改変する工程及び（ｃ）二次ランによってフラグを立てたメチオニンを単離する工程を含む方法を提供している。さらにもう１つの実施態様において、本発明は、タンパク質を含有するサンプルからシステイン上で改変されたフラグを立てたペプチドを単離するための方法において、（ａ）タンパク質サンプルを酸化させる工程、（ｂ）タンパク質ペプチド混合物を生成する工程、（ｃ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｄ）各々のフラクション中のペプチドの中に存在するシステイン残基を化学的に改変する工程及び（ｅ）二次ランによってフラグを立てたシステイン−ペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。さらにもう１つの実施態様において本発明は、タンパク質を含有するサンプルからホスホ−セリン及び／又はホスホ−トレオニン上で改変されたフラグを立てたペプチドを単離するための方法において、（ａ）タンパク質サンプルを酸化させる工程；（ｂ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｃ）各フラクション内のホスホセリン及び／又はホスホ−トレオニンを含むペプチドを酵素的に改変させる工程及び（ｄ）二次ランによってフラグを立てたホスホ−セリン及びホスホ−トレニオンペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。
【００３９】
さらにもう１つの実施態様において、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドサブセットを単離する方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）一次フラクションの各々に対しキレート剤を添加する工程、及び（ｃ）二次ランによって、キレート化されたペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。前記キレート化用化合物は、小さい複合体形成分子、補因子、抗体などであり得る。
【００４０】
さらにもう１つに実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からリン酸化されたペプチドを単離する方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）前記一次フラクションに対し少なくとも１つのキレート化用化合物を添加する工程、及び（ｃ）二次ランによって、リン酸化されたペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。特定の実施態様においては、リン酸化されたペプチドの単離のために用いられるキレート化用化合物は、Ｆｅ3＋及びイミノジアセテートを含む。
【００４１】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドサブセットを単離するための方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各フラクション内のペプチドの少なくとも１つの中の少なくとも１つのアミノ酸に対し、かさ高く膨大な実体を化学的又は酵素的に添加する工程、及び（ｃ）二次ランによって各フラクションから前記フラグを立てたペプチドを単離させる工程を含み、一次ラン及び二次ランがサイズ排除カラム上で同一の又は実質的に類似した条件下で実施される方法を提供している。
【００４２】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からグリコシル化されたペプチドを単離するための方法において、（ａ）一次ランによって、タンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各フラクション内のペプチド上に存在するグリコシル化構造を化学及び／又は酵素的に改変させる工程及び（ｃ）二次ランによって改変されたグリコシル化構造を含むフラグを立てたペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。特定の実施態様においては、グリコシル化構造の改変は、例えば、化学的及び／又は酵素的脱グリコシル化であり得、また代替的には、グリコシル基は、その他の形で同時溶出している非改変ペプチドから分離され得るように、異なる生物理学的又は生化学的特性をもつ部分へと変換され得る。例えば、シアリル化されたグリコシル鎖は、ノイラミニダーゼ処理により脱シアリル化され得、クロマトグラフィー媒質上でのシフトを結果としてもたらす。
【００４３】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からε−Ｎ−アセチル化ペプチドを単離する方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各フラクション内でε−Ｎ−アセチル化ペプチドを酵素的に脱アセチル化する工程及び（ｃ）二次ランによって、脱アセチル化されたフラグを立てたペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。
【００４４】
上述のように、本発明が提供する方法でのフラグを立てたペプチドのサブセットの単離では、ペプチドの亜集団のみがタンパク質ペプチド混合物内で改変を受けることが必要とされる。複数の利用分野において、改変は、ペプチド上で直接実施できる。しかしながら、（ａ）サンプル内のタンパク質の前処理及び／又は（ｂ）タンパク質ペプチド混合物内のペプチドの前処理は、本発明で単離可能であるペプチドクラスの範囲を広げることができるようにする。原理を例示するために、システイン含有ペプチドをいかにして単離できるかの例について記述する。１以上のシステインを含有するペプチドを、例えばアクリルアミドとの化学的反応によって、より親水性あるフラグを立てたペプチドに変換しうる、ということは明白である。この化学的改変はシステインをより親水性の高いＳ−プロピオンアミド−システインへと変換させる。このシステイン誘導体は、酸化反応によってさらに一層親水性の高いバージョンに変換され得る。かかる酸化は、Ｓ−プロピオンアミド−システインをＳ−プロピオンアミド−システインスルホキシドに変換させる。Ｓ−プロピオンアミド−システイン−スルホキシド誘導体を含有するフラグを立てたペプチドは、ひじょうに有意な親水性シフトを示すため、本発明を用いて非改変ペプチドのバルクから容易に単離させることができる。しかしながら、上述の化学的改変を適用することによりシステイン含有ペプチドが改変させるばかりでなく、メチオニン含有ペプチドも改変される（これは、酸化が同様にメチオニンをそのより親和性の高いメチオニンスルホキシド誘導体へと変換させるためである）。その結果、２つのタイプのフラグを立てたペプチドが改変によって同時に生成され、同様に同時に単離されることになる。Ｃys ペプチド及びＭet ペプチドのこのような同時単離を回避するため、前処理工程が導入される。
【００４５】
１つの特定の実施態様においては、混合物中のタンパク質は、それを構成するペプチドへと分割される前に酸化される。この処理の結果、メチオニンからそのメチオニンスルホキシド誘導体への酸化がもたらされる。その後、タンパク質は、沈殿させられ、ジスルフィド架橋をチオール基に変換させるべく還元される。タンパク質の分割の結果もたらされるタンパク質ペプチド混合物は、その後、本発明に従って一次ランに付され、フラクションはアクリルアミドで化学的に改変され、その後続いて酸化される。メチオニンはすでに前処理工程中に酸化されていることから、このときにはＣys含有ペプチドのみが改変されることになる。フラグを立てたＳ−プロピオンアミド−システインスルホキシドペプチドは、顕著なＭet−ペプチドの夾雑が無く、二次ランを適用して単離される。
【００４６】
この例は、選択されたアミノ酸（又は修飾されたアミノ酸又はアミノ酸残基など）に向かう改変反応の選択性が、一次ランに先立ちサンプル中のタンパク質を前処理することによって得られる、ということを例示している。かかる前処理は、一次ランに先立ち、タンパク質ペプチド混合物内のペプチドに対し同等にうまく向けることができる。特定のケースでは、一次ランの間に前処理を実施することもできる。それによって本発明はさらに、タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチドを単離するための方法において、ａ）工程（ｃ）で望まれないアミノ酸が同時改変されるのを防ぐため、タンパク質ペプチド混合物内のペプチド及び／又はサンプル内のペプチドを前処理する工程；（ｂ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションに分離させる工程；（ｃ）各フラクション内の少なくとも１つのペプチドの中の少なくとも１つのアミノ酸を化学的及び／又は酵素的に改変させる工程及び（ｄ）二次ランによってフラグを立てたペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。かかる前処理は、１以上の化学的及び／又は酵素的反応を含むことができる。
【００４７】
特定の実施態様では、フリーＮＨ2末端を伴うタンパク質から誘導されるフラグを立てたペプチドを単離することができる。後者の方法には以下の工程が含まれる：すなわち、（ａ）タンパク質を含むサンプルを前処理してシステイン側鎖を誘導体化し、リシンをホモアルギニンへと変換させる工程；（ｂ）アルファ−ＮＨ2−基をチオカルバモイル誘導体へと変換させる工程、（ｃ）タンパク質ペプチド混合物を調製する工程、（ｄ）混合物中の新たに生成したＮＨ2基をブロックする工程；（ｅ）混合物を酸で処理して、工程（ｄ）でブロックされたペプチドのＮＨ2末端残基の喪失を誘発する工程、（ｆ）第１のクロマトグラフィーランの中で、前処理されたタンパク質ペプチド混合物を分離する工程、（ｇ）新たに生成されたＮＨ2基をアセチル化用化合物で改変しそれによってフラグを立てたペプチドのサブセットを生成する工程；及び（ｈ）二次クロマトグラフィー工程で前記フラグを立てたペプチドを単離する工程。特定のケースでは、後者の実施態様の工程ｄ）は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で実施することができる。もう１つの特定のケースでは、工程ｅ）はＴＦＡで実施される。
【００４８】
上述のように、逆作用モードでは、本発明は、タンパク質ペプチド混合物から同定ペプチドを単離する方法を提供している。この実施態様においては、タンパク質ペプチド混合物中の少数のペプチドが未改変のままにとどまり、一方ペプチドのバルクは改変された状態となる。改変されたペプチドは、そのクロマトグラフィー挙動を変える特性を獲得し、一方同定ペプチドは改変せず、そのもとのクロマトグラフィー挙動を保持する。したがって、同定ペプチドは、それらの一次ラン中に行なったように二次ラン中、同時に溶出し、一方改変されたペプチドは前後にシフトさせられる。こうして、各フラクション中で、改変されたペプチドから同定ペプチドを分離し、同定ペプチドを単離することが可能となる。
【００４９】
以上で記述したとおりのフラグを立てたペプチドでの状況と類似の形で、本発明は、改変が一次ランからのペプチドフラクションの各々において有効であることを必要としている。それによって、一次クロマトグラフィー工程から得られた各々のフラクション内で、改変されたペプチドは、二次クロマトグラフィー工程において同定ペプチドとは全く異なって移動しなくてはならない。適用される改変のタイプに応じて、シフトは例えば、疎水親水性性又は正味電荷の変化によってひき起こされる可能性がある。このシフトは、δｐと呼ばれ、全ての個々の改変されたペプチドについて特異的である。疎水性の変化の例においては、δｐ値は疎水性モーメントの変化としてか、又はクロマトグラフィーランにおける有機溶媒の百分率として表現されうるが、最も実用的には、一定の与えられたクロマトグラフィー／電気泳動条件下での時間単位で表現できる。それによって、δｐは全ての改変されたペプチドについて必ずしも同一ではなく、δmaxとδminの間に存在する。δｐは、誘発された改変の性質、カラム固定相の性質、移動相（緩衝液、溶媒）、温度その他といったような一定数の要因により影響される。一次ランからのフラクション内のペプチドがウインドウｗ1内で溶出する例においては、同定ペプチドは、二次ランの間ほぼ同じウインドウｗ1内で溶出することになる。好ましい実施態様においては、δminは、改変されたペプチドがウインドウｗ1内で溶出する（そしてこのようにして同定ペプチドとオーバラップする）ことを回避するのに充分でなくてはならない。この法則は、一次ランから回収された全てのフラクションについて適用されるべきである。優先的に、δminは、改変されたペプチドと同定ペプチドの間のオーバラップを最小限におさえるためｗ1又はそれ以上であるべきである。例えばｗ1＝１分であるならば、δminは、できれば１分以上であるべきである。しかしながら、同定ペプチドの溶出ウインドウ内の改変されたペプチドのわずかな汚染は、好ましくないが受容可能であるということは自明である。各々の一次ランフラクション内の改変されたペプチドからの同定ペプチドの最適な分離を得るためのδminの値の操作は、本発明の一部であり、なかでも、改変した状態となるように選択されたアミノ酸（単複）、改変のタイプ及びクロマトグラフィー条件（カラムタイプ、緩衝液、溶媒など）の正しい組合せを含む。当業者にとっては、例えばイオン交換クロマトグラフィー又はその他のタイプのクロマトグラフィーで同定ペプチドを単離するために同じアプローチを適用できるということは明白である。
【００５０】
したがって本発明はさらに、タンパク質ペプチド混合物からペプチドサブセットを単離する方法において、（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションに分離する工程；（ｂ）各フラクション内の少なくとも５０％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％以上のペプチドを化学的及び／又は酵素的改変する工程；及び（ｃ）クロマトグラフィーによって同定ペプチドを単離する工程を含み、工程（ａ）及び（ｃ）のクロマトグラフィーが同じタイプのクロマトグラフィーで行なわれる方法を提供している。フラグを立てたペプチドでのアプローチと同様に、一次ランと二次ランの間の改変は例えば、アミノ酸、修飾されたアミノ酸（グリコシル化、リン酸化、アセチル化など）、インビトロで或る種のアミノ酸に付加された修飾及び／又は１以上のアミノ酸上の特定の残基の改変であり得る。
【００５１】
前述の通り、本発明により提供されている方法での同定ペプチドのサブセットの単離は、大部分のペプチドがタンパク質ペプチド混合物内で改変されることを必要とする。複数の利用分野において、この改変は、ペプチド上で直接実施できる。しかしながら、（ａ）サンプル内のタンパク質の前処理及び／又は（ｂ）タンパク質ペプチド混合物内のペプチドの前処理は、本発明で単離可能であるペプチドクラスの範囲を広げることができるようにする。特定のケースでは、前処理は、一次ランの間でも実施可能である。
【００５２】
原理を例示するために、アミノ末端ブロックされたペプチド（すなわち、そのアミノ末端でインビボでブロックされたタンパク質のアミノ末端から誘導されたペプチド）をいかにして単離できるかの例について記述する。アミノ末端ブロックされたペプチドは、本発明に従って、（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物を分離すること；（ｂ）ペプチドのフリーアミノ末端基を改変すること（アミノ末端でブロックされたタンパク質から誘導されたペプチドはフリーアミノ末端基をもたない）及び：（ｃ）クロマトグラフィーによって改変されたペプチドのバルクからアミノ末端でブロックされた同定ペプチドを分離すること（なおここで工程（ａ）及び（ｅ）のクロマトグラフィーは同じタイプのクロマトグラフィーで行なわれる）によって単離可能である。このアプローチは、アミノ末端でブロックされたペプチドの多くを単離することを可能にするものの、リシンを含有するアミノ末端でブロックされたペプチドの集団が該手順の中で選択されることはない。リシンもまたフリーアミノ基を有し、したがって工程（ｂ）での改変は同様に、リシンを含有するアミノ末端でブロックされたペプチドをも改変することになる。リシンも含有するアミノ末端でブロックされたペプチドの集団はそれによって改変され、したがって同定ペプチドの一部を成さず、単離されないことになる。この集団の喪失を回避するため、一次ランを先立ちタンパク質リシンをε−ＮＨ2−基をブロックされたアミノ基に変換させる前処理工程が導入される。特定の実施態様においては、フリーε−ＮＨ2−基を伴うリシンは、ホモアルギニンへと変換され、その後、トリプシンによる消化が行なわれ、これにより、ホモアルギンにおいてタンパク質が分割され、フリーα−アミノ酸がこれらの位置で生成される。その結果、リシンを含有するアミノ末端でブロックされたペプチドはもはや改変されず、同定ペプチドとして単離されることになる。
【００５３】
この例は、一次ランに先立ちサンプル内のタンパク質を前処理することによって、選択されたアミノ酸（又は修飾されたアミノ酸又はアミノ酸残基）に向かう改変反応の選択性が増強されるということを示している。かかる前処理は、タンパク質ペプチド混合物内のペプチドに対しても同等にうまく向けられる。本発明はそれによってさらに、タンパク質ペプチド混合物から同定ペプチドを単離する方法において、ａ）タンパク質ペプチド混合物内のペプチド及び／又はサンプル内のタンパク質の前処理；（ｂ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションに分離する工程；（ｃ）各フラクション内の大部分のペプチド内の少なくとも１つのアミノ酸を化学的及び／又は酵素的に改変する工程及び（ｄ）二次ランによって同定ペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。かかる前処理は、１以上の化学的及び／又は酵素的反応を含むことができる。
【００５４】
本発明はさらに、タンパク質を含むサンプルの中のタンパク質のアミノ末端でブロックされたペプチドを単離する方法において、（１）タンパク質リシンε−ＮＨ2−基をグアニジル基及びその他の部分に変換する工程；（２）タンパク質がホモアルギニンにおいて分割されこれらの位置でフリーα−アミノ酸を生成するような形でタンパク質サンプルを消化する工程、（３）一次ラン内でタンパク質ペプチド混合物をフラクション化する工程、（４）各フラクション内のペプチドのフリーアミノ末端基を疎水性、親水性又は荷電成分で改変させる工程及び（５）二次ランで非改変同定ペプチドを単離する工程を含む方法を提供している。
【００５５】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質を含むサンプル内のタンパク質のアミノ末端ペプチドを単離するための方法を提供している。この方法は、以下の工程を含む：すなわち（１）タンパク質リシンε−ＮＨ2基をグアニジル基又はその他の部分に変換する工程；（２）各タンパク質のアミノ末端側でフリーα−アミノ基を変換し、ブロックされた（さらに反応しない）基を生み出す工程、（３）タンパク質サンプルを消化して、新たに生成されたフリーＮＨ2基をもつペプチドを生み出す工程、（４）一次ランにおけるタンパク質ペプチド混合物のフラクション化、（５）疎水性、親水性又は荷電成分で各フラクション内のペプチドの前記フリーＮＨ2基を改変する工程、及び（６）二次ランで非改変同定ペプチドを単離する工程。このアプローチは、フリーα−アミノ酸基をもつアミノ末端ペプチド及びブロックされたα−アミノ酸基をもつアミノ末端ペプチドの両方を含む、タンパク質サンプル内のタンパク質のアミノ末端ペプチドを特異的に単離することを可能にする。フリーα−アミノ基が同位体で標識づけされた残基でブロックされるような形で上述のプロトコルの中の工程２を実施することで、フリーＮＨ2基をもつアミノ末端ペプチドとインビボでブロックされたアミノ末端ペプチドを識別することが可能となる。後者の実施態様の１つの利用分野としては、タンパク質を含む２つの異なるサンプル間のタンパク質の内部タンパク質分解プロセッシングの研究がある（例えば、例８を参照のこと）。
【００５６】
逆作用モードのさらにもう１つの実施態様においては、一次ランと二次ランの間の化学的又は酵素的改変は、大部分のペプチド内に存在する。アミノ酸にターゲティングにされる。かかる豊富なアミノ酸は、少なくとも５０％のペプチド、好ましくは７５％を超えるペプチド、さらに好ましくは９０％を超えるペプチドの中に存在する。
【００５７】
もう１つの実施態様においては、同定ペプチドは、タンパク質のＣＯＯＨ−末端（カルボキシ末端）ペプチドである。
【００５８】
さらにもう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドサブセットを単離するための方法において、（ａ）一次ランによってタンパク質ペプチド混合物をフラクションへと分離する工程、（ｂ）各フラクション内の大部分のペプチドの中の少なくとも１つのアミノ酸に対し、かさ高く膨大な実体を化学的又は酵素的に添加する工程、及び（ｃ）二次ランによって各フラクションから前記同定ペプチドを単離させる工程を含み、一次ラン及び二次ランがサイズ排除カラム上で同一の又は実質的に類似した条件下で実施される方法を提供している。
【００５９】
本発明に従った方法は、各々のフラクション内で、大部分の未改変ペプチドからのフラグを立てたペプチドを分離できるようにし、最終的に完全タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチドの特異的サブセットを単離する結果となる。上述のように、かかるフラグを立てたペプチドは、例えば、１以上のメチオニンを含有するペプチド、１以上のシステインを含有するペプチド、１以上のメチオニン及び／又は１以上のシステインを含有するペプチド、ホスホペプチド、チロシン上でリン酸化されたペプチド、ε−Ｎ−アセチル化システインを含有するペプチドであり得る。フラグを立てたペプチドは、由来するタンパク質を高レベルで代表し、そのため、フラグを立てたペプチドは、それらの対応するタンパク質の同定要素として役立つ。したがって本発明はさらに、タンパク質を含むサンプル内のペプチドサブセット及びその対応するタンパク質を同定するための方法を提供している。その上、本発明の実施態様のいずれかに従ったフラグを立てたペプチドの単離はさらにペプチド分析と結合されている。
【００６０】
同様にして、本発明に従った方法は、各々のフラクション内で、大部分の改変されたペプチドからの同定ペプチドを分離できるようにし、最終的に完全タンパク質ペプチド混合物から同定ペプチドの特異的サブセットを単離する結果となる。上述のように、かかる同定ペプチドは、例えば、アミノ酸末端ペプチド、アミノ酸ブロックされたペプチド、カルボキシ末端ペプチドであり得る。同定ペプチドは、由来するタンパク質を高レベルで代表し、そのため、同定ペプチドは、それらの対応するタンパク質の同定要素として役立つ。したがって本発明はさらに、タンパク質を含むサンプル内のペプチドサブセット及び対応するタンパク質を同定するための方法を提供している。その上、本発明の実施態様のいずれかに従ったフラグを立てたペプチドの単離はさらにペプチド分析と結合されている。
【００６１】
好ましいアプローチにおいては、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのペプチド分析は、質量分析計で実施される。しかしながら、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、電気泳動、検定における活性測定、特異的抗体での分析、エドマン配列決定などといったその他の方法を用いてさらに分析及び同定することもできる。
【００６２】
分析及び同定工程は、異なる要領で実施可能である。１つの要領では、クロマトグラフィーカラムから溶出するフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドが直接分析装置へと導かれる。代替的アプローチでは、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、フラクションの形で回収される。かかるフラクションは、さらなる分析又は同定へと進む前に操作されてもされなくてもよい。かかる操作の一例は、濃縮工程とそれに続くさらなる分析及び同定のための例えばＭＡＬＤＩ−標的上での各濃縮物のスポッティングから成る。
【００６３】
好ましい実施態様においては、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドはハイスループット質量分析技術で分析される。得られる情報は、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの質量である。ひとたびペプチド質量が例えば内部較正手順（O'Connor及びCostello, 2000）を用いてフーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）で非常に正確に規定されたならば、そのペプチド質量をペプチド質量データベース内の対応するペプチドの質量と明白に相関させ、それによってフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを同定することが可能である。しかしながら、一部の従来の質量分析計の精度は、各ペプチドの分光分析的に決定された質量を配列データベース内のそれに対応するペプチド及びタンパク質と明白に相関させるのに充分なものではない。それでも明白に同定され得るペプチドの数を増大させるため、ペプチドの質量についてのデータは、その他の情報で補完される。１つの実施態様においては、質量分析計で決定された通りのペプチドの質量は、改変されたアミノ酸の１以上の残査を各フラグを立てたペプチドが含有しているという証明済みの知識（例えばメチオニンスルホキシドフラグを立てたペプチドの場合は、６４amuのニュートラルロスによって証明されている）、及び／又は、ペプチドが既知の特異性をもつ分割プロテアーゼを用いてタンパク質を含むサンプルの消化の後生成されたという知識で補完されている。例えば、トリプシンは、精確にリシン及びアルギニンの部位で分割し、標準的に約５００〜５０００ダルトンの分子量をもちＣ末端リシン又はアルギニンアミノ酸をもつペプチドを生み出すという周知の特性を有している。この組合せた情報は、ペプチドの質量、配列及び／又は同一性に関する情報を収納するデータベースをスクリーニングしかつ対応するペプチド及びタンパク質を同定するために使用される。
【００６４】
もう１つの実施態様においては、少なくとも１つのフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのペプチド質量を正確に測定するだけのことによって親タンパク質の同一性を決定する方法は、選択されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの情報内容をさらに豊かにすることによって改善可能である。フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドに対しいかにして情報を追加できるかの制限的意味のない例として、これらのペプチドのフリーＮＨ2基を、同位体で標識付けされた２つの異なる基の付加によって化学的反応の中で特異的に化学的に変更させることができる。この変更の結果として、前記ペプチドは、予め定められた数の標識づけされた基を獲得する。変更作用物質は、２つの化学的に同一ではあるが同位体的には異なる作用物質の混合物であることから、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、質量スペクトルの中で、ペプチド対として顕示される。これらのペプチドダブレット間の質量シフトの範囲は、前記ペプチド内に存在するフリーアミノ酸の数を表わすものである。このことをさらに例示するため、例えば、フラグを立てたペプチドの情報内容を、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びトリデウテロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの等モル混合物を用いてペプチド中のフリーＮＨ2基を特異的に変更することによって富化され得る。この変換反応の結果として、ペプチドは、ペプチドダブレット内に観察された質量シフトの範囲から容易に演繹できるように、予め定められた数のＣＨ3−ＣＯ（ＣＤ3−ＣＯ）基を獲得する。したがって、３アム（amu）のシフトは１つのＮＨ2基と対応し、３及び６amuのシフトは２つのＮＨ2基と対応し、３、６、及び９amuのシフトはペプチド内の３つのＮＨ2基の存在を顕示する。この情報はさらに、ペプチド質量に関するデータ、改変されたアミノ酸の１以上の残基の存在に関する知識、及び／又はペプチドが既知の特異性をもつプロテアーゼを用いて生成されたという知識を補足する。
【００６５】
フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを同定するのに使用可能であるさらにもう１つの情報要素としては、クロマトグラフィー中の溶出時間に反映されるペプチドの疎水親水性の大平的（ＧＲＡＶＹ）である。同一の質量又は質量測定の誤差範囲内に入る質量を伴う２つ以上のペプチドを、その実験的に決定されたＧＲＡＶＹとコンピュータ内で予測されたＧＲＡＶＹの比較によって識別することが可能である。
【００６６】
フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを分析するために、あらゆる質量分析計を使用することができる。質量分析計の制限的意味のない例としては、Perseptive Biosystems, Framingham, Massachusettsから入手可能であるマトリクス援用レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」飛行時間形（「ＴＯＦ」）質量分析形ＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ポストソース分解分析において使用するためのBrucker-Daltonias, Bremen, Germany製のReflex III及びＡＰ Biotech製のEttan ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ；Finnigan ＭＡＴ、San Jose, Californiaから入手可能な電気スプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン・トラップ質量分析計；Finnigan ＭＡＴから入手可能であるＥＳＩ四極子質量分析計又はApplied BioSystems Group, Foster City CaliforniaのＧＳＴＡＲパルサーハイブリッドＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム、及び内部較正手順を用いたフーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）（O'Connor and Costells, 2000）が含まれる。
【００６７】
ペプチドの実験上の質量スペクトルとペプチド質量及び対応するタンパク質のデータベースとを比較するために本発明において使用されるタンパク質同定ソフトウェアが、当該技術分野において利用可能である。このような１つのアルゴリズムであるPro Foundは、タンパク質を探索するためにベイジアンアルゴリズムを、また、実験データとデータベース内のタンパク質の間の最適な整合を同定するためにＤＮＡデータベースを用いる。ProFoundは、World-Wideウェブ上で＜http//prowl.rockefeller.edu＞及び＜http//www.proteometricks.com＞でアクセスできる。ProFoundは、非冗長データベース（ＮＲ）にアクセスする。ペプチド探索は、ＥＭＢＬウェブサイトでアクセス可能である。同様に、Chaurand P. et al.(1999)J. Am. Soc. Mass. Spectrom 10、91、Patterson S.D.,(2000)、Am. Physiol. Soc. 59-65、Yates JR(1998)Electrophoresis, 19、893 も参照のこと。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＭＡＳＣＯＴによっても分析可能である（Matrix Science Ltd. Londonよりhttp://www.matrixscience.com.にて入手可能）。
【００６８】
もう１つの好ましい実施態様においては、単離されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは個別に、質量分析計内でのフラグメント化に付される。このようにして、ペプチドの質量に関する情報はさらに、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドについての（部分）配列データで補完される。この組合された情報とペプチド質量及びペプチド及びタンパク質配列データベース内の情報を比較することにより、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを同定することが可能となる。１つのアプローチでは、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのフラグメント化は、衝突誘発形解離（ＣＩＤ）によって行なわれるのが最も都合がよく、一般にＭＳ2又はタンデム質量分析計と呼ばれる。代替的には、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドイオンは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ内での揮発及びイオン化の後、その飛行中に崩壊し得る。このプロセスは、ポストソース分解（ＰＳＤ）と呼ばれる。このような１つの質量分析のアプローチにおいては、選択されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、直接的又は間接的に電気スプレー質量分析計のイオン源内に移送され、次にＭＳ／ＭＳモードでさらにフラグメント化される。それによって１つの態様においては、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの部分配列情報がＭＳnフラグメントスペクトル（ここではｎは２以上であるものとする）から回収され、本願で記述する配列データベース内でのペプチド同定のために使用される。
【００６９】
特定の実施態様においては、ペプチドのアルファ−ＮＨ2−末端がスルホン酸部分基で改変される場合、ＭＡＬＤＩ−ポストソース分解分析の中で付加的な配列情報を得ることができる。ＮＨ2末端がスルホン酸基を担持するフラグを立てたペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳモードで検出される場合、特定のフラグメント化パターンに従って誘発される。このモードにより、アミノ酸配列の迅速かつ容易な演繹が可能となる。特に、例６ｂは、ＮＨ2−末端フラグを立てたペプチドがフリーＮＨ2末端をもつタンパク質からいかにして単離されるかの手順について記述している。
【００７０】
本発明はさらに、タンパク質を含有するサンプルの中の１以上のタンパク質の同定のための方法を提供している。一方では、タンパク質を含むサンプルの分割が何千ものペプチドを含むタンパク質ペプチド混合物を結果としてもたらし、これが現在利用できるクロマトグラフィーシステム及び質量分析システムの解像能力を越えているということが知られている。他方では、１つのタンパク質はその構成ペプチドのうちの１以上のものの同定に基づいて同定され得るということがわかっている。本発明は、タンパク質ペプチド混合物から多種多様な異なるタイプのフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを単離し同定するための方法を提供している。フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの全てのセットは、タンパク質ペプチド混合物内のペプチドの１つのサブセットを表わしている。もとのペプチド混合物のこの単純化が、二次ランにおけるペプチドの同時溶出を著しく削減し、質量分析計その他のような分析器でのフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの効率の良い同定を結果としてもたらす。フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、その対応する親タンパク質にとって特有の同定要素であることが最も多いことから、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの同定により、タンパク質を含むもとのサンプル内のタンパク質の同定が可能になる。したがって、その複合ペプチドのうちの１以上のものを単離しかつ同定することによりタンパク質を含むサンプル内のタンパク質を同定するタスクは、本発明の方法を用いて可能となる。
【００７１】
したがって本発明はさらに、タンパク質を含むサンプル中のタンパク質を同定するための方法において、（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｂ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的及び／又は酵素的に改変させて、改変されたペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）二次ランによって各フラクションからフラグを立てたペプチドを単離する工程；（ｄ）フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程、を含む方法を提供している。
【００７２】
したがって本発明はさらに、タンパク質を含むサンプル中のタンパク質を同定するための方法において、（ａ）クロマトグラフィーによってタンパク質ペプチド混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｂ）各フラクション内の大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的及び／又は酵素的に改変させて、未改変ペプチドのサブセットを生成する工程、及び（ｃ）二次ランによって各フラクションから同定ペプチドを単離する工程；（ｄ）同定ペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程、を含む方法をも提供している。
【００７３】
当業者にとっては、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの既知の同一性から出発して、ペプチド、タンパク質及びＤＮＡ配列データベースをスクリーニングすることにより、対応するタンパク質の同一性を容易に決定できるということは、同様に明白である。スクリーニングするためのソフトウェア及びデータベースは共に当該技術分野において利用可能である。
【００７４】
タンパク質を含むサンプル中のタンパク質を同定するために本発明に従って使用可能なフラグを立てたペプチドは、例えば、メチオニン含有ペプチド、システイン含有ペプチド、ヒスチジン含有ペプチド、チロシン含有ペプチド、リシン含有ペプチド、トリプトファン含有ペプチド、アルギニン含有ペプチド、プロリン含有ペプチド、フェニルアラニン含有ペプチド又はこれらのフラグを立てたペプチドのうちの２つ以上のものの組合せである。
【００７５】
タンパク質を含むサンプル中の翻訳と同時又は翻訳後に修飾されたタンパク質の存在を同定するためには、本発明に従って、その他のフラグを立てたペプチドを使用することができる。例えば本発明は、タンパク質を含むサンプル中のリン酸化されたタンパク質を同定するための方法を提供している。したがって、１つのアプローチでは、リン酸化されたアミノ酸を含有するペプチドが本発明に従って改変され、フラグを立てたペプチドとして単離される。これらのフラグを立てたペプチド及びそれらの相関するタンパク質のその後の同定は、サンプル中のリン酸化されたタンパク質（又はホスホプロテオーム）の同定を結果としてもたらす。本発明は同様に、グリコシル化タンパク質、チロシン−リン酸化タンパク質、セリン−及び／又はトレオニンリン酸化タンパク質、アセチル化タンパク質、ε−Ｎ−アセチル化タンパク質、硫酸化タンパク質などといったタンパク質を含むサンプル中のその他のタイプの翻訳と同時又は翻訳後に修飾されたタンパク質を同定するための方法をも提供する。
【００７６】
サンプル中のタンパク質を同定するために本発明に従って使用できる同定ペプチドは、例えば、タンパク質のアミノ末端ペプチドである。これらのペプチドの各々の質量は、質量分析法を用いて決定することができる。かかるペプチドの質量とかかるペプチドがアミノ末端ペプチドであるという知識を混ぜ合わせることで、大部分のペプチドについて、対応する親ペプチドを明白に同定するのに充分である。本発明のこの態様のさらなる実施態様においては、アミノ末端ペプチドの質量のみを収納するデータベースが設計され、これらのデータベースに対して、単離されたアミノ末端同定ペプチドの質量が精査される。このアプローチでは、単離された同定ペプチドが、制限されたデータベース内の質量と一意的に整合する確率はきわめて高い。さらに、このアプローチは、ペプチドベースのプロテオームアプローチの複雑性を著しく低減させ、分析速度を著しく増大させる。
【００７７】
本発明が例えば高から低の存在度に、酸性から塩基性まで、小形から大形まで、可溶性タンパク質から膜タンパク質まで変動するタンパク質を含むサンプル中の全範囲のタンパク質の同定を可能にするということに言及しておくこともまた重要である。さらに、本発明は、非常に少量の細胞から出発して、タンパク質を含むサンプル中のタンパク質を同定する方法を提供している。本発明により、提供される方法は、非常に効率が良くかつ感度の良いものであることから、例えば、５０，０００個というわずかなヒトの細胞から出発して数百から千以上のタンパク質を同定することが可能である。より少数の細胞を出発材料として使用しても、タンパク質を含むサンプル内の何百ものタンパク質を同定することがなおも可能である。明らかに、本発明の方法は同様に、多数の細胞に適用することができる。例えばアミノ末端でブロックされたタンパク質又はタンパク質分解によって分割されたタンパク質を同定するために、その他の同定ペプチドを使用することができる。
【００７８】
もう１つの実施態様においては、本発明は、タンパク質を含む２つ以上のサンプル内の１以上のタンパク質の相対量を決定するための方法を提供する。この方法は、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの使用を含む。この方法では、２つのサンプルは、１つのサンプルから単離されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドが１つの同位体を含有し、第２のサンプルから単離したフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドが、同じ元素のもう１つの同位体を含有するような形で処理される。
【００７９】
この方法には、（ａ）第１の同位体を用いた第１のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｂ）第２の同位体で第２のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｃ）第２のサンプルのタンパク質ペプチド混合物と第１のサンプルのタンパク質ペプチド混合物を混ぜ合わせる工程；（ｄ）タンパク質ペプチド混合物をクロマトグラフィーによってペプチドのフラクションへと分離させる工程；（ｅ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｆ）クロマトグラフィーによって各フラクションからのフラグを立てたペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｄ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｇ）単離されたフラグを立てたペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｈ）同一であるもののディファレンシャルな同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドのピーク高さを比較することにより、各サンプル中のフラグを立てたペプチドの相対量を計算する工程；及び（ｉ）フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程が含まれている。
【００８０】
同じアプローチを逆モード作用で追うことができ、その場合、この方法には、（ａ）第１の同位体を用いた第１のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｂ）第２の同位体で第２のサンプル中に存在するペプチドを標識づけする工程；（ｃ）第２のサンプルのタンパク質ペプチド混合物と第１のサンプルのタンパク質ペプチド混合物を混ぜ合わせる工程；（ｄ）タンパク質ペプチド混合物をクロマトグラフィーによってペプチドのフラクションへと分離させる工程；（ｅ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｆ）クロマトグラフィーによって各フラクションからの同定ペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｄ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｇ）単離された同定ペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｈ）同一であるもののディファレンシャルな同位体で標識づけされた同定ペプチドのピーク高さを比較することにより、各サンプル中の同定ペプチドの相対量を計算する工程、及び（ｉ）同定ペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定する工程が含まれている。
【００８１】
上述のように、同じアプローチを前処理工程と組合せた形で用いることができるということは明白である。該方法は、工程（ｄ）及び（ｆ）におけるクロマトグラフィー分離が同一であるか又は実質的に類似している場合にも適用可能である。同様に、工程（ｃ）内で両方のサンプルからのペプチドを混合する代りに、第１及び第２のサンプルからのペプチドを別々に工程（ｄ）及び／又は（ｅ）及び／又は（ｆ）に付し、（ｆ）又は（ｇ）の工程（ｄ）又は（ｅ）において組合わさった状態にすることができるということも明白である。
【００８２】
第１及び第２のサンプルにおけるペプチドのディファレンシャルな同位体標識づけは、当該技術分野において利用可能な数多くの異なる要領で実施することができる。主要な要素は、第１及び第２のサンプル中の同じタンパク質から由来した特定のペプチドが、そのペプチドの１以上のアミノ酸内に異なる同位体が存在する点を除いて同一であるということにある。標準的な１実施態様においては、第１のサンプル内の同位体は、自然の中に広く存在する同位体を意味する天然同位体となり、第２のサンプル中の同位体は、以下稀少同位体と呼ぶ、さほど一般的でない同位体となる。天然及び稀少同位体の対の例としては、ＨとＤ、Ｏ16とＯ18、Ｃ12とＣ13、Ｎ14とＮ15がある。本願では、同位体対のうち重い方の同位体で標識づけされたペプチドは、重ペプチドとも呼ばれる。同位体対の軽い方の同位体で標識づけされたペプチドはここでは、軽ペプチドとも呼ばれる。例えば、Ｈで標識づけされたペプチドは軽ペプチドと呼ばれ、一方Ｄで標識づけされた同じペプチドは重ペプチドと呼ばれる。天然同位体で標識づけされたペプチド及び稀少同位体で標識づけされたその対応物は、化学的に非常に類似しており、同じ形でクロマトグラフィーにより分離し、また同じ要領でイオン化する。しかしながら、質量分析計といった分析装置内に供給された時点で、ペプチドは軽及び重ペプチドへと分離する。重ペプチドは、取込まれた選ばれた同位体標識の重量がより大きいものであることから、わずかに高い質量をもつ。ディファレンシャルに同位体で標識づけされたペプチドの質量間の差がわずかであることから、単離されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの質量分析の結果として、各々重ペプチドと軽ペプチドを表わす密に離隔した２つのピークの複数の対がもたらされることになる。重ペプチドの各々は、重い同位体で標識づけされたサンプルに由来し、軽ペプチドの各々は、光同位体で標識づけされたサンプルに由来する。各対の中の重及び軽ピークのピーク強度の比（相対的存在度）はこのとき測定される。これらの比率は、各サンプル内のそのペプチド（及びその対応するタンパク質）の相対量（ディファレンシャル発生度）の尺度を提供する。ピーク強度は、従来の要領で（例えばピーク高さ又はピーク表面積）を計算することによって）計算できる。本願で記述したとおり、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを同定してサンプル中のタンパク質の同定を可能にすることもできる。１つのサンプル中にタンパク質が存在するもののもう１つのサンプル中には存在しない場合、（このタンパク質に対応する）単離されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、重又は軽同位体のいずれかを含有しうる１つのピークとして検出されることになる。しかしながら、一部のケースでは、組合せ形サンプルの質量分析中に観察された単一のピークをどのサンプルが生成したかを決定することは困難である可能性がある。この問題は、２つの異なる同位体又は２つの異なる数の重同位体で、タンパク質分解による分割の前か後で第１のサンプルを２重標識づけすることによって解決することができる。標識づけ用作用物質の例としては、アシル化剤がある。
【００８３】
ペプチド内の天然及び／又は稀少同位体の取込みは、多くのやり方で得ることができる。１つのアプローチにおいては、タンパク質は、細胞内で標識づけされる。第１のサンプルのための細胞は例えば、天然同位体を含有するアミノ酸で補足された培地内で成長させられ、第２のサンプルのための細胞は、稀少同位体を含有するアミノ酸で補足された培地内で成長させられる。１つの実施態様においては、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたアミノ酸は、改変された状態となるように選択されたアミノ酸である。例えば、メチオニンが選択されたアミノ酸である場合、細胞は、標識づけされていないＬ−メチオニン（第１のサンプル）か又はＣβ及びＣγ位置で重水素化され従って４amuだけ重いＬ−メチオニン（第２のサンプル）のいずれかが補足された培地の中で成長させられる。
【００８４】
両方のサンプルからのタンパク質／ペプチドの混合は、異なる時点で行なうことができる。混合は、サンプルのレベルで行なうこともできるし（例えば両方のサンプルからの等しい数の細胞を混合する）、あるいはまた、サンプル１及びサンプル２から別々にタンパク質を単離させその後混合させることもでき、また、サンプル１からのタンパク質をペプチドへと消化させ、サンプル２からのタンパク質をペプチドへと消化させて、サンプル１及びサンプル２に由来するペプチドを混合すること、等々も可能である。混合手順の如何に関わらず、本発明はさらに、タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたメチオニン−ペプチドを単離するためにも使用される。メチオニン−ペプチドは、その同位体構成とは無関係に単離されることになり、上述の通りの質量分析計内でのメチオニンペプチドの分析により、サンプル１及びサンプル２中のその対応するタンパク質の相対量を決定することができる。
【００８５】
異なる同位体の取込みも同様に、酵素アプローチにより得ることができる。例えば、「通常の」水（Ｈ216Ｏ）中のトリプシンでタンパク質を含む１つのサンプルを処理し、「重」水（Ｈ218Ｏ）中のトリプシンで第２のタンパク質を含むサンプルを処理することにより、標識づけを実施することができる。本願で使用する「重水」は、Ｏ原子が18Ｏ−同位体である水分子を意味する。トリプシンは、新たに生成された部位のＣＯＯＨ−末端に水の２つの水素を取込むという周知の特性を示す。それによって、Ｈ216Ｏ内でトリプシン化されたサンプル１において、ペプチドは「通常の」質量をもち、一方サンプル２においては、ペプチド（大部分のＣＯＯＨ−末端ペプチドを除いて）は、２つの18Ｏ原子の取込みと対応する４amuの質量増加を有する。この４amuの差は、質量分析計内でフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの重及び軽バージョンを識別しそれによって２つのサンプル中の対応するペプチド／タンパク質の比率を決定するのに充分である。したがって本発明は、さらに、少なくとも２つのサンプルの中の少なくとも１つのタンパク質の相対量を決定するための方法において、ａ）Ｈ216Ｏの存在下でトリプシンで第１のサンプルのタンパク質を消化し、Ｈ218Ｏの存在下でトリプシンで第２のサンプルのタンパク質を消化する工程；ｂ）２つのトリプシン消化されたタンパク質ペプチド混合物を混ぜ合わせる工程；ｃ）組合せた混合物を一次ランに付す工程（ディファレンシャルに同位体で標識づけされたペプチドは、同じクロマトグラフィー挙動を有することから、同じフラクションに分離する）；ｄ）各フラクション内で少なくとも１つのペプチドの少なくと１つのアミノ酸を化学的及び／又は酵素的に改変させる工程；ｅ）二次ランによってフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを単離する工程（ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、同じクロマトグラフィー挙動を有することから、同じフラクション内でソートする）；ｆ）質量分析計において単離されたペプチドを分析する工程；ｇ）そのピーク高さを含み入れることにより対応する重及び軽ペプチドの相対量を計算する工程；及びｈ）ペプチドとそれらの対応するタンパク質を同定する工程を含む方法を提供している。
【００８６】
ディファレンシャル同位体の取込みはさらに、タンパク質又はペプチドレベルで実施され得る既知の化学的反応に基づく多数の標識づけ手順で得ることができる。例えば、タンパク質は、ＮＨ2基をグアニジニウム基に変換させそれによって各々の先行するリシン位置でホモアルギニンを生成する、Ｏ−メチルイソ尿素でのグアジニル化反応により変化させることができる。第１のサンプルからのタンパク質は、天然同位体を伴う試薬と反応させることができ、第２のサンプルからのタンパク質は、稀少同位体を伴う試薬と反応させることができる。ペプチドは同様に、重水素化アセトアルデヒドでのシフの塩基形成とそれに続く通常の又は重水素化されたホウ水素化ナトリウムでの還元によって変更することができた。穏やかな条件下で進行するものとして知られているこの反応は、予想可能な数の重水素原子の取込みを導くことができる。ペプチドは、α−ＮＨ2−基又はリシンのε−ＮＨ2基のいずれかにおいて又はその両方で変更されることになる。類似の変更は、重水素化されたホルムアルデヒドで行なうことができ、その後重水素化されたＮａＢＤ4での還元が続き、これにより、アミノ基のメチル化された態様が生成されることになる。ホルムアルデヒドでの反応は、重水素をリシン側鎖にのみ取込んで全タンパク質についてか、又は、α−ＮＨ2及びリシン由来のＮＨ2基の両方が標識づけされることになるペプチド混合物について実施することができる。アルギニンは反応しないことから、これもまた、Ａrg含有ペプチド及びＬys含有ペプチドの間の識別を行なうための方法を提供する。第一級アミノ基は、例えばアセチルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＡＮＨＳ）で容易にアシル化される。それによって、１つのサンプルは、通常のＡＮＨＳでアセチル化され得、一方第２のサンプルは、13ＣＨ3ＣＯ−ＮＨＳ又はＣＤ3ＣＯ−ＮＨＳのいずれかでアシル化され得る。全てのリシンのε−ＮＨ2基はこの要領で、ペプチドのアミノ末端に加えて誘導体化される。さらにその他の標識づけ方法としては、ヒドロキシ基及びアミンを内含する官能基のさほど特異的でない標識づけのために使用することができるトリメチルクロロシラン及びヒドロキシル基をアセチル化するのに使用可能である無水酢酸がある。
【００８７】
さらにもう１つのアプローチでは、一次アミノ酸は、重ペプチドと軽ペプチドを５amu、６amu、７amu、８amuさらにはより大きな質量差で区別することを可能にする化学基で標識づけされる。かかる化合物の例は、例１６で言及されている。代替的には、ディファレンシャル同位体標識づけは、５amu以上、６amu、７amu、８amu以上さらにはそれより大きい質量差で重及び軽変異体を区別できるようにする、ペプチドのカルボキシ末端で実施される。本発明の方法は、サンプル内に存在しうるタンパク質タイプを予め知っていることを必要としないため、検査対象サンプル内に存在する既知及び未知の両方のタンパク質の相対量を決定するのに使用することができる。
【００８８】
少なくとも２つのサンプル中で少なくとも１つのタンパク質の相対量を決定するために本発明において提供されている方法は、細胞、組織又は生体液（例えば乳頭吸引液、唾液、精液、脳脊髄液、尿、血清、血漿、滑液）、器官及び／又は全生体の中のタンパク質レベルを比較するのに広く応用できる。かかる比較には、例えば病的な及び非病的な、ストレスの加わった及び加わっていない、薬物処置された及びされていない、良性及び悪性、粘着性及び非粘着性、感染した及び未感染の、形質変換された及びされていない亜細胞フラクション、細胞、組織、体液、器官及び／又は全体の評価、が組み込まれている。この方法は同様に、異なる刺激にさらされた又は異なる発達工程にあるか又は１以上の遺伝子が沈殿化されているか又は過剰発現されている状態にあるか又は１以上の遺伝子がノックアウトされた状態にある亜細胞フラクション、細胞、組織、体液、生体、全生体におけるタンパク質レベルを比較できるようにもしている。
【００８９】
もう１つの実施態様においては、本願に記述されている方法は、同様に、（例えばガン、神経変性疾患、炎症、循環器疾患、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染又はその他のあらゆる疾病などの）病的状態を表わす特異的タンパク質セット又は１以上のタンパク質マーカーの発現の有無又はそのレベルの変動の検出のための診断検定においても利用することができる。特異的利用分野としては、転移性ガン及び侵襲性ガンにおいて存在する標的タンパク質の同定、トランスジェニックマウスにおけるタンパク質のディファレンシャル発現、病的組織におけるアップレギュレート又はダウンレギュレートされているタンパク質の同定、代謝シフトといったような生理学的変化を伴う細胞における細胞内変化の同定、ガンにおけるバイオマーカーの同定、シグナリング経路の同定が含まれる。
【００９０】
異なるサンプル中の大きいタンパク質セットの定量分析を、フラグを立てたペプチド及び同定ペプチドの両方を用いて実施することができる。標準的な例においては、メチオニン又はシステイン又はヒスチジン又はこれらのアミノ酸のうちの２つの組合せの改変に基づくフラグを立てたペプチドが使用されることになる。もう１つの標準的例では、アミノ末端ペプチド又はカルボキシ末端ペプチドに基づく同定ペプチドが使用される。さらに、本発明は、タンパク質の修飾状態のプロテオーム全体の定性及び定量分析を達成するために使用することができる。例えば、複数の信号翻訳経路において、タンパク質の中に存在するセリン、トレオニン及びチロシン残基は往々にしてリン酸化された状態となる。１つの特定の実施態様においては、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドは、ホスホ−アミノ酸の存在に基づいて選択されたフラグを立てたペプチドである。重及び軽フラグを立てたペプチドの相対的存在度の比較により、タンパク質を含む２つのサンプル内のリン酸化されたタンパク質の相対的存在度を比較することが可能となる。さらにもう１つの実施態様においては、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドは、ホスホセリン及び／又はホスホトレオニン又はホスホチロシンの存在に基づいて選択されるフラグを立てたペプチドである。さらにもう１つの実施態様においては、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドは、ε−Ｎ−アセチル化リシン含有ペプチドの存在に基づいて選択されたフラグを立てたペプチドである。さらにもう１つの実施態様においては、ディファレンシャルに同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチドは、グリコシル基の存在に基づいて選択されたフラグを立てたペプチドである。
【００９１】
本発明はさらに、タンパク質を含む単一のサンプル中の１以上のタンパク質の量を定量化するための方法を提供している。この方法は、
（ａ）タンパク質ペプチド混合物を調製する工程；（ｂ）基準ペプチド同位体から識別可能な同位体で標識づけされた合成基準ペプチドを既知の量だけ混合物に添加し、それによって前記合成基準ペプチド及び前記基準ペプチド対応物が工程（ｄ）で改変されることになる工程；（ｃ）クロマトグラフィーによって混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｄ）各フラクション内のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｅ）クロマトグラフィーによって各フラクションからのフラグを立てたペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｃ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｆ）フラグを立てたペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｇ）合成基準ペプチドのピーク高さを基準ペプチドと比較することによってサンプル中に存在するタンパク質の量を決定する工程を含む。
【００９２】
同じ方法を逆転モード作用で適用することができ、ここでこの方法は、（ａ）タンパク質ペプチド混合物を調製する工程；（ｂ）基準ペプチド同位体から識別可能な同位体で標識づけされた合成基準ペプチドを既知の量だけ混合物に添加し、それによって前記合成基準ペプチド及び前記基準ペプチド対応物が工程（ｄ）で改変されることになる工程；（ｃ）クロマトグラフィーによって混合物をペプチドフラクションへと分離させる工程；（ｄ）各フラクション内のペプチドのうちの大部分のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を化学的に又は酵素的又は化学的かつ酵素的に改変させる工程、及び（ｅ）クロマトグラフィーによって各フラクションからの同定ペプチドを単離させる工程であって、該クロマトグラフィーが工程（ｃ）と同じタイプのクロマトグラフィーで実施される工程；（ｆ）同定ペプチドの質量分析法による分析を実施する工程；（ｇ）合成基準ペプチドのピーク高さを基準ペプチドと比較することによってサンプル中に存在するタンパク質の量を計算する工程を含む。
【００９３】
上述のように、同じ方法を前処理工程と組合せた形で用いることができるということは明白である。該方法は、工程（ｃ）及び（ｅ）におけるクロマトグラフィー分離が同一であるか又は実質的に類似している場合にも適用可能である。
【００９４】
「基準ペプチド」は、本願では、その親タンパク質を明白に同定するのに充分な配列及び／又は質量を有するペプチドである。基準ペプチドの当量のペプチド合成は、容易であることが好ましい。明確さを期して、本願で使用されている基準ペプチドは、それが代表するタンパク質の中で見られるような未変性ペプチドであり、一方本願で用いられる合成基準ペプチドというのは、同じペプチドの合成対応物である。かかる合成基準ペプチドは、ペプチド合成によって適切に産生されるが、組換えによって産生することもできる。組換え型産生は、当該技術分野において広く利用可能であるように、多数のベクター及び宿主で得ることができる。基準ペプチドは、好ましくは、質量分析法において充分にイオン化する。充分にイオン化する基準ペプチドの制限的意味のない例としては、アルギニンを含有する基準ペプチドがある。好ましくは、基準ペプチドは同様に、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドとして容易に単離できる。後者の好ましい実施態様においては、基準ペプチドは同時にフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドでもある。
【００９５】
基準ペプチド及びその合成基準ペプチド対応物は、化学的に非常に類似しており、クロマトグラフィーにより同じ形で分離し、かつ同じ要領でイオン化する。しかしながら、基準ペプチド及びその合成基準ペプチド対応物は、ディファレンシャルに同位体で標識づけされている。したがって、基準ペプチドが同じくフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドである好ましい実施態様においては、基準ペプチド及びその合成基準ぺプチド対応物は類似の要領で改変され、一次ラン及び二次ランそして場合によっては三次ランの同じフラクション内で単離される。しかしながら、基準ペプチド及びその合成基準ペプチドは、質量分析計といったような分析装置に供給された時点で、軽及び重ペプチドへと分離する。重ペプチドは、取込まれた選択された重同位体の重量がさらに重いことから、わずかに高い質量をもつ。
【００９６】
基準ペプチドとその合成基準ペプチドの間のこの非常に小さい質量差のため、両方のペプチドは、質量分析において認識可能な密に離隔した２つのピークとして現われることになる。ピーク高さ又はピーク強度間の比率を計算することができ、これらは、合成基準ペプチドの量に対する基準ペプチドの量の比を決定する。タンパク質ペプチド混合物には既知の絶対量の合成基準ペプチドが添加されることから、基準ペプチドの量を容易に計算することができ、タンパク質を含むサンプル中の対応するタンパク質の量を計算することができる。
【００９７】
基準ペプチド及びその合成基準ペプチドをディファレンシャルに同位体で標識づけするいくつかの方法が、当該技術分野において知られている。第１のアプローチでは、基準ペプチドは、稀少同位体を担持し、合成対応物は天然同位体を担持する。このアプローチでは、合成基準ペプチドは、大規模調製物中のその天然同位体と、合成基準ペプチドを化学的に効率良く合成することができる。基準ペプチドを稀少同位体で標識づけするためには、稀少同位体でペプチドを示唆的に同位体で標識づけするための上述の方法のうちのいずれでも応用することができる（インビボ 標識づけ、酵素標識づけ、化学的標識づけなど）。インビボ 標識づけの１例としては、市販の重水素化されたメチオニンＣＨ3−ＳＣＤ2−ＣＤ2−ＣＨ−（ＮＨ2）−ＣＯＯＨを取込み、合計ペプチド質量に４amuを付加するというものがある。代替的には、合成基準ペプチドは、同じく重水素化アルギニンＨ2ＮＣ−（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＤ2）3−ＣＤ−（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ）を含有することもでき、こうして、合計ペプチド質量に７amuが加わることになる。当業者にとっては、その重水素化されたつまり15Ｎ又は13Ｃ態様が存在する全てのアミノ酸をこのプロトコルで考慮することができる、ということは明確であるはずである。このアプローチのもう１つの例として、Ｈ218Ｏの存在下でトリプシンを用いてタンパク質を含むサンプルをタンパク質分解するというものがあるが、その他の数多くの方法を使用することができる。それによって、好ましい実施態様においては、１つのサンプル内の少なくとも１つのタンパク質の定量分析は、ａ）ペプチドが稀少同位体（例えば重同位体）を担持しているタンパク質ペプチド混合物を調製する工程；ｂ）このタンパク質ペプチド混合物に対し、天然同位体（例えば軽同位体）を担持する合成基準ペプチドを添加する工程；ｃ）合成基準ペプチドを同じく含有するタンパク質ペプチド混合物を一次クロマトグラフィー分離によってフラクションに分離する工程；ｄ）少なくともこの基準ペプチド及びその合成基準ぺプチド対応物を化学的及び／又は酵素的に改変する工程；ｅ）二次クロマトグラフィー分離によってフラグを立てた基準ペプチド及びフラグを立てた合成基準ペプチドを単離する工程；ｆ）合成基準ペプチドに対する基準ペプチドのピーク高さの比率を質量分析法によって決定する工程及びｇ）タンパク質を含むサンプル内で、基準ペプチドにより代表されるタンパク質の量を計算する工程を含む。
【００９８】
もう１つの好ましい実施態様においては、基準ペプチドは、同時に同定ペプチドでもある。このアプローチにも上述の方法を同等にうまく適用することができるが、工程ｄ）において、基準ペプチド及びその合成基準ペプチドは未改変のままにとどまることになり、工程ｅ）では、（基準ペプチド及びその合成基準ペプチドを内含する）同定ペプチドは単離される。
【００９９】
もう１つの好ましい実施態様においては、１つの単一サンプル中の少なくとも１つのタンパク質の定量的決定は、前記Ｈ218Ｏ中のタンパク質混合物をトリプシンでペプチドへと消化させる工程；ｂ）天然同位体を担持する少なくとも１つの合成基準ペプチドを既知の量だけ、結果として得られたタンパク質ペプチド混合物に添加する工程；ｃ）一次クロマトグラフィー分離においてタンパク質ペプチド混合物をフラクション化する工程；ｄ）１以上の特異的アミノ酸上で各フラクションを化学的及び／又は酵素的に改変させる工程（タンパク質ペプチド混合物及び特異的アミノ酸を含有する合成基準ペプチドからの両方のペプチドが改変されることになる）；ｅ）第２のクロマトグラフィー分離によってフラグを立てたペプチドを単離させる工程（これらのフラグを立てたペプチドは、生体基準ペプチド及びその合成基準ペプチド対応物の両方を含む）；ｆ）フラグを立てたペプチドを質量分析により分析し、基準ペプチド及びその合成基準ぺプチド対応物の相対量を決定する工程を含む。ここでもまた、同時に同定ペプチドでもある基準ペプチドで類似のアプローチに従うことができる。
【０１００】
同様に、上述の方法は、基準ペプチドをＮＩＰで標識づけしその合成基準ペプチド対応物を稀少同位体で標識づけする１つのモードで応用することもできる。
【０１０１】
タンパク質を含むサンプル中のタンパク質の量を定量化するための本発明の上述の方法は、サンプル中の１個から最高数百個までのタンパク質を定量化するために使用することができる。全てのタンパク質が定量されるためには、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の基準ペプチドが必要である。特定の１実施態様においては、各々の合成基準ペプチドが、その基準ペプチド対応物の予想量と等モルの量で添加される。
【０１０２】
タンパク質を含むサンプル内で少なくとも１つのタンパク質を定量化するために本発明で提供されている方法は、異なる利点をもつタンパク質を定量化するために広く応用することができる。例えば、本発明を用いることにより、１つのサンプル中で１以上のタンパク質のレベルを決定する診断検定を開発することができる。
【０１０３】
もう１つの例においては、サンプル中の特定のタンパク質の特異的な既知のスプライス変異体を定量化するために、基準ペプチドを使用することができる。特異的タンパク質から特定のスプライス変異体が知られており、このスプライス変異体が検出されることを目的としている場合には、特定のタンパク質のこのスプライス変異体とのみ対応する合成基準ペプチドを合成することができる。実際には、エキソンスキッピングのために新しい接合部が形成されることが多く、それによって、親タンパク質内には発生せずスプライス変異体の中でのみ発生する特異的基準ペプチドを選択することができる。しかしながら、数多くのケースで、問題のスプライス変異体と親タンパク質を識別するために２つ以上の基準ペプチドを選択することが勧められる。同様に、同じ細胞又は組織内で親タンパク質と合わせて特定のスプライス変異体が発現され、それによって両方がそのサンプル中に存在することも一般的である。往々にして、特定のスプライス変異体及び親タンパク質の発現レベルは異なっている。基準ペプチド間の検出及び存在度を用いて、スプライス変異体とその親タンパク質の間の発現レベルを計算することができる。さらにもう１つの例では、薬物が１つの細胞内の特定のタンパク質の発現に大きな影響を及ぼしうるということが周知である。現方法では、異なる実験条件下で１つの又は一組の問題のタンパク質の量を正確に測定することが可能である。したがって、ゲノム利用といったような等価の技術を、ファルマコプロテオミクス及びトキシコプロテオミクスを含めたタンパク質レベルで応用することができる。疾病の遺伝子マーカーはヒトゲノムの配列決定と共に著しく注目を集めてきたが、数多くの状況において、タンパク質マーカーがより有用である。例えば、タンパク質疾病マーカーを表わす基準ペプチドに基づく診断検定を、基本的に、問題のあらゆる疾病について開発することができる。最も適切にも、かかる疾病マーカーは、細胞、組織又は器官サンプル又は例えば血球、血漿、血清、尿、精液、唾液、乳頭吸引流体、滑液又は脳脊髄液を含む体液の中で定量化することができる。このとき、本発明に従って、タンパク質疾病マーカー用の基準ペプチドを、その患者の疾病が急速に進行しているか又は緩慢に進行しているか、患者が或る種の疾病を発生させる確率が高いか否かを監視するため、さらには治療の効力を監視するために使用することができる。実際、ＳＮＰといったような遺伝子マーカーとは対照的に、特異的疾病を表わすタンパク質疾病マーカーのレベルは、疾病の変調又は進行に応答して急速に変化しうる。タンパク質疾病マーカー用の基準ペプチドは例えば、本発明に従って、例えばガン、肥満、糖尿病、ぜんそく及び炎症、うつ病、そう病、パニック障害及び統合失調症を含めた精神神経疾患といったような複雑な遺伝子疾患の診断の改善のために使用することもできる。これらの疾患の多くは、多数の細胞及び生化学経路及び事象に反映される複雑な事象に起因して発生する。したがって、数多くのタンパク質マーカーは、これらの疾病と相関関係をもつことが判明するかもしれない。本発明は、１個から数百個のタンパク質マーカーを同時に追跡することを可能にする。本発明を用いたタンパク質マーカーの同定及び相対的及び絶対的定量化の可能性は、より正確な診断上の下位分類を導くことができると思われる。
【０１０４】
もう１つの実施態様においては、本発明は、本発明の方法を実施することができるペプチドソーター装置に向けられている。本願で記述するように、タンパク質ペプチド混合物又は複合ペプチド混合物を分析するための方法は、混合物をフラクションに分ける完全タンパク質ペプチド混合物を用いた一次クロマトグラフィー工程及びフラクション中のペプチド内に存在する少なくとも１つの特異的アミノ酸の化学的及び／又は酵素的改変の後に実施される第２のクロマトグラフィー工程という２つの連続したクロマトグラフィー工程が含まれる可能性がある。本願で記述する通り、「ペプチドソーター」という語は、本発明に従った非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを効率良く分離するか又は、代替的に本発明に従った改変されたペプチドから同定ペプチドを効率良く分離する装置を意味する。好ましい態様においては、第２のランの間に（ｉ）非改変ペプチドがそのもとの溶出時間にとどまりフラグを立てたペプチドが誘発されて溶出時間のシフトを受けるか又は（ii）逆転モードで、同定ペプチドがそのもとの溶出時間にとどまり、改変されたペプチドのバルクが誘発されて溶出時間のシフトを受けるような形で、同一又は非常に類似したクロマトグラフィー条件が２つのクロマトグラフィー工程において使用される。本願で記述されているように、ペプチドソーターは特に、ラン１の後に得られるフラクションのプール及び第２のクロマトグラフィー工程（例えばフラグを立てたペプチドが非改変ペプチドから分離される工程か又は代替的にはラン１のフラクションの各々からのフラグを立てたペプチド（又は同定ペプチド）の単離加速させるため同定ペプチドか改変されたペプチドから分離される工程）の最適な組織を意味する。
【０１０５】
タンパク質ペプチド混合物から単離されたフラグを立てたペプチドを単離し同定するための１つのアプローチは、一次クロマトグラフィー分離から全てのフラクションを独立して回収し、フラクションの各々の中で化学的及び／又は酵素的改変を実施し、同じクロマトグラフィー条件内でかつ同じ又は実質的に類似したカラム上で独立して全てのフラクションを再度ランさせることにある。実質的には、各々の独立して実行された二次ランのフラグを立てたペプチドは回収され、質量分析計といったような分析計器に渡される。しかしながら、かかるアプローチには、多大なクロマトグラフィー時間を必要とし、質量分析計上で多くの作業時間を占める。クロマトグラフィー機器及び質量分析計の両方のより効率の良い経済的な使用を得るため、本発明は、異なるフラクションに由来するフラグを立てたペプチドの間及び１つのフラクションからのフラグを立てたペプチドと１以上のその他のフラクションからの未改変ペプチドの間の溶出オーバラップを回避しながら一次クロマトグラフィー分離の複数のフラクションのプールを可能にするペプチドソーターの使用を提供し、また逆転モードでは、本発明は、異なるフラクションに由来する同定ペプチドの間及び１つのフラクションからの同定ペプチドと１以上のその他のフラクションからの改変されたペプチドの間の溶出オーバラップを回避しながら一次クロマトグラフィー分離の複数のフラクションのプールを可能にするペプチドソーターの使用を提供している。
【０１０６】
ペプチドをソートするためのシステムの一般的原理は、以下のように例示することができる。一次クロマトグラフィー 工程から得られた各々のフラクションにおいて、フラグを立てたペプチドは、未改変ペプチドとは全く異なる形で溶出する。フラグを立てたペプチド内のアミノ酸（単複）の改変が、δminの下限とδmaxの上限でのフラグを立てたペプチドの溶出のシフトを誘発する場合には、一次クロマトグラフィーラン（ｗ１）から単離された各フラクションの溶出ウインドウはδminに等しいものであり得るが、好ましくは１つのフラクション内の最大数のフラグを立てたペプチド及び未改変ペプチドの全く異なる溶出を可能にするためδmin／２以下である。一次ランは、ここでは時間ｔ３〜ｔ４の間にあるウインドウｗ１と呼ばれるフラクションに分割される。制限的な意味のない例において、ｗ１は１分とされる（図１Ａ）。ペプチドがその改変された誘導体へと変換されることに起因するクロマトグラフィーシフトの一例が図１Ｂに表わされている。それによって、この概念は、ｔ３〜ｔ４の間で溶出する１分フラクションを任意に選定することにより、この概念が例示されている。改変されたこのフラクションからのペプチドは、δｐとして表現される親水性シフト（各々の改変されたペプチドについてシフト）を示す。改変の効果は、選択されたフラクションから誘導された全てのペプチドについてつねに同一であることから、δｐは全ての改変されたペプチドについて異なる値を示し、したがって２つの外部値：δminとδmaxの間で変動することになる（それによってδmin≦δｐ≦δmax）。ｔ１及びｔ２をそれぞれソートされたフラグを立てたペプチドが溶出を開始及び停止する時間とし、ｔ３及びｔ４を選択されたフラクションをとり囲む時刻とすると、δmin＝ｔ３−ｔ２、δmax＝ｔ４−ｔ１となる。それによって、ソートされたペプチドが中で溶出するウインドウ（ｗ２）を、親水性シフト及び選択されたフラクションサイズ（ｗ１）で表わすことができる。ｗ２＝ｔ２−ｔ１又はｗ２＝δmax−δmin−ｗ１〔数１〕。
【０１０７】
一次ランの複数のフラクションが組合わされる（プールされる）場合には、プールされたフラクションでの第２のランの間、１つの選択されたフラクションからのソートされたフラグを立てたペプチドが、先行するフラクションの１つの未改変ペプチドと同時溶出しないことが重要である。このことは、図２に概略的に表わされている。それによって、ｔ′１はｔ４から測定されて時間差ｗ３のところで開始すべきである。二次ランの間に未改変ペプチドについてつねに幾分かの展延が認められることから、ｗ３をゼロと考えるべきではない。このことはすなわち、次のフラクションの溶出時間であるｔ′３が次のように表現されることになるということを意味している：
ｔ′３＝ｔ３＋ｗ１＋ｗ３＋ｗ２＋δmin
又はｔ′３＝ｔ３＋ｗ１＋ｗ３＋ｗ２＋δmax−ｗ１−ｗ２
又はｔ′３＝ｔ３＋ｗ３＋δmax
又はｔ′３−ｔ３＝Δｔ＝ｗ３＋δmax〔数２〕
【０１０８】
それによって好ましくはプールすることのできる２つの連続するフラクションの間の空間は、一定の与えられたフラクションの未改変ペプチドと次のフラクションのフラグを立てたペプチドの間の間隔どり及びδmaxによって決定される。それによって、δmax＝７分でありｗ３＝５分である場合には、二次ランのために優先的に組合せされ得る一次ランのフラクションは１２分だけ離隔されている（例えばｗ１が１分に等しい場合、フラクション１０、２２、３４など）。これらの値は、δmax及びδminが全勾配にわたり一定にとどまる場合にあてはまる。クロマトグラフィー条件に応じて、δｐ値はフラクション全体にわたりわずかに変動しうる。例えば、改変されたメチオニン−ペプチドについて親水性シフトが、より早い時点で溶出するより親水性の高いものに比べ、より疎水性の高いペプチドについてわずかに小さい、ということが観察された。ＴＦＡ／アセトリニトリル系内では、この回帰は制限され、したがってこれを容易に補正することができる。しかしながら、その他のクロマトグラフィー条件では、この回帰はさらに顕著なものであり、したがって考慮に入れられる。したがって、（例１８で示されているような）補正率λｎが提供される。λｎは、溶媒Ｂの濃度がConcＢnとして示されている一定の与えられたフラクション（η）でのδｐについての補正率である。λｎとConcＢnの間に線形相関が存在する場合には、これはλｎ＝ａ、ConcＢn＋ｂ〔数３〕として表わされることになる。例１８で記述されているＴＦＡ／アセトニトリル系、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム及びメチオニンペプチドの酸化に起因する親水性フィルムを用いて、ａ＝０．００２及びｂ＝１．００２であることが見極められた。それによって、この例では、１０％の溶媒Ｂを含有するフラクションについて、λ１０＝−０．００２．１０＋１．００２＝１であり、５０％の溶媒Ｂを含有するフラクションについて、λ５０＝−０．００２・５０＋１．００２＝０．９０２である。このことはすなわち、１０％の溶媒Ｂを伴うフラクションにおいてδmin＝２分でδmax＝７分であるとき、ｗ２は７分−２分−１分＝４分となるということを意味する。５０％の溶媒Ｂを含有するフラクションの中での組合された又はプールされたモードでのｗ２についてのこの値は、ｗ２ｃ＝７分・０．９０２−２分・０．９０２−１＝３．５１分となる。
【０１０９】
それによって、ソーティングシステムを調整するためには、δmax及びδminがそれぞれ早期溶出フラクション及び晩期溶出フラクションについて決定され、その後、早期フラクションからとられたδmax及び晩期ＦＸからとられたδminとしてセットされる。それによってｗ２ｃ：δmax．λ（早期フラクション）−δmin．λ（後期フラクション）−ｗ１〔数４〕。
【０１１０】
１つの例においては、
ｗ２ｃ＝７分−１．８分−１分＝４．２分
【０１１１】
全ソーティングプロセス全体にわたり一定のｗ２ｃ−値を使用した後、より優れたソーティング効率を達成するために、一次ランのフラクションを選択するために、δmax及びδminの回帰を使用することもできる。これは、溶媒Ｂの勾配の間にシフトが強い影響を受ける場合にあてはまる可能性がある。等式３の値ａ及びｂがａ＝−０．０２でｂ＝１．２であり、δmin＝２min、δmax＝７minであると仮定すると、フラクション１０（１０％の溶媒Ｂ）でのシフトはδmax＝７分及びｗ２＝４分となる。δmax及びδminがラン中に影響を受けない場合には、次のフラクションは２２分にあるはずである。しかしながら、等式３のａ及びｂについての値がａ＝−０．０２及びｂ＝１．２であると仮定すると、λ２２＝−０．０２×２２＋１．２＝０．７７６、δmax２２＝７×０．７６＝５．３２分となる。また、ｔ′３＝１０分＋５分＋５．３２分＝２０．３２分である。それによって、次のフラクションはこのときフラクション２２に代ってフラクション２１であり得、新しいλ２１はこのときλ２１＝０．７８、δmax×２１＝７×０．７８＝５．４６＝５．４６分となる。それによってｔ′３は少なくとも時間１０分＋５分＋５．４６分＝２０．４６分で考えることができる。選択された次のフラクションがフラクション２１であるとすると、どの次のフラクションが先行するものと最も近く追従することになるかを再計算することが可能である。こは、フラクション３１であり、これについてλ３１は０．５８、そしてδmax＝４．０６分となる。それによってｔ″３＝２１分＋５分＋４．０６分＝３０．１分となる。同じ計算に従って、ここでλ３９＝０．４２、δmax＝２．９４分であるフラクション３９を内含することができる。それによってｔ″′３＝３１分＋５分＋２．９４分＝３８．９４分  等々である。ペプチドソーターの原理を例示するため、フラグを立てたペプチドについて１つの例が実施され、ｘ／２に等しい溶出ウインドウｗ１でかつ回帰無しで（勾配全体を通して一定のシフトが仮定される）フラクションが単離される。タンパク質ペプチド混合物に由来する全てのペプチドの合計ラン１溶出ウインドウが２０ｘに等しい場合には、ｘ／２のウインドウを伴う４０個のフラクション（第１のフラクション：０〜ｘ／２；第２のフラクション：ｘ／２〜ｘ；第３のフラクション：ｘ〜３ｘ／２、…）が回収される。最も単純なアプローチでは、全てのフラクションは個別に化学的及び／又は酵素的なアミノ酸改変工程に付され、ペプチドは、ラン１に実質的に類似するクロマトグラフィー条件下でラン２に付される。ラン２はフラグを立てたペプチドを未改変ペプチドから分離する。クロマトグラフィー及び分析時間を制限するため、ラン１から得られたフラクションをプールすることにより手順を最適化してきた。プール作業は、改変反応に先立ち一次フラクションで実施でき、そうでなければ改変されたフラクションで実施することができる。改変されたフラクションは、本発明に従ってペプチドが化学的及び／又は酵素的な改変を受けてきたフラクションである。
【０１１２】
例中、プール作業は、改変反応の前のフラクションで行なわれる。一次クロマトグラフィーランの後、以下のフラクションがプールされる：フラクション１（０×ｘ／２）、とフラクション８（７ｘ／２〜４λ）、１５（７ｘ〜１５ｘ／２）、２２（２１ｘ／２〜１１ｘ）、２９（１４ｘ〜２９ｘ／２）、及び３６（３５ｘ／２〜１８ｘ）。類似の形で、フラクション２はフラクション９、１６、２３、３０及び３７と共にプールされ；フラクション３はフラクション１０、１７、２４、３１及び３８と共にプールされ；フラクション４はフラクション１１、１８、２５、３２及び３９と共にプールされ；フラクション５は、フラクション１２、１９、２６、３３及び４０と共にプールされ；フラクション６はフラクション１３、２０、２７及び３４と共にプールされ；フラクション７はフラクション１４、２１、２８及び３５と共にプールされる。７つのプールは少なくとも１つの特異的アミノ酸上で化学的及び／又は酵素的に改変され、７つのプールの各々は、一次クロマトグラフィー分離と実質的に類似したクロマトグラフィー条件下でラン２に別々に付される。各プール内のフラクションの正しい組合せを選択することで、フラグを立てたペプチドは、未改変ペプチドが溶出するものとして知られている時間とは全く異なるウインドウ内で溶出しており、また同じプール内の異なるフラクションに由来するフラグを立てたペプチド間のオーバラップは全く存在しない。フラグを立てたペプチド内の特異的アミノ酸の変異が疎水性分離カラム上の順方向シフトを誘発し、このシフトの値がｘ〜２ｘの間で変動する（これはδminについての値＝ｘ／２、δmax＝５ｘ／２、ｗ１＝ｘ／２及びｗ３＝７ｘ／２を暗に意味している）制限的意味のない例においては、第１のプール内のフラグを立てたペプチドは、例えばフラクション［−２ｘ〜−ｘ／２］、［３ｘ／２〜３ｘ］、［５ｘ〜１３ｘ／２］、［１７ｘ／２〜１０ｘ］、［１２ｘ〜２７ｘ／２］及び［３１×２〜１７ｘ］内で回収されることになる。プール２から７までについて、類似のアプローチに従う。したがってこの例では４０の再ランの代りに、プールについて７回の二次ランしか実行する必要がない。この二次ラン中に溶出するフラグを立てたペプチドは、例えば、直ちに同定するためのオンライン接続された質量分析計のイオン源内に直接移すことができる。上述のプール戦略は、制限的意味のない例である。当業者にとっては、より多い又は少ないプールを作り上げるべく類似の戦略を開発することができ、類似の戦略を同定ペプチドに適用することができる、ということは明白である。プールの数の選択は、なかでも（ｉ）化学的又は酵素的改変によって誘発される間隔シフト、ii）一次クロマトグラフィー分離から回収されたフラクションの溶出ウインドウ及びiii）クロマトグラフィー時間及び分析時間を最適化する必要性によって左右される。本発明は同様に、並列カラムソーターの使用をも提供する。並列カラムソーターでは、単一カラムに基づく方法は、並列に（すなわち同期的に）作動する一定数のカラムを用いて遂行される。並列ソーターは、正に同じ条件（流量、勾配など）でランされる一定数の同一のカラムを収納している。
【０１１３】
並列ソーターの一般的原理は、１２のペプチドフラクションプールを生成し、δｐがｘ／２と５ｘ／２の間にあり、フラグを立てたペプチドと非改変ペプチドの間の親水性シフトである、以下の制限的意味のない例により説明できる。一次クロマトグラフィーランに由来する全てのペプチドの全溶出ウインドウが２０ｘに等しい場合には、ｘ／２ウインドウを伴う４０個のフラクションが回収される。それによって、一次クロマトグラフィーランの後、以下のフラクションをプールすることができる：すなわち、フラクション１（０〜ｘ／２）、とフラクション１３（６ｘ〜１３ｘ／２）、２５（１２ｘ〜２５ｘ／２）及び３７（１８ｘ〜３７ｘ／２）。同様にして、フラクション２はフラクション１４、２６及び３８と共にプールされ；フラクション３はフラクション１５、２７及び３９と共にプールされ；フラクション４はフラクション１６、２８及び４０と共にプールされ；フラクション５はフラクション１７及び２９と共にプールされ；フラクション６はフラクション１８及び３０と共にプールされ；フラクション７はフラクション１９、及び３１と共にプールされ；フラクション８は、フラクション２０及び３２と共にプールされ；フラクション９はフラクション２１及び３３と共にプールされ；フラクション１０は、フラクション２２及び３４と共にプールされ；フラクション１１はフラクション２３及び３５と共にプールされ；フラクション１２はフラクション２４及び３６と共にプールされる。１２個のプールはその後、少なくとも１つの選択されたアミノ酸上で化学的及び／又は酵素的に改変される。代替的アプローチにおいては、各々のフラクションはまず第１に改変に付され、プール作業は改変されたフラクションで実施される。表IIは、１２のフラグを立てたペプチドプールの理論的シフトの計算を含んでいる。１２の改変されたプールの各々（すなわち改変されたフラクションを含有するプール）が、単一カラムソーター上で一次クロマトグラフィー分離と等しいか又は少なくともそれにきわめて類似したクロマトグラフィー条件の下でラン２に付される場合には、毎回、フラグを立てたペプチドを含む（１つのプール内に存在する）フラクションの間に９ｘ／２の「空の」溶出ウインドウが存在する。この９ｘ／２の空の溶出ウインドウは、このウインドウ内ではいかなるフラグを立てたペプチドも溶出せず、いかなるフラグを立てたペプチドも適切な分析装置に送られ得ないことから、クロマトグラフィー分離ならびに分析装置にとって「デッド間隔」である。並列カラムソーターは、最も適切には、２、３、４本又はそれ以上のカラムが実質的に類似の条件（流量、勾配etc.）で同時に二次クロマトグラフィーランを実施し、並列ソーターの出口が直接分析装置と接続されている装置である。並列カラムソーターは、ほぼこの並列ソーター内で使用されるカラム数により、一連の直列単一カラムに通常必要とされるクロマトグラフィー分離時間を割る。並列カラムソーターが３本のカラムから成る、制限的な意味のない例においては、改変されたプールは、改変されたプールの好ましい組合せと並行して再度ランされる。それによって、並列カラムソーターを使用することの利点は、全体的ペプチドソ���ティング時間を大幅に削減できることだけではなく、フラグを立てたペプチドの検出が連続的に行なわれ得るような形での改変されたフラクションからのフラグを立てたペプチドの選択の間のデッド間隔の数が制限されたものである、ということにもある。表IIに例示されているように、上述の制限的意味のない例については、改変されたプールの好ましい組合せというのは、改変されたプール１、５及び９が第１のラン内で３本の並列カラム上に投入され、改変されたプール２、６及び１０が第２のラン内で３本の並列カラム上に投入され、改変されたプール３、７及び１１が第３のランの中で３本の並列カラム上に投入され、改変されたプール４、８及び１２が第４のラン内で３本の並列カラム上に投入される場合である。改変されたプールの上述の組合せでは、４回のランの各々において並列カラムからフラグを立てたペプチドが溶出する間隔の間にほぼ完璧な整列が存在する。カラムＩ、II及びIIIが同時に開始された場合、カラムＩ、プールＩ、フラクション１からのフラグを立てたペプチドはまず最初にウインドウ−２ｘ〜−ｘ／２で溶出することになる。次のフラグを立てたペプチド流は、カラムII、プール５、フラクション５から来る；これらのフラグを立てたペプチドは、ウインドウ０〜３ｘ／２で溶出することになる。これらの後には、ｗｗ２ｘ〜７ｘ／２で溶出するカラムIII、プール９、フラクション９からのフラグを立てたペプチドが続く。その後のフラグを立てたペプチドは、ｗｗ４ｘ〜１１ｘ／２でカラムＩ、プール１、フラクション１３から溶出する等々（異なるプールからのフラグを立てたペプチドの間のオーバラップの可能性を避けるため、ｘ／２のウインドウが各々の２つのフラグを立てたペプチド溶出ウインドウの間に導入された）。ペプチドソーターの中で、カラムＩ、II及びIIIから溶出するフラグを立てたペプチドは連続的に、質量分析計といったような分析装置へと移行させられる。各々のラン内のフラグを立てたペプチドが中断無く溶出するという事実は、分析装置内へのペプチドの連続流を導く。ひとたび第１のランが完了した時点で、第２のランを開始させることができ、その後第３及び第４のランが続く。上述のプール戦略は、制限的な意味のない例である。当業者にとっては、プール及び並列カラムの数のその他の組合せにより、類似の結果すなわち、例えば質量分析計内でのペプチドの連続的分析に直ちに結合されたフラグを立てたペプチドの連続的なクロマトグラフィー溶出が導かれ得るということは明白であろう。プール及びカラムの数の選択は、なかでもｉ）化学的又は酵素的改変によって誘発された間隔δｐ、ii）一次クロマトグラフィー分離から回収されたフラクションの溶出ｗｗ及びiii）クロマトグラフィー時間と分析時間を最適化する必要性によって左右される。同様に当業者には、同定ペプチドの単離のためにもこの並列カラムアプローチを応用できるということが明白となると思われる。
【０１１４】
本発明のもう１つの態様においては、多重カラムペプチドソーターが提供されている。かかる多重カラムペプチドソーターが作り出され、組合せ型並列直列モードで作動する一定数の並列カラムソーターで基本的に構成されている。かかる並列ソーターは基本的にｚ本のカラムのセットをｙ倍含んでおり、ここでｚ本のカラムは並列に連結されている。制限的な意味のない例においては、ｙ＝３でありｚ＝３である多重力ラムソーターは、９カラムのソーターである。３本の並列カラムセットはＡ、Ｂ及びＣと呼ばれる。Ａの個々のカラムは、Ｉ、II及びIIIと呼ばれ、Ｂの個々のカラムは、Ｉ′、II′及びIII′と呼ばれ；Ｃの個々のカラムは、Ｉ″、II″及びIII″と呼ばれる。並列カラムの１セットは、先行するセットに対し一定の遅延（θと呼称される）を伴って作動する。したがって、並列ソーターＢは、並列ソーターＡとの関係においてθという遅延を伴って開始し、並列ソーターＣは、並列ソーターＢの開始後θだけ遅延して、また並列ソーターＡの開始後２θだけ遅延して開始する。多重カラムソーターにおいては、改変されたペプチドの１つのラン１フラクションのみがカラム１本につき一定の与えられた時間で処理されるということを指摘することが重要である。それによって、９カラムソーターの例においては、フラグを立てたペプチド（又は同定ペプチド）の９つのフラクションが同時に処理される。このことは、複数の改変されたフラクションが戦略的にプールされ同時に投入される２つの前述のソーター（すなわち１カラムペプチドソーター及び並列ソーター）とは異なっている。多重カラムソーター上でその時点でフラグを立てたペプチド（又は同定ペプチド）の１つのフラクションしか処理されないことから、流量精度の制御（すなわち二次クロマトグラフィー工程）は、前述のソーターほど重要ではない。多重カラムソーターのもう１つの利点は、それが、フラグを立てたペプチドのクロマトグラフィーシフトが異なるフラクション全体にわたり著しく変動する場合において、非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離するように充分適応されているという点にある。同様にして、多重カラムソーターは、改変されたペプチドから同定ペプチドを分離するために充分適応されている。
【０１１５】
多重カラムソーターの機構は、表II中に表わされているような改変されたフラクションの溶出ウインドウを使用する９カラムペプチドソーターについての制限的な意味のない例として説明される。カラムＩ上には、改変されたフラクション１が投入され、カラムII上には、改変されたフラクション１３が投入され、カラムIII上には改変されたフラクション２５が投入される。システムＢ（カラムＩ′、II′及びIII′）にはそれぞれ改変されたフラクション２、１４及び２６が投入され、システムＣ（カラムＩ″、II″及びIII″）にはそれぞれ改変されたフラクション３．１５及び２７が投入される。表IIを見ればわかるように、システムＡの３本のカラムが同時に開始させられ、システムＢの３本のカラムは全て遅延θ＝３ｘ／２を伴って開始し、システムＣの３本のカラムは全て２θ＝３ｘ（システムＡに対して）の遅延を伴って開始する場合、フラグを立てたペプチドの溶出中のデッド時間は最少量である。多重カラムペプチドソーターが例えば上述の設定値に従ってランされる場合、システムＡ、カラムＩ、フラクション１からのフラグを立てたペプチドはまず最初に予め定められたｗｗ−２ｘ〜−ｘ／２で溶出することになり、それに続いて、システムＢ、カラムＩ′、フラクション２からのフラグを立てたペプチドがｗｗ０〜３ｘ／２で溶出し、その後続いて、システムＣ、カラム１″、フラクション３からのフラグを立てたペプチドはｗｗ２ｘ〜７ｘ／２で溶出し、その後システムＡ、カラムII、フラクション１３からのフラグを立てたペプチドがｗｗ４ｘ〜１１ｘ／２で溶出する…等々。さらに、表IIに提示されているフラクションの完全なソーティングは、ラン１：システムＡ（１、１３、２５）、システムＢ（２、１４、２６）、システムＣ（３、１５、２７）；ラン２：システムＡ（４、１６、２８）、システムＢ（５、１７、２９）、システムＣ（６、１８、３０）；ラン３：システムＡ（７、１９、３１）、システムＢ（８、２０、３２）、システムＣ（９、２１、３３）；ラン４：システムＡ（１０、２２、３４）、システムＢ（１１、２３、３５）、システムＣ（１２、２４、３６）及びラン５：システムＡ（３７）、システムＢ（３８）、システムＣ（３９、４０）という５回のランで実施できる。当業者にとっては、並列及び直列カラムのその他の組合せが類似の結果を導く可能性があることまた多重カラムペプチドソーターが同定ペプチドの単離にも同等にうまく適用可能であることが明白であろう。カラムの数、その配置及びカラム上に投入されるフラクションの選択は、なかでもｉ）化学的又は酵素的改変によって誘発された間隔δｐ、ii）一次クロマトグラフィー分離から回収されたフラクションの溶出ウインドウ及びiii）クロマトグラフィー時間と分析時間を最適化する必要性によって左右される。
【０１１６】
当業者にとっては、本発明の方法を実施するペプチドソーターは、市販のオートインジェクターー、ＨＰＬ−機器及び自動フラクションコレクターを用いて完全自動式にでも機能させることができるということが明白である。したがって、ペプチドソーターの当該例は、網羅的であるものとみなされるべきではない。電気泳動及びイオン交換クロマトグラフィーシステムを含めた複数の変形態様も同等に実現可能である。完全さを期して、同定ペプチドをソートするためのペプチドソーターを、同じ原理に基づいて設計することができる。
【０１１７】
例示的実施態様はさらに、選択的かつ効率の良い形で上述のプロテオーム分析方法を実施するためのシステムを提供している。論述した通り、一次クロマトグラフィーカラムは、複合ペプチド混合物の初期分離を実施する。一次クロマトグラフィーカラムは、複合ペプチド混合物を、規定の条件セットの下で少なくとも２つのフラクションへと分離する。例えば一次クロマトグラフィーカラムは、予め定められた溶媒勾配及び予め定められた流量でカラムを溶出することにより、タンパク質ペプチド混合物を分離する。一次クロマトグラフィー分離から結果としてもたらされるフラクションは、全く異なる溶出時間をもつ複数のフラクションを上述のように複数のプールされたフラクションへと混ぜ合わせるように、戦略的にプールされ得る。プールされたフラクションはその後改変されて、各フラクションについて１組の改変されたペプチド及び一組の非改変ペプチドを結果としてもたらすことができる。１つの変形実施態様に従うと、フラクションはまず最初に上述の方法を用いて改変され、その後、一組のプールされたフラクションの形に戦略的にプールされ、ここでプールされたフラクション中の各々のフラクションは一組の改変されたペプチド及び１組の非改変ペプチドを含む。二次クロマトグラフィー分離では、改変されたペプチドは、未改変ペプチドから分離される。このとき、単離されたペプチドは、タンパク質を同定するべく分析され得る。
【０１１８】
二次クロマトグラフィー分離は、図９で例示されているように、単一カラムペプチドソーター１０を用いて実施され得る。例示的実施態様に従うと、単一カラムペプチドソーター１０が、一次クロマトグラフィーカラムと順々に作動し、二次クロマトグラフィーカラム１１を含む。例示的実施態様に従うと、二次クロマトグラフィーカラム１１は、一次クロマトグラフィーカラムとタイプ、サイズ、形状及びその他のパラメータが実質的に同一である。例示的二次クロマトグラフィーカラム１１はさらに、実質的に類似したクロマトグラフィー条件下で機能する。例えば、例示的実施態様に従うと、二次クロマトグラフィーカラムは、一次クロマトグラフィーカラム内で分離をもたらすのに用いられた溶媒勾配と同一か又は実質的に類似した溶媒勾配及び同一か又は実質的に類似の流量で溶出される。例示的ペプチドソーター１０はさらに、少なくとも１つの溶媒タンクに連結された溶媒ポンプ１２を内含する溶媒システムを内含する。溶媒ポンプ１２は、二次カラム１０に対し予め定められた溶媒勾配を提供する。分離のためカラムにフラクション又はプールされたフラクションを導入するために、サンプルインジェクター１３が具備されている。ペプチドをソーティングするためのシステム１０はさらに、溶媒及びサンプル流を制御し二次カラム入口１５まで導くための１組の入口バルブ１４を内含している。図９のペプチドをソーティングするためのシステム１０はさらに、二次カラム１０の出口６からの流れを制御し、廃棄物容器１７、フラクションコレクター１８及び／又はオンライン接続された分析装置１９のイオン源の間で二次カラム１０からの溶出物を導くための出口バルブセット５１を内含している。バルブ１４、５１の動作を制御し誘導するために、バルブコントロールシステム５０が具備されている。例示的実施態様に従うと、分析装置１９は質量分析計を含んでいるが、当業者であれば、本願で記述されているもののようなタンパク質を同定するための適切なあらゆる分析装置を利用できるということを認識することだろう。論述されている通り、改変されたペプチドは、二次カラム１０内の非改変ペプチドとは全く異なる形で溶出し、改変されたペプチドの単離及び同定を行なうことができるようにする。当業者にとっては、改変されたペプチドから同定ペプチドを分離するためにも同じ原理（カラム）を使用できるということは明らかである。
【０１１９】
二次クロマトグラフィー工程をもたらすために利用されるカラムは一次カラムとは分離した全く異なるものとして例示されているが、当業者であれば、例示的実施態様の一次及び二次クロマトグラフィー工程を実施するために単一カラムを利用することができるということを認識することだろう。例えば、複合混合物を、一定の与えられたクロマトグラフィーカラムを用いてフラクションの形に分離することができる。一定の与えられたカラムは、清浄され、その後二次クロマトグラフィー工程のために再利用することができる。
【０１２０】
変形実施態様に従うと、改変されたフラクションの分離は、図１２ａ及び１２ｂに例示されているように、並行カラムペプチドをソーティングするためのシステムを用いて実施可能である。論述した通り、複合混合物は、一次クロマトグラフィーカラムを用いてまず分離され、上述の方法を用いて改変され、改変工程の前又は後で戦略的にプールされる。改変されプールされたフラクションはその後、第２のクロマトグラフィー工程を受けて、改変されたペプチド及び非改変ペプチドの分離をもたらす。図１２ａに例示されている並列カラムペプチドをソーティングするためのシステム２０は、二次クロマトグラフィー工程の効率及び速度を著しく改善する。例示されているように、並列カラムシステム２０は、並列に連結された複数の実質的に同一の二次クロマトグラフィーカラム２１ａ、２１ｂ、２１ｃを含む。並列カラムシステム２０の二次クロマトグラフィーカラム２１ａ、２１ｂ、２１ｃは、複合混合物の一次分離を実施するために用いられる一次クロマトグラフィーカラムとサイズ、形状及びその他のクロマトグラフィーパラメータに関し同一か又は実質的に類似している。例示的実施態様に従うと、ペプチドをソーティングするためのシステムは３本の二次カラムを含んでいる。しかしながら、当業者であれば、並列に連結された任意の適切な数のクロマトグラフィーカラムを利用できること、そして本発明が３本のカラムの例示的実施態様に制限されるものではないことを認識することだろう。同じ機械的原理は、同定ペプチドを単離するためにも適用できる。
【０１２１】
図１２ａに示されているように、並列カラムシステム２０は、それぞれ各カラム２１ａ、２１ｂ、２１ｃに対応する１組の溶媒システム２２ａを内含する。各々の溶媒ポンプは、一組の溶媒タンクに連結され、対応する二次カラムに対して予め定められた溶媒勾配を提供する。並列カラムペプチドをソーティングするためのシステム２０はさらに、１以上の二次カラムにサンプルを導入するため、二次カラム２２ａ、２２ｂ、２２ｃの入口２５ａ、２５ｂ、２５ｃに結合されたサンプルインジェクター２３を含んでいる。溶媒及びサンプル流を制御し、選択された二次カラムに導くため、１組の入口バルブ２４が具備されている。また、廃棄物容器２７、フラクションコレクター２８及び／又は質量分析計といったようなオンライン接続された分析装置２９のイオン源の間で二次カラム２０ａ、２０ｂ、２０ｃの入口２６ａ、２６ｂ、２６ｃからの溶出物を制御し導くために１組の出口バルブ５３が具備されている。バルブ２４、５３の作動を制御するために、バルブコントロールシステム５５が具備されている。
【０１２２】
図１２ｂに示されている並列カラムペプチドをソーティングするためのシステムの変形実施態様に従うと、ペプチドをソーティングするためのシステム２０′内で二次並列カラム２０ａ′、２０ｂ′、２０ｃ′に対する溶媒勾配を提供するために、単一の溶媒ポンプ５８が利用される。図１２ｂのペプチドをソーティングするためのシステムは、溶媒システムを除いて、図１２ａのペプチドをソーティングするためのシステムと実質的に類似している。例示されている通り、溶媒タンクから並列二次カラムまで溶媒 混合物を圧送するために単一の溶媒ポンプ５８が利用される。図１２ｂ内に例示されている実施態様においては、１組の流量調節器５２を含む制御されたスプリッタシステムが、溶媒ポンプ５８から並列二次カラム２０ａ′、２０ｂ′、２０ｃ′まで溶媒の流れを制御し導くために利用される。
【０１２３】
図１３に示されているさらにもう１つの実施態様に従うと、本発明の二次クロマトグラフィー工程を実施するための代替的ペプチドをソーティングするためのシステム３０には、直列／並列併用モードで動作する複数の並行カラムセットが含まれている。例示的実施態様に従うと、図１３のペプチドをソーティングするためのシステムは、複数の直列に連結された二次カラムセット４１、４２、４３を含む。各々の二次カラムセット４１、４２、４３は、並列に連結された複数の二次カラム４１ａ、４１ｂ、４１ｃ、４２ａ、４２ｂ、４２ｃ、４３ａ、４３ｂ、４３ｃを含む。
当業者であれば、例示的ペプチドをソーティングするためのシステムが例示された数のカラム及びカラムセットに制限されるものではなく、例示的実施態様の二次クロマトグラフィー工程を実施するためには任意の適切な数の並列カラム及び直列カラムセットを利用することができるということを認識するだろう。
【０１２４】
図１３のペプチドをソーティングするためのシステム３０では、一次クロマトグラフィーランから産生されたペプチドの単一の改変されたフラクションが、１カラムあたり一定の与えられた時間で処理される。フラクションは、選択されたカラム上で一度に１つずつ投入され、非改変ペプチドからの各フラクションの中の改変されたペプチドの分離をもたらすため、各々それぞれのカラムに溶媒勾配が提供される。二次カラムセット内の選択された二次カラムにペプチドフラクションを導入するため、サンプルインジェクター１３ａ、１３ｂ、１３ｃが各々の二次カラムセット４１、４２、４３にそれぞれ具備され、連結されている。それぞれのカラムセットに対し予め定められた時点で予め定められた溶媒勾配を提供するため、溶媒ポンプ１２ａ、１２ｂ、１２ｃを内含する溶媒システムが各々の二次カラムセット４１、４２、４３にそれぞれ具備され連結されている。一組の入口バルブ４４が、溶媒ポンプからの溶媒流及びサンプルインジェクターからのサンプル流を制御し二次カラムセット４１、４２、４３内の二次カラムの入口まで導く。廃棄物容器４７、フラクションコレクター４８及び／又はオンライン接続された分析装置４９のイオン源に対し、二次カラムの出口４１ａ、４１ｂ、４１ｃ、４２ａが連結され二次カラムからの溶出物を導いている。バルブ１４、５１の作動を制御し誘導するため、バルブコントロールシステム５０が具備されている。
【０１２５】
溶媒ポンプ１２ａ、１２ｂ、１２ｃは、選択された時間的周期でそれぞれのカラムセット４１、４２、４３のための予め定められた溶媒勾配を開始させるように構成されている。例えば、第１の溶媒ポンプ１２ａは、第１のセット４１の二次カラム４１ａ、４１ｂ、４１ｃの中で各フラクションの分離をもたらすため第１の予め定められた時間でカラムセット４１内で第１の適切な溶媒勾配を初期化する。溶媒勾配は、第１のセット内が各二次カラム４１ａ、４１ｂ、４１ｃ全体にわたり展開される。選択された遅延の後、第２の溶媒ポンプ１２ｂは、第２の予め定められた時間で二次カラム４２の第２のセットの中で同一の又は実質的に同一の溶媒勾配を初期化する。第２の溶媒システムは、第２のセット４２内の二次カラム４２ａ、４２ｂ、４２ｃ内で各フラクションの分離をもたらすため、各々の二次カラム４２ａ、４２ｂ、４２ｃ全体にわたり溶媒勾配を展開させる。最後に、選択された遅延の後、第３の溶媒ポンプ１２Ｃが、第３のフラクションセットの分離をもたらすべく第３の二次カラムセット４３内で同一の又は実質的に同一の溶媒勾配を初期化する。記述された構成は、フラクション内の改変されたペプチド及びその改変されたペプチドに対応するタンパク質を同定するため、分離され単離されたペプチドの連続流をフラクションコレクター４８及び／又はオンライン接続された分析装置４９のイオン源に提供する。
【０１２６】
図１３のペプチドをソーティングするためのシステムは、一次カラムよりも実質的に小さい二次カラムセット４１ａ、４１ｂ、４１ｃ、４２ａ、４２ｂ、４２ｃ、４３ａ、４３ｂ、４３ｃを用いて実現できる。二次カラム４１ａ、４１ｂ、４１ｃ、４２ａ、４２ｂ、４２ｃ、４３ａ、４３ｂ、４３ｃは同様に、さほど高価でない使い捨ての材料で形成されていてよい。このようにして、例示された実施態様のペプチドをソーティングするためのシステム３０は、本発明のプロテオーム分析の速度及び効率を著しく改善するばかりでなく、分析の実施コストを削減する。上述の機械的原理は、非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離するため又は、改変されたペプチドから同定ペプチドを分離するために使用することができる。
【０１２７】
それによって、もう１つの実施態様においては、本発明は、ペプチドをソーティングするためのシステムにおいて、ａ）規定の条件セットの下でタンパク質ペプチド混合物を複数のフラクションへと分離することを目的とし、それによって各フラクションがその後少なくとも１つのアミノ酸の改変を受けてフラグを立てたペプチドを生成することになり、かつ改変されたフラクションは１セットのプールされたフラクションの形にプールされた、各々のプールされたフラクションが少なくとも２つの改変されたフラクションを含んでいる一次クロマトグラフィーカラム、及び；ｂ）第１のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラムと並列に配置された少なくとも１本の第２の二次クロマトグラフィーカラムを含みかつ、規定の条件セットと実質的に同一である条件の下でフラグを立てたペプチドの単離を行ない、それによって（ｉ）１つのプール内の異なるフラクションからのフラグを立てたペプチドの間又はプール間で及び（ii）フラグを立てたペプチドと未改変ペプチドの間で溶出オーバラップが全く存在しないようにしている１セットの二次クロマトグラフィーカラム、を含むシステムを提供している。
【０１２８】
さらにもう１つの実施態様においては、規定の条件セットの下でタンパク質ペプチド混合物を複数のフラクションへと分離することを目的とし、それによって各フラクションがその後少なくとも１つのアミノ酸の改変を受けて改変されたペプチドと未改変ペプチドを生成することになり、かつ改変されたフラクションは１セットのプールされたフラクションの形にプールされた、各々のプールされたフラクションが少なくとも２つの改変されたフラクションを含んでいる一次クロマトグラフィーカラム；及び第１のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２のプールされたフラクションを分離するための第１の二次クロマトグラフィーカラムと並列に配置された少なくとも１本の第２の二次クロマトグラフィーカラムを含みかつ、規定の条件セットと実質的に同一である条件の下で同定ペプチドの単離を行ない、それによって（ｉ）１つのプール内の異なるフラクションからの同定ペプチドの間又はプール間で及び（ii）同定ペプチドと改変されたペプチドの間で溶出オーバラップが全く存在しないようにしている１セットの二次クロマトグラフィーカラムを含む、ペプチドをソーティングするためのシステムを提供している。
【０１２９】
もう１つの実施態様においては、システムはさらに、第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２の二次クロマトグラフィーカラムからの溶出物を回収するための第２のクロマトグラフィーカラムセットに対する出口を含む。
【０１３０】
もう１つの実施態様においては、システムはさらに、出口に連結された分析装置を含む。
【０１３１】
もう１つの実施態様においては、システムはさらに、二次クロマトグラフィーカラムセットから廃棄物を回収するための出口に連結された廃棄物容器を含む。
【０１３２】
さらにもう１つの実施態様においては、システムはさらに、第１の二次カラム及び第２の二次カラムのうちの１本の中にプールされたフラクションを注入するため二次クロマトグラフィーカラムセットに結合されたサンプルインジェクターを含む。
【０１３３】
さらにもう１つの実施態様においては、システムはさらに、サンプルインジェクターから第１の二次カラム及び第２の二次カラムのうちの１本までプールされたフラクションを導くためのサンプル注入バルブセットを含む。
【０１３４】
さらにもう１つの実施態様においては、システムはさらに、二次クロマトグラフィーカラムセットに対し溶媒勾配を提供するための溶媒システムを含む。
【０１３５】
さらにもう１つの実施態様においては、前記溶媒システムには、第１の二次クロマトグラフィーカラムに対して溶媒勾配を提供するための第１の溶媒ポンプ及び第２の二次クロマトグラフィーカラムに対して溶媒勾配を提供するための第２の溶媒ポンプが含まれている。
【０１３６】
もう１つの実施態様においては、前記溶媒システムには、第１の二次クロマトグラフィーカラム及び第２の二次クロマトグラフィーカラムに連結された溶媒ポンプ、第１の二次クロマトグラフィーカラムへの溶媒流を調節するための第１の流量調節器及び第２の二次クロマトグラフィーカラムへの溶媒流を調節するための第２の流量調節器が含まれている。
【０１３７】
もう１つの実施態様においては、システムはさらに、二次クロマトグラフィーカラムセットから溶出物を回収するためのフラクションコレクターを含む。
【０１３８】
さらにもう１つの実施態様においては、システムはさらに、サンプル注入バルブセットを制御するためのバルブ制御システムを含む。
【０１３９】
さらにもう１つの実施態様においては、前記システム内で、第１及び第２の二次クロマトグラフィーカラムは、一次カラムと実質的に同一である。
【０１４０】
さらにもう１つの実施態様においては、前記システム内では、タンパク質ペプチド混合物の分離をもたらすために第１の溶媒勾配が一次カラムに適用され、プールされたフラクションの分離をもたらすために、第１の溶媒勾配と実質的に同一のものである第２の溶媒勾配が二次カラムに適用される。
【０１４１】
もう１つの実施態様においては、本発明は、第１のクロマトグラフィーカラム及びそれと実質的に並列に配置された第２のクロマトグラフィーカラムを含む第１のクロマトグラフィーカラムセット、第１のクロマトグラフィーカラムセットにサンプルを提供するための第１のサンプルインジェクター、第１の予め定められた時点で第１のクロマトグラフィーカラムに対し予め定められた溶媒勾配を提供するための第１の溶媒システム、第３のクロマトグラフィーカラム及びそれと実質的に並列に配置された第４のクロマトグラフィーカラムを含む第２のクロマトグラフィーカラムセット、第２のクロマトグラフィーカラムセットにサンプルを提供するための第２のサンプルインジェクター、及び第２の予め定められた時点で第２のクロマトグラフィーカラムに対し予め定められた溶媒勾配を提供するため第２の溶媒システムを含むペプチドをソーティングするためのシステムを提供する。
【０１４２】
さらにもう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、クロマトグラフィーカラムから廃棄物を回収するため、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムセットの出力端に連結された廃棄物容器を含む。さらにもう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、予め定められた間隔で、カラムから溶出物を回収するため、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムセットの出力端に連結されているフラクションコレクターを含む。さらにもう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、第１及び第２のクロマトグラフィーカラムの出力端に連結された分析装置を含む。もう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、クロマトグラフィーカラムの入口を制御するためクロマトグラフィーカラムの入口に連結された入口バルブセットを含む。さらにもう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、カラムから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つまで溶出物を導くためクロマトグラフィーカラムの出口に連結された出口バルブセットを含む。さらにもう１つの実施態様においては、このソーティングシステムはさらに、入口バルブセット及び出口バルブセットを制御するためのバルブ制御システムを含む。
【０１４３】
もう１つ実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物のフラクションセットを提供する工程；第１の並列なクロマトグラフィーカラムセット及び第２の並列なクロマトグラフィーカラムセットを含むペプチドをソーティングするためのシステムを提供する工程、タンパク質ペプチド混合物の第１のフラクションセットを第１のカラムセットにかける工程；タンパク質ペプチド混合物の第２のフラクションセットを第２のカラムセットにかける工程；第１のフラクションセットの分離を初期化するため、第１の予め定められた時間に第１のカラムセット内に溶媒勾配を提供する工程；及び第２のフラクションセットの分離を初期化するため第１の予め定められた時間に続く第２の予め定められた時間に第２のカラムセット内に溶媒勾配を提供する工程を含む、ペプチド分離方法を提供する。さらにもう１つ実施態様においては、本発明はさらに、第１のカラムセットから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つまで溶出物を導く工程を含む。さらにもう１つ実施態様においては、本発明はさらに、第２のカラムセットから廃棄物容器、フラクションコレクター及び分析装置のうちの１つまで溶出物を導く工程を含む。
【０１４４】
もう１つ実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチドを単離する方法において、（ａ）タンパク質ペプチド混合物を分離するための一次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；（ｂ）規定の条件セット下でタンパク質ペプチド混合物を１セットのフラクションへと分離するべく一次クロマトグラフィーカラム内にタンパク質ペプチド混合物を注入する工程；（ｃ）フラクションセット内のフラクションのうちの少なくとも１つを改変させて１セットの改変されたフラクションを形成する工程であって、改変されたフラクションがフラグを立てたペプチドのサブセット及び未改変ペプチドのサブセットを含む工程；（ｄ）第１の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションをプールして第１のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第１及び第２の改変されたフラクションからのフラグを立てたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの未改変ペプチドとフラグを立てたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｅ）第３の改変されたフラクションと第４の改変されたフラクションをプールして第２のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第３及び第４の改変されたフラクションからのフラグを立てたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの未改変ペプチドとフラグを立てたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｆ）未改変ペプチドのサブセットからフラグを立てたペプチドのサブセットを分離するため第１の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｇ）第１の改変されたフラクションを第２の改変されたフラクション内のフラグを立てたペプチドのサブセットを単離するべく規定の条件セット下で二次クロマトグラフィーカラムを用いて第１のプールされたフラクションを分離する工程を含む、方法を提供する。
【０１４５】
もう１つ実施態様においては、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチドを単離する方法において、（ａ）タンパク質ペプチド混合物を分離するための一次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；（ｂ）規定の条件セット下でタンパク質ペプチド混合物を１セットのフラクションへと分離するべく一次クロマトグラフィーカラム内にタンパク質ペプチド混合物を注入する工程；（ｃ）フラクションセット内のフラクションのうちの少なくとも１つを改変させて１セットの改変されたフラクションを形成する工程であって、改変されたフラクションが改変されたペプチドのサブセット及び同定ペプチドのサブセットを含む、工程；（ｄ）第１の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションをプールして第１のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第１及び第２の改変されたフラクションからの改変されたペプチドの間及び、ii）前記フラクションの同定ペプチドと改変されたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｅ）第３の改変されたフラクションと第４の改変されたフラクションをプールして第２のプールされたフラクションを形成する工程であって、ここでｉ）第３及び第４の改変されたフラクションからの同定ペプチドの間及び、ii）前記フラクションの同定ペプチドと改変されたペプチドの間に溶出オーバラップが全く存在しない工程；（ｆ）同定ペプチドのサブセットから改変されたペプチドのサブセットを分離するため第１の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｇ）第１の改変されたフラクションを第２の改変されたフラクション内の同定ペプチドのサブセットを単離するべく規定の条件セット下で二次クロマトグラフィーカラムを用いて第１のプールされたフラクションを分離する工程を含む、方法を提供する。
【０１４６】
さらにもう１つ実施態様においては、本発明はさらに、第３の改変されたフラクション及び第４の改変されたフラクション内のフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのサブセットを単離するための規定の条件セット下で第１の二次クロマトグラフィーカラムを用いて第２のプールされたフラクションを分離する工程を含む。
【０１４７】
さらにもう１つ実施態様においては、前記方法はさらに、（ｈ）１つのフラクション内の未改変ペプチドのサブセットから改変されたペプチドサブセットを分離するため、第１の二次クロマトグラフィーカラムと実質的に並列して配置された第２の二次クロマトグラフィーカラムを提供する工程；及び（ｉ）第３の改変されたフラクションと第２の改変されたフラクションの中の改変されたペプチドのサブセットを単離するべく規定の条件セット下で第２の二次クロマトグラフィーカラムを用いて第２のプールされたフラクションを分離する工程を含む。
【０１４８】
さらにもう１つ実施態様においては、前記方法はさらに、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを分析装置まで導く工程を含む。
【０１４９】
さらにもう１つ実施態様においては、前記方法はさらに、データベース検索と組合せて、分析装置を用いて同定ペプチド又はフラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質を同定する工程を含む。
【０１５０】
以下では、本発明の異なる工程のうちのいくつかについてさらに多くの情報を提供する記述が提示される。
【０１５１】
Ｉ．タンパク質ペプチド混合物の調製
タンパク質を含有するサンプル（タンパク質ペプチド混合物）に由来するタンパク質ペプチド混合物が、化学的又は酵素的分割又は消化といったような当該技術分野において記述されている方法により得られる。好ましい１態様においては、タンパク質は、タンパク質分解酵素によって消化される。トリプシンは、リシン及びアルギニンの部位で分割して、標準的にアミノ酸約５〜５０個という長さ及び約５００〜５０００ダルトンの分子量をもつ荷電ペプチドを生み出すことから、特に好適な酵素である。かかるペプチドは、質量分析法による分析のために特に適している。本発明においても同様に使用可能なプロテアーゼの制限的意味の無いリストとしては、Lysobacter enzymogenesエンドプロテイナーゼLys-C、Staphylocolococus aureusエンドプロテイナーゼGlu-C（Ｖ８プロテアーゼ）、Pseudomonos fragiエンドプロテイナーゼAsp-N及びクロストリパインがある。本発明では、Bacillus subtilisズブチリシン、プロカインペプシン及びTritirachium albumプロテイナーゼＫといった特異性がさらに低いプロテイナーゼも使用できる。
【０１５２】
代替的には、タンパク質をペプチドに分割するために、化学的試薬を使用することもできる。例えば、メチオニン残基においてタンパク質を分割するためには、臭化シアンを用いることができる。酸性条件下で、制限された加水分解により、化学的フラグメント化を適用することもできる。代替的には、トリプトファン部位で分割するべく、ＢＮＰＳ−スカトールを使用することができる。イソチオシアネートを伴う化学的に誘発されたラダーを用いるか又はアミノペプチダーゼ処理を用いた、部分的ＮＨ2末端分解を使用することもできる。
【０１５３】
II．クロマトグラフィー
本願で使用されている「クロマトグラフィー工程」又は「クロマトグラフィー」という語は、化学的物質を分離するための方法を意味し、当該技術分野において広範に利用可能である。好ましいアプローチにおいては、通常は細く分割された固体、フィルター材料のシート又は固体の表面上の液体の薄膜である静止した物質上の気体又は液体の移動流から化学物質が吸着される相対速度が用いられる。クロマトグラフィーは、存在する個々の物質の数、性質又は相対量についての詳細な知識が事前に存在しない場合でさえ、化合物の混合物を分離することのできる多目的方法である。この方法は、生物由来の化学的化合物（例えばアミノ酸、タンパク質のフラグメント、ペプチド、タンパク質、リン脂質、ステロイドなど）及び香料及びフレーバといったような揮発性芳香族混合物及び石油の複合混合物の分離のために広く使用されている。最も広く用いられているカラム状液体技術は、ポンプが液体移動相を高圧下で高効率の密に詰込まれたカラム内に強制的に通す高性能液体クロマトグラフィーである。クロマトグラフィー技術についての近年の概観は、本願に参考として組み込まれるMeyer M., 1998、ＩＳＢＮ：０４７１９８３７３Ｘ及びCappiello A. et al.(2001)Mass Spectrom. Rev. 20(2):88-104によって記述されている。当該技術分野で記述されたその他の最近開発された方法及び当該技術分野において利用可能となってきた新しいクロマトグラフィー方法も同様に使用可能である。クロマトグラフィーのいくつかの例としては、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー又はアフィニティクロマトグラフィー例えばイムノアフィニティ及び固定化金属アフィニティクロマトグラフィーがある。
【０１５４】
クロマトグラフィーは、複数の分離技術の１つである。キャピラリー電気泳動法、フリーフロー電気泳動法などといった電気泳動法及び全ての変形態様がこのグループのもう１つの成員である。後者の場合、駆動力は電界であり、これが異なるイオン電荷の溶質に対し異なる力を及ぼす。抵抗力は、流れない溶媒の粘度である。これらの力の組合せは、各溶質に固有のイオン浮動度を生み出す。いくつかの例としては、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び未変性ゲル電気泳動法がある。キャピラリー電気泳動法には、キャピラリーゲル電気泳動法、キャピラリーゾーン電気泳動法、キャピラリー電気クロマトグラフィー、キャピラリー等電点及びアフィニティ電気泳動法が含まれる。これらの技術は、本願に参考として組み込まれている、Mckay P., 化学入門、Science Seminar, Genetech Inc.再生科学部門の中で記述されている。
【０１５５】
III．緩衝液
本発明の方法は、一次ランにおける分離条件、改変工程における反応条件、二次ランにおける分離条件及び質量分析計といったような分析装置内の溶出するフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを分析するための条件の間の相容性を必要とする。前述の通り、一次ラン及び二次ランにおけるクロマトグラフィー条件及び改変反応により誘発されたクロマトグラフィーシフトの組合せは、一次ランにおいてタンパク質ペプチド混合物から得られた各フラクションからフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを単離する可能性を決定する。同様に前述した通り、好ましい実施態様において、一次ラン及び二次ランのクロマトグラフィー条件は同じであるか又は実質的に類似している。
【０１５６】
さらに好ましい実施態様においては、両方のクロマトグラフィー工程で使用される緩衝液及び／又は溶媒は、２つのクロマトグラフィー工程の間の改変工程で化学的及び／又は酵素的反応の効率の良い進行を可能にするのに必要とされる条件と相容性あるものである。特に好ましい実施態様においては、一次ラン、二次ラン及び改変工程における溶媒及び緩衝液の性質は、同一か又は実質的に類似している。さらに好ましい実施態様においては、前記緩衝液及び溶媒は、質量分析を実施するのに必要とされる条件と相容性をもつ。かかる緩衝液及び溶媒を規定するには、調整及び微調整が必要である（そしてかかる条件は、先行技術において利用可能ではない）。この同調を示す例は、例えば例９の中で記述されている。
【０１５７】
特定のタイプのフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを伴う本発明の一部の実施態様については、一次ラン、改変工程、二次ラン及び分析の手順全体を通して使用できる同一か又は実質的に類似緩衝液及び／又は溶媒の１つのセットを設計することは、不可能とはいわないまでも非常に困難である。
【０１５８】
例えば、改変工程においてはペプチドを改変するための化学的及び／又は酵素的反応は、一次ラン及び／又は二次ランにおいて使用される緩衝液と相容性のない特異的な反応条件を要求する。これらの場合、フラクション内の緩衝液／溶媒条件は、改変工程の前及び／又は後に変更され、この変更は、例えば抽出、凍結乾燥及び再溶解工程、沈殿及び再溶解工程、適切な緩衝液／溶媒に対する透析またさらには急勾配での高速逆相分離といったような当該技術分野において記述された方法を用いて実施される。
【０１５９】
もう１つの厄介な問題は、一次ランを開始する前にタンパク質ペプチド混合物中に存在する緩衝液／溶媒の組成でありうる。本願で以上に言及した前処理工程の適用は、一次ランを実施するための緩衝液／溶媒とは相容性のない特異的緩衝液／溶媒条件を要求する可能性がある。代替的には、その生物供給源からのタンパク質の調製／単離のための条件は、結果として、一次ランにマイナスの干渉を与える化合物でのタンパク質混合物又はタンパク質ペプチド混合物の汚染をもたらす可能性がある。これらの状況下では、タンパク質混合物又はタンパク質ペプチド混合物の緩衝液／溶媒組成は、一次ランと相容性あるものにするべく変更される。かかる変更は、例えば抽出、凍結乾燥及び再溶解工程、沈殿及び再溶解工程、適切な緩衝液／溶媒に対する透析またさらには急勾配での高速逆相分離といったような当該技術分野において記述された方法を用いて実施される。
【０１６０】
本発明のさらにもう１つの実施態様においては二次ランの緩衝液／溶媒は、溶出するフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの分析の実施と相容性をもつものではない。このような場合、二次ランから回収されたフラクション内の緩衝液／溶媒は、条件を例えば質量分析計での分析と相容性あるものにするべく変更される。かかる変更は、例えば抽出、凍結乾燥及び再溶解工程、沈殿及び再溶解工程、適切な緩衝液／溶媒に対する透析またさらには急勾配での高速逆相分離といったような当該技術分野において記述された方法を用いて実施される。代替的には、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを伴うフラクションを回収し、以下三次ランと呼ばれる第３の一連の分離のために再度組合わされる。この三次ランは、溶出するフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを質量分析計で分析できるように形で設計されている。戦略及びプール戦略の例は、例えば例１８に記述されている。
【０１６１】
等価物
当業者であれば、日常的な実験だけを用いて、本願に記述されている本発明の特定の実施態様に対する数多くの等価物を認識するか又はそれを究明できることだろう。例えば、クロマトグラフィーは、数多くの場合において、電気泳動法により置換され得る。電気泳動法技術には、（キャピラリー）ゲル電気泳動法、（キャピラリー）電気クロマトグラフィー、（キャピラリー）等電点及びアフィニティ電気泳動法が含まれる。さらにもう１つの等価物例においては、改変は物理的改変でもありうる。例えば、ペプチドを高温にさらすと、感熱性ペプチドの（部分的）変性が結果としてもたらされる可能性があり、その結果、これらのペプチドは、もう１つのクロマトグラフィー挙動を獲得することになる。
【０１６２】
例えば、本発明は、タンパク質ペプチド混合物からペプチドのサブセットを単離させる方法において、（ａ）最初にタンパク質ペプチド混合物をクロマトグラフィーによってペプチドフラクションに分離する工程、（ｂ）各フラクションを高温に対し露呈する工程及び（ｃ）第２のクロマトグラフィーによって物理的に改変されたペプチドを単離する工程を含み、最初の及び第２の分離工程のクロマトグラフィーが同じクロマトグラフィータイプで実施され、両方の分離におけるクロマトグラフィー条件が好ましくは同一か又は実質的に類似している方法を提供している。逆転モードでは、高温に対する露呈の後未改変であるペプチドは、工程ｃ）の中で単離される。特定の実施態様においては、高温に対する露呈は、二次ランの前ではなく二次ランの間に適用することさえできる。
【０１６３】
もう１つの可能性は、一次ラン又は二次ランが磁界の存在下で実施されるということにある。この磁界はこのとき、磁気に対し感応性をもつペプチドの溶出又は移動に特異的に影響を及ぼす。例えば、ホスホチロシンに対して向けられた特異的抗体でコーティングされた磁気粒子が、タンパク質ペプチド混合物に添加され得る。ホスホチロシン含有ペプチドは磁界の影響を特異的に受けることになる。
【０１６４】
実施例
例１：  メチオニン残基の特異的な化学的改変
タンパク質ペプチド混合物を、本発明に記述された方法に従って生成し、改変のために、比較的稀なアミノ酸メチオニンを選択した。文献中で立証されているように、メチオニンを改変するための１つのアプローチは、スルホキシド形成及びスルホン形成を導き得る化学的酸化によるものである。メチオニンを含むペプチドを、例えば過ギ酸又はその他の過酸を伴う強い酸化条件を用いていることにより、そのスルホン誘導体へと変換させることができる（Toennies and Homiller, 1942及びHirs, 1956）。さらに強い酸化条件はむしろ厳しく、かつ充分に選択的でない。メチオニン−スルホキシドの形成は、メチオニンと空気の接触時点で進行する。しかしながら、室温及び低ｐＨ（１％ＴＦＡ）で０．５％のＨ2Ｏ2の存在下で、この反応は３０分未満で完了する。興味深いことに、これらの穏やかな条件下で、酸化に対し非常に感応性がある２つのその他の残基であるシステイン及びトリプトファンは共に、ほとんど又は全く酸化されない。この結論には、多種多様なＴrpペプチド、Ｃysペプチド及びＭetペプチドを酸化させその後反応生成物をＨＰＬＣ分析及び質量分析に付すことによって達した。反応の特異性の１例が図３に示されている。両方のメチオニン改変（スルホキシド及びスルホン−誘導体）が共に、非変性メチオニンに比べ高い親水性をもつ（スルホキシド誘導体よりもスルホン誘導体の方が程度は低い）。メチオニン−スルホキシドに向かってのメチオニン残基を含有するペプチドの特異的な穏やかな化学的酸化は、メチオニンに対する改変の特異性及び非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離する最適な特性を理由として、本発明において優先的に運用された。実験により、本発明の条件下で、複合ペプチド混合物又はタンパク質ペプチド混合物の中で非改変ペプチドからメチオニンスルホキシド改変ペプチドを大規模に分離するために、このメチオニン改変を効率良く使用することができる、ということが実証されている。本発明の１つの重要な要素は、ペプチドがメチオニンからそのメチオニン−スルホキシド態様へと変換された時点で疎水性が大きく低下することにある。このことは、逆相クロマトグラフィー中の有機溶媒のより低い濃度に対する酸化されたペプチドの溶出のシフトによって例示される（ここでは、前面又は親水性シフトと呼ぶ）。異なるメチオニン含有ペプチドを用いると同時に、逆相クロマトグラフィー条件を用いて、酸化されたメチオニンを含有する広い範囲のペプチドを未改変ペプチドのプールから効率良く分離できるということが実証される。クロマトグラフィー条件に応じて、酸化されたペプチドの溶出における親水性シフトが著しく異なるものでありうるということが実証されている。結果は、正しい条件を用いることにより、より低い修飾物質濃度に関する標準勾配における３分から７分以上までのシフトを得ることができる、ということを示している。これは、異なるシステム内の１つのペプチドランについて例示されている（表III）。大きいシフトは、ＮＨ4Ａｃ／メタノール系で系統的に観察された。ＴＦＡ／アセトニトリル又はＨＣＯＯＨ／アセトニトリルの組合せで、さらに小さいもののなお有意なシフトが認められた。原則的に、表IIIに記された全ての系は、��ーティングプロセスで使用可能である。以下の全ての例において、我々は０．１％のＴＦＡ／アセトニリトル又は０．１％のＨＣＯＯＨ／アセトニリトル混合物を使用した。ペプチドをソーティングするためのシステムがその他の溶媒システムの使用を排除するものではないということを明確にしておくべきである。ＨＣＯＯＨ／アセトニトリルの組合せは、フラグを立てたペプチドが電気スプレーＭＳで分析される予定である場合に使用できる１つのアプローチである。興味深いことに、フラグを立てたペプチドの親水性シフトは（一次クロマトグラフィーラン内で同じフラクションに由来する場合でさえ）、同一ではなく、著しく変動する可能性さえある。それによって酸化は、配列に依存しうる可変的な効果をもつと思われる。さらに特定的には、一次ランで１分の間隔で回収されてきたメチオニンペプチドは、このとき、二次ランにおいてより大きな時間的間隔内（例えば４分以内）でそのスルホキシド態様として溶出することになる。このことは、選択されたメチオニン含有ペプチドがより大きな時間的間隔で二次ラン中に溶出しており、これが分離システムの解像能力を著しく増大させることから、主要な利点である。その結果、フラグを立てたペプチドの同時溶出は減少し、ペプチドはより漸進的に、より低い圧縮度で溶出し、それによって質量分析計に対する同定のためのより優れた提示を可能にする。
【０１６５】
ペプチド内でメチオニン側鎖を改変させるための代替的アプローチは、スルホニウムイオンの形成を結果としてもたらすヨウ化メチルといったようなハロゲン化アルキルとの反応である（Rothgeb et al., 1977）。この反応はゆっくりと進行し、８時間以上後に完了する。本発明で記述された方法に従って、タンパク質ペプチド混合物を生成する。例えばアニオン交換カラムで一次ランを実施し、フラクションを回収する。このフラクションは、例えばメチオニン残基を含むペプチドと特異的に反応するヨウ化メチルで改変される。その結果として、メチオニンを含むペプチドは改変され（メチオニン残基はそのスルホニウムイオンへと改変される）、異なる電荷を有し、結果として得られたフラグを立てたペプチドは、イオン交換カラム上で未改変ペプチドとは異なって移動する。一次ランと二次ランのクロマトグラフィー条件は、同一の又は類似のクロマトグラフィー条件下で実施される。より特定的には、この改変の結果、フラグを立てたペプチドがアニオン交換器（例えばＭＯＮＯＱ又はＤＥＡＥ−カラム）上に通された時点でフラグを立てたペプチドの溶出速度は速くなり、カチオン交換器（例えばMonoS、ホスホセルロース）上では溶出速度は低下する。
【０１６６】
例２：  システイン残基の特異的な化学的改変
タンパク質ペプチド混合物を、本願に以上で記述した方法のうちの１つを用いて生成し、システイン残基の特異的な化学的改変を実施する。この改変は、例えば、逆相ＨＰＬＣ中に親水性シフトを受ける、より親水性の誘導体へのシステインペプチドの特異的変換に基づくものである。いくつかの試薬がこれらの必要条件を満たすことができる。例えば、ヨードアセトアミド、ヨードアセテート、エチレンイミン、プロモエチルアミン、アクリルアミド及び４−ビニルピリシンとの反応は全て、システインを、逆相条件下でより親水性の挙動を示す化合物へと変換する。さらに、これらの化合物は全て、Ｈ2Ｏ2による酸化を受け、さらに一層親水性の高いその対応するスルホキシド誘導体の形成を結果としてもたらす。ここで酸化によるシフトがここではメチオニン酸化の場合に比べさほど顕著でないということに言及しておくことが重要である。しかしながら、遊離チオールシステイン誘導体とその改変され酸化された対応物の間のシフトを混ぜ合わせると、メチオニンスルホキシド形成について測定されたものと類似したフラグを立てたペプチドの全体的シフトが観察された（図４）。以下の反応スキーム（ｉ）は、本発明に従って非改変ペプチドからフラグを立てたｃｙｓペプチドを分離するのに改変を用いることができるような形で、システイン残基をいかにして特異的に化学的改変させうるかの例を示している。そのような、プロトコルは、以下の通りである。タンパク質混合物を１％のＴＦＡ中で８Ｍの尿素内に溶解させ、まず最初に２５℃で３０分間Ｈ2Ｏ2（最終濃度１％）で処理し、結果として、タンパク質混合物内に存在する全てのメチオニン残基のスルホキシド形成がもたらされる。次に、タンパク質を、４体積のエタノールの添加後−２０℃で一晩沈殿させる。沈殿したタンパク質を遠心分離により回収し、１回１mlのエタノール−水（体積比３：１）で洗浄する。洗浄したタンパク質ペレットを８Ｍの尿素、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．６内で再度溶解させ、２倍のモル数の過剰のトリブチルホスフィンを添加し、全てのＳ−Ｓ架橋をチオール基へと変換させた。ペプチドを特異的分割（最も適切にはトリプシンが用いられる）により生成し、タンパク質ペプチド混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（一次ラン）で分離し、二次ランの間に各々の回収されたフラクションの中の非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離できるようにするようなフラクション数で回収する。各フラクション中でシステイン残基をｐＨ８．６の緩衝液中のアクリルアミドとの反応によりそのＳ−プロピオンアミド誘導体へと変換させる（Sechi and Chait, 1998）。この反応の直後に、１％のＴＦＡ中のＨ2Ｏ2で酸化を行ない、Ｓ−プロピオンアミド誘導体をより親水性のスルホキシド態様に変換させる。後者について以下の（ｉ）で記述されている。
【０１６７】
【化１】
2005500990.tif 000003
【０１６８】
両方の反応共、短時間で完成に達し、いかなる中間生成物も検出できない（図４）。さらにこれらの反応は、中間工程で試薬を除去することなく、逐次的に実施できる。それによって、最後の酸化工程の後に得られた全混合物をＲＰ−ＨＰＬＣカラム上にかけ、一次ランの間と同一の又は非常に類似したクロマトグラフィー条件を用いることにより、非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離することができる。その後、フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質の同一性を決定するために、質量分析計といったような分析装置にフラグを立てたペプチドを移行させる。この手順は、一次ランの間に回収された各フラクションについて反復される。クロマトグラフィー分離及び分析に必要とされる時間を最適化するために、並列及び／又は直列な多重カラムから成るペプチドソーターを使用することができる。
【０１６９】
反応シーケンスの一変形態様においては、タンパク質ペプチド混合物を生成するためにタンパク質の分割から出発して、タンパク質予備酸化及び沈殿工程を省略することができる。その後、酸性ｐＨでタンパク質ペプチド混合物上で最初の酸化工程が実施され、それに続いて過剰のＮａＢＨ4でｐＨ８．６で還元され、上述のとおりその他の改変工程（アクリルアミドとの反応及び酸化）が行なわれる。これらの反応は全て、中間精製工程なく連続的に行なうこともできる。
【０１７０】
１工程手順が関与するシステイン含有ペプチドについて選択するためのさらにもう１つの代替的方法は、ＳＨ含有ペプチドをその混合ジスルフィド態様に変換させる（５、５′−ジチオビス（２−ニトロベンゾエート）すなわちＤＴＮＢ）との反応に基づいている。
【０１７１】
【化２】
2005500990.tif 000004
【０１７２】
ペプチドの混合ジスルフィド態様は、そのＳＨ対応物よりも疎水性が高く、ペプチドソーティングプロセスにおいてより遅く溶出する。この方法は同様に、遊離ＳＨとジスルフィドペプチドの間の識別も可能にする。実際、還元工程を省略することにより、本発明では遊離ＳＨを担持するペプチドのみが単離され、一方Ｓ−Ｓペプチドは単離されない。しかしながら、タンパク質又はペプチド混合物がソーティングプロセスの一次ランに先立って還元される場合には、ＳＨ及びＳ−Ｓペプチドの和がソートされる。
【０１７３】
例３：  メチオニン及びシステイン残基の和の特異的な化学的改変
手順は、メチオニン残基の予備酸化工程が省略されるという点を除いて、システイン残基を特異的に改変させるための手順と同一である（例２参照）。反応シーケンスは、トリブチルホスフィンでのタンパク質混合物の還元とそれに続く酵素的又は化学的分割で開始する。タンパク質ペプチド混合物は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離され、各フラクションはアクリルアミドでの反応により改変され、その直後にＨ2Ｏ2で酸化される。ここではメチオニン−ペプチドは改変されたシステインペプチドと共に酸化され、両タイプのフラグを立てたペプチド共、一次ランと類似の条件を用いてクロマトグラフィーで分離した時点で親水性シフトを示す。図５は、Ｍet−ソーティング、Ｃys−ソーティング及びＭet＋Ｃys−ソーティングモードでのさまざまな反応シーケンスをまとめている。
【０１７４】
例４：  ホスホセリン及びホスホトレオニン−ペプチドの特異的改変
本願で以上に記述したとおりにタンパク質ペプチド混合物を生成し、１クラスの翻訳と同時に又は翻訳後に修飾されたペプチドを特異的に単離する。ここでは、ホスホセリン及びホスホトレニオン含有ペプチドを単離するための戦略についての一例が提供されている。ホスホセリン及びホスホトレオニン含有ペプチドを、リン酸エステル部分のアルカリ性β−脱離によりそれぞれそのデヒドロアラニン及びデヒドロアミノ−２−酪酸誘導体へと改変させる。エタンチオールのマイケル付加が、前者をＳ−エチルシステイン誘導体へ、そして後者をβ−メチルＳ−エチルシステイン誘導体へと変換させる（Weckwerth et al., 2000）。これらのチオエーテル含有アミノ酸誘導体を、メチオニン残基の酸化に類似したＨ2Ｏ2との反応の後、そのそれぞれのスルホキシド態様に改変させる。メチオニン−ペプチドとの混合を回避し、またアルカリ処理中のシステインにおけるβ−脱離を回避するため、タンパク質混合物をまず最初にHirs（1956）に従って過ギ酸で酸化させる。この工程は、メチオニンをスルホン態様に、またシステイン残基をシステイン酸に変換する。精製水に対する透析の後、タンパク質混合物を、１：１００のトリプシン対合計タンパク質の比率で一晩３７℃で、５０mMの重炭酸アンモニウム中で、トリプシンを用いて消化させる。トリプシン消化物（１０μl）を、Ｈ2Ｏ／ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ／５ＭのＮａＯＨの２：２：１：０．６５の混合物×５０μlに添加し、６０μlのエタンチオールを添加する。反応混合物を５０℃で３時間加熱し、冷却後、２０％の酢酸６０μlとアセトニトリル１０μlを添加してクエンチさせる。タンパク質ペプチド混合物を、二次ランにおいて各々の回収されたフラクション中の非改変ペプチドからフラグを立てたペプチドを分離できるようにするフラクション数で、逆相クロマトグラフィー（一次ラン）によって分離する。各フラクション中で、ペプチドをＨ2Ｏ2で酸化させる。メチオニン及びシステインは、早期酸化工程で酸化されたことから、ここでは、Ｓ−エチルシステイン及びβ−メチル−Ｓ−エチルシステインのみがそのスルホキシド誘導体に酸化される（反応式iii及びivを参照のこと）。これらのスルホキシド誘導体は、はるかに高い親水性をもつ。各々のフラクションを、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上にかけ、一次ラン中と同一の又は類似のクロマトグラフィー条件を用いることにより、フラグを立てたペプチド（それぞれホスホセリン及びホスホトレオニン含有ペプチドを表わすＳ−エチルシステインスルホキシド及びβ−メチル−Ｓ−エチルシステインスルホキシド）を非改変ペプチドから分離する。その後、対応するフラグを立てたペプチド及びそのリン酸化タンパク質を同定するべく、質量分析計といったような分析装置にフラグを立てたペプチドを移す。さらに、質量分析中のＲＳＯＨ（ここでＲ＝エチル）（７８amu）のニュートラルロススキャンにより、フラグを立てたペプチドの両方のタイプの真正度がさらに確認できるようになる（Steen及びMann, 2000）。後者の事実は、質量分析法によるフラグを立てたペプチドの測定の後に見られたニュートラルロスのため、それぞれホスホセリン及びホスホトレオニン含有ペプチドを表わすＳ−エチルシステインスルホキシド及びβ−メチル−���−エチルシステインスルホキシドの真正度についての内部対照が存在することを意味している。
【０１７５】
アルカリβ−脱離反応が、４℃で０．５ＭのＬｉＯＨを用いてより穏やかなアルカリ性条件下でも実施でき、それによって上述のＨ2Ｏ／ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ／５Ｍ ＮａＯＨの混合物に置き換わるということを指摘することが有利である（Sakaguchi et al., 2001）。
【０１７６】
【化３】
2005500990.tif 000005
【０１７７】
代替的なホスホ−ペプチドをソーティングするためのシステムは、ｐＨ５．０での逆相クロマトグラフィーによりリン酸化ペプチドと脱リン酸化ペプチドの間の疎水性の差異を利用する。以下で概略的に記す手順は、かかるアプローチの一例である。タンパク質ペプチド混合物を、本願で以上に記したとおりに生成する。ここでは前記混合物中に存在するペプチドを、溶出用溶媒として１０mMのＮＨ4Ａｃ、ｐＨ５．０／アセトニトリル（又はＮＨ4ＡＣ／メタノール又はその他）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより分離し、１分のフラクションで回収する。これらのフラクションの中に存在するペプチドを一般的なホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）で処理する。脱リン酸化ペプチドはそのリン酸化された前駆物質に比べさほど疎水性ではなく、したがって一次ランと同一か又は実質的に類似のクロマトグラフィー条件下で二次クロマトグラフィー分離中に疎水性シフトを受け、このため、それらのソーティングが可能となる。ここで、疎水性シフトがｐＨ５．０で、それより低いｐＨ値よりも大きく、ソーティングプロセスにおける０．１％のＴＦＡ又は０．１％のＨＣＯＯＨ系の使用をさほど魅力的なものでなくしている、ということに言及しておくことが重要である。
【０１７８】
興味深い１つのオプションは、ホスホリル含有化合物の分離のために特に適応された分離系の使用である。かかる系は例えば、溶媒ＡとしてのｐＨ５．０の５mMのリン酸テトラブチルアンモニウム及び６０mMのＮＨ4Ｈ2ＰＯ4並びに溶媒Ｂとしてのメタノール（５mMのリン酸テトラブチルアンモニウム）と組合わされたアブソボスフェア（absobosphere）ヌクレオシド−ヌクレオシド材料（Alltech）で構成され得る。
【０１７９】
脱リン酸化方法を用いてホスホペプチドをソートするもう１つのやり方は、負に荷電したホスホリル基のロスに基づくものである。この場合、一次ラン及び二次ランは、イオン交換カラム上か又は電気泳動手段によって実施される。例えば、一次ラン及び二次ランがｐＨ６．０でMonoQ−カラム又はＤＥＡＥ−カラム上で実施される場合には、全ての脱リン酸化されたペプチド種はアニオン交換器に対する結合力の方が弱いことから、順方向シフトを示すことになる。脱リン酸化ペプチド種が陽極シフトを示し、キャピラリー電気泳動法を使用することによっても、類似の効果を得、またソーティングプロセスを導くことができる。
【０１８０】
酵素的（例えば一般的又は特異的ホスファターゼ）又は化学的（例えばアルカリ性条件下でのβ−脱離）手段のいずれかで実施できる脱リン酸化工程に基づくあらゆるソーティング手順が、さまざまなリン酸化された種について選択する可能性を提供するということを強調することが重要である。
【０１８１】
ホスホペプチドについてソートするさらにもう１つの方法は、ホスホペプチドとＦｅ3＋−キレートの間の非共有結合複合体の形成に基づいている。本願で記述した通りにタンパク質ペプチド混合物を生成する。前記混合物中に存在するペプチドは、溶出用溶媒として１０mMのＮＨ4Ａｃ、ｐＨ５．０／アセトニトリル（又はＮＨ4Ａｃ／メタノールその他）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣにより一次ラン１において、前記混合物中に存在するペプチドを分離し、１分の時間的間隔で回収する。これらのフラクションの各々の中に存在するペプチドを、同じクロマトグラフィーカラム上で、ただし今度はホスホペプチドとジキレート複合体を形成するＦｅ3＋及びイミノジアセテートを含有する溶媒の中で、二次ランにおいて分離する。この複合体は、遊離ホスホペプチドのものと比べて異なる位置で溶出し、ホスホペプチドの単離を可能にする。このディファレンシャルクロマトグラフィーは再び、効率のよいソーティングプロセスのためのプラットフォームを形成する。
【０１８２】
例５：  ε−Ｎ−アセチル化ペプチドについての選択
ヌクレオソームヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の一定数のリシンε−アミノ基及び場合によってはその他の因子のアセチル化は、クロマチン構造を修飾し、転写活性の増大を導く。アセチル化の程度の改変は、細胞増殖に結びつけられる確率が高く、アポトーシス、壊死又はその他のいくつかの病的状況を標示する可能性がある。さらに、アセチル化状態は、すでに正常な細胞と新生物細胞（例えば前立腺ガン）の間で非常に早期に違いが出てくる。ここでもまた、例えば脱アセチル化をペプチドソーティングためのシフティング原理として使用してアセチル化されたペプチドについて選択的にソートするために、本発明を用いることができる。かかる戦略の１例が、例示目的で以下に提供される。核抽出物からのタンパク質ペプチド混合物を、単離されたタンパク質のトリプシン分割によって生成する。トリプシンは、Ａrg及びＬysで分割するが、アセチル化されたリシン側鎖では分割しない。得られたペプチド混合物を、溶媒Ａとして０．１％のＴＦＡを、また溶媒Ｂとして７０％のアセトニトリル中の０．０９％のＴＦＡを用い、１％の溶媒Ｂ／分の漸増勾配及び８０μl／分の流速で（カラム内径２．１mm、長さ２５０mm）、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ラン１内で分離させる。溶出するペプチドを１分間隔で回収する。全てのフラクションを乾燥させ、適切な緩衝液中で再度溶解させ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡ）で処理する。例えば、酵母Ｒｐｄ３（クラス１）、酵母ＨＤＡ１（クラスII）又はＮＡＤ＋依存性Ｓｉｒ２クラスのタンパク質の完全に又は部分的に精製された調製物（再考のためにはFurumai et al.2001を参照のこと）。脱アセチル化に起因して、ペプチドはより親水性となり、より低いアセトニトリル濃度で溶出する。この親水性の差に起因して、また本発明を適用することにより、二次ランの間に未改変ペプチドから脱アセチル化ペプチド（フラグを立てたペプチド）を分離することが可能である。溶出のシフトは、メチオニンからメチオニンスルホキシドペプチドへの改変について測定されたシフトと比較可能である。フラグを立てたペプチド及びその対応するタンパク質の各々の性質は、例えば、ＭＳ／ＭＳを用いて又は各フラグを立てたペプチドの質量をきわめて正確に測定することによって、決定される。これにより、もとのタンパク質混合物内のタンパク質の同定が可能となる。
【０１８３】
２つのサンプル（例えば異なる細胞型）の間のε−Ｎ−アセチル化ペプチドの差を定量的に決定するために、Ｈ216Ｏ（サンプル１）又はＨ218Ｏ（サンプル２）のいずれかの中でのトリプシン消化によりタンパク質ペプチド混合物が生成される。両方のタンパク質ペプチド混合物共、一次ランの前に混合され、上述の通りにさらに処理される。サンプル１中の任意のランダムタンパク質Ｘからのフラグを立てたペプチドが、サンプル２中の同じタンパク質Ｘからの同じフラグを立てたペプチドと、二次ラン内で同時溶出する。サンプル１及びサンプル２からのフラグを立てたペプチドはそれぞれ16Ｏ及び18Ｏを担持することから、これらは、質量分析において２つのピークとして現われる。ピークの強度又は表面積を計算し、16Ｏを２回含むフラグを立てたペプチド対18Ｏを２回含むフラグを立てたペプチドの比は、両方の比較対象サンプルの中のこのペプチドのアセチル化度に正比例している。
【０１８４】
例６ａ：  インビボでＮＨ2末端ブロックされたタンパク質から誘導されたＮＨ2−末端ペプチドの選択
本発明のもう１つの利用分野は、ＮＨ2−末端ブロックされたタンパク質から誘導されるペプチドサブセットの単離にある。これらの大部分は、アセチル化されたペプチド（真核生物）又はホルミル化されたペプチド（原核生物）でありうる。ＮＨ2末端ブロックされたペプチドのみを選択し、リシン残基を含むアミノ末端でブロックされたペプチドの損失を回避するため、タンパク質を含むサンプルを予め処理する。１つのアプローチでは、サンプルは、ｐＨ１０でＯ−メチルイソ尿素でまずグアニジン化され、リシン側鎖をそのグアニジニウム誘導体へと変換させる。α−アミノ基は、ε−アミノ基よりもはるかにゆっくりとこの試薬と反応し（Plapp et al., 1971）、したがってそのグアニジウム誘導体へは全く又は最小限しか変換されない。
【０１８５】
本発明に従うと、タンパク質は、その後トリプシン消化に付される。トリプシンは、より低速でではあるもののアルギニン及びホモアルギニンの両方を分割し（後者はグアニジン化リシンから誘導される）、したがって消化物は、ブロックされたタンパク質アミノ末端を含むものを除き、生成された全てのペプチドにおいて遊離α−アミノ基を生成する。タンパク質ペプチド混合物は、今度は逆相カラム上に通され、回収されたフラクションの各々の中で、二次ランの間に非改変ペプチドから改変されたペプチドを分離することを可能にするようなフラクション数で分離される。例えば、各々のフラクションの中に、ペプチドの遊離ＮＨ2基と反応するフェニルイソシアネート（ＰＩＣ）が添加される。その結果、遊離ＮＨ2基を伴う全てのペプチドは、フェニルカルバモイル（ＰＣ）基を獲得し、ペプチドをより疎水性にする（図６）。ＮＨ2−末端ブロックされたタンパク質から誘導されたペプチドは改変されない。ペプチド混合物はＲＰ−ＨＰＬＣカラムにかけられ、ラン１中と類似の又は同一のクロマトグラフィー条件を用いることにより、改変されたペプチドを非改変同定ペプチド（すなわちアミノ末端でブロックされたペプチド）から分離する。それによって、この例では、大部分のペプチドが改変され、遅延され（疎水性シフト）、一方非改変ペプチドのサブセットは、二次ラン中に、変わらない位置で溶出する。これは「逆ソーティング手順」と呼ばれる。
【０１８６】
疎水性シフトの範囲は、ＮＨ2末端反応誘導体の化学的性質を変更することによって改変できる。当該技術分野において既知の方法は、本章で記述されているソーティングプロセスにおけるＰＩＣに対する代替案として使用できるさまざまなイソシアネート（ＩＣ）改変反応について記述している。例えば、トリフルオロアセチル−ＩＣ、アリル−ＩＣ、ナフタレン−ＩＣ、フルオレセイン−ＩＣなどとの反応も同様に使用できる。遊離α−ＮＨ2−基を伴うペプチドの疎水性シフトは同様に、α−ＮＨ2−基について特異的なその他のあらゆる定量的改変反応によって得ることもできる。試薬リストには、例えばアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び全てのアシル化試薬、Ｆ−moc−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）又はニコチノイル（オキシ）スクシンイミドが含まれる。試薬及び条件の最終的選択においては、改変反応は、α−ＮＨ2−基のみに制限され、遊離ＮＨ2基を伴うペプチドの少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％そして最も好ましくはさらにそれ以上の割合を改変するであろうことが明白である。
【０１８７】
例６ｂ：  遊離ＮＨ2末端をもつタンパク質から誘導されたＮＨ2末端ペプチドの選択
この例は、タンパク質ペプチド混合物内に存在する遊離ＮＨ2末端を伴うタンパク質から誘導されたＮＨ2末端ペプチドをいかにしてソートできるかを示している。この方法の特定の利点は、ハイスループットＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ分析に理想的に適しているそのＮＨ2末端に付着したスルホン酸基でフラグを立てたペプチドを得ることができるという事実による（Keough T et al.(1999)）。タンパク質を含むサンプルをまず最初にトリブチルホスフィンで処理し、続いてタンパク質変性緩衝液内のヨードアセトアミドで処理する。この工程はシステイン側鎖の誘導体化を導き、リシンをホモアルギニンに変換させるグアニジン化反応がその直後に続く。次に、フェニルイソチアシアネート（ＰＩＴＣ）又は周知の可溶性Braunitzer試薬（１，５−ジスルホニルナフタレン−３−イソチオシアネート）といったようなイソチオシアネート誘導体でα−ＮＨ2基をブロックする。それによって、混合物中に存在するタンパク質は、このときそのＳＨ基（アセトアミド誘導体として）、そのε−ＮＨ2基（ホモアルギニンとして）及びそのα−ＮＨ2基（そのチオカルバモイル誘導体として）において誘導体化されている。ここでトリプシンでひきつづき分割することで、各々の新しい分割部位で新しい遊離のα−ＮＨ2基セットが生成される。これらは、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）との反応により効率良くブロックされ得る。最終的な前処理済みのタンパク質ペプチド混合物は、このとき４つのタイプのＮＨ2末端ブロックされたペプチドで構成されている。まず第１に、インビボでブロックされたタンパク質から誘導されたペプチド； すなわちα−ＮＨ2アセチル化（真核生物）又はホルミル化（原核生物）ペプチド；第２に、ＴＮＢＳでブロックされたペプチド；第３にピログルタミン酸によりブロックされ、グルタミン残基の前でトリプシン分割後に自然発生的に発生しうるペプチド；そして第４にチオカルバモイル（ＴＣ）誘導体によりブロックされたペプチド、である。後者は、タンパク質アミノ末端ペプチドに対応する、ペプチドサブセットを表わす。４つのタイプのＮＨ2末端ブロックされたペプチドのうち、ＴＣペプチドのみが酸処理に対し感応性をもつことが知られており、周知のEdman化学に従ってＮＨ2末端残基を遊離することになる。それによって、濃縮ＴＦＡからなる群より選択されたでのペプチド混合物の処理は、新しい遊離のＮＨ2末端を生成するＴＣ−ペプチドの第１のアミノ酸を除去する。この時点で、ペプチド混合物は、回収されたフラクションの各々の中で、二次ラン中に非改変ペプチドから改変されたペプチドを分離できるようにするようなフラクション数で、ラン１で分離され回収される。各々のフラクション中で、ＮＨ2特異的試薬が添加され、ペプチドサブセットを遊離ＮＨ2基で選択的に改変させる。かかる試薬は、ＴＮＢＳであっても、またより疎水性の高いペプチドを導くアセチル化化合物であってもよい。しかしながら特定の実施態様においては、この試薬は、Keough T. et al., 1999により開発された化学又はα−ＮＨ2基においてスルホン酸部分を有するペプチドを改変させる類似の化合物で構成され得る。これらのフラグを立てたペプチドはここでもまた、ＲＰ−クロマトグラフィー又は、本発明に従���て実施されるイオン交換クロマトグラフィー手順を用いて選択的にソートされ得る。ＮＨ2末端スルホン酸基を担持するペプチドの１つの重要な様相は、アミノ酸配列の非常に高速かつ容易な演繹を可能にし、したがってソートされたペプチドの効率の良い高い処理能力のＭＡＬＤＩ−ベースの分析及び同定のための途を開く、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳモードで現在使用されている条件下でのそれらの特定的フラグメント化にある。
【０１８８】
遊離ＮＨ2末端をもつタンパク質から誘導された容易に配列決定できるペプチドのソーティングを導く連続的な化学的又は酵素的工程の一例を以下にまとめる：
工程１：  還元及びそれに続くヨードアセトアミドでの反応
工程２：  リシン側鎖のホモアルギニンへの変換
工程３：  チオカルバモイル誘導体内の遊離α−ＮＨ2基の変換
工程４：  修飾されたタンパク質を沈殿させるか又はゲルろ過により精製する。
工程５：  トリプシンで分割する。
工程６：  トリニトロベンゼンスルホネートでペプチドを修飾する。
工程７：  濃縮ＴＦＡで処理する。
工程８：  水で希釈し、一次ランでタンパク質ペプチド混合物を分離する。
工程９：  ＮＨ2末端ブロッキング試薬で、好ましくはスルホアセチル化により各フラクションのペプチドを改変させる。
工程１０：  二次ランでフラグを立てたペプチドをソートする。
工程１１：  ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ又はＥＳＩ−ＣＩＤ又はＭＡＬＤＩ−ＣＩＤによりフラグを立てたペプチドを分析する。
工程１２：  一連のｙイオンによって産生された配列に基づいてペプチドを同定する。
【０１８９】
タンパク質は、いかなる既知のブロック化基も一般に担持しない、新しいＮＨ2末端を常に導くことから、この手順は、タンパク質の内部分割を研究するために特別に適応させることができる（例８）。同様に、このソーティングプロセスがここでもまた、スルホアセチル化されたペプチドについての正の選択を実施し、スルホアセチル化反応（ここでは交互反応）が完全に進行しなかった場合でさえ非改変ペプチドによる汚染を回避又は最小限にする直接的なアプローチであるという点を強調しておくことも有意義であり価値ある。
【０１９０】
例７：  複合タンパク質混合物中に存在するタンパク質から誘導されたＮＨ2末端ペプチドの選択
細胞溶解物といったような複合混合物のうちの１つのタンパク質を１つの同定ペプチド（ＮＨ2末端ペプチド）によって表わす技術は、以下で個別的ペプチド質量ベースのプロテオミクス（ＩＰＭＢＰ、例１０参照）と呼ばれる。この手順は、ヨードアセトアミド又は当該分野で既知の類似のＳＨ特異的試薬でのタンパク質システインの変換で始まる。次に、タンパク質を、Ｏ−メチルイソ尿素と反応させて、ε−リシンをそのグアニジニウム誘導体（ホモアルギニン）へと変換させる。使用された反応条件下でタンパク質のα−ＮＨ2基は変化しないものの、ε−ＮＨ2基は変化するということを指摘しておくことが重要である。次の工程では、タンパク質を例えばアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシニドでアセチル化させる。次の工程では、例えばトリプシン分割によりタンパク質ペプチド混合物を生成し、このタンパク質ペプチド混合物を第１のクロマトグラフィー工程において分離させる。各フラクションに対し、ペプチド上で遊離ＮＨ2−基と定量的に反応するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を添加する。タンパク質のアミノ末端から誘導されたペプチドは、そのＮＨ2基が予めアセチル基でブロックされていたために、この試薬と反応できない、という点に留意することが大切である。遊離ＮＨ2基をもつペプチドは、トリニトロベンゼン基（ＴＮＢ）を獲得し、これらのペプチドをより疎水性の強いものにする。したがって、各フラクションからのペプチドが、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムラン上でラン１中と類似のクロマトグラフィー条件下で分離された時点で、改変されたＴＮＢ含有ペプチドは非改変同定ペプチド（すなわち全てアミノ末端でブロックされたペプチド）から分離される。このセットアップにおいて、単離された非改変同定ペプチドは、タンパク質のアミノ末端から誘導され、ＮＨ2末端アセチル基（例えば真核細胞抽出物が使用された場合）を含有することになる。
【０１９１】
もう１つの方法では、タンパク質混合物を、タンパク質システインをそのカルボキサミド誘導体へと変換させることによって前処理する。次の工程で、タンパク質を、そのε−ＮＨ2及びα−ＮＨ2基の両方でアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシニドでアセチル化させる。その後、トリプシンでの分割によりタンパク質ペプチド混合物を生成する。全てのリシン側鎖が前にアセチル化されているため、トリプシンによる分割は、優先的にアルギニンのＣＯＯＨ末端にある。ペプチドソーティングプロセスを含めた全ての付加的な工程は、上述の通りに実施される。これは、混合物中に存在する全てのタンパク質のアミノ末端ペプチドの単離を導く。これらは、非改変同定ペプチドとしてソートされる。
【０１９２】
代替的アプローチでは、タンパク質の遊離α−ＮＨ2−末端のディファレンシャル同位体標識づけを導くアセチル−及びトリジューテロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシニドの等モル混合物でタンパク質をアセチル化する。次の工程では、トリプシンでタンパク質混合物を消化し、タンパク質ペプチド混合物を逆相カラムに通し、回収されたフラクションの各々の中で、ラン２中に非改変ペプチドから改変されたペプチドを分離できるようにするようなフラクション数で分離させる。各フラクションに対して、ペプチド上で遊離ＮＨ2基と定量的に反応するトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を添加する。したがって、ここでもまた、各フラクションからのペプチドが、ラン１中と類似のクロマトグラフィー条件下でＲＰ−ＨＰＬＣカラムラン上で分離させられた時点で、改変されたＴＮＢ含有ペプチドは、非改変同定ペプチドから分離される。このセットアップでは、（我々の手順の間に改変された）遊離α−ＮＨ2基をもつタンパク質から誘導されたペプチドは今や２重タグ付きＣＨ3−ＣＯ／ＣＤ3−ＣＯ−部分で標識づけされているのに対し、すでにインビボでブロックされたタンパク質から誘導されたペプチドは、ＣＨ3−ＣＯ基を担持している。各フラクションからの非改変同定ペプチドを、各々の個別のペプチドの質量及び配列を決定するため質量分析計に移行させる。重要なことに、遊離α−ＮＨ2基をもつタンパク質から誘導されたペプチドのグループが（３amuで分離された）ダブレットとして現われることから、この分析により、これらのペプチドとインビボですでにブロックされたタンパク質から誘導されたペプチドを区別することが可能となる。
【０１９３】
代替的には、ＴＮＢＳは、プロセス中で、フェニルイソシアネート（ＰＩＣ）又は、遊離ＮＨ2基をブロックできる類似の化合物で置換される。ＮＨ2末端でホルミル化されたペプチドの場合、同じソーティング手順に従う。それによって、ホルミル化されたペプチドを、２重ＣＨ3−ＣＯ／ＣＤ3−ＣＯタグで標識づけされたペプチド（上記参照）と共にソートする。我々のソーティング手順が同様に、そのＮＨ2末端にピログルタミン酸を担持するペプチドをもソートするということを記しておくことが重要である。かかるペプチドは、ＮＨ2末端グルタミンが生成された場合、酵素的分割の間に形成されうる。ペプチドのフラグメント化が使用される質量分析法は、ＮＨ2末端ペプチドといずれかの内部的に生成されたペプチドを識別できるようにＮＨ2末端アセチルとピログルタミン酸を識別しうる。
【０１９４】
例８：  本発明を用いた全細胞溶解物内の内部的なタンパク質分解プロセッシングを受けたタンパク質の同定及びプロセッシング部位の位置特定
往々にしてタンパク質は、特異的プロアテーゼの作用に起因して内部的に分割される。この現象は例えば、カスパーゼの活性化に起因するアポトーシスの開始時点で見られる。内部的タンパク質プロセッシングもまた通常の細胞の発達中の重要な工程であり得、かかるプロセスは、重要な生理学的役割を果たす可能性がある。さらに、前駆体分子内のタンパク質分割は、タンパク質の成熟を導くプロセスである。これらの処理の検出は、現代プロテオミクスにおける根本的要素を成す。我々の発明は、プロセスを受けたタンパク質の性質及びプロセッシング部位の場所の両方を同定できるようにする。典型的な、ただし制限的な意味のない実験プロトコルを以下に記述する。まず第１に、全細胞溶解物から誘導されたタンパク質をトリ−ブチルホスフィンで還元し、ヨードアセテートでＳＨ基をブロックする。この反応は、ｐＨ８．６で変性濃度のグアニジニウム−ＨＣｌ（６Ｍ）の下で実施される。逆ソーティング方法（ひいては、未改変ペプチドが同定ペプチドとして選択される方法）のためには、尿素含有緩衝液を使用しないことが勧められる。実際、長時間にわたる尿素との接触は、ペプチドのカルバミル化を導き、かかるペプチドは同様に望ましくない産物としてソートされることになる。この工程で、過剰の試薬及び緩衝液を、一晩−２０℃で４体積のエタノール中で沈殿させることによって除去する。遠心分離でタンパク質沈殿物を回収し、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液中の小容量の６Ｍのグアニジニウムの中で再度溶解させる。代替的には、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液中の６Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌの中でのゲルろ過工程により、試薬及び緩衝液を除去することができる。遊離のＮＨ2基をその対応するアセチル又はニコチノイル誘導体に変換させるため、アセチル又はニコチノイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加する。代替的には、例７にあるように、アセチル及びトリジューテロアセチル誘導体の１／１の混合物を使用する。この第２の例では、ニコチノイル誘導体のＨ４又はＤ４−型の１／１の混合物が利用される（Munchback, M et al., 2000）。アセチル化反応を、ｐＨ８．５のトリス−ＨＣｌをアセチル化試薬に対して１モル過剰に添加することにより終結させ、１Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌまで希釈させるか又は０．５％のＮＨ4ＨＣＯ3に対し透析させ、その後トリプシンで消化させる。結果として得られたペプチドを、一次クロマトグラフィー分離に付す。その後、各フラクションを、新たに生成された遊離ペプチド α−ＮＨ2−基（例えばトリニトロベンゼンスルホネート、アセチルＮ−スクシンイミドエステル、フェニルイソシアネートなど）と定量的に反応する試薬で処理する。二次ランにおけるこれらの処理済みフラクションの再ランは、このとき、最後の反応工程で反応した全てのペプチドを、より疎水性の高い位置に向かって転位させ、一方すでにインビボでブロックされたか又は一次ランの前の前処理によってＮＨ2末端ブロックされた全てのペプチド又はＮＨ2末端ピロリドンカルボン酸を伴うペプチドは、それらが一次ラン中に溶出した位置と同じ位置で非改変同定ペプチドとして回収される。２つの異なるサンプルからのタンパク質溶解物のペプチドパターンを比較するこ��により、プロセスを受けたタンパク質の性質及び正確な分割部位の両方について情報を提供する新たに生成されたＮＨ2末端から誘導されたペプチドを同定することが可能である。上述の実験は、同定ペプチドをソートする一般的原理をなおも保ちながら、複数の要領で変動させることができる。例えば、ＳＨ反応性及びＮＨ2反応性化合物でタンパク質を変換させた後、タンパク質をＨ216Ｏ（サンプル１）及びＨ218Ｏ（サンプル２）中でトリプシンで消化させる。この実験を用いると、タンパク質プロセッシングの範囲のディファレンシャル定量化を２つのサンプルの間で研究することができる。それによって、トリプシン分割の後、サンプル１及びサンプル２が等しい比率で組合わされ、この混合物が第１のクロマトグラフィーランで分離される。その後、各フラクションを、遊離α−ＮＨ2基と反応する試薬で処理する（例えばトリニトロベンゼンスルホネート、アセチルＮ−スクシンイミドエステル、フェニルイソシアネートなど）。二次ランにおけるこれらの処理済みフラクションの再ランは、このとき最後の反応工程で反応した全てのペプチドを、より疎水性の高い位置に向かって転位させ、一方すでにインビボでブロックされたか、又は一次ランの前の前処理によってＮＨ2末端ブロックされた全てのペプチド又はＮＨ2末端ピロリドンカルボン酸を伴うペプチドは、それらが一次ラン中に溶出した位置と同じ位置で非改変同定ペプチドとして回収される。軽（16Ｏ）及び重（18Ｏ）ペプチドは化学的に非常に類似しており、各々のペプチド対は同じ要領で分離し、同じく同じ要領でイオン化する。質量分析法の間に、軽及び重ペプチドは、重ペプチドが４amuの質量増加を有することから分離する。この分離は、２つのサンプル中でタンパク質プロセッシングの範囲のディファレンシャル定量化を正確に測定するのに充分なものである。
【０１９５】
例９：  緩衝液系
本発明の重要な要素は、１）ペプチドを改変させるのに利用される反応条件、及び２）フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを分析し同定するのに用いられる質量分析アプローチのタイプ、との関係における及びこれらの一体化されたペプチド分離条件の選択にある。この点を例示する目的で、以下では、手順のこの無欠性の側面を考慮に入れてタンパク質ペプチド混合物からいかにしてメチオニン−ペプチドを選択するかのいくつかの例について記述する。一つの例では、ＴＦＡ／アセトニトリル系内で、一次ランを行ない、１％のＴＦＡ／Ｈ2Ｏ2の中で酸化工程を行なう。二次ランは同様にＴＦＡ／アセトリニトル系内で行なわれ、一方、ペプチド質量測定は、微量のＴＦＡには感応しないＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって行なわれる（以下参照）。したがってこのプロトコルでは、対イオンＴＦＡは、一次ランの始めから全二次ランまで、手順全体を通して変化しない。フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの同定が電気スプレー−イオン化（ＥＳＩ−ＭＳ）によって行なわれる場合には、ＴＦＡがイオンクラスタを形成してＭＳ−測定に干渉することがわかっているため（Mirza and Chait, 1994）、ＴＦＡ−系は推められない。したがって、第２の例としては、ＨＣＯＯＨ／アセトニトリル系がＥＳＩによる効率の良いイオン化を可能にすることから、今度はこの系の中で一次ラン及び二次ランの両方共が実施される。しかしながら、ＨＣＯＯＨの存在下では、過ギ酸の形成ひいてはスルホキシド及びスルホン誘導体の両方におけるメチオニン側鎖の変換が導かれることから、スルホキシド−メチオニンペプチドを生成するための中間酸化工程を実施することができない。それによって、ここでは、１％のＴＦＡ及び０．５％のＨ2Ｏ2混合物の中で酸化工程が行なわれる。この場合、２つの連続するクロマトグラフィー工程と改変の間で対イオンの性質は同じではなく、二次ランの間のイオン対合効果に影響を及ぼす可能性がある。ここでは、比較的低い濃度のＴＦＡのため、擾乱効果は重要ではない。これは、ＴＦＡ濃度が増大させられる場合又は改変工程中により強いイオン対合効果を伴って対イオンが使用される場合に問題となりうる。要約すると、一次ラン及び二次ラン全体を通して、改変工程中、及び質量分析中、緩衝液の性質を変化のない状態に保つことが好ましい。これが行なえない場合、又はクロマトグラフィープロセス内の緩衝液が質量分析で使用される溶媒とは異なる場合には、第３のクロマトグラフィーランを実施することができる。
【０１９６】
同じ方針で、一次ランを開始する前にタンパク質ペプチド混合物内に存在する緩衝液イオンを考慮に入れることが重要でありうる。理想的には、タンパク質ペプチド混合物内の緩衝イオンは、一次ラン及び二次ランの間に用いられるものと同じであるべきである。タンパク質ペプチド混合物中の緩衝イオンが過度に発散的である場合、当該技術分野において利用可能な複数の方法で、必要な適応化を得ることができる。例えば、これは、トリプシン消化の前に適切な緩衝液に対しタンパク質混合物を透析させることによって得ることができる。代替的には、一次ランを開始する前に、急な勾配をもつ短かい逆相（ＲＰ）−分離を付加することもできる。この高速ＲＰ分離の間に塩は除去され、ペプチドは一次ラン及び二次ランにおいて使用されることになる適正な対イオンを獲得していく。この高速ＲＰ工程から溶出するペプチドを合わせて、凍結乾燥させ、一次ランに適した緩衝液の中に溶解させる。大部分の理想的なイオン条件下にペプチド混合物をもってくる手順をここではコンディショニング工程と呼ぶ。ペプチド混合物のコンディショニングが重要である一例について以下で記述する。
【０１９７】
クローシングを阻害するため、クエン酸緩衝液を添加することによってヒト血漿を調製する。かかる全血漿タンパク質調製物のトリプシン消化が一次クロマトグラフィー工程に直接付される場合、ペプチド分離は、ペプチド混合物の中にもともと存在するクエン酸塩による影響を受けることになる。未改変ペプチドがここで、クエン酸塩がほとんど存在しない二次ランのために移行させられた場合、イオン対合の変化に起因する望ましくないシフトが存在するかもしれない。この種のシフトは、遅く溶出する疎水性ペプチドの場合よりも、勾配の始めに溶出する親水性のさらに高いペプチドについてより大きいものである。一次ランにおけるクエン酸塩の効果は、まず最初に、有機溶媒の急な勾配を用いて高速ＲＰカラム全体にタンパク質ペプチド混合物を通すことによって回避される。フル勾配全体にわたり溶出するペプチドは全て回収され、凍結乾燥により乾燥されるか又は真空乾燥され、一次ランに先立ち適切な緩衝液の中で再度溶解させられる。タンパク質ペプチド混合物をコンディショニングすることによって、ソーティング手順全体にわたり同じ又は同一のクロマトグラフィー条件が確保される。コンディショニング工程は同様に、ソーティングカラムを漸進的に汚染しうる化合物を除去する清浄工程としても重要である。
【０１９８】
例１０：  個別的ペプチド質量ベースのプロテオミクス（ＩＰＭＢＰ）
本発明に従うと、複合ペプチド混合物又はタンパク質ペプチド混合物からフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドのサブセットを選択することが可能である。さらに、本発明に従うと、ペプチド及び対応するタンパク質は、質量分析計といったような適切な分析装置で同定される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて、前記ペプチドの質量を測定するが、これは、ペプチド及びその対応するタンパク質を明白に同定するのにつねに充分であるとはかぎらない。この例では、単離されたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの情報内容を増大させるためのいくつかのアプローチが記述されている。これにより、増大する数の前記ペプチドを、質量分析計を用いたその質量の単純な決定によって明白に決定することが可能となる。このアプローチは、個別的ペプチド質量ベースのプロテオミクス（ＩＰＭＢＰ）と呼ばれる。
【０１９９】
１０．１  エンドプロテイナーゼ−ＬysＣで生成されたペプチドについてのＩＰＭＢＰ
本発明を使用することで、特異的アミノ酸の１以上の被検物を含むペプチドを選択することが可能となる。明白に同定できるペプチド数を増大させるために、選択されたペプチド内にこのアミノ酸が存在するはずであるという知識が用いられる。１つのアプローチは、特異的アミノ酸の少なくとも１つの残基を含有するものとして知られているペプチドの質量のみを含有するサブデータベースを構築することにある。例えば、特異的アミノ酸としてメチオニンが選択された場合には、少なくとも１つのメチオニンを含有するペプチドの質量を伴うサブデータベースが作り出され、各々のメチオニン含有フラグを立てたペプチドの質量がこのデータベースに対してスクリーニングされる。
【０２００】
明白に決定されているフラグを立てたペプチドは同定ペプチドの割合のさらなる増加は、特異的プロテアーゼを使用することによって得られる。一例においては、エンドプロテイナーゼ−ＬysＣが使用される。この例では、（SwissProtデータベースリリース３９．０から抽出される）ヒト及びE. coliのタンパク質のコンピュータ内でのエンドプロテイナーゼ−Ｌys−Ｃ消化によって、誘導されると考えられる全てのペプチドを含有するデータベースが構築された。このデータベースから、そのモノアイソトピック質量が７００Daと４０００Daの間になくてはならず、かつ少なくとも１つのメチオニン残基が含まれていなくてはならないという特異的基準を満たすペプチドのサブデータベースが作り出された。このサブデータベースは、増大しつつあるペプチド質量に応じて指標づけされ、その後、その親タンパク質に対する特有の識別子として使用できるペプチド、すなわち正確に３ケタまで測定されたその質量が特有のペプチド配列に対応しているペプチドの数が計算された。これらの計算から、計算上のヒトペプチド質量の９１％及び計算上のE. coliペプチド質量の９５％が、特有の固定用ペプチドとして役立つことが観察された（図７）。同様にして、これらの特有の識別子のうちの少なくとも１つを含んでいたデータベース内のタンパク質の数を計算し、両方の種について８０％以上のタンパク質がこのようにして同定できるということが観察された。この戦略をハイスループットペプチドベースのプロテオミクス用に使用するためには、ペプチド質量を非常に高い精度で測定する必要がある。近年公表されたように、かかる高い質量精度は、例えば、内部較正手順を用いたフーリエ変換質量分析計（ＦＴＭＳ）で充分手の届くところにある（O'connor及びCostello, 2000）。この精度レベルが達せされない場合直ちに、同定パワーの非常に急速な降下を予想することができる。同様にして、統計学的見地から見ると、データベースが大きくなれば、小さいものに比べ、生み出される明白な割当ては少なくなる。したがって、好ましくは、ＩＰＭＢＰ−探索アルゴリズムを単一の種又は生体に向けることが好ましい。これらのシミュレートされた実験については、例えばトリプシン又はキモトリプシン消化に比べ平均して大きいペプチドを生成するエンドプロテイナーゼＬys−Ｃが使用された。後者の酵素又は異なるプロテアーゼの組合せ使用は、より多くの入力をもつペプチドデータベースを結果としてもたらし、それによって、ＩＰＭＢＰにより独自に同定されうるタンパク質の数及び特有のペプチド質量の数の両方が減少することになる。
【０２０１】
１０．２  ペプチドの情報内容の強化
時間のかかるＭＳ／ＭＳ分析を用いることなく、より厳しい基準を得るため、フラグを立てたペプチドの情報内容は、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとトリジューテロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの等モル混合物を用いてペプチド内の遊離ＮＨ2−基を特異的に変更することによってさらに強化される。この変換反応の結果として、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、これらのペプチド中の遊離ＮＨ2基の数に応じて予め定められた数のＣＨ3−ＣＯ（ＣＤ3−ＣＯ）基を獲得する。獲得した基の数は、ペプチドダブレットの観察された質量シフトの範囲から容易に演繹できる。例えば、３amuのシフトは、１つのＮＨ2基の存在と対応し、３及び６amuのシフトは２つのＮＨ2基と対応し、３、６及び９amuのシフトは、ペプチド内の３つのＮＨ2基の存在を示す。遊離ＮＨ2基の変更は、タンパク質消化の後で、ただし一次ランの開始の前に実施されるのが最も適切である。ペプチド内の遊離ＮＨ2基のアセチル化は、ペプチドの疎水性を増大させる。この効果にもかかわらず、例えばメチオニン酸化の後に得られる親水性シフト（δmin及びδmax）の範囲（例１参照）は、ペプチドがアセチル化されなかった場合と類似している。それによって、本発明は、このアプローチでも同様に適用可能である。このアプローチを上述のアプローチと組合せて用いると、フラグを立てたペプチドの各々について以下の情報が得られる：すなわち（１）ＭＳにより決定される質量、（２）特異的に選択されたアミノ酸（例えばメチオニン）の残基の数及び（３）遊離アミノ基の数。この組合された情報は、上述のようなデータベース及びサブデータベースをスクリーニングすることによって明白に同定できるフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの数を著しく増加させる。
【０２０２】
さらに、このアプローチは、２つの混合物中に存在するペプチドの比率を決定するために使用できる。この例では、１つのサンプルから来たペプチドを、酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアセチル化し、第２のサンプルからのペプチドをトリジューテロ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアセチル化する。質量スペクトルで測定した各々のフラグを立てたペプチドの２つの同位体型の比率は、その後、定量的比較を行なうために用いられる。ディファレンシャル定量的方法においては、トリプシンペプチド内のリシン残基の数を決定するためにＯ−メチルイソ尿素を用い、この付加的情報が従来の探索方法を用いたタンパク質同定の全体的成功を改善するということを示したBrancia et al.（2001）によって、類似のアプローチが近年公表された。このアプローチと本発明の組合せは、明白に同定されうるペプチドの割合をさらに著しく改善する。
【０２０３】
同一か又は非常に類似した質量をもつものの、疎水性又は正味電荷の異なる複数のペプチドを識別することを可能にするという理由から、分離システム内（例えば一次ラン中）にある一定の与えられたペプチドの溶出又は移動時間は重要な追加情報である。
【０２０４】
１０．３  ＮＨ2末端トリプシンペプチドについて選択することによるＩＰＭＢＰ
この発明においては、例えば、ＮＨ2末端ブロックされたタンパク質のＮＨ2末端ペプチドについてソートすることが可能である（例６ａ）が、この考え方は、サンプル中の全てのタンパク質のＮＨ2末端ペプチドに拡大される（例７）。図６では、インビボのＮＨ2ブロックされたタンパク質（最も確率が高いのは、ＮＨ2アセチル化、ＮＨ2ホルミル化又はピログルタミル化されたもの）から誘導されたペプチドの特異的ソーティング方法が示されている。この手順の変形態様を用いて（例７）、我々は、タンパク質ペプチド混合物内に存在するタンパク質の全てとは言わないまでも大部分からのＮＨ2末端ペプチドについて特異的にソートすることもできる。この手順は、同様に、インビボでＮＨ2末端ブロックされたタンパク質から及び遊離ＮＨ2基を伴うタンパク質から誘導されたペプチドの間で識別を行なうことができるようにもしている。最後に、ソートされたこれらのＮＨ2末端ペプチドの質量は、例えば質量分析計を用いて容易に決定することができる。
【０２０５】
このアプローチの重要な利点は、それがタンパク質のアミノ末端ペプチドについて選択するということにある。その結果、ペプチドに対応するタンパク質の同定は、データベース内に記憶されているペプチドの質量とペプチド質量を相関させるための探索を今やデータベース内のアミノ末端ペプチドの質量に制限できることから、大幅に単純化されている。その結果、大部分のペプチドについて、ペプチドをその対応するタンパク質と明白に相関させることが可能である。理想的な１つの状況では、全てのＮＨ2末端ペプチドを、その対応する親タンパク質の単独の代表的同定ペプチドとみなすことができ、タンパク質の同定の問題を主として１タンパク質−１ペプチドの相関関係に帰することができる。このことはすなわち、１０００の異なるタンパク質の混合物について、１０００の異なる同定ペプチドを探索しなくてはならない、ということを意味している。インビボでのタンパク質の成熟中のＮＨ2末端でのプロセッシングの範囲がつねにわかっているとはかぎらないことから、ゲノムＤＮＡ配列を用いた単純なコンピュータシミュレーションによりこの仮定を確認するには、幾分かの困難が伴う。例えば、β−細胞質アクチンは最初Ｍet−Ｃys−Ａsp−Ａsp−Ａsp−Ｉle−として合成されるが、最終的には、先立つＭet及びＣysの連続的除去後のアセチル基の添加にを伴ってアセチル−Ａsp−Ａsp−Ａsp−Ｉle…に処理される（Redman及びRubenstein, 1984）。「予測不可能な」ＮＨ2末端タンパク質プロセッシングの問題は、ＭＳ／ＭＳ又はＰＳＤアプローチによりまずは全ての同定ペプチドを選択しその後同定することによって解決される。これらの研究は、ソートされたＮＨ2末端ペプチドがアルギニン又はホモアルギニン（ｈＡrg）のいずれかを含有することになり、これはひじょうに効率良くイオン化しＭＳ／ＭＳ分析中に主としてｙタイプのフラグメントイオンを生成しそれによって容易に解釈可能なスペクトルを導くことがわかっているため（Biemann, 1990）、過度に複雑なものではない。すでに１０．２節で言及した通り、同定ペプチドの溶出又は移動時間は、同定ペプチドを完全に同定するためにその合計質量と組合せられるべき貴重かつ充分な付加的パラメータでありうる。それによって、この特異的ペプチドがどのタンパク質から誘導されているかの情報と共にそのクロマトグラフィー特性と組合わされた全ての同定ペプチドの質量は、関係型データベースの中に記憶される。このことはすなわち、大部分のケースにおいて、同定ペプチドの質量をその親タンパク質と明白な形で相関させることが可能であるということを意味している。
【０２０６】
１０．４  定量的ディファレンシャルプロテオームアプローチにおけるＩＰＭＢＰの使用
同定ペプチドを用いた定量的プロテオームアプローチにおいてＩＰＭＢＰを使用するための手順は、以下の工程から成る：すなわち、例７に記述された手順に従って、タンパク質ペプチド混合物１からのタンパク質をまずシステインで修飾し、グアニジン化し、その後Ｎ末端アセチル化する。その後タンパク質をＨ216Ｏの存在下でトリプシンで消化させる。同じ手順をタンパク質ペプチド混合物２について実施するが、今度はトリプシン消化をＨ218Ｏの存在下で実施する。トリプシンは、その標的ペプチド結合の分割の触媒として作用するだけでなく、分割された部位で水から派生した２つの酸素原子を取り込む（例えばSchnoelzer et al., 1996を参照のこと）（Rose et al., 1983）。それによってタンパク質ペプチド混合物１から誘導されたペプチドは、２つの16Ｏ−同位体でＣＯＯＨ末端で標識づけされ、一方、タンパク質ペプチド混合物２に由来するペプチドは、今度は２つの18Ｏ−同位体を担持し、異なる混合物に由来する同じペプチドを４amuで区別している。ここで、ペプチド混合物を組合せ、第１カラム上を通す（ラン１）。ペプチドをフラクションの形で再び回収し、そのα−アミノ基で、疎水性（又は親水性）基を担持する特異的試薬により標識づけする。このとき、ＮＨ2末端ブロックされたタンパク質（インビボ又はインビトロ）から誘導されたペプチドは二次ランで移動せず、ラン１と同じ溶出時間間隔で回収可能である。これとは対照的に、一次ランの後ＮＨ2基において反応した全ての改変されたペプチドは、ここで疎水性／親水性シフトを受け、それらが標識づけを受ける前に取っていた位置から分離する。遊離α−アミノ基を改変するために親水性試薬が使用される場合、ＮＨ2末端ブロックされたペプチドに比べ、改変されたペプチドの親水性シフトが観察される。しかしながら、ペプチドの遊離α−アミノ基はすでに親水性であることから、大部分のブロッキング試薬は、遊離アミノ基ペプチドよりも遅く溶出するより疎水性の高い化合物を導く。単離された同定ペプチドの質量分析の時点で、このとき２つのタイプのペプチドダブレットすなわち４amuだけ分離し（２つの16Ｏと２つの18Ｏ同位体をもつことの間の差）、インビボでブロックされたタンパク質から誘導されたもの、が検出される。ピーク強度又はピーク表面積の比率は、２つの混合物内の対応するタンパク質の相対的比率を反映している。第２のタイプのダブレットは、７amuだけ（２つの16Ｏと２つの18Ｏ同位体をもつことの間の差に、３つのＨ原子と３つのＤ原子をもつことの間の差を増分したもの）分離されており、遊離ＮＨ2末端を有していたサンプル中のタンパク質から誘導される。ピーク強度又はピーク表面積の比率は、ここでも、２つの混合物内の対応するタンパク質の相対比を反映している。定量的示差ＮＨ2末端ペプチドアプローチのための反応スキームは、図８にまとめられている。
【０２０７】
16Ｏ／18Ｏディファレンシャル標識づけ方法に対する代替案は、化学的に合成され、少なくとも１つの重水素化された（又は重同位体13Ｃ、15Ｎのいずれかのタイプ）アミノ酸を含み、天然の同定ペプチド対「重」合成同定ペプチドの質量分析法による充分な分離を可能にするフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドの使用である。ここで「重」ペプチドは内部標準として役立つ。それによって、合成ペプチドは既知の数量でタンパク質ペプチド混合物に添加され、その天然の対応物と共にソートされる。質量分析計におけるペプチドピーク比の比較により、天然の同定ペプチド対添加された合成ペプチドの相対的な定量的推定が可能となる。
【０２０８】
かかる同位体で標識づけされたフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドは、例えば、重水素化ロイシン（例えば１０amuの質量差を生成するＬ−ロイシン−ｄ10）又は重水素化メチオニンを含有し得る。後者は、Ｍet含有ペプチドがソートされた場合に便利であるかもしれない（例えば例１、１８、１９及び２０を参照のこと）。
【０２０９】
トリプシンペプチドの大部分がアルギニンかリシンで終結していること、また化学的ペプチド合成がＣＯＯＨ−末端から出発し、ＮＨ2末端に向かって進むことから、重水素化リシン又は重水素化アルギニンのいずれかから出発して全てのペプチドを合成することができ、一方その他のアミノ酸は、その天然の誘導体として付着されうる。この場合、分割可能なリンカーアームによってすでに重水素化リシン又は重水素化アルギニンが上に連結されている固相支持体を使用することができる。かかる固相樹脂は、従来の固相ペプチド合成によりあらゆる種類の重フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドをそこから合成できる一般的な出発材料として使用可能である。
【０２１０】
例１１：  単一カラムシステムを用いたペプチドソーター装置
タンパク質ペプチド混合物から例えばメチオニン含有ペプチドを単離するための本発明の基本的プロトコルは、２つの連続したクロマトグラフィー工程から成る。すなわち、その１つは、酸化されたメチオニン−ペプチドと非改変ペプチドの間の最も適したシフトを生成することがわかっている溶媒システム内で行なわれ、電気スプレー又はＭＡＬＤＩ−イオン化手順のいずれとも最も互換性のあるＲＰ−ＨＰＬＣ工程である。酸化工程の後に実施される第２のＲＰ−ＨＰＬＣランは、同じ又は非常に類似したクロマトグラフィー条件下で行なわれ、そのため酸化されたペプチドのみが前方にシフトし、一方非改変ペプチドはそのもとの溶出時間にとどまることになる。この原理は、非メチオニンペプチドからメチオニンペプチドを分離するため、複数のやり方で用いられる。それによって図９に概略的に表わされている単一カラムシステムでは、全細胞ペプチド混合物の一次ラン（ラン１）は、標準的逆相カラム（例えば内径２．１mm×２５cmのＣ−１８ＲＰ−カラム、Vydac Separations Group, CA）上で行なわれる。これは、一次ランと呼ばれ、E. coli溶解物からのペプチドのＵＶ吸光度プロフィールは図１０に示されている。１０分間５％の溶媒Ｂでの初期均一濃度洗浄工程の後、カラムを、９５分間一分あたり１％の溶媒Ｂで線形的に増大するアセトニトリル勾配で溶出させる。緩衝液 Ａは、０．１％のトリフルオロ酢酸から成り、一方、緩衝液 Ｂは、７０％のアセトニトリル中の０．０９％のＴＦＡから成る。流量は、８０μl／分の速度で一定に保たれ、０．５mlのエッペンドルフ管の中に８０μlのフラクションを回収する。合計４０のフラクションを回収する。回収された第１のフラクションは、フラクション nr１０と呼ばれる（これは、勾配の開始後１８分〜１９分の間で溶出し、２３％の溶媒Ｂと対応する）。最後に回収されたフラクション（勾配の開始後５７分〜５８分の間で溶出し、６３％の溶媒Ｂと対応する）には４９という番号が与えられる。この実験セットアップでは、フラクション中のペプチド内に存在するメチオニン残基のみが特異的に化学的に改変され、酸化されたメチオニン残基を含有するペプチドは、ここではＭet−ＳＯペプチドと呼ばれる。特異的改変は、以下のように行なわれる。各々のフラクションを真空乾燥し、１％の水中ＴＦＡから成り、これに対し３０％のＨ2Ｏ2原液が添加されて０．５％のＨ2Ｏ2最終濃度が得られている酸化混合物の中で再度溶解させる。酸化を、３０℃で３０分間進行させ、その後溶液を直ちに、二次ランのためのＲＰ−カラム上にかける。本発明に従うと、同じ又は類似のクロマトグラフィー条件下で同じカラム上で酸化後の全てのフラクションを再度ランさせることがきわめて好ましい。ラン２内と同じ条件を用いて、Ｍet−ＳＯペプチドは未改変ペプチドのバルクの前で６〜２分の間で溶出する。１つのアプローチは、全てのフラクションを別々にランさせ、これを４０個のフラクションの各々について行なうことである。かかるアプローチは、大量のＨＰＬＣ時間を必要とするのみならず、質量分析計上での重要な作業時間を占有する。ＨＰＬＣ機器及び質量分析計の両方をより経済的に使用するため、そしてプロセス全体を加速するため、我々は、一次ランのい��つかのフラクションをプールして、先行フラクションからの未改変ペプチドと前方にシフトするフラグを立てたペプチドのオーバラップを避け、かつ１つのフラクションからのフラグを立てたペプチドともう１つのフラクションからのフラグを立てたペプチドのオーバラップを避けることにより、分離回数を削減した。このプロトコルを設定する前に、我々は酸化後の有意な数の合成メチオニン含有ペプチドの親水性シフトを測定し、大部分のシフトが６％未満２％以上の溶媒Ｂであり、それによって我々の実験で使用した勾配において６〜２分のウインドウ内にあったことを認識した（表IIIも参照のこと）。シフトしたペプチドとペプチド材料のバルクの間に存在する２分のゾーンでは、我々は極くわずかなメチオニン−ペプチドしか認めなかったが、その代り、バルクペプチドの大きなピークから広がるわずかな非改変ペプチドをすでに検出した。この特定の実験セッティングにおいて２つのフラクションから来たフラグを立てたペプチドの溶出内のオーバラップを避けるためには、これら２つのフラクション間に少なくとも６分の溶出差があることが必要である（例えば、フラクション１０について、これはフラクション１７であったはずである）。しかしながら、安全性の理由から、我々は酸化されたメチオニン−ペプチドの次のグループの溶出を可能にする前に大きいピークフラクションの溶出の後にさらに５分の溶出時間を加えた。このことはすなわち、二次ランについて、我々が１２分の間隔により一次ランにおいて分離されたフラクションを混ぜ合わせることができたということを意味している。それによって我々は、フラクション２２、３４及び４６とフラクション１０を組合せた。同様にして我々はフラクション２３、３５及び４７などとフラクション１１を組合せた。二次ランについてのフラクションプール作業の完全なリストが、表IVＡに示されている。標準的二次ランのＵＶ吸光度プロフィール（フラクション１０、２２、３４及び４６を混ぜ合わせるラン２Ａ）は図１１に示されている。メチオニンＳＯ−ペプチドは毎回、未改変ペプチドが溶出すると予想された時間より前６分〜２分の間隔内に回収された。それによって上述のラン２Ａの例では、酸化されたペプチドがフラクション４〜７、１６〜１９、２８〜３１及び４０〜４３（表IVＡ）の中で回収された。残りの二次ランにおける酸化されたペプチドは、表IVＡ中にさらに列挙されている通りに回収された。それによって合計して、我々は、一次ランからの全てのフラクションを網羅するべく連続１２回のこのような二次分離を実施しなければならない。ここで記述されたソーティングプロセスで利用されている時間的間隔及びウインドウが選択されたクロマトグラフィーシステム又はソートすべき成分のタイプに応じて変更され得るということをここで付け加えておくべきであろう。例えば例１８では、我々は、同様にメチオニンペプチドもソートするべく異なる時間的間隔及びウインドウを用い、ただしＨＣＯＯＨ／アセトニリトル系を用いたソーティングプロセスを記述している。時間的間隔及びウインドウを各々の特定の問題（例えばホスホ−ペプチドのソーティング、Ｎ−ε−アセチル化ペプチドのソーティング、ＮＨ2−末端ペプチ��のソーティングなど）に適応させなくてはならないというのは自明のことである。
【０２１１】
二次ランの間に溶出するＭet−ＳＯペプチドは、オンライン接続された質量分析計（例えばＥＳＩベースの質量分析計）のイオン源の中に直接通すこともできるし又はさらなるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＲＥＴＯＦ−ＭＳ分析のため小さいアリコートの形で回収するか又はハイスループットＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析のためにＭＡＬＤＩ−標的プレート上に小さな液滴の形で直接スポットさせることもできる。代替的には、ソートされたＭet−ＳＯペプチドをエッペンドルフ管の中に回収し、考えられる第３の一連の分離（ここでは三次ランと呼ばれる）のために再度組合わすことができる。後者は、ペプチドソーティングがＴＦＡ−含有システム内で実施された場合に必要となり得、一方分析はＥＳＩ−ＭＳによって行なわれる。実際ＴＦＡは、電気スプレー中にイオンのクラスタ化をひき起こしペプチドの検出及びＭＳ／ＭＳ分析を著しく損なうものとして知られている（Mirza及びChait. 1994）。これは、対イオンとして０．０５％のＨＣＯＯＨ又はｐＨ５．７の１０mMのＮＨ4ＡＣ緩衝液のいずれかが使用される場合にはあてはまらない。後者の系の使用が、先行ランで用いたＴＦＡ−系と比べたときペプチド溶出時間中のシフトを生み出し、場合によっては望ましくないピーク蓄積ひいては効率の悪いペプチド同定を導く可能性がある、ということを認識すべきである。表IVＢ及びIVＣで、我々は、二次ランから誘導されたフラクションを三次ランの実施に向けてどのようにプールし得るかを例示する２つの異なるスキームを提示している。異なるラン全体を通して溶媒中で同一の対イオンが使用される場合、次々に溶出するフラクションを混ぜ合わせることができる。例えば、ラン２Ａのフラクション４−７をラン２Ｅのフラクション８−１１、ラン２Ｉのフラクション１２−１５、ラン２Ａのフラクション１６−１９、ラン２Ｅのフラクション２０−２３、ラン２Ｉのフラクション２４−２７、ラン２Ａのフラクション２８−３１、ラン２Ｅのフラクション３２−３５、ラン２Ｉのフラクション３６−３９、ラン２Ａのフラクション４０−４３（表IVＢ中で青色でマークされている）と混ぜ合わせることができる。残りのフラクションは、類似の要領で、表IVＢに示されている通りに組合わされ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄという４つの三次ランにその成分を分離できる４つのプールを導く。三次ランで０．０５％のＨＣＯＯＨを使用する場合には、毎回フラクションの半分のみを混ぜ合わせることが勧められる。それによって、ラン３′Ａについて、このときラン２Ａのフラクション４−７をラン２Ｉのフラクション１２−１５、ラン２Ｅのフラクション２０−２３、ラン２Ａのフラクション２８−３１及びラン２Ｉのフラクション３６−３９と共にプールする。その他の組合せは、ここでも表IVＣに列挙され、８つの異なる三次ラン（３′Ａから３′Ｈまで）に分離される。三次ランを実施するために二次ランからのフラクションをプールするさらにその他の組合せも可能である。上述のような三次ランは数回のランにわたりペプチドをより良く分散させるために重要であるが、ペプチドが二次ラン中にカラムを溶出した時点で直ちにそれらを同定するのがさらに効率良く迅速なことである。時間的展望から見ると、後者は、Ｍet−ＳＯ���プチドがいかなる回収も可能でない８分ブロックにより分離された間隔で溶出することから、単一カラムペプチドソーティング装置の場合最適ではない。これらの８分ブロックは、３本のカラムを同時にランする場合、２回の４分溶出物で満杯にできる。かかる３カラム型ペプチドソーターの設計については、例１２で記述される。
【０２１２】
もとのタンパク質ペプチド混合物のペプチドの大部分を形成する改変されたペプチドが廃棄されるか又はその他の分析のために使用される一方で、未改変ペプチドが同定ペプチドとしてソートされ回収される逆ソーティングプロセスが用いられる場合には、以下の手順が明白である。
【０２１３】
全ての改変されたペプチドが同定ペプチドの溶出位置の前で６〜２分の間でシフトするものとし、１分の一次フラクションが取られた（Ｗ1＝１分）ものと仮定して、以上で使用したメチオニン酸化の例で使用されたものと類似のペプチドシフト値を用いると、−６〜−２分の間で溶出する改変されたペプチドは分析されないものの、一次ランで取られた場合と同じ時間的間隔内で同定ペプチドが回収される。ここでは、非改変ペプチドがもとの混合物のわずかなフラクションを表わす一方で、改変されたペプチドがペプチドのバルクを形成する、ということが明白であるはずである。
【０２１４】
同様に、二次ラン中に大量のペプチドが不在であることに起因して、二次ラン中に未改変ペプチドが溶出するウインドウが幾分か広がっているかもしれないということを指摘することも重要である。したがって、未改変の同定ペプチドが、Ｗ1よりもわずかに広いウインドウ、例えばＷ1の時間的間隔の前後０．５分の中でより良く回収される。
【０２１５】
メチオニン酸化の例と同様、ここでもまた、我々は、一次ランのフラクション１０、２２、３４及び４６を混ぜ合わせることができる。ここで、フラクション４−７、１６−１９、２８−３１及び４０−４３内で溶出する改変されたペプチドは廃棄され、一方同定ペプチドは今度は、フラクション９．５〜１１．５分、２１．５〜２３．５分、３３．５〜３５．５分及び４５．５〜４７．５分の中で回収される。
【０２１６】
それによって、ペプチド回収プログラム内の変更を最小限におさえながら、通常のソーティングプロセスと同じ装置で逆ソーティングプロセスを実施することができる。
【０２１７】
ここでもまた、クロマトグラフィーのシステム及び条件及び使用される改変化学又は手順に応じてシフト時間が変動するということは、当業者にとっては明白であるはずである。
【０２１８】
例１２：  ３カラムペプチドをソーティングするための装置
全体的なペプチドソーティング時間を短縮するため、全ての工程について単一のＲＰ−ＨＰＬＣカラムに基づいた例１１を用いている手順は、ここでは、並行して同期的に作動する３本のカラムを用いて実施される。かかるソーティングシステムの概略図は、図１２に示されている。このペプチドソーティング装置は、正確に同一の条件（流量、勾配など）でランされる３本の同一のＲＰカラムを収納している。同一の条件を達成するために、これらのカラムは各々高圧ポンプ及び溶媒混合装置と連絡され、３本のカラム内の流量及び勾配を正確に制御している（図１２Ａ）。代替的には、単一の高圧ポンプにより３本のカラムが供給を受け、一方各カラムに対する流量は、流量制御できるスプリッタバルブによって監視される（図１２Ｂ）。カラムＩ上には、ラン１からのフラクション１０、２２、３４及び４６をかける。ラン１と全く同じ流量及び勾配が作り出される。カラムは、１０分間５％の溶媒Ｂ中の０．１％のＴＦＡ（例えば０．０９％ＴＦＡ中の７０％のアセトニトリル）でまず洗浄される。その後、ラン１の場合のような勾配を１分あたり１％の溶媒Ｂという勾配で続行する。４分目から７分目の最後まで（フラクション４〜７）、Ｍet−ＳＯペプチドを回収するか又はこれらを分析のためＭＳ−装置のイオン源の中へと導く。代替的には、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるさらなる分析のためMicro Blotter（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いることで、４〜７溶出物を小さなアリコートの形で回収する。８〜１５分目で、溶出物を再び廃棄物に導く。１６分目で、ラン１内のフラクション２２に由来するMet-ＳＯペプチドの第２のブーストを回収する。この回収及び分析は、１６〜１９分（フラクション１６−１９）の間に行なわれる。次に２８−３１分の間隔まで溶出物を再び廃棄し、この間に、もともとフラクション３４から誘導されたMet-ＳＯペプチドの第３のブーストを回収する。３２分目で回収を停止し、溶出物をさらに廃棄物内へ導く。勾配を、ラン１の場合と同様に、フラクション４０−４３の付加的な回収を伴って続行し、勾配開始から５８分後に完了させ、その後３０分間０．１％のＴＦＡでの再平衡化工程を続ける。このときフラクション１４、２６及び３８が投入されているカラムIIを、カラムＩについて上述したものと正に同じ条件でランする。ここで、８−１１、２０−２３及び３２−３５の時間的間隔で、Ｍet−ＳＯペプチドを保存する。カラムIIIには、フラクション１８、３０及び４２をかけ、カラムＩ及びIIと同じ条件及び同じ周期性でランさせる。ここではＭet−ＳＯペプチドは、１２−１５、２４−２７及び３６−３９の時間的間隔で溶出する。３本のカラムでのランが同時に動作している場合、Ｍet−ＳＯペプチド分析の間にはもはやデッド間隔が全く見られない。実際、表Ｖで実証されているように、我々は、４〜７、１６〜１９、２８〜３１及び４０〜４３分目の間にカラムＩの生成物を、８〜１１、２０〜２３及び３２〜３５分目に間にカラムIIの生成物を分析する一方で、カラムIIIのものは１２〜１５、２４〜２７及び３６〜３９分目の時間中保存される。これらの１０個の時間的間隔は完全に整列させることができ、その結果、ＭＳ計器へのＭet−ＳＯペプチ���の連続流が得られる。ここでもまた、一次ランの間に合計１０分で当初捕捉されたメチオニンペプチドが今や、４０分の合計時間枠全体にわたるＭＳ装置の広がりへとソーティング後に送り出され、はるかに優れた分析条件を作り出す、ということに言及しておくことが大切である。さらに、質量分析計がより効率良く溶出ペプチドを選択し分析できるように、Ｍet−ＳＯペプチドが溶出する時間的間隔の間に流量を減少させることも可能である。それによって、我々は、Ｍet−ＳＯペプチドがソーティングシステムを溶出する時点で、一種のピークパーキング（Davis et al, 1995）手順を使用することができる。このことは、その他の連結されたカラム内での溶出時間の適応を必要とする。カラムＩ上で分離された組合せ型フラクション１１、２３、３５及び４７、カラムII上のフラクション１５、２７及び３９、及びカラムIII上のフラクション１９、３１及び４３を用いて、今度は、第２の３重ランが実施される。ここでもまた、Ｍet−ＳＯペプチドは、カラムＩについては５〜８、１７〜２０、２９〜３２及び４１〜４４の時間的間隔、カラムIIについては９〜１２、２１〜２４及び３３〜３６の間隔、そしてカラムIIIについては１３〜１６、２５〜２８及び３７〜４０の間隔で回収される。ラン１のフラクションの全ての組合せ及びＭet−ＳＯペプチドの保存は表Ｖに概略的に表わされている。全手順を通したバルブ操作は、表VIに描かれている。それによって、３カラム式ペプチドソーターを用いることにより、我々は今や、合計４回の二次ランで複合混合物から全てのＭet−ＳＯペプチドを分離することができる。全てのランは、投入、洗浄、溶出及び再平衡化を含めて約１２０分かかることになるため、全細胞溶解物からの全Ｍet−ＳＯソーティング工程は、ほぼ５００分で遂行可能である。このソーティングプロセスは、オンライン接続した質量分析計を用いて直接監視することができる。代替的には、Ｍet−ＳＯペプチドの溶出物を三次ランにおけるさらなる組合せ及び分析のために回収することができ、そうでなければ、連続的なハイスループット分析を可能にするＭＡＬＤＩ−標的上で、小さなアリコートへと溶出物をスポットさせることもできる。ここで使用されているＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件に加えて、はるかに速い溶出時間を可能にし、それによって全体的にソーティングプロセスを削減するカラムシステムを用いて、同じソーティングプロセスを実施できる、ということも言及しておくべきである。
【０２１９】
例１３：  ９カラム式ペプチドソーティング装置
図１３には、９カラム式ペプチドソーティング装置の構成が示されている。第１の３本のカラムは、１つの勾配ポンプと１つのサンプルインジェクターと連結されている。各々１つの勾配ポンプ及び１つのサンプルインジェクターと連結された第２及び第３の一連のカラムが存在する。小さな使い捨て式カラムでありうる９本のカラムは、３つのユニットに分けられている。ユニットＡはカラムＩ、II及びIIIを含み、一方ユニットＢ及びＣはそれぞれカラムＩ′、II′、III′及びＩ″、II″、III″を内含する。カラムＩ上には、ラン１のフラクション１２を、カラムIIにはフラクション２４、カラムIIIにはフラクション３６をかける。各々の投入手順の後には、少なくとも１０分間の溶媒Ａでの洗浄工程が続いている。その後、勾配を開始させる（１分あたり１％の溶媒Ｂの増加）。勾配は最初、カラムＩの上しか通されない。このカラムは、０〜５分の間で予めコンディショニングを受けている。Ｍet−ＳＯペプチドは、６〜９分の間で溶出し、カラムは１０〜１６分の間で洗浄される。１７分目で、１分間最初に平衡化されるカラムIIを勾配が通過するような形でバルブが配置される。Ｍet−ＳＯペプチドは、１８〜２１分の間で回収され、カラムは２２〜２８分まで洗浄される。２９分目で、勾配は、１分間予めコンディショニングされるカラムIII内へと導かれる。Ｍet−ＳＯペプチドは、３０〜３３分の間で溶出され、その後続いて、３４分から勾配の終わりまで洗浄が行なわれる。システムＢ（カラムＩ′、II′及びIII′）には、それぞれフラクション１３、２５及び３７が投入され、システムＡに対し３分の遅れで、同一のプログラムを用いて展開される。それによって、Ｍet−ＳＯペプチドは、１０−１３（Ｉ′）、２２−２３（II′）及び３４−３７（III′）の時点でソートする。システムＣ（カラムＩ″、II″及びIII″）についても、フラクション１４、２６及び３７で、システムＡに対し６分の遅延で、同じプログラムが使用される。対応するＭet−ＳＯペプチドは、間隔１４−１７（Ｉ″）、２６−２９（II″）及び３８−４１（III″）で回収される。それによって、Ｉ工程手順では、一度に９つのフラクションからＭet−ＳＯペプチドをソートする。表VIIで示されている通りにフラクションが投入され回収される付加的な４回のこのようなランが、もとの混合物中に存在する全てのＭet−ＳＯペプチドの完全なソーティングを導く。表VIIIには、完全なランの間のバルブ設定値についての完全な記述が提供されている。９カラム式ペプチドソーティング装置の重要な一面は、システムの全体的設計及びカラム寸法が、一次ランで使用されるものと異なっているという点にある。これはＲＰ−吸着剤及び溶媒システムが同一に保たれている場合でさえ、異なる溶出時間が発生する可能性がある、ということを意味している。この問題のための１つの解決法は、ペプチド混合物に添加される着色した（Ａla）n−Ａrg合成混合物（例１４参照）の使用である。こうして、一次ラン中のフラクション回収を導く基準点として連続的な着色されたピークを使用することが可能となる。それによって、２つの連続する着色されたピークの間又はその回りに、フラクションを回収することができる。次に同じ着色された基準成分を、ペプ���ドソーターにフラクション回収を導くように用いることもできる。基準化合物と組合せた９カラム式ペプチドソーターの使用は、ＮＨ2末端ペプチドについてのソーティングプロセスにおいて特に有益である（例６及び７参照）。後者のプロセスでは、ソートされたペプチドは改変されず、着色された基準混合物と共にとどまり、一方ソートされない大部分のペプチドは遅延させられ、着色された基準混合物から離される。
【０２２０】
この９カラム式ソーターによる１つのランは、約６０分以内で達成され、これは、完全ソーティングプロセスが±３００分つまり５時間以内で終わるということを意味している。ここで、このソーター内では小さく安価なカラムを使用することができるということに言及しておくことが重要である。１カラムにつき１個のフラクションしか処理されないことから、流量精度は、１本の単一カラム上に複数のフラクションが投入されるシステムの場合ほど重要ではない。全てのランは同様に、ポンプ及びバルブに対し課せられる要望が少ない比較的低圧で行なうことができる。９カラム式ソーターは同様に、親水性シフトが、メチオニンスルホキシド形成中に規則的に測定されるものに比べ大きいか又は小さいものである状況に対して、より良く適応される。これは、メタノールクロマトグラフィーシステムが使用される場合、又はシステイン誘導体が酸化される場合にあてはまる（表III参照）。ここで記述する異なるペプチドソーターは、異なる数のカラムをもつ類似のソーターの構成を排除しない、制限された例である。
【０２２１】
例１４：  ペプチドソーターの較正
ペプチドソーターの効率及び精度は、主として、カラム分離の再現性に左右される。それによってソーターの設置のみならずその規則的監視のためには、溶媒勾配範囲全体を網羅しかつ質量分析計、吸光度又はその他の手段により監視できる成分混合物又はペプチド較正混合物を使用するのが実用的である。制限的な意味のない例として、我々はここで、ＣＯＯＨ−末端アルギニン残基に結合した変動する数のアラニンから成る化学合成されたペプチド混合物（ｎが７〜４２までの範囲内にあるＡlan−Ａrg）を使用している。この混合物は、従来の固相合成手順を用いて合成される（Merrifield, 1963）。ペプチド伸長のために９７％のＦmoc−Ａla及び３％のtBoc−Ａlaの混合物を用いて、成長するペプチド鎖３％の中の各々のサイクルの後に早熟のストップが生成される。このタイプの合成戦略は、質量（７１amu）及び疎水性の両面で連続した変化示す一組のペプチドを生み出す１つのアラニンの添加によって全ての成分が他の成分と異なっているような混合物を生み出す。それによって上述の例の場合、一定の与えられた溶出ウインドウ（Ｗ１）は同様に、充分明確な質量値をもつこの混合物からの１つ以上のペプチドによっても特徴づけされうる。制限的な意味のない例示として、０．１％のＴＦＡをイオンとして用いアセトニトリルを修飾物質として用いるＣ１８−ＲＰ−カラム上のＮＨ2−Ａｌａn−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ混合物についての溶出プロフィールが示されている（図１４Ａ）。かかる較正化合物の着色されたバージョンを、Ａｌａn−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇというイプシロン−アミノ基を介し着色された部分の共有結合を可能にする、付加的なリシン残基でのポリ−Ａla−ペプチドの合成によって得ることができる。
【０２２２】
このペプチド較正混合物は、ペプチドソーター装置内での各カラムの特性及び特徴を監視し、かつ全システムを較正するために使用される。これは、一次ラン中に較正ペプチドをサンプルから誘導されたペプチド混合物と混合することによって行なうことができる。較正化合物の溶出プロフィールのあらゆる調整が、修飾物質濃度の変更、溶出勾配の改変、カラム温度の変更、オクチルアミン又はドデシル硫酸塩といったイオン対合剤の添加又は溶媒Ｂに対するテトラヒドロフラン又はプロパノールの添加などといったような当該分野で周知の従来の手段によって実施される。同じペプチド較正混合物は同様に、高い精度に達するべく、質量分析計、特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ機を較正するためにも使用される。
【０２２３】
例１５：  ペプチドの同定及び親タンパク質の割当て
二次ラン内で又は三次カラムシステムから溶出するフラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを、電気スプレー質量分析計のイオン源の中に直接通し、次に、ＭＳ／ＭＳモードでさらにフラグメント化させる。ＭＳ／ＭＳ フラグメント化スペクトルから部分的配列情報を回収し、配列データベース内のペプチド同定のために使用する。ラン２内で広い時間的間隔にわたりフラグを立てたペプチドが漸進的に溶出されることから、これらのペプチドの同時溶出は最小限であり、ＭＳ／ＭＳの分解能は著しく増強される（例えば、例１８参照）。本発明は、同様に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによってペプチドを同定するためにも使用される。実際、フラグを立てたペプチド又は同定ペプチドを迅速に走査するために、ハイスループットＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ技術が利用される。このために、我々は例えば、ペプチドがＰＯＲＯＳ５０Ｒ２ビーズ上にバッチ内吸着され、標的ディスクに移送され、ＭＡＬＤＩマトリクス化合物で標的上で脱離される、ペプチド−ビーズ濃縮方法（Gavaert et al.1997及びGevaert et al., 1998）を使用する。得られる情報は、合計ペプチド質量に制限され、これは、それが精確に測定できない場合、明白な同定にはつねに充分なものであるとはかぎらない。より決定的な同定を導く付加的な情報を回収する方法がいくつか存在する。
【０２２４】
例えば、Ｍet−ＳＯペプチドについては、ペプチドがＭet−ＳＯを含有するか否かが確かめられる。これらのペプチドは、質量分析の間に観察されるメタンスルフェン酸（６４amu）の効率の良いニュートラルロスにより特徴づけされる（図１５）。メタンスルフェン酸損失の後、ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ分析における見かけの安定性をそれに与えるその振動エネルギーを失ったように思われる。したがって、Ｍet−ＳＯペプチドから解釈可能なポストソース分解（ＰＳＤ）スペクトルを生成することはほとんど不可能であり、したがってＭＡＬＤＩ−質量分析法を用いたペプチドの同定のためのツールが失なわれる。ＰＳＤの問題を回避するための方法がいくつか存在する。まず最初に、Ｎ−（メチル）メルカプトアセトアミドといったような還元剤でこれらを処理することにより、Ｍet−ＳＯペプチドをその当初の構造まで逆還元させることができる（Houghten and Li, 1981）。第２に、またより便利な方法として、Ｍet−ＳＯペプチドを、過ギ酸（Hirs, 1956）又はＨ2Ｏ2でのより長いインキュベーション（例えば室温で２４時間）を用いてその対応するスルホン誘導体へとさらに酸化させる。メチオニンスルホンもメチオニン−ペプチドも両方共、対応するスルホキシドよりもはるかに優れたＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ分解スペクトルを生み出す。この工程で、スルホン−ペプチドについてニュートラルロスはほとんど観察されず、より優れたＰＳＤスペクトルが生み出されるということに注目すべきである。
【０２２５】
代替的な１つのアプローチでは、ペプチドを衝突活性化解離（ＣＡＤ）によりフラグメント化することができる。このタイプのフラグメント化は、スルホキシドにより誘発される双極子を発生させることが比較的少なく、したがって、Ｍet−ＳＯペプチドから配列情報を生成する上での重要なツールである（例１８）。
【０２２６】
さらなる情報を得るためのもう１つの方法は、イソシアネートでの化学的に誘発されたラダーを用いるか（Chait et al., 1993）、又はアミノペプチダーゼ（Caprioli and Fan, 1986）による、部分的ＮＨ2末端分解に基づくものである。この方法は、完全な同定を導くすべてのペプチドのＮＨ2末端における充分な情報を提供する。かかるアミノペプチダーゼ消化又はラダー配列決定は、ハイスループットシステムにおいて特に有益であるが、複合度の比較的低いペプチド混合物に対してのみ実施可能である。
【０２２７】
それによって、ペプチドのＮＨ2末端からの部分的配列情報と組合わされた１つ以上のメチオニン残基の割当て、精確に測定されたペプチド質量の組合せは、全溶解物からの全てとは言わないまでも大部分のペプチドを明白に同定するために、充分拘束性がある。
【０２２８】
この工程で、精確に測定された質量に基づくペプチド及び親タンパク質の同定のために記述され、例１０で説明されている付加的な方法も参照されたい。
【０２２９】
例１６：  ２つのサンプル中の定量的な相対的ペプチド量の決定
相対的で定量的な形で２つの細胞セット又はより一般的に２つの異なるサンプル内のタンパク質発現レベルを比較するために、各々の調製物のタンパク質溶解物をトリプシンで消化させる。１つのサンプル中では、トリプシン消化をＨ216Ｏ中で実施し、一方第２のサンプルの消化はＨ218Ｏ中で進行する。トリプシンは、新たに生成された部位のＣＯＯＨ末端において水の分子の２つの酸素を取込ませる可能性を有する（Rose et al., 1983及びSchnoelzer et al., 1996）。それによってＨ216Ｏ内でトリプシン処理されたサンプル１の全てのペプチドは正常な質量をもち、一方サンプル２は、１つ及び２つの18Ｏ−同位体の取込みに対応する２amu及び４amuの質量増加を伴うペプチド（大部分のＣＯＯＨ末端ペプチドを除く）を含有している。ペプチドの２つの18Ｏ−態様の相対比は、ペプチドの性質、酵素の活性及び18Ｏ−水の純度を含めたいくつかの要因によって左右され、したがって相対的定量測定のために18Ｏ−取込みが使用される場合、ペプチド内の２つの18Ｏ−同位体の取込みの範囲を、全体的計算の中で考慮しなければならない（Stewart et al., 2001）。
【０２３０】
消化は別々に実施されるが、メチオニン−ペプチドのソーティングを含めたその後の全ての処理は、酵素原子の顕著な逆交換無く、２つの消化物の混合物について進めることができる。16Ｏ−及び18Ｏ−消化物を混合し、メチオニン上で改変されたフラグを立てたペプチド（Ｍet−ＳＯペプチド）の単離に付される。メチオニンフラグを立てたペプチドは、例えば、例１５に記述されている通りに同定できる。軽（16Ｏ）及び重（18Ｏ）ペプチドは、化学的に非常に類似しており、各々の対は同じ要領で分離することになる。これらは同様に、同じ形でイオン化する。質量分析の間にだけ、これらは、軽ペプチドと重ペプチドへと分離する。（後者は、１つ及び２つの18Ｏ−原子の取込みのため２及び４amuというさらに高い質量をもつ）。18Ｏの取込みよって誘発されたイオン分離は、重ペプチドに対する軽ペプチドの比を正確に測定しそれによって２つのサンプル内のタンパク質の比を決定するのに充分である（例えばMirgorodskaya et al., 2000）。全手順の概略的提示は、図１６Ａに与えられている。
【０２３１】
相対的定量分析のための18Ｏ−取込みをテストするために、我々は、「通常の」16Ｏ−水の中で１回と18Ｏ−水の中で１回（純度９５％、ＡＲＣLaboratories, Amsterdam, オランダ）、３７℃で１６時間トリプシンを用いて、（例２０及び２１にあるように調製された）血小板細胞質ゾル及び膜骨格フラクションを消化させた。一次ランに先立ち、16Ｏ−消化物１部を18Ｏ−消化物２部と混合させ、サンプルを１％のＴＦＡまで酸性化しメチオニンフラグを立てたペプチドを、単一カラムペプチドをソーティングするためのシステムを用いて例１で記述した通りにペプチド混合物からソートさせた（例１１）。
【０２３２】
ＬＣ−ＭＳ分析において、上述のように観察されたペプチドイオンの18Ｏ／16Ｏ比を計算した。この分析の結果は、図１６ＢＢの中に記されており、ペプチド比が一般に２前後で変動することを確認しており、このタイプの同位体標識づけ技術が定量的プロテオーム分析に適していることを表わしている。
【０２３３】
我々はさらに、１つは通常のＨ2Ｏ中、もう１つはＨ218Ｏ（９５％の18Ｏ）中でトリプ
シンにより２つの等量のウシ血清アルブミンを消化することによって18Ｏ−標識づけの使用を確認した。１８時間の消化の後、両方のペプチド混合物を混合し、ＨＰＬＣにより分離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。１９のペプチドについて、我々は標識づけ手順の影響を受けなかった同位体（例えば13Ｃ−同位体）のピーク高さを比較した。値をさらに９５％のＨ218Ｏの存在について補正し、図１７で組合せた。タンパク質消化物が実験の開始時点で混合されたモル比ときわめてうまく対応する１．０３という平均比を１９のペプチドについて測定した。大部分の値が、予測された値と非常によく合致し、極値は０．８４と１．２０である（表IX）。この実験は、トリプシン消化中の安定した同位体標識づけが定量的示差プロテオーム研究のためのベースを形成し、本発明で使用されるということを例示している。
【０２３４】
ディファレンシャル同位体標識づけは同様に代替的な方法によっても行なうことができ、そのうちのいくつかが、以下で簡単に言及されている。標識づけ手順は既知の化学反応に基づき、タンパク質又はペプチドのいずれかのレベルで実施することができる。以下では、ディファレンシャル標識づけのために用いられる一定数の反応について記述する。ペプチドは、例えば試薬対すなわちメチルイソシアネート／トリジューテロメチルイソシアネート（ｖ）； エチルイソシアネート／ペンタジューテロ−エチルイソシアネート（vi）；フェニルイソシアネート／ペンタジューテロ−フェニルイソシアネート（vii）；アセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド／トリジューテロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（viii）で変化させることができる。これらの化合物は全て、α−ＮＨ2及びε−ＮＨ2基と特異的かつ定量的に反応することがわかっている。改変試薬の最終的選択は、その試薬の重水素化態様の利用可能性、価格、化学的安定性及び実験室内快適性に左右されることになる。もう１つの重要な側面は、質量分析計内でのイオン化工程中のアダクツの安定性である。重水素化態様でのこれらの試薬の各々についての反応式は以下に記されている。
【０２３５】
【化４】
2005500990.tif 000006
【０２３６】
「軽」及び「重」ペプチドの間にさらに大きい質量差が必要とされる場合には、13Ｃ、15Ｎ、及び重水素が組合わされている基又はより大きな重水素化された基を使用することができる。例えば、ＮＨ2末端を特異的に標識づけするためのヒドロキシブチリル基（ＨＯ−ＣＤ2−ＣＤ2−ＣＯ−）の使用により、我々は、６amuの差を作り出すことができるようになるだろう。代替的には、ＮＨ2末端を標識づけするための13ＣＤ3−13ＣＤ2−ＣＯ−プロピオニル基の使用により、我々は７amuの差を作り出すことができるだろう。さらに一層明示的には、13Ｃで標識づけされた及び重水素化されたニコチノイル誘導体（Ｎ13Ｃ5Ｄ4ＣＯ−）の使用により、我々は、９amuの質量差を使用することができるだろう。これらの基全てから、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを合成できるということは、当業者にとって既知のことであるはずである。
【０２３７】
同様に、本発明において記述されている構造式では、Ｄが重水素2Ｈを表わしていることも明らかである。
【０２３８】
重水素化アセトールでのShiff塩基の形成と、それに続く水素化ホウ素ナトリウムでの還元（Geoghegan et al., 1979）によって、ペプチドを改変させることも可能である。この反応は、穏やかな条件下で進行することが記述されており、アミノ基１個あたりわずか１分子のアセトールの添加を導き、第２級アミン（ix）を作り出す。このとき、重水素化されたアミンは、５個の交換不能の重水素原子を含有し、その重水素化されていない対応物から５amuだけ分離することになる。ペプチドは、リシンのε−ＮＨ2基及びα−ＮＨ2−基の両方で改変され、（アルギニンペプチドについて）５amu、また（リシンペプチドについて）１０amuの質量増加を導く。基礎を成す反応は以下に示されている。
【０２３９】
【化５】
2005500990.tif 000007
【０２４０】
ここで引用されている例は、ディファレンシャル同位体タグ付けのために用いることのできるより広範な改変反応のうちのいくつかの例示を表わしているにすぎない。
【０２４１】
例１７：  １つのサンプル中のタンパク質のモル比を測定するための定量的示差プロテオーム表示
質量分析法を用いたその代表的ペプチドを介したタンパク質の同定用手順は、定性的であるが定量的ではない。実際、ペプチドは、その精製の後ディファレンシャル損失を示し、ペプチドは、その化学的性質及び混合物内に存在するその他のペプチドに応じて非常に可変的で予測不能な形でイオン化することができる。この現象は、ＭＳの分野でイオン化の抑制として周知である（Krause et al.,1999）。しかしながら、例１６で実証されているように、質量分析は、化学的にペプチドを区別しないものの質量分析計で区別し測定することのできる同位体タグで２つのサンプルのうちの１つを標識づけできる場合に定量的なものとなる。我々はここで、１つの単一サンプル内のタンパク質の相対比を測定するためにディファレンシャル同位体標識づけの同じ原理を使用する。これは、既知の量の基準ペプチドをサンプルに添加することによって行なうことができる。これらは、サンプル中に存在するタンパク質から誘導されるペプチドであり、その配列は、その親タンパク質を明白に同定するのに充分なものである。基準ペプチドは、好ましくは同様に、さらに質量分析内で充分イオン化する容易に単離されるペプチドとして選択される。メチオニンフラグを立てたペプチド（Ｍet−ＳＯペプチド）について選択するプロトコルにおいては、基準ペプチドは、好ましくはアルギニン残基をも含有するか又は効率の良いイオン化のために処理されているメチオニン含有ペプチドである。定量化すべき全てのタンパク質は、少なくとも１つの、好ましくは２つ以上の基準ペプチドによって表わされなくてはならない。基準ペプチドは、従来の質量分析計において両方の態様を識別するのに充分大きいディファレンシャル同位体標識づけにより、その合成の対応物と異なっている。本願ですでに指摘したように、４amuの差で充分である。かかる同位体による区別は、さまざまなやり方で得られ、ここでいくつかの例を提供する。最も便利な形としては、同位体で標識づけされた基準ペプチドは、Ｈ218Ｏ内でのタンパク質混合物のトリプシン消化によって生成される。基準ペプチドの相応する合成の対応物は、その天然同位体で合成される。かかる化学合成は、多重ペプチド合成装置を用いて大規模に実施される（Zuckermann et al.,1992）。
【０２４２】
タンパク質を含有する特定のサンプル中の標的タンパク質の量を決定するためのプロトコルの一例は、以下のように要約される：すわなち（ｉ）基準ペプチドを標的タンパク質から選択する、（ii）相応する合成の対応物を合成する、（iii）Ｈ218Ｏの存在下でタンパク質サンプルをトリプシンで消化させる、（iv）タンパク質ペプチド混合物に対して既知の量の合成基準ペプチドを添加する（好ましくは、合成基準ペプチドの量は、基準ペプチドの予測量に匹敵している）、（ｖ）フラグを立てたペプチドを分離するべく混合物を本発明に付す、（vi）フラグを立てたペプチドを例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析する、（vii）基準ペプチド及び合成基準ペプチドはプロセス内で同時溶出され、質量スペクトル内で２つのピークとして現われることになる、（viii）２つのピークの各々の表面積を計算する、（ix）両方のピーク間の比は、基準ペプチドの量、そしてそれに対応して特定のサンプル中の標的タンパク質の量を計算できるようにする。このプロトコルは、明らかに、同定ペプチドのためにも使用でき、複数の形で適応可能である。例えば、サンプル中の多数の（１００以上もの）標的タンパク質の量を決定し、それによって一定の与えられたサンプル中の数多くの標的タンパク質の発現レベルを測定するためにこれを容易に拡張することができる。明らかにこのアプローチは同様に、多数のサンプル中の標的タンパク質の量を測定し、比較するためにも使用できる。かかる結果は、例えば、疾病又は薬物の効果及び副作用を予知、監視又は診断するために使用可能である。
【０２４３】
代替的アプローチでは、合成ペプチドは、まれな同位体を担持し、一方タンパク質から生成される基準ペプチドは天然同位体である。例えば、メチオニン含有ペプチドを選択した場合、合成基準ペプチドの中に市販の重水素化メチオニン（ＣＨ3ＳＣＤ2ＣＤ2ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＯＨ）を取込み、合計ペプチド質量に４amuを加えることが可能である。代替的には、合成基準ペプチドは同様に重水素化アルギニンを含有しており、この場合これは合計ペプチド質量に７amuを加える。そこからの重水素化された15Ｎ又は13Ｃ態様が存在している全てのアミノ酸が、このプロトコルにおいて考慮できるということは明白であるはずである。さらにもう１つの代替的アプローチは、着色された螢光性の又はその他の形で測定可能な基が結合した状態で合成基準ペプチドを設計することにある。全ての基準ペプチドについて同じ分子消散係数を表示する汎用カラータグを導入することによって、全ての基準ペプチドの量を定量化することが容易になる。定量化可能な基は、通常の保管の間充分に安定しているが、制御された化学的又は酵素的プロセスによって基準ペプチドから放出されるアンカー又はリンカーで、ペプチドに結合されるべきである。例えば、基準ペプチドに対しＡla−Ｌysリンカー配列によって、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホネート基（最大分子吸収係数５５７nm）といったようなカラー染料をリンクさせることができる（Freedman and Radda, 1968）。通常、合計リシンからペプチド混合物を生成するために実施されるトリプシン消化が、ここでは、同様にリシン残基のＣＯＯＨ末端結合で基準ペプチドを分割し、それによって染料及びリンカーを残りのペプチドから放出することになる（ｘ）。
【０２４４】
【化６】
2005500990.tif 000008
【０２４５】
タンパク質消化がＨ218Ｏの中で、着色された基準ペプチドの存在下で実施される場合には、遊離された基準ペプチドは同じく、その遊離ＣＯＯＨ末端で同位体で標識づけされた状態となる。したがって、着色されたペプチドのトリプシン消化は、Ｈ216Ｏの中で別に行なわれ、単に消化の終わりで全ペプチド混合物に添加されるにすぎない。染料と基準ペプチドの間のリンカーも同じく、残りのペプチドが影響を受けない条件下で化学的に分割され得る。
【０２４６】
例１８：  Esherichia coli（菌株Ｋ１２）のプロテオームの分析
１０9個のE. coli Ｋ１２細胞を、培養された静止増殖期から取り出し、穏やかな遠心分離によってペレット化し、ｐＨ７．２の２０mMのリン酸緩衝液中の１０mMのＮａＣｌ １mlで４回洗浄し、ｐＨ８．０の１００mMのリン酸緩衝液中の４Ｍの尿素１mlの中での音波処理によって溶解させた。Airfuge内で１００，０００×ｇでの遠心分離により溶解物を清澄させ、その後ｐＨ８．０で１００mMのリン酸緩衝液を用いて尿素濃度を１Ｍまで減少させた。１mlのタンパク質混合物（２５０・１０6個のE. coli細胞に対応する）に対し１０μgのトリプシンを添加し、消化を３７℃で一晩進行させ、ＴＦＡでの酸性化により停止させた。得られたタンパク質ペプチド混合物（５０・１０6のE. coli細胞に対応する）の５分の１を、０．１％のＴＦＡ（溶媒Ａ）で平衡化させた内径２．１mm×２５cmのＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム上にかけた。カラムをまず最初に１０分間、５％の溶媒Ｂ（０．０９％のＴＦＡ中の７０％のアセトニトリル）で洗浄し、その後、漸増する濃度の溶媒Ｂの線形勾配を用いて、固定カラム相からペプチドを溶出させた。流量を８０μl／分に保ち、１％の溶媒Ｂ／分という勾配を設定した。１分（すなわち８０μl）のフラクションを回収した。勾配開始から１８分後に第１のフラクションを回収し、これに１０という番号を付した。このフラクションの後に３９個の付加的な８０μlのフラクションが続き、最後のフラクション（フラクション４９）で、溶媒Ｂの濃度は、約４４％のアセトニトリルに相当する６３％に達した。勾配を、フラクション回収無しで３７分間続行し、ＨＰＬＣ−ランの開始から１０５分後に終結した。このラン（ここでは一次ランと呼ぶ）のＵＶ吸光度プロフィール（２１４nmでの）は、図１０に示されている。回収した全てのフラクションを真空乾燥させ、さらに使用するまで−２０℃で保管した。二次ランのためにプールしたフラクションを１％のＴＦＡ５９μl中に再度溶解させ、３０％のＨ2Ｏ2原液１μlを添加することでＨ2Ｏ2で０．５％とした。３０℃で３０分間、酸化反応を進行させ、その後サンプルは乾燥させず、直ちにクロマトグラフィーのために用いた。単一カラム式ペプチドソーター（例１１参照）を用いて、最初の二次ラン（ラン２Ａ）のためフラクション１０、２２、３４及び４６を組合せ、時間的間隔４〜７、１６〜１９、２８〜３１及び４０〜４３内で酸化されたメチオニン−ペプチドを回収した。一次ランのその他のフラクションのプールについては、表IVＡ内に要約した通りの組合せ及び回収時間を用いた。標準的な二次ラン（フラクション１０、２２、３４及び４６が組合わされたラン２Ａ）のＵＶ吸光度プロフィールは図１１に示されている。これらのペプチドがその間に回収された時間的間隔は、図１１内の線の間に示されている。この４分間の間に、各々３０秒の８回の連続的フラクションでペプチドを回収した（すなわち４０μlのフラクション）。合計で、ラン２Ａの３２のフラクションを得た。全ペプチドセットを網羅するため連続して１１回の付加的二次ランを実施した（表IVＡ）。回収されたフラクションに対し疎水性Poros（登録商標）５０Ｒ２ビーズの懸濁液を添加し（Gevaert et al., 1997）、フラクションを真空乾燥させた。添加したビーズ上で濃縮させたペプチドを、０．１％のＴＦＡ  アセトニトリル（１／１）中の０．７μlのＭＡＬＤＩ−マトリックス溶液（４％のα−シアノ桂皮酸と１％の−２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含有する）中で脱離させ、（メチオニン−スルホキシド含有ペプチドの容易な監視及び確認を可能にする）リフレクトロンモードでのペプチド質量分析のためＭＡＬＤＩ−標的に移した。図１５は、予想通りメチオニン−スルホキシドペプチドのみが観察された二次ラン２Ａからの２つのフラクションのＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示している。回収された３２０の二次フラクションの中に存在する全てのペプチドの分析の後、我々は、少なくとも１つのメチオニン残基を含有する１６１８個を含めた１７２０個の異なるペプチドを測定することができた。これら１６１８個のペプチドの測定された質量は、表IXに列挙されている。図１８は、一次ランの全てのフラクションについて、酸化されたＭetを含有することを実証できなかったペプチド（赤）に対するＭet−ＳＯ−ペプチド（青）の数を示している。これは、メタンスルフェン酸の標準的なニュートラルロスが明確に観察されなかったか、又はいくつかの非メチオニン含有ペプチドがソーティングプロセス中にすべり込んだかのいずれかの事実に起因する。この実施態様において、我々は、ソートされたペプチドの９４％が、Ｍetの存在を確認できるペプチドで構成されていることを確認した。このことは、全細胞溶解物が使用された場合でさえ我々のソーティングシステムが特異性をもつことを示している。
【０２４７】
第２工程では、ソートされたペプチドとその対応する親タンパク質を同定した。したがって、ここでもまた１Ｍの尿素及び０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ８．０中の２５０・１０6個のE. coli Ｋ１２細胞から調製された１mlのタンパク質混合物を消化させた。１０μgのトリプシンを添加し、消化を３７℃で一晩進行させた。消化の終わりで、結果として得たタンパク質ペプチド混合物を５分間トリブチルホスフィンで還元させ、ギ酸で酸性化させた（最終濃度１％）。Ｃ１８の逆相ＨＰＬＣカラム（ＩＤ２．１mm×２５０mm；Ｖydac２１８ＭＳ５２）上に得られたタンパク質ペプチド混合物の５分の１（５０・１０6のE. coli 細胞に対応する）をかけた。このカラムを、溶媒Ａとしての０．０５％のＨＣＯＯＨで平衡化した。カラムをまず最初に１０分間１００％の溶媒Ａで洗浄した。８０μl／分の流量でペプチドを溶出するために、１％の溶媒Ｂ／分（溶媒Ｂは７０％のアセトニトリル中の０．０５％のＨＣＯＯＨ）の線形勾配を使用した。ＵＶ検出器（Applied Biosystems Inc., ７５９Ａ吸光検出器）を用いて２１４nmでペプチドＵＶ吸光プロフィールを記録した。１分のフラクションを回収した。このフラクションは、勾配開始から３０分後に回収し、３０という番号を付した。番号８０まで、さらに５０個のフラクションを回収した。回収したフラクションは全て真空乾燥させ、さらなる使用まで−２０℃で保管した。二次ランのためにプールしたフラクションを１％のＴＦＡ５９μlの中に再度溶解させ、３０％のＨ2Ｏ2の原液１μlを添加することでＨ2Ｏ2で０．５％とした。３０℃で３０分間、酸化反応（本発明に従った特異的アミノ酸としてのメチオニンのための交互工程）を進行させ、その後サンプルは乾燥させず、直ちに二次ランに用いるためにＲＰ−カラム上にかける。例１１で記述されている単一カラム式ペプチドソーターを用いて、一次ランからのフラクション４１、５４、６７、８０を組合せ、それぞれ時間的間隔３１−３９、４４−５２、５７−６５及び７０〜７８内で酸化されたペプチド（フラグを立てたペプチド）を回収した。一次ランのプールされたフラクション及び二次ランからの回収したフラクションが、表Ｘに記されている。フラグを立てたペプチドを４分の時間的間隔で回収した我々の先行例とは対照的に、ここでは８分間隔で（各８０μlの８個のフラクション）及び未改変ペプチドの溶出より１分前に、フラグを立てたペプチドを回収した。それによって、Ｗ1＝１分で、δmax＝１０分、δmin＝１分及びＷ2＝８分である。各々の二次ランは４つの組合せたウインドウ（Ｗ2）を含んでいたため、Ｍet−ＳＯペプチド（ひいてはメチオニン改変済みフラグを立てたペプチド）は、各８０μlの３２のフラクション上で回収された。その後、奇数番号の二次フラクション全てを組合せ、乾燥させ、４５μlの溶媒Ａ（＝０．０５％のＨＣＯＯＨ）内で再溶解させた。この混合物の半分を、トラッピングカラム及びApplied Biosystems Inc.の１２０ＡのＨＰＬＣ分析装置に連結させた内径０．０７５mm（長さ１５cm）のナノカラム（Ｃ１８、Pepmap ＬＣ Packings）上にかけた。溶媒Ａとして０．０５％のＨＣＯＯＨを用い、溶媒Ｂとして７０％のアセトニトリル中の０．０５％のＨＣＯＯＨを用いて２２０分で０％Ｂ〜１００％Ｂの勾配���形成した。フロースプリッタ（Acurate, ＬＣ Packings）を用いて、６０μl／分のプレスプリッタ溶媒流量を約２２nl／分まで低減させた。金属コーティングされた溶融シリカ針（ＦＳ３６０−２０−１０−Ｄ−５−Ｃ７，New Objective）によってＱ−ＴＯＦ質量分析計（Micromass UK Limited, Altincham, UK）のＺ−スプレーイオン源内に溶出用ペプチドを導入した。Masslynx NT（バージョン３，４）を用いてデータ依存回収モードでデータを分析した。ＭＳ／ＭＳ分析のためには、２重荷電イオンのみを自動的に選択した。閾値を４０カウント／秒にセットし、アルゴン原子との衝突によって、選択されたイオンをフラグメント化した。全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを、E. coliのタンパク質のみを収納するタンパク質データベースを用いてＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science Ltd. London）により蓄積し分析した。明白な同定は、ＭＡＳＣＯＴの「確率ベースMowse評点」（Perkins et al., 1999）に依存した。各々のフラクションの残りの半分を、先行するランにおいて検出された全ての２重荷電イオンを含む排除リストを用いてナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳに再び付した。閾値を今度は２５カウント／秒にセットし、選択されたイオンを５秒間フラグメント化した。同じ手順を、偶数番号のフラクションについて反復した。全てのタンパク質同定データを最終的に組合せた。全てのナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳランから、合計６４３７のＣＩＤ−スペクトルを生成した（表XI）。これらのＣＩＤスペクトルは、ＭＡＳＣＯＴサーバーへの提出後、２５４３の注釈付きスペクトルを結果としてもたらした。
【０２４８】
全てのフラクションのソートされたＭet−ＳＯ ペプチドの同定は、約７６７の異なるE. coli ペプチドの同定を導いた（表XII）。全てのタンパク質は、タンパク質１個あたり平均２．２個のメチオニン含有ペプチドによってカバーされた。
【０２４９】
我々は、アミノアシルｔ−ＲＮＡシンセターゼといったような副次的タンパク質の系統群の次に、そして（３つの独立して単離されたＭetペプチドにより確認される）lac−リプレッサー及び少なくとも１９のその他のリプレッサーといったような非常に副次的のタンパク質の次に、E. coliの合計タンパク質質量の約１０％を占める全ての検出可能なリボソームタンパク質を同定した。これらの結果は、主要タンパク質の存在下での低存在度のタンパク質の検出を可能にする、本発明により達成されるダイナミックレンジの範囲を例示している。さらに我々は同じく、高い疎水性プロフィールをもつタンパク質及び既知の膜タンパク質も多数同定し、これは、生物学的に重要な膜タンパク質の莫大なアレイに対するより優れたアクセスを示唆していた。
【０２５０】
従来の２Ｄゲル分析とそれに続くＭＡＬＤＩベースのタンパク質同定により２倍量のE. coli細胞（１００・１０6細胞）を分析した場合、８６個のタンパク質を同定した。ゲルフリー研究における７６７個のタンパク質と比べ、後者について少なくとも１０倍そしておそらくそれよりはるかに高い感受性が存在している。２Ｄゲルをランする場合に「古典的な汚染物質」として往々にして指摘されるヒトの皮ふケラチンによる汚染が本発明の方法を使用した場合大幅に削減され、さらには完全に存在しなくなる、ということを強調しておくことが重要である。これらの分析は、５０・１０6個のE. coli細菌の当量で実施された。これは、±５０，０００〜１００，０００の動物細胞内に存在するタンパク質の量に対応し、この技術の高い感応度を例示している。本発明は、少数の細胞から出発してプロテオームを測定することを可能にする。これにより、従来の応用分野では手の届かなかった状況におけるディファレンシャルタンパク質発現を分析することが可能となる。本発明は、小さな腫瘍生検材料内、脳の小さな下位領域内、細胞ソーティングによって選択された細胞内、心臓の小さな下位領域内、血管内のプラーク形成座の中でのタンパク質発現の分析を可能にする。本発明の方法は、きわめて複合度の高い混合物からメチオニンペプチドを効率良くソートする。さらに、フラグを立てたペプチドは一度に得られず、数多くのフラクション全体にわたり漸進的にソートされ、それによってはるかに効率の良い検出を保証する連続的な形で質量分析計に供給される。このことは、二次ランの溶出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ検出を用いたE. coliプロテオームからの１６１８個の異なるＭet−ペプチドの検出によって最も良く例示されている。
【０２５１】
望まれる場合、本発明の方法は、毒性又は腐食性化学物質を使用することなく達成できる。例えば、全体的なソーティング品質に影響を及ぼすことなくアセトニトリルをエタノールに、そしてＴＦＡをＮＨ4Ａｃ 緩衝液により置換することが可能である。
【０２５２】
例１９：  ヒト血漿の部分的プロテオーム分析
出発材料として、（約６０mgのタンパク質材料を含み基本的に汚染性細胞の無い）１mlの凍結乾燥したヒト血漿を使用した。乾燥したサンプルを、ｐＨ８．７のトリス−ＨＣｌ ５０mMとトリブチルホスフィン２％を含む調製されたばかりの８Ｍの尿素１mlの中に再度溶解させた。消化に先立ち、５０mMのトリス−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．７）３mlを加えることによって尿素の濃度を４倍希釈した。このサンプルの１フラクション、２００μl（これはタンパク質材料約３mgに対応する）を、２０μgのトリプシン（Promega, Madison, WI.USAからの配列決定グレードの修飾されたトリプシン）でのタンパク質消化のために使用した。消化を３７℃の恒常な温度で一晩続行させ、酸性化によって停止させた。０．１％のＴＦＡ中のアセトニトリルの急な勾配を用いて、Sample Cleanup RP-Column（Agilent Technologies）（I.D. ２．１mm×２０mm、Ｖydac Ｃ18ＲＰ−ビーズ詰め）上にペプチドを通過させることによって、この消化混合物の半分を予備コンディショニングした。０％の溶媒Ｂ（水中０．１％のＴＦＡ中の７０％のアセトニトリル）から１００％の溶媒Ｂまでの線形勾配を、０．２ml／分の流量で１４分間生成した。全溶出物を回収し、真空下で乾燥させ、１００μlの溶媒Ａ（水中０．１％のＴＦＡ）中で再溶解させた。
【０２５３】
その後タンパク質ペプチド混合物をソーティングプロセスに付した。ペプチド混合物をかけた後、Waters ＡＣＴＩＯＮ分析装置（Waters Corporate, Milford, MA, USA）を用いて１ml／分の恒常流量で２０分間、０．１％の水中ＴＦＡ（Baker ＨＰＬＣで分析済み、Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, オランダ）（溶媒Ａ）を用いてカラムを洗い流した。その後、７０分にわたり０．１％の水中ＴＦＡ（１００％の溶媒Ｂ）中７０％のアセトニトリル（Baker ＨＰＬＣ分析済み）までの線形勾配（したがって、１分あたり１％の溶媒Ｂの増加）を用いて、ＲＰカラムからペプチドを溶出した。最終工程で、カラムを溶媒Ｂを洗い流し、次のサンプル注入に先立ち溶媒Ａで再度平衡化した。ラン１において、（１１．４％の溶媒Ｂすなわち８％のアセトニトリルに対応する）２８分と（７１．４％の溶媒Ｂすなわち５０％のアセトニトリル）７０分の間の時間枠内で溶出するペプチドを、Gilson ２２１ＸＬ Liquid Handler（Gilson SAS, Villers Le Bel, France）を用いて１分（すなわち１ml）のフラクション内で回収した。それによって、合計４２の一次フラクションを回収した。
【０２５４】
メチオニン残基の酸化の前に、各々の一次フラクションを完全に乾燥するまで乾燥させた。（表IVＡで記述されたものと類似のセットアップで）二次ランのためにプールされた一次フラクションを、３０％のＨ2Ｏ2２μlを加えた１％のＴＦＡ１００μlの中で再溶解させた。メチオニン残基の酸化反応を３０℃で３０分間進行させ、その後一次フラクションをプールし、一次分離に用いられたものと同じＲＰ−ＨＰＬＣカラム上にかけ、一次ラン中と全く同じクロマトグラフィー条件下でこの二次ランにおいてペプチドをフラクション化した。ここで、未改変ペプチドの溶出に先立つ９分〜１分の間に、８分の時間的間隔で（各1mlの８回のサブフラクション）、フラグを立てたペプチドを回収した。２つの一次フラクションからソートされたペプチド上で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。したがって、一次フラクション２５からの回収されたソート済みペプチドを全て組合せ、乾燥させ、２００μlの溶媒Ａ（０．０５％の水中ギ酸）中で再溶解させ、この混合物の２０分の１を、トラッピングカラム及びApplied Biosystems Inc. １２０Ａ ＨＰＬＣ分析装置に連結された内径０．０７５mm（長さ１５cm）のナノカラム（Ｃ１８ Pepmap, LC Packings）上にかけた。一次フラクション２６からの全てのソート済みペプチドについて同じことを行なった。
【０２５５】
溶媒Ａとして０．０５％のＨＣＯＯＨを用い、溶媒Ｂとして７０％のアセトニトリル中の０．０５％のＨＣＯＯＨを用いて、２２０分で０％Ｂから１００％Ｂまでの勾配を形成した。フロースプリッタ（Acurate, LC Packings）を用いて約２００μl／分まで６０μl／分のプレスプリッタ溶媒流量を低減させた。金属コーティングされた溶融シリカ針（ＦＳ３６０−２０−１０−Ｄ−５−Ｃ７、New Objective）によってＱ−ＴＯＦ質量分析計（Micromass UK Limited, Altincham, UK）のＺ−スプレーイオン源内に溶出ペプチドを導入した。Masslynx NT（バージョン３，４）を用いてデータ依存回収モードでデータを分析し、ＭＳ／ＭＳ分析のためには、２重荷電イオンを自動的に選択した。閾値を４０カウント／秒にセットし、アルゴン原子との衝突によって、選択されたイオンを４秒間フラグメント化した。
【０２５６】
全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質データベース（リリース４０，１０）を用い、しかも探索をヒトタンパク質に制限して、ＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science Ltd, London）により蓄積し分析した。タンパク質の同定は、ＭＡＳＣＯＴの「確率ベースMowse評点」（Perkins et al., 1999）に依存していた。第１のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランの後、イオン排除リストを作成し、これをその後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランのために使用して、分析されたペプチドの数を増大させた。ここで、閾値を今度は２５カウント／秒にセットし、選択されたイオンを５秒間フラグメント化した。
【０２５７】
これら４つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳランから結果として得たタンパク質同定データを組合せ、表XIIIに示す。ここで認められるように、血清アルブミン（１００mlあたり約３〜４ｇの濃度）、アルファ−ミクログロブリン、アポリポタンパク質 Ｂ−１００及びフィブリノーゲンベータ鎖といったような高乃至中存在度の血漿タンパク質が、スプライシング因子Ｕ２ＡＦ３５kDaのサブユニット及びジンクフィンガータンパク質といったような予想外の（核）タンパク質の次に存在している。ヒト血漿プロテオームのこの制限された分析は明らかに、この技術の高いダイナミックレンジを実証している：すなわち、高い存在度のタンパク質が、ひじょうに稀なタンパク質の次に同定される。さらに、血漿アルブミン及び抗体といったような主要成分を予め除去することなく、副次的タンパク質を同定できるということを示すことが重要である。さらに、これらのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ研究のために用いられた血漿の対応する体積は、１マイクロリットルの範囲内にあり、これは、この技術の究極の感応性を例示している。
【０２５８】
例２０：  ヒト血小板の部分的プロテオーム分析
約５００×１０9個の血小板を含有する。１回のヒト採血当量の軟膜細胞材料を、２つの等しいフラクションに分け、１０００×ｇで１０分間の遠心分離に付した。ＢＳＡを削除したTyrodeＩ 緩衝液１０mlで３回、ペレット化した血小板を洗浄し、毎回その後に１，０００×ｇで１０分間の遠心分離工程を行ない、最終的に、合計１０mlのＢＳＡを含まないTyrodeＩ 緩衝液（Ardlie et al., 1970）中に懸濁させた。プロテアーゼ阻害物質のカクテル（CompleteTM，Roche Diagnostics GmbH, Manheim, ドイツ）を含有するｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液２５mM中の０．５％のTriton Ｘ−１００ １０mlを添加することによって、血小板懸濁液を溶解させた。溶解した血小板懸濁液を１０分間１０，０００×ｇで遠心分離に付して細胞骨格フラクションを除去し（Fox et al., 1993）、その後２．５mlのタンパク質混合物（すなわち６２．５×１０9の血小板の当量）を、Sephadex（登録商標）Ｇ−２５Ｍカラム（ＰＤ−１０カラム、Pharmacia Bioteck AB, Uppsala, スウェーデン）上でｐＨ９．０の１０mMのリン酸ナトリウム緩衝液３．５mlの中で脱塩した。脱塩したタンパク質混合物を遠心分離真空濃縮装置内で１mlまで濃縮し、水浴中で５分間沸とうさせ、１５分間氷上に置いた。３７℃で２０μgのトリプシン（Promega, Madison, WI, USAからの配列決定グレードの修飾されたトリプシン）を用いてタンパク質を一晩消化させることによって、タンパク質ペプチド混合物を生成した。
【０２５９】
Agilent Chem Stationソフトウェアモジュールの制御下でAgilent１１００ Series毛管ＬＣシステムに結合された狭い中ぐりの逆相ＺＯＲ ＢＡＸ（登録商標）３０００ＳＢ−Ｃ１８カラム（内径２．１×１５０mm，Agilent Technologies Waldbronn, ドイツ）上に、約３×１０9の血小板から抽出されたタンパク質材料に相当するタンパク質消化物のフラクション５０μlを、注入した。サンプルの注入後、８０μl／分という定常流で、溶媒勾配を展開した。まず第１に、カラムを水中０．１％のＴＦＡ（Baker ＨＰＬＣ分析済み、Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, オランダ）（溶媒Ａ）で１０分間洗い流し、その後１００分にわたり（したがって１％の溶媒Ｂ／分の増加）にわたり０．１％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）中の７０％アセトニトリル（Baker ＨＰＬＣ分析済み）までの線形勾配を続けた（一次ラン）。４０分（溶媒Ｂの３０％の濃度に対する）から始めて、Agilent １１００Series フラクションコレクターを用いてマイクロタイタープレート内で、各々１分（又は８０μl）の合計４８個のフラクションの形でペプチドを回収した。１２分までに分離されたフラクション（表XIV参照）をプールし、遠心分離真空濃縮器の中で完全に乾くまで乾燥させた。
【０２６０】
７０μlの水中１％ＴＦＡの中に乾燥したフラクションを再度溶解させ、Agilent １１００Series Wellプレートサンプラーの中に設置した。出来たばかりの３％のＨ2Ｏ2水溶液１４μlをペプチド混合物の入ったバイアルに移すことで、この区画の中で自動的にメチオニン酸化反応が進行した。この反応は３０℃で恒常な温度で３０分間進行し、その後、サンプルを直ちにＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で注入した。一定の与えられた実験条件の下で、メチオニン−スルホキシド含有ペプチドは一般に、相当する一次フラクションの等量の時間に先立ち、７分〜１分の時間枠（表XIV参照）内で溶出し、８つのサブフラクションの形で回収された。Ｍet−ＳＯ−ペプチドの回収の後、全ての同一番号のサブフラクションをプールし、（例えばラン２Ａ（表XIV）についてはフラクション１２．１、２４．１、３６．１及び４８．１がプールされた）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に完全に乾くまで乾燥させた。
【０２６１】
１回の二次ランのプールされ乾燥されたサブフラクション中に存在するペプチドを、アセトニトリル／水（体積比で２／９８）の混合物中の０．１％のギ酸２０μl（溶媒Ａ）の中で溶解させ、そのうち１０μlを、ＣapＬＣシステム（Micromass UK Limited, Cheshire, UK）を用いて、２０μl／分の溶媒Ａの流量（合計投入時間５分）で、Ｉ.Ｄ.Ｏ.３mm×５mmのトラッピングカラム（Pep Map, LC Packings, Amsterdam, オランダ）上に自動的に注入した。ストリームバルブを切換えることにより、タッピングカラムを、注入サイクルと同時に開始される２成分溶媒勾配でバックフラッシュし、それによってナノ規模の逆相Ｃ１８カラム（Ｉ.Ｄ. ０.７５×１５０mmのPepmapTMカラム、ＬＣ Packings）上にサンプルをかける。５μl／分の恒常流で溶媒送達システムをランさせ、１／２５のフロースプリッタを用いて、ナノ−カラムの中に２００ｎｌ／分の溶媒を導いた。２５分で適用した０％〜１００％の溶媒Ｂ勾配を用いて固定相からペプチドを溶出した。ナノカラムの出口は、Ｑ−ＴＯＦ質量分析（Micromass UK Lmited, Cheshire, UK）の入口の前に設置された金属コーティングされた溶融シリカの遠位PicoTipTM針（PicoTipTMＦＳ３６０−２０−１０−Ｄ−Ｃ７，New Objective, Inc., Woburn, MA, USA）に連結した。ストリームバルブを切換えてから１５分後に、Ｑ−ＴＯＦ質量分析での自動的データ依存回収を開始した。回収パラメータは、２重及び３重に荷電したイオンのみがフラグメント化のために選択されるような形で選択された。注入サイクルの開始から５１分後にストリームバルブを切換え戻した。
【０２６２】
各ＬＣ−ＭＳ／ＭＳラン内で得たＣＩＤスペクトルを、MicromassのMasslynxソフトウェア（バージョン３，４）から入手したProteinlynxを用いてMascot受容可能フォーマット（pkl−フォーマット）に自動的に変換させた。Mascotアルゴリズムを用いたＳＷＩＳＳＰＲＯＴ（リリース４０，１０）ヒト配列のみを含む局所的に記憶されたデータベース内でのタンパク質同定のためにＣＩＤ−ピークリストを使用した。以下の探索パラメータを使用した：酵素；トリプシン、分割欠落最大数：２、固定的修飾：無し、可変的修飾：酸化（Ｍ），pyro-Glu（Ｎ末端Ｅ及びＱ），ペプチド許容誤差：０．３Da，ＭＳ／ＭＳ許容誤差：０．２５Da及びペプチド電荷；２＋又は３＋。同定されたペプチドの最終リストを得るため、Mascotからの結果セットのバッチ処理を行なった。Mascotにより第１位にランク付けされたペプチドのみを保ち、同一性又は相同性閾値より評点の低いペプチドは廃棄した。
【０２６３】
表XVには、２回の二次ランで８個の一次フラクションからソートされたメチオニン−スルホキシド含有ペプチドを分析することにより得られた結果が提示されている。フラグを立てたペプチドを配列決定するために合計１６のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析が実施された。ＭＡＳＣＯＴデータベース検索アルゴリズムを用いて、少なくとも１つのＭet−ＳＯ−残基を含む２０１個のペプチドを同定した。いくつかのフラグを立てたペプチド特に、アクチン及びミオシンといったようなきわめて存在度の高い血小板ＲＰが連続するサブフラクションの中に存在し、これは、データ「クリーニング」の時点で９８個の特有のＭetＳＯ−ペプチドを保留することができたという事実を説明している。これらのＭetＳＯ−ペプチドは７４個の異なるタンパク質に対応していた（表XV参照）。ミオシン、アルファ−アクチン、タリン、ダインキュリン及びアクチンといったような既知の存在度の高い血小板タンパク質のいくつかを多数のペプチドによって同定したが、大部分のタンパク質は、１つのペプチド配列のみを用いて同定することができた。これらのタンパク質のいくつかは、そのサイズが大きいことから（例えばタリン（分子量２７０kDa）及びミオシンの重鎖（分子量２２６kDa）、２−Ｄゲル上ではほとんど検出されない、という点を強調しておくことが重要である。
【０２６４】
プロテオーム分析のための我々のソーティング技術のダイナミックレンジは、この制限されたデータセットの中ですでに明白である。例えば、ras関連のタンパク質といったような２−Ｄゲル上で検出するのが困難な存在度の低いタンパク質が、恐らくはこれらの細胞内で少なくとも１０００倍存在度が高いアクチン、チューブリン、トロポミオシン、タリン及びミオシンといったようなきわめて存在度の高いタンパク質の次に同定される。重要なことに、これらのタンパク質の５つの異なるイソ型（ＲＡＣ１−ＨＵＭＡＮ、ＲＡＬＡ−ＨＵＭＡＮ、ＲＡＰＢ−ＨＵＭＡＮ、ＲＢ５Ａ−ＨＵＭＡＮ及びＲＢ５Ｂ−ＨＵＭＡＮ）が同定され（表XV）、そのうちの１つＲＢ５Ａ−ＨＵＭＡＮは２つの異なるフラグを立てたペプチドでさえ同定された。
【０２６５】
２−Ｄゲル上で検出するのが困難であるタンパク質のクラスの１つは、疎水性タンパク質である。我々の制限された血小板プロテオームの中に、我々は、その疎水性のため通常は２−Ｄゲル上でほとんど検出されないＬＩＭ及びＳＨ３ドメインタンパク質１（ＧＲＡＶＹ値−１．０２）、カルメニン前駆体（ＧＲＡＶＹ値−１．０１）及びモエシン（ＧＲＡＶＹ値−０．９８）といったような疎水性の非常に高いタンパク質を同定した。
【０２６６】
例２１：  ヒト血小板のプロテオームのアセチル化されたアミノ末端アルギニンエンディングペプチド
出発物質として、例２０で調製された通りの細胞質ゾル及び膜骨格調製物を使用した。遠心分離真空濃縮機の中で、１．５mlの脱塩タンパク質混合物（約９mg又は３００nmolの合計タンパク質材料推定量）を約１mlまで乾燥させた。このタンパク質混合物に対し、４Ｍの最終濃度となるまで固体塩酸グアニジニウムを添加した。この混合物にｎ−プロパノール中の０．５％のトリブチルホスフィン４０μlを付加し周囲温度で３０分間インキュベートすることによって、タンパク質を還元した。調製されたばかりの４０nmol／μlのヨードアセタミド溶液１８８μlを還元したタンパク質混合物に添加し、暗所で３７℃で９０分間タンパク質をアルキル化した。タンパク質溶液を合計体積１．５mlまで水で希釈し、その後この混合物５００μlをＮＡＰTM−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech）上で脱塩し、２５０mMの塩酸グアニジニウムを含むｐＨ７．９の２５０mMのトリス・ＨＣｌ１mlを回収した。この脱塩タンパク質混合物を、真空乾燥によりその体積の半分まで濃縮させ、水浴で５分間沸とうさせ、１０分間氷上に置き、その後、１０μgのトリプシン（Promegaからの配列決定グレードの修飾されたトリプシン）を添加した。３７℃の恒常な温度で一晩タンパク質分解消化を進行させ、ＴＦＡによる酸性化により停止させた。
【０２６７】
あらゆる不溶性材料を除去するための遠心分離の後、得られたペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣカラム（４．６Ｉ.Ｄ.×２５０mmのＲＰ−ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム、Vydac Separations Group）上で分離した。カラム上にサンプルを注入した後、アセトニトリルの漸増濃度勾配を用いてペプチド混合物をフラクション化した。まず最初に、Waters Gradient ControllerとWaters Model５１０溶媒ポンプを用いて１ml／分の恒常流で５分間、０．１％の水中ＴＦＡ（Baker ＨＰＬＣ分析済み）（溶媒Ａ）でカラムを洗い流した。その後、７０分にわたり０．１％の水中ＴＦＡ（１００％溶媒Ｂ）中の７０％のアセトニトリル（Baker ＨＰＬＣ分析済み）までの線形勾配（したがって分あたり１％のアセトニトリル増加）を用いて、ＲＰカラムからペプチドを溶出した。最終工程で、カラムを徹底的に溶媒Ｂで洗い流し、次のサンプル注入に先立ち溶媒Ａで再度平衡化した。（０％の溶媒Ｂに対応する）２分と（８７．１％の溶媒Ｂと６１％のアセトニトリルに対応する）６６分の間で溶出するペプチドを、各４mlの１６個の一次フラクションの形で回収した。
【０２６８】
遠心分離真空濃縮機の中で完全に乾くまで全ての一次フラクションを乾燥させ、ｐＨ９．０の５０mMのホウ酸ナトリウム１mlの中で再度溶解させた。各々の一次フラクションについて、ペプチド混合物の半分を使用して、０．１Ｍの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸水溶液（ＴＮＢＳ）（Sigma）３μlを添加することでペプチドをその遊離アミノ基においてブロックし、一方残りの半分を対照として使用した。反応は３７℃で６０分間進行させ、その後０．１ＭのＴＮＢＳをさらに３μl添加し、再び３７℃で６０分間インキュベートした。５００μlの酢酸エチル（水で平衡化されたもの）で大部分のＴＮＢ−ペプチドならびにＴＮＢＳの反応副産物（例えばピクリン酸塩）を抽出した。この抽出手順を２回くり返した。Ｎ末端ブロックされた（アセチル化された）リシンを含まないアルギニンエンディングペプチドを含む水相を、真空下で乾燥させた。上述の通り、ＴＮＢＳ−修飾反応は、遊離アミノ基を伴う残りの少量のペプチドが反応できるようにするべく、２度目にくり返される。乾燥した生成物を溶媒Ａ中で溶解させ、各５００μlの合計１５のサブフラクションの形で７．５分（もとの一次フラクションの回収の開始より２分前に始まる）の合計ウインドウ内でペプチドが回収された二次ランに付す。各々のサブフラクションを乾燥させ、水中アセトニトリル混合物（体積比で２／９８）中の０．１％のギ酸２０μl中で再度溶解させ（そのうち１０μlはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために用いられた）、例１９及び２０で記述された通りにタンパク質の同定のために使用した。
【０２６９】
ＭＡＳＣＯＴベースのデータベース検索に関しては、以下の探索パラメータを使用した：酵素：トリプシン、分割欠落最大数：２固定的修飾：無し、可変的修飾：アセチル化（Ｎ末端）、酸化（Ｍ），pyro-Glu（Ｎ末端Ｅ及びＱ），ペプチド許容誤差：０．３Da、ＭＳ／ＭＳ許容誤差：０．２５Da及びペプチド電荷：２＋又は３＋。同定されたペプチドの最終リストを得るため、Mascotからの結果セットのバッチ処理を行なった。ＭＡＳＣＯＴにより第１位にランク付けされその同一性及び／又は相同性閾値を満たしたペプチドのみが留保され、その対応する前駆体ペプチドと共に表XVIで組合されている。予想された通り、アルギニン残基で終わる天然にブロックされた（アセチル化された）Ｎ−末端ペプチドの次に、ピログルタミン酸で出発しかつ、プロリン残基で始まるペプチドもソートされる。前者は、環状ブロッキング残基の形成に起因し、一方Ｎ末端プロリンは、ＴＮＢＳと反応しない第２級アミンを形成する。
【０２７０】
同定されたペプチドに加えて、我々は、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索アルゴリズムを用いたＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおいて明白な同定を導かなかったＭＳ／ＭＳ−スペクトルからの１８３の新たに誘導されたペプチド配列タグのリストを提示している（表XVII）。誘導されたタグの大部分はＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡといったような相同性ベースの探索用ツールである。それらは、対応する配列が入手可能な配列データベース内に列挙されていないデータであるようなタンパク質のアセチル化されたＮ末端ペプチドを表わしている確率が最も高いと思われる。
【０２７１】
例２２：  ヒト血小板抽出物中に存在するタンパク質のＮＨ2末端ペプチドの単離に基づく制限されたプロテオーム分析
先行例とは対照的に、我々は、ここでは、ブロックされたアミノ末端をもつもの及びフリーアミノ末端をもつものを含めた、サンプル中に存在するタンパク質のＮＨ2末端同定ペプチドを単離し、タンパク質同定のために使用できるような形で、改変化学（alternation chemistry）を修正した。
【０２７２】
出発材料として、我々は、例２０及び２１で調製された通りのヒト血小板の細胞質ゾル及び膜骨格調製物を使用した。遠心真空濃縮器の中で５００μlの脱塩タンパク質混合物（推定量約３mg）を約４００μlまで濃縮した。このタンパク質混合物に対し、４Ｍの最終濃度になるまで、塩酸グアニジニウムを添加した。周囲温度で３０分間トリブチルホスフィン（ｎ−プロパノール中の新鮮な０．５％溶液１４μl）を加えることでタンパク質を還元した。調製したばかりのＨ2Ｏ中の４０nmol／μlのヨードアセタミド溶液６２．５μlを還元したタンパク質混合物に添加し、暗所にて３７℃で９０分間タンパク質をアルキル化した。その後、この混合物をＮＡＰTM−５カラム（Amersham Pharmacia Biotech）上で脱塩し、１Ｍの塩酸グアニジンを含有するｐＨ８．０で緩衝された２５０mMのリン酸ナトリウム１ml中で回収した。この体積を、遠心真空濃縮器の中で半分まで濃縮した。固体スルフォール−ヒドロキシスクシンイミドアセテートを５０倍のモル過剰分だけ添加しこの混合物を室温で９０分間インキュベートすることにより、α−及びε−アミンの両方をアセチル化した。１μlのヒドロキシルアミンをタンパク質反応混合物に添加することによって、ヒドロキシル及びＣＯＯＨ基の可能なアセチル化を逆転させた。タンパク質分解に先立ち、ＮＡＰTM−５カラム上にタンパク質混合物を脱塩させ、２５０mMの塩酸グアニジンを含有する合計１mlのｐＨ７．９の５０mMのトリス・ＨＣｌの形で回収した。この脱塩したタンパク質混合物を真空乾燥によりその体積の２分の１まで濃縮し、水浴中で５分間沸とうさせ、１０分間氷上に置き、その後１０μgのトリプシン（Promegaからの配列決定グレードの修飾されたトリプシン）を添加した。３７℃の恒常な温度で一晩タンパク質分解消化を続け、ＴＦＡによる酸性化により停止した。
【０２７３】
アセチル化されたアミノ末端ペプチドについてのソーティングプロセスを、例２１に記述されているものと同一の条件下で同じＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で実施した。表XVIII内に示されているのは、２つの一次フラクション（９及び１０）からソートされたアミノ末端ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の後に得られた結果である。これは、合計フラクション数の１／８を占める。ここでもまた、フラグメント化されたペプチドを同定するためにＭＡＳＣＯＴアルゴリズムを用い、パラメータはここで、リシン残基のアセチル化が付加的な可変的修飾であったことを除き、例２１に記述されているものと同じようにセットされた。
【０２７４】
この部分的プロテオーム分析（分析可能な全材料の１２．５％のみが使用された）は、同定可能な２６個の異なるタンパク質を生み出した（表XVIII参照）。興味深いことに、アクチンといったような主要タンパク質が、キナーゼ又はホスファターゼといったような低存在度のもの及び必須膜タンパク質であることが予測されているＤＡＤ−１ タンパク質といったような疎水性タンパク質の次に同定される。さらに、例２１の場合と同様、我々は、ＭＡＳＣＯＴアルゴリズムを用いていかなる同定をも導かなかったものの解釈可能なフラグメント化スペクトルを与えた一定数のペプチドイオンを分析した。これらのスペクトルは、新たに解釈されたが、得られた４８のペプチド配列タグ（表XIX中に示されている）は、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴといったような配列相同性ベースのデータベース検索ツールを用いた明白な同定を全く導かなかった。我々はこれらの配列が、データベース内でまだ利用可能でない配列をもつ新規のタンパク質を表わしていると仮定している。
【０２７５】
例２３：  複合混合物内のタンパク質のＣＯＯＨ−末端ペプチドの特異的単離
手順は、ヨードアセトアミド又は当該分野で既知の類似のＳＨ−特異的試薬でのタンパク質システインの変換から始まる。次にタンパク質混合物をトリプシンで消化して、タンパク質ペプチド混合物を生成させる。その後、タンパク質のＣＯＯＨ末端部分から誘導されたペプチドのＣＯＯＨ末端及びペプチドの終わりにあるＡrg及びＬysのＣＯＯＨ基を含めた全てのＣＯＯＨ基とエステルを、またチロシンとエーテルを形成するジアゾ誘導体で、この全ペプチド混合物を処理する。
【０２７６】
これらの予め処理されたペプチドを次に通常の又は逆相のクロマトグラフィーにより分離し、溶出するペプチドを、回収されたフラクションの各々の中で二次ラン中の非改変ペプチドからの改変されたペプチドの分離を可能にするような数のフラクションの形で回収する。各々のフラクション内でトリプシンが添加されＡrg及びＬys残基においてエステルを逆加水分解する一方、一般にＡrg又はＬys残基で構成されているタンパク質のＣＯＯＨ末端にあるエステルを含めたその他のＣＯＯＨエステルは、トリプシンによって逆加水分解されない。それによって、ＣＯＯＨ末端ペプチドを除く全てのトリプシンペプチドは改変され、二次ラン中にシフトする。それによってＣＯＯＨ末端ペプチドは、それらが一次ラン中に溶出したのと同じ時間的間隔内で非改変ペプチドとして二次ラン内で回収される。
【０２７７】
ジアゾ誘導体候補は、非常に反応性があり毒性のジアゾメタン又はフェニルジアゾメタン又はより理想的には不揮発性でより安定した、水溶性のジアゾ誘導体でありうる。これらの化合物は全て、ＣＯＯＨ基とその対応するエステルまで、また、フェノール基と対応するエーテルまで反応する。
【０２７８】
Ａrg又はＬys ＣＯＯＨ基のエステルは、トリプシンの基質であり、対応するペプチド結合と類似の形で加水分解される。
【０２７９】
ＣＯＯＨ−末端Ｌysのベンゾイルエステルの加水分解反応は、スキーマ（xi）に描かれている。
【０２８０】
【化７】
2005500990.tif 000009
【０２８１】
略号
２Ｄ：  ２次元
ＣＡＤ：  衝突活性化解離
ＤＴＴ：  ジチオトレイトール
ＥＳＴ：  電気スプレーイオン化
ＥＳＴ：  発現された配列タグ
ＦＴＭＳ：  フーリエ変換質量分析法
ＩＣＡＴ：  同位体コードされた親和性タグ
ＩＤ−ペプチド：  同定ペプチド
ＩＰＧ：  固定化されたｐＨ勾配
ＩＴＣ：  イソチオシアネート
ＬＣ：  液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：  液体クロマトグラフィー及びタンデムＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳ：  ＭＡＬＤＩ−リフレクトロンＴＯＦ−ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：  マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型−質量分析法
Ｍet−ＳＯ：  メチオニン−スルホキシド
ＭＳ／ＭＳ：  タンデムＭＳ
ＭＳ：  質量分析法
ＭＷ：  分子量
ＰＩ：  等電点
ＰＩＴＣ：  フェニルイソチオシアネート
ＰＭＦ：  ペプチド質量ファンガープリント
ＰＳＤ：  ポストソース分解
ＰＴＣ：  フェニルチオカルバミル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：  逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＤＳ：  ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸
【０２８２】
表
表Ｉ  微量アミノ酸が欠如した予測されたタンパク質の百分率。全ての種のタンパク質配列は、SwissProt, バージョン３９から抽出された。Ｍet（−開始）は、開始メチオニンが除去された後に得られた数を意味する。
【０２８３】
【表１】
2005500990.tif 000010
【０２８４】
表II：  ペプチドソーターの原理は、フラグを立てたペプチドについて例示的に案出されている。フラクションは、ラン１において、Ｘ／２に等しい溶出ウインドウＷ１で単離される。タンパク質ペプチド混合物に由来する全てのペプチドの合計ラン１溶出ウインドウが２０Ｘに等しい場合には、Ｘ／２のウインドウをもつ４０のフラクション（第１のフラクション：０〜Ｘ／２；第２のフラクション：Ｘ／２〜Ｘ；第３のフラクション：Ｘ〜３Ｘ／２…）が回収される。フラグを立てたペプチド内の特異的アミノ酸の改変が疎水性分離カラム上で順方向シフトを誘発し、このシフトの値がＸ〜２Ｘの間で変動する場合、これは、δminについての値＝Ｘ／２、δmax＝５Ｘ／２、Ｗ１＝Ｘ／２及びＷ３＝７Ｘ／２）を暗に意味する。並列ソーターの一般的原理は、１２のペプチド フラクションプールを生成する例により説明することができる。それによって一次クロマトグラフィーランの後、以下のフラクションをプールすることができる：  フラクション１（０〜Ｘ／２）とフラクション１３（６Ｘ〜１３Ｘ／２）、２５（１２Ｘ〜２５Ｘ／２）及び３７（１８Ｘ〜３７Ｘ／２）。同様にして、フラクション２は、フラクション１４、２６及び２８と共にプールされ；フラクション３はフラクション１５、２７及び３９とプールされ；フラクション４はフラクション１６、２８及び４０とプールされ；フラクション５はフラクション１７及び２９とプールされ；フラクション６はフラクション１８及び３０とプールされ；フラクション７はフラクション１９及び３１とプールされ、フラクション８はフラクション２０及び３２とプールされ；フラクション９はフラクション２１及び３３とプールされ；フラクション１０は、フラクション２２及び３４とプールされ；フラクション１１はフラクション２３及び３５とプールされ；フラクション１２はフラクション２４及び３６と共にプールされる。１２のプールはこのとき、少なくとも１つの選択されたアミノ酸上で、化学的及び／又は酵素的に改変される。表IIは、１２のフラグを立てたペプチドプールの理論上のシフトの計算を含んでいる。
【０２８５】
【表２】
2005500990.tif 000011
【０２８６】
表III：  スルホキシド態様への酸化に起因するペプチドＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＫ−ＣＯＯＨの親水性シフト。１分あたり１％の線形勾配を用いて、異なる有機溶媒で溶出を実施した。緩衝液組成物は、トリフルオロ酢酸、ｐＨ５．７の酢酸アンモニウム又はギ酸のいずれかであった。カラムは毎回、Ｃ１８の逆相カラム（内径４．６×２５００mm）であった。酸化されたペプチド態様の保持時間は、分単位で表わされており（ＲｔＭＥＴ−ＯＸ(min)）、シフトは、非酸化ペプチドとスルホキシドペプチドの間の分単位で表現されている。（Ｒｔ(min)）。絶対溶出時間（ＲｔＭＥＴ−ＯＸ(min)）は、システム内で用いられたイオンの性質に大きく左右され、シフトの範囲（Ｒｔ(min)）は、有機修飾物質の性質により主として決定される。最強のシフトは、メタノールが有機修飾物質として用いられた場合に観察された。修飾物としてのエタノール又はアセトニトリルについては観察されなかった重大なピーク拡幅効果が存在したため、実際にはこれは使用されなかった。
【０２８７】
【表３】
2005500990.tif 000012
【０２８８】
表IVＡ：  一次ランから誘導されたフラクションを組合せ、二次ランの間にフラクションを回収する様式。ラン番号（２Ａ−２Ｌ）は、二次ランに与えられた番号を意味する。便宜上、第１の回収されたフラクションをｎ°１０と呼ぶ（本文参照）。このフラクションは、一次ラン中にアセトニトリル勾配の開始後１８分〜１９分の間に溶出する。連続するフラクションは最高４９まで番号付けされ、１分のフラクションを表わしている。
【０２８９】
【表４】
2005500990.tif 000013
【０２９０】
表IVＢ：  三次ランにおける分離のための二次ランから誘導されたフラクションの組合せ様式。３Ａ−３Ｄは三次ランに与えられた番号を意味する。色は、表IVＡで使用されたものを意味する。
【０２９１】
【表５】
2005500990.tif 000014
【０２９２】
表IVＣ：  三次ラン内での分離のための、二次ランから誘導されたフラクションの組合せ様式。ここでは、ギ酸が緩衝液系として用いられた場合の代替的なフラクション組合せ方法を示している（３′Ａ−３′Ｈ）。フラクション番号内で用いているカラーコードは、表IVＡ及びIVＢで使用されているものと同一である。
【０２９３】
【表６】
2005500990.tif 000015
【０２９４】
表Ｖ：  ３カラム式ペプチドソーター（図１２）を用いた、二次ラン内での分離のための一次ランから誘導されたフラクションの組合せ様式。２Ａ−２Ｄは、二次ランを意味し、溶出するフラクションは、ＥＳＩベースの質量分析にオンライン接続されているか又は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるさらなる分析のために回収可能である。
【０２９５】
【表７】
2005500990.tif 000016
【０２９６】
表VII：  ９カラム式ペプチドソーター（図１３）を用いた、二次ラン内での分離のための一次ランから誘導されたフラクションの組合せ様式。２Ａ−２Ｅは、二次ランを意味し、溶出するフラクションは、ＥＳＩベースの質量分析にオンライン接続されているか又は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるさらなる分析のために回収可能である。
【０２９７】
【表８】
2005500990.tif 000017
【０２９８】
【表９】
2005500990.tif 000018
【０２９９】
３カラム式ペプチドソーターの完全なラン中のバルブ動作
一次ランのフラクション１０、２２、３４及び４６をカラムＩ上に混合物としてかけ、フラクション１４、２６、３８及び５０をカラムII上に、フラクション１８、３０、及び４２をカラムIII上にかける。各々の投入には１分かかると予想されている。次に、３本のカラムを１０分間同時に、２％の溶媒Ｂで洗浄する。その後、２％の溶媒Ｂから５５％の溶媒Ｂまで、線形勾配が開始し、この溶媒Ｂは、０．１％のＴＦＡを添加した７０％の水中アセトニトリルである。勾配は、一次ランでこれを使用した場合と同一である。バルブ開（＋）；バルブ閉（−）。バルブはａ−ｉ（高圧バルブ）及びｊ−ｏ（低圧デッドボリュームバルブ）と番号付けされ、図１２に示されている。投入、洗浄…を含む全ラン…
【０３００】
【表１０】
2005500990.tif 000019
【０３０１】
９カラム式ペプチドソーターにおけるバルブ設定例
システムＡのバルブ設定の動作が記述されている。＋：バルブ開；  −：バルブ閉。一次ランのフラクション１２をカラム１に、フラクション２４をカラムIIに、フラクション３６をカラムIIIにかける。分あたり１％の溶媒Ｂだけ増加する線形勾配が形成される。この勾配は、５５％の溶媒Ｂまで増加する。改変されたペプチドは６分と９分の間（６−９）、１８−２１及び３０−３３の間で回収され、実線の棒で表わされている。バルブが示されている。ａ−ｇは高圧バルブであり、ｈ−ｏ及びｐ−ｒはデッドボリューム低圧バルブである。ラインは連結用チュービングを表わす。
【０３０２】
【表１１】
2005500990.tif 000020
2005500990.tif 000021
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【０３０３】
表Ｘ：  自動ＭＳ／ＭＳ分析と組合わされた三次ランにおける分離のための二次ランから誘導されたフラクションの組合せ様式。ラン３Ｌからの結果は、表１１及び１２及び本文中にさらに記されている。
【０３０４】
【表１２】
2005500990.tif 000026
【０３０５】
表XI：  E. coli タンパク質の同定を導く得られたＭＳ／ＭＳ−スペクトルの数を示す表
【０３０６】
【表１３】
2005500990.tif 000027
【０３０７】
表XII：  ＭetＳＯでソートされたペプチドについてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により同定されたタンパク質のリスト。タンパク質は、そのSwissProt入力名に従ってソートされる。
【０３０８】
【表１４】
2005500990.tif 000028
2005500990.tif 000029
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【０３０９】
表XIII：  未フラクション化の全ヒト血漿に対するトリプシン消化により、複合タンパク質ペプチド混合物を生成した。１マイクロリットルの血漿の当量を用いて、酸化によりＭetペプチドをソートした。一次ランの…個のフラクションのうち２個のみをさらに分析した。これらのフラクション中の同定されたペプチド及び対応するタンパク質が列挙されている。（ＤＢ入力：http://wwwexpasy. Ch/sprotによって入手可）。
【０３１０】
【表１５】
2005500990.tif 000044
【０３１１】
【表１６】
2005500990.tif 000045
【０３１２】
一定の与えられたクロマトグラフィー条件下で、二次ラン（第２カラム）の間にメチオニン含有ペプチドのソーティングのためにどの一次フラクション（その描かれた回収時間は第３欄に記されている）をプールできるかを示す概要。ＭetＳＯ−ペプチドの回収のための溶出間隔は、最終欄に与えられている。ラン２Ａ及び２Ｆで得られたＭet−ＳＯペプチドは、さらにタンパク質の同定に使用されるものであった（表XV参照）。
【０３１３】
表XV：  合計８個の一次フラクションから２回の二次ランにおいてソートされたＭet−ＳＯペプチドを分析することにより同定されたＲＰ及びペプチドのリスト。この表で提示されている結果は、ソートされたＭet−ＳＯペプチドについての１６回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳランの後に得られた。タンパク質は、ヒト血小板のTriton可溶性フラクションから得られた。
【０３１４】
【表１７】
2005500990.tif 000046
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2005500990.tif 000048
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【０３１５】
表XVI：  ヒト血小板細胞質ゾル及び膜骨格抽出物のトリプシン消化からのそのアセチル化されリシンを含まないＮ末端アルギニンエンディングペプチドの選択の後に同定されたタンパク質。同定されたペプチドは、次の３つの部分に分けられる：（１）天然にＮ末端ブロックされたペプチド、（２）（同じくタンパク質のＮ末端をカバーする）プロリンで始まるペプチドそして（３）（タンパク質ペプチド混合物の調製の副産物である）ピログルタミン酸で始まる内部ペプチド。
【０３１６】
【表１８】
2005500990.tif 000050
2005500990.tif 000051
2005500990.tif 000052
【０３１７】
表XVII：  ＭＡＳＣＯＴといったようなＭＳ／ＭＳ−ベースのデータベース検索ツールを用いたタンパク質の明白な同定を導かなかったソートされたアセチル化されたアルギニン含有無リシンアミノ末端ペプチド（例２１）からのＭＳ／ＭＳスペクトルからの新たに誘導されたペプチド配列タグ。ペプチドがそこからソートされる一次フラクションが、ペプチドの質量及びＮ−＞Ｃから誘導された配列タグ（ｍ＝メチオニンスルホキシド、ｘ＝割当てられていないアミノ酸）が、示されている。
【０３１８】
【表１９】
2005500990.tif 000053
2005500990.tif 000054
【０３１９】
表XVIIIＡ：  そのＮ末端ペプチドの選択後に同定されたタンパク質。ヒト血小板細胞質ゾル及び膜骨格抽出物のトリプシン消化物の中で、２つの一次フラクションが分析された。Ａ．同定されたタンパク質；Ｂ．利用可能なデータベース内で同定できなかった、ＭＳ／ＭＳスペクトルから誘導された配列のリスト。
【０３２０】
【表２０】
2005500990.tif 000055
2005500990.tif 000056
【０３２１】
表XIX：  ＭＡＳＣＯＴといったような探索ツールを用いた明白な同定を導かなかったソートされたアミノ末端ペプチド（例２２）からのＭＳ／ＭＳスペクトルからの新たに誘導されたペプチド配列（ｋ＝アセチル化されたリシン、ｘ＝割当てされていないアミノ酸）。
【０３２２】
【表２１】
2005500990.tif 000057
2005500990.tif 000058
2005500990.tif 000059
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2005500990.tif 000061
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【図面の簡単な説明】
【０３２３】
【図１】直接的ペプチドソーティングプロセスを実証し、ソーティングプロセスを記述するために用いられる異なるパラメータを示す、図表である。（Ａ）一次ランで分離された合計タンパク質ペプチド混合物；ｔ３及びｔ４は、一定の与えられたフラクション（ｗ１）について考慮された時間的間隔を表わす。（Ｂ）フラグを立てたペプチドは、δminとδmaxの間の親水性シフトを表示する。これらは、ウインドウｗ２内で時間的間隔ｔ１及びｔ２の間で溶出する。（Ｃ）フラグを立てたペプチドはより疎水性の高いものであり、δ′とδ′maxの間で疎水性シフトを示し、ウインドウｗ２′の時間ｔ５とｔ６の間で溶出する。
【図２】一次ランからの４つのフラクション（図１Ａ）はプールされ、改変プロセスに付された。これらは、二次ランに付され、フラグを立てたペプチドはそれぞれｔ１とｔ２の間、ｔ′１とｔ′２の間、ｔ″１とｔ″２の間、そしてｔ″′１及びｔ″′２の間で溶出している。フラクションは、ソートされたペプチドが以前のフラクションからの未改変ペプチドとオーバラップしないような形で組合わされる。フラクションをプールすることにより、二次ランの数が削減される。
【図３Ａ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図３Ｂ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図３Ｃ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図３Ｄ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図３Ｅ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図３Ｆ】３０℃で３０分間１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2での処理の前（下部トレース）及び後（上部トレース）のＮＨ2−ＹＳＦＶＭＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ａ）、ＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｂ）及びＮＨ2−ＹＳＦＶＷＴＡＥＲ−ＣＯＯＨ（Ｃ）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離の２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。溶出する対照とＨ2Ｏ2処理されたペプチド（それぞれ下部トレース対上部トレース）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトルが、図Ｄ−Ｆに示されている。
【図４Ａ】（Ａ）逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ−カラム上で分離されたペプチドＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨの２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。ペプチドは、アクリルアミドにより改変され、それに続いてそのＳ−プロピオンアミド−システインスルホキシド誘導体（下部トレース）へと酸化させられ、この誘導体は、同じＨＰＬＣ条件下でランされた場合、未改変ペプチド（上部レース）に比べて約２分の親水性シフトを示している。ＴＦＡ−アセトリニトリル系内のスルホキシド誘導体に典型的な密に移動する鏡像異性体ダブレットの存在に留意されたい。（Ｂ）ペプチドＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨのＳ−プロピオンアミドシステインスルホキシド誘導体のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトル。システイン残基の改変された側鎖の急速な中性喪失から発生するフラグメントイオンは、青色で示され、これは、親ペプチド内の修飾されたペプチドの存在を同定するのに大いに役立つ。
【図４Ｂ】（Ａ）逆相Ｃ１８ＨＰＬＣ−カラム上で分離されたペプチドＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨの２１４nmのＵＶ吸光度プロフィール。ペプチドは、アクリルアミドにより改変され、それに続いてそのＳ−プロピオンアミド−システインスルホキシド誘導体（下部トレース）へと酸化させられ、この誘導体は、同じＨＰＬＣ条件下でランされた場合、未改変ペプチド（上部レース）に比べて約２分の親水性シフトを示している。ＴＦＡ−アセトリニトリル系内のスルホキシド誘導体に典型的な密に移動する鏡像異性体ダブレットの存在に留意されたい。（Ｂ）ペプチドＮＨ2−ＹＳＦＶＣＴＡＥＲ−ＣＯＯＨのＳ−プロピオンアミドシステインスルホキシド誘導体のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトル。システイン残基の改変された側鎖の急速な中性喪失から発生するフラグメントイオンは、青色で示され、これは、親ペプチド内の修飾されたペプチドの存在を同定するのに大いに役立つ。
【図５】メチオニン、システイン及びシステイン及びメチオニン含有ペプチドの合計のソーティングに使用される反応シーケンスの概覧。
【図６】ＮＨ2−末端ブロックされたペプチドのサブセットをソートする上での主要な工程の概略的説明。臨界アミノ酸残基が表わされている。Ｒ＝Ａｒｇ、Ｋ＝Ｌｙｓ、ｈＲ＝homoＡｒｇ、ＰＩＣ＝フェニルイソシアネート、ＰＣ＝フェニルアルバミル。全てのＰＴＣ−ペプチドがより疎水性のものとなる。Ｎ−アセチル化ペプチドは変わらず、まさにラン１で行なった通りにラン２で溶出することになる。ブロックされたペプチドはそれによって大半のＰＴＣ−ペプチドから分離することになる。
【図７】ヒト及びE. coliの両方に由来するキュレートSwissProtタンパク質入力に対するコンピュータ内でのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化により生成された「特有」ペプチド質量の数を示す円グラフ。両方のケースにおいて見られるように、９０％以上のペプチド質量（０．００１Daの精度で計算されたもの）が、データベース内の少なくとも１つのメチオニン残基を含有する特有ペプチド配列に対応し、それによって、それらの親タンパク質を同定するために使用可能である。
【図８】定量的示差ＮＨ2−末端ペプチドペースのプロテオームアプローチを導く反応の概略的要約。臨界アミノ酸側鎖が示されている。Ｒ＝Ａｒｇ、Ｋ＝Ｌｙｓ、ｈＲ＝homoＡｒｇ、ＰＩＣ＝フェニルイソシアネート、ＰＣ＝フェニルカルバミル、ＴＮＢＳ＝トリニトロベンゼンスルホネート。16Ｏ／18／Ｏは、それぞれＨ216Ｏ又はＨ218Ｏ内での消化によって得られたディファレンシャル標識づけを意味する。
【図９】単一カラムペプチドソーター：  ペプチドソーティングは、一次ランのフラクションについて改変が行なわれた後、二次ランの間に起こる。一次ランからのペプチドフラクションは、表IVＡで規定されているように組合わされ、サンプルインジェクターによって投入された。一次ランにおいても二次ラン中も全ての条件（ＲＰ−吸着剤、流量、勾配、溶媒など）が同一に保たれた。単一カラムバージョンでは、全てのペプチドが同じカラムを通過する。サンプル投入後、従来の市販の高圧ＨＰＬＣポンプシステム（ここでは溶媒ポンプと呼ばれる）を用いて勾配が作り出される。バルブは自動的に操舵され（ａ及びｂは高圧バルブであり、ｃ及びｄは低圧バルブである）、溶媒流を、分析用計器（フラクションコレクター、質量分析計又はＭＡＬＤ１−標的）又は廃棄物のいずれかの所望の方向に導く。
【図１０】５０．１０６ E. coli細胞の溶解物の合計トリプシン消化物のＲＰ−ＨＰＬＣ分離（内径２．１×２５０mmのＣ１８−カラム）の２１４nmＵＶ吸光度プロフィール。５％Ｂから出発して、８０μl／分の定流で１％Ｂ／分の漸増線形勾配を利用することによって、トリプシンペプチドが溶出される。２３％の溶媒Ｂと６３％の溶媒Ｂの間で溶出するペプチドを各８０μlの４０のフラクション内に回収する。最初に回収したフラクションは１０と番号づけされ、最後のものは４９と番号づけされている（例１８も参照のこと）。取上げられ図１１でさらに処理されたフラクションは、青色の開放矩形囲みで示されている。
【図１１】フラクション１０、２２、３４及び４６（一次ラン）内で存在するペプチドの穏やかな酸化（１％のＴＦＡ中の０．５％のＨ2Ｏ2を使用）の後に得られたメチオニン−スルホキシドペプチドの回収を示す２１４nmＵＶ吸光度プロフィール。Ｍet−ＳＯペプチドの回収は、大量の未修飾ペプチドの溶出より６分前に開始され、４分間持続する。クロマトグラフィー条件は、図１０に示された通り同一であった。未修飾ペプチドを含有するフラクションは、青色矢印で示され、ソートされたペプチドは、赤色で限定されている：４−７、１６−１９、２８−３１及び４０−４３（表IVＡ）。
【図１２Ａ】３重カラムへソーター：  このシステムは、並列に連結された３本の同一ＲＰカラムで作動する。ここでもまた、並列ランの間のみならず、一次ランと比較しても、全ての条件か同一に保たれている。一次ランから回収されたフラクションは、表Ｖに規定されているように、組合され、修飾され、各カラム上で分布させられた。溶媒流は、３本のカラム全体を通して一定に保たれる。これは、各々の個々のカラムを高圧ポンプシステムに連結し、それによって３本のこのようなポンプを使用することによって（バージョンＡ）か又は単一の高圧ポンプを用いるものの制御されたスプリッタシステムを用いて各カラムに向けての流量を制御することによって（バージョンＢ）達成できる。かかる流量調節器は現在市販されている（バルブａ−ｉは高圧バルブであり、バルブｊ−ｏは低圧バルブである）。これらのバルブはＰＣで操舵でき、投入、分離及び分析（フラクション回収、質量分析計又はＭＡＬＤＩ−標的）を含め完全自動運転を可能にする。
【図１２Ｂ】３重カラムへソーター：  このシステムは、並列に連結された３本の同一ＲＰカラムで作動する。ここでもまた、並列ランの間のみならず、一次ランと比較しても、全ての条件か同一に保たれている。一次ランから回収されたフラクションは、表Ｖに規定されているように、組合され、修飾され、各カラム上で分布させられた。溶媒流は、３本のカラム全体を通して一定に保たれる。これは、各々の個々のカラムを高圧ポンプシステムに連結し、それによって３本のこのようなポンプを使用することによって（バージョンＡ）か又は単一の高圧ポンプを用いるものの制御されたスプリッタシステムを用いて各カラムに向けての流量を制御することによって（バージョンＢ）達成できる。かかる流量調節器は現在市販されている（バルブａ−ｉは高圧バルブであり、バルブｊ−ｏは低圧バルブである）。これらのバルブはＰＣで操舵でき、投入、分離及び分析（フラクション回収、質量分析計又はＭＡＬＤＩ−標的）を含め完全自動運転を可能にする。
【図１３】９カラムペプチドソーター：  このシステムは、以下のような複数の面で以前の装置とは異なっている：  ｉ）一次ランの１フラクションが毎回１本のカラム上に投入される、ii）各カラムは、一次ランのカラムより小さく、使い捨て材料で構成されていてよい、及びiii）勾配が次のカラムに向けて方向づけされる前にすべてのカラムが完全に展開されているような形で直列／並列組合せモードで作動させられる。カラムはより小さいものであることから、作動時間を減少させることができる。カラムの入口を制御するバルブａ−ｇは高圧バルブである。バルブｈ−ｏ及びｐ−ｒは、異なるカラムの出口流を廃棄物又は分析システムのいずれかに制御し、低圧デッドボリュームバルブであり得る。カラムＩ、II及びIIIは、同じ溶媒勾配で現像され、勾配の最初の部分は、カラムＩに向けられ、第２の部分は、カラムIIのために用いられ、第３の部分は、カラムIIIに向けられる（詳細については、例１３を参照のこと）。フラグを立てたペプチド及び未改変ペプチドの分離は、ＰＣを用いて操作可能であるバルブ設定により舵取りされる。９カラムソーターが、先行セットに比べて遅延を伴ってランする、各々３本のカラムから成る３セットで作動し、ここで記述する例では、この遅延は３分にセットされた： すなわち、ＢはＡよりも３分遅れて始動し、ＣはＢの開始から３分後に始動した。カラムセットの各々に由来する溶出ペプチドは、バルブｐ−ｒにより、上述のように分析ツールに向かって導かれる。
【図１４Ａ】：  （Ａ）ペプチド基準混合物  ＮＨ2−Ａlan−Ａrg−ＣＯＯＨ（ｎ＝７〜４２）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離のＵＶ吸光度プロフィール（２１４nm）。付加的な１アラニン残基で異なっているこの混合物の成分が明確に認識できる。分離は、０．１％のＴＦＡ中の線形アセトニトリル勾配を用いて内径２．１mmのＲＰ−ＨＰＬＣＣ１８−カラム上で行なわれた。（Ｂ）７１amu'sで分離されたこの混合物中に存在する異なる成分を明らかにするＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図１４Ｂ】：  （Ａ）ペプチド基準混合物  ＮＨ2−Ａlan−Ａrg−ＣＯＯＨ（ｎ＝７〜４２）のＲＰ−ＨＰＬＣ分離のＵＶ吸光度プロフィール（２１４nm）。付加的な１アラニン残基で異なっているこの混合物の成分が明確に認識できる。分離は、０．１％のＴＦＡ中の線形アセトニトリル勾配を用いて内径２．１mmのＲＰ−ＨＰＬＣＣ１８−カラム上で行なわれた。（Ｂ）７１amu'sで分離されたこの混合物中に存在する異なる成分を明らかにするＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳスペクトル。
【図１５Ａ】回収されたＭet−ＳＯペプチドの２つのフラクション内に存在するペプチドのＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ質量スペクトル（図Ａ及びＢ）。同定されたＭet−ＳＯペプチドの質量が与えられ、リフレクトロンモードで観察されたメタンスルフェン酸の損失を伴うそれらの特徴的フラグメント化生成物が表わされ、より短かいフラグメントを与えている（青色矢印でしめされている）。
【図１５Ｂ】回収されたＭet−ＳＯペプチドの２つのフラクション内に存在するペプチドのＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ質量スペクトル（図Ａ及びＢ）。同定されたＭet−ＳＯペプチドの質量が与えられ、リフレクトロンモードで観察されたメタンスルフェン酸の損失を伴うそれらの特徴的フラグメント化生成物が表わされ、より短かいフラグメントを与えている（青色矢印でしめされている）。
【図１６Ａ】メチオニンペプチドについてソートする定量的示差プロテオームアプローチの図表。ＭＳＯは、メチオニンスルホキシドを意味する。
【図１６Ｂ】メチオニンペプチドについてソートする定量的示差プロテオームアプローチの図表。ＭＳＯは、メチオニンスルホキシドを意味する。
【図１７】ＢＳＡの16Ｏ−及び18Ｏ−で標識づけされたトリプシン消化物の１／１の混合物合計５pmolから得られた１９個のペプチド（Ｘ軸にペプチド質量）のＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳで測定された同位体比（Ｘ軸の値）。ＢＳＡ−mixの測定された割当量については、１．０３という平均値が得られた。
【図１８】メチオニンを含有していることが実証できなかったペプチド（赤で示す）との関係における５０・１６6個のE. coliの細胞からのタンパク質材料のトリプシン消化物の一次フラクション内でのＭＡＬＤＩ−ＲＥＴＯＦ−ＭＳを用いたＭet−ＳＯペプチドの数（青色で示す）を描いたグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005500990.tif 000275
【国際調査報告】
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