(57)【要約】本発明は、代謝的に関連する組織において発現されるヒト遺伝子ファミリーの同定に関する。前記遺伝子は、“タンパク質クラスターＶ”と称され、肥満症や糖尿病のような代謝疾患の診断において及び前記疾患の治療に使用される物質の同定において有用であると予想されるポリペプチド群をコードする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｂ）（ａ）に記載の核酸分子のポリペプチドコード領域に相補性のヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸分子、及び
（ｃ）遺伝コードの結果として（ａ）または（ｂ）に記載のヌクレオチド配列に縮重する核酸配列を含む核酸分子
から選択されることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の核酸分子によりコードされることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
請求の範囲第１項に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド配列を有し、このヌクレオチド配列の発現を媒介し得ることを特徴とする複製可能な発現ベクター。
【請求項６】
請求の範囲第４項または第５項に記載のベクターを有することを特徴とする培養宿主細胞。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載の宿主細胞をポリペプチドを生産する条件下で培養し、生じたポリペプチドを回収することを含むことを特徴とするポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項に記載の核酸分子を調節し得る物質の同定方法であって、（ｉ）前記核酸分子を含む細胞を用意し、（ｉｉ）前記細胞を候補物質と接触させ、（ｉｉｉ）候補物質の非存在下では存在しない効果について前記細胞をモニターすることを含むことを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝的に関連した組織において発現されるヒト遺伝子ファミリーの同定に関する。前記遺伝子は、“タンパク質クラスター”と称され、肥満症や糖尿病のような代謝疾患の診断において及び前記疾患の治療に使用される物質の同定において有用であると予想されるポリペプチド群をコードする。
【背景技術】
【０００２】
代謝疾患は、正常な代謝を破壊する疾患または障害と定義される。これらの疾患は栄養不足により、内分泌系、肝臓または腎臓の疾患に関連して、または遺伝子欠陥の結果として生じ得る。代謝疾患は、エネルギーの発生、細胞成分の再生、または前記プロセスから生ずる不必要物質の排除に必須の１つ以上の化学反応における異常に起因する状態である。関与する代謝経路に応じて、１つの欠陥化学反応から１つの身体機能しか関わらない狭い結果または多くの臓器及び系に影響を与える広範囲の結果が生ずる恐れがある。
【０００３】
代謝に影響を及ぼす主要ホルモンの１つは、膵臓のランゲルハンス島のβ細胞で合成されるインスリンである。インスリンは主に代謝方向を調節し、多くのプロセスを基質の貯蔵に向かって、基質の分解から遠ざけて進める。インスリンは、グルコースやアミノ酸、及びカリウム、マグネシウムやリンのような主要ミネラルの血液から細胞への輸送を高めるように働く。また、インスリンは、共通する全方向（すなわち、小単位からの大分子の合成）を有する細胞内の各種酵素反応をも調節する。インスリン作用の欠陥（糖尿病）は、（ｉ）グリコーゲンの形でのグルコースの貯蔵及びエネルギーのためのグルコースの酸化、（ｉｉ）脂肪酸及びその前駆体からの脂肪の合成及び貯蔵、並びに脂肪酸酸化の完成、（ｉｉｉ）アミノ酸からのタンパク質の合成、において重大な問題を引き起こす。
【０００４】
糖尿病には２つの型がある。Ｉ型は、インスリン注射を必要とするインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）である。Ｉ型は従来若年性糖尿病と呼ばれていた。このＩ型では、膵臓からインスリンが分泌されないので、注射によりインスリンを摂取しなければならない。ＩＩ型のインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は食事制限によりコントロールされ得る。ＩＩ型は膵臓からのインスリン分泌の不足及び分泌インスリンに対する組織耐性に起因し、β細胞によるインスリンの分泌の微妙な変化により悪化する。従来は若年及び成人に分類されていたが、いずれの型も年令に関わらず発症し得る。しかしながら、ＮＩＤＤＭは最も一般的な型であり、全糖尿病患者の９０％を占めている。糖尿病の正確な原因は依然不明であるが、ＮＩＤＤＭが遺伝及び肥満に関連していることは明らかである。過体重か肥満となったヒトには明らかにＮＩＤＤＭ糖尿病にかかりやすい遺伝的素因がある。
【０００５】
肥満は通常、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で割った値のボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）で定義されている。体重は十分な精度で管理される。体重は、正常な体重を有する者のみならず、体重が目標とする設定値を越えている多くの肥満者でも管理されると考えられる。肥満の判定は遺伝、環境及び管理に分けられる。
【０００６】
最近の知見は、どのように遺伝子が肥満を決定するか、どのように遺伝子が体重の管理に影響を及ぼし得るかを説明するのに役立つ。例えば、ｏｂ遺伝子が変異されるとマウスで大肥満が生じた。ｏｂ遺伝子をクローン化して、この遺伝子によりコードされるタンパク質であるレプチンが同定された。レプチンは脂肪組織細胞中で生産され、体脂肪をコントロールするように働く。レプチンはエネルギー代謝をコントロールする脳の領域と脂肪組織の間のシグナルとして機能し、体重に影響を及ぼすので、レプチンの存在は体重が管理されるという考えを裏付ける。
【０００７】
糖尿病や肥満症のような代謝疾患は臨床的且つ遺伝的に異質の疾患である。分子遺伝学の最近の進歩から、ＩＤＤＭ及び青年の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）を含めた幾つかのサブタイプのＮＩＤＤＭに関わる遺伝子が認識された（Ｖｅｌｈｏ  ＆  Ｆｒｏｇｕｅｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．，２３，補遺２：３４−３７（１９９７））。しかしながら、幾つかのＩＤＤＭ感受性遺伝子は未だ同定されておらず、ＮＩＤＤＭの共通する型に関与する遺伝子はほんの少ししか知られていない。候補遺伝子及びＩＤＤＭまたはＮＩＤＤＭの動物モデルにおいてマッピングされる遺伝子の研究、並びに異なる人種から糖尿病ファミリーの全ゲノムスキャンニングにより、多くの糖尿病感受性遺伝子及び新規の有力薬物に対する分子標的が同定されなければならない。代謝疾患に関わる遺伝子が同定されると、新規の予防及び治療方法が開発されるであろう。
【０００８】
β３−アドレナリン受容体（ＡＲ）は多数の強力な抗肥満薬物標的の１つであり、前記標的に対する選択的アゴニストが開発されている。げっ歯動物では、β３−ＡＲ  ｍＲＮＡは白色脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）中に多く存在する。内在性β３−アドレナリン受容体を欠くマウスでは体脂肪が僅かしか増加せず、他の点では正常に見えることが立証されている（Ｖ．Ｓ，Ｓｕｓｕｌｉｃら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（４９）：２９４８３−２９４９２（１９９５））。前記マウスは、脂肪分解及びエネルギー支出を増加させ、インスリン及びレプチンレベルに悪影響を及ぼすことが判明している特定のβ３−アゴニストＣＬ−３１６，２４３に対して完全に耐性である。β３−ＡＲを白色及び褐色脂肪組織の両方または褐色脂肪組織のみで異所的に発現させた場合、食欲不振及びインスリン分泌促進効果が白色脂肪組織により媒介されるようであることが最近判明した（Ｄ．Ｇｒｕｊｉｃ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（２８）：１７６８６−９３（１９９７））。これらの効果がβ３−ＡＲアゴニストにより媒介される機構は依然として十分に理解されていない。
【０００９】
いずれも２００１年７月３１日に発表されたＫ．Ｄ．Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３８８６２−３８８６９及びＳ．Ｃａｓｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：３８８７０−３８８７６には、本発明の“クラスターＶ”タンパク質に相当するタンパク質をコードする新規な遺伝子ファミリーが開示されており、この中には真菌、植物及び動物中のメンバーが含まれている。前記タンパク質はアシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ；ＥＣ  ２．３．１．２０）機能を有することが分かっている。前記遺伝子ファミリーは既に同定されているＤＧＡＴ（１）ファミリーとは無関係であり、ＤＧＡＴ２と称されていた。ＤＧＡＴ２は肝臓及び白色脂肪組織において高発現レベルを有することが分かっており、このことから哺乳動物トリグリセリド代謝において重大な役割を果たし得ることが示唆される。
【発明の開示】
【００１０】
本発明によれば、遺伝子及びコード化相同タンパク質のファミリー（以下、「タンパク質クラスターＶ」）が同定された。従って、本発明は、（ａ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子、（ｂ）（ａ）に記載の核酸分子のポリペプチドコード領域に相補性のヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸分子、及び（ｃ）遺伝コードの結果として（ａ）または（ｂ）に記載のヌクレオチド配列に縮重する核酸配列を含む核酸分子から選択される単離核酸分子を提供する。
【００１１】
本発明の核酸分子には、ｃＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲにより単離したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びその組合せが含まれる。ＤＮＡから転写したＲＮＡも本発明に包含される。
【００１２】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は一般的プロトコル（例えば、上掲のＡｕｓｕｂｅｌら）から当業界で公知であり、例えば＋６５℃で０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び＋６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄として理解され得る。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様において、前記核酸分子は配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９と同一のヌクレオチド配列を有する。しかしながら、本発明の核酸分子は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示す配列に厳密に限定されない。むしろ、本発明のタンパク質クラスターＶポリペプチドの特徴を実質的に有するタンパク質をコードするならば置換、小さな欠失、挿入または反転のような修飾を有する核酸分子も本発明に包含される。従って、配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％相同のヌクレオチド配列を有する核酸分子が本発明に包含される。
【００１４】
遺伝コードのために配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示すヌクレオチド配列に縮重するヌクレオチド配列を有する核酸分子も本発明に包含される。３ヌクレオチドの逐次分類、すなわちコドンはアミノ酸をコードする。６４コドン及び２０個の天然アミノ酸が存在し得るので、多くのアミノ酸は１つ以上のコドンによりコードされる。遺伝コードの天然の「縮重」または「縮退」は当業界で公知である。よって、配列表に示すヌクレオチド配列はタンパク質クラスターＶポリペプチドをコードする配列の大きいが有限の群の中の１例にすぎない。
【００１５】
本発明の核酸分子は分子生物学の分野の当業者に公知の技術で多数の用途を有する。これらの技術には、ハイブリダイゼーションプローブとして、染色体及び遺伝子マッピングのため、ＰＣＲ法、センスまたはアンチセンス核酸の産生、新規の治療用分子のスクリーニング等の分野が含まれる。
【００１６】
より具体的には、本発明により提供される配列情報により、当業界で公知の方法を用いてコード化ポリペプチドの大規模発現が可能となる。本発明の核酸分子により、サザン及び／またはノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲを含めた公知の技術を用いて関連ポリペプチド、例えばヒト対立遺伝子変異体及び種同族体をコードする核酸分子を同定、単離することができる。ヒトＤＮＡの配列の知識から、サザンハイブリダイゼーションやＰＣＲを用いてクラスターＶ中のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ配列、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のような発現制御調節配列の同定も可能となる。本発明の核酸分子は、クラスターＶ中のタンパク質を発現させる細胞の能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明の核酸分子は疾患または病的状態の原因となる座の遺伝的変化を同定するために使用される診断方法の基礎となり得る。前記情報は診断のため及び治療方法を選択するために使用される。
【００１７】
更なる態様として、本発明は上記した核酸分子によりコードされる単離ポリペプチドを提供する。好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０のアミノ酸配列を有する。しかしながら、本発明のポリペプチドは配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに厳密に限定されない。むしろ、、タンパク質クラスターＣポリペプチドの特徴を実質的に有するならば置換、小さな欠失、挿入または反転のような修飾を有するポリペプチドも本発明に包含される。従って、配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％相同のアミノ酸配列を有するポリペプチドが本発明に包含される。
【００１８】
更なる態様として、本発明は上記した核酸分子を含むベクターを提供する。前記ベクターは、例えば本発明のＤＮＡ分子を有し、このＤＮＡ分子の発現を媒介し得る複製可能な発現ベクターであり得る。本明細書中、「複製可能な」とはベクターが導入された所定型の宿主細胞においてベクターが複製し得ることを意味する。ベクターの例はバクテリオファージのようなウイルス、コスミド、プラスミド及び他の組換えベクターである。核酸分子を当業界で公知の方法によりベクターゲノムに挿入する。
【００１９】
本発明のベクターを有する培養宿主細胞も本発明に包含される。前記宿主細胞は原核細胞、単細胞の真核細胞または多細胞生物由来の細胞であり得る。よって、宿主細胞の例は大腸菌のような細菌細胞、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母由来の細胞、または哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞にベクターを導入するために使用される方法は組換えＤＮＡ方法に通じている当業者には公知の標準方法である。
【００２０】
別の態様として、本発明は宿主細胞をポリペプチドを生産する条件下で培養し、生じたポリペプチドを回収することを含むポリペプチドの生産方法を提供する。細胞を増殖するために使用される媒体はその目的に適した慣用の媒体であり得る。好適なベクターは上記したベクターであり、好適な宿主細胞は上記にリストした細胞型であり得る。ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入するために使用される方法はその目的のために組換えＤＮＡ分野で公知の方法であり得る。細胞により発現させた組換えポリペプチドは細胞の種類及びベクターの組成に応じて分泌され得る。すなわち、細胞膜を介して放出され得る。
【００２１】
更なる態様として、本発明は本発明の核酸分子を調節し得る物質の同定方法を提供し、その方法は（ｉ）前記核酸分子を含む細胞を用意し、（ｉｉ）前記細胞を候補物質と接触させ、（ｉｉｉ）候補物質の非存在下では存在しない効果について前記細胞をモニターすることを含む。
【００２２】
スクリーニング目的で、適当な宿主細胞をリポーター遺伝子を有するベクターを用いて本発明の核酸分子の制御下で形質転換させ得る。リポーター遺伝子の発現を公知の活性を有する物質（すなわち、標準物質）または予想活性を有する物質（すなわち、「試験物質」または「候補物質」）の存在または非存在下で測定し得る。試験物質の存在下でのリポーター遺伝子の発現レベルの変化を標準物質によりもたらされる発現レベルと比較する。このようにして、本アッセイで活性物質が同定され、相対力価が測定される。
【００２３】
トランスフェクションアッセイは、有効物質を同定するための特に有用なスクリーニングアッセイであり得る。トランスフェクションアッセイでは、本発明の核酸分子に作動的に結合するレポーター遺伝子のような遺伝子を含む核酸を所望の細胞型にトランスフェクトする。候補物質の存在下でレポーター遺伝子の試験発現レベルを測定し、対照の発現レベルと比較する。有効物質は、リポーター遺伝子の対照発現レベルとは異なる試験発現レベルを生ずる物質として同定される。なお、対照発現レベルは候補物質の非存在下で測定した発現レベルである。細胞のトランスフェクト方法及び各種の有用なリポーター遺伝子は当業界で公知である（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８５，サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（１９９０年）発行を参照。上掲のＳａｍｂｒｏｏｋも参照されたい）。
【００２４】
本明細書中、用語「一般的プロトコル」及び「一般的手順」は分子生物学的技術に関連して使用されているとき、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４年）発行またはＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A laboratory manual)」，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行のような一般的な実験マニュアルに記載されているプロトコル及び手順と理解されたい。
【実施例１】
【００２５】
タンパク質クラスターの同定
Ｗｏｒｍｐｅｐ２０データーベースリリース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｅｌｅｇａｎｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）においてすべての土壌線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質を用いる“全部対全部”ＢＬＡＳＴ手順により、相同タンパク質ファミリー（以下、“タンパク質クラスターＶ”と呼ぶ）を同定した。Ｗｏｒｍｐｅｐデーターベースは、英国ケンブリッジに所在のＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ及び米国セントルイスに所在のＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒが共同で実施した土壌線虫ゲノム配列決定プロジェクトからの予想タンパク質を含んでいる。１８，９４０個のタンパク質をＷｏｒｍｐｅｐ２０から検索した。これらのタンパク質を、類似のタンパク質を分類するためにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎクラスタリング法（Ｔ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ及びＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，「共通分子サブ配列の同定(Identification of common molecular subsequences)」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７（１）：１９５−１９７（１９８１）；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，「タンパク質配列ライブラリーの検索：Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＦＡＳＴａアルゴリズムの感度及び選択性の比較(Searching protein sequence libraries: comparison of the sensitivity and selectivity of the Smith-Waterman and FASTA algorithms)」，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：６３５−６５０（１９９１）；Ｏｌｓｅｎら，「Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントの最適化(Optimizing Smith-Waterman alignments)」，Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．，３０２−３１３（１９９０））において使用した。完全な注釈付きタンパク質を除き、未知の機能を有する１０，１３０個のタンパク質を１，８００クラスターに分類できた。
【００２６】
得られた配列クラスターをデーターベースＦｌｙｂａｓｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｍｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）に含まれているキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）タンパク質と比較し、注釈付きタンパク質を除いた。土壌線虫及びキイロショウジョウバエに保存されている未知タンパク質クラスターをｗｏｒｍ／ｆｌｙデーター組に保存し、これをＣｅｌｅｒａヒトゲノムデーターベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｅｒａ．ｃｏｍ）に対してＢＬＡＳＴ方法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ／ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ３．ｈｔｍｌ）で使用した。重複断片を、ワシントン大学（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＵＷＧＣ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｐｈａｒｐ．ｈｔｍ）で開発したＰＨＲＡＰソフトウェアを用いて完全長タンパク質にできるだけ密接に集めた。未知の機能を有する相同タンパク質群（“タンパク質クラスターＶ”）を更なる研究のために選択した。
【００２７】
ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）より提供されたＥＳＴデーターベースを用いて、クラスターＶ中のヒトタンパク質が発現したかどうかをチェックし、推定擬似遺伝子を同定した。１つの推定擬似遺伝子を同定し、除いた。
【実施例２】
【００２８】
タンパク質クラスターＶの分析
（ａ）アラインメント
このタンパク質ファミリーのヒト部分には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９に示す核酸配列によりコードされる配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２０に示す７つの異なる１５０〜２５０残基ポリペプチドが含まれている。配列番号２に示すアミノ酸配列は、遺伝子“ＷＵＧＳＣ：Ｈ＿ＤＪ０７４７Ｇ１８．５”（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００４８７６）によりコードされるヒト２６１ａａ配列に対応すると同定された。機能は前記遺伝子に関連していなかった。
【００２９】
ＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルアラインメントソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いたタンパク質クラスターＶ中に含まれるヒトポリペプチドのアラインメントを表Ｉに示す。このアラインメントは、タンパク質の１００残基領域（配列番号２中のＮｏ．２３〜１４７に対応）にわたって高度の保存を示し、新規ドメインの存在が暗示される。
【００３０】
（ｂ）ＨＭＭ−Ｐｆａｍ
ヒトファミリーメンバーに対してＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索を実施した。Ｐｆａｍはタンパク質ファミリー及びドメインの大型コレクションである。Ｐｆａｍは前記ファミリーのマルチプルタンパク質アラインメント及びプロファイル−ＨＭＭ（プロファイル隠れマルコフモデル）を含む。プロファイル−ＨＭＭは、配列ファミリーのコンセンサスの統計的説明を用いて感受性データーベース検索をするために使用し得る。ＰｆａｍはＷＷＷ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ；及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｒ．ｋｉ．ｓｅ／Ｐｆａｍ）で入手可能である。Ｐｆａｍの後者バージョン（４．３）は１８１５ファミリーを含んでいる。これらのＰｆａｍファミリーはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ３７及びＴｒＥＭＢｌ  ９中のタンパク質の６３％に匹敵する。Ｐｆａｍについては、Ｂａｔｅｍａｎら，「Ｐｆａｍタンパク質ファミリーデーターベース(The Pfam protein families database)」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２６３−２６６（２０００）；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら，「Ｐｆａｍ：タンパク質ドメインのマルチプル配列アラインメント及びＨＭＭ−プロファイル(Pfam: Multiple Sequence Alignments and HMM-Profiles of Protein Domains)」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：３２２−３２５（１９９８）；Ｓｏｎｎｈａｍｍｂｅｒら，「Ｐｆａｍ：種子アラインメントに基づくタンパク質ドメインファミリーの包括的データーベース(Pfam: a Comprehensive Database of Protein Domain Families Based on Seed Alignements)」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５−４２０（１９９７）を参照されたい。
【００３１】
ＨＭＭ−Ｐｆａｍ検索から、タンパク質クラスターＶには従来公知のドメインは同定できなかったことが分かる。
【００３２】
（ｃ）ＴＭ−ＨＭＭ
クラスターＶ中のヒトタンパク質をＴＭ−ＨＭＭ道具（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−１．０で入手可能）を用いて分析した。ＴＭ−ＨＭＭは貫膜タンパク質におけるα−ヘリックスの位置及び指向をモデリングし、予想する方法である（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら，「タンパク質配列中の貫膜ヘリックスを予想するための隠れマルコフモデル(A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences)」，ＩＳＭＮ，６：１７５−１８２（１９９８））。上記結果から、ヒトクラスターＶは３〜４個の貫膜セグメントを含むことが分かる。
【００３３】
（ｄ）非ヒトオルソログの分析
土壌線虫ゲノムは、Ｋ０７Ｂ１．４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００３３８４）、Ｆ５９Ａ１．１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ８１５５７）、Ｙ５２Ｇ８Ｂ．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＣ００６８０４）及びＷ０１Ａ１１．２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ６４８５２）と称されるヒトクラスターＶ遺伝子にオルソログな４つの遺伝子を含んでいる。最も近い祖先（Ｋ０７Ｂ１．４）は１０個のヒト遺伝子産物と平均で４４％同一である（「ネマトーダ土壌線虫のゲノム配列：生物学研究のためのプラットフォーム；土壌線虫配列決定コンソーシアム(Genome sequence of the nematode C.elegans: a platform for investigating biology; The C.elegans Sequencing Consortium)」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：２０１２−２０１８（１９９８）も参照されたい。正誤表がＳｃｉｅｎｃｅ，２８３：３５，２８３：２１０３及び２８５：１４９３（１９９３）に記載されている）。
【００３４】
キイロショウジョウバエゲノムは、ヒトクラスターＶにオルソログな４つの遺伝子を含んでいる。最も密接に関連している遺伝子はＣＧ１９４２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００３８４０＿３６）及びＣＧ１９４６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ００３８４０＿３７）であり、これらはヒト遺伝子産物に対して３９％同一であり（Ａｄａｍｓら，「キイロショウジョウバエのゲノム配列(The genome sequence of Drosophila melanogaster)」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：２１８５−２１９５（２０００）も参照）、ヒトタンパク質組に対して４２％同一である。
【００３５】
クラスターＶ中のヒトタンパク質はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＣＹＯＲ２４５Ｃ＿１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７５１５３）及びサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ＳＰＣＣ５４８＿１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ３５９６８５）の２つの酵母タンパク質に対して２７％の同一性を示す。酵母タンパク質は未知の機能を有する。
【実施例３】
【００３６】
発現分析
ヒト遺伝子の組織分布をＩｎｃｙｔｅ  Ｌｉｆｅｓｅｑ（登録商標）データーベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｃｙｔｅ．ｃｏｍ）を用いて研究した。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７に示す遺伝子は主に以下の組織で発現されることが分かった：
配列番号１及び３：肝臓，消化器系、
配列番号７及び９：外分泌腺，結合組織，生殖細胞、
配列番号１１：女性性器，尿路、
配列番号１７：女性性器，神経系、
配列番号１３及び１５：消化器系、
配列番号５：心血管系。
【００３７】
従って、核酸分子及びコード化ポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在する組織及び細胞型を鑑別同定するため、遺伝子が発現する組織に関連する疾患及び障害を診断するために使用されると提案される。
【実施例４】
【００３８】
クラスターＶ遺伝子に対するβ３−ＡＲアゴニストの影響
マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイリング、比較ゲノム及びゲノタイピングを含めた用途においてＤＮＡ及びＲＮＡ変異を測定するために使用され得る数千の各種ＤＮＡ配列の高次マトリックスから構成される（最近の検討のため、例えばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら，「ＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現のモニタリング(Monitoring gene expression using DNA microarrays)」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３（３）：２８５−２９１（２０００）；またはＤｕｇｇａｎら，「ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる発現プロファイリング(Expression profiling using cDNA Microarrays)」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，補遺２１：１０−１４（１９９９）参照）。
【００３９】
β３−ＡＲアゴニストがインビボで脂肪組織での遺伝子調節に影響を及ぼすメカニズムを調べるために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐオリゴヌクレオチドアレイを用いてβ３−ＡＲアゴニストＣＬ−３１６，２４３で処理したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスまたは食塩液を注射した対照マウス由来の白色脂肪組織中の多数の遺伝子の転写物プロファイルを比較することにより研究を実施した。
【００４０】
対照マウス及びβ３−ＡＲアゴニスト処理マウス由来の白色脂肪組織からポリＡ＋ｍＲＮＡを抽出した。前記ｍＲＮＡをＴ７タグ付きオリゴ−ｄＴプライマーを用いて転写し、２本鎖ｃＤＮＡを作成した。次いで、これらのｃＤＮＡを増幅し、インビトロトランスクリプション（ＩＶＴ）を用いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ及びビオチニル化ヌクレオチドで標識した。ＩＶＴ後得られたｃＲＮＡを精製し、熱により断片化すると、約３５〜２００塩基のＲＮＡ断片サイズの分布が生じた。それぞれ３アレイ（サブＡ、サブＢ及びサブＣ）及び２アレイ（サブＡ及びサブＢ）の２組のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｕｌ９Ｋ及びＭｕｌ１Ｋ組を（推奨されている緩衝液中で）対照または処理変性サンプルと４５℃で一晩ハイブリダイズした。次いで、前記アレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションを利用してＲ−フィコエリトリンストレプトアビジンで染色した。カートリッジをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ共焦点スキャナーを用いて走査し、画像をＧｅｎｅＣｈｉｐ３．１ソフトウェァ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて分析した。
【００４１】
上記結果から、虫遺伝子Ｆ５９Ａ１．１０にオルソログなマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡ２７５９４８）はβ３−ＡＲアゴニスト処理によりダウンレギュレートされることが分かる。クラスターＣ中のヒト遺伝子は代謝的に重要なシグナル経路にも関わることが仮定される。
【実施例５】
【００４２】
多重組織ノーザンブロッティング
クラスターＶ中のタンパク質の発現プロファイルを十分に分析するために多重組織ノーザンブロッティング（ＭＴＮ）を実施する。多重組織ノーザン（ＭＴＮＴＭ）ブロット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍｔｎ）は各種ヒト、マウスまたはラット組織由来のＰｒｅｍｉｎｕｍポリＡ＋ＲＮＡを特徴づける予備作成したノーザンブロットである。ＭＴＮブロットを使用すると、各種組織中の転写物のサイズ及び相対存在量を分析することができる。ＭＴＮブロットを使用すると、遺伝子ファミリー及び交互スプライス形態を調査し、交差種相同性を評価することができる。
【実施例６】
【００４３】
タンパク質クラスターＶに結合するポリペプチドの同定
タンパク質クラスターＶと相互作用するタンパク質をアッセイするために、２ハイブリッドスクリーニング方法を実施することができる。Ｆｉｅｌｄ及びＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３４０：２４５−２４７（１９８９）に記載されたのが最初である２ハイブリッド方法は、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための酵母ベースの遺伝的アッセイである。この方法により、相互作用するタンパク質を同定できるだけでなく、該タンパク質のためにクローン化遺伝子を即座に利用し得る。
【００４４】
２ハイブリッド方法は、２つの公知タンパク質（すなわち、対応遺伝子が既にクローン化されているタンパク質）が相互作用するかを調べるために使用することができる。２ハイブリッド方法の別の重要な用途は、２ハイブリッドライブニリーをスクリーニングすることにより標的タンパク質と相互作用する未知のタンパク質を同定することである。参考のために、例えばＣｈｉｅｎら，「２ハイブリッドシステム：当該タンパク質と相互作用するタンパク質の遺伝子を同定及びクローンする方法(The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest)」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１）；Ｂａｒｔｅｌ  ＰＬ，Ｆｉｅｌｄｓ，「２ハイブリッドシステムを用いるタンパク質−タンパク質相互作用の分析(Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system)」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２５４：２４１−２６３（１９９５）；またはＷａｌｌａｃｈら，「酵母２ハイブリッドスクリーニング技術及びアポトーシスにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の研究でのその使用(The yeast two-hybrid screening technique and its use in the study of protein-protein interactions in apoptosis)」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（２）：１３１−１３６（１９９８）を参照されたい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｍａｔｃｈｍａｋｅｒも参照されたい。
【００４５】
２ハイブリッド方法は２つのタンパク質の相互作用を示すために転写活性化の回復を使用する。この方法は、多くの真核転写活性化剤が、特定のプロモーター配列に結合するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）とＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体によりＤＮＡ結合部位の下流の遺伝子を転写させる活性化ドメイン（ＡＤ）の２つの物理的に区別されるモジュレータードメインから構成されるという事実に基づく。ＤＮＡ−ＢＤベクターはＤＮＡ−ＢＤとバイトタンパク質Ｘを融合させるべく使用され、ＡＤベクターはＡＤと別のタンパク質Ｙを融合させるべく使用される。バイトタンパク質と相互作用する新規で未知のタンパク質を検索するためにＡＤとのハイブリッドの全ライブラリーも構築され得る。バイトタンパク質Ｘと候補タンパク質Ｙの間で相互作用が生ずると、ＤＮＡ結合及び活性化に関与する２つの機能ドメインが連結され、その結果転写活性が機能的に回復する。２つのハイブリッドを、適当な上流結合部位を含むリポーター遺伝子を有する酵母宿主菌株に同時形質転換させる。この場合、リポーター遺伝子の発現が候補タンパク質と標的タンパク質の相互作用を示す。
【実施例７】
【００４６】
クラスターＶ遺伝子の完全長クローニング
インビボで特定ＤＮＡセグメントを酵素増幅するための公知方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、タンパク質クラスターＶ遺伝子をクローニングすることができる。組織ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、適当なプラスミドにクローン化し、配列決定され得る。参考のために、例えばＨｏｏｆｔ  ｖａｎ  Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ，「ＰＣＲによるｃＤＮＡクローニング：地雷敷設区域のガイド付きツアー(PCR-assisted cDNA cloning: a guided tour of the minefield)」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：３９０−３９２（１９９８）；Ｌｅｎｓｔｒａ，「ライフサイエンスにおけるポリメラーゼ連鎖反応の応用(The applications of the polymerase chain reaction in the life sciences)」，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１：６０３−６１４（１９９５）；またはＲａｓｈｔｃｈｉａｎ，「ポリメラーゼ連鎖反応を用いる遺伝子のクローニング及び遺伝子操作のための新規方法(Novel methods for cloning and engineering genes using the polymerase chain reaction)」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｙｎｏｌｏｇｙ，６：３０−３６（１９９５）を参照されたい。ＰＣＲ産物のクローニングを容易とするために適当な末端を作成するための各種方法は、例えば上掲のＡｕｓｕｂｅｌら（セクション１５．７）に記載されている。
【００４７】
タンパク質クラスターＶの完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するための別の方法では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ断片またはその一部をファージｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションスクリーニング用プローブとして使用し得る。ＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法により増幅させる。プライマーは好ましくは１０〜２５ヌクレオチド長であり、当業者に公知の方法により決定される。ラムダファージ−ベクターにクローン化したｃＤＮＡを含むラムダファージライブラリーを大腸菌宿主細胞と一緒に寒天プレート上で平板培養し、増殖させる。ファージプラークをナイロン膜上に移し、上記したように作成したＤＮＡファージプラークとハイブリダイズさせる。プレートからポジティブコロニーを単離する。ｃＤＮＡを含むプラスミドを一般的方法により単離ファージから取り出す。プラスミドＤＮＡをクローンから単離する。プラスミドを適当な制限酵素を用いて消化させることにより、挿入物のサイズを測定する。全挿入物の配列をプラスミドの自動配列決定により調べる。
【実施例８】
【００４８】
真核宿主細胞におけるタンパク質の組換え発現
クラスターＶのタンパク質を生産するために、ポリペプチドコード化核酸分子を適当な宿主細胞において適当な発現ベクター及び一般的な遺伝子工学技術を用いて発現させる。例えば、ポリペプチドコード化配列を市販されている発現ベクターにサブクローン化し、哺乳動物（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））細胞に一般的なトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。タンパク質を安定的に発現する細胞を選択する。場合により、タンパク質を一般的なクロマトグラフィー技術を用いて細胞から精製してもよい。精製を助けるために、アミノ酸配列の一部に相当する１つ以上の合成ペプチド配列に対する抗血清を作成し、この抗血清をタンパク質をアフィニティー精製するために使用する。
【実施例９】
【００４９】
遺伝子機能の測定
各遺伝子の生物学的機能または作用モードを解明するための方法は当業界で公知である。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）はクローン化遺伝子を特異的に且つ強力に不活化する方法を与え、遺伝子機能を研究するための有力な道具である。参考のために、例えばＦｉｒｅ，「ＲＮＡトリガー遺伝子のサイレンシング(RNA-triggered gene silencing)」，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：３５８−３６３（１９９９）；またはＫｕｗａｂａｒａ及びＣｏｕｌｓｏｎ，「遺伝子機能を調べるための一般的技術のＲＮＡｉ−展望(RNAi-prospects fo a general technique for determining gene function)」，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１６：３４７−３４９（２０００）を参照されたい。内在性ｍＲＮＡのセンス及びアンチセンス配列に相当する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入すると、同族体ｍＲＮＡは分解し、遺伝子は沈黙する。このタイプの転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は最初土壌線虫で発見された（Ｆｉｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１（１９９８））。最近、ＲＮＡ干渉は土壌線虫染色体Ｉ（Ｆｒａｓｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：３２５−３３０（２０００））上の推定遺伝子のほぼ９０％及び線虫染色体ＩＩＩ（Ｇｏｎｃｚｙら，Ｎａｔｕｒｅ，４０８：３３１−３３６（２０００））上の推定遺伝子の９６％を標的するために使用されている。
【００５０】
【表１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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