(57)【要約】  本発明は、複雑なサンプル中の病原性カンピロバクター種を特異的に検出するための方法を提供する。標的病原性カンピロバクター種は、カンピロバクター・ジェジュニまたはカンピロバクター・コリであることができる。複雑なサンプルは、食物サンプル、水サンプル、または選択的に集積化された食物マトリックスであることができる。検出方法は、内部陽性対照がある、またはないＰＣＲ増幅と、適切なプライマーペアとを使用する。同一反応中で複数種が検出できる。方法を実施するのに必要な試薬は、キットとしておよび／または錠剤形態で提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＰＣＲ増幅のためにサンプルを調製するステップと、
（ｂ）ＰＳ１（配列番号：１および２）およびＰＳ２（配列番号：３および４）プライマーの組み合わせを使用して、サンプルのＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）ＰＣＲ増幅結果を調べるステップと
を含んでなり、
陽性の増幅が病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種の存在を示す、サンプル中の病原性カンピロバクター種を検出する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、（１）細菌の集積、（２）サンプルからの細菌細胞分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
病原性カンピロバクター種がカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）またはカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが食品または水のサンプルを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）ＰＣＲ増幅のためにサンプルを調製するステップと、
（ｂ）ＰＳ１プライマー（配列番号：１および２）を使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）ＰＣＲ増幅結果を調べるステップと
を含んでなり、
陽性の増幅がサンプル中の病原性カンピロバクター・コリの存在を示す、サンプル中のカンピロバクター・コリを検出する方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、（１）細菌の集積、（２）サンプルからの細菌細胞分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ＰＣＲ増幅のためにサンプルを調製するステップと、
（ｂ）ＰＳ２（配列番号：３および４）プライマーを使用してサンプルのＰＣＲ増幅を実施するステップと、
（ｃ）ＰＣＲ増幅結果を調べるステップと
を含んでなり、
陽性の増幅がサンプル中のカンピロバクター・ジェジュニの存在を示す、サンプル中のカンピロバクター・ジェジュニを検出する方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）が、（１）細菌の集積、（２）サンプルからの細菌細胞分離、（３）細胞溶解、および（４）全ＤＮＡ抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号：１または配列番号：２の核酸配列から本質的になる、カンピロバクター・コリの特異的検出のための単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号：３または配列番号：４の核酸配列から本質的になる、カンピロバクター・ジェジュニの特異的検出のための単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
サンプルが選択的に集積化された食物マトリックスを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）ＰＳ１（配列番号：１および２）およびＰＳ２（配列番号：３および４）からなる群より選択される少なくとも１対のＰＣＲプライマーと、
（ｂ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含んでなる適切なＰＣＲ試薬の混合物と
を含んでなる、
サンプル中のカンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリからなる群より選択される病原性カンピロバクター種検出のためのキット。
【請求項１３】
適切なＰＣＲ試薬の混合物が錠剤で提供される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、その内容全体を本願明細書に援用した２００１年８月８日に出願された米国仮出願第６０／３１０，８８２号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、カンピロバクター細菌検出のための迅速な方法、オリゴヌクレオチド分子、およびそのために有用な試薬キットに関する。具体的には標的細菌は、ＤＮＡ増幅生成物を蛍光染料で標識する手段によって、ホモジナス形式またはゲルベースの形式においてＰＣＲにより検出される。
【背景技術】
【０００３】
カンピロバクター種は、全世界で食物系胃腸炎と関連づけられる最も一般的な細菌である。症例の圧倒的多数（地域によってはおよそ９０％）がカンピロバクター・ジェジュニと関連づけられ、残りの症例はＣ．ｃｏｌｉ（Ｃ．コリ）によって引き起こされるが、少数の症例はＣ．ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ（Ｃ．ウプサリエンシス）およびＣ．ｌａｒｉ（Ｃ．ラリ）などのその他の種と関連づけられる。
【０００４】
生物体は、健康な畜牛および家禽などの動物に残存することが多く、ヒトの疾病の保有宿主になることができる。カンピロバクター分離菌の同定は困難であることが多く、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）とＣ．コリとの区別は、馬尿酸塩の加水分解の表現型試験に依存する。菌種誤認によって、監視モニタリング、疫学的調査、および検出が困難になる。その結果、ほとんどの感染症の出所は不明であることが多い。
【０００５】
カンピロバクター種を検出し区別できる必要性があるが、現在利用できる技術は多くの欠点を有する。特に感度が高く、都合の良い、２つの主要な病原性種を区別できる満足のいく検出方法がない。
【０００６】
従来の集積培養技術は感度を欠いており、時間がかかる。例えば、Ｃ．ジェジュニは食物中で生育せず、常在ミクロフローラの高いバックグラウンドと比較して、その数は少ないことが知られている。またサンプルの調製、保存および輸送の間に、潜在的に培養できる細胞が失われることが多いので、カンピロバクター表面生菌数は迅速に低下する。Ｃ．ジェジュニは、ｐＨまたは温度極値、酸素レベル増大または栄養素枯渇などの環境ストレスがかかると、培養できないが生存可能な感染性形態になることが知られている。さらに培養集積培地は抗生物質を含有することが多く、カンピロバクターの生育を阻害するかもしれない。
【０００７】
いくつかの組換えＤＮＡベースの検出方法、特にＤＮＡ増幅ベースの方法も当該技術分野で知られている。しかしこれらの方法は、Ｃ．コリとＣ．ジェジュニを識別しなかったり（例えば非特許文献１および非特許文献２を参照されたい）、あるいは種間の区別をするために追加的制限消化ステップを必要としたり（例えばフォックス（Ｆｏｘ）らの特許文献１）、さもなければ制限酵素と種同定のためのプローブとの組み合わせを必要としたりする（例えばマクミラン（ＭｃＭｉｌｌｉａｎ）らの特許文献２で開示される、ＳＤＡ生成物のプローブベースの検出のために放射性同位体を使用する鎖置換増幅法）。さらにフォックス（Ｆｏｘ）らおよびマクミラン（ＭｃＭｉｌｌａｎ）らの方法は、感度に劣り（およそ細胞１００個／反応）、食物、水、および臨床分野で使用するには、満足できないかもしれない。
【０００８】
非特許文献３は、ＰＣＲアッセイとプローブ検出の複雑な組み合わせを使用して、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニの検出と同定を達成する方法を開示する。第１のＰＣＲを使用して、Ｃ．コリ、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ウプサリエンシス、Ｃ．ラリ、およびＣ．ヘルベティカス（Ｃ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）からのＤＮＡを増幅し、分離菌がＣ．コリ／ジェジュニ、Ｃ．ウプサリエンシス、Ｃ．ラリ、またはＣ．ヘルベティカスであるかどうかを判定するためのプローブハイブリッド形成が続いた。Ｃ．コリをＣ．ジェジュニから区別するために、彼らは次に４つのプライマーを有する第２のＰＣＲを実施した。Ｃ．コリをＣ．ジェジュニから区別するために使用された第２のＰＣＲは、プローブ同定でＣ．コリ／ジェジュニ陽性であった４７８の分離菌において、３５を種分化できなかった。
【０００９】
非特許文献４は、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニを検出および同定するためのｃｅｕＥ遺伝子に基づいたＰＣＲベースの方法を開示している。双方の種の検出はＣ．コリのためのもの、そしてＣ．ジェジュニのためのものの２つの異なるＰＣＲ反応を必要とする。プライマーセットは、限られた数の試験菌株（１２のＣ．ジェジュニおよび１６のＣ．コリ）で、１００％の包括性（ｉｎｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）および１００％の排他性（ｅｘｃｌｕｓｉｖｉｔｙ）を示した。しかしこの試験は、Ｃ．コリで８９４ｂｐ、Ｃ．ジェジュニで８９７ｂｐの単位複製配列を生じ、アガロースゲル電気泳動により区別できなかった。したがってこの試験では、同じ反応試験管中での他方の存在下における１種の同定は可能でない。
【００１０】
多重ＰＣＲまたは多重化は、１つのＰＣＲ中に複数のプライマーセットを組み合わせることにより、２つ以上の標的の同定を可能にする技術である。当該技術分野でこれまでに記載されたプライマーセットのいずれも、双方の対象プライマーセットの異なる最適反応温度、または同一の単位複製配列サイズのために多重化できなかった。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，０８０，５４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０６６，４６１号明細書
【非特許文献１】ギーセンドルフ（Ｇｉｅｓｅｎｄｏｒｆ）ら著、１９９２年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８：３８０４〜３８０８
【非特許文献２】ヴェグミュラー（Ｗｅｇｍｕｌｌｅｒ）ら著、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．５９：２１６１〜２１６５
【非特許文献３】ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら著、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３８６０〜３８６４
【非特許文献４】ゴンザレズ（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら著、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：７５９〜７６３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって（１）双方の種がサンプル中に存在しても互いに干渉しない、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニの双方に対する一段階の種同定、（２）多重化を可能にする試験、（３）反応あたり細胞１〜１０個の感度がある試験、および（４）存在するＣ．コリおよび／またはＣ．ジェジュニの数を定量化する能力を有する試験を達成できる、ＰＣＲベースの方法および適切なＰＣＲプライマーに対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、（ｉ）ＰＣＲ増幅のためのサンプルを調製するステップと、（ｉｉ）ＰＳ１およびＰＳ２プライマーの組み合わせを使用して、サンプルのＰＣＲ増幅を実施するステップと、（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅の結果を調べるステップとを含んでなり、陽性の増幅が病原性カンピロバクター種の存在を示す、サンプル中の病原性カンピロバクター種を検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明の検出方法は、（ｉ）細菌の集積、（ｉｉ）サンプルからの細菌細胞の分離、（ｉｉｉ）細胞溶解、および（ｉｖ）全ＤＮＡの抽出のプロセスの少なくとも１つを含んでなるステップをさらに包含する。
【００１５】
本発明の別の実施態様では、標的病原性カンピロバクター種は、カンピロバクター・ジェジュニまたはカンピロバクター・コリであることができる。
【００１６】
さらに別の実施態様では、サンプルは食物サンプル、水サンプル、または選択的に集積化された食物マトリックス（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｆｏｏｄ  ｍａｔｒｉｘ）を含んでなる。
【００１７】
本発明は、配列番号：１〜４をはじめとするが、これに限定されるものではない核酸配列から本質的になる、カンピロバクター・ジェジュニまたはカンピロバクター・コリの特異的検出のためのポリヌクレオチドプライマーの使用をさらに包含する。
【００１８】
本発明のさらに別の実施態様は、（ｉ）ＰＳ１およびＰＳ２からなる群より選択される少なくとも１対のＰＣＲプライマー、および（ｉｉ）熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含んでなる適切なＰＣＲ試薬の混合物を含んでなる、病原性カンピロバクター種の検出のためのキットに関係する。
【００１９】
さらに別の実施態様では、適切なＰＣＲ試薬の混合物が錠剤中に提供される。
【００２０】
配列の概要
配列番号：１は、細菌ＤＮＡおよび配列番号：２とのポリメラーゼ連鎖反応において、特異的にカンピロバクター・コリを検出するｃａｄＦ遺伝子の領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号：２は、細菌ＤＮＡおよび配列番号：１とのポリメラーゼ連鎖反応において、特異的にカンピロバクター・コリを検出するｃａｄＦ遺伝子の領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号：３は、細菌ＤＮＡおよび配列番号：４とのポリメラーゼ連鎖反応において、特異的にカンピロバクター・ジェジュニを検出するｃａｄＦ遺伝子の領域に対する５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号：４は、細菌ＤＮＡおよび配列番号：３とのポリメラーゼ連鎖反応において、特異的にカンピロバクター・ジェジュニを検出するｃａｄＦ遺伝子の領域に対する３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号：５は、カンピロバクター・コリからのｃａｄＦ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号：６は、配列番号：１および２中のプライマーのＰＣＲ増幅生成物の１本の鎖を表すヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号：７は、カンピロバクター・ジェジュニからのｃａｄＦ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号：８は、配列番号：３および４中のプライマーのＰＣＲ増幅生成物の１本の鎖を表すヌクレオチド配列である。
【００２８】
発明の詳細な記述
本発明は、細菌のｃａｄＦ遺伝子の一部の増幅、またはそれとのハイブリッド形成に基づいて、病原性カンピロバクター種、すなわちＣ．ジェジュニおよびＣ．コリを検出、同定、区別する方法を提供する。
【００２９】
カンピロバクター・ジェジュニまたはカンピロバクター・コリのどちらかにユニークな核酸領域が、ｃａｄＦ遺伝子中に同定された。上述の種のどちらかの検出および同定のために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に適切なオリゴヌクレオチドプライマーが開発された。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（バックマン（Ｂａｃｋｍａｎ）ら、１９８９年、ＥＰ０３２０３０８号；カリーノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：３〜２０）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（カリーノ（Ｃａｒｒｉｎｏ）ら、１９９５年、上記）、および自立配列複製（３ＳＲ）と「Ｑレプリカーゼ増幅」（プフェッファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ）ら、１９９５年、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９：３７５〜４０７）などのその他の核酸増幅方法でも有用である。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成プローブとしても使用される。ＤＮＡプローブを使用したハイブリッド形成は、食物、臨床、および環境サンプル中の病原体の検出のために頻繁に使用されており、方法論は概して当業者には知られている。概してプローブハイブリッド形成の感度および特異性の程度は、既述の増幅技術を通じて達成されるものよりも低いことが、認められている。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用する、増幅ベースおよびハイブリッド形成ベースのどちらの方法も、集積化された、あるいは精製までされた培養中のＣ．ジェジュニおよびＣ．コリの同定を確認するのに使用しうる。本発明の好ましい実施態様は、（１）複雑なサンプル混合物を非選択的増殖培地内で培養して、標的細菌を蘇生するステップと、（２）標的細菌の全ＤＮＡを放出するステップと、（３）全ＤＮＡに本発明のプライマーペアによる増幅プロトコルを施すステップとを含んでなる。
【００３２】
しかしより重要なことには、オリゴヌクレオチドを使用して、ヒトまたは動物からの臨床標本、あるいは汚染された食物または水サンプルなどの複雑なサンプル中で、予備集積または精製の必要性なしに、２種を直接検出および同定しうる。
【００３３】
下でより詳細に説明するように、増幅した核酸は、例えばゲル電気泳動、核酸プローブハイブリッド形成、蛍光終点測定、および融解曲線分析によって同定される。
【００３４】
本発明は、サンプルがＣ．ジェジュニ、またはＣ．コリ、または両者を含有するかどうかを迅速で正確に判定できるようにする。
【００３５】
プライマー／オリゴヌクレオチド：デザインおよび配列情報
本発明のオリゴヌクレオチドは、その他のカンピロバクター種またはその他の細菌の存在に起因する擬陽性なしに、複雑な混合物から、特異的にカンピロバクター・コリまたはカンピロバクター・ジェジュニを同定するためにデザインされた。またオリゴヌクレオチドを使用して、２つのカンピロバクター種のどちらかを増幅しても良い。複数のプライマーおよび組み合わせを多様な反応条件下で試験した。２つのプライマーセットＰＳ１（Ｃ．コリに特異的であり、配列番号：１および配列番号：２の配列を有する２つのプライマーからなる）、およびＰＳ２（Ｃ．ジェジュニに特異的であり、配列番号：３および配列番号：４の配列を有する２つのプライマーからなる）は、ｃａｄＦ遺伝子配列（コンケル（Ｋｏｎｋｅｌ）ら、１９９９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：５１０〜５１７）を使用してデザインされた。
【００３６】
双方のプライマーセットは、意図される標的細菌分離菌を１００％増幅でき、多数の非標的分離菌は全く増幅しないことが実証された。
【００３７】
カンピロバクター・コリおよびカンピロバクター・ジェジュニのＰＣＲ増幅生成物は、それぞれ配列番号：６および８で示される。各標的生物体に対する特異性を保持しながら、プライマー二量体またはヘアピンなどの有害なプライマー立体配置を排除する、ミネソタ州プリマスのナショナル・バイオサイエンシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）からのプライマーデザインプログラム（Ｏｌｉｇｏ５．０）を使用した。
【００３８】
サンプルの調製
本発明によるオリゴヌクレオチドおよび方法は、サンプル調製の必要性なしに、直接あらゆる適切な臨床または環境サンプルと一緒に使用しても良い。より高い感度を達成するために、そして時間が制限要因でない状況では、サンプルを前処理して予備増幅集積を実施することが好ましい。
【００３９】
食物由来細菌病原体検出のための業界の最低基準は、「細菌学的分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）」第８版、改訂Ａ、バージニア州アーリントンの公認分析科学者協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＶＡ）の第１章、アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗｓ）ら著、１９８４年、「食物サンプルおよびサンプルホモジネート調製（Ｆｏｏｄ  Ｓａｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）」で述べられるように、２５ｇの食物マトリックス内の１個の病原体細胞の存在を確実に検出する方法である。この厳しい基準を満たすため、生化学的、免疫学的、または核酸ハイブリッド形成手段による検出を容易にするために、集積方法および培地が開発されて標的病原体細胞の増殖が促進されている。典型的な集積手順は、標的細菌の増殖および健康を増進し、かつ存在するあらゆるバックグラウンドつまり非標的微生物の増殖を阻害する培地を用いる。例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、「細菌学的分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）」第８版、改訂Ａ、バージニア州アーリントンの公認分析科学者協会の第７章、ハント（（Ｈｕｎｔ）ら著、１９９５年、「食物および水中のカンピロバクター種の単離および同定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒ）」で述べられるカンピロバクターアッセイ手順を推奨する。この手順では、選択的肉汁培地であるボルトンの肉汁が使用されて、損傷したカンピロバクター細胞を安定した状態に復帰させ、生育を促進する。多様な細菌病原体のために選択培地が開発されており、当業者は濃縮する特定の生物体に適切な培地を選択することを知っている。一般的考察および非選択的培地の処方については、バージニア州アーリントン、ウィルソンブールバード２２００、４００号室の公認分析科学者協会によって発行され配布される、ＦＤＡ細菌学的分析マニュアル（ＦＤＡ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）（１９９８年）の２２２０１〜３３０１で述べられている。
【００４０】
選択生育後、さらに詳しい分析のために複雑な混合物のサンプルを取る。この試料採取手順は、当業者には周知の多様な手段によって達成されても良い。好ましい実施態様では、５μＬの集積培養を取り、プロテアーゼを含有する２００μＬの溶解溶液に添加する。デラウェア州ウィルミントンのクアリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）からのＢＡＸ（登録商標）システムのユーザーガイドで述べられるように、溶解溶液を３７℃で２０分間加熱し、それに９５℃で１０分間のプロテアーゼ不活性化が続く。
【００４１】
増幅条件
当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、標的カンピロバクター細菌の成功裏の検出のために、あらゆる概して許容可能なＰＣＲ条件を使用しても良いこと、そして試験するサンプルおよびその他の実験室条件次第で、最適感度および特異性を達成するのに、ＰＣＲ条件のための慣例的最適化が必要であるかもしれないことを理解するであろう。最適には当業者は、その他の非標的種のＰＣＲ生成物を与えることなく、全ての意図される特異的標的からＰＣＲ増幅生成物を得る。
【００４２】
好ましい実施態様では、以下のサイクリング条件を使用した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、オレゴン州ユージンのモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ,Ｅｕｇｅｎｅ,ＯＲ）からのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、および緩衝剤構成要素を含有し、デラウェア州ウィルミントンのクアリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によって製造されるＢＡＸ（登録商標）試薬錠剤１錠、および５μＬのプライマー混合物を含有するＰＣＲチューブに、４５μＬの溶菌液を添加し、ＰＣＲ中で各プライマーについて０．１５０μモルの最終濃度を得る。ＰＣＲサイクリング条件は、次のとおりであった。９４℃で２分間、９４℃で１５秒間、６５℃で２分間、そして７２℃で１分間を３８サイクル。
【００４３】
次にＰＣＲ反応物を臭化エチジウム染色された２％アガロースゲル上で、２００Ｖで３０分間泳動し、次に結果をＵＶ光下で視覚化した（図２）。
【００４４】
ホモジナスＰＣＲ（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＰＣＲ）
ホモジナスＰＣＲとは、テンプレートまたはプライマーからの増幅生成物分離（ゲル電気泳動によるものなど）が必要でない、ＤＮＡ増幅生成物検出方法を指す。本発明のホモジナス検出は、典型的に蛍光染料存在下で、反応混合物の蛍光レベルを測定することで達成される。
【００４５】
好ましい実施態様では、特にデラウェア州ウィルミントンのクアリコン（Ｑｕａｌｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）からのＢＡＸ（登録商標）システムのハードウェアおよび試薬錠剤によるＤＮＡ融解曲線分析が使用される。システムの詳細は、その内容を本願明細書に援用した国際公開第９７／１１１９７号および国際公開第００／６６７７７号にある。
【００４６】
融解曲線分析
融解曲線分析は、選択された時点での各増幅サイクル中に、増幅された標的（「標的単位複製配列」）の蛍光をモニターすることで、二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出し定量化する。
【００４７】
当業者には周知のように、温度が融解温度よりも高いと、ｄｓＤＮＡの２本の鎖は分離または融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、特定の溶液条件下では、融解はある温度（以下ＴＭＳと称する）で開始して、別の温度（以下ＴＭＥと称する）で完了する。見慣れた用語であるＴｍは、融解が５０％完了する温度を示す。
【００４８】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解する変性相と、プライマーが１本鎖になった標的に結合するのに温度が最適であるプライマーアニーリング相と、ＤＮＡポリメラーゼが機能するのに温度が最適である（温度ＴＥにおける）鎖伸長相を伴う。本発明によると、ＴＭＳはＴＥより高くなくてはならず、ＴＭＥはＤＮＡポリメラーゼが熱不活性化する温度よりも低くなくてはならない（大幅に低いことが多い）。融解特性は、デオキシヌクレオチド組成およびｄｓＤＮＡの長さなどの特定のｄｓＤＮＡ分子の固有特性によってもたらされる。
【００４９】
挿入色素は二本鎖ＤＮＡに結合する。適切な励起波長の光に暴露すると、色素に依存して、色素／ｄｓＤＮＡ複合体は蛍光を発し、蛍光の強度はｄｓＤＮＡの濃度に比例するであろう。ｄｓＤＮＡを検出し定量化するためのＤＮＡ挿入色素の使用を活用する方法は、当該技術分野で知られている。多くの色素が知られており、当該技術分野でこれらの目的のために使用されている。本方法は、このような関係も利用する。このような色素の例としては、挿入色素が挙げられる。このような色素の例としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ＴＯＴＯ（登録商標）−１｛キノリニウム，１−１’−［１，３−プロパンジイルビス［（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−、四ヨウ化物｝、およびＹｏＰｒｏ（登録商標）｛キノリニウム，４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］−，二ヨウ化物｝が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明のために最も好ましい色素は、オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって製造されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ（登録商標）などの非相称でないシアン化物色素である。
【００５０】
融解曲線分析は、温度を増大させながら蛍光変化をモニターすることで得られる。温度が、ＰＣＲ単位複製配列に特異的なＴＭＳに達すると、ｄｓＤＮＡは変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性すると、挿入色素はＤＮＡから解離して蛍光は減少する。温度変化に対してプロットした、温度変化で除した蛍光の対数の負の値の数理解析からは、融解曲線として知られるグラフのピークが帰結する（図１）。
【００５１】
図１に示すデータ変換プロセスには以下が伴う。
１．データを補間して等間隔のデータポイントを得る
２．蛍光（Ｆ）の対数を取る
３．ｌｏｇ  Ｆを滑らかにする
４．−ｄ（ｌｏｇ  Ｆ）／ｄＴを計算する
５．（標的生物次第で）データを１度の間隔の１１〜１３個のデータポイントに減少させる。
【００５２】
本検出方法は、標的ｄｓＤＮＡを検出および定量化するのに使用でき、それから標的生物体の存在およびレベルが求められる。本方法は非常に特異的で敏感である。検出できる最少標的ｄｓＤＮＡ数は１〜１０個の間である。
【００５３】
内部陽性対照
好ましい実施態様では、病原性生物体のためのＰＣＲ錠剤は内部陽性対照を含有する。ＰＣＲ反応中に含有される内部陽性対照の利点については、既に述べられており（その内容を本願明細書に援用した１９９７年３月２７日公開の国際公開第９７／１１１９７号）、以下が含まれる。（ｉ）対照は単一プライマーを使用して増幅しても良く、（ｉｉ）対照増幅生成物の量はサンプル中に含有されるいかなる標的ＤＮＡとも無関係であり、（ｉｉｉ）手動および自動試験手順の双方における使用の容易さと高度な再現性のために、対照ＤＮＡをその他の増幅試薬と共に錠剤にでき、（ｉｖ）対照は、ホモジナス検出で、すなわち反応物から生成物ＤＮＡを分離せずに使用でき、（ｖ）内部対照は、反応中に潜在的に生成するその他の単位複製配列と異なる融解プロフィールを有する。対照ＤＮＡは、プライマー誘導増幅反応中で増幅できるのに適切なサイズと塩基の組成物である。対照ＤＮＡ配列は標的細菌から、あるいは別の供給源から得られても良いが、標的単位複製配列ＤＮＡを増幅できるようにするのと同一条件下で、再現性良く増幅しなくてはならない。対照反応は、増幅反応を確証するのに有用である。対照ＤＮＡの増幅は、試験されるサンプルと同一反応チューブ内で起きるので、サンプルが標的について陰性である、すなわち標的単位複製配列が生成しない場合に、成功裏の増幅反応を示唆する。増幅反応の有意な確証を達成するために、適切な数の対照ＤＮＡのコピーが各増幅反応に含まれなくてはならない。
【００５４】
好ましい実施態様では、パーキン−エルマー・コーポレーション（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）７７００配列検出システム（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）などの蛍光検出能付き自動化サーマルサイクラーが使用される。蛍光データは必要に応じて種々の変換と共に、送出されてパーソナルコンピュータなどのデータ処理装置の助けを借りて処理される。このような自動化操作のための方法および機器は当業者には明らかであり、続く実施例で例証される。
【００５５】
自動化ＢＡＸ（登録商標）システムおよび融解曲線分析を使用して、いくつかの増幅を分析した。図３は、８２．５℃に融解曲線ピークを有するＣ．コリ陽性のサンプルの融解曲線を示す。Ｃ．ジェジュニＰＣＲ生成物は、８０．５℃で融解する（データ示さず）。図４は、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニの双方を含有するサンプルの融解曲線分析を示す。図５は、内部陽性対照がカンピロバクター多重ＰＣＲに添加されたＣ．コリ陽性のサンプルの融解曲線分析を示す。内部陽性対照は７８℃で融解し、それはカンピロバクター単位複製配列から明確に区別できる。
【００５６】
多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）
本発明による方法は、同時に複数の標的単位複製配列を検出するのにも使用できる（「多重検出」）。多重ＰＣＲの技術は、従来の「一標的」ＰＣＲよりも多くの利点を提供する。多重ＰＣＲは、複数の標的のためのＰＣＲプライマーの開発を必要とし、それらは個々の標的に対して特異的で相互に適合性である。多重プライマーが適合性であるためには、全プライマーは、同一化学反応条件下で、同一アニーリング温度でアニールしなくてはならない。またプライマーは、プライマーが特にそのためにデザインされたのでないその他の多重標的と交差反応またはアニールしてはならず、プライマーは増幅中にその他の多重プライマーと交差反応または結合してはならない。ＰＣＲのアガロースゲル検出のためには、各単位複製配列が異なる速度でアガロースゲル中を移動して、視覚的に特徴的なバンドが帰結するように、単位複製配列はサイズが特徴的でなくてはならない。ホモジナス検出のためには、標的単位複製配列は、各標的融解曲線のピークの特異的同定を可能にする、特徴的な融解曲線特性を有するべきである。
【００５７】
これらのカンピロバクター種の誤認を防ぐために、並びにカンピロバクター個体数のモニタリングを助けるために、Ｃ．ジェジュニおよびＣ．コリ双方の検出および種同定のための多重ＰＣＲアッセイが開発された。一般細菌遺伝子の配列分析を使用して、Ｃ．ジェジュニのための１組のプライマーセット、そしてＣ．コリのための１組のセットを開発した。これらのプライマーは、アガロースゲル検出、あるいはＤＮＡ増幅と検出を組み合わせて特異的標的の存在または不在を判定するホモジナス形式のどちらかを使用する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルと共に使用した。
【００５８】
４５μＬの溶解細胞を１個の試薬錠剤および全４プライマーを含有するＰＣＲチューブに入れて、細菌株を試験した。試薬錠剤は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド、および緩衝剤構成要素を含有する。ＰＣＲの結果を各２５６回のアガロースゲル電気泳動によって判定した。多重ＰＣＲの試験からは、それぞれのプライマーセットで、１３０株のＣ．ジェジュニおよび６６株のＣ．コリについて１００％の包含性が帰結した。プライマーはまた、５つのその他のカンピロバクター種および３つのアルコバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）種を代表する６０の分離菌で試験した際に、１００％の排他性も示した。この多重ＰＣＲに関する本研究には、融解曲線分析および内部陽性対照の組み込みに基づく、ホモジナス検出形式の開発が関与する。
【００５９】
キットおよび試薬錠剤
本発明のために、あらゆる適切な核酸複製組成物が使用できる。典型的なＰＣＲ増幅組成物は、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマー、および適切なポリメラーゼを含有する。核酸組成物が液体形態であれば、当該技術分野で知られている適切な緩衝剤が使用される（サムブルック，Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）ら、１９８９年、「分子クローニング：実験室マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））。
【００６０】
あるいは、組成物が錠剤試薬中に含有される場合、典型的な錠剤試薬は安定剤などを含む。
【００６１】
本発明の文脈で、複製組成物は、それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するのに使用するためにデザインされているかどうかによって、修正される。標的ＤＮＡ（試験複製組成物）を増幅する複製組成物は、（ｉ）ポリメラーゼ（概して熱安定性の）、（ｉｉ）標的ＤＮＡとハイブリッド形成できるプライマーペア、および（ｉｉｉ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝剤を含む。対照ＤＮＡ（陽性対照、または陽性の複製組成物）を増幅する複製組成物は、（ｉ）ポリメラーゼ（概して熱安定性の）、（ｉｉ）対照ＤＮＡ、（ｉｉｉ）対照ＤＮＡとハイブリッド形成できる少なくとも１つのプライマー、および（ｉｖ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝剤を含む。場合によっては、陰性対照複製組成物を含めることが有用かもしれない。陰性対照組成物は、試験組成物と同一試薬を含有するが、ポリメラーゼがない。このような対照の主要な機能は、方法が蛍光性検出手段を用いる場合に、ホモジナス形式において偽性バックグラウンド蛍光をモニターすることである。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例で、本発明をさらに詳しく定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみを目的とすることを理解されたい。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を把握でき、その精神と範囲を逸脱することなく本発明の種々の変更と修正を行い、それを種々の使用法および条件に適合させられる。
【００６３】
一般的方法
細菌培養物の維持と増殖のために適切な材料と方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、「属微生物学の手法マニュアル」（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグズ・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、ワシントンＤＣの米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）（１９９４年）またはトマスＤ．ブロック（ＴｈｏｍａｓＤ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版（１９８９年）マサチューセッツ州サンダーランドのシナエア・アソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、または細菌学的分析マニュアル（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）第６版、バージニア州アーリントンの公認分析科学者協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＶＡ）（１９８４年）にある。
【００６４】
以下の実施例で、カンピロバクター株を生育させるのに使用した選択培地は、カリフォルニア州サンタマリアのハーディ・ダイアグノスティックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＳａｎｔａＭａｒｉａ，ＣＡ）から得られたボルトン肉汁であった。
【００６５】
細菌細胞の増殖および維持のために使用したその他の全試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、メリーランド州ゲティスバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られた。
【００６６】
プライマー（配列番号：１〜４）は、アラバマ州ハンツビルのリサーチ・ジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）によって調製された。以下はＰＣＲで使用した試薬である。オレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）からのＳｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、インディアナ州インディアナポリスのベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）からのデオキシヌクレオチド、オハイオ州シンシナティのＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）からの緩衝剤。
【００６７】
略語の意味は次の通りである。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味する。
【００６８】
実施例１
カンピロバクター特異的ＤＮＡ断片の増幅
その他のカンピロバクター種またはその他の細菌に対して擬陽性を与えることなく、複雑な混合物から特にカンピロバクター・コリまたはカンピロバクター・ジェジュニを同定するように、プライマーペアをデザインした。複数のプライマーおよび組み合わせを多様な反応条件下で試験した。最適化されたプライマーおよび反応条件は、カンピロバクターのＰＣＲベースの検出について既述されたたものとは異なった。出版されたそれぞれのｃａｄＦ遺伝子配列、配列番号：５および７（コンケル（Ｋｏｎｋｅｌ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏ  ３７：５１０〜５１７）を使用して、２つのプライマーセット（カンピロバクター・コリに特異的なＰＳ１、およびカンピロバクター・ジェジュニに特異的なＰＳ２、表１）をデザインした。カンピロバクター・コリおよびカンピロバクター・ジェジュニのＰＣＲ増幅生成物は、それぞれ配列番号：６および８で示される。各標的生物体に対する特異性を保持しながら、プライマー二量体またはヘアピンなどの有害なプライマー立体配置を除外する、ミネソタ州プリマスのナショナル・バイオサイエンシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）からのプライマーデザインプログラム（Ｏｌｉｇｏ５．０）を使用した。
【００６９】
【表１】
2005511014.tif 000002
【００７０】
２つのプライマーセットを種々のＰＣＲサイクリング条件下、および種々のプライマー濃度で試験して、反応のための最適条件を求めた。所望の結果は、全ての種特異的標的についてＰＣＲ増幅生成物を与えながら、その他の種にはＰＣＲ生成物を与えなかった。２つのＣ．コリ株および５つのＣ．ジェジュニ株の溶菌液に対して最適条件を試験した。上述のプライマーセットによって、各プライマー濃度１．０μＭで以下のサイクリング条件を試験した：９４℃で２分間の初期ＤＮＡ変性、引き続いて９４℃で３０秒間の変性、６５℃で２分間のプライマーアニーリング、そして７２℃で１分間のプライマー伸長を３８サイクル。陽性のＰＣＲの判定は、上述のようにアガロースゲル電気泳動で達成された。Ｃ．コリに対する陽性の反応からはサイズ５０６ｂｐのＤＮＡバンド、Ｃ．ジェジュニに対する陽性の反応からはサイズ１７５ｂｐのＤＮＡバンドの出現が帰結した（図２）。
【００７１】
【表２】
2005511014.tif 000003
【００７２】
プライマーセットＰＳ１およびＰＳ２を１つの多重ＰＣＲに組み合わせて、Ｃ．コリ、Ｃ．ジェジュニ、追加的カンピロバクター種、および非カンピロバクター細菌からなる細菌株のパネルに対して試験した。結果を表３および４に示す。
【００７３】
【表３】
2005511014.tif 000004
【００７４】
【表４】
2005511014.tif 000005
【００７５】
【表５】
2005511014.tif 000006
【００７６】
このアッセイ中の各プライマーセットは、その各標的について１００％の包括性を、試験した全ての非標的生物体について１００％の排他性を実証した。
【００７７】
多重ＰＣＲの感度は、各プライマーセットに対して標的細菌１〜１０個であった。
【００７８】
これらのＰＣＲ結果は、既存のカンピロバクター検出法（米国特許第６，０８０，５４７号）に対する改善を実証する。この特許は、４つのカンピロバクター種、Ｃ．コリ、Ｃ．ジェジュニ、Ｃ．ラリ、およびＣ．ウプサリエンシスのＰＣＲによる検出を開示するが、個々の種を識別するために、制限消化ステップを必要とする。本発明は、人に対して病原性の唯一のカンピロバクター種である、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニを独立に同定する。
【００７９】
カンピロバクター株検出の追加的方法が、米国特許第６，０６６，４６１号で開示されている。この特許は、ＰＣＲでなく鎖置換増幅（ＳＤＡ）の使用を開示し、ＳＤＡ生成物のプローブベースの検出のために放射性同位体を必要とする。このアッセイの感度が１００個の細胞であるのに対し、本発明の感度は１〜１０個の細胞の範囲である。
【００８０】
実施例２
Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニのための多重ＰＣＲを融解曲線検出を使用する自動化ＢＡＸ（登録商標）システム上でも実施した。Ｃ．コリに対する陽性反応は、８２．５℃での融解曲線ピークの存在に帰結した（図３）。
【００８１】
図４は、Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニの双方を含有するサンプルの融解曲線結果を示す。Ｃ．ジェジュニＰＣＲ生成物は８０．５℃で融解し、それは８２．５℃．でのＣ．コリ融解曲線ピークとは明確に識別できる。内部陽性対照（ＩＮＰＣ）を組み込んで、多重ＰＣＲをさらに拡張した。ＩＮＰＣ（標的ＤＮＡおよびプライマー）のための試薬をプライマーセットＰＳ１およびＰＳ２を含有するカンピロバクター多重反応に添加した。
【００８２】
図５は、Ｃ．コリ陽性のサンプルの融解曲線結果を示す。ＩＮＰＣは７８℃に融解曲線ピークを有するのに対し、Ｃ．コリ融解曲線ピークは８２．５℃のままである。ＩＮＰＣの組込みによって、Ｃ．コリおよび／またはＣ．ジェジュニが存在するかどうかを示し、またＣ．コリまたはＣ．ジェジュニのどちらも存在しない場合、試験が適切に機能したかどうかを示す（ＩＮＰＣ結果）１試験管試験が、ユーザーに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】融解曲線分析のプロセスを示す。標的ＤＮＡの蛍光変化は、融解中に捕捉される。温度変化に対してプロットした、温度変化で除した蛍光の対数の負の値の数理解析からは、融解曲線として知られるグラフのピークが帰結する。
【図２】Ｃ．コリおよびＣ．ジェジュニの結果を示すゲル写真である。一番左側のレーン上下はＤＮＡ分子量ラダー。レーン２〜９上下は個々のサンプル結果であり、陽性のＣ．ジェジュニのバンドが１７５ｂｐ（レーン２〜６および８〜９）にあり、Ｃ．コリのバンドが５０６ｂｐ（レーン７）にある。
【図３】Ｃ．コリ融解曲線を示す。温度は８２．５℃でピークに達し、Ｃ．コリの存在が示される。
【図４】Ｃ．ジェジュニ／Ｃ．コリの融解曲線を示す。温度はＣ．コリでは８２．５℃でピークに達するが、Ｃ．ジェジュニでは８０．５℃であり、同一反応中での双方の生物体の検出が可能になる。
【図５】Ｃ．コリに対する内部陽性対照の融解曲線を示す。温度はＣ．コリでは８２．５℃でピークに達するが、内部陽性対照（ＩＮＰＣ）では７８℃なので、標的単位複製配列とＩＮＰＣが同時にモニターできる。ＩＮＰＣは、標的単位複製配列が存在しない場合でもサンプル溶液中のＰＣＲ反応の忠実度検査することによって、システム処理量の効率を増大させる。
【配列表】
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2005511014.tif 000008
2005511014.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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