(57)【要約】肺がん及び類似の病理の診断と治療のために用いることができる方法及び組成物が記載されている。また、肺がん及び類似の病理のモジュレーターを同定するために用いることができる方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からの細胞における肺がん関連転写物を検出する方法であって、該患者からの生物学的サンプルを、表1A-16に示されるような配列と少なくとも80%同一である配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが、表1A-16に示されているような配列と少なくとも95%同一である配列に選択的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該生物学的サンプルが組織サンプルであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該生物学的サンプルが単離された核酸を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該核酸がmRNAであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、該生物学的サンプルを該ポリヌクレオチドと接触させるステップの前に、核酸を増幅させるステップを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該ポリヌクレオチドが表1A-16に示されたある配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該ポリヌクレオチドがラベル標識されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該ラベルが蛍光ラベルであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ポリヌクレオチドが固体表面に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該患者が肺がんを治療するための治療養生法を受けていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該患者が肺がんにかかっている疑いがあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
肺がんの治療処置の有効性をモニターする方法であって：
（ｉ）該治療処置を受けている患者からの生物学的サンプルを用意するステップ；及び
（ii）該生物学的サンプルを、表1A-16に示されるような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させることにより該生物学的サンプルにおける肺がん関連転写物のレベルを決定し、それによって該治療の有効性をモニターするステップ；
を含む方法。
【請求項１４】
さらに、
（iii ）該肺がん関連転写物の該レベルを、該患者からの該治療処置以前の、又は該治療処置のもっと早期の生物学的サンプルにおける肺がん関連転写物のレベルと比較するステップ；
を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該患者がヒトであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
肺がんの治療処置の有効性をモニターする方法であって：
（ｉ）該治療処置を受けている患者からの生物学的サンプルを用意するステップ；及び
（ii）該生物学的サンプルを、表1A-16に示されるような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させることによって、該ポリペプチドが肺がん関連抗体に特異的に結合することで該生物学的サンプルにおける該肺がん関連抗体のレベルを決定し、それにより該治療の有効性をモニターするステップ；
を含む方法。
【請求項１７】
さらに、
（iii ）該肺がん関連抗体の該レベルを、該患者からの該治療処置以前の又は該治療処置のもっと早期の生物学的サンプルにおける該肺がん関連抗体のレベルと比較するステップ；
を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該患者がヒトであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
肺がんの治療処置の有効性をモニターする方法であって：
（ｉ）該治療処置を受けている患者からの生物学的サンプルを用意するステップ；及び
（ii）該生物学的サンプルを抗体と接触させて、該抗体が表1A-16に示されるような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる肺がん関連ポリペプチドと特異的に結合することで、該生物学的サンプルにおける該肺がん関連ポリペプチドのレベルを決定し、それにより該治療の有効性をモニターするステップ；
を含む方法。
【請求項２０】
さらに、
（iii ）該肺がん関連ポリペプチドの該レベルを、該患者からの該治療処置以前の又は該治療処置のもっと早期の生物学的サンプルにおける該肺がん関連ポリペプチドのレベルと比較するステップ；
を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該患者がヒトであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
表1A-16に示されるようなポリヌクレオチド配列から成る単離された核酸。
【請求項２３】
ラベル標識されていることを特徴とする請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
該ラベルが蛍光ラベルであることを特徴とする請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
請求項２２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
表1A-16に示されるようなポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項２９】
さらに、エフェクター成分と結合していることを特徴とする請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
該エフェクター成分が蛍光ラベルであることを特徴とする請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
該エフェクター成分が放射性同位元素又は細胞毒性化学物質であることを特徴とする請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
抗体断片であることを特徴とする請求項２９に記載の抗体。
【請求項３３】
ヒト化された抗体であることを特徴とする請求項２９に記載の抗体。
【請求項３４】
患者からの生物学的サンプルにおける肺がん細胞を検出する方法であって、該生物学的サンプルを請求項２８に記載の抗体と接触させるステップを含む方法。
【請求項３５】
該抗体がさらにエフェクター成分と結合されていることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該エフェクター成分が蛍光ラベルであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者における肺がんに特異的な抗体を検出する方法であって、該患者からの生物学的サンプルを、表1A-16からの配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項３８】
肺がん関連ポリペプチドを修飾する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）該化合物を肺がん関連ポリペプチドと接触させるステップ；ただし、該ポリペプチドは、表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる；及び
（ii）該化合物が該ポリペプチドに及ぼす機能的効果を決定するステップ；
を含む方法。
【請求項３９】
該機能的効果が物理的効果であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該機能的効果が化学的効果であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
該ポリペプチドが真核宿主細胞又は細胞膜で発現されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
該機能的効果が該ポリペプチドに結合するリガンドを測定することによって決定されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが組み換えであることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
肺がん関連細胞の増殖を阻害して患者における肺がんを治療する方法であって、請求項３８に記載の方法によって同定された化合物の治療的に有効な量を該被験者に投与するステップを含む方法。
【請求項４５】
該化合物が抗体であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該患者がヒトであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
薬剤スクリーニング分析法であって：
（ｉ）肺がんにかかっている哺乳類又はそれから単離された細胞にテスト化合物を投与するステップ；
（ii）治療された細胞又は哺乳類における表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現のレベルを、対照の細胞又は哺乳類における該ポリヌクレオチドの遺伝子発現のレベルと比較するステップ；
を含み、該ポリヌクレオチドの発現のレベルを変化させる化合物を肺がん治療のための候補とすることを特徴とする分析法。
【請求項４８】
該対照が、該テスト化合物で治療されなかった肺がんの哺乳類又はそれからの細胞であることを特徴とする請求項４７に記載の分析法。
【請求項４９】
該対照が、正常な細胞又は哺乳類であることを特徴とする請求項４７に記載の分析法。
【請求項５０】
肺がんにかかっている哺乳類を治療する方法であって、請求項４７に記載の分析法で同定された化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項５１】
肺がんにかかっている哺乳類を治療する製薬組成物であって、請求項４７に記載の分析法で同定された化合物及び生理的に受容される賦形剤を含む製薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年4月18日に出願されたUSSN 60/284,770; 2001年5月10日に出願されたUSSN 60/290,492; 2001年11月29日に出願されたUSSN 60/334,370; 2001年11月9日に出願されたUSSN 60/339,245; 2001年11月13日に出願されたUSSN 60/350,666;及び2002年4月12日に出願されたUSSN 60/xxx,xxx (Docket OMNI-602P);と関連しており、これらは各々参照によって全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明が属する技術分野
本発明は、肺がんに関与している核酸とタンパク質発現プロフィールの同定、及び核酸、産物、及びそれに対する抗体、に関し、肺がんの診断と治療におけるそれらの発現プロフィール及び組成物の利用に関する。本発明はさらに、肺がん又は関連した状態を阻止する物質及び／又は標的を同定し利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肺がんは合衆国で２番目に多く発生するがんであり、がんに関連した死亡原因のトップである。毎年、160,000人をこえる新しい肺がんの症例が発生しテイルと推定される。肺がんと診断された人たちの86パーセントが5年以内に死亡する。肺がんは、男性における最も多い内臓のがんであり、男性でも女性でも全てのがん死亡の約３分の１を占めている。実は、肺がんは男性においても女性においても、あらゆる原因による死亡の7%を占めている。
【０００４】
喫煙は肺がんの第１の原因であり、肺がんの80%より多くが喫煙によって生じている。フィルターなしの巻煙草から出る煙には400乃至500の異なる気体状物質が存在する。最も注目される物質としては、窒素酸化物、シアン化水素、ホルムアルデヒド、ベンゼン、及びトルエンがあげられる。巻煙草の煙に存在する粒子には、ニコチン、タバコ・アルカロイド類（ノルニコチン、アナタビン、アナバシン）、ナフタレン、芳香族アミン、フェノール、及びタバコ特有のニトロソアミン、など少なくとも3,500の異なる化合物が含まれる。
【０００５】
タバコ特有のニトロソアミンは、タバコの乾燥（curing）と加工のさいに形成され、ヒトにおける肺がんの原因になっている疑いがある。齧歯類の研究では、NNKとして知られるタバコ特有のニトロソアミンは、どこに、そしてどのように加えられるかに関わりなく、肺アデノーマ及び肺腺がんを生ずる。NNALとして知られるタバコ特有のニトロソアミンも齧歯類に肺腺がんを生ずる。
【０００６】
巻煙草の煙に見出される多くの化学物質は、“二番手”の、すなわち、側流の煙を吸い込む非喫煙者にも影響を及ぼす。実際、非喫煙者が吸い込む煙は喫煙者が吸い込む煙と同様の化学組成を有するが、重要なことは、発がん性のタバコ特有のニトロソアミンは、二番手の煙により高い濃度で存在するということである。このような理由やその他の理由により、“受動喫煙”は肺がんの重要な原因であり、毎年非喫煙者に3,000人ものがん死亡を発生させている。
【０００７】
喫煙の他に、肺がんの原因と考えられる他の因子として、アスベストやウランへの仕事での被曝、ラドン、多環式芳香族炭化水素、クロム、ニッケル、及び無機砒素、などの危険な化学物質への被曝、遺伝因子、食事、などがあげられる。
【０００８】
いろいろな肺がんの組織分類は、肺から始まるがんのタイプを定義している。例えば、Travis et al., (1999) Histological Typing of Lung and Pleural Tumours (International Histological Classification of Tumours, No. 1)を見よ。４つの主要な細胞タイプが全ての原発性肺新生物の88%より多くを占めている。それは次の４つである：扁平上皮又は類表皮がん、小細胞（燕麦細胞とも呼ばれる）がん、腺がん、及び大細胞がん（大細胞未分化がんとも呼ばれる）。残りは、未分化がん、カルチノイド、気管支腺がん、その他の稀少タイプである。いろいろな細胞タイプは自然史も治療に対する応答も異なっており、したがって、正しい組織診断が効果的な治療の最初のステップである。
【０００９】
小細胞肺がん（SCLC）は全ての肺がんの18-25%を占め、非小細胞肺がんに比べて頻度が低く、一般に非小細胞肺がんよりも急速に離れた器官に拡がる。一般に、見つかった時点で、小細胞肺がんは既に外科治療や治療意図を実行できる限界を超えて拡がっている。しかし、十分初期に見つかれば、このがんも化学療法や胸部放射線治療に応答することが多い。
【００１０】
非小細胞肺がん（NSCLC）はもっと発生頻度が高い肺がん形態である。非小細胞肺がんは、扁平上皮細胞がん、腺がん、及び大細胞がんを含み、全ての肺がんの75%よりも多くを占める。見つかった時点で局在している非小細胞肺がんは、外科的及び／又は放射線治療で治癒することがあるが、普通はかなりの転移が起こるまでは見つからないし、転移したがんは普通は外科的治療、化学療法、あるいは放射線治療にもあまり応答しない。
【００１１】
肺がんのリスクが高い無症候の人のスクリーニングは多くの場合効果がないことが判明している。一般に、肺がん患者のうちで無症候の間に病気が見つかった人は5乃至15%にすぎない。もちろん、初期発見と治療は肺がんに対する闘いの決定的因子である。がんが早期に、がんが肺から拡がる前に見つかった人たちの平均生存率は49%である。肺がんはしばしば肺の外へ拡がり、診断された時点では骨や脳に拡がっている可能性がある。早期に見つかった肺がんでは予後は良いであろうが、効果的な治療手段がないため、早期発見が必ずしも肺がんによる全体死亡率を変化させない。
【００１２】
このように、肺がんの診断と予後、及び肺がんの効果的な治療、の方法が望まれている。したがって、本発明では肺がんの診断と予後に用いられる方法が提供される。さらに、肺がんを修飾できる、例えば治療することができる治療物質候補をスクリーニングするために用いられる方法が提供される。さらに、本発明では、肺疾患やその他の転移性がんに治療的に介入するための分子標的や組成物が提供される。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、肺がん細胞でアップ−及びダウン−レギュレートされる遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。このような遺伝子は診断のために有用であり、また肺がんを修飾する治療化合物、例えば抗体、をスクリーニングするための標的としても役立つ。本発明の核酸又はそれがコードするタンパク質を検出する方法はいろいろな目的に利用できる。例えば、肺がんの早期発見、肺がんの治療後の再発の監視と早期発見、肺がんの治療に対する応答のモニタリング、肺がんの予後の判定、肺がん治療の指針、手術後の化学療法や放射線治療のための患者選定、治療の選択、腫瘍予後、治療、又は治療への応答の判定、及び肺の前がん病変の早期発見、などである。良性又は前がん病変の例としては：無気肺、気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、線維症、過敏性肺炎（HP）、間質性肺線維症（IPF）、喘息、及び気管支拡張症、などがあげられる。介入のその他の様態は、本発明の以下の記述から当業者には明らかになるであろう。
【００１４】
ある様態で、本発明は患者からの細胞における肺がんに関連した転写物を検出する方法を提供し、この方法は患者からの生体サンプルを、表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させるステップを含む。あるいはまた、サンプルを特異的結合試薬、例えば抗体、と接触させることもできる。
【００１５】
ある実施の形態では、このポリヌクレオチドは表1A-16に示されているような配列と少なくとも95%同一な配列に選択的にハイブリダイズする。別の実施の形態では、ポリヌクレオチドは表1A-16に示されているような配列を含む。
【００１６】
ある実施の形態では、生体サンプルは組織サンプル、又は体液である。別の実施の形態では、生体サンプルは単離された核酸、例えばmRNA、を含む。
【００１７】
ある実施の形態では、ポリヌクレオチドは、例えば蛍光ラベルで、標識されている。ある実施の形態では、ポリヌクレオチドは固体表面に固定されている。ある実施の形態では、患者はある治療方式に従って肺がん治療を受けている。別の実施の形態では、患者は肺がんの疑いがある。ある実施の形態では、患者は霊長類、例えばヒト、である。
【００１８】
ある実施の形態では、この方法はさらに、生体サンプルをポリヌクレオチドと接触させる前に核酸を増幅するステップを含む。
【００１９】
別の様態で、本発明は肺がんの治療処置の効力をモニターする方法を提供し、この方法は（ｉ）治療処置を受けている患者からの生体サンプルを用意するステップ；及び（ii）その生体サンプルを、表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドと接触させて生体サンプルにおける肺がんと関連した転写のレベルを決定し、それによって治療の効力をモニターするステップ；を含む。あるいは、サンプルはタンパク質について、例えばサンプルを抗体と接触させて、評価することもできる。
【００２０】
ある実施の形態では、この方法はさらに、（iii ）この肺がんに関連した転写のレベルを、治療処置の前の、又はその初期の、患者からの生体サンプルにおける肺がんに関連した転写のレベルと比較するステップを含む。あるいは、サンプルはタンパク質の比較に関して評価することもできる。
【００２１】
別の様態では、本発明は肺がんの治療処置の効力をモニターする方法を提供し、その方法は：（ｉ）治療処置を受けている患者からの生体サンプルを用意するステップ；及び（ii）その生体サンプルを、表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させて、このポリペプチドが肺がんに関連した抗体に特異的に結合することから、その生体サンプルにおける肺がんに関連した抗体のレベルを決定し、それによって治療の効力をモニターするステップ；を含む。
【００２２】
ある実施の形態では、この方法はさらに、（iii ）この肺がんに関連した抗体のレベルを、治療処置の前の、又はその初期の、患者からの生体サンプルにおける肺がんに関連した抗体のレベルと比較するステップを含む。
【００２３】
別の様態では、本発明は肺がんの治療処置の効力をモニターする方法を提供し、その方法は：（ｉ）治療処置を受けている患者からの生体サンプルを用意するステップ；及び（ii）その生体サンプルをある抗体と接触させて、その抗体が表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと特異的に結合することから、その生体サンプルにおける肺がんに関連したポリペプチドのレベルを決定し、それによって治療の効力をモニターするステップ；を含む。
【００２４】
ある実施の形態では、この方法はさらに、（iii ）この肺がんに関連したポリペプチドのレベルを、治療処置の前の、又はその初期の、患者からの生体サンプルにおける肺がんに関連したポリペプチドのレベルと比較するステップを含む。ある様態では、本発明は、表1A-16に示されているようなポリヌクレオチド配列から成る単離された核酸分子を提供する。ある実施の形態では、発現ベクター又は細胞はこの単離された核酸を含む。ある様態では、本発明は、表1A-16に示されているようなポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドを提供する。
【００２５】
別の様態で、本発明は、表1A-16に示されているようなポリヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。ある実施の形態では、この抗体はエフェクター成分、例えば蛍光ラベル、放射性同位元素、又は細胞毒性化学物質、と結合している。ある実施の形態では、この抗体は抗体断片である。別の実施の形態では、抗体は人化されている。
【００２６】
ある様態で、本発明は、患者における肺がんを検出する方法を提供し、この方法は患者からの生体サンプルをここで上述したような抗体又はタンパク質と接触させるステップを含む。
【００２７】
別の様態で、本発明は、患者におけるある肺がん遺伝子に特異的な抗体を検出する方法を提供し、この方法は患者からの生体サンプルを表1A-16の配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドと接触させるステップを含む。
【００２８】
別の様態では、本発明は、肺がんに関連したポリペプチドを修飾する化合物を同定する方法を提供し、この方法は：（ｉ）化合物を、表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである肺がんに関連したポリペプチドと接触させるステップ；及び（ii）この化合物がポリペプチドに及ぼす機能的効果を決定するステップ；を含む。
【００２９】
ある実施の形態では、この機能的効果は物理的効果、酵素的効果、又は化学的効果である。ある実施の形態では、ポリペプチドは真核宿主細胞又は細胞膜に発現される。別の実施の形態では、ポリペプチドは組み換えられている。ある実施の形態では、機能的効果はポリペプチドと結合するリガンドを測定して決定される。
【００３０】
別の様態で、本発明は、患者における肺がんを治療するために肺がんに関連した細胞の増殖又はその他の決定的プロセスを阻害する方法を提供し、この方法は、被験者に治療的に有効な量の、本明細書で上述したように同定された化合物ヲ投与するステップを含む。ある実施の形態では、その化合物は抗体である。
【００３１】
別の様態で、本発明は、薬剤スクリーニング分析法を提供し、この分析法は（ｉ）肺がんにかかっている哺乳類又はそれから単離された細胞にテスト化合物を投与するステップ；（ii）治療された細胞又は哺乳類における表1A-16に示されているような配列と少なくとも80%同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルを、対照の細胞又は哺乳類におけるそのポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと比較するステップ；を含み、そのポリヌクレオチドの発現レベルを変化させるテスト化合物は肺がん治療の候補になる。
【００３２】
ある実施の形態では、対照はそのテスト化合物で治療されなかった肺がんにかかっている哺乳類又はそれからの細胞である。別の実施の形態では、対照は正常な細胞又は哺乳類、又は悪性でない肺疾患である。
【００３３】
別の様態で、本発明は、肺がんにかかっている哺乳類を治療する方法を提供し、その方法は本明細書で上述したように同定された化合物を投与するステップを含む。
【００３４】
別の様態で、本発明は、肺がんにかかっている哺乳類を治療するための製薬組成物を提供し、この組成物は本明細書で述べるような分析法で同定された化合物及び生理的に受容される賦形剤を含む。
【００３５】
発明の詳細な説明
上で略述した目的に従って、本発明は肺の疾患又はがんの診断と治療のための新しい方法、ならびに肺がんを修飾する組成物をスクリーニングする方法を提供する。“肺の疾患又はがんの治療、監視、検出、又は修飾”とは、肺疾患（悪性であれ、非悪性、例えば気腫、気管支炎、又は線維症、であれ）を有する患者ならびに肺がんにかかっている患者における肺疾患の治療、監視、検出、又は修飾であって、表1A-16の遺伝子の遺伝子発現が増加又は減少して被験者が疾患を有する可能性が高いことを示すものを含む。特に、これらの標的は主として肺がんサンプルから同定されるが、同じ標的は他の医学的状態の分析でも同様に見出されると考えられる。これらの他の状態も同様の組織に影響する同様な病理的プロセスから生ずる、例えば肺がん、小細胞肺がん（燕麦細胞がん）、非小細胞がん（例えば、扁平上皮細胞がん、腺がん、大細胞肺がん、カルチノイド、肉芽腫）、線維症（特発性肺線維症（IPF）、過敏性肺炎（HP）、間質性肺炎、非特異性特発肺炎（NSIP））、慢性閉塞性肺疾患（COPD、例えば、気腫、慢性気管支炎）、喘息、気管支拡張症、及び食道がん、などである。例えば、NCIのウエブ・ページ及びUSSN 60/347,349 とUSSN 60/xxx,xxx(docket LFBR-001-1P, 2002年3月29日出願)を見よ。これらは、それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。治療は、肺がんの治療、又は関連した状態の治療、又は転移の治療であってもよい。
【００３６】
特に、これらのがんで選択的に発現されるマーカーの同定によって、その発現を診断、予後判定、又は治療の方法として利用することが可能に成る。そのようなものとして、本発明は、それらのマーカーを選択的に同定するのに役立ついろいろな組成物、例えば核酸、ポリペプチド、抗体、及び小分子の作用物質／拮抗物質、を定める。例えば、治療的方法はタンパク質治療薬という形をとり、選択的な機能の局在化又は修飾（疾患と因果的に作用するマーカーの場合）のために、ワクチンのために、結合パートナーの同定、又は拮抗作用のために、例えばアンチセンスやRNAiを用いて、マーカー発現を利用することができる。マーカーは肺疾患のサブセット（部分集合）を分子的に特徴づけるために利用することができ、それらのサブセットは実際に非常に異なる治療を必要とする。さらに、マーカーはまた、特定のがんに関連した疾患で、例えば非悪性疾患で同様の組織に影響を及ぼす疾患、あるいは同じような誘導／維持のメカニズムを有する疾患、で重要であることがある。転移のプロセスや特性も標的になる。診断及び予後における利用は、例えば関連しているが異なる疾患をサブセットにまとめるのに、又は治療戦略を決定するために利用できる。検出方法は、核酸に基づくもの、例えばPCR又はハイブリダイゼーション法、であっても、タンパク質に基づくもの、例えばELISA、画像技術（imaging）、IHC、等であってもよい。診断は、定性的なことも定量的なこともあり、発現レベルの増加を検出することも減少を検出することもある。
【００３７】
表1A-16は、肺がんサンプルにおいて発現の増加又は減少を示す遺伝子のヌクレオチド配列に対し、unigene クラスタ識別ナンバーを与えている。これらの表はまた、unigene クラスターの部分であるヌクレオチド配列を与えるexemplar accession ナンバー（ExAccn）を与えている。表1Aで、“ターゲット（target）１”又は“ターゲット２”とマークされた遺伝子は治療ターゲットとして特に有用である。“ターゲット３”とマークされた遺伝子は診断マーカーとして特に有用である。“chron”とマークされた遺伝子は、肺がん及び正常組織に比べて慢性疾患の肺で（例えば、気腫、気管支炎、線維症で）アップ−レギュレート（昂進）される。いくつかの分析では、“chron” カテゴリーに関する比は、慢性疾患の肺サンプルの70パーセンタイル値を正常な肺サンプルの90パーセンタイル値で割ったものを用いて決定された。ターゲットに関する比は、肺腫瘍サンプルの70パーセンタイル値を正常な肺サンプルの90パーセンタイル値で割ったものを用いて決定された。
定義
“肺がんタンパク質”又は“肺がんポリヌクレオチド”又は“肺がんに関連した転写物”という用語は、核酸及びポリペプチドの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、及び種間相同体であって：（１）表1A-16のunigeneクラスターの又はそれに関連したヌクレオチド配列と、約60%をこえるヌクレオチド配列同一性を、65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 好ましくは91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は99%以上のヌクレオチド配列同一性を、好ましくは少なくとも約25, 50, 100, 200, 500, 1000以上のヌクレオチドにわたって有するヌクレオチド配列を有する；（２）表1A-16のunigeneクラスターの又はそれに関連したヌクレオチド配列、又は保存的に修飾されたその変異体、によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して育成された抗体、例えばポリクローナル抗体、と結合する；（３）表1A-16の核酸配列、又はその相補配列及び保存的に修飾されたその変異体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で特異的にハイブリダイズする；又は（４）表1A-16のunigeneクラスターの又はそれに関連したヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と、約60%をこえるアミノ酸配列同一性を、65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 好ましくは91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,又は99%以上のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約25, 50, 100, 200, 500, 1000以上のアミノ酸にわたって有するアミノ酸配列を有するものを指す。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列は、普通、それだけに限定されないが、霊長類、例えばヒト；齧歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、その他の動物、などといった哺乳類からのものである。“肺がんポリペプチド” 及び“肺がんポリヌクレオチド”は、天然に見られる形態も組み換え形態も含む。
【００３８】
“全長”肺がんタンパク質又は核酸とは、１つ以上の天然に見られる野生タイプの肺がんポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に通常含まれるエレメントを含む肺がんポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、又はその変異体、を指す。“全長”とは、翻訳後の処理、又は交互（alternative）スプライシングを含むスプライシング、のいろいろな段階の前でも後でもよい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、“生体サンプル”とは、生物組織又は液体のサンプルであって、核酸又はポリペプチド、例えば肺がんタンパク質，ポリヌクレオチド、又は転写、を含むものである。このようなサンプルは、霊長類、例えばヒト、又は齧歯類、例えばマウス及びラット、から単離された組織を含むが、それだけに限定されない。生体サンプルは、また、生検や剖検サンプルなどの組織の切片、組織検査のために取られた凍結切片、公的記録材料、血液、血漿、血清、痰、糞、涙、粘液、毛髪、皮膚、等も含む。生体サンプルは、また、患者組織から得られる外植片及び一次及び／又は形質転換細胞培養も含む。生体サンプルは、普通、真核生物から、最も好ましくは、哺乳類、例えばチンパンジーやヒトなどの霊長類、；ウシ；イヌ；ネコ；例えばモルモット、ラット、マウスなどの齧歯類；又はその他の哺乳類；又は鳥類；爬虫類；魚、などから得られる。家畜も好ましい。
【００４０】
“生体サンプルを用意する”とは、本発明に記載された方法で使用するために生体サンプルを得ることを意味する。多くの場合、これは動物から細胞のサンプルを取り出すことによって行われるが、以前に単離された細胞（例えば、別の人によって、別の時点で、及び／又は別の目的で単離されたもの）を用いて行うことも、本発明の方法を生体で実行して行うこともできる。治療や経過を含む公的記録組織や材料は特に有用である。
【００４１】
“同一”又はパーセント“同一性”という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関連して、例えば、BLAST又はBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを以下で述べるようなデフォルト・パラメータを用いた測定によって、又は手動による整列と視覚的検査による測定で（例えば、NCBIウエブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などを見よ）、同じ、又は定められたパーセンテージのアミノ酸残基又はヌクレオチドが同じ（例えば、ある比較ウインドー又は指定された領域にわたって最大の対応が得られるように比較、整列したときに、定められた領域で、約60%の同一性、好ましくは、70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 以上の同一性）である２つ以上の配列又はサブ配列を指す。そのような配列は、その場合、“実質的に同一”であると言われる。この定義はまた、テスト配列の相補体も指す、又は、にも適用される。この定義はまた、欠失及び／又は挿入、置換、及び天然に起こる変異体、例えば多型又は対立変異体、及び人工の変異体を有する配列も含む。以下で述べるように、好ましいアルゴリズムはギャップなども考慮することができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって、さらに好ましくは、長さが50-100アミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００４２】
配列の比較では、普通、１つの配列が基準の配列として用いられ、テスト配列がそれと比較される。配列比較アルゴリズムを用いるときには、テスト配列と基準の配列がコンピュータに入力され、必要ならばサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータが指定される。デフォルト・プログラム・パラメータを用いることができることが好ましいが、別のパラメータを指定することもできる。すると配列比較アルゴリズムが、プログラム・パラメータに基づいて、基準配列に対するテスト配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、“比較ウインドー”とは、典型的には20乃至600,普通約50乃至約200,さらに普通には約100乃至約150,から成るグループから選択される連続する位置のセグメントで、ある配列が同じ数の連続する位置の基準配列と、２つの配列が最適に整列された後に比較されるセグメントを指す。比較のために配列を整列させる方法は当業者には周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 の局所ホモロジー・アルゴリズムによって；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 のホモロジー整列アルゴリズムによって；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 の類似性サーチ法によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって（Wisconsin Genetics Software PackageのGAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA、Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）；又は手動による整列と視覚的検査によって（例えば、Ausubel et al., (eds. 1955 and supplements) Current Protocols in Molecular Biology, を見よ）；実行できる。
【００４４】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの好ましい例としては、BLAST and BLAST 2.0アルゴリズムがあげられる。これはAltschul, et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記述されている。BLAST and BLAST 2.0は、本明細書に記載されるパラメータによって、本発明の核酸及びタンパク質に関するパーセント配列同一性を決定するために用いられる。BLAST分析を実行するためのソフトウエアはNational Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公共的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、問題配列で長さWの短いワードを同定して，データベース配列における同じ長さのワードと整列させたときにある正の閾値スコアTにマッチする又はそれを満たす高スコア配列ペア（HSPs）を同定する。Tは、隣接ワード・スコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., 前出）。この最初の隣接ワード・ヒットが種子となって、それを含むもっと長いHSPsを見つけるサーチが開始される。ワード・ヒットは、各配列に沿って両方向に、累積整列スコアが増加できる限り延長される。累積スコアは、例えばヌクレオチド配列の場合、パラメータM （マッチする残基のペアに対する報酬スコア、常に＞０）とN（ミスマッチの残基に対するペナルティー・スコア、常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向へのワード・ヒットの延長は：累積整列スコアが達成された最大の値より量Xだけ低下したとき；１つ以上のマイナスのスコアの残基整列が累積して累積スコアがゼロ以下になったとき；又は、どちらかの配列の終わりに達したとき、停止される。BLASTアルゴリズム・パラメータW, T,及びXは整列の感度とスピードを決定する。（ヌクレオチド配列に関する）BLASTNプログラムは、デフォルトとして11というワード長（W）、10という期待値（E）、M=5, N=-4 、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして3というエアード長、10という期待値（E）、を用い、BLOSUM62スコアリング・マトリックス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915 を見よ）は、50という整列（B）、10という期待値（E）、M=5, N=-4 、及び両方の鎖の比較を用いる。
【００４５】
BLASTアルゴリズムは、また、２つの配列の間の類似性の統計的解析も行う（例えば、Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA  90:5873-5787, を見よ）。BLASTアルゴリズムによって与えられる類似性の１つの尺度は最小総和確率（smallest sum probability, P(N)）であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然によって起こる確率の目安を与える。例えば、テスト核酸と基準核酸の比較で最小総和確率が約0.2未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満、である場合、核酸は基準配列と類似している（similar）と見なされる。 Log値はマイナスの大きな数、例えば5, 10, 20, 30, 40, 40, 70, 90, 110, 150, 170, etc.である。
【００４６】
２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの目安は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して育成された抗体に免疫的に相互反応する（cross reactive）ということである。すなわち、ポリペプチドが実質的に第２のポリペプチドと同一である、例えば２つのポリペプチドは保存的な置換によって異なるだけである場合である。２つの核酸配列が実質的に同一であるというもう１つの目安は、２つの分子又はその相補体がストリンジェントな条件の下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の目安は、同じプライマーを用いて配列を増幅することができるということである。
【００４７】
“宿主細胞”とは、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製又は発現をサポートする天然に見られる細胞又は形質転換された細胞である。宿主細胞は、培養された細胞、外植体、生体中の細胞、などであってよい。宿主細胞は、E. coliなどの原核細胞であるか、又は酵母、昆虫、両生類、又はCHO, Hela, といった哺乳類細胞などの真核細胞である（例えば、American Type Culture Collection カタログ、又はウエブサイトwww.atcc.org を見よ）。
【００４８】
“単離された”、“精製された”、又は“生物学的に純粋”という用語は、その原生状態で見出されるときには普通それに伴っている成分が実質的に又は本質的に含まれていない物質を指す。純度及び均一性は、普通、分析化学の手法、例えばポリアクリルアミド・ゲル電気泳動や高性能液体クロマトグラフィー、を用いて決定される。ある試料中に主要な物質種として存在するタンパク質や核酸は実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、その遺伝子に自然に横付けしてその遺伝子がコードしているタンパク質以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームから分離されている。いくつかの実施形態では、“精製された”という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に１つのバンドを生ずるということを表す。好ましくは、それは、核酸又はタンパク質が少なくとも約85%純粋である、さらに好ましくは少なくとも95%純粋である、最も好ましくは少なくとも99%純粋である、ことを意味する。別の実施の形態では、“精製する”又は“精製”とは、精製される組成物から少なくとも１つの汚染物質又は成分を除去することを意味する。この意味で、精製は、必ずしも精製された化合物が均一であること、例えば100%純粋であることを要求しない。
【００４９】
“ポリペプチド”、“ペプチド”、及び“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すものとして本明細書において交換可能に用いられている。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に見られるアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマーにも、天然に見られるアミノ酸ポリマー、修飾された残基を含むもの、及び天然に見られないアミノ酸ポリマーと同様に適用される。
【００５０】
“アミノ酸”という用語は、天然に見られるアミノ酸と合成されるアミノ酸、ならびに天然に見られるアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体、を指す。天然に見られるアミノ酸は、遺伝コードによってコードされているもの、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びO-ホスフォセリン、である。アミノ酸類似体は、天然に見られるアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素と結合したα−カーボン、カルボキシル基、アミノ基、及びR-基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルフォキシド、メチオニン・メチル・スルフォニウム、などを有する化合物を指す。このような類似体は、修飾されたR-基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド・バックボーンを有することがあるが天然に見られるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なるが、別のアミノ酸と同様に機能する構造を有する。
【００５１】
本明細書では、アミノ酸は、普通に知られている３文字の記号で表示されるか、又はIUPAC-IUB 生化学用語表記委員会が勧告している１文字の記号で表示される。ヌクレオチドも同様に、普通に受容されている１文字のコードで表示される。
【００５２】
“保存的に修飾された変異体”という用語は、アミノ酸はいれつにも核酸配列にも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な又は関連した、例えば自然に近接する、配列を指す。遺伝コードが縮退しているため、多数の機能的に同一の核酸がほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA, GCC, GCG, 及びGCUは、それぞれ、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されている各位置で、そのコドンを対応する上述の別のコドンに変えてもコードされるポリペプチドは変化しない。このような核酸の変異は“サイレント変異”であり、これは保存的に修飾された変異の一種である。本明細書であるポリペプチドをコードする各核酸配列は、また、その核酸のサイレント変異も記述している。状況によっては、（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUGと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除き）核酸の中の各コドンは変更して機能的に同様の分子を生ずるようにすることができる。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現される産物に関しては記載された配列に暗に含まれているが、実際のプローブ配列に関しては必ずしもそうではない。
【００５３】
アミノ酸配列に関しては、ある核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列で、コードされた配列の中の１つのアミノ酸又は小さなパーセンテージのアミノ酸を変える、付加する、又は削除する個々の置換、欠失、又は付加は、その変更がアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸への置換を生ずる場合には、“保存的に修飾された変異体”になることを、当業者であれば認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を与える保存的な置換の表は、当業者には周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に付加されるものであり、それを排除しない。典型的な保存的な置換としては、互いに次のものがあげられる：１）アラニン（A）, グリシン（G）；２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；４）アルギニン（R）、リシン（K）；５）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；７）セリン（S）、トレオニン（T）；及び８）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を見よ）。
【００５４】
ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、いろいろなレベルの組織で記述できる。この組織の一般的な議論は、例えば、Alberts, et al. (1994) Molecular Biology of the Cell (3rd ed.) 及びCantor and Scimmel (1980) Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules を見よ。“一次構造”は、ある特定ペプチドのアミノ酸配列を指す。“二次構造”は、あるポリペプチド内の局所的に秩序ある三次元構造を指す。これらの構造は、普通、ドメインと呼ばれる。ドメインはポリペプチドの部分であって、しばしばポリペプチドのコンパクトな単位を形成し、普通は25から約500アミノ酸という長さである。典型的なドメインは、β−シートやα−ヘリックスの区間のようなあまり組織されていないセクションから構成されている。“三次構造”は、あるポリペプチド・モノマーの完全な三次元構造を指す。“四次構造”は、通常、独立な三次元ユニットの非共有結合による連関によって形成された三次元構造を指す。非等方項は又、エネルギー項とも呼ばれる。
【００５５】
本明細書で用いられる“核酸”又は“オリゴヌクレオチド”又は“ポリヌクレオチド”又は文法的な等価物は、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合で結ばれたものを意味する。オリゴヌクレオチドは、普通、長さが約5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 30, 40, 50ヌクレオチド又はそれ以上から、長さが約100ヌクレオチドまでである。核酸及びポリヌクレオチドは、長さがもっと長い、例えば200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 10,000, etc.という任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は、一般に、フォスフォジエステル結合を含むが、場合によっては少なくとも１つの異なる結合、例えばフォスフォルアミデート、フォスフォルチオエート、フォスフォルジチオエート、又はO-メチルフォスフォルアミジト結合（Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press, を見よ）；及びペプチド核酸バックボーンと結合、を有する核酸類似体が含まれる。その他の核酸類似体としては、ポジティブ・バックボーンをもつもの；非イオン・バックボーン、非リボース・バックボーンをもつもの；及び米国特許Nos.5,235,033 及び5,034,506,及びSanghui and Cook, eds. Carbohydrate Modification in Antisense Research, ASC Symposium Series 580のChapters 6 and 7に記載されているものがある。１つ以上の炭素環シュガーを含む核酸も核酸の１つの定義に含まれる。リボース−フォスフェート・バックボーンの修飾はいろいろな理由で、例えば、生理的環境における、又はバイオチップ上のプローブとしての、これらの分子の安定性と半減期を増大させるために、行われる。天然に見られる核酸と核酸類似体の混合物を作ることもできる；あるいはまた、いろいろな核酸類似体の混合物、及び天然に見られる核酸と類似体の混合物、を作ることもできる。
【００５６】
特に好ましいのは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（PNA）である。このバックボーンは、天然に見られる核酸の強く荷電したフォスフォジエステル・バックボーンと異なり、中性条件の下で実質的に非イオン性である。これは２つの利点をもたらす。第１に、PNAバックボーンは、ハイブリダイゼーション・カイネティックスが優れている。PNAsは、ミスマッチの塩基対と完全にマッチした塩基対で比べた融点（Tm）の変化が大きくなる。DNAとRNAは普通、内部ミスマッチで2-4℃というTmの低下を示す。非イオン性のPNAバックボーンでは、この低下は7-9℃に近い。同様に、その非イオン性によって、このバックボーンにくっついた塩基のハイブリダイゼーションは塩濃度によって比較的影響を受けない。さらに、PNAsは細胞酵素によって劣化せず、したがってもっと安定である。
【００５７】
核酸は、定められたように一本鎖でも二本鎖でも、又は二本鎖と一本鎖の両方の配列の部分を含んでいてもよい。当業者には理解されるように、一本鎖の記述は、相補的な鎖の配列も定める；したがって、本明細書に記載された配列はその配列と相補的な配列も与える。核酸は、DNA, ゲノムDNAとcDNAの両方、RNA, 又はハイブリッドで、この場合核酸はデオキシリボ核酸とリボ核酸の組合せ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ハイポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、etc. の組合せを含む。“転写”は、普通、天然に見られるRNAを、例えばpre-mRNA, hnRNA, 又はmRNAを指す。本明細書で用いられる場合、“ヌクレオシド”という用語は、ヌクレオチドとヌクレオシド、及びヌクレオチド類似体、及び修飾されたヌクレオシド、例えばアミノ修飾ヌクレオシチド、を含む。さらに、“ヌクレオシド”は天然に見られない類似体構造を含む。このように、例えばそれぞれ塩基を含むペプチド核酸の個別ユニットが本明細書でヌクレオシドと呼ばれる。
【００５８】
“ラベル”又は“検出可能部分”とは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、生理的、化学的、又はその他の物理的手段によって検出可能な組成物である。有用なラベルとしては、例えば、32P、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAでよく用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及びタンパク質、その他の、例えば放射性ラベルをペプチドに組み込むことによって検出可能にできるもの、又はペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用できるもの、などがあげられる。ラベルは、がん核酸、タンパク質、及び抗体に組み込むことができる。抗体とラベルを結合するには、当業者に公知の多くの方法が用いられる、例えば、Hunter et al., (1962) Nature 144:945; David et al., (1974) Biochemistry 13:1014-1021; Pain et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219-230;及びNygren (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407-412に記載されている方法を使用できる。
【００５９】
“エフェクター”又は“エフェクター部分” 又は“エフェクター成分”とは、抗体に、共有結合で、リンカー又は化学結合で、又は非共有結合で、イオン結合で、van der Waals力で、静電的に、又は水素結合で結合される（又はリンクされる、又は接合される）分子である。“エフェクター”は、いろいろな分子が考えられる、例えば検出部分、すなわち、放射性化合物、蛍光化合物、酵素又は基質、エピトープ・タグなどのタグ、毒素；活性化部分、化学療法物質；リパーゼ；抗生物質；又はベータ腺などの“硬い”放射線を出す放射性同位元素、など、があり得る。
【００６０】
“ラベルされた核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”とは、ラベルと、共有結合で、リンカー又は化学結合で、又は非共有結合で、イオン結合で、van der Waals力で、静電的に、又は水素結合によって結合されて、プローブの存在がプローブに結合されたラベルの存在を検出することによって検出できるようになっているものである。あるいはまた、高アフィニティー相互作用を用いる方法で、結合パートナーの対の一方が他方に結合する場合、例えばビオチン、ストレプトアビジン、同じ結果を達成できる。
【００６１】
本明細書で用いる場合、“核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド”とは、相補的な配列の標的核酸に１つ以上のタイプの化学結合によって、普通は相補的な塩基のペアリング、例えば水素結合形成によるペアリングによって、結合できる核酸である。本明細書で用いる場合、プローブは天然の塩基（すなわち、A, G, C, 又はT）又は修飾された塩基（7-デアザグアノシン、イノシン、等）を含む。さらに、プローブの塩基はフォスフォジエステル結合以外の結合で、好ましくはハイブリダイゼーションと機能的に干渉しない結合で、結合していてもよい。例えば、プローブは、成分塩基がフォスフォジエステル結合ではなくペプチド結合で結合しているペプチド核酸であってもよい。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー（厳しさ）に依存するが、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列にも結合することができる。プローブは、好ましくは直接に、例えば同位元素、発色団、発光団、色素体で、ラベルされるか、又は間接的に、例えばストレプトアビジンが後で結合するビオチンで、ラベルされる。プローブの存在又は非存在を調べることによって、選んだ配列又はサブ配列の存在又は非存在を検出できる。診断又は予後判定はゲノム・レベルで行っても、RNA又はタンパク質発現のレベルで行ってもよい。
【００６２】
“組み換え”という用語は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して用いられた場合、その細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが異種核酸又はタンパク質の導入、又は原生の核酸又はタンパク質の変改によって修飾されているということ、又は細胞がそのように修飾された細胞から導出されたということを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、その細胞の原生の（非組み換え）形態では見られない遺伝子を発現する、又は、そうでない場合は異常に発現される、少ししか又は全く発現されない原生の遺伝子を発現する。本明細書では“組み換え核酸”という用語は、一般に最初はin vitroで核酸を操作して、例えばポリメラーゼとエンドヌクレアーゼを用いて天然には通常見られない形態で形成された核酸を意味する。このようにして、異なる配列の操作的な連結が達成される。したがって、通常は連結していないDNA分子をin vitroで結合して形成された線形の単離された核酸又は発現ベクターはどちらも本発明の目的には組み換えと見なされる。組み換え核酸が作られ、宿主細胞又は生物に導入された後は、それは非組み換え的に複製される、すなわち、in vitro の操作ではなく、宿主細胞のin vivoの細胞機構によって複製されることは言うまでもない；しかし、このような核酸は、いったん組み換えで生成されると、その後非組み換え的に複製されても、本発明の目的には依然として組み換えであると見なされる。同様に、“組み換えタンパク質”とは、組み換え法を用いて、すなわち、上述のような組み換え核酸の発現によって作られるタンパク質である。
【００６３】
“異種の（heterologous）”という用語は、核酸の部分に関して用いられる場合、核酸が、通常天然では同じ相互関係で見出されることがない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸が組み換えで生成され、例えば無関係の遺伝子からの２つ以上の配列が新しい機能的な核酸を作るように配置されている、例えばある源からのプロモーターと別の源からのコーディング領域が並んでいるような場合である。同様に、異種タンパク質とは、多くの場合、天然では同じ相互関係で見出されることがない２つ以上のサブ配列を指す（例えば、融合タンパク質）。
【００６４】
“プロモーター”とは、普通、核酸の転写を導く一連の核酸制御配列である。本明細書で用いられる場合、プロモーターは、転写の開始地点の近くの必要な核酸配列を含む、例えばポリメラーゼIIタイプのプロモーターの場合、TATAエレメントを含む。プロモーターはまた、オプションとして、遠くのエンハンサーまたはリプレッサー・エレメントを含み、これらは転写の開始地点から数千塩基対も離れていることがある。“構成性”プロモーターとは、たいていの環境条件及び発生条件の下で活性なプロモーターである。“誘導性”プロモーターとは、環境的または発生的な調節の下で活性になるプロモーターである。“操作的にリンクされる”という用語は、ある核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、又は一連の転写因子結合サイト）と第２の核酸配列の間の機能的な連関を指し、例えば、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を導くような場合である。
【００６５】
“発現ベクター”とは、組み換え又は合成で生成される核酸構築物であって、宿主細胞におけるある特定の核酸の転写を可能にする一連の定められた核酸エレメントを含む。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、又は核酸断片の一部であってもよい。普通、発現ベクターは転写される核酸を、プロモーターとの操作的な連関で含んでいる。
【００６６】
“．．．と選択的に（又は、特異的に）ハイブリダイズする”というフレーズは、ある分子がある特定のヌクレオチド配列と、その配列が複雑な混合物（例えば、細胞全体又はライブラリーDNA又はRNA）中にあるときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で結合、二本鎖を作る、又はハイブリダイズすることを指す。
【００６７】
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”というフレーズは、あるプローブが、普通核酸の複雑な混合物において、標的のサブ配列とハイブリダイズするが、他のどんな配列とも本質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件というのは配列に依存し、状況によって異なる。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳しい指針は、Tijssen (1993) Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probe (vol. 24) Elsevierの中の“ハイブリダイゼーションの原理と核酸分析の戦略の概観”に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度pHでその特定の配列の熱的な融点（Tm）よりも約5-10℃低くなるように選ばれる。Tmは、（定められたイオン強度、pH、及び核濃度の下で）標的と相補的なプローブの50%が平衡で標的配列とハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Tmで、プローブの50%が平衡で占有されている）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0 Mナトリウム・イオンより低く、普通約0.01乃至1.0 Mナトリウム・イオン濃度（又は他の塩）で、pHが7.0乃至8.3、温度は短いプローブ（例えば、10乃至50ヌクレオチド）では少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば、50ヌクレオチドをこえる）では少なくとも約60 ℃となる。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤（destabilizing agent）を加えて達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのためには、ポジティブ信号は少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンド・ハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は多くの場合次のようになる：50%ホルムアミド、5x SSC、及び1% SDS、42℃でインキュベート、又は5x SSC、1% SDS、65℃でインキュベート、洗浄は0.2x SSC，及び0.1%SDS、65℃。PCRでは、約36℃という温度が低ストリンジェンシー増幅で典型的であるが、アニール温度はプライマーの長さによって約32℃と48℃の間で異なる。高ストリンジェンシーのPCR増幅では、約62 ℃という温度が典型的であるが、高ストリンジェンシー・アニール温度は、プライマーの長さと特異性によって約50℃から約65℃までにわたる。高及び低ストリンジェンシー増幅の両方で、典型的なサイクル条件は、90℃-95℃の変性段階が0.5-2 min.、アニール段階が0.5-2 min.続き、約72℃の延長段階が1-2 min.などである。低及び高ストリンジェンシー増幅の手順と指針は、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications に見出される。
【００６８】
ストリンジェントな条件の下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは、例えば、ある核酸のコピーが遺伝子コードによって許されるコドン縮退を最大に利用して作られるような場合に起こる。このような場合、核酸は、普通、適度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする。“適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”の例としては、40%ホルムアミド、1 M NaCl、1% SDS、37℃のバッファーにおけるハイブリダイゼーションで洗浄が1x SSC、45℃、という例があげられる。ポジティブ・ハイブリダイゼーションは少なくともバックグラウンドの２倍である。別のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を用いて、同様のストリンジェンシーの条件を与えることができる。ハイブリダイゼーション・パラメータを決定するためのその他の指針は多くの参照文献に、例えば、Ausubel et al.(ed.) Current Protocols in Molecular Biology,  Lippincott, に見られる。
【００６９】
肺がんタンパク質の活性を変化させる化合物をテストする分析という文脈における“機能的効果”というフレーズは、間接又は直接に肺がんタンパク質又は核酸の影響下にあるパラメータの決定、例えば生理的、酵素的、機能的、物理的、又は化学的効果、例えば肺がんを減少させる能力、などを含む。リガンド結合活性；細胞生活力、ソフト寒天上の細胞成長；固定法依存性；成長の接触阻害と密度制限；細胞増殖；細胞の形質転換；成長因子又は血清依存性；腫瘍特異的なマーカー・レベル；Matrigelへの侵入；in vivoの腫瘍成長と転移；転移している細胞におけるmRNA とタンパク質発現、及び肺がん細胞のその他の特性、を含む。“機能的効果”は、in vitro, in vivo, 及びex vivo 活性を含む。
【００７０】
“機能的効果を決定する”というフレーズは、間接又は直接に肺がんタンパク質又は核酸の影響下にあるパラメータを増加又は減少させる化合物について、例えば生理的、酵素的、機能的、物理的、又は化学的効果、を分析することを意味する。このような機能的効果は、当業者に公知の多くの手段によって、例えば、タンパク質の分光的特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、流体力学的（例えば、形）、クロマトグラフィック、又は溶解度、の変化によって、肺がんタンパク質の誘導可能なマーカー又は転写活性化の測定；結合活性の測定又は結合分析、例えば抗体やその他のリガンドへの結合、の測定、及び細胞増殖の測定によって行われる。肺がんのある化合物の機能的効果の決定は、また、当業者に公知の肺がん分析によっても行うことができる、例えば、ソフト寒天上の細胞成長；固定法依存性；成長の接触阻害と密度制限；細胞増殖；細胞の形質転換；成長因子又は血清依存性；腫瘍特異的なマーカー・レベル；Matrigelへの侵入；in vivoの腫瘍成長と転移；転移している細胞におけるmRNA とタンパク質発現、及び肺がん細胞のその他の特性、などである。機能的効果は、当業者に公知の多くの手段で評価することができる、例えば、形態的特徴の変化を定量的及び定性的に測定する顕微鏡検査、肺がん関連配列に関するRNA又はタンパク質レベルの測定、RNA安定性の測定、下流又はレポーター遺伝子発現の同定（CAT、ルシフェラーゼ、β−gal、GFP、など）、例えば、化学発光、蛍光、測色反応、抗体結合、誘導性マーカー、及びリガンド結合分析、などである。
【００７１】
肺がんポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列の“抑制体”、“活性化体”及び“修飾物質”は、肺がんポリヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列のin vitro及びin vivo分析によって同定された活性化する、抑制する、又は修飾する分子又は化合物を指すのに用いられる。抑制体は、肺がんタンパク質に、例えば、結合する、活性を部分的又は完全にブロックする、活性を減少させる、阻止する、活性化を遅らせる、不活性化する、不感化する、又は活性又は発現をダウン−レギュレートする化合物、例えば拮抗物質、である。“活性化体”は、肺がんタンパク質の活性を増加させる、開く、活性化する、助ける、増強する、敏感化する、作動させる、又はアップ−レギュレートする化合物である。抑制体、活性化体、又は修飾物質は、また、肺がんタンパク質の遺伝的に修飾されたバージョンも含む、例えば、活性が変化したバージョン、ならびに天然及び合成のリガンド、拮抗物質、作動物質、抗体、小さな化学分子、なども含む。このような抑制体及び活性化体の分析法としては、例えば、肺がんタンパク質をin vitroで、細胞で、又は細胞膜で発現させること、推定される修飾物質である化合物を用いて上述のような活性への機能的効果を測定することがあげられる。肺がんの活性化体及び抑制体は、また、肺がん細胞をテスト化合物と一緒に培養して１つ以上の、例えば1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 又はそれ以上の肺がんタンパク質、例えば表1A-16に示されている配列でコードされる肺がんタンパク質の発現の増加又は減少を測定して同定することができる。
【００７２】
可能な活性化体、抑制体、又は修飾物質で処理された肺がんタンパク質の分析サンプルが、抑制体、活性化体、又は修飾物質なしの対照サンプルと比較されて抑制の程度が調べられる。対照サンプル（抑制体で処理されないもの）には100%という相対タンパク質活性値が与えられる。対照と比べた活性値が約80%、好ましくは50%、さらに好ましくは25-0%、であるとき、ポリペプチドの抑制が達成されている。対照（活性化体によって処理されていないもの）と比べた活性値が110%、好ましくは150%、さらに好ましくは200-500%（すなわち、対照に比べて2倍乃至5倍高い）、さらに好ましくは1000-3000%、であるとき、肺がんポリペプチドの活性化は達成されている。
【００７３】
“細胞成長の変化”というフレーズは、in vitro又はin vivoの細胞成長及び増殖特性、例えば、細胞の生活力、の何らかの変化、フォーカスの形成、固定法からの独立、半固体又はソフト寒天での成長、成長の接触阻害と密度制限の変化、成長因子又は血清要求の減少、細胞形態の変化、不死化の獲得又は消失、腫瘍特異的マーカーの獲得又は消失、適当な動物宿主に注射されたときに腫瘍を形成又は抑制する能力、及び／又は細胞の不死化、を指す。例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (3rd ed.)を見よ。
【００７４】
“腫瘍細胞”とは、腫瘍における前がん細胞、がん細胞、及び正常細胞を指す。
【００７５】
組織培養における“がん細胞”、“形質転換細胞”、又は“形質転換”とは、自発的又は誘導された表現型の変化であって、必ずしも新しい遺伝物質の取り込みが関わっていないものを指す。形質転換は、形質転換するウイルスによる感染や新しいゲノムDNAの取り込み、又は外来のDNAの取り込みによって生ずることがあるが、それはまた、自発的に、又は発がん因子への曝露の後で内部の遺伝子の突然変異によっても起こりうる。形質転換は表現型の変化、例えば細胞の不死化、異常な成長制御、非形態的な変化、及び／又は悪性腫瘍、と関連している（Freshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique (3rd ed.)を見よ）。
【００７６】
“抗体”とは、免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域を含むポリペプチド又はその断片で抗原に特異的に結合し、認識するものを指す。認められている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパ又はラムダと分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、それらはさらに、それぞれ、免疫グロブリンのクラス、IgG, IgM, IgA, IgD, 及びIgEを定める。普通、抗体の抗原に結合する領域又はその機能的等価物が結合の特異性とアフィニティーで最も重要である。Paul, Fundamental Immunologyを見よ。
【００７７】
ある例示的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは四量体を含む。各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から成り、各対は１つの“軽”鎖（約25 kD）と１つの“重”鎖（約50-70 kD）を有する。各鎖のN-末端は、抗原の認識にに主にあたる約100から110以上のアミノ酸から成る可変領域を定める。可変軽鎖（VL）と可変重鎖（VH）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖と重鎖を指す。
【００７８】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、又はいろいろなペプチダーゼによる消化で生成される特性が明らかないくつかの断片として存在する。例えば、ペプシンは抗体をヒンジ領域のジスルファイド結合の下で消化して、F(ab)'2、それ自体はジスルファイド結合によってVH-CH1に結合される軽鎖であるFabの二量体を生ずる。F(ab)'2は、おだやかな条件の下で還元されてヒンジ領域のジスルファイド結合を切断して、F(ab)'2 二量体をFab'モノマーに変換する。Fab'モノマーは、本質的にFabにヒンジ領域の一部がついているものである（Paul(ed. 1999) Fundamental Immunology(4th ed.)を見よ）。いろいろな抗体断片が無傷の抗体の消化によって定義されているが、それらの断片は化学的に又は組み換えDNAの方法によって新しく合成できるということは当業者には理解されるであろう。したがって、本明細書で用いられる抗体という用語は、完全な抗体の修飾によって生じた抗体断片、又は組み換えDNAの方法によって新しく合成された断片（例えば、単鎖のFv）、又はファージ・ディスプレー・ライブラリーを用いて同定される断片（例えば、McCafferty,et al. (1990) Nature 348:552-554 を見よ）も含む。
【００７９】
抗体、例えば組み換え、モノクローナル、ポリクローナル抗体、の調製には当業者に公知の多くの方法を用いることができる（例えば、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495-497; Kozbor, et al. (1983)Immunology Today; 4:72; Cole, et al.(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapyのpp.77-96; Coligan(1991 and supplements)Current Protocols in Immunology; Harlow and Lane(1988) Antibodies, A laboratory Manual; 及びGoding (1986）Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(2nd ed.)を見よ）。単鎖抗体を生成する方法（米国特許No．4,946,778）を本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するように用いることができる。また、遺伝子導入マウスや他の哺乳類などの生物を用いて人化された抗体を発現させることができる。あるいはまた、ファージ・ディスプレー法を用いて選ばれた抗原に特異的に結合する抗体及び異側性のFab断片を同定することができる（例えば、McCafferty,et al. (1990) Nature 348:552-554 を見よ）。
【００８０】
“キメラ抗体”とは、抗体分子であって、例えば、（a）定常領域又はその一部が変化し、置き換えられ、又は交換されて、抗原結合部位（可変領域）が異なる又は変化したクラス、エフェクター機能、及び／又は種の定常領域、又はキメラ抗体に新しい性質を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤、等、に結合されているもの；又は（b）可変領域又はその一部が変化し、置き換えられ、又は交換されて、異なる又は変化した抗原特異性を有する可変領域となっているもの、である。
肺がん関連配列の同定
ある様態では、診断情報が欲しいいろいろな患者サンプルで遺伝子の発現レベルを決定して発現プロフィールを求める。ある個別サンプルの発現プロフィールは、本質的にそのサンプルの状態を表す“指紋”である；２つの状態がある特定の遺伝子を同様に発現することがあるが、いくつかの遺伝子を同時に評価することで、細胞の状態に特徴的な遺伝子発現プロフィールを生成することができる。すなわち、正常な組織をがん組織や転移性のがん組織から区別したり、転移性のがん組織を生存しているがん患者からの組織と比較することができる。知られているいろいろな肺がん状態の組織の発現プロフィールを比較することによって、これらの状態の各々でどの遺伝子が重要であるかに関する情報が（遺伝子のアップ−及びダウン−レギュレーションも含めて）得られる。分子プロフィーリングは、現在は一括されている疾患名称のサブタイプを区別できる、例えば、肺がんの異なる形態を（慢性疾患、腺がん、等）を区別できる。
【００８１】
肺がん組織と非肺がん組織で異なって発現される配列が同定されると、その情報をいろいろな仕方で利用することが可能になる。例えば、ある特定の治療方式を評価することができる：ある化学療法の薬剤がある患者における肺がんを、したがって腫瘍の成長又は再発を、ダウンレギュレートするように作用しているか、を評価できる。あるいはまた、ある治療ステップが他のマーカーを誘発し、それを標的として用いて腫瘍を破壊できるかもしれない。同様に、患者のサンプルを知られている発現プロフィールと比較することによって診断を行ったり、治療の結果を確認したりすることもできる。悪性の疾患を非悪性の状態と比べることもできる。転移性の組織を分析して、その組織における肺がんのステージを決定したり、原発腫瘍の出発点、例えば遠隔原発部位からの転移、を決定したりできる。さらに、これらの遺伝子発現プロフィール（又は個々の遺伝子）は、特定の発現プロフィールを模倣又は変化させることに着眼して薬剤候補をスクリーニングすることを可能にする；例えば、肺がん発現プロフィールを抑制する薬剤を探すスクリーニングを行うことができる。これは、重要な肺がん遺伝子のセットを含むバイオチップを作成し、それをこのスクリーニングに用いて行うことができる。PCR法を選択したプライマー対で用いて、RNA又はゲノム配列を分析することができる。これらの方法はまた、タンパク質ベースで行うこともできる；すなわち、肺がんタンパク質のタンパク質発現レベルを診断目的に、又は候補物質をスクリーニングするために評価することができる。さらに、アンチセンス核酸の投与も含めて肺がん核酸配列を遺伝子治療の目的で投与することができる、又は肺がんタンパク質を（抗体及びその他の修飾因子も含めて）治療薬として又はタンパク質又はDNAワクチンとして投与することもできる。
【００８２】
したがって、本発明は、肺がん組織で正常な組織及び／又は非悪性の肺疾患と比べて、又は異なるタイプの肺疾患で、異なって発現される核酸及びタンパク質配列、ここで“肺がん配列”と呼ぶものを提供する。以下で略述するように、肺がん配列は肺がんにおいてアップレギュレートされる（すなわち、より高いレベルで発現される）ものも、ダウンレギュレートされる（すなわち、より低いレベルで発現される）ものも含む。ある好ましい実施の形態では、この肺がん配列はヒトからのものである；しかし、当業者には理解されるように、他の生物からの肺がん配列は疾患の動物モデル及び薬剤評価で有用である；したがって、他の肺がん配列も、脊椎動物から、例えば齧歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモット、等）、霊長類、農場動物（例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、等）及びペット（イヌ、ネコ、等）からの配列が提供される。他の生物からの肺がん配列は以下に述べるような方法を用いて得られる。
【００８３】
肺がん配列は、核酸配列もアミノ酸配列も含む。当業者には理解されるように、そして以下で詳しく述べるように、肺がん核酸配列は、診断用途、これは天然に見られる核酸を検出するものであるが、ならびにスクリーニング用途、などいろいろな用途で有用である；例えば、核酸プローブを含むバイオチップや肺がん配列に対する選択されたプローブを含むPCRマイクロタイタ・プレートを生成することができる。
【００８４】
肺がん配列は、最初にここで示される肺がん配列との核酸及び／又はアミノ酸配列の実質的な相同性によって同定することができる。このような相同性は、全体的な核酸又はアミノ酸配列に基づき、一般に以下で述べるように相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件を用いて決定される。
【００８５】
肺がん関連配列を同定するために、肺がんスクリーンは普通、異なる組織で同定された遺伝子の比較、例えば正常組織とがん組織、がん状態と非悪性状態、非悪性状態と正常組織、又は転移性疾患の患者からの腫瘍組織サンプルvs.非転移組織、などの比較を含む。その他の適当な組織比較としては、肺がんサンプルと他のがん、例えば乳がん、他の消化器がん、前立腺、卵巣、等、からの転移性がんサンプルとの比較があげられる。非転移性疾患組織と転移をしている組織からのサンプルが核酸プローブを含むバイオチップで用いられる。サンプルは、該当する場合、まず顕微解剖され、mRNAの調製のために当業者に公知の仕方で処理される。適当なバイオチップは、例えばAffymetrix, Santa Clara, CA, から市販されている。ここで述べたような遺伝子発現プロフィールが生成され、データが分析される。
【００８６】
ある実施の形態では、正常状態と疾患状態で発現に変化が見られる遺伝子が、他の正常組織、好ましくは正常な肺であるが、非限定的に結腸、心臓、脳、肝臓、胸、腎臓、筋肉、前立腺、小腸、大腸、脾臓、骨、及び／又は胎盤、で発現される遺伝子と比較される。ある好ましい実施の形態では、肺がんスクリーンで同定された遺伝子で他の組織（例えば、必須の器官）で顕著な量で発現されるものはプロフィールから除かれるが、実施の形態によってはこれは必要ない（例えば、器官が生命の後のステージでなくても良い場合）。すなわち、薬剤についてスクリーニングするとき、標的にする発現は、通常、疾患特異的であることが、他の器官への服作用を最小にするために好ましい。
【００８７】
ある好ましい実施の形態では、肺がん配列は肺がんでアップレギュレートされるものである；すなわち、これらの遺伝子の発現はがん組織で、正常な肺又はその他の器官におけるよりも高い。本明細書で用いられる場合、“アップレギュレーション”とは、比が１よりも大きい数で表されるときに、比が１よりも大きいこと、好ましくは1.5以上、さらに好ましくは2.0以上、であることを意味する。別の実施の形態は、正常な状態に比べて非悪性状態でアップレギュレートされる配列に向けられる。本明細書におけるunigeneクラスター識別ナンバー及びaccessionナンバーはGenBank配列データベースに関するものであり、accessionナンバーの配列は参照によってはっきりと本明細書に組み込まれる。GenBankは当業者に公知である、例えば、Benson, DA, et al.(1998) Nucleic Acids Research 26:1-7 及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を見よ。配列はまた、他のデータベース、例えば、European Molecular Biology Laboratory (EMBL)及びDNA Database of Japan (DDBJ)、からも入手できる。別の実施の形態は、正常な状態に比べて非悪性状態でアップレギュレートされる配列に向けられる。場合によっては、配列は利用できる配列のアセンブリから得られ、又はゲノムDNAからエクソン予測アルゴリズム、例えばFGENESH(Salamov and Solovyev (2000)Genome Res. 10:516-522)、を用いて予測することができる。場合によっては、配列は単離された核酸のクローニングと配列決定によって得られた。
【００８８】
別の好ましい実施の形態では、肺がん配列は肺がんでダウンレギュレートされるものである；すなわち、これらの遺伝子の発現はがん組織で、正常な肺又はその他の器官におけるよりも低い。本明細書で用いられる場合、“ダウンレギュレーション”とは、比が１よりも大きい数で表されるときに、比が１よりも大きいこと、好ましくは1.5以上、さらに好ましくは2.0以上、であること、又は比が１よりも小さい数で表されるときに、比が１よりも小さいこと、好ましくは0.5以下、さらに好ましくは0.25以下、であることを意味する。
情報学
肺がんにおいて過剰に又は過少に発現される遺伝子を同定できることは、さらに高分解能、高感度のデータセットを提供し、それは診断、治療、薬剤の開発、薬理遺伝学、タンパク質構造、バイオセンサー開発、その他の関連分野で利用することができる。例えば、発現プロフィールは肺がん患者の診断又は予後評価に利用できる。又は、別の例として、細胞以下の毒物学的情報を生成して薬剤の構造と活性の相関のよりよい指針とすることができる（Anderson(1998) Pharmaceutical Proteomics: Targets, Mechanism, and Function, IBC Proteomics conference, Coronado, CA (June 11-12, 1998)で発表された論文、を見よ）。細胞以下の毒物学的情報は、また、化学的被曝の予想される毒物学的影響と予想される許容曝露限界を予測する生物センサー・デバイスにも利用できる（米国特許No. 5,811,231を見よ）。同様な利点は、他の生体分子及びバイオアクティブ物質（例えば、核酸、糖類、脂質、薬剤、など）に関するデータセットからも生ずる。
【００８９】
したがって、別の実施の形態で、本発明は少なくとも１組の分析データを含むデータベースを提供する。このデータベースに含まれるデータは、例えば、アレー分析を単独で、又はライブラリー型式で用いて得られる。このデータベースはデータが管理され伝送される形態でも良いが、好ましくは電子データベースである。本発明の電子データベースは、データベースの格納とアクセスを可能にする電子装置、例えばパーソナル・コンピュータ、で管理することもできるが、好ましくは広域ネットワーク、例えばWorld Wide Web、上で配布される。
【００９０】
ペプチド配列データを含むデータベースについてのこのセクションのフォーカスは説明の分かり易さのためだけである。同様のデータベースは、本発明の分析を用いて得られる分析データに関して構成できることは当業者には明らかであろう。
【００９１】
肺がんを表すサンプルからのいろいろな分子種及び巨大分子種の相対及び／又は絶対存在量を同定及び／又は定量化する組成及び方法、すなわち、本明細書に記載される肺がん関連配列の同定は、豊富な情報を提供し、それを病理的状態、疾病素質、薬剤試験、治療モニタリング、遺伝子−疾病因果的連関、免疫と生理状態の相関関係の同定、などと関連づけることができる。本発明の分析から生成されるデータは人の手による検討と分析に適しているが、ある好ましい実施の形態では、高速コンピュータによるデータ処理が利用される。
【００９２】
生体分子情報に索引をつけて検索するためのいろいろな方法は当業者には公知である。例えば、米国特許Nos. 6,023,650 and 5,966,712は、生体分子配列情報を、１つ以上のタンパク質機能ヒエラルキーによって配列をカタログ化してサーチできるような仕方で格納するリレーショナル・データベース・システムを記載している。米国特許No. 5,953,727は、部分長配列の集まりから全長配列を得る１つ以上の配列決定プロジェクトとの関連に従って部分長DNA配列の集まりに索引をつけてサーチできるようにする型式で情報を含む配列レコードを有するリレーショナル・データベースを開示している。米国特許No. 5,706,498は、キー配列と標的配列の類似度に基づいて遺伝子データベースにおける配列データ項目と類似した遺伝子配列を検索する遺伝子データベース検索システムを開示している。米国特許No. 5,538,897は、ペプチドの質量分析断片パタンを用いて、予測された質量スペクトルと実験的に得られた質量スペクトルとの適合の良さの尺度を用いた比較によってコンピュータ・データベースのアミノ酸配列を同定する方法を開示している。米国特許No. 5,926,818は、オンライン解析処理（OLAP）と記述される多次元データ分析の機能を含む多次元データベースを開示しており、これは予測されるデータと実際のデータを１つよりも多くの統合パス又は次元に従って統合を行うものである。米国特許No. 5,295,261は、ハイブリッド・データベース構造を報告しており、そこでは各データベース・レコードのフィールドが２つのクラス、ナビゲーション・データとインフォメーション・データに分割され、ナビゲーショナル・フィールドは階層的なトポロジカル・マップで格納され、それはツリー構造として、又は２つ以上のツリー構造の併合として見ることができる。
【００９３】
また、Mount, et al.(2001) Bioinformatics; Durbin, et al. (eds. 1999) Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids; Baxevanis and oeullette (eds. 1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins; Rashidi and Buehler (1999) Bioinformatics: Basic Applications in Biological Science and Medicine; Setubal, et al. (eds. 1997) Introduction to Computational Molecular Biology; Misener and Krawetz (eds, 2000) Bioinformatics: Method and Protocols; Higgins and Taylor (eds, 2000) Bioinformatics: Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach; Brown (2001) Bioinformatics: A Biologist's Guide to Biocomputing and the Internet; Han and Kamber (2000) Data Mining: Concepts and Techniques (2000); 及びWaterman (1995) Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes、を見よ。
【００９４】
本発明は、クロス作表された分析データ・レコードをコンピュータ検索可能な形態で格納する、例えば各配列特異性レコードが得られた標的を含むサンプルのソースを明らかにする形でデータを格納する、コンピュータとソフトウエアを含むコンピュータ・データベースを提供する。
【００９５】
ある例示的な実施の形態では、標的を含むサンプルのソースの少なくとも１つは、病理的な不調がないと知られている対照組織サンプルからである。ある変形例では、少なくとも１つのソースは知られている病理組織検体、例えば新生物病変、又は肺がんに関して分析される別の組織検体である。別の変形例では、分析レコードはサンプルの各標的分子種について１つ以上の以下のパラメータをクロス作表する：（１）固有識別コード、これは例えば、標的分子構造及び／又は特徴的な分離座標（characteristic separation coordinate）（例えば、電気泳動座標）；（２）サンプル・ソース；及び（３）サンプルに存在する標的分子種の絶対及び／又は相対量。
【００９６】
本発明は、また、コンピュータ・データ記憶装置における標的データの集まりの格納と検索を提供し、コンピュータ・データ記憶装置としては磁気ディスク、光ディスク、磁気−光ディスク、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、RDRAM、DDR RAM、磁気バブル記憶装置、その他のデータ記憶装置、CPUレジスター及びオン-CPUデータ記憶アレーなど、が含まれる。普通、標的データ・レコードは磁化可能な媒質上の磁気ドメインの列のビット・パタンとして、又はDRAMデバイスのセルの列（例えば、トランジスタとトランジスタ上にある電荷貯蔵区域から成る各セル）などの荷電状態又はトランジスタ・ゲート状態の列として、記憶される。ある実施の形態では、本発明は、そのような記憶装置、及びそれで構成されるコンピュータ・システムであって、タンパク質発現指紋レコードで標的ソースとクロス作表された少なくとも10 の標的データ・レコードに関し固有識別子（unique identifiers）を含むビット・パタンを含むものを提供する。
【００９７】
標的がペプチド又は核酸である場合、本発明は好ましくは関連するペプチド又は核酸配列を同定する方法であって、コンピュータ記憶装置又はデータベースに記憶された又はそれから検索されたペプチド又は核酸配列分析レコードと少なくとも１つの他の配列のコンピュータによる比較を行うステップを含む方法を提供する。この比較は、配列分析又は比較アルゴリズム又はそのコンピュータ・プログラム実施形態（例えば、FASTA, TFASTA, GAP, BESTFIT）を含む、及び／又は、比較は、ある検体のポリペプチド又は核酸サンプルから決定される配列のプールにおけるあるペプチド又は核酸の配列の相対量についてであってもよい。
【００９８】
本発明は、また、好ましくは、本発明の分析からのデータを検索に適したファイル・フォーマトでコードし、コンピュータによる配列分析、比較、又は相対定量化方法で処理いているビット・パタンを含む磁気ディスク、例えばIBM-互換（DOS, Windows, Windows95/98/2000, Windows NT, OS/2）又はその他のフォーマト（例えば、Linux, Solaris, AIX, SCO Unix, VMS, MV, Macintosh, etc.）のフロッピー・ディスケット又はハード（固定、Winchester）ディスク・ドライブ、などを提供する。
【００９９】
本発明は、また、複数のコンピューティング・デバイスが、Ethernetケーブル（coax又は10BaseT）、電話線、ISDNライン、無線ネットワーク、光ファイバー、又はその他の適当な信号伝送媒体、によってリンクされて成るネットワークであって、少なくとも１つのネットワーク・デバイス（例えば、コンピュータ、ディスク・アレー、etc.）が、本発明の分析から得られたデータをコードするビット・パタンを構成する磁気ドメイン（例えば、磁気ディスク）及び／又は電荷ドメイン（例えば、DRAMセルのアレー）のパタンを含むネットワークを提供する。
【０１００】
本発明は、また、分析データを伝送する方法であって、モデム、ISDNターミナル・アダプター、DSL、ケーブル・モデム、ATMスイッチ、などの電子通信デバイスでの電子信号を発生するステップを含み、この信号は本発明の方法によって得られる分析のデータ又は複数の分析結果を含むデータベースをコードするビット・パタンを（生の又は暗号化されたフォーマトで）含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１０１】
ある好ましい実施の形態では、本発明は、質問（query）標的を本発明の方法によって得られる分析結果などの一連のデータ構造を含むデータベースと比較し、その標的データとの同一性の度合いとギャップ・ウエイトに基づいてデータベース標的をランクづけするコンピュータ・システムを提供する。中央処理装置は、好ましくは、分析結果を整列及び／又は比較する多米のコンピュータ・プログラムをロードして実行するように初期化される。質問標的のデータはI/Oデバイスによって中央処理装置に入力される。コンピュータ・プログラムを実行すると、中央処理装置は分析結果のバイナリー記述を含むデータ・ファイルから分析データを検索する。
【０１０２】
標的データ又はレコードとコンピュータ・プログラムは、普通ランダム・アクセス・メモリー（例えば、DRAM, SRAM, SGRAM, 又はSDRAM）である二次記憶装置に移される。データベース標的は、選ばれた分析特性（例えば、選ばれたアフィニティー部分との結合）と質問標的の同じ特性との間の対応の度合いによってランクづけされ、結果はI/Oデバイスによって出力される。例えば、中央処理装置は、通常のコンピュータ（例えば、Intel Pentium, PowerPC, Alpha, PA-8000, SPARC, MIPS 4400, MIPS 10000, VAX, etc.）であり；プログラムは、市販の又は公共ドメインの分子生物学ソフトウエア・パッケージ（例えば、UWGCG Sequence Analysis Software, Darwin）であり；データ・ファイルは光又は磁気ディスク、データ・サーバー、記憶装置（例えば、DRAM, SRAM, SGRAM, SDRAM, EPROM, バブル・メモリー、フラッシュ・メモリー、etc.）であり；I/Oデバイスは、ビデオディスプレーとキーボードを備えた端末、モデム、ISDNターミナル・アダプター、Ethernetポート、パンチカード・リーダー、磁気テープ・リーダー、又は他の適当なI/Oデバイスであってよい。
【０１０３】
好ましくは、本発明はまた、上述のようなコンピュータ・システムの利用を提供し、それは：（１）コンピュータ；（２）本発明の方法によって得られたペプチド配列特異性の全体をコードした記憶されたビット・パタン；（３）質問標的などの比較標的；及び（４）整列と比較のためのプログラム、普通は計算された類似度の値に基づいて比較結果のランクづけを行うプログラム、を含む利用である。
肺がん関連タンパク質の特性
本発明の肺がんタンパク質は、分泌されるタンパク質、膜貫通タンパク質、又は細胞内タンパク質に分類される。ある実施の形態では、肺がんタンパク質は細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質及び／又は核に見出される。細胞内タンパク質は、細胞機能と複製の（例えば、信号経路を含む）全ての側面に関与する；これらのタンパク質の発現異常はしばしば調節も制御もされない細胞プロセスを生ずる（例えば、Alberts (eds. 1994) Molecular Biology of the Cell (3rd ed.)を見よ）。例えば、多くの細胞内タンパク質は酵素活性を有する、すなわち、タンパク質キナーゼ活性、タンパク質ホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチド・サイクラー是活性、ポリメラーゼ活性、などの酵素活性を有する。細胞内タンパク質は、また、タンパク質の錯体を構成したり、タンパク質を細胞内のいろいろな場所に向けることに関与するドッキング・タンパク質として働き、生物の構造的な完全性を維持することに関与する。
【０１０４】
タンパク質を特徴づける際にますます重要になってきているコンセプトは、タンパク質の中で定められた機能を付与された１つ以上の構造モチーフの存在である。タンパク質の中に、タンパク質の酵素ドメインで見出されるきわめて保存的な配列の他に、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するきわめて保存的な配列が同定されている。例えば、Src-homology-2(SH2)ドメインはチロシン−リン酸化ターゲットに配列依存的な仕方で結合する。SH2ドメインと異なるPTBドメインも、チロシン−リン酸化ターゲットに結合する。SH3ドメインはプロリン・リッチなターゲットと結合する。さらに、ほんのいくつかあげただけでも、PHドメイン、テトラトリコペプチド反復ドメイン、及びWDドメインは，タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが示されている。これらのあるものはまた、リン脂質又はその他の第二メッセンジャーとの結合にも関与している。当業者には理解されるように、これらのモチーフはアミノ酸配列に基づいて同定できる；したがって、タンパク質の配列の分析は、分子の酵素潜在能及び／又はそのタンパク質が結びつく可能性がある分子についての洞察を提供する。有用なデータベースの１つはPfam(タンパク質ファミリーズ)であり、これは、よくあるタンパク質ドメインをカバーした配列マルチプル・アラインメント及び隠れマルコフ・モデルの大きなコレクションである。バージョンはインターネットによって、Washington University in St. Louis, Sanger Center in England,及びKarolinska Institute in Sweden から入手できる（例えば、Bateman, et al.(2000) Nuc. Acids Res. 28:263-266; Sonnhammer, et al.(1997) Proteins 28: 405-420; Bateman, et al.(1999) Nuc. Acids Res. 27:260-262; 及びSonnhammer, et al. (1998) Nuc. Acids Res. 26:320-322を見よ）。
【０１０５】
別の実施の形態では、肺がん配列は膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は細胞のリン脂質層に延びている分子である。これらの分子は細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、又はその両方を有する。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、既に細胞内タンパク質について述べたようないくつかの機能を有する。例えば、細胞内ドメインは酵素活性を有し、及び／又は別のタンパク質に対する結合部位として働く。しばしば、膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは両方の役割を果たす。例えば、いくつかのレセプター・チロシン・キナーゼはタンパク質キナーゼ活性とSH2ドメインの両方を有する。さらに、レセプター分子自体での自己リン酸化は，別のSH2ドメインを含むタンパク質に対する結合部位を生成する。
【０１０６】
膜貫通タンパク質は、１つ乃至多数の膜貫通ドメインを含む。例えば、レセプター・チロシン・キナーゼ、いくつかのサイトカイン・レセプター、レセプター・グアニリル・シクラーゼ、及びレセプター・セリン／トレオニン・タンパク質キナーゼは、単一の膜貫通ドメインを含む。しかし、チャンネル、ポンプ、アデニリル・シクラーゼなど他のいろいろなタンパク質は多数の膜貫通ドメインを含む。多くの重要な細胞表面レセプター、例えばGタンパク質結合レセプター（GPCRs）は、膜に拡がる７つの領域を含むため“７膜貫通ドメイン”と分類されている。膜貫通ドメインの特徴は、約17の連続する疎水性アミノ酸とそれに続く荷電アミノ酸である。したがって、ある特定タンパク質のアミノ酸配列を分析すると、タンパク質内部の膜貫通ドメインの位置説かずを予測できる（例えば、PSORTウエブサイトhttp://psort.nibb.ac.jp/を見よ）。
【０１０７】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは多様である；しかし、いろいろな細胞外ドメインには保存されるモチーフが繰り返し見出される。保存される構造及び／又は機能はいろいろな細胞外モチーフに帰着されている。多くの細胞外ドメインが他の分子との結合に関与している。ある様態では、細胞外ドメインはレセプターに見られる。レセプター・ドメインに結合する因子としては循環するリガンドがあり、これはペプチド、タンパク質、又はアデノシンなどの小さな分子である。例えば、EGF, FGF, 及びPDGFなどの成長因子は循環する成長因子であり、同類のレセプターと結合していろいろな細胞応答を開始させる。その他の因子としては、サイトカイン、ミトゲン因子、ホルモン、神経栄養因子などがあげられる。細胞外ドメインは、また、細胞に関連する分子と結合する。この点で、それらは細胞−細部相互作用を媒介することができる。細胞に関連するリガンドは、例えばグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーによって、細胞につながれることも、又はそれ自体が膜貫通タンパク質であることもある。細胞外ドメインは、また、細胞外マトリックスと結びついて細胞構造の維持に役立つこともある。
【０１０８】
膜貫通タンパク質である肺がんタンパク質は、ここで記述されるように細胞外免疫治療で容易にアクセスできる標的であるから、本発明では特に好ましいものである。さらに、以下で述べるように膜貫通タンパク質はまた、様相をイメージするのに有用である。抗体を用いてこのような容易にアクセスできるタンパク質にその場で、又は組織学的分析で、ラベルすることができる。あるいはまた、抗体によって細胞内タンパク質にラベルすることもできるが、その場合分析サンプルは普通透過性を高めて細胞内タンパク質にアクセスできるようにする。さらに、膜タンパク質を処理して可溶タンパク質を放出させるようにしたり、残りの断片を露出させたりすることができる。放出された可溶タンパク質は有用な診断マーカーになり、処理された残りのタンパク質断片が疾患の有用な肺マーカーになる。
【０１０９】
また、膜貫通タンパク質は、膜貫通配列を、例えば組み換え法で、除去することによって可溶にできることは当業者には理解されるであろう。さらに、可溶にされた膜貫通タンパク質は適当な信号配列を加えることによって組み換え手段で分泌されるようにすることができる。
【０１１０】
別の実施の形態では、肺がんタンパク質は分泌されるタンパク質であり、その分泌は構成性であるか又は調節される。これらのタンパク質は信号ペプチド又は信号配列を有し、それが分泌経路に分子を向ける。分泌されたタンパク質はいろいろな生理的な事象に関与する、例えば、循環している場合、しばしば信号を他のいろいろな細胞タイプに伝送する役目をする。分泌されたタンパク質は、autocrine様態（その因子を分泌した細胞に作用する）、paracrine様態（その因子を分泌した細胞のすぐ近くにある細胞に作用する）、内分泌（endocrine）様態（離れている細胞に、例えば血流に分泌されて、作用する）、又は外分泌（exocrine）様態（例えば、管を通して、又は隣接する上皮表面に、汗腺、皮脂腺、膵管、涙腺、乳腺、耳のsax生成腺、etc.）で機能する。こうして、分泌された分子はしばしばいろいろな生理的な側面を修飾し変化させるために用いられる。分泌されるタンパク質である肺がんタンパク質は、診断マーカーとして、例えば血液、血漿、血清、又は糞便テストで、良い標的になるので、本発明には特に好ましい。酵素であるものは抗体又は小さな分子標的である。その他のものは、例えばCTLメカニズムによって、ワクチン標的として有用である。
肺がん核酸の利用
上で述べたように、肺がん配列は最初に、ここで示される肺がん配列との実質的な核酸及び／又はアミノ酸配列の相同性又はリンケージによって同定される。このような相同性は核酸又はアミノ酸の全体配列に基づいており、一般に以下で述べるように相同性プログラム又はハイブリダイゼーション条件を用いて決定される。普通、あるmRNAでリンクされる配列は同じ分子で見出される。
【０１１１】
本発明の肺がん核酸配列、例えば表1A-16における配列、はもっと大きな遺伝子の断片であってもよい、すなわち、それらは核酸セグメントである。ここで言う“遺伝子”は、コーディング領域、非コーディング領域、及びコーディング領域と非コーディング領域の混合、を含む。したがって、当業者には理解されるように、本明細書で提供される配列を用いて、いずれかの方向に拡大された肺がん遺伝子の配列が、長い配列又は全長配列をクローニングするために当業者には公知の方法を用いて得られる；Ausubel, et al. 前出、を見よ。情報学（informatics）によって多くのことが可能であり、多くの配列を集めて、単一の遺伝子に対応する多数の配列を含むようにすることができる、例えばUniGeneなどのシステム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）。
【０１１２】
いったん肺がん核酸が同定されたら、それをクローニングし、必要なら、その構成部分を組み換えて肺がん核酸コーディング領域の全体、又はmRNA配列全体を形成することができる。天然の源から切り離されると、例えばプラスミドやその他のベクターに収められる、又は線形の核酸セグメントとしてそれから切り出されると、組み換え肺がん核酸は、他の肺がん核酸を、例えば延長されたコーディング領域を、同定し単離するためのプローブとしてさらに利用できる。また、それは、修飾された又は変異体肺がん核酸又はタンパク質を作るための“前駆体”核酸としても利用できる。
【０１１３】
本発明の肺がん核酸はいろいろな仕方で利用される。第１の実施の形態では、肺がん核酸に対する核酸プローブが作られ、バイオチップに取り付けられて、以下で述べるようなスクリーニング及び診断方法で使用される、又は、投与するために、例えば遺伝子治療に、RNAi、ワクチン、及び／又はアンチセンス用途で使用される。あるいはまた、肺がんタンパク質のコーディング領域を含む肺がん核酸を発現ベクターに入れて肺がんタンパク質を発現させて、やはりスクリーニングのために、又は患者に投与するために用いることができる。
【０１１４】
ある好ましい実施の形態では、肺がん核酸（図に示されている核酸配列及び／又はその相補体）に対する核酸プローブが作られる。バイオチップに取り付けられる核酸プローブは、肺がん核酸、すなわち、標的配列（サンプルの標的配列又は他のプローブ配列と、例えばサンドイッチ分析で）と実質的に相補的で、標的配列と本発明のプローブのハイブリダイゼーションが起こるように設計される。以下で述べるように、この相補性は完全でなくてもよい；いくつかの塩基対のミスマッチがあって、それが標的配列と本発明の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションに障害になってもよい。しかし、変異の数が非常に大きく、最もストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件でもハイブリダイゼーションが起こらない場合、その配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書における“実質的に相補的”という表現は、プローブが標的配列に対して十分相補的であって適当な反応条件の下で、特にここで示されるような高ストリンジェンシー条件の下で、ハイブリダイズすることを意味する。
【０１１５】
核酸プローブは一般に一本鎖であるが、一部分が一本鎖で一部分が二本鎖であってもよい。プローブが一本鎖であるか二本鎖であるかは、標的配列の構造、組成、及び性質によって決められる。一般に核酸プローブは長さが約8乃至約100塩基の範囲にあり、好ましくは約10乃至約80塩基の範囲、特に好ましくは約30乃至約50塩基の範囲、にある。すなわち、一般にORF's又は遺伝子全体の相補体は用いられない。いくつかの実施形態では、数百塩基に達する長さの核酸を用いることができる。
【０１１６】
ある好ましい実施の形態では、配列あたり２つ以上のプローブが用いられ、オーバラップするプローブ又は標的の異なる区間に対するプローブが用いられる。すなわち、１つの特定標的に対して、２つ、３つ、４つ以上のプローブが、好ましくは３つのプローブが、冗長さを組み込むように用いらる。プローブはオーバラップしても（すなわち、いくつかの配列が共通するように）、離れていてもよい。場合によっては、PCRプライマーを用いて信号を増幅し、感度を高めることもできる。
【０１１７】
当業者には理解されるように、核酸はいろいろな仕方で固体サポートに付着又は固定することができる。本明細書では、“固定される”及びその文法的等価物によって、核酸と固体サポートの間の結びつき又は結合が十分で、以下で述べるような結合、洗浄、分析、及び除去の条件の下で安定であることを意味する。結合は、普通、共有結合でも非共有結合でもよい。本明細書では、“非共有結合”及びその文法的等価物によって、普通、静電的、親水的、又は疎水的相互作用の１つ以上を意味する。非共有結合には、分子、例えばストレプトアビジンのサポートへの共有結合的な付着とビオチン化されたプローブのストレプトアビジンへの非共有結合が含まれる。本明細書では、“共有結合”及びその文法的等価物によって、２つの部分、固体サポートとプローブ、がシグマ結合、パイ結合、及び配位（coordination）結合、などの少なくとも１つの結合によって付着していることを意味する。共有結合は、プローブと固体サポートの間に直接形成されても、クロス・リンカーによって形成されても、固体サポートとプローブのいずれか、又は両方の分子に特定反応基を含めることによって形成されてもよい。固定化は、また、共有結合と非共有結合の組合せを用いてもよい。
【０１１８】
一般に、当業者には理解されるように、プローブはいろいろな仕方でバイオチップに付着される。ここで記述されるように、核酸を最初に合成して後でバイオチップに付着させることも、核酸をバイオチップ上で直接合成することもできる。
【０１１９】
バイオチップは適当な固体基板を含む。本明細書では“基板”又は“固体サポート”又は文法的等価物によって、核酸プローブの付着又は結びつきのために変形させることができ、少なくとも１つの検出方法に使用できる物質を意味する。しばしば、基板は、（ndivitual）仕切りと識別のために適当な離散的な個別サイトを含む。当業者には理解されるように、可能な基板の数は非常に大きく、次のようなものを含むがそれだけに限定されない：ガラス、修正又は機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、及びスチレンと他の物質のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン、etc.）、ポリサッカライド、ナイロン又は、ニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコンと修正シリコンなどシリカをベースとする物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、など。一般に、基板は光学的検出を可能にするものであり、認められるほどの蛍光を発しない。好ましい基板は、再使用可能な低蛍光プラスチックという表題の1999年3月15日出願の米国特許出願、U.S. Application Serial No. 09/270,214に記載されており、これは参照によって本明細書に全体が取り込まれる。
【０１２０】
一般に、基板は平面であるが、当業者には理解されるように、その他の形態の基板も使用できる。例えば、プローブをチューブの内側表面に配置してフロースルー・サンプル分析でサンプル量を最小にすることができる。同様に、基板は、特定プラスチックで作られる独立気泡を含むフレキシブル発泡材など、フレキシブルであってもよい。
【０１２１】
ある好ましい実施の形態では、バイオチップとプローブの表面が、その後の二者の付着のために化学的官能基で誘導体化される。したがって、例えばバイオチップは、それだけに限定されないが、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基及びチオール基などの化学的官能基で誘導体化されるが、アミノ基が特に好ましい。これらの官能基をもちいると、プローブはプローブ上の官能基を用いて付着させることができる。例えば、アミノ基を含む核酸はアミノ基を含む表面に、例えば当業者に公知のリンカーを用いて、例えば周知のホモ−又はヘテロ−二官能基リンカーを用いて、付着させることができる（1994 Pierce Chemical Companyカタログ、クロス・リンカーについての技術的なセクション、p. 155-200）。さらに、場合によっては、アルキル基（置換及びヘテロ・アルキル基を含む）などの追加のリンカーを用いることができる。
【０１２２】
この実施の形態では、オリゴヌクレオチドが合成された後、固体サポートの表面に付着される。5'又は3'末端が固体サポートに付着されるか、又は付着は内部ヌクレオシドにリンケージによって行われる。
【０１２３】
別の実施の形態では、固体サポートへの固定化は非常に強いけれども、非共有結合である。例えば、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドを作ってストレプトアビジンで共有結合で覆われた表面に結合させるという形で付着させることができる。
【０１２４】
あるいはまた、オリゴヌクレオチドを当業者に公知の仕方で表面に合成することもできる。例えば、光重合化合物及び方法を用いた光活性化法を用いることもできる。ある好ましい実施の形態では、公知のフォトリソグラフィー法、例えばWO 95/25116; WO 95/35505; U.S. Patent Nos. 5,700,637 and 5,445,934;及び引用されている参照文献；（これらは全て参照によりはっきりと組み込まれる）に記載されている方法によって核酸をその場で（in situ）合成することもできる；これらの付着方法が、Affymetrix GeneChip TM 法の基礎をなしている。
【０１２５】
しばしば、肺がん関連配列の発現レベルを測定するために増幅による分析が行われる。これらの分析は普通、逆転写と合わせて行われる。この分析で、肺がん関連核酸は増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、又はPCR）でのテンプレートとして用いられる。定量的な増幅では、増幅産物の量は元のテンプレートの量に比例する。適当な対照との比較によって肺がん関連RNAの量の測定値が得られる。定量的な増幅の方法は当業者には周知である。定量的なPCRの詳細な手順は、例えば、Innis, et al.(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applicationsに見られる。
ある実施の形態では、TaqManに基づく分析を用いて発現が測定される。TaqMan に基づく分析は、5'蛍光染料と3'停止剤を含む蛍光発生オリゴヌクレオチド・プローブを用いる。プローブはPCR産物とハイブリダイズするが、3'末端にブロッキング剤があるためにそれ自体は延長されない。PCR 産物がその後のサイクルで増幅されるとき、AmpliTaqなど、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性がTaqManプローブの開裂を生ずる。この開裂は5'蛍光染料と3'停止剤を分離し、その結果、増幅の関数として蛍光の増加が生ずる（例えば、Perkin-Elmerが提供している文献、例えばwww.2.perkin-elmer.comを見よ）。
【０１２６】
その他の適当な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace (1989)Genomics 4:560, Landegren, et al. (1988)Science 241:1077, 及びBarringer, et al. (1990) Gene 89:117）、転写増幅（Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173）、自己持続配列複製（Guatelli, et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、ドットPCR、及びリンカー・アダプターPCR、等があげられるが、それだけに限定されない。
核酸からの肺がんタンパク質の発現
ある好ましい実施の形態では、例えば肺がんタンパク質をコードする肺がん核酸を用いていろいろな発現ベクターを作り、以下で説明するように肺がんタンパク質を発現させて、それをスクリーニング分析で用いることができる。発現ベクターと組み換えDNAテクノロジーは当業者には周知であり（例えば、Ausubel, 前出、及びFernandez and Hoeffler (eds. 1999) Gene Expression Systemを見よ）、それを用いてタンパク質が発現される。発現ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであるか、又は宿主ゲノムに統合されるベクターである。一般に、これらの発現ベクターには、転写及び翻訳調節核酸が肺がんタンパク質をコードする核酸に操作的にリンクされて含まれている。“制御配列”という用語は、特定の宿主生物で操作的にリンクされているコーディング配列の発現のために用いられるDNA配列を指す。例えば原核生物に適当な制御配列は、プロモーター、オプションとしてオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化信号、及びエンハンサーを含む。
【０１２７】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置されているとき、“操作的にリンクされ”ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドのDNAと操作的にリンクされている；プロモーター又はエンハンサーはあるコーディング配列の転写に影響を及ぼすとき、そのコーディング配列と操作的にリンクされている；又は、リボソーム結合部位は、あるコーディング配列の翻訳を助けるとき、そのコーディング配列と操作的にリンクされている。一般に、“操作的にリンクされる”とは、リンクされているDNA配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接してリーディング・フェーズ（reading phase）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。リンキングは普通、適当な制限部位での結紮によって行われる。そのような部位が存在しない場合、合成のオリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常のやり方で用いる。転写及び翻訳調節核酸が、一般に、肺がんタンパク質を発現させるために用いられる宿主細胞に適当である。多くのタイプの適当な発現ベクター、及び適当な調節配列がいろいろな宿主細胞に関して当業者には公知である。
【０１２８】
一般に、転写及び翻訳調節核酸は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンハンサー又はアクチベーター配列、などを含むが、それだけに限定されない。ある好ましい実施の形態では、調節配列は、プロモーターと転写開始及び停止配列を含む。
【０１２９】
プロモーター配列は、構成性又は誘導性プロモーターである。プロモーターは天然に見られるプロモーター又はハイブリッド・プロモーターである。２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッド・プロモーターも当業者には公知であり、本発明において有用である。
【０１３０】
さらに、発現ベクターは他のエレメントを含むこともできる。例えば、発現ベクターは２つの複製システムを有し、２つの生物で維持することが、例えば哺乳類又は昆虫細胞で発現させ、原核宿主でクローニングと増幅することが可能である。さらに、発現ベクターを統合するために、発現ベクターはしばしば、宿主細胞のゲノムと相同な配列を少なくとも１つ含み、好ましくは発現構成物に横付けされる２つの相同配列を含む。統合するベクターは適当な相同配列を選んでベクターに包含することによって宿主細胞の特定の座に向けられる。統合するベクターのための構成物は当業者には公知である（例えば、Fernandez and Hoeffler, 前出）。
【０１３１】
さらに、ある好ましい実施の形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択できるようにするために選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業者には周知であり、用いる宿主細胞によって異なる。
【０１３２】
本発明の肺がんタンパク質は、通常、肺がんタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を適当な条件の下で培養して肺がんタンパク質の発現を発生又は誘導することによって生成される。肺がんタンパク質の発現に適当な条件は、発現ベクターと宿主細胞の選択によって異なり、当業者は日常的な実験又は最適化によってその条件を容易に確認できる。例えば、発現ベクターにおいて構成性プロモーターを使用するためには宿主細胞の成長と増殖の最適化が必要になるが、誘導性のプロモーターを使用する場合は適当な成長条件が誘導のために必要である。さらに、ある実施の形態では、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞での発現に用いられるバキュロウイルス・システムは溶解ウイルスであり、収穫時期の選択が産物の収率にとって決定的に重要になる。
【０１３３】
適当な宿主細胞としては、酵母、バクテリア、原始バクテリア、菌類、及び昆虫と哺乳類細胞を含む動物細胞、があげられる。特に有益なのは、Saccharomyces cerevisiaeとその他の酵母、E. coli, Bacillus subtilis, Sf9 細胞、C129細胞、293細胞、Neurospora, BHK, CHO, COS, Hela 細胞、HUVEC(ヒト臍静脈上皮細胞)、THP1細胞（マクロファージ細胞系統）及びいろいろなその他のヒト細胞及び細胞系統、である。
【０１３４】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質は哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現システムも当業者に公知であり、レトロウイルス及びアデノウイルス・システムを含む。哺乳類プロモーターとして特に有用なのは哺乳類ウイルス遺伝子である。ウイルス遺伝子はしばしば強く発現され、宿主の範囲が広いからである。例としては、SV40アーリー・プロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス・メジャー・レート・プロモーター、ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・プロモーター、及びCMVプロモーターなどがあげられる（例えば、fernandez and Hoeffler, 前出、を見よ）。普通、哺乳類細胞が認識する転写停止及びポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンに対し3'に位置する調節領域であり、プロモーター・エレメントと共にコーディング配列に横付けされている。転写ターミネーターとポリアデニル化信号の例としてはSV40から得られるものがあげられる。
【０１３５】
外来の核酸を哺乳類宿主、ならびに他の宿主、に導入する方法は当業者には周知であり、用いる宿主細胞によって異なる。方法としては、デキストランに媒介される形質移入、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレンに媒介される形質移入、原形質融合、電気穿孔、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポゾームへの封入、及びDNAの核舳の直接顕微注入、などがある。
【０１３６】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質はバクテリア・システムで発現される。バクテリオファージからのプロモーターも使用することができ、当業者には公知である。さらに、合成プロモーター及びハイブリッド・プロモーターも使用できる；例えば、tacプロモーターはtrpとlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、バクテリア・プロモーターは、バクテリアのRNAポリメラーゼと結合し転写を開始できる能力をもつ天然の非バクテリア起源のプロモーターを含むことができる。機能するプロモーター配列の他に、効果的なリボソーム結合部位も望ましい。発現ベクターはまた、バクテリアにおける肺がんタンパク質の分泌を可能にする信号ペプチド配列も含むことができる。タンパク質は成長媒質に分泌されるか（グラム陽性バクテリア）、又は細胞の内側と外側の膜の間の周辺質スペース二分泌される（グラム陰性バクテリア）。バクテリア発現ベクターはまた、形質転換されたバクテリアの系統を選択することを可能にする選択マーカー遺伝子を含むこともできる。適当な選択遺伝子としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンなどの薬剤に対する耐性をバクテリアに与える遺伝子があげられる。選択マーカーは、また、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン生合成経路にあるもの、を含む。これらの成分が発現ベクターに組み込まれる。バクテリアの発現ベクターは当業者には周知であり、特にBacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris, 及びStreptococcus lividansのベクターなどがある（例えば、Fernanndez and Hoeffler, 前出）。バクテリア発現ベクターは、バクテリア宿主細胞に当業者に周知の方法によって、例えば塩化カルシウム処理、電気穿孔、などによって形質転換される。
【０１３７】
ある実施の形態では、肺がんタンパク質は昆虫細胞で生成される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイルスによる発現ベクターは当業者に周知である。
【０１３８】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質は酵母細胞で生成される。酵母発現システムは当業者に周知であり、Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis とK. lactis, Pichia guillerimondii とP. pastoris, Schizosaccharomyces pombe, 及びYarrowia lipolyticaの発現ベクターなどがある。
【０１３９】
肺がんタンパク質は、また、融合タンパク質として当業者に周知の方法を用いて生成することもできる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を生成するために、所望のエピトープが小さい場合、肺がんタンパク質をキャリア・タンパク質と融合させて免疫原を形成することができる。あるいはまた、肺がんタンパク質は、アフィニティー精製のため又はその他の理由により発現を増加させるために融合タンパク質として作ることができる。例えば、肺がんタンパク質が肺がんペプチドである場合、発現のためにそのペプチドをコードする核酸を他の核酸にリンクさせることができる。
【０１４０】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質は発現の後、精製又は単離される。肺がんタンパク質はいろいろな仕方で精製又は単離することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動的、分子的、免疫的、クロマトグラフィー的方法があり、イオン交換、疎水性、アフィニティー、及び逆相HPLCクロマトグラフィー、及びクロマトフォーカシングなどがある。例えば、肺がんタンパク質は標準的な抗肺がんタンパク質抗体カラムを用いて精製することができる。限外濾過及び膜分離濾過を、タンパク質濃縮化と合わせて用いることもできる。適当な精製技術に関する一般的な指針としては、Scopes(1982) Protein Purification を見よ。必要な精製の度合いは、葉尾含タンパク質の用途によって異なる。場合によっては、精製の必要は全くない。
【０１４１】
発現され、必要ならば精製された後、肺がんタンパク質と核酸はいくつかの用途で有用である。それらは、免疫選択試薬として、ワクチン試薬として、スクリーニング剤、治療薬として、抗体の生成のために、転写又は翻訳阻害剤として使用できる。
肺がんタンパク質の変異体
ある実施の形態では、肺がんタンパク質は、野生タイプ配列に対して誘導体又は変異体肺がんタンパク質である。すなわち、以下で詳しく述べるように、誘導体肺がんペプチドはしばしば少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含み、アミノ酸置換が特に好ましい。アミノ酸置換、欠失、又は挿入は肺がんペプチドの中の特定の残基で起こることがある。
【０１４２】
本発明の肺がんタンパク質のある実施の形態には、アミノ酸配列変異体も含まれる。これらの変異体は普通、次の３つのクラス：すなわち、置換、挿入、又は欠失変異体、の１つ以上に入る。変異体は、通常、肺がんをコードするDNAのヌクレオチドのカセット又はPCR突然変異油発その他の方法による部位特異的な突然変異誘発によって変異体をコードするDNAを生成し、その後上述のように組み換え細胞培養においてDNAを発現させることにより調製される。しかし、約100-150までの残基を有する変異体肺がんタンパク質断片がin vitro合成によって調製できる。アミノ酸配列変異体は、変異が予め決まっているという特徴があり、この特徴によって天然に見られる肺がんタンパク質のアミノ酸配列の対立形質的又は種間の変動から区別される。変異体は普通天然に見られる類似体と定性的に同様な生物学的活性を示すが、以下で詳しく述べるように修飾された特性を有する変異体を選択することもできる。
【０１４３】
アミノ酸配列の変化を導入する部位又は領域はしばしば予め決まっているが、突然変異自体は予め決まっている必要はない。例えば、ある与えられた部位における突然変異の性能を最適化するために、ランダム突然変異を標的部位又は領域で行って、発現された肺がんタンパク質変異体をスクリーニングして所望の活性の最適な組合せを見つけることができる。配列が知られているDNAにおいて予め定められた部位で置換突然変異を行う方法がある、例えば、M13プライマー突然変異誘発及びPCR突然変異誘発、である。突然変異体のスクリーニングは、しばしば肺がんタンパク質活性の分析によって行われる。
【０１４４】
アミノ酸置換は、普通、単一残基の置換である；挿入は、通常、約1乃至20アミノ酸のオーダーであるが、それよりかなり大きな挿入も場合によって許される。欠失は一般に約1乃至約20残基の範囲にあるが、場合によっては欠失はずっと大きい。
【０１４５】
置換、欠失、挿入、又はその任意の組合せを用いて最終的な誘導体に到達することができる。一般に、分子の変化を最小にするために、これらの変更は数アミノ酸で行われる。状況によってはもっと大きな変更も許容されることがある。肺がんタンパク質の特性の小さな変化が望まれる場合、一般に置換が、定義のセクションで示されたアミノ酸置換チャートにしたがって行われる。
【０１４６】
変異体は普通、定性的には本質的に同じ生物的活性を示し、天然に見られる類似体と同じ免疫応答を誘発するが、肺がんタンパク質の特性を必要に応じて変改するように変異体を選ぶこともできる。あるいはまた、肺がんタンパク質の生物的活性を変化させるように変異体を設計又は再組織することができる。例えば、グリコシル化部位を付加、変更、又は除去することができる。
【０１４７】
肺がんポリペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲に含まれる。共有結合修飾の１つのタイプは、肺がんポリペプチドの標的アミノ酸残基を、肺がんポリペプチドの選ばれた側鎖又はN-又はC-末端残基と反応できる有機誘導体化物質と反応させることである。二官能基物質による誘導体化は、肺がんポリペプチドを水に不溶の支持マトリックスに架橋させて以下で詳しく述べるように抗肺がんポリペプチド抗体を精製する方法又はスクリーニング分析で使用するのに有用である。よく用いられる架橋物質としては、1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルデヒド、N-ヒドロキシスクシニミド・エステル、例えば、4-アジドサリチル酸によるエステル、ホモ二官能性イミドエステル、例えば3,3'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジル・エステル、二官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタン、及びメチル-3-（（p-アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミデートなどの物質があげられる。
【０１４８】
その他の修飾としては、グルタミニル及びアスパラギニル残基を、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に変える脱アミド化、プロリンとセリンのヒドロキシル化、セリニル、トレオニル、又はチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のγ−アミノ基のメチル化（Creighton (1983) Proteins: Structure and Molecular Properties, pp. 79-86）、N-末端アミンのアセチル化、及びC-末端カルボキシル基のアミド化、などがあげられる。
【０１４９】
本発明に包含される肺がんポリペプチドの共有結合修飾の別のタイプとしては、ポリペプチドの本来のグリコシル化パタンの変更がある。本明細書における、“本来のグリコシル化パタンの変更”とは、本来の配列の肺がんポリペプチドの１つ以上の炭化水素部分の付加又は欠失を意味する。グリコシル化パタンはいろいろな仕方で変更できる。例えば、肺がん関連配列を発現させるのに異なる細胞を用いると異なるグリコシル化パタンが得られる。
【０１５０】
肺がんポリペプチドへのグリコシル化部位の付加も、そのアミノ酸配列を変えることによって行われる。この変更は、例えば、本来の配列の肺がんポリペプチドに対する１つ以上のセリン又はトレオニン残基の付加、又は置換によって行われる（O-リンクされたグリコシル化部位）。オプションとして、肺がんアミノ酸配列はDNAレベルでの変化によって、特に肺がんポリペプチドを予め定められた塩基で突然変異させて所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成するという仕方で変更することができる。
【０１５１】
肺がんポリペプチドの炭化水素部分の数を増加させる別の方法は、ポリペプチドにグリコシドを化学的又は酵素的に結合させるものである。このような方法は、当業者には、例えばWO 87/05330に、及びAplin and Wriston (1981)CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306に記載されている。
【０１５２】
肺がんポリペプチドに存在している炭化水素部分の除去は、化学的又は酵素的に、又はグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異による置換によって、行われる。化学的な脱グリコシル化の方法は当業者に公知であり、例えばHakimuddin, et al.(1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52及びEdge, et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131に記載されている。ポリペプチドの炭化水素部分の開裂は、Thotakura, et al.(1987) Meth. Enzymol., 138:350に記載されているようないろいろなendo-及びexo-グリコシダーゼを用いて実行できる。
【０１５３】
別のタイプの肺がんの共有結合による修飾は、肺がんポリペプチドをいろいろな非タンパク質ポリマーの１つ、例えばポリエチレン・グリコール、ポリプロピレン・グリコール、又はポリオキシアルキレン、と、U.S.Patent Nos. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670, 417, 4,791,192, 又は4,179,337に記載されているような仕方でリンクさせることである。
【０１５４】
本発明の肺がんポリペプチドは、また、肺がんポリペプチドが別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合された形のキメラ分子を形成するという仕方で修飾することもできる。ある実施の形態では、このようなキメラ分子は肺がんポリペプチドとタグ・ポリペプチドの融合を含み、それが抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープ（抗原決定基）を与える。このエピトープ・タグは一般に肺がんポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に配置される。このような肺がんポリペプチドのエピトープ・タグ形態の存在はタグ・ポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。また、エピトープ・タグを設けることで、肺がんポリペプチドをエピトープ・タグに結合する抗タグ抗体又は別のタイプのアフィニティー・マトリックスを用いたアフィニティー精製によって容易に精製することが可能になる。別の実施の形態では、キメラ分子は肺がんポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンのある特定領域との融合から成る。キメラ分子の二価形態のためには、この融合をIgG分子のFc領域との間で行うことができる。
【０１５５】
いろいろなタグ・ポリペプチドとそれぞれの抗体は周知であり、例えば、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；HIS6及び金属キレーション・タグ、flu HAタグ・ポリペプチド及びその抗体12CA5（Field, et al.(1988) Mol. Cell Biol. 8: 2159-2165；c-mycタグとそれに対する抗体8F9, 3C7, 6E10, G4, B7及び9E10（Evan, et al(1985) Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616）；及びHerpes Simplex ウイルス・グリコプロテインD（gD）タグとそれに対する抗体（Poborsky, et al. (1990) Protein Engineering 3(6):547-553）。その他のタグ・ポリペプチドとしては、Flag-ペプチド（Hopp, et al. (1988) Biotechnology 6:1204-1210）；KT3エピトープ・ペプチド（Martin, et al.(1992) Science 255:192-194）；チューブリン・エピトープ・ペプチド（Skinner, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:15163-15166）；及びT7 遺伝子10タンパク質ペプチド・タグ（Lutz-Freyermuth, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397）、などがある。
【０１５６】
肺がんファミリーのその他の肺がんタンパク質、及び以下で述べるようにクローニングされ発現される他の生物からの肺がんタンパク質、も含まれる。したがって、プローブ又は縮退ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー配列を用いて霊長類やその他の生物からその他の関連肺がんタンパク質を見つけることができる。当業者には理解されるように、特に有用なプローブ及び／又はプライマー配列として、肺がん核酸配列のユニークな部分がある。一般に当業者に公知であるが、好ましいPCRプライマーは長さが約15乃至約35ヌクレオチドであり、さらに好ましくは約20乃至約30であり、必要に応じてイノシンを含む。PCR反応条件は当業者には周知である（例えば、Innis, PCR Protocols, 前出）。
肺がんタンパク質に対する抗体
ある好ましい実施の形態では、例えば免疫治療又は免疫診断のために、肺がんタンパク質を用いて抗体を生成しようとするとき、肺がんタンパク質は全長のタンパク質トスも１つのエピトープ又は決定因子を共有しなければならない。ここで“エピトープ”又は“決定因子”とは、普通、MHCの文脈での抗体又はT-細胞レセプターを生成及び／又は結合するタンパク質の部分を意味する。ほとんどの場合、小さな肺がんタンパク質に対して作られた抗体が全長のタンパク質、特に線形エピトープに結合することができる。ある好ましい実施の形態では、エピトープはユニークである；すなわち、ユニークなエピトープに対して生成された抗体は、ほとんど全く交差感受性を示さない。
【０１５７】
ポリクローナル抗体を調製する方法は周知である（例えば、Coligan, 前出；及びHarlow and Lane, 前出）。ポリクローナル抗体は、免疫化物質及び、望ましい場合、アジュバントを１回以上注入することによって哺乳類に生み出すことができる。普通、免疫化物質及び／又はアジュバントは、哺乳類に複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳類に注入される。免疫化物質は、表1A-16の核酸によってコードされるタンパク質又はその断片又はその融合タンパク質を含む。免疫化物質を免疫化している哺乳類で免疫原性があることが知られているタンパク質と結合することも有効である。免疫原性があるタンパク質としては、例えば、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・チログロブリン、及びダイズ・トリプシン阻害因子、などがあげられる。アジュバントとしては、例えば、Freundの完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント（モノホスフォリル・リピッドA、合成トレハロース・ジコリノミコレート）などがあげられる。免疫化の手順は当業者によって選択される。
【０１５８】
あるいはまた、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体はKohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載されているようなハイブリドーマ法によって調製できる。 ハイブリドーマ法では、普通、マウス、ハムスター、その他の適当な宿主動物が、免疫化物質によって免疫化されて、その免疫化物質に特異的に結合する抗体を産生する、又は産生できる、リンパ球を誘発する。あるいはまた、リンパ球をin vitroで免疫化することもできる。免疫化物質は、普通、表の核酸がコードするポリペプチド、又はその断片、又はその融合タンパク質、を含む。一般に、ヒト起源の細胞が望ましい場合は末梢血液リンパ球（“PBLs”）が用いられ、ヒト以外の哺乳類のソースが望ましい場合は脾臓細胞又はリンパ節細胞が用いられる。次に、リンパ球は不死化された細胞ラインと適当な融合剤、例えばポリエチレン・グリコール、を用いて融合されてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding(1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103）。不死化された細胞ラインは通常、形質転換された哺乳類細胞、特に齧歯類、ウシ、又は霊長類を起源とする脊髄腫細胞、である。通常、ラット又はマウスの脊髄腫細胞が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合されない不死化された細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の物質を含む適当な培地で培養できる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチン−グアニン−ホスフォリボシル−トランスフェラーゼ（HGPRT又はHPRT）を欠いている場合、ハイブリドーマの培地は普通、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（“HAT培地”）、これらの物質がHGPRT欠乏細胞の成長を阻害する。
【０１５９】
ある実施の形態では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は普通モノクローナルの、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、又は同じ抗原上の２つのエピトープに結合特異性を有する、好ましくはヒト抗体又は人化された抗体である。ある実施の形態では、結合特異性の１つは表の核酸によってコードされるタンパク質又はその断片に対するものであり、他の１つは他の何らかの抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプター・サブユニット、に対するもの、好ましくは腫瘍特異的なものである。あるいはまた、四量体タイプのテクノロジーで多価の反応物質が作り出される。
【０１６０】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質に対する抗体は、裸の形の又はエフェクター部分に結合した肺がんタンパク質の生物的機能を低下又は除去することができる。すなわち、肺がん組織（又は肺がんを含む細胞）に対して抗肺がんタンパク質抗体（ポリクローナル、又は好ましくはモノクローナル）を加えると肺がんが減少又は消失する。一般に，活性、成長、サイズなどの少なくとも25%の減少が好ましく、少なくとも約50%の減少が特に好ましく、約95-100%の減少が特別に好ましい。
【０１６１】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質に対する抗体は人化された抗体である（例えば、Xenerex Bioscience, Medarex, Inc., Abgenix, Inc., Protein Design Labs, Inc.）。ヒト以外の（例えば、マウスの）抗体の人化された形は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 又は抗体のその他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子で、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含むものである。人化された抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、レシピエントの相補決定領域（CDR）からの残基が、所望の特異性、アフィニティー、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種のCDRからの残基（ドナー抗体）によって置き換えられている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が対応する非ヒト残基で置き換えられる。人化された抗体は、また、レシピエント抗体にも、導入されたCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基も含むことがある。一般に、人化された抗体は、少なくとも１つの、普通は２つの、可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでCDR領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、フレームワーク（FR）領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。人化された抗体は、また、最適には普通、免疫グロブリンの定常領域（Fc）の少なくとも一部、普通ヒト免疫グロブリンのそれを含む（Jones, et al. (1986) Nature 332:522-525; Riechmann, et al. (1988) Nature 332:323-329; 及びPresta (1992) Curr. Op. Strct. Biol. 2:593-596）。人化はWinterと共同研究者の方法に従って（Jones, et al. (1986) Nature 332:522-525; Riechmann, et al. (1988) Nature 332:323-329; Verhoeyen, et al.(1988) Science 239:1534-1536）、齧歯類のCDRs又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に代えることによって行うことができる。したがって、このような人化された抗体はキメラ抗体であり（U.S. Patent No. 4,816,567）、無傷のヒト可変ドメインより実質的に小さな部分が非ヒト種からの対応する配列に代えられている。
【０１６２】
ヒト様（human-like）抗体も、ファージ・ディスプレー・ライブラリー（Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol. 227: 381; Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581）など、当業者に公知のいろいろな方法によって生成することができる。Cole, et al. 及びBoerner, et al.の方法も、ヒト・モノクローナル抗体の調製に利用できる（Cole, et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77; and Boerner, et al. (1991) J. Immunol. 147(1):86-95）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンの座を遺伝子導入マウス、例えば内生的な免疫グロブリン遺伝子が部分的に又は完全に不活性化されたマウス、に導入して作ることができる。抗原を投与すると、ヒト抗体の産生が観測されるが、それは遺伝子の再配置、組立及び抗体のレパートリーを含めて、ほとんど全ての点でヒトで見られるものと非常によく似ている。このアプローチは、例えば、U.S.Patent Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 及び以下の科学文献に記載されている；Marks, et al.(1972) Bio/Technology 10:779-783; Lonberg, et al. (1994) Nature 368: 856-859; Morrison (1994) Nature 368: 812-13; Fishwild, et al. (1996)Nature Biotechnology 14: 845-51; Neuberger (1996) Nature Biotechnology 14:826; 及びLonberg and Huszar (1995)Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93。
【０１６３】
免疫治療とは、肺がんタンパク質に対して生成された抗体による肺がんの治療を意味する。本明細書で用いる場合、免疫治療は受動的又は能動的である。本明細書で定義される受動的免疫治療とは、レシピエント（患者）に抗体及び／又はT-細胞応答を誘発することである。免疫応答の誘発は、抗体が生成される抗原をレシピエントに与えた結果である。抗原は、それに対する抗体を生成したいと望むポリペプチドをレシピエントに注射することによって、又はレシピエントに抗原を発現できる核酸を、抗原を発現する条件の下で接触させることによって与えられ、それが免疫応答につながる。
【０１６４】
ある好ましい実施の形態では、それに対する抗体が生成される肺がんタンパク質は、上述のような分泌されるタンパク質である。理論には拘束されないが、治療のために用いられる抗体は分泌されるタンパク質に結合して、それがレセプターに結合するのを妨げ、分泌される肺がんタンパク質を不活性化するのであろう。
【０１６５】
別の好ましい実施の形態では、それに対する抗体が生成される肺がんタンパク質は膜貫通タンパク質である。理論には拘束されないが、治療のために用いられる抗体は肺がんタンパク質の細胞外ドメインに結合して、それが他のタンパク質、例えば循環するリガンド又は細胞に関連する分子、と結合するのを妨げる。抗体は、膜貫通肺がんタンパク質のダウンレギュレーションを引き起こすであろう。抗体は、肺がんタンパク質の細胞外ドメインと結合するタンパク質に対する競合的、非競合的又は未競合的阻害因子になるであろう。抗体は肺がんタンパク質の拮抗因子となるか、又は膜貫通肺がんタンパク質の活性化を妨げるか、又は特定の細胞経路を誘発又は抑制する可能性がある。ある実施の形態では、抗体が肺がんタンパク質への他の分子の結合を妨げるとき、抗体はその細胞の成長を妨げる。抗体は、また、細胞を、例えばそれだけに限定されないが、TNF-α, TNF-β, IL-1, INF-γ,及びIL-2,などの細胞毒性物質、又は5FU, ビンブラスチン、アクチノマイシンD, シスプラチン、メトトレキセート、などの化学療法剤、に向ける又は敏感化するために用いられる。場合によっては、抗体は膜貫通タンパク質と錯体になったときに血清補体を活性化するサブタイプに属し、それによって細胞毒性又は抗原依存的な細胞毒性（ADCC）を媒介する。したがって、肺がんは膜貫通肺がんタンパク質に向けられた抗体を患者に投与することによって治療される。抗体標識は、補毒素（co-toxin）を活性化したり、毒素のペイロード（payload）を局在化したり、又はその他の仕方で細胞を局所的に切除する手段を与える。
【０１６６】
別の好ましい実施の形態では、抗体はエフェクター部分に結合される。エフェクター部分は、放射性ラベルや蛍光ラベルなどの標識部分を含むいろいろな分子である可能性があり、又は治療部分である可能性もある。ある様態では、治療部分は肺がんタンパク質の活性を修飾する小さな分子である。別の様態では、治療部分は肺がんタンパク質に関連した又はすぐ近くにある分子の活性を修飾する。治療部分は、肺がんに関連したプロテアーゼ又はコラゲナーゼ活性などの酵素又は信号活性を阻害する。
【０１６７】
ある好ましい実施の形態では、治療部分はまた、細胞毒性物質である。この方法では、細胞毒性物質を肺がん組織又は細胞に向ける結果，病んでいる細胞の数が減少し、肺がんに関連した症状が軽減する。細胞毒性物質は数多く多様であり、細胞毒性薬剤又は毒素又はそのような毒素のアクティブな断片を含むが、それだけに限定されない。適当な毒素と対応する断片としては、ジフテリアA鎖、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン、サポリン、オーリスタチン、などがあげられる。細胞毒性物質としては、また、肺がんタンパク質に対して生成された抗体に放射性同位元素を結合して、又は抗体に共有結合で付着されたキレート剤に放射性核種を結合して作られた放射性化学物質が含まれる。治療部分を膜貫通肺がんタンパク質に向けることは、肺がんで病んでいる区域における治療部分の局所濃度を高めるだけでなく、振り向けられない治療部分に関連した有害な副作用を減少させることにもなる。
【０１６８】
別の好ましい実施の形態では、それに対する抗体が生成される肺がんタンパク質は細胞内タンパク質である。この場合、抗体は細胞への進入を容易にするタンパク質その他のものに結合される。ある場合には、抗体はエンドサイトーシスによって細胞へ進入する。別の実施の形態では、抗体をコードする核酸が個体又は細胞に投与される。さらに、肺がんタンパク質が細胞内部で的を絞ることが、例えば核に、できる場合、向けられる抗体がその標的の場所への信号を、すなわち、核局在化信号を含むようにすることができる。
【０１６９】
本発明の肺がん抗体は、肺がんタンパク質に特異的に結合する。“特異的に結合する”とは、本明細書では、抗体がそのタンパク質に少なくとも約0.1 mMというKdで、普通は少なくとも約1 μMというKdで、好ましくは少なくとも約0.1 μM以上というKdで、最も好ましくは0.01 μM以上というKdで、結合することを意味する。特定の標的に結合し関連する他の配列に結合しないという選択性も重要である。
診断及び治療への応用のための肺がん配列の検出
ある様態では、遺伝子のRNA発現レベルが肺がん表現型のいろいろな細胞状態に関して決定される。遺伝子の発現レベルが、正常組織（例えば、肺がんになっていない）、肺がん組織（場合によっては、以下で述べるように、予後に関連する肺がんのいろいろな重篤度に関して）、又は非悪性疾患について評価され、発現プロフィールが得られる。ある特定細胞状態又は進行点でのいし発現プロフィールは、本質的に、その細胞状態の“指紋”である。２つの状態である特定の医師が同じように発現されることはあるが、いくつかの遺伝子を同時に評価するとその細胞の状態を反映する遺伝子発現プロフィールを生成することができる。異なる状態にある発現プロフィールを比較することにより、それらの状態の各々でどの遺伝子が（遺伝子のアップ−及びダウン−レギュレーションも含めて）重要であるかという情報が得られる。すると、ある組織サンプルが正常な組織又はがん組織のどちらの遺伝子発現プロフィールを示しているかを決定して診断を行ったり確認することができる。これによって、関連する状態の分子診断が可能になる。
【０１７０】
“差動的発現”又はその文法的等価物は、本明細書で用いられる場合、細胞及び組織の内部及び間での時間的及び／又は細胞による遺伝子発現パタンの定性的又は定量的な差異を指す。すなわち、差動的に発現される遺伝子は、その発現が定性的に、例えば活性化又は不活性化を含めて、変化することが可能である。遺伝子は、ある特定の状態で別の状態に比べてオン又はオフになり、それによって２つ以上の状態の比較が可能になる。定性的に調節される遺伝子は、ある状態又は細胞タイプにおいて標準的な方法で検出できる発現パタンを示す。いくつかの遺伝子は、ある状態又は細胞タイプで発現されるが、両方では発現されない。あるいはまた、発現の差異が、例えば、発現が増加又は減少するという形で定量的であることもある；すなわち、遺伝子発現はアップレギュレートされて転写の量が増加するか、又はダウンレギュレートされて転写の量が減少する。発現が異なる度合いは、以下で述べるような標準的な特性測定法によって、例えばAffymetrix GeneChip TM 発現アレー、Lockhart(1996) Nature Biotechnology 14:1675-1680（参照によって明示して本明細書に組み込まれる）を用いて、十分に定量化できればよい。その他の方法としては、例えば、定量リバース・トランスクリプターゼPCR、ノーザン分析、及びRNAseプロテクションなどがあるが、それだけに限定されない。上述したように、好ましくは発現の変化は（すなわち、アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）普通少なくとも約50%,さらに好ましくは少なくとも約100%, さらに好ましくは少なくとも約150%, さらに好ましくは少なくとも約200%, 300乃至少なくとも1000%が特に好ましい。
【０１７１】
評価は遺伝子転写レベル又はタンパク質レベルで行われる。遺伝子発現の量は遺伝子転写物の等価RNA又はDNAに対する核酸プローブを用いてモニターされ、遺伝子発現レベルの定量化が行われる。あるいはまた、最終的な遺伝子産物（タンパク質）自身を、例えば、肺がんタンパク質に対する抗体と標準的な免疫分析（ELISA、など）によって、又は質量分析法、2Dゲル電気泳動分析、など他の方法によって、モニターすることもできる。肺がん遺伝子に対応するタンパク質、例えば肺がん又は疾患表現型で重要なものと同定されたタンパク質、を肺がん診断試験で評価することができる。ある好ましい実施の形態では、遺伝子発現モニタリングがいくつかの遺伝子について同時に行われる。
【０１７２】
肺がん核酸プローブを本明細書で上述したようにバイオチップに取り付けて特定細胞における肺がん配列を検出し定量化することができる。この分析は、以下で実施例においてさらに詳しく述べる。PCR法を用いて感度を高めることができる。多重タンパク質発現モニタリングも行うことができる。同様に、これらの分析を個体ベースでも行うことができる。
【０１７３】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質をコードする核酸が検出される。肺がんタンパク質をコードするDNA又はRNAを検出することができるが、特に関心がもたれるのは、肺がんタンパク質をコードするmRNAを検出する方法である。mRNAを検出するプローブは、そのmRNAと相補的でそれとハイブリダイズするヌクレオチド／デオキシヌクレオチド・プローブであり、例えばオリゴヌクレオチド、cDNA又はRNAであるが、それだけに限定されない。プローブはまた、ここで定義されたような検出できるラベルを含まなければならない。ある方法では、mRNAは、調べようとする核酸をナイロン膜などの固体サポートに固定し、プローブをサンプルとハイブリダイズした後に検出される。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後に、ラベルが検出される。別の方法では、mRNAの検出はその場で（in situ）行われる。この方法では、透過性にされた細胞又は組織サンプルに、検出できるようにラベルされた核酸プローブを、プローブが標的mRNAとハイブリダイズするのに十分な時間接触させる。非特異的に結合したプローブを除去するために洗浄した後に、ラベルが検出される。例えば、肺がんタンパク質をコードするｍRNAと相補的な、ジゴキシゲニンでラベルされたリボプローブ（RNAプローブ）が、ジゴキシゲニンを抗ジゴキシゲニン二次抗体と結合させ、ニトロブルー・テトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル・ホスフェートで現像して検出される。
【０１７４】
ある好ましい実施の形態では、本明細書で記載された３つのタンパク質のクラス（分泌される、膜貫通、又は細胞内）からのいろいろなタンパク質が診断分析で用いられる。肺がんタンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び肺がん配列を含む細胞が、診断分析に用いられる。これは個別の遺伝子又は対応するポリペプチド・レベルで行うことができる。ある好ましい実施の形態では、発現プロフィールが、好ましくは高スループットのスクリーニング方法と合わせて用いられて、発現プロフィール遺伝子及び／又は対応するポリペプチドのモニタリングを可能にする。
【０１７５】
ここで記載し定義されたように、細胞内、膜貫通、又は分泌されるタンパク質を含む肺がんタンパク質は、肺がんのマーカーとして、例えば予後判定又は診断のために利用される。肺がんが推定される組織におけるこれらのタンパク質の検出は、肺がん又は同様の疾患の検出、予後判定、又は診断を可能にし、多分、治療戦略の選択を可能にするであろう。ある実施の形態では、抗体を用いて肺がんタンパク質を検出する。ある好ましい方法は、ゲル（普通、変性及び還元タンパク質ゲル、しかし別のタイプのゲル、例えば等電点ゲルなど、であってもよい）での電気泳動によってサンプルからのタンパク質を分離する。タンパク質の分離の後、肺がんタンパク質が、束肺がんタンパク質に対して生成された抗体による免疫ブロッティングによって、検出される。免疫ブロッティングの方法は、当業者には周知である。
【０１７６】
別の好ましい方法では、肺がんタンパク質に対する抗体が、in situ（その場での）イメージング法で，例えば組織学で（例えば、Asai(ed. 1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, Vol. 37）、利用される。この方法では、細胞に１つ乃至多数の肺がんタンパク質に対する抗体を接触させる。洗浄して非特異的な抗体結合を除去した後、抗体の存在を検出する。ある実施の形態では、抗体は検出可能なラベル、例えば多重カラー蛍光又はコンフォーカル・イメージング、を含む二次抗体と共にインキュベートすることによって検出される。別の方法では、肺がんタンパク質に対する一次抗体が検出できるマーカー、例えば、基質に作用する酵素マーカー、を含む。別の好ましい実施形態では、複数の一次抗体の各々が別々の検出可能なラベルを含む。この方法は、特に複数の肺がんタンパク質の同時スクリーニングで利用される。その他多くの組織学的イメージング法が本発明によって提供される。
【０１７７】
ある好ましい実施の形態では、ラベルは、異なる波長の放出を検出して区別できる蛍光光度計で検出される。さらに、この方法では、蛍光励起セルソーター（FACS）を用いることができる。
【０１７８】
別の好ましい実施の形態では、抗体が血液、血清、血漿、糞便、その他のサンプルから肺がんを診断するのに用いられる。したがって、これらのサンプルは肺がんタンパク質の存在をプローブしたり、テストするために使用できる。抗体は、ELISA、免疫ブロッティング（ウエスタン・ブロッティング）、免疫沈澱法、BIACORE法、など、前述した免疫分析方法によって肺がんタンパク質を検出するために利用できる。逆に、抗体の存在は、内生的な肺がんタンパク質に対する免疫応答、又はワクチン、を示唆する。
【０１７９】
ある好ましい実施の形態では、組織アレー（array）に対するラベルされた肺がん核酸プローブのin situハイブリダイゼーションが行われる。例えば、肺がん組織及び／又は正常組織を含む組織サンプルのアレーが作成される。次にin situハイブリダイゼーション（例えば、Ausubel, 前出、を見よ）が行われる。個体と標準との間で指紋が比較されると、熟練者ならばその知見に基づいて診断、予後判定、又は予測を行うことができる。さらに、診断を示す遺伝子は予後判定を示す遺伝子と異なることがあり、細胞の状態の分子プロフィーリングが応答する状態と治療に抵抗する状態の区別に導くことがあり、結果を予測できることもあるということは言うまでもない。
【０１８０】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び肺がん配列を含む細胞が、予後分析に用いられる。上と同様、長期的な予後の観点から肺がんの臨床的、病理的、その他の情報に相関する遺伝子発現プロフィールを生成でｋる。やはりこれも、タンパク質レベルでも核酸レベルでも行うことができるが、遺伝子を用いることが好ましい。単一又は複数の遺伝子をいろいろな組み合わせで用いることができる。上と同様、肺がんプローブをバイオチップに取り付けて、組織又は患者における肺がん配列の検出と定量化に使用できる。分析は、上で診断に関して述べたように進められる。PCR法はさらに高感度の正確な定量化を可能にする。
治療化合物の分析
ある好ましい実施の形態では、ここで記述されたようなタンパク質、核酸、及び抗体が薬剤スクリーニング分析で利用される。肺がんタンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び肺がん配列を含む細胞が、薬剤スクリーニング分析で、薬剤候補が“遺伝子発現プロフィール”又はポリペプチドの発現プロフィールに及ぼす効果を評価することによって利用される。ある好ましい実施の形態では、発現プロフィールが、好ましくは高スループットのスクリーニング方法と合わせて用いられ、候補物質で治療した後の発現プロフィール遺伝子をモニターすることが可能になる（例えば、Zlokarnik, et al. (1998) Science 279:84-8; Heid (1996) Genome Res. 6:986-94）。
【０１８１】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質、抗体、核酸、修飾されたタンパク質及び肺がん配列を含む細胞が、薬剤スクリーニング分析で用いられる。すなわち、本発明は、肺がん表現型を、又は肺がんタンパク質の同定された生理的機能を修飾する組成物をスクリーニングする新しい方法を提供する。上と同様、これは個々の遺伝子レベルで、又は薬剤候補が“遺伝子発現プロフィール”に及ぼす効果を評価することによって行うことができる。ある好ましい実施の形態では、発現プロフィールが、好ましくは高スループットのスクリーニング方法と合わせて用いられ、候補物質で治療した後の発現プロフィール遺伝子をモニターすることが可能になる、Zlokarnik, 前出、を見よ。
【０１８２】
ここで差動的に発現される遺伝子を同定すると、いろいろな分析を行うことができる。ある好ましい実施の形態では、分析は個々の遺伝子又はタンパク質レベルで行うことができる。すなわち、肺がんで調節が変化しているある特定遺伝子を同定したら、テスト化合物を遺伝子発現を修飾する能力に関して、又は肺がんタンパク質との結合に関してスクリーニングすることができる。したがって、“修飾（modulation）”とは、遺伝子発現の増加又は減少を含む。好ましい修飾の量は、正常組織vs.肺がんになった組織での最初の遺伝子発現の変化によるが、変化は少なくとも10%、好ましくは50%、さらに好ましくは100-300%、そしてある実施の形態では、300-1000%以上である。すなわち、ある遺伝子が正常組織に比べて肺がん組織において4倍の増加を示す場合、多くの場合約4分の1への減少が好ましい；同様に正常組織に比べて肺がん組織において10分の1への減少が見られる場合、テスト化合物によって誘発される発現の10倍の増加が目標となる。
【０１８３】
遺伝子発現の量は核酸プローブを用いてモニターすることができ、遺伝子発現レベルの定量化又は遺伝子産物自体を、例えば肺がんタンパク質に対する抗体と標準的な免疫分析を用いて、モニターすることができる。プロテオミックスと分離技術も発現の定量化を可能にする。
【０１８４】
ある好ましい実施の形態では、いくつかの対象についての遺伝子又はタンパク質発現、すなわち、発現プロフィール、が同時にもにたーされる。このプロフィールは、普通、ここで記述された複数の対象に関わる。
【０１８５】
この実施の形態では、ある特定細胞における肺がん配列の検出と定量化のために、ここで述べたように肺がん核酸プローブがバイオチップに取り付けられる。あるいはまた、PCRを利用することもできる。すなわち、例えば一連のマイクロタイタ・プレートを用い、所望のウエルにプライマーを加える。次にPCR反応を行って各ウエルについて分析する。
【０１８６】
発現モニタリングを行って１つ以上の肺がん関連配列、例えば表に示されたポリヌクレオチド配列、の発現を修飾する化合物を同定することができる。一般に、ある好ましい実施の形態では、分析の前にテスト化合物が細胞に加えられる。さらに、肺がんを修飾する、肺がんタンパク質を修飾する、肺がんタンパク質に結合する、又は肺がんタンパク質と抗体、基質、又はその他の結合相手との結合に干渉する物質を同定するためのスクリーンが提供される。
【０１８７】
本明細書で用いられる場合、“テスト化合物”、又は“薬剤候補”又は“モジュレーター”又はその文法的等価物は、分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小さな有機分子、ポリサッカライド、ポリヌクレオチド、etc.であって、直接又は間接に肺がん表現型を、又は肺がん配列、例えば核酸又はタンパク質配列の発現を変化させる能力に関してテストされるものを意味する。好ましい実施の形態では、モジュレーターは本明細書で示される核酸又はタンパク質の発現プロフィールを変化させる。ある実施の形態では、モジュレーターは肺がんの表現型を、例えば正常又は非悪性組織の指紋にまで、抑制する。別の実施の形態では、モジュレーターが肺がん表現型を誘発する。一般に、複数の分析混合物が異なる物質濃度で並行して調べられ、いろいろな濃度に対する応答の差が得られる。普通これらの濃度の１つがネガティブ対照として、すなわち、ゼロ濃度で、又は検出レベルより低いレベルで、用いられる。
【０１８８】
ある様態では、モジュレーターは肺がんタンパク質の効果を中和する。“中和する”という用語は、あるタンパク質の活性と細胞へのその効果が阻害又はブロックされるということを意味する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、可能なモジュレーターの組合せライブラリーが、肺がんポリペプチドと結合する能力又は活性を修飾する能力に関してスクリーニングされる。通常、有用な性質を持つ化学的な物質は、ある望ましい性質又は活性、例えば阻害活性、を持つ化合物（“リード化合物”と呼ばれる）を同定し、リード化合物の変異体を作り出し、それらの変異体化合物の性質と活性を評価して生成される。しばしば、この分析には高スループット・スクリーニング（HTS）方法が用いられる。
【０１９０】
ある好ましい実施の形態では、高スループット・スクリーニング方法は、多数の可能な治療化合物（候補化合物）を含むライブラリーを用意するステップを含む。この“組合せ化学ライブラリー”を１つ以上の分析でスクリーニングして、望ましい特徴的な活性を示すライブラリー・メンバー（特定化学種又はサブクラス）を同定する。こうして同定された化合物が、従来のリード化合物として用いられるか、又はそれ自身可能な又は実際の治療薬として用いられる。
【０１９１】
組合せ化学ライブラリーは、試薬などのいくつかの化学的“建築ブロック”を組み合わせることによって化学的合成又は生物的合成によって生成される多様な化合物の集まりである。例えば、ポリペプチド（例えば、突然変異タンパク質）ライブラリーのようなある線形組合せ化学ライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる化学的な建築ブロックを、ある与えられた化合物長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）であらゆる可能な仕方で組み合わせることによって形成される。化学的な建築ブロックのこのような組合せによる混合によって何百万という化合物を合成することができる（Gallop, et al. (1994)J. Med. Chem. 37(9):1233-1251）。
【０１９２】
組合せ化学ライブラリーの調製とスクリーニングは当業者には周知である。このような組合せ化学ライブラリーとしては、それだけに限定されないが、次のようなものがある：ペプチド・ライブラリー（例えば、U.S. Patent No. 5,010,175, Furka (1991)Rept. Prot. Res. 37: 487-493, Houghton, et al.(1991) Nature 354:84-88）、ペプトイド（PCT Publication No. WO 91/19735）、コードされたペプチド（PCT Publication No. WO 93/20242）、ランダム・バイオオリゴマー（PCT Publication No. WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（U.S. Patent No. 5,288,514）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、及びジペプチドなどのジバーソマー（diversomers）（Hobbs, et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913）、ビニル様ポリペプチド（Hagihara, et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:6568）、Beta-D-Glucose足場をもつ非ペプチド・ペプチド模倣物（Hirschmann, et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218）、類似有機合成小化合物ライブラリー（Chen, et al. (1994)  J. Amer. Chem. Soc. 116:2661）、オリゴカルバメート（Cho, et al. (1993) Science 261:1303）、及び／又はペプチジル・ホスフォネート（Campbell, et al. (1994) J. Org. Chem. 59:658）。一般に、以下を見よ、Gordon, et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1385, 核酸ライブラリー（例えば、Stratagene, Corp.を見よ）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、U.S. Patent No. 5,539,083を見よ）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn, et al. (1996) Nature Biotechnolgy 14(3):309-314,及びPCT /US96/10287を見よ）、炭化水素ライブラリー（例えば、Liang, et al. (1996) sCIENCE 274:1520-1522, 及びU.S.Patent No. 5,593,853を見よ）、及び小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum(1993) C&EN, Jan. 18,p. 33; イソプレノイド、U.S.Patent No. 5,569,588; チアゾリジノンとメタチアザノン、U.S.Patent No. 5,549,974; ピロリジン、U.S. Patent No. 5,525,735; モルフォリノ化合物、U.S. Patent No. 5,506,337; ベンゾジアゼピン、U.S. Patent No. 5,288,514; など）
組合せライブラリーの作成のためのデバイスは商業的に入手できる（例えば、357MPS, 390MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, Ma, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA,を見よ）。
【０１９３】
溶液相のケミストリーのためにいくつかのロボット・システムが開発されている。これらのシステムには、Takeda Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)によって開発された自動化された合成装置、及びロボット・アームを用いる多くのロボット・システム（Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.）など、化学者が行う手動の合成操作を模倣する自動化されたワークステーションが含まれる。上記のデバイスは、適当な変更によって、本発明で使用するのに適したものになる。さらに、多数の組合せライブラリー自体が商業的に入手できる（例えば、ComGenex, Princeton, NJ., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc. St. Louis, MO, Chemstar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticls, Exton, PA, Martek Bioscience, Columbia, MD, etc.を見よ）。
【０１９４】
モジュレーターを同定するための分析は高スループット・スクリーニングが可能である。好ましい分析は、こうして肺がん遺伝子の転写、ポリペプチド発現、及びポリペプチド活性の修飾を検出する。
【０１９５】
特定核酸又はタンパク質産物の存在、非存在、定量化、その他の性質を評価するための高スループット分析は当業者には周知である。同様に、結合分析やレポーター遺伝子分析も周知である。例えば、U.S. Patent No. 5,559,410はタンパク質に関する高スループット・スクリーニング方法を開示しており、U.S. Patent No. 5,585,639は核酸に関する高スループット・スクリーニング方法（すなわち、アレーによる）を開示しており、U.S. Patent Nos. 5,576,220と5,541,061はリガンド／抗体結合のスクリーニングのための高スループット方法を開示している。
【０１９６】
さらに、高スループット・スクリーニング・システムは商業的に入手できる（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; etc.を見よ）。これらのシステムは、普通、サンプル及び試薬のピペット注入、液体の分与、時間を計ったインキュベーション、及び分析に適した検出器におけるマイクロプレートの最終読取、などの手順を自動化している。これらのシステムは、高スループットと迅速スタート，ならびに高度のフレキシビリティーと注文生産を可能にしている。これらのシステムのメーカーは、いろいろな高スループット・システムについての詳細なプロトコルを提供している。例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合、などの修飾を検出するスクリーニング・システムを記載した技術報告を出している。
【０１９７】
ある実施の形態では、モジュレーターはタンパク質であり、しばしば天然に見られるタンパク質及び天然に見られるタンパク質の断片である。例えば、タンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質様細胞抽出物のランダム又は定方向消化物が用いられる。こうして、本発明の方法でスクリーニングするためのタンパク質のライブラリーを作成できる。この実施の形態で特に好ましいのは、バクテリア、菌類、ウイルス、及び哺乳類タンパク質のライブラリーであり、最後のものが好ましく、ヒトのタンパク質が特に好ましい。特に有用なテスト化合物は、標的が属するタンパク質のクラスに向けられ、例えば酵素の基質、又はリガンドやレセプター、である。
【０１９８】
ある好ましい実施の形態では、モジュレーターは約5乃至約30アミノ酸のペプチドであり、約5乃至約20アミノ酸というものが好ましく、約7乃至約15アミノ酸というものが特に好ましい。ペプチドは、天然に見られるタンパク質の消化物、ランダム・ペプチド、又は“偏った”ランダム・ペプチド、である。本明細書における“ランダム化される”又はその文法的等価物は、核酸又はペプチドが、それぞれ、ヌクレオチドとアミノ酸の本発明にランダムな配列から成ることを意味する。これらのランダム・ペプチド（又は核酸、以下で述べる）はしばしば化学的に合成されるので、ヌクレオチド又はアミノ酸をどんな位置にも組み込む。ランダム化されたタンパク質又は核酸を生成するように合成プロセスを設計して、配列の全長にわたって可能な組合せの全部又は大部分が形成されるようにして、ランダム化されたバイオアクティブなタンパク質様物質のライブラリーを構成することができる。
【０１９９】
ある実施の形態だは、ライブラリーは完全にランダム化され、配列にはどの位置にも何も偏向や定常部がない。ある好ましい実施の形態では、ライブラリーは偏向している。すなわち、配列のいくつかの位置は一定に保たれるか、又は限定された数の可能性から選択される。ある好ましい実施の形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸残基はある定められたクラスの中で、例えば疎水性のアミノ酸、親水性の残基、立体的に偏向（小さい又は大きい）した残基、核酸結合ドメインを生成する方向、システインの生成、架橋、SH3ドメインのためのプロリン、リン酸化部位としてのセリン、トレオニン、チロシン、又はヒスチジン、etc.などのクラス内でランダム化される。
【０２００】
肺がんのモジュレーターは、上で定義されたような核酸であってもよい。
【０２０１】
上でタンパク質に関して一般的に述べたように、核酸修飾物質は天然に見られる核酸、ランダムな核酸、又は“偏向した”ランダムな核酸である。タンパク質に関して上で述べたように、原核又は真核生物のゲノムの消化物を用いることもできる。
【０２０２】
ある好ましい実施の形態では、候補化合物は有機化学部分（chemical moieties）であり、その多様な候補は文献から入手できる。
【０２０３】
候補物質が加えられ、細胞がある長さの時間インキュベートされた後、標的配列を含むサンプルが分析される。必要ならば、標的配列は公知の方法を用いて調製される。例えば、サンプルは、公知の細胞溶解バッファー、電気穿孔、etc.を用いて、細胞を溶解するように処理し、精製及び／又はPCRなどの増幅を必要に応じて行うこともできる。例えば、ヌクレオチドにラベルを共有結合で取り付けてin vitro 転写を行うこともある。一般に、核酸はビオチン-FITC、又はPE、又はcy3又はcy5でラベルされる。
【０２０４】
ある好ましい実施の形態では、標的配列は、例えば蛍光剤、化学発光剤、化学物質、又は放射性信号によってラベルされて、プローブとの標的配列の特異的結合を検出する手段とする。ラベルは又、酵素、例えばアルカリ・ホスファターゼやホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなど、適当な基質が与えられると検出できる産物を生ずる酵素であってもよい。あるいはまた、ラベルは、酵素阻害物質など、結合するが酵素によって触媒されない又は変化しない標識された化合物又は小さな分子デアッテモヨイ。ラベルはまた、エピトープ・タグ又はストレプトアビジンに特異的に結合するビオチンなど、ある部分又は化合物であってもよい。例えばビオチンの場合、ストレプトアビジンが上述のようにラベルされ、結合した標的配列に関する検出可能な信号を与える。未結合のラベルされたストレプトアビジンは普通、分析の前に除去される。
【０２０５】
核酸分析は、直接ハイブリダイゼーション分析であっても、複数のプローブを用いる“サンドイッチ分析”を含むものであってもよく、これは一般的に、U.S. Patent Nos. 5,681,702, 5,597,909, 5,545,730, 5,594,117, 5,591,584, 5,571,670, 5,580,731, 5,571,670, 5,591,584, 5, 624,802, 5,635,352, 5,594,118, 5,359,100, 5,124,246, 及び5,681,697 に記載されており、これらは全て参照によって本明細書に組み込まれる。この実施の形態では、一般に、標的核酸が上述のように調製され、ハイブリダイゼーション錯体を形成できる条件の下で複数の核酸プローブを含むバイオチップに加えられる。
【０２０６】
本発明では、上述のように、高、中間、及び低ストリンジェンシー条件を含むいろいろなハイブリダイゼーション条件を用いることができる。分析は、一般に、標的の存在下でのみラベル・プローブのハイブリダイゼーション錯体の形成を可能にするストリンジェンシー条件の下で行われる。ストリンジェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨ、有機溶剤濃度、等の熱力学変数であるステップ・パラメータを変えることによってコントロールできる。
【０２０７】
これらのパラメータを用いて、一般的にU.S. Patent No. 5,681,697に記載されているように、非特異的結合をコントロールすることもできる。したがって、いくつかのステップは非特異的結合を減らすために高いストリンジェンシー条件で行うことが望ましい。
【０２０８】
ここで概略を述べた反応は、いろいろな仕方で行うことができる。反応の成分は同時に加えることも、順次、異なる順序で加えることもでき、好ましい実施の形態は以下で示される。さらに、反応はいろいろな他の反応成分を含むことがある。例えば、塩、バッファー、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、などを、最適のハイブリダイゼーション及び検出を助け、及び／又は非特異的又はバックグラウンド相互作用を減らすために用いることができる。分析の効率を改善する反応物質、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌物質、等も、サンプル調製方法や標的の純度によって必要に応じて用いることができる。
【０２０９】
分析データを分析して、発現レベルを決定し、状態による発現レベルの変化を個々の遺伝子について決定して、遺伝子発現プロフィールを構成する。
【０２１０】
スクリーニングを行って、肺がん表現型のモジュレーターを同定する。ある実施の形態では、スクリーニングを行ってある特定発現プロフィールを誘発又は抑制し、好ましくは関連する表現型を生成するモジュレーターを同定する。別の実施の形態では、例えば診断に応用するために、ある特定の状態で差動的に発現される遺伝子を同定した後、スクリーニングを行って個々の遺伝子の発現を変化させるモジュレーターを同定することができる。別の実施の形態では、スクリーニングを行って、差動的に発現される遺伝子の発現産物の生物的機能を変化させるモジュレーターを同定する。やはり、ある特定の状態におけるある遺伝子の重要性を同定した後、スクリーニングを行って、遺伝子産物と結合する及び／又はその生物的活性を修飾する物質を同定する、又は遺伝的多型を評価する。
【０２１１】
遺伝子をスクリーニングして、ある候補物質に応答して誘発されるものを探すことができる。肺がん発現パタンを抑制して正常な発現パタンに導く能力、又は１つの肺がん遺伝子発現プロフィールを正常な組織の遺伝子の発現を模倣するように修飾する能力、に基づいてモジュレーターを同定した後、上述の様なスクリーニングを行ってその物質に応答して特異的に修飾される遺伝子を同定することができる。正常組織とその物質で治療された肺がん組織の発現プロフィールの比較から、正常組織又は肺がん組織で発現されず、その物質で治療された組織で発現される遺伝子が明らかになる。これらの物質特異的な配列を同定して、肺がん遺伝子又はタンパク質に関して本明細書で記載される方法で利用することができる。特に、これらの配列とそれがコードするタンパク質はその物質で治療された細胞をマーク又は識別するのに利用できる。さらに、その物質で誘発されるタンパク質に対する抗体を生成して、治療された肺がん組織サンプルを新しい治療の標的にすることがきる。
【０２１２】
こうして、ある実施の形態では、あるテスト化合物が肺がん細胞の集団、関連する肺がん発現プロフィールを有する集団に、投与される。本明細書において、“投与”又は“接触させる”とは、候補物質が細胞に、その物質が細胞に作用するのを許すような仕方で加えられることを意味し、その作用が取り込まれて細胞内で作用するか、細胞表面での作用であるかは問わない。ある実施の形態では、タンパク質様の候補物質（すなわち、ペプチド）をコードする核酸が、アデノウイルス又はレトロウイルス構成物などのウイルス構成物に入れられ、そのペプチド物質の発現が行われるように、細胞に加えられる、例えばPCT US97/01019。調節できる遺伝子治療システムも用いることができる。
【０２１３】
テスト化合物を細胞に投与したら、望むならば細胞を洗浄することができ、細胞はある長さの時間、好ましくは生理的条件の下でインキュベートされる。その後、細胞を収穫され、ここで述べたように新しい遺伝子発現プロフィールが生成される。
【０２１４】
こうして、例えば、肺がん組織又は非悪性組織をスクリーニングして、肺がん表現型を修飾する、例えば誘発又は抑制する物質を探すことができる。発現プロフィールの少なくとも１つの遺伝子、好ましくは多くの遺伝子、の変化はその物質が肺がんの活動に影響を及ぼすことを示す。肺がん表現型のこのような目印をはっきりさせることによって、表現型を変化させる新しい薬剤のスクリーニングを考案することができる。このアプローチでは、薬剤の標的を知る必要はなく、最初の発現スクリーニング・プラットホームに表す必要もなく、標的タンパク質の転写のレベルが変化する必要もない。
【０２１５】
肺がんポリペプチド活性の測定、又は肺がんの、又は肺がん表現型の測定はいろいろな分析法によって行うことができる。例えば、テスト化合物が転移性ポリペプチドの機能に及ぼす影響は上述のパラメータを調べることによって測定される。活性に影響を及ぼす適当な生理的変化を用いて、テスト化合物が本発明のポリペプチドに及ぼす影響を評価することができる。無傷の細胞又は動物を用いて機能的な結果を決定すると、いろいろな影響、例えば肺がんの場合、腫瘍、腫瘍の成長、腫瘍の転移、血管新生、ホルモン放出、既知の及び未知の遺伝マーカーへの転写の変化（例えば、ノーザン・ブロット）、細胞代謝の変化、例えば細胞成長又はｐＨの変化、及びcGMPなどの細胞内第二メッセンジャーの変化、に関連した影響を測定できる。本発明のぶんせきでは、哺乳類の、例えばマウス、好ましくはヒトの、肺がんのポリペプチドが普通用いられる。
【０２１６】
修飾活性を有する化合物を同定する分析は、in vitroで行うことができる。例えば、肺がんポリペプチドにまず可能なモジュレーターを接触させ、適当な長さの時間、例えば0.5乃至48時間、インキュベートする。ある実施の形態では、肺がんポリペプチドのレベルが、タンパク質又はmRNAのレベルを測定することによってin vitroで決定される。タンパク質のレベルは普通、肺がんポリペプチド又はその断片に選択的に結合する抗体によって、ウエスタン・ブロッティング、ELISA、などの免疫分析法を用いて測定される。mRNAの測定には、増幅、例えばPCR, LCRによる増幅、又はハイブリダイゼーション分析、例えばノーザン・ハイブリダイゼーション、RNAseプロテクション、ドット・ブロッティング、などが好ましい。タンパク質又はmRNAのレベルは普通、本明細書に記載されているように、直接又は間接にラベルされた検出物質、例えば、蛍光又は放射能ラベルされた核酸、放射能又は酵素でラベルされた抗体、などを用いて検出される。
【０２１７】
あるいはまた、肺がんタンパク質のプロモーターがレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、CAT、又はβ−galなどのレポーター遺伝子と操作的にリンクされているポーター遺伝子システムを考案することもできる。このレポーター構成物（construct）は、普通、細胞に形質移入される。可能なモジュレーターで処理した後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、又は活性が当業者には公知の標準的な方法で測定される。
【０２１８】
ある好ましい実施の形態では、上述のように、スクリーニングが個々の遺伝子と遺伝子産物（タンパク質）について行われる。すなわち、ある特定の状態である特定の差動的に発現される遺伝子が重要であると同定したら、遺伝子の発現又は遺伝子産物自身のモジュレーターのスクリーニングを行うことができる。差動的に発現される遺伝子の遺伝子産物は、本明細書において“肺がんタンパク質”と呼ばれることがある。肺がんタンパク質は断片であってもよく、逆にここで示された断片に対する全長タンパク質であってもよい。
【０２１９】
ある実施の形態では、特定遺伝子の発現のモジュレーターのスクリーニングが行われる。普通、１つ又は数個の遺伝子の発現だけが評価される。別の実施の形態では、スクリーニングは最初に発現されるタンパク質に差動的に結合する化合物を見つけるように設計される。次に、これらの化合物が差動的に発現される活性を修飾する能力が評価される。さらに、最初の候補化合物が同定されたら、変異体をさらにスクリーニングして構造活性関係をより良く評価できるようにする。ある好ましい実施の形態では、結合分析が行われる。一般に、精製又は単離された遺伝子産物が用いられる；すなわち、１つ以上の差動的に発現される核酸の遺伝子産物が作られる。例えば、タンパク質遺伝子産物に対する抗体が生成され、標準的な免疫分析が行われて存在するタンパク質の量が決定される。あるいはまた、肺がんタンパク質を含む細胞を分析で用いることができる。
【０２２０】
したがって、ある好ましい実施の形態では、方法は肺がんタンパク質と候補化合物を組み合わせるステップと、肺がんタンパク質に対するその化合物の結合を決定するステップを含む。好ましい実施の形態は、ヒトは胃ガンタンパク質を用いるものであるが、他の哺乳類のタンパク質も、例えばヒトの疾患の動物モデルを開発するために、用いることができる。ある実施の形態では、本明細書において述べるように、変異体又は誘導体肺がんタンパク質を用いることができる。
【０２２１】
一般に、本発明の方法のある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質又は候補物質は不溶性のサポートに、好ましくは分離されたサンプル収容区域を有するサポート（例えば、マイクロタイター・プレート、アレー、etc.）に非拡散的に結合される。不溶サポートは、組成物が結合できる組成で作られ、可溶物質から容易に分離され、その他の点でスクリーニングの方法全体と両立する。このようなサポートの表面は、固体又は多孔質で、好適な形である。適当な不溶性サポートの例としては、マイクロタイター・プレート、アレー、膜、及びビーズなどがあげられる。これらは普通、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖、ナイロン、又はニトロセルロース、テフロンTM、等があげられる。マイクロタイター・プレートとアレーは、少量の試薬とサンプルによって多数の分析を同時に行うことができるので、特に好適である。組成物の具体的な結合の仕方は、試薬及び本発明の方法全体と両立し、組成物の活性を維持し、非拡散的である限り、普通はあまり重要ではない。好ましい結合方法としては、抗体の利用（タンパク質がサポートに結合されたときに、リガンド結合部位も活性化配列も立体的にブロックしない抗体）、“粘着性”又はイオン性サポートへの直接結合、化学的架橋、表面上でのタンパク質又は候補物質の合成、などがあげられる。タンパク質又は候補物質の結合の後、過剰な物質は洗浄によって除去される。次に、サンプル収容区域はウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、又はその他の無害なタンパク質又はその他の化合物部分と共にインキュベートすることによってブロックされる。
【０２２２】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質がサポートに結合され、テスト化合物が分析に加えられる。あるいはまた、候補物質がサポートに結合され、肺がんタンパク質が加えられる。新しい結合物質としては、特異抗体、化学ライブラリーのスクリーニングで同定された非天然結合物質、ペプチド類似体、などがあげられる。特に有益なのは、ヒト細胞への毒性が低い物質を探すスクリーニング分析である。このために、ラベルされたin vitroタンパク質−タンパク質結合分析、電気泳動移動度シフト分析、タンパク質結合の免疫分析、官能分析（リン酸化分析、等）など、いろいろな分析を利用することができる。
【０２２３】
肺がんタンパク質へのテスト修飾化合物の結合の測定はいくつかの方法で行うことができる。ある好ましい実施の形態では、化合物がラベルされ、結合が直接決定される、例えば肺がんタンパク質の全部又は一部を固体サポートに付着させ、ラベルされた候補物質（例えば、蛍光ラベル）を加え、過剰な試薬を洗い流し、固体サポート上にラベルが存在するかどうかを決定する。いろいろなブロッッキング及び洗浄ステップを必要に応じて利用できる。
【０２２４】
いくつかの実施の形態では、成分の１つだけがラベルされる、例えばタンパク質（又はタンパク質様候補化合物）をラベルすることができる。あるいはまた、２つ以上の成分を異なるラベルで標識することもできる、例えばタンパク質を125Iで、化合物を蛍光体でラベルすることができる。近接試薬（proximity reagent）、例えば停止又はエネルギー伝達試薬も有用である。
【０２２５】
ある実施の形態では、テスト化合物の結合は競合結合分析によって決定される。競合体は、標的分子（例えば、肺がんタンパク質）に結合することが知られている結合部分、例えば抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンド、などである。状況によっては、化合物とその結合部分の間で結合の競争が起こって、結合部分が化合物を追い出すことになる。ある実施の形態では、テスト化合物がラベルされる。化合物、又は競合体、又はその両方、が最初にタンパク質に、もしあれば結合が起こるに十分な時間、加えられる。インキュベーションは、最適活性を助けるような温度、普通4から40℃までの間、で行うことができる。インキュベーション時間は、例えば、迅速な高スループット・スクリーニングを容易にするように最適化される。普通、0.1乃至1時間で十分である。過剰な試薬は一般に除去又は洗い流される。次に、第二の成分が加えられ、ラベルされた化合物が存在するかどうかが結合を示す証左として追跡される。
【０２２６】
ある好ましい実施の形態では、教護歌いが最初に加えられ、続いてテスト化合物が加えられる。教護歌いが排除サレルコトハ、テスト化合物が肺がんタンパク質と結合しており、したがって、肺がんタンパク質と結合してその活性を修飾できる可能性があるという証左である。この実施の形態では、どちらの成分をラベル標識することもできる。例えば、競合体をラベル標識した場合、洗浄液中にラベルが存在することは、それが試薬によって追い出されたことを示す。あるいはまた、テスト化合物をラベル標識した場合、サポートにラベルが存在することが競合体を排除したことを示す。
【０２２７】
別の実施の形態では、テスト化合物が最初に加えられ、インキュベートされ洗浄された後、競合体が加えられる。競合体による結合が存在しないことが、テスト化合物の方が高いアフィニティーで肺がんタンパク質に結合していることを示す。テスト化合物をラベル標識した場合、サポートにラベルが存在することが、競合体の結合がないことと合わせて、テスト化合物が肺がんタンパク質に結合できることを示す。
【０２２８】
ある好ましい実施の形態では、方法は、肺がんタンパク質の活性を修飾できる物質を同定するための差動的スクリーニングを含む。ある実施の形態では、方法は、肺がんタンパク質と競合体を第一のサンプルで組み合わせるステップを含む。第二のサンプルは、テスト化合物、肺がんタンパク質、及び競合体を
含む。両方のサンプルについて競合体の結合が測定され、２つのサンプルの間の結合の変化又は差は、肺がんタンパク質と結合してその活性を修飾できる可能性のある物質の存在を示す。すなわち、第二のサンプルにおける競合体の結合が第一のサンプルと比べて異なる場合、その物質は肺がんタンパク質と結合することができる。
【０２２９】
あるいはまた、差動的スクリーニングを用いて、原生の肺がんタンパク質には結合するが修飾された肺がんタンパク質には結合できない薬剤候補が同定される。肺がんタンパク質の構造をモデル化し、その部位と相互作用する物質を合成するための合理的な薬剤デザインで利用することができる。肺がんタンパク質の活性に影響を及ぼす薬剤の候補も、そのタンパク質の活性を高める又は低下させる能力に関する薬剤のスクリーニングによって同定される。
【０２３０】
分析では、ポジティブ対照とネガティブ対照を用いることもできる。好ましくは、対照とテスト・サンプルを少なくとも三重複で分析して統計的に有意な結果を得るようにする。全てのサンプルのインキュベーションは、候補物質がタンパク質に結合するのに十分な時間行う。インキュベーションの後、サンプルを洗浄して非特異的に結合した物質を洗い流し、結合している、一般にラベルされた物質の量を決定する。例えば、放射性ラベルが用いられる場合、サンプルはシンチレーション・カウンターでカウントして結合した化合物の量を決定する。
【０２３１】
他のいろいろな試薬をスクリーニング分析に含めることができる。それは例えば、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、など、最適のタンパク質−タンパク質結合を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウンド相互作用を減らすために用いられるものである、その他の点で分析の効率を改善できる試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤、などを用いることができる。成分の混合物は、必要な結合を可能にする順序で加えられる。
【０２３２】
ある好ましい実施の形態では、本発明は肺がんタンパク質の活性を修飾することができる化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、上で定義されたようなテスト化合物を肺がんタンパク質を含む細胞に加えるステップを含む。好ましい細胞タイプはほとんどどんな細胞も含む。細胞は肺がんタンパク質をコードする組み換え核酸を含む。ある好ましい実施の形態では、候補物質のライブラリーが複数の細胞でテストされる。
【０２３３】
ある様態では、分析は、以前又は以後の生理的信号、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、作用電位、化学療法を含む薬理的因子、放射線、発がん因子、又は他の細胞（例えば、細胞−細胞相互作用）、などの存在下で又は非存在下で評価される。別の例では、決定因子は細胞サイクル・プロセスの異なる段階で決定される。
【０２３４】
このようにして、肺がん物質を修飾する化合物が同定される。薬理的活性を有する化合物は肺がんタンパク質の活性を強める又は妨害することができる。いったん同定されたら、同様の構造を評価してその化合物の決定的な構造的特徴を明らかにする。
【０２３５】
ある実施の形態では、肺がんの細胞分裂を抑制する方法が提供される。この方法は、肺がん抑制剤の投与を含む。別の実施の形態では、肺がんを抑制する方法が提供される。この方法は、肺がん抑制剤の投与を含む。さらに別の実施の形態では、肺がんの細胞又は個体を治療する方法、例えば肺がん抑制剤の投与を含む方法、が提供される。
【０２３６】
ある実施の形態では、肺がん抑制剤は上で説明したような抗体である。別の実施の形態では、肺がん抑制剤はアンチセンス分子である。
【０２３７】
以下に記述されるような、いろいろな細胞成長、増殖、生活力、及び転移分析法は当業者には公知である。
軟寒天増殖又は懸濁でのコロニー形成
正常細胞は付着して増殖するための固体基質を必要とする。形質転換した細胞はこの表現型を失って、基質から離れた状態で増殖する。例えば、形質転換した細胞は、攪拌される懸濁培養中で、又は半固体媒質、例えば半固体又は軟寒天に懸濁して増殖できる。形質転換した細胞は、腫瘍サプレッサー遺伝子が形質移入されると、正常な表現型を再生させて、付着して増殖するために固体基質を必要とするようになる。軟寒天増殖又は懸濁でのコロニー形成分析を用いて、肺がん配列のモジュレーター、宿主細胞で発現されると異常な細胞増殖と形質転換を阻害するモジュレーターを同定できる。ある治療化合物は、攪拌される懸濁培養で又は半固体又は軟寒天などの半固体媒質中に懸濁して増殖できる宿主細胞の能力を減少又は消失させる。
【０２３８】
軟寒天増殖又は懸濁でのコロニー形成分析の方法は、参照によって本明細書に組み込まれるFreshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Techniques (3rd ed.)に記載されている。
増殖の接触阻害及び密度制限
普通、正常細胞はペトリ皿で平らな組織されたパタンで他の細胞に接触するまで増殖する。細胞が互いに接触すると、細胞は接触阻害されて増殖を停止する。しかし、細胞が形質転換されると、細胞は接触阻害されずに、増殖し続け、高い密度で無秩序な増殖巣になる。このように、形質転換した細胞は正常細胞よりも高い飽和密度まで増殖する。これは形態的に、まわりの正常細胞の規則的なパタンの中に無方向の単細胞層や増殖巣の丸い細胞が形成されることで見つけることができる。あるいはまた、飽和密度における（3H）-チミジンによるラベリング・インデックスを用いて 増殖の密度制限を測定することもできる。Freshney (1994)、前出、を見よ。形質転換した細胞は、腫瘍サプレッサー遺伝子が形質移入されると、正常な表現型を再生して、接触阻害されるようになり、低い密度までしか増殖しなくなる。
【０２３９】
この分析では、飽和密度における（3H）-チミジンによるラベリング・インデックスが増殖の密度制限を測定する好ましい方法である。形質転換された宿主細胞に肺がん関連配列が形質移入され、非制限的な媒質条件で飽和密度で24 時間増殖させる。（3H）-チミジンでラベルされた細胞のパーセンテージがオートラジオグラフィーによって決定される。Freshney (1994)、前出、を見よ。
成長因子又は血清依存性
形質転換した細胞は、普通、正常細胞よりも血清依存性が低い（例えば、Temin (1966) J. Natl. Cancer Insti. 37:167-175; Eagle, et al.(1970) J. Exp. Med. 131:836-879; Freshney, 前出、を見よ）。これは、一部は、形質転換した細胞によるいろいろな成長因子の放出による。形質転換した宿主細胞の成長因子又は血清依存性を対照のそれと比較することができる。
腫瘍特異的マーカーのレベル
腫瘍細胞はいくつかの因子（以下では“腫瘍特異的マーカー”）を正常細胞より多量に放出する。例えば、プラスミノゲン活性化因子（PA）は、ヒトの神経膠腫からは正常な脳細胞からよりも高レベルで放出される（例えば、Gullino, “血管形成、腫瘍血管新生、及び腫瘍増殖への干渉の可能性”、in Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Cancer, pp. 178-184, を見よ）。同様に、腫瘍血管形成因子（TAF）は腫瘍細胞において正常細胞よりも高レベルで放出される。例えば、Folkman(1992) “血管形成とがん”, in Sem. Cancer Biol. を見よ。
【０２４０】
これらの因子の放出を測定するいろいろな方法がFreshney (1994), 前出、に記載されている。また、Unkeles, et al. (1974) J. Biol. Chem. 249: 4295-4305; Strickland and Beers (1976) J. Biol. Chem. 251: 5694-5702; Whur, et al. (1980) Br. J. Cancer 42:305-312; Gullino, “血管形成、腫瘍血管新生、及び腫瘍増殖への干渉の可能性”、in Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Cancer, pp. 178-184,  Freshney Anticancer Res. 5:111-130 (1985);を見よ。
Matrigelへの侵入性
Madrigelやその他の細胞外マトリックス成分への侵入の度合いは、肺がん関連配列を修飾する化合物を同定する分析として用いることができる。腫瘍細胞は、悪性度とMadrigelやその他の細胞外マトリックス成分への侵入性の間で良い相関を示す。この分析では、腫瘍形成細胞が普通宿主細胞として用いられる。これらの宿主細胞における腫瘍サプレッサー遺伝子の発現は、宿主細胞の侵入性を減少させるであろう。
【０２４１】
Freshney (1994)、前出、に記載されている方法を用いることができる。簡単に言うと、宿主細胞の侵入性のレベルはMadrigel又はその他の細胞外マトリックス成分でコーティングされたフィルターを用いて測定できる。ゲルの中へ、又はゲルを通ってフィルターの遠い方の側への貫通が、侵入性として評価され、組織学的に細胞の数及び動いた距離によって評価される、又は細胞を125I によって予めラベルし、フィルターの遠い方の側又は皿の底で放射能をカウントすることによって評価される。例えば、Freshney (1994)、前出、を見よ。
in vivoでの腫瘍増殖
肺がん関連配列が細胞増殖に及ぼす影響は遺伝子導入又は免疫抑制マウスでテストできる。肺がん遺伝子が破壊されたり、肺がん遺伝子が挿入されたりしたノックアウト遺伝子導入マウスを作ることができる。ノックアウト遺伝子導入マウスは、マーカー遺伝子やその他の異種遺伝子を相同的組み換えによってマウアスのゲノムの内生的な肺がん遺伝子部位に挿入することによって作ることができる。このようなマウスは、内生的な肺がん遺伝子を肺がん遺伝子の突然変異バージョンに代えることによって、又は内生的な肺がん遺伝子を、例えば発がん物質への曝露によって突然変異させることによって作ることができる。
【０２４２】
DNA構成物が胚幹細胞の核に導入される。新しく構成された遺伝的な損傷を含む細胞が宿主マウスの胚に注入され、それが雌レシピエントに再移植される。これらの胚の一部は、一部は突然変異体の細胞ラインから由来する生殖細胞を有するキメラ・マウスに発育する。したがって、このキメラ・マウスを育種することによって、導入された遺伝的損傷を含む新しい系統のマウスを得ることができる（例えば、Capecci, et al. (1989) Science 244:1288, を見よ）。標的のキメラ・マウスは、Hogan, et al.(1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 及びRobertson(ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.に従って得ることができる。
【０２４３】
あるいはまた、いろいろな免疫抑制又は免疫不全宿主動物を使用することができる。例えば、遺伝的に胸腺が欠損した“ヌード”マウス（例えば、Giovanella, et al. (1974) J. Natl. Cancer Inst. 52:921, を見よ）、SCID マウス、胸腺切除マウス、又は照射マウス（例えば、Bradley, et al. (1978) Br. J. Cancer 38: 263; Selby, et al. (1980) Br. J. Cancer 41: 52, を見よ）、などを宿主として用いることができる。移植可能な腫瘍細胞（普通、約106 細胞）を同質遺伝子的な宿主に注射すると、高い割合の事例に侵襲性の腫瘍が生ずるが、同様の起源の正常細胞では生じない。侵襲性の腫瘍を生じた宿主に、肺がん関連配列を発現している細胞が皮下注射で注入される。適当な長さの時間の後、好ましくは4-8週後、腫瘍の成長が測定され（例えば、体積で、又は最大寸法で）、対照と比較される。統計的に有意な減少を（例えば、Student's T 検定で）示した腫瘍は、成長が阻害されたと言われる。
肺がんのポリヌクレオチド・モジュレーター
アンチセンス及びRNAiポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、肺がん関連タンパク質の活性は、アンチセンス又は阻害ポリヌクレオチド、すなわち、コーディングmRNA核酸配列、例えば肺がんタンパク質mRNA、又はそのサブ配列、に対し相補的な核酸、好ましくはそれと特異的にハイブリダイズする核酸、を用いてダウンレギュレートされる、又は完全に阻害される。
【０２４４】
本発明の文脈では、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、天然に見られるヌクレオチド、又は天然に見られるサブユニット又はその近い類似体から形成される合成種を含むことができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドはまた、変化した糖部分又は糖間リンケージを有することがある。それらの例としては、フォスフォロチオネート及びその他のイオウを含む分子種があり、その利用は当業者に公知である。本発明では、類似体とは、実効的に肺がんタンパク質mRNAとハイブリダイズするように機能する限り類似体と了解する。例えばIsis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor, Inc., Natick, MA, を見よ。
【０２４５】
このようなアンチセンス・ポリヌクレオチドは、組み換え手段を用いて容易に合成することができる、又はin vitroで合成できる。このような合成のための設備は、Applied Biosystemsなど数社から市販されている。フォスフォロチオネート及びアルキル化された誘導体などのオリゴヌクレオチドの調製も当業者に周知である。
【０２４６】
ここで用いられるアンチセンス分子は、アンチセンス又はセンス・オリグヌクレオチドを含む。センス・オリグヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖と結合して転写をブロックするために用いられる。アンチセンス及びセンス・オリグヌクレオチドは、肺がん分子に関する標的mRNA（センス）又はDNA（アンチセンス）と結合できる一本鎖核酸配列（RNA又はDNA）を含む。好ましいアンチセンス分子は、表の肺がん配列に対するもの、又はそのリガンド又は活性化因子に対するものである。本発明によるアンチセンス又はセンス・オリグヌクレオチドは、一般に少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14乃至30ヌクレオチドの断片を含む。ある与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づいてアンチセンス又はセンス・オリグヌクレオチドを誘導できる方法は、例えば、Stein and Cohen (1988) Cancer Res. 48:2659 及びvan der Krol, et al. (1988) BioTechniques 6:958に記載されている。
【０２４７】
RNA干渉とは、遺伝子の発現を配列特異的な仕方で抑制するメカニズムである。例えば、Brumelkamp, et al. (2002) Sciencexpress (21 March, 2002); Sharp(1999) Genes Dev. 13:139-141; and Cathew(2001) Curr. Op. Cell Biol. 13:244-248; を見よ。哺乳類細胞で、短い、例えば21 ntの、二本鎖小干渉RNAs (siRNA)がRNAi応答を効果的に誘発することが示された。例えば、Elbashir, et al. (2001) Nature 411:494-498; を見よ。このメカニズムを用いて、同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートすることが、例えば疾患の治療又は疾患との関連の検証に用いることができる。
リボザイム
アンチセンス・ポリヌクレオチドの他に、リボザイムを用いて肺がん関連ヌクレオチド配列を標的にしてその転写を阻害することができる。リボザイムは触媒的に他のRNA分子を開裂させるRNA分子である。いろいろな種類のリボザイムが記載されている、例えばグループＩリボザイム、ハンマーヘッド・リボザイム、ヘアピン・リボザイム、RNaseP、及びアクスヘッド・リボザイム、などである（いろいろなリボザイムの性質についての一般的な概観としては、例えば、Castanotto, et al. (1994) Adv. in Pharmacology 25:289-317; を見よ）。
ヘアピン・リボザイムの一般的特徴は、例えば、Hampel, et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18:299-304; European Patent Publication No. 0 360 257; U.S. Patent No.5,254,678; に記述されている。調製の方法は当業者には周知である（例えば、WO 94/26877; Ojwang, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Yamada, et al. (1994) Human Gene Therapy 1:39-45; Leavit, et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703; Leavit, et al.(1994) Human Gene Therapy 5:1151-120; and Yamada, et al. (1994) Virology 205:121-126; を見よ）。
肺がんのポリヌクレオチド・モジュレーターは、WO 91/04753に記載されているように、リガンドと結合する分子との接合体を形成することによって標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入することができる。適当なリガンドと結合する分子としては、細胞表面レセプター、成長因子、その他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターと結合するその他のリガンド、などがあげられるが、それだけに限定されない。リガンドと結合する分子の接合はリガンドと結合する分子が対応する分子又はレセプターと結合する能力、又はセンス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はその接合されたバージョンが細胞内に進入するのをブロックする能力、を実質的に妨害しないことが好ましい。あるいはまた、肺がんのポリヌクレオチド・モジュレーターは、例えば、WO 90/10448に記載されているようにポリヌクレオチド−脂質錯体を形成することによって、標的核酸配列を含む細胞に導入することができる。アンチセンス分子、又はノックアウト及びノックイン・モデル、は、治療の方法として以外に、上述のようなスクリーニング分析にも用いることができることは言うまでもない。
【０２４８】
したがって、ある実施の形態では、細胞又は生物における肺がんを修飾する方法が提供される。ある実施の形態では、この方法は、内生的な肺がんタンパク質の生物的活性を低下又は消失させる抗肺がん抗体を細胞に投与するステップを含む。あるいはまた、この法は凹は、細胞又は生物に肺がんタンパク質をコードする組み換え核酸を投与するステップを含む。これはいくつかの仕方で行うことができる。ある好ましい実施の形態では、例えば、肺がんでその肺がん配列がダウンレギュレートされる場合、細胞における肺がん遺伝子産物の量を増加させることによってこのような状態を逆転させることができる。これは、例えば、内因的な肺がん遺伝子を過剰発現させることによって、又は公知の遺伝子治療方法を用いて、その肺がん配列をコードする遺伝子を投与することによって、遂行される。ある好ましい実施の形態では、この遺伝子治療法は、例えば、参照によって全体が本明細書に取り込まれるPCT/US93/03868に記載されているように、強化相同的組み換え（EHR）による外因的な遺伝子の組込みを含む。あるいはまた、例えば、肺がん配列が肺がんでアップレギュレートされる場合、その内因的な肺がん遺伝子の活性を、例えば肺がんアンチセンス又はRNAi核酸の投与によって減少させる。
【０２４９】
ある実施の形態では、本発明の肺がんタンパク質を用いてその肺がんタンパク質に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体を生成することもできる。同様に、標準的な方法で、肺がんタンパク質をアフィニティー・クロマトグラフィー・カラムに組み合わせることができる。次に、このカラムを用いて、産生、診断、又は治療目的に有用な肺がん抗体を精製することができる。ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質に対してユニークなエピトープに対する抗体が生成される：すなわち、この抗体は他のタンパク質に対して交差感受性をほとんど全く示さない。この肺がん抗体を標準アフィニティー・クロマトグラフィー・カラムと組み合わせて、肺がんタンパク質を精製するのに用いることができる。この抗体は、また、肺がんタンパク質と特異的に結合するのでブロッキング・ポリペプチドとして用いることもできる。
変異体肺がん関連配列を同定する方法
理論には拘束されないが、いろいろな肺がん配列の発現は肺がんと相関している。したがって、突然変異体又は変異体肺がん遺伝子に基づいた障害を決定することができる。ある実施の形態では、本発明は、変異体肺がん遺伝子を含む細胞を同定する方法、例えばある細胞における少なくとも１つの肺がん遺伝子の配列の全部又は一部を決定する方法、を提供する。ある好ましい実施の形態では、本発明はある個体の肺がん遺伝子型を同定する方法、例えばその個体の少なくとも１つの肺がん遺伝子の配列の全部又は一部を決定する方法、を提供する。これは一般に、その個体の少なくとも１つの組織で行われ、いくつかの組織又は同じ組織の異なるサンプルの評価を含むことがある。この方法は、配列を決定した肺がん遺伝子の配列を知られている肺がん遺伝子、すなわち、野生型遺伝子と比較するステップを含む。
【０２５０】
その場合、肺がん遺伝子の全部又は一部の配列を知られている肺がん遺伝子の配列と比較して、差があるかどうかを決定することができる。これは、知られている相同性プログラム、例えばBestfit, etc.,を用いて行うことができる。ある好ましい実施の形態では、患者の肺がん遺伝子と知られている肺がん遺伝子の間に配列の差が存在することが、本明細書に述べられたように、疾患の状態又は疾患の状態の性向と相関する。
【０２５１】
ある好ましい実施の形態では、肺がん遺伝子をプローブとして用いてゲノムにおけるその肺がん遺伝子のコピーの数を決定する。
【０２５２】
別の好ましい実施の形態では、肺がん遺伝子をプローブとして用いて肺がん遺伝子の染色体での局在を決定する。染色体での局在などの情報は、特に肺がん遺伝子の座に転座などの染色体異常が同定されるとき、診断又は予後判定を下すのに利用される。
製薬組成物及びワクチン組成物の投与
ある実施の形態では、治療的に有効な用量の肺がんタンパク質又はそのモジュレーターが、患者に投与される。“治療的に有効な用量”とは、本明細書では、そのために投与される効果を生ずるだけの用量を意味する。正確な用量は、治療の目的にもより、当業者であれば公知の方法によって決定できる（例えば、Ansel, et al. (1992) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;  Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd (1999) Dosage Calculation）。肺がん分解、全身vs. 局所送達、及び新しいプロテアーゼ合成速度、ならびに年齢、体重、一般的健康、性別、食事、投与時刻、薬剤相互作用、及び病状の重篤度、などに関する調整が必要であり、当業者であれば日常的な実験によって決定できる。
【０２５３】
本発明の目的では、“患者”とはヒトとその他の動物、特に哺乳類、を含む。したがって、この方法はヒトの治療にも、獣医学の用途にも応用できる。好ましい実施の形態では、患者は哺乳類であり、好ましくは霊長類であり、最も好ましい実施の形態では、患者はヒトである。
【０２５４】
本発明の肺がんタンパク質及びそのモジュレーターの投与はいろいろな仕方で行うことができ、例えば経口的に、皮下的に、静脈内に、鼻腔内に、経皮的に、腹腔内に、筋肉内に、肺内に、子宮に、直腸に、眼内に、行うことができるが、それだけに限定されない。場合によって、例えば傷や炎症の治療で、肺がんタンパク質及びそのモジュレーターは溶液又はスプレーで直接塗布されることがある。
【０２５５】
本発明の製薬組成物は、肺がんタンパク質を患者に投与するのに適当な形で含んでいる。好ましい実施の形態では、この製薬組成物は水溶性の形で、例えば製薬的に受容される塩として存在し、酸及び塩基塩の両方を含む。“製薬的に受容される酸付加塩”とは、自由塩基の生物的な有効性を保持する塩であって、生物的その他で望ましくないものではなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、などの無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマール酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、によって形成される塩を指す。“製薬的に受容される塩基付加塩”とは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの無機塩基から得られるものを含む。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩である。製薬的に受容される有機非毒性塩基から得られる塩としては、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に見られる置換アミンを含む置換アミン、環式アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミン、などの塩があげられる。
【０２５６】
製薬組成物は、また、以下のものを１つ以上含むことがある：血清アルブミンなどのキャリア・タンパク質；バッファー；微結晶セルロース、ラクトース、コーンその他のスターチ、などの充填剤；結合剤；甘味料とその他の芳香剤；着色剤；及びポリエチレン・グリコール。
【０２５７】
この製薬組成物は、投与の方法によるが、いろいろなユニット投与形態で投与できる。例えば、経口投与に適したユニット投与形態としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジなどがあるが、それだけに限定されない。肺がんタンパク質モジュレーター（例えば、抗体、アンチセンス構成物、リボザイム、小有機分子、など）は、経口投与される場合、消化から保護しなければならないことが認識されている。普通、これは、分子を酸及び酵素による加水分解に対して耐えられるようにする組成物で分子を錯体化することによって、又は分子を適当な耐性のキャリア、例えばリポゾームや保護バリア、でパッケージすることによって遂行される。薬剤を消化から保護する手段は当業者には周知である。
【０２５８】
投与のための組成物は、普通、肺がんタンパク質モジュレーターを製薬的に受容されるキャリアに、好ましくは水性のキャリアに溶解された形で含む。いろいろな水性キャリア、例えば緩衝生理食塩水など、を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、通常の、周知の殺菌方法によって無菌化できる。組成物は、生理的条件を近似するために、ｐＨ調節剤や緩衝剤、毒性調節剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、製薬的に受容される補助物質を必要に応じて含むことができる。これらの調合における活性物質の濃度は非常に多様であり、主に液体の量、粘度、体重、などに基づいて、選択された特定の投与モードと患者のニーズにしたがって選ばれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., 1980) 及びHardman, et al., (eds. 1996) Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics）。
【０２５９】
静脈内投与のための典型的な製薬組成物は、１日患者あたり約0.1 乃至10 mgである。特に薬剤が血流中でなく隔離された部位、例えば体の空所又は器官の内腔など、に投与されるとき、１日患者あたり0.1から約100 mgまでという投薬量を用いることができる。局所投与では実質的にもっと高い投与量も可能である。非経口的に投与できる組成物の実際の調製方法は、当業者には公知又は明らかである、例えば、Remington's Pharmaceutical Science  and Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics , 前出。
【０２６０】
肺がんタンパク質のモジュレーターを含む組成物は、治療処置又は予防処置のために投与することができる。治療目的の場合、組成物は疾患（例えば、がん）で苦しんでいる患者に、その疾患及び合併症を治す、又は少なくとも部分的に停止させるに十分な量で投与される。これを遂行するのに十分な量が、“治療的に有効な用量”と定義される。この用途に効果的な量は疾患の重篤性と患者の健康の一般的な状態による。組成物は、用量及び頻度によって、必要に応じかつ患者に許容される限り、単一投与又は複数投与で投与される。いずれにせよ、組成物は患者を効果的に治療するために本発明の物質を十分な量で与えなければならない。哺乳類におけるがんの発生を阻止又は遅らせることができるモジュレーターの量は“予防的に効果的な用量”と呼ばれる。予防的な処置のために必要な具体的な用量は、医学的な状態とその哺乳類の経歴、予防しようとする特定のがん、ならびに年齢、体重、性別、投与ルート、効率、などの他の因子、による。このような予防的処置は、例えば、以前にがんになった哺乳類においてがんの再発を予防するために、又は、少なくとも部分的に、遺伝子発現プロフィールに基づいてがんを発病する確率がかなり高いと考えられる哺乳類で用いることができる。ワクチン戦略を、DNAワクチンの形又はタンパク質ワクチンの形で用いることもできる。
【０２６１】
本発明の肺がんタンパク質修飾化合物は、単独で投与することも、別の肺がん修飾化合物と組み合わせて、又は別の治療物質、例えば他の抗がん剤や治療と組み合わせて投与することもできるということは理解されるであろう。
【０２６２】
多数の実施の形態で、１つ以上の核酸、例えば、表に示された核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えばアンチセンス又はRNAiポリヌクレオチド又はリボザイム、がin vitro 又はin vivoで細胞に導入される。本発明は、in vitro（細胞なし）、ex vivo、又はin vivo（細胞又は生物をベースとする）組み換え発現システムを用いて肺がん関連ポリペプチド及び核酸を発現させるために有用な方法、試薬、ベクター、及び細胞を提供する。
【０２６３】
タンパク質又は核酸の発現のために核酸を宿主細胞に導入するのに用いる具体的な手順は、用途特異的である。外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するために多くの手順を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム移入、スフェロプラスト、電気穿孔、リポゾーム、マイクロインジェクション、プラズマ・ベクター、ウイルス・ベクター、及びクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又はその他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するためのその他の周知の方法、がある（例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 (Berger), Ausubel, et al. (eds. 1999) Current Protocols (supplemented through 1999), 及びSambrook, et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed. Vol. 1-3); を見よ）。
【０２６４】
ある好ましい実施の形態では、肺がんタンパク質とモジュレーター は、治療物質として投与され、上述のように調合できる。同様に、肺がん遺伝子（全長配列、部分配列、又は肺がんコーディング領域の調節配列を含む）も遺伝子治療目的で投与できる。これらの肺がん遺伝子はアンチセンス又は阻害的応用、例えば阻害RNAとして又は遺伝子治療（例えば、ゲノムへの組み込みのため）又はアンチセンス組成物としての応用、を含む。
【０２６５】
肺がんポリペプチド及びポリヌクレオチドは、また、HTL, CTL, 及び抗体応答を刺激するためのワクチン組成物として投与することもできる。このようなワクチン組成物としては、例えば、脂質化されたペプチド（例えば、Vitiello, et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:341; を見よ）、ポリ（DL-ラクチド-co-グリコリド）（“PLG”）小球に封入されたペプチド組成物（例えば、Eldridge, et al. (1991) Molec. Immunol. 28:287-294; Alonso, et al. (1994) Vaccine 12:299-306; Jones, et al. (1995) Vaccine 13:675-681; を見よ）、免疫刺激複合体（ISCOMS）に収められたペプチド組成物（例えば、Takahashi, et al. (1990) Nature 344:873-875; Hu, et al. (1998) Clin. Exp. Immunol. 113:235-243; を見よ）、多重抗原ペプチド・システム（MAPs）（例えば、Tam (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413; Tam (1996) J. Immunol. Methods 196:17-32; を見よ）、多価ペプチドとして調合されたペプチド；砲撃送達システムで使用されるペプチド、普通、結晶ペプチド、ウイルス送達ベクター（Perkus, et al., p.379, In: Kaufman(ed. 1996) Concepts in Vaccine development; Chakrabarti, et al. (1986) Nature 320:535; Hu, et al. (1986) Nature 320:537; Kieny, et al. (1986) AIDS Bio/Technology 4:790; Top, et al. (1971) J. Infect. Dis. 124: 148; Chanda, et al. (1990) Virology 175: 535）、ウイルス又は合成起源の粒子（例えば、Kofler, et al. (1996) J. Immunol. Methods 192:25; Eldridge, et al. (1993) Sem. Hematol. 30:16; Falo, et al. (1995) Nature Med. 7:649; を見よ）、アジュバント（Warren, et al. (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:369; Gupta, et al. (1993) Vaccine 11:293）、リポゾーム（Ready, et al. (1992) J. Immunol. 148:1585; Rock (1996) Immunol. Today 17:131）、又は裸の又は粒子に吸着されたcDNA（Ulmer, et al. (1993) Science 259:1745; Robinson, et al. (1993) Vaccine 11:957; Shiver, et al. p.423 In: Kaufman(ed. 1996) Concepts in Vaccine development; Cease and Berzofsky (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:923 and Eldridge, et al. (1993) Sem. Hematol. 30:16）、毒素を標的にした送達方法、レセプター・ターゲッティングと呼ばれる方法、例えばAvant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusettes)のテクノロジー、も利用できる。
【０２６６】
ワクチン組成物は、しばしば、アジュバントを含む。多くのアジュバントが、抗原を急速な代謝から保護するように設計された物質、例えば水酸化アルミニウムや鉱物油、及び免疫応答の刺激物質、例えば脂質A, Bortadella pertussis 又はMycobacterium tuberculosisに由来するタンパク質、を含む。いくつかのアジュバントは、市販されている、例えばフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）; Merckアジュバント（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；AS-2（SmithKline Beecham, Philadelphia, PA）；水酸化アルミニウム（alum）やリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、又は亜鉛の塩；アシル化されたチロシンの不溶懸濁物；アシル化された砂糖；陽又は陰イオンで誘導体化された多糖；ポリホスファザン；生分解性のマイクロスフェア；モノホスフォリル脂質A及びquil A；などである。サイトカイン、例えばGM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12、及び他の同様の成長因子もアジュバントとして使用できる。
【０２６７】
ワクチンは、核酸組成物として投与することもでき、その場合は１つ以上のポリペプチド又はその断片をコードするDNA又はRNAが患者に投与される。このアプローチは、例えば、Wolff, et al. (1990) Science 247:1465 ならびにU.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; WO 98/04720 に記載されている。DNAベースの送達テクノロジーの例としては、“裸のDNA”；促進（bupivicaine, ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン脂質錯体、及び粒子媒介（“遺伝子銃”）又は圧力媒介送達（例えば、U.S. Patent No. 5,922,687 を見よ）などがあげられる。
【０２６８】
治療的又は予防的な免疫化のために、本発明のペプチドはウイルス又はバクテリア・ベクターによって発現させることができる。発現ベクターの例としては、ワクチニア又は鶏痘などの弱毒化されたウイルス宿主があげられる。このアプローチは、ワクチニア・ウイルスを、例えば肺がんポリペプチド又はポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用する。宿主に導入されると、組み換えワクチニア・ウイルスは免疫原ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコルで用いられるワクチニア・ベクター及び方法は、例えば、U.S. Patent No. 4,722,848 に記載されている。もう１つのベクターはBCG (Bacille Calmette Guerin)である。BCGベクターは、Stover, et al. (1991) Nature 351:456-460に記載されている。治療的投与又は免疫化で利用できるその他のいろいろなベクター、例えば、アデノ及びアデノ関連ウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、Salmonella typhi ベクター、解毒された炭疽毒素ベクター、など、は本明細書における記述から当業者には明らかであろう（例えば、Shata, et al. (2000) Mol Med Today 6:66-71; Shedlock, et al. (2000) J. Leukoc. Biol. 68:793-806; Hipp, et al. (2000) In Vivo 14:571 - 585; を見よ）。
【０２６９】
DNAワクチンとしての遺伝子を利用する方法は周知であり、肺がん遺伝子又は肺がん遺伝子の一部を調節可能なプロモーター又は組織特異的なプロモーターの制御下に置いて肺がん患者で発現させるステップを含む。DNAワクチンに用いられる肺がん遺伝子は全長の肺がんタンパク質をコードすることができるが、さらに好ましくは肺がんタンパク質から由来するペプチドを含む肺がんタンパク質の部分をコードする。ある実施の形態では、患者は、肺がん遺伝子から得られる複数のヌクレオチド配列を含むDNAワクチンによって免疫化される。例えば、肺がんタンパク質のサブフラグメントをコードする肺がん関連遺伝子又は配列が発現ベクターに導入され、クラスＩ MHC の形での免疫原性及び細胞毒性T細胞応答を発生させる能力がテストされる。この手順によって細胞内エピトープなどの抗原を提示する細胞に対する細胞毒性のT細胞応答を生成することが可能になる。
【０２７０】
ある好ましい実施の形態では、DNAワクチンは、アジュバント分子をコードする遺伝子をDNAワクチンと共に含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによってコードされる肺がんポリペプチドに対する免疫原性応答を増加させるサイトカインを含む。付加的な又は別のアジュバントも利用できる。
【０２７１】
別の好ましい実施の形態では、肺がん遺伝子は肺がんの動物モデルを生成するために用いられる。同定された肺がん遺伝子が転移性組織において抑圧又は減少する場合、遺伝子治療テクノロジー、例えばアンチセンス又は阻害的なRNAが肺がん遺伝子に向けられる遺伝子治療テクノロジーが、また、遺伝子の発現を減少又は抑圧する。肺がんの動物モデルは、肺がん関連配列のモジュレーター又は肺がんのモジュレーターのスクリーニングで利用される。同様に、遺伝子ノックアウト法を含む遺伝子導入動物テクノロジーは、例えば適当な遺伝子ターゲッティング・ベクターによる相同的組み換えの結果として、肺がんタンパク質の発現の消失又は増加を生ずる。望む場合、肺がんタンパク質の組織特異的な発現又はノックアウトが必要になるであろう。
【０２７２】
肺がんタンパク質が肺がんで過剰に発現させることも可能である。したがって、肺がんタンパク質を過剰に発現する遺伝子導入動物を生成することができる。所望の発現レベルに応じていろいろな強さのプロモーターを用いて導入遺伝子を発現させることができる。また、組み込まれた導入遺伝子のコピーの数を決定し比較して導入遺伝子の発現レベルを決定することができる。このような方法で生成された動物は肺がんの動物モデルとして利用でき、さらに、肺がんを治療するためのモジュレーターのスクリーニングでも有用である。
診断及び／又は予後判定の用途で用いられるキット
上で示唆した診断、研究、及び治療用途で用いるために、本発明によってキットも提供される。診断及び研究用途では、このキットは以下の少なくとも１つを含む：分析試薬、緩衝剤、肺がん特異的な核酸又は抗体、ハイブリダイゼーション・プローブ及び／又はプライマー、アンチセンス・ポリヌクレオチド、リボザイム、RNAi、ドミナント・ネガティブ肺がんポリペプチド又はポリヌクレオチド、肺がん関連配列の小分子阻害物質、etc。 治療用の製品は、無菌の生理食塩水又は別の製薬的に受容されるエマルジョン又は懸濁液のベースを含む。
【０２７３】
さらに、キットは、本発明の方法を実行するための指示（例えば、手順）を含む説明資料を含む。普通、説明資料は、書かれた又は印刷されたものを含むが、それだけに限定されない。これらの指示を格納してそれをエンド・ユーザーに伝えることができる媒体も本発明によって考えられている、このような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、CD ROM）、などがあるが、それだけに限定されない。このような媒体は、それらの説明資料を提供するインターネット・サイトのアドレスを含む。
【０２７４】
本発明は、また、肺がん関連配列のモジュレーターをスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは容易に入手できる材料と試薬から作成できる。例えば、このようなキットは１つ以上の以下の材料を含む：肺がん関連ポリペプチド又はポリヌクレオチド、反応チューブ、及び肺がん関連活性をテストするための指示。オプションとして、キットは生物的に活性な肺がんタンパク質を含む。本発明にしたがって、いろいろなキットと成分を、意図しているキットのユーザー及びユーザーの個々のニーズに応じて作ることができる。診断は、普通、複数の遺伝子又は産物の評価を必要とする。普通、遺伝子は、過去のデータや出てきたデータで同定される病気の重要なパラメータとの相関に基づいて選ばれる。
【０２７５】
実施例
実施例１：遺伝子チップ分析
遺伝子チップを用いていろいろな正常組織とがん組織の分子プロフィールを決定して分析した。RNAが単離され、遺伝子チップの分析が（Glynne, et al. (2000) Nature 403:672-676; Zhao, et al. (2000) Genes Dev. 14:981-993）に記載されているように行われた。
表1Aと1Bは、以前に2001年4月18日にUSSN 60/284,770(18501-001500US)で、及び2001年11月29日にUSSN 60/334,370(18501-001520US)で登録された。
【０２７６】
【表１】
2005527180.tif 000002
【０２７７】
【表２】
2005527180.tif 000003
【０２７８】
【表３】
2005527180.tif 000004
【０２７９】
【表４】
2005527180.tif 000005
【０２８０】
【表５】
2005527180.tif 000006
【０２８１】
【表６】
2005527180.tif 000007
【０２８２】
【表７】
2005527180.tif 000008
【０２８３】
【表８】
2005527180.tif 000009
【０２８４】
【表９】
2005527180.tif 000010
【０２８５】
表1Bは、表1AにおいてUnigeneID'sを欠いているPkeyについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が、Clustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いて配列類似性に基づいてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーがAccessionの欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０２８６】
【表１０】
2005527180.tif 000011
【０２８７】
【表１１】
2005527180.tif 000012
【０２８８】
【表１２】
2005527180.tif 000013
【０２８９】
【表１３】
2005527180.tif 000014
【０２９０】
表2A〜8Cは以前にUSSN 60/339,245(18501-004100US)で2001年11月９日に出願された。
表２Aは、正常な肺及び慢性疾患の肺に比べて肺腫瘍でダウンレギュレートされる504の遺伝子を示している。慢性疾患の肺サンプルは、線維症，気腫、気管支炎などの慢性の非悪性疾患を代表している。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:             慢性疾患肺サンプルのAIの90パーセンタイル値を腺がん及び扁平上皮がんサンプルのAIの80パーセンタイル値で割って得られる値
R2:             正常肺サンプルのAIの中央値を腺がん及び扁平上皮がんサンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R3:             正常肺サンプルのAIの中央値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値を、腺がん及び扁平上皮がんサンプルのAIの90パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値で割って得られる値
R4:             正常肺サンプルのAIの中央値を扁平上皮がん及び腺がんサンプルの平均AIで割って得られる値
R5:             正常肺サンプルのAIの中央値を腺がんの90パーセンタイル値で割って得られる値
R6:             正常肺サンプルのAIの中央値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値を、腺がんのAIの90パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値で割って得られる値
R7:             正常肺サンプルのAIの中央値を扁平上皮がんの90パーセンタイル値で割って得られる値
R8:             正常肺サンプルのAIの中央値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値を、扁平上皮がんのAIの90パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値で割って得られる値
【０２９１】
【表１４】
2005527180.tif 000015
【０２９２】
【表１５】
2005527180.tif 000016
【０２９３】
【表１６】
2005527180.tif 000017
【０２９４】
【表１７】
2005527180.tif 000018
【０２９５】
【表１８】
2005527180.tif 000019
【０２９６】
【表１９】
2005527180.tif 000020
【０２９７】
【表２０】
2005527180.tif 000021
【０２９８】
表2Bは、表2AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が、Clustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いて配列類似性に基づいてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーがAccessionの欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０２９９】
【表２１】
2005527180.tif 000022
【０３００】
表3Aは、正常な肺に比べて慢性疾患の肺でアップレギュレートされる452の遺伝子を示している。慢性疾患の肺サンプルは、線維症，気腫、気管支炎などの慢性の非悪性疾患を代表している。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:             慢性疾患肺サンプルのAIの80パーセンタイル値を正常肺サンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R2:             慢性疾患肺サンプルのAIの80パーセンタイル値を正常肺サンプル、扁平上皮がん及び腺がん、の90パーセンタイル値で割って得られる値
R3:             慢性疾患肺サンプルのAIの70パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値を正常肺サンプル、扁平上皮がん及び腺がん、の90パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル、の全体のAIの15パーセンタイル値で割って得られる値
【０３０１】
【表２２】
2005527180.tif 000023
【０３０２】
【表２３】
2005527180.tif 000024
【０３０３】
【表２４】
2005527180.tif 000025
【０３０４】
【表２５】
2005527180.tif 000026
【０３０５】
【表２６】
2005527180.tif 000027
【０３０６】
【表２７】
2005527180.tif 000028
【０３０７】
表3Bは、表3AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が、Clustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いて配列類似性に基づいてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーがAccessionの欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３０８】
【表２８】
2005527180.tif 000029
【０３０９】
表4Aは、化学療法又は放射線療法で治療された患者からのサンプルでアップレギュレートされる202の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:             化学療法又は放射線療法で治療された患者からのサンプルのAIの平均を正常肺サンプルのAIの平均で割って得られる値
【０３１０】
【表２９】
2005527180.tif 000030
【０３１１】
【表３０】
2005527180.tif 000031
【０３１２】
【表３１】
2005527180.tif 000032
【０３１３】
表4Bは、表4AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３１４】
【表３２】
2005527180.tif 000033
【０３１５】
表5Aは、正常な肺及び慢性疾患の肺に比べて扁平上皮がん及び腺がん肺腫瘍においてアップレギュレートされる680の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:             扁平上皮がん及び腺がん肺腫瘍サンプルのAIの70パーセンタイル値を正常な肺及び慢性疾患の肺サンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R2:             腺がん肺腫瘍サンプルのAIの80パーセンタイル値を正常な肺及び慢性疾患の肺サンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R3:             扁平上皮がん肺腫瘍サンプルのAIの80パーセンタイル値を正常な肺及び慢性疾患の肺サンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R4:             腺がん肺腫瘍サンプルのAIの80パーセンタイル値を扁平上皮がん肺腫瘍サンプルのAIの80パーセンタイル値で割って得られる値
R5:             扁平上皮がん及び腺がん肺腫瘍サンプルのAIの70パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル全体のAIの15パーセンタイル値を正常及び慢性疾患肺サンプルの90パーセンタイル値マイナス正常な肺、慢性疾患の肺及び腫瘍サンプル全体のAIの15パーセンタイル値で割って得られる値
【０３１６】
【表３３】
2005527180.tif 000034
【０３１７】
【表３４】
2005527180.tif 000035
【０３１８】
【表３５】
2005527180.tif 000036
【０３１９】
【表３６】
2005527180.tif 000037
【０３２０】
【表３７】
2005527180.tif 000038
【０３２１】
【表３８】
2005527180.tif 000039
【０３２２】
【表３９】
2005527180.tif 000040
【０３２３】
【表４０】
2005527180.tif 000041
【０３２４】
【表４１】
2005527180.tif 000042
【０３２５】
表5Bは、表5AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３２６】
【表４２】
2005527180.tif 000043
【０３２７】
表6Aは、肺がんの喫煙者に比べて肺がんの非喫煙者でアップレギュレートされる99の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:             腺がんの非喫煙者のサンプルのAIの平均を腺がんの喫煙者のサンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R2:             扁平上皮がんの非喫煙者のサンプルのAIの平均を扁平上皮がんの喫煙者のサンプルのAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
【０３２８】
【表４３】
2005527180.tif 000044
【０３２９】
【表４４】
2005527180.tif 000045
【０３３０】
表6Bは、表6AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３３１】
【表４５】
2005527180.tif 000046
【０３３２】
表7Aは、肺がんの喫煙者に比べて肺がんの非喫煙者でダウンレギュレートされる98の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:              腺がんの喫煙者のサンプルのAIの90パーセンタイル値を腺がんの非喫煙者のサンプルのAIの平均で割って得られる値
R2:              扁平上皮がんの喫煙者のサンプルのAIの90パーセンタイル値を扁平上皮がんの非喫煙者のサンプルのAIの平均で割って得られる値
【０３３３】
【表４６】
2005527180.tif 000047
【０３３４】
【表４７】
2005527180.tif 000048
【０３３５】
表7Bは、表7AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３３６】
【表４８】
2005527180.tif 000049
【０３３７】
表8Aは、40以上の異なる正常な体組織の集まりと比べて肺腫瘍又は慢性疾患の肺においてアップ−又はダウン−レギュレートされる1720の遺伝子を示す。慢性疾患の肺サンプルは、線維症，気腫、気管支炎などの慢性の非悪性疾患を代表している。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu02 Genechip アレーの39494のプローブセットから選ばれた。この分析で得られた各プローブセットについての遺伝子発現データはmRNA発現の相対レベルを反映する規格化された値である平均強度（AI）で表された。
Pkey:           Unique Eosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:              肺腫瘍のAIの70パーセンタイル値を正常な肺のAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
R2:              慢性疾患の肺のAIの70パーセンタイル値を正常な肺のAIの90パーセンタイル値で割って得られる値
【０３３８】
【表４９】
2005527180.tif 000050
【０３３９】
【表５０】
2005527180.tif 000051
【０３４０】
【表５１】
2005527180.tif 000052
【０３４１】
【表５２】
2005527180.tif 000053
【０３４２】
【表５３】
2005527180.tif 000054
【０３４３】
【表５４】
2005527180.tif 000055
【０３４４】
【表５５】
2005527180.tif 000056
【０３４５】
【表５６】
2005527180.tif 000057
【０３４６】
【表５７】
2005527180.tif 000058
【０３４７】
【表５８】
2005527180.tif 000059
【０３４８】
【表５９】
2005527180.tif 000060
【０３４９】
【表６０】
2005527180.tif 000061
【０３５０】
【表６１】
2005527180.tif 000062
【０３５１】
【表６２】
2005527180.tif 000063
【０３５２】
【表６３】
2005527180.tif 000064
【０３５３】
【表６４】
2005527180.tif 000065
【０３５４】
【表６５】
2005527180.tif 000066
【０３５５】
【表６６】
2005527180.tif 000067
【０３５６】
【表６７】
2005527180.tif 000068
【０３５７】
【表６８】
2005527180.tif 000069
【０３５８】
【表６９】
2005527180.tif 000070
【０３５９】
表8Bは、表8AにおいてUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３６０】
【表７０】
2005527180.tif 000071
【０３６１】
【表７１】
2005527180.tif 000072
【０３６２】
【表７２】
2005527180.tif 000073
【０３６３】
表8Cは、UnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いている表8AのPkeysについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０３６４】
【表７３】
2005527180.tif 000074
【０３６５】
【表７４】
2005527180.tif 000075
【０３６６】
【表７５】
2005527180.tif 000076
【０３６７】
【表７６】
2005527180.tif 000077
【０３６８】
【表７７】
2005527180.tif 000078
【０３６９】
表9A: 肺がん治療のための可能な治療、診断、及び予後判定ターゲット
表9Aは、正常な体組織に比べて肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイドを含む）でアップレギュレートされる約1312の遺伝子を示す。 これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表9Bは、表9AでUnigeneID'sを欠いているプライム・キー(Pkey)についてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表9Cは、表9AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkeysについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:        Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:     Unigeneナンバー
Unigene Title: Unigene名称
R1:              肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイドを含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
R2:              非悪性肺疾患サンプル（気管支炎、気腫、線維症、無気肺、喘息を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
【０３７０】
【表７８】
2005527180.tif 000079
【０３７１】
【表７９】
2005527180.tif 000080
【０３７２】
【表８０】
2005527180.tif 000081
【０３７３】
【表８１】
2005527180.tif 000082
【０３７４】
【表８２】
2005527180.tif 000083
【０３７５】
【表８３】
2005527180.tif 000084
【０３７６】
【表８４】
2005527180.tif 000085
【０３７７】
【表８５】
2005527180.tif 000086
【０３７８】
【表８６】
2005527180.tif 000087
【０３７９】
【表８７】
2005527180.tif 000088
【０３８０】
【表８８】
2005527180.tif 000089
【０３８１】
【表８９】
2005527180.tif 000090
【０３８２】
【表９０】
2005527180.tif 000091
【０３８３】
【表９１】
2005527180.tif 000092
【０３８４】
【表９２】
2005527180.tif 000093
【０３８５】
【表９３】
2005527180.tif 000094
【０３８６】
表9B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０３８７】
【表９４】
2005527180.tif 000095
【０３８８】
【表９５】
2005527180.tif 000096
【０３８９】
【表９６】
2005527180.tif 000097
【０３９０】
表9C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０３９１】
【表９７】
2005527180.tif 000098
【０３９２】
【表９８】
2005527180.tif 000099
【０３９３】
表10A: 肺がん及び非悪性肺疾患の治療のための可能な治療、診断、及び予後判定ターゲット
表2Aは、肺腫瘍及び正常体組織に比べて非悪性肺疾患でアップレギュレートされる、及び／又は、正常な肺及び非悪性肺疾患と比べて肺腫瘍でダウンレギュレートされる約307の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表10Bは、表10AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表10Cは、表10AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkeysについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene名称
R1:              肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイド腫瘍を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
R2:              非悪性肺疾患サンプル（気管支炎、気腫、線維症、無気肺、喘息を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
【０３９４】
【表９９】
2005527180.tif 000100
【０３９５】
【表１００】
2005527180.tif 000101
【０３９６】
【表１０１】
2005527180.tif 000102
【０３９７】
【表１０２】
2005527180.tif 000103
【０３９８】
【表１０３】
2005527180.tif 000104
【０３９９】
表10B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４００】
【表１０４】
2005527180.tif 000105
【０４０１】
表10C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４０２】
【表１０５】
2005527180.tif 000106
【０４０３】
表11A:  腺がんを他の肺疾患及び正常肺から区別する遺伝子
表11Aは、肺の腺がんにおいて他の肺腫瘍、非悪性肺疾患、及び正常な肺と比べてアップレギュレートされる約84の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表11Bは、表11AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表11Cは、表11AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkey'sについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene名称
R1:              肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイド腫瘍を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
R2:              非悪性肺疾患サンプル（気管支炎、気腫、線維症、無気肺、喘息を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
【０４０４】
【表１０６】
2005527180.tif 000107
【０４０５】
【表１０７】
2005527180.tif 000108
【０４０６】
表11B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４０７】
【表１０８】
2005527180.tif 000109
【０４０８】
表11C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４０９】
【表１０９】
2005527180.tif 000110
【０４１０】
表12A:  扁平上皮がんを他の肺疾患及び正常肺から区別する遺伝子
表12Aは、肺の扁平上皮がんにおいて他の肺腫瘍、非悪性肺疾患、及び正常な肺と比べてアップレギュレートされる約72の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表12Bは、表12AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表12Cは、表12AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkey'sについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene名称
R1:              肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイド腫瘍を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
R2:              非悪性肺疾患サンプル（気管支炎、気腫、線維症、無気肺、喘息を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
【０４１１】
【表１１０】
2005527180.tif 000111
【０４１２】
【表１１１】
2005527180.tif 000112
【０４１３】
表12B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４１４】
【表１１２】
2005527180.tif 000113
【０４１５】
表12C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４１６】
【表１１３】
2005527180.tif 000114
【０４１７】
表13A:  非悪性肺疾患を肺腫瘍及び正常な肺と区別する遺伝子
表13Aは、肺腫瘍及び正常な肺と比べて非悪性肺疾患でアップレギュレートされる約23の遺伝子を示す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表13Bは、表13AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表13Cは、表13AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkey'sについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene名称
R1:              肺腫瘍（扁平上皮がん、腺がん、小細胞がん、肉芽腫、カルチノイド腫瘍を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
R2:              非悪性肺疾患サンプル（気管支炎、気腫、線維症、無気肺、喘息を含む）の平均を正常な肺サンプルの平均で割って得られる値
【０４１８】
【表１１４】
2005527180.tif 000115
【０４１９】
表13B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４２０】
【表１１５】
2005527180.tif 000116
【０４２１】
表10C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４２２】
【表１１６】
2005527180.tif 000117
【０４２３】
表14A:  可能な肺疾患ターゲットの好ましい用途と細胞での局在
表14Aは、表9Aと10Aに現れる遺伝子の細胞での局在と好ましい用途を示す。mAbはモノクローナル抗体を表し、diagは診断を表し、s.m.は小分子を表し、CTLは細胞毒性リンパ球リガンドを表す。これらの遺伝子は、Eos/Affymetrix Hu03 Genechip アレーの59680のプローブセットから選ばれた。
表14Bは、表14AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表14Cは、表14AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkey'sについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene名称
Pref.Utility:   好ましい用途
Pred.Loc:        予測される細胞での局在
【０４２４】
【表１１７】
2005527180.tif 000118
【０４２５】
【表１１８】
2005527180.tif 000119
【０４２６】
表14B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４２７】
【表１１９】
2005527180.tif 000120
【０４２８】
表14C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４２９】
【表１２０】
2005527180.tif 000121
【０４３０】
表15A:  表16における全ての配列に関する情報
表15Aは、表16の全ての配列に関するSeq ID No, Pkey, ExAccn, UnigeneID, 及びUnigene Title を示す。
表15Bは、表15AでUnigeneID'sを欠いているPkey'sについてアクセッション・ナンバーを示す。各プローブセットについて、我々はオリゴヌクレオチドをそれから設計した遺伝子クラスター・ナンバーを記した。遺伝子クラスターは、Genbank ESTsとmRNAsから得られた配列を用いて編纂された。これらの配列が配列類似性に基づいてClustering and Alignment Tools (Double Twist, Oakland California)を用いてクラスター化された。各クラスターを含む配列のGenbankアクセッション・ナンバーが“Accession”の欄にリストされている。
表15Cは、表15AにおいてUnigeneID'sとアクセッション・ナンバーを欠いているPkey'sについてゲノム位置を示す。各予測されたエクソンに対して、我々は予測に用いられたゲノム配列源をリストした。各予測されたエクソンのヌクレオチド位置もリストされている。
Seq ID No:       配列IDナンバー
Pkey:            ユニークEosプローブセット識別ナンバー
ExAccn:         Exemplarアクセッション・ナンバー、Genbankアクセッション・ナンバー
UnigeneID:      Unigeneナンバー
Unigene Title:  Unigene gene名称
【０４３１】
【表１２１】
2005527180.tif 000122
【０４３２】
【表１２２】
2005527180.tif 000123
【０４３３】
【表１２３】
2005527180.tif 000124
【０４３４】
【表１２４】
2005527180.tif 000125
【０４３５】
【表１２５】
2005527180.tif 000126
【０４３６】
表15B
Pkey            Unique Eosプローブセット識別ナンバー
CAT ナンバー：  遺伝子クラスター・ナンバー
Accession      Genbankアクセッション・ナンバー
【０４３７】
【表１２６】
2005527180.tif 000127
【０４３８】
表15C
Pkey:            Eosプローブセットに対応するユニーク・ナンバー
Ref:             配列源。この欄の7けたの数字はGenbank 識別（GI）ナンバーである。“Dunham I, et al.”は、“ヒト染色体22のDNA配列”という標題の刊行物、Dunham I, et al. Nature (1999) 402:489-495、を指す。
Strand:         エクソンが予測されたDNA鎖を示す。
Nt_position    予測されるエクソンのヌクレオチド位置を示す。
【０４３９】
【表１２７】
2005527180.tif 000128
【０４４０】
表16
【０４４１】
【表１２８】
2005527180.tif 000129
【０４４２】
【表１２９】
2005527180.tif 000130
【０４４３】
【表１３０】
2005527180.tif 000131
【０４４４】
【表１３１】
2005527180.tif 000132
【０４４５】
【表１３２】
2005527180.tif 000133
【０４４６】
【表１３３】
2005527180.tif 000134
【０４４７】
【表１３４】
2005527180.tif 000135
【０４４８】
【表１３５】
2005527180.tif 000136
【０４４９】
【表１３６】
2005527180.tif 000137
【０４５０】
【表１３７】
2005527180.tif 000138
【０４５１】
【表１３８】
2005527180.tif 000139
【０４５２】
【表１３９】
2005527180.tif 000140
【０４５３】
【表１４０】
2005527180.tif 000141
【０４５４】
【表１４１】
2005527180.tif 000142
【０４５５】
【表１４２】
2005527180.tif 000143
【０４５６】
【表１４３】
2005527180.tif 000144
【０４５７】
【表１４４】
2005527180.tif 000145
【０４５８】
【表１４５】
2005527180.tif 000146
【０４５９】
【表１４６】
2005527180.tif 000147
【０４６０】
【表１４７】
2005527180.tif 000148
【０４６１】
【表１４８】
2005527180.tif 000149
【０４６２】
【表１４９】
2005527180.tif 000150
【０４６３】
【表１５０】
2005527180.tif 000151
【０４６４】
【表１５１】
2005527180.tif 000152
【０４６５】
【表１５２】
2005527180.tif 000153
【０４６６】
【表１５３】
2005527180.tif 000154
【０４６７】
【表１５４】
2005527180.tif 000155
【０４６８】
【表１５５】
2005527180.tif 000156
【０４６９】
【表１５６】
2005527180.tif 000157
【０４７０】
【表１５７】
2005527180.tif 000158
【０４７１】
【表１５８】
2005527180.tif 000159
【０４７２】
【表１５９】
2005527180.tif 000160
【０４７３】
【表１６０】
2005527180.tif 000161
【０４７４】
【表１６１】
2005527180.tif 000162
【０４７５】
【表１６２】
2005527180.tif 000163
【０４７６】
【表１６３】
2005527180.tif 000164
【０４７７】
【表１６４】
2005527180.tif 000165
【０４７８】
【表１６５】
2005527180.tif 000166
【０４７９】
【表１６６】
2005527180.tif 000167
【０４８０】
【表１６７】
2005527180.tif 000168
【０４８１】
【表１６８】
2005527180.tif 000169
【０４８２】
【表１６９】
2005527180.tif 000170
【０４８３】
【表１７０】
2005527180.tif 000171
【０４８４】
【表１７１】
2005527180.tif 000172
【０４８５】
【表１７２】
2005527180.tif 000173
【０４８６】
【表１７３】
2005527180.tif 000174
【０４８７】
【表１７４】
2005527180.tif 000175
【０４８８】
【表１７５】
2005527180.tif 000176
【０４８９】
【表１７６】
2005527180.tif 000177
【０４９０】
【表１７７】
2005527180.tif 000178
【０４９１】
【表１７８】
2005527180.tif 000179
【０４９２】
【表１７９】
2005527180.tif 000180
【０４９３】
【表１８０】
2005527180.tif 000181
【０４９４】
【表１８１】
2005527180.tif 000182
【０４９５】
【表１８２】
2005527180.tif 000183
【０４９６】
【表１８３】
2005527180.tif 000184
【０４９７】
【表１８４】
2005527180.tif 000185
【０４９８】
【表１８５】
2005527180.tif 000186
【０４９９】
【表１８６】
2005527180.tif 000187
【０５００】
【表１８７】
2005527180.tif 000188
【０５０１】
【表１８８】
2005527180.tif 000189
【０５０２】
【表１８９】
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