(57)【要約】グリコシル化タンパク質の分析。本発明は、異なる糖化パターンを有する、少なくとも２つのアイソフォームを持つタンパク質の分析方法であって、前記方法は、前記タンパク質を含むサンプルに、炭化水素結合剤と、少なくとも２つの前記アイソフォームに結合し得るリガンドとを接触させる工程、前記炭化水素結合剤と前記タンパク質の結合体、および／または、前記第１リガンドと前記タンパク質の結合体を検出する工程、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる糖化パターンを持つ少なくとも２つのアイソフォームを有するタンパク質の分析方法であって、
前記タンパク質を含むサンプルに、炭化水素結合剤と、少なくとも２つの前記アイソフォームに結合し得るリガンドとを接触させる工程、前記炭化水素結合剤と前記タンパク質との結合体、および／または、前記第１リガンドと前記タンパク質との結合体を検出する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記炭化水素結合剤がレクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、トランスフェリン、アルカリホスファターゼ、絨毛性ゴナドトロピンおよびα-フェトプロテインから選択される、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルを、前記炭化水素結合剤と接触させ、その後、前記リガンドと接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルを、前記リガンドと接触させ、その後、前記炭化水素結合剤と接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、基質に固定化されている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドと前記炭化水素結合剤を接触させた後、前記サンプルに、前記タンパク質に結合可能であるが、前記タンパク質と前記炭化水素結合剤との結合体には結合しない第２リガンドを接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素的に活性であり、前記リガンドと前記炭化水素結合剤を接触させた後、前記サンプルに、前記タンパク質の酵素作用に対する基質を接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
炭化水素結合剤およびタンパク結合リガンドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析方法のためのキット。
【請求項１０】
少なくとも２つのタンパク質結合リガンドを含み、そのうちの少なくとも１つは、基質に固定化されている、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
さらに、前記キットを使用するために、分析されるタンパク質の酵素活性に対する基質を含む、請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、糖化および非糖化アイソフォーム、または完全および部分的に糖化されたアイソフォームのような、糖化のパターンが異なる２以上のアイソフォームを有するタンパク質の分析、ならびに、このような分析用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質には、糖化パターンが異なる、２以上の異なるアイソフォームが存在する。このような違い、または、異なる糖化アイソフォームの相対的な特性は、疾患や障害、または基質の過剰摂取を示し、このため、異なる糖化アイソフォーム間の区別ができる分析システムが必要とされている。
【０００３】
しかしながら、内因性タンパク質の異なる糖化アイソフォームを区別するための抗体の使用は、内因性糖化タンパク質の特定のアイソフォームに特異的または優先的に結合する抗体を作れる成功率が相対的に低いため、相対的に問題がある。
【０００４】
内因性タンパク質の異なる糖化アイソフォームの相対濃度の決定が臨床的重要性である実験は、血液タンパク質トランスフェリンのケースである。トランスフェリンのアミノ酸骨格は、末端シアル酸基を有するbi- またはtri-antennaryオリゴ糖側鎖を持つ、２つのサイト(Asn 413 および Asn 611)を含む。健常者においては、血液トランスフェリン分子の大半は、４または５つのシアル酸基を持つが、アルコール中毒患者は、シアル酸基を持たないか、２または３つのシアル酸基を有するトランスフェリン分子の割合が相対的に増加する（非特許文献１）。トランスフェリンアイソフォームの異常な相対的存在度は、炭化水素欠乏糖化タンパク質症候群（carbohydrate-deficient glycoprotein syndromes：CDGS)または先天性糖化疾患（congenital disorders of glycosylation：CDG)の患者において生じる（非特許文献２）。
【０００５】
このような炭化水素欠乏トランスフェリン（carbohydrate-deficient transferrin：CDT)または炭化水素欠損トランスフェリン（carbohydrate-free transferrin：CFT)のための様々な分析が、提案されている。しかしながら、分析の適当な自動化は、一般的に、４または５つのシアル酸基を有するものから、３またはそれ以下のシアル酸基を有するトランスフェリン分子を分離するために、異なるアイソフォームを樹脂から放出させ又は樹脂から回収する異なるpH基準におけるイオン交換樹脂の使用に依存している。このような分析の例は、特許文献１(Pharmacia)、２(Axis)および３(Axis)に記載されている。
【０００６】
翻訳後糖化（post-translational glycosylation）を持つタンパク質には、異なる糖化アイソフォームが生じる。このように、トランスフェリンの他にも、臨床的に関連性のあるタンパク質は、ガンや他の疾患に対する糖化マーカー、例えば、アルカリホスファターゼ(AP)(非特許文献３)、α−フェトプロテイン(AFP)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)およびプリオンタンパク質(CD230)もまた、異なる糖化アイソフォームが存在する。
【非特許文献１】Arndt in Clinical Chemistry 47: 13-27 (2001)
【非特許文献２】Keir et al. in Ann. Clin. Biochem. 36: 20-36 (1999)
【非特許文献３】Magnusson et al. Clinical Chemistry 44: 1621-1628 (1998)
【特許文献１】米国特許出願公開4626355号（US-A-4626355）
【特許文献２】国際公開96/26444号（WO 96/26444）
【特許文献３】国際公開01/42795号（WO 01/42795）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
哺乳類アルカリホスファターゼは、酵素の偏在ファミリー（ubiquitous family）を含む。APは、糖タンパク質酵素であり、グリコシルホスファチジルイノシトール部分が膜アンカー（membrane anchor）として働く細胞質膜の外側のリーフレットに存在している。肝臓AP、骨APおよび腎臓APの分子量(天然)は、それぞれ152、166および168kDaと測定されている。通常の骨組織鉱化作用（bone mineralization）におけるそれらの役割に加えて、生理学上およびネオプラスティシズムコンディションにおけるL/B/K APの他の機能は、知られていない。アルカリホスファターゼは、ヒト血清に様々なアイソフォームで存在している。血清における異なるアイソフォームの同定は、様々な翻訳後修飾（post-translational modifications）により、複雑である。２つの主な循環APイソ酵素、すなわちbone APと肝臓APは、区別することが困難である。これは、それらが、単一の遺伝子産物であり、違いは、糖化のみだからである。全血清APは、度々、定型の臨床分析において、骨格状態（skeletal）および胆系状態（hepatobiliary status）の決定が望まれる。全AP活性に寄与する様々なアイソフォームが、有用な臨床的情報として提供されることが提案されている。確かに、血清の骨AP(BAP)活性の定量測定は、骨形成速度の指標として提供できる。
【０００８】
α−フェトプロテイン（AFP）は、哺乳類の胎児発育段階における主なタンパク質であり、胎児肝臓や卵黄嚢（yolk sac）により主に合成される。肝腫瘍および卵黄嚢ガンは、しばしばこのタンパク質を生産するため、診断におけるガンマーカーとして普通に使用されている。特に、AFPは、肝細胞性ガン（HCC）や、非精上皮しゅ性生殖細胞腫瘍（non-seminomatous germ cell tumours：NSGCT)の診断における、血清マーカーとして広く使用されている。AFPは、また、正常な妊娠、ガンと同様の良性肝臓疾患において向上する。AFPは、炭化水素構造が異なる、様々な疾患に関連するアイソフォームが存在する。存在する分析は、これらのアイソフォームを容易に区別することができない。
【０００９】
本発明に対して関係する他の糖タンパク質としては、α-1-酸糖化タンパク質（alpha-1-acid glycoprotein）、α-1-アンチトリプシン（alpha-1-antitrypsin）、ハプログロブリン（haptoglobin）、チログロブリン（thyroglobulin）、前立腺特異抗原（prostate specific antigen）、HEMPAS エリスロサイトバンド３（erythrocyte band 3）（これは先天性不全エリスロポエティック貧血２型（congenital dyserythropoietic anemia type II）に関連する)、PC-1 結晶細胞膜糖タンパク質（plasma-cell membrane glycoprotein）、CD41 糖タンパク質IIb、CD42b グリコカリシン（glycocalicin）、CD43 白血球シアログリコプロテイン（leukocyte sialoglycoprotein）、CD63 リソソーム-膜-結合グリコプロテイン３（lysosomal-membrane-associated glycoprotein 3）、CD66a 胆汁グリコプロテイン（biliary glycoprotein）、CD66f 妊娠特異的b1グリコプロテイン（pregnancy specific b1 glycoprotein）、CD164 マルチ糖化コアプロテイン24（multi-glycosylated core protein 24）およびCD235 glycophorin familyが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
我々は、分析における糖化タンパク質アイソフォームを区別するための抗体や他のリガンドの使用に関する問題に、炭化水素結合剤の分析を追加することによって、取り組むことを見出した。すなわち、前記炭化水素結合剤は、例えば、アイソフォームにおいて存在する炭化水素側鎖のような、タンパク質の異なる糖化アイソフォームに共通する抗体/リガンド結合部位を覆う役割を果たし、前記薬剤の結合は、炭化水素結合剤の非存在下において、糖化または非糖化のタンパク質に結合することができる抗体（他のタンパク質結合部分）について、続いて起こる結合を妨げる。
【００１１】
このように、発明のある面は、異なる糖化パターンの少なくとも２つ以上のアイソフォームを有するタンパク質の分析方法の提供であり、前記方法は、前記タンパク質を含む試料に、炭化水素結合剤および少なくとも２つの前記アイソフォームに結合可能なリガンドを接触させる工程と、直接的または間接的に、前記炭化水素結合剤と前記タンパク質との結合体および/または前記リガンドと前記タンパク質との結合体を検出する工程を含む。
【００１２】
本発明のさらなる面は、本発明による分析方法のためのキットの提供であって、前記キットは、炭化水素結合剤およびタンパク質結合リガンドを含む。
【００１３】
本発明のキットは、また、少なくとも２つ、好ましくは糖タンパク質のアイソフォームの全てに結合可能な第２リガンドに結合する基質を含む。この第２リガンドは、好ましくは糖化部位から離れた部位において、糖化タンパク質に結合するものであることが好ましい。特に好ましい形態において、この第２リガンドは、多孔質膜に固定化されている。
【００１４】
前記キットは、好ましくは、分析方法を行うための組成を含むことが好ましく、さらに、糖化タンパク質：第１リガンド結合体および/または糖化タンパク質/炭化水素結合剤結合体に結合し得る、任意に標識化された第２リガンドを含むことが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の分析方法において、タンパク質は、炭化水素結合剤およびリガンドに、同時または逐次に接触することができる。逐次接触は、炭化水素結合剤と初めに接触することが好ましい。逐次接触が使用される場合、所望であれば、第１結合剤の未結合過剰分をもちろん除去できるが、タンパク質は、第２結合剤が供給される前に、第１結合剤から分離されない（すなわち、脱結合）。
【００１６】
タンパク質により形成される結合体の検出は、上述のように、直接または間接的に行われる。このように、結合体の特性（例えば、発光吸収、エミッションまたは分散）または前記炭化水素結合剤またはリガンドの特性は、検出され、または、さらに、検出可能な特性もしくは結果を誘発するための能力を持つ結合剤が使用される。さらにこの結合剤は、タンパク質結合体と結合するものや、さらなる基質への結合において、タンパク質結合体と競争するものがあげられる。任意に標識化された結合剤の使用による、このような直接的および間接的な分析物の検出は、診断分析の分野において慣用技術である。
【００１７】
結合体検出の方法は、結合剤が、放射ラベル、発色団または蛍光団のようなレポーター部分で標識されているか、それらが酵素活性であるか（例えば、光の発生や検出種の発生等により、検出可能な凝集の反応を触媒し得る）、それらが光分散により検出できる凝集を形成するか等、結合剤の性質に応じて行われる。このような検出システムは、診断分析の分野において慣用技術である。
【００１８】
本発明の分析方法において使用される前記炭化水素結合剤は、糖化タンパク質の炭化水素側鎖に結合し得る、また、タンパク質骨格におけるエピトープを遮蔽する種であってもよい。このように前記炭化水素結合剤は、例えば、高い電荷の官能基を持つ低分子であり、または、より好ましくは、高分子である。本文における「高分子」とは、分子量500D以上の化合物を意味し、好ましくは、1000D以上、例えば、500〜100000Dであり、好ましくは1000〜20000Dである。
【００１９】
前記炭化水素結合剤は、水または水混和有機溶媒、またはこれらの混合液に可溶の化合物であることが好ましい。本発明の分析に使用される前記炭化水素結合剤は、ペプチド（例えば、タンパク質または他のポリペプチドもしくはオリゴペプチド）であることが特に好ましい。しかしながら、炭化水素基に結合可能な他の高分子も使用可能である。このような化合物は、ライブラリー設計（例えば、コンビナトリアル技術を用いて生産される、ファージライブラリーディスプレイまたはケミカルライブラリーのようなオリゴペプチドディスプレイライブラリー等）のような通常の科学技術により見出される。しかしながら、多数の炭化水素結合高分子は、文献で知られており、タンパク質グループの具体例としてレクチンが知られている。
【００２０】
レクチンは、炭化水素部分に高い特異性である１以上（たいてい２つ）の結合部位を持つ天然非イムノグロブリンのタンパク質または糖化タンパク質である。
【００２１】
レクチンは、ほとんどの生体生物の組織に見られ、血液型群活性（blood group activity）に基づく細胞の凝集能力タイプにより、植物抽出物において初めて発見された。レクチンという用語は、凝集活性を定義するために初めて使用されたけれども、前記用語は、一般的に、細胞の凝集能力にかかわらず、多くの資源由来の糖結合タンパク質をカバーするために使用されている。
【００２２】
今日まで最も研究されているレクチンは、多重結合（multimeric）であり、非共有的に結合したサブユニットを含んでいる。レクチンは、コンカナバリンA（またはCanavalia ensiformis 由来ConA）のような、２以上の同じサブユニットを含み、または、Phaseolus vulgaris agglutininのような異なるサブユニットを含む。この多重結合（multimeric）構造は、レクチンにセルの凝集や糖結合体の沈殿を形成する能力を与える。ほとんどレクチンは、いくつかのタイプの細胞を凝集できるが、細胞凝集は必須ではない。いくつかのレクチンは、スクシニル化ConAのように、細胞に結合できるが、凝集を生じず、いくつかのレクチンは、全てセルに結合しない。この細胞への結合能力の欠如は、レクチン構造の結果であり、または、細胞表面において適当なレセプターオリゴ糖が欠如しているためである。細胞の凝集は、レクチンを検出するために一般的に使用される分析であり、いまだ検出されない多くの非凝集レクチンが天然に存在している。
【００２３】
各レクチンは、特定の炭化水素構造に対して特異性を有しているので、同一の糖組成であるオリゴ糖でさえ、区別され、分離できる。いくつかのレクチンは、マンノースまたはグルコース残基を持つ構造にのみ結合するが、一方、他のレクチンは、ガラクトース残基のみを認識する。いくつかのレクチンは、オリゴ糖において、特定の糖が末端の非還元部位にあることが必要であるが、一方、他のレクチンは、オリゴ糖鎖内において糖と結合できる。いくつかのレクチンは、aとbアノマー（anomer）を区別しないが、他のレクチンは、結合のために、正しいアノマー性（anomeric）構造だけでなく、糖の特異的配列も必要とする。
【００２４】
このように、本発明の分析方法において使用されるレクチンは、分析されるタンパク質の炭化水素側鎖に結合し得るレクチンから選択されるべきである。タンパク質は、１種類以上の炭化水素側鎖を有しており、タンパク質の異なる炭化水素側鎖に結合し得る２以上の異なるレクチンが、使用できる。適切なレクチンは、公知の結合能力から、または、タンパク質の異なるアイソフォームに対する結合能力からスクリーニングによって選択できる。分析方法の所望の形式は、炭化水素結合剤：タンパク質結合体の全含量の決定を伴い、炭化水素結合剤（例えば、レクチン）は、放射線標識、発色団または蛍光団のようなレポーター部で標識化してもよい。
【００２５】
現在利用できるレクチンとしては、以下のものが含まれる。AAA - Allium oscalonicum agglutinin (エシャロット); AAA - Aloe arborescens agglutinin (キダチアロエKidachi aloe, narrow leaved sword aloe); AAA - Artocarpus altilis agglutinin; AAA, AAnA - Anguilla anguilla agglutinin (淡水ウナギfreshwater eel); AAurA - Aleuria aurantia agglutinin (オレンジピール菌orange peel fungus); AAusA - Androctonus australis agglutinin (サハラサソリ); ABA, AbiA, ABL - Agaricus bisporus agglutinin (マッシュルーム); ABrA - Amphicarpaea bracteata agglutinin (アメリカヤブマメ); ACA - Allium cepa agglutinin (タマネギ); ACA - Alocasia indica lectin; ACA - Amaranthus caudatus agglutinin (アマランサスamaranth, tassel flower, インカ小麦inca wheat); ACL - Amaranthus cruentus lectin (アカアマランサスred amaranth, ムラサキアマランサスpurple amaranth); ACmA - Arisaema curvatum lectin; AFA - Afimbrial adhesin (細菌); AGL - Aplysia gonad lectin; AIA - Artocarpus integrifolia agglutinin (Artocarpus heterophyllus, Indian jaca tree, バラミツjackfruit); ALA - Artocarpus lakoocha agglutinin (lakoocha, small jack, monkey fruit); AlloA - Allomyrina dichotoma agglutinin (マメコガネJapanese beetle); AMA -Allium moly agglutinin (dwarf flowering onions); AMA - Arum maculatum agglutinin (アラムlords and ladies); AQN - spermadhesin; APA - Aaptos papillata agglutinin; APA - Abrus precatorius agglutinin (トウアズキjequirity bean, coral bead plant, lucky bean, crab's eyes); APA/APL - Aegopodium podagraria agglutinin/lectin (ground elder, achweed); APA - Allium porrum agglutinin (ニラネギleek); APL - Aquathanatephorus pendulus lectin; ARA - Agropyrum repens agglutinin (シバムギcouch grass); AREL - Agropyrum repens embryo lectin (シバムギcouch grass); ARL - Athelia rolfsii lectin; ARLL - Agropyrum repens leaf lectin (シバムギcouch grass); ASA/ASL - Allium sativum agglutinin/lectin (ニンニクgarlic, garden rocambole); ASL - Amaranthus spinosus agglutinin (thorny pigweed, spiny amaranth); AUA - Allium ursinum agglutinin (ラムソンramson, bears garlic); AVA - Allium vineale agglutinin (crow garlic); AWN - spermadhesin; BanLec - Banana lectin (Musa paradisiac); BCL - Botrytis cinerea lectin; BDA - Bryonia dioica agglutinin (ブリオニアwhite bryony); BfL - Butea frondosa lectin (Butea monosperma, bastard teak, flame of the forrest); BGA-Biomphalaria glabrata agglutinin; Blec - bud lectin (エンドウPisum sativum); BLA - Birgus latro agglutinin (ヤシガニcoconut crab); BMA - Bowringia milbraedii agglutinin; BPA - Bauhinia purpurea agglutinin (camels foot tree, purple mountain ebony); BSA/BSL/BSI/BSII - Bandeiraea simplicifolia agglutinin/lectin/isolectin (Griffonia simplicifolia); BsyL - Brachypodium sylvaticum lectin (ヤマカモジグサfalse brome grass); CA - Cymbidium agglutinin; CAA - Caragana arborescens agglutinin (Siberian pea tree); CAA/CPA - Cicer arietinum agglutinin (ガルバンゾーchick pea, ceri bean); CAA/CAL - Colchicum autumnale agglutinin/lectin (meadow saffron); CBL - Cyphomandra betacea lectin (tamarillo fruit, トマトノキtree tomato); CBP-35 - Lactosamine-binding protein (マウス繊維芽細胞ｍmouse fibroblasts); CBP-67 - Carbohydrate-binding protein (rat liver nuclei); CBP-70 - Carbohydrate-binding protein (HL60 cell nuclei); CCL - Ceratobasidium cornigerum lectin; CD-MPR - Cation dependent mannose-phosphate receptor; CEA - Colocasia esculenta lectin (タロイモtaro); CGA - Canavalia gladiata lectin (ニホンタチナタマメJapanese Jack bean); CGA - Canna generalis lectin; CHA - Cepaeae hortensis agglutinin (マキガイｍsnail); CHA - Cymbidium hybrid lectin; CIA - Coccinia grandis lectin (C. indica, C. cordifolia, Ivy gourd, scarlet gourd); CI-MPR - Cation independent mannose-phosphate receptor; CLA - Cladrastis lutea lectin (Yellow wood); CLA - Clivia miniata agglutinin (Clivia); CLC - Charcot-Leyden crystal protein; CLL - Chicken lactose-binding lectin; CMA - Chelidonium majus agglutinin (クサノオウcelandine, greater celandine); CMA - Clivia miniata lectin; CMA - Cucurbita maxima agglutinin (ヘボカボチャmarrow, 冬カボチャwinter squash); CMA - Cytisus multiflorus agglutinin; Con A - Concanavalin A (Canavalia ensiformis, タチナタマメjack bean); CPA - Cucurbita pepo agglutinin (カボチャpumpkin, ヘボカボチャsummer squash, gourd); CRA - Carcinoscorpin (Carcinoscorpius rotunda); CRCA - Carcinoscorpius rotunda cauda (カブトガニIndian horseshoe crab); CS, CSA, CSA-II, CSL - Cytisus scoparius agglutinin (Sarothamnus scoparius, エニシダScotch broom); CSA, CSA-I, CSL - Cytisus sessilifolius agglutinin (ポルトガルエニシダPortugal broom); CSL - Cerebellar soluble lectin, cell-sealing lectin; CTA - Clerodendron trichotomum lectin; CTL - Croton tiglium lectin (ハズcroton); DBA - Dolichos biflorus agglutinin (horse gram); DGA - Dioclea grandiflora lectin; DIA - Datura innoxia agglutinin; DLA, LPA - Dolichos lablab agglutinin (Lablab niger, Lablab purpureus, Hyacinth bean, lablab bean, black seeded kidney bean); DSA - Datura stramonium agglutinin (チョウセンアサガオJimson weed, シロバナヨウシュチョウセンアサガオthornapple); EBL - Elderberry lectin (Sambucus nigra agglutinin elderberry, eldertree, ニワトコelder); ECA, ECorA - Erythrina corallodendron agglutinin (West Indian coral tree); ECA, ECL - Erythrina cristagalli agglutinin (cocks comb coral tree); EEA - Euonymus europaeus agglutinin (prickwood, ニシキギspindle tree); EHA - Epipactis helleborine agglutinin (broad leaved helleborine); EHA, EHL - Eranthis hyemalis lectin (キバナセツブンソウwinter aconite); EHA - Euphorbia heterophylla agglutinin (Mexican fire plant, painted spurge); GBL - Glucan-binding lectin (Streptococcus sp.); GCA - Geodia cydonium agglutinin; GMP-140 - Platelet granule membrane protein-140, p-selectin; GNA - Galanthus nivalis agglutinin (スノードロップsnowdrop); GNL - Peanut nodule lectin (Arachis hypogaea); GPA - Gonatanthus pumilus agglutinin; GS, GSA - Griffonia simp1icifolia agglutinin (now Bandeirea simplicifolia agglutinin); GSL - Gerardia savaglia lectin (ニセジギタリスfalse foxglove); HAA - Helix aspersa agglutinin (カラツムリgarden snail); HAA - Homarus americanas agglutinin (ロブスターlobster); HCA - Hura crepitans agglutinin (sand-box tree); HHA - Hippeastrum hybrid agglutinin (アマリリスamaryllis); HL-3, HL-13 -Human lectins; L-29, HL-29 - Lactosamine-binding protein (ヒト肺human lung); HPA - Helix pomatia agglutinin (エスカルゴRoman snail, 食用カタツムリedible snail); HTA - Helianthus tuberosus lectin (キクイモJerusalem artichoke); HVA - Hordeum vulgare lectin (大麦barley); IAA - Iberis amara agglutinin (candy tuft); IRA - Iris hybrid lectin (ダッチアイリスDutch iris); JFL - Jackfruit lectin (Antocarpus heterophyllus, bread fruit tree); L-I, L-II - Leaf lectins from Winged bean (Psophocarpus tetragonolobus, goa bean, winged pea); L-34 - beta-galactoside-specific lectin (マウス繊維肉腫mouse fibrosarcoma); LAA, LAL, LALA - Laburnum alpinum agglutinin (スコッチラバーナムScotch laburnum); LAA - Leptospermum archinoides agglutinin (オーストラリアティーツリーAustralian tea tree); LAA - Leucojum aestivum agglutinin (スノーフレークsnowflake, サマースノーフレークsummer snowflake); LAA - Luffa acutangula agglutinin (ridge gourd); LAL - Laelia autumnalis lectin; LAM-14 - Mouse lymphocyte homing receptor; LANA - Laburnum angyriodes agglutinin (キングサリlaburnum); LBA, LBL, PLA - Lima bean agglutinin (Phaseolus limensis, Phaseolus lunatus); LBP - Laminin-binding protein (マウスマクロファージmouse macrophages); LCA, LcH - Lens culinaris agglutinin (ヒラマメlentil); LCL - Litchi chinensis lectin; LcLI, II - Lathyrus cicera isolectins (dwarf chicling vetch, カラスノエンドウvetch); LEA, LEL, TL - Lycopersicon esculentum agglutinin (トマトtomato); LEC-CAM - Selectins, group of C-type lectins; LEL - Loranthus europaeus lectin (loranthus, misteltoe); LFA - Limax flavus agglutinin; LL1 Lymphocyte lectin 1 (哺乳類mammals); LNA - Lablab niger agglutinin; LOA - Lathyrus odoratus lectin (スウィートピーsweet pea); LOA1, 2 - Listera ovata (トウェイブレードtwayblade); LoLI, II - Lathyrus ochrus isolectins (yellow flowered pea); LPA, DLA - Lablab purpureus agglutinin (Lablab niger, Dolichos lablab, Hyacinth bean, lablab bean, black seeded kidney bean); LPA - Lathyrus pratensis agglutinin (bastard vetchling, meadow lathyrus); LPA - Limulin (Limulus polyphemus, カブトガニhorseshoe crab); LSA - Lathyrus sativum agglutinin (chicling vetch); LTA - Lotus tetragonolobus agglutinin (ハスlotus, birds foot trefoil, also Tetragonolobus purpurea, winged pea, asparagus pea); LtubL - Lathyrus tuberosus tuber lectin (tuberous lathyrus); LtuLI, II- Lathyrus tuberosus seed isolectins (tuberous lathyrus); LVA - Leucojum vernum agglutinin (スノーフレークsnowflake, スプリングスノーフレークspring snowflake); Mac-2 - Macrophage surface antigen, major non-integrin laminin-binding protein (ヒトhuman, マウスmouse); MAA, MAH, MAHs, MAL - Maackia amurensis agglutinin/lectin; MBA - Machaerium biovulatum agglutinin; MBA - Mung bean agglutinin (Vigna radiata, Phaseolus aureus); MBP - Maltose-binding protein (動物animals); MBP - Mannan-binding protein (動物animals); MBP-A - Mannose-binding protein A (ラットrat); MCA - Momordica charantia agglutinin (bitter pear melon, bitter gourd); ME-C2, ME-D2, ME-E2, ME-F2 - Machaerocereus eruca isolectins; MEA - Machaerocereus eruca lectin; MEL-14 - Mouse lymphocyte homing receptor; MGA - Mycoplasma gallisepticum agglutinin; mGBP - Mouse galactose binding protein; MIA - Mangifera indica agglutinin (マンゴーの木mango tree); ML, VAA - Mistletoe lectin (Viscum album); MLA - Macharium lunatus agglutinin; MMA, MML - Marah macrocarpus lectin (野生キュウリwild cucumber); MMR - Macrophage mannose receptor (動物animals); MNL - Peanut nodule and cotyledon lectin (Arachis hypogea); MPA - Maclura pomifera agglutinin (maclura, オーセージオレンジosage orange, hedge apple tree); MPR - Mannose-phosphate receptor (動物animals); MT LEC1 - Medicago truncatala lectin; NFA - Nonfimbrial adhesin (細菌bacteria); NFL - Neoregelia flandria lectin; NLA - Narcissus lobularis agglutinin; NPA/NPL - Narcissus pseudonarcissus agglutinin/lectin (ラッパズイセンdaffodil); OSA, RL - Oryza sativa agglutinin (コメrice); PA-I, PA-II - Pseudomonas aeruginosa lectins; PAA, Pa-l,2,3,4,5 -
Phytolacca americana isolectins (アメリカヤマゴボウpokeweed, pigeon berry); PAA - Percea americana agglutinin (アボカドavocado); PALL - Phragmites australis lectin (common reed); PADGEM - Platelet granule membrane protein-140, p-selectin; PCA - Phaseolus coccineus agglutinin (scarlet runner bean); PHA - Phytohemagglutinin (Phaseolus vulgaris, red kidney bean); PHA-E - Erythroagglutinating isolectin of PHA; PHA-L - Leucoagglutinating isolectin of PHA; PL - Pseudamonas lectin; PLA, LBA, LBL - Phaseolus limensis agglutinin (P. lunatus, アオイロマメlima bean); PMA - Polygonatum multiflorum lectin (common Solomon's seal); PNA - Arachis hypogaea agglutinin (ピーナッツpeanut); Po66-CBP - Beta-galactoside-binding lectin in lung carcinoma; PPA - Ptilota plumosa agglutinin (red marine algae); PRA - Peanut root lectin (Arachis hypogea); PRA - Pterocarpus rhorii agglutinin; PSA, PsA - Pisum sativum agglutinin (エンドウgarden pea, common pea); PsNlec-l - Pisum sativum nodule lectin 1 (エンドウgarden pea, common pea); PTA, PTL, WBA - Psophocarpus tetragonolobus agglutinin (goa bean, winged pea); PWM - Poke weed mitogen (Phytolacca americana); R1 - Receptro 1, recognin 1; RaRF - Ra reactive factors (哺乳類血清mammalian serum); RCA, RCA12O, RCL I, RCL II - Ricinus communis agglutinin (castor oil bean); RCA6O, RCL III, RCL IV - ricin, ricin D, ricin E (Ricinus communis, ヒマ種子ｈcastor bean, ricin); RCL - Rhizoctonia crocorum lectin; RL, OSL - Rice lectin (Oryza sativa); RL-29 - Lactosamine-binding protein (ラット肺rat lung); RPA, RPsA - Robinia pseudoaccacia seed agglutinin (ニセアカシアblack locust, false acacia); RpbA - Robinia pseudoaccacia bark agglutinin (ニセアカシアblack locust, false acacia); RSA - Rhizoctonia solani lectin; SAP - Serum amyloid protein (mammals); SBA - Soybean agglutinin (Glycine max, ダイズsoya bean); SCA - Sambucus canadensis lectin (Canadian elderberry); SCA - Secale cereale lectin (rye); SEA - Sambucus ebulus lectin (dward elder); SER - Sheep erythrocyte receptor (マウスマクロファージmouse macrophages); SGA - Sauromatum guttatum agglutinin; SGL - Sarcocystis gigantea lectin; SHA - Salvia horminum lectin (サルビアsalvia); SJA, SJAbg/SJAbm - Sophora japonica agglutinin (Japanese/Chinese pagoda tree); SL - Onobrychis viciifolia lectin (sanfoin); SML - Sarcocystis muris lectin; SML - Sclerotinia minor lectin; SNA - Sambucus nigra agglutinin (elderberry, eldertree, elder); SP-A - Pulmonary surfactant protein-A (哺乳類mammals); SRA - Sambucus racemosa lectin (red-berried elder); STA - Solanum tuberosum agglutinin (イモpotato); SSA - Salvia sclarea agglutinin (サルビアclary, fetid clary sage); SSA - Sambucus sieboldiana lectin (Japanese elderberry); SSA - Soybean seedling agglutinin; SSA - Stenostylis stenocarpa agglutinin; SML - Sclerotinia sclerotiorum lectin; SVAK - Snake venom agglutinin (Naja naja kaouthia); SVAM - Snake venom agglutinin (Naja mossambica mossambica); SWA - Sarothamnus welwitschii lectin (エニシダbroom); TAA - Thorn apple agglutinin (Datura stramonium, Jimson weed); TCA - Tetracarpidium conophorum lectin (Nigerian walnut); TKA - Trichosantes kirilowii agglutinin (serpent cucumber); TL, LEA, LEL - Tomato lectin (Lycopersicon esculentum); TL, TxLC, TxLM - Tulipa lectins (チューリップtulip); TPA - Tetragonolobus purpurea agglutinin (winged pea, asparagus pea, also Lotus
Tetragonolobus, lotus, birds foot treefoil); TxLC-I, TL - Tulipa lectin (tulip); TxLM-I, TxLM-II - Tulipa lectins (tulip); UDA - Urtica dioica agglutinin (stinging nettle, nettle); UEA - Ulex europaeus agglutinin (furze, gorse); VAA, ML - Viscum album agglutinin (mistletoe); VCA - Vicia cracca lectin (common vetch); VEA - Vicia ervilia lectin (bitter vetch); VFA - Favin, Vicia faba agglutinin (broad bean, garden bean); VGA - Vicia graminea agglutinin; VRA - Vigna racemosa agglutinin; VSA - Vicia sativa agglutinin (tare, vetch); VVA, VVL - Vicia villosa agglutinin (hairy vetch); WBA, PTA, PTL - Winged bean agglutinin (Psophocarpus tetragonolobus, goa bean, winged pea); WBTL - Winged bean tuber lectin (Psophocarpus tetragonolobus, goa bean, winged pea); WGS-I - Winged bean green shell lectin (Psophocarpus tetragonolobus, goa bean, winged pea); WFA, WFH - Wisteria floribunda agglutinin (Japanese wisteria); WGA - Wheat germ agglutinin (Triticum vulgare); XL35 - Xenopus laevis oocyte lectin; および ZMA - Zea mays lectin (corn, maize)である。
【００２６】
本発明の分析において使用できる第１リガンドは、少なくとも１つのアイソフォームについて、炭化水素結合剤により非結合である場合、前記タンパク質に結合可能であるが、タンパク質：炭化水素結合剤結合体に結合する能力が減少しているか、もしくは、能力がない化合物が使用できる。一般的に、第１リガンドは、抗体または抗体フラグメント、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、または小さい有機分子等である。抗体および抗体フラグメントが好ましく、特にモノクローナル抗体が好ましい。第１リガンドは、所望であれば、例えば、放射ラベル、発色団または蛍光団等で標識してもよい。第１リガンドは、タンパク質の炭化水素移送アイソフォームおよびタンパク質の炭化水素欠乏アイソフォームに結合可能なリガンドの選択によって（例えば、タンパク質やそれらのフラグメントに対する抗体の増加により）、もしくはライブラリースクリーニングによって、選択することができる。
【００２７】
好ましい一形態において、抗体は、タンパク質のアミノ酸配列部分、特に、タンパク質における糖化部位と重複するかまたは隣接する部分（例えば、10アミノ酸残基以内）に相当する（類似する）配列を有するオリゴペプチドの免疫結合体に対して調製することができる。このようなオリゴペプチドは、それ自身、糖化されてもよく、また、一般的に長さが8〜50アミノ酸残基であり、例えば、10〜30残基である。
【００２８】
選択される候補物質は、本発明の分析方法において、第１リガンドとしての使用に適するリガンドを同定するために、タンパク質：炭化水素結合剤結合体に対してスクリーニングを行うことがでできる。
【００２９】
本発明の分析方法の形式に依存して、分析方法の実行は、２以上の第２リガンドの追加使用を組み込んでもよい。このようにタンパク質の全アイソフォームに結合可能な第２リガンドは、サンプルの残りからタンパク質を濃縮または分離するために使用することができる。一般的に、基質と結合したこのようなリガンドをサンプルに接触させてもよいし、好ましくは、基質を洗浄すること等により、サンプルの残りから基質を分離してもよい。前記基質は、例えば、板状、ロッド状、ビーズ状、ファイバー状、または、チューブや容器における表面コーティングのような、便利な形態をとることができる。特に好ましくは、前記基質は、磁気で置換できるポリマービーズ、例えば、超常磁性的クリスタルを含むビーズなどがあげられる。このような磁性ビーズは、例えば、Dynal Biotech（Oslo, Norway）等が商業的利用できる。
【００３０】
他の第２リガンドは、検出するタンパク質の炭化水素欠乏アイソフォームの含量や相対含量を考慮するように、検出可能な種や事象の発生に使用できる。このような第２リガンドは、一般的に、タンパク質：炭化水素結合剤結合体もしくはタンパク質：第１リガンド結合体に結合できるリガンドであり、例えば、結合体において、炭化水素結合剤または第１リガンドに曝されている、タンパク質の結合部位に結合できるリガンドである。
【００３１】
第１リガンドまたは第２リガンドもしくは炭化水素結合剤の標識化は、慣用の合成化学技術、例えば、リガンドまたは炭化水素結合剤を、任意に活性化した後、二官能性連結剤および標識種、または、活性化標識化種、もしくは標識種と二官能性連結剤との結合体と反応させることにより、行うことができる。
【００３２】
本発明の一実施形態において、検出は、表面プラズモン共鳴(SPR)が使用でき、SPR応答は、分子の結合または解離として、検出表面における質量濃度の変化を反映する、無浸襲光学技術である。このように表面結合した糖タンパク質、すなわち、はじめレクチンに曝され、それから第１リガンドに曝された糖タンパク質は、第１リガンドが結合可能な場合の応答とは異なり（糖タンパク質は炭化水素欠如bであり、レクチン結合は生じない）、レクチンが第１リガンドを結合から妨げる場合に、SPR応答を生じる。
【００３３】
この場合、糖タンパク質の表面結合は、糖化部位から離れた糖化タンパク質の領域に結合する、リガンド（例えば、抗体）が結合した基質を用いることにより達成できる。
【００３４】
SPRは、Biacore analysis（Biacore AB（Uppsala, Sweden）が使用可能）として知られる所有のシステムを用いて行うことができる。
【００３５】
本発明の方法は、例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート形式（一般的に、n×m ウェルプレートは、nおよびmが、20までの正の整数であり、特に96ウェルのイクロタイタープレート）を使用する、複数サンプルの分析への使用に特に適している。
【００３６】
本発明の分析方法において、炭化水素欠如は、定量的、半定量的または定性的に決定できる（例えば、正常と非正常の間、または穏やかな状態と過酷な状態の間において、限界を示す所定値の下または上として）。しかしながら、一般的に、炭化水素欠損であるアイソフォームの存在の％（例えば、mole％）として、炭化水素欠如を表すことが好ましい。本発明の分析方法の最後に、例えば、炭化水素結合剤の使用無しに、分析を平行して行うこと等により、糖化タンパク質の全含量を決定することが好ましい。
【００３７】
本発明の分析に使用されるサンプルは、一般的なサンプル、体細胞、組織または流体（例えば、尿、唾液、血液等）由来のサンプルである。好ましくは、サンプルは、血液または血液（例えば、血清）由来のサンプルである。サンプルを採取する患者の種は哺乳類、爬虫類、鳥類、魚類、甲殻類等の種であり、好ましくは哺乳類（特にヒト）である。
【００３８】
糖化タンパク質が細胞結合または細胞封入体の場合、サンプルは、糖化タンパク質を放出するために慣用法で処理することができる。同様に、糖化タンパク質は、所望であれば、金属化したり（metallated）（例えば、タンパク質が鉄結合タンパク質の場合、鉄イオンの添加により）、脱金属化（demetallated）または変性させてもよい。サンプルがプレトリートメントされた場合の正確な特性（precise nature）は、分析される特定の糖化タンパク質に依存する。
【００３９】
アルカリホスファトーゼおよびトランスフェリンについて、本発明に従った分析の例を、貼付する図１〜３に図示した。
【００４０】
図１は、本発明に従ったアシアロトランスフェリンの分析における工程（1〜5）を図式的に示す。
【００４１】
図２は、本発明に従った骨および肝臓アルカリホスファターゼの分析における工程（1〜4/4’）を図式的に示し、図３は、本発明に従った骨および肝臓アルカリホスファターゼの分析における工程（1〜4/4’）を図式的に示す。
【００４２】
前記図において、コラム（図１は３つ、図２および図３は、それぞれ２つ）は、分析試薬と異なるタンパク質アイソフォームとの相互作用を図式的に示す。図１において、コラムA、BおよびCは、それぞれ、テトラシアロ−、ジシアロ-およびアシアロトランスフェリンとの相互作用を示す。図２および図３において、コラムAおよびBは、それぞれ骨および肝臓アルカリホスフォターゼとの相互作用を示す。
【００４３】
図１に関して、工程１は、表面に固定化された抗トランスフェリン抗体を示し、工程２において、トランスフェリンが結合（サンプルからの捕獲により）、工程３において、はじめのレクチンが添加され、炭化水素化されたアイソフォームにおける炭化水素に結合し、工程４において、さらなるレクチンが添加され、そして、工程５において、非レクチン結合アシアロアイソフォームに結合できるのみである、トランスフェリンに対する第２抗トランスフェリン抗体が添加される。前記第２抗体は、その複合体の検出を容易にするために標識化されてもよい。
【００４４】
図２に関して、工程１は、表面に固定化された抗アルカリホスファターゼ抗体を示し、工程２において、アルカリホスファターゼが結合（サンプルからの捕獲により）、工程３において、骨アイソフォームに結合可能であるが、肝臓アイソフォームには結合できないレクチンが添加され、工程４において、アルカリホスファターゼに対する基質（▲）が添加され、もしくは、工程４’においてアルカリホスファターゼに対する第２抗体が添加される。酵素的な基質変化、もしくは、前記第２抗体の標識は、測定する肝臓APの量を考慮する。
【００４５】
図３に関して、工程１は、表面に固定化された抗アルカリホスファターゼ抗体を示し、工程２において、アルカリホスファターゼが結合（サンプルからの捕獲により）し、工程３において、肝臓アイソフォームに結合可能であるが、骨アイソフォームには結合できないレクチンが添加され、工程４において、アルカリホスファターゼに対する基質（▲）が添加され、もしくは、工程４においてアルカリホスファターゼに対する第２抗体が添加される。酵素的な基質変化、もしくは、前記第２抗体の標識は、測定する肝臓APの量を考慮する。
【００４６】
本発明は、さらに、以下の限定されない実施例の記載によりさらに例証される。
【実施例１】
【００４７】
トランスフェリンのN- lobeに結合できる２つのリガンドを使用した。これらは、Biogenisis（Poole, Dorset, UK）から購入した、酵素処理によって製造されるクローン2A2およびF(ab)2断片として言及されるfull IgGモノクローナル抗体である。
【００４８】
これらのトランスフェリン結合リガンドは、Biacoreによって提供されるプロトコールに従って、標準アミン結合を用いて、Biacore chips CM5 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)の表面に結合された。このように、例えば、モノクローナル抗体(50 μg/mL)を0.01M HEPES緩衝液(pH 7.4； 0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005% v/v ポリソルベート20含有)で希釈し、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびN-エチル-N-ジメチルアミノプロピルJカルボジイミドを用いて、流速10 μL/minで、前記チップ表面に固定化した。全ての試薬は、10μL/minの流速で前記チップに注入した。
【００４９】
ジシアロトランスフェリン（disialotransferrin）およびアシアロトランスフェリンは、アニオン交換HPLCを用いて、プールしたヒト患者血清から単離した。それから、これらを、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005% v/v ポリソルベート20を含む0.01M HEPES緩衝液で濃度58、5.8、2.9、0.29μg/mLに希釈した。
【００５０】
E8抗体、すなわちトランスフェリンのC-lobeに特異な抗体（カンサス大学から購入し（米国：Dr J.D. Cook）、Guindiらの方法によって調製した（Am. J. Clin. Nutr. 47:37-41 (1988)）を、このHEPES緩衝液で100μg/mL濃度に希釈した。
【００５１】
レクチンSNAおよびConA（Vector Laboratories（Peterborough, UK）およびSigma Aldrich Norway AS（Oslo, Norway）からそれぞれ購入）を、5mM CaCl2、5mM MnCl2および5mM MgCl2を添加したHEPES緩衝液で濃度100μg/mLに希釈した（２価カチオンの存在は、しばしばレクチン構造や結合を安定化させるために推奨される）。
【００５２】
リガンド結合Biacore chipsは、トランスフェリンアイソフォーム溶液と接触させ、さらに、SNAおよびConA溶液と連続的に接触させた。それから、Biacore 1000 測定機を用いて、各トランスフェリンアイソフォーム溶液-２A2リガンド結合に対して、相対感度単位（relative response units (RU)）を記録した。それから、前記chipsを、E8溶液と接触させて、再び、RU値を記録した。
【００５３】
酵素処理されたクローン２A2のF(ab)2断片は、Biacore chip 表面に同じように結合した。
【００５４】
アシアロトランスフェリンおよびジシアロトランスフェリンのサンプルについて、E8に曝した際のRUの変化は、それぞれ+12.94％および0.00％であった。これは、異なるグルコシル化されたアイソフォーム間を区別するための分析能力を証明し、また、混入物における異なるグリコシル化されたアイソフォームの濃度または相対濃度を決定するための分析能力を証明する。
【実施例２】
【００５５】
マイクロタイタープレート法
分析は、以下に示す工程で行われる
１．  調製した血清サンプル100μLを、capture-antibody coated (例えば、2A2 coated)に添加する。Nunc break-apart well strips and 、室温で30分間、振とう(600/min)しながらインキュベートする。
２．0.15 M NaCl、5 mM MnCl2、5 mM CaCl2および0.05% Tween 20 (PBS/Tween20)を含む0.05Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)300μLで6回洗浄する。
３．0.15 M NaCl、5mM MnCl2、5 mM CaCl2を含む0.05M PBS（pH7.4）に、0.5mg/mL SNA (Sambucus nigra lectin)150μLを添加する。室温で20分間、振とう(600/min)させながら、インキュベートする。
４．ウェルの中身を吸引し、捨てる（洗浄しない）。
５．0.15 M NaCl、5 mM MnCl2、5 mM CaCl2を含む0.05M PBS（ｐH6.0）に、ConA-FITC (Concanavalin ensiformis lectin) 0.5 mg/mL を150μL添加する。室温で20分間、振とう(600/min)させながら、インキュベートする。
５．一方、0.15 M NaClおよび1% BSA (PBS/BSA)を含む0.05M PBS(pH7.4)で適当に希釈することにより、125I-ラベル化 E8 トレーサー抗体を調製する。
6．ウェルの中身を吸引し、捨てる（洗浄しない）。
７． 100000cpm/200μL付近になるよう、PBS/BSAで適当に希釈した125I-ラベル化 E8 トレーサー抗体200μLを添加する。コンタミネーションをフ防ぐためにプレートをシールし、室温で20分間、振とう(400/min)させながら、インキュベートする。わかれたカウンティング容器に、トータルcpmカウントのため、125I-ラベル化 E8を200μL添加する。
８．シールを除去し、プレートに吸収性ペーパーを逆にしてかぶせ、液体を除去するために、穏やかに軽くたたく。放射廃棄物として適宜前記ペーパーを捨てる。
９．１ウェルに対し300μL のPBS/Tween20で、6回洗浄を行う。ウェルを区別して壊し、カウンティング容器に移す。
【実施例３】
【００５６】
マイクロタイタープレート法
分析は、以下に示す工程で行われる
１．  調製した血清サンプル100μLを、capture-antibodyでコートした(例えば、2A2 coated)Nunc break-apart well stripsに添加し、室温で30分間、振とう(600/min)しながらインキュベートする。
２．  0.15 M NaCl、5 mM MnCl2、5 mM CaCl2および0.05% Tween 20 (PBS/Tween20)を含む0.05Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS：ｐH7.4)300μLで6回洗浄する。
３．  0.15 M NaCl、5mM MnCl2、5 mM CaCl2を含む0.05M PBS（pH7.4）に、0.5mg/mL SNA (Sambucus nigra lectin)150μLを添加する。室温で20分間、振とう(600/min)させながら、インキュベートする。
４．  ウェルの中身を吸引し、捨てる（洗浄しない）。
５．  ConA-FITC（コンカナバリンensiformis レクチン）0.5 mg/mL を150μL、0.15 M NaCl、5mM MnCl2、5 mM CaCl2を含む0.05M PBS (pH6.0)に添加する。室温で20分間、振とう(600/min)させながら、インキュベートする。
６．  EDC(N-エチル-N'-(3-ジメチル-アミノ−プロピル)-カルボジイミド  ハイドロクロリド)0.1mg/mL溶液を0.1M PBS(pH7.2)で調製し、この溶液100μLをレクチンを含むウェルに添加する。室温で20分間、振とう(600/min)させながら、インキュベートする。
７．  一方、0.15 M NaClおよび1% BSA (PBS/BSA)を含む0.05M PBS(pH7.4)で適当に希釈することにより、125I-ラベル化 E8 トレーサー抗体を調製する。
８．  １ウェルに対し400μL のPBS/Tween20で、3回洗浄する。
９．  100000cpm/200μL付近になるよう、PBS/BSAで適当に希釈した125I-ラベル化 E8 トレーサー抗体200μLを添加する。コンタミネーションを防ぐためにプレートをシールし、室温で20分間、振とう(400/min)させながら、インキュベートする。わかれたカウンティング容器に、トータルcpmカウントのため、125I-ラベル化 E8を200μL添加する。
１０．  シールを除去し、プレートに吸収性ペーパーを逆にしてかぶせ、液体を除去するために、穏やかに軽くたたく。放射廃棄物として適宜前記ペーパーを捨てる。
１１．  １ウェルに対し300μL のPBS/Tween20で、6回洗浄を行う。ウェルを区別して壊し、カウンティング容器に移す。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明に従ったアシアロトランスフェリンの分析における工程（1〜5）を図式的に示す。
【図２】図２は、本発明に従った骨および肝臓アルカリホスファターゼの分析における工程（1〜4/4’）を図式的に示す。
【図３】図３は、本発明に従った骨および肝臓アルカリホスファターゼの分析における工程（1〜4/4’）を図式的に示す。
【図１】
2005527835.tif 000002
【図２】
2005527835.tif 000003
【図３】
2005527835.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月25日(2004.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる糖化パターンを持つ少なくとも２つのアイソフォームを有するタンパク質の分析方法であって、以下の工程を含む方法。
（ａ）前記タンパク質を含むサンプルに、炭化水素結合剤と、少なくとも２つの前記アイソフォームに結合し得る第１リガンドとを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）に続いて、前記サンプルに、前記タンパク質に結合し得るが、前記タンパク質と炭化水素結合剤との結合体には結合しない、第２リガンドを接触させる工程、
（ｃ）前記炭化水素結合剤と前記タンパク質の結合体、および／または、前記第１リガンドと前記タンパク質の結合体を検出する工程。
【請求項２】
前記炭化水素結合剤がレクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、トランスフェリン、アルカリホスファターゼ、絨毛性ゴナドトロピンおよびα-フェトプロテインから選択される、請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルを、前記炭化水素結合剤と接触させ、その後、前記第１リガンと接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルを、前記第１リガンドと接触させ、その後、前記炭化水素結合剤と接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１リガンドが、基質に固定化されている、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が酵素的に活性であり、前記第１リガンドおよび前記炭化水素結合剤の接触の後に、前記サンプルに、前記タンパク質の酵素作用に対する基質を接触させる、請求項１〜の６いずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
炭化水素結合剤、第１のタンパク結合リガンドおよび第２のタンパク結合リガンドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分析方法のためのキット。
【請求項９】
前記リガンドにおいて、少なくとも前記第１のタンパク質結合リガンドが基質に固定化されている、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
さらに、前記キットを使用するために、分析されるタンパク質の酵素活性に対する基質を含む、請求項８記載のキット。
【国際調査報告】
2005527835.tif 000005
2005527835.tif 000006
2005527835.tif 000007